(57)【要約】  本発明は、脳標的ペプチド及び生理活性物質を含む脳標的持続型結合体に関するもので、血液脳関門を通過して、持続性かつ安定性が改善された生理活性物質を含む持続型結合体及びその製造方法に関する。本発明の脳標的ペプチド及び生理活性物質を含む脳標的持続型結合体は、血液脳関門を通過して脳疾患に関連する疾患の治療が可能であり、また、生理活性物質の活性が生体内で維持されて血中半減期が増加される脳標的ペプチド及び生理活性物質を含む脳標的持続型結合体を提供する。
2020501611.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で表される脳標的持続型結合体：
Ｘ−Ｌ1−Ｆ−Ｌ2−Ｙ  （１）
ここで、
Ｘが、生理活性物質であり、
Ｙが、脳標的ペプチドであり、
Ｌ1及びＬ2が、ペプチド性または非ペプチド性リンカーであり、
Ｌ1及びＬ2がペプチド性リンカーである時、前記ペプチド性リンカーが、０〜１０００個のアミノ酸を含み、
Ｆが、ＦｃＲｎ結合部位を含む免疫グロブリン不変領域である。
【請求項２】
前記持続型結合体が、血液脳関門を通過して、脳組織内に生理活性物質が伝達されることを特徴とする、請求項１に記載の脳標的持続型結合体。
【請求項３】
前記脳標的ペプチドが、血液脳関門を通過可能なアミノ酸配列を有する、ペプチド、タンパク質、または抗体を含むものである、請求項１に記載の脳標的持続型結合体。
【請求項４】
前記脳標的ペプチドが、受動輸送（passive transport）による経路または受容体媒介輸送（receptor-mediated transport）による経路を介して血液脳関門を通過するものである、請求項３に記載の脳標的持続型結合体。
【請求項５】
前記生理活性物質が、トキシン；またはＧＬＰ−１（Glucagon like peptide-1）受容体アゴニスト；グルカゴン受容体アゴニスト； ＧＩＰ（Gastric inhibitory polypeptide）受容体アゴニスト；ＦＧＦ（Fibroblast growth factor）受容体アゴニスト；コレシストキニン（Cholecystokinin）受容体アゴニスト；ガストリン（gastrin）受容体アゴニスト；メラノコルチン（melanocortin）受容体アゴニスト；ヒト成長ホルモン；成長ホルモン放出ホルモン；成長ホルモン放出ペプチド；インターフェロン；インターフェロン受容体；コロニー刺激因子；インターロイキン；インターロイキン受容体；酵素；インターロイキン結合タンパク質；サイトカイン結合タンパク質；マクロファージ活性因子；マクロファージペプチド；Ｂ細胞因子；Ｔ細胞因子；タンパク質Ａ；アレルギー抑制因子；細胞壊死糖タンパク質；免疫毒素；リンホトキシン；腫瘍壊死因子；腫瘍抑制因子；転移成長因子；α−１アンチトリプシン；アルブミン；α−ラクトアルブミン（alpha-lactalbumin）；アポリポタンパク質Ｅ；赤血球生成因子；高糖鎖化赤血球生成因子；アンジオポエチン（angiopoietin）；ヘモグロビン；トロンビン（thrombin）；トロンビン受容体活性ペプチド；トロンボモジュリン（thrombomodulin）；血液因子ＶＩＩ；血液因子ＶＩＩａ；血液因子ＶＩＩＩ；血液因子ＩＸ；血液因子ＸＩＩＩ；プラスミノーゲン活性因子；フィブリン結合ペプチド；ウロキナーゼ；ストレプトキナーゼ；ヒルディン（hirudin）；タンパク質Ｃ；Ｃ反応性タンパク質；レニン抑制剤；コラゲナーゼ抑制剤；スーパーオキシドジスムターゼ；レプチン；血小板由来成長因子；上皮細胞成長因子；表皮細胞成長因子；アンジオスタチン（angiostatin）；アンジオテンシン（angiotensin）；骨形成成長因子；骨形成促進タンパク質；カルシトニン；インスリン；アトリオペプチン；軟骨誘導因子；エルカトニン（elcatonin）；結合組織活性因子；組織因子経路インヒビター（tissue factor pathway inhibitor）；卵胞刺激ホルモン；黄体形成ホルモン；黄体形成ホルモン放出ホルモン；神経成長因子類；アキソジェネシス因子−１（axogenesis factor-1）；脳性ナトリウム利尿ペプチド（brain-natriuretic peptide）；グリア細胞由来神経栄養因子（glial derived neurotrophic factor）；ネトリン（netrin）；好中球抑制因子（neurophil inhibitor factor）；神経栄養因子；ニュールツリン（neuturin）；副甲状腺ホルモン；リラキシン；セクレチン；ソマトメジン；インスリン様成長因子；副腎皮質ホルモン；グルカゴン；コレシストキニン；膵臓ポリペプチド；ガストリン放出ペプチド；コルチコトロピン放出因子；甲状腺刺激ホルモン；オートタキシン（autotaxin）；ラクトフェリン（lactoferrin）；ミオスタチン（myostatin）； ＡＤＮＰ（activity-dependent neuroprotective protein）、ＢＡＣＥ１（beta-secretase1）、ＡＰＰ（Amyloid Precursor Protein）、ＮＣＡＭ（Neural cell adhesion molecule）、アミロイドβ（Amyloid beta）、タウ（Tau）、ＲＡＧＥ（receptor for advanced glycation endproducts ）、α−シヌクレイン（alpha-synuclein）、またはこれらのアゴニストまたはアンタゴニスト；受容体類、受容体アゴニスト；細胞表面抗原；モノクローナル抗体；ポリクローナル抗体；抗体断片；ウイルス由来ワクチン抗原；１つ以上の受容体アゴニストを活性化させるハイブリッドポリペプチドまたはキメラ（chimeric）ポリペプチド；及びこれらのアナログを含む群からなる群から選択された生理活性物質である、請求項１に記載の脳標的持続型結合体。
【請求項６】
前記トキシンが、メイタンシン（Maytansine）またはその誘導体、オーリスタチン（Auristatin）またはその誘導体、デュオカルマイシン（Duocarmycin）またはその誘導体、及びＰＢＤ（Pyrrolobenzodiazepine）またはその誘導体からなる群から選択され、ＧＬＰ−１（Glucagon like peptide-1）受容体アゴニストが、天然型エキセンジン−３または天然型エキセンジン−４、及びこれらのアナログからなる群から選択されたものであり、ＦＧＦ受容体アゴニストが、ＦＧＦ１またはそのアナログ、ＦＧＦ１９またはそのアナログ、ＦＧＦ２１またはそのアナログ、及びＦＧＦ２３またはそのアナログからなる群から選択され、
インターフェロンが、インターフェロンα、インターフェロンβ及びインターフェロンγからなる群から選択され、
インターフェロン受容体が、インターフェロンα受容体、インターフェロンβ受容体、インターフェロンγ受容体、及び水溶性タイプＩインターフェロン受容体からなる群から選択され、
インターロイキンが、インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイキン−６、インターロイキン−７、インターロイキン−８、インターロイキン−９、インターロイキン−１０、インターロイキン−１１、インターロイキン−１２、インターロイキン−１３、インターロイキン−１４、インターロイキン−１５、インターロイキン−１６、インターロイキン−１７、インターロイキン−１８、インターロイキン−１９、インターロイキン−２０、インターロイキン−２１、インターロイキン−２２、インターロイキン−２３、インターロイキン−２４、インターロイキン−２５、インターロイキン−２６、インターロイキン−２７、インターロイキン−２８、インターロイキン−２９、及びインターロイキン−３０からなる群から選択され、
インターロイキン受容体が、インターロイキン−１受容体またはインターロイキン−４受容体であり、
酵素が、β−グルコシダーゼ（beta-glucosidase）、α−ガラクトシダーゼ（alpha-galactosidase）、β−ガラクトシダーゼ（beta-galactosidase）、イズロニダーゼ（iduronidase）、イズロン酸−２−スルファターゼ（iduronate-2-sulfatase）、ガラクトース−6−スルファターゼ（Galactose-6-sulfatase）、酸性α−グルコシダーゼ（acid alpha-glucosidase）、酸性セラミダーゼ（acid ceramidase）、酸性スフィンゴミエリナーゼ（acid sphingomyelinsase）、ガラクトセレブロシダーゼ（galactocerebrosidsase）、アリールスルファターゼ（arylsulfatase）Ａ、アリールスルファターゼＢ、β−ヘキソサミニダーゼ（beta-hexosaminidase）Ａ、β−ヘキソサミニダーゼＢ、ヘパリンＮ−スルファターゼ（heparin N-sulfatase）、α−Ｄ−マンノシダーゼ（alpha-D-mannosidase）、β−グルクロニダーゼ（beta-glucuronidase）、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６スルファターゼ（N-acetylgalactosamine-6 sulfatase）、リソソーム酸性リパーゼ（lysosomal acid lipase）、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（alpha-N-acetyl-glucosaminidase）、グルコセレブロシダーゼ（glucocerebrosidase）、ブチリルコリンエステラーゼ（butyrylcholinesterase）、キチナーゼ（Chitinase）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（glutamate decarboxylase）、イミグルセラーゼ（imiglucerase）、リパーゼ（lipase）、ウリカーゼ（Uricase）、血小板活性因子アセチルヒドロラーゼ（Platelet-Activating Factor Acetylhydrolase）、中性エンドペプチダーゼ（neutral endopeptidase）、ミエロペルオキシダーゼ（myeloperoxidase）、α−ガラクトシダーゼＡ、アガルシダーゼα（agalsidase alpha）、アガルシダーゼβ、α−Ｌ−イズロニダーゼ（alpha-L-iduronidase）、ブチリルコリンエステラーゼ（butyrylcholinesterase）、キチナーゼ（chitinase）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（glutamate decarboxylase）、及びイミグルセラーゼ（imiglucerase）からなる群から選択され、
インターロイキン結合タンパク質が、ＩＬ−１８ｂｐであり、
サイトカイン結合タンパク質が、ＴＮＦ（Tumor necrosis factor）結合タンパク質であり、
神経成長因子類が、神経成長因子、毛様体神経栄養因子（cilliary neurotrophic factor）、アキソジェネシス因子−１（axogenesis factor-1）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（brain-natriuretic peptide）、グリア細胞由来神経栄養因子（glial derived neurotrophic factor）、ネトリン（netrin）、好中球抑制因子（neurophil inhibitor factor）、神経栄養因子、及びニュールツリン（neuturin）からなる群から選択され、
ミオスタチン受容体が、ＴＮＦＲ（Ｐ７５）、ＴＮＦＲ（Ｐ５５）、ＩＬ−１受容体、ＶＥＧＦ受容体、及びＢ細胞活性因子受容体からなる群から選択され、
ミオスタチン受容体アンタゴニストが、ＩＬ１−Ｒａであり、
細胞表面抗原が、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４５、及びＣＤ６９からなる群から選択され、
抗体断片類が、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2及びＦｄからなる群から選択される、請求項５に記載の脳標的持続型結合体。
【請求項７】
前記ＧＬＰ−１受容体アゴニストが、天然型エキセンジン−４、天然型エキセンジン−４のＮ末端アミン基が除去されたエキセンジン−４、天然型エキセンジン−４のＮ末端アミン基がヒドロキシル基に置換されたエキセンジン−４、天然型エキセンジン−４のＮ末端アミン基がジメチル基に修飾されたエキセンジン−４、天然型エキセンジン−４のＮ末端アミン基がカルボキシル基に置換されたエキセンジン−４、天然型エキセンジン−４の一番目のアミノ酸（ヒスチジン）のα炭素が除去されたエキセンジン−４；及び前記エキセンジン−４の１２番目のアミノ酸（リジン）がセリンに置換されたエキセンジン−４及び前記エキセンジン−４の１２番目のアミノ酸（リジン）がアルギニンに置換されたエキセンジン−４からなる群から選択される、請求項６に記載の脳標的持続型結合体。
【請求項８】
前記受容体媒介輸送による経路が、インスリン受容体（insulin receptor）、トランスフェリン受容体（transferrin receptor）、低密度リポタンパク質受容体（low density lipoprotein receptor）、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質（Low density lipoprotein receptor‐related protein）、レプチン受容体（leptin receptor）、ニコチン性アセチルコリン受容体（nicotinic acetylcholine receptor）、グルタチオン輸送体（Glutathione transporter）、カルシウム依存性カリウムチャネル（calcium-activated potassium channel）、及びＲＡＧＥ（receptor for advanced glycation endproducts）、及び前記受容体のリガンド及び前記受容体またはリガンドに結合する抗体からなる群から選択されたいずれか一つを介して受容体媒介輸送の経路によって血液脳関門を通過する、請求項４に記載の脳標的持続型結合体。
【請求項９】
前記Ｌ1が、ＦのＮ末端の領域に連結されて、Ｌ2が、ＦのＣ末端の領域に連結されたものである、請求項１に記載の脳標的持続型結合体。
【請求項１０】
前記式（１）のＦ−Ｌ2−Ｙが、
下記式（２）で表される構造である、請求項１に記載の脳標的持続型結合体：
2020501611.tif 000032
（２）
ここで、
Ｆa及びＦbが、それぞれのヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む免疫グロブリンＦｃ領域を含む一本のポリペプチド鎖であって、Ｆa及びＦbが、ヒンジ領域でジスルフィド結合で互いに連結されて、これにより前記結合体が、Ｆｃ切片を含み、Ｆaが、Ｌ1と共有結合で連結され、
それぞれのＢＴＰa1、......、ＢＴＰanが、互いに同じか異なる脳標的ペプチドであり、
それぞれのＢＴＰb1、......、ＢＴＰbn’が、互いに同じか異なる脳標的ペプチドであり、
それぞれのＬ2a1、......、Ｌ2anが、互いに同じか異なるペプチド性リンカーであり、
それぞれのＬ2b1、......、Ｌ2bn’が、互いに同じか異なるペプチド性リンカーであり、
この時、ｎ及びｎ’が、それぞれ独立して自然数である。
【請求項１１】
前記Ｌ1が、ＦaのＮ末端に連結されたものであり、Ｌ2a1及びＬ2b1が、それぞれＦa及びＦbのＣ末端に連結されたものである、請求項１０に記載の脳標的持続型結合体。
【請求項１２】
ｎ＝ｎ’であって、それぞれＬ2a1＝Ｌ2b1、......、Ｌ2an＝Ｌ2bn’とＢＴＰa1＝ ＢＴＰb1、......、 ＢＴＰan＝ ＢＴＰbn’の条件を満足する、請求項１１に記載の脳標的持続型結合体。
【請求項１３】
前記Ｌ1が、ＸのＮ末端アミン基、リジンの側鎖に位置するアミン基、またはシステインの側鎖に位置する−ＳＨ基（チオール基）に連結されたものである、請求項１０に記載の脳標的持続型結合体。
【請求項１４】
前記生理活性物質であるＸが、２個〜１０００個のアミノ酸からなるポリペプチドである、請求項１０に記載の脳標的持続型結合体。
【請求項１５】
前記ｎ及びｎ’が、１〜５である、請求項１０に記載の脳標的持続型結合体。
【請求項１６】
前記Ｌ1が、０．５〜１００ｋＤａのサイズである非ペプチド性リンカーである、請求項１０に記載の脳標的持続型結合体。
【請求項１７】
前記非ペプチド性リンカーが、ポリエチレングリコールである、請求項１６に記載の脳標的持続型結合体。
【請求項１８】
前記Ｌ2が、ペプチド性リンカーであって、（ＧＳ）ｍ、（ＧＧＳ）ｍ、（ＧＧＧＳ）ｍ、または（ＧＧＧＧＳ）ｍであり、ｍが、１〜１０である、請求項１に記載の脳標的持続型結合体。
【請求項１９】
前記Ｌ1及びＬ2のいずれかが、ペプチド性リンカーであって、もう一つが、非ペプチド性リンカーである、請求項１に記載の脳標的持続型結合体。
【請求項２０】
前記Ｌ1が非ペプチド性リンカーであり、Ｌ2がペプチド性リンカーである時、ペプチド性リンカーが、０〜１０００個のアミノ酸を含むものである、請求項１に記載の脳標的持続型結合体。
【請求項２１】
前記Ｌ1及びＬ2のいずれかまたは両方が非ペプチド性リンカーである時、非ペプチド性リンカーが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール−プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、多糖類、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸、脂肪酸、高分子重合体、低分子化合物、ヌクレオチド及びこれらの組み合わせからなる群から選択されたものである、請求項１または１０に記載の脳標的持続型結合体。
【請求項２２】
前記Ｌ1及びＬ2のいずれかまたは両方がペプチド性リンカーである時、前記ＸとＦ、またはＦとＹが、共有化学結合、非共有化学結合、またはこれらの組み合わせでＬ1及びＬ2によって互いに結合され、Ｌ1及びＬ2が、０〜１０００個のアミノ酸を含むものである、請求項１に記載の脳標的持続型結合体。
【請求項２３】
Ｌ1及びＬ2のいずれかまたは両方がペプチド性リンカーである時、Ｌ1及びＬ2が、０個のアミノ酸からなるものであって、
（ｉ）ＸとＦ、またはＦとＹが、ペプチド結合によって結合されたものであり；または
（ｉｉ）ＸとＦ、及びＦとＹが、ペプチド結合によって結合されたものである、請求項１に記載の脳標的持続型結合体。
【請求項２４】
Ｌ1及びＬ2のいずれかはペプチド性リンカーであり、このうち他の一つは非ペプチド性リンカーである時、
ペプチド性リンカーが、０〜１０００個のアミノ酸を含むリンカーであり、
非ペプチド性リンカーが、ポリエチレングリコールである、請求項１に記載の脳標的持続型結合体。
【請求項２５】
Ｆが、免疫グロブリンＦｃ領域を含むものである、請求項１に記載の脳標的持続型結合体。
【請求項２６】
前記免疫グロブリンＦｃ領域が、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４ドメインからなる群から選択された１つ〜４つのドメインを含む、請求項２５に記載の脳標的持続型結合体。
【請求項２７】
前記免疫グロブリンＦｃ領域が、ヒンジ領域をさらに含むものである、請求項２５に記載の脳標的持続型結合体。
【請求項２８】
前記免疫グロブリンＦｃ領域が、ＩｇＧのＦｃ領域である、請求項２５または１０に記載の脳標的持続型結合体。
【請求項２９】
前記免疫グロブリンＦｃ領域が、ＩｇＧ４ Ｆｃ領域である、請求項２８に記載の脳標的持続型結合体。
【請求項３０】
前記免疫グロブリンＦｃ領域が、ヒト配列の非糖鎖化ＩｇＧ４ Ｆｃ領域である、請求項２９に記載の脳標的持続型結合体。
【請求項３１】
Ｌ1によってＸのＮ末端及びＦのＮ末端が連結されたものであり、Ｌ2によってＹのＮ末端及びＦのＣ末端が連結されたものである、請求項１に記載の脳標的持続型結合体。
【請求項３２】
Ｌ1の一末端が、Ｘのリジン残基またはシステイン残基に、Ｌ1の他の末端が、ＦのＮ末端に連結されたものであり、
Ｌ2によってＹのＮ末端及びＦのＣ末端が連結されたものである、請求項１に記載の脳標的持続型結合体。
【請求項３３】
下記段階を含む、請求項１に記載の脳標的持続型結合体を製造する方法：
（ｉ）（ａ）生理活性物質であるＸ、ペプチド性または非ペプチド性リンカーであるＬ1、及び免疫グロブリンＦｃ領域を含むＦが結合された、Ｘ−Ｌ1−Ｆ、及び（ｂ）脳標的ペプチドであるＹ 、ペプチド性または非ペプチド性リンカーであるＬ2が結合されたＬ2−Ｙを製造する段階；及び
（ｉｉ）前記（ａ）Ｘ−Ｌ1−Ｆ及び（ｂ）Ｌ2−Ｙを連結する段階。
【請求項３４】
下記段階を含む、請求項１に記載の脳標的持続型結合体を製造する方法：
（ｉ）（ａ）生理活性物質であるＸ、及びペプチド性または非ペプチド性リンカーであるＬ1が結合された、Ｘ−Ｌ1及び（ｂ）脳標的ペプチドであるＹ、ペプチド性または非ペプチド性リンカーであるＬ2、及び免疫グロブリンＦｃ領域を含むＦが結合されたＦ−Ｌ2−Ｙを製造する段階；及び
（ｉｉ）前記（ａ）Ｘ−Ｌ1及び（ｂ）Ｆ−Ｌ2−Ｙを連結する段階。
【請求項３５】
下記段階を含む、請求項１に記載の脳標的持続型結合体を製造する方法：
（ｉ）脳標的ペプチドであるＹ、ペプチド性または非ペプチド性リンカーであるＬ2、及び免疫グロブリンＦｃ領域を含むＦが結合されたＦ−Ｌ2−Ｙを製造する段階；及び
（ｉｉ）前記Ｆ−Ｌ2−ＹとＸとをペプチド性または非ペプチド性リンカーであるＬ1で連結する段階。
【請求項３６】
（ａ）のＬ1が、ペプチド性リンカーであり、（ｂ）のＬ2が、非ペプチド性リンカーである、請求項３３〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
（ａ）のＬ1が、非ペプチド性リンカーであり、（ｂ）のＬ2が、ペプチド性リンカーである、請求項３３〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記Ｌ1が、両末端官能基を有する非ペプチド性重合体であって、前記両末端官能基が、それぞれアミン反応基（amine‐reactive group）またはチオール反応基（thiol‐reactive group）であり、前記両末端官能基が、互いに同じ種類であるか、異なる種類である、請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
非ペプチド性リンカー及びＸ及びＹが、それぞれの官能基によって連結され、この時、非ペプチド性リンカーの官能基がアルデヒド基、マレイミド（maleimide）基及びスクシンイミド誘導体（succinimide derivative）からなる群から選択されるものである、請求項３３〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
配列番号２、４、６、８、１０、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８及び４０で表されるアミノ酸配列の中で選択されるいずれか一つのアミノ酸配列からなる、脳標的ペプチド。
【請求項４１】
請求項４０に記載の脳標的ペプチドをコードする、分離されたポリヌクレオチド。
【請求項４２】
請求項４１に記載のポリヌクレオチドを含む、組換え発現ベクター。
【請求項４３】
請求項４２に記載の組換え発現ベクターを含む、形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脳標的可能な持続型タンパク質結合体及びその製造方法に関する。また、本発明は、新規な脳標的ペプチド及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
脳への効果的な治療薬剤伝達の必要性が台頭しているが、脳に対する新たな薬剤の開発は他の身体に比べてはるかに遅い速度で進行されている。これらの遅い進行は、ほとんどの薬剤が血液脳関門（blood-brain barrier、ＢＢＢ）を形成する脳毛細血管壁（brain capillary wall）を介して脳内に浸透できない状況に相当部分が起因する。血液脳関門（blood-brain barrier、ＢＢＢ）とは、脳血管の内皮細胞間のタイトジャンクション（tight junction）及びこれをさらに強化する星状細胞（astrocyte）からなる構造物であって、血管内部の物質が血管壁を通過して脳実質内に簡単に出ないようにする機能をする。このような理由で、脳疾患治療剤として開発された多くの薬が血液脳関門の通過がよく行われないという問題点がある。ほぼ１００％の巨大分子の薬剤及び９８％以上の小型分子の薬剤は、ＢＢＢを通過できない。ごく一部の薬剤、高脂質溶解性及び４００〜５００ダルトン（dalton）以下の分子量を有する小型分子のみがＢＢＢを実際に通過する。また、ＢＢＢを通過する小型分子の中で、ごく一部だけが薬学的に有意な量でＢＢＢを通過する。
【０００３】
少数の脳疾患、例えば、うつ病、情動障害、慢性疼痛、てんかんだけがＢＢＢを通過する小型分子の薬剤に反応する。はるかに多くの脳疾患、例えば、アルツハイマー病、脳卒中／神経保護、脳や脊髄損傷、脳腫瘍、脳のＨＩＶ感染、様々な運動失調症誘発障害（ataxia-producing disorder）、筋萎縮性側索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis、ＡＬＳ）、ハンチントン病（Huntington disease）、脳に影響を与える幼年期先天性遺伝子エラー（childhood inborn genetic error）、パーキンソン病（Parkinson's disease）、多発性硬化症（multiple sclerosis）は、通常の脂質溶解性の小型分子量の薬剤に反応しない。
【０００４】
現在、血液脳関門を通過して薬物などを伝達できる伝達体（carrier）に対する開発が活発に進められている。一方、特定のアミノ酸配列を有するペプチドは、血液脳関門を通過し、薬物やｓｉＲＮＡなどを伝達する機能を有すると言われているが、まだ特定構造体のサイズが大きい生理活性物質の伝達可能性があるかについての研究は、不備の状態である（非特許文献１）。また、効果的な小型分子の薬剤が存在するごく少数の脳疾患に対しても新しく向上された薬剤に関する開発と研究がさらに必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際特許公開第ＷＯ９７／３４６３１号、
【特許文献２】国際特許公開第ＷＯ９６／３２４７８号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Kumar et al., Nature. 2007, 448:39-43
【非特許文献２】J. Pept. Res., 2005, 65, 550-555 (J.Spengler et al.)
【非特許文献３】H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の一つの目的は、血液脳関門を通過して、生理活性の効力を維持し、生理活性物質の半減期を延長させうる生体適合性物質が含まれた、脳標的持続型結合体を提供することにある。
【０００８】
本発明のもう一つの目的は、生理活性物質を、免疫グロブリンＦｃ領域が融合された脳標的ペプチドの免疫グロブリンＦｃ領域と相互結合によって結合された、脳標的持続型結合体を提供することにある。
【０００９】
本発明のもう一つの目的は、脳標的ペプチドと生理活性物質とを含む持続型結合体である、下記の式（１）で表される脳標的持続型結合体を提供することにある。  Ｘ−Ｌ1−Ｆ−Ｌ2−Ｙ  （１）
ここで、
Ｘは、生理活性物質であり、
Ｙは、脳標的ペプチドであり、
Ｌ1及びＬ2は、ペプチド性または非ペプチド性リンカーであり、
Ｌ1及びＬ2がペプチド性リンカーである時、前記ペプチド性リンカーは、０〜１０００個のアミノ酸を含み、
Ｆは、ＦｃＲｎ結合部位を含む免疫グロブリン不変領域である。
【００１０】
本発明のもう一つの目的は、前記免疫グロブリンＦｃ領域が融合または非ペプチド性リンカーによって連結された脳標的ペプチドまたは生理活性物質をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、前記ベクターを含む形質転換体、前記ポリヌクレオチド、ベクター、形質転換体を一つ以上含むキットを提供することにある。
【００１１】
本発明のもう一つの目的は、免疫グロブリンＦｃ領域と融合された脳標的ペプチド結合体がコードされた後に化学結合され、免疫グロブリンＦｃ領域と融合された脳標的ペプチド結合体の免疫グロブリンＦｃ領域が生理活性物質と相互結合によって結合された脳標的持続型結合体を提供することにある。
【００１２】
本発明のもう一つの目的は、免疫グロブリンＦｃ領域と融合された脳標的ペプチド結合体がコードされた後に化学結合され、免疫グロブリンＦｃ領域と融合された脳標的ペプチド結合体の免疫グロブリンＦｃ領域が生理活性物質と相互結合によって結合された脳標的持続結合体を製造する方法を提供することにある。
【００１３】
本発明のもう一つの目的は、前記式（１）を有する脳標的持続型結合体を製造する方法を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、前記脳標的持続型結合体を含む組成物を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、薬剤の製造において、前記脳標的持続型結合体の用途を提供することにある。
【００１４】
本発明のもう一つの目的は、新規な脳標的ペプチドを提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、前記脳標的ペプチドをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、前記ベクターを含む形質転換体、または前記ポリヌクレオチド、ベクター、及び形質転換体を一つ以上含むキットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明を具現するための一つの様態は、血液脳関門を通過する、生理活性効力を維持し、生理活性物質の半減期を延長させうる生体適合性物質が含まれた、脳標的持続型結合体、またはその製造方法を提供する。
【００１６】
本発明を具現するためのより具体的な様態は、下記式（１）で表される脳標的持続型結合体を提供する：
Ｘ−Ｌ1−Ｆ−Ｌ2−Ｙ  （１）
ここで、
Ｘは、生理活性物質であり、
Ｙは、脳標的ペプチドであり、
Ｌ1及びＬ2は、ペプチド性または非ペプチド性リンカーであり、
Ｌ1及びＬ2がペプチド性リンカーである時、前記ペプチド性リンカーは、０〜１０００個のアミノ酸を含み、
Ｆは、ＦｃＲｎ結合部位を含む免疫グロブリン不変領域である。
【００１７】
一つの具体例において、前記Ｆは二量体の形態であってもよい。
前記具体例に係る前記脳標的持続型結合体において、前記持続型結合体は血液脳関門を通過して、脳組織の内に生理活性物質が伝達されることを特徴とする。
前記具体例に係る前記脳標的持続型結合体において、前記脳標的ペプチドは血液脳関門を通過できるアミノ酸配列を有する、ペプチド、タンパク質、または抗体を含むことを特徴とする。
【００１８】
前記具体例のいずれかに係る前記脳標的持続型結合体において、前記脳標的ペプチドは受動輸送（passive transport）による経路または受容体媒介輸送（receptor-mediated transport）による経路を介して血液脳関門を通過することを特徴としてもよいが、これに制限されるものではない。その例として、血液脳関門を通過できるペプチド、タンパク質または抗体が挙げられ、特にその種類とサイズに制限されない。
【００１９】
前記具体例のいずれかに係る前記脳標的持続型結合体において、前記「アミノ酸」は、任意の自然発生または非天然発生または合成アミノ酸の残基を含むアミノ酸の一部分（moiety）、つまり、１つ、２つ、３つまたはそれ以上の炭素原子、典型的には、１つの（α）炭素原子によって直接連結された少なくとも１つのカルボキシル残基と少なくとも１つのアミノ残基とを含む、任意の一部分を意味する。
前記具体例のいずれかに係る前記脳標的持続型結合体において、前記脳標的ペプチドは、受容体媒介輸送による経路を介して血液脳関門を通過することを特徴とする。
【００２０】
前記具体例のいずれかに係る前記脳標的持続型結合体において、前記受容体媒介輸送（receptor-mediated transport）による経路は、インスリン受容体（insulin receptor）、トランスフェリン受容体（transferrin receptor）、低密度リポタンパク質受容体（low density lipoprotein receptor）、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質（Low density lipoprotein receptor‐related protein）、レプチン受容体（leptin receptor）、ニコチン性アセチルコリン受容体（nicotinic acetylcholine receptor）、グルタチオン輸送体（Glutathione transporter）、カルシウム依存性カリウムチャネル（calcium-activated potassium channel）、及びＲＡＧＥ（receptor for advanced glycation endproducts）、及び前記受容体のリガンド及び前記受容体またはリガンドに結合する抗体からなる群から選択されたいずれか一つを介して受容体媒介輸送の経路によって血液脳関門を通過することを特徴とするが、これに制限されない。前記脳標的ペプチドは、このような経路を介して血液脳関門を通過するペプチド、タンパク質、または抗体からなる群から選択されるか、前記ペプチド、タンパク質、または抗体から分離された一部のペプチド配列であってもよいが、これに制限されない。
【００２１】
前記具体例のいずれかに係る前記脳標的持続型結合体において、前記生理活性物質はトキシン；またはＧＬＰ−１（Glucagon like peptide-1）受容体アゴニスト；グルカゴン受容体アゴニスト； ＧＩＰ（Gastric inhibitory polypeptide）受容体アゴニスト；ＦＧＦ（Fibroblast growth factor）受容体アゴニスト；コレシストキニン（Cholecystokinin）受容体アゴニスト；ガストリン（gastrin）受容体アゴニスト；メラノコルチン（melanocortin）受容体アゴニスト；ヒト成長ホルモン；成長ホルモン放出ホルモン；成長ホルモン放出ペプチド；インターフェロン；インターフェロン受容体；コロニー刺激因子（顆粒球コロニー刺激因子）；インターロイキン；インターロイキン受容体；酵素；インターロイキン結合タンパク質；サイトカイン結合タンパク質；マクロファージ活性因子；マクロファージペプチド；Ｂ細胞因子；Ｔ細胞因子；タンパク質Ａ；アレルギー抑制因子；細胞壊死糖タンパク質；免疫毒素；リンホトキシン；腫瘍壊死因子；腫瘍抑制因子；転移成長因子；α−１アンチトリプシン；アルブミン；α−ラクトアルブミン（alpha-lactalbumin）；アポリポタンパク質Ｅ；赤血球生成因子；高糖鎖化赤血球生成因子；アンジオポエチン（angiopoietin）；ヘモグロビン；トロンビン（thrombin）；トロンビン受容体活性ペプチド；トロンボモジュリン（thrombomodulin）；血液因子ＶＩＩ；血液因子ＶＩＩａ；血液因子ＶＩＩＩ；血液因子ＩＸ；血液因子ＸＩＩＩ；プラスミノーゲン活性因子；フィブリン結合ペプチド；ウロキナーゼ；ストレプトキナーゼ；ヒルディン（hirudin）；タンパク質Ｃ；Ｃ反応性タンパク質；レニン抑制剤；コラゲナーゼ抑制剤；スーパーオキシドジスムターゼ；レプチン；血小板由来成長因子；上皮細胞成長因子；表皮細胞成長因子；アンジオスタチン（angiostatin）；アンジオテンシン（angiotensin）；骨形成成長因子；骨形成促進タンパク質；カルシトニン；インスリン；アトリオペプチン；軟骨誘導因子；エルカトニン（elcatonin）；結合組織活性因子；組織因子経路インヒビター（tissue factor pathway inhibitor）；卵胞刺激ホルモン；黄体形成ホルモン；黄体形成ホルモン放出ホルモン；神経成長因子類；アキソジェネシス因子−１（axogenesis factor-1）；脳性ナトリウム利尿ペプチド（brain-natriuretic peptide）；グリア細胞由来神経栄養因子（glial derived neurotrophic factor）；ネトリン（netrin）；好中球抑制因子（neurophil inhibitor factor）；神経栄養因子；ニュールツリン（neuturin）；副甲状腺ホルモン；リラキシン；セクレチン；ソマトメジン；インスリン様成長因子；副腎皮質ホルモン；グルカゴン；コレシストキニン；膵臓ポリペプチド；ガストリン放出ペプチド；コルチコトロピン放出因子；甲状腺刺激ホルモン；オートタキシン（autotaxin）；ラクトフェリン（lactoferrin）；ミオスタチン（myostatin）； ＡＤＮＰ（activity-dependent neuroprotective protein）、ＢＡＣＥ１（beta-secretase1）、ＡＰＰ（Amyloid Precursor Protein）、ＮＣＡＭ（Neural cell adhesion molecule）、アミロイドβ（Amyloid beta）、タウ（Tau）、ＲＡＧＥ（receptor for advanced glycation endproducts ）、α−シヌクレイン（alpha-synuclein）、またはこれらのアゴニストまたはアンタゴニスト；受容体類、受容体アゴニスト；細胞表面抗原；モノクローナル抗体；ポリクローナル抗体；抗体断片；ウイルス由来ワクチン抗原���１つ以上の受容体アゴニストを活性化させるハイブリッドポリペプチドまたはキメラ（chimeric）ポリペプチド；及びこれらのアナログを含む群からなる群から選択された生理活性物質であることを特徴とする。
【００２２】
前記具体例のいずれかに係る前記脳標的持続型結合体において、
前記トキシンは、メイタンシン（Maytansine）またはその誘導体、オーリスタチン（Auristatin）またはその誘導体、デュオカルマイシン（Duocarmycin）またはその誘導体、及びＰＢＤ（Pyrrolobenzodiazepine）またはその誘導体からなる群から選択され、
ＧＬＰ−１（Glucagon like peptide-1）受容体アゴニストは、天然型エキセンジン−３または天然型エキセンジン−４、及びこれらのアナログからなる群から選択されたものであり、
ＦＧＦ受容体アゴニストは、ＦＧＦ１またはそのアナログ、ＦＧＦ１９またはそのアナログ、ＦＧＦ２１またはそのアナログ、及びＦＧＦ２３またはそのアナログからなる群から選択され、
インターフェロンは、インターフェロンα、インターフェロンβ及びインターフェロンγからなる群から選択され、
インターフェロン受容体は、インターフェロンα受容体、インターフェロンβ受容体、インターフェロンγ受容体、及び水溶性タイプＩインターフェロン受容体からなる群から選択され、
インターロイキンは、インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイキン−６、インターロイキン−７、インターロイキン−８、インターロイキン−９、インターロイキン−１０、インターロイキン−１１、インターロイキン−１２、インターロイキン−１３、インターロイキン−１４、インターロイキン−１５、インターロイキン−１６、インターロイキン−１７、インターロイキン−１８、インターロイキン−１９、インターロイキン−２０、インターロイキン−２１、インターロイキン−２２、インターロイキン−２３、インターロイキン−２４、インターロイキン−２５、インターロイキン−２６、インターロイキン−２７、インターロイキン−２８、インターロイキン−２９、及びインターロイキン−３０からなる群から選択され、
インターロイキン受容体は、インターロイキン−１受容体またはインターロイキン−４受容体であり、
酵素は、β−グルコシダーゼ（beta-glucosidase）、α−ガラクトシダーゼ（alpha-galactosidase）、β−ガラクトシダーゼ（beta-galactosidase）、イズロニダーゼ（iduronidase）、イズロン酸−２−スルファターゼ（iduronate-2-sulfatase）、ガラクトース−６−スルファターゼ（Galactose-6-sulfatase）、酸性α−グルコシダーゼ（acid alpha-glucosidase）、酸性セラミダーゼ（acid ceramidase）、酸性スフィンゴミエリナーゼ（acid sphingomyelinsase）、ガラクトセレブロシダーゼ（galactocerebrosidsase）、アリールスルファターゼ（arylsulfatase）Ａ、アリールスルファターゼＢ、β−ヘキソサミニダーゼ（beta-hexosaminidase）Ａ、β−ヘキソサミニダーゼＢ、ヘパリンＮ−スルファターゼ（heparin N-sulfatase）、α−Ｄ−マンノシダーゼ（alpha-D-mannosidase）、β−グルクロニダーゼ（beta-glucuronidase）、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６スルファターゼ（N-acetylgalactosamine-6 sulfatase）、リソソーム酸性リパーゼ（lysosomal acid lipase）、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（alpha-N-acetyl-glucosaminidase）、グルコセレブロシダーゼ（glucocerebrosidase）、ブチリルコリンエステラーゼ（butyrylcholinesterase）、キチナーゼ（Chitinase）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（glutamate decarboxylase）、イミグルセラーゼ（imiglucerase）、リパーゼ（lipase）、ウリカーゼ（Uricase）、血小板活性因子アセチルヒドロラーゼ（Platelet-Activating Factor Acetylhydrolase）、中性エンドペプチダーゼ（neutral endopeptidase）、ミエロペルオキシダーゼ（myeloperoxidase）、α−ガラクトシダーゼＡ、アガルシダーゼα（agalsidase alpha）、アガルシダーゼβ、α−Ｌ−イズロニダーゼ（alpha-L-iduronidase）、ブチリルコリンエステラーゼ（butyrylcholinesterase）、キチナーゼ（chitinase）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（glutamate decarboxylase）、及びイミグルセラーゼ（imiglucerase）からなる群から選択され、
インターロイキン結合タンパク質は、ＩＬ−１８ｂｐであり、
サイトカイン結合タンパク質は、ＴＮＦ（Tumor necrosis factor）結合タンパク質であり、
神経成長因子類は、神経成長因子、毛様体神経栄養因子（cilliary neurotrophic factor）、アキソジェネシス因子−１（axogenesis factor-1）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（brain-natriuretic peptide）、グリア細胞由来神経栄養因子（glial derived neurotrophic factor）、ネトリン（netrin）、好中球抑制因子（neurophil inhibitor factor）、神経栄養因子、及びニュールツリン（neuturin）からなる群から選択され、
ミオスタチン受容体は、ＴＮＦＲ（Ｐ７５）、ＴＮＦＲ（Ｐ５５）、ＩＬ−１受容体、ＶＥＧＦ受容体、及びＢ細胞活性因子受容体からなる群から選択され、
ミオスタチン受容体アンタゴニストは、ＩＬ１−Ｒａであり、
細胞表面抗原は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４５、及びＣＤ６９からなる群から選択され、
抗体断片類は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2及びＦｄからなる群から選択されることを特徴とする。
【００２３】
前記具体例のいずれかに係る前記脳標的持続型結合体において、前記ＧＬＰ−１受容体アゴニストは、 天然型エキセンジン−４、天然型エキセンジン−４のＮ末端アミン基が除去されたエキセンジン−４、天然型エキセンジン−４のＮ末端アミン基がヒドロキシル基に置換されたエキセンジン−４、天然型エキセンジン−４のＮ末端アミン基がジメチル基に修飾されたエキセンジン−４、天然型エキセンジン−４のＮ末端アミン基がカルボキシル基に置換されたエキセンジン−４、天然型エキセンジン−４の一番目のアミノ酸（ヒスチジン）のα炭素が除去されたエキセンジン−４；及び前記エキセンジン−４の１２番目のアミノ酸（リジン）がセリンに置換されたエキセンジン−４及びエキセンジン−４の１２番目のアミノ酸（リジン）がアルギニンに置換されたエキセンジン−４からなる群から選択されることを特徴とする。
前記具体例のいずれかに係る前記脳標的持続型結合体において、前記Ｌ1はＦのＮ末端領域に連結され、Ｌ2はＦのＣ末端領域に連結されることを特徴とする。
【００２４】
前記具体例のいずれかに係る前記脳標的持続型結合体において、前記式（１）のＦ−Ｌ2−Ｙは、下記式（２）で表される構造である、脳標的持続型結合体であることを特徴とする：
2020501611.tif 000003
ここで、Ｆa及びＦbは、それぞれのヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む免疫グロブリンＦｃ領域を含む一本のポリペプチド鎖であって、Ｆa及びＦbは、ヒンジ領域でジスルフィド結合で互いに連結されてＦｃ切片を含み、Ｆaは、Ｌ1と共有結合で連結され、それぞれのＢＴＰa1、......、ＢＴＰanは、互いに同じか異なる脳標的ペプチドであり、それぞれのＢＴＰb1、......、ＢＴＰbn’は、互いに同じか異なる脳標的ペプチドであり、
それぞれのＬ2a1、......、Ｌ2anは、互いに同じか異なるペプチド性リンカーであり、それぞれのＬ2b1、......、Ｌ2bn’は、互いに同じか異なるペプチド性リンカーであり、
この時、ｎ及びｎ’は、それぞれ独立して自然数である。
【００２５】
前記具体例のいずれかに係る前記脳標的持続型結合体において、前記Ｌ1は、ＦaのＮ末端に連結されたものであり、Ｌ2a1及びＬ2b1は、それぞれＦa及びＦbのＣ末端に連結されたことを特徴とする。
前記具体例のいずれかに係る前記脳標的持続型結合体において、ｎ＝ｎ 'であって、それぞれＬ2a1＝Ｌ2b1、......、Ｌ2an＝Ｌ2bn’とＢＴＰa1＝ ＢＴＰb1、......、 ＢＴＰan＝ ＢＴＰbn’の条件を満足することを特徴とする。
【００２６】
前記具体例のいずれかに係る前記脳標的持続型結合体において、前記Ｆは、Ｆa 及びＦbであり、Ｌ2−Ｙは（Ｌ2a−Ｙ）ｎ及び（Ｌ2b−Ｙ）ｎ’であって、前記脳標的持続型結合体は、下記式（３）で表されるものである、脳標的持続型結合体であることを特徴とする：
2020501611.tif 000004
ここで、前記Ｘは生理活性物質であり、
Ｌ1は、ペプチド性リンカーまたは非ペプチド性リンカーであり、
Ｆa及びＦbは、それぞれヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む免疫グロブリンＦｃ領域であって、Ｆa及びＦbはヒンジ領域に位置するシステイン残基の間のジスルフィド結合で互いに共有結合で連結されたものであり、
Ｙa及びＹbは、脳標的ペプチドであって、それぞれ互いに同じ種類または異なる種類の脳標的ペプチドであり、
Ｌ2a及びＬ2bそれぞれはペプチド性リンカーであって、前記Ｌ2a及びＬ2bは、互いに同じ種類または異なる種類であり、
ｎ及びｎ’は、それぞれ独立して１以上の自然数である。
【００２７】
前記具体例のいずれかに係る前記脳標的持続型結合体において、前記Ｌ1は、Ｆａ のＮ末端領域に連結されたものであり、Ｌ2a及びＬ2bは、それぞれＦa及びＦbのＣ末端領域に連結されたことを特徴とする。
前記具体例のいずれかに係る前記脳標的持続型結合体において、前記Ｌ1は、Ｘのアミン基またはチオール基に連結されたことを特徴とする。
【００２８】
前記具体例のいずれかに係る前記脳標的持続型結合体において、前記Ｌ1は、ＸのＮ末端アミン基、リジンの側鎖に位置するアミン基、またはシステインの側鎖に位置する−ＳＨ基（チオール基）に連結されたことを特徴とする。
前記具体例のいずれかに係る前記脳標的持続型結合体において、前記生理活性物質であるＸは、２個〜１０００個のアミノ酸からなるポリペプチドであることを特徴とする。
【００２９】
前記具体例のいずれかに係る前記脳標的持続型結合体において、前記ｎ及びｎ’は、１〜５であることを特徴とする。
前記具体例のいずれかに係る前記脳標的持続型結合体において、前記Ｌ1は、０．５〜１００ｋＤａのサイズである非ペプチド性リンカーであることを特徴とする。
【００３０】
前記具体例のいずれかに係る前記脳標的持続型結合体において、前記非ペプチド性リンカーは、ポリエチレングリコールであることを特徴とする。
前記具体例のいずれかに係る前記脳標的持続型結合体において、前記Ｌ2は、ペプチド性リンカーであって、（ＧＳ）ｍ、（ＧＧＳ）ｍ、（ＧＧＧＳ）ｍ、または（ＧＧＧＧＳ）ｍであり、ｍは、１〜１０であることを特徴とする。
【００３１】
前記具体例のいずれかに係る前記脳標的持続型結合体において、前記式（１）の前記Ｌ1及びＬ2のいずれかは、ペプチド性リンカーであり、もう一つは、非ペプチド性リンカーであることを特徴とする。
前記具体例のいずれかに係る前記脳標的持続型結合体において、前記式（１）の前記Ｌ1は非ペプチド性リンカーであり、Ｌ2はペプチド性リンカーである時、ペプチド性リンカーは、０〜１０００個のアミノ酸を含むことを特徴とする。
【００３２】
前記具体例のいずれかに係る前記脳標的持続型結合体において、前記式（１）の脳標的持続型結合体は、Ｌ1によってＸのＮ末端及びＦのＮ末端が連結されたものであり、Ｌ2によってＹのＮ末端及びＦのＣ末端が連結されたことを特徴とする。
前記具体例のいずれかによる前記持続型結合体において、前記式（１）の脳標的持続型結合体は、Ｌ1の一末端は、Ｘのリジン残基またはシステイン残基などに、Ｌ1の他の末端は、ＦのＮ末端に連結されたものであり、Ｌ2によってＹのＮ末端及びＦのＣ末端が連結されたことを特徴とする。
【００３３】
前記具体例のいずれかに係る前記脳標的持続型結合体において、前記式（１）の前記Ｌ1及びＬ2のいずれかまたは両方が非ペプチド性リンカーである時、非ペプチド性リンカーは、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール−プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、多糖類、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸、脂肪酸、高分子重合体、低分子化合物、ヌクレオチド及びこれらの組み合わせからなる群から選択されたことを特徴とする。
【００３４】
前記具体例のいずれかに係る前記脳標的持続型結合体において、前記式（１）の 前記Ｌ1及びＬ2のいずれかまたは両方がペプチド性リンカーである時、前記ＸとＦ、またはＦとＹは、共有化学結合、非共有化学結合、またはこれらの組み合わせでＬ1及びＬ2によって互いに結合され、Ｌ1及びＬ2が、０〜１０００個のアミノ酸を含むことを特徴とする。ペプチド性リンカーが０個のアミノ酸である場合は、共有化学結合であるペプチド結合によって結合されたことを特徴とする。
【００３５】
前記具体例のいずれかに係る前記脳標的持続型結合体において、前記式（１）のＬ1及びＬ2のいずれかまたは両方がペプチド性リンカーである時、Ｌ1及びＬ2は、０個のアミノ酸からなるものであって、（ｉ）ＸとＦ、またはＦとＹは、ペプチド結合によって結合されたものであり；または（ｉｉ）ＸとＦ、及びＦとＹは、ペプチド結合によって結合されたものである、脳標的持続型結合体を特徴とする。
【００３６】
前記具体例のいずれかに係る前記脳標的持続型結合体において、前記式（１）のＬ1及びＬ2のいずれかはペプチド性リンカーであり、このうち他の一つは非ペプチド性リンカーである時、ペプチド性リンカーは、０〜１０００個のアミノ酸を含むリンカーであり、非ペプチド性リンカーは、ポリエチレングリコールであることを特徴とする。
【００３７】
前記具体例のいずれかに係る前記脳標的持続型結合体において、前記式（１）のＦは、免疫グロブリンＦｃ領域を含むことを特徴とする。
前記具体例のいずれかに係る前記脳標的持続型結合体において、前記免疫グロブリンＦｃ領域がＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４ドメインからなる群から選択される１つ 〜４つのドメインを含むことを特徴とする。
【００３８】
前記具体例のいずれかに係る前記脳標的持続型結合体において、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒンジ領域をさらに含むことを特徴とする。
前記具体例のいずれかに係る前記脳標的持続型結合体において、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧのＦｃ領域であることを特徴とする。
【００３９】
前記具体例のいずれかに係る前記脳標的持続型結合体において、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、前記免疫グロブリン不変領域はＩｇＧ１またはＩｇＧ４由来であることを特徴とする。
前記具体例のいずれかに係る前記脳標的持続型結合体において、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ４ Ｆｃ領域であることを特徴とする。
【００４０】
前記具体例のいずれかに係る前記脳標的持続型結合体において、前記免疫グロブリンＦｃ領域がヒト配列の非糖鎖化ＩｇＧ４ Ｆｃ領域であることを特徴とする。
本発明はもう一つの様態として、前記式（１）の脳標的持続結合体を製造する方法を提供する。
【００４１】
一つの具体例として、前記製造方法は、（ｉ）（ａ）生理活性物質であるＸ、ペプチド性または非ペプチド性リンカーであるＬ1、及び免疫グロブリンＦｃ領域を含むＦが結合された、Ｘ−Ｌ1−Ｆ 、及び（ｂ）脳標的ペプチドであるＹ、ペプチド性または非ペプチド性リンカーであるＬ2が結合されたＬ2−Ｙを製造する段階； 及び（ｉｉ）前記（ａ）Ｘ−Ｌ1−Ｆ、（ｂ）Ｌ2−Ｙを連結する段階を含むことを特徴とする。
もう一つの具体例として、前記（ａ）のＬ1は、ペプチド性リンカーであり、（ｂ）のＬ2は、非ペプチド性リンカーであることを特徴とする。
【００４２】
もう一つの具体例として、前記製造方法は、（ｉ）（ａ）生理活性物質であるＸ、及びペプチド性または非ペプチド性リンカーであるＬ1が結合された、Ｘ−Ｌ1及び（ｂ）脳標的ペプチドであるＹ、ペプチド性または非ペプチド性リンカーであるＬ2、及び免疫グロブリンＦｃ領域を含むＦが結合されたＦ−Ｌ2−Ｙを製造する段階； 及び（ｉｉ）前記（ａ）Ｘ−Ｌ1及び（ｂ）Ｆ−Ｌ２−Ｙを連結する段階を含むことを特徴とする。
もう一つの具体例として、前記（ａ）のＬ1は、非ペプチド性リンカーであり、（ｂ）のＬ2は、ペプチド性リンカーであることを特徴とする。
【００４３】
もう一つの具体例として、前記製造方法は、（ｉ）脳標的ペプチドであるＹ、ペプチド性または非ペプチド性リンカーであるＬ2、及び免疫グロブリンＦｃ領域を含むＦが結合された、Ｆ− Ｌ2−Ｙを製造する段階；及び（ｉｉ）前記Ｆ− Ｌ2−ＹとＸとをペプチド性または非ペプチド性リンカーであるＬ1で連結する段階を含む、前記式（１）の脳標的持続型結合体を製造する方法であることを特徴とする。
もう一つの具体例として、前記Ｌ1は、非ペプチド性リンカーであり、Ｌ2はペプチド性リンカーであることを特徴とする。
【００４４】
もう一つの具体例として、 非ペプチド性リンカー及びＸ及びＹは、それぞれの反応基によって連結され、この時、非ペプチド性リンカーの反応基はアルデヒド基、マレイミド（maleimide）基及びスクシンイミド誘導体（succinimide derivative）からなる群から選択されることを特徴とする。
【００４５】
本発明はもう一つの様態として、免疫グロブリンＦｃ領域と融合された脳標的ペプチド結合体がコードされた後に化学結合して、化学結合された免疫グロブリンＦｃ領域に他の生理活性物質が結合されて、互いに異なる生理活性物質が含まれた持続性結合体を提供する。
【００４６】
前記化学結合された免疫グロブリンＦｃ領域結合体は、２つの免疫グロブリンＦｃ領域（単量体Ｆｃ領域が結合した二量体形態のＦｃ領域）を有し、それぞれに結合する生理活性物質は１ヶ所の免疫グロブリン領域（単量体Ｆｃ領域）だけに結合したり、２ヶ所の免疫グロブリン領域の両方（それぞれの二量体形態のＦｃ領域）に結合してもよい。
【００４７】
前記化学結合は共有結合であってもよく、より具体的には、ジスルフィド結合であってもよく、さらに具体的には、２つの免疫グロブリンＦｃ領域のヒンジ領域で形成されるジスルフィド結合であってもよいが、特にこれに制限されるものではない。
【００４８】
より具体的には、（ｉ）前記したペプチド性リンカー（例えば、ペプチド結合）を介して脳標的ペプチドが１分子の免疫グロブリンＦｃ領域のＣ末端部位に連結された、第１免疫グロブリンＦｃ領域、及び（ｉｉ）前記したペプチド性リンカー（例えば、ペプチド結合）を介して脳標的ペプチドが１分子の免疫グロブリンＦｃ領域のＣ末端部位に連結された、第２免疫グロブリンＦｃ領域が化学結合を介して二量体を形成し、これらの二量体形態の免疫グロブリンＦｃ領域の２分子のいずれか１分子のＮ末端領域に１分子の生理活性物質が連結されたり、または２分子すべてのＮ末端領域それぞれに生理活性物質が一つずつ連結された形態であってもよいが、特にこれに制限されない。前記した第１免疫グロブリンＦｃ領域及び第２免疫グロブリンＦｃ領域は融合タンパク質の形態であって、免疫グロブリンＦｃ領域が、脳標的ペプチドとペプチド結合を介してインフレーム（in-frame）融合されたものであってもよく、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含んでもよいが、特にこれに制限されない。
【００４９】
前記第１免疫グロブリンＦｃ領域及び第２免疫グロブリンＦｃ領域間の化学結合は、具体的には、共有結合であってもよく、より具体的には、ジスルフィド結合であってもよく、さらに具体的には、両方の免疫グロブリンＦｃ領域のヒンジ領域で形成されるジスルフィド結合であってもよいが、特にこれに制限されるものではない。
【００５０】
本発明を具現する他の一つの様態は、前記脳標的持続型タンパク質結合体を含む組成物である。
本発明を具現する他の一つの様態は、薬剤の製造において、前記脳標的持続型タンパク質結合体の用途である。
【００５１】
本発明を具現する他の一つの様態は、新規な脳標的ペプチドである。
一つの具体例において、前記脳標的ペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８及び４０で表されるアミノ酸配列の中で選択されるいずれかのアミノ酸配列からなる、脳標的ペプチドであることを特徴とする。
【００５２】
本発明を具現するための別の様態は、前記脳標的ペプチドをコードする、分離されたポリヌクレオチドである。
本発明を具現するための別の様態は、前記ポリヌクレオチドを含む、組換え発現ベクターである。
本発明を具現するための別の様態は、前記組換え発現ベクターを含む、形質転換体である。
【発明の効果】
【００５３】
本発明の脳標的ペプチドと生理活性物質を含む脳標的持続型結合体は、生体内で血液脳関門を通過して、生理活性を維持し、血中半減期が著しく増加する効果がある。前記脳標的持続型結合体は安定性も改善されて、脳関連疾患の治療剤として用いられてもよい。また、新規な脳標的ペプチドを提供し、新規な脳標的持続型結合体を製造して、脳関連疾患の治療剤として用いられてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】脳標的ペプチドの血液脳関門（blood brain barrier）の通過程度を確認するための通過細胞外排出（transcytosis）の実験結果を示した図である。
【図２】脳標的ペプチドの血液脳関門の通過程度をマウスで脳分布実験を行って確認した結果を示した図である。
【図３】免疫グロブリンＦｃ領域が結合された脳標的ペプチドと免疫グロブリンＦｃ領域単独の血液脳関門の通過程度を確認した図である。
【図４】生理活性物質であるＧＩＰ誘導体を含む、脳標的持続型結合体の血液脳関門の通過程度を確認するための通過細胞外排出の実験結果を示した図である。
【図５】生理活性物質であるイデュルスルファーゼ（idursulfase）を含む、脳標的持続型結合体で生理活性物質であるイデュルスルファーゼの生理活性が維持するかどうかを確認した図である。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
以下、本発明を詳細に説明する。
一方、本願で開示された各説明及び実施形態は、それぞれの他の説明及び実施形態にも適用されてもよい。つまり、本願で開示された様々な要素のすべての組み合わせが本発明のカテゴリに属する。また、下記記述される具体的な叙述によって、本発明のカテゴリが限定されるとは言えない。
【００５６】
また、当該技術分野の通常の知識を有する者は、通常の実験のみを用いて本出願に記載された本発明の特定様態に対する多数の等価物を認識したり、確認できる。さらに、これらの同等物は、本発明に含まれるものと意図される。
本明細書全般を介して、アミノ酸に対する通常の１文字及び３文字コードが用いられる。また、Ｄａｐ（ジアミノプロピオン酸、diaminopropionic acid）などのような他のアミノ酸に対して一般的に許容される３文字のコードが用いられる。また、本明細書で略語で言及されたアミノ酸は、ＩＵＰＡＣ-ＩＵＢ命名法に従って記載された。
【００５７】
本発明を具現する一つの様態は、脳標的ペプチドと生理活性物質とを含む脳標的持続型結合体を提供する。より具体的には、前記脳標的持続型結合体は、免疫グロブリンＦｃ領域を中心に、それぞれペプチド性リンカー及び／または直接融合または非ペプチド性リンカーによって連結された脳標的ペプチド及び生理活性物質が結合されたものであってもよいが、これに制限されない。本発明の脳標的持続型結合体は、脳標的ペプチドが生理活性物質でなく、免疫グロブリンＦｃ領域にペプチド性リンカー、直接融合、非ペプチド性リンカーによって連結されたことを特徴とする。
【００５８】
本発明を具現するためのより具体的な様態は、下記式（１）を有する脳標的持続型結合体を提供する：
Ｘ−Ｌ1−Ｆ−Ｌ2−Ｙ  （１）
ここで、
Ｘは、生理活性物質であり、
Ｙは、脳標的ペプチドであり、
Ｌ1及びＬ2は、ペプチド性または非ペプチド性リンカーであり、
Ｌ1及びＬ2がペプチド性リンカーである時、前記ペプチド性リンカーは、０〜１０００個のアミノ酸を含み、
Ｆは、ＦｃＲｎ結合部位を含む免疫グロブリン不変領域である。
【００５９】
このような本発明の持続型結合体の形態は、脳標的ペプチドとＦｃ領域を中心に生理活性物質が結合されたことを特徴とする。具体的には、免疫グロブリンＦｃ領域に結合する脳標的ペプチドは、免疫グロブリンＦｃ領域とペプチド性リンカーで結合し、生理活性物質は非ペプチド性リンカーで結合することを特徴とするが、２種類すべてペプチド性リンカー及び／または非ペプチド性リンカーで結合してもよく、これに制限されない。前記ペプチド性リンカーは、０個〜１０００個のアミノ酸を含むリンカーであってもよいが、本発明の結合体を形成しうるペプチド性リンカーは、制限なく含まれる。前記ペプチド性リンカーが０個のアミノ酸を含む場合、これはリンカーではなく、ペプチド結合によって融合された形態の結合体であってもよい。
【００６０】
前記脳標的持続型結合体の式（１）のＦ−Ｌ2−Ｙは、下記式（２）で表される構造である、脳標的持続型結合体であってもよい：
2020501611.tif 000005
ここで、Ｆa及びＦbは、それぞれヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む免疫グロブリンＦｃ領域を含む一本のポリペプチド鎖であって、Ｆa及びＦbは、ヒンジ領域でジスルフィド結合で互いに連結されてＦｃ切片を含み、Ｆaは、Ｌ1と共有結合で連結され、それぞれのＢＴＰa1、......、ＢＴＰanは、互いに同じか異なる脳標的ペプチドであり、それぞれのＢＴＰb1、......、ＢＴＰbn’は、互いに同じか異なる脳標的ペプチドであり、
それぞれのＬ2a1、......、Ｌ2anは、互いに同じか異なるペプチド性リンカーであり、それぞれのＬ2b1、......、Ｌ2bn’は、互いに同じか異なるペプチド性リンカーであり、
この時、ｎ及びｎ’は、それぞれ独立して自然数であってもよい。
【００６１】
前記脳標的持続型結合体において、前記Ｌ1はＦaのＮ末端に連結されたものであり、Ｌ2a1及びＬ2b1は、それぞれＦa及びＦbのＣ末端に連結されたものであってもよい。
前記式（２）の脳標的持続型結合体において、ｎ＝ｎ’であって、それぞれＬ2a1＝Ｌ2b1、......、Ｌ2an＝Ｌ2bn’とＢＴＰa1＝ ＢＴＰb1、......、 ＢＴＰan＝ ＢＴＰbn’の条件を満足できるが、これに制限されない。
【００６２】
前記脳標的持続型結合体の式（１）のＦは、Ｆa及びＦbであり、Ｌ2−Ｙは（Ｌ2a−Ｙ）ｎ及び（Ｌ2b−Ｙ）ｎ’であって、前記脳標的持続型結合体は、下記式（３）で表されてもよい：
2020501611.tif 000006
ここで、
前記Ｘは、生理活性物質であり、
Ｌ1は、ペプチド性リンカーまたは非ペプチド性リンカーであり、
Ｆa及びＦbは、それぞれヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む免疫グロブリンＦｃ領域であって、Ｆa及びFbはヒンジ領域に位置するシステイン残基の間のジスルフィド結合で互いに共有結合で連結されたものであり、
Ｙa及びＹbは、脳標的ペプチドであって、それぞれ互いに同じ種類または異なる種類の脳標的ペプチドであり、
Ｌ2a及びＬ2bそれぞれはペプチド性リンカーであって、前記Ｌ2a及びＬ2bは、互いに同じ種類または異なる種類であり、
ｎ及びｎ’は、それぞれ独立して１以上の自然数である。
【００６３】
前記ｎ及びｎ’がそれぞれ独立して２以上の自然数である場合、同じか異なる種類の脳標的ペプチドが２つ以上連結されているものであってもよく、前記２以上の脳標的ペプチドは縦列（tandem）で連結された形態であってもよいが、これに制限されない。
【００６４】
前記ｎ及びｎ’は、１または２以上の自然数であってもよく、ｎ及びｎ’は、同一の自然数であるか、互いに異なる自然数であってもよいが、これに制限されない。 ｎ及びｎ’は１〜１０、１〜５であってもよく、その例としては、それぞれ１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であってもよいが、本発明の脳標的持続型結合体の一部分（moiety）を構成する一部として結合されたＦｃ領域及び生理活性物質を、ＢＢＢを通過して脳に伝達できる個数は制限なく含まれる。
【００６５】
前記脳標的持続型結合体は、Ｌ1によってＸのＮ末端領域及びＦのＮ末端領域が連結されたものであり、Ｌ2によってＹのＮ末端領域及びＦのＣ末端領域が連結されたものであってもよい。また、前記脳標的持続型結合体は、Ｌ1の一末端はＸのリジン残基またはシステイン残基などに、Ｌ1の他の末端は、ＦのＮ末端領域に連結されたものであり、Ｌ2によってＹのＮ末端領域及びＦのＣ末端領域が連結された形態であってもよい。
【００６６】
前記脳標的持続型結合体のＬ1はＦのＮ末端領域に連結され、Ｌ2はＦのＣ末端領域に連結されたものであってもよく、前記Ｌ1はＦaのＮ末端領域に連結されたものであり、Ｌ2a及びＬ2bはそれぞれＦa及びＦbのＣ末端領域に連結されたものであってもよい。前記Ｌ1はＸのアミン基またはチオール基に連結されたものであってもよく、Ｌ1はＸのＮ末端アミン基、リジンの側鎖に位置するアミン基、またはシステインの側鎖に位置する−ＳＨ基（チオール基）に連結されたものであってもよいが、これに制限されない。
【００６７】
本発明において、用語、「Ｎ末端領域」は、ペプチドまたはタンパク質のアミノ末端を意味するもので、本発明の目的上、非ペプチド性リンカーを始めとするリンカーと結合しうる位置をいう。その例として、これに制限されないが、Ｎ末端領域の最末端のアミノ酸残基だけでなく、Ｎ末端周囲のアミノ酸残基をすべて含んでもよく、具体的には、最末端から１番目〜２０番目のアミノ酸残基を含んでもよい。しかし、特にこれに制限されるものではない。
【００６８】
本発明において、用語、「Ｃ末端領域」は、ペプチドまたはタンパク質のカルボキシル末端を意味するもので、本発明の目的上、非ペプチド性リンカーを始めとするリンカーと結合しうる位置をいう。その例として、これに制限されないが、Ｃ末端領域の最末端のアミノ酸残基だけでなく、Ｃ末端領域周囲のアミノ酸残基をすべて含んでもよく、具体的には、最末端から１番目〜２０番目のアミノ酸残基を含んでもよい。しかし、特にこれに制限されるものではない。
【００６９】
本発明において、用語、「脳標的持続型結合体」は、脳標的ペプチド及び生理活性物質を含み、免疫グロブリン不変領域を含んでＦｃＲｎ結合部位を有する物質に脳標的ペプチド及び生理活性物質がそれぞれ直接または間接的に連結された構造を有する結合体をいう。前記持続型結合体は、「持続性結合体」と併用してもよく、前記持続型結合体に含まれる生理活性物質が生理活性物質の活性持続の時間を増やしうる免疫グロブリン不変領域を含み、ＦｃＲｎ結合部位を有する生体適合性材料と前記０〜１０００個のアミノ酸とを含む、ペプチド性リンカー及び／または非ペプチド性リンカーと結合した物質を意味する。
【００７０】
前記脳標的持続型結合体は、血液脳関門を通過して、脳組織内に生理活性物質を伝達してもよいが、特にこれに制限されるものではない。
前記脳標的持続型結合体を構成する要素をより具体的に説明すると、次の通りである。
本発明において、「脳標的ペプチド」は、血液脳関門を通過できるアミノ酸配列を含むペプチド、またはタンパク質、または抗体を含む。前記脳標的ペプチドは、本発明の脳標的持続型結合体を構成する１つの一部分に該当する。
【００７１】
また、前記脳標的ペプチドは、公知のペプチド、タンパク質、または抗体から分離された一部の配列であって、ＢＢＢを通過して血液脳関門を通過できる活性を保有したものであってもよい。
【００７２】
本発明において、用語、「アミノ酸」は、任意の自然発生または非天然発生または合成アミノ酸残基を含むアミノ酸の一部分（moiety）、つまり、１つ、２つ、３つまたはそれ以上の炭素原子、典型的には、１つの（α）炭素原子によって直接連結された少なくとも１つのカルボキシル残基と少なくとも１つのアミノ残基とを含む、任意の一部分を意味する。
【００７３】
本発明の脳標的ペプチドは、 受動輸送（passive transport）による経路または受容体媒介輸送（receptor-mediated transport）による経路を介して血液脳関門を通過することを特徴としてもよいが、これに制限されるものではない。その例として、血液脳関門を通過できるペプチド、タンパク質または抗体が挙げられ、特にその種類とサイズに制限されない。
【００７４】
一方、前記脳標的ペプチドは、受容体媒介輸送による経路を介して血液脳関門を通過するものであってもよい。
一方、前記脳標的ペプチドは、受容体媒介輸送による経路を介して血液脳関門を通過するものであってもよい。
【００７５】
具体的には、前記脳標的ペプチドは、インスリン受容体（insulin receptor）；トランスフェリン受容体（transferrin receptor）；低密度リポタンパク質受容体（low density lipoprotein receptor）；低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質（Low density lipoprotein receptor‐related protein）；レプチン受容体（leptin receptor）；ニコチン性アセチルコリン受容体（nicotinic acetylcholine receptor）；グルタチオン輸送体（Glutathione transporter）；カルシウム依存性カリウムチャネル（calcium-activated potassium channel）；及びＲＡＧＥ（receptor for advanced glycation endproducts）；及び前記受容体のリガンド及び前記受容体またはリガンドに結合する抗体からなる群から選択されるいずれか一つを介して受容体媒介輸送の経路によって血液脳関門を通過してもよいが、特にこれに制限されない。このような経路を介して血液脳関門を通過するペプチド、タンパク質、抗体からなる群から選択されたものであってもよく、または前記ペプチド、タンパク質または抗体から分離された一部のペプチドであってもよいが、これに制限されない。その例として、配列番号２のＨＡＩＴＹＰＲＨペプチド（ＢＴＰ１ペプチド）、配列番号４のＴＨＲペプチド（ＢＴＰ２ペプチド）、配列番号６のＡｎｇｉｏｐｅｐ−２ペプチド（ＢＴＰ３ペプチド）、配列番号８のＡｐｏＢペプチド（ＢＴＰ４ペプチド）、配列番号１０のＡｐｏＥペプチド（ＢＴＰ５ペプチド）などのペプチドが用いられてもよいが、本発明の脳標的持続型結合体に含まれて、結合されたＦ−Ｌ2−Ｙ構造体をＢＢＢを通過して脳内に伝達させうるペプチドは制限なく含まれる。
【００７６】
もう一つの具体例として、配列番号２０のＢＴＰ６ペプチド、配列番号２２のＢＴＰ７ペプチド、配列番号２４のＢＴＰ８ペプチド、配列番号２６のＢＴＰ９ペプチド、配列番号２８のＢＴＰ１０ペプチド、配列番号３０のＢＴＰ１１ペプチド、配列番号３２のＢＴＰ１２ペプチド、配列番号３４のＢＴＰ１３ペプチド、配列番号３６のＢＴＰ１４ペプチド、配列番号３８のＢＴＰ１５ペプチド、または配列番号４０のＢＴＰ１６ペプチドであってもよいが、これに制限されない。
【００７７】
もう一つの具体例として、前記脳標的ペプチドは、
（１）Ａｎｇｉｏｐｅｐ−２：ＴＦＦＹＧＧＳＲＧＫＲＮＮＦＫＴＥＥＹ−ＯＨ（配列番号：４１）、
（２）ＡｐｏＢ（３３７１〜３４０９）：ＳＶＩＤＡＬＱＹＫＬＥＧＴＴＲＬＴＲＫＲＧＬＫＬＡＴＡＬＳＬＳＮＫＦＶＥＧＳ（配列番号：４２）、
（３）ＡｐｏＥ（１５９〜１６７）2：（ＬＲＫＬＲＫＲＬＬ）2（配列番号：４３）、
（４）ペプチド−２２：Ａｃ−Ｃ（＆）ＭＰＲＬＲＧＣ（＆）−ＮＨ2（配列番号：４４）、
（５）ＴＨＲ：ＴＨＲＰＰＭＷＳＰＶＷＰ−ＮＨ2（配列番号：４５）、
（６）ＴＨＲ ｒｅｔｒｏ−ｅｎａｎｔｉｏ:ｐｗｖｐｓｗｍｐｐｒｈｔ−ＮＨ2（配列番号：４６）、
（７）ＣＲＴ:Ｃ（＆）ＲＴＩＧＰＳＶＣ（＆）（配列番号：４７）、
（８）Ｌｅｐｔｉｎ ３０：ＹＱＱＩＬＴＳＭＰＳＲＮＶＩＱＩＳＮＤＬＥＮＬＲＤＬＬＨＶＬ（配列番号：４８）、
（９）ＲＶＧ２９：ＹＴＩＷＭＰＥＮＰＲＰＧＴＰＣＤＩＦＴＮＳＲＧＫＲＡＳＮＧ−ＯＨ（配列番号：４９）
（１０）DＣＤＸ：ＧｒｅｉｒｔＧｒａｅｒｗｓｅｋｆ−ＯＨ（配列番号：５０）
（１１）Ａｐａｍｉｎ：Ｃ（＆１）ＮＣ（＆２）ＫＡＰＥＴＡＬＣ（＆１）−ＡＲＲＣ（＆２）ＱＱＨ−ＮＨ2（配列番号：５１）、
（１２）ＭｉｎｉＡｐ−４：［Ｄａｐ］（＆）ＫＡＰＥＴＡＬＤ（＆）（配列番号：５２）、
（１３）ＧＳＨ：γ−Ｌ−ｇｌｕｔａｍｙｌ−ＣＧ−ＯＨ
（１４）Ｇ２３：ＨＬＮＩＬＳＴＬＷＫＹＲＣ（配列番号：５３）、
（１５）ｇ７：ＧＦｔＧＦＬＳ（Ｏ−β−Ｇｌｃ）−ＮＨ2（配列番号：５４）、
（１６）ＴＧＮ：ＴＧＮＹＫＡＬＨＰＨＮＧ（配列番号：５５）、
（１７）ＴＡＴ（４７〜５７）：ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−ＮＨ2（配列番号：５６）、
（１８）ＳｙｎＢ１：ＲＧＧＲＬＳＹＳＲＲＲＦＳＴＳＴＧＲ（配列番号：５７）、
（１９）Ｄｉｋｅｔｏｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｓ：＆（Ｎ−ＭｅＰｈｅ）−（Ｎ−ＭｅＰｈｅ）Ｄｉｋｅｔｏｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｓ、または
（２０）ＰｈＰｒｏ：（Ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｌｉｎｅ）4−ＮＨ2（配列番号：５８）であってもよいが、これに制限されない。
【００７８】
前記配列で＆は非特許文献２に記載された環状ペプチドに対する命名法に従った記号であって、「＆」は、連結位置（connecting point）をいう。例えば、単一鎖で最初に記載された「＆」は、化学結合の一末端の位置を、２番目に記載された「＆」は、前記化学結合が付着される部位をいう。例えば、「＆Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ＆」は、アラニンとプロリン間に化学結合が形成されて環状ペプチドを形成することを示す。２以上の化学結合が存在する場合、その化学結合が形成される位置を示すために、＆１、＆２のような記号を用いてもよい。例えば、＆１Ａｓｐ（＆２）−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｄｐｒ（＆２）−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ＆１のように示された場合、Ａｓｐ及びＭｅｔ間に化学結合が形成され、Ａｓｐ及びＤｐｒ間に化学結合が形成されることをいう。一方、[Ｄａｐ]は、ジアミノプロピオン酸（diaminopropionic acid）を示す。
【００７９】
本発明において、「生理活性物質」は、前記脳標的持続型結合体の一部分（moiety）をなす一構成であってもよいもので、生体内である生理作用を有する物質を総称する概念として、様々な生理活性を有する。前記生理活性物質であるＸは、２個〜１０００個のアミノ酸、２個〜９５０個、２個〜９００個、２個〜８５０個、２個〜８００個、２個〜７５０個、２個〜７００個、５個〜７００個のアミノ酸、５個〜６５０個、５個〜６００個、５個〜５５０個、５個〜５００個、５個〜４５０個、５個〜４００個、５個〜３５０個、５個〜３００個、５個〜２５０個、５個〜２００個、５個〜１５０個、５個〜１００個、５個〜９０個、５個〜８０個、５個〜７０個、５個〜６０個、５個〜５０個、５個〜４０個、５個〜３０個、５個〜２５個、または５個〜２０個前後からなるポリペプチドであってもよいが、これに制限されない。前記生理活性物質を構成するポリペプチドは、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質すべてを含む。
【００８０】
前記生理活性物質は、トキシンまたは生理活性ポリペプチドであってもよく、人間の疾病を治療または予防する目的で用いられるサイトカイン、インターロイキン、インターロイキン結合タンパク質、酵素、抗体、成長因子、転写調節因子、血液因子、ワクチン、構造タンパク質、リガンドタンパク質または受容体、細胞表面抗原、受容体アンタゴニスト、糖尿及び肥満に治療効果を示す小腸及び膵臓から分泌される生理活性ペプチド、ＧＰＣＲ（G protein-coupled receptors）アゴニストもしくはアンタゴニストなどのようなさまざまな生理活性ポリペプチド、これらのアナログを例示してもよいが、これに制限されない。
【００８１】
本発明で用いられる用語、「Ｘのアナログ」は、Ｘと同じ種類の活性を示せる物質であって、Ｘのアゴニスト（agonist）、Ｘの誘導体（derivatives）、Ｘの断片（fragments）、Ｘの変異体（variants）などをすべて含む。
具体的には、トキシンはがん細胞の死滅に効果的なメイタンシン（Maytansine）及び／またはその誘導体、オーリスタチン（Auristatin）及び／またはその誘導体、デュオカルマイシン（Duocarmycin）及び／またはその誘導体、ＰＢＤ（Pyrrolobenzodiazepine）及び／またはその誘導体の中から選択されてもよいが、がん細胞の死滅に効力を示すトキシンは制限なく含まれる。
【００８２】
具体的には、生理活性ポリペプチドは、ＧＬＰ−１受容体アゴニスト、グルカゴン受容体アゴニスト、ＧＩＰ（Gastric inhibitory polypeptide）受容体アゴニスト、ＦＧＦ（Fibroblast growth factors）受容体アゴニスト（ＦＧＦ１、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２３など）、コレシストキニン（Cholecystokinin）受容体アゴニスト、ガストリン（gastrin）受容体アゴニスト、メラノコルチン（melanocortin）受容体アゴニスト、ヒト成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ペプチド、インターフェロン類とインターフェロン受容体類（例えば、インターフェロン−α、−β及び−γ、水溶性タイプＩインターフェロン受容体など）、コロニー刺激因子、インターロイキン類（例えば、インターロイキン−１、−２、−３、−４、−５、−６、−７、−８ 、−９、−１０、−１１、−１２、−１３、−１４、−１５、−１６、−１７、−１８、−１９、−２０、−２１、−２２、−２３、−２４、−２５、−２６、−２７、−２８、−２９、−３０など）とインターロイキン受容体類（例えば、ＩＬ−１受容体、ＩＬ−４受容体など）、酵素類（例えば、β−グルコシダーゼ（beta-glucosidase）、α−ガラクトシダーゼ（alpha-galactosidase）、β−ガラクトシダーゼ（beta-galactosidase）、イズロニダーゼ（iduronidase）、イズロン酸−２−スルファターゼ（iduronate-2-sulfatase）、ガラクトース−６−スルファターゼ（Galactose-6-sulfatase）、酸性α−グルコシダーゼ（acid alpha-glucosidase）、酸性セラミダーゼ（acid ceramidase）、酸性スフィンゴミエリナーゼ（acid sphingomyelinsase）、ガラクトセレブロシダーゼ（galactocerebrosidsase）、アリールスルファターゼ（arylsulfatase）Ａ、Ｂ、β−ヘキソサミニダーゼ（beta-hexosaminidase）Ａ、Ｂ、ヘパリンＮ−スルファターゼ（heparin N-sulfatase）、α−Ｄ−マンノシダーゼ（alpha-D-mannosidase）、β−グルクロニダーゼ（beta-glucuronidase）、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６スルファターゼ（N-acetylgalactosamine-6 sulfatase）、リソソーム酸性リパーゼ（lysosomal acid lipase）、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（alpha-N-acetyl-glucosaminidase）、グルコセレブロシダーゼ（glucocerebrosidase）、ブチリルコリンエステラーゼ（butyrylcholinesterase）、キチナーゼ（chitinase）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（glutamate decarboxylase）、イミグルセラーゼ（imiglucerase）、リパーゼ（lipase）、ウリカーゼ（Uricase）、血小板活性因子アセチルヒドロラーゼ（Platelet-Activating Factor Acetylhydrolase）、中性エンドペプチダーゼ（neutral endopeptidase）、ミエロペルオキシダーゼ（myeloperoxidase）、α−ガラクトシダーゼＡ、アガルシダーゼα（agalsidase alpha）、β、α−Ｌ−イズロニダーゼ（alpha-L-iduronidase）、ブチリルコリンエステラーゼ（butyrylcholinesterase）、キチナーゼ（chitinase）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（glutamate decarboxylase）、イミグルセラーゼ（imiglucerase）、リパーゼ（lipase）、ウリカーゼ（Uricase）、血小板活性因子アセチルヒドロラーゼ（Platelet-Activating Factor Acetylhydrolase）、中性エンドペプチダーゼ（neutral endopeptidase）及びミエロペルオキシダーゼ（myeloperoxidase）など）、インターロイキン及びサイトカイン結合タンパク質（例えば、IL−１８bp, ＴＮＦ−結合タンパク質など）マクロファージ活性因子、マクロファージペプチド、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、タンパク質Ａ、アレルギー抑制因子、細胞壊死糖タンパク質、免疫毒素、リンホトキシン、腫瘍壊死因子、腫瘍抑制因子、転移成長因子、α−１アンチトリプシン、アルブミン、α−ラクトアルブミン（alpha-lactalbumin）、アポリポタンパク質Ｅ、赤血球生成因子、高糖鎖化赤血球生成因子、アンジオポエチン類（angiopoietin）、ヘモグロビン、トロンビン（thrombin）、トロンビン受容体活性ペプチド、トロンボモジュリン（thrombomodulin）、血液因子ＶＩＩ、血液因子ＶＩＩａ、血液因子ＶＩＩＩ、血液因子ＩＸ、血液因子ＸＩＩＩ、プラスミノーゲン活性因子、フィブリン結合ペプチド、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ヒルディン（hirudin）、タンパク質Ｃ、Ｃ反応性タンパク質、レニン抑制剤、コラゲナーゼ抑制剤、スーパーオキシドジスムターゼ、レプチン、血小板由来成長因子、上皮細胞成長因子、表皮細胞成長因子、アンジオスタチン（angiostatin）、アンジオテンシン（angiotensin）、骨形成成長因子、骨形成促進タンパク質、カルシトニン、インスリン、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、エルカトニン（elcatonin）、結合組織活性因子、組織因子経路インヒビター（tissue factor pathway inhibitor）、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、神経成長因子類（神経成長因子、毛様体神経栄養因子（cilliary neurotrophic factor）、アキソジェネシス因子−１（axogenesis factor-1）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（brain-natriuretic peptide）、グリア細胞由来神経栄養因子（glial derived neurotrophic factor）、ネトリン（netrin）、好中球抑制因子（neurophil inhibitor factor）、神経栄養因子、ニュールツリン（neuturin））、副甲状腺ホルモン、リラキシン、セクレチン、ソマトメジン、インスリン様成長因子、副腎皮質ホルモン、グルカゴン、コレシストキニン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、コルチコトロピン放出因子、甲状腺刺激ホルモン、オートタキシン（autotaxin）、ラクトフェリン（lactoferrin）、ミオスタチン（myostatin）、 ＡＤＮＰ（activity-dependent neuroprotective protein）、ＢＡＣＥ１（beta-secretase1）、ＡＰＰ（Amyloid Precursor Protein）、ＮＣＡＭ（Neural cell adhesion molecule）、アミロイドβ（Amyloid beta）、タウ（Tau）、ＲＡＧＥ（receptor for advanced glycation endproducts ）、α−シヌクレイン（alpha-synuclein）、またはこれらのアゴニストまたはアンタゴニスト、これらの受容体類（例えば、ＴＮＦＲ（Ｐ７５）、ＴＮＦＲ（Ｐ５５）、ＩＬ−１受容体、ＶＥＧＦ受容体、Ｂ細胞活性因子受容体など）、受容体アンタゴニスト（例えば、ＩＬ１−Ｒａなど）、細胞表面抗原（例えば、ＣＤ２、３、４、５、７、１１ａ、１１ｂ、１８、１９、２０、２３、２５、３３、３８、４０、４５、６９など）、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片類（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2及びＦｄ）、ウイルス由来ワクチン抗原、１つ以上の受容体アゴニストを活性化させるハイブリッドポリペプチドまたはキメラ（chimeric）ポリペプチドなどを例示してもよいが、これに限定されるものではない。
【００８３】
本発明の用語、「イズロン酸−２−スルファターゼ（iduronate-2-sulfatase）」は、ハンター症候群（Hunter syndrome、ＭＰＳ−ＩＩ）に関係されるスルファターゼ酵素であって、ヘパラン硫酸（heparin sulfate）及びデルマタン硫酸（dermatan sulfate）のリソソーム分解に必要な酵素である。本発明の一具体的な形態では、「イズロン酸−２−スルファターゼ（iduronate-2-sulfatase）」でヒトイズロン酸−２−スルファターゼの一精製形態である「イデュルスルファーゼ（idursulfase）」を用いてもよく、前記イズロン酸−２−スルファターゼに含まれることは自明である。前記イデュルスルファーゼは、例えば、イデュルスルファーゼαまたはイデュルスルファーゼβであってもよいが、これに制限されない。
【００８４】
前記イズロン酸−２−スルファターゼ酵素は、当業界で知られた方法で準備または製造してもよく、具体的には、動物細胞発現ベクターを挿入した動物細胞を培養して、培養物から精製してもよく、または商業的に利用可能な酵素を購入して用いてもよいが、これに制限されない。
【００８５】
本発明で適用可能な生理活性ポリペプチドは、天然型であるか、大腸菌のような原核細胞や酵母細胞、昆虫細胞または動物細胞のような真核生物で遺伝子組換えによって生産されたものであってもよく、また、天然型と同等の活性または同種の活性を保持するアナログであってもよく、例えば、１つ以上のアミノ酸位置で突然変異が起きた誘導体であってもよいが、これに制限されない。
【００８６】
一方、前記ＧＬＰ−１受容体アゴニストは、天然型エキセンジン−４、エキセンジン−４のＮ末端アミン基が除去されたエキセンジン−４誘導体、エキセンジン−４のＮ末端アミン基がヒドロキシル基に置換されたエキセンジン−４誘導体、エキセンジン−４のＮ末端アミン基がジメチル基に修飾されたエキセンジン−４誘導体、エキセンジン−４の１番目のアミノ酸（ヒスチジン）のα炭素を除去（deletion）したエキセンジン−４誘導体、エキセンジン−４の１２番目のアミノ酸（リジン）がセリンに置換されたエキセンジン−４誘導体、及びエキセンジン−４の１２番目のアミノ酸（リジン）がアルギニンに置換されたエキセンジン−４誘導体からなる群から選択されてもよいが、特にこれに制限されない。
【００８７】
本発明は一つの具体例として、生理活性物質が免疫グロブリンＦｃ領域と融合された脳標的ペプチドの免疫グロブリンＦｃ領域に相互結合で結合されたことを特徴とする、脳標的持続型結合体を提供する。
【００８８】
本発明において、「Ｆ」は、免疫グロブリン不変領域を含み、ＦｃＲｎ結合部位を含む物質をいう。具体的には、本発明の脳標的持続型結合体を構成する１つの一部分に該当する。その例として、前記ＦはＦｃＲｎ結合部位を含有する免疫グロブリンＦｃ領域であってもよい。
【００８９】
もう一つの具体例として、免疫グロブリンＦｃ領域と融合された脳標的ペプチドの免疫グロブリンＦｃ領域は、免疫グロブリンＦｃ領域のほか、生体適合性物質であってもよい。
【００９０】
本発明において、用語、「生体適合性物質」とは、生理活性物質または融合または共有結合されて結合体を形成したとき、生理活性物質の生体内半減期を増加して、活性持続時間を伸ばす物質である。その例として、半減期の増大及び生体利用率及び持続的な活性維持が最優先の目的であるため、生理活性物質と融合または結合されうることは様々な生体適合性材料、例えば、ポリエチレングリコール、脂肪酸、コレステロール、アルブミン及びその断片、アルブミン結合物質、エラスチン、エラスチンの水溶性前駆体及びエラスチンタンパク質配列の一部の繰り返し単位の重合体、特定アミノ酸配列の繰り返し単位の重合体、抗体、抗体断片、ＦｃＲｎ結合物質、生体内結合組織、ヌクレオチド、フィブロネクチン、トランスフェリン（Transferrin）、多糖類（saccharide）、高分子重合体などを制限なく含む。
【００９１】
免疫グロブリンＦｃ領域は、生体内で代謝される生分解性のポリペプチドであるため、薬物のキャリアとして使用するのに安全である。また、免疫グロブリンＦｃ領域は、免疫グロブリン全体分子に比べて相対的に分子量が小さいため、結合体の製造、精製、及び収率の面で有利であるのみならず、アミノ酸配列が抗体ごとに異なるため、高い非均質性を示すＦａb部分が除去されて、物質の同質性が大幅に増加し、血中抗原性の誘発可能性も低くなる効果も期待できる。
【００９２】
本発明で用いられる免疫グロブリンＦｃ領域と融合された脳標的ペプチド結合体は、免疫グロブリンＦｃ領域とペプチド結合で連結されて発現宿主で持続型結合体として生産される。発現宿主は、外部遺伝子で形質転換させ、タンパク質を生産できる大腸菌のような微生物であってもよく、酵母、昆虫細胞、動物細胞などに制限がない。
【００９３】
本発明において、「免疫グロブリン不変領域」は、脳標的持続型結合体の一部分（moiety）をなす一構成であってもよいもので、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖可変領域と軽鎖不変領域（ＣＬ１）を除いた、重鎖不変領域２（ＣＨ２）及び重鎖不変領域３（ＣＨ３）の部分を含む。重鎖不変領域にヒンジ（hinge）部分を含むこともある。
【００９４】
前記免疫グロブリン不変領域は、免疫グロブリンＦｃ領域であってもよい。
前記Ｆの免疫グロブリン不変領域は、免疫グロブリンＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４ドメインからなる群から選択された１つ〜４つのドメインを含むものであってもよい。
【００９５】
本発明の免疫グロブリン不変領域は、１）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメイン、２）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ２ドメイン、３）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ３ドメイン、４）ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン、５）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメインのうち１つまたは２つの以上のドメインと免疫グロブリンのヒンジ領域（またはヒンジ領域の一部）との組み合わせ（例えば、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメイン、及びヒンジ領域（またはその一部）との組み合わせ）、６）重鎖不変領域の各ドメインと軽鎖不変領域の二量体であってもよい。本発明のヒンジ領域は、天然のヒンジ領域だけではなく、公知のヒンジ領域の一部をすべて含む。
具体的には、前記Ｆの免疫グロブリン不変領域は、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含んでもよいが、特にこれに制限されない。
【００９６】
また、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、天然型アミノ酸配列だけでなく、その配列誘導体（mutant）を含む。アミノ酸配列誘導体とは、天然アミノ酸配列のうちの１つ以上のアミノ酸残基が欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはこれらの組み合わせによって異なる配列を有することを意味する。例えば、ＩｇＧ Ｆｃの場合、結合に重要であると知られている２１４〜２３８、２９７〜２９９、３１８〜３２２または３２７〜３３１番のアミノ酸残基が変形のために適した部位として用いられてもよい。また、ジスルフィド結合を形成できる部位が除去されたり、天然型ＦｃからＮ末端のいくつかのアミノ酸が除去されたり、または天然型ＦｃのＮ末端にメチオニン残基が付加されることもあるなど、様々な種類の誘導体が可能である。また、エフェクター機能をなくすために、補体結合部位、例えばＣ１ｑ結合部位が除去されてもよく、ＡＤＣＣ（antibody dependent cell mediated cytotoxicity）部位が除去されてもよい。これらの免疫グロブリンＦｃ領域配列の誘導体を製造する技術は、特許文献１及び特許文献２などに開示されている。
【００９７】
分子の活性を全体的に変更させないタンパク質及びペプチドでのアミノ酸交換は、当該分野で知られている（非特許文献３）。最も一般的に起こる交換は、アミノ酸残基、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｙ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ間の交換である。場合によっては、リン酸化（phosphorylation）、硫化（sulfation）、アクリル化（acrylation）、糖化（glycosylation）、メチル化（methylation）、ファルネシル化（Farnesylation）、アセチル化（acetylation）及びアミド化（amidation）などに修飾（ modification）されてもよい。
【００９８】
上述した免疫グロブリン不変領域誘導体は、本発明の免疫グロブリン不変領域と同等の生物学的活性を示し、免疫グロブリン不変領域の熱、ｐＨなどに対する構造的な安定性を増大させたものであってもよい。
【００９９】
また、このような免疫グロブリン不変領域は、ヒト、牛、ヤギ、ブタ、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、またはモルモットなどの動物の生体内から分離した天然型から得られてもよく、形質転換された動物細胞または微生物から得られた遺伝子組換え型またはその誘導体であってもよい。ここで、天然型から獲得する方法は、全体免疫グロブリンをヒトまたは動物の生体から分離した後、タンパク質分解酵素を処理して取得する方法であってもよい。パパインを処理する場合には、Ｆａb及びＦｃに切断されるし、ペプシンを処理する場合には、ｐＦ’ｃ及びＦ（ａｂ）2に切断される。これをサイズ排除クロマトグラフィー（size-exclusion chromatography）などを用いて、ＦｃまたはｐＦ’ｃを分離してもよい。より具体的な実施形態では、ヒト由来のＦｃ領域を微生物から収得した組換え型免疫グロブリンＦｃ領域である。
【０１００】
また、免疫グロブリン不変領域は、天然型糖鎖、天然型に比べて増加した糖鎖、天然型に比べて減少した糖鎖または糖鎖が除去された形態であってもよい。これらの免疫グロブリンＦｃ糖鎖の増減または除去には、化学的方法、酵素学的方法及び微生物を用いた遺伝工学的方法のような通常の方法が用いられてもよい。ここで、Ｆｃから糖鎖が除去された免疫グロブリンＦｃ領域は、補体（c１q）との結合力が著しく低下し、抗体依存性細胞傷害または補体依存性細胞傷害が減少または除去されるため、生体内で不要な免疫反応を誘発しない。この点で、薬物のキャリアとしての本来の目的により適合する形態は糖鎖が除去されたり、非糖鎖化された免疫グロブリン不変領域といえる。
【０１０１】
本発明において、「糖鎖の除去（Deglycosylation）」は、酵素で糖を除去したＦｃ領域をいい、非糖鎖化（Aglycosylation）は原核動物、より具体的な実施形態では、大腸菌で生産して糖鎖化されない免疫グロブリン不変領域を意味する。
一方、免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒトまたは牛、ヤギ、ブタ、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、モルモットなどの動物起源であってもよく、好ましくは、ヒト起源である。
【０１０２】
また、免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ由来またはこれらの組み合わせ（combination）またはこれらの混成（hybrid）によるＦｃ領域であってもよい。その例として、ヒト血液中に最も豊富なＩｇＧまたはＩｇＭ由来であってもよく、リガンド結合タンパク質の半減期を向上させることが公知されたＩｇＧ由来であってもよい。一方、本発明において、組み合わせ（combination）とは、二量体または多量体を形成する時、同一起源の短鎖免疫グロブリンＦｃ領域を暗号化するポリペプチドが異なる起源の短鎖ポリペプチドと結合を形成することを意味する。つまり、ＩｇＧ Ｆｃ、ＩｇＡ Ｆｃ、ＩｇＭ Ｆｃ、ＩｇＤ Ｆｃ及びＩｇＥのＦｃ断片からなるグループから選択された２つ以上の断片から二量体または多量体の製造が可能である。
【０１０３】
本発明において、「ハイブリッド（hybrid）」とは、短鎖の免疫グロブリンＦｃ領域内に２つ以上の異なる起源の免疫グロブリンＦｃ断片に該当する配列が存在することを意味する用語である。本発明の場合、様々な形態のハイブリッドが可能である。つまり、ＩｇＧ Ｆｃ、ＩｇＭ Ｆｃ、ＩｇＡ Ｆｃ、ＩｇＥ Ｆｃ及びＩｇＤ ＦｃのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４からなるグループから１つ〜４つのドメインからなるドメインのハイブリッドが可能であり、ヒンジを含んでもよい。
【０１０４】
一方、ＩｇＧもＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４のサブクラスに分けることができ、本発明ではこれらの組み合わせまたはこれらの混成化も可能である。その例として、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４サブクラスであり、具体的な例として、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ、Complementdependent cytotoxicity）などのエフェクター機能（effector function）がほとんどないＩｇＧ４のＦｃ領域であってもよいが、これに制限されない。また、実施形態の一例として、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域またはＩｇＧ４ Ｆｃ領域であるが、これに制限されるものではない。
【０１０５】
本発明において、前記式（１）の 「Ｌ1及び／またはＬ2」は、前記脳標的持続型結合体の一部分（moiety）をなす一構成要素であって、免疫グロブリンＦｃ領域に脳標的ペプチドまたは生理活性物質を結合させるリンカーを意味する。前記リンカー（linker）とは、基本的には２つの融合パートナーを共有結合などで連結しうる連結体を意味する。リンカーは、融合パートナーを連結する役割の他に、融合パートナーの間に一定のサイズの間隔を付与する役割を実行したり、柔軟性や強直性を提供する役割を実行してもよい。しかし、特にこれに制限されるものではない。
【０１０６】
一つの具体例として、前記式（１）のＬ1及びＬ2のいずれか一つはペプチド性リンカーであり、もう一つは非ペプチド性リンカーであることを特徴としてもよい。または、前記Ｌ1及びＬ2のいずれか一つはペプチド性リンカーであり、もう一つは非ペプチド性リンカーであってもよく、前記Ｌ1及びＬ2の両方がペプチド性リンカーであってもよく、一方では、前記Ｌ1及びＬ2の両方が非ペプチド性リンカーであってもよいが、特にこれに制限されない。
【０１０７】
もう一つの具体例として、前記式（１）の前記Ｌ1及びＬ2のいずれかまたは両方が非ペプチド性リンカーである時、非ペプチド性リンカーは、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール−プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、多糖類、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸、脂肪酸、高分子重合体、低分子化合物、ヌクレオチド、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されたものであってもよい。しかし、これに限られない。
【０１０８】
もう一つの具体例として、前記Ｌ1は非ペプチド性リンカーであり、Ｌ2はペプチド性リンカーである時、ペプチド性リンカーは、０〜１０００個のアミノ酸を含むものであってもよい。もう一つの具体例として、前記Ｌ1は非ペプチド性リンカーであり、Ｌ2はペプチド性リンカーで０個のアミノ酸を含むものである場合、Ｆと脳標的ペプチドであるＹは、直接融合によって形成されうる。
【０１０９】
もう一つの具体例として、前記式（１）の前記Ｌ1及びＬ2のいずれかまたは両方がペプチド性リンカーである時、前記ＸとＦ、またはＦとＹは共有化学結合、非共有化学結合またはこれらの組み合わせでＬ1及びＬ2によって互いに結合され、Ｌ1及びＬ2が０〜１０００個のアミノ酸を含むことを特徴とする。ペプチド性リンカーが０個のアミノ酸である場合は、共有化学結合であるペプチド結合によって結合されたものであってもよい。
もう一つの具体例として、前記式（１）のＬ1及びＬ2のいずれかまたは両方がペプチド性リンカーである時、Ｌ1及びＬ2は、０個のアミノ酸からなるものであって、（ｉ）ＸとＦ、またはＦとＹはペプチド結合によって結合されたものであり；または（ｉｉ）ＸとＦ、及びＦとＹはペプチド結合によって結合されたものであってもよい。
【０１１０】
本発明において、「ペプチド性リンカー」は、２つの融合パートナーを連結するペプチド結合またはアミノ酸の重合体を含む。具体的には、前記ペプチド性リンカーは、０個〜１０００個のアミノ酸配列を含んでもよく、より具体的には、０個〜９００個、０個〜８００個、０個〜７００個、０個〜６００個、０個〜５００個、０個〜４００個、０個〜３００個、０個〜２５０個、０個〜２００個、０個〜１５０個、０個〜１００個、０個〜９０個、０個〜８０個、０個〜７０個、０個〜６０個、０個〜５０個、０個〜４０個、０個〜３０個、０個〜２５個、０個〜２０個、０個〜１５個、または０個〜１０個のアミノ酸配列を含んでもよいが、特にこれに制限されない。
【０１１１】
また、前記ペプチド性リンカーの例としては、ＧＧＧＧＳ（配列番号：５９）モチーフ、ＧＳモチーフ、ＧＧＧＳ（配列番号：６０）モチーフ、またはＧＧＳＧ（配列番号：６１）モチーフが繰り返される形態のアミノ酸配列で構成されるペプチドが挙げられ、前記モチーフが１〜１０回繰り返されてもよいが、特にこれに制限されるものではない。
また、前記Ｌ2がペプチド性リンカーである場合、Ｌ2は（ＧＳ）ｍ、（ＧＧＳ）ｍ、（ＧＧＧＳ）ｍ、または（ＧＧＧＧＳ）ｍであり、ｍは、１〜１０であってもよいが、これに制限されない。
【０１１２】
もう一つの具体例として、前記式（１）のＬ1及びＬ2のいずれか一つはペプチド性リンカーであり、このうち、他の一つは非ペプチド性リンカーである時、ペプチド性リンカーは、０〜１０００個のアミノ酸を含むリンカーであり、非ペプチド性リンカーは、ポリエチレングリコールであることを特徴としてもよい。しかし、これに制限されない。
本発明において、前記「非ペプチド性リンカー」は、繰り返し単位が２つ以上結合された生体適合性リンカーを意味し、前記繰り返し単位は、ペプチド結合ではなく、任意の共有結合を介して互いに連結される。
【０１１３】
もう一つの具体例として、前記非ペプチド性リンカー及びＸ及びＹは、それぞれの反応基によって連結され、この時、非ペプチド性リンカーの反応基がアルデヒド基、マレイミド（maleimide）基及びスクシンイミド誘導体（succinimide derivative ）からなる群が選択されるものであってもよい。前記Ｌ１は両末端官能基を有する非ペプチド性重合体であり、前記両末端官能基は、それぞれアミン反応基（amine-reactive group）またはチオール反応基（thiol-reactive group）であり、前記両末端官能基は、互いに同じ種類であるか、異なる種類であってもよいが、これに制限されない。
【０１１４】
本発明に使用可能な非ペプチド性リンカーである非ペプチド性重合体は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、多糖類、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、ＰＬＡ（ポリ乳酸、polylactic acid）及びＰＬＧＡ（ポリ乳酸グリコール酸、polylactic-glycolic acid）のような生分解性高分子、脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸、オリゴヌクレオチド及びこれらの組み合わせで構成された群から選択されてもよく、その例として、ポリエチレングリコールであってもよいが、これに制限されない。当該分野ですでに知られているこれらの誘導体及び当該分野の技術水準で容易に製造できる誘導体も、本発明の範囲に含まれる。
【０１１５】
本発明で用いられてもよい非ペプチド性リンカーは、生体内のタンパク質分解酵素に抵抗性のある重合体であれば、制限なく用いられてもよい。非ペプチド性重合体の分子量は、０を超え、約１００ｋＤａの範囲、その例として、約０．５〜約１００ｋＤａ、約１〜約１００ｋＤａの範囲、または約１〜約２０ｋＤａの範囲であるが、これに制限されない。
【０１１６】
本発明において、用語、「約」は、±０．５、±０．４、±０．３、±０．２、±０．１などをすべて含む範囲であって、約という用語の後に来る数値と同等か類似の範囲の数値をすべて含むが、これに制限されない。
また、前記非ペプチド性リンカーは、一種類の重合体だけでなく、異なる種類の重合体の組み合わせが用いられてもよい。
【０１１７】
一方、本発明に用いられる非ペプチド性リンカーである非ペプチド性重合体は、免疫グロブリンＦｃ領域及び生理活性物質が共有結合を形成できるように、結合体を形成する前に、非ペプチド性リンカーは、Ｆ、ＸまたはＹの官能基と結合できる官能基を保有してもよい。
【０１１８】
具体的には、前記非ペプチド性リンカーは、少なくとも２つの末端官能基を有してもよく、具体的には、２つまたは３つの末端官能基を有してもよく、より具体的には、２つの末端官能基を有してもよい。
前記官能基は、アルデヒド基、マレイミド基及びスクシンイミド誘導体で構成された群から選択されてもよいが、これに制限されない。
前記で、アルデヒド基として、プロピオンアルデヒド基またはブチルアルデヒド基を例として挙げてもよいが、これに制限されない。
【０１１９】
前記で、スクシンイミド誘導体としては、スクシンイミジルバレレート、スクシンイミジルメチルブタノエート、スクシンイミジルメチルプロピオネート、スクシンイミジルブタノエート、スクシンイミジルプロピオネート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ヒドロキシスクシンイミジル、スクシンイミジルカルボキシメチルまたはスクシンイミジルカーボネートが用いられてもよいが、これに制限されない。
【０１２０】
前記非ペプチド性リンカーの両末端官能基は、互いに同じか異ってもよい。
例えば、一方の末端にはマレイミド基を有してもよく、他方の末端にはアルデヒド基、例えば、プロピオンアルデヒド基、またはブチルアルデヒド基を有してもよい。両末端にヒドロキシ官能基を有するポリエチレングリコールを非ペプチド性重合体として用いる場合には、公知の化学反応によって前記ヒドロキシ基を前記様々な反応基で活性化したり、商業的に入手可能な変形された反応基を有するポリエチレングリコールを用いて本発明の結合体を製造してもよい。
【０１２１】
また、前記非ペプチド性リンカーの両末端または三末端がすべてアルデヒド基である同種の機能性非ペプチド性重合体であってもよい。
例えば、前記非ペプチド性リンカーは、両末端にプロピオンアルデヒド基を有する非ペプチド性重合体、具体的には、両末端にプロピオンアルデヒド基を有するＰＥＧであってもよいが、特にこれに制限されない。
【０１２２】
前記非ペプチド性リンカーが両末端に反応アルデヒド基の官能基を有する場合、非特異的反応を最小化して、非ペプチド性重合体の両末端で生理活性ポリペプチド及び免疫グロブリンとそれぞれ結合するのに効果的である。アルデヒド結合による還元性アミン化で生成された最終的な産物は、アミド結合で連結されたものよりはるかに安定的である。アルデヒド官能基は、低いｐＨでＮ末端に選択的に反応し、高いｐＨ、例えばｐＨ９．０の条件ではリジン残基と共有結合を形成しうる。
【０１２３】
本発明の持続型脳標的結合体は、免疫グロブリンＦｃ領域と融合された脳標的ペプチド結合体がコードされた後に化学結合し、化学結合された免疫グロブリンＦｃ領域に他の生理活性物質が結合されて、互いに異なる生理活性物質が含まれた持続性結合体であってもよい。
【０１２４】
前記化学結合された免疫グロブリンＦｃ領域結合体は、２つの免疫グロブリンＦｃ領域（単量体Ｆｃ領域が結合した二量体形態のＦｃ領域）を有し、それぞれに結合する生理活性物質は、１ヶ所の免疫グロブリン領域（単量体Ｆｃ領域）のみ結合したり、２ヶ所の免疫グロブリン領域のすべて（それぞれ二量体形態のＦｃ領域）に結合してもよい。
【０１２５】
前記化学結合は共有結合であってもよく、より具体的には、ジスルフィド結合であってもよく、さらに具体的には、２つの免疫グロブリンＦｃ領域のヒンジ領域で形成されるジスルフィド結合であってもよいが、特にこれに制限されるものではない。
【０１２６】
より具体的には、（ｉ）前記したペプチド性リンカー（例えば、ペプチド結合）を介して脳標的ペプチドが１分子の免疫グロブリンＦｃ領域のＣ末端部位に連結された、第１免疫グロブリンＦｃ領域、及び（ｉｉ）前記したペプチド性リンカー（例えば、ペプチド結合）を介して脳標的ペプチドが１分子の免疫グロブリンＦｃ領域のＣ末端部位に連結された、第２免疫グロブリンＦｃ領域が化学結合を介して二量体を形成し、これらの二量体形態の免疫グロブリンＦｃ領域の２分子のいずれかの１分子のＮ末端領域に１分子の生理活性物質が連結されるか、または２分子すべてのＮ末端領域のそれぞれに生理活性物質が一つずつ連結された形態であってもよいが特にこれに制限されない。前記した第１免疫グロブリンＦｃ領域及び第２免疫グロブリンＦｃ領域は融合タンパク質の形態であって、免疫グロブリンＦｃ領域が、脳標的ペプチドとペプチド結合を介してインフレーム融合されたものであってもよく、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含んでもよいが、特にこれに制限されない。
【０１２７】
前記第１免疫グロブリンＦｃ領域及び第２免疫グロブリンＦｃ領域間の化学結合は、具体的には、共有結合であってもよく、より具体的には、ジスルフィド結合であってもよく、さらに具体的には、２つ免疫グロブリンＦｃ領域のヒンジ領域で形成されるジスルフィド結合であってもよいが、特にこれに制限されるものではない。
【０１２８】
本発明は、もう一つの様態として、前記式（１）の脳標的持続型結合体を製造する方法を提供する。
一つの具体例として、前記製造方法は、（ｉ）（ａ）生理活性物質であるＸ、ペプチド性または非ペプチド性リンカーであるＬ1、及び免疫グロブリンＦｃ領域を含むＦが結合された、Ｘ−Ｌ1−Ｆ 、及び（ｂ）脳標的ペプチドであるＹ、ペプチド性または非ペプチド性リンカーであるＬ2が結合されたＬ2−Ｙを製造する段階；及び（ｉｉ）前記（ａ）Ｘ−Ｌ1−Ｆ及び（ｂ）Ｌ2−Ｙを連結する段階を含む、前記式（１）の脳標的持続型結合体を製造する方法であることを特徴としてもよい。この時、もう一つの具体例として、前記（ａ）のＬ1はペプチド性リンカーであり、（ｂ）のＬ2は非ペプチド性リンカーであることを特徴としてもよい。
【０１２９】
もう一つの具体例として、前記製造方法は、（ｉ）（ａ）生理活性物質であるＸ、及びペプチド性または非ペプチド性リンカーであるＬ1が結合された、Ｘ−Ｌ1及び（ｂ）脳標的ペプチドであるＹ、ペプチド性または非ペプチド性リンカーであるＬ2、及び免疫グロブリンＦｃ領域を含むＦが結合されたＦ−Ｌ2−Ｙを製造する段階； 及び（ｉｉ）前記（ａ）Ｘ−Ｌ1及び（ｂ）Ｆ−Ｌ2−Ｙを連結する段階を含む、前記式（１）の脳標的持続型結合体を製造する方法であることを特徴とする。この時、もう一つの具体例として、前記（ａ）のＬ1は非ペプチド性リンカーであり、（ｂ）のＬ2はペプチド性リンカーであることを特徴としてもよい。
【０１３０】
もう一つの具体例として、前記の製造方法は、（ｉ）脳標的ペプチドであるＹ、ペプチド性または非ペプチド性リンカーであるＬ2、及び免疫グロブリンＦｃ領域を含むＦが結合されたＦ− Ｌ2−Ｙを製造する段階；及び（ｉｉ）前記Ｆ−Ｌ2−ＹとＸとをペプチド性または非ペプチド性リンカーであるＬ1で連結する段階を含む、前記式（１）の脳標的持続型結合体を製造する方法であることを特徴とする。この時、もう一つの具体例として、前記Ｌ1は非ペプチド性リンカーであり、Ｌ2はペプチド性リンカーであることを特徴としてもよい。前記Ｌ2は０個のアミノ酸であってもよく、この場合、Ｆ−Ｙの形態で直接融合形態であってもよい。
【０１３１】
もう一つの具体例として、前記非ペプチド性リンカー及びＸ及びＹは、それぞれの官能基によって連結され、この時、非ペプチド性リンカーの官能基がアルデヒド基、マレイミド（maleimide）基及びスクシンイミド誘導体（succinimide derivative ）からなる群から選択されたものであってもよい。
【０１３２】
本発明の前記脳標的ペプチド及び生理活性物質を含む持続型結合体は、血液脳関門の通過が可能であり、生理活性が維持されて持続性と安定性が向上された持続性結合体を提供する。
本発明を具現する他の一つの様態は、前記脳標的ペプチド、前記脳標的ペプチドをコードする分離されたポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び前記発現ベクターを含む形質転換体を提供する。
一方、前記脳標的ペプチドは、ペプチドそれ自体、その塩（例えば、前記ペプチドの薬学的に許容可能な塩）、またはそれらの溶媒和物の形態をすべて含む。
【０１３３】
また、脳標的ペプチドは、薬学的に許容される任意の形態であってもよい。
前記塩の種類は特に制限されない。ただ、個体、例えば哺乳類に安全かつ効果的な形態であることが望ましいが、特にこれに制限されるものではない。
前記用語、「薬学的に許容される」は、医薬的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、またはアレルギー反応などを引き起こすことなく、目的の用途に効果的に使用可能な物質を意味する。
【０１３４】
本発明において、用語、「薬学的に許容される塩」とは、薬学的に許容される無機酸、有機酸、または塩基から誘導された塩を含む。適切な酸の例としては、塩酸、臭素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、リン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、コハク酸、トルエン−ｐ−スルホン酸、酒石酸、酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ベンゼンスルホン酸などが挙げられる。適切な塩基から誘導された塩は、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属、マグネシウムなどのアルカリ土金属、及びアンモニウムなどを含んでもよい。
また、本発明で用いられる用語、「溶媒和物」は、本発明に係るペプチドまたはその塩が溶媒分子と複合体を形成したものをいう。
【０１３５】
前記脳標的ペプチドをコードする分離されたポリヌクレオチドは、その配列と７５％以上、具体的には８５％以上、より具体的には、９０％以上、さらに具体的には、９５％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を本発明のカテゴリに含む。
【０１３６】
本発明に係る組換えベクターは、典型的にクローニングのためのベクターまたは発現のためのベクターとして構築されてもよく、原核細胞または真核細胞を宿主細胞にして構築されてもよい。
本発明において、用語、「ベクター」とは、適当な宿主細胞で目的タンパク質を発現できる組換えベクターであって、核酸挿入物が発現されるように動作可能に連結された必須的な調節要素を含む核酸構造物（construct）を意味する。
【０１３７】
前記組換えベクターを宿主細胞に形質転換（transformation）または形質感染（transfection）させることで、本発明の脳標的持続型結合体を収得してもよい。
本発明で前記脳標的ペプチドをコードするポリヌクレオチドは、プロモーターに作動可能に連結されてもよい。
【０１３８】
本発明に係るポリヌクレオチドを含む組換えベクターを形質転換させるための方法は、前記例に限定されず、当業界で一般的に用いられる形質転換または形質感染の方法が制限なく用いられてもよい。
本発明に係るポリヌクレオチドを含む組換えベクターを宿主細胞内に導入することにより、本発明の形質転換体（transformant）を獲得してもよい。
【０１３９】
本発明に適した宿主は、本発明に係るポリヌクレオチドを発現するようにする限り、特に制限されない。本発明に用いられてもよい宿主の特定の例として、大腸菌（E. coli）のようなエシェリキア（Escherichia）属細菌；バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）のようなバチルス（Bacillus）属細菌；シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）のようなシュードモナス（Pseudomonas）属細菌；ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）のような酵母；スポドプテラ・フルギペルダ（ＳＦ９）のような昆虫細胞；及びＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＳＣなどの動物細胞がある。
以下、下記実施例により本発明をより詳細に説明する。ただ、下記実施例は、本発明を例示するためのもので、本発明の範囲がこれに制限されるものではない。
【実施例】
【０１４０】
実施例１：免疫グロブリンＦｃ領域及び脳標的ペプチドが結合された融合タンパク質の製造
免疫グロブリン不変領域を含み、ＦｃＲｎ結合部位を有する生体適合性の物質、脳標的ペプチド及び生理活性物質が、ペプチド性リンカーで連結された脳標的ペプチド及び生理活性ポリペプチドを含む持続性結合体を製造するために、免疫グロブリンＦｃ領域及び脳標的ペプチドが結合された融合タンパク質を製造した。
そこで、脳標的ペプチドの例として、５つのペプチドを選択した（表１）。
【０１４１】
【表１】
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【０１４２】
結合された生理活性ポリペプチドの半減期を増加させうる生体適合性の物質として、ヒンジ領域が含まれるＩｇＧ４ Ｆｃ領域を選択し、前記ヒンジ領域が含まれたＩｇＧ４ Ｆｃ領域と脳標的ペプチドを遺伝子レベルで融合して発現ベクターにそれぞれ挿入した。
前記ヒンジ領域が含まれたＩｇＧ４ Ｆｃ領域と脳標的ペプチドは、ペプチドリンカーで連結するか、直接融合する方式により、具体的には下記のようなヒンジ領域が含まれたＩｇＧ４ Ｆｃ領域と脳標的ペプチドとが含まれた融合タンパク質を合成した（Ｂｉｏｎｅｅｒで合成）（表２）。下記表２−１〜２−６の配列で分かるように、ＩｇＧ４ Ｆｃ領域のＣ末端に脳標的ペプチドのＮ末端がペプチドリンカーで連結されるか、直接融合する方式により製造された免疫グロブリンＦｃ領域及び脳標的ペプチドが結合された融合タンパク質を製造した。
【０１４３】
【表２】
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合成された免疫グロブリンＦｃ領域と融合された脳標的ペプチドをコードする遺伝子は、両末端にＮｄｅＩとＢａｍＨＩを含んでおり、ＮｄｅＩとＢａｍＨＩで切断したｐＥＴ２２ｂ発現ベクターに挿入した。前記免疫グロブリンＦｃ領域と融合された脳標的ペプチドをコードする遺伝子が挿入された発現ベクターをＢＬ２１（ＤＥ３）菌株に挿入し、免疫グロブリンＦｃ領域と脳標的ペプチドが連結された持続型融合タンパク質を発現させた。
【０１４４】
実施例２：脳標的ペプチドの製造
免疫グロブリンＦｃ領域に融合する様々な脳標的ペプチドを探索するために、前記ＢＴＰ１〜ＢＴＰ５を含み、追加の脳標的ペプチドを設計して合成した（表３）。
【表３】
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前記脳標的ペプチドが実際に脳標的になるかどうかを確認するために、インビトロ（in vitro）及びインビボ（in vivo）試験を行った。
【０１４５】
実施例３：脳標的ペプチドの通過細胞外排出の分析（Transcytosis assay）
脳標的ペプチドの血液脳関門（blood brain barrier、ＢＢＢ）の通過程度を確認するために、通過細胞外に排出（transcytosis）実験を行った。ヒト脳内皮細胞（Human cerebral endothelial cells）であるｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞を微多孔膜（microporous membrane）の上で５×1０4細胞／ｃｍ2で１０日間培養した。ＢＢＢが形成がされたかどうかを確認するために、ＦＩＴＣ−デキストラン（７０ｋＤａ）で浸透実験（penetration test）を行い、タイトジャンクション（tight junction）が形成されることを確認した後、２５ｍＭのＦＩＴＣ−ＢＴＰ５、ＦＩＴＣ−ＢＴＰ１１、ＦＩＴＣ−ＢＴＰ１２、 ＦＩＴＣ−ＢＴＰ１６及びＦＩＴＣ− エキセンジン−４、ＦＩＴＣ−Ｐ−８（陰性対照区、Ｐ−８）をｈＣＭＥＣ／Ｄ３の上に置き、２時間、２４時間後にＦＩＴＣの蛍光光度（fluorescence intensity）を測定した（図１）。
その結果、すべてのＢＴＰはエキセンジン−４と陰性対照区（Ｐ−８）より高い通過を示した。時間が経つにつれて、ＢＴＰ５、ＢＴＰ１１、ＢＴＰ１６などの脳標的ペプチドの通過が増加することが確認できた。
前記のような結果は、本発明で確認した脳標的ペプチドが効果的にＢＢＢを通過できることを示唆する。
【０１４６】
実施例４：脳標的ペプチドの脳分布（brain distribution）の確認
脳標的ペプチドの血液脳関門（blood brain barrier）の通過程度を確認するために、マウスでの脳分布実験（brain distribution test）を行った。マウスのＣＣＡ（common carotid artery）を介して２ｍｇ／ｈｅａｄで投与した後にマウスの脳を分離した後、断片に切ってＦＩＴＣの蛍光（fluorescence）を用い、顕微鏡で脳標的ペプチドの血液脳関門の通過程度を確認した（図２）。
ＣＣＡを介して注入された脳標的ペプチドは、注入特性上、一方の脳領域に広がるべきであるが、試験結果、脳の一方の領域に広がることを１２．５倍率の顕微鏡で観察できた。また、長期記憶に重要な役割をする海馬体（hippocampus）の細胞体が分布する領域にＦＩＴＣの蛍光が観察されることを２００倍率の顕微鏡で確認できた。これにより、脳標的ペプチドが血液脳関門を通過して脳組織に入ることを確認した。
このような結果は、本発明の脳標的ペプチドがインビトロだけでなく、実際の生体内でも脳への標的化が可能であることを示唆するもので、脳標的ペプチドに結合された生理活性物質もＢＢＢを通過して効果的に脳への伝達ができることを示唆する。また、持続型結合体の形態である本発明の結合体は、生体内持続性が増加し、このような持続性が増加するほど脳への標的化がさらに効率的に実行されうることを示唆する。
【０１４７】
実施例５：免疫グロブリンＦｃ領域と脳標的ペプチドとを含む融合タンパク質の発現ベクターの製造
追加の融合タンパク質を発現するために発現ベクターを製造した。結合された生理活性ポリペプチドの半減期を増加させうる生体適合性物質として、ヒンジ領域が含まれたＩｇＧ４ Ｆｃ領域を選択し、前記ヒンジ領域が含まれたＩｇＧ４ Ｆｃ領域と脳標的ペプチドを遺伝子レベルで融合して発現ベクターにそれぞれ挿入した。
前記ヒンジ領域が含まれたＩｇＧ４ Ｆｃ領域と脳標的ペプチドは、ペプチドリンカーで連結するか、直接融合する方式によって、具体的には下記表４のような配列を有する、ヒンジ領域が含まれたＩｇＧ４ Ｆｃ領域とそのＦｃ ＣＨ３領域のＣ末端の方向に脳標的ペプチドがペプチド結合で連結された融合タンパク質を合成した（韓国バイオニア社で合成）（表４）。下記表４−１〜４−７の配列から分かるように、ＩｇＧ４ Ｆｃ領域のＣ末端に脳標的ペプチドのＮ末端がペプチドリンカーで連結されるか、直接融合する方式により製造された免疫グロブリンＦｃ領域及び脳標的ペプチドが結合された融合タンパク質を製造した。
【０１４８】
【表４】
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【０１４９】
合成された免疫グロブリンＦｃ領域と融合された脳標的ペプチドをコードする遺伝子は、両末端にＮｄｅＩとＢａｍＨＩを含んでいて、ＮｄｅＩとＢａｍＨＩで切断したｐＥＴ２２ｂ発現ベクターに挿入した。前記免疫グロブリンＦｃ領域と融合された脳標的ペプチドをコードする遺伝子が挿入された発現ベクターをＢＬ２１（ＤＥ３）菌株に挿入して、免疫グロブリンＦｃ領域と融合された脳標的ペプチド持続型融合タンパク質を発現させた。
【０１５０】
実施例６：免疫グロブリンＦｃ領域と２つ以上の脳標的ペプチドが連結されている融合タンパク質の発現ベクターの製造
受容体結合力を増加させるための追加的な融合タンパク質を発現するために発現ベクターを製造した。結合された生理活性ポリペプチドの半減期を増加させうる生体適合性物質として、ヒンジ領域が含まれたＩｇＧ４ Ｆｃ領域を選択し、前記構築された発現ベクターにリンカーと脳標的ペプチドを遺伝子レベルで部位特異的変異（site-directed mutagenesis）ＰＣＲ技法を用いて挿入した。具体的には、配列番号プライマー（表５）を用いて、免疫グロブリンＦｃ領域のＣ末端と脳標的ペプチドのＮ末端の間、または脳標的ペプチドのＣ末端とベクターのＢａｍＨＩが含まれた部位の間にリンカーと脳標的ペプチドを挿入した。前記のＰＣＲ技法で２つ以上に複製された脳標的ペプチドを含む融合タンパク質（表６）を発現する発現ベクターを構築した。この融合タンパク質は、表６に示した配列を有するが、例えば、Ｆｃ−ＢＴＰ２２結合体は前記表２のＢＴＰ５ペプチドの２単位がリンカーを介してＦｃ切片のＣＨ３領域のＣ末端方向にペプチド結合する。具体的には、下記表６で確認できるように、免疫グロブリンＦｃ領域のＣ末端と脳標的ペプチドのＮ末端がペプチドリンカーで連結されるか、直接融合する方式によって製造された。この場合、脳標的ペプチドは、縦列（tandem）に連結される２つ以上の脳標的ペプチドは、１単位の脳標的ペプチドがリンカーで連結される形態である。
【０１５１】
【表５】
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【０１５２】
【表６】
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【０１５３】
実施例７：免疫グロブリンＦｃ領域及び脳標的ペプチドが融合された融合タンパク質の発現
ｐＥＴ２２ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社）のＴ７プロモーター調節下の免疫グロブリンＦｃ領域及び脳標的ペプチドが融合された融合タンパク質の発現を行った。それぞれの構築された発現ベクターでＥ.ｃｏｌｉ ＢＬ２１−ＤＥ３（Ｅ. ｃｏｌｉ Ｂ Ｆ−ｄｃｍ ｏｍｐＴ ｈｓｄＳ(ｒＢ−ｍＢ−) ｇａｌ λＤＥ３）；Ｎｏｖａｇｅｎ）を形質転換した。形質転換の方法は、Ｎｏｖａｇｅｎ社で推薦する方法に従った。各組換え発現ベクターが形質転換された個々の単一コロニーを取り、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）が含まれた２×ルリアブロス（Luria Broth、ＬＢ）培地に接種し、３７℃で１５時間培養した。組換え菌株の培養液と３０％グリセロールが含まれた２×ＬＢ培地を１：１（ｖ／ｖ）の割合で混合して、各１ｍｌずつクライオチューブに分注し、−１４０℃に保管した。これを組換え融合タンパク質の生産のための細胞ストック（cell stock）として使用した。
免疫グロブリンＦｃ領域及び脳標的ペプチドが融合された結合体の発現のために、各細胞ストック（stock）１バイアル（vial）を溶かして、５００ｍｌの２×ルリアブロス（ＬＢ）培地に接種し、３７℃で１４〜１６時間振とう培養した。ＯＤ６００の値が４．０以上を示すと培養を終了し、これを種培養液として用いた。５Ｌ発酵器（Ependorf、アメリカ）を用いて、種培養液を１．６Ｌの発酵培地に接種し、初期バッチ（bacth）発酵を開始した。培養条件は、温度３７℃、空気量２Ｌ／分（１ｖｖｍ）、攪拌速度６５０ｒｐｍ及び２０％アンモニア水を用いてｐＨ６．７０に維持した。発酵の進行は、培養液内の栄養素が制限された時、追加培地（feeding solution）を添加して、流加培養を行った。菌株の成長は、ＯＤ値によってモニタリングし、ＯＤ値が１２０以上で最終濃度０．５ｍＭのＩＰＴＧで導入した。培養は導入した後、約２３〜２５時間までさらに進行し、培養終了後、遠心分離器を使用して組換え菌株を収穫し、使用するまで−８０℃で保管した。
【０１５４】
実施例８：免疫グロブリンＦｃ領域及び脳標的ペプチドが融合された融合タンパク質の回収及びリフォールディング（refolding）
前記実施例７で発現させた免疫グロブリンＦｃ領域及び脳標的ペプチドが融合された融合タンパク質を可溶性の形態に変えるために、細胞を破砕してリフォールディングした。各培養液２００ｍｌに該当する細胞ペレットを２００ｍｌの溶解緩衝液（５０ｍＭトリス（ｐＨ９．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０．２Ｍ塩化ナトリウム及び０．５％トリトンＸ−１００）に再浮遊した。マイクロフルイダイザー（microfluidizer）プロセッサーＭ−１１０ＥＨ（AC Technology Corp. Model M1475C）を用いて、１５，０００ｐｓｉの圧力で実行し、細胞を破砕した。破砕された細胞溶解物を１２，２００ｇで４℃で３０分間遠心分離して上澄み液を捨てて、２００ｍＬの洗浄緩衝液（０．５％トリトンＸ−１００及び２０ｍＭトリス（ｐＨ８．０））に再浮遊した。１２，２００ｇで４℃で３０分間遠心分離してペレットを２００ｍＬの洗浄緩衝液（２０ｍＭトリス（ｐＨ８．０））に再浮遊した後、同様の方法で遠心分離した。ペレットを取って、１００ｍＬの緩衝液（８Ｍグアニジン−ＨＣｌ、５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０））に再浮遊して、常温で２時間攪拌した。２時間後、１２，２００ｇで２３℃で３０分間遠心分離した後、上澄み液を取った後に２．５ｍＭジチオトレイトール（Dithiothreitol）を添加した後、３７℃で３０分間攪拌した。可溶化された免疫グロブリンＦｃ領域及び脳標的ペプチドが融合された融合タンパク質のリフォールディング（refolding）のために、ここに３．５Ｌの緩衝液（３Ｍウレア、１ｍＭシステイン、０．１６０Ｍアルギニン、５０ｍＭトリス（ｐＨ９．２）、２０％グリセロール）を蠕動ポンプ（peristaltic pump）を用いて１ｍＬ／分の流速で入れながら４℃で３６時間撹拌した。免疫グロブリンＦｃ領域及び脳標的ペプチドが融合された融合タンパク質内の免疫グロブリンＦｃ領域は、二量体（dimer）で発現する。
【０１５５】
実施例９：親和性結合クロマトグラフィー（affinity chromatography）の精製
リフォールディングが終わった試料を１２，２００ｇで４℃で３０分間遠心分離した後、上澄み液を取って０．２２μｍのフィルター（satorius）でフィルタリングした後、試料のｐＨを５０％ＨＣｌを用いてｐＨ７．５に調整した。１０ｍＭトリス（ｐＨ７．０）を緩衝液で平衡化したプロテインＡ−セファロース（GE healthcare社）カラムに試料を結合させた後、１００ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．３）と１０％グリセロール緩衝液を用いて、免疫グロブリンＦｃ領域及び脳標的ペプチドが融合された結合体タンパク質を溶出した。
【０１５６】
実施例１０：疎水性結合クロマトグラフィーの精製
溶出された試料に０．６Ｍ硫酸アンモニウムを挿入した後、１０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）と０．６Ｍ硫酸アンモニウム緩衝液で平衡化されたＰｈｅｎｙｌ ＨＰ（GE healthcare社）カラムに０．６Ｍ硫酸アンモニウムを挿入した試料を結合させた後、１０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）緩衝液を用いて濃度が０％から１００％になるように６カラム容量の直線濃度勾配で免疫グロブリンＦｃ領域及び脳標的ペプチドが融合された融合タンパク質を溶出した。
【０１５７】
実施例１１：免疫グロブリンＦｃ領域と脳標的ペプチドが連結されている融合タンパク質の脳分布（brain distribution）の確認
免疫グロブリンＦｃ領域と脳標的ペプチドが連結されている融合タンパク質の血液脳関門（blood brain barrier）の通過程度を確認するために、マウスで脳分布実験（brain distribution test）を行った。マウスの静脈内注射（intravenous）を介して、１０ｍｇ／ｋｇで投与した後、２時間後にマウスの脳を分離した後、免疫グロブリンＦｃ領域と脳標的ペプチドが連結されている融合タンパク質の濃度を測定して、血液脳関門の通過程度を確認した（図３）。
その結果、免疫グロブリンＦｃ領域と脳標的ペプチドの血液脳関門の通過程度は、免疫グロブリンＦｃ領域より血清に比べて脳で高濃度で測定され、高い通過程度を示した。免疫グロブリンＦｃ領域に同一種類の脳標的ペプチドが２つ以上連結されている融合タンパク質の場合、１つだけ連結された時より脳で高い濃度で測定され、高いＴ／Ｓ ｒａｔｉｏを確認できた。
このような結果は、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域と脳標的ペプチドが融合された融合タンパク質が実際の生体内でも効果的にＢＢＢを通過して、脳への伝達が可能であることを示唆する。また、持続型結合体の形態である本発明の融合タンパク質は、生体内の持続性が増加し、このような持続性が増加するほど脳への標的化がさらに効率的に実行されうることを示唆する。
以下では、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域と脳標的ペプチドが融合された持続型融合タンパク質に生理活性物質が連結された場合も、効果的にＢＢＢを通過して脳に伝達されて、脳で生理活性を示すことを確認する実験を追加で行った。
【０１５８】
実施例１２：イデュルスルファーゼ（Idursulfase）とＰＥＧ結合体の製造
典型的なサイズのタンパク質を生理活性物質として含む脳標的持続型結合体の例として、イデュルスルファーゼ（約７２ｋＤａ）を含む脳標的持続型結合体を製造した。この脳標的持続型結合体の前駆体として、まずイデュルスルファーゼにリンカーとしてポリエチレングリコールが連結されたモノＰＥＧ化結合体を次のように製造した。
イデュルスルファーゼ（アイルランドShire社）を適正濃度まで濃縮した後、１０Ｋブチル−ＡＬＤ（２）ＰＥＧ（両末端の水素がそれぞれブチルアルデヒド基に改質されている１０ｋＤａポリエチレングリコール、日本のＮＯＦ社）をイデュルスルファーゼのＮ末端にＰＥＧ化させるため、イデュルスルファーゼ：１０Ｋブチル−ＡＬＤ（２）ＰＥＧのモル比を１：１０になるようにして、イデュルスルファーゼ濃度を１０ｍｇ／ｍＬとし、４℃で約２時間反応させた。この時、０．１Ｍリン酸カリウム（ｐＨ６．０）緩衝溶液に２０ｍＭ濃度のＮａＢＨ3ＣＮ（sodium cyanoborohydirde）還元剤を添加して反応させた。反応液は、リン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）とＮａＣｌ濃度勾配を利用したＳｏｕｒｃｅ １５Ｑ（GE、米国）カラムを用い、モノＰＥＧ化結合体であるイデュルスルファーゼ−１０Ｋ ＰＥＧを精製した。
【０１５９】
実施例１３：脳標的持続型結合体であるイデュルスルファーゼ−１０ＫＤａ ＰＥＧ−Ｆｃ−ＢＴＰ２２結合体の製造
次に、イデュルスルファーゼ−１０ｋＤａ ＰＥＧ結合体を脳標的ペプチドを含むＦｃ切片に連結させて脳標的持続型結合体を製造した。実施例１２で精製したイデュルスルファーゼ−１０Ｋ ＰＥＧと脳標的融合タンパク質の代表例であるＦｃ−ＢＴＰ２２のモル比が１：１０になるようにして、イデュルスルファーゼ濃度を１０ｍｇ／ｍＬとし、２５℃で１５時間反応させた。この時、反応液はダルベッコリン酸緩衝液（ＤＰＢＳ）と還元剤として１０ｍＭ ＮａＢＨ3ＣＮを添加した。
反応が終結した後、反応液をリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）とＮａＣｌ濃度勾配を用いてＳｏｕｒｃｅ １５Ｑ（GE、米国）カラムに適用し、硫酸アンモニウムとリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）の濃度勾配を用いてＳｏｕｒｃｅ １５ＩＳＯ（ＧＥ、米国）に適用し、目的とする脳標的持続型結合体であるイデュルスルファーゼ−１０Ｋ ＰＥＧ−Ｆｃ−ＢＴＰ２２を精製した。これはイデュルスルファーゼ−Ｆｃ−ＢＴＰ２２と混用される。
【０１６０】
実施例１４：ＧＩＰ誘導体とＰＥＧとの結合体の製造
典型的なサイズのペプチドを生理活性物質として含む脳標的持続型結合体の例として、４０個のアミノ酸残基からなるＧＩＰ（glucose-dependent insulinotropic polypeptide）受容体刺激活性のある人工ＧＩＰ誘導体の脳標的持続型結合体を製造した。この持続型結合体の前駆体として、まず人工ＧＩＰ誘導体のリンカーとしてポリエチレングリコールが連結されたモノＰＥＧ化結合体を次のように製造した。
１０ｋ ＭＡＬ−ＰＥＧ−ＡＬＤ（一末端の水素原子が３−［Ｎ−（３−Ｎ−マレイミド−１−オキソプロリル）アミノ］プロピル基、反対側末端の水素原子が３−オキソプロピル基（プロピルアルデヒド基）に改質されている１０ｋＤａポリエチレングリコール、日本のＮＯＦ社）をこのＧＩＰ誘導体のＣ末端システインにＰＥＧ化させるために、ＧＩＰ誘導体：ＰＥＧのモル比を１：１．３になるようにして、ＧＩＰ誘導体の濃度を３ｍｇ／ｍＬとし、４℃で約１時間反応させた。この時、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）＋４５％イソプロパノール溶媒で反応させた。反応液は、クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０）＋４５％エタノールとＫＣｌ濃度勾配を用いたＳＰ ＨＰ（ＧＥ、米国）カラムを用い、モノＰＥＧ化結合体であるＧＩＰ誘導体−１０Ｋ ＰＥＧを精製した。
【０１６１】
実施例１５：ＧＩＰ誘導体−１０Ｋ ＰＥＧ−Ｆｃ−ＢＴＰ２２結合体の製造
次に、ＧＩＰ誘導体−１０Ｋ ＰＥＧ結合体を脳標的ペプチドを含むＦｃ切片に連結させて脳標的持続型結合体を製造した。実施例１４で精製したＧＩＰ誘導体−１０Ｋ ＰＥＧとＦｃ−ＢＴＰ２２のモル比が１：２になるようにして、全体反応濃度を４．５５ ｍｇ／ｍＬとし、４℃で１６時間反応させた。この時、反応液は、ＤＰＢＳと還元剤として２０ｍＭ ＮａＢＨ3ＣＮを添加した。
反応が終結した後、反応液はリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）と硫酸アンモニウム濃度勾配を用いて、Ｓｏｕｒｃｅ １５ＩＳＯ（GE、米国）カラムに適用し、同じ緩衝液と同じカラムに再び適用して、目的とする脳標的持続型結合体であるＧＩＰ誘導体−１０Ｋ ＰＥＧ−Ｆｃ−ＢＴＰ２２を精製した。これはＧＩＰ誘導体−Ｆｃ ＢＴＰ２２と混用される。
【０１６２】
実施例１６：脳標的持続型結合体の通過細胞外排出の分析
実施例で得られた脳標的持続型結合体の血液脳関門の通過程度を確認するために、通過細胞外排出（transcytosis）実験を行った。ヒト脳内皮細胞（Human cerebral endothelial cells）であるｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞を微多孔膜（microporous membrane）の上で５×1０4細胞／ｃｍ2で１０日間培養した。ＢＢＢが形成されたかどうかを確認するために、ＦＩＴＣ−デキストラン（７０ｋＤａ）で浸透実験（penetration test）を行い、タイトジャンクション（tight junction）が形成されたことを確認した後、２５ｍＭの脳標的持続型結合体をｈＣＭＥＣ／Ｄ３の上に置き、２時間、４時間後にＥＬＩＳＡ ｋｉｔを用いてタンパク質の濃度を測定した。
その結果、ＧＩＰ誘導体−１０Ｋ ＰＥＧ−Ｆｃ−ＢＴＰ２２は、対照群と比較して、血液脳関門の通過効果を示し、時間の経過とともに通過率も高くなることが確認できた（図４）。イデュルスルファーゼ−１０Ｋ ＰＥＧ−Ｆｃ−ＢＴＰ２２に対しても同様の血液脳関門の透過性が見られた（図示せず）。
前記のような結果は、本発明で確認した脳標的持続結合体が効果的にＢＢＢを通過することができることを示唆する。
【０１６３】
実施例１７：イデュルスルファーゼ−１０ｋＤａ ＰＥＧ−Ｆｃ−ＢＴＰ２２結合体の活性の測定
イデュルスルファーゼ−１０Ｋ ＰＥＧ−Ｆｃ−ＢＴＰ２２結合体の製造に伴うイデュルスルファーゼの酵素活性（specific activity）の変化があるかどうかを測定するために、インビトロ酵素活性実験を行った。イデュルスルファーゼの酵素基質として知られている4-Methylumbelliferyl α-L-Idopyranosiduronic Acid-2-sulfate Sodium Salt（４ＭＵ−α−ＩｄｏｐｙｒａＡ−２）をイデュルスルファーゼβ及びＩＤＳ−Ｆｃ−ＢＴＰ２２と３７℃で４時間反応させた後、二次反応酵素であるα−イズロニダーゼと再び３７℃で２４時間反応させた。最終的に生成された４−メチルウンベリフェロン（4-Methylumbelliferone；４ＭＵ）の蛍光を測定することにより、前記物質に対する酵素活性を測定した（図５）。
その結果、結合体を形成しない遊離イデュルスルファーゼとイデュルスルファーゼ−１０Ｋ ＰＥＧ−Ｆｃ−ＢＴＰ２２の酵素活性がそれぞれ２３．４±１．９４、１０．８±１．３９ｎｍｏｌ／分／μgで示された。ここで酵素活性の値はイデュルスルファーゼの換算重量（μg）当たりの比活性（Specific activity）で計算したが、つまり、時間当たり酵素反応の数を遊離イデュルスルファーゼの場合は重量で、イデュルスルファーゼ−１０Ｋ ＰＥＧ−Ｆｃ−ＢＴＰ２２の場合はこの結合体内でイデュルスルファーゼ部分が占める換算重量で割った値である。結論として、イデュルスルファーゼに比べてイデュルスルファーゼ−１０Ｋ ＰＥＧ−Ｆｃ−ＢＴＰ２２の酵素活性が４６．６％で、一部が減少したが、酵素を本発明の脳標的持続型結合体に製造したときにも、その結合体で有意な酵素活性が示されることを確認した。
前記で製造された持続性結合体は、Ｆｃ領域に結合された脳標的ペプチドによって血液脳関門の通過が可能であり、結合された生理活性物質の生理活性が維持されて、持続性かつ安定性が改善された持続性結合体を提供して、新しいＢＢＢ通過が可能な治療薬の開発プラットフォームを提供できる。
【０１６４】
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者は、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更せず、他の具体的な形態で実施されうることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はすべての面で例示的なものであり、制限的なものではないものと理解しなければならない。本発明の範囲は、前記詳細な説明より、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導き出されるすべての変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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