(57)【要約】  本発明は、平滑筋疾患の１種又は複数種の徴候又は症状を緩和する方法を提供する。本開示の組成物は、Ｍａｘｉ−Ｋチェネルペプチドをコードする核酸を含むプラスミドベクターを含み得る。本開示の組成物を、単一単位用量で少なくとも２箇所以上の部位に排尿筋内投与し得る。
2020520383.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト対象の過活動膀胱症候群又は排尿筋過活動の徴候又は症状を処置するか又は緩和する方法であって、プロモーターと、Ｍａｘｉ−Ｋチャネルペプチドをコードする核酸とを有するベクターを含む組成物の単位用量を少なくとも２箇所以上の部位に排尿筋内投与することを含む方法。
【請求項２】
前記プロモーターは平滑筋プロモーターである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プロモーターはサイトメガロウイルス中期−初期プロモーターである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記単位用量は単一単位用量である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記単位用量は約５，０００〜５０，０００ｍｃｇである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記単位用量は少なくとも１０，０００ｍｃｇである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記単位用量は１６，０００ｍｃｇ又は２４，０００ｍｃｇである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記組成物を５箇所以上の部位に投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記組成物を１０箇所以上の部位に投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記組成物を１５箇所以上の部位に投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記組成物を２０箇所以上の部位に投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記徴候又は症状は排尿又は切迫の頻度である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ベクターは、下記の順序：
ａ．ヒトサイトメガロウイルス中期−初期プロモーター配列；
ｂ．Ｔ７プライミング部位配列；
ｃ．ｈＳｌｏオープンリーディングフレーム配列；
ｄ．ＢＧＨポリアデニル化シグナル配列；
ｅ．カナマイシン耐性配列；及び
ｆ．ｐＵＣ複製起点配列
で核酸エレメントを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ヒトサイトメガロウイルス中期−初期プロモーター配列は配列番号１である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
Ｔ７プライミング部位配列は配列番号２である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＢＧＨポリアデニル化シグナル配列は配列番号３である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記カナマイシン耐性配列は配列番号５である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記ｐＵＣ複製起点配列は配列番号４である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記ｈＳｌｏオープンリーディングフレーム配列は配列番号７である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
前記ｈＳｌｏオープンリーディングフレーム配列は、配列番号７のヌクレオチド位置１０５４で単一点変異を有し、前記点変異は配列番号８の３５２位でセリンを生じる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
下記の順序：
ｇ．配列番号１を含むヒトサイトメガロウイルス中期−初期プロモーター配列；
ｈ．配列番号２を含むＴ７プライミング部位配列；
ｉ．配列番号７を含むｈＳｌｏオープンリーディングフレーム配列；
ｊ．配列番号３を含むＢＧＨポリアデニル化シグナル配列；
ｋ．配列番号５を含むカナマイシン耐性配列；及び
ｌ．配列番号４を含むｐＵＣ複製起点配列
で核酸エレメントを含むベクター。
【請求項２２】
前記ｈＳｌｏオープンリーディングフレーム配列は、配列番号７のヌクレオチド位置１０５４で単一点変異を有し、前記点変異は配列番号８の３５２位でセリンを生じる、請求項２１に記載のベクター。
【請求項２３】
前記ベクターは、プラスミド、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レトロウイルスベクター、又はリポソームを含む、請求項２１又は２２に記載のベクター。
【請求項２４】
前記プラスミドはｐＶＡＸである、請求項２３に記載のベクター。
【請求項２５】
請求項２３に記載の複数のベクターと、薬学的に許容される賦形剤又は担体とを含む医薬組成物。
【請求項２６】
前記医薬組成物は平滑筋への注射用に製剤化されている、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
前記複数のベクターは、生理食塩水溶液中の２０〜２５％のスクロースと組み合わされている、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
単位用量は単一単位用量である、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
単位用量は約５，０００〜５０，０００ｍｃｇである、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
単位用量は少なくとも１０，０００ｍｃｇである、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
単位用量は１６，０００ｍｃｇ又は２４，０００ｍｃｇである、請求項２５に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年５月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／５０５，３８２号明細書の利益を主張し、この内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は一般に、平滑筋機能障害に関連する１種又は複数種の症状を改善するための医学療法の分野に関する。具体的には、膀胱の平滑筋機能障害。
【０００３】
配列表の組み込み
２０１８年５月１１日に作成され且つサイズが３０ＫＢである、ＩＯＮＣ−００２−００１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔという名称のテキストファイルの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
膀胱機能の異常は、米国の数百万人の男性及び女性の生活の質に顕著に影響を及ぼす一般的な問題である。多くの一般的な疾患（例えば、ＢＨＰ、真性糖尿病、多発性硬化症、及び脳卒中）は、正常な膀胱機能を変化させる。膀胱機能の顕著で有害な変化はまた、加齢の正常な結果でもある。膀胱の生理機能の変化には、下記の２種の主な臨床症状が存在する：無緊張性膀胱及び過敏性膀胱（ｈｙｐｅｒｒｅｆｌｅｘｉｃ  ｂｌａｄｄｅｒ）。無緊張性膀胱又は排尿筋活動低下は、排尿筋平滑筋（膀胱壁の外側の平滑筋）の効果のない収縮性に起因して、尿内容物を空にする能力が低下している。無緊張性状態又は活動低下状態では、平滑筋の収縮性の低下は、膀胱機能障害の病因に関係している。そのため、平滑筋の緊張の薬理学的調節は根本的な問題を修正するには不十分であるということは驚くことではない。実際には、この状態を処置するための一般的な方法は清潔間欠カテーテル法（ｃｌｅａｎ  ｉｎｔｅｒｍｉｔｔｅｎｔ  ｃａｔｈｅｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ）を使用し、これは、慢性尿路感染、腎盂腎炎、及び最終的な腎不全の予防に成功した手段である。従って、無緊張性膀胱の処置により疾患の症状が寛解されるが、根本的な原因は修正されない。
【０００５】
逆に、排尿筋過活動を示す過敏性の、抑制されていない、又は膀胱は、膀胱の充填中に自然に収縮し、これにより頻尿、尿意切迫、及び尿失禁が生じる場合があり、個人は、尿の通過を制御することができない。過敏性膀胱は、処置がより困難な問題である。この状態を処置するために使用されている薬物は通常、部分的な効果のみであり、患者の使用と熱意とを制限する重度の副作用を有する。現在承認されている処置オプション（例えば、オキシブチニン及びトルテラジン（ｔｏｌｔｅｒａｄｉｎｅ））は大部分が非特異的であり、膀胱筋細胞のムスカリンレセプター経路及び／又はカルシウムチャネルの遮断を最も頻繁に伴う。身体内の多くの器官系の細胞機能におけるこれら２種の経路の中心的な重要性を考慮すると、そのような治療戦略は、膀胱平滑筋の緊張を調節するための粗い方法だけではなく、むしろ、この治療戦略の本当の作用機序に起因して、この治療戦略はまた、顕著で望ましくない全身効果を有することも実質的に保証されている。従って、膀胱機能障害のための改善された処置オプションに対する大きなニーズが存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
平滑筋の緊張の変化に起因する疾患の治療又は処置を開発しようとする多数の試みにもかかわらず、現在の治療法は、制限された有効性及び／又は顕著な副作用をもたらすことから不十分である。そのため、副作用を最小限に抑えつつ有効性を高めることにより、変化した平滑筋の緊張の根底にある原因に対処するための薬学的介入及び／又は医学的介入が当分野で長年にわたり必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、プロモーターと、Ｍａｘｉ−Ｋチャネルペプチドをコードする核酸とを有するベクターを含む組成物の単位用量を少なくとも２箇所以上の部位に排尿筋内（ｉｎｔｒａｄｅｔｒｕｓｏｒａｌｌｙ）投与することによる、ヒト対象の過活動膀胱症候群又は排尿筋過活動の徴候又は症状を処置するか又は緩和する方法を提供する。このプロモーターは、例えば、平滑筋プロモーター又はサイトメガロウイルス中期−初期プロモーターである。この単位用量は単一単位用量である。或いは、２つ以上の単位用量を異なる時間で投与する。
【０００８】
この単位用量は約５，０００〜５０，０００ｍｃｇである。例えば、この単位用量は少なくとも１０，０００ｍｃｇである。好ましくは、この単位用量は１６，０００ｍｃｇ又は２４，０００ｍｃｇである。
【０００９】
本組成物を、５箇所、１０箇所、１５箇所、２０箇所、又はより多くの部位に投与する。
【００１０】
この徴候又は症状は、例えば、排尿又は切迫の頻度である。
【００１１】
一部の態様では、このベクターは、下記の順序：ヒトサイトメガロウイルス中期−初期プロモーター配列、例えば配列番号１；Ｔ７プライミング部位配列、例えば配列番号２；ｈＳｌｏオープンリーディングフレーム配列、例えば配列番号７；ＢＧＨポリアデニル化シグナル配列、例えば配列番号３；カナマイシン耐性配列、例えば配列番号５；及びｐＵＣ複製起点配列、例えば配列番号４で核酸エレメントを含む。ある特定の態様では、このｈＳｌｏオープンリーディングフレーム配列は、配列番号７の１０５４位で点変異を含み、その結果、配列番号８の３５２位でセリンが生じる。
【００１２】
本発明は、ベクターであって、下記の順序：ヒトサイトメガロウイルス中期−初期プロモーター配列、例えば配列番号１；Ｔ７プライミング部位配列、例えば配列番号２；ｈＳｌｏオープンリーディングフレーム配列、例えば配列番号７；ＢＧＨポリアデニル化シグナル配列、例えば配列番号３；カナマイシン耐性配列、例えば配列番号５；及びｐＵＣ複製起点配列、例えば配列番号４で核酸エレメントを含むベクターを提供する。このベクターの一部の態様では、このｈＳｌｏオープンリーディングフレーム配列は、配列番号７のヌクレオチド位置１０５４で単一点変異を有し、前記点変異は配列番号８の３５２位でセリンを生じる。一部の態様では、このベクターは、プラスミド、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レトロウイルスベクター、又はリポソームを含む。一部の態様では、このプラスミドはｐＶＡＸである。
【００１３】
本発明は、本開示の複数のベクターと、薬学的に許容される賦形剤又は担体とを含む医薬組成物を提供する。一部の態様では、この医薬組成物は平滑筋への注射用に製剤化されている。一部の態様では、この複数のベクターは、生理食塩水溶液中の２０〜２５％のスクロースと組み合わされている。
【００１４】
本開示の医薬組成物の一部の態様では、単位用量は単一単位用量である。一部の態様では、この単位用量は約５，０００〜５０，０００ｍｃｇである。一部の態様では、この単位用量は少なくとも１０，０００ｍｃｇである。一部の態様では、この単位用量は１６，０００ｍｃｇ又は２４，０００ｍｃｇである。
【００１５】
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用途は、本発明が関連する分野の当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で説明されているものと類似の又は同等の方法及び材料を本発明の実行で使用し得るが、適切な方法及び材料を下記で説明する。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、その全体が参照により明示的に組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が支配するだろう。加えて、本明細書で説明されている材料、方法、及び例は単なる例示であり、限定することは意図されていない。
【００１６】
本発明の他の特徴及び利点は、下記の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかであり、且つこれらに包含されるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ−Ｄ】２つの処置群における２週間の閉塞後の排尿パラメータを示す一連の４つの棒グラフである。
【図２Ａ−Ｃ】コントロール群（図２Ａ）、ベクターのみ（ｐＶＡＸ）群（図２Ｂ）、及びｈＳｌｏで処置した群（図２Ｃ）における２週間の閉塞後の膀胱内圧測定記録を示す一連の３つのグラフである。
【図３】ベクターのみ（ｐＶＡＸ）、並びにｐＶＡＸ／ｈＳＬＯ  ３００及び１０００μｇを与えたラットにおける膀胱内圧記録の３つのグラフを示す。
【図４】１０００μｇの２回注射後の雌ラットの組織中におけるｐＶＡＸ／ｈＳＬＯベクターの平均コピー数を示す棒グラフである。
【図５】ヒト対象におけるｐＶＡＸ／ｈＳＬＯベクターの注射部位を示す図である。
【図６】ヒト対象における処置による経時的な１日当たりの平均排尿数の変化を示す棒グラフである。エラーバーは平均の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。
【図７】ヒト対象における処置による経時的な平均切迫エピソードの変化を示す棒グラフである。エラーバーは平均の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。
【図８】ｐＶＡＸ／ｈＳＬＯのプラスミドマップである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、膀胱の生理学的機能障害を処置するための遺伝子治療の方法を提供する。具体的には、本発明は、ヒトＭａｘｉ−Ｋチャネル（ｈＭａｘｉ−Ｋ）を発現する遺伝子を含むベクターの膀胱壁の平滑筋への直接注射により女性の過活動膀胱及び尿失禁の症状が有意に緩和されたとうい発見に基づく。具体的には、参加者に、膀胱への２０〜３０回の筋肉内注射として投与するｈＭａｘｉ−Ｋの１６，０００ｍｃｇ又は２４，０００ｍｃｇのいずれかの総用量を投与した。参加者を２４週間以内に８回観察し、１８ヶ月にわたり追跡調査した。各診察の７日前に収集した平均日記データから、プラセボと比較した、ｈＭａｘｉ−Ｋが投与された参加者の１日当たりの排尿と１日当たりの切迫エピソードの平均回数との静的に有意な減少が明らかになった。
【００１９】
ＭａｘｉＫチャネル（ＢＫチャネルとしても既知である）は細胞からのカリウムイオンの排出経路を提供し、電圧感受性Ｃａ２＋チャネルの阻害により平滑筋の弛緩を可能にし、それにより、病理学的に高められた平滑筋の緊張を軽減することにより臓器機能の正常化を達成する。用語「ＭａｘｉＫチャネル」及び「ＢＫチャネル」は、本明細書では互換的に使用される。
【００２０】
構造的に、ＭａｘｉＫチャネルは、アルファサブユニット及びベータサブユニットで構成されている。４つのアルファサブユニットは、このチャネルの細孔を形成し、これらのアルファサブユニットは、単一のＳｌｏ１遺伝子（Ｓｌｏ、ｈＳｌｏ、及びカリウムカルシウム活性化チャネルサブファミリＭアルファ１、又はＫＣＮＭＡ１とも称される）によりコードされる。ＭａｘｉＫチャネル機能を調節し得る４つのベータサブユニットが存在する。各ベータサブユニットは、別個の組織特異的発現及び調節機能を有し、ベータ−１サブユニット（カリウムカルシウム活性化チャネルサブファミリＭレギュレータベータサブユニット１、又はＫＣＮＭＢ１）は、平滑筋細胞中で主に発現される。
【００２１】
基礎となる筋小胞体のリアノジン感受性カルシウム貯蔵部位に極めて近接するＭａｘｉＫチャネルの戦略的クラスターは、多様な平滑筋（例えば膀胱）中でのカルシウムシグナル（即ちスパーク）と膜電位との局所的な調節のための重要なメカニズムを提供する。細胞内カルシウムレベルの上昇はＭａｘｉＫチャネルの開放確率を増加させ、そのため、カルシウム感受性ＭａｘｉＫチャネルを通るＫ＋の外への動きが増加する。Ｋ＋の排出により、細胞外への正の電荷の正味の移動が引き起こされ、細胞の内部は外側に対してより負に帯電している。これには２つの大きな効果がある。第一に、膜電位の増加により、確実に、カルシウムチャネルが開いているよりも閉じている時間が長くなる。第二に、カルシウムチャネルは閉じられている可能性が高いことから、細胞へのＣａ２＋の正味の流動が減少し、それに応じて遊離細胞内カルシウムレベルが低下する。細胞内カルシウムの減少により、平滑筋の弛緩が促進される。従って、細胞膜中により多くのＭａｘｉＫチャンルを有するということの主な意味は、弛緩のための任意の刺激に対する平滑筋細胞の弛緩の増強につながるはずであるということである。
【００２２】
排尿筋細胞間の細胞間コミュニケーションの増加は、部分的な尿道閉塞（ＰＵＯ）の動物モデルと排尿筋過活動（ＤＯ）を有するヒトとの両方で起こる。細胞間コミュニケーションの増加に関しては、細胞間カップリングのレベルが潜在的により低い正常な膀胱と比較した場合に、増加したカルシウムシグナル伝達の影響が増大する場合がある。このカルシウムシグナル伝達の増加は、ＰＵＯラットモデルで観察される「非排尿性収縮」の少なくとも部分的に一因となる。しかしながら、（例えば、本開示の組成物又は方法のＭａｘｉＫチャネルをコードする導入遺伝子の過剰発現の結果として）ＭａｘｉＫチャネル発現が並行して増加した場合には、おそらく、これらのトランスフェクトされた細胞により発現される、結果としての組換え及び／又はトランスジェニックＭａｘｉＫチャネルが、異常に増加したカルシウムシグナルを「短絡」させる場合がる。これにより、ギャップジャンクションを介したさらなる広がりが妨げられ、そのため、（例えば、トランスフェクトされていない筋細胞動員による）異常な且つ増加したカルシウムシグナル伝達の十分な増大が妨げられて異常な収縮反応が緩和される。本開示の組成物又は方法のＭａｘｉＫチャネルをコードする導入遺伝子の過剰発現による個々の細胞又は細胞群における異常な収縮反応の減少により、切迫の臨床的相関であるＤＯの特徴の非排尿性収縮が除去されるか又は寛解される。逆に、排尿反応における脊髄反射の関与により、ＤＯに関連する異常に増加したカルシウムシグナル伝達をはるかに超えて協調的な排尿筋収縮が生じることから、ＭａｘｉＫ導入遺伝子の過剰発現は、より頑強な排尿収縮反応に有意に又は検出可能に影響を及ぼすことなく、（ＩＭＰ（排尿間圧（ｉｎｔｅｒｍｉｃｔｕｒｉｔｉｏｎ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ）又はＳＡ（コントロールレベルと比較した自発活動）の減少として動物モデルにおいて測定した場合に）ＤＯの一因となる、より弱い、異常に増加したカルシウムシグナルを効率的に減少させ得るか又は阻害し得る。
【００２３】
加齢及び疾患により、大きなコンダクタンスＣａ２＋活性化電圧感受性カリウム（ＢＫα）チャネルのαサブユニットを発現する遺伝子であるｈＳｌｏ遺伝子の最終産物の発現が変化する可能性がある。この変化により、器官を構成する平滑筋の緊張の器官特異的な生理学的修正が減少する。この影響は、ヒトの疾患（例えば、陰茎にける勃起不全（ＥＤ）、膀胱における尿意切迫、頻度、夜間頻尿、及び尿失禁（例えば、過活動膀胱（ＯＡＢ）症候群）、肺における喘息、結腸における過敏性大腸、眼における緑内障、並びに前立腺における膀胱下尿道閉塞）を引き起こす、器官中の平滑筋細胞の増大した緊張である。
【００２４】
本発明の方法
本発明は、平滑筋の生理学的機能障害を処置するための遺伝子治療の方法を提供する。具体的には、本発明の方法を使用して、過活動膀胱（ＯＡＢ）症候群又は排尿筋過活動の症状を処置するか、又は緩和する。
【００２５】
ＯＡＢ症候群は、尿意切迫、頻度、夜間頻尿、及び尿失禁が挙げられるがこれらに限定されない一群の症状を特徴とする。ＯＡＢは、突発性ＯＡＢと神経原性ＯＡＢとに細分される。
【００２６】
排尿筋過活動は、自発的であり得るか又は誘発され得る充填期中の不随意な排尿筋収縮を特徴とする尿流動態観察として定義される。排尿筋過活動は、突発性排尿筋過活動と神経原性排尿筋過活動とに細分される。
【００２７】
本開示の組成物及び方法は、必要とするヒト対象又は患者の細胞への、ｈＭａｘｉ−Ｋをコードする核酸の送達を提供する。場合によっては、この核酸の送達は遺伝子治療と称され得る。
【００２８】
本開示の組成物及び方法は、ｈＭａｘｉ−Ｋ核酸又はその変異体の送達のための任意の適切な方法を提供する。場合によっては、この核酸の送達を、任意の適切な「ベクター」（「遺伝子送達」ビヒクル又は「遺伝子導入」ビヒクルとも称されることもある）を使用して実施し得る。ベクター、送達ビヒクル、遺伝子送達ビヒクル、又は遺伝子導入ビヒクルは、標的細胞に送達するポリヌクレオチドを含む任意の適切な高分子又は分子の複合体を指す場合がある。場合によっては、標的細胞は、核酸又は遺伝子が送達されるあらゆる細胞であり得る。送達するポリヌクレオチドは、遺伝子治療における目的のコーディング配列（例えばｈＳｌｏ遺伝子）を含み得る。
【００２９】
ｈＳｌｏ遺伝子は、排尿筋への直接注射により膀胱の平滑筋細胞に導入される。
【００３０】
例えば、適切なベクターとして、ウイルスベクター、（例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、及びレトロウイルス）、リポソーム、他の脂質含有複合体、並びに標的細胞へのポリヌクレオチドの送達を媒介し得る他の高分子複合体が挙げられ得るがこれらに限定されない。
【００３１】
或いは、哺乳動物ベクターを使用して、裸のＤＮＡ導入により、平滑筋細胞にｈＳｌｏ遺伝子を導入する。「裸のＤＮＡ」は、本明細書では、非ウイルスベクターに含まれるＤＮＡと定義される。このＤＮＡ配列を、好ましくはレシピエントの血液と等張である滅菌水溶液と組み合わせ得る。そのような溶液を、生理学的適合物質（例えば、塩化ナトリウム、グリシン、及び同類のもの）を含む水に、このＤＮＡを懸濁させ、生理学的条件に適合する緩衝ｐＨを維持し、次いで溶液を滅菌することにより調製し得る。本発明の好ましい実施形態では、このＤＮＡを、平滑筋細胞への導入に備えて、２０〜２５％のスクロース含有生理食塩水溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）と組み合わせる。
【００３２】
本明細書で説明されているように、核酸はポリヌクレオチドを指す場合がある。核酸及びポリヌクレオチドは互換的に使用され得る。場合によっては、核酸はＤＮＡを含んでもよいしＲＮＡを含んでもよい。一部の態様では、核酸は、Ｍａｘｉ−Ｋの発現用のＤＮＡ又はＲＮＡを含み得る。一部の態様では、ＲＮＡ核酸として、目的の遺伝子（例えばＳｌｏ）の転写産物、イントロン、非翻訳領域、終止配列、及び同類のものが挙げられ得るがこれらに限定されない。他の場合では、ＤＮＡ核酸として、ハイブリッドプロモーター遺伝子配列、強力な構成的プロモーター配列、目的の遺伝子（例えばＳｌｏ）、非翻訳領域、終止配列、及び同類のもの等の配列が挙げられ得るがこれらに限定されない。場合によっては、ＤＮＡ及びＲＮＡの組み合わせが使用され得る。
【００３３】
本明細書の開示で説明されているように、用語「発現構築物」は、核酸コーディング配列の一部又は全てが転写され得る遺伝子産物をコードする核酸又はポリヌクレオチドを含む、あらゆるタイプの遺伝子構築物を含むことが意図されている。この転写産物はタンパク質へと翻訳され得る。一部の態様では、この転写産物は、部分的に翻訳されてもよいし翻訳されなくてもよい。ある特定の態様では、発現には、遺伝子の転写と、ｍＲＮＡの遺伝子産物への翻訳との両方が含まれる。他の態様では、発現には、目的の遺伝子をコードする核酸の転写のみが含まれる。
【００３４】
核酸を、核酸の量として測定し得る。一般に、核酸の任意の適切な量を、本開示の組成物及び方法と共に使用し得る。場合によっては、核酸は、少なくとも約１ｐｇ、１０ｐｇ、１００ｐｇ、１ｐｇ、１０ｐｇ、１００ｐｇ、２００ｐｇ、３００ｐｇ、４００ｐｇ、５００ｐｇ、６００ｐｇ、７００ｐｇ、８００ｐｇ、９００ｐｇ、１μｇ、１０μｇ、１００μｇ、２００μｇ、３００μｇ、４００μｇ、５００μｇ、６００μｇ、７００μｇ、８００μｇ、９００μｇ、１ｎｇ、１０ｎｇ、１００ｎｇ、２００ｎｇ、３００ｎｇ、４００ｎｇ、５００ｎｇ、６００ｎｇ、７００ｎｇ、８００ｎｇ、９００ｎｇ、１ｍｇ、１０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、７００ｍｇ、８００ｍｇ、９００ｍｇ、１ｇ、２ｇ、３ｇ、４ｇ、又は５ｇであり得る。場合によっては、核酸は、最大約１ｐｇ、１０ｐｇ、１００ｐｇ、１ｐｇ、１０ｐｇ、１００ｐｇ、２００ｐｇ、３００ｐｇ、４００ｐｇ、５００ｐｇ、６００ｐｇ、７００ｐｇ、８００ｐｇ、９００ｐｇ、１μｇ、１０μｇ、１００μｇ、２００μｇ、３００μｇ、４００μｇ、５００μｇ、６００μｇ、７００μｇ、８００μｇ、９００μｇ、１ｎｇ、１０ｎｇ、１００ｎｇ、２００ｎｇ、３００ｎｇ、４００ｎｇ、５００ｎｇ、６００ｎｇ、７００ｎｇ、８００ｎｇ、９００ｎｇ、１ｍｇ、１０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、７００ｍｇ、８００ｍｇ、９００ｍｇ、１ｇ、２ｇ、３ｇ、４ｇ、又は５ｇであり得る。
【００３５】
場合によっては、核酸は、少なくとも約５０００ｍｃｇ、７５００ｍｃｇ、１０，０００ｍｃｇ、１２，５００ｍｃｇ、１５，０００ｍｃｇ、１６，０００ｍｃｇ、１７，５００ｍｃｇ、２０，０００ｍｃｇ、２２，５００ｍｃｇ、２４，０００ｍｃｇ、２５，０００ｍｃｇ、３０，０００ｍｃｇ、３５，０００ｍｃｇ、４０，０００ｍｃｇ、４５，０００ｍｃｇ、又は５０，０００ｍｃｇであり得る。
【００３６】
本明細書で使用される場合、ｍｃｇ及びμｇは互換的に使用される。
【００３７】
本発明は、具体的には、平滑筋の緊張の調節に関与するＭａｘｉＫチャネルタンパク質が平滑筋の弛緩を調節する遺伝子治療の方法を提供する。このタンパク質は、平滑筋の弛緩を促進するか又は増強し、そのため、平滑筋の緊張が軽減されるだろう。具体的には、膀胱において平滑筋の緊張が軽減されると、膀胱容量が増加するだろう。
【００３８】
さらに、本発明は、具体的には、対象の膀胱の平滑筋の緊張を調製する方法であって、この対象の膀胱の平滑筋細胞への、平滑筋の緊張の調節に関与するタンパク質をコードするＤＮＡ配列の導入と、対象の膀胱の弛緩を増強するための、対象の膀胱の平滑筋細胞の十分な数の発現とを含む方法を提供する。この実施形態では、本発明の方法を使用して過敏性膀胱を緩和する。過敏性膀胱は、様々な障害（例えば、神経原性の機能障害、及び動脈原性の機能障害）、並びに膀胱の平滑筋の不完全な弛緩又は増大した収縮性を引き起こす他の状態に起因し得る。この対象は動物であってもよいしヒトであってもよく、好ましくはあヒトである。
【００３９】
本発明の組換えベクター及びプラスミドはまた、適切な宿主細胞中でベクター構築物の発現を引き起こすために、適切な調節エレメントをコードするヌクレオチド配列も含んでもよい。本明細書で使用される場合、「発現」は、ベクターの、挿入されたＤＮＡをｍＲＮＡへと転写する能力を指し、その結果、この挿入された核酸によりコードされるタンパク質の合成が起こり得る。当業者は下記を認識するだろう：（１）様々なエンハンサー及びプロモーターが、本発明の構築物中での使用に適していること；並びに（２）この構築物は、組換えベクター構築物の宿主細胞への導入時での、平滑筋の緊張の調節に関与するタンパク質をコードするＤＮＡ配列の適切な転写及び処理に必須の開始配列、終止配列、及び制御配列を含むであろうこと。
【００４０】
本発明により提供される非ウイルスベクターは、平滑筋の緊張の調節に関与するタンパク質をコードするＤＮＡ配列の平滑筋細胞中での発現のために、当業者に既知の下記のベクターの内のいずれかの全て又は一部を含んでもよい：ｐＶａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ｐＣＭＶβ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＥＴ−３ｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ｐＰｒｏＥｘ−１（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｐＦａｓｔＢａｃ  １（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｐＳＦＶ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｐｃＤＮＡ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＳＬ３０１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＳＥ２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＳＥ３８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＴｒｃＨｉｓ  Ａ，Ｂ，Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲＳＥＴ  Ａ，Ｂ，Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＡＣ３６０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＶＬ１３９２及びｐＶｌ１３９２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＣＤＭ８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐｃＤＮＡ  Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐｃＤＮＡ  Ｉ（ａｍｐ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＺｅｏＳＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲｃ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲｃ／ＲＳＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲＥＰ７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲＥＰ８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲＥＰ９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲＥＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＥＢＶＨｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、並びにλＰｏｐ６。当業者には他のベクターが明らかであるだろう。好ましくは、このベクターはｐＶａｘである。
【００４１】
一部の実施形態では、このｐＶａｘベクターの配列は、
【化１】
2020520383.tif 000003
の配列を含む。一部の実施形態では、このｐＶＡＸ配列は、配列番号１０に対して少なくとも９５％同一であるか、少なくとも９６％同一であるか、少なくとも９７％同一であるか、少なくとも９８％同一であるか、又は少なくとも９９％同一である配列を含む。一部の実施形態では、このｐＶＡＸ配列は、配列番号１０の２位でのＡのＧへの置換、配列番号１０の５位でのＧの付加、配列番号１０の１１５８位でのＣのＴへの置換、配列番号１０の２０９２位でのＡの欠失、配列番号１０の２４９３位でのＣのＴへの置換、又はこれらの組み合わせを含む。
【００４２】
本発明に適したプロモーターとして、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、及び誘導性プロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、このプロモーターは平滑筋プロモーターである。他の実施形態では、このプロモーターは筋細胞プロモーターである。好ましくは、このプロモーターは、尿路上皮特異的発現プロモーターではない。
【００４３】
本発明の一実施形態では、平滑筋の緊張の調節に関与するタンパク質をコードするＤＮＡ配列の発現は、このＤＮＡ配列が導入されている特定のベクターにより制御され、且つこのベクターの影響を受ける。いくつかの真核生物ベクターは、挿入された核酸を宿主細胞内で高レベルに発現し得るように操作されている。そのようなベクターは、多数の強力なプロモーターの内の１つを利用して、高レベルの発現を指示する。真核生物ベクターは、ウイルス遺伝子のプロモーター−エンハンサー配列（特に、腫瘍ウイルスのもの）を使用する。本発明のこの特定の実施形態は、誘導性プロモーターの使用により、タンパク質をコードするＤＮＡ配列の発現の調節を提供する。誘導性プロモーターの非限定的な例として、メタロチオネインプロモーター、及びマウス乳房腫瘍ウイルスプロモーターが挙げられる。ベクターに応じて、平滑筋細胞中でのＤＮＡ配列の発現は、この細胞の成長サイクルにおける特定の時点での特定の化合物の添加により誘導されるだろう。本発明の組換えベクターでの使用に有効なプロモーター及びエンハンサーの他の例として、下記が挙げられるがこれらに限定されない：ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）、ＳＶ４０（シミアンウイルス４０）、ＨＳＶ（単純ヘルペスウイルス）、ＥＢＶ（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス）、レトロウイルス、アデノウイスルのプロモーター及びエンハンサー、並びに平滑筋特異的プロモーター及び平滑筋特異的エンハンサー。平滑筋特異的プロモーターの一例はＳＭ２２αである。例示的な平滑筋プロモーターが米国特許第７，１６９，７６４号明細書で説明されており、この内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００４４】
好ましい実施形態では、このプロモーターはＳＭ２２αプロモーター配列であり、
【化２】
2020520383.tif 000004
等の配列が挙げられ得るがこれに限定されない。
【００４５】
好ましい実施形態では、このプロモーターはヒトサイトメガロウイルス中期−初期プロモーター配列であり、
【化３】
2020520383.tif 000005
等の配列が挙げられ得るがこれに限定されない。
【００４６】
一部の態様では、Ｔ７プライミング部位として、ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ  配列番号２等の配列が挙げられ得るがこれに限定されない。
【００４７】
一部の態様では、本開示のＤＮＡ配列又はタンパク質を発現させるために使用される組換えウイルス及び／又はプラスミドは、ポリＡ（ポリアデニル化）配列（例えば、本明細書で提供されるもの（例えばＢＧＨポリＡ配列））を含む。一般に、任意の適切なポリＡ配列を、導入遺伝子の所望の発現に使用してもよい。例えば、場合によっては、本開示は、ＢＧＨポリＡ配列又はＢＧＨポリＡ配列の一部を含む配列を提供する。場合によっては、本開示は、１種又は複数種のポリＡ配列又は配列要素の組み合わせを含むポリＡ配列を提供する。場合によっては、ポリＡ配列は使用されない。場合によっては、１種又は複数種のポリＡ配列は、非翻訳領域（ＵＴＲ）、３’ＵＴＲ、又は終止配列と称され得る。
【００４８】
ポリＡ配列は、１〜１０ｂｐ、１０〜２０ｂｐ、２０〜５０ｂｐ、５０〜１００ｂｐ、１００〜５００ｂｐ、５００ｂｐ〜１Ｋｂ、１Ｋｂ〜２Ｋｂ、２Ｋｂ〜３Ｋｂ、３Ｋｂ〜４Ｋｂ、４Ｋｂ〜５Ｋｂ、５Ｋｂ〜６Ｋｂ、６Ｋｂ〜７Ｋｂ、７Ｋｂ〜８Ｋｂ、８Ｋｂ〜９Ｋｂ、及び９Ｋｂ〜１０Ｋｂの長さを含み得る。ポリＡ配列は、少なくとも１ｂｐ、２ｂｐ、３ｂｐ、４ｂｐ、５ｂｐ、６ｂｐ、７ｂｐ、８ｂｐ、９ｂｐ、１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、６０ｂｐ、７０ｂｐ、８０ｂｐ、９０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１Ｋｂ、２Ｋｂ、３Ｋｂ、４Ｋｂ、５Ｋｂ、６Ｋｂ、７Ｋｂ、８Ｋｂ、９Ｋｂ、及び１０Ｋｂの長さを含み得る。ポリＡ配列は、最大１ｂｐ、２ｂｐ、３ｂｐ、４ｂｐ、５ｂｐ、６ｂｐ、７ｂｐ、８ｂｐ、９ｂｐ、１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、６０ｂｐ、７０ｂｐ、８０ｂｐ、９０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１Ｋｂ、２Ｋｂ、３Ｋｂ、４Ｋｂ、５Ｋｂ、６Ｋｂ、７Ｋｂ、８Ｋｂ、９Ｋｂ、及び１０Ｋｂの長さを含み得る。
【００４９】
場合によっては、ＢＧＨポリＡとして、
【化４】
2020520383.tif 000006
等の配列が挙げられ得るがこれに限定されない。
【００５０】
場合によっては、ポリＡ配列は、タンパク質発現に影響を及ぼす様々なパラメータ（例えば、限定されないが、細胞中での導入遺伝子のｍＲＮＡ半減期、導入遺伝子のｍＲＮＡの安定性、又は転写調節）に対して最適化され得る。例えば、ポリＡ配列は、導入遺伝子のｍＲＮＡ転写を増加させるように変更され得、これによりタンパク質発現が増加し得る。場合によっては、このポリＡ配列は、導入遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の半減期を短縮するように変更され得、これによりタンパク質の発現が減少し得る。
【００５１】
一部の態様では、本ベクターは、複製起点配列（例えば、本明細書で提供されるもの）をコードする配列を含む。複製起点配列は一般に、プラスミド／ベクターの増殖に有用な配列を提供する。
【００５２】
場合によっては、ｐＵＣ複製起点配列として、
【化５】
2020520383.tif 000007
等の配列が挙げられ得るがこれに限定されない。
【００５３】
本ベクターはまた、選択可能なマーカーを含んでもよい。選択可能なマーカーは、陽性であり得るか、陰性であり得るか、又は二機能性であり得る。陽性の選択可能なマーカーは、このマーカーを保有する細胞の選択を可能にし、陰性の選択可能なマーカーは、このマーカーを保有する細胞の選択的な排除を可能にする。様々なそのようなマーカー遺伝子（例えば、二機能性（即ち、陽性／陰性）マーカー）が説明されている（例えば、１９９２年５月２９日に公開されたＬｕｐｔｏｎ，Ｓ．，国際公開第９２／０８７９６号パンフレット；及び１９９４年１２月８日に公開されたＬｕｐｔｏｎ，Ｓ．，国際公開第９４／２８１４３号パンフレットを参照されたい）。陰性の選択可能なマーカーの例として、抗生物質（例えば、アンピシリン又はカナマイシン）に対する耐性遺伝子の包含が挙げられ得る。そのようなマーカー遺伝子は、遺伝子治療の状況で有利であり得る制御の追加の尺度を提供し得る。多種多様なそのようなベクターは当分野で既知であり、且つ一般に利用可能である。
【００５４】
場合によっては、カナマイシンに対する耐性をコードする核酸として、
【化６】
2020520383.tif 000008
等の配列が挙げられ得るがこれに限定されない。
【００５５】
組換えベクター／プラスミドは、ヒトＭａｘｉ−Ｋタンパク質、変異体Ｍａｘｉ−Ｋタンパク質、又はこれらの機能的断片をコードするポリヌクレオチドを含む。本発明での使用に適したＭａｘｉ−Ｋタンパク質をコードする例示的な核酸として、配列番号６の核酸配列が挙げられる。
ｈＳｌｏ
【化７】
2020520383.tif 000009
【化８】
2020520383.tif 000010
【化９】
2020520383.tif 000011
【００５６】
ｈＳｌｏ遺伝子の改変を使用して、例えば、ＢＫチャネル発現、活性、上流のシグナル伝達事象、及び／又は下流のシグナル伝達事象の変更により引き起こされるヒト疾患を効率的に処置し得る。ｈＳｌｏの野生型のヌクレオチド配列又はペプチド配列への改変として、欠失、挿入、フレームシフト、置換、及び逆位が挙げられ得るがこれらに限定されない。例えば、ｈＳｌｏの野生型配列への企図される改変として、ｈＳｌｏをコードするＤＮＡ配列、ｃＤＮＡ配列、若しくはＲＮＡ配列の単一ヌクレオチドの置換、及び／又はｈＳｌｏをコードするペプチド配列若しくはポリペプチド配列の単一アミノ酸の置換が挙げられる。ｈＳｌｏをコードするＤＮＡ配列、ｃＤＮＡ配列、若しくはＲＮＡ配列の単一ヌクレオチドの置換、及び／又はｈＳｌｏをコードするペプチド配列若しくはポリペプチド配列の単一アミノ酸の置換はまた、点変異とも称される。ｈＳｌｏをコードするＤＮＡ配列内の、ｃＤＮＡ内の、若しくはＲＮＡ配列内の置換、及び／又はｈＳｌｏをコードするペプチド配列内の、若しくはポリペプチド内の置換は、保存されてもよいし保存されなくてもよい。
【００５７】
ｈＳｌｏ遺伝子における好ましい改変として、配列番号７に従ってナンバリングされた場合に核酸位置１０５４での点変異が挙げられる。この点変異により、配列番号７に従ってナンバリングされた場合にＭａｘｉＫチャネルタンパク質の３５２位でのアミノ酸置換が生じる。例えば、この点変異はトレオニン（Ｔ）のセリン（Ｓ）への置換（例えばＴ３５２Ｓ）である。任意に、ｈＳｌｏ遺伝子中の追加の改変として、配列番号８に従ってナンバリングされた場合にアミノ酸位置４９６、６０２、６８１、７７８、８０５、又は９７７での１つ又は複数のアミノ酸置換を生じる点変異が挙げられる。
【００５８】
アミノ酸配列（配列番号８）中の追加の変異も黒色の背景での白色の字体で強調し、且つ変異の名称（例えば、Ｃ９７７Ａ（Ｃ１）、Ｃ４９６Ａ（Ｃ２）、Ｃ６８１Ａ（Ｃ３）、Ｍ６０２Ｌ（Ｍ１）、Ｍ７７８Ｌ（Ｍ２）、及びＭ８０５Ｌ（Ｍ３））を添付する。
【化１０】
2020520383.tif 000012
【化１１】
2020520383.tif 000013
【化１２】
2020520383.tif 000014
【化１３】
2020520383.tif 000015
【００５９】
本発明は、平滑筋の緊張の調節に関与するタンパク質をコードする外因性ＤＮＡ配列を発現する平滑筋細胞をさらに提供する。本明細書で使用される場合、「外因性」は、生物又は細胞に導入されるあらゆるＤＮＡを意味する。一部の実施形態では、この外因性ＤＮＡ配列はｈＳｌｏをコードする。
【００６０】
医薬組成物
医薬組成物は、１種又は複数種の活性成分と、１種又は複数種の添加剤、担体、安定剤、又は増量剤と含む製剤であって、所望の診断結果、又は治療効果若しくは予防効果を達成するためにヒト患者への投与に適した製剤である。貯蔵安定性及び取扱いの利便性のために、医薬組成物を、患者への投与の前に生理食塩水又は水で再構成され得る凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）（即ち、凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ  ｄｒｉｅｄ））粉末又は真空乾燥粉末として製剤化し得る。或いは、この医薬組成物を水溶液として製剤化し得る。医薬組成物はタンパク質性活性成分を含み得る。医薬組成物中に存在するタンパク質活性成分の安定化を試みるために、様々な添加剤（例えば、アルブミン及びゼラチン）が様々な成功度で使用されている。加えて、凍結乾燥の凍結条件下でのタンパク質の変性を減少させるために、アルコール等の抗凍結剤が使用されている。
【００６１】
内用に適した医薬組成物として、滅菌水溶液又は分散液、及び滅菌注射溶液又は分散液の即時調製用の滅菌粉末が挙げられる。静脈内投与の場合、適切な担体として、生理食塩水、静菌水、又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、この組成物は滅菌されていなければならず、且つ容易な注射能力（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度まで流動性であるべきである。この組成物は、製造及び貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌等の微生物の混入作用に対して保護されていなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール、及び同類のもの）、並びにこれらの適切な混合物を含む溶媒又は分散媒であり得る。適切な流動性を、例えば、レシチン等のコーティングの使用により、分散液の場合に必要される粒径の維持により、並びに界面活性剤（例えば、ポリソルベート（Ｔｗｅｅｎ（商標））、ドデシル硫酸ナトリウム（ラウリル硫酸ナトリウム）、ラウリルジメチルアミンオキシド、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、ポリエトキシル化アルコール、ポリオキシエチレンソルビタン、オクトキシノール（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００（商標））、Ｎ，Ｎ−ジメチルドデシルアミン−Ｎ−オキシド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＨＴＡＢ）、ポリオキシル１０ラウリルエーテル、Ｂｒｉｊ  ７２１（商標）、胆汁塩（デオキシコール酸ナトリウム、コール酸ナトリウム）、プルロニック酸（ｐｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）（Ｆ−６８、Ｆ−１２７）、ポリオキシルヒマシ油（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（商標））、ノニルフェノールエトキシレート（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（商標））、シクロデキストリン、及びエチルベンゼトニウムクロリド（Ｈｙａｍｉｎｅ（商標）））の使用により維持し得る。微生物の作用の防止を、様々な抗菌剤及び抗真菌剤（例えば、パラベテン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール、及び同類のもの）により達成し得る。多くの場合では、この組成物中に等張剤（例えば、糖、ポリアルコール（例えば、マンニトール、ソルビトール）、塩化ナトリウム）を含めることが好ましいだろう。この内部組成物の長期にわたる吸収は、この組成物に、吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン）を含めることによりもたらされ得る。
【００６２】
必要な量の活性化合物を、上記に列挙した成分の内の１つ又は組み合わせと共に適切な溶媒に組み込み、その後、必要に応じてろ過滅菌することにより、滅菌溶液を調製し得る。一般に、活性化合物を、基本的な分散媒と、上記に列挙したものからの必要な他の成分とを含む滅菌ビヒクルに組み込むことにより、分散液を調製する。滅菌されている注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合には、調製方法は、活性成分の粉末と、既に滅菌ろ過された溶液からの任意の追加の所望の成分とを生じる真空乾燥及び凍結乾燥である。
【００６３】
本医薬組成物を、投与のための説明書と一緒に、容器、パック、又はディスペンサーに入れることができる。
【００６４】
本開示のある特定の組成物はまた、製剤中に担体化合物も組み込む。本明細書で使用される場合、「担体化合物」又は「担体」は、不活性である（即ち、それ自体が生物学的活性を有さない）が、例えば、生物学的に活性な核酸の分解又は循環からの除去の促進により生物学的活性を有する核酸のバイオアベイラビリティを低下させるインビボのプロセスにより核酸として認識される核酸又はその類似体を指し得る。一般に過剰な後者の物質との核酸及び担体化合物の共投与は、おそらく共通のレセプターに対する担体化合物と核酸との競合に起因して、肝臓、腎臓、又は他の余分な循環リザーバーで回収される核酸の量の実質的な減少をもたらし得る。例えば、肝組織中での部分的なホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの回収は、ポリイノシン酸、硫酸デキストラン、ポリシチジン酸、又は４−アセトアミド−４’イソチオシアノ−スチルベン−２，２’ジスルホン酸と共投与される場合には減少する可能性がある（Ｍｉｙａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，１９９５，５，１１５−１２１；Ｔａｋａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＆  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．，１９９６，６，１７７−１８３）。
【００６５】
ベクターを、哺乳動物患者（特にヒト）への投与ための医薬組成物に組み込み得る。このベクター又はビリオンを、好ましくは３〜８の範囲のｐＨで、より好ましくは６〜８の範囲のｐＨで、最も好ましくは６．８〜７．２の範囲のｐＨで、非毒性で不活性な薬学的に許容される水性担体で製剤化し得る。そのような滅菌組成物は、再構成時に許容可能なｐＨを有する水性緩衝液に溶解される治療用分子をコードする核酸を含むベクターを含むだろう。
【００６６】
一部の態様では、本明細書で提供される医薬組成物は、薬学的に許容される担体及び／又は添加剤（例えば、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ホスフェート及びアミノ酸、ポリマー、ポリオール、糖、緩衝液、保存料、並びに他のタンパク質）との混合物である治療上有効な量のベクターを含む。例示的なアミノ酸、ポリマー、及び糖、並びに同類のものは、オクチルフェノキシポリエトキシエタノール化合物、ポリエチレングリコールモノステアレート化合物、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、スクロース、フルクトース、デキストロース、マルトース、グルコース、マンニトール、デキストラン、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール、キシリトール、ラクトース、トレハロース、ウシ又はヒトの血清アルブミン、シトレート、アセテート、リンゲル溶液及びハンクス溶液、システイン、アルギニン、カルニチン、アラニン、グリシン、リシン、バリン、ロイシン、ポリビニルピロリドン、ポリエチレン、並びにグリコールである。
【００６７】
一部の態様では、本明細書で提供される医薬組成物は、緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、又はリン酸ナトリウム／硫酸ナトリウム、トリス緩衝液、グリシン緩衝液、滅菌水、及び当業者に既知の他の緩衝液（例えば、Ｇｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９６６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５：４６７により説明されているもの））を含む。好ましい医薬組成物は、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、及びスクロースを含む。
【００６８】
一部の態様では、本明細書で提供される医薬組成物は、懸濁液の粘度を増加させる物質（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、スクロース、又はデキストラン）を約１〜３０パーセントの量で含み、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０パーセント（体積／体積）の量で含む。好ましくは、スクロースは約１０〜３０％（体積／体積）であり、最も好ましくは、スクロースは約２０％（体積／体積）である。
【００６９】
投与前に、本医薬組成物は、製造中に使用される成分（例えば、培養成分、宿主細胞タンパク質、宿主細胞ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ）を含まず、マイコプラズマ（ｍｙｃｏｐｌａｓｍ）、エンドトキシン、及び微生物混入物を実質的に含まない。好ましくは、本医薬組成物は、１０、５、３、２、又は１ＣＦＵ／綿棒（ｓｗａｂ）未満を有する。最も好ましくは、組成物は０ＣＦＵ／綿棒を有する。本医薬組成物中のエンドトキシンレベルは、２０ＥＵ／ｍＬ未満であるか、１０ＥＵ／ｍＬ未満であるか、又は５ＥＵ／ｍＬ未満である。
【００７０】
キット
本開示に有用な組成物及び試薬を、本開示の適用を容易にするためのキットに入れてもよい。一部の態様では、本方法は、本開示の組換え核酸を含むキットを提供する。一部の態様では、本方法は、本開示の組換えウイルスを含むキットを提供する。説明書は、あらゆる所望の形態（例えば、限定されないが、キット挿入物に印刷されたもの、１つ又は複数の容器に印刷されたもの、及びコンピュータ可読記憶媒体等の電子気記憶媒体上で提供される電子的に保存された説明書）である可能性がある。同様に任意に含まれるのは、ユーザーが情報を統合して制御用量を算出することを可能にする、コンピュータ可読記憶媒体上のソフトウェアパッケージである。
【００７１】
別の態様では、本開示は、本明細書で提供される医薬組成物を含むキットを提供する。さらに別の態様では、本開示は、疾患の処置におけるキットを提供する。
【００７２】
一態様では、キットは、（ａ）本明細書で提供される組換えウイルスと、（ｂ）この組換えウイルスの治療上有効な量を細胞又は個体に投与するための説明書とを含む。一部の態様では、このキットは、この組換えウイルスを投与するための薬学的に許容される塩又は溶液を含み得る。任意に、このキットは、ラベル又は別個の挿入物の形態で、適切な操作パラメータの説明書をさらに含み得る。例えば、このキットは、組換えウイルスの用量を調製するために医師又は検査技師に情報を提供する標準的な説明書を有し得る。
【００７３】
任意に、このキットは標準又はコントロールの情報をさらに含み得、その結果、患者サンプルをコントロール情報標準と比較して、組換えウイルスの試験量が治療量であるかどうかを決定し得る。任意に、このキットは、投与用のデバイス（例えば、シリンジ、フィルタニードル、延長チューブ、及びカニュール）をさらに含む可能性がある。
【００７４】
定義
本明細書で説明されている本開示の組成物及び方法は、別途示さない限り、分子生物学（組換え技術を含む）、細胞生物学、生化学、免疫化学、及び眼科の技術の従来の技術及び説明を利用し得、これらは当業者のスキル内である。そのような従来の技術には、対象の網膜又は視力を観察して分析する方法、組換えウイルスのクローニング及び増殖、医薬組成物の製剤化、並びに生化学的精製及び免疫化学が含まれる。本明細書の実施例を参照することにより、適切な技術の具体的な説明を得ることができる。しかしながら、当然のことながら、等価の従来の手順も使用し得る。そのような従来の技術及び説明を標準的な実験室マニュアルで見出し得、例えば、Ｇｒｅｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ（Ｖｏｌｓ．Ｉ−ＩＶ）（１９９９）；Ｗｅｉｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｖａｒｉａｔｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２００７）；Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ，Ｄｖｅｋｓｌｅｒ，Ｅｄｓ．，ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２００３）；Ｂｏｗｔｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：Ａ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｍａｎｕａｌ（２００３）；Ｍｏｕｎｔ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（２００４）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｒｏｍ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２００６）；及びＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２００２）（全てＣｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓから）；Ｓｔｒｙｅｒ，Ｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（４ｔｈ  Ｅｄ．）Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｎ．Ｙ．（１９９５）；Ｇａｉｔ，”Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ”ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ（１９８４）；Ｎｅｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｘ，Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｕｂ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２０００）；並びにＢｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｕｂ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００２）で見出し得、これらは全て、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００７５】
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、別途文脈が明確に示さない限り、複数形も含むことが意図されている。さらに、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｗｉｔｈ）」、又はこれらの変形が、詳細な説明及び／又は特許請求の範囲のいずれかで使用されている限りにおいては、そのような用語は、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と同様の方法で包含的であることが意図されている。
【００７６】
本明細書では、範囲は、「約」ある特定の値からとして、及び／又は「約」別の特定の値までとして表され得る。そのような範囲が表される場合、別のケースでは、ある特定の値から、及び／又は他の特定の値までが含まれる。同様に、先行詞「約」の使用により値が近似値として表される場合、この特定の値が別のケースを形成することが理解されるだろう。範囲のそれぞれのエンドポイントは、他のエンドポイントとの関連で及び他のエンドポイントとは無関係にの両方で重要であることがさらに理解されるだろう。用語「約」は、本明細書で使用される場合、特定の使用の文脈内で、述べられた数値から１５％プラスマイナスである範囲を指す。例えば、約１０は８．５〜１１．５の範囲を含むだろう。用語「約」はまた、値の測定における典型的な誤差又は不正確さも説明する。
【００７７】
本発明の文脈では、用語「処置する」又は「処置」は、本明細書で使用される場合、そのような用語が適用される障害若しくは状態、又はそのような障害若しくは状態（例えば突発性過活動膀胱症候群）の１種若しくは複数種の症状を反転させること、緩和すること、これらの進行を阻害すること、又は予防することを意味する。
【００７８】
本発明によれば、用語「患者」又は「必要とする患者」は、突発性過活動膀胱症候群に罹患しているか又は罹患している可能性があるヒト又は非ヒト哺乳動物を対象とする。
【００７９】
本明細書で使用される場合、用語「排尿筋（ｄｅｔｒｕｓｏｒ）」又は「排尿筋（ｄｅｔｒｕｓｏｒ  ｍｕｓｃｌｅ）」は、膀胱の筋肉を意味する。「排尿筋内」は、排尿筋へを意味する。
【００８０】
本明細書で意図される場合、語句「単離核酸」は、あらゆるタイプの単離核酸を指し、特に、天然の又は合成のＤＮＡ又はＲＮＡ、一本鎖又は二本鎖であり得る。具体的には、核酸が合成である場合、核酸は、具体的には核酸の分解に対する耐性を増加させるために、塩基又は結合の非天然改変を含み得る。核酸がＲＮＡである場合、この改変は、このＲＮＡの末端のキャッピング又はリボース骨格の２’位の改変を特に包含し、その結果、例えば、（２’−デオキシリボース若しくは２’−デオキシリボース−２’−フルオロリボースが生じるように）ヒドロキシル部分を抑制することにより、又は（２’−Ｏ−メチル−リボースが生じるように）ヒドロキシル部分をアルキル基（例えばメチル基）で置換することにより、ヒドロキシル部分の反応性が低下する。
【００８１】
２種のアミノ酸配列又は核酸配列は、アミノ酸配列又は核酸配列の８０％超が同一であり、好ましくは８５％超が同一であり、好ましいは９０％超が同一であるか、又は約９０％超が類似しており、好ましくは９５％超が類似している（機能的に同一である）場合には、「実質的に相同」であるか、又は「実質的に類似」している。２種のアミノ酸配列又は２種の核酸の同一性パーセントを決定するために、これらの配列を、最適な比較目的のために整列させる（例えば、第２のアミノ酸配列又は核酸配列との最適な整列のために、第１のアミノ酸配列又は核酸配列の配列中にギャップを導入し得る）。次いで、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置でのアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較する。第１の配列中の位置が第２の配列中の対応する位置と同一のアミノ酸残基又はヌクレオチドで占められている場合には、これらの分子はその位置で同一である。２種の配列間の同一性パーセントは、これらの配列により共有される同一の位置の数の関数である。一実施形態では、２種の配列は長さが同一である。２種の配列間の同一性パーセントの決定を、数学的アルゴリズムを使用して達成し得る。好ましくは、類似する又は相同の配列は、例えば、ＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＧＣＧ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ７，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）パイルアッププログラム、又はＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等の配列比較アルゴリズムの内のいずれかを使用する整列により特定される。
【００８２】
本明細書で使用される場合、用語「ベクター」は、核酸分子であって、この核酸分子が連結されている別の核酸を輸送し得る核酸分子を指す。あるタイプのベクターは「プラスミド」であり、このプラスミドは、追加のＤＮＡセグメントがライゲートされ得る環状の二本鎖ＤＮＡループを指す。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、このウイルスベクターでは、追加のＤＮＡセグメントがウイルスゲノムにライゲートされ得る。ある特定のベクターは、このベクターが導入される宿主細胞中での自己複製が可能である（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター、及びエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより宿主ゲノムと一緒に複製される。さらに、ある特定のベクター、発現ベクターは、それらが機能的に連結されている遺伝子の発現を指示し得る。
【００８３】
他の実施形態
本発明をその詳細な説明と併せて説明したが、上述の説明は、本発明の範囲を例示することが意図されており、限定することは意図されておらず、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって定義される。他の態様、利点、及び変更は、下記の特許請求の範囲内である。
【実施例】
【００８４】
実施例１：ｈＭａｘｉ−Ｋ遺伝子導入による非臨床研究
ラット
ラットモデルにおける部分的な泌尿器出口の閉塞の病態生理は、ヒトで観察される、対応する下部尿路の症状の多くの関連する特徴を再現する。述べた生理学的類似性及び病態生理学的類似性により、ラット膀胱に関する研究は、ヒト膀胱の生理及び機能障害の少なくともいくつかの特徴の洞察を提供するであろうと仮定することは理にかなっている。
【００８５】
ラット膀胱の生理はヒト膀胱の多くの特徴と類似していることから、研究は、部分的な泌尿器出口の閉塞のラットモデルでの膀胱過活動を寛解させるための、ｈＳｌｏ  ｃＤＮＡ（即ち、ｍａｘｉ−Ｋチャネル）による膀胱注入Ｋチャネル遺伝子治療の潜在的有用性を調べた。
【００８６】
ある研究では、２２匹の雌のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを、部分的な尿道（即ち、出口、ＰＵＯ）閉塞に供し、１７匹の偽手術コントロールラットを並行に走らせた。閉塞の６週間後、全てのラットの膀胱のドーム中に、恥骨上カテーテルを外科手術により留置した。１２匹の閉塞ラットに、カテーテル挿入の最中にＰＢＳ−２０％スクロース  １ｍｌ中のｈＳｌｏ／ｐｃＤＮＡ  １００μｇの膀胱滴下注入を行ない、別の１０匹の閉塞ラットに、ＰＢＳ−２０％スクロース１ｍｌ（７匹のラット）又はｐｃＤＮＡのみを含むＰＢＳ−２０％スクロース１ｍｌ（３匹のラット）を投与した。手術の２日後、全ての動物に対して膀胱内圧測定を実施して、意識のあるラット及び拘束されていないラットにおける排尿反射の特徴を調べた。閉塞は、膀胱重量の３〜４倍の増加と、ほぼ全ての排尿パラメータの推定値の変化とに関連していた（表１を参照されたい）。
【００８７】
ＰＢＳ−２０％スクロースを注射した閉塞ラットは、排尿間で自発的な膀胱収縮を日常的に示した。対照的に、ｈＳｌｏ注射は、あらゆる他の膀胱内測定パラメータに検出可能な影響を及ぼすことなく、閉塞に関連する膀胱の活動亢進を除去した。おそらく、ラット膀胱中でのｈＳｌｏの発現は、閉塞動物で通常観察される収縮性の増加に機能的に拮抗し、それにより膀胱の過剰活動を寛解させる。
【００８８】
別の研究では、ｈＳｌｏ遺伝子導入が、閉塞された雄のラットモデルで観察される排尿間の圧力変動を変更する及び／又は寛解させる能力を調べた。これらの研究のために、会陰アプローチを使用して２週間にわたりラットを閉塞させた。２週間の閉塞の後、膀胱内圧測定検査のためにラットにカテーテルを挿入し、２つの処置群の内の１つに留置した。年齢を一致させたコントロールラットを偽の閉塞に供し、並行に走らせた。
【００８９】
全ての実験動物の排尿パラメータの平均値を表２にまとめ、これらの結果の顕著な特徴を図１及び図２においてグラフで示す。重要なことに、６週間閉塞した雌のラットでの研究と同様に、ｈＳｌｏ／ｐＶＡＸ  １００μｇの単一膀胱内滴下注入は、主要な生理学的関連のいくつかの排尿パラメータの統計学的に有意な変化と関連していた。
【００９０】
３番目の研究では、雌のラットにおける２週間の部分的な尿道出口閉塞後のｈＳｌｏ遺伝子導入の効果を評価した。部分的な尿道出口閉塞（ＰＵＯ）を引き起こすために、上記で説明したように、２００〜２５０ｇの体重の雌のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの尿道に結紮糸を留置した（Ｃｈｒｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。結紮糸の留置の２週間後、ラットを、恥骨上カテーテルの留置のための手術に供した。２日後、膀胱機能の研究（即ち、膀胱内圧測定）を、代謝ケージ内の意識のある拘束されていないラットに対して実施した。表３及び図３に示すように、２週間の部分的な尿道出口閉塞の後、雌のラットは、膀胱容量の２倍超の増加と有意な自発的膀胱収縮の出現とにより明らかなように、膀胱機能の有意な変化を示す。自発的膀胱収縮の増加は排尿間の圧力変動として観察され（図３を参照されたい）、ＳＡ値及びＩＭＰ値で観察される、対応する増加により、表３に示すように定量され得る。ｐＶＡＸ／ｈＳｌｏ  ３００μｇ及び１０００μｇ（ＰＢＳ−２０％スクロース１ｍｌ中）の１回の腔内膀胱注射により、排尿筋過活動がほぼ完全に除去された。この効果は、ｐＶＡＸベクターのみで処置されたラットと比較した場合に、ｈＳｌｏで処置された閉塞ラットのＩＭＰ及びＳＡの有意な減少に反映される（表３を参照されたい）。このモデルでは、ｈＳｌｏ遺伝子導入の真のＤＯ効果の関係は示されていなかったが、この研究では、ＤＯの１ログ単位の変動（１００〜１０００μｇ）を超えて、統計的に有意であり、さらに、膀胱が空になる能力に対するあらゆる検出可能な効果がない場合には、ＤＯの減少において生理学的な関連が存在することが実証された。即ち、この動物モデルでは、ｐＶＡＸ／ｈＳｌｏは、膀胱機能にいかなる有害な影響も与えることなく、流出閉塞に関連するＤＯの病態生理学的影響を寛解させ得る。６週間閉塞した雌のＳｐｒａｇｕｅ  ＤａｗｌｅｙラットでのｐＶＡＸ／ｈＳｌｏ  １００μｇの滴下注入後に同様の効果を観察し、下記に示す。
【００９１】
膀胱壁に注射された遺伝子導入の様々な体積の分布を評価するためのウサギ研究を、直接膀胱内注射を使用する、ＯＡＢを有する女性の臨床試験の開始前に実施した（表４）。体重が平均６ポンドである９羽の雌の成体のＮｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ白ウサギを使用した。これらの動物を麻酔にかけ、ｐＶＡＸ−ｌａｃｚを、膀胱壁の４箇所、８箇所、及び１０箇所の部位に、０．０５、０．１、及び０．１５ｍｌのアリコートで排尿筋に注射した。３羽の動物の追加のセットに、最高量の担体（４箇所、８箇所、又は１０箇所の部位×０．１５ｍｌ）のみで、担体のみを注射した。プラスミドは、４０００μｇ／ｍｌの濃度で溶液中に存在した。１週間後、これらの動物を安楽死させ、膀胱を摘出して秤量した。青色の領域を、組織学的検査及び分子分析のために準備した。ｈＳｌｏ発現組織の分子分析を、ＲＮＡ抽出及びリアルタイムＰＣＲで行なった。加えて、様々なウサギ組織に対して病理組織診断を実施した。
【００９２】
この動物モデルでは膀胱への直接注射が困難であることから、１羽のウサギのみに０．０５ｍｌを注射した。６羽のウサギは、４箇所、８箇所、及び１０箇所の部位で０．１ｍｌを有した（膀胱の内側から３羽；膀胱の外側から３羽）。３羽のウサギは、４箇所、８箇所、及び１０箇所の部位で０．１５ｍｌを有した。結果は、注射回数がより多いウサギ（８〜１０回の注射）は、注射回数が最少の数羽の動物（４回の注射）と比べて発現が少ないことを示した。全体的な結論は、膀胱壁への直接注射は遺伝子の発現をもたらすが、おそらく１ｃｍ離れた注射のより広い分布で最もうまくいくように見える。遺伝子を、処置後３０分まで血液中で検出した。縫合糸に起因して肉芽腫病変を観察した（ウサギモデルにおける一般的な人為的結果）。
【００９３】
毒性学
ＯＡＢの徴候に関して、ヒトの試験で使用されるようなラットにおけるｐＶＡＸ／ｈＳｌｏの膀胱内投与の同一の経尿道経路をシミュレートすることは技術的に不可能である。従って、ｐＶＡＸ／ｈＳｌｏの膀胱内注射を評価する毒性学及び生体内分布の研究では、動物の膀胱を外科的に曝露し、研究物質を、針を使用して膀胱に直接注射した。
【００９４】
血液学的パラメータ及び化学的パラメータへのｐＶＡＸ／ｈＳｌｏの効果を、１５匹の２７５〜３００ｇｍの正常な雌のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットで評価した。ｐＶＡＸ／ｈＳｌｏ（８匹の動物）又はｐＶＡＸベクター（７匹の動物）のいずれか１０００μｇを、外科的曝露の後に膀胱の内腔に直接注射した。試験物質の注射後４、８、及び２４時間並びに１週間で、動物をＣＯ２麻酔で安楽死させた直後に、心臓スティックにより血液サンプルを採取した。サンプルを、グルコース、尿素窒素、クレアチニン、総タンパク質、総ビリルビン、アルカリホスファターゼ、ＡＬＴ、ＡＳＴ、コレステロール、ナトリウム、カリウム、塩化物、Ａ／Ｇ比、ＢＵＮ／クレアチニン比、グロブリン、リパーゼ、アミラーゼ、トリグリセリド、ＣＰＫ、ＧＴＰ、マグネシウム、及び浸透圧に関して分析した。これらの検査室パラメータは、４つの時点でｐＶＡＸ／ｈＳｌｏとコントロールとの間で類似していた。
【００９５】
雌のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（２７５〜３００ｇｍ）の病理組織診断へのｐＶＡＸ／ｈＳｌｏの効果を、２つの研究で評価した。第１の研究では、４匹のラットに部分的膀胱閉塞手術をし、２週間後に、ＰＢＳ−２０％スクロース１０００μＬ中のｐＶＡＸ／ｈＳｌｏ  １００μｇを、膀胱が外科手術により露出した膀胱の内腔に直接投与した。１匹の動物を、ｐＶＡＸ／ｈＳｌｏの注射後１、８、及び２４時間並びに１週間で安楽死させた。４７種の器官の組織を１０％ホルマリンで直ちに固定し、通常の組織病理学検査のために処理した。病理組織学的変化は膀胱でのみ認められ、漿膜炎、浮腫、出血、及び線維症からなった。これらの変化は、部分的な尿道閉塞により予想されるものと一致し、ｐＶＡＸ／ｈＳｌｏの注射と関連するとは考えられなかった。
【００９６】
ｐＶＡＸ／ｈＳｌｏを投与した、ＰＵＯ有するラットの膀胱の病理組織学的変化のために、膀胱に対する組織診への、ベクター（ｐＶＡＸ）及びＰＢＳ−２０％スクロースと比較したｐＶＡＸ／ｈＳｌｏの効果を、正常なラットで評価した。外科手術による曝露の後、下記の試験物質を膀胱内腔に直接注射した：１）ＰＢＳ−２０％スクロース０．６ｍｌ、２）ＰＢＳ−２０％スクロース０．６ｍｌ中のｐＶＡＸ  １０００μｇ、又は３）ＰＢＳ−２０％スクロース０．６ｍｌ中のｐＶＡＸ／ｈＳｌｏ  １０００μｇ。滴下注入の７２時間後にＣＯ２で動物を安楽死させ、膀胱と摘出してすぐに１０％ホルマリン溶液で固定した。膀胱壁への針穿刺の機械的影響を制限し、且つｐＶＡＸ／ｈＳｌｏ、ベクター、又は希釈剤により引き起こされる可能性のある炎症のあらゆる潜在的な影響を最小限に抑えるために、７２時間の時点を選択した。
【００９７】
膀胱の検査では著しい所見はなかった。全体的に、ｐＶＡＸ／ｈＳｌｏとビヒクル又はｐＶＡＸのいずれかとの間には、処置に関連する差異はなかった。尿路上皮では、処置に関連する変化は認められなかった。組織学的検査で見られた病変は、分布が散乱性又は多巣性ではなく局所性であったことから、注射に使用された針による外傷と一致した。
【００９８】
生体内分布研究では、２７５〜３００ｇの正常な雌のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの露出した膀胱の内腔に試験物質を直接注射した。ＰＢＳ−２０％スクロース０．６ｍｌ中のｐＶＡＸ／ｈＳｌｏ  １０００μｇを１２匹の動物に投与し、ＰＢＳ−２０％スクロース０．６ｍｌを５匹の動物に投与した（図４）。試験物質の注射後２４時間、１週間、及び１ヶ月で、４匹の動物それぞれを屠殺した。組織サンプルを、下記のような指定の順序で採取した：心臓、肝臓、脳、腎臓、脾臓、肺、大動脈、気管、リンパ節、眼、二頭筋、結腸、膣、及び子宮。
【００９９】
検証済みのＱＰＣＲ法により、ゲノムＤＮＡサンプルをカナマイシン遺伝子に関して分析した。結果は、ｐＶＡＸ／ｈＳｌｏ  １０００μｇの注射後に、大動脈、子宮、膀胱、及び尿道で２４時間後にプラスミドを検出し得たことを示す。１週間で、膀胱中において約１３００万個のコピー／総ＤＮＡのμｇを測定し、二頭筋においてもｐＶＡＸ／ｈＳｌｏをわずかに検出し得た。この結果を、図４（下記）においてグラフ形式で示す。
【０１００】
これらの結果は、海綿体内注射後の所見とは異なるが、１３００万個のコピー／総ＤＮＡのμｇの検出は、これらのワクチンの臨床治験薬（ＩＮＤ）試験での６０日後のＤＮＡワクチン注射の部位で持続するプラスミドの＜３０個のコピー／１０５個の宿主細胞よりも依然として低い。これらのＤＮＡワクチン研究は、筋肉内送達、皮下送達、皮内送達、又は粒子に媒介される送達が、異所でのプラスミドの長期にわたる持続をもたらさないことを実証した。加えて、動物の外科出術により露出した膀胱にｐＶＡＸ／ｈＳｌｏを直接注射するための手順が、膀胱以外の組織中でプラスミドを検出する能力を説明する場合がある。ヒトでは、経尿道カテーテルを使用してｈＭａｘｉ−Ｋを膀胱に直接滴下注入し、組織の損傷又は外傷に起因するプラスミド分布のリスクが明らかに著しく低下する。
【０１０１】
実施例２：ｈＭａｘｉ−Ｋ遺伝子導入によるヒト臨床試験
試験設計
これは、突発性（非神経原性）過活動膀胱症候群（ＯＡＢ）及び排尿筋過活動（ＤＯ）の女性患者の膀胱壁への直接注射として投与されるｈＭａｘｉ−Ｋ遺伝子の２種の漸増用量の安全性及び潜在的活性を評価するフェーズ１Ｂの多施設研究である。
【０１０２】
この研究の対象集団は、過活動膀胱（ＯＡＢ）及び排尿筋過活動を有するがそれ以外では健康である、出産可能性のない（例えば、子宮摘出、研究登録前に最後の月経周期＞１２ヶ月と定義される卵管結紮若しくは閉経後、又は血清ＦＳＨ＞４０ｍＩＵ／Ｌ）≧１８歳の女性である。
【０１０３】
包含基準には、下記の内の少なくとも１つを含む≧６ヶ月の継続時間の過活動膀胱の臨床症状が含まれる。
１．頻尿（≧８回／２４時間）
２．尿意切迫の症状（先送りすることが困難である、排尿に対する突然の抑え難い願望の訴え）、又は夜間頻尿の症状（排尿するために２回以上夜間に起きるという訴え）
３．切迫性尿失禁（１週間当たり平均５回−切迫性尿失禁とは下記のように定義される：切迫感を伴うか又は切迫感が即時に先行する不随意な漏出の訴え）
【０１０４】
参加者はまた、≦２００ｍｌの残尿量を実証するスクリーニング時での膀胱スキャンと、少なくとも５ｃｍ／Ｈ２Ｏの、排尿筋の≧１の制御されていない収縮のベースライン尿流動態試験の最中に記録された排尿筋過活動とを有した。
【０１０５】
表６は、診察による処置スケジュール及び手順の概要を示す。
【０１０６】
この研究の主な目的は、有害事象の発生と、プラセボ（ＰＢＳ−２０％スクロース）と比較したｈＭａｘｉ−Ｋの約２０〜３０回の膀胱壁筋肉内注射の単回処置との関係とを評価することである。これは、二重盲検の、不均衡なプラセボをコントロールとした連続投与試験であった。参加者は、出産可能性のない１８歳以上の健康な女性であり、下記のうちの少なくとも１つを伴う≧６ヶ月の持続時間の中程度のＯＡＢ／ＤＯを有した：１日当たり≧８回の頻尿、尿意切迫又は夜間頻尿の症状（排尿するために２回以上夜間に起きるという訴え）、切迫性尿失禁（１週間当たり５回以上の尿失禁エピソード）、及びＣＭＧで記録された少なくとも５ｃｍ／Ｈ２Ｏ圧の、排尿筋の≧１の制御されていない一過性収縮を有する排尿筋過活動。参加者の全員が、抗コリン薬による以前の処置に失敗していた。４例がオナボツリヌムトキシンＡ療法に失敗していた。
【０１０７】
参加者を、２種の用量（１６，０００μｇ若しくは２４，０００μｇ）の内の１種でのｈＭａｘｉ−Ｋ、又はプラセボのいずれかに無作為に割り当てた。膀胱鏡検査の最中に、膀胱壁への２０〜３０回のＩＭ注射として処置を施した。参加者を２４週間以内に８回観察し、１８ヶ月にわたり追跡調査した。治験薬の投与後に発生する全ての報告された有害事象を記録した。スクリーニング診察１Ａ（−１週目）及び注射後４週目（診察５）及び２４週間目（診察８）で複合ＣＭＧ（Ｃｏｍｐｌｅｘ  ＣＭＧ’ｓ）を行なった。排尿後残尿量（ＰＶＲ）を、Ｂｌａｄｄｅｒｓｃａｎ（登録商標）により毎診察時に測定した。
【０１０８】
有効性を評価するためのデータを、処置群（プラセボ対２種の積極的処置群との組み合わせ、及びプラセボ対組み合わせた処置群の組み合わせ）毎に概要記述統計（ｓｕｍｍａｒｙ  ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｖｅ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ）を使用して評価した。線形混合効果モデルを使用して、プラセボと積極的処置との間のベースラインからの変化の差異を推定し、異なる結果に対する用量反応があったかどうかを試験した。一般化推定方程式（ＧＥＥ）モデルを使用して、バイナリエンドポイント対する効果を推定した。
【０１０９】
６例の参加者には１６０００μｇを投与し、３例の参加者には２４０００μｇを投与し、且つ４例の参加者にはプラセボを投与した。両方の積極的処置群において、有害事象（ＡＥ）の大部分は重症度が軽度であり、全てが治験薬とは無関係であると見なされた。２例の女性は、ｈＭａｘｉ−Ｋによる処置後に軽度の無関係なＵＴＩを有し、１例には投与後１ヶ月で２４０００μｇを投与し、もう１例には投与後６ヶ月で１６０００μｇを投与した。１６０００μ群で、下記の無関係の深刻なＡＥが１件報告された：ＥＲ診察と必要とし且つ喘息処置が施された後に回復した、寒空に起因する既存の喘息の悪化。ＡＥに起因して中止された対象はおらず、全ての登録対象は６ヶ月の試験を完了した。加えて、１８ヶ月の長期にわたる研究後の安全性の追跡調査の最中に、これまで追跡した対象で問題は報告されなかった（１３例の内の９例が１８ヶ月の追跡調査を完了し、１３例の内の１３例が１２ヶ月の追跡調査を完了した）。
【０１１０】
各診察前の７日間にわたり収集した日記データの平均は、プラセボ及びベースラインに対して統計的に有意な（Ｐ＜０．０５）改善を明らかにし、試験の６ヶ月にわたり、１日当たりの平均排尿回数、及び１日当たりの切迫エピソードの平均数が永続的に減少した。下記の表７及び表８で示される変化は、プラセボと比較したベースラインからの平均変化（＋／−ＳＥ）である。
【０１１１】
生活の質パラメータ（Ｋｉｎｇ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ）は、生活への影響、役割制限、身体的制限、社会的制限、及び睡眠エネルギーのドメインにおいて、個々の積極的処置及び組み合わされた積極的処置（全ての用量）対プラセボ及び対ベースラインに関する統計的に有意な持続的平均変化を示した。
【０１１２】
このフェーズ１Ｂ臨床試験の結果は、試験の６ヶ月の持続期間にわたりｈＭａｘｉ−Ｋの単回投与が続いた後に、排尿及び切迫エピソードの数の有意な減少を示した。この結果を、ＰＶＲの変化及び処置に関連する深刻な有害事象の非存在下で観察した。この新たな臨床試験の結果は、ヒトＭａｘｉ−Ｋ遺伝子の単回排尿筋内投与が安全であったことを初めて示す。
【０１１３】
登録された対象集団が小さいにもかかわらず、参加者の日記からの全体的な所見は、全ての積極的処置に関して、プラセボに対する及びベースラインに対する排尿の平均数及び切迫エピソードの平均数の有意な減少（ｐ＜０．０５）を示し、治験薬の全ての用量に関して、ベースラインに対する切迫性尿失禁エピソードの平均数の有意な減少（ｐ＜０．０５）を示した。処置に対する参加者の反応は、診察３及び５において、全ての積極的な用量対プラセボに関していくつかの正のｐ値を示した（表９を参照されたい）。排尿及び切迫エピソードの数の減少に関して、プラセボ及びベースラインに対するこれらの有意な変化は、最終診察８（２４週目）までに全ての診察で見られた。おそらく、２４０００μｇ群で登録された少数の参加者（Ｎ＝３）に起因して、２種の積極的処置（１６０００μｇ及び２４０００μｇ）の間に有意な差異は見られなかった。
【０１１４】
生活の質パラメータ（Ｋｉｎｇ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ）は、多くのドメインにおいて、プラセボ及びベースラインに対して、個々の積極的処置及び組み合わされた積極的処置群（全ての用量）に関して統計的に有意な平均改善を示した。これは下記を含んだ：
・ドメイン２：生活への影響
・ベースラインに対して、診察５にて、全ての積極的な用量の場合にＰ＝０．０１４、及び２４０００μｇの場合にｐ＝０．００７、
・プラセボに対して、診察５にて、２４０００μｇの場合にＰ＝０．０１６；
・診察５にて、１６０００μｇ群に対して、２４０００μｇ群の場合にＰ＝０．０１６
・診察６にて、ベースラインに対して、全ての積極的な用量の場合にＰ＝０．０４３
・診察７にて、ベースラインに対して、１６０００μｇの場合にＰ＝０．０１０、及び全ての積極的な用量の場合にｐ＝０．００５
・診察８にて、ベースラインに対して、全ての積極的な用量の場合にＰ＝０．０２６
・ドメイン３：役割制限
・診察５にて、ベースラインに対して、１６０００μｇ、２４０００μｇ、及び全ての積極的な用量それぞれの場合にＰ＝０．００４、Ｐ＝０．０１５、Ｐ＜０．００１
・診察５にて、プラセボに対して、１６０００μｇ、２４０００μｇ、及び全ての積極的な用量それぞれの場合にＰ＝０．０３０、Ｐ＝０．０３５、及びＰ＝０．０１５
・診察６にて、ベースラインに対して、１６０００μｇ、２４０００μｇ、及び全ての積極的な用量それぞれの場合にＰ＝０−０２３、Ｐ＝０．０１４、及びＰ＝０．００１
・診察６にて、プラセボに対して、１６０００μｇ、２４０００μｇ、及び全ての積極的な用量それぞれの場合にＰ＝０．０４７、Ｐ＝０．０２０、及びＰ＝０．０１４
・診察７にて、プラセボに対して、１６０００μｇ、２４０００μｇ、及び全ての積極的な用量それぞれの場合にＰ＝０．０１２、Ｐ＝０．０１４、及びＰ＜０．００１
・診察７にて、プラセボに対して、２４０００μｇ及び全ての積極的な用量それぞれの場合にＰ＝０．０３２及びＰ＝０．０２１
・診察８にて、ベースラインに対して、２４０００μｇ及び全ての積極的な用量それぞれの場合にＰ＝０．０１４及びＰ＝０．００５
・診察８にて、プラセボに対して、１６０００μｇ、２４０００μｇ、及び全ての積極的な用量それぞれの場合にＰ＝０．０４７、Ｐ＝０．００７、及びＰ＝０．００７
・ドメイン４  身体的制限
・診察６にて、ベースラインに対して、２４０００μｇ及び全ての積極的な用量それぞれの場合にＰ＝０．０１８及びＰ＝０．００５
・診察７にて、ベースラインに対して、１６０００μｇ、２４０００μｇ、及び全ての積極的な用量それぞれの場合にＰ＝０．０１２、Ｐ＝０．０１８、及びＰ＝０．００１
・診察８にて、ベースラインに対して、１６０００μｇ、２４０００μｇ、及び全ての積極的な用量それぞれの場合にＰ＝０．０１２、Ｐ＝０．０４７、及びＰ＝０．００３
・ドメイン５：社会的制限
・診察６にて、ベースライン及びプラセボそれぞれに対して、２４０００μｇの場合にＰ＝０．０３２及びＰ＝０．２２
・診察７にて、ベースラインに対して、２４０００μｇ及び全ての積極的な用量それぞれの場合にＰ＝０．００２及びＰ＝０．００４
・診察７にて、プラセボに対して、２４０００μｇ及び全ての積極的な用量それぞれの場合にＰ＝０．００８及びＰ＝０．０４３
・診察８にて、ベースラインに対して、２４０００μｇ及び全ての積極的な用量それぞれの場合にＰ＝０．００２及びＰ＝０．０１４
・診察８にて、プラセボに対して、２４０００μｇの場合にＰ＝０．００６
・ドメイン８：睡眠エネルギー
・診察５にて、ベースラインに対して、１６０００μｇ、２４０００μｇ、及び全ての積極的な用量それぞれの場合にＰ＝０．０４７、Ｐ＝０．００７、及びＰ＝０．００１
・診察５にて、プラセボに対して、２４０００μｇ及び全ての積極的な用量それぞれの場合にＰ＝０．０２０及びＰ＝０．０１５
・診察６にて、ベースラインに対して、２４０００μｇ及び全ての積極的な用量それぞれの場合にＰ＝０．００５及びＰ＝０．００６
・診察７にて、ベースラインに対して、２４０００μｇ及び全ての積極的な用量それぞれの場合にＰ＝０．００１及びＰ＝０．００６
・診察７にて、プラセボに対して、２４０００μｇの場合にＰ＝０．０１２
【０１１５】
７２時間パッド試験（表１２）は、ベースラインに対するｈＭａｘｉ−Ｋの積極的な用量に関して、診察３〜６及び診察８で、ある程度の統計的に有意な変化を示したが、診察３〜５及び診察８ではプラセボに関しても統計的に有意な変化があった。全体的に、プラセボ群は積極的処置群と比べて疾患が軽度であるように見え、積極的処置のベースライン（Ｖ２）パッド重量は、プラセボ群のものと比べてほぼ２倍高かった。加えて、プラセボのＶ１Ａ平均パッド重量はわずか２９グラムであったが、この群のＶ２での重量は２５９グラムであった（Ｖ１と比べてほぼ９倍高い）。これは、参加者００２−００１がＶ１Ａの前にパッドを捨てていたことに起因し（そのため、彼女はＶ１Ａ平均には含まれなかった）、彼女は、他の３例のプラセボ参加者と比べて疾患がより重症であったように見える（Ｖ２での３日間の平均パッド重量は２９５グラムであったが、他の３例の参加者の場合は３．３〜３６グラムであった）。
【０１１６】
【表１】
2020520383.tif 000016
【０１１７】
【表２】
2020520383.tif 000017
【０１１８】
【表３】
2020520383.tif 000018
【０１１９】
【表４】
2020520383.tif 000019
【０１２０】
【表５】
2020520383.tif 000020
【０１２１】
【表６】
2020520383.tif 000021
【０１２２】
【表７】
2020520383.tif 000022
【０１２３】
【表８】
2020520383.tif 000023
【０１２４】
【表９】
2020520383.tif 000024
【０１２５】
【表１０】
2020520383.tif 000025
【０１２６】
【表１１】
2020520383.tif 000026
【０１２７】
【表１２】
2020520383.tif 000027
【０１２８】
【表１３】
2020520383.tif 000028
【０１２９】
【表１４】
2020520383.tif 000029
【０１３０】
【表１５】
2020520383.tif 000030
【０１３１】
【表１６】
2020520383.tif 000031
【０１３２】
【表１７】
2020520383.tif 000032
【０１３３】
【表１８】
2020520383.tif 000033
【０１３４】
【表１９】
2020520383.tif 000034
【０１３５】
【表２０】
2020520383.tif 000035
【０１３６】
【表２１】
2020520383.tif 000036
【図１】
2020520383.tif 000037
【図２−ＡＢ】
2020520383.tif 000038
【図２−Ｃ】
2020520383.tif 000039
【図３】
2020520383.tif 000040
【図４】
2020520383.tif 000041
【図５】
2020520383.tif 000042
【図６】
2020520383.tif 000043
【図７】
2020520383.tif 000044
【図８】
2020520383.tif 000045
【配列表】
2020520383000001.app
【国際調査報告】
2020520383.tif 000046
2020520383.tif 000047
2020520383.tif 000048