(57)【要約】試料ウェルの表面を調製する方法が提供される。いくつかの態様において、試料ウェル表面を調製する方法は、試料ウェルをブロックコポリマーと接触させて、試料ウェルの金属酸化物表面上に防汚オーバーレイを形成することを含む。いくつかの態様において、試料ウェル表面を不動態化および／または選択的に官能化する方法が提供される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料ウェルのシリカ表面を官能化する方法であって、前記方法は、
金属酸化物表面およびシリカ表面を有する試料ウェルを、金属酸化物表面上のコーティング層に優先的に結合するブロックコポリマーと接触させることと、
前記試料ウェルを、シリカ表面に優先的に結合して官能化シリカ表面を生成する官能化剤と接触させることであって、前記官能化剤はカップリング部分を含む、前記官能化剤と接触させることと、
を含む方法。
【請求項２】
前記試料ウェルを、前記金属酸化物表面に優先的に結合して前記金属酸化物表面上にコーティング層を形成する両親媒性試薬と接触させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記両親媒性試薬が、金属酸化物表面に優先的に結合するように構成された親水性頭部基と、ブロックコポリマーに優先的に結合するように構成された疎水性尾部基とを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記親水性頭部基が、硫酸塩、亜硫酸塩、リン酸塩、ホスホン酸塩、ヒドロキシル、カテコール酸塩、イソシアネート、ヒドロキサメート、またはカルボキシル官能基を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記疎水性尾部基がＣ１−Ｃ３０アルキル鎖を含む、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
前記両親媒性試薬が、式ＣＨ３（ＣＨ２）ｎＰＯ３Ｈ２のアルキルホスホン酸化合物を含み、式中、ｎが１〜３０の値を有する整数である、請求項２〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記両親媒性試薬が、ヘキシルホスホン酸、オクチルホスホン酸、デシルホスホン酸、ドデシルホスホン酸、ポリビニルホスホン酸、１２−ホスホノ−１−ドデカンスルホン酸、１０−ウンデシニルホスホン酸、またはヘプタデカフルオロデシルホスホン酸を含む、請求項２〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ブロックコポリマーが、ＡブロックおよびＢブロックを含むＡＢＡ型ブロックコポリマーである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記コーティング層が、ＡＢＡ型ブロックコポリマーのＢブロックに優先的に結合する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ＢブロックがＡブロックよりも疎水性が高い、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
Ａブロックが第１のポリエーテルブロックを含み、Ｂブロックが第１のポリエーテルブロックよりも疎水性の高い第２のポリエーテルブロックを含む、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ＡＢＡ型ブロックコポリマーが式Ｉ：
（Ａａ）（Ｂｂ）（Ａａ）  （式Ｉ）
式中、ＡはＡブロックを含むポリエーテル化合物のモノマー単位であり、ａは２〜１５０の値の整数であり；Ｂは、Ｂブロックを含むポリエーテル化合物のモノマー単位であり；かつｂは１０〜１００の値の整数である、
の化合物である、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
Ａブロックがポリエチレンオキシドを含み、Ｂブロックがポリプロピレンオキシドを含む、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ＡＢＡ型ブロックコポリマーが式ＩＩの化合物である：
【化１】
2020520332.tif 000005
式中、ａは２〜１５０の値の整数であり、ｂは１０〜１００の値の整数である、
請求項８〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記金属酸化物表面が、酸化アルミニウム、酸化チタン、酸化ジルコニウム、酸化鉄、酸化スズ、または酸化タンタルを含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記官能化剤がシラン化合物を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記シラン化合物が、モノエトキシシラン、メトキシシラン、ジエトキシシラン、トリクロロシラン、またはジエトキシ、メトキシシランを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記官能化剤のカップリング部分が、ビオチン分子、アビジンタンパク質、ストレプトアビジンタンパク質、レクチンタンパク質、またはＳＮＡＰタグを含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記官能化剤のカップリング部分が、アミン基、アジド基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アルキル基、アルキン基、またはスルフヒドリル基を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
対象分子のカップリング部分への結合を可能にするのに適した条件下で、官能化シリカ表面を有する試料ウェルをカップリング部分に結合するように構成される対象分子と接触させて、それにより対象分子を官能化されたシリカ表面と結合させることをさらに含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
試料ウェルと対象分子とを接触させることが、洗浄ステップを介在させることなく、試料ウェルと官能化剤とを接触させることに続いて起こる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
対象分子が重合酵素である、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
対象分子が、ハイブリダイズしたプライマー／重合酵素複合体を有する鋳型核酸分子を含むシークエンシング用鋳型複合体である、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２４】
対象分子が、約１００倍〜約１０００倍の選択性、約２００倍〜約８００倍の選択性、約４００倍〜約６００倍の選択性、または約１０００倍〜約２０００倍の選択性で、金属酸化物表面よりも官能化シリカ表面に優先的に結合する、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
金属酸化物表面に対して官能化シリカ表面における対象分子の選択性が、ブロックコポリマーと接触していない試料ウェルと比較して、約１０倍〜約１００倍、約５０倍〜約５００倍、約１００倍〜約１０００倍、または約２００倍〜約４００倍、大きい、請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
集積デバイスであって、
金属酸化物表面とシリカ表面とを有する試料ウェルを含む基板と、
親水性頭部基および疎水性尾部基を含む両親媒性試薬によって形成された金属酸化物表面上のコーティング層であって、前記両親媒性試薬は、親水性頭部基を介して金属酸化物表面に結合している、前記コーティング層と、
ＡブロックおよびＢブロックを含むＡＢＡ型ブロックコポリマーによって形成されたコーティング層上の防汚オーバーレイであって、ＡＢＡ型ブロックコポリマーは、Ｂブロックを介してコーティング層に結合している、防汚オーバーレイと、
シリカ表面に結合した官能化剤であって、同官能化剤はカップリング部分を含む官能化剤と、
を含む集積デバイス。
【請求項２７】
前記基板が試料ウェルのアレイを含み、各試料ウェルが金属酸化物表面およびシリカ表面を有する、請求項２６に記載の集積デバイス。
【請求項２８】
前記試料ウェルが、前記基板の表面に形成された上部開口と、前記基板の表面の遠位にある底面とを含む、請求項２６または２７に記載の集積デバイス。
【請求項２９】
前記底面はシリカ表面に含まれる、請求項２８に記載の集積デバイス。
【請求項３０】
前記集積デバイスは、次世代シークエンシング機器とインターフェースするように構成される、請求項２６〜２９のいずれか一項に記載の集積デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、一般に選択的に改変された基板表面部分およびその調製方法に関する。本明細書で提供される技術の態様は、試料ウェル表面の１つまたは複数の所望の部分の反応性を変更することに関する。いくつかの態様では、本開示は、試料ウェルの１つまたは複数の表面部分を選択的に改変する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
マイクロアレイは、核酸分析、核酸シークエンシング、遺伝子発現分析、ジェノタイピング、突然変異分析、ペプチド分析、ペプチドシークエンシング、薬物スクリーニングなど、単一分子分析のツールとして広く使用されている。一般に、ガラス、金属、プラスチック、または他の基板の表面に形成されるマイクロアレイは、所望の化学種に対して反応性がより高くなる、または反応性がより低くなるように選択的に改変された表面部分を含むことができる。たとえば、単一分子分析では、検出または観察のために、対象分子を基板の所望の領域に閉じ込めることを必要とする場合がある。非特異的に結合した分子の集団がそのような領域内にある場合、分析中に干渉信号を除去することが困難な場合があり、全体的な統計分析に関与することとなり結果の精度が低下する可能性がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本明細書で開示される技術の態様は、試料ウェル表面の選択的に官能化された（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ）部分を生成する方法、およびそれを含むデバイスに関する。いくつかの実施形態において、試料ウェルの不動態化された表面部分を調製する方法が本願にて提供される。いくつかの実施形態において、本開示は、防汚特性を有する試料ウェルの不動態化された表面部分を調製する方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、試料ウェルのシリカ表面部分の選択的官能化を促進するための試料ウェルの金属酸化物表面部分の不動態化に関する。いくつかの実施形態において、本開示で提供される技術を使用して、対象分子（ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ）を試料ウェルの所望の領域に閉じ込める（ｃｏｎｆｉｎｅ）ことができる。
【０００４】
いくつかの態様において、本開示は、第１の表面および第２の表面を有する試料ウェルを、第１の表面のコーティング層に優先的に結合するブロックコポリマーと接触させることを含む、試料ウェルの表面を選択的に官能化する方法を提供する。いくつかの実施形態において、第１の表面上に防汚オーバーレイを形成するのに十分な量で試料ウェルをブロックコポリマーと接触させる。いくつかの実施形態において、方法は、試料ウェルを、第２の表面と優先的に結合して官能化された第２の表面を生成する官能化剤と、接触させることをさらに含み、同官能化剤はカップリング部分を含む。いくつかの実施形態において、官能化剤と接触させる前に、試料ウェルをブロックコポリマーと接触させる。いくつかの実施形態において、試料ウェルは、ブロックコポリマーと接触する前に官能化剤と接触させる。
【０００５】
いくつかの実施形態において、第１の表面は金属または金属酸化物の表面である。いくつかの実施形態において、第１の表面はプラスチック表面（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニル、ポリテトラフルオロエチレン、またはそれらの組み合わせ）である。いくつかの実施形態において、第２の表面はシリカ表面である。いくつかの実施形態において、第１の表面は金属酸化物表面であり、第２の表面はシリカ表面である。いくつかの実施形態において、コーティング層は両親媒性試薬を含む。
【０００６】
いくつかの態様において、本開示は、金属酸化物表面およびシリカ表面を有する試料ウェルを、金属酸化物表面上のコーティング層と優先的に結合するブロックコポリマーと接触させることを含む、試料ウェルのシリカ表面を官能化する方法を提供する。いくつかの実施形態において、試料ウェルを金属酸化物表面上に防汚オーバーレイを形成するのに十分な量でブロックコポリマーと接触させる。いくつかの実施形態において、方法は、試料ウェルを、シリカ表面と優先的に結合して官能化シリカ表面を生成する官能化剤と接触させることをさらに含む。いくつかの実施形態において、官能化剤はカップリング部分を含む。いくつかの実施形態において、官能化剤と接触させる前に、試料ウェルをブロックコポリマーと接触させる。いくつかの実施形態において、試料ウェルは、ブロックコポリマーと接触させる前に官能化剤と接触させる。
【０００７】
いくつかの実施形態において、方法は、金属酸化物表面に優先的に結合して金属酸化物表面上にコーティング層を形成する両親媒性試薬を試料ウェルと接触させることをさらに含む。いくつかの実施形態において、両親媒性試薬は、金属酸化物表面に優先的に結合するように構成された親水性頭部基（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｈｅａｄ  ｇｒｏｕｐ）と、ブロックコポリマーに優先的に結合するように構成された疎水性尾部基（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｔａｉｌ  ｇｒｏｕｐ）と、を含む。
【０００８】
いくつかの実施形態において、親水性頭部基は、硫酸塩、亜硫酸塩、リン酸塩、ホスホン酸塩、ヒドロキシル、カテコール酸塩、イソシアネート、ヒドロキサメート、またはカルボキシル官能基を含む。いくつかの実施形態において、親水性頭部基は、カルボニル、アミノ、スルフヒドリル、エーテル、エステル、ホスホジエステル、グリコシド、またはカルボキサミド官能基を含む。いくつかの実施形態において、疎水性尾部基はＣ１−Ｃ３０アルキル鎖を含む。いくつかの実施形態において、疎水性尾部基は、置換または非置換アルキレン；置換または非置換アルケニレン；置換または非置換アルキニレン；置換または非置換ヘテロアルキレン；置換または非置換ヘテロアルケニレン；置換または非置換ヘテロアルキニレン；置換または非置換ヘテロシクリレン（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｙｌｅｎｅ）；置換または非置換カルボシクリレン；置換または非置換アリーレン（ａｒｙｌｅｎｅ）；置換または非置換ヘテロアリーレン；およびその組み合わせ、からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、疎水性尾部基はポリフッ素化炭素鎖を含む。
【０００９】
いくつかの実施形態において、両親媒性試薬は、式ＣＨ３（ＣＨ２）ｎＰＯ３Ｈ２のアルキルホスホン酸化合物を含み、式中、ｎは１〜３０の値を有する整数である。いくつかの実施形態において、両親媒性試薬は、ヘキシルホスホン酸、オクチルホスホン酸、デシルホスホン酸、ドデシルホスホン酸、ポリビニルホスホン酸、１２−ホスホノ−１−ドデカンスルホン酸、１０−ウンデシニルホスホン酸、またはヘプタデカフルオロデシルホスホン酸を含む。いくつかの実施形態において、両親媒性試薬はフッ素系界面活性剤を含む。いくつかの実施形態において、フッ素系界面活性剤は、式ＣＦ３（ＣＦ２）ｎＺの化合物であり、式中、ｎは１〜３０の値を有する整数であり、Ｚは親水性頭部基である。
【００１０】
いくつかの実施形態において、両親媒性試薬の疎水性尾部は共有結合部分（ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｍｏｉｅｔｙ）を含む。そのような実施形態において、方法は、共有結合部分と結合するように構成されたポリマー化合物と試料ウェルとを接触させ、それによりポリマー化合物を金属酸化物表面の両親媒性試薬に共有結合させることをさらに含む。いくつかの実施形態において、両親媒性試薬は、式Ｙ（ＣＨ２）ｎＰＯ３Ｈ２のアルキルホスホン酸化合物を含み、式中、ｎは１〜３０の値を有する整数であり、Ｙは共有結合部分である。いくつかの実施形態において、共有結合部分は、アミン基、アジド基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アルキル基、アルキン基、またはスルフヒドリル基を含む。
【００１１】
いくつかの実施形態において、ブロックコポリマーは、ＡブロックおよびＢブロックを含むＡＢＡ型ブロックコポリマーである。いくつかの実施形態において、コーティング層は、（例えば、防汚オーバーレイを形成するために）ＡＢＡ型ブロックコポリマーのＢブロックに優先的に結合する。いくつかの実施形態において、ＢブロックはＡブロックよりも疎水性が高い。いくつかの実施形態において、Ａブロックは第１のポリエーテルブロックを含み、Ｂブロックは第１のポリエーテルブロックよりも疎水性の高い第２のポリエーテルブロックを含む。
【００１２】
いくつかの実施形態において、ＡＢＡ型ブロックコポリマーは式Ｉの化合物である：
（Ａａ）（Ｂｂ）（Ａａ）  （式Ｉ）
式中、ＡはＡブロックを含むポリエーテル化合物のモノマー単位であり、ａは２〜１５０の値の整数であり；Ｂは、Ｂブロックを含むポリエーテル化合物のモノマー単位であり；かつｂは１０〜１００の値の整数である。
【００１３】
いくつかの実施形態において、Ａブロックはポリエチレンオキシドを含み、Ｂブロックはポリプロピレンオキシドを含む。いくつかの実施形態において、ＡＢＡ型ブロックコポリマーは式ＩＩの化合物である：
【００１４】
【化１】
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【００１５】
式中、ａは２〜１５０の値の整数であり；かつｂは１０〜１００の値の整数である。
いくつかの実施形態において、金属酸化物表面は、酸化アルミニウム、酸化チタン、酸化ジルコニウム、酸化鉄、酸化スズ、または酸化タンタルである。
【００１６】
いくつかの実施形態において、官能化剤はシラン化合物を含む。いくつかの実施形態において、シラン化合物は、モノエトキシシラン、メトキシシラン、ジエトキシシラン、トリクロロシラン、またはジエトキシ、メトキシシランを含む。いくつかの実施形態において、シラン化合物はシラン−ＰＥＧ化合物を含む。いくつかの実施形態において、シラン化合物は、チオールシラン化合物またはアミノシラン化合物を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態において、官能化剤のカップリング部分は、ビオチン分子、アビジンタンパク質、ストレプトアビジンタンパク質、レクチンタンパク質、またはＳＮＡＰ−タグを含む。いくつかの実施形態において、官能化剤のカップリング部分は、アミン基、アジド基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アルキル基、アルキン基、またはスルフヒドリル基を含む。
【００１８】
いくつかの実施形態において、方法は、官能化シリカ表面を有する試料ウェルを、対象分子のカップリング部分への結合を可能にするのに適した条件下で、カップリング部分に結合するように構成された対象分子と接触させることをさらに含み、それにより対象分子が官能基化されたシリカ表面に結合する。
【００１９】
いくつかの実施形態において、試料ウェルと対象分子とを接触させることは、洗浄ステップを介在させることなく、試料ウェルと官能化剤とを接触させることの後に起こる。いくつかの実施形態において、試料ウェルと対象分子とを接触させることは、洗浄ステップを介在させることなく、試料ウェルとブロックコポリマーとを接触させることの後に起こる。いくつかの実施形態において、試料ウェルを洗浄ステップを介在させることなく、別々の接触ステップにてブロックコポリマーおよび官能化剤と接触させる。
【００２０】
いくつかの実施形態において、対象分子は重合酵素を含む。いくつかの実施形態において、重合酵素はＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼはＴ４ＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼはＴ７ＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼはｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼはＭ２ＹＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼはヒツジキンバエ（Ｌｕｃｉｌｉａ  ｃｕｐｒｉｎａ）のＤＮＡポリメラーゼである。
【００２１】
いくつかの実施形態において、対象分子は、ハイブリダイズしたプライマー／重合酵素複合体を有する鋳型核酸分子を含むシークエンシング用鋳型複合体である。いくつかの実施形態において、鋳型核酸分子は、約１ｋｂ〜約５ｋｂ、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約１５ｋｂ、約１５ｋｂ〜約２０ｋｂ、または約２０ｋｂ〜約２５ｋｂである。いくつかの実施形態において、核酸分子は、約２５ｋｂ〜約５０ｋｂ、約５０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約５００ｋｂ、または約５００ｋｂ〜約１０００ｋｂである。
【００２２】
いくつかの実施形態において、対象分子は、約１００倍〜約１０００倍の選択性で、約２００倍〜約８００倍の選択性で、約４００倍〜約６００倍の選択性で、または約１０００倍〜約２０００倍の選択性で、金属酸化物表面（例えば、ブロックコポリマーおよび／またはコーティング層を含む金属酸化物表面）よりも官能化シリカ表面に優先的に結合する。
【００２３】
いくつかの実施形態において、金属酸化物表面（例えば、ブロックコポリマーおよび／またはコーティング層を含む金属酸化物表面）に対して官能化シリカ表面への対象分子の選択性は、ブロックコポリマーと接触していない試料ウェルと比較して、約１０倍〜約１００倍、約５０倍〜約５００倍、約１００倍〜約１０００倍、または約２００倍〜約４００倍、大きい。
【００２４】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法は、対象分子をシークエンシング反応に供することをさらに含む。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法は、対象分子（例えば、シークエンシング用鋳型複合体）を次世代シークエンシング技術に供することをさらに含む。
【００２５】
いくつかの態様において、本開示は、金属酸化物表面およびシリカ表面を有する試料ウェルを含む基板（例えば、固体支持体）を含む集積デバイス（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｄｅｖｉｃｅ）を提供する。いくつかの実施形態において、集積デバイスは、親水性頭部基および疎水性尾部基を含む両親媒性試薬によって形成された金属酸化物表面上のコーティング層をさらに含む。いくつかの実施形態において、両親媒性試薬は、親水性頭部基を介して金属酸化物表面に結合している。いくつかの実施形態において、集積デバイスは、ＡブロックおよびＢブロックを含むＡＢＡ型ブロックコポリマーによって形成されたコーティング層上に防汚オーバーレイをさらに含む。いくつかの実施形態において、ＡＢＡ型ブロックコポリマーは、Ｂブロックを介してコーティング層に結合している。いくつかの実施形態において、集積デバイスは、シリカ表面に結合した官能化剤をさらに含む。いくつかの実施形態において、官能化剤はカップリング部分を含む。
【００２６】
いくつかの実施形態において、基板は試料ウェルのアレイを備え、各試料ウェルは金属酸化物表面およびシリカ表面を有する。
いくつかの実施形態において、試料ウェルは、基板の表面に形成された上部開口と、基板の表面の遠位にある底面とを含む。いくつかの実施形態において、底面はシリカ表面に含まれる。
【００２７】
いくつかの実施形態において、シリカ表面に結合した官能化剤のカップリング部分は、ビオチン分子、アビジンタンパク質、ストレプトアビジンタンパク質、レクチンタンパク質、またはＳＮＡＰタグを含む。いくつかの実施形態において、シリカ表面に結合した官能化剤のカップリング部分は、アミン基、アジド基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アルキル基、アルキン基、またはスルフヒドリル基を含む。
【００２８】
いくつかの実施形態において、集積デバイスは、次世代シークエンシング機器とインターフェースするように構成されている。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】試料ウェルの断面図を示す。
【図２Ａ】試料ウェルのシリカ表面部分を選択的に官能化するプロセスのワークフローを示す。
【図２Ｂ】試料ウェルのシリカ表面部分を選択的に官能化するプロセスのワークフローを示す。
【図３】基板の金属酸化物表面部分上に防汚オーバーレイを形成することにより、基板のシリカ表面部分が選択的に官能化されるプロセスを示す。
【図４】基板の金属酸化物部分上にグラフト化ポリマー不動態化層を生成することにより、金属酸化物表面を不動態化するプロセスを示す。
【図５】ブロックコポリマーの非限定的な構成を示す。
【図６】濡れ性（ｗｅｔｔａｂｉｌｉｔｙ）実験の撮像結果を示す。
【図７】結合選択性アッセイの撮像結果を示す。
【図８−１】蛍光アッセイから得られた結果の読み出しとグラフ表示とを示す。
【図８−２】蛍光アッセイから得られた結果の読み出しとグラフ表示とを示す。
【図９−１】本明細書に記載されるいくつかの実施形態に従って選択的に官能化された表面を有する集積デバイスを使用して実行されたシークエンシング反応の結果を示す。
【図９−２】本明細書に記載されるいくつかの実施形態に従って選択的に官能化された表面を有する集積デバイスを使用して実行されたシークエンシング反応の結果を示す。
【図９−３】本明細書に記載されるいくつかの実施形態に従って選択的に官能化された表面を有する集積デバイスを使用して実行されたシークエンシング反応の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
当業者は、本明細書に記載される図が例示目的のみであることを理解するであろう。場合によっては、本発明の様々な態様は、本発明の理解を容易にするために誇張または拡大して示される場合があることを理解されたい。図面において、同様の参照文字は、一般に、様々な図面を通して機能的に類似および／または構造的に類似の要素の同様の特徴を指す。図面は必ずしも縮尺通りではなく、その代わりに教示の原理を説明することに重点が置かれている。図面は、決して本教示の範囲を限定することを意図していない。
【００３１】
本発明の特徴および利点は、図面と併せて以下に述べる詳細な説明からより明らかになるであろう。
図面を参照して実施形態を説明する場合、方向の参照（「上」、「下」、「上部」、「下部」、「左」、「右」、「水平」、「垂直」など）が使用され得る。そのような参照は、読者が正しい配向で図面を認識するのに役立つように意図されているに過ぎない。これらの方向の参照は、具体的なデバイスの好ましいまたは唯一の配向を記載することを意図していない。デバイスは、他の配向で具体化されてもよい。
【００３２】
詳細な説明から明らかなように、図面（例えば、図１〜９）に描かれた例および本願の全体にわたる例示の目的のためにさらに記載された例は、非限定的実施形態について記載しており、いくつかの場合には、例示をより明確にする目的で、あるプロセスを簡易化するかまたは特徴もしくはステップを省略していることもある。
【００３３】
本開示の態様は、選択的に改変された表面部分を有する試料ウェル、およびその調製方法に関する。いくつかの態様において、本開示は、第１の表面部分と第２の表面部分とを有する試料ウェルの表面部分を改変する方法を提供する。いくつかの実施形態において、試料ウェルを、第１の表面部分と優先的に結合して同第１の表面部分上にコーティング層を形成する両親媒性試薬と接触させる。いくつかの実施形態において、試料ウェルを、第１の表面部分上のコーティング層に優先的に結合するブロックコポリマーと接触させる（例えば、第１の表面部分上に防汚オーバーレイを形成するために）。いくつかの実施形態において、試料ウェルを、第２の表面部分と優先的に結合して官能化された第２の表面部分を生成する官能化剤と接触させる。いくつかの実施形態において、第１の表面部分はプラスチック表面であり、第２の表面部分はシリカ表面である。いくつかの実施形態において、第１の表面部分は金属酸化物表面であり、第２の表面部分はシリカ表面である。
【００３４】
他の態様の中でも、本開示は、選択的に改変された表面部分を有する試料ウェルを調製する方法を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される技術を使用して、金属酸化物からなる表面部分とシリカからなる表面部分とを有する試料ウェルの金属酸化物表面を不動態化することができる。いくつかの実施形態において、本開示は、防汚特性を有する不動態化された金属酸化物表面を生成する方法を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載された不動態化された金属酸化物表面を使用して、試料ウェルのシリカ表面部分の選択的官能化を促進することができる。いくつかの実施形態において、試料ウェルの選択的に改変された表面部分を使用して、試料ウェルの所望の領域への対象分子の閉じ込めを促進することができる。
【００３５】
特定の技術において、単一分子分析は、単一分子の観察および／または信号検出が最適である試料ウェルの所望の領域に対象分子を閉じ込めることを含む。対象分子を所望の領域に閉じ込めることは、試料ウェルの表面部分を選択的に改変することで実現できる。例えば、所望の領域内の表面部分は、対象分子を保持するように官能化されるが、所望の領域の外側の表面部分は官能化されない。そのような選択的な官能化は、所望の領域の外側の表面部分を不動態化し、それを官能化に対して不活性にすることにより達成できる。
【００３６】
表面の不動態化（Ｓｕｒｆａｃｅ  ｐａｓｓｉｖａｔｉｏｎ）とは、一般に、それにより表面が環境に対して反応しにくくなるプロセスを指す。例えば、基板の第２の表面を第１の表面よりも選択的に官能化することが望ましいいくつかの実施形態において、第１の表面を不動態化して、それを官能化が不可能であるか、または官能化に対して高度に耐性にすることができる。従来の表面不動態化技術は、自己組織化（ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ）単分子層を形成する組成物の使用を伴う可能性があり、これは通常、単分子層のさまざまな欠陥により不完全に覆われた表面を生成する。これらの欠陥は、実際には、官能化が発生する可能性のある露出表面の部位を提供する。本願の発明者らは、単分子層の欠陥を効果的に隠す試薬を使用して、これらおよび他の制限を克服できることを認識および評価した。本願の発明者らは、これらの試薬のいくつかが生物学的反応の文脈で有利に適用できる不動態化表面に防汚特性を付与することをさらに認識し、さらに評価した。
【００３７】
本開示の態様は、試料ウェルの表面部分の選択的な改変に関する。いくつかの実施形態において、試料ウェルは、異なる化学組成を有する少なくとも２つの表面部分を含む。例えば、図１は、本願のいくつかの非限定的な実施形態による、集積デバイス１００に含まれる試料ウェル１８０の断面図を示す。試料ウェル１８０は、金属層１０４に形成され、集積デバイス１００のシリカ層１０６内に延びる開口によって画定される小さな体積（ｖｏｌｕｍｅ）または領域を備えてもよい。試料ウェル１８０は、金属酸化物コーティング１０２で少なくとも部分的に覆われた１つ以上の側壁を有していてもよい。いくつかの実施形態において、本明細書に記載された技術に従って、金属酸化物コーティングを不動態化して、不動態化コーティング１０８を生成することができる。不動態化コーティング１０８は、いくつかの実施形態において、金属酸化物コーティング１０２を官能化剤１３０に対して不活性にすることができる。このようにして、官能化剤１３０は好ましくはシリカ層１０６に結合する。いくつかの実施形態において、官能化剤１３０は、対象分子１９０に結合するように構成された結合部分を含む。したがって、シリカ層１０６の選択的に官能化された表面は、対象の分子１９０を試料ウェル１８０の底面に近接した領域に閉じ込めることを可能にする。いくつかの実施形態において、不動態化コーティング１０８は、側壁と相互作用する、または側壁に付着する対象分子１９０の量を減らすために、コーティング層および／または防汚オーバーレイを含む。いくつかの実施形態において、コーティング層および／または防汚オーバーレイは、側壁への生物学的反応における成分の付着を低減または排除する。
【００３８】
いくつかの実施形態において、選択的に改変された表面部分を有する試料ウェルは、図２Ａに描かれたワークフローに従って調製することができる。図示されるように、金属酸化物表面２０２およびシリカ表面２０６を有する試料ウェルは、不動態化ステップ（ｉ）を受けて、金属酸化物表面上にコーティング層２１０を生成する。いくつかの実施形態において、コーティング層２１０は、試料ウェルを、金属酸化物表面に優先的に結合する両親媒性試薬と接触させることにより形成される。次いで、ステップ（ｉｉ）で試料ウェルをブロックコポリマーにさらして、金属酸化物表面上に防汚オーバーレイ２２０を生成することができる。いくつかの実施形態において、防汚オーバーレイ２２０は、試料ウェルを、金属酸化物表面上のコーティング層に優先的に結合するブロックコポリマーと接触させることにより形成される。試料ウェルは、官能化シリカ表面２３０を生成するために、官能化ステップ（ｉｉｉ）にさらに供することができる。いくつかの実施形態において、官能化シリカ表面２３０は、試料ウェルを、シリカ表面に優先的に結合する官能化剤と接触させることにより形成される。
【００３９】
いくつかの実施形態において、図２Ａのプロセスにおけるステップの順序は、示されているものとは異なり得ることを理解されたい。例えば、いくつかの実施形態において、図２Ｂに示されるワークフローに従って、選択的に改変された表面部分を有する試料ウェルを調製することができる。図示されるように、金属酸化物表面およびシリカ表面を有する試料ウェルは、不動態化ステップ（ｉ）を受けて、金属酸化物表面上にコーティング層を生成する。コーティング層を有する試料ウェルは、官能化されたシリカ表面を生成するために、官能化ステップ（ｉｉ）にさらに供され得る。次いで、ステップ（ｉｉｉ）で試料ウェルをブロックコポリマーにさらして、金属酸化物表面上に防汚オーバーレイを生成することができる。図２Ａおよび２Ｂに示されているプロセスは、特定の表面組成、たとえば金属酸化物表面およびシリカ表面を有する試料ウェルの例を示す。いくつかの実施形態において、これらの図に示され、本明細書の他の場所で説明される技術は、異なる表面組成を有する試料ウェルで利用できることを理解されたい。例えば、いくつかの実施形態において、表面２０２はプラスチック表面であってもよい。プラスチック表面の例には、限定されるものではないが例として、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニル、ポリテトラフルオロエチレン、およびそれらの組み合わせが含まれる。
【００４０】
いくつかの実施形態において、官能化剤は、試料ウェル上の複数の表面組成物に結合することができ、例えば、官能化剤は、金属酸化物またはシリカ表面組成物のそれぞれに結合することができる。そのような実施形態において、本明細書に記載される技術を有利に用いて、試料ウェルの所望の領域または特定の表面組成物への官能化剤の結合を制限することができる。例えば、いくつかの実施形態において、試料ウェルの金属酸化物表面を不動態化して、金属酸化物表面の官能化の程度を防止または制限することができ、結果として官能化を試料ウェルの異なる表面（例えば、シリカ表面）に制限することができる。いくつかの実施形態において、不動態化コーティングにおける欠陥（ｄｅｆｅｃｔｓ）は、露出した金属酸化物表面の部位をもたらす可能性があり、それは、金属酸化物表面の望ましくない官能化をもたらす可能性がある。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される技術は、不動態化コーティング中の露出された金属酸化物表面の部位を隠して、高い選択性でシリカ表面の官能化を促進することができる。
【００４１】
いくつかの態様において、本明細書に記載される方法は、金属酸化物表面部分およびシリカ表面部分を有する試料ウェルを、金属酸化物表面上のコーティング層と優先的に結合して防汚オーバーレイを形成するブロックコポリマーと接触させることを含む。いくつかの実施形態において、防汚オーバーレイは、コーティング層の欠陥を補償する。いくつかの実施形態において、コーティング層は単分子層を含む。本明細書で使用される場合、「単分子層（ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）」とは、単一分子の厚さを有する層を指す。いくつかの実施形態において、「単分子層」という用語は、「自己組織化単分子層」（「ＳＡＭ」）と交換可能に使用され、後者は、分子が吸着によって表面上に集合体を自発的に形成する自己集合のプロセスを指す（例えば、化学吸着、物理吸着）。分子集合のこのプロセス中に、さまざまな固有の要因（例えば、形成の熱力学、吸着質の化学的性質）または外部要因（例えば、表面の不完全性、不純物）により、単分子層に欠陥が現れることがある。いくつかの実施形態において、単分子層の欠陥は、露出表面の部位をもたらす。本開示は、いくつかの実施形態において、防汚オーバーレイを使用してそのような欠陥部位を隠す方法を提供する。
【００４２】
例えば、図３は、官能化剤がシリカ表面部分に選択的に結合できるように、防汚オーバーレイが不動態化された金属酸化物表面部分の一部として形成されるプロセスを示す。いくつかの実施形態において、金属酸化物表面３０２およびシリカ表面３０４を有する基板（例えば、試料ウェル）は、金属酸化物表面３０２上にコーティング層３１０を含む。いくつかの実施形態において、金属酸化物表面３０２は、酸化アルミニウム、酸化チタン、酸化ジルコニウム、酸化鉄、酸化スズ、または酸化タンタルから構成される。いくつかの実施形態において、コーティング層３１０は、疎水性尾部３１４と、金属酸化物表面３０２に優先的に結合する親水性頭部基３１６とを有する両親媒性試薬を用いて形成される。いくつかの実施形態において、両親媒性試薬は、金属酸化物表面３０２上に分子集合体を形成する。図示されるように、いくつかの実施形態において、両親媒性試薬によって形成されたコーティング層３１０の自己組織化時に単分子層に１つまたは複数の欠陥３１８が形成され得る。いくつかの実施形態において、基板（例えば、試料ウェル）は、金属酸化物表面３０２上のコーティング層３１０と優先的に結合して、金属酸化物表面３０２上に防汚オーバーレイ３２０を形成するブロックコポリマー３２２を基板と接触させることを含む不動態化ステップ（ｉ）を受ける。いくつかの実施形態において、図３に示されるように、ブロックコポリマーとコーティング層との間に形成される相互作用の性質および／または程度は、欠陥部位を効果的に覆う。
【００４３】
いくつかの実施形態において、ブロックコポリマー３２２は、Ａブロック３２４およびＢブロック３２６を有するＡＢＡ型ブロックコポリマーである。いくつかの実施形態において、コーティング層３１０は、ＡＢＡ型ブロックコポリマーのＢブロック３２６に優先的に結合する。いくつかの実施形態において、Ｂブロック３２６は、Ａブロック３２４に対して疎水性である。そのような実施形態において、Ｂブロック３２６は、疎水性効果に基づいてコーティング層３１０の疎水性尾部基３１４と相互作用を形成することができる。疎水性効果は、一般に、非極性分子が水溶液中で凝集し、水分子を排除する傾向を指す。したがって、コーティング層３１０の疎水性尾部基３１４が水性溶媒にさらされると、コーティング層３１０は、より疎水性のＢブロック３２６にてブロックコポリマー３２２と優先的に会合する。いくつかの実施形態において、ＢブロックはＡブロックよりも疎水性が高く、ＡおよびＢはそれぞれ適切な重合度を有し、その結果、摂氏２５度で、水溶液中において、０．０１重量％〜１０重量％の間、または０．０１重量％および１０重量％に等しい臨界ミセル濃度（例えば、０．０１重量％〜１重量％の間、または０．０１重量％および１重量％に等しい）で存在する。「臨界ミセル濃度」という用語は、当技術分野におけるその通常の意味を有し、その濃度およびそれより上の濃度にて、（Ａブロックの重合度）と（Ｂブロックの重合度）の特定の比に対して安定したミセル（例えば、持続性ミセル）を形成する。臨界ミセル濃度は、当業者に周知の方法により測定することができ、表面張力測定または動的光散乱測定が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、防汚層３２０によって提供される露出された金属酸化物表面３０２のさらなる被覆は、シリカ表面３０４の選択的官能化を促進する。
【００４４】
図３に示すように、いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法は、防汚オーバーレイ３２０を有する基板（例えば、試料ウェル）を、シリカ表面３０４に優先的に結合する官能化剤３３２と接触させるステップを含むことができる。いくつかの実施形態において、官能化剤３３２は、金属酸化物表面３０２またはシリカ表面３０４のいずれかと結合することができる。しかしながら、いくつかの実施形態において、金属酸化物表面３０２は、官能化剤３３２が金属酸化物表面３０２に結合することを回避する不動態化層３３０を備えて調製され、シリカ表面３０４への選択的結合を常に促進して官能化シリカ表面を生成する。いくつかの実施形態において、官能化剤３３２は、シリカ表面３０４に結合することができるシラン化合物を含む。いくつかの実施形態において、シラン化合物は、モノエトキシシラン、メトキシシラン、ジエトキシシラン、トリクロロシラン、またはジエトキシ、メトキシシランを含む。
【００４５】
いくつかの実施形態において、官能化剤３３２はカップリング部分３３４を含む。いくつかの実施形態において、カップリング部分３３４を使用して、対象分子をシリカ表面３０４に付着させることができる。いくつかの実施形態において、カップリング部分３３４は、非共有結合対の第１のパートナーであり得る。このようにして、いくつかの実施形態において、非共有結合対の第２のパートナーを含む対象分子は、非共有結合を介してシリカ表面３０４に結合することができる。いくつかの実施形態において、官能化剤３３２のカップリング部分３３４は、ビオチン分子、アビジンタンパク質、ストレプトアビジンタンパク質、レクチンタンパク質、またはＳＮＡＰタグであり得る。いくつかの実施形態において、カップリング部分３３４は、共有結合対の第１のパートナー（例えば、反応性化学基）であり得る。このようにして、いくつかの実施形態において、共有結合対の第２のパートナーを含む対象分子は、共有結合を介してシリカ表面３０４に結合することができる。いくつかの実施形態において、官能化剤３３２のカップリング部分３３４は、アミン基、アジド基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アルキル基、アルキン基、またはスルフヒドリル基であり得る。いくつかの実施形態において、カップリング部分３３４は、クリックケミストリーコンジュゲーション技術と適合性がある。クリックケミストリーでのコンジュゲーションが可能な反応性化学基は、当技術分野で知られており、例えば、ニュー，ケイ（Ｎｅｗ，Ｋ．）他、（２００９年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒ．Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．、第２４（３）巻、２８９−３０２頁、ティルムルガン，ピー（Ｔｈｉｒｕｍｕｒｕｇａｎ，Ｐ．）他、（２０１３年）、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．、第１１３（７）巻、４９０５−４９７９頁に記載されており、それらの内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。いくつかの実施形態において、図３に示されるプロセスは、試料ウェルを両親媒性試薬と接触させて、金属酸化物表面３０２上にコーティング層３１０を形成するステップをさらに含む。
【００４６】
両親媒性試薬およびコーティング層
本明細書で使用される「両親媒性試薬」は、金属酸化物表面上にコーティング層を生成するために使用できる試薬を指す。いくつかの実施形態において、両親媒性試薬は、分子が第２の部分に対して親水性である第１の部分を含み、その第２の部分が結果として第１の部分に対して疎水性であるため、両親媒性とみなされる分子である。いくつかの実施形態において、親水性部分は、疎水性部分と比較して水溶性である。いくつかの実施形態において、疎水性部分は、親水性部分と比較して水不溶性である。いくつかの実施形態において、両親媒性試薬は、親水性頭部基および疎水性尾部基を含む。
【００４７】
単分子層の自己組織化を促進するために、適切な両親媒性試薬を所望の特性（極性、疎水性、親水性、サイズ、構造的剛性など）に基づいて選択できる。例えば、いくつかの実施形態において、両親媒性試薬は、疎水性尾部基の疎水性を変更することにより特定の溶媒系用に設計することができる。いくつかの実施形態において、両親媒性試薬は、式ＣＨ３（ＣＨ２）ｎＰＯ３Ｈ２のアルキルホスホン酸化合物を含み、式中、ｎは１〜３０の値を有する整数である。いくつかの実施形態において、両親媒性試薬は、ヘキシルホスホン酸、オクチルホスホン酸、デシルホスホン酸、ドデシルホスホン酸、ポリビニルホスホン酸、１２−ホスホノ−１−ドデカンスルホン酸、１０−ウンデシニルホスホン酸、またはヘプタデカフルオロデシルホスホン酸を含む。
【００４８】
いくつかの実施形態において、両親媒性試薬はフッ素系界面活性剤を含む。いくつかの実施形態において、フッ素系界面活性剤は、式ＣＦ３（ＣＦ２）ｎＺの化合物であり、式中、ｎは１〜３０の値を有する整数であり、Ｚは親水性頭部基である。フッ素化界面活性剤または過フッ素化アルキル化物質とも呼ばれるフッ素系界面活性剤は、複数のフッ素原子を有する合成有機フッ素化合物である。いくつかの実施形態において、フッ素系界面活性剤は、−ＣＦ２−、−ＣＦ２ＣＦ３、または−ＣＦ３基の少なくとも１つを有する任意の化合物であり得る。適切なフッ素系界面活性剤は、本明細書に記載される方法で使用される表面組成および他の実験条件を考慮して選択することができる。例えば、フッ素系界面活性剤およびその特性は、同時に係属する米国特許出願公開第２００６０２３４９０１号明細書に記載されており、その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれている。フッ素系界面活性剤およびそれを合成する方法のさらなる例は、米国特許出願第０９／５７０，８５３号に記載されており、その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００４９】
いくつかの実施形態において、両親媒性試薬の親水性頭部基は、金属酸化物表面と会合することができる化学基（例えば、官能基）である。いくつかの実施形態において、親水性頭部基は、金属または金属酸化物の表面組成物とキレート化することができる。適切な親水性頭部基は、基板（たとえば試料ウェル）上に存在する表面組成を考慮して選択できる。例えば、両親媒性試薬の親水性頭部基は、頭部基が不動態化される所望の表面に優先的に結合するように設計することができる。したがって、いくつかの実施形態において、親水性頭部基は、シリカ表面よりも金属酸化物表面に優先的に結合するように設計されている。いくつかの実施形態において、親水性頭部基は、水分子との水素結合供与体相互作用または水素結合受容体相互作用を形成することができる。親水性頭部基の例は、限定されるものではないが、硫酸塩、亜硫酸塩、スルホン酸塩、硫黄基、リン酸塩、ホスホン酸塩、ヒドロキシル、カテコレート、イソシアネート、ヒドロキサメート、カルボキシル、アミノ基、アミド基、カルボキシル基、およびヒドロキシル基が含まれる。本明細書に開示される化学基は、特定のプロトン化状態または酸化状態に制限されることを意図するものではないことを理解されたい。したがって、例えば、本明細書で使用される「カルボキシル基」は、とりわけ、カルボン酸基（Ｒ−ＣＯＯＨ）およびカルボキシレート基（Ｒ−ＣＯＯ−）を指す。
【００５０】
いくつかの実施形態において、疎水性尾部基は、溶媒温度、ｐＨ、およびイオン強度などの実験依存条件に従って設計されてもよい。一般に、両親媒性試薬の疎水性尾部基は、両親媒性試薬の親水性頭部基よりも、基板の金属または金属酸化物表面に対して低い親和性を有することが好ましい。いくつかの実施形態において、疎水性尾部基は、ブロックコポリマーの所望のブロックと優先的に相互作用するように構成される。いくつかの実施形態において、所与の一連の実験条件下で完全に可溶性ではないように疎水性尾部基を設計することが望ましい場合がある。例えば、いくつかの実施形態において、疎水性尾部基の水溶性を制限することにより、単分子層コーティングを形成する際の両親媒性試薬の自己組織化が促進される。いくつかの実施形態において、疎水性尾部基は、飽和または不飽和、置換または非置換、環状、分岐または非分岐脂肪族鎖である。いくつかの実施形態において、脂肪族鎖は４〜２８個の炭素原子を含む。いくつかの実施形態において、疎水性尾部基はＣ１−Ｃ３０アルキル鎖を含む。
【００５１】
いくつかの実施形態において、両親媒性試薬の疎水性尾部は共有結合部分を含む。そのような実施形態において、方法は、共有結合部分を結合するように構成されたポリマー化合物と試料ウェルを接触させ、それによりポリマー化合物を金属酸化物表面の両親媒性試薬に共有結合させることをさらに含む。たとえば、図４は、金属酸化物表面を不動態化する非限定的なプロセスを示す。図示されるように、金属酸化物表面４０２およびシリカ表面４０４を有する基板（例えば、試料ウェル）は、共有結合部分４４４を含む両親媒性試薬４４２と基板を接触させることを含む第１の不動態化ステップ（ｉ）を受ける。いくつかの実施形態において、両親媒性試薬は、式Ｙ（ＣＨ２）ｎＰＯ３Ｈ２のアルキルホスホン酸化合物を含み、式中、ｎは１〜３０の値を有する整数であり、Ｙは共有結合部分である。いくつかの実施形態において、共有結合部分は、アミン基、アジド基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アルキル基、アルキン基、またはスルフヒドリル基を含む。両親媒性試薬４４２は、シリカ表面４０４よりも金属酸化物表面４０２と優先的に結合する親水性頭部基を介して金属酸化物表面４０２上で自己組織化する。いくつかの実施形態において、金属酸化物表面４０２は、両親媒性試薬の共有結合部分よりも親水性頭部基に優先的に結合する。
【００５２】
いくつかの実施形態において、図４に示すように、基板（例えば、試料ウェル）は、基板を、両親媒性試薬４４２の共有結合部分４４４に結合するように構成されたポリマー化合物４５２と接触させることを含む追加の不動態化ステップ（ｉｉ）にさらに受ける。このようにして、ポリマー化合物４５２は、金属酸化物表面４０２上の両親媒性試薬４４２にグラフトされ、露出した金属酸化物表面の部位を最小化する単分子層形成にてより高密度の表面被覆を提供する。いくつかの実施形態において、ポリマー化合物４５２はポリエーテル化合物を含む。ポリマー化合物およびポリエーテル化合物が本明細書に記載されている。いくつかの実施形態において、ポリマー化合物４５２は、不動態化された金属酸化物表面４０２に防汚特性を付与するように選択される。いくつかの実施形態において、ポリマー化合物４５２は、本明細書に記載されるように、ブロックコポリマーと優先的に会合するように選択される。いくつかの実施形態において、ポリマー化合物４５２は、共有結合部分４４４に結合するようにポリマー化合物４５２を構成する部分４５４を含む。いくつかの実施形態において、部分４５４は、アミン基、アジド基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アルキル基、アルキン基、またはスルフヒドリル基を含む。
【００５３】
いくつかの態様において、本明細書に記載される方法を使用して、金属酸化物表面にコーティング層を形成することにより、金属酸化物表面を不動態化することができる。本明細書で使用される場合、「コーティング層」は、金属酸化物表面上に直接形成する単分子層を指す。いくつかの実施形態において、コーティング層は、単分子層自己組織化により金属酸化物表面上に形成される。いくつかの実施形態において、コーティング層は、秩序化されたまたは不規則な単分子層である。いくつかの実施形態において、コーティング層は、規則正しく密に詰まった単分子層であり得る。いくつかの実施形態において、コーティング層は均質または不均質の単分子層であり得る。いくつかの実施形態において、コーティング層を形成するために使用される成分は、金属酸化物表面上で自己組織化することが許容される。理論に束縛されることを望まないが、金属酸化物表面上の単分子層自己組織化は自由エネルギー最小化を介して起こると考えられている。例えば、両親媒性試薬の親水性頭部基は、金属酸化物表面に優先的に引き付けられ、それは金属酸化物表面上の頭部基の凝集を促進して、単分子層の規則正しい組織化を達成する。金属酸化物表面は、両親媒性試薬の頭部基がその周りに集合し、両親媒性試薬の疎水性尾部基が金属酸化物表面から延びたままになる鋳型として見ることもできる。したがって、いくつかの実施形態において、コーティング層の文脈における尾部基は、ブロックコポリマーと自由に会合して、防汚オーバーレイを生成する。
【００５４】
防汚オーバーレイおよびブロックコポリマー
本明細書で使用される場合、「防汚オーバーレイ（ａｎｔｉｆｏｕｌｉｎｇ  ｏｖｅｒｌａｙ）」とは、組成物が付着する物品の表面の生体分子に対する耐性を提供または増加させる組成物を指す。たとえば、いくつかの実施形態において、試料ウェル表面上の防汚オーバーレイ（たとえば、金属酸化物）は、基準基板、すなわち防汚オーバーレイを欠く同じまたはそうでなければ機能的に同等の基板への接着量について、タンパク質、核酸、ヌクレオチド、標識ヌクレオチド、細胞、組織、および／または他の生体物質を含む生体分子の付着に抵抗し得る。いくつかの実施形態において、試料ウェル表面上の防汚オーバーレイ（例えば、金属酸化物）は、生物学的反応で使用される疎水性成分（例えば、色素分子、色素標識ヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸など）のような疎水性分子の付着に抵抗し得る。いくつかの実施形態において、付着の量は、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％またはそれを超えて、例えば、８５％、９０％、９５％、９９％、９９．５％、９９．９％またはそれを超えて、基準基板に対して減少するであろう。いくつかの実施形態において、防汚オーバーレイは、重合酵素および／または核酸に対して実質的に耐性がある。いくつかの実施形態において、防汚オーバーレイは、血液試料に存在する生体分子に対して実質的に耐性がある。
【００５５】
いくつかの実施形態において、防汚オーバーレイは、金属酸化物表面上に形成される。いくつかの実施形態において、防汚オーバーレイは、金属酸化物表面との直接相互作用（例えば、金属酸化物組成物とのキレート化）により、金属酸化物表面上に形成することができる。いくつかの実施形態において、防汚オーバーレイは、１つ以上の介在層との相互作用を通じて金属酸化物表面上に形成することができる。例えば、いくつかの実施形態において、金属酸化物表面上のコーティング層（例えば、単分子層）との相互作用により、金属酸化物表面上に防汚オーバーレイが形成される。いくつかの実施形態において、防汚オーバーレイは、疎水性効果によりコーティング層と相互作用する。疎水性効果とは、疎水性分子が水溶液中で凝集し、水分子を排除する傾向を指す。いくつかの実施形態において、コーティング層を有する金属酸化物表面を、コーティング層に優先的に結合するブロックコポリマーと接触させることにより、金属酸化物表面に防汚特性が付与される。
【００５６】
本明細書で使用されるように、「ブロックコポリマー」とは、それぞれが隣接するブロックの構造とは異なる構造を有する、２つ以上のポリマーブロックを有するポリマーを指す。すべてのブロックを含む構造全体がブロックコポリマーを形成する。２つまたは３つの異なるブロックを有するブロックコポリマーは、それぞれジブロックコポリマーまたはトリブロックコポリマーと称される。いくつかの実施形態において、コポリマーの各ブロックは、文字（例えば、「Ａ」ブロック、「Ｂ」ブロック、「Ｃ」ブロックなど）によって表され、ここで、各文字は、コポリマーのそのブロックに明確な特性をもたらす異なる構造組成を有するコポリマーのブロックを示す。いくつかの実施形態において、各ブロックは、ブロックコポリマー内の別のブロックに対してそのブロックに付与される疎水性または親水性などの所望の特性に基づいて選択できる１つまたは複数の型のモノマー単位または構成単位で構成される。例えば、いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるブロックコポリマーは、ＡブロックおよびＢブロックを有するＡＢＡ型トリブロックコポリマーであり、ＢブロックはＡブロックと比較して疎水性である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるブロックコポリマーは、ＡブロックおよびＢブロックを有するＡＢ型ジブロックコポリマーであり、ＢブロックはＡブロックと比較して疎水性である。
【００５７】
いくつかの実施形態において、トリブロックコポリマーは、親水性（Ａ）ブロックと疎水性（Ｂ）ブロックが交互になった３つの異なるブロックを有する。図５は、ブロックコポリマーおよびその部分の非限定的な構成を一般的に示している。図示されるように、ＡＢＡ型トリブロックコポリマー５０２は、モノマーユニットの第２のセット（白丸）からなるＡブロックが両側に隣接するモノマーユニットの第１のセット（斜線丸）からなるＢブロックを含むことができる。いくつかの実施形態において、ＡＢＡ型ブロックコポリマーは、式Ｉ：（Ａａ）（Ｂｂ）（Ａａ）によって表すことができ、式中、Ａは、Ａブロックを含むポリマー構造のモノマー単位であり、ａは、Ａブロックの重合度であり、２〜１５０の値を有する整数であり、Ｂは、Ｂブロックを含むポリマー構造のモノマー単位であり、ｂはＡブロックの重合度であり、１０〜１００の値の整数である。
【００５８】
いくつかの実施形態において、ＡまたはＢブロックのいずれかは、それ自体がコポリマーであってもよい。例えば、いくつかの実施形態において、ブロックコポリマーのＡブロックおよび／またはＢブロックは、２つ以上の型のモノマー単位を含むことができる。いくつかの実施形態において、モノマー単位は、交互のモノマー５０４としてＡブロックおよび／またはＢブロック内に存在することができる。いくつかの実施形態において、モノマー単位は、ランダム構成５０６でＡブロックおよび／またはＢブロック内に存在することができる。いくつかの実施形態において、コポリマー接合部の化学的界面はテーパー状であってもよい。例えば、いくつかの実施形態において、Ａブロックのモノマー単位がＢブロックのモノマー単位に徐々に移行するように、ＡブロックとＢブロックをテーパー状界面５０８によって分離することができる。したがって、本明細書で使用される「Ａブロック」および「Ｂブロック」という用語は、一般に、異なる相対的疎水性／親水性特性を有するブロックコポリマーのブロックを指すことができ、いずれかのブロックを特定のモノマー単位に限定するものとして解釈されるべきではないことを理解されたい。
【００５９】
いくつかの実施形態において、トリブロックコポリマーの概略的な一般化は、式［ＡａＢｂＣｃ．．．］ａ［ＸｘＹｙＺｚ．．．］ｂ［ＡａＢｂＣｃ．．．］ａによって表され、式中、各文字はモノマー単位を表し、モノマー単位の各下付き文字は特定のブロック内のその単位のモル分率を表し、３つのドットは各ブロック内のモノマー単位の数が増減する可能性があることを示し、かつａおよびｂは、ＡブロックおよびＢブロックの重合度をそれぞれ示す。概略図によって示唆されるように、いくつかの実施形態において、各構成単位の数および性質は、各ブロックに対して別々に制御され得る。概略図は、各ブロック内の構成単位の数または異なる型の構成単位の数の間の関係を推測することを意味するものではなくかつ解釈されるべきものではなく、特定のブロック内の構成単位の特定の数または配置を説明することを意図するものでもない。各ブロックにおいて、特に明記しない限り、構成単位は、純粋にランダムな、交互のランダムな、規則的な交互の、規則的なブロックの、またはランダムなブロックの構成で配置されてもよい。
【００６０】
いくつかの実施形態において、ブロックコポリマーは分岐構造を含むことができる。例えば、図５は、ブロックコポリマーの分岐ブロック５１０の例を示しており、所定のブロック内の１つ以上のモノマー単位は、２つ以上の隣接するモノマー単位に結合することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるブロックコポリマーは、ブラシコポリマー５１２として構成され得る。このように、第１のポリマーブロック（影付きの円）はコーティング層と優先的に相互作用するように設計でき、一方、第２のポリマーブロック（白丸）は外側に広がり、防汚特性を提供するように設計できる。
【００６１】
いくつかの実施形態において、ブロックコポリマーの少なくとも１つのブロック（例えば、Ａブロックおよび／またはＢブロック）は、防汚特性を有する組成物を含む。いくつかの実施形態において、ブロックコポリマーの少なくとも１つのブロック（例えば、Ａブロックおよび／またはＢブロック）は、電気的に中性の組成物、親水性組成物、および／または水素結合供与体を含むが水素結合受容体を含まない組成物を有する。いくつかの実施形態において、ブロックコポリマーの少なくとも１つのブロック（例えば、Ａブロックおよび／またはＢブロック）は、ポリアクリレート（例えば、ウレタン結合側鎖を含むポリアクリレート）、オリゴ糖、ポリウレタン（例えば、熱可塑性セグメント化ポリウレタン）、またはポリエーテル（例えば、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（プロピレングリコール）、ポリ（ブチレングリコール））、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、ブロックコポリマーの各ブロック（例えば、ＡブロックおよびＢブロック）は、それぞれのポリアクリレート（例えば、ウレタン結合側鎖を含むポリアクリレート）、オリゴ糖、ポリウレタン（例えば、熱可塑性セグメント化ポリウレタン）、またはポリエーテル（例えば、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（プロピレングリコール）、ポリ（ブチレングリコール））、またはそれらの組み合わせを含む。
【００６２】
いくつかの実施形態において、ブロックコポリマーの少なくとも１つのブロックは、ポリエーテルを含むポリマー構造である。いくつかの実施形態において、ブロックコポリマーの各ブロックは、ポリエーテルを含むポリマー構造である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのブロックは、エチレンオキシド（−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−）繰り返し単位を含むモノマー単位のオリゴマー構造またはポリマー構造である。いくつかの実施形態において、Ａブロックは第１のポリエーテルブロックを含み、Ｂブロックは第１のポリエーテルブロックよりも疎水性の高い第２のポリエーテルブロックを含む。いくつかの実施形態において、Ａブロックはポリエチレンオキシドを含み、Ｂブロックはポリプロピレンオキシドを含む。いくつかの実施形態において、Ａブロックおよび／またはＢブロックは、ポリエチレンオキシドとポリプロピレンオキシドの混合物を含み、この混合物は、Ａブロックと比較してＢブロックの相対的疎水性を変化させない。いくつかの実施形態において、ＡＢＡ型ブロックコポリマーは式ＩＩの化合物である：
【００６３】
【化２】
2020520332.tif 000004
【００６４】
式中、ａは２〜１５０の値の整数であり、ｂは１０〜１００の値の整数である。いくつかの実施形態において、ａは１０〜３０の値を含み、ｂは４０〜１００の値を含む。いくつかの実施形態において、ａは約２０の値であり、ｂは約７０の値である。いくつかの実施形態において、ａは８０〜１２０の値を含み、ｂは３５〜９５の値を含む。いくつかの実施形態において、ａは約１００の値であり、ｂは約６５の値である。
【００６５】
いくつかの実施形態において、トリブロックコポリマーなどのブロックコポリマーは、特定の機能要件を提供するために構造上の制限を有する場合がある。例えば、ブロックコポリマーの総分子量（例えば、重量平均分子量、または数平均分子量）は、ポリマーが２５℃で液体であるか、あるいは２５℃で特定の最大粘度を有するように十分に低くてもよい。いくつかの実施形態において、ブロックコポリマーの総分子量（例えば、重量平均分子量）は、ゴニオメーターを使用して決定され、表面官能化を決定し、続いて飛行時間型二次イオン質量分析を使用して分析され得る。いくつかの実施形態において、ブロックコポリマーの総分子量（例えば、重量平均分子量）は、例えば、約７，０００ｇ／ｍｏｌ以下、または約６，５００ｇ／ｍｏｌ以下、または約６，０００ｇ／モル以下、または約５，５００ｇ／ｍｏｌ以下、または約５，０００ｇ／ｍｏｌ以下、または約、または約４，５００ｇ／ｍｏｌ以下、または約４，０００ｇ／ｍｏｌ以下、または約３，５００ｇ／ｍｏｌまたは以下、または約３，０００ｇ／ｍｏｌ、または約２，５００ｇ／ｍｏｌ以下、または約２，０００ｇ／ｍｏｌ以下、または約１，５００ｇ／ｍｏｌ以下、または約１，０００ｇ／ｍｏｌ以下であってもよい。いくつかの実施形態において、ブロックコポリマーの総分子量は６００ｇ／ｍｏｌ〜１，５００ｇ／ｍｏｌの間である。
【００６６】
いくつかの実施形態において、ブロックコポリマーに特定の特性を付与するために、ポリマー内の特定のブロックの分子量が指定されてもよい。例えば、ＡＢＡ型ブロックコポリマーにおけるＢブロックの分子量は、ブロックコポリマーの全分子量に対して変更されてもよく、Ｂブロックがコーティング層と相互作用する程度を変えることができる。Ａ：４４．０５（８８１）、Ｂ：５８．０８（４０６５）。いくつかの実施形態において、Ｂブロックの分子量は、ＡＢＡ型ブロックコポリマーの全分子量の、約３０％〜約４０％、約４０％〜約５０％、約５０％〜約６０％、約６０％〜約７０％、約７０％〜約８０％を、またはそれを超えて、構成する。
【００６７】
官能化
特定の実施形態において、本明細書に記載される技術を使用して、対象分子を試料ウェルの所望の領域に閉じ込めることができる。いくつかの実施形態において、所望の領域は、「標的体積（ｔａｒｇｅｔ  ｖｏｌｕｍｅ）」または「反応体積（ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｖｏｌｕｍｅ）」と呼ばれ得る。いくつかの実施形態において、試料ウェルは、集積デバイスの第１層を通って開口の遠位の底面まで同集積デバイスの第２層に延びる同集積デバイスの表面に形成された開口によって画定される体積または空間を占める。いくつかの実施形態において、開口と試料ウェルの底面との間に配置された第１層および第２層の露出面は、試料ウェルが占める体積または空間をさらに規定する側壁と呼ばれ得る。
【００６８】
いくつかの実施形態において、第１層は金属クラッド層である。いくつかの実施形態において、金属クラッド層は、１つ以上の種類の金属（例えば、アルミニウム、チタン、ジルコニウム、鉄、スズ、タンタルなど）を含む。いくつかの実施形態において、第１層の露出表面部分は金属酸化物を含む。いくつかの実施形態において、第２層は透明材料またはガラスである。いくつかの実施形態において、第２層の露出表面部分は、溶融シリカまたは二酸化ケイ素を含む。いくつかの実施形態において、試料ウェルの側壁は、第１層および第２層の露出表面部分のそれぞれの少なくとも一部から構成される。いくつかの実施形態において、試料ウェルの底面はシリカを含む。いくつかの実施形態において、底面に隣接する側壁の少なくとも一部はシリカを含む。
【００６９】
１つ以上の分子または複合体（例えば、シークエンシング用鋳型）が底面に固定される実施形態において、１つ以上の分子または複合体の付着を可能にするために底面を官能化することが望ましい場合がある。特定の実施形態において、底面は透明ガラスを含む。特定の実施形態において、底面は溶融シリカまたは二酸化ケイ素を含む。いくつかの実施形態において、底面はシランで官能化されている。いくつかの実施形態において、底面はイオン荷電ポリマーで官能化されている。いくつかの実施形態において、イオン荷電ポリマーはポリ（リジン）を含む。いくつかの実施形態において、底面は、ポリ（リジン）−グラフト−ポリ（エチレングリコール）で官能化されている。いくつかの実施形態において、底面はビオチン化ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で官能化されている。
【００７０】
いくつかの実施形態において、底面は、アルキル鎖を含むシランで官能化されている。いくつかの実施形態において、底面は、任意に置換されたアルキル鎖を含むシランで官能化されている。いくつかの実施形態において、底面は、ポリ（エチレングリコール）鎖を含むシランで官能化されている。いくつかの実施形態において、底面は、カップリング基を含むシランで官能化されている。例えば、カップリング基は、アミン基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、スルフヒドリル基、金属、キレート剤などの化学部分を含んでもよい。代替的に、それらは、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、レクチン、ＳＮＡＰタグ（商標名）などの特異的結合要素、あるいはそれゆえ基板、会合もしくは結合ペプチドまたはタンパク質、抗体または抗体フラグメント、核酸または核酸類似体など、を含み得る。付随的に、あるいは代替的に、カップリング基を使用して、場合によっては化学官能基と特異的結合要素の両方を含み得る、対象分子と連結または結合するために使用される追加の基を結合することができる。例として、カップリング基、例えばビオチンは、基板表面上に堆積され、所定の領域で選択的に活性化され得る。次いで、中間結合剤、例えばストレプトアビジンが、第１のカップリング基にカップリングされ得る。この特定の例ではビオチニル化される対象分子は、ストレプトアビジンに結合される。
【００７１】
いくつかの実施形態において、底面は、ビオチンまたはその類似体を含むシランで官能化されている。いくつかの実施形態において、底面は、ポリ（エチレングリコール）鎖を含むシランで官能化され、ポリ（エチレングリコール）鎖はビオチンを含む。特定の実施形態において、底面はシランの混合物で官能化され、少なくとも１つの種類のシランはビオチンを含み、少なくとも１つの種類のシランはビオチンを含まない。いくつかの実施形態において、混合物は、ビオチンを含まないシランに対して、約１０分の１、約２５分の１、約５０分の１、約１００分の１、約２５０分の１、約５００分の１または約１０００分の１のビオチン化シランを含む。
【００７２】
対象分子
いくつかの態様において、本開示は、対象分子を試料ウェルの所望の領域に閉じ込めるために有用な技術を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法は、官能化表面を有する試料ウェルを、官能化表面に結合するように構成された対象分子と接触させるステップを含む。
【００７３】
いくつかの実施形態において、対象分子は重合酵素である。本明細書で使用される「ポリメラーゼ」および「重合酵素（ｐｏｌｙｍｅｒｉｚｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ）」という用語は、一般に、重合反応を触媒することができる任意の酵素を指す。ポリメラーゼの例には、限定されるものではないが、核酸ポリメラーゼ、転写酵素またはリガーゼが含まれる。ポリメラーゼは重合酵素であり得る。（例えば、核酸シークエンシングのための）単一分子核酸伸長を対象とする実施形態は、標的核酸分子に相補的な核酸を合成することができる任意のポリメラーゼを使用してもよい。いくつかの実施形態において、ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、および／またはそれらの１つ以上の突然変異体または改変形態であり得る。いくつかの実施形態において、ポリメラーゼは、２０１６年１２月１９日に出願された同時係属米国仮出願第６２／４３６，４１０号（その内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる）から選択される任意のポリメラーゼであってもよい。
【００７４】
いくつかの実施形態において、対象分子はシークエンシング用鋳型である。本明細書で使用される「シークエンシング用鋳型」は、分析（例えば、シークエンシング分析）の対象である分子である。いくつかの実施形態において、シークエンシング用鋳型は核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、核酸分子は「標的」または「鋳型」核酸と称される。いくつかの実施形態において、核酸分子は、少なくとも１つのハイブリダイズしたプライマー／重合酵素複合体を含む。例えば、いくつかの実施形態において、核酸分子を、シークエンシングプライマーが核酸分子にアニールするように、核酸分子の一部に相補的なシークエンシングプライマーと接触させる。このプライミング位置は、重合酵素（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼ）が核酸分子に結合して、ハイブリダイズしたプライマー／重合酵素複合体を形成する部位を生成する。したがって、いくつかの実施形態において、対象分子は、ハイブリダイズしたプライマー／重合酵素複合体を有する鋳型核酸分子を含むシークエンシング用鋳型複合体である。
【００７５】
いくつかの実施形態において、試料ウェルと対象分子との接触は、介在する洗浄ステップを行うことなく、試料ウェルと官能化剤との接触の後に起こる。
いくつかの実施形態において、対象分子は、約１００倍〜約１０００倍の選択性、約２００倍〜約８００倍の選択性、約４００倍〜約６００倍の選択性、または約１０００倍〜約２０００倍の選択性で、不動態化金属酸化物表面よりも官能化シリカ表面に優先的に結合する。例えば、いくつかの実施形態において、対象分子は、約８０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍、１１００倍、１２００倍、１３００倍、１４００倍、１５００倍、１６００倍、１７００倍、１８００倍、１９００倍、または約２０００倍以上の選択性で官能化シリカ表面に優先的に結合する。
【００７６】
いくつかの実施形態において、不動態化された金属酸化物表面に対して官能化シリカ表面における対象分子の選択性は、ブロックコポリマーと接触していない試料ウェルと比較して、約１０倍〜約１００倍、約５０倍〜約５００倍、約１００倍〜約１０００倍、または約２００倍〜約４００倍大きい。例えば、いくつかの実施形態において、不動態化された金属酸化物表面に対して官能化シリカ表面における対象分子の選択性は、ブロックコポリマーと接触していない試料ウェルと比較して、約１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍、４００倍、４５０倍、５００倍、５５０倍、６００倍、６５０倍、７００倍、７５０倍、８００倍、８５０倍、９００倍、９５０倍、または約１０００倍以上大きい。
【００７７】
試料装填
いくつかの態様において、本開示は、試料ウェルの１つまたは複数の表面を調製するのに有用な技術に関する。例えば、いくつかの実施形態において、本開示は、試料ウェルの表面を官能化するための方法および組成物を提供する。本明細書に記載される１つ以上の組成物を含む試料は、任意の数の適切な方法によって試料ウェルを含む基板に添加され得る。いくつかの実施形態において、試料は、例えば、ピペット、ディスペンサー、または任意の適切な流体移送デバイス／システムを介して、専門家によって装填される。いくつかの実施形態において、試料は、自動化された手段（例えば、ロボット装置／システム）によって装填される。いくつかの実施形態において、試料は、１つ以上のマイクロ流体チャネルを介して装填される。
【００７８】
いくつかの実施形態において、分析装置に分子を送達するために一般的に使用される方法により、試料を基板（例えば、試料ウェルを含む集積デバイス、アレイ）に送達することができる。例えば、送達方法は、本明細書に記載される組成物の１つまたは複数を流体に懸濁させ、得られた懸濁液を基板上に流すことを含むことができる。これには、関連する懸濁液を基板の１つまたは複数の領域にピペッティングするのみならず、電気方向または圧力ベースの流体フローなど、よりアクティブなフロー方法を含めることができる。いくつかの実施形態において、例えば、基板の特定の領域で所望の表面が官能化される場合、試料は基板の選択された領域に流し込まれる。基板の領域は、関連する懸濁液を基板の正しい領域にピペッティングするのみで、送達の選択的標的にもなり得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される試薬、コポリマー、分子、化学物質、組成物、および／または物質は、２０１６年１２月１９日に出願された同時係属米国仮出願第６２／４３６，４０７号（その内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる）に記載された技術に従って試料ウェルに装填される。
【００７９】
本明細書に記載されるように、本開示の態様は、両親媒性試薬、ブロックコポリマー、官能化剤、および対象分子のうちの１つまたは複数を使用して試料ウェルを調製する方法を提供する。いくつかの実施形態において、試料ウェルは、これらの成分のうちの２つ以上にほぼ同時にさらされ得る。いくつかの実施形態において、試料ウェルは、これらの構成要素のそれぞれに段階的にさらされる。いくつかの実施形態において、試料ウェルを両親媒性試薬とブロックコポリマーにほぼ同時にさらして、不動態化表面を生成する。いくつかの実施形態において、試料ウェルは、コーティング層を生成するために他の成分の前に両親媒性試薬にさらされる。いくつかの実施形態において、試料ウェルは、同試料ウェルがブロックコポリマーにさらされる期間を超える期間にわたって両親媒性試薬にさらされる。例えば、いくつかの実施形態において、両親媒性試薬は、金属酸化物表面を有する試料ウェルとのより長いインキュベーション期間を必要とし得る分子自己組織化のプロセスによりコーティング層を生成する。
【００８０】
いくつかの実施形態において、試料ウェルがブロックコポリマーにさらされる前に、試料ウェルを両親媒性試薬に約２４時間さらしてコーティング層を形成する。いくつかの実施形態において、試料ウェルは、同試料ウェルがブロックコポリマーにさらされる前に、約４〜８時間、約８〜１２時間、約１２〜１６時間、約１６〜２０時間、約２０〜２４時間、約２４〜２８時間、約２８〜３２時間、約３２〜３６時間、約３６〜４０時間、約４０〜４４時間、約４４〜４８時間、またはそれを超える期間、両親媒性試薬にさらされて、コーティング層が形成される。いくつかの実施形態において、コーティング層を有する試料ウェルは、試料ウェルが官能化剤にさらされる前に、約２時間、ブロックコポリマーにさらされる。いくつかの実施形態において、コーティング層を有する試料ウェルは、約３０分間、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間の、またはそれを超える期間の間、ブロックコポリマーにさらされて、金属酸化物表面上に防汚層を形成する。
【００８１】
いくつかの実施形態において、防汚層を有する試料ウェルは、約１〜２時間の間、官能化剤にさらされる。いくつかの実施形態において、試料ウェルは約３０分間、官能化剤にさらされる。いくつかの実施形態において、試料ウェルは約１時間、官能化剤にさらされる。いくつかの実施形態において、試料ウェルは約２時間、官能化剤にさらされる。いくつかの実施形態において、試料ウェルは、約３０〜９０分間、官能化剤にさらされる。いくつかの実施形態において、試料ウェルは、約３時間、官能化剤にさらされる。いくつかの実施形態において、試料ウェルは官能化剤に３時間超、官能化剤にさらされる。
【００８２】
いくつかの実施形態において、官能化されたシリカ表面を有する試料ウェルは、対象の分子に約１〜２時間さらされる。いくつかの実施形態において、試料ウェルは、対象分子に約３０分間さらされる。いくつかの実施形態において、試料ウェルは、対象分子に約１時間さらされる。いくつかの実施形態において、試料ウェルは、対象分子に約２時間さらされる。いくつかの実施形態において、試料ウェルは、対象分子に約３０〜９０分間さらされる。いくつかの実施形態において、試料ウェルは、対象分子に約３時間さらされる。いくつかの実施形態において、試料ウェルは、対象分子に３時間超、さらされる。
【００８３】
試料調製
いくつかの実施形態において、標的核酸を含む試料は、対象（例えば、ヒトまたは他の対象）から得られた生物学的試料から抽出され得る。いくつかの実施形態において、対象は患者であり得る。いくつかの実施形態において、診断の、予後の、および／または治療の目的のために、標的核酸を検出および／または配列決定することができる。いくつかの実施形態において、シークエンシングアッセイに関する情報は、疾患または状態の診断、予後、および／または治療を支援するのに有用であり得る。いくつかの実施形態において、対象は、疾患（例えば、癌）などの健康状態を有する疑いがある場合がある。いくつかの実施形態において、対象は疾患の治療を受けている可能性がある。
【００８４】
いくつかの実施形態において、生物学的試料は、対象の体液または組織、例えば、呼吸、唾液、尿、血液（例えば、全血または血漿）、糞便、若しくは他の体液または生検試料から抽出され得る。いくつかの例において、１つまたは複数の核酸分子が対象の体液または組織から抽出される。１つ以上の核酸は、対象の組織の一部などの対象から得られた１つ以上の細胞から抽出されてもよいし、全血などの対象の無細胞体液から得られてもよい。
【００８５】
生物学的試料は、検出（たとえば、シークエンシング）のための調製時に処理される場合がある。そのような処理には、生物学的試料からの生体分子（例えば、核酸分子）の単離および／または精製、ならびに生体分子のより多くのコピーの生成が含まれ得る。いくつかの例において、１つまたは複数の核酸分子が対象の体液または組織から単離および精製され、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの核酸増幅により増幅される。次に、１つ以上の核酸分子またはそのサブユニットは、シークエンシングなどにより同定され得る。しかしながら、いくつかの実施形態において、増幅を必要とせずに核酸試料を評価（例えば、配列決定）することができる。
【００８６】
本願に記載されているように、シークエンシングには、例えば、鋳型核酸分子と相補的な核酸分子を合成して、ヌクレオチドの取り込みを経時的に特定する（たとえば、合成によるシークエンシング）ことによるような、鋳型に相補的または類似の別の生体分子を合成することにより、鋳型生体分子（例えば、核酸分子）の個々のサブユニットを決定することが含まれる。別の方法として、シークエンシングには、生体分子の個々のサブユニットの直接的な特定が含まれる。
【００８７】
シークエンシング
いくつかの態様において、本明細書に記載される方法およびデバイスは、試料中の個々の分子または粒子の検出を可能にする分析技術で使用され得る。個々の分子は、限定されるものではなく例として、アミノ酸、ポリペプチド、ヌクレオチド、核酸、または検出可能な部分を含むその変異体であり得る。例えば、いくつかの実施形態において、本開示で提供される方法および組成物は、単一分子核酸シークエンシング技術と併せて使用され得る。単一分子核酸シークエンシングにより、鋳型核酸に相補的な核酸分子の伸長をリアルタイムで監視することにより、単一核酸分子の配列を決定することができる。
【００８８】
いくつかの実施形態において、本願の態様は、生物学的試料のアッセイに関連する方法で使用することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法は、試料中の１つまたは複数の核酸またはポリペプチドの配列を決定するために、および／または、試料中の１つまたは複数の核酸またはポリペプチド変異体（例えば、対象遺伝子の１つまたは複数の突然変異）の存在または非存在を決定するために使用される技術において有用である。いくつかの実施形態において、診断、予後、および／または治療目的のために、核酸配列情報を提供するか、または関心のある１つまたは複数の核酸の有無を決定するために、患者試料（たとえば、ヒト患者試料）について試験を実施できる。いくつかの例において、診断試験は、例えば対象の生物学的試料中の無細胞ＤＮＡ分子および／または発現産物（例えばＲＮＡ）をシークエンシングすることにより、対象の生物学的試料中の核酸分子をシークエンシングすることを含み得る。例えば、本開示は、同時係属中の米国特許出願第１４／５４３，８６５号、第１４／５４３，８６７号、第１４／５４３，８８８号、第１４／８２１，６５６号、第１４／８２１，６８６号、第１４／８２１，６８８号、第１５／１６１，０６７号、第１５／１６１，０８８号、第１５／１６１，１２５号、第１５／２５５，２４５号、第１５／２５５，３０３号、第１５／２５５，６２４号、第１５／２６１，６９７号、第１５／２６１，７２４号、第１５／６００，９７９号、第１５／８４６，９６７号、第１５／８４７，００１号、第６２／２８９，０１９号、第６２／２９６，５４６号、第６２／３１０，３９８号、第６２／３３９，７９０号、第６２／３４３，９９７号、第６２／３４４，１２３号、第６２／４２６，１４４号、第６２／４３６，４０７号および第６２／４３６，４１０号（それぞれの内容は参照により本明細書に組み込まれる）に記載された技術において有利に利用され得る方法および組成物を提供する。
【００８９】
本願のいくつかの態様は、核酸およびタンパク質などの生物学的ポリマーをシークエンシングできる技術において有用である。いくつかの実施形態において、本願に記載される方法および組成物は、核酸またはタンパク質に組み込まれる一連のヌクレオチドまたはアミノ酸モノマーを同定する技術で使用することができる（例えば、一連の標識ヌクレオチドまたはアミノ酸モノマーの取り込みの経時変化を検出することにより）。いくつかの実施形態において、本願に記載される方法および組成物は、試料ウェル中の重合酵素により合成される鋳型依存性核酸シークエンシング反応生成物に組み込まれる一連のヌクレオチドを同定する技術に組み込まれ得る。いくつかの実施形態において、重合酵素は、本明細書に記載される選択性の高い表面官能化技術を使用して、試料ウェルの所望の領域に付着させることができる。
【００９０】
いくつかの実施形態において、ポリメラーゼ、標的核酸、およびプライマーを含む複合体が溶液中で形成され、複合体が固体支持体に固定化される（例えば、ポリメラーゼ、プライマー、および／または標的核酸の固定化を介して）。
【００９１】
試料ウェル
いくつかの態様において、本開示は、金属酸化物表面およびシリカ表面を有する試料ウェルを含む基板を含む集積デバイスを提供する。いくつかの実施形態において、集積デバイスは、親水性頭部基および疎水性尾部基を含む両親媒性試薬によって形成された金属酸化物表面上のコーティング層をさらに含む。いくつかの実施形態において、両親媒性試薬は、親水性頭部基を介して金属酸化物表面に結合している。いくつかの実施形態において、集積デバイスは、ＡブロックおよびＢブロックを含むＡＢＡ型ブロックコポリマーによって形成されたコーティング層上に防汚オーバーレイをさらに含む。いくつかの実施形態において、ＡＢＡ型ブロックコポリマーは、Ｂブロックを介してコーティング層に結合している。いくつかの実施形態において、集積デバイスは、シリカ表面に結合した官能化剤をさらに含み、官能化剤はカップリング部分を含む。
【００９２】
いくつかの実施形態において、基板は試料ウェルのアレイを含み、各試料ウェルは金属酸化物表面およびシリカ表面を有する。いくつかの実施形態において、試料ウェルは、基板の表面に形成された上部開口と、基板の表面の遠位にある底面とを含む。いくつかの実施形態において、底面はシリカ表面に含まれる。いくつかの実施形態において、集積デバイスは、次世代シークエンシング機器とインターフェースするように構成される。
【００９３】
本明細書で使用される場合、「集積デバイス（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｄｅｖｉｃｅ）」は、ベース機器とインターフェースすることができるデバイスである。いくつかの実施形態において、集積デバイスは、１つ以上の試料ウェルおよび／またはセンサーを含み得る。いくつかの実施形態において、集積デバイスは、光を放出または検出するベース機器とインターフェースすることができてもよい。そのような実施形態において、集積デバイスは、それぞれが導波路を含む１つ以上の試料ウェルを備えてもよい。
【００９４】
本明細書に記載されるタイプの集積デバイスは、その中に対象分子を受け取るように構成された１つまたは複数の試料ウェルを含み得る。いくつかの実施形態において、試料ウェルは、底面などの試料ウェルの表面上に配置され得る対象分子を受承する。いくつかの実施形態において、試料ウェルは集積デバイス内に形成され、試料ウェルの底面は、それが形成される集積デバイスの表面に対して遠位にある。いくつかの実施形態において、対象分子が配置される底面は、所望のレベルの励起エネルギーで対象分子を励起するように構成された導波路から、ある距離を有していてもよい。いくつかの実施形態において、導波路に沿って伝搬する光学モードのエバネセント場が対象分子と重なるように、導波路に対して試料ウェルを配置することができる。
【００９５】
試料ウェルは、集積デバイスの表面に上部開口を有していてもよく、同上部開口を介して対象分子を試料ウェルに配置してもよい。上部開口のサイズは、装填される試料内の対象分子（シークエンシング用鋳型、重合酵素など）のサイズなど、さまざまな要因に依存し得る。いくつかの実施形態において、上部開口のサイズは、試料ウェルを含む集積デバイスが利用されている機器または装置に依存し得る。たとえば、試料ウェル内からの光を検出するデバイスでは、迷光からバックグラウンド信号が発生する場合がある。対象分子が試料ウェルに配置され、励起エネルギーで励起されると、バックグラウンド信号が放出エネルギーの望ましくない変動を引き起こし、測定にノイズが発生する場合がある。そのような変動を制限するために、上部開口のサイズは、バックグラウンド信号の少なくとも一部をブロックするように構成されてもよい。
【００９６】
試料ウェルの体積は、いくつかの実装形態において、約１０−２１リットルから約１０−１５リットルの間であり得る。試料ウェルの体積が小さいため、対象分子が自然環境で見られる濃度と同様の濃度で検査試料に濃縮され得る場合でも、単一試料事象（たとえば、単一分子事象）の検出が可能である。たとえば、マイクロモル濃度の対象分子は、集積デバイスと接触して配置された標本に存在する可能性があるが、ピクセルレベルでは、対象の約１つの分子（または単一分子事象）のみが、任意の所与の時点にて、試料ウェル内にあり得る。
【００９７】
統計的には、一部の試料ウェルに対象分子が含まれていない場合と、一部の試料ウェルに複数の対象分子が含まれている場合がある。しかしながら、かなりの数の試料ウェルに対象の単一分子を含めることができるため（たとえば、いくつかの実施形態において少なくとも３０％）、多数の試料ウェルに対して単一分子分析を並行して実行できる。単一分子または単一試料事象を各試料ウェルで分析できるため、集積デバイスにより、アンサンブル平均では見過ごされる可能性のある個々の事象を検出できる。
【実施例】
【００９８】
実施例１．ブロックコポリマーを使用した金属酸化物表面の濡れ性の改善
金属酸化物表面の不動態化のプロセスは、濡れ性実験によって評価した。ＴｉＯ２およびＳｉＯ２からなる表面領域を有するクーポン（ｃｏｕｐｏｎ）は、コーティング層の形成およびその後の防汚オーバーレイの形成を含む２段階プロセスにかけられた。これらの実験の目的のため、ヘキシルホスホン酸（ＨＰＡ）を使用してコーティング層を生成し、プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）（登録商標）Ｐ１２３トリブロックコポリマー（ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａＨ）を使用して防汚層を生成した。
【００９９】
ＴｉＯ２／ＳｉＯ２クーポンを２４時間の間、ＨＰＡにさらし、ＴｉＯ２表面上のＨＰＡ単分子層を自己組織化させた。ＨＰＡの不動態化に続いて、表面の濡れ性を接触角測定により評価した。クーポンのＴｉＯ２側の液滴は約８５°と測定され、ＳｉＯ２側の液滴は約１５°と測定された。時間の関数としての接触角のプロットは、２時間後もＨＰＡ不動態化ＴｉＯ２表面で液滴の接触角が安定したままであることを示していた。
【０１００】
ＨＰＡでの不動態化の後、ＴｉＯ２／ＳｉＯ２クーポンをトリブロックコポリマーに２時間さらした。繰り返し述べるが、接触角の測定値は、クーポンの各面について得られた。ＳｉＯ２側の濡れ性は、接触角が約１５°に維持された状態であり、トリブロックコポリマーステップの影響を受けていないように見えた。これは、ブロックコポリマーの添加によってＳｉＯ２の親水性が変化しないことを示唆している。対照的に、クーポンのＴｉＯ２側では、接触角が約４５°に減少した状態であり、濡れ性の測定可能な増加が見られた。ＴｉＯ２上の液滴の画像は、最初のＨＰＡ不動態化の後のもの（図６の上側）およびＨＰＡ不動態化表面をブロックコポリマーへさらした後のもの（図６の下側）を得た。ここでの濡れ性の変化は、ＨＰＡ不動態化ＴｉＯ２の親水性がブロックコポリマーの添加後に顕著に増加することを示唆している。さらに、これらの観察結果は、ブロックコポリマーによって形成される防汚オーバーレイの形成と一致する。
【０１０１】
実施例２．表面官能性を評価するための結合選択性アッセイ
シラン化の表面選択性は、ＴｉＯ２／ＳｉＯ２クーポン上のビオチン共役シランを用いた、量子ドット（ＱＤ）−ストレプトアビジンアッセイによって評価した。これらの実験において、ＨＰＡ不動態化コーティングのみで調製されたクーポン、またはＨＰＡ不動態化に続いてトリブロックコポリマーによる防汚オーバーレイを備えて調製されたクーポンのいずれかについて、シラン化合物の表面選択性を調べた。アッセイした異なる条件の蛍光イメージングの結果を図７に示す。
【０１０２】
バックグラウンド蛍光測定は、表面化学修飾ステップを受けていないＴｉＯ２／ＳｉＯ２クーポンを使用して得た（図７の上部）対照実験のために、ＨＰＡでの不動態化とそれに続くシラン−ＰＥＧ−ビオチンによる表面官能化により、ＴｉＯ２／ＳｉＯ２クーポンを調製した。蛍光測定は、ＱＤ−ストレプトアビジン結合アッセイを用いて得た。これは、クーポンのシラン化が、ＳｉＯ２側について約２倍の選択性で発生したことを示すものであった（図７の中央部）。選択性は、バックグラウンド蛍光強度測定値を対照強度測定値から引くことにより決定した。たとえば、ＳｉＯ２：ＴｉＯ２についての対照の選択性は、図７（上部、中央部）で報告された測定値を使用して概算され、ここで、選択性は、（Ｓｉｃｏｎｔｒｏｌ−Ｓｉｂｌａｎｋ）／（Ｔｉｃｏｎｔｒｏｌ−Ｔｉｂｌａｎｋ）＝（５３０００−３４００）／（２５０００−２０００）＝（４９６００）／（２３０００）＝約２．２、またはおおよそ２倍の選択性であった。
【０１０３】
次に、ＨＰＡ不動態化およびトリブロックコポリマーオーバーレイを用いて、実施例１と同様にＴｉＯ２／ＳｉＯ２クーポンを調製した。コポリマー修飾クーポンのシラン化後、蛍光測定により、シラン化合物がＴｉＯ２側よりもＳｉＯ２側に５００：１を超える選択性で結合したことが示された（図７の下部）。図示されているように、コポリマークーポンのＴｉＯ２側で検出された蛍光シグナルは、ブランク実験でのＴｉＯ２側に近似していた。したがって、選択性はすでに述べたように計算され、ＳｉＯ２側について５００倍を超える優先度を示すものと概算された（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｄ）。
【０１０４】
実施例３．生物学的反応における防汚効果
シークエンシングチップに対する防汚オーバーレイの効果は、ＨＰＡまたはＨＰＡ／トリブロックコポリマーで処理されたチップ上の色素標識ヌクレオチドからの蛍光発光を観察することにより評価した。図８（左側）に示すように、ＨＰＡ／トリブロックコポリマーで処理されたチップでは、最小限の蛍光シグナルが観察された。対照的に、ＨＰＡのみで処理されたチップは、溶液中の標識ヌクレオチドから検出されたはるかに大きな発光を示した（図８の右側）。これらの結果は、ＨＰＡ／トリブロックコポリマーで処理されたチップよりもＨＰＡで処理されたチップが、試料のエバネッセント体積内に保持されている色素標識ヌクレオチドに対してより感受性が高かったことを示す。さらに、これは、トリブロックコポリマーが防汚特性を付与して、エバネッセント体積内の表面に付着する染料の感受性を最小化または排除することを示唆している。ＨＰＡ／トリブロックコポリマー処理チップを使用してシーケンス反応をさらに実施し、トリブロックコポリマー表面不動態化法との適合性を確認した（図９）。
【０１０５】
同等物および範囲
本明細書においていくつかの発明の実施形態について記載および例示してきたが、当業者は、機能を実施するための、ならびに／あるいは本明細書に記載される結果および／または１つもしくは複数の利点を得るためのさまざまなその他の手段および／または構造について容易に想定するであろうが、そのような変更および／または修正のそれぞれは、本明細書に記載されている本発明の実施形態の範囲内であるとみなされる。より一般的に、当業者は、本明細書に記載されるすべてのパラメータ、寸法、材料、および構成が例示であることを意味し、実際のパラメータ、寸法、材料、および／または構成が特定の用途、または発明の教示が使用される用途に依存することを容易に理解するであろう。当業者は、ルーチン的な実験のみを使用して、本明細書に記載される特定の発明の実施形態に対する多くの同等物を認識するか、あるいは確認することができるであろう。したがって、前述の実施形態は例としてのみ提示されるものであり、別途、具体的に説明および特許請求されない限り、添付した特許請求の範囲およびその同等物の範囲内で、発明の実施形態を実施できることを理解されたい。本開示の発明の実施形態は、本明細書に記載されるそれぞれ個々の特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法を対象とする。さらに、そのような機能、システム、物品、材料、キット、および／または方法が相互に矛盾しない場合、そのような機能、システム、物品、材料、キット、および／または方法の２つ以上の任意の組み合わせは、本開示の発明の範囲内に含まれる。
【０１０６】
本明細書で定義および使用されるすべての定義は、辞書の定義、参照により援用される文書の定義、および／または定義された用語の通常の意味を制御するものであると理解されるべきである。
【０１０７】
本明細書に開示されるすべての参考文献、特許、および特許出願は、それぞれが引用される主題に関して参照により組み込まれ、それらは場合によっては文書全体を包含してもよい。
【０１０８】
本明細書および特許請求の範囲において使用される不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、明らかに反対の指示がない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきである。
【０１０９】
語句「および／または」は、本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、そのように結びつけられた複数の要素の「いずれかまたは両方」、すなわち、ある場合には結合的に存在し、またその他の場合には非結合的に存在する要素を意味するものと理解されるべきである。「および／または」を用いて列記された複数の要素は、同様に、即ち、そのように結びつけられた複数の要素の「１つまたは複数」として解釈されるべきである。「および／または」の句により特に特定される要素以外のその他の要素が、特に特定された要素と関連するまたは関連しないに関わらず、任意選択的に存在する可能性がある。したがって、非限定的な例として、「Ａおよび／またはＢ」なる記載は、非制限的（ｏｐｅｎ−ｅｎｄｅｄ）言語、例えば「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等と連携して使用される場合、１つの実施形態ではＡのみ（任意選択的にＢ以外の要素を含む）；別の実施形態ではＢのみ（任意選択的にＡ以外の要素を含む）；さらに別の実施形態ではＡとＢの両方（任意選択的にその他の要素を含む）等、を参照する。
【０１１０】
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、「または」は、上記で定義された「および／または」と同じ意味を有すると理解されるべきである。たとえば、リスト内の項目を区切る場合、「または」あるいは「および／または」は、包括的、つまり要素の数またはリストの少なくとも１つを含むが２つ以上、任意選択的にさらなるリスト化されていない項目を含むと解釈されるものとする。「〜のうちの１つのみ（ｏｎｌｙ  ｏｎｅ  ｏｆ）」、「〜のうちのまさに１つ（ｅｘａｃｔｌｙ  ｏｎｅ  ｏｆ）」、または特許請求の範囲において使用される場合の「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、明確に反示される用語に限り、複数の要素の数またはリストのうちのまさに１つの要素を含むことを指す。一般に、本明細書で使用される「または」なる用語は、排他性の用語、例えば「いずれか（ｅｉｔｈｅｒ）」、「〜のうちの１つ（ｏｎｅ  ｏｆ）」、「〜のうちの１つのみ（ｏｎｌｙ  ｏｎｅ  ｏｆ）」、または「〜のうちのまさに１つ（ｅｘａｃｔｌｙ  ｏｎｅ  ｏｆ）」等が先行する場合に限り、排他的な代替的用語（すなわち、「一方または他方、ただし両方ではない（ｏｎｅ  ｏｒ  ｔｈｅ  ｏｔｈｅｒ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｂｏｔｈ）」）を示すと解釈するものとする。「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、特許請求の範囲において使用される場合、特許法の分野で使用される通常の意味を有するものとする。
【０１１１】
本願明細書および特許請求の範囲において使用する場合、１つまたは複数の要素のリストを参照する際の語句「少なくとも１つ」は、要素のリスト内の任意の１つまたは複数の要素から選択される少なくとも１つの要素を意味するものと理解されるべきであるが、要素のリスト内に特にリスト化されているあらゆる要素それぞれの少なくとも１つを必ずしも含む必要はなく、また要素のリスト内の要素の任意の組み合わせを排除するものでもない。この定義は、語句「少なくとも１つ」が指す要素のリスト内で特に特定された要素以外の要素が、そのような特に特定された要素に関連するか関連しないかに関わらず、任意選択的に存在し得ることも可能にする。したがって、非限定的な例として、「ＡおよびＢのうちの少なくとも１つ」（または同じく「ＡまたはＢのうちの少なくとも１つ」、または同じく「Ａおよび／またはＢのうちの少なくとも１つ」）とは、１つの実施形態では、Ａは少なくとも１つであり、任意選択的に２つ以上を含み、Ｂは存在しない（任意選択的にＢ以外の要素を含む）こと；別の実施形態では、Ｂは少なくとも１つであり、任意選択的に２つ以上を含み、Ａは存在しない（任意選択的にＡ以外の要素を含む）こと；さらに別の実施形態では、Ａは少なくとも１つであり、任意選択的に２つ以上を含み、Ｂは少なくとも１つであり、任意選択的に２つ以上を含む（任意選択的にその他の要素を含む）こと等を指す。
【０１１２】
また、反対であることが明確に示されない限り、複数のステップまたは行為を含む本願で特許請求された任意の方法において、方法のステップまたは行為の順序は、該ステップまたは行為が引用された順序に必ずしも限定されないことも理解されるべきである。
【０１１３】
特許請求の範囲および上記した明細書において、すべての移行句、例えば「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「〜を担持する（ｃａｒｒｙｉｎｇ）」、「〜を有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「〜を含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「〜を伴う（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、「〜を保持する（ｈｏｌｄｉｎｇ）」、「〜から構成される（ｃｏｍｐｏｓｅｄ  ｏｆ）」等は非制限的である、すなわち、〜を含むが、これらに限定されない、を意味するものと理解される。移行句「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」および「〜から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」に限り、特許審査手順の米国特許オフィスマニュアル（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｏｆｆｉｃｅ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｅｘａｍｉｎｉｎｇ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）、セクション２１１１．０３に規定するように、それぞれ限定的（ｃｌｏｓｅｄ）または半限定的な（ｓｅｍｉ−ｃｌｏｓｅｄ）移行句であるものとする。非制限的な移行句（例えば、「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」）を使用する本文書に記載されている実施形態も、代替的実施形態においては、非制限的移行句により記載される、「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」特徴および「〜から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」特徴、としてやはり企図されていると認められるべきである。例えば、本開示が「ＡおよびＢを含む組成物」について記載する場合、本開示は、「ＡおよびＢからなる組成物」および「ＡおよびＢから本質的になる組成物」といった代替的実施形態も企図している。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2020520332.tif 000013
【図８−１】
2020520332.tif 000014
【図８−２】
2020520332.tif 000015
【図９−１】
2020520332.tif 000016
【図９−２】
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【図９−３】
2020520332.tif 000018
【国際調査報告】
2020520332.tif 000019
2020520332.tif 000020