(57)【要約】  ヒスチジン緩衝液中においてＰＣＳＫ−９抗体又はその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物が提供される。また、前記医薬組成物は、糖類及び非イオン性界面活性剤を含んでもよい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＰＣＳＫ−９抗体又はその抗原結合フラグメントと緩衝液とを含む医薬組成物であって、前記緩衝液が、好ましくはヒスチジン緩衝液又はコハク酸緩衝液又はリン酸緩衝液又はクエン酸緩衝液であり、より好ましくはヒスチジン緩衝液であり、最も好ましくはヒスチジン−塩酸緩衝液である、医薬組成物。
【請求項２】
前記抗ＰＣＳＫ−９抗体又はその前記抗原結合フラグメントの濃度が、約１ｍｇ／ｍＬ〜１５０ｍｇ／ｍＬであり、好ましくは約３０ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬであり、より好ましくは４５ｍｇ／ｍＬ〜５５ｍｇ／ｍＬであり、最も好ましくは５０ｍｇ／ｍＬである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記医薬組成物のｐＨが、約５．５〜６．５であり、好ましくは約６．０〜６．５であり、最も好ましくは６．０である、請求項１又は請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記緩衝液の濃度が、約５ｍＭ〜３０ｍＭであり、好ましくは５ｍＭ〜２０ｍＭであり、さらに好ましくは５ｍＭ〜１５ｍＭであり、最も好ましくは１０ｍＭである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
さらに二糖類を含み、前記二糖類が、好ましくはトレハロース又はスクロースから選択され、最も好ましくはスクロースである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記二糖類の濃度が、約１０ｍｇ／ｍＬ〜７５ｍｇ／ｍＬであり、好ましくは約２０ｍｇ／ｍＬ〜４０ｍｇ／ｍＬであり、最も好ましくは２５ｍｇ／ｍＬである、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
さらに界面活性剤を含み、前記界面活性剤が、好ましくはポリソルベートであり、より好ましくはポリソルベート８０である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記界面活性剤の濃度が、約０．０５ｍｇ／ｍＬ〜０．６ｍｇ／ｍＬであり、好ましくは０．１ｍｇ／ｍＬ〜０．４ｍｇ／ｍＬであり、さらに好ましくは０．１ｍｇ／ｍＬ〜０．３ｍｇ／ｍＬであり、最も好ましくは０．２ｍｇ／ｍＬである、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記抗ＰＣＳＫ−９抗体又はその前記抗原結合フラグメントが、それぞれ配列番号１２、配列番号１３及び配列番号１４のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに、それぞれ配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１７のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記抗ＰＣＳＫ−９抗体又はその前記抗原結合フラグメントが、配列番号１８〜２３から成る群から選択される重鎖可変領域と、配列番号２４〜２７から成る群から選択される軽鎖可変領域とを含む、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記抗ＰＣＳＫ−９抗体の軽鎖アミノ酸配列が、配列番号３０の抗体軽鎖アミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、前記抗ＰＣＳＫ−９抗体の重鎖アミノ酸配列が、配列番号２８又は配列番号３２の抗体重鎖アミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の医薬組成物を調製する方法であって、抗ＰＣＳＫ−９抗体又はその抗原結合フラグメントの貯蔵溶液を緩衝液と置換するステップを含み、前記緩衝液が、好ましくはヒスチジン緩衝液であり、前記緩衝液の濃度が、好ましくは約５ｍＭ〜３０ｍＭであり、前記緩衝液のｐＨが、約６．０〜６．５である、方法。
【請求項１３】
さらに、前記置換するステップから得られた溶液にスクロース及びポリソルベート８０を添加し、次いで緩衝液で最終量とするステップを含み、前記緩衝液の濃度が、好ましくは約１０ｍＭ〜２０ｍＭであり、前記緩衝液のｐＨが、約６．０〜６．５である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の医薬組成物を凍結乾燥するステップを含む、抗ＰＣＳＫ−９抗体を含む凍結乾燥製剤を調製する方法。
【請求項１５】
前記凍結乾燥が、逐次的に、予備凍結、一次乾燥及び二次乾燥のステップを含む、  請求項１４に記載の抗ＰＣＳＫ−９抗体を含む凍結乾燥製剤を調製する方法。
【請求項１６】
請求項１４又は１５に記載の方法によって調製される前記抗ＰＣＳＫ−９抗体を含む凍結乾燥製剤。
【請求項１７】
抗ＰＣＳＫ−９抗体を含む再構成溶液を調製する方法であって、請求項１６に記載の凍結乾燥製剤を再構成するステップを含み、再構成のための溶媒が、好ましくは注射用水である、方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法によって調製される前記抗ＰＣＳＫ−９抗体を含む再構成溶液。
【請求項１９】
前記抗ＰＣＳＫ−９抗体又は前記抗原結合フラグメントの濃度が、約１２０ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬであり、最も好ましくは１５０ｍｇ／ｍＬである、請求項１８に記載の抗ＰＣＳＫ−９抗体を含む再構成溶液。
【請求項２０】
前記医薬組成物のｐＨが、約６．０〜６．５であり、好ましくは６．３である、請求項１８に記載の抗ＰＣＳＫ−９抗体を含む再構成溶液。
【請求項２１】
前記緩衝液の濃度が、約１５ｍＭ〜４５ｍＭであり、好ましくは３０ｍＭである、請求項１８に記載の抗ＰＣＳＫ−９抗体を含む再構成溶液。
【請求項２２】
さらに二糖類を含み、前記二糖類が、好ましくはトレハロース又はスクロースから選択され、最も好ましくはスクロースである、請求項１８に記載の抗ＰＣＳＫ−９抗体を含む再構成溶液。
【請求項２３】
前記二糖類の濃度が、約５５ｍｇ／ｍＬ〜９５ｍｇ／ｍＬであり、好ましくは７５ｍｇ／ｍＬである、請求項２２に記載の抗ＰＣＳＫ−９抗体を含む再構成溶液。
【請求項２４】
さらに界面活性剤を含み、前記界面活性剤が、好ましくはポリソルベートであり、より好ましくはポリソルベート８０である、請求項１８に記載の抗ＰＣＳＫ−９抗体を含む再構成溶液。
【請求項２５】
前記界面活性剤の濃度が、約０．４ｍｇ／ｍＬ〜０．８ｍｇ／ｍＬであり、好ましくは０．６ｍｇ／ｍＬである、請求項２４に記載の抗ＰＣＳＫ−９抗体を含む再構成溶液。
【請求項２６】
ＰＣＳＫ−９媒介疾患又はＰＣＳＫ−９媒介障害を処置するための薬物の製剤における、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の医薬組成物、又は、請求項１６に記載の凍結乾燥製剤、又は、請求項１８〜２５のいずれか一項に記載の凍結乾燥製剤の再構成溶液の使用であって、前記疾患又は前記障害が、好ましくはコレステロール関連疾患であり、より好ましくは、高コレステロール血症、心疾患、メタボリック症候群、糖尿病、冠動脈性心疾患、脳卒中、心血管疾患、アルツハイマー病及び全身性異脂肪血症から成る群から選択され、最も好ましくは、高コレステロール血症、異脂肪血症、アテローム性動脈硬化、ＣＶＤ又は冠動脈性心疾患である、使用。
【請求項２７】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の医薬組成物の治療上有効量、又は、請求項１６に記載の凍結乾燥製剤、又は、請求項１８〜２５のいずれか一項に記載の凍結乾燥製剤の再構成溶液を、それを必要とする患者に投与することを含む、ＰＣＳＫ−９関連疾患又はＰＣＳＫ−９関連障害を処置し、予防する方法であって、前記疾患又は前記障害が、好ましくはコレステロール関連疾患であり、より好ましくは、高コレステロール血症、心疾患、メタボリック症候群、糖尿病、冠動脈性心疾患、脳卒中、心血管疾患、アルツハイマー病及び全身性異脂肪血症から成る群から選択され、最も好ましくは、高コレステロール血症、異脂肪血症、アテローム性動脈硬化、ＣＶＤ又は冠動脈性心疾患である、方法。
【請求項２８】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の医薬組成物、又は請求項１６に記載の凍結乾燥製剤、又は請求項１８〜２５のいずれか一項に記載の凍結乾燥製剤の再構成溶液を含む容器を含む製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１７年６月３０日に出願された中国特許出願第ＣＮ２０１７１０５１９８２９．６号の優先権を主張するものである。上記出願の全体の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、医薬製剤の分野に属し、特に、抗ＰＣＳＫ−９抗体及びその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物と、薬物としてのその使用とに関する。
【背景技術】
【０００３】
高コレステロール血症は、血清コレステロールのレベルの上昇を特徴とする、脂質の異常代謝を伴う疾患である。その主要な症状は、血管内におけるコレステロール凝集を引き起こし、結果的にアテローム性動脈硬化を形成する血清コレステロールのレベルの上昇である。多くの臨床的研究結果及び実験的研究結果は、脂質の異常代謝が冠動脈性心疾患の発症及び発現と密接に相関することを証明してきた。ゆえに、血液中のコレステロールの濃度を低下させることは、アテローム性動脈硬化を処置し、予防するための主要な手段となってきた。
【０００４】
生活水準の急速な向上に伴って、脂質異常血症も、中国の都市部及び農村部の居住者を危険に陥れる主要な因子になってきた。２０１２年の統計によれば、中国の１年当たりの死者の約４０％は、心臓血管疾患が原因であると考えられた。現在、中国の成人における脂質異常血症の罹患率は１８．６％であり、約１６０，０００，０００人の人々が脂質異常血症に罹患している。様々な型の脂質異常血症の罹患率は、以下の通りである。すなわち、高コレステロール血症が２．９％、高トリグリセリド血症が１１．９％、低高密度リポタンパク質血症が７．４％、血中コレステロールレベルのわずかな増加が３．９％である。慢性疾患の予防及び管理のブランチ委員会（Ｂｒａｎｃｈ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）、疾患の予防及び管理についての専門家委員会（Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｔｓ  ｏｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）及び保健省（Ｍｉｎｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ）によって研究された「予防についての慢性疾患の予防及び管理についての中国専門家のコンセンサス（Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｅｘｐｅｒｔｓ  Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｏｎ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅ）」（２０１２年）において、中国において高コレステロール血症に罹患している人々は３３，０００，０００人存在するが、地方の地域の観点からは、脂質異常血症の罹患率は上記のデータよりもはるかに深刻であることが示された。
【０００５】
現時点では、脂質レベルを管理するために臨床的に用いられる薬物は、主にスタチンに重点を置いている。リピトール（Ｌｉｐｔｏｒ）は、最も広く用いられ、最も売れているコレステロール降下薬物であり、肝臓内のコレステロール生成酵素の効果を遮断することによってコレステロールの生成を減少させ、肝臓による血液からのコレステロールの取り込みを増やすことによって、血液中のコレステロールの濃度を低下させる。しかし、リピトールには、その短所がある。第１に、リピトールは、低密度リポタンパク質を３０％〜４０％減少させることができるが、依然として多くの患者において血中脂質レベルの効果的な低下（低密度リポタンパク質の濃度が５０ｍｇ／ｄＬ未満）を達成できないことは、データから理解されるであろう。第２に、患者の中で、リピトールに対する反応率の人種的差異がある。これらの理由により、患者は、依然として、血中脂質を減少させるためのより有効な医薬を必要としている。
【０００６】
常染色体優性一遺伝子性遺伝性疾患として、家族性高コレステロール血症（ＦＭ）は、血液中の総コレステロール（ＴＣ）及び低密度リポタンパク質−コレステロール（ＬＤＬ−ｃ）の有意な増加、黄色板症、角膜環及び早発性心血管疾患を臨床的な特徴とするものである。低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬ受容体、ＬＤＬＲ）遺伝子の変異は、ＬＤＬＲの不足又は欠乏を引き起こし、その結果、ＬＤＬ−ｃは、分解のための肝臓に移送されず、結果として血液中のＬＤＬ−ｃのレベルが増加する。現在、ＬＤＬＲ遺伝子、アポリポタンパク質Ｂ１００遺伝子及びプロタンパク質コンベルターゼサブチリシン／ケキシン型９（ＰＣＳＫ−９）遺伝子などの３種の遺伝子がＦＭの発症と相関することが確認されている。
【０００７】
プロタンパク質コンベルターゼとして、プロタンパク質コンベルターゼサブチリシン／ケキシン型９（ＰＣＳＫ−９）は、分泌枯草菌ファミリーにおけるプロテアーゼＫのサブファミリーに属する。コードされたタンパク質は、可溶性酵素前駆体として合成され、自己触媒によって小胞体内において分子内でプロセッシングされる。実験結果によれば、ＰＣＳＫ−９は、ＬＤＬ受容体の分解を促進することが可能であり、したがって、血漿中のＬＤＬコレステロールの含有率を増加させるが、一方でＬＤＬ受容体は、ＬＤＬを循環系から除去する主要な経路である肝臓内のＬＤＬのエンドサイトーシスプロセスを媒介する。ＰＣＳＫ−９遺伝子変異が高コレステロール血症（ＡＤＨ）患者の１２．５％において同定されたことが分かっている。様々な型のＰＣＳＫ−９変異がある。ＰＣＳＫ−９によって調節されるＬＤＬ−ｃレベルに対する変異の異なる影響によれば、変異は、２つの型、すなわち機能喪失型及び機能獲得型に分けることができる。それらの中で、機能喪失型変異は、低血中コレステロールレベルに関連し、アテローム硬化型心疾患の発症を予防する。低コレステロールに関連するＰＣＳＫ−９の変異率は、アフリカ人の集団が他の人種よりも高い。ＰＣＳＫ−９の機能獲得型変異体は、ＰＣＳＫ−９の機能を増加させ、ＬＤＬＲの発現を減少させることによって、血漿コレステロールレベルを増加させ、それによって重度の高コレステロール血症及び早発性冠状動脈アテローム性動脈硬化症心疾患を発症する可能性がある。現在、ＰＣＳＫ−９の機能獲得型変異としては、Ｄ３７４Ｙ、Ｓ１２７Ｒ、Ｆ２１６Ｌ、Ｎ１５７Ｋ、Ｒ３０６Ｓなどが挙げられることが分かっている。ＰＣＳＫ−９野生型と比較すると、Ｄ３７４Ｙ変異体の細胞表面上のＬＤＬＲは３６％減少し、Ｓ１２７Ｒ変異体のそれは１０％減少した。
【０００８】
しかし、抗体は、それらの大きい分子量、複雑な構造、及び分解、重合又は望ましくない化学改変に対する影響の受けやすさのため、不安定になる。抗体を投与のために適切なものにするため、貯蔵及びその後の使用の間におけるそれらの安定性を維持するため、並びにより良好な効果を発揮するため、抗体の安定製剤の研究は、特に重要である。
【０００９】
いくつかの企業は、現在、ＣＮ１０３７１７２３７Ａ（特許文献１）、ＣＮ１０４３６４２６６Ａ（特許文献２）などのように抗ＰＣＳＫ−９抗体及び医薬製剤を開発している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】中国特許出願公開第１０３７１７２３７号
【特許文献２】中国特許出願公開第１０４３６４２６６号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかし、新しい抗ＰＣＳＫ−９抗体のために、投与のためにより適切なＰＣＳＫ−９を含む医薬（製剤）組成物を開発する必要性が依然としてある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、抗ＰＣＳＫ−９抗体又はその抗原結合フラグメントと緩衝液とを含む医薬組成物であって、前記緩衝液が、好ましくはヒスチジン緩衝液又はコハク酸緩衝液又はリン酸緩衝液又はクエン酸緩衝液であり、より好ましくはヒスチジン緩衝液であり、最も好ましくはヒスチジン−塩酸緩衝液である、医薬組成物を提供する。
【００１３】
代替的な実施形態において、前記医薬組成物中における前記抗ＰＣＳＫ−９抗体又はその前記抗原結合フラグメントの濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜１５０ｍｇ／ｍＬであり、好ましくは３０ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬであり、より好ましくは５０ｍｇ／ｍＬ〜６０ｍｇ／ｍＬであり、最も好ましくは５０ｍｇ／ｍＬである。前記抗ＰＣＳＫ−９抗体又はその前記抗原結合フラグメントのそのような濃度の非限定的な例としては、４５ｍｇ／ｍＬ、４６ｍｇ／ｍＬ、４７ｍｇ／ｍＬ、４８ｍｇ／ｍＬ、４９ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、５１ｍｇ／ｍＬ、５２ｍｇ／ｍＬ、５３ｍｇ／ｍＬ、５４ｍｇ／ｍＬ、５５ｍｇ／ｍＬ、５６ｍｇ／ｍＬ、５７ｍｇ／ｍＬ、５８ｍｇ／ｍＬ、５９ｍｇ／ｍＬ又は６０ｍｇ／ｍＬが挙げられる。
【００１４】
代替的な実施形態において、前記緩衝液の濃度は、約５ｍＭ〜５０ｍＭであり、好ましくは５ｍＭ〜３０ｍＭであり、前記緩衝液の濃度の非限定的な例としては、１０ｍＭ、１２ｍＭ、１４ｍＭ、１６ｍＭ、１８ｍＭ、２０ｍＭ、２２ｍＭ、２４ｍＭ、２６ｍＭ、２８ｍＭ及び３０ｍＭが挙げられ、より好ましくは１０ｍＭ〜１５ｍＭが挙げられ、最も好ましくは１０ｍＭが挙げられる。
【００１５】
代替的な実施形態において、前記医薬組成物の緩衝液のｐＨは、約５．５〜６．５であり、好ましくは約６．０〜６．５であり、緩衝液のｐＨの非限定的な例としては、約６．０、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４又は約６．５が挙げられる。
【００１６】
さらに、代替の実施形態において、前記医薬組成物は、さらに糖類を含む。本明細書における「糖類」は、単糖類、二糖類、三糖類、多糖類、糖アルコール類、還元糖類、非還元糖類などを含む従来の組成物（ＣＨ２Ｏ）ｎ及びその誘導体を含む。本明細書における糖類の例としては、グルコース、スクロース、トレハロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、デキストラン、グリセリン、エリスリトール、グリセロール、アラビトール、シリトール（ｓｙｌｉｔｏｌ）、ソルビトール、マンニトール、メリビオース、メレチトース、ラフィノース、マンノトリオース、スタキオース、マルトース、ラクツロース、マルツロース、ソルビトール、マルチトール、ラクチトール、イソマルツロースなどが挙げられる。本明細書における好ましい糖類は、非還元二糖類であり、より好ましくはトレハロース又はスクロースである。
【００１７】
代替的な実施形態において、前記医薬中の前記糖類の濃度は、約１０ｍｇ／ｍＬ〜７５ｍｇ／ｍＬであり、好ましくは２０ｍｇ／ｍＬ〜６０ｍｇ／ｍＬであり、より好ましくは約２０ｍｇ／ｍＬ〜４０ｍｇ／ｍＬであり、最も好ましくは２５ｍｇ／ｍＬである。前記糖類の濃度の非限定的な例としては、２０ｍｇ／ｍＬ、２１ｍｇ／ｍＬ、２２ｍｇ／ｍＬ、２３ｍｇ／ｍＬ、２３ｍｇ／ｍＬ、２４ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬ、２６ｍｇ／ｍＬ、２７ｍｇ／ｍＬ、２８ｍｇ／ｍＬ、２９ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ、３１ｍｇ／ｍＬ、３２ｍｇ／ｍＬ、３３ｍｇ／ｍＬ、３４ｍｇ／ｍＬ、３５ｍｇ／ｍＬ、３６ｍｇ／ｍＬ、３７ｍｇ／ｍＬ、３８ｍｇ／ｍＬ、３９ｍｇ／ｍＬ又は４０ｍｇ／ｍＬが挙げられる。
【００１８】
代替的な実施形態において、前記医薬組成物は、さらに界面活性剤を含む。本明細書において、「界面活性剤」は、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ポロキサマー、トリトン、ドデシル硫酸ナトリウム、ナトリウムラウリルスルホネート（ｓｏｄｉｕｍ  ｌａｕｒｅｌ  ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）、ナトリウムオクチルグリコシド、ラウリルスルホベタイン、ミリスチルスルホベタイン、リノレイルスルホベタイン、ステアリルスルホベタイン、ラウリルサルコシン、ミリスチルサルコシン、リノレイルサルコシン、ステアリルサルコシン、リノレイルベタイン、ミリスチルベタイン、セチルベタイン、ラウロアミドプロピルベタイン、コカミドプロピルベタイン、リノールアミドプロピルベタイン、ミリスタミドプロピルベタイン、パルミドプロピルベタイン、イソステラミドプロピルベタイン、ミリスタミドプロピル−ジメチルアミン、パルミドプロピルジメチルアミン、イソステラミドプロピルジメチルアミン、ナトリウムメチルココイルタウレート、ナトリウムメチルオレイルタウレート、ポリエチルグリコール、ポリプロピルグリコール、エチレンとプロピレングリコールとのコポリマーなどから成る群から選択され得る。本明細書における好ましい界面活性剤は、ポリソルベート２０又はポリソルベート８０であり、より好ましくはポリソルベート８０である。
【００１９】
代替的な実施形態において、前記医薬組成物中の界面活性剤の濃度は、約０．０５ｍｇ／ｍＬ〜１．０ｍｇ／ｍＬであり、好ましくは０．１ｍｇ／ｍＬ〜０．４ｍｇ／ｍＬであり、前記界面活性剤の濃度の非限定的な例としては、０．１ｍｇ／ｍＬ、０．１５ｍｇ／ｍＬ、０．２ｍｇ／ｍＬ、０．２５ｍｇ／ｍＬ、０．３ｍｇ／ｍＬ、０．３５ｍｇ／ｍＬ、０．４ｍｇ／ｍＬが挙げられ、さらに好ましくは０．１ｍｇ／ｍＬ〜０．３ｍｇ／ｍＬが挙げられ、より好ましくは０．１ｍｇ／ｍＬ〜０．２ｍｇ／ｍＬが挙げられ、最も好ましくは０．２ｍｇ／ｍＬが挙げられる。
【００２０】
代替的な実施形態において、前記医薬組成物は、
（ａ）１〜１５０ｍｇ／ｍＬの抗ＰＣＳＫ−９抗体又はその抗原結合フラグメント、
（ｂ）５〜３０ｍＭのヒスチジン緩衝液（ｐＨが約５．５〜６．５、より好ましくは約６．０〜６．５）、
（ｃ）１０〜７５ｍｇ／ｍＬのスクロース、及び
（ｄ）０．０５〜０．６ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、
を含む。
【００２１】
代替的な実施形態において、前記医薬組成物は、
（ａ）５０ｍｇ／ｍＬの抗ＰＣＳＫ−９抗体又はその抗原結合フラグメント、
（ｂ）５〜２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、
（ｃ）２５ｍｇ／ｍＬのスクロース、及び
（ｄ）０．１〜０．３ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、
を含む。
【００２２】
代替的な実施形態において、前記医薬組成物は、
（ａ）１〜１５０ｍｇ／ｍＬの抗ＰＣＳＫ−９抗体又はその抗原結合フラグメント、及び
（ｂ）５〜３０ｍＭのヒスチジン緩衝液、
を含み、前記医薬組成物のｐＨは約６．０〜６．５である。
【００２３】
代替的な実施形態において、前記医薬組成物は、
（ａ）１〜１５０ｍｇ／ｍＬの抗ＰＣＳＫ−９抗体又はその抗原結合フラグメント、
（ｂ）５〜３０ｍＭのヒスチジン緩衝液、
（ｃ）１０〜７５ｍｇ／ｍＬのスクロース、及び
（ｄ）０．０５〜０．６ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、
を含み、前記医薬組成物のｐＨは約６．０〜６．５であり、前記ヒスチジン緩衝液は、好ましくはヒスチジン−塩酸緩衝液である。
【００２４】
代替的な実施形態において、前記医薬組成物は、
（ａ）５０ｍｇ／ｍＬの抗ＰＣＳＫ−９抗体又はその抗原結合フラグメント、
（ｂ）５〜２０ｍＭのヒスチジン緩衝液、
（ｃ）２５ｍｇ／ｍＬのスクロース、及び
（ｄ）０．１〜０．３ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、
を含み、前記医薬組成物のｐＨは約６．０〜６．５であり、前記ヒスチジン緩衝液は、好ましくはヒスチジン−塩酸緩衝液である。
【００２５】
代替的な実施形態において、前記医薬組成物は、
（ａ）５０ｍｇ／ｍＬの抗ＰＣＳＫ−９抗体又はその抗原結合フラグメント、
（ｂ）１０ｍＭのヒスチジン緩衝液、
（ｃ）２５ｍｇ／ｍＬのスクロース、及び
（ｄ）０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、
を含み、前記医薬組成物のｐＨは６．３±０．１であり、前記ヒスチジン緩衝液は、好ましくはヒスチジン−塩酸緩衝液である。
【００２６】
代替的な実施形態において、前記医薬組成物は、
（ａ）１５０ｍｇ／ｍＬの抗ＰＣＳＫ−９抗体又はその抗原結合フラグメント、
（ｂ）３０ｍＭのヒスチジン−塩酸緩衝液、
（ｃ）７５ｍｇ／ｍＬのスクロース、及び
（ｄ）０．６ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、
を含む、前記医薬組成物の最終ｐＨは６．３である。
【００２７】
代替的な実施形態において、前記医薬組成物は、
（ａ）５０ｍｇ／ｍＬの抗ＰＣＳＫ−９抗体又はその抗原結合フラグメント、
（ｂ）１０ｍＭのヒスチジン−塩酸緩衝液、ｐＨ６．０、
（ｃ）２５ｍｇ／ｍＬのスクロース、及び
（ｄ）０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、
を含む。
【００２８】
代替的な実施形態において、前記医薬組成物は、
（ａ）１５０ｍｇ／ｍＬの抗ＰＣＳＫ−９抗体又はその抗原結合フラグメント、
（ｂ）２０ｍＭのヒスチジン−塩酸緩衝液、ｐＨ６．５、及び
（ｃ）７０ｍｇ／ｍＬのスクロース、
を含む。
【００２９】
代替的な実施形態において、前記医薬組成物は、
（ａ）１５０ｍｇ／ｍＬの抗ＰＣＳＫ−９抗体又はその抗原結合フラグメント、
（ｂ）２０ｍＭのヒスチジン−塩酸緩衝液、ｐＨ６．５、及び
（ｃ）７０ｍｇ／ｍＬのα，α−ジヒドラテトレハロース（ｄｉｈｙｄｒａｔｅｔｒｅｈａｌｏｓｅ）、
を含む。
【００３０】
代替的な実施形態において、前記医薬組成物は、
（ａ）５０ｍｇ／ｍＬの抗ＰＣＳＫ−９抗体又はその抗原結合フラグメント、
（ｂ）２０ｍＭのヒスチジン−塩酸緩衝液（ｐＨ６．０）、
（ｃ）２５ｍｇ／ｍＬのスクロース、及び
（ｄ）０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、
を含む。
【００３１】
代替的な実施形態において、前記医薬組成物は、
（ａ）５０ｍｇ／ｍＬの抗ＣＳＫ−９抗体又はその抗原結合フラグメント、
（ｂ）２０ｍＭのヒスチジン−塩酸緩衝液（ｐＨ６．５）、
（ｃ）２５ｍｇ／ｍＬのスクロース、及び
（ｄ）０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、
を含む。
【００３２】
代替的な実施形態において、前記医薬組成物中における前記抗ＰＣＳＫ−９抗体又はその前記抗原結合フラグメントは、
それぞれ配列番号１２、配列番号１３及び配列番号１４の配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＲ３、並びに
それぞれ配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１７の配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３、
を含む。
【００３３】
代替的な実施形態において、医薬組成物中における前記抗ＰＣＳＫ−９抗体又はその前記抗原結合フラグメントは、マウス抗体、キメラ抗体及びヒト化抗体から成る群から選択され、好ましくはヒト化抗体である。
【００３４】
代替的な実施形態において、前記医薬組成物中の前記抗ＰＣＳＫ−９抗体の軽鎖は、ｈ００１−４−ＹＴＥ抗体の軽鎖のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有し、前記医薬組成物中の前記抗ＰＣＳＫ−９抗体の重鎖は、ｈ００１−４−ＹＴＥ抗体の重鎖のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する。ｈ００１−４−ＹＴＥ抗体の軽鎖配列は、配列番号３０のアミノ酸配列を有し、ｈ００１−４−ＹＴＥ抗体の重鎖配列は、配列番号３２のアミノ酸配列を有する。
【００３５】
本発明は、さらに、抗ＰＣＳＫ−９抗体又はその抗原結合フラグメントの貯蔵溶液を緩衝液と置換するステップを含む上記の医薬組成物を調製する方法を提供する。好ましくは、前記緩衝液はヒスチジン緩衝液であり、より好ましくはヒスチジン−塩酸緩衝液である。前記緩衝液の濃度は、好ましくは約５ｍＭ〜３０ｍＭであり、前記緩衝液の濃度の非限定的な例としては、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、１２ｍＭ、１４ｍＭ、１６ｍＭ、１８ｍＭ、２０ｍＭ、２２ｍＭ、２４ｍＭ、２６ｍＭ、２８ｍＭ及び３０ｍＭが挙げられ、より好ましくは１０ｍＭ〜１５ｍＭであり、前記緩衝液のｐＨは、約６．０〜６．５であり、非限定的な例としては、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４及び６．５が挙げられる。
【００３６】
さらに、上記の医薬組成物を調製する方法は、さらに、前記置換ステップから得られた前記溶液にスクロース及びポリソルベート８０を添加し、次いで緩衝液で最終量とするステップを含み、前記緩衝液の濃度は、好ましくは約１０ｍＭ〜２０ｍＭであり、前記緩衝液の濃度の非限定的な例としては、１０ｍＭ、１２ｍＭ、１４ｍＭ、１６ｍＭ、１８ｍＭ及び２０ｍＭが挙げられ、前記緩衝液のｐＨは、約６．０〜６．５であり、前記緩衝液のｐＨの非限定的な例としては、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４及び６．５が挙げられる。
【００３７】
本発明は、さらに、上記の医薬組成物を凍結乾燥するステップを含む、抗ＰＣＳＫ−９抗体を含む凍結乾燥製剤を調製する方法を提供する。
【００３８】
代替的な実施形態において、抗ＰＣＳＫ−９抗体を含む凍結乾燥製剤を調製する前記方法は、逐次的に、予備凍結、一次乾燥及び二次乾燥のステップを含み、前記予備凍結は、真空の状態の必要がない５℃から−４０℃〜−５０℃への、最も好ましくは−４５℃への凍結である。一次乾燥温度は、−１４℃〜０℃であり、最も好ましくは−５℃であり、真空のパラメータは、０．１ｍＢａｒ〜０．５ｍＢａｒであり、最も好ましくは０．３ｍＢａｒである。二次乾燥温度は、２０℃〜３０℃であり、好ましくは２５℃であり、真空度は、０．１ｍＢａｒ〜０．５ｍＢａｒであり、最も好ましくは０．３ｍＢａｒであり、真空度は、０．００５ｍＢａｒ〜−０．０２ｍＢａｒに、最も好ましくは０．０１ｍＢａｒに低下させる。
【００３９】
本発明は、さらに、上記の抗ＰＣＳＫ−９抗体を含む凍結乾燥製剤を調製する前記方法によって調製される抗ＰＣＳＫ−９抗体を含む凍結乾燥製剤を提供する。
【００４０】
いくつかの実施形態において、前記凍結乾燥製剤は、少なくとも３ヵ月間、少なくとも６ヵ月、少なくとも１２ヵ月、少なくとも１８ヵ月、又は少なくとも２４ヵ月、２〜８℃で安定である。いくつかの実施形態において、前記凍結乾燥製剤は、少なくとも７日間、少なくとも１４日間、又は少なくとも２８日間、４０℃で安定である。
【００４１】
本発明は、さらに、上記の凍結乾燥製剤を再構成するステップを含む、抗ＰＣＳＫ−９抗体を含む凍結乾燥製剤の再構成溶液を調製する方法を提供し、再構成のための溶媒は、注射用水、生理食塩水又はグルコースの溶液から選択されるが、これらに限定されるものではない。
【００４２】
本発明は、さらに、上記の抗ＰＣＳＫ−９抗体を含む凍結乾燥製剤の再構成溶液を調製する前記方法によって調製される抗ＰＣＳＫ−９抗体を含む凍結乾燥製剤の再構成溶液を提供する。
【００４３】
代替的な実施形態において、本発明の抗ＰＣＳＫ−９抗体を含む前記再構成溶液は、凍結乾燥前の前記医薬組成物に含まれる前記成分の濃度の２〜５倍、好ましくは３倍の濃度を有する成分を含む。
【００４４】
代替的な実施形態において、前記抗ＰＣＳＫ−９抗体又は前記抗原結合フラグメントの濃度が、約１２０ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬであり、最も好ましくは１５０ｍｇ／ｍＬである、本発明の抗ＰＣＳＫ−９抗体を含む再構成溶液。
【００４５】
代替的な実施形態において、本発明の前記抗ＰＣＳＫ−９抗体を含む前記再構成溶液について、前記医薬組成物のｐＨは、約６．０〜６．５であり、好ましくは６．４である。前記再構成溶液のｐＨは、前記原薬の前記製剤において用いられる前記緩衝液のｐＨに関連する。前記原薬のｐＨが６．０である場合、前記最終的再構成溶液のｐＨは６．３±１である。
【００４６】
代替的な実施形態において、本発明の前記抗ＰＣＳＫ−９抗体を含む前記再構成溶液について、前記緩衝液の濃度は、約１５ｍＭ〜４５ｍＭであり、好ましくは３０ｍＭである。
【００４７】
代替的な実施形態において、本発明の前記抗ＰＣＳＫ−９抗体を含む前記再構成溶液は、さらに、二糖類を含み、前記二糖類は、好ましくはトレハロース及びスクロースから成る群から選択され、最も好ましくはスクロースである。
【００４８】
代替的な実施形態において、本発明の前記抗ＰＣＳＫ−９抗体を含む前記再構成溶液について、前記二糖類の濃度は、約５５ｍｇ／ｍＬ〜９５ｍｇ／ｍＬであり、好ましくは約７５ｍｇ／ｍＬである。
【００４９】
代替的な実施形態において、本発明の前記抗ＰＣＳＫ−９抗体を含む前記再構成溶液は、さらに、界面活性剤を含み、前記界面活性剤は、好ましくはポリソルベートであり、より好ましくはポリソルベート８０である。
【００５０】
代替的な実施形態において、本発明の前記抗ＰＣＳＫ−９抗体を含む前記再構成溶液について、前記界面活性剤の濃度は、約０．４ｍｇ／ｍＬ〜０．８ｍｇ／ｍＬであり、好ましくは０．６ｍｇ／ｍＬである。
【００５１】
本発明は、さらに、本明細書に記載される前記安定医薬組成物の内のいずれかを含む容器を含む製品又はキットを提供する。いくつかの実施形態において、それはガラスバイアルである。
【００５２】
本発明は、さらに、ＰＣＳＫ−９媒介疾患又はＰＣＳＫ−９媒介障害を処置するための薬物の製剤における、前記医薬組成物、又は前記凍結乾燥製剤、又は上記の凍結乾燥製剤の前記再構成溶液の使用を提供するものであって、前記疾患又は前記障害は、好ましくはコレステロール関連疾患であり、より好ましくは、高コレステロール血症、心疾患、メタボリック症候群、糖尿病、冠動脈性心疾患、脳卒中、心血管疾患、アルツハイマー病及び全身性異脂肪血症から成る群から選択され、最も好ましくは、高コレステロール血症、異脂肪血症、アテローム性動脈硬化、ＣＶＤ又は冠動脈性心疾患である。
【００５３】
本発明は、さらに、治療上有効量の前記医薬組成物又は前記凍結乾燥製剤又は上記の凍結乾燥製剤の前記再構成溶液を、それを必要とする患者に投与することを含む、ＰＣＳＫ−９関連疾患又はＰＣＳＫ−９関連障害を処置し、予防する方法を提供するものであって、前記疾患又は前記障害は、好ましくはコレステロール関連疾患であり、より好ましくは、高コレステロール血症、心疾患、メタボリック症候群、糖尿病、冠動脈性心疾患、脳卒中、心血管疾患、アルツハイマー病及び全身性異脂肪血症から成る群から選択され、最も好ましくは、高コレステロール血症、異脂肪血症、アテローム性動脈硬化、ＣＶＤ又は冠動脈性心疾患である。
【００５４】
本発明は、さらに、前記医薬組成物又は前記凍結乾燥製剤又は上記の凍結乾燥製剤の前記再構成溶液を含む容器を含む製品を提供する。
【００５５】
本明細書に記載される各種実施形態の特性の内の１つ、いくつか又は全ては、本発明の他の実施形態を形成するために組み合わされてもよいことを理解すべきである。本発明のこれらの態様及び他の態様は、当業者にとって明らかであろう。本発明のこれらの実施形態及び他の実施形態は、さらに、以下の発明を実施するための形態で記載される。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
本開示をより容易に理解することができるために、ある種の専門用語及び科学用語が以下で具体的に定義される。本文献における他の部分で具体的に定義されない限り、本明細書において用いられる全ての他の専門用語及び科学用語は、一般に本発明が属する当業者によって理解されるものと同じ意味を有するものとする。
【００５７】
本明細書で用いられる場合、「緩衝液」は、その酸塩基共役成分の作用によってｐＨの変化を阻止する緩衝溶液を指す。適切な範囲内のｐＨを管理する緩衝液の例としては、酢酸緩衝液、コハク酸緩衝液、グルコン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、シュウ酸緩衝液、乳酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酒石酸緩衝液、フマル酸緩衝液、グリシルグリシン緩衝液及び他の有機酸緩衝液が挙げられる。
【００５８】
「ヒスチジン緩衝液」は、ヒスチジンイオンを含む緩衝液である。ヒスチジン緩衝液の例としては、ヒスチジン−塩酸緩衝液、ヒスチジン酢酸緩衝液、ヒスチジンリン酸緩衝液及びヒスチジン硫酸緩衝液などが挙げられ、好ましくはヒスチジン−塩酸緩衝液である。ヒスチジン−塩酸緩衝液は、ヒスチジン及び塩酸によって調製されるか、又はヒスチジン及びヒスチジン塩酸によって調製される。
【００５９】
「クエン酸緩衝液」は、クエン酸イオンを含む緩衝液である。クエン酸緩衝液の例としては、クエン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液、クエン酸−クエン酸カリウム緩衝液、クエン酸−クエン酸カルシウム緩衝液及びクエン酸−クエン酸マグネシウム緩衝液などが挙げられる。好ましいクエン酸緩衝液は、クエン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液である。
【００６０】
「コハク酸緩衝液」は、コハク酸イオンを含む緩衝液である。コハク酸緩衝液の例としては、コハク酸−コハク酸ナトリウム緩衝液、コハク酸−コハク酸カリウム緩衝液、コハク酸−コハク酸カルシウム緩衝液などが挙げられる。好ましいコハク酸緩衝液は、コハク酸−コハク酸ナトリウム緩衝液である。
【００６１】
「リン酸緩衝液」は、リン酸イオンを含む緩衝液である。リン緩衝溶液の例としては、リン酸水素二ナトリウム−リン酸二水素ナトリウム緩衝液及びリン酸水素二ナトリウム−リン酸二水素カリウム緩衝液などが挙げられる。好ましいリン酸緩衝液は、リン酸水素二ナトリウム−リン酸二水素ナトリウム緩衝液である。
【００６２】
「酢酸緩衝液」は、酢酸イオンを含む緩衝液である。酢酸緩衝液の例としては、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、酢酸ヒスチジン緩衝液、酢酸−酢酸カリウム緩衝液、酢酸−酢酸カルシウム緩衝液及び酢酸−酢酸マグネシウム緩衝液などが挙げられる。好ましい酢酸緩衝液は、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液である。
【００６３】
「医薬組成物」は、本発明に係る１つ以上の化合物又はその生理学的／医薬的に許容し得る塩若しくはプロドラッグ（ｐｒｏｄｕｇ）と、生理学的／医薬的に許容し得る担体及び賦形剤などの他の化学成分との混合物を含むものを指す。医薬組成物は、抗体活性成分の安定性を維持し、生物への投与を促進し、活性成分の吸収を容易にすることによって、生物学的効果を発揮することを目的とする。本明細書で用いられる場合、「医薬組成物」及び「製剤」は、相互排他的ではない。
【００６４】
「凍結乾燥製剤」は、液体若しくは溶液の形態の医薬組成物又は液体製剤若しくは溶液製剤の真空凍結乾燥ステップによって得られる製剤又は医薬組成物を指す。
【００６５】
本発明の凍結乾燥は、予備凍結、一次乾燥及び二次乾燥を含む。予備凍結の目的は、生成物を凍結して結晶性固体を得ることである。予備凍結温度及び予備凍結速度は、２つの重要なプロセスパラメータである。本発明において、予備凍結温度は、−４５℃に設定され、予備凍結速度は、１℃／分に設定される。一次乾燥は、凍結乾燥の主要段階である昇華としても知られている。その目的は、生成物から氷を除去し、生成物に対する損傷を最小限に抑えると共に、生成物の形状を維持することである。第１の乾燥の温度及び真空度が適切でない場合、生成物の崩壊が引き起こされることになる。より高い温度及びより高い真空度は、凍結乾燥の効率性を増進することになるが、同時に、生成物の崩壊のリスクを増大させることになる。本発明の一次乾燥の温度は、本技術分野における従来の温度であってもよく、例えば、−２７℃〜０℃、好ましくは、−１４℃〜−５℃であってもよい。二次乾燥は、脱離としても知られており、極真空（０．０１ｍｂａｒ）のポンピングを行い、温度を高める（２０〜４０℃）ことによって生成物から結合水を除去する主要ステップである。ほとんどの生物学的生成物は温度に影響されやすいので、二次乾燥の温度は、前記温度範囲内の低点（すなわち、２５℃）として設定される。凍結乾燥時間は、凍結器、凍結乾燥製剤の用量、及び凍結乾燥製剤の容器に関連する。凍結乾燥のそのような時間設定調整は、当業者によく知られている。
【００６６】
本発明の医薬組成物は、以下の安定した効果を達成することができる、すなわち、前記抗体は、貯蔵後のその物理的安定性及び／又は化学的安定性及び／又は生物学的活性を実質的に保持することが可能であり、好ましくは、前記医薬組成物は、貯蔵後のその物理的安定性、化学的安定性及び生物学的活性を実質的に保持する。貯蔵時間は、概して、前記医薬組成物の所定の貯蔵寿命に基づいて選択される。現在、選択された温度で、選択された時間、貯蔵後の安定性を測定するタンパク質の安定性を測定するための多くの分析手法がある。
【００６７】
「安定」医薬抗体製剤は、少なくとも３ヵ月間、好ましくは６ヵ月間、より好ましくは１年間、さらに好ましくは２年間、冷却温度（２〜８℃）でいかなる著しい変化も観察されない医薬抗体製剤である。さらに、「安定」液体製剤は、２５℃及び４０℃を含む温度で、１ヵ月、３ヵ月又は６ヵ月を含む期間の貯蔵後に所望の特徴を示すものを含む。安定性についての典型的な許容し得る基準は、以下の通りである。すなわち、典型的には、ＳＥＣ−ＨＰＬＣで測定した場合に、抗体モノマーの約１０％以下、好ましくは約５％しか分解されない。前記医薬抗体製剤は、視覚的分析で、無色であるか、又は透明〜わずかに乳白色である。前記製剤の濃度、ｐＨ及び重量オスモル濃度には、±１０％以下の変動がある。典型的には、約１０％以下、好ましくは約５％のクリッピングが観察される。典型的には、約１０％以下、好ましくは約５％の凝集が形成される。
【００６８】
抗体は、色及び／又は透明性の視覚的な検査の際、又はＵＶ光散乱、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）及び動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定される際、凝集、沈殿及び／又は変性の著しい増加を示さない場合、医薬製剤において「その物理的安定性を保持する」。タンパク質高次構造の変化は、タンパク質三次構造を決定する蛍光分光法によって、及びタンパク質二次構造を決定するＦＴＩＲ分光法によって評価され得る。
【００６９】
抗体は、著しい化学的変化を示さない場合、医薬製剤において「その化学的安定性を保持する」。化学的安定性は、タンパク質の化学的改変形態を検出し、定量することによって評価され得る。多くの場合タンパク質化学構造を改変する分解プロセスとしては、加水分解又はクリッピング（例えばサイズ排除クロマトグラフィ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥなどの方法によって評価される）、酸化（方法、例えば質量分析又はＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ／ＭＳと組み合わせたペプチドマッピングなどによって評価される）、脱アミド化（例えばイオン交換クロマトグラフィ、毛管等電点電気泳動、ペプチドマッピング、イソアスパラギン酸測定などの方法によって評価される）、異性化（イソアスパラギン酸の含有率の測定、ペプチドマッピングなどによって評価される）が挙げられる。
【００７０】
ある時点における抗体の生物学的活性が、前記医薬製剤が調製された時点で示された生物学的活性の所定の範囲内にある場合、抗体は、医薬製剤において「その生物学的活性を保持する」。抗体の生物学的活性は、例えば、抗原結合アッセイによって決定され得る。
【００７１】
本明細書で用いられる場合、アミノ酸についての一文字コード及び三文字コードは、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２４３，（１９６８）ｐ３５５８に記載されている。
【００７２】
本明細書で用いられる場合、「抗体」は、イムノグロブリン、すなわち、２個の同一重鎖と２個の同一軽鎖との間のジスルフィド結合によって共に結合される４ペプチド鎖構造を指す。
【００７３】
本発明において、本明細書に記載される抗体軽鎖は、さらに、ヒト若しくはマウスのκ、λ鎖又はその変異体を含む軽鎖定常領域を含む。
【００７４】
本発明において、本明細書に記載される抗体重鎖は、さらに、ヒト若しくはマウスのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、又はその変異体を含む重鎖定常領域を含む。
【００７５】
可変領域（Ｆｖ領域）は、抗体重鎖及び抗体軽鎖のＮ末端に近いアミノ酸の内の約１１０個を含む。定常領域（Ｃ領域）は、抗体のＣ末端に近い残りのアミノ酸を含み、比較的安定している。可変領域は、３つの超可変領域（ＨＶＲ）と４つの比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）とを含む。抗体の特異性を決定する３つの超可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも称される。軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）及び重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の各々は、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４でアミノ末端からカルボキシ末端まで配列された３つのＣＤＲ領域及び４つのＦＲ領域を含む。３つの軽鎖ＣＤＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を指し、３つの重鎖ＣＤＲは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を指す。本明細書における抗体又は抗原結合フラグメントのＬＣＶＲ領域及びＨＣＶＲ領域内のＣＤＲアミノ酸残基の数及び位置は、公知のＫａｂａｔナンバリング基準（ＬＣＤＲ１−３、ＨＣＤＥ２−３）に従うか、又はＫａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａナンバリング基準（ＨＣＤＲ１）に従う。
【００７６】
本発明の抗体は、マウス抗体、キメラ抗体及びヒト化抗体を含み、好ましくはヒト化抗体を含む。
【００７７】
本発明における「マウス抗体」という用語は、本技術分野における知識及び技術に従って調製される抗ヒトＰＣＳＫ−９モノクローナル抗体を指す。生成の間、対象体にＰＣＳＫ−９抗原を注射し、次いで、所望の配列又は機能的特性を有するハイブリドーマ発現抗体を単離した。
【００７８】
「キメラ抗体」という用語は、マウス抗体の可変領域に、ヒト抗体の定常領域を融合することによって形成される抗体であり、これは、前記マウス抗体によって誘導される免疫応答を軽減することができる。キメラ抗体を構築するために、まず、マウス特異的モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを確立し、次いで、マウスハイブリドーマ細胞から可変領域遺伝子をクローニングする。続いて、所望により、ヒト抗体の定常領域遺伝子をクローニングする。マウス可変領域遺伝子をヒト定常領域遺伝子でライゲーションして、キメラ遺伝子を形成し、次いでそれをヒトベクター内に挿入し、最後に、真核生物又は原核生物産業系内でキメラ抗体分子を発現させる。本発明の好ましい実施形態において、抗ＰＣＳＫ−９キメラ抗体の軽鎖は、さらに、ヒトκ、λ鎖又はその変異体の軽鎖定常領域を含む。抗ＰＣＳＫ−９キメラ抗体の重鎖は、さらに、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３若しくはＩｇＧ４の重鎖定常領域又はその変異体を含む。ヒト抗体の定常領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３若しくはＩｇＧ４又はその変異体の重鎖定常領域から選択され得、好ましくはヒトＩｇＧ２又はＩｇＧ４又はアミノ酸変異後のＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害）毒性がないＩｇＧ４の重鎖定常領域を含む、から選択され得る。
【００７９】
「ヒト化抗体」という用語は、ＣＤＲグラフト抗体としても知られており、ヒト抗体の可変領域フレームワーク中にマウスＣＤＲ配列をグラフトすることによって産生される抗体、すなわち、異なる型のヒト抗体フレームワーク配列から産生した抗体を指す。ヒト化抗体は、大量のマウスのタンパク質成分を担持するキメラ抗体によって誘導される強い抗体応答の短所を克服する。そのようなフレームワーク配列は、生殖系列抗体遺伝子配列又は公開された参照を網羅する公的ＤＮＡデータベースから得られ得る。例えば、ヒト重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子の生殖系列ＤＮＡ配列は、「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖系列配列データベース（ウェブのｗｗｗ．ｍｒｃｃｐｅ．ｃｏｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅで利用可能）及びＫａｂａｔ，ＥＡら、１９９１  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  ５ｔｈ  Ｅｄにおいて見出され得る。免疫原性の低下に伴う活性の低下を回避するために、ヒト抗体の可変領域内のフレームワーク配列に最小限の復帰変異を生じさせて活性を維持した。本発明のヒト化抗体は、ファージディスプレイによってＣＤＲ親和性成熟が生じるヒト化抗体も含む。
【００８０】
「抗ＰＣＳＫ−９抗体」は、限定されるものではないがＰＣＴ／ＣＮ２０１６／１１１０５３のＰＣＳＫ−９ヒト化抗体のｈ００１シリーズが挙げられるＰＣＳＫ−９に特異的に結合する抗体である。ｈ００１シリーズＰＣＳＫ−９ヒト化抗体は、ヒトＰＣＳＫ−９免疫マウスによってスクリーニングされ、ヒト化形質転換によって得られた。
【００８１】
本発明における「抗原結合フラグメント」は、抗原結合活性を有するＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント又はＦ（ａｂ’）２フラグメント、並びにＰＣＳＫ−９結合抗体のＶＨ領域及びＶＬ領域によって形成される、ヒトＰＣＳＫ−９に結合するｓｃＦｖフラグメント及びＰＣＳＫ−９に結合することができる他のフラグメントを指し、それは、本発明に記載される抗体の配列番号１２〜配列番号１７から成る群から選択される１つ以上のＣＤＲ領域を含む。定常領域を有することなく、Ｆｖ断片は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、これは、全ての抗原結合部位を有する最小限の抗体フラグメントである。概して、Ｆｖ抗体は、さらに、ＶＨドメイン及びＶＬドメインの間のポリペプチドリンカーを含み、抗原結合のために必要な構造を形成することができる。また、異なるリンカーを用いて２つの抗体の可変領域を結合し、単一鎖抗体又は単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）と名付けられたポリペプチド鎖を形成することもできる。本発明における「ＰＣＳＫ−９への結合」という用語は、それがヒトＰＣＳＫ−９と相互作用することができることを意味する。本発明における「抗原結合部位」という用語は、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントによって認識される、抗原上の連続的又は非連続的三次元部位を指す。
【００８２】
抗体及び抗原結合フラグメントを産生し、精製する方法は、本技術分野でよく知られており、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｇｕｉｄｅ  ｏｆ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｃｈａｐｔｅｒｓ  ５−８  ａｎｄ  １５に見出され得る。本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、１つ以上のヒトフレームワーク領域（ＦＲ）を非ヒト由来ＣＤＲに導入するために遺伝子操作される。ヒトＦＲ生殖系列配列は、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）ヒト抗体可変領域生殖系列遺伝子データベースと、ＩＭＧＴの、そのウェブサイトを介したＭＯＥソフトウェアと、又はＩｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ＦａｃｔｓＢｏｏｋ，２００１ＩＳＢＮ０１２４４１３５１のＭＯＥソフトウェアとを比較することによって得られ得る。
【００８３】
本発明の操作された抗体又は抗原結合フラグメントは、従来の方法を用いて調製及び精製され得る。例えば、重鎖及び軽鎖をコードするｃＤＮＡ配列をクローニングし、ＧＳ発現ベクターに組換えてもよい。組換えイムノグロブリン発現ベクターをＣＨＯ細胞に安定してトランスフェクトしてもよい。本技術分野でよく知られているより多くの推奨方法として、哺乳動物発現系によって、典型的にはＦｃ領域内の高保存Ｎ末端で抗体のグリコシル化が生じる。ヒトＰＣＳＫ−９に特異的に結合する抗体の発現によって安定したクローンを得てもよい。バイオリアクタ内において抗体産生のための無血清培地中で陽性クローンを増殖させてもよい。抗体が分泌された培地は、従来の手法によって精製され得る。例えば、便宜には、調整された緩衝液によって平衡化させたタンパク質Ａ又はＧセファロースＦＦカラムに前記培地を適用してもよい。前記カラムは、非特異的結合成分を除去するために洗浄される。結合抗体をｐＨグラジエントによって溶出し、次いでプールし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって抗体フラグメントを決定する。従来の手法を用いて、前記抗体を濾過し、濃縮させてもよい。可溶性凝集体及び多量体は、サイズ排除又はイオン交換を含む従来の手法によって効果的に除去され得る。得られた産生物は、例えば−７０℃で直ちに凍結され得るか、又は凍結乾燥され得る。
【００８４】
「保存的改変」又は「保存的置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）又は保存的置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）」は、タンパク質の生物学的活性を改変することなく変化を頻繁に生じさせ得るようなタンパク質中のアミノ酸と同様の特性（例えば電荷、側鎖の大きさ、疎水性／親水性、主鎖高次構造及び剛性など）を有する他のアミノ酸との置換を指す。概して、ポリペプチドの非必須領域内の単一アミノ酸置換は、実質的にはポリペプチドの生物学的活性を改変しないことが、当業者によって知られている（例えば、Ｗａｔｓｏｎら、（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ，Ｔｈｅ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，ｐ．２２４（４．ｓｕｐ．ｔｈ  Ｅｄ．）参照）。また、構造的又は機能的に同様のアミノ酸の置換は、生物学的活性を損なう可能性が低い。
【００８５】
アミノ酸「同一性」は、２つのタンパク質配列又は２つのポリペプチド配列の間の配列類似性を指す。２つの比較された配列の両方における位置に同じアミノ酸残基がある場合、前記分子は、その位置において同一である。パーセント配列同一性及びパーセント配列類似性を決定するために適切なアルゴリズムの例としては、それぞれＡｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０及びＡｌｔｓｃｈｕｌら、（１９７７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２に記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズム及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムがある。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、全米バイオテクノロジー情報センター（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）で入手可能である。
【００８６】
「投与」及び「処置」は、動物、ヒト、実験対象、細胞、組織、器官又は生物学的液に適用する場合、外因性の医薬、治療、診断のための薬剤又は組成物を動物、ヒト、対象、細胞、組織、器官又は体液に接触させることを指す。「投与」及び「処置」は、例えば、治療方法、薬物動態学的方法、診断方法、研究方法及び実験的方法を指す。細胞の処置は、細胞に試薬を接触させること、及び液が細胞と接触している前記液に試薬を接触させることを含む。「投与」及び「処置」は、試薬、診断、結合化合物又は他の細胞による、例えば細胞のインビトロ及びエクスビボでの処置も意味する。「処置」は、それがヒト、獣医学的対象又は研究的対象に適用される場合、治療的な処置、予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）若しくは予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）な手段、又は研究的及び診断的な適用を指す。
【００８７】
「治療」は、本発明の結合化合物の内のいずれかを含む組成物などの治療薬剤を、前記薬剤が治療活性を有することが知られている１つ以上の疾患症候を有する患者に、内的又は外的に投与することを意味する。典型的には、前記治療薬剤は、処置される対象又は集団における１つ以上の疾患症候を、任意の臨床的に測定可能な程度への、そのような（１又は複数の）症候の進行の退縮を誘導するように、又は前記進行の阻害を行うように、緩和するために有効な量で投与される。任意の特定の疾患症候を緩和するために有効である治療薬剤の量（「治療上有効量」とも称される）は、疾患状況、年齢、患者の体重、及び患者において所望の応答を誘発する薬物の能力などの様々な因子に応じて変化し得る。疾患症候が緩和されたかどうかは、典型的にはその症候の重症度又は進行状態を評価するために医師又は他の熟練した保健医療提供者によって用いられる任意の臨床的測定によって評価され得る。本発明の実施形態（例えば、治療のための方法又は製造品）は、全ての患者における対象の（１又は複数の）疾患症候を緩和する際に有効ではない可能性があるが、スチューデントのｔ検定、カイ二乗検定、マン及びホイットニーによるＵ検定、クラスカル・ワリス検定（Ｈ検定）、ヨンキー・テルプストラ検定及びウィルコクソン検定など、本技術分野で知られている任意の統計的検定によって決定される通りの統計的に有意な患者数における対象の（１又は複数の）標的疾患症候を緩和するべきである。
【００８８】
「有効量」は、医学的状態の症候又は徴候を寛解させるか、又は予防するために充分な量を含む。有効量は、診断を可能にするか、又は容易にするために充分な量も意味する。特定の患者又は獣医学的対象のための有効量は、処置されている状態、患者の全身の健康、投与の経路及び用量、並びに副作用の重症度などの因子に応じて変化し得る。有効量は、著しい副作用又は毒性作用を回避する最大用量又は投与プロトコルであることができる。
【００８９】
「Ｔｍ値」は、タンパク質の熱変性温度、すなわち、タンパク質の半分が変性し、タンパク質の空間的構造がこの時点で破壊される温度を指し、ゆえに、Ｔｍ値が高くなればなるほど、タンパク質の熱的安定性が高くなる。
【００９０】
「置換」は、抗体タンパク質を溶解する溶媒系の置換を指す。例えば、安定製剤の緩衝液系は、物理的操作モードによって抗体タンパク質を含む高塩又は高張性溶媒系を置換するために用いられる。物理的操作モードとしては、限外濾過、透析、又は遠心分離後の再構成が挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【実施例】
【００９１】
実施例及び試験
以下において、さらに、以下の実施例を参照して本発明を詳細に記載するが、これらの実施例は、例示的目的のためのものであって、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【００９２】
本発明の実施例において、特定の条件が記載されない場合、実験は、概して、従来の条件下で、又は、材料若しくは製品の製造業者によって提案される条件下で行われる。試薬の原料が具体的に示されていない場合、試薬は、商業的に入手可能な従来の試薬である。
【００９３】
実施例
ＰＣＳＫ−９抗原及び抗体の製剤化
実施例１  ＰＣＳＫ−９抗原及び試験タンパク質の製剤化
タンパク質の設計及び発現
抗原及び試験タンパク質のアミノ酸配列を設計するために、本発明のＰＣＳＫ−９のための鋳型として、Ｕｎｉｐｒｏｔ  前駆蛋白質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ヒトＰＣＳＫ−９、Ｕｎｉｐｒｏｔ番号：Ｑ８ＭＢＰ７）を用いた。所望により、ＰＣＳＫ−９タンパク質をｈｉｓタグなどの異なる標識又はＰＡＤＲＥペプチドなどの免疫促進ペプチドで融合し、次いで、それぞれｐＴＴ５ベクター（Ｂｉｏｖｅｃｔｏｒ、Ｃａｔ＃：１０２７６２）又はｐＴａｒｇｅＴベクター（ｐｒｏｍｅｇａ、Ａ１４１０）にクローニングし、２９３個の細胞で一過性に発現させるか、又はＣＨＯ−Ｓ細胞で安定的に発現させ、精製した。最終的に、本発明の抗原及び試験タンパク質を得た。
【００９４】
ＰＣＳＫ−９−Ｈｉｓ６：マウスを免疫するための免疫原又は検出試薬として用いられるＨｉｓタグを有するＰＣＳＫ−９、は以下のとおりである。
2020532491.tif 000002
【００９５】
ＰＡＤＲＥペプチド及びＨｉｓ−タグを有するＰＣＳＫ−９：ＰＣＳＫ−９−ＰＡＤＲＥ−Ｈｉｓ６、これは、免疫化を促進し得るＰＡＤＲＥペプチドを含む免疫原として用いられる。
2020532491.tif 000003
【００９６】
ＴＥＶ切断部位を有するＨｉｓタグ及びＰＣＳＫ−９の融合タンパク質：ＰＣＳＫ−９−ＴＥＶ−Ｈｉｓ６、Ｎ−ＰＣＳＫ−９（Ｎ末端ＰＣＳＫ−９ドメイン）、これは、ＴＥＶ切断によって得ることが可能であり、免疫原として用いることが可能である。
2020532491.tif 000004
【００９７】
Ｈｉｓ−タグを有するＰＣＳＫ−９−Ｄ３７４Ｙ変異体タンパク質：ＰＣＳＫ−９−Ｄ３７４Ｙ−Ｈｉｓ６、これは、試験試薬として用いられる。
2020532491.tif 000005
【００９８】
ビオチン受容ペプチドＢＰ１５及びＨｉｓタグが挿入されたＰＣＳＫ−９タンパク質、すなわち、ＰＣＳＫ−９−ＢＰ１５−Ｈｉｓ６。試験試薬として、発現の間にＢＰ１５ペプチド位置をビオチン化することが可能であり、したがって、インビトロにおけるビオチン標識化及び高次構造変化の可能性が回避される。
2020532491.tif 000006
【００９９】
ＰＣＳＫ−９−Ｙは、ビオチン受容ペプチドＢＰ１５及びＨｉｓタグが挿入されたＰＣＳＫ−９  Ｄ３７４Ｙ変異体タンパク質、すなわち、ＰＣＳＫ−９−Ｄ３７４Ｙ−ＢＰ１５−Ｈｉｓ６の略語であり、これは、試験タンパク質として用いられる。
2020532491.tif 000007
【０１００】
Ｆｌａｇタグ及びＨｉｓタグを有するＰＣＳＫ−９受容体タンパク質のＬＤＬＲ細胞外ドメイン、すなわち、ＬＤＬＲ−ＥＣＤ−Ｆｌａｇ−Ｈｉｓ６、これは、試験試薬として用いられる。
2020532491.tif 000008
【０１０１】
ＬＣＤＲ−Ｆｃ、すなわち、ｈＩｇＧ１  Ｆｃを有する（ＰＣＳＫ−９結合活性を有する）短縮されたＬＤＬＲ細胞外ドメインの融合タンパク質：すなわち、ＬＤＬＲ−ｓＥＣＤ−Ｆｃ（ｈＩｇＧ１）、これは、試験試薬として用いられる。
2020532491.tif 000009
【０１０２】
ｈＩｇＧ１  Ｆｃを有する（ＰＣＳＫ−９結合活性を有する）より短縮されたＬＤＬＲ細胞外ドメインの融合タンパク質、すなわち、ＬＤＬＲ−ｓｓＥＣＤ−Ｆｃ（ｈＩｇＧ１）、これは、検出試薬として用いられる。
2020532491.tif 000010
【０１０３】
実施例２  ＰＣＳＫ−９の精製組換えタンパク質及びＬＤＬＲ関連組換えタンパク質、並びにハイブリドーマ抗体及び組換え抗体の精製
１．Ｈｉｓ−タグを有する組換えタンパク質の精製ステップ：
細胞発現上清の試料を高速の遠心分離で遠心分離し、不純物を除去した。緩衝液をＰＢＳで置換し、イミダゾールを５ｍＭの終濃度になるように加えた。５ｍＭのイミダゾールを含有する２〜５カラム量のＰＢＳ溶液でニッケルカラムを平衡化させた。緩衝液の置換後の上清試料をＩＭＡＣカラムにロードした。Ａ２８０における読取り値がベースラインに減少するまで、５ｍＭのイミダゾールを含有するＰＢＳ溶液で前記カラムを洗浄した。次いで、クロマトグラフィカラムをＰＢＳ＋１０ｍＭイミダゾールで洗浄して、非特異的結合タンパク質を除去し、流出物を回収した。３００ｍＭのイミダゾールを含有するＰＢＳ溶液で標的タンパク質を溶出させ、溶出ピークを回収した。回収した溶出物を濃縮し、さらにゲルクロマトグラフィＳｕｐｅｒｄｅｘ２００（ＧＥ）によって精製し、移動相はＰＢＳであった。多量体ピークを除去し、溶出ピークを回収した。得られたタンパク質を、電気泳動、ペプチドマッピング及びＬＣ−ＭＳによって同定した。ＰＣＳＫ−９−Ｈｉｓ６（配列番号１）、ＰＣＳＫ−９−ＰＡＤＲＥ−Ｈｉｓ６（配列番号２）、ＰＣＳＫ−９−ＴＥＶ−Ｈｉｓ６（配列番号３）、ＰＣＳＫ−９−Ｄ３７４Ｙ−Ｈｉｓ６（配列番号４）、ＰＣＳＫ−９−ＢＰ１５−Ｈｉｓ６（配列番号５）及びＰＣＳＫ−９−Ｄ３７４Ｙ−ＢＰ１５−Ｈｉｓ６（配列番号６）を得て、本発明の免疫原又は試験タンパク質として用いた。ＰＣＳＫ−９−ＴＥＶ−Ｈｉｓ６を精製し、ＴＥＶ酵素によって切断し、得られた生成物から、ＩＭＡＣカラムを介して、ＴＥＶ酵素、不完全に切断されたＰＣＳＫ−９−ＴＥＶ−Ｈｉｓ６、又はＨｉｓ−タグを有するＣ末端ドメインフラグメントを除去した。ＩＭＡＣ溶出物を濃縮して、Ｎ末端ドメインを有するＰＣＳＫ−９セグメントのみ（Ｎ−ＰＣＳＫ−９と略記される）を得て、マウスに免疫するための免疫原として用いた。
【０１０４】
２．Ｈｉｓタグ及びＦｌａｇタグを有するＬＤＬＲ−ＥＣＤ−Ｆｌａｇ−Ｈｉｓ６（配列番号７）の組換えタンパク質の精製ステップ：
試料を高速で遠心分離して、不純物を除去し、次いで適切な量に濃縮した。Ｆｌａｇ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃｏｌｕｍｎを２〜５カラム量の０．５×ＰＢＳ緩衝液で平衡化させた。不純物を除去した後、細胞発現上清の試料を前記カラムにロードした。Ａ２８０における読取り値がベースラインに減少するまで、前記カラムを０．５×ＰＢＳで洗浄した。０．３ＭのＮａＣｌを含有するＰＢＳで前記カラムを洗浄し、不純物タンパク質を溶出させて、回収した。標的タンパク質を０．１Ｍの酢酸（ｐＨ３．５〜４．０）で溶出させて、回収し、次いで、中性に調整したｐＨ値とした。回収した溶出物を濃縮し、さらにゲルクロマトグラフィＳｕｐｅｒｄｅｘ２００（ＧＥ）によって精製し、移動相はＰＢＳであった。多量体ピークを除去し、溶出ピークを回収した。得られたタンパク質を、電気泳動、ペプチドマッピング及びＬＣ−ＭＳによって同定し、後の使用のために分注した。ＦＬＡＧ／Ｈｉｓ６タグを有するＬＤＬＲ−ＥＣＤ−Ｆｌａｇ−Ｈｉｓ６（配列番号７）を得て、本発明の抗体の性能試験のために用いた。
【０１０５】
３．ＬＤＬＲ  Ｆｃの融合タンパク質の精製ステップ：
細胞発現上清の試料を高速で遠心分離して、不純物を除去し、次いで、試料を適切な量に濃縮して、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラムにロードした。Ａ２８０における読取り値がベースラインに減少するまで、前記カラムをＰＢＳで洗浄した。標的タンパク質を１００ｍＭの酢酸ナトリウムで溶出して、ｐＨ３．０とし、次いで、１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌで中和した。溶出した試料を適切に濃縮し、前もってＰＢＳで平衡化されたゲルクロマトグラフィＳｕｐｅｒｄｅｘ２００（ＧＥ）によってさらに精製した。多量体がないピークを回収した。両方ともＰＣＳＫ−９抗体の性能試験のために用いることができるＬＤＬＲ−ｓＥＣＤ−Ｆｃ（ｈＩｇＧ１）（配列番号８）及びＬＤＬＲ−ｓｓＥＣＤ−Ｆｃ（ｈＩｇＧ１）（配列番号９）を精製するために、この方法を用いた。
【０１０６】
実施例３  抗ヒトＰＣＳＫ−９ハイブリドーマモノクローナル抗体の調製
１．免疫化
マウスを免疫することによって抗ヒトＰＣＳＫ−９モノクローナル抗体を産生した。ＳＪＬ白色マウス（雌、６週齢）（Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｖｉｔａｌ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、動物許可番号：ＳＣＸＫ（Ｂｅｉｊｉｎｇ）２０１２−０００１）を、この実験で用いて、ＳＰＦ実験室で産生させた。購入後、マウスを、２０〜２５℃の温度及び４０〜６０％の湿度で、１２／１２時間の明暗周期で、１週間、実験室内で保持した。環境に順応させたマウスを、１群当たり６〜１０匹のマウスで、以下の２つのスキームに従って免疫した。免疫原は、Ｈｉｓタグを有するヒトＰＣＳＫ−９−Ｈｉｓ６（配列番号１）、ＰＣＳＫ−９−ＰＡＤＲＥ−Ｈｉｓ６（配列番号２）及びＮ−ＰＣＳＫ−９（配列番号３）であった。
【０１０７】
スキームＡ：フロイントアジュバントによる乳化（ｓｉｇｍａ  Ｌｏｔ  Ｎｕｍ：Ｆ５８８１／Ｆ５５０６）：一次免疫のために完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）を用い、追加免疫のために不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）を用いた。アジュバントに対する抗原の比は１：１であり、第１免疫については１００μｇ／匹、追加免疫については５０μｇ／匹であった。０日において、一次免疫後に２週間に１回、合計６〜８週間、各マウスに１００μｇの乳化抗原を腹腔内（ＩＰ）注射した。
【０１０８】
スキームＢ：マウスにＴｉｔｅｒｍａｘ（ｓｉｇｍａ  Ｌｏｔ  Ｎｕｍ：Ｔ２６８４）及びＡｌｕｍ（Ｔｈｒｅｍｏ  Ｌｏｔ  Ｎｕｍ：７７１６１）を交差免疫した。アジュバント（ｔｉｔｅｒｍａｘ）に対する抗原の比は１：１であり、アジュバント（Ａｌｕｍ）に対する抗原の比は３：１であり、第１免疫については１０〜２０μｇ／匹、追加免疫については５μｇ／匹であった。０日において、一次免疫後に１週間に１回、各マウスに２０／１０μｇの乳化抗原を腹腔内（ＩＰ）注射したが、合計６〜１１週間、Ｔｉｔｅｒｍａｘ及びＡｌｕｍを交互に用いた。免疫の４週間後、前記抗原を、背部及び腹部の腫脹状態に従って、背部又は腹腔内に注射した。
【０１０９】
２．細胞融合
血清中の高抗体力価（試験１及び２（ＰＣＳＫ−９を結合するためのＥＬＩＳＡ法参照））及び定常傾向がある力価を有するマウスを、脾細胞融合のために選択した。融合の７２時間前に、腹腔内注射によって、選択されたマウスにＰＣＳＫ−９−Ｈｉｓ６を免疫した（１０μｇ／匹）。最適化されたＰＥＧ媒介融合手法によって、脾臓リンパ球及び骨髄腫細胞Ｓｐ２／０（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−８２８７（商標））を融合して、ハイブリドーマ細胞を得た。融合ハイブリドーマ細胞をＨＡＴ完全培地（２０％ＦＢＳ、１×ＨＡＴ及び１×ＯＰＩを含有するＲＰＭＩ−１６４０培地）で再懸濁し、次いで、９６ウェル細胞培養プレートに分注し（１×１０５／１５０μＬ／ウェル）、３７℃及び５％ＣＯ２でインキュベートした。融合後の５日において、ＨＡＴ完全培地を５０μＬ／ウェルで加え、３７℃及び５％ＣＯ２でインキュベートした。融合後の７日〜８日において、細胞増殖密度に基づいて、全ての培地を２００μＬ／ウェルでＨＴ完全培地（２０％ＦＢＳ、１×ＨＴ及び１×ＯＰＩを含有するＲＰＭＩ−１６４０培地）に交換し、３７℃及び５％ＣＯ２でインキュベートした。
【０１１０】
３．ハイブリドーマ細胞のスクリーニング
融合後の１０日〜１１日において、細胞増殖密度に基づいて、ＰＣＳＫ−９又はＰＣＳＫ−９−Ｙの結合についてのＥＬＩＳＡ試験を行った（試験１及び２参照）。ＬＤＬＲへのＰＣＳＫ−９又はＰＣＳＫ−９−Ｙの結合のＥＬＩＳＡを阻害することによって、ＥＬＩＳＡ試験と組み合わせた陽性細胞を検出した（試験３及び４参照）。陽性ウェル内の培地を交換し、細胞を細胞密度に基づいて直ちに２４ウェルプレートに増殖させた。再試験の際、２４ウェルプレートに移した細胞株を保存し、第１サブクローンに供した。第１サブクローンスクリーニング後の陽性細胞（試験１及び２参照）を保存し、第２サブクローンに供した。第２サブクローン後の陽性細胞（試験１及び２参照）を保存し、タンパク質発現に供した。多重融合すると、ＬＤＬＲへのＰＣＳＫ−９又はＰＣＳＫ−９−Ｙの結合を阻害することができるハイブリドーマ細胞が得られた。
【０１１１】
阻害アッセイ及び結合アッセイによるスクリーニングによってハイブリドーマクローンｍＡｂ−００１を得た。無血清細胞培養によって抗体をさらに調製し、試験例における使用のための精製例によって抗体を精製した。
【０１１２】
ハイブリドーマクローンｍＡｂ−００１のマウス抗体可変領域配列は、以下の通りだった。
【０１１３】
2020532491.tif 000011
2020532491.tif 000012
【０１１４】
【表１】
2020532491.tif 000013
【０１１５】
実施例４  抗ヒトＰＣＳＫ−９ハイブリドーマモノクローナル抗体のヒト化
１．ハイブリドーマクローンｍＡｂ−００１のためのヒト化フレームワークの選択
ＩＭＧＴヒト抗体重鎖及び軽鎖可変領域生殖系列遺伝子データベース並びにＭＯＥソフトウェアをアラインメントすることによって、ｍＡｂ−００１を有する高い相同性を有する重鎖可変領域遺伝子及び軽鎖可変領域遺伝子をそれぞれ鋳型として選択した。これらの２つのマウス抗体のＣＤＲを対応するヒト鋳型にそれぞれグラフトして、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４の順序の可変領域配列を形成した。Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従ってアミノ酸残基を番号付与し、アノテートした。
【０１１６】
マウス抗体ｍＡｂ−００１のヒト化軽鎖鋳型はＩＧＫＶ１−３９＊０１及びｈｊｋ２．１であり、ヒト化重鎖鋳型はＩＧＨＶ１−２＊０２及びｈｊｈ２である。ヒト化後に得られたヒト化抗体ｈ００１−１の可変領域配列は、以下の通りである。
2020532491.tif 000014
2020532491.tif 000015
【０１１７】
２．ハイブリドーマクローンｍＡｂ−００１のための鋳型選択及び復帰変異設計を表２に示した。ハイブリドーマの復帰変異後のヒト化配列の組み合わせを表２に示した。
【０１１８】
【表２】
2020532491.tif 000016
【０１１９】
「グラフトされた」は、マウス抗体ＣＤＲをヒト生殖系列ＦＲ領域配列にグラフトさせたことを表し、変異体可変領域の特異的な（ｓｅｐｃｉｆｉｃ）配列を表３に示した。
【０１２０】
【表３】
2020532491.tif 000017
【０１２１】
【表４】
2020532491.tif 000018
【０１２２】
３．上記のヒト化配列を組み合わせて、重鎖定常領域がヒトＩｇＧ１から誘導され、且つ軽鎖（ｌｉｇｈａｔ  ｃｈａｉｎ）定常領域がヒトカッパ鎖から誘導される抗体を形成した。対応するヒト化抗体を得て、本発明で得られたＰＣＳＫ−９抗体が、ＰＣＳＫ−９及びＰＣＳＫ−９−Ｙとの比較的高い結合活性を有し、また、前記抗体が、ＬＤＬＲへのＰＣＳＫ−９／ＰＣＳＫ−９−Ｙの結合を効果的に阻止することもできることが確認された。
【０１２３】
実施例５．抗ヒトＰＣＳＫ−９ヒト化抗体ＩｇＧ１及びＩｇＧ１−ＹＴＥフォーマットの構築及び発現。
【０１２４】
抗ヒトＰＣＳＫ−９ヒト化抗体を構築し、発現させる方法は、以下の通りである。
【０１２５】
１．プライマー設計：オンラインソフトウェアＤＮＡＷｏｒｋｓ（ｖ３．２．２、ｈｔｔｐ：／／ｈｅｌｉｘｗｅｂ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｄｎａｗｏｒｋｓ／）を用いて複数のプライマーを設計して、組換えのために必要な遺伝子フラグメントを含むＶＨ／ＶＫを合成した：５’−３０ｂｐシグナルペプチド＋ＶＨ／ＶＫ＋３０ｂｐ  ＣＨ１／ＣＬ−３’。プライマー設計の原理は、以下の通りである。すなわち、標的遺伝子２が２つのアミノ酸において標的遺伝子１と異なる場合、図１に示されるように変異部位に特異的な他のプライマーを設計した。
【０１２６】
２．フラグメントスプライシング：ＴａｋａＲａプライマーＳＴＡＲ  ＧＸＬ  ＤＮＡポリメラーゼの説明書に従って、上記で設計された複数のプライマーで二段階ＰＣＲ増幅を行い、組換えのために必要な遺伝子フラグメントを含むＶＨ／ＶＫを得た。
【０１２７】
３．発現ベクターｐＨｒ（シグナルペプチド及び定常領域遺伝子（ＣＨ１−ＦＣ／ＣＬ）フラグメントを有する）の構築及び制限酵素消化。
【０１２８】
図２に示されるように、認識配列がその切断部位と異なる、ＢｓｍＢＩなどのいくつかの特別な制限酵素の特性を利用することによって、発現ベクターｐＨｒ（シグナルペプチド及び定常領域遺伝子（ＣＨ１−ＦＣ／ＣＬ）フラグメントを有する）を設計し、構築した。前記ベクターを直線化するためにＢｓｍＢＩを使用し、後の使用のためにゲルを切断して、回収した。
【０１２９】
４．組換え発現ベクターＶＨ−ＣＨ１−ＦＣ−ｐＨｒ／ＶＫ−ＣＬ−ｐＨｒの構築。
【０１３０】
組換えのために必要な遺伝子フラグメントを含むＶＨ／ＶＫと、ＢｓｍＢＩ酵素で消化された、回収された発現ベクターｐＨｒ（シグナルペプチド及び定常領域遺伝子（ＣＨ１−ＦＣ／ＣＬ）フラグメントを有する）とを、３：１の比でＤＨ５αコンピテント細胞に加え、０℃の氷浴内で３０分間インキュベートし、４２℃で９０秒間熱ショックを与えた。次いで、５倍量のＬＢ培地を加え、３７℃で４５分間インキュベートし、ＬＢ−Ａｍｐプレート上にプレート培養し、３７℃で一晩培養した。単一クローンを採集し、配列決定して、標的クローンを得た。
【０１３１】
本発明の抗体は、限定されるものではないが、上記の方法に従って設計及び構築（ｃｏｎｓｔｒｃｕｔｅｄ）され得る。ｈ００１−４を例として挙げると、抗体及びその変異体を設計して、以下のものを得た：１）ｈ００１−４−ＷＴ：ｈ００１−４のＩｇＧフォーマット、すなわち、ヒトＩｇＧ１から誘導される重鎖定常領域とヒトカッパ鎖から誘導される軽鎖定常領域とを組み合わせるヒト化配列の組み合わせｈ００１−４、２）ｈ００１−４−ＹＴＥ：ｈ００１−４−ＩｇＧ１−ＹＴＥフォーマット、すなわち、変異体ヒトＩｇＧ１（ＹＴＥ変異）の重鎖定常領域とヒトカッパ鎖から誘導される軽鎖定常領域とを組み合わせるヒト化配列の組み合わせｈ００１−４。変異ヒトＩｇＧ１は、変異の他の形態であってもよい。
【０１３２】
構築され、且つ発現させた抗ヒトＰＣＳＫ−９ヒト化抗体（ＩｇＧ１及びそのＩｇＧ１−ＹＴＥフォーマット）の配列は、以下の通りである。
【０１３３】
Ｈ００１−４  ＩｇＧ１フォーマット（その重鎖定常領域はヒトＩｇＧ１に由来し、軽鎖定常領域はヒトカッパ軽鎖に由来する）。
【０１３４】
重鎖（ヒトＩｇＧ１）のアミノ酸配列は、以下の通りである。
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYWMHWVRQAPGQGLEWMGYINPSSGFTKYHQNFKDRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARQYDYDEDWYFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号２８
【０１３５】
重鎖のＤＮＡ配列は、以下の通りである。
2020532491.tif 000019
【０１３６】
h001-4-カッパ
軽鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである。
DIVMSQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLNSRTRKNFLAWYQQKPGKSPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSFNLFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号３０
【０１３７】
軽鎖のＤＮＡ配列は、以下の通りである。
2020532491.tif 000020
【０１３８】
ｈ００１−４−ＩｇＧ１−ＹＴＥの軽鎖はｈ００１−４−カッパである（配列番号３０）。
【０１３９】
ＩｇＧ１−ＹＴＥの重鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである。
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYWMHWVRQAPGQGLEWMGYINPSSGFTKYHQNFKDRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARQYDYDEDWYFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号３２
【０１４０】
重鎖のＤＮＡ配列は、以下の通りである。
2020532491.tif 000021
【０１４１】
抗体医薬組成物（製剤）の例示的調製プロセス
ステップ１：一定量の精製された抗ＰＣＳＫ−９抗体試料（例えば、ｈ００１−４−ＹＴＥ）を得て、タンパク質が６０ｍｇ／ｍＬ（±２ｍｇ／ｍＬ）に濃縮されるまで、限外濾過膜によって、抗体を含まない緩衝液（例えば、１０ｍＭ、ｐＨ６．０のヒスチジン−塩酸緩衝液）の量の６倍で溶媒（好ましくは限外濾過による）を置換した。スクロースの終濃度が２５ｍｇ／ｍＬになるまで、一定量のスクロース貯蔵溶液を加え、混合した。Ｔｗｅｅｎ−８０の終濃度が０．２ｍｇ／ｍＬになるまで、一定量のＴｗｅｅｎ−８０貯蔵溶液を加え、混合した。１０ｍＭでｐＨ６．０のヒスチジン緩衝液を加えて、最終的に５０ｍｇ／ｍＬ（±５ｍｇ／ｍＬ）の濃度のタンパク質とした。最終生成物のｐＨは、約６．３±０．１である（試験される他の製剤又は安定製剤は、同様の手法によって調製される）。
【０１４２】
生成物を濾過した後、インプロセス制御の試料を得て、その無菌性を決定した。原薬を０．２２μｍのＰＶＤＦフィルタエレメントに通し、濾過液を回収した。
【０１４３】
ステップ２：ローディング量を３．６ｍＬに調整し、部分的に栓を有する６ｍＬのバイアル内に濾過液を充填し、充填の開始時、中期及び終了時にそれぞれインプロセス制御試料採取によってローディングの差を検出した。
【０１４４】
ステップ３：栓をした溶液を凍結乾燥室内に充填し、凍結乾燥した。凍結乾燥プロセスは、予備凍結、一次乾燥及び二次乾燥を含む。凍結乾燥手順が完了した後、凍結乾燥粉末を真空中に塞いだ。
【０１４５】
2020532491.tif 000022
【０１４６】
凍結乾燥のために用いられる時間は、実際の状況に従って調整され得る。凍結乾燥器の型、凍結乾燥された調剤のローディング能力、及び凍結乾燥された薬物の容器は、凍結乾燥時間に影響を及ぼす。そのような時間における調整は、当業者によく知られている。
【０１４７】
ステップ４：蓋付け機のスイッチを入れ、アルミニウムカバーを加え、このようにして蓋付けを行う。
【０１４８】
ステップ５：目視検査を行って、生成物が崩壊、不正確なローディング能力などの欠陥を含まないことを確認した。バイアルのラベルを印刷して、貼り付け、紙箱のラベルを印刷し、紙箱を折り畳んで包装し、箱のラベルを貼り付けた。
【０１４９】
実施例６．緩衝液系のスクリーニング
タンパク質濃度が１ｍｇ／ｍＬである抗ＰＣＳＫ−９抗体製剤試料を以下の緩衝溶液によって調製した。
１）２０ｍＭクエン酸−クエン酸ナトリウム、ｐＨ４．０
２）２０ｍＭクエン酸−クエン酸ナトリウム、ｐＨ４．５
３）２０ｍＭクエン酸−クエン酸ナトリウム、ｐＨ５．０
４）２０ｍＭクエン酸−クエン酸ナトリウム、ｐＨ５．５
５）２０ｍＭクエン酸−クエン酸ナトリウム、ｐＨ６．０
６）２０ｍＭリン酸二水素ナトリウム−リン酸水素二ナトリウム、ｐＨ６．０
７）２０ｍＭリン酸二水素ナトリウム−リン酸水素二ナトリウム、ｐＨ６．５
８）２０ｍＭリン酸二水素ナトリウム−リン酸水素二ナトリウム、ｐＨ７．０
９）２０ｍＭリン酸二水素ナトリウム−リン酸水素二ナトリウム、ｐＨ７．５
１０）２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５
１１）２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０
１２）２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５
【０１５０】
各製剤試料中の抗ＰＣＳＫ−９抗体の熱安定性を示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって決定した。抗ＰＣＳＫ−９抗体の熱変性中央温度（Ｔｍ）分析は、それがｐＨ６．０以上でより良好な熱的安定性を有することを示した。結果を表５に示した。ゆえに、後続の試験のために、ヒスチジン−塩酸、リン酸二水素ナトリウム−リン酸水素二ナトリウム、コハク酸ナトリウム−コハク酸塩及びクエン酸−クエン酸ナトリウムなどの６．０〜６．５のｐＨを有する緩衝液を選択した。
【０１５１】
【表５】
2020532491.tif 000023
【０１５２】
タンパク質濃度が１ｍｇ／ｍＬである抗ＰＣＳＫ−９抗体製剤試料を以下の緩衝溶液によって調製した。
１）２０ｍＭヒスチジン−塩酸、ｐＨ６．０
２）２０ｍＭヒスチジン−塩酸、ｐＨ６．５
３）２０ｍＭリン酸二水素ナトリウム−リン酸水素二ナトリウム、ｐＨ６．０
４）２０ｍＭリン酸二水素ナトリウム−リン酸水素二ナトリウム、ｐＨ６．５
５）２０ｍＭコハク酸−コハク酸ナトリウム、ｐＨ６．０
６）２０ｍＭクエン酸−クエン酸ナトリウム、ｐＨ６．０
７）２０ｍＭクエン酸−クエン酸ナトリウム、ｐＨ６．５
【０１５３】
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって、各製剤試料中の抗ＰＣＳＫ−９抗体の熱安定性を決定した。抗ＰＣＳＫ−９抗体の熱変性中央温度（Ｔｍ）分析は、ヒスチジン緩衝液系、リン酸緩衝液系及びコハク酸緩衝液系における抗ＰＣＳＫ−９抗体が、クエン酸緩衝液系のものよりもわずかに安定していたことを示した（表６参照）。
【０１５４】
【表６】
2020532491.tif 000024
【０１５５】
実施例７．製剤中の糖類のスクリーニング
タンパク質濃度が１５０ｍｇ／ｍＬである抗ＰＣＳＫ−９抗体製剤試料を以下の緩衝溶液によって調製した。
１）２０ｍＭヒスチジン−塩酸、７０ｍｇ／ｍＬのスクロース、ｐＨ６．５
２）２０ｍＭヒスチジン−塩酸、７０ｍｇ／ｍＬのα，α−トレハロース二水和物、ｐＨ６．５
【０１５６】
各製剤を濾過し、０．５ｍＬ／本で２ｍＬのバイアル内に充填し、バイアルを栓で封止した。試料を得て、４０℃の高温実験、低温の照明実験、凍結融解サイクル実験（試料を−２０℃で２４時間配置し、次いで取り出して、室温に置き、試料を完全に融解させて、混合したが、これが１サイクルである）に供した。結果から、スクロース及びトレハロースは、抗ＰＣＳＫ−９抗体の安定性に対して同様の影響を及ぼすことが示された。抗ＰＣＳＫ−９抗体のための安定剤としてスクロースを選択し、結果を表７に示した。
【０１５７】
【表７】
2020532491.tif 000025
【０１５８】
タンパク質濃度が１５０ｍｇ／ｍＬである抗ＰＣＳＫ−９抗体製剤試料を以下の緩衝溶液によって調製した。
１）２０ｍＭヒスチジン−塩酸、０ｍｇ／ｍＬのスクロース、ｐＨ６．５
２）２０ｍＭヒスチジン−塩酸、１０ｍｇ／ｍＬのスクロース、ｐＨ６．５
３）２０ｍＭヒスチジン−塩酸、４０ｍｇ／ｍＬのスクロース、ｐＨ６．５
４）２０ｍＭヒスチジン−塩酸、７０ｍｇ／ｍＬのスクロース、ｐＨ６．５
【０１５９】
浸透圧値は、スクロースの濃度が７０ｍｇ／ｍＬ以上である場合、浸透圧が最小限の皮下注射要件を満たすことを示す。低濃度の凍結乾燥及び高濃度の再構成のプロセス（３倍量の原薬を凍結乾燥し、１倍量の注射用水を再構成し、特に明記しない限り、本発明は上記の比を採用して凍結−再構成を行う）によって、本発明の抗ＰＣＳＫ−９抗体製剤を調製する。最終的処方（再構成製剤）におけるスクロース濃度を７５ｍｇ／ｍＬに設定する場合、それは、注射のための浸透圧要件を満たすだけでなく、原薬中のスクロース濃度の設定も容易にし、２５ｍｇ／ｍＬのスクロース濃度が冷凍乾燥に容易である。
【０１６０】
【表８】
2020532491.tif 000026
【０１６１】
実施例８．製剤中の界面活性剤のスクリーニング
タンパク質濃度が１５０ｍｇ／ｍＬである抗ＰＣＳＫ−９抗体製剤試料を以下の緩衝溶液によって調製した。
１）２０ｍＭヒスチジン−塩酸、ｐＨ６．５
２）２０ｍＭヒスチジン−塩酸、０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート２０、ｐＨ６．５
３）２０ｍＭヒスチジン−塩酸、０．４ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、ｐＨ６．５
【０１６２】
各製剤試料を濾過し、０．５ｍＬ／本で２ｍＬのバイアル内に充填し、バイアルを栓で封止した。試料を２５℃の一定温度の振盪機上に配置し、３００ｒｐｍで振盪した。外観の結果から、界面活性剤が抗ＰＣＳＫ−９抗体の凝集を効果的に防止することが示される。Ｈ００１−４−ＹＴＥにおいて、ポリソルベート２０とポリソルベート８０との間に有意な差はなかった。抗ＰＣＳＫ−９抗体製剤の安定剤としてポリソルベート８０を選択した。
【０１６３】
【表９】
2020532491.tif 000027
【０１６４】
実施例９．製剤中の緩衝液系のスクリーニング及び確認
ｐＨ６．０若しくは６．５の２０ｍＭのヒスチジン−塩酸又は２０ｍＭのコハク酸−コハク酸ナトリウムを含有する緩衝溶液を用いて、２５ｍｇ／ｍＬのスクロース、０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、及び５０ｍｇ／ｍＬの抗体を含有する製剤試料を調製した。各製剤を濾過し、凍結乾燥のために３．６ｍＬ／本で６ｍＬのバイアル内に充填し、凍結乾燥殺菌粉末のために用いられたハロゲン化ブチルゴムの栓でバイアルを封止した。凍結乾燥された生成物を、２〜８℃、２５℃及び４０℃で貯蔵し、次いで、安定性分析のための注射水による再構成を行った。結果から、抗ＰＣＳＫ−９抗体が２〜８℃及び２５℃で非常に安定したことが示された。しかし、０日における再構成製剤の外観は、ｐＨ６．０のコハク酸緩衝液が、Ｈｉｓ系（表に示されない）と比較して著しい乳白色を有したことを示したので、抗ＰＣＳＫ−９抗体の緩衝液系としてヒスチジン系を選択した。
【０１６５】
【表１０】
2020532491.tif 000028
【０１６６】
実施例１０．製剤成分の総合的スクリーニング
５０ｍｇ／ｍＬの抗ＰＣＳＫ−９及び２５ｍｇ／ｍＬのスクロースを含有する抗ＰＣＳＫ−９抗体製剤試料を、異なるｐＨ、異なるイオン強度における、異なる濃度の界面活性剤を含む以下の緩衝液によって調製した。
１）１０ｍＭヒスチジン−塩酸、０．１ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、ｐＨ６．５
２）１０ｍＭヒスチジン−塩酸、０．３ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、ｐＨ６．０
３）１０ｍＭヒスチジン−塩酸、０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、ｐＨ５．５
４）１５ｍＭヒスチジン−塩酸、０．３ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、ｐＨ５．５
５）１０ｍＭヒスチジン−塩酸、０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、ｐＨ６．０
６）１５ｍＭヒスチジン−塩酸、０．３ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、ｐＨ６．５
７）１５ｍＭヒスチジン−塩酸、０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、ｐＨ６．０
８）５ｍＭヒスチジン−塩酸、０．３ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、ｐＨ５．５
９）１５ｍＭヒスチジン−塩酸、０．１ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、ｐＨ５．５
１０）５ｍＭヒスチジン−塩酸、０．１ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、ｐＨ６．０
１１）５ｍＭヒスチジン−塩酸、０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、ｐＨ６．５
【０１６７】
各製剤試料を濾過し、凍結乾燥のために３．６ｍＬ／本で６ｍＬのバイアル内に充填し、凍結乾燥殺菌粉末のために用いられたハロゲン化ブチルゴムの栓でバイアルを封止した。安定性分析のために、凍結乾燥された生成物を４０℃で貯蔵した。ＳＥＣモノマーの差に基づいたデータ分析によって、０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルビド（ｐｏｌｙｓｏｒｂｉｄｅ）８０を含有するｐＨ６．０の１０ｍＭヒスチジン−塩酸緩衝液を用いた抗ＰＣＳＫ−９抗体の製剤は、５０ｍｇ／ｍＬのタンパク質及び２５ｍｇ／ｍＬのスクロースの条件下でより安定したことが示された。凍結乾燥及び再構成の後、最終製剤中の各成分（１５０ｍｇ／ｍＬのタンパク質、７５ｍｇ／ｍＬのスクロース、３０ｍＭのヒスチジン−塩酸緩衝液及び０．６ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０）の濃度を、ｐＨ６．３±０．１で、凍結乾燥の前に、原薬の３倍濃度として決定した。
【０１６８】
【表１１】
2020532491.tif 000029
【０１６９】
実施例１１．一次乾燥の温度の最適化
５０ｍｇ／ｍＬの抗ＰＣＳＫ−９抗体濃度、２５ｍｇ／ｍＬのスクロース、０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を有する抗ＰＣＳＫ−９抗体製剤試料をｐＨ６．０で１０ｍＭヒスチジン−塩酸によって調製した。抗体を３．６ｍＬ／本で６ｍＬのバイアル内に充填し、それぞれ−１４℃及び−５℃の一次乾燥温度で凍結乾燥し、バイアルを凍結乾燥のために栓で封止した。凍結乾燥の前後の再構成試料を比較した。結果から、−５℃が凍結乾燥プロセスの好ましい一次乾燥温度であることが示される。
【０１７０】
【表１２】
2020532491.tif 000030
【０１７１】
実施例１２．異なる材料の製剤と容器との間の適合性の決定
２５ｍｇ／ｍＬのスクロース及び０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０によって、ｐＨ６．０で１０ｍＭのヒスチジン−塩酸を含む溶液中において５０ｍｇ／ｍＬでＨ００１−４−ＹＴＥを調製した。製剤試料をそれぞれガラス瓶、液体貯蔵バッグ及び３１６Ｌのステンレス鋼タンク内に充填し、２〜８℃で２４時間置いた。タンパク質含有率及び純度分析によって、Ｈ００１−４−ＹＴＥが２４時間以内に安定したことが示された。製剤は、３１６Ｌのステンレス鋼タンク、ガラス瓶及び液体貯蔵バッグと適合性がある。
【０１７２】
【表１３】
2020532491.tif 000031
【０１７３】
実施例１３．異なる濾過器による製剤の適合性の決定
２５ｍｇ／ｍＬのスクロース及び０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０によって、ｐＨ６．０における１０ｍＭヒスチジン塩酸緩衝液を含む溶液中で、Ｈ００１−４−ＹＴＥを５０ｍｇ／ｍＬで調製した。製剤試料を０．２２μｍのＰＥＳ濾過器及びＰＶＤＦ濾過器に通し、試験のために３０分及び１時間の時点で試料を得た。タンパク質含有率、外観及び純度の分析によって、Ｈ００１−４−ＹＴＥが濾過器との接触の１時間以内に安定したことが示された。前記製剤は、ＰＥＳ濾過器及びＰＶＤＦ濾過器に適合性がある。
【０１７４】
【表１４】
2020532491.tif 000032
【０１７５】
実施例１４．製剤の他の代替的製剤
本発明の医薬組成物を、直接、原薬又は医薬製剤の注射溶液として用いることができる。本発明の医薬組成物を医薬製剤の貯蔵溶液として用いる場合、凍結乾燥製剤を、凍結乾燥プロセスによって調製し、臨床用途のための注射溶液中に再構成する。本発明の凍結乾燥製剤を低濃度の凍結乾燥及び高濃度の再構成のプロセスに従って調製し、すなわち、
低濃度の医薬製剤溶液を凍結乾燥して、凍結乾燥製剤を得て、凍結乾燥製剤を、より高い濃度の臨床用途のための医薬組成物に再構成する。凍結乾燥製剤は、液体製剤よりも長い安定性を有する。凍結乾燥製剤のために用いられる医薬製剤の原薬について、各成分の濃度が高いほど、必要な凍結乾燥時間は長くなる。凍結乾燥プロセスの設定における各種指標を総合的に考慮する場合、医薬製剤の再構成後の注射剤の各成分の濃度は、通常、再構成後の注射剤の各成分の濃度の２〜５倍であり、本発明の好ましい実施形態においては３倍である。
【０１７６】
本発明によって提供される安定医薬製剤は、抗ＰＣＳＫ−９抗体タンパク質（ｈ００１−４−ＹＴＥなどの非限定的な実施形態）と、以下の安定緩衝液の内のいずれかの組み合わせとを含む。
【０１７７】
（１）抗体ｈ００１−４−ＹＴＥ  １５０ｍｇ／ｍＬ、７５ｍｇ／ｍＬのスクロース、０．６ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、及び３０ｍＭヒスチジン−塩酸緩衝液、ｐＨ６．４、
【０１７８】
（２）抗体ｈ００１−４−ＹＴＥ  １５０ｍｇ／ｍＬ、７５ｍｇ／ｍＬのスクロース、０．６ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、及び３０ｍＭヒスチジン−塩酸緩衝液、ｐＨ６．２、
【０１７９】
（３）抗体ｈ００１−４−ＹＴＥ  １５０ｍｇ／ｍＬ、７５ｍｇ／ｍＬのスクロース、０．６ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、及び３０ｍＭヒスチジン−塩酸緩衝液、ｐＨ６．３、
【０１８０】
（４）抗体ｈ００１−４−ＹＴＥ  ５０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬのスクロース、０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、及び１０ｍＭヒスチジン−塩酸緩衝液、ｐＨ６．４、
【０１８１】
（５）抗体ｈ００１−４−ＹＴＥ  ５０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬのスクロース、０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、及び１０ｍＭヒスチジン−塩酸緩衝液、ｐＨ６．３、
【０１８２】
（６）抗体ｈ００１−４−ＹＴＥ  ５０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬのスクロース、０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、及び１０ｍＭヒスチジン−塩酸緩衝液、ｐＨ６．２、
【０１８３】
（７）抗体ｈ００１−４−ＹＴＥ  ５０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬのスクロース、０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、及び１０ｍＭヒスチジン−塩酸緩衝液、最終ｐＨ６．１、
【０１８４】
（８）抗体ｈ００１−４−ＹＴＥ  ５０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬのスクロース、０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、及び１０ｍＭヒスチジン−塩酸緩衝液、ｐＨ６．０、
【０１８５】
（９）抗体ｈ００１−４−ＹＴＥ  ５０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬのスクロース、０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、及び１０ｍＭのヒスチジン−塩酸緩衝液、ｐＨ６．５、
【０１８６】
（１０）抗体ｈ００１−４  ５０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬのスクロース、０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、及び１０ｍＭヒスチジン−塩酸緩衝液、ｐＨ６．３、
【０１８７】
（１１）抗体ｈ００１−４  ５０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬのスクロース、０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、及び１０ｍＭヒスチジン−塩酸緩衝液、ｐＨ６．２、
【０１８８】
（１２）抗体ｈ００１−４  ５０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬのスクロース、０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、及び１０ｍＭヒスチジン−塩酸緩衝液、ｐＨ６．４、
【０１８９】
（１３）抗体ｈ００１−４−ＹＴＥ  ５０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬのスクロース、０．１ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、及び２０ｍＭヒスチジン−塩酸緩衝液、ｐＨ６．３、
【０１９０】
（１４）抗体ｈ００１−４−ＹＴＥ  ５０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬのスクロース、０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、及び１５ｍＭヒスチジン−塩酸緩衝液、ｐＨ６．２、
【０１９１】
（１５）抗体ｈ００１−４−ＹＴＥ  ５０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬのスクロース、０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、及び２０ｍＭヒスチジン−塩酸緩衝液、ｐＨ６．４。
【０１９２】
（１６）抗体ｈ００１−４−ＹＴＥ  ３０ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬのスクロース、０．０５ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、及びｐＨ５．５の５ｍＭヒスチジン−塩酸緩衝液、
【０１９３】
（１７）抗体ｈ００１−４−ＹＴＥ  ７０ｍｇ／ｍＬ、７５ｍｇ／ｍＬのスクロース、０．６ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、及びｐＨ６．５の３０ｍＭヒスチジン−塩酸緩衝液、
【０１９４】
（１８）抗体ｈ００１−４−ＹＴＥ  ４５ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬのスクロース、０．１ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、及びｐＨ６．０の８ｍＭヒスチジン−塩酸緩衝液、
【０１９５】
（１９）抗体ｈ００１−４−ＹＴＥ  ５５ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬのスクロース、０．３ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、及びｐＨ６．２の１５ｍＭヒスチジン−塩酸緩衝液。
【０１９６】
凍結乾燥プロセスによって本発明の医薬組成物を対応する凍結乾燥製剤に調製することが可能であり、凍結乾燥製剤を注射水によって再構成して、臨床用途のための以下の医薬組成物を得ることができる。
【０１９７】
（１）抗ＰＣＳＫ−９抗体タンパク質  １５０ｍｇ／ｍＬ、７５ｍｇ／ｍＬのスクロース、０．６ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、及び２０ｍＭヒスチジン−塩酸緩衝液、ｐＨ６．３±０．１、
【０１９８】
（２）抗ＰＣＳＫ−９抗体タンパク質  １２０ｍｇ／ｍＬ、５５ｍｇ／ｍＬのスクロース、０．４ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、及び１０ｍＭヒスチジン−塩酸緩衝液、ｐＨ６．０、
【０１９９】
（３）抗ＰＣＳＫ−９抗体タンパク質  ２００ｍｇ／ｍＬ、９５ｍｇ／ｍＬのスクロース、０．８ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、及び３０ｍＭヒスチジン−塩酸緩衝液、ｐＨ６．５。
【０２００】
本発明の特定の実施形態が上記で記載されたが、当業者は、これらが単に例示的なものに過ぎないということを理解するであろう。本発明の原理及び本質を逸脱することなく、これらの実施形態に対して多くの変更及び修正を為してもよい。ゆえに、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって規定される。
【配列表】
2020532491000001.app
【国際調査報告】
2020532491.tif 000033
2020532491.tif 000034
2020532491.tif 000035
2020532491.tif 000036
2020532491.tif 000037
2020532491.tif 000038