(57)【要約】  本発明は、機能性Ｉ型またはＩＩ型ＲｕＢｉｓＣＯ酵素と機能性ホスホリブロキナーゼ（ＰＲＫ）を発現し、解糖経路が少なくとも部分的に阻害されている遺伝的に改変された微生物に関し、当該微生物は、外因性分子を産生および／または内因性分子を過剰産生するように遺伝的に改変されている。本発明によれば、ペントースリン酸経路の酸化分岐もまた少なくとも部分的に阻害され得る。本発明はまた、目的分子の産生または過剰産生のためにそのように遺伝的に改変された微生物の使用および目的分子の合成または生物変換のための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
機能性ＲｕＢｉｓＣＯ酵素および機能性ホスホリブロキナーゼ（ＰＲＫ）を発現し、解糖経路が１，３−ビホスホ−Ｄ−グリセリン酸（１，３−ＢＰＧ）の産生の上流または３−ホスホグリセリン酸（３ＰＧ）の産生の上流、およびグリセルアルデヒド−３−リン酸（Ｇ３Ｐ）の産生の下流で少なくとも部分的に阻害されている遺伝的に改変された微生物であって、当該微生物が、ＲｕＢｉｓＣＯ酵素またはホスホリブロキナーゼ酵素以外の、目的の外因性分子を産生および／または目的の内因性分子を過剰産生するように遺伝的に改変されている、微生物。
【請求項２】
ペントースリン酸経路の酸化分岐もまた少なくとも部分的に阻害されている、請求項１に記載の遺伝的に改変された微生物。
【請求項３】
前記微生物が、組換えＲｕＢｉｓＣＯ酵素および／またはＰＲＫを発現するように遺伝的に改変されている、請求項１または２に記載の遺伝的に改変された微生物。
【請求項４】
前記微生物が、リブロース−５−リン酸産生の上流の前記ペントースリン酸経路の酸化分岐を阻害するように遺伝的に改変されている、請求項２または３に記載の遺伝的に改変された微生物。
【請求項５】
前記外因性分子および／または前記内因性分子が、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ビタミン、ステロール、フラボノイド、テルペン、テルペノイド、脂肪酸、ポリオールおよび有機酸から選択される、請求項４に記載の遺伝的に改変された微生物。
【請求項６】
前記微生物が、真核細胞であり、酵母、真菌、微細藻類または原核細胞から選択的に選ばれ、優先的には細菌である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の遺伝的に改変された微生物。
【請求項７】
グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の発現が、少なくとも部分的に阻害されている、請求項１〜６のいずれか一項に記載の遺伝的に改変された微生物。
【請求項８】
ホスホグリセリン酸キナーゼをコードする遺伝子の発現が、少なくとも部分的に阻害される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の遺伝的に改変された微生物。
【請求項９】
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼまたは６−ホスホグルコノラクトナーゼまたは６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の発現が、少なくとも部分的に阻害されている、請求項７または８に記載の遺伝的に改変された微生物。
【請求項１０】
前記微生物が、機能性Ｉ型またはＩＩ型ＲｕＢｉｓＣＯと機能性ホスホリブロキナーゼ（ＰＲＫ）を発現するように遺伝的に改変されたサッカロミセス・セレビシエ属の酵母であって、ＴＤＨ１、ＴＤＨ２および／またはＴＤＨ３遺伝子の発現が少なくとも部分的に阻害されている、請求項１〜９のいずれか一項に記載の遺伝的に改変された微生物。
【請求項１１】
前記微生物が、機能性Ｉ型またはＩＩ型ＲｕＢｉｓＣＯと機能性ホスホリブロキナーゼ（ＰＲＫ）を発現するように遺伝的に改変されたサッカロミセス・セレビシエ酵母であって、ＰＧＫ１遺伝子の発現が少なくとも部分的に阻害されている、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の遺伝的に改変された微生物。
【請求項１２】
ＺＷＦ１遺伝子の発現が、少なくとも部分的に阻害されている、請求項１０または１１に記載の遺伝的に改変された微生物。
【請求項１３】
前記微生物が、機能性Ｉ型またはＩＩ型ＲｕＢｉｓＣＯと機能的ホスホリブロキナーゼ（ＰＲＫ）を発現するように遺伝的に改変されたアスペルギルス属の糸状菌であって、ｐｇｋ遺伝子およびｇｓｄＡ遺伝子の発現が少なくとも部分的に阻害されている、請求項１〜９のいずれか一項に記載の遺伝的に改変された微生物。
【請求項１４】
前記微生物が、機能性Ｉ型またはＩＩ型ＲｕＢｉｓＣＯと機能的ホスホリブロキナーゼ（ＰＲＫ）を発現するように遺伝的に改変された大腸菌であって、ｇａｐＡ遺伝子および／またはｐｇｋ遺伝子、ならびに任意にｚｗｆ遺伝子の発現が少なくとも部分的に阻害されている、請求項１〜９のいずれか一項に記載の遺伝的に改変された微生物。
【請求項１５】
アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ビタミン、ステロール、フラボノイド、テルペン、テルペノイド、脂肪酸、ポリオールおよび有機酸から選択的に選ばれる目的分子の産生または過剰産生のための、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の遺伝的に改変された微生物の使用。
【請求項１６】
グルタミン酸、クエン酸、イタコン酸またはＧＡＢＡの産生または過剰産生のための、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
少なくとも１つの目的分子を産生するための生物工学的方法であって、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の遺伝的に改変された微生物を、当該微生物によって前記目的分子の合成または生物変換を可能にする条件下で培養する工程と、任意に前記目的分子を回収および／または精製する工程とを含むことを特徴とする、方法。
【請求項１８】
前記目的分子が、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ビタミン、ステロール、フラボノイド、テルペン、テルペノイド、脂肪酸、ポリオールおよび有機酸から選択される、請求項１７に記載の生物工学的方法。
【請求項１９】
前記目的分子が、グルタミン酸、クエン酸、イタコン酸またはＧＡＢＡから選択される、請求項１７または１８に記載の生物工学的方法。
【請求項２０】
前記微生物が、前記目的分子の生物変換または合成に関与する少なくとも１つの酵素を発現するように遺伝的に改変されている、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の生物工学的方法。
【請求項２１】
前記微生物が、前記目的分子の分解に関与する酵素を少なくとも部分的に阻害するように遺伝的に改変されている、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の生物工学的方法。
【請求項２２】
目的分子を産生する方法であって、（ｉ）請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組換え微生物への前記目的分子の合成または生物変換に関与する酵素をコードする少なくとも１つの配列を挿入することと、（ｉｉ）前記酵素の発現を可能にする条件下で前記微生物を培養することと、任意に（ｉｉｉ）前記目的分子を回収および／または精製することとを含む、方法。
【請求項２３】
目的分子を産生する方法であって、（ｉ）請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組換え微生物への前記目的分子の分解に関与する酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現を阻害することと、（ｉｉ）前記酵素の発現を可能にする条件下で前記微生物を培養することと、任意に（ｉｉｉ）前記目的分子を回収および／または精製することとを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、目的分子の産生のために、少なくとも部分的な炭素源として二酸化炭素を使用することができる遺伝的に改変された微生物に関する。より具体的には、本発明は、少なくとも解糖経路が少なくとも部分的に阻害されている微生物に関する。本発明はまた、そのような微生物を使用した少なくとも１つの目的分子の産生のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
過去数年間にわたって、目的分子を大量に産生できるようにするために、多くの微生物学的プロセスが開発されてきた。
【０００３】
例えば、発酵プロセスは、グルコースなどの発酵性炭素源から微生物によって分子を産生するために使用される。
【０００４】
微生物において、当該微生物によって同化され得ない補助基質を目的分子に変換することを可能にする、生物変換プロセスも開発されてきた。この場合も、目的分子の実際の産生のためにではなく、生物変換に必要の可能性がある補因子、より具体的にはＮＡＤＰＨの産生のために、炭素源が必要とされる。一般に、そのような微生物学的プロセスの産生収率は、主に補因子の必要性とレドックス代謝反応のバランスを取ることの難しさゆえに低い。微生物によって同化され得る炭素源が依然として必要であるため、そのような分子の費用コストの価格の問題もある。言い換えれば、現在、微生物学的プロセスで目的分子を産生するためには、確かに低い工業的価値の分子（グルコースまたはその他）を提供する必要があるが、それは特定の分子の産生を経済的に魅力的でないものにするのに十分である。
【０００５】
同時に、大気中への排出が絶えず増加している二酸化炭素（ＣＯ２）は、現在の微生物学的プロセスでは、仮にあったとしてもほとんど使用されておらず、他方、目的分子の産生のための微生物による消費は、産生コストを削減するだけでなく、特定の生態学的問題にも対処する。
【０００６】
したがって、現在のプロセスよりも低価格で目的分子を大量に産生できる微生物学的プロセスが依然として求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
植物や光合成微生物と同じように、ＣＯ２を捕捉し、それを主要な炭素源として使用するように遺伝的に改変された非光合成微生物を使用する利点は既に実証されている。例えば、機能性ＲｕＢｉｓＣＯ（リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ−ＥＣ４．１．１．３９）と機能性ＰＲＫ（ホスホリブロキナーゼ−ＥＣ２．７．１．１９）を発現して部分カルビン回路を再現し、二酸化炭素分子を捕捉することによってリブロース−５−リン酸を２つの３−ホスホグリセリン酸分子に変換するように改変された微生物が開発されてきた。
【０００８】
炭素源としてＣＯ２を使用して目的分子を産生するためにカルビン回路によって提供される解決策に取り組むことにより、本発明者らは、カルビン回路の一部（ＰＲＫ／ＲｕＢｉｓＣＯ）を解糖の少なくとも部分的な阻害に結びつけることによって目的分子の産生収率を増加させることが可能であることを発見した。本発明者らはまた、ペントースリン酸経路の酸化分岐も少なくとも部分的に阻害することによって目的分子の産生中に外因性ＣＯ２の消費を増加させることが可能であることを発見した。このようにして開発された微生物は、アミノ酸、有機酸、テルペン、テルペノイド、ペプチド、脂肪酸、ポリオールおよびその他などの多数の目的分子を大規模かつ工業的に魅力的な収率で産生することを可能にする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
したがって、本発明は、機能性ＲｕＢｉｓＣＯ酵素および機能性ホスホリブロキナーゼ（ＰＲＫ）を発現し、解糖経路が少なくとも部分的に阻害されている遺伝的に改変された微生物に関し、当該微生物が、ＲｕＢｉｓＣＯ酵素またはホスホリブロキナーゼ酵素以外の、目的の外因性分子を産生および／または目的の内因性分子を過剰産生するように遺伝的に改変されている。
【００１０】
特定の一つの実施形態において、遺伝的に改変された微生物は、同じく少なくとも部分的に阻害されているペントースリン酸経路の酸化分岐を有する。
【００１１】
本発明はまた、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ビタミン、ステロール、フラボノイド、テルペン、テルペノイド、脂肪酸、ポリオールおよび有機酸から選択的に選ばれる目的分子の産生または過剰産生のための、本発明による遺伝的に改変された微生物の使用に関する。
【００１２】
本発明はまた、少なくとも１つの目的分子を産生または過剰産生するための生物工学的方法であって、本発明による遺伝的に改変された微生物を、当該微生物によって前記目的分子の合成または生物変換を可能にする条件下で培養する工程と、任意に前記目的分子を回収および／または精製する工程とを含んでなることを特徴とする方法に関する。
【００１３】
本発明はまた、目的分子を産生する方法であって、（ｉ）本発明による組換え微生物への前記目的分子の合成または生物変換に関与する酵素をコードする少なくとも１つの配列を挿入することと、（ｉｉ）前記酵素の発現を可能にする条件下で前記微生物を培養することと、任意に（ｉｉｉ）前記目的分子を回収および／または精製することとを含んでなる方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】解糖、ペントースリン酸経路およびＥｎｔｎｅｒ−Ｄｏｕｄｏｒｏｆｆ（エントナー−ドゥドロフ）経路の一般的な図である。
【図２】本発明による解糖経路の阻害の略図である。
【図３】本発明によるペントースリン酸経路の酸化分岐の阻害と組み合わせた解糖経路の阻害の略図である。
【００１５】
発明の詳細な説明
定義
「組換え微生物」、「改変された微生物」および「組換え宿主細胞」という用語は、本明細書で互換的に使用され、内因性ヌクレオチド配列を発現もしくは過剰発現し、異種ヌクレオチド配列を発現するように遺伝的に改変された微生物、または内因性遺伝子の変化した発現を有する微生物を指す。「変化」とは、遺伝子の発現、または１つ以上のポリペプチドもしくはポリペプチドサブユニットをコードするＲＮＡ分子もしくは同等のＲＮＡ分子のレベル、または１つ以上のポリペプチドもしくはポリペプチドサブユニットの活性が調節されることを意味することから、発現、レベルまたは活性は、改変がない場合に観察されるものよりも高くなるかまたは低くなる。
【００１６】
「組換え微生物」、「改変された微生物」および「組換え宿主細胞」という用語は、特定の組換え微生物だけでなく、そのような微生物の後代または潜在的な後代も指すと理解される。突然変異または環境の影響ゆえに、後続の世代でいくつかの改変が生じることがあるため、これらの子孫は母細胞と同一ではないこともあるが、ここで使用される用語の範囲内のまま理解される。
【００１７】
本発明の文脈において、少なくとも部分的に「阻害された」または「不活性化された」代謝経路とは、（前記代謝経路を阻害するように遺伝的に改変されていない）同じ野生型微生物と比較して、考慮される微生物でもはや適切に機能することができない変化した代謝経路を指す。特に、代謝経路が中断され、中間代謝物の蓄積につながることがある。そのような中断は、例えば、考慮される代謝経路の中間代謝産物の分解に必要な酵素を阻害すること、および／またはその酵素をコードする遺伝子の発現を阻害することによって達成され得る。代謝経路は、弱化、すなわち速度を落とすこともできる。そのような弱化は、例えば、考慮される代謝経路に関与する１つ以上の酵素を部分的に阻害すること、および／またはこれらの酵素の少なくとも１つをコードする遺伝子の発現を部分的に阻害すること、および／または特定の反応に必要な補因子を活用することによって達成され得る。「少なくとも部分的に阻害された代謝経路」という表現は、考慮される代謝経路のレベルが、野生型微生物のレベルと比較して少なくとも２０％、より優先的には少なくとも３０％、４０％、５０％以上減少していることを意味する。減少はより大きくてよく、特に少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％よりも大きくてよい。本発明によれば、考慮される代謝経路が前記微生物によってもはや全く使用されないという意味で、阻害は完全であり得る。本発明によれば、そのような阻害は一時的または永続的であり得る。
【００１８】
本発明によれば、「遺伝子発現の阻害」とは、考慮される微生物で遺伝子がもはや発現されないこと、または（遺伝子発現を阻害するように遺伝的に改変されていない）野生型微生物と比較してその発現が減少しており、対応するタンパク質の産生の欠乏もしくはその産生の有意な減少、特に２０％超、より優先的には３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％の減少につながることを意味する。一つの実施形態において、阻害は完全であり得、すなわち、前記遺伝子によってコードされるタンパク質はもはや全く産生されない。遺伝子発現の阻害は、考慮される遺伝子の１つ以上のヌクレオチドの欠失、突然変異、挿入および／または置換によって達成され得る。優先的には、遺伝子発現の阻害は、対応するヌクレオチド配列の完全な欠失によって達成される。本発明によれば、それ自体が当業者に知られており、微生物に適用可能な遺伝子阻害の任意の方法を使用することができる。例えば、遺伝子発現の阻害は、相同組換え（Ｄａｔｓｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０００；９７：６６４０−５；Ｌｏｄｉｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４ｔｈ  ｅｄ．２０００．Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ．ＩＳＢＮ  ０−７１６７−３１３６−３）；遺伝子発現および／またはコードされたタンパク質活性を改変するランダムまたは定方向突然変異誘発（Ｔｈｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．１９８７；５１：５０３−１２）；その発現を変化させる遺伝子のプロモーター配列の改変（Ｋａｕｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２０１１；７６５：２７５−９４．ｄｏｉ：１０．１００７／９７８−１−６１７７９−１９７−０＿１６）；ゲノム中の誘発局所病変の標的化（ＴＩＬＬＩＮＧ）；接合およびその他によって達成され得る。別の特定のアプローチは、例えば、天然または人工起源の可動性遺伝因子（トランスポゾン）を使用したトランスポゾン突然変異誘発による、外来配列の挿入による遺伝子不活性化である。別の好ましい実施形態によれば、遺伝子発現の阻害は、ノックアウト技術によって達成される。遺伝子発現の阻害はまた、干渉、リボザイムまたはアンチセンスＲＮＡを使用して遺伝子を消滅させることによって達成され得る（Ｄａｎｅｈｏｌｔ、２００６年、ノーベル生理学・医学賞）。本発明の文脈において、「干渉ＲＮＡ」または「ｉＲＮＡ」という用語は、標的遺伝子の発現を遮断および／または対応するｍＲＮＡの分解を促進することができる任意のｉＲＮＡ分子（例えば一本鎖ＲＮＡまたは二本鎖ＲＮＡ）を指す。遺伝子阻害はまた、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ；９３：１１５６−１１６０）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ、または「ＴＡＬＥＮ」（Ｏｕｓｔｅｒｏｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２０１６；１３３８：２７−４２．ｄｏｉ：１０．１００７／９７８−１−４９３９−２９３２−０＿３）、Ｃａｓ９ヌクレアーゼと、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピートとを組み合わせたシステム、または「ＣＲＩＳＰＲ」（Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，��ａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３  Ｏｃｔ；１０（１０）：９５７−６３．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．２６４９）、またはメガヌクレアーゼ（Ｄａｂｏｕｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１２．４０：６３６７−７９）を使用して、所定のゲノムの直接的な遺伝的に改変を可能にするゲノム編集方法によっても達成され得る。遺伝子発現の阻害はまた、前記遺伝子によってコードされたタンパク質を不活性化することにより達成され得る。
【００１９】
本発明の文脈において、「ＮＡＤＰＨ依存性」または「ＮＡＤＰＨ消費」生合成または生物変換とは、１つ以上の酵素がＮＡＤＰＨ補因子の酸化によって得られる電子の付随的な供給を必要とするすべての生合成または生物変換経路を意味する。「ＮＡＤＰＨ依存性」生合成または生物変換経路は、特に、アミノ酸（例えばアルギニン、リジン、メチオニン、トレオニン、プロリン、グルタミン酸、ホモセリン、イソロイシン、バリン）、γ−アミノ酪酸、テルペノイドおよびテルペン（例えばファルネセン）、ビタミンおよび前駆体（例えばパントイン酸、パントテン酸、トランスニューロスポレン、フィロキノン、トコフェロール）、ステロール（例えばスクアレン、コレステロール、テストステロン、プロゲステロン、コルチゾン）、フラボノイド（例えばフランビノン、ベスチノン（ｖｅｓｔｉｎｏｎｅ））、有機酸（例えばクエン酸、コハク酸、シュウ酸、イタコン酸、クマル酸、３−ヒドロキシプロピオン酸）、ポリオール（例えばソルビトール、キシリトール、グリセロール）、ポリアミン（例えばスペルミジン）、ＮＡＤＰ依存性シトクロムｐ４５０を介した立体特異的ヒドロキシル化からの芳香族分子（例えばフェニルプロパノイド、テルペン、脂質、タンニン、香料、ホルモン）の合成に関わる。
【００２０】
様々な分子（ヌクレオチド配列、ペプチド、酵素およびその他）に関して本明細書で使用される「外因性」という用語は、考慮される微生物に通常もしくは自然に見られない分子および／または考慮される微生物によって産生されない分子を指す。逆に、「内因性」または「天然」という用語は、考慮される微生物に通常もしくは自然に見られる分子および／または考慮される微生物によって産生される分子を示す様々な分子（ヌクレオチド配列、ペプチド、酵素およびその他）を指す。
【００２１】
微生物
本発明は、内因性または外因性の目的分子の産生のための遺伝的に改変された微生物を提案する。
【００２２】
「遺伝的に改変された」微生物とは、微生物のゲノムが改変されて、目的分子の生合成もしくは生物変換経路に関与する酵素、またはその生物学的に活性なフラグメントをコードする核酸配列を組み込むことを意味する。前記核酸配列は、任意の適切な分子クローニング法によって、前記微生物のゲノムまたはその祖先の１つに導入されていてもよい。本発明の文脈において、微生物のゲノムは、例えばプラスミド、エピソーム、合成染色体およびその他に含まれる染色体外遺伝物質をはじめとする、微生物に含まれるすべての遺伝物質を指す。導入された核酸配列は、異種配列、すなわち、前記微生物に自然に存在しないもの、または相同配列であってもよい。有利には、目的核酸配列を有する転写ユニットは、１つ以上のプロモーターの制御下で微生物のゲノムに導入される。そのような転写ユニットには、有利には、転写ターミネーターなどの通常の配列、および必要に応じて他の転写調節因子も含まれている。
【００２３】
本発明で使用可能なプロモーターには、構成的プロモーター、すなわち、ほとんどの細胞状態および環境条件で活性であるプロモーター、ならびに外因性の物理的または化学的刺激によって活性化または抑制され、したがってこれらの刺激の有無に応じて変動する発現状態を誘導する誘導性プロモーターが含まれている。例えば、微生物が酵母である場合、ＴＥＦ１、ＴＤＨ３、ＰＧＩ１、ＰＧＫ、ＡＤＨ１のうちの遺伝子のプロモーターなどの構成的プロモーターを使用することが可能である。酵母で使用することができる誘導性プロモーターの例は、ｔｅｔＯ−２、ＧＡＬ１０、ＧＡＬ１０−ＣＹＣ１、ＰＨＯ５である。
【００２４】
一般に、本発明による遺伝的に改変された微生物は、次の特徴を有する：
−  機能性ＲｕＢｉｓＣＯ（ＥＣ４．１．１．３９）の発現；
−  機能性ＰＲＫ（ＥＣ２．７．１．１９）の発現；
−  解糖の少なくとも部分的な阻害；および
−  目的分子の合成および／もしくは生物変換に関与する少なくとも１つの遺伝子の発現、ならびに／または目的分子の合成および／もしくは生物変換と競合する活性をコードする少なくとも１つの遺伝子の阻害。
【００２５】
本発明によれば、任意の微生物を使用することができる。優先的には、微生物は真核細胞であり、酵母、真菌、微細藻類または原核細胞から優先的には選択され、優先的には細菌またはシアノバクテリアである。
【００２６】
一つの実施形態において、本発明による遺伝的に改変された微生物は、子嚢菌（スペルモフトラ科およびサッカロミセス科）、担子菌類（ロイコスポリジウム属、ロドスポリジウム属、スポリジオボルス属、フィロバシジウム属およびフィロバシディエラ属）ならびに不完全菌類に属するデューテロミセテス酵母（スポロボロミケス科およびクリプトコッカス科）のうちから優先的には選択される酵母である。優先的には、本発明による遺伝的に改変された酵母は、ピキア属、クルイベロミセス属、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、カンジダ属、リポミセス属、ロドトルラ属、ロドスポリジウム属、ヤロウィア属またはデバリオミセス属に属する。より優先的には、本発明による遺伝的に改変された酵母は、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、クルイベロミセス・マルシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・カルスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・ディアスタチカス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロミセス・ダグラシー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロミセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロミセス・ノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・オビホルミス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）、シゾサッカロミセス・ポンペ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、ロドトルラ・グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ）、ロドスポリジウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、デバリオミセス・ハンゼニ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｈａｎｓｅｎｉｉ）およびリポミセス・スターキー（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｓｔａｒｋｅｙｉ）から選択される。
【００２７】
別の実施形態において、本発明による遺伝的に改変された微生物は真菌であり、より具体的には「糸状」真菌である。本発明の文脈において、「糸状真菌」は、ユーミコチナ亜門のすべての糸状形態を指す。例えば、本発明による遺伝的に改変された真菌は、アスペルギルス属、トリコデルマ属、ニューロスポラ属、ポドスポラ属、エンドシア属、ムコール属、コクリオボルス属またはイネいもち病菌に属する。優先的には、本発明による遺伝的に改変された真菌は、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗｏｍａｒｉ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）およびトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）から選択される。
【００２８】
別の実施形態において、本発明による遺伝的に改変された微生物は微細藻類である。本発明の文脈において、「微細藻類」は、優先的には網または上網である緑藻綱、黄金色綱、プリムネシオ藻綱、珪藻綱もしくは珪藻門、ユーグレナ藻綱、紅藻綱、またはトレボキシシオ藻綱に属する、すべての真核生物の微細藻類を指す。優先的には、本発明による遺伝的に改変された微細藻類は、ナノクロロプシス属（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓｐ．）（例えばナノクロロプシス・オクラタ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｏｃｕｌａｔｅ）、ナノクロロプシス・ガディタナ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｇａｄｉｔａｎａ）、ナノクロロプシス・サリナ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓａｌｉｎａ））、テトラセルミス属（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ  ｓｐ．）（例えばテトラセルミス・スエシカ（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ  ｓｕｅｃｉｃａ）、テトラセルミス・チュイ（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ  ｃｈｕｉｉ））、クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｐ．）（例えばクロレラ・サリナ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａ）、クロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）、クロレラ・エリプソイデア（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ）、クロレラ・エマゾーニ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）、クロレラ・ミヌチシマ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｍａ）、クロレラ・ピレノイドサ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ）、クロレラ・ソルキニアナ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）、クロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ））、クラミドモナス属（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）（例えばクラミドモナス・レインハルディ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ））、ドナリエラ属（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓｐ．）（例えばドナリエラ・テルチオレクタ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａ）、ドナリエラ・サリナ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａ））、フェオダクチラム・トリコルヌツム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｕｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）、ボツリオコッカス・ブラウニー（Ｂｏｔｒｙｃｏｃｃｕｓ  ｂｒａｕｎｉｉ）、クロオモナス・サリナ（Ｃｈｒｏｏｍｏｎａｓ  ｓａｌｉｎａ）、シクロテラ・クリプティカ（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａ）、シクロテラ属（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｓｐ．）、エットリア・テキセンシス（Ｅｔｔｌｉａ  ｔｅｘｅｎｓｉｓ）、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）、ギムノジニウム・ネルソニ（Ｇｙｍｎｏｄｉｎｉｕｍ  ｎｅｌｓｏｎ）、ヘマトコッカス・プルビアリス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）、イソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｇａｌｂａｎａ）、モノラフィディウム・ミヌツム（Ｍｏｎｏｒａｐｈｉｄｉｕｍ  ｍｉｎｕｔｕｍ）、モノラフィディウム属（Ｍｏｎｏｒａｐｈｉｄｉｕｍ  ｓｐ．）、ネオクロリス・オレアブンダンズ（Ｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｏｌｅｏａｂｕｎｄａｎｓ）、ニッチア・ラエビス（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ｌａｅｖｉｓ）、オノラフィディウム属（Ｏｎｏｒａｐｈｉｄｉｕｍ  ｓｐ．）、パブロバ・ルテリ（Ｐａｖｌｏｖａ  ｌｕｔｈｅｒｉ）、フェオダクチラム・トリコルヌツム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）、ポルフィリジウム・クルエンタム（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ  ｃｒｕｅｎｔｕｍ）、セネデスムス属（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ｓｐ．）（例えばセネデスムス・オブリカス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ｏｂｌｉｑｕｕｓ）、セネデスムス・クアドリカウラウラ（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ｑｕａｄｒｉｃａｕｌａｕｌａ）、セネデスムス属）、スティココッカス・バシラリス（Ｓｔｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｂａｃｉｌｌａｒｉｓ）、スピルリナ・プラテンシス（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）、タラシオシラ属（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｓｐ．）から選択される。
【００２９】
一つの実施形態において、本発明による遺伝的に改変された微生物は、優先的にはアシドバクテリア門、アクチノバクテリア門、アクウィフクス門、バクテロイデス門、クラミジア門、クロロビウム門、クロロフレクサス門、クリシオゲネス門、シアノバクテリア門、デフェリバクター門、デイノコッカス・テルムス門、ディクチオグロムス門、フィブロバクター門、フィルミクテス門、フソバクテリウム門、ゲンマティモナス門、ニトロスピラ門、プランクトミケス門、プロテオバクテリア門、スピロヘータ門、サーモデスルフォバクテリア門、テルモミクロビウム門、テルモトガ門またはウェルコミクロビウム門から選択される細菌である。好ましくは、本発明による遺伝的に改変された細菌は、アカリクロリス属、アセトバクター属、アクチノバシラス属、アグロバクテリウム属、アリシクロバシラス属、アナベナ属、アナシスティス属、アネロビオスピリウム属、アクウィフェクス属、アルスロバクター属、アルスロスピラ属、アゾバクター属、バシラス属、ブレビバクテリウム属、バークホルデリア属、クロロビウム属、クロマチウム属、クロロバキュラム属、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属、カプリアビダス属、シアノバクテリア属、エンテロバクター属、デイノコッカス属、エルウィニア属、エシェリキア属、ゲオバクター属、グロイオバクター属、グルコノバクタ−属、ハイドロゲノバクター属、クレブシエラ属、ラクトバシラス属、ラクトコッカス属、マンヘミア属、メソリゾビウム属、メチロバクテリウム属、マイコバクテリウム属、ミクロキスティス属、ニトロバクター属、ニトロソモナス属、ニトロスピナ属、ニトロスピラ属、ノストック属、フォルミディウム属、プロクロロコッカス属、シュードモナス属、ラルストニア属、リゾビウム属、ロドバクター属、ロドコッカス属、ロドシュードモナス属、ロドスピリルム属、サルモネラ属、セネデスムス属、セラチア属、シゲラ属、スタフィロコッカス属、ストレプトミセス属、シネココッカス属、シネコシスティス属、サーモシネココッカス属、トリコデスミウム属またはザイモモナス属に属する。また、好ましくは、本発明による遺伝的に改変された細菌は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス種（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、アグロバクテリウム・サクシニシプロデュセンス種（Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）、アグロバクテリウム・サクシノゲネス種（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、アクウィフェクス・エオリクス種（Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ）、アクウィフェクス・フィロフィルス種（Ａｑｕｉｆｅｘ  ｐｙｒｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・サブティリス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｎｅｓ）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス種（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、ブレビバクテリウム・イマリオフィラム種（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ）、クロストリジウム・パストゥリアヌム種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｅｕｒ���ａｎｕｍ）、クロストリジウム・リュングダリィ種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ）、クロストリジウム・アセトブチリクム種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、クロストリジウム・ベイジェリンキィ種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｇｅｒｉｎｃｋｉｉ）、コリネバクテリウム・グルタミクム種（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、カプリアビダス・ネカトール種（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ）、カプリアビダス・メタリデュランス種（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ）、エンテロバクター・サカザキ種（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓａｋａｚａｋｉｉ）、エシェリヒア・コリ種（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、グルコノバクター・オキシダンス種（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）、ハイドロゲノバクター・サーモフィルス種（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、クレブシエラ・オキシトカ種（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ）、ラクトコッカス・ラクティス種（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ラクトバチルス・プランタルム種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、マンヘミア・サクシニシプロデュセンス種（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）、メゾリゾビウム・ロティ種（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ）、シュードモナス・エルギノーザ種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・メバロニィ種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｖａｌｏｎｉｉ）、シュードモナス・プディカ種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｄｉｃａ）、シュードモナス・プチダ種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・フルオレッセンス種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、リゾビウム・エトリ種（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｅｔｌｉ）、ロドバクター・カプスラータ種（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）、ロドバクター・スフェロイデス種（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、ロドスピリルム・ルブルム種（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｒｕｂｒｕｍ）、サルモネラ・エンテリカ種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）、サルモネラ・エンテリカ種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）、サルモネラ・チフス種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）、サルモネラ・ティフィムリウム種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、シゲラ・ディセンテリアエ種（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、シゲラ・フレクスネリ種（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、シゲラ・ソンネ種（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ）、スタフィロコッカス・アウレウス種（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、ストレプトミセス・セリカラー種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ザイモモナス・モビリス種（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）、アカリクロリス・マリーナ種（Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｍａｒｉｎａ）、アナベナ・バリアビリス種（Ａｎａｂａｅｎａ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）、アルスロスピラ・プラテ���シス種（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）、アルスロスピラ・マキシマ種（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｍａｘａ）、クロロビウム・テピダム種（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ  ｔｅｐｉｄｕｍ）、クロロバキュラム属の種（Ｃｈｌｏｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ｓｐ．）、シアノバクテリア属の種（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ  ｓｐ．）、グロイオバクター・ビオラセウス種（Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｏｌａｃｅｕｓ）、ミクロキスティス・エルギノーサ種（Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ノストック・プンクチフォルメ種（Ｎｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ）、プロクロロコッカス・マリヌス種（Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ）、シネココッカス・エロンガトゥス種（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）、シネコシスティス属の種（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．）、サーモシネココッカス・エロンガトゥス種（Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）、トリコデスミウム・エリトラエウム種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ  ｅｒｙｔｈｒａｅｕｍ）およびロドシュードモナス・パルストリス種（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）から選択される。
【００３０】
機能性ＲｕＢｉｓＣＯおよび機能性ＰＲＫの発現
本発明によれば、微生物は、機能性ＲｕＢｉｓＣＯおよび機能性ＰＲＫを自然に発現することができる。これは、例えば、微細藻類および藍藻類などの光合成微生物の場合に当てはまる。
【００３１】
自然界にはＲｕＢｉｓＣＯのいくつかの形態がある（Ｔａｂｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｂｏｔ．２００８；５９（７）：１５１５−２４．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｊｘｂ／ｅｒｍ３６１）。Ｉ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型は、リブロース−１，５−二リン酸のカルボキシル化および酸素化反応を触媒する。Ｉ型は、真核生物および細菌に存在する。それは２つのタイプのサブユニットから成る：大サブユニット（ＲｂｃＬ）および小サブユニット（ＲｂｃＳ）。機能性酵素複合体は、８個のＬサブユニットと８個のＳサブユニットから成る十六量体である。これらのサブユニットの正しいアセンブリには、少なくとも１つの特定のシャペロン：ＲｂｃＸの介入も必要である（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１０  Ｊａｎ  １４；４６３（７２７８）：１９７−２０２．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０８６５１）。ＩＩ型は、主にプロテオバクテリア、古細菌（アーキアまたはアーキア・バクテリア）および渦鞭毛藻類に見られる。その構造はずっと単純である：それは（２つの同一のＲｂｃＬサブユニットによって形成された）ホモ二量体である。生物に応じて、Ｉ型ＲｕＢｉｓＣＯをコードする遺伝子は、ｒｂｃＬ／ｒｂｃＳ（例えばシネココッカス・エロンガトゥス）、またはｃｂｘＬＣ／ｃｂｘＳＣ、ｃｆｘＬＣ／ｃｆｘＳＣ、ｃｂｂＬ／ｃｂｂＳ（例えばカプリアビダス・ネカトール）と呼ばれることもある。生物に応じて、ＩＩ型ＲｕＢｉｓＣＯをコードする遺伝子は、一般にｃｂｂＭと呼ばれる（例えばロドスピリルム・ルブルム）。ＩＩＩ型は、古細菌に存在する。一般に、ＲｂｃＬサブユニットの二量体の形態で、または二量体の五量体で見られる。生物に応じて、ＩＩＩ型ＲｕＢｉｓＣＯをコードする遺伝子は、ｒｂｃＬ（例えばサーモコッカス・コダカレンシス）、ｃｂｂＬ（例えばハロバクテリウム属）と呼ばれることもある。
【００３２】
２つのクラスのＰＲＫが知られている：プロテオバクテリアに見られるクラスＩの酵素は八量体であり、シアノバクテリアや植物に見られるクラスＩＩの酵素は四量体または二量体である。生物に応じて、ＰＲＫをコードする遺伝子は、ｐｒｋ（例えばシネココッカス・エロンガトゥス）、ｐｒｋＡ（例えばクラミドモナス・レインハルディ）、ｐｒｋＢ（例えばエシェリキア・コリ（大腸菌））、ｐｒｋ１、ｐｒｋ２（例えばレプトリングビヤ属）、ｃｂｂＰ（例えばニトロバクター・ブルガリス）またはｃｆｘＰ（例えばカプリアビダス・ネカトール）と呼ばれることもある。
【００３３】
使用される微生物が機能性ＲｕＢｉｓＣＯおよび機能性ＰＲＫを自然に発現しない場合、前記微生物は、一般に異種ＲｕＢｉｓＣＯおよびＰＲＫを発現するように遺伝的に改変されている。有利には、そのような場合、微生物は、前記タンパク質をコードする配列、および有利には適切な転写因子を統合する１つ以上の発現カセットをそのゲノムに統合するように形質転換されている。発現すべきＲｕＢｉｓＣＯのタイプに応じて、ＲｕＢｉｓＣＯを形成するサブユニットの適切なアセンブリを促進するためには、微生物によって発現された１つ以上のシャペロンタンパク質を有する必要があることもある。これは、Ｉ型ＲｕＢｉｓＣＯの場合に特に当てはまり、機能性ＲｕＢｉｓＣＯを得るには、特定のシャペロン（Ｒｂｃｘ）およびジェネラリストシャペロン（ｇｅｎｅｒａｌｉｓｔ  ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ）（例えばＧｒｏＥＳやＧｒｏＥＬ）をコードする遺伝子の導入および発現が必要である。国際公開第２０１５／１０７４９６号は、機能性Ｉ型ＲｕＢｉｓＣＯおよびＰＲＫを発現するように酵母の遺伝的な改変の仕方を詳細に説明している。ＧＵＡＤＡＬＵＰＥ−ＭＥＤＩＮＡ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｆｕｅｌｓ，６，１２５，２０１３）に記載されている方法を参照することもできる。
【００３４】
一つの実施形態において、微生物は、一般にＩ型ＲｕＢｉｓＣＯを発現するように遺伝的に改変されている。別の実施形態において、微生物は、ＩＩ型ＲｕＢｉｓＣＯを発現するように遺伝的に改変されている。別の実施形態において、微生物は、ＩＩＩ型ＲｕＢｉｓＣＯを発現するように遺伝的に改変されている。
【００３５】
以下の表１および２に、例として、微生物を形質転換して機能性ＲｕＢｉｓＣＯおよび機能性ＰＲＫを発現させるために使用することができる、ＲｕＢｉｓＣＯおよびＰＲＫをコードする配列を示す。
【００３６】
【表１】
2020506723.tif 000002
【００３７】
【表２】
2020506723.tif 000003
【００３８】
解糖の阻害
本発明によれば、解糖経路は少なくとも部分的に阻害されていることから、微生物は、通常この代謝経路をもはや使用することができなくなる（図１−解糖）。言い換えれば、微生物は、（他の遺伝的改変とは無関係に）解糖経路が阻害されていない野生型微生物と同様にグルコースを同化する能力をもはや有していない。
【００３９】
特定の一つの実施形態において、微生物は、グリセルアルデヒド−３−リン酸（Ｇ３Ｐ）の産生の下流で解糖を全体的または部分的に阻害するように遺伝的に改変されている。
【００４０】
例えば、解糖は、１，３−ビホスホ−Ｄ−グリセリン酸（１，３−ＢＰＧ）の産生の上流または３−ホスホグリセリン酸（３ＰＧ）の産生の上流で阻害されている。
【００４１】
微生物に応じて、グリセルアルデヒド−３−リン酸（Ｇ３Ｐ）と３−ホスホグリセリン酸（３ＰＧ）との間で必要とされる反応は、（ｉ）同時に作用する２つの酵素、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．１２、略してＧＡＰＤＨもしくはまれにＧ３ＰＤＨ）およびホスホグリセリン酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．３、略してＰＧＫ）によって、または（ｉｉ）単一の非リン酸化グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ酵素（ＥＣ１．２．１．９、略してＧＡＰＮ）によって管理され得る。
【００４２】
グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）は、ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨのペアを反応の方向に電子供与体／受容体として使用して、Ｇ３Ｐから１，３−ビホスホ−Ｄ−グリセリン酸（１，３−ＢＰＧ）への可逆的変換を触媒する。生物に応じて、ＧＡＰＤＨをコードする遺伝子は、ｇａｐＡ、ｇａｐＢ、ｇａｐＣ（例えば大腸菌、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ））、ＧＡＰＤＨ、ＧＡＰＤ、Ｇ３ＰＤ、ＧＡＰＤＨＳ（例えばホモ・サピエンス）、ＴＤＨ１、ＴＤＨ２、ＴＤＨ３（例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、ｇａｐ、ｇａｐ２、ｇａｐ３（例えばマイコバクテリウム属、ノストック属）と呼ばれることもある。
【００４３】
ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）は、補因子としてＡＴＰ／ＡＤＰのペアを使用して、１，３−ＢＰＧから３ＰＧへの可逆的変換を触媒する。生物に応じて、ＰＧＫをコードする遺伝子は、ＰＧＫ、ＰＧＫ１、ＰＧＫ１、ＰＧＫ２、ＰＧＫ３、ｐｇｋＡ、ＰＧＫＢ、ＰＧＫＣ、ｃｂｂＫ、ｃｂｂＫＣ、ｃｂｂＫＰ（例えばカプリアビダス・ネカトール）と呼ばれることもある。
【００４４】
非リン酸化グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＮ）は、１，３−ＢＰＧを経由せずに、Ｇ３Ｐから３ＰＧへの変換を触媒する。この反応は、電子受容体として作用するＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨの補因子ペアの存在下で触媒される。生物に応じて、ＧＡＰＮをコードする遺伝子は、ＧＡＰＮ（例えばバチルス属、ストレプトコッカス属）、ＧＡＰＮ１（例えばクラミドモナス属）と呼ばれることもある。
【００４５】
特定の一例において、微生物は、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の発現が少なくとも部分的に阻害されるように遺伝的に改変されている。優先的には、遺伝子発現は完全に阻害されている。
【００４６】
あるいはまたはさらに、ホスホグリセリン酸キナーゼをコードする遺伝子の発現も少なくとも部分的に阻害され得る。優先的には、遺伝子発現は完全に阻害されている。
【００４７】
あるいは、微生物は、非リン酸化グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の発現が少なくとも部分的に阻害されるように遺伝的に改変されている。優先的には、遺伝子発現は完全に阻害されている。
【００４８】
以下の表３、４および５は、例として、標的微生物に応じて阻害され得るグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼおよび非リン酸化グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする配列を列挙する。当業者には、微生物に応じて、阻害すべき目的酵素にどの遺伝子が対応するかは公知である。
【００４９】
【表３】
2020506723.tif 000004
【００５０】
【表４】
2020506723.tif 000005
【００５１】
【表５】
2020506723.tif 000006
【００５２】
一般に、３−ホスホグリセリン酸（３ＰＧ）の産生は、本発明による遺伝的に改変された微生物では、解糖を介してもはや可能ではないか、少なくとも有意に減少している。
【００５３】
特定の例示的な実施形態において、微生物は、ＴＤＨ１（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：８５３３９５）、ＴＤＨ２（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：８５３４６５）および／またはＴＤＨ３遺伝子（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：８５３１０６）の発現が少なくとも部分的に阻害されているサッカロミセス・セレビシエ属の酵母である。
【００５４】
別の特定の例示的な実施形態において、微生物は、ＰＧＫ１遺伝子（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：５２３０）の発現が少なくとも部分的に阻害されているサッカロミセス・セレビシエ属の酵母である。
【００５５】
別の例示的な実施形態において、微生物は、ＰＧＫ１遺伝子（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：５２３０）の発現、ＴＤＨ１遺伝子（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：８５３３９５）、ＴＤＨ２（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：８５３４６５）および／またはＴＤＨ３遺伝子（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：８５３１０６）の発現が少なくとも部分的に阻害されているサッカロミセス・セレビシエ属の酵母である。
【００５６】
特定の例示的な実施形態において、微生物は、ｇａｐＡ遺伝子（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：９４７６７９）の発現が少なくとも部分的に阻害されている大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）である。
【００５７】
別の特定の例示的な実施形態において、微生物は、ｐｇｋ遺伝子（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：９４７４１４）の発現が少なくとも部分的に阻害されている大腸菌）である。
【００５８】
別の例示的な実施形態において、微生物は、ｐｇｋ遺伝子（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：９４７４１４）の発現および／またはｇａｐＡ遺伝子（遺伝子ＩＤ：９４７６７９）の発現が少なくとも部分的に阻害されている大腸菌である。
【００５９】
本発明によれば、機能性ＲｕＢｉｓＣＯおよび機能性ＰＲＫを発現する遺伝的に改変された微生物は、他方でペントースリン酸経路によって産生されるリブロース−５−リン酸からＣＯ２を捕捉することにより３ＰＧを産生することができる（図２）。
【００６０】
３ＰＧからピルビン酸への代謝に必要な酵素は微生物では阻害されないため、前記微生物は３ＰＧを代謝してピルビン酸とＡＴＰを産生することができる。
【００６１】
したがって、遺伝的に改変された微生物は、相補的な炭素源としてＣＯ２を使用してピルビン酸およびＮＡＤＰＨ補因子を産生することができる。
【００６２】
本発明の文脈において、「相補的」な炭素源とは、微生物が、ピルビン酸産生のための大部分のまたは主な炭素源を構成する、発酵性糖（グルコース、ガラクトース、スクロース、フルクトースおよびその他）によって提供される炭素原子に加えて、部分炭素源としてＣＯ２を使用することを意味する。
【００６３】
したがって、本発明による遺伝的に改変された微生物は、ピルビン酸（およびその後に続く目的分子）の産生のために、ペントースリン酸経路を介したグルコース代謝中に通常失われるＣＯ２を固定および使用することによって炭素収率を増加させることを可能にする。
【００６４】
ペントースリン酸経路の酸化分岐の阻害
特定の一つの実施形態において、本発明による遺伝的に改変された微生物はまた、ペントースリン酸経路の酸化分岐も少なくとも部分的に阻害されるように改変されている。
【００６５】
優先的には、微生物は、リブロース−５−リン酸産生の上流のペントースリン酸経路の酸化分岐を阻害するように遺伝的に改変されている（図１−ペントースリン酸経路）。
【００６６】
リブロース−５−リン酸（Ｒｕ５Ｐ）産生の上流のペントースリン酸経路の酸化分岐の中断は、グルコース−６−リン酸（Ｇ６Ｐ）からのＲｕ５Ｐ合成プロセスでの１つ以上の反応を特異的に標的とする。この合成は、一般に、３つの酵素の連続した作用によって触媒される：（ｉ）グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．４９、略してＧ６ＰＤＨ）、（ｉｉ）６−ホスホグルコノラクトナーゼ（ＥＣ３．１．１．３１、略してＰＧＬ）および（ｉｉｉ）６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．４４、略してＰＧＤ）。
【００６７】
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）は、ペントースリン酸経路の最初の反応、すなわち、グルコース−６−リン酸から６−ホスホグルコノラクトン（６ＰＧＬ）への酸化を触媒し、同時にＮＡＤＰ＋の１分子をＮＡＤＰＨに還元する。生物に応じて、Ｇ６ＰＤＨをコードする遺伝子は、Ｇ６ＰＤ（例えばホモ・サピエンスの）、Ｇ６ｐｄｘ（例えばムスクルス（Ｍｕｓｃｕｌｕｓ）の）、ｇｓｄＡ（例えばアスペルギルス・ニデュランスの）、ｚｗｆ（例えば大腸菌の）またはＺＷＦ１（例えばサッカロミセス・セレビシエの）と呼ばれることもある。
【００６８】
６−ホスホグルコノラクトナーゼ（ＰＧＬ）は、６ＰＧＬからの６−ホスホグルコン酸（６ＰＧＡ）の合成を触媒する加水分解酵素である。生物に応じて、ＰＧＬをコードする遺伝子は、ｐｇｌ（例えば大腸菌、シネコシスティス属の）、ｐｇｌｓ（例えばロドバクター科の細菌の）またはＳＯＬ（例えばサッカロミセス・セレビシエの）と呼ばれることもある。
【００６９】
６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＧＤ）は、６ＰＧＡからのＲｕ５Ｐの合成を触媒し、同時にＮＡＤＰ＋分子をＮＡＤＰＨに還元し、ＣＯ２分子を放出する酸化還元酵素である。生物に応じて、ＰＧＤをコードする遺伝子は、ｇｎｄ（例えば大腸菌、サッカロミセス・セレビシエの）、ＰＧＤ（例えばホモ・サピエンスの）、ｇｎｔＺ（例えばバチルス・サブティリスの）または６−ＰＧＤＨ（例えばラクトバチルス・パラコリノイデスの）と呼ばれることもある。
【００７０】
特定の一例において、微生物は、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の発現が少なくとも部分的に阻害されるように遺伝的に改変されている。優先的には、遺伝子発現は完全に阻害されている。
【００７１】
あるいはまたはさらに、微生物は、６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードする遺伝子の発現が少なくとも部分的に阻害されるように遺伝的に改変されている。優先的には、遺伝子発現は完全に阻害されている。
【００７２】
あるいはまたはさらに、微生物は、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の発現が少なくとも部分的に阻害されるように遺伝的に改変されている。優先的には、遺伝子発現は完全に阻害されている。
【００７３】
以下の表６、７および８は、例として、標的微生物に応じて阻害され得るグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、６−ホスホグルコノラクトナーゼおよび６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼをコードする配列を列挙する。当業者には、微生物に応じて、阻害すべき目的酵素にどの遺伝子が対応するかは公知である。
【００７４】
【表６】
2020506723.tif 000007
【００７５】
【表７】
2020506723.tif 000008
【００７６】
【表８】
2020506723.tif 000009
【００７７】
一般に、リブロース−５−リン酸（Ｒｕ５Ｐ）の産生は、本発明による遺伝的に改変された微生物では、ペントースリン酸経路を介してもはや可能ではないか、少なくとも有意に減少している。
【００７８】
特定の例示的な実施形態において、微生物は、ＺＷＦ１遺伝子の発現が少なくとも部分的に阻害されているサッカロミセス・セレビシエ属の酵母である。
【００７９】
特定の一例において、サッカロミセス・セレビシエ属の酵母は、ＴＤＨ１、ＴＤＨ２、ＴＤＨ３および／またはＰＧＫ１遺伝子の発現、ならびにＺＷＦ１遺伝子の発現が少なくとも部分的に阻害されるように遺伝的に改変されている。
【００８０】
別の特定の例示的な実施形態において、微生物は、ｚｗｆ遺伝子の発現が少なくとも部分的に阻害されている大腸菌属の細菌である。
【００８１】
特定の一例において、大腸菌属の細菌は、ｇａｐＡおよび／またはｐｇｋ遺伝子の発現、ならびにｚｗｆ遺伝子の発現が少なくとも部分的に阻害されるように遺伝的に改変されている。
【００８２】
別の例において、微生物は、ｐｇｋ遺伝子およびｇｓｄＡ遺伝子の発現が部分的に阻害されるように遺伝的に改変されたアスペルギルス・ニガーまたはアスペルギルス・テレウスなどのアスペルギルス属の糸状真菌である。
【００８３】
本発明によれば、機能性ＲｕＢｉｓＣＯおよび機能性ＰＲＫを発現し、その解糖経路およびペントースリン酸経路の酸化分岐が少なくとも部分的に阻害される遺伝的に改変された微生物は、解糖経路を介した３ＰＧの産生またはペントースリン酸経路の酸化分岐を介したＲｕ５Ｐの産生を行うことができなくなる。一方で、解糖の開始時（阻害の上流で）に産生されるフルクトース−６−リン酸（Ｆ６Ｐ）および／またはグリセルアルデヒド−３−リン酸（Ｇ３Ｐ）の産生を転換することによってＲｕ５Ｐを産生することができる。この産生は、微生物に自然に存在し、活性がある酵素トランスケトラーゼ（ＥＣ２．２．１．１）、トランスアルドラーゼ（ＥＣ２．２．１．２）、リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ＥＣ５．３．１．６）、およびリブロース−５−リン酸エピメラーゼ（ＥＣ５．１．３．１）のおかげで可能である（図３）。
【００８４】
本発明の微生物では３ＰＧからピルビン酸への代謝に必要な酵素が阻害されないため、前記微生物は３ＰＧを代謝してピルビン酸およびＡＴＰを産生することができる。
【００８５】
したがって、遺伝的に改変された微生物は、外因性ＣＯ２を相補的な炭素源として使用することによってピルビン酸を産生することができる。
【００８６】
したがって、本発明による遺伝的に改変された微生物は、ピルビン酸（およびその後に続く目的分子）の産生のために、外因性ＣＯ２を固定および使用することによって炭素収率を増加させることを可能にする。ここでも、炭素収率が増加する。
【００８７】
Ｅｎｔｎｅｒ−Ｄｏｕｄｏｒｏｆｆ経路の阻害
特定の一つの実施形態において、本発明による遺伝的に改変された微生物は、Ｅｎｔｎｅｒ−Ｄｏｕｄｏｒｏｆｆ経路を有し、これは少なくとも部分的に阻害されている。主に細菌（特にグラム陰性菌）に見られるこの経路は、グルコースからピルビン酸を産生するための解糖およびペントース経路に代わるものである。より正確には、この経路は、Ｐ−グルコン酸でペントースリン酸経路に接続し、特にピルビン酸で解糖をもたらす。
【００８８】
優先的には、微生物は、６−ホスホグルコン酸産生の下流のＥｎｔｎｅｒ−Ｄｏｕｄｏｒｏｆｆ経路反応を阻害するように遺伝的に改変されている。この阻害により、競合する可能性のある経路が排除され、ＰＲＫ／ＲｕＢｉｓＣＯエンジニアリングの基質として６−ホスホグルコン酸の利用可能性が確保される。
【００８９】
６−ホスホグルコン酸産生の下流のＥｎｔｎｅｒ−Ｄｏｕｄｏｒｏｆｆ経路の中断は、６−ホスホグルコン酸からのピルビン酸合成プロセスでの１つ以上の反応を特異的に標的とする。この合成は、２つの酵素：（ｉ）６−ホスホグルコン酸デヒドラターゼ（「ＥＤＤ」−ＥＣ．４．２．１．１２）および（ｉｉ）２−デヒドロ−３−デオキシ−ホスホグルコン酸アルドラーゼ（「ＥＤＡ」−Ｅ．Ｃ．４．１．２．１４）の連続的な作用によって開始される。
【００９０】
６−ホスホグルコン酸デヒドラターゼは、６−ホスホグルコン酸から２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸への脱水を触媒する。生物に応じて、６−ホスホグルコン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子は、ｅｄｄ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿４１６３６５、例えば大腸菌の）またはｉｌｖＤ（例えばマイコバクテリウム属の）と呼ばれることもある。
【００９１】
２−デヒドロ−３−デオキシ−ホスホグルコン酸アルドラーゼは、６−ホスホグルコン酸デヒドラターゼによって産生される２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸からのピルビン酸分子およびグリセルアルデヒド−３−リン酸分子の合成を触媒する。生物に応じて、２−デヒドロ−３−デオキシ−ホスホグルコン酸アルドラーゼをコードする遺伝子は、ｅｄａ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿４１６３６４、例えば大腸菌の）またはｋｄｇＡ（例えばサーモプロテウス・テナクスの）またはｄｇａＦ（例えばサルモネラ・ティフィムリウムの）と呼ばれることもある。
【００９２】
特定の一例において、微生物は、６−ホスホグルコン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子の発現が少なくとも部分的に阻害されるように遺伝的に改変されている。優先的には、遺伝子発現は完全に阻害されている。
【００９３】
あるいはまたはさらに、微生物は、２−デヒドロ−３−デオキシ−ホスホグルコン酸アルドラーゼをコードする遺伝子の発現が少なくとも部分的に阻害されるように遺伝的に改変されている。優先的には、遺伝子発現は完全に阻害されている。
【００９４】
以下の表９および１０は、例として、標的微生物に応じて阻害され得る６−ホスホグルコン酸デヒドラターゼおよび２−デヒドロ−３−デオキシ−ホスホグルコン酸アルドラーゼをコードする配列を列挙する。当業者には、微生物に応じて、阻害すべき目的酵素にどの遺伝子が対応するかは公知である。
【００９５】
【表９】
2020506723.tif 000010
【００９６】
【表１０】
2020506723.tif 000011
【００９７】
一般に、この実施形態において、ピルビン酸の産生は、Ｅｎｔｎｅｒ−Ｄｏｕｄｏｒｏｆｆ経路を介してもはや可能ではないか、少なくとも有意に減少している。
【００９８】
特定の例示的な実施形態において、微生物は、ｅｄｄ遺伝子の発現が少なくとも部分的に阻害されている大腸菌属の細菌である。
【００９９】
特定の一例において、大腸菌の細菌は、ｇａｐＡおよびｅｄｄ遺伝子の発現が少なくとも部分的に阻害されるように遺伝的に改変されている。
【０１００】
本発明によれば、機能性ＲｕＢｉｓＣＯおよび機能性ＰＲＫを発現し、その解糖経路およびＥｎｔｎｅｒ−Ｄｏｕｄｏｒｏｆｆ経路が少なくとも部分的に阻害されている遺伝的に改変された微生物は、解糖によって３ＰＧまたはＥｎｔｎｅｒ−Ｄｏｕｄｏｒｏｆｆ経路によってピルビン酸をもはや産生することができない。したがって、グルコースからの炭素流は、ＰＲＫ／ＲｕＢｉｓＣＯエンジニアリングに向けられることが好ましい。
【０１０１】
目的分子の産生
本発明によれば、遺伝的に改変された微生物は、目的の外因性分子の産生および／または目的の内因性分子の過剰産生を行うように形質転換されている。
【０１０２】
本発明の文脈において、目的分子は、優先的には０．８ｋＤａ以下の分子量を有する小さな有機分子を指す。
【０１０３】
一般に、上記のように微生物に加えられた遺伝的改変は、目的分子の合成および／または生物変換経路の炭素収率を改善する。
【０１０４】
本発明の文脈において、「改善された」収率は、最終産物の量を指す。一般に、本発明の文脈において、炭素収率は、特に重量による発酵性糖の量に対する最終製品の量の比率に対応する。本発明によれば、炭素収率は、本発明による遺伝的に改変された微生物では、同一の培養条件下に置かれた野生型微生物と比較して増加する。有利には、炭素収率は、２％、５％、１０％、１５％、１８％、２０％以上増加する。本発明による遺伝的に改変された微生物は、単純にその分子を産生または過剰産生するように遺伝的に改変された微生物によって産生される異種分子よりも大量の目的分子（最終産物）を産生することができる。本発明によれば、遺伝的微生物はまた、野生型微生物と比較して内因性分子を過剰産生することができる。内因性分子の過剰産生は、主に量の観点から理解される。有利には、遺伝的に改変された微生物は、野生型微生物よりも少なくとも２０重量％、３０重量％、４０重量％、５０重量％以上の内因性分子を産生する。有利には、本発明による微生物は、アミノ酸、テルペノイド、テルペン、ビタミンおよび／またはビタミン前駆体、ステロール、フラボノイド、有機酸、ポリオール、ポリアミン、ＮＡＤＰ依存性チトクロムｐ４５０およびその他を介した立体特異的ヒドロキシル化から得られる芳香族分子のうちの少なくとも１つの分子を産生または過剰産生するように遺伝的に改変されている。
【０１０５】
特定の一例において、微生物は、アルギニン、リジン、メチオニン、トレオニン、プロリン、グルタミン酸、ホモセリン、イソロイシン、バリンおよびγ−アミノ酪酸から優先的には選択される少なくとも１つのアミノ酸を過剰産生するように遺伝的に改変されている。
【０１０６】
特定の一例において、微生物は、ファルネセンなどのテルペノイド経路、およびテルペン経路から分子を産生または過剰産生するように遺伝的に改変されている。
【０１０７】
特定の一例において、微生物は、パントイン酸、パントテン酸、トランスニューロスポレン、フィロキノンおよびトコフェロールから優先的には選択されるビタミンまたは前駆体を産生または過剰産生するように遺伝的に改変されている。
【０１０８】
特定の一例において、微生物は、スクアレン、コレステロール、テストステロン、プロゲステロンおよびコルチゾンから優先的には選択されるステロールを産生または過剰産生するように遺伝的に改変されている。
【０１０９】
特定の一例において、微生物は、フラビノンおよびベスチノンから優先的には選択されるフラボノイドを産生または過剰産生するように遺伝的に改変されている。
【０１１０】
特定の一例において、微生物は、クマル酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、クエン酸、シュウ酸、コハク酸およびイタコン酸から優先的には選択される有機酸を産生または過剰産生するように遺伝的に改変されている。
【０１１１】
特定の一例において、微生物は、ソルビトール、キシリトールおよびグリセロールから優先的には選択されるポリオールを産生または過剰産生するように遺伝的に改変されている。
【０１１２】
特定の一例において、微生物は、ポリアミン、優先的にはスペルミジンを産生または過剰産生するように遺伝的に改変されている。
【０１１３】
特定の一例において、微生物は、フェニルプロパノイド、テルペン、脂質、タンニン、香料、ホルモンから優先的には選択される、ＮＡＤＰ依存性シトクロムｐ４５０を介した立体特異的ヒドロキシル化からの芳香族分子を産生または過剰産生するように遺伝的に改変されている。
【０１１４】
目的分子が生物変換によって得られる場合、遺伝的に改変された微生物は、有利には、変換すべき基質を含む培地で培養される。一般に、本発明による遺伝的に改変された微生物による目的分子の産生または過剰産生は、当業者に知られている適切な培地で前記微生物を培養することによって得られる。
【０１１５】
「適切な培地」という用語は、一般に、炭素源；硫酸アンモニウムなどのニトロゲン源；蛍光体の供給源、例えば一塩基性リン酸カリウム；微量元素、例えば銅、ヨウ化物、鉄、マグネシウム、亜鉛またはモリブデン酸の塩；ビタミン、およびアミノ酸または他の増殖促進物質などの他の増殖因子などの前記微生物の維持および／または増殖のための必須または有益な栄養素を提供する滅菌培地を指す。必要に応じてアンチフォーム剤を追加してもよい。本発明によれば、この適切な培地は、化学的に定義されたものでも複雑なものであってもよい。したがって、培地は、Ｖｅｒｄｕｙｎら（Ｙｅａｓｔ．１９９２．８：５０１−１７）によって定義され、Ｖｉｓｓｅｒら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．２００２．７９：６７４−８１）によって適合された、または酵母ニトロゲンベース（ＹＮＢ）培地（ＭＰ  ＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓもしくはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）などの市販されている合成培地と組成が同一もしくは類似していてもよい。
【０１１６】
特に、培地は、グルコース、ガラクトース、スクロース、糖蜜、またはこれらの糖の副産物などの単純な炭素源を含んでいてもよく、任意に炭素共基質としてＣＯ２が補充されている。本発明によれば、単純な炭素源は、目的微生物の正常な増殖を可能にしなければならない。場合によっては、リグノセルロース系バイオマス、稲わらまたはデンプンなどの複雑な炭素源を使用することも可能である。複雑な炭素源の使用には、通常、使用前に前処理が必要とされる。
【０１１７】
特定の一つの実施形態において、培地は、グルコース、キシロースまたはアラビノースなどの単糖、スクロースなどの二糖、酢酸、酪酸、プロピオン酸または吉草酸などの有機酸のうちの少なくとも１つの炭素源を含み、異なる種類のポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）、処理されたまたは未処理のグリセロールを促進する。
【０１１８】
産生および／または過剰産生すべき分子に応じて、栄養因子（Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｓ、Ｋ、Ｍｇ、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｃａ、Ｓｎ：Ｋｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ，Ｇ．−Ｑ．Ｃｈｅｎ，１４：８５−１１９，（２０１０））の供給を活用することができる。これは特に、ポリヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）をはじめとするポリヒドロアルカン酸（ＰＨＡ）の合成および細胞内蓄積を促進することに当てはまる。
【０１１９】
本発明によれば、目的分子の工業規模での産生を可能にする任意の培養方法を考慮することができる。有利には、培養は、バイオリアクターで、特にバッチ、流加および／または連続培養モードで行われる。優先的には、目的分子の産生に関連する培養は、例えば濃度が２００ｇ／Ｌ〜７００ｇ／Ｌの間であり得る濃縮グルコース溶液を加えることによる、１つ以上の基質の制御された供給に対応する流加モードである。プロセス中のビタミンの制御された供給はまた、産生性にとって有益である（Ａｌｆｅｎｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００２．６０：６７−７２）。アンモニウム塩溶液を加えて、ニトロゲンの供給を制限することも可能である。
【０１２０】
発酵は、一般にバイオリアクターで、エルレンマイヤーフラスコでの固体および／または液体前培養の可能な工程を伴って、目的分子の産生のために必要な少なくとも単純な炭素源および／または外因性ＣＯ２供給を含む適切な培地により行われる。
【０１２１】
一般に、本発明による微生物の培養条件は、微生物および／または産生／過剰産生すべき分子に応じて、当業者によって容易に適応可能である。例えば、培養温度は、酵母の場合、２０℃〜４０℃、好ましくは２８℃〜３５℃であり、より詳細には、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の場合、約３０℃である。培養温度は、カプリアビダス・ネカトールの場合、２５℃〜３５℃、好ましくは３０℃である。
【０１２２】
したがって、本発明はまた、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ビタミン、ステロール、フラボノイド、テルペン、テルペノイド、脂肪酸、ポリオールおよび有機酸から優先的には選択される目的分子の産生または過剰産生のための、本発明による遺伝的に改変された微生物の使用に関する。
【０１２３】
本発明はまた、少なくとも１つの目的分子を産生する生物工学的方法であって、本発明による遺伝的に改変された微生物を、前記微生物によって前記目的分子の合成または生物変換を可能にする条件下で培養する工程と、任意に前記目的分子を回収および／または精製する工程とを含むことを特徴とする方法に関する。
【０１２４】
特定の一つの実施形態において、微生物は、前記目的分子の合成に関与する少なくとも１つの酵素を発現するように遺伝的に改変されている。
【０１２５】
別の特定の実施形態において、微生物は、前記目的分子の生物変換に関与する少なくとも１つの酵素を発現するように遺伝的に改変されている。
【０１２６】
本発明はまた、目的分子を産生する方法であって、（ｉ）本発明による組換え微生物への前記目的分子の合成または生物変換に関与する酵素をコードする少なくとも１つの配列を挿入することと、（ｉｉ）前記酵素の発現を可能にする条件下で前記微生物を培養することと、任意に（ｉｉｉ）前記目的分子を回収および／または精製することとを含む方法に関する。
【０１２７】
例えば、真菌、特に糸状真菌、例えば機能性ＰＲＫと機能性Ｉ型またはＩＩ型ＲｕＢｉｓＣＯを発現するように遺伝的に改変され、かつｐｇｋ（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：４９８２５３９）およびｇｓｄＡ遺伝子（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：４９７９７９７５１）の発現が少なくとも部分的に阻害されているアスペルギルス・ニガーよってクエン酸を過剰産生することが可能である。
【０１２８】
また、真菌、特に糸状真菌、例えば機能性ＰＲＫと機能性Ｉ型またはＩＩ型ＲｕＢｉｓＣＯを発現するように遺伝的に改変され、かつｐｇｋ遺伝子（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：４３５４９７３）およびｇｓｄＡ遺伝子（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：４３１６２３２）の発現が少なくとも部分的に阻害されているアスペルギルス・テレウスまたはアスペルギルス・ニガーよってイタコン酸を過剰産生することが可能である。
【０１２９】
同様に、酵母、例えば機能性ＰＲＫと機能性Ｉ型またはＩＩ型ＲｕＢｉｓＣＯ、ファルネセンシンターゼを発現するように遺伝的に改変され、かつＰＧＫ１遺伝子（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：５２３０）の発現が少なくとも部分的に阻害されているサッカロミセス・セレビシエの酵素によってファルネセンを過剰産生することが可能である。
【０１３０】
また、細菌、例えば機能性ＰＲＫと機能性Ｉ型またはＩＩ型ＲｕＢｉｓＣＯを発現するように遺伝的に改変され、かつｇａｐＡ遺伝子（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：９４７６７９）の発現が少なくとも部分的に阻害されている大腸菌属の細菌によってグルタミン酸を過剰産生することが可能である。この過剰産生は、ｇａｐＡ遺伝子の少なくとも部分的な阻害がｚｗｆ遺伝子（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：９４６３７０）の少なくとも部分的な阻害と組み合わされている株でも発生し得る。
【０１３１】
同様に、細菌、例えば機能性ＰＲＫと機能性Ｉ型またはＩＩ型ＲｕＢｉｓＣＯ、ならびにグルタミン酸デカルボキシラーゼｇａｄＢ（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：９４６０５８）を発現するように遺伝的に改変され、かつｇａｐＡ遺伝子（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：９４７６７９）の発現が少なくとも部分的に阻害されている大腸菌属の細菌によってγ−アミノ酪酸を過剰産生することが可能である。この過剰産生は、ｇａｐＡ遺伝子の少なくとも部分的な阻害がｚｗｆ遺伝子（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：９４６３７０）の少なくとも部分的な阻害と組み合わされている株でも発生し得る。
【０１３２】
同様に、細菌、例えば機能性ＰＲＫと機能性Ｉ型またはＩＩ型ＲｕＢｉｓＣＯ、ならびにグリオキシル酸からシュウ酸への酸化を可能にする酵素活性、優先的にはグリオキシル酸デヒドロゲナーゼＦＰＧＬＯＸＤＨ１（ｍＲＮＡ：ＢＡＨ２９９６４．１）、グリオキシル酸オキシダーゼＧＬＯ（ｍＲＮＡ：ＡＯＷ７３１０６．１）または乳酸デヒドロゲナーゼＬＤＨＡ（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：３９３９）を発現するように遺伝的に改変され、かつｇａｐＡ遺伝子（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：９４７６７９）およびｚｗｆ遺伝子（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：９４６３７０）の発現が少なくとも部分的に阻害されている大腸菌属の細菌によってコハク酸およびシュウ酸を過剰産生することが可能である。
【実施例】
【０１３３】
例１：バイオインフォマティクス解析
ａ）理論収率の計算
ｉ）ペントースリン酸経路および解糖を使用する野生型株と本発明による改変株との間のグルコースからの炭素固定収率の比較
【０１３４】
本発明に従って記載される改変の利点を評価するために、関与する反応の化学量論に基づいて理論収率計算を行った。
【０１３５】
２つのシナリオを解析した：ＰＲＫ−ＲｕＢｉｓＣＯエンジニアリングによって提供される改善（ｉ）ＮＡＤＰＨ依存性生合成経路（例えばファルネセン合成）の収率に対する解糖阻害株、および（ｉｉ）解糖および目的生合成経路（例えばクエン酸合成）の収率に対するペントースリン酸経路の酸化分岐阻害株。
【０１３６】
ＮＡＤＰＨ依存生合成経路の改善の文脈において、ペントースリン酸経路を介したグルコースからのＮＡＤＰＨおよびグリセルアルデヒド−３−リン酸（Ｇ３−Ｐ）の形成の理論平衡は、次の式（１）に従って計算した：
（１）３グルコース＋５ＡＴＰ＋６ＮＡＤＰ＋＋３Ｈ２Ｏ→５Ｇ３−Ｐ＋５ＡＤＰ＋６ＮＡＤＰＨ＋１１Ｈ＋＋３ＣＯ２
Ｇ３Ｐからピルビン酸形成に進むと、次の平衡に到達する：
（２）３グルコース＋５ＡＤＰ＋６ＮＡＤＰ＋＋５ＮＡＤ＋＋５Ｐｉ→５ピルビン酸＋５ＡＴＰ＋６ＮＡＤＰＨ＋５ＮＡＤＨ＋１１Ｈ＋＋３ＣＯ２＋２Ｈ２Ｏ
１モルのグルコースの平衡を正規化すると、次の収率が得られる：
（３）グルコース＋１．６７ＡＤＰ＋２ＮＡＤＰ＋＋１．６７ＮＡＤ＋＋１．６７Ｐｉ→１．６７ピルビン酸＋１．６７ＡＴＰ＋２ＮＡＤＰＨ＋１．６７ＮＡＤＨ＋３．６７Ｈ＋＋ＣＯ２＋０．６７Ｈ２Ｏ
【０１３７】
したがって、ペントースリン酸経路を使用することによって、１モルのグルコースから１．６７モルのピルビン酸と２モルのＮＡＤＰＨが産生される。しかしながら、リブロース−５−リン酸が６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．４４）によって形成されると、脱炭酸によって１モルの炭素が失われる。それと比較して、解糖経路によるピルビン酸形成は、次の収率を与える：
（４）グルコース＋２ＡＤＰ＋２ＮＡＤ＋＋２Ｐｉ→２ピルビン酸＋２ＡＴＰ＋２ＮＡＤＨ＋２Ｈ＋＋２Ｈ２Ｏ
【０１３８】
したがって、ペントースリン酸経路によるピルビン酸産生の理論上の最大収率は０．８２ｇピルビン酸／ｇグルコース（消費されたグルコース１ｇ当たりの合成ピルビン酸のｇ数）であり、解糖経路では０．９８ｇピルビン酸／ｇグルコースである。
【０１３９】
ＰＲＫ／ＲｕＢｉｓＣＯエンジニアリングを解糖系阻害株（例えばサッカロミセス・セレビシエ酵母のΔＰＧＫ１）に統合することによって、炭素固定フラックスはペントースリン酸経路の酸化分岐にリダイレクトされ、次いでＰＲＫ／ＲｕＢｉｓＣＯエンジニアリングにリダイレクトされる（図２を参照）。このフラックスは、次の収率で、３−ホスホグリセリン酸（３ＰＧ）形成のレベルでの解糖経路の終わりに関連している：
（５）グルコース＋２ＡＴＰ＋２ＮＡＤＰ＋＋２Ｈ２Ｏ→２３ＰＧ＋２ＡＤＰ＋２ＮＡＤＰＨ＋６Ｈ＋
３ＰＧからピルビン酸形成に進むと、次の平衡に到達する：
（６）グルコース＋２ＮＡＤＰ＋→２ピルビン酸＋２ＮＡＤＰＨ＋４Ｈ＋
【０１４０】
本発明による改変を微生物に統合することにより、ペントース経路での脱炭酸によって失われる炭素分子を回収することが可能になる。したがって、ＮＡＤＰＨを産生している間の理論上の最大炭素固定収率は０．９８ｇピルビン酸／ｇグルコースであり、ペントースリン酸経路によるピルビン酸の産生によって得られる収率が２０．５％改善される。
【０１４１】
２つ目のケース（図３を参照）では、ＰＲＫ／ＲｕＢｉｓＣＯエンジニアリングは、解糖（例えばサッカロミセス・セレビシエ酵母の場合はΔＰＧＫ１）とペントースリン酸経路の酸化分岐（例えばサッカロミセス・セレビシエ酵母の場合はΔＺＷＦ１）の両方について阻害されている株に統合されている。その場合、グルコースからのＮＡＤＰＨおよび３−ホスホグリセリン酸（３ＰＧ）の形成の理論平衡は、
（７）２．５グルコース＋６ＡＴＰ＋３ＣＯ２＋３Ｈ２Ｏ→６３ＰＧ＋６ＡＤＰ＋１２Ｈ＋
３ＰＧからピルビン酸形成に進むと、次の平衡に到達する：
（８）２．５グルコース＋３ＣＯ２→６ピルビン酸＋３Ｈ２Ｏ＋６Ｈ＋
１モルのグルコースの平衡を正規化すると、次の収率が得られる：
（９）グルコース＋１．２ＣＯ２→２．４ピルビン酸＋１．２Ｈ２Ｏ＋２．４Ｈ＋
【０１４２】
本発明による改変を統合することにより、消費された１モルのグルコース当たり１．２個の追加の炭素分子を固定することが可能になる。対応する理論上の最大収率は１．１７ｇピルビン酸／ｇグルコースであり、解糖の炭素固定収率と比較して約２０％が改善されている。
【０１４３】
ｉｉ）クエン酸産生への適用
２つ目のケースでは、サッカロミセス・セレビシエ酵母、野生型株、およびＰＲＫ／ＲｕＢｉｓＣＯエンジニアリングを組み込んで本発明に従って改変され、かつ解糖経路を阻害するようにＰＧＫ１遺伝子が欠失され、ペントース経路の酸化分岐を阻害するＺＷＦ１遺伝子が欠失された改変株でのクエン酸産生に計算が適用される。
【０１４４】
ピルビン酸からのクエン酸の産生は、次の平衡式によって要約される：
（１１）２ピルビン酸＋ＡＴＰ＋ＮＡＤ＋＋２Ｈ２Ｏ→クエン酸＋ＡＤＰ＋ＮＡＤＨ＋Ｐｉ＋３Ｈ＋
【０１４５】
この合成にはＮＡＤＰＨは必要とされないが、２モルのピルビン酸が必要とされる。最適には、野生型株は、次の平衡で、これら２モルのピルビン酸を式（４）に従って１モルのグルコースから解糖により得る：
（１２）グルコース＋ＡＤＰ＋３ＮＡＤ＋＋Ｐｉ→クエン酸＋ＡＴＰ＋３ＮＡＤＨ＋５Ｈ＋
【０１４６】
対応するｇピルビン酸／ｇグルコース収率は１．０７である。
【０１４７】
解糖経路およびペントースリン酸経路について阻害された本発明による改変株の文脈において、必要とされる２つのピルビン酸は、次の平衡で、わずか０．８３モルのグルコースで得られる（式９を参照）：
（１３）０．８３グルコース＋ＣＯ２＋ＡＴＰ＋ＮＡＤ＋＋Ｈ２Ｏ→クエン酸＋ＡＤＰ＋ＮＡＤＨ＋Ｐｉ＋５Ｈ＋
【０１４８】
対応するｇピルビン酸／ｇグルコース収率は１．２８であり、野生型株の収率と比較して理論上の最大増加は約２０％である。
【０１４９】
ｂ）フラックス平衡解析による生合成収率のシミュレーション
バイオインフォマティクスによるアプローチでは、フラックス平衡解析（ＦＢＡ）も実施して、本発明に従って記載される改変が異なる生合成経路の収率に与える影響をシミュレートした。
【０１５０】
ＦＢＡは、ゲノム規模で代謝ネットワークをシミュレートする数理モデルに基づいている（Ｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１０；２８：２４５−２４８）。再構築されたネットワークには、所定の生物の既知の代謝反応が含まれ、特に細胞の維持または増殖を確保するために、細胞のニーズが統合される。ＦＢＡにより、これらのネットワークを介した代謝産物の流量を計算することが可能になるため、理論増殖速度と代謝産物の産生収率の両方の予測をすることが可能になる。
【０１５１】
ｉ）手順
ＦＢＡシミュレーションは、ＯｐｔＦｌｕｘソフトウェア（Ｒｏｃｈａ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｓｙｓｔ  Ｂｉｏｌ．２０１０  Ａｐｒ  １９；４：４５．ｄｏｉ：１０．１１８６／１７５２−０５０９−４−４５）と、サッカロミセス・セレビシエ代謝モデルｉＭＭ９０４（Ｍｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｓｙｓｔ  Ｂｉｏｌ．２００９  Ｍａｒ  ２５；３：３７．ｄｏｉ：１０．１１８６／１７５２−０５０９−３７）を用いて実施した。このモデルは、（ｉ）ＰＲＫ型反応の追加、（ｉｉ）ＲｕＢｉｓＣＯ型反応の追加を伴う異種ＣＯ２固定経路を含む、本発明に従って記載される改善を含むように改変した。
【０１５２】
特定の例示的な実施形態において、異種経路を介した分子の産生をシミュレートするのに必要な反応もモデルに追加した。
【０１５３】
特定の例示的な実施形態において、ファルネセンの異種産生のために、ファルネセンシンターゼ反応（ＥＣ４．２．３．４６またはＥＣ４．２．３．４７）を追加した。
【０１５４】
第２の特定の例示的な実施形態において、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．１．１．３６）およびポリヒドロキシ酪酸シンターゼ（ＥＣ２．３．１．Ｂ２または２．３．１．Ｂ５）反応をモデルに追加して、ポリヒドロキシ酪酸のモノマーであるβ−ヒドロキシ酪酸の異種産生経路をシミュレートした。
【０１５５】
別の特定の例示的な実施形態において、γ−アミノ酪酸の異種産生のために、グルタミン酸デカルボキシラーゼ反応（ＥＣ４．１．１．１５）を追加した。
【０１５６】
別の特定の例示的な実施形態において、イタコン酸の異種産生のために、アコニット酸デカルボキシラーゼ反応（ＥＣ４．１．１．６）を追加した。
【０１５７】
別の特定の例示的な実施形態において、シュウ酸の異種産生のために乳酸デヒドロゲナーゼ反応（ＥＣ１．１．１．２７）を追加した。
【０１５８】
シミュレーションは、本発明に従って記載される条件下（例えば、培地中で無制限のグルコースの存在、好気性培養条件）でのサッカロミセス・セレビシエ株のｉｎ  ｖｉｖｏ培養条件をシミュレートすることを目的とした、当業者によって再現可能な一連の制約をモデルに適用することによって行った。
【０１５９】
特定の例示的な実施形態において、本発明に従って記載される解糖活性の減少およびペントースリン酸経路をシミュレートするために、酵素ＰＧＫ１（例えばグルタミン酸、β−ヒドロキシ酪酸、ファルネセン）およびＺＷＦ１（例えばクエン酸産生）の反応を実質的に不活性化することによってシミュレーションを実施した。
【０１６０】
シミュレーションは、本発明に従って記載される改善が、試験された生合成経路の産生収率に及ぼす影響を評価するために、改変されていない「野生型株」モデルで並行して行う。
【０１６１】
ｉｉ）結果
得られた理論収率および本発明に従って提供される改善の割合を以下の表１１に記載する。
【０１６２】
【表１１】
2020506723.tif 000012
【０１６３】
例２：サッカロミセス・セレビシエでのファルネセン産生の改善
サッカロミセス・セレビシエの酵母株である、市販の株ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＪＲＩＶ００００００００）に由来するＣＥＮ．ＰＫ  １６０５（Ｍａｔ  ａ  ＨＩＳ３  ｌｅｕ２−３．１１２  ｔｒｐ１−２８９  ｕｒａ３−５２  ＭＡＬ．２８ｃ）を、ＣＯ２損失なしでＮＡＤＰＨを産生し、ひいてはグルコースからのα−ファルネセン産生の改善を可能にするようにエンジニアリングする。
【０１６４】
ａ）解糖経路の不活性化
そのために、解糖経路をＰＧＫ１遺伝子の欠失によって不活性化した。解糖が阻害されると、結果として生じる酵母株は、グルコースを炭素・エネルギー源として使用することができなくなる。したがって、バイオマス合成経路にグリセロールを供給し、エネルギー経路にエタノールを供給する必要がある。ＰＧＫ１が欠失された株は、ＹＰＧＥ（酵母エキスペプトングリセロールエタノール）培地で増殖させる。
【０１６５】
ＰＧＫ１遺伝子の欠失は、次のようにして得られた：
プラスミドｐＵＧ６（Ｐ３０１１４−Ｅｕｒｏｓｃａｒｆ）に含まれるＫａｎＭＸカセットに由来するＧ４１８耐性遺伝子のコーディングフェーズ（ｃｏｄｉｎｇ  ｐｈａｓｅ）を、オリゴヌクレオチドＣＢ１０１（配列番号１）およびＣＢ１０２（配列番号２）で増幅した：
配列番号１：ＣＢ１０１（フォワード）：５′−ＡＣＡＧＡＴＣＡＴＣＡＡＧＧＡＡＧＴＡＡＴＴＡＴＣＴＡＣＴＴＴＴＴＡＣＡＡＣＡＡＡＴＡＴＡＡＡＡＣＡＡＴＧＧＧＴＡＡＧＧＡＡＡＡＧＡＣＴＣＡＣＧＴＴＴＣ−３′
配列番号２：ＣＢ１０２（リバース）：５′−ＧＧＧＡＡＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＡＡＡＡＡＴＴＧＡＴＣＴＡＴＣＧＡＴＴＴＣＡＡＴＴＣＡＡＴＴＣＡＡＴＴＴＡＧＡＡＡＡＡＣＴＣＡＴＣＧＡＧＣＡＴＣＡＡＡＴＧＡＡＡＣ−３′
【０１６６】
オリゴヌクレオチドの下線部は、Ｋａｎ配列と完全に相同であり、残りの配列は、ＰＧＫ１遺伝子座の相同組換え配列をその両端に含むＰＣＲアンプリコンを生成するように、サッカロミセス・セレビシエのゲノム上のＰＧＫ１遺伝子のコーディングフェーズに隣接する領域に対応する。
【０１６７】
当業者による形質転換反応（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｌａｂ  ｃｏｕｒｓｅ  ｍａｎｕａｌ，１９９７；Ｇｉｅｔｚ  ａｎｄ  Ｓｃｈｉｅｓｔ，１９９５，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５［５］：２２５−２６９）のために、ＣＥＮ．ＰＫ株  １６０５を、５０ｍＬ容量の複合体リッチ培地ＹＰＤ（酵母エキス・ペプトン・デキストロース）で３０℃にて６００ｎｍの光学密度０．８に増殖させた。細胞を室温で２，５００ｒｐｍにて５分間遠心分離した。上清を除去し、細胞を２５ｍＬの滅菌水に再懸濁し、室温にて２，５００ｒｐｍで再度５分間遠心分離した。上清を除去した後、細胞を４００μＬの１００ｍＭ滅菌酢酸リチウムに再懸濁した。
【０１６８】
同時に、２ｍＬのチューブで次のようにして形質転換ミックスを調製した：２５０μＬの５０％ＰＥＧ、５ｍｇ／ｍＬで１０μＬの「キャリア」ＤＮＡ、３６μＬの１Ｍ酢酸リチウム、５または１０μＬの精製ＰＣＲ反応（欠失カセット）および３５０μＬの水。
【０１６９】
再懸濁した細胞（５０μＬ）を形質転換混合物に加え、水浴で４２℃にて４０分間インキュベートした。
【０１７０】
インキュベーション後、チューブを室温にて５，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清を廃棄した。細胞を２ｍＬのＹＰＧＥ（酵母エキス・ペプトン・グリセロール・エタノール）培地に再懸濁し、１４ｍＬのチューブに移し、２００ｒｐｍで３０℃にて２時間インキュベートした。次いで、細胞を室温にて５，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。上清を除去し、細胞を１ｍＬの滅菌水に再懸濁し、再度１分間遠心分離し、１００μＬの滅菌水に再懸濁し、ＹＰＧＥ＋Ｇ４１８（１８０μｇ／ｍＬ）に広げる。
【０１７１】
得られたコロニーは、ＰＧＫ１遺伝子の欠失の検証のためにジェノタイピングし、ＥＱ−０１３４（ＣＥＮ．ＰＫ  １６０５  Δｐｇｋ１：：ｋａｎ）と参照した。
【０１７２】
ｂ）ＰＲＫ−ＲｕＢｉｓＣＯ−α−ファルネセンシンターゼ酵素の導入
解糖の代替経路を再構成し、Δｐｇｋ１株がグルコース上で増殖することを可能にするために、前記株を、以下の組合せ発現を可能にするように改変した：
・  リブロース−５Ｐを消費してリブロース−１．５ｂｉｓＰを与えることによってペントースリン酸経路に移植されるホスホリブロキナーゼＰＲＫをコードする遺伝子ならびに
・  Ｉ型ＲｕＢｉｓＣＯ（構造遺伝子ＲｂｃＬおよびＲｂｃＳおよびシャペロンＲｂｃＸ、ＧｒｏＥＳおよびＧｒｏＥＬを有する）。ＲｕＢｉｓＣＯは、リブロース−１．５ｂｉｓＰと１モルのＣＯ２を消費して、解糖経路のＰＧＫ１欠失の下流に３−ホスホグリセリン酸を形成する。
【０１７３】
この代替経路により再び、株はグルコースをその主な炭素・エネルギー源として消費することが可能になる。
【０１７４】
α−ファルネセンを産生するために、酵母はα−ファルネセンシンターゼ遺伝子（ＡＦＳ１、配列番号７１、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１８２２４１）を欠いている。
【０１７５】
また、ＰＲＫ−ＲｕＢｉｓＣＯエンジニアリングに必要とされる７つの遺伝子（表１２）は、適合した複製起点を有し、それぞれが栄養要求性または抗生物質耐性の補完のための異なる遺伝子を持つ自律複製が可能な４つのプラスミドベクターにクローニングされており、３つまたは４つのプラスミド構築物を含む株の選択が可能になる。
【０１７６】
これらのプラスミドのうちの２つはＡｒｓ／ＣＥＮ複製起点を有するシングルコピーであり、３つ目は２μ起点を有するマルチコピーである。
【０１７７】
【表１２】
2020506723.tif 000013
【０１７８】
ｒｂｃＬ、ｒｂｃＳ、ｒｂｃＸおよびｐｒｋなどのシネココッカス・エロンガトゥスからの遺伝子（国際公開第２０１５１０７４９６号に記載）ならびにマルス・ドメスティカ（Ｍａｌｕｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）α−ファルネセンシンターゼ（Ｔｉｐｐｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．  ２０１６  Ｊａｎ；１１３（１）：７２−８１）を、サッカロミセス・セレビシエ酵母でのコドンの使用に最適化した。
【０１７９】
酵母の形質転換について前述したプロトコルに従って、株ＥＱ−０１３４を、３０℃にて５０ｍＬ容量の複合体リッチ培地ＹＰＧＥ（酵母エキス・ペプトン・・グリセロール・エタノール）で増殖させた。細胞を室温にて２，５００ｒｐｍで５分間遠心分離する。上清を除去し、細胞を２５ｍＬの滅菌水に再懸濁し、室温にて２，５００ｒｐｍで再度５分間遠心分離する。上清を除去した後、細胞を４００μＬの１００ｍＭ滅菌酢酸リチウムに再懸濁する。同時に、次の形質転換ミックスを調製する：２５０μＬの５０％ＰＥＧ、５ｍｇ／ｍＬで１０μＬの「キャリア」ＤＮＡ、３６μＬの１Ｍ酢酸リチウム、１０μＬ（３μｇの次の組合せのうちの１つ、ｐＦＰＰ４５＋ｐＦＰＰ５６＋ｐＦＰＰ２０またはｐＬ４＋ｐＦＰＰ４５＋ｐＦＰＰ５６＋ｐＦＰＰ２０）および３５０μＬの水。
【０１８０】
再懸濁した細胞（５０μＬ）を形質転換混合物に加え、水浴で４２℃にて４０分間インキュベートした。インキュベーション後、チューブを室温にて５，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清を廃棄した。細胞をグリセロールとエタノールを含む２ｍＬのＹＮＢ（硫酸アンモニウムを含む酵母ニトロゲンベース）に再懸濁し、１４ｍＬのチューブに移し、１０％ＣＯ２に富む大気下で３０℃にて２時間インキュベートした。最終ミックスを、硫酸アンモニウム＋ＬＵＷ（ロイシンウラシル、トリプトファン）を含まないＣＳＭ＋該当する場合はノウルセオトリシンを含み、グリセロールとエタノールを炭素源とした用いたＹＮＢ寒天培地に広げた。
【０１８１】
前述のプロトコルに従って、株ＣＥＮ．ＰＫ  １６０５は、次のプラスミドの組合せで形質転換する：ｐＬ４＋ｐＦＬ３６＋ｐＣＭ１８５＋ｐＶ５１ＴＥＦ
【０１８２】
得られたクローンは、すべてのエンジニアリング遺伝子のジェノタイピングし、次いで液体培地ＹＮＢ硫酸アンモニウムとグルコースに適合させた。
・  ＥＱ−０１５３（ＣＥＮ．ＰＫ  １６０５  Δｐｇｋ１：：ｋａｎ）（ｐＦＰＰ４５＋ｐＦＰＰ５６＋ｐＦＰＰ２０）
・  ＥＱ−０２５３（ＣＥＮ．ＰＫ  １６０５  Δｐｇｋ１：：ｋａｎ）（ｐＬ４＋ｐＦＰＰ５６＋ｐＦＰＰ２０＋ｐＦＰＰ４５）
・  ＥＱ−０３５３（ＣＥＮ．ＰＫ  １６０５）（ｐＬ４＋ｐＦＬ３６＋ｐＣＭ１８５＋ｐＶ５１ＴＥＦ）
【０１８３】
ｃ）グルコースとＣＯ２を含む液体培地での増殖に対する株ＥＱ−０１５３およびＥＱ−０２５３の適応
エルレンマイヤーフラスコでのバッチ式培養を、適切な培地と１０％外因性ＣＯ２供給により、振盪インキュベーター（１２０ｒｐｍ、３０℃）で、ＥＯＮ分光光度計（ＢｉｏＴｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して測定した０．０５ＯＤ６００ｎｍで接種して行う。目的株は、ＰＲＫ発現が誘発されない条件下で、かつ適切な場合はノウルセオトリシンの存在下で、１０ｇ／Ｌのグリセロールと７．５ｇ／Ｌのエタノールを含むＹＮＢ＋ＣＳＭ−ＬＵＷ培地で増殖させる。これらの条件下では、ＰＧＫ１遺伝子の欠失の前後に株を供給する必要がある。
【０１８４】
十分な量のバイオマスを得た後、ＰＲＫ／ＲｕＢｉｓＣＯエンジニアリングの使用に株を適合させるために、少なくとも２５０ｍＬのエルレンマイヤーフラスコで５０ｍＬ以上の容量の培養物を接種する。この適合は、２０ｇ／Ｌのグルコースを含むＹＮＢ＋ＣＳＭ−ＬＵＷ培地で、必要に応じてノーセオトリシン（ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）の存在下および上記のように外因性ＣＯ２供給下で行う。
【０１８５】
有意な増殖開始が観察された後、ＣＳＭ−ＬＵＷに含まれるアミノ酸とニトロゲンベースを含まない最小無機培地、すなわち、２０ｇ／Ｌのグルコース、必要に応じてノーセオトリシンおよび上記のように外因性ＣＯ２供給を含むＹＮＢのみに株を適合させる。
【０１８６】
ｄ）エルレンマイヤーフラスコでのファルネセンの産生
ＰＧＫ１遺伝子での解糖経路に欠失を有するサッカロミセス・セレビシエ株ＥＱ−０２５３を、ＰＲＫとＲｕＢｉｓＣＯを使用してＣＯ２損失なしでＮＡＤＰＨを過剰産生しながらファルネセンを産生するように増殖させる。
【０１８７】
この目的株は、ＰＧＫ１の欠失またはＰＲＫとＲｕＢｉｓＣＯの追加なしで、異種α−ファルネセンシンターゼの導入後にファルネセンを産生する参照株ＥＱ−０３５３と比較する。
【０１８８】
株ＥＱ−０２５３（ＣＥＮ．ＰＫ  １６０５  Δｐｇｋ１：：ｋａｎ）（ｐＬ４＋ｐＦＰＰ５６＋ｐＦＰＰ２０＋ｐＦＰＰ４５）およびＥＱ−０３５３（ＣＥＮ．ＰＫ  １６０５）（ｐＬ４＋ｐＦＬ３６＋ｐＣＭ１８５＋ｐＶ５１ＴＥＦ）を、２０ｇ／ＬのＤ−グルコースを含むＹＮＢ培地で増殖させ、これに１００μｇ／Ｌのノーセオトリシンを加えた。２０ｍＬの培地を含む前培養物を０．０５ＯＤ６００ｎｍで２５０ｍＬのバッフル付きエルレンマイヤーフラスコに接種し、１０％ＣＯ２で調整した雰囲気を有するＭｉｎｉｔｒｏｎインキュベーターで３０℃にて１２０ｒｐｍで２４時間振盪させた。最初の前培養物から、５０ｍＬの培地を０．０５ＯＤ６００ｎｍで２５０ｍＬのエルレンマイヤーフラスコに接種し、３０℃、１０％ＣＯ２で１２０ｒｐｍにて２４時間振盪させた。２回目の前培養物から同じくエルレンマイヤーフラスコ（５００ｍＬ、バッフル付き）で行った培養物も０．０５ＯＤ６００ｎｍで１００ｍＬの同じ培地に接種し、これに５０μｇ／ｍＬのアンピシリン、１０μＬのアンチフォーム（Ａｎｔｉｆｏａｍ  ２０４、Ｓｉｇｍａ、Ａ６４２６）および１０％（ｖ／ｖ）のドデカンを加えた（Ｔｉｐｐｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔａｌａｎｔａ（２０１６），１４６：１００−１０６）。培養物を、１０％ＣＯ２の存在下に３０℃にて１２０ｒｐｍで振盪させた。６００ｎｍで濁度を測定することによって増殖をモニターした。
【０１８９】
ファルネセンを抽出するために、５００μＬの有機相を収集し、５，０００ｇで５分間遠心分離して２つの相を完全に分離した。有機相は、ＧＣ−ＭＳ分析まで４℃で保存した。α−ファルネセンの検出と定量化は、シングル四重極質量分析法によって実施した。Ｚｅｂｒｏｎ  ＺＢ−ＦＦＡＰカラムを、キャリアガスとして水素と共に２．９５ｍＬ／分の固定速度で使用した。入口温度は２６０℃であり、１μＬのサンプルをスプリットレスモードで注入した。初期オーブン温度は７０℃（４分）であり、次いで１６０℃まで徐々に上昇させ（７℃／分）、次いで２４０℃まで徐々に上昇させ（４０℃／分）、その温度を１．０５分間維持した。質量分析検出では、トランスファーライン温度とソースの温度はそれぞれ２５０℃と２００℃であった。質量獲得は、ｔ＝１０分とｔ＝２０分の間で行った。株によって産生されたα−ファルネセンの定量化のために、ファルネセン異性体ミックス（Ｓｉｇｍａ、Ｗ３８３９０２）を使用して７点を含む外部キャリブレーションを実施した
【０１９０】
株によって消費されたグルコースを定量化するために、５００μＬの培地を、同じファルネセン抽出ＯＤで収集し、５，０００ｇで４℃にて５分間遠心分離した。上清をろ過し（Ｍｉｎｉｃａｒｔ  ＲＣ４、ザルトリウス０．４５μｍ）、フラスコに−２０℃で保存した。このサンプルに含まれるグルコースを、ポンプ、８℃冷蔵オートサンプラーおよび屈折率（ＲＩ）検出器（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＩＯＴＡ  ２）を備えたＵｌｔｉＭａｔｅ  ３０００  ＨＰＬＣ−ＵＶ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で定量化した。Ｒｅｚｅｘ  ＲＯＡ−Ｏｒｇａｎｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈ＋カラム１５０×７．８ｍｍ（８％）、粒径８μｍ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、００Ｈ−０１３８−ＫＯ）を、Ｃａｒｂｏ−Ｈプレカラム４×３．０ｍｍと共に使用した。カラムの温度は３５℃であり、流量は０．５ｍＬ／分に設定した。５ｍＭ  Ｈ２ＳＯ４で水性移動相と共にアイソクラティック溶出を実施し、３０分間継続した。各サンプルに対して２０μＬの容量を注入した。化合物の同定は、保持時間と標準の比較に基づいていた。外部キャリブレーションには、１０点の可変グルコース濃度（０〜２０ｇ／Ｌ）が含まれている。
【０１９１】
炭素収率Ｙα−ファルネセン／グルコースは、ＥＱ−０２５３株とＥＱ−０３５３株の両方で消費されたグルコース１グラム当たりに産生されるファルネセンのグラム数で計算する：
【０１９２】
【数１】
2020506723.tif 000014
【０１９３】
【表１３】
2020506723.tif 000015
【０１９４】
観察されたＤ−グルコースに対するα−ファルネセンの質量収率の増加は、対照株ＥＱ−０３５３と比較して株ＥＱ−０２５３で９．６％であった。
【０１９５】
例３：サッカロミセス・セレビシエでのクエン酸産生の改善
ａ）交配型ＭＡＴａの半数体株でのＺＷＦ１遺伝子およびＩＤＨ１遺伝子の不活性化
・  ＺＷＦ１遺伝子の不活性化
【０１９６】
ｈｐｈＭＸカセット（ｌｏｘＰ−ｐＡｇＴＥＦ１−ｈｐｈ−ｔＡｇＴＥＦ１−ｌｏｘＰ）に由来し、プラスミドｐＵＧ７５（Ｐ３０６７１）−Ｅｕｒｏｓｃａｒｆ）に含まれるハイグロマイシンＢ耐性遺伝子のコーディングフェーズを、オリゴヌクレオチドＳｄｚｗｆ１およびＲｄｚｗｆ１（表１４）で増幅する。これにより、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼＺＷＦ１遺伝子座の相同組換え配列をその両端に含むΔｚｗｆ１  ＰＣＲアンプリコンを生成することが可能になる。
【０１９７】
【表１４】
2020506723.tif 000016
【０１９８】
オリゴヌクレオチドの下線部は、選択遺伝子の配列と完全に相同な部分に対応し、残りの配列は、サッカロミセス・セレビシエのゲノム上で欠失すべき標的遺伝子のコーディングフェーズに隣接する領域に対応する。
【０１９９】
市販の株ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＪＲＩＶ００００００００）に由来する前述の株ＣＥＮ．ＰＫ  １６０５（Ｍａｔ  ａ  ＨＩＳ３  ｌｅｕ２−３．１１２  ｔｒｐ１−２８９  ｕｒａ３−５２  ＭＡＬ．２８ｃ）を、上記のΔｚｗｆ１ＰＣＲフラグメントで形質転換する。
【０２００】
形質転換反応のために、株ＣＥＮ．ＰＫ  １６０５を、５０ｍＬの容量の複合体リッチ培地ＹＰＤ（酵母エキス・ペプトン・デキストロース、ここでは２０ｇ／Ｌのグルコース）で３０℃にて６００ｎｍの光学密度０．８まで増殖させる。細胞を室温にて２，５００ｒｐｍで５分間遠心分離する。上清を除去し、細胞を２５ｍＬの滅菌水に再懸濁し、室温にて２，５００ｒｐｍで再度５分間遠心分離する。上清を除去した後、細胞を４００μＬの１００ｍＭ滅菌酢酸リチウムに再懸濁する。
【０２０１】
同時に、２ｍＬのチューブで次のようにして形質転換ミックスを調製する：２５０μＬの５０％ＰＥＧ、５ｍｇ／ｍＬで１０μＬの「キャリア」ＤＮＡ、３６μＬの１Ｍ酢酸リチウム、１０μＬの精製ＰＣＲ反応（欠失カセット）および３５０μＬの水。
【０２０２】
再懸濁した細胞（５０μＬ）を形質転換混合物に加え、水浴で４２℃にて４０分間インキュベートする。インキュベーション後、チューブを室温にて５，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清を廃棄する。細胞を２ｍＬのＹＰＤ（酵母エキス・ペプトン・デキストロース）培地に再懸濁し、１４ｍＬのチューブに移し、２００ｒｐｍで３０℃にて２時間インキュベートする。次いで、細胞を室温にて５，０００ｒｐｍで１分間遠心分離する。上清を除去し、細胞を１ｍＬの滅菌水に再懸濁し、再度１分間遠心分離し、１００μＬの滅菌水に再懸濁し、ＹＰＤ＋ハイグロマイシンＢ（２００μｇ／ｍＬ）に広げる。
【０２０３】
得られたコロニーは、ＺＷＦ１遺伝子の欠失の検証のためにジェノタイピングし、ＥＱＳＣ−００２（ＣＥＮ．ＰＫ  １６０５  Δｚｗｆｌ：：ｈｐｈ）と参照した。
【０２０４】
・  ＩＤＨ１遺伝子の不活性化
この遺伝子の不活性化により、クエン酸を蓄積させることが可能になる（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔ．２０１６  Ｍａｒ  ３；１５：４８）。
【０２０５】
ｎａｔＭＸカセット（ｌｏｘＰ−ｐＡｇＴＥＦ１−ｎａｔ−ｔＡｇＴＥＦ１−ｌｏｘＰ）に由来し、プラスミド（ｐＵＧ７４（Ｐ３０６７０）−Ｅｕｒｏｓｃａｒｆ）に含まれるノーセオトリシンＢ耐性遺伝子のコーディングフェーズを、オリゴヌクレオチドＳｄｉｄｈ１およびＲｄｉｄｈ１で増幅する（表１３）。これにより、イソクエン酸デヒドロゲナーゼＩＤＨ１サブユニット遺伝子座の相同組換え配列をその両端に含むΔｉｄｈ１  ＰＣＲアンプリコンを生成することが可能になる。
【０２０６】
市販の株ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＪＲＩＶ００００００００）に由来する前述の株ＥＱＳＣ−００２（ＣＥＮ．ＰＫ  １６０５  Δｚｗｆ１：：ｈｐｈ）およびＣＥＮ．ＰＫ  １６０５（Ｍａｔ  ａ  ＨＩＳ３  ｌｅｕ２−３．１１２  ｔｒｐ１−２８９  ｕｒａ３−５２  ＭＡＬ．２８ｃ）を、ＩＤＨ１遺伝子の不活性化のためにＰＣＲフラグメントで形質転換する。
【０２０７】
形質転換反応のために、株ＥＱＳＣ−００２およびＣＥＮ．ＰＫ  １６０５を、５０ｍＬの容量の複合体リッチ培地ＹＰＤ（酵母エキス・ペプトン・デキストロース、ここでは２０ｇ／Ｌのグルコース）で３０℃にて６００ｎｍの光学密度０．８まで増殖させる。細胞を室温にて２，５００ｒｐｍで５分間遠心分離する。上清を除去し、細胞を２５ｍＬの滅菌水に再懸濁し、室温にて２，５００ｒｐｍで再度５分間遠心分離する。上清を除去した後、細胞を４００μＬの１００ｍＭ滅菌酢酸リチウムに再懸濁する。
【０２０８】
同時に、２ｍＬのチューブで次のようにして形質転換ミックスを調製する：２５０μＬの５０％ＰＥＧ、５ｍｇ／ｍＬで１０μＬの「キャリア」ＤＮＡ、３６μＬの１Ｍ酢酸リチウム、１０μＬの精製ＰＣＲ反応（欠失カセット）および３５０μＬの水。
【０２０９】
再懸濁した細胞（５０μＬ）を形質転換混合物に加え、水浴で４２℃にて４０分間インキュベートする。インキュベーション後、チューブを室温にて５，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清を廃棄する。細胞を２ｍＬのＹＰＤ（酵母エキス・ペプトン・デキストロース）に再懸濁し、１４ｍＬのチューブに移し、２００ｒｐｍで３０℃にて２時間インキュベートする。次いで、細胞を室温にて５，０００ｒｐｍで１分間遠心分離する。上清を除去し、細胞を１ｍＬの滅菌水に再懸濁し、再度１分間遠心分離し、１００μＬの滅菌水に再懸濁し、ＹＰＤ＋ハイグロマイシンＢ（２００μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ）に広げる。
【０２１０】
得られたコロニーは、ＩＤＨ１遺伝子の欠失の検証のためにジェノタイピングし、ＥＱＳＣ−００３（ＣＥＮ．ＰＫ  １６０５  Δｚｗｆ１：：ｈｐｈ、Δｉｄｈ１：：ｎａｔ）と呼んだ。
【０２１１】
ｂ）交配型ＭＡＴαの半数体株でのＰＧＫ１遺伝子の不活性化
ＫａｎＭＸカセット（ｌｏｘＰ−ｐＡｇＴＥＦ１−ｋａｎＭＸ−ｔＡｇＴＥＦ１−ｌｏｘＰ）に由来し、プラスミドｐＵＧ６（Ｐ３０１１４）−Ｅｕｒｏｓｃａｒｆに含まれるＧ４１８耐性遺伝子のコーディングフェーズを、オリゴヌクレオチドＳｄｐｇｋ１およびＲｄｐｇｋ１で増幅して（表１３）、３−ホスホグリセリン酸キナーゼＰＧＫ１遺伝子座の相同組換え配列をその両端に含むΔｐｇｋｌ  ＰＣＲアンプリコンを生成する。
【０２１２】
市販の株ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＪＲＩＶ００００００００）に由来する株ＣＥＮ．ＰＫ  １６０６（Ｍａｔ  ａｌｐｈａ  ＨＩＳ３  ｌｅｕ２−３．１１２  ｔｒｐ１−２８９  ｕｒａ３−５２  ＭＡＬ．２８ｃ）を、ＰＧＫ１遺伝子の不活性化のためにＰＣＲフラグメントで形質転換する。
【０２１３】
形質転換反応のために、株ＣＥＮ．ＰＫ  １６０６を、５０ｍＬの容量の複合体リッチ培地ＹＰＤ（酵母エキス・ペプトン・デキストロース、ここでは２０ｇ／Ｌのグルコース）で３０℃にて６００ｎｍの光学密度０．８まで増殖させる。細胞を室温にて２，５００ｒｐｍで５分間遠心分離する。上清を除去し、細胞を２５ｍＬの滅菌水に再懸濁し、室温にて２，５００ｒｐｍで再度５分間遠心分離する。上清を除去した後、細胞を４００μＬの１００ｍＭ滅菌酢酸リチウムに再懸濁する。
【０２１４】
同時に、２ｍＬのチューブで次のようにして形質転換ミックスを調製する：２５０μＬの５０％ＰＥＧ、５ｍｇ／ｍＬで１０μＬの「キャリア」ＤＮＡ、３６μＬの１Ｍ酢酸リチウム、１０μＬの精製ＰＣＲ反応（欠失カセット）および３５０μＬの水。
【０２１５】
再懸濁した細胞（５０μＬ）を形質転換混合物に加え、水浴で４２℃にて４０分間インキュベートする。インキュベーション後、チューブを室温にて５，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清を廃棄する。細胞を２ｍＬのＹＰＧＥ（酵母エキス・ペプトン・２０ｇ／Ｌグリセロール、３０ｇ／Ｌエタノール）に再懸濁し、１４ｍＬのチューブに移し、２００ｒｐｍで３０℃にて２時間インキュベートする。次いで、細胞を室温にて５，０００ｒｐｍで１分間遠心分離する。上清を除去し、細胞を１ｍＬの滅菌水に再懸濁し、再度１分間遠心分離し、１００μＬの滅菌水に再懸濁し、ＹＰＧＥ＋１５０μｇ／ｍｌのＧ４１８に広げる。
【０２１６】
得られたコロニーは、ＰＧＫ１遺伝子の欠失の検証のためにジェノタイピングし、ＥＱＳＣ−００８（ＣＥＮ．ＰＫ  １６０５，Δｐｇｋ１：：ｋａｎ）と参照した。
【０２１７】
ｃ）ＩＤＨ１、ＺＷＦ１およびＰＧＫ１が交配によって不活性化されている株の構築
反対の交配型ＥＱＳＣ−００３（ＣＥＮ．ＰＫ  １６０５  Δｚｗｆ１：：ｈｐｈ、Δｉｄｈ１：：ｎａｔ）とＥＱＳＣ−００８（ＣＥＮ．ＰＫ  １６０６  Δｐｇｋ１：：ｋａｎ）の半数体株を、株ＥＱＳＣ−００８の場合は寒天培地：ＹＰＤ（酵母エキス・ペプトン・デキストロース）で、株ＥＱＳＣ−００３の場合はＹＰＧＥ（酵母エキス・ペプトン・グリセロール・エタノール）で３０℃にて一晩増殖させる。次いで、ＹＰＧＥ（酵母エキス・ペプトン・グリセロール・エタノール）寒天培地＋１５０μｇ／ｍＬのＧ４１８＋２００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢに直接接触させることによって２つの株を交配させる。Ｇ４１８およびハイグロマイシンＢの二重選択により２つの親株が排除され、ＭＡＴａ／ＭＡＴα、ＺＷＦ１／Δｚｗｆ１：：ｈｐｈ、ＩＤＨ１／Δｉｄｈ１：：ｎａｔ、ＰＧＫ１／Δｐｇｋ１：：ｋａｎ二倍体株のみがこの培地で増殖する。この交配から単離された二倍体クローンを収集する。３つのカセットΔｚｗｆ１：：ｈｐｈ、Δｉｄｈ１：：ｎａｔ、Δｐｇｋ１：：ｋａｎの存在は、１５０μｇ／ｍＬのＧ４１８または２００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢまたは５０μｇ／ｍＬのノーセオトリシンを補充したＹＰＧＥ（酵母エキス・ペプトン・グリセロール・エタノール）寒天培地での増殖テストによって検証する。得られた株をＥＱＳＣ−００９（ＣＥＮ．ＰＫ  １６０７、ＭＡＴａ／ＭＡＴα、ＺＷＦ１／Δｚｗｆ１：：ｈｐｈ、ＩＤＨ１／Δｉｄｈ１：：ｎａｔ、ＰＧＫ１／Δｐｇｋ１：：ｋａｎ）と参照する。
【０２１８】
前述の株ＥＱＳＣ−００９（ＣＥＮ．ＰＫ  １６０７、ＭＡＴａ／ＭＡＴα、ＺＷＦ１／Δｚｗｆ１：：ｈｐｈ、ＩＤＨ１／Δｉｄｈ１：：ｎａｔ、ＰＧＫ１／Δｐｇｋ１：：ｋａｎ）を、ＹＰＧＥ（酵母エキス・ペプトン・グリセロール・エタノール）寒天培地で３０℃にて一晩増殖させる。次いで、細胞を液体培養で欠乏培地（胞子形成培地、１％酢酸カリウム＋ロイシン＋ウラシル＋トリプトファン）に入れて二倍体細胞の減数分裂を誘発し、ひいては４つの半数体胞子を含む四分子の形成をもたらす。四分子を、ＹＮＢ．ＧＥ培地（酵母ニトロゲンベース、グリセロール、エタノール）＋ロイシン＋ウラシル＋トリプトファン＋１ｇ／Ｌグルタミン酸＋２０ｍｇ／Ｌメチオニン＋４０ｍｇ／Ｌシステインに広げ、（マイクロダイセクターを使用して）直ぐに解剖して同じ培地で胞子を単離する。胞子を３０℃で数日間発芽させる。このようにして得られた半数体細胞の遺伝的内容は、選択培地：１５０μｇ／ｍＬのＧ４１８または２００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢまたは５０μｇ／ｍＬのノーセオトリシンを補充したＹＰＧＥ（酵母エキス・ペプトン・グリセロール・エタノール）での増殖によってテストし、それらの交配タイプは、交配タイプＭＡＴａまたはＭＡＴαの２つのｔｅｃｔｒｉｘ株（ｔｅｃｔｒｉｘ  ｓｔｒａｉｎｓ）と交配することによってテストする。得られたコロニーは、ＰＧＫ１、ＩＤＨ１、ＺＷＦ１遺伝子の欠失の検証のためにジェノタイピングし、これらの遺伝子に対応する転写産物の不在は、リボ核酸の逆転写後のリアルタイムＰＣＲによって検証する。得られた株のうちの１つをＥＱＳＣ−００４（ＣＥＮ．ＰＫ  １６０６  ＭＡＴα  Δｚｗｆ１：：ｈｐｈ、Δｉｄｈ１：：ｎａｔ、Δｐｇｋ１：：ｋａｎ）と参照する。
【０２１９】
ｄ）ＰＲＫ−ＲｕＢｉｓＣＯ酵素の導入
ＰＲＫ−ＲｕＢｉｓＣＯエンジニアリングに必要な６つの遺伝子（以下の表１５）は、適合した複製起点を有し、それぞれが異なる栄養要求性補完遺伝子を持つ自律複製が可能な３つのプラスミドベクターにクローニングされており、３つのプラスミド構築物を含む株の選択が可能になる（国際公開第２０１５１０７４９６を参照）。これらのプラスミドのうちの２つはＡｒｓ／ＣＥＮ複製起点を有するシングルコピーであり、３つ目は２μ起点を有するマルチコピーである。
【０２２０】
【表１５】
2020506723.tif 000017
【０２２１】
前述の形質転換プロトコルによれば、株ＥＱＳＣ−００４（ＣＥＮ．ＰＫ  １６０６  Δｚｗｆ１：：ｈｐｈ、Δｉｄｈ１：：ｎａｔ、Δｐｇｋ１：：ｋａｎ）を、５０ｍＬの容量の複合体リッチ培地ＹＰＧＥ（酵母エキス・ペプトン・グリセロール・エタノール）で３０℃にて６００ｎｍの光学密度０．８まで増殖させた。細胞を室温にて２，５００ｒｐｍで５分間遠心分離する。上清を除去し、細胞を２５ｍＬの滅菌水に再懸濁し、室温にて２，５００ｒｐｍで再度５分間遠心分離する。上清を除去した後、細胞を４００μＬの１００ｍＭ滅菌酢酸リチウムに再懸濁する。
【０２２２】
同時に、２ｍＬのチューブで次のようにして形質転換ミックスを調製する：２５０μＬの５０％ＰＥＧ、５ｍｇ／ｍＬで１０μＬの「キャリア」ＤＮＡ、３６μＬの１Ｍ酢酸リチウム、１０μＬ（３μｇ）のｐＦＰＰ４５＋ｐＦＰＰ５６＋ｐＦＰＰ２０の組合せおよび３５０μＬの水。
【０２２３】
再懸濁した細胞（５０μＬ）を形質転換混合物に加え、水浴で４２℃にて４０分間インキュベートする。インキュベーション後、チューブを室温にて５，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清を廃棄する。細胞を２ｍＬのＹＰＧＥ（酵母エキス・ペプトン・グリセロール・エタノール）＋２ｍｇ／Ｌのドキシサイクリンに再懸濁し、１４ｍＬのチューブに移し、２００ｒｐｍで３０℃にて２時間インキュベートする。次いで、細胞を室温にて５，０００ｒｐｍで１分間遠心分離する。上清を除去し、細胞を１ｍＬの滅菌水に再懸濁し、再度１分間遠心分離し、１００μＬの滅菌水に再懸濁し、ＹＮＢ．ＧＥ（酵母ニトロゲンベース・グリセロール・エタノール）＋１ｇ／Ｌのグルタミン酸＋２０ｍｇ／Ｌのメチオニン＋４０ｍｇ／Ｌのシステイン＋２ｍｇ／Ｌのドキシサイクリンに広げる。得られた株をＥＱＳＣ−００６（ＣＥＮ．ＰＫ  １６０６  Δｚｗｆ１：：ｈｐｈ、Δｉｄｈ１：：ｎａｔ、Δｐｇｋ１：：ｋａｎ）（ｐＦＰＰ４５＋ｐＦＰＰ５６＋ｐＦＰＰ２０）と参照する。
【０２２４】
前述の形質転換プロトコルによれば、株ＥＱＳＣ−００５（ＣＥＮ．ＰＫ  １６０５  Δｉｄｈ１：：ｎａｔ）を、５０ｍＬの容量の複合体リッチ培地ＹＰＧＥ（酵母エキス・ペプトン・グリセロール・エタノール）で３０℃にて６００ｎｍの光学密度０．８まで増殖させた。細胞を室温にて２，５００ｒｐｍで５分間遠心分離する。上清を除去し、細胞を２５ｍＬの滅菌水に再懸濁し、室温にて２，５００ｒｐｍで再度５分間遠心分離する。上清を除去した後、細胞を４００μＬの１００ｍＭ滅菌酢酸リチウムに再懸濁する。
【０２２５】
同時に、２ｍＬのチューブで次のようにして形質転換ミックスを調製する：２５０μＬの５０％ＰＥＧ、５ｍｇ／ｍＬで１０μＬの「キャリア」ＤＮＡ、３６μＬの１Ｍ酢酸リチウム、１０μＬ（３μｇ）のｐＶ５１ＴＥＦ＋ｐＦＬ３６＋ｐＣＭ１８５の組合せおよび３５０μＬの水。
【０２２６】
再懸濁した細胞（５０μＬ）を形質転換混合物に加え、水浴で４２℃にて４０分間インキュベートする。インキュベーション後、チューブを室温にて５，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清を廃棄する。細胞を２ｍＬのＹＰＤ（酵母エキス・ペプトン・デキストロース）に再懸濁し、１４ｍＬのチューブに移し、２００ｒｐｍで３０℃にて２時間インキュベートする。次いで、細胞を室温にて５，０００ｒｐｍで１分間遠心分離する。上清を除去し、細胞を１ｍＬの滅菌水に再懸濁し、再度１分間遠心分離し、１００μＬの滅菌水に再懸濁し、ＹＮＢＤ（酵母ニトロゲンベース・デキストロース）＋２ｍｇ／Ｌのドキシサイクリンに広げる。得られた株をＥＱＳＣ−００７（ＣＥＮ．ＰＫ  １６０５  Δｉｄｈ１：：ｎａｔ）（ｐＶ５１ＴＥＦ＋ｐＦＬ３６＋ｐＣＭ１８５）と参照する。
【０２２７】
ｄ）株ＥＱＳＣ−００６およびＥＱＳＣ−００７の適合および進化段階
グルコースとＣＯ２を含むＹＮＢ（酵母ニトロゲンベース）液体培地での増殖に対する株ＥＱＳＣ−００６およびＥＱＳＣ−００７の適応
【０２２８】
エルレンマイヤーフラスコでのバッチ式培養を、適切な培地と１０％外因性ＣＯ２供給により、振盪インキュベーター（１２０ｒｐｍ、３０℃）で、ＥＯＮ分光光度計（ＢｉｏＴｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して測定した０．０５ＯＤ６００ｎｍで接種して行う。目的株は、ＰＲＫ発現が誘発されない条件下で、１０ｇ／Ｌのグリセロールと７．５ｇ／Ｌのエタノール＋５０ｍｇ／Ｌのグルタミン酸を含むＹＮＢ＋ＣＳＭ−ＬＵＷ培地で増殖させる。
【０２２９】
十分な量のバイオマスを得た後、ＰＲＫ／ＲｕＢｉｓＣＯエンジニアリングの使用に株を適合させるために、少なくとも２５０ｍＬのエルレンマイヤーフラスコで５０ｍＬ以上の容量の培養物を接種する。この適合は、２０ｇ／Ｌのグルコース、５０ｍｇ／Ｌのグルタミン酸および上記のように外因性ＣＯ２供給を含むＹＮＢ＋ＣＳＭ−ＬＵＷ培地で行う。
【０２３０】
有意な増殖開始が観察された後、ＣＳＭ−ＬＵＷに含まれる、以下に示されているものを除くアミノ酸と、ニトロゲンベースを含まない最小無機培地、すなわち、最終濃度で２０ｇ／Ｌのグルコース、１ｇ／Ｌのグルタミン酸、４０ｍｇ／ＬのＬ−システインおよび２０ｍｇ／ＬのＬ−メチオニンおよび上記のように外因性ＣＯ２供給を含むＹＮＢのみに株を適合させる。
【０２３１】
ｅ）エルレンマイヤーフラスコでのクエン酸の産生
ＰＧＫ１遺伝子での解糖経路、ペントースリン酸経路の酸化部分、およびクレブス回路に欠失を有するサッカロミセス・セレビシエ株ＥＱＳＣ−００６を、ＰＲＫとＲｕＢｉｓＣＯを使用してＣＯ２損失なしでクエン酸を産生するように増殖させる。この目的株を、ＰＧＫ１もしくはＺＷＦ１の欠失またはＰＲＫとＲｕＢｉｓＣＯの添加なしで、ＩＤＨ１遺伝子の不活性化後にクエン酸を産生する参照株ＥＱＳＣ−００７と比較する。
【０２３２】
ＥＱＳＣ−００６株（ＣＥＮ．ＰＫ  １６０５  Δｚｗｆ１：：ｈｐｈ、Δｉｄｈ１：：ｎａｔ、Δｐｇｋ１：：ｋａｎ、ｐＦＰＰ４５＋ｐＦＰＰ５６＋ｐＦＰＰ２０）およびＥＱＳＣ−００７（ＣＥＮ．ＰＫ  １６０５  Δｉｄｈ１：：ｎａｔ、ｐＶ５１ＴＥＦ＋ｐＦＬ３６＋ｐＣＭ１８５）を、２０ｇ／ＬのＤ−グルコース（ＹＮＢ  Ｄ２０）を補充した酵母ニトロゲンベース（ＹＮＢ）培地で培養した。
【０２３３】
グルコースに対するクエン酸の質量収率を確立するために、２０ｍＬの培地を含む前培養物を０．０５ＯＤ６００ｎｍで２５０ｍＬのバッフル付きエルレンマイヤーフラスコに接種し、３０℃にて１２０ｒｐｍで振盪させた。最初の前培養物から、５０ｍＬの培地を０．０５ＯＤ６００ｎｍで２５０ｍＬのエルレンマイヤーフラスコに接種し、３０℃にて１２０ｒｐｍで振盪させた。培養は、０．０５ＯＤ６００ｎｍで１００ｍＬの同じ培地に接種した２回目の前培養物からエルレンマイヤーフラスコ（５００ｍＬ、バッフル付き）で３０℃、１２０ｒｐｍにて行った。６００ｎｍで濁度を測定することによって増殖をモニターした。
【０２３４】
クエン酸定量化のために、５００μＬの培地を回収し、５，０００ｇ、５分、４℃で遠心分離した。上清をろ過し（Ｍｉｎｉｃａｒｔ  ＲＣ４、ザルトリウス０．４５μｍ）、フラスコに−２０℃で保存してから、シングル四重極質量分析計に結合されたＨＰＬＣ分析（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＵｌｔｉＭａｔｅ  ３０００  ＨＰＬＣ）を行った。各サンプル（２０μＬ）をＡｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈ  Ｈ＋カラム、３００ｍｍ×７．８ｍｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、１２５−０１４０）に注入した。０．５ｍＬ／分の流量でのアイソクラティック溶出は、水酸化アンモニウムでｐＨを４．５に調節した０．０３７％ギ酸（ｖ／ｖ）の水溶液で行った。カラムオーブン温度は６５℃であった。質量分析の解析条件は次のとおりであった：陰性エレクトロスプレーモード、ソース温度４５０℃、ニードル電圧３ｋＶ、コーン電圧５０Ｖ。市販のクエン酸ナトリウム溶液を使用して７点外部キャリブレーションを実施した。
【０２３５】
株によって消費されたグルコースを定量化するために、クエン酸定量化と同じ培養ＯＤ６００ｎｍで５００μＬの培地を回収し、４℃にて５，０００ｇ、５分で遠心分離した。上清をろ過し（Ｍｉｎｉｃａｒｔ  ＲＣ４、ザルトリウス０．４５μｍ）、フラスコに−２０℃で保存した。このサンプルに含まれるグルコースを、ポンプ、８℃冷蔵オートサンプラー、屈折率（ＲＩ）検出器（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＩＯＴＡ  ２）を備えたＨＰＬＣ−ＲＩ  ＵｌｔｉＭａｔｅ  ３０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって定量化した。Ｒｅｚｅｘ  ＲＯＡ−Ｏｒｇａｎｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈ＋カラム１５０×７．８ｍｍ（８％）、粒径８μｍ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、００Ｈ−０１３８−ＫＯ）を、Ｃａｒｂｏ−Ｈプレカラム４×３．０ｍｍと共に使用した。カラムオーブン温度は３５℃であり、流量は０．５ｍＬ／分に設定した。５ｍＭ  Ｈ２ＳＯ４で水性移動相と共に３０分のアイソクラティック溶出を実施した。各サンプルに対して２０μＬの容量を注入した。化合物の同定は、保持時間と標準の比較に基づいていた。外部キャリブレーションには、１０点の可変グルコース濃度（０〜２０ｇ／Ｌ）が含まれている。
【０２３６】
Ｙクエン酸／グルコース質量収率は、ＥＱＳＣ−００６３株とＥＱＳＣ−００７株の両方で消費されたグルコース１グラム当たりに産生されるクエン酸のグラム数で計算した：
【０２３７】
【数２】
2020506723.tif 000018
【０２３８】
【表１６】
2020506723.tif 000019
【０２３９】
対照株ＥＱＳＣ−００７と比較して、株ＥＱＳＣ−００６ではＤ−グルコースに対するクエン酸の質量収率が１９．５％増加した。
【０２４０】
例４：大腸菌でのグルタミン酸産生の改善
α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の欠失が、グルタミン酸産生を増加させる（Ｕｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１０  Ｍａｙ  ３；１４７（１）：１７−３０．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｂｉｏｔｅｃ．２０１０．０２．０１８）。
【０２４１】
これらの例では、ｓｕｃＡ遺伝子が欠失された大腸菌株Ｋ１２  ＭＧ１６５５を使用した。この株は、大腸菌の遺伝子欠失バンク（Ｂａｂａ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｓｙｓｔ  Ｂｉｏｌ．２００６；２：２００６．０００８）に由来し、Ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  ＣｅｎｔｅｒからＪＷ０７１５−２という名称で、参照番号８７８６（ＪＷ０７１５−２：ＭＧ１６５５  ΔｓｕｃＡ：：Ｋａｎ）で提供される。
【０２４２】
４Ａ］解糖の不活性化によるグルタミン酸産生の改善
ａ）ＦｌｐリコンビナーゼによるＦＴＲ領域の特異的組換えによる選択カセットの除去
上記の株ＪＷ０７１５−２の構築に使用したものと同じ欠失ストラテジーを再利用できるようにするため（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）、リコンビナーゼを使用して選択カセットを欠失させた。
【０２４３】
プラスミドｐ７０７−Ｆｌｐｅ（Ｇｅｎｅ  ＢｒｉｄｇｅｓのＱｕｉｃｋ  ＆  Ｅａｓｙ  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  Ｒｅｄ（登録商標）／ＥＴ（登録商標）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｋｉｔに付属）を、キットプロトコルに従ってエレクトロポレーションにより形質転換する。０．２％グルコース、０．０００３％テトラサイクリンを補充し、０．３％Ｌ−アラビノースを添加したＬＢ寒天上で細胞を選択する。得られたクローンの対抗選択を、それらが０．００１５％カナマイシンを補充した同じ培地でもはや増殖することができないことを検証することによって行う。
【０２４４】
得られた株はＥＱ．ＥＣ００２：ＭＧ１６５５  ΔｓｕｃＡと呼ぶ。
【０２４５】
ｂ）Ｅｎｔｎｅｒ−Ｄｏｕｄｏｒｏｆｆ代謝経路をコードするｅｄｄ−ｅｄａオペロンの欠失
ｅｄｄ−ｅｄａオペロンの欠失は、相同組換えと、サプライヤーのプロトコルに従ってＱｕｉｃｋ  ＆  Ｅａｓｙ  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  Ｒｅｄ（登録商標）／ＥＴ（登録商標）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｇｅｎｅ  Ｂｒｉｄｇｅｓ）を使用することによって実施する。
１．ＦＲＴ−ＰＫＧ−ｇｂ２−ｎｅｏ−ＦＲＴ耐性遺伝子発現カセットを増幅するように設計され、染色体上の欠失遺伝子座の隣接領域、すなわち位置１９３２０６５−１９３２１１５および１９３４６０４−１９３４６５４に５０ヌクレオチド以上で相同な５′配列を有し、それによりオペロン全体の両側の細菌ゲノム上にカセットの組換えアームを生成するオリゴヌクレオチド。
２．大腸菌Ｋ−１２株ＥＱ．ＥＣ００２は、キットプロトコルに従ってプラスミドｐＲｅｄＥＴを用いたエレクトロポレーションにより形質転換する。得られたコロニーは、０．２％グルコース、０．０００３％テトラサイクリンを含むリッチ複合培地ＬＢ寒天上で選択する。
３．液体ＬＢ中０．３％アラビノースによって１時間誘発されたＲｅｄＥＴリコンビナーゼの存在下に第１の工程で得られたアンプリコンの形質転換。そのために、欠失カセットによるＲｅｄＥＴを発現する細胞の２回目のエレクトロポレーションを実施し、０．２％グルコース、０．０００３％テトラサイクリンを補充し、０．３％Ｌ−アラビノースおよび０．００１５％カナマイシンを添加したＬＢ寒天上でコロニーを選択する。
４．プラスミドｐ７０７−Ｆｌｐｅ（Ｇｅｎｅ  ＢｒｉｄｇｅｓのＱｕｉｃｋ  ＆  Ｅａｓｙ  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  Ｒｅｄ（登録商標）／ＥＴ（登録商標）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｋｉｔに付属）を、キットプロトコルに従ってエレクトロポレーションにより形質転換する。０．２％グルコース、０．０００３％テトラサイクリンを補充し、０．３％Ｌ−アラビノースを添加したＬＢ寒天上で細胞を選択する。得られたクローンの対抗選択を、それらが０．００１５％カナマイシンを補充した同じ培地でもはや増殖することができないことを検証することによって行う。
５．得られた株はＥＱ．ＥＣ００３：ＭＧ１６５５  ΔｓｕｃＡ  Δｅｄｄ−ｅｄａと呼ぶ。
【０２４６】
ｃ）ｇａｐＡ遺伝子の欠失
ｇａｐＡ遺伝子の欠失は、相同組換えと、サプライヤーのプロトコルに従ってＱｕｉｃｋ  ＆  Ｅａｓｙ  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  Ｒｅｄ（登録商標）／ＥＴ（登録商標）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｇｅｎｅ  Ｂｒｉｄｇｅｓ）を使用することによって実施する。
１．ＦＲＴ−ＰＫＧ−ｇｂ２−ｎｅｏ−ＦＲＴ耐性遺伝子発現カセットを増幅するように設計され、欠失遺伝子座の隣接領域、すなわち遺伝子（ｇａｐＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｘ０２６６２．１）のコーティングフェーズに５０超ヌクレオチドの相同な５′配列を有し、それにより細菌ゲノム上にカセットの組換えアームを生成するオリゴヌクレオチド。
２．大腸菌Ｋ−１２株ＥＱ．ＥＣ００３は、キットプロトコルに従ってプラスミドｐＲｅｄＥＴを用いたエレクトロポレーションにより形質転換する。得られたコロニーは、０．２％グルコース、０．０００３％テトラサイクリンを含むリッチ複合培地ＬＢ寒天上で選択する。
３．液体ＬＢ中０．３％アラビノースによって１時間誘発されたＲｅｄＥＴリコンビナーゼの存在下に第１の工程で得られたアンプリコンの形質転換。そのために、欠失カセットによるＲｅｄＥＴを発現する細胞の２回目のエレクトロポレーションを実施し、０．２％グリセロールおよび０．３％ピルビン酸、０．０００３％テトラサイクリンを補充し、０．３％Ｌ−アラビノースおよび０．００１５％カナマイシンを添加したＬＢ寒天上でコロニーを選択する。
【０２４７】
欠失は、ジェノタイピングとシーケンシングによって検証し、得られた株の名称は
・  ＥＱ．ＥＣ００２：ＭＧ１６５５  ΔｓｕｃＡ
・  ＥＱ．ＥＣ００３：ＭＧ１６５５  ΔｓｕｃＡ  Δｅｄｄ−ｅｄａ
・  ＥＱ．ＥＣ００４：ＭＧ１６５５  ΔｓｕｃＡ  Δｅｄｄ−ｅｄａ  ΔｇａｐＡ：：ｋａｎ
である。
【０２４８】
ｄ）ＣＯ２固定に必要とされるエンジニアリングの挿入
大腸菌でのＩ型ＲｕＢｉｓＣＯの異なる成分の組換え発現のために、以下の表１７に記載される遺伝子を、以下の表１８に記載される遺伝子を含む合成オペロンとしてクローニングする。
【０２４９】
【表１７】
2020506723.tif 000020
【０２５０】
【表１８】
2020506723.tif 000021
【０２５１】
これらの遺伝子の発現レベルを制御するために、以下の表１９に示されるリボソーム結合配列（ＲＢＳ）を、可変転写効率（Ｌｅｖｉｎ−Ｋａｒｐ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  Ｓｙｎｔｈ  Ｂｉｏｌ．２０１３  Ｊｕｎ  ２１；２（６）：３２７−３６．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｓｂ４００００２ｎ；Ｚｅｌｃｂｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１３  Ｍａｙ；４１（９）：ｅ９８）で各遺伝子のコーディングフェーズの間に挿入する。ＲＢＳ配列が散在する連続した各コーディングフェーズを、ＰＬｔｅｔＯ−１プロモーター、ｐ１５Ａ複製起点およびアンピシリン耐性遺伝子を含むｐＺＡ１１ベクター（Ｅｘｐｒｅｓｓｙｓ）への連続挿入によって構築する。
【０２５２】
【表１９】
2020506723.tif 000022
【０２５３】
上記の計画に従って示された異なるベクターをエレクトロポレーションすることによって、いくつかの株を産生する。
ＥＱ．ＥＣ００５→（ＥＱ．ＥＣ００３＋ｐＺＡ１１）：ＭＧ１６５５  ΔｓｕｃＡ  Δｅｄｄ−ｅｄａ
ＥＱ．ＥＣ００６→（ＥＱ．ＥＣ００４＋ｐＥＱＥＣ００５）：ＭＧ１６５５  ΔｓｕｃＡ  Δｅｄｄ−ｅｄａ  ΔｇａｐＡ：：ｋａｎ（ＲｕＢｉｓＣＯ）
ＥＱ．ＥＣ００７→（ＥＱ．ＥＣ００４＋ｐＥＱＥＣ００６）：ＭＧ１６５５  ΔｓｕｃＡ  Δｅｄｄ−ｅｄａ  ΔｇａｐＡ：：ｋａｎ（ＲｕＢｉｓＣＯ＋ＰＲＫ）
ＥＱ．ＥＣ００９→（ＥＱ．ＥＣ００４＋ｐＥＱＥＣ００８）：ＭＧ１６５５  ΔｓｕｃＡ  Δｅｄｄ−ｅｄａ  ΔｇａｐＡ：：ｋａｎ（ＰＲＫ）
【０２５４】
２ｇ／Ｌのグリセロールおよび５ｇ／Ｌのピルビン酸ならびに１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを補充したＬＢ培地でクローンを選択する。十分な量のバイオマスを得た後、ＰＲＫ／ＲｕＢｉｓＣＯエンジニアリングの使用に株を適合させるために、最小２５０ｍＬのエルレンマイヤーフラスコで５０ｍＬ以上の容量の培養物を接種する。この適合は、２ｇ／Ｌのグルコース、上記のように３７℃で外因性ＣＯ２供給を含むＬＢ培地で行う。
【０２５５】
ｅ）グルタミン酸産生
グルタミン酸産生のために、５００ｍＬのＬＢ培養からの細胞を、２０ｍＬのＭＳ培地（４０ｇ／Ｌのグルコース、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２０ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１０ｍｇ／ＬのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１０ｍｇ／ＬのＭｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２ｇ／Ｌの酵母エキス、３０ｇ／ＬのＣａＣＯ３、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリン）にＣＯ２雰囲気下０．１の圧力で接種する。
【０２５６】
残留するグルタミン酸とグルコースは、バイオアナライザー（サクラ精機）で測定する。炭素収率Ｙｐ／ｓは、消費されたグルコース１グラム当たりに産生されるグルタミン酸のグラム数で計算する。
【０２５７】
この収率は、対照株ＥＱ．ＥＣ００５（空）、ＥＱ．ＥＣ００６（ＲｕＢｉｓＣＯのみ）と比較して、株ＥＱ．ＥＣ００７（ＲｕＢｉｓＣＯ＋ＰＲＫ）については１０％大幅に増加する。対照株ＥＱ．ＥＣ００９（ＰＲＫのみ）は生育不能である。
【０２５８】
４Ｂ］解糖およびペントースリン酸酸化経路の不活性化による産生の改善
ａ）ＦｌｐリコンビナーゼによるＦＴＲ領域の特異的組換えによる選択カセットの除去
この工程は、上記の例４Ａ］と同じ方法で実施する。
【０２５９】
得られた株はＥＱ．ＥＣ００２：ＭＧ１６５５  ΔｓｕｃＡｂと呼ぶ。
【０２６０】
ｂ）ｚｗｆ遺伝子の欠失
ｚｗｆ遺伝子（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：９４６３７０）の欠失は、相同組換えと、例４Ａ］に詳述されているように、サプライヤーのプロトコルに従ってＱｕｉｃｋ  ＆  Ｅａｓｙ  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  Ｒｅｄ（登録商標）／ＥＴ（登録商標）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｇｅｎｅ  Ｂｒｉｄｇｅｓ）を使用することにより実施する。
【０２６１】
得られた株はＥＱ．ＥＣ０１０：ＭＧ１６５５  ΔｓｕｃＡ  Δｚｗｆと呼ぶ。
【０２６２】
ｃ）ｇａｐＡ遺伝子の欠失
大腸菌Ｋ−１２株ＥＱ．ＥＣ０１０のｇａｐＡ遺伝子（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：９４６３７０）の欠失は、相同組換えと、例４Ａ］に詳述されているように、サプライヤーのプロトコルに従ってＱｕｉｃｋ  ＆  Ｅａｓｙ  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  Ｒｅｄ（登録商標）／ＥＴ（登録商標）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｇｅｎｅ  Ｂｒｉｄｇｅｓ）を使用することにより実施する。
【０２６３】
欠失は、ジェノタイピングとシーケンシングによって検証し、得られた株の名称は
・  ＥＱ．ＥＣ００２：ＭＧ１６５５  ΔｓｕｃＡ
・  ＥＱ．ＥＣ０１０：ＭＧ１６５５  ΔｓｕｃＡ  Δｚｗｆ
・  ＥＱ．ＥＣ０１１：ＭＧ１６５５  ΔｓｕｃＡ  Δｚｗｆ  ΔｇａｐＡ
である。
【０２６４】
ｄ）ＣＯ２固定に必要とされるエンジニアリングの挿入
大腸菌での機能性ＰＲＫ／ＲｕＢｉｓＣＯ系の異なる成分の組換え発現のために、表２０に記載され、Ｉ型ＲｕＢｉｓＣＯ、ホスホリブロキナーゼ、シャペロンおよび炭酸脱水酵素をコードする遺伝子を、上記の遺伝子を含む合成オペロンとしてクローニングする（表２１）。
【０２６５】
【表２０】
2020506723.tif 000023
【０２６６】
【表２１】
2020506723.tif 000024
【０２６７】
これらの遺伝子の発現レベルを制御するために、表１７に示されるリボソーム結合配列（ＲＢＳ）（例４Ａ］）を参照）を、可変転写効率（Ｌｅｖｉｎ−Ｋａｒｐ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  Ｓｙｎｔｈ  Ｂｉｏｌ．２０１３  Ｊｕｎ  ２１；２（６）：３２７−３６．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｓｂ４００００２ｎ；Ｚｅｌｃｂｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１３  Ｍａｙ；４１（９）：ｅ９８）で各遺伝子のコーディングフェーズの間に挿入する。ＲＢＳ配列が散在する連続した各コーディングフェーズを、ＰＬｔｅｔＯ−１プロモーター、ｐ１５Ａ複製起点およびアンピシリン耐性遺伝子を含むｐＺＡ１１ベクター（Ｅｘｐｒｅｓｓｙｓ）への連続挿入によって構築する。炭酸脱水酵素（ｉｃｆＡ）を加えることで、重炭酸イオンを利用可能なＣＯ２分子に相互変換することが可能になり、ＲｕＢｉｓＣＯの効率が改善される。
【０２６８】
下記の計画に従って示された異なるベクターをエレクトロポレーションすることによって、いくつかの株を産生する。
ＥＱ．ＥＣ０１２→（ＥＱ．ＥＣ００２＋ｐＺＡ１１）：ＭＧ１６５５  ΔｓｕｃＡ
ＥＱ．ＥＣ０１４→（ＥＱ．ＥＣ０１１＋ｐＥＱＥＣ００６）：ＭＧ１６５５  ΔｓｕｃＡ  Δｚｗｆ  ΔｇａｐＡ（ＲｕＢｉｓＣＯ＋ＰＲＫ）
ＥＱ．ＥＣ０１５→（ＥＱ．ＥＣ０１１＋ｐＥＱＥＣ００７）：ＭＧ１６５５  ΔｓｕｃＡ  Δｚｗｆ  ΔｇａｐＡ（ＲｕＢｉｓＣＯ＋ＰＲＫ＋炭酸脱水酵素）
【０２６９】
形質転換後、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを補充したＬＢグリセロール、ピルビン酸培地でクローンを選択する。ＰＲＫおよびＲｕＢｉｓＣＯエンジニアリングによる株の適合および進化段階を、例４Ａ］に記載されているように実施する。
【０２７０】
ｅ）グルタミン酸産生
グルタミン酸産生のために、５００ｍＬのＬＢ培養からの細胞を、２０ｍＬのＭＳ培地（４０ｇ／Ｌのグルコース、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２０ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１０ｍｇ／ＬのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１０ｍｇ／ＬのＭｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２ｇ／Ｌの酵母エキス、３０ｇ／ＬのＣａＣＯ３、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリン）にＣＯ２雰囲気下０．１の圧力で接種する。
【０２７１】
残留するグルタミン酸とグルコースは、バイオアナライザー（ＹＳＩ  Ｉｎｃ．）で測定する。炭素収率Ｙｐ／ｓは、消費されたグルコース１グラム当たりに産生されるグルタミン酸のグラム数で計算する。
【０２７２】
この収率は、対照株ＥＱ．ＥＣ０１２（空）と比較して、株ＥＱ．ＥＣ０１４（ＲｕＢｉｓＣＯ＋ＰＲＫ）および株ＥＱ．ＥＣ０１５（ＲｕＢｉｓＣＯ＋ＰＲＫ＋炭酸脱水酵素）については１５％大幅に増加する。対照株ＥＱ．ＥＣ００９（ＰＲＫのみ）は生育不能である。
【０２７３】
４Ｃ］解糖および酸化ペントースリン酸経路の不活性化、ならびにピルビン酸デカルボキシラーゼおよびグルタミン酸デヒドロゲナーゼの過剰発現による産生の改善
【０２７４】
ａ）ＦｌｐリコンビナーゼによるＦＴＲ領域の特異的組換えによる選択カセットの除去
この工程は、上記の例４Ａ］と同じ方法で実施する。
【０２７５】
得られた株はＥＱ．ＥＣ００２：ＭＧ１６５５  ΔｓｕｃＡと呼ぶ。
【０２７６】
ｂ）ｚｗｆ遺伝子の欠失
ｚｗｆ遺伝子（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：９４６３７０）の欠失は、相同組換えと、例４Ａ］に詳述されているように、サプライヤーのプロトコルに従ってＱｕｉｃｋ  ＆  Ｅａｓｙ  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  Ｒｅｄ（登録商標）／ＥＴ（登録商標）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｇｅｎｅ  Ｂｒｉｄｇｅｓ）を使用することにより実施する。得られた株はＥＱ．ＥＣ０１０：ＭＧ１６５５  ΔｓｕｃＡ  Δｚｗｆと呼ぶ。
【０２７７】
ｃ）ｇａｐＡ遺伝子の欠失
大腸菌Ｋ−１２株ＥＱ．ＥＣ０１０のｇａｐＡ遺伝子の欠失は、相同組換えと、例４Ａ］に詳述されているように、サプライヤーのプロトコルに従ってＱｕｉｃｋ  ＆  Ｅａｓｙ  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅ  ＤｅｌｅｔｉｏｎＲｅｄ（登録商標）／ＥＴ（登録商標）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｇｅｎｅ  Ｂｒｉｄｇｅｓ）を使用することにより実施する。欠失は、ジェノタイピングとシーケンシングによって検証し、得られた株の名称は
・  ＥＱ．ＥＣ００２：ＭＧ１６５５  ΔｓｕｃＡ
・  ＥＱ．ＥＣ０１０：ＭＧ１６５５  ΔｓｕｃＡ  Δｚｗｆ
・  ＥＱ．ＥＣ０１１：ＭＧ１６５５  ΔｓｕｃＡ  Δｚｗｆ  ΔｇａｐＡ
である。
【０２７８】
ｄ）ＣＯ２固定に必要とされるエンジニアリングの挿入
大腸菌での機能性ＰＲＫ／ＲｕＢｉｓＣＯ系の異なる成分の組換え発現のために、表２２に記載され、ＩＩ型ＲｕＢｉｓＣＯ、ホスホリブロキナーゼおよび炭酸脱水酵素をコードする遺伝子を、上記の遺伝子を含む合成オペロンとしてクローニングする（表２３）。
【０２７９】
【表２２】
2020506723.tif 000025
【０２８０】
【表２３】
2020506723.tif 000026
【０２８１】
これらの遺伝子の発現レベルを制御するために、表１７に示されるリボソーム結合配列（ＲＢＳ）（例４Ａ］）を参照）を、可変転写効率で各遺伝子のコーディングフェーズの間に挿入する。ＲＢＳ配列が散在する連続した各コーディングフェーズを、ＰＬｔｅｔＯ−１プロモーター、ｐ１５Ａ複製起点およびアンピシリン耐性遺伝子を含むｐＺＡ１１ベクター（Ｅｘｐｒｅｓｓｙｓ）への連続挿入によって構築する。グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｄｈＡ）およびピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｖｃＡ）を加えることで、グルタミン酸のより良好な産生が可能になる。炭酸脱水酵素（ＣＡ）を加えることで、重炭酸イオンを利用可能なＣＯ２分子に相互変換することが可能になり、ＲｕＢｉｓＣＯの効率が改善される。
【０２８２】
下記の計画に従って示された異なるベクターをエレクトロポレーションすることによって、いくつかの株を産生する。
ＥＱ．ＥＣ０１６→（ＥＱ．ＥＣ００２＋ｐＥＱＥＣ０１１）：ＭＧ１６５５  ΔｓｕｃＡ（グルタミン酸デヒドロゲナーゼ＋ピルビン酸カルボキシラーゼ）
ＥＱ．ＥＣ０１７→（ＥＱ．ＥＣ０１１＋ｐＥＱＥＣ００９）：ＭＧ１６５５  ΔｓｕｃＡ  Δｚｗｆ  ΔｇａｐＡ（ＲｕＢｉｓＣＯ＋ＰＲＫ＋グルタミン酸デヒドロゲナーゼ＋ピルビン酸カルボキシラーゼ）
ＥＱ．ＥＣ０１８→（ＥＱ．ＥＣ０１１＋ｐＥＱＥＣ０１０）：ＭＧ１６５５  ΔｓｕｃＡ  Δｚｗｆ  ΔｇａｐＡ（ＲｕＢｉｓＣＯ＋ＰＲＫ＋炭酸脱水酵素＋グルタミン酸デヒドロゲナーゼ＋ピルビン酸カルボキシラーゼ＋炭酸脱水酵素）
【０２８３】
形質転換後、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを補充したＬＢグリセロール、ピルビン酸培地でクローンを選択する。ＰＲＫおよびＲｕＢｉｓＣＯエンジニアリングによる株の適合および進化段階を、例４Ａ］に記載されているように実施する。
【０２８４】
ｅ）グルタミン酸産生
グルタミン酸産生のために、５００ｍＬのＬＢ培養からの細胞を、２０ｍＬのＭＳ培地（４０ｇ／Ｌのグルコース、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２０ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１０ｍｇ／ＬのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１０ｍｇ／ＬのＭｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２ｇ／Ｌの酵母エキス、３０ｇ／ＬのＣａＣＯ３、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリン）にＣＯ２雰囲気下０．１の圧力で接種する。
【０２８５】
残留するグルタミン酸とグルコースは、バイオアナライザー（ＹＳＩ  Ｉｎｃ．）で測定する。炭素収率Ｙｐ／ｓは、消費されたグルコース１グラム当たりに産生されるグルタミン酸のグラム数で計算する。
【０２８６】
この収率は、対照株ＥＱ．ＥＣ０１６と比較して、株ＥＱ．ＥＣ０１７およびＥＱ．ＥＣ０１８については１５％大幅に増加する。
【０２８７】
例５：カプリアビダス・ネカトール（Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ）でのポリヒドロキシ酪酸産生の改善
本発明に従って提案される遺伝的改変により得られる還元力の増加はまた、既存の代謝経路よりもかなりの利益を有し得る。
【０２８８】
これは、ポリヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）を自然に産生する細菌株カプリアビダス・ネカトールＡＴＣＣ  １７６９９の場合に当てはまる。この細菌は、独立栄養条件と従属栄養条件の両方の条件下で成長することができる。ｇａｐＡ遺伝子（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼＮＣ＿００８３１３．１）の欠失は、代謝フラックスをペントースリン酸経路に転換し、ＮＡＤＰＨ還元ヌクレオチドのプールを増加させ、それによりＰＨＢの産生収率が増加する。
【０２８９】
このカプリアビダス・ネカトールＨ１６株は、メガプラスミドｐＨＧ１と２つの染色体を有する。ｇａｐＡ遺伝子の欠失は、グラム陰性菌の枯草菌自殺遺伝子ｓａｃＢを含むベクターを生成することにより実施する（Ｑｕａｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ．１９９３  Ｍａｙ  １５；１２７（１）：１５−２１；  Ｌｉｎｄｅｎｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１０  Ａｕｇ；７６（１６）：５３７３−８２およびＡｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２０１２  Ａｕｇ；７８（１５）：５３７５−８３）。
【０２９０】
ａ）Ｅｎｔｎｅｒ−Ｄｏｕｄｏｒｏｆｆ代謝経路の不活性化
ｅｄｄおよびｅｄａ遺伝子の隣接領域（ｅｄｄの上流およびｅｄａの下流）に対応する２つのＰＣＲアンプリコンを、Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００２  Ｄｅｃ；６８（１２）：５９２５−３２）に記載されている手順に従った制限により、プラスミドｐＪＱ２００ｍｐ１８Ｃｍでクローニングする。
【０２９１】
次いで、改変されたプラスミドｐＪＱ２００ｍｐ１８Ｃｍ：：Δｅｄｄ−ｅｄａを、塩化カルシウム形質転換法によって大腸菌株Ｓ１７−１に形質転換する。カプリアビダス・ネカトールへの遺伝物質の移入は、Ｓ１７−１細菌の細胞単層を含む皿で寒天上にカプリアビダス・ネカトール培養物をスポットすることによる接合によって行う。選択目的で１０％スクロースの存在下に３０℃の栄養ブイヨン（ＮＴ）培地で選択を行い（Ｈｏｇｒｅｆｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １９８４  Ａｐｒ；１５８（１）：４３−８）、５０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含む無機培地で検証する。
【０２９２】
欠失は、ジェノタイピングとシーケンシングによって検証する。したがって、結果として得られる株ＥＱＣＮ＿００２には、Ｅｎｔｎｅｒ−Ｄｏｕｄｏｒｏｆｆ代謝経路の遺伝子ｅｄｄ−ｅｄａ．ＥＱＣＮ＿００２：Ｈ１６  Δｅｄｄ−ｅｄａが欠失している。
【０２９３】
ｂ）解糖経路の不活性化
ｇａｐＡ遺伝子の隣接領域に対応する２つのＰＣＲアンプリコンを、Ｌｉｎｄｅｎｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．２０１２に記載されている手順に従った制限により、プラスミドｐｊＱ２００ｍｐ１８Ｔｃでクローニングする。
【０２９４】
次いで、改変されたプラスミドｐｊＱ２００ｍｐ１８Ｔｃ：：ΔｇａｐＡを、塩化カルシウム形質転換法によって大腸菌株Ｓ１７−１に形質転換する。遺伝物質の移入は、Ｓ１７−１細菌の細胞単層を含む皿で寒天上にカプリアビダス・ネカトール培養物をスポットすることによる接合によって行う。選択目的で１０％スクロースの存在下に３０℃の栄養ブイヨン（ＮＴ）培地で選択を行い（Ｈｏｇｒｅｆｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９８４  Ａｐｒ；１５８（１）：４３−８）、２５μｇ／ｍＬのテトラサイクリンを含む無機培地で検証する。
【０２９５】
欠失は、ジェノタイピングとシーケンシングによって検証する。したがって、結果として得られる株ＥＱＣＮ＿００３には、ｇａｐＡ遺伝子ＥＱＣＮ＿００３：  Ｈ１６  Δｅｄｄ−ｅｄａ  ΔｇａｐＡが欠失している。
【０２９６】
ｇａｐＡ遺伝子の解糖経路およびｅｄｄ−ｅｄａ遺伝子のＥｎｔｎｅｒ−Ｄｏｕｄｏｒｏｆｆ経路に欠失を有するＥＱＣＮ＿００３株は成長して、ＰＲＫおよびＲｕＢｉｓＣＯ酵素の使用により外因性ＣＯ２を固定することによってＰＨＢ産生収率を改善する。
【０２９７】
ｂ）バイオリアクターでのＰＨＢの産生
凍結ストックからの接種物を、フルクトースの存在下に３０℃で４８〜９６時間インキュベートしたクライオチューブから５０〜１００μＬの割合で固体培地に広げる。ＲｕＢｉｓＣＯおよびＰＲＫをコードする遺伝子の発現は、従属栄養好気性条件下にカプリアビダス・ネカトールで維持される（Ｒｉｅ  Ｓｈｉｍｉｚｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．２０１５；５：  １１６１７．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ２０１５  Ｊｕｌ  １．）。
【０２９８】
エルレンマイヤーフラスコでのバッチ培養（５０ｍＬで１０ｍＬ、次いで２５０ｍＬで５０ｍＬ）を、２０ｇ／Ｌフルクトースの適切な培地と１０％外因性ＣＯ２供給により、振盪インキュベーター（１００〜２００ｒｐｍ、３０℃）で、０．０１の最小接種量により行う。
【０２９９】
ＰＨＢ産生収率を改善する目的株ＥＱＣＮ＿００３を、栄養制限が存在する従属栄養条件下でＰＨＢを自然に蓄積する参照株Ｈ１６と比較する。
【０３００】
株の産生性はバイオリアクターで比較する。バイオリアクターで行われる培養に、上記の条件下で固体および／または液体増幅鎖からエルレンマイヤーフラスコに播種する。Ｍｙ−ｃｏｎｔｒｏｌ型（Ａｐｐｌｉｋｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，デルフト、オランダ国）７５０ｍＬまたはＢｉｏｓｔａｔ  Ｂ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ、ゲッティンゲン、ドイツ国）２．５Ｌのバイオリアクターを、０．０１ＯＤ６２０ｎｍに相当する密度で播種する。
【０３０１】
ＰＨＢの蓄積は増殖から切り離す。培養は３０℃で調整し、通気量は、最小溶存酸素濃度を２０％（３０℃、１ｂａｒ）より高く維持するために０．１ＶＶＭ（気体体積／液体体積／分）〜１ＶＶＭであり、振盪は、使用されるバイオリアクターの規模に応じて適合させる。入口ガス流は、任意にＣＯ２を補充した空気から成る。ＣＯ２補充は１％〜１０％である。１４％または７％アンモニア溶液でｐＨを７に調節する。流加培養法では、一定の炭素／リンまたは炭素／ニトロゲン比を維持しながら、リンまたはニトロゲンの制限と組み合わせた非限定的な炭素基質の供給が可能である。ＰＨＢ抽出および定量化は、Ｂｒａｎｄｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１３  Ｊｕｌ；７９（１４）：４４３３−９）の方法に従って実施する。プロトコルは、１ｍＬのクロロホルムを１０ｍｇの凍結乾燥細胞に加え、続いて８５０μＬのメタノールと１５０μＬの硫酸を加えることから成る。混合物を１００℃で２．５時間加熱し、冷却し、５００μＬの水を加える。遠心分離によって２つの相を分離し、硫酸ナトリウムを加えて有機相を乾燥させる。サンプルをろ過し、Ｍｕｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１３  Ｊｕｌ；７９（１４）：４４３３−９）によって記載されているように分析する。
【０３０２】
野生型カプリアビダス・ネカトールＨ１６培養物と株ＥＱＣＮ＿００３株：Ｈ１６  Δｅｄｄ−ｅｄａ  ΔｇａｐＡとの比較により、消費されたフルクトース１グラム当たりのＰＨＢのグラム数の比率に相当する炭素収率が５％増加することが示される。
【０３０３】
例６：大腸菌でのＧＡＢＡ産生の改善
例４Ｂ］に従ってグルタミン酸産生の収率を増加させるように遺伝的に改変された大腸菌Ｋ−１２株は、グルタミン酸デカルボキシラーゼｇａｄＢ（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：９４６０５８）の構成的発現を可能にし、ひいてはγ−アミノ酪酸の産生収率を増加させるように改変することもできる。
【０３０４】
α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の欠失は、グルタミン酸産生も増加させる（Ｕｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１０  Ｍａｙ  ３；１４７（１）：１７−３０．ｄｏｉ：  １０．１０１６／ｊ．ｊｂｉｏｔｅｃ．２０１０．０２．０１８）。
【０３０５】
この例では、例４Ｂ］から得られた以下の株を使用する：
・  ＥＱ．ＥＣ００２：ＭＧ１６５５  ΔｓｕｃＡ
・  ＥＱ．ＥＣ０１０：ＭＧ１６５５  ΔｓｕｃＡ  Δｚｗｆ
・  ＥＱ．ＥＣ０１１：ＭＧ１６５５  ΔｓｕｃＡ  Δｚｗｆ  ΔｇａｐＡ
【０３０６】
ａ）ｇａｄＢ遺伝子の構成的過剰発現
ｇａｄＢ遺伝子の過剰発現を、細菌発現ベクターｐＺＥ２１ＭＣＳ（ＥＸＰＲＥＳＳＹＳ）にサブクローニングする。このベクターは、ＣｏｌＥ１複製起点およびカナマイシン抗生物質耐性遺伝子を有する。
【０３０７】
速やかに、ｇａｄＢ遺伝子（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：９４６０５８）のコーディングフェーズを、株ＭＧ１６５５  ΔｓｕｃＡのゲノムから、１５７０５９５〜１５７０６４５および１５７２０９５〜１５７２０４５の位置をカバーする大腸菌Ｋ−１２ゲノムに相同なプライマーで増幅する。これらの各プライマーを、マルチクローニングサイトを除くベクターｐＺＥ２１ＭＣＳを増幅することによって得られるフラグメントの両端で１８超ヌクレオチドの相同な浮動配列（ｆｌｏａｔｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）に結合させる。２つのアンプリコンをＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ｕｓｅｒ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）のプロトコルに従って組み合わせて、ｇａｄＢ遺伝子の構成的過剰発現を可能にするプラスミドｐＥＱＥＣ０３０を形成する。
【０３０８】
ｂ）ＣＯ２固定に必要とされるエンジニアリングの挿入
大腸菌での機能性Ｉ型ＲｕＢｉｓＣＯの異なる成分の組換え発現のために、表１７に記載される遺伝子（例４Ａ］）を、表２２に記載される構築構造に従って合成オペロンとしてクローニングする。
【０３０９】
異なるベクターのアセンブリ
表２４に記載される遺伝子のコーディング配列（ＣＤＳ）を、表２４に記載される３つの統合ブロックが得られるように、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ（登録商標）ＨｉＦｉ  ＤＮＡ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  Ｋｉｔ（Ｅ２３２１）で提供されるプロトコルに従って増幅し、ブロックにアセンブルする。
【０３１０】
次いで、各ブロックを、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ｕｓｅｒ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）のプロトコルに従って増幅することで、以下の表２４に記載されるプラスミドを形成する。
【０３１１】
【表２４】
2020506723.tif 000027
【０３１２】
これらの遺伝子の発現レベルを制御するために、表１９に示されるリボソーム結合配列（ＲＢＳ）（例４Ｂ）を参照）を、可変転写効率（Ｌｅｖｉｎ−Ｋａｒｐ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  Ｓｙｎｔｈ  Ｂｉｏｌ．２０１３  Ｊｕｎ  ２１；２（６）：３２７−３６．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｓｂ４００００２ｎ；Ｚｅｌｃｂｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１３  Ｍａｙ；４１（９）：ｅ９８）で各遺伝子のコーディングフェーズの間に挿入する。ＲＢＳ配列が散在する連続した各コーディングフェーズを、ＰＬｔｅｔＯ−１プロモーター、ｐ１５Ａ複製起点およびアンピシリン耐性遺伝子を含むｐＺＡ１１ベクター（Ｅｘｐｒｅｓｓｙｓ）への連続挿入によって構築する。グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ｇａｄＢ）を加えることで、グルタミン酸をγ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）に変換することが可能になる。
【０３１３】
下記の計画に従って示された異なるベクターをエレクトロポレーションすることによって、いくつかの株を産生する。
ＥＱ．ＥＣ０１３→（ＥＱ．ＥＣ００２＋ｐＺＡ１１＋ｐＥＱ０３０）：ＭＧ１６５５  ΔｓｕｃＡ＋（ｇａｄＢ）
ＥＱ．ＥＣ０２０→（ＥＱ．ＥＣ０１１＋ｐＥＱ０３０＋ｐＥＱＥＣ００６）：ＭＧ１６５５  ΔｓｕｃＡ  Δｚｗｆ  ΔｇａｐＡ＋（ｇａｄＢ）＋（ＲｕＢｉｓＣＯ＋ＰＲＫ）
【０３１４】
形質転換後、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンおよび３０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを補充したＬＢグリセロール、ピルビン酸培地でクローンを選択する。ＰＲＫおよびＲｕＢｉｓＣＯエンジニアリングによる株の適合および進化段階を、例４Ａ］に記載されているように実施する。
【０３１５】
ｃ）ＧＡＢＡ産生
ＧＡＢＡ産生のために、５００ｍＬのＬＢ培養からの細胞を、２０ｍＬのＭＳ培地（４０ｇ／Ｌのグルコース、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２０ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１０ｍｇ／ＬのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１０ｍｇ／ＬのＭｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２ｇ／Ｌの酵母エキス、３０ｇ／ＬのＣａＣＯ３、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンおよび３０ｍｇ／Ｌのカナマイシン）にＣＯ２雰囲気下０．１の圧力で、３０℃にてｐＨ３．５で接種する。
【０３１６】
ＧＡＢＡ濃度を、ＯｐｔｉｍａＰａｋ  Ｃ１８カラム（４．６×１５０ｍｍ、ＲＳ  Ｔｅｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、テジョン広域市、韓国）を使用した高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で測定する。サンプルを１２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、１００μＬの上清を新しいエッペンドルフチューブに移す。これらのチューブに次の試薬を加える：２００μＬの１Ｍ重炭酸ナトリウムバッファー（ｐＨ９．８）、アセトニトリル中１００μＬの８０ｇ／Ｌダンシルクロリドおよび６００μＬの再蒸留水。混合物を８０℃で４０分間インキュベートする。１００μＬの２％酢酸を加えて反応を停止する。混合物を１２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。次いで、上清を０．２μｍ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅフィルターでろ過し、ＵＶ検出器を使用してＡｇｉｌｅｎｔシステムのＨＰＬＣによって分析する。溶離液Ａ［テトラヒドロフラン／メタノール／酢酸ナトリウム５０ｍＭ、ｐＨ６．２（５：７５：４２０（容量で））］および溶離液Ｂ（メタノール）を使用したバイナリー非線形グラジエントを使用して、誘導体化サンプルを分離する。残留グルコースを、バイオアナライザー（ＹＳＩ  Ｉｎｃ．）で測定する。
【０３１７】
炭素収率Ｙｐ／ｓは、消費されたグルコース１グラム当たりに産生されるＧＡＢＡのグラム数で計算する。
【０３１８】
この収率は、対照株ＥＱ．ＥＣ０１３  ΔｓｕｃＡ（ＧａｄＢ）と比較して、株ＥＱ．ＥＣ０２０  ΔｓｕｃＡ  Δｚｗｆ  ΔｇａｐＡ（ＲｕＢｉｓＣＯ＋ＰＲＫ）＋（ＧａｄＢ）については１５％大幅に増加する。
【０３１９】
例７：大腸菌でのコハク酸およびシュウ酸の産生の改善
オオウズラタケ（Ｆｏｍｉｔｏｐｓｉｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）からのグリオキシル酸デヒドロゲナーゼＦＰＧＬＯＸＤＨ１（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：９４６０５８）の構成的発現を可能にし、ｉｃｄ遺伝子（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：９４５７０２）の発現を減少させ、かつａｃｅＢ遺伝子（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：９４８５１２）とｓｄｈＡ遺伝子（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：９４５４０２）を不活性化するように遺伝的に改変された大腸菌Ｋ−１２株は、コハク酸およびシュウ酸の産生収率を増加させる。
【０３２０】
イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ｉｃｄ）発現の減少は、代謝フラックスがグリオキシル酸シャントにリダイレクトされることを可能にする。リンゴ酸シンターゼ（ａｃｅＢ）とコハク酸デヒドロゲナーゼ（ｓｄｈＡ）の不活性化は、産生されたグリオキシル酸とコハク酸のそれぞれが再消費されることを防止する。コハク酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の欠失は、好気性条件下でのコハク酸産生を増加させる（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ｒｅｓ．２０１４  Ｍａｙ−Ｊｕｎ；１６９（５−６）：４３２−４０）。リンゴ酸シンターゼ遺伝子の欠失は、グリオキシル酸デヒドロゲナーゼの構成的発現によってシュウ酸に変換されるグリオキシル酸の蓄積を可能にする。
【０３２１】
この例では、ｓｄｈＡ遺伝子が欠失された大腸菌Ｋ−１２株ＭＧ１６５５を使用する。この株は、大腸菌Ｋ−１２の遺伝子欠失バンク（Ｂａｂａ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｓｙｓｔ  Ｂｉｏｌ．２００６；２：２００６．０００８）に由来し、Ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  ＣｅｎｔｅｒからＪＷ０７１５−２という名称で、参照番号８３０２（ＪＷ０７１３−１：ＭＧ１６５５  ΔｓｄｈＡ：：Ｋａｎ）で提供される。
【０３２２】
ａ）ＦｌｐリコンビナーゼによるＦＴＲ領域の特異的組換えによる選択カセットの除去
上記の株ＪＷ０７１５−２の構築に使用したものと同じ欠失ストラテジーを再利用できるようにするため（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）、リコンビナーゼを使用して選択カセットを欠失させる。
【０３２３】
プラスミドｐ７０７−Ｆｌｐｅ（Ｇｅｎｅ  ＢｒｉｄｇｅｓのＱｕｉｃｋ  ＆  Ｅａｓｙ  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  Ｒｅｄ（登録商標）／ＥＴ（登録商標）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｋｉｔに付属）を、キットプロトコルに従ってエレクトロポレーションにより形質転換する。０．２％グルコース、０．０００３％テトラサイクリンを補充し、０．３％Ｌ−アラビノースを添加したＬＢ寒天上で細胞を選択する。得られたクローンの対抗選択を、それらが０．００１５％カナマイシンを補充した同じ培地でもはや増殖することができないことを検証することによって行う。
【０３２４】
得られた株はＥＱ．ＥＣ０４０：ＭＧ１６５５  ΔｓｄｈＡと呼ぶ。
【０３２５】
ｂ）ａｃｅＢ遺伝子の欠失
ａｃｅＢ遺伝子（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：９４８５１２）の欠失は、相同組換えと、サプライヤーのプロトコルに従ってＱｕｉｃｋ  ＆  Ｅａｓｙ  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  Ｒｅｄ（登録商標）／ＥＴ（登録商標）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｇｅｎｅ  Ｂｒｉｄｇｅｓ）を使用することにより実施する。
【０３２６】
ＦＲＴ−ＰＫＧ−ｇｂ２−ｎｅｏ−ＦＲＴ耐性遺伝子発現カセットを増幅するように設計され、染色体上の欠失遺伝子座の隣接領域、すなわち位置４２１５４２８−４２１５４７８および４２１７１２９−４２１７０２９にに５０超ヌクレオチドの相同な５′配列を有し、それによりａｃｅＢ遺伝子コーディング配列の両側の細菌ゲノム上にカセットの組換えアームを生成するオリゴヌクレオチド。
【０３２７】
大腸菌Ｋ−１２株ＥＱ．ＥＣ０４０は、キットプロトコルに従ってプラスミドｐＲｅｄＥＴを用いたエレクトロポレーションにより形質転換する。得られたコロニーは、０．２％グルコース、０．０００３％テトラサイクリンを含むリッチ複合培地ＬＢ寒天上で選択する。
【０３２８】
液体ＬＢ中０．３％アラビノースによって１時間誘発されたＲｅｄＥＴリコンビナーゼの存在下に第１の工程で得られたアンプリコンの形質転換。そのために、欠失カセットの２回目の形質転換を、ＲｅｄＥＴを発現する細胞でのエレクトロポレーションにより実施し、０．２％グルコース、０．０００３％テトラサイクリンを補充し、０．３％Ｌ−アラビノースおよび０．００１５％カナマイシンを添加したＬＢ寒天上でコロニーを選択する。
【０３２９】
プラスミドｐ７０７−Ｆｌｐｅ（Ｇｅｎｅ  ＢｒｉｄｇｅｓのＱｕｉｃｋ  ＆  Ｅａｓｙ  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  Ｒｅｄ（登録商標）／ＥＴ（登録商標）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｋｉｔに付属）を、キットプロトコルに従ってエレクトロポレーションにより形質転換する。０．２％グルコース、０．０００３％テトラサイクリンを補充し、０．３％Ｌ−アラビノースを添加したＬＢ寒天上で細胞を選択する。得られたクローンの対抗選択を、それらが０．００１５％カナマイシンを補充した同じ培地でもはや増殖することができないことを検証することによって行う。
【０３３０】
得られた株はＥＱ．ＥＣ０４１：ＭＧ１６５５  ΔｓｄｈＡ  ΔａｃｅＢと呼ぶ。
【０３３１】
ｃ）ｉｃｄ遺伝子プロモーターの変化
ｉ．ストラテジー
弱いプロモーターによるｉｃｄ遺伝子（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：９４５７０２）のネィティブプロモーターの代替を、相同組換えと、サプライヤーのプロトコルに従ってＱｕｉｃｋ  ＆  Ｅａｓｙ  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  Ｒｅｄ（登録商標）／ＥＴ（登録商標）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｇｅｎｅ  Ｂｒｉｄｇｅｓ）を使用することにより実施する。
【０３３２】
ｉｉ．弱いプロモーターＰｏｘｂ１の導入
ｉｃｄ遺伝子プロモーターを、弱いと特徴付けられるプロモーターＰｏｘｂ１を結合するカセットと、抗生物質耐性遺伝子を含むＰｏｘｂ１カセットの挿入の選択を可能にする抗生物質耐性遺伝子カセットとで代替する。
【０３３３】
ＦＲＴ−ＰＫＧ−ｇｂ２−ｎｅｏ−ＦＲＴ耐性遺伝子発現カセットを増幅するように設計され、センスオリゴのＰｉｃｄプロモーター遺伝子座の左側隣接領域（ゲノム標的ＬＡ）、すなわちゲノム上の位置１１９４９１１〜１１９４９６１に５０超ヌクレオチドの相同な５′配列を有するオリゴヌクレオチドであって、リバースオリゴのスペーサーＲ配列（表２３）は、Ｐｏｘｂ１フラグメントとのアセンブリを可能にするフラグメントの増幅を可能にする。
【０３３４】
プラスミドＰＳＦ−ＯＸＢ１（Ｓｉｇｍａ  ＃ＯＧＳ５５３）のＰｏｘｂ１プロモーターを増幅するように設計され、リバースオリゴのＰｉｃｄプロモーター遺伝子座の右側隣接領域（ゲノム標的ＬＡ）、すなわちゲノム上の位置１１９５１７３〜１１９５１２３に５０超ヌクレオチドの相同な５′配列を有するオリゴヌクレオチドであって、オリゴのスペーサーＳ配列（表２５）は、Ｐｏｘｂ１フラグメントの増幅を生じる。
【０３３５】
ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ（登録商標）ＨｉＦｉ  ＤＮＡ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  Ｋｉｔ（Ｅ２３２１）を使用した融合フラグメントの増幅により、代替プロモーターを抗生物質選択カセットと組み合わせることが可能になる。
【０３３６】
【表２５】
2020506723.tif 000028
【０３３７】
大腸菌Ｋ−１２株ＥＱ．ＥＣ０４１は、キットプロトコルに従ってプラスミドｐＲｅｄＥＴを用いたエレクトロポレーションにより形質転換する。得られたコロニーは、０．２％グルコース、０．０００３％テトラサイクリンを含むリッチ複合培地ＬＢ寒天上で選択する。
【０３３８】
液体ＬＢ中０．３％アラビノースによって１時間誘発されたＲｅｄＥＴリコンビナーゼの存在下に第１の工程で得られたアンプリコンの形質転換。そのために、欠失カセットの２回目の形質転換を、ＲｅｄＥＴを発現する細胞でのエレクトロポレーションにより実施し、０．２％グルコース、０．０００３％テトラサイクリンを補充し、０．３％Ｌ−アラビノースおよび０．００１５％カナマイシンを添加したＬＢ寒天上でコロニーを選択する。
【０３３９】
プラスミドｐ７０７−Ｆｌｐｅ（Ｇｅｎｅ  ＢｒｉｄｇｅｓのＱｕｉｃｋ  ＆  Ｅａｓｙ  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  Ｒｅｄ（登録商標）／ＥＴ（登録商標）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｋｉｔに付属）を、キットプロトコルに従ってエレクトロポレーションにより形質転換する。０．２％グルコース、０．０００３％テトラサイクリンを補充し、０．３％Ｌ−アラビノースを添加したＬＢ寒天上で細胞を選択する。得られたクローンの対抗選択を、それらが０．００１５％カナマイシンを補充した同じ培地でもはや増殖することができないことを検証することによって行う。
【０３４０】
得られた株はＥＱ．ＥＣ０４２：ＭＧ１６５５  ΔｓｄｈＡ  ΔａｃｅＢ  Ｐｉｃｄ：：Ｐｏｘｂ１と呼ぶ。
【０３４１】
ｄ）ｚｗｆ遺伝子の欠失
ｚｗｆ遺伝子（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：９４６３７０）の欠失は、相同組換えと、サプライヤーのプロトコルに従ってＱｕｉｃｋ  ＆  Ｅａｓｙ  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  Ｒｅｄ（登録商標）／ＥＴ（登録商標）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｇｅｎｅ  Ｂｒｉｄｇｅｓ）を使用することによって実施する。
【０３４２】
ＦＲＴ−ＰＫＧ−ｇｂ２−ｎｅｏ−ＦＲＴ耐性遺伝子発現カセットを増幅するように設計され、染色体上の欠失遺伝子座の隣接領域、すなわち位置１９３４７８９〜１９３４８３９および１９３６３６４〜１９３６３１４に５０超ヌクレオチドの相同な５′配列を有し、それによりオペロン全体の両側の細菌ゲノム上にカセットの組換えアームを生成するオリゴヌクレオチド。
【０３４３】
大腸菌Ｋ−１２株ＥＱ．ＥＣ０４２は、キットプロトコルに従ってプラスミドｐＲｅｄＥＴを用いたエレクトロポレーションにより形質転換する。得られたコロニーは、０．２％グルコース、０．０００３％テトラサイクリンを含むリッチ複合培地ＬＢ寒天上で選択する。
【０３４４】
液体ＬＢ中０．３％アラビノースによって１時間誘導されたＲｅｄＥＴリコンビナーゼの存在下に第１の工程で得られたアンプリコンの形質転換。そのために、欠失カセットの２回目の形質転換を、ＲｅｄＥＴを発現する細胞でのエレクトロポレーションにより実施し、０．２％グルコース、０．０００３％テトラサイクリンを補充し、０．３％Ｌ−アラビノースおよび０．００１５％カナマイシンを添加したＬＢ寒天上でコロニーを選択する。
【０３４５】
プラスミドｐ７０７−Ｆｌｐｅ（Ｇｅｎｅ  ＢｒｉｄｇｅｓのＱｕｉｃｋ  ＆  Ｅａｓｙ  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  Ｒｅｄ（登録商標）／ＥＴ（登録商標）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｋｉｔに付属）を、キットプロトコルに従ってエレクトロポレーションにより形質転換する。０．２％グルコース、０．０００３％テトラサイクリンを補充し、０．３％Ｌ−アラビノースを添加したＬＢ寒天上で細胞を選択する。得られたクローンの対抗選択を、それらが０．００１５％カナマイシンを補充した同じ培地でもはや増殖することができないことを検証することによって行う。
【０３４６】
得られた株はＥＱ．ＥＣ０４３：ＭＧ１６５５  ΔｓｄｈＡ  ΔａｃｅＢ  Ｐｉｃｄ：：Ｐｏｘｂ１  Δｚｗｆと呼ぶ。
【０３４７】
ｅ）ｇａｐＡ遺伝子の欠失
ｇａｐＡ遺伝子の欠失は、相同組換えと、サプライヤーのプロトコルに従ってＱｕｉｃｋ  ＆  Ｅａｓｙ  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  Ｒｅｄ（登録商標）／ＥＴ（登録商標）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｇｅｎｅ  Ｂｒｉｄｇｅｓ）を使用することによって実施する。
【０３４８】
ＦＲＴ−ＰＫＧ−ｇｂ２−ｎｅｏ−ＦＲＴ耐性遺伝子発現カセットを増幅するように設計され、欠失遺伝子座の隣接領域、すなわち遺伝子（ｇａｐＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｘ０２６６２．１）のコーティングフェーズに５０超ヌクレオチドの相同な５′配列を有し、それにより細菌ゲノム上にカセットの組換えアームを生成するオリゴヌクレオチド。
【０３４９】
大腸菌Ｋ−１２株ＥＱ．ＥＣ０４３は、キットプロトコルに従ってプラスミドｐＲｅｄＥＴを用いたエレクトロポレーションにより形質転換する。得られたコロニーは、０．２％グルコース、０．０００３％テトラサイクリンを含むリッチ複合培地ＬＢ寒天上で選択する。
【０３５０】
液体ＬＢ中０．３％アラビノースによって１時間誘発されたＲｅｄＥＴリコンビナーゼの存在下に第１の工程で得られたアンプリコンの形質転換。そのために、欠失カセットによるＲｅｄＥＴを発現する細胞の２回目のエレクトロポレーションを実施し、０．２％グリセロールおよび０．３％ピルビン酸、０．０００３％テトラサイクリンを補充し、０．３％Ｌ−アラビノースおよび０．００１５％カナマイシンを添加したＬＢ寒天上でコロニーを選択する。
【０３５１】
プラスミドｐ７０７−Ｆｌｐｅ（Ｇｅｎｅ  ＢｒｉｄｇｅｓのＱｕｉｃｋ  ＆  Ｅａｓｙ  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  Ｒｅｄ（登録商標）／ＥＴ（登録商標）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｋｉｔに付属）を、キットプロトコルに従ってエレクトロポレーションにより形質転換する。０．２％グルコース、０．０００３％テトラサイクリンを補充し、０．３％Ｌ−アラビノースを添加したＬＢ寒天上で細胞を選択する。得られたクローンの対抗選択を、それらが０．００１５％カナマイシンを補充した同じ培地でもはや増殖することができないことを検証することによって行う。
【０３５２】
得られた株はＥＱ．ＥＣ０４４：ＭＧ１６５５  ΔｓｄｈＡ  ΔａｃｅＢ  Ｐｉｃｄ：：Ｐｏｘｂ１  Δｚｗｆ  ΔｇａｐＡと呼ぶ。
【０３５３】
ｆ）ＦＰＧＬＯＸＤＨ１遺伝子およびａｃｅＡ遺伝子の構成的過剰発現
ＦＰＧＬＯＸＤＨ１遺伝子（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：９４６０５８）およびａｃｅＡ遺伝子（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：９４８５１７）のコーティング配列（ＩＣＤＳ）を、表２４に記載される構造に従って合成オペロンとして細菌発現ベクターｐＺＥ２１ＭＣＳ（ＥＸＰＲＥＳＳＹＳ）にサブクローニングする。このベクターは、ＣｏｌＥ１複製起点およびカナマイシン抗生物質耐性遺伝子を有する。
【０３５４】
これらの各プライマーを、マルチクローニングサイトを除くベクターｐＺＥ２１ＭＣＳを増幅することによって得られるフラグメントの両端で１８超ヌクレオチドの相同な浮動配列に結合させる。２つのアンプリコンをＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ｕｓｅｒ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）のプロトコルに従って組み合わせて、ＦＰＧＬＯＸＤＨ１遺伝子およびａｃｅＡ遺伝子の構成的過剰発現を可能にするプラスミドｐＥＱＥＣ０３５を形成する。
【０３５５】
ｇ）ＣＯ２固定に必要とされるエンジニアリングの挿入
大腸菌での機能性Ｉ型ＲｕＢｉｓＣＯの異なる成分の組換え発現のために、表１７に記載される遺伝子（例４Ａ］）を、合成オペロンの形態でクローニングする。
【０３５６】
表２に記載される遺伝子のコーディング配列（ＣＤＳ）を、表２６に記載される３つの統合ブロックが得られるように、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ（登録商標）ＨｉＦｉ  ＤＮＡ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  Ｋｉｔ（Ｅ２３２１）で提供されるプロトコルに従って増幅し、ブロックにアセンブルする。各ブロックを、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ｕｓｅｒ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）のプロトコルに従って増幅することで、以下の表２４に記載されるプラスミドを形成する。
【０３５７】
【表２６】
2020506723.tif 000029
【０３５８】
これらの遺伝子の発現レベルを制御するために、表１９（例４Ｂ］）に示されるリボソーム結合配列（ＲＢＳ）を、可変転写効率（Ｌｅｖｉｎ−Ｋａｒｐ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  Ｓｙｎｔｈ  Ｂｉｏｌ．２０１３  Ｊｕｎ  ２１；２（６）：３２７−３６．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｓｂ４００００２ｎ；Ｚｅｌｃｂｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１３  Ｍａｙ；４１（９）：ｅ９８）で各遺伝子のコーディングフェーズの間に挿入する。ＲＢＳ配列が散在する連続した各コーディングフェーズを、ＰＬｔｅｔＯ−１プロモーター、ｐ１５Ａ複製起点およびアンピシリン耐性遺伝子を含むｐＺＡ１１ベクター（Ｅｘｐｒｅｓｓｙｓ）への連続挿入によって構築する。
【０３５９】
下記の計画に従って示された異なるベクターをエレクトロポレーションすることによって、いくつかの株を産生する。
ＥＱ．ＥＣ０４５→（ＥＱ．ＥＣ０４２＋ｐＺＡ１１＋ｐＺＥ２１ＭＣＳ）：ＭＧ１６５５  ΔｓｄｈＡ  ΔａｃｅＢ  Ｐｉｃｄ：：Ｐｏｘｂ１
ＥＱ．ＥＣ０４６→（ＥＱ．ＥＣ０４５＋ｐＥＱＥＣ００６＋ｐＥＱＥＣ０３５）：  ＭＧ１６５５  ΔｓｄｈＡ  ΔａｃｅＢ  Ｐｉｃｄ：：Ｐｏｘｂ１  Δｚｗｆ  ΔｇａｐＡ＋（ＦＰＧＬＯＸＤＨ１＋ａｃｅＡ）＋（ＲｕＢｉｓＣＯ＋ＰＲＫ）
【０３６０】
形質転換後、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンおよび３０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを補充したＬＢグリセロール、ピルビン酸培地でクローンを選択する。ＰＲＫおよびＲｕＢｉｓＣＯエンジニアリングによる株の適合および進化段階を、例４Ａ］に記載されているように実施する。
【０３６１】
ｈ）コハク酸およびシュウ酸の産生
コハク酸およびシュウ酸の産生のために、５００ｍＬのＬＢ培養からの細胞を、２０ｍＬのＭＳ培地（４０ｇ／Ｌのグルコース、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２０ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１０ｍｇ／ＬのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１０ｍｇ／ＬのＭｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２ｇ／Ｌの酵母エキス、３０ｇ／ＬのＣａＣＯ３、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリン、３０ｍｇ／Ｌのカナマイシン）にＣＯ２雰囲気下０．１の圧力で、３０℃にてｐＨ３．５で接種する。
【０３６２】
コハク酸濃度は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で測定し、培養サンプルは１２，０００ｇで５分間遠心分離する。
【０３６３】
ｉ．コハク酸の測定
培養上清を０．２μｍ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅフィルターでろ過し、カチオン交換カラム（Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ８７−Ｈ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）、ＵＶ吸光度検出器（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇ１３１５Ｄ）および屈折率（ＲＩ）検出器（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＨＰ１０４７Ａ）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣシステム（シリーズ１１００）で分析する。サンプルは、流量０．４ｍＬ／分にて５ｍＭのＨ２Ｓ０４移動相で分離する。カラムオーブンの度は６５℃である。
【０３６４】
残留グルコースは、バイオアナライザー（Ｙｓｉ  Ｉｎｃ．）またはＡｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ８７−Ｈカラムを用いたＨＰＬＣ屈折率測定器で測定する。
【０３６５】
炭素収率Ｙｐ／ｓは、消費されたグルコース１グラム当たりの産生されたコハク酸のグラム数で計算する。
【０３６６】
この収率は、対照株ＥＱ．ＥＣ０４５（空）と比較して、エンジニアリング株ＥＱ．ＥＣ０４６については６％大幅に増加する。
【０３６７】
ｉｉ）シュウ酸の測定
ペレットを、２ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ  リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）で２回洗浄し、−２０℃で保存する。サンプル（１ｍＬ）を、０．７５ｇのガラスビーズ（４２５〜６００μｍ）で予冷したチューブに移し、Ｆａｓｔ  Ｐｒｅｐホモジナイザー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、エーレムボーデゲム、オランダ）に導入し、スピード調節６で４回２０秒間バーストさせる。溶解物を４℃および３６，０００ｇで２０分間遠心分離する。総タンパク質の測定を、ローリー法（Ｌｏｗｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９５１）に従って実施する。オキザロ酢酸アセチルヒドロラーゼ（ＥＣ３．７．１．１．１）活性を、（Ｌｅｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９７６）に記載されているように、２５５ｎｍでのオキザロ酢酸（ＯＡＡ）の直接光学測定の変更を使用して測定する。ＯＡＡエノール互変異性体の消失は、石英キュベットを使用してＨｉｔａｃｈｉ  Ｍｏｄｅｌ  １００−６０分光光度計（日立、東京、日本）で２５℃にて２５５ｎｍで調べる。１ｍＬの反応混合物は、１００ｍＭ  イミダゾール−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．９ｍＭ  ＭｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１ｍＭ  ＯＡＡ、２０μＬの細胞抽出物を含む（細胞抽出物の容量が異なる対照により、酵素活性と細胞抽出物の量との間の線形関係が確認される）。反応は、細胞抽出物を加えることで開始される。
【０３６８】
炭素収率Ｙｐ／ｓは、消費されたグルコース１グラム当たりの産生されたシュウ酸のグラム数で計算する。
【０３６９】
この効率は、対照株ＥＱ．ＥＣ０４５（空）と比較して、エンジニアリング株ＥＱ．ＥＣ０４６については３％大幅に増加する。
【０３７０】
例８：アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）でのクエン酸産生の改善
ａ）ストラテジー
解糖経路の非機能性をもたらすにｐｇｋＡ遺伝子（Ｌｏｃｕｓ  ｔａｇ（遺伝子座タグ）  Ａｎ０８ｇ０２２６０）の不活性化、およびペントースリン酸経路の酸化部分を阻害するｇｓｄＡ遺伝子（Ｌｏｃｕｓ  ｔａｇ  Ａｎ０２ｇ１２１４０）の不活性化は、ＰＲＫおよびＲｕＢｉｓＣＯ酵素の機能性発現のための６つの遺伝子、すなわちＣＯ２固定のためのＲｂｃＳ、ＲｂｃＬ、ＲｂｃＸ、ＧｒｏＥＳ、ＧｒｏＥＬおよびＰＲＫを統合するために使用される。
【０３７１】
ｂ）ＤＮＡ構築物
ｉ）不活性化すべき遺伝子を標的とするためのガイドＲＮＡ配列
これらの２つの遺伝子のそれぞれにおいて、ＮＧＧモチーフによって区切られた２０ヌクレオチドの配列（下線を引いたＣＲＩＳＰＲ標的配列）を決定した（表２７）。いずれの場合も、この配列は、標的遺伝子に特異的であるが、アスペルギルス・ニガーのゲノムでもユニークである。これらの配列は、アスペルギルス・ニガーのゲノムの相同領域とヘテロ二本鎖を形成することによりＣＡＳ９エンドヌクレアーゼの作用を指示して、選択された遺伝子座で特異的に二本鎖切断を誘発するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を発現するために使用する。
【０３７２】
【表２７】
2020506723.tif 000030
【０３７３】
Ｓａｒｋａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．２０１７  Ｄｅｃ；２４５（Ｐｔ  Ｂ）：１３２７−１３３３）に記載されているプラスミドｐＦＣ３３２（Ａｄｄｇｅｎｅ＃８７８４５）には、ｇＲＮＡ発現カセット、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼの機能性発現を可能にするカセット、およびこのプラスミドの選択を可能にするＨｐｈカセットが含まれている。プラスミドには、プラスミドの一時的な増殖を可能にするフラグメントＡＭＡ１＿２．８も含まれている。最後に、大腸菌の複製起点も存在している。
【０３７４】
別の遺伝子を標的とするために、ＦＳ  ＡとＦＳ  Ｂとの間のｇＲＮＡカセットを簡単に交換することができる。このプラスミドは、抗生物質選択カセットを除去し、表２７に記載される配列に有利なｇＲＮＡの特異性を可能にする２０ヌクレオチドを改変して、ｐｇｋＡを標的とするプラスミドｐＥＱ０６１０およびｇｓｄＡを標的とするプラスミドｐＥＱ０６１１を形成するために、このプラスミドの異なる部分を増幅することによって改変する。
【０３７５】
ドナープラスミド
ゲノムとの相同領域
ドナープラスミドは、プラスミドｐＵＣ１９（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｍ７７７８９．２）と、統合のために選択された遺伝子座と相同な、それぞれ約１５００ｂｐのゲノム標的配列（ｇｅｎｏｍｉｃ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）（ＬＡおよびＲＡ）との間のＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ｕｓｅｒ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）アセンブリから成る。ＬＡおよびＲＡ配列は、ガイドＲＮＡが標的とする遺伝子座配列にそれぞれ５′および３′で隣接している。ゲノムＤＮＡ／ガイドＲＮＡヘテロダイマーは、二本鎖切断のＣａｓ９エンドヌクレアーゼによって認識される（遺伝子座１：ｐｇｋＡ；遺伝子座２：ｇｓｄＡ）（表２８）。ＲＡおよびＬＡフラグメントは、ｐｇｋＡ遺伝子およびｇｓｄＡ遺伝子のプライマーで増幅する（表２９）。アンプリコン配列は、配列表に記載されている（配列番号５５〜配列番号５８）。Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ｕｓｅｒ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）のプロトコルに従って、３つのフラグメントのすべてのフォワードプライマーに１８ヌクレオチドの伸長部を加えて、プラスミド（ｐＥＱ０６００またはｐＥＱ０６０１）の機能性アセンブリと、大きな非対称認識部位（１２〜４０個の塩基対）を持つＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素Ｉ−ＣｅｕＩおよびＩ−ＳｃｅＩ）の２つの制限部位の導入とを可能にする。これらは１８個の塩基対の認識配列であり、したがってまれである。切断が調査部位（ｒｅｃｏｎｎａｉｓｓａｎｃｅ  ｓｉｔｅ）で非対称であるという事実により、細菌ベクターｐＵＣ１９からの配列を欠くフラグメントの放出が可能になる。これらの２つの酵素により、大腸菌でのクローニングによる増幅後の制限により統合ブロックの抽出が可能になる。
【０３７６】
【表２８】
2020506723.tif 000031
【０３７７】
【表２９】
2020506723.tif 000032
【０３７８】
エンジニアリング発現カセット
プロモーターとターミネーターを、ＧｅｎＢａｎｋデータに基づいて同定する。選択されたプロモーターは、＋１転写点から決定し、「コア」配列（ＴＡＴＡボックス）と当該プロモーターの最適な機能を可能にするトランス活性化配列の両方をカバーするために１．４ｋｂ上流に移動する。
【０３７９】
ターミネーターの場合、遺伝子の停止コドンの５００ｂｐ後にカットオフを行う。
４つの発現カセットの各統合ブロックの構造は次のように定義される：最初のレベルは、単純な要素、すなわちプロモーター、コーディング配列（ＣＤＳ）およびターミネーターから成る。プロモーター要素（表３０）およびターミネーター要素（表３１）（その配列は、配列表（配列番号５９〜６２）に提供されている）は、表３２に従ってエンジニアリングＣＤＳで増幅し、アセンブルする。ＣＤＳ（その配列は、配列表（配列番号６３〜６６）で提供されている）は、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ（登録商標）ＨｉＦｉ  ＤＮＡ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  Ｋｉｔ（Ｅ２３２１）で提供されているプロトコルに従って増幅することで、表にまとめられている機能性発現カセットを得る。４つの遺伝子の各統合ブロックは、転写干渉（ｔｒａｎｓ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）を制限するために４つの異なるペア（プロモーター／ターミネーター）を含むように編成されている。６つの遺伝子の各統合ブロックは、転写干渉を制限するために、６つの異なるペア（プロモーター／ターミネーター）を含むように編成されている。
【０３８０】
ゲノムの標的遺伝子座に挿入するためのドナーフラグメント
異なる複数の発現カセット（ＲｂｃＳ、ＲｂｃＬおよびＲｂｃＸ）または（ＧｒｏＥＳ、ＧｒｏＥＬおよびＰＲＫ）を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ｕｓｅｒ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）のプロトコルに従って増幅し、、抗生物質選択カセット（表）の周りにアセンブルして、ドナープラスミド（ｐＥＱ０６０２またはｐＥＱ０６０３）を形成する。
【０３８１】
【表３０】
2020506723.tif 000033
【０３８２】
【表３１】
2020506723.tif 000034
【０３８３】
【表３２】
2020506723.tif 000035
【０３８４】
【表３３】
2020506723.tif 000036
【０３８５】
ｃ）アスペルギルス・ニガー形質転換
アスペルギルス・ニガーでのＤＮＡの形質転換は、真菌の細胞壁の存在に制約されており、酵母または大腸菌と比較して非常に効果がない。それにもかかわらず、トリコデルマ・ハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）のＬｙｓｉｎｇ  Ｅｎｚｙｍｅ（登録商標）、ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）のキチナーゼおよび、ヘリックス・ポマティア（Ｈｅｌｉｘ  ｐｏｍａｔｉａ）のβ−グルクロニダーゼからなるカクテルなどの細胞壁分解酵素での処理により真菌糸体（ｆｕｎｇａｌ  ｈｙｐｈａｅ）または分生胞子を発芽させて調製したプロトプラストの形質転換（ｄｅ  Ｂｅｋｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００９  Ｍａｒ；７６（３）：３０５−６）により、形質転換体を産生することが可能になる。
【０３８６】
アスペルギルス・ニガー株ＣＢＳ  ５１３−８８を、２５０ｍＬの形質転換培地を含む１Ｌエルレンマイヤーフラスコで３０℃にて増殖させる（Ｋｕｓｔｅｒｓ−ｖａｎ  Ｓｏｍｅｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅｔ．１９９１  Ｓｅｐ；２０（４）：２９３−９）。２５０ｒｐｍで１６時間増殖させた後、ミラクロス（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）でのろ過により菌糸体を収集し、脱イオン水で洗浄する。プロトプラストを、トリコデルマ・ハルジアナムからの５ｇ／Ｌの溶解酵素（Ｓｉｇｍａ  Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）、ストレプトマイセス・グリセウスからの０．０７５Ｕｍｌ−１のキチナーゼ（Ｓｉｇｍａ）、ヘリックス・ポマティアからの４６０Ｕｍｌ−１のグルクロニダーゼの存在下に、ＫＭＣ（０．７Ｍ  ＫＣｌ、５０ｍＭ  ＣａＣｌ２、２０ｍＭ  Ｍｅｓ／ＮａＯＨ、ｐＨ５．８）中で３７℃および１２０ｒｐｍにて２時間調製する。プロトプラストは、顕微鏡で３０分毎にモニターする。プロトプラストをミラクロスフィルターでろ過し、２０００ｘｇおよび４℃で１０分間遠心分離して収集する。プロトプラストを冷ＳＴＣ（１．２Ｍ  ソルビトール、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、５０ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．５）で洗浄し、次いで１００ｐｉのＳＴＣに再懸濁し、形質転換に直接使用する。
【０３８７】
代謝経路をアスペルギルス・ニガーのゲノムに統合するためには、プラスミドと線形フラグメントの同時形質転換が必要とされる。プラスミドｐＥＱ０６１０をドナーフラグメントと共に同時形質転換して、ｐｇｋＡ遺伝子を不活性化しながらエンジニアリングの一部をゲノムに統合する。同様に、プラスミドｐＥＱ０６１１をドナーフラグメントと共に同時形質転換して、ｇｓｄＡ遺伝子を不活性化しながらエンジニアリングの他の部分をゲノムに統合する。これらの配列は、相同組換えのマトリックスと選択マーカーの両方として機能する：抗生物質耐性遺伝子ＨｐｈまたはＢｌｅの機能性発現との統合中。これらの株は、統合イベントでの直接選択を可能にするハイグロマイシンＢまたはブレオマイシンが加えられている最小培地プレート上で直接選択する。複製起点ＡＭＡ１＿２．８が存在するため、プラスミドｐＣＡＳ＿ｐｙｒＧ２は簡単に失われ、Ｃａｓ９タンパク質の一時的な発現のみが引き起こされ、これにより非標的有害作用のリスクが低減する。
【０３８８】
線形カセット（１０μｇ）およびプラスミド（５μｇ）を、少なくとも１０７個のプロトプラストおよび新たに調製した３３０μＬのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）溶液（２５％ＰＥＧ６０００、５０ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５）を含む１００μＬのＳＴＣ溶液と混合し、氷上で２０分間保持する。追加の２ｍＬのＰＥＧ溶液と混合し、室温で１０分間インキュベートした後、プロトプラスト混合物を４ｍＬのＳＴＣで希釈する。
【０３８９】
形質転換体の選択は、１５０μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢを加えたＭＭプレートまたは５０μｇ／ｍＬのブレオマイシンを加えたＭＭプレートで行う。すべての形質転換体は、選択培地から単一コロニーを少なくとも２回単離することによって精製する。フラグメントの挿入は、適切なコントロールプライマーを用いて標的遺伝子座をシーケンシングすることによって検証する。
【０３９０】
真菌細胞からのゲノムＤＮＡを、Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン、ＵＳＡ）を使用して、改変されたプロトコルで単離する。菌糸体をＣＭ（３０℃、１５０ｒｐｍ）中２９０ｐｉの５０ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液および１０ｐｉのリティカーゼ（１０ｍｇ／ｍＬ）で一晩培養して、細胞壁を除去する。３７℃で９０分間インキュベートした後、懸濁液を遠心分離し、上清を廃棄する。菌糸体ペレットを、３００μＬの核溶解液（ｎｕｃｌｅｉ  ｌｙｓｉｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）と１００μＬのタンパク質沈殿溶液（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に再懸濁する。サンプルを氷上で５分間インキュベートし、遠心分離する。ＤＮＡをイソプロパノールで沈殿させ、７０％エタノールで洗浄する。ＤＮＡペレットは、ＲＮａｓｅ（１００μｇ／ｍＬ）を含むＤＮＡ再水和液（ＤＮＡ  ｒｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で再水和する。発現カセットの成功した形質転換と統合を、ＰＣＲによって検証した。
【０３９１】
【表３４】
2020506723.tif 000037
【０３９２】
ＥＱ１５００株およびＥＱ１５０２株からの分生胞子（１０８／Ｌ）を接種し、ＭｎＳＯ４を含まない総グルコース含有量１５％、総ニトロゲン含有量０．２％および１０％ＣＯ２のＶｏｇｅｌ培地を含む振盪フラスコに入れて、振盪培養器（１８０ｒｐｍ）で３０℃にて培養する。グルコースおよび有機酸の測定は、Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７  Ｈカラム（３００×７．８ｍｍ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を備えたＨＰＬＣ（島津製作所、京都；日本）で上記のように実施した（Ｂｌｕｍｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｓｔｅｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。グルコースおよびクエン酸の検出には屈折率検出器（ＲＩＤ−１０  Ａ、島津製作所）を使用し、ｃｉｓ−アコニット酸およびｔｒａｎｓ−アコニット酸の検出には３００ｎｍでＰＤＡ検出器（ＳＰＤ−Ｍ２０Ａ、島津製作所）を使用する。このカラムは、流量０．６ｍＬ／分で、移動相として０．００４Ｍ  Ｈ２ＳＯ４水溶液を用いて６０℃にて使用する。３回の生物学的複製で培養を行った。
【０３９３】
ｄ）分析方法
細胞外代謝産物の定量化のために、培養サンプルを１４，０００ｘｇで５分間遠心分離する。上清を、０．４５ｐｍ孔径のフィルターでろ過する。ろ液を、分析するまで−２０℃で保持する。クエン酸およびシュウ酸の濃度は、Ａｍｅｔｈｙｓｔ  Ｃ１８−Ｈカラム（２５０×４．６ｍｍ、Ｓｌｅｐａｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｎｅｗａｒｋ、ＤＥ、ＵＳＡ）を使用して２１０ｎｍの紫外線で検出および定量化する。０．８ｍＬ／分の流量で０．０３％Ｈ３ＰＯ４を用いて３０℃にて溶出を行う。３，５−ジニトロサリチル酸法で還元糖を検出する。バイオマス測定：５ｍＬのサンプルをミラクロス（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）でろ過して菌糸体を収集し、蒸留水で洗浄する。菌糸体を「ミラクロス」で１０５℃に加熱する。乾燥菌体重量（ＤＣＷ）の計算のために、ミラクロスの重量を事前に測定し、総重量から差し引いて正味重量を出し、次いで単位容量当たりの正味重量をＤＣＷとして計算する。
【０３９４】
完全な分析後、グルコース消費の関数としてのクエン酸産生収率の比較は、野生型株ＥＱ１５００よりもエンジニアリングされた株ＥＱ１５０２で１８％高い。
【０３９５】
例９：アスペルギルス・テレウスでのイタコン酸産生の改善
ａ）ストラテジー
解糖経路の非機能性をもたらすｐｇｋＡ遺伝子（Ｌｏｃｕｓ  ｔａｇ  ＡＴＥＧ＿００２２４）の不活性化、およびペントースリン酸経路の酸化部分を阻害するｇｓｄＡ遺伝子（Ｌｏｃｕｓ  ｔａｇ  ＡＴＥＧ＿０１６２３）の不活性化は、ＰＲＫおよびＲｕＢｉｓＣＯ酵素の機能性発現のための６つの遺伝子、すなわちＣＯ２固定のためのＲｂｃＳ、ＲｂｃＬ、ＲｂｃＸ、ｇｒｏＥＳ、ｇｒｏＥＬおよびＰＲＫを統合するために使用される。
【０３９６】
ｂ）ＤＮＡ構築物
ｉ）不活性化すべき遺伝子を標的とするためのガイドＲＮＡ配列
【０３９７】
これらの２つの遺伝子のそれぞれにおいて、ＮＧＧモチーフによって区切られた２０ヌクレオチドの配列（下線を引いたＣＲＩＳＰＲ標的配列）を決定した（表３５）。いずれの場合も、この配列は、標的遺伝子に特異的であるが、アスペルギルス・テレウスのゲノムでもユニークである。これらの配列は、アスペルギルス・テレウスのゲノムの相同領域とヘテロ二重鎖を形成することによりＣＡＳ９エンドヌクレアーゼの作用を指示して、選択された遺伝子座で特異的に二本鎖切断を誘発するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を発現するために使用する。２つ目のイントロンで同定される配列であるｐｇｋＡの場合、最初の２０個のヌクレオチドはゲノム内でユニークなパターンを有し、２つのミスマッチも許容する。４つ目のイントロンで同定される配列であるｇｓｄＡの場合、最初の２０個のヌクレオチドはゲノム内でユニークなパターンを有し、２つのミスマッチも許容する。
【０３９８】
【表３５】
2020506723.tif 000038
【０３９９】
Ｓａｋａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ  ｔｅｃｈｎｏｌ．２０１７；２４５（Ｐｔ  Ｂ）：１３２７−１３３３）に記載されているプラスミドｐＦＣ３３２（Ａｄｄｇｅｎｅ  ＃８７８４５）には、ｇＲＮＡ発現カセット、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼの機能性発現用カセット、およびこのプラスミドの選択用Ｈｐｈカセットが含まれている。このプラスミドには、プラスミドの一時的な増殖を可能にするフラグメントＡＭＡ１＿２．８も含まれている。最後に、大腸菌の複製起点も存在している。
【０４００】
別の遺伝子を標的とするために、ＦＳ  ＡとＦＳ  Ｂとの間のｇＲＮＡカセットを簡単に交換することができる。このプラスミドは、抗生物質選択カセットを除去し、表３５に記載される配列に有利なｇＲＮＡの特異性を可能にする２０ヌクレオチドを改変して、アスペルギルス・テレウスのゲノムでｐｇｋＡを標的とするプラスミドｐＥＱ０６１５およびｇｓｄＡを標的とするプラスミドｐＥＱ０６１６を形成するために、このプラスミドの異なる部分を増幅することによって改変する。
【０４０１】
ｉｉ）ドナープラスミド
ゲノムとの相同領域
ドナープラスミドは、プラスミドｐＵＣ１９（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｍ７７７８９．２）と、統合のために選択された遺伝子座と相同な、それぞれ約１５００ｂｐのゲノム標的配列（ＬＡおよびＲＡ）との間のＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ｕｓｅｒ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）アセンブリから成る。ＬＡおよびＲＡ配列は、ガイドＲＮＡが標的とする遺伝子座配列にそれぞれ５′および３′で隣接している。ゲノムＤＮＡ／ガイドＲＮＡヘテロダイマーは、二本鎖切断のＣａｓ９エンドヌクレアーゼによって認識される（遺伝子座１：ｐｇｋＡ；遺伝子座２：ｇｓｄＡ）（表３５）。ＲＡおよびＬＡフラグメントは、ｐｇｋＡ遺伝子については表３６に、ｇｓｄＡ遺伝子については表３７に記載されているプライマーで増幅する。アンプリコン配列は、配列表に記載されている（配列番号６７〜７０）。
【０４０２】
Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ｕｓｅｒ  Ｍａｎｊｕａｌ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）のプロトコルに従って、３つのフラグメントのすべてのフォワードプライマーに１８ヌクレオチドの伸長部を加えて、プラスミド（ｐＥＱ０６０４またはｐＥＱ０６０５）（３３）の機能性アセンブリと、大きな非対称認識部位（１２〜４０個の塩基対）を持つＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素Ｉ−ＣｅｕＩおよびＩ−ＳｃｅＩ）の２つの制限部位の導入とを可能にする。これらは１８個の塩基対の認識配列であり、したがってまれであり、記載したアセンブリには存在していない。切断が調査部位で非対称であるという事実により、細菌ベクターｐＵＣ１９からの配列を欠くフラグメントの放出が可能になる。これらの２つの酵素により、大腸菌でのクローニングによる増幅後の制限により統合ブロックの抽出が可能になる。
【０４０３】
【表３６】
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【０４０４】
【表３７】
2020506723.tif 000040
【０４０５】
エンジニアリング発現カセット
プロモーターとターミネーターを、ＧｅｎＢａｎｋデータに基づいて同定する。選択されたプロモーターは、＋１転写点から決定し、「コア」配列（ＴＡＴＡボックス）と当該プロモーターの最適な機能を可能にするトランス活性化配列の両方をカバーするために１．４ｋｂ上流に移動する。
【０４０６】
ターミネーターの場合、遺伝子の停止コドンの５００ｂｐ後にカットオフを行う。
４つの発現カセットの各統合ブロックの構造は次のように定義される：最初のレベルは、単純な要素、すなわちプロモーター、コーディング配列（ＣＤＳ）およびターミネーターから成る。プロモーター要素（表３０）およびターミネーター要素（表３１）は、表３２に従ってエンジニアリングＣＤＳで増幅し、アセンブルする。ＣＤＳは、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ（登録商標）ＨｉＦｉ  ＤＮＡ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  Ｋｉｔ（Ｅ２３２１）で提供されているプロトコルに従って増幅することで、表にまとめられている機能性発現カセットを得る。４つの遺伝子の各統合ブロックは、転写干渉を制限するために４つの異なるペア（プロモーター／ターミネーター）を含むように編成されている。６つの遺伝子の各統合ブロックは、転写干渉を制限するために、６つの異なるペア（プロモーター／ターミネーター）を含むように編成されている。
【０４０７】
ゲノムの標的遺伝子座に挿入するためのドナーフラグメント
異なる複数の発現カセット（ＲｂｃＳ、ＲｂｃＬおよびＲｂｃＸまたはＧｒｏＥＳ、ＧｒｏＥＬおよびＰＲＫ）を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ｕｓｅｒ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）のプロトコルに従って増幅し、、抗生物質選択カセット（表３８）の周りにアセンブルして、ドナープラスミド（ｐＥＱ０６０６またはｐＥＱ０６０７）を形成する。
【０４０８】
【表３８】
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【０４０９】
ｃ）アスペルギルス・テレウスの形質転換
アスペルギルス・テレウスＤＮＡの形質転換は、アスペルギルス・テレウス株ＮＩＨ２６２を使用して、アスペルギルス・ニガーに適用されたストラテジー（例８）に従って行う。
【０４１０】
【表３９】
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【０４１１】
３％グルコースでのアスペルギルス・テレウス株ＥＱ１６００およびＥＱ１６０２の培養
Ｈｅｖｅｋｅｒｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０１４；９８：６９８３−６９８９）によって記載される最適化された培地組成を使用する。それには、１リットルあたり０．８ｇのＫＨ２ＰＯ４、３ｇのＮＨ４ＮＯ３、１ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、５ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１．６７ｍｇのＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、８ｍｇのＺｎＳＯ４．７Ｈ２Ｏおよび１５ｍｇのＣｕＳＯ４・７Ｈ２Ｏが含まれている。希酸（０．７５％ｖ／ｖ、１６０℃、１０分）で前処理し、酵素的に糖化（ｐＨ５．０、４５℃、７２時間）した麦わら加水分解物（１５０ｇ／Ｌ）から得られる典型的な糖濃度を模倣するために、３０ｇ／Ｌまでの適切な量のグルコースを使用する。糖と他のすべての成分は、滅菌原液から加える。株ＥＱ１６００およびＥＱ１６０２の胞子調製物に接種する前に、ＣａＣｌ２を含まない培地のｐＨを０．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４で３．１に調節する。培養は、１０％ＣＯ２の環境で７〜１０日間、３３℃で１２５ｍＬエルレンマイヤーフラスコに２５ｍＬの培地を入れて、２００ｒｐｍにて振盪培養器で振盪させながら行う。発酵中、ｐＨは調べない。酸素の継続的な供給を確保するために、時間研究のためのサンプリング中はフラスコの振盪を維持する。すべての実験を３回行う。すべての培地成分は、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉから得られる。これらの実験では、必要に応じて、各糖を脱イオン水に溶解し、Ｄｏｗｅｘ  ５０−Ｘ８（１００／２００メッシュ）カチオン交換樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）のカラム（４４０×４５ｍｍ）に通してマンガンを除去する。
【０４１２】
ｄ）分析手順
細胞集団の濃度は、乾燥菌体重量から決定する。発酵ブロスに存在する細胞集団を１０，０００ｇで１０分間遠心分離することにより収集し、脱イオン水で慎重に３回すすぐ。すすいだ細胞集団を、恒量が得られるまで８０℃で完全に乾燥させた。遠心分離（１０，０００ｇ、１０分）後の発酵ブロスは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用してグルコース、イタコン酸および副産物（コハク酸、α−ケトグルタル酸、リンゴ酸、ｃｉｓ−アコニット酸およびｔｒａｎｓ−アコニット酸）を分析するまで−２０℃で保存する。Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ  ＨＰＬＣシステム（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ａｍｅｒｉｃａ、Ｉｎｃ．，Ｃｏｌｕｍｂｉａ、ＭＤ）を使用する。糖と有機酸の分析のために、それぞれ２つのカラム（灰出しカートリッジとＣａｒｂｏ−Ｐ保護カートリッジ付きのＡｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｐカラム３００×７．８ｍｍと、Ｍｉｃｒｏｇｕａｒｄ  Ｃａｔｉｏｎ  Ｈカートリッジ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）付きの１つのＡｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ  ８７Ｈカラム３００×７．８ｍｍ）を使用する。Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ  ８７Ｐカラムは８５℃に維持し、グルコースはＭｉｌｌｉ−Ｑ酸性脱イオン水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を用いて０．６ｍＬ／分の流量で溶出させる。
【０４１３】
Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ  ８７Ｈカラムは６５℃に維持し、糖と有機酸を、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ脱イオンろ過水を使用して調製された５ｍＭ  Ｈ２ＳＯ４により０．５ｍＬ／分の速度で溶出させる。糖の場合は屈折率検出器、有機酸の場合は２１０ｎｍのＵＶ検出器を使用して検出を行う。プロピオン酸（１％、重量／容量）を内部標準として使用し、１０％ＣＯ２のもと、３３℃で７〜１０日間の好気性発酵中に失われる液体を推定する。有機酸を含むすべてのＨＰＬＣ標準はＳｉｇｍａから購入される。マンガン濃度（ｐｐｂレベル）は、Ｏｐｔｉｍａ  ７０００ＤＶ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）誘導結合プラズマ発光分光分析装置（ＩＣＰ−ＯＥＳ）を使用して、Ｂａｋｏｔａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｕｒ  Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５；１１７：１４５２−１４６２）によって記載されている手法で測定する。
【０４１４】
グルコースからのイタコン酸の産生の結果に基づいて、参照株ＥＱ１６００と比較してエンジニアリングされた株ＥＱ１６０２では１５％のグルコースからのイタコン酸の質量収率の増加が観察される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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