(57)【要約】  少なくともＶＨ及びＣＨ１抗体ドメインを含む抗体重鎖（ＨＣ）に会合した、ＶＬ及びＣＬ抗体ドメインから構成される抗体軽鎖（ＬＣ）の同種のＬＣ／ＨＣ二量体を含む抗原結合分子（ＡＢＭ）であって、会合は、ＶＬとＶＨドメインとの、及びＣＬとＣＨ１ドメインとの対形成によるものであり、ＣＬドメインの１８位及びＣＨ１ドメインの２６位のアミノ酸は反対の極性のものであり、ナンバリングはＩＭＧＴに従う抗原結合分子。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくともＶＨ及びＣＨ１抗体ドメインを含む抗体重鎖（ＨＣ）に会合した、ＶＬ及びＣＬ抗体ドメインから構成される抗体軽鎖（ＬＣ）の同種の軽鎖／重鎖（ＬＣ／ＨＣ）二量体を含む抗原結合分子（ＡＢＭ）であって、会合は、ＶＬドメイン及びＶＨドメイン、並びにＣＬドメイン及びＣＨ１ドメインの対形成によるものであり、ＣＬドメインの１８位及びＣＨ１ドメインの２６位のアミノ酸は反対極性のものであり、ナンバリングはＩＭＧＴに従う、前記抗原結合分子。
【請求項２】
Ａ
ａ）ＣＬドメインが、少なくとも点突然変異Ｔ１８Ｘ（Ｘは、Ｒ、Ｈ、若しくはＫのいずれかである）を含有する、配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣカッパであり；
ｂ）ＣＨ１ドメインが、少なくとも点突然変異Ｋ２６Ｘ（Ｘは、Ｄ若しくはＥのいずれかである）を含有する、配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む；又は
Ｂ
ａ）ＣＬドメインが、少なくとも点突然変異Ｋ１８Ｘ（Ｘは、Ｄ又はＥのいずれかである）を含有する、配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣラムダであり；
ｂ）ＣＨ１ドメインが、２６位のＫが他のいずれのアミノ酸によっても置換されていないか、若しくは少なくとも点突然変異Ｋ２６Ｘ（Ｘは、Ｒ又はＨのいずれかである）を含有する、配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む；又は
Ｃ
ａ）ＣＬドメインが、１８位のＫが他のいずれのアミノ酸によっても置換されていないか、若しくは少なくとも点突然変異Ｋ１８Ｘ（Ｘは、Ｒ又はＨのいずれかである）を含有する、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣラムダであり；
ｂ）ＣＨ１ドメインが、少なくとも点突然変異Ｋ２６Ｘ（Ｘは、Ｄ又はＥのいずれかである）を含有する、配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
請求項１に記載のＡＢＭであって、
ナンバリングがＩＭＧＴに従う、前記ＡＢＭ。
【請求項３】
同種のＬＣ／ＨＣ二量体が、ＣＬドメイン及びＣＨ１ドメインの間に少なくとも１つのドメイン間ジスルフィド架橋を含む、請求項１又は２に記載のＡＢＭ。
【請求項４】
ＣＬドメインが点突然変異Ｆ７Ｘをさらに含み、ＸがＳ、Ａ、又はＶのいずれかであり、ＣＨ１ドメインが点突然変異Ａ２０Ｌをさらに含み、ナンバリングがＩＭＧＴに従う、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＡＢＭ。
【請求項５】
ＶＬドメイン及びＶＨドメインが、界面領域内のアミノ酸の極性を変化させるいずれの点突然変異をも含有しない、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＡＢＭ。
【請求項６】
ＨＣが、少なくとも１つのＣＨ２ドメイン及び少なくとも１つのＣＨ３ドメインをさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のＡＢＭ。
【請求項７】
抗体Ｆａｂ若しくは（Ｆａｂ）２フラグメント、又はＦｃ部分を含む全長抗体のいずれかであり、好ましくはＡＢＭが全長ＩｇＧ抗体である、請求項１〜５のいずれかに記載のＡＢＭ。
【請求項８】
異なる抗原又はエピトープを認識する第１及び第２のＦａｂアームを含むヘテロ二量体抗体であって、第１及び第２のＦａｂアームの一方のみが同種のＬＣ／ＨＣ二量体を含むヘテロ二量体抗体である、請求項１〜６のいずれかに記載のＡＢＭ。
【請求項９】
第１及び第２のＦａｂアームの一方のみが、
ａ）ＣＬドメインにおける点突然変異Ｆ７Ｘ（ＸはＳ、Ａ、又はＶのいずれかである）；及び
ｂ）ＣＨ１ドメインにおける点突然変異Ａ２０Ｌ
を含み、ナンバリングがＩＭＧＴに従う、請求項８に記載のＡＢＭ。
【請求項１０】
Ａ
ａ）前記第１のＦａｂアームが、請求項１又は２のいずれかにおいて特定される点突然変異によって特徴付けられる同種のＬＣ／ＨＣ二量体を含み、ＣＬ及びＣＨ１ドメインは請求項４において特定される点突然変異をさらに含み；
ｂ）前記第２のＦａｂアームが、ａ）の点突然変異のいずれも含まない、又は
Ｂ
ａ）前記第１のＦａｂアームが、請求項１又は２のいずれかにおいて特定される点突然変異によって特徴付けられる同種のＬＣ／ＨＣ二量体を含み、ＣＬ及びＣＨ１ドメインは請求項４において特定される点突然変異をさらに含まず；
ｂ）前記第２のＦａｂアームが、請求項４において特定される点突然変異を含む、
請求項８又は９に記載のＡＢＭ。
【請求項１１】
ＣＨ２及びＣＨ３ドメインをそれぞれ含む２つのＨＣであって、二量体化してＦｃ領域となるＨＣをさらに含み、ＣＨ３ドメインが、
ａ）ヒトＩｇＡ及びＩｇＧ  ＣＨ３配列の交互セグメントから構成される鎖交換設計ドメイン（ＳＥＥＤ）ＣＨ３ヘテロ二量体；
ｂ）１つ又は複数のノブ又はホール突然変異、好ましくはＴ３６６Ｙ／Ｙ４０７’Ｔ、Ｆ４０５Ａ／Ｔ３９４’Ｗ、Ｔ３６６Ｙ：Ｆ４０５Ａ／Ｔ３９４’Ｗ：Ｙ４０７’Ｔ、Ｔ３６６Ｗ／Ｙ４０７’Ａ、及びＳ３５４Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｙ３４９’Ｃ：Ｔ３６６’Ｓ：Ｌ３６８’Ａ：Ｙ４０７’Ｖのいずれか；
ｃ）第２のＣＨ３ドメインのシステイン残基に共有結合し、これによりドメイン間ジスルフィド架橋を導入する、好ましくは両方のＣＨ３ドメインのＣ末端を連結する、第１のＣＨ３ドメインにおけるシステイン残基；
ｄ）斥力電荷がヘテロ二量体形成を抑制する１つ又は複数の突然変異、好ましくはＫ４０９Ｄ／Ｄ３９９’Ｋ、Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３９９’Ｒ、Ｋ４０９Ｅ／Ｄ３９９’Ｋ、Ｋ４０９Ｅ／Ｄ３９９’Ｒ、Ｋ４０９Ｄ：Ｋ３９２Ｄ／Ｄ３９９’Ｋ：Ｅ３５６’Ｋ又はＫ４０９Ｄ：Ｋ３９２Ｄ：Ｋ３７０Ｄ／Ｄ３９９’Ｋ：Ｅ３５６’Ｋ：Ｅ３５７’Ｋのいずれか；及び／又は
ｅ）ヘテロ二量体形成及び／又は熱安定性について選択された１つ又は複数の突然変異、好ましくは
Ｔ３５０Ｖ：Ｌ３５１Ｙ：Ｆ４０５Ａ：Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３５０Ｖ：Ｔ３６６Ｌ：Ｋ３９２Ｌ：Ｔ３９４Ｗ、
Ｔ３５０Ｖ：Ｌ３５１Ｙ：Ｆ４０５Ａ：Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３５０Ｖ：Ｔ３６６Ｌ：Ｋ３９２Ｍ：Ｔ３９４Ｗ、
Ｌ３５１Ｙ：Ｆ４０５Ａ：Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３６６Ｌ：Ｋ３９２Ｍ：Ｔ３９４Ｗ、
Ｆ４０５Ａ：Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３６６Ｌ：Ｋ３９２Ｍ：Ｔ３９４Ｗ、又は
Ｆ４０５Ａ：Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３６６Ｌ：Ｔ３９４Ｗ
のいずれか
のうちの１つ又は複数を導入するように設計されており、
ナンバリングはＫａｂａｔのＥＵインデックスに従う、請求項８〜１０のいずれか１項に記載のＡＢＭ。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれかに記載のＡＢＭをコードする単離された核酸。
【請求項１３】
請求項１２に記載の核酸を組み込んでいる発現カセット又はベクター。
【請求項１４】
請求項１２に記載の核酸、又は請求項１３に記載の発現カセット若しくはベクターを含む宿主細胞。
【請求項１５】
前記ＡＢＭを発現する条件下で請求項１４に記載の宿主細胞を培養することにより、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のＡＢＭを生成する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト抗体ドメイン配列を含む抗原結合分子（ＡＢＭ）、特に、少なくともＶＨ及びＣＨ１抗体ドメインを含む抗体重鎖に会合した、ＶＬ及びＣＬ抗体ドメインから構成される抗体軽鎖の同種の二量体を含む抗原結合分子であって、その会合は、ＶＬドメインとＶＨドメインとの、及びＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの対形成によるものであり、好ましい対形成は、ＣＬドメイン及びＣＨ１ドメインにおける特定の点突然変異によって支持される、抗原結合分子に関する。
【背景技術】
【０００２】
モノクローナル抗体は、治療用抗原結合分子として広く使用されている。基本的な抗体構造について、天然のＩｇＧ１免疫グロブリンを例として用いて、本明細書で説明する。
【０００３】
２本の等しい重鎖（Ｈ）及び２本の等しい軽鎖（Ｌ）が結合して、Ｙ字型の抗体分子を形成する。各重鎖は４つのドメインを有する。アミノ末端可変ドメイン（ＶＨ）は、Ｙ字の先端にある。これらに３つの定常ドメイン：ＣＨ１、ＣＨ２、及びＹ字の柄の端部に当たるカルボキシ末端側のＣＨ３が続く。短いストレッチであるスイッチ部分が、重鎖可変領域と定常領域を結びつける。ヒンジが、ＣＨ２及びＣＨ３（Ｆｃフラグメント）を残りの抗体（Ｆａｂフラグメント）と結びつける。天然の抗体分子内のヒンジ部分をタンパク質分解切断することにより、１つのＦｃと２つの等しいＦａｂフラグメントが生成され得る。軽鎖は、スイッチにより分けられた２つのドメイン、可変ドメイン（ＶＬ）と定常ドメイン（ＣＬ）から構成される。
【０００４】
ヒンジ領域内のジスルフィド結合は、２本の重鎖を結びつける。軽鎖は、追加のジスルフィド結合により重鎖と連結している。Ａｓｎ結合した炭水化物部分が、免疫グロブリンのクラスに応じて、定常ドメインの異なる位置で結合している。ＩｇＧ１の場合、ヒンジ領域内の２つのジスルフィド結合が、Ｃｙｓ２３５とＣｙｓ２３８の対の間で２本の重鎖を一体化している。軽鎖は、ＣＨ１ドメインにおけるＣｙｓ２２０（ＥＵインデックスのナンバリング）又はＣｙｓ２３３（Ｋａｂａｔによるナンバリング）と、ＣＬドメインにおけるＣｙｓ２１４（ＥＵインデックス及びＫａｂａｔナンバリング）との間の２つの追加のジスルフィド結合によって重鎖にカップリングされる。炭水化物部分が、各ＣＨ２のＡｓｎ３０６に結合して、Ｙ字の柄の部分に特徴的な膨らんだ部分を生成する。
【０００５】
このような特徴は、重要な機能的意義を有する。重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域はいずれも、Ｎ末端領域、すなわちＹ字の「先端部分」にあり、抗原と反応するように配置されている。分子のこの先端部分は、アミノ酸配列のＮ末端が位置する側である。Ｙ字の柄の部分は、エフェクター機能、例えば補体の活性化、及びＦｃ受容体との相互作用、又はＡＤＣＣ及びＡＤＣＰ等に効果的に関与するように構成される。柄のＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、エフェクタータンパク質との相互作用を促進するように膨らんでいる。アミノ酸配列のＣ末端は、先端部分とは反対側に位置し、Ｙ字の「根元」と呼ばれる場合もある。
【０００６】
ラムダ（λ）及びカッパ（κ）と呼ばれる２種類の軽鎖が抗体中に見出される。所定の免疫グロブリンは、κ鎖又はλ鎖のいずれか一方を有し、それぞれ１つ有することはない。機能的な差異は、λ又はκの軽鎖を有する抗体の間で見出されない。
【０００７】
抗体分子内の各ドメインは、圧縮された逆平行βバレル内で、相互に緊密にパックされた２つのβシートからなる類似した構造を有する。この保存的構造は、免疫グロブリンフォールドと呼ばれる。定常ドメインの免疫グロブリンフォールドは、４本のストランドからなるシートに対向してパックされた３本のストランドからなるシートを含む。このフォールドは、各シートのβストランド間の水素結合により、内部の対向するシートの残基間の疎水結合により、及びシート間のジスルフィド結合により安定化している。３本のストランドからなるシートは、ストランドＣ、Ｆ、及びＧを含み、また４本のストランドからなるシートは、ストランドＡ、Ｂ、Ｅ、及びＤを有する。文字Ａ〜Ｇは、免疫グロブリンフォールドのアミノ酸配列に沿って、βストランドの連続的な位置を表す。
【０００８】
可変ドメインのフォールドは、４本及び５本のストランドからなる２つのシート内に配置された９本のβストランドを有する。５本のストランドからなるシートは、定常ドメインの３本のストランドからなるシートと構造的に相同であるが、余分なストランドＣ’及びＣ’’を含む。残りのストランド（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ）は、定常ドメインの免疫グロブリンフォールド内のカウンターパートと同一のトポロジー及び類似した構造を有する。ジスルフィド結合は、定常ドメインの場合と同様に、対向するシート内のストランドＢとＦとを結びつける。
【０００９】
免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖両方の可変ドメインは、３つの高頻度可変性ループ、又は相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。Ｖドメインの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）は、βバレル構造の一方の端部に密集している。ＣＤＲは、免疫グロブリンフォールドのβストランドＢ−Ｃ、Ｃ’−Ｃ’’、及びＦ−Ｇを結びつけるループである。ＣＤＲ内の残基は、免疫グロブリン分子毎に変化し、各抗体に抗原特異性を付与する。
抗体分子の先端部分に位置するＶＬ及びＶＨドメインは、６個のＣＤＲ（ドメイン毎に３個）が、抗原と特異的結合するための表面（又はキャビティ）を構成する際に協力し合うように、緊密にパックされている。従って、抗体の天然の抗原結合部位は、軽鎖可変ドメインのストランドＢ−Ｃ、Ｃ’−Ｃ’’、及びＦ−Ｇ、並びに重鎖可変ドメインのストランドＢ−Ｃ、Ｃ’−Ｃ’’、及びＦ−Ｇを結びつけるループから構成される。
【００１０】
天然の免疫グロブリン内のＣＤＲループではない、又はＣＤＲループにより決定される抗原結合ポケットの一部分ではないループ、並びに任意選択的にＣＤＲループ領域内の隣接したループは、抗原結合又はエピトープ結合特異性を有さないが、免疫グロブリン分子及び／又はそのエフェクター全体の正しいフォールディング、又はその他の機能に寄与し、従って構造的ループと呼ばれる。
【００１１】
先行技術文書では、既存の抗原結合部位を操作し、これにより新規の結合特性を導入するために、免疫グロブリン様スキャフォールドがこれまで採用されてきたことが示されている。ほとんどの場合、ＣＤＲ領域が、抗原との結合を目的として改変されてきた、換言すれば、免疫グロブリンフォールドの場合、その結合アフィニティー又は特異性を変化させるために、天然の抗原結合部位のみが修飾された。操作がなされたそのような免疫グロブリンの異なるフォーマットについて記載する、膨大な量の文献が存在するが、該免疫グロブリンは、ファージ粒子表面上に提示された、又は様々な原核生物又は真核生物の発現系において可溶性に発現した一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）又はＦａｂフラグメントの形態で高頻度に発現する。
【００１２】
抗体構築物は、２つの異なる標的を認識する改善された治療法のために現在開発中である。
【００１３】
Ｄａｖｉｓら（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｄｅｓｉｇｎ  ＆  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ２０１０年、第２３巻（４）、１９５〜２０２頁）は、ストランド交換設計ドメイン（ＳＥＥＤ）ＣＨ３ヘテロ二量体（heterodiomer）を用いて、二重特異性で非対称性の融合タンパク質の設計を支援するヘテロ二量体Ｆｃプラットフォームについて記載する。このようなヒトＩｇＧ及びＩｇＡ  ＣＨ３ドメインの誘導体は、ヒトＩｇＡ配列とＩｇＧ配列との交互に反復したセグメントから構成される相補的なヒトＳＥＥＤ  ＣＨ３ヘテロ二量体を作り出す。ＳＥＥＤ操作は、国際公開第２００７／１１０２０５Ａ２号及び欧州特許第１９９９１５４Ｂ１号に更に記載されている。国際公開第２０１０／１３６１７２Ａ１号は、抗体のＦｃ部分のＣ末端に繋がった１つ又は２つの一本鎖Ｆａｂを含む、トリ又はテトラ特異的抗体について開示する。
【００１４】
Ｂｅｃｋら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第１０巻、５号、２０１０年５月１日、３４５〜３５２頁）は、次世代治療用抗体について記載し、特に異なる種類の二重特異性抗体に言及している。
【００１５】
Ｒｉｄｇｗａｙら（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第９巻、７号、１９９６年、６１７〜６２１頁）は、重鎖をヘテロ二量体化させるための抗体ＣＨ３ドメインの「ノブ・イントゥ・ホール（knobs into-holes）」エンジニアリングについて記載する。
【００１６】
Ｖｏｎ  Ｋｒｅｕｄｅｎｓｔｅｉｎら（Ｌａｎｄｅｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、第５巻、５号、２０１３年、６４６〜６５４頁）は、安定性を目的として改変されたヘテロ二量体Ｆｃに基づく二重特異性抗体スキャフォールドについて記載する。
【００１７】
Ｌｉｕら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０１５年、第２９０巻：７５３５〜７５６２頁）は、静電的機構によって一価の二重特異性ヘテロ二量体ＩｇＧ抗体を作製する戦略を記載している。正しい軽鎖（ＬＣ）と重鎖（ＨＣ）との対形成を有する抗ＨＥＲ２及び抗ＥＧＦＲ抗体に由来するヘテロ二量体ＩｇＧ分子は、一過性であり、安定的にトランスフェクトされた哺乳動物細胞によって産生された。ＬＣとＨＣとの特異的な対形成は、ＶＨ−ＶＬ及びＣＨ１−ＣＬ界面で極性又は疎水性残基を切り替えることによって駆動された。操作された変異体の各々は、それらの中でＶＨ及びＶＬドメインにおける一連の点突然変異によって特徴付けられた。さらに、点突然変異は、ＣＨ１ドメインにおいて操作され、例えば、Ｋ１４７Ｄであり、ＣＬ（Ｃカッパ又はＣκ）ドメインにおいて操作され、例えば、Ｔ１８０Ｋ（ＥＵインデックスによるナンバリング）であった。いくつかの変異体は、とりわけＣＨ１ドメインの１４７位及びＣκドメインの１８０又は１３１位に点突然変異を含有していた。
【００１８】
国際公開第２０１４／０８１９５５号はさらに、以下のドメイン：第１及び第２のＣＨ３ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＣＬドメイン、ＶＨドメイン及びＶＬドメインの各々に１つ又は複数の置換を含むこのようなヘテロ二量体抗体を開示する。
【００１９】
Ｌｅｗｉｓら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０１４年、第３２巻：１９１〜１９８頁）は、直交Ｆａｂインターフェースの構造に基づく設計による二重特異性ＩｇＧ抗体の生成について記載する。改善されたＨＣ−ＬＣの対形成を有する二重特異性ＩｇＧが産生された。可変ドメインが重鎖及び軽鎖の特異的な会合を支配することが見出された。２つの異なる設計は、ＶＨ、ＶＬ、ＣＨ１及びＣＬドメインの各々において点突然変異を用いていた。設計の１つは、とりわけＣＨ１ドメインの１４６位及びＣラムダドメインの１２９位に点突然変異を含有していた（Ｋａｂａｔによるナンバリング）。
【００２０】
Ｄｉｌｌｏｎら（ＭＡｂｓ、２０１６；ＤＯＩ：１０．１０８０／１９４２０８６２．２０１６．１２６７０８９）は、単一の哺乳動物細胞における異なるアイソタイプ及び起源の種の二重特異性ＩｇＧの産生、ならびに以前に記載された選好的な重鎖へテロ二量体化のためのノブ−イントゥ−ホール突然変異と組み合わせて、選択的Ｆａｂアーム会合を容易にする設計について記載する。
【００２１】
上記の設計の二重特異性抗体は、必然的に、ＶＨ及びＶＬドメインに位置される主な点突然変異を含む一連の点突然変異を組み合わせてＩｇＧ構造を安定化させる。正しい対形成がＣＨ１及びＣＬドメインのみの点突然変異によって既に支持されている二重特異性抗体を設計することが望ましい。
【発明の概要】
【００２２】
ＶＨ及びＶＬドメインのフレームワークを変化させずに、ＨＣとＬＣとの正しい対形成を支持する、抗体重鎖及び軽鎖の改善された対形成を提供することが本発明の目的である。このような改善された対形成は、二重特異性抗体の産生を容易にする。
本目的は、本発明の主題により解決される。
【００２３】
本発明によれば、少なくともＶＨ及びＣＨ１抗体ドメインを含む抗体重鎖（ＨＣ）に会合した、ＶＬ及びＣＬ抗体ドメインから構成される抗体軽鎖（ＬＣ）の同種のＬＣ／ＨＣ二量体を含む抗原結合分子（ＡＢＭ）であって、会合は、ＶＬドメインとＶＨドメインとの、及びＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの対形成によるものであり、ＣＬドメインの１８位及びＣＨ１ドメインの２６位のアミノ酸は反対の極性のものであり、ナンバリングはＩＭＧＴに従う、抗原結合分子が提供される。
【００２４】
具体的には、同種のＬＣ／ＨＣ二量体は、同種の（ドメイン）対を形成するように対形成される同種のドメインによって特徴付けられる。特に、ＬＣ／ＨＣ二量体は同種のものであることが理解され、これは、単量体ＣＬ及びＣＨ１ドメインが同種の又は合致する対応物であり、好ましくは互いに認識して、野生型ドメインと比較して一対のＣＬ及びＣＨ１ドメインを生成するためである。具体的には、本明細書に記載されるＣＬドメインは、好ましくは同種のＣＨ１ドメインと対形成している。本明細書に記載されるＣＨ１ドメインは、好ましくは同種のＣＬドメインと対形成している。
【００２５】
具体的な態様によれば、ＡＢＭは、好ましくは引力によって互いに対形成するが、好ましくは、反発力のために非同種の又は野生型である他の対応するドメインとは対形成しない、同種のＣＬ及びＣＨ１抗体ドメインによって特徴付けられる。これにより、野生型抗体ドメインであるか、又はそれぞれの点突然変異を介して非同種にされている（会合の可能性を減少させるために反発している）対応抗体ドメインの誤った対形成は大いに減少する。
【００２６】
具体的には、同種のＣＬドメイン及びＣＨ１ドメインは、特に、
ａ）ＣＬドメインの１８位のアミノ酸残基は正極性のものであり、特にＲ、Ｈ、若しくはＫのいずれかであり、ＣＨ１ドメインの２６位のアミノ酸残基は負極性のものであり、特にＤ若しくはＥのいずれかである；又は
ｂ）ＣＬドメインの１８位のアミノ酸残基は負極性のものであり、特にＤ若しくはＥのいずれかであり、ＣＨ１ドメインの２６位のアミノ酸残基は正極性のものであり、特にＲ、Ｈ、又はＫのいずれかである
となるように、列挙されたアミノ酸位置で反対の極性によって特徴付けられる。
【００２７】
具体的には、ＡＢＭは、ＣＬドメインの１８位での点突然変異、及びＣＨ１ドメインの２６位での点突然変異のいずれか又はその両方である１つ又は２つの点突然変異を含む。
【００２８】
他に指示がない限り、本明細書において、位置はＩＭＧＴシステムに従ってナンバリングされる（Ｌｅｆｒａｎｃら、１９９９年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、第２７巻：２０９〜２１２頁）。特許請求の範囲において指示される位置のナンバリングは、以下の表に指示されるように、Ｋａｂａｔ及びＫａｂａｔのＥＵインデックスによるナンバリングに対応する。Ｋａｂａｔナンバリングスキームの説明は、Ｋａｂａｔ，ＥＡら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ（ＮＩＨ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｎｏ．９１−３２４２、第５版（１９９１年））に見出すことができる。
【００２９】
【表１】
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【００３０】
指示された位置は、驚くべきことに、ＨＣとＬＣが改善されたアフィニティーで会合する（対形成する）Ｆａｂアームを構築するときに優性であることが判明した。従来技術の構築物は、異なる位置に配置されたＣＨ１及びＣＬ点突然変異の異なる対を含み、それは優性なＶＨ及びＶＬ点突然変異以外に操作された。指示されたＣＬ及びＣＨ１位置に反対の極性を確立することによって、突然変異したＣＬ及びＣＨ１ドメインの同種の対（本明細書では、同種のドメイン又は同種の対として理解される）が好ましくは産生される。同時に、誤った同種の対形成、又は野生型ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの対形成が著しく減少する。
【００３１】
具体的には、ＡＢＭは、以下のように特徴付けられる：
Ａ
ａ）ＣＬドメインは、少なくとも点突然変異Ｔ１８Ｘ（Ｘは、Ｒ、Ｈ、若しくはＫのいずれかである）を含有する、配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣカッパであり；
ｂ）ＣＨ１ドメインは、少なくとも点突然変異Ｋ２６Ｘ（Ｘは、Ｄ若しくはＥのいずれかである）を含有する、配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；又は
Ｂ
ａ）ＣＬドメインは、少なくとも点突然変異Ｋ１８Ｘ（Ｘは、Ｄ又はＥのいずれかである）を含有する、配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣラムダであり；
ｂ）ＣＨ１ドメインは、２６位のＫが他のいずれのアミノ酸によっても置換されていないか、若しくは少なくとも点突然変異Ｋ２６Ｘ（Ｘは、Ｒ又はＨのいずれかである）を含有する、配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；又は
Ｃ
ａ）ＣＬドメインは、１８位のＫが他のいずれのアミノ酸によっても置換されていないか、若しくは少なくとも点突然変異Ｋ１８Ｘ（Ｘは、Ｒ又はＨのいずれかである）を含有する、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣラムダであり；
ｂ）ＣＨ１ドメインは、少なくとも点突然変異Ｋ２６Ｘ（Ｘは、Ｄ又はＥのいずれかである）を含有する、配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
ナンバリングはＩＭＧＴに従う。
【００３２】
具体的には、ＣＬ及びＣＨ１ドメインは、ヒト起源のもの、具体的には、ヒトＩｇＧ又はＩｇＧ１分子のもの、特に、天然に存在するヒト配列と少なくとも９０％の配列同一性及び１つ又は複数の点突然変異、例えば本明細書に記載されているものによって特徴付けられ、具体的には、ヒトＩｇＧ、ＩｇＭ又はＩｇＥ構造中のそれぞれのドメインの構造、特にヒトＩｇＧ１構造に類似する抗体ドメインのベータ−バレル構造によってさらに特徴付けられる機能的に活性な変異体である。
【００３３】
本明細書に記載されるＣカッパ、Ｃラムダ、又はＣＨ１ドメインのいずれかの機能的に活性な変異体は、具体的には、対応の合致する抗体ドメインと対形成することができる抗体ドメイン構造によって特徴付けられ、特に、
Ａ
ａ）ＣＬドメイン変異体は、配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、点突然変異Ｔ１８Ｘ（Ｘは、Ｒ、Ｈ、若しくはＫのいずれかである）を含有するＣカッパ変異体であり；
ｂ）点突然変異Ｋ２６Ｘ（Ｘは、Ｄ若しくはＥのいずれかである）を除いて、配列番号３として同定されたアミノ酸配列からなるＣＨ１ドメイン
と対形成することができ；又は
Ｂ
ａ）ＣＬドメイン変異体は、配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、点突然変異Ｋ１８Ｘ（Ｘは、Ｄ又はＥのいずれかである）を含有するＣラムダ変異体であり；
ｂ）配列番号３、若しくは点突然変異Ｋ２６Ｘ（Ｘは、Ｒ又はＨのいずれかである）を除く配列番号３のいずれかとして同定されたアミノ酸配列からなるＣＨ１ドメイン
と対形成することができ；又は
Ｃ
ａ）ＣＬドメイン変異体は、１８位のＫが他のいずれのアミノ酸によっても置換されていないか、若しくは点突然変異Ｋ１８Ｘ（Ｘは、Ｒ若しくはＨのいずれかである）を含有する、配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣラムダ変異体であり；
ｂ）点突然変異Ｋ２６Ｘ（Ｘは、Ｄ又はＥのいずれかである）を除いて、配列番号３として同定されたアミノ酸配列からなるＣＨ１ドメイン
と対形成することができる。
【００３４】
具体的には、Ｃカッパアミノ酸配列（本明細書において野生型又は親とも呼ばれる）は、配列番号１によって同定される。
【００３５】
具体的には、Ｃラムダアミノ酸配列（本明細書において野生型又は親とも呼ばれる）は、配列番号２によって同定される。
【００３６】
具体的には、ＣＨ１アミノ酸配列（本明細書において野生型又は親とも呼ばれる）は、配列番号３によって同定される。
【００３７】
具体的には、ＣＬドメインは、１個以上の点突然変異、好ましくは最大１０個の点突然変異、特に１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のいずれかの点突然変異を含むヒトＩｇＧ１のＣＬ配列又はその操作された機能的に活性な変異体によって特徴付けられる。
【００３８】
具体的には、ＣＨ１ドメインは、１個以上の点突然変異、好ましくは最大１０個の点突然変異、特に１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のいずれかの点突然変異を含むヒトＩｇＧ１のＣＨ１配列又はその操作された機能的に活性な変異体によって特徴付けられる。
【００３９】
具体的には、ＣＬドメイン及びＣＨ１ドメインのいずれか又は各々は、１個以上の点突然変異、好ましくは最大１０個の点突然変異、特に１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のいずれかの点突然変異を含む各ヒトＩｇＧ１配列又はその操作された機能的に活性な変異体によって特徴付けられる。
【００４０】
具体的には、二量体は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間に少なくとも１つのドメイン間ジスルフィド架橋を含む。具体的には、ドメイン間ジスルフィド架橋は、ＣＨ１ドメインのＣｙｓ２２０（ＥＵインデックスナンバリング）又はＣｙｓ２３３（Ｋａｂａｔに従うナンバリング）、及びＣＬドメインのＣｙｓ２１４ｓ（ＥＵインデックス及びＫａｂａｔナンバリング）を架橋している。
【００４１】
具体的には、ＣＬドメインは、点突然変異Ｆ７Ｘをさらに含み、Ｘは、Ｓ、Ａ、又はＶのいずれかであり、ＣＨ１ドメインは、点突然変異Ａ２０Ｌをさらに含み、ナンバリングはＩＭＧＴに従う。このようなさらなる点突然変異は、同種のＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの好ましい対形成をさらに支持する。
【００４２】
具体的には、ＡＢＭのＶＬドメイン及びＶＨドメインは、ＶＬドメインとＶＨドメインとを対形成するときにドメイン間接触を提供し、これにより抗原結合部位を形成する界面領域のアミノ酸の極性を変えるいずれの点突然変異をも含有しない。
【００４３】
具体的には、ＡＢＭは、ＶＨ／ＶＬドメイン対から構成される機能的抗原結合部位を含み、標的と結合する能力を有するが、その時のアフィニティーは高く、ＫＤは、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、又は１０−１０Ｍのいずれよりも低い。具体的には、ＡＢＭは、２つの異なる抗原を標的とする二重特異性又はヘテロ二量体抗体であり、この場合、各抗原は抗体により認識されるが、その時のＫＤは、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、又は１０−１０Ｍのいずれよりも低い。
【００４４】
具体的には、ＨＣは、少なくとも１つのＣＨ２ドメイン及び少なくとも１つのＣＨ３ドメインをさらに含む。特に、ＨＣは、ＣＨ２ドメインによって伸長され、さらにＣＨ３ドメインによって伸長され、すなわち、ＣＨ２−ＣＨ３ドメインの配列は、ＣＨ２−ＣＨ３ドメインとそれぞれの鎖の二量体からなるＦｃ領域を形成するように、ＣＨ２−ＣＨ３ドメインを含む別の抗体鎖とさらに対形成される。具体的には、ＨＣは、リンカー又はヒンジ領域を使用して又は使用せずに、ＣＨ２ドメインをＣＨ１ドメインのＣ末端に融合することによって伸長される。具体的には、ＨＣは、リンカーを使用して又は使用せずに、ＣＨ３ドメインをＣＨ２ドメインのＣ末端に融合することによってさらに伸長される。場合によっては、ＨＣは、リンカーを使用して又は使用せずに、ＣＨ４ドメインをＣＨ３ドメインのＣ末端に融合することによってさらに伸長される。
【００４５】
具体的には、ＡＢＭは、ヒンジ領域、好ましくはヒトヒンジ領域、例えば、配列番号４として同定されるアミノ酸配列を含む又はそれからなるなどのヒトＩｇＧ１ヒンジ領域を含む。
【００４６】
ドメインの結合は、特に組み換え融合又は化学結合による。特定の結合は、１つのドメインのＣ末端と別のドメインのＮ末端との結合を介し得るが、この場合、例えば末端領域内の１つ又は複数のアミノ酸残基がドメインサイズを短縮するために除去される、又はドメインの可撓性を高めるために延長される。
【００４７】
具体的には、短縮したドメイン配列は、例えば少なくとも１、２、３、４、又は５、最大６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸を除去するなどして、Ｃ末端及び／又はＮ末端領域において欠損を含む。
【００４８】
具体的には、リンカー又は免疫グロブリンのヒンジ領域若しくはヒンジ領域の少なくとも一部である連結配列、例えばペプチドリンカーが使用され得、これは、例えば、少なくとも１、２、３、４、又は５個のアミノ酸、最大１０、１５、又は２０個のアミノ酸を含む。連結配列は、本明細書において「接合部」とも呼ばれる。ドメインは、リンカーによって、例えば、ドメイン間の天然の接合部を含むように、ドメインに隣接して天然に位置する免疫グロブリンドメインのＮ末端又はＣ末端領域に由来するアミノ酸配列を介して伸長され得る。或いは、リンカーは、ヒンジ領域に由来するアミノ酸配列を含有し得る。しかしながら、リンカーは同様に人工的な配列であり得、例えば、好ましくは５〜２０個のアミノ酸の長さ、好ましくは８〜１５個のアミノ酸の長さを有する、連続したＧｌｙ及び／又はＳｅｒアミノ酸からなり得る。
【００４９】
具体的な態様によれば、ＡＢＭは、天然に存在する免疫グロブリン又は免疫グロブリン様のスキャフォールドの構造を含む抗体又は免疫グロブリンであり、このＡＢＭは、少なくとも１つ（好ましくは２つ）の抗原結合部位、及び適切な連結配列を使用して又は使用しないで重鎖及び軽鎖に連結された抗体ドメインから構成される構造によって特徴付けられ、ＨＣは、ＬＣと二量体化して少なくとも１つの抗原結合部位を形成し、任意選択的に２つのＨＣが二量体化してＦｃ領域を形成する。
【００５０】
具体的には、ＡＢＭは、抗体Ｆａｂ若しくは（Ｆａｂ）２フラグメント、又はＦｃ部分若しくはＦｃ領域を含む全長抗体のいずれかであり、好ましくはＡＢＭは、全長ＩｇＧ、ＩｇＭ又はＩｇＥ抗体、特にＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のいずれかである。具体的には、ＡＢＭは、任意の適切な順序で１つ若しくは２つのＦａｂアーム又はＦａｂフラグメント（Ｆａｂ部分）を含む。具体的な実施形態によれば、ＡＢＭは、２つより多いＦａｂアーム、例えば、３つ又は４つのＦａｂアームをさらに含み得、少なくとも１つ又は１つのみのＦａｂアームは、本明細書に記載される同種のＬＣ／ＨＣ対ならびに同種のＣＬ及びＣＨ１ドメインを含む。具体的な実施形態によれば、他のＦａｂアームは、野生型（天然に存在する）ＣＬドメイン及びＣＨ１ドメインを含む。
具体的な実施形態によれば、ＡＢＭは、１つの同種のＬＣ／ＨＣ二量体のみを含み、ＨＣは、ＣＨ２−ＣＨ３を含み、場合によりＣＨ４をさらに含むＦｃ鎖とさらに二量体化され、これによりＦｃ領域が得られる。このようなＡＢＭは、具体的には、ただ１つのＦａｂアーム及びＦｃ領域によって特徴付けられる一価の単一特異性抗体である。
【００５１】
別の具体的な実施形態によれば、ＡＢＭは、少なくとも２つのＬＣ／ＨＣ二量体を含み、ＬＣ／ＨＣ二量体のうちの１つのみが、本明細書に記載されるように、同種のＬＣ／ＨＣ二量体ならびに同種のＣＬドメイン及びＣＨ１ドメイン（すなわち、同種のＣＬ／ＣＨ１対）によって特徴付けられる。或いは、ＡＢＭは、本明細書に記載される点突然変異によって特徴付けられる第１の同種のＣＬ／ＣＨ１対を含む第１の同種のＬＣ／ＨＣ二量体を含む第１のＬＣ／ＨＣ二量体、及び本明細書に記載される点突然変異によって特徴付けられる第２の同種のＣＬ／ＣＨ１対を含む第２の同種のＬＣ／ＨＣ二量体から構成され、これらは、第１の同種のＣＬドメイン及びＣＨ１ドメインが好ましくは互いに対形成し、第２の同種のＣＬドメイン及びＣＨ１ドメインが好ましくは互いに対形成するように第１のＣＬ／ＣＨ１対のそれとは異なる。しかしながら、第１の同種のＣＬ／ＣＨ１対のＣＬドメインは、好ましくは、第２の同種のＣＬ／ＣＨ１対のＣＨ１ドメインと対形成せず（又はさらに反発し）、第１の同種のＣＬ／ＣＨ１対のＣＨ１ドメインは、好ましくは、第２の同種のＣＬ／ＣＨ１対のＣＬドメインと対形成しない（又はさらに反発する）。
【００５２】
具体的な実施形態によれば、ＡＢＭは、２つの異なるＦａｂアームを含み、これにより、それぞれが特異的な結合特性を有する２つの異なるＦｖ構造を提供する。具体的には、ＡＢＭは、２つの異なる抗原又は抗原の２つの異なるエピトープを標的とするヘテロ二量体又は二重特異性抗体である。
【００５３】
本発明はさらに、異なる抗原又はエピトープを認識する第１及び第２のＦａｂアームを含むヘテロ二量体又は二重特異性抗体を提供し、第１及び第２のＦａｂアームの一方のみが本明細書に記載されるＡＢＭの同種のＬＣ／ＨＣ二量体を含む。具体的には、ヘテロ二量体抗体は、二重特異性抗体若しくは免疫グロブリン、又はそれらの抗原結合フラグメント、例えば二重特異性の全長免疫グロブリン、又は（Ｆａｂ）２である。
【００５４】
具体的には、ＡＢＭは二重特異性抗体であり、第１の標的は、ＣＤ３、ＣＤ１６又はＨｅｒ２ｎｅｕのいずれかであり、第２の標的はＥＧＦＲである。
【００５５】
Ｆａｂアームは、本明細書において、特に、任意のジスルフィド架橋を有するか又は有さない、ＶＨ−ＣＨ１ドメイン配列からなるＨＣとＶＬ−ＣＬ（カッパ又はラムダ）ドメイン配列からなるＬＣの二量体、ヒンジドメイン、及び／又は抗体ドメインを結びつけるリンカー配列として理解される。Ｆａｂアームは、典型的には、抗体から切断された場合のＦａｂフラグメント（又はＦａｂ部分）として理解される。Ｆａｂアームは、単一特異的及び一価的にのみ標的に結合することができる、ＶＨドメインとＶＬドメインとの対形成によって形成された唯一の抗原結合部位によって具体的に特徴付けられる。
【００５６】
具体的には、二重特異性抗体の第１及び第２のＦａｂアームの一方のみが、
ａ）ＣＬドメインの点突然変異Ｆ７Ｘ（Ｘは、Ｓ、Ａ、又はＶのいずれかである）；及び
ｂ）ＣＨ１ドメインの点突然変異Ａ２０Ｌ
を含み、ナンバリングはＩＭＧＴに従う。
【００５７】
上記に指示された７位及び２０位でのこのような点突然変異は、本明細書において、支持的な点突然変異として理解され、これは、実際にはアミノ酸残基の極性を変えないが、対応するアミノ酸残基の寸法と合致する立体的特徴を有する。
【００５８】
具体的には、上記で指示された支持的なＦ７Ｘ点突然変異（Ｘは、Ｓ、Ａ、又はＶのいずれかである）を含むＣＬドメインは、支持的なＡ２０Ｌ点突然変異を含む対応するＣＨ１ドメインを引き付け、好ましくはそれと対形成するが、野生型ＣＨ１ドメイン、又はＡ２０Ｌ点突然変異を含有しないＣＨ１ドメインと対形成するのは好ましくない。
【００５９】
具体的には、上記で指示された支持的なＡ２０Ｌ点突然変異を含むＣＨ１ドメインは、上記で指示された支持型Ｆ７Ｘ点突然変異（Ｘは、Ｓ、Ａ、又はＶのいずれかである）を含む対応するＣＬドメインを引き付け、好ましくはそれと対形成するが、野生型ＣＬドメイン、又は上記で指示されたＦ７Ｘ点突然変異（Ｘは、Ｓ、Ａ、又はＶのいずれかである）を含有しないＣＬドメインと対形成するのは好ましくはない。
【００６０】
具体的には、ヘテロ二量体抗体は、
Ａ
ａ）上記第１のＦａｂアームは、上記で同定された点突然変異によって具体的に特徴付けられる、本明細書に記載される同種のＬＣ／ＨＣ二量体を含み、特に、１つ又は２つの点突然変異は、反対の極性である、ＣＬドメインの１８位のアミノ酸残基、及びＣＨ１ドメインの２６位のアミノ酸残基が提供され、ＣＬドメイン及びＣＨ１ドメインは、上記で同定された支持的な点突然変異、特にＣＬドメイン中点突然変異Ｆ７Ｘ（Ｘは、Ｓ、Ａ、若しくはＶのいずれかである）、及びＣＨ１ドメインの点突然変異Ａ２０Ｌをさらに含み；ならびに
ｂ）上記第２のＦａｂアームは、ａ）の点突然変異のいずれも含まない、又は
Ｂ
ａ）上記第１のＦａｂアームは、上記で同定された点突然変異によって具体的に特徴付けられる、本明細書に記載される同種のＬＣ／ＨＣ二量体を含み、特に、１つ又は２つの点突然変異は、反対の極性である、ＣＬドメインの１８位のアミノ酸残基、及びＣＨ１ドメインの２６位のアミノ酸残基が提供され、ＣＬドメイン及びＣＨ１ドメインは、上記で同定された支持的な点突然変異、特にＣＬドメイン中点突然変異Ｆ７Ｘ（Ｘは、Ｓ、Ａ、若しくはＶのいずれかである）、及びＣＨ１ドメインの点突然変異Ａ２０Ｌをさらに含まない；ならびに
ｂ）上記第２のＦａｂアームは、上記で同定された支持的な点突然変異、特にＣＬドメインの点突然変異Ｆ７Ｘ（Ｘは、Ｓ、Ａ、又はＶのいずれかである）、及びＣＨ１ドメインの点突然変異Ａ２０Ｌを含む
によって特徴付けられる。
【００６１】
Ａのこのような二重特異性構築物は、具体的には、２つのＦａｂアームのうちの１つのみ（すなわち、第１のＦａｂアーム）で操作される同種のＬＣ／ＨＣ二量体の同種のＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの対形成が好ましく、操作によって、他のＦａｂアーム（すなわち、第２のＦａｂアーム）のＨＣ又はＬＣのいずれかと対形成するか又は結合することが好ましくない、本明細書に記載される点突然変異によって特徴付けられる。
【００６２】
Ｂのこのような二重特異性構築物は、具体的には、ＣＬドメインの１８位及びＣＨ１ドメインの２６位での１つ又は２つの点突然変異によって、これらの位置で反対の極性のものであるアミノ酸残基が得られることによって特徴付けられる、本明細書に記載される同種のＬＣ／ＨＣに二量体を含む第１のＦａｂアーム、
ａ）第１のＦａｂアームのＨＣが第１のＦａｂアームのＬＣと対形成するか又はそれに結合することが好ましく、第２のＦａｂアームのＬＣと対形成するか又はそれに結合するが好ましくはなく；及び
ｂ）第１のＦａｂアームのＬＣが第１のＦａｂアームのＨＣと対形成するか又はそれに結合することが好ましく、第２のＦａｂアームのＨＣと対形成するか又はそれに結合するが好ましくはない；これは、
ｃ）第２のＦａｂアームのＨＣが第２のＦａｂアームのＬＣと対形成するか又はそれに結合することが好ましく、第１のＦａｂアームのＬＣと対形成するか又はそれに結合することが好ましくはなく；及び
ｄ）第２のＦａｂアームのＬＣが第２のＦａｂアームのＨＣと対形成するか又はそれに結合することが好ましく、第１のＦａｂアームのＨＣと対形成するか又はそれに結合することが好ましくはない
ことを意味する支持的な点突然変異を含む第２のＦａｂアームによって特徴付けられる。
【００６３】
具体的な実施形態によれば、第１と第２のＦａｂアームはともに、ＣＬドメインの１８位及びＣＨ１ドメインの２６位に１つ又は２つの点突然変異を含み、これにより、これらの位置で反対の極性のものであるアミノ酸残基が得られ、なおも第１及び第２のＦａｂアームの点突然変異は異なり、これにより、
ａ）１８位のアミノ酸残基はＣＨ１ドメインを特異的に認識する正極性のものであり、２６位のアミノ酸残基は負極性のものである、ＣＬドメインを含む第１のＦａｂアーム；及び
ｂ）１８位のアミノ酸残基はＣＨ１ドメインを特異的に認識する負極性のものであり、２６位のアミノ酸残基が正極性のものである、ＣＬドメインを含む第２のＦａｂアーム
を産生し、任意選択的に、支持的な点突然変異は、第１のＦａｂアーム又は第２のＦａｂアームのいずれかにある。
【００６４】
さらなる実施形態は、二重特異性構築物に言及し、
ａ）１８位のアミノ酸残基はＣＨ１ドメインを特異的に認識する正極性のものであり、２６位のアミノ酸残基は負極性のものである、ＣＬドメインを含む第１のＦａｂアーム；及び
ｂ）ＣＬドメインの１８位のアミノ酸残基及び／又はＣＨ１ドメインの２６位のアミノ酸残基は、電荷を有さないものであり、特にＮ、Ｃ、Ｑ、Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、若しくはＹのいずれか；又は非極性のものであり、特にＡ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ若しくはＶのいずれかである、第２のＦａｂアーム
であり、任意選択的に、支持的な点突然変異は、第１のＦａｂアーム又は第２のＦａｂアームのいずれかにある。
【００６５】
具体的な態様によれば、本明細書に記載されるＡＢＭ、特に本明細書に記載されるヘテロ二量体抗体は、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン、及びに任意選択的にＣＨ４ドメインをそれぞれ含む２つのＨＣであって、二量体化してＦｃ領域となるＨＣを含む。
【００６６】
Ｆｃ領域は、具体的に、それぞれがＣＨ２−ＣＨ３抗体ドメインの鎖を含むことによって特徴付けられるＦｃ鎖の二量体によって特徴付けられ、その二量体はホモ二量体又はヘテロ二量体であり得、第１のＦｃ鎖は、ＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインにおける少なくとも１つの点突然変異において第２のＦｃ鎖と異なる。
【００６７】
具体的には、Ｆｃ領域は、
ａ）ヒトＩｇＡ及びＩｇＧ  ＣＨ３配列の交互セグメントから構成される鎖交換設計ドメイン（ＳＥＥＤ）ＣＨ３ヘテロ二量体；
ｂ）１つ若しくは複数のノブ若しくはホール突然変異、好ましくはＴ３６６Ｙ／Ｙ４０７’Ｔ、Ｆ４０５Ａ／Ｔ３９４’Ｗ、Ｔ３６６Ｙ：Ｆ４０５Ａ／Ｔ３９４‘Ｗ：Ｙ４０７’Ｔ、Ｔ３６６Ｗ／Ｙ４０７’Ａ及びＳ３５４Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｙ３４９’Ｃ：Ｔ３６６’Ｓ：Ｌ３６８’Ａ：Ｙ４０７’Ｖのいずれか；
ｃ）第２のＣＨ３ドメインのシステイン残基に共有結合し、これによりドメイン間ジスルフィド架橋が導入され、好ましくは両方のＣＨ３ドメインのＣ末端を連結する、第１のＣＨ３ドメインのシステイン残基；
ｄ）反発性の電荷がヘテロ二量体の形成を抑制する１つ若しくは複数の突然変異、好ましくはＫ４０９Ｄ／Ｄ３９９’Ｋ、Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３９９’Ｒ、Ｋ４０９Ｅ／Ｄ３９９’Ｋ、Ｋ４０９Ｅ／Ｄ３９９’Ｒ、Ｋ４０９Ｄ：Ｋ３９２Ｄ／Ｄ３９９’Ｋ：Ｅ３５６’Ｋ又はＫ４０９Ｄ：Ｋ３９２Ｄ：Ｋ３７０Ｄ／Ｄ３９９’Ｋ：Ｅ３５６’Ｋ：Ｅ３５７’Ｋのいずれか；並びに／又は
ｅ）ヘテロ二量体形成及び／若しくは熱安定性のために選択された１つ若しくは複数の突然変異、好ましくはＴ３５０Ｖ：Ｌ３５１Ｙ：Ｆ４０５Ａ：Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３５０Ｖ：Ｔ３６６Ｌ：Ｋ３９２Ｌ：Ｔ３９４Ｗ、
Ｔ３５０Ｖ：Ｌ３５１Ｙ：Ｆ４０５Ａ：Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３５０Ｖ：Ｔ３６６Ｌ：Ｋ３９２Ｍ：Ｔ３９４Ｗ、
Ｌ３５１Ｙ：Ｆ４０５Ａ：Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３６６Ｌ：Ｋ３９２Ｍ：Ｔ３９４Ｗ、
Ｆ４０５Ａ：Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３６６Ｌ：Ｋ３９２Ｍ：Ｔ３９４Ｗ、又は
Ｆ４０５Ａ：Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３６６Ｌ：Ｔ３９４Ｗのいずれか、
のうちの１つ又は複数を導入するように設計されている及び／又はこれにより特徴付けられる２つのＣＨ３ドメインを含み、
但し、ナンバリングはＫａｂａｔのＥＵインデックスに基づく。
【００６８】
このようなＣＨ３突然変異は、好ましくは互いに対形成する２つの異なるＦｃ鎖及びＨＣ（少なくとも異なるＣＨ３ドメインの配列によって異なる）をそれぞれ産生するように操作されて、これによりＦｃ鎖又はＨＣのヘテロ二量体を得て、ＨＣホモ二量体、すなわち同じ配列の２つのＨＣの二量体を産生する傾向を実質的に低下させる。
【００６９】
本明細書に記載するＣＨ３点突然変異を規定する際には、「スラッシュ」は、各対の一方の鎖又は一方のドメイン上の点突然変異を、他方の鎖又は他方のドメインに由来する点突然変異から区別する；アミノ酸位置のナンバリングにおける「インデント」は、ヘテロ二量体の第２の鎖又は二量体を意味する。「コロン」は、複数ある鎖又はドメインのうちの１つの鎖又はドメイン上の点突然変異の組み合わせを、それぞれ特定する。
【００７０】
上記のように、ヘテロ二量体形成及び／又は熱安定性のために選択された突然変異、又はＶｏｎ  Ｋｒｅｕｄｅｎｓｔｅｉｎら［８］の開示による更なる突然変異のいずれも利用可能である。
【００７１】
好ましくは、（ｉ）ノブ突然変異；又は（ｉｉ）ホール突然変異、又は（ｉｉｉ）ノブ及びホール突然変異が１つの鎖又はドメイン上に改変され、またカウンターパートの（ｉ）ホール突然変異、又は（ｉｉ）ノブ突然変異、又は（ｉｉｉ）ホール及びノブ突然変異が、ヘテロ二量体の他方の鎖上で改変される。
【００７２】
具体的には、１つ又は２つの改変されたＣＨ３ドメインを含むＣＨ３ドメインの対は、２つのＣＨ３ドメインの対を結びつける２以上の（追加）ドメイン間ジスルフィド架橋（briges）を、例えば２、又は３個含み得る。
【００７３】
具体的には、異なる突然変異（上記ａ）に基づく）が、ＣＨ３ドメインの各対の両ＣＨ３ドメインにおいて、同種の（マッチングする）対を生成するために改変されるが、この場合、一方のドメインは、βシート領域内に接触表面の立体修飾を含むが、そのような接触表面は、相補的な立体修飾を通じて他方のドメインの各接触表面と選好的に結合する。そのような立体修飾は、例えば、「ノブ」又は「ホール」構造を生成するような、異なるアミノ酸残基及び側鎖に主に起因し、「ノブ・イントゥ・ホール」二量体を形成する相補性を有する。
【００７４】
具体的な態様によれば、Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインの各々は、配列番号５として同定されるアミノ酸配列又は配列番号５の機能的変異体を有するＩｇＧ型であり、これは、少なくとも２アミノ酸長の少なくとも１つのベータ鎖ＩｇＡセグメントを組み入れることによって鎖交換を得るように操作され、Ｆｃ領域は、好ましくは、第１のＣＨ３ドメインのＩｇＡセグメントと第２のＣＨ３ドメインのＩｇＡセグメントと対形成することにより、ＣＨ３ドメインの同種の対を含む。そのようなストランド交換ＣＨ３ドメインは、例えばそれぞれ異なる位置に配置し、そして非ＩｇＡセグメント、例えばＩｇＧセグメントにより互いに分離している少なくとも１、２、３、４、又は５個の異なるＩｇＡセグメントを組み込む、ＩｇＡアミノ酸配列及びＩｇＧアミノ酸配列の交互に反復したセグメントを特に含み得る。
【００７５】
具体的な態様によれば、ＡＢＭは、任意選択的にＦｃ領域において、Ｆｃガンマ受容体結合部位及び／又はＣ１ｑ結合部位を含むエフェクター機能コンピテント抗体である。
【００７６】
具体的には、抗体は、ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣ活性のいずれかにより特徴付けられる。
【００７７】
別の具体的な態様によれば、ＡＢＭは、Ｆｃγ受容体及び／又はＣ１ｑとの結合が欠損しているＦｃ領域を含むエフェクター陰性（ＥＮ）抗体である。
【００７８】
具体的には、抗体は、エフェクター欠損性であり（本明細書では、エフェクター陰性とも呼ばれる）、Ｆｃ領域を介したＦｃγ受容体又はＣＤ１６ａとの結合は実質的に低下又は欠損している。
【００７９】
具体的には、エフェクター陰性抗体は、ヒトＩｇＧ２のＣＨ２配列、又は改変されたその変異体により特徴付けられ、例えば「ＶＨ（１）−ＣＨ３＿ＫＮＯＢ（Ｔ３６６Ｙ）−ＣＨ２ＥＮ−ＣＨ３ＡＧ」（配列番号１５）で用いられるような、Ｃ末端側ＣＨ３ドメインのＮ末端に融合した（ナンバリングはＫａｂａｔのＥＵインデックスに基づく）、米国特許第８５６２９８６号に記載の修飾型ヒトＩｇＧ２のＣＨ２ドメイン（Ｆ２９６Ａ、Ｎ２９７Ｑ）を含む。
【００８０】
具体的には、ＥＮ抗体は、実質的に低下したＡＤＣＣ及び／若しくはＣＤＣを有する、又は一切有さない。
【００８１】
具体的には、ＡＢＭは、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとのインタージャンクションのＦｃＲｎ結合部位、及び／又はＣＨ２ドメインのＮ末端領域内のＦｃγ受容体結合部位、及び／又はＣＨ２ドメインのＮ末端領域内のＣ１ｑ結合部位を含む抗体のＦｃ部分を含む。
【００８２】
具体的な態様によれば、ＡＢＭは、もしあれば、ＣＨ２ドメイン及び／又はＣＨ３ドメインに配置するｐＨ依存性のＦｃＲｎ結合部位を含む。具体的には、ＦｃＲｎ結合部位は、ｐＨ依存性にＦｃＲｎと結合するアフィニティーを有し、そのときのＫＤは１０−４Ｍ未満、又は１０−５Ｍ、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、若しくは１０−８Ｍ未満である。
【００８３】
具体的には、ｐＨ依存性にＦｃＲｎと結合する結合アフィニティーは、生理学的ｐＨ（ｐＨ７．４）における同結合アフィニティーと比較して、ｐＨ５〜６において、少なくとも１対数、好ましくは少なくとも２対数、又は３対数増加している。
【００８４】
更なる態様によれば、ＡＢＭは、ｐＨ依存性のＦｃＲｎ結合を変化させるために改変される。例えば、少なくとも１つのＣＨ３ドメインは、ｐＨ依存性のＦｃＲｎ結合を低下させるためにＦｃＲｎ結合部位に少なくとも１つの突然変異、具体的にはＨ４３３Ａ若しくはＨ４３５Ａ突然変異の少なくとも１つ、又はＨ４３３ＡとＨ４３５Ａ突然変異の両方を含むように操作され、ナンバリングはＫａｂａｔのＥＵインデックスによる。ｐＨ依存性のＦｃＲｎ結合の低下は、ｐＨ依存性にＦｃＲｎと結合する結合アフィニティーが、生理学的ｐＨ（ｐＨ７．４）における同結合アフィニティーと比較して、ｐＨ５〜６において１対数を超えて低い、好ましくはほぼ同等又はそれ以下であり得る。
【００８５】
具体的な実施形態とは、本明細書に例示するＡＢＭのいずれか、又は実施例セクションに記載する重鎖及び軽鎖のいずれか、若しくは重鎖及び軽鎖の対のいずれかを含む抗体のいずれかを意味する。具体的には、本明細書に記載するＡＢＭは、実施例セクションに記載する重鎖及び軽鎖を含み得る、又はそれから構成され得る。
【００８６】
具体的には、本明細書に記載されるＡＢＭは、医療用、診断用又は分析用に提供される。
【００８７】
本発明はさらに、本明細書に記載されるＡＢＭを、好ましくは非経口又は粘膜製剤中に含み、任意選択的に薬学的に許容される担体又は賦形剤を含有する医薬製剤を提供する。
【００８８】
本発明はさらに、本明細書に記載されるＡＢＭをコードする単離された核酸を提供する。
【００８９】
本発明はさらに、本明細書に記載される核酸、及び任意選択的に核酸配列によってコードされるＡＢＭを発現するためのさらなる配列、例えば、調節配列を含むか若しくは組み込んでいる発現カセット又はプラスミドを提供する。
【００９０】
具体的には、発現カセット又はプラスミドは、本明細書に記載されるＡＢＭ、又は本明細書に記載されるＡＢＭのＨＣ及び／若しくはＬＣを発現するためのコード配列を含む。
【００９１】
具体的な例によれば、ＡＢＭは、１つ又は複数のＨＣ及びＬＣからなり、ＨＣの各々は、同じＨＣアミノ酸配列によって特徴付けられ、ＬＣの各々は、同じＬＣアミノ酸配列によって特徴付けられ、ＨＣ及びＬＣのコード配列は、一価又はホモ二量体抗体を産生するために使用される。
【００９２】
別の具体的な例によれば、ＡＢＭは、２つの異なるＨＣ及び２つの異なるＬＣからなり、２つの異なるＨＣ及び２つの異なるＬＣのコード配列は、ヘテロ二量体又は二重特異性抗体を産生するために使用される。
【００９３】
本発明はさらに、本明細書に記載されるＡＢＭをコードする１つ又は複数の核酸分子を組み込んでいる、少なくとも１つの発現カセット又はプラスミドを含む産生宿主細胞を提供する。
【００９４】
具体的には、宿主細胞は、ＡＢＭを一過性に又は安定的に発現する。具体的な例によれば、宿主細胞は、真核宿主細胞、好ましくは酵母又は哺乳動物細胞のいずれかである。
【００９５】
本発明はさらに、本明細書に記載されるＡＢＭを産生する方法であって、本明細書に記載される宿主細胞は、上記ＡＢＭを産生する条件下で培養又は維持される、方法を提供する。
【００９６】
具体的には、ＡＢＭは、細胞培養上清から単離及び／又は精製され得る。具体的な例によれば、ＡＢＭは、２つの異なるＨＣ及び２つの異なるＬＣを含むヘテロ二量体である二重特異性の全長抗体であり、ＡＢＭは、それぞれ同種のＨＣ／ＬＣ対ならびに同種のＣＬ及びＣＨ１ドメインとの正しい対形成を含み、ＡＢＭは、宿主細胞によって産生され、最大ピーク強度を比較する質量分析法（ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ）により測定した場合、産生された抗体の１０％未満、好ましくは５％未満が誤って対形成される。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】二重特異性ＩｇＧ  ＢｘＭは、界面突然変異を有しない（左パネル）、又はＭａＢ４０の界面変異を有する（右パネル）のいずれかでＥｘｐｉ２９３Ｆにおいて一過性で産生された。両方の抗体を脱グリコシル化し、ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳにより分析した。Ｂ１０ｖ５の軽鎖及び重鎖は白色で示され、ｈｕ２２５Ｍの軽鎖及び重鎖は黒色で示される。検出された各鎖対形成変異体の相対存在量は、検出された全ての完全なＩｇＧのパーセンテージとして指示される。ＢｘＭ  ｗｔでは、Ｆａｂにおいてミスペアリングを有する両方の変異体は、かなりの量で検出可能である（最大ピーク強度を比較した場合、各々１２％）。したがって、正しく対形成した変異体のピークはまた、軽鎖が位置を交換したミスペアリングの変異体を含有する。ＢｘＭ  ＭａＢ４０の産生は、正しく対形成した変異体のみをもたらした。ミスペアリングの変異体は、界面操作により消失した。
【図２】精製されたＢｘＭ野生型及びＢｘＭ  ＭａＢ４０の分析用サイズ排除クロマトグラフィー。両方のＩｇＧは、１６．３分の予想時間に溶出する。ＳＥＣプロファイルにおける界面操作の悪影響は検出できなかった。
【図３】二重特異性ＩｇＧ  ＢｘＯは、界面突然変異を有しない（ＢｘＯ  ｗｔ、左上パネル）、又はＭａＢ４０の界面突然変異を有する（ＢｘＯ  ＭａＢ４０、右上パネル）のいずれかでＨＥＫ２９３−６Ｅにおいて一過性に産生された。Ｂ１０ｖ５  Ｆａｂにおける支持的な突然変異が導入され、二重特異性抗体であるＢｘＯ  ＭａＢ５／４０、ＢｘＯ  ＭａＢ２１／４０及びＢｘＯ  ＭａＢ４５／４０の作成をもたらした（下の残りのパネル）。全ての抗体を脱グリコシル化し、ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳにより分析した。Ｂ１０ｖ５の軽鎖及び重鎖は白色で示され、ＯＫＴ３の軽鎖及び重鎖は黒色で示される。検出された各鎖対形成変異体の相対存在量は、検出された全ての完全なＩｇＧのパーセンテージとして指示される。ＢｘＯ  ｗｔでは、Ｆａｂにおいてミスペアリングを有する両方の変異体は、様々な量で検出可能であり、４０％を超えるミスペアリングの抗体が蓄積する。ミスペアリングは、ＢｘＯ  ＭａＢ４０においてかなり低下したが、なお検出可能であった。ＭａＢ４０の突然変異だけでなく、支持的な突然変異のいずれかのものも含有するＢｘＯは、改善された対形成挙動を示した。検出された完全なＩｇＧの９０％超が、正しくＢｘＯと対形成された。
【図４】精製されたＢｘＯ野生型、ＢｘＯ  ＭａＢ４０、ＢｘＯ  ＭａＢ５／４０及びＢｘＯ  ＭａＢ４５／４０の分析用サイズ排除クロマトグラフィー。全てのＩｇＧは、１５．４分の予想時間に溶出する。ＳＥＣプロファイルにおける界面操作の悪影響は検出できなかった。
【図５】配列：配列番号１：ヒトＩｇＧ１のＣカッパドメインのアミノ酸配列；配列番号２：ヒトＩｇＧ１のＣラムダドメインのアミノ酸配列；配列番号３：ヒトＩｇＧ１のＣＨ１ドメインのアミノ酸配列；配列番号４：ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域のアミノ酸配列；配列番号５：ヒトＩｇＧ１のＣＨ３ドメインのアミノ酸配列
【発明を実施するための形態】
【００９８】
本明細書を通じて使用される具体的な用語は、以下の意味を有する。
【００９９】
本明細書で使用される用語「抗原結合分子」又はＡＢＭは、抗原又はそのエピトープを特定の結合アフィニティー及び／又はアビディティーで特異的に認識又は結合するポリペプチドである結合ドメインを含む分子を意味する。ＡＢＭの具体的な例によれば、結合ドメインは、単一ドメイン抗体、一本鎖可変ドメイン、Ｆｄフラグメント、アルマジロリピートポリペプチド、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン、テネイシンＩＩＩ型ドメイン、アンキリンリピートモチーフドメイン、リポカリン、クニッツ（Kunitz）ドメイン、Ｆｙｎ由来ＳＨ２ドメイン、ミニタンパク質、Ｃ型レクチン様ドメインスキャフォールド、操作された抗体模倣物、及び抗原結合機能性を保持する上記のいずれかの遺伝子操作された対応物からなる群から選択されるポリペプチドを含む免疫グロブリン型結合領域である。
【０１００】
ＡＢＭの具体的な実施形態は、抗体又はその抗原結合フラグメントを含むか又はそれからなる。
【０１０１】
用語「抗体」は、本明細書で用いる場合、免疫グロブリン若しくは免疫グロブリン様分子である抗原結合ポリペプチド、或いは例えば１つ若しくは複数の抗体ドメインから構成され、また免疫グロブリン又は抗体と類似した抗原結合特性を担持する、モジュラー抗体フォーマットを提示するその他のタンパク質、特に、単一、又は二重、又は多重特異性の結合特性、或いは１価、２価、又は多価の結合特性を示し得るタンパク質、例えば、特に細胞関連のタンパク質若しくは血清タンパク質を含む自己抗原等の病原体起源又はヒト構造物の、例えば抗原、エフェクター分子、又は構造物のエピトープに対応する少なくとも２つの特異的結合部位を示し得るタンパク質として定義される。用語「抗体」及び「免疫グロブリン」は、本明細書では交換可能に用いられる。
【０１０２】
抗体は、１つ若しくは複数のリンカー配列を有する、又は有さない免疫グロブリンの重鎖及び／又は軽鎖の定常ドメイン及び／又は可変ドメインとして理解される抗体ドメインから一般的に構成される又はそれを含む。抗体は、可変抗体ドメインの対、例えば１つ若しくは２つのＶＨ／ＶＬの対等を含む、結合配列又はヒンジ領域を有する、又は有さない可変及び／又は定常抗体ドメインの組み合わせから構成される又はそれを含むものと特に理解される。ポリペプチドは、ループ配列により連結した抗体ドメイン構造の少なくとも２つのβストランドからなるβバレル構造を含む場合には、抗体ドメインとして理解される。抗体ドメインは、天然型構造のドメインであり得る、或いは、例えば、抗原結合特性又はその他の任意の特性、例えば安定性又は機能的特性、例えばＦｃ受容体ＦｃＲｎ及び／又はＦｃγ受容体との結合等を修飾するために、突然変異誘発又は誘導体生成により修飾され得る。
【０１０３】
用語「抗体」には、本明細書で用いる場合、免疫グロブリン様構造の抗体を含む、完全長抗体が特に含まれる。特に、抗体は、完全長抗体、例えばＩｇＧタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４サブタイプ）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、又はＩｇＭ抗体の完全長抗体であり得る。
【０１０４】
この用語はさらに、抗体、抗体ドメイン、若しくは抗体フラグメントの誘導体、組み合わせ又は融合のいずれかを含む。
【０１０５】
用語「全長抗体」は、具体的に重鎖の二量体を含む、抗体のＦｃ領域又は少なくともＦｃ部分の大部分を含む任意の抗体分子を指すために使用される。この用語「完全長抗体」は、本明細書では、特定の抗体分子が抗体フラグメントではないことを強調するのに用いられる。
【０１０６】
本明細書によれば、抗体は、免疫グロブリン遺伝子又は免疫グロブリン遺伝子のフラグメントにより実質的にコードされる１つ若しくは複数のポリペプチドを含むタンパク質（又はタンパク質複合体）として一般的に理解される。よく知られた免疫グロブリン遺伝子として、κ、λ、α、γ、δ、ε、及びμ定常領域遺伝子、並びに免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。軽鎖（ＬＣ）は、カッパ（ＶＬドメイン及びＣラムダドメインを含む）又はラムダ（ＶＬドメイン及びＣカッパドメインを含む）のいずれかとして分類される。重鎖（ＨＣ）は、γ、μ、α、δ、又はεとして分類されるが、それは次に免疫グロブリンクラスであるＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥをそれぞれ定義する。
【０１０７】
ＨＣ又はＬＣは、相互に結合してドメインの鎖を生成する少なくとも２つのドメインからそれぞれ構成される。抗体ＨＣは、ＶＨ抗体ドメイン、及びＶＨにＣ末端で結合した少なくとも１つの抗体ドメインを含み、すなわち、少なくとも１つの抗体ドメインは、連結配列を使用して又は使用しないでＶＨドメインのＣ末端に結びつけられることが具体的に理解される。抗体ＬＣは、ＶＬ抗体ドメイン、及びＶＬにＣ末端で結合した少なくとも１つの抗体ドメインを含み、すなわち、少なくとも１つの抗体ドメインは、連結配列を使用して又は使用しないでＶＬドメインのＣ末端に結びつけられる。
【０１０８】
定義には、可変領域（例えば、ｄＡｂ、Ｆｄ、Ｖｌ、Ｖｋ、Ｖｈ、ＶＨＨ等）及び定常領域の重鎖及び軽鎖のドメイン、又は天然抗体の個々のドメイン、例えばＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４、Ｃｌ、及びＣｋ等、並びに構造的ループにより連結した抗体ドメインの少なくとも２本のβストランドからなるミニドメインが更に含まれる。一般的に、特異的ＣＤＲ構造を通じて抗原結合部位を有する抗体は、ＶＨ／ＶＬドメイン対のＣＤＲループを通じて標的抗原と結合することができる。
【０１０９】
用語「抗体」には、異なる標的抗原に対する及び／又は立体配置が異なる抗体ドメインを含むその他の抗体を実質的に含まない単離された形態の抗体が特に含まれるものとする。更に、単離された抗体は、単離された抗体と、例えば少なくとも１つのその他の抗体、例えばモノクローナル抗体又は異なる特異性を有する抗体フラグメント等との組み合わせを含有する組み合わせ調製物に含まれ得る。
【０１１０】
用語「抗体」は、ヒト種、例えば哺乳動物、例えばマウス、ウサギ、ヤギ、ラクダ、ラマ、ウシ及びウマ、又はトリ、例えばニワトリなどの動物起源の抗体に適用され、この用語は、特に、動物起源の配列、例えば、ヒト配列に基づく組換え抗体を含む。
【０１１１】
用語「抗体」は、ヒト抗体に特に適用される。
【０１１２】
用語「ヒト」には、抗体において用いられる場合、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する抗体が含まれるものと理解される。ヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基（例えば、ランダム又は部位特異的ｉｎ  ｖｉｔｒｏ突然変異誘発性により又はｉｎ  ｖｉｖｏ体細胞突然変異により導入された突然変異）を、例えばＣＤＲ内に含み得る。ヒト抗体として、ヒト免疫グロブリンライブラリから、又は１つ若しくは複数のヒト免疫グロブリンについて遺伝子導入された動物から単離された抗体が挙げられる。
【０１１３】
ヒト抗体は、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、及びＩｇＭからなる群より選択される、又はそれに由来するのが好ましい。
【０１１４】
マウス抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ、ＩｇＧ２Ｃ、ＩｇＧ３、及びＩｇＭからなる群より選択される、又はそれに由来するのが好ましい。
【０１１５】
用語「抗体」は、キメラの抗体、例えば異なる種を起源とする配列、例えばマウス及びヒトを起源とする配列等を有するキメラ抗体に更に適用される。
【０１１６】
用語「キメラ」とは、抗体において用いられる場合、重鎖及び軽鎖の各アミノ酸配列の一部分が、特定の種に由来する、又は特定のクラスに属する免疫グロブリン内の対応する配列と相同である一方、鎖の残りのセグメントは別の種又はクラスの対応する配列と相同である分子を意味する。一般的に、軽鎖及び重鎖の両方の可変領域は、哺乳動物の１つの種に由来する免疫グロブリンの可変領域を模倣する一方、定常部分は、他方に由来する免疫グロブリンの配列と相同である。例えば、可変領域は、容易に入手可能なＢ細胞又はヒト以外の宿主生物に由来するハイブリドーマを、例えばヒト細胞調製物に由来する定常領域と組み合わせて利用する現在知られているソースに由来し得る。
【０１１７】
用語「抗体」は、ヒト化した抗体に更に適用され得る。
【０１１８】
用語「ヒト化」とは、抗体において用いられる場合、ヒト以外の種から得られた免疫グロブリンに実質的に由来する抗原結合部位を有する分子を意味し、分子の残りの免疫グロブリン構造は、ヒト免疫グロブリンの構造及び／又は配列に基づく。抗原結合部位は、定常ドメインと融合した完全な可変ドメイン、又は可変ドメイン内の該当するフレームワーク領域とグラフト結合した相補性決定領域（ＣＤＲ）のみを含み得る。抗原結合部位は、野生型であり得る、又は例えば１つ若しくは複数のアミノ酸置換により修飾され得る、好ましくはヒト免疫グロブリンとより密接に類似するように修飾され得る。ヒト化免疫グロブリンのいくつかの形態は、すべてのＣＤＲ配列を保存する（例えば、６つすべてのＣＤＲを含有するマウス抗体由来のヒト化マウス抗体）。その他の形態は、オリジナルの抗体に関して変更が加えられた１つ又は複数のＣＤＲを有する。
【０１１９】
具体的な実施形態によれば、本明細書に記載されるＡＢＭに含まれる全ての抗体ドメインは、少なくとも６０％の配列同一性、又は少なくとも７０％、８０％、９０％若しくは９５％の配列同一性を有するヒト起源のもの又はそのヒト化若しくは機能的に活性な変異体であり、好ましくは、抗体ドメインの起源は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、又はＩｇＥ抗体のいずれかである。具体的には、全ての抗体ドメインは、同じ基本的な免疫グロブリンフォールドに由来するが、ｂシートフォーマットは異なり得るが、特にＶドメインでは結びつけるループは確かに可変である。
【０１２０】
用語「抗体」は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体、特に組み換え抗体に更に適用され、該用語には、組み換え手段により調製、発現、作製、又は単離されるすべての抗体及び抗体構造が含まれ、例えば異なる起源に由来する遺伝子又は配列を含む、動物、例えばヒトを含む哺乳動物に由来する抗体、例えばキメラ抗体、ヒト化抗体、又はハイブリドーマ由来の抗体等が挙げられる。更なる事例として、抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から単離された抗体、又は組み換え体から単離された抗体、抗体若しくは抗体ドメインのコンビナトリアルライブラリ、又は抗体遺伝子配列をその他のＤＮＡ配列にスプライシングする工程と関係する任意のその他の手段により調製、発現、作製、又は単離された抗体が挙げられる。
【０１２１】
用語「抗体」には、新規の抗体、又は既存の、例えば天然由来の抗体の機能的に活性な変異体が含まれるものと理解される。抗体の変異体、特に抗体様分子の変異体、又は抗体変異体という用語は、そのような分子の誘導体もやはり含むべきものと更に理解される。      
【０１２２】
誘導体とは、１つ若しくは複数の抗体の任意の組み合わせ、及び／又は抗体の任意のドメイン若しくはミニドメインが、任意の位置で、１つ若しくは複数のその他のタンパク質、例えばその他の抗体若しくは抗体フラグメント等のほか、リガンド、酵素、毒素等と融合し得る融合タンパク質である。本明細書に記載されるＡＢＭ又は抗体は、具体的には、単離されたポリペプチドとして、又は、例えば、組換え、融合又はコンジュゲーション技術を通じて、他のペプチド又はポリペプチドとの組み合わせ分子として、使用することができる。ペプチドは、抗体ドメイン配列と相同であるのが好ましく、また少なくともアミノ酸５個分の長さであるのが好ましく、少なくとも１０個分、又は更に少なくともアミノ酸５０個分若しくは１００個分の長さであるのがより好ましく、また抗体ドメインのループ領域を少なくとも部分的に構成する。
【０１２３】
抗体の誘導体は、様々な化学的技法、例えば共有結合カップリング、静電相互作用、ジスルフィド結合等により、その他の物質との会合又は結合によっても取得可能である。抗体に結合したその他の物質は、脂質、炭水化物、核酸、有機分子及び無機分子、又は任意のこれらの組み合わせであり得る（例えば、ＰＥＧ、プロドラッグ、又は薬物）。誘導体は、同一のアミノ酸配列を有するが、全体的に若しくは部分的に非天然の又は化学的に修飾されたアミノ酸からなる抗体も含む。具体的な実施形態では、抗体は、生物学的に許容される化合物との特異的相互作用を可能にする追加タグを含む誘導体である。使用可能なタグに関して、抗体がその標的と結合する際に、その結合に対して悪影響を有さない又は悪影響が許容可能である限り、特別な制限は存在しない。適するタグの例として、Ｈｉｓ−タグ、Ｍｙｃ−タグ、ＦＬＡＧ−タグ、ストレップ−タグ、カルモジュリン−タグ、ＧＳＴ−タグ、ＭＢＰ−タグ、及びＳ−タグが挙げられる。別の具体的な実施形態では、抗体は、標識を含む誘導体である。用語「標識」とは、本明細書で用いる場合、検出可能な化合物又は組成物を意味し、「標識」抗体が生成するように抗体と直接又は間接的にコンジュゲートされている。標識は、そのものが検出可能、例えば放射性同位体標識若しくは蛍光標識であり得る、又は酵素標識の場合は、基質化合物若しくは組成物の検出可能な化学変化を触媒し得る。
【０１２４】
抗体の誘導体は、例えば、親抗原結合（例えば、ＣＤＲ）又はフレームワーク（ＦＲ）配列等の親抗体又は親抗体配列に由来し、例えば、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ若しくは組み換えエンジニアリングにより取得された突然変異体又は変異体、又は化学的誘導体生成若しくは合成によるそれ以外のものである。
【０１２５】
用語「変異体」は、本明細書で用いる場合、本明細書に記載するような、任意の「突然変異体」、「同族体」、又は「誘導体」を特に含むものとする。用語「変異体」は、具体的には、特定の機能性によって特徴付けられる機能的に活性な変異体を包含する。
【０１２６】
本明細書に記載されるＡＢＭ又は抗体の機能性は、特に、特定の抗原結合特性（特にエピトープ特異性）ならびにＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの好ましい対形成によって特徴付けられ、ＣＬドメインの１８位のアミノ酸、及び／又はＣＨ１ドメインの２６位のアミノ酸は、反対の極性によって特徴付けられる（ナンバリングはＩＭＧＴによる）。抗体定常ドメインの機能的変異体の機能性は、本明細書では、抗体ドメイン対を生成するために、対応する抗体ドメインと対形成する能力として理解される。特に、本明細書に記載されるＣＬドメイン及びＣＨ１ドメインの機能的変異体は、好ましい対形成のための優性な点突然変異を含み、ここで、ＣＬドメインの１８位のアミノ酸及び／又はＣＨ１ドメインの２６位のアミノ酸は、反対の極性によって特徴付けられ（「優性な点突然変異」；ＩＭＧＴによるナンバリング）、任意選択的に、さらなる点突然変異は、ＣＬ／ＣＨ１二量体を生成するための好ましい対形成を支持するが、対形成の可能性を減少させない。
【０１２７】
用語「変異体」は、ミュータント抗体又は抗体のフラグメント等の抗体を特に意味するものとし、例えば、特にインサートを除去、交換し、特定の抗体アミノ酸配列又は領域に導入する、或いは例えば、抗体安定性、エフェクター機能、若しくは半減期を改変するために定常ドメインにおいて、又は、例えば当技術分野において利用可能なアフィニティー成熟技法により、抗原結合特性を改善するために、可変ドメインにおいて、アミノ酸配列を化学的に誘導化する突然変異誘発法により取得される。任意の公知の突然変異誘発法が採用され得るが、これには、例えばランダム化技法により取得されるような、所望の位置での点突然変異が含まれる。場合によっては、位置は、例えば任意の可能性のあるアミノ酸を用いて、又は抗体配列をランダム化するのに好ましいアミノ酸を選択することによりランダムに選択される。用語「突然変異誘発」とは、ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列を変化させるための、当技術分野でよく知られた任意の技法を意味する。好ましい種類の突然変異誘発として、エラープローンＰＣＲ突然変異誘発、飽和突然変異誘発、又はその他の部位特異的突然変異誘発が挙げられる。
【０１２８】
用語「機能的変異体」は、本明細書では「機能的に活性な変異体」とも呼ばれ、例えば、１つ若しくは複数のアミノ酸の挿入、除去、又は置換、或いはアミノ酸配列内の１つ若しくは複数のアミノ酸残基の化学的誘導体生成、或いはヌクレオチド配列内の、又は例えば、ＣＤＲ若しくはＦＲ配列内の配列の遠位末端部のいずれか若しくは両方におけるヌクレオチドの化学的誘導体生成による親配列の修飾に起因する配列（例えば、親抗体に由来する）を含み得るが、その修飾は、この配列の活性に影響を及ぼさない、特に損なわない。選択された標的抗原に対して特異性を有する結合部位の場合、抗体の機能的に活性な変異体は、事前に決定された結合特異性をなおも有するが、但し、例えば、特定のエピトープに対する微細特異性、アフィニティー、アビディティー、Ｋｏｎ又はＫｏｆｆレート等を変化させるために変更され得る。例えば、アフィニティー成熟型抗体は、機能的に活性な変異体抗体として特に理解される。従って、アフィニティー成熟型抗体内の修飾されたＣＤＲ配列は、機能的に活性な変異体として理解される。
【０１２９】
機能的活性は、例えば、標的抗原との結合特異性、及び／又は分子に求められるｉｎ  ｖｉｖｏ半減期、及び／又はｐＨ依存性のＦｃＲｎ結合を測定するアッセイ法において、親分子と対比しながら変異体の構造及び機能により決定されるのが好ましく、例えば、抗体の機能性測定による標準アッセイ法において決定される。
【０１３０】
抗原が細胞表面上で発現する場合、抗体の機能的な活性は、抗原結合に関して、ＥＬＩＳＡアッセイ法、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ法、Ｏｃｔｅｔ  ＢＬＩアッセイ法、又はＦＡＣＳに基づくアッセイ法で一般的に測定される。
【０１３１】
機能的に活性な変異体は、例えば、親抗体、例えば、ＩｇＧ１構造等の抗体の特異的天然構造を有するモノクローナル抗体の配列を変化させて、標的抗原の認識において同一の特異性を有するが、親構造とは異なる構造を有する変異体を取得する、例えば、抗体ドメインのいずれかを改変して特異的突然変異を導入する、二重特異性構築物を生成する、又は親分子のフラグメントを生成すること等により取得可能である。
【０１３２】
一般的に、親の抗体又は配列は、抗原結合部位近傍の配列領域内又は結合部位内に、抗原結合を損なわない突然変異が組み込まれた変異体であって、好ましくは抗原結合能力を含め、親抗体と類似した生物活性を有する、例えば抗原を標的とする特異的結合アッセイ法又は機能的試験により測定したときに、実質的に同一の生物活性を有する変異体を生成するように改変可能である。
【０１３３】
用語「実質的に同一の生物活性」とは、本明細書で用いる場合、実質的に同一の活性、すなわち同等の抗体又は親抗体について測定したときの活性の少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、例えば、少なくとも１００％、又は少なくとも１２５％、又は少なくとも１５０％、又は少なくとも１７５％、又は例えば、最大２００％として表わされる活性を意味する。
【０１３４】
本明細書に記載する好ましい変異体は、抗原結合に関して機能的に活性であり、好ましくは個々の抗原と特異的に結合するが、標的抗原ではないその他の抗原と有意に結合しない能力を有するが、例えば、そのときのＫｄ値の差異は、少なくとも２対数、好ましくは少なくとも３対数である。機能的に活性な変異体による抗原結合は、一般的に損なわれず、親の抗体若しくは配列、又は例えば、Ｋｄ値の差異が２対数未満、好ましくは３対数未満の配列変異体を含む抗体の結合アフィニティーと実質的にほぼ等しい結合アフィニティーに対応するが、但し、アフィニティーが改善しさえする、例えばＫｄ値の差異が少なくとも１対数、好ましくは少なくとも２対数となる可能性も有する。
【０１３５】
好ましい実施形態では、親抗体の機能的に活性な変異体は、
ａ）抗体の生物学的に活性なフラグメントであり、該フラグメントは、分子の配列のうちの少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、及び最も好ましくは少なくとも９７％、９８％、又は９９％を含み、
ｂ）少なくとも１つのアミノ酸が置換、付加、及び／又は除去された抗体に由来し、機能的に活性な変異体は、分子又はその一部分に対して配列相同性を有し、例えば、少なくとも５０％の配列相同性、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、なおもより好ましくは少なくとも９０％、なおいっそうより好ましくは少なくとも９５％、及び最も好ましくは少なくとも９７％、９８％、又は９９％の配列相同性を有する抗体等であり、並びに／或いは
ｃ）抗体又はその機能的に活性な変異体、及びポリペプチド又はヌクレオチド配列とは異種の少なくとも１つの更なるアミノ酸又はヌクレオチドから構成される。
【０１３６】
一実施形態では、本明細書に記載されるＡＢＭ又は抗体の機能的に活性な変異体は、上記される変異体と本質的に同一であるが、異なる種の相同配列に由来するという点で、それぞれ、そのポリペプチド又はコードするヌクレオチド配列と相違する。これらは、天然由来の変異体又は類似体と呼ばれる。
【０１３７】
用語「機能的に活性な変異体」には、天然由来の対立遺伝子変異体、並びに突然変異体、又は任意のその他の非天然由来の変異体も含まれる。当技術分野において公知なように、対立遺伝子変異体は、ポリペプチドの生物学的機能を本質的に変化させない１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠損、又は付加を有するものとして特徴づけられる、交互に入れ替わった形態の（ポリ）ペプチドである。
【０１３８】
機能的に活性な変異体は、ポリペプチド又はヌクレオチド配列中、例えば１つ又は複数の点突然変異の配列変更によって得ることができ、本明細書に記載されるように使用される場合、配列変更は、未変更ポリペプチド又はヌクレオチド配列の機能を保持又は改善する。そのような配列変更として、（保存的な）置換、付加、除去、突然変異、及び挿入を挙げることができるが、但しこれらに限定されない。
【０１３９】
特定の機能的に活性な変異体は、ＣＤＲ変異体である。ＣＤＲ変異体には、ＣＤＲ領域内の少なくとも１つのアミノ酸が修飾されたアミノ酸配列が含まれ、上記修飾は、アミノ酸配列の化学的又は部分的な変更であり得るが、そのように修飾しても、変異体は、修飾前の配列の生物学的特徴を保持することが可能である。ＣＤＲアミノ酸配列の部分的な変更は、１つから数個のアミノ酸、例えば、１、２、３、４、若しくは５個のアミノ酸の除去又は置換による、又は１つから数個のアミノ酸、例えば、１、２、３、４、若しくは５個のアミノ酸の付加又は挿入による、又は１つから数個のアミノ酸、例えば、１、２、３、４、若しくは５個のアミノ酸の化学的誘導体生成による、又はその組み合わせによる可能性がある。アミノ酸残基内の置換は、保存的な置換、例えば１つの疏水性アミノ酸と代替的疏水性アミノ酸との置換であり得る。
【０１４０】
保存的な置換は、アミノ酸の側鎖及び化学的特性に関連するアミノ酸のファミリー内で生ずる置換である。そのようなファミリーの例として、塩基性側鎖、酸性側鎖、非極性脂肪族側鎖、非極性芳香族側鎖、非荷電極性側鎖、小型の側鎖、大型の側鎖を有するアミノ酸等が挙げられる。
【０１４１】
点突然変異とは、異なるアミノ酸に関する１つ又は複数の一重（非連続的）又は二重のアミノ酸の置換若しくは交換、欠失又は挿入において、非改変アミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列の発現を引き起こすポリヌクレオチドの改変と特に理解される。
【０１４２】
特定の態様によれば、抗体のＣＬドメイン及びＣＨ１ドメインとの好ましい対形成について本明細書に記載されるＣＬドメイン及びＣＨ１ドメインの点突然変異は、ＣＬドメインの１８位のアミノ酸残基の極性及び／又はＣＨ１ドメインの２６位のアミノ酸残基を反対の極性に変化させることであり、ナンバリングはＩＭＧＴに従う。具体的な実施形態を以下に指す：
ａ）ＣＬドメインの１８位のアミノ酸残基が正極性のものである場合、ＣＨ１ドメインの２６位のアミノ酸残基は負極性のものである；又は
ｂ）ＣＬドメインの１８位のアミノ酸残基が負極性のものである場合、ＣＨ１ドメインの２６位のアミノ酸残基は正極性のものである。
【０１４３】
上記された点突然変異は、本明細書において「優性な」点突然変異と呼ばれ、これは、指示された位置における反対の極性のこのような点突然変異によって、たとえＣＬドメイン若しくはＣＨ１ドメインにおいて、又は隣接するＶＬ若しくはＶＨドメインにおいて、さらなる点突然変異がない場合でも、このような点突然変異を有するＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの好ましい対形成によって特徴付けられるＡＭＢ又は抗体を産生することができるためである。
【０１４４】
優性な点突然変異以外に、ＬＣとＨＣとの好ましい対形成をさらに改善するさらなる点突然変異が存在し得、例えば、その突然変異は、本明細書において「支持的な」点突然変異と呼ばれる。このような支持的な点突然変異は、ＣＬ及び／若しくは対応するＣＨ１ドメインのいずれか、又はＶＬ及び／若しくは対応するＶＨドメインのいずれかにおいて操作され得る。例示的な支持的な点突然変異は、以下の通りである：ＣＬドメインの点突然変異Ｆ７Ｘ（Ｘは、Ｓ、Ａ、又はＶのいずれかである）；及び対応するＣＨ１ドメインの点突然変異Ａ２０Ｌ、ナンバリングはＩＭＧＴに従う。典型的には、支持的な点突然変異は、アミノ酸残基の置換によって特徴付けられる保存的な点突然変異であり、アミノ酸残基の極性はこのような置換によって変化しない。
【０１４５】
本明細書に記載されるＡＢＭ又は抗体の変異体は、同じ極性及び／又は電荷のアミノ酸の交換を指す点突然変異を含み得る。これに関して、アミノ酸は、６４個のトリプレットコドンによってコードされている２０個の天然アミノ酸を指す。これらの２０個のアミノ酸は、中性電荷、正電荷、及び負電荷を持つものに分割することができる。
【０１４６】
２０個の天然アミノ酸をそれぞれの３文字表記と１文字表記、及び極性とともに以下の表に示す。
【０１４７】
【表２】
2020505929.tif 000003
【０１４８】
ポリペプチド配列に関する「アミノ酸配列の同一性のパーセント（％）」は、配列相同性の最大パーセントを達成するように、また配列相同性の一部として保存的置換を一切考慮せずに配列の位置合わせを行い、そして必要な場合にはギャップを導入した後に、所定のポリペプチド配列内のアミノ酸残基と一致する候補配列内のアミノ酸残基の百分率（％）として定義される。当業者は、比較の対象となる配列の全長にわたり、一致性が最大となるのに必要とされる任意のアルゴリズムを含め、一致性を測定するしかるべきパラメーターを決定することができる。
【０１４９】
ＡＢＭ又は抗体変異体には、例えば、糖鎖工学により生成される特定のグリコシル化パターンを有する同族体、類似体、フラグメント、修飾体、又は変異体が含まれるものと特に理解され、抗体変異体は機能的であり、例えば、特定の標的に結合し、機能的特性を有するなど、また機能的同等物として役に立つ可能性がある。ＡＢＭ又は抗体は、グリコシル化されても、またグリコシル化されなくてもよい。例えば、本明細書に記載するような組み換えＡＢＭ又は抗体は、抗体を発現する宿主細胞により決定される分子の特異的グリコシル化が可能となるように、適する哺乳動物細胞内で発現され得る。
【０１５０】
抗体ドメイン、特にＣＬ又はＣＨ１ドメイン等の定常抗体ドメインの「βシート」又は「βストランド」という用語は、本明細書では以下のように理解される。抗体ドメインは、少なくとも２つ又は３つのバックボーン水素結合により横方向に連結した少なくとも２本のβストランドから一般的に構成され、一般的に捻じられた、ひだ状のシートを形成する。βストランドは、一般的に長さが３〜１０個のアミノ酸からなる単一の連続的なアミノ酸のストレッチであり、そのように延長型の立体構造を採るが、また少なくとももう一方のストランドとのバックボーン水素結合に関与してβシートを形成する。βシート内では、βストランドの大部分は、他方のストランドに隣接して配置し、そして広範な水素結合ネットワークをその近傍のストランドと形成し、その場合、一方のストランドのバックボーン内のＮ−Ｈ基が、隣接したストランドのバックボーン内のＣ＝Ｏ基と水素結合を形成する。
【０１５１】
抗体定常ドメイン、例えばＣＬ又はＣＨ１ドメイン等の構造は、ループにより連結したβストランドからなる可変ドメインの構造と類似しており、その一部は、短いαヘリックス型ストレッチを含む。様々なＦｃ結晶構造のｂ因子から理解されるように、フレームワークは、おおむね剛性であり、またループは比較的柔軟性である。抗体ＣＬ又はＣＨ１ドメインは、βシート（Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ−Ｇ）を形成する７本のβストランドを一般的に有し、この場合、βストランドは、複数のループ、すなわちドメインのＮ末端側先端部分に位置する３つのループ（Ａ−Ｂ、Ｃ−Ｄ、Ｅ−Ｆ）、及びドメインのＮ末端側先端部分に位置する更なる３つのループ（Ｂ−Ｃ、Ｄ−Ｅ、Ｆ−Ｇ）を介して結合している。ドメインの「ループ領域」は、ベータ鎖の領域間に位置するタンパク質の部分を指す（例えば、ＣＬドメイン又はＣＨ１ドメインの各々は、Ｎ末端からＣ末端に配向した７つのベータシートＡ〜Ｇを含む）。
【０１５２】
好ましくは、一対の抗体ドメイン、例えば、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインの対形成は、各々のドメインのＡ、Ｂ及び／又はＥ鎖を伴う結合表面（本明細書においては、結合界面と呼ぶ）を結びつけることによって（ヘテロ）二量体を産生する。ＣＬドメインのベータシート領域とＣＨ１ドメインのベータシート領域とのこのような接触により、二量体（ＣＬ／ＣＨ１と称される）が産生される。
【０１５３】
具体的には、本明細書に記載さるＣＬドメイン及びＣＨ１ドメインは、ヒトＩｇＧ１抗体のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。
【０１５４】
特に、Ｃカッパドメインは、配列番号１として同定されたアミノ酸配列、又はその機能的変異体、例えば、特定の配列同一性を有するものによって特徴付けられる。
【０１５５】
特に、Ｃラムダドメインは、配列番号２として同定されたアミノ酸配列、又はその機能的変異体、例えば、特定の配列同一性を有するものによって特徴付けられる。
【０１５６】
特に、ＣＨ１ドメインは、配列番号３として同定されたアミノ酸配列、又はその機能的変異体、例えば、特定の配列同一性を有するものによって特徴付けられる。
【０１５７】
或いは、本明細書に記載されるＣＬ及びＣＨ１抗体ドメインは、ヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、又はそれらの機能的変異体、例えば、特定の配列同一性を有するもののいずれかのアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。
【０１５８】
抗体のＦｖ部分は、典型的には、各々のドメインのＣ鎖、Ｃ’鎖及びＦ鎖を伴う結合表面（結合界面）を結びつけることによって（ヘテロ）二量体を産生するＶＬドメインとＶＨドメインの対として理解される。ＶＬドメインのベータシート領域とＶＨドメインのベータシート領域のこのような接触により、二量体（ＶＬ／ＶＨと称される）が産生される。
【０１５９】
Ｆａｂアームは、本明細書において、第１及び第２の抗体鎖の対として理解され、第１の鎖は、ＶＬドメインのＣ末端に連結される、ＶＬドメイン及びＣＬドメインを含むか又はそれからなり（軽鎖、ＬＣ）、第２の鎖は、ＶＨドメインのＣ末端に連結される、ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインを含むか又はそれからなり（重鎖、ＨＣ）、ＶＬは、結合界面を介してＶＨに結びつけ（それと対形成し）、ＣＬは、結合界面を介してＣＨ１に結びつけ（それと対形成し）、これによりＬＣ及びＨＣの（ヘテロ）二量体（ＬＣ／ＨＣとも称される）を産生する。
【０１６０】
抗体のＦｃ部分は、本明細書において、各々がＣＨ２ドメイン及び、抗体鎖の対（Ｆｃ鎖）として理解され、ＣＨ２ドメインのＣ末端に連結されているＣＨ３ドメインを含む抗体鎖の対（Ｆｃ鎖）として理解される。各々の抗体鎖のＣＨ２ドメインは、各々のＣＨ２ドメインのＡ、Ｂ及び／又はＥ鎖を伴う結合表面（結合界面）を介して互いに結びつけ、各々の抗体鎖のＣＨ３ドメインは、各々のＣＨ３ドメインのＡ、Ｂ及び／又はＥ鎖を伴う結合表面（結合界面）を介して互いに結びつけ（それと対形成し）、これによりＦｃ鎖の（ホモ）二量体を産生する。本明細書に記載されるＦｃ部分は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭ由来であり得る。
【０１６１】
本明細書に記載される一実施形態では、Ｆｃ部分は、突然変異したＣＨ３ドメイン、例えば、１つ又は複数の突然変異、又はノブ若しくはホール突然変異を含むように、異種配列で置換された１つ又は複数のベータ鎖の少なくとも一部を有するものを含む。このような場合、Ｆｃ領域は、２つの異なるＣＨ３ドメインの会合によって特徴付けられるＦｃ鎖のヘテロ二量体を含む。
【０１６２】
特異的ノブ突然変異は、βストランド構造の追加の突起を提供する１つ又は複数のアミノ酸を組み込むことにより２つのドメイン間で接触表面を増加させる１つ又は複数のアミノ酸置換、例えばＴ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｆ４０５Ａからなる群より選択されるＣＨ３ノブ突然変異のうちの１つ又は複数である。特異的ノブ修飾とは、抗体のＣＨ３ドメイン内の突然変異Ｔ３６６Ｗを指す（ナンバリングはＫａｂａｔのＥＵインデックスに基づく）。ノブ突然変異は、例えばホール突然変異を組み込むように修飾された別の抗体ドメインに結合するためのマッチング（同種）表面を特に提供する。
【０１６３】
特異的ホール突然変異は、βストランド構造の追加の陥凹部を提供する１つ又は複数のアミノ酸を組み込むことにより、２つのドメイン間で接触表面を増加させる１つ又は複数のアミノ酸置換、例えばＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖからなる群より選択されるＣＨ３ホール突然変異のうちの１つ又は複数である。特異的ホール修飾とは、抗体のＣＨ３ドメイン内の突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｙ４０７Ｔのいずれかを指す（ナンバリングはＫａｂａｔのＥＵインデックスに基づく）。ホール突然変異は、例えばノブ突然変異を組み込むように修飾された別の抗体ドメインに結合するためのマッチング（同種）表面を特に提供する。
【０１６４】
マッチングするノブ・イントゥ・ホール突然変異として、例えばＣＨ３ドメインの対の一方のＣＨ３ドメイン上のＴ３６６Ｙと、これにマッチングする第２のＣＨ３ドメイン上のＹ４０７’Ｔが挙げられ、本明細書ではＴ３６６Ｙ／Ｙ４０７’Ｔと呼ばれる。更なるマッチング突然変異として
Ｔ３６６Ｙ／Ｙ４０７’Ｔ、
Ｆ４０５Ａ／Ｔ３９４’Ｗ、
Ｔ３６６Ｙ：Ｆ４０５Ａ／Ｔ３９４‘Ｗ：Ｙ４０７’Ｔ、
Ｔ３６６Ｗ／Ｙ４０７’Ａ、及び／又は
Ｓ３５４Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｙ３４９’Ｃ：Ｔ３６６’Ｓ：Ｌ３６８’Ａ：Ｙ４０７’Ｖ
が挙げられる。
【０１６５】
特異的ＣＨ３突然変異には、例えばＣＨ３βストランド内の１つ又は複数のセグメント又は配列が突然変異しており、オリジナルのＣＨ３ドメインとは異なる抗体ドメイン、例えば異なるタイプ又はサブタイプの抗体ドメインのセグメント又は配列が組み込まれている場合、分子間のβストランドスワップが含まれる。特異的突然変異体は、ストランド交換により取得されるが、この場合、ＩｇＧタイプのＣＨ３ドメインにＩｇＡタイプのＣＨ３ドメインの１つ又は複数のセグメント又は配列が組み込まれる。２つのストランド交換ＣＨ３ドメインが突然変異して同種の対を形成する場合、ＣＨ３ドメインそれぞれのＩｇＡセグメント又は配列は、突然変異したＣＨ３ドメインが、野生型ＣＨ３ドメインよりも選好的に相互に対をなすように、同種のドメイン間接触表面を生成する。セグメントスワップを組み込んだ抗体ドメインのそのような修飾の具体例として、ストランド交換設計ドメイン（ＳＥＥＤ）を挙げることができる。そのような修飾は、非対称性又は二重特異性抗体、特に重鎖のＳＥＥＤ修飾型ＣＨ３ドメインを選好的に対形成させることによって二重特異性抗体を生成するのに利用可能である。これは、保存されたＣＨ３ドメイン内の構造的に関連した配列の交換に基づく。ＳＥＥＤ  ＣＨ３ドメイン内のヒトＩｇＡ及びＩｇＧに由来の交互に反復する配列は、ＡＧ及びＧＡと表される非対称性であるが相補的な２つのドメインを生成する。ＳＥＥＤデザインは、ＡＧ及びＧＡ  ＳＥＥＤ  ＣＨ３ドメインのホモ二量体化を回避しつつ、ＡＧ／ＧＡヘテロ二量体の効率的な生成を可能にする。
【０１６６】
抗体ドメイン若しくはＬＣ／ＨＣ、又はＦｃ鎖の結びつけは、ドメイン内又はドメイン間のジスルフィド架橋によってさらに支持され得る。ジスルフィド結合は、２つのシステインのチオール基の酸化により通常形成され、これによりＳ原子が結合して２つのシステイン残基の間でジスルフィド架橋が形成される。
【０１６７】
具体的な実施形態によれば、抗体ドメインは、追加のドメイン内ジスルフィド架橋によって抗体ドメインを、又は追加のドメイン間ジスルフィド架橋によって一対の抗体ドメインを安定化させるためにジスルフィド架橋を形成することができるシステイン残基を組み入れる突然変異を含む。具体的には、システインは、ＣＨ３ドメインのＣ末端領域内又はＣ末端に挿入され得る（アミノ酸付加又はアミノ酸置換による）。追加のシステイン修飾を有する一対のＣＨ３は、ＣＨ３対間のジスルフィド結合形成によって安定化され、これによりＣＨ３／ＣＨ３二量体を産生し得る。一部の実施形態では、ジスルフィド連結された抗体ドメインは、ホモ二量体又はヘテロ二量体、すなわち同一又は異なるドメインの対である。
【０１６８】
抗体鎖又はドメインの正しい対形成を可能にするために、任意のＣＨ３突然変異法が、特に利用可能であり、例えばノブ・イントゥ・ホール技術、ＳＥＥＤ技術、電荷反発技術、ジスルフィド結合、又はクロス−ｍＡｂ技術が、正しく会合しない分子の量を低減するために利用可能である。
【０１６９】
抗体ドメインの「対」は、本明細書において２つの抗体ドメイン一式として理解され、この場合、一方は、その表面上又はキャビティ内に、他方のドメイン上の部位と特異的に結合する、従って相補的な部位を有する。抗体ドメインは会合（associate）及び会合（assemble）して、ベータシート領域の接触を介して一対の抗体ドメインを形成し得る。そのようなドメインの対は二量体とも呼ばれ、例えば静電相互作用、組み換え融合、又は共有結合により会合するが、例えば固体形態及び液状形態の両方において、２つのドメインを物理的に直接会合させる。本明細書において具体的に記載されているのは、本明細書において同定された位置での特定の点突然変異を介した同種の抗体ドメインの好ましい対となりうるＣＬ／ＣＨ１二量体である。
【０１７０】
「好ましい対形成」は、本明細書では、抗体ドメイン又は抗体鎖の二量体の形成として理解され、これにより抗体ドメイン又は抗体鎖の対が得られ、この対は、抗体ドメインの結合界面のアフィニティー又はアビディティーの増加、及びドメイン対又はＨＣ／ＬＣ対の（熱）安定性の増加を介して形成される。同種の抗体ドメインは、本明細書に記載されるような、好ましくは同じ型の任意の野生型ドメイン全体で互いに対形成するような、界面領域における修飾によって産生され得る。
【０１７１】
一対の抗体ドメインにおいて、抗体ドメインは、本明細書では、「対応する」ドメインと呼ばれる。本明細書に記載される抗体において、以下のドメインは、一対の抗体ドメインを適切に形成する対応物（スラッシュ（／）で分離された対応物）と見なされる：
ＶＬ／ＶＨ；
ＣＬ（Ｃラムダダ又はカッパ）／ＣＨ１；
ＣＨ２／ＣＨ２；
ＣＨ３／ＣＨ３。
【０１７２】
用語「同種」とは、ドメインの対又はドメイン二量体に関して、各ドメイン上で、そのようなドメインの対を選好的に形成する接触表面が得られるようにする、マッチング結合ポイント又は構造を有するドメインとして理解される。具体的なドメインは、少なくとも１つのドメインがその同種の（対応する）結合パートナーに選好的に結合してドメイン対を生成するように修飾されている場合、「同種の」又は同種の対のドメインとして理解される。好ましくは、両方の同種のドメインは、合致する突然変異、例えば、反対の極性のアミノ酸残基を導入するための突然変異、ノブ−イントゥ−ホール突然変異、ＳＥＥＤ突然変異、ジスルフィド架橋形成のための追加のシステイン残基、又は電荷反発技術を用いた修飾を取り込むように設計される。
【０１７３】
用語「多価」とは、本明細書に記載するＡＢＭ又は抗体に関して、同一の標的抗原に結合する、特にそのような標的抗原の同一の又は異なるエピトープと結合する少なくとも２つの結合部位を有する分子を指すものとする。該用語には、２価の抗体、又は例えば少なくとも２、３、４個、若しくはそれより多くの結合部位を通じて標的抗原と結合する２以上の結合価を有する分子が含まれるものとする。例えば、２価の抗体は、２つの対からなり、その両方とも同一の標的抗原と結合するＶＨ／ＶＬドメインを介した２つの抗原結合部位を有し得る。
【０１７４】
用語「多重特異性」とは、本明細書に記載するＡＢＭ又は抗体に関して、少なくとも２つの異なる標的抗原と特異的に結合する少なくとも２つの結合部位を有する分子を指すものとする。該用語には、二重特異性抗体、又は２つ以上の標的抗原と、例えば少なくとも２、３、４個、若しくはそれより多くの結合部位を通じて結合する２つ以上の特異性を有する分子が含まれるものとする。
【０１７５】
例えば、二重特異性抗体は、ＶＨ／ＶＬドメインの一方の対（Ｆｖ領域）を通じて１つの標的抗原と結合し、またＶＨ／ＶＬドメイン（Ｆｖ領域）の第２の対により別の標的抗原と結合し得る。二重特異性抗体は、典型的には、４つの異なる抗体鎖、すなわち、２つのＨＣ及び２つのＬＣから構成され、そのため、２つの異なるＣＤＲ結合部位が、第１のＨＣと第１のＬＣとの、及び第２のＨＣと第２のＬＣのヘテロ二量体化（対形成）によって形成される。
【０１７６】
本明細書で使用される「抗原」又は「標的」という用語は、特に、抗体の結合部位によって認識することができる全ての抗原及び標的分子（パラトープとも呼ばれる）を含む。本明細書に記載される結合分子によって標的化される具体的に好ましい抗原は、免疫学的又は治療的に関連性があることが既に証明されているか又はそうであり得る抗原、とりわけ臨床効果が試験されている抗原である。用語「標的」又は「抗原」は、本明細書で用いる場合、（ヒト又はその他の動物の）、自己抗原である腫瘍関連受容体及び可溶性の腫瘍関連抗原、例えば、腫瘍細胞上に位置する受容体、又はそのような腫瘍と関連して癌患者の循環系内に豊富に存在すサイトカイン若しくは又は増殖因子からなる群より選択される分子を特に含むものとする。更なる抗原は、病原体起源、例えば微生物又はウイルス性の病原体の抗原であり得る。
【０１７７】
標的抗原は、標的分子全体、又はそのような分子のフラグメント、特に下部構造、例えば免疫学的に関連し、すなわち、天然抗体又はモノクローナル抗体によって認識可能でもある、「エピトープ」（例えばＢ細胞エピトープ、Ｔ細胞エピトープ）と一般的に呼ばれる標的のポリペプチド又は炭水化物構造として認識される。本明細書で使用される用語「エピトープ」とは、本明細書に記載されるＡＢＭ若しくは抗体の結合部位に対する、特異的結合パートナーを完全に構成するか又は特異的結合パートナーの一部であり得る分子構造を特に指す。用語「エピトープ」は、ハプテンも意味する。化学的には、エピトープは、炭水化物、ペプチド、脂肪酸、有機物質、生体物質、又は無機物質、又はその誘導体及び任意のその組み合わせから構成され得る。エピトープがポリペプチドの場合、少なくとも３個のアミノ酸、好ましくは８〜５０個のアミノ酸、及びより好ましくは約１０〜２０個のアミノ酸が、ペプチド内に通常含まれる。ペプチドの長さに重大な上限はなく、タンパク質のほぼ完全長ポリペプチド配列を含む場合もある。エピトープは、直鎖状又は高次構造エピトープであり得る。直鎖状エピトープは、ポリペプチドの一次配列又は炭水化物鎖からなる単一のセグメントから構成される。直鎖状エピトープは、連続性又は重複性であり得る。高次構造エピトープは、アミノ酸又は炭水化物から構成され、ポリペプチドのフォールディングにより一体化して三次構造を形成し、またアミノ酸は、直鎖状配列において必ずしも相互に隣接していない。特に、エピトープは、診断上関連する分子の少なくとも一部分である、すなわちサンプル中のエピトープの有無は、患者の疾患若しくは健康状態、又は製造におけるプロセスの状態、又は環境及び食物の状態と定性的又は定量的に相関する。エピトープは、治療上関連する分子、すなわち疾患の経過に変化をもたらす、特異的結合ドメインの標的対象となり得る分子の少なくとも一部分に相当し得る。
【０１７８】
特定の実施形態は、天然に存在する抗原若しくはエピトープ、又はエピトープの合成（人工）抗原を指す。天然に存在する抗原の誘導体である人工抗原は、抗原性又は安定性が増加するという利点を有する可能性があり、これは、特定のＡＢＭ又は抗体に対する結合パートナーとして認識されることに関連する。
【０１７９】
本明細書で用いる場合、用語「特異性」又は「特異的結合」とは、不均質な分子集団内で目的の同種リガンドを判別する結合反応を意味する。したがって、指定された条件下（例えばイムノアッセイ条件下）で、本明細書に記載されるＡＢＭ又は抗体は、その特定の標的に結合し、試料中に存在する他の分子に有意な量では結合しない。特異的結合とは、結合はターゲットアイデンティティーに関して選択的であることを意味し、選択に応じて結合アフィニティー又はアビディティーは高、中、又は低となる。選択的結合は、結合定数又は結合動力学が少なくとも１０倍異なる場合に通常実現し、好ましくは、差異は少なくとも１００倍、より好ましくは少なくとも１０００倍である。
【０１８０】
用語「可変結合領域」は「ＣＤＲ領域」とも呼ばれるが、本明細書で用いる場合、抗原との結合相互作用能力のある可変構造を有する分子を意味する。そのような分子は、そのまま利用可能、又はより大きなタンパク質に組み入れ可能であり、従って結合機能を備えたそのようなタンパク質の特異的領域を形成する。可変構造は、結合タンパク質の天然のレパートリー、例えば免疫グロブリン又は抗体等に由来し得る。可変構造は、ランダム化技法、特に本明細書に記載する技法によっても生成可能である。これらは、突然変異誘発されたＣＤＲ又は非ＣＤＲ領域（例えば、定常抗体ドメインの構造ループ領域）、抗体可変ドメイン又は定常ドメインのループ領域、特に抗体のＣＤＲループを含む。典型的には、本明細書に記載されるＡＢＭ又は抗体の結合構造は、このような可変結合領域によって形成される。
【０１８１】
本明細書に記載されるＡＢＭ又は抗体の目的で使用される「細胞傷害性」又は「細胞傷害活性」という用語は、抗原に結合した場合、プログラムされた細胞死を活性化し、アポトーシスを誘発する細胞抗原に対して指向される任意の特定分子を指す。特異的抗体は、エフェクター細胞に対するその活性により効果を有し、その結果、細胞傷害性Ｔ細胞、又は抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）、及び／又は細胞食作用（ＡＤＣＰ）に関与する細胞の活性化を引き起こす。特異的抗体は、アポトーシス誘発性のプログラム細胞死により、並びに／或いはＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣ活性に関与するエフェクター細胞がＦｃ受容体と結合することにより、抗体で被覆された標的細胞を殺傷する。
【０１８２】
本明細書に記載されるＡＢＭ又は抗体は、Ｆｃエフェクター機能を示してもよく又は示さなくてもよい。Ｆｃは、補体を導入することができ、また免疫複合体の形成による表面抗原の結合を通じて、標的抗原又は標的細胞の除去を支援する。
【０１８３】
特定の抗体は、活性なＦｃ部分又はＦｃエフェクター機能を欠損している場合もあり、従って抗体のＦｃ部分を含まない、又はＦｃγ受容体結合部位を含まない抗体ドメインから構成され得る、或いは例えばＦｃエフェクター機能を低減する、特にＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣ活性を無効にする又は低減する修飾により、Ｆｃエフェクター機能を欠いている抗体ドメインを含み得る。修飾を組み込んで、Ｆｃエフェクター機能を高める、特にＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣ活性が増強するように、代替的抗体が改変され得る。
【０１８４】
そのような修飾は、突然変異誘発、例えばＦｃγ受容体結合部位内の突然変異により、又は抗体フォーマットのＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣ活性を阻害する誘導体又は薬剤により影響を受ける可能性があり、その結果、Ｆｃエフェクター機能が低下又は増加する。
【０１８５】
用語「抗原結合部位」又は「結合部位」とは、抗原結合に関与するＡＢＭ又は抗体の部分を意味する。抗体の抗原結合部位は、典型的には、重（「Ｈ」）及び／又は軽（「Ｌ」）鎖のＮ末端可変（「Ｖ」）領域、又はその可変ドメインのアミノ酸残基によって形成される。重鎖及び軽鎖のＶ領域内の３つの高度に多様なストレッチは、「高度可変領域」と呼ばれ、フレームワーク領域として知られているより保存されたフランキングストレッチの間に挿入されている。抗原結合部位は、結合したエピトープ又は抗原の三次元表面に相補的な表面を提供するが、また高度可変領域は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」と呼ばれる。ＣＤＲ内に組み込まれた結合部位は、本明細書では「ＣＤＲ結合部位」とも呼ばれる。
【０１８６】
用語「発現」とは、次のように理解される。発現産物、例えば本明細書に記載するようなＡＢＭ又は抗体等の所望のコーディング配列、及び制御配列、例えば作動可能な結合内のプロモーター等を含有する核酸分子が、発現を目的として利用可能である。このような配列で形質転換又はトランスフェクトされた宿主は、コードされたタンパク質を生成する能力を有する。形質転換を有効にするために、ベクターに発現系を含めることができる；但し、関連するＤＮＡも宿主染色体に組み込むことができる。特に該用語は、例えば、ベクターに担持され、宿主細胞に導入された外来ＤＮＡによりコードされるタンパク質発現用の、適する条件に置かれた宿主細胞及び適合するベクターを意味する。
【０１８７】
コーディングＤＮＡは、特定のポリペプチド又はタンパク質、例えば抗体等に対応する特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列である。プロモーターＤＮＡは、コーディングＤＮＡの発現を開始、規制、さもなければ媒介、又は制御するＤＮＡ配列である。プロモーターＤＮＡ及びコーディングＤＮＡは、同一の遺伝子又は異なる遺伝子に由来し得るが、また、同一の又は異なる生物に由来し得る。組み換えクローニングベクターには、多くの場合、クローニング又は発現用の１つ若しくは複数の複製系、宿主内で選択するための１つ若しくは複数のマーカー、例えば抗生物質耐性、及び１つ若しくは複数の発現カセットが含まれる。
【０１８８】
本明細書で用いられる「ベクター」は、クローン化された組み換えヌクレオチド配列、すなわち組み換え遺伝子の転写、及び適する宿主生物内でのそのｍＲＮＡの翻訳に必要とされるＤＮＡ配列として定義される。
【０１８９】
「発現カセット」とは、定義された制限部位においてベクターに挿入可能な発現産物をコードするＤＮＡのＤＮＡコーディング配列又はセグメントを意味する。カセット制限部位は、正しいリーディングフレーム内へのカセットの挿入を保証するように設計される。一般的に、外来ＤＮＡは、ベクターＤＮＡの１つ又は複数の制限部位に挿入され、次にベクターにより伝染性ベクターＤＮＡと共に宿主細胞に搬送される。発現ベクター等の、挿入又は付加されたＤＮＡを有するＤＮＡのセグメント又は配列は、「ＤＮＡ構築物」とも呼ばれる場合がある。
【０１９０】
発現ベクターは、発現カセットを含み、また宿主細胞における自律複製のための起点又はゲノム組み込み部位、１つ又は複数の選択マーカー（例えば、抗生物質、例えばゼオシン（ｚｅｏｃｉｎ）、カナマイシン、Ｇ４１８、又はハイグロマイシン等に対する耐性を付与するアミノ酸合成遺伝子又は遺伝子）、いくつかの制限酵素切断部位、適するプロモーター配列、及び転写終結因子を通常更に含むが、これらの成分は作動可能に共に結合している。用語「ベクター」には、本明細書で用いる場合、自律複製ヌクレオチド配列、並びにゲノム組み込み用ヌクレオチド配列が含まれる。一般的な種類のベクターは「プラスミド」であり、それは一般的に、追加（外来）のＤＮＡを容易に受け入れ可能な二本鎖ＤＮＡの自己完結型分子であるが、また適する宿主細胞に容易に導入可能である。プラスミドベクターは、多くの場合、コーディングＤＮＡ及びプロモーターＤＮＡを含有し、また外来ＤＮＡの挿入に適する１つ又は複数の制限部位を有する。特に、用語「ベクター」又は「プラスミド」は、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列（例えば、外来遺伝子）を宿主細胞に導入可能であり、その結果宿主を形質転換させ、そして導入された配列の発現（例えば、転写及び翻訳）を促進する媒体を意味する。
【０１９１】
用語「宿主細胞」とは、本明細書で用いる場合、特定の組み換えタンパク質、例えば本明細書に記載するようなＡＢＭ又は抗体等を生成するように形質転換された初代対象細胞、及び子孫を指すものとする。すべての子孫が親細胞とまったく同一とは限らないが（計画的若しくは偶然の突然変異、又は環境の差異に起因して）、但し、該子孫が、当初形質転換された細胞の機能と同一の機能を保持する限り、そのように変化した子孫もその用語に含まれるものと理解すべきである。用語「宿主細胞株」とは、組み換え遺伝子を発現させて、組み換えポリペプチド、例えば組み換え抗体等を生成するのに用いられるような宿主細胞の細胞株を意味する。用語「細胞株」とは、本明細書で用いる場合、長期間にわたり増殖能力を獲得した特定の細胞型の確立されたクローンを意味する。そのような宿主細胞又は宿主細胞株は、細胞培養内で維持可能、及び／又は組み換えポリペプチドを生成するために培養可能である。
【０１９２】
用語「単離された」又は「単離」とは、核酸、抗体、又はその他の化合物に関して本明細書で用いる場合、「実質的に純粋な」形態で存在するように、それが本来関連する環境から十分に分離された化合物を指すものとする。「単離された」とは、その他の化合物又は材料との人工的又は合成混合物、或いは基本的な活性を妨害しない、そして例えば、不完全な精製に起因して存在し得る不純物の存在の除外を必ずしも意味しない。特に、本明細書に記載されるＡＢＭ又は抗体をコードする単離された核酸分子はまた、特定の宿主細胞における発現を改善するために天然に存在する核酸配列のコドン最適化変異体、又は化学合成されたものを含むことが意味される。
【０１９３】
核酸を参照しながら、用語「単離された核酸」が時に用いられる。この用語は、ＤＮＡに適用される場合、配列から分離したＤＮＡ分子を意味するが、その場合、該ＤＮＡ分子の起源となる生物の天然由来のゲノム内では、該ＤＮＡ分子は該配列と隣接する。例えば、「単離された核酸」は、ベクター、例えばプラスミド又はウイルスベクター等に挿入された、或いは原核細胞若しくは真核細胞又は宿主生物のゲノムＤＮＡに組み込まれたＤＮＡ分子を含み得る。ＲＮＡに適用される場合、用語「単離された核酸」は、上記で定義した単離されたＤＮＡ分子によりコードされるＲＮＡ分子を主に意味する。或いは、該用語は、天然の状態（すなわち、細胞又は組織内）ではその他の核酸と関連するＲＮＡ分子であるが、そのような核酸から十分に分離した該ＲＮＡ分子を意味し得る。「単離された核酸」（ＤＮＡ又はＲＮＡ）は、生物学的手段又は合成手段により直接生成し、そして生成期間中に存在するその他の成分から分離した分子を更に表す場合もある。
【０１９４】
ポリペプチド又はタンパク質、例えば単離された抗体等を参照する際に、用語「単離された」とは、化合物が本来関連する物質、例えば天然の環境、又は化合物が調製される場合（例えば、細胞培養）であって、そのような調製が組み換えＤＮＡ技術によりｉｎ  ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ  ｖｉｖｏで実施される場合、その環境において見出されるその他の化合物等を含まない、若しくは実質的に含まない該化合物を特に指すものとする。単離された化合物は、希釈剤、又はアジュバントと共に処方化され得るが、またなおも実用的な目的で単離され得る−例えば、ポリペプチド又はポリヌクレオチドは、診断又は治療で用いられる場合、薬学的に許容される担体又は賦形剤と混合され得る。
【０１９５】
用語「組み換え」とは、本明細書で用いる場合、「遺伝子工学により調製される、又は遺伝子工学の結果」を意味するものとする。或いは、「設計された」という用語が使用される。例えば、抗体又は抗体ドメインは、それぞれの親配列を設計して、修飾された抗体又はドメインを生成することによって変異体を生成するように設計され得る。組み換え宿主は、発現ベクター又はクローニングベクターを特に含む、又は組み換え核酸配列を含むように、特に宿主にとって外来のヌクレオチド配列を利用して遺伝子改変されている。組み換えタンパク質は、宿主内で各組み換え核酸を発現することにより産生される。用語「組み換え抗体」には、本明細書で用いる場合、組み換え手段により調製、発現、作製、又は単離される抗体、例えば（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子が遺伝子導入された若しくは染色体導入された動物（例えば、マウス）から単離された抗体、又はそれから調製されたハイブリドーマ、（ｂ）抗体を発現するように形質転換した宿主細胞から単離された、例えばトランスフェクトーマ由来の抗体、（ｃ）組み換え、コンビナトリアルヒト抗体ライブラリから単離された抗体、及び（ｄ）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列を、その他のＤＮＡ配列にスプライシングする工程と関係する任意のその他の手段により調製、発現、作製、又は単離される抗体等が含まれる。そのような組み換え抗体は、例えば抗体成熟期間中に生ずる再配列及び突然変異を含めるように改変された抗体を含む。
【０１９６】
所望の構造を有する抗体が識別されたら、そのような抗体は、例えばハイブリドーマ技法又は組み換えＤＮＡ技術を含む、当技術分野において周知の方法により生成可能である。
【０１９７】
ハイブリドーマ法では、マウス又はハムスター等のその他の適する宿主動物が、免疫化で用いられるタンパク質と特異的に結合する抗体を産生する、又は産生する能力を有するリンパ球を誘発するように免疫化される。或いは、リンパ球は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫化され得る。次に、適する融合剤、例えばポリエチレングリコール等を用いてリンパ球をミエローマ細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する。
【０１９８】
ハイブリドーマ細胞が増殖する培養培地は、抗原に対するモノクローナル抗体の産生について分析される。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降法により、又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイ法、例えばラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ）又は酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）等により測定される。
【０１９９】
組み換えモノクローナル抗体は、例えば、必要とされる抗体鎖をコードするＤＮＡを単離し、そして発現用のコーディング配列で組み換え宿主細胞をトランスフェクトすることにより、周知の組み換え発現ベクター、例えば本明細書に記載するＡＢＭ又は抗体をコードするヌクレオチド配列を含む発現カセット（複数可）を用いて生成可能である。組み換え宿主細胞は、原核細胞及び真核細胞、例えば上記の細胞等であり得る。
【０２００】
特定の態様によれば、ヌクレオチド配列は、抗体をヒト化する、又は抗体のアフィニティー若しくはその他の特徴を改善する遺伝子操作で利用可能である。例えば、抗体がヒトを対象とした臨床トライアル及び治療で用いられる場合には、定常領域は、ヒト定常領域とより密接に類似させて免疫反応を避けるように改変され得る。標的抗原に対するアフィニティーがより高まるように抗体配列を遺伝子操作するのが望ましいと考えられる。標的抗原に対する抗体の結合能力をなおも維持しつつ、抗体に１つ又は複数のポリヌクレオチドの変化を生じさせ得ることは、当業者にとって明白である。
【０２０１】
様々な手段による抗体分子の生成は、一般的によく理解されている。例えば、米国特許第６３３１４１５号（Ｃａｂｉｌｌｙら）は、抗体の組み換え生成の方法について記載するが、この場合、重鎖及び軽鎖は、単一のベクターから又は単一の細胞中の２つの別個のベクターから同時に発現される。Ｗｉｂｂｅｎｍｅｙｅｒら、（１９９９年、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ、第１４３０巻（２）：１９１〜２０２頁）、並びにＬｅｅ及びＫｗａｋ（２００３年、Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１０１巻：１８９〜１９８頁）は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の分離培養物中に発現したプラスミドを用いて個別に生成した重鎖及び軽鎖からのモノクローナル抗体の製造について記載する。抗体の生成に関連する様々なその他の技法が、例えばＨａｒｌｏｗら、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、（１９８８年）に提示されている。
【０２０２】
モノクローナル抗体は、培養物中の連続細胞系により抗体分子を生成する任意の方法を用いて生成される。モノクローナル抗体を調製するのに適する方法の例として、Ｋｏｈｌｅｒら（１９７５年、Ｎａｔｕｒｅ、第２５６巻：４９５〜４９７頁）のハイブリドーマ法、及びヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ、１９８４年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第１３３巻：３００１頁；及びＢｒｏｄｅｕｒら、１９８７、ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、５１〜６３頁）が挙げられる。
【０２０３】
本明細書に記載するＡＢＭ又は抗体は、治療を必要としている対象への治療投与において利用可能である。
【０２０４】
用語「対象」は、本明細書で用いる場合、温血哺乳動物、特にヒト又はヒト以外の動物を指すものとする。従って、用語「対象」は、特にイヌ、ネコ、ウサギ、ウマ、ウシ、ブタ、及び家禽を含む動物も指す場合がある。特に、本明細書に記載するＡＢＭ又は抗体は、疾患状態の予防又は治療を必要とする対象又は患者を治療するために、医学的用途で提供される。用語「患者」には、予防上又は治療上の処置を受けるヒト及びその他の哺乳動物対象が含まれる。用語「処置」は、従って、予防上の処置と治療上の処置の両方が含まれるように意図される。
【０２０５】
具体的には、本明細書に記載するＡＢＭ又は抗体は、実質的に純粋な形態で提供される。用語「実質的に純粋な」又は「精製された」とは、本明細書で用いる場合、少なくとも５０％（ｗ／ｗ）、好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％の化合物、例えば核酸分子又は抗体等を含む調製物を指すものとする。純度は、化合物に適する方法により測定される（例えば、クロマトグラフィー法、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、ＨＰＬＣ分析法等）。
【０２０６】
用語「治療有効量」は、化合物、例えば、本明細書に記載されるＡＢＭ又は抗体の「有効量」又は「十分な量」という用語のいずれかと本明細書において交換可能に使用され、対象に投与された場合に、臨床結果を含む有益な又は所望の結果に十分な量又は活性であり、そのため、有効量又はその同義語は、それが適用されている文脈に依存する。
【０２０７】
有効な量とは、そのような疾患又は障害を治療、予防、又は阻止するのに十分な化合物の量を意味するように意図されている。疾患という文脈において、本明細書に記載するＡＢＭ又は抗体の治療上有効な量は、抗体とその標的抗原の相互作用から利益を得る疾患又は状態を治療、調節、軽減する、逆転させる、又はそれに影響を及ぼすのに特に用いられる。
【０２０８】
そのような有効な量に対応する化合物の量は、様々な要因、例えば投与される薬物又は化合物、医薬製剤、投与経路、疾患又は障害の種類、治療される対象又は宿主の同一性等に応じて変化するものの、当業者によりルーチン的に決定可能である。
【０２０９】
本明細書に記載されるＡＢＭ又は抗体は、具体的には、医薬組成物に使用され得る。したがって、本明細書に記載されるＡＢＭ又は抗体、及び薬学的に許容される担体又は賦形剤、例えば、体液中の免疫グロブリンとともに天然には存在しないか、又は免疫グロブリンとともに天然に存在する人工担体又は賦形剤を含む医薬組成物が提供され、さらに、異なる量若しくは比率で担体又は賦形剤を含有する調製物中に提供される。
【０２１０】
本明細書に記載される医薬組成物は、ボーラス注射若しくは注入として、又は持続注入によって投与することができる。そのような投与手段を円滑にするのに適する医薬担体は、当技術分野において周知されている。
【０２１１】
薬学的に許容される担体として、本明細書に記載するＡＢＭ又は抗体と生理学的に適合するあらゆるすべての適する固体又は液体の物質、溶媒、分散媒、コーティング物、等張性吸収遅延剤等が一般的に挙げられる。薬学的に許容される担体の更なる例として、無菌の水、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等、並びにその任意の組み合わせが挙げられる。
【０２１２】
１つのそのような態様では、抗体は、所望の投与経路に適する１つ又は複数の担体と併用可能であり、抗体は、例えば、ラクトース、スクロース、スターチ、アルカノン酸、ステアリン酸のセルロースエステル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸及び硫酸のナトリウム塩及びカルシウム塩、アカシア、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン（polyvinylpyrrolidine）、ポリビニルアルコールのいずれかと混合され得るが、また任意選択的に、従来方式での投与用として更に錠剤化又はカプセル化される。或いは、免疫グロブリンは、生理食塩水、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、カルボキシメチルセルロースのコロイド溶液、エタノール、コーン油、ピーナッツ油、綿実油、ゴマ油、トラガカントガム、及び／又は様々なバッファーに溶解し得る。その他の担体、アジュバント、及び投与様式は、医薬品技術分野で周知されている。担体は、制御放出型材料又は時間遅延材料、例えばグリセリルモノステアレート若しくはグリセリルジステアレート等を単独で、又はワックス若しくは当技術分野において周知のその他の材料と共に含み得る。
【０２１３】
追加の薬学的に許容される担体は、当技術分野において公知であり、また例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳに記載されている。液状製剤は、液剤、乳剤又は懸濁剤であり得、また賦形剤、例えば懸濁剤、可溶化剤、界面活性剤、防腐剤、及びキレート剤等を含み得る。
【０２１４】
本発明の抗体、及び１つ又は複数の治療上活性な薬剤が処方化される場合、医薬組成物が検討される。所望の純度を有する上記抗体を任意選択的な薬学的に許容される担体、賦形剤、又は安定剤と混合することにより、安定な製剤が、凍結乾燥された製剤又は水溶液の形態で保存用に調製される。Ｉｎ  ｖｉｖｏ投与用として用いられる製剤は、特に無菌状態であり、好ましくは無菌の水溶液の形態である。これは、滅菌濾過メンブレンを通過する濾過又はその他の方法により容易に実現される。本明細書に開示の免疫グロブリン及びその他の治療上活性な薬剤は、イムノリポソームとしても処方化され得る、及び／又はマイクロカプセル中に捕捉され得る。
【０２１５】
本発明の抗体を含む医薬組成物の投与は、経口、皮下、静脈内、鼻腔内、耳内（intraotically）、経皮、粘膜、局所的、例えばゲル、軟膏、ローション、クリーム等、腹腔内、筋肉内、肺内、膣内、非経口、直腸、又は眼内を含む様々な方法において実施可能である。
【０２１６】
非経口投与で用いられる代表的な製剤として、皮下、筋肉内、又は静脈内注射に適する製剤、例えば無菌の液体、乳剤又は懸濁剤が挙げられる。
【０２１７】
本発明は、本明細書で提示する実施例に詳記するような代表的な抗体を特に提供する。例えば、分子の構造及び機能を改善するために、Ｆｃを更に改変する場合、又は異なるＣＤＲ結合部位を含む、若しくは異なる特異性を有する抗体を生成する場合、特に２つの異なるＦｖ領域を取得する場合、更なる抗体変異体が、例えば例示した免疫グロブリンの機能的変異体を含め可能性を有する。
【０２１８】
上記説明は、下記の実施例を参照しながらより十分に理解される。但し、そのような実施例は、本発明の１つ又は複数の実施形態を実践する方法を代表するに過ぎず、発明の範囲を制限するものと読み取るべきでない。
【実施例】
【０２１９】
実施例１：Ｂ１０ｖ５×ｈｕ２２５Ｍ  ＳＥＥＤ
ＩｇＧ構造を有する二重特異性抗体が記載される。Ｂ１０ｖ５−Ｆａｂはヒトｃ−ＭＥＴに結合し、一方、ｈｕ２２５Ｍ−ＦａｂはヒトＥＧＦＲ（上皮細胞増殖因子受容体）に結合する。ｈｕ２２５Ｍ軽鎖とｈｕ２２５Ｍ重鎖との間の界面は、二重特異性ＩｇＧの両方の軽鎖をそれらの同種の重鎖に指向させる突然変異を有する。抗体のＣＨ３ドメインは、重鎖のヘテロ二量体化を強化するためにＳＥＥＤドメイン（ＳＥＥＤ−ＡＧ又はＳＥＥＤ−ＧＡと呼ばれる、Ｄａｖｉｓら、２０１０年及び米国出願公開第２００７／０２８７１７０Ａ１号）によって置換される。ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ分析を用いて４つの鎖全ての正しい会合を確認する。以下では、この二重特異性ＩｇＧを説明するためにＢｘＭという用語を使用する。
【０２２０】
以下の全ての鎖は、哺乳動物系において発現させるためにベクターｐＴＴ５（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  Ｃａｎａｄａ）に別々にクローニングされた。
【０２２１】
ＳＥＥＤ−ＧＡを有するｈｕ２２５Ｍ重鎖をｈｕ２２５Ｍ＿ＨＣ＿ＧＡ（配列番号６）と命名した：
ＭＫＬＰＶＲＬＬＶＬＭＦＷＩＰＡＳＬＳＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＦＳＬＴＮＹＧＶＨＷＭＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳＲＶＴＩＴＳＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＡＬＴＹＹＤＹＥＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＰＳＥＥＬＡＬＮＥＬＶＴＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＬＱＧＳＱＥＬＰＲＥＫＹＬＴＷＡＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＩＬＲＶＡＡＥＤＷＫＫＧＤＴＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＤＲＳＰＧＫ
下線部：シグナルペプチドＭＫＬＰＶＲＬＬＶＬＭＦＷＩＰＡＳＬＳ（配列番号７）
【０２２２】
ｈｕ２２５Ｍ軽鎖をｈｕ２２５Ｍ＿ＬＣ（配列番号８）と命名した：
ＭＫＬＰＶＲＬＬＶＬＭＦＷＩＰＡＳＬＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＧＴＮＩＨＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＫＹＡＳＥＳＩＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＹＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＶＡＴＹＹＣＱＱＮＹＮＷＰＴＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
下線部：シグナルペプチドＭＫＬＰＶＲＬＬＶＬＭＦＷＩＰＡＳＬＳ（配列番号７）
【０２２３】
ＳＥＥＤ−ＡＧを有するＢ１０ｖ５重鎖をＢ１０ｖ５＿ＨＣ＿ＡＧ（配列番号９）と命名した：
ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＥＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＤＲＲＩＴＨＴＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＦＲＰＥＶＨＬＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＡＲＧＦＹＰＫＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＳＲＱＥＰＳＱＧＴＴＴＦＡＶＴＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＴＩＳＬＳＰＧＫ
下線部：シグナルペプチドＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ（配列番号１０）
【０２２４】
Ｂ１０ｖ５軽鎖をＢ１０ｖ５＿ＬＣ（配列番号１１）と命名した：
ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＥＰＶＬＴＱＰＰＳＶＳＶＡＰＧＥＴＡＴＩＰＣＧＧＤＳＬＧＳＫＩＶＨＷＹＱＱＲＰＧＱＡＰＬＬＶＶＹＤＤＡＡＲＰＳＧＩＰＥＲＦＳＧＳＫＳＧＴＴＡＴＬＴＩＳＳＶＥＡＧＤＥＡＤＹＦＣＱＶＹＤＹＨＳＤＶＥＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰＳＳＥＥＬＱＡＮＫＡＴＬＶＣＬＩＳＤＦＹＰＧＡＶＴＶＡＷＫＡＤＳＳＰＶＫＡＧＶＥＴＴＴＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳＹＬＳＬＴＰＥＱＷＫＳＨＫＳＹＳＣＱＶＴＨＥＧＳＴＶＥＫＴＶＡＰＴＥＣＳ
下線部：シグナルペプチドＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ（配列番号１０）
【０２２５】
ｈｕ２２５Ｍへの界面突然変異の導入
突然変異は、製造業者のプロトコルに従って、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅライトニング部位特異的突然変異誘発キット（＃２１０５１９、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた部位特異的突然変異誘発によって導入された。突然変異Ｋ２６Ｄは、ｈｕ２２５Ｍ＿ＨＣ＿ＡＧのＣＨ１に導入され、突然変異Ｔ１８Ｒは、ｈｕ２２５Ｍ＿ＬＣのＣＬに導入された。突然変異の導入の成功は、目的の遺伝子を配列決定することによって確認された。
【０２２６】
突然変異Ｋ２６Ｄを有するｈｕ２２５Ｍ重鎖をｈｕ２２５Ｍ＿ＨＣ＿ｒｅｓＱ２８＿ＧＡ（配列番号１２）と命名した：
ＭＫＬＰＶＲＬＬＶＬＭＦＷＩＰＡＳＬＳＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＦＳＬＴＮＹＧＶＨＷＭＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳＲＶＴＩＴＳＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＡＬＴＹＹＤＹＥＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＤＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＰＳＥＥＬＡＬＮＥＬＶＴＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＬＱＧＳＱＥＬＰＲＥＫＹＬＴＷＡＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＩＬＲＶＡＡＥＤＷＫＫＧＤＴＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＤＲＳＰＧＫ
下線部：シグナルペプチドＭＫＬＰＶＲＬＬＶＬＭＦＷＩＰＡＳＬＳ（配列番号７）
【０２２７】
突然変異Ｔ１８Ｒを有するｈｕ２２５Ｍ軽鎖をｈｕ２２５Ｍ＿ＬＣ＿ＭＢ４０（配列番号１３）と命名した：
ＭＫＬＰＶＲＬＬＶＬＭＦＷＩＰＡＳＬＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＧＴＮＩＨＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＫＹＡＳＥＳＩＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＹＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＶＡＴＹＹＣＱＱＮＹＮＷＰＴＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＲＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
下線部：シグナルペプチドＭＫＬＰＶＲＬＬＶＬＭＦＷＩＰＡＳＬＳ（配列番号７）
【０２２８】
Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞におけるＢｘＭ野生型及び突然変異ＢｘＭ  ＭａＢ４０の発現と精製
ＢｘＭは、製造業者のプロトコルに従って、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞及びＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３トランスフェクションキット（ｔｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ａ１４５２５）を用いて発現させた。２つの異なるトランスフェクションが設定された：
【０２２９】
【表３】
2020505929.tif 000004
【０２３０】
各鎖をコードするＤＮＡは４つの異なるプラスミド上にあった。トランスフェクション中のプラスミドのモル比は、２：１：１：１（Ｂ１０ｖ５重鎖：Ｂ１０ｖ５軽鎖：ｈｕ２２５Ｍ重鎖：ｈｕ２２５Ｍ軽鎖）であった。
【０２３１】
突然変異体ＢｘＭ  ＭａＢ４０は、ｈｕ２２５ＭのＣＨ１上に突然変異Ｋ２６Ｄ（ｈｕ２２５Ｍ＿ＨＣ＿ｒｅｓＱ２８＿ＧＡ、配列番号１２）及びｈｕ２２５ＭのＣＬ上にＴ１８Ｒ（ｈｕ２２５Ｍ＿ＬＣ＿ＭＢ４０、配列番号１３）を含有したが、ＢｘＭ野生型はいずれの突然変異をも含有していなかった。培養物を遠心分離し、目的のタンパク質を含有する上清を０．２２μｍフィルターで濾過し、製造業者の説明書に従ってＭｏｎｔａｇｅ抗体精製キット、及びＰＲＯＳＥＰ−Ａ  Ｍｅｄｉａ（Ｍｅｒｃｋ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＬＳＫ２ＡＢＡ２０）を備えたＳｐｉｎカラムを用いて精製した。精製されたＢｘＭ野生型及びＢｘＭ  ＭａＢ４０をＡｍｉｃｏｎ  ｕｌｔｒａ−１５、１０ｋＤａ  ＭＷＣＯを使用して濃縮し、次に、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｓｅｒ透析カセット０．５〜３ｍｌ、７，０００ＭＷＣＯ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、＃６６３７０）を使用してＰＢＳに対して透析した。合計で、ＢｘＭ野生型とＢｘＭ  ＭａＢ４０の両方は、独立して２回、発現、精製及び分析された。両方の繰り返しで同様の結果が得られた。
【０２３２】
鎖対形成を分析するためのＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ分析
ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳシステムで測定する前に、両方の試料のＮ−グリカンをＰＮＧａｓｅ  Ｆを用いて放出させた。可能性のある１０個全ての鎖対形成変異体の質量を計算し、それらの存在について質量スペクトルを分析した。４つの異なる鎖を含有するが、両方の軽鎖がそれらの非同種の重鎖に結合しているミスペアリング変異体（すなわち、交換された軽鎖を有するＢｘＭ）は、正しく会合されたＢｘＭと同じ質量を有し、したがって正しく対形成したＢｘＭと区別することできない。しかしながら、一方又は両方の軽鎖のそれらの非同種の重鎖へのミスペアリングを検出することができない場合、交換された軽鎖を有するＢｘＭの存在を統計的に排除することができる。同様に、両方の軽鎖のミスペアリングが少量（＜５％の相対存在量）でのみ検出される場合、上記ミスペアリング変異体はごく僅かな量（＜１％）でしか存在しない。
【０２３３】
試料のいずれにおいても重鎖ホモ二量体は検出されなかった（図１）。ＢｘＭ野生型では、両方の軽鎖がそれらの非同種の重鎖に類似した量で結合することができ（両方の場合で１２％の相対存在量）、正しく対形成したＢｘＭの７６％しか生じなかった（軽鎖が交換されたＢｘＭではカウントしていない）。ＢｘＭでは、ＭａＢ４０のミスペアリングは検出できず、正しく対形成した二重特異性ＩｇＧのみが検出された。
【０２３４】
結論として、界面突然変異の導入は、軽鎖と重鎖のミスペアリングの完全な消失をもたらした。
【０２３５】
【表４】
2020505929.tif 000005
【０２３６】
サイズ排除クロマトグラフィーＨＰＬＣ（ＨＰＬＣ−ＳＥＣ）
ＳＥＣを用いてＢｘＭ野生型及びＢｘＭ  ＭａＢ４０を分析した。両方のクロマトグラムは、ＩｇＧについて予想された１５．６分に主ピークを示した。凝集の徴候は、突然変異体ならびに野生型において検出可能であった（図２）。
【０２３７】
熱安定性を決定するための熱シフトアッセイ
リアルタイムＰＣＲシステムＳｔｅｐ  Ｏｎｅ  Ｐｌｕｓを用いてサーマルシフトアッセイを行った。ＢｘＭ野生型及びＢｘＭ  ＭａＢ４０の濃度はＰＢＳ中１μＭであり、２０×最終濃度の色素Ｓｙｐｒｏ  Ｏｒａｎｇｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。両方の試料を三重に測定した。ＢｘＭ野生型のサーモグラムは、６４．８℃及び７４．５℃で２つの変性事象を明らかにした。ＢｘＭ  ＭａＢ４０のサーモグラムは、６４．６℃及び７４．６℃で２つの変性事象を明らかにした。したがって、界面突然変異は、タンパク質の熱安定性を損なわない。
【０２３８】
その抗原に対するＢｘＭのアフィニティー
ＢｘＭ野生型及びＭａＢ４０のアフィニティーは、プロテインＡで被覆されたバイオセンサーを備えたＯｃｔｅｔシステムを用いて分析された。抗原として、ｃＭＥＴ及びＥＧＦＲの細胞外ドメインを用いた。アフィニティーを決定するために３つの異なる濃度の抗体を試験した。ｃＭＥＴに対するＢｘＭ  ｗｔのＫＤは０．３５ｎＭであり、ＥＧＦＲに対しては５．３ｎＭであった。ｃＭＥＴに対するＢｘＭ  ＭａＢ４０のＫＤは０．４２ｎＭであり、ＥＧＦＲに対しては２．９ｎＭであり、これは、界面突然変異が抗体のアフィニティーを損なわないことを裏付けている。
【０２３９】
両抗原の同時結合
ＢｘＭがその両方の抗原に同時に結合する能力は、ストレプトアビジン被覆したバイオセンサーを備えたＯｃｔｅｔ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて確認された。まず、バイオセンサーは、ビオチン化ｃＭＥＴを含有する溶液に浸された。クエンチング及び緩衝液交換の後、バイオセンサーは、ＢｘＭ野生型又はＢｘＭ  ＭａＢ４０のいずれかを含有する溶液に浸された。両方の場合において、抗体によるその第１の抗原への結合が検出された。その後、バイオセンサーは、ＥＧＦＲを含有する溶液に浸され、第２の抗原への結合を野生型及びＭａＢ４０について検出した。
【０２４０】
ＨＥＫ２９３−６Ｅの収量における界面突然変異の影響
ＢｘＭ野生型及びＢｘＭ  ＭａＢ４０は、標準的な技術に従って、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いた一過性トランスフェクションを使用するＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  Ｃａｎａｄａ）において発現された。発現されたＩｇＧをプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、ＰＢＳに対して透析した。両方のタンパク質試料の吸光度を２８０ｎｍで測定して濃度を決定した。合計で、両方のタンパク質を発現させ、精製し、独立して３回測定して、平均収量を計算した。ＢｘＭ野生型の収量は５７．３ｍｇ／Ｌ（±１３．７標準偏差）であり、ＢｘＭ  ＭａＢ４０の収量は５８．９ｍｇ／Ｌ（±７．３標準偏差）であり、これは、界面操作がタンパク質収量に有害な影響を及ぼさないことを実証している。
【０２４１】
実施例２：Ｂ１０ｖ５×ＯＫＴ３  ＳＥＥＤ
実施例１において記載したのと類似するＩｇＧ構造を有する二重特異性抗体が記載される。Ｂ１０ｖ５−Ｆａｂはヒトｃ−ＭＥＴに結合し、一方、ＯＫＴ３−ＦａｂはヒトＣＤ３に結合する。ＯＫＴ３軽鎖とＯＫＴ３重鎖の間の界面は、実施例１において記載したのと同じ突然変異を有する。さらに、重鎖に対する軽鎖の正しい対形成をさらに強化するために、Ｂ１０ｖ５−Ｆａｂにおける突然変異を導入した。上記のように、ＳＥＥＤ技術は、重鎖のヘテロ二量体化に適用された。ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ分析を使用して、４つ全ての鎖の正しい会合を確認した。以下では、この二重特異性ＩｇＧを説明するためにＢｘＯという用語を使用する。
【０２４２】
構築物のクローニング
Ｂ１０ｖ５重鎖（配列番号９）及び軽鎖（配列番号１１）は実施例１に記載されている。
【０２４３】
以下の全ての鎖は、哺乳動物系において発現させるためにベクターｐＴＴ５（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  Ｃａｎａｄａ）に別々にクローニングされた。
【０２４４】
ＯＫＴ３重鎖をＯＫＴ３＿ＨＣ＿ＧＡ（配列番号１４）と命名した：
ＭＫＬＰＶＲＬＬＶＬＭＦＷＩＰＡＳＬＳＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＮＱＫＶＫＤＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＡＦＬＱＭＤＳＬＲＰＥＤＴＧＶＹＦＣＡＲＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹＷＧＱＧＴＰＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＰＳＥＥＬＡＬＮＥＬＶＴＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＬＱＧＳＱＥＬＰＲＥＫＹＬＴＷＡＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＩＬＲＶＡＡＥＤＷＫＫＧＤＴＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＤＲＳＰＧＫ
下線部：シグナルペプチドＭＫＬＰＶＲＬＬＶＬＭＦＷＩＰＡＳＬＳ（配列番号７）
【０２４５】
ＯＫＴ３軽鎖をＯＫＴ３＿ＬＣ（配列番号１５）と命名した：
ＭＫＬＰＶＲＬＬＶＬＭＦＷＩＰＡＳＬＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＴＰＧＫＡＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＦＴＦＧＱＧＴＫＬＱＩＴＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
下線部：シグナルペプチドＭＫＬＰＶＲＬＬＶＬＭＦＷＩＰＡＳＬＳ（配列番号７）
【０２４６】
ＯＫＴ３及びＢ１０ｖ５への界面突然変異の導入
突然変異は、上記のように製造業者のプロトコルに従って、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅライトニング部位特異的突然変異誘発キット（＃２１０５１９、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた部位特異的突然変異誘発によって導入された。ＯＫＴ３では、ＣＨ１に突然変異Ｋ２６Ｄ、及びＣＬにＴ１８Ｒが導入された。Ｂ１０ｖ５では、ＣＨ１に突然変異Ａ２０Ｌ、及びＣＬにＦ７Ｓ、Ｆ７Ａ又はＦ７Ｖのいずれかが導入された。突然変異の導入の成功は、目的の遺伝子を配列決定することによって確認された。
【０２４７】
突然変異Ｋ２６Ｄを有するＯＫＴ３重鎖をＯＫＴ３＿ＨＣ＿ｒｅｓＱ２８＿ＧＡ（配列番号１６）と命名した：
ＭＫＬＰＶＲＬＬＶＬＭＦＷＩＰＡＳＬＳＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＮＱＫＶＫＤＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＡＦＬＱＭＤＳＬＲＰＥＤＴＧＶＹＦＣＡＲＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹＷＧＱＧＴＰＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＤＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＰＳＥＥＬＡＬＮＥＬＶＴＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＬＱＧＳＱＥＬＰＲＥＫＹＬＴＷＡＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＩＬＲＶＡＡＥＤＷＫＫＧＤＴＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＤＲＳＰＧＫ
下線部：シグナルペプチドＭＫＬＰＶＲＬＬＶＬＭＦＷＩＰＡＳＬＳ（配列番号７）
【０２４８】
突然変異Ｔ１８Ｒを有するＯＫＴ３軽鎖をＯＫＴ３＿ＬＣ＿ＭＢ４０（配列番号１７）と命名した：
ＭＫＬＰＶＲＬＬＶＬＭＦＷＩＰＡＳＬＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＴＰＧＫＡＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＦＴＦＧＱＧＴＫＬＱＩＴＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＲＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
下線部：シグナルペプチドＭＫＬＰＶＲＬＬＶＬＭＦＷＩＰＡＳＬＳ（配列番号７）
【０２４９】
突然変異Ａ２０Ｌを有するＢ１０ｖ５重鎖をＢ１０ｖ５＿ＨＣ＿ｒｅｓＱ２０３＿ＡＧ（配列番号１８）と命名した：
ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＥＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＤＲＲＩＴＨＴＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＬＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＦＲＰＥＶＨＬＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＡＲＧＦＹＰＫＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＳＲＱＥＰＳＱＧＴＴＴＦＡＶＴＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＴＩＳＬＳＰＧＫ
下線部：シグナルペプチドＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ（配列番号１０）
【０２５０】
突然変異Ｆ７Ｓを有するＢ１０ｖ５軽鎖をＢ１０ｖ５＿ＬＣ＿ＭＢ９（配列番号１９）と命名した：
ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＥＰＶＬＴＱＰＰＳＶＳＶＡＰＧＥＴＡＴＩＰＣＧＧＤＳＬＧＳＫＩＶＨＷＹＱＱＲＰＧＱＡＰＬＬＶＶＹＤＤＡＡＲＰＳＧＩＰＥＲＦＳＧＳＫＳＧＴＴＡＴＬＴＩＳＳＶＥＡＧＤＥＡＤＹＦＣＱＶＹＤＹＨＳＤＶＥＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＳＰＰＳＳＥＥＬＱＡＮＫＡＴＬＶＣＬＩＳＤＦＹＰＧＡＶＴＶＡＷＫＡＤＳＳＰＶＫＡＧＶＥＴＴＴＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳＹＬＳＬＴＰＥＱＷＫＳＨＫＳＹＳＣＱＶＴＨＥＧＳＴＶＥＫＴＶＡＰＴＥＣＳ
下線部：シグナルペプチドＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ（配列番号１０）
【０２５１】
突然変異Ｆ７Ａを有するＢ１０ｖ５軽鎖をＢ１０ｖ５＿ＬＣ＿ＭＢ２１（配列番号２０）と命名した：
ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＥＰＶＬＴＱＰＰＳＶＳＶＡＰＧＥＴＡＴＩＰＣＧＧＤＳＬＧＳＫＩＶＨＷＹＱＱＲＰＧＱＡＰＬＬＶＶＹＤＤＡＡＲＰＳＧＩＰＥＲＦＳＧＳＫＳＧＴＴＡＴＬＴＩＳＳＶＥＡＧＤＥＡＤＹＦＣＱＶＹＤＹＨＳＤＶＥＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＡＰＰＳＳＥＥＬＱＡＮＫＡＴＬＶＣＬＩＳＤＦＹＰＧＡＶＴＶＡＷＫＡＤＳＳＰＶＫＡＧＶＥＴＴＴＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳＹＬＳＬＴＰＥＱＷＫＳＨＫＳＹＳＣＱＶＴＨＥＧＳＴＶＥＫＴＶＡＰＴＥＣＳ
下線部：シグナルペプチドＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ（配列番号１０）
【０２５２】
突然変異Ｆ７Ｖを有するＢ１０ｖ５軽鎖をＢ１０ｖ５＿ＬＣ＿ＭＢ４５（配列番号２１）と命名した：
ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＥＰＶＬＴＱＰＰＳＶＳＶＡＰＧＥＴＡＴＩＰＣＧＧＤＳＬＧＳＫＩＶＨＷＹＱＱＲＰＧＱＡＰＬＬＶＶＹＤＤＡＡＲＰＳＧＩＰＥＲＦＳＧＳＫＳＧＴＴＡＴＬＴＩＳＳＶＥＡＧＤＥＡＤＹＦＣＱＶＹＤＹＨＳＤＶＥＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＶＰＰＳＳＥＥＬＱＡＮＫＡＴＬＶＣＬＩＳＤＦＹＰＧＡＶＴＶＡＷＫＡＤＳＳＰＶＫＡＧＶＥＴＴＴＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳＹＬＳＬＴＰＥＱＷＫＳＨＫＳＹＳＣＱＶＴＨＥＧＳＴＶＥＫＴＶＡＰＴＥＣＳ
下線部：シグナルペプチドＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ（配列番号１０）
【０２５３】
ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞におけるＢｘＯ野生型、ならびに突然変異体ＢｘＯ  ＭａＢ４０、ＢｘＯ  ＭａＢ５／４０、ＢｘＯ  ＭａＢ２１／４０及びＢｘＯ  ＭａＢ４５／４０の発現及び精製
二重特異性抗体は、標準的な技術に従って、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いた一過性トランスフェクションを使用するＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞において発現された。４つの異なるトランスフェクションが設定された：
【０２５４】
【表５】
2020505929.tif 000006
【０２５５】
各鎖をコードするＤＮＡは４つの異なるプラスミド上にあった。トランスフェクション中のプラスミドのモル比は、２：１：１：１（Ｂ１０ｖ５重鎖：Ｂ１０ｖ５軽鎖：ＯＫＴ３重鎖：ＯＫＴ３軽鎖）であった。培養物をトランスフェクションの５日後に遠心分離により回収し、上清をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。全ての試料をＰＢＳに対して透析した。
【０２５６】
鎖対形成を分析するためのＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ分析
測定前に両方の試料のＮ−グリカンをＰＮＧａｓｅ  Ｆを用いて放出させた。実施例１に記載したように分析を実施した。界面突然変異の導入は、重鎖に対する軽鎖の検出可能なミスペアリングにおいて顕著な減少をもたらした（図３）。
【０２５７】
【表６−１】
2020505929.tif 000007
【０２５８】
【表６−２】
2020505929.tif 000008
【０２５９】
サイズ排除クロマトグラフィーＨＰＬＣ（ＨＰＬＣ−ＳＥＣ）
ＳＥＣを用いてＢｘＯ野生型、ＢｘＯ  ＭａＢ５／４０及びＢＸＯ  ＭａＢ４５／４０を分析した。全てのクロマトグラムは、ＩｇＧについて予想された１５．５分に主ピークを示した（図４）。凝集の兆候は、突然変異体ならびに野生型において類似した量で検出可能であった。
【０２６０】
検討
実施例１は、ｈｕ２２５Ｍ  Ｆａｂにおいて突然変異を有するか又は有しない、ＢｘＭと呼ばれる、ＩｇＧ構造を有する二重特異性抗体の産生を記載する。ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳによるＢｘＭ野生型の分析は、軽鎖のそれらの同種の重鎖に対する正しい対形成を強化するためのいずれの操作もなしに、二重特異性ＩｇＧを産生する課題を実証する。両方の軽鎖は、それらの非同種の重鎖に、合わせて２４％の量で結合することができ、これは、次に精製タンパク質試料の７６％のみが正しく対形成した二重特異性ＩｇＧであったことを意味する。
【０２６１】
突然変異体ＢｘＭ  ＭａＢ４０を作製するために、両方ともｈｕ２２５Ｍ  Ｆａｂにおける２つの点突然変異であるＣＨ１のＫ２６Ｄ及びＣＬのＴ１８Ｒのみが導入された。これらの突然変異は、誤った軽鎖−重鎖の対形成を完全に阻害するのに十分であった。以前の報告（Ｌｅｗｉｓら、２０１４年、Ｌｉｕら、２０１５年）とは対照的に、可変ドメインの操作は必要ではなかった。したがって、本発明の突然変異は、他の様々な二重特異性抗体に広く適用できる可能性がある。さらに、可変ドメインにおけるいずれの突然変異をも除外することは、その抗原に対する抗体のアフィニティーに影響を及ぼす危険性を制限する。
【０２６２】
さらなる調査は、ＢｘＭ  ＭａＢ４０に導入された突然変異が、熱安定性ならびにタンパク質収量に有害な影響を及ぼさないことを明らかにした。さらに、ＢｘＭ  ＭａＢ４０は、その両方の抗原に対して、ＢｘＭ野生型のそれと類似したアフィニティーを有し、バイオレイヤー干渉法によって実証されるように、両方の抗原に同時に結合することができた。サイズ排除クロマトグラフィーは、ＢｘＭ  ＭａＢ４０とＢｘＭ野生型の間に相違がないことを明らかにし、これは、突然変異が抗体の凝集又は分解の増加をもたらさないことを証明する。
【０２６３】
同定された突然変異が一般的な用途のものであるかどうかを評価するために、実施例２に示すように異なる二重特異性抗体ＢｘＯを構築した。実施例１と同様に、突然変異を有しないＢｘＯ（野生型）は、ＯＫＴ３  ＦａｂのＣＨ１における突然変異Ｋ２６Ｄ及びＣＬにおける突然変異Ｔ１８Ｒを有するＢｘＯ（ＢｘＯ  ＭａＢ４０と呼ばれる）と比較された。ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳによるＢｘＯ野生型の分析は、それらの非同種の重鎖に対する軽鎖のミスペアリングが、ＢｘＭ野生型において検出されたミスペアリングよりも優勢であることを明らかにした。全体で、検出された４０％を超えるＩｇＧがＦａｂにおいてミスペアリングを示し、６０％未満の正しく対形成したＢｘＯをもたらした。ＢｘＯ  ＭａＢ４０の分析は、前述の突然変異の導入がまた軽鎖の対形成挙動にかなりの効果を有することを示した。ＢｘＯ  ＭａＢ４０における検出された７４％のＩｇＧが正しく対形成していた。鎖の正しい会合をさらに強化するために、支持的な突然変異をＢｘＯの他のＦａｂ、すなわちＢ１０ｖ５  Ｆａｂに導入し、ＢｘＯ  ＭａＢ  ５／４０、ＢｘＯ  ＭａＢ２１／４０及びＢｘＯ  ＭａＢ４５／４０の作製をもたらした。支持的な突然変異を含有する３つの突然変異体全てにおいて、正しく対形成した二重特異性ＩｇＧの量は非常に改善された（ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳにおける＞９０％の相対量）。
【０２６４】
サイズ排除クロマトグラフィーによるＢｘＯ野生型、ＢｘＯ  ＭａＢ５／４０及びＢＸＯ  ＭａＢ４５／４０の分析は、本突然変異が凝集又は分解に関して抗体に有害な影響を及ぼさないことを実証した。
【０２６５】
実施例３：ＣＨ１とＣＬの間の境界における位置でのアミノ酸側鎖の表面露出
ＧＥＴＡＲＥＡプログラム（Ｆｒａｃｚｋｉｅｗｉｃｚら、１９９８年、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．、第１９巻、３１９〜３３３頁）を用いて、タンパク質の溶媒接触可能表面積又は溶媒和エネルギーを計算した。野生型ＣＨ１及びＣＬドメインを有するヒト免疫不全ウイルス１型のｇｐ４１に対するヒトモノクローナル抗体ＦａｂフラグメントであるヒトＩｇＧ１  Ｆａｂフラグメント１ＤＦＢ．ｐｄｂの原子座標（Ｈｅら、１９９２年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８９巻：７１５４〜７１５８頁）、インプットとしてプログラムに供給された。１．４オングストロームのプローブ半径が適用された。ＣＨ１ドメインの残基ＡＬＡ２０及びＬＹＳ２６、ならびにＣＬドメインのＰＨＥ７及びＴＨＲ１８についてのプログラムのアウトプットを以下の表Ｉに示す。
【０２６６】
主鎖及び側鎖原子からの寄与は、それぞれ４列目及び５列目に列挙されている。次のカラムは、残基あたりの「ランダムコイル」値に対する側鎖表面積の比を列挙する。残基Ｘの「ランダムコイル」値は、３０個のランダム立体配座の集合におけるトリペプチドＧｌｙ−Ｘ−ＧｌｙにおけるＸの平均溶媒接近可能表面積である。比率の値が５０％を超える場合は、残基は溶媒に曝露されていると見なされ、比率が２０％未満の場合は埋もれ、比率が少なくとも２０％である場合は埋もれない。２０個のアミノ酸についての「ランダムコイル」値を以下の表ＩＩに列挙する。
【０２６７】
【表７】
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【０２６８】
【表８】
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【０２６９】
上記の表Ｉに示される結果から、４つの残基のうち３つが埋もれ（比率（％）値が５％未満）、一方、ＣＬドメインの残基ＴＨＲ１８は比率（％）値が３８．３であり、したがって、埋もれていないことが理解される。
【０２７０】
ＣＨ／ＣＨ１界面内に埋もれていないＣＬドメインの突然変異位置ＴＨＲ１８がＣＬ／ＣＨ１ドメインの対形成の改善をもたらすことを見出したことは驚くべきことであった。本明細書にさらに記載されるように、改善された対形成は、ＣＬドメインをＣＨ１ドメインと対形成させる場合に特に見出され、ＣＬドメインの１８位のアミノ酸残基は、ＣＨ１ドメインの２６位のアミノ酸残基と反対の極性を有する。
【０２７１】
従来技術の工学的アプローチは、反対の極性を有する荷電残基によって置換されるべき重鎖及び軽鎖の界面に沿った残基対を選択するための特定の基準を適用したため、これはより驚くべきことであった。先行技術によるこのような基準（例えば、Ｌｉｕら、Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０１５年、第２９０巻：７５３５〜７５６２頁；及び国際公開第２０１４／０８１９５５Ａ１号）によれば、全ての位置が埋もれることが不可欠であると考えられた。
【０２７２】
したがって、ＣＬドメインの１８位は、この先行技術の規則の例外であり、ＣＨ１とＣＬの間の界面内に埋もれていないにもかかわらず、驚くべきことにＣＬ／ＣＨ１ドメイン対の安定性に寄与する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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