(57)【要約】  変更および改善されたＰＡＭ特異性を有する遺伝子操作されたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、ならびにゲノム工学、エピゲノム工学およびゲノム標的化におけるそれらの使用。【選択図】図１
2020532967.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の位置：Ｄ１１３５、Ｓ１１３６、Ｇ１２１８、Ｅ１２１９、Ｒ１３３５および／もしくはＴ１３３７の３つ、４つ、５つまたは６つすべてで変異を有する、単離された化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）タンパク質であって、前記変異が、ＶＳＲＥＥＲまたはＶＳＲＥＱＲではない、タンパク質。
【請求項２】
配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である配列を含む、請求項１に記載の単離されたタンパク質。
【請求項３】
表Ａ、１、２または３に示される変異のセットを含む、請求項１に記載の単離されたタンパク質。
【請求項４】
以下の変異のセット：
ＬＲＳＶＱＬ、ＬＲＫＩＱＫ、ＬＲＳＶＱＫ、ＬＷＫＩＱＫ、ＶＲＫＩＱＫ、ＬＷＫＩＱＫ、ＩＲＡＶＱＬ、ＶＲＫＬＲＳ、ＧＲＫＩＱＫ、ＳＷＲＶＶＶ、ＳＷＫＶＬＫ、ＴＡＨＦＫＶ、ＭＳＧＶＫＣ、ＬＲＳＶＲＳ、ＳＫＴＬＲＰ、ＭＷＶＨＬＮ、ＴＷＳＭＲＧ、ＫＲＲＣＫＶ、ＶＲＡＶＱＬ、ＶＳＳＶＲＳ、ＶＲＳＶＲＳ、ＳＲＭＨＣＫ、ＧＷＫＬＬＲ、ＧＷＫＯＱＫ、ＶＡＫＬＬＲ、ＶＡＫＩＱＫ、ＶＡＫＩＬＲ、ＧＲＫＩＬＲ、ＶＲＫＬＬＲ、ＩＲＡＶＱＬ、ＶＲＫＩＱＫ、またはＶＲＭＨＣＫバリアント（例えば、ＮＧＴＮ  ＰＡＭについて）；ＭＱＫＳＥＲ、ＶＲＫＳＥＲ、ＩＣＫＳＥＲ、ＬＲＳＶＥＲ、ＬＷＬＥＴＲ、ＬＳＲＷＥＲ、ＭＱＳＶＱＬ、ＶＲＲＥＥＲ、ＩＣＣＣＥＲ、ＬＳＲＷＱＲ、ＬＷＲＶＶＡ、ＷＭＱＡＹＧ、ＬＷＲＳＥＹ、ＳＱＳＷＲＳ、ＬＫＡＷＲＳ、ＬＷＧＷＱＨ、ＭＣＳＦＥＲ、ＬＷＭＲＥＱ、ＬＷＲＶＶＡ、ＨＳＳＷＶＲ、ＭＷＳＥＰＴ、ＧＳＮＹＱＳ、ＦＭＱＷＶＮ、ＹＣＳＷＶＧ、ＭＣＡＷＣＧ、ＦＭＱＷＶＲ、またはＳＳＫＷＰＡバリアント（例えば、ＮＧＣＮ  ＰＡＭについて）；ＬＲＳＶＲＳ、ＳＲＱＭＲＧ、ＭＲＡＲＫＥ、ＳＲＭＨＣＫ、ＶＲＲＥＱＲ、ＶＲＧＥＱＲ、ＬＲＬＳＡＲ、ＡＷＴＥＶＴＲ、ＫＷＭＭＣＧ、ＶＲＧＡＫＥ、ＡＷＮＦＱＶ、ＬＷＴＴＬＮ、ＳＲＭＨＣＫ、ＣＷＣＱＣＶ、ＡＥＥＱＱＲ、ＧＷＥＫＶＲ、ＮＲＡＶＮＧ、ＬＲＳＹＬＨ、ＶＲＧＮＮＲ、ＶＱＤＡＱＲ、ＧＷＲＱＳＫ、ＡＷＬＣＬＳ、ＫＷＡＲＶＶ、ＭＷＡＡＲＰ、ＳＲＭＨＣＫ、ＶＫＭＡＫＧ、ＱＲＫＴＲＥ、ＬＣＲＱＱＲ、ＣＷＳＨＱＲ、ＳＲＴＨＴＱ、ＬＷＥＶＩＲ、ＶＳＳＶＲＳ、ＶＲＳＶＲＳ、ＩＲＡＶＲＳ、ＳＲＳＶＲＳ、ＬＷＫＩＱＫ、またはＶＲＭＨＣＫバリアント（例えば、ＮＧＡＮ  ＰＡＭについて）
を含む、請求項１〜３に記載の単離されたタンパク質。
【請求項５】
Ｄ１０、Ｅ７６２、Ｄ８３９、Ｈ９８３またはＤ９８６；およびＨ８４０またはＮ８６３での変異からなる群から選択されるヌクレアーゼ活性を減少させる１つまたは複数の変異をさらに含む、請求項１に記載の単離されたタンパク質。
【請求項６】
前記変異が、
（ｉ）Ｄ１０ＡまたはＤ１０Ｎ、および
（ｉｉ）Ｈ８４０Ａ、Ｈ８４０ＮまたはＨ８４０Ｙ
である、請求項５に記載の単離されたタンパク質。
【請求項７】
Ｎ４９７、Ｒ６６１、Ｎ６９２、Ｍ６９４、Ｑ６９５、Ｈ６９８、Ｋ８１０、Ｋ８４８、Ｑ９２６、Ｋ１００３およびＲ０１６０での変異、ならびに任意選択でＫ５２６および／またはＲ６９１での変異からなる群から選択される特異性を増加させる１つまたは複数の変異をさらに含む、請求項１に記載の単離されたタンパク質。
【請求項８】
Ｎ６９２Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｈ６９８Ａ、Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｍ６９４Ａ、Ｋ８１０Ａ、Ｋ８４８Ａ、Ｋ１００３Ａ、Ｒ０１６０Ａ、Ｙ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ、Ｌ１６９Ａ／Ｑ６９５Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｙ４５０Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｌ１６９Ａ／Ｙ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ、Ｌ１６９Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｙ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｎ４９７Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｙ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｙ４５０Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｌ１６９Ａ／Ｙ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｌ１６９Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｙ４５０Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｎ４９７Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、およびＹ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅ；Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ、Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｈ６９８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｈ６９８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｈ６９８Ａ；Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ；Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｇ５８２Ａ／Ｖ５８３Ａ／Ｅ５８４Ａ／Ｄ５８５Ａ／Ｎ５８８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｇ５８２Ａ／Ｖ５８３Ａ／Ｅ５８４Ａ／Ｄ５８５Ａ／Ｎ５８８Ａ；Ｔ６５７Ａ／Ｇ６５８Ａ／Ｗ６５９Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｔ６５７Ａ／Ｇ６５８Ａ／Ｗ６５９Ａ／Ｒ６６１Ａ；Ｆ４９１Ａ／Ｍ４９５Ａ／Ｔ４９６Ａ／Ｎ４９７Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｆ４９１Ａ／Ｍ４９５Ａ／Ｔ４９６Ａ／Ｎ４９７Ａ；Ｋ９１８Ａ／Ｖ９２２Ａ／Ｒ９２５Ａ／Ｑ９２６Ａ；または９１８Ａ／Ｖ９２２Ａ／Ｒ９２５Ａ；Ｋ８５５Ａ；Ｋ８１０Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ；またはＫ８４８Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ、および任意選択でＫ５２６Ａおよび／またはＲ６９１Ａの変異を含む、請求項７に記載の単離されたタンパク質。
【請求項９】
任意の介在リンカーで異種性機能ドメインと融合された請求項１〜８に記載の単離されたタンパク質を含む融合タンパク質であって、前記リンカーが、前記融合タンパク質の活性を妨げない、融合タンパク質。
【請求項１０】
前記異種性機能ドメインが、転写活性化ドメインである、請求項９に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
前記転写活性化ドメインが、ＶＰ１６、ＶＰ６４、ｒＴＡ、ＮＦ−κＢ  ｐ６５または複合性ＶＰＲ（ＶＰ６４−ｐ６５−ｒＴＡ）からのものである、請求項９に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
前記異種性機能ドメインが、転写サイレンサーまたは転写抑制ドメインである、請求項９に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
前記転写抑制ドメインが、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメイン、ＥＲＦリプレッサードメイン（ＥＲＤ）またはｍＳｉｎ３Ａ相互作用ドメイン（ＳＩＤ）である、請求項１２に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
前記転写サイレンサーが、ヘテロクロマチンタンパク質１（ＨＰ１）である、請求項１２に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
前記異種性機能ドメインが、ＤＮＡのメチル化状態を改変する酵素である、請求項１２に記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
ＤＮＡのメチル化状態を改変する前記酵素が、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）またはＴＥＴタンパク質である、請求項１５に記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
前記ＴＥＴタンパク質が、ＴＥＴ１である、請求項１６に記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
前記異種性機能ドメインが、ヒストンサブユニットを改変する酵素である、請求項９に記載の融合タンパク質。
【請求項１９】
ヒストンサブユニットを改変する前記酵素が、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）またはヒストンデメチラーゼである、請求項１８に記載の融合タンパク質。
【請求項２０】
前記異種性機能ドメインが、塩基エディターである、請求項９に記載の融合タンパク質。
【請求項２１】
前記塩基エディターが、（ｉ）シチジンデアミナーゼドメイン、好ましくは、アポリポタンパク質Ｂ  ｍＲＮＡ編集酵素、デアミナーゼの触媒ポリペプチド様（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリー、任意選択で、ＡＰＯＢＥＣ１、ＡＰＯＢＥＣ２、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ／Ｅ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＰＯＢＥＣ３ＨもしくはＡＰＯＢＥＣ４；活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）、任意選択で、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＣＤＡ）；シトシンデアミナーゼ１（ＣＤＡ１）もしくはＣＤＡ２；またはｔＲＮＡに作用するシトシンデアミナーゼ（ＣＤＡＴ）からなる群から選択されるシチジンデアミナーゼドメイン、あるいは（ｉｉ）アデノシンデアミナーゼ、好ましくは、アデノシンデアミナーゼ１（ＡＤＡ１）、ＡＤＡ２；ＲＮＡ１に作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ１）、ＡＤＡＲ２、ＡＤＡＲ３；ｔＲＮＡ１に作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＴ１）、ＡＤＡＴ２、ＡＤＡＴ３；および天然に存在するまたは遺伝子操作されたｔＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ＴａｄＡ）からなる群から選択されるアデノシンデアミナーゼである、請求項２０に記載の融合タンパク質。
【請求項２２】
前記異種性機能ドメインが、生物学的テザーである、請求項９に記載の融合タンパク質。
【請求項２３】
前記生物学的テザーが、ＭＳ２、Ｃｓｙ４またはラムダＮタンパク質である、請求項２２に記載の融合タンパク質。
【請求項２４】
前記異種性機能ドメインが、ＦｏｋＩである、請求項９に記載の融合タンパク質。
【請求項２５】
請求項１〜２４に記載のタンパク質をコードする単離された核酸。
【請求項２６】
請求項２５に記載の単離された核酸を含むベクター。
【請求項２７】
請求項２５に記載の単離された核酸が、以下の位置：Ｄ１１３５、Ｓ１１３６、Ｇ１２１８、Ｅ１２１９、Ｒ１３３５および／もしくはＴ１３３７の１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つすべてで変異を有する、単離された化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）タンパク質を発現するための１つまたは複数の制御ドメインに作動可能に連結された、請求項２４に記載のベクター。
【請求項２８】
請求項２５に記載の核酸を含み、および任意選択で、請求項１〜２４に記載のタンパク質を発現する宿主細胞、好ましくは、哺乳動物宿主細胞。
【請求項２９】
細胞のゲノムを変更する方法であって、請求項１〜２４に記載の単離されたタンパク質もしくは融合タンパク質、および前記細胞の前記ゲノムの選択された部分に相補的な領域を有するガイドＲＮＡを、前記細胞で発現させること、または前記細胞をこれらと接触させることを含む方法。
【請求項３０】
前記単離されたタンパク質または融合タンパク質が、核局在化配列、細胞透過性ペプチド配列および／もしくはアフィニティタグの１つまたは複数を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記細胞が、幹細胞である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記細胞が、胚性幹細胞、間葉系幹細胞もしくは人工多能性幹細胞であるか、生きている動物における細胞であるか、または胚における細胞である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）分子を変更する方法であって、前記ｄｓＤＮＡ分子を、請求項１〜２４に記載の単離されたタンパク質もしくは融合タンパク質、および前記ｄｓＤＮＡ分子の選択された部分に相補的な領域を有するガイドＲＮＡと接触させることを含む方法。
【請求項３４】
前記ｄｓＤＮＡ分子が、インビトロにある、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記融合タンパク質およびＲＮＡが、リボヌクレオタンパク質複合体にある、請求項３３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
本出願は、２０１７年８月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／５４９，３０３号、および２０１８年３月１２日に出願された同第６２／６４１，６８７号の利益を主張する。前述の全内容は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府による支援を受けた研究または開発
本発明は、米国国立衛生研究所によって付与された、助成金番号ＧＭ１０５３７８、ＧＭ１０７４２７、ＧＭ１１８１５８およびＧＭ０８８０４０の政府支援により行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
技術分野
本発明は、少なくとも一部は、変更および改善されたプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）特異性を有する遺伝子操作されたクラスター化した規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）、ならびにゲノム工学、エピゲノム工学およびゲノム標的化におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、多種多様な生物体および細胞の種類において、効率が良く、カスタマイズ可能なゲノム編集を可能にする（Sander & Joung, Nat Biotechnol 32, 347-355 (2014)；Hsuet al., Cell 157, 1262-1278 (2014); Doudna & Charpentier, Science 346, 1258096 (2014)；Barrangou & May, Expert Opin Biol Ther 15, 311-314 (2015)）。Ｃａｓ９による標的部位認識は、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡとして公知の２つの短いＲＮＡによって導かれ（Deltcheva et al., Nature 471, 602-607 (2011)；Jinek et al., Science 337, 816-821 (2012)）、これらは融合してキメラ単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）とすることができる（Jinek et al., Science 337, 816-821 (2012)；Jinek et al., Elife 2, e00471 (2013); Mali et al., Science 339, 823-826 (2013)；Cong et al., Science 339, 819-823 (2013)）。ｓｇＲＮＡ（ｃｒＲＮＡに由来する）の５’末端は、標的ＤＮＡ部位と塩基対形成することができ、それによって、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ複合体による部位特異的切断の直接リプログラミングを可能にする（Jinek et al., Science 337, 816-821 (2012)）。しかしながら、Ｃａｓ９は、ｓｇＲＮＡと塩基対形成するＤＮＡの近位にある特異的プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）も認識しなければならず（Mojica et al., Microbiology 155, 733-740 (2009)；Shah et al., RNA Biol 10, 891-899 (2013)；Jinek et al., Science 337, 816-821 (2012)；Sapranauskas et al, Nucleic Acids Res 39, 9275-9282 (2011)；Horvath et al., J Bacteriol 190, 1401-1412 (2008)）、この要件は、配列特異的な認識を開始するために必要であるが（Sternberg et al., Nature 507, 62-67 (2014)）、これはまた、ゲノム編集のためにこれらのヌクレアーゼの標的化範囲を制限し得る。幅広く使用される化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）は、短いＮＧＧ  ＰＡＭを認識し（Jinek et al., Science 337, 816-821 (2012); Jiang et al., Nat Biotechnol 31, 233-239 (2013)）、これは、ランダムなＤＮＡ配列の８ｂｐごとに１回生じる。一方、これまでに特徴付けられた他のＣａｓ９オルソログは、より長いＰＡＭを認識することができる（Horvath et al., J Bacteriol 190, 1401-1412 (2008)；Fonfara et al., Nucleic Acids Res 42, 2577-2590 (2014)；Esvelt et al., Nat Methods 10, 1116-1121 (2013)；Ran et al., Nature 520, 186-191 (2015)；Zhang et al., Mol Cell 50, 488-503 (2013)）。例えば、ウイルス送達のためにより適切ないくつかのより小さなＣａｓ９オルソログの１つである黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）は（Horvath et al., J Bacteriol 190, 1401-1412 (2008)；Ran et al., Nature 520, 186-191 (2015)；Zhang et al., Mol Cell 50, 488-503 (2013)）、ランダムなＤＮＡの３２ｂｐごとに１回生じると予想されるより長いＮＮＧＲＲＴ  ＰＡＭを認識する。Ｃａｓ９オルソログの標的化範囲の広幅化は、小さな遺伝要素（例えば、転写因子結合部位（Canver et al. Nature. 527(7577):192-7 (2015)；Vierstra et al., Nat Methods. 12(10):927-30 (2015)）の改変、またはＰＡＭ内に配列の相違を位置させることによるアレル特異的変更を行うこと（Courtney, D.G. et al. Gene Ther. 23(1):108-12 (2015)）を含むさまざまな適用のために重要である。本発明者らは、以前に、ＮＧＡおよびＮＧＣＧ  ＰＡＭ配列により部位を認識することができるＳｐＣａｓ９のバリアントを遺伝子操作により作製したが（Kleinstiver et al, Nature 2015；国際公開第２０１６／１４１２２４号パンフレット）、それにもかかわらず多くの代替のＰＡＭ配列は標的化できないままである。
【発明の概要】
【０００５】
本明細書に記載されるように、一般に使用される化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）を、構造情報、細菌選択に基づく指向進化およびコンビナトリアル設計を使用して、新規なＰＡＭ配列を認識するように遺伝子操作した。これらの変更されたＰＡＭ特異性バリアントは、野生型ＳｐＣａｓ９によって効率よく標的化することができないヒト細胞中のレポーター部位および内在性遺伝子部位の安定した編集を可能にする。本知見は、本明細書において「バリアント」または「本バリアント」と総称される、幅広く有用なＳｐＣａｓ９バリアントを提供する。
【０００６】
第１の態様において、本発明は、以下の位置：Ｄ１１３５、Ｓ１１３６、Ｇ１２１８、Ｅ１２１９、Ｒ１３３５および／もしくはＴ１３３７の３つ、４つ、５つまたは６つすべてで、例えば、Ｄ１１３５、Ｓ１１３６、Ｇ１２１８、Ｅ１２１９、Ｒ１３３５および／もしくはＴ１３３７（Ｄ１１３５Ｘ／Ｓ１１３６Ｘ／Ｇ１２１８Ｘ／Ｅ１２１９Ｘ／Ｒ１３３５Ｘ／Ｔ１３３７Ｘ、ここで、Ｘは、任意のアミノ酸である）の２つ、３つ、４つ、５つまたはすべてで、変異を有し、例えば、示された変異を有する配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、９０％または９５％同一である配列を含む、単離された化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）タンパク質を提供する。いくつかの実施形態において、バリアントＳｐＣａｓ９タンパク質は、表Ａ、１、２または３に示される変異のセット、例えば、以下の変異のセットの１つ：ＬＲＳＶＱＬ、ＬＲＫＩＱＫ、ＬＲＳＶＱＫ、ＬＷＫＩＱＫ、ＶＲＫＩＱＫ、ＬＷＫＩＱＫ、ＩＲＡＶＱＬ、ＶＲＫＬＲＳ、ＧＲＫＩＱＫ、ＳＷＲＶＶＶ、ＳＷＫＶＬＫ、ＴＡＨＦＫＶ、ＭＳＧＶＫＣ、ＬＲＳＶＲＳ、ＳＫＴＬＲＰ、ＭＷＶＨＬＮ、ＴＷＳＭＲＧ、ＫＲＲＣＫＶ、ＶＲＡＶＱＬ、ＶＳＳＶＲＳ、ＶＲＳＶＲＳ、ＳＲＭＨＣＫ、ＧＷＫＬＬＲ、ＧＷＫＯＱＫ、ＶＡＫＬＬＲ、ＶＡＫＩＱＫ、ＶＡＫＩＬＲ、ＧＲＫＩＬＲ、ＶＲＫＬＬＲ、ＩＲＡＶＱＬ、ＶＲＫＩＱＫ、またはＶＲＭＨＣＫバリアント（例えば、ＮＧＴＮ  ＰＡＭについて）；ＭＱＫＳＥＲ、ＶＲＫＳＥＲ、ＩＣＫＳＥＲ、ＬＲＳＶＥＲ、ＬＷＬＥＴＲ、ＬＳＲＷＥＲ、ＭＱＳＶＱＬ、ＶＲＲＥＥＲ、ＩＣＣＣＥＲ、ＬＳＲＷＱＲ、ＬＷＲＶＶＡ、ＷＭＱＡＹＧ、ＬＷＲＳＥＹ、ＳＱＳＷＲＳ、ＬＫＡＷＲＳ、ＬＷＧＷＱＨ、ＭＣＳＦＥＲ、ＬＷＭＲＥＱ、ＬＷＲＶＶＡ、ＨＳＳＷＶＲ、ＭＷＳＥＰＴ、ＧＳＮＹＱＳ、ＦＭＱＷＶＮ、ＹＣＳＷＶＧ、ＭＣＡＷＣＧ、ＦＭＱＷＶＲ、またはＳＳＫＷＰＡバリアント（例えば、ＮＧＣＮ  ＰＡＭについて）；ＬＲＳＶＲＳ、ＳＲＱＭＲＧ、ＭＲＡＲＫＥ、ＳＲＭＨＣＫ、ＶＲＲＥＱＲ、ＶＲＧＥＱＲ、ＬＲＬＳＡＲ、ＡＷＴＥＶＴＲ、ＫＷＭＭＣＧ、ＶＲＧＡＫＥ、ＡＷＮＦＱＶ、ＬＷＴＴＬＮ、ＳＲＭＨＣＫ、ＣＷＣＱＣＶ、ＡＥＥＱＱＲ、ＧＷＥＫＶＲ、ＮＲＡＶＮＧ、ＬＲＳＹＬＨ、ＶＲＧＮＮＲ、ＶＱＤＡＱＲ、ＧＷＲＱＳＫ、ＡＷＬＣＬＳ、ＫＷＡＲＶＶ、ＭＷＡＡＲＰ、ＳＲＭＨＣＫ、ＶＫＭＡＫＧ、ＱＲＫＴＲＥ、ＬＣＲＱＱＲ、ＣＷＳＨＱＲ、ＳＲＴＨＴＱ、ＬＷＥＶＩＲ、ＶＳＳＶＲＳ、ＶＲＳＶＲＳ、ＩＲＡＶＲＳ、ＳＲＳＶＲＳ、ＬＷＫＩＱＫ、またはＶＲＭＨＣＫバリアント（例えば、ＮＧＡＮ  ＰＡＭについて）を含む。いくつかの実施形態において、変異は、ＶＳＲＥＥＲ（ＶＲＥＲとしても公知）またはＶＳＲＥＱＲ（ＶＲＱＲとしても公知）ではない。
【０００７】
いくつかの実施形態において、バリアントＳｐＣａｓ９タンパク質は、Ｄ１０、Ｅ７６２、Ｄ８３９、Ｈ９８３またはＤ９８６；およびＨ８４０またはＮ８６３での変異からなる群から選択されるヌクレアーゼ活性を減少させる１つまたは複数の変異を含む。いくつかの実施形態において、変異は、（ｉ）Ｄ１０ＡまたはＤ１０Ｎ、および（ｉｉ）Ｈ８４０Ａ、Ｈ８４０ＮまたはＨ８４０Ｙである。
【０００８】
いくつかの実施形態において、バリアントＳｐＣａｓ９タンパク質は、Ｎ４９７、Ｋ５２６、Ｒ６６１、Ｒ６９１、Ｎ６９２、Ｍ６９４、Ｑ６９５、Ｈ６９８、Ｋ８１０、Ｋ８４８、Ｑ９２６、Ｋ１００３および／もしくはＲ０１６０での変異からなる群から選択される特異性を増加させる１つまたは複数の変異を含む。いくつかの実施形態において、変異は、Ｎ６９２Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｈ６９８Ａ、Ｎ４９７Ａ、Ｋ５２６Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｒ６９１Ａ、Ｍ６９４Ａ、Ｋ８１０Ａ、Ｋ８４８Ａ、Ｋ１００３Ａ、Ｒ０１６０Ａ、Ｙ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ、Ｌ１６９Ａ／Ｑ６９５Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｙ４５０Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｌ１６９Ａ／Ｙ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ、Ｌ１６９Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｙ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｎ４９７Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｙ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｙ４５０Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｌ１６９Ａ／Ｙ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｌ１６９Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｙ４５０Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｎ４９７Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、およびＹ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅ；Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ、Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｈ６９８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｈ６９８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｈ６９８Ａ；Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ；Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｇ５８２Ａ／Ｖ５８３Ａ／Ｅ５８４Ａ／Ｄ５８５Ａ／Ｎ５８８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｇ５８２Ａ／Ｖ５８３Ａ／Ｅ５８４Ａ／Ｄ５８５Ａ／Ｎ５８８Ａ；Ｔ６５７Ａ／Ｇ６５８Ａ／Ｗ６５９Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｔ６５７Ａ／Ｇ６５８Ａ／Ｗ６５９Ａ／Ｒ６６１Ａ；Ｆ４９１Ａ／Ｍ４９５Ａ／Ｔ４９６Ａ／Ｎ４９７Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｆ４９１Ａ／Ｍ４９５Ａ／Ｔ４９６Ａ／Ｎ４９７Ａ；Ｋ９１８Ａ／Ｖ９２２Ａ／Ｒ９２５Ａ／Ｑ９２６Ａ；または９１８Ａ／Ｖ９２２Ａ／Ｒ９２５Ａ；Ｋ８５５Ａ；Ｋ８１０Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ；またはＫ８４８Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａである。いくつかの実施形態において、タンパク質は、Ｋ５２６またはＲ６９１での変異を含まない。
【０００９】
本明細書において、任意の介在リンカーで異種性機能ドメインと融合された本明細書に記載の単離されたバリアントＳｐＣａｓ９タンパク質を含む融合タンパク質であって、リンカーが、融合タンパク質の活性を妨げない、融合タンパク質も提供する。いくつかの実施形態において、異種性機能ドメインは、転写活性化ドメインである。いくつかの実施形態において、転写活性化ドメインは、ＶＰ６４またはＮＦ−κＢ  ｐ６５からのものである。いくつかの実施形態において、異種性機能ドメインは、転写サイレンサーまたは転写抑制ドメインである。いくつかの実施形態において、転写抑制ドメインは、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメイン、ＥＲＦリプレッサードメイン（ＥＲＤ）またはｍＳｉｎ３Ａ相互作用ドメイン（ＳＩＤ）である。いくつかの実施形態において、転写サイレンサーは、ヘテロクロマチンタンパク質１（ＨＰ１）、例えば、ＨＰ１αまたはＨＰ１βである。いくつかの実施形態において、異種性機能ドメインは、ＤＮＡのメチル化状態を改変する酵素である。いくつかの実施形態において、ＤＮＡのメチル化状態を改変する酵素は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）またはＴＥＴタンパク質である。いくつかの実施形態において、ＴＥＴタンパク質は、ＴＥＴ１である。いくつかの実施形態において、異種性機能ドメインは、ヒストンサブユニットを改変する酵素である。いくつかの実施形態において、ヒストンサブユニットを改変する酵素は、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）またはヒストンデメチラーゼである。
【００１０】
いくつかの実施形態において、異種性機能ドメインは、塩基エディター、例えば、シチジンデアミナーゼドメイン、例えば、ＡＰＯＢＥＣ１、ＡＰＯＢＥＣ２、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ／Ｅ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＰＯＢＥＣ３ＨもしくはＡＰＯＢＥＣ４を含む、アポリポタンパク質Ｂ  ｍＲＮＡ編集酵素、デアミナーゼの触媒ポリペプチド様（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリー；活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）、例えば、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＣＤＡ）；シトシンデアミナーゼ１（ＣＤＡ１）もしくはＣＤＡ２；またはｔＲＮＡに作用するシトシンデアミナーゼ（ＣＤＡＴ）からのものである。いくつかの実施形態において、異種性機能ドメインは、アデノシンＤＮＡ塩基を改変するデアミナーゼであり、例えば、デアミナーゼは、アデノシンデアミナーゼ１（ＡＤＡ１）、ＡＤＡ２；ＲＮＡ１に作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ１）、ＡＤＡＲ２、ＡＤＡＲ３；ｔＲＮＡ１に作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＴ１）、ＡＤＡＴ２、ＡＤＡＴ３；および天然に存在するまたは遺伝子操作されたｔＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ＴａｄＡ）である。いくつかの実施形態において、異種性機能ドメインは、生物学的テザーである。いくつかの実施形態において、生物学的テザーは、ＭＳ２、Ｃｓｙ４またはラムダＮタンパク質である。いくつかの実施形態において、異種性機能ドメインは、ＦｏｋＩである。
【００１１】
いくつかの実施形態において、異種性機能ドメインは、内因性ＤＮＡ修復もしくは塩基除去修復（ＢＥＲ）経路を阻害または増強する酵素、ドメインあるいはペプチド、例えば、ＢＥＲを開始するウラシルの除去を媒介するウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ、ウラシルＮ−グリコシラーゼまたはＵＮＧとしても公知）を阻害するウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤；あるいはバクテリオファージＭｕからのＧａｍなどのＤＮＡ末端結合タンパク質である。
【００１２】
本明細書において、本明細書に記載のバリアントＳｐＣａｓ９タンパク質をコードする単離された核酸、および任意選択で、本明細書に記載のバリアントＳｐＣａｓ９タンパク質を発現するための１つまたは複数の制御ドメインに作動可能に連結された、単離された核酸を含むベクターも提供する。本明細書において、任意選択で、本明細書に記載のバリアントＳｐＣａｓ９タンパク質を発現する、本明細書に記載の核酸を含む宿主細胞、例えば、哺乳動物宿主細胞も提供する。本明細書において、本明細書に記載のバリアントＳｐＣａｓ９タンパク質、およびバリアントタンパク質によって標的化されるＰＡＭ配列を有する配列を標的化するガイドＲＮＡを含むリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体も提供する。
【００１３】
本明細書において、本明細書に記載の単離されたバリアントＳｐＣａｓ９タンパク質、および細胞のゲノムの選択された部分に相補的な領域を有するガイドＲＮＡを、細胞で発現させることによって、細胞のゲノムを変更する方法を提供する。
【００１４】
本明細書において、バリアントタンパク質、および細胞のゲノムの選択された部分に相補的な領域を有するガイドＲＮＡを、細胞で発現させることによって、細胞のゲノムを変更する、例えば、選択的に変更するための方法を提供する。
【００１５】
細胞を、本明細書に記載のタンパク質バリアント、および細胞のゲノムの選択された部分に相補的な領域を有するガイドＲＮＡと接触させることによって、細胞のゲノムを変更する、例えば、選択的に変更するための方法も提供する。
【００１６】
いくつかの実施形態において、単離されたタンパク質または融合タンパク質は、核局在化配列、細胞透過性ペプチド配列および／もしくはアフィニティタグの１つまたは複数を含む。
【００１７】
本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態において、細胞は、幹細胞、例えば、胚性幹細胞、間葉系幹細胞もしくは人工多能性幹細胞であるか、生きている動物における細胞であるか、あるいは胚、例えば、哺乳動物、昆虫もしくは魚類（例えば、ゼブラフィッシュ）の胚における細胞または胚細胞である。
【００１８】
さらに、本明細書において、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）分子を変更するための方法、例えば、インビトロの方法を提供する。この方法は、ｄｓＤＮＡ分子を、１つまたは複数の本明細書に記載のバリアントタンパク質、およびｄｓＤＮＡ分子の選択された部分に相補的な領域を有するガイドＲＮＡと接触させることを含む。
【００１９】
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、この発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。方法および材料は、本発明における使用のために本明細書に記載され、当技術分野において公知の他の適切な方法および材料を使用することもできる。材料、方法および例は、説明のみを目的とし、限定することを意図するものではない。本明細書において列挙される、すべての刊行物、特許出願、特許、配列、データーベースのエントリーおよび他の参照は、それらの全体が参照によって組み込まれる。矛盾がある場合には、定義を含む本明細書が支配する。
【００２０】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および図面から、ならびに特許請求の範囲から明らかになろう。
【００２１】
本特許または本出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラーの図面を伴う本特許または本出願公開の写しは、申請および必要な料金の支払により、特許庁によって提供されるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１Ａ〜１Ｂは、ＳｐＣａｓ９  ＰＡＭバリアントライブラリーの生成およびスクリーニングに関する。（ａ）ＰＡＭ認識のために重要な６つの位置で多様なアミノ酸の組み合わせを有するＳｐＣａｓ９バリアントのライブラリーを生成するために、変性オリゴライブラリーをＳｐＣａｓ９コード配列の３つの領域にクローニングして、赤で強調された６つのコドンをランダム化した。（ｂ）細菌選択アッセイの概略図、ここで、ＳｐＣａｓ９バリアントおよびｓｇＲＮＡは、１つのプラスミドから発現し、第２のプラスミドは、誘導毒性遺伝子およびカスタマイズ化標的部位をコードする。両方のプラスミドは、細菌に同時形質転換され、毒性プラスミドの標的部位でコードされるＰＡＭを認識することができるＳｐＣａｓ９  ＰＡＭバリアントを保有する細胞のみが、毒性遺伝子の発現を誘導する培地上で生存することができる（選択培地は１０ｍＭのアラビノースを含有する）。
【図２−１】図２Ａ〜２Ｆは、ＮＧＴＮ  ＰＡＭを有する部位を認識する細菌選択から得られたＳｐＣａｓ９  ＰＡＭバリアントに関する。（Ａ〜Ｆ）ＮＧＴＧ、ＮＧＴＴ、ＮＧＴＣまたはＮＧＴＡ  ＰＡＭ配列を運ぶ陽性選択プラスミドに対する初期スクリーニングからのＳｐＣａｓ９バリアントをコードするプラスミドを、細菌スクリーニングアッセイで再スクリーニングして、ＮＧＴＮ  ＰＡＭ配列を有する標的部位に対する活性を評価した。パネルＣ、ＥおよびＦについて、バリアントはまた、ＮＧＡＧ、ＮＧＡＴ、ＮＧＡＣおよびＮＧＡＡ  ＰＡＭを有する標的部位に対してスクリーニングした。示されたＰＡＭを有する部位におけるバリアントのおおよその活性を、非選択培地（クロラムフェニコールのみ）におけるコロニーの数を選択培地（クロラムフェニコール＋１０ｍＭのアラビノース）のものと比較することによって計算し、生存％を計算した（表１）。数字にアスタリスクがあるバリアントは、以前のアッセイにおいて試験されたプラスミドを示し（この図の上側パネルに示される）、これらのバリアントのアミノ酸配列は表１に見ることができる。
【図２−２】図２−１と同様である。
【図３】図３Ａ〜３Ｃは、ヒト細胞におけるＳｐＣａｓ９  ＮＧＴＮ  ＰＡＭバリアントの活性に関する。（Ａ、Ｂ）ＮＧＴＡ、ＮＧＴＣ、ＮＧＴＴおよびＮＧＴＧ  ＰＡＭを保有するＥＧＦＰにおける部位に対する、（選択によって得られたか、または合理的に設計された）さまざまなＳｐＣａｓ９バリアントの活性を評価するためのヒト細胞ＥＧＦＰ破壊アッセイ。エラーバーは、ｎ＝２〜７についてのｓ．ｅ．ｍを表す。（Ｃ）ＮＧＴＧ、ＮＧＴＡ、ＮＧＴＣまたはＮＧＴＴ  ＰＡＭを保有する部位に対する、ＳｐＣａｓ９−ＮＧＴＮ  ＰＡＭバリアント、ＳｐＣａｓ９−ＬＲＳＶＱＬバリアントを行うトップの１つの内在性遺伝子破壊活性。Ｔ７Ｅ１アッセイによって定量された遺伝子破壊。
【図４】図４Ａ〜４Ｆは、ＮＧＣＮ  ＰＡＭを有する部位を認識する細菌選択から得られたＳｐＣａｓ９  ＰＡＭバリアントに関する。（Ａ〜Ｂ）ＮＧＣＧ、ＮＧＣＴ、ＮＧＣＣまたはＮＧＣＡ  ＰＡＭ配列を運ぶ陽性選択プラスミドに対する初期スクリーニングからのＳｐＣａｓ９バリアントをコードするプラスミドを、細菌スクリーニングアッセイで再スクリーニングして、ＮＧＣＮ  ＰＡＭ配列を有する標的部位に対する活性を評価した。示されたＰＡＭを有する部位におけるバリアントのおおよその活性を、非選択培地（クロラムフェニコールのみ）におけるコロニーの数を選択培地（クロラムフェニコール＋１０ｍＭのアラビノース）のものと比較することによって計算し、生存％を計算した（表２）。数字にアスタリスクがあるバリアントは、以前のアッセイにおいて試験されたプラスミドを示し（この図の上側パネルに示される）、これらのバリアントのアミノ酸配列は表２に見ることができる。
【図５−１】図５Ａ〜５Ｅは、ヒト細胞におけるＳｐＣａｓ９  ＮＧＣＮ  ＰＡＭバリアントの活性に関する。（Ａ〜Ｅ）ＮＧＣＡ、ＮＧＣＣ、ＮＧＣＴおよびＮＧＣＧ  ＰＡＭを保有するＥＧＦＰにおける部位に対する、（選択によって得られたか、または合理的に設計された）さまざまなＳｐＣａｓ９バリアントの活性を評価するためのヒト細胞ＥＧＦＰ破壊アッセイ。（Ａ）ＮＧＣＡ  ＰＡＭ部位、（Ｂ）ＮＧＣＣ  ＰＡＭ部位、（Ｃ）ＮＧＣＴ  ＰＡＭ部位、（Ｄ）ＮＧＣＣおよびＮＧＣＴ  ＰＡＭ部位、ならびに（Ｅ）さまざまなＮＧＣＮ  ＰＡＭ部位を有する部位に対する活性。
【図５−２】図５−１と同様である。
【図６】図６Ａ〜６Ｂは、ＮＧＡＮ  ＰＡＭを有する部位を認識する細菌選択から得られたＳｐＣａｓ９  ＰＡＭバリアントに関する。（Ａ〜Ｂ）ＮＧＡＧ、ＮＧＡＴ、ＮＧＡＣまたはＮＧＡＡ  ＰＡＭ配列を運ぶ陽性選択プラスミドに対する初期スクリーニングからのＳｐＣａｓ９バリアントをコードするプラスミドを、細菌スクリーニングアッセイで再スクリーニングして、ＮＧＡＮ  ＰＡＭ配列を有する標的部位に対する活性を評価した。示されたＰＡＭを有する部位におけるバリアントのおおよその活性を、非選択培地（クロラムフェニコールのみ）におけるコロニーの数を選択培地（クロラムフェニコール＋１０ｍＭのアラビノース）のものと比較することによって計算し、生存％を計算した（表３）。これらのバリアントのアミノ酸配列は表３に見ることができる。
【図７】図７Ａ〜７Ｂは、ヒト細胞におけるＳｐＣａｓ９  ＮＧＡＮ  ＰＡＭバリアントの活性に関する。（Ａ〜Ｂ）（Ａ）ＮＧＡＡ、ＮＧＡＣ、ＮＧＡＴおよびＮＧＡＧ  ＰＡＭ、または（Ｂ）さまざまなＮＧＡＣ  ＰＡＭを保有するＥＧＦＰにおける部位に対する、（選択によって得られたか、または合理的に設計された）さまざまなＳｐＣａｓ９バリアントの活性を評価するためのヒト細胞ＥＧＦＰ破壊アッセイ。
【図８】ヒト細胞におけるＳｐＣａｓ９  ＰＡＭバリアントとｘＣａｓ９のヌクレアーゼ活性の比較。内因性遺伝子破壊活性をＴ７Ｅ１アッセイによって評価した。
【図９−１】図９は、ヒト細胞の内因性部位おけるＳｐＣａｓ９  ＰＡＭバリアントとｘＣａｓ９の塩基編集活性の比較に関する。（Ａ）ＳｐＣａｓ９  ＰＡＭバリアントのＢＥ３バージョン（Komor et al., Nature. 2016 May 19;533(7603):420-4）を、ＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏによって行った標的化ディープシークエンシングおよび解析によって評価される、ＣからＴへの塩基編集活性について試験した（Pinello et al., Nat Biotechnol. 2016 Jul 12; 34(7): 695-697；Nat Biotechnol. 2016 Jul 12; 34(7): 695-697）。ｘ軸に表示された編集されたシトシンヌクレオチドは、Ｃａｓ９標的配列の最もＰＡＭから遠位の位置として位置１から番号付けされる。（Ｂ）ＳｐＣａｓ９  ＰＡＭバリアントのＡＢＥ７．１０バージョン（Gaudelli et al., Nature. 2017 Nov 23;551(7681):464-471）を、ＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏによって行った標的化ディープシークエンシングおよび解析によって評価される、ＡからＧへの塩基編集活性について試験した。ｘ軸に表示された編集されたアデノシンヌクレオチドは、Ｃａｓ９標的配列の最もＰＡＭから遠位の位置として位置１から番号付けされる。
【図９−２】図９−１と同様である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
表１：ＮＧＴＮ  ＰＡＭを保有する部位に対する細菌のバリアントの選択結果および活性
表２：ＮＧＣＮ  ＰＡＭを保有する部位に対する細菌のバリアントの選択結果および活性
表３：ＮＧＡＮ  ＰＡＭを保有する部位に対する細菌のバリアントの選択結果および活性
【００２４】
化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）によるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の認識は、標的ＤＮＡ認識の重要な第１ステップであり、ＳｐＣａｓ９が結合およびＤＮＡを加水分解することを可能にする。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ゲノム編集のために幅広く使用されているが１〜４、Ｃａｓ９が切断することができる配列の範囲は、標的部位における特異的ＰＡＭについての必要性によって制限される５、６。例えば、これまでに最も安定かつ幅広く使用されているＣａｓ９であるＳｐＣａｓ９は、主に、ＮＧＧ  ＰＡＭを認識する。結果として、多くの場合、さまざまなゲノム編集の応用のために必要な正確さで二本鎖の破壊（ＤＳＢ）を標的化することは困難であり得る。加えて、Ｃａｓ９による不完全なＰＡＭ認識は、望まない標的外変異の生成をもたらし得る７、８。意図的に変更および／または改善されたＰＡＭ特異性を有するＣａｓ９誘導体は、これらの限界に対処するだろう。
【００２５】
結晶構造から、野生型ＳｐＣａｓ９が２つのアルギニンアミノ酸側鎖（Ｒ１３３３およびＲ１３３５）を利用して、塩基を、基準のＮＧＧ  ＰＡＭ配列のグアニンに特異的に接触させることが明らかである。しかしながら、ＰＡＭ認識を変更し、かつＳｐＣａｓ９の標的範囲を改善するために、本発明者らおよび他者は、これらのアルギニンのいずれか１つまたは両方の単純な変異は、ＰＡＭ選好性を転換しないことを示した（Anders et al, Nature 2014; Kleinstiver et al, Nature 2015；国際公開第２０１６／１４１２２４号パンフレット）。本発明者らは、以前に、ＮＧＡおよびＮＧＣＧ  ＰＡＭ配列を標的化することができるＳｐＣａｓ９のバリアントを進化させるための選択アプローチに着手したが（Kleinstiver et al, Nature 2015；国際公開第２０１６／１４１２２４号パンフレット）、しかしながら、多くの代替のＰＡＭ配列は、標的化できないままである。
【００２６】
現在アクセスできないＰＡＭ配列の標的化を可能にすることによってＳｐＣａｓ９の有用性をさらに拡大するために、本発明者らは、新規なＰＡＭ配列を認識する能力があるＳｐＣａｓ９バリアントについて選択するための代替戦略を考えた。ＳｐＣａｓ９コード配列内のある特定の位置がＰＡＭ認識のために重要であることが以前に確立されており（Kleinstiver et al., Nature 2015；国際公開第２０１６／１４１２２４号パンフレット）、本発明者らは、ＰＡＭ相互作用ドメインの３つの別々の領域内の６つのアミノ酸をランダム化して、これらの位置：Ｄ１１３５／Ｓ１１３６、Ｇ１２１８／Ｅ１２１９およびＲ１３３５／Ｔ１３３７で多様なコドン使用頻度を有するＳｐＣａｓ９バリアントのライブラリーを生成させる集中飽和変異生成アプローチを実施した。そうするために、本発明者らは、コードされたこれらの６つのアミノ酸を含有するＳｐＣａｓ９のコドンで、ＮＮＳヌクレオチドトリプレット（ここで、Ｎは任意のヌクレオチドであり、ＳはＧまたはＣである）をコードするランダム化オリゴヌクレオチドカセットを連続してクローニングした（図１Ａ）。次いで、得られるＳｐＣａｓ９バリアントのライブラリーを、以前に記載されたようにして（Kleinstiver et al., Nature 2015）、本発明者らの細菌陽性選択アッセイを使用する選択に供して、さまざまなＮＧＮＮ  ＰＡＭ配列を保有する標的部位を切断することができるバリアントを特定した（図１Ｂ）。簡潔には、発現したＳｐＣａｓ９バリアントが陽性選択プラスミドにおいてコードされる標的部位（ＰＡＭおよびスペーサー配列）を認識することができる場合にのみ、細菌は、選択条件（１０ｍＭのアラビノース上に蒔かれ、これは、ｃｃｄＢ毒性遺伝子の転写を誘導する）で生存することができる。強いＰＡＭ認識は、選択プラスミドの加水分解をもたらし、ｃｃｄＢ発現の誘導を防ぎ、それによって、細菌の増殖を可能にする。このように、ＳｐＣａｓ９ライブラリーのスクリーニングの間に、１０ｍＭのアラビノースを含有する培地で増殖するコロニーは、目的とする代替ＰＡＭを持つ部位を標的化することができるＳｐＣａｓ９  ＰＡＭバリアントをコードすると予想される（図１Ｂ）。
【００２７】
変更されたＰＡＭ特異性を有する遺伝子操作されたＣａｓ９バリアント
この研究において遺伝子操作されたＳｐＣａｓ９バリアントは、野生型ＳｐＣａｓ９によってアクセス可能な標的部位の範囲を大いに増加させ、効率がよいＨＤＲを実施するため、ＮＨＥＪ媒介インデルを小さな遺伝要素に標的化するため、およびＰＡＭについての要件を利用して同じ細胞中の２つの異なるアレルの間を区別するために、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９プラットフォームを使用する機会をさらに増強する。以前はアクセス可能ではなかったＮＧＴＮおよびＮＧＣＨ（ここで、Ｈは、Ａ、ＣまたはＴである）ＰＡＭ含有部位を現在標的化することができるバリアント、ならびにＮＧＡＣに対する活性を改善することができるバリアントの選択および合理的設計は、正確かつ高分解能のゲノム編集のための見込みを改善する。変更されたＰＡＭ特異性ＳｐＣａｓ９バリアントは、細菌およびヒト細胞の両方においてＳｐＣａｓ９によって現在標的化できない内在性遺伝子部位を効率よく破壊することができ、これらが、いろいろな異なる細胞の種類および生物体において働くことを示唆する。
【００２８】
本明細書に記載のすべてのＳｐＣａｓ９バリアントは、例えば、単純な部位指定変異生成によって、既存の広く使用されているベクターに迅速に組み込むことができ、それらは、ＰＡＭ相互作用ドメイン内に含有される少数の変異のみを必要とするので、バリアントはまた、ＳｐＣａｓ９プラットフォームに以前に記載された他の改善とともに働くはずである（例えば、トランケートｓｇＲＮＡ（Tsai et al., Nat Biotechnol 33, 187-197 (2015)；Fu et al., Nat Biotechnol 32, 279-284 (2014)）、ニッカーゼ変異（Mali et al., Nat Biotechnol 31, 833-838 (2013)；Ran et al., Cell 154, 1380-1389 (2013)）、二量体ＦｏｋＩ−ｄＣａｓ融合体（Guilinger et al., Nat Biotechnol 32, 577-582 (2014)；Tsai et al., Nat Biotechnol 32, 569-576 (2014)）；および高フィデリティーバリアント（Kleinstiver et al. Nature 2016））。
【００２９】
変更されたＰＡＭ特異性を有するＳｐＣａｓ９バリアント
したがって、本明細書において、ＳｐＣａｓ９バリアントを提供する。ＳｐＣａｓ９野生型配列は以下の通りである。
【００３０】
【化１−１】
2020532967.tif 000003
【００３１】
【化１−２】
2020532967.tif 000004
【００３２】
本明細書に記載のＳｐＣａｓ９バリアントは、以下の位置：Ｄ１１３５、Ｓ１１３６、Ｇ１２１８、Ｅ１２１９、Ｒ１３３５および／もしくはＴ１３３７、例えば、Ｄ１１３５Ｘ／Ｓ１１３６Ｘ／Ｇ１２１８Ｘ／Ｅ１２１９Ｘ／Ｒ１３３５Ｘ／Ｔ１３３７Ｘ（ここで、Ｘは、任意のアミノ酸である）の１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つすべてで（またはこれらと類似の位置）、変異を含むことができる。いくつかの実施形態において、ＳｐＣａｓ９バリアントは、配列番号１のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％または９５％同一であり、例えば、配列番号１の残基の最大で５％、１０％、１５％または２０％まで、例えば、保存的変異で置き換えられた、相違を有する。好ましい実施形態において、本バリアントは、所望の親の活性、例えば、ヌクレアーゼ活性（親が、ニッカーゼまたは死Ｃａｓ９である場合を除く）ならびに／またはガイドＲＮＡおよび標的ＤＮＡと相互作用する能力を保持する。
【００３３】
２つの核酸配列の同一性パーセントを決定するために、配列は、最適な比較の目的のために整列される（例えば、ギャップは、最適な整列のための第１および第２のアミノ酸もしくは核酸配列の一方または両方に導入することができ、非相同配列は、比較の目的のために無視することができる）。比較の目的のために整列された参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも８０％であり、いくつかの実施形態において、少なくとも９０％または１００％である。次いで、対応するアミノ酸の位置またはヌクレオチドの位置でのヌクレオチドが比較される。第１の配列中の位置は、第２の配列中の対応する位置と同じヌクレオチドによって占められ、その結果、分子は、その位置で同一である（本明細書で使用される場合、核酸の「同一性」は核酸の「相同性」と同等である）。２つの配列の間の同一性パーセントは、２つの配列の最適な整列化のために導入することが必要な、ギャップの数およびそれぞれのギャップの長さを考慮して、配列によって共有される同一の位置の数の関数である。２つのポリペプチドまたは核酸配列の間の同一性パーセントは、当技術分野における技能内であるさまざまな方法、例えば、Ｓｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ（Smith, T. F. and M. S. Waterman (1981) J Mol Biol 147:195-7）；ＧｅｎｅＭａｔｃｈｅｒ  Ｐｌｕｓ（商標）に組み込まれた「Ｂｅｓｔ  Ｆｉｔ」（Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics, 482-489 (1981)）、Schwarz and Dayhof (1979) Atlas of Protein Sequence and Structure, Dayhof, M.O., Ed, pp 353-358；ＢＬＡＳＴプログラム（基本的なローカルアライメント検索ツール；（Altschul, S. F., W. Gish, et al. (1990) J Mol Biol 215: 403-10）、ＢＬＡＳＴ−２、ＢＬＡＳＴ−Ｐ、ＢＬＡＳＴ−Ｎ、ＢＬＡＳＴ−Ｘ、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２、ＣＬＵＳＴＡＬ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に利用可能なコンピューターソフトウェアを使用して、決定される。加えて、当業者は、比較される配列の長さに対する最大の整列を達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、整列を測定するための適切なパラメーターを決定することができる。一般に、タンパク質または核酸のためには、比較の長さは、最大で、かつ全長を含む、任意の長さ（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％）であり得る。本組成物および方法の目的のために、配列の全長の少なくとも８０％が、ＢＬＡＳＴアルゴリズムおよび初期設定パラメーターを使用して整列される。
【００３４】
本発明の目的のために、２つの配列の間の配列の比較および同一性パーセントの決定は、ギャップペナルティ１２、ギャップ拡張ペナルティ４およびフレームシフトギャップペナルティ５でＢｌｏｓｓｕｍ６２スコアリング行列を使用して達成することができる。
【００３５】
保存的置換は、典型的には、以下の群内での置換を含む：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。
【００３６】
いくつかの実施形態において、ＳｐＣａｓ９バリアントは、表１、２または３に示される変異のセット、例えば、以下の変異のセットの１つ：Ｄ１１３５Ｘ／Ｓ１１３６Ｘ／Ｇ１２１８Ｘ／Ｅ１２１９Ｘ／Ｒ１３３５Ｘ／Ｔ１３３７Ｘ：ＳｐＣａｓ９−ＬＷＫＩＱＫ、ＬＷＫＩＱＫ、ＩＲＡＶＱＬ、ＳＷＲＶＶＶ、ＳＷＫＶＬＫ、ＴＡＨＦＫＶ、ＭＳＧＶＫＣ、ＬＲＳＶＲＳ、ＳＫＴＬＲＰ、ＭＷＶＨＬＮ、ＴＷＳＭＲＧ、ＫＲＲＣＫＶ、ＶＲＡＶＱＬ、ＶＳＳＶＲＳ、ＶＲＳＶＲＳ、ＳＲＭＨＣＫ、ＧＲＫＩＱＫ、ＧＷＫＬＬＲ、ＧＷＫＯＱＫ、ＶＡＫＬＬＲ、ＶＡＫＩＱＫ、ＶＡＫＩＬＲ、ＧＲＫＩＬＲ、ＶＲＫＬＬＲ、ＬＲＳＶＱＬ、ＩＲＡＶＱＬ、ＶＲＫＩＱＫ、ＶＲＭＨＣＫ、ＬＲＫＩＱＫ、ＬＲＳＶＱＫ、またはＶＲＫＩＱＫバリアント（例えば、ＮＧＴＮ  ＰＡＭについて）；ＷＭＱＡＹＧ、ＭＱＫＳＥＲ、ＬＷＲＳＥＹ、ＳＱＳＷＲＳ、ＬＫＡＷＲＳ、ＬＷＧＷＱＨ、ＭＣＳＦＥＲ、ＬＷＭＲＥＱ、ＬＷＲＶＶＡ、ＨＳＳＷＶＲ、ＭＷＳＥＰＴ、ＧＳＮＹＱＳ、ＦＭＱＷＶＮ、ＹＣＳＷＶＧ、ＭＣＡＷＣＧ、ＬＷＬＥＴＲ、ＦＭＱＷＶＲ、ＳＳＫＷＰＡ、ＬＳＲＷＱＲ、ＩＣＣＣＥＲ、ＶＲＫＳＥＲ、またはＩＣＫＳＥＲバリアント（例えば、ＮＧＣＮ  ＰＡＭについて）；またはＬＲＬＳＡＲ、ＡＷＴＥＶＴＲ、ＫＷＭＭＣＧ、ＶＲＧＡＫＥ、ＭＲＡＲＫＥ、ＡＷＮＦＱＶ、ＬＷＴＴＬＮ、ＳＲＭＨＣＫ、ＣＷＣＱＣＶ、ＡＥＥＱＱＲ、ＧＷＥＫＶＲ、ＮＲＡＶＮＧ、ＳＲＱＭＲＧ、ＬＲＳＹＬＨ、ＶＲＧＮＮＲ、ＶＱＤＡＱＲ、ＧＷＲＱＳＫ、ＡＷＬＣＬＳ、ＫＷＡＲＶＶ、ＭＷＡＡＲＰ、ＳＲＭＨＣＫ、ＶＫＭＡＫＧ、ＱＲＫＴＲＥ、ＬＣＲＱＱＲ、ＣＷＳＨＱＲ、ＳＲＴＨＴＱ、ＬＷＥＶＩＲ、ＶＳＳＶＲＳ、ＶＲＳＶＲＳ、ＬＲＳＶＲＳ、ＩＲＡＶＲＳ、ＳＲＳＶＲＳ、ＬＷＫＩＱＫ、ＶＲＭＨＣＫ、またはＳＲＭＨＣＫ（例えば、ＮＧＡＮ  ＰＡＭについて）を含む。いくつかの実施形態において、ＳｐＣａｓ９バリアントは、Ｄ１１３５Ｌ／Ｓ１１３６Ｒ／Ｇ１２１８Ｓ／Ｅ１２１９Ｖ／Ｒ１３３５Ｘ／Ｔ１３３７Ｘ、例えば、ＬＲＳＶＱＬまたはＬＲＳＶＲＳを含む。いくつかの実施形態において、Ｄ１１３５での残基は、Ｌ、Ｇ、Ｉ、Ｖ、ＭまたはＳである。いくつかの実施形態において、Ｓ１１３６での残基は、Ｒ、Ｑ、Ｗ、ＳまたはＣである。いくつかの実施形態において、Ｇ１２１８での残基は、Ｓ、Ｋ、Ｓ、Ｒ、Ｌ、Ｃ、Ｇ、ＡまたはＱである。いくつかの実施形態において、Ｅ１２１９での残基は、Ｖ、Ｉ、Ｓ、Ｅ、Ｗ、Ｃ、ＡまたはＲである。いくつかの実施形態において、Ｒ１３３５での残基は、Ｒ、Ｑ、Ｅ、Ｖ、ＴまたはＫである。いくつかの実施形態において、Ｔ１３３７での残基は、Ｓ、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ａ、Ｅ、ＴまたはＧである。いくつかの実施形態において、バリアントは、表Ａにおける変異のセットの１つを含む。
【００３７】
【表１】
2020532967.tif 000005
【００３８】
いくつかの実施形態において、ＳｐＣａｓ９バリアントはまた、タンパク質のヌクレアーゼ部分を触媒的に不活性にするために、Ｃａｓ９のヌクレアーゼ活性を低減もしくは破壊する以下のアミノ酸の位置の１つ：Ｄ１０、Ｅ７６２、Ｄ８３９、Ｈ９８３またはＤ９８６、およびＨ８４０またはＮ８６３、例えば、Ｄ１０Ａ／Ｄ１０ＮおよびＨ８４０Ａ／Ｈ８４０Ｎ／Ｈ８４０Ｙで変異を含み、これらの位置での置換は、アラニン（これらは、Nishimasu al., Cell 156, 935-949 (2014)にある）、または他の残基、例えば、グルタミン、アスパラギン、チロシン、セリンもしくはアスパラギン酸塩、例えば、Ｅ７６２Ｑ、Ｈ９８３Ｎ、Ｈ９８３Ｙ、Ｄ９８６Ｎ、Ｎ８６３Ｄ、Ｎ８６３ＳまたはＮ８６３Ｈであろう（国際公開第２０１４／１５２４３２号パンフレットを参照されたい）。いくつかの実施形態において、バリアントは、Ｄ１０ＡもしくはＨ８４０Ａでの変異（一本鎖ニッカーゼを生成する）、またはＤ１０ＡおよびＨ８４０Ａでの変異（ヌクレアーゼ活性を無効にし、この変異は死Ｃａｓ９またはｄＣａｓ９として公知である）を含む。
【００３９】
いくつかの実施形態において、ＳｐＣａｓ９バリアントはまた、タンパク質の特異性を増加させる（すなわち、標的外の効果を低減する）１つまたは複数のアミノ酸の位置で変異を含む。いくつかの実施形態において、ＳｐＣａｓ９バリアントは、以下の残基：Ｎ４９７、Ｋ５２６、Ｒ６６１、Ｒ６９１、Ｎ６９２、Ｍ６９４、Ｑ６９５、Ｈ６９８、Ｋ８１０、Ｋ８４８、Ｑ９２６、Ｋ１００３および／もしくはＲ０１６０で、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２または１３すべての変異を含む。いくつかの実施形態において、変異は、Ｎ６９２Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｈ６９８Ａ、Ｎ４９７Ａ、Ｋ５２６Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｒ６９１Ａ、Ｍ６９４Ａ、Ｋ８１０Ａ、Ｋ８４８Ａ、Ｋ１００３Ａ、Ｒ０１６０Ａ、Ｙ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ、Ｌ１６９Ａ／Ｑ６９５Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｙ４５０Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｌ１６９Ａ／Ｙ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ、Ｌ１６９Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｙ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｎ４９７Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｙ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｙ４５０Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｌ１６９Ａ／Ｙ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｌ１６９Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｙ４５０Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｎ４９７Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、およびＹ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅ；Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ、Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｈ６９８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｈ６９８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｈ６９８Ａ；Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ；Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｇ５８２Ａ／Ｖ５８３Ａ／Ｅ５８４Ａ／Ｄ５８５Ａ／Ｎ５８８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｇ５８２Ａ／Ｖ５８３Ａ／Ｅ５８４Ａ／Ｄ５８５Ａ／Ｎ５８８Ａ；Ｔ６５７Ａ／Ｇ６５８Ａ／Ｗ６５９Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｔ６５７Ａ／Ｇ６５８Ａ／Ｗ６５９Ａ／Ｒ６６１Ａ；Ｆ４９１Ａ／Ｍ４９５Ａ／Ｔ４９６Ａ／Ｎ４９７Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｆ４９１Ａ／Ｍ４９５Ａ／Ｔ４９６Ａ／Ｎ４９７Ａ；Ｋ９１８Ａ／Ｖ９２２Ａ／Ｒ９２５Ａ／Ｑ９２６Ａ；または９１８Ａ／Ｖ９２２Ａ／Ｒ９２５Ａ；Ｋ８５５Ａ；Ｋ８１０Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ；またはＫ８４８Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａである。例えば、米国特許第９５１２４４６号；Kleinstiver et al., Nature. 2016 Jan 28;529(7587):490-5；Slaymaker et al., Science. 2016 Jan 1;351(6268):84-8；Chen et al., Nature. 2017 Oct 19;550(7676):407-410；Tsai and Joung, Nature Reviews Genetics 17:300-312 (2016)；Vakulskas et al., Nature Medicine 24:1216-1224 (2018)；Casini et al., Nat Biotechnol. 2018 Mar;36(3):265-27を参照されたい。いくつかの実施形態において、本バリアントは、Ｋ５２６またはＲ６９１での変異を含まない。
【００４０】
いくつかの実施形態において、ＳｐＣａｓ９バリアントは、以下の位置：Ｌ１６９Ａ、Ｙ４５０、Ｎ４９７、Ｒ６６１、Ｑ６９５、Ｑ９２６および／もしくはＤ１１３５Ｅの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたは７つすべてで変異を含み、例えば、いくつかの実施形態において、バリアントＳｐＣａｓ９タンパク質は、以下：Ｎ４９７、Ｒ６６１、Ｑ６９５およびＱ９２６の１つ、２つ、３つまたは４つすべてで、例えば、以下の変異：Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５ＡおよびＱ９２６Ａの１つ、２つ、３つまたは４つすべてで、変異を含む。いくつかの実施形態において、バリアントＳｐＣａｓ９タンパク質は、Ｑ６９５および／またはＱ９２６で、ならびに任意選択で、例えば、限定されないが、Ｙ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ、Ｌ１６９Ａ／Ｑ６９５Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｙ４５０Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｌ１６９Ａ／Ｙ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ、Ｌ１６９Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｙ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｎ４９７Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｙ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｙ４５０Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｌ１６９Ａ／Ｙ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｌ１６９Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｙ４５０Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｎ４９７Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、およびＹ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅを含む、Ｌ１６９、Ｙ４５０、Ｎ４９７、Ｒ６６１およびＤ１１３５Ｅの１つ、２つ、３つ、４つまたは５つすべてで変異を含む。例えば、Kleinstiver et al., Nature 529:490-495 (2016)；国際公開第２０１７／０４０３４８号パンフレット；米国特許第９，５１２，４４６号を参照されたい。
【００４１】
いくつかの実施形態において、ＳｐＣａｓ９バリアントはまた、以下の位置：Ｆ４９１、Ｍ４９５、Ｔ４９６、Ｎ４９７、Ｇ５８２、Ｖ５８３、Ｅ５８４、Ｄ５８５、Ｎ５８８、Ｔ６５７、Ｇ６５８、Ｗ６５９、Ｒ６６１、Ｎ６９２、Ｍ６９４、Ｑ６９５、Ｈ６９８、Ｋ９１８、Ｖ９２２、および／またはＲ９２５の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つまたはそれ以上で、および任意選択でＱ９２６で変異を含み、好ましくは、以下の位置：Ｆ４９１、Ｍ４９５、Ｔ４９６、Ｎ４９７、Ｇ５８２、Ｖ５８３、Ｅ５８４、Ｄ５８５、Ｎ５８８、Ｔ６５７、Ｇ６５８、Ｗ６５９、Ｒ６６１、Ｎ６９２、Ｍ６９４、Ｑ６９５、Ｈ６９８、Ｋ９１８、Ｖ９２２および／もしくはＲ９２５の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つまたはそれ以上で、および任意選択でＱ９２６で変異を有する配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である配列、ならびに任意選択で核局在化配列、細胞透過性ペプチド配列および／もしくはアフィニティタグの１つまたは複数を含む。
【００４２】
いくつかの実施形態において、タンパク質は、以下：Ｎ６９２、Ｍ６９４、Ｑ６９５、およびＨ６９８；Ｇ５８２、Ｖ５８３、Ｅ５８４、Ｄ５８５、およびＮ５８８；Ｔ６５７、Ｇ６５８、Ｗ６５９、およびＲ６６１；Ｆ４９１、Ｍ４９５、Ｔ４９６、およびＮ４９７；またはＫ９１８、Ｖ９２２、Ｒ９２５、およびＱ９２６の１つ、２つ、３つまたは４つすべてで変異を含む。
【００４３】
いくつかの実施形態において、タンパク質は、以下の変異：Ｎ６９２Ａ、Ｍ６９４Ａ、Ｑ６９５Ａ、およびＨ６９８Ａ；Ｇ５８２Ａ、Ｖ５８３Ａ、Ｅ５８４Ａ、Ｄ５８５Ａ、およびＮ５８８Ａ；Ｔ６５７Ａ、Ｇ６５８Ａ、Ｗ６５９Ａ、およびＲ６６１Ａ；Ｆ４９１Ａ、Ｍ４９５Ａ、Ｔ４９６Ａ、およびＮ４９７Ａ；またはＫ９１８Ａ、Ｖ９２２Ａ、Ｒ９２５Ａ、およびＱ９２６Ａの１つ、２つ、３つ、４つまたはすべてを含む。
【００４４】
いくつかの実施形態において、タンパク質は、変異：Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａを含む。
【００４５】
いくつかの実施形態において、タンパク質は、変異：Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｈ６９８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｈ６９８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｈ６９８Ａ；Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ；Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｇ５８２Ａ／Ｖ５８３Ａ／Ｅ５８４Ａ／Ｄ５８５Ａ／Ｎ５８８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｇ５８２Ａ／Ｖ５８３Ａ／Ｅ５８４Ａ／Ｄ５８５Ａ／Ｎ５８８Ａ；Ｔ６５７Ａ／Ｇ６５８Ａ／Ｗ６５９Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｔ６５７Ａ／Ｇ６５８Ａ／Ｗ６５９Ａ／Ｒ６６１Ａ；Ｆ４９１Ａ／Ｍ４９５Ａ／Ｔ４９６Ａ／Ｎ４９７Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｆ４９１Ａ／Ｍ４９５Ａ／Ｔ４９６Ａ／Ｎ４９７Ａ；Ｋ９１８Ａ／Ｖ９２２Ａ／Ｒ９２５Ａ／Ｑ９２６Ａ；または９１８Ａ／Ｖ９２２Ａ／Ｒ９２５Ａを含む。例えば、Chen et al., “Enhanced proofreading governs CRISPR-Cas9 targeting accuracy,” bioRxiv, doi.org/10.1101/160036 (August 12, 2017)を参照されたい。
【００４６】
いくつかの実施形態において、バリアントタンパク質は、Ｒ７８０、Ｋ８１０、Ｒ８３２、Ｋ８４８、Ｋ８５５、Ｋ９６８、Ｒ９７６、Ｈ９８２、Ｋ１００３、Ｋ１０１４、Ｋ１０４７および／もしくはＲ１０６０、例えば、Ｒ７８０Ａ、Ｋ８１０Ａ、Ｒ８３２Ａ、Ｋ８４８Ａ、Ｋ８５５Ａ、Ｋ９６８Ａ、Ｒ９７６Ａ、Ｈ９８２Ａ、Ｋ１００３Ａ、Ｋ１０１４Ａ、Ｋ１０４７Ａおよび／もしくはＲ１０６０Ａ、例えば、Ｋ８５５Ａ；Ｋ８１０Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ；（ｅＳｐＣａｓ９  １．０とも称される）；またはＫ８４８Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ（ｅＳｐＣａｓ９  １．１とも称される）の１つまたは複数で変異を含む（Slaymaker et al., Science. 2016 Jan l;351(6268):84-8を参照されたい）。
【００４７】
本明細書において、ＳｐＣａｓ９バリアントをコードする単離された核酸、任意選択でバリアントタンパク質を発現するための１つまたは複数の制御ドメインと作動可能に連結された単離された核酸を含むベクター、ならびに、核酸を含み、および任意選択でバリアントタンパク質を発現する宿主細胞、例えば、哺乳動物宿主細胞も提供する。
【００４８】
本明細書に記載のバリアントは、細胞のゲノムを変更するために使用することができ、この方法は、一般に、細胞中のバリアントタンパク質を、細胞のゲノムの選択された部分に相補的な領域を有するガイドＲＮＡと一緒に発現させることを含む。細胞のゲノムを選択的に変更するための方法は、当技術分野において、公知であり、例えば、米国特許第８，６９７，３５９号；米国特許出願公開第２０１０／００７６０５７号；米国特許出願公開第２０１１／０１８９７７６号；米国特許出願公開第２０１１／０２２３６３８号；米国特許出願公開第２０１３／０１３０２４８号；国際公開第２００８／１０８９８９号パンフレット；国際公開第２０１０／０５４１０８号パンフレット；国際公開第２０１２／１６４５６５号パンフレット；国際公開第２０１３／０９８２４４号パンフレット；国際公開第２０１３／１７６７７２号パンフレット；米国特許出願公開第２０１５／００５０６９９号；米国特許出願公開第２０１５／００４５５４６号；米国特許出願公開第２０１５／００３１１３４号；米国特許出願公開第２０１５／００２４５００号；米国特許出願公開第２０１４／０３７７８６８号；米国特許出願公開第２０１４／０３５７５３０号；米国特許出願公開第２０１４／０３４９４００号；米国特許出願公開第２０１４／０３３５６２０号；米国特許出願公開第２０１４／０３３５０６３号；米国特許出願公開第２０１４／０３１５９８５号；米国特許出願公開第２０１４／０３１０８３０号；米国特許出願公開第２０１４／０３１０８２８号；米国特許出願公開第２０１４／０３０９４８７号；米国特許出願公開第２０１４／０３０４８５３号；米国特許出願公開第２０１４／０２９８５４７号；米国特許出願公開第２０１４／０２９５５５６号；米国特許出願公開第２０１４／０２９４７７３号；米国特許出願公開第２０１４／０２８７９３８号；米国特許出願公開第２０１４／０２７３２３４号；米国特許出願公開第２０１４／０２７３２３２号；米国特許出願公開第２０１４／０２７３２３１号；米国特許出願公開第２０１４／０２７３２３０号；米国特許出願公開第２０１４／０２７１９８７号；米国特許出願公開第２０１４／０２５６０４６号；米国特許出願公開第２０１４／０２４８７０２号；米国特許出願公開第２０１４／０２４２７０２号；米国特許出願公開第２０１４／０２４２７００号；米国特許出願公開第２０１４／０２４２６９９号；米国特許出願公開第２０１４／０２４２６６４号；米国特許出願公開第２０１４／０２３４９７２号；米国特許出願公開第２０１４／０２２７７８７号；米国特許出願公開第２０１４／０２１２８６９号；米国特許出願公開第２０１４／０２０１８５７号；米国特許出願公開第２０１４／０１９９７６７号；米国特許出願公開第２０１４／０１８９８９６号；米国特許出願公開第２０１４／０１８６９５８号；米国特許出願公開第２０１４／０１８６９１９号；米国特許出願公開第２０１４／０１８６８４３号；米国特許出願公開第２０１４／０１７９７７０号；米国特許出願公開第２０１４／０１７９００６号；米国特許出願公開第２０１４／０１７０７５３号；Makarova et al., "Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems" 9(6) Nature Reviews Microbiology 467-477 (1-23) (Jun. 2011)；Wiedenheft et al., "RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea" 482 Nature 331-338 (Feb. 16, 2012)；Gasiunas et al., "Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria" 109(39) Proceedings of the National Academy of Sciences USA E2579-E2586 (Sep. 4, 2012)；Jinek et al., "A Programmable Dual-RNA-Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity" 337 Science 816-821 (Aug. 17, 2012)；Carroll, "A CRISPR Approach to Gene Targeting" 20(9) Molecular Therapy 1658-1660 (Sep. 2012)；２０１２年５月２５日に出願された米国出願第６１／６５２，０８６号；Al-Attar et al., Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPRs): The Hallmark of an Ingenious Antiviral Defense Mechanism in Prokaryotes, Biol Chem. (2011) vol. 392, Issue 4, pp. 277-289；Hale et al., Essential Features and Rational Design of CRISPR RNAs That Function With the Cas RAMP Module Complex to Cleave RNAs, Molecular Cell, (2012) vol. 45, Issue 3, 292-302を参照されたい。
【００４９】
本明細書に記載のバリアントタンパク質は、前述の参照文献に記載のＳｐＣａｓ９タンパク質の代わりに、表１、２または３によるＰＡＭ配列を有する配列を標的化するガイドＲＮＡとともに使用することができる。
【００５０】
加えて、本明細書に記載のバリアントは、当技術分野において公知の野生型Ｃａｓ９または他のＣａｓ９変異（上記に記載のｄＣａｓ９またはＣａｓ９ニッカーゼなど）の代わりに、融合タンパク質、例えば、国際公開第２０１４／１２４２８４号パンフレットに記載の異種性機能ドメインを有する融合タンパク質において使用することができる。例えば、好ましくは、１つもしくは複数のヌクレアーゼ低減変異または致死変異を含むバリアントは、Ｃａｓ９のＮまたはＣ末端において、転写活性化ドメインもしくは他の異種性機能ドメイン（例えば、転写リプレッサー（例えば、ＫＲＡＢ、ＥＲＤ、ＳＩＤなど、例えば、ｅｔｓ２リプレッサー因子（ＥＲＦ）のリプレッサードメイン（ＥＲＤ）の４７３〜５３０番目のアミノ酸、ＫＯＸ１のＫＲＡＢドメインの１〜９７番目のアミノ酸、もしくはＭａｄ  ｍＳＩＮ３相互作用ドメイン（ＳＩＤ）の１〜３６番目のアミノ酸；Beerli et al., PNAS USA 95:14628-14633 (1998)を参照されたい）、またはヘテロクロマチンタンパク質１（ＨＰ１、ｓｗｉ６としても公知）などのサイレンサー、例えば、ＨＰ１αもしくはＨＰ１β；ＭＳ２コートタンパク質、エンドリボヌクレアーゼＣｓｙ４もしくはラムダＮタンパク質に結合したものなどの固定ＲＮＡ結合配列に融合された長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）をリクルートすることができるタンパク質またはペプチド；ＤＮＡのメチル化状態を改変する酵素（例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）またはＴＥＴタンパク質）；ヒストンサブユニットを改変する酵素（例えば、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（例えば、リジンまたはアルギニン残基のメチル化のため）もしくはヒストンデメチラーゼ（例えば、リジンまたはアルギニン残基の脱メチル化のため））に融合させることができる。
【００５１】
いくつかの実施形態において、異種性機能ドメインは、塩基エディター、例えば、シトシンＤＮＡ塩基を改変するデアミナーゼ、例えば、ＡＰＯＢＥＣ１、ＡＰＯＢＥＣ２、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ／Ｅ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＰＯＢＥＣ３ＨおよびＡＰＯＢＥＣ４を含む、アポリポタンパク質Ｂ  ｍＲＮＡ編集酵素、デアミナーゼの触媒ポリペプチド様（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリー（例えば、Yang et al., J Genet Genomics. 2017 Sep 20;44(9):423-437を参照されたい）；活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）、例えば、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＣＤＡ）；シトシンデアミナーゼ１（ＣＤＡ１）およびＣＤＡ２；ならびにｔＲＮＡに作用するシトシンデアミナーゼ（ＣＤＡＴ）からのシチジンデアミナーゼである。以下の表に例示的な配列を提示し、他の配列を使用することもできる。
【００５２】
【表２】
2020532967.tif 000006
【００５３】
いくつかの実施形態において、異種性機能ドメインは、アデノシンＤＮＡ塩基を改変するデアミナーゼであり、例えば、デアミナーゼは、アデノシンデアミナーゼ１（ＡＤＡ１）、ＡＤＡ２；ＲＮＡ１に作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ１）、ＡＤＡＲ２、ＡＤＡＲ３（例えば、Savva et al., Genome Biol. 2012 Dec 28;13(12):252を参照されたい）；ｔＲＮＡ１に作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＴ１）、ＡＤＡＴ２、ＡＤＡＴ３（Keegan et al., RNA. 2017 Sep;23(9):1317-1328およびSchaub and Keller, Biochimie. 2002 Aug;84(8):791-803を参照されたい）；および天然に存在するまたは遺伝子操作されたｔＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ＴａｄＡ）（例えば、Gaudelli et al., Nature. 2017 Nov 23;551(7681):464-471（ＮＰ＿４１７０５４．２（大腸菌（Escherichia coli）株Ｋ−１２亜株ＭＧ１６５５）を参照されたい;例えば、Wolf et al., EMBO J. 2002 Jul 15;21(14):3841-51を参照されたい）である。以下の表に例示的な配列を提示し、他の配列を使用することもできる。
【００５４】
【表３】
2020532967.tif 000007
【００５５】
いくつかの実施形態において、異種性機能ドメインは、内因性ＤＮＡ修復もしくは塩基除去修復（ＢＥＲ）経路を阻害または増強する、酵素、ドメインあるいはペプチド、例えば、チミンＤＮＡグリコシラーゼ（ＴＤＧ；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００３２１１．４（核酸）およびＮＰ＿００３２０２．３（タンパク質））、またはウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ、ウラシルＮ−グリコシラーゼまたはＵＮＧとしても公知；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００３３６２．３（核酸）およびＮＰ＿００３３５３．１（タンパク質））、またはＢＥＲを開始するウラシルの除去を媒介するＵＮＧを阻害するウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）（例えば、Mol et al., Cell 82, 701-708 (1995)；Komor et al., Nature. 2016 May 19;533(7603)を参照されたい）；あるいはＤＮＡ修復酵素を阻害およびより正確な編集をもたらす（意図的ではない塩基編集がより少ない）、遊離ＤＮＡ末端に結合するバクテリオファージＭｕからのタンパク質であるＧａｍなどのＤＮＡ末端結合タンパク質である。例えば、Komor et al., Sci Adv. 2017 Aug 30;3(8):eaao4774を参照されたい。
【００５６】
例えば、使用することもできる当技術分野において公知の、Komor et al., Nature. 2016 May 19;533(7603):420-4；Nishida et al., Science. 2016 Sep 16;353(6305). pii: aaf8729；Rees et al., Nat Commun. 2017 Jun 6;8:15790；またはKim et al., Nat Biotechnol. 2017 Apr;35(4):371-376)を参照されたい。
【００５７】
多くのドメインについての配列は、ＤＮＡ中のメチル化シトシンのヒドロキシル化を触媒する。例示的なタンパク質としては、１０−１１転位（ＴＥＴ）１〜３ファミリー、ＤＮＡ中で５−メチルシトシン（５−ｍＣ）を５−ヒドロキシメチルシトシン（５−ｈｍＣ）に変換する酵素が挙げられる。
【００５８】
ヒトＴＥＴ１〜３についての配列は、当技術分野において公知であり、以下の表に示す。
【００５９】
【表４】
2020532967.tif 000008
【００６０】
いくつかの実施形態において、触媒ドメインの全長配列のすべてまたは一部は、例えば、７つの高度に保存されたエクソンによってコードされる、システインリッチ拡張および２ＯＧＦｅＤＯドメインを含む触媒モジュール、例えば、１５８０〜２０５２番目のアミノ酸を含むＴｅｔ１触媒ドメイン、１２９０〜１９０５番目のアミノ酸を含むＴｅｔ２、および９６６〜１６７８番目のアミノ酸を含むＴｅｔ３を含むことができる。３つすべてのＴｅｔタンパク質中の重要な触媒残基および全長配列についてのこれらの補助物質を示す配列について（例えば、配列２ｃを参照されたい）、Iyer et al., Cell Cycle. 2009 Jun 1;8(11):1698-710. Epub 2009 Jun 27の図１を参照されたい；いくつかの実施形態において、配列は、Ｔｅｔ１の１４１８〜２１３６番目のアミノ酸またはＴｅｔ２／３の対応する領域を含む。
【００６１】
他の触媒モジュールは、Iyer et al., 2009において特定されたタンパク質からのものであり得る。
【００６２】
いくつかの実施形態において、異種性機能ドメインは、生物学的テザーであり、ＭＳ２コートタンパク質、エンドリボヌクレアーゼＣｓｙ４またはラムダＮタンパク質のすべてまたは一部（例えば、これらからのＤＮＡ結合ドメイン）を含む。これらのタンパク質は、ｄＣａｓ９  ｇＲＮＡ標的化配列によって特異化された場所に特異的ステムループ構造を含有するＲＮＡ分子をリクルートするために使用することができる。例えば、ＭＳ２コートタンパク質、エンドリボヌクレアーゼＣｓｙ４またはラムダＮに融合されたｄＣａｓ９バリアントは、ＸＩＳＴまたはＨＯＴＡＩＲなどの長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）をリクルートするために使用することができ、例えば、Ｃｙｓ４、ＭＳ２またはラムダＮ結合配列に連結された、Keryer-Bibens et al., Biol. Cell 100:125-138 (2008)を参照されたい。あるいは、Ｃｓｙ４、ＭＳ２またはラムダＮタンパク質結合配列は、例えば、Keryer-Bibens et al.（上記）に記載の別のタンパク質と連結され得、このタンパク質は、本明細書に記載の方法および組成物を使用して、ｄＣａｓ９バリアント結合部位に標的化することができる。いくつかの実施形態において、Ｃｓｙ４は、触媒的に不活性である。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９バリアント、好ましくは、ｄＣａｓ９バリアントは、国際公開第２０１４／２０４５７８号パンフレットに記載のＦｏｋＩと融合される。
【００６３】
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、ｄＣａｓ９バリアントおよび異種性機能ドメインの間にリンカーを含む。これらの融合タンパク質（または連結された構造中の融合タンパク質の間）で使用することができるリンカーは、融合タンパク質の機能を妨げない任意の配列を含むことができる。好ましい実施形態において、リンカーは、短く、例えば、２〜２０アミノ酸であり、典型的には、フレキシブルである（すなわち、グリシン、アラニンおよびセリンなどの高自由度のアミノ酸を含む）。いくつかの実施形態において、リンカーは、ＧＧＧＳ（配列番号２）もしくはＧＧＧＧＳ（配列番号３）からなる１つまたは複数のユニット、例えば、ＧＧＧＳ（配列番号２）もしくはＧＧＧＧＳ（配列番号３）ユニットの２つ、３つ、４つまたはそれ以上のリピートを含む。他のリンカー配列を使用することもできる。
【００６４】
送達および発現系
本明細書に記載のＣａｓ９バリアントを使用するために、これらをコードする核酸からこれらを発現することが望ましくあり得る。これは、いろいろな方法で行うことができる。例えば、Ｃａｓ９バリアントをコードする核酸は、複製および／もしくは発現のために、原核細胞または真核細胞に形質転換するための中間ベクターにクローニングすることができる。中間ベクターは、典型的には、Ｃａｓ９バリアントの産生のためにＣａｓ９バリアントをコードする核酸の貯蔵または操作のための、原核ベクター、例えば、プラスミド、またはシャトルベクターもしくは昆虫ベクターである。Ｃａｓ９バリアントをコードする核酸は、植物細胞、動物細胞、好ましくは、哺乳動物細胞もしくはヒト細胞、真菌細胞、細菌細胞または原生動物細胞への投与のために、発現ベクターにクローニングすることもできる。
【００６５】
発現を得るために、Ｃａｓ９バリアントをコードする配列は、典型的には、直接転写のためのプロモーターを含有する発現ベクターにサブクローニングされる。適切な細菌および真核プロモーターは、当技術分野において周知であり、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3d ed. 2001)；Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990)；およびCurrent Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 2010)に記載されている。遺伝子操作されたタンパク質を発現させるための細菌発現系は、例えば、大腸菌（E. coli）、バチルス種（Bacillus sp.）およびサルモネラ（Salmonella）で利用可能である（Palva et al., 1983, Gene 22:229-235）。このような発現系のためのキットが市販されている。哺乳動物細胞、酵母および昆虫細胞のための真核発現系は、当技術分野において周知であり、これも市販されている。
【００６６】
核酸の直接発現のために使用されるプロモーターは、特定の適用に依存する。例えば、強い構成的プロモーターは、典型的には、融合タンパク質の発現および精製のために使用される。対照的に、Ｃａｓ９バリアントが遺伝子制御のためにインビボで投与されるべきである場合、構成的プロモーターまたは誘導プロモーターのいずれかを、Ｃａｓ９バリアントの特定の使用に応じて、使用することができる。加えて、Ｃａｓ９バリアントの投与のための好ましいプロモーターは、ＨＳＶ  ＴＫなどの弱いプロモーター、または同様の活性を有するプロモーターであり得る。プロモーターは、トランス活性化に応答するエレメント、例えば、低酸素応答エレメント、Ｇａｌ４応答エレメント、ｌａｃリプレッサー応答エレメント、ならびにテトラサイクリン調節系およびＲＵ−４８６系などの低分子調節系（例えば、Gossen & Bujard, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547；Oligino et al., 1998, Gene Ther., 5:491-496；Wang et al., 1997, Gene Ther., 4:432-441；Neering et al., 1996, Blood, 88:1147-55；およびRendahl et al., 1998, Nat. Biotechnol., 16:757-761を参照されたい）を含むこともできる。
【００６７】
プロモーターに加えて、発現ベクターは、典型的には、原核または真核のいずれかの宿主細胞での核酸の発現のために必要なすべての追加エレメントを含有する転写ユニットまたは発現カセットを含有する。したがって、典型的な発現カセットは、例えば、Ｃａｓ９バリアントをコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーター、および例えば、転写物、転写終結、リボソーム結合部位または翻訳終結の効率がよいポリアデニル化のために必要な任意のシグナルを含有する。カセットの追加エレメントは、例えば、エンハンサー、および異種スプライシングイントロンシグナルを含んでいてもよい。
【００６８】
細胞に遺伝情報を運ぶために使用される特定の発現ベクターは、Ｃａｓ９バリアントの意図される使用、例えば、植物、動物、細菌、真菌、原性動物などにおける発現に関して選択される。標準的な細菌発現ベクターとしては、ｐＢＲ３２２系プラスミド、ｐＳＫＦ、ｐＥＴ２３Ｄなどのプラスミド、ならびにＧＳＴおよびＬａｃＺなどの市販のタグ融合発現系が挙げられる。
【００６９】
真核ウイルスからの制御エレメントを含有する発現ベクターは、多くの場合、真核発現ベクター、例えば、ＳＶ４０ベクター、パピローマウイルスベクターおよびエプスタインバーウイルスに由来するベクターにおいて使用される。他の例示的な真核ベクターとしては、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥが挙げられ、任意の他のベクターは、ＳＶ４０早期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または真核細胞における発現のために効果的であることが示されているその他のプロモーターの指示の下でタンパク質の発現を可能にする。
【００７０】
Ｃａｓ９バリアントを発現するためのベクターとしては、ガイドＲＮＡの発現を推進する、ＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター、例えば、Ｈ１、Ｕ６または７ＳＫプロモーターを挙げることができる。これらのヒトプロモーターは、プラスミドのトランスフェクション後、哺乳動物細胞中においてＣａｓ９バリアントの発現を可能にする。
【００７１】
いくつかの発現系は、チミジンキナーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼおよびジヒドロ葉酸レダクターゼなどの安定的にトランスフェクトされた細胞株の選択のためのマーカーを有する。例えば、昆虫細胞においてバキュロウイルスベクターをポリヒドリンプロモーターまたは他の強いバキュロウイルスプロモーターの指示の下、配列をコードするｇＲＮＡとともに使用する、高収率の発現系も適切である。
【００７２】
典型的に発現ベクターに含まれるエレメントは、大腸菌（E. coli）において機能するレプリコン、組み換えプラスミドを保有する細菌の選択を可能にする抗生物質耐性をコードする遺伝子、および組み換え配列の挿入を可能にするプラスミドの非必須領域のユニークな制限部位も含む。
【００７３】
標準的なトランスフェクション方法を使用して、大量のタンパク質を発現する、細菌、哺乳動物、酵母または昆虫の細胞株を生成し、次いで、これは、標準的な技術を使用して精製される（例えば、Colley et al., 1989, J. Biol. Chem., 264:17619-22; Guide to Protein Purification, in Methods in Enzymology, vol. 182 (Deutscher, ed., 1990)を参照されたい）。真核細胞および真核細胞の形質転換は、標準的な技術に従って行われる（例えば、Morrison, 1977, J. Bacteriol. 132:349-351；Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology 101:347-362 (Wu et al., eds, 1983)を参照されたい）。
【００７４】
外来ヌクレオチド配列を宿主細胞に導入するための任意の公知の手順を使用してもよい。これらは、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、リポソーム、マイクロインジェクション、ネイキッドＤＮＡ、プラスミドベクター、ウイルスベクター、エピソームおよびインテグレーションの両方、ならびにクローニングされたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、または他の外来遺伝物質を宿主細胞に導入するための任意の他の周知の方法を含む（例えば、Sambrook et al.（上記）を参照されたい）。使用される特定の遺伝子操作手順は、Ｃａｓ９バリアントを発現する能力がある宿主細胞に少なくとも１つの遺伝子を成功裏に導入する能力があることのみが必要である。
【００７５】
あるいは、本方法は、Ｃａｓ９バリアントタンパク質およびガイドＲＮＡを一緒に、例えば、複合体として、送達することを含み得る。例えば、Ｃａｓ９バリアントおよびｇＲＮＡは、宿主細胞中で過剰発現および精製され、次いで、ガイドＲＮＡ（例えば、試験管中）と複合体化して、リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）を形成し、細胞に送達することができる。いくつかの実施形態において、バリアントＣａｓ９は、細菌Ｃａｓ９発現プラスミドの使用によって、細菌から発現および精製することができる。例えば、Ｈｉｓタグ化バリアントＣａｓ９タンパク質は、細菌細胞中で発現し、次いで、ニッケルアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製することができる。ＲＮＰの使用は、ヌクレアーゼもしくはガイドをコードするか、またはｍＲＮＡとしてヌクレアーゼをコードするプラスミドＤＮＡを送達する必要性を回避する。ＲＮＰ送達はまた、おそらく、ＲＮＰの半減期がより短く、ヌクレアーゼおよびガイドの持続的発現がないので（プラスミドから取得する場合）、特異性を改善し得る。ＲＮＰは、例えば、脂質媒介トランスフェクションまたはエレクトロポレーションを使用して、インビボまたはインビトロで細胞に送達することができる。例えば、Liang et al. "Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection." Journal of biotechnology 208 (2015): 44-53；Zuris, John A., et al. "Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo." Nature biotechnology 33.1 (2015): 73-80；Kim et al. "Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins." Genome research 24.6 (2014): 1012-1019を参照されたい。
【００７６】
本発明は、ベクター、およびベクターを含む細胞を含む。
【実施例】
【００７７】
本発明を以下の実施例においてさらに記載し、これは、特許請求の範囲に記載の本発明の範囲を限定するものではない。
【００７８】
方法
以下の材料および方法を実施例１において使用した。
【００７９】
プラスミドおよびオリゴヌクレオチド
Ｔ７Ｅ１アッセイのための内因性ヒト遺伝子標的部位を増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドの配列は表４に見られる。
【００８０】
【表５】
2020532967.tif 000009
【００８１】
細菌Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ発現プラスミドを、Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡを別々に発現させるための２つのＴ７プロモーターを用いて、以前に記載されるようにして（Kleinstiver et al., Nature 2015）、構築した。Ｄ１１３５、Ｓ１１３６、Ｇ１２１８、Ｅ１２１９、Ｒ１３３５およびＴ１３３７の位置で可変アミノ酸を含有する細菌発現プラスミドを、これらの位置でランダム化コドンをコードするオリゴヌクレオチドを、親ＳｐＣａｓ９細菌発現ベクターにクローニングすることによって生成した（図１）。
【００８２】
ヒト細胞での発現のために、ＳｐＣａｓ９における点変異を、ｐＣＭＶ−Ｔ７−ｈＳｐＣａｓ９−ＮＬＳ−３ｘＦＬＡＧベクター（ＪＤＳ２４６；配列は、ここで、ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／４３８６１／ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ／に見られる）への等温アセンブリーによって生成した。
【００８３】
ｓｇＲＮＡのＵ６発現のためのプラスミド（所望のスペーサーオリゴをクローニングすることができる）を、ＢｓｍＢＩ消化ＢＰＫ１５２０に適切にアニーリングされたオリゴをクローニングすることによって生成した。
【００８４】
ＳｐＣａｓ９バリアントを進化させるための細菌系陽性選択アッセイ
陽性選択プラスミド（埋め込まれた標的部位を有する）を含有する形質転換受容性のある大腸菌（E.coli）ＢＷ２５１４１（λＤＥ３）２３をＣａｓ９／ｓｇＲＮＡをコードするプラスミドで形質転換した。ＳＯＢ培地中での回収の６０分後、形質転換体を、クロラムフェニコール（非選択的）またはクロラムフェニコール＋１０ｍＭアラビノース（選択的）のいずれかを含有するＬＢプレートに蒔いた。
【００８５】
新規ＰＡＭを切断することができるＳｐＣａｓ９バリアントについて選択するために、ランダム化Ｄ１１３５Ｘ／Ｓ１１３６Ｘ／Ｇ１２１８Ｘ／Ｅ１２１９Ｘ／Ｒ１３３５Ｘ／Ｔ１３３７Ｘ  ＳｐＣａｓ９ライブラリーをコードするプラスミドを、目的とするＰＡＭを有する標的部位をコードする陽性選択プラスミドを既に保有している大腸菌（E.coli）ＢＷ２５１４１（λＤＥ３）細胞にエレクトロポレーションした。生存コロニーを、終夜増殖させ、ミニプレップして、ＳｐＣａｓ９−ＸＸＸＸＸＸ発現プラスミドを抽出し、個々に、以前に記載のＰＡＭ配列を有する陽性選択を含有する大腸菌（E.coli）ＢＷ２５１４１（λＤＥ３）細胞に再形質転換して、生存表現型とそのプラスミドの連結を再試験し、それによって、偽陽性クローンを排除した。一般に、約３００クローンを、追跡実験で再スクリーニングした。二次スクリーニングにおける真正の生存コロニーのＳｐＣａｓ９発現プラスミドを、シークエンシングして、特異性の変更をもたらすＤ１１３５、Ｓ１１３６、Ｇ１２１８、Ｅ１２１９、Ｒ１３３５および／またはＴ１３３７の位置でのアミノ酸を特定した（表１〜３を参照されたい）。シークエンシングされたクローンにおいて観察された変異を、生存クローンにおけるそれらの頻度、および（いくつかの場合では）ヒト細胞系ＥＧＦＰ破壊アッセイにおける活性に基づいて、さらなる評価のために選択した。
【００８６】
ヒト細胞培養およびトランスフェクション
ＥＧＦＰ−ＰＥＳＴレポーター遺伝子の単一の統合されたコピーを保有するＵ２ＯＳ細胞およびＵ２ＯＳ．ＥＧＦＰ細胞（Reyon, D. et al. FLASH assembly of TALENs for high-throughput genome editing. Nat Biotechnol 30, 460-465 (2012)）を、１０％のＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシンおよび２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を有するＡｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ培地中、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。細胞株の特定を、ＳＴＲプロファイリング（ＡＴＣＣ）およびディープシークエンシングによって検証し、細胞を、マイコプラズマ汚染について２週間に１回試験した。Ｕ２ＯＳ．ＥＧＦＰ培養培地に、追加で、４００μｇ／ｍＬのＧ４１８を補充した。細胞を、Ｌｏｎｚａ  ４Ｄ−ヌクレオフェクターのＤＮ−１００プログラムを使用して、製造者の指示書に従って、７５０ｎｇのＣａｓ９プラスミドおよび２５０ｎｇのｓｇＲＮＡプラスミドで同時トランスフェクトした。空のＵ６プロモータープラスミドで一緒にトランスフェクトされたＣａｓ９プラスミドを、すべてのヒト細胞実験について、陰性対照として使用した。
【００８７】
ヒト細胞ＥＧＦＰ破壊アッセイ
ＥＧＦＰ破壊実験を、以前に記載されたようにして（Fu, Y. et al. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nat Biotechnol 31, 822-826 (2013); Reyon, D. et al. FLASH assembly of TALENs for high-throughput genome editing. Nat Biotechnol 30, 460-465 (2012)）、行った。トランスフェクションのおよそ５２時間後、Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、トランスフェクトされたＵ２ＯＳ．ＥＧＦＰ細胞中のＥＧＦＰ蛍光を測定した。Ｃａｓ９および空のＵ６プロモータープラスミドの陰性対照トランスフェクションを使用して、すべての実験について、約２．５％のバックグラウンドのＥＧＦＰのロスを確立した。
【００８８】
Ｔ７Ｅ１アッセイ
Ｔ７Ｅ１アッセイを、以前に記載されたようにして１５、行った。Ｕ２ＯＳヒト細胞のために、ゲノムＤＮＡを、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＤＮＡｄｖａｎｃｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ単離キット（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を使用して、トランスフェクションの約７２時間後に、トランスフェクトされた細胞から抽出した。ヒト細胞のゲノムＤＮＡからの標的遺伝子座を、表４に列挙したプライマーを使用して増幅した。概略で２００ｎｇの精製ＰＣＲ産物を、変性させ、アニーリングし、およびＴ７Ｅ１（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）で消化した。変異生成頻度を、以前に記載されたようにして１５、Ｑｉａｘｃｅｌキャピラリー電気泳動装置（ＱＩａｇｅｎ）を使用して定量化した。
【００８９】
[実施例１]
現在アクセスできないＰＡＭ配列の標的化を可能にすることによってＳｐＣａｓ９の有用性をさらに拡大するために、本発明者らは、新規なＰＡＭ配列を認識する能力があるＳｐＣａｓ９バリアントについて選択するための代替戦略を考えた。ＳｐＣａｓ９コード配列内のある特定の位置がＰＡＭ認識のために重要であることが以前に確立されており（Kleinstiver et al., Nature 2015）、本発明者らは、６つの位置でアミノ酸をランダム化して、ＰＡＭ相互作用ドメイン：Ｄ１１３５／Ｓ１１３６、Ｇ１２１８／Ｅ１２１９およびＲ１３３５／Ｔ１３３７の３つの別々の領域内で多様なコドン使用頻度を有するＳｐＣａｓ９バリアントのライブラリーを生成させる、集中変異生成アプローチを実施した。そうするために、本発明者らは、コードされたこれらの６つのアミノ酸を含有するＳｐＣａｓ９のコドンで、ＮＮＳヌクレオチドトリプレット（ここで、Ｎは任意のヌクレオチドであり、ＳはＧまたはＣである）をコードするランダム化オリゴヌクレオチドカセットを連続してクローニングした（図１Ａ）。次いで、得られるＳｐＣａｓ９バリアントのライブラリーを、以前に記載されたようにして（Kleinstiver et al., Nature 2015）、さまざまなＮＧＮＮ  ＰＡＭ配列をコードする標的部位に対して、本発明者らの細菌陽性選択アッセイでスクリーニングした（図１Ｂ）。簡潔には、ＳｐＣａｓ９が陽性選択プラスミドにおいてコードされる標的部位（ＰＡＭおよびスペーサー配列）を認識することができる場合にのみ、細菌は、選択条件（１０ｍＭのアラビノース上に蒔かれ、これは、ｃｃｄＢ毒性遺伝子の転写を誘導する）で生存することができる。強いＰＡＭ認識は、選択プラスミドの加水分解をもたらし、ｃｃｄＢ発現の誘導を防ぎ、細菌の増殖を可能にする。このように、ＳｐＣａｓ９ライブラリーのスクリーニングの間に、１０ｍＭのアラビノースを含有する培地で増殖したコロニーは、代替ＰＡＭを標的化することができるＳｐＣａｓ９  ＰＡＭバリアントをコードすると予想される（図１Ｂ）。
【００９０】
本発明者らは、最初に、ＮＧＴＧ、ＮＧＴＴ、ＮＧＴＣおよびＮＧＴＡ  ＰＡＭを有する標的部位をコードする陽性選択プラスミドにおいて、ランダム化されたＤ１１３５Ｘ／Ｓ１１３６Ｘ／Ｇ１２１８Ｘ／Ｅ１２１９Ｘ／Ｒ１３３５Ｘ／Ｔ１３３７Ｘ  ＳｐＣａｓ９ライブラリー（ＳｐＣａｓ９−ＸＸＸＸＸＸ、ここで、Ｘは、任意のアミノ酸である）をスクリーニングした。それぞれの異なるＰＡＭ選択のために、アラビノース選択からの４８の生存コロニーを集め、クロラムフェニコール含有培地中で終夜増殖させて、プラスミドをコードするヌクレアーゼを回収した。一次スクリーニングにおいて偽陽性の割合を低減するために、すべての推定上のＰＡＭバリアントプラスミドを、その後、標的部位をコードする陽性選択プラスミドに対して、およびそれらが最初にスクリーニングされたＰＡＭに対して、再スクリーニングした（データは示さない）。この再スクリーニングアッセイにおいて少なくとも５０％生存の真正バリアントのサブセットをシークエンシングして、１１３５、１１３６、１２１８、１２１９、１３３５、１３３７番目の残基でのアミノ酸を特定し（表１）、次いで、これらのバリアントを、ＮＧＴＧ、ＮＧＴＴ、ＮＧＴＣおよびＮＧＴＡ  ＰＡＭに対してより広範にスクリーニングして、ＮＧＴＮ部位に対する活性を評価した（図２ａ〜２ｂおよび表１）。注意：この記載以降、細菌アッセイにおいて、ＳｐＣａｓ９バリアントは、それらのバリアント番号（ｖＮＧＴＮ−＃）によって記載し、またはヒトアッセイにおいて「アミノ酸名称」によって記載し、ここで、アミノ酸名称は、ＳｐＣａｓ９−ＸＸＸＸＸＸの形式であり、ここで、６つのＸは、１１３５、１１３６、１２１８、１２１９、１３３５および１３３７番目の位置でのアミノ酸識別を表す（表１〜３において見られる）。再スクリーニングはわずかな傾向を特定し、ここで、いくつかの場合において、バリアントは、最初に選択されたもの（例、ｖＮＧＴＮ−１、−３、−１２、−２７、−２８など）に対するＮＧＴＮ  ＰＡＭに対して最も高い活性を有し、いくつかのバリアントは、ＮＧＴＮ  ＰＡＭ（例、ｖＮＧＴＮ−１５、−３１、−３５など、これは、ＮＧＴＣおよびＮＧＴＡを標的化することができる）の組み合わせを標的化することができ、いくつかのバリアントは、ＮＧＴＮ  ＰＡＭ（例、ｖＮＧＴＮ−９、−１０、−３０など）のすべてを標的化することができる（図２Ａ〜２Ｂおよび表１）。これらの結果に基づいて、新規なバリアントを、初期スクリーニングにおいて十分に行われたクローン中の１１３５、１１３６、１２１８、１２１９、１３３５および１３３７番目の位置でアミノ酸を生じる頻度に基づいて、合理的に設計した。これらの合理的に設計されたＮＧＴＮバリアントを、ＮＧＴＧ、ＮＧＴＴ、ＮＧＴＣおよびＮＧＴＡ  ＰＡＭ（図２Ｃ〜２Ｆ）に対する細菌スクリーニングにおいて評価し、いくつかの場合において、ＮＧＡＮ  ＰＡＭ（ＮＧＡＧ、ＮＧＡＴ、ＮＧＡＣ、ＮＧＡＡ；図２Ｃ、２Ｅ〜２Ｆ）に対してもスクリーニングした。再び、上記の選好性と一致した性質を有する多数の興味深いバリアントを特定したが、とりわけ、ＰＡＭ（例、ＮＧＴＧもしくはＮＧＡＧ  ＰＡＭを標的化することができるｖＮＧＴＧ−３７、またはＮＧＴＣおよびＮＧＡＣ  ＰＡＭにおけるｖＮＧＴＧ−１８ならびに−４１など）の４番目の位置での選好性を与え得るいくつかの追加バリアント、ＮＧＴＮ  ＰＡＭ（例、ｖＮＧＴＮ−４０、−４６、−４８など）のすべてを標的化することができる追加バリアント、およびＮＧＴＮもしくはＮＧＡＮ  ＰＡＭ（例、ｖＮＧＴＮ−７、−４４、−５９など；図２Ｃ〜２Ｆおよび表１）のすべてまたはほぼすべてを標的化することができるバリアントを特定した。
【００９１】
細菌中のＮＧＴＮ  ＰＡＭ部位を標的化することができるいくつかのバリアントを特定し、本発明者らは、これらの選好性がヒト細胞における真正な活動に翻訳されるか否かを決定することを試みた。本発明者らのヒトＵ２ＯＳ  ＥＧＦＰ破壊アッセイにおける１２の異なるＮＧＴＮ  ＰＡＭバリアントの初期スクリーニングにおいて、本発明者らは、ＮＧＴＴおよびＮＧＴＧ  ＰＡＭ（例、ＳｐＣａｓ９−ＧＲＫＩＱＫ、−ＶＡＫＬＬＲ、−ＶＲＫＬＬＲなど）を安定して標的化し得るバリアント、およびすべてのＮＧＴＮ  ＰＡＭ部位（例、ＳｐＣａｓ９−ＬＲＳＶＱＬ、−ＩＲＡＶＱＬなど）を改変し得るいくつかのバリアントを特定した（図３Ａ）。ヒト細胞ＥＧＦＰ破壊アッセイにおいてこれらのバリアントおよび追加の合理的に設計されたバリアントのサブセットのさらなるスクリーニングは、ＳｐＣａｓ９−ＬＲＳＶＱＬ、−ＬＲＫＩＱＫ、−ＬＲＳＶＱＫなどを、ＮＧＴＮ  ＰＡＭ配列を標的化することができる有望なバリアントとして特定した（図３Ｂ）。ヒト細胞でのＮＧＴＮ  ＰＡＭ配列におけるＳｐＣａｓ９−ＬＲＳＶＱＬの活性をより厳しく特徴付けるために、本発明者らは、ヒトＵ２ＯＳ細胞において、ＥＭＸ１、ＦＡＮＣＦおよびＲＵＮＸ１遺伝子にわたる３２の異なる内因性部位にわたって、このヌクレアーゼバリアントの活性を調べた。この解析は、ＮＧＴＧ、ＮＧＴＡ、ＮＧＴＣおよびＮＧＴＴ  ＰＡＭを持つさまざまな内因性部位におけるＳｐＣａｓ９−ＬＲＳＶＱＬの安定した活性を明らかにした（図３Ｃ、本発明者らの選択および合理的に設計したＰＡＭバリアントが公表されたＳｐＣａｓ９バリアントで以前に標的化できなかった多数の遺伝子座にわたって効率よく機能することができることを実証する）。
【００９２】
本発明者らは、ＳｐＣａｓ９−ＶＲＥＲ（Ｄ１１３５Ｖ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｒ１３３５Ｅ／Ｔ１３３７Ｒ置換をコードする）と呼ばれるＮＧＣＧ  ＰＡＭ部位（Kleinstiver et al., Nature, 2015）を効率的に標的化することができるＳｐＣａｓ９バリアントを以前に記載した。このバリアントは、以前にアクセス可能ではなかった部位の標的化を可能にするが、これは、拡張されたＮＧＣＧ  ＰＡＭを有する部位における活性を制限する。現在ＮＧＣＴ、ＮＧＣＣおよびＮＧＣＡを含むＮＧＣＮ  ＰＡＭをすべて潜在的に標的化することによってＳｐＣａｓ９  ＰＡＭバリアントの有用性を拡大するために、本発明者らは、上記に記載のものに対する同様の選択を行ったが、ＮＧＣＧ、ＮＧＣＴ、ＮＧＣＣまたはＮＧＣＡ  ＰＡＭのいずれかを有する標的部位を保有する陽性選択プラスミドに対するＳｐＣａｓ９−ＸＸＸＸＸＸライブラリーをスクリーニングした（図４Ａ〜４Ｂおよび表２）。本発明者らがＮＧＴＮ選択で観察したものと酷似して、ＮＧＣＮバリアントの再スクリーニングは、バリアントが、最初に選択されたＮＧＣＮ  ＰＡＭ（例、ｖＮＧＣＮ−３、−８、−９、−１７など）に対して最も高い活性を有する場合、いくつかのバリアントが、ＮＧＣＮ  ＰＡＭ（例、ｖＮＧＣＮ−１０など、これは、ＮＧＣＴ、ＮＧＣＣおよびＮＧＣＡを標的化することができる）の組み合わせを標的化することができること、ならびにいくつかのバリアントがＮＧＣＮ  ＰＡＭ（例、ｖＮＧＣＮ−１、−２、−５、−１８、−２６など）のすべてを標的化することができることを特定した（図４Ａ〜４Ｂおよび表２）。さまざまな合理的に生成されたＮＧＣＮバリアントを、ＳｐＣａｓ９−ＸＸＸＸＸＸ選択クローンにおけるアミノ酸富化の観察に基づいてクローニングし、ＮＧＣＮ  ＰＡＭに対する活性について細菌中で試験した（図４Ａ〜４Ｂ、表２、データは示さない）。
【００９３】
次に、本発明者らは、本発明者らのＵ２ＯＳ  ＥＧＦＰ破壊アッセイにおけるさまざまなＮＧＣＮ選択ＳｐＣａｓ９  ＰＡＭバリアントの活性を調べて、それらの再標的化ＰＡＭ選好性およびヌクレアーゼ活性がヒト細胞で再現されるか否かを決定した（図５Ａ〜５Ｄ）。本発明者らは、ＮＧＣＡ  ＰＡＭ（ＳｐＣａｓ９−ＭＱＫＳＥＲ、−ＬＷＲＶＶＡ、−ＬＷＬＥＴＲなど；図５Ａ）、ＮＧＣＣ  ＰＡＭ（ＳｐＣａｓ９−ＭＱＫＳＥＲ、−ＬＳＲＷＱＲ、−ＩＣＣＣＥＲなど；図５Ａ）、ＮＧＣＴ  ＰＡＭ（ＳｐＣａｓ９−ＭＱＫＳＥＲ；図５Ｃ）、またはＮＧＣＣおよびＮＧＣＴ  ＰＡＭ（ＳｐＣａｓ９−ＭＱＫＳＥＲ、−ＶＲＫＳＥＲ、−ＩＣＫＳＥＲなど；図５Ｃ）に対する多数のバリアントの活性を観察した。さらに、全部で１５のＮＧＣＡ、ＮＧＣＣ、ＮＧＣＴおよびＮＧＣＧ部位に対するＳｐＣａｓ９−ＭＱＫＳＥＲ、−ＶＲＫＳＥＲ、−ＩＣＫＳＥＲバリアントの試験は、すべてのクラスのＮＧＣＮ  ＰＡＭに対するそれぞれのバリアントの安定した活性を明らかにした（図５Ｅ）。いくつかの場合において、これらのバリアントは、公表されたＳｐＣａｓ９−ＶＲＥＲ（例えば、図５Ｂ〜５Ｃに示される）より優れ得るが、これは、一般に、ＳｐＣａｓ９−ＶＲＥＲによって効率的に標的化されないことが以前に示されたＰＡＭに対してであった。まとめると、これらの新しいバリアントは、ＳｐＣａｓ９−ＭＱＫＳＥＲ、およびすべてのＮＧＣＮ  ＰＡＭに対して安定した活性を有する他のバリアントにより、以前にアクセス可能であったＮＧＣＧの代わりに、ＮＧＣＴ、ＮＧＣＣおよびＮＧＣＡに、ＳｐＣａｓ９の標的化を拡大する。
【００９４】
加えて、本発明者らは、ＳｐＣａｓ９−ＶＱＲ（Ｄ１１３５Ｖ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ；Kleinstiver et al., Nature, 2015）およびＳｐＣａｓ９−ＶＲＱＲ（Ｄ１１３５Ｖ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ；Kleinstiver and Pattanayak et al., Nature, 2016）と呼ばれるＮＧＡＮ  ＰＡＭ部位を効率的に標的化することができるＳｐＣａｓ９バリアントも以前に記載している。しかしながら、これらのバリアントは、ＮＧＡＧ＞ＮＧＡＡ＝ＮＧＡＴ＞ＮＧＡＣの順で、ＮＧＡＮ  ＰＡＭのサブクラスへの選好性を有し、すなわち、これらは、ＮＧＡＣ  ＰＡＭ部位に対する準最適な活性を有する。ＮＧＡＮ  ＰＡＭのＳｐＣａｓ９標的化を潜在的に改善するために、本発明者らは、ＮＧＡＧ、ＮＧＡＴ、ＮＧＡＣおよびＮＧＡＡ  ＰＡＭをコードする陽性選択プラスミドに対する上記に記載のＳｐＣａｓ９−ＸＸＸＸＸＸライブラリーによる選択を行った（図６Ａ〜６Ｂおよび表３）。ＮＧＡＮバリアントの再スクリーニングは、クローンが、最初に選択されたＮＧＡＮ  ＰＡＭ（例、ＮＧＡＧにおけるｖＮＧＡＮ−１、−２、−１７、−２６から−３０など、ＮＧＡＴにおけるｖＮＧＡＮ−３２、ＮＧＡＣにおけるｖＮＧＡＮ−４、−５、−４０、−４１など）に対する最も高い活性を有すること、いくつかのバリアントがＮＧＡＮ  ＰＡＭ（例、ＮＧＡＴおよびＮＧＡＣを標的化することができるｖＮＧＡＮ−２０、−２１など、またはＮＧＡＧおよびＮＧＡＣを標的化することができるｖＮＧＡＮ−２２）の組み合わせを標的化することができること、ならびにいくつかのバリアントがＮＧＡＮ  ＰＡＭ（例、ｖＮＧＡＮ−３、−１３、−２５、−３１など）のすべてを標的化することができることを明らかにした（図６Ａ〜６Ｂおよび表３）。
【００９５】
多数のＳｐＣａｓ９−ＸＸＸＸＸＸバリアントが細菌スクリーニングにおける強いＮＧＡＣ  ＰＡＭ標的化を明らかにしたので、多くのバリアントを、本発明者らのヒト発現ベクターにサブクローニングして、本発明者らのヒト細胞Ｕ２ＯＳ  ＥＧＦＰ破壊アッセイにおいて活性を調べた。ＥＧＦＰにおける単一のＮＧＡＡ、ＮＧＡＣ、ＮＧＡＴおよびＮＧＡＧ  ＰＡＭ部位に対するバリアントのサブセットの初期スクリーニングは、ある特定のバリアントが、ＮＧＡＣ  ＰＡＭを保有する部位でＳｐＣａｓ９−ＶＱＲよりも潜在的に優れていることを明らかにした（図７Ａ）。図７Ａからのバリアントおよび追加で選択されたバリアントのより広範囲におよぶ試験は、複数のＳｐＣａｓ９バリアントが、ＳｐＣａｓ９−ＬＲＳＶＲＳ、−ＭＲＡＲＫＥ、−ＳＲＱＭＲＧなどを含む、ＥＧＦＰ破壊アッセイ（図７Ｂ）において調べられたＮＧＡＣ  ＰＡＭの一部または４つすべてに対するＳｐＣａｓ９−ＶＲＱＲと比べて活性が改善されていることを明らかにした。
【００９６】
次いで、本発明者らは、本発明者らのＳｐＣａｓ９バリアントの活性を、緩和されたＮＧ  ＰＡＭ選好性が報告されているｘＣａｓ９と呼ばれる最近記載されたＳｐＣａｓ９  ＰＡＭバリアント（Hu et al., Nature volume 556, pages 57-63 (05 April 2018)）と比較した。本発明者らの以前の結果と一致して、本発明者らは、ＶＲＱＲバリアント（ＶＳＲＥＱＲとしても公知）を有するＮＧＡ  ＰＡＭを有する部位、ＶＲＥＲ（ＶＳＲＥＥＲとしても公知）およびＭＱＫＳＥＲバリアントを有するＮＧＣＧ  ＰＡＭを有する部位、ならびにＬＲＳＶＱＬバリアントを有するＮＧＴ  ＰＡＭを有する部位の安定したヌクレアーゼ標的化（Ｔ７Ｅ１アッセイによって評価された場合に、１５〜５０％の間）を観察した（図８）。しかしながら、ｘＣａｓ９バリアントにより、ＮＧＡ、ＮＧＣＧまたはＮＧＴ  ＰＡＭを有する部位の標的化は、１０％超の効率は観察されず、さらにまた、本発明者らは、ｘＣａｓ９が、野生型ＳｐＣａｓ９と比較して、ＮＧＧ  ＰＡＭを有する標的部位で平均で約２分の１の効果であったことを観察した（図８）。これらの結果は、本発明者らのＳｐＣａｓ９  ＰＡＭバリアントが、ｘＣａｓ９と比較した場合に、いろいろなＰＡＭに対してより効果的なヌクレアーゼであることを実証する。
【００９７】
[実施例２]
正確な単一の塩基編集イベントを行うための能力は、最近、遺伝子操作されたＳｐＣａｓ９塩基エディター（ＢＥ）コンストラクトを使用して実証され（例えば、Komor et al., Nature. 2016 May 19;533(7603):420-4；Nishida et al., Science. 2016 Sep 16;353(6305)；Kim et al., Nat Biotechnol. 2017 Apr;35(4):371-376；Komor et al., Sci Adv. 2017 Aug 30;3(8):eaao4774；およびGaudelli et al., Nature. 2017 Nov 23;551(7681):464-471を参照されたい）、これは、非標的ＤＮＡ鎖のｓｓＤＮＡ到達性を引き起こすＲループを形成するＳｐＣａｓ９−ｇＲＮＡの形成を利用する。したがって、異種性のシチジンまたはアデニンデアミナーゼ酵素ドメインのＳｐＣａｓ９への融合体は、露出したｓｓＤＮＡ鎖上で作用し得、それぞれ、ＣからＴへの変更（いわゆる、シトシン塩基エディター、またはＣＢＥ）またはＡからＧへの変更（いわゆる、アデノシン塩基エディター、またなＡＢＥ）の効率がよい導入をもたらす。細胞の塩基除去修復（ＢＥＲ）は、ウラシル塩基を除去するためにウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ；ウラシルＮ−グリコシラーゼまたはＵＮＧとしても公知）を利用するので、この内因性プロセスは、シチジンＢＥによって生成した編集を効率的に元に戻してしまう可能性がある。これは、シチジンの脱アミノ化がウラシル中間体をもたらすからである。したがって、シチジンＢＥの効率を改善するために、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）などの異種エフェクタードメインはまた、ＳｐＣａｓ９と融合して、ＵＤＧを阻害することができ、ＢＥＲの開始を覆し、シチジンＢＥの有効性を増加させる。
【００９８】
したがって、本発明者らは、本発明者らのＳｐＣａｓ９  ＰＡＭバリアントの拡大された標的範囲が、以前にアクセス可能ではなかった部位の編集を可能にすることによって、塩基エディターの有用性を改善することができるか否かを決定することを試みた。そうするために、本発明者らは、ＢＥ３（Komor et al., Nature. 2016 May 19;533(7603):420-4）ＰＡＭバリアントを構築して、ＮＧＡおよびＮＧＴ  ＰＡＭを有する部位を認識する能力があるＣＢＥを生成した。本発明者らは、ＮＧＡ  ＰＡＭを有する部位において、ＣＢＥ−ＶＲＱＲバリアントが、編集ウィンドウにおいて７．５％〜６４．２％の間のＣからＴへの変換を示した一方で、ｘＣａｓ９が、同じ部位において０％〜１９．９％のＣからＴへの編集を示したことを見出した（図９Ａ）。同様に、ＮＧＴ  ＰＡＭを有する部位において、ＣＢＥ−ＬＲＳＶＱＬバリアントは、１０．８％〜５０．３％の間のＣからＴへの変換を示した一方で、ＣＢＥ−ｘＣａｓ９が、同じ部位において０％〜２８．５％のＣからＴへの編集を示した（図９Ａ）。本発明者らは、ＮＧＧ  ＰＡＭを有する部位において、野生型ＳｐＣａｓ９（５２．５％〜６２．４％）と比較して、ＣＢＥ−ｘＣａｓ９によるＣからＴへの編集活性（２６．７％〜３７．２％）の著しい減少も観察した（図９Ａ）。これらの結果は、ＶＲＱＲおよびＬＲＳＶＱＬのＢＥ３バージョンが、それぞれ、ｘＣａｓ９より約２倍大きい割合で、ＮＧＡおよびＮＧＴ  ＰＡＭを有する部位において、効果的なＣＢＥであることを実証する。
【００９９】
次に、本発明者らは、本発明者らのＰＡＭバリアントのＡＢＥ（７．１０）（Gaudelli et al., Nature. 2017 Nov 23;551(7681):464-471）バージョンを構築して、ヒト細胞におけるＡからＧへの変換を媒介するＡＢＥとしてそれらの有効性を決定した。本発明者らは、ＡＢＥ−ｘＣａｓ９で観察された０％〜１２．５％の編集と比較して、ＮＧＡ  ＰＡＭを有する部位において、ＡＢＥ−ＶＲＱＲによるＡからＧへの強い編集活性（８．０％〜７７．３％）を観察した（図９Ｂ）。同様に、ＮＧＣＧ  ＰＡＭを有する部位において、ＡＢＥ−ＶＲＥＲ（０％〜７５．９％）およびＡＢＥ−ＭＳＱＫＥＲ（５．４％〜９０．４％）バリアントは、またもや、ＡからＧへの編集について、ＡＢＥ−ｘＣａｓ９（０％〜６２．３％）より優れていた（図９Ｂ）。本発明者らは、ＮＧＧ  ＰＡＭを有する部位において、野生型ＳｐＣａｓ９（１３．９％〜５０．４％）と比較して、ＡＢＥ−ｘＣａｓ９によるＡからＧへの編集の減少（０％〜１６．９％）も観察した（図９Ｂ）。本発明者らの結果は、ＶＲＱＲのＡＢＥ（７．１０）バージョンが、ＮＧＡ  ＰＡＭを有する部位におけるＡからＧへの編集の媒介に効果的であること、ならびにＶＲＥＲおよびＭＳＱＫＥＲのＡＢＥ（７．１０）バージョンが、ＮＧＣＧ  ＰＡＭを有する部位において効果的であることを明らかにする。
【０１００】
参照文献
【０１０１】
【表６−１】
2020532967.tif 000010
【０１０２】
【表６−２】
2020532967.tif 000011
【０１０３】
他の実施形態
本発明をその詳細な説明と関連して記載したが、前述の記載は、説明することを意図するものであって、本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、本発明は、添付の特許請求の範囲によって規定されることが理解されるべきである。他の態様、利点および改変は、以下の特許請求の範囲内である。
【０１０４】
【表７−１】
2020532967.tif 000012
【０１０５】
【表７−２】
2020532967.tif 000013
【０１０６】
【表７−３】
2020532967.tif 000014
【０１０７】
【表８−１】
2020532967.tif 000015
【０１０８】
【表８−２】
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【０１０９】
【表８−３】
2020532967.tif 000017
【０１１０】
【表９−１】
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【０１１１】
【表９−２】
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【０１１２】
【表９−３】
2020532967.tif 000020
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【配列表】
2020532967000001.app
【国際調査報告】
2020532967.tif 000033
2020532967.tif 000034
2020532967.tif 000035