(57)【要約】  ＤＮＡ編集に用いられるシステムを提供する。システムはｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡを含んでいる。ｃｒＲＮＡは式Ｉ：Ｎｘ−ｎｃｒＲＮＡに示されるＲＮＡであり、式中、Ｎｘはスベーサー配列であり、ｎｃｒＲＮＡは配列表におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１−４に示されるＲＮＡである。ｔｒａｃｒＲＮＡは配列表におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５−８に示されるＲＮＡである。  【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡ編集に用いられるシステムであって、システムは甲または乙を含み、
甲は、以下のＮ１）およびＮ２）：
Ｎ１）
名称がＲＮＡ−２であるＲＮＡまたはＲＮＡ−２に関連する生物材料；
Ｎ２）  名称がＲＮＡ−１であるＲＮＡまたはＲＮＡ−１に関連する生物材料
であり、
ＲＮＡ−２は式Ｉに示されるＲＮＡであり、
式Ｉ：  Ｎｘ−ｎｃｒＲＮＡ
式中、ＮｘはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムにおけるスベーサー配列、
ｎｃｒＲＮＡは以下のａ１）〜ａ４）の中の何れか一つ：
ａ１）  配列表におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１に示されるＲＮＡ；
ａ２）  ａ１）の５′端および／または３′端に1個または複数個のヌクレオチドを添加して得られるＲＮＡ；
ａ３）  ａ１）またはａ２）において限定したＲＮＡと８５％以上の同一性を有するＲＮＡ；
ａ４）  配列表におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１に示されるＲＮＡの修飾物
であり、
ＲＮＡ−２に関連する生物材料は以下のＡ１）〜Ａ５）の中の何れか一つ：
Ａ１）  ＲＮＡ−２をコードするＤＮＡ分子；
Ａ２）  Ａ１）のＤＮＡ分子を含有する発現カセット；
Ａ３）  Ａ１）のＤＮＡ分子を含有する組換えベクター、またはＡ２）の発現カセットを含有する組換えベクター；
Ａ４）  Ａ１）のＤＮＡ分子を含有する組換え微生物、またはＡ２）の発現カセットを含有する組換え微生物、またはＡ３）の組換えベクターを含有する組換え微生物；
Ａ５）  Ａ１）のＤＮＡ分子を含有する細胞株、または含有Ａ２）を含有する発現カセットの細胞株
であり、
ＲＮＡ−１は以下のｂ１）〜ｂ４）の中の何れか一つ：
ｂ１）  配列表におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５に示されるＲＮＡ；
ｂ２）  ｂ１）の５′端および／または３′端に1個または複数個のヌクレオチドを添加して得られるＲＮＡ；
ｂ３）  ｂ１）またはｂ２）において限定したＲＮＡと８５％以上の同一性を有するＲＮＡ；
ｂ４）  配列表におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５に示されるＲＮＡの修飾物
であり、
ＲＮＡ−１に関連する生物材料は以下のＢ１）〜Ｂ５）の中の何れか一つ：
Ｂ１）  ＲＮＡ−１をコードするＤＮＡ分子；
Ｂ２）  Ｂ１）のＤＮＡ分子を含有する発現カセット；
Ｂ３）  Ｂ１）のＤＮＡ分子を含有する組換えベクター、またはＢ２）の発現カセットを含有する組換えベクター；
Ｂ４）  Ｂ１）のＤＮＡ分子を含有する組換え微生物、またはＢ２）の発現カセットを含有する組換え微生物、またはＢ３）の組換えベクターを含有する組換え微生物；
Ｂ５）  Ｂ１）のＤＮＡ分子を含有する細胞株、またはＢ２）の発現カセットを含有する細胞株
であり、
ｎｃｒＲＮＡとＲＮＡ−１とは一部の断片にて相補し、
乙は、ＲＮＡ−２である、ことを特徴とするシステム。
【請求項２】
請求項１に記載のシステムであって、ａ２）のＲＮＡは以下のａ２１）〜ａ２３）の中の何れか一つ：
ａ２１）  長さが１２−１４ｎｔのＲＮＡ；
ａ２２）  長さが１２−１６ｎｔのＲＮＡ；
ａ２３）  長さが１２−１８ｎｔのＲＮＡ
であり、
および／または、ｂ２）のＲＮＡは以下のｂ２１）〜ｂ２４）の中の何れか一つ：
ｂ２１）  長さが６４−６６ｎｔのＲＮＡ；
ｂ２２）  長さが６４−６８ｎｔのＲＮＡ；
ｂ２３）  長さが６４−７０ｎｔのＲＮＡ；
ｂ２４）  長さが６４−８６ｎｔのＲＮＡ
であり、
および／または、リボヌクレオチド修飾物はリボヌクレオチドに対してリボース、リン酸骨格および／または塩基において修飾して得られる物質であり、
修飾物はＲＮＡにおける少なくとも1個のヌクレオチドに対してリボース、リン酸骨格および／または塩基において修飾して得られる物質であり、
および／または、
ＤＮＡは以下のＭ１）〜Ｍ５）の中の何れか一つ：
Ｍ１）  真核生物のＤＮＡ；
Ｍ２）  動物のＤＮＡ；
Ｍ３）  哺乳類動物のＤＮＡ；
Ｍ４）  ヒトのＤＮＡ；
Ｍ５）  マウスのＤＮＡ
であることを特徴とするシステム。
【請求項３】
請求項１または２に記載のシステムであって、
ａ２１）のＲＮＡは配列表におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２に示されるＲＮＡであり、
ａ２２）のＲＮＡは配列表におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３に示されるＲＮＡであり、
ａ２３）のＲＮＡは配列表におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４に示されるＲＮＡであり、
および／または、ｂ２１）のＲＮＡは配列表におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６に示されるＲＮＡであり、
ｂ２２）のＲＮＡは配列表におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７に示されるＲＮＡであり、
ｂ２３）のＲＮＡは配列表におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．８に示されるＲＮＡであり、
および／または、
修飾は２′−Ｏ−メチル修飾、２′−脱酸素修飾、２′−フッ素修飾またはコレステロール修飾であり、
および／または、
ＤＮＡはＶＥＧＦＡ遺伝子、ＥＭＸ１遺伝子、Ｏｃｔ４遺伝子、Ｂｅｔａ−３遺伝子、Ｂｅｔａ５遺伝子、ＴＰ５３遺伝子またはＴＰ５３遺伝子のプロモーターである、ことを特徴とするシステム。
【請求項４】
請求項１から３の何れか一項に記載のシステムであって、
ＤＮＡはＶＥＧＦＡ遺伝子である場合、ＲＮＡ−２はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．９−１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２８およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２９の中の少なくとも１個の配列に示されるＲＮＡであり、
ＤＮＡはＯｃｔ４遺伝子である場合、ＲＮＡ−２はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１３−１５の中の少なくとも１個の配列に示されるＲＮＡであり、
ＤＮＡはＥＭＸ１遺伝子である場合、ＲＮＡ−２はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１６−１９の中の少なくとも１個の配列に示されるＲＮＡであり、
ＤＮＡはβサラセミア遺伝子である場合、ＲＮＡ−２はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２０−２２に示されるＲＮＡであり、
ＤＮＡはＴＰ５３遺伝子である場合、ＲＮＡ−２はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２３および／または２４に示されるＲＮＡであり、
ＤＮＡはＴＰ５３遺伝子のプロモーターである場合、ＲＮＡ−２はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２５−２７の中の少なくとも１個の配列に示されるＲＮＡである、ことを特徴とするシステム。
【請求項５】
請求項１から４の何れか一項に記載のシステムであって、システムはＣａｓ９ヌクレアーゼまたはＣａｓ９ヌクレアーゼに関連する生物材料を含み、
Ｃａｓ９ヌクレアーゼに関連する生物材料は以下のＣ１）〜Ｃ７）の中の何れか一つ：
Ｃ１）  Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードする核酸分子；
Ｃ２）  Ｃ１）の核酸分子を含有する発現カセット；
Ｃ３）  Ｃ１）の核酸分子を含有する組換えベクター、またはＣ２）の発現カセットを含有する組換えベクター；
Ｃ４）  Ｃ１）の核酸分子を含有する組換え微生物、またはＣ２）の発現カセットを含有する組換え微生物、またはＣ３）の組換えベクターを含有する組換え微生物；
Ｃ５）  Ｃ１）の核酸分子を含有する細胞株、またはＣ２）の発現カセットを含有する細胞株
であることを特徴とするシステム。
【請求項６】
請求項５に記載のシステムであって、Ｃａｓ９ヌクレアーゼはＲ１）またはＲ２）：
Ｒ１）  細菌；
Ｒ２）  レンサ球菌属、ブドウ球菌属、ロシア（Ｒｏｔｈｉａ）菌属、髄膜炎菌属、パービバキュラム（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ）菌属、または乳酸桿菌属
に由来することを特徴とするシステム。
【請求項７】
以下のＯ１）またはＯ２）：
Ｏ１）  請求項１から４の何れか一項に記載のＲＮＡ−２またはＲＮＡ−２に関連する生物材料；
Ｏ２）  請求項１から３の何れか一項に記載のＲＮＡ−１またはＲＮＡ−１に関連する生物材料。
【請求項８】
以下の何れか一つの応用：
Ｘ１  請求項１から４の何れか一項に記載のｎｃｒＲＮＡの、ｃｒＲＮＡ製造への応用；
Ｘ２  請求項１から４の何れか一項に記載のｎｃｒＲＮＡの、ＤＮＡ編集への応用；
Ｘ３  請求項１から４の何れか一項に記載のｎｃｒＲＮＡの、ＤＮＡ編集製品の製造への応用；
Ｘ４  請求項１から３の何れか一項に記載のＲＮＡ−１の、ｔｒａｃｒＲＮＡとしての応用；
Ｘ５  請求項１から３の何れか一項に記載のＲＮＡ−１またはＲＮＡ−１に関連する生物材料の、ＤＮＡ編集への応用；
Ｘ６  請求項１から３の何れか一項に記載のＲＮＡ−１またはＲＮＡ−１に関連する生物材料の、ＤＮＡ編集製品の製造への応用；
Ｘ７  請求項１から４の何れか一項に記載のＲＮＡ−２の、ｃｒＲＮＡとしての応用；
Ｘ８  請求項１から４の何れか一項に記載のＲＮＡ−２またはＲＮＡ−２に関連する生物材料の、ＤＮＡ編集への応用；
Ｘ９  請求項１から４の何れか一項に記載のＲＮＡ−２またはＲＮＡ−２に関連する生物材料の、ＤＮＡ編集製品の製造への応用；
Ｘ１０  請求項１から６の何れか一項に記載のシステムの、ＤＮＡ編集への応用；
Ｘ１１  請求項１から６の何れか一項に記載のシステムの、生体内または生体外遺伝子発現の干渉への応用；
Ｘ１２  請求項１から６の何れか一項に記載のシステムの、ＤＮＡ編集発生の動物、植物または細胞モデルの構築への応用。
【請求項９】
ＤＮＡを編集する方法であって、請求項１から６の何れか一項に記載のシステムを使用してＤＮＡを処理してＤＮＡの編集を実現する方法。
【請求項１０】
請求項１から６の何れか一項に記載のシステムの製造方法であって、システム中の各物質のそれぞれを別々に包装することを含む製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物技術の分野における、ＤＮＡ編集に用いられるシステムおよびその応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、細菌と古細菌において長期な進化の過程で形成された獲得免疫防御機構であり、侵入したウイルスおよび外因性ＤＮＡの対抗に利用可能である。機能的エレメントによって、ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムはＩ型、II型とIII型のシステムに分類することができる。これら三型のシステムはさらにＣａｓタンパク質をコードする遺伝子によってもっと多くのサブ型に分類することができる。Ｉ型およびIII型のＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムはｃｒＲＮＡおよびＣａｓタンパク質という２つのエレメントだけの関与が必要であるが、II型ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムはｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびＣａｓタンパク質という３つのエレメントを含む。
【０００３】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムは、侵入したファージとプラスミドＤＮＡのフラグメントをＣＲＩＳＰＲに組み入れ、相応するＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡｓ（ｃｒＲＮＡｓ）によってホモロジー配列の分解を誘導することにより、免疫性を提供するものである。当該システムの動作原理は以下の如くである。ｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ由来ＲＮＡ）が塩基ペアリングによってｔｒａｃｒＲＮＡ（トランス活性化ＲＮＡ）と結合してｔｒａｃｒＲＮＡ−ｃｒＲＮＡ複合体を形成して、この複合体が、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（Ｃａｓ９タンパク質）がｃｒＲＮＡとペアリングの標的部位にて二本鎖ＤＮＡを切断することを誘導する。
【０００４】
Ｃａｓ９にＨＮＨとＲｕｖＣという二つの重大なドメインがあり、それぞれがＤＮＡ二本鎖の中の一つの一本鎖を切断する。ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）が発生し、細胞の修復機構が起動する。細胞は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）という精密でない修復法によって遺伝子部位特異的変異を誘発させることもでき、相同組換え（ＨＲ）法によって修復し精密な遺伝子部位特異的変異導入または遺伝子置換えを実現することもできる。Ｃａｓ９は、細菌、ヒト細胞、ゼブラフィッシュやマウスにおいて、すでに成功的にゲノム工程研究が行われた。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の目的は、ＤＮＡ編集に用いられるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを提供することである。
【０００６】
本発明は、まず、ＤＮＡ編集用のシステムを提供し、当該システムはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムであって、甲または乙を含み、
甲は、以下のＮ１）およびＮ２）：
Ｎ１）  名称がＲＮＡ−２であるＲＮＡまたはＲＮＡ−２に関連する生物材料；
Ｎ２）  名称がＲＮＡ−１であるＲＮＡまたはＲＮＡ−１に関連する生物材料であり、
ＲＮＡ−２は式Ｉに示されるＲＮＡであり、
式Ｉ：  Ｎｘ−ｎｃｒＲＮＡ
式中、ＮｘはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムにおけるスベーサー配列であり、
ｎｃｒＲＮＡは以下のａ１）〜ａ４）の中の何れか一つであり：
ａ１）  配列表におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１に示されるＲＮＡ；
ａ２）  ａ１）の５′端および／または３′端に1個または複数個のヌクレオチドを添加して得られるＲＮＡ；
ａ３）  ａ１）またはａ２）において限定したＲＮＡと８５％以上の同一性を有するＲＮＡ；
ａ４）  配列表におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１に示されるＲＮＡの修飾物であり、
ＲＮＡ−２に関連する生物材料は以下のＡ１）〜Ａ５）の中の何れか一つであり：
Ａ１）  ＲＮＡ−２をコードするＤＮＡ分子；
Ａ２）  Ａ１）のＤＮＡ分子を含有する発現カセット；
Ａ３）  Ａ１）のＤＮＡ分子を含有する組換えベクター、またはＡ２）の発現カセットを含有する組換えベクター；
Ａ４）  Ａ１）のＤＮＡ分子を含有する組換え微生物、またはＡ２）の発現カセットを含有する組換え微生物、またはＡ３）の組換えベクターを含有する組換え微生物；
Ａ５）  Ａ１）のＤＮＡ分子を含有する細胞株、またはＡ２）の発現カセットを含有する細胞株であり、
ＲＮＡ−１は以下のｂ１）〜ｂ４）の中の何れか一つであり：
ｂ１）  配列表におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５に示されるＲＮＡ；
ｂ２）  ｂ１）の５′端および／または３′端に1個または複数個のヌクレオチドを添加して得られるＲＮＡ；
ｂ３）  ｂ１）またはｂ２）において限定したＲＮＡと８５％以上の同一性を有するＲＮＡ；
ｂ４）  配列表におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５に示されるＲＮＡの修飾物であり、
ＲＮＡ−１に関連する生物材料は以下のＢ１）〜Ｂ５）の中の何れか一つであり：
Ｂ１）  ＲＮＡ−１をコードするＤＮＡ分子；
Ｂ２）  Ｂ１）のＤＮＡ分子を含有する発現カセット；
Ｂ３）  Ｂ１）のＤＮＡ分子を含有する組換えベクター、またはＢ２）の発現カセットを含有する組換えベクター；
Ｂ４）  Ｂ１）のＤＮＡ分子を含有する組換え微生物、またはＢ２）の発現カセットを含有する組換え微生物、またはＢ３）の組換えベクターを含有する組換え微生物；
Ｂ５）  Ｂ１）のＤＮＡ分子を含有する細胞株、またはＢ２）の発現カセットを含有する細胞株であり、
ｎｃｒＲＮＡとＲＮＡ−１とは一部のフラグメントにて相補して茎領域と環領域を含む構造を構成しており、
乙は、ＲＮＡ−２である。
【０００７】
ＲＮＡ−２のＮｘ部分が５′端に位置し、ＲＮＡ−２のｎｃｒＲＮＡ部分が３′端に位置し、両部分はヌクレオシド結合を介して連結される。ＮｘはＲＮＡ配列であって、編集される目的ＤＮＡのフラグメントに相補し、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム中のスベーサー配列の要求に満足する。
【０００８】
Ｎはリボースヌクレオチドまたはリボースヌクレオチド修飾物であり得、ｘはＮの個数である。
ただし、ｘは非ゼロの自然数である。ｘは具体的に以下のｅ１）〜ｅ３）の中の何れか一つである：
ｅ１）  １５〜２２の何れか一つの整数；
ｅ２）  １９〜２１の何れか一つの整数；
ｅ３）  ２０。
【０００９】
ＲＮＡ−２はｎｃｒＲＮＡを介してＲＮＡ−１の一部のフラグメントと複合体を形成することができ、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム中のＣａｓタンパク質（即ちＣａｓヌクレアーゼ）は当該複合体と結合してＤＮＡの編集を実現することができる。
【００１０】
1個または複数個のヌクレオチドを添加するとは、具体的に１個から１０個のヌクレオチドを添加することができる。
【００１１】
ここで「同一性」という用語は、天然核酸配列との配列相似性を指す。「同一性」とは、本発明のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５に示されるヌクレオチド配列と８５％またはそれ以上、または９０％またはそれ以上、または９５％またはそれ以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含むことを意図する。同一性は、人目やコンピュータソフトウェアで評価することが可能である。コンピュータソフトウェアを使用する場合、二つまたは複数個の配列の間の同一性は、パーセント（％）にて表示でき、それは関連配列間の同一性の評価に用いられる。
【００１２】
ストリンジェントな条件は、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液で６８℃でハイブリダイズして、二回（毎回５ｍｉｎ）洗浄して、そして、０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液で６８℃でハイブリダイズし、二回（毎回１５ｍｉｎ）洗浄すること、または、０．１×ＳＳＰＥ（または０．１×ＳＳＣ）、０．１％ＳＤＳ溶液で６５℃でハイブリダイズして洗浄することである。
【００１３】
８５％以上の同一性は、８５％、９０％または９５％以上の同一性であり得る。
【００１４】
当業者が、特に容易に既知の方法、例えば定向進化や点変異誘発の方法によって、本発明のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５を変異誘発することができる。それら人工修飾された、本発明のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５のヌクレオチド配列と７５％またはそれ以上の同一性を有するヌクレオチドは、相同な機能を有していれば、すべて本発明のヌクレオチド配列から由来し且つ本発明と同等の配列である。
【００１５】
細胞株は繁殖材料を含まない。
【００１６】
上記システムにおいて、
ａ２）  ＲＮＡは以下のａ２１）〜ａ２３）の中の何れか一つであり得る：
ａ２１）  長さが１２−１４ｎｔのＲＮＡ；
ａ２２）  長さが１２−１６ｎｔのＲＮＡ；
ａ２３）  長さが１２−１８ｎｔのＲＮＡ。
ｂ２）  ＲＮＡは以下のｂ２１）〜ｂ２４）の中の何れか一つであり得る：
ｂ２１）  長さが６４−６６ｎｔのＲＮＡ；
ｂ２２）  長さが６４−６８ｎｔのＲＮＡ；
ｂ２３）  長さが６４−７０ｎｔのＲＮＡ；
ｂ２４）  長さが６４−８６ｎｔのＲＮＡ。
【００１７】
リボヌクレオチドはＡ、Ｕ、ＣまたはＧであり得る。リボヌクレオチド修飾物は、Ａ、Ｕ、ＣまたはＧに対してリボース、リン酸骨格および／または塩基において修飾して得られる物質であり得、
修飾物は、ＲＮＡ中の少なくとも1個のヌクレオチドに対してリボース、リン酸骨格および／または塩基において修飾して得られる物質である。
【００１８】
修飾は、２′−Ｏ−メチル修飾、２′−脱酸素修飾、２′−フッ素修飾またはコレステロール修飾であり得る。
【００１９】
ＤＮＡは、以下のＭ１）〜Ｍ５）の中の何れか一つであり得る：
Ｍ１）  真核生物のＤＮＡ；
Ｍ２）  動物のＤＮＡ；
Ｍ３）  哺乳類動物のＤＮＡ；
Ｍ４）  ヒトのＤＮＡ；
Ｍ５）  マウスのＤＮＡ。
【００２０】
上記システムにおいて、
ａ２１）  ＲＮＡは配列表におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２に示されるＲＮＡであり得、
ａ２２）  ＲＮＡは配列表におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３に示されるＲＮＡであり得、
ａ２３）  ＲＮＡは配列表におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４に示されるＲＮＡであり得る。
ｂ２１）  ＲＮＡは配列表におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６に示されるＲＮＡであり得、
ｂ２２）  ＲＮＡは配列表におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７に示されるＲＮＡであり得、
ｂ２３）  ＲＮＡは配列表におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．８に示されるＲＮＡであり得る。
【００２１】
修飾は２′−Ｏ−メチル修飾、２′−脱酸素修飾、２′−フッ素修飾またはコレステロール修飾であり得る。
【００２２】
ＤＮＡはＶＥＧＦＡ（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  Ａ）遺伝子、ＥＭＸ１（Ｅｍｐｔｙ  ｓｐｉｒａｃｌｅｓ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ  １）遺伝子、Ｏｃｔ４（ｏｒｇａｎｉｃ  ｃａｔｉｏｎ／ｃａｒｎｉｔｉｎｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ４）遺伝子、βサラセミア遺伝子、ＴＰ５３（ｔｕｍｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐ５３）遺伝子またはＴＰ５３遺伝子のプロモーターであり得る。
【００２３】
上記システムにおいて、ＲＮＡ−２はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．９−２９の中の何れか一つの配列に示されるＲＮＡであり得る。
【００２４】
ＤＮＡがＶＥＧＦＡ遺伝子である場合、ＲＮＡ−２はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．９−１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２８およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２９の中の少なくとも１個の配列に示されるＲＮＡであり、
ＤＮＡがＯｃｔ４遺伝子である場合、ＲＮＡ−２はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１３−１５の中の少なくとも１個の配列に示されるＲＮＡであり、
ＤＮＡがＥＭＸ１遺伝子である場合、ＲＮＡ−２はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１６−１９の中の少なくとも１個の配列に示されるＲＮＡであり、
ＤＮＡがβサラセミア遺伝子である場合、ＲＮＡ−２はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２０−２２に示されるＲＮＡであり、
ＤＮＡがＴＰ５３遺伝子である場合、ＲＮＡ−２はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２３および／または２４に示されるＲＮＡであり、
ＤＮＡがＴＰ５３遺伝子のプロモーターである場合、ＲＮＡ−２はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２５−２７の中の少なくとも１個の配列に示されるＲＮＡである。
【００２５】
上記システムはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムであり得、具体的に、II型のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム、例えばＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムであり得る。
【００２６】
上記システムは、さらにＮ３）を含み得、Ｎ３）はＣａｓ９ヌクレアーゼまたはＣａｓ９ヌクレアーゼに関連する生物材料であり、
Ｃａｓ９ヌクレアーゼに関連する生物材料は以下のＣ１）〜Ｃ７）の中の何れか一つである：
Ｃ１）  Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードする核酸分子；
Ｃ２）  Ｃ１）の核酸分子を含有する発現カセット；
Ｃ３）  Ｃ１）の核酸分子を含有する組換えベクター、またはＣ２）の発現カセットを含有する組換えベクター；
Ｃ４）  Ｃ１）の核酸分子を含有する組換え微生物、またはＣ２）の発現カセットを含有する組換え微生物、またはＣ３）の組換えベクターを含有する組換え微生物；
Ｃ５）  Ｃ１）の核酸分子を含有する細胞株、またはＣ２）の発現カセットを含有する細胞株。
【００２７】
上記システムにおいて、Ｃａｓ９ヌクレアーゼはＲ１）またはＲ２）に由来する：
Ｒ１）  細菌；
Ｒ２）  レンサ球菌属、ブドウ球菌属、ロシア（Ｒｏｔｈｉａ）菌属、髄膜炎菌属、パービバキュラム（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ）菌属、または乳酸桿菌。
【００２８】
レンサ球菌属細菌は具体的に化膿性レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）であり得る。ブドウ球菌属細菌は具体的に黄色ブドウ球菌であり得る。Ｃａｓ９ヌクレアーゼは具体的にＧｅｎｂａｎｋ  ＩＤ：ＡＱＭ５２３２３．１に示されるタンパク質であり得る。
【００２９】
上記システムはさらにＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム９のＤＮＡ編集方法によるＤＮＡ編集においてｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびＣａｓ９ヌクレアーゼ以外に必要となる他の試薬および／または器具を含む。
【００３０】
上記システムがＲＮＡ−２とＲＮＡ−１を含有する場合、ＲＮＡ−１とＲＮＡ−２のモル比は１：（１−１．５）であり得る。
【００３１】
上記システムがＣａｓ９、ｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡを含有する場合、Ｃａｓ９とｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡのモル比は１：（１−２０）：（１：２０）であり得、具体的に１：（１−８）：（１：８）であり得、さらに１：（１−４）：（１：４）であり得、またさらに１：（２−４）：（２−４）であり得る。
【００３２】
ＲＮＡ−２が少なくとも２個のＲＮＡである場合、上記モル比におけるＲＮＡ−２は複数個のＲＮＡの総濃度をもって計算する。
【００３３】
具体的に、上記システムは、ＲＮＡ−２のみであることもでき、Ｎ１）とＮ２）から構成されることもでき、Ｎ１）、Ｎ２）とＮ３）から構成されることもできる。
【００３４】
本発明は、さらに以下のＯ１）またはＯ２）を提供する：
Ｏ１）  ＲＮＡ−２またはＲＮＡ−２に関連する生物材料；
Ｏ２）  ＲＮＡ−１またはＲＮＡ−１に関連する生物材料。
【００３５】
本発明は、さらに以下の何れか一つの応用を提供する：
Ｘ１  ｎｃｒＲＮＡのｃｒＲＮＡの製造への応用；
Ｘ２  ｎｃｒＲＮＡのＤＮＡ編集への応用；
Ｘ３  ｎｃｒＲＮＡのＤＮＡ編集製品の製造への応用；
Ｘ４  ＲＮＡ−１のｔｒａｃｒＲＮＡとしての応用；
Ｘ５  ＲＮＡ−１またはＲＮＡ−１に関連する生物材料のＤＮＡ編集への応用；
Ｘ６  ＲＮＡ−１またはＲＮＡ−１に関連する生物材料のＤＮＡ編集製品の製造への応用；
Ｘ７  ＲＮＡ−２のｃｒＲＮＡとしての応用；
Ｘ８  ＲＮＡ−２またはＲＮＡ−２に関連する生物材料のＤＮＡ編集への応用；
Ｘ９  ＲＮＡ−２またはＲＮＡ−２に関連する生物材料のＤＮＡ編集製品の製造への応用；
Ｘ１０  システムのＤＮＡ編集への応用；
Ｘ１１  システムの、生体内（in vivo）または生体外(in vitro)遺伝子発現の干渉への応用；
Ｘ１２  システムの、ＤＮＡ編集発生の動物、植物または細胞モデルの構築への応用。
【００３６】
上記製品はＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムであり得、具体的に、II型のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム、例えばＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムであり得る。
【００３７】
本発明はさらにＤＮＡを編集する方法を提供しており、当該方法は上記システムによってＤＮＡを処理してＤＮＡの編集を実現することを含む。
【００３８】
上記システムによってＤＮＡ編集をする体系において、上記システムがＲＮＡ−２を含有する場合、ＲＮＡ−２の濃度は１００−８００ｎＭであり得、具体的に２００−４００ｎＭであり得る。上記システムがＲＮＡ−１を含有する場合、ＲＮＡ−１の濃度は１００−８００ｎＭであり得、具体的に２００−４００ｎＭであり得る。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムはさらにＣａｓ９ヌクレアーゼまたはＣａｓ９ヌクレアーゼに関連する生物材料を含有することができる。
【００３９】
上記システムにＣａｓ９ヌクレアーゼを含有するときに、Ｃａｓ９ヌクレアーゼの濃度が２０−４００ｎＭであり得、具体的には、１００−４００ｎＭ，さらに１００−２００ｎＭであり得る。上記システムにＣａｓ９ヌクレアーゼをコードする遺伝子を含有するベクターを含むとき、上記ベクターの使用量が１−２００μｇであり得、さらに２０−１００μｇ，よりさらに３０−５０μｇあるいは１−５μｇであり得る。上記ベクターの使用量が好ましく３μｇである。
【００４０】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムによって細胞中の遺伝子を編集する場合、上記体系における細胞とＲＮＡ−２の比率は０．５万−６万の細胞：１００ｎＭ  ＲＮＡ−２であり得、さらに０．７５万−４万の細胞：１００ｎＭ  ＲＮＡ−２であり得、またさらに１−１．２５万の細胞：１００ｎＭ  ＲＮＡ−２であり得る。
【００４１】
上記細胞は真核細胞であり得る。上記細胞はさらに哺乳類動物細胞であり得、例えば２９３Ｔ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＴＨＰ１細胞、ＨＵＶＥＣ細胞またはＣ２Ｃ１２マウス筋芽細胞であり得る。
【００４２】
本発明はさらに上記システムの製造方法を提供しており、当該方法は上記システムにおける各物質のそれぞれを別々包装することを含む。
【００４３】
上記システムの製造方法は、上記システムの各ＲＮＡを合成することを含み得る。上記合成は化学法によって合成し得る。
【００４４】
本発明では、上記ＤＮＡはすべて以下のＭ１）〜Ｍ５）の中の何れか一つであり得る：
Ｍ１）  真核生物のＤＮＡ；
Ｍ２）  動物のＤＮＡ；
Ｍ３）  哺乳類動物のＤＮＡ；
Ｍ４）  ヒトのＤＮＡ；
Ｍ５）  マウスのＤＮＡ。
【００４５】
編集の効率は、少なくとも１％或いは１％以上であり、例えば２％、３％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％または９０％である。
【００４６】
本発明において、各配列の１番目はすべてその配列の５′末端である。
【００４７】
上記ＤＮＡ編集はＤＮＡに対する切断であり得る。
【００４８】
実験の証明において、本発明のＤＮＡ編集に用いられるシステムはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムとしてＤＮＡ編集に用いることができ、ここでは、ｃｒＲＮＡであるＲＮＡ−２中のｎｃｒＲＮＡ部分の長さが１４ｎｔとする場合（即ちｎｃｒＲＮＡ２の場合）、Ｃａｓ９の酵素消化効率が最高となり、生体外の酵素消化効果が８９．２％、細胞内の酵素消化効果が２９．４％となる。ｔｒａｃｒＲＮＡであるＲＮＡ−１の長さが６６ｎｔとする場合、Ｃａｓ９の酵素消化効果が最適となり、生体外の酵素消化効果が９０．７％、細胞内の酵素消化効果が２９．８％となる。また、ＲＮＡ−２が修飾された後、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システム中のＣａｓ９の酵素消化効果は明らかな変化がない。ＲＮＡ−２およびＲＮＡ−１は何れもＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムエレメントがＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムによって目的ＤＮＡを編集するときに用いることができる場合、ＤＮＡの編集が細胞および目的ＤＮＡの影響を受けなく、何れもＤＮＡの編集を実現でき、しかも、当該システムによって直接に動物生体内のＤＮＡを編集することもできる。当該ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムによってＤＮＡを編集するときに、さらに、複数個の配列が異なるＲＮＡ−２によって編集の効率をあげることができ、Ｃａｓ９を安定に発現する細胞によってＤＮＡ編集の効率を向上できる。本発明のＲＮＡ−２およびＲＮＡ−１の配列が短く、化学合成による獲得が容易で、ＲＮＡの純度および生産規模の上昇に役たち、そして、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムの製造と応用を簡単化させる。また化学合成したＲＮＡエレメントはプラスミド発現が必要でなく、プラスミド構築の問題（例えばプラスミド適合性、プラスミドベクターのキャパシティ、複数個のプラスミドからなる系の構築困難等）を回避でき、しかも、化学修飾はより容易にでき、生体内応用に適宜である。上記から、本発明のＲＮＡ−２およびＲＮＡ−１はＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システム中のｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡエレメントとして目的ＤＮＡの編集に用いることが可能であると分かった。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】図１は異なるｃｒＲＮＡの場合のＣａｓ９の生体外酵素消化効果である。
【図２】図２は異なるｃｒＲＮＡの場合のＣａｓ９の細胞内酵素消化効果である。
【図３】図３は異なるｔｒａｃｒＲＮＡの場合のＣａｓ９の生体外酵素消化効果である。
【図４】図４は異なるｔｒａｃｒＲＮＡの場合のＣａｓ９の細胞内酵素消化効果である。
【図５】図５はｃｒＲＮＡの修飾の、Ｃａｓ９の生体外酵素消化効果への影響である。
【図６】図６はｃｒＲＮＡの修飾の、Ｃａｓ９の細胞内酵素消化効果への影響である。
【図７】図７はＶＥＧＦＡ遺伝子に関して異なる細胞株におけるＣａｓ９ヌクレアーゼの切断効果である。
【図８】図８は異なるＯｃｔ４−Ｅ−Ｔ１−ｃｒＲＮＡ濃度のＣａｓ９ヌクレアーゼの切断効果である。ここで、８００、４００と２００はすべてＯｃｔ４−Ｅ−Ｔ１−ｃｒＲＮＡの濃度であり、単位は共にｎＭである。
【図９】図９は異なるｃｒＲＮＡの場合のＣａｓ９ヌクレアーゼのＥＭＸ１遺伝子のＤＮＡモジュールに対する生体外切断効果である。ここで、Ｅ１Ｒ、Ｅ７Ｆ、Ｅｅ３ＦとＥ２ＦはそれぞれＥ１Ｒ−ｃｒＲＮＡ、Ｅ７Ｆ−ｃｒＲＮＡ、Ｅｅ３Ｆ−ｃｒＲＮＡとＥ２Ｆ−ｃｒＲＮＡを示す。
【図１０】図１０は異なるｃｒＲＮＡの場合のＣａｓ９ヌクレアーゼの生体外切断効果である。ここで、Ｂｅｔａ−３−Ｔ１、Ｂｅｔａ−３−Ｔ３とＢｅｔａ−５−Ｔ３はそれぞれＢｅｔａ−３−Ｔ１−ｃｒＲＮＡ、Ｂｅｔａ−３−Ｔ３−ｃｒＲＮＡとＢｅｔａ−５−Ｔ３−ｃｒＲＮＡを示す。
【図１１】図１１は異なるｃｒＲＮＡの場合のＯｃｔ４遺伝子の細胞内切断効果である。ここで、Ｅ−Ｔ１、Ｅ−Ｔ２とＥ−Ｔ３はそれぞれＯｃｔ４−Ｅ−Ｔ１−ｃｒＲＮＡ、Ｏｃｔ４−Ｅ−Ｔ２−ｃｒＲＮＡとＯｃｔ４−Ｅ−Ｔ３−ｃｒＲＮＡを示す。
【図１２】図１２は異なるＥｅ３Ｆ−ｃｒＲＮＡ用量の場合のＣａｓ９ヌクレアーゼのＥＭＸ１遺伝子に対する細胞内切断効果である。ここで、４００、２００、１００および５０はすべてＥｅ３Ｆ−ｃｒＲＮＡの用量であり、単位は共にｎｇである。
【図１３】図１３は異なるｃｒＲＮＡの場合のヌクレアーゼの遺伝子に対する細胞内切断効果である。ここで、Ｂｅｔａ−３−Ｔ１、Ｂｅｔａ−３−Ｔ３とＢｅｔａ−５−Ｔ３はそれぞれＢｅｔａ−３−Ｔ１−ｃｒＲＮＡ、Ｂｅｔａ−３−Ｔ３−ｃｒＲＮＡとＢｅｔａ−５−Ｔ３−ｃｒＲＮＡを示す。
【図１４】図１４はマウス細胞（Ｃ２Ｃ１２）とマウス生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）のＶＥＧＦＡ遺伝子切断効果である。
【図１５】図１５はＴＰ５３フラグメントのプロモーターおよびエキソン領域の細胞内切断効果である。
【図１６】図１６はＴＰ５３フラグメントのプロモーターおよびエキソン領域の生体外切断効果である。
【図１７】図１７は複数個のｃｒＲＮＡの場合のＣａｓ９ヌクレアーゼのＯｃｔ４遺伝子に対する生体外切断効果である。ここで、ＭｉｘはＯｃｔ４−Ｅ−Ｔ１−ｃｒＲＮＡ、Ｏｃｔ４−Ｅ−Ｔ２−ｃｒＲＮＡとＯｃｔ４−Ｅ−Ｔ３−ｃｒＲＮＡの共通実験結果を示し、ＥＴ２はＯｃｔ４−Ｅ−Ｔ２−ｃｒＲＮＡを示す。
【図１８】図１８は複数個のｃｒＲＮＡの場合のＣａｓ９ヌクレアーゼのＯｃｔ４遺伝子に対する細胞内切断効果である。ここで、ＭｉｘはＯｃｔ４−Ｅ−Ｔ１−ｃｒＲＮＡ、Ｏｃｔ４−Ｅ−Ｔ２−ｃｒＲＮＡとＯｃｔ４−Ｅ−Ｔ３−ｃｒＲＮＡの共通実験結果を示し、ＥＴ２はＯｃｔ４−Ｅ−Ｔ２−ｃｒＲＮＡを示す。
【図１９】図１９は異なるＣａｓ９ドナーの場合の酵素消化効果である。
【図２０】図２０は異なるＣａｓ９濃度の場合の酵素消化効果である。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
以下、具体的な実施の形態を組み合わせて本発明のさらなる詳細な説明を行う。挙げられる実施例は、本発明を説明するために用いられるもので、本発明の範囲を限定する意図がない。以下の実施例における実験方法は、特別な説明がない限り、すべて通常の方法である。以下の実施例に用いられる材料、試薬、機器等は、特別な説明がない限り、すべて商業的に得られる。以下の実施例中の定量試験は、すべて三回の重複な実験が設置され、その結果は平均値を取る。
【００５１】
2020513732.tif 000002
【００５２】
ここで、Ｃａｓ９ヌクレアーゼの配列はＮＣＢＩにおけるＧｅｎｂａｎｋ  ＩＤ：ＡＱＭ５２３２３．１に示される配列である。当該タンパク質は化膿性レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来する。
以下の実施例におけるＣａｓ９−２９３Ｔ細胞、Ｃａｓ９−ＨｅＬａ細胞、Ｃａｓ９−ＴＨＰ−１細胞およびＣａｓ９−ＨＵＶＥＣ細胞は、広州易錦生物技術有限公司のＧｅｎｏｍｅ−ＴＡＬＥＲ（商標）＆Ｇｅｎｏｍｅ−ＣＲＩＳＰＲ（商標）ヒトＡＡＶＳ１  Ｓａｆｅ  Ｈａｒｂｏｒ遺伝子を試薬カセット（Ｃａｔａｌｏｇ＃ＳＨ−ＡＶＳ−Ｋ１００）にノックインして、２９３Ｔ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＴＨＰ−１細胞およびＨＵＶＥＣ細胞のそれぞれにＣａｓ９のコーディング遺伝子を導入して得られる細胞である。
【００５３】
2020513732.tif 000003
2020513732.tif 000004
【実施例】
【００５４】
実施例１
ＤＮＡ編集に用いられるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムエレメントの製造。
【００５５】
本実施例におけるＤＮＡ編集に用いられるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムエレメントはｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡである。
ｃｒＲＮＡは式Ｉに示されるＲＮＡである。
式Ｉ：  Ｎｘ−ｎｃｒＲＮＡ
ただし、Ｎはリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチド修飾物の中の何れか一つであり、リボヌクレオチドはＡ、Ｕ、ＣおよびＧの中の何れか一つであり、リボヌクレオチド修飾物はＡ、Ｕ、ＣまたはＧに対して２′−Ｏ−メチル修飾またはコレステロール修飾して得られる物質であり、
ｘはＮの個数であって、２０であり、
ｎｃｒＲＮＡはｎｃｒＲＮＡ１、ｎｃｒＲＮＡ２、ｎｃｒＲＮＡ２ｙ、ｎｃｒＲＮＡ３およびｎｃｒＲＮＡ４の中の何れか一つであり、
ｎｃｒＲＮＡ１は配列表におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１に示されるＲＮＡであり、
ｎｃｒＲＮＡ２は配列表におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２に示されるＲＮＡであり、
ｎｃｒＲＮＡ２ｙはそれぞれｎｃｒＲＮＡ２の５′の開始端の第１０、第１１および第１３位のヌクレオチドに対して２′−Ｏ−メチル修飾して得られる物質であり、
ｎｃｒＲＮＡ３は配列表におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３に示されるＲＮＡであり、
ｎｃｒＲＮＡ４は配列表におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４に示されるＲＮＡである。
ｔｒａｃｒＲＮＡはｔｒａｃｒＲＮＡ１、ｔｒａｃｒＲＮＡ２、ｔｒａｃｒＲＮＡ３とｔｒａｃｒＲＮＡ４であり、
ｔｒａｃｒＲＮＡ１は配列表におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５に示されるＲＮＡであり、
ｔｒａｃｒＲＮＡ２は配列表におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６に示されるＲＮＡであり、
ｔｒａｃｒＲＮＡ３は配列表におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７に示されるＲＮＡであり、
ｔｒａｃｒＲＮＡ４は配列表におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．８に示されるＲＮＡである。
配列表における各配列の１番目は共に同配列の５′末端である。
【００５６】
実施例２
異なるｎｃｒＲＮＡの長さのＤＮＡ編集効率への影響
一  生体外酵素消化の測定
１  ＤＮＡテンプレートの製造
２９３Ｔ細胞ゲノムＤＮＡをテンプレートとして、Ｐｈｕｓｉｏｎ酵素（即ちＰｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を用いて２回のＰＣＲによる増幅してＶＥＧＦＡ（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  Ａ）標的遺伝子断片、即ちＤＮＡテンプレートを得た。１回目のＰＣＲによる増幅に用いられるプライマーはＶＥＧＦＡ−Ｆ１・ＶＥＧＦＡ−Ｒ１とし、２回目のＰＣＲによる増幅は１回目のＰＣＲによる増幅の生成物をテンプレートとしてプライマーＶＥＧＦＡ−Ｆ３・ＶＥＧＦＡ−Ｒ３を使用して増幅した。２回目のＰＣＲによる増幅生成物（即ちＤＮＡテンプレート）の長さが４８５ｂｐであった。
【００５７】
２  Ｃａｓ９の生体外酵素消化
Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、１０×Ｃａｓ９Buffer、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡとH２Oを均一に混ぜて、３７℃で１５ｍｉｎインキュベートして、それから、工程１におけるＤＮＡテンプレートを入れて均一に混ぜて、そして３７℃で７０ｍｉｎインキュベートした。反応系は具体的に表３に示される。ｃｒＲＮＡを代えてH２Oを用いてネガティブコントロール（ｎｅｇ．）とした。ここでは、ｃｒＲＮＡはＶＥＧＦＡ−ｃｒＲＮＡ１、ＶＥＧＦＡ−ｃｒＲＮＡ２、ＶＥＧＦＡ−ｃｒＲＮＡ３およびＶＥＧＦＡ−ｃｒＲＮＡ４とした。各反応系においてある１種類のｃｒＲＮＡとした。ＶＥＧＦＡ−ｃｒＲＮＡ１、ＶＥＧＦＡ−ｃｒＲＮＡ２、ＶＥＧＦＡ−ｃｒＲＮＡ３およびＶＥＧＦＡ−ｃｒＲＮＡ４の構造式は実施例１の式Ｉの通りに示されており、Ｎｘ部分は同様で、ｎｃｒＲＮＡはそれぞれ実施例１のｎｃｒＲＮＡ１、ｎｃｒＲＮＡ２、ｎｃｒＲＮＡ３およびｎｃｒＲＮＡ４とする。Ｎｘの配列は共に５′−ＣＣＡＣＡＧＧＧＡＡＧＣＵＧＧＧＵＧＡＡ−３′であり、当該配列はＶＥＧＦＡ遺伝子の一部の配列に相補し、ｔｒａｃｒＲＮＡは実施例１のｔｒａｃｒＲＮＡ２とした。
【００５８】
2020513732.tif 000005
【００５９】
３  磁気ビーズによる精製
１）  ３０μｌの工程２における酵素消化生成物をＥＰ管中に移した。
２）  2倍体積分の磁気ビーズをＥＰ管中におけるサンプルとボルテックスシェイクして充分に均一に混ぜて、５−１０ｍｉｎ放置した。
３）  ＥＰ管を磁力ラックに置いて、すべての磁気ビーズを側壁に吸着させたときに、上澄みを吸い上げた。
４）  ＥＰ管中に２００μｌの８０％（体積パーセント）のエタノール水溶液を入れて、磁気ビーズを洗浄して脱離させた。
５）  上澄み液を吸い取り、室温で３−５ｍｉｎ放置し、壁に付けられる磁気ビーズに皹が発生したときに、２０μｌの水を入れて溶解させた。
６）  水を入れた後のＥＰ管を磁力ラックから外して、３−５ｍｉｎ放置した。
７）  ＥＰ管を磁力ラックに置き戻して、上澄みはサイクルのサンプルとした。
【００６０】
４  Ａｇｉｌｅｎｔ（アジレント）２２００核酸自動電気泳動システムによる測定
１−２μｌのサンプルおよびそれと等体積の染料を取って同システムにより測定した。
【００６１】
５  酵素消化の結果
（１）  計算方法
Ａｇｉｌｅｎｔ２２００核酸自動電気泳動システムによる測定によってＤＮＡ断片の分布と濃度結果を得て、数式によって酵素消化効率が得られた。
2020513732.tif 000006
ｆ（ｃｕｔ）＝（ｂ＋ｃ）／（ａ＋ｂ＋ｃ）；
ただし、ａは切断されなかった断片のモル濃度（ｐｍｏｌ／ｌ）であり、ｂ、ｃはそれぞれ切断された断片のモル濃度（ｐｍｏｌ／ｌ）である。
【００６２】
（2）   結果解析
図１から、ｃｒＲＮＡの長さが３２ｎｔ（ＶＥＧＦＡ−ｃｒＲＮＡ１）、３４ｎｔ（ＶＥＧＦＡ−ｃｒＲＮＡ２）、３６ｎｔ（ＶＥＧＦＡ−ｃｒＲＮＡ３）および３８ｎｔ（ＶＥＧＦＡ−ｃｒＲＮＡ４）とする場合、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、Ｃａｓ９を含む生体外酵素消化系が４８５ｂｐのＤＮＡテンプレートを切断することができると分かった。ｃｒＲＮＡの長さが３４ｎｔとする場合、Ｃａｓ９酵素消化効果は最適（Ｉｎｄｅｌ％は８９．２％）となり、即ちｎｃｒＲＮＡ部分の長さが１４ｎｔとする場合（即ちｎｃｒＲＮＡ２の場合）、Ｃａｓ９酵素消化効率が最大となる。
【００６３】
二  Ｃａｓ９細胞内酵素消化の測定
１  細胞トランスフェクション
（１）  Ｃａｓ９−２９３Ｔ細胞は３７℃で５％のＣＯ２を培養条件とし、１０％のウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ培地を用いてインキュベーター内で培養された。ここで、Ｃａｓ９−２９３Ｔ細胞は遺伝子編集によってＣａｓ９ヌクレアーゼをコーディングする遺伝子が安定的に導入され、Ｃａｓ９ヌクレアーゼが発現できる（配列はＮＣＢＩにおけるＧｅｎｂａｎｋ  ＩＤ：ＡＱＭ５２３２３．１に示す配列である）。
【００６４】
（２） トランスフェクションの前日に、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを安定的に発現するＣａｓ９−２９３Ｔ細胞を２４ウェルプレート中にプレーティングした。
【００６５】
（３）  細胞密度を４×１０４−５×１０４個／ｍＬ程度に調整して、Ｌｉｐｏ２０００（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００）を用いてｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡをトランスフェクションした。ここで、ｃｒＲＮＡは工程１におけるＶＥＧＦＡ−ｃｒＲＮＡ１、ＶＥＧＦＡ−ｃｒＲＮＡ２、ＶＥＧＦＡ−ｃｒＲＮＡ３およびＶＥＧＦＡ−ｃｒＲＮＡ４とした。各反応系においてある１種類のｃｒＲＮＡとした。ｔｒａｃｒＲＮＡは実施例１のｔｒａｃｒＲＮＡ２とした。ｃｒＲＮＡを代えてＨ２Ｏを用いてネガティブコントロール（ｎｅｇ．）とした。具体的な方法は以下の通りである。
A  ５０μｌのｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地を１．５ｍｌのＥＰ管に置いて、１μｌのＬｉｐｏ２０００を入れて、静かに均一に混ぜて、室温で５ｍｉｎ放置した。
B  ５０μｌのｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地を１．５ｍｌのＥＰ管において、２００ｎｇのｃｒＲＮＡと３００ｎｇのｔｒａｃｒＲＮＡを入れて、充分に均一に混ぜた。
C  ＡおよびＢで得られる溶液を混合して、室温で２０ｍｉｎ放置した。
D  （１）の２４ウェル培養プレートにおける培地を一部吸い出し、ウェル中における培地の残量が３００μｌ程度になり、Ｃで得られる溶液を培養ウェルに添加して均一に混ぜた。
E  ３−６ｈ後に培養ウェルに１０％のウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ培地を１ｍｌまで補充して、細胞をインキュベーターに置き戻して４８ｈ培養した後、細胞ゲノムＤＮＡを抽出した。
【００６６】
２  細胞ゲノムＤＮＡの抽出
（１）ＴＩＡＮＧＥＮ血液・組織・細胞ゲノムＤＮＡ抽出キットのプロトコールに基づいてＤＮＡを抽出した。
（２）  アガロースゲル電気泳動によってＤＮＡの抽出効果を測定し、またＤＮＡ濃度および純度を測定した。
【００６７】
３  ネステッドＰＣＲによる目的ＤＮＡ断片の増幅
（１）ネステッドＰＣＲによる増幅
Ｐｈｕｓｉｏｎ酵素を用いてＶＥＧＦＡ標的遺伝子を増幅した。１回目のＰＣＲによる増幅に用いられるプライマーはＶＥＧＦＡ−Ｆ１・ＶＥＧＦＡ−Ｒ１とし、２回目のＰＣＲによる増幅は１回目のＰＣＲによる増幅生成物をテンプレートとしてプライマーＶＥＧＦＡ−Ｆ３・ＶＥＧＦＡ−Ｒ３を用いて増幅した。
【００６８】
（２）工程（１）で得られる２回目のＰＣＲ生成物をアニールして、アニール生成物を直接に次の工程の酵素消化に用いた。
【００６９】
アニール系は以下の通りである。ここで、Buffer（バッファー）２はＴ７  Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ（エンドヌクレアーゼ）Ｉ（NEB Art. No. : M0302L）とする。
2020513732.tif 000007
【００７０】
ＰＣＲ装置でアニール反応した。アニール条件は以下の通りである。
2020513732.tif 000008
【００７１】
４  Ｔ７ＥＩ酵素消化効率の測定
ＮＥＢ  Ｔ７のエンドヌクレアーゼＩ（Ｔ７ＥＩ）によって工程３のアニール生成物を酵素で消化し、３７℃で４０ｍｉｎインキュベートした後、１μｌのプロテアーゼＫを入れて、３７℃で５ｍｉｎインキュベートした。
【００７２】
酵素消化系（２０μｌ）：
2020513732.tif 000009
【００７３】
５  電気泳動による測定
酵素消化サンプルはＡｇｉｌｅｎｔ２２００核酸自動電気泳動システムによる測定に供した。
【００７４】
６  酵素消化の結果
（１）  計算方法は工程一と同様である。
（２）  解析
結果が図２に示される。結果から、ｃｒＲＮＡ長さが３２ｎｔ（ＶＥＧＦＡ−ｃｒＲＮＡ１）、３４ｎｔ（ＶＥＧＦＡ−ｃｒＲＮＡ２）、３６ｎｔ（ＶＥＧＦＡ−ｃｒＲＮＡ３）および３８ｎｔ（ＶＥＧＦＡ−ｃｒＲＮＡ４）としたいずれの場合でも、Ｃａｓが４８５ｂｐの目的ＤＮＡの目的断片を切断できると分かった。ｃｒＲＮＡ長さが３４ｎｔとした場合、Ｃａｓ９酵素消化効果が最適（Ｉｎｄｅｌ％は２９．４％）となり、即ちｎｃｒＲＮＡ部分の長さが１４ｎｔとした場合（即ちｎｃｒＲＮＡ２の場合）、Ｃａｓ９酵素消化効率が最大となった。
【００７５】
実施例３
異なるｔｒａｃｒＲＮＡ長さのＤＮＡ編集効率への影響
一  生体外酵素消化の測定
１  方法
実施例２の工程一の方法に従い、ｃｒＲＮＡがＶＥＧＦＡ−ｃｒＲＮＡ５とし、ｔｒａｃｒＲＮＡがそれぞれ実施例１のｔｒａｃｒＲＮＡ１、ｔｒａｃｒＲＮＡ２、ｔｒａｃｒＲＮＡ３およびｔｒａｃｒＲＮＡ４とする場合のｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、Ｃａｓ９を含む生体外酵素消化系の酵素消化効率をそれぞれ測定した。各種類の反応系ごとに、ある１種類のｔｒａｃｒＲＮＡとして、また、ｔｒａｃｒＲＮＡを代えて水を用いてネガティブコントロール（ｎｅｇ．）としている。
【００７６】
ここで、ＶＥＧＦＡ−ｃｒＲＮＡ５の配列はＵＧＡＣＵＧＣＣＧＵＣＵＧＣＡＣＡＣＣＣ  ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２８）である。
【００７７】
２  結果
Ａｇｉｌｅｎｔ２２００核酸自動電気泳動システムによる測定によって得られるＤＮＡ断片の分布と濃度の結果（図３）から、ｔｒａｃｒＲＮＡ長さが６４ｎｔ（ｔｒａｃｒＲＮＡ１）、６６ｎｔ（ｔｒａｃｒＲＮＡ２）、６８ｎｔ（ｔｒａｃｒＲＮＡ３）および７０ｎｔ（ｔｒａｃｒＲＮＡ４）とした何れの場合でも、Ｃａｓ９が４８５ｂｐのＤＮＡテンプレートを切断できるという結論が得られる。Ｉｎｄｅｌ％の結果から、ｔｒａｃｒＲＮＡ長さが６６ｎｔとした場合（即ちｔｒａｃｒＲＮＡ２の場合）、Ｃａｓ９の酵素消化効果が最適となり、Ｉｎｄｅｌ％が９０．７％であったと分かった。
【００７８】
二  細胞内酵素消化の測定
１  方法
実施例２の工程二の方法に従い、ｃｒＲＮＡが工程一におけるＶＥＧＦＡ−ｃｒＲＮＡ５とし、ｔｒａｃｒＲＮＡがそれぞれ実施例１のｔｒａｃｒＲＮＡ１、ｔｒａｃｒＲＮＡ２、ｔｒａｃｒＲＮＡ３およびｔｒａｃｒＲＮＡ４とした場合のＣａｓ９の酵素消化効率をそれぞれ測定した。各種類の反応系ごとに、ある１種類のｔｒａｃｒＲＮＡとして、また、ｔｒａｃｒＲＮＡを代えて水を用いてネガティブコントロール（ｎｅｇ．）とした。
【００７９】
２  結果
Ａｇｉｌｅｎｔ２２００核酸自動電気泳動システムによる測定によって得られるＤＮＡ断片の分布と濃度結果（図４）から、ｔｒａｃｒＲＮＡ長さが６４ｎｔ（ｔｒａｃｒＲＮＡ１）、６６ｎｔ（ｔｒａｃｒＲＮＡ２）、６８ｎｔ（ｔｒａｃｒＲＮＡ３）および７０ｎｔ（ｔｒａｃｒＲＮＡ４）としたいずれの場合でも、Ｃａｓ９が４８５ｂｐの目的断片を切断できるという結論が得られる。Ｉｎｄｅｌ％の結果から、ｔｒａｃｒＲＮＡ長さが６６ｎｔとした場合（即ちｔｒａｃｒＲＮＡ２の場合）、Ｃａｓ９の酵素消化効果が最適となり、Ｉｎｄｅｌ％が２９．８％であったと分かった。
【００８０】
実施例４
異なる修飾の酵素消化測定
一  生体外酵素消化の測定
１  方法
２９３Ｔ細胞ゲノムをテンプレートとして、標的遺伝子ＶＥＧＦＡ断片を増幅する。具体的な方法は実施例１と同様である。
【００８１】
実施例２の工程一の方法に従い、ｃｒＲＮＡがそれぞれＶＥＧＦＡ−ｃｒＲＮＡ２−１およびＶＥＧＦＡ−ｃｒＲＮＡ２−２とし、ｔｒａｃｒＲＮＡが実施例１のｔｒａｃｒＲＮＡ２とした場合の、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、Ｃａｓ９を含む生体外酵素消化系の酵素消化効率を測定した。各反応系ごとにある１種類のｃｒＲＮＡとした。実施例２のＶＥＧＦＡ−ｃｒＲＮＡ２をコントロールとし、ｔｒａｃｒＲＮＡを代えてＨ２Ｏを用いてネガティブコントロール（ｎｅｇ．）とした。
【００８２】
ここでは、ＶＥＧＦＡ−ｃｒＲＮＡ２−１は実施例３のｃｒＲＮＡ５の２番目、３０番目、３１番目および３３番目の位置に対して２′−Ｏ−メチルにより修飾して得られる物質であり、具体的に以下である：
ＵＧｍＡＣＵＧＣＣＧＵＣＵＧＣＡＣＡＣＣＣＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣｍＵｍＡＵｍＧ  ｍは２′−Ｏ−メチル修飾を示す。
ＶＥＧＦＡ−ｃｒＲＮＡ２−２はｃｒＲＮＡ２に対してコレステロールにより修飾して得られる物質であり、具体的に以下である：
Ｃｈｏｌ−ＵＧＡＣＵＧＣＣＧＵＣＵＧＣＡＣＡＣＣＣＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣｈｏｌはコレステロールによる修飾を示す。
【００８３】
２  結果
Ａｇｉｌｅｎｔ２２００核酸自動電気泳動システムによる測定によって得られるＤＮＡ断片の分布と濃度結果である図５から、ｃｒＲＮＡに対して化学修飾（メチル化修飾ＶＥＧＦＡ−ｃｒＲＮＡ２−１、コレステロール修飾ＶＥＧＦＡ−ｃｒＲＮＡ２−２）した後、いずれの場合もＣａｓ９ヌクレアーゼが４８５ｂｐの目的断片を切断でき、ＶＥＧＦＡ−ｃｒＲＮＡ２と比べて酵素消化効率は明らかな変化がないと分かった。
【００８４】
二  細胞内酵素消化の測定
１  方法
実施例２の工程二の方法に従い、ｃｒＲＮＡがそれぞれ工程一におけるＶＥＧＦＡ−ｃｒＲＮＡ２−１とＶＥＧＦＡ−ｃｒＲＮＡ２−２とし、ｔｒａｃｒＲＮＡが実施例１のｔｒａｃｒＲＮＡ２とした場合のＣａｓ９の酵素消化効率をそれぞれ測定した。各反応系ごとにある１種類のｃｒＲＮＡとした。実施例２のＶＥＧＦＡ−ｃｒＲＮＡ２をコントロールとして、ｃｒＲＮＡを代えてH２Oを用いてネガティブコントロール（ｎｅｇ．）とした。
【００８５】
２  結果
Ａｇｉｌｅｎｔ２２００核酸自動電気泳動システムによる測定によって得られるＤＮＡ断片の分布と濃度結果である図６から、ｃｒＲＮＡに対して化学修飾（メチル化修飾ＶＥＧＦＡ−ｃｒＲＮＡ２−１、コレステロール修飾ＶＥＧＦＡ−ｃｒＲＮＡ２−２）した後、いずれの場合も４８５ｂｐの目的断片を切断でき、ＶＥＧＦＡ−ｃｒＲＮＡ２と比べて酵素消化効率は明らかな変化がないと分かった。
【００８６】
実施例５
異なる細胞株の酵素消化測定
１  方法
実施例２の工程二の方法に従い、Ｃａｓ９−２９３Ｔ細胞をＣａｓ９−ＨｅＬａ細胞、Ｃａｓ９−ＴＨＰ−１細胞とＣａｓ９−ＨＵＶＥＣ細胞にそれぞれ替えて、他の工程が変わらなく、異なる細胞株のＣａｓ９酵素消化効率への影響を測定した。各反応系ごとにある１種類の細胞とした。用いられるｃｒＲＮＡは実施例２のＶＥＧＦＡ−ｃｒＲＮＡ２とし、ｔｒａｃｒＲＮＡは実施例１のｔｒａｃｒＲＮＡ２とする。ｔｒａｃｒＲＮＡを代えてH２Oを用いてネガティブコントロール（ｎｅｇ．）とした。
【００８７】
２  結果
Ａｇｉｌｅｎｔ２２００核酸自動電気泳動システムによる測定によって得られるＤＮＡ断片の分布と濃度の結果である図７から、異なるタイプの細胞株において、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡをトランスフェクションした後、いずれの場合もＣａｓ９ヌクレアーゼが目的断片を切断できると分かられ、且つ各ネガティブコントロールの結果からも、いずれの場合もネガティブコントロールの酵素消化効率が０となると示される。
【００８８】
実施例６
異なる遺伝子の酵素消化効率の測定
標的遺伝子はＯｃｔ４（ｏｒｇａｎｉｃｃａｔｉｏｎ／ｃａｒｎｉｔｉｎｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ４）遺伝子、ＥＭＸ１（Ｅｍｐｔｙ  ｓｐｉｒａｃｌｅｓ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ  １）遺伝子、Ｂｅｔａ−３遺伝子およびＢｅｔａ−５遺伝子とした。ここで、Ｂｅｔａ−３およびＢｅｔａ−５共はβサラセミア遺伝子であり、Ｂｅｔａ−３遺伝子はβサラセミア遺伝子変異誘発位点ＣＤ１７（ＨＢＢ：ｃ．５２Ａ＞Ｔ）を含有し、Ｂｅｔａ−５遺伝子はβサラセミア遺伝子変異誘発位点ＣＤ１７（ＨＢＢ：ｃ．５２Ａ＞Ｔ）を含有する。
【００８９】
Ｏｃｔ４遺伝子に用いられるｃｒＲＮＡはＯｃｔ４−Ｅ−Ｔ１−ｃｒＲＮＡ、Ｏｃｔ４−Ｅ−Ｔ２−ｃｒＲＮＡおよびＯｃｔ４−Ｅ−Ｔ３−ｃｒＲＮＡとし、ｔｒａｃｒＲＮＡは実施例１のｔｒａｃｒＲＮＡ２とした。ｃｒＲＮＡの構成は実施例１の式Ｉに示されるように、各ｃｒＲＮＡのｎｃｒＲＮＡ部分は同様で、すべて実施例１のｎｃｒＲＮＡ２としたが、Ｎｘ部分は異なる。各ｃｒＲＮＡの配列は以下である。
Ｏｃｔ４−Ｅ−Ｔ１−ｃｒＲＮＡ：  ＧＧＵＵＡＵＵＵＣＵＡＧＡＡＧＵＵＡＧＧ  ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１３）
Ｏｃｔ４−Ｅ−Ｔ２−ｃｒＲＮＡ：  ＣＵＵＣＵＡＣＡＧＡＣＵＡＵＵＣＣＵＵＧ  ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１４）
Ｏｃｔ４−Ｅ−Ｔ３−ｃｒＲＮＡ：  ＧＧＡＡＡＧＧＧＧＡＧＡＵＵＧＡＵＡＡＣ  ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１５）
【００９０】
ＥＭＸ１遺伝子に用いられるｃｒＲＮＡはＥ１Ｒ−ｃｒＲＮＡ、Ｅ７Ｆ−ｃｒＲＮＡ、Ｅｅ３Ｆ−ｃｒＲＮＡおよびＥ２Ｆ−ｃｒＲＮＡとし、ｔｒａｃｒＲＮＡは実施例１のｔｒａｃｒＲＮＡ２とした。ｃｒＲＮＡの構成は実施例１の式Ｉに示されるように、各ｃｒＲＮＡのｎｃｒＲＮＡ部分は同様で、すべて実施例１のｎｃｒＲＮＡ２としたが、Ｎｘ部分は異なる。各ｃｒＲＮＡの配列は以下である。
Ｅ１Ｒ−ｃｒＲＮＡ：  ＡＡＧＧＣＣＧＵＧＣＧＧＡＵＣＣＧＣＵＵ  ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１６）
Ｅ７Ｆ−ｃｒＲＮＡ：  ＡＧＧＵＣＣＧＡＣＧＵＧＵＵＧＧＡＧＵＧ  ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１７）
Ｅｅ３Ｆ−ｃｒＲＮＡ：  ＣＧＡＵＧＵＣＡＣＣＵＣＣＡＡＵＧＡＣＵ  ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１８）
Ｅ２Ｆ−ｃｒＲＮＡ：  ＵＣＵＣＧＣＣＣＵＣＧＣＡＧＣＵＧＣＵＧ  ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１９）
【００９１】
Ｂｅｔａ−３遺伝子に用いられるｃｒＲＮＡはＢｅｔａ−３−Ｔ１−ｃｒＲＮＡおよびＢｅｔａ−３−Ｔ３−ｃｒＲＮＡとし、ｔｒａｃｒＲＮＡは実施例１のｔｒａｃｒＲＮＡ２とした。ｃｒＲＮＡの構成は実施例１の式Ｉに示されるように、各ｃｒＲＮＡのｎｃｒＲＮＡ部分は同様で、すべて実施例１のｎｃｒＲＮＡ２としたが、Ｎｘ部分は異なる。各ｃｒＲＮＡの配列は以下である。
Ｂｅｔａ−３−Ｔ１−ｃｒＲＮＡ：  ＧＵＧＵＧＧＣＡＡＡＧＧＵＧＣＣＣＵＵＧ  ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２０）
Ｂｅｔａ−３−Ｔ３−ｃｒＲＮＡ：  ＡＣＣＡＡＵＡＧＡＡＡＣＵＧＧＧＣＡＵＧ  ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２１）
Ｂｅｔａ−５遺伝子に用いられるｃｒＲＮＡはＢｅｔａ−５−Ｔ３−ｃｒＲＮＡとし、ｔｒａｃｒＲＮＡは実施例１のｔｒａｃｒＲＮＡ２とした。ｃｒＲＮＡの構成は実施例１の式Ｉに示され、配列は以下である。
Ｂｅｔａ−５−Ｔ３−ｃｒＲＮＡ：  ＣＧＵＡＡＡＵＡＣＡＣＵＵＧＣＡＡＡＧＧ  ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２２）
【００９２】
一  生体外酵素消化の測定
１  ＤＮＡテンプレートの製造
２９３Ｔ細胞ゲノムをテンプレートとして、標的遺伝子であるＯｃｔ４遺伝子、ＥＭＸ１遺伝子、Ｂｅｔａ−３遺伝子およびＢｅｔａ−５遺伝子の断片、即ちＤＮＡテンプレートを増幅する。
【００９３】
Ｏｃｔ４遺伝子のＤＮＡテンプレートの１回目の増幅に用いられるプライマーはＯｃｔ４−ｏｕｔｅｒ−Ｆ１およびＯｃｔ４−ｏｕｔｅｒ−Ｒ１とし、２回目の増幅に用いられるプライマーはＯｃｔ４−ｉｎｎｅｒ−Ｆ１およびＯｃｔ４−ｉｎｎｅｒ−Ｒ１とした。
【００９４】
ＥＭＸ１遺伝子のＤＮＡテンプレートはＥＭＸ１−Ｅ２Ｆ、ＥＭＸ１−Ｅ１Ｒ、ＥＭＸ１−Ｅ７ＦおよびＥＭＸ１−Ｅｅ３Ｆとし、各テンプレートに用いられるプライマーは以下の通りである。
ＥＭＸ１−Ｅ２Ｆ：  ＤＮＡテンプレートの１回目の増幅に用いられるプライマーはＥ１−１Ｒ／２Ｆ−ＷＦ／ＮＦおよびＥ１−１Ｒ／２Ｆ−ＷＲとし、２回目の増幅に用いられるプライマーはＥ１−１Ｒ／２Ｆ−ＷＦ／ＮＦおよびＥ１−１Ｒ／２Ｆ−ＮＲとした。
ＥＭＸ１−Ｅ１Ｒ：  ＤＮＡテンプレートの１回目の増幅に用いられるプライマーはＥ１−１Ｒ／２Ｆ−ＷＦ・ＮＦおよびＥ１−１Ｒ・２Ｆ−ＷＲとし、２回目の増幅に用いられるプライマーはＥ１−１Ｒ・２Ｆ−ＷＦ・ＮＦおよびＥ１−１Ｒ・２Ｆ−ＮＲとした。
ＥＭＸ１−Ｅ７Ｆ：  ＤＮＡテンプレートの１回目の増幅に用いられるプライマーはＥ１−７−Ｆ−ＷＦおよびＥ１−７−Ｆ−ＷＲとし、２回目の増幅に用いられるプライマーはＥ１−７−Ｆ−ＮＦおよびＥ１−７−Ｆ−ＮＲとした。
ＥＭＸ１−Ｅｅ３Ｆ：  ＤＮＡテンプレートの１回目の増幅に用いられるプライマーはＥ１−ｅ３Ｆ−ＷＦおよびＥ１−ｅ３Ｆ−ＷＲとし、２回目の増幅に用いられるプライマーはＥ１−ｅ３Ｆ−ＮＦおよびＥ１−ｅ３Ｆ−ＮＲとした。
Ｂｅｔａ−３遺伝子のＤＮＡテンプレートの１回目の増幅に用いられるプライマーはＢｅｔａ−ｏｕｔｅｒ−Ｆ１およびＢｅｔａ−ｏｕｔｅｒ−Ｒ１とし、２回目の増幅に用いられるプライマーはＢｅｔａ３−ｉｎｎｅｒ−Ｆ１およびＢｅｔａ３−ｉｎｎｅｒ−Ｒ１とした。
Ｂｅｔａ−５遺伝子のＤＮＡテンプレートの１回目の増幅に用いられるプライマーはＢｅｔａ−ｏｕｔｅｒ−Ｆ１およびＢｅｔａ−ｏｕｔｅｒ−Ｒ１とし、２回目の増幅に用いられるプライマーはＢｅｔａ５−ｉｎｎｅｒ−Ｆ１およびＢｅｔａ５−ｉｎｎｅｒ−Ｒ１とした。
【００９５】
２  Ｃａｓ９の生体外酵素消化
実施例２の工程一における２〜５の方法に従い、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびＣａｓ９を含有する生体外酵素消化系を用いて工程１の各ＤＮＡテンプレートを酵素で消化して、各反応系ごとにある１種類のｃｒＲＮＡとした。ｔｃｒＲＮＡを代えてH２Oを用いてネガティブコントロール（ｎｅｇ．）とした。
【００９６】
２ー１  Ｏｃｔ４遺伝子
Ｏｃｔ４−Ｅ−Ｔ１−ｃｒＲＮＡが異なる濃度（２００ｎＭ、４００ｎＭおよび８００ｎＭ）とする場合のＣａｓ９の生体外酵素消化系の酵素消化効率を測定した。各系におけるｔｒａｃｒＲＮＡの濃度はｃｒＲＮＡの濃度によって違って、同一の反応系においてｔｒａｃｒＲＮＡの濃度とｃｒＲＮＡ濃度とが同じであるように維持するが、他の物質の濃度はすべて表３に示される。
【００９７】
結果から、Ｏｃｔ４−Ｅ−Ｔ１−ｃｒＲＮＡの濃度が２００ｎＭ、４００ｎＭおよび８００ｎＭとするいずれの場合でも、Ｃａｓ９がＯｃｔ４遺伝子のＤＮＡテンプレートを切断できる（図８）と分かった。
【００９８】
２ー２  ＥＭＸ１遺伝子
異なるｃｒＲＮＡ（Ｅ１Ｒ−ｃｒＲＮＡ、Ｅ７Ｆ−ｃｒＲＮＡ、Ｅｅ３Ｆ−ｃｒＲＮＡおよびＥ２Ｆ−ｃｒＲＮＡ）のＣａｓ９によるＥＭＸ１遺伝子のＤＮＡテンプレートの生体外酵素消化の酵素消化効率を測定する。ＥＭＸ１遺伝子のＤＮＡテンプレートであるＥＭＸ１−Ｅ２Ｆ、ＥＭＸ１−Ｅ１Ｒ、ＥＭＸ１−Ｅ７ＦおよびＥＭＸ１−Ｅｅ３Ｆに対応するｃｒＲＮＡｈはそれぞれＥ２Ｆ−ｃｒＲＮＡ、Ｅ１Ｒ−ｃｒＲＮＡ、Ｅ７Ｆ−ｃｒＲＮＡおよびＥｅ３Ｆ−ｃｒＲＮＡであり、各系は何れも表３に示される。
【００９９】
結果から、異なるｃｒＲＮＡは何れもＥＭＸ１遺伝子のＤＮＡテンプレートを切断できる（図９）と分かった。
【０１００】
２ー３  Ｂｅｔａ−３遺伝子およびＢｅｔａ−５遺伝子
Ｂｅｔａ−３−Ｔ１−ｃｒＲＮＡおよびＢｅｔａ−３−Ｔ３−ｃｒＲＮＡが存在した場合のＣａｓ９によるＢｅｔａ−３遺伝子のＤＮＡテンプレートの生体外酵素消化の酵素消化効率、以およびＢｅｔａ−５−Ｔ３−ｃｒＲＮＡが存在した場合のＣａｓ９によるＢｅｔａ−５遺伝子のＤＮＡテンプレートの生体外酵素消化の酵素消化効率を測定した。
【０１０１】
結果から、Ｂｅｔａ−３−Ｔ１−ｃｒＲＮＡおよびＢｅｔａ−３−Ｔ３−ｃｒＲＮＡが存在したいずれの場合でもＣａｓ９がＢｅｔａ−３遺伝子のＤＮＡテンプレートを切断でき、Ｂｅｔａ−５−Ｔ３−ｃｒＲＮＡが存在した場合、Ｃａｓ９がＢｅｔａ−５遺伝子のＤＮＡテンプレートを切断できる（図１０）と分かった。
【０１０２】
二  細胞内酵素消化の測定
実施例２の工程二の方法に従い、Ｃａｓ９ヌクレアーゼのＯｃｔ４遺伝子、ＥＭＸ１遺伝子、Ｂｅｔａ−３遺伝子およびＢｅｔａ−５遺伝子に対する酵素消化効率を測定した。各反応系ごとにある１種類のｃｒＲＮＡとした。ｃｒＲＮＡを代えてH２Oを用いてネガティブコントロール（ｎｅｇ．）とした。
【０１０３】
Ｏｃｔ４遺伝子に用いられるｃｒＲＮＡはＯｃｔ４−Ｅ−Ｔ１−ｃｒＲＮＡ、Ｏｃｔ４−Ｅ−Ｔ２−ｃｒＲＮＡおよびＯｃｔ４−Ｅ−Ｔ３−ｃｒＲＮＡとし、方法は何れも実施例２の工程二と同様であった。ネステッドＰＣＲによる目的ＤＮＡ断片の増幅において、Ｏｃｔ４遺伝子に用いられるプライマーは、１回目の増幅に用いられるプライマーをＯｃｔ４−ｏｕｔｅｒ−Ｆ１およびＯｃｔ４−ｏｕｔｅｒ−Ｒ１とし、２回目の増幅に用いられるプライマーをＯｃｔ４−ｉｎｎｅｒ−Ｆ１およびＯｃｔ４−ｉｎｎｅｒ−Ｒ１とした。結果から、異なるｃｒＲＮＡが存在する何れの場合でも、Ｃａｓ９ヌクレアーゼがＯｃｔ４遺伝子を切断できる（図１１）と分かった。
【０１０４】
ＥＭＸ１遺伝子に用いられるｃｒＲＮＡはＥｅ３Ｆ−ｃｒＲＮＡとし、Ｅｅ３Ｆ−ｃｒＲＮＡの用量はそれぞれ５０ｎｇ、１００ｎｇ、２００ｎｇ、４００ｎｇとした。同一の反応系においてｔｒａｃｒＲＮＡの濃度とｃｒＲＮＡ濃度とが同じであるように維持して、他の物質の用量および方法はいずれも実施例２の工程二と同様であった。ネステッドＰＣＲによる目的ＤＮＡ断片の増幅において、ＥＭＸ１遺伝子に用いられるプライマーは、１回目の増幅に用いられるプライマーをＥ１−ｅ３Ｆ−ＷＦおよびＥ１−ｅ３Ｆ−ＷＲとし、２回目の増幅に用いられるプライマーをＥ１−ｅ３Ｆ−ＮＦおよびＥ１−ｅ３Ｆ−ＮＲとした。結果から、異なる用量のｃｒＲＮＡの何れの場合でも、Ｃａｓ９ヌクレアーゼがＥＭＸ１遺伝子を切断できる（図１２）と分かった。
【０１０５】
Ｂｅｔａ−３遺伝子に用いられるｃｒＲＮＡはＢｅｔａ−３−Ｔ１−ｃｒＲＮＡおよびＢｅｔａ−３−Ｔ３−ｃｒＲＮＡとし、Ｂｅｔａ−５遺伝子に用いられるｃｒＲＮＡはＢｅｔａ−５−Ｔ３−ｃｒＲＮＡとした。方法は何れも実施例２の工程二と同様であった。ネステッドＰＣＲによる目的ＤＮＡ断片の増幅において、Ｂｅｔａ−３遺伝子に用いられるプライマーは、１回目の増幅に用いられるプライマーをＢｅｔａ−ｏｕｔｅｒ−Ｆ１およびＢｅｔａ−ｏｕｔｅｒ−Ｒ１とし、２回目の増幅に用いられるプライマーをＢｅｔａ３−ｉｎｎｅｒ−Ｆ１およびＢｅｔａ３−ｉｎｎｅｒ−Ｒ１とし、また、Ｂｅｔａ−５遺伝子に用いられるプライマーは、１回目の増幅に用いられるプライマーをＢｅｔａ−ｏｕｔｅｒ−Ｆ１およびＢｅｔａ−ｏｕｔｅｒ−Ｒ１とし、２回目の増幅に用いられるプライマーをＢｅｔａ５−ｉｎｎｅｒ−Ｆ１およびＢｅｔａ５−ｉｎｎｅｒ−Ｒ１とした。結果から、Ｂｅｔａ−３−Ｔ１−ｃｒＲＮＡおよびＢｅｔａ−３−Ｔ３−ｃｒＲＮＡが存在する何れの場合でもＣａｓ９ヌクレアーゼがＢｅｔａ−３遺伝子を切断でき、Ｂｅｔａ−５−Ｔ３−ｃｒＲＮＡが存在する場合、Ｃａｓ９ヌクレアーゼがＢｅｔａ−５遺伝子を切断できる（図１３）と分かった。
【０１０６】
実施例７
マウスゲノムＶＥＧＦ遺伝子の酵素消化の測定
一  細胞内酵素消化の測定
実施例２の工程二の方法に従い、Ｃａｓ９−２９３Ｔ細胞を、Ｃａｓ９を含有するＣ２Ｃ１２マウス筋芽細胞に替えて、他の工程が変わらなく、Ｃａｓ９を含有するＣ２Ｃ１２マウス筋芽細胞においてＣａｓ９のＶＥＧＦＡ遺伝子酵素消化効率への影響を測定した。用いられるｃｒＲＮＡは修飾されたＶＥＧＦＡ−ｃｒＲＮＡ６、即ちＶＥＧＦＡ−ｃｒＲＮＡ６−１とし、ｔｒａｃｒＲＮＡは実施例１のｔｒａｃｒＲＮＡ２とした。ｃｒＲＮＡを代えてH２Oを用いてネガティブコントロール（ｎｅｇ．）とした。
【０１０７】
ＶＥＧＦＡ−ｃｒＲＮＡ６：  ＡＡＧＡＧＧＡＧＡＧＧＧＧＧＣＣＧＣＡＧ  ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２９）
ＶＥＧＦＡ−ｃｒＲＮＡ６−１はＶＥＧＦＡ−ｃｒＲＮＡ６の２番目、３０番目、３１番目および３３番目の位置に対して２′−Ｏ−メチルで修飾して得られる物質であり、具体的に以下である。
ＡＡｍＧＡＧＧＡＧＡＧＧＧＧＧＣＣＧＣＡＧ  ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣｍＵｍＡＵｍＧ
ｍは２′−Ｏ−メチル修飾を示す。
【０１０８】
Ｃａｓ９を含有するＣ２Ｃ１２マウス筋芽細胞の製造方法は以下の通りである。
１  Ｌｉｐｏ２０００によるプラスミドＰＸ２６０のトランスフェクション
（１）  ５０μｌのｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地を１．５ｍｌのＥＰ管に置いて、１μｌのＬｉｐｏ２０００を入れて、均一に混ぜた後、室温で５ｍｉｎ放置した。
（２）  ５０μｌのｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地を１．５ｍｌのＥＰ管に置いて、１μμｇのＰＸ２６０プラスミドを入れて、均一に混ぜた。
（３）  （１）および（２）で得られる溶液を混合して、室温で２０ｍｉｎ放置した。
（４）  Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞を培養した２４ウェル培養プレートにおける培地を一部吸い出し、ウェル中における培地残量が３００−５００μｌ程度になり、（３）で得られたサンプルを培養ウェルに入れて、３−６ｈ後に培養ウェルに１０％のウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ培地を１ｍｌまで補充して、細胞をインキュベーターに置き戻して培養した。
【０１０９】
２  プラスミドのトランスフェクションの２４ｈ後に、Ｌｉｐｏ２０００によってｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡをトランスフェクションした。トランスフェクションの方法は実施例２の工程一における１の（３）と同様である。
【０１１０】
二  Ｃ５７ｂｌ／６マウス生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）の酵素消化の測定
１  Ｃ５７ｂｌ／６マウス生体内のトランスフェクション
（１）  Ｃ５７ＢＬ／６マウス（北京維通利華実験動物有限公司）にペントバルビタールナトリウムを注射して麻酔させた。３０ｍｇ／ｋｇ静脈または腹腔注射である。
【０１１１】
（２）  製剤混合
５μｇのＣａｓ９プラスミド（即ちＰＸ２６０）、４μＭのｃｒＲＮＡ（２０μｌ）および４μＭのｔｒａｃｒＲＮＡ（２０μｌ）を２００μｌの生理食塩水に溶解させて、振動して均一に混ぜた。６μｌのトランスフェクション試薬（即ちＴｕｒｂｏＦｅｃｔ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ）を入れて充分に混合させた。上記混合液を室温で１５−２０分間放置して、トランスフェクション製剤として筋肉に注射した。用いられるｃｒＲＮＡは修飾されたＶＥＧＦＡ−ｃｒＲＮＡ６、即ちＶＥＧＦＡ−ｃｒＲＮＡ６−１とし、ｔｒａｃｒＲＮＡは実施例１のｔｒａｃｒＲＮＡ２とした。
【０１１２】
２ー２  マウス筋肉内注射
マウス大腿二頭筋に対して２００μｌの工程２ー１のトランスフェクション製剤を注射した。
【０１１３】
２ー３  マウス筋肉組織のゲノムＤＮＡの抽出
トランスフェクション後の７日目に、血液・組織・細胞ゲノム抽出キットによって大腿二頭筋ゲノムＤＮＡを抽出した。
【０１１４】
２ー４  ネステッドＰＣＲによる目的ＤＮＡ断片の増幅
方法は実施例２の工程二における３と同様であった。用いられるプライマーはＶＥＧＦＡ−ｏｕｔｅｒ−Ｆ１（マウス）、ＶＥＧＦＡ−ｏｕｔｅｒ−Ｒ１（マウス）、ＶＥＧＦＡ−ｉｎｎｅｒ−Ｆ１（マウス）およびＶＥＧＦＡ−ｉｎｎｅｒ−Ｒ１（マウス）とした。
【０１１５】
２ー５  Ｔ７ＥＩの酵素消化効率の測定
ＮＥＢ  Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ（Ｔ７ＥＩ）を用いて消化した。具体的な方法は実施例２の工程二における４と同様であった。
【０１１６】
２ー６  電気泳動による測定
酵素消化サンプルをＡｇｉｌｅｎｔ２２００核酸自動電気泳動システムによる測定に供した。
【０１１７】
３  結果解析
計算方法は実施例２と同様であった。
Ａｇｉｌｅｎｔ２２００核酸自動電気泳動システムによる測定によって得られるＤＮＡ断片の分布と濃度の結果から、マウスにおいて、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびＣａｓ９プラスミドをマウス細胞またはマウス体内に導入した場合では、５２６ｂｐの目的ＤＮＡの目的断片を２個のＤＮＡ鎖に切断できる（図１４）と分かった。
【０１１８】
実施例８
プロモーター、エキソンの酵素消化の測定
ＴＰ５３（ｔｕｍｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐ５３）遺伝子およびエキソンの酵素消化効率を測定した。用いられるｃｒＲＮＡはそれぞれＴＰ５３−Ｐ−Ｔ１、ＴＰ５３−Ｐ−Ｔ２、ＴＰ５３−Ｅ−Ｔ１、ＴＰ５３−Ｅ−Ｔ２およびＴＰ５３−Ｅ−Ｔ３とした。各反応系においてある１種類のｃｒＲＮＡとした。用いられるｔｒａｃｒＲＮＡは実施例１のｔｒａｃｒＲＮＡ２とした。ｃｒＲＮＡを代えてH２Oを用いてネガティブコントロール（ｎｅｇ．）とした。用いられるｃｒＲＮＡの配列は以下である。
ＴＰ５３−Ｐ−Ｔ１：  ＣＡＡＵＵＣＵＧＣＣＣＵＣＡＣＡＧＣＵＣ  ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２３）
ＴＰ５３−Ｐ−Ｔ２：  ＣＣＣＣＡＡＡＡＵＧＵＵＡＧＵＡＵＣＵＡ  ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２４）
ＴＰ５３−Ｅ−Ｔ１：  ＣＣＣＵＣＣＣＡＵＧＵＧＣＵＣＡＡＧＡＣ  ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２５）
ＴＰ５３−Ｅ−Ｔ２：  ＵＧＧＧＡＧＣＧＵＧＣＵＵＵＣＣＡＣＧＡ  ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２６）
ＴＰ５３−Ｅ−Ｔ３：  ＣＣＡＧＵＣＵＵＧＡＧＣＡＣＡＵＧＧＧＡ  ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２７）
（Ｐはプロモーターを、Ｅはエキソンを示す）
【０１１９】
一  生体外酵素消化の測定
１  ＤＮＡテンプレートの製造
２９３Ｔ細胞ゲノムをテンプレートとして、標的遺伝子ＴＰ５３断片、即ちＤＮＡテンプレートを増幅した。
【０１２０】
１回目の増幅に用いられるプライマーはＴＰ５３−ｏｕｔｅｒ−ＦＰおよびＴＰ５３−ｏｕｔｅｒ−ＲＰとし、２回目の増幅に用いられるプライマーはＴＰ５３−ｉｎｎｅｒ−ＦＰおよびＴＰ５３−ｉｎｎｅｒ−ＲＰとした。
【０１２１】
２  Ｃａｓ９の生体外酵素消化
実施例２の工程一における２−５の方法に従い、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびＣａｓ９を含有する生体外酵素消化系により工程１のＤＮＡテンプレートを消化した。
【０１２２】
二  細胞内酵素消化の測定
実施例２の工程二の方法に従い、Ｃａｓ９ヌクレアーゼのＴＰ５３断片に対する酵素消化効率を測定した。ｃｒＲＮＡを代えてH２Oを用いてネガティブコントロール（ｎｅｇ．）とした。
【０１２３】
Ａｇｉｌｅｎｔ２２００核酸自動電気泳動システムによる測定によって得られるＤＮＡ断片の分布と濃度結果である図１５〜図１６から、ｃｒＲＮＡ・ｔｒａｃｒＲＮＡ・Ｃａｓ９ヌクレアーゼシステムはＴＰ５３断片のプロモーターおよびエキソン領域を切断できると分かった。
【０１２４】
実施例９
複数個のｃｒＲＮＡの酵素消化の測定
一  生体外酵素消化の測定
１  Ｃａｓ９の生体外酵素消化
Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、１０×Ｃａｓ９Ｂｕｆｆｅｒ、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡとＨ２Ｏを均一に混ぜて、３７℃で１５ｍｉｎインキュベートして、それからＤＮＡテンプレートを入れて、均一に混ぜてから、３７℃で７０ｍｉｎインキュベートした。ｃｒＲＮＡを代えてＨ２Ｏを用いてネガティブコントロール（ｎｅｇ．）とした。ＤＮＡテンプレートは実施例６のＯｃｔ４遺伝子のＤＮＡテンプレートとし、用いられるｃｒＲＮＡはＯｃｔ４−Ｅ−Ｔ１−ｃｒＲＮＡ、Ｏｃｔ４−Ｅ−Ｔ２−ｃｒＲＮＡおよびＯｃｔ４−Ｅ−Ｔ３−ｃｒＲＮＡとして、ｔｒａｃｒＲＮＡは実施例１のｔｒａｃｒＲＮＡ２とした。Ｃａｓ９の生体外酵素消化系は以下の通りである。当該系では、３種類のｃｒＲＮＡ、即ちＯｃｔ４−Ｅ−Ｔ１−ｃｒＲＮＡ、Ｏｃｔ４−Ｅ−Ｔ２−ｃｒＲＮＡおよびＯｃｔ４−Ｅ−Ｔ３−ｃｒＲＮＡが含まれている。
【０１２５】
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ｃｒＲＮＡとしてＯｃｔ４−Ｅ−Ｔ２−ｃｒＲＮＡを単独的に用いて実験した。対照的に、Ｏｃｔ４−Ｅ−Ｔ２−ｃｒＲＮＡの濃度は４００ｎＭとした。
【０１２６】
２  磁気ビーズによる精製
実施例２の工程一における３と同様である。
【０１２７】
３  Ａｇｉｌｅｎｔ２２００核酸自動電気泳動システムによる測定
実施例２の工程一における４と同様である。
【０１２８】
二  細胞内酵素消化の測定
実施例２の工程二の方法に従い、Ｏｃｔ４−Ｅ−Ｔ１−ｃｒＲＮＡ、Ｏｃｔ４−Ｅ−Ｔ２−ｃｒＲＮＡおよびＯｃｔ４−Ｅ−Ｔ３−ｃｒＲＮＡならびに実施例１のｔｒａｃｒＲＮＡ２を用いて一緒にトランスフェクションした。ｃｒＲＮＡ６の用量は何れも６６．７ｎｇとし、ｔｒａｃｒＲＮＡ２の用量は３００ｎｇとした。ｃｒＲＮＡとしてＯｃｔ４−Ｅ−Ｔ２−ｃｒＲＮＡを単独的に用いて実験し、対照として、Ｏｃｔ４−Ｅ−Ｔ２−ｃｒＲＮＡの用量は２００ｎｇとした。
【０１２９】
Ａｇｉｌｅｎｔ２２００核酸自動電気泳動システムによる測定によって得られるＤＮＡ断片の分布と濃度結果である図１７〜図１８から、ｃｒＲＮＡの用量が一致した場合、Ｏｃｔ４遺伝子に関する複数個のｃｒＲＮＡの酵素消化効率は１個のｃｒＲＮＡより高く、生体外と細胞においてはそれぞれ１倍と２倍以上向上した。
【０１３０】
実施例１０
異なるＣａｓ９ドナーの細胞酵素消化の測定
一  Ｃａｓ９を安定に発現する細胞
Ｃａｓ９ドナーはＣａｓ９を安定に発現する２９３Ｔ細胞、即ちＣａｓ９−２９３Ｔとした。具体的な方法は実施例２における工程一と同様である。用いられるｃｒＲＮＡおよびＴｒａｃＲＮＡはそれぞれ実施例２のｃｒＲＮＡ２および実施例１のｔｒａｃｒＲＮＡ２とした。
【０１３１】
２  Ｃａｓ９プラスミド
Ｃａｓ９ドナーはＣａｓ９プラスミド（即ちＰＸ２６０）とした。
２ー１  Ｌｉｐｏ２０００によるプラスミドＰＸ２６０のトランスフェクション
（１）  ５０μｌのｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地を１．５ｍｌのＥＰ管に置いて、１μｌのＬｉｐｏ２０００を入れて、均一に混ぜてから、室温で５ｍｉｎ放置した。
（２）  ５０μｌのｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地を１．５ｍｌのＥＰ管に置いて、１μｇのＰＸ２６０のプラスミドを入れて、均一に混ぜた。
（３）  （１）および（２）で得られる溶液を混合して、室温で２０ｍｉｎ放置した。
（４）  ２９３Ｔ細胞を培養した２４ウェル培養プレートにおける培地を一部吸い出し、ウェル中における培地残量が３００−５００μｌ程度になり、（３）で得られたサンプルを培養ウェル中に添加して、３−６ｈ後に培養ウェル中にウシ胎児血清を１０％含有するＤＭＥＭ培地を１ｍｌまで補充して、細胞をインキュベーターに置き戻して培養した。
【０１３２】
２ー２  プラスミドトを２４ｈランスフェクションした後、Ｌｉｐｏ２０００によってｃｒＲＮＡおよびＴｒａｃｒＲＮＡをトランスフェクションした。トランスフェクションの方法は実施例２の工程一における１の（３）と同様である。用いられるｃｒＲＮＡおよびＴｒａｃＲＮＡはそれぞれ実施例２のｃｒＲＮＡ２および実施例１のｔｒａｃｒＲＮＡ２とした。
【０１３３】
実施例の工程二における２―６の方法に従い、Ａｇｉｌｅｎｔ２２００核酸自動電気泳動システムによる測定によって得られるＤＮＡ断片の分布と濃度結果である図１９から、正常の２９３Ｔ細胞においてトランスフェクションされたプラスミドがＣａｓ９を発現して、さらにｃｒＲＮＡおよびＴｒａｃｒＲＮＡをトランスフェクションしたから、同じく目的ＤＮＡ断片を酵素消化することが可能で、効率はＣａｓ９が安定的にトランスフェクションされた細胞（Ｃａｓ９−２９３Ｔ）より低いと分かった。
【０１３４】
実施例１１
異なるＣａｓ９濃度の生体外酵素消化の測定
１  方法
実施例２の工程一の方法に従い、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、および異なる濃度のＣａｓ９を含む生体外酵素消化系の酵素消化効率をそれぞれ測定した。Ｃａｓ９の濃度はそれぞれ２０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭとし、他の成分含有量は実施例２の工程一と同様である。
【０１３５】
用いられるｃｒＲＮＡおよびＴｒａｃＲＮＡはそれぞれ実施例２のＶＥＧＦＡ−ｃｒＲＮＡ２および実施例１のｔｒａｃｒＲＮＡ２とした。
【０１３６】
２  結果
Ａｇｉｌｅｎｔ２２００核酸自動電気泳動システムによる測定によって得られるＤＮＡ断片の分布と濃度結果（図２０）から、タンパク質濃度が２０−４００ｎＭとした場合は、酵素消化効率が５０％以上となり、タンパク質濃度が１００−４００ｎＭとした場合は、酵素消化効率が８０％以上となり、タンパク質濃度が１００−２００ｎＭとした場合は、酵素消化効率が８５％以上となるという結論が得られる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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