(57)【要約】  本発明は、試験化合物が硫黄系匂い物質からの悪臭を中和し得るかどうかを決定するための方法に関する。当該方法は、試験化合物および硫黄系匂い物質を嗅覚受容体ＯＲ４Ｅ２と接触させることと、試験化合物の存在下および非存在下における硫黄系匂い物質へのＯＲ４Ｅ２の結合またはＯＲ４Ｅ２の活性を比較することとを包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験化合物が硫黄系匂い物質からの知覚される悪臭を中和し得るかどうかを決定するための方法であって、
前記方法が：
ａ）ＯＲ４Ｅ２への前記硫黄系匂い物質の結合を許すかまたは前記硫黄系匂い物質によるＯＲ４Ｅ２の活性化を許す条件下において、試験化合物の存在下および非存在下、ＯＲ４Ｅ２ポリペプチドを前記硫黄系匂い物質と接触させるステップと；
ｂ）試験化合物の存在下および非存在下における前記硫黄系匂い物質へのＯＲ４Ｅ２の結合またはＯＲ４Ｅ２の活性を比較するステップと；
を含み、
試験化合物の非存在下における結合または活性に対して相対的に、試験化合物の存在下における結合の阻害または活性の減少が、硫黄系匂い物質からの知覚される悪臭を中和し得る化合物として試験化合物を同定する、
方法。
【請求項２】
ステップａ）がＯＲ４Ｅ２を発現する細胞内または上において行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞が哺乳類細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記哺乳類細胞が、ヒト胚性腎臓細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、および前記細胞の膜調製物から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ステップａ）がＣｕ２＋イオンの存在下において行われる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ＯＲ４Ｅ２ポリペプチドが配列（配列番号１）を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ＯＲ４Ｅ２ポリペプチドが、少なくとも８５％の同一性を配列番号１に対して有する配列を有するが、ただし、配列番号１の位置１２、４２、１１８、１６５、２３４、２３７、２４１、および２７０のアミノ酸は保存されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ＯＲ４Ｅ２ポリペプチドが配列（配列番号２）を有する核酸によってコードされる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ステップｂ）において、試験化合物の存在下および非存在下における硫黄系匂い物質と接触させられたＯＲ４Ｅ２の活性を比較することを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ステップｂ）が：
ｉ）コントロールに対するＯＲ４Ｅ２の応答を測定することと；
ｉｉ）試験化合物の非存在下において硫黄系匂い物質に対するＯＲ４Ｅ２の応答を測定することと；
ｉｉｉ）第１の倍率変化［ＦＯＣ１＝ステップｉ）において得られた応答によって除算されたステップｉｉ）において得られた応答］を計算することと；
ｉｖ）試験化合物の存在下において硫黄系匂い物質に対するＯＲ４Ｅ２の応答を測定することと；
ｖ）第２の倍率変化［ＦＯＣ２＝ステップｉ）において得られた応答によって除算されたステップｉｖ）において得られた応答］を計算することと；
ｖｉ）ＦＯＣ１およびＦＯＣ２を比較することと、
を含み、
ＦＯＣ２／ＦＯＣ１の比が０．８未満である場合には、試験化合物が、硫黄系匂い物質からの知覚される悪臭を中和し得る化合物として同定される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＦＯＣ２／ＦＯＣ１の比が、例えば０．５未満、０．１未満、０．０５未満、または０．０１未満などの、０．７未満である場合には、試験化合物が、硫黄系匂い物質からの知覚される悪臭を中和し得る化合物として同定される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
硫黄系匂い物質が、スルファニルアルカノール、例えば２−メルカプト−３−メチル−１−ブタノール、３−メルカプト−２−メチル−１−ペンタノール、３−メルカプト−２−メチル−１−プロパノール、３−メルカプト−３−メチル−１−ブタノール、３−メルカプト−１−ヘキサノール、３−メチル−３（２−メチルジスルファニル）−ブタン−１−オール、または３−メルカプト−３−メチル−１−ヘキサノール；スルファニルアルデヒドまたはケトン、例えば３−メルカプト−２−メチルペンタナール、１−メルカプト−３−ペンタノン、２−メルカプト−３−ペンタノン、または３−メルカプト−３−ペンタノン；スルファニルエステル、例えば３−メチル−３−メルカプトブチルアセテートまたは３−メチル−３−メルカプトブチルフォルメート；チオール、例えば１−メトキシヘプタン−３−チオール、４−メトキシ−２−メチルブタン−２−チオール、または１−プロパンチオール；チオグリコール酸；ジチオグリコール酸；スルフィド、例えばメチル−２−プロペニルジスルフィド、ジメチルスルフィド、ジメチルジスルフィド、ジメチルトリスルフィド、ジアリルスルフィド、ジアリルジスルフィド、またはジアリルトリスルフィド；アリルメルカプタン；アリシン；アリイン；およびシステインから選択される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
硫黄系匂い物質がスルファニルアルカノールまたはスルフィドである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法によって同定される化合物を含む、家庭用、洗濯用、パーソナルケア、アニマルケア、または産業用製品。
【請求項１５】
硫黄系匂い物質からの知覚される悪臭を中和し得る化合物を同定するためのＯＲ４Ｅ２ポリペプチドの使用。
【請求項１６】
ＯＲ４Ｅ２ポリペプチドが配列（配列番号１）を有する、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
ＯＲ４Ｅ２ポリペプチドが配列（配列番号２）を有する核酸によってコードされる、請求項１５に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、悪臭、特に硫黄系匂い物質からの悪臭を中和し得る化合物を同定するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトは多種多様な化学物質が別個の匂いを有していると知覚する。匂い知覚は鼻において開始し、そこでは匂い物質が嗅覚受容体（ＯＲ）の大きいファミリーによって検出される。
【０００３】
嗅覚受容体蛋白質は、単一コードエキソン遺伝子から生ずるＧ蛋白質共役受容体（ＧＰＣＲ）の大きいファミリーのメンバーである。嗅覚受容体は多くの神経伝達物質受容体およびホルモン受容体と共通に７回膜貫通型ドメイン構造を持っており、匂い物質シグナルの認識とＧ蛋白質によって媒介される伝達とを担っている。
【０００４】
天然または人工起源の揮発性化合物は、呼吸上皮に所在するＧ蛋白質共役受容体の特定のセットによって検出され得る。１つの匂い物質は複数の嗅覚受容体（ＯＲ）を活性化できるということと、１つのＯＲは異なる匂い物質を検出できるということとが提唱されている（非特許文献１）。ヒトゲノムは２つの主要なクラスに属する〜４００個の完全な嗅覚受容体遺伝子を含有している。クラスＩの「魚類型受容体」ＯＲはおそらく水溶性の匂い物質を検出し、一方で、クラスＩＩの「四肢動物特異的受容体」ＯＲは空気中の揮発性物質に対して応答すると考えられている（非特許文献２）。
【０００５】
最近、異種細胞において（メチルチオ）メタンチオールに応答するマウス嗅覚受容体が同定された（非特許文献３）。
【０００６】
ヒト体臭は、皮膚表面に存在する天然物質ならびに汗および脂腺からの分泌物から作り出される。それらの物質は酸化的分解または皮膚微生物による代謝によって特徴的な匂い化合物に変換される。
【０００７】
ヒトアポクリン汗腺分泌物は、高濃度で腋窩に存在する皮膚フローラの作用によって高度に個人的な匂いを生成することが公知である。揮発性ステロイド、脂肪族の分枝および直鎖脂肪酸はヒト腋臭の主な寄与因子として報告されている。具体的には、３−ヒドロキシ−３−メチル−２−ヘキサン酸は腋分泌物中に存在するグルタミンコンジュゲートを起源とすることが見いだされた（非特許文献４）。
【０００８】
硫黄含有化合物もまたヒト腋臭の寄与因子であることが見いだされている（非特許文献４；非特許文献５）。硫黄含有化合物は着用済みの洗濯物上においてはＬ−メチオニンの異化から（非特許文献６）、および尿から（非特許文献７）もまた同定されている。
【０００９】
場合によっては、硫黄含有物質、例えばヘアトリートメント製品のためのチオグリコール酸または塩およびシステインは、活性成分として消費者または産業用製品に意図的にもまた追加されており、克服されることを必要とする望ましくないベース臭を製品に与える。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Malnic B, Hirono J, Sato T, Buck LB. "Combinatorial receptor codes for odors." Cell 1999 96(5):713-23
【非特許文献２】Glusman G, Bahar A, Sharon D, Pilpel Y, White J, Lancet D. "The olfactory receptor gene superfamily: data mining, classification, and nomenclature. Mamm." Genome 2000 11(11):1016-23
【非特許文献３】Duan X, Block E, Li Z, Connelly T, Zhang J, Huang Z, Su X, Pan Y, Wu L, Chi Q, Thomas S, Zhang S, Ma M, Matsunami H, Chen GQ, Zhuang H. "Crucial role of copper in detection of metal-coordinating odorants." Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2012 109(9):3492-7
【非特許文献４】Troccaz. "The biosynthetic pathway of sulphur-containing molecules in Human Axillary Malodor: from precursors to odorous volatiles." These de doctorat : Univ. Geneve, 2009, no. Sc. 4102 (https://archive-ouverte.unige.ch/unige:4563)
【非特許文献５】Natsch A, Schmid J, Flachsmann F. "Identification of odiferous sulfanylalkanols in human axilla secretions and their formation through cleavage of cysteine precursors by a C-S lyase isolated from axilla bacteria." Chemistry & Biodiversity 2004 1(7):1058-1072
【非特許文献６】Denawaka C, Fowlis, I, Dean J. "Source, impact and removal of malodour from soiled clothing." Journal of Chromatography A 2016 (1438): 216-225
【非特許文献７】Troccaz M, Niclass Y, Anziani P, Starkenmann C. "The influence of thermal reaction and microbial transformation on the odour of human urine." Flavour & Fragrance Journal 2013 (28) : 200-211.
【非特許文献８】Li S, Ahmed L, Zhang R, Pan Y, Matsunami H, Burger JL, Block E, Batista VS, Zhuang H. "Smelling sulfur: copper and silver regulate the response of human odorant receptor OR2T11 to low-molecular-weight thiols." Journal of the American Chemical Society 2016 (doi:10.1021/jacs6b06983)
【非特許文献９】Noe F, Polster J, Geithe C, Kotthoff M, Schieberle P, Krautwurst D. OR2M3: "A highly specific and narrowly tuned human odorant receptor for the sensitive detection of onion key food odorant 3-mercapto-2-methylpentan-1-ol." Chemical Sciences 2016, 00:1-16 (doi:10.1093/chemse/bjw118)
【非特許文献１０】Saito H, Kubota M, Roberts RW, Chi Q, Matsunami H. "RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors." Cell 2004 119(5):679-91
【非特許文献１１】Von Dannecker LE, Mercadante AF, Malnic B. "Ric-8B, an olfactory putative GTP exchange factor, amplifies signal transduction through the olfactory-specific G-protein Galphaolf." J Neurosci. 2005 Apr 13;25(15):3793-800
【非特許文献１２】Von Dannecker LE, Mercadante AF, Malnic B. "Ric-8B promotes functional expression of odorant receptors." Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2006 103(24):9310-4
【非特許文献１３】Bufe B, Hofmann T, Krautwurst D, Raguse JD, Meyerhof W. "The human TAS2R16 receptor mediates bitter taste in response to beta-glucopyranosides." Nat. Genet. 2002 32(3):397-401
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
ヒト嗅覚受容体ＯＲ４Ｅ２が硫黄系匂い物質に対して応答するということが、今回見いだされた。その結果、硫黄系匂い物質からの悪臭の知覚を中和し得る化合物を同定するために、このポリペプチドの使用が検討される。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
１つの態様において、本発明は、試験化合物が硫黄系匂い物質からの知覚される（嗅ぎ取られる）悪臭を中和し得るかどうかを決定するための方法に関し、前記方法は：
ａ）ＯＲ４Ｅ２への前記硫黄系匂い物質の結合を許すかまたは前記硫黄系匂い物質によるＯＲ４Ｅ２の活性化を許す条件下において、試験化合物の存在下および非存在下、ＯＲ４Ｅ２ポリペプチドを硫黄系匂い物質と接触させるステップと；
ｂ）試験化合物の存在下および非存在下における前記硫黄系匂い物質へのＯＲ４Ｅ２の結合またはＯＲ４Ｅ２の活性を比較するステップと、
を含み、
試験化合物の非存在下における結合または活性に対して相対的に、試験化合物の存在下における結合の阻害または活性の減少は、硫黄系匂い物質からの知覚される悪臭を中和し得る化合物として試験化合物を同定する。
【００１３】
別の態様において、本発明は、上述の方法によって同定される化合物を含む悪臭抑制組成物に関する。
【００１４】
別の態様において、本発明は、上述の方法によって同定される化合物または上で定義されている悪臭抑制組成物を含む、家庭用、洗濯用、パーソナルケア、アニマルケア、または産業用製品に関する。
【００１５】
別の態様において、本発明は、硫黄系匂い物質からの知覚される悪臭を中和し得る化合物を同定するためのＯＲ４Ｅ２ポリペプチドの使用に関する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明においては、悪臭、特に硫黄系匂い物質からの悪臭を中和し得る化合物を同定するための方法が提供され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】図１Ａは、代表的な硫黄系匂い物質３−メルカプト−３−メチルブタノールの増大していく濃度に対するＯＲ４Ｅ２の応答を示している。
【図１Ｂ】図１Ｂは、代表的な硫黄系匂い物質ジアリルトリスルフィドの増大していく濃度に対するＯＲ４Ｅ２の応答を示している。
【図２Ａ】図２Ａは、ある試験化合物の増大していく濃度に対するＯＲ４Ｅ２の応答を示している。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ある試験化合物の増大していく濃度に対するＯＲ４Ｅ２の応答を示している。
【図３Ａ】図３Ａは、悪臭および試験化合物の評価（強度）を示している。
【図３Ｂ】図３Ｂは、悪臭および試験化合物の評価（快さ）を示している。
【図４Ａ】図４Ａは、ブランクまたは試験化合物どちらかとの悪臭の混合物の評価（総合的な強度）を示している。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ブランクまたは試験化合物どちらかとの悪臭の混合物の評価（総合的な快さ）を示している。
【図４Ｃ】図４Ｃは、ブランクまたは試験化合物どちらかとの悪臭の混合物の評価（悪臭の存在の強度）を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、ヒト嗅覚受容体ＯＲ４Ｅ２が硫黄系匂い物質による刺激に対して応答するという知見に基づく。従って、ＯＲ４Ｅ２受容体は、硫黄系匂い物質からの知覚される悪臭を中和し得る化合物をスクリーニングするための有用なツールである。
【００１９】
１つの態様において、本発明は、試験化合物が硫黄系匂い物質からの知覚される悪臭を中和し得るかどうかを決定するための方法を提供し、前記方法は：
ａ）ＯＲ４Ｅ２への前記硫黄系匂い物質の結合を許すかまたは前記硫黄系匂い物質によるＯＲ４Ｅ２の活性化を許す条件下において、試験化合物の存在下および非存在下、ＯＲ４Ｅ２ポリペプチドを硫黄系匂い物質と接触させるステップと；
ｂ）試験化合物の存在下および非存在下における前記硫黄系匂い物質へのＯＲ４Ｅ２の結合またはＯＲ４Ｅ２の活性を比較するステップと、
を含み、
試験化合物の非存在下における結合または活性に対して相対的に、試験化合物の存在下における結合の阻害または活性の減少は、硫黄系匂い物質からの知覚される悪臭を中和し得る化合物として試験化合物を同定する。
【００２０】
それゆえに、本発明の方法は、ＯＲ４Ｅ２への硫黄系匂い物質の結合を可能にするかまたは前記硫黄系匂い物質によるＯＲ４Ｅ２の活性化を可能にする条件下において、試験化合物の存在下および非存在下、ＯＲ４Ｅ２ポリペプチドを硫黄系匂い物質と接触させるステップを含む。１つの実施形態においては、ＯＲ４Ｅ２の活性化を可能にする最小有効量を決定するために、硫黄系匂い物質の異なる濃度が用いられる。
【００２１】
本発明の文脈において、「硫黄系匂い物質」は、ヒトまたは動物の体の悪臭、特にヒトの汗の悪臭もしくはヒトの腋の悪臭の寄与因子である硫黄含有化合物、または食料を起源とする硫黄含有化合物、またはホームもしくはパーソナルケア消費者製品に意図的に追加されている硫黄含有化合物である。
【００２２】
１つの実施形態において、硫黄系匂い物質は、スルファニルアルカノール、例えば２−メルカプト−３−メチル−１−ブタノール、３−メルカプト−２−メチル−１−ペンタノール、３−メルカプト−２−メチル−１−プロパノール、３−メルカプト−３−メチル−１−ブタノール、３−メルカプト−１−ヘキサノール、３−メチル−３（２−メチルジスルファニル）−ブタン−１−オール、または３−メルカプト−３−メチル−１−ヘキサノール；スルファニルアルデヒドまたはケトン、例えば３−メルカプト−２−メチルペンタナール、１−メルカプト−３−ペンタノン、２−メルカプト−３−ペンタノン、または３−メルカプト−３−ペンタノン；スルファニルエステル、例えば３−メチル−３−メルカプトブチルアセテートまたは３−メチル−３−メルカプトブチルフォルメート；チオール、例えば１−メトキシヘプタン−３−チオール、４−メトキシ−２−メチルブタン−２−チオール、または１−プロパンチオール；チオグリコール酸；ジチオグリコール酸；スルフィド、例えばメチル−２−プロペニルジスルフィド、２，４−ジチアペンタン、ジメチルスルフィド、ジメチルジスルフィド、ジメチルトリスルフィド、ジアリルスルフィド、ジアリルジスルフィド、またはジアリルトリスルフィド；アリルメルカプタン；アリシン；アリイン；およびシステインから選択される。好ましい実施形態において、硫黄系匂い物質は、上で定義されているスルファニルアルカノールまたはスルフィド、特に、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合、例えば１つまたは２つの炭素−炭素二重結合を有するスルフィドである。
【００２３】
１つの実施形態において、ＯＲ４Ｅ２ポリペプチドを硫黄系匂い物質と接触させるステップは、水に溶解したときにＣｕ２＋イオンを遊離する銅塩、例えば無機塩、例えばＣｕＳＯ４として追加された、Ｃｕ２＋イオンの存在下において行われる。
【００２４】
１つの実施形態において、ＯＲ４Ｅ２ポリペプチドを硫黄系匂い物質と接触させるステップは前記ポリペプチドを発現する細胞内または上において行われる。本発明に従うと、前記細胞は、哺乳類細胞、具体的にはヒト胚性腎臓細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＨｅＬａ細胞、または前記細胞の膜調製物であり得るが、これに限定されない。ポリペプチドを発現する細胞は、形質膜への効率的な受容体トラフィッキングにとって重要な少なくとも１つの補助蛋白質をもまた発現し得る；細胞は、さらに刺激性Ｇ蛋白質（Ｇ・ｓともまた呼ばれる）、好ましくはＧ・ｏｌｆＧ蛋白質を発現し得る。
【００２５】
ＯＲ４Ｅ２ポリペプチドは、本願の出願日の時点で配列データベースにおいて現在参照される配列によって定義される。多型バリアントがヒト集団内に存在し得るということは当業者には公知である。それらの多型バリアントは一般的には数アミノ酸（例えば１から１０アミノ酸）だけ異なる。
【００２６】
１つの実施形態において、ＯＲ４Ｅ２ポリペプチドは配列番号１の配列を有する。
【００２７】
別の実施形態において、ＯＲ４Ｅ２ポリペプチドは、少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を配列番号１に対して有する配列を有するが、ただし配列番号１の位置１２、４２、１１８、１６５、２３４、２３７、２４１、および２７０のアミノ酸は保存されている。本明細書において用いられる用語「配列の同一性」は、至適にアラインメントされたときの配列の全長に渡っての２つのアミノ酸配列間の配列の同一性を意味し、例えばプログラムＣｌｕｓｔａｌＷを用いることによる（http://www.clustal.org/；Thompson JD, Higgins DG, Gibson TJ. (1994); Acids Res., 22, 4673-4680）．（ギャップ開始ペナルティー＝１０；ギャップ伸長ペナルティー＝０．１）。
【００２８】
１つの実施形態において、ＯＲ４Ｅ２ポリペプチドは配列番号２の配列を有する核酸配列によってコードされる。
【００２９】
１つの実施形態において、ポリペプチドＯＲ４Ｅ２をコードする核酸配列は好適な発現ベクター内の構築物に包含され得、これはホスト内において構築物を複製および発現でき、対応するポリペプチドの発現に至る。好適な構築物は限定されないが、ただし、ＯＲ４Ｅ２核酸配列はＯＲ４Ｅ２の発現を導くための適切な発現コントロール配列（単数または複数）といずれかの他の要件とに作動可能に連結される。例えば、ＯＲ４Ｅ２ポリペプチドをコードする核酸配列は直接的にタグ付けされ得るか、または間接的にレポーティングシステムと連関させられ得、ひとたびＯＲ４Ｅ２がリガンド（単数または複数）によって活性化されると読取可能または測定可能なシグナルに至り、その結果、受容体の活性化後のシグナル伝達が検出、測定、および／またはモニターされ得る。レポーティングシステムのいずれかの型が本発明の文脈において用いられ得る。例えば、その活性がＯＲ４Ｅ２活性化の指標である応答エレメント、好ましくはＧ・ｏｌｆＧ蛋白質などの刺激性Ｇ蛋白質（Ｇ・ｓ）によって活性化されるアデニル酸シクラーゼによって刺激されるｃＡＭＰ応答エレメントによって転写が駆動される遺伝子を含むレポーティングシステムが用いられ得る。ＯＲ４Ｅ２を発現するためのいずれかの方法が用いられ得、好ましくは、ＯＲ４Ｅ２をコードする核酸配列を含む構築物を含有する発現ベクターのトランスフェクションである。
【００３０】
いくつかの実施形態において、硫黄系匂い物質は、さらに、ＯＲ２Ｃ１ポリペプチド、ＯＲ２Ｔ１１ポリペプチド、およびＯＲ２Ｍ３ポリペプチドから選択される少なくとも１つの他のヒト嗅覚受容体と、任意にＣｕ２＋イオンの存在下において接触させられ得る。ＯＲ４Ｅ２ポリペプチドを硫黄系匂い物質と接触させるステップに関して上に記載されている流儀は、硫黄系匂い物質を他の嗅覚受容体（単数または複数）と接触させるステップにもまた適用され得る。ＯＲ２Ｃ１、ＯＲ２Ｔ１１、およびＯＲ２Ｍ３受容体についての詳細はＧｅｎｅＣａｒｄｓ（登録商標）データベース（http://www.genecards.org/）に見いだされ得る。ＯＲ２Ｔ１１およびＯＲ２Ｃ１はチオールによって活性化されることが報告されている（非特許文献８）。ＯＲ２Ｍ３もまたチオールによって活性化されることが報告されている（非特許文献９）。所与の硫黄系匂い物質が（ＯＲ４Ｅ２ポリペプチドを活性化することに加えて）ＯＲ２Ｃ１、ＯＲ２Ｔ１１、およびＯＲ２Ｍ３ポリペプチドの少なくとも１つを活性化する場合には、前記匂い物質は本発明の方法への使用にとって特に好ましい匂い物質と見なされ得る。
【００３１】
本発明の方法は、試験化合物の存在下および非存在下における硫黄系匂い物質へのＯＲ４Ｅ２の結合またはＯＲ４Ｅ２の活性を比較するステップをもまた含み、試験化合物の非存在下における結合または活性に対して相対的に、試験化合物の存在下における結合の阻害または活性の減少は、硫黄系匂い物質からの知覚される悪臭を中和し得る化合物として試験化合物を同定する。
【００３２】
１つの実施形態において、試験化合物は、前記試験化合物の存在下および非存在下における（硫黄系匂い物質と接触させられた）ＯＲ４Ｅ２の活性の比較によって、硫黄系匂い物質からの知覚される悪臭を中和し得る化合物として同定される（またはされない）。上で指示されているように、試験化合物の非存在下における活性に対して相対的に、試験化合物の存在下における活性の減少は、試験化合物が硫黄系匂い物質からの知覚される悪臭を中和できるという結論に至る。
【００３３】
当分野において公知のいずれかの方法が、試験化合物の存在下または非存在下における硫黄系匂い物質に対するＯＲ４Ｅ２の応答を読取または測定するために用いられ得る。
【００３４】
１つの実施形態において、ＯＲ４Ｅ２の活性は、試験化合物がＯＲ４Ｅ２の応答を誘起する場合に読取可能または測定可能なシグナルに至るレポーティングシステムを用いることによって検出される。本発明の文脈において用いられ得るレポーティングシステムは、イメージングシステム、蛍光システム、酵素システム、結合システムを包含するが、これに限定されない。例えば、次のレポーターシステムが用いられ得る：蛍光色素によるカルシウムイメージング、発光タンパク質、例えばＧＦＰ、エクオリン、酵素レポーターシステム、例えばルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ＧＴＰガンマＳ結合試験、ｃＡＭＰレベルの変化の測定、その他同種類のもの。有利には、その活性がＯＲ４Ｅ２活性化の指標である応答エレメントによって転写が駆動される遺伝子を含む、レポーティングシステムが用いられ得る。好ましくは、遺伝子転写は、Ｇ・ｏｌｆＧ蛋白質などの刺激性Ｇ蛋白質（Ｇ・ｓ）によって活性化されるアデニル酸シクラーゼによって刺激されるｃＡＭＰ応答エレメントによって駆動される。
【００３５】
１つの実施形態において、ステップｂ）は：
ｉ）コントロールに対するＯＲ４Ｅ２の応答を測定することと；
ｉｉ）試験化合物の非存在下において硫黄系匂い物質に対するＯＲ４Ｅ２の応答を測定することと；
ｉｉｉ）第１の倍率変化［ＦＯＣ１＝ステップｉ）において得られた応答によって除算されたステップｉｉ）において得られた応答］を計算することと；
ｉｖ）試験化合物の存在下において硫黄系匂い物質に対するＯＲ４Ｅ２の応答を測定することと；
ｖ）第２の倍率変化［ＦＯＣ２＝ステップｉ）において得られた応答によって除算されたステップｉｖ）において得られた応答］を計算することと；
ｖｉ）ＦＯＣ１およびＦＯＣ２を比較することと、
を含むか、またはこれらからなり、
ＦＯＣ２＜ＦＯＣ１の場合に、試験化合物は、硫黄系匂い物質からの知覚される悪臭を中和し得る化合物として同定される。
【００３６】
１つの実施形態において、コントロールは、硫黄系匂い物質および／または試験化合物を希釈するために用いられる緩衝液である。
【００３７】
１つの実施形態においては、ステップｖｉ）において得られるＦＯＣ２／ＦＯＣ１比が、例えば０．７未満、０．５未満、０．３未満、０．１未満、０．０５未満、または０．０１未満などの、０．８未満である場合には、試験化合物は、硫黄系匂い物質からの知覚される悪臭を中和し得る化合物として同定される。
【００３８】
１つの実施形態においては、本発明の方法によって同定された試験化合物が硫黄系匂い物質からの知覚される悪臭を実際に中和するという確認が、「におい嗅ぎ」試験の手段によって得られ得る。例えば、参加者のパネルは、硫黄系匂い物質からの悪臭および試験化合物を別々に嗅ぎ取り、それから悪臭と試験化合物との混合物を嗅ぎ取り、参加者のパネルが嗅ぎ取ったものの強度および快さをその都度評価するように求められ得る。有利には、第１に悪臭、それから試験化合物、最後に悪臭と試験化合物との混合物が嗅ぎ取られる。
【００３９】
本発明の方法は、硫黄系匂い物質からの知覚される悪臭を中和し得、ゆえに種々の消費者製品に組み込まれ得る化合物を同定することを可能にする。
【００４０】
そのため、別の態様において、本発明は上述の方法によって同定される化合物を含む悪臭抑制組成物に関する。
【００４１】
別の態様において、本発明は、上述の方法によって同定される化合物または上で定義されている悪臭抑制組成物を含む、家庭用製品、洗濯用製品、パーソナルケア製品、アニマルケア製品、または産業用製品に関する。好適な製品は、家庭内使用、施設内使用、または産業使用のためであり得る。かかる製品の例は、猫砂、洗濯用洗剤、自宅および公共空間のためのエアケア製品、パーソナルケア腋用製品、例えばデオドラント、ヘアケア／トリートメント製品、脱毛用製品、足／靴手入れ製品、トイレおよびキッチンクリーナー、ファームスプレー、ごみ／生ゴミ入れのための製品、ごみ／生ゴミ捨て場のための製品、または下水処理施設のための製品を包含する。
【００４２】
別の態様において、本発明は、硫黄系匂い物質からの知覚される悪臭を中和し得る化合物を同定するためのＯＲ４Ｅ２ポリペプチドの使用に関する。
【００４３】
本発明は次の限定しない例によって例示される。
【実施例】
【００４４】
＜細胞株、培地、および細胞培養条件＞
実験は、形質膜への効率的な受容体トラフィッキングにとって必須な補助蛋白質ｈＲＴＰ１ｓを内在的に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞（例えばＧＥヘルスケアから入手可能）を用いて行った（非特許文献１０；非特許文献１１；および非特許文献１２）。細胞株は、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清、Ｅｕｒｏｃｌｏｎｅ社ｃａｔ．ＥＣＳ０１８０Ｌ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｅｕｒｏｃｌｏｎｅ社ｃａｔ．Ｂ３００１Ｄ）、５０μｇ／ｍＬのＧ４１８、２５μｇ／ｍＬのハイグロマイシン、および１０μｇ／ｍＬのゼオシンを添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｅｕｒｏｃｌｏｎｅ社）によって維持した。
【００４５】
標準的な拡大培養条件は、１．５×１０６〜１．８×１０６個の細胞をＴ７５フラスコに週２回播種することからなり、約１０×１０６〜１５×１０６個の細胞を〜８０％コンフルエントで回収した。
【００４６】
＜ヒト嗅覚受容体のクローニング＞
ＯＲ４Ｅ２のｃＤＮＡはカスタム遺伝子合成（ライフテクノロジーズ）によって作り出した。それから、受容体ＤＮＡを、インフレーム３'で、膜貫通局在エピトープからｐｃＤＮＡ５発現ベクターにサブクローニングした（非特許文献１３）。受容体の誤りのないアイデンティティーは自動シーケンシングによってチェックした。
【００４７】
＜リガンドおよび緩衝液＞
全ての硫黄系匂い物質は溶媒としてＤＭＳＯを用いて１００ｍＭストック溶液として調製し、−２０℃で保存した。硫酸銅（ＩＩ）を３０ｍＭストック水溶液として調製した。実験の日に、異なるストック溶液をアッセイ緩衝液（タイロード緩衝液）によって直接的に希釈した。その組成は：５ｍＭのＫＣｌ、１３０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２、５ｍＭのＮａＨＣＯ３、１ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４である。
【００４８】
匂い物質は下の表１に指示されている濃度で用いた。
【００４９】
【表１】
2020513564.tif 000002
【００５０】
＜機器および消耗品＞
実験はＦＬＩＰＲ  Ｔｅｔｒａ（登録商標）ハイスループット細胞系スクリーニングシステム（モレキュラーデバイス）を用いて行った。細胞をトランスフェクションし、ブラック３８４ウェルポリスチレンアッセイプレート、ブラック／クリアボトム（ＭＡＴＲＩＸ社Ｐａｒｔ＃ＣＰＬ−４３３２）に播種した。
【００５１】
＜リポフェクタミン２０００による一過的トランスフェクション＞
全ての一過的トランスフェクションは製造者のプロトコールに従ってリポフェクタミン２０００（インビトロジェン）によって行った。１０μＬのリポフェクタミン２０００を５００μＬのＤＭＥＭによって希釈し、室温で５分間インキュベーションした。同時に、３μｇのプラスミドＤＮＡを５００μＬのＤＭＥＭによって希釈し、リポフェクタミン２０００混合物に追加して１０００μＬの終体積を得た。室温における３０分間のインキュベーション後に、１，６００，０００細胞／ｍＬを含有する１０００μＬの細胞懸濁液にＤＮＡ−リポフェクタミン複合体を追加した。その後、ウェルあたり２５μＬの完成混合物をブラック３８４ウェルポリスチレンアッセイプレートに播種した。トランスフェクションの３時間後に、２０％ＦＢＳを含有する２５μＬのＤＭＥＭを各ウェルに追加した。
【００５２】
＜ＦＬＩＰＲ  Ｔｅｔｒａ（登録商標）を用いるルミネセンス測定＞
ＯＲ４Ｅ２受容体のｃＤＮＡをｐＮＬ（ＮｌｕｃＰ／ＣＲＥ／Ｈｙｇｒｏ）（プロメガ）とコトランスフェクションした。ｐＮＬ（ＮｌｕｃＰ／ＣＲＥ／Ｈｙｇｒｏ）ベクターは、ルシフェラーゼレポーター遺伝子ＮａｎｏＬｕｃの転写を駆動する環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）応答エレメント（ＣＲＥ）を含有する。ＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼはルミネセンスレポーターとしての至適性能のために組換えられた小型の酵素（１９．１ｋＤａ）である。その酵素は新規基質フリマジンを用いるとホタル（フォティヌス・ピラリス）またはウミシイタケルシフェラーゼのどちらかよりも約１００倍明るく、高強度のグロー型ルミネセンスを生成する。
【００５３】
このアッセイでは、その正しい嗅覚受容体との硫黄系匂い物質の相互作用は、内在的に発現されるヒトＧαｓＧ蛋白質の活性化に至る。Ｇαｓは、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）をｃＡＭＰに変換するアデニル酸シクラーゼを活性化する刺激性Ｇ蛋白質である。そのため、転写されたルシフェラーゼの活性は嗅覚受容体活性化の指標として用いられ得る。
【００５４】
トランスフェクションの２４時間後に、培地をトランスフェクション済み細胞から除去し、希釈された硫黄系匂い物質を含有する３０μＬのタイロード緩衝液を３７℃で４時間に渡って追加した。それから、細胞を自動蛍光測定イメージングプレートリーダー（ＦＬＩＰＲ  Ｔｅｔｒａ（登録商標）、モレキュラーデバイス）に移した。それから、フリマジンを含有する２０μＬの基質混合物を追加した。この追加は細胞溶解をもたらし、検出可能な発光をもたらすその基質フリマジンとのルシフェラーゼの相互作用を許した。
【００５５】
＜データ分析＞
異なるウェルレプリケートから得られたデータ（ｎ＝４）を、Ｅｘｃｅｌ、Ｓｃｒｅｅｎ  Ｗｏｒｋｓ、およびＳｉｇｍａＰｌｏｔ  １１によって分析した。硫黄系匂い物質に対する受容体の応答をタイロード緩衝液に対する受容体の平均応答によって除算した（倍率変化：ＦＯＣ）。もたらされたＦＯＣ値の平均および標準偏差を計算し、ＳｉｇｍａＰｌｏｔ  １１ソフトウェアによって当てはめされた濃度−応答曲線または垂直棒グラフにプロットした。
【００５６】
＜試験化合物をスクリーニングするためのプロトコール＞
試験化合物を、ＯＲ４Ｅ２活性化へのそれらの阻害効果について評価した。試験化合物およびコントロールは実験の日にタイロード緩衝液中に新たに調製した。全ての試験化合物は、活性化濃度の硫黄系匂い物質との組み合わせとして、３０μＭで試験した。
【００５７】
匂い物質蒸発を回避するために、化合物試験プレートはスクリーニングのちょうど２〜３時間前に調製した。従って、化合物はマザープレートから適切な量のタイロード緩衝液を含有するスクリーニングプレートに３８４ピペットヘッドによって直接的にピペッティングした。それから、コントロールおよび硫黄系匂い物質をウェルに追加した。それから、調製した化合物プレートをトランスフェクション済み細胞プレート上に移し、３７℃で３〜４時間インキュベーションした。次に、読取に先立って室温における３０分間の平衡化期間があった。この手続きは一定したシグナルを作り出し、ルミネセンス読み出しに時々観察される傘様パターンを回避する。
【００５８】
試験化合物スクリーニングはトリプリケートで行った。異なるウェルレプリケートから得られたデータをＧｅｎｅＤａｔａ  Ｓｃｒｅｅｎｅｒによって分析した。硫黄系匂い物質との組み合わせとしての各個々の化合物のトリプリケートの平均ＦＯＣ１値を、いずれかの試験化合物の非存在下における硫黄系匂い物質について得られた活性値（ＦＯＣ２）と比べた。
例１
【００５９】
表１の５つの硫黄系匂い物質に対するＯＲ４Ｅ２の応答を検討するために、細胞を受容体のプラスミドＤＮＡによって一過的にトランスフェクションした。トランスフェクションの２４時間後に、細胞を硫黄系匂い物質の７つの異なる濃度によって刺激した（表１参照）。刺激の４時間後に、細胞を基質混合物によって溶解し、ルシフェラーゼ活性を検出した。図１Ａおよび１Ｂは、それぞれ３−メルカプト−３−メチルブタノールおよびジアリルトリスルフィドの増大していく濃度に対するＯＲ４Ｅ２の応答を示している。両方の匂い物質はＯＲ４Ｅ２活性化への正の効果を有した。
例２
【００６０】
細胞をＯＲ４Ｅ２のプラスミドＤＮＡによって一過的にトランスフェクションした。トランスフェクションの２４時間後に、細胞を次の試験化合物の７つの異なる濃度によって刺激した：シオザキソウ花油または花エキス（それぞれＣＡＳ  Ｎｏ．８０１６−８４−０、９１７７０−７５−１）およびオポポナックス油（ＣＡＳ  Ｎｏ．８０２１−３６−１）。刺激は３００μＭのＯＲ４Ｅ２活性化因子２，４−ジチアペンタンの存在下においてした。刺激の４時間後に、細胞を基質混合物によって溶解し、ルシフェラーゼ活性を検出した。その上、試験化合物はＯＲ４Ｅ２を発現しない細胞でもまた試験した（モック）。これらの細胞を３０ｎＭイソプロテレノールの存在下において同じ試験化合物によって刺激して、試験化合物のＯＲ４Ｅ２に無関係な阻害効果についてコントロールした。異なるウェルレプリケートから得られたデータを、平均および標準偏差を計算することによってグラフパッドプリズムによって分析した。いずれかの試験化合物の非存在下における２，４−ジチアペンタンに対するＯＲ４Ｅ２の応答を１００％にセットし、濃度−応答曲線を計算した。
【００６１】
図２Ａ〜２Ｂは、それぞれ３００μＭの２，４−ジチオペンタン（ＯＲ４Ｅ２）または３０ｎＭのイソプロテレノール（モック）の存在下における、上述の化合物（それぞれシオザキソウ、オポポナックス油）の増大していく濃度に対するＯＲ４Ｅ２トランスフェクション細胞（ドット）およびコントロール細胞（四角）の応答を示している。
例３
【００６２】
悪臭に対するいくつかの化合物の活性な効果を例示するために、それらの効き目を評価するための試験を設計した。
【００６３】
参加者
試験は２４人の参加者を包含した。それらは全員が嗅ぎ取ることができ、参加することに同意する前に試験についての詳細な情報を与えられた。女性は妊娠中ではなかった。
【００６４】
方法
試験は、分子によって飽和した１つまたは２つの芯材を内部に有する一連の６×６０ｍＬ瓶を用いた。最初の３つの瓶はそれぞれ悪臭単独（３−メルカプト−２−メチルブタノール）、化合物Ｔ＊（ＡＭＴ）単独、および化合物Ｏ＊（ＡＭＯ）単独を含有した。３つの他の瓶は化合物の混合物を含有した：「悪臭＋ブランク（何もなし）」、「悪臭＋ＡＭＴ」、および「悪臭＋ＡＭＯ」。悪臭の濃度は実生活に近くセットした。試験化合物の強度は悪臭のものと釣り合うようにセットした。
（＊Ｔ＝シオザキソウ、Ｏ＝オポポナックス油。例２において同定されている通り）。
【００６５】
試験は３パートでされた。第１パートでは、参加者は悪臭単独を嗅ぎ取ることによって試験を始め、強度については０「私は何も嗅ぎ取らない」から９「極めて強い」までの強度スケールで、嗜好度については０「極めて不快」から９「極めて快い」までの強度スケールでそれを格付けした。参加者には、試験のさらに後段でそれを認識できるように十分長く嗅ぎ取るようにもまた命じた。
【００６６】
第２パートでは、参加者は２つの試験化合物をランダムな順序で嗅ぎ取った。再び、参加者には、参加者が嗅ぎ取ったものの強度と嗜好度とについて格付けするように求めた。
【００６７】
第３パートでは、参加者は混合物をランダムな順序で嗅ぎ取り、瓶内部の匂いの総合的な強度と参加者が嗅ぎ取ったものの総合的な嗜好度とを格付けした。それらには、０「悪臭が存在しない」から９「悪臭が極めて強い」までの強度スケールで、悪臭の存在の強度をもまた格付けさせた。
【００６８】
結果
試験の最初の２つのパートの結果は図３Ａ〜３Ｂに示されている。図３Ａは瓶内の各化合物単独の強度スコアを示している。図３Ｂは瓶内の各化合物単独の嗜好度スコアを示している。同じ文字によってリンクされたバー同士は異ならない（９５％のダンカン検定）。エラーバーは９５％の信頼区間を示している。ＡＮＯＶＡ分析は、悪臭が２つの試験化合物よりも強烈（Ｆ＝１０．４９、ｐ＜０．０１）かつ不快（Ｆ＝９．１６、ｐ＜０．０１）であるということを示した。
【００６９】
試験の第３パートの結果が図４Ａ〜４Ｃに示されている。図４Ａは、内部に分子の混合物を有する３つの瓶同士では総合的な強度が異ならなかったということを示している。ＡＮＯＶＡ分析は有意ではなかった。しかしながら、ＡＮＯＶＡ分析は、悪臭単独（ブランクと組み合わせられている）が悪臭＋試験化合物の２つの混合物よりも快くないと判定されるということを示した（図４Ｂ参照）（Ｆ＝３．２０、ｐ＜０．０５）。図４Ｃは、試験化合物と組み合わせられたときには、悪臭の存在が同様には評価されないということを示している。試験化合物と組み合わせられたときには、その強度はより低い（Ｆ＝３．２８；ｐ＜０．０５）。
【００７０】
一緒にすると、これらの結果は、ＯＲ４Ｅ２受容体を活性化する化合物が、前記悪臭と組み合わせられたときに標的となる悪臭の強度の縮減を許すということを示している。この試験は、効果が強度の違いを原因としていないということを実証している。単独で判定されたときには、試験化合物は悪臭よりも強烈ではないと知覚されている。混合物として判定されたときに、異なる混合物同士は強度が異ならない。嗜好度評価は試験化合物が極端に快くはないということを示している。総合的な嗜好度は、悪臭と試験化合物のそれぞれの組み合わせが不快さを減少させるということを示している。それは、混合物中の検出される悪臭の強度をもまた和らげる。
【００７１】
本発明をその特定の実施形態の参照によって詳細に記載したが、その主旨および範囲から逸脱することなしに種々の変更および改変がそれらになされ得るということは当業者には明らかであろう。本願は２０１６年１２月１４日出願の欧州特許出願第１６３０６６８０．６号に基づいており、その主題全体は参照によって本明細書に組み込まれる。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明においては、悪臭、特に硫黄系匂い物質からの悪臭を中和し得る化合物を同定するための方法を提供することが可能である。
【図１Ａ】
2020513564.tif 000003
【図１Ｂ】
2020513564.tif 000004
【図２Ａ】
2020513564.tif 000005
【図２Ｂ】
2020513564.tif 000006
【図３Ａ】
2020513564.tif 000007
【図３Ｂ】
2020513564.tif 000008
【図４Ａ】
2020513564.tif 000009
【図４Ｂ】
2020513564.tif 000010
【図４Ｃ】
2020513564.tif 000011
【配列表】
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【国際調査報告】
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2020513564.tif 000013
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