(57)【要約】  本出願は、試料中の、カルバペネマーゼ産生性のエンテロバクター目、シュードモナス属、およびアシネトバクター属の存在を検出するための方法であって、カルバペネマーゼ産生性のエンテロバクター目、シュードモナス属またはアシネトバクター属を含む疑いのある試料を用意すること、当該試料を、（７Ｒ）−７−［（ｚ）−２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−（Ｚ）−２（メトキシイミノ）アセトアミド］−３−（２，４−ジニトロスチリル）−３−セフェム−４−カルボン酸）またはその塩の溶液と反応させること、およびカルバペネマーゼ産生性のエンテロバクター目、シュードモナス属、またはアシネトバクター属が当該試験試料中に存在する場合に、反応媒体中の色の変化を検出すること、を含む方法に関する。
2020529850.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の、カルバペネマーゼ産生性のエンテロバクター目、シュードモナス属、およびアシネトバクター属の存在を検出するための方法であって、
カルバペネマーゼ産生性のエンテロバクター目、シュードモナス属、またはアシネトバクター属を含む疑いのある試料を用意すること、
当該試料を、（７Ｒ）−７−［（ｚ）−２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−（Ｚ）−２（メトキシイミノ）アセトアミド］−３−（２，４−ジニトロスチリル）−３−セフェム−４−カルボン酸）またはその塩の溶液と反応させること、および
カルバペネマーゼ産生性のエンテロバクター目、シュードモナス属、またはアシネトバクター属が当該試験試料に存在する場合における反応媒体中の色の変化を検出すること、を含む方法。
【請求項２】
当該試料が生物学的試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
当該生物学的試料が、尿などの生体試料または典型的には分離細胞培養物からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記方法が、（７Ｒ）−７−［（ｚ）−２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−（Ｚ）−２（メトキシイミノ）アセトアミド］−３−（２，４−ジニトロスチリル）−３−セフェム−４−カルボン酸）またはその塩との反応前または反応と同時に、試料を溶解させるステップをさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
当該試料の溶解が、（７Ｒ）−７−［（ｚ）−２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−（Ｚ）−２（メトキシイミノ）アセトアミド］−３−（２，４−ジニトロスチリル）−３−セフェム−４−カルボン酸）またはその塩の存在下で起こる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
当該試料の溶解が、ポリミキシン、グリコペプチドおよびポリペプチド抗生物質の組合せによって促進される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
試料の（［（７Ｒ）−７−［（ｚ）−２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−（Ｚ）−２（メトキシイミノ）アセトアミド］−３−（２，４−ジニトロスチリル）−３−セフェム−４−カルボン酸）またはその塩との反応が、色の変化を観察するのに十分な時間、好ましくは１時間未満、より好ましくは３０分未満、最も好ましくは約５〜約２０分間、行われる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
当該試料の（［（７Ｒ）−７−［（ｚ）−２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−（Ｚ）−２（メトキシイミノ）アセトアミド］−３−（２，４−ジニトロスチリル）−３−セフェム−４−カルボン酸）またはその塩との反応が、約５℃〜約４０℃、より好ましくは約２０℃〜約３７℃、最も好ましくは３５℃の温度で行われる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
広域スペクトルβ−ラクタム（ＥＳＢＬ）阻害剤、ＡｍｐＣ阻害剤またはこれらの混合物をさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
（［（７Ｒ）−７−［（ｚ）−２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−（Ｚ）−２（メトキシイミノ）アセトアミド］−３−（２，４−ジニトロスチリル）−３−セフェム−４−カルボン酸）またはその塩が、カルバペネムもしくはペネム単独と組み合わせて、または広域スペクトルβ−ラクタム（ＥＳＢＬ）阻害剤、ＡｍｐＣ阻害剤もしくはこれらの混合物と組み合わせて使用される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
広域スペクトル阻害剤がクラブラン酸であり、ＡｍｐＣ阻害剤がクロキサシリンまたはその混合物である、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
当該阻害剤が、約３０μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌの濃度のクラブラン酸及び約３００μｇ／ｍｌ〜約５００μｇ／ｍｌの濃度のクロキサシリンのうちの少なくとも１つを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
（［（７Ｒ）−７−［（ｚ）−２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−（Ｚ）−２（メトキシイミノ）アセトアミド］−３−（２，４−ジニトロスチリル）−３−セフェム−４−カルボン酸）またはその塩が、有機溶媒、有機酸および硫酸亜鉛の少なくとも１種を含む溶液に溶解されている、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
当該有機溶媒が、極性非プロトン性溶媒、好ましくはＤＭＳＯであり、前記有機酸が直鎖状飽和ジカルボン酸である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
（［（７Ｒ）−７−［（ｚ）−２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−（Ｚ）−２（メトキシイミノ）アセトアミド］−３−（２，４−ジニトロスチリル）−３−セフェム−４−カルボン酸）またはその塩の、試料中の、カルバペネマーゼ産生性のエンテロバクター目、シュードモナス属、およびアシネトバクター属の存在を検出するための使用。
【請求項１６】
（［（７Ｒ）−７−［（ｚ）−２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−（Ｚ）−２（メトキシイミノ）アセトアミド］−３−（２，４−ジニトロスチリル）−３−セフェム−４−カルボン酸）またはその塩が、カルバペネムもしくはペネムだけと組み合わせて、または広域スペクトルβ−ラクタム（ＥＳＢＬ）阻害剤、ＡｍｐＣもしくはこれらの混合物と組み合わせて使用される、請求項１５に記載の（［（７Ｒ）−７−［（ｚ）−２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−（Ｚ）−２（メトキシイミノ）アセトアミド］−３−（２，４−ジニトロスチリル）−３−セフェム−４−カルボン酸）またはその塩の使用。
【請求項１７】
微生物がカルバペネム加水分解性β−ラクタマーゼを産生するかどうかを判定するためのキットであって、
（［（７Ｒ）−７−［（ｚ）−２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−（Ｚ）−２（メトキシイミノ）アセトアミド］−３−（２，４−ジニトロスチリル）−３−セフェム−４−カルボン酸）またはその塩を含むバイアル、
（［（７Ｒ）−７−［（ｚ）−２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−（Ｚ）−２（メトキシイミノ）アセトアミド］−３−（２，４−ジニトロスチリル）−３−セフェム−４−カルボン酸）またはその塩でコーティングされたウェルを有するマイクロタイタープレート、または
ＨＭＲＺ−９８（［（７Ｒ）−７−［（ｚ）−２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−（Ｚ）−２（メトキシイミノ）アセトアミド］−３−（２，４−ジニトロスチリル）−３−  セフェム−４−カルボン酸）またはその塩を含浸させた分析ディスク、および
広域スペクトルβ−ラクタム（ＥＳＢＬ）阻害剤、ＡｍｐＣ阻害剤もしくはこれらの混合物、を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中の、カルバペネマーゼ産生性のエンテロバクター目（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、およびアシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）の存在を検出するための方法、ならびにそのような方法で使用するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
カルバペネマーゼは、カルバペネムなどの様々な抗生物質に対して活性なβ−ラクタマーゼの１群である。カルバペネマーゼは、ベータ−ラクタマーゼの３つのクラス、すなわちＡｍｂｌｅｒクラスＡ、ＡｍｂｌｅｒクラスＢおよびＡｍｂｌｅｒクラスＤに属する。これら３つのクラスのカルバペネマーゼは、臨床的に重要な細菌に、カルバペネムに対する耐性をもたらし、あるいはカルバペネムに対する感受性を低下させる。したがって、カルバペネマーゼを産生する細菌は臨床的に興味深く、これらの細菌の蔓延を防ぎ、及び、多剤耐性や全抗菌薬耐性（ｐａｎｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）を減少させるために、これらを早期に検出するための方法が求められる。
【０００３】
カルバペネマーゼ産生性バクテリアを検出するために、「Ｅｔｅｓｔ（登録商標）」などのＭＩＣストリップ製品および「ホッジ試験変法」の２種の試験が、臨床的に広く使用されている。「Ｅｔｅｓｔ（登録商標）」では、指標カルバペネムと、試験微生物に対するカルバペネム陽性酵素阻害抗菌剤を、寒天上に対向する所定の勾配で準備し、これらを用いて該抗菌剤の最小阻害濃度（ＭＩＣ）と抑制濃度比を求める。「ホッジ試験変法」では、レポーター細菌がカルバペネム含有ディスクに向かって増殖し、ディスクの周囲に、特徴的な「クローバーの葉」の形をした増殖パターンを形成した場合に、カルバペネマーゼ産生性菌を検出する。この現象は、試験分離菌によって産生されるカルバペネム不活化酵素によって仲介されうる。またカルバペネマーゼ遺伝子の分子検出技術も使用されている。しかし３種の試験のすべてに不利な点がある。「Ｅｔｅｓｔ（登録商標）」と「ホッジ試験変法」は、感度も特異性も不十分である一方、分子検出技術は複雑で費用がかかる。さらに、３種の検出方法はすべて、試料がカルバペネマーゼ産生性菌を含有しているかどうかを判定するための所要時間が最大で２４時間に達する、非常に時間を要するものである。院内感染や薬剤耐性の移動を制御する場合に、これは不十分である。
【０００４】
最近、カルバペネマーゼ産生性菌を検出するための酸測色技術が開発されている。この方法は、「Ｅｔｅｓｔ（登録商標）」、「ホッジ試験変法」および分子検出技術と比べて分析時間を顕著に短縮すると報告されている。国際公開ＷＯ２０１２／１７５６３７にはこのような方法が開示されており、具体的には、分析時間が２時間未満であると報告されている。しかし、現在の迅速な表現型試験は、試料中のカルバペネマーゼ産生性シュードモナス（Ｈｅｉｎｒｉｃｈｓら、２０１５年）およびアシネトバクターの検出のための感度及び特異性に乏しい。特に、偽陰性の結果が得られることがある。
【０００５】
また、カルバペネマーゼ産生性のエンテロバクター科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）の迅速検出は、これらの生物の蔓延を抑えることに重要であり、これらの検出に表現型法も分子法も利用できるが、あらゆる状況でも理想的な検出方法は１つも存在していない（Ｌｕｔｇｒｉｎｇ、Ｌｉｍｂａｇｏ、２０１６）。抗菌剤感受性試験に関する欧州委員会（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｔｅｓｔｉｎｇ、ＥＵＣＡＳＴ、２０１８年）によると、近年の分類研究は、エンテロバクター科の定義を狭めた。その結果、エンテロバクター目（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）は、唯一の科であるエンテロバクター科を含むグラム陰性バクテリアの目である。したがって、本発明は、エンテロバクター目について言及する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、特異性及び感度が高いだけでなく、臨床的に容易に利用されうる、カルバペネマーゼ産生性のエンテロバクター目、シュードモナス属、およびアシネトバクター属の、試料中での存在を検出する方法を提供することにニーズがある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、発色性セファロスポリン（７Ｒ）−７−［（ｚ）−２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−（Ｚ）−２（メトキシイミノ）アセトアミド］−３−（２，４−ジニトロスチリル）−３−セフェム−４−カルボン酸またはその塩を用いる表現型試験を行うことにより、カルバペネマーゼ産生性のエンテロバクター目、シュードモナス属、およびアシネトバクター属の存在を極めて短いタイムスケールで検出できることを見出した。
【０００８】
特に、本発明者らによって見出された検出方法は、カルバペネマーゼの存在を試験する前に、発現を誘導または阻害する可能性のある試薬に、分離菌を前もって暴露させる必要がないので、別の特別な期間を必要としない。
【０００９】
一態様において、本発明者らは、発色性セファロスポリン（７Ｒ）−７−［（ｚ）−２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−（Ｚ）−２（メトキシイミノ）アセトアミド］−３−（２，４−ジニトロスチリル）−３−セフェム−４−カルボン酸またはその塩を用いて、カルバペネマーゼ産生性のエンテロバクター目、シュードモナス属、およびアシネトバクター属の、このような細菌への感染が疑われる患者からの試料中における存在を検出できることを見出した。
【００１０】
すなわち、第１態様において、本発明は、患者からの試料中の、カルバペネマーゼ産生性のエンテロバクター目、シュードモナス属、およびアシネトバクター属の存在を検出するための方法であって、カルバペネマーゼ産生性のエンテロバクター目、シュードモナス属、またはアシネトバクター属を含む疑いのある試料を用意すること、当該試料を、（７Ｒ）−７−［（ｚ）−２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−（Ｚ）−２（メトキシイミノ）アセトアミド］−３−（２，４−ジニトロスチリル）−３−セフェム−４  カルボン酸またはその塩の溶液と反応させること、および反応媒体中の色の変化を検出すること、を含み、ここで黄から赤への色の変化が、カルバペネマーゼ産生性のエンテロバクター目、シュードモナス属、またはアシネトバクター属が当該試験試料中に存在することを示す前記方法を提供する。
【００１１】
第２態様によると、本発明は、（７Ｒ）−７−［（ｚ）−２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−（Ｚ）−２（メトキシイミノ）アセトアミド］−３−（２，４−ジニトロスチリル）−３−セフェム−４  カルボン酸またはその塩の、試料中の、カルバペネマーゼ産生性のエンテロバクター目、シュードモナス属、およびアシネトバクター属の存在を検出するための使用方法を提供する。
【００１２】
第３態様によると、本発明はまた、微生物がカルバペネム加水分解性β−ラクタマーゼを産生するかどうかを判定するためのキットであって、（７Ｒ）−７−［（ｚ）−２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−（Ｚ）−２（メトキシイミノ）アセトアミド］−３−（２，４−ジニトロスチリル）−３−セフェム−４  カルボン酸またはその塩を含浸させた分析ディスクと、広域スペクトルβ−ラクタム（ＥＳＢＬ）阻害剤、ＡｍｐＣ阻害剤またはこれらの混合物とを含む前記キットも提供する。
【００１３】
本発明はまた、（７Ｒ）−７−［（ｚ）−２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−（Ｚ）−２（メトキシイミノ）アセトアミド］−３−（２，４−ジニトロスチリル）−３−セフェム−４−カルボン酸またはその塩を含む、１つのウェルまたは一連のウェルを含むマイクロタイタープレート、及び、試験試料中のカルバペネマーゼ産生体の存在を検出することにおけるその使用、にも関する。
【００１４】
また本発明は、（７Ｒ）−７−［（ｚ）−２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−（Ｚ）−２（メトキシイミノ）アセトアミド］−３−（２，４−ジニトロスチリル）−３−セフェム−４−カルボン酸またはその塩を含む、バイアルまたは微量遠心チューブ（microfuge tube）、及び、試験試料中のカルバペネマーゼ産生性菌の存在を検出することにおけるその使用、にも関する。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
抗生物質耐性の広がりを防ぎ、例えばペネム及びカルバペネムなどの抗生物質の有効性を維持する必要な処置を取るために、カルバペネマーゼ産生性菌を迅速に検出できる方法が必要とされている。本発明の方法は、試料がカルバペネマーゼ産生性バクテリアを有しているかどうかを、速やかに且つ確実な様式で判定する解釈可能な結果を、使用者に提供することによって、このニーズに対処する。
【００１６】
特に、本方法は、カルバペネマーゼ産生性のエンテロバクター目、シュードモナス属、およびアシネトバクター属の菌種の存在を検出するための、迅速で確実な表現型試験の提供に適切でありうる。したがって、本発明は、他の既知の方法および／または試験を用いて迅速かつ確実に試験できないであろう、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）などのカルバペネマーゼ産生性バクテリアの存在を検出するための、迅速で確実な表現型試験の提供に適した方法を、有利に提供する。
【００１７】
第１態様において、本発明はしたがって、試料中の、カルバペネマーゼ産生性のエンテロバクター目、シュードモナス属、およびアシネトバクター属の存在を検出するための方法であって、カルバペネマーゼ産生性のエンテロバクター目、シュードモナス属、またはアシネトバクター属を有する疑いのある試料を用意すること、当該試料を、（７Ｒ）−７−［（ｚ）−２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−（Ｚ）−２（メトキシイミノ）アセトアミド］−３−（２，４−ジニトロスチリル）−３−セフェム−４−カルボン酸またはその塩の溶液と反応させること、およびカルバペネマーゼ産生性のエンテロバクター目、シュードモナス属、またはアシネトバクター属が当該試験試料に存在する場合に、反応媒体中の色の変化を検出すること、を含む前記方法を提供する。
【００１８】
本発明の方法は、エンテロバクター目、シュードモナス属、およびアシネトバクター属の種におけるカルバペネマーゼ産生の検出に、１００％の感度および１００％の特異性を有しうる。
【００１９】
本発明の方法は、（７Ｒ）−７−［（ｚ）−２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−（Ｚ）−２（メトキシイミノ）アセトアミド］−３−（２，４−ジニトロスチリル）−３−セフェム−４−カルボン酸またはその塩が、カルバペネマーゼなどのβ−ラクタマーゼによって加水分解されうるという概念に基づいている。（［（７Ｒ）−７−［（ｚ）−２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−（Ｚ）−２（メトキシイミノ）アセトアミド］−３−（２，４−ジニトロスチリル）−３−セフェム−４−カルボン酸の加水分解は、黄から赤への観察可能な色変化をもたらす。
【００２０】
好ましくは、本発明の方法を、カルバペネマーゼ産生性菌に感染している疑いのある対象から得られた試料に対して行われる。当該試料は、例えば体液、組織、または細胞試料などの、対象から得られた任意の生物学的試料でありうる。好ましくは、当該試料は、分離された細胞培養物に由来するものであってもよく、あるいは尿試料である。当該試料は、哺乳動物でありうる対象から、既知の方法で得られうる。好ましくは、当該試料が得られる対象はヒトである。
【００２１】
本発明の方法は、いずれかの、エンテロバクター目、シュードモナス属、またはアシネトバクター属のカルバペネマーゼ産生性バクテリアを検出するために用いられうる。好ましくは、カルバペネマーゼ産生性バクテリアは、院内感染または市中感染の原因となる細菌などの、臨床的に重要な細菌である。
【００２２】
典型的には、本発明の方法で使用される基質である、（７Ｒ）−７−［（ｚ）−２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−（Ｚ）−２（メトキシイミノ）アセトアミド］−３−（２，４−ジニトロスチリル）−３−セフェム−４−カルボン酸またはその塩の濃度は、０．１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは１ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは２ｍｇ／ｍｌ〜３ｍｇ／ｍｌである。
【００２３】
いくつかの実施形態によると、（７Ｒ）−７−［（ｚ）−２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−（Ｚ）−２（メトキシイミノ）アセトアミド］−３−（２，４−ジニトロスチリル）−３−セフェム−４−カルボン酸またはその塩との反応より前に、カルバペネマーゼ産生性バクテリアを溶解させる。該バクテリアの溶解は、既知の技術によって行われうる。任意的に、エンテロバクター目、シュードモナス属、またはアシネトバクター属の菌種が、混合前に、微量遠心チューブまたはバイアル中で、タンパク質抽出バッファー／試薬に再懸濁されてもよい。十分に混合するために、適切な時間、ボルテックスすることにより混合が行われうる。好ましくは、約２〜約１０秒、例えば５秒間、当該試料をボルテックスすることにより混合が達成されうる。その後、チューブが、５〜３０分間、適切な温度でインキュベートされうる。任意的に、チューブは、約１０分間インキュベートされうる。好適な温度は、約２５℃〜約４５℃でありうる。好ましくは、チューブを約３５℃〜約３７℃でインキュベートされうる。
【００２４】
いくつかの実施形態において、試料の溶解は、ポリミキシン、グリコペプチドおよびポリペプチド抗生物質の組合せによって促進される。
【００２５】
溶解された試料でありうる当該試料の、（７Ｒ）−７−［（ｚ）−２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−（Ｚ）−２（メトキシイミノ）アセトアミド］−３−（２，４−ジニトロスチリル）−３−セフェム−４−カルボン酸またはその塩との反応は、色の変化を観察するのに十分な時間行われうる。好ましくは、色の変化は１時間未満で観測される。より好ましくは、色の変化は３０分未満で観察されてもよい。最も好ましくは、色の変化は約５〜約２０分で観察されうる。
【００２６】
当該試料の、（７Ｒ）−７−［（ｚ）−２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−（Ｚ）−２（メトキシイミノ）アセトアミド］−３−（２，４−ジニトロスチリル）−３−セフェム−４−カルボン酸またはその塩との反応は、適切な温度で行われうる。好ましくは、反応を約５℃〜約４０℃で行われうる。例えば、反応は、約１５℃〜約３０℃、例えば室温など、で行われうる。好ましくは、反応は、約２０℃〜約３７℃、最も好ましくは３５℃で行われうる。
【００２７】
また、発色性セファロスポリン（７Ｒ）−７−［（ｚ）−２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−（Ｚ）−２（メトキシイミノ）アセトアミド］−３−（２，４−ジニトロスチリル）−３−セフェム−４−カルボン酸またはその塩は、広域スペクトルベータ−ラクタマーゼ類（ＥＳＢＬ類）やＡｍｐＣ類による加水分解にも感受性である。しかしながら、ＥＳＢＬおよびＡｍｐＣ酵素の影響は、適切な阻害化合物の添加によって除かれうる。したがって、このような阻害剤が存在する場合、色の変化はカルバペネマーゼの存在を示す。
【００２８】
したがって、一実施形態では、本方法は、広域スペクトルβ−ラクタム（ＥＳＢＬ）阻害剤、ＡｍｐＣ阻害剤またはこれらの混合物をさらに含む。任意の適切な阻害剤が用いられうる。いくつかの好適な阻害剤には、クラブラン酸、クロキサシリンおよびこれらの混合物が含まれる。任意的に、当該阻害剤は、約３０μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌの濃度のクラブラン酸及び約３００μｇ／ｍｌ〜約５００μｇ／ｍｌの濃度のクロキサシリンのうちの少なくとも１つを含む。阻害剤がクラブラン酸及びクロキサシリンを含む場合、これらは等量部混合されて、阻害剤混合物としてもよい。あるいは、異なった量および／または別の成分が用いられうる。また、任意のカルバペネムまたはペネムが、単独で、またはＥＳＢＬ阻害剤及びＡｍｐＣ阻害剤の両方と組み合わせて使用されて、ＥＳＢＬとＡｍｐＣの活性をさらに除きうる。
【００２９】
広域スペクトルベータ−ラクタマーゼ類（ＥＳＢＬ類）やＡｍｐＣ類を阻害する阻害剤の選択は、カルバペネマーゼ発現のスペクトル全体を可視化できるようになる。
【００３０】
本発明の一実施形態では、（７Ｒ）−７−［（ｚ）−２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−（Ｚ）−２（メトキシイミノ）アセトアミド］−３−（２，４−ジニトロスチリル）−３−セフェム−４−カルボン酸またはその塩は、有機溶媒、有機酸および硫酸亜鉛の少なくとも１種を含む溶液に溶解されうる。任意的に、当該有機溶媒は極性非プロトン性溶媒でありうる。好適な溶媒はＤＭＳＯでありうる。当該有機酸は任意の好適な有機酸でありうる。好適な有機酸は、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸またはセバシン酸などの直鎖状飽和ジカルボン酸群からのものを含みうる。
【００３１】
当該試料の反応は、例えば、阻害剤混合物を混合すること、（７Ｒ）−７−［（ｚ）−２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−（Ｚ）−２（メトキシイミノ）アセトアミド］−３−（２，４−ジニトロスチリル）−３−セフェム−４−カルボン酸またはその塩を、有機溶媒、有機酸および硫酸亜鉛の少なくとも１種を含む溶液に溶解すること、試験するための、ある量のカルバペネマーゼ産生性のエンテロバクター目、シュードモナス属、またはアシネトバクター属を、ある量のタンパク質抽出試薬に懸濁すること、および／または、懸濁したカルバペネマーゼ産生性のエンテロバクター目、シュードモナス属、またはアシネトバクター属を加熱して生試料とすること、および溶解した試料を、（７Ｒ）−７−［（ｚ）−２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−（Ｚ）−２（メトキシイミノ）アセトアミド］−３−（２，４−ジニトロスチリル）−３−セフェム−４−カルボン酸（またはその塩）の溶液に、ある量の当該阻害剤混合物とともに加えること、の少なくともいくつかを含む逐次的なステップを利用して行われうることを理解されたい。
【００３２】
他の実施形態では、反応プロセスは、非逐次的な反応プロセスで行われてもよく、この工程では、（７Ｒ）−７−［（ｚ）−２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−（Ｚ）−２（メトキシイミノ）アセトアミド］−３−（２，４−ジニトロスチリル）−３−セフェム−４−カルボン酸またはその塩、有機溶媒、有機酸、硫酸亜鉛のうち３又はそれより多くが、カルバペネマーゼ産生性のエンテロバクター目、シュードモナス属、またはアシネトバクター属の試料に加えられ、反応プロセスと同時にｉｎ  ｓｉｔｕで溶解されうる。
【００３３】
例えば、非溶解試料が、（７Ｒ）−７−［（ｚ）−２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−（Ｚ）−２（メトキシイミノ）アセトアミド］−３−（２，４−ジニトロスチリル）−３−セフェム−４−カルボン酸またはその塩、有機溶媒および有機塩と反応されうる「ワンポット（one-pot）」合成技術を利用して、当該試料の反応が行われうる。任意的に、当該有機溶媒はＤＭＳＯであってよく、及び、当該有機酸は、コハク酸などの直鎖状飽和ジカルボン酸であってよい。
【００３４】
第２の態様において、本発明は、試料中の、カルバペネマーゼ産生性のエンテロバクター目、シュードモナス属、またはアシネトバクター属の存在を検出するための、（７Ｒ）−７−［（ｚ）−２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−（Ｚ）−２（メトキシイミノ）アセトアミド］−３−（２，４−ジニトロスチリル）−３−セフェム−４−カルボン酸またはその塩の使用を提供する。
【００３５】
（７Ｒ）−７−［（ｚ）−２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−（Ｚ）−２（メトキシイミノ）アセトアミド］−３−（２，４−ジニトロスチリル）−３−セフェム−４−カルボン酸またはその塩は、任意的に粉末状でありうる。（［（７Ｒ）−７−［（ｚ）−２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−（Ｚ）−２（メトキシイミノ）アセトアミド］−３−（２，４−ジニトロスチリル）−３−セフェム−４−カルボン酸またはその塩は、ＤＭＳＯ及びコハク酸の混合物に溶解されてよく、次に、硫酸亜鉛が加えられうる。例えば、（７Ｒ）−７−［（ｚ）−２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−（Ｚ）−２（メトキシイミノ）アセトアミド］−３−（２，４−ジニトロスチリル）−３−セフェム−４−カルボン酸またはその塩は、１部のＤＭＳＯと３〜２０部のコハク酸に溶解され、次に、硫酸亜鉛を最終濃度が０．１ｍＭ〜１０ｍＭになるように加えられてもよい。好ましくは、（７Ｒ）−７−［（ｚ）−２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−（Ｚ）−２（メトキシイミノ）アセトアミド］−３−（２，４−ジニトロスチリル）−３−セフェム−４−カルボン酸またはその塩は、１部のＤＭＳＯと５〜９部のコハク酸に溶解されてもよい。必要に応じて、（７Ｒ）−７−［（ｚ）−２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−（Ｚ）−２（メトキシイミノ）アセトアミド］−３−（２，４−ジニトロスチリル）−３−セフェム−４−カルボン酸またはその塩が、１部のＤＭＳＯと７部のコハク酸に溶解され、その次に、硫酸亜鉛を最終濃度が１ｍＭになるように加えられてもよい。
【００３６】
溶解された又は全体の細胞試料は、（７Ｒ）−７−［（ｚ）−２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−（Ｚ）−２（メトキシイミノ）アセトアミド］−３−（２，４−ジニトロスチリル）−３−セフェム−４−カルボン酸またはその塩の溶液に、約等量部で加えられてもよい。当該溶解されたまたは全体の細胞試料は、（７Ｒ）−７−［（ｚ）−２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−（Ｚ）−２（メトキシイミノ）アセトアミド］−３−（２，４−ジニトロスチリル）−３−セフェム−４−カルボン酸またはその塩の溶液に、室温で加えられてもよい。任意的に、約２０μｌ〜約１００μｌの当該溶解された試料と、（７Ｒ）−７−［（ｚ）−２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−（Ｚ）−２（メトキシイミノ）アセトアミド］−３−（２，４−ジニトロスチリル）−３−セフェム−４−カルボン酸またはその塩の溶液が用いられてもよい。
【００３７】
ある量の阻害剤が加えられてもよい。適切な阻害剤または阻害剤混合物が、２０μｌ〜約２００μｌの量で用いられてもよい。好ましくは、約５０μｌ〜約１５０μｌの阻害剤が用いられてもよい。任意的に、最終濃度が約４０μｇ／ｍｌおよび４００μｇ／ｍｌになるように調整したクラブラン酸とクロキサシリンを等量部で含む阻害剤の約１００μｌが加えられてもよい。
【００３８】
代替的には、異なった阻害剤または阻害剤混合物が、またはそれらの比で、同等な最終濃度で、加えられてもよい。
【００３９】
色の変化が起きるかどうかを判定するために、得られた溶液の内容物が、最大で１時間、好ましくは３０分まで観察されてよい。好ましくは、溶液を５〜３０分間観察される必要があるだけであってよい。
【００４０】
黄から橙／赤への色の変化が起こることは、カルバペネマーゼ産生性のエンテロバクター目、シュードモナス属、またはアシネトバクター属が当該試験試料中に存在することを示しうる。
【００４１】
カルバペネマーゼ産生性のエンテロバクター目、シュードモナス属、またはアシネトバクター属が試験試料中に存在するかどうかを試験するために、ある量のエンテロバクター目、シュードモナス属、またはアシネトバクター属の菌種が、タンパク質抽出バッファー／試薬に懸濁されうる。その後、溶液が混合され及びインキュベートされて、溶解された試料を生成しうる。当該溶解された試料の一部を、ある量の（７Ｒ）−７−［（ｚ）−２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−（Ｚ）−２（メトキシイミノ）アセトアミド］−３−（２，４−ジニトロスチリル）−３−セフェム−４−カルボン酸またはその塩と、任意的に当該阻害剤混合物に加えることができ、色の変化の観察により、試験が陽性であることを確認する。
【００４２】
エンテロバクター目、シュードモナス属、またはアシネトバクター属の菌種の使用量は、約０．１μｌ〜約１０μｌでありうる。例えば、約０．２μｌ、０．５μｌ、１μｌ、２μｌまたは５μｌが用いられうる。タンパク質抽出試薬の使用量は５０〜２５０μｌでありうる。例えば、約５０μｌ、７５μｌ、１００μｌ、１５０μｌが用いられてもよい。好ましくは、約１μｌのエンテロバクター目、シュードモナス属、またはアシネトバクター属の菌種と、約１００μｌのタンパク質抽出バッファー／試薬とが、用いられうる。任意の適切なタンパク質抽出バッファー／試薬が用いられうる。
【００４３】
混合は、例えば撹拌、振とう、およびボルテックス混合を含むがこれらに限定されない適切な手法を用いて達成されうる。例えば、溶液が、約１〜６０秒間、例えば約５秒間、ボルテックス混合されてもよい。混合は、インキュベーション前および／またはインキュベーション中に行って、溶解試料としてもよい。インキュベーションは、適切な温度で、適切な時間、行われうる。例えば、インキュベーションは、約３０〜４５℃、好ましくは約３５〜３７℃の温度で、約１〜約３０分間、好ましくは約１０分間、行われうる。
【００４４】
任意的に、試験は非溶解試料について行われてもよい。
【００４５】
当該溶解（または非溶解）試料の適切な一部が、適切な量の（７Ｒ）−７−［（ｚ）−２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−（Ｚ）−２（メトキシイミノ）アセトアミド］−３−（２，４−ジニトロスチリル）−３−セフェム−４−カルボン酸またはその塩の溶液に、任意的にある量の当該阻害剤混合物とともに加えられてもよい。任意的に、約１０μｌ〜約１００μｌ、例えば約５０μｌの溶解（または非溶解）試料が、約２０μ〜約１００μｌ、例えば約５０μｌの（７Ｒ）−７−［（ｚ）−２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−（Ｚ）−２（メトキシイミノ）アセトアミド］−３−（２，４−ジニトロスチリル）−３−セフェム−４−カルボン酸またはその塩の溶液に、任意的に、さらに約２０〜２００μｌ、例えば約１００μｌの当該阻害剤混合物とともに加えられてもよい。
【００４６】
好ましくは、試料と、（７Ｒ）−７−［（ｚ）−２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−（Ｚ）−２（メトキシイミノ）アセトアミド］−３−（２，４−ジニトロスチリル）−３−セフェム−４−カルボン酸またはその塩の溶液と、必要に応じて阻害剤混合物とが、室温で加えられてもよい。
【００４７】
第３態様において、本発明は、微生物がカルバペネム加水分解性β−ラクタマーゼを産生するかどうかを判定するためのキットを提供し、このキットは、（［（７Ｒ）−７−［（ｚ）−２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−（Ｚ）−２（メトキシイミノ）アセトアミド］−３−（２，４−ジニトロスチリル）−３−セフェム−４−カルボン酸）またはその塩を含浸させた分析ディスクと、広域スペクトルβ−ラクタム（ＥＳＢＬ）阻害剤、ＡｍｐＣ阻害剤またはこれらの混合物とを含みうる。
【００４８】
さらなる態様では、本発明は、カルバペネマーゼ産生性のエンテロバクター目、シュードモナス属、またはアシネトバクター属の存在を検出するためのマイクロ流体デバイスまたは電気化学センシングデバイスであって、（７Ｒ）−７−［（ｚ）−２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−（Ｚ）−２（メトキシイミノ）アセトアミド］−３−（２，４−ジニトロスチリル）−３−セフェム−４−カルボン酸またはその塩である基質を含むデバイスを提供する。
【００４９】
該マイクロ流体デバイスは、表現型的に読み取られうる結果を与える、任意のデバイスでありうる。例えば、該マイクロ流体デバイスはマイクロキャピラリーフィルムでありうる。
【００５０】
電気化学センシングデバイスは、（７Ｒ）−７−［（ｚ）−２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−（Ｚ）−２（メトキシイミノ）アセトアミド］−３−（２，４−ジニトロスチリル）−３−セフェム−４−カルボン酸またはその塩の加水分解に伴い生じるシグナルを与えるであろう任意のデバイスでありうる。例えば、電気化学センシングデバイスは、電極、チップ、キット、またはイオン的に帯電した膜でありうる。
【００５１】
試薬キットとの溶解試料の反応は、カルバペネマーゼ産生性のエンテロバクター目、シュードモナス属、またはアシネトバクター属が当該試験試料中に存在した場合の、（７Ｒ）−７−［（ｚ）−２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−（Ｚ）−２（メトキシイミノ）アセトアミド］−３−（２，４−ジニトロスチリル）−３−セフェム−４−カルボン酸またはその塩の溶液中での色の変化を観察するのに十分な時間、行われうる。典型的には、色の変化は、当該試料を緩衝剤／試薬と混合してから、１時間未満、より好ましくは３０分未満で観察される。典型的には、試薬キットとの当該試料の反応は、５℃〜４０℃、好ましくは１５℃〜３０℃の温度、より好ましくは室温で行われる。
【００５２】
本試薬キットは、本発明の方法に従い、カルバペネマーゼ産生性のエンテロバクター科、シュードモナス属、またはアシネトバクター属のバクテリアへの感染を、高い信頼性と精度で同定する極めて迅速な方法を提供するために用いられうる。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】シュードモナス菌種の表現型の結果を示す図である。
【図２】アシネトバクター  バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｉｉ）の表現型の結果を示す図である。
【図３】本発明の方法および標準的技術を用いた、シュードモナスおよびアシネトバクター菌種の比較試験を示す図である。
【図４】カルバペネマーゼ産生性腸内細菌を検出するための、表現型の結果を示す図である。
【００５４】
本発明を、以下と実施例を参照しながら、さらに説明する。
【実施例１】
【００５５】
阻害剤混合物及び（［（７Ｒ）−７−［（ｚ）−２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−（Ｚ）−２（メトキシイミノ）アセトアミド］−３−（２，４−ジニトロスチリル）−３−セフェム−４−カルボン酸を含む試験溶液が調製され、そして、これを用いて、表１および２に詳述するとおり、多数の試験試料中のカルバペネマーゼ産生性シュードモナスまたはアシネトバクターの存在を調べた。
【００５６】
試験溶液は以下のように調製された。
【００５７】
１）クラブラン酸とクロキサシリンが、最終濃度が４０μｇ／ｍｌと４００μｇ／ｍｌになるように調製され、等量部で混合されて、当該阻害剤混合物を得た。
【００５８】
２）粉末状の（７Ｒ）−７−［（ｚ）−２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−（Ｚ）−２（メトキシイミノ）アセトアミド］−３−（２，４−ジニトロスチリル）−３−セフェム−４−カルボン酸またはその塩が、１部のＤＭＳＯと７部のジカルボン酸に溶解され、その後、硫酸亜鉛を最終濃度１ｍＭになるように加えた。
【００５９】
３）１μｌの白金耳量のシュードモナス属またはアシネトバクター属の菌種が、１００μｌの市販入手可能なタンパク質抽出バッファー／試薬、または、５０ｍＭトリスＨＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、および１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００を含む１００μｌの抽出緩衝剤に、微量遠心チューブ内で懸濁された。
【００６０】
４）懸濁したシュードモナス属またはアシネトバクター属菌種が、５秒間ボルテックスにより混合され、その後、マイクロチューブ内の当該試料を３５℃〜３７℃に加温し、１０分間インキュベートして、溶解試料を得た。
【００６１】
５）５０μｌの当該溶解試料を、９６マイクロタイタープレートのウェル内の５０μｌの（７Ｒ）−７−［（ｚ）−２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−（Ｚ）−２（メトキシイミノ）アセトアミド］−３−（２，４−ジニトロスチリル）−３−セフェム−４−カルボン酸またはその塩の溶液及び１００μｌの当該阻害剤混合物に、室温で加えられた。
【００６２】
６）細胞溶解物を添加しながら、ウェルの内容物がピペッティングによって混合された。
【００６３】
７）当該試料が３０分まで視覚的に観察され、（［（７Ｒ）−７−［（ｚ）−２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−（Ｚ）−２（メトキシイミノ）アセトアミド］−３−（２，４−ジニトロスチリル）−３−セフェム−４−カルボン酸またはその塩の溶液と当該試料を混合してから、５、１０、２０および３０分で、溶液の色が記録された。
【００６４】
【表１】
2020529850.tif 000003
【００６５】
表１に示されるとおり、（７Ｒ）−７−［（Ｚ）−２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−（Ｚ）−２（メトキシイミノ）アセトアミド］−３−（２，４−ジニトロスチリル）−３−セフェム−４−カルボン酸またはその塩は、９種すべてのカルバペネマーゼ産生性シュードモナス菌種を成功裏に検出した。本発明の方法の感度は１００％であり、特異性も同じであった。
【００６６】
シュードモナス菌種それぞれの表現型の結果を図１に示す。
【００６７】
これらの試験は、本発明の方法が、シュードモナス属菌種におけるＮＤＭ−１、ＩＭＰおよびＶＩＭの検出に極めて感度が高いことを示す。さらに、（７Ｒ）−７−［（ｚ）−２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−（Ｚ）−２（メトキシイミノ）アセトアミド］−３−（２，４−ジニトロスチリル）−３−セフェム−４−カルボン酸またはその塩の溶液の黄色は、室温で溶解細菌試料を添加後、５分以内に、赤色に顕著に変化することが示される。より長時間経過すると、より強い赤色が発色しうるが、５分後の色の変化は陽性反応を示すのに十分である。
【００６８】
【表２】
2020529850.tif 000004
【００６９】
表２に示されるとおり、（７Ｒ）−７−［（Ｚ）−２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−（Ｚ）−２（メトキシイミノ）アセトアミド］−３−（２，４−ジニトロスチリル）−３−セフェム−４−カルボン酸またはその塩は、５種すべてのカルバペネマーゼ産生性アシネトバクター  バウマニを成功裏に検出した。本発明の方法の感度は１００％であり、特異性も同じであった。
【００７０】
アシネトバクター  バウマニそれぞれの、対応する表現型の結果が図２に示されている。
【００７１】
これらの試験は、本発明の方法が、アシネトバクター菌種におけるＯＸＡの検出に極めて感度が高いことを示す。さらに、（７Ｒ）−７−［（ｚ）−２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−（Ｚ）−２（メトキシイミノ）アセトアミド］−３−（２，４−ジニトロスチリル）−３−セフェム−４−カルボン酸またはその塩の溶液の黄色は、室温で溶解細菌試料を添加後、５分以内に、赤色に顕著に変化する。より長時間経過すると、より強い赤色が発色しうるが、５分後の色の変化は陽性反応を示すのに十分である。
【実施例２】
【００７２】
試験溶液が実施例１の方法にしたがって調製され、これを用いて５種のシュードモナス分離菌の試験を行った。このうち４種の分離菌はカルバペネム類に耐性があり、１種はカルバペネマーゼ非産生体であった。４種のカルバペネマーゼ産生性シュードモナス分離菌のうち、２種はＮＤＭ−１であり、残りの２種はＶＩＭであった。６種のアシネトバクター分離菌も試験された。そのうち５種の分離菌はカルバペネム類に耐性があり、１種はカルバペネマーゼ非産生体であった。５種すべてのカルバペネマーゼ産生性アシネトバクター分離菌はＯＸＡであった。
【００７３】
また、当業者に既知の、カルバペネム類への感受性が低下した菌株を検出するための市販の測色試験を用いて、各シュードモナスおよびアシネトバクター分離菌の対応する試験を行った。標準手順にしたがって、測色に基づく比較試験を３５℃〜３７℃で行う一方、本発明の方法による試験を室温で行った。
【００７４】
これらの試験結果を表３に示し、観察された色の変化を図３に示す。
【００７５】
試験には、カルバペネマーゼ陰性緑膿菌とアシネトバクター  イオフィイ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｉｗｏｆｆｉ）分離菌からなる、陰性対照のシュードモナスおよびアシネトバクター分離菌が含まれた。残りのすべての分離菌はカルバペネマーゼ産生体であった。
【００７６】
【表３】
2020529850.tif 000005
【００７７】
表３に示されるとおり、（７Ｒ）−７−［（ｚ）−２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−（Ｚ）−２（メトキシイミノ）アセトアミド］−３−（２，４−ジニトロスチリル）−３−セフェム−４−カルボン酸またはその塩と、市販のｐＨ依存診断法との比較において試験された１１種の生物のうち、（７Ｒ）−７−［（ｚ）−２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−（Ｚ）−２（メトキシイミノ）アセトアミド］−３−（２，４−ジニトロスチリル）−３−セフェム−４−カルボン酸またはその塩は、カルバペネマーゼ産生性シュードモナスおよびアシネトバクター分離菌の９種すべてを成功裏に検出したが、標準的技術を用いた試験は、１種のアシネトバクター分離菌においてカルバペネマーゼ産生を検出しなかった（表中で強調されている）。標準法試験で誤認された偽陰性は、ＯＸＡ−２７であった。
【００７８】
したがって、標準法の特異性は１００％であるが、感度は８９％しかなかった一方、本発明の方法は、感度も特異性も１００％であることが示される。したがって本発明の方法は、当該試験試料中のカルバペネマーゼ産生性シュードモナスまたはアシネトバクターの存在を検知するための、既知の技術と比べて改善された感度を有する、迅速な方法を提供する。
【実施例３】
【００７９】
２種の試験溶液を実施例１の方法にしたがって調製した。一方の溶液は実施例１に記載したとおりであり、他方の溶液は、（７Ｒ）−７−［（ｚ）−２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−（Ｚ）−２（メトキシイミノ）アセトアミド］−３−（２，４−ジニトロスチリル）−３−セフェム−４−カルボン酸またはその塩の代わりに、発色性セファロスポリンＨＭＲＺ−８６を使用した。
【００８０】
次に、両試験溶液が、６８種のシュードモナス分離菌を試験するために用いられた。そのうち８種の分離菌はカルバペネムに耐性があり、６０種はカルバペネマーゼ非生産体であった。８種のカルバペネマーゼ産生性シュードモナス分離菌のうち、４種はＮＤＭ−１であり、２種はＶＩＭであり、残りの２種はＩＭＰであった。
【００８１】
ＨＭＲＺ−８６または（７Ｒ）−７−［（ｚ）−２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−（Ｚ）−２（メトキシイミノ）アセトアミド］−３−（２，４−ジニトロスチリル）−３−セフェム−４−カルボン酸のいずれかを用いた両試験溶液が、本発明の方法にしたがって行った（室温で行った）。試験結果が表４に示されている。
【００８２】
【表４−１】
2020529850.tif 000006
【表４−２】
2020529850.tif 000007
【表４−３】
2020529850.tif 000008
【表４−４】
2020529850.tif 000009
【表４−５】
2020529850.tif 000010
【表４−６】
2020529850.tif 000011
【００８３】
表４に示すように、（７Ｒ）−７−［（ｚ）−２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−（Ｚ）−２（メトキシイミノ）アセトアミド］−３−（２，４−ジニトロスチリル）−３−セフェム−４−カルボン酸と、ＨＭＲＺとの比較において試験された８種のカルバペネマーゼ産生性シュードモナス生物のうち、（７Ｒ）−７−［（ｚ）−２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−（Ｚ）−２（メトキシイミノ）アセトアミド］−３−（２，４−ジニトロスチリル）−３−セフェム−４−カルボン酸は、８種すべてのカルバペネマーゼ産生性シュードモナス分離菌を成功裏に検出したが、（７Ｒ）−７−［（ｚ）−２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−（Ｚ）−２（メトキシイミノ）アセトアミド］−３−（２，４−ジニトロスチリル）−３−セフェム−４−カルボン酸の代わりにＨＭＲＺ−８６を用いた試験は、２種のＮＤＭ−１産生性分離菌を検出しなかった（表４中で強調されている）。
【００８４】
したがって、本発明の技術は、感度も特異性も１００％であるが、ＨＭＲＺ−８６を用いた候補色原体性基質は、７５％の感度であることがわかる。したがって、（７Ｒ）−７−［（ｚ）−２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−（Ｚ）−２（メトキシイミノ）アセトアミド］−３−（２，４−ジニトロスチリル）−３−セフェム−４−カルボン酸を用いた本発明の方法は、試験試料中のカルバペネマーゼ産生性シュードモナスまたはアシネトバクターの迅速な検出のための、より高い感度を有する。
【実施例４】
【００８５】
（［（７Ｒ）−７−［（ｚ）−２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−（Ｚ）−２（メトキシイミノ）アセトアミド］−３−（２，４−ジニトロスチリル）−３−セフェム−４−カルボン酸、阻害剤混合物、硫酸亜鉛および増量剤を含むジカルボン酸緩衝試験溶液が調製され、表５に示されるように、１４７種の試験分離菌中の、カルバペネマーゼ産生性のエンテロバクター目、シュードモナス属、またはアシネトバクター属の存在を検出するために用いられた。
【００８６】
試験溶液を以下のように調製した。
【００８７】
１）粉末状の（７Ｒ）−７−［（ｚ）−２−（２−アミノチアゾール−４−イル）−（Ｚ）−２（メトキシイミノ）アセトアミド］−３−（２，４−ジニトロスチリル）−３−セフェム−４−カルボン酸が、１部のＤＭＳＯと７部のジカルボン酸に溶解された。
【００８８】
２）その後、ジカルボン酸を、試験溶液１部とジカルボン酸４部の比でさらに加えることにより、上記ステップ１の溶液を緩衝化した。
【００８９】
３）クラブラン酸とクロキサシリンを最終濃度が４０μｇ／ｍｌと４００μｇ／ｍｌになるように調製し、等量部混合して、当該阻害剤混合物とした。
【００９０】
４）硫酸亜鉛とＰＥＧ８０００を、それぞれ最終濃度１ｍＭと０．５％になるように、当該阻害剤混合物に加えた。
【００９１】
５）２ｍＭのポリミキシンと、４ｍＭのグリコペプチドと、１．５ｍＭのポリペプチド抗生物質とを含む混合物も、当該阻害剤混合物を含む溶液に溶解した。
【００９２】
６）次に、当該阻害剤混合物、硫酸亜鉛、ＰＥＧ８０００および上記ステップ５に記載の抗生物質混合物を含む２．８ｍｌ容量の溶液を、７２時間凍結乾燥し、ペレットとした。
【００９３】
その後、カルバペネマーゼの存在の検出を以下の手順で行った。
【００９４】
（ａ）上記ステップ２の試験溶液を３．５ｍｌ加えることにより、ペレットを元に戻す。
【００９５】
（ｂ）ペレットを室温で１分間で完全に溶解させ、内容物を１０秒間穏やかにボルテックスすることにより混合する。
【００９６】
（ｃ）元に戻した溶液は黄色である。もし溶液が他の色を呈すれば、使用しない。
【００９７】
（ｄ）元に戻した溶液５００μｌを微量遠心チューブに分注する。試験ごとに１本のチューブ。
【００９８】
（ｅ）純粋で新鮮な試験生物の培養物を用いて、１μｌの白金耳量の細菌を微量遠心チューブに加え、１０秒間ボルテックスによりよく混合する。
【００９９】
（ｆ）３５〜３７℃で１０分間インキュベートし、試験溶液の色を記録する。
【０１００】
【表５】
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【０１０１】
１１０種の腸内細菌が試験された。そのうち７２種の分離菌はカルバペネマーゼ産生体であり、３８種は非カルバペネマーゼ産生体であった。試験した分離菌のうち、５７種はクレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）菌種［１２種のＥＳＢＬ、５種のＡｍｐＣ、１０種のＯＸＡ、１３種のＫＰＣおよび１７種のＭβＬ（６種のＮＤＭ、６種のＩＭＰおよび５種のＶＩＭ）］、２４種は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）［８種のＥＳＢＬ、５種のＡｍｐＣ、５種のＯＸＡ、１種のＫＰＣおよび５種のＭβＬ（２種のＶＩＭ、２種のＮＤＭおよび１種のＩＭＰ）］、２３種はエンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）菌種［６種のＥＳＢＬ、１０種のＡｍｐＣ、２種のＯＸＡ、４種のＭβＬ（２種のＶＩＭ、２種のＮＤＭおよび１種のＫＰＣ）］であり、３種のシトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）菌種［すべてＮＤＭ］、１種のクルビエラ（Ｋｌｕｖｙｅｒａ）菌種［ＮＤＭ産生菌］、２種のサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）分離菌を試験した。サルモネラはいずれもＡｍｐＣ産生菌であった［非カルバペネマーゼ］。
【０１０２】
２３種のシュードモナス分離菌が試験された。そのうち８種の分離菌は、２種のＮＤＭ、２種のＩＭＰおよび４種のＶＩＭを含むＭβＬカルバペネマーゼ産生性菌であった。１５種のシュードモナス分離菌は、カルバペネマーゼ非産生菌であった［そのうち１４種は酵素が介するメカニズムを有さず、１種の分離菌はＡｍｐＣ産生菌であった］。
【０１０３】
１４種のアシネトバクター分離菌が試験された。そのうち１３種の分離菌はカルバペネマーゼ産生性菌であり、１種はカルバペネマーゼ非産生菌であった。カルバペネマーゼ産生性菌のうち、１２種はオキサシリナーゼ産生分離菌であった［４種のＯＸＡ−２３、１種のＯＸＡ−２５、１種のＯＸＡ−２６、１種のＯＸＡ−２７、１種のＯＸＡ−５８、ならびに２種のＯＸＡ２３＋ＯＸＡ−５１、１種のＯＸＡ−２３＋ＯＸＡ−２７＋ＯＸＡ−５１および１種のＯＸＡ−９５＋ＡｍｐＣなどの共産生菌］。カルバペネマーゼ産生性アシネトバクター分離菌のうち１種は、ＭβＬ産生菌であった。
【０１０４】
表５に示されるとおり、試験された全１４７種の分離菌のうち、本発明の方法は、カルバペネマーゼ産生性のエンテロバクター目、シュードモナス属、およびアシネトバクター属の分離菌８３種のうち、８１種を検出した。これは、広域のグラム陰性菌に対する９７．５９％の合計感度と１００％の特異性に相当する。一方、市販のキットは、緑膿菌への使用が適切ではないとされており（Ｈｅｎｒｉｃｈｓら、２０１５年）、また発色性ＨＭＲＺ−８６を採用していると考えられる競合する他の主なキットは、カルバペネマーゼ産生性腸内細菌の検出に、６４．９％の感度と９０％の特異性しか示さなかった（Ｍａｎｃｉｎｉら、２０１７年）。したがって、現在のところ、本発明は、シュードモナスおよびアシネトバクター分離菌への使用に適切であるだけでなく、腸内細菌目にも拡張できる、極めて高感度で高特異的な、唯一の迅速な測色カルバペネマーゼ検出方法である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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