(57)【要約】【課題】試料中の標的細胞の存在又は非存在の正確な測定を提供する。【解決手段】例えば、前記試料を前記標的細胞に結合可能な複数の形質導入粒子と混合可能であり、前記形質導入粒子は、前記標的細胞に複数の検出可能なレポーター分子を生成させるように形成された核酸分子を含むように改変されており、前記粒子は前記核酸分子に結合して前記１又は複数の標的細胞へ送達する。レポーター分子の量に関連するシグナルデータ点のセットを受領し、前記シグナルデータ点を解析して正確に前記試料中の標的細胞を検出する。システム及び方法が開示される。【選択図】図４Ｃ
2020504605.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中に存在する１又は複数の標的細胞を検出する方法であって、
（ａ）前記試料を前記１又は複数の標的細胞に結合可能な複数の形質導入粒子と混合し、前記複数の形質導入粒子は、（ｉ）前記１又は複数の標的細胞に複数のレポーター分子を生成させるように形成された核酸分子を含むように改変されている、（ｉｉ）前記核酸分子に結合して前記１又は複数の標的細胞へ送達するように形成されている、及び（ｉｉｉ）非複製である工程、
（ｂ）前記１又は複数の標的細胞が前記試料中に存在する場合、前記複数のレポーター分子を発現するために充分な条件下で前記試料及び前記複数の形質導入粒子を維持する工程、
（ｃ）前記複数のレポーター分子の量にそれぞれ関連する複数のシグナルデータ点を受け取り、前記複数のシグナルデータ点は、前記試料中の前記１又は複数の標的細胞の存在を示す工程、
（ｄ）前記複数のシグナルデータ点を使用して第一の曲線を作成する工程、
（ｅ）前記第一の曲線に基づいて以下のパラメータを計算することにより前記第一の曲線を解析する工程：曲線下面積（ＡＵＣ）；ピーク下面積（Ａ２）；面積比；全体の最大強度（ｇｌｏｂａｌｍａｘＲＬＵ）；及び相対変動（Ｒｖａｒ）、及び
（ｆ）面積比及びＲｖａｒを比較し、直線閾値を適用して陽性シグナルデータ点のセットを同定し、前記陽性シグナルデータ点のセットは前記試料中の前記１又は複数の標的細胞の存在を反映する工程、を含む、前記方法。
【請求項２】
さらに前記第一の曲線に基づいて以下のパラメータ：シグナル対ノイズ比（Ｓ２Ｎ）；変動係数（ＣＶ）；スパイク検出；ピーク位置；指数関数的なスロープ（ｅＳｌｏｐｅ）；質量中心（ＣＭ）；及び相対面積（ｒＡｒｅａ）の少なくとも一つを計算することによって前記第一の曲線を解析すること、をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記陽性シグナルデータ点のセットを用いて第二の曲線を生成し、前記第二の曲線に対してｒＡｒｅａ及びＳ２Ｎを比較して陽性シグナルデータ点の修正セットを同定し、前記陽性シグナルデータ点の修正セットは、前記試料中の前記１又は複数の標的細胞の存在を反映することとする工程、をさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＤｅｌｔａＡ２Ａ及びＣＭを比較し、さらなる直線閾値を適用して、前記試料中の１又は複数の標的細胞の存在を反映する陽性シグナルデータ点の改良セットを同定する工程、をさらに含む、請求項２又は３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
ｒＡｒｅａ＝Ａ２／（ピーク領域で最大）である、請求項２〜４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
面積比＝Ａ２／ＡＵＣであり、
【数１】
2020504605.tif 000012
請求項１〜５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記直線閾値が、Ａ２ＡＩｎｔ＋Ｒｖａｒ＊Ａ２ＡＳｌｐであり、Ａ２ＡＩｎｔが、Ａ２Ａ対Ｒｖａｒの閾値線の切片であり、Ｒｖａｒが、
【数２】
2020504605.tif 000013
Ａ２ＡＳｌｐが、前記Ａ２Ａ対Ｒｖａｒの閾値線の傾きである、請求項１〜６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
ｒＡｒｅａＩｎｔ＋Ｓ２Ｎ＊ｒＡｒｅａＳｌｐの直線閾値を適用すること、をさらに含む、請求項３〜７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
台形法を用いてＡＵＣを計算する、請求項１〜８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
Ａ２が一定のタイムインターバルにおいて定義される、請求項１〜９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
Ａ２が可変のタイムインターバルにおいて定義される、請求項１〜９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記タイムインターバルが、−０．１０秒〜１０．０秒の範囲にある、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記タイムインターバルが、−０．２５秒＜選択されたピーク時間（秒）＜＋２．００秒の間で可変である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記方法が、前記試料における抗生物質耐性を検出するために使用される、請求項１〜１３の何れか一項に記載の方法。
【請求項１５】
試料中に存在する１又は複数の標的細胞を検出するように構成されたシステムであって、
（ａ）内部に試料を配置することができる一定の容積を画定する容器、
（ｂ）内部に１又は複数の試薬を配置することができる一定容積を画定する試薬モジュールであって、前記１又は複数の試薬は前記標的細胞に結合可能な複数の形質導入粒子を含んでおり、前記複数の形質導入粒子は、（ｉ）核酸分子を含むように改変され、（ｉｉ）前記１又は複数の標的細胞に複数の検出可能なレポーター分子を生成させるように形成され、（ｉｉｉ）非複製である、前記試薬モジュール、
（ｃ）光学的検出サブシステム及び／又は電気的検出サブシステムを備える検出器であって、前記複数の検出可能なレポーター分子を検出するように構成された、前記検出器、
（ｄ）前記検出器に動作可能に接続され、コンピュータ実装方法を実行するように構成されたプロセッサであって、前記方法が：
（ｉ）前記複数のレポーター分子の量にそれぞれ関連する複数のシグナルデータ点を受け取り、前記複数のシグナルデータ点は、前記試料中の前記１又は複数の標的細胞の存在を示すこと、
（ｉｉ）前記複数のシグナルデータ点を使用して第一の曲線を作成すること、
（ｉｉｉ）前記第一の曲線に基づいて以下のパラメータを計算することにより前記第一の曲線を解析すること：曲線下面積（ＡＵＣ）；ピーク下面積（Ａ２）；面積比；全体の最大強度（ｇｌｏｂａｌｍａｘＲＬＵ）；及び相対変動（Ｒｖａｒ）、及び
（ｉｖ）面積比及びＲｖａｒを比較し、直線閾値を適用して陽性シグナルデータ点のセットを同定し、前記陽性シグナルデータ点のセットは前記試料中の前記１又は複数の標的細胞の存在を反映すること、を含む前記プロセッサ、を備える、システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書に記載の実施形態は、改変形質導入粒子を使用した細胞を検出するためのシステム及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌、特に薬剤耐性株の検出は、細菌感染の診断及び感染拡大の制限において重要なステップである。例えば、メチシリン耐性又はメチシリン感受性黄色ブドウ球菌（それぞれＭＲＳＡ及びＭＳＳＡ）は、一般的な黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）の薬剤耐性バージョンであり、米国の人口の大部分が保有している。ＭＲＳＡ感染症のほとんどは病院で発生し、高い死亡率を持つ可能性がある（ＭＲＳＡ感染症により米国で毎年約１９，０００人が死亡）。また、カルバペネム耐性腸内細菌科細菌（ｃａｒｂａｐｅｎｅｍ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ（ＣＲＥ））又はカルバペネム産生腸内細菌科細菌（ｃａｒｂａｐｅｎｅｍａｓｅ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ（ＣＰＥ））は、カルバペネムクラスの抗生物質に耐性のあるグラム陰性菌であり、そのような感染症に対する最終手段の薬剤と考えられている。ＭＲＳＡと同様に、病院はＣＲＥ及びＣＰＥによる感染症の主な感染場所である。したがって、ＭＲＳＡ、ＭＳＳＡ、ＣＲＥ及びＣＰＥなどの感染を引き起こす細菌株（それらの表現型及び／又は遺伝子型並びに他の分子標的を含む）の効率的で正確かつ迅速な同定が必要とされている。特に重要なのは、様々な試料（例えば、ヒト試料、環境試料、植物試料、獣医試料、食品試料など）から細菌の表現型及び／又は遺伝子型並びにその他の分子標的を特定する能力であり、それにより適切な治療及び感染対策を適時に開始可能となる。
【０００３】
細菌を同定するための公知の方法の１つは細菌培養を含む。培養は非常に高感度であるが、結果を得るのに２〜３日（又はそれ以上）かかることが多いため、迅速な診断や効率的なスクリーニングの目的には適していない。公知の培養方法は、アッセイを実施するために高度に訓練された要員を必要とするシステムを使用して実施されることが多く、したがって、様々な異なる設定での使用には適していない。公知の培養方法もまた汚染を受けやすく、偽陽性及び／又は細菌の誤同定をもたらし得る。さらに、公知の培養方法は、様々な細菌種の同定のために特別にテーラーメイドされた培養プロトコルを使用するため、広域の細菌パネルを試験することはコストを急騰し得る。
【０００４】
細菌細胞を検出するための他の公知の方法には、ＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸の単離及び分析が含まれる。試料から核酸を単離するための公知の方法は、高価で特殊な装置を必要とするいくつかのストリンジェントな試料調製工程を含むことが多い。特にそのような工程には、１）プロテアーゼを添加することにより、細菌又は細胞を含む試料内のタンパク質を除去すること、２）残りのバルク試料を崩壊させ、その中に含まれる核酸を露出させること（細胞溶解とも称される）こと、３）前記試料から前記核酸を沈殿させること、４）さらなる分析のために前記核酸を洗浄及び／又は調製すること、及び５）種を同定するために前記核酸を分析すること、を含む。前記試料を調整後、公知の分析方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、遺伝子配列決定、遺伝子フィンガープリント法、蛍光、イムノアッセイ、電気化学イムノアッセイ、マイクロアレイ、任意の他の適切な技術又はそれらの組み合わせを含み得る。ＰＣＲには広範な商業的用途が見出されているが、高価な試薬及び機器を含む複数の工程をしばしば必要とする。ＰＣＲを含む多くの公知の方法はベンチトップ試験には適さない（例えば、比較的熟練した要員を必要とする）。さらに、公知のＰＣＲ法は熱サイクル及び／又は高温を使用するため、分析のコスト、時間及び／又は複雑さを増大させる可能性がある。そして、ＤＮＡ配列を検出するためのＰＣＲ法は試料細胞を溶解するので、そのような方法は生細胞と死細胞とを区別することができない。
【０００５】
細胞同定のためのいくつかの公知のシステム及び方法は、特定の細菌を同定及び／又は検出するためのバクテリオファージの使用を含む。いくつかの公知の方法では、レポーター分子でタグ付けされたファージを用いて特定の細菌株を標的にして感染させることができる。感染後、前記ファージは、溶解サイクル（すなわち、細胞壁を破壊して標的細菌を死滅させる）及び／又は溶原性サイクル（すなわち、細菌を死滅させずに細菌と共にファージを複製する）を経ることができ、その後増幅された子孫ファージが検出される。ファージ検出に頼るそのような公知の方法はしばしば制限的又は複雑な工程を含む。例えば、いくつかの公知のファージ検出に基づく同定方法はファージ複製（その間に細菌を溶解可能である）に依存し、そして典型的にはこのプロセスを容易にするために細胞培養を必要とする。いくつかの公知のファージ検出に基づく方法は、慎重に計量された及び／又はｐＨ制御された試薬を使用して、試料からの特異的に結合したファージの除去又は「結合解除」を必要とする。さらに、いくつかの公知のファージ検出に基づく方法は、添加されるファージの量の慎重な計量に依存し、及び／又は試薬を添加／除去するために反応チャンバを開閉することを含む。これは、汚染及び／又は試薬の時期尚早な混合を招き、誤った結果をもたらし、本質的にアッセイを複雑にする可能性がある。
【０００６】
他のファージに基づく方法は、レポーター遺伝子を含み得るヌクレオチドを標的細菌に送達するように設計され、前記標的細菌にレポーター分子を発現させるバクテリオファージを使用する。いくつかの公知の方法は、アッセイ中に複製するファージを含むが、これはレポーター分子が産生される細胞の望ましくない溶解をもたらし得る。他の公知のファージに基づく方法は、アッセイ条件下において複製機能が抑制されるバクテリオファージを使用する。しかしながら、そのような公知の方法は、複製関数が抑制されたままである狭い範囲の条件（例えば、温度条件）のために実施困難である。そのような方法は容易に制御されず、溶解活性をもたらし得る。さらに他の方法は、溶解サイクルの代わりに溶原性サイクルを経る溶原性ファージ（テンペレートファージ）の使用を示唆する。しかしながら、そのような公知の方法は散発的な溶解活性も受けやすい。天然ファージのライフサイクルの組込みはまた、プロファージで溶原化され得る標的細胞による重複感染免疫のためにレポーターファージ宿主範囲の制限をもたらし得る。したがって、この種の公知の方法は学術的設定で行われてきたが、臨床的設定では適用できない。
【０００７】
ファージに基づく方法の使用に関する上記の欠点に加えて、公知の方法は、バクテリオファージ同定の「ウォークアウェイ（ｗａｌｋ  ａｗａｙ）」システムを可能にする自動化又は計装を使用しない。例えば、多くの公知のシステムは、閉鎖系の取り扱い及び／又は、例えば、フラッシュルミネセンス反応などの特定のレポーター分子によって生成されるシグナルの測定には対応していない。したがって、公知のシステム及び方法は、熟練した要員及び試料の綿密な取り扱いを必要とし、これは偽陽性又は偽陰性の可能性を増大させ得る。
【０００８】
よって、臨床試料中の細菌種の迅速で費用効果が高くかつ容易な検出及び同定のための改良された装置及び方法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００９】
実施形態は、試料中の標的細胞の存在又は非存在の正確な測定を提供することができる。具体的な実施形態では，前記標的細胞は病原体であり、本明細書に記載の方法及びシステムは、前記試料中の前記標的細胞が抗生物質又は抗生物質のクラスに対して耐性があるかどうかを同定するために使用することができる。具体的な実施形態では、前記試料を、１又は複数の標的細胞に結合可能な複数の形質導入粒子と混合する。前記形質導入粒子は、前記標的細胞に検出可能なレポーター分子を生成させるように形成された核酸分子を含むように改変される。前記粒子が、前記核酸分子を発現し、結合し、前記標的細胞内に送達することにより前記レポーター分子を発現することを確実にするために充分な条件下で、前記試料を前記粒子と混合する。レポーター分子の量を示すシグナルデータ点のセットを受領し、前記シグナルデータ点を用いて曲線を生成する。そして前記曲線を前記検出可能なシグナルの正確な測定を提供するように解析し、そうすることにより、前記標的細胞の前記試料中での存在又は非存在を測定可能である。
【００１０】
よって、一態様において、試料中に存在する１又は複数の標的細胞を検出する方法が提供される。前記方法は、（ａ）前記試料を前記１又は複数の標的細胞に結合可能な複数の形質導入粒子と混合し、前記複数の形質導入粒子は、（ｉ）前記１又は複数の標的細胞に複数のレポーター分子を生成させるように形成された核酸分子を含むように改変されている、（ｉｉ）前記核酸分子に結合して前記１又は複数の標的細胞へ送達するように形成されている、及び（ｉｉｉ）非複製である工程、（ｂ）前記１又は複数の標的細胞が前記試料中に存在する場合、前記複数のレポーター分子を発現するために充分な条件下で前記試料及び前記複数の形質導入粒子を維持する工程、（ｃ）前記複数のレポーター分子の量にそれぞれ関連する複数のシグナルデータ点を受け取り、前記複数のシグナルデータ点は、前記試料中の前記１又は複数の標的細胞の存在を示す工程、（ｄ）前記複数のシグナルデータ点を使用して第一の曲線を作成する工程、（ｅ）前記第一の曲線に基づいて以下のパラメータを計算することにより前記第一の曲線を解析する工程：曲線下面積（ＡＵＣ）；ピーク下面積（Ａ２）；面積比；全体の最大強度（ｇｌｏｂａｌｍａｘＲＬＵ）；及び相対変動（Ｒｖａｒ）、及び（ｆ）面積比及びＲｖａｒを比較し、直線閾値を適用して陽性シグナルデータ点のセットを同定し、前記陽性シグナルデータ点のセットは前記試料中の前記１又は複数の標的細胞の存在を反映する工程、を含む。いくつかの実施形態では、前記方法は、さらに前記第一の曲線に基づいて以下のパラメータの少なくとも一つを計算することによって前記第一の曲線を解析すること、をさらに含む：曲線下面積（ＡＵＣ）；ピーク下面積（Ａ２）；全体の最大強度（ｇｌｏｂａｌｍａｘＲＬＵ）；相対変動（Ｒｖａｒ）；シグナル対ノイズ比（Ｓ２Ｎ）；変動係数（ＣＶ）；スパイク検出；ピーク位置；指数関数的なスロープ（ｅＳｌｏｐｅ）；面積比；質量中心（ＣＭ）；及び相対面積（ｒＡｒｅａ）。いくつかの実施形態では、前記方法は、前記陽性シグナルデータ点のセットを用いて第二の曲線を生成し、前記第二の曲線に対してｒＡｒｅａ及びＳ２Ｎを比較して陽性シグナルデータ点の修正セットを同定し、前記陽性シグナルデータ点の修正セットは、前記試料中の前記１又は複数の標的細胞の存在を反映することとする工程、をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記方法は、ＤｅｌｔａＡ２Ａ及びＣＭを比較し、さらなる直線閾値を適用して、前記試料中の１又は複数の標的細胞の存在を反映する陽性シグナルデータ点の改良セットを同定する工程、をさらに含む。いくつかの実施形態では、ｒＡｒｅａ＝Ａ２／（ピーク領域で最大）である。いくつかの実施形態では、面積比＝Ａ２／ＡＵＣであり、Ｒｖａｒが以下である。
【００１１】
【数１】
2020504605.tif 000003
【００１２】
いくつかの実施形態では、前記直線閾値が、Ａ２ＡＩｎｔ＋Ｒｖａｒ＊Ａ２ＡＳｌｐであり、Ａ２ＡＩｎｔが、Ａ２Ａ対Ｒｖａｒの閾値線の切片であり、Ｒｖａｒが以下である。
【００１３】
【数２】
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【００１４】
Ａ２ＡＳｌｐが、前記Ａ２Ａ対Ｒｖａｒの閾値線の傾きである。特定の実施形態では、前記方法は、ｒＡｒｅａＩｎｔ＋Ｓ２Ｎ＊ｒＡｒｅａＳｌｐの直線閾値を適用すること、をさらに含む。いくつかの実施形態では、台形法を用いてＡＵＣを計算する。いくつかの実施形態ではＡ２が一定のタイムインターバルにおいて定義される。特定の実施形態では、前記タイムインターバルが、−０．１０秒〜１０．０秒の範囲にある。いくつかの実施形態では、Ａ２が可変のタイムインターバルにおいて定義される。特定の実施形態では、前記タイムインターバルが、−０．２５秒＜選択されたピーク時間（秒）＜＋２．００秒の間で可変である。いくつかの実施形態では、前記方法が、前記試料における抗生物質耐性を検出するために使用される。
【００１５】
試料中に存在する１又は複数の標的細胞を検出するコンピュータ実装方法も提供される。前記方法は、コンピュータシステムにおいて：（ａ）前記複数のレポーター分子の量にそれぞれ関連する複数のシグナルデータ点を受け取り、前記複数のシグナルデータ点は、前記試料中の前記１又は複数の標的細胞の存在を示すこと、（ｂ）前記複数のシグナルデータ点を使用して第一の曲線を作成すること、（ｃ）前記第一の曲線に基づいて以下のパラメータを計算することにより前記第一の曲線を解析すること：曲線下面積（ＡＵＣ）；ピーク下面積（Ａ２）；面積比；全体の最大強度（ｇｌｏｂａｌｍａｘＲＬＵ）；及び相対変動（Ｒｖａｒ）、及び（ｄ）面積比及びＲｖａｒを比較し、直線閾値を適用して陽性シグナルデータ点のセットを同定し、前記陽性シグナルデータ点のセットは前記試料中の前記１又は複数の標的細胞の存在を反映すること、を含む。いくつかの実施形態では、前記方法は、さらに前記第一の曲線に基づいて以下のパラメータの少なくとも一つを計算することによって前記第一の曲線を解析すること、をさらに含む：シグナル対ノイズ比（Ｓ２Ｎ）；変動係数（ＣＶ）；スパイク検出；ピーク位置；指数関数的なスロープ（ｅＳｌｏｐｅ）；質量中心（ＣＭ）；及び相対面積（ｒＡｒｅａ）。いくつかの実施形態では、前記方法は、さらに前記第一の曲線に基づいて以下のパラメータを計算することによって前記第一の曲線を解析すること、をさらに含む：曲線下面積（ＡＵＣ）；ピーク下面積（Ａ２）；全体の最大強度（ｇｌｏｂａｌｍａｘＲＬＵ）；相対変動（Ｒｖａｒ）；シグナル対ノイズ比（Ｓ２Ｎ）；変動係数（ＣＶ）；スパイク検出；ピーク位置；指数関数的なスロープ（ｅＳｌｏｐｅ）；面積比；質量中心（ＣＭ）；及び相対面積（ｒＡｒｅａ）。いくつかの実施形態では、前記方法は、前記陽性シグナルデータ点のセットを用いて第二の曲線を生成し、前記第二の曲線に対してｒＡｒｅａ及びＳ２Ｎを比較して陽性シグナルデータ点の修正セットを同定し、前記陽性シグナルデータ点の修正セットは、前記試料中の前記１又は複数の標的細胞の存在を反映することとする工程、をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記方法は、ＤｅｌｔａＡ２Ａ及びＣＭを比較し、さらなる直線閾値を適用して、前記試料中の１又は複数の標的細胞の存在を反映する陽性シグナルデータ点の改良セットを同定する工程、をさらに含む。いくつかの実施形態では、ｒＡｒｅａ＝Ａ２／（ピーク領域で最大）である。いくつかの実施形態では、面積比＝Ａ２／ＡＵＣであり、Ｒｖａｒが以下である。
【００１６】
【数３】
2020504605.tif 000005
【００１７】
いくつかの実施形態では、前記直線閾値が、Ａ２ＡＩｎｔ＋Ｒｖａｒ＊Ａ２ＡＳｌｐであり、Ａ２ＡＩｎｔが、Ａ２Ａ対Ｒｖａｒの閾値線の切片であり、Ｒｖａｒが以下である。
【００１８】
【数４】
2020504605.tif 000006
【００１９】
Ａ２ＡＳｌｐが、前記Ａ２Ａ対Ｒｖａｒの閾値線の傾きである。特定の実施形態では、前記方法は、ｒＡｒｅａＩｎｔ＋Ｓ２Ｎ＊ｒＡｒｅａＳｌｐの直線閾値を適用すること、をさらに含む。いくつかの実施形態では、台形法を用いてＡＵＣを計算する。いくつかの実施形態ではＡ２が一定のタイムインターバルにおいて定義される。特定の実施形態では、前記タイムインターバルが、−０．１０秒〜１０．０秒の範囲にある。いくつかの実施形態では、Ａ２が可変のタイムインターバルにおいて定義される。特定の実施形態では、前記タイムインターバルが、−０．２５秒＜選択されたピーク時間（秒）＜＋２．００秒の間で可変である。いくつかの実施形態では、前記方法が、前記試料における抗生物質耐性を検出するために使用される。
【００２０】
別の態様では、試料中に存在する１又は複数の標的細胞を検出するように構成されたシステムが提供される。前記システムは：
（ａ）内部に試料を配置することができる一定の容積を画定する容器、
（ｂ）内部に１又は複数の試薬を配置することができる一定容積を画定する試薬モジュールであって、前記１又は複数の試薬は前記標的細胞に結合可能な複数の形質導入粒子を含んでおり、前記複数の形質導入粒子は、（ｉ）核酸分子を含むように改変され、（ｉｉ）前記１又は複数の標的細胞に複数の検出可能なレポーター分子を生成させるように形成され、（ｉｉｉ）非複製である、前記試薬モジュール、
（ｃ）光学的検出サブシステム及び／又は電気的検出サブシステムを備える検出器であって、前記複数の検出可能なレポーター分子を検出するように構成された、前記検出器、（ｄ）前記検出器に動作可能に接続され、コンピュータ実装方法を実行するように構成されたプロセッサであって、前記方法が：
（ｉ）前記複数のレポーター分子の量にそれぞれ関連する複数のシグナルデータ点を受け取り、前記複数のシグナルデータ点は、前記試料中の前記１又は複数の標的細胞の存在を示すこと、
（ｉｉ）前記複数のシグナルデータ点を使用して第一の曲線を作成すること、
（ｉｉｉ）前記第一の曲線に基づいて以下のパラメータを計算することにより前記第一の曲線を解析すること：曲線下面積（ＡＵＣ）；ピーク下面積（Ａ２）；面積比；全体の最大強度（ｇｌｏｂａｌｍａｘＲＬＵ）；及び相対変動（Ｒｖａｒ）、及び
（ｉｖ）面積比及びＲｖａｒを比較し、直線閾値を適用して陽性シグナルデータ点のセットを同定し、前記陽性シグナルデータ点のセットは前記試料中の前記１又は複数の標的細胞の存在を反映すること、を含む前記プロセッサ、
を備える。
【００２１】
いくつかの実施形態では、前記方法は、さらに前記第一の曲線に基づいて以下のパラメータの少なくとも一つを計算することによって前記第一の曲線を解析すること、をさらに含む：シグナル対ノイズ比（Ｓ２Ｎ）；変動係数（ＣＶ）；スパイク検出；ピーク位置；指数関数的なスロープ（ｅＳｌｏｐｅ）；質量中心（ＣＭ）；及び相対面積（ｒＡｒｅａ）。いくつかの実施形態では、前記方法は、さらに前記第一の曲線に基づいて以下のパラメータを計算することによって前記第一の曲線を解析すること、をさらに含む：曲線下面積（ＡＵＣ）；ピーク下面積（Ａ２）；全体の最大強度（ｇｌｏｂａｌｍａｘＲＬＵ）；相対変動（Ｒｖａｒ）；シグナル対ノイズ比（Ｓ２Ｎ）；変動係数（ＣＶ）；スパイク検出；ピーク位置；指数関数的なスロープ（ｅＳｌｏｐｅ）；面積比；質量中心（ＣＭ）；及び相対面積（ｒＡｒｅａ）。いくつかの実施形態では、前記方法は、前記陽性シグナルデータ点のセットを用いて第二の曲線を生成し、前記第二の曲線に対してｒＡｒｅａ及びＳ２Ｎを比較して陽性シグナルデータ点の修正セットを同定し、前記陽性シグナルデータ点の修正セットは、前記試料中の前記１又は複数の標的細胞の存在を反映することとする工程、をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記方法は、ＤｅｌｔａＡ２Ａ及びＣＭを比較し、さらなる直線閾値を適用して、前記試料中の１又は複数の標的細胞の存在を反映する陽性シグナルデータ点の改良セットを同定する工程、をさらに含む。いくつかの実施形態では、ｒＡｒｅａ＝Ａ２／（ピーク領域で最大）である。いくつかの実施形態では、面積比＝Ａ２／ＡＵＣ及びＲｖａｒが以下である。
【００２２】
【数５】
2020504605.tif 000007
【００２３】
いくつかの実施形態では、前記直線閾値が、Ａ２ＡＩｎｔ＋Ｒｖａｒ＊Ａ２ＡＳｌｐであり、Ａ２ＡＩｎｔが、Ａ２Ａ対Ｒｖａｒの閾値線の切片であり、Ｒｖａｒが以下である。
【００２４】
【数６】
2020504605.tif 000008
【００２５】
Ａ２ＡＳｌｐが、前記Ａ２Ａ対Ｒｖａｒの閾値線の傾きである。特定の実施形態では、前記方法は、ｒＡｒｅａＩｎｔ＋Ｓ２Ｎ＊ｒＡｒｅａＳｌｐの直線閾値を適用すること、をさらに含む。いくつかの実施形態では、台形法を用いてＡＵＣを計算する。いくつかの実施形態ではＡ２が一定のタイムインターバルにおいて定義される。特定の実施形態では、前記タイムインターバルが、−０．１０秒〜１０．０秒の範囲にある。いくつかの実施形態では、Ａ２が可変のタイムインターバルにおいて定義される。特定の実施形態では、前記タイムインターバルが、−０．２５秒＜選択されたピーク時間（秒）＜＋２．００秒の間で可変である。いくつかの実施形態では、前記方法が、前記試料における抗生物質耐性を検出するために使用される。
【発明の効果】
【００２６】
本発明の実施形態の性質及び利点のより良い理解は、以下の詳細な説明及び添付の図面を参照して得られるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、本明細書に記載のように試料を分析するように構成された機器のブロック図である。
【図２】図２は、フラッシュアンドグロー反応に供した試料の発光シグナルの典型的なプロットである。
【図３Ａ−３Ｆ】図３Ａ〜図３Ｐは、追加的データ解析無しでの、代表的な陽性及び陰性曲線である。
【図３Ｇ−３Ｌ】図３Ａ〜図３Ｐは、追加的データ解析無しでの、代表的な陽性及び陰性曲線である。
【図３Ｍ−３Ｐ】図３Ａ〜図３Ｐは、追加的データ解析無しでの、代表的な陽性及び陰性曲線である。
【図４Ａ−４Ｂ】図４Ａ〜図４Ｃは、本明細書に記載の方法を説明するフローチャートである。図４Ａは、前記方法の全体像を提供する。図４Ｂは、前記方法のデータ解析部分のさらなる詳細を説明する。
【図４Ｃ】図４Ｃは、前記方法のデータ解析部分について追加的詳細を提供する。
【図５】図５は、ＳｐｅｃｔｒｏＭａｘ（登録商標）機器で実施したアッセイ結果の解析を示す。図５は、前記アッセイで検出されたシグナルデータ点由来の曲線のＡ２／ＡＵＣ（面積比）対Ｒｖａｒプロットを含む。
【図６】図６は、図５に示す曲線のさらなる解析結果を示す。図中、閾値線からの距離をｅＳｌｏｐｅに対してプロットした。
【図７】図７は、ＶｉｖｏＤＸ機器で実施したアッセイ結果の解析を示す。図中、前記アッセイで検出されたシグナルデータ点由来の曲線のＡ２／ＡＵＣ（面積比）対Ｒｖａｒプロットを含む。
【図８】図８は、図７の解析から同定した陽性シグナルデータをさらに解析した結果を示す。図中、相対面積をＣＶに対してプロットした。
【図９】図９は、本明細書に記載の方法の１又は複数の工程を実施するために使用可能な例示的なコンピュータシステムの概略図である。
【図１０】図１０は、本明細書に記載の代替アルゴリズムのための内部計算に使用された３つのタイムインターバルを示す。
【図１１】図１１は、前記代替方法を用いた陽性又は陰性何れかの曲線コールである、結果＿１を、Ａ２／Ａ対Ｒｖａｒのプロットと共に示す。図１１の中心を通る黒線は、Ａ２ＡＩｎｔ＋Ｒｖａｒ＊Ａ２ＡＳｌｐのプロットであり、この線より上の黒点は、陽性及びこの線より下の黒点は陰性である。
【図１２】図１２は、前記代替となる方法を用いた陽性又は陰性何れかの曲線コールである、結果＿２を示す。ＤｅｌｔａＡ２Ａ＞０である図１１のデータ点を、図１２にプロットした。軸線は、ｒＡｒｅａ対Ｓ２Ｎである。図１２の閾値線は、ｒＡｒｅａＩｎｔ＋Ｓ２Ｎ＊ｒＡｒｅａＳｌｐのプロットであり、この線より上のデータ点は陽性及びこの線より下のデータ点は陰性である。
【図１３】図１３は、質量中心（ＣＭ）閾値を求めるために用いられる、ＤｅｌｔａＡ２Ａ対ＣＭのプロットである。ＤｅｌｔａＡ２Ａは、図１１におけるＡ２Ａ対Ｒｖａｒプロット上の点から閾値線Ａ２ＡＩｎｔ＋Ｒｖａｒ＊Ａ２ＡＳｌｐを差し引いたものと定義される。ＣＭ＞ＣＭＭａｘ、ＭａｘＳｉｇｎａｌ＞ｍｉｎＲＬＵ及びｚＴｅｓｔ  ０である曲線は、無効とされる。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
実施形態において、フラッシュアンドグロー反応に基づく試料中の１又は複数の標的細胞の存在を検出可能である。従来の方法は、偽陽性試料及び偽陰性試料を検出し、不正確な結果となり、治療の決定に悪影響を及ぼす可能性があった。本明細書に記載の方法及びシステムは、従来の論理を用いて正しく検出されなかった標的細胞を確実に正確に同定するためのメカニズムを提供する。
【００２９】
本明細書中で他に定義されない限り、本明細書中で使用される科学的及び技術的用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。さらに、文脈によって他に必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含む。冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、本明細書では、冠詞の文法上の目的語の１又は複数（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用される。例として、「１つの要素」は１又は複数の要素を意味する。
【００３０】
用語「検出する」、「検出すること」、「検出」及び類似の用語は、存在又は非存在並びに程度、量、レベル又は何かが起こる確率を見出すか決定するプロセスを広く指すために本出願において使用される。例えば、用語「検出すること」は、標的細胞に関して使用される場合、その存在、非存在、レベル又は量並びに標的細胞の存在又は非存在の確率又は尤度を見出すか決定することを意味し得る。「存在を検出する」という表現及び関連する表現は定性的及び定量的検出を含むことを理解されたい。
【００３１】
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチドのポリマー（例えば、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチド）を指し、天然に存在する核酸（アデノシン、グアニジン、シトシン、ウラシル及びチミジン）、天然に存在しない核酸及び修飾核酸を含む。この用語は、ポリマーの長さ（例えば、モノマーの数）によって制限されない。核酸は一本鎖でも二本鎖でもよく、一般に５’−３’ホスホジエステル結合を含むが、場合によっては、ヌクレオチド類似体は他の結合を有していてもよい。モノマーは典型的にはヌクレオチドと称される。用語「非天然ヌクレオチド」又は「修飾ヌクレオチド」は、修飾された窒素含有塩基、糖若しくはリン酸基を含むか、又はその構造中に非天然部分を組み込んでいるヌクレオチドを指す。非天然ヌクレオチドの例には、ジデオキシヌクレオチド、ビオチン化ヌクレオチド、アミノ化ヌクレオチド、脱アミノ化ヌクレオチド、アルキル化ヌクレオチド、ベンジル化ヌクレオチド及びフルオロフォア標識ヌクレオチドが含まれる。
【００３２】
本明細書中で使用される場合、標的細胞は細菌であり、限定されるものではないが、例えば、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、ヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ゼノラブダス属（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、アエロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）、アクチノバチルス属（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、カロスリックス属（Ｃａｌｏｔｈｒｉｘ）、メタノコックス属（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）、ステノトロフォモナス属（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）、クラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）及びエルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）が挙げられる。以下の標的細胞が具体的に考えられる。
【００３３】
・ブドウ球菌属、特に、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌及びメチシリン感受性黄色ブドウ球菌（それぞれ、ＭＲＳＡ及びＭＳＳＡ）
・腸内細菌科、特に、カルバペネム耐性腸内細菌科細菌（ＣＲＥ）又はカルバペネム産生腸内細菌科細菌（ＣＰＥ）
・緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ヒトを含む動植物に病気を引き起こす可能性がある一般的なグラム陰性菌緑膿菌は、その遍在性、本質的に進化した抗生物質耐性機構、及び重篤な疾患ー特に人工呼吸器関連肺炎や様々な敗血症症候群などの院内感染ーとの関連性について認識されている多剤耐性病原体である。
・アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、易感染性の免疫系の人々に影響を与えるヒトの日和見病原体であるグラム陰性球桿菌であり、病院由来（院内感染）としてますます重要になっている。アシネトバクター・バウマニは、ＥＳＫＡＰＥ病原体（エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）及びエンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）種）としても同定されており、院内感染症の大部分の原因となっている、高率で抗生物質耐性を有する一群の病原体である。
・コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（Ｃｏａｇｕｌａｓｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）は、皮膚及び粘膜の常在菌である。表皮ブドウ球菌（Ｓ．  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）は、最も蔓延している種で、皮膚上の全てのコアグラーゼ陰性ブドウ球菌の約６０％〜７０％を占める。コアグラーゼ陰性ブドウ球菌は、院内感染を伴うことが多い。逆に、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌は皮膚に偏在しているため、血液培養の最も頻繁な汚染物質であり、培養試験の解釈を複雑にすることが多い。コアグラーゼ陰性ブドウ球菌のうちペニシリン耐性は、９０％〜９５％に近い。メチシリン及び半合成ペニシリンに対する耐性は、８０パーセント以上のＣｏＮＳ分離株で認められている。これらの分離株は、ベータラクタムに加えて、多くの種類の抗生物質に耐性がある。
・バンコマイシン耐性腸球菌（Ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ）（ＶＲＥ）及びフルオロキノロン耐性腸内細菌科細菌（Ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅａｒｅ）（ＦＲＥ）は、それぞれ、これらの種類の細菌に対する一般的な治療選択肢であるバンコマイシン及びフルオロキノロンに耐性のある特定の種類の薬剤耐性細菌である。
【００３４】
標的細胞間、例えば、ＭＲＳＡとＭＳＳＡ又はＣＰＥとＣＲＥを識別することは困難であり得る。例えば、ＰＣＴ公報の国際公開第２０１４／１６０４１８号パンフレット、国際公開第２０１４／１６４７６８号パンフレット及び国際公開第２０１５／１６４７４６号パンフレット並びに米国特許出願公開第２０１５／０２１８６１３号明細書に記載されるように、特定の標的細胞が試料中に存在するかどうかを決定するためのいくつかの試験はフラッシュ反応を含む。そのようなフラッシュシグナルは、例えば、様々なタイムポイントで検出されるシグナルデータ点として、検出器によって検出可能であり、フラッシュシグナルは、例えば生細胞発光アッセイを含む様々な検査対象の多数の反応において生じ得る。
【００３５】
いくつかの実施形態では、試料中の標的細胞の存在は、試料中の標的細胞及び活性化試薬を含むフラッシュ反応から生じるシグナルに基づいて検出することができる。具体例では、システムは、発光アッセイ（活性化試薬を含む例）を介して、例えばＣＲＥ、ＣＰＥ、ＭＲＳＡ又はＭＳＳＡ等の標的細胞の存在を検出するために設計されている。前記アッセイは、第二の試薬を介して活性化された場合に標的生細胞に発光シグナルを生成させる第一の試薬を使用することができる。データを収集するために検出器（例えば、光電子増倍管（ＰＭＴ）を用いた検出器）が使用される。収集したデータは、その収集したデータの特性に基づいて、標的細胞の有無を区別するために分析することができる。解析により、前述の検査対象の存在について、試料の正確な測定を提供することができる。解析のパラメータは、結果が参照データに関して所望の感度及び特異性を生成するように、前述の標的細胞に対して陽性及び陰性であることが知られているそれぞれの試料からの参照データに基づいて選択され得る。
【００３６】
参照データは、標準として受け入れられているものも含め、任意の適切な参照アッセイに基づいて、前述の標的細胞について陽性／陰性として同定され得る。例えば、参照データは、ＦＤＡ文書（ＦＤＡ  Ｄｒａｆｔ  Ｄｏｃｕｍｅｎｔ−Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ−Ｂａｓｅｄ  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−  Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）  ａｎｄ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＳＡ）、２０１１年５月１日発行）に記載されているＭＲＳＡ検出のための濃縮培養方法に基づいて、ＭＲＳＡについて陽性／陰性であることがわかっていると決定されている。
【００３７】
いくつかの実施形態では、ＰＣＴ公報の国際公開第２０１４／１６４７６８号パンフレットに記載のシステムは、ＰＣＴ公報の国際公開第２０１５／１６４７４６号パンフレットに記載の消耗品を用いて、アッセイ及び性能について記載されているＰＣＴ公報の国際公開第２０１４／１６０４１８号パンフレットに記載の標的細胞アッセイを実施することにより採用できる。
【００３８】
標的細胞又は他の検査対象を検出及び同定するためのシステム、装置及び方法は、前記標的細胞に対して同定及び結合し、前記標的細胞を改変ヌクレオチドへ送達可能な形質導入粒子を含み得る。図１のブロック図に示すように、いくつかの実施形態では、システム１００は、遺伝子改変形質導入粒子１１０、容器１２０、レポーター１３０、検出機器１４０及びプロセッサ１５０を含む。具体的な実施形態では、前記粒子１１０は、試薬モジュール１６０内に配置される。前記システム１００は、前記形質導入粒子１１０が特定の標的を含む試料Ｓと混合されたときに前記レポーター１３０を生成することができるように、前記容器１２０及び／又は前記検出機器１４０を操作、取り扱い及び／又は作動するように構成される。このように、前記システム１００及び関連する方法は、「切替可能な」アッセイとして考えることができ、前記レポーター１３０が生成されるような条件（例えば、前記標的細胞の存在）になるまで、前記試料中に前記レポーター１３０が全く存在しないことを意味する。検出機器１４０は、光電子増倍管（ＰＭＴ）であり得る。ＰＭＴは、前記反応から光子を検出し、時間経過に伴うシグナルを提供する。
【００３９】
前記形質導入粒子１１０は、レポーターＤＮＡ及び／又はＲＮＡを標的細胞内へ送達可能な任意の適切な粒子であり得る。例えば、いくつかの実施形態において、前記形質導入粒子は、バクテリオファージ由来であり得るか、前記試料Ｓ中の標的細菌に核酸分子を導入することができる非生物学的由来のベクターであり得る。前記形質導入粒子１１０はさらに改変されている及び／又は改変された分子、例えば、組換えＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオチド、プラスミド、リボザイム、アプタマー及び／又はタンパク質を担持するように構成されている。いくつかの実施形態では、前記形質導入粒子１１０は、自身が由来するウイルスベクター（例えば、バクテリオファージ）に由来する如何なるＤＮＡも含まない。同様に述べると、いくつかの実施形態では、前記形質導入粒子は、ウイルスベクターが由来するウイルスに関連する野生型ウイルス機能を発揮することができる野生型ＤＮＡを欠くウイルスベクターである。
【００４０】
いくつかの実施形態では、前記形質導入粒子１１０は、溶解性又は溶原性サイクルの何れでも複製することはできない。前記形質導入粒子から全ての形態の複製を排除することによって、前記標的細胞は、前記レポーター分子の産生中に維持され（すなわち、破壊、死滅又は溶解されず）、それにより共に使用される前記方法の正確性及び信頼性が改善される。特に、ウイルス粒子の野生型ウイルス機能は溶原性複製を示すことができ、溶解性複製のための能力を必要とするので、複製機能（例えば、溶解性サイクル）を抑制しようとする試みは、溶解性サイクルがアッセイのいくつかの集団をもたらさないという充分な確実性を提供しない可能性がある。
【００４１】
前記形質導入粒子１１０は、１又は複数の標的細胞に関連している及び／又は特異的であることによって特徴付けることができる。同様に述べると、前記形質導入粒子１１０は、核酸分子に結合し、前記標的細胞へ核酸分子を送達するように形成される。例えば、前記形質導入粒子は、例えば、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、ヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ゼノラブダス属（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、アエロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）、アクチノバチルス属（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、カロスリックス属（Ｃａｌｏｔｈｒｉｘ）、メタノコックス属（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）、ステノトロフォモナス属（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）、クラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）及びエルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）等の如何なる細菌に対しても結合するように選択、改変及び／又は産生される。具体的な実施形態では、前記標的細胞は、腸内細菌科、特に、カルバペネム耐性腸内細菌科細菌（ＣＲＥ）又はカルバペネム産生腸内細菌科細菌（ＣＰＥ）である。さらなる実施形態では、前記標的細胞は、ブドウ球菌属、特に、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌及びメチシリン感受性黄色ブドウ球菌（それぞれ、ＭＲＳＡ及びＭＳＳＡ）であり、前記形質導入粒子は、ＭＲＳＡ及び／又はＭＳＳＡに結合するように選択、改変及び／又は産生される。
【００４２】
前記形質導入粒子１１０は、さらに、検出可能なレポーター１３０（例えば、前記機器１４０を介して）を発現するための遺伝子及び／又は核酸分子を含有するように、産生及び／又は改変できる。前記レポーター１３０は、細菌ルシフェラーゼ、真核生物ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ等）、比色検出に適した酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、免疫検出に適したタンパク質（例えば、タンパク質Ａ等）、免疫検出に適したペプチド又はペプチドタグ（例えば、３×ＦＬＡＧ等）及び／又はアプタマーとして機能する核酸又は酵素活性を示す核酸の何れでもあり得る。より具体的には、前記形質導入粒子１１０は、前記レポーター１３０を自律的に生成しない及び／又は前記レポーター１３０を含まない。代わりに、形質導入粒子１１０は、その中に含まれる改変核酸分子を、前記標的細胞、例えば、細菌に伝達するように構成され、それにより前記改変核酸分子は、細菌ＤＮＡの天然の転写及び翻訳機能を使用して前記レポーター１３０を生成する。よって、前記レポーター１３０は、「切替可能な」レポーターとして考えることができ、前記レポーター１３０が生成されるような条件（例えば、前記標的細胞の存在）になるまで、前記試料中に前記レポーター１３０が全く存在しないことを意味する。このように、特定の方法は、非結合レポーター１３０の洗浄、レポーター又は同種のものの初期量を説明するためのシグナル減算を伴わなくてもよい。よって、前記システム１００及び関連する方法により、均質なアッセイの開発が可能となる。さらに、温度サイクルは必要としなくてもよく、例えば３７℃の低温で短時間の加熱で充分であり得る。
【００４３】
前記レポーター１３０を発現させるように形成された前記レポーターシステム及び本明細書に開示の前記レポーターシステムの何れも、プロモーターの制御下で前記非複製的形質導入粒子１１０（又は本明細書に開示の他の形質導入粒子の何れか）にレポーター分子を組み込むことにより、生細菌及び／又は標的細胞の存在を報告する目的で開発することができる。この形質導入粒子１１０が、形質導入粒子１１０の宿主範囲内の細胞内に、前記レポーターシステムを導入すると、前記プロモーターは、前記レポーター分子の発現を促進することができる。
【００４４】
例えば、ＭＳＳＡ／ＭＲＳＡレポーターアッセイは、任意の適したシステムを用いて、開発及び／又は実施可能である。そのような実施形態では、非複製的形質導入粒子（例えば、前記形質導入粒子１１０）は、黄色ブドウ球菌特異的バクテリオファージから発生し、構成的プロモーターの制御下の細菌ルシフェラーゼ遺伝子ｌｕｘＡＢが組み込まれる。この形質導入粒子が黄色ブドウ球菌に前記レポーターシステムを導入すると、前記構成的プロモーターが、黄色ブドウ球菌の生菌の存在を報告するために適したｌｕｘＡＢを発現可能である。また、黄色ブドウ球菌細胞と前記形質導入粒子を混合する前に又は同時に、抗生物質のセフォキシチン又は類似の抗生物質も添加する場合、前記細胞がｍｅｃＡ遺伝子を含有及び発現しなければ、前記アッセイでｌｕｘＡＢは発現されることはなく、前記細胞がＭＳＳＡである（すなわち、セフォキシチンによる阻害に感受性がある）ことを示す。しかしながら、前記細胞がｍｅｃＡ遺伝子を含有及び発現すれば前記アッセイでｌｕｘＡＢは発現され、前記細胞がＭＲＳＡである（すなわち、セフォキシチンによる阻害に耐性がある）ことを示す。
【００４５】
生細菌の存在を報告するために開発されたと記載しているが、他の実施形態では、前記レポーター１３０及び前記利用可能なレポーターシステムの何れも標的細菌内の標的遺伝子の存在を報告するために開発可能である。このシステムでは、無プロモーターレポーター遺伝子は、標的遺伝子配列に相同である核酸配列の下流に配置され、このレポーターコンストラクトが非複製的形質導入粒子に組み込まれる。前記形質導入粒子が、前記レポーターコンストラクトを標的細胞に導入すると、前記標的細胞が前記標的遺伝子を含有しない限り、前記レポーター遺伝子は、発現されることはなく、前記レポーター遺伝子が、標的細胞内で前記標的遺伝子プロモーターに作動的に結合するように、相同組換え事象が、前記標的細胞内の標的遺伝子座において前記レポーター遺伝子を組み込む。
【００４６】
そのような一つの実施形態では、黄色ブドウ球菌特異的非複製的形質導入粒子（例えば、前記形質導入粒子１１０）に、ｍｅｃＡ遺伝子に相同である核酸配列からなるレポーターコンストラクトを、無プロモーター細菌ルシフェラーゼ遺伝子ｌｕｘＡＢの上流で組み込むことにより、ＭＲＳＡレポーターシステムを開発できる。前記形質導入粒子が、前記レポーターコンストラクトを標的黄色ブドウ球菌細胞に導入すると、前記標的細胞が前記標的ｍｅｃＡ遺伝子を含有しない限り、前記レポーター遺伝子は、発現されることはなく、前記レポーター遺伝子が、標的細胞内でｍｅｃＡ遺伝子プロモーターに作動的に結合するように、相同組換え事象が、前記標的細胞内のｍｅｃＡ遺伝子座においてｌｕｘＡＢ遺伝子を組み込む。
【００４７】
いくつかの実施形態では、形質導入粒子１１０、前記形質導入粒子１１０に含有される前記核酸分子及び／又はそれらに関連するレポーターシステムは、２００８年４月１８日に国際特許出願として出願された、「Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ」を標題とする米国特許出願公開第２０１０／０１１２５４９号明細書に示され記載された組換えバクテリオファージの何れかの部分を含み得る。
【００４８】
前記試料Ｓは、例えば、ヒト鼻腔スワブ、血液、尿、獣医用試料、食品試料及び／又は環境試料といった標的検査対象を含み得る如何なる試料でもあり得る。いくつかの実施形態では、前記試料Ｓは、準備が不要なもの、例えば、分離や洗浄工程が不要な供給源から得られた未加工試料であり得る。よって、前記システム１００及び関連する方法は、均質であり得る。いくつかの実施形態では、前記試料Ｓは、少量の標的細胞（例えば、ＭＲＳＡ検出用鼻腔スワブ）を含み得る。そのような試料を使用する場合、前記システム１００及び関連する方法は、例えば、シグナルの最小閾値より大きいシグナルを生成するための前記レポーター分子１３０の産生量の増加に至る、細胞複製促進のための加熱及び／又はインキュベーション期間を含み得る。
【００４９】
他の実施形態では，前記試料Ｓは、多めの量の標的細胞（例えば、陽性細菌性血液培養物）を有し得る。そのような場合、細胞複製は、前記標的細胞の同定に充分な陽性シグナルを生成する必要はない。いくつかのそのような実施形態では、前記試料は、特定の状態に維持され得る。例えば、予め定められた期間、例えば、約４時間未満の間、ほぼ室温より高いか同等の温度、２５℃又は３７℃に維持される。そのような実施形態では、前記試料Ｓを維持する前記温度及び期間は、レポーター分子１３０の産生量が、細胞複製と無関係に測定可能なシグナルを生成するために充分となるようにする。そのような実施形態では、前記試料は、所定の温度で、例えば、６時間、８時間、最大１８時間、又はさらに長時間維持され得る。
【００５０】
いくつかの実施形態では、前記容器１２０は、第一の試薬、例えば、前記標的細胞を維持するための細菌性栄養素若しくは増殖培地（例えば、最小必須培地）及び／又は適切な緩衝液（例えば、Ａｍｉｅｓ、ＰＢＳ、ＴＲＩＳ、ＨＥＰＥＳ等）を含むことができ、細菌性細胞増殖又は同種のものを促進する。いくつかの実施形態では、抗生物質、例えば、セフォキシチンを、例えば、生細胞アッセイを目的とした場合、前記第一の試薬に含有させることができる。前記標的細胞を含有する試料Ｓを、容器１２０に添加し、その後容器１２０に前記形質導入粒子１１０を添加可能である。前記標的細胞が存在する場合、前記形質導入粒子１１０は、内在する核酸配列を前記標的細胞へ運び、それにより前記形質導入粒子１１０に含まれる核酸が、前記標的細胞、例えば、宿主細菌の遺伝子に組み込まれる。
【００５１】
いくつかの実施形態では、前記容器１２０は、前記容器１２０の外部領域から前記試料Ｓを流動的に単離するように構成される。そのような実施形態では、前記形質導入粒子１１０は、前記形質導入粒子１１０が混合される前に、前記試料Ｓからの流動的単離において維持される。いくつかの実施形態では、前述の維持とは、前記シグナルを生成するために充分な量の複数の前記レポーター分子１３０を、標的細胞複製と無関係に産生するような期間、前記試料Ｓを維持することを含み得る。本明細書に記載されるように、混合は、前記領域及び前記容器１２０の間の隔離を維持しながら、前記形質導入粒子１１０を前記試料Ｓに配置することを含む。
【００５２】
いくつかの実施形態では、前記容器１２０は、前記レポーター分子１３０と反応して前記シグナルの生成を誘導、触媒及び／又は増強するように形成された活性化試薬を含むように構成され得る。例えば、前記レポーター分子１３０は、ルシフェラーゼであり得、前記容器１２０は、前記シグナルの生成により検出され得る発光反応を引き起こす、開始させる及び／又は触媒するように形成されたアルデヒド試薬を含有するように構成され得る。一実施形態では、容器１２０のキャップは、システム１００の機器による作動（例えば、ブリスターからの押し出し）を介して形質導入された試料と混合される前記活性化試薬（例えば、ブリスター内に含有）を含み得る。
【００５３】
様々な実施形態では、前記活性化試薬は、全ての炭素鎖長の異なるアルデヒドを含む、炭素６のアルデヒド炭素（ヘキサナール）、炭素１３のアルデヒド炭素（トリデカナール）及び／又は炭素１４のアルデヒド炭素（テトラデカナール）を含み得る。いくつかの実施形態では、前記容器１２０は、前記試料Ｓに配置される前に試料Ｓからの流動的単離において前記活性化試薬を維持するように構成され得る。このように、前記活性化試薬を前記試料Ｓへ送達するタイミングをコントロール可能である。いくつかの実施形態では、前記システム１００は、前記活性化試薬を、任意の適切な時間で及び／又は任意の適切な方法で添加し、検出可能なシグナルを誘導するためのメカニズムを含み得る。例えば、本明細書に詳細に記載されるように、いくつかの実施形態では、前記システム１００及び／又は前記容器１２０は、所望の混合レベルを促進するために、活性化試薬を所定の速度（又は流量）で前記試料Ｓに搬送するためのメカニズムを含み得る。
【００５４】
前記機器１４０は、前記レポーター分子１３０及び／又は前記レポーター分子１３０に触媒される反応を検出するための任意の適切な機器であり得る。例えば、前記機器１４０は、光学的（例えば、光電子増倍管、蛍光光度計、分光光度計、ラテラルフローアッセイによる比色検出、イメージングに基づいた検出、ＣＣＤ、バイオ発光を検出するための発光検出器、比色又は蛍光マイクロアレイ）及び／又は電気的検出手段（例えば、電気化学電流測定、電位差測定、導電率測定、インピーダンス測定、電量分析、及び／又は他の電気化学センサー）を含み得る。
【００５５】
機器１４０は、測定データを解析するプロセッサ１５０に接続される。この接続は、有線又は無線であり得る。無線接続の例として、機器１４０において取り外し可能なデータ記憶装置は、前記測定データを記憶可能であり、前記記憶装置は、コンピュータシステム１５０に対し取り外し及び挿入可能である。
【００５６】
いくつかの実施形態では、前記システム１００及び／又は関連する方法は、前記標的細胞の如何なる増幅も必要としない迅速試験用に構成され得る。前記システム１００及び本明細書に記載の方法を用いて、検出可能なレポーター分子１３０の充分量を生成するために、前記形質導入粒子１１０由来の前記核酸配列を前記標的細胞が含有するために必要な時間は、比較的短時間、例えば、１時間、２時間、３時間又は４時間、最大１８時間であり得る。いくつかの実施形態では、前記システム１００は、試料Ｓの収集及び／又は形質導入粒子１１０の添加後に閉鎖系となるように構成され得る。具体的な実施形態では、前記試料Ｓの添加後の外部環境からの流動的単離において、前記容器は維持される。これにより、例えば、汚染の機会を減らせる。上述のように、前記システム１００は未加工試料を収容し得るので、前記システム１００及び関連する法は、如何なる洗浄又は試料Ｓからの流体移動工程を必要としない。よって、前記システム１００は、操作が簡単、迅速、安価、自動化が容易であり得る。いくつかの実施形態では、前記システム１００は、例えば、生細胞の報告、遺伝子の報告、細菌耐性及び／又は抗生物質感受性の測定及び／又は細菌毒素検出等の様々な方法を実施するように構成され得るプラットフォームシステムであり得る。
【００５７】
実施形態は、フラッシュタイプの反応を包含し、グローシグナルが認められる後期領域をも包含し得る。発光アッセイは、様々なタイプであり得る。発光アッセイは、基質（活性化試薬）を用いる化学又は酵素反応である。前記レポーター分子が細菌ルシフェラーゼ（ＬｕｘＡＢ）である場合、基質は、脂肪アルデヒド（例えば、トリデカナール）であり得る。基質が前記化学又は酵素反応において機能する場合、副産物として光が放出される。発光反応の主な二つのタイプは、フラッシュタイプ及びグロータイプである。フラッシュ発光反応は、例えば、秒単位、分単位で素早く生じ得、非常に明るいシグナルが放出される。グロー発光アッセイは何時間も続くことがあり得るが、通常はフラッシュ発光アッセイほど明るくはない。
【００５８】
上述のように、活性化試薬が、検査対象又は検査対象から生成された分子（例えば、形質導入粒子に対応して細菌により生じたレポーター分子）を活性化すると、フラッシュシグナルが試料により生成され得る。しかし、フラッシュシグナルは、前記標的検査対象と同様にその他の類似の検査対象により生成され得る。例えば、フラッシュシグナルは、ＭＳＳＡ及びＭＲＳＡに対して生成される。これは、前記標的検査対象に対して前記試料を陽性又は陰性として分類する判別分析において問題を生じる。
【００５９】
図２に、フラッシュアンドグロー反応に供した試料それぞれからのＭＲＳＡシグナル及びＭＳＳＡシグナルの代表的なプロット２００を示す。横軸は時間に対応している。縦軸は検出器（例えば、ＰＭＴ）で測定された信号強度に対応している。測定データは、ベースライン測定（活性化試薬添加前に収集したデータ）及び基質測定（活性化試薬添加後に収集したシグナルデータ）を含む。そのようなシグナルは、ＭＲＳＡ以外の他の検査対象となる可能性がある。
【００６０】
示された２つのシグナルは、異なる最大値（ＭＳＳＡでは約４００及びＭＲＳＡでは約１０５０）を有するが、これら最大値は非常に近似し得る。いくつかのＭＳＳＡ試料は、いくつかのＭＲＳＡ試料の最大値よりも高い最大シグナル値（ピーク）さえ有し得る。陽性シグナルは、非常に低いピークから高いピークまでの幅広い範囲のピークを有し得る。同様のシグナルのこのノイズは、陽性及び陰性試料の区別における問題を引き起こす可能性がある。よって、単に最大値を使用することは、例えば、以下に示すように、所望の感度及び特異性未満の偽陽性が多過ぎることになる。さらに、前記ピークは様々なタイムポイントで生じ得る。追加的データ解析無しでの代表的な陽性及び陰性曲線例を図３Ａ〜図３Ｐに示す。
【００６１】
これらの問題に対処するために、実施形態では、前記シグナルデータの動態の範囲を分析するために、単一の値だけでなく、時間経過に伴う複数のシグナル値を使用可能である。実施形態では、陽性及び陰性試料を区別する方法として、そのピークの周りのシグナルの曲率を分析することも可能である。そのような手法は、所望の感度及び特異性を提供するために互いに非常に近い信号を区別することに集中することができる。そのような近いデータについてここで検討する。
【００６２】
図４Ａ〜図４Ｃは、本明細書に記載の前記方法の一つの実施形態について説明する。まず、上述のように、１又は複数の標的細胞を含むと思われる試料を、前記１又は複数の標的細胞に結合可能な複数の形質導入粒子と混合する（４１０）。前記複数の形質導入粒子は、以下の特性を有する：（ｉ）前記粒子は、前記１又は複数の標的細胞に複数のレポーター分子を生成させるように形成された核酸分子を含むように改変されている；（ｉｉ）前記粒子は、前記核酸分子に結合して前記１又は複数の標的細胞へ送達するように形成されている；及び（ｉｉｉ）前記粒子は、非複製である。前記第一の工程で形成される混合物は、前記標的細胞が前記試料中に存在する場合、前記複数のレポーター分子を発現するために充分な条件下で、維持される（４２０）。前記レポーター分子は、例えば、発光シグナルの放出を介して検出可能なシグナルを生成する（４３０）。各データ点は、前記試料中の前記１又は複数の標的細胞の存在を示すレポーター分子の量と関連する。前記生成されたシグナルは、１又は複数のデータ解析工程（４４０）に供され、前記データセットはその後、前記試料が前記１又は複数の標的細胞を含むかを決定するために用いられる（４５０）。
【００６３】
前記１又は複数のシグナル解析工程をさらに詳細に図４Ｂに説明する。前記複数のレポーター分子によって生成された検出可能なシグナルは、シグナル強度を経時的にプロットした第一の曲線を生成する（４３４）ために用いられる、１又は複数のシグナルデータ点のセットとしてプロセッサに受領される（４３２）。前記第一の曲線は、曲線解析パラメータのセットを計算することにより解析され（４３６）、１又は複数の前記パラメータを、前記試料中の前記１又は複数の標的細胞の存在を反映する前記陽性シグナルデータ点を反映するために用いる（４３８）。
【００６４】
様々な曲線解析パラメータを計算して、陽性シグナルデータ点を同定するために用いることができる。例えば、前記曲線解析パラメータは、限定されるものではないが、以下に挙げる１又は複数を含む：
【００６５】
（ａ）曲線下面積（ＡＵＣ）
ＡＵＣは、曲線下の総面積として定義され、例えば、台形として前記曲線の下の領域を近似してその面積を計算する台形公式を用いて決定され得る。ＡＵＣを計算するための他の方法が当該技術分野において知られており、それらには、限定されるものではないが、以下に記載されるようなシンプソンの公式が含まれる：ｈｔｔｐ：／／ｍａｔｈｗｏｒｌｄ．ｗｏｌｆｒａｍ．ｃｏｍ／ＳｉｍｐｓｏｎｓＲｕｌｅ．ｈｔｍｌ．  Ｓｅｅ  ａｌｓｏ，  Ａｂｒａｍｏｗｉｔｚ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｓ．）．  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｆｏｒｍｕｌａｓ，  Ｇｒａｐｈｓ，  ａｎｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  Ｔａｂｌｅｓ，  ９ｔｈ  ｐｒｉｎｔｉｎｇ．  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｄｏｖｅｒ，  ｐ．  ８８６，  １９７２；Ｈｏｒｗｉｔｚ，  Ａ．  “Ａ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｉｍｐｓｏｎ’ｓ  Ｒｕｌｅ  ｆｏｒ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｉｎｔｅｇｒａｌｓ．”  Ｊ．  Ｃｏｍｐｕｔ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．  １３４，  １−１１，  ２００１。
【００６６】
（ｂ）ピーク下面積（Ａ２）
理想的な状況下では、フラッシュアンドグローアッセイは、定義された時間で強度が急激に指数関数的に増加し、続いてゆっくりとした指数関数的減衰となる発光応答（陽性の場合）を生成する。これは、例えば、図２において説明される。Ａ２は、所定のタイムインターバル内の、ピーク下の領域として定義される。前記タイムインターバルは、一定又は可変であり得る。例えば、前記タイムインターバルは、−０．１０秒〜７．０秒、特に２．０秒〜６．５秒、２．０秒〜４．０秒、より好ましくは２．７５秒〜３．２５秒の範囲で一定であり得る。前記タイムインターバルは、５．０秒〜７．０秒、例えば、５．２５秒〜６．２５秒の範囲で一定とすることも可能である。別法としては、前記タイムインターバルは可変であり得、例えば、−０．２５秒＜選択されたピーク時間（秒）＜＋２．００秒又は−０．２５秒＜選択されたピーク時間（秒）＜＋１．００秒であり得る。
【００６７】
（ｃ）全体の最大強度（ｇｌｏｂａｌｍａｘＲＬＵ）
ＧｌｏｂａｌｍａｘＲＬＵは、全タイムポイントにおける最大発光シグナルである。ＲＬＵは、未加工データに基づく相対的発光シグナルであり、ｎＲＬＵは、前記シグナルを異常値の検出及び除去に使用されるＨａｍｐｅｌフィルターを通過した後の未加工シグナルである。
【００６８】
（ｄ）相対変動（Ｒｖａｒ）
Ｒｖａｒは、隣接するシグナル間の絶対値の差の合計を信号全体の最大発光で割った値である。大きなＲｖａｒは、ノイズの増加を示す。このパラメータは、前記シグナル内のノイズの１つの表現である。数学的には、Ｒｖａｒ＝ｓｕｍ（｜ＲＬＵ（ｎ＋１）−ＲＬＵ（ｎ）｜）／ｇｌｏｂａｌｍａｘＲＬＵであり、ＲＬＵは、相対的発光シグナルであり、ＲＬＵ（ｎ）は、タイムポイントｎにおけるＲＬＵである。
【００６９】
（ｅ）シグナル対ノイズ比（Ｓ２Ｎ）
Ｓ２Ｎは、ピーク領域内の最大発光シグナルをピーク領域外の発光シグナルの標準偏差で割ったものである。数学的には、Ｓ２Ｎは、ｐｅａｋ＿ｒｅｇｉｏｎ＿ｇｌｏｂａｌｍａｘＲＬＵ／ｓｔｄｅｖ（ピーク領域外のＲＬＵ）であり、ｐｅａｋ＿ｒｅｇｉｏｎ＿ｇｌｏｂａｌｍａｘＲＬＵは、前記第一の曲線のピーク領域に対応するタイムインターバルであり、ｓｔｄｅｖ（ピーク領域外のＲＬＵ）は、ｐｅａｋ＿ｒｅｇｉｏｎ＿ｇｌｏｂａｌｍａｘＲＬＵ前後のタイムインターバルである。
【００７０】
（ｆ）変動係数（ＣＶ）
ＣＶは、ピーク領域外の発光シグナルの標準偏差をピーク内の平均発光シグナルで割ったものである。ＣＶは、前記シグナルにおけるノイズの別の表現である。大きなＣＶは、ノイズの増加を示す。ＣＶ＝ｓｔｄｅｖ（ピーク領域外のＲＬＵ）／ｍｅａｎ（ＲＬＵピーク領域）であり、ＲＬＵは、相対的発光シグナルであり、ピーク領域外のＲＬＵは、前記ピーク領域外の相対的発光シグナルであり、ＲＬＵピーク領域は、前記ピーク領域における相対的発光シグナルである。
【００７１】
（ｇ）スパイク検出
ピーク領域におけるスパイクの存在と実際のシグナルを区別することが重要である。ｔｍがスパイクの時間であれば、スパイクは、隣接する左側又は右側のいずれかで発光シグナルがゼロに等しいと定義され、他方の隣接側は、ピークに対して発光シグナルが９０％低下するか、又はその後のタイムポイントでピークに対して発光シグナルが９５％低下する。数学的には、
・ＲＬＵ［ｔｍ−１］＝０及び（ＲＬＵ［ｔｍ＋１］≦（０．０１−０．４）＊ＲＬＵ［ｔｍ］又はＲＬＵ［ｔｍ＋２］≦（０．００１−０．３）＊ＲＬＵ［ｔｍ］）、
・ＲＬＵ［ｔｍ＋１］＝０及び（ＲＬＵ［ｔｍ−１］≦（０．１）＊ＲＬＵ［ｔｍ］又はＲＬＵ［ｔｍ−２］≦（０．００１−０．３）＊ＲＬＵ［ｔｍ］）、
・ＲＬＵ［ｔｍ−１］＝０及び（ＲＬＵ［ｔｍ＋１］≦（０．０１−０．４）＊ＲＬＵ［ｔｍ］又はＲＬＵ［ｔｍ＋２］≦（０．０５）＊ＲＬＵ［ｔｍ］）、又は
・ＲＬＵ［ｔｍ＋１］＝０及び（ＲＬＵ［ｔｍ−１］≦（０．１）＊ＲＬＵ［ｔｍ］又はＲＬＵ［ｔｍ−２］≦（０．０５）＊ＲＬＵ［ｔｍ］）。
ＲＬＵは、相対的発光シグナルであり、ｔｍは、前記第一の曲線におけるスパイクに対応する時間であり、＊ＲＬＵ［ｔｍ］は、前記スパイクの相対的発光シグナルである。
【００７２】
（ｈ）ピーク位置
陽性のピークと見なされるためには、ピークは一定のタイムポイントセット内に配置される必要がある。前記ピークがこの領域外であると、陰性のピークと見なされる。一実施形態では、前記一定のセットは、２．７５秒〜３．２５秒を含む。代替となる実施形態では、前記一定のセットは、５．２５秒〜６．２５秒を含む。しかしながら、当業者は、オペレーターの特定の必要性及び試料が分析されるシステムの仕様に基づいてタイムポイントのセットを経験的に決定可能であることを容易に理解するであろう。
【００７３】
（ｉ）指数関数的なスロープ（ｅＳｌｏｐｅ）
ピークが許容ピーク範囲内にあると仮定すると、発光シグナルは、典型的には、以下の式に従って指数関数的に減衰する。
【００７４】
Ａ＊Ｅｘｐ［−Ｂ＊（ｔ−ｔｍａｘ）］であり、前記ピークの時間であり、Ｂは、ｅＳｌｏｐｅである。
【００７５】
ｅＳｌｏｐｅが所定の閾値を超えると、前記曲線は陰性と見なされる。
【００７６】
（ｊ）面積比（Ａ２Ａ；Ａ２／ＡＵＣ）
Ａ２及びＡＵＣが面積比、すなわちＡ２／ＡＵＣとして使用されるので、マシーン・ツー・マシーンの変動が最小になる。
【００７７】
（ｋ）相対面積（ｒＡｒｅａ）
面積比（ｊ）の計算に加えて又は計算の代わりに、相対面積は、曲線の陽性／陰性の決定に有用である。相対面積＝ｇｌｏｂａｌｍａｘＲＬＵ／ＡＵＣは、無次元であるため、マシーン・ツー・マシーンの変動は最小限に抑えられる。具体的な実施形態では、ピーク領域におけるｒＡｒｅａ＝Ａ２／ｍａｘＳｉｇｎａｌである。
【００７８】
（ｌ）ＤｅｌｔａＡ２Ａ
Ａ２Ａ対Ｒｖａｒプロットから閾値線Ａ２ＡＩｎｔ＋Ｒｖａｒ＊Ａ２ＡＳｌｐを差し引いた点である。
【００７９】
（ｎ）ＭａｘＳｉｇｎａｌ（最大シグナル）
ピーク領域の最大シグナル（インターバル２）である。
【００８０】
（ｏ）質量中心（ＣＭ）質量中心：ＣＭ＝ｓｕｍ（ＲＬＵ（ｔ）×ｔ）／ｓｕｍ（ＲＬＵ（ｔ））
ＤｅｌｔａＡ２Ａ対ＣＭのプロットは、ＣＭ閾値の決定に用いられ、ＣＭ＞ＣＭＭａｘ、ＭａｘＳｉｇｎａｌ＞ｍｉｎＲＬＵＺ及びＴｅｓｔ  ０の曲線は、無効とされる。
【００８１】
図４Ｃに示すように、曲線解析パラメータが決定されると（４３６）、前記曲線は、面積比とＲｖａｒを比較し、直線閾値を適用して（４４１）陽性のシグナルデータ点を同定する（４３８）ことによってさらに評価される。また若しくは代替的に、データは、陽性のシグナルデータ点を使用して第二の曲線を生成し（４４２）、前記第二の曲線についてｒＡｒｅａとＣＶとを比較し（４４３）、陽性のシグナルデータ点の修正セットを生成する（４４４）ことによってさらに評価できる。追加的に又は代替的に、データは、前記陽性シグナルデータ点を使用して第二の曲線を生成し、前記第二の曲線についてｒＡｒｅａとＳ２Ｎを比較し、陽性のシグナルデータ点の修正セットを生成することによっても評価できる。
【００８２】
以下の実施例に説明するように、本明細書に記載の方法を使用して、高い感度と特異性で陽性試料を検出できる。特に、データを解析することにより、すなわち、シグナルデータ点に基づいて曲線を生成し、曲線に基づいてアッセイ曲線パラメータを計算し、適切な閾値に対して前記曲線パラメータを比較することにより、従来の方法を用いて達成可能なものよりも高い程度の感度及び特異性で、試料中の１又は複数の標的細胞の存在を同定することができる。
【００８３】
本明細書に記載の方法は、図１に記載及び説明されるように、プロセッサを含むコンピュータシステムに動作可能に接続されているシステムにより実施可能である。コンピュータシステムは、デスクトップ及びラップトップコンピュータ、タブレット、携帯電話、その他のモバイル機器を含み得る。図９に説明するように、コンピュータシステムは、システムバス７５を介して相互接続された１又は複数のサブシステムを含み得る。ディスプレイアダプタ８２に接続されているプリンタ７４、キーボード７８、記憶装置７９、モニタ７６及びその他などの追加的サブシステムを示す。Ｉ／Ｏコントローラ７１に接続する周辺機器及び入力／出力（Ｉ／Ｏ）装置は、入力／出力（Ｉ／Ｏ）ポート７７（例えば、ＵＳＢ、ＦｉｒｅＷｉｒｅ（登録商標））などの当該技術分野で公知の任意の数の手段によってコンピュータシステムに接続することができる。例えば、Ｉ／Ｏポート７７又は外部インターフェース８１（例えば、イーサネット、Ｗｉ−Ｆｉ等）を用いて、コンピュータシステム１０を、インターネット等の広範囲のネットワーク、マウス入力装置又はスキャナーに接続できる。前記システムバス７５を介した相互接続により、中央処理装置７３が各サブシステムと通信し、サブシステム間の情報交換と同様に、システムメモリ７２又は記憶装置７９（例えば、ハードドライブなどの固定ディスク又は光ディスク）からの命令の実行を制御することを可能にする。前記システムメモリ７２及び／又は前記記憶装置７９をまとめてコンピュータ可読媒体としてもよい。別のサブシステムは、カメラ、マイクロフォン、加速度計及び同種のものなどのデータ収集装置８５である。本明細書に記載のデータは何れも、１つの構成要素から別の構成要素へ出力可能であり、ユーザーに対して出力できる。
【００８４】
コンピュータシステムは、例えば、外部インターフェース８１又は内部インターフェースによって互いに接続された複数の同じ構成要素又はサブシステムを含み得る。いくつかの実施形態では、コンピュータシステム、サブシステム又は装置はネットワークを介して通信可能である。そのような場合、１つのコンピュータをクライアントと見なし、別のコンピュータをサーバーと見なし、それぞれが同じコンピュータシステムの一部とすることができる。クライアントとサーバーはそれぞれ、複数のシステム、サブシステム又は又は構成要素を含むことができる。
【００８５】
本発明の実施形態のいずれも、ハードウェア（例えば、特定用途向け集積回路又はフィールドプログラマブルゲートアレイ）を使用すること及び／又は一般的にプログラム可能なプロセッサを備えたコンピュータソフトウェアをモジュール方式又は統合方式で使用することによって、制御ロジックの形で実施できることを理解されたい。本明細書で使用される場合、プロセッサは、シングルコアプロセッサ、同じ統合チップ上のマルチコアプロセッサ、又は単一の回路基板上の若しくはネットワーク化された複数の処理ユニットを含む。本明細書の開示及び教示に基づいて、当業者は、ハードウェア及びハードウェアとソフトウェアの組み合わせを使用して本発明の実施形態を実施するための他の方法及び／又は方法を知り、理解するであろう。
【００８６】
本願に記載のソフトウェアコンポーネント又は機能のいずれも、例えば、Ｊａｖａ、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｃ＃、Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ−Ｃ、Ｓｗｉｆｔ又はＰｅｒｌやＰｙｔｈｏｎ等のスクリプト言語等の任意の適切なコンピュータ言語を使用して、例えば、従来の又はオブジェクト指向の技術を用いて、プロセッサによって実行されるソフトウェアコードとして実装され得る。前記ソフトウェアコードは、記憶及び／又は送信のためにコンピュータ可読媒体上に一連の命令又はコマンドとして記憶してもよい。適切な非一過性のコンピュータ可読媒体は、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、読み取り専用メモリ（ＲＯＭ）、ハードドライブやフロッピーディスク等の磁気媒体又はコンパクトディスク（ＣＤ）やＤＶＤ（デジタル多用途ディスク）等の光媒体、フラッシュメモリ及び同種のものを含み得る。前記コンピュータ可読媒体は、そのような記憶装置又は伝送装置の任意の組み合わせとしてもよい。
【００８７】
そのようなプログラムはまた、インターネットを含む様々なプロトコルに準拠する有線、光学、及び／又は無線ネットワークを介した送信に適した搬送波信号を使用して符号化及び送信してもよい。したがって、本発明の実施形態によるコンピュータ可読媒体は、そのようなプログラムで符号化されたデータシグナルを使用して作成され得る。プログラムコードで符号化されたコンピュータ可読媒体は、互換性のある装置と一緒にパッケージされるか、他の装置とは別に（例えば、インターネットダウンロードを介して）提供され得る。任意のそのようなコンピュータ可読媒体は、単一のコンピュータ製品（例えば、ハードドライブ、ＣＤ又はコンピュータシステム全体）上又は中に存在してもよく、システム又はネットワーク内の異なるコンピュータ製品上又は中に存在してもよい。コンピュータシステムは、本明細書に記載の結果のうちのいずれかをユーザーに提供するためのモニタ、プリンタ又は他の適切なディスプレイを含み得る。
【００８８】
本明細書に記載の方法の何れも、工程を実行するように構成することができる１又は複数のプロセッサを含むコンピュータシステムを使用して全体的又は部分的に実行してもよい。よって、実施形態は、潜在的に異なる構成要素がそれぞれの工程又はそれぞれの工程のグループを実行することで、本明細書に記載される方法のうちの何れかの工程を実行するように構成されたコンピュータシステムを対象とし得る。番号付けされた工程として提示されているが、本明細書における方法の工程は同時に又は異なる順序で実行可能である。さらに、これらの工程の一部は他の方法からの他の工程の一部と共に使用されてもよい。また、工程の全部又は一部は任意選択であり得る。さらに、前記方法の何れかの任意の工程は、モジュール、ユニット、回路又はこれらの工程を実行するための他の手段を用いて実行することができる。
【００８９】
特定の実施形態の特定な詳細は、本発明の実施形態の精神及び範囲から逸脱することなく、任意の適切な方法で組み合わせてもよい。しかしながら、本発明の他の実施形態は、各個々の態様に関する特定の実施形態、又はこれらの個々の態様の特定の組み合わせを対象としてもよい。
【００９０】
本発明の例示的な実施形態の上記の説明は、例示及び説明を目的として提示されている。それは、網羅的であること又は記載された詳細な形態に本発明を限定することを意図するものではなく、上記の教示に照らして多くの改変及び変形が可能である。
【実施例】
【００９１】
実施例１
ＳｐｅｃｔｒｏＭａｘ機器によりＣＲＥを検出する方法
米国特許第９，４８１，９０３号明細書に記載のプロトコルを使用して１又は複数のＣＲＥ標的細胞を含む試料をＳｐｅｃｔｒｏＭａｘ機器で分析した。簡単に説明すると、前記試料を容器内で複数の形質導入粒子と混合し、内容物を少なくとも２時間室温以上の温度に維持した。これらの条件は、測定可能なシグナルを生成するための量のレポーター分子を生成するのに充分であった。測定可能なシグナルを、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｌ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，  ＬＬＣ．、サニーベール、カリフォルニア、９４０８９）で検出した。
【００９２】
本明細書で同定された曲線解析パラメータを、前記機器に動作可能に接続されているプロセッサを用いて計算した。図５に、ｙ軸上の面積比対ｘ軸上のＲｖａｒのプロットを示す。陽性と注釈された点は黒丸で、陰性と注釈された点は白四角で示され、黒線（傾きと切片を含む）は陽性と陰性のシグナルを区切る。図５に示すように、陽性領域に（陰性）データがあるが、これらのデータは３つの異なる基準によって陰性とされた：（ａ）白丸を用いて識別されたデータ点は、スパイクの存在のために陰性とされた；（ｂ）白菱形を使用して識別されたデータ点は、ピークが許容範囲外であるため、陰性とされた；及び（ｃ）Ｓで識別されたデータは、ｅＳｌｏｐｅが閾値を超えたため、陰性とされた。
【００９３】
図６は、閾値線（ｙ軸）からの距離対ｅＳｌｏｐｅ（ｘ軸）のプロットである。図中、ｅＳｌｏｐｅの閾値０．１１を用いて、この値よりも大きい点を陰性とした。曲線コール結果と注釈付き結果との比較を表１に示す。
【００９４】
【表１】
2020504605.tif 000009
【００９５】
実施例２
ＶｉｖｏＤｘ機器を用いてＣＲＥを検出する方法
実施例１に記載した方法を用いて試料を調製しアッセイを実施したが、アッセイはＶｉｖｏＤｘ機器で行った（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．、プレザントン、カリフォルニア、９４５８８）。図７、面積比対Ｒｖａｒのプロットを示す。閾値線（中等度陽性）より上のデータを分析した。結果を図８に示す。相対面積（ｙ軸）をＣＶ（ｘ軸）に対してプロットした。中等度陽性であるデータの第２の分割は、修正された陽性対陰性曲線コールを生成するために使用された。表２は、これらのデータの相関を示す。面積比対Ｒｖａｒ（図７）のみを用いたところ、偽陰性はなく、２つの偽陽性が認められた。しかしならが、相対面積対ＣＶを用いたところ、注釈と曲線コールの間に完全な一致が認められた。
【００９６】
【表２】
2020504605.tif 000010
【００９７】
実施例３
ＶｉｖｏＤｘ機器を用いてＣＲＥを検出する代替方法
実施例１に記載した方法を用いて試料を調製しアッセイを実施したが、アッセイは代替のアルゴリズムを用いてＶｉｖｏＤｘ機器で行った。前記方法において、発光シグナルの２つの異なる値を用いた：ＲＬＵ（未加工シグナル）及びｎＲＬＵ（異常値を検出して除去するために使用されたＨａｍｐｅｌフィルターを通過した後の未加工シグナル）。以下のパラメータを除いて、全ての計算でｎＲＬＵを使用した：Ｒｖａｒ（相対的変動）及びＣＭ（質量中心）。
【００９８】
図１０に示すように、３つのタイムインターバルを、前記代替となるアルゴリズムの内部計算に使用した。これらは、図１０において、インターバル１（Ｉｎｔｅｒｖａｌ＿１）、インターバル２（Ｉｎｔｅｒｖａｌ＿２）及びインターバル３（Ｉｎｔｅｒｖａｌ＿３）と標識される。インターバル２及び３は、相対的であり、最大ピークに関連する時間に依存する。インターバル１は、０から終了時刻（ＥｎｄＴｉｍｅ）までのすべての時間のセットとして定義される。インターバル２は、以下の条件に基づいて定義される：（ａ）ｎＲＬＵの最大値が、ｔＭｉｎからｔＮｏｉｓｅのタイムインターバル間にある場合、ｔＰｅａｋは、最大値の配列数、すなわち、Ｉｎｔｅｒｖａｌ＿２＝（ｔＰｅａｋ−１：ｔＰｅａｋ＋３）；又は（ｂ）ｎＲＬＵの最大値が、ｔＭｉｎからｔＮｏｉｓｅのタイムインターバル外にある場合、Ｉｎｔｅｒｖａｌ＿２＝（ｔＭｉｎ／０．２５＋１：ｔＭａｘ／０．２５＋１）。インターバル３は、以下の条件に基づいて定義される：（ａ）ｎＲＬＵの最大値が、ｔＭｉｎからｔＮｏｉｓｅのタイムインターバル間にある場合、ｔＰｅａｋは、最大値の配列数であり、Ｉｎｔｅｒｖａｌ＿３＝（１：ｔＰｅａｋ−２及びｔＰｅａｋ＋６：ＥｎｄＴｉｍｅ／０．２５＋１）；又は（ｂ）ｎＲＬＵの最大値が、ｔＭｉｎからｔＮｏｉｓｅのタイムインターバル外にある場合、Ｉｎｔｅｒｖａｌ＿３＝（１：ｔＭｉｎ／０．２５及びｔＮｏｉｓｅ／０．２５＋２：ＥｎｄＴｉｍｅ／０．２５＋１）。
【００９９】
前記代替アルゴリズムは、所定の発光曲線が陽性か陰性かを決定する、スパイクカーブを陰性に設定する、間違ったインターバルにおいて最大シグナルを持つ曲線を陰性として設定する、閾値より大きい質量中心を持つ曲線を無効として設定する、及び注釈付きデータの初期セットによって閾値パラメータ値を決定するために用いられた。以下の表は、代替メソッドの入力パラメータ及び出力パラメータそれぞれ示す。
【０１００】
【表３】
2020504605.tif 000011
【０１０１】
スパイク試験を用いて、ＭａｘＳｉｇｎａｌが実際のピークであるのかスパイクであるのかを確認した。スパイクは、ＭａｘＳｉｇｎａｌの片側のベースライン以下の発光（ＲＬＵ）値を持つと定義されるが、反対側の最初の点が（ｓｐｉｋｅ×ＭａｘＳｉｇｎａｌ）より小さい値であるか、又はＭａｘＳｉｇｎａｌの反対側の２番目の点が（ｓｐｉｋｅ／２×ＭａｘＳｉｇｎａｌ）より小さい値である。ｎＲＬＵはスパイク試験に使用される。ｔＭＳはＭａｘＳｉｇｎａｌに関連付けられているタイムインデックスである。ベースラインは以下のように定義される：ｍｖ＝中央値（ｎＲＬＵ［０〜５秒］）、ｓｄ＝標準偏差（ｎＲＬＵ［０〜５秒］）、ベースライン＝ｍｖ＋３＊ｓｄ。
【０１０２】
右スパイク試験：
ＲＬＵ（ｔＭＳ−１）＜＝Ｂａｓｅｌｉｎｅ  ＡＮＤ  ｛［ＲＬＵ（ｔＭＳ＋１）＜ｓｐｉｋｅ＊ＭａｘＳｉｇｎａｌ］  ＯＲ  ［ＲＬＵ（ｔＭＳ＋２）＜ｓｐｉｋｅ／２＊ＭａｘＳｉｇｎａｌ］｝。
【０１０３】
左スパイク試験：
ＲＬＵ（ｔＭＳ＋１）＜＝Ｂａｓｅｌｉｎｅ  ＡＮＤ  ｛［ＲＬＵ（ｔＭＳ−１）＜ｓｐｉｋｅ＊ＭａｘＳｉｇｎａｌ］  ＯＲ  ［ＲＬＵ（ｔＭＳ−２）＜ｓｐｉｋｅ／２＊ＭａｘＳｉｇｎａｌ］｝。
【０１０４】
ＭａｘＳｉｇｎａｌが有効であるかどうかを指定するためにｚＴｅｓｔを使用した。ｚＴｅｓｔの取り得る値は、ＭａｘＳｉｇｎａｌが有効（［ｔＭｉｎ：ｔＮｏｉｓｅ］の範囲においてスパイクではなくｇｌｏｂａｌ＿ｍａｘｉｍｕｍ）であれば、ｚＴｅｓｔ＝１、ＭａｘＳｉｇｎａｌがスパイクであれば、ｚＴｅｓｔ＝０、ＭａｘＳｉｇｎａｌが［ｔＭｉｎ：ｔＮｏｉｓｅ］の範囲外であれば、ｚＴｅｓｔ＝−１である。
【０１０５】
結果＿１は、代替方法を用いた陽性又は陰性何れかの曲線コールであり、図１１に示されている。図１１に、Ａ２／Ａ対Ｒｖａｒのプロットを示す。陽性点を黒丸で示し、陰性点を白四角で示し、スパイクを白丸で示し、ｔＭｉｎからｔＮｏｉｓｅの範囲外のピークを白菱形で示す。Ｘは、ＭａｘＲＬＵ＜ｍｉｎＲＬＵの曲線を示し、図１１の中心を通る黒線は、Ａ２ＡＩｎｔ＋Ｒｖａｒ＊Ａ２ＡＳｌｐのプロットである。この線より上の黒点は、陽性及びこの線より下の黒点は陰性である。
【０１０６】
結果＿２は、陽性又は陰性何れかの曲線コールであり、図１２に示されている。ＤｅｌｔａＡ２Ａ＞０である図１１のデータ点を、図１２にプロットした。図１２の軸線は、ｒＡｒｅａ対Ｓ２Ｎである。図１２では、結果＿１を使用したものに比べて曲線コールの改善が示された。図１２の閾値線は、ｒＡｒｅａＩｎｔ＋Ｓ２Ｎ＊ｒＡｒｅａＳｌｐのプロットであり、この線より上のデータ点は陽性及びこの線より下のデータ点は陰性である。
【０１０７】
図１３に示すように、ＤｅｌｔａＡ２Ａ対ＣＭプロットを用いて質量中心（ＣＭ）閾値を決定した。ＤｅｌｔａＡ２Ａは、図１１におけるＡ２Ａ対Ｒｖａｒプロット上の点から閾値線Ａ２ＡＩｎｔ＋Ｒｖａｒ＊Ａ２ＡＳｌｐを差し引いたものと定義される。ＣＭ＞ＣＭＭａｘ、ＭａｘＳｉｇｎａｌ＞ｍｉｎＲＬＵ及びｚＴｅｓｔ  ０である曲線は、無効とされる。
【０１０８】
前記代替となる方法では、ｒＡｒｅａＩｎｔ＋Ｓ２Ｎ＊ｒＡｒｅａＳｌｐに定義される線より上にある場合、曲線コールは陽性であった（図１２）。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ−３Ｆ】
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【図３Ｇ−３Ｌ】
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【図３Ｍ−３Ｐ】
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【図４Ａ−４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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