(57)【要約】  本発明は、２個以上のペプチドループが足場への付着点の間に内在されるように分子足場に共有結合しているポリペプチドに関する。特に、本発明は、ＣＤ１３７の高親和性結合剤であるペプチドを記載する。本発明はまた、１個または複数のエフェクターおよび／または官能基にコンジュゲートされた、前記ペプチドを含む薬物コンジュゲート、前記ペプチドリガンドおよび薬物コンジュゲートを含む医薬組成物、ならびにＣＤ１３７によって媒介される疾患または障害の予防、抑制または処置における、前記ペプチドリガンドおよび薬物コンジュゲートの使用を含む。
2020529427.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２個のポリペプチドループが分子足場上で形成されるように、少なくとも２個のループ配列によって隔てられている少なくとも３個の反応性基と、前記ポリペプチドの前記反応性基との共有結合を形成する分子足場とを含むポリペプチドを含む、ＣＤ１３７に対して特異的なペプチドリガンド。
【請求項２】
前記反応性基は、システイン残基またはペニシラミンを含む、請求項１に記載のペプチドリガンド。
【請求項３】
前記ループ配列は、５個または６個のアミノ酸、例えば６個のアミノ酸を含む、請求項１または２に記載のペプチドリガンド。
【請求項４】
Ｃｉ−Ｉ−Ｅ−Ｅ−Ｇ−Ｑ−Ｙ−Ｃｉｉ−Ｘ１−Ｘ２−Ｄ−Ｘ３−Ｙ／Ｑ／Ｍ−Ｘ４−Ｃｉｉｉ（配列番号２０）；
Ｃｉ−Ｄ−Ｉ−Ｇ−Ｐ−Ｐ−Ｙ−Ｃｉｉ−Ｙ−Ｒ／Ａ−Ｄ−Ｍ／Ｐ−Ｙ−Ｍ−Ｃｉｉｉ（配列番号２１）；
Ｃｉ−Ｄ−Ｅ−Ｗ−Ｇ−Ｌ−Ｆ／Ｙ−Ｃｉｉ−Ｉ／Ｆ−Ｐ／Ａ−Ｈ−Ｓ／Ｐ−Ｄ−Ｃｉｉｉ（配列番号２２）；および
ＣｉＩＥＰＧＰＦＣｉｉＹＡＤＰＹＭＣｉｉｉ（配列番号１９）；
（式中、Ｘ１〜Ｘ４は、任意のアミノ酸残基を表し、Ｃｉ、ＣｉｉおよびＣｉｉｉは、それぞれ、第１、第２および第３のシステイン残基を表す）から選択されるアミノ酸配列または薬学的に許容されるその塩を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチドリガンド。
【請求項５】
双方とも６個のアミノ酸からなる２個のループ配列によって隔てられている３個のシステイン残基を含み、前記ペプチドリガンドは：
Ｃｉ−Ｉ−Ｅ−Ｅ−Ｇ−Ｑ−Ｙ−Ｃｉｉ−Ｘ１−Ｘ２−Ｄ−Ｘ３−Ｙ／Ｑ／Ｍ−Ｘ４−Ｃｉｉｉ（配列番号２０）；
Ｃｉ−Ｄ−Ｉ−Ｇ−Ｐ−Ｐ−Ｙ−Ｃｉｉ−Ｙ−Ｒ／Ａ−Ｄ−Ｍ／Ｐ−Ｙ−Ｍ−Ｃｉｉｉ（配列番号２１）；および
ＣｉＩＥＰＧＰＦＣｉｉＹＡＤＰＹＭＣｉｉｉ（配列番号１９）；
（式中、Ｘ１〜Ｘ４は、任意のアミノ酸残基を表し、Ｃｉ、ＣｉｉおよびＣｉｉｉは、それぞれ、第１、第２および第３のシステイン残基を表す）から選択されるアミノ酸配列または薬学的に許容されるその塩を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチドリガンド。
【請求項６】
６個のアミノ酸からなる第１のループ配列と５個のアミノ酸からなる第２のループ配列との２個のループ配列によって隔てられている３個のシステイン残基を含み、前記ペプチドリガンドは：
Ｃｉ−Ｄ−Ｅ−Ｗ−Ｇ−Ｌ−Ｆ／Ｙ−Ｃｉｉ−Ｉ／Ｆ−Ｐ／Ａ−Ｈ−Ｓ／Ｐ−Ｄ−Ｃｉｉｉ（配列番号２２）；
（式中、Ｃｉ、ＣｉｉおよびＣｉｉｉは、それぞれ、第１、第２および第３のシステイン残基を表す）であるアミノ酸配列または薬学的に許容されるその塩を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチドリガンド。
【請求項７】
Ｃｉ−Ｉ−Ｅ−Ｅ−Ｇ−Ｑ−Ｙ−Ｃｉｉ−Ｘ１−Ｘ２−Ｄ−Ｘ３−Ｙ／Ｑ−Ｘ４−Ｃｉｉｉ（配列番号２０）のペプチドリガンドは、配列番号１〜１４：
ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＹＲＤＭＹＭＣｉｉｉ（配列番号１）；
ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＹＡＤＰＹＭＣｉｉｉ（配列番号２）；
ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＹＡＤＰＹＹＣｉｉｉ（配列番号３）；
ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＹＳＤＰＹＹＣｉｉｉ（配列番号４）；
ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹＭＣｉｉｉ（配列番号５）；
ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＹＡＤＨＱＬＣｉｉｉ（配列番号６）；
ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＨＡＤＰＹＹＣｉｉｉ（配列番号７）；
ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＨＡＤＰＹＦＣｉｉｉ（配列番号８）；
ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＹＡＤＨＹＭＣｉｉｉ（配列番号９）；
ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＹＡＤＰＹＬＣｉｉｉ（配列番号１０）；
ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＹＳＤＰＹＬＣｉｉｉ（配列番号１１）；
ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹＬＣｉｉｉ（配列番号１２）；
ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＨＡＤＰＹＭＣｉｉｉ（配列番号１３）；および
ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＨＡＤＰＱＭＣｉｉｉ（配列番号１４）；
（式中、Ｃｉ、ＣｉｉおよびＣｉｉｉは、それぞれ、第１、第２および第３のシステイン残基を表す）のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列または薬学的に許容されるその塩、
例えば、
Ａ−（配列番号１）−Ａ（本明細書中で７４−０１−００−Ｎ００４と称される）；
Ａ−（配列番号２）−Ａ（本明細書中で７４−０１−０１−Ｎ００１と称される）；
Ａ−（配列番号３）−Ａ（本明細書中で７４−０１−０２−Ｎ００１と称される）；
Ａ−（配列番号４）−Ａ（本明細書中で７４−０１−０３−Ｎ００１と称される）；
Ａ−（配列番号５）−Ａ（本明細書中で７４−０１−０４−Ｎ００１と称される）；
Ａ−（配列番号６）−Ａ（本明細書中で７４−０１−０５−Ｎ００１と称される）；
Ａ−（配列番号７）−Ａ（本明細書中で７４−０１−０６−Ｎ００１と称される）；
Ａ−（配列番号８）−Ａ（本明細書中で７４−０１−０７−Ｎ００１と称される）；
Ａ−（配列番号９）−Ａ（本明細書中で７４−０１−０８−Ｎ００１と称される）；
Ａ−（配列番号１０）−Ａ（本明細書中で７４−０１−０９−Ｎ００１と称される）；
Ａ−（配列番号１０）−ＳＶＧ（本明細書中で７４−０１−０９−Ｔ０３−Ｎ００２と称される）；
Ａ−（配列番号１１）−Ａ（本明細書中で７４−０１−１０−Ｎ００１と称される）；
Ａ−（配列番号１２）−Ａ（本明細書中で７４−０１−１１−Ｎ００１と称される）；
Ａ−（配列番号１３）−Ａ（本明細書中で７４−０１−１３−Ｎ００１と称される）；および
Ａ−（配列番号１４）−Ａ（本明細書中で７４−０１−１４−Ｎ００１と称される）
から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項４または５に記載のペプチドリガンド。
【請求項８】
Ｃｉ−Ｄ−Ｉ−Ｇ−Ｐ−Ｐ−Ｙ−Ｃｉｉ−Ｙ−Ｒ／Ａ−Ｄ−Ｍ／Ｐ−Ｙ−Ｍ−Ｃｉｉｉ（配列番号２１）のペプチドリガンドは：
ＣｉＤＩＧＰＰＹＣｉｉＹＲＤＭＹＭＣｉｉｉ（配列番号１５）；および
ＣｉＤＩＧＰＰＹＣｉｉＹＡＤＰＹＭＣｉｉｉ（配列番号１６）；
（式中、Ｃｉ、ＣｉｉおよびＣｉｉｉは、それぞれ、第１、第２および第３のシステイン残基を表す）から選択されるアミノ酸配列または薬学的に許容されるその塩、
例えば、
Ａ−（配列番号１５）−Ａ（本明細書中で７４−０１−１６−Ｎ００１と称される）；および
Ａ−（配列番号１６）−Ａ（本明細書中で７４−０１−１７−Ｎ００１と称される）
から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項４または５に記載のペプチドリガンド。
【請求項９】
Ｃｉ−Ｄ−Ｅ−Ｗ−Ｇ−Ｌ−Ｆ／Ｙ−Ｃｉｉ−Ｉ／Ｆ−Ｐ／Ａ−Ｈ−Ｓ／Ｐ−Ｄ−Ｃｉｉｉ（配列番号２２）のペプチドリガンドは：
ＣｉＤＥＷＧＬＦＣｉｉＩＰＨＳＤＣｉｉｉ（配列番号１７）；および
ＣｉＤＥＷＧＬＹＣｉｉＦＡＨＰＤＣｉｉｉ（配列番号１８）；
（式中、Ｃｉ、ＣｉｉおよびＣｉｉｉは、それぞれ、第１、第２および第３のシステイン残基を表す）から選択されるアミノ酸配列または薬学的に許容されるその塩、
例えば、
Ａｃ−Ａ−（配列番号１７）−Ａ（本明細書中で７４−０２−００−Ｎ００４と称される）；および
Ａ−（配列番号１８）−Ａ（本明細書中で７４−０２−０１−Ｎ００１と称される）
から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項４または６に記載のペプチドリガンド。
【請求項１０】
ＣｉＩＥＰＧＰＦＣｉｉＹＡＤＰＹＭＣｉｉｉ（配列番号１９）のペプチドリガンドは：
Ａ−（配列番号１９）−ＮＲＶ（本明細書中で７４−１９−００−Ｔ０１−Ｎ００２と称される）
のアミノ酸配列を含む、請求項４または５に記載のペプチドリガンド。
【請求項１１】
ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ（配列番号２３）；
ＣｉＩＫＥＧＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ（配列番号２４）；
ＣｉＩＥＫＧＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ（配列番号２５）；
ＣｉＩＥＥ（Ｄ−Ｋ）ＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ（配列番号２６）；
ＣｉＩＥＥＧＫＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ（配列番号２７）；
ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＫＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ（配列番号２８）；
ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＦＡＤＫＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ（配列番号２９）；および
ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹＫＣｉｉｉ（配列番号３０）；
（式中、Ｃｉ、ＣｉｉおよびＣｉｉｉは、それぞれ、第１、第２および第３のシステイン残基を表す）から選択されるか、または薬学的に許容されるその塩である、請求項１または２に記載のペプチドリガンド。
【請求項１２】
Ｎ末端およびＣ末端修飾を含み、
Ａ−ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号３１；ＢＣＹ３８１４）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ｄａｐ（配列番号３２；ＢＣＹ７７３２）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＫＥＧＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号３３；ＢＣＹ７７３３）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＥＫＧＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号３４；ＢＣＹ７７３４）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＥＥ（Ｄ−Ｋ）ＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号３５；ＢＣＹ７７３５）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＥＥＧＫＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号３６；ＢＣＹ７７３６）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＫＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号３７；ＢＣＹ７７３７）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＦＡＤＫＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号３８；ＢＣＹ７７３８）；および
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹＫＣｉｉｉ−Ａ（配列番号３９；ＢＣＹ７７３９）；
（式中、Ｃｉ、ＣｉｉおよびＣｉｉｉは、それぞれ、第１、第２および第３のシステイン残基を表し、Ａｃは、Ｎ末端アセチル基を表し、Ｄａｐは、ジアミノプロピオン酸を表す）から選択されるアミノ酸配列または薬学的に許容されるその塩を含む、請求項１または２に記載のペプチドリガンド。
【請求項１３】
ＣｉＬＰＰＧＱＹＣｉｉＦＰＤＬＬＬＣｉｉｉ（配列番号４０；７４−２２−００）
（式中、Ｃｉ、Ｃｉｉ、およびＣｉｉｉは、それぞれ、第１、第２、および第３のシステイン残基を表す）であるアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載のペプチドリガンド。
【請求項１４】
双方とも６個のアミノ酸からなる２個のループ配列によって隔てられている３個のシステイン残基を含み、前記ペプチドリガンドは：
Ｃｉ−Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｖ−Ｅ／Ｄ／Ｐ／Ｓ−Ｐ／Ｅ／Ａ−Ｇ−Ｐ／Ｑ−Ｙ／Ｆ−Ｃｉｉ−Ｙ−Ａ−Ｄ−Ｐ−Ｙ／Ｍ−Ｍ／Ｌ／Ｙ−Ｃｉｉｉ（配列番号４１）；
（式中、Ｃｉ、Ｃｉｉ、およびＣｉｉｉは、それぞれ、第１、第２、および第３のシステイン残基を表す）であるアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載のペプチドリガンド。
【請求項１５】
ＢＣＹ７２３８、ＢＣＹ７２４１、ＢＣＹ７２４３、およびＢＣＹ７２４６のペプチドを除く、表１、３、４、および５に列挙されるアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載のペプチドリガンド。
【請求項１６】
双方とも６個のアミノ酸からなる２個のループ配列によって隔てられている３個のシステイン残基を含み、前記ペプチドリガンドは：
Ｃｉ−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｃｉｉ−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｄ−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｃｉｉｉ（配列番号２６６）；
（式中、Ｃｉ、Ｃｉｉ、およびＣｉｉｉは、それぞれ、第１、第２、および第３のシステイン残基を表し、
Ｘ５は、Ｉｌｅ、ｔＢｕＡｌａ、またはＣｈｇを表し；
Ｘ６は、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ａａｄ、ＨｙＰ、またはＯｘａを表し；
Ｘ７は、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、またはＡａｄを表し；
Ｘ８は、Ｇｌｙ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ａｌａ、Ｌ−Ａｌａ、Ｄ−Ｐｈｅ、Ｄ−Ｇｌｕ、Ｄ−Ｇｌｎ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｄ−Ｓｅｒ、またはＤ−Ｔｒｐを表し；
Ｘ９は、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、５，５−ｄｍＰ、Ｏｉｃ、Ｏｘａ、ＨｙＰ、Ａｉｂ、またはＡｃ５ｃを表し；
Ｘ１０は、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、３ＭｅＰｈｅ、４ＭｅＰｈｅ、４ＦＰｈｅ、２Ｎａｌ、４ＭｅＯＰｈｅ、または４，４−ＢＰＡを表し；
Ｘ１１は、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、４ＭｅＰｈｅ、２ＦＰｈｅ、４ＦＰｈｅ、４Ｐａｌ、４，４−ＢＰＡ、４ｔＢｕＰｈｅ、ＮＯ２Ｐｈｅ、または４ＢｒＰｈｅを表し；
Ｘ１２は、ＡｌａまたはＬｙｓを表し；
Ｘ１３は、ＰｒｏまたはＬｙｓを表し；
Ｘ１４は、ＴｙｒまたはＬｙｓを表し；
Ｘ１５は、Ｍｅｔ、Ｌｙｓ、Ｎｌｅ、ＨＬｅｕ、またはＡｈｐを表す）であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチドリガンド。
【請求項１７】
配列番号２６６のペプチドリガンドは、以下のペプチド：
ＢＣＹ７２３９、ＢＣＹ７２４０、ＢＣＹ７２４２、ＢＣＹ７２４４、ＢＣＹ７２４５、ＢＣＹ７２４７、ＢＣＹ７２４８、ＢＣＹ７２４９、ＢＣＹ７４１６、ＢＣＹ７２８７、ＢＣＹ７２９７、ＢＣＹ７１５４、ＢＣＹ７１５６、ＢＣＹ７１５７、ＢＣＹ７１５８、ＢＣＹ７１６２、ＢＣＹ７１６５、ＢＣＹ７１６６、ＢＣＹ７１６７、ＢＣＹ７１６８、ＢＣＹ７１６９、ＢＣＹ７１７０、ＢＣＹ７１７４、ＢＣＹ７１７５、ＢＣＹ７１７７、ＢＣＹ７１７８、ＢＣＹ７１７９、ＢＣＹ７１８３、ＢＣＹ７１８５、ＢＣＹ７１９５、ＢＣＹ７１９８、ＢＣＹ７２１１、ＢＣＹ７３１１、ＢＣＹ７７６８、ＢＣＹ７７７０、ＢＣＹ７７７２、ＢＣＹ７７７３、ＢＣＹ７７７４、ＢＣＹ７７７５、ＢＣＹ７７７６、ＢＣＹ７７９６、ＢＣＹ７７９８、ＢＣＹ７８０１、ＢＣＹ７８０２、ＢＣＹ７９３６、ＢＣＹ７９４１、ＢＣＹ７９４２、ＢＣＹ７９４４、ＢＣＹ７９５０、ＢＣＹ７９５４、ＢＣＹ７９５８、ＢＣＹ７９５９、ＢＣＹ７９６０、ＢＣＹ７９５２、ＢＣＹ７９６１、ＢＣＹ８６５６、ＢＣＹ８６５９、ＢＣＹ８６６３、ＢＣＹ８６６８、ＢＣＹ８６６９、ＢＣＹ８６７４、ＢＣＹ８６７５、ＢＣＹ９２７３、ＢＣＹ３８１４、ＢＣＹ７５２７およびＢＣＹ７９６５
のＣｉ〜Ｃｉｉｉ配列（すなわち、Ｎ末端およびＣ末端のいずれの付加も有しない）；または
以下のペプチド：
ＢＣＹ７２３９、ＢＣＹ７２４０、ＢＣＹ７２４２、ＢＣＹ７２４４、ＢＣＹ７２４５、ＢＣＹ７２４７、ＢＣＹ７２４８、ＢＣＹ７２４９、ＢＣＹ７４１６、ＢＣＹ７２８７、ＢＣＹ７２９７、ＢＣＹ７１５４、ＢＣＹ７１５６、ＢＣＹ７１５７、ＢＣＹ７１５８、ＢＣＹ７１６２、ＢＣＹ７１６５、ＢＣＹ７１６６、ＢＣＹ７１６７、ＢＣＹ７１６８、ＢＣＹ７１６９、ＢＣＹ７１７０、ＢＣＹ７１７４、ＢＣＹ７１７５、ＢＣＹ７１７７、ＢＣＹ７１７８、ＢＣＹ７１７９、ＢＣＹ７１８３、ＢＣＹ７１８５、ＢＣＹ７１９５、ＢＣＹ７１９８、ＢＣＹ７２１１、ＢＣＹ７３１１、ＢＣＹ７７６８、ＢＣＹ７７７０、ＢＣＹ７７７２、ＢＣＹ７７７３、ＢＣＹ７７７４、ＢＣＹ７７７５、ＢＣＹ７７７６、ＢＣＹ７７９６、ＢＣＹ７７９８、ＢＣＹ７８０１、ＢＣＹ７８０２、ＢＣＹ７９３６、ＢＣＹ７９４１、ＢＣＹ７９４２、ＢＣＹ７９４４、ＢＣＹ７９５０、ＢＣＹ７９５４、ＢＣＹ７９５８、ＢＣＹ７９５９、ＢＣＹ７９６０、ＢＣＹ７９５２、ＢＣＹ７９６１、ＢＣＹ８６５６、ＢＣＹ８６５９、ＢＣＹ８６６３、ＢＣＹ８６６８、ＢＣＹ８６６９、ＢＣＹ８６７４、ＢＣＹ８６７５、ＢＣＹ９２７３、ＢＣＹ３８１４、ＢＣＹ７５２７およびＢＣＹ７９６５
の完全な配列（すなわち、Ｎ末端およびＣ末端の全ての付加を含む）から選択される、請求項１６に記載のペプチドリガンド。
【請求項１８】
双方とも６個のアミノ酸からなる２個のループ配列によって隔てられている３個のシステイン残基を含み、前記ペプチドリガンドは：
Ｃｉ−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｃｉｉ−Ｘ１１−Ａ−Ｄ−Ｐ−Ｙ−Ｘ１５−Ｃｉｉｉ（配列番号２６７）；
（式中、Ｃｉ、Ｃｉｉ、およびＣｉｉｉは、それぞれ、第１、第２、および第３のシステイン残基を表し；
Ｘ５は、ＩｌｅまたはｔＢｕＡｌａを表し；
Ｘ６は、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、またはＰｒｏを表し；
Ｘ７は、ＧｌｕまたはＤ−Ｌｙｓを表し；
Ｘ８は、Ｇｌｙ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｐｈｅ、またはＤ−Ａｌａを表し；
Ｘ９は、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、またはＰｒｏを表し；
Ｘ１０は、Ｔｙｒまたは４ＭｅＰｈｅを表し；
Ｘ１１は、Ｐｈｅまたは４ＦＰｈｅを表し；
Ｘ１５は、ＭｅｔまたはＮｌｅを表す）から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチドリガンド。
【請求項１９】
配列番号２６７のペプチドリガンドは、以下のペプチド：
ＢＣＹ７２３９、ＢＣＹ７２４０、ＢＣＹ７２４２、ＢＣＹ７４１６、ＢＣＹ７１５６、ＢＣＹ７１６６、ＢＣＹ７１７４、ＢＣＹ７７７４、ＢＣＹ９２７３、ＢＣＹ３８１４、ＢＣＹ７５２７およびＢＣＹ７９６５
のＣｉ〜Ｃｉｉｉ配列（すなわち、Ｎ末端およびＣ末端のいずれの付加も有しない）；または
以下のペプチド：
ＢＣＹ７２３９、ＢＣＹ７２４０、ＢＣＹ７２４２、ＢＣＹ７４１６、ＢＣＹ７１５６、ＢＣＹ７１６６、ＢＣＹ７１７４、ＢＣＹ７７７４、ＢＣＹ９２７３、ＢＣＹ３８１４、ＢＣＹ７５２７およびＢＣＹ７９６５
の完全な配列（すなわち、Ｎ末端およびＣ末端の全ての付加を含む）から選択される、請求項１８に記載のペプチドリガンド。
【請求項２０】
前記分子足場は、１，１’，１”−（１，３，５−トリアジナン−１，３，５−トリイル）トリプロパ−２−エン−１−オン（ＴＡＴＡ）から選択される、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のペプチドリガンド。
【請求項２１】
前記薬学的に許容される塩は、遊離酸、またはナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム塩から選択される、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のペプチドリガンド。
【請求項２２】
前記ＣＤ１３７は、ヒトＣＤ１３７である、請求項１〜２１のいずれか１項に記載のペプチドリガンド。
【請求項２３】
１個または複数のエフェクターおよび／または官能基にコンジュゲートされた、請求項１〜２２のいずれか１項に記載のペプチドリガンドを含む薬物コンジュゲート。
【請求項２４】
１個または複数の細胞毒性剤にコンジュゲートされた請求項１〜２２のいずれか１項に記載のペプチドリガンドを含む薬物コンジュゲート。
【請求項２５】
１個または複数の薬学的に許容される添加剤と組み合わせて、請求項１〜２２のいずれか１項に記載のペプチドリガンドまたは請求項２３もしくは２４に記載の薬物コンジュゲートを含む医薬組成物。
【請求項２６】
ＣＤ１３７によって媒介される疾患または障害の予防、抑制または処置において使用するための、請求項１〜２２のいずれか１項に記載のペプチドリガンドまたは請求項２３もしくは２４に記載の薬物コンジュゲート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２個以上のペプチドループが足場への付着点の間に内在されるように分子足場に共有結合しているポリペプチドに関する。特に、本発明は、ＣＤ１３７の高親和性結合剤であるペプチドを記載する。本発明はまた、１個または複数のエフェクターおよび／または官能基にコンジュゲートされた、前記ペプチドを含む薬物コンジュゲート、前記ペプチドリガンドおよび薬物コンジュゲートを含む医薬組成物、ならびにＣＤ１３７によって媒介される疾患または障害の予防、抑制または処置における、前記ペプチドリガンドおよび薬物コンジュゲートの使用を含む。
【背景技術】
【０００２】
環式ペプチドは、タンパク質の標的に対して高親和性および標的特異性を伴って結合することができ、したがって、療法の開発のための魅力的な分子クラスである。実際、いくつかの環式ペプチドは、例えば、抗菌ペプチドであるバンコマイシン、免疫抑制剤であるシクロスポリンまたは抗がん薬であるオクトレオチドとして、既に臨床において首尾よく使用されている（Ｄｒｉｇｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００８），Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  ７（７），６０８−２４）。優れた結合特性は、ペプチドと標的との間に形成された相対的に大きな相互作用表面と共に、環状構造のコンホメーション上の柔軟性の低下に起因する。典型的には、大環状分子は、例えば、環式ペプチドＣＸＣＲ４アンタゴニストＣＶＸ１５（４００Å２；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００７），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３０，１０６６−７１）、インテグリンαＶｂ３に結合するＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐモチーフを有する環式ペプチド（３５５Å２）（Ｘｉｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６（５５６５），１５１−５）またはウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーターに結合する環状ペプチド阻害剤ウパイン−１（ｕｐａｉｎ−１）（６０３Å２；Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００７），Ｊ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  １６０（１），１−１０）のように、数百平方オングストロームの表面に結合する。
【０００３】
それらの環状配置によって、ペプチド大環状分子は、直鎖状ペプチドより柔軟でなく、標的への結合によるエントロピーのより小さな損失に至り、より高い結合親和性をもたらす。低減した柔軟性はまた、直鎖状ペプチドと比較して、標的特異的立体構造の固定、結合特異性の増加をもたらす。このような効果は、その環が開環されると他のＭＭＰに及ぶその選択性を失う、マトリックスメタロプロテイナーゼ８（ＭＭＰ−８）の強力かつ選択的な阻害剤により例証されてきた（Ｃｈｅｒｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８），Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ４１（１１），１７４９−５１）。大環状化によって達成される好ましい結合特性は、例えば、バンコマイシン、ナイシンおよびアクチノマイシンにおけるように、１つを超えるペプチド環を有する多環状ペプチド（multicyclic peptide）においてさらにより明白である。
【０００４】
異なる研究チームが、従前からシステイン残基を有するポリペプチドを合成分子構造に繋いでいる（Ｋｅｍｐ  ａｎｄ  ＭｃＮａｍａｒａ（１９８５）、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ；Ｔｉｍｍｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ）。Ｍｅｌｏｅｎおよび共同研究者は、タンパク質表面の構造的模倣のための合成足場上への、複数のペプチドループの急速および定量的な環化のための、トリス（ブロモメチル）ベンゼンおよび関連分子を使用してきた（Ｔｉｍｍｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００５），ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ）。候補薬物化合物の生成のための方法（ここでは、前記化合物がシステイン含有ポリペプチドを分子足場、例えば、トリス（ブロモメチル）ベンゼンに連結することによって生じる）は、国際公開第２００４／０７７０６２号および国際公開第２００６／０７８１６１号に開示されている。
【０００５】
ファージディスプレイに基づくコンビナトリアルアプローチが開発され、目的の標的に対する二環式ペプチドの大きなライブラリーが生成およびスクリーニングされてきた（Ｈｅｉｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００９），Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ５（７），５０２−７および国際公開第２００９／０９８４５０号）。手短に言えば、３個のシステイン残基、および６個のランダムアミノ酸の２つの領域（Ｃｙｓ−（Ｘａａ）６−Ｃｙｓ−（Ｘａａ）６−Ｃｙｓ）を含有する直鎖状ペプチドのコンビナトリアルライブラリーを、ファージ上に提示させ、システイン側鎖を小分子（トリス−（ブロモメチル）ベンゼン）へと共有結合的に連結することによって環化させた。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の第１の態様によれば、少なくとも２個のポリペプチドループが分子足場上で形成されるように、少なくとも２個のループ配列によって隔てられている少なくとも３個の反応性基と、ポリペプチドの反応性基との共有結合を形成する分子足場とを含むポリペプチドを含む、ＣＤ１３７に対して特異的なペプチドリガンドが提供される。
【０００７】
本発明のさらなる態様によれば、１個または複数のエフェクターおよび／または官能基にコンジュゲートされた、本明細書中で定義されるペプチドリガンドを含む薬物コンジュゲートが提供される。
【０００８】
本発明のさらなる態様によれば、１個または複数の薬学的に許容される添加剤と組み合わせて、本明細書中で定義されるペプチドリガンドまたは薬物コンジュゲートを含む医薬組成物が提供される。
【０００９】
本発明のさらなる態様によれば、ＣＤ１３７によって媒介される疾患または障害の予防、抑制または処置において使用するための、本明細書で定義されるペプチドリガンドまたは薬物コンジュゲートが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】二環式ペプチドＢＣＹ５９２を用いたＣＤ１３７細胞活性アッセイの結果である。
【図２】蛍光偏光によって測定したＣＤ１３７への結合についての、ＣＤ１３７Ｌまたはモノクローナル抗体ウトミルマブの、蛍光標識されたペプチドＢＣＹ６４０との競合である。
【図３】蛍光偏光によって測定したＣＤ１３７への結合についての、モノクローナル抗体ウトミルマブまたはウレルマブの、蛍光標識されたペプチドＢＣＹ６４０との競合である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
［本発明の詳細な説明］
言及することができる本発明の特定の一態様によれば、少なくとも２個のポリペプチドループが分子足場上で形成されるように、少なくとも２個のループ配列によって隔てられている少なくとも３個のシステイン残基と、ポリペプチドのシステイン残基との共有結合を形成する分子足場とを含むポリペプチドを含む、ＣＤ１３７に対して特異的なペプチドリガンドが提供される。
【００１２】
一実施形態では、前記ループ配列は、５個または６個のアミノ酸を含む。
【００１３】
さらなる実施形態では、前記ペプチドリガンドは、双方とも６個のアミノ酸からなる２個のループ配列によって隔てられている３個のシステイン残基を含む。
【００１４】
さらなる実施形態では、前記ペプチドリガンドは、一方が５個のアミノ酸からなり、他方が６個のアミノ酸からなる２個のループ配列によって隔てられている３個のシステイン残基を含む。
【００１５】
一実施形態では、前記ペプチドリガンドは：
Ｃｉ−Ｉ−Ｅ−Ｅ−Ｇ−Ｑ−Ｙ−Ｃｉｉ−Ｘ１−Ｘ２−Ｄ−Ｘ３−Ｙ／Ｑ／Ｍ−Ｘ４−Ｃｉｉｉ（配列番号２０）；
Ｃｉ−Ｄ−Ｉ−Ｇ−Ｐ−Ｐ−Ｙ−Ｃｉｉ−Ｙ−Ｒ／Ａ−Ｄ−Ｍ／Ｐ−Ｙ−Ｍ−Ｃｉｉｉ（配列番号２１）；
Ｃｉ−Ｄ−Ｅ−Ｗ−Ｇ−Ｌ−Ｆ／Ｙ−Ｃｉｉ−Ｉ／Ｆ−Ｐ／Ａ−Ｈ−Ｓ／Ｐ−Ｄ−Ｃｉｉｉ（配列番号２２）；および
ＣｉＩＥＰＧＰＦＣｉｉＹＡＤＰＹＭＣｉｉｉ（配列番号１９）；
（式中、Ｘ１〜Ｘ４は、任意のアミノ酸残基を表し、Ｃｉ、ＣｉｉおよびＣｉｉｉは、それぞれ、第１、第２および第３のシステイン残基を表す）から選択されるアミノ酸配列または薬学的に許容されるその塩を含む。
【００１６】
アラニンスキャニング実験を、本発明の選択したペプチドに行った。アラニンスキャンは、どのアミノ酸位置が、置換、ならびに親和性および／または他の所望の性質のさらなる最適化に最も適用可能であるかを予測するのに用いられる。親のペプチド配列（ＢＣＹ７１５１；配列番号９２）に対する親和性に基づいて、アラニンスキャンペプチドを３つのカテゴリーに特徴付けた：１．親和性のロスなし、２．親和性が２〜１０倍弱い、３．親和性が＞１０倍弱い。カテゴリー１およびカテゴリー２のペプチドは、代替的なアミノ酸置換による広範囲にわたるＳＡＲ試験を経験することができる。カテゴリー３のペプチドは、固定されて維持され、または高度に類似するアミノ酸でのみ置換された。アラニンスキャンの結果は、表２に示されており、位置９のアスパラギン酸（Ｄ）アミノ酸残基が結合に最も重要であることが分かる。なぜなら、このアミノ酸残基の、アラニン残基による置換が、結合活性を消失させたからである。
【００１７】
また、Ｄ−アラニンスキャニング実験を、本発明の選択したペプチドに行った。全ての二環式ペプチドのデフォルトの調製品は、Ｌ型の配置にあるので、Ｄ−アラニンスキャンは、どのアミノ酸位置がＤ−アミノ酸置換に適用可能であるかを示す。Ｄ−アラニンスキャンの結果は、表２に示されており、位置４のグリシン（Ｇ）をＤ−Ａｌａで置換すると、参照ペプチドに対する親和性が向上したことが分かる。これは、Ｄ−Ａｌａ４ペプチド（ＢＣＹ７２９７；配列番号１０６）が重要であることを意味する。なぜなら、非天然のＤ異性体アミノ酸と関連する親和性の向上および他の利点がもたらされるからである。
【００１８】
一実施形態では、前記ペプチドリガンドは、双方とも６個のアミノ酸からなる２個のループ配列によって隔てられている３個のシステイン残基を含み、前記ペプチドリガンドは：
Ｃｉ−Ｉ−Ｅ−Ｅ−Ｇ−Ｑ−Ｙ−Ｃｉｉ−Ｘ１−Ｘ２−Ｄ−Ｘ３−Ｙ／Ｑ／Ｍ−Ｘ４−Ｃｉｉｉ（配列番号２０）；
Ｃｉ−Ｄ−Ｉ−Ｇ−Ｐ−Ｐ−Ｙ−Ｃｉｉ−Ｙ−Ｒ／Ａ−Ｄ−Ｍ／Ｐ−Ｙ−Ｍ−Ｃｉｉｉ（配列番号２１）；および
ＣｉＩＥＰＧＰＦＣｉｉＹＡＤＰＹＭＣｉｉｉ（配列番号１９）；
（式中、Ｘ１〜Ｘ４は、任意のアミノ酸残基を表し、Ｃｉ、ＣｉｉおよびＣｉｉｉは、それぞれ、第１、第２および第３のシステイン残基を表す）から選択されるアミノ酸配列または薬学的に許容されるその塩を含む。
【００１９】
一実施形態では、Ｘ１は、Ｙ、Ｆ、およびＨから選択される。
【００２０】
一実施形態では、Ｘ２は、Ｒ、Ａ、およびＳから選択される。
【００２１】
一実施形態では、Ｘ３は、Ｍ、Ｐ、およびＨから選択される。
【００２２】
一実施形態では、Ｘ４は、Ｍ、Ｙ、Ｌ、およびＦから選択される。
【００２３】
一実施形態では、前記ペプチドリガンドは、６個のアミノ酸からなる第１のループ配列と５個のアミノ酸からなる第２のループ配列との２個のループ配列によって隔てられている３個のシステイン残基を含み、前記ペプチドリガンドは：
Ｃｉ−Ｄ−Ｅ−Ｗ−Ｇ−Ｌ−Ｆ／Ｙ−Ｃｉｉ−Ｉ／Ｆ−Ｐ／Ａ−Ｈ−Ｓ／Ｐ−Ｄ−Ｃｉｉｉ（配列番号２２）；
（式中、Ｃｉ、ＣｉｉおよびＣｉｉｉは、それぞれ、第１、第２および第３のシステイン残基を表す）であるアミノ酸配列または薬学的に許容されるその塩を含む。
【００２４】
さらなる実施形態では、Ｃｉ−Ｉ−Ｅ−Ｅ−Ｇ−Ｑ−Ｙ−Ｃｉｉ−Ｘ１−Ｘ２−Ｄ−Ｘ３−Ｙ／Ｑ／Ｍ−Ｘ４−Ｃｉｉｉのペプチドリガンド（配列番号２０）は、配列番号１〜１４：
ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＹＲＤＭＹＭＣｉｉｉ（配列番号１）；
ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＹＡＤＰＹＭＣｉｉｉ（配列番号２）；
ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＹＡＤＰＹＹＣｉｉｉ（配列番号３）；
ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＹＳＤＰＹＹＣｉｉｉ（配列番号４）；
ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹＭＣｉｉｉ（配列番号５）；
ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＹＡＤＨＱＬＣｉｉｉ（配列番号６）；
ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＨＡＤＰＹＹＣｉｉｉ（配列番号７）；
ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＨＡＤＰＹＦＣｉｉｉ（配列番号８）；
ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＹＡＤＨＹＭＣｉｉｉ（配列番号９）；
ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＹＡＤＰＹＬＣｉｉｉ（配列番号１０）；
ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＹＳＤＰＹＬＣｉｉｉ（配列番号１１）；
ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹＬＣｉｉｉ（配列番号１２）；
ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＨＡＤＰＹＭＣｉｉｉ（配列番号１３）；および
ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＨＡＤＰＱＭＣｉｉｉ（配列番号１４）；
（式中、Ｃｉ、ＣｉｉおよびＣｉｉｉは、それぞれ、第１、第２および第３のシステイン残基を表す）のいずれか１個から選択されるアミノ酸配列または薬学的に許容されるその塩を含む。
【００２５】
さらなる実施形態では、Ｃｉ−Ｉ−Ｅ−Ｅ−Ｇ−Ｑ−Ｙ−Ｃｉｉ−Ｘ１−Ｘ２−Ｄ−Ｘ３−Ｙ／Ｑ／Ｍ−Ｘ４−Ｃｉｉｉ（配列番号２０）のペプチドリガンドは：
Ａ−（配列番号１）−Ａ（本明細書中で７４−０１−００−Ｎ００４と称される）；
Ａ−（配列番号２）−Ａ（本明細書中で７４−０１−０１−Ｎ００１と称される）；
Ａ−（配列番号３）−Ａ（本明細書中で７４−０１−０２−Ｎ００１と称される）；
Ａ−（配列番号４）−Ａ（本明細書中で７４−０１−０３−Ｎ００１と称される）；
Ａ−（配列番号５）−Ａ（本明細書中で７４−０１−０４−Ｎ００１と称される）；
Ａ−（配列番号６）−Ａ（本明細書中で７４−０１−０５−Ｎ００１と称される）；
Ａ−（配列番号７）−Ａ（本明細書中で７４−０１−０６−Ｎ００１と称される）；
Ａ−（配列番号８）−Ａ（本明細書中で７４−０１−０７−Ｎ００１と称される）；
Ａ−（配列番号９）−Ａ（本明細書中で７４−０１−０８−Ｎ００１と称される）；
Ａ−（配列番号１０）−Ａ（本明細書中で７４−０１−０９−Ｎ００１と称される）；
Ａ−（配列番号１０）−ＳＶＧ（本明細書中で７４−０１−０９−Ｔ０３−Ｎ００２と称される）；
Ａ−（配列番号１１）−Ａ（本明細書中で７４−０１−１０−Ｎ００１と称される）；
Ａ−（配列番号１２）−Ａ（本明細書中で７４−０１−１１−Ｎ００１と称される）；
Ａ−（配列番号１３）−Ａ（本明細書中で７４−０１−１３−Ｎ００１と称される）；および
Ａ−（配列番号１４）−Ａ（本明細書中で７４−０１−１４−Ｎ００１と称される）
から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００２６】
さらなる実施形態では、Ｃｉ−Ｄ−Ｉ−Ｇ−Ｐ−Ｐ−Ｙ−Ｃｉｉ−Ｙ−Ｒ／Ａ−Ｄ−Ｍ／Ｐ−Ｙ−Ｍ−Ｃｉｉｉ（配列番号２１）のペプチドリガンドは：
ＣｉＤＩＧＰＰＹＣｉｉＹＲＤＭＹＭＣｉｉｉ（配列番号１５）；および
ＣｉＤＩＧＰＰＹＣｉｉＹＡＤＰＹＭＣｉｉｉ（配列番号１６）；
（式中、Ｃｉ、ＣｉｉおよびＣｉｉｉは、それぞれ、第１、第２および第３のシステイン残基を表す）から選択されるアミノ酸配列または薬学的に許容されるその塩を含む。
【００２７】
さらなる実施形態では、Ｃｉ−Ｄ−Ｉ−Ｇ−Ｐ−Ｐ−Ｙ−Ｃｉｉ−Ｙ−Ｒ／Ａ−Ｄ−Ｍ／Ｐ−Ｙ−Ｍ−Ｃｉｉｉ（配列番号２１）のペプチドリガンドは：
Ａ−（配列番号１５）−Ａ（本明細書中で７４−０１−１６−Ｎ００１と称される）；および
Ａ−（配列番号１６）−Ａ（本明細書中で７４−０１−１７−Ｎ００１と称される）
から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００２８】
さらなる実施形態では、Ｃｉ−Ｄ−Ｅ−Ｗ−Ｇ−Ｌ−Ｆ／Ｙ−Ｃｉｉ−Ｉ／Ｆ−Ｐ／Ａ−Ｈ−Ｓ／Ｐ−Ｄ−Ｃｉｉｉ（配列番号２２）のペプチドリガンドは：
ＣｉＤＥＷＧＬＦＣｉｉＩＰＨＳＤＣｉｉｉ（配列番号１７）；および
ＣｉＤＥＷＧＬＹＣｉｉＦＡＨＰＤＣｉｉｉ（配列番号１８）；
（式中、Ｃｉ、ＣｉｉおよびＣｉｉｉは、それぞれ、第１、第２および第３のシステイン残基を表す）から選択されるアミノ酸配列または薬学的に許容されるその塩を含む。
【００２９】
さらなる実施形態では、Ｃｉ−Ｄ−Ｅ−Ｗ−Ｇ−Ｌ−Ｆ／Ｙ−Ｃｉｉ−Ｉ／Ｆ−Ｐ／Ａ−Ｈ−Ｓ／Ｐ−Ｄ−Ｃｉｉｉ（配列番号２２）のペプチドリガンドは：
Ａｃ−Ａ−（配列番号１７）−Ａ（本明細書中で７４−０２−００−Ｎ００４と称される）；および
Ａ−（配列番号１８）−Ａ（本明細書中で７４−０２−０１−Ｎ００１と称される）
から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００３０】
一実施形態では、ＣｉＩＥＰＧＰＦＣｉｉＹＡＤＰＹＭＣｉｉｉ（配列番号１９）のペプチドリガンドは：
Ａ−（配列番号１９）−ＮＲＶ（本明細書中で７４−１９−００−Ｔ０１−Ｎ００２と称される）
のアミノ酸配列を含む。
【００３１】
一実施形態では、分子足場は、１，１’，１”−（１，３，５−トリアジナン−１，３，５−トリイル）トリプロパ−２−エン−１−オン（ＴＡＴＡ）から選択され、ペプチドリガンドは：
Ａ−（配列番号１）−Ａ（本明細書中で７４−０１−００−Ｎ００４と称される）；
Ａ−（配列番号２）−Ａ（本明細書中で７４−０１−０１−Ｎ００１と称される）；
Ａ−（配列番号３）−Ａ（本明細書中で７４−０１−０２−Ｎ００１と称される）；
Ａ−（配列番号４）−Ａ（本明細書中で７４−０１−０３−Ｎ００１と称される）；
Ａ−（配列番号５）−Ａ（本明細書中で７４−０１−０４−Ｎ００１と称される）；
Ａ−（配列番号６）−Ａ（本明細書中で７４−０１−０５−Ｎ００１と称される）；
Ａ−（配列番号７）−Ａ（本明細書中で７４−０１−０６−Ｎ００１と称される）；
Ａ−（配列番号８）−Ａ（本明細書中で７４−０１−０７−Ｎ００１と称される）；
Ａ−（配列番号９）−Ａ（本明細書中で７４−０１−０８−Ｎ００１と称される）；
Ａ−（配列番号１０）−Ａ（本明細書中で７４−０１−０９−Ｎ００１と称される）；
Ａ−（配列番号１０）−ＳＶＧ（本明細書中で７４−０１−０９−Ｔ０３−Ｎ００２と称される）；
Ａ−（配列番号１１）−Ａ（本明細書中で７４−０１−１０−Ｎ００１と称される）；
Ａ−（配列番号１２）−Ａ（本明細書中で７４−０１−１１−Ｎ００１と称される）；
Ａ−（配列番号１３）−Ａ（本明細書中で７４−０１−１３−Ｎ００１と称される）；
Ａ−（配列番号１４）−Ａ（本明細書中で７４−０１−１４−Ｎ００１と称される）；
Ａ−（配列番号１５）−Ａ（本明細書中で７４−０１−１６−Ｎ００１と称される）；
Ａ−（配列番号１６）−Ａ（本明細書中で７４−０１−１７−Ｎ００１と称される）；
Ａｃ−Ａ−（配列番号１７）−Ａ（本明細書中で７４−０２−００−Ｎ００４と称される）；および
Ａ−（配列番号１８）−Ａ（本明細書中で７４−０２−０１−Ｎ００１と称される）
から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００３２】
この実施形態の足場／ペプチドリガンドは、本明細書中で表１に示されるように、優れたＣＤ１３７競合結合を実証した。
【００３３】
さらなる実施形態では、前記ペプチドリガンドは：
ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ（配列番号２３）；
ＣｉＩＫＥＧＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ（配列番号２４）；
ＣｉＩＥＫＧＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ（配列番号２５）；
ＣｉＩＥＥ（Ｄ−Ｋ）ＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ（配列番号２６）；
ＣｉＩＥＥＧＫＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ（配列番号２７）；
ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＫＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ（配列番号２８）；
ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＦＡＤＫＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ（配列番号２９）；および
ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹＫＣｉｉｉ（配列番号３０）；
（式中、Ｃｉ、ＣｉｉおよびＣｉｉｉは、それぞれ、第１、第２および第３のシステイン残基を表す）から選択されるか、または薬学的に許容されるその塩である。
【００３４】
さらなる実施形態では、前記ペプチドリガンドは、Ｎ末端およびＣ末端修飾を含み、
Ａ−ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号３１；ＢＣＹ３８１４）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ｄａｐ（配列番号３２；ＢＣＹ７７３２）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＫＥＧＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号３３；ＢＣＹ７７３３）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＥＫＧＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号３４；ＢＣＹ７７３４）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＥＥ（Ｄ−Ｋ）ＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号３５；ＢＣＹ７７３５）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＥＥＧＫＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号３６；ＢＣＹ７７３６）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＫＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号３７；ＢＣＹ７７３７）；
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＦＡＤＫＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ−Ａ（配列番号３８；ＢＣＹ７７３８）；および
Ａｃ−Ａ−ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹＫＣｉｉｉ−Ａ（配列番号３９；ＢＣＹ７７３９）；
（式中、Ｃｉ、ＣｉｉおよびＣｉｉｉは、それぞれ、第１、第２および第３のシステイン残基を表し、Ａｃは、Ｎ末端アセチル基を表し、Ｄａｐは、ジアミノプロピオン酸を表す）から選択されるアミノ酸配列または薬学的に許容されるその塩を含む。
【００３５】
代替的な実施形態では、前記ペプチドリガンドは：
ＣｉＬＰＰＧＱＹＣｉｉＦＰＤＬＬＬＣｉｉｉ（配列番号４０；７４−２２−００）
（式中、Ｃｉ、ＣｉｉおよびＣｉｉｉは、それぞれ、第１、第２、および第３のシステイン残基を表す）であるアミノ酸配列を含む。
【００３６】
代替的な実施形態では、前記ペプチドリガンドは、双方とも６個のアミノ酸からなる２個のループ配列によって隔てられている３個のシステイン残基を含み、前記ペプチドリガンドは：
Ｃｉ−Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｖ−Ｅ／Ｄ／Ｐ／Ｓ−Ｐ／Ｅ／Ａ−Ｇ−Ｐ／Ｑ−Ｙ／Ｆ−Ｃｉｉ−Ｙ−Ａ−Ｄ−Ｐ−Ｙ／Ｍ−Ｍ／Ｌ／Ｙ−Ｃｉｉｉ（配列番号４１）；
（式中、Ｃｉ、ＣｉｉおよびＣｉｉｉは、それぞれ、第１、第２、および第３のシステイン残基を表す）であるアミノ酸配列を含む。
【００３７】
さらなる実施形態では、前記アミノ酸配列は、表１に列挙されるペプチド配列から選択される。さらなる実施形態では、前記アミノ酸配列は、ＢＣＹ７２３８、ＢＣＹ７２４１、ＢＣＹ７２４３、およびＢＣＹ７２４６のペプチドを除く、表１に列挙されるペプチド配列から選択される。この実施形態のペプチドを、ＣＤ１３７の直接結合アッセイにおいて試験され、良好なレベルの結合が実証された。
【００３８】
さらなる実施形態では、前記アミノ酸配列は、表３に列挙されるペプチド配列から選択される。この実施形態のペプチドを、ＣＤ１３７の直接結合アッセイにおいて試験され、良好なレベルの結合が実証された。
【００３９】
さらなる実施形態では、前記アミノ酸配列は、表４および表５に列挙されるペプチド配列から選択される。この実施形態のペプチドを、ＣＤ１３７のＳＰＲアッセイにおいて試験され、良好なレベルの結合が実証された。
【００４０】
さらなる実施形態では、前記アミノ酸配列は、ＢＣＹ５９２から選択される。データを、本明細書中で図１に示しており、これは、二環式ペプチドＢＣＹ５９２が、細胞ベースのアッセイにおいてＣＤ１３７Ｌ活性を阻害したことを示す。
【００４１】
代替的な実施形態では、前記ペプチドリガンドは、双方とも６個のアミノ酸からなる２個のループ配列によって隔てられている３個のシステイン残基を含み、前記ペプチドリガンドは：
Ｃｉ−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｃｉｉ−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｄ−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｃｉｉｉ（配列番号２６６）；
（式中、Ｃｉ、ＣｉｉおよびＣｉｉｉは、それぞれ、第１、第２、および第３のシステイン残基を表し；
Ｘ５は、Ｉｌｅ、ｔＢｕＡｌａ、またはＣｈｇを表し；
Ｘ６は、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ａａｄ、ＨｙＰ、またはＯｘａを表し；
Ｘ７は、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、またはＡａｄを表し；
Ｘ８は、Ｇｌｙ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ａｌａ、Ｌ−Ａｌａ、Ｄ−Ｐｈｅ、Ｄ−Ｇｌｕ、Ｄ−Ｇｌｎ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｄ−Ｓｅｒ、またはＤ−Ｔｒｐを表し；
Ｘ９は、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、５，５−ｄｍＰ、Ｏｉｃ、Ｏｘａ、ＨｙＰ、Ａｉｂ、またはＡｃ５ｃを表し；
Ｘ１０は、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、３ＭｅＰｈｅ、４ＭｅＰｈｅ、４ＦＰｈｅ、２Ｎａｌ、４ＭｅＯＰｈｅ、または４，４−ＢＰＡを表し；
Ｘ１１は、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、４ＭｅＰｈｅ、２ＦＰｈｅ、４ＦＰｈｅ、４Ｐａｌ、４，４−ＢＰＡ、４ｔＢｕＰｈｅ、ＮＯ２Ｐｈｅ、または４ＢｒＰｈｅを表し；
Ｘ１２は、ＡｌａまたはＬｙｓを表し；
Ｘ１３は、ＰｒｏまたはＬｙｓを表し；
Ｘ１４は、ＴｙｒまたはＬｙｓを表し；
Ｘ１５は、Ｍｅｔ、Ｌｙｓ、Ｎｌｅ、ＨＬｅｕ、またはＡｈｐを表す）
であるアミノ酸配列を含む。
【００４２】
一実施形態では、配列番号２６６のペプチドリガンドは、以下のペプチド：
ＢＣＹ７２３９、ＢＣＹ７２４０、ＢＣＹ７２４２、ＢＣＹ７２４４、ＢＣＹ７２４５、ＢＣＹ７２４７、ＢＣＹ７２４８、ＢＣＹ７２４９、ＢＣＹ７４１６、ＢＣＹ７２８７、ＢＣＹ７２９７、ＢＣＹ７１５４、ＢＣＹ７１５６、ＢＣＹ７１５７、ＢＣＹ７１５８、ＢＣＹ７１６２、ＢＣＹ７１６５、ＢＣＹ７１６６、ＢＣＹ７１６７、ＢＣＹ７１６８、ＢＣＹ７１６９、ＢＣＹ７１７０、ＢＣＹ７１７４、ＢＣＹ７１７５、ＢＣＹ７１７７、ＢＣＹ７１７８、ＢＣＹ７１７９、ＢＣＹ７１８３、ＢＣＹ７１８５、ＢＣＹ７１９５、ＢＣＹ７１９８、ＢＣＹ７２１１、ＢＣＹ７３１１、ＢＣＹ７７６８、ＢＣＹ７７７０、ＢＣＹ７７７２、ＢＣＹ７７７３、ＢＣＹ７７７４、ＢＣＹ７７７５、ＢＣＹ７７７６、ＢＣＹ７７９６、ＢＣＹ７７９８、ＢＣＹ７８０１、ＢＣＹ７８０２、ＢＣＹ７９３６、ＢＣＹ７９４１、ＢＣＹ７９４２、ＢＣＹ７９４４、ＢＣＹ７９５０、ＢＣＹ７９５４、ＢＣＹ７９５８、ＢＣＹ７９５９、ＢＣＹ７９６０、ＢＣＹ７９５２、ＢＣＹ７９６１、ＢＣＹ８６５６、ＢＣＹ８６５９、ＢＣＹ８６６３、ＢＣＹ８６６８、ＢＣＹ８６６９、ＢＣＹ８６７４、ＢＣＹ８６７５、ＢＣＹ９２７３、ＢＣＹ３８１４、ＢＣＹ７５２７およびＢＣＹ７９６５
のＣｉ〜Ｃｉｉｉ配列（すなわち、Ｎ末端およびＣ末端のいずれの付加も有しない）から選択される。
【００４３】
さらなる実施形態では、配列番号２６６のペプチドリガンドは、以下のペプチド：
ＢＣＹ７２３９、ＢＣＹ７２４０、ＢＣＹ７２４２、ＢＣＹ７２４４、ＢＣＹ７２４５、ＢＣＹ７２４７、ＢＣＹ７２４８、ＢＣＹ７２４９、ＢＣＹ７４１６、ＢＣＹ７２８７、ＢＣＹ７２９７、ＢＣＹ７１５４、ＢＣＹ７１５６、ＢＣＹ７１５７、ＢＣＹ７１５８、ＢＣＹ７１６２、ＢＣＹ７１６５、ＢＣＹ７１６６、ＢＣＹ７１６７、ＢＣＹ７１６８、ＢＣＹ７１６９、ＢＣＹ７１７０、ＢＣＹ７１７４、ＢＣＹ７１７５、ＢＣＹ７１７７、ＢＣＹ７１７８、ＢＣＹ７１７９、ＢＣＹ７１８３、ＢＣＹ７１８５、ＢＣＹ７１９５、ＢＣＹ７１９８、ＢＣＹ７２１１、ＢＣＹ７３１１、ＢＣＹ７７６８、ＢＣＹ７７７０、ＢＣＹ７７７２、ＢＣＹ７７７３、ＢＣＹ７７７４、ＢＣＹ７７７５、ＢＣＹ７７７６、ＢＣＹ７７９６、ＢＣＹ７７９８、ＢＣＹ７８０１、ＢＣＹ７８０２、ＢＣＹ７９３６、ＢＣＹ７９４１、ＢＣＹ７９４２、ＢＣＹ７９４４、ＢＣＹ７９５０、ＢＣＹ７９５４、ＢＣＹ７９５８、ＢＣＹ７９５９、ＢＣＹ７９６０、ＢＣＹ７９５２、ＢＣＹ７９６１、ＢＣＹ８６５６、ＢＣＹ８６５９、ＢＣＹ８６６３、ＢＣＹ８６６８、ＢＣＹ８６６９、ＢＣＹ８６７４、ＢＣＹ８６７５、ＢＣＹ９２７３、ＢＣＹ３８１４、ＢＣＹ７５２７およびＢＣＹ７９６５
の完全な配列（すなわち、Ｎ末端およびＣ末端の全ての付加を含む）から選択される。
【００４４】
これらのペプチドは全て、本明細書中に記載される直接結合アッセイもしくはＳＰＲアッセイにおいて、良好なレベルの結合を実証し、またはＬｙｓ残基による置換に対して許容性があるペプチドを表した。
【００４５】
一実施形態では、Ｘ５は、ＩｌｅまたはｔＢｕＡｌａを表す。
【００４６】
一実施形態では、Ｘ６は、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、またはＰｒｏを表す。
【００４７】
一実施形態では、Ｘ７は、ＧｌｕまたはＤ−Ｌｙｓを表す。
【００４８】
一実施形態では、Ｘ８は、Ｇｌｙ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｐｈｅ、またはＤ−Ａｌａを表す。
【００４９】
一実施形態では、Ｘ９は、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、またはＰｒｏを表す。
【００５０】
一実施形態では、Ｘ１０は、Ｔｙｒまたは４ＭｅＰｈｅを表す。
【００５１】
一実施形態では、Ｘ１１は、Ｐｈｅまたは４ＦＰｈｅを表す。
【００５２】
一実施形態では、Ｘ１２は、Ａｌａを表す。
【００５３】
一実施形態では、Ｘ１３は、Ｐｒｏを表す。
【００５４】
一実施形態では、Ｘ１４は、Ｔｙｒを表す。
【００５５】
一実施形態では、Ｘ１５は、ＭｅｔまたはＮｌｅを表す。
【００５６】
さらなる実施形態では、前記ペプチドリガンドは、双方とも６個のアミノ酸からなる２個のループ配列によって隔てられている３個のシステイン残基を含み、前記ペプチドリガンドは：
Ｃｉ−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｃｉｉ−Ｘ１１−Ａ−Ｄ−Ｐ−Ｙ−Ｘ１５−Ｃｉｉｉ（配列番号２６７）；
（式中、Ｃｉ、ＣｉｉおよびＣｉｉｉは、それぞれ、第１、第２および第３のシステイン残基を表し；
Ｘ５は、ＩｌｅまたはｔＢｕＡｌａを表し；
Ｘ６は、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、またはＰｒｏを表し；
Ｘ７は、ＧｌｕまたはＤ−Ｌｙｓを表し；
Ｘ８は、Ｇｌｙ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｐｈｅ、またはＤ−Ａｌａを表し；
Ｘ９は、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、またはＰｒｏを表し；
Ｘ１０は、Ｔｙｒまたは４ＭｅＰｈｅを表し；
Ｘ１１は、Ｐｈｅまたは４ＦＰｈｅを表し；
Ｘ１５は、ＭｅｔまたはＮｌｅを表す）であるアミノ酸配列を含む。
【００５７】
一実施形態では、配列番号２６７のペプチドリガンドは、以下のペプチド
ＢＣＹ７２３９、ＢＣＹ７２４０、ＢＣＹ７２４２、ＢＣＹ７４１６、ＢＣＹ７１５６、ＢＣＹ７１６６、ＢＣＹ７１７４、ＢＣＹ７７７４、ＢＣＹ９２７３、ＢＣＹ３８１４、ＢＣＹ７５２７およびＢＣＹ７９６５
のＣｉ〜Ｃｉｉｉ配列（すなわち、Ｎ末端およびＣ末端のいずれの付加も有しない）から選択される。
【００５８】
さらなる実施形態では、配列番号２６７のペプチドリガンドは、以下のペプチド
ＢＣＹ７２３９、ＢＣＹ７２４０、ＢＣＹ７２４２、ＢＣＹ７４１６、ＢＣＹ７１５６、ＢＣＹ７１６６、ＢＣＹ７１７４、ＢＣＹ７７７４、ＢＣＹ９２７３、ＢＣＹ３８１４、ＢＣＹ７５２７およびＢＣＹ７９６５
の完全な配列（すなわち、Ｎ末端およびＣ末端の全ての付加を含む）から選択される。
【００５９】
これらのペプチドは全て、本明細書中に記載される直接結合アッセイもしくはＳＰＲアッセイにおいて、優れたレベルの結合を実証し、またはＬｙｓ残基による置換に対して許容性があるペプチドを表した。
【００６０】
一実施形態では、配列番号２６７のペプチドリガンドは、以下のペプチド：
ＢＣＹ７２３９、ＢＣＹ７２４０、ＢＣＹ７２４２およびＢＣＹ７４１６
のＣｉ〜Ｃｉｉｉ配列（すなわち、Ｎ末端およびＣ末端のいずれの付加も有しない）から選択される。
【００６１】
さらなる実施形態では、配列番号２６７のペプチドリガンドは、以下のペプチド：
ＢＣＹ７２３９、ＢＣＹ７２４０、ＢＣＹ７２４２およびＢＣＹ７４１６
の完全な配列（すなわち、Ｎ末端およびＣ末端の全ての付加を含む）から選択される。
【００６２】
これらのペプチドは、Ｌｙｓ残基による置換に対して許容性があるペプチドを表した。
【００６３】
一実施形態では、配列番号２６７のペプチドリガンドは、以下のペプチド：
ＢＣＹ９２７３、ＢＣＹ３８１４、ＢＣＹ７５２７、およびＢＣＹ７９６５
のＣｉ〜Ｃｉｉｉ配列（すなわち、Ｎ末端およびＣ末端のいずれの付加も有しない）から選択される。
【００６４】
さらなる実施形態では、配列番号２６７のペプチドリガンドは、以下のペプチド：
ＢＣＹ９２７３、ＢＣＹ３８１４、ＢＣＹ７５２７およびＢＣＹ７９６５
の完全な配列（すなわち、Ｎ末端およびＣ末端の全ての付加を含む）から選択される。
【００６５】
これらのペプチドは全て、本明細書中に記載される直接結合アッセイまたはＳＰＲアッセイにおいて、良好なレベルの結合を実証した。
【００６６】
一実施形態では、配列番号２６７のペプチドリガンドは、以下のペプチド：
ＢＣＹ７１５６、ＢＣＹ７１６６、ＢＣＹ７１７４およびＢＣＹ７７７４
のＣｉ〜Ｃｉｉｉ配列（すなわち、Ｎ末端およびＣ末端のいずれの付加も有しない）から選択される。
【００６７】
さらなる実施形態では、配列番号２６７のペプチドリガンドは、以下のペプチド：
ＢＣＹ７１５６、ＢＣＹ７１６６、ＢＣＹ７１７４およびＢＣＹ７７７４
の完全な配列（すなわち、Ｎ末端およびＣ末端の全ての付加を含む）から選択される。
【００６８】
これらのペプチドは全て、本明細書中に記載される直接結合アッセイまたはＳＰＲアッセイにおいて、優れたレベルの結合を実証した。
【００６９】
他に定義しない限り、本明細書において使用される全ての技術および科学用語は、技術分野、例えば、ペプチド化学、細胞培養およびファージディスプレイ、核酸化学および生化学の技術分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。分子生物学、遺伝学的および生化学的方法について標準的な技術を使用する（参照により本明細書中に組み込まれている、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄ．，２００１，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）４ｔｈ  ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．を参照されたい）。
【００７０】
［命名法］
番号付け
式（Ｉ）の化合物内のアミノ酸残基の位置に言及するとき、システイン残基（Ｃｉ、ＣｉｉおよびＣｉｉｉ）は、これらが不変であるため番号付けから除外される。したがって、式（Ｉ）の化合物内のアミノ酸残基の番号付けは、下記のように言及される。
−Ｃｉ−Ｉ１−Ｅ２−Ｅ３−Ｇ４−Ｑ５−Ｙ６−Ｃｉｉ−Ｙ７−Ｒ８−Ｄ９−Ｍ１０−Ｙ１１−Ｍ１２−Ｃｉｉｉ−（配列番号１）
【００７１】
この説明の目的で、全ての二環式ペプチドは、ＴＢＭＢ（１，３，５−トリス（ブロモメチル）ベンゼン）または１，１’，１”−（１，３，５−トリアジナン−１，３，５−トリイル）トリプロパ−２−エン−１−オン（ＴＡＴＡ）で環化されて、トリ置換された構造体が生じるとみなされる。ＴＢＭＢおよびＴＡＴＡによる環化は、Ｃｉ、ＣｉｉおよびＣｉｉｉ上で起こる。
【００７２】
分子フォーマット
二環コア配列に対するＮ末端またはＣ末端の伸長は、ハイフンによって隔てられて配列の左側または右側に加えられる。例えば、Ｎ末端βＡｌａ−Ｓａｒ１０−Ａｌａテールは、
βＡｌａ−Ｓａｒ１０−Ａ−（配列番号Ｘ）
として示される。
【００７３】
［ペプチドリガンド］
ペプチドリガンドは、本明細書において言及するように、分子足場に共有結合しているペプチドを指す。典型的には、このようなペプチドは、足場へと共有結合を形成することができる２個もしくはそれより多い反応性基（すなわち、システイン残基）と、ペプチドが足場に結合しているときループを形成するためにループ配列と称される前記反応性基の間に内在される配列とを含む。この場合、ペプチドは、少なくとも３個のシステイン残基（本明細書においてＣｉ、ＣｉｉおよびＣｉｉｉと言及される）を含み、足場上に少なくとも２個のループを形成する。
【００７４】
［ペプチドリガンドの利点］
本発明の特定の二環式ペプチドは、注射、吸入、経鼻、目、経口または局所投与のための適切な薬物様分子として考慮されることを可能とするいくつかの有利な特性を有する。このような有利な特性は、以下を含む。
−種交差反応性。これは、前臨床薬力学および薬物動態学的査定のための典型的な必要条件である；
−プロテアーゼ安定性。二環式ペプチドリガンドは理想的には、血漿プロテアーゼ、上皮（「膜アンカー」）プロテアーゼ、胃および腸のプロテアーゼ、肺表面プロテアーゼ、細胞内プロテアーゼなどに対して安定性を示すべきである。二環リード候補を動物モデルにおいて開発することができ、かつヒトへと信頼性をもって投与することができるように、プロテアーゼ安定性は、異なる種の間で維持すべきである；
−望ましい溶解性プロファイル。これは、製剤化および吸収の目的のために重要である、荷電および親水性残基に対する疎水性残基、ならびに分子内／分子間の水素結合の比率の関数である；ならびに
−循環中の最適な血漿内半減期。臨床適応症および処置レジメンによって、急性の疾病管理の設定における短い曝露のための二環式ペプチドを開発すること、または循環における増強された保持を伴う二環式ペプチドを開発することが必要とされてもよく、したがって、より慢性の病態の管理のために最適である。望ましい血漿内半減期を推進する他の要因は、薬剤の持続性の曝露による付随する毒物学に対する最大の治療上の効率のための持続性の曝露の必要性である。
−選択性。本発明の特定のペプチドリガンドは、他のＣＤに対してよりも良好な選択性を実証する。
【００７５】
［薬学的に許容される塩］
塩の形態は本発明の範囲内であり、ペプチドリガンドへの言及は、前記リガンドの塩の形態を含むことを認識されたい。
【００７６】
本発明の塩は、通常の化学的方法、例えば、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｕｓｅ，Ｐ．Ｈｅｉｎｒｉｃｈ  Ｓｔａｈｌ（Ｅｄｉｔｏｒ），Ｃａｍｉｌｌｅ  Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ（Ｅｄｉｔｏｒ），ＩＳＢＮ：３−９０６３９−０２６−８，Ｈａｒｄｃｏｖｅｒ，３８８  ｐａｇｅｓ，Ａｕｇｕｓｔ  ２００２に記載されている方法によって、塩基性または酸性部分を含有する親化合物から合成することができる。一般に、このような塩は、これらの化合物の遊離酸または遊離塩基形態と、水もしくは有機溶媒、またはその２つの混合物中の適当な塩基または酸とを反応させることによって調製することができる。
【００７７】
酸付加塩（単塩または二塩（ｍｏｎｏ−  ｏｒ  ｄｉ−ｓａｌｔｓ））は、無機および有機の両方の多種多様の酸と共に形成し得る。酸付加塩の例は、酢酸、２，２−ジクロロ酢酸、アジピン酸、アルギン酸、アスコルビン酸（例えば、Ｌ−アスコルビン酸）、Ｌ−アスパラギン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、４−アセトアミド安息香酸、ブタン酸、（＋）ショウノウ酸、ショウノウ−スルホン酸、（＋）−（１Ｓ）−ショウノウ−１０−スルホン酸、カプリン酸、カプロン酸、カプリル酸、ケイ皮酸、クエン酸、シクラミン酸、ドデシル硫酸、エタン−１，２−ジスルホン酸、エタンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ギ酸、フマル酸、ガラクタル酸、ゲンチシン酸、グルコヘプトン酸、Ｄ−グルコン酸、グルクロン酸（例えば、Ｄ−グルクロン酸）、グルタミン酸（例えば、Ｌ−グルタミン酸）、α−オキソグルタル酸、グリコール酸、馬尿酸、ハロゲン化水素酸（例えば、臭化水素酸、塩酸、ヨウ化水素酸）、イセチオン酸、乳酸（例えば、（＋）−Ｌ−乳酸、（±）−ＤＬ−乳酸）、ラクトビオン酸、マレイン酸、リンゴ酸、（−）−Ｌ−リンゴ酸、マロン酸、（±）−ＤＬ−マンデル酸、メタンスルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ナフタレン−１，５−ジスルホン酸、１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、ニコチン酸、硝酸、オレイン酸、オロト酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモ酸、リン酸、プロピオン酸、ピルビン酸、Ｌ−ピログルタミン酸、サリチル酸、４−アミノ−サリチル酸、セバシン酸、ステアリン酸、コハク酸、硫酸、タンニン酸、（＋）−Ｌ−酒石酸、チオシアン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ウンデシレン酸および吉草酸からなる群から選択される酸、ならびにアシル化アミノ酸およびカチオン交換樹脂と共に形成される単塩または二塩を含む。
【００７８】
塩の１つの特定の群は、酢酸、塩酸、ヨウ化水素酸、リン酸、硝酸、硫酸、クエン酸、乳酸、コハク酸、マレイン酸、リンゴ酸、イセチオン酸、フマル酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、硫酸、メタンスルホン酸（メシル酸）、エタンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、吉草酸、プロパン酸、ブタン酸、マロン酸、グルクロン酸およびラクトビオン酸から形成される塩からなる。１つの特定の塩は、塩酸塩である。別の特定の塩は、酢酸塩である。
【００７９】
化合物がアニオン性であるか、またはアニオン性であり得る官能基を有する（例えば、−ＣＯＯＨは、−ＣＯＯ−であり得る）場合、塩は、有機または無機塩基と共に形成され、適切なカチオンを生じさせ得る。適切な無機カチオンの例には、これらに限定されないが、アルカリ金属イオン、例えば、Ｌｉ＋、Ｎａ＋およびＫ＋、アルカリ土類金属カチオン、例えば、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋、および他のカチオン、例えば、Ａｌ３＋またはＺｎ＋が含まれる。適切な有機カチオンの例には、これらに限定されないが、アンモニウムイオン（すなわち、ＮＨ４＋）および置換アンモニウムイオン（例えば、ＮＨ３Ｒ＋、ＮＨ２Ｒ２＋、ＮＨＲ３＋、ＮＲ４＋）が含まれる。いくつかの適切な置換アンモニウムイオンの例は、メチルアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、プロピルアミン、ジシクロヘキシルアミン、トリエチルアミン、ブチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジン、ベンジルアミン、フェニルベンジルアミン、コリン、メグルミン、およびトロメタミン、ならびにアミノ酸、例えば、リジンおよびアルギニンに由来するものである。一般の第四級アンモニウムイオンの例は、Ｎ（ＣＨ３）４＋である。
【００８０】
式（Ｉ）の化合物が、アミン官能基を含有する場合、これらは、当業者には周知の方法によって、例えば、アルキル化剤との反応によって第四級アンモニウム塩を形成し得る。このような第四級アンモニウム化合物は、式（Ｉ）の範囲内である。
【００８１】
［修飾された誘導体］
本明細書に定義されているようなペプチドリガンドの修飾された誘導体は本発明の範囲内であることを認識されたい。このような適切な修飾された誘導体の例は、Ｎ末端および／またはＣ末端修飾；１個もしくは複数の非天然アミノ酸残基による１個もしくは複数のアミノ酸残基の置換（例えば、１個もしくは複数の等比体積アミノ酸または等電子アミノ酸による１個もしくは複数の極性アミノ酸残基の置換；他の非天然の等比体積アミノ酸または等電子アミノ酸による１個もしくは複数の非極性アミノ酸残基の置換）；スペーサー基の付加；１個もしくは複数の酸化耐性アミノ酸残基による１個もしくは複数の酸化感受性アミノ酸残基の置換；アラニンによる１個もしくは複数のアミノ酸残基の置換、１個もしくは複数のＤ−アミノ酸残基による１個もしくは複数のＬ−アミノ酸残基の置換；二環式ペプチドリガンド内の１個もしくは複数のアミド結合のＮ−アルキル化；代替的結合による１個もしくは複数のペプチド結合の置換；ペプチド骨格長の修飾；別の化学基による１個もしくは複数のアミノ酸残基のアルファ−炭素上の水素の置換、前記アミノ酸を官能化するための、適切なアミン、チオール、カルボン酸およびフェノール反応性試薬によるアミノ酸、例えば、システイン、リジン、グルタミン酸／アスパラギン酸およびチロシンの修飾、ならびに官能化に適した直交反応性を導入するアミノ酸、例えば、それぞれ、アルキンまたはアジド担持部分による官能化を可能にするアジドまたはアルキン基担持アミノ酸の導入または置換から選択される１つもしくは複数の修飾を含む。
【００８２】
一実施形態では、修飾された誘導体は、Ｎ末端および／またはＣ末端修飾を含む。さらなる実施形態では、修飾された誘導体は、適切なアミノ反応性化学反応を使用するＮ末端修飾、および／または適切なカルボキシ反応性化学反応を使用するＣ末端修飾を含む。さらなる実施形態では、前記Ｎ末端またはＣ末端修飾は、これらに限定されないが、細胞毒性剤、放射性キレート剤（ｒａｄｉｏｃｈｅｌａｔｏｒ）または発色団を含めたエフェクター基の付加を含む。
【００８３】
さらなる実施形態では、修飾された誘導体は、Ｎ末端修飾を含む。さらなる実施形態では、Ｎ末端修飾は、Ｎ末端アセチル基を含む。この実施形態では、Ｎ末端システイン基（本明細書においてＣｉと言及される基）は、ペプチド合成の間に無水酢酸または他の適当な試薬でキャップされ、Ｎ末端がアセチル化されている分子をもたらす。この実施形態は、アミノペプチダーゼのための潜在的な認識ポイントを除去する利点を提供し、二環式ペプチドの分解についての可能性を回避する。
【００８４】
代替的な実施形態では、Ｎ末端修飾は、エフェクター基のコンジュゲーションおよび二環性ペプチドのその標的に対する効力の保持を容易にする分子スペーサー基の付加を含む。
【００８５】
さらなる実施形態では、修飾された誘導体は、Ｃ末端修飾を含む。さらなる実施形態では、Ｃ末端修飾は、アミド基を含む。この実施形態では、Ｃ末端システイン基（本明細書においてＣｉｉｉと言及される基）は、ペプチド合成の間にアミドとして合成され、Ｃ末端がアミド化されている分子をもたらす。この実施形態は、カルボキシペプチダーゼについての潜在的な認識ポイントを除去する利点を提供し、二環式ペプチドのタンパク質分解についての可能性を低減させる。
【００８６】
一実施形態では、修飾された誘導体は、１個もしくは複数の非天然アミノ酸残基による１個もしくは複数のアミノ酸残基の置換を含む。この実施形態では、分解性プロテアーゼによって認識されず、標的効力によって有害効果も有しない、等比体積／等電子側鎖を有する非天然アミノ酸を選択し得る。
【００８７】
あるいは、近くのペプチド結合のタンパク質分解加水分解が、立体構造的および立体的に妨害されるように、制約されたアミノ酸側鎖を有する非天然アミノ酸を使用し得る。特に、これらは、プロリン類似体、かさ高い側鎖、Ｃα−二置換誘導体（例えば、アミノイソ酪酸、Ａｉｂ）、およびシクロアミノ酸、単純な誘導体であるアミノ−シクロプロピルカルボン酸が関係する。
【００８８】
一実施形態では、修飾された誘導体は、スペーサー基の付加を含む。さらなる実施形態では、修飾された誘導体は、Ｎ末端システイン（Ｃｉ）および／またはＣ末端システイン（Ｃｉｉｉ）へのスペーサー基の付加を含む。
【００８９】
一実施形態では、修飾された誘導体は、１個もしくは複数の酸化耐性アミノ酸残基による１個もしくは複数の酸化感受性アミノ酸残基の置換を含む。さらなる実施形態では、修飾された誘導体は、ナフチルアラニンまたはアラニン残基によるトリプトファン残基の置換を含む。この実施形態は、生成した二環式ペプチドリガンドの医薬安定性プロファイルを改善させる利点を提供する。
【００９０】
一実施形態では、修飾された誘導体は、１個もしくは複数の疎水性アミノ酸残基による１個もしくは複数の荷電アミノ酸残基の置換を含む。代替的な実施形態では、修飾された誘導体は、１個もしくは複数の荷電アミノ酸残基による１個もしくは複数の疎水性アミノ酸残基の置換を含む。荷電アミノ酸残基に対する疎水性アミノ酸残基の正確なバランスは、二環式ペプチドリガンドの重要な特徴である。例えば、疎水性アミノ酸残基は、血漿タンパク質結合の程度、およびしたがって、血漿中の利用可能な遊離画分の濃度に影響を与え、一方、荷電アミノ酸残基（特に、アルギニン）は、細胞表面上のリン脂質膜とのペプチドの相互作用に影響を与え得る。組み合わせたこの２つは、ペプチド薬物の半減期、分布容積および曝露に影響を与えてもよく、臨床的エンドポイントによって調整することができる。さらに、荷電アミノ酸残基に対する疎水性アミノ酸残基の正確な組合せおよび数は、注射部位における刺激作用を低減し得る（ペプチド薬物が皮下で投与された場合）。
【００９１】
一実施形態では、修飾された誘導体は、１個もしくは複数のＤ−アミノ酸残基による１個もしくは複数のＬ−アミノ酸残基の置換を含む。この実施形態は、立体障害によって、およびβターンコンホメーションを安定化させるＤ−アミノ酸の傾向によって、タンパク質分解安定性を増加させると考えられる（Ｔｕｇｙｉ  ｅｔ  ａｌ（２００５）ＰＮＡＳ，１０２（２），４１３−４１８）。
【００９２】
一実施形態では、修飾された誘導体は、任意のアミノ酸残基の除去、およびアラニンによる置換を含む。この実施形態は、潜在的なタンパク質分解攻撃部位を除去する利点を提供する。
【００９３】
上述の修飾のそれぞれは、ペプチドの効力または安定性を意図的に改善させる役割を果たすことに留意すべきである。修飾に基づいたさらなる効力の改善は、下記の機序によって達成し得る。
−より高い親和性が達成されるように、疎水性効果を利用し、より低いオフレート（ｏｆｆ  ｒａｔｅ）をもたらす疎水性部分を組み込むこと；
−長距離イオン相互作用（ｌｏｎｇ−ｒａｎｇｅ  ｉｏｎｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ）を利用し、より速いオンレート（ｏｎ  ｒａｔｅ）およびより高い親和性をもたらす荷電基を組み込むこと（例えば、Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｒａｐｉｄ，ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃａｌｌｙ  ａｓｓｉｓｔｅｄ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９９６），Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３，４２７−３１を参照されたい）；ならびに
−例えば、エントロピーにおける損失が標的結合において最小であるように、アミノ酸の側鎖を正確に制約し、エントロピーにおける損失が標的結合によって最小であるように、骨格のねじれ角を制約し、かつ同一の理由のために分子中にさらなる環化を導入することによって、さらなる制約をペプチドに組み込むこと。（レビューについて、Ｇｅｎｔｉｌｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ，（２０１０），１６，３１８５−２０３、およびＮｅｓｔｏｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍ（２００９），１６，４３９９−４１８を参照されたい）。
【００９４】
［同位体のバリエーション］
本発明は、本発明の全ての薬学的に許容される（放射性）同位体標識ペプチドリガンドであって、１個もしくは複数の原子が、同じ原子数を有する原子によって置換されているが、天然で通常見出される原子質量または質量数と異なる原子質量または質量数を有する原子によって置換されている、（放射性）同位体標識ペプチドリガンド、関連性のある（放射性）同位体を保持することができる金属キレート化基が付着している（「エフェクター」と称される）本発明のペプチドリガンド、および特定の官能基が、関連性のある（放射性）同位体または同位体的に標識されている官能基と共有結合的に置換されている本発明のペプチドリガンドを含む。
【００９５】
本発明のペプチドリガンド中に含まれるのに適した同位体の例は、水素の同位体、例えば、２Ｈ（Ｄ）および３Ｈ（Ｔ）、炭素の同位体、例えば、１１Ｃ、１３Ｃ、および１４Ｃ、塩素の同位体、例えば、３６Ｃｌ、フッ素の同位体、例えば、１８Ｆ、ヨウ素の同位体、例えば、１２３Ｉ、１２５Ｉ、および１３１Ｉ、窒素の同位体、例えば、１３Ｎおよび１５Ｎ、酸素の同位体、例えば、１５Ｏ、１７Ｏ、および１８Ｏ、リンの同位体、例えば、３２Ｐ、硫黄の同位体、例えば、３５Ｓ、銅の同位体、例えば、６４Ｃｕ、ガリウムの同位体、例えば、６７Ｇａまたは６８Ｇａ、イットリウムの同位体、例えば、９０Ｙ、ルテチウムの同位体、例えば、１７７Ｌｕ、およびビスマスの同位体、例えば、２１３Ｂｉを含む。
【００９６】
本発明の特定の同位体標識されたペプチドリガンド、例えば、放射性同位体を組み込んでいるものは、薬物および／または基質組織分布の研究において、患部組織上のＣＤ１３７標的の存在および／または不在を臨床的に評価するために有用である。本発明のペプチドリガンドは、標識化合物と他の分子、ペプチド、タンパク質、酵素または受容体との間の複合体の形成を検出または同定するために使用することができるという点で、貴重な診断上の特性をさらに有することができる。検出または同定方法は標識化剤、例えば、放射性同位体、酵素、蛍光物質、発光性物質（例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、エクオリンおよびルシフェラーゼ）などで標識されている化合物を使用することができる。放射性同位体トリチウム、すなわち、３Ｈ（Ｔ）、および炭素１４、すなわち、１４Ｃは、組み込みの容易さ、およびすぐ検出できる手段であるという観点で、この目的に特に有用である。
【００９７】
より重い同位体、例えば、重水素、すなわち、２Ｈ（Ｄ）による置換は、より大きな代謝安定性、例えば、インビボでの半減期の増加または投与必要量の低減によって生じる特定の治療上の利点を提供し得、したがって、いくつかの環境において好ましくあり得る。
【００９８】
ポジトロン放出同位体、例えば、１１Ｃ、１８Ｆ、１５Ｏおよび１３Ｎによる置換は、標的占有率を検査するためのポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）研究において有用であり得る。
【００９９】
本発明のペプチドリガンドの同位体的に標識されている化合物は一般に、当業者には公知の従来の技術によって、または従前に用いられている非標識試薬の代わりに適当な同位体標識された試薬を使用して、添付の実施例において記載されているものと類似したプロセスによって、調製することができる。
【０１００】
［分子足場］
分子足場は、例えば、国際公開第２００９／０９８４５０号およびその中で引用されている参照文献、特に、国際公開第２００４／０７７０６２号および国際公開第２００６／０７８１６１号に記載されている。
【０１０１】
上記の文献において留意されているように、分子足場は、小分子、例えば、小有機分子であり得る。
【０１０２】
一実施形態では、分子足場は、巨大分子であり得る。一実施形態では、分子足場は、アミノ酸、ヌクレオチドまたは炭水化物から構成される巨大分子である。
【０１０３】
一実施形態では、分子足場は、ポリペプチドの官能基と反応して、共有結合を形成することができる反応性基を含む。
【０１０４】
分子足場は、ペプチドと連結を形成する化学基、例えば、アミン、チオール、アルコール、ケトン、アルデヒド、ニトリル、カルボン酸、エステル、アルケン、アルキン、アジド、無水物、スクシンイミド、マレイミド、ハロゲン化アルキルおよびハロゲン化アシルを含み得る。
【０１０５】
一実施形態では、分子足場は、ヘキサヒドロ−１，３，５−トリアジン、とりわけ１，３，５−トリアクリロイルヘキサヒドロ−１，３，５−トリアジン（「ＴＡＴＡ」）、またはそれらの誘導体を含んでもよいし、これらからなってもよい。
【０１０６】
一実施形態では、分子足場は、２，４，６−トリス（ブロモメチル）メシチレンである。この分子は、１，３，５−トリス（ブロモメチル）ベンゼン（ＴＢＭＢ）と同様であるが、ベンゼン環に付着している３個のさらなるメチル基を含有する。これは、さらなるメチル基がポリペプチドとのさらなる接点を形成し、したがって、さらなる構造的制約を加え得るという利点を有する。
【０１０７】
本発明の分子足場は、本発明のコードされたライブラリーのポリペプチドの官能基が分子足場と共有結合的連結を形成することを可能とする化学基を含有する。前記化学基は、アミン、チオール、アルコール、ケトン、アルデヒド、ニトリル、カルボン酸、エステル、アルケン、アルキン、無水物、スクシンイミド、マレイミド、アジド、ハロゲン化アルキルおよびハロゲン化アシルを含めた広範囲の官能性から選択される。
【０１０８】
分子足場上で使用され、システインのチオール基と反応することができる足場反応性基は、ハロゲン化アルキル（またはハロゲノアルカンもしくはハロアルカンとも称される）である。
【０１０９】
具体例には、ブロモメチルベンゼンまたはヨードアセトアミドが含まれる。化合物をタンパク質中のシステインに選択的にカップリングするのに用いられる他の足場反応性基は、マレイミド、αβ不飽和カルボニル含有化合物、およびα−ハロメチルカルボニル含有化合物である。本発明において分子足場として使用し得るマレイミドの例は、トリス−（２−マレイミドエチル）アミン、トリス−（２−マレイミドエチル）ベンゼン、トリス−（マレイミド）ベンゼンを含む。αβ不飽和カルボニル含有化合物の例は、１，１’，１”−（１，３，５−トリアジナン−１，３，５−トリイル）トリプロパ−２−エン−１−オン（ＴＡＴＡ）（Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１４），５３（６），１６０２−１６０６）である。α−ハロメチルカルボニル含有化合物の例は、Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−（ベンゼン−１，３，５−トリイル）トリス（２−ブロモアセトアミド）である。セレノシステインはまた、システインと同様の反応性を有し、かつ同じ反応のために使用することができる天然アミノ酸である。このように、システインが記述される場合は必ず、状況が他に示唆しない限り、典型的にはセレノシステインを置換することは許容される。
【０１１０】
［反応性基］
本発明の分子足場は、ポリペプチド上の官能基または反応性基を介して（すなわち、共有結合的に）、ポリペプチドに結合されてよい。当該基は、典型的に、ポリペプチドポリマー内に見出される特定のアミノ酸の側鎖から形成される。そのような反応性基は、システイン側鎖、リジン側鎖、もしくはＮ末端アミン基、または他の適切な任意の反応性基であってよい。詳細を、国際公開第２００９／０９８４５０号パンフレットに見出すことができる。
【０１１１】
天然のアミノ酸の反応性基の例は、システインのチオール基、リジンのアミノ基、アスパルテートもしくはグルタメートのカルボキシル基、アルギニンのグアニジウム基、チロシンのフェノール基、またはセリンのヒドロキシル基である。非天然のアミノ酸は、アジド基、ケトカルボニル基、アルキン基、ビニル基、またはハロゲン化アリール基が挙げられる広範な反応性基を提供することができる。ポリペプチドの末端のアミノ基およびカルボキシル基はまた、分子足場／分子コアへの共有結合を形成する反応性基としても機能することができる。
【０１１２】
一実施形態では、反応性基は、システイン残基を含む。代替的な実施形態では、反応性基は、ペニシラミンを含む。
【０１１３】
本発明のポリペプチドは、少なくとも３個の反応性基を含有する。前記ポリペプチドはまた、４個以上の反応性基を含有することができる。反応性基が多く用いられるほど、ループは分子足場内に多く形成され得る。
【０１１４】
好ましい実施形態では、３個の反応性基を有するポリペプチドが生成される。三回回転対称性（ｔｈｒｅｅ−ｆｏｌｄ  ｒｏｔａｔｉｏｎａｌ  ｓｙｍｍｅｔｒｙ）を有する分子足場／分子コアとの前記ポリペプチドの反応により、単一の生成物異性体が生成される。単一の生成物異性体の生成は、いくつかの理由のために好都合である。化合物ライブラリーの核酸は、分子コアとのポリペプチドの反応と同時に形成される異性体状態の分子ではなく、ポリペプチドの一次配列のみをコードする。１個の生成物異性体のみを形成することができるならば、生成物異性体への核酸の割当てが明確に定義される。複数の生成物異性体が形成されるならば、核酸は、スクリーニングプロセスまたは選択プロセスにおいて単離された生成物異性体の性質に関する情報を与えることができない。単一の生成物異性体の形成はまた、本発明のライブラリーの特定のメンバーが合成されるならば、有利である。この場合、分子足場とのポリペプチドの化学反応は、異性体の混合物ではなく単一の生成物異性体を産生する。
【０１１５】
本発明の別の実施形態では、４個の反応性基を有するポリペプチドが生成される。四面体対称性を有する分子足場／分子コアとの前記ポリペプチドの反応により、２個の生成物異性体が生成される。２個の異なる生成物異性体が、１本の同じ核酸によってコードされるにしても、双方の異性体を化学的に合成して、２個の異性体を分離して、双方の異性体を、標的リガンドへの結合について試験することによって、単離した異性体の異性体性質を判定することができる。
【０１１６】
本発明の一実施形態では、ポリペプチドの反応性基の少なくとも１個は、残りの反応性基と直交（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）する。直交反応性基の使用により、前記直交反応性基を、分子コアの特定の部位に向けることができる。直交反応性基を包含するリンクする戦略を用いて、形成される生成物異性体の数を制限してもよい。言い換えれば、少なくとも３個の結合の１個または複数について、少なくとも３個の結合の残りについて選択した反応性基と別個のまたは異なる反応性基を選択することによって、分子足場上の特定の位置にポリペプチドの特定の反応性基を結合させ、または向ける特定のオーダーを、有益に達成することができる。
【０１１７】
別の実施形態では、本発明のポリペプチドの反応性基は、分子リンカーと反応し、前記リンカーは、最終の結合状態において分子足場とポリペプチドとの間に介在することとなるように、分子足場と反応することができる。一部の実施形態では、ポリペプチドのライブラリーまたはセットのメンバーのアミノ酸は、天然または非天然の任意のアミノ酸によって置換することができる。これらの交換可能なアミノ酸から除外されるのは、ループ配列が単独で交換可能であるようにポリペプチドを分子コアに架橋結合させる官能基を保有するものである。交換可能なポリペプチド配列は、ランダムな配列、不変の配列、またはランダムなアミノ酸および不変のアミノ酸を有する配列のいずれかを有する。反応性基を有するアミノ酸は、ポリペプチド内の定義された位置内に位置決めされる。なぜなら、当該アミノ酸の位置が、ループサイズを決定するからである。
【０１１８】
チオール媒介コンジュゲーションの代替物を用いて、共有結合性相互作用を介して分子足場をペプチドに付着させることができる。あるいは、当該技術は、本発明に従って選択または単離された後の、ポリペプチドへのさらなる部分（例えば、分子足場とは異なる、注目する小分子）の修飾または付着に用いられてもよい。その場合、この実施形態では、付着は明らかに、共有結合性である必要はなく、非共有結合性の付着を包含してよい。当該方法は、要求される化学反応性基を有する非天然のアミノ酸を有するタンパク質およびペプチドを、相補的な反応性基を有する小分子と組み合わせて提示するファージを作製することによって、または、選択相／単離相の後に分子が製造されることとなる場合、非天然のアミノ酸を、化学的に、または組換えにより合成されたポリペプチド中に組み込むことによって、チオール媒介方法の代わりに（またはこれと組み合わせて）用いられてもよい。さらなる詳細を、国際公開第２００９／０９８４５０号パンフレットまたはＨｅｉｎｉｓら、Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ２００９，５（７），５０２−７において見出すことができる。
【０１１９】
［エフェクターおよび官能基］
本発明のさらなる態様によれば、１個または複数のエフェクターおよび／または官能基にコンジュゲートされた、本明細書中で定義されるペプチドリガンドを含む薬物コンジュゲートが提供される。
【０１２０】
エフェクターおよび／または官能基を、例えば、ポリペプチドのＮ末端および／もしくはＣ末端に、ポリペプチド内のアミノ酸に、または分子足場に付着させることができる。
【０１２１】
適切なエフェクター基は、抗体、およびその部分またはフラグメントを含む。例えば、エフェクター基は、抗体軽鎖定常領域（ＣＬ）、抗体ＣＨ１重鎖ドメイン、抗体ＣＨ２重鎖ドメイン、抗体ＣＨ３重鎖ドメイン、またはそれらの任意の組合せを、１個または複数の定常領域ドメインに加えて含むことができる。エフェクター基はまた、抗体のヒンジ領域（通常はＩｇＧ分子のＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間に見出されるような領域）を含んでもよい。
【０１２２】
本発明のこの態様のさらなる実施形態では、本発明によるエフェクター基は、ＩｇＧ分子のＦｃ領域である。有利には、本発明によるペプチドリガンド−エフェクター基は、ｔβ半減期が１日以上、２日以上、３日以上、４日以上、５日以上、６日以上、または７日以上であるペプチドリガンドＦｃ融合を含む、またはこれからなる。最も有利には、本発明によるペプチドリガンドは、ｔβ半減期が１日以上であるペプチドリガンドＦｃ融合を含む、またはこれからなる。
【０１２３】
官能基として、一般に、結合基、薬物、他の実体の付着用の反応性基、細胞中への大環状ペプチドの吸収を助ける官能基等が挙げられる。
【０１２４】
細胞中に侵入するペプチドの能力により、細胞内対象に対してペプチドは有効となり得ることとなる。細胞中に侵入する能力を有するペプチドによってアクセスされ得る標的として、転写因子、細胞内シグナル伝達分子、例えば、チロシンキナーゼおよびアポトーシスの経路に関与する分子が挙げられる。細胞の侵入を可能にする官能基として、ペプチドまたは分子足場のいずれかに加えられたペプチドまたは化学基が挙げられる。例えばＶＰ２２、ＨＩＶ−Ｔａｔ、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）属のホメオボックスタンパク質（アンテナペディア）に由来するようなペプチドが、例えば、Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ（２００７）Ｖｏｌｕｍｅ  ３５，ｐａｒｔ  ４，ｐ８２１；Ｇｕｐｔａ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ（２００４）Ｖｏｌｕｍｅ  ５７  ９６３７中に記載されている。血漿膜を通した移動に有効であることが示された短いペプチドの例として、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）属アンテナペディアタンパク質由来の１６個のアミノ酸侵入ペプチド（Ｄｅｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ（１９９４）Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌｕｍｅ  ２６９  ｐ１０４４４）、１８個のアミノ酸「両親媒性ペプチドモデル」（Ｏｅｈｌｋｅ  ｅｔ  ａｌ（１９９８）Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔｓ  Ｖｏｌｕｍｅ  １４１４  ｐ１２７）、およびＨＩＶ  ＴＡＴタンパク質のアルギニンリッチ領域が挙げられる。非ペプチドアプローチとして、生体分子に容易に付着することができる小分子模倣体またはＳＭＯＣの使用が挙げられる（Ｏｋｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ（２００７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｖｏｌｕｍｅ  ４  ｐ１５３）。グアニジウム基を分子に加える他の化学戦略もまた、細胞侵入を増強する（Ｅｌｓｏｎ−Ｓｃｗａｂ  ｅｔ  ａｌ（２００７）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  Ｖｏｌｕｍｅ  ２８２  ｐ１３５８５）。細胞中への吸収を増強するために、ステロイド等の小分子量の分子が分子足場に加えられてもよい。
【０１２５】
ペプチドリガンドに付着し得る官能基の一クラスは、抗体およびその結合フラグメント、例えばＦａｂ、Ｆｖ、または単一のドメインフラグメントを含む。特に、ペプチドリガンドの半減期をインビボで増大させることができるタンパク質に結合する抗体が用いられてもよい。
【０１２６】
一実施形態では、本発明によるペプチドリガンド−エフェクター基は、１２時間以上、２４時間以上、２日以上、３日以上、４日以上、５日以上、６日以上、７日以上、８日以上、９日以上、１０日以上、１１日以上、１２日以上、１３日以上、１４日以上、１５日以上、または２０日以上からなる群から選択されるｔβ半減期を有する。有利には、本発明によるペプチドリガンド−エフェクター基または組成物は、１２〜６０時間の範囲内にあるｔβ半減期を有することとなる。さらなる実施形態では、１日以上のｔβ半減期を有することとなる。さらなる実施形態では、１２〜２６時間の範囲内となろう。
【０１２７】
本発明の特定の一実施形態では、官能基は、金属キレーターから選択され、これは、医薬関連の金属放射性同位体を複合体形成するのに適している。
【０１２８】
また、考えられるエフェクター基として、酵素、例えば酵素／プロドラッグ治療に用いられるカルボキシペプチダーゼＧ２が挙げられ、ペプチドリガンドは、ＡＤＥＰＴにおいて、抗体を置換する。
【０１２９】
本発明の特定の一実施形態では、官能基は、薬物、例えばがん治療用の細胞毒性剤から選択される。適切な例として、アルキル化剤、例えばシスプラチンおよびカルボプラチン、ならびにオキサリプラチン、メクロレタミン、シクロホスファミド、クロラムブシル、イホスファミド；代謝拮抗薬（プリン類似体アザチオプリンおよびメルカプトプリンまたはピリミジン類似体が挙げられる）；植物アルカロイドおよびテルペノイド（ビンカアルカロイド、例えばビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、およびビンデシンが挙げられる）；ポドフィロトキシン、ならびにその誘導体エトポシドおよびテニポシド；タキサン（元々タキソールとして知られたパクリタキセルが挙げられる）；トポイソメラーゼインヒビタ（カンプトセシン：イリノテカンおよびトポテカンが挙げられる）、ならびにＩＩ型インヒビタ（アムサクリン、エトポシド、リン酸エトポシド、およびテニポシドが挙げられる）が挙げられる。さらなる薬剤は、抗腫瘍抗生物質を含むことができ、これらは免疫抑制剤であるダクチノマイシン（腎臓移植において使用される）、ドキソルビシン、エピルビシン、ブレオマイシン、カリケアマイシンなどを含む。
【０１３０】
本発明の１つのさらなる特定の実施形態では、細胞毒性剤は、マイタンシノイド（例えば、ＤＭ１）またはモノメチルアウリスタチン（例えば、ＭＭＡＥ）から選択される。
【０１３１】
ＤＭ１は、メイタンシンのチオール含有誘導体である細胞毒性剤であり、下記の構造
【化１】
2020529427.tif 000003
を有する。
【０１３２】
モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）は合成の抗新生物剤であり、下記の構造
【化２】
2020529427.tif 000004
を有する。
【０１３３】
本発明の特定のさらなる一実施形態では、細胞毒性剤はマイタンシノイド（例えばＤＭ１）から選択される。
【０１３４】
一実施形態では、細胞毒性剤は、切断可能な結合、例えばジスルフィド結合またはプロテアーゼ感受性結合によって、二環式ペプチドに連結される。さらなる実施形態では、ジスルフィド結合に隣接する基が、ジスルフィド結合の障害を制御するように、これによって切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）速度および細胞毒性剤の付随する放出を制御するように修飾される。
【０１３５】
公開されている研究は、ジスルフィド結合のいずれかの側に立体障害を導入することによって、ジスルフィド結合の感受性が低下するように修飾する可能性を確立した（Ｋｅｌｌｏｇｇ  ｅｔ  ａｌ（２０１１）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２２，７１７）。立体障害の程度が大きいほど、細胞内グルタチオン、また細胞外（全身性）還元剤による還元率を引き下げ、結果として、細胞の内側および外側の双方に毒素が放出される容易性を引き下げる。ゆえに、細胞内環境内での効率的な放出（治療効果を最大にする）に対する、循環中のジスルフィド安定性の最適条件の選択（毒素の不所望の副作用を最小にする）を、ジスルフィド結合のいずれかの側での妨害の程度の注意深い選択によって、達成することができる。
【０１３６】
ジスルフィド結合のいずれかの側にある障害は、標的化実体（ここでは、二環式ペプチド）上、または分子構築体の毒素側に、１個または複数のメチル基を導入することによって調節される。
【０１３７】
一実施形態では、細胞毒性剤およびリンカーは、国際公開第２０１６／０６７０３５号パンフレットに記載されるものの任意の組合せから選択される（それらの細胞毒性剤およびリンカーは、参照によって本明細書の一部をなすものとする）。
【０１３８】
［合成］
本発明のペプチドは、標準的な技術、それに続くインビトロでの分子足場との反応によって合成的に製造し得る。これが行われるとき、標準的な化学を使用し得る。これは、さらなる下流の実験または検証のための可溶性材料の急速で大規模な調製を可能とする。このような方法は、通常の化学、例えば、Ｔｉｍｍｅｒｍａｎら（上記）において開示されているものを使用して達成することができる。
【０１３９】
このように、本発明はまた、本明細書に示したように選択されたポリペプチドまたはコンジュゲートの製造に関し、ここで製造は、下記で例示したような任意選択のさらなるステップを含む。一実施形態では、これらのステップは、化学合成によって作製された最終生成物であるポリペプチド／コンジュゲート上で行われる。
【０１４０】
任意選択的に、目的のポリペプチド中のアミノ酸残基は、コンジュゲートまたは複合体を製造するとき、置換し得る。
【０１４１】
ペプチドはまた、例えば、別のループを組み込み、したがって複数の特異性を導入するために、伸長することができる。
【０１４２】
ペプチドを伸長させるために、それは、標準的な固相または液相化学を使用して、オルトゴナル保護されたリジン（および類似体）を使用して、そのＮ末端もしくはＣ末端において、またはループ内で単純に化学的に伸長し得る。標準的な（バイオ）コンジュゲーション技術を使用して、活性化されたまたは活性化可能なＮ末端またはＣ末端を導入し得る。あるいは、付加は、例えば、（Ｄａｗｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９４．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  Ｎａｔｉｖｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：７７６−７７９）に記載されているように、フラグメント縮合もしくは天然化学的ライゲーションによって、または例えば、（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１９９４  Ｄｅｃ  ２０；９１（２６）：１２５４４−８もしくはＨｉｋａｒｉ  ｅｔ  ａｌ  Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  Ｖｏｌｕｍｅ  １８，Ｉｓｓｕｅ  ２２，１５  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２００８，Ｐａｇｅｓ  ６０００−６００３）に記載されているように、スブチリガーゼ（ｓｕｂｔｉｌｉｇａｓｅ）を使用して酵素によって行い得る。
【０１４３】
あるいは、ペプチドは、ジスルフィド結合を介したさらなるコンジュゲーションによって伸長または修飾し得る。これは、いったん、細胞の還元性環境内にあれば、第１および第２のペプチドが互いから解離することを可能とするさらなる利点を有する。この場合、分子足場（例えばＴＡＴＡ）を、３個のシステイン基と反応するように第１のペプチドの化学合成中に加えることができる。次いで、さらなるシステインまたはチオールを、第１のペプチドのＮまたはＣ末端に添付することができ、その結果、このシステインまたはチオールは、第２のペプチドの遊離システインまたはチオールとのみ反応して、ジスルフィド連結二環式ペプチド−ペプチドコンジュゲートを形成する。
【０１４４】
同様の技術は、潜在的に四重特異性分子を生じさせる、２個の二環式二重特異性大環状分子の合成／カップリングに等しく適用される。
【０１４５】
さらに、他の官能基またはエフェクター基の付加は、適当な化学、ＮまたはＣ末端においてカップリングを使用して、または側鎖を介して、同じ様式で達成し得る。一実施形態では、カップリングは、いずれの実体の活性も遮断しない様式で行われる。
【０１４６】
［医薬組成物］
本発明のさらなる態様によれば、１種または複数の薬学的に許容される添加剤と組み合わせた、本明細書に定義されるペプチドリガンドまたは薬物コンジュゲートを含む医薬組成物が提供される。
【０１４７】
一般に、本ペプチドリガンドは、薬理学的に適当な添加剤または担体と一緒に精製された形態で利用されることとなる。典型的には、これらの添加剤または担体は、食塩水および／または緩衝化した媒体を含む、水溶液またはアルコール溶液／水溶液、エマルジョンまたは懸濁液を含む。非経口ビヒクルは、塩化ナトリウム溶液、リンゲルのデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウムおよび乳酸リンゲル液を含む。適切な生理学的に許容されるアジュバントは、ポリペプチド複合体を懸濁液中に保持することが必要であれば、増粘剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチンおよびアルギネートから選択し得る。
【０１４８】
静脈内ビヒクルは、液体および栄養素補充液および電解質補充液、例えば、リンゲルのデキストロースに基づくものを含む。保存剤および他の添加物、例えば、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤および不活性ガスがまた存在し得る（Ｍａｃｋ（１９８２）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）。
【０１４９】
本発明のペプチドリガンドは、別々に投与される組成物として、または他の薬剤と併せて使用され得る。これらは、抗体、抗体フラグメントおよび様々な免疫治療薬、例えば、シクロスポリン、メトトレキサート、アドリアマイシンまたはシスプラチンおよび免疫毒素を含むことができる。医薬組成物は、投与前にプールされるかどうかに拘らず、本発明のタンパク質リガンド、またはそれどころか異なる特異性を有する本発明による選択したポリペプチドの組合せ、例えば、異なる標的リガンドを使用して選択されるポリペプチドと併せた、様々な細胞毒性剤または他の薬剤の「カクテル」を含むことができる。
【０１５０】
本発明による医薬組成物の投与経路は、当業者には一般に公知の任意のものであってよい。治療のために、本発明のペプチドリガンドは、標準的な技術によって任意の患者に投与することができる。投与は、非経口的、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮的、肺の経路を介するもの、または適切な、カテーテルによる直接の注入によるものが挙げられる、適当なモードによってなされてよい。好ましくは、本発明による医薬組成物は、吸入によって投与されることとなる。投与量および投与の頻度は、患者の年齢、性別および状態、他の薬物の併行投与、逆の徴候（ｃｏｕｎｔｅｒｉｎｄｉｃａｔｉｏｎｓ）および臨床医が考慮する他のパラメーターによって決まる。
【０１５１】
本発明のペプチドリガンドを、貯蔵のために凍結乾燥し、使用の前に適切な担体中で再構成することができる。この技術は、有効であることが示されてきており、公知の凍結乾燥および再構成技術を用いることができる。凍結乾燥および再構成は、様々な程度の活性の損失をもたらし得、そのレベルは、補償するために上方に調節しなければならないことがあることを当業者は認識するであろう。
【０１５２】
本ペプチドリガンドまたはそのカクテルを含有する組成物は、予防的および／または治療的処置のために投与することができる。特定の治療的用途において、選択した細胞の集団の少なくとも部分阻害、抑制、モデュレーション、死滅、またはいくつかの他の測定可能なパラメーターを達成する適当な量は、「治療有効用量」として定義される。この投与量を達成するのに必要とされる量は、疾患の重症度および患者自身の免疫系の全体的状況によって決まるが、一般に、１キログラムの体重当たり０．００５〜５．０ｍｇの選択したペプチドリガンドの範囲であり、０．０５〜２．０ｍｇ／ｋｇ／用量の用量がより一般に使用される。予防的用途のために、本ペプチドリガンドまたはそのカクテルを含有する組成物はまた、同様または僅かにより低い投与量で投与し得る。
【０１５３】
本発明によるペプチドリガンドを含有する組成物は、哺乳動物における選択した標的細胞集団の変化、不活性化、死滅または除去を助けるために予防的および治療的設定において利用し得る。さらに、本明細書に記載されているペプチドリガンドは、体外でまたはインビトロで選択的に使用され、細胞の異種性コレクションからの標的細胞集団を死滅させるか、枯渇させるか、またはその他の方法で効果的に除去し得る。哺乳動物からの血液は、選択したペプチドリガンドと体外で合わせてもよく、それによって、標準的な技術によって、哺乳動物へと返すために、望ましくない細胞は死滅させるか、または血液から他の方法で除去される。
【０１５４】
［治療上の使用］
本発明の二環式ペプチドは、ＣＤ１３７結合剤として、特定の有用性を有する。
【０１５５】
ＣＤ１３７は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体ファミリーのメンバーである。その代替名は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー９（ＴＮＦＲＳＦ９）、４−ＩＢＢであり、リンパ球活性化（ＩＬＡ）によって誘導される。ＣＤ１３７は、活性化されたＴ細胞によって発現され得るが、その程度はＣＤ４＋Ｔ細胞上でよりもＣＤ８＋上で大きい。また、ＣＤ１３７発現は、樹状細胞、濾胞樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、顆粒球、および炎症部位の血管壁の細胞上で見出される。ＣＤ１３７の特徴付けられる一活性は、その、活性化されたＴ細胞に対する共刺激活性である。ＣＤ１３７の架橋は、Ｔ細胞増殖、ＩＬ−２分泌、生存および細胞溶解活性を増強する。さらに、マウスにおいて、腫瘍を消失させる免疫活性を増強することができる。
【０１５６】
ＣＤ１３７は、ＴＣＲ活性化の直後に誘導されるＴ細胞共刺激受容体である（Ｎａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ，５：３５７−３６３（２００５）；Ｗａｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２３：２３−６８（２００５））。活性化されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞上での発現に加えて、ＣＤ１３７はまた、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）およびＮＫ−Ｔ細胞、単球、好中球、ならびに樹状細胞上で発現される。Ｂ細胞、単球／マクロファージ、および樹状細胞が挙げられる抗原提示細胞上で、その天然のリガンドであるＣＤ１３７Ｌが説明されてきた（Ｗａｔｔｓ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，２３：２３−６８（２００５））。そのリガンドと相互作用してすぐに、ＣＤ１３７は、ＴＣＲによって誘導されるＴ細胞増殖、サイトカイン生成、機能成熟、および長期間にわたるＣＤ８＋Ｔ細胞生存を増大させる（Ｎａｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｕｒｒ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ，５：３５７−３６３（２００５），Ｗａｔｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，２３：２３−６８（２００５））。
【０１５７】
ＣＤ１３７Ｌ、またはＣＤ１３７に対するアゴニストモノクローナル抗体（ｍＡｂ）によるＣＤ１３７を介してのシグナル伝達は、ＴＣＲによって誘導されるＴ細胞増殖、サイトカイン生成、機能成熟、および長期間にわたるＣＤ８＋Ｔ細胞生存を増大させる。これらの作用は、（１）ＮＦ−κΒ、ｃ−Ｊｕｎ  ＮＨ２−末端キナーゼ／ストレス−活性化タンパク質キナーゼ（ＪＮＫ／ＳＡＰＫ）、およびｐ３８マイトジェン−活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）シグナル伝達経路の活性化、ならびに（２）抗アポトーシス関連遺伝子および細胞周期関連遺伝子の発現の制御に起因する。
【０１５８】
ＣＤ１３７欠損マウスおよびＣＤ１３７Ｌ欠損マウスの双方において実行した実験は、加えて、完全に競合的なＴ細胞応答の生成において、ＣＤ１３７共刺激の重要性を実証した。
【０１５９】
ＩＬ−２およびＩＬ−１５で活性化されたＮＫ細胞は、ＣＤ１３７を発現し、アゴニストｍＡｂによるＣＤ１３７のライゲーションは、ＮＫ細胞の増殖およびＩＦＮ−γ分泌を刺激するが、細胞溶解活性を刺激しない。
【０１６０】
さらに、ＣＤ１３７で刺激されたＮＫ細胞は、活性化されたＴ細胞のインビトロ増殖を促進する。
【０１６１】
それらの共刺激機能によれば、ＣＤ１３７に対するアゴニストｍＡｂは、心臓および皮膚の同種移植の拒絶を促進し、定着腫瘍を根絶し、一次抗ウイルスＣＤ８＋Ｔ細胞応答を広げ、かつＴ細胞細胞溶解能を増大させることを示してきた。これらの研究は、ＣＤ１３７シグナル伝達が、腫瘍および感染に対して免疫を増強し得るＴ細胞機能を促進するという見解を支持する。
【０１６２】
本発明の方法に従って選択されるポリペプチドリガンドは、インビボでの治療的および予防的用途、インビトロおよびインビボでの診断用途、インビトロでのアッセイおよび試薬用途等において用いてもよい。選択したレベルの特異性を有するリガンドは、ヒトではない動物における試験が関与する用途（ここでは、交差反応性が望ましい）、または診断用途（ここでは、相同体またはパラログとの交差反応性は、注意深く制御する必要がある）において有用である。いくつかの用途、例えば、ワクチン用途において、所定の範囲の抗原に対して免疫応答を引き出す能力を利用して、特定の疾患および病原体に対してワクチンを調整することができる。
【０１６３】
少なくとも９０〜９５％の均質性の実質的に純粋なペプチドリガンドは、哺乳動物への投与のために好ましく、９８〜９９％またはそれ超の均質性は、特に、哺乳動物がヒトであるとき、製薬学的用途のために最も好ましい。所望の通り部分的にまたは均一となるまで精製すると、選択したポリペプチドは、診断的もしくは治療的に（体外を含めた）、またはアッセイ手順、免疫蛍光染色などを開発し、行うことにおいて使用し得る（Ｌｅｆｋｏｖｉｔｅ  ａｎｄ  Ｐｅｒｎｉｓ，（１９７９  ａｎｄ  １９８１）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）。
【０１６４】
本発明のさらなる態様によれば、ＣＤ１３７によって媒介される疾患または障害の予防、抑制または処置において使用するための、本明細書中に定義されるようなペプチドリガンドまたは薬物コンジュゲートが提供される。
【０１６５】
本発明のさらなる態様によれば、ＣＤ１３７によって媒介される疾患または障害を予防、抑制または処置する方法であって、これを必要とする患者に、エフェクター基および本明細書に定義されるペプチドリガンドの薬物コンジュゲートを投与することを含む方法が提供される。
【０１６６】
一実施形態では、ＣＤ１３７は、哺乳類のＣＤ１３７である。さらなる実施形態では、哺乳類のＣＤ１３７は、ヒトＣＤ１３７（ｈＣＤ１３７）である。
【０１６７】
一実施形態では、ＣＤ１３７によって媒介される疾患または障害は、がん、感染、および炎症から選択される。さらなる実施形態では、ＣＤ１３７によって媒介される障害または疾患は、がんから選択される。
【０１６８】
処置（または阻害）し得るがん（およびそれらの良性の対応物）の例には、これらに限定されないが、上皮由来の腫瘍（腺がん、扁平上皮がん、移行上皮がんおよび他の癌腫を含めた様々なタイプの腺腫および癌腫）、例えば、膀胱および尿路、乳房、胃腸管（食道、胃（胃の）、小腸、結腸、直腸および肛門を含めた）、肝臓（肝細胞がん）、胆嚢および胆管系、膵外分泌部、腎臓，肺（例えば、腺がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、気管支肺胞上皮がんおよび中皮腫）、頭頸部（例えば、舌、口腔、喉頭、咽頭、上咽頭、扁桃、唾液腺、鼻腔および副鼻腔のがん）、卵巣、輪卵管、腹膜、膣、外陰部、陰茎、子宮頸部、子宮筋層、子宮内膜、甲状腺（例えば、甲状腺濾胞腺がん）、副腎、前立腺、皮膚および付属器（例えば、黒色腫、基底細胞がん、扁平上皮細胞がん、角化棘細胞腫、異形成母斑）の癌腫；血液学的悪性腫瘍、およびリンパ球系統の関連する状態（例えば、急性リンパ球性白血病［ＡＬＬ］、慢性リンパ球性白血病［ＣＬＬ］、Ｂ細胞リンパ腫、例えば、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫［ＤＬＢＣＬ］、濾胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫および白血病、ナチュラルキラー［ＮＫ］細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、毛様細胞白血病、意義不明な単クローン性ガンマグロブリン血症、形質細胞腫、多発性骨髄腫、および移植後のリンパ増殖性障害）、ならびに血液学的悪性腫瘍および骨髄細胞系統の関連する状態（例えば、急性骨髄性白血病［ＡＭＬ］、慢性骨髄性白血病［ＣＭＬ］、慢性骨髄単球性白血病［ＣＭＭＬ］、好酸球増加症候群、骨髄増殖性障害、例えば、真性多血症、本態性血小板血症および原発性骨髄線維症、骨髄増殖性症候群、骨髄異形成症候群、および前骨髄球性白血病）を含めた血液学的悪性腫瘍（すなわち、白血病、リンパ腫）、ならびに前悪性血液障害およびボーダーライン悪性腫瘍の障害；間葉起源の腫瘍、例えば、軟部組織、骨または軟骨の肉腫、例えば、骨肉腫、線維肉腫、軟骨肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、血管肉腫、カポジ肉腫、ユーイング肉腫、滑膜肉腫、類上皮肉腫、胃腸間質腫瘍、良性および悪性の組織球腫、ならびに隆起性皮膚線維肉腫；中枢または末梢神経系の腫瘍（例えば、星状細胞腫、神経膠腫および神経膠芽腫、髄膜腫、上衣腫、松果体腫瘍およびシュワン細胞腫）；内分泌腫瘍（例えば、下垂体腫瘍、副腎腫瘍、島細胞腫瘍、副甲状腺腫瘍、カルチノイド腫瘍および甲状腺の髄様がん）；目および付属器腫瘍（例えば、網膜芽細胞腫）；生殖細胞および絨毛性腫瘍（例えば、奇形腫、精上皮腫、未分化胚細胞腫、胞状奇胎および絨毛がん）；ならびに小児および胎児性腫瘍（例えば、髄芽細胞腫、神経芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、および原始神経外胚葉性腫瘍）；または患者を悪性腫瘍に対して影響を受けやすくさせる先天性もしくはその他の症候群（例えば、色素性乾皮症）が含まれる。
【０１６９】
さらなる実施形態では、がんは、造血器悪性腫瘍から選択され、例えば、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、Ｂ慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）、ＢおよびＴ急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、Ｔ細胞リンパ腫（ＴＣＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）から選択される。
【０１７０】
本明細書において用語「予防」への言及は、疾患の誘発の前の保護的組成物の投与が関与する。「抑制」は、誘導的事象の後であるが、疾患の臨床的な出現の前の組成物の投与を指す。「処置（治療）」は、病徴が明らかとなった後の防護的組成物の投与が関与する。
【０１７１】
疾患から保護するか、疾患を処置することにおいて、ペプチドリガンドの有効性をスクリーニングするために使用することができる動物モデル系が利用可能である。動物モデル系の使用は、ヒトおよび動物標的と交差反応することができ、動物モデルの使用を可能にするポリペプチドリガンドの開発を可能にする本発明によって促進される。
【０１７２】
本発明を、下記の実施例を参照して下記でさらに記載する。
【実施例】
【０１７３】
［材料および方法］
＜ペプチド合成＞
ペプチド合成は、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓによって製造されたＳｙｍｐｈｏｎｙペプチド合成機、およびＭｕｌｔｉＳｙｎＴｅｃｈによるＳｙｒｏ  ＩＩ合成機を使用したＦｍｏｃ化学に基づいた。適当な側鎖保護基を有する標準的なＦｍｏｃ−アミノ酸を用いた（Ｓｉｇｍａ、Ｍｅｒｃｋ）。該当する場合、標準的なカップリング条件を各々の場合に用いた後、標準的な方法論を用いて脱保護した。ペプチドを、ＨＰＬＣを用いて精製して、単離後、１，３，５−トリアクリロイルヘキサヒドロ−１，３，５−トリアジン（ＴＡＴＡ、Ｓｉｇｍａ）で修飾した。このために、直鎖状ペプチドを、５０：５０のＭｅＣＮ：Ｈ２Ｏで約３５ｍＬまで希釈して、アセトニトリル中の約５００μＬの１００ｍＭのＴＡＴＡを加えて、Ｈ２Ｏ中の５ｍＬの１ＭのＮＨ４ＨＣＯ３で反応を開始させた。反応をＲＴにて約３０〜６０分間進めて、反応が完了すると（ＭＡＬＤＩによって判断）、凍結乾燥させた。完了すると、Ｈ２Ｏ中の１ｍｌの１ＭのＬ−システイン塩酸塩一水和物（Ｓｉｇｍａ）を、約６０分間のＲＴでの反応に加えて、過剰ＴＡＴＡをクエンチした。
【０１７４】
凍結乾燥に続いて、修飾されたペプチドを上記のように精製し、その間、Ｌｕｎａ  Ｃ８をＧｅｍｉｎｉ  Ｃ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）と置き換え、酸を０．１％トリフルオロ酢酸に変更した。正確なＴＡＴＡ−修飾材料を含有する純粋な画分をプールし、凍結乾燥し、貯蔵のために−２０℃にて保持した。
【０１７５】
全てのアミノ酸は、他に断らない限り、Ｌ型配置のものを使用した。
【０１７６】
場合によっては、ペプチドは、以下の方法を用いて、毒素の遊離チオール基とのカップリング前に活性化ジスルフィドに変換される；４−メチル（スクシンイミジル４−（２−ピリジルチオ）ペンタノアート）（１００ｍＭ）の乾燥ＤＭＳＯ（１．２５ｍｏｌ当量）溶液を、ペプチド（２０ｍＭ）の乾燥ＤＭＳＯ（１ｍｏｌ当量）溶液に加えた。反応液を十分に混合して、ＤＩＰＥＡ（２０ｍｏｌ当量）を加えた。反応を、ＬＣ／ＭＳによって、完了するまで監視した。
【０１７７】
＜略語＞
Ａａｄ  ２−アミノアジピン酸
Ａｂｕ  ２−アミノ酪酸
Ａｃ５ｃ  アミノシクロペンタンカルボン酸
Ａｈｐ  アミノヘプタン酸
Ａｉｂ  アミノイソ酪酸
Ｍｅ−Ａｌａ  メチルアラニン
ＮＭｅ−Ａｌａ  Ｎ−メチルアラニン
ｔＢｕＡｌａ  ｔ−ブチルアラニン
Ａｐｉ  アミノピメリン酸
Ａｚｅ  アゼチジン
４，４−ＢＰＡ  ４，４−ビフェニルアラニン
ＣＦ３Ｇ  トリフルオロメチル−アラニン
Ｃｈａ  ３−シクロヘキシルアラニン
Ｃｈｇ  Ｌ−シクロヘキシルグリシン
Ｃｉｔ  シトルリン
Ｈ−Ｃｙｓ  ホモシステイン
Ｄａｐ  ジアミノピメリン酸
Ｆｌ  フルオレセイン
ＮＭｅＧｌｕ  Ｎ−メチルグルタミン酸
ＨＧｌｎ  ホモグルタミン
ＨｙＰ  ヒドロキシプロリン
Ｈｌｅｕ  ホモロイシン
Ｎｌｅ  ノルロイシン
Ｎａｌ  ナフチルアラニン
ＮＭｅｌｌｅ  Ｎ−メチル−イソロイシン
Ｏｉｃ  オクタヒドロインドールカルボン酸
Ｏｘａ  オキサゾリジン−４−カルボン酸
Ｐａｌ  ピリジルアラニン
Ｐｅｎ  ペニシラミン
ｐＣａＰｈｅ  ｐａｒａ−カルバモイル−フェニルアラニン
ｐＣｏＰｈｅ  ｐａｒａ−カルボキシ−フェニルアラニン
Ｐｈｇ  フェニルグリシン
ＨＰｈｅ  ホモフェニルアラニン
ＦＰｈｅ  フルオロフェニルアラニン
ＭｅＰｈｅ  メチルフェニルアラニン
ＭｅＯＰｈｅ  メトキシフェニルアラニン
ｔＢｕＰｈｅ  ｔ−ブチルフェニルアラニン
ＮＯ２Ｐｈｅ  ニトロフェニルアラニン
ＢｒＰｈｅ  ブロモフェニルアラニン
Ｐｉｐ  ピペコリン酸
５，５−ｄｍＰ  ５，５−ジメチル−Ｌ−プロリン
Ｓａｒ  サルコシン
ＨＳｅ（ｍｅ）  ホモセリン（Ｍｅ）
ＴｅｔｒａＺ  テトラゾールアラニン
ＮＭｅＴｙｒ  Ｎ−メチルチロシン
【０１７８】
［生物学的データ］
＜１．  ＣＤ１３７直接結合アッセイ＞
ヒトＣＤ１３７（Ｋｉ）に対する本発明のペプチドの親和性を、国際公開第２０１６／０６７０３５号パンフレットに開示される方法に従う蛍光偏光アッセイを用いて判定した。本発明のペプチドを、蛍光タグ（フルオレセイン、Ｆｌ）で標識して、１００ｍＭのＮａＣｌおよび０．０５％ｔｗｅｅｎ（ｐＨ７．５）と、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ中２．５ｎＭに希釈した。ＣＤ１３７タンパク質を、黒色の壁および底の低結合低容量３８４ウェルプレート内で、ペプチドと同じアッセイバッファ中３μＭから始めて滴定して、２５μＬの総容量中１ｎＭペプチドをアッセイした。典型的には、５μＬアッセイバッファ、１０μＬ  ＣＤ１３７タンパク質、その後１０μＬ蛍光ペプチドを加えることによって、アッセイをセットアップした。ＣＤ１３７タンパク質の濃度は、３μＭから始まる１２個の異なる濃度を与えるような２分の１段階希釈であった。ＦＰ  ４８５  ５２０  ５２０光モジュールを備えたＢＭＧ  ＰＨＥＲＡｓｔａｒ  ＦＳで、２５℃にて、ウェルあたり２００フラッシュで、かつ０．１秒の位置決め遅延で、測定を行った。あるいは、３０フラッシュに設定したＦＩＴＣ  ＦＰ  Ｄｕａｌ  Ｅｎｈミラーを備えたＥｎｖｉｓｉｏｎ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて、測定を実行した。各ウェルを、５分毎に６０分間測定した。分析に用いたゲインを、タンパク質がウェル内になかった６０分の終了後、各トレーサーについて判定した。ｍＰを、二次方程式の標準的な１：１結合モデルにフィットさせて、Ｋｄ値を生じさせた。本発明の選択したペプチドを、上述のアッセイで試験した。結果を表１〜３に示す。
【０１７９】
【表１Ａ】
2020529427.tif 000005
【表１Ｂ】
2020529427.tif 000006
【表１Ｃ】
2020529427.tif 000007
【０１８０】
【表２Ａ】
2020529427.tif 000008
【表２Ｂ】
2020529427.tif 000009
【０１８１】
【表３Ａ】
2020529427.tif 000010
【表３Ｂ】
2020529427.tif 000011
【表３Ｃ】
2020529427.tif 000012
【表３Ｄ】
2020529427.tif 000013
【０１８２】
＜２．  ＣＤ１３７  ビアコア実験＞
（ａ）アミンカップリングしたＣＤ１３７標的アッセイの記述
ビアコア実験を実行して、ヒトＣＤ１３７（ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）タンパク質に結合するペプチドのｋａ（Ｍ−１ｓ−１）、ｋｄ（ｓ−１）、ＫＤ（ｎＭ）値を求めた。ＣＤ１３７タンパク質を希釈して、チップＣＭ５（＃ＢＲ−１００５−３０）に標準的なアミンカップリング手順を用いて固定した。ＣＤ１３７タンパク質を、ＮａＡｃ  ｐＨ５．５中１０μｇ／ｍｌに希釈して、カップリングに用いた。次に、エタノールアミンを注入して、残る活性エステルを不活化する。
【０１８３】
ＣＤ１３７タンパク質を、ＣＤ１３７タンパク質の１８０ＲＵにて固定して、２５００ＭＷのペプチドが約２５ＲＵになる最大の理論上の結合応答を生じさせた。タンパク質標的を注入しなかった以外は正確に同じ手順に従うアミンカップリングの場合に、参照流細胞（Ｆｃ１またはＦｃ３）のブランク固定を実行する。ペプチドを、３００〜４５０ｎＭの出発濃度にて試験され、１／２段階希釈で希釈した。ＤＭＳＯ濃度を、一定のままになるように調整した。
【０１８４】
以下のように、流量５０μｌ／分、２００秒の結合、６００秒の解離、かつ６０秒の安定化にて、ペプチド結合動態解析を実行した。１：１モデルＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを用いて、二環式ペプチドをフィットさせた。
【０１８５】
本発明の選択したペプチドを、上述のアッセイで試験した。結果を表４に示す。
【０１８６】
【表４】
2020529427.tif 000014
【０１８７】
（ｂ）ビオチン化したＣＤ１３７標的アッセイの記述
ビアコア実験を実行して、ヒトＣＤ１３７タンパク質に結合するペプチドのｋａ（Ｍ−１ｓ−１）、ｋｄ（ｓ−１）、ＫＤ（ｎＭ）値を求めた。組換えヒトＣＤ１３７ホモトリマー（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を、ＰＢＳ中に再懸濁させて、メーカーの示唆したプロトコルのように、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（商標）Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を用いてビオチン化した。タンパク質を脱塩して、非カップリングビオチンを、スピンカラムを用いてＰＢＳ中に除去した。
【０１８８】
結合の分析のために、ＸａｎＴｅｃ  ＣＭＤ５００Ｄチップを利用して、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００機器を用いた。ランニングバッファとしてのＨＢＳ−Ｎ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）による、標準的なアミン−カップリング化学を２５℃にて用いて、ストレプトアビジンをチップ上に固定した。手短に言うと、カルボキシメチルデキストランの表面を、１：１の比率の０．４Ｍの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）／０．１ＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の７分の、１０μｌ／分の流量での注入により、活性化した。ストレプトアビジンの捕捉のために、タンパク質を、１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）中で０．２ｍｇ／ｍｌに希釈して、１２０μｌを、活性化されたチップ表面上に注入することによって、捕捉した。残りの活性化された基を、１Ｍエタノールアミン（ｐＨ８．５）の７分の注入でブロックして、ビオチン化されたＣＤ１３７を、８００〜１８００ＲＵのレベルまで捕捉した。バッファを、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０に変えて、段階希釈のペプチドを、０．５％の最終ＤＭＳＯ濃度のバッファ中に調製した。トップのペプチド濃度は、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中で、６倍、さらに３倍（５００ｎＭ）、または２倍（１０μＭ）の希釈により、５００ｎＭまたは１０μＭであった。ＳＰＲ分析を、６０秒の結合および１００〜６００秒の解離で、９０μｌ／分の流量にて２５℃で走らせた。各サイクルの後、再生ステップ（１０μｌの１０ｍＭグリシン（ｐＨ２））を用いた。データを、ＤＭＳＯ除外容量作用について補正した。標準的なプロセシング手順を用いて、全てのデータを、ブランク注入および参照表面について二重参照（ｄｏｕｂｌｅ−ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｄ）して、データプロセシングおよび動態フィッティングを、Ｓｃｒｕｂｂｅｒソフトウェア、バージョン２．０ｃ（ＢｉｏＬｏｇｉｃ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて実行した。必要に応じて、物質移動効果を許容する物質移動モデルを用いて、データをフィットさせた。
【０１８９】
本発明の選択したペプチドを、上述のアッセイで試験した。結果を表５に示す。
【０１９０】
【表５Ａ】
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【表５Ｂ】
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【表５Ｃ】
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【表５Ｄ】
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【０１９１】
＜３．  ＣＤ１３７細胞活性＞
ＣＤ１３７特異的ペプチドの生物活性を、細胞ＣＤ１３７ルシフェラーゼリポーターアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて試験した。この市販のキット内の細胞は、ＣＤ１３７の下流で活性化されるルシフェラーゼを発現する。このアッセイを用いて、アゴニズム（ＣＤ１３７リガンド、ＣＤ１３７Ｌによって例示される）およびアンタゴニズム（二環式ペプチド７４−０１−０４−Ｎ００２によって例示される）を評価することができる。
【０１９２】
Ｐｒｏｍｅｇａ  ＣＤ１３７細胞活性アッセイは、ＮＦ−κＢルシフェラーゼ発光を、Ｊｕｒｋａｔ細胞中のＣＤ１３７活性化のリードアウトとして用いる。手短に言うと、ＦＢＳを解凍して、１％ＦＢＳをＲＰＭＩ−１６４０（ＰｒｏｍｅｇａキットＣＳ１９６００５）に加えることにより培地を調製することによって、実験を実行した。アッセイにおいて、最終濃度としてＲＰＭＩ−１６４０培地中１００ｎＭに希釈したアゴニズムＣＤ１３７Ｌ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ２２９５−４Ｌ／ＣＦ）を与える濃度にて、アゴニストを希釈した。希釈してから、滅菌した９６ウェルプレート内で二環式ペプチドを減量調節した。二環式ペプチドについて示唆される出発濃度は１０μＭであり、アゴニストＣＤ１３７Ｌに対して１００倍の超過である。再現サンプル用に十分な試薬を調製してから、１／３段階希釈を実行した。陽性対照ＣＤ１３７Ｌおよび二環式ペプチドのみを含めた。水浴でＣＤ１３７−Ｊｕｒｋａｔ細胞を解凍してから、５００μｌの細胞を、９．５ｍｌの予め温めた１％ＦＢＳのＲＰＭＩ−１６４０培地に加えた。白色の細胞培養プレートに５０μｌ細胞／ウェルを加えた。１２．５μｌの二環式ペプチドを（６×最終濃度にて）細胞に加えた。その後、再現サンプルとして１２．５μｌのアゴニストを（６×最終濃度にて）、または１％ＦＢＳのＲＰＭＩ−１６４０のみをバックグラウンド対照として加えた。
【０１９３】
細胞を、ＣＤ１３７Ｌアゴニストおよび二環式ペプチドと、３７℃、５％ＣＯ２にて６時間、共インキュベートした。６時間後、Ｂｉｏ−Ｇｌｏ（商標）を解凍して、室温にてアッセイを進めた。ウェルあたり７５μｌのＢｉｏ−Ｇｌｏ（商標）を加えて、５〜１０分インキュベートした。ＰｈｅｒａｓｔａｒプレートリーダーＬＵＭ  ｐｌｕｓモデルで発光シグナルを読んで、ＭＡＲＳソフトウェアを用いて３６００をゲインした。ＣＤ１３７Ｌのみと比較して、パーセンテージ阻害を算出することによって、データを分析した。データをｘ＝ｌｏｇ（Ｘ）に変換してから、応答変数スロープ（４パラメーター）に対して対数（インヒビタ）をプロットして、ＩＣ５０値を算出した。
【０１９４】
Ｐｒｏｍｅｇａ  ＣＤ１３７細胞リポーターアッセイ（製品番号ＣＳ１９６００８）を用いて、天然のリガンドＣＤ１３７Ｌ誘導を阻害する際のペプチドＢＣＹ５９２（７４−０１−０４−Ｎ００２；配列番号１８９）のアンタゴニスト作用を求めた。ＣＤ１３７アッセイ細胞を、三量体ＣＤ１３７Ｌ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）＋ＢＣＹ５９２ペプチドと共インキュベートした。ＣＤ１３７リポーター活性を、ＮＦ−κＢプロモーター駆動ルシフェラーゼ活性として求めた。ペプチドＢＣＹ５９２の作用を、アッセイにおけるベースラインＣＤ１３７Ｌ活性に対する阻害％としてプロットして、ＩＣ５０値を求めるのに用いた。
【０１９５】
結果を図１に示す。ここでは、ＣＤ１３７に対して特異的な二環式ペプチドＢＣＹ５９２が、ＣＤ１３７Ｌ活性を阻害するアンタゴニストとして作用することができると分かる。この結果は、ＣＤ１３７生物活性をブロックすることが所望される状況でこのペプチドを用いることができることを示す。ＣＤ１３７活性は、局所の免疫細胞によって駆動される炎症に起因して、肝障害を引き起こし得ることが知られている。したがって、二環式ペプチドＢＣＹ５９２（推論によって、本発明の他の二環式ＣＤ１３７ペプチド）は、ＣＤ１３７−ＣＤ１３７Ｌ駆動炎症を引き下げ得、ＣＤ１３７アゴニストの肝毒性を引き下げることとなると考えられる。
【０１９６】
＜４．  蛍光偏光競合結合アッセイ＞
ｈＣＤ１３７特異的Ｂｉｃｙｃｌｅペプチドの結合部位を、蛍光標識されたＣＤ１３７結合ペプチドと、天然のリガンドＣＤ１３７Ｌ、アゴニスト抗体ウレルマブおよびウトミルマブとの競合実験によって判定した。ウレルマブ抗体は、固有の結合部位に結合する一方、ＣＤ１３７Ｌおよびウトミルマブは双方とも、リガンド結合部位と呼ばれる部位に結合する。
【０１９７】
競合物アゴニストＣＤ１３７Ｌ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）、ウレルマブ、およびウトミルマブを、アッセイバッファ（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％Ｐ２０、ｐＨ７．５）内で、５００〜１０００ｎＭのトップ濃度に希釈した。ヒトＣＤ１３７タンパク質（ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、アッセイにおいて、５００ｎＭの最終濃度に希釈した。最後に、蛍光トレーサーペプチドＢＣＹ６４０（７４−０１−０４−Ｎ００１）を、１ｎＭにて加えた。典型的には、５μＬのアゴニスト競合物、１０μＬのＣＤ１３７タンパク質、その後に１０μＬの蛍光ペプチドを加えることによって、アッセイをセットアップした。黒色の壁および底の低結合低容量３８４ウェルプレート内で、２５μＬの総容量を調製した。ＦＰ  ４８５  ５２０  ５２０光モジュールを備えたＢＭＧ  ＰＨＥＲＡｓｔａｒ  ＦＳで、２５℃にて、ウェルあたり２００フラッシュで、かつ０．１秒の位置決め遅延で、測定を行った。各ウェルを、５分毎に６０分間測定した。ゲインを、標的タンパク質なしでトレーサーを含有するウェル内にセットした。リードした６０分の終了後のｍＰ値を、アゴニストの濃度に対してプロットした。ｍＰ値の低下は、既知のアゴニストとトレーサーペプチドとの競合を示す。
【０１９８】
結果を図２および図３に示す。ここでは、ＣＤ１３７結合Ｂｉｃｙｃｌｅ（ＢＣＹ６４０）が、天然のＣＤ１３７リガンド（ＣＤ１３７Ｌ）およびＣＤ１３７抗体（ウトミルマブ）の双方と共有される生理的に関連したエピトープに結合することが分かる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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