(57)【要約】  本願は、N末端及びC末端を有する三重特異性抗体モノマーであって、N末端からC末端まで直列に、N末端に第一のscFvドメイン、Fabドメイン、Fcドメイン、及びC末端に第二のscFvドメイン、を含む、三重特異性抗体モノマーを提供する。一実施形態では、第一のscFvドメイン、Fabドメイン、及び第二のscFvドメインは、異なる抗原に対する結合特異性をそれぞれ有する。
2020529864.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
N末端及びC末端を有する三重特異性抗体モノマーであって、
N末端からC末端まで直列に、
N末端に第一のscFvドメイン、
Fabドメイン、
Fcドメイン、及び
C末端に第二のscFvドメイン、
を含み、
前記第一のscFvドメイン、Fabドメイン、及び第二のscFvドメインは、異なる抗原に対する結合特異性をそれぞれ有し、且つ
前記第一のscFvドメイン、Fabドメイン、及び第二のscFvドメインは、腫瘍抗原又は免疫シグナル伝達抗原に対する特異性をそれぞれ有する、
三重特異性抗体モノマー。
【請求項２】
前記第一のscFvドメイン、Fabドメイン、及び第二のscFvドメインがそれぞれ独立して、ROR1、PD-L1、CD3、CD28、41BB、CEA、HER2、EGFRvIII、EGFR、LMP1、LMP2A、メソセリン、PSMA、EpCAM、グリピカン-3、gpA33、GD2、TROP2、NKG2D、BCMA、CD19、CD20、CD33、CD123、CD22、CD30、PDL1、PD1、OX40、4-1BB、GITR、TIGIT、TIM-3、LAG-3、CTLA4、CD40、VISTA、ICOS、BTLA、LIGHT、HVEM、CSF1R、CD73、及びCD39から選択される抗原に対する結合特異性を有する、請求項1に記載の三重特異性抗体モノマー。
【請求項３】
前記第一のscFvドメイン、Fabドメイン、及び第二のscFvドメインがそれぞれ独立して、ROR1、PD-L1、及びCD3から選択される抗原に対する結合特異性を有する、請求項1に記載の三重特異性抗体モノマー。
【請求項４】
前記第一のscFvドメインがROR1に対する結合特異性を有する、請求項1に記載の三重特異性抗体モノマー。
【請求項５】
前記FabドメインがPD-L1に対する結合特異性を有する、請求項1記載の三重特異性抗体モノマー。
【請求項６】
前記第二のscFvドメインがCD3に対する結合特異性を有する、請求項1に記載の三重特異性抗体モノマー。
【請求項７】
前記第一のscFvドメインがROR1に対する結合特異性を有し、前記FabドメインがPD-L1に対する結合特異性を有し、前記第二のscFvがCD3に対する結合特異性を有する、請求項1に記載の三重特異性抗体モノマー。
【請求項８】
前記FcドメインがヒトIgG1 Fcを含む、請求項1記載の三重特異性抗体モノマー。
【請求項９】
ヒトPD-L1、ヒトCD3、及びヒトROR1、ヒトCD19又はEGFR VIIIのうちの1つに対する結合特異性を有する、請求項1に記載の三重特異性抗体モノマー。
【請求項１０】
前記第一のscFvドメインが(G4S)nリンカーを含み、nが2〜4の整数であり、前記第一のscFvドメインがリンカーを介してFabドメインに連結している、請求項1に記載の三重特異性抗体モノマー。
【請求項１１】
ヒトROR1に対する結合特異性を有するアミノ酸配列を有し、前記アミノ酸配列は配列番号5、6、7又は8とパーセンテージ相同性を有し、且つ前記パーセンテージ相同性は90％以上である、請求項1に記載の三重特異性抗体モノマー。
【請求項１２】
ヒトCD19に対する結合特異性を有するアミノ酸配列を有し、前記アミノ酸配列は配列番号43、44、45又は46とパーセンテージ相同性を有し、且つ前記パーセンテージ相同性は90％以上である、請求項1記載の三重特異性抗体モノマー。
【請求項１３】
EGFR vIIIに対する結合特異性を有するアミノ酸配列を有し、前記アミノ酸配列は配列番号39、40、41又は42とパーセンテージ相同性を有し、前記パーセンテージ相同性は90％以上である、請求項1に記載の三重特異性抗体モノマー。
【請求項１４】
ヒトPD-L1に対する結合特異性を有するアミノ酸配列を有し、前記アミノ酸配列は配列番号13、14、15、又は16とパーセンテージ相同性を有し、前記パーセンテージ相同性は90％以上である、請求項1に記載の三重特異性抗体モノマー。
【請求項１５】
ヒトCD3に対する結合特異性を有するアミノ酸配列を有し、前記アミノ酸配列は配列番号21、22、23、又は24とパーセンテージ相同性を有し、前記パーセンテージ相同性は90％以上である、請求項1記載の三重特異性抗体モノマー。
【請求項１６】
配列番号13〜34、39〜46とパーセンテージ相同性を有するアミノ酸配列を含み、前記パーセンテージ相同性は90％以上である、scFvドメイン。
【請求項１７】
配列番号13〜16とパーセンテージ相同性を有するアミノ酸配列を含み、前記パーセンテージ相同性は90％以上である、Fabドメイン。
【請求項１８】
配列番号47及び48とパーセンテージ相同性を有するアミノ酸配列を含み、前記パーセンテージ相同性は90％以上である、Fcドメイン。
【請求項１９】
請求項1に記載の三重特異性抗体モノマーを含む多重特異性抗体。
【請求項２０】
前記多重特異性抗体が、ヒトPD-L1、ヒトCD3、又はヒトROR1、ヒトCD19又はEGFR VIIIのうちの1つへの結合特異性を有する三重特異性抗体である、請求項19記載の多重特異性抗体。
【請求項２１】
本願に開示の配列番号とパーセンテージ相同性を有するアミノ酸配列を有し、前記パーセンテージ相同性は90％以上である、請求項20に記載の多重特異性抗体。
【請求項２２】
(G4S)4リンカーを介してFabドメインに連結されたscFvドメインを含む、請求項20に記載の多重特異性抗体。
【請求項２３】
請求項1に記載の三重特異性抗体モノマー又は請求項19に記載の多重特異性抗体をコードする単離された核酸配列。
【請求項２４】
請求項23に記載の単離された核酸配列を含む発現ベクター。
【請求項２５】
宿主細胞が原核細胞又は真核細胞である、請求項22に記載の単離された核酸配列を含む宿主細胞。
【請求項２６】
免疫複合体であって、
リンカーを介して請求項19に記載の多重特異性抗体に連結された細胞毒性剤又は造影剤を含み、
前記リンカーは、エステル結合、エーテル結合、アミド結合、ジスルフィド結合、イミド結合、スルホン結合、リン酸結合、リンエステル結合、ペプチド結合、又はそれらの組み合わせから選択される共有結合を含む、
免疫複合体。
【請求項２７】
前記リンカーが疎水性ポリ（エチレングリコール）リンカーを含む、請求項26に記載の免疫複合体。
【請求項２８】
前記細胞毒性剤が、カリケアマイシン、有糸分裂阻害剤、毒素、放射性同位体、毒素、治療薬、又はそれらの組み合わせの一群から選ばれる、化学療法剤、増殖阻害剤、又は細胞毒性剤を含む、請求項26に記載の免疫複合体。
【請求項２９】
薬学的に許容される担体と、請求項19に記載の多重特異性抗体又は請求項26に記載の免疫複合体の少なくとも1つとを含む、医薬組成物。
【請求項３０】
放射性同位体、放射性核種、毒素、化学療法剤又はそれらの組み合わせから選択される治療薬をさらに含む、請求項29に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
ヒト対象のがんを治療又は予防する方法であって、
精製された請求項19の多重特異性抗体、請求項26の免疫複合体、又はそれらの組み合わせを含む医薬組成物の有効量をヒト対象に投与する工程を含む、
方法。
【請求項３２】
前記癌が、ROR1、CEA、HER2、EGFR、EGFRvIII、LMP1、LMP2A、メソセリン、PSMA、EpCAM、グリピカン-3、gpA33、GD2、TROP2、NKG2D、BCMA、CD19、CD20、CD33、CD123、CD22、又はCD30を発現する細胞を含む、請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
有効量の治療薬を共投与することをさらに含む、請求項31に記載の方法。
【請求項３４】
前記治療薬が、抗エストロゲン剤、受容体チロシンキナーゼ阻害剤、キナーゼ阻害剤、細胞周期阻害剤、DNA、RNA、又は蛋白質合成阻害剤、RAS阻害剤、チェックポイント阻害剤、PD1阻害剤、PDL1、CTLA4、4-1BB、OX40、GITR、ICOS、LIGHT、TIM3、LAG3、TIGIT、CD40、CD27、HVEM、BTLA、VISTA、B7H4、CSF1R、NKG2D、CD73、それらの誘導体又は組み合わせを含む、請求項35に記載の方法。
【請求項３５】
有効濃度の請求項19に記載の多重特異性抗体を含む溶液であって、前記溶液がヒト対象の血漿である、溶液。
【発明の詳細な説明】
【関連出願への相互参照】
【０００１】
この出願は、2017年6月25日出願の米国仮特許出願第62524554号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に明確に組み込まれる。
【技術分野】
【０００２】
本明細書の開示は、典型的には、生物学的治療の技術分野に関し、より具体的には、多重特異性抗体の作製及び使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
がん細胞は、宿主の免疫系による破壊と排除を回避するためのさまざまな戦略を実施する。主要なメカニズムの1つは免疫編集であり、オリジナルのがんに対する免疫応答は、腫瘍特異的抗原の主要組織適合性複合体（MHC）提示のダウンレギュレーションを通じて免疫系によって認識されないオリジナルのがん細胞の変異体を選択する免疫学的圧力を提供する。別のメカニズムは腫瘍微小環境内に存在し、制御性T細胞（Treg）や骨髄由来サプレッサー細胞（MDSC）などの細胞が、トランスフォーミング成長因子ベータ（TGF）やインターロイキン-10（IL-10）などの免疫抑制サイトカインの生産を通じて、細胞傷害性T細胞又はナチュラルキラー細胞の細胞溶解活性を積極的に阻害する。また、腫瘍微小環境内では、がん細胞は、免疫応答のダウンレギュレーションと自己寛容の促進に重要な役割を果たすプログラム細胞死蛋白質1（PD-1）などのT細胞上の抑制性受容体に結合するProgrammed Death Ligand 1（PD-L1）などの1つ以上の「免疫チェックポイント」受容体又は分子をしばしば発現する（Vinay et al., 2015, Semin. Cancer Biol.,(35): S185-S198、 Dunnet al., 2004, Immunity, 21(2): 137-48、 Adachi & Tamada, 2015, Cancer Sci., 106(8): 945-50）。
【０００４】
腫瘍が免疫系による認識を回避するメカニズムがよりよく理解され続けるにつれて、これらのメカニズムを標的とする新しい治療法が最近現れてきた。2011年3月25日に、米国食品医薬品局（FDA）は、切除不能又は転移性メラノーマの治療のためのイピリムマブ注射（ヤーボイ、ブリストル・マイヤーズスクイブ）を承認した。ヤーボイは、活性化T細胞に発現する細胞傷害性Tリンパ球関連蛋白質4（CTLA-4）に結合し、CTLA-4と抗原提示細胞のCD80/86との相互作用をブロックし、それにより、CTLA-4を介してT細胞に送達されるネガティブ又は阻害シグナルをブロックし、多くの患者で腫瘍の根絶につながる抗原特異的T細胞の再活性化をもたらす。数年後の2014年、FDAは進行性メラノーマの治療薬としてキイトルーダ（ペンブロリズマブ、メルク）とオプジーボ（ニボルマブ、ブリストルマイヤーズスクイブ）を承認した。これらのモノクローナル抗体は、活性化及び/又は疲弊T細胞で発現するPD-1に結合し、腫瘍で発現したPD-L1とPD-1の相互作用をブロックし、それにより、PD-1を介したT細胞への阻害シグナルが除去され、その結果、抗原特異的T細胞が再活性化され、多くの患者で再び腫瘍が根絶される。それ以降、進行性メラノーマの治療において、単一のモノクローナル抗体ヤーボイをモノクローナル抗体ヤーボイとオプジーボの組み合わせと比較する追加の臨床試験が実施され、抗体の組み合わせで治療された患者の全生存期間と無増悪生存期間の改善を示した（Hodi et al., 2016, Lancet Oncol. 17(11):1558-1568、Hellman et al., 2018, Cancer Cell 33(5):853-861）。但し、多くの臨床試験では、1つ以上の免疫チェックポイント分子に特異的なモノクローナル抗体でがん患者を治療することの大きな利点が示され、抗原特異的T細胞によって認識される新規T細胞エピトープを生成する高い変異負荷を有する患者のみが臨床反応を示すというデータが浮かび上がってきた（Snyder et al., 2014, NEJM 371:2189-2199）。腫瘍の変異負荷が低い患者は、目的の臨床反応をほとんど示しない（Snyder et al., 2014, NEJM 371:2189-2199、Hellman et al., 2018, Cancer Cell 33(5):853-861）。
【０００５】
近年、他のグループは、T細胞を活性化する抗原提示細胞によるネオエピトープ提示の存在を必要としない代替アプローチを開発した。一例は、二重特異性抗体の開発である。ここで、腫瘍関連抗原（例えば、CD19）に特異的な抗体の結合ドメインが、T細胞上のCD3に特異的な抗体結合ドメインにリンクされ、従って、二重特異性T細胞エンゲージャー又はBiTe分子を生成する。2014年、FDAは、前駆体B細胞急性リンパ芽球性白血病の治療のためにブリノツムマブ（Blinotumumab）と呼ばれる二重特異性抗体を承認した。ブリノツムマブは、白血病細胞に発現するCD19に特異的なscFvとT細胞に発現するCD3に特異的なscFvをリンクする。但し、再発又は難治性のALL患者の初期応答率が50％を超えているにもかかわらず、多くの患者はブリノツムマブ療法又はブリノツムマブによる治療の成功後の再発に抵抗力がある。ブリノツムマブに対する耐性またはブリノツムマブ治療後の再発は、活性化T細胞に発現するPD-1を介して抑制シグナルを駆動するPD-L1などの腫瘍細胞に発現する免疫チェックポイント阻害分子の発現に起因するという証拠が現れてきている（Feucht et al., 2016, Oncotarget 7(47):76902-76919）。ブリノツムマブによる治療に抵抗性を示した患者の事例研究では、PD-1に特異的で、T細胞発現PD-1と腫瘍細胞発現PD-L1との相互作用をブロックするモノクローナル抗体（ペンブロリズマブ（キートルーダ、メルク））を追加してブリノツムマブ療法のセカンドラウンドが行われましたが、1人の患者では、劇的な反応が起こり、骨髄の腫瘍細胞が45％から5％未満に減少した（Feucht et al., 2016, Oncotarget 7(47):76902-76919）。これらの結果は、二重特異性BiTe分子を1つ以上のモノクローナル抗体と組み合わせることにより、いずれかの薬剤単独と比較して臨床活性が顕著に向上しことを示す。
【発明の概要】
【０００６】
一態様では、本願は、三重特異性抗体モノマー、その抗原結合断片、及び多重特異性抗体を提供する。
【０００７】
一実施形態では、三重特異性抗体モノマーはN末端及びC末端を有し、N末端からC末端まで直列に、N末端に第一のscFvドメイン、Fabドメイン、Fcドメイン、及びC末端に第二のscFvドメインを含む。第一のscFvドメイン、Fabドメイン、及び第二のscFvドメインは、異なる抗原に対する結合特異性をそれぞれ有する。
【０００８】
抗原は、腫瘍抗原、免疫シグナル伝達抗原、又はそれらの組み合わせであってもよい。一実施形態では、第一のscFvドメイン、Fabドメイン、及び第二のscFvドメインは、腫瘍抗原に対する結合特異性をそれぞれ有する。一実施形態では、第一のscFvドメイン、Fabドメイン、及び第二のscFvドメインは、免疫シグナル伝達抗原に対する結合特異性をそれぞれ有する。
【０００９】
一実施形態では、第一のscFvドメインは、腫瘍抗原に対する結合特異性を有する。一実施形態では、第一のscFvドメインは、免疫シグナル伝達抗原に対する結合特異性を有する。一実施形態では、Fabドメインは、腫瘍抗原に対する結合特異性を有する。一実施形態において、Fabドメインは、免疫シグナル伝達抗原に対する結合特異性を有する。一実施形態では、第二のscFvドメインは、腫瘍抗原に対する結合特異性を有する。一実施形態では、第二のscFvドメインは、免疫シグナル伝達抗原に対する結合特異性を有する。
【００１０】
一実施形態では、第一のscFvドメイン、Fabドメイン、及び第二のscFvドメインは、それぞれ独立して、ROR1、PD-L1、CD3、CD28、41BB、CEA、HER2、EGFRvIII、EGFR、LMP1、LMP2A、メソセリン、PSMA、EpCAM、グリピカン-3、gpA33、GD2、TROP2、NKG2D、BCMA、CD19、CD20、CD33、CD123、CD22、CD30、PDL1、PD1、OX40、4-1BB、GITR、TIGIT、TIM-3、LAG-3、CTLA4、CD40、VISTA、ICOS、BTLA、LIGHT、HVEM、CSF1R、CD73、及びCD39から選択される抗原に対する結合特異性を有する。
【００１１】
一実施形態では、第一のscFvドメイン、Fabドメイン、及び第二のscFvドメインは、それぞれ独立して、ROR1、PD-L1、及びCD3から選択される抗原に対する結合特異性を有する。一実施形態では、第一のscFvドメインは、ROR1に対する結合特異性を有する。一実施形態では、FabドメインはPD-L1に対する結合特異性を有する。一実施形態では、第二のscFvドメインはCD3に対する結合特異性を有する。一実施形態では、第一のscFvドメインはROR1に対して結合特異性を有し、FabドメインはPD-L1に対して結合特異性を有し、第二のscFvはCD3に対して結合特異性を有する。
【００１２】
本明細書に開示の抗体モノマー及び抗体は、ヒト化されてもよい。一実施形態では、FcドメインはヒトIgG1 Fcである。
【００１３】
本願は、本明細書に開示の三重特異性抗体モノマー及び抗体のscFvドメインを提供する。一実施形態では、scFvドメインは、配列番号13〜34, 39〜46とパーセンテージ相同性を有するアミノ酸配列を含む。パーセンテージ相同性は、70％、80％、90％、95％、98％、又は99％以上である。
【００１４】
本願は、本明細書に開示の三重特異性抗体モノマー及び抗体のFabドメインを提供する。一実施形態では、Fabドメインは、配列番号13〜16とパーセンテージ相同性を有するアミノ酸配列を含む。パーセンテージ相同性は、70％、80％、90％、95％、98％、又は99％以上である。
【００１５】
本願は、本明細書に開示の三重特異性抗体モノマー及び抗体のFcドメインを提供する。一実施形態では、Fabドメインは、配列番号47及び48とパーセンテージ相同性を有するアミノ酸配列を含む。パーセンテージ相同性は、70％、80％、90％、95％、98％、又は99％以上である。
【００１６】
三重特異性抗体モノマー及び抗体中の第一のscFvドメイン、第二のscFvドメイン、Fabドメイン及びFcドメインは、本明細書に開示の配列の任意の組み合わせであってもよい。
【００１７】
一実施形態では、本願は、三重特異性抗体モノマーを含む多重特異性抗体を提供する。一実施形態では、多重特異性抗体は、第一の三重特異性モノマー及び第二の三重特異性モノマーを含む。一実施形態では、第一及び第二の三重特異性モノマーは同じであり、多重特異性抗体は対称性の三重特異性抗体である。一実施形態では、第一及び第二の三重特異性モノマーは異なり、多重特異性抗体は非対称抗体である。一実施形態では、多重特異性抗体は、三重特異性抗体、四重特異性抗体、五重特異性抗体、又は六重特異性抗体である。
【００１８】
一実施形態では、多重特異性抗体は、第一の三重特異性抗体モノマー及び第二の三重特異性抗体モノマーを含む。第一の三重特異性抗体モノマーは、N末端及びC末端を有し、N末端からC末端まで直列に、N末端の第一のscFvドメイン、第一のFabドメイン、第一のFcドメイン、及びC末端の第二のscFvドメインを含む。第二の多重特異性抗体モノマーは、N末端及びC末端を有し、N末端からC末端まで直列に、N末端の第三のscFvドメイン、第二のFabドメイン、第二のFcドメイン、及びC末端の第四のscFvドメインを含む。一実施形態では、第三のscFvドメイン、第二のFabドメイン、及び第四のscFvドメインは、異なる抗原に対する結合特異性をそれぞれ有する。一実施形態では、第二のscFvドメイン、及び第四のscFvドメインは、異なる抗原に対する結合特異性をそれぞれ有する。一実施形態では、第一のscFvドメイン、及び第三のscFvドメインは、異なる抗原に対する結合特異性をそれぞれ有する。一実施形態では、第一のFabドメイン、及び第二のFabドメインは、異なる抗原に対する結合特異性をそれぞれ有する。
【００１９】
一実施形態では、多重特異性抗体は三重特異性抗体である。一実施形態において、本願は、3つの異なる結合ドメインを有する操作された抗体又は「三重特異性」抗体を提供する。第一の結合ドメインはT細胞上のCD3に特異的であり、第二の結合ドメインは限定されないが、ROR1、CEA、HER2、EGFR、EGFRvIII、LMP1、LMP2A、メソセリン、PSMA、EpCAM、グリピカン-3、gpA33、GD2、TROP2、BCMA、CD19、CD20、CD33、CD123、CD22、CD30などの腫瘍関連抗原に特異的であり、第三の結合ドメインは、PDL1、PD1、OX40、4-1BB、GITR、TIGIT、TIM-3、LAG-3、CTLA4、CD40、VISTA、ICOS、BTLA、Light、HVEM、CD73、CD39などの免疫チェックポイント調節因子に特異的である。一実施形態では、三重特異性抗体は、本願に開示される配列番号とパーセンテージ相同性を有するアミノ酸配列を含む。パーセンテージ相同性は、70％、80％、90％、95％、98％、又は99％以上である。
【００２０】
一実施形態では、抗体は精製、単離、又は非天然に存在する。
【００２１】
本願はさらに、三重特異性モノマー、その抗原結合断片、又は本明細書に開示の多重特異性抗体をコードする単離された核酸配列を提供する。一実施形態では、単離された核酸配列は、本明細書に開示の三重特異性抗体モノマーをコードする。
【００２２】
本願は、本明細書に開示の単離された核酸配列を含む発現ベクター又は宿主細胞をさらに提供する。一実施形態では、宿主細胞は発現ベクターを含む。一実施形態では、宿主細胞は原核細胞又は真核細胞である。
【００２３】
本願はさらに、リンカーを介して三重特異性抗体モノマー、抗原結合断片、又は多重特異性抗体に連結した細胞毒性剤又はイメージング剤を含む免疫複合体を提供する。
【００２４】
リンカーは、切断可能又は切断不能であり得る。一実施形態では、リンカーは、エステル結合、エーテル結合、アミド結合、ジスルフィド結合、イミド結合、スルホン結合、リン酸結合、リンエステル結合、ペプチド結合、又はそれらの組み合わせなどの共有結合であってもよい。一実施形態において、リンカーは、疎水性ポリ（エチレングリコール）リンカーを含んでいてもよい。
【００２５】
細胞毒性剤は、カリケアマイシン、有糸分裂阻害剤、毒素、放射性同位体、治療薬、又はそれらの組み合わせの一群から選ばれる、化学療法剤、増殖阻害剤、又は細胞毒性剤を含んでいてもよい。一実施形態では、細胞毒性剤は、カリケアマイシン、オゾガマイシン、モノメチルオーリスタチンE、エムタンシン、それらの誘導体又は組み合わせを含んでいてもよい。
【００２６】
造影剤は、造影目的に有用な任意の化合物であり得る。一実施形態では、造影剤は、放射性核種、蛍光剤、量子ドット、又はそれらの組み合わせであってもよい。
【００２７】
別の態様において、本願は、抗体モノマー、その抗原結合断片、又は本明細書に開示の抗体の作製方法を提供する。一実施形態では、多重特異性抗体の生産方法は、抗体をコードする核酸配列が発現されるように抗体をコードする核酸配列を含む宿主細胞を培養する工程、抗体を精製する工程を含む。
【００２８】
さらなる態様では、本願は医薬組成物を提供する。一実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される担体と、三重特異性抗体モノマー、多重特異性抗体、免疫複合体、又はそれらの組み合わせを含む。
【００２９】
一実施形態では、医薬組成物は治療薬をさらに含む。治療薬は、放射性同位元素、放射性核種、毒素、化学療法剤、抗体、酵素、又はそれらの組み合わせが含んでいてもよい。一実施形態では、治療薬は、抗エストロゲン剤、受容体チロシンキナーゼ阻害剤、キナーゼ阻害剤、細胞周期阻害剤、DNA、RNA又は、蛋白質合成阻害剤、RAS阻害剤、免疫チェックポイント阻害剤、又はそれらの組み合わせを含む。
【００３０】
さらなる態様において、本願は、三重特異性抗体モノマー、多重特異性抗体、免疫複合体、又はそれらの組み合わせを使用してがんを治療又は予防する方法を提供する。一実施形態では、方法は、有効量の三重特異性抗体モノマー、多重特異性抗体、免疫複合体、又はそれらの組み合わせを、そのような治療を必要とする対象に投与することを含む。一実施形態では、方法は、そのような治療を必要とする対象に、三重特異性抗体モノマー、多重特異性抗体、免疫複合体、又はそれらの組み合わせを含む医薬組成物の有効量を投与することを含む。一実施形態では、がんを有する対象の治療方法は、本明細書に開示の有効量の三重特異性抗体を対象に投与する工程を含む。
【００３１】
一実施形態では、方法は、有効量の多重特異性モノマー、多重特異性抗体、免疫複合体、それらの抗原結合断片を腫瘍部位に直接注入する工程を含む。
【００３２】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示の治療方法が現在存在する治療法を上回る利点として、限定されないが、以下を含む。1）IgG Fcドメインを含めると、二重特異性BiTe分子と比較して血清中の半減期が長くなるという特徴がある、2）免疫チェックポイントモジュレーター、例えば、PD-L1に特異的な結合ドメインを含めると、腫瘍発現PD-L1が活性化T細胞に発現したPD-1に結合することの抑制効果を阻害し得る、及び3）T細胞上のCD3を腫瘍関連抗原と架橋することで、キメラ抗原受容体T細胞（CAR-T）の場合と同様に、患者からT細胞を取り出し、腫瘍細胞に特異的になるように遺伝子改変してから患者にT細胞を再導入する必要なく、T細胞を「リダイレクト」して腫瘍を死滅させる。
【００３３】
種々のがんが、三重特異性抗体モノマー、多重特異性抗体、免疫複合体、又はそれらの組み合わせで治療できる。がんの例は、乳がん、大腸がん、肛門がん、膵臓がん、胆嚢がん、胆管がん、頭頸部がん、鼻咽頭がん、皮膚ガン、メラノーマ、卵巣がん、前立腺がん、尿道がん、肺がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、脳腫瘍、神経膠腫、神経芽細胞腫、食道がん、胃がん、肝臓がん、腎臓がん、膀胱がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、甲状腺がん、眼がん、肉腫、骨がん、白血病、骨髄腫又はリンパ腫を含むが、これらに限定されない。一実施形態では、がんは、ROR1、CEA、HER2、EGFR、EGFRvIII、LMP1、LMP2A、メソセリン、PSMA、EpCAM、グリピカン-3、gpA33、GD2、TROP2、NKG2D、BCMA、CD19、CD20、CD33、CD123、CD22を発現する細胞を含む。
【００３４】
対象の治療方法は、治療薬の有効量を共投与することを含んでもよい。一実施形態では、治療薬は、抗体、化学療法薬、酵素、又はそれらの組み合わせを含む。一実施形態では、治療薬は、抗エストロゲン剤、受容体チロシンキナーゼ阻害剤、キナーゼ阻害剤、細胞周期阻害剤、DNA、RNA又は蛋白質合成阻害剤、RAS阻害剤、又はそれらの組み合わせを含む。
【００３５】
一実施形態では、治療薬はカペシタビン、シスプラチン、シクロホスファミド、メトトレキサート、5-フルオロウラシル、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ムスチン、ビンクリスチン、プロカルバジン、プレドニゾロン、ブレオマイシン、ビンブラスチン、ダカルバジン、エトポシド、エピルビシン、ペメトレキセド、フォリン酸、ゲミシタビン、オキサリプラチン、イリノテカン、トポテカン、カンプトテシン、ドセタキセル、パクリタキセル、フルベストラント、タモキシフェン、レトロゾール、エキセメスタン、アナストロゾール、アミノグルテチミド、テストラクトン、ボロゾール、フォルメスタン、ファドロゾール、エルロチニブ、ラファチニブ、ダサチニブ、ゲフィチニブ、オシメルチニブ、ヴァンダータニブ、アファチニブ、イマチニブ、パゾピニブ、ラパチニブ、スニチニブ、ニロチニブ、ソラフェニブ、ナブ-パリタキセル、エベロリムス、テムシロリムス、ダブラフェニブ、ベムラフェニブ、トラメチニブ、ビンタフォリド、アパチニブ、クリゾチニブ、ペリフォルシン、オラパリブ、ボルテゾミブ、トファシチニブ、トラスツズマブ、それらの誘導体又は組み合わせを含む。
【００３６】
一実施形態では、治療薬はチェックポイント阻害剤を含む。一実施形態では、治療薬は、PD1、PDL1、CTLA4、4-1BB、OX40、GITR、ICOS、LIGHT、TIM3、LAG3、TIGIT、CD40、CD27、HVEM、BTLA、VISTA、B7H4、CSF1R、NKG2D、CD73、それらの誘導体又は組み合わせの阻害剤を含む。
【００３７】
治療される対象はヒトであってもよい。一実施形態において、本願は、有効濃度の三重特異性抗体モノマー、その抗原結合断片、多重特異性抗体、それらの組み合わせを含む溶液を提供し、溶液は対象の血漿である。
【００３８】
さらに他の実施形態は、以下の詳細な説明から当業者には容易に明らかになるであろう。ここで、考えられる最良のモードを説明する目的で実施形態を説明する。理解されるように、他の異なる実施形態が可能であり、実施形態のいくつかの詳細は、それらの精神及び範囲からすべて逸脱することなく、様々な明白な点で改変が可能である。従って、図面及び詳細な説明は、本質的に例示と見なされるべきであり、限定と見なされるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
本明細書の開示の前述及び他の特徴は、添付の図面と併せて、以下の説明及び添付の特許請求の範囲からより完全に明らかになるであろう。図面は、本明細書の開示に従って用意されたいくつかの実施形態のみを示しており、従って、その範囲を限定するものと見なされるべきではなく、本明細書の開示は、添付の図面の使用を通じてさらなる特異性及び詳細が説明され得る。
【００４０】
【図１】図1に、結合及びRTCCアッセイで使用される実施例の三重特異性抗体の例を示す。
【図２】図2は、実施例の三重特異性抗体で使用される抗体結合ドメインの特異性を示す。
【図３】図３は、少なくとも1つの実施形態の対称性の三重特異性抗体を示す図である。
【図４】図４は、いくつかの実施形態のROR1発現CHO細胞に結合する三重特異性抗体のFACS分析を示す実験結果のスナップショットである。
【図５】図5は、いくつかの実施形態のPD-L1発現CHO細胞に結合する三重特異性抗体のFACS分析を示す実験結果のスナップショットである
【図６】図6は、いくつかの実施形態のエフェクターとしてCD3+T細胞及び標的としてROR1陽性B-急性リンパ芽球性白血病細胞株カスミ-2を用いたリダイレクトT細胞細胞毒性アッセイを示す実験結果のスナップショットである
【図７】図7は、いくつかの実施形態のエフェクターとしてCD4+制御性T細胞及び標的としてROR1陽性B-急性リンパ芽球性白血病細胞株カスミ-2を用いたリダイレクトT細胞細胞毒性アッセイを示す実験結果のスナップショットである
【図８】図8は、いくつかの実施形態のエフェクターとして「疲弊」CD8+T細胞及び標的としてROR1陽性B-急性リンパ芽球性白血病細胞株カスミ-2を用いたリダイレクトT細胞細胞毒性アッセイを示す実験結果のスナップショットである
【図９】図9は、いくつかの実施形態のエフェクターとしての末梢血単核細胞及び標的としてのグリオブラストーマ細胞株U87-EGFRviiiを用いたリダイレクトT細胞細胞毒性アッセイを示す実験結果のスナップショットである
【図１０】図10は、いくつかの実施形態のエフェクターとして末梢血単核細胞及び標的としてグリオブラストーマ細胞株U87-EGFRviiiを用いたリダイレクトT細胞細胞傷害性アッセイを示す実験結果のスナップショットである
【図１１】図11は、いくつかの実施形態のエフェクターとしてPBMC細胞及び標的としてCD19陽性B-急性リンパ芽球性白血病細胞株カスミ-2を用いたリダイレクトT細胞細胞毒性アッセイを示す実験結果のスナップショットである
【発明を実施するための形態】
【００４１】
以下の詳細な説明では、本明細書の一部を形成する添付図面を参照する。図面では、文脈からそうでないことが示されない限り、同様の記号は通常は、同様のコンポーネントを識別する。詳細な説明、図面、及び特許請求の範囲に記載されている例示的な実施形態は、限定することを意図していない。本明細書に提示される主題の精神又は範囲から逸脱することなく、他の実施形態を利用することができ、他の変更を加えることができる。本明細書に一般的に記載され、図に示される本開示の態様は、多種多様な異なる構成で配置、置換、組み合わせ、分離、及び設計できることは容易に理解されよう。これらはすべて本明細書で明確に検討されている。
【００４２】
本明細書の開示は、特に、単離された抗体、そのような抗体の作製方法、二重特異性又は多重特異性分子、そのような抗体又は抗原結合断片から構成される抗体-薬物複合体及び/又は免疫複合体、抗体、二重特異性又は多重特異性分子、抗体-薬物複合体及び/又は免疫複合体を含む医薬組成物、分子及び組成物を作製する方法、及び本明細書に開示の分子及び組成物を使用したがんの治療方法を提供する。
【００４３】
「抗体」という用語は最も広い意味で使用され、望ましい生物学的活性を示す限り、単一のモノクローナル抗体（アゴニスト及びアンタゴニスト抗体を含む）、ポリエピトープ特異性を有する抗体組成物、及び抗体断片（例えば、Fab、F(ab')2、及びFv）を具体的にカバーする。いくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナル、ポリクローナル、キメラ、単鎖、二重特異性又は二重有効性、サル化、ヒト及びヒト化抗体、並びにその活性断片であってもよい。既知の抗原に結合する分子の活性断片の例には、Fab、F(ab′)2、scFv及びFv断片が含まれ、Fab免疫グロブリン発現ライブラリーの産物、並びに上記の抗体及び断片のいずれかのエピトープ結合断片を含む。いくつかの実施形態において、抗体は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分、即ち抗原に免疫特異的に結合する結合部位を含む分子を含んでいてもよい。免疫グロブリンは、免疫グロブリン分子の任意のタイプ（IgG、IgM、IgD、IgE、IgA、及びIgY）又はクラス（IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、及びIgA2）又はサブクラスであり得る。一実施形態では、抗体は、抗体全体及び抗体全体由来の任意の抗原結合断片であってもよい。典型的な抗体は、典型的には2本の重(H)鎖と2本の軽(L)鎖を有するヘテロテトラマー蛋白質を指す。各重鎖は、重鎖可変ドメイン（VHと略記）及び重鎖定常ドメインで構成される。各軽鎖は、軽鎖可変ドメイン（VLと略記）及び軽鎖定常ドメインで構成される。VH及びVL領域は、超可変相補性決定領域（CDR）のドメインと、フレームワーク領域（FR）と呼ばれるより保存された領域にさらに細分化してもよい。各可変ドメイン（VH又はVL）は典型的には、次の順序で配置された3つのCDRと4つのFRで構成される。アミノ末端からカルボキシ末端までがFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。軽鎖及び重鎖の可変領域内には、抗原と相互作用する結合領域がある。
【００４４】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指す。即ち、集団を含む個々の抗体は、少量存在する可能性のある自然発生突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は非常に特異的であり、単一の抗原部位に向けられる。さらに、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に向けられる。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養により合成され、他の免疫グロブリンにコンタミネーションされていないという点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集団から得られるという抗体の特性を示し、特定の方法による抗体の生産を必要とすると解釈されない。例えば、本明細書の開示に従って使用されるモノクローナル抗体は、Kohler & Milstein, Nature, 256:495 (1975)によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製されてもよく、又は組換えDNA法によって作製されてもよい（例えば、U.S. Pat. No. 4,816,567参照）。
【００４５】
モノクローナル抗体は、特定の種に由来する、又は特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と重鎖及び/又は軽鎖の一部が同一又は相同であり、一方、鎖の残りの部分は、所望の生物活性を示す限り、別の種に由来する、又は別の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体、並びにそのような抗体の断片の対応する配列と同一又は相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を含んでいてもよい（U.S. Pat. No. 4,816,567、及び Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 [1984]）。
【００４６】
モノクローナル抗体は、マウスハイブリドーマ又はファージディスプレイ（レビューはSiegel. Transfus. Clin. Biol. 9:15-22 (2002)参照）を含むさまざまな方法を使用して、又は初代B細胞から直接抗体を分子クローニングすること（Tiller. New Biotechnol. 28:453-7 (2011)参照）で生産し得る。本明細書の開示において、抗体は、ヒトPD-L1蛋白質及び細胞表面上でヒトPD-L1を一過性発現する細胞の両方でウサギを免疫することにより作製された。ウサギは、親和性、多様性、特異性の高い抗体を作成することが知られている（Weber et al. Exp. Mol. Med. 49:e305）。免疫動物のB細胞をin vitroで培養し、抗PD-L1抗体の生産についてスクリーニングした。抗体可変遺伝子は、組換えDNA技術を使用して単離され、得られた抗体は組換えで発現され、PD-1とPD-L1の結合を阻害する能力、非ヒト霊長類PD-L1に結合する能力、ヒトT細胞活性化を増強する能力などの所望の特徴についてさらにスクリーニングされた。この抗体発見の一般的な方法は、Seeber et al. PLOS One. 9:e86184 (2014)に記載されている方法と似ている。
【００４７】
「抗原又はエピトープ結合部分もしくは断片」という用語は、抗原（この場合はPD-L1）に結合することができる抗体の断片を指す。これらの断片は、インタクト抗体の抗原結合機能及び追加機能の能力を有していてもよい。結合断片の例は、合成リンカーによって単一ポリペプチド鎖に接続された抗体の単一アームのVL及びVHドメインからなる単鎖Fv断片（scFv）、又はVL、定常軽鎖（CL）、VH、及び定常重鎖1（CH1）ドメインからなる一価断片であるFab断片を含むが、これらに限定されない。抗体断片はさらに小さいサブ断片であり、単一のCDRドメイン、特にVL及び/又はVHドメインのいずれかからのCDR3領域と同じくらい小さいドメインで構成できる（例えば、Beiboer et al., J. Mol. Biol. 296:833-49 (2000)参照）。抗体断片は、当業者に知られている従来の方法を使用して生産される。抗体断片は、インタクト抗体で使用される同じ技術を使用して、有用性に関してスクリーニングできる。
【００４８】
「抗原又はエピトープ結合断片」は、多くの当該技術分野で知られている技術により、本明細書の開示の抗体に由来し得る。例えば、精製モノクローナル抗体をペプシンなどの酵素で切断し、HPLCゲルろ過にかけることができる。次に、Fab断片を含む適切な画分を収集し、膜濾過などにより濃縮し得る。抗体の活性断片の単離のための一般的な技術のさらなる説明については、例えば、Khaw, B. A. et al. J. Nucl. Med. 23:1011-1019 (1982)、Rousseaux et al. Methods Enzymology, 121:663-69, Academic Press, 1986を参照。
【００４９】
抗体のパパイン消化は、それぞれが単一の抗原結合部位を持つ「Fab」断片と呼ばれる2つの同一の抗原結合断片と、その名前が容易に結晶化する能力を反映する残りの「Fc」断片を生成する。ペプシン処理により、2つの抗原結合部位を有し、抗原を架橋できるF(ab′)2断片が生成される。
【００５０】
Fab断片は、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の最初の定常ドメイン（CH1）を含んでいてもよい。Fab′断片は、抗体ヒンジ領域からの1つ以上のシステインを含む重鎖CH1ドメインのカルボキシ末端にいくつかの残基が追加されていることにより、Fab断片とは異なる。Fab′-SHは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するFab 'の本明細書における呼称である。F(ab′)2抗体断片は元々、間にヒンジシステインを有するFab'断片のペアとして生成された。抗体断片の他の化学的結合も知られている。
【００５１】
「Fv」は、完全な抗原認識及び結合部位を含む最小の抗体断片である。この領域は、1つの重鎖可変ドメインと1つの軽鎖可変ドメインのダイマーで構成され、非共有結合で緊密に結合している。この構成では、各可変ドメインの3つのCDRが相互作用して、VH-VLダイマーの表面に抗原結合部位を規定する。集合的に、6つのCDRは抗体に抗原結合特異性を付与する。但し、単一の可変ドメイン（又は、抗原に特異的な3つのCDRのみを含むFvの半分）でも、結合部位全体よりも低い親和性でありながら、抗原を認識して結合してもよい。
【００５２】
脊椎動物種由来の抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパとラムダ（λ）と呼ばれる2つの明確に異なるタイプのいずれかに割り当てることができる。
【００５３】
重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンには5つの主要なクラスがある。IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、及びこれらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、IgG-1、IgG-2、IgG-3、IgG-4、IgA-1及びIgA-2にさらに分けられ得る。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、デルタ、イプシロン、γ、及びμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造と三次元配置はよく知られている。
【００５４】
「ヒト化抗体」は、非ヒトドナー免疫グロブリンに由来するCDRを有し、分子の残りの免疫グロブリン由来部分が1つ（又はそれ以上）のヒト免疫グロブリンに由来する操作された抗体のタイプを指す。さらに、フレームワークサポート残基は、結合親和性を保持するために変更されてもよい。「ヒト化抗体」を得る方法は、当業者によく知られている。（例えば、Queen et al., Proc. Natl Acad Sci USA, 86:10029-10032 (1989), Hodgson et al., Bio/Technology, 9:421 (1991)参照）。
【００５５】
本明細書で使用される「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「蛋白質」という用語は互換性があり、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸から構成される生体分子を意味すると定義される。
【００５６】
本明細書で使用される「a」、「an」、及び「the」という用語は、「1つ以上」を意味すると定義され、文脈が不適切でない限り複数形を含む。
【００５７】
「単離された」とは、それが自然に発生する成分の少なくともいくつかを含まない生体分子を意味する。「単離された」とは、本明細書に開示の様々なポリペプチドを説明するために使用される場合、発現元の細胞又は細胞培養物から同定及び分離及び/又は回収されたポリペプチドを意味する。典型的には、単離されたポリペプチドは、少なくとも1つの精製工程により調製される。「単離された抗体」とは、異なる抗原結合特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指す。
【００５８】
「組換え」とは、外因性宿主細胞で組換え核酸技術を使用して抗体が生成されることを意味する。
【００５９】
「抗原」という用語は、生物、特に動物、より具体的にはヒトを含む哺乳動物において免疫応答を誘発することができる実体又はその断片を指す。この用語は、抗原性又は抗原決定基に関与する免疫原及びその領域を含む。
【００６０】
また、本明細書で使用される「免疫原性」という用語は、免疫原性剤に対する抗体、T細胞又は他の反応性免疫細胞の生産を誘発又は増強し、ヒト又は動物の免疫応答に寄与する物質を指す。個体が治療される障害を緩和又は軽減するために、本明細書の開示の投与された免疫原性組成物に対して十分な抗体、T細胞及び他の反応性免疫細胞を生産すると、免疫応答が生じる。
【００６１】
特定の抗原又はエピトープに対する「特異的結合」又は「特異的に結合する」又は「特異的」とは、非特異的相互作用とは明らかに異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、一般に結合活性を持たない同様の構造の分子である対照分子の結合と比較して、分子の結合を決定することにより測定し得る。例えば、特異的結合は、標的に類似した制御分子との競合により決定し得る。
【００６２】
特定の抗原又はエピトープに対する特異的結合は、例えば、少なくとも約10-4M、少なくとも約10-5M、少なくとも約10-6M、少なくとも約10-7M、少なくとも約10-8M、少なくとも約10-9M、少なくとも約10-10M、少なくとも約10-11M、少なくとも約10-12M、又はそれ以上の抗原又はエピトープに対するKDを有する抗体によって示され得る。ここで、KDは特定の抗体-抗原相互作用の解離速度を指す。典型的には、抗原に特異的に結合する抗体は、抗原又はエピトープに対して対照分子の20〜、50〜、100〜、500〜、1000〜、5000〜、10000〜倍、又はより大きいKDを有してもよい。
【００６３】
また、特定の抗原又はエピトープに対する特異的結合は、例えば、対照に対するエピトープについて少なくとも20〜、50〜、100〜、500〜、1000〜、5000〜、10000〜倍、又はより大きい抗原又はエピトープに対するKA又はKaを有する抗体により示すことができる。ここで、KA又はKaは、特定の抗体-抗原相互作用の結合（association）速度を意味する。
【００６４】
2つの配列間の「相同性」は、配列の同一性によって決定される。互いに比較される2つの配列の長さが異なる場合、配列同一性は、好ましくは、より長い配列のヌクレオチド残基と同一であるより短い配列のヌクレオチド残基の割合に関する。配列同一性は、コンピュータープログラムを使用して従来通りに決定できる。所定の配列と本明細書の開示の上記の配列との比較において現れる逸脱は、例えば、追加、欠失、置換、挿入又は組換えによって引き起こされてもよい。
【００６５】
一態様では、本願は、三重特異性抗体モノマー、その抗原結合断片、及び多重特異性抗体を提供する。いくつかの実施形態において、本願は、対称性の三重特異性抗体及びその抗原結合断片の生成を記載する。一実施形態では、三重特異性抗体は、3つの異なる抗体結合ドメインを有する単量体のダイマーである。
【００６６】
モノマーは、第一の結合特異性を有すN末端の単鎖断片可変（scFv）、それに続く第二の結合特異性を有すフラグメント抗体（Fab）ドメイン、それに続くヒトIgG1 CH1、ヒンジ、CH2、及びCH3ドメイン、それに続くC末端の第三の結合特異性を有すscFvを含む。
【００６７】
対応するカッパ又はラムダ軽鎖は、典型的な抗体のように別個のVL-CL鎖として発現する。モノマーは、図3に示すように、腫瘍関連抗原に結合する1つのドメイン、アゴニスト又はアンタゴニスト特性を有す免疫チェックポイントドメインに結合する1つのドメイン、T細胞上のCD3複合体に結合する1つのドメインを有する。
【００６８】
一実施形態において、N末端scFvは、20アミノ酸G4Sリンカーにより作動可能に連結された配向VL-VHであり、C末端scFvは、15又は20アミノ酸G4Sリンカーにより連結された配向VH-VLである。これらのリンカーはそれぞれ、1つのドメインのC末端をパートナードメインのN末端に遺伝的に融合する。N末端scFvは、10アミノ酸の短いG4SリンカーでFabドメインに融合する。同様に、C末端scFvは10アミノ酸G4SリンカーでヒトIgG1 Fcドメインの末端に融合する。
【００６９】
一実施形態では、対称性の三重特異性抗体は、sROR1（Karvonen et al, 2017, Biochem Soc Trans, 45(2): 457-464、Aghebati-Maleki et al, 2017, Biomed Pharmacother. 88:814-822、Shabani et al, 2015, Expert Opin Ther Targets. 19(7):941-55.）又はCD19（Johnsen et al., 2014 Leuk Lymphoma, 55(6):1251-60）などの腫瘍関連抗原（TAA）、又は上皮成長因子受容体のviii突然変異体（Gan et al., 2013, FEBS J. 280(21):5350-70）に結合するように設計された。
【００７０】
一実施形態において、三重特異性抗体は、腫瘍微小環境において多くの腫瘍で発現されるPD-L1などのがん細胞に対する免疫応答に関与する第二の抗原に結合するように設計された（Dunn & Rao, 2017, Mol Immunol. 13;87:227-239、Balar & Weber. 2017, Cancer Immunol Immunother. 66(5):551-564.）。
【００７１】
一実施形態では、三重特異性抗体はまた、T細胞特異的である第三の抗原CD3に結合するように設計された。このクラスの抗体は、TAA及び/又はPD-L1を介して腫瘍に結合し、CD3を介して腫瘍の近くにある任意のCD3+T細胞に結合し得る。これは、リダイレクトT細胞の細胞毒性又はRTCCと呼ばれるプロセスである（Baeuerle and Reinhardt, 2009, Cancer res. 69(12):4941-4）。
【００７２】
細胞毒性は一般にCD8+T細胞の作用により達成されるが、CD4+T細胞の役割は実証されている（Haas et al., 2009 Immunobiology, 214(6):441-53）。さらに、これらの三重特異性抗体で使用されるPD-L1結合ドメインは、腫瘍細胞で発現するPD-L1とT細胞上のPD-1の相互作用をブロックするように選択されているため、T細胞活性化へのこの阻害経路が減少又は排除される（Feucht et al., 2016, Oncotarget 7(47):76902-76919）。
【００７３】
Fc受容体を発現している細胞の表面上の三重特異性抗体の架橋を排除するため、IgG1ヒンジ領域付近のアミノ酸変異（アラニン）がL234、L235、及びG237の位置（Strohl WR, 2009, Curr Opin Biotechnol. 20(6):685-91）に導入され、「エフェクターヌル」表現型と呼ばれる抗体依存性細胞傷害（ADCC）又は補体依存性細胞傷害（CDC）エフェクター機能のないFcドメインが生じた。
【００７４】
一実施形態では、三重特異性分子は、腫瘍関連抗原としてヒトROR1（配列番号5〜8）、ヒトCD19（配列番号43〜46）、又はEGFR vIII（配列番号39〜42）のいずれかを標的とする。これらの標的化三重特異性蛋白質のそれぞれはまた、抗ヒトPD-L1（配列番号13〜16）、及び抗ヒトCD3結合ドメイン（配列番号21〜24）を運ぶ。これらの結合ドメインは、ペプチドのN末端ドメイン1（D1）に配置するためのscFv、VLVH、又はC末端ドメイン3（D3）に配置するためのscFv、VHVLに変換された。
【００７５】
一実施形態では、本明細書に記載のscFv分子は、V領域の向き（LH又はHL）に関係なく、VH及びVLを作動可能に連結する20アミノ酸フレキシブル(G4S)X4リンカーを含む。三重特異性蛋白質の残りの位置ドメイン2（D2）は、IgG1重鎖VH-CH1-ヒンジ-CH2-CH3で構成され、その対応する軽鎖VL-CLはカッパ又はラムダ鎖のいずれかであり得る。D1とD2は、10アミノ酸(G4S)x2リンカーを介して遺伝的にリンクされ、D2とD3は、連続的な〜125kDaの重鎖ペプチドをもたらす。
【００７６】
適切な軽鎖と共トランスフェクトした場合、一例の対称性の三重特異性ペプチドは、その後IgG1 Fcを通して精製でき（プロテインA／プロテインG）、機能活性を評価するためにアッセイできる。重鎖と軽鎖の遺伝子「カセット」は、制限酵素サイト（重鎖にはHindIII/NheI、軽鎖にはHindIII/BsiWI）、又はギブソンアセンブリー（SGI-DNA, La Jolla, CA）、インフュージョン（Takara Bio USA）、NEBuilder（NEB, Ipswich, MA）などの「制限フリークローニング」のいずれかを使用してV領域をクローニングできるように以前に構築された。後者は本明細書で使用された。
【００７７】
本願は、三重特異性抗体モノマー、その抗原結合断片、及び多重特異性抗体の作製方法を提供する。一実施形態では、抗体は三重特異性抗体である。三重特異性抗体蛋白質は、インタクト分子の設計、各ドメインのヌクレオチド配列の合成とクローニング、哺乳類細胞での発現、及び最終産物の精製を含むプロセスを通じて生産される。
【００７８】
ヌクレオチド配列はGeneious 10.2.3ソフトウェアパッケージ（Biomatters, Auckland, NZ）を使用して構築され、遺伝子合成（Genewiz, South Plainsfield, NJ）のためにコンポーネントドメインに分割された。この例では、SI-27X63（配列番号52）はコンポーネントドメインに分割された。ここで、抗ヒトROR1 Igドメイン特異的クローン338H4 VLVH scFvはD1を占め、抗ヒトPD-L1クローンPL230C6はD2（Fab位置）を占め、抗ヒトCD3クローン284A10 VHVL scFvはC末端D3を占める。
【００７９】
NEBuilder Webベースツールを使用して、各ドメインが部位特異的組換えを管理する20〜30ヌクレオチドによってそのフランキングドメインと重複するように、5'及び3'ヌクレオチドをより大きな蛋白質の位置に応じて各ドメインに付加し、それにより、1回の遺伝子アセンブリ工程で各ドメインを遺伝的に融合する。
【００８０】
小アリコートで大腸菌DH10b（Invitrogen, Carlsbad, CA）に形質転換し、TB+カルベニシリン100ug/mlプレート（Teknova, Hollister, CA）に播種し、37℃で一晩インキュベートした。得られたコロニーを選択し、2mlの一晩培養物をTB+カルベニシリンでインキュベーションした。DNAを一晩培養物から調製し（Thermo-Fisher, Carlsbad, CA）、続いて各ドメインに隣接するシークエンスプライマー（Sigma,St. Louis, MO）を使用して配列決定した（Genewiz, South Plainsfield, NJ）。Geneiousで全てのDNA配列を構築して分析した。
【００８１】
別の態様において、本願は、三重特異性抗体モノマー、多重特異性抗体、抗原結合断片、及びそれらの免疫複合体を含む、医薬組成物を提供する。医薬組成物の製剤化は、当業者に知られている標準的な方法論に従って実施できる。
【００８２】
一実施形態では、本明細書に開示の抗体及びモノマーは、生理学的に許容される製剤で調製することができ、公知の技術を使用して薬学的に許容される担体、希釈剤及び/又は賦形剤を含んでいてもよい。例えば、本明細書に記載の抗体は、機能的に同等な抗体又はその機能的部分を含んでもよく、特に、機能的に等価な抗体又はその機能的部分を含むモノクローナル抗体は、薬学的に許容される担体、希釈剤及び/又は賦形剤と組み合わされて、治療組成物を形成する。
【００８３】
治療を必要とするヒト患者などの対象への投与に適した組成物の製剤に関して、本明細書に開示の抗体は、選択された投与経路に応じて、当技術分野で公知の薬学的に許容される担体と混合又は組み合わせることがしてもよい。本明細書に開示の抗体の適用様式に特定の制限はなく、適切な投与経路及び適切な組成物の選択は、過度の実験なしに当技術分野で知られている。
【００８４】
適切な医薬担体、希釈剤及び/又は賦形剤は当技術分野でよく知られており、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、水、油/水エマルジョンなどのエマルジョンを含む。
【００８５】
「薬学的に許容される」とは、適切な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、又はその他の問題や合併症を伴わずにヒト又は動物の組織と接触に使用するのに適した化合物、材料、組成物、及び剤形で、合理的な利益/リスク比に見合ったものを指す。
【００８６】
一実施形態では、医薬組成物は、例えば、特にヒト起源の、血清アルブミン又は免疫グロブリンなどの蛋白質性担体を含んでもよい。目的の用途に応じて、本明細書に開示の医薬組成物中にさらなる生物学的に活性な薬剤が存在してもよい。一実施形態では、蛋白質性の薬学的活性物質は、1用量あたり1 ng〜10 mgの量で存在してもよい。一般に、投与計画は、本明細書の開示の抗体の0.1μg〜10mgの範囲、特に1.0μg〜1.0mgの範囲、より具体的には1.0μg〜100μgの範囲にすべきであり、これらの範囲内にある個々の数字もすべて開示の一部である。投与が連続注入により行われる場合、より適切な用量は、体重1キログラムあたり1時間あたり0.01μg〜10mg単位の範囲であり、これらの範囲内にある個々の数値もすべて本明細書の開示の一部である。
【００８７】
組成物は、適切な薬学的に有効な用量で、固体、液体又はエアロゾルの形態で対象に投与してもよい。固体組成物の例には、ピル、クリーム、及び移植可能な投与単位を含む。ピルは経口投与してもよい。治療用クリームは局所投与してもよい。移植可能な投与単位は、局所的に、例えば、腫瘍部位に投与されてもよく、又は治療組成物のシステマチックな放出のために、例えば、皮下に移植されてもよい。液体組成物の例には、筋肉内、皮下、静脈内、動脈内への注射に適した製剤、及び局所及び眼内投与用の製剤を含む。エアロゾル製剤の例には、肺への投与用の吸入製剤を含む。
【００８８】
組成物の投与量は、例えば、治療されている状態、使用される特定の組成物、患者の体重、サイズ、性別、一般的な健康状態、体表面積などのその他の臨床的要因、投与される特定の化合物又は組成物、同時に投与される他の薬物、及び投与経路などの様々な要因に依存することが当業者に良く知られている。
【００８９】
「治療有効量」という用語は、ヒト又は動物に投与されたときに、そのヒト又は動物で治療効果をもたらすのに十分な応答を誘発する抗体の量、例えば、対象の病気を改善する量を指す。有効量は、通常の手順に従って当業者により容易に決定される。疾患ががんである場合、有効量の薬は、限定するものではないが、がん細胞の成長、がん細胞の増殖、がん細胞の運動性、末梢器官へのがん細胞の浸潤、腫瘍転移及び腫瘍成長を含む1又は複数の特徴を阻害（例えば、ある程度遅延させる、阻害するか又は止める）してもよい。あるいは、疾患ががんの場合、有効量の薬は、対象に投与されると、腫瘍成長を遅延又は止めること、腫瘍サイズ（例えば、体積又は質量）を低下させること、がんと関連した1又は複数の症状をある程度緩和すること、無増悪生存期間を延長すること、（例えば、部分的反応又は完全反応を含む）客観的反応が得られること、全生存期間を長くすることの1又は複数を成し遂げることがしてもよい。薬は、存在しているがん細胞の成長を防止する及び/又は殺すことができる程度に、細胞増殖抑制性及び/又は細胞毒性である。
【００９０】
当業者は、がんなどの状態を効果的に治療する本願に開示の抗体の有効量又は濃度を決定する能力を有する。当業者は、過度に実験することなく、医薬組成物の様々な成分の割合、投与量及び頻度などの他のパラメーターを得てもよい。例えば、注入に適切な溶液としては、限定するものではないが、約1〜約20、約1〜約10mg抗体/mlであってもよい。例示的な用量としては、限定するものではないが、約0.1〜約20、約1〜約5mg/Kg体重であってもよい。例示的な投与頻度としては、限定するものではないが、1日1回又は週3回であってもよい。
【００９１】
組成物は、標準的な投与経路により投与されてもよい。典型的には、組成物は、局所、経口、直腸、鼻、皮内、腹腔内、又は非経口（例えば、静脈内、皮下、又は筋肉内）経路により投与されてもよい。さらに、組成物は、生分解性ポリマーなどの徐放性マトリックスに組み込まれてもよく、ポリマーは、送達が望まれる場所の近く、例えば、腫瘍の部位に移植される。この方法は、単回投与の投与、所定の時間間隔での反復投与の投与、及び所定の期間の持続投与を含む。
【００９２】
多くの投与形態が可能であるが、例示的な投与形態は、特に静脈内又は動脈内注入に関する溶液注入である。典型的には、注入のための適切な医薬組成物としては、限定するものではないが、バッファー、界面活性剤、又は安定剤などの、医薬的に適切な担体又は賦形剤を含んでもよい。例示的なバッファーとしては、限定するものではないが、酢酸バッファー、リン酸バッファー又はクエン酸バッファーを含んでもよい。例示的な界面活性剤としては、限定するものではないが、ポリソルベートを含んでもよい。例示的な安定剤は、限定するものではないが、ヒトアルブミンを含んでもよい。
【００９３】
一実施形態では、投与は非経口的（例えば、静脈内）であってもよい。非経口投与用の製剤には、無菌の水性又は非水性溶液、懸濁液及びエマルジョンを含む。非水性溶媒は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、オレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルを含むが、これらに限定されない。水性溶媒は、水、アルコール/水溶液、生理食塩水及び緩衝媒体を含むエマルジョン又は懸濁液からなる群から選択されてもよい。非経口ビヒクルは、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液、又は固定油を含む。静脈内ビヒクルは、液体及び栄養補給剤、電解質補給剤（リンガーデキストロースに基づくものなど）などを含む。例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなどの防腐剤が存在してもよい。
【００９４】
抗体モノマー、抗体、抗原結合断片、及びそれらの免疫複合体は、治療目的のために治療薬又は治療薬を含む組成物と組み合わせて使用されてもよい。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体分子は、有効量で1つ以上の追加の治療薬と組み合わせて使用される。追加の治療薬には、抗体、化学療法薬、酵素、又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、追加の治療薬は、抗エストロゲン剤、受容体チロシンキナーゼ阻害剤、キナーゼ阻害剤、細胞周期阻害剤、DNA、RNA、又は蛋白質合成阻害剤、RAS阻害剤、又はそれらの組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、追加の治療薬はチェックポイント阻害剤であり得る。いくつかの実施形態において、治療薬は、PD1、PDL1、CTLA4、4-1BB、OX40、GITR、ICOS、LIGHT、TIM3、LAG3、TIGIT、CD40、CD27、HVEM、BTLA、VISTA、B7H4、CSF1R、NKG2D、CD73、それらの誘導体又は組み合わせの阻害剤を含む。
【００９５】
一実施形態では、治療薬はカペシタビン、シスプラチン、シクロホスファミド、メトトレキサート、5-フルオロウラシル、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ムスチン、ビンクリスチン、プロカルバジン、プレドニゾロン、ブレオマイシン、ビンブラスチン、ダカルバジン、エトポシド、エピルビシン、ペメトレキセド、フォリン酸、ゲミシタビン、オキサリプラチン、イリノテカン、トポテカン、カンプトテシン、ドセタキセル、パクリタキセル、フルベストラント、タモキシフェン、レトロゾール、エキセメスタン、アナストロゾール、アミノグルテチミド、テストラクトン、ボロゾール、フォルメスタン、ファドロゾール、エルロチニブ、ラファチニブ、ダサチニブ、ゲフィチニブ、オシメルチニブ、ヴァンダータニブ、アファチニブ、イマチニブ、パゾピニブ、ラパチニブ、スニチニブ、ニロチニブ、ソラフェニブ、ナブ-パリタキセル、エベロリムス、テムシロリムス、ダブラフェニブ、ベムラフェニブ、トラメチニブ、ビンタフォリド、アパチニブ、クリゾチニブ、ペリフォルシン、オラパリブ、ボルテゾミブ、トファシチニブ、トラスツズマブ、それらの誘導体又は組み合わせであってもよい。
【００９６】
乳がん、大腸がん、膵臓がん、頭頸部がん、メラノーマ、卵巣がん、前立腺がん、非小細胞肺がん、神経膠腫、食道がん、鼻咽頭がん、肛門がん、直腸がん、胃がん、膀胱がん、子宮頸がん、又は脳がんを含むがんは、がん関連遺伝子で発現してもよい。特定のモノクローナル抗体又は抗原結合断片によるがん関連活性の阻害は、がんに対する治療効果をもたらしてもよい。さらに、がん関連蛋白質に特異的なモノクローナル抗体又は抗原結合断片を含む治療有効量の組成物を投与すると、細胞毒性剤の効果により、がんの発生又は転移を治癒、予防、改善、及び遅延させ得る。
【００９７】
本明細書の開示は、本明細書に含まれる特定の実施形態及び実施例の以下の詳細な説明を参照することにより、より容易に理解されてもよい。本明細書の開示は、その特定の実施形態の特定の詳細を参照して説明されたが、そのような詳細な説明は、開示の範囲に対する限定とみなされるべきではない。
【実施例】
【００９８】
実施例1：ROR1発現CHO細胞に結合する三重特異性抗体のFACS分析
表1及び2にリストされている三重特異性抗体について、全長ヒトROR1を安定して発現するチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞への結合を試験した。抗体を2X最終濃度で調製し、50ulのPBS/2％FBSの96ウェルプレートの8ウェルで1：3で滴定し、そして、50ul PBS/2％FBS中の5,000 ROR1-CHO細胞を加えた。この混合物を氷上で30分間インキュベートし、200ul PBS/2％FBSで1回洗浄し、そして、ストックの1：1000希釈の二次抗体PEヤギ抗ヒトIgG Fcを加え、この混合物を氷上で30分間インキュベートした。細胞を2 x 200 ul PBS/2％FBSで洗浄し、50 ul PBS/2％FBSに再懸濁し、BD LSRFORTESSAで分析した。結合プロファイルを図4に示す。ROR1結合ドメインを含む全ての三重特異性抗体は、さまざまなレベルでCHO-ROR1細胞に結合した。
【００９９】
実施例2：PD-L1発現CHO細胞に結合する三重特異性抗体のFACS分析
表1及び2にリストされている三重特異性抗体について、全長ヒトPD-L1を安定して発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO）細胞への結合を試験した。抗体を2X最終濃度で調製し、50 ulのPBS/2％FBSの96ウェルプレートの8ウェルで1：3で滴定し、そして、50ul PBS/2％FBS中の5,000 PD-L1-CHO細胞を加えた。この混合物を氷上で30分間インキュベートし、200ul PBS/2％FBSで1回洗浄し、そして、ストックの1：1000希釈の二次抗体PEヤギ抗ヒトIgG Fcを加え、この混合物を氷上で30分間インキュベートした。細胞を2 x 200 ul PBS/2％FBSで洗浄し、50 ul PBS/2％FBSに再懸濁し、BD LSRFORTESSAで分析した。結合プロファイルを図5に示す。PD-L1結合ドメインを含む全ての三重特異性抗体は、類似のレベルでCHO-PD-L1細胞に結合した。
【０１００】
実施例3：エフェクターとしてのCD3+ T細胞及び標的としてのB-急性リンパ芽球性白血病（B-ALL）細胞株カスミ-2を用いたリダイレクトT細胞細胞傷害性（RTCC）アッセイ
表1及び2にリストされている三重特異性抗体について、エフェクターとしてヒトCD3+ T細胞を使用して、B-ALL細胞株カスミ2に対するRTCC活性を試験した。5x10e6のカスミ2標的細胞を、10 mlの培地で0.5 uMのCFSE（Invitrogen、#C34554）で37℃で20分間標識した。細胞を50mlの培地で3回洗浄した後、10mlに再懸濁し再カウントした。抗体を4X最終濃度で調製し、200 ulのRPMI+10％FBSの96ウェルプレートの10ウェルで1:10に滴定した。製造元のプロトコルに従って、EasySepTMヒトT細胞濃縮キット（Stemcell Technologies、#19051）を使用して、正常ドナーの末梢血単核細胞からヒトCD3+ T細胞を濃縮した。最終細胞集団を、FACS分析により98％のCD3 + T細胞であると決定した（データ非表示）。最終の96ウェルプレートで、100 ulの標的細胞（5,000）、50 ulのCD3+ T細胞（50,000）、及び50 ulの各抗体希釈液をアッセイの各ウェルに加えることにより、標的細胞、T細胞、及び連続滴定抗体を組み合わせた。アッセイプレートを37℃で約72時間インキュベートした後、各アッセイウェルの内容物を回収し、残っているCFSE標識標的細胞の数について分析した。図6に示すように、ROR1結合ドメインを含む全ての三重特異性抗体は、CD3+ T細胞に結合しないFITC結合ドメインをC末端ドメイン3の位置に有する対照SI-27X62を除き、0.01 nM又は10 pM未満で標的細胞を強力に死滅させた。
【０１０１】
実施例4：エフェクターとしてのCD4+制御性T細胞及び標的としてのB-急性リンパ芽球性白血病（B-ALL）細胞株カスミ-2を用いたリダイレクトT細胞細胞傷害性（RTCC）アッセイ。
表1及び2にリストされている三重特異性抗体について、エフェクターとしてヒトCD4+制御性T細胞を使用して、B-ALL細胞株カスミ2に対するRTCC活性について試験した。5x10e6のカスミ2標的細胞を、10 mlの培地で0.5 uMのCFSE（Invitrogen、＃C34554）で37℃で20分間標識した。細胞を50mlの培地で3回洗浄した後、10mlに再懸濁し再カウントした。抗体を4X最終濃度で調製し、200 ulのRPMI+10％FBSの96ウェルプレートの10ウェルで1:10に滴定した。製造元のプロトコルに従って、EasySepTMヒトCD4+ CD127lowCD25+制御性T細胞単離Kit（Stemcell #18063）を使用して、ヒトCD4+制御性T細胞を生成した。濃縮された制御性T細胞をMiltenyi CD3/CD28活性化ビーズ（#-130-095-353）を使用して刺激し、5％のヒト血清と500U/mlの組換えヒトIL-2（Peprotech #200-02）を添加した完全RPMIで14日間培養した。制御性T細胞の最終集団は、FACSにより90％以上のCD127low CD25++であると分析された（データ非表示）。最終の96ウェルプレートで、100 ulの標的細胞（5,000）、50 ulのCD4+制御性T細胞（50,000）、及び50 ulの各抗体希釈液をアッセイの各ウェルに加えることにより、標的細胞、T細胞、及び連続滴定抗体を組み合わせた。アッセイプレートを37℃で約72時間インキュベートした後、各アッセイウェルの内容物を回収し、残っているCFSE標識標的細胞の数について分析した。図7に示すように、ROR1結合ドメインを含む全ての三重特異性抗体は、CD3+ T細胞に結合しないFITC結合ドメインをC末端ドメイン3の位置に有する対照SI-27X62を除き、0.1 nM又は100 pM未満で標的細胞を強力に死滅させた。
【０１０２】
実施例5：エフェクターとして「疲弊」CD8+T細胞及び標的としてB-急性リンパ芽球性白血病（B-ALL）細胞株カスミ-2を用いたリダイレクトT細胞細胞傷害性（RTCC）アッセイ
表1及び2に記載されている三重特異性抗体について、エフェクターとして「疲弊」ヒトCD8+T細胞を使用して、B-ALL細胞株カスミ2に対するRTCC活性を試験した。5x10e6のカスミ2標的細胞を、10 mlの培地で0.5 uMのCFSE（Invitrogen、#C34554）で37℃で20分間標識した。細胞を50mlの培地で3回洗浄した後、10mlに再懸濁し再カウントした。抗体を4X最終濃度で調製し、200 ulのRPMI+10％FBSの96ウェルプレートの10ウェルで1:10に滴定した。製造元のプロトコルに従って、EasySepTMヒトCD8+T細胞濃縮キット（Stemcell #19053）を使用して、ヒトCD8+T細胞を濃縮した。濃縮CD8+T細胞をMiltenyi CD3/CD28活性化ビーズ（#-130-095-353）を使用して刺激し、5％ヒト血清と500U/ml組換えヒトIL-2（Peprotech #200）を添加した完全RPMIで7日間培養した。疲弊CD8+T細胞の最終集団は、FACSにより疲弊のいくつかのマーカー、例えば、PD-1、TIGIT、TIM-3、LAG-3を発現する95％を超えるCD8+細胞であることが分析された（データ非表示）。最終の96ウェルプレートで、100 ulの標的細胞（5,000）、50 ulの疲弊CD8+T細胞（50,000）、及び50 ulの各抗体希釈液をアッセイの各ウェルに加えることにより、標的細胞、T細胞、及び連続滴定抗体を組み合わせた。アッセイプレートを37℃で約72時間インキュベートした後、各アッセイウェルの内容物を回収し、残っているCFSE標識標的細胞の数について分析した。図8に示すように、338H4 ROR1結合ドメインを含む三重特異性抗体は、0.1 nM又は100 pM未満で標的細胞を強力に死滅させ、一方、R11又は323H7 ROR1結合ドメインを持つ抗体は、標的細胞を弱く死滅させ、CD3+T細胞に結合しないC末端ドメイン3の位置にFITC結合ドメインを有する対照SI-27X62は、ネガティブな殺傷活性を示した。
【０１０３】
実施例6：エフェクターとして末梢血単核細胞及び標的として表皮成長因子viii（EGFRviii）変異体をトランスフェクトしたU87ヒトグリオブラストーマ細胞株を用いたリダイレクトT細胞細胞傷害（RTCC）アッセイ
表1及び2に記載されている三重特異性抗体について、エフェクターとしてヒトPBMCを使用して、U87-EGFRviii細胞株に対するRTCC活性を試験した。U87-EGFR viiiにNucLight Redレンチウィルス（IncuCyte(R)）を導入して、蛍光mKate2蛋白質を安定して発現する細胞株を作成した（Shcherbo et al., 2009, J. Biochem, 418(3): 567-574）。抗体を4X最終濃度で調製し、200ulのRPMI+10％FBSの96ウェルプレートの3ウェルで1:10に滴定した。ヒトPBMCを、正常なヒト末梢血から収集された濃縮白血球除去製品である「ロイコパック」からの標準フィコール密度勾配により精製した。最終の96ウェルプレートで、100ulの標的細胞（5,000）、50ulのPBMC（200,000）、及び50ulの各抗体希釈液をアッセイの各ウェルに加えることにより、標的細胞、PBMC、及び連続滴定抗体を組み合わせた。アッセイプレートを37℃で約72時間インキュベートした後、各アッセイウェルの内容物を回収し、残っているNucLight Red標的細胞の数について分析した。図9に示すように、PL230 x 806 x 480C8の構成を持つ三重特異性分子のセットは、10pM以上の抗体で標的細胞を強力に死滅させた。PD-L1結合ドメインPL230C6を含まない対照抗体SI-37X3 FITC x 806 x 480C8も標的細胞を強力に死滅させたが、PD-L1結合ドメインを有する三重特異性抗体SI-37X1 PL230C6 x 806 x 480C8よりもわずかに低い効能であった。EGFRviii結合ドメイン806を含まない対照の三重特異性抗体SI-27X109 PL230C6 x FITC x 480C8は、標的細胞の非常に弱い死滅を示し、CD3結合ドメイン480C8を含まない対照の三重特異性抗体SI-37X4 PL230C6 x 806 x FITCは、標的細胞の無視できるほどの殺滅を示した。図10に示すように、806 x PL230C6 x 480C8の構成を有する三重特異性分子のセットは、10pM以上の抗体で標的細胞の強力な死滅を示し、三重特異性抗体SI-37X2 806 x PL230C6 x 480C8は三重特異性の3つの位置のそれぞれにFITC結合ドメインがある3つの対照三重特異性抗体よりも強力であった。
【０１０４】
実施例7：エフェクターとしてPBMC細胞及び標的としてCD19陽性B急性リンパ芽球性白血病細胞株カスミ-2を用いたリダイレクトT細胞細胞傷害性アッセイ
表1及び2に記載されている三重特異性抗体について、エフェクターとしてPBMCを使用して、B-ALL細胞株カスミ2に対するRTCC活性を試験した。5x10e6のカスミ2標的細胞を、10mlの培地中の0.5uMのCFSE（Invitrogen、#C34554）で37℃で20分間標識した。細胞を50mlの培地で3回洗浄した後、10mlに再懸濁し再カウントした。抗体を4X最終濃度で調製し、200ulのRPMI+10％FBSの96ウェルプレートの10ウェルで1:10に滴定した。ヒトPBMCを、正常なヒト末梢血から収集された濃縮白血球除去製品である「ロイコパック」からの標準フィコール密度勾配により精製した。最終の96ウェルプレートで、100ulの標的細胞（5,000）、50ulのPBMC（50,000）、及び50ulの各抗体希釈液をアッセイの各ウェルに加えることにより、標的細胞、T細胞、及び連続滴定抗体を組み合わせた。アッセイプレートを37℃で約72時間インキュベートした後、各アッセイウェルの内容物を回収し、残っているCFSE標識標的細胞の数について分析した。図10に示すように、三重特異性の3つの位置のそれぞれにFITC結合ドメインがある3つの対照の三重特異性抗体と比較して、三重特異性抗体SI34X2 21D4 x PL230C6 x 480C8は0.01 nM未満で標的細胞を強力に死滅させた。
【０１０５】
本明細書の開示は、特定の実施形態又は実施例を参照して説明されたが、実施形態は例示であり、開示範囲はそのように限定されないことが理解されてもよい。本明細書の開示の代替の実施形態は、本明細書の開示が関係する当業者に明らかになり得る。そのような代替実施形態は、本明細書の開示の範囲内に包含されると見なされる。従って、本明細書の開示の範囲は、添付の特許請求の範囲によって定義され、前述の説明によってサポートされている。本明細書の開示において引用又は言及された全ての参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０６】
配列表
抗体の相補性決定領域（CDR）は、KABAT番号付けシステムを使用して定義され、以下のアミノ酸（aa）配列リスト中で下線が引かれている。
軽鎖  CDR1: 残基24-34
CDR2: 残基50-56
CDR3: 残基89-97
重鎖  CDR1: 残基31-35
CDR2: 残基50-65
CDR3: 残基95-102
> 配列番号1
抗ROR1 R11 VH nt
CAGTCCGTGAAGGAGTCCGAGGGCGACCTGGTGACCCCCGCCGGCAACCTGACCCTGACCTGCACCGCCTCCGGCTCCGACATCAACGACTACCCCATCTCCTGGGTGCGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTTCATCAACTCCGGCGGCTCCACCTGGTACGCCTCCTGGGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGGACCTCCACCACCGTGGACCTGAAGATGACCTCCCTGACCACCGACGACACCGCCACCTACTTCTGCGCCCGGGGCTACTCCACCTACTACGGCGACTTCAACATCTGGGGCCCCGGCACCCTGGTGACCATCTCCTCG
> 配列番号2
抗ROR1 R11 VH aa
QSVKESEGDLVTPAGNLTLTCTASGSDINDYPISWVRQAPGKGLEWIGFINSGGSTWYASWVKGRFTISRTSTTVDLKMTSLTTDDTATYFCARGYSTYYGDFNIWGPGTLVTISS
> 配列番号3
抗ROR1 R11 VL nt
GAGCTGGTGATGACCCAGACCCCCTCCTCCACCTCCGGCGCCGTGGGCGGCACCGTGACCATCAACTGCCAGGCCTCCCAGTCCATCGACTCCAACCTGGCCTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCCACCCTGCTGATCTACCGGGCCTCCAACCTGGCCTCCGGCGTGCCCTCCCGGTTCTCCGGCTCCCGGTCCGGCACCGAGTACACCCTGACCATCTCCGGCGTGCAGCGGGAGGACGCCGCCACCTACTACTGCCTGGGCGGCGTGGGCAACGTGTCCTACCGGACCTCCTTCGGCGGCGGCACCGAGGTGGTGGTGAAG
> 配列番号4
抗ROR1 R11 VL aa
ELVMTQTPSSTSGAVGGTVTINCQASQSIDSNLAWFQQKPGQPPTLLIYRASNLASGVPSRFSGSRSGTEYTLTISGVQREDAATYYCLGGVGNVSYRTSFGGGTEVVVK
> 配列番号5
抗ROR1 323H7 VHv4 nt
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCATCAGTCGCTACCACATGACTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGGACATATTTATGTTAATAATGATGACACAGACTACGCGAGCTCCGCGAAAGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCGAGATTGGATGTTGGTGGTGGTGGTGCTTATATTGGGGACATCTGGGGCCAGGGAACTCTGGTTACCGTCTCTTCA
> 配列番号6
抗ROR1 323H7 VHv4 aa
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTISRYHMTWVRQAPGKGLEWIGHIYVNNDDTDYASSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTATYFCARLDVGGGGAYIGDIWGQGTLVTVSS
> 配列番号7
抗ROR1 323H7 VLv1 nt
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGTCCAGTCAGAGTGTTTATAACAACAACGACTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGTTCCTAAGCTCCTGATCTATTATGCTTCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCTCGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTGCAGGCGGTTATGATACGGATGGTCTTGATACGTTTGCTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
> 配列番号8
抗ROR1 323H7 VLv1 aa
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSQSVYNNNDLAWYQQKPGKVPKLLIYYASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCAGGYDTDGLDTFAFGGGTKVEIK
> 配列番号9
抗ROR1 338H4 VHv3 nt
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTACTGCCTCTGGATTCTCCCTCAGTAGCTATGCAATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAGGGGGCTGGAGTGGATCGGAATCATTTATGCTAGTGGTAGCACATACTACGCGAGCTCGGCGAAAGGCAGATTCACCATCTCCAAAGACAATACCAAGAACACGGTGGATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAATTTATGACGGCATGGACCTCTGGGGCCAGGGAACTCTGGTTACCGTCTCTTCA
> 配列番号10
抗ROR1 338H4 VHv3 aa
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLSSYAMSWVRQAPGRGLEWIGIIYASGSTYYASSAKGRFTISKDNTKNTVDLQMNSLRAEDTAVYYCARIYDGMDLWGQGTLVTVSS
> 配列番号11
抗ROR1 338H4 VLv4 nt
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCAATTGCCAGGCCAGTCAGAACATTTACAGCTACTTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGTTCCTAAGCGCCTGATCTATCTGGCATCTACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCTCGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTACACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCAAAGCAATTATAACGGTAATTATGGTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
> 配列番号12
抗ROR1 338H4 VLv4 aa
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQNIYSYLSWYQQKPGKVPKRLIYLASTLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDVATYYCQSNYNGNYGFGGGTKVEIK
>配列番号13 
抗PD-L1 PL230C6 VHv3 nt
CAGTCGGTGGAGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTACAGCCTCTGGAATCGACCTTAATACCTACGACATGATCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTAGAGTGGGTTGGAATCATTACTTATAGTGGTAGTAGATACTACGCGAACTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAGACAATACCAAGAACACGGTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCCAGAGATTATATGAGTGGTTCCCACTTGTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCTAGT
>配列番号14 
抗PD-L1 PL230C6 VHv3 aa
QSVEESGGGLVQPGGSLRLSCTASGIDLNTYDMIWVRQAPGKGLEWVGIITYSGSRYYANWAKGRFTISKDNTKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARDYMSGSHLWGQGTLVTVSS
>配列番号15 
抗PD-L1 PL230C6 VLv2 nt
GCCTATGATATGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCAAGTGTCAGGCCAGTGAGGACATTTATAGCTTCTTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCCATTCTGCATCCTCTCTGGCATCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTACTATTGTCAACAGGGTTATGGTAAAAATAATGTTGATAATGCTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
>配列番号16 
抗PD-L1 PL230C6 VLv2 aa
AYDMTQSPSSVSASVGDRVTIKCQASEDIYSFLAWYQQKPGKAPKLLIHSASSLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGYGKNNVDNAFGGGTKVEIK
>配列番号17 
抗CD3 I2C VH nt
CAGGTGCAATTGGTGGAAAGCGGAGGGGGACTGGTGCAGCCCGGGGGAAGTCTGAAGCTGTCCTGTGCCGCCAGCGGCTTTACCTTCAACAAGTACGCCATGAATTGGGTCCGACAGGCCCCAGGGAAAGGCCTGGAATGGGTGGCACGGATTCGGTCCAAGTACAACAACTACGCCACCTACTACGCTGACTCCGTGAAGGACAGATTCACCATCAGCCGGGACGACTCTAAGAACACCGCCTATCTGCAGATGAACAACCTGAAAACCGAGGATACAGCTGTGTACTATTGTGTGCGGCACGGCAACTTCGGCAACTCCTACATCTCCTACTGGGCCTATTGGGGACAGGGAACACTGGTCACCGTGTCTAGC
>配列番号18 
抗CD3 I2C VH aa
QVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVSS
>配列番号19 
抗CD3 I2C VL nt
CAGACCGTGGTCACCCAGGAACCTTCCCTGACCGTCTCCCCAGGCGGCACCGTGACCCTGACCTGTGGCTCCTCTACCGGCGCTGTGACCTCCGGCAACTACCCTAACTGGGTGCAGCAGAAACCCGGACAGGCTCCTAGAGGCCTGATCGGCGGCACCAAGTTTCTGGCCCCTGGCACCCCTGCCAGATTCTCCGGCTCCCTGCTGGGAGGCAAGGCCGCTCTGACCCTGTCTGGCGTGCAGCCTGAGGACGAGGCCGAGTACTACTGTGTGCTGTGGTACTCCAACAGATGGGTGTTCGGAGGCGGCACAAAGCTGACCGTGCTGTCCTCG
>配列番号20 
抗CD3 I2C VL aa
QTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVLSS
>配列番号21 
抗CD3 284A10 VHv1 nt
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCATCAGTACCAATGCAATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGGAGTCATTACTGGTCGTGATATCACATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCAGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGCGCGACGGTGGATCATCTGCTATTACTAGTAACAACATTTGGGGCCAAGGAACTCTGGTCACCGTTTCTTCA
>配列番号22 
抗CD3 284A10 VHv1 aa
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTISTNAMSWVRQAPGKGLEWIGVITGRDITYYASWAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGGSSAITSNNIWGQGTLVTVSS
>配列番号23 
抗CD3 284A10 VLv1 nt
GACGTCGTGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCAATTGCCAAGCCAGTGAGAGCATTAGCAGTTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGAAGCATCCAAACTGGCATCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTACTGCCAAGGCTATTTTTATTTTATTAGTCGTACTTATGTAAATTCTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
>配列番号24 
抗CD3 284A10 VLv1 aa
DVVMTQSPSTLSASVGDRVTINCQASESISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYEASKLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQGYFYFISRTYVNSFGGGTKVEIK
>配列番号25 
抗CD3 299F6 VHv2 nt
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTACGGCCTCTGGATTCACCATCAGTAGCAATGCAATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGGAGTCATTACTGGTCGTGATATCACATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCAGATTCACCATCTCCAAAGACACCTCCAAGAACACGGTGGATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGCGCGACGGTGGATCATCTGCTATTACTAGTAACAACATTTGGGGCCAAGGAACTCTGGTCACCGTTTCTTCA
>配列番号26 
抗CD3 299F6 VHv2 aa
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTISSNAMSWVRQAPGKGLEWIGVITGRDITYYASWAKGRFTISKDTSKNTVDLQMNSLRAEDTAVYYCARDGGSSAITSNNIWGQGTLVTVSS
>配列番号27
抗CD3 299F6 VLv1 nt
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAAGCCAGTGAGAGCATTAGCAGTTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGAAGCATCCAAACTGGCATCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTACTGCCAAGGCTATTTTTATTTTATTAGTCGTAGTTATGTAAATGCTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
>配列番号28 
抗CD3 299F6 VLv1 aa
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASESISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYEASKLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQGYFYFISRSYVNAFGGGTKVEIK
>配列番号29 
抗CD3 480C8 VHv1 nt
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGAATCGACCTCAGTAGCAATGCAATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGGAGTCATTACTGGTCGTGATATCACATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCAGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGCGCGACGGTGGATCATCTGCTATTAATAGTAAGAACATTTGGGGCCAAGGAACTCTGGTCACCGTTTCTTCA
>配列番号30 
抗CD3 480C8 VHv1 aa
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGIDLSSNAMSWVRQAPGKGLEWIGVITGRDITYYASWAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGGSSAINSKNIWGQGTLVTVSS
>配列番号31 
抗CD3 480C8 VHv2 nt
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTACGGCCTCTGGAATCGACCTCAGTAGCAATGCAATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAAGGGCTGGAGTGGATCGGAGTCATTACTGGTCGTGATATCACATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCAGATTCACCATCTCCAAAGACACCTCCAAGAACACGGTGGATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGCGCGACGGTGGATCATCTGCTATTAATAGTAAGAACATTTGGGGCCAAGGAACTCTGGTCACCGTTTCTTCA
>配列番号32 
抗CD3 480C8 VHv2 aa
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGIDLSSNAMSWVRQAPGKGLEWIGVITGRDITYYASWAKGRFTISKDTSKNTVDLQMNSLRAEDTAVYYCARDGGSSAINSKNIWGQGTLVTVSS
>配列番号33 
抗CD3 480C8 VLv1 nt
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAAGCCAGTGAGAGCATTAGCAGTTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGAAGCATCCAAACTGGCATCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTACTGCCAAGGCTATTTTTATTTTATTAGTCGTACTTATGTAAATGCTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
>配列番号34 
抗CD3 480C8 VLv1 aa
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASESISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYEASKLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQGYFYFISRTYVNAFGGGTKVEIK
>配列番号35 
抗FITC 4-4-2- (4420) VH nt
GAGGTGAAGCTGGATGAGACTGGAGGAGGCTTGGTGCAACCTGGGAGGCCCATGAAACTCTCCTGTGTTGCCTCTGGATTCACTTTTAGTGACTACTGGATGAACTGGGTCCGCCAGTCTCCAGAGAAAGGACTGGAGTGGGTAGCACAAATTAGAAACAAACCTTATAATTATGAAACATATTATTCAGATTCTGTGAAAGGCAGATTCACCATCTCAAGAGATGATTCCAAAAGTAGTGTCTACCTGCAAATGAACAACTTAAGAGTTGAAGACATGGGTATCTATTACTGTACGGGTTCTTACTATGGTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
>配列番号36 
抗FITC 4-4-2- (4420) VH aa
EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYETYYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDYWGQGTSVTVSS
>配列番号37 
抗FITC 4-4-2- (4420) VL nt
GATGTCGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTACGTTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGGTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAAGTACACATGTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA
>配列番号38 
抗FITC 4-4-2- (4420) VL aa
DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLRWYLQKPGQSPKVLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPWTFGGGTKLEIK
>配列番号39 
抗EGFRvIII mAb 806 VH nt
GATGTGCAGCTTCAGGAGTCGGGACCTAGCCTGGTGAAACCTTCTCAGTCTCTGTCCCTCACCTGCACTGTCACTGGCTACTCAATCACCAGTGATTTTGCCTGGAACTGGATTCGGCAGTTTCCAGGAAACAAGCTGGAGTGGATGGGCTACATAAGTTATAGTGGTAACACTAGGTACAACCCATCTCTCAAAAGTCGAATCTCTATCACTCGCGACACATCCAAGAACCAATTCTTCCTGCAGTTGAACTCTGTGACTATTGAGGACACAGCCACATATTACTGTGTAACGGCGGGACGCGGGTTTCCTTATTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA
>配列番号40 
抗EGFRvIII mAb 806 VH aa
DVQLQESGPSLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDFAWNWIRQFPGNKLEWMGYISYSGNTRYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTIEDTATYYCVTAGRGFPYWGQGTLVTVSA
>配列番号41 
抗EGFRvIII mAb 806 VL nt
GACATCCTGATGACCCAATCTCCATCCTCCATGTCTGTATCTCTGGGAGACACAGTCAGCATCACTTGCCATTCAAGTCAGGACATTAACAGTAATATAGGGTGGTTGCAGCAGAGACCAGGGAAATCATTTAAGGGCCTGATCTATCATGGAACCAACTTGGACGATGAAGTTCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGAGCCGATTATTCTCTCACCATCAGCAGCCTGGAATCTGAAGATTTTGCAGACTATTACTGTGTACAGTATGCTCAGTTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA
>配列番号42 
抗EGFRvIII mAb 806 VL aa
DILMTQSPSSMSVSLGDTVSITCHSSQDINSNIGWLQQRPGKSFKGLIYHGTNLDDEVPSRFSGSGSGADYSLTISSLESEDFADYYCVQYAQFPWTFGGGTKLEIK
>配列番号43 
抗CD19 21D4 VH nt
GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCAGAGGTGAAGAAACCAGGAGAGTCTCTGAAGATCTCCTGTAAGGGTTCTGGATACAGCTTTAGCAGTTCATGGATCGGCTGGGTGCGCCAGGCACCTGGGAAAGGCCTGGAATGGATGGGGATCATCTATCCTGATGACTCTGATACCAGATACAGTCCATCCTTCCAAGGCCAGGTCACCATCTCAGCCGACAAGTCCATCAGGACTGCCTACCTGCAGTGGAGTAGCCTGAAGGCCTCGGACACCGCTATGTATTACTGTGCGAGACATGTTACTATGATTTGGGGAGTTATTATTGACTTCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
>配列番号44 
抗CD19 21D4 VH aa
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFSSSWIGWVRQAPGKGLEWMGIIYPDDSDTRYSPSFQGQVTISADKSIRTAYLQWSSLKASDTAMYYCARHVTMIWGVIIDFWGQGTLVTVSS
>配列番号45 
抗CD19 21D4 VL nt
GCCATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAGCAGTGCTTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCTCCTAAGCTCCTGATCTATGATGCCTCCAGTTTGGAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGTTTAATAGTTACCCATTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAA
>配列番号46 
抗CD19 21D4 VL aa
AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSALAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPFTFGPGTKVDIK
>配列番号47 
ヒトIgG1ヌル(ADCC/CDCヌル変異を有すG1m-fa) nt
GCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGCGGGGGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCGCGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
>配列番号48
ヒトIgG1ヌル(ADCC/CDCヌル変異を有すG1m-fa) aa
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
>配列番号49 
ヒトIgカッパnt
CGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
>配列番号50 
ヒトIgカッパaa
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
>配列番号51 
SI-27X63 (323H7-L1H4-scFv x PL230C6-H3-Fab x 284A10-H1L1-scFv)重鎖nt
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGTCCAGTCAGAGTGTTTATAACAACAACGACTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGTTCCTAAGCTCCTGATCTATTATGCTTCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCTCGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTGCAGGCGGTTATGATACGGATGGTCTTGATACGTTTGCTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAAGGCGGTGGCGGTAGTGGGGGAGGCGGTTCTGGCGGCGGAGGGTCCGGCGGTGGAGGATCAGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCATCAGTCGCTACCACATGACTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGGACATATTTATGTTAATAATGATGACACAGACTACGCGAGCTCCGCGAAAGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCGAGATTGGATGTTGGTGGTGGTGGTGCTTATATTGGGGACATCTGGGGCCAGGGAACTCTGGTTACCGTCTCTTCAGGCGGTGGAGGGTCCGGCGGTGGTGGATCCCAGTCGGTGGAGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTACAGCCTCTGGAATCGACCTTAATACCTACGACATGATCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTAGAGTGGGTTGGAATCATTACTTATAGTGGTAGTAGATACTACGCGAACTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAGACAATACCAAGAACACGGTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCCAGAGATTATATGAGTGGTTCCCACTTGTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCTAGTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGCGGGGGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCGCGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTATACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTGGCGGTGGAGGGTCCGGCGGTGGTGGATCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCATCAGTACCAATGCAATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGGAGTCATTACTGGTCGTGATATCACATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCAGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGCGCGACGGTGGATCATCTGCTATTACTAGTAACAACATTTGGGGCCAAGGAACTCTGGTCACCGTTTCTTCAGGCGGTGGCGGTAGTGGGGGAGGCGGTTCTGGCGGCGGAGGGTCCGGCGGTGGAGGATCAGACGTCGTGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCAATTGCCAAGCCAGTGAGAGCATTAGCAGTTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGAAGCATCCAAACTGGCATCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTACTGCCAAGGCTATTTTTATTTTATTAGTCGTACTTATGTAAATTCTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
>配列番号52 
SI-27X63 (323H7-L1H4-scFv x PL230C6-H3-Fab x 284A10-H1L1-scFv)重鎖aa
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSQSVYNNNDLAWYQQKPGKVPKLLIYYASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCAGGYDTDGLDTFAFGGGTKVEIK (抗ROR1 323H7 VLv1)
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (Gly4Ser)x4リンカー
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTISRYHMTWVRQAPGKGLEWIGHIYVNNDDTDYASSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTATYFCARLDVGGGGAYIGDIWGQGTLVTVSS (抗ROR1 323H7 VHv4)
GGGGSGGGGS (Gly4Ser)x2リンカー
QSVEESGGGLVQPGGSLRLSCTASGIDLNTYDMIWVRQAPGKGLEWVGIITYSGSRYYANWAKGRFTISKDNTKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARDYMSGSHLWGQGTLVTVSS (抗PD-L1 PL230C6 VHv3)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (ヒトIgG1ヌル)
GGGGSGGGGS (Gly4Ser)x2リンカー
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTISTNAMSWVRQAPGKGLEWIGVITGRDITYYASWAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGGSSAITSNNIWGQGTLVTVSS (抗CD3 284A10 VHv1)
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (Gly4Ser)x4リンカー
DVVMTQSPSTLSASVGDRVTINCQASESISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYEASKLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQGYFYFISRTYVNSFGGGTKVEIK (抗CD3 284A10 VLv1)
>配列番号53 
SI-27X63 (323H7-L1H4-scFv x PL230C6-H3-Fab x 284A10-H1L1-scFv)軽鎖nt
GCCTATGATATGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCAAGTGTCAGGCCAGTGAGGACATTTATAGCTTCTTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCCATTCTGCATCCTCTCTGGCATCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTACTATTGTCAACAGGGTTATGGTAAAAATAATGTTGATAATGCTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
>配列番号54 
SI-27X63 (323H7-L1H4-scFv x PL230C6-H3-Fab x 284A10-H1L1-scFv)軽鎖aa
AYDMTQSPSSVSASVGDRVTIKCQASEDIYSFLAWYQQKPGKAPKLLIHSASSLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGYGKNNVDNAFGGGTKVEIK (抗PD-L1 PL230C6 VLv2)
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (ヒトIgカッパ)
【図１】
2020529864.tif 000003
【図２】
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【図３】
2020529864.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
2020529864000001.app
【国際調査報告】
2020529864.tif 000014
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