(57)【要約】  分析および診断目的のために生体試料内の生細胞を固定化する方法であって、分析する所定数の細胞を含有する生体試料を提供するステップ、分析装置で使用するために特に適切な平面支持体を提供するステップであって、該平面支持体がナノ構造材料を含む表面コーティングで官能化された表面を含む、ステップと、生体試料に含有される細胞を平面支持体の官能化表面に接着させるために、前記平面支持体の前記官能化表面に前記生体試料の層状層を沈着させるステップと、生体試料の層状層上に固定剤を配置するステップとを含む、方法。前述のステップは全て、少なくとも２５℃を下回る温度で実施する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析および診断目的のために生体試料内の生細胞を固定化する方法であって、
−  分析する所定数の細胞を含有する生体試料を提供するステップと、
−  分析装置で使用するために特に適切な平面支持体を提供するステップであって、該平面支持体がナノ構造材料を含む表面コーティングで官能化された表面を含む、ステップと、
−  該生体試料に含有される該細胞を該平面支持体の官能化表面に接着させるために、該平面支持体の該官能化表面に該生体試料の層状層を沈着させるステップと、
−  該生体試料の該層状層上に固定剤を配置するステップと、
を含み、これらのステップを少なくとも２５℃を下回る温度で実施し、
該生体試料に含有される該細胞を該平面支持体の該官能化表面に接着させるステップをさらに含み、該ステップを、２５℃を下回る温度で実施する、方法。
【請求項２】
生体試料の前記層状層を前記平面支持体上に配置するステップと前記層状層上に前記固定剤を配置するステップとの間の時間範囲が４分未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記平面支持体の全表面積と生体試料の前記層状層によって占有される前記平面支持体の表面積との間の比が１．５と９との間である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記生体試料の前記層状層の体積が１マイクロリットルと２ミリリットルとの間である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
閉じ込め疎水性物質を前記平面支持体に結びつけるステップをさらに含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
フィルムのナノ構造材料が、酸化亜鉛（ＺｎＯ）、二酸化ジルコニウム（ＺｒＯ２）、二酸化チタン（ＴｉＯ２）のいずれか１種から選択される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記平面支持体の前記表面コーティングに付着したままの前記生細胞が希少細胞である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
請求項１から７のいずれかに記載の方法を実施するステップと、
循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を同定するために前記生体試料を分析するステップと、
患者に関する最初の臨床データを得るために画像分析によってＣＴＣを計数するステップと、を含む、患者の腫瘍の診断または予測の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体液の機器分析の分野に関し、特に、リキッドバイオプシー試料の分析および診断目的のために生体試料を固定化する方法に関して開発された。
【背景技術】
【０００２】
リキッドバイオプシーは、特定の疾患または医学的に関心のある生理学的状態について潜在的に診断価値のある細胞を含有する様々な体の部分から採取された生体液試料、例えば、末梢血、骨髄、脳脊髄液、尿、唾液、痰、涙および精液からなる。
【０００３】
免疫学的および分子的特徴付けによるリキッドバイオプシー試料中に存在する細胞の分析は、初期診断を行うためだけでなく、療法の有効性の評価まで、病態のスクリーニング、予防、同定および経過観察のためのますます重要な診断方法になっている。
【０００４】
例えば、固形腫瘍由来の循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）として知られる希少腫瘍細胞は、様々な生体液中で同定されてきた。科学的研究は、臨床的観点から効率的で有効であること、もっと厳密にいえば、敏感で特異的であることを立証できた単離分析方法を開発することに、かなりの労力を傾けてきた。
【０００５】
腫瘍細胞と同様に、循環胎児細胞（ＣＦＣ）は、妊娠女性で同定された。ＣＦＣは、単純な血液試料で、したがって、非侵襲性の方法で、母体血から単離することができる希少細胞である。このような「リキッドバイオプシー」試料は、染色体異数性または他の胎児の遺伝的異常の非侵襲性出生前診断（ＮＩＰＤ）のために使用することができる。
【０００６】
ＣＴＣの計数が特定の腫瘍の進化に関する臨床診断データを提供するというパラダイムは、様々な臨床研究から明らかになった。ごく最近、正確なプロテオミクスおよび分子的特徴付けが、これらの希少細胞を元の腫瘍に結びつけ、この疾患の転帰を正確に予測するのに欠かせないことが立証された。
【０００７】
ＣＴＣまたは他の希少細胞を単離し、これらの細胞を免疫学的または分子的手段によって特徴付け、生体液中におけるこれらの臨床的意義を評価することを最終目的とした種々の公知のアプローチが多く存在する。しかし、定義によると、これらの細胞は、例えば造血区画に属し、自発的には接着しない数百万の他の循環細胞と共に、血液または他の液体中を循環する希少細胞である。結果として、希少細胞を速やかに安定した方法で単離してその後の試験のために支持体に固定化することは、簡単または迅速な作業ではない。
【０００８】
臨床レベルでは、細胞形態学はリキッドバイオプシーの細胞分析における別の関連要素である。生細胞は全て、外部刺激、例えば、抗体基質のタンパク質表面またはコーティングへの接着、薬物治療、流速もしくは圧力によるストレスのある環境状態に応答する。外部刺激に対するこの生物学的応答は、細胞形態の実質的な変化の原因となり、ひいては不正確な診断を招く恐れがある。
【０００９】
例えば、特許文献１および特許文献２は、フラクタルまたはナノ構造表面を利用する方法であって、前記表面に生体液試料を沈着させる前に、表面に特定の抗体、例えば、抗ＥｐＣＡＭ、および／または修飾抗体を接着させて提供するステップを含む方法を開示している。
【００１０】
逆に、臨床評価目的のため、「インビボ」条件に対応する「変化していない」生物学的特性を有する細胞を得るために、このような変化を誘導することが知られているいかなる操作、外部刺激との相互作用および／または生体試料の処理延長も最小限に抑えるべきである。
【００１１】
生細胞の細胞遠心分離は、これらの基準に合致する別の公知の分析方法である。試料に遠心力を適用することによって、この方法は、細胞を、顕微鏡スライドなどの支持体に押しつけ、細胞の固定およびその後の免疫学的（免疫蛍光）または分子的（ＦＩＳＨ）方法による染色を可能にする。
【００１２】
しかし、この方法は、細胞の部分的または全体的破裂を引き起こし、細胞の形態を根本的に変化させ、結果の診断評価を困難にさせる。
【００１３】
別の公知の方法は、障害物の間に生じた流路のサイズより大きい、所定のサイズを有する細胞を捕捉するために、一連の障害物を通って流れる生体液を提供する。例えば、特許文献３は、基質、基質に結合して基質から外に向かって伸長する伸長部分および伸長部分に配置された官能化グラフェンオキシドを開示している。伸長部分は、生体液が流れる複数の放射状流路および室を画定する。さらに、ＣＴＣを同定するためのリキッドバイオプシーの場合、前記表面に生体液試料を沈着させる前に、１種または複数のマーカー、抗体、抗原、タンパク質または特異的腫瘍結合剤、例えば、抗ＥｐＣＡＭをグラフェンオキシドに適用する。
【００１４】
同様に、特許文献４において、生体液が流れることができる多孔質の一連の障害物を含むマイクロおよびナノ構造を提供することが知られている。これらの障害物は、障害物の間に生じた流路のサイズよりも大きい寸法を有する細胞の通過を機械的に阻止することができる。この場合はまた、障害物を横切る細胞を化学的に操作することができる物質を障害物に適用する。
【００１５】
生体試料が流れる経路に挿入された障害物を通るＣＴＣを選択、捕捉する解決法の主な欠点の１つは、流動ストレスを受ける細胞自体の生物学的、したがって形態学的変化によってもたらされる。さらに、これらの方法は、性質上、表面膜タンパク質のサイズまたは発現によって均質な細胞集団を選択しており、生体試料全てを特徴付ける不均一特性を考慮していない。この生物学的不均一性は、これらの方法が提供することができない臨床的に重要なデータである。
【００１６】
試料の生物学的代表性（representativeness）を含む数多くのパラメータが診断精度に影響を及ぼす可能性があるので、リキッドバイオプシー試料の分析の全体を通じて非常に正確な細胞形態を提供し、試料内で、臨床的に価値のある所定の生物学的特性を備えた多数の細胞を維持することができる方法が必要である。ＣＴＣの特定の場合では、サイズ、形態、およびタンパク質発現の様々な特性を有する生きた循環細胞分画を分析することができれば、起こり得る転移過程の早期診断の最も適切な分析手段となることは間違いない。転移過程は、血液区画中で生き延びて標的器官の組織を侵襲し、転移腫瘍増殖の過程を開始することができる１種または複数のＣＴＣに由来することは周知である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】ＣＮ１０３６６７１９１
【特許文献２】ＣＮ１０５９５０４３６
【特許文献３】国際公開第２０１３０４９６３６号パンフレット
【特許文献４】国際公開第２０１２０１６１３６号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
上記に鑑みて、本発明の目的は、この必要性に対する解決法を提供することである。別の目的は、妥当な費用で、簡単かつ合理的な解決法により結果を得ることである。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
これらの目的は、独立請求項に記載した本発明の特性によって実現される。従属請求項は、本発明の好ましい、および／または特に有利な態様の概略を示す。
【００２０】
本発明の一実施形態は、分析および診断目的のために生体試料内の生細胞を固定化する方法であって、
−  分析する所定数の細胞を含有する生体試料を提供するステップと、
−  分析装置で使用するために特に適切な平面支持体を提供するステップであって、該平面支持体がナノ構造材料を含む表面コーティングで官能化された表面を含む、ステップと、
−  生体試料に含有される細胞を平面支持体の官能化表面に接着させるために、該生体試料の層状層を該平面支持体の該官能化表面に沈着させるステップと、
−  生体試料の層状層上に固定剤を配置するステップと
を含み、これらのステップを、２５℃を下回る温度で実施し、
生体試料に含有される細胞を平面支持体の官能化表面に接着させるステップをさらに含み、該ステップを、２５℃を下回る温度で実施する、方法を提供する。
【００２１】
この解決法は、この方法の全ステップが周囲温度に実質的に対応する温度で実施されるので、試料の元の状態を反映する特性を可能な限り保持する。したがって、生体試料中の細胞に細胞形態を変化させる温度変化または流動ストレスを与える必要がない。
【００２２】
本発明の別の態様は、生体試料の層状層を平面支持体上に配置するステップと該層状層上に固定剤を配置するステップとの間が４分未満の時間範囲であることを条件とする。
【００２３】
この解決法のおかげで、生体試料に含有される細胞は元の「インビボ」状態を変化させる形態学的変化を受けないことを保証することができ、公知の生細胞固定化法と比較して通常の処理時間を１００倍も短縮することができる。
【００２４】
本発明のさらなる態様は、平面支持体の全表面積と生体試料の層状層によって占有された平面支持体の表面積との間の比が１．５と９との間であることを条件とする。
【００２５】
この解決法の結果として、細胞接着に利用可能な顕微鏡スライドの表面積は最高２０ｍｍ×６０ｍｍとすることができ、したがって、利用可能な表面は最大限に活用され、大量の生体試料を分析するのに必要な標準スライドは少なくなる。
【００２６】
本発明の別の態様は、平面支持体の表面コーティングに付着したままの生体試料に含有される生細胞のパーセンテージは９０％よりも高いことを条件とする。
【００２７】
本発明の別の態様は、平面支持体の表面コーティングに付着したままの生体試料に含有される生細胞のパーセンテージは９９％と等しいことを条件とする。
【００２８】
したがって、前記解決法は、特に、希少細胞集団における希少細胞の分析の場合、患者試料を忠実に表していることを保証することができる。
【００２９】
本発明のさらなる態様は、前記生体試料の層状層の体積が１マイクロリットルと２ミリリットルとの間であることを条件とする。
【００３０】
この解決法のおかげで、広範囲の生体試料体積を分析することができ、全てについて、同じ接着効率パーセンテージが得られ、その結果、同じ数の識別可能な細胞が得られる。
【００３１】
本発明の別の態様は、閉じ込め疎水性物質を平面支持体に結びつけるステップを含む。
【００３２】
本発明のさらに別の態様では、フィルムのナノ構造材料は、酸化亜鉛（ＺｎＯ）、二酸化ジルコニウム（ＺｒＯ２）、二酸化チタン（ＴｉＯ２）のいずれか１種から選択される。
【００３３】
前記解決法は、官能化材料が正常細胞の活動を妨害せず、細胞培養物を調製するために使用した試薬と反応しないことを保証する。さらに、二酸化チタンは自発蛍光が弱いので、蛍光をベースにした測定を改善することができる。
【００３４】
本発明の別の態様は、平面支持体の表面コーティングに付着したままの生細胞が希少細胞であることを条件とする。
【００３５】
この解決法の結果、生体試料中で同定された希少細胞を元の腫瘍に結びつけ、疾患および／または与えられている医学的処置の転帰を正確に予測することが可能である。
【００３６】
本発明のさらなる実施形態は、以前に報告された方法を実施するステップと、生体試料を分析してＣＴＣを同定するステップと、画像分析によってＣＴＣを計数して患者に関する最初の臨床データを得るとステップを含む、患者の腫瘍の診断または予測の方法を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
一部の実施形態は、分析する所定数の生細胞を含有する生体試料の用意を含む。この明細書全体を通じて、「生体試料」は、例えば、リキッドバイオプシーに由来し、溶液中で除タンパク質化された、様々な生体液中に存在する生細胞の細胞学的試料と解釈されるべきである。生体試料は、ヒトから収集され、分析時まで適切な容器中で、所定の環境条件下で保存される。
【００３８】
分析前に、生体試料、したがって、生体試料中の生細胞は、標準的手順によって、例えば、生体試料が血液ならば、赤血球溶解手法によって、予備処理を行うことができる。その後、この細胞を等張生理食塩水、例えば、リン酸緩衝液中に分散させることができる。
【００３９】
他の場合には、例えば、例として限定はしないが、脳脊髄液の存在下において、生体試料にはいかなる予備処理も行わない。
【００４０】
一部の実施形態は、希少細胞、例えば、希少腫瘍細胞、すなわち、固形腫瘍由来の循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）をおそらく含有している生体試料の調製を含む。同様に、他の実施形態は、循環胎児細胞（ＣＦＣ）をおそらく含有している生体試料の調製を含む。
【００４１】
一部の実施形態は、生体試料中に存在する細胞をカウントすることも含む。例えば、血液試料の場合、通常は希少細胞を含有しないが、分析する細胞の数をその後のステップで決定するために細胞をカウントする。
【００４２】
一旦生体試料が調製できたら、生体試料を平面支持体、例えば、分析機器で使用するために特に適切である顕微鏡スライド上にのせる。所定の時間範囲後、生体試料中に含有され、平面支持体上に沈着した細胞は、アルコール性または架橋結合性固定剤を使用して固定させ、例えば、限定はしないが、細胞着色剤、抗体またはＤＮＡ／ＲＮＡプローブによって分析し、可視または蛍光染色で可視化する。
【００４３】
例えば、生体液中に存在する希少細胞または非希少細胞等の、診断対象の標的細胞を同定する分析操作のために、特異的マーカーを使用することができる。
【００４４】
次に、平面支持体上にのせられた生体試料は、自動化蛍光または明野顕微鏡下で分析し、特に関心のあるマーカーに基づいて標的細胞を同定することができる。例えば、血液中の循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の場合、汎ケラチンおよびＣＤ４５マーカーを使用して上皮または造血起源の細胞を明らかにする。画像分析によって、ＣＴＣ（汎ケラチン陽性およびＣＤ４５陰性）と同定された希少細胞を計数して、患者におけるＣＴＣ一覧に関する最初の臨床データを入手する。
【００４５】
一旦標的細胞を同定したら、標的細胞を平面支持体上に集め、顕微鏡操作または「レーザーマイクロダイセクション」によって単離し、分子アッセイによって単一細胞ゲノムまたはトランスクリプトームシークエンシングまで試験することができる。特定の疾患状態に特異的な標的細胞の分子的および生物学的特徴付けは、個別化医療の場合、疾患診断のための分析データとなる。
【００４６】
本発明の好ましい実施形態の１つによれば、分析および診断目的のために生体試料内の生細胞を固定化する方法は、生体試料を受容するのに特に適切な平面支持体を提供する第１のステップを含む。
【００４７】
平面支持体は好ましい方向に伸長した平坦な支持体で、厚さは非常に薄く、例えば、限定はしないが、厚さは約１ｍｍである。平面支持体は壁および天井を含むいかなる形態の物理的な封じ込め境界も含まない。
【００４８】
平面支持体は、例えば、水晶、ある種のプラスティック、または好ましくはガラス等の透明な材料から形成されることが好ましい。平面支持体のサイズは、広い制限内で変化するが、本発明の平面支持体が特に分析装置における使用に適切で、この分野で既に使用されている自動化手段で取り扱うことができるように、医療および生物学分野における自動分析に使用される支持体と同様であることが好ましい。例えば、平面支持体は水平寸法が２５×７６ｍｍで厚さが１ｍｍであってもよい。
【００４９】
平面支持体は、少なくとも平坦なナノ構造表面、すなわち、官能化された、ナノ構造材料を含む表面コーティング、例えば、フィルムが適用される平坦な表面を含む。本発明の可能な実施形態の１つによれば、表面コーティングは、例えば、限定はしないが、酸化亜鉛（ＺｎＯ）、二酸化ジルコニウム（ＺｒＯ２）、好ましくは二酸化チタン（ＴｉＯ２）をフィルムの形態で含むことができる。ナノ構造材料のフィルム、ならびに平坦なナノ構造表面は、サイズ分布が５０ｎｍ未満であるナノ粒子を含み、厚さが２０ｎｍと２００ｎｍとの間、好ましくは４０ｎｍと６０ｎｍとの間であり、表面粗さが２ｎｍと３０ｎｍとの間、好ましくは５ｎｍと１５ｎｍとの間である。
【００５０】
限定はしないが、スパッタリング、パルスレーザー堆積（ＰＬＤ）、または、好ましくは、パルスマイクロプラズマクラスター源（ＰＭＣＳ）を使用する超音波ビームにおけるナノ粒子の沈着を含む様々な技術を使用して、ナノ構造材料のフィルムを平面支持体の平坦な表面に沈着させてもよい。
【００５１】
ナノ構造材料のフィルム、ならびに平坦なナノ構造表面は、その親水性を高めるために酸素プラズマで処理することが好ましい。
【００５２】
平坦なナノ構造表面は、所定のサイズを有する区切られた領域を画定する。平坦なナノ構造表面は、平面支持体全体の領域に対応する１領域を画定していてもよく、または平面支持体全体の領域よりも小さいサイズを有する１領域を画定していてもよい。
【００５３】
分析および診断目的のために生体試料内の生細胞を固定化する方法は、所定量の生体試料を平坦なナノ構造表面に直接沈着させる、沈着の第２の後続のステップを含む。
【００５４】
本発明の特徴によれば、生体試料の層状層は、平面支持体、したがって平坦なナノ構造表面にのせ、したがって沈着させることができる。この明細書全体を通じて、層状層は、物質の水平方向のサイズが前記物質の厚さよりも大きいある量の前記物質と解釈される。
【００５５】
平面支持体にのせ、したがって沈着させた生体試料の層状層の体積は、平面支持体の平坦なナノ構造表面の面積と所望する結果を得るために分析しなければならない生体試料の量との両方によって大きく変化する。
【００５６】
分析および診断目的のために生体試料内の生細胞を固定化する方法は、生体試料中に含有される生細胞を平坦なナノ構造表面に接着、または固定化する第３の後続のステップを含む。このステップの間に、生体試料の層状層は前記平坦なナノ構造表面に所定の時間範囲静置されて、生体試料中に含有される細胞を表面に接触させて接着させ、したがって平坦なナノ表面に固定化させる。
【００５７】
分析および診断目的のために生体試料内の生細胞を固定化する方法は、生体試料中に含有され、前の段階においてナノ構造の平坦な表面に接着、または固定化された生細胞を、固定物質、例えば、アルコール性または架橋結合性固定剤の適用によって固定させる、生細胞を固定させる第４の後続のステップを含む。
【００５８】
本発明の特に有利な特徴によれば、機器によって生体試料を分析するステップの前のステップは全て、２５℃を下回る温度で実施することができる。特に、生体試料中に含有される細胞が平面支持体の表面コーティングに接着するように生体試料の層状層を平面支持体にのせるステップ、および固定剤を生体試料の層状層に配置するステップは、２５℃を下回る温度、好ましくは１８℃と２５℃との間の温度、さらにより好ましくは２１℃と２５℃との間の温度で実施することができる。
【００５９】
さらにより好ましくは、細胞を平坦なナノ構造表面に固定化するステップは、２５℃を下回る温度、好ましくは１８℃と２５℃との間の温度、さらにより好ましくは２１℃と２５℃との間の温度で実施する。さらに、細胞を平坦なナノ構造表面に固定化するステップは、細胞インキュベーション装置に平面支持体を配置することなく、一般的に、いかなるインキュベーションステップも介在させることなく実施する。
【００６０】
本発明のさらに特に有利な特徴によれば、生体試料の層状層を平面支持体にのせるステップと固定剤を前記層状層に配置するステップとの間の所定の時間範囲は、先行技術と比較して著しく短縮することができる。特に、前記時間範囲は５分未満、好ましくは４分未満であってもよい。
【００６１】
さらにより好ましくは、本発明の方法の接着または固定化のステップの所定の時間範囲、すなわち、生体試料の層状層を前記平坦なナノ構造表面に定置させる所定の時間範囲は、５分未満、さらにより好ましくは４分未満である。
【００６２】
本出願人によって実行されたいくつかの実験は、このような温度範囲およびこのような時間範囲が、水平方面の寸法が２５ｍｍ×７６ｍｍに等しく、１μｌと２ｍｌとの間の体積の生体試料の層状層をのせることができる平面支持体を使用することによってどのように実現することができるかを示している。
【００６３】
これらの実験でまた明らかになった驚くべき効果は、このような温度範囲、特に、時間範囲は、生体試料中に含有される生細胞を、平坦なナノ構造表面に９０％を上回るパーセンテージで、多くの場合、９９％に等しいパーセンテージで接着、または固定化させることである。
【００６４】
公知の方法およびシステムでは、その後の分析ステップにおいて重要となる十分な数の細胞を平面支持体上に固定するのに、ずっと長い時間範囲が必要である。公知の種類の方法およびシステムでは、本発明の方法と同一の時間範囲の使用では、細胞の劣化を低減させたが、個別化医療の分野で疾患を診断するために、特に、希少細胞集団の希少細胞を分析する場合、妥当な分析データを構築するため等のパーセンテージで生細胞を接着させることはできなかった。
【００６５】
このような実験はまた、どのように平面支持体の全表面積と生体試料の層状層によって占有された平面支持体の表面積との間の比が好ましくは１．５と９との間になることができるかを明らかにした。
【００６６】
本発明による分析および診断目的のために生体試料内の生細胞を固定化する方法は、生体液試料の前記表面への沈着段階の前に、平面支持体の平坦なナノ構造表面を特異的抗体、例えば、抗ＥｐＣＡＭ、および／または修飾抗体の接着によって提供するいかなるステップも含まない。
【００６７】
本発明による分析および診断目的のために生物学的試料内の生細胞を固定化する方法は、生体液が平坦なナノ構造表面上を流れるようにするいかなるステップも含まない。特に、本発明の方法は、障害の間に生じた流路のサイズより大きい所定のサイズを有する細胞を保持するために、生体液が一連の障害を流れるいかなるステップも含まない。
【００６８】
本発明の別の特に有利な特徴によれば、本発明の平面支持体の平坦なナノ構造表面は、タンパク質抗体マトリクス表面またはコーティングを含まない。
【００６９】
本発明のさらに特に有利な特徴によれば、生体液中に含有される生細胞は、接着または固定化ステップ中に、流動または圧力による環境ストレス状態にさらされない。
【００７０】
これらの条件はいずれも、生物学的状態の撹乱を最小限に抑えて、臨床試験のために典型的な細胞試料を提供し、および他の公知の固定化および単離法で示された限界を克服するのに不可欠である。
【００７１】
本発明の方法で実現した結果のさらなる利点は、正確な診断を得るために分析する生体試料の量、したがって、平面支持体の量にある。例えば、リキッドバイオプシーから生じる試料中、例えば、末梢血中の希少細胞を同定するためには、多数の細胞が必要である。血液が生体試料の場合、細胞の数は約３０００万〜４０００万個の白血球（ｗｈｉｔｅ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ）（白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ））でなければならない。
【００７２】
本発明の方法によって、平面支持体当たり著しい数の細胞、例えば、平面支持体当たり少なくとも２００万〜３００万個に等しい数を固定化することができる。したがって、血液試料の検査は、ほんの１０〜１５枚の平面支持体で完了することができた。反対に、公知の細胞遠心分離法では、平面支持体当たりの細胞数は非常に少ないので、患者のリキッドバイオプシー試料を管理し分析することは不可能である。
【００７３】
さらに、生体試料の数がより少なければ、マーカー染色によって自動化管理が可能になり、試薬消費量の節約に結びつき、その結果大切な費用が削減される。
【００７４】
本発明の一実施形態によれば、分析および診断目的のために生体試料内の生細胞を固定化する方法はまた、閉じ込め疎水性物質を平面支持体に結びつけるステップを含む。閉じ込め疎水性物質は、疎水性化合物、または構造上水に親和性を示さない官能基を含む任意の物質である。
【００７５】
本出願人が実行した数多くの実験は、閉じ込め疎水性物質はアルコールベースが好ましく、揮発性溶媒中に溶解していると便利であることを示している。
【００７６】
平面支持体上の閉じ込め疎水性物質の配置は、水性液体の通過を防ぐ１つまたは複数の封じ込め境界を画定する。封じ込め境界は、形状およびサイズが様々で、生体試料の層状層をいかなる他の物理的封じ込め境界要素がなくても閉じ込めることができる１つまたは複数の表面領域を画定することができる。
【００７７】
閉じ込め疎水性物質を適用した後、揮発性溶媒が溶解するように平面支持体を乾燥させる。したがって、封じ込め境界は、乾燥すると、平面支持体の表面と実質的に同一平面の分子層を形成する。
【００７８】
このようにして、平面支持体に、同じ生体試料またはそれぞれ異なる生体試料であるいくつかの層状層を沈着させ、それらを互いに分離して維持することができる。さらに、様々なサイズで、表面領域に含有される生体液が様々な体積である表面領域を生成することができる。平面支持体を標準の自動化液体処理プラットフォームで処理しなければならない場合、この解決法は特に有効である。
【００７９】
閉じ込め疎水性物質を平面支持体に結びつけるステップは、平面支持体を提供するステップの後、生体試料の層状層を平面支持体に沈着させるステップの前に行うことが好ましい。
【００８０】
本出願人によって実行された試験が示したさらに驚くべき効果は、本発明の分析および診断目的のために生体試料内の生細胞を固定化する方法は、生細胞のみを平面支持体の平坦なナノ構造表面に接着させることが可能であることである。
【００８１】
詳細は全て、他の技術的に均等な要素によって置き換えることができる。同様に、使用した材料、ならびに生じる形状および寸法は、必要に応じて、以下の特許請求の範囲の保護の範囲内を逸脱することなく、任意であることができる。
【手続補正書】
【提出日】令和2年8月20日(2020.8.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析および診断目的のために生体試料内の生細胞を固定化する方法であって、
−  分析する所定数の細胞を含有する生体試料を提供するステップと、
−  分析装置で使用するために特に適切な平面支持体を提供するステップであって、該平面支持体がナノ構造材料を含む表面コーティングで官能化された表面を含む、ステップと、
−  該生体試料に含有される該細胞を該平面支持体の官能化表面に接着させるために、該平面支持体の該官能化表面に該生体試料の層状層を沈着させるステップと、
−  該生体試料の該層状層上に固定剤を配置するステップと、
を含み、これらのステップを少なくとも２５℃を下回る温度で実施し、
該生体試料に含有される該細胞を該平面支持体の該官能化表面に接着させるステップを含み、該ステップを、２５℃を下回る温度で実施し、
前記生体試料の前記層状層を前記平面支持体上に配置するステップと前記層状層上に前記固定剤を配置するステップとの間の時間範囲が４分未満である、方法。
【請求項２】
前記平面支持体の全表面積と生体試料の前記層状層によって占有される前記平面支持体の表面積との間の比が１．５と９との間である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生体試料の前記層状層の体積が１マイクロリットルと２ミリリットルとの間である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
閉じ込め疎水性物質を前記平面支持体に結びつけるステップをさらに含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
フィルムのナノ構造材料が、酸化亜鉛（ＺｎＯ）、二酸化ジルコニウム（ＺｒＯ２）、二酸化チタン（ＴｉＯ２）のいずれか１種から選択される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記平面支持体の前記表面コーティングに付着したままの前記生細胞が希少細胞である、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
請求項１から６のいずれかに記載の方法を実施するステップと、
循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を同定するために前記生体試料を分析するステップと、
患者に関する最初の臨床データを得るために画像分析によってＣＴＣを計数するステップと、を含む、患者の腫瘍の診断または予測の方法。
【国際調査報告】
2020529866.tif 000002
2020529866.tif 000003
2020529866.tif 000004