(57)【要約】本発明は、糸球体の足細胞傷害型腎臓病を予防又は治療する薬物の調製へのアクテオシドの使用を提供し、医薬分野に属する。発明者が検討したところ、アクテオシドは糸球体の足細胞活性を効果的に回復し、その異常移行能を低減し、足細胞の細胞骨格を保護し、足細胞傷害マーカーであるｎｅｐｈｒｉｎ蛋白とｓｙｎａｐｔｏｐｏｄｉｎ蛋白の発現レベルを回復し、尿蛋白を顕著に低減することができることを発見した。そのため、アクテオシドは、単独で又はその他の薬物との併用で、糸球体の足細胞傷害に関する疾患を予防又は治療する薬物又は健康製品の調製に適用することができ、また、その他の薬物の足細胞への傷害を緩和する薬物又は健康製品への使用に適用することができ、糸球体の足細胞傷害による疾患に新な治療手段と考えを提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
糸球体の足細胞傷害を予防又は治療する薬物又は健康製品の調製への、アクテオシドの使用。
【請求項２】
糸球体の足細胞内におけるｎｅｐｈｒｉｎ蛋白の発現レベルを回復する薬物又は健康製品の調製への、アクテオシドの使用。
【請求項３】
糸球体の足細胞内におけるｎｅｐｈｒｉｎ蛋白の遺伝子発現レベルを回復する薬物又は健康製品の調製への、アクテオシドの使用。
【請求項４】
糸球体の足細胞内におけるｓｙｎａｐｔｏｐｏｄｉｎ蛋白の発現を回復する薬物又は健康製品の調製への、アクテオシドの使用。
【請求項５】
糸球体の足細胞内におけるｓｙｎａｐｔｏｐｏｄｉｎ蛋白の遺伝子発現を回復する薬物又は健康製品の調製への、アクテオシドの使用。
【請求項６】
糸球体の足細胞傷害型腎臓病を予防又は治療する薬物又は健康製品の調製への、アクテオシドの使用。
【請求項７】
前記糸球体の足細胞傷害型腎臓病は、最小限の変更腎症、巣状分節性糸球体硬化症、糖尿病性腎症、ループス腎炎、膜性増殖性腎炎及び膜性腎症を含むことを特徴とする、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記糸球体の足細胞傷害型腎臓病は、最小限の変更腎症及び巣状分節性糸球体硬化症を含むことを特徴とする、請求項６に記載の使用。
【請求項９】
薬物の足細胞への傷害を緩和する薬物又は健康製品の調製への、アクテオシドの使用。
【請求項１０】
足細胞傷害を予防又は治療する薬物又は健康製品の調製への、アクテオシドと腎臓治療薬物との併用の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１７年０９月０４日に中国国家知識産権局に提出された特許出願番号が２０１７１０７８３９２８．５であり、発明の名称が「糸球体の足細胞傷害型腎臓病を予防又は治療する薬物の調製へのアクテオシドの使用」である中国特許出願の優先権を主張するものであり、当該中国特許出願の全内容は参照により本開示に組み入れられる。
【０００２】
本発明は、医薬分野に関し、具体的に、糸球体の足細胞傷害型腎臓病を予防又は治療する薬物の調製へのアクテオシドの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
蛋白尿は、腎臓病の重要な臨床症状であり、このような疾患が終末期に進展する独立な危険因子であり、蛋白尿の発生を低減・制御することで腎臓病の進展を先延ばしにすることができ、そのため、現在、安全で効果的な蛋白尿治療ターゲットを探すことは、腎臓分野で検討される重点と注目点になっている。
【０００４】
近年、ますます多くの検討により表明するように、足細胞傷害は、蛋白尿の発生を引き起こす要因であり、足細胞構造と機能の異常は、スリット隔膜構造と機能異常や足突起消失に繋がり、糸球体濾過機能に障害があり、高分子タンパク質が尿に入り、これにより、蛋白尿を形成してしまう。即ち、腎臓病は、通常に糸球体の足細胞への傷害を伴う。そのため、薬物の足細胞傷害への作用は、腎臓病に対する治療効果を決定する。そこで、本発明は、蛋白尿を治療する新たな形態を提出する。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の目的は、アクテオシドの新用途を提供し、糸球体の足細胞傷害による疾患に新な治療手段と考えを提供することにある。
【０００６】
本発明の上述目的を実現するため、以下の技術案を採用する。
【０００７】
糸球体の足細胞傷害を予防又は治療する薬物又は健康製品の調製へのアクテオシドの使用。
【０００８】
糸球体の足細胞内におけるｎｅｐｈｒｉｎの発現レベルを回復する薬物又は健康製品の調製へのアクテオシドの使用。
【０００９】
糸球体の足細胞内におけるｎｅｐｈｒｉｎ遺伝子の発現レベルを回復する薬物又は健康製品の調製へのアクテオシドの使用。
【００１０】
糸球体の足細胞内におけるｓｙｎａｐｔｏｐｏｄｉｎの発現を回復する薬物又は健康製品の調製へのアクテオシドの使用。
【００１１】
糸球体の足細胞内におけるｓｙｎａｐｔｏｐｏｄｉｎ遺伝子の発現を回復する薬物又は健康製品の調製へのアクテオシドの使用。
【００１２】
糸球体の足細胞傷害型腎臓病を予防又は治療する薬物又は健康製品の調製へのアクテオシドの使用。
【００１３】
薬物の足細胞への傷害を緩和する薬物又は健康製品の調製へのアクテオシドの使用。
【００１４】
足細胞傷害を予防又は治療する薬物又は健康製品の調製へのアクテオシドと腎臓治療薬物との併用の使用。
【００１５】
従来技術に比べると、本発明の有効な効果は、例えば以下のことを含む。
【００１６】
糸球体の足細胞疾患は、臨床に一般的な腎臓病であり、膜性腎症、最小限の変更腎症、巣状分節性糸球体硬化症、糖尿病性腎症、ループス腎炎、膜性増殖性病変等を含み、現在、臨床では効果的な治療に乏しい。糸球体の足細胞発生機能構造の変更は、上述したこれらの疾患で多くの蛋白尿を生じる要因の一つであり、この段階での介入は、これらの糸球体傷害型腎臓病を治療する経路の一つである。
【００１７】
発明者は検討したところ、アクテオシドは糸球体の足細胞活性を効果的に回復し、その異常移行能を低減し、足細胞の細胞骨格を保護し、足細胞傷害マーカーであるｎｅｐｈｒｉｎ蛋白とｓｙｎａｐｔｏｐｏｄｉｎ蛋白の発現レベルを回復することで、尿蛋白を顕著に低減することができることを発見した。そのため、アクテオシドは、単独で又はその他の薬物との併用で、糸球体の足細胞傷害に関する疾患を予防又は治療する薬物又は健康製品の調製に適用することができ、また、その他の薬物の足細胞への傷害を緩和する薬物又は健康製品への使用に適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
本発明の実施例または従来技術の技術案をより明確に説明するために、実施例または従来技術の説明で使用される添付図面を以下に簡単に説明する。
【図１】図１は、実施例１におけるアクテオシドのピューロマイシン腎症ラットの蛋白尿に対する作用状況（ＣＯＮ：正常対照群、ＰＡＮ：ピューロマイシン疾患群、ＰＡＮ＋ＡＣＴ：ピューロマイシン＋アクテオシド群。＊：ｐ＜０．０５  ｖｓ  ＣＯＮ、＃：ｐ＜０．０５  ｖｓ  ＰＡＮ、ｎ＝５−８）である；
【図２】図２は、実施例１におけるアクテオシドの足細胞足突起に対する保護効果（ＣＯＮ：正常対照群、ＰＡＮ：ピューロマイシン疾患群、ＰＡＮ＋ＡＣＴ：ピューロマイシン＋アクテオシド治療群。黒色ｂａｒ：１μｍ。）である；
【図３】図３は、実施例１におけるアクテオシドの足細胞傷害マーカーに対する効果（ＣＯＮ：正常対照群、ＰＡＮ：ピューロマイシン疾患群、ＰＡＮ＋ＡＣＴ：ピューロマイシン＋アクテオシド治療群。＊：ｐ＜０．０５  ｖｓ  ＣＯＮ、＃：ｐ＜０．０５  ｖｓ  ＰＡＮ、ｎ＝５−８、白色ｂａｒ：４０μｍ。）である
【図４】図４は、アクテオシドが足細胞をピューロマイシンによる足細胞傷害（ＣＯＮ：正常対照群、ＰＡＮ：ピューロマイシン疾患群、ＡＣＴ：アクテオシド群、ＰＡＮ＋ＡＣＴ：ピューロマイシン＋アクテオシド治療群。＊：ｐ＜０．０５  ｖｓ  ＣＯＮ、＃：ｐ＜０．０５  ｖｓ  ＰＡＮ、ｎ＝３。Ｃでの白色ｂａｒ：２００μｍ、Ｆでの白色ｂａｒ：４０μｍ）から保護する図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、実施例を組合わせて本発明の技術案を詳しく説明するが、以下の実施例は、本発明を解釈するためだけに用いられ、本発明の範囲を限定するものと理解されてはならない。実施例で具体的な条件が明記されていない場合に、常用の条件又はメーカーによって推奨される条件で行う。用いられる試薬又は器械は、メーカーが明記されていない場合に、すべて市販品として入手できる一般的な製品である。
【００２０】
蛋白尿は、腎臓病の重要な臨床症状であるため、現在、安全で効果的な蛋白尿治療ターゲットを探すことは、腎臓分野で検討される重点と注目点になっている。近年、多くの検討により表明するように、足細胞傷害は、蛋白尿の発生を引き起こす要因であり、足細胞構造と機能の異常は、スリット隔膜構造と機能異常や足突起消失に繋がり、糸球体濾過機能に障害があり、高分子タンパク質が尿に入り、これにより、蛋白尿を形成してしまう。即ち、腎臓病は、通常に糸球体の足細胞への傷害を伴う。
【００２１】
糸球体の足細胞疾患は、臨床で一般的な腎臓疾患である。糸球体の足細胞発生機能構造の変更は、上述したこれらの疾患で多くの蛋白尿を生じる要因の一つであり、この段階での介入は、これらの糸球体傷害型腎臓病を治療する経路の一つである。
【００２２】
そこで、本実施形態は、糸球体の足細胞傷害を治療又は予防する新経路、即ちアクテオシドの新用途を提供する。具体的には、以下のとおりである。
【００２３】
アクテオシド（Ａｃｔｅｏｓｉｄｅ、以下ＡＣＴと略称される）、別名：ベルバコシド；英別名：Ｖｅｒｂａｓｃｏｓｉｄｅ；  Ｋｕｓａｇｉｎｉｎ。分子量  ６２４．５９、分子式  Ｃ２９Ｈ３６Ｏ１５、ＣＡＳ登録番号：６１２７６−１７−３。その構造式は以下のとおである。
【００２４】
【化１】
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【００２５】
アクテオシドは、アカヤジオウ（Ｒｅｈｍａｎｎｉａ  Ｇｌｕｔｉｎｏｓａ）の葉、ニクジュウヨウ（Ｃｉｓｔａｎｃｈｅ  ｄｅｓｅｒｔｉｃｏｌａ、肉従蓉）、紫珠（Ｃａｌｌｉｃａｒｐａｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ  Ｖａｈｌ）の葉等の複数の被子植物に存在するフェニルエタノイド配糖体類化合物である。現在、薬理学検討により、当該成分は、免疫調節、神経保護、肝臓保護、補腎陽、抗炎症と抗血小板凝集等の広い薬理学作用を有することを表明した。
【００２６】
検討により表明するように、アクテオシドは、基本的に毒がなくて、安全で効果的な天然活性成分であり、経口、注射及粘膜等の種々な臨床用薬物とすることができる。また、当該成分は、水溶性が非常によく、その製剤は、薬学的に許容される任意の剤型に適用する。
【００２７】
一様態において、本実施形態は、糸球体の足細胞傷害を予防又は治療する薬物又は健康製品の調製へのアクテオシドの使用を提供する。
【００２８】
発明者は検討したところ、アクテオシドは足細胞活性を効果的に回復し、その異常移行能を低減し、足細胞の細胞骨格を保護することで、尿蛋白を顕著に低減することができることを発見した。これにより、アクテオシドは、糸球体の足細胞傷害を予防又は治療する効能を有することを示す。
【００２９】
更に、検討により確認するように、糸球体の足細胞が傷害される場合に、足細胞内におけるｎｅｐｈｒｉｎ蛋白とｓｙｎａｐｔｏｐｏｄｉｎ蛋白発現レベル及び遺伝子発現レベルのいずれでも、ダウンレギュレーションし、これにより、ｎｅｐｈｒｉｎ蛋白とｓｙｎａｐｔｏｐｏｄｉｎ蛋白が糸球体の足細胞傷害の蛋白質マーカーであって、糸球体の足細胞が傷害されたか否かを指示するものであることが分かった。
【００３０】
発明者は、アクテオシドの生体外と生体内での薬効についての検討により発見するように、アクテオシドは、足細胞傷害でｎｅｐｈｒｉｎとｓｙｎａｐｔｏｐｏｄｉｎの蛋白質発現レベルを顕著に向上させ、ｎｅｐｈｒｉｎとｓｙｎａｐｔｏｐｏｄｉｎの遺伝子発現をアップレギュレーションし、足細胞を保護することができる。
【００３１】
これにより、アクテオシドは、糸球体の足細胞内におけるｎｅｐｈｒｉｎ蛋白の発現レベルを回復する薬物又は健康製品の調製に利用でき；また、アクテオシドは、糸球体の足細胞内におけるｎｅｐｈｒｉｎ蛋白の遺伝子発現レベルを回復する薬物又は健康製品の調製に利用できることを示す。
【００３２】
同様に、アクテオシドは、糸球体の足細胞内におけるｓｙｎａｐｔｏｐｏｄｉｎ蛋白の発現を回復する薬物又は健康製品の調製に利用でき；また、アクテオシドは、糸球体の足細胞内におけるｓｙｎａｐｔｏｐｏｄｉｎ蛋白の遺伝子発現を回復する薬物又は健康製品の調製に利用できることを示す。
【００３３】
他の様態において、本実施形態は、糸球体の足細胞傷害型腎臓病を予防又は治療する薬物又は健康製品の調製へのアクテオシドの使用を提供する。
【００３４】
更に、糸球体の足細胞傷害型腎臓病は、最小限の変更腎症、巣状分節性糸球体硬化症、糖尿病性腎症、ループス腎炎、膜性増殖性腎炎、膜性腎症を含む。これらの腎臓病のいずれでも、大量の蛋白尿が生じて、糸球体の足細胞発生機能構造の変更は、これらの腎臓病で大量の蛋白尿が生じる要因の一つである。そのため、糸球体の足細胞に対して保護作用を奏するアクテオシドは、これらの腎臓病の治療に利用できる。
【００３５】
より好ましくは、糸球体の足細胞傷害型腎臓病は、最小限の変更腎症、巣状分節性糸球体硬化症を含む。発明者が検討したところ、アクテオシドは、最小限の変更腎症と巣状分節性糸球体硬化症との２種類の、糸球体の足細胞傷害による腎臓病に対しては、良好な治療効果を示し、この２種類の腎臓病の更なる治療に利用できることを確認した。
【００３６】
他の様態において、本実施形態は、薬物の足細胞への傷害を緩和する薬物又は健康製品の調製へのアクテオシドの使用を提供する。
【００３７】
腎は主に排泄責任を持つため、食物又は薬物の代謝でも排泄過程でも、大きな役割を果たすため、外因性薬物によって相対的に傷害されやすい。実践によって発見するように、ある外因性薬物を使用した後、ｎｅｐｈｒｉｎとｓｙｎａｐｔｏｐｏｄｉｎの発現レベルをダウンレギュレーションし、糸球体の足細胞を傷害することがある。発明者が検討したところ、アクテオシドは、足細胞を保護し、このような外因性薬物の足細胞への傷害を緩和できることを発見した。そのため、アクテオシドは、薬物の足細胞への傷害を緩和する薬物又は健康製品の調製に利用できる。
【００３８】
他の様態において、本実施形態は、足細胞傷害を予防又は治療する薬物又は健康製品の調製へのアクテオシドと腎臓治療薬物との併用の使用を提供する。
【００３９】
更に、アクテオシドは、活性成分として、医薬的に許容される補助材又はキャリアとともに調製して医薬組成物を得ることができ、また、当該医薬組成物は、種々な剤型であることが可能である。
【００４０】
当該医薬組成物が長期間にわたって活性成分を速く放出し続けるように、当該医薬組成物は、本分野で開示した一般的な方法により製造することができる。当該医薬組成物の投与経路は、経口、鼻腔投与、又は非経口投与である。当該医薬組成物の製剤は、粉末、顆粒、錠剤、乳剤、シロップシロップ、エアロゾル剤、軟カプセル剤、硬カプセル剤、無菌注射剤、及び滅菌粉末等であってもよい。
【００４１】
ここで、「医薬的に許容される」という用語とは、化合物をヒトに投与場合に、当該化合物が生理的に許容され、また胃腸障害や眩暈等のアレルギー反応又はこれらのアレルギー反応に類似する全身性アレルギー反応が発生しないことを意味する。
【００４２】
本発明において、「医薬的に許容される補助材又はキャリア」は、粘着剤（例えば微結晶セルロース、アルギン酸塩、ゼラチン及びポリビニルピロリドン）、充填剤（例えば澱粉、ショ糖、グルコース及び無水乳酸）、崩壊剤（例えば架橋ＰＶＰ、架橋デンプングリコール酸ナトリウム、架橋カルボキシルメチル・セルロース・ナトリウム、及び低置換ヒドロキシプロピルセルロース）、滑剤（ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸アルミニウム、タルク、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム）、湿潤剤（例えばグリセリン）、界面活性剤（例えばセチルアルコール）及び吸収促進剤、矯味剤、甘味料、希釈剤、コーティング剤等を含むがこれらに限らない。
【００４３】
以下、実施例を組み合わせて本発明の特徴と性能をさらに詳しく説明する。
【実施例】
【００４４】
以下、試験データーを組み合わせて、本発明の実施形態によって提供されるアクテオシドの足細胞傷害への治療効果を評価する。
【００４５】
一．   実験過程：
１．ピューロマイシンラット腎症モデルの確立
当該動物実験は、北京大学第一病院動物倫理委員会によって審査して承認され、決議番号がＪ２０１６４４であった。同じバッチのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ雄ラット（６周）５１匹は、北京チャールス・リバー社から購入され、北京大学第一病院動物センター（クリーングレード、clean grade）で飼育し、環境に適応してから３日後、ランダムに３群に分けた：
１．正常対照群（ＣＯＮ）
２．ピューロマイシン疾患群（ＰＡＮ）
３．ピューロマイシン＋アクテオシド治療群（ＰＡＮ＋ＡＣＴ）
【００４６】
ここで、２群と３群に対して、実験の０日目にピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ  Ｐ７１３０）１５ｍｇ／１００ｇを腹腔内単回注射した。正常対照群に対して同じ投与量で生理食塩水を腹腔内注射した。３群に対して、毎日、１０ｍｇ／ｋｇのアクテオシドを強制経口投与し、１群と２群に対して、毎日、同じ投与量で注射用水を強制経口投与した。実験過程中、それぞれ投与前（Ｄａｙ  ０）、投与後５、１０、１５、２０日目（Ｄａｙ  ５，Ｄａｙ  １０，Ｄａｙ  １５，Ｄａｙ  ２０）にラットの尿を２４時間収集して尿蛋白定量測定（日立７１７０Ａ自動生化学分析装置）に用いられた。ピューロマイシンを注射してから２０日目（Ｄａｙ  ２０）にラットを殺処分し、腎臓標本を収集し、腎臓標本は、後続の蛋白質抽出、ＲＮＡ抽出、パラフィン留め及び標本冷凍、分離糸球体に用いられた。
【００４７】
２．細胞培養
小鼠足細胞系ＭＰＣ５が米国ニューヨークＭｏｕｎｔ  Ｓｉｎａｉ医学部のＰｅｔｅｒ  Ｍｕｎｄｅｌ教授によって恵贈された。足細胞を蘇生させた後、３３℃、５％ＣＯ２の細胞インキュベーター内に置いて培養して、増殖させ、その融合度が８０％程度になった時、３７℃インキュベーターに移動し、１０−１４日分化させて、足細胞が分化成熟した後、足細胞を６ウェルプレートに接種し、プレートの表面に付着させた後、それにピューロマイシン、アクテオシドを加え、足細胞を２４時間刺激した後、蛋白質又はＲＮＡを収集してその後の検出に用いられた。
【００４８】
３．Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ
分離した糸球体又は細胞に、対応する投与量の蛋白質溶解液ＲＩＰＡ（５０  Ｍｍ  Ｔｒｉｓ．ｃｌ（ＰＨ  ７．４）、１５０  Ｍｍ  ＮａＣｌ、０．１％  ＳＤＳ、１％Ｔｒｉｔｏｎ−１００、１０Ｍｍ  ＥＤＴＡ、１％  Ｓｏｄｉｕｍ  ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ及びプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ  Ｐ８３４０）を加え、溶解された後、蛋白質を抽出してその後の検出に用いられ、電気泳動及び免疫応答過程は、以下のとおりである：分離ゲルと濃縮ゲルを配置した後、サンプルをロードして電気泳動を始め、ここで、電気泳動電圧８０Ｖで２０−３０分間、１２０Ｖで約９０分間、その後３００ミリアンペアの定電圧で膜に１００分間転写し（Ｃｏｎｓｔａｎｔ ｖｏｌｔａｇｅ ｔｒａｒｓｍｅｍｂｒａｎｅ ）をし、ポンソーＳで膜を染色し、蛋白質の分離状况を初歩的に観察し、分子量によって目的とするタンパク質バンドを切り取り、ＰＢＳＴで配置された５％の牛乳に置いて３０−６０分間密封し、続いて特異的一次抗体を加え、４℃で一晩（１２−１６ｈ）インキュベートし、本検討に係る一次抗体は、ｎｅｐｈｒｉｎ（Ｓｉｇｍａ，ＰＲＳ２２６５−１００ＵＧ）、β−ａｃｔｉｎ（Ｓａｎｔａ，ｓｃ−１３０６５６）であり、次の日にＰＢＳＴで１０分間×３回洗浄した後、対応する二次抗体（Ｓｕｎｇｅｎｅ  Ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＨＲＰ  ＬＫ２００１，Ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＨＲＰ  ＬＫ２００３）を加え、室温で１−１．５時間放置し、最後に、ＰＢＳＴで１０分間×３回洗浄した後、呈色し、露光した。
【００４９】
４．ＲＮＡの抽出及びＰＣＲのリアルタイム定量
収集された糸球体又は細胞にＴｒｉｚｏｌ（Ｔｈｅｒｍｏ  １５５９６０２６）を加え、十分に混合した後、氷上で５分間放置し、その後、クロロホルム（北京化学工場）を加え、遠心した後、上層である水相を新なＥＰ管に移動し、等体積のイソプロパノール（北京化学工場）を加えて沈殿させ、遠心して上清加を捨てて、２倍体積の７５％エタノールを加えて洗浄し、遠心して上清を捨てて、５−１０分間沈殿して乾燥し、それに１５μｌのＤＥＰＣ水（Ａｍｒｅｓｃｏ  Ｅ４７６−１００ＭＬ）を加え、純度と濃度を測定した後、−８０℃で保存するか、又はｃＤＮＡ（ＴｒａｎｓＧｅｎ  ＡＴ３０１−０２）に直接逆転写し、ＲＮＡがｃＤＮＡに逆転写した後、ＰＣＲ反応（ＴｒａｎｓＧｅｎ  ＡＱ４０１−０１）をリアルタイム定量し、上述の逆転写して合成されたｃＤＮＡをテンプレートとして、２０μｌのｑＰＣＲ反応系［Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ（１０Μｍ）０．５μｌ、Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ（１０Μｍ）０．５μｌ、２×ｑＰＣＲ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ  １２．５μｌ、ｃＤＮＡ  テンプレート２μｌ、残部ｄｄＨ２Ｏ、合計２０μｌ］を確立し、反応系を配置した後、機器にかけて検出した（ＰＣＲのリアルタイム定量装置が米国Ｂｉｏ−Ｒａｄ  社ＣＦＸ  ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲ機器で、反応条件が５０℃で２分間、９５℃で１０分間、（９５℃で５ｓ、６１℃で３１ｓ）のサイクルを３５回繰り返した。用いられるプライマー配列は以下のとおりである：
【００５０】
β−ａｃｔｉｎ：ｓｅｎｓｅ：５−ＡＧＣＣＡＴＧＴＡＣＧＴＡＧＣＣＡＴＣＣ−３
ａｎｔｉｓｅｎｓｅ：５−ＧＣＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＡＡＧＣＴＧＴＡ−３
ＮＰＨＳ１：ｓｅｎｓｅ：５−ＡＴＧＣＴＧＡＣＣＣＡＴＣＣＣＴＧＴＣ−３
【００５１】
ａｎｔｉｓｅｎｓｅ：５−ＣＣＡＣＣＡＣＡＣＡＧＧＴＴＧＧＡＴＴＴ−３。
【００５２】
５．ＭＴＳによる足細胞活性の検出
【００５３】
足細胞を継代して計数した後、１．０×１０５／ｍＬの密度で９６ウェルプレートに均一に接種し、細胞をプレートの表面に付着させた後、それぞれピューロマイシン、アクテオシドを加えて足細胞を処理し、さらに２４  ｈを経た後、培地を捨てて、ＭＴＳ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｇ１１１２）含有培地を加え、ＭＴＳ含量が１００μｌ培地あたり１０ｕｌのＭＴＳであり、ＭＴＳを添加した９６ウェルプレートを３７℃の暗環境に４ｈ放置してから取り出し、マイクロプレートリーダーを用いて４９０  ｎｍ波長でＯＤ値を測定した。
【００５４】
６．細胞移動実験
ラットＩ  型コラーゲンでコートした６ウェルプレートに、分化した足細胞を接種し、その融合度が６０％になった際に、２００μＬ無菌で高圧のピペットチップを用いて底板に線を描いた後、ＰＢＳで完全に洗い流して、清潔な培地に取り換え、これを０時間として、倒立顕微鏡で写真を撮った後、それに対応する薬物を加えて介入そ、２４時間後に、再度写真を撮って、最後にＩｍａｇｅＪソフトウェアで分析し、最終結果をコード百分率として表示する。
【００５５】
７．免疫蛍光
腎臓組織を切片として切り出し、まず、キシレン及び濃度勾配のあるアルコールで脱ろう処理を行った後、抗原回復をさらに行い、０．３％のＴｒｉｔｏｎ−ＰＢＳでパンチし、ＰＢＳで洗浄した後、５％のＢＳＡで密封し、その後、特異的一次抗体を加え、ウェットボックス内において４℃で一晩放置し、次の日に、ＰＢＳで洗浄し、蛍光二次抗体を密封し、日陰で、室温で３０分間（ウェットボックス中）放置し、その後、細胞核染料であるＤＡＰＩ（ＺＡＧＢ−ＢＩＯ）１：５００を用いて室温で３０分間（ウェットボックス中）インキュベートし、脱イオン水を通過し、５０％緩衝グリセロールで封入、エナメルで縁を封止し、蛍光顕微鏡で観察し、写真を撮った。細胞実験では、まず、細胞を６ウェルプレートに接種した後、４％のパラホルムアルデヒド（細胞）（Ｌｅｇｅｎｅ  ＤＦ０１３５）で固定し、室温で１５分間放置した後、ＰＢＳで洗浄し、さらに０．３％のＴｒｉｔｏｎ−ＰＢＳでパンチし、その後のステップは、組織切片と同様であった。
【００５６】
８．統計分析
各実験を３回繰り返し、データーをＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ，ｖｅｒｓｉｏｎ  ５（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）統計ソフトウェアで処理し、複数の群の比較は、一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）を利用し、２群の比較は、独立したサンプルのＴ検定を利用し、Ｐ＜０．０５である場合に、差異有統計学的に有意であると認められる。
【００５７】
二、試験結果：
１．アクテオシドのピューロマイシン腎症ラットの蛋白尿に対する作用状況
アクテオシドのピューロマイシンによる腎症ラットへの治療効果を明確するために、ラットを、正常対照群（ＣＯＮ）と、疾患群（ＰＡＮ）と、アクテオシド群（ＰＡＮ＋ＡＣＴ）との３群に分けた。５日おきに各群のラットの尿標本を２４時間収集した。各群のラットｍｐ血液と尿サンプルを収集して検出することで、アクテオシドの腎症蛋白尿レベルへの治療効果を示した。
【００５８】
ラボラトリー検査の結果は、図１に示すように、疾患群、即ちピューロマイシンによるラット腎症モデルで、２４時間の尿蛋白が５日目に正常対照群よりも顕著に高め、１０日目にピーク値に到達し、その後、ゆっくり低減し始め、２０日目までに蛋白尿が顕著にに低減したが、依然として正常対照群よりも高めた。治療群で、５日目に、アクテオシド群は、ピューロマイシン群に比べると、２４時間の尿蛋白に顕著な差異がなく、１０日目に、アクテオシド群は、疾患群に比べると、２４時間の尿蛋白が顕著に低減し、アクテオシドがピューロマイシンによるラット蛋白尿の進展を緩和できることを示し、また、１５日目にも、２０日目にも、２４時間の蛋白尿の結果により、アクテオシド治療群が腎症ラット蛋白尿の異常を顕著に緩和できることを示した。
【００５９】
２．アクテオシドのピューロマイシン腎症ラットの足細胞に対する保護効果
ピューロマイシンによるラット腎症モデルについて、最も典型な病理変更は、電子顕微鏡で足細胞の足突起融合が消失することにある。足細胞のこの異常変更は、蛋白尿と疾患の進展を引き起こし、足細胞異常が蛋白尿と腎臓病の発生・発展の要因であることを示す。そのため、本検討では、蛋白尿を２４時間検出した上、アクテオシドが護足細胞を損傷から保護できるか否かを検証した。
【００６０】
図２に示すように、ピューロマイシンによる腎症モデルについて、実験終点、即ちピューロマイシンによる腎症モデルの２０日目に、ピューロマイシン群の足細胞は、部分的に足突起が融合し、足突起が異常（図２Ａ、Ｂ）であることを示し、アクテオシド群では、足細胞の足突起が顕著に回復し、わずかに融合し、正常対照群と類似し（図２Ｃ）、アクテオシドが足細胞の足突起の異常な融合状況を回復できることを示した。
【００６１】
病理変更の他、アクテオシドのラット腎症モデルにおける足細胞への保護効果を明確するために、本検討は、足細胞傷害のマーカーであるｓｙｎａｐｔｏｐｏｄｉｎ、ｎｅｐｈｒｉｎを検出した。
【００６２】
図３Ａ−Ｃに示すように、実験の２０日目に、免疫蛍光で足細胞傷害マーカーであるｓｙｎａｐｔｏｐｏｄｉｎを染色し、蛍光強度によってアクテオシドの足細胞への保護作用を検出した。ピューロマイシン群で、蛍光強度が正常対照群よりも弱く、即ち、ｓｙｎａｐｔｏｐｏｄｉｎの発現が少なく、足細胞傷害を示し；アクテオシド群で、蛍光強度が回復し、アクテオシドがｓｙｎａｐｔｏｐｏｄｉｎ発現をアップレギュレーションして足細胞を保護できることを示した。
【００６３】
さらに、実験の２０日目に、ｗｅｓｔｅｒｎとＰＣＲのリアルタイム定量技術によりｎｅｐｈｒｉｎ遺伝子と蛋白質発現レベル（図３Ｄ−Ｆ）を検出し、結果により、ｎｅｐｈｒｉｎは、ピューロマイシン疾患群で、遺伝子と蛋白質レベルとをダウンレギュレーションし、足細胞の損傷を示し；アクテオシドで治療した後、ｎｅｐｈｒｉｎ発現レベルが高め、アクテオシドが足細胞を保護できることを示した。
【００６４】
３．生体外検討でのアクテオシドの足細胞への保護作用
【００６５】
腎症動物モデルに対する生体内の検討結果により、アクテオシドが足細胞を保護してさらに蛋白尿を低減できることを示し、その足細胞への保護作用をさらに確認するために、本検討は、ピューロマイシンによる足細胞傷害の細胞モデルを用いて、その効果を検証した。まず、本検討では、生体外ピューロマイシンによる足細胞傷害モデルを確立した。
【００６６】
図４Ａに示すように、細胞活性実験ＭＴＳ（ＭＴＳがホルマザン化合物であって、活細胞内のデヒドロゲナーゼ類がＭＴＳを液状で可溶なホルマザン化合物に転換し、４９０ｎｍで測定された吸収値で示されるホルマザン生成物の数量は、培養物での活性細胞の数量に比例し、そのため、細胞活性の検出に用いられる）により、ピューロマイシンが足細胞を処理した際に、足細胞活性が低減し、また対照群と統計学的に差異があったことを検出した。一方、ピューロマイシンによる足細胞傷害の場合に、アクテオシドを用いて、足細胞活性が回復され、傷害群と統計学的に差異があった。
【００６７】
さらに、足細胞の移動実験も、アクテオシドが足細胞を保護できることを検証するために用いられ、検討により、足細胞が正常な生理状況で、ある程度の移動能を有し、足細胞が傷害される場合に、足細胞の移行能が増加することが報告された。試験において、足細胞を、ピューロマイシン処理前に、無菌黄色ピペットチップでスクラッチした後（０時間）、図像を採集し、２４時間後、スクラッチした箇所に対して図像を採集して分析した。結果により、ピューロマイシンで処理した時、図４Ｂ、Ｃに示すように、ピューロマイシンで足細胞を処理した後、細胞が移動して占める面積が増加し、足細胞の動的移行能が増加し、細胞内の骨格が損傷により不安定になり、足細胞傷害を示した。アクテオシドで処理した後、足細胞の移行能が回復され、アクテオシドが足細胞の異常移行能を回復できることを示した。
【００６８】
また、足細胞傷害の蛋白質マーカーであるｎｅｐｈｒｉｎは、ピューロマイシンによる足細胞傷害でダウンレギュレーションを発現し、足細胞傷害を示した。アクテオシドで処理した後、アップレギュレーションを発現し、ピューロマイシン群に比べると、蛋白質のアップレギュレーションに統計学的に差異があった（図４Ｄ、Ｅ）。
【００６９】
さらに、ファロイジンで足細胞の細胞骨格のマイクロフィラメントタンパク質を染色し、結果により、正常な足細胞中の細胞骨格のマイクロフィラメントタンパク質繊維束も、一定の応力の方向で整列し、足細胞が傷害される時、細胞骨格のマイクロフィラメントタンパク質は、短桿状にランダムに排列し、図４Ｆに示すように、足細胞がピューロマイシンによって処理された後、足細胞骨格は、短桿状にランダムに排列し；アクテオシドを利用した後、細胞骨格の排列が回復され、排列がそろって、アクテオシドが足細胞を傷害から保護できることを示した。
【００７０】
以上のように、本発明は、アクテオシドが糸球体の足細胞活性を効果的に回復し、その異常移行能を低減し、足細胞の細胞骨格を保護し、足細胞傷害マーカーであるｎｅｐｈｒｉｎ蛋白とｓｙｎａｐｔｏｐｏｄｉｎ蛋白の発現レベルを回復することで、尿蛋白を顕著に低減することができることを示す。そのため、アクテオシドは、単独で又はその他の薬物との併用で、糸球体の足細胞傷害に関する疾患を予防又は治療する薬物又は健康製品の調製に適用することができ、また、その他の薬物の足細胞への傷害を緩和する薬物又は健康製品への使用に適用することができる。
【００７１】
具体的な実施例を示して本発明を詳しく説明したが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、他の変更、又は修正を行うことができる。そのため、添付の特許請求の範囲には、本発明の範囲にある全ての変更や修正が含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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