(57)【要約】  誘導ラマン顕微鏡法から増強された像を提供するためにポリインを使用する光学的超多重化方法が開示される。いくつかの例示の実施形態では、上記ポリインは、小器官を標的とするものであるか、又はスペクトル的にバーコード化されたものである。イメージングは、上記ポリインを使用して生細胞全体又は生細胞内の特定の小器官をイメージングすることにより増強されることが可能である。このポリインは、光学的データ記憶（すなわち、符号化）及び特定（すなわち、復号化）への応用例でも使用することができる。【選択図】図１５
2020532497.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２〜約２００の下記式を有するポリインを含むライブラリーであって、
【化１】
2020532497.tif 000063
上記式中、ｎは１〜１９の整数であり、
Ｒ１及びＲ２は、独立に、アリール、Ｃ１〜２０アルキル、トリアルキルシリル、アリールジアルキルシリル、ジアリールアルキルシリル、金属、金属錯体、アリール−Ｃ１〜２０アルキル、Ｃ１〜２０アルキル−アリール、ヘテロアリール、ヘテロアリール−Ｃ１〜２０アルキル又はＣ１〜２０アルキル−ヘテロアリールであり、これらの基の各々は、任意に１以上の置換基で置換されていてもよく、
これらの基における水素のうちの１以上は、任意に重水素化されていてもよく、
前記アルキン部分における炭素のうちの１以上は、任意に１３Ｃ標識されていてもよく、
前記アリール、Ｃ１〜２０アルキル、アリール−Ｃ１〜２０アルキル、Ｃ１〜２０アルキル−アリール、ヘテロアリール、ヘテロアリール−Ｃ１〜２０アルキル又はＣ１〜２０アルキル−ヘテロアリール基のうちの１以上にある前記置換基は、蛍光標識、抗原、抗体、抗体断片、抗体模倣体、ペプチド、タンパク質、核酸、脂質、炭水化物、ビオチン、ストレプトアビジン、アビジン、抗ビオチン、葉酸、葉酸結合タンパク質、ＩｇＧ、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、炭水化物、レクチン、脂質、核酸、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシル、カルボキシル、アシル、アリール、アシルオキシ、アミノ、アミド、カルボキシル誘導体、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、アルコキシ、アリールオキシ、ニトロ、シアノ、スルホン酸、チオール、イミン、スルホニル、スルファニル、スルフィニル、スルファモイル、エステル、カルボン酸、アミド、ホスホニル、ホスフィニル、ホスホリル、ホスフィン、チオエステル、チオエーテル、酸ハロゲン化物、無水物、オキシム、ヒドラジン、カルバメート、カーボネート、尿素、ホスホン酸、及びホスホネートからなる群から選択されるライブラリー。
【請求項２】
前記アリール、Ｃ１〜２０アルキル、アリール−Ｃ１〜２０アルキル、Ｃ１〜２０アルキル−アリール、ヘテロアリール、ヘテロアリール−Ｃ１〜２０アルキル又はＣ１〜２０アルキル−ヘテロアリール基にある前記置換基の１以上が、ナノ粒子、微小粒子、抗体、ペプチド、タンパク質、核酸、脂質、又は炭水化物上にある官能基に結合されることが可能である請求項１に記載のライブラリー。
【請求項３】
前記アリール、Ｃ１〜２０アルキル、アリール−Ｃ１〜２０アルキル、Ｃ１〜２０アルキル−アリール、ヘテロアリール、ヘテロアリール−Ｃ１〜２０アルキル又はＣ１〜２０アルキル−ヘテロアリール基にある前記置換基の１以上が、前記ポリインのラマンスペクトルを非置換の基に対してシフトさせることができる電子吸引性基又は電子供与性基である請求項１に記載のライブラリー。
【請求項４】
前記アリール、Ｃ１〜２０アルキル、アリール−Ｃ１〜２０アルキル、Ｃ１〜２０アルキル−アリール、ヘテロアリール、ヘテロアリール−Ｃ１〜２０アルキル又はＣ１〜２０アルキル−ヘテロアリール基にある前記置換基の１以上が、特定の小器官又は細胞区画を標的とする置換基である請求項１に記載のライブラリー。
【請求項５】
ｎが２〜１９の整数である請求項１に記載のライブラリー。
【請求項６】
ｎが３〜５の整数である請求項１に記載のライブラリー。
【請求項７】
ポリインの数が２〜約１００である請求項１に記載のライブラリー。
【請求項８】
ポリインの数が４〜約５０である請求項１に記載のライブラリー。
【請求項９】
前記ポリインのうちの１以上が固体支持体中又は固体支持体上に存在する請求項１に記載のライブラリー。
【請求項１０】
前記固体支持体がナノ粒子又は微小粒子である請求項９に記載のライブラリー。
【請求項１１】
前記ナノ粒子又は微小粒子が複数の官能基を含むポリマーから形成されており、前記複数の官能基の２以上がポリインに結合されている請求項１０に記載のライブラリー。
【請求項１２】
前記ナノ粒子又は微小粒子が、１以上の蛍光標識、抗原、抗体、抗体断片、抗体模倣体、ペプチド、タンパク質、核酸、脂質、炭水化物、ビオチン、ストレプトアビジン、アビジン、抗ビオチン、葉酸、葉酸結合タンパク質、ＩｇＧ、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、炭水化物、レクチン、脂質、又は核酸に結合されている請求項１０に記載のライブラリー。
【請求項１３】
前記ナノ粒子又は微小粒子がポリマーから形成されており、２以上のポリインが前記ポリマーナノ粒子又はポリマー微小粒子の内部に封入されている請求項１０に記載のライブラリー。
【請求項１４】
前記ナノ粒子が約２〜約１００ｎｍの直径を有し、前記微小粒子が約１００ｎｍ超約１００μｍ未満の直径を有する請求項１０に記載のライブラリー。
【請求項１５】
前記ナノ粒子が約５〜約５０ｎｍの直径を有する請求項１０に記載のライブラリー。
【請求項１６】
前記ナノ粒子が約５〜約２０ｎｍの直径を有する請求項１０に記載のライブラリー。
【請求項１７】
前記ナノ粒子が、ナノボディ、ナノビーズ、ナノロッド、ナノスター、ナノワイヤ、金属ナノ構造体及びカーボンナノチューブからなる群から選択される請求項１０に記載のライブラリー。
【請求項１８】
前記核酸が、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｔｍＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム、リボスイッチ、アプタマー、プライマー、プローブ、及び人工核酸類似体からなる群から選択される請求項１２に記載のライブラリー。
【請求項１９】
前記抗体が、幹細胞、癌細胞、免疫細胞、神経細胞、グリア細胞、細菌、真菌及びウイルスからなる群から選択される１以上の生物学的粒子に特異的に結合する請求項１２に記載のライブラリー。
【請求項２０】
前記ナノ粒子が金属ナノ粒子である請求項１７に記載のライブラリー。
【請求項２１】
前記固体支持体がチップである請求項９に記載のライブラリー。
【請求項２２】
前記固体支持体が微小粒子である請求項９に記載のライブラリー。
【請求項２３】
前記微小粒子がポリマー微小粒子である請求項２２に記載のライブラリー。
【請求項２４】
前記ナノ粒子又は微小粒子が、１以上のデンドリマー、グラフトコポリマー、又はくし型コポリマーを含む請求項１３に記載のライブラリー。
【請求項２５】
Ｃａｒｂｏｗ２１７２、Ｃａｒｂｏｗ２１４１、Ｃａｒｂｏｗ２１２８、Ｃａｒｂｏｗ２１００、Ｃａｒｂｏｗ２０８６、Ｃａｒｂｏｗ２０６６、Ｃａｒｂｏｗ２０４９、及びＣａｒｂｏｗ２０１７からなる群から選択される１以上のポリインを含む請求項１に記載のライブラリー。
【請求項２６】
Ｃａｒｂｏｗ２１７２、Ｃａｒｂｏｗ２１４１、Ｃａｒｂｏｗ２１２８、Ｃａｒｂｏｗ２１００、Ｃａｒｂｏｗ２０８６、Ｃａｒｂｏｗ２０６６、Ｃａｒｂｏｗ２０４９、及びＣａｒｂｏｗ２０１７からなる群から選択されるポリインのいずれも含まない請求項１に記載のライブラリー。
【請求項２７】
前記ポリインが、１０％未満のクロストークで十分に分解されたラマンピークを有する請求項１から請求項２６のいずれか一項に記載のライブラリー。
【請求項２８】
標識を含む製造品であって、前記標識は、１〜２００の請求項１から請求項２６のいずれか一項に記載のポリインを含む製造品。
【請求項２９】
ＩＤバッジ、パスポート、運転免許証、クレジットカード、商品タグ、通貨、金融商品、文書、医薬、容器、衣類、靴、ハンドバッグ、及びＤＶＤからなる群から選択される請求項２８に記載の製造品。
【請求項３０】
少なくとも２つのポリインが前記標識中又は前記標識上に存在する請求項２８に記載の製造品。
【請求項３１】
前記ポリインの各々が、最大５つの異なる濃度で存在する請求項３０に記載の製造品。
【請求項３２】
製造品を標識する方法であって、１〜２００の請求項１に記載のポリインを含む標識を準備する工程と、前記標識を製造品に貼付又は接着する工程とを備え、
各ポリインは最大５つの異なる濃度で存在することができ、
各ポリインは、ラマンスペクトルにおいて約１８５０〜約２６００ｃｍ−１に単一の、既知の強いピークを有し、前記標識に存在するすべての他のポリインと最少のクロストークを提示し、与えられたポリインについての最少のクロストークは、別のポリイン由来のピークとの約１０％未満の重なりとして定義される方法。
【請求項３３】
前記標識のラマンスペクトルを得る工程をさらに含み、前記ラマンスペクトル中のピークが、前記標識のポリインの種類及び濃度に基づいて前記標識に存在すると予想される既知のピークに合致するとき、真正品が特定され、前記ラマンスペクトル中のピークが、前記標識のポリインの種類及び濃度に基づいて前記標識に存在すると予想される既知のピークに合致しないとき、偽造品が特定される請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
注目する生物学的粒子が生物試料に存在するか否かを判定する方法であって、
ａ）哺乳動物から生物試料を入手する工程と、
ｂ）前記生物試料を、
ｉ）抗原、抗体、抗体断片、抗体模倣体、ペプチド、核酸、脂質、炭水化物、ビオチン、ストレプトアビジン、アビジン、抗ビオチン、葉酸、葉酸結合タンパク質、ＩｇＧ、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、炭水化物、レクチン、脂質、及び注目する生物学的粒子に特異的に結合することが知られている核酸からなる群から選択される結合メンバーに結合されている請求項１から請求項２６のいずれか一項に記載のポリイン、又は
ｉｉ）複数の１以上の請求項１から請求項２６のいずれか一項に記載のポリインに結合されているか又は複数の１以上の請求項１から請求項２６のいずれか一項に記載のポリインを封入するナノ粒子又は微小粒子であって、前記複数の１以上のポリインはスペクトル的にバーコード化されたポリインであり、前記ナノ粒子又は微小粒子は、抗原、抗体、抗体断片、抗体模倣体、ペプチド、核酸、脂質、炭水化物、ビオチン、ストレプトアビジン、アビジン、抗ビオチン、葉酸、葉酸結合タンパク質、ＩｇＧ、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、炭水化物、レクチン、脂質、及び注目する生物学的粒子に特異的に結合することが知られている核酸からなる群から選択される結合メンバーに結合されているナノ粒子又は微小粒子
とインキュベーションする工程であって、
前記注目する生物学的粒子が前記生物試料中に存在する場合に、前記ポリイン、ナノ粒子、又は微小粒子と前記注目する生物学的粒子との間で複合体が形成される工程と、
ｃ）インキュベーションした前記試料をセルソーティング及び／又は細胞計数工程に供する工程であって、前記ポリイン、ナノ粒子、又は微小粒子と複合体形成した前記注目する生物学的粒子が、前記生物試料中に存在する場合、光に曝露され、前記光が前記生物試料中の粒子と接触するときに散乱される光からラマンスペクトルが得られる工程と、
ｄ）前記ポリイン、又は複数の１以上のスペクトル的にバーコード化されたポリインに結合されているか若しくは複数の１以上のスペクトル的にバーコード化されたポリインを封入する前記ナノ粒子若しくは微小粒子、が注目する生物学的粒子に結合した場合に存在する、前記ポリインと整合するピークが、前記ラマンスペクトル中に存在するか否かを判定することにより、注目する生物学的粒子が前記生物試料中に存在するか否かを判定する工程と
を備える方法。
【請求項３５】
前記哺乳動物がヒトである請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記セルソーティング及び／又は細胞計数の方法がフローサイトメトリーである請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記フローサイトメトリーがＳＲＳフローサイトメトリーである請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
多重化様式で実施される請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
２〜５０，０００の異なる注目する生物学的粒子の同時検出を可能にする請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記注目する生物学的粒子が、幹細胞、癌細胞、免疫細胞、神経細胞、グリア細胞、細菌、ウイルス、及び／又は真菌からなる群から選択される請求項３４に記載の方法。
【請求項４１】
前記生物試料が、血漿、血清、脳脊髄液、尿、精液、唾液、乳頭吸引液、リンパ液、細針吸引液、水、髄液、腹水、胸水、及び滑液からなる群から選択される請求項３４に記載の方法。
【請求項４２】
生物試料中の細菌性髄膜炎又は敗血症と関連する細菌の存在を判定するために使用される請求項３４に記載の方法。
【請求項４３】
幹細胞、癌細胞、免疫細胞、神経細胞、及び／又はグリア細胞をソーティング及び／又は計数するために使用される請求項３４に記載の方法。
【請求項４４】
ａ）哺乳動物から生物試料を入手する工程であって、前記生物試料は標的核酸を含んでもよく含まなくてもよい工程と、
ｂ）前記試料を、ポリメラーゼ増幅（ＰＡ）反応を実施するための組成物と組み合わせて混合物を形成する工程であって、前記組成物は、請求項１から請求項２６のいずれか一項に記載のポリインに連結された少なくとも１つのプライマー又はプローブを含む工程と、
ｃ）前記混合物に対してＰＡを実施して、前記標的核酸が前記生物試料中に存在する場合は増幅産物を生成し、前記標的核酸が前記生物試料中に存在しない場合は増幅産物を生成しない工程と、
ｄ）工程ｃ）の間に生成された又は生成されなかった増幅産物の存在又は不存在を検出する工程と、
ｅ）検出される増幅産物の存在又は不存在に基づいて、前記標的核酸の存在又は不存在を判定する工程と
を備え、
前記増幅産物の存在は、前記少なくとも１つのプライマー又はプローブに連結された前記ポリインの既知のラマン散乱スペクトルに基づいて、ラマン分光法を使用して検出される方法。
【請求項４５】
前記哺乳動物がヒトである請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記ポリメラーゼ増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応である請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記ポリメラーゼ増幅反応が多重化様式で実施される請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
標的核酸の数、及び前記標的核酸に特異的に結合するプライマー及び／又はプローブの対応する数が、２〜約１００である請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
癌の検出、遺伝子導入生物の分類及び分析、マイクロサテライトの増幅及び分析、細菌若しくはウイルス、抗原、翻訳後修飾を有するタンパク質の分類及び検出、又は一塩基多型（ＳＮＰ）、欠失、反復、及びエピジェネティック修飾を分析するための複数のＤＮＡ領域の増幅のために使用される請求項４４に記載の方法。
【請求項５０】
新規なＳＮＰを発見するため、又は生物学的粒子の中の公知のＳＮＰを検出するために使用される請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
検出しようとされる前記癌が、前記方法を使用して判定することができる遺伝子情報と関連づけられており、前記方法が、癌細胞の種類に関する情報を評価する工程、及び前記情報をこの種類の癌細胞に特定的な個別化医療アプローチを開発するために使用する工程をさらに備える請求項４７に記載の方法。
【請求項５２】
前記生物学的粒子がＨＩＶウイルスであり、前記方法が、前記ウイルス中の公知のＳＮＰの存在及び／又は種類を判定するために使用される請求項４７に記載の方法。
【請求項５３】
前記ウイルス中の公知のＳＮＰの存在及び／又は種類に関する前記情報を、この種のＨＩＶ感染に特定的な個別化医療アプローチを開発するために使用する工程をさらに備える請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
生物試料中の抗原の存在又は不存在を判定するための方法であって、
ａ）哺乳動物から生物試料を入手する工程と、
ｉ）前記生物試料を、注目する抗原が前記生物試料中に存在する場合に前記注目する抗原に特異的に結合する一次抗体とインキュベーションして、前記抗原が前記生物試料中に存在する場合に前記一次抗体及び前記抗原の複合体を形成するようにし、前記抗原が前記生物試料中に存在しない場合に複合体を形成しないようにする工程、及び
ｉｉ）ＤＮＡイニシエータ結合二次抗体を添加する工程であって、前記ＤＮＡイニシエータ結合二次抗体は、前記一次抗体が前記抗原と複合体を形成した場合に、前記一次抗体と複合体を形成する工程、又は
ｉｉｉ）一次抗体と注目する抗原との間の複合体がすでに形成されたと疑われる場合に、前記試料をＤＮＡイニシエータ結合二次抗体とインキュベーションする工程であって、前記ＤＮＡイニシエータ結合二次抗体は、前記一次抗体が前記注目する抗原との複合体を形成した場合に一次抗体と複合体を形成する工程と、
ｂ）２つのヘアピン核酸構造を添加する工程であって、前記２つのヘアピン核酸構造のうちの少なくとも一方は請求項１から請求項２６のいずれか一項に記載のポリインに共有結合されており、前記少なくとも一方のポリインは既知のラマン散乱ピークを有し、
前記ＤＮＡイニシエータ結合二次抗体が前記一次抗体と複合体を形成する場合に、前記イニシエータは、前記２つのヘアピンが逐次的に二本鎖増幅ポリマーへと集合する連鎖反応を開始し、前記二本鎖増幅ポリマーは、少なくとも１つのポリインを含む工程と、
ｃ）前記既知のラマン散乱ピークに基づいて前記少なくとも１つのポリインの存在又は不存在を判定することにより、ラマン分光法を使用して前記二本鎖増幅ポリマーの存在を検出する工程と、
ｄ）前記少なくとも１つのポリインと関連する前記既知のラマンピークの存在又は不存在に基づいて、前記注目する抗原の存在又は不存在を判定する工程と
を備える方法。
【請求項５５】
多重化様式で実施される請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
検出しようとされる前記抗原がウイルス感染、細菌感染、又は真菌感染と関連する請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
生物試料中の抗原の存在又は不存在を判定するための方法であって、
ａ）哺乳動物から生物試料を入手する工程と、
ｂ）前記生物試料を、注目する抗原が前記生物試料中に存在する場合に前記注目する抗原に特異的に結合する一次抗体とインキュベーションして、前記抗原が前記生物試料中に存在する場合に前記一次抗体及び前記抗原の複合体を形成するようにし、前記抗原が前記生物試料中に存在しない場合に複合体を形成しないようにする工程であって、
前記一次抗体は、請求項１から請求項２４のいずれか一項に記載の１以上のポリインで標識されているか、又は固体支持体に結合されているかのいずれかであり、前記固体支持体は、請求項１から請求項２４のいずれか一項に記載の１以上のポリインに結合されているか、又は請求項１から請求項２４のいずれか一項に記載の１以上のポリインを封入する工程と、
ｃ）存在する場合、前記既知のラマン散乱ピークに基づいて前記少なくとも１つのポリインの存在又は不存在を判定することにより、前記抗原及び前記一次抗体の前記複合体の存在を検出する工程と、
ｄ）前記少なくとも１つのポリインと関連する前記既知のラマンピークの存在又は不存在に基づいて、前記注目する抗原の存在又は不存在を判定する工程と
を備える方法。
【請求項５８】
多重化様式で実施される請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
検出しようとされる前記抗原がウイルス感染、細菌感染、又は真菌感染と関連する請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
生物試料中の抗原の存在又は不存在を判定するための方法であって、
ａ）哺乳動物から生物試料を入手する工程と、
ｉ）前記生物試料を、注目する抗原が前記生物試料中に存在する場合に前記注目する抗原に特異的に結合する一次抗体とインキュベーションして、前記抗原が前記生物試料中に存在する場合に前記一次抗体及び前記抗原の複合体を形成するようにし、前記抗原が前記生物試料中に存在しない場合に複合体を形成しないようにする工程、及び
ｉｉ）二次抗体を添加する工程であって、前記二次抗体は、前記一次抗体が前記抗原と複合体を形成した場合に、前記一次抗体と複合体を形成する工程、又は
ｉｉｉ）一次抗体と注目する抗原との間の複合体がすでに形成されたと疑われる場合に、前記試料を二次抗体とインキュベーションする工程であって、前記二次抗体は、前記一次抗体が前記注目する抗原との複合体を形成した場合に一次抗体と複合体を形成し、
ｂ）前記二次抗体は、請求項１から請求項２６のいずれか一項に記載の１以上のポリインで標識されているか、又は固体支持体に結合されているかのいずれかであり、前記固体支持体は、請求項１から請求項２６のいずれか一項に記載の１以上のポリインに結合されているか、又は請求項１から請求項２６のいずれか一項に記載の１以上のポリインを封入する工程と、
ｃ）前記既知のラマン散乱ピークに基づいて前記少なくとも１つのポリインの存在又は不存在を判定することにより、ラマン分光法を使用して前記一次抗体と前記二次抗体との間で形成された前記複合体の存在を検出する工程と、
ｄ）前記少なくとも１つのポリインと関連する前記既知のラマンピークの存在又は不存在に基づいて、前記注目する抗原の存在又は不存在を判定する工程と
を備える方法。
【請求項６１】
多重化様式で実施される請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
検出しようとされる前記抗原がウイルス感染、細菌感染、又は真菌感染と関連する請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
ラマン分光法工程における散乱光の検出が幅広い範囲の波長を検出する検出器を使用して検出される請求項３２から請求項６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
培養された生細胞のイメージング方法であって、
生細胞を培養する工程であって、前記生細胞は、注目するインビトロ組織細胞培養物、又は注目するインビボ対象から抽出された細胞である工程と、
前記培養された生細胞をウェルに播種する工程と、
培地中で前記ウェルの各々をポリインの単一の色で標識する工程であって、前記ポリインは１以上の色を含む工程と、
標識された前記培養された生細胞を、誘導ラマン顕微鏡法のためにイメージングチャンバーに加える工程と、
誘導ラマン顕微鏡法を使用して前記細胞をイメージングする工程であって、各細胞は、イメージング時間のあいだ単一の色で維持される工程と
を備える方法。
【請求項６５】
前記ポリインが請求項１から請求項２６のいずれか一項に記載のポリインである請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記ポリインが、１０％未満のクロストークで十分に分解されたラマンピークを有するポリイン化合物である請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
前記ポリインが、Ｃａｒｂｏｗ２１７２、Ｃａｒｂｏｗ２１４１、Ｃａｒｂｏｗ２１２８、Ｃａｒｂｏｗ２１００、Ｃａｒｂｏｗ２０８６、Ｃａｒｂｏｗ２０６６、Ｃａｒｂｏｗ２０４９、及びＣａｒｂｏｗ２０１７からなる群から選択される１以上のポリインを含む請求項６４に記載の方法。
【請求項６８】
前記ポリインが、Ｃａｒｂｏｗ２１７２、Ｃａｒｂｏｗ２１４１、Ｃａｒｂｏｗ２１２８、Ｃａｒｂｏｗ２１００、Ｃａｒｂｏｗ２０８６、Ｃａｒｂｏｗ２０６６、Ｃａｒｂｏｗ２０４９、及びＣａｒｂｏｗ２０１７からなる群から選択されるポリインのいずれも含まない請求項６４に記載の方法。
【請求項６９】
培養される前記細胞が、幹細胞、癌細胞、免疫細胞、神経細胞及びグリア細胞からなる群から選択される請求項５６に記載の方法。
【請求項７０】
培養された生細胞の小器官のイメージング方法であって、
生細胞を培養する工程であって、前記生細胞は、注目するインビトロ組織細胞培養物、又は注目するインビボ対象から抽出された細胞である工程と、
前記培養された生細胞をポリインと共に培地中でインキュベーションする工程であって、前記ポリインは、各々、特異的な小器官標的プローブを含む工程と、
前記培養された生細胞を前記ポリインで標識する工程と、
振動顕微鏡法を使用して前記細胞をイメージングする工程と
を備える方法。
【請求項７１】
前記振動顕微鏡法が誘導ラマン顕微鏡法である請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
培養される前記細胞が、幹細胞、癌細胞、免疫細胞、神経細胞及びグリア細胞からなる群から選択される請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
前記ポリインとインキュベーションし前記ポリインで標識する前に、前記培養された生細胞をウェルに播種する工程、及び
前記培養された生細胞を前記ポリインで標識する工程であって、前記ポリインが、各々、特異的な小器官標的プローブを含み、さらには、前記特異的な小器官標的プローブが異なる小器官を特異的に標的とする工程
をさらに備える請求項７０に記載の方法。
【請求項７４】
前記特異的な小器官標的プローブが、前記培養された生細胞中の細胞膜、ＥＲ、ゴルジ、ミトコンドリア、脂質滴、リソソーム、ペルオキシソーム、核、及び細胞骨格からなる群から選択される異なる小器官を特異的に標的とする請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記ポリインが請求項１から請求項２６のいずれか一項に記載のポリインである請求項７０に記載の方法。
【請求項７６】
前記ポリインが、１０％未満のクロストークで十分に分解されたラマンピークを有するポリイン化合物である請求項７０に記載の方法。
【請求項７７】
前記ポリインが、Ｃａｒｂｏｗ２１７２、Ｃａｒｂｏｗ２１４１、Ｃａｒｂｏｗ２１２８、Ｃａｒｂｏｗ２１００、Ｃａｒｂｏｗ２０８６、Ｃａｒｂｏｗ２０６６、Ｃａｒｂｏｗ２０４９、及びＣａｒｂｏｗ２０１７からなる群から選択される１以上のポリインを含む請求項７０に記載の方法。
【請求項７８】
前記ポリインが、Ｃａｒｂｏｗ２１７２、Ｃａｒｂｏｗ２１４１、Ｃａｒｂｏｗ２１２８、Ｃａｒｂｏｗ２１００、Ｃａｒｂｏｗ２０８６、Ｃａｒｂｏｗ２０６６、Ｃａｒｂｏｗ２０４９、及びＣａｒｂｏｗ２０１７からなる群から選択されるポリインのいずれも含まない請求項７０に記載の方法。
【請求項７９】
スペクトル的にバーコード化されたビーズを使用する生細胞のタグ付け方法であって、
ポリスチレンビーズをスペクトル的にバーコード化されたポリインと混合する工程と、
前記ビーズを前記スペクトル的にバーコード化されたポリインと結合して、バーコード化ビーズを形成する工程と、
生細胞を培養する工程であって、前記生細胞は、注目するインビトロ組織細胞培養物、又は注目するインビボ対象から抽出された細胞である工程と、
培養された前記生細胞を前記バーコード化ビーズと培地中でインキュベーションする工程と、
前記培養された生細胞を前記バーコード化ビーズで標識する工程と、
前記培養された生細胞を、振動顕微鏡法を使用してイメージングする工程と、
視野全体の前記バーコード化ビーズの前記スペクトルバーコードを、ハイパースペクトルの振動画像に基づいて復号化する工程と
を備える方法。
【請求項８０】
前記振動顕微鏡法が誘導ラマン分光法である請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記ポリインが請求項１から請求項２６のいずれか一項に記載のポリインである請求項７９に記載の方法。
【請求項８２】
前記ポリインが、１０％未満のクロストークで十分に分解されたラマンピークを有するポリイン化合物である請求項７９に記載の方法。
【請求項８３】
前記ポリインが、Ｃａｒｂｏｗ２１７２、Ｃａｒｂｏｗ２１４１、Ｃａｒｂｏｗ２１２８、Ｃａｒｂｏｗ２１００、Ｃａｒｂｏｗ２０８６、Ｃａｒｂｏｗ２０６６、Ｃａｒｂｏｗ２０４９、及びＣａｒｂｏｗ２０１７からなる群から選択される１以上のポリインを含む請求項７９に記載の方法。
【請求項８４】
前記ポリインが、Ｃａｒｂｏｗ２１７２、Ｃａｒｂｏｗ２１４１、Ｃａｒｂｏｗ２１２８、Ｃａｒｂｏｗ２１００、Ｃａｒｂｏｗ２０８６、Ｃａｒｂｏｗ２０６６、Ｃａｒｂｏｗ２０４９、及びＣａｒｂｏｗ２０１７からなる群から選択されるポリインのいずれも含まない請求項７９に記載の方法。
【請求項８５】
フローサイトメトリーにより癌細胞の集団を特定する方法であって、
１以上の炭素原子ワイヤを注目する対象の生細胞と会合させる工程であって、前記炭素原子ワイヤは、前記生細胞の特異的細胞表面マーカーを検出する抗体と結合され、前記抗体は前記生細胞の細胞表面マーカーに結合する工程と、
前記生細胞を、フローサイトメーターの絞り込まれたフロー流の中に位置決めする工程と、
前記フローサイトメーターの前記絞り込まれたフロー流内の前記生細胞を、所定の波長の光で照射する工程であって、前記炭素原子ワイヤは前記照射に曝される工程と、
前記生細胞からの散乱光を検出する工程と、
前記散乱光を分析して、生細胞の個々の群を特定する工程と、
前記抗体に結合された前記炭素原子ワイヤによって生成される前記散乱光に基づいて癌細胞を検出する工程であって、前記抗体は、癌細胞と会合する特異的細胞表面マーカーを検出する工程と
を備える方法。
【請求項８６】
前記炭素原子ワイヤが、１以上の請求項１から請求項２６のいずれか一項に記載のポリインを含む請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記炭素原子ワイヤが、１０％未満のクロストークで十分に分解されたラマンピークを有するポリイン化合物を含む請求項８５に記載の方法。
【請求項８８】
前記炭素原子ワイヤが、Ｃａｒｂｏｗ２１７２、Ｃａｒｂｏｗ２１４１、Ｃａｒｂｏｗ２１２８、Ｃａｒｂｏｗ２１００、Ｃａｒｂｏｗ２０８６、Ｃａｒｂｏｗ２０６６、Ｃａｒｂｏｗ２０４９、及びＣａｒｂｏｗ２０１７からなる群から選択される１以上のポリインを含む請求項８５に記載の方法。
【請求項８９】
フローサイトメトリーベースの高スループット医療診断の方法であって、
１以上の炭素原子ワイヤを注目する対象の生細胞と会合させる工程であって、前記生細胞の特定の分集団は、炭素原子ワイヤの別個のセットと特異的に会合する工程と、
前記生細胞をフローサイトメーターの中で位置決めする工程と、
前記生細胞を前記フローサイトメーターの絞り込まれたフロー流内で照射する工程であって、前記炭素原子ワイヤは前記照射に曝露される工程と、
前記生細胞からの散乱光を検出する工程と、
前記散乱光を分析して、生細胞の個々の群を特定する工程と、
前記散乱光の分析に基づいて、前記注目する対象の疾患を検出する工程と
を備える方法。
【請求項９０】
前記生細胞が、幹細胞、癌細胞、免疫細胞、神経細胞及びグリア細胞からなる群から選択される請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記炭素原子ワイヤが、１以上の請求項１から請求項２６のいずれか一項に記載のポリインを含む請求項８９に記載の方法。
【請求項９２】
前記炭素原子ワイヤが、１０％未満のクロストークで十分に分解されたラマンピークを有するポリイン化合物を含む請求項８９に記載の方法。
【請求項９３】
前記炭素原子ワイヤが、Ｃａｒｂｏｗ２１７２、Ｃａｒｂｏｗ２１４１、Ｃａｒｂｏｗ２１２８、Ｃａｒｂｏｗ２１００、Ｃａｒｂｏｗ２０８６、Ｃａｒｂｏｗ２０６６、Ｃａｒｂｏｗ２０４９、及びＣａｒｂｏｗ２０１７からなる群から選択される１以上のポリインを含む請求項８９に記載の方法。
【請求項９４】
前記ポリインが、Ｃａｒｂｏｗ２１７２、Ｃａｒｂｏｗ２１４１、Ｃａｒｂｏｗ２１２８、Ｃａｒｂｏｗ２１００、Ｃａｒｂｏｗ２０８６、Ｃａｒｂｏｗ２０６６、Ｃａｒｂｏｗ２０４９、及びＣａｒｂｏｗ２０１７からなる群から選択されるポリインのいずれも含まない請求項８９に記載の方法。
【請求項９５】
セルソーティング方法であって、
炭素原子ワイヤを注目する対象の生細胞と会合させる工程であって、前記生細胞の特定の分集団は、炭素原子ワイヤの別個のセットと特異的に会合する工程と、
前記生細胞の特定の分集団と炭素原子ワイヤの別個のセットとの特異的な会合によって、前記生細胞の特定の分集団をセルソーティングする工程であって、前記セルソーティングは分光法を使用して実施される工程と
を備える方法。
【請求項９６】
ソーティングされる前記細胞が、幹細胞、癌細胞、免疫細胞、神経細胞及びグリア細胞からなる群から選択される１以上の細胞を含む請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
前記炭素原子ワイヤが、１以上の請求項１から請求項２６のいずれか一項に記載のポリインを含む請求項９５に記載の方法。
【請求項９８】
前記炭素原子ワイヤが、１０％未満のクロストークで十分に分解されたラマンピークを有するポリイン化合物を含む請求項９５に記載の方法。
【請求項９９】
前記炭素原子ワイヤが、Ｃａｒｂｏｗ２１７２、Ｃａｒｂｏｗ２１４１、Ｃａｒｂｏｗ２１２８、Ｃａｒｂｏｗ２１００、Ｃａｒｂｏｗ２０８６、Ｃａｒｂｏｗ２０６６、Ｃａｒｂｏｗ２０４９、及びＣａｒｂｏｗ２０１７からなる群から選択される１以上のポリインを含む請求項９５に記載の方法。
【請求項１００】
前記ポリインが、Ｃａｒｂｏｗ２１７２、Ｃａｒｂｏｗ２１４１、Ｃａｒｂｏｗ２１２８、Ｃａｒｂｏｗ２１００、Ｃａｒｂｏｗ２０８６、Ｃａｒｂｏｗ２０６６、Ｃａｒｂｏｗ２０４９、及びＣａｒｂｏｗ２０１７からなる群から選択されるポリインのいずれも含まない請求項９５に記載の方法。
【請求項１０１】
前記分光法がＳＲＳフローサイトメトリーを含む請求項９５に記載の方法。
【請求項１０２】
インビボで細胞アトラスを生成する方法であって、
炭素原子ワイヤを注目する対象の生細胞と会合させる工程であって、前記生細胞の特定の分集団は、炭素原子ワイヤの別個のセットと特異的に会合する工程と、
前記生細胞の特定の分集団間の関係をマッピングする工程であって、前記生細胞の特定の分集団は、それらと炭素原子ワイヤの別個のセットとの特異的な会合によって識別可能である工程と
を備える方法。
【請求項１０３】
前記細胞分集団が、幹細胞、癌細胞、免疫細胞、神経細胞及びグリア細胞からなる群から選択される１以上の細胞を含む請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
前記炭素原子ワイヤが、１以上の請求項１から請求項２６のいずれか一項に記載のポリインを含む請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０５】
前記炭素原子ワイヤが、１０％未満のクロストークで十分に分解されたラマンピークを有するポリイン化合物を含む請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０６】
前記炭素原子ワイヤが、Ｃａｒｂｏｗ２１７２、Ｃａｒｂｏｗ２１４１、Ｃａｒｂｏｗ２１２８、Ｃａｒｂｏｗ２１００、Ｃａｒｂｏｗ２０８６、Ｃａｒｂｏｗ２０６６、Ｃａｒｂｏｗ２０４９、及びＣａｒｂｏｗ２０１７からなる群から選択される１以上のポリインを含む請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０７】
前記ポリインが、Ｃａｒｂｏｗ２１７２、Ｃａｒｂｏｗ２１４１、Ｃａｒｂｏｗ２１２８、Ｃａｒｂｏｗ２１００、Ｃａｒｂｏｗ２０８６、Ｃａｒｂｏｗ２０６６、Ｃａｒｂｏｗ２０４９、及びＣａｒｂｏｗ２０１７からなる群から選択されるポリインのいずれも含まない請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０８】
前期共鳴条件が存在しない固定細胞及び組織を免疫染色しイメージングする方法であって、
共役長、末端封鎖置換又は同位体編集のうちの少なくとも１つの組み合わせを選ぶことにより、周波数多重化のためのポリインを製造する工程と、
ポリイン由来のプローブを形成する工程であって、前記プローブは、周波数多重化のための前記ポリインを含む工程と、
前記ポリイン由来のプローブを固定細胞又は組織に与える工程であって、前記ポリイン由来のプローブは前記固定細胞又は組織を免疫染色する工程と、
免疫染色後に前記固定細胞又は前記組織をイメージングする工程と
を備える方法。
【請求項１０９】
前記細胞が、幹細胞、癌細胞、免疫細胞、神経細胞及びグリア細胞からなる群から選択される１以上の細胞を含む請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
前記ポリインが請求項１から請求項２６のいずれか一項に記載のポリインである請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１１】
前記ポリインが、Ｃａｒｂｏｗ２１７２、Ｃａｒｂｏｗ２１４１、Ｃａｒｂｏｗ２１２８、Ｃａｒｂｏｗ２１００、Ｃａｒｂｏｗ２０８６、Ｃａｒｂｏｗ２０６６、Ｃａｒｂｏｗ２０４９、及びＣａｒｂｏｗ２０１７からなる群から選択される請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１２】
前記ポリインが、Ｃａｒｂｏｗ２１７２、Ｃａｒｂｏｗ２１４１、Ｃａｒｂｏｗ２１２８、Ｃａｒｂｏｗ２１００、Ｃａｒｂｏｗ２０８６、Ｃａｒｂｏｗ２０６６、Ｃａｒｂｏｗ２０４９、及びＣａｒｂｏｗ２０１７からなる群から選択されるポリインのいずれも含まない請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１３】
ポリインプローブの多重ナノスケールシグナル増幅の方法であって、
デンドリマー又はポリマーナノ構造体のうちの少なくとも１つを複数のポリインでグラフト化する工程であって、前記デンドリマー又は前記ポリマーナノ構造体のうちの少なくとも１つは、ボトルブラシ型ナノ材料及び星型ナノ材料の群から選択される１以上を含む工程と、
前記グラフト化デンドリマー又は前記ポリマーナノ構造体のうちの少なくとも１つからポリインプローブを形成する工程と
を備える方法。
【請求項１１４】
前記複数のポリインが、１以上の請求項１から請求項２６のいずれか一項に記載のポリインを含む請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
前記複数のポリイン化合物が、各々、１０％未満のクロストークで十分に分解されたラマンピークを有する請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１６】
前記ポリインが、Ｃａｒｂｏｗ２１７２、Ｃａｒｂｏｗ２１４１、Ｃａｒｂｏｗ２１２８、Ｃａｒｂｏｗ２１００、Ｃａｒｂｏｗ２０８６、Ｃａｒｂｏｗ２０６６、Ｃａｒｂｏｗ２０４９、及びＣａｒｂｏｗ２０１７からなる群から選択される１以上のポリインを含む請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１７】
前記ポリインが、Ｃａｒｂｏｗ２１７２、Ｃａｒｂｏｗ２１４１、Ｃａｒｂｏｗ２１２８、Ｃａｒｂｏｗ２１００、Ｃａｒｂｏｗ２０８６、Ｃａｒｂｏｗ２０６６、Ｃａｒｂｏｗ２０４９、及びＣａｒｂｏｗ２０１７からなる群から選択されるポリインのいずれも含まない請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１８】
超多重化検出のためにポリインプローブのシグナル強度を増強する方法であって、
貴金属ナノ構造体をポリイン分子でコーティングする工程であって、前記貴金属ナノ構造体は、ナノ球体、ナノロッド及びナノスターからなる群から選択される１以上のナノ構造体を含む工程と、
表面増強ラマン散乱によるシグナル増幅のために、物理吸着又は化学修飾を使用する工程と
を備える方法。
【請求項１１９】
前記ポリイン分子が、１以上の請求項１から請求項２６のいずれか一項に記載のポリインを含む請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
前記ポリイン分子が、各々、１０％未満のクロストークで十分に分解されたラマンピークを有する請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２１】
前記ポリイン分子が、Ｃａｒｂｏｗ２１７２、Ｃａｒｂｏｗ２１４１、Ｃａｒｂｏｗ２１２８、Ｃａｒｂｏｗ２１００、Ｃａｒｂｏｗ２０８６、Ｃａｒｂｏｗ２０６６、Ｃａｒｂｏｗ２０４９、及びＣａｒｂｏｗ２０１７からなる群から選択される１以上のポリインを含む請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２２】
前記ポリインが、Ｃａｒｂｏｗ２１７２、Ｃａｒｂｏｗ２１４１、Ｃａｒｂｏｗ２１２８、Ｃａｒｂｏｗ２１００、Ｃａｒｂｏｗ２０８６、Ｃａｒｂｏｗ２０６６、Ｃａｒｂｏｗ２０４９、及びＣａｒｂｏｗ２０１７からなる群から選択されるポリインのいずれも含まない請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２３】
周波数暗号化による偽造防止方法であって、
ハイパースペクトルＳＲＳ画像を使用して商用販売のための製品をイメージングし、前記製品を標識するために使用される１以上のポリインの存在を特定する工程
を備え、
前記商用販売のための製品は、前記製品の製造中に１以上のポリインで標識され、
さらに、前記ハイパースペクトルＳＲＳ画像中の前記１以上のポリインの不存在は、前記製品が偽造品であることを意味する方法。
【請求項１２４】
前記１以上のポリインが、１以上の請求項１から請求項２６のいずれか一項に記載のポリインを含む請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２５】
前記１以上のポリイン化合物が、各々、１０％未満のクロストークで十分に分解されたラマンピークを有する請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２６】
前記ポリインが、Ｃａｒｂｏｗ２１７２、Ｃａｒｂｏｗ２１４１、Ｃａｒｂｏｗ２１２８、Ｃａｒｂｏｗ２１００、Ｃａｒｂｏｗ２０８６、Ｃａｒｂｏｗ２０６６、Ｃａｒｂｏｗ２０４９、及びＣａｒｂｏｗ２０１７からなる群から選択される１以上のポリインを含む請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２７】
前記ポリインが、Ｃａｒｂｏｗ２１７２、Ｃａｒｂｏｗ２１４１、Ｃａｒｂｏｗ２１２８、Ｃａｒｂｏｗ２１００、Ｃａｒｂｏｗ２０８６、Ｃａｒｂｏｗ２０６６、Ｃａｒｂｏｗ２０４９、及びＣａｒｂｏｗ２０１７からなる群から選択されるポリインのいずれも含まない請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２８】
周波数暗号化による本人確認方法であって、
ハイパースペクトルＳＲＳ画像を使用して特定用タグをイメージングし、前記タグを標識するために使用される１以上のポリインの存在を特定する工程
を備え、
前記タグは、前記タグの製造中に１以上のポリインで標識され、
前記ハイパースペクトルＳＲＳ画像中の前記１以上のポリインの不存在は、前記タグが偽物であることを意味する方法。
【請求項１２９】
前記１以上のポリインが、１以上の請求項１から請求項２６のいずれか一項に記載のポリインを含む請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３０】
前記１以上のポリイン化合物が、各々、１０％未満のクロストークで十分に分解されたラマンピークを有する請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３１】
前記ポリインが、Ｃａｒｂｏｗ２１７２、Ｃａｒｂｏｗ２１４１、Ｃａｒｂｏｗ２１２８、Ｃａｒｂｏｗ２１００、Ｃａｒｂｏｗ２０８６、Ｃａｒｂｏｗ２０６６、Ｃａｒｂｏｗ２０４９、及びＣａｒｂｏｗ２０１７からなる群から選択される１以上のポリインを含む請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３２】
前記ポリインが、Ｃａｒｂｏｗ２１７２、Ｃａｒｂｏｗ２１４１、Ｃａｒｂｏｗ２１２８、Ｃａｒｂｏｗ２１００、Ｃａｒｂｏｗ２０８６、Ｃａｒｂｏｗ２０６６、Ｃａｒｂｏｗ２０４９、及びＣａｒｂｏｗ２０１７からなる群から選択されるポリインのいずれも含まない請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３３】
培養された生細胞をイメージングするためのキットであって、
非特異的に標的化されたポリインと、
小器官標的ポリインと、
スペクトル的にバーコード化されたポリインと、
培養された生細胞のイメージングにおいて前記ポリインを使用するための説明書と
を含むキット。
【請求項１３４】
前記ポリインが、１以上の請求項１から請求項２６のいずれか一項に記載のポリインを含む請求項１３３に記載のキット。
【請求項１３５】
前記ポリインが、各々、１０％未満のクロストークで十分に分解されたラマンピークを有する請求項１３３に記載のキット。
【請求項１３６】
前記ポリインが、Ｃａｒｂｏｗ２１７２、Ｃａｒｂｏｗ２１４１、Ｃａｒｂｏｗ２１２８、Ｃａｒｂｏｗ２１００、Ｃａｒｂｏｗ２０８６、Ｃａｒｂｏｗ２０６６、Ｃａｒｂｏｗ２０４９、及びＣａｒｂｏｗ２０１７からなる群から選択される１以上のポリインを含む請求項１３３に記載のキット。
【請求項１３７】
前記ポリインが、Ｃａｒｂｏｗ２１７２、Ｃａｒｂｏｗ２１４１、Ｃａｒｂｏｗ２１２８、Ｃａｒｂｏｗ２１００、Ｃａｒｂｏｗ２０８６、Ｃａｒｂｏｗ２０６６、Ｃａｒｂｏｗ２０４９、及びＣａｒｂｏｗ２０１７からなる群から選択されるポリインのいずれも含まない請求項１３３に記載のキット。
【請求項１３８】
多重ＰＣＲを実施するためのキットであって、
ａ）各々が、異なる請求項１から請求項２６のいずれか一項に記載のポリインで標識された２〜５０のプライマーと、
ｂ）ＤＮＡポリメラーゼと
を含むキット。
【請求項１３９】
前記ＤＮＡポリメラーゼがＴａｑポリメラーゼである請求項１３８に記載のキット。
【請求項１４０】
バッファーをさらに含む請求項１３８に記載のキット。
【請求項１４１】
さらに、前記バッファーが、ＰＣＲ増幅のための最適化された塩濃度を含む請求項１３８に記載のキット。
【請求項１４２】
ＤＮＡの融解挙動を改変することにより異なる鋳型の増幅を容易にする１以上のＰＣＲ添加剤をさらに含む請求項１３８に記載のキット。
【請求項１４３】
ジメチルスルホキシドをさらに含む請求項１３８に記載のキット。
【請求項１４４】
前記ポリインは、１以上の請求項１から請求項２６のいずれか一項に記載のポリインを含む請求項１３８に記載のキット。
【請求項１４５】
前記ポリインが、各々、１０％未満のクロストークで十分に分解されたラマンピークを有する請求項１３８に記載のキット。
【請求項１４６】
前記ポリインが、Ｃａｒｂｏｗ２１７２、Ｃａｒｂｏｗ２１４１、Ｃａｒｂｏｗ２１２８、Ｃａｒｂｏｗ２１００、Ｃａｒｂｏｗ２０８６、Ｃａｒｂｏｗ２０６６、Ｃａｒｂｏｗ２０４９、及びＣａｒｂｏｗ２０１７からなる群から選択される１以上のポリインを含む請求項１３８に記載のキット。
【請求項１４７】
前記ポリインが、Ｃａｒｂｏｗ２１７２、Ｃａｒｂｏｗ２１４１、Ｃａｒｂｏｗ２１２８、Ｃａｒｂｏｗ２１００、Ｃａｒｂｏｗ２０８６、Ｃａｒｂｏｗ２０６６、Ｃａｒｂｏｗ２０４９、及びＣａｒｂｏｗ２０１７からなる群から選択されるポリインのいずれも含まない請求項１３８に記載のキット。
【請求項１４８】
ハイブリダイゼーション連鎖反応増幅を実施するためのキットであって、イニシエータに曝露されると自己組織化する１以上の準安定な核酸モノマーを含み、前記モノマーのうちの少なくとも１つは、請求項１から請求項２６のいずれか一項に記載のポリインに結合されているキット。
【請求項１４９】
第１の準安定な核酸モノマーの一部分に相補的な領域を含む１以上の準安定な核酸モノマーをさらに含む請求項１４８に記載のキット。
【請求項１５０】
前記モノマーが、ループ領域及び二本鎖領域を含むヘアピン核酸構造を含む請求項１４８又は請求項１４９に記載のキット。
【請求項１５１】
イニシエータをさらに含む請求項１４８に記載のキット。
【請求項１５２】
前記イニシエータが核酸を含む請求項１５１に記載のキット。
【請求項１５３】
注目する抗原に結合する一次抗体をさらに含む請求項１５１に記載のキット。
【請求項１５４】
前記一次抗体が注目する抗原と複合体を形成した場合にのみ前記一次抗体と複合体を形成するＤＮＡイニシエータ結合二次抗体をさらに含む請求項１５３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１７年８月３日出願の米国仮出願第６２／５４０，９５３号及び２０１８年１月１２日出願の米国仮出願第６２／６１６，６２４号の利益及び優先権を主張する。これらの開示全体は、参照により本明細書に援用したものとする。
【０００２】
連邦政府により資金提供を受けた研究に関する記載
本発明は、米国国立衛生研究所により授与された交付番号Ｒ０１ＥＢ０２０８９２のもとでの政府助成によって為されたものである。政府は、本発明において所定の権利を有する。
【０００３】
本開示の分野
本開示は、全体として、ポリインを使用する生細胞イメージングにおける光学的超多重化用途、及び光学的超多重化用途に有用なポリインのライブラリーに関する。
【背景技術】
【０００４】
現在のビッグデータ時代は、大量の情報の迅速な蓄積に対する要求の高まりを作り出し、これには多数のターゲットの高スループットの多重検出が非常に望ましい。光学的検出は、遠距離場での非侵襲的な情報読み出しのための最も効率的な方法のうちの１つである。結果として、多重化顕微鏡法及び多重化バーコーディング等の多くの光学的な多重化技術が開発されてきている。これらの技術は、主として有機色素、蛍光タンパク質、又は量子ドット、希土類元素ナノ粒子及びアップコンバージョンナノ結晶を含めた無機の発光性ナノ材料の蛍光に基づく。
【０００５】
しかしながら、蛍光スペクトルにおける広い線幅及び著しい重なりに起因して、蛍光検出のために解像できる特徴部の数は限られている。従って、多重化蛍光顕微鏡は、１０色同時イメージングですら達成できず、複雑な光学設定及びスペクトルのアンミキシングの使用を必要とし、そしてスペクトルエンコーディング（ｓｐｅｃｔｒａｌ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ）を組み合わせて用いたとしても、不可避のクロストーク（相互干渉）及び自己消光の問題に起因して２０００未満の光学バーコードしか作り出すことができない。
【０００６】
多重化は、非常に多くの独特の種の高スループット同時測定を指す。現代のライフサイエンス及び技術は、分子イメージングプローブを用いたタンパク質複合体中の複数の構成要素又は単一細胞中の複数の小器官（オルガネラ）の同時可視化、セルソーティング、医学的診断及びビーズベースの懸濁アッセイを用いる創薬のための抗原又は小分子の高スループット検出、並びに本人確認（ｉｄｅｎｔｉｔｙ  ｓｅｃｕｒｉｔｙ）及び偽造防止のための高密度情報記憶及び暗号化等、多重化技術に対するますます大きい要求を有している。複雑系において多重化を達成するためには、多重化は、容易に適用でき特定できる区別可能なコードのマトリクスを必要とし、光コードは、遠距離場での非侵襲性で非破壊的な読み出しのための最も普及している方法のうちの１つである。
【０００７】
光学的多重化のために、多くの発光性材料が最近の数十年にわたって開発されてきた。例えば、生物系におけるマルチカラーイメージング法について有機色素及び蛍光タンパク質が広く応用され、量子ドット、金属ナノ構造体、希土類元素ナノ粒子、及びアップコンバージョンナノ結晶を含めた無機の発光性材料は、多重特定のためのスペクトルバーコーディングにおいて一般に使用され、この多重特定は、高スループットスクリーニング及びデータセキュリティへの応用への鍵である。しかしながら、広い線幅及び著しいスペクトルの重なりのため、現在の発光性材料における解像できる特徴部の数は限られている。複数のレーザー、フィルター及び検出器並びに複雑なスペクトルアンミキシング及び色補正を必要とする蛍光多重化顕微鏡法によっては、７色ですら、生細胞において実用的にイメージングすることができない。そして、有機色素における不可避のクロストーク、好適な特徴部の数を制約する異なる量子ドット間のＦＲＥＴエネルギー移動、希土類ナノ結晶及び金属ナノ粒子に関する復号化手順の複雑化に起因して、符号化の組み合わせを用いても２０００未満のスペクトルバーコードしか到達できない。それゆえ、スペクトルの制約を克服し積年の「多重化の天井」を打ち破ることができる新しい光学材料が大いに必要とされている。
【０００８】
ポリインは、炭素原子ワイヤとしても知られる交互の一重結合及び三重結合を有するｓｐ混成の炭素原子の直鎖である。ｓｐ３混成のダイヤモンド並びに二次元状のグラフェン、準一次元のカーボンナノチューブ、及び準ゼロ次元のフラーレンを含めたｓｐ２混成の低次元系等の他の周知の炭素材料と比べて、ｓｐ混成の炭素原子ワイヤは、本来の一次元構造を有する最も研究されていない炭素同素体のうちの１つである。安定なポリインを入手することの困難さのため、それらはほとんど調べられていない。理論上は、ポリインは、非常に高い熱伝導率、大きい機械的強度、及びいずれの公知の材料よりも大きい剛性等の多くの魅力的な特性を有するはずである。最近の１０年間にわたって、明確な組成及び構造を有するポリインの化学合成に向けて顕著な進展が成し遂げられ、ポリイン鎖を立体的に安定化するためにかさ高い末端封鎖基を使用することにより、４４個の連続する炭素原子を有する単離可能なポリインが合成された。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
このように、本明細書に上記される欠点の少なくともいくつかを克服することができるポリインによる例示的な光学的超多重化を提供することは有益である可能性がある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
光学的多重化は、ライフサイエンス、医学及び情報技術に広くインパクトを与える。現在の多重化技術は、発光性材料におけるスペクトルの重なり及び著しいクロストークに起因して、限定的な数に限られている。
【００１１】
１つの例示の実施形態では、本開示は、新しいポリイン系材料（本明細書中で、ポリインという）、及び超多重化検出のためのそれらの光学特性の利用に関する。このような例示の実施形態の１つの態様では、当該ポリインは、２〜２００のメンバー、より典型的には１０〜１００のメンバー、さらにより典型的には４〜５０のメンバーを含むライブラリーに存在する。別の例示の実施形態では、本開示は、誘導ラマン散乱等のラマン散乱による光学的超多重化における本明細書に記載されるポリインの使用に関する。
【００１２】
このような例示の実施形態の１つの態様では、上記ポリインは、下記構造
【化１】
2020532497.tif 000003
を有し、
上記式中、ｎは、１〜１９、典型的には２〜１９、さらにより典型的には３〜５の整数であり、
Ｒ１及びＲ２は、独立に、アリール、Ｃ１〜２０アルキル、トリアルキルシリル、アリールジアルキルシリル、ジアリールアルキルシリル、金属、金属錯体、アリール−Ｃ１〜２０アルキル、Ｃ１〜２０アルキル−アリール、ヘテロアリール、ヘテロアリール−Ｃ１〜２０アルキル又はＣ１〜２０アルキル−ヘテロアリールであり、これらの基の各々は、任意に１以上の置換基で置換されていてもよく、
これらの基における水素のうちの１以上は、重水素化されていてもよく、
上記アルキン部分における炭素のうちの１以上は１３Ｃ標識されていてもよく、
上記アリール、Ｃ１〜２０アルキル、アリール−Ｃ１〜２０アルキル、Ｃ１〜２０アルキル−アリール、ヘテロアリール、ヘテロアリール−Ｃ１〜２０アルキル又はＣ１〜２０アルキル−ヘテロアリール基のうちの１以上にある上記置換基は、金属ナノ構造体、抗体、ペプチド、核酸、脂質、又は炭水化物に結合することができる官能基；上記ポリインのラマンスペクトルを非置換の基に対してシフトさせることができる電子吸引性基又は電子供与性基；特異的な小器官、細胞区画、（上記ポリインが蛍光及びラマン分光法の両方を使用して検出されるようにできる）蛍光標識、ビオチン又はストレプトアビジンを標的とする基を含む。
【００１３】
このような例示の実施形態の別の態様では、上記ポリインは、１０％未満のクロストークで十分に分解されたラマンピークを有する。
【００１４】
代表的なポリインとしては、作業実施例に記載されるＣａｒｂｏｗ２１７２、Ｃａｒｂｏｗ２１４１、Ｃａｒｂｏｗ２１２８、Ｃａｒｂｏｗ２１００、Ｃａｒｂｏｗ２０８６、Ｃａｒｂｏｗ２０６６、Ｃａｒｂｏｗ２０４９及びＣａｒｂｏｗ２０１７が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１５】
作業実施例に示されるように、ポリインの小ライブラリーは、１つの強いピーク及び最少のクロストークを有する２０の別個の周波数を示すことが明らかにされている。これらのポリインは、共役長、同位体混入及び置換バリエーションの理にかなった操作を使用して調製された。これらのポリインを使用して、最大３０チャネルの並行的な光学検出を、蛍光を併用して成し遂げることができる。超多重化ポリインを用いて、１５色の生細胞イメージングを、複雑なアンミキシングの必要なしに実証することができ、小器官の１０色光学イメージングを、単一の生細胞において優れた特異性、感度及び光安定性並びに生細胞適合性で成し遂げることができる。
【００１６】
別の例示の実施形態では、本開示は、本明細書に記載されるポリインに結合される材料に関する。このポリインが結合されてもよい代表的な材料としては、ナノビーズ、ナノロッド、ナノスター及びナノワイヤ、例えば金属ナノ構造体及びカーボンナノチューブを含めたナノ粒子、マイクロビーズ、例えばポリスチレンマイクロビーズを含めた微小粒子（マイクロ粒子）、幹細胞、癌細胞、免疫細胞、神経細胞、グリア細胞、細菌、真菌、及び／又はウイルスに特異的に結合するナノボディ、抗体模倣体及び抗体を含めたナノボディ、抗体、抗体模倣体、ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡ等のＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｔｍＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム等のＲＮＡ、リボスイッチを含めた核酸、アプタマー、プライマー、プローブ、並びにペプチド核酸、モルホリノ核酸及びロックド核酸、グリコール核酸、及びトレオース核酸等の人工核酸類似体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１７】
このような例示の実施形態の１つの態様では、本開示は、物質に結合されたポリインのライブラリーに関する。複数の小器官を標的とすることができるポリインを含むライブラリーは、細胞中の小器官をイメージングするために使用することができる。幹細胞、癌細胞、免疫細胞、神経細胞、グリア細胞、細菌、ウイルス、及び／又は真菌に結合する抗体、ナノボディ、抗体模倣体、核酸等に連結されたポリインを含むライブラリーは、抗原、受容体、遺伝子材料の存在、並びに／又は生物試料に存在する幹細胞、癌細胞、免疫細胞、神経細胞、グリア細胞、細菌、ウイルス、及び／若しくは真菌の種類を特定するために使用することができる。特定の抗体、モノボディ、核酸、アプタマー等も、サイトカイン、タンパク質及び他の因子等の細胞産物の存在を判定するために使用することができる。
【００１８】
別の例示の実施形態では、上記ポリインは、超多重化スペクトルバーコーディングを使用する光学的なデータ記憶及び特定のために使用される。複数の、例えば５０，０００超の、別個のバーコードを、高スループットの診断アッセイのためのミクロンサイズのビーズにおいて容易に生成することができ、より大きい数の光学的ＩＤを単一細胞のタグ付け及びマッピングのために得ることができる。このように、本願は、光学的多重化の現在の限界を大きく広げ、多重化生細胞イメージング、高スループット医学的診断、及びインビボでの細胞アトラスを容易にする。
【００１９】
別の例示の実施形態では、上記ポリインは、培養された生細胞をイメージングするために使用される。この方法は、注目するインビボ対象から抽出された、注目するインビトロ組織細胞培養物に由来することができる生細胞を培養すること、培養された上記生細胞をウェルに播種すること、及び培地中で各ウェルをポリインの単一の色で標識することを含み、上記ポリインは１以上の色を含む。標識された培養された生細胞は、次に誘導ラマン顕微鏡法のためにイメージングチャンバーに加えられ、これらの細胞は、誘導ラマン顕微鏡法を使用してイメージングされ、各細胞は、イメージング時間のあいだ単一の色で維持される。
【００２０】
別の例示の実施形態では、上記ポリインは、培養された生細胞中の小器官をイメージングするために使用される。この方法は、注目するインビトロ組織細胞培養物に由来することができるか又は注目するインビボ対象から抽出することができる生細胞を培養すること、培養された上記生細胞をポリインと共に培地中でインキュベーションすることであって、上記ポリインは、各々、特異的な小器官標的プローブを含むこと、上記培養された生細胞を上記ポリインで標識すること、及び誘導ラマン顕微鏡法を使用して上記細胞をイメージングすることを含む。このような例示の実施形態の１つの態様では、上記培養された生細胞は、それらがインキュベーションされ上記ポリインで標識される前に、ウェル中に播種され、次いで上記細胞は上記ポリインで標識され、上記ポリインは、各々、特異的な小器官標的プローブを含み、このプローブは、異なる小器官を特異的に標的とする。代表的な小器官標的プローブとしては、上記培養された生細胞の中の細胞膜、小胞体（ＥＲ）、ゴルジ、ミトコンドリア、脂質滴、リソソーム、核及びチューブリンを標的とするプローブが挙げられる。
【００２１】
別の例示の実施形態では、上記ポリインは、スペクトル的にバーコード化されたビーズを使用する生細胞のタグ付け方法において使用される。この方法は、ポリスチレンビーズ等のポリマーマイクロビーズをスペクトル的にバーコード化されたポリインと混合すること、このビーズを上記スペクトル的にバーコード化されたポリインと結合して、バーコード化ビーズを形成すること、及び注目するインビトロ組織細胞培養物に由来することができるか又は注目するインビボ対象から抽出することができる生細胞を培養することを含む。このバーコード化ビーズは、上記培養された生細胞と共に培地中でインキュベーションされ、これにより、上記培養された生細胞はバーコード化ビーズで標識される。培養された生細胞は、次いで、誘導ラマン顕微鏡法を使用してイメージングすることができ、視野全体の上記バーコード化ビーズのスペクトルバーコードは、ハイパースペクトルＳＲＳ（Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  Ｒａｍａｎ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ：誘導ラマン散乱）画像に基づいて復号化することができる。
【００２２】
別の例示の実施形態では、上記ポリインは、フローサイトメトリー、又は細胞をソーティング／計数するための他の方法を使用して、癌細胞の集団を特定するために使用される。この方法は、１以上のポリイン（本明細書中で「炭素原子ワイヤ」とも呼ばれる）を注目する対象の生細胞と会合させることを含み、上記炭素原子ワイヤは、上記生細胞の特異的細胞表面マーカーを検出しその特異的細胞表面マーカーに結合する抗体と結合され、さらには、上記抗体は上記生細胞の細胞表面マーカーに結合する。上記生細胞は、フローサイトメーターの絞り込まれたフロー流の中に位置決めされ、フローサイトメーターの絞り込まれたフロー流内で所定の波長の光で照射される。この細胞は照射に曝され、光は、上記細胞と接触するので、屈折される。上記生細胞から生じる散乱光は周波数領域で検出され、ラマン散乱スペクトルが分析され、生細胞の個々の群が特定される。癌細胞ではない細胞は上記炭素原子ワイヤ結合抗体に連結されず、一方で、癌細胞は上記炭素原子ワイヤ結合抗体に連結される。癌細胞は、抗体に結合された上記炭素原子ワイヤによって生成される散乱光のラマンスペクトルに基づいて検出される。
【００２３】
特定の細胞型は、単一波長での、吸収ではなく散乱光のラマンスペクトルに基づいて検出することができる。この散乱は、レイリー散乱ではなく、むしろ、励起光の波長と比べて異なる波長を有するラマン散乱である。ラマンスペクトルを見ることにより、癌細胞及び非癌細胞を別個に特定することが可能である。１つの例示の実施形態では、散乱光は、幅広い範囲の波長を検出する検出器を使用して、例えば分光器及び／又はカメラを使用して検出される。
【００２４】
別の例示の実施形態では、上記ポリインは、フローサイトメトリーベースの高スループット医療診断の方法において使用される。この方法は、（特定の病状を意味している細胞の特定の分集団にある特異的生物学的マーカーと複合体を形成する１以上の抗体、核酸又は他の分子に結合されていてもよい）１以上の炭素原子ワイヤを注目する対象の生細胞と会合させることを含み、上記生細胞の特定の分集団は、炭素原子ワイヤの別個のセットと特異的に会合する。この生細胞はフローサイトメーターの中で位置決めされ、その生細胞は、フローサイトメーターの絞り込まれたフロー流内で照射され、上記炭素原子ワイヤはこの照射に曝される。生細胞からの散乱光は検出され、生細胞の個々の群を特定するために分析される。ラマン散乱スペクトルの分析は、細胞の特定の分集団への上記炭素原子ワイヤの結合（上記細胞集団に存在する場合）に基づいて特定の疾患の診断を提供することができる。炭素原子ワイヤに結合される場合、上記細胞の特定の分集団のメンバーは、結合していない細胞は散乱させないことになる特定の波長の光を散乱させることになる。従って、１以上の分集団内の細胞の存在は、検出することが可能で、特定の病状と相関づけることが可能である。例えば、患者が細菌感染又はウイルス感染を有しているか否かが明らかでない場合、細菌に、好ましくは１以上の特定の細菌に結合する抗体、核酸又は他の分子に結合された炭素原子ワイヤを使用することができ、細菌、理想的には特定の種類の細菌、が検出される場合、適切な抗生物質が投与されることが可能であり、細菌が検出されない場合、抗生物質投与は回避されうる。これは、患者が敗血症又は細菌性髄膜炎を有している場合は特に有利である可能性があり、リアルタイムアッセイは、適切な看護を受けている患者において遅延を生じることが多い通常の細胞培養ベースの手法よりも特に好ましい可能性がある。
【００２５】
別の例示の実施形態はセルソーティング方法を含む。この方法は、炭素原子ワイヤを注目する対象の生細胞と会合させることを含み、上記生細胞の特定の分集団は、炭素原子ワイヤの別個のセットと特異的に会合する。上記生細胞の特定の分集団は、分光法を使用して、その細胞の分集団と炭素原子ワイヤの別個のセットとの特異的な会合に基づいてソートされる。蛍光を使用して上記細胞を特定することよりはむしろ、誘導ラマン分光法を使用することができる。各々が異なる細胞の分集団に結合し、かつ各々が異なる「スペクトルバーコード」を有する炭素原子ワイヤのライブラリーが使用される場合、単一の生物試料が複数の細胞型の分集団についてスクリーニングされることが可能である。
【００２６】
別の例示の実施形態では、上記ポリインは、インビボで細胞アトラスを生成するために使用される。この方法は、炭素原子ワイヤを注目する対象の生細胞と会合させることであって、この生細胞の特定の分集団は、炭素原子ワイヤの別個のセットと特異的に会合することと、上記生細胞の特定の分集団間の関係をマッピングすることであって、この生細胞の特定の分集団は、それらと炭素原子ワイヤの別個のセットとの特異的な会合によって識別可能であることとを含む。
【００２７】
他の実施形態では、上記ポリインは、特定及び／又は暗号化の目的で非生物系において使用される。例示の一実施形態では、上記ポリインは、周波数暗号化を含む偽造防止方法において使用される。この方法は、ハイパースペクトルＳＲＳ画像を使用して商用販売のための製品をイメージングし、上記製品を標識するために使用された１以上のポリインの存在を特定することを含み、上記商用販売のための製品は、製品製造中に１以上のポリインで標識され、さらに上記ハイパースペクトルＳＲＳ画像中の上記１以上のポリインの不存在は、その製品が偽造品であることを意味する。
【００２８】
別の例示の実施形態では、上記ポリインは周波数暗号化による本人確認方法において使用される。この方法は、ハイパースペクトルＳＲＳ画像を使用して特定用タグをイメージングし、このタグを標識するために使用される１以上のポリインの存在を特定することを含み、上記タグは、その製造中に１以上のポリインで標識され、さらに上記ハイパースペクトルＳＲＳ画像中の上記１以上のポリインの不存在は、そのタグが偽物であることを意味する。このような例示の実施形態の１つの態様では、上記特定用タグは、磁気帯又はチップ等の別の検出方法も含むことができ、２種存在してもよい。
【００２９】
２以上のポリインを含むライブラリーが、培養された生細胞をイメージングするためのキットに存在してもよい。このキットは、１以上の非特異的に標的化されたポリイン、小器官標的ポリイン、スペクトル的にバーコード化されたポリイン、ビーズ又は他の微小粒子に取り付けられたポリイン、及び／又は金属ナノ構造体に取り付けられたポリイン、並びに培養された生細胞のイメージングにおいて上記ポリインを使用するための説明書を含むことができる。例示の一実施形態では、このキットは、非特異的に標的化されたポリイン、小器官標的ポリイン、及びスペクトル的にバーコード化されたポリイン、並びに培養された生細胞のイメージングにおいて上記ポリインを使用するための説明書を含む。
【００３０】
上記方法及び／又はキットが、癌細胞、幹細胞、免疫細胞、神経細胞、グリア細胞、細菌、真菌、ウイルス、及び／又は他の種類の生物学的粒子を探すために使用される１つの例示の実施形態では、上記ポリインは、ナノ粒子、微小粒子等の固体支持体、又は金粒子等の金属ナノ構造体に取り付けられる。この例示の実施形態の１つの態様では、上記粒子の直径は約２〜約２００ｎｍ、より典型的には約２〜約１００ｎｍ、さらにより典型的には約４〜約５０ｎｍである。
【００３１】
上記方法及び／又はキットが、ＤＮＡを特定するために使用される別の例示の実施形態では、１以上のプライマー及び／又はプローブは１以上のポリイン、例えば式Ｉのポリインに結合され、この１以上のプライマー及び／又はプローブが、本発明によらなければ蛍光標識されたプライマー及び／又はプローブが使用されてもよいスクリーニング方法において使用され、ただし、蛍光標識されたプライマー及び／又はプローブの存在又は不存在を検出するために蛍光が使用されるのに対して、本明細書に記載されるポリインで標識されたプライマー及び／又はプローブの存在又は不存在を検出するためにラマン分光法が使用される。
【００３２】
本開示の例示の実施形態のこれら及び他の目的、特徴及び利点は、添付の特許請求の範囲と併せて解釈されると、本開示の例示の実施形態の以下の詳細な説明を読めば明らかになろう。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
本開示のさらなる目的、特徴及び利点は、本開示の例証となる実施形態を示す添付の図面と併せて解釈される以下の詳細な説明から明らかになるであろう。
【００３４】
【図１】図１は、フェニル封鎖ポリインにおけるラマン振動の長さ依存性である。（ａ）２−インから６−インまでのポリインの規格化されたラマンスペクトル。これらのスペクトルは、明確のために縦軸方向にずらされている。（ｂ）ポリインのラマン強度は、両対数プロットにおいてべき乗則の依存性に従い、共役長とともに超線形的に増加する。（ｃ）ポリインのラマン周波数は、約４０ｃｍ−１のずれの間隔で長さの増加とともにほぼ直線的に減少する。
【図２】図２は、ポリインのラマン周波数展開である。（ａ）共役伸長、同位体混入及び末端封鎖のバリエーションによる統一されたポリイン骨格に対する周波数調節。（ｂ）１３Ｃ同位体標識（赤色）を有するポリインにおける周波数粗調整。（ｃ）電子供与性基及び電子吸引性基（青色）を有するポリインの周波数微調整であり、これは、粗調整範囲（赤色の破線）に補完的である。
【図３】図３は、超多重化ポリインである。（ａ）カーボンレインボー（Ｃａｒｂｏｗ）と名付けられた別個のラマン周波数を有する２０種のポリインの化学構造。（ｂ）生体直交型のスペクトル範囲におけるＣａｒｂｏｗの高度に分解されたラマンピーク。
【図４】図４は、ポリインを用いた超多重化光学イメージングである。（ａ）サブμΜ  ＳＲＳ検出感度を有する４−インの線形濃度依存性。（ｂ）４−イン結合抗体を用いた固定細胞におけるα−チューブリンの免疫染色及びイメージング。（ｃ）超多重化ポリインを用いた生細胞の１５色のタンデム蛍光ＳＲＳイメージング。（ｄ〜ｈ）生細胞イメージング用のポリインに基づく、ミトコンドリアＭｉｔｏ（ｄ）、リソソームＬｙｓｏ（ｅ）、細胞膜ＰＭ（ｆ）、小胞体ＥＲ（ｇ）及び脂肪滴ＬＤ（ｈ）を含む５つの小器官標的プローブの化学構造、並びに対応するＳＲＳ像（上側パネル）及び蛍光像（下側パネル）。（ｉ）生細胞における細胞膜、ＥＲ、ゴルジ、ミトコンドリア、脂質滴、リソソーム、核、チューブリン、及びアクチンの１０色光学イメージング。２つの種の重なりが各画像に示されている。
【図５】図５は、ポリインを用いた超多重化光学バーコーディングである。（ａ）ポリマービーズは、物理的吸収によるポリインの組み合わせローディングによって容易に符号化される。挿入画像は、バーコード化ポリスチレンビーズの明視野像を示す。（ｂ）ＳＲＳ読み出しを用いる１０個の周波数及び３つの強度におけるポリインのスペクトルバーコーディングであり、これは、３１０＝５９０４９の別個のバーコードを得ることができる。（ｃ）明視野像によって示されるように、細胞は、複数の符号化ビーズで標識されている。バーコード情報は生細胞において十分に保存されており、自発ラマン測定により明瞭に読み出される。（ｄ）ＳＲＳ顕微鏡法を用いるビーズ性状（同一性）の迅速復号化及び空間可視化。左：生細胞内部の未特定のビーズの２９４０ｃｍ−１画像。右：特徴的周波数でのハイパースペクトルイメージングによる視野全体における復号化されたビーズ。復号化されたマップにおける各ビーズの色は、（ｃ）のスペクトルバーコードに対応する。
【図６】図６は、２−インから６−インまでのポリインのＵＶ−Ｖｉｓ吸収スペクトルである。このスペクトルは、明確のために縦軸方向にずらされている。吸収極大は、追加される三重結合ごとに約３５ｎｍ赤色移動する。３セットのピークが、最高波長で振動微細構造として明瞭に観察され、これは強い振電相互作用を示す。
【図７】図７は、共役伸長、末端封鎖のバリエーション、及び同位体混入によるポリインの周波数検討である。４０種の構造が合成され、ＤＭＳＯ中で測定されたラマン周波数（単位：ｃｍ−１）と共に示されている。
【図８】図８は、超多重化ポリインを用いる生細胞の１５色イメージングである。十分に分解された周波数を有する５種の蛍光色素及び１０種のポリインの個々のチャネルが、ほとんどクロストークなく示されている。複雑なマトリクスアンミキシングの必要はなく、単純なアンミキシングが、隣接するチャネルを減算することにより行われる。
【図９】図９は、小器官標的ポリインの生細胞ＳＲＳイメージング及び蛍光性小器官マーカーとのとの共局在である。特徴的な標識パターンが、各小器官について、３ｎｍ離れて無視できるほどのクロストークしかなく示されており、これは、ポリインのシャープな振動特性を提示し、蛍光色素のスペクトル分解能をはるかに超えている。高い共局在は、市販の蛍光マーカーを伴う小器官標的ポリインの間でも観察される。
【図１０】図１０は、生細胞イメージングにおけるポリインの優れた光安定性である。ＨｅＬａ細胞は、２μΜ  ４−インＬｙｓｏと共に１時間、４μΜ  ４−インＭｉｔｏと共に１時間又は１０μΜ  ２−イン１２１３ＬＤと共に一晩インキュベーションされる。細胞は、１００フレームに対してほぼ同一の強度で連続的にイメージングされ、強度トレースは最小の減衰（＜２％）を示す。
【図１１】図１１は、生細胞におけるポリインの最小の細胞毒性及びＳＲＳレーザーの光毒性である。生ＨｅＬａ細胞及び死ＨｅＬａ細胞の標品がＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ生存率キットを用いて検証される。５つの小器官標的ポリインはすべて、カルセインＡＭ（緑色、生細胞マーカー）及びＥｔｈＤ−１（赤色、死細胞マーカー）の２色イメージングにより示されるとおり、生細胞においてほとんど細胞毒性を呈しない。また、最小の光毒性は、ＳＲＳ照射を用いた細胞において観察される。多重化生細胞イメージングにおいて同じレーザー出力及び滞留時間を使用する２９４０ｃｍ−１（タンパク質ＣＨ３）での１５フレームの連続ＳＲＳイメージングの後、同じ領域の細胞は、ＳＲＳレーザー曝露がない周囲細胞と比べて、生存率アッセイにおいて観察可能な細胞死を示さない。
【図１２】図１２は、共焦点ラマン顕微鏡によるポリスチレンビーズにおける１０種の代表的なスペクトルバーコードである。５３２ｎｍ励起に適合する５種のポリイン（Ｃａｒｂｏｗ２１４１、Ｃａｒｂｏｗ２１６０、Ｃａｒｂｏｗ２１８３、Ｃａｒｂｏｗ２２０２及びＣａｒｂｏｗ２２２６）が、自発ラマン測定のためのスペクトル的な符号化（表２）において使用される。
【図１３】図１３は、生細胞における符号化ビーズのハイパースペクトルＳＲＳイメージングである。明視野像は、細胞中の未特定のビーズの空間分布を示す。ポリインの特徴的周波数における連続的なＳＲＳイメージングは、空間中でのビーズ性状の迅速な復号化及び可視化を可能にする。色はシグナル強度を示し、黄色はより強いシグナルを示し、他方で赤色はより弱いシグナルを示す。
【図１４】図１４は、本人確認及び偽造防止のためのポリインを用いる周波数暗号化である。ＰＤＭＳ上の微視的なＣｏｌｕｍｂｉａロゴは明視野像においては類似して見え、ハイパースペクトルＳＲＳ画像は、周波数領域における両方のロゴの真の同一性を明らかにする。例えば、赤色のＣｏｌｕｍｂｉａは偽物であり、青色のＣｏｌｕｍｂｉａは真正のものである。
【図１５】図１５は、本開示の特定の例示の実施形態に係る例示的なシステムの例示的なブロック図の説明である。
【図１６】図１６ａ〜ｄは、ハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）増幅がタンパク質イメージングにおいてＳＲＳシグナルを大きく増強することができることを示す写真である。１６（ａ）は、タンパク質シグナル増幅のためのＨＣＲスキームを示す。注目する標的は、通常の免疫染色により、しかしＤＮＡイニシエータ結合二次抗体を使用して標識される。このイニシエータは、２種のラマン色素標識ヘアピンが逐次的に長い二本鎖増幅ポリマーへと集合する連鎖反応を開始する。１６（ｂ）は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏ  ６４７（Ａ６４７）を使用するウサギα−チューブリンでの増幅の定量を示す。通常のＡ６４７結合抗ウサギ抗体で免疫染色されＡ６４７結合ＨＣＲ増幅剤でＨＣＲ増幅されたＨｅＬａ細胞についての画像。上段は蛍光によって検出され、下段はＳＲＳによって検出されたものである。「より高い設定」は、１０倍高いレーザー出力を示す。１６（ｃ）は、通常のＡ６４７に対するＨＣＲ−Ａ６４７の増幅倍率が１０倍超であることを示す。エラーバーは、異なる視野間のｓ．ｅ．ｍを表す。１６（ｄ）は、ＨＣＲ法が、低存在量の膜貫通型の腫瘍マーカーＥｐＣＡＭに対してＳＲＳシグナルを大きく増強することができるということを示す。これらの図では、スケールバーは２０μｍである。
【００３５】
図面全体にわたって、同じ参照数字及び参照符号は、特段の記載がない限り、図示された実施形態の類似の特徴部、要素、コンポーネント又は部分を表すために使用される。さらに、これより本開示は図を参照して詳細に記載されるが、本開示は、例証となる実施形態に関連してそのように記載され、図及び添付の特許請求の範囲に示された特定の実施形態によって限定されない。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本開示を実施するためのいくつかの様式が、その態様に関して提示され、本明細書中で以降に論じられる。しかしながら、本開示は、記載された実施形態に限定されず、当業者は、本開示の基本的概念から逸脱せずに本開示の多くの他の実施形態が可能であるということ、及びあらゆるそのような別法も本願の範囲に含まれることになるということはわかるであろう。本開示の他の形式及び構成が本開示の教示に簡単に組み込まれうることが想定されるが、ただ１つの特定の構成が、明確性及び開示の目的で、そして範囲の限定としてではなく示され記載される。
【００３７】
本明細書で使用される小見出しは、組織立ての目的のためのみのものであり、本明細書又は添付の請求項の範囲を限定するために用いることを意図されていない。本願全体にわたって使用される場合、語句「…てもよい」は、必須の意味（すなわち、「…なければならない」を意味する）ではなく、許容の意味で（すなわち、「…する可能性を有していること」を意味する）使用される。本明細書中の用語「ａ」及び「ａｎ」は、数量の限定を表さず、参照される項目のうちの少なくとも１つの存在を表す。
【００３８】
範囲は、本明細書中では、「約」付きの１つの特定の値から、及び／又は「約」付きの別の特定の値までとして表現されてもよい。そのような範囲が表現される場合、別の例示の実施形態は、その１つの特定の値から、及び／又はその他の特定の値までを含む。同様に、先行語句「約」の使用により値が近似値として表現されている場合、その特定の値は別の例示の実施形態を形成するということが理解されよう。各範囲の端点は、他方の端点に関しても、及び他方の端点とは独立にも意味を持つということがさらに理解されよう。本明細書に開示されるいくつかの値が存在すること、及び各値もその値そのものに加えて「約」その特定の値として本明細書に開示されるということも理解される。例えば、値「１０」が開示されている場合、「約１０」も開示されている。当業者によって適切に理解されるように、ある値が開示されている場合、その値「以下の」値、「その値以上の」値及び値間の可能な範囲も開示されているということも理解される。例えば、値「１０」が開示されている場合、「１０以下の」及び「１０以上の」も開示されている。
【００３９】
本開示の種々の例示の実施形態は、以下の例示的で非限定的な定義を参照するとよりよく理解されよう。
【００４０】
Ｉ．例示的な定義
用語「独立に」は、独立に適用される変動因子が、適用ごとに独立に変動することを示すために本明細書で使用されうる。従って、Ｒ”ＸＹＲ”等の化合物において、Ｒ”が「独立に炭素又は窒素」である場合、両方のＲ”は炭素であることができるし、両方のＲ”は窒素であることができるし、又は１つのＲ”が炭素であることができかつ他方のＲ”が窒素であることもできる。
【００４１】
用語「アルキル」は、本明細書で使用する場合、特段の記載がない限り、置換及び非置換のアルキル基の両方を含めて、飽和の直鎖状、分枝状、又は環状の、第一級、第二級、又は第三級の炭化水素を指すことができる。このアルキル基は、他の点では反応を妨げないか又はプロセスにおいて改善をもたらす任意の部分で任意に置換されていてもよく、この部分としては、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシル、カルボキシル、アシル、アリール、アシルオキシ、アミノ、アミド、カルボキシル誘導体、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、アルコキシ、アリールオキシ、ニトロ、シアノ、スルホン酸、チオール、イミン、スルホニル、スルファニル、スルフィニル、スルファモイル、エステル、カルボン酸、アミド、ホスホニル、ホスフィニル、ホスホリル、ホスフィン、チオエステル、チオエーテル、酸ハロゲン化物、無水物、オキシム、ヒドラジン、カルバメート、カーボネート、尿素、ホスホン酸、又はホスホネートが挙げられるが、これらに限定されず、これらの部分は、保護されていなくてもよく、又は例えば、参照により本明細書に援用するＧｒｅｅｎｅら、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、第２版、１９９１年に教示されるように当業者に公知であるとおり、必要に応じて保護されていてもよい。具体的には、ＣＦ３及びＣＨ２ＣＦ３が挙げられる。
【００４２】
本明細書本文では、Ｃ（アルキル範囲）という用語が使用される場合は常に、この用語は、独立に、そのクラスの各メンバーを、具体的にかつ別々に示されたかの如くに含むことができる。用語「アルキル」はＣ１〜２２アルキル部分を含むことができ、用語「低級アルキル」はＣ１〜６アルキル部分を含む。関係するアルキルラジカルは、接尾辞「−アン」を接尾辞「−イル」に置き換えることにより命名されることは、当業者に理解される。
【００４３】
用語「アルケニル」は、１以上の二重結合を含むものであれば、直鎖状若しくは分枝状の、不飽和炭化水素ラジカルを指すことができる。本明細書に開示されるアルケニル基は、反応プロセスに悪影響を及ぼさない任意の部分で任意に置換されていてもよく、この部分としては、アルキル部分の置換基について記載されたものが挙げられるが、これらに限定されない。アルケニル基の非限定的な例としては、エチレン、メチルエチレン、イソプロピリデン、１，２−エタン−ジイル、１，１−エタン−ジイル、１，３−プロパン−ジイル、１，２−プロパン−ジイル、１，３−ブタン−ジイル、及び１，４−ブタン−ジイルが挙げられる。
【００４４】
用語「アルキニル」は、１以上の三重結合を含むものであれば、直鎖状若しくは分枝状の、不飽和の非環状炭化水素ラジカルを指すことができる。このアルキニル基は、反応プロセスに悪影響を及ぼさない任意の部分で任意に置換されていてもよく、この部分としては、アルキル部分の置換基について上記されたものが挙げられるが、これらに限定されない。好適なアルキニル基の非限定的な例としては、エチニル、プロピニル、ヒドロキシプロピニル、ブチン−１−イル、ブチン−２−イル、ペンチン−１−イル、ペンチン−２−イル、４−メトキシペンチン−２−イル、３−メチルブチン−１−イル、ヘキシン−１−イル、ヘキシン−２−イル、及びヘキシン−３−イル、３，３−ジメチルブチン−１−イルラジカルが挙げられる。
【００４５】
用語「アルキルアミノ」又は「アリールアミノ」は、それぞれ１つ又は２つのアルキル置換基又はアリール置換基を有するアミノ基を指すことができる。
【００４６】
用語「アシル」は、エステル基の非カルボニル部分が、直鎖状、分枝状、若しくは環状のアルキル又は低級アルキル、アルコキシアルキル（メトキシメチルが挙げられるが、これらに限定されない）、アラルキル（ベンジルが挙げられるが、これらに限定されない）、アリールオキシアルキル（フェノキシメチル等）、アリール（フェニルが挙げられるが、これらに限定されない）からなる群から選択されるカルボン酸エステルを指すことができ、この非カルボニル部分は、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩ）、アルキル（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３及びＣ４が挙げられるが、これらに限定されない）又はアルコキシ（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３及びＣ４が挙げられるが、これらに限定されない）、アルキルスルホニル又はアラルキルスルホニル（メタンスルホニルが挙げられるが、これらに限定されない）等のスルホン酸エステル、リン酸のモノエステル、ジエステル又はトリエステル、トリチル又はモノメトキシトリチル、置換ベンジル、トリアルキルシリル（例えば、ジメチル−ｔ−ブチルシリル）又はジフェニルメチルシリルで任意に置換されている。上記エステル中のアリール基は、最適には、フェニル基を含む。用語「低級アシル」は、上記非カルボニル部分が低級アルキルであるアシル基を指す。
【００４７】
用語「脂肪族」は、芳香族ではない炭化水素を指すことができ、例としては、アルカン、アルケン及びアルキン等の開いた鎖構造を有する炭化水素、理想的には１〜１２個の炭素を有するもの、並びに環状炭化水素、理想的には３〜１０個の炭素を有するものが挙げられる。
【００４８】
用語「アルコキシ」及び「アルコキシアルキル」は、アルキル部分を有する直鎖状若しくは分枝状のオキシ含有ラジカル、例えばメトキシラジカルを包含することができる。用語「アルコキシアルキル」は、アルキルラジカルに取り付けられた１以上のアルコキシラジカルを有するアルキルラジカル、つまりモノアルコキシアルキル及びジアルコキシアルキルラジカルを形成するアルキルラジカルも包含する。「アルコキシ」ラジカルは、１以上のハロ原子、例えばフルオロ、クロロ又はブロモでさらに置換されて、「ハロアルコキシ」ラジカルを与えてもよい。このようなラジカルの例としては、フルオロメトキシ、クロロメトキシ、トリフルオロメトキシ、ジフルオロメトキシ、トリフルオロエトキシ、フルオロエトキシ、テトラフルオロエトキシ、ペンタフルオロエトキシ、及びフルオロプロポキシが挙げられる。
【００４９】
用語「アルキルアミノ」は、それぞれアミノラジカルに取り付けられた１つ又は２つのアルキルラジカルを含む「モノアルキルアミノ」及び「ジアルキルアミノ」を表すことができる。アリールアミノという用語は、それぞれアミノラジカルに取り付けられた１つ又は２つのアリールラジカルを含む「モノアリールアミノ」及び「ジアリールアミノ」を表す。用語「アラルキルアミノ」は、アミノラジカルに取り付けられたアラルキルラジカル包含する。アラルキルアミノという用語は、それぞれアミノラジカルに取り付けられた１つ又は２つのアラルキルラジカルを含む「モノアラルキルアミノ」及び「ジアラルキルアミノ」を表す。さらに、アラルキルアミノという用語は、アミノラジカルに取り付けられた１つのアラルキルラジカル及び１つのアルキルラジカルを含む「モノアラルキルモノアルキルアミノ」を表す。
【００５０】
用語「アリール」は、単独又は組み合わせて、１つ、２つ又は３つの環を含む炭素環式芳香族系を意味することができ、このような環は、ペンダント式に一緒に取り付けられてもよいし、又は縮合していてもよい。アリールの非限定的な例としては、フェニル、ビフェニル若しくはナフチル、又は芳香環から水素を除いたあとに残る他の芳香族基が挙げられる。アリールという用語は、置換された部分及び非置換部分の両方を含む。
【００５１】
用語「アルカリール」又は「アルキルアリール」は、アリール置換基を有するアルキル基を指すことができる。用語「アラルキル」又は「アリールアルキル」は、アルキル置換基を有するアリール基を指す。
【００５２】
用語「ヘテロ原子」は、本明細書で使用する場合、酸素、硫黄、窒素及びリンを指すことができる。
【００５３】
用語「ヘテロアリール」又は「複素芳香族」は、本明細書で使用する場合、少なくとも１つの硫黄、酸素、窒素又はリンを芳香環に含む芳香族を指すことができる。いくつかの例示の実施形態では、ヘテロアリール環は、５〜１０個の環原子を有する部分であって、その１〜５個の環原子がヘテロ原子である部分であることができる。
【００５４】
用語「ヘテロアリールアルキル」は、Ｃ１〜１２アルキル基に取り付けられたヘテロアリール部分を指すことができる。
【００５５】
上記アリール、アリールアルキル、アルキルアリール、ヘテロアリール及びヘテロアリールアルキル基は、任意選択的に、検出されるべきポリインの能力に悪影響を及ぼさない任意の部分で置換されていてもよく、この部分としては、アルキル部分について上記されたものが挙げられるが、これらに限定されない。置換アリールの非限定的な例としては、ヘテロアリールアミノ、Ｎ−アリール−Ｎ−アルキルアミノ、Ｎ−ヘテロアリールアミノ−Ｎ−アルキルアミノ、ヘテロアラルコキシ、アリールアミノ、アリールアルキルアミノ、アリールチオ、モノアリールアミドスルホニル、アリールスルホンアミド、ジアリールアミドスルホニル、モノアリールアミドスルホニル、アリールスルフィニル、アリールスルホニル、ヘテロアリールチオ、ヘテロアリールスルフィニル、ヘテロアリールスルホニル、アロイル、ヘテロアロイル、アラルカノイル、ヘテロアラルカノイル、ヒドロキシアラルキル、ヒドキシヘテロアラルキル、ハロアルコキシアルキル、アリール、アラルキル、アリールオキシ、アラルコキシ、アリールオキシアルキル、飽和ヘテロシクリル、部分飽和ヘテロシクリル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールオキシアルキル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、アリールアルケニル、及びヘテロアリールアルケニル、カルボアラルコキシが挙げられる。用語「ハロ」は、本明細書で使用する場合、クロロ、ブロモ、ヨード及びフルオロを含むことができる。
【００５６】
用語「複素環式」、「ヘテロシクリル」及びシクロヘテロアルキルは、環の中に酸素、硫黄、窒素又はリン等の少なくとも１つのヘテロ原子が存在する非芳香族環状基を指すことができる。
【００５７】
ヘテロアリール基及び複素環式基の非限定的な例としては、フリル、フラニル、ピリジル、ピリミジル、チエニル、イソチアゾリル、イミダゾリル、テトラゾリル、ピラジニル、ベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル、キノリル、イソキノリル、ベンゾチエニル、イソベンゾフリル、ピラゾリル、インドリル、イソインドリル、ベンゾイミダゾリル、プリニル、カルバゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、１，２，４−チアジアゾリル、イソオキサゾリル、ピロリル、キナゾリニル、シンノリニル、フタラジニル、キサンチニル（ｘａｎｔｈｉｎｙｌ）、ハイポキサンチニル（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｙｌ）、チオフェン、フラン、ピロール、イソピロール、ピラゾール、イミダゾール、１，２，３−トリアゾール、１，２，４−トリアゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、ピリミジン又はピリダジン、及びプテリジニル、アジリジン類、チアゾール、イソチアゾール、１，２，３−オキサジアゾール、チアジン、ピリジン、ピラジン、ピペラジン、ピロリジン、オキサジラン類、フェナジン、フェノチアジン、モルホリニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピラジニル、キノキサリニル、キサンチニル、ハイポキサンチニル、プテリジニル、５−アザシチジニル（ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｙｌ）、５−アザウラシリル、トリアゾロピリジニル、イミダゾロピリジニル、ピロロピリミジニル、ピラゾロピリミジニル、アデニン、Ｎ６−アルキルプリン、Ｎ６−ベンジルプリン、Ｎ６−ハロプリン、Ｎ６−ビニルプリン、Ｎ６−アセチレン性プリン、Ｎ６−アシルプリン、Ｎ６−ヒドロキシアルキルプリン、Ｎ６−チオアルキルプリン、チミン、シトシン、６−アザピリミジン、２−メルカプトピリミジン、ウラシル、Ｎ５−アルキルピリミジン類、Ｎ５−ベンジルピリミジン類、Ｎ５−ハロピリミジン類、Ｎ５−ビニルピリミジン、Ｎ５−アセチレン性ピリミジン、Ｎ５−アシルピリミジン、Ｎ５−ヒドロキシアルキルプリン、及びＮ６−チオアルキルプリン、及びイソオキサゾリルを挙げることができる。上記複素芳香族基は、アリールについて上記したとおり、任意に置換されていてもよい。これらの複素環式基又は複素芳香族基は、ハロゲン、ハロアルキル、アルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、カルボキシル誘導体、アミド、アミノ、アルキルアミノ及びジアルキルアミノからなる群から選択される１以上の置換基で任意に置換されていてもよい。この複素芳香族は、所望に応じて部分的に又は完全に水素化されていてもよい。非限定的な例として、ジヒドロピリジンがピリジンの代わりに使用されてもよい。上記複素環式基又はヘテロアリール基上の官能性の酸素及び窒素の基は、必要に応じて又は所望に応じて保護されていてもよい。好適な保護基は当業者にとっては周知であり、その例としては、トリメチルシリル、ジメチルヘキシルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル及びｔ−ブチルジフェニルシリル、トリチル又は置換トリチル、アルキル基、アセチル及びプロピオニル等のアシル基、メタンスルホニル、並びにｐ−トルエンスルホニルが挙げられる。上記複素環式基又は複素芳香族基は、反応に悪影響を及ぼさない任意の部分、例えばアリールについて上記されたもの（これらに限定されない）で置換されていてもよい。
【００５８】
用語「核酸」は、ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡを含めたＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｔｍＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム等のＲＮＡ、リボスイッチ、アプタマー、プライマー、プローブ、並びにペプチド核酸、モルホリノ核酸及びロックド核酸、グリコール核酸、及びトレオース核酸等の人工核酸類似体を指すことができる。
【００５９】
用語「ペプチド」は、１つのアミノ酸のカルボキシル基によって別のアミノ酸のアミノ基に連結された２〜１００個のアミノ酸を含有する天然化合物又は合成化合物を指すことができる。
【００６０】
用語「保護（された）」は、本明細書で使用する場合、及び特段の記載がない限り、さらなる反応を防止するため、又は他の目的のために酸素原子、窒素原子又はリン原子に付加される基を指すことができる。実に様々な酸素及び窒素の保護基は、有機合成の当業者に公知であり、例えば、前出のＧｒｅｅｎｅら、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓに記載されている。
【００６１】
用語「スペクトル的にバーコード化されたポリイン」は、各々が特有のスペクトルバンドを有する複数のポリインが使用されるところに関することができる。これらの複数のポリインは、ナノ粒子又は微小粒子等の固体支持体に結合されることが可能であるし、又はナノ粒子又は微小粒子等の固体支持体内に封入されることが可能である。ナノ粒子は、典型的には約２〜約１００ｎｍのサイズを有し、微小粒子は、典型的には約０．１〜１００μｍの直径を有する。上記固体支持体は、注目する生物学的粒子に特異的に結合することが知られている結合メンバーに結合されることもできる。生物試料由来のラマンスペクトルにおいてポリインのピークを測定することにより、注目する生物学的粒子が生物試料に存在するか否かを判定することができる。複数のポリインの存在は、複数のスペクトルバンドの生成を可能にし、これにより、固体支持体に特有の「バーコード」が提供される。いくつかの例示の実施形態では、固体支持体におけるポリインのスペクトルバーコーディングは、マイクロ流体力学を使用するなどの制御された物理的吸収、又は制御された化学合成により成し遂げることができる。
【００６２】
用語「固体支持体」は、本明細書で使用する場合、上記ポリインの１以上、及び、理想的には、抗体、核酸等の結合メンバーが結合される任意の種類の固体支持体を指す。例としては、ナノビーズ、ナノロッド、ナノスターを含めたナノ粒子、並びに金属ナノ構造体及びカーボンナノチューブ等のナノワイヤ、ポリスチレンマイクロビーズ等のマイクロビーズを含めた微小粒子、並びにチップが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６３】
本明細書で使用する場合、フローサイトメトリーは、細胞計数、セルソーティング（細胞選別）、バイオマーカー検出及びタンパク質工学で用いられるレーザーベース又はインピーダンスベースの、生物物理学的な技術であることができる。細胞は、流体の流れに懸濁され、電子的な検出装置に通される。フローサイトメーターは、毎秒数千までの粒子の物理的及び化学的な特徴の同時マルチパラメトリック分析を可能にする。一般的なバリエーションには、注目する粒子をその光学特性に基づいて物理的に分離しこれにより精製するフローサイトメーターの分析能力を選別装置に関連づけることが含まれる。このようなプロセスはセルソーティングと呼ばれ、機器は一般に「セルソーター」と呼ばれる。
【００６４】
最近のフローサイトメーターは、毎秒数千もの粒子を「リアルタイム」で分析するために使用することができ、セルソーターとして構成される場合には、特定の光学特性を有する粒子を同程度の速度で活発に分離及び単離することができる。
【００６５】
フローサイトメーターは、例えば、５つの主要構成要素、フローセル、測定システム、検出器、増幅システム、及びシグナルの分析のためのコンピューターを有することができる。フローセルは、細胞が検知のために一列縦隊で光線を通過するように細胞を運び整列させる液体流（シース液）を有する。測定システムは、一般に、インピーダンス（又は電気伝導率）の測定、並びに光シグナルを生じる光学系  −  ランプ（水銀、キセノン）；高出力水冷式レーザー（アルゴン、クリプトン、色素レーザー）；低出力空冷式レーザー（アルゴン（４８８ｎｍ）、赤色−ＨｅＮｅ（６３３ｎｍ）、緑色−ＨｅＮｅ、ＨｅＣｄ（ＵＶ））；ダイオードレーザー（青色、緑色、赤色、紫色）を使用する。検出器及びアナログデジタル変換（ＡＤＣ）システムは、前方散乱光（ＦＳＣ）及び側方散乱光（ＳＳＣ）のアナログ測定値並びに色素特異的蛍光シグナルを、コンピューターによって処理することができるデジタル信号に変換する。増幅システムは、線形的であってもよいし、又は対数的であってもよい。
【００６６】
フローサイトメーターを使用して試料からデータを収集するプロセスは、「取得（アクイジション）」と呼ぶことができる。取得は、フローサイトメーターに物理的に接続されたコンピューター、及びサイトメーターとのデジタルインターフェースを取り扱うソフトウェアによって媒介されることが可能である。このソフトウェアは、試験されている試料に対してパラメータ（例えば、電圧、補正）を調整することができ、また、パラメータが正しく設定されていることを確実にするために、試料データを取得しつつ最初の試料情報を表示することを支援する。
【００６７】
フローサイトメーターは、通常、複数のレーザー及び蛍光検出器を有することができる。レーザー及び検出器の数が増えると、複数の抗体標識が可能になり、標的集団をそれらの表現型マーカーによりより正確に特定することが可能になる。特定の機器は、個々の細胞のデジタル画像を撮影することさえ可能であり、これにより、細胞内又は細胞の表面上の蛍光シグナルの位置の分析が可能になる。
【００６８】
本明細書で使用する場合、誘導ラマン分光法フローサイトメトリーは、誘導ラマン分光法をフローサイトメトリーと組み合わせる技術であることができる。ＳＲＳフローサイトメトリー、より具体的には、多重誘導ラマン散乱プロセスは、例えば、Ｚｈａｎｇら、「Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  Ｒａｍａｎ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ｆｏｒ  ｌａｂｅｌ−ｆｒｅｅ  ｓｉｎｇｌｅ−ｐａｒｔｉｃｌｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ」、Ｏｐｔｉｃａ、第４巻、第１号／２０１７年１月に記載されている。例えば、３２チャネルの検出器アレイを使用することにより、ＳＲＳフローサイトメーターは、２００ｃｍ−１のスペクトル範囲及び毎秒１０，０００粒子超のスループットで単一の粒子を検出することができる。
【００６９】
誘導ラマン散乱（ＳＲＳ）顕微鏡法は、化学結合の振動周波数を見るイメージング技術であることができる。異なるタイプの結合は、周囲の分子環境に基づいて異なる周波数を有することになる。例えば、ＤＮＡ分子のＣ−Ｈ結合（２，９５６ｃｍ−１）は、タンパク質のＣ−Ｈ結合（２，９３１ｃｍ−１）又は脂質のＣ−Ｈ結合（２，８５４ｃｍ−１）と比べて、わずかに異なる振動周波数を有している。従来のラマン分光法とは異なり、ＳＲＳは、試料に関するデータを迅速に得ることができ、リアルタイムのインビボ研究を可能にする。
【００７０】
ハイパースペクトルイメージングは、スペクトル（分光）イメージング又はスペクトル解析と一般に称されるクラスの技術の一部であることができる。ハイパースペクトルイメージングは、マルチスペクトルイメージングに関連する。ハイパースペクトルイメージング（ＨＳＩ）は、連続及び隣接する範囲の波長（例えば０．１ｎｍのステップで４００〜１１００ｎｍ）を使用するのに対し、マルチスペクトルイメージング（ＭＳＩ）は、選ばれた場所で小集団の目的波長（例えば２０ｎｍのステップで４００〜１１００ｎｍ）を使用する。
【００７１】
マルチスペクトルイメージングは、不連続で多少狭いバンドでいくつかの画像を扱う。「不連続で多少狭い」ことは、カラー写真から、可視波長におけるマルチスペクトルイメージングを区別するものである。マルチスペクトルセンサーは、可視から長波長の赤外までのスペクトルをカバーする多くのバンドを有してもよい。マルチスペクトル画像は、対象（物体）の「スペクトル」を生成しない。
【００７２】
ハイパースペクトルイメージングは、連続スペクトル範囲にわたって狭いスペクトルバンドをイメージングすることを扱うことができ、その現場のすべての画素のスペクトルを生成することができる。２０バンドしか有しないセンサーも、それが、２０バンドが各々１０ｎｍの幅を有して範囲５００〜７００ｎｍをカバーする場合には、ハイパースペクトル的であることができる。ハイパースペクトルイメージングでは、記録されたスペクトルは、微細な波長分割を有し、広い範囲の波長をカバーする。ハイパースペクトルイメージングは、間隔をあけたスペクトルバンドを測定するマルチスペクトルイメージングとは異なり、隣接するスペクトルバンドを測定する。
【００７３】
本明細書で使用する場合、用語「振動顕微鏡法」は、共焦点ラマン顕微鏡法及びラインスキャンラマン顕微鏡法等の自発ラマン顕微鏡法、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）顕微鏡法、チップ増強ラマン散乱（ＴＥＲＳ）顕微鏡法、赤外顕微鏡法、赤外ＡＦＭ顕微鏡法、赤外光熱顕微鏡法、及びコヒーレント反ストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ）顕微鏡法等のコヒーレントラマン顕微鏡法を含むことができる。
【００７４】
上に提供された例示的で非限定的な定義を踏まえて、以降には、上記ポリイン、このポリインと種々の生物学的部分及び非生物学的部分との結合体、複数の上記ポリインを含むライブラリー、生物学的応用における上記ポリインの使用、及び非イメージング応用を含めた非生物学的応用における上記ポリインの使用が記載される。
【００７５】
Ｉ．ポリイン
本明細書に記載されるポリインは、超多重化されたイメージング及び分析における幅広い応用を有する新しいクラスの一次元光学材料を代表することができる。これらの化合物は、光学的超多重化技術の現在の限界を広げ、ライフサイエンス、医学的診断、創薬及びデータセキュリティにおいて新しい機会を提供する。
【００７６】
フェニル、アルキル又は他の末端封鎖基を有する一クラスのポリイン化合物が設計され、合成され、特性解析され、超多重化検出のためにそれらの特有の光学特性が利用された。ポリインは、交互の一重結合及び三重結合を有するｓｐ混成の炭素原子の直鎖であり、本明細書中では炭素原子ワイヤとも称される。共役伸長、末端封鎖のバリエーション及び同位体編集によるポリインの電子密度及び核質量の両方に対する系統的な調節を通して、ラマン散乱による超多重化されたイメージング及びスペクトルバーコーディングの両方について並外れた光学材料であるポリインが開発された。
【００７７】
上記ポリインは、２〜２０個、好ましくは３〜２０個、より典型的には、３〜１０個程度の三重結合を単結合と交互に備え、好ましくは２〜６個の三重結合を備える。当該ポリインは、１以上の末端封鎖基を備え、これは、当該ポリインの１つの末端又は両末端に存在することができる。
【００７８】
当該ポリインは、その分子のいずれかの末端又は両末端に末端封鎖基を含むことができる。例示の一実施形態では、１つ又は両方の末端封鎖基は、独立に、アリール又はヘテロアリール環であり、他の実施形態では、１つ又は両方の末端封鎖基は、アルキル基、アルキルアリール基、アリールアルキル基、複素環式基、ヘテロアリールアルキル基、シリル基、金属原子（すなわち、末端炭素原子に共有結合されているか又は末端アセチレンにおける三重結合に錯体形成しているかの、銀アセチリド又は水銀アセチリド等の金属アセチリド）又は金属錯体基である。アルキル基が１つ又は両方の末端封鎖基として使用されるいくつかの例示の実施形態では、そのアルキル基は、直鎖状アルキル基よりはむしろ分枝状又は環状のアルキル基であり、情報と信念に基づくと、分枝、又はシクロアルキル基によってもたらされる立体障害は、当該ポリイン分子を安定化することができる。
【００７９】
いくつかの例示の実施形態では、上記アリール環及び／又はヘテロアリール環は、電子供与性基又は電子吸引性基であってもよい１以上の官能基で官能化されている。
【００８０】
このような例示の実施形態の１つの態様では、上記ポリインは、下記構造
【化２】
2020532497.tif 000004
を有し、
上記式中、ｎは、１〜１９、典型的には２〜１９、さらにより典型的には３〜５の整数であり、
Ｒ１及びＲ２は、独立に、アリール、Ｃ１〜２０アルキル、シリル基、金属原子及び金属錯体、アリール−Ｃ１〜２０アルキル、Ｃ１〜２０アルキル−アリール、ヘテロアリール、ヘテロアリール−Ｃ１〜２０アルキル又はＣ１〜２０アルキル−ヘテロアリールであり、これらの基の各々は、任意に１以上の置換基で置換されていてもよく、
これらの基における水素のうちの１以上は、重水素化されていてもよく、
上記アルキン部分における炭素のうちの１以上は１３Ｃ標識されていてもよく、
上記アリール、Ｃ１〜２０アルキル、アリール−Ｃ１〜２０アルキル、Ｃ１〜２０アルキル−アリール、ヘテロアリール、ヘテロアリール−Ｃ１〜２０アルキル又はＣ１〜２０アルキル−ヘテロアリール基のうちの１以上にある上記置換基は、金属ナノ構造体、抗体、ペプチド、核酸、脂質、炭水化物に結合することができる官能基；上記ポリインのラマンスペクトルを非置換の基に対してシフトさせることができる電子吸引性基又は電子供与性基；特異的な小器官、細胞区画、（上記ポリインが蛍光及びラマン分光法の両方を使用して検出されるようにできる）蛍光標識、ビオチン又はストレプトアビジンを標的とする基を含む。
【００８１】
上記アリール、Ｃ１〜２０アルキル、アリール−Ｃ１〜２０アルキル、Ｃ１〜２０アルキル−アリール、ヘテロアリール、ヘテロアリール−Ｃ１〜２０アルキル又はＣ１〜２０アルキル−ヘテロアリール基のうちの１以上にある代表的な置換基としては、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシル、カルボキシル、アシル、アリール、アシルオキシ、アミノ、アミド、カルボキシル誘導体、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、アルコキシ、アリールオキシ、ニトロ、シアノ、スルホン酸、チオール、イミン、スルホニル、スルファニル、スルフィニル、スルファモイル、エステル、カルボン酸、アミド、ホスホニル、ホスフィニル、ホスホリル、ホスフィン、チオエステル、チオエーテル、酸ハロゲン化物、無水物、オキシム、ヒドラジン、カルバメート、カーボネート、尿素、ホスホン酸、及びホスホネートのうちの１以上が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８２】
代表的なポリインとしては、作業実施例に記載されるような、Ｃａｒｂｏｗ２１７２、Ｃａｒｂｏｗ２１４１、Ｃａｒｂｏｗ２１２８、Ｃａｒｂｏｗ２１００、Ｃａｒｂｏｗ２０８６、Ｃａｒｂｏｗ２０６６、Ｃａｒｂｏｗ２０４９及びＣａｒｂｏｗ２０１７が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８３】
このような例示の実施形態の別の態様では、上記ポリインは、１０％未満のクロストークで十分に分解されたラマンピークを有する。
【００８４】
抗体及び他の結合メンバーへの結合
種々の結合メンバーが、本明細書に記載されるポリインへの結合に好適であり、この結合により、上記ポリインが本明細書に記載される種々の検出方法で使用できるようになりうる。
【００８５】
いくつかの例示の実施形態では、結合メンバーは、注目する標的に特異的に結合し、またポリインに取り付けられることができるその能力について選択される。好適な結合メンバーとしては、例えば、抗原、抗体、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、抗ビオチン、葉酸、葉酸結合タンパク質、ＩｇＧ、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、炭水化物、レクチン、脂質及び核酸が挙げられる。この結合メンバーとしては、ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡ等のＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｔｍＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム等のＲＮＡ、リボスイッチを含めた核酸、アプタマー、プライマー、プローブ、並びにペプチド核酸、モルホリノ核酸及びロックド核酸、グリコール核酸、及びトレオース核酸等の人工核酸類似体も挙げられる。
【００８６】
上記ポリインは、末端封鎖基として直接、又は１つ又は両方の末端封鎖基上の官能基に取り付けることにより上記結合メンバーに結合することができる。当業者は、どのようにして結合メンバーをアルキンに、又は末端封鎖基に取り付けるかを容易に理解することができる。
【００８７】
例えば、アリール末端封鎖基上のカルバメート部分は、抗体又はペプチドを結合するために使用することができる。当該ポリインの末端アルキン基は、例えば、パラジウムカップリング反応を使用してアリール／ヘテロアリールハロゲン化物に結合することができる。プライマー又はプローブの一部である塩基上にハロゲンが存在する場合、このタイプのカップリング反応は、プライマー又はプローブを末端封鎖基としてのポリインに直接取り付けるために使用することができる。同様に、このタイプの化学は、他の核酸を当該ポリインに取り付けるために使用することができる。例えば、ＮＨＳエステル及びマレイミド基を使用すること等のアミン、カルボキシル、及びチオールベースの架橋化学、又はクリックケミストリーは、ペプチド、タンパク質及び核酸をポリイン結合するために使用することができる。
【００８８】
小器官を標的とする部分への結合
上記ポリインは、中性の骨格及び高い膜透過性を有し、従って、生細胞、小器官特異的イメージングプローブへと官能化されることが可能である。適切なリンカー又は官能基を、異なる標的指向基を当該ポリインに取り付けるために使用することができる。例示の一実施形態では、リンカー又は官能基は、アリール末端封鎖基又はアルキル末端封鎖基に存在する。
【００８９】
以下は、小器官を標的とする部分の非限定的な例である。トリフェニルホスホニウム（ＴＰＰ＋）は、正電荷に起因してミトコンドリアマトリックスに対して高親和性を有するモチーフである。同様にミトコンドリアマトリックスを標的とする他の正に帯電したモチーフも使用することができる。
【００９０】
リソソーム内腔は酸性であり、塩基性のモチーフは、リソソーム内部でプロトン化されてトラップ（捕捉）されることができる可能性がある。モノアルキルアミン及びジアルキルアミンは、使用することができる代表的なモチーフである。例としては、ジメチルアミン、ジエチルアミン、ジプロピルアミン、ジイソプロピルアミン、ジブチルアミン、及びモルホリン基が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９１】
細胞膜は、アニオン性リン酸頭部を含む。カチオン性のジアンモニウム基は、これらのアニオン性リン酸頭部との相互作用を介して細胞膜を染色するために使用することができる。
【００９２】
異なる末端基、例えばペンタフルオロベンズアミド基又はグリベンクラミド基を有するエチレングリコール鎖は、小胞体を標的とするために使用することができる。
【００９３】
脂質滴は、脂肪酸と相互作用することが知られており、そのためカルボン酸及び／又はカルボキシレート末端脂肪酸鎖（典型的には８〜２１個の炭素長）は、上記ポリインの末端へ直接、又はアリール末端封鎖基へ取り付けられることが可能である。これらの脂肪酸鎖は脂肪酸と似ており、このため、この官能性を有するポリインは、効率よく脂質滴に組み込まれることが可能であるプローブとして機能することができる。
【００９４】
ポリインでグラフトされたポリマー／デンドリマー
シグナル強度をさらに増強するために、多重ナノスケールシグナル増幅アプローチを通して超多重化検出のための次世代ポリインプローブを開発することができる。
【００９５】
デンドリマー並びにボトルブラシ型及び星型のナノ材料等のポリマーナノ構造体は、トポロジカルなシグナル増幅のために複数のポリインでグラフトすることができる。例えば、デンドリマーは、ダイバージェント（ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ）法、コンバージェント（ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ）法、及びクリック法を使用して段階的なやり方で調製される。ダイバージェント合成では、デンドリマーは、多官能性コアから組み立てられ、この多官能性コアは、一連の反応、通常はＭｉｃｈａｅｌ反応により外に向かって拡張される。コンバージェント合成では、デンドリマーは、最終的に球体の表面になる小分子から構築され、反応は内に向かって進行し、内側へと構築され、最終的にコアに取り付けられる。この方法は、ダイバージェント合成が使用される場合よりも、より単分散性であるデンドリマーを与える傾向があるが、そのデンドリマーはより小さい傾向もある。クリックケミストリーは、例えば、Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ反応、チオール−エン反応及びチオール−イン反応、及びアジド−アルキン反応を使用する。（末端封鎖基が取り付けられる前の）上記ポリインは、末端アセチレン性基を含むため、この基は、上記ポリインをデンドリマーに取り付けるためのチオール−イン反応、アジド−アルキン反応、及びＤｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ反応において使用することができる。
【００９６】
ポリインコーティング
例えばナノスフェア（ナノ球体）、ナノロッド及びナノスター等の貴金属ナノ構造体は、表面増強ラマン散乱によるシグナル増幅のために、物理吸着又は化学修飾を使用してポリイン分子でコーティングされることが可能である。ナノ構造体をコーティングするための従来からのコーティング方法を用いることができる。例えば、ナノ粒子をコーティングする１つの方法は、ａ）ナノ粒子、ｂ）コーティング前駆体及びｃ）このコーティング前駆体と反応することができる１以上の反応性基を含む１以上のポリインをせん断にかける工程であって、これらのコーティング前駆体及び１以上のポリインが反応してナノ構造体上にコーティングを与える工程を備える。
【００９７】
微小粒子／ナノ粒子への取り付け
いくつかの例示の実施形態では、ポリインは、ナノ粒子及び／又は微小粒子（ナノ粒子、ポリスチレンビーズ、金粒子等）に結合される。
【００９８】
ナノ粒子又は微小粒子が反応性官能基を含む場合、そのナノ粒子又は微小粒子上の官能基と反応する官能基を含むポリインを合成することができ、ナノ粒子又は微小粒子と当該ポリインとの間の共有結合による取り付けを形成することができる。しかしながら、このアプローチの１つの限界は、粒子に取り付けられるポリインの量が、各粒子上の基の数及び当該ポリインと首尾よく連結されるこのような基の百分率に応じて変わりうることであり、各粒子上の基の数自体が、例えば、粒径に応じて変わりうることである。
【００９９】
いくつかの例示の実施形態では、粒子に比較的一貫した量のポリイン標識を与えることが所望される。比較的一定の粒径を有し、比較的一貫した量の結合されたポリインを有する粒子を製造するための１つの方法は、デンドリマーを使用することである。デンドリマーは、デンドリマーの末端にある活性官能基によって、既知量の上記ポリインを含むことができる。
【０１００】
当該ポリインは、化学的手段によりナノ粒子／微小粒子に結合されることが可能である。一定範囲の官能化された基が、上記ポリイン上に存在することができ、そのポリインをナノ粒子／微小粒子に取り付けるために使用することができ、その例としては、低分子量リガンド（Ｃｈｅｎら、Ｌｉｇａｎｄ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｉｎ  ｖｉｖｏ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ、１２９（１８）（２００７）、５７９８−５７９９頁）、ペプチド（Ｍｕら、Ａｎｔｉ−ＨＥＲ２／ｎｅｕ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｉｒｏｎ  ｏｘｉｄｅ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ  ｔｏ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ、Ｎａｎｏｓｃａｌｅ（２０１５）、タンパク質（Ｍｅｚｉａｎｉ及びＳｕｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｒｏｍ  ｒａｐｉｄ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌ  ｆｌｕｉｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ、１２５（２６）（２００３）、８０１５−８０１８頁）、多糖（Ｌｅｍａｒｃｈａｎｄら、Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ−ｄｅｃｏｒａｔｅｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．、５８（２）（２００４）、３２７−３４１頁）、多価不飽和脂肪酸及び飽和脂肪酸（Ｆａｈｍｙら、Ｓｕｒｆａｃｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｐｏｌｙｅｓｔｅｒｓ  ｗｉｔｈ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｄｒｕｇ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２６（２８）（２００５）、５７２７−５７３６頁）、ＤＮＡ（Ｃｓａｋｉら、Ｔｈｅ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ＤＮＡ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｇｏｌｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｌａｂｅｌｓ  ａｆｔｅｒ  ｍｅｔａｌ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ、Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４（１２）（２００３）、１２６２頁）、抗体（Ａｒｒｕｅｂｏら、Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｊ．Ｎａｎｏｍａｔｅｒ．、２００９（２００９）、３７頁）、プラスミド、並びにｓｉＲＮＡが挙げられる。
【０１０１】
タンパク質／ペプチド／抗体を金ナノ粒子に結合するための２つの主な戦略は、古典的な受動吸着、及び共有結合による結合である。
【０１０２】
ＩＩ．ポリインライブラリー
例示の一実施形態では、本明細書に記載されるポリイン（複数）は、ライブラリー、例えば２〜５０，０００のメンバー、より典型的には２〜約２００のメンバー、さらにより典型的には２〜約１００のメンバー、なおより典型的には約４〜約５０のメンバーを有するライブラリーに存在する。
【０１０３】
このような例示の実施形態のいくつかの態様では、当該ポリインライブラリーは、幹細胞、癌細胞、細菌、ウイルス、又は真菌を含めた異なる種類の細胞に特異的な抗体に連結された複数のポリインを含む。
【０１０４】
このような例示の実施形態の他の態様では、当該ポリインライブラリーは、幹細胞、癌細胞、細菌、ウイルス、又は真菌を含めた異なる種類の細胞に特異的な核酸に連結された複数のポリインを含む。
【０１０５】
このような例示の実施形態のさらに他の態様では、当該ポリインライブラリーは、プライマーに連結された複数のポリインを含み、このプライマーは、チトクロムＰ４５０変異等の一塩基多型の存在を特定するため、薬物耐性を示しうるＨＩＶ等のウイルスに存在する、若しくはＨＥＲ２等の癌細胞に存在する変異、及び患者のための適切な治療過程を決定する際に有用である可能性がある他の変異の種類を特定するために、遺伝子スクリーニングへの応用で使用することができる。この態様では、ポリイン標識の使用は、ＰＣＲ技術における蛍光標識の使用を置き換え、ラマン分光法の使用は蛍光の検出を置き換える。すべてが識別可能なシグナルを有する複数の「バーコード化」プライマーが一度にスクリーニングできるので、これは、１回のスキャンでの複数の変異の同時検出を可能にする。
【０１０６】
このような例示の実施形態のすべての態様では、個々のポリインは、ラマン分光法において互いに対して最小の「クロストーク（相互干渉）」でシグナルを提供する複数のポリインを提供するように、同位体標識、アルキン部分の数の差、及び末端封鎖基官能化等の構造的な差異を含むことができる。
【０１０７】
当該ライブラリーは、単一の強いピーク及び最少のクロストークを有し、約１８５０〜約２６００ｃｍ−１の範囲の最大５０個の別個の周波数を有するポリインを含むことができる。最大５０チャネルの並行的な光学検出は、この周波数範囲内の蛍光を併用して成し遂げることができる。超多重化ポリインを用いて、最大５０色の生細胞イメージング、典型的には最大３０色の生細胞イメージング、より典型的には最大１５色の生細胞イメージングが、複雑なアンミキシングの必要もなく、この周波数範囲内で成し遂げることが可能である。
【０１０８】
加えて、光学的なデータ記憶及び特定への応用に有用なライブラリーは、かなりの数の別個のバーコード、例えば、最大約１０１３個のバーコード、いくつかの例示の実施形態では、少なくとも約５０，０００以上の別個のバーコードを生成するに十分なポリインを含むことができる。これらの別個のバーコードは、例えば、最大約２００個の個々のポリインしか含まないライブラリーを用いるだけでも成し遂げることができる。例えば、バーコードは、各々が自身のシグナル、好ましくは、隣接するポリイン（すなわち、別のポリインのラマンスペクトルピークに隣接したラマンスペクトルピークを有するポリイン）に関連するシグナルと約１０％超の「クロストーク」をしないシグナルを有する１以上のポリインを含むことができる。
【０１０９】
ライブラリー中にわずか３つのポリインがあるだけでも、数多くのバーコードを作製することができる。例えば、それらのポリインのすべてが同じ濃度で存在する場合、ポリイン１、ポリイン２、ポリイン３、ポリイン１及びポリイン２、ポリイン１及びポリイン３、ポリイン２及びポリイン３、並びにポリイン１、ポリイン２及びポリイン３の合計７つの組み合わせを有することができる。しかしながら、これらのポリインは異なる濃度で存在することができ、異なる濃度は、異なる高さ（シグナル強度）を有するラマンスペクトルピークを与えることになる。典型的には、最大約５個の異なる濃度を区別することができる。そのため、わずか３つのポリインがあれば、可能な５つの異なる濃度で、６３個の可能な組み合わせ（すなわち、２００超の可能な組み合わせ）を有することができる。従って、最大２００個のポリインがあれば、そのポリインの複数の可能な濃度で、膨大な数の可能なポリインの組み合わせを有することが可能である。
【０１１０】
複数の濃度で存在するか否かにかかわらず複数のポリインを得るために、固体構造、例えばＩＤバッジ、パスポート、運転免許証、クレジットカード、商品タグ、通貨、無記名債券又は他の金融商品等の債券、及び医薬、容器、衣類、靴、ハンドバッグ、ＤＶＤ等の製造品の中でポリインの完全混和を有することは、有利であることができる。このように標識された物品の特有のラマンシグネチャー（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）は、身元詐称（なりすまし犯罪）、財産窃盗、偽造、文書偽造、及び不正薬品の販売及び／又は消費を防止するのに役立つことができる。
【０１１１】
いくつかの例示の実施形態では、当該ライブラリーは、ナノ粒子及び／又は微小粒子と複合体形成したポリインを含み、他の実施形態では、当該ライブラリーは、ナノ粒子及び／又は微小粒子と複合体形成していないポリインを含む。さらなる他の実施形態では、当該ライブラリーは、ナノ粒子及び／又は微小粒子と複合体形成したポリインとナノ粒子及び／又は微小粒子と複合体形成していないポリインとの組み合わせを含む。
【０１１２】
ＩＩＩ．ポリイン合成
ポリイン合成の１つの態様は、２以上のアセチレン部分を一緒にカップリングしてポリインを形成することを伴う。代表的なカップリング化学としては、Ｇｌａｓｅｒカップリング、Ｅｇｌｉｎｔｏｎ反応、Ｈａｙカップリング、及びＣａｄｉｏｔ−Ｃｈｏｄｋｉｅｗｉｃｚカップリングが挙げられる。
【０１１３】
Ｅｇｌｉｎｔｏｎ反応は、末端アルキンの酸化的カップリングであり、ピリジン中での末端アルキンと化学量論量の銅（ＩＩ）塩との反応により及び対称ビスアセチレン又は環状ビスアセチレンの合成を可能にする。
【０１１４】
Ｇｌａｓｅｒカップリングは、末端アルキンのカップリング反応による対称ビスアセチレン又は環状ビスアセチレンの合成である。機構的には、この反応は、Ｅｇｌｉｎｔｏｎ反応に類似している。差異は、触媒的な銅（Ｉ）の使用であり、銅（Ｉ）は、触媒サイクルの中で反応媒体中の酸素によって再酸化される。
【０１１５】
関連するＨａｙカップリングは、カップリング工程を実施するために銅−ＴＭＥＤＡ（Ν，Ν，Ν’，Ν’−テトラメチルエチレンジアミン）錯体を使用することを伴うが、Ｈａｙカップリングは、Ｇｌａｓｅｒカップリングと比べていくつかの利点を有する。使用される銅−ＴＭＥＤＡ錯体はより広い範囲の溶媒に可溶であり、そのため、この反応はより汎用性がある。
【０１１６】
Ｃａｄｉｏｔ−Ｃｈｏｄｋｉｅｗｉｃｚカップリングは、非対称アセチレンの形成を可能にし、末端アルキン及びアルキニルハロゲン化物の銅（Ｉ）触媒カップリングを伴う。
【０１１７】
これらのカップリング化学のすべては、末端封鎖基、例えばアリール末端封鎖基上、カップリングされるアルキンのうちの一方又は両方の上の様々な置換と適合する。末端封鎖基上の置換基がこれらのカップリング化学のうちの１つと適合しない範囲では、置換基は、ある場合には保護することができる。保護基の使用は当業者にとって周知である（例えば、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎ、Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９９、２７−３３、７０８−７１１を参照）。
【０１１８】
Ｃａｄｉｏｔ−Ｃｈｏｄｋｉｅｗｉｃｚカップリング化学は非対称アセチレンを形成するために使用することができ、他の反応は対称的なアセチレンを形成する傾向があるが、それらは、アセチレンモノマーの混合物が使用される場合には、非対称アセチレンを形成するためにも使用することができる。例えば、アセチレンＡ及びアセチレンＢの混合物は二量体ＡＡ、ＡＢ及びＢＢを形成することになり、これらは、個々の種類の二量体に分離することができる。
【０１１９】
上記ポリインが３以上のアルキニル部分を有する場合、一方側のハロ−アルキニル部分は、他方の側にトリアルキルシリル保護基等の保護基を有するアルキンと連結されることが可能である。カップリング工程の後に、保護基は取り除かれることが可能で、末端アルキンが形成される。この末端アルキンは他のハロアルキンと連結されることが可能である。
【０１２０】
ハロアルキン自体は、例えば、硝酸銀の存在下でＮ−ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ）をアセチレンと反応させることにより調製することができる。
【０１２１】
本明細書中に記載されるポリインは、同位体標識された化合物を含み、この同位体標識された化合物は、１以上の原子が、天然で通常見出される原子質量又は質量数とは異なる原子質量又は質量数を有する原子によって置き換えられていることを除き、本明細書中に提示される種々の式及び構造で記載される化合物と同一である。
【０１２２】
他の実施形態では、本発明の化合物に組み込まれる同位体の例としては、水素、炭素、窒素、酸素、フッ素及び塩素の同位体、例えば、それぞれ２Ｈ、３Ｈ、１１Ｃ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、１７Ｏ、３５Ｓ、１８Ｆ、３６Ｃｌ等が挙げられる。
【０１２３】
同位体標識された化合物、例えば１３Ｃ又は２Ｈ等の同位体が組み込まれている化合物は、薬物及び／又は基質の組織分布アッセイにおいて有用である。
【０１２４】
所望される場合、１３Ｃ標識は、アルキンが一緒に連結され当該ポリインが形成される場合には、１以上の個々のアルキンに存在することができる。さらに、ジュウテリウム又はトリチウム標識は、１つ又は両方の末端封鎖基に存在することができる。
【０１２５】
さらに、いくつかの例示の実施形態では、ジュウテリウム、すなわち２Ｈ、等の同位体による置換は、例えば、インビボ半減期の向上等のより大きい代謝安定性から生じる特定の利点をもたらすことができる。
【０１２６】
代謝の部位（１又は複数）でのジュウテリウムによる水素の１つ又は複数の置き換え（炭素−水素結合から炭素−ジュウテリウム結合へ）は、代謝の速度を遅くすることになると予想される。これは、上記化合物に、比較的長い半減期、及び体内からのより緩慢なクリアランスをもたらすことができる。ジュウテリウムを有機誘導体に組み込む方法は、当業者にとって周知である。代表的な方法は、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．２００７、４６、７７４４−７７６５に開示される。従って、これらの技術を使用して、１以上のジュウテリウム原子を当該ポリイン中に与えることができる。
【０１２７】
末端封鎖基は、アルキンが連結される時にそのアルキン上に存在してもよいし、又はカップリング化学が完了した後に加えられてもよい。例えば、ブロモ置換基又はヨード置換基等のハロ置換基を有するフェニル基は、パラジウムカップリング化学により末端アルキンに取り付けられることが可能である。代表的な条件は、例えば、Ｓｗｅｎｔｏｎら、ＣｈｅｍＩｎｆｏｒｍ  ５６（２１）（１９９１）に開示されている。アルキル基は、例えば、最初に末端アルキンを、例えば、ブチルリチウム等の強塩基との反応により脱プロトン化し、次いでメチル、第一級又は第二級のアルカンの上のハロゲン、トシレート等の脱離基を置換することによる求核置換を使用して取り付けることが可能である（同文献）。
【０１２８】
芳香族（アリール、ヘテロアリール）末端封鎖基を官能化することに関して、当業者は、実に様々な官能基をアリール部分又はヘテロアリール部分に容易に導入することができる。
【０１２９】
アリール環上に置換を提供することが望ましい場合、求電子性芳香族置換を、特定の所望の官能性を提供するために使用することができる。例えば、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アルカリール、アリールアルキル、アルケニル、アルキニル及びアシル基は、Ｆｒｉｅｄｅｌ−Ｃｒａｆｔｓアルキル化／アリール化／アシル化反応を使用して付加することができる。他の求電子性芳香族置換反応を使用して、例えば、クロロニウムイオン又はブロモニウムイオンをその場（ｉｎ  ｓｉｔｕ）で形成し、それらを芳香環と反応させることによりハロゲンを提供すること、又はスルホニウムイオン又はニトロニウムイオンを形成してスルホニル基又はニトロ基を提供することができる。
【０１３０】
Ｆｒｉｅｄｅｌ  Ｃｒａｆｔｓアルキル化は、適切なハロ−アルキル部分、及びルイス酸を使用して行われる。このアルキル部分はカルボカチオンを形成し、アリール環からの電子がこのカルボカチオンと結合を形成し、アリール環上に正電荷を置く。このアリール環は、次に、プロトンを失う。アルキル部分及びアルカリール部分（ベンジル部分等）をこのやり方で付加することができる。
【０１３１】
Ｆｒｉｅｄｅｌ  Ｃｒａｆｔｓアシル化は、同様であるが、酸塩化物等の酸ハロゲン化物を使用して、ケトン部分を環上に置く。この酸ハロゲン化物は、酢酸、プロピオン酸、酪酸等のアルキル酸であってもよく、又は安息香酸、ｐ−トルイル酸等の芳香族酸であってもよい。
【０１３２】
Ｆｒｉｅｄｅｌ  Ｃｒａｆｔｓアリール化（Ｓｃｈｏｌｌ反応としても知られる）は、ルイス酸によって触媒される２つのアリール環とのカップリング反応である。このカップリング反応の間に失われるプロトンは、追加的な触媒として働く。典型的な試薬は、ジクロロメタン中の塩化鉄（ＩＩＩ）、ジクロロメタン中の塩化銅（ＩＩ）、ＰＩＦＡ及び三フッ化ホウ素エーテル錯体、アセトニトリル中のＢＦ３を伴うモリブデン（Ｖ）塩化物及び四酢酸鉛である。
【０１３３】
求電子性芳香族置換は、特定の５員ヘテロアリール環上でも実施されることが可能である。非置換のピロール、フラン及びチオフェンを、求電子置換により置換芳香族複素環へと変換することができる。これに関して、フラン、チオフェン、ピロール及びそれらの誘導体は、すべて、ベンゼンと比べて非常に活性化されている。これらの化合物は、すべて、非共有電子対を有する原子（酸素、硫黄又は窒素）を芳香環のメンバーとして含有し、このことは、カチオン性中間体の安定性を実質的に高める。ベンゼン環の場合のように、これらの置換は、最初の求電子剤付加、それに続く「オニウム」中間体からのプロトン喪失による芳香環の再生によって起こる。上記芳香族５員複素環はすべて求電子置換を受け、一般的な反応性の順序は、ピロール＞＞フラン＞チオフェン＞ベンゼンである。置換は、典型的には２位で起こる。ピロールへの求電子置換の例は、Ｐｉｃｔｅｔ−Ｓｐｅｎｇｌｅｒ反応及びＢｉｓｃｈｌｅｒ−Ｎａｐｉｅｒａｌｓｋｉ反応である。
【０１３４】
加えて、置換５員環ヘテロアリールは、アンモニア、アミン、五酸化リン、又は五硫化リンと組み合わせた１，４−ジケトンの環化によっても合成できる。この閉環の前に脱水（縮合）が起こり、これは、次に２つの二重結合、従って芳香族π系を与える。エネルギー的に有利な芳香族系の形成は、上記反応の駆動力のうちの１つである。１，４−ジケトン又はアミン上に存在する官能基は、次に、ヘテロアリール環に組み込まれる。
【０１３５】
上記ポリインの散乱波長（すなわち、ラマン周波数）は、ジュウテリウム又は１３Ｃ標識の存在又は不存在、ポリイン中のアルキン基の数、末端封鎖基に存在する置換の存在、種類、及び等を含めたいくつかの要因に応じて変わりうる。例えば、アリール／ヘテロアリール環上の電子供与性基及び電子吸引性基は、非置換のアリール／ヘテロアリール環と比べて上記ポリインのラマン周波数を変えることができる。
【０１３６】
当業者は、どの官能基が電子供与性及び電子吸引性であるかを理解している。代表的な電子供与性基としては、フェノール／フェノキシド、第三級アミン、第二級アミン、第一級アミン、エーテル、アルキル基、アリール基、及びビニル基が挙げられるが、これらに限定されない。代表的な電子吸引性基としては、トリフレート、ノシレート、ブロシレート、トシレート、−ＣＦ３及び−ＣＣｌ３等のトリハライド、ニトリル、スルホネート、ニトロ基、アンモニウム塩、第四級アンモニウム塩、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、アシルクロリド等のアシルハロゲン化物、エステル、アミド並びにハロゲン化物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３７】
別の例示の実施形態では、１つ又は両方の末端封鎖基は、アルキル基、好ましくは分枝状アルキル基である。というのも、分枝構造は分子に安定性をもたらすからである。上で論じたように、メチル、第一級又は第二級のアルキル部分については、アルキル末端封鎖基を与えるための求核的置換反応において、アセチレン性イオンを使用することができる。アルキンとハロゲン化アルキルとのＳｏｎｏｇａｓｈｉｒａカップリングも行うことができ、このカップリングは、両方のカップリング相手の中の、エーテル、エステル、アミド、ニトリル、ケト、複素環、アセタール及びハロゲン化アリールを含めた広い範囲の官能基に耐える。このカップリングは、特定のＣ−Ｘ結合（Ｘ＝Ｉ、Ｂｒ、Ｃｌ）に対して選択的であることができ、複数の反応性部位を有するハロゲン化アルキルのオルソゴナルな官能化が可能である（Ｖｅｃｈｏｒｋｉｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ。１３１、３４、１２０７８−１２０７９）。
【０１３８】
代表的な合成は、作業実施例に与えられる。
【０１３９】
ＩＶ．注目する生物学的粒子の特定方法
いくつかの例示の実施形態では、注目する生物学的粒子（すなわち、結合メンバー）に結合する抗体、ペプチド、核酸、及び他の材料は、本明細書に記載される１以上のポリインで標識され、注目する生物学的粒子の存在又は不存在を判定するために使用されることが可能である。
【０１４０】
このような例示の実施形態のいくつかの態様では、当該方法は、注目する生物学的粒子、例えば癌細胞、幹細胞、免疫細胞、神経細胞、グリア細胞、細菌、ウイルス又は真菌が患者から採取した生物試料に存在するか存在しないかを判定するために使用される。
【０１４１】
代表的な生物試料としては、全血、血漿又は血清等の血液産物、脳脊髄液、尿、精液、唾液、乳頭吸引液、リンパ液、細針吸引液（ｆｉｎｅ  ｎｅｅｄｌｅ  ａｓｐｉｒａｔｅ）、水、髄液、腹水、胸水、及び滑液が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４２】
代表的な生物学的粒子としては、幹細胞、癌細胞、赤血球（赤血球細胞）、白血球（白血球細胞）、顆粒球、血小板、単球、好中球、リンパ球、細菌、ウイルス及び真菌が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４３】
例示の一実施形態では、注目する生物学的粒子（すなわち、結合粒子）に結合する抗体、核酸又は他の材料は、本明細書中に記載される１以上のポリインに結合され、ポリイン標識された抗体、核酸等が形成される。
【０１４４】
患者由来の生物試料は、次いで、ポリイン標識された抗体、核酸等と共にインキュベーションされることが可能である。この生物試料が注目する生物学的粒子を含む場合、その生物学的粒子が上記ポリイン標識された抗体、核酸等と結合を形成することになる。
【０１４５】
結合体形成（従って、注目する生物学的粒子の存在）は、その生物学的粒子上でのポリイン標識された抗体、核酸等の存在を特定することによって確かめることができる。
【０１４６】
この検出は、当業者にとって公知である技術を使用して達成することができる。例えば、ポリインが結合された抗体、オリゴヌクレオチド等は、免疫組織化学、イムノサイトメトリー、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション等による、固定細胞及び組織中の抗原タンパク質及び核酸の超多重化イメージングに供することができる。これらの技術は、任意選択的に、より高いレベルの多重化のための免疫標識及びイメージング、並びに超解像及び深部組織の超多重化イメージング及び検出のための検体拡張及びクリアリング技術とさらに組み合わせることができる。
【０１４７】
同様に、異なる抗体、核酸等で標識されている場合、ポリインは、特にフローサイトメトリー又は他の関連技術と組み合わされたときに、セルソーティングへの応用で使用できる。例えば、正常細胞及び癌細胞は、それぞれの表面上に別個のタンパク質種が存在することに起因して、簡単に分離することができる。当業者は、抗体、核酸等を本明細書に記載されるポリイン（「炭素原子ワイヤ」とも呼ばれる）と結合する方法、並びに患者から抽出された生細胞を抗体−炭素原子ワイヤ結合体で標識する方法、及びこの標識された試料のフローサイトメトリーを行う方法を理解しているであろう。
【０１４８】
このような例示の実施形態では、上記セルソーティング技術は、専門化された種類のフローサイトメトリーである蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）と類似しているが、蛍光を使用するのではなく、本技術は、ラマン分光法を使用して、ポリイン標識付きの細胞を特定する。
【０１４９】
同様に、細菌、ウイルス及び真菌は、種々の標的、例えば受容体を、そのそれぞれの表面に有することが知られている。これらの標的は、種々の抗体、核酸及び類似の結合メンバーと結合されることが可能である。
【０１５０】
例示の一実施形態では、生物試料が、癌細胞、幹細胞、細菌、真菌又はウイルスに特異的に結合する１以上のポリイン標識された抗体、核酸等と共にインキュベーションされ、そしてその生物試料が標識された抗体、核酸等に結合する癌細胞、幹細胞、細菌、真菌又はウイルスを含む場合、結合体が形成されることになる。この結合体は、特定可能なポリイン標識を有することになり、この特定可能なポリイン標識は、例えば、誘導ラマン分光法、自発ラマン分光法、赤外分光法又は他のコヒーレントラマン技術を使用して検出することができる。
【０１５１】
フローサイトメトリー、又は生物学的粒子が光源を通り過ぎて流れる類似技術を使用すると、特定のポリインの存在を検出することにより、上記注目する生物学的粒子と上記ポリイン標識された抗体、核酸等との間の結合体の存在又は不存在を判定することができる。
【０１５２】
つまり、生物試料がフローサイトメトリーに供される場合、粒子は、管を通って流れることになり、放射線源を通り過ぎることができる。粒子が、特定のポリインに結合されている特定の抗体／核酸と結合されている場合、その結合体中の（放射線源を使用して検出される）上記ポリインの存在は、この抗体／核酸と会合した生物学的粒子がその生物試料中に存在するということを意味する。特定のポリインが検出されない場合、これは、抗体／核酸と会合した生物学的粒子はその生物試料中に存在しないということを意味する。
【０１５３】
例えば、いくつかの生物学的粒子が生物試料中に存在すればそのような生物学的粒子に特異的に結合することができる複数の異なる抗体、核酸等を含有するポリイン標識した抗体、核酸等のライブラリーを調製することができる。各々が異なる抗体／核酸に結合される様々なポリインを使用することにより、生物試料中の特定種類の生物学的粒子の存在又は不存在を特定することができる。
【０１５４】
この技術は、細菌感染、ウイルス感染又は真菌感染の迅速検出を可能にすることができるだけではなく、細菌、ウイルス又は真菌の特定種類の迅速判定も可能にすることができる。
【０１５５】
この技術は、癌細胞の存在又は不存在を迅速に検出するために使用することもできる。例示の一実施形態では、腫瘍の外科的除去の後、組織、例えば外科的手術部位近傍から採取された組織の試料を、癌の存在又は不存在について評価して、腫瘍全体が除去されたことを確実にするために十分広い周辺部分が切除されたことを確認することができる。
【０１５６】
いくつかの例示の実施形態では、当該ポリインは、培養された生細胞をイメージングするために使用される。この方法は、注目するインビボ対象から抽出された注目するインビトロ組織細胞培養物に由来することができる生細胞を培養すること、上記培養された生細胞をウェルに播種する工程と、及び培地中で各ウェルをポリインの単一の色で標識することを含み、上記ポリインは１以上の色を含む。上記標識された培養された生細胞は、次に、誘導ラマン顕微鏡法のためにイメージングチャンバーに加えられ、この細胞は、誘導ラマン顕微鏡法を使用してイメージングされ、各細胞は、イメージング時間のあいだ単一の色で維持される。
【０１５７】
他の実施形態では、上記ポリインは、培養された生細胞中の小器官をイメージングするために使用される。この方法は、注目するインビトロ組織細胞培養物に由来することができるか又は注目するインビボ対象から抽出することができる生細胞を培養すること、培養された上記生細胞をポリインと共に培地中でインキュベーションすることであって、上記ポリインは、各々、特異的な小器官標的プローブを含むこと、上記培養された生細胞を上記ポリインで標識すること、及び誘導ラマン顕微鏡法を使用して上記細胞をイメージングすることを含む。このような例示の実施形態の１つの態様では、上記培養された生細胞は、それらがインキュベーションされ上記ポリインで標識される前に、ウェル中に播種され、次いでその細胞は上記ポリインで標識され、このポリインは、各々、特異的な小器官標的プローブを含み、このプローブは、異なる小器官を特異的に標的にする。代表的な小器官標的プローブとしては、培養された生細胞の中の細胞膜、小胞体（ＥＲ）、ゴルジ、ミトコンドリア、脂質滴、リソソーム、核及びチューブリンを標的とするプローブが挙げられる。
【０１５８】
さらに他の実施形態では、上記ポリインは、スペクトル的にバーコード化されたビーズを使用する生細胞のタグ付け方法において使用される。この方法は、ポリスチレンビーズ等のポリマーマイクロビーズをスペクトル的にバーコード化されたポリインと混合すること、上記ビーズを上記スペクトル的にバーコード化されたポリインと結合して、バーコード化ビーズを形成すること、及び注目するインビトロ組織細胞培養物に由来することができるか又は注目するインビボ対象から抽出することができる生細胞を培養することを含む。上記バーコード化ビーズは、上記培養された生細胞と共に培地中でインキュベーションされ、これにより、その培養された生細胞は上記バーコード化ビーズで標識される。上記培養された生細胞は、次いで、誘導ラマン顕微鏡法を使用してイメージングすることができ、視野全体のバーコード化ビーズのスペクトルバーコードは、ハイパースペクトルＳＲＳ（誘導ラマン散乱）画像に基づいて復号化することができる。
【０１５９】
別の例示の実施形態では、当該ポリインは、フローサイトメトリー、又は細胞を選別（ソーティング）／計数するための他の方法を使用して、癌細胞の集団を特定するために使用される。この方法は、１以上のポリイン（本明細書中で「炭素原子ワイヤ」とも呼ばれる）を注目する対象の生細胞と会合させることであって、この炭素原子ワイヤは、上記生細胞の特異的細胞表面マーカーを検出しその特異的細胞表面マーカーに結合する抗体と結合され、さらには、この抗体は上記生細胞の細胞表面マーカーに結合することを含む。上記生細胞は、フローサイトメーターの絞り込まれたフロー流の中に位置決めされ、フローサイトメーターの絞り込まれたフロー流内で所定の波長の光で照射される。上記細胞は照射に曝され、光は、その細胞と接触するので、屈折される。この生細胞から生じる散乱光は検出され、ラマン散乱スペクトルが分析され、生細胞の個々の群が特定される。癌細胞ではない細胞は上記炭素原子ワイヤ結合抗体に連結されず、一方で、癌細胞は上記炭素原子ワイヤ結合抗体に連結される。癌細胞は、上記抗体に結合された炭素原子ワイヤによって生成される散乱光のラマンスペクトルに基づいて検出される。別の例示の実施形態では、上記ポリインは、フローサイトメトリーベースの高スループット医療診断の方法において使用される。この方法は、いくつかの態様では、ナノ粒子又は微小粒子等の固体支持体に結合され、そして特定の病状を意味している細胞の特定の分集団にある特異的生物学的マーカーと複合体を形成する１以上の抗体、核酸又は他の結合分子に結合されていてもよい１以上の炭素原子ワイヤを、注目する対象の生細胞と会合させることを含み、上記生細胞の特定の分集団は、炭素原子ワイヤの別個のセットと特異的に会合する。上記生細胞はフローサイトメーターの中で位置決めされ、その生細胞は、フローサイトメーターの絞り込まれたフロー流内で照射され、上記炭素原子ワイヤはこの照射に曝される。この生細胞からの散乱光は検出され、生細胞の個々の群を特定するために分析される。散乱光の分析は、細胞の特定の分集団への上記炭素原子ワイヤの結合（その細胞集団に存在する場合）に基づいて特定の疾患の診断を提供することができる。上記炭素原子ワイヤに結合される場合、上記細胞の特定の分集団のメンバーは、結合していない細胞は散乱させないことになる特定の波長の光を散乱させることになる。従って、１以上の分集団内の細胞の存在は、検出することが可能で、特定の病状と相関づけることが可能である。例えば、患者が細菌感染又はウイルス感染を有しているか否かが明らかでない場合、細菌に、好ましくは１以上の特定の細菌に結合する炭素原子ワイヤを選択することができ、細菌、理想的には特定の種類の細菌、が検出される場合、適切な抗生物質が投与されることが可能であり、細菌が検出されない場合、抗生物質投与は回避されうる。これは、患者が敗血症又は細菌性髄膜炎を有している場合は特に有利である可能性があり、リアルタイムアッセイは、適切な看護を受けている患者において遅延を生じることが多い通常の細胞培養ベースの手法よりも特に好ましい可能性がある。別の例示の実施形態は、セルソーティング方法を含む。この方法は、炭素原子ワイヤを注目する対象の生細胞と会合させることを含み、上記生細胞の特定の分集団は、炭素原子ワイヤの別個のセットと特異的に会合する。その生細胞の特定の分集団は、分光法を使用して、その細胞の分集団と炭素原子ワイヤの別個のセットとの特異的会合に基づいて選別される。蛍光を使用して細胞を特定することよりはむしろ、誘導ラマン分光法を使用することができる。各々が異なる細胞の分集団に結合し、かつ各々が異なる「スペクトルバーコード」を有する炭素原子ワイヤのライブラリーが使用される場合、単一の生物試料が複数の細胞型の分集団についてスクリーニングされることが可能である。
【０１６０】
別の例示の実施形態では、上記ポリインは、インビボで細胞アトラスを生成するために使用される。この方法は、炭素原子ワイヤを注目する対象の生細胞と会合させることであって、この生細胞の特定の分集団は、炭素原子ワイヤの別個のセットと特異的に会合すること、上記生細胞の特定の分集団間の関係をマッピングすることであって、その生細胞の特定の分集団は、それらと炭素原子ワイヤの別個のセットとの特異的な会合によって識別可能であることを含む。
【０１６１】
スクリーニングにおいてこの技術をどのように使用することができるかの一例は、髄膜炎については、第一に、その髄膜炎が細菌性であるか又はウイルス性であるか、及び細菌性である場合、どの細菌が存在するかを判定することである。脳脊髄液（ＣＳＦ）の試料は、患者から得ることができ、髄膜炎の原因となる細菌又はウイルスに結合するポリイン標識された抗体／核酸と共にインキュベーションすることができる。この試料は、次いで、フローサイトメトリー又は生物学的粒子が放射線源を通り過ぎて流れる他の技術に供されることが可能である。誘導ラマン分光法を使用して測定される光散乱等の光散乱が、生物学的粒子が存在すること又は存在しないことを示す（その生物学的粒子がポリイン標識された抗体／核酸に結合されることによって）場合、適切な治療が処方されうる。髄膜炎がウイルス性である場合、抗生物質の投与を回避することができる。髄膜炎が細菌性である場合、適切な抗生物質が投与されうる。この技術は、敗血症を迅速に診断するためにも使用することができる。ポリインの大ライブラリーは、異なる種類の髄膜炎等の異なる標的の並行検出のために使用することができ、二次酵素反応を必要とする典型的なＥＬＩＳＡアッセイよりも待ち時間が短縮された高速スクリーニングが可能になる。
【０１６２】
いくつかの例示の実施形態では、上記ポリインは、抗体、核酸等の結合性材料だけでなく、金粒子、ポリスチレンビーズ等のナノ粒子又は微小粒子にも結合される。他の実施形態では、上記ポリインは、金属ナノワイヤに結合される。さらなる他の実施形態では、上記ポリインは、ナノ粒子にも微小粒子にも結合されない。微小粒子／ナノ粒子に結合することにより、より高い検出感度及びより多いスペクトルバーコードを、微小粒子／ナノ粒子における濃縮されたポリイン及び組み合わせ標識を用いて成し遂げることができる。
【０１６３】
これらの例示の実施形態のいくつかの態様では、抗体及び抗体断片等のタンパク質及びペプチド、プライマー及びプローブを含めた核酸を含めた結合剤、並びに本明細書に記載される他の結合剤に結合するポリマーも、結合又は物理的捕捉により、本明細書に記載される複数のポリインに連結される。結合剤への結合に加えて、上記ポリマーは、本明細書に記載される複数のポリインに共有結合されることも可能であり、又は上記ポリマーは、ナノ粒子又は微小粒子へと成形されることも可能であり、ポリインは、その形成の間にナノ粒子又は微小粒子の中へと物理的に捕捉される。
【０１６４】
グラフト、くし型、又は他の好適なポリマーであってよいポリマーに複数のポリインを共有結合で取り付ける代表的な方法は、複数の反応性基を有するポリマー、及びそのポリマー上の反応性基とのカップリング反応に参加することができる複数の官能基を有する複数のポリインを準備する工程と、カップリング反応を実施して、上記ポリマーを上記複数のポリインと連結する工程とを備える。特にポリマーが多分散性ポリマーである場合には、特定のポリマーに付加されるポリインの量を制御することは困難である可能性がある。ポリマーに取り付けられるポリインの量が制御される実施形態では、デンドリマー、又は低多分散性のモノマーを使用することが好ましい可能性がある。
【０１６５】
上記ポリインをナノ粒子及び／又は微小粒子の中に物理的に捕捉するための代表的な方法としては、モノマーをポリマー粒子に変換する重合反応の際に当該ポリイン（１又は複数種）を存在させること；ポリマー溶液をポリマーナノ粒子又はポリマー微小粒子に変換する噴霧乾燥条件；並びにポリマー及び本明細書に記載される１以上のポリインが溶液に溶解される沈殿ベースの手法が挙げられるが、これらに限定されない。これらのポリマー及びポリイン（１又は複数種）は、理想的には溶液が急速に撹拌されている間に溶液から沈殿し、この沈殿は、例えば、溶媒又は共溶媒を除くこと、非溶媒を加えること、ｐＨを調整すること、溶液のイオン強度を調整すること等により成し遂げることができる。これは、上記ポリマー及び１以上のポリインが溶液から沈殿して、ナノ粒子又は微小粒子を形成することを引き起こす。ナノ粒子及び微小粒子を形成するためのこれらの技術はは、当業者にとって周知である。
【０１６６】
さらに他の例示の実施形態では、上記ポリインは、ナノ粒子又は微小粒子には結合されないが、シグナルは、スクリーニングされる標的が遺伝子材料である場合のポリメラーゼ増幅、及び標的がペプチド又はタンパク質である場合のハイブリダイゼーション連鎖反応（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＨＣＲ）等の種々の生物学的技術を使用して増幅される。これらの例示の実施形態のいくつかの態様では、スクリーニングは、チップベースのスクリーニング方法及び／又は多重化ポリメラーゼ増幅若しくはＨＣＲ技術を使用することにより、高スループットに行うことができる。これらの例示の実施形態は、以降でより詳細に論じられる。
【０１６７】
ハイブリダイゼーション／増幅技術
ある場合には、標的核酸、タンパク質又はペプチド等の標的が、十分低濃度で試料中に存在し、手軽な検出を可能にするには不十分なポリインの結合しか存在しない可能性がある。代表的な標的核酸としては、核酸配列、エピジェネティック修飾、一塩基多型、欠失及び付加が挙げられ、代表的なタンパク質及び／又はペプチドとしては、抗原、翻訳後修飾を有するタンパク質、及び抗原に結合する一次抗体が挙げられる。
【０１６８】
そのような場合には、シグナルを増幅することが有用である可能性がある。シグナル増幅に有用な様々な生物学的技術がある。ポリメラーゼ増幅等のいくつかの生物学的技術は、核酸標的に関連する増幅に特異的である。ハイブリダイゼーション連鎖反応等の他の生物学的技術は、タンパク質標的及びペプチド標的に関連する増幅に特異的である。
【０１６９】
分子生物学では、一本鎖のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）分子が相補的なＤＮＡ又はＲＮＡにアニーリングするハイブリダイゼーションは、遺伝子スクリーニングアッセイから得られるシグナルを増幅するために使用することができる。二本鎖ＤＮＡ配列は一般に生理的条件下で安定であるが、（一般的に、周囲温度を上げることにより）実験室でこれらの条件を変えることは、その分子が一本鎖へと分離することを引き起こすことになる。これらの鎖は、互いに相補的であるが、その周囲に存在する他の配列にも相補的である可能性がある。周囲温度を下げることで、一本鎖分子が互いにアニーリングする又は「ハイブリダイズする」ことが可能になる。
【０１７０】
ハイブリダイゼーションは、本明細書で使用する場合、サザンブロット、ノーザンブロット、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、及びＤＮＡ配列決定に向けた他の従来の手法等の分子生物学技術を包含することができる。
【０１７１】
定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）としても知られるリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（リアルタイムＰＣＲ）は、従来のＰＣＲにおけるようなＤＮＡ分子の増幅の終了時ではなく、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の間に標的とされたＤＮＡ分子の増幅をリアルタイムでモニターする。この例示の実施形態のいくつかの態様では、リアルタイムＰＣＲは、定量的に使用することができ（定量リアルタイムＰＣＲ）、また場合によっては半定量的に、すなわち特定の量超／未満のＤＮＡ分子で使用することができる（半定量リアルタイムＰＣＲ）。
【０１７２】
リアルタイムＰＣＲにおいてＰＣＲ産物を検出するための代表的な一般的方法としては、（１）任意の二本鎖ＤＮＡとインターカレートする非特異的蛍光色素、及び（２）蛍光レポーターで標識されたオリゴヌクレオチドからなる配列特異的ＤＮＡプローブであって、このプローブとその相補的配列とのハイブリダイゼーション後にのみ検出が可能になる配列特異的ＤＮＡプローブが挙げられるが、これらに限定されない。これらの方法の両方のバリエーションである例示の実施形態では、蛍光色素／レポーターは、本明細書に記載されるポリイン標識の１以上で置き換えることができる。
【０１７３】
従来の多重ポリメラーゼ連鎖反応（多重ＰＣＲ）は、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、いくつかの異なるＤＮＡ配列を同時に（多くの別々のＰＣＲ反応をすべて一緒に１つの反応において行うかのように）増幅することを含む。このプロセスは、サーマルサイクラーの中で複数のプライマー、及び温度介在性ＤＮＡポリメラーゼを使用して、試料中のＤＮＡを増幅する。この例示の実施形態のいくつかの態様では、配列決定は、多重化された様式で実施される。
【０１７４】
多重ＰＣＲは、複数のプライマーセットを単一のＰＣＲ混合物内で使用して様々なサイズの増幅産物を生成することができ、この増幅産物は、異なるＤＮＡ配列に特異的である。複数の配列を一度に標的とすることにより、別法なら何回かの実行を必要とする追加情報が、１回の試験実行から得られうる。プライマーセットの各々についてのアニーリング温度は、１つの反応内で正しく機能するように最適化される必要がある。いくつかの例示の実施形態では、特に増幅産物サイズが重なる場合には、異なる増幅産物は、各々が本明細書に記載される異なるポリインで標識されている標識されたプライマーを使用して識別及び可視化することができる。このアプローチと従来の多重ＰＣＲとの間の１つの差異は、従来の多重ＰＣＲは蛍光色素を使用するが、この例示の実施形態では、プライマーセットの中の１以上のプライマーがポリイン標識で標識されていることである。蛍光標識とは対照的に、蛍光標識間の「クロストーク」が原因で、使用できるプライマーの数が最少になる場合、本明細書に記載されるポリイン標識を使用すれば著しく少ないクロストークしか存在しないようにでき、より大きい数の標識プライマーを多重ＰＣＲスクリーニングで使用できるようになる。
【０１７５】
別の例示の実施形態では、本明細書に記載されるポリインで標識された１以上のプライマーを使用して多重ＰＣＲを実施するためのキットが提供される。当該キットは、２〜約５０のプライマー、例えば２〜約２０のプライマーであって、そのうちの１以上が本明細書に記載されるポリインで標識されたプライマー、及びＤＮＡポリメラーゼ、例えばＴａｑポリメラーゼを含む。このキットは、任意選択的にＰＣＲ増幅のための最適化された塩濃度も含むことができる適切なバッファーも含んでよい。使用することができる代表的な塩としては、塩化マグネシウム等のマグネシウム塩、及び塩化カリウム等のカリウム塩、及び／又は硫酸アンモニウム等のアンモニウム塩が挙げられる。ＤＮＡの融解挙動を改変することにより異なる鋳型の増幅を容易にするＰＣＲ添加剤も存在することができる。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）は、ＰＣＲキットにおける別の一般に使用される添加剤である。このような添加剤は当業者にとって周知である。
【０１７６】
本明細書に記載されるポリイン標識されたプライマー、及び多重ＰＣＲキットを使用して多重ＰＣＲを実施するための代表的な応用例としては、癌の検出、遺伝子導入生物の分類及び分析、マイクロサテライトの増幅及び分析、細菌及びウイルスの分類及び検出、並びに一塩基多型（ＳＮＰ）、一特徴多型（ｓｉｎｇｌｅ  ｆｅａｔｕｒｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）（ＳＦＰ−ＩｎＤｅｌ（欠失）等の欠失、反復、及びエピジェネティック修飾を分析するための複数のＤＮＡ領域の増幅が挙げられる。本明細書に記載される試薬を使用する多重ＰＣＲは、新規なＳＮＰを発見し、公知のＳＮＰを検出するために使用することができる。
【０１７７】
使用の際には、プライマーが、例えば、ＳＮＰが生物試料に存在することを示す注目する標的核酸に結合する場合、プライマー結合の存在は、特異的ポリイン標識と関連づけられるラマンスペクトルピークの存在によって判定することができる。プライマー結合の不存在は、このラマンスペクトルピークの不存在によって判定することができる。従って、そのプライマーを標的核酸とインキュベーションし、プライマーが標的核酸に結合する場合には増幅産物を形成し、増幅産物が存在する場合、増幅産物上にある標識を、ラマン分光法を使用して検出することにより、注目する標的核酸が存在するか否かを判定することができる。複数のプライマーが使用される場合、この技術は、複数の標的核酸の存在又は不存在を同時に判定するために使用することができる。この例示の実施形態のいくつかの態様では、式Ｉのポリインに連結されたプライマーの数は２〜１００である。
【０１７８】
蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）は、多くの場合は特定の染色体上のＤＮＡ配列を検出及び位置づけするために使用される実験室的方法である。１つの例示の実施形態では、この技術で使用される蛍光標識の１以上が、本明細書に記載されるポリイン標識で置き換えられる。
【０１７９】
標的がタンパク質又はペプチドである場合、シグナルを増幅するために、ハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）増幅等の技術を使用することができる。
【０１８０】
ハイブリダイゼーション連鎖反応増幅は、試料中の分析物を検出するようにシグナルを増幅する方法として、標的分析物等のイニシエータに曝露されると自己組織化する準安定な核酸モノマーを使用することができる。この試料は、イニシエータ相補領域を含む第１の準安定なモノマー及び第１のモノマーの一部分に相補的な領域を含む第２の準安定なモノマーと接触させることができる。代表的なモノマーとしては、例えば、ループ領域及び二本鎖領域を含むヘアピン核酸構造が挙げられる。
【０１８１】
上記第１及び第２のモノマーは、イニシエータの存在下で重合する。好ましくは、第１のモノマーのイニシエータ相補領域へのイニシエータのハイブリダイゼーションは重合を開始する。重合は、上記モノマーのうちの一方の供給が尽きるまで、続く。第１及び第２のモノマーを含むポリマーの特定は、試料中の上記分析物の存在を意味する。ポリマーは、例えば、ゲル電気泳動により特定されうるが、当該ポリイン色素の存在により、ＳＲＳを含めたラマン分光法等の分光技術を使用してポリマーを検出することが可能になる。
【０１８２】
イニシエータは、核酸であることができる。いくつかの例示の実施形態では、分析物は、イニシエータを含む。他の実施形態では、試料は、さらに開始トリガーと接触することができる。開始トリガーは、上記イニシエータと、注目する分析物を特異的に認識することができる結合分子、例えばアプタマーとを含むことができる。上記イニシエータは、第１のモノマーにハイブリダイズすることができ、上記結合分子が分析物によって結合されると重合の引き金を引くことができる。１つの実施形態では、分析物は、細菌、真菌又はＨＩＶ等のウイルスなどの病原体と関連する核酸である。試料は、患者由来の生物試料であってもよい。
【０１８３】
この例示の実施形態のいくつかの態様では、図１６ａに示されるように、注目する抗原は一次抗体に結合し、この一次抗体はＤＮＡイニシエータ結合二次抗体に結合する。このＤＮＡイニシエータ結合二次抗体は、一次抗体が注目する抗原と複合体を形成した場合に、その一次抗体と複合体を形成するにすぎない。一次抗体が注目する抗原との複合体を形成していない場合には、ＤＮＡイニシエータ結合二次抗体は、一次抗体との複合体を形成しない。
【０１８４】
従って、１つの例示の実施形態では、ヒト等の哺乳動物から生物試料を得て、この試料を、注目する抗原がその生物試料中に存在する場合にその注目する抗原に特異的に結合する一次抗体と共にインキュベーションする場合、その抗原がその生物試料中に存在すれば、この一次抗体及び抗原の複合体が形成されうるが、抗原がその生物試料中に存在しなければ、複合体は形成されないことになる。この例示の実施形態では、この哺乳動物は、注目する抗原に対する一次抗体を獲得していない。他の例示の実施形態では、この哺乳動物はすでに注目する抗原に対する一次抗体を獲得しており、このため、生物試料を一次抗体と共にインキュベーションする必要はない。
【０１８５】
生物試料が注目する抗原を含んでいたが一次抗体を含んでおらず、その試料が一次抗体と共にインキュベーションされて複合体が形成されたか、又は生物試料がすでに一次抗体と注目する抗原との間の複合体を含んでいたかによらず、ＤＮＡイニシエータ結合二次抗体を加えることができる。このＤＮＡイニシエータ結合二次抗体は、一次抗体が注目する抗原との複合体を形成していれば、一次抗体と複合体を形成する。
【０１８６】
二次抗体が一次抗体と、生物試料中の注目する抗原の存在を意味する複合体を形成する場合、ＤＮＡイニシエータ結合二次抗体中のＤＮＡイニシエータは、核酸モノマーの重合を引き起こすことができる。代表的な核酸モノマーは、ヘアピン構造、典型的には、少なくとも一方が既知のラマン散乱ピークを有する本明細書に記載されるポリインで標識された２つのヘアピン構造を含む。これらの２つのヘアピン核酸構造を加えることにより、ＤＮＡイニシエータ結合二次抗体が一次抗体との複合体を形成していれば、このイニシエータは、その２つのヘアピンが逐次的に二本鎖増幅ポリマーへと集合する連鎖反応を開始し、この二本鎖増幅ポリマーは、少なくとも１つ（１種）の式Ｉのポリインを含む。
【０１８７】
この二本鎖増幅ポリマーの存在又は不存在は、次に、既知のラマン散乱ピーク（１又は複数）に基づいてその少なくとも１つの式Ｉのポリインの存在又は不存在を判定することにより、ラマン分光法を使用して、することができる。次に、上記少なくとも１つのポリインと関連する既知の振動ピーク（１又は複数）の存在又は不存在に基づいて、注目する抗原の存在又は不存在を判定することができる。つまり、重合が開始された場合にのみ、当該ポリインは、ラマンスペクトルに存在し、二次抗体が一次抗体に結合した場合にのみ、重合は開始されることになり、一次抗体が注目する抗原にも結合される場合にのみ、二次抗体は一次抗体に結合することになる。この例示の実施形態のいくつかの態様では、ＨＣＲ増幅反応は多重化様式で実施される。この例示の実施形態のいくつかの態様では、ポリインに連結される核酸モノマーの数、及び二次抗体の数は、２〜１００である。
【０１８８】
本明細書中の他の箇所に記載されているように、好適なイニシエータは、２つのポリイン標識されたヘアピンが逐次的に長い二本鎖増幅ポリマーへと集合する連鎖反応を開始することができる。ポリイン標識されたヘアピン核酸構造等のポリイン標識されたモノマーを使用して、上記モノマーが蛍光標識で標識されている場合よりも、自己消光が存在せず有意に高いシグナル増幅を達成することができる。
【０１８９】
さらに他の例示の実施形態では、生物試料中の注目する抗原の存在又は不存在は、増幅の必要なしに判定することができる。例えば、一次抗体は、生物試料中の抗原が存在する場合、その抗原に結合するために使用することができる。直接、又は抗体及び１以上のポリインを固体支持体に結合することにより１以上のポリインを一次抗体に結合することにより、（直接又は間接に）標識された一次抗体に対するその結合により、注目する抗原の存在を検出することができる。
【０１９０】
同様に、生物試料中に抗原が存在する場合にその抗原に結合する一次抗体は、その生物試料に加えられてもよいし、又は生物試料が由来した対象がその抗原に曝露されたことがあり、すでに抗体応答を獲得している場合にはすでに存在していることができる。一次抗体が注目する抗原に結合した場合にその一次抗体に結合する二次抗体を加えることができる。この第２抗体は、直接、又は上記抗体及び上記１以上のポリインを固体支持体に結合することにより、１以上のポリインで標識されることが可能である。その抗原の存在は、抗原に結合する第１抗体に結合する二次抗体上に存在する当該ポリインの存在についてスクリーニングすることにより判定することができる。抗原が存在しない場合には、一次抗体は、抗原に結合しないことになり、そのため、二次抗体は一次抗体に結合しないことになり、そのため、注目する抗原の存在を示すシグナルは検出されないことになる。
【０１９１】
イメージングを超える例示的応用
多重化する能力はイメージングを超える。ポリインは、光学的なデータ記憶及び特定を実証する超多重化スペクトルバーコーディングによる情報科学に応用できる。テーラーメイド医療の今の時代に、ビーズベースの懸濁アッセイは、高スループットの多重化分析を成し遂げるために非常に有望であり、その高スループットの多重化分析の核心は、正確な検出に対する識別可能なバーコードの能力である。ポリインは直接的なスペクトル的な符号化及び復号化のための多数の十分に分解されたピークを有するだけでなく、ラマン散乱は、効力状態の超短寿命に起因して、本質的に蛍光における光退色も共鳴エネルギー移動の複雑化もない。従って、ポリインを用いて、周波数領域バーコーディングは、組み合わせの符号化を通して非常に大きい数に到達することができる。
【０１９２】
多重化は、イメージングを超える応用例において有用でありうる。システムバイオロジー及びテーラーメイド医療は、細胞並びに抗原及び薬物等の生体分子の高スループット分析から恩恵を受け、この技術は、ビーズ等の微小物体に対する識別可能なバーコーディングを必要とすることが多い。Ｃａｒｂｏｗは、光学的データ記憶（すなわち、符号化）及び特定（すなわち、復号化）に応用された。ポリマービーズを情報担体として利用して、３つの別個の強度レベル（すなわち、三進数の１桁）で１０個の解像可能な周波数を用いるスペクトルバーコーディングが、Ｃａｒｂｏｗを用いて達成できる（図５）。特定のポリイン混合物を有する３μｍサイズのポリスチレンビーズが膨潤−拡散技術によってローディングされ、各ビーズは、単一の調製工程で所望のスペクトル情報を用いて符号化された（図５ａ）。ＳＲＳ読み出しによって復号化された４つの代表的なコードによって例証されるように、これら１０個の特定の周波数の各々における強度は、０、１又は２のいずれかとして一義的にデジタル化することができる（図５ｂ及び表１）。スペクトルバーコードは、従来の自発ラマン分光法によっても読み出すことができ、１０個のスペクトルパターンが、一粒子レベルで復号化される（図１２及び表２）。２つの隣接する周波数からのすべての９個の組み合わせは十分に特定され、クロストークに対する堅牢性を明らかにする。従って、３１０−１＝５９０４８個の別個のスペクトルバーコードが生成されることが可能である一方で、これまでの記録は約１，０００個である。従来の光学バーコーディング材料と比べて、Ｃａｒｂｏｗは、指数関数的に組み合わせコード化の恩恵を受けるより多くの解像可能な周波数をもたらすだけではなく、蛍光におけるような光退色もエネルギー移動の複雑化もない。
【０１９３】
最近、多チャンネルＳＲＳフローサイトメトリーが、毎秒１１，０００個の粒子のスループットでポリマービーズを検出すると報告されている。ＳＲＳフローサイトメトリーと併用すると、ポリインで符号化されたミクロンサイズのビーズは、診断用分析のために数万の標的を同時に検出するための高スループット懸濁アッセイに応用することが可能である。
【０１９４】
【表１】
2020532497.tif 000005
【０１９５】
【表２】
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【０１９６】
インビトロ検出に加えて、バーコード化ビーズは、潜在的に、個々の細胞をタグ付けするための特有のＩＤとして使用することができる。それらの小さいサイズのため、複数のビーズを、単一細胞をタグ付けする際に組み合わせることができる。ＨｅＬａ細胞は、異なるバーコードを含有するいくつかのビーズを取り込むことができる。符号化された情報は、２４時間後に生細胞内部に保持され、自発ラマン分光法により読み出すことができる（図５ｃ）。さらには、一度に１つのビーズのスペクトルを測定すること以外に、離散的な周波数でのハイパースペクトルＳＲＳイメージングは、視野内のすべてのビーズを復号化することができ（図５ｄ及び図１３）、細胞性状の迅速可視化が可能になる。従って、３つの符号化ビーズを使用すれば、各細胞をタグ付けすることは、５９０４８Ｃ３＝３×１０１３個のＩＤを生成し、この数のＩＤは、人体中のすべての細胞（約１０１３細胞）をバーコーディングするのに十分である。これは、有機色素、量子ドット及びアップコンバージョンナノ結晶に基づく現在最新技術又はビーズ直径のウィスパリングギャラリーモード検出の限界よりも大きい桁である。
【０１９７】
従って、ポリインは、既存の「多重化の天井」を上回る光学的超多重化のためのイメージング及びバーコーディングプローブへと操作された。ポリインの強いシグナルは、電子非共鳴の条件下の線状に共役する三重結合の超線形の二次分極率増大に由来し、他方で、ＭＡＲＳ色素は、そのシグナルを、面状に結合された発色団の電子の前期共鳴増大から導く。例示的な例証された応用例では、厳密なレーザー前期共鳴条件は必要とはされず、これらの応用例は、より少ないクロストークで、及びアンミキシングの必要なく周波数をさらに広げより良好に分離する。Ｃａｒｂｏｗプローブは、ポリインの中性の骨格のため、生細胞への応用及びスペクトルバーコーディングにもより好適である。現在の技術は、さらに改善されうる。材料の展望からは、より長いポリインを用いてより多くの色が入手できる。ポリインの周波数は、長さの増加と共に１，８５０ｃｍ−１に向かって赤色移動することができ、これは１５０ｃｍ−１の拡張範囲（窓）をもたらす。顕微鏡法の展望からは、生細胞中の単一の小器官のＳＲＳイメージングは、１フレームあたり２秒という短時間で成し遂げることができ（図１３）、高速ハイパースペクトルＳＲＳイメージングは、生細胞の高速の動力学を捕らえるために適用することができる。バーコーディングの展望からは、抗体又は酵素で官能化されたビーズは、医学的診断及び創薬のために応用できる。ＳＲＳフローサイトメトリーは、毎秒数万個のビーズを検出するためにも採用できる。加えて、バーコード化ビーズを使用して、細胞の相互作用は、例えば、ヒト細胞アトラスプロジェクトのために、潜在的にマッピングすることができる。最後に、本人確認及び偽造防止への応用についての原理証明として、本発明者らは、微視的パターンでの周波数暗号化を実証する（図１４）。継続的なプローブ開発及び高速ハイパースペクトル検出の実装を伴って、ポリインは、超多重化されたイメージング及び分析での幅広い応用を有することができる新しいクラスの一次元光学材料を代表し、ライフサイエンス、医学、及び情報記憶において刺激的な機会を提供する。本開示の例示の実施形態は、ブロックチェーン用途でも使用することができる。ポリインは、金属ナノ構造体に結合されて、ラマン散乱シグナルを数桁も大きく増大させることができる。ポリインに取り付けられた金属ナノ構造体のこの新しい構造は、ヒトの組織の免疫組織化学のために使用することができ、非常に多くのマーカーの多重化イメージングをもたらす。
【０１９８】
本開示の例示の実施形態は、イメージングプローブ、診断アッセイ、テーラーメイド医療及びデータセキュリティ等の光学的超多重化用途のための新しいセットの材料を提供することができる。複数の小器官標的プローブは、生細胞における多色顕微鏡法のために開発され、本開示の例示の実施形態で明らかにされるビーズベースのスペクトル符号化は、医学的診断及び創薬のための多重化懸濁アッセイで広く応用されることが可能である。加えて、本開示の例示の実施形態は、光学的情報記憶及び偽造防止用途のための文書セキュリティにおいて使用することができる。さらに、ナノスケールのシグナル増幅を用いて、本開示の例示の実施形態は、疾患診断学及びテーラーメイド医療のための抗原及び核酸の多重化イムノイメージング及び検出において使用することができる。
【０１９９】
ポリインに基づく分子プローブは、多重化顕微鏡法のために、生細胞中の異なる種を標的とする。ポリインで符号化されたビーズ表面は、インビトロアッセイのための抗体及び酵素等の異なる生理活性分子で官能化される。表面官能化されたビーズは、臨床診断学及び創薬における高スループットの多重検出のために、ビーズベースの懸濁アッセイにおいてＳＲＳフローサイトメトリーと組み合わされる。情報暗号化技術は、データセキュリティのための超多重化ポリインに基づく。ナノスケールのシグナル増幅技術は、ポリインのシグナルを増強するために使用される。シグナル増強ポリインプローブは、固定細胞及び組織中の抗原及び核酸の超多重化イムノイメージングのために、抗体及びオリゴヌクレオチドに結合される。
【０２００】
加えて、ポリマービーズのポリインの組み合わせ符号化を通して、光学的読み出しのための約６０，０００個の別個のバーコードを成し遂げるための超多重化されたスペクトルバーコーディングが実証された。これは、高スループット医学的診断及び創薬のためのビーズベースの懸濁アッセイにおいて、最近報告されたＳＲＳフローサイトメトリーと組み合わせることが可能であった。加えて、ポリインは、ヒト細胞アトラスにおける個別の細胞標識のための数百億個の光学的ＩＤを生成するために使用することができ、このＩＤ数は、蛍光色素、量子ドット及びアップコンバージョンナノ結晶に基づく現在の最新技術の上限よりもかなりの桁数大きい。さらに、超多重化ポリインは、潜在的な文書セキュリティ及び偽造防止の応用例のための光学的データ記憶及び情報暗号化に応用することができる。
【０２０１】
本開示の例示の実施形態は、以下の非限定的な実施例を参照してより良好に理解される。本開示の実施形態の実施のための方法、材料及び手順が本明細書中に記載される。当業者は、本開示が以降に開示された方法、材料及び手順に限定されないことを理解するであろう。当業者は、本開示が、植物及び哺乳動物の両方における特定の細胞型に関係する治療的及び診断的アプローチと併せて使用されてもよいことを理解するであろう。本開示のさらなる態様及び利点は、添付の図面と共に解釈される以下の説明から明らかであろう。
【実施例】
【０２０２】
本開示の例示のこの実施形態を代表する具体的な化合物は、以下の実施例及び反応順序により調製した。実施例及び反応順序を描く図は、本開示の例示の実施形態の理解を助けるために例証として与えられており、添付の請求項に示される本開示の例示の実施形態を何ら限定しないと解釈されるべきである。当該化合物は、本開示の例示の実施形態のさらなる化合物を製造するための後続の例において中間体として使用することもできる。それらの反応のいずれにおいても、得られる収率を最適化する試みは、必ずしもなされていない。当業者なら、反応時間、温度、溶媒及び／又は試薬の日常的な変更を通してそのような収率を高める方法を知っているであろう。
【０２０３】
以下の合成例に示されるように、２０個の十分に分解されたラマン周波数が代表的なポリインに関して得られ、これは、蛍光を併用して３０色の光学検出を成し遂げることができる。ポリインのこのセットは、本明細書中では、「カーボンレインボー」又は「Ｃａｒｂｏｗ」と称される。この超多重化ポリインを用いて、同時の１５チャネルの光学イメージングが生細胞において実証され、これは、すべての蛍光ベース及びラマンベースの方法で報告されている中で最高のものに属する。当該ポリインは、最小の細胞毒性及び顕著な光安定性と共に優れた生細胞適合性を提示し、高細胞透過性で非特異的バックグラウンドがほとんどなく、細胞内イメージングに特に好適である。５つの小器官標的ポリインは、成功裏に開発され、高特異性及び無視できるほどのクロストークを伴って生細胞における１０色の小器官イメージングが達成された。
【０２０４】
フェニル末端封鎖基を有する一連のポリインを合成し、特徴づけた。Ｇｌａｓｅｒ−Ｈａｙカップリング及びＣａｄｉｏｔ−Ｃｈｏｄｋｉｅｗｉｃｚカップリングを使用して、効率的で堅牢な経路を使用して、２〜６個の三重結合（Ｃ≡Ｃ）を有する奇数及び偶数のポリインを調製した（図１）。極性のヒドロキシメチル基が手軽な精製のためにフェニル環に導入され、この基は、後続の官能化のための活性部位として働く。長さが２−インから６−インまで増加しＨＯＭＯ−ＬＵＭＯバンドギャップが低下するのするにつれて、ＵＶ−Ｖｉｓスペクトルは、ＵＶ領域（３３７ｎｍ）から可視（４７６ｎｍ）領域までのポリインシフトにおいて最長の吸収波長を明確な振動的な進行で示す（図６）。本明細書に開示されるすべてのポリイン化合物は、ＮＭＲ及び質量分析によって特徴づけられたとおり、周囲条件下で良好な化学安定性を示す。
【０２０５】
これらのフェニル封鎖ポリインは、特有の振動スペクトル特性を提示する。それらはすべて、狭い線幅（１３ｃｍ−１）で強いラマンピークを提示し（図１ａ）、これは、一重結合及び三重結合の両方の集合的な異位相の結合長の交替振動に由来する。ラマンサイレントな（ラマンに反応しない）スペクトル領域におけるこのような単一の鋭いピークは、高感度で特異的な検出を約束する。加えて、三重結合の数が２から６まで増加するにつれて、ラマン強度は、べき乗則の指数２．７７±０．０６で超線形的に大きくなる（図１ｂ）。この傾向は、他の共役オリゴマーの二次分極率で観察される依存性と類似しており、このことは、単独のアルキンよりもはるかに高い検出感度を示唆する。より重要なことに、２−インから６−インへ進むと、ポリインのピーク周波数は、２，２２６ｃｍ−１から２，０６６ｃｍ−１へとほぼ直線的にシフトし（図１ｃ）、この周波数領域においてこれらのポリインを自然に分離する。それゆえ、単一の強いピーク、狭い線幅及び異なる長さの自然の周波数間隔という特有のスペクトル特徴により、これらのポリインは、光学的多重化のための理想的な骨格となる。
【０２０６】
単一の強いピーク、狭い線幅及び異なる長さのポリインにおける自然の周波数間隔をふまえて、この炭素原子ワイヤ骨格を、超多重化光学検出用にラマン周波数を広げるためにさらに操作した（図２ａ）。振動周波数は、２つの独立の因子によって決定されることが知られており、その因子の１つは、核間の電子密度に関連する振動モードの力の定数であり、他方は、個々の核の重量にリンクするそのモードの換算質量である。振動モードの換算質量及び力の定数の両方を調節することにより、８０ｃｍ−１〜２ｃｍ−１の範囲のポリイン周波数の粗調整及び微調整を成し遂げることができる。同位体混入は、ラマン周波数に強く影響を及ぼすことができる換算質量を変更ための有効なアプローチである。ポリイン中に複数の三重結合があると、１３Ｃ同位体標識パターンを最適化することができ、選択的な位置にある１以上の三重結合を、モジュール式に同位体混入でき、これにより、ポリインの周波数を２０〜８０ｃｍ−１という大きい範囲で正確に調整することができる。複数の三重結合に同位体混入することの周波数移動効果は、１つ、２つ及び３つの原子で１３Ｃ標識した４−イン系列（図２ｂ）によって明らかにされるように、相加的であるようである。同位体編集したポリインにおける小さいピークの出現は、おそらく不均一な１３Ｃ標識によるポリイン点対称性の破壊に起因する、相互排除違反から生じたＩＲ活性モードに原因がある。
【０２０７】
末端封鎖フェニル環を電子供与性基又は電子吸引性基で置換することで、ポリイン鎖上でのπ電子の非局在化に影響を及ぼすことにより振動周波数を調整することが可能になる（図２ｃ）。実際、４−インの２，１４１ｃｍ−１と比べて、電子供与性のジメチルアミン−Ｎ（ＣＨ３）２では、二置換の４−インは、２３ｃｍ−１の有意な赤色移動を示すが、一方で、電子吸引性のトリフルオロメチル−ＣＦ３は３ｃｍ−１の青色移動を示す。正確な置換位置も重要である。同じ−ＮＨ２であっても、パラ位は強い共鳴効果に起因して最大の赤色移動（２，１２８ｃｍ−１）を示す。オルト位（２，１３３ｃｍ−１）が次であり、メタ位（２，１３９ｃｍ−１）が最も小さい。このように、末端封鎖置換は、１３Ｃ同位体混入からの粗調整（２０〜８０ｃｍ−１）を補完する周波数微調整（２〜２０ｃｍ−１）をもたらす。
【０２０８】
周波数超多重化のために探索した４０を超える分子（図７）から、別個のラマン周波数を有する２０個の構造（「Ｃａｒｂｏｎ  ＲａｉｎｂＯ」又は「Ｃａｒｂｏｗ」と呼ぶ）が、統一された炭素原子ワイヤ骨格に基づいて得られ（図３ａ）、これらは、ラマンサイレントな範囲における分解可能な周波数の最大数を表す。例えば、さらなる末端封鎖基としてフェニルの代わりにアルキルを使用すると、さらに２，２６２ｃｍ−１まで青色移動させることができる。市販の色素からの指紋領域における６つの報告されたラマン周波数及び４つの一般に利用可能な蛍光チャネルと組み合わせると、３０色が解像でき、これは、本発明者らが知る限り、並行的な光学検出について報告された最高のものである。この範囲で最近報告された１４のＭＡＲＳ色素と比べて、Ｃａｒｂｏｗピークは、より均等な間隔で現れ、実質的により少ないクロストークで十分に分解されている。例えば、最も近接したＣａｒｂｏｗピークのスペクトル分離は、ＭＡＲＳ色素におけるスペクトル分離のほぼ２倍である。
【０２０９】
Ｃａｒｂｏｗの多重化能力は、複数の種の同時可視化のための生体イメージングに有用である。本発明者らは、最初に、非常に高い感度及び特異性で誘導ラマン散乱（ＳＲＳ）顕微鏡法を使用してＣａｒｂｏｗの検出感度を特性解析した。Ｓ／Ｎ比１、１−ｍｓの時定数で６３０ｎＭの４−インという低い値（ほとんどのポリインについて５μＭ未満）を、ＳＲＳ顕微鏡下で検出することができる（図４ａ）。これは、単独のアルキンタグのこれまでのＳＲＳ検出よりもほぼ５００倍高感度である。
【０２１０】
サブμΜ感度が与えられ、ＳＲＳイメージングのためにポリインを二次抗体に結合することによる特定のタンパク質の免疫染色が実証された（例えば、図４ｂを参照）。α−チューブリン線維構造のパターンが、良好なコントラストで可視化された。３ｎｍずらして波長を調整すると、オフ共鳴チャネルにおいて無視できるバックグラウンドシグナルを示す。このようなシャープなスペクトル特性は、蛍光アプローチにとっては達成が困難である。従って、Ｃａｒｂｏｗは、タンパク質特異的イメージングのための標準的な免疫染色手順と十分に適合する。同様に、異なる抗体で標識された場合、ポリインは、フローサイトメトリーとの併用によりセルソーティングにおいて大きな有望性を有するであろう。例えば、正常細胞及び癌細胞は、それらの表面の別個のタンパク質種に起因して簡単に分離することができる。当業者は、抗体及び炭素原子ワイヤを結合する方法、抗体−炭素原子ワイヤ結合体で患者から抽出された生細胞を標識する方法、並びに標識された試料のフローサイトメトリーを行う方法を理解しているであろう。
【０２１１】
空間分解した生細胞の例示的な１５色イメージングが実証された（図４ｃ）。この生細胞の各々は、１５色（５種の蛍光分子及び１０種のＣａｒｂｏｗ分子）のうちの１色で単一に染色された。すべての細胞は、複雑なアンミキシングの必要なしに１つの１５チャネル画像の中で混合物から個々に及び明白に特定することができる（図８）。このような分解能は、幅広くかつ重なりがあるスペクトルを有する蛍光イメージングにとって、及びチャネル間の相当なクロストークに起因してスペクトルアンミキシングのための所定のマトリクスを必要とするＭＡＲＳ色素にとっては困難であろう。それゆえ、Ｃａｒｂｏｗ分子は、生細胞についてほとんど報告されない多重化度で、直接的な検出及び分析を用いて光学イメージングを容易にする。
【０２１２】
さらに、中性の骨格及び高い膜透過性のため、Ｃａｒｂｏｗ分子は、生細胞、小器官特異的イメージングプローブへ機能化されることが可能である。フェニル環上のカルバメートリンカーを介して、異なる標的指向基が導入された（図４ｄ〜図４ｈ）。トリフェニルホスホニウム（ＴＰＰ＋）は、正電荷に起因してミトコンドリアマトリックスへの高親和性を有するモチーフである。ＴＰＰ＋が取り付けられた４−イン（Ｃａｒｂｏｗ２１４１Ｍｉｔｏ）は、ミトコンドリアへの特異的な局在を示す（図４ｄ）。リソソーム内腔は酸性であり、この中では、塩基性単位はプロトン化されて内部に捕捉されており、従って本発明者らは、Ｃａｒｂｏｗ２１４１をリソソームへ標的化するためにジメチルアミン基を使用した（Ｃａｒｂｏｗ２１４１Ｌｙｓｏ、図４ｅ）。同様に、Ｃａｒｂｏｗ２１４１ＰＭ中のカチオン性ジアンモニウム基は、アニオン性リン酸頭部との相互作用により細胞膜を染色するために使用される。さらには、ペンタフルオロベンズアミド基は、小胞体を標的とするために、Ｃａｒｂｏｗ２２２６ＥＲにおいてエチレングリコール鎖と共に使用される（図４ｆ、図４ｇ）。最後に、カルボキシレート末端のＣ１２アルキル鎖が、脂肪酸を模倣するためにＣａｒｂｏｗ２２０２に取り付けられ（Ｃａｒｂｏｗ２２０２ＬＤ）、このプローブは、脂質滴に効率よく組み込まれる（図４ｈ）。すべての５つのイメージングプローブは、生細胞中で対応する蛍光マーカーと共に共局在化パターンを示す（図９）。また、Ｃａｒｂｏｗプローブは、１００の連続フレーム後の高い光安定性（＞９８％）（図１０）を提示し、細胞毒性をほとんど提示しない（図１１）。
【０２１３】
５つの小器官標的Ｃａｒｂｏｗプローブ及び５つの蛍光レポーターを合わせ、生細胞中の、細胞膜、小胞体、ゴルジ、ミトコンドリア、リソソーム、脂質滴、核、チューブリン及びアクチンを含めた細胞内構造体のタンデム１０色光学イメージングを達成した（図４ｉ）。細胞活性における小器官インタラクトームの必須の役割を認識して、最大６色の小器官イメージングが、最近、スペクトルアンミキシング及び色補正を用いて蛍光顕微鏡によって成し遂げられた。生細胞における１０色の小器官イメージングは、画像処理において何らアンミキシング又は色補正なしで成し遂げられたが、これは、他の手段によって成し遂げることは困難である。これは、生細胞内部の多標的イメージングについて実証された最高の多重化度であり、Ｃａｒｂｏｗの十分に分解された周波数及び生細胞適合性に決定的に依るものである。
【０２１４】
合成例
材料及び方法
実施例１
すべての試薬及び溶媒は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ及びＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入し、特段の記載がない限りさらに精製することなく使用した。フラッシュクロマトグラフィーは、シリカゲル（Ｓｉｌｉｃｙｃｌｅ、４０〜６３μｍ）上で実施した。ＴＬＣは、５ｍｍ  Ｅ．Ｍｅｒｃｋシリカプレート（６０Ｆ−２５４）上で実施し、ＵＶ光又は過マンガン酸カリウム（ＫＭｎＯ４）若しくはモリブデン酸アンモニウムセリウム（ＣＡＭ）染色によって可視化した。
【０２１５】
核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルは、Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ（コロンビア大学化学学部）のＢｒｕｋｅｒ  ５００（５００ＭＨｚ）  Ｂｒｕｋｅｒ  ４００（４００ＭＨｚ）フーリエ変換（ＦＴ）ＮＭＲスペクトロメーターで記録した。ＮＭＲスペクトルは、残留する未重水素化溶媒を使用して較正した（１Ｈ：ＣＤＣｌ３についてδ  ７．２６、ＭｅＯＨ−ｄ４についてδ  ３．３１、ＤＭＳＯ−ｄ６についてδ  ２．５０；１３Ｃ：ＣＤＣｌ３についてδ  ７７．１６、ＭｅＯＨ−ｄ４についてδ  ４９．０、ＤＭＳＯ−ｄ６についてδ  ３９．５０）。多重度を説明するために、以下の略語を使用した：ｓ＝一重線、ｄ＝二重線、ｔ＝三重線、ｑ＝四重線、ｍ＝多重線、ｂｒ＝ブロード。高分解能質量スペクトル（ＨＲＭＳ）は、複数の注入口及びイオン化能を有するＱＴＯＦ検出器を備えるＸＥＶＯ  Ｇ２−ＸＳ  Ｗａｔｅｒｓ質量分析計で記録した。ＵＶ−Ｖｉｓ吸収スペクトルは、９６プレートを使用してＴｅｃａｎ  ｉｎｆｉｎｉｔｅ  ２００で測定した。
【０２１６】
Ｃａｒｂｏｗジインの合成
Ｃａｒｂｏｗ２２２６
【化３】
2020532497.tif 000007
アセトン（５ｍｌ）中のＣｕＣｌ（１００ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）及びＴＭＥＤＡ（３００μｌ、２．０ｍｍｏｌ）の溶液に、室温で１０分間、空気を吹き込み、次いで、ＣＨ２Ｃｌ２（３ｍｌ）中の４−エチニルベンジルアルコール（２６４ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）及びフェニルアセチレン（０．６６ｍｌ、６．０ｍｍｏｌ）の混合物を添加し、空気とともに室温で２時間撹拌を続けた。溶媒を減圧でエバポレーションし、残渣をクロマトグラフィーにかけ、Ｃａｒｂｏｗ２２２６（３１２ｍｇ、６７％）を白色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）：δ  ７．５５−７．５０（ｍ，４Ｈ），７．４０−７．３０（ｍ，５Ｈ），４．６９（ｓ，２Ｈ），１．９２（ｂｒ，１Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  １４２．２，１３２．８，１３２．６，１２９．３，１２８．６，１２６．９，１２１．９，１２１．０，８１．７，８１．５，７４．１，７４．０，６４．９；ＨＲＭＳ（ＡＳＡＰ）：Ｃ１７Ｈ１２Ｏ＋［Ｍ］＋に対する計算値  ２３２．０８８８、実測値  ２３２．０８８９。
【０２１７】
他のＣａｒｂｏｗジインを、Ｃａｒｂｏｗ２２２６と同じ手順を使用して調製した。
【化４】
2020532497.tif 000008
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）：δ  ３．７８−３．６８（ｍ，４Ｈ），２．５２（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，４Ｈ），２．１７（ｂｒ，２Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ７４．８，６６．９，６０．９，２３．７；ＨＲＭＳ（ＡＳＡＰ）：Ｃ８Ｈ１１Ｏ２＋［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値  １３９．０７５９、実測値  １３９．０７６０。
【化５】
2020532497.tif 000009
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ；ＭｅＯＨ−ｄ４）：δ  ４．１９（ｓ，４Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＭｅＯＨ−ｄ４）：δ  ７８．８，６９．４，５０．９；ＨＲＭＳ（ＡＳＡＰ）：Ｃ１２Ｈ１２Ｏ４＋［２Ｍ］＋に対する計算値  ２２０．０７３６、実測値  ２２０．０７２６。
【化６】
2020532497.tif 000010
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）：δ  ７．５０−７．４５（ｍ，２Ｈ），７．３７−７．２７（ｍ，３Ｈ），３．８４−３．７５（ｍ，２Ｈ），２．６４（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，２Ｈ），１．９６（ｂｒ，１Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  １３２．７，１２９．２，１２８．５，１２１．８，８１．１，７５．５，７４．１，６６．９，６０．９，２４．１；ＨＲＭＳ（ＡＳＡＰ）：Ｃ１２Ｈ１１Ｏ＋［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値  １７１．０８１０、実測値  １７１．０８０５。
【化７】
2020532497.tif 000011
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）：δ  ７．５２−７．４６（ｍ，２Ｈ），７．３９−７．２８（ｍ，３Ｈ），４．４３（ｓ，２Ｈ），２．２８（ｂｒ，１Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  １３２．７，１２９．４，１２８．５，１２１．５，８０．６，７８．７，７３．３，７０．５，５１．７；ＨＲＭＳ（ＡＳＡＰ）：Ｃ１１Ｈ７＋［Ｍ−ＯＨ］＋に対する計算値  １３９．０５４８、実測値  １３９．０５６５。
【化８】
2020532497.tif 000012
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ７．１８（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），６．５３（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），５．６５（ｂｒ，２Ｈ），４．２１（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ）；ＨＲＭＳ（ＡＳＡＰ）：Ｃ１１Ｈ８Ｎ＋［Ｍ−ＯＨ］＋に対する計算値  １５４．０６５７、実測値  １５４．０６６４。
【化９】
2020532497.tif 000013
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）：δ  ７．２９（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），６．５９（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），３．８６（ｂｒ，２Ｈ），１．３０（ｓ，９Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  １４７．２，１３４．１，１１４．７，１１１．３，９１．４，７２．２，６４．２，５３．５，３０．７，２８．４；ＨＲＭＳ（ＡＳＡＰ）：Ｃ１４Ｈ１６Ｎ＋［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値  １９８．１２８３、実測値  １９８．１２７７。
【化１０】
2020532497.tif 000014
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）：δ  ７．５６−７．４８（ｍ，２Ｈ），７．３８−７．３０（ｍ，５Ｈ），６．５９（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），３．８９（ｂｒ，２Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  １４７．７，１３４．２，１３２．５，１２８．９，１２８．５，１２２．３，１１４．７，１１０．７，８２．９，８０．９，７４．６，７２．２；ＨＲＭＳ（ＡＳＡＰ）：Ｃ１６Ｈ１２Ｎ＋［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値  ２１８．０９７０、実測値  ２１８．０９７６。
【化１１】
2020532497.tif 000015
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ７．６０−７．４５（ｍ，４Ｈ），７．４３−７．２７（ｍ，５Ｈ），４．７２（ｓ，２Ｈ）；ＨＲＭＳ（ＡＳＡＰ）：１２Ｃ１５１３Ｃ２Ｈ１２Ｏ［Ｍ］＋に対する計算値  ２３４．０９５５、実測値  ２３４．０９５２。
【化１２】
2020532497.tif 000016
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）：δ  ７．５８−７．４９（ｍ，２Ｈ），７．４０−７．３１（ｍ，４Ｈ），７．１９−７．１３（ｍ，１Ｈ），６．７２−６．６６（ｍ，２Ｈ），４．３２（ｂｒ，２Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ８２．９（ｄ，Ｊ＝７８４．８Ｈｚ），７３．９（ｄ，Ｊ＝７８４．８Ｈｚ）；ＨＲＭＳ（ＡＳＡＰ）：１２Ｃ１４１３Ｃ２Ｈ１２Ｎ＋［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値  ２２０．１０３７、実測値  ２２０．１０３５。
【化１３】
2020532497.tif 000017
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）：δ  ７．５６−７．４６（ｍ，２Ｈ），７．４１−７．２８（ｍ，５Ｈ），６．６０（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），３．８９（ｂｒ，２Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ８１．０（ｄ，Ｊ＝７８２．８Ｈｚ），７４．４（ｄ，Ｊ＝７８２．８Ｈｚ）；ＨＲＭＳ（ＡＳＡＰ）：１２Ｃ１４１３Ｃ２Ｈ１２Ｎ＋［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値  ２２０．１０３７、実測値  ２２０．１０３８。
【０２１８】
Ｃａｒｂｏｗトリインの合成
Ｃａｒｂｏｗ２１８３
【化１４】
2020532497.tif 000018
アセトン（４０ｍｌ）中のフェニルアセチレン（１．３２ｍＬ、１２．０ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ−ブロモスクシンイミド（２．２４ｇ、１２．６ｍｍｏｌ）及びＡｇＮＯ３（２０４ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を室温で２時間撹拌した。次いで、この混合物を減圧下で濾過し、濾液をＨ２Ｏ（５０ｍＬ）の中へと注ぎ込んだ。この生成物混合物を石油エーテル（３×３０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥した。溶媒を減圧下で濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィーによって精製し、フェニルアセチレン臭化物生成物Ｓ１を無色の液体として得た。
【０２１９】
１００ｍＬの３つ口フラスコ中の上記のフェニルアセチレン臭化物Ｓ１（２．０９ｇ、１１．６ｍｍｏｌ）、ＣｕＩ（６６．４ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）、及びＰｄ（ＰＰｈ３）２Ｃｌ２（０．２４ｇ、０．３５ｍｍｏｌ）の混合物を脱気し、再びＮ２で満たした。この手順を３回繰り返した後、トリエチルアミン（５５ｍＬ）及び（トリメチルシリル）アセチレン（２．４５ｍＬ、１７．４ｍｍｏｌ）をシリンジで加えた。この反応溶液を５０℃で２時間撹拌し、次いで、溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を、溶離液として石油エーテルを用いるカラムクロマトグラフィーによってさらに精製し、Ｓ２（１．４７ｇ、６４％）を黄色の液体として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ７．５２−７．４８（ｍ，２Ｈ），７．４０−７．３０（ｍ，３Ｈ），０．２５（ｓ，９Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  １３２．８，１２９．４，１２８．５，１２１．６，９０．８，８８．０，７６．９，７４．３，−０．２；ＨＲＭＳ（ＡＳＡＰ）：Ｃ１３Ｈ１４Ｓｉ＋［Ｍ］＋に対する計算値  １９８．０８６５、実測値  １９８．０８７３。
【０２２０】
【化１５】
2020532497.tif 000019
アセトン（８ｍｌ）中の４−エチニルベンジルアルコール（１３２ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ−ブロモスクシンイミド（１８７ｍｇ、１．０５ｍｍｏｌ）及びＡｇＮＯ３（１７．２ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を室温で３時間撹拌した。次いで、この混合物を減圧下で濾過し、濾液をＨ２Ｏ（１０ｍＬ）の中へと注ぎ込んだ。この生成物混合物をエチルエーテル（３×１０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、減圧下で濃縮した。得られた残渣をフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、化合物Ｓ３（１７７ｍｇ、８４％）を白色固体として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ７．４３（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），７．２９（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），４．６７（ｓ，２Ｈ），１．９２（ｂｒ，１Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  １４１．６，１３２．３，１２６．９，１２２．０，８０．０，６４．９，４９．９；ＨＲＭＳ（ＡＳＡＰ）：Ｃ９Ｈ６Ｂｒ＋［Ｍ−ＯＨ］＋に対する計算値  １９２．９６５３、実測値  １９２．９６５８。
【０２２１】
【化１６】
2020532497.tif 000020
ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ（１：１、２ｍＬ）中のＳ２（３０ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｋ２ＣＯ３（８３ｍｇ、０．６０ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を室温で１時間撹拌した後、Ｈ２Ｏを添加し、この混合物をエーテルで抽出した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、溶媒を減圧下で蒸発させた。残渣Ｓ４をトルエン（２ｍＬ）で希釈し、０℃に冷却した。ＣｕＣｌ（５．２ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）、ＮＨ２ＯＨ・ＨＣｌ（７．０ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）及びＢｕＮＨ２（６０μＬ、０．６ｍｍｏｌ）をこの順に添加した。アルキニルブロミドＳ３（３２ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を１ｍＬトルエンで希釈し、上記混合物に滴下した。この反応混合物を室温まで加温し、１０時間撹拌した。この反応をＨ２Ｏでクエンチし、エーテルで抽出した。有機層をＨ２Ｏで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥した。溶媒をロータリー・エバポレーターにより除去した後、生成物をシリカ上でのカラムクロマトグラフによって精製し、Ｃａｒｂｏｗ２１８３（２１ｍｇ、５４％）を黄色固体として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ７．５８−７．４８（ｍ，４Ｈ），７．４３−７．３７（ｍ，１Ｈ），７．３７−７．３０（ｍ，４Ｈ），４．７２（ｓ，２Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  １４２．６，１３３．２，１３３．０，１２９．７，１２８．５，１２６．８，１２１．０，１２０．１，７８．６，７８．５，７４．５，７４．４，６６．５，６６．５，６４．８；ＨＲＭＳ（ＡＳＡＰ）：Ｃ１９Ｈ１２Ｏ＋［Ｍ］＋に対する計算値  ２５６．０８８８、実測値  ２５６．０８９５。
他のＣａｒｂｏｗトリインを、Ｃａｒｂｏｗ２１８３と同じ手順を使用して調製した。
【化１７】
2020532497.tif 000021
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）：δ  ７．５５−７．５０（ｍ，２Ｈ），７．４０−７．３０（ｍ，５Ｈ），６．５８（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），３．９５（ｂｒ，２Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  １４８．１，１３４．８，１３３．０，１２９．６，１２８．６，１２１．４，１１４．７，１０９．７，８０．１，７８．４，７４．９，７２．９，６７．４，６５．９；ＨＲＭＳ（ＡＳＡＰ）：Ｃ１８Ｈ１１Ｎ＋［Ｍ］＋に対する計算値  ２４１．０８９１、実測値  ２４１．０８７６。
【化１８】
2020532497.tif 000022
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ７．５６−７．５０（ｍ，４Ｈ），７．４２−７．３０（ｍ，５Ｈ），４．７２（ｓ，２Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ６６．６；ＨＲＭＳ（ＡＳＡＰ）：１２Ｃ１７１３Ｃ２Ｈ１２Ｏ［Ｍ］＋に対する計算値  ２５８．０９５５、実測値  ２５８．０９４６。
【化１９】
2020532497.tif 000023
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）：δ  ７．５６−７．５０（ｍ，２Ｈ），７．４１−７．２９（ｍ，５Ｈ），６．５８（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），３．９５（ｂｒ，２Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ６６．８，６６．４；ＨＲＭＳ（ＡＳＡＰ）：１２Ｃ１６１３Ｃ２Ｈ１１Ｎ＋［Ｍ］＋に対する計算値  ２４３．０９５９、実測値  ２４３．０９５２。
【０２２２】
Ｃａｒｂｏｗテトラインの合成
Ｃａｒｂｏｗ２１４１
【化２０】
2020532497.tif 000024
アセトン（７ｍｌ）中のＣｕＣｌ（１２０ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）及びＴＭＥＤＡ（３６０μｌ、２．４ｍｍｏｌ）の溶液に室温で１０分間、空気を吹き込み、次いで、ＣＨ２Ｃｌ２中の（トリメチルシリル）アセチレン（１．０１ｍＬ、７．２ｍｍｏｌ）及び４−エチニルベンジルアルコール（３１７ｍｇ、２．４ｍｍｏｌ）の混合物を添加し、空気とともに室温で２時間撹拌を続け、次いで、減圧で濃縮した。残渣をクロマトグラフィーにかけ、化合物Ｓ５（３３９ｍｇ、６２％）を黄色固体として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）：δ  ７．４７（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），７．３０（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），４．６７（ｓ，２Ｈ），１．９５（ｂｒ，１Ｈ），０．２３（ｓ，９Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  １４２．３，１３２．９，１２６．９，１２０．６，９０．８，８７．９，７６．７，７４．３，６４．８，−０．３；ＨＲＭＳ（ＡＳＡＰ）：Ｃ１４Ｈ１５Ｓｉ＋［Ｍ−ＯＨ］＋に対する計算値  ２１１．０９４３、実測値  ２１１．１０１９。
【０２２３】
【化２１】
2020532497.tif 000025
ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ（１：１、６ｍＬ）中のＳ５（１００ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）及びＳ２（１３０ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｋ２ＣＯ３（２４３ｍｇ、１．７６ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を室温で１時間撹拌した後、Ｈ２Ｏを添加し、この混合物をエーテルで抽出した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、溶媒を減圧下で蒸発させた。残渣を次の工程に直接使用した。
【０２２４】
アセトン（５ｍｌ）中のＣｕＣｌ（４４ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）及びＴＭＥＤＡ（１３２μｌ、０．８８ｍｍｏｌ）の溶液に室温で１０分間、空気を吹き込み、次いで、上記のＣＨ２Ｃｌ２中の混合物を添加し、空気とともに室温で１時間撹拌し続け、次いで、減圧で濃縮し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、Ｃａｒｂｏｗ２１４１（６４ｍｇ、５２％）を黄色固体として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ７．５６−７．５１（ｍ，４Ｈ），７．４４−７．３８（ｍ，１Ｈ），７．３７−７．３１（ｍ，４Ｈ），４．７２（ｓ，２Ｈ），１．７８（ｂｒ，１Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  １４３．１，１３３．５，１３３．３，１３０．１，１２８．７，１２６．９，１２０．７，１１９．８，７７．９，７７．７，７４．６，７４．５，６７．４，６７．３，６４．９，６３．９，６３．８；ＨＲＭＳ（ＡＳＡＰ）：Ｃ２１Ｈ１２Ｏ＋［Ｍ］＋に対する計算値  ２８０．０８８８、実測値  ２８０．０８７６。
【０２２５】
他のＣａｒｂｏｗテトラインを、Ｃａｒｂｏｗ２１４１と同じ手順を使用して調製した。
【化２２】
2020532497.tif 000026
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ７．７４−７．５３（ｍ，８Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  １３３．４，１３１．６（ｄ，Ｊ＝３２．８Ｈｚ），１２５．５（ｑ，Ｊ＝３．８Ｈｚ），１２４．３，１２３．６（ｄ，Ｊ＝２７２．３Ｈｚ），７６．３，７６．２，６８．０，６３．６；ＨＲＭＳ（ＡＳＡＰ）：Ｃ２２Ｈ８Ｆ６＋［Ｍ］＋に対する計算値  ３８６．０５３２、実測値  ３８６．０５４２。
【化２３】
2020532497.tif 000027
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ７．７２（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，４Ｈ），７．６９（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，４Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  １３３．８，１３２．５，１２７．０，１１８．１，１１１．２，７８．３，７５．３，６８．７，６３．５７；ＨＲＭＳ（ＡＳＡＰ）：Ｃ２２Ｈ９Ｎ２＋［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値  ３０１．０７６６、実測値  ３０１．０７５７。
【化２４】
2020532497.tif 000028
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ７．５８−７．５０（ｍ，２Ｈ），７．４５−７．３８（ｍ，１Ｈ），７．３８−７．３１（ｍ，２Ｈ），７．１２（ｔ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），６．９５（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），６．８３（ｔ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，１Ｈ），６．７２（ｄｄ，Ｊ＝８．０，２．４Ｈｚ，１Ｈ），３．７４（ｓ，２Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  １４６．４，１３３．２，１３０．０，１２９．５，１２８．６，１２３．７，１２１．１，１２０．５，１１８．８，１１７．１，７８．１，７７．６，７４．５，７３．８，６７．３，６６．９，６３．８，６３．５；ＨＲＭＳ（ＡＳＡＰ）：Ｃ２０Ｈ１２Ｎ＋［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値  ２６６．０９７０、実測値  ２６６．０９７４。
【化２５】
2020532497.tif 000029
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ７．５７−７．５２（ｍ，２Ｈ），７．５１（ｓ，３Ｈ），７．４３−７．３８（ｍ，１Ｈ），７．３８−７．３２（ｍ，２Ｈ），７．２１（ｓ，１Ｈ），２．２０（ｓ，３Ｈ）；ＨＲＭＳ（ＡＳＡＰ）：Ｃ２２Ｈ１４ＮＯ＋［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値  ３０８．１０７５、実測値  ３０８．１０７３。
【化２６】
2020532497.tif 000030
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ８．３６（ｓ，１Ｈ），７．５４（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），７．５０−７．３０（ｍ，４Ｈ），６．７７（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，１Ｈ），６．３５（ｓ，２Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  １４５．２，１３９．０，１３３．２，１３２．０，１３０．０，１２８．６，１２０．５，１１９．１，１０８．９，７７．９，７６．１，７４．４，７４．１，６７．４，６７．２，６３．９，６３．６；ＨＲＭＳ（ＡＳＡＰ）：Ｃ２０Ｈ１１Ｎ２Ｏ２＋［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値  ３１１．０８２１、実測値  ３１１．０８１５。
【化２７】
2020532497.tif 000031
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ７．５５（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），７．４７−７．２９（ｍ，４Ｈ），７．１９（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ），６．６８（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ），４．３６（ｓ，２Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  １５０．９，１３３．８，１３３．２，１３１．５，１３０．０，１２８．６，１２０．６，１１８．１，１１４．５，１０４．５，７９．７，７８．１，７５．２，７４．５，６８．８，６７．２，６４．６，６３．６；ＨＲＭＳ（ＡＳＡＰ）：Ｃ２０Ｈ１２Ｎ＋［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値  ２６６．０９７０、実測値  ２６６．０９７２。
【化２８】
2020532497.tif 000032
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ７．６０−７．４７（ｍ，２Ｈ），７．４５−７．２８（ｍ，５Ｈ），６．５８（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），３．９９（ｂｒ，２Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  １４８．３，１３５．０，１３３．１，１２９．８，１２８．５，１２０．８，１１４．６，１０８．９，７９．３，７７．５，７４．６，７３．０，６７．６，６６．８，６４．５，６３．５；ＨＲＭＳ（ＡＳＡＰ）：Ｃ２０Ｈ１２Ｎ＋［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値  ２６６．０９７０、実測値  ２６６．０９７４。
【化２９】
2020532497.tif 000033
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ７．５８−７．４８（ｍ，２Ｈ），７．４７−７．２９（ｍ，５Ｈ），６．６４−６．５３（ｍ，２Ｈ），３．０２（ｓ，６Ｈ）；ＨＲＭＳ（ＡＳＡＰ）：Ｃ２２Ｈ１６Ｎ＋［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値  ２９４．１２８３、実測値  ２９４．１２７６。
【化３０】
2020532497.tif 000034
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ７．５３（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），７．４６−７．３０（ｍ，３Ｈ），７．０５（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），６．９２（ｓ，１Ｈ），６．５９（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），４．１６（ｓ，２Ｈ），３．８５（ｓ，３Ｈ）；ＨＲＭＳ（ＡＳＡＰ）：Ｃ２１Ｈ１４ＮＯ＋［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値  ２９６．１０７５、実測値  ２９６．１０７１。
【化３１】
2020532497.tif 000035
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ７．６５−７．５９（ｍ，４Ｈ），７．４４（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），６．６１（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），３．０４（ｓ，６Ｈ）；ＨＲＭＳ（ＡＳＡＰ）：Ｃ２３Ｈ１５Ｎ２＋［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値  ３１９．１２３５、実測値  ３１９．１２３９。
【化３２】
2020532497.tif 000036
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ７．５７−７．５０（ｍ，４Ｈ），７．４４−７．３８（ｍ，１Ｈ），７．３７−７．３１（ｍ，４Ｈ），４．７２（ｓ，２Ｈ），１．７３（ｂｒ，１Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ７８．１（ｄ，Ｊ＝７８６．０Ｈｚ），７４．３（ｄ，Ｊ＝７８６．０Ｈｚ）；ＨＲＭＳ（ＡＳＡＰ）：１２Ｃ１９１３Ｃ２Ｈ１２Ｏ［Ｍ］＋に対する計算値  ２８２．０９５５、実測値  ２８２．０９５１。
【化３３】
2020532497.tif 000037
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＭｅＯＨ−ｄ４）：δ  ７．２０（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，４Ｈ），６．６１（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，４Ｈ）；ＨＲＭＳ（ＡＳＡＰ）：Ｃ２０Ｈ１３Ｎ２＋［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値  ２８１．１０７９、実測値  ２８１．１０８０。
【化３４】
2020532497.tif 000038
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ７．４０（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，４Ｈ），６．５８（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，４Ｈ），３．００（ｓ，１２Ｈ）；ＨＲＭＳ（ＡＳＡＰ）：Ｃ２４Ｈ２１Ｎ２＋［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値  ３３７．１７０５、実測値  ３３７．１６９６。
【化３５】
2020532497.tif 000039
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＭｅＯＨ−ｄ４）：δ  ６．９９（ｄｄ，Ｊ＝８．１，１．７Ｈｚ，２Ｈ），６．９４（ｄ，Ｊ＝１．７Ｈｚ，２Ｈ），６．６３（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，２Ｈ），３．８４（ｓ，６Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＭｅＯＨ−ｄ４）：δ  １４６．３，１４０．７，１２７．６，１１３．９，１１３．４，１０６．８，７９．９，７１．４，６６．０，６３．８，５４．７；ＨＲＭＳ（ＡＳＡＰ）：Ｃ２２Ｈ１７Ｎ２Ｏ２＋［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値  ３４１．１２９０、実測値  ３４１．１２９６。
【化３６】
2020532497.tif 000040
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ７．５６−７．５０（ｍ，４Ｈ），７．４５−７．３９（ｍ，１Ｈ），７．３８−７．３０（ｍ，４Ｈ），４．７２（ｓ，２Ｈ），１．７５（ｂｒ，１Ｈ）；ＨＲＭＳ（ＡＳＡＰ）：１２Ｃ１７１３Ｃ４Ｈ１１［Ｍ−ＯＨ］＋に対する計算値  ２６７．０９９５、実測値  ２６７．１０１１。
【化３７】
2020532497.tif 000041
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ７．６１−７．４７（ｍ，２Ｈ），７．４５−７．２９（ｍ，５Ｈ），６．６５−６．５１（ｍ，２Ｈ），３．９８（ｂｒ，２Ｈ）；ＨＲＭＳ（ＡＳＡＰ）：１２Ｃ１４１３Ｃ６Ｈ１１Ｎ＋［Ｍ］＋に対する計算値  ２７１．１０９３、実測値  ２７１．１０９３。
【化３８】
2020532497.tif 000042
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ７．５６−７．５０（ｍ，４Ｈ），７．４４−７．３９（ｍ，１Ｈ），７．３８−７．３１（ｍ，４Ｈ），４．７２（ｓ，２Ｈ），１．７３（ｂｒ，１Ｈ）；ＨＲＭＳ（ＡＳＡＰ）：１２Ｃ１５１３Ｃ６Ｈ１１［Ｍ−ＯＨ］＋に対する計算値  ２６９．１０６２、実測値  ２６９．１１１６。
【化３９】
2020532497.tif 000043
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ７．５３（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），７．４２−７．３０（ｍ，５Ｈ），６．５８（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），３．９７（ｂｒ，２Ｈ）；ＨＲＭＳ（ＡＳＡＰ）：１２Ｃ１４１３Ｃ６Ｈ１１Ｎ＋［Ｍ］＋に対する計算値  ２７１．１０９３、実測値  ２７１．１０９３。
【化４０】
2020532497.tif 000044
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ７．５３（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），７．４２−７．３２（ｍ，５Ｈ），６．５８（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），３．９７（ｂｒ，２Ｈ）；ＨＲＭＳ（ＡＳＡＰ）：１２Ｃ１２１３Ｃ８Ｈ１２Ｎ＋［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値  ２７４．１２３８、実測値  ２７４．１２２２。
【化４１】
2020532497.tif 000045
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ７．４０（ｄｄ，Ｊ＝８．８，４．９Ｈｚ，４Ｈ），６．５９（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，４Ｈ），３．０１（ｓ，１２Ｈ）；ＨＲＭＳ（ＡＳＡＰ）：１２Ｃ１６１３Ｃ８Ｈ２１Ｎ２＋［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値  ３４５．１９６８、実測値  ３４５．１９７１。
【０２２６】
Ｃａｒｂｏｗペンタインの合成
Ｃａｒｂｏｗ２１００
【化４２】
2020532497.tif 000046
Ｈ２Ｏ（１８μＬ、１．０ｍｍｏｌ）を添加したアセトニトリル中のＳ２（４８ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）の溶液に、ＡｇＦ（３０ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）を添加し、この混合物を２０分間撹拌した。次に、Ｎ−ブロモスクシンイミド（５１ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）を導入し、この混合物を３時間撹拌した。アセトニトリルを減圧下で除去し、残渣をエチルエーテルで希釈した。有機層をＨ２Ｏで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥した。溶媒を除去し、残渣をカラムクロマトグラフィーによってさらに精製し、純粋な生成物Ｓ６を得た。
【０２２７】
３つ口フラスコ中のＳ６、ＣｕＩ（４．４ｍｇ、０．０２４ｍｍｏｌ）、及びＰｄ（ＰＰｈ３）２Ｃｌ２（１６．８ｍｇ、０．０２４ｍｍｏｌ）の混合物を脱気し、再びＮ２で満たした。この手順を３回繰り返した後、トリエチルアミン（５ｍＬ）及び（トリメチルシリル）アセチレン（４７ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）をシリンジで加えた。この反応溶液を５０℃で２時間撹拌し、次いで、溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を、溶離液として石油エーテルを用いるカラムクロマトグラフィーによってさらに精製し、Ｓ７（３６ｍｇ、６７％）を黄色の液体として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ７．５４−７．４９（ｍ，２Ｈ），７．４２−７．３６（ｍ，１Ｈ），７．３６−７．２９（ｍ，２Ｈ），０．２３（ｓ，９Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  １３３．１，１２９．８，１２８．５，１２０．８，８９．０，８８．１，７６．９，７４．３，６６．８，６１．６，−０．５；ＨＲＭＳ（ＡＳＡＰ）：Ｃ１５Ｈ１４Ｓｉ＋［Ｍ］＋に対する計算値  ２２２．０８６５、実測値  ２２２．０８４３。
【０２２８】
【化４３】
2020532497.tif 000047
Ｈ２Ｏ（１８μＬ、１．０ｍｍｏｌ）を添加したアセトニトリル中のＳ５（３２ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）の溶液に、ＡｇＦ（１８ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）を添加し、この混合物を２０分間撹拌した。次に、Ｎ−ブロモスクシンイミド（２９ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）を添加し、この混合物を５時間撹拌した。アセトニトリルを減圧下で除去し、残渣をエチルエーテルで希釈した。有機層をＨ２Ｏ、塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥した。溶媒を除去し、残渣をカラムクロマトグラフィーによってさらに精製し、Ｓ９（２４ｍｇ、７３％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ７．４９（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），７．３１（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），４．６９（ｓ，２Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  １４２．４，１３３．０，１２６．８，１２０．２，７４．３，７３．９，６５．４，６４．８，４４．５；ＨＲＭＳ（ＡＳＡＰ）：Ｃ１１Ｈ６Ｂｒ＋［Ｍ−ＯＨ］＋に対する計算値：２１６．９６５３、実測値：２１６．９６６１。
【０２２９】
【化４４】
2020532497.tif 000048
ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ（１：１、１ｍＬ）中のＳ７（１１ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｋ２ＣＯ３（２８ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を室温で１時間撹拌した後、Ｈ２Ｏを添加し、この混合物をエーテルで抽出した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、溶媒を減圧下で蒸発させた。残渣Ｓ８をトルエン（１ｍＬ）で希釈し、０℃に冷却した。ＣｕＣｌ（５．２ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）、ＮＨ２ＯＨ・ＨＣｌ（７．０ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）及びＢｕＮＨ２（６０μＬ、０．６ｍｍｏｌ）をこの順に添加した。トルエン（１ｍＬ）中のアルキニルブロミド１９（１２ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）を上記混合物に滴下した。この反応混合物を室温に加温し、１０時間撹拌した。この反応をＨ２Ｏでクエンチし、エーテルで抽出した。有機層をＨ２Ｏ、塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥した。溶媒をロータリー・エバポレーターにより除去した後、生成物をシリカ上でのカラムクロマトグラフによって精製し、Ｃａｒｂｏｗ２１００（７．１ｍｇ、４７％）を黄色固体として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ７．６０−７．４６（ｍ，４Ｈ），７．４５−７．３８（ｍ，１Ｈ），７．３８−７．２８（ｍ，４Ｈ），４．７３（ｓ，２Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）  δ  １４３．２，１３３．６，１３３．４，１３０．２，１２８．６，１２６．８，１２０．３，１１９．３，７７．５，７４．４，７４．４，６７．３，６７．３，６４．７，６４．５，６４．５，６２．８，６２．８；ＨＲＭＳ（ＡＳＡＰ）：Ｃ２３Ｈ１２Ｏ＋［Ｍ］＋に対する計算値：３０４．０８８８、実測値：３０４．０８６４。
Ｃａｒｂｏｗ２０３６を、Ｃａｒｂｏｗ２１００と同じ手順を使用して調製した。
【化４５】
2020532497.tif 000049
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ７．５８−７．４７（ｍ，４Ｈ），７．４５−７．３７（ｍ，１Ｈ），７．３６−７．２９（ｍ，４Ｈ），４．７２（ｓ，２Ｈ）；ＨＲＭＳ（ＡＳＡＰ）：１２Ｃ１７１３Ｃ６Ｈ１２Ｏ［Ｍ］＋に対する計算値  ３１０．１０８９、実測値  ３１０．１０９０。
【０２３０】
ヘキサインの合成
Ｃａｒｂｏｗ２０６６
【化４６】
2020532497.tif 000050
３つ口フラスコ中のジアセチレンブロミドＳ９（２９ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）、ＣｕＩ（２．２ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ）、及びＰｄ（ＰＰｈ３）２Ｃｌ２（８．４ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ）の混合物を脱気し、再びＮ２で満たした。この手順を３回繰り返した後、トリエチルアミン（２ｍＬ）及び（トリメチルシリル）アセチレン（２４ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）をシリンジで加えた。この反応溶液を５０℃で２時間撹拌し、次いで、溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣をカラムクロマトグラフィーによってさらに精製し、生成物Ｓ１０をアセトニトリル（１ｍＬ）に溶解した。Ｈ２Ｏ（１１μＬ、０．６ｍｍｏｌ）及びＡｇＦ（１５ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を添加し、この混合物を２０分間撹拌した。次に、Ｎ−ブロモスクシンイミド（２７ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を添加し、この混合物を５時間撹拌した。アセトニトリルを減圧下で除去し、残渣をエチルエーテルで希釈した。有機層をＨ２Ｏ、塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥した。溶媒を除去し、残渣をカラムクロマトグラフィーによってさらに精製し、Ｓ１１（１６ｍｇ、５２％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ７．５１（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ），７．３３（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ），４．７１（ｓ，２Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）  δ  １４２．９，１３３．３，１２６．８，１１９．７，７５．６，７４．２，６７．２，６６．１，６４．７，５９．０，４２．９；ＨＲＭＳ（ＡＳＡＰ）：Ｃ１３Ｈ６Ｂｒ＋［Ｍ−ＯＨ］＋に対する計算値：２４０．９６５３、実測値：２４０．９６４７。
【０２３１】
【化４７】
2020532497.tif 000051
化合物Ｓ８をトルエン（１ｍＬ）で希釈し、０℃に冷却した。ＣｕＣｌ（５．２ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）、ＮＨ２ＯＨ・ＨＣｌ（７．０ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）及びＢｕＮＨ２（６０μＬ、０．６ｍｍｏｌ）をこの順に添加した。トルエン（１ｍＬ）中のアルキニルブロミドＳ１１（１３ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）を上記混合物に滴下した。この反応混合物を室温に加温し、１０時間撹拌した。この反応をＨ２Ｏでクエンチし、エーテルで抽出した。有機層をＨ２Ｏ、塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥した。溶媒をロータリー・エバポレーターにより除去した後、生成物をシリカ上でのカラムクロマトグラフによって精製し、Ｃａｒｂｏｗ２０６６（６．８ｍｇ、４２％）を黄色固体として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ７．６７（ｄｄ，Ｊ＝１６．９，７．６Ｈｚ，４Ｈ），７．５５（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．４５（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），７．３８（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），４．５２（ｓ，２Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  １４７．１，１３４．１，１３４．０，１３１．９，１２９．６，１２７．２，１１８．８，１１６．７，７９．６，７９．２，７３．８，７３．５，６７．０，６６．９，６４．７，６４．６，６４．０，６３．９，６３．５，６３．３，６２．８；ＨＲＭＳ（ＡＳＡＰ）：Ｃ２５Ｈ１３Ｏ＋［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値：３２９．０９６６、実測値：３２９．０９４４。
【０２３２】
Ｃａｒｂｏｗ２０１７を、Ｃａｒｂｏｗ２０６６と同じ手順を使用して調製した。
【化４８】
2020532497.tif 000052
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ７．６８−７．５９（ｍ，４Ｈ），７．５７−７．５０（ｍ，１Ｈ），７．４８−７．３５（ｍ，４Ｈ），４．５０（ｓ，２Ｈ）；ＨＲＭＳ（ＡＳＡＰ）：１２Ｃ１９１３Ｃ６Ｈ１２Ｏ［Ｍ］＋に対する計算値  ３３４．１０８９、実測値  ３３４．１０８０。
【０２３３】
４−インＬｙｓｏの合成
【化４９】
2020532497.tif 000053
ＣＨ２Ｃｌ２（１ｍｌ）中の１（８．４ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）に、１，１’−カルボニルジイミダゾール（９．７ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）を室温で添加した。この混合物を室温で６時間撹拌した後、Ｈ２Ｏを添加し、この混合物をＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、溶媒を減圧下で蒸発させた。残渣をＣＨ２Ｃｌ２（１ｍｌ）に溶解し、Ｎ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン（６．６μＬ、０．０６ｍｍｏｌ）を添加し、室温で２０時間撹拌を続け、次いで、減圧で濃縮し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、化合物２を黄色固体として得た（９．８ｍｇ、８２％）。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ７．６１−７．４７（ｍ，４Ｈ），７．４３−７．２８（ｍ，５Ｈ），５．５４（ｂｒ，１Ｈ），５．０９（ｓ，２Ｈ），３．３５−３．２５（ｍ，２Ｈ），２．４９（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ），２．２８（ｓ，６Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）  δ  １５６．３，１３９．０，１３３．４，１３３．３，１３０．１，１２８．７，１２８．０，１２０．６，１２０．２，７７．８，７７．５，７４．８，７４．５，６７．４，６７．３，６５．９，６３．８，６３．７，５８．２，４５．１，３８．２；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ２６Η２３Ν２Ｏ２＋［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値：３９９．１８９４、実測値：３９９．１８９４。
【化５０】
2020532497.tif 000054
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ７．５６−７．４９（ｍ，４Ｈ），７．４３−７．３８（ｍ，１Ｈ），７．３６−７．３１（ｍ，４Ｈ），５．６６（ｂｒ，１Ｈ），５．１０（ｓ，２Ｈ），３．３５−３．２７（ｍ，２Ｈ），２．５７（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ），２．３５（ｓ，６Ｈ）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：１２Ｃ２２１３Ｃ４Ｈ２３Ｎ２Ｏ２＋［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値：３９５．１７６０、実測値：３９５．１７６７。
【０２３４】
２−インＭｉｔｏの合成
【化５１】
2020532497.tif 000055
ＣＨ２Ｃｌ２（１ｍｌ）中の１（１０．５ｍｇ、０．０４５ｍｍｏｌ）に、１，１’−カルボニルジイミダゾール（１１．２ｍｇ、０．０６８ｍｍｏｌ）を室温で添加した。この混合物を室温で３時間撹拌した後、Ｈ２Ｏを添加し、この混合物をＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、溶媒を減圧下で蒸発させた。残渣をＣＨ２Ｃｌ２（１ｍｌ）に溶解させ、（３−アミノプロピル）トリフェニルホスホニウムブロミド（４３ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ）を添加し、室温で１５時間撹拌を続け、次いで、減圧で濃縮し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、化合物２を黄色固体として得た（２３ｍｇ、７８％）。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）：δ  ７．７９−７．６９（ｍ，８Ｈ），７．６７−７．６０（ｍ，６Ｈ），７．５３−７．４６（ｍ，３Ｈ），７．４３−７．３８（ｍ，２Ｈ），７．３７−７．２８（ｍ，５Ｈ），５．０５（ｓ，２Ｈ），３．８１−３．６９（ｍ，２Ｈ），３．５０−３．４０（ｍ，２Ｈ），１．８８−１．７６（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）  δ  １５６．９，１３８．８，１３５．２（ｄ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ），１３３．６，１３３．５，１３２．６，１３０．６，１２９．３，１２８．５，１２７．７，１２１．８，１２０．９，１１７．８，８１．７，８１．６，７４．１，７４．０，６５．５，４０．４（ｄ，Ｊ＝６８．８Ｈｚ），２２．８（ｄ，Ｊ＝１５．２Ｈｚ），２０．５；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ３９Ｈ３３ＮＯ２Ｐ＋［Ｍ−Ｂｒ］＋に対する計算値：５７８．２２４９、実測値：５７８．２２４９。
【０２３５】
４−インＭｉｔｏの合成
【化５２】
2020532497.tif 000056
ＣＨ２Ｃｌ２（１ｍｌ）中の１（８．４ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）に、１，１’−カルボニルジイミダゾール（９．７ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）を室温で添加した。この混合物を室温で６時間撹拌した後、Ｈ２Ｏを添加し、この混合物をＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、溶媒を減圧下で蒸発させた。残渣をＣＨ２Ｃｌ２（１ｍｌ）に溶解させ、（３−アミノプロピル）トリフェニルホスホニウムブロミド（２０ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）を添加し、室温で２０時間撹拌を続け、次いで、減圧で濃縮し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、化合物２を黄色固体として得た（１６ｍｇ、７５％）。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）：δ  ７．８０−７．６０（ｍ，１４Ｈ），７．５７−７．４９（ｍ，３Ｈ），７．４４−７．２８（ｍ，７Ｈ），５．０５（ｓ，２Ｈ），３．７８−３．６５（ｍ，２Ｈ），３．５０−３．４０（ｍ，２Ｈ），１．９０−１．７５（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）  δ  １５６．９，１３９．８，１３５．２（ｄ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ），１３３．６，１３３．５，１３３．３（ｄ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ），１３０．６，１３０．１，１２８．６，１２７．７，１２０．６，１１９．６，１１７．８，７７．９，７７．８，７４．５，６７．４，６７．３，６５．５，６３．８，４０．５（ｄ，Ｊ＝６８．８Ｈｚ），２２．８（ｄ，Ｊ＝１５．２Ｈｚ），２０．３；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ４３Ｈ３３ＮＯ２Ｐ＋［Ｍ−Ｂｒ］＋に対する計算値：６２６．２２４９、実測値：６２６．２２５２。
【化５３】
2020532497.tif 000057
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）：δ  ７．８０−７．７５（ｍ，３Ｈ），７．７３−７．６２（ｍ，１１Ｈ），７．５７−７．５０（ｍ，３Ｈ），７．４６−７．３０（ｍ，７Ｈ），５．０６（ｓ，２Ｈ），３．７０−３．６０（ｍ，２Ｈ），３．４９−３．４０（ｍ，２Ｈ），１．８８−１．７８（ｍ，２Ｈ）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：１２Ｃ３７１３Ｃ６Ｈ３３ＮＯ２Ｐ＋［Ｍ−Ｂｒ］＋に対する計算値：６３２．２４５０、実測値：６３２．２４５２。
【０２３６】
４−インＰＭの合成
【化５４】
2020532497.tif 000058
化合物１７（１６８ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（４ｍＬ）に溶解した。次いで、得られた溶液を室温でホスゲン溶液（０．９０ｍＬ、１．２ｍｍｏｌ）へと滴下し、２４時間撹拌した。次いで、残留するホスゲン及び溶媒を高真空により除去し、黄色がかった固体を得て、これをＴＨＦ（２ｍＬ）に溶解し、これを、さらに精製することなく後続の反応のために直接使用した。
【０２３７】
ＴＨＦ（４ｍＬ）及び水（３ｍＬ）中の３−ブロモプロパン−１−アミン臭化水素酸塩（２６３ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）及び炭酸ナトリウム（２５４ｍｇ、２．４ｍｏｌ）の混合物に、上記のクロロホルメートを室温で滴下し、次いでこの反応混合物を室温で１時間撹拌した。この反応混合物をエチルエーテルで希釈し、次いで有機層を塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥した。溶媒をロータリー・エバポレーターにより除去した後、生成物をシリカ上でのカラムクロマトグラフによって精製し、化合物１７０（１７８ｍｇ、６７％）を黄色固体として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ７．５７−７．４９（ｍ，４Ｈ），７．４３−７．３８（ｍ，１Ｈ），７．３７−７．２８（ｍ，４Ｈ），５．０９（ｓ，２Ｈ），４．９２（ｂｒ，１Ｈ），３．４３（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），３．３６（ｑ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），２．１３−２．０３（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  １５６．２，１３８．７，１３３．５，１３３．３，１３０．２，１２８．７，１２８．１，１２０．６，１２０．４，７７．９，７４．９，７４．５，６７．５，６７．３，６６．１，６３．９，６３．７，３９．６，３２．５，３０．６；ＨＲＭＳ（ＡＳＡＰ）：Ｃ２５Ｈ１８ＢｒＮＯ２＋［Ｍ］＋に対する計算値  ４４３．０５２１、実測値  ４４３．０５３３。
【０２３８】
アセトン（１ｍＬ）中の１（２２ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）の溶液に、ＮａＩ（７５ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を６０℃で１２時間撹拌した後、Ｈ２Ｏを添加し、この混合物をエーテルで抽出した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、溶媒を減圧下で除去した。残渣をＴＨＦ（１ｍＬ）に溶解し、Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−テトラメチル−１，３−プロパンジアミン（４２μＬ、０．２５ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を５０℃で１８時間撹拌した。溶媒を減圧下でエバポレーションにより除去し、粗生成物をジエチルエーテルで数回洗浄した。この一価の電荷を有する中間体をＣＨ３ＣＮ（１ｍＬ）に溶解し、ＣＨ３Ｉ（６２μＬ、１ｍｍｏｌ）をこの溶液に加えた。この反応混合物を６０℃で１６時間撹拌した後、溶媒及びＣＨ３Ｉを減圧下で蒸発させ、黄色固体（１６ｍｇ、４３％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ  ７．６０−７．５４（ｍ，４Ｈ），７．５０−７．４５（ｍ，１Ｈ），７．４４−７．３６（ｍ，４Ｈ），５．１２（ｓ，２Ｈ），４．５１（ｓ，１Ｈ），３．５７−３．４４（ｍ，６Ｈ），３．３０−３．２８（ｍ，２Ｈ），３．２７（ｓ，９Ｈ），３．２１（ｓ，６Ｈ），２．４５−２．３４（ｍ，２Ｈ），２．１０−２．００（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ  １５８．６，１４１．１，１３４．４，１３４．２，１３１．６，１２９．９，１２８．９，１２１．３，１２０．８，７９．０，７８．６，７４．６，７４．３，６７．５，６７．２，６６．８，６４．３，６４．１，６３．７，６１．４，５４．８，５４．３，５１．９，３８．８，２４．５，１９．０，１５．４；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ３３Ｈ３９Ｎ３Ｏ２２＋［Ｍ−２Ｉ］２＋に対する計算値  ２５４．６５１５、実測値  ２５４．６５２８。
【０２３９】
２−インＥＲの合成
【化５５】
2020532497.tif 000059
ＴＨＦ（３ｍＬ）中の１７（７０ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）の溶液に、ホスゲン溶液（０．６３ｍＬ、０．９ｍｍｏｌ）を室温で添加し、２４時間撹拌した。次いで、残留するホスゲン及び溶媒を高真空により除去し、固体を得て、これをＴＨＦ（２ｍＬ）に溶解し、これを、さらに精製することなく後続の反応のために直接使用した。
【０２４０】
ＴＨＦ（２ｍＬ）及び水（１ｍＬ）中のグリシン（６８ｍｇ、０．９ｍｍｏｌ）及び炭酸ナトリウム（１５９ｍｇ、１．５ｍｏｌ）の混合物に、上記のクロロホルメートを室温で滴下し、次いで、この反応混合物を室温で２時間撹拌した。この反応混合物を０．１Ｍ  ＨＣｌでクエンチし、エチルエーテルで希釈した。有機層を塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥した。溶媒をロータリー・エバポレーターにより除去した後、生成物をシリカ上でのカラムクロマトグラフによって精製し、化合物１７０（５８ｍｇ、５８％）を白色固体として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ  ７．５５−７．５０（ｍ，４Ｈ），７．４３−７．３５（ｍ，５Ｈ），５．１３（ｓ，２Ｈ），３．８４（ｓ，２Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ  １７３．５，１５８．９，１３９．９，１３３．５，１３３．４，１３０．５，１２９．７，１２８．８，１２２．９，１２２．４，８２．３，８１．９，７４．５，７４．３，６７．０，４３．１；ＨＲＭＳ（ＡＳＡＰ）：Ｃ２０Ｈ１４ＮＯ４−［Ｍ−Ｈ］−に対する計算値  ３３２．０９２３、実測値  ３３２．０９３１。
【０２４１】
ＤＭＦ（１ｍＬ）中の１５（６．８ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）を、室温で、ＤＩＰＥＡ（１８μｌ、０．１ｍｍｏｌ）及びＨＡＴＵ（７．６ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）で処理した。５分後、Ｎ−Ｂｏｃ−２，２’−（エチレンジオキシ）−ジエチルアミン（７．４ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を室温で一晩撹拌し、この反応を、水を加えることによりクエンチした。生成物をＤＣＭで抽出し、ＭｇＳＯ４で乾燥した。溶媒をロータリー・エバポレーターで濃縮し、残渣をシリカゲルカラム上で精製して、カップリング生成物を得て、これをＴＦＡ−ＣＨ２Ｃｌ２（１：４、１ｍＬ）に溶解した。この反応混合物を室温で１時間撹拌し、濃縮して、さらに精製することなくアミン生成物を得た。このアミンをＣＨ２Ｃｌ２（１ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却した。トリエチルアミン（２８μＬ、０．２ｍｍｏｌ）及び塩化ペンタフルオロベンゾイル（６μＬ、０．０４ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を０℃で１時間撹拌した後、Ｈ２Ｏを添加し、この混合物をＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、溶媒を減圧下で除去した。残渣をカラムクロマトグラフィーによってさらに精製し、６ａ（６．３ｍｇ、４８％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ７．５４−７．４８（ｍ，４Ｈ），７．４０−７．２７（ｍ，５Ｈ），６．９７（ｂｒ，１Ｈ），６．４８（ｂｒ，１Ｈ），５．６１（ｂｒ，１Ｈ），５．０８（ｓ，２Ｈ），３．８１（ｄ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，２Ｈ），３．６８−３．５８（ｍ，８Ｈ），３．５６−３．５０（ｍ，２Ｈ），３．４５−３．４０（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  １６９．０，１５７．８，１５６．６，１３７．４，１３２．８，１３２．６，１２９．４，１２８．６，１２８．０，１２１．９，１２１．８，８２．０，８１．１，７４．５，７３．９，７０．５，７０．４，６９．６，６９．５，６６．６，４４．６，４０．３，３９．３；ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ）：Ｃ３３Ｈ２８Ｆ５Ｎ３Ｏ６Ｎａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋に対する計算値  ６８０．１７９６、実測値  ６８０．１７９１。
【０２４２】
２−イン１２１３ＬＤの合成
【化５６】
2020532497.tif 000060
ＣＨ３ＣＮ（１０ｍＬ）中の１１−ブロモウンデカン酸メチル１（８５２ｍｇ、２．９ｍｍｏｌ）の溶液に、ＰＰｈ３（８３６ｍｇ、３．２ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を８５℃で４８時間撹拌した後、溶媒を減圧下でエバポレーションにより除去し、残渣をジエチルエーテルで３回洗浄した。粗生成物をＴＨＦ（１０ｍＬ）に溶解し、ＮａＮＨ２（１７０ｍｇ、４．３ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。この反応混合物を０℃で３０分間撹拌した後、ベンズアルデヒド（０．３５ｍＬ、３．５ｍｍｏｌ）を添加し、これを室温に加温し、室温で１０時間撹拌し続けた。Ｈ２Ｏを滴下してこの反応をクエンチし、混合物をＥｔ２Ｏで抽出し、次いで、合わせた有機層を塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィーによって精製し、１（４６８ｍｇ、５６％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ７．３８−７．２０（ｍ，５Ｈ），６．４５（ｄ，Ｊ＝１１．６Ｈｚ，１Ｈ），５．７０（ｄｔ，Ｊ＝１１．８，７．２Ｈｚ，１Ｈ），３．７０（ｓ，３Ｈ），２．４１−２．３０（ｍ，４Ｈ），１．７５−１．６０（ｍ，２Ｈ），１．５２−１．４３（ｍ，２Ｈ），１．３４−１．２０（ｍ，１０Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  １７４．４，１３７．９，１３３．３，１２８．９，１２８．２，１２６．５，１２５．８，５１．５，３４．２，３０．０，２９．６，２９．５，２９．４，２９．３，２９．２，２８．７，２５．０；ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ）：Ｃ１９Ｈ２９Ｏ２＋［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値  ２８９．２１６８、実測値  ２８９．２１６７。
【０２４３】
ＥｔＯＡｃ（４ｍＬ）中の１１（１７３ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）の溶液に、１０％Ｐｄ／Ｃ触媒（１０ｍｇ）を添加した。この反応混合物をＨ２雰囲気下、室温で一晩撹拌した。セライトパッドを通す濾過により触媒を除去し、有機溶媒を減圧下で蒸発させた。粗生成物をＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）に溶解し、次いで、ＡｇＯＴｆ（１５４ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）及びヨウ素（１５２ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）を室温で添加した。この反応混合物を室温で２時間撹拌した後、飽和亜硫酸水素ナトリウム溶液を添加し、室温で１０分間撹拌した。この混合物をエーテルで抽出し、有機層をＨ２Ｏ、塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥した。溶媒を減圧下で除去し、残渣をカラムクロマトグラフィーによってさらに精製し、６ａ（１８７ｍｇ、７５％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ７．６０（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），６．９４（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），３．６９（ｓ，３Ｈ），２．５６（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），２．３３（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），１．６９−１．５４（ｍ，４Ｈ），１．４０−１．２３（ｍ，１４Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  １７４．３，１４２．５，１３７．３，１３０．６，９０．６，５１．５，３５．５，３４．２，３１．３，２９．６，２９．５，２９．４，２９．３，２９．２，２５．０；ＨＲＭＳ（ＡＳＡＰ）：Ｃ１９Ｈ３０ＩＯ２＋［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値  ４１７．１２９０、実測値  ４１７．１２９８。
【０２４４】
２５ｍＬの３つ口フラスコ中のヨウ化アリール１１（１６６ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）、ＣｕＩ（７．６ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）、及びＰｄ（ＰＰｈ３）２Ｃｌ２（２８ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）の混合物を脱気し、再びＮ２で満たした。この手順を３回繰り返した後、トリエチルアミン（５ｍＬ）及び（トリメチルシリル）アセチレン−１，２−１３Ｃ２（６０ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）をシリンジで加えた。この反応溶液を４０℃で２時間撹拌し、次いで、溶媒を減圧下で蒸発させた。残渣をカラムクロマトグラフィーによってさらに精製して、純粋な生成物を得て、これをＭｅＯＨ（４ｍＬ）に溶解し、Ｋ２ＣＯ３（１３８ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を室温で３時間撹拌した後、Ｈ２Ｏを添加し、この混合物をエーテルで抽出した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、溶媒を減圧下で蒸発させた。残渣をカラムクロマトグラフィーによって精製し、６ａ（９１ｍｇ、７２％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ７．４０（ｄｄ，Ｊ＝５．４，７．８Ｈｚ，２Ｈ），７．１３（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，２Ｈ），３．６７（ｓ，３Ｈ），３．０３（ｄｄ，Ｊ＝５２．２，２４８．４Ｈｚ，１Ｈ），２．６０（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），２．３０（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），１．６５−１．５４（ｍ，４Ｈ），１．３５−１．２４（ｍ，１４Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  １７４．４，１４４．１，１３２．１（ｔ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），１２８．５（ｄ，Ｊ＝２１．４Ｈｚ），１１９．７（ｄ，Ｊ＝５５．２Ｈｚ），８４．０（ｄ，Ｊ＝６９８．２Ｈｚ），７６．４（ｄ，Ｊ＝６９８．２Ｈｚ），５１．５，３６．０，３４．２，３１．３，２９．６，２９．５，２９．４，２９．３，２９．２，２５．１；ＨＲＭＳ（ＡＳＡＰ）：１２Ｃ１９１３Ｃ２Ｈ３１Ｏ２＋［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値  ３１７．２３９２、実測値  ３１７．２４０１。
【０２４５】
アセトン（１ｍｌ）中のＣｕＣｌ（５．０ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）及びＴＭＥＤＡ（１５μＬ、０．１０ｍｍｏｌ）の溶液に、室温で１０分間、空気を吹き込み、次いで、ＣＨ２Ｃｌ２（１ｍｌ）中の１１（１６ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）及びフェニルアセチレン（２２μＬ、０．２ｍｍｏｌ）の混合物を添加し、空気とともに室温で１時間撹拌し続けた。溶媒を減圧でエバポレーションし、残渣をカラムクロマトグラフィーによってさらに精製し、純粋な生成物を得て、これを、ＴＨＦ−ＭｅＯＨ（２：１、０．９ｍＬ）に溶解し、３．０Ｍ  ＫＯＨ（０．１ｍＬ、０．３ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を室温で１時間撹拌した後、１．０Ｍ  ＨＣｌを添加し、この混合物をエーテルで抽出した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、溶媒を減圧下で蒸発させた。残渣をカラムクロマトグラフィーによって精製し、１（１１．６ｍｇ、５５％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）：δ  ７．５６−７．４９（ｍ，２Ｈ），７．４７−７．４１（ｍ，２Ｈ），７．３９−７．３０（ｍ，３Ｈ），７．１５（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），２．６０（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），２．３５（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），１．６９−１．５３（ｍ，４Ｈ），１．３７−１．２３（ｍ，１４Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）  δ  １７９．６，１４４．８，１３２．６，１３２．５，１２９．２，１２８．７（ｄ，Ｊ＝２２．６Ｈｚ），１２８．５，１２２．１（ｄ，Ｊ＝１５．６Ｈｚ），１１９．０（ｄｄ，Ｊ＝６０．０，３６４．０Ｈｚ），８２．１（ｄ，Ｊ＝７８４．０Ｈｚ），７３．３（ｄ，Ｊ＝７８４．０Ｈｚ），３６．１，３４．１，３１．３，２９．６，２９．５，２９．４，２９．３，２９．２，２４．８；ＨＲＭＳ（ＡＳＡＰ）：１２Ｃ２６１３Ｃ２Ｈ３１Ｏ２−［Ｍ−Ｈ］−に対する計算値  ４０１．２３９１、実測値  ４０１．２４０２。
【０２４６】
【化５７】
2020532497.tif 000061
ＣＨ２Ｃｌ２（１ｍｌ）中の１（７．２ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）に、１，１’−カルボニルジイミダゾール（６．５ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）を室温で添加した。この混合物を室温で３時間撹拌した後、Ｈ２Ｏを添加し、この混合物をＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、溶媒を減圧下で蒸発させた。残渣をＣＨ２Ｃｌ２（１ｍｌ）に溶解し、ｎ−ブチルアミン（７．５μＬ、０．０７５ｍｍｏｌ）を添加し、室温で１２時間撹拌を続け、次いで、減圧で濃縮し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、化合物２を黄色固体として得た（６．８ｍｇ、７２％）。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ７．５９−７．５２（ｍ，４Ｈ），７．４６−７．４０（ｍ，１Ｈ），７．３９−７．３１（ｍ，４Ｈ），５．１１（ｓ，２Ｈ），４．７５（ｂｒ，１Ｈ），３．２２（ｑ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），１．５６−１．４６（ｍ，２Ｈ），１．４２−１．３２（ｍ，２Ｈ），０．９４（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  １５６．２，１３９．１，１３３．５，１３３．３，１３０．２，１２８．７，１２８．０，１２０．６，１２０．２，７７．９，７７．５，７４．８，７４．５，６７．５，６７．３，６５．９，６３．９，６３．７，４１．０，３２．１，２０．０，１３．８；ＨＲＭＳ（ＡＳＡＰ）：Ｃ２６Ｈ２１ＮＯ２＋［Ｍ］＋に対する計算値：３７９．１５７８、実測値：３７９．１５７２。
【０２４７】
【化５８】
2020532497.tif 000062
化合物１７（８．４ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１ｍＬ）に溶解した。次いで、得られた溶液を室温でホスゲン溶液（０．０４５ｍＬ、０．０６ｍｍｏｌ）へと滴下し、２４時間撹拌した。次いで、残留するホスゲン及び溶媒を高真空により除去し、黄色がかった固体を得て、これをＴＨＦ（１ｍＬ）に溶解し、これを、さらに精製することなく後続の反応のために直接使用した。
【０２４８】
ＴＨＦ（１ｍＬ）及び水（１ｍＬ）中の４−アミノブタン酸（６．２ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）及び炭酸ナトリウム（１０．５ｍｇ、０．１ｍｏｌ）の混合物に、上記のクロロホルメートを室温で滴下し、次いでこの反応混合物を室温で１時間撹拌した。この反応混合物を０．１Ｍ  ＨＣｌでクエンチし、酢酸エチルで希釈した。有機層を塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥した。溶媒をロータリー・エバポレーターにより除去した後、生成物を、さらに精製することなく次の反応のために直接使用した。
【０２４９】
ＣＨ２Ｃｌ２（１ｍＬ）中の上記の生成物に、ＤＭＡＰ（３．６ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシルスクシンイミド（１１．２ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）及びＥＤＣＩ（１１．５ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を室温で２４時間撹拌した後、Ｈ２Ｏを添加し、この混合物をエーテルで抽出した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、溶媒を減圧下で蒸発させた。残渣をカラムクロマトグラフィーによって精製し、６ａ（８．６ｍｇ、５７％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ７．５６−７．５０（ｍ，４Ｈ），７．４３−７．２９（ｍ，５Ｈ），５．０９（ｓ，２Ｈ），３．３２（ｑ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），２．８２（ｓ，４Ｈ），２．６６（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），２．０３−１．９４（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  １６９．２，１６８．３，１５６．３，１３８．９，１３３．５，１３３．３，１３０．２，１２８．７，１２８．０，１２０．６，１２０．３，７７．９，７７．５，７４．８，７４．５，６７．５，６７．３，６６．１，６３．９，６３．７，４０．０，２８．５，２５．７，２５．０；ＨＲＭＳ（ＡＳＡＰ）：Ｃ３０Ｈ２３Ｎ２Ｏ６＋［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値：５０７．１５５６、実測値：５０７．１５６０。
【０２５０】
実施例２：誘導ラマン散乱（ＳＲＳ）顕微鏡法
集積レーザーシステム（ｐｉｃｏＥＭＥＲＡＬＤ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  ＆  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．）を使用して、８０ＭＨｚの繰返し率で２つの同調レーザー光線を生成する。基本のストークスビーム（１０６４ｎｍ、６ｐｓパルス幅）を電気光学変調器により＞９０％の変調度で８ＭＨｚで強度変調し、波長可変ポンプビーム（７２０〜９９０ｎｍ、５〜６ｐｓパルス幅）を組み込みの光パラメトリック発振器により生成する。このポンプビーム及びストークスビームは、レーザーシステム内部の２つのダイクロイックミラー及びディレイステージを使用して時空間的に重ね合わされ、そして最適化された近赤外スループットで倒立型走査型多光子レーザー顕微鏡（ＦＶ１２００ＭＰＥ、Ｏｌｙｍｐｕｓ（オリンパス））に向けて組み合わされる。
これらのレーザーを、２５×水対物レンズ（ＸＬＰｌａｎ  Ｎ、開口数１．０５  ＭＰ、Ｏｌｙｍｐｕｓ）又は６０×水対物レンズ（ＵＰｌａｎＡＰＯ／ＩＲ、開口数１．２、Ｏｌｙｍｐｕｓ）を通して高近赤外透過で試料上に合焦する。ポンプレーザー及びストークスレーザーのビームサイズは、対物レンズの背面口径に合うように調整される。試料のあと、両方のビームは、ケラー照明下で、高開口数油浸系コンデンサレンズ（開口数１．４、Ｏｌｙｍｐｕｓ）によって有効に集められ、レーザー走査動作は、望遠鏡を用いてデスキャンする（内部検出される）。高光学濃度のバンドパスフィルター（８９０／２２０  ＣＡＲＳ、Ｃｈｒｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いてストークスビームをブロックすることにより、飽和閾値及び応答帯域幅を最大にするために、６４ＤＣ電圧で逆バイアスされた大面積（１０ｍｍ×１０ｍｍ）シリコンフォトダイオード（ＦＤＳ１０１０、Ｔｈｏｒｌａｂｓ）によってポンプビームだけを検出する。フォトダイオードの出力電流を、８ＭＨｚ電子バンドパスフィルター（ＫＲ２７２４、ＫＲ  ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ）を用いてフィルター処理し、そしてＲＦロックインアンプ（ＳＲ８４４、Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｙｓｔｅｍｓ又はＨＦ２ＬＩ、Ｚｕｒｉｃｈ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）に入る前に５０Ωで終端させる。
【０２５１】
誘導ラマン損失信号は、ショット雑音限界（ｓｈｏｒｔ−ｎｏｉｓｅ−ｌｉｍｉｔｅｄ）感度に近い感度で、８ＭＨｚ周波数での復調によりポンプビームから抽出する。各ピクセルでのロックインアンプからの同相信号は、顕微鏡のアナログインターフェースボックス（ＦＶ１０−ＡＮＡＬＯＧ、Ｏｌｙｍｐｕｓ）に送信され、視野全体にわたる走査によりＳＲＳ画像が生成される。ＳＲＳ画像は、特段の記載がない限り、ロックインアンプからの３０μｓ時定数及び１００μｓピクセル滞留時間（３２０×３２０フレームあたり１０．２ｓ）で、２５×対物レンズを使用して取得される。対物レンズのあとに測定すると、すべての細胞画像についてポンプ出力は１２〜４８ｍＷであり、ストークス出力は４０〜１２０ｍＷである（図４）。ビーズ（図５ｄ及び図１３）及びパターン（図１４）のイメージングについては、ポンプ出力は１２〜２４ｍＷであり、ストークス出力は２０ｍＷである。α−チューブリンのイムノイメージング（図４ｂ）では、１００μｓ時定数及び２００μｓピクセル滞留時間を使用する。１０色の生細胞小器官イメージング（図４ｉ）は、６０×対物レンズ及び８０μｓ時定数を使用して実施する。光安定性実験（図１０）は、フレーム（３２０×３２０ピクセル）あたり０．４ｓで、３μｓ時定数及び４μｓピクセル滞留時間を用いて実施する。誘導ラマン散乱スペクトルは、ポンプビームを選択した波長範囲にわたって逐一走査することにより取得する。
【０２５２】
すべての明視野像及び蛍光像を、ＣＷレーザー励起（４８８、５４３及び６３５ｎｍ）及び標準的なバンドパスフィルターセットを用いるＯｌｙｍｐｕｓ  ＦＶ１２００共焦点顕微鏡を使用して収集する。ＮｕｃＢｌｕｅの２光子蛍光像を、７８０ｎｍポンプレーザー励起を用いて収集し、デスキャンなしの（外部検出用の）光電子増倍管チューブによって検出する。すべての画像は、ＩｍａｇｅＪによって解析され、色が割り当てられる。
【０２５３】
自発ラマン分光法
ラマンスペクトルは、共焦点ラマン顕微鏡（Ｘｐｌｏｒａ、Ｈｏｒｉｂａ  Ｊｏｂｉｎ  Ｙｖｏｎ）で、ＬａｂＳｐｅｃ  ６ソフトウェアを用いて室温で集めた。試料は、５０×乾燥（空気用）対物レンズ（ＭＰｌａｎ  Ｎ、開口数０．７５、Ｏｌｙｍｐｕｓ）を介して、５３２ｎｍダイオードレーザー（対物レンズのあとで２７ｍＷ）により励起する。ビーズ溶液試料（図１２）についてのデータ取得時間は５ｓであり、生細胞中のビーズ（図５ｃ）については１０ｓである。
【０２５４】
実施例３：４−インＮＨＳエステルとの二次抗体結合
ヤギ抗ウサギ二次抗体（２ｍｇ／ｍＬ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＡＰ１３２）を、炭酸水素ナトリウム溶液を用いてｐＨ約８．３に調整する。４ｍｇ／ｍＬの４−インＮＨＳエステルのＤＭＳＯ溶液５０μＬを２５０μＬタンパク質溶液に、撹拌しながら滴下する。反応液を、緩やかに撹拌しながら室温で１時間保つ。この標的抗体を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）  Ｇ−２５（Ｓｉｇｍａ、Ｇ２５１５０）を用いるゲル透過クロマトグラフィーを使用して精製する。Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）  Ｇ−２５ゲルを最初に９０℃で１時間、ＰＢＳバッファー中で膨潤させ、室温で落ち着かせる。次に、このゲルを新しいＰＢＳバッファーで交換し、４℃で保存する。ゲルクロマトグラフィーについては、カラム（直径約１ｃｍ及び長さ＞１２ｃｍ）に膨潤したゲルをローディングし、ＰＢＳバッファーで平衡化する。上記抗体溶液を載せ、ＰＢＳで溶出する。４−イン結合抗体についての淡色の第１のバンドを集める。この溶液を短時間遠心分離し、上清をＡｍｉｃｏｎ（登録商標）  Ｕｌｔｒａ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＦＣ５０１０９６）を使用して、５ｍＭアジ化ナトリウムを含むＰＢＳ中約２ｍｇ／ｍＬの最終濃度まで濃縮し、−２０℃で保存する。
【０２５５】
実施例４：ＳＲＳ及び蛍光イメージングのための試料調製
ＨｅＬａ細胞を、１０％ウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（インビトロジェン）、１６０００）及び１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１５１４０）を添加したＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１１９６５）と共に培養する。すべての細胞培養液を、３７℃及び５％ＣＯ２の加湿された環境中で維持する。
【０２５６】
すべての試料を、イメージングのために、ＰＢＳ溶液で満たしたイメージングスペーサ（Ｓｉｇｍａ、ＧＢＬ６５４００８）を使用してチャンバーに集める。
【０２５７】
固定ＨｅＬａ細胞におけるα−チューブリンイメージングのための免疫染色（図４ｂ）
ＨｅＬａ細胞を、４穴プレート中のガラスカバースリップ上に、約１ｍＬの培地を用いて２４時間播種する。細胞を、メタノールを用いて２５分固定し、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び０．３Ｍグリシンを添加した１０％ヤギ血清で２回洗浄し、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ＰＢＳ溶液を用いて４０分間透過処理する。ウサギの抗α−チューブリン一次抗体（Ａｂｅａｍ、ａｂ  １８２５１）を、３％  ＢＳＡ溶液中１：５０希釈で上記細胞に加え、４℃で一晩インキュベーションする。次に、この細胞を１０％ヤギ血清で３０分間ブロッキングし、４−インに結合されたヤギ抗ウサギ二次抗体と共に１０％ヤギ血清中で１：２５希釈により４℃で一晩インキュベーションする。この細胞をＰＢＳで２回洗浄し、そのあとでイメージングする。
【０２５８】
超多重化ポリインを用いる生ＨｅＬａ細胞の１５色イメージング（図４ｃ）
ＨｅＬａ細胞を、２４穴プレートの１５ウェルに２４時間播種する。各ウェルを、培地中、３７℃で蛍光色素又はポリインの単色で、２−インＭｉｔｏ（５μΜ）、Ｃａｒｂｏｗ２１７２（３μΜ）、Ｃａｒｂｏｗ２１４１（１０μΜ）、Ｃａｒｂｏｗ２１２８（２μΜ）、Ｃａｒｂｏｗ２１００（４μΜ）、Ｃａｒｂｏｗ２０８６（１０μΜ）、Ｃａｒｂｏｗ２０６６（１０μΜ）、Ｃａｒｂｏｗ２０４９（５μΜ）及びＣａｒｂｏｗ２０１７（１０μΜ）については４時間、２−イン１２１３ＬＤ（４μΜ）については２４時間、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ（１００ｎＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｍ７５１４）、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｏｒａｎｇｅ  ＣＭＴＭＲｏｓ（５０ｎＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｍ７５１０）、及びＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｄｅｅｐ  Ｒｅｄ（５０ｎＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｍ２２４２６）については１時間、ＮｕｃＢｌｕｅ（登録商標）  Ｌｉｖｅ  ＲｅａｄｙＰｒｏｂｅｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ（１滴、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｒ３７６０５）及びＦＭ  ４−６４（５μｇ／ｍＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｔ３１６６）については３０分間標識する。次に、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、トリプシンで２分間各ウェルから剥がし、新しい培地と混合する。この細胞混合物を１０００ｒｐｍで１．５分間遠心分離し、細胞ペレットをＰＢＳと混合する。細胞をイメージングチャンバーに加え、１時間静置してイメージング前に動きを低減させ、各細胞を、イメージング時間の間、単色で維持する。
【０２５９】
Ｃａｒｂｏｗ２１４１を用いる生ＨｅＬａ細胞中のミトコンドリアイメージング（図４ｄ）
ＨｅＬａ細胞を、４穴プレート中のガラスカバースリップ上で２４時間培養し、２μΜ  Ｃａｒｂｏｗ２１４１Ｍｉｔｏを培地中で、３７℃で１時間添加する。細胞を、イメージング前にＰＢＳで３回洗浄する。共局在のために、１００ｎＭ  ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｄｅｅｐ  Ｒｅｄを使用して、ミトコンドリアを１時間染色する。
【０２６０】
Ｃａｒｂｏｗ２１４１Ｌｙｓｏを用いる生ＨｅＬａ細胞におけるリソソームイメージング（図４ｅ）
細胞を、４穴プレート中のガラスカバースリップ上で２４時間培養し、４μΜ  Ｃａｒｂｏｗ２１４１Ｌｙｓｏを細胞に３７℃で３０分間添加する。細胞を、イメージング前にＰＢＳで３回洗浄する。共局在のために、１００ｎＭ  ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌ７５２８）を使用して、リソソームを３０分間染色する。
Ｃａｒｂｏｗ２１４１ＰＭを用いる生ＨｅＬａ細胞における細胞膜イメージング（図４ｆ）
細胞を、培地中、３７℃で２０分間、３μΜ  Ｃａｒｂｏｗ２１４１ＰＭと共にインキュベーションし、イメージング前にＰＢＳで３回洗浄する。共局在のために、０．５μｇ／ｍＬ  ＣｅｌｌＭａｓｋ  Ｄｅｅｐ  Ｒｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃ１００４６）を使用して、細胞膜を５分間染色する。
【０２６１】
Ｃａｒｂｏｗ２２２６ＥＲを用いた生ＨｅＬａ細胞又は生ＣＯＳ−７細胞における小胞体イメージング（図４ｇ）
細胞を、４穴プレート中のガラスカバースリップ上で２４時間培養し、３７℃で２時間、１０μΜ  Ｃａｒｂｏｗ２２２６ＥＲと共にインキュベーションした。細胞を、イメージング前にＰＢＳで３回洗浄した。共局在のために、１μΜ  ＥＲＴｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｅ３４２５１）を使用して、小胞体を２時間染色した。
【０２６２】
Ｃａｒｂｏｗ２２０２ＬＤを用いる生ＨｅＬａ細胞又はＣＯＳ−７細胞における脂質滴イメージング（図４ｈ）
細胞を、４穴プレート中のガラスカバースリップ上で２４時間培養し、１０μΜ  Ｃａｒｂｏｗ２２０２ＬＤを、細胞培地に３７℃で一晩加えた。細胞を、イメージング前にＰＢＳで３回洗浄した。共局在のために、１μΜ  Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｎ１１４２）を使用して、脂質滴を１０分間染色した。
【０２６３】
ポリインプローブを用いる生ＨｅＬａ細胞における１０色小器官特異的イメージング（図４ｉ）
ＨｅＬａ細胞を、培地を含む４穴プレート中のガラスカバースリップ上で２４時間播種し、アクチン−ＧＦＰプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃ１０５８２）を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎプロトコルに従ってイメージング前に４８時間、細胞にトランスフェクトした。イメージング前に、１０μΜ  Ｃａｒｂｏｗ２２０２ＬＤを、３７℃で一晩、その培地に添加した。イメージングの日に、細胞を、３７℃で、１０μΜ  Ｃａｒｂｏｗ２２２６ＥＲ及び０．０２％  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐ３０００ＭＰ）と共に２時間、２μΜ  Ｃａｒｂｏｗ２０８６Ｌｙｓｏ、４μΜ  Ｃａｒｂｏｗ２０６２Ｍｉｔｏ及び１μΜ  ＳｉＲ−ｔｕｂｕｌｉｎ（Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ、ＣＹ−ＳＣ００２）と共に１時間、３μΜ  Ｃａｒｂｏｗ２１４１ＰＭ及び一滴のＮｕｃＢｌｕｅと共に２０分間インキュベーションした。イメージングの１時間前に、細胞を、ハンクス緩衝塩溶液（ＨＢＳＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１４０２５）中の５μΜ  ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ  Ｃｅｒａｍｉｄｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｄ７５４０）及び０．１％  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７で、３７℃で１０分間標識した。インキュベーション後、細胞をＰＢＳ溶液で２回洗浄し、イメージング前に１分間、氷上の５μｇ／ｍＬ  ＦＭ  ４−６４  ＨＢＳＳ溶液（マグネシウムもカルシウムもなし）に素早く浸漬した。
【０２６４】
細胞生存率アッセイ（図１１）
ＨｅＬａ細胞を、特定条件で、小器官標的ポリインと共にインキュベーションするか、又はＳＲＳレーザーにより照射する。次に、哺乳類細胞用Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ生存率／細胞毒性キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌ３２２４）を使用して、２μΜカルセインＡＭ及び４μΜ  ＥｔｈＤ−１作業溶液と３７℃で２０分間インキュベーションすることにより、細胞生存率アッセイを実施する。
【０２６５】
実施例５：超多重化ポリインを用いるポリスチレンビーズでのスペクトルバーコーディング
１０μＬの３．０μｍポリスチレンビーズ（１０％水溶液、Ｓｉｇｍａ、ＬＢ３０）を５μＬ  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７（ＤＭＳＯ中２０％）及び８５μＬ脱イオン水と混合する。選択したポリイン（ＤＭＳＯ中）を、１００μＬ脱イオン水及び１００μＬ  ＴＨＦ（Ｓｉｇｍａ、４０１７５７）の溶液中で指定された濃度（表１及び表２）に希釈する。次いで、このポリインのＴＨＦ−水の溶液を１００μＬのビーズ及びＦ−１２７溶液と混合した。１０分間ボルテックス処理した後に、この混合物を振盪機上で、室温で２時間さらに撹拌し、次いで脱イオン水で３回洗浄した。生細胞標識のために、バーコード化ビーズを、１重量％ポリ−Ｌ−リジン水溶液（Ｍｗ＝３０，０００〜７０，０００、Ｓｉｇｍａ、Ｐ２６３６）中、室温で３０分間インキュベーションし、使用前に水で３回洗浄した。
【０２６６】
実施例６：スペクトル的にバーコード化されたビーズを用いる生細胞のタグ付け
ＨｅＬａ細胞を、培地を含む４穴プレート中のガラスカバースリップ上に２４時間播種する。細胞を、共焦点ラマン測定（図５ｃ）又はＳＲＳイメージング（図５ｄ及び図１３）の前に、バーコード化ビーズと共に２４時間インキュベーションする。カスタムのＭＡＴＬＡＢ（登録商標）プログラムを使用して、視野全体のスペクトルバーコードのビーズをハイパースペクトルＳＲＳ画像に基づいて復号化する。
【０２６７】
実施例７：微視的パターンの製作及び超多重化ポリインを用いた周波数暗号化
ＰＭＭＡ（４９５Ｋ  Ａ４  ＋  ９５０Ｋ  Ａ９）をＳｉ／ＳｉＯ２基板にスピンコーティングし、１７０℃で１０分間ベーキングする。この基板を電子線リソグラフィー及び現像剤の溶液に曝し、Ｃｏｌｕｍｂｉａロゴの微視的パターンを生成する。ＰＤＭＳ前駆体を、Ｓｙｌｇａｒｄ  １８４  Ｓｉｌｉｃｏｎｅ  Ｅｌａｓｔｏｍｅｒ  Ｋｉｔを使用して調製する。エラストマー及び硬化剤（１０：１の比）を混合し、パターン形成後のＳｉ／ＳｉＯ２基板の上へと注ぐ。８０℃で１時間加熱した後、そのＰＤＭＳパターンを基板から剥がす。
【０２６８】
上記Ｃｏｌｕｍｂｉａロゴを有するＰＤＭＳを、選択したポリイン（０．２〜１．２ｍＭ）を有するエタノール溶液（Ｆｉｓｈｅｒ、ＢＰ２８１８）中に室温で一晩浸漬することにより、周波数暗号化を実施する。エタノールのエバポレーション後、イメージング前に、上記パターンを脱イオン水でリンスする（図１４）。
【０２６９】
分光法測定における相関分析（図１ｂ及び図４ａ）のために、Ｏｒｉｇｉｎソフトウェアを用いて最小二乗回帰を適用する。報告するｎ値は、実験で独立に測定された化合物の数（図１ｂ）及び濃度の数（図４ａ）を表す。免疫染色及びイメージング実験（図４ｂ）については、実験は、独立に４回繰り返し、類似の結果を得た。１５色イメージング実験（図４ｃ）については、実験は、独立に３回繰り返し、類似の結果を得た。生細胞、小器官標的実験（図４ｄ〜図４ｈ）については、実験は、独立に５回繰り返し、類似の結果を得た。１０色小器官標的イメージング（図４ｉ）については、実験は、独立に３回繰り返し、類似の結果を得た。自発ラマン読み出しによる生細胞におけるビーズ標識（図５ｃ）又はＳＲＳイメージング（図５ｄ）については、実験は、独立に３回繰り返し、類似の結果を得た。
【０２７０】
図１５は、本開示に係るシステムの例示の実施形態のブロック図を示す。例えば、本明細書に記載される本開示に係る例示的手順は、処理装置及び／又は計算装置１５０５により遂行することができる。このような処理／計算装置１５０５は、例えば全体としてコンピューター／プロセッサ１５１０である、若しくはコンピューター／プロセッサ１５１０の一部である、又はコンピューター／プロセッサ１５１０を含むが、コンピューター／プロセッサ１５１０に限られないことがあり、そのコンピューター／プロセッサ１５１０は、例えば１以上のマイクロプロセッサを含み、コンピューターアクセス可能媒体（例えば、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ハードドライブ、又は他の記憶デバイス）上に記憶される命令を使用することができる。図１５に示すように、例えば、コンピューターアクセス可能媒体１５１５（例えば、本明細書中に上記されたように、ハードディスク、フロッピーディスク（登録商標）、メモリスティック、ＣＤ−ＲＯＭ、ＲＡＭ、ＲＯＭ等、又はそれらの集合体などの記憶装置）が（例えば、処理装置１５０５と通信している様態で）準備されてもよい。コンピューターアクセス可能媒体１５１５は、その媒体上に実行可能命令１５２０を内包することができる。加えて、又は代替的に、記憶装置１５２５は、コンピューターアクセス可能媒体１５１５とは別個に設けられうるものであり、この記憶装置１５２５は、命令を処理装置１５０５に提供することを、例えば本明細書に上記された所定の提示的な手順、プロセス、及び方法を実行するための処理装置を構成するように行うことができる。
【０２７１】
さらに、例示的な処理装置１５０５は、入出力装置１５３５を設けられる、又は含むことがあり、それらの入出力装置１５３５は、例えば有線ネットワーク、ワイヤレスネットワーク、インターネット、イントラネット、データ収集プローブ、センサー等を備えることができる。図１５に示すように、例示的な処理装置１５０５は、例示的な表示装置１５３０と通信している様態にありうるものであり、その表示装置１５３０は、本開示の特定の例示の実施形態によれば、例えば、処理装置から情報を出力することに加えて、処理装置に情報を入力するために構成されるタッチスクリーンであることができる。さらに、例示的な表示装置１５３０及び／又は記憶装置１５２５は、ユーザアクセス可能フォーマット及び／又はユーザ可読フォーマットでデータを表示及び／又は記憶するために使用することができる。
【０２７２】
実施例８：タンパク質のＳＲＳイメージングのための増幅方法の実例
ＨＣＲ（ハイブリダイゼーション連鎖反応）系は、標的のＤＮＡ又はＲＮＡの断片への曝露の際に安定なＤＮＡモノマーの自己組織化の引き金を引くことになるカスケード増幅方法である［３７］。それは、もともと、核酸シグナルを増幅するために開発された。最近、イムノシグナルハイブリダイゼーション連鎖反応（ｉｓＨＣＲ）が、抗体−抗原相互作用をＨＣＲ技術と組み合わせると報告されており、これは、最大２〜３桁の免疫蛍光シグナルの増幅を低バックグラウンドでもたらす［３８］。
【０２７３】
低存在量タンパク質標的由来の本発明のＳＲＳシグナルを増幅するために、本発明者らの考えは、短鎖のＤＮＡ配列を免疫染色における二次抗体に結合することにより、このｉｓＨＣＲ増幅方法を採用することである（図１６ａ）。この設計に基づいて、本発明者らは、ＳＲＳ及び２つの振動プローブ（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏ  ６４７及びＡｔｔｏ７４０）を用いてタンパク質イメージングを実証した。
【０２７４】
Ａｌｅｘａ  ６４７での蛍光により定量すると、１０倍超の増幅率が成し遂げられた（図１６ｂ〜図１６ｃ）。これは、非常に刺激的である。というのも、この結果により、ＳＲＳ技術は超多重化タンパク質イメージングにおいて力強いものになるからである。図１６ｂにおいて、本発明者らは、ＨＣＲなしでは、Ａ６４７染色したチューブリンについてのＳＲＳ画像は低ＳＮＲで非常にぼやけていることを提示した。興味深いことに、そして注目すべきことに、同じ条件下（レーザー出力、時定数、抗体濃度）で、本発明者らは、チューブリン−Ａ６４７に対するＨＣＲ増幅後のＳＲＳ画像を簡単に集めた。同様に、膜貫通型糖タンパク質ＥｐＣＡＭ（広く使用される腫瘍マーカー）のようないくつかの低存在量の標的に対して、ＨＣＲ増幅は、シグナル増強及び画質向上について実際に有用である（図１６ｄ）。
【０２７５】
例示的な参考文献
以下の参考文献は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
１．  Ｄｅａｎ，Ｋ．Ｍ．及びＰａｌｍｅｒ，Ａ．Ｅ．  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｄｙｎａｍｉｃ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｍａｇｉｎｇ．  Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．  １０、５１２−５２３（２０１４）。
２．  Ｖａｌｍ，Ａ．Ｍ．ら、Ａｐｐｌｙｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍｓ−ｌｅｖｅｌ  ｓｐｅｃｔｒａｌ  ｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｔｏ  ｒｅｖｅａｌ  ｔｈｅ  ｏｒｇａｎｅｌｌｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ．  Ｎａｔｕｒｅ  ５４６、１６２−１６７（２０１７）。
３．  Ｎｉｅｈｏｅｒｓｔｅｒ，Ｔ．ら、Ｍｕｌｔｉ−ｔａｒｇｅｔ  ｓｐｅｃｔｒａｌｌｙ  ｒｅｓｏｌｖｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｌｉｆｅｔｉｍｅ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．  Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １３、２５７−２６２（２０１６）。
４．  Ｋｒｕｔｚｉｋ，Ｐ．Ｏ．及びＮｏｌａｎ，Ｇ．Ｐ．  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｃｅｌｌ  ｂａｒｃｏｄｉｎｇ  ｉｎ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ａｌｌｏｗｓ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｄｒｕｇ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ．  Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３、３６１−３６８（２００６）。
５．  Ｌｕ，Ｊ．ら、ＭｉｃｒｏＲＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｃｌａｓｓｉｆｙ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４３５、８３４−８３８（２００５）。
６．  Ｌｉ，Ｙ．、Ｃｕ，Ｙ．Ｔ．Ｈ．及びＬｕｏ，Ｄ．  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  ＤＮＡ  ｗｉｔｈ  ＤＮＡ−ｂａｓｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｎａｎｏｂａｒｃｏｄｅｓ．  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２３、８８５−８８９（２００５）。
７．  Ｌｅｎｇ，Ｙ．、Ｓｕｎ，Ｋ．、Ｃｈｅｎ，Ｘ．及びＬｉ，Ｗ．  Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ａｒｒａｙｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ−ｅｎｃｏｄｅｄ  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．  ４４、５５５２−５５９５（２０１５）。
８．  Ｚｉｊｌｓｔｒａ，Ｐ．、Ｃｈｏｎ，Ｊ．Ｗ．及びＧｕ，Ｍ．  Ｆｉｖｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎｓ  ｉｎ  ｇｏｌｄ  ｎａｎｏｒｏｄｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４５  ９、４１０−４１３（２００９）。
９．  Ｌｕ，Ｙ．ら、Ｔｕｎａｂｌｅ  ｌｉｆｅｔｉｍｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌｓ．  Ｎａｔ．Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ  ８、３２−３６（２０１４）。
１０．  Ｎｇｕｙｅｎ，Ｈ．Ｑ．ら、Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｏｖｅｒ  ｏｎｅ  ｔｈｏｕｓａｎｄ  ｕｎｉｑｕｅｌｙ  ｉｄｅｎｔｉｆｉａｂｌｅ  ｓｐｅｃｔｒａｌ  ｃｏｄｅｓ．  Ａｄｖ．Ｏｐｔ．Ｍａｔｅｒ．  ５、１６００５４８（２０１７）。
１１．  Ｆｏｕｒｎｉｅｒ−Ｂｉｄｏｚ，Ｓ．ら、Ｆａｃｉｌｅ  ａｎｄ  ｒａｐｉｄ  ｏｎｅ−ｓｔｅｐ  ｍａｓｓ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｑｕａｎｔｕｍ−ｄｏｔ  ｂａｒｃｏｄｅｓ．  Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．  ４７、５５７７−５５８１（２００８）。
１２．  Ｈａｎ，Ｍ．、Ｇａｏ，Ｘ．、Ｓｕ，Ｊ．Ｚ．及びＮｉｅ，Ｓ．  Ｑｕａｎｔｕｍ−ｄｏｔ−ｔａｇｇｅｄ  ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｃｏｄｉｎｇ  ｏｆ  ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １９、６３１−６３５（２００１）。
１３．  Ｃａｏ，Ｙ．Ｃ．、Ｊｉｎ，Ｒ．及びＭｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｒａｍａｎ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ  ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９７、１５３６−１５４０（２００２）。
１４．  Ｊｉｎ，Ｒ．、Ｃａｏ，Ｙ．Ｃ．、Ｔｈａｘｔｏｎ，Ｃ．Ｓ．及びＭｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．  Ｇｌａｓｓ−ｂｅａｄ−ｂａｓｅｄ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｕｓｉｎｇ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  Ｒａｍａｎ  ｌａｂｅｌｓ．  Ｓｍａｌｌ  ２、３７５−３８０（２００６）。
１５．  Ｃａｓａｒｉ，Ｃ．Ｓ．、Ｔｏｍｍａｓｉｎｉ，Ｍ．、Ｔｙｋｗｉｎｓｋｉ，Ｒ．Ｒ．及びＭｉｌａｎｉ，Ａ．  Ｐｏｌｙｙｎｅｓ：  １−Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｗｉｔｈ  ｔｕｎａｂｌｅ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．  Ｎａｎｏｓｃａｌｅ  ８、４４１４−４４３５（２０１６）。
１６．  Ｈｉｒｓｃｈ，Ａ．  Ｔｈｅ  ｅｒａ  ｏｆ  ｃａｒｂｏｎ  ａｌｌｏｔｒｏｐｅｓ．  Ｎａｔ．Ｍａｔｅｒ．  ９、８６８−８７１（２０１０）。
１７．  Ｌｉｕ，Ｍ．、Ａｒｔｙｕｋｈｏｖ，Ｖ．Ｉ．、Ｌｅｅ，Ｈ．、Ｘｕ，Ｆ．及びＹａｋｏｂｓｏｎ，Ｂ．Ｉ．  Ｃａｒｂｙｎｅ  ｆｒｏｍ  ｆｉｒｓｔ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ：  ｃｈａｉｎ  ｏｆ  Ｃ  ａｔｏｍｓ，ａ  ｎａｎｏｒｏｄ  ｏｒ  ａ  ｎａｎｏｒｏｐｅ．  ＡＣＳ  Ｎａｎｏ  ７、１００７５−１００８２（２０１３）。
１８．  Ｃｈａｌｉｆｏｕｘ，Ｗ．Ａ．及びＴｙｋｗｉｎｓｋｉ，Ｒ．Ｒ．  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙｙｎｅｓ  ｔｏ  ｍｏｄｅｌ  ｔｈｅ  ｓｐ−ｃａｒｂｏｎ  ａｌｌｏｔｒｏｐｅ  ｃａｒｂｙｎｅ．  Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．  ２、９６７−９７１（２０１０）。
１９．  Ｌｕｕ，Ｔ．ら、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ａｎｄ  ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｄｉａｒｙｌｐｏｌｙｙｎｅｓ．  Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．  ７、５１−５４（２００５）。
２０．  Ｍｉｌａｎｉ，Ａ．、Ｔｏｍｍａｓｉｎｉ，Ｍ．、Ｄｅｌ  Ｚｏｐｐｏ，Ｍ．、Ｃａｓｔｉｇｌｉｏｎｉ，Ｃ．及びＺｅｒｂｉ，Ｇ．  Ｃａｒｂｏｎ  ｎａｎｏｗｉｒｅｓ：ｐｈｏｎｏｎ  ａｎｄ  ｐｉ−ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｃｏｎｆｉｎｅｍｅｎｔ．  Ｐｈｙｓ．Ｒｅｖ．Ｂ  ７４、１５３４１８（２００６）。
２１．  Ｌｕｃｏｔｔｉ，Ａ．ら、Ａｂｓｏｌｕｔｅ  Ｒａｍａｎ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｖｉｂｒａｔｉｏｎａｌ  ｓｅｃｏｎｄ  ｈｙｐｅｒｐｏｌａｒｉｚａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ａｄａｍａｎｔｙｌ  ｅｎｄｃａｐｐｅｄ  ｐｏｌｙｙｎｅｓ．  Ｊ．Ｒａｍａｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃ．  ４３、１２９３−１２９８（２０１２）。
２２．  Ｙａｍａｋｏｓｈｉ，Ｈ．ら、Ａｌｋｙｎｅ−ｔａｇ  Ｒａｍａｎ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｆｏｒ  ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｂｉｌｅ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｉｎ  ｌｉｖｅ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．  １３４、２０６８１−２０６８９（２０１２）。
２３．  Ｃｈｅｎ，Ｚ．ら、Ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ  ｌｉｖｅ−ｃｅｌｌ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｂｙ  ｉｓｏｔｏｐｉｃａｌｌｙ  ｅｄｉｔｅｄ  ａｌｋｙｎｅ  ｖｉｂｒａｔｉｏｎａｌ  ｐａｌｅｔｔｅ．  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．  １３６、８０２７−８０３３（２０１４）。
２４．  Ｌｉｕ，Ｚ．ら、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ  Ｒａｍａｎ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｌｉｖｅ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｉｓｏｔｏｐｉｃａｌｌｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｓｉｎｇｌｅ  ｗａｌｌｅｄ  ｃａｒｂｏｎ  ｎａｎｏｔｕｂｅｓ．  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．  １３０、１３５４０−１３５４１（２００８）。
２５．  Ｌｕｃｏｔｔｉ，Ａ．ら、Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ−ｓｔａｔｅ  ｎｏｎｌｉｎｅａｎｔｙ  ｏｆ  ｓｐ−ｃａｒｂｏｎ  ｃｈａｉｎｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ＩＲ  ａｎｄ  Ｒａｍａｎ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：ｖｉｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｔｕａｌ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ．  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．  １３１、４２３９−４２４４（２００９）。
２６．  Ｗｅｉ，Ｌ．ら、Ｓｕｐｅｒ−ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｖｉｂｒａｔｉｏｎａｌ  ｉｍａｇｉｎｇ．  Ｎａｔｕｒｅ  ５４４、４６５−４７０（２０１７）。
２７．  Ｆｒｅｕｄｉｇｅｒ，Ｃ．Ｗ．ら、Ｌａｂｅｌ−ｆｒｅｅ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｂｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  Ｒａｍａｎ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２２、１８５７−１８６１（２００８）。
２８．  Ｗｅｉ，Ｌ．ら、Ｌｉｖｅ−ｃｅｌｌ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ａｌｋｙｎｅ−ｔａｇｇｅｄ  ｓｍａｌｌ  ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｂｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  Ｒａｍａｎ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ．  Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １１、４１０−４１２（２０１４）。
２９．  Ｙａｍａｋｏｓｈｉ，Ｈ．ら、Ａ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｒａｍａｎ  ｐｒｏｂｅ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｂｉｓａｒｙｌｂｕｔａｄｉｙｎｅ  ｆｏｒ  ｌｉｖｅ  ｃｅｌｌ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ．  Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．  ２５、６６４−６６７（２０１５）。
３０．  Ｗｉｌｓｏｎ，Ｒ．、Ｃｏｓｓｉｎｓ，Ａ．Ｒ．及びＳｐｉｌｌｅｒ，Ｄ．Ｇ．  Ｅｎｃｏｄｅｄ  ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒｓ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．  Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．  ４５、６１０４−６１１７（２００６）。
３１．  Ｌｅｅ，Ｊ．Ｈ．、Ｇｏｍｅｚ，Ｉ．Ｊ．、Ｓｉｔｔｅｒｌｅ，Ｖ．Ｂ．及びＭｅｒｅｄｉｔｈ，Ｊ．Ｃ．  Ｄｙｅ−ｌａｂｅｌｅｄ  ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ  ｌａｔｅｘ  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ  ｐｒｅｐａｒｅｄ  ｖｉａ  ａ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｓｗｅｌｌｉｎｇ−ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．  Ｊ．Ｃｏｌｌｏｉｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉ．  ３６３、１３７−１４４（２０１１）。
３２．  Ｈｕｍａｒ，Ｍ．及びＹｕｎ，Ｓ．Ｈ．  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍｉｃｒｏｌａｓｅｒｓ．  Ｎａｔ．Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ  ９、５７２−５７６（２０１５）。
３３．  Ａｇａｒｗａｌ，Ｎ．Ｒ．ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｃｈａｉｎ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｏｎｇ  ｐｏｌｙｙｎｅｓ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｉｎｆｒａｒｅｄ  ａｎｄ  Ｒａｍａｎ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ．  Ｊ．Ｒａｍａｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃ．  ４４、１３９８−１４１０（２０１３）。
３４．  Ｏｚｅｋｉ，Ｙ．ら、Ｈｉｇｈ−ｓｐｅｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｐｅｃｔｒａｌ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ  ｗｉｔｈ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  Ｒａｍａｎ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ．  Ｎａｔ．Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ  ６、８４５−８５１（２０１２）。
３５．  Ｌｉａｏ，Ｃ．Ｓ．ら、Ｍｉｃｒｏｓｅｃｏｎｄ  ｓｃａｌｅ  ｖｉｂｒａｔｉｏｎａｌ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｂｙ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  Ｒａｍａｎ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｃｉ．  Ａｐｐｌ．  ４、ｅ２６５（２０１５）。
３６．  Ｚｈａｎｇ，Ｃ．ら、Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  Ｒａｍａｎ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ｆｏｒ  ｌａｂｅｌ−ｆｒｅｅ  ｓｉｎｇｌｅ−ｐａｒｔｉｃｌｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ．  Ｏｐｔｉｃａ  ４、１０３−１０９（２０１７）。
３７．  Ｃｈｏｉ  ＨＭ、Ｂｅｃｋ  ＶＡ、Ｐｉｅｒｃｅ  ＮＡ．  Ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ：ｈｉｇｈｅｒ  ｇａｉｎ，ｌｏｗｅｒ  ｃｏｓｔ，ｇｒｅａｔｅｒ  ｄｕｒａｂｉｌｉｔｙ．  ＡＣＳ  Ｎａｎｏ．  ２７、４２８４−９４（２０１４）。
３８．  Ｌｉｎ  Ｒ、Ｆｅｎｇ  Ｑ、Ｌｉ  Ｐ、Ｚｈｏｕ  Ｐ、Ｗａｎｇ  Ｒ、Ｌｉｕ  Ｚ、Ｗａｎｇ  Ｚ、Ｑｉ  Ｘ、Ｔａｎｇ  Ｎ、Ｓｈａｏ  Ｆ、Ｌｕｏ  Ｍ．  Ａ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ−ｃｈａｉｎ−ｒｅａｃｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｏｓｉｇｎａｌｓ．  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  １５、２７５−２７８（２０１８）。
【０２７６】
前述のことは、本開示の原理を例解するにすぎない。記載された実施形態に対する種々の改変及び変更が、当業者には、本明細書においての教示に鑑みて明らかであろう。したがって、当業者は、本明細書において明示的に示されない、又は記載されていないが、本開示の原理を実施する、並びに、かくして、本開示の趣旨及び範囲の中にあり得る、数多くのシステム、装置、及び手順を考案することができることになるということが察知されるであろう。種々の異なる例示的な実施形態は、当業者により理解されるはずであるように、互いと一緒に、及び、互いと交換可能に使用され得る。加えて、本開示の明細書、図面、及び特許請求の範囲を含めて、本開示において使用される所定の用語は、例えばデータ及び情報を含むが、それらに限られない、所定の実例において同義的に使用され得る。互いに同義的であり得るこれらの単語、及び／又は、他の単語が、本明細書において同義的に使用され得る一方で、そのような単語が、同義的に使用されないことを意図され得る実例が存し得るということが理解されるべきである。さらに、従来技術知識が、上記で本明細書に参照により明示的に組み込まれていない限りにおいて、その従来技術知識は、その全体において本明細書に明示的に組み込まれている。参照されるすべての出版物は、参照によりその全体を本明細書に援用したものとする。
【図１】
2020532497.tif 000064
【図２】
2020532497.tif 000065
【図３】
2020532497.tif 000066
【図４】
2020532497.tif 000067
【図５】
2020532497.tif 000068
【図６】
2020532497.tif 000069
【図７】
2020532497.tif 000070
【図８】
2020532497.tif 000071
【図９】
2020532497.tif 000072
【図１０】
2020532497.tif 000073
【図１１】
2020532497.tif 000074
【図１２】
2020532497.tif 000075
【図１３】
2020532497.tif 000076
【図１４】
2020532497.tif 000077
【図１５】
2020532497.tif 000078
【図１６】
2020532497.tif 000079
【手続補正書】
【提出日】平成31年3月27日(2019.3.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２〜約２００の下記式を有するポリインを含むライブラリーであって、
【化１】
2020532497.tif 000080
上記式中、ｎは１〜１９の整数であり、
Ｒ１及びＲ２は、独立に、アリール、Ｃ１〜２０アルキル、トリアルキルシリル、アリールジアルキルシリル、ジアリールアルキルシリル、金属、金属錯体、アリール−Ｃ１〜２０アルキル、Ｃ１〜２０アルキル−アリール、ヘテロアリール、ヘテロアリール−Ｃ１〜２０アルキル又はＣ１〜２０アルキル−ヘテロアリールであり、これらの基の各々は、任意に１以上の置換基で置換されていてもよく、
これらの基における水素のうちの１以上は、任意に重水素化されていてもよく、
前記アルキン部分における炭素のうちの１以上は、任意に１３Ｃ標識されていてもよく、
前記アリール、Ｃ１〜２０アルキル、アリール−Ｃ１〜２０アルキル、Ｃ１〜２０アルキル−アリール、ヘテロアリール、ヘテロアリール−Ｃ１〜２０アルキル又はＣ１〜２０アルキル−ヘテロアリール基のうちの１以上にある前記置換基は、蛍光標識、抗原、抗体、抗体断片、抗体模倣体、ペプチド、タンパク質、核酸、脂質、炭水化物、ビオチン、ストレプトアビジン、アビジン、抗ビオチン、葉酸、葉酸結合タンパク質、ＩｇＧ、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、炭水化物、レクチン、脂質、核酸、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシル、カルボキシル、アシル、アリール、アシルオキシ、アミノ、アミド、カルボキシル誘導体、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、アルコキシ、アリールオキシ、ニトロ、シアノ、スルホン酸、チオール、イミン、スルホニル、スルファニル、スルフィニル、スルファモイル、エステル、カルボン酸、アミド、ホスホニル、ホスフィニル、ホスホリル、ホスフィン、チオエステル、チオエーテル、酸ハロゲン化物、無水物、オキシム、ヒドラジン、カルバメート、カーボネート、尿素、ホスホン酸、及びホスホネートからなる群から選択されるライブラリー。
【請求項２】
前記アリール、Ｃ１〜２０アルキル、アリール−Ｃ１〜２０アルキル、Ｃ１〜２０アルキル−アリール、ヘテロアリール、ヘテロアリール−Ｃ１〜２０アルキル又はＣ１〜２０アルキル−ヘテロアリール基にある前記置換基の１以上が、ナノ粒子、微小粒子、抗体、ペプチド、タンパク質、核酸、脂質、又は炭水化物上にある官能基に結合されることが可能である請求項１に記載のライブラリー。
【請求項３】
２〜約２００の下記式を有するポリインを含むライブラリーであって、
【化２】
2020532497.tif 000081
上記式中、ｎは１〜１９の整数であり、
Ｒ１及びＲ２は、独立に、アリール、Ｃ１〜２０アルキル、トリアルキルシリル、アリールジアルキルシリル、ジアリールアルキルシリル、金属、金属錯体、アリール−Ｃ１〜２０アルキル、Ｃ１〜２０アルキル−アリール、ヘテロアリール、ヘテロアリール−Ｃ１〜２０アルキル又はＣ１〜２０アルキル−ヘテロアリールであり、これらの基の各々は、任意に１以上の置換基で置換されていてもよく、
これらの基における水素のうちの１以上は、任意に重水素化されていてもよく、
前記アルキン部分における炭素のうちの１以上は、任意に１３Ｃ標識されていてもよく、
前記アリール、Ｃ１〜２０アルキル、アリール−Ｃ１〜２０アルキル、Ｃ１〜２０アルキル−アリール、ヘテロアリール、ヘテロアリール−Ｃ１〜２０アルキル又はＣ１〜２０アルキル−ヘテロアリール基のうちの１以上にある前記置換基は、蛍光標識、抗原、抗体、抗体断片、抗体模倣体、ペプチド、タンパク質、核酸、脂質、炭水化物、ビオチン、ストレプトアビジン、アビジン、抗ビオチン、葉酸、葉酸結合タンパク質、ＩｇＧ、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、炭水化物、レクチン、脂質、核酸、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシル、カルボキシル、アシル、アリール、アシルオキシ、アミノ、アミド、カルボキシル誘導体、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、アルコキシ、アリールオキシ、ニトロ、シアノ、スルホン酸、チオール、イミン、スルホニル、スルファニル、スルフィニル、スルファモイル、エステル、カルボン酸、アミド、ホスホニル、ホスフィニル、ホスホリル、ホスフィン、チオエステル、チオエーテル、酸ハロゲン化物、無水物、オキシム、ヒドラジン、カルバメート、カーボネート、尿素、ホスホン酸、及びホスホネートからなる群から選択され、
前記アリール、Ｃ１〜２０アルキル、アリール−Ｃ１〜２０アルキル、Ｃ１〜２０アルキル−アリール、ヘテロアリール、ヘテロアリール−Ｃ１〜２０アルキル又はＣ１〜２０アルキル−ヘテロアリール基にある前記置換基の１以上が、前記ポリインのラマンスペクトルを非置換の基に対してシフトさせることができる電子吸引性基又は電子供与性基であるライブラリー。
【請求項４】
前記アリール、Ｃ１〜２０アルキル、アリール−Ｃ１〜２０アルキル、Ｃ１〜２０アルキル−アリール、ヘテロアリール、ヘテロアリール−Ｃ１〜２０アルキル又はＣ１〜２０アルキル−ヘテロアリール基にある前記置換基の１以上が、特定の小器官又は細胞区画を標的とする置換基である請求項１に記載のライブラリー。
【請求項５】
ｎが２〜１９の整数である請求項１に記載のライブラリー。
【請求項６】
ｎが３〜５の整数である請求項１に記載のライブラリー。
【請求項７】
ポリインの数が２〜約１００である請求項１に記載のライブラリー。
【請求項８】
ポリインの数が４〜約５０である請求項１に記載のライブラリー。
【請求項９】
２〜約２００の下記式を有するポリインを含むライブラリーであって、
【化３】
2020532497.tif 000082
上記式中、ｎは１〜１９の整数であり、
Ｒ１及びＲ２は、独立に、アリール、Ｃ１〜２０アルキル、トリアルキルシリル、アリールジアルキルシリル、ジアリールアルキルシリル、金属、金属錯体、アリール−Ｃ１〜２０アルキル、Ｃ１〜２０アルキル−アリール、ヘテロアリール、ヘテロアリール−Ｃ１〜２０アルキル又はＣ１〜２０アルキル−ヘテロアリールであり、これらの基の各々は、任意に１以上の置換基で置換されていてもよく、
これらの基における水素のうちの１以上は、任意に重水素化されていてもよく、
前記アルキン部分における炭素のうちの１以上は、任意に１３Ｃ標識されていてもよく、
前記アリール、Ｃ１〜２０アルキル、アリール−Ｃ１〜２０アルキル、Ｃ１〜２０アルキル−アリール、ヘテロアリール、ヘテロアリール−Ｃ１〜２０アルキル又はＣ１〜２０アルキル−ヘテロアリール基のうちの１以上にある前記置換基は、蛍光標識、抗原、抗体、抗体断片、抗体模倣体、ペプチド、タンパク質、核酸、脂質、炭水化物、ビオチン、ストレプトアビジン、アビジン、抗ビオチン、葉酸、葉酸結合タンパク質、ＩｇＧ、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、炭水化物、レクチン、脂質、核酸、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシル、カルボキシル、アシル、アリール、アシルオキシ、アミノ、アミド、カルボキシル誘導体、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、アルコキシ、アリールオキシ、ニトロ、シアノ、スルホン酸、チオール、イミン、スルホニル、スルファニル、スルフィニル、スルファモイル、エステル、カルボン酸、アミド、ホスホニル、ホスフィニル、ホスホリル、ホスフィン、チオエステル、チオエーテル、酸ハロゲン化物、無水物、オキシム、ヒドラジン、カルバメート、カーボネート、尿素、ホスホン酸、及びホスホネートからなる群から選択され、前記ポリインのうちの１以上が固体支持体中又は固体支持体上に存在し、前記固体支持体が、チップ、ナノ粒子又はポリマー微小粒子であるライブラリー。
【請求項１０】
前記固体支持体がナノ粒子又は微小粒子である請求項９に記載のライブラリー。
【請求項１１】
前記ナノ粒子又は微小粒子が複数の官能基を含むポリマーから形成されており、前記複数の官能基の２以上がポリインに結合されている請求項１０に記載のライブラリー。
【請求項１２】
前記ナノ粒子又は微小粒子が、１以上の蛍光標識、抗原、抗体、抗体断片、抗体模倣体、ペプチド、タンパク質、核酸、脂質、炭水化物、ビオチン、ストレプトアビジン、アビジン、抗ビオチン、葉酸、葉酸結合タンパク質、ＩｇＧ、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、炭水化物、レクチン、脂質、又は核酸に結合されている請求項１０に記載のライブラリー。
【請求項１３】
前記ナノ粒子又は微小粒子がポリマーから形成されており、２以上のポリインが前記ポリマーナノ粒子又はポリマー微小粒子の内部に封入されている請求項１０に記載のライブラリー。
【請求項１４】
前記ナノ粒子が約２〜約１００ｎｍの直径を有し、前記微小粒子が約１００ｎｍ超約１００μｍ未満の直径を有する請求項１０に記載のライブラリー。
【請求項１５】
前記ナノ粒子が約５〜約５０ｎｍの直径を有する請求項１０に記載のライブラリー。
【請求項１６】
前記ナノ粒子が約５〜約２０ｎｍの直径を有する請求項１０に記載のライブラリー。
【請求項１７】
前記ナノ粒子が、ナノボディ、ナノビーズ、ナノロッド、ナノスター、ナノワイヤ、金属ナノ構造体及びカーボンナノチューブからなる群から選択される請求項１０に記載のライブラリー。
【請求項１８】
前記核酸が、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｔｍＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム、リボスイッチ、アプタマー、プライマー、プローブ、及び人工核酸類似体からなる群から選択される請求項１２に記載のライブラリー。
【請求項１９】
前記抗体が、幹細胞、癌細胞、免疫細胞、神経細胞、グリア細胞、細菌、真菌及びウイルスからなる群から選択される１以上の生物学的粒子に特異的に結合する請求項１２に記載のライブラリー。
【請求項２０】
前記ナノ粒子が金属ナノ粒子である請求項１７に記載のライブラリー。
【請求項２１】
前記固体支持体がチップである請求項９に記載のライブラリー。
【請求項２２】
前記固体支持体がポリマー微小粒子である請求項９に記載のライブラリー。
【請求項２３】
前記ナノ粒子又は微小粒子が、１以上のデンドリマー、グラフトコポリマー、又はくし型コポリマーを含む請求項１３に記載のライブラリー。
【請求項２４】
Ｃａｒｂｏｗ２１７２、Ｃａｒｂｏｗ２１４１、Ｃａｒｂｏｗ２１２８、Ｃａｒｂｏｗ２１００、Ｃａｒｂｏｗ２０８６、Ｃａｒｂｏｗ２０６６、Ｃａｒｂｏｗ２０４９、及びＣａｒｂｏｗ２０１７からなる群から選択される１以上のポリインを含む請求項１に記載のライブラリー。
【請求項２５】
Ｃａｒｂｏｗ２１７２、Ｃａｒｂｏｗ２１４１、Ｃａｒｂｏｗ２１２８、Ｃａｒｂｏｗ２１００、Ｃａｒｂｏｗ２０８６、Ｃａｒｂｏｗ２０６６、Ｃａｒｂｏｗ２０４９、及びＣａｒｂｏｗ２０１７からなる群から選択されるポリインのいずれも含まない請求項１に記載のライブラリー。
【請求項２６】
前記ポリインが、１０％未満のクロストークで十分に分解されたラマンピークを有する請求項１、請求項２、請求項３、請求項４、請求項５、請求項６、請求項７、請求項８、請求項９、請求項１０、請求項１１、請求項１２、請求項１３、請求項１４、請求項１５、請求項１６、請求項１７、請求項１８、請求項１９、請求項２０、請求項２１、請求項２２、請求項２３、請求項２４又は請求項２５に記載のライブラリー。
【請求項２７】
標識を含む製造品であって、前記標識は、１〜２００の請求項１、請求項２、請求項３、請求項４、請求項５、請求項６、請求項７、請求項８、請求項９、請求項１０、請求項１１、請求項１２、請求項１３、請求項１４、請求項１５、請求項１６、請求項１７、請求項１８、請求項１９、請求項２０、請求項２１、請求項２２、請求項２３、請求項２４又は請求項２５に記載のポリインを含む製造品。
【請求項２８】
ＩＤバッジ、パスポート、運転免許証、クレジットカード、商品タグ、通貨、金融商品、文書、医薬、容器、衣類、靴、ハンドバッグ、及びＤＶＤからなる群から選択される請求項２７に記載の製造品。
【請求項２９】
少なくとも２つのポリインが前記標識中又は前記標識上に存在する請求項２７に記載の製造品。
【請求項３０】
前記ポリインの各々が、最大５つの異なる濃度で存在する請求項２９に記載の製造品。
【請求項３１】
製造品を標識する方法であって、１〜２００の請求項１に記載のポリインを含む標識を準備する工程と、前記標識を製造品に貼付又は接着する工程とを備え、
各ポリインは最大５つの異なる濃度で存在することができ、
各ポリインは、ラマンスペクトルにおいて約１８５０〜約２６００ｃｍ−１に単一の、既知の強いピークを有し、前記標識に存在するすべての他のポリインと最少のクロストークを提示し、与えられたポリインについての最少のクロストークは、別のポリイン由来のピークとの約１０％未満の重なりとして定義される方法。
【請求項３２】
前記標識のラマンスペクトルを得る工程をさらに含み、前記ラマンスペクトル中のピークが、前記標識のポリインの種類及び濃度に基づいて前記標識に存在すると予想される既知のピークに合致するとき、真正品が特定され、前記ラマンスペクトル中のピークが、前記標識のポリインの種類及び濃度に基づいて前記標識に存在すると予想される既知のピークに合致しないとき、偽造品が特定される請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
注目する生物学的粒子が生物試料に存在するか否かを判定する方法であって、
ａ）哺乳動物から生物試料を入手する工程と、
ｂ）前記生物試料を、
ｉ）抗原、抗体、抗体断片、抗体模倣体、ペプチド、核酸、脂質、炭水化物、ビオチン、ストレプトアビジン、アビジン、抗ビオチン、葉酸、葉酸結合タンパク質、ＩｇＧ、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、炭水化物、レクチン、脂質、及び注目する生物学的粒子に特異的に結合することが知られている核酸からなる群から選択される結合メンバーに結合されている請求項１、請求項２、請求項３、請求項４、請求項５、請求項６、請求項７、請求項８、請求項９、請求項１０、請求項１１、請求項１２、請求項１３、請求項１４、請求項１５、請求項１６、請求項１７、請求項１８、請求項１９、請求項２０、請求項２１、請求項２２、請求項２３、請求項２４若しくは請求項２５に記載のポリイン、又は
ｉｉ）複数の１以上の請求項１、請求項２、請求項３、請求項４、請求項５、請求項６、請求項７、請求項８、請求項９、請求項１０、請求項１１、請求項１２、請求項１３、請求項１４、請求項１５、請求項１６、請求項１７、請求項１８、請求項１９、請求項２０、請求項２１、請求項２２、請求項２３、請求項２４若しくは請求項２５に記載のポリインに結合されているか又は複数の１以上の請求項１、請求項２、請求項３、請求項４、請求項５、請求項６、請求項７、請求項８、請求項９、請求項１０、請求項１１、請求項１２、請求項１３、請求項１４、請求項１５、請求項１６、請求項１７、請求項１８、請求項１９、請求項２０、請求項２１、請求項２２、請求項２３、請求項２４若しくは請求項２５に記載のポリインを封入するナノ粒子又は微小粒子であって、前記複数の１以上のポリインはスペクトル的にバーコード化されたポリインであり、前記ナノ粒子又は微小粒子は、抗原、抗体、抗体断片、抗体模倣体、ペプチド、核酸、脂質、炭水化物、ビオチン、ストレプトアビジン、アビジン、抗ビオチン、葉酸、葉酸結合タンパク質、ＩｇＧ、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、炭水化物、レクチン、脂質、及び注目する生物学的粒子に特異的に結合することが知られている核酸からなる群から選択される結合メンバーに結合されているナノ粒子又は微小粒子
とインキュベーションする工程であって、
前記注目する生物学的粒子が前記生物試料中に存在する場合に、前記ポリイン、ナノ粒子、又は微小粒子と前記注目する生物学的粒子との間で複合体が形成される工程と、
ｃ）インキュベーションした前記試料をセルソーティング及び／又は細胞計数工程に供する工程であって、前記ポリイン、ナノ粒子、又は微小粒子と複合体形成した前記注目する生物学的粒子が、前記生物試料中に存在する場合、光に曝露され、前記光が前記生物試料中の粒子と接触するときに散乱される光からラマンスペクトルが得られる工程と、
ｄ）前記ポリイン、又は複数の１以上のスペクトル的にバーコード化されたポリインに結合されているか若しくは複数の１以上のスペクトル的にバーコード化されたポリインを封入する前記ナノ粒子若しくは微小粒子、が注目する生物学的粒子に結合した場合に存在する、前記ポリインと整合するピークが、前記ラマンスペクトル中に存在するか否かを判定することにより、注目する生物学的粒子が前記生物試料中に存在するか否かを判定する工程と
を備える方法。
【請求項３４】
前記哺乳動物がヒトである請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記セルソーティング及び／又は細胞計数の方法がフローサイトメトリーである請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記フローサイトメトリーがＳＲＳフローサイトメトリーである請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
多重化様式で実施される請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
２〜５０，０００の異なる注目する生物学的粒子の同時検出を可能にする請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記注目する生物学的粒子が、幹細胞、癌細胞、免疫細胞、神経細胞、グリア細胞、細菌、ウイルス、及び／又は真菌からなる群から選択される請求項３３に記載の方法。
【請求項４０】
前記生物試料が、血漿、血清、脳脊髄液、尿、精液、唾液、乳頭吸引液、リンパ液、細針吸引液、水、髄液、腹水、胸水、及び滑液からなる群から選択される請求項３３に記載の方法。
【請求項４１】
生物試料中の細菌性髄膜炎又は敗血症と関連する細菌の存在を判定するために使用される請求項３３に記載の方法。
【請求項４２】
幹細胞、癌細胞、免疫細胞、神経細胞、及び／又はグリア細胞をソーティング及び／又は計数するために使用される請求項３３に記載の方法。
【請求項４３】
ａ）哺乳動物から生物試料を入手する工程であって、前記生物試料は標的核酸を含んでもよく含まなくてもよい工程と、
ｂ）前記試料を、ポリメラーゼ増幅（ＰＡ）反応を実施するための組成物と組み合わせて混合物を形成する工程であって、前記組成物は、請求項１、請求項２、請求項３、請求項４、請求項５、請求項６、請求項７、請求項８、請求項９、請求項１０、請求項１１、請求項１２、請求項１３、請求項１４、請求項１５、請求項１６、請求項１７、請求項１８、請求項１９、請求項２０、請求項２１、請求項２２、請求項２３、請求項２４又は請求項２５に記載のポリインに連結された少なくとも１つのプライマー又はプローブを含む工程と、
ｃ）前記混合物に対してＰＡを実施して、前記標的核酸が前記生物試料中に存在する場合は増幅産物を生成し、前記標的核酸が前記生物試料中に存在しない場合は増幅産物を生成しない工程と、
ｄ）工程ｃ）の間に生成された又は生成されなかった増幅産物の存在又は不存在を検出する工程と、
ｅ）検出される増幅産物の存在又は不存在に基づいて、前記標的核酸の存在又は不存在を判定する工程と
を備え、
前記増幅産物の存在は、前記少なくとも１つのプライマー又はプローブに連結された前記ポリインの既知のラマン散乱スペクトルに基づいて、ラマン分光法を使用して検出される方法。
【請求項４４】
前記哺乳動物がヒトである請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記ポリメラーゼ増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応である請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記ポリメラーゼ増幅反応が多重化様式で実施される請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
標的核酸の数、及び前記標的核酸に特異的に結合するプライマー及び／又はプローブの対応する数が、２〜約１００である請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
癌の検出、遺伝子導入生物の分類及び分析、マイクロサテライトの増幅及び分析、細菌若しくはウイルス、抗原、翻訳後修飾を有するタンパク質の分類及び検出、又は一塩基多型（ＳＮＰ）、欠失、反復、及びエピジェネティック修飾を分析するための複数のＤＮＡ領域の増幅のために使用される請求項４３に記載の方法。
【請求項４９】
新規なＳＮＰを発見するため、又は生物学的粒子の中の公知のＳＮＰを検出するために使用される請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
検出しようとされる前記癌が、前記方法を使用して判定することができる遺伝子情報と関連づけられており、前記方法が、癌細胞の種類に関する情報を評価する工程、及び前記情報をこの種類の癌細胞に特定的な個別化医療アプローチを開発するために使用する工程をさらに備える請求項４６に記載の方法。
【請求項５１】
前記生物学的粒子がＨＩＶウイルスであり、前記方法が、前記ウイルス中の公知のＳＮＰの存在及び／又は種類を判定するために使用される請求項４６に記載の方法。
【請求項５２】
前記ウイルス中の公知のＳＮＰの存在及び／又は種類に関する前記情報を、この種のＨＩＶ感染に特定的な個別化医療アプローチを開発するために使用する工程をさらに備える請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
生物試料中の抗原の存在又は不存在を判定するための方法であって、
ａ）哺乳動物から生物試料を入手する工程と、
ｉ）前記生物試料を、注目する抗原が前記生物試料中に存在する場合に前記注目する抗原に特異的に結合する一次抗体とインキュベーションして、前記抗原が前記生物試料中に存在する場合に前記一次抗体及び前記抗原の複合体を形成するようにし、前記抗原が前記生物試料中に存在しない場合に複合体を形成しないようにする工程、及び
ｉｉ）ＤＮＡイニシエータ結合二次抗体を添加する工程であって、前記ＤＮＡイニシエータ結合二次抗体は、前記一次抗体が前記抗原と複合体を形成した場合に、前記一次抗体と複合体を形成する工程、又は
ｉｉｉ）一次抗体と注目する抗原との間の複合体がすでに形成されたと疑われる場合に、前記試料をＤＮＡイニシエータ結合二次抗体とインキュベーションする工程であって、前記ＤＮＡイニシエータ結合二次抗体は、前記一次抗体が前記注目する抗原との複合体を形成した場合に一次抗体と複合体を形成する工程と、
ｂ）２つのヘアピン核酸構造を添加する工程であって、前記２つのヘアピン核酸構造のうちの少なくとも一方は請求項１、請求項２、請求項３、請求項４、請求項５、請求項６、請求項７、請求項８、請求項９、請求項１０、請求項１１、請求項１２、請求項１３、請求項１４、請求項１５、請求項１６、請求項１７、請求項１８、請求項１９、請求項２０、請求項２１、請求項２２、請求項２３、請求項２４又は請求項２５に記載のポリインに共有結合されており、前記少なくとも一方のポリインは既知のラマン散乱ピークを有し、
前記ＤＮＡイニシエータ結合二次抗体が前記一次抗体と複合体を形成する場合に、前記イニシエータは、前記２つのヘアピンが逐次的に二本鎖増幅ポリマーへと集合する連鎖反応を開始し、前記二本鎖増幅ポリマーは、少なくとも１つのポリインを含む工程と、
ｃ）前記既知のラマン散乱ピークに基づいて前記少なくとも１つのポリインの存在又は不存在を判定することにより、ラマン分光法を使用して前記二本鎖増幅ポリマーの存在を検出する工程と、
ｄ）前記少なくとも１つのポリインと関連する前記既知のラマンピークの存在又は不存在に基づいて、前記注目する抗原の存在又は不存在を判定する工程と
を備える方法。
【請求項５４】
多重化様式で実施される請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
検出しようとされる前記抗原がウイルス感染、細菌感染、又は真菌感染と関連する請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
生物試料中の抗原の存在又は不存在を判定するための方法であって、
ａ）哺乳動物から生物試料を入手する工程と、
ｂ）前記生物試料を、注目する抗原が前記生物試料中に存在する場合に前記注目する抗原に特異的に結合する一次抗体とインキュベーションして、前記抗原が前記生物試料中に存在する場合に前記一次抗体及び前記抗原の複合体を形成するようにし、前記抗原が前記生物試料中に存在しない場合に複合体を形成しないようにする工程であって、
前記一次抗体は、請求項１、請求項２、請求項３、請求項４、請求項５、請求項６、請求項７、請求項８、請求項９、請求項１０、請求項１１、請求項１２、請求項１３、請求項１４、請求項１５、請求項１６、請求項１７、請求項１８、請求項１９、請求項２０、請求項２１、請求項２２、請求項２３、請求項２４若しくは請求項２５に記載の１以上のポリインで標識されているか、又は固体支持体に結合されているかのいずれかであり、前記固体支持体は、請求項１、請求項２、請求項３、請求項４、請求項５、請求項６、請求項７、請求項８、請求項９、請求項１０、請求項１１、請求項１２、請求項１３、請求項１４、請求項１５、請求項１６、請求項１７、請求項１８、請求項１９、請求項２０、請求項２１、請求項２２、請求項２３、請求項２４若しくは請求項２５に記載の１以上のポリインに結合されているか、又は請求項１、請求項２、請求項３、請求項４、請求項５、請求項６、請求項７、請求項８、請求項９、請求項１０、請求項１１、請求項１２、請求項１３、請求項１４、請求項１５、請求項１６、請求項１７、請求項１８、請求項１９、請求項２０、請求項２１、請求項２２、請求項２３、請求項２４若しくは請求項２５のいずれか一項に記載の１以上のポリインを封入する工程と、
ｃ）存在する場合、前記既知のラマン散乱ピークに基づいて前記少なくとも１つのポリインの存在又は不存在を判定することにより、前記抗原及び前記一次抗体の前記複合体の存在を検出する工程と、
ｄ）前記少なくとも１つのポリインと関連する前記既知のラマンピークの存在又は不存在に基づいて、前記注目する抗原の存在又は不存在を判定する工程と
を備える方法。
【請求項５７】
多重化様式で実施される請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
検出しようとされる前記抗原がウイルス感染、細菌感染、又は真菌感染と関連する請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
生物試料中の抗原の存在又は不存在を判定するための方法であって、
ａ）哺乳動物から生物試料を入手する工程と、
ｉ）前記生物試料を、注目する抗原が前記生物試料中に存在する場合に前記注目する抗原に特異的に結合する一次抗体とインキュベーションして、前記抗原が前記生物試料中に存在する場合に前記一次抗体及び前記抗原の複合体を形成するようにし、前記抗原が前記生物試料中に存在しない場合に複合体を形成しないようにする工程、及び
ｉｉ）二次抗体を添加する工程であって、前記二次抗体は、前記一次抗体が前記抗原と複合体を形成した場合に、前記一次抗体と複合体を形成する工程、又は
ｉｉｉ）一次抗体と注目する抗原との間の複合体がすでに形成されたと疑われる場合に、前記試料を二次抗体とインキュベーションする工程であって、前記二次抗体は、前記一次抗体が前記注目する抗原との複合体を形成した場合に一次抗体と複合体を形成し、
ｂ）前記二次抗体は、請求項１、請求項２、請求項３、請求項４、請求項５、請求項６、請求項７、請求項８、請求項９、請求項１０、請求項１１、請求項１２、請求項１３、請求項１４、請求項１５、請求項１６、請求項１７、請求項１８、請求項１９、請求項２０、請求項２１、請求項２２、請求項２３、請求項２４若しくは請求項２５に記載の１以上のポリインで標識されているか、又は固体支持体に結合されているかのいずれかであり、前記固体支持体は、請求項１、請求項２、請求項３、請求項４、請求項５、請求項６、請求項７、請求項８、請求項９、請求項１０、請求項１１、請求項１２、請求項１３、請求項１４、請求項１５、請求項１６、請求項１７、請求項１８、請求項１９、請求項２０、請求項２１、請求項２２、請求項２３、請求項２４若しくは請求項２５に記載の１以上のポリインに結合されているか、又は請求項１、請求項２、請求項３、請求項４、請求項５、請求項６、請求項７、請求項８、請求項９、請求項１０、請求項１１、請求項１２、請求項１３、請求項１４、請求項１５、請求項１６、請求項１７、請求項１８、請求項１９、請求項２０、請求項２１、請求項２２、請求項２３、請求項２４若しくは請求項２５に記載の１以上のポリインを封入する工程と、
ｃ）前記既知のラマン散乱ピークに基づいて前記少なくとも１つのポリインの存在又は不存在を判定することにより、ラマン分光法を使用して前記一次抗体と前記二次抗体との間で形成された前記複合体の存在を検出する工程と、
ｄ）前記少なくとも１つのポリインと関連する前記既知のラマンピークの存在又は不存在に基づいて、前記注目する抗原の存在又は不存在を判定する工程と
を備える方法。
【請求項６０】
多重化様式で実施される請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
検出しようとされる前記抗原がウイルス感染、細菌感染、又は真菌感染と関連する請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
ラマン分光法工程における散乱光の検出が幅広い範囲の波長を検出する検出器を使用して検出される請求項３１、請求項３２、請求項３４、請求項３５、請求項３６、請求項３７、請求項３８、請求項３９、請求項４０、請求項４１、請求項４２、請求項４４、請求項４５、請求項４６、請求項４７、請求項４８、請求項４９、請求項５０、請求項５１、請求項５２、請求項５４、請求項５５、請求項５７、請求項５８、請求項６０又は請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
培養された生細胞のイメージング方法であって、
生細胞を培養する工程であって、前記生細胞は、注目するインビトロ組織細胞培養物、又は注目するインビボ対象から抽出された細胞である工程と、
前記培養された生細胞をウェルに播種する工程と、
培地中で前記ウェルの各々をポリインの単一の色で標識する工程であって、前記ポリインは１以上の色を含む工程と、
標識された前記培養された生細胞を、誘導ラマン顕微鏡法のためにイメージングチャンバーに加える工程と、
誘導ラマン顕微鏡法を使用して前記細胞をイメージングする工程であって、各細胞は、イメージング時間のあいだ単一の色で維持される工程と
を備える方法。
【請求項６４】
前記ポリインが、請求項１、請求項２、請求項３、請求項４、請求項５、請求項６、請求項７、請求項８、請求項９、請求項１０、請求項１１、請求項１２、請求項１３、請求項１４、請求項１５、請求項１６、請求項１７、請求項１８、請求項１９、請求項２０、請求項２１、請求項２２、請求項２３、請求項２４又は請求項２５に記載のポリインである請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記ポリインが、１０％未満のクロストークで十分に分解されたラマンピークを有するポリイン化合物である請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
前記ポリインが、Ｃａｒｂｏｗ２１７２、Ｃａｒｂｏｗ２１４１、Ｃａｒｂｏｗ２１２８、Ｃａｒｂｏｗ２１００、Ｃａｒｂｏｗ２０８６、Ｃａｒｂｏｗ２０６６、Ｃａｒｂｏｗ２０４９、及びＣａｒｂｏｗ２０１７からなる群から選択される１以上のポリインを含む請求項６３に記載の方法。
【請求項６７】
前記ポリインが、Ｃａｒｂｏｗ２１７２、Ｃａｒｂｏｗ２１４１、Ｃａｒｂｏｗ２１２８、Ｃａｒｂｏｗ２１００、Ｃａｒｂｏｗ２０８６、Ｃａｒｂｏｗ２０６６、Ｃａｒｂｏｗ２０４９、及びＣａｒｂｏｗ２０１７からなる群から選択されるポリインのいずれも含まない請求項６３に記載の方法。
【請求項６８】
培養される前記細胞が、幹細胞、癌細胞、免疫細胞、神経細胞及びグリア細胞からなる群から選択される請求項５５に記載の方法。
【請求項６９】
培養された生細胞の小器官のイメージング方法であって、
生細胞を培養する工程であって、前記生細胞は、注目するインビトロ組織細胞培養物、又は注目するインビボ対象から抽出された細胞である工程と、
前記培養された生細胞をポリインと共に培地中でインキュベーションする工程であって、前記ポリインは、各々、特異的な小器官標的プローブを含む工程と、
前記培養された生細胞を前記ポリインで標識する工程と、
振動顕微鏡法を使用して前記細胞をイメージングする工程と
を備える方法。
【請求項７０】
前記振動顕微鏡法が誘導ラマン顕微鏡法である請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
培養される前記細胞が、幹細胞、癌細胞、免疫細胞、神経細胞及びグリア細胞からなる群から選択される請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
前記ポリインとインキュベーションし前記ポリインで標識する前に、前記培養された生細胞をウェルに播種する工程、及び
前記培養された生細胞を前記ポリインで標識する工程であって、前記ポリインが、各々、特異的な小器官標的プローブを含み、さらには、前記特異的な小器官標的プローブが異なる小器官を特異的に標的とする工程
をさらに備える請求項６９に記載の方法。
【請求項７３】
前記特異的な小器官標的プローブが、前記培養された生細胞中の細胞膜、ＥＲ、ゴルジ、ミトコンドリア、脂質滴、リソソーム、ペルオキシソーム、核、及び細胞骨格からなる群から選択される異なる小器官を特異的に標的とする請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記ポリインが、請求項１、請求項２、請求項３、請求項４、請求項５、請求項６、請求項７、請求項８、請求項９、請求項１０、請求項１１、請求項１２、請求項１３、請求項１４、請求項１５、請求項１６、請求項１７、請求項１８、請求項１９、請求項２０、請求項２１、請求項２２、請求項２３、請求項２４又は請求項２５に記載のポリインである請求項６９に記載の方法。
【請求項７５】
前記ポリインが、１０％未満のクロストークで十分に分解されたラマンピークを有するポリイン化合物である請求項６９に記載の方法。
【請求項７６】
前記ポリインが、Ｃａｒｂｏｗ２１７２、Ｃａｒｂｏｗ２１４１、Ｃａｒｂｏｗ２１２８、Ｃａｒｂｏｗ２１００、Ｃａｒｂｏｗ２０８６、Ｃａｒｂｏｗ２０６６、Ｃａｒｂｏｗ２０４９、及びＣａｒｂｏｗ２０１７からなる群から選択される１以上のポリインを含む請求項６９に記載の方法。
【請求項７７】
前記ポリインが、Ｃａｒｂｏｗ２１７２、Ｃａｒｂｏｗ２１４１、Ｃａｒｂｏｗ２１２８、Ｃａｒｂｏｗ２１００、Ｃａｒｂｏｗ２０８６、Ｃａｒｂｏｗ２０６６、Ｃａｒｂｏｗ２０４９、及びＣａｒｂｏｗ２０１７からなる群から選択されるポリインのいずれも含まない請求項６９に記載の方法。
【請求項７８】
スペクトル的にバーコード化されたビーズを使用する生細胞のタグ付け方法であって、
ポリスチレンビーズをスペクトル的にバーコード化されたポリインと混合する工程と、
前記ビーズを前記スペクトル的にバーコード化されたポリインと結合して、バーコード化ビーズを形成する工程と、
生細胞を培養する工程であって、前記生細胞は、注目するインビトロ組織細胞培養物、又は注目するインビボ対象から抽出された細胞である工程と、
培養された前記生細胞を前記バーコード化ビーズと培地中でインキュベーションする工程と、
前記培養された生細胞を前記バーコード化ビーズで標識する工程と、
前記培養された生細胞を、振動顕微鏡法を使用してイメージングする工程と、
視野全体の前記バーコード化ビーズの前記スペクトルバーコードを、ハイパースペクトルの振動画像に基づいて復号化する工程と
を備え、前記ポリインは、１０％未満のクロストークで十分に分解されたラマンピークを有するポリイン化合物である方法。
【請求項７９】
前記振動顕微鏡法が誘導ラマン分光法である請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記ポリインが、請求項１、請求項２、請求項３、請求項４、請求項５、請求項６、請求項７、請求項８、請求項９、請求項１０、請求項１１、請求項１２、請求項１３、請求項１４、請求項１５、請求項１６、請求項１７、請求項１８、請求項１９、請求項２０、請求項２１、請求項２２、請求項２３、請求項２４又は請求項２５に記載のポリインである請求項７８に記載の方法。
【請求項８１】
前記ポリインが、Ｃａｒｂｏｗ２１７２、Ｃａｒｂｏｗ２１４１、Ｃａｒｂｏｗ２１２８、Ｃａｒｂｏｗ２１００、Ｃａｒｂｏｗ２０８６、Ｃａｒｂｏｗ２０６６、Ｃａｒｂｏｗ２０４９、及びＣａｒｂｏｗ２０１７からなる群から選択される１以上のポリインを含む請求項７８に記載の方法。
【請求項８２】
前記ポリインが、Ｃａｒｂｏｗ２１７２、Ｃａｒｂｏｗ２１４１、Ｃａｒｂｏｗ２１２８、Ｃａｒｂｏｗ２１００、Ｃａｒｂｏｗ２０８６、Ｃａｒｂｏｗ２０６６、Ｃａｒｂｏｗ２０４９、及びＣａｒｂｏｗ２０１７からなる群から選択されるポリインのいずれも含まない請求項７８に記載の方法。
【請求項８３】
フローサイトメトリーにより癌細胞の集団を特定する方法であって、
１以上の炭素原子ワイヤを注目する対象の生細胞と会合させる工程であって、前記炭素原子ワイヤは、前記生細胞の特異的細胞表面マーカーを検出する抗体と結合され、前記抗体は前記生細胞の細胞表面マーカーに結合する工程と、
前記生細胞を、フローサイトメーターの絞り込まれたフロー流の中に位置決めする工程と、
前記フローサイトメーターの前記絞り込まれたフロー流内の前記生細胞を、所定の波長の光で照射する工程であって、前記炭素原子ワイヤは前記照射に曝される工程と、
前記生細胞からの散乱光を検出する工程と、
前記散乱光を分析して、生細胞の個々の群を特定する工程と、
前記抗体に結合された前記炭素原子ワイヤによって生成される前記散乱光に基づいて癌細胞を検出する工程であって、前記抗体は、癌細胞と会合する特異的細胞表面マーカーを検出する工程と
を備える方法。
【請求項８４】
前記炭素原子ワイヤが、１以上の請求項１、請求項２、請求項３、請求項４、請求項５、請求項６、請求項７、請求項８、請求項９、請求項１０、請求項１１、請求項１２、請求項１３、請求項１４、請求項１５、請求項１６、請求項１７、請求項１８、請求項１９、請求項２０、請求項２１、請求項２２、請求項２３、請求項２４又は請求項２５に記載のポリインを含む請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記炭素原子ワイヤが、１０％未満のクロストークで十分に分解されたラマンピークを有するポリイン化合物を含む請求項８３に記載の方法。
【請求項８６】
前記炭素原子ワイヤが、Ｃａｒｂｏｗ２１７２、Ｃａｒｂｏｗ２１４１、Ｃａｒｂｏｗ２１２８、Ｃａｒｂｏｗ２１００、Ｃａｒｂｏｗ２０８６、Ｃａｒｂｏｗ２０６６、Ｃａｒｂｏｗ２０４９、及びＣａｒｂｏｗ２０１７からなる群から選択される１以上のポリインを含む請求項８３に記載の方法。
【請求項８７】
フローサイトメトリーベースの高スループット医療診断の方法であって、
１以上の炭素原子ワイヤを注目する対象の生細胞と会合させる工程であって、前記生細胞の特定の分集団は、炭素原子ワイヤの別個のセットと特異的に会合する工程と、
前記生細胞をフローサイトメーターの中で位置決めする工程と、
前記生細胞を前記フローサイトメーターの絞り込まれたフロー流内で照射する工程であって、前記炭素原子ワイヤは前記照射に曝露される工程と、
前記生細胞からの散乱光を検出する工程と、
前記散乱光を分析して、生細胞の個々の群を特定する工程と、
前記散乱光の分析に基づいて、前記注目する対象の疾患を検出する工程と
を備える方法。
【請求項８８】
前記生細胞が、幹細胞、癌細胞、免疫細胞、神経細胞及びグリア細胞からなる群から選択される請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記炭素原子ワイヤが、１以上の請求項１、請求項２、請求項３、請求項４、請求項５、請求項６、請求項７、請求項８、請求項９、請求項１０、請求項１１、請求項１２、請求項１３、請求項１４、請求項１５、請求項１６、請求項１７、請求項１８、請求項１９、請求項２０、請求項２１、請求項２３、請求項２４、請求項２５又は請求項２６に記載のポリインを含む請求項８７に記載の方法。
【請求項９０】
前記炭素原子ワイヤが、１０％未満のクロストークで十分に分解されたラマンピークを有するポリイン化合物を含む請求項８７に記載の方法。
【請求項９１】
前記炭素原子ワイヤが、Ｃａｒｂｏｗ２１７２、Ｃａｒｂｏｗ２１４１、Ｃａｒｂｏｗ２１２８、Ｃａｒｂｏｗ２１００、Ｃａｒｂｏｗ２０８６、Ｃａｒｂｏｗ２０６６、Ｃａｒｂｏｗ２０４９、及びＣａｒｂｏｗ２０１７からなる群から選択される１以上のポリインを含む請求項８７に記載の方法。
【請求項９２】
前記ポリインが、Ｃａｒｂｏｗ２１７２、Ｃａｒｂｏｗ２１４１、Ｃａｒｂｏｗ２１２８、Ｃａｒｂｏｗ２１００、Ｃａｒｂｏｗ２０８６、Ｃａｒｂｏｗ２０６６、Ｃａｒｂｏｗ２０４９、及びＣａｒｂｏｗ２０１７からなる群から選択されるポリインのいずれも含まない請求項８７に記載の方法。
【請求項９３】
セルソーティング方法であって、
炭素原子ワイヤを注目する対象の生細胞と会合させる工程であって、前記生細胞の特定の分集団は、炭素原子ワイヤの別個のセットと特異的に会合する工程と、
前記生細胞の特定の分集団と炭素原子ワイヤの別個のセットとの特異的な会合によって、前記生細胞の特定の分集団をセルソーティングする工程であって、前記セルソーティングは分光法を使用して実施される工程と
を備え、前記炭素原子ワイヤは、１以上の請求項１、請求項２、請求項３、請求項４、請求項５、請求項６、請求項７、請求項８、請求項９、請求項１０、請求項１１、請求項１２、請求項１３、請求項１４、請求項１５、請求項１６、請求項１７、請求項１８、請求項１９、請求項２０、請求項２１、請求項２２、請求項２３、請求項２４又は請求項２５に記載のポリインを含む方法。
【請求項９４】
ソーティングされる前記細胞が、幹細胞、癌細胞、免疫細胞、神経細胞及びグリア細胞からなる群から選択される１以上の細胞を含む請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記炭素原子ワイヤが、１０％未満のクロストークで十分に分解されたラマンピークを有するポリイン化合物を含む請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記炭素原子ワイヤが、Ｃａｒｂｏｗ２１７２、Ｃａｒｂｏｗ２１４１、Ｃａｒｂｏｗ２１２８、Ｃａｒｂｏｗ２１００、Ｃａｒｂｏｗ２０８６、Ｃａｒｂｏｗ２０６６、Ｃａｒｂｏｗ２０４９、及びＣａｒｂｏｗ２０１７からなる群から選択される１以上のポリインを含む請求項９４に記載の方法。
【請求項９７】
前記ポリインが、Ｃａｒｂｏｗ２１７２、Ｃａｒｂｏｗ２１４１、Ｃａｒｂｏｗ２１２８、Ｃａｒｂｏｗ２１００、Ｃａｒｂｏｗ２０８６、Ｃａｒｂｏｗ２０６６、Ｃａｒｂｏｗ２０４９、及びＣａｒｂｏｗ２０１７からなる群から選択されるポリインのいずれも含まない請求項９４に記載の方法。
【請求項９８】
前記分光法がＳＲＳフローサイトメトリーを含む請求項９４に記載の方法。
【請求項９９】
インビボで細胞アトラスを生成する方法であって、
炭素原子ワイヤを注目する対象の生細胞と会合させる工程であって、前記生細胞の特定の分集団は、炭素原子ワイヤの別個のセットと特異的に会合する工程と、
前記生細胞の特定の分集団間の関係をマッピングする工程であって、前記生細胞の特定の分集団は、それらと炭素原子ワイヤの別個のセットとの特異的な会合によって識別可能である工程と
を備え、前記炭素原子ワイヤは、１以上の請求項１、請求項２、請求項３、請求項４、請求項５、請求項６、請求項７、請求項８、請求項９、請求項１０、請求項１１、請求項１２、請求項１３、請求項１４、請求項１５、請求項１６、請求項１７、請求項１８、請求項１９、請求項２０、請求項２１、請求項２２、請求項２３、請求項２４又は請求項２５に記載のポリインを含む方法。
【請求項１００】
前記細胞分集団が、幹細胞、癌細胞、免疫細胞、神経細胞及びグリア細胞からなる群から選択される１以上の細胞を含む請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記炭素原子ワイヤが、１０％未満のクロストークで十分に分解されたラマンピークを有するポリイン化合物を含む請求項９９に記載の方法。
【請求項１０２】
前記炭素原子ワイヤが、Ｃａｒｂｏｗ２１７２、Ｃａｒｂｏｗ２１４１、Ｃａｒｂｏｗ２１２８、Ｃａｒｂｏｗ２１００、Ｃａｒｂｏｗ２０８６、Ｃａｒｂｏｗ２０６６、Ｃａｒｂｏｗ２０４９、及びＣａｒｂｏｗ２０１７からなる群から選択される１以上のポリインを含む請求項９９に記載の方法。
【請求項１０３】
前記ポリインが、Ｃａｒｂｏｗ２１７２、Ｃａｒｂｏｗ２１４１、Ｃａｒｂｏｗ２１２８、Ｃａｒｂｏｗ２１００、Ｃａｒｂｏｗ２０８６、Ｃａｒｂｏｗ２０６６、Ｃａｒｂｏｗ２０４９、及びＣａｒｂｏｗ２０１７からなる群から選択されるポリインのいずれも含まない請求項９９に記載の方法。
【請求項１０４】
前期共鳴条件が存在しない固定細胞及び組織を免疫染色しイメージングする方法であって、
共役長、末端封鎖置換又は同位体編集のうちの少なくとも１つの組み合わせを選ぶことにより、周波数多重化のためのポリインを製造する工程と、
ポリイン由来のプローブを形成する工程であって、前記プローブは、周波数多重化のための前記ポリインを含む工程と、
前記ポリイン由来のプローブを固定細胞又は組織に与える工程であって、前記ポリイン由来のプローブは前記固定細胞又は組織を免疫染色する工程と、
免疫染色後に前記固定細胞又は前記組織をイメージングする工程と
を備える方法。
【請求項１０５】
前記細胞が、幹細胞、癌細胞、免疫細胞、神経細胞及びグリア細胞からなる群から選択される１以上の細胞を含む請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
前記ポリインが請求項１、請求項２、請求項３、請求項４、請求項５、請求項６、請求項７、請求項８、請求項９、請求項１０、請求項１１、請求項１２、請求項１３、請求項１４、請求項１５、請求項１６、請求項１７、請求項１８、請求項１９、請求項２０、請求項２１、請求項２２、請求項２３、請求項２４又は請求項２５に記載のポリインである請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０７】
前記ポリインが、Ｃａｒｂｏｗ２１７２、Ｃａｒｂｏｗ２１４１、Ｃａｒｂｏｗ２１２８、Ｃａｒｂｏｗ２１００、Ｃａｒｂｏｗ２０８６、Ｃａｒｂｏｗ２０６６、Ｃａｒｂｏｗ２０４９、及びＣａｒｂｏｗ２０１７からなる群から選択される請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０８】
前記ポリインが、Ｃａｒｂｏｗ２１７２、Ｃａｒｂｏｗ２１４１、Ｃａｒｂｏｗ２１２８、Ｃａｒｂｏｗ２１００、Ｃａｒｂｏｗ２０８６、Ｃａｒｂｏｗ２０６６、Ｃａｒｂｏｗ２０４９、及びＣａｒｂｏｗ２０１７からなる群から選択されるポリインのいずれも含まない請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０９】
ポリインプローブの多重ナノスケールシグナル増幅の方法であって、
デンドリマー又はポリマーナノ構造体のうちの少なくとも１つを複数のポリインでグラフト化する工程であって、前記デンドリマー又は前記ポリマーナノ構造体のうちの少なくとも１つは、ボトルブラシ型ナノ材料及び星型ナノ材料の群から選択される１以上を含む工程と、
前記グラフト化デンドリマー又は前記ポリマーナノ構造体のうちの少なくとも１つからポリインプローブを形成する工程と
を備え、前記複数のポリインは、１以上の請求項１、請求項２、請求項３、請求項４、請求項５、請求項６、請求項７、請求項８、請求項９、請求項１０、請求項１１、請求項１２、請求項１３、請求項１４、請求項１５、請求項１６、請求項１７、請求項１８、請求項１９、請求項２０、請求項２１、請求項２２、請求項２３、請求項２４又は請求項２５に記載のポリインを含む方法。
【請求項１１０】
前記複数のポリイン化合物が、各々、１０％未満のクロストークで十分に分解されたラマンピークを有する請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
前記ポリインが、Ｃａｒｂｏｗ２１７２、Ｃａｒｂｏｗ２１４１、Ｃａｒｂｏｗ２１２８、Ｃａｒｂｏｗ２１００、Ｃａｒｂｏｗ２０８６、Ｃａｒｂｏｗ２０６６、Ｃａｒｂｏｗ２０４９、及びＣａｒｂｏｗ２０１７からなる群から選択される１以上のポリインを含む請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１２】
前記ポリインが、Ｃａｒｂｏｗ２１７２、Ｃａｒｂｏｗ２１４１、Ｃａｒｂｏｗ２１２８、Ｃａｒｂｏｗ２１００、Ｃａｒｂｏｗ２０８６、Ｃａｒｂｏｗ２０６６、Ｃａｒｂｏｗ２０４９、及びＣａｒｂｏｗ２０１７からなる群から選択されるポリインのいずれも含まない請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１３】
超多重化検出のためにポリインプローブのシグナル強度を増強する方法であって、
貴金属ナノ構造体をポリイン分子でコーティングする工程であって、前記貴金属ナノ構造体は、ナノ球体、ナノロッド及びナノスターからなる群から選択される１以上のナノ構造体を含む工程と、
表面増強ラマン散乱によるシグナル増幅のために、物理吸着又は化学修飾を使用する工程と
を備え、前記ポリイン分子は、１以上の請求項１、請求項２、請求項３、請求項４、請求項５、請求項６、請求項７、請求項８、請求項９、請求項１０、請求項１１、請求項１２、請求項１３、請求項１４、請求項１５、請求項１６、請求項１７、請求項１８、請求項１９、請求項２０、請求項２１、請求項２２、請求項２３、請求項２４又は請求項２５に記載のポリインを含む方法。
【請求項１１４】
前記ポリイン分子が、各々、１０％未満のクロストークで十分に分解されたラマンピークを有する請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
前記ポリイン分子が、Ｃａｒｂｏｗ２１７２、Ｃａｒｂｏｗ２１４１、Ｃａｒｂｏｗ２１２８、Ｃａｒｂｏｗ２１００、Ｃａｒｂｏｗ２０８６、Ｃａｒｂｏｗ２０６６、Ｃａｒｂｏｗ２０４９、及びＣａｒｂｏｗ２０１７からなる群から選択される１以上のポリインを含む請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１６】
前記ポリインが、Ｃａｒｂｏｗ２１７２、Ｃａｒｂｏｗ２１４１、Ｃａｒｂｏｗ２１２８、Ｃａｒｂｏｗ２１００、Ｃａｒｂｏｗ２０８６、Ｃａｒｂｏｗ２０６６、Ｃａｒｂｏｗ２０４９、及びＣａｒｂｏｗ２０１７からなる群から選択されるポリインのいずれも含まない請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１７】
周波数暗号化による偽造防止方法であって、
ハイパースペクトルＳＲＳ画像を使用して商用販売のための製品をイメージングし、前記製品を標識するために使用される１以上のポリインの存在を特定する工程
を備え、
前記商用販売のための製品は、前記製品の製造中に１以上のポリインで標識され、
さらに、前記ハイパースペクトルＳＲＳ画像中の前記１以上のポリインの不存在は、前記製品が偽造品であることを意味する方法。
【請求項１１８】
前記１以上のポリインが、１以上の請求項１、請求項２、請求項３、請求項４、請求項５、請求項６、請求項７、請求項８、請求項９、請求項１０、請求項１１、請求項１２、請求項１３、請求項１４、請求項１５、請求項１６、請求項１７、請求項１８、請求項１９、請求項２０、請求項２１、請求項２２、請求項２３、請求項２４又は請求項２５に記載のポリインを含む請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
前記１以上のポリイン化合物が、各々、１０％未満のクロストークで十分に分解されたラマンピークを有する請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２０】
前記ポリインが、Ｃａｒｂｏｗ２１７２、Ｃａｒｂｏｗ２１４１、Ｃａｒｂｏｗ２１２８、Ｃａｒｂｏｗ２１００、Ｃａｒｂｏｗ２０８６、Ｃａｒｂｏｗ２０６６、Ｃａｒｂｏｗ２０４９、及びＣａｒｂｏｗ２０１７からなる群から選択される１以上のポリインを含む請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２１】
前記ポリインが、Ｃａｒｂｏｗ２１７２、Ｃａｒｂｏｗ２１４１、Ｃａｒｂｏｗ２１２８、Ｃａｒｂｏｗ２１００、Ｃａｒｂｏｗ２０８６、Ｃａｒｂｏｗ２０６６、Ｃａｒｂｏｗ２０４９、及びＣａｒｂｏｗ２０１７からなる群から選択されるポリインのいずれも含まない請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２２】
周波数暗号化による本人確認方法であって、
ハイパースペクトルＳＲＳ画像を使用して特定用タグをイメージングし、前記タグを標識するために使用される１以上のポリインの存在を特定する工程
を備え、
前記タグは、前記タグの製造中に１以上のポリインで標識され、
前記ハイパースペクトルＳＲＳ画像中の前記１以上のポリインの不存在は、前記タグが偽物であることを意味し、前記１以上のポリインは、１以上の請求項１、請求項２、請求項３、請求項４、請求項５、請求項６、請求項７、請求項８、請求項９、請求項１０、請求項１１、請求項１２、請求項１３、請求項１４、請求項１５、請求項１６、請求項１７、請求項１８、請求項１９、請求項２０、請求項２１、請求項２２、請求項２３、請求項２４又は請求項２５に記載のポリインを含む方法。
【請求項１２３】
前記１以上のポリイン化合物が、各々、１０％未満のクロストークで十分に分解されたラマンピークを有する請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２４】
前記ポリインが、Ｃａｒｂｏｗ２１７２、Ｃａｒｂｏｗ２１４１、Ｃａｒｂｏｗ２１２８、Ｃａｒｂｏｗ２１００、Ｃａｒｂｏｗ２０８６、Ｃａｒｂｏｗ２０６６、Ｃａｒｂｏｗ２０４９、及びＣａｒｂｏｗ２０１７からなる群から選択される１以上のポリインを含む請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２５】
前記ポリインが、Ｃａｒｂｏｗ２１７２、Ｃａｒｂｏｗ２１４１、Ｃａｒｂｏｗ２１２８、Ｃａｒｂｏｗ２１００、Ｃａｒｂｏｗ２０８６、Ｃａｒｂｏｗ２０６６、Ｃａｒｂｏｗ２０４９、及びＣａｒｂｏｗ２０１７からなる群から選択されるポリインのいずれも含まない請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２６】
培養された生細胞をイメージングするためのキットであって、
非特異的に標的化されたポリインと、
小器官標的ポリインと、
スペクトル的にバーコード化されたポリインと、
培養された生細胞のイメージングにおいて前記ポリインを使用するための説明書と
を含むキット。
【請求項１２７】
前記ポリインが、１以上の請求項１、請求項２、請求項３、請求項４、請求項５、請求項６、請求項７、請求項８、請求項９、請求項１０、請求項１１、請求項１２、請求項１３、請求項１４、請求項１５、請求項１６、請求項１７、請求項１８、請求項１９、請求項２０、請求項２１、請求項２２、請求項２３、請求項２４又は請求項２５に記載のポリインを含む請求項１３３に記載のキット。
【請求項１２８】
前記ポリインが、各々、１０％未満のクロストークで十分に分解されたラマンピークを有する請求項１２７に記載のキット。
【請求項１２９】
前記ポリインが、Ｃａｒｂｏｗ２１７２、Ｃａｒｂｏｗ２１４１、Ｃａｒｂｏｗ２１２８、Ｃａｒｂｏｗ２１００、Ｃａｒｂｏｗ２０８６、Ｃａｒｂｏｗ２０６６、Ｃａｒｂｏｗ２０４９、及びＣａｒｂｏｗ２０１７からなる群から選択される１以上のポリインを含む請求項１２７に記載のキット。
【請求項１３０】
前記ポリインが、Ｃａｒｂｏｗ２１７２、Ｃａｒｂｏｗ２１４１、Ｃａｒｂｏｗ２１２８、Ｃａｒｂｏｗ２１００、Ｃａｒｂｏｗ２０８６、Ｃａｒｂｏｗ２０６６、Ｃａｒｂｏｗ２０４９、及びＣａｒｂｏｗ２０１７からなる群から選択されるポリインのいずれも含まない請求項１２７に記載のキット。
【請求項１３１】
多重ＰＣＲを実施するためのキットであって、
ａ）各々が、異なる請求項１、請求項２、請求項３、請求項４、請求項５、請求項６、請求項７、請求項８、請求項９、請求項１０、請求項１１、請求項１２、請求項１３、請求項１４、請求項１５、請求項１６、請求項１７、請求項１８、請求項１９、請求項２０、請求項２１、請求項２２、請求項２３、請求項２４又は請求項２５に記載のポリインで標識された２〜５０のプライマーと、
ｂ）ＤＮＡポリメラーゼと
を含むキット。
【請求項１３２】
前記ＤＮＡポリメラーゼがＴａｑポリメラーゼである請求項１３１に記載のキット。
【請求項１３３】
バッファーをさらに含む請求項１３１に記載のキット。
【請求項１３４】
さらに、前記バッファーが、ＰＣＲ増幅のための最適化された塩濃度を含む請求項１３１に記載のキット。
【請求項１３５】
ＤＮＡの融解挙動を改変することにより異なる鋳型の増幅を容易にする１以上のＰＣＲ添加剤をさらに含む請求項１３１に記載のキット。
【請求項１３６】
ジメチルスルホキシドをさらに含む請求項１３１に記載のキット。
【請求項１３７】
前記ポリインが、各々、１０％未満のクロストークで十分に分解されたラマンピークを有する請求項１３１に記載のキット。
【請求項１３８】
前記ポリインが、Ｃａｒｂｏｗ２１７２、Ｃａｒｂｏｗ２１４１、Ｃａｒｂｏｗ２１２８、Ｃａｒｂｏｗ２１００、Ｃａｒｂｏｗ２０８６、Ｃａｒｂｏｗ２０６６、Ｃａｒｂｏｗ２０４９、及びＣａｒｂｏｗ２０１７からなる群から選択される１以上のポリインを含む請求項１３１に記載のキット。
【請求項１３９】
前記ポリインが、Ｃａｒｂｏｗ２１７２、Ｃａｒｂｏｗ２１４１、Ｃａｒｂｏｗ２１２８、Ｃａｒｂｏｗ２１００、Ｃａｒｂｏｗ２０８６、Ｃａｒｂｏｗ２０６６、Ｃａｒｂｏｗ２０４９、及びＣａｒｂｏｗ２０１７からなる群から選択されるポリインのいずれも含まない請求項１３１に記載のキット。
【請求項１４０】
ハイブリダイゼーション連鎖反応増幅を実施するためのキットであって、イニシエータに曝露されると自己組織化する１以上の準安定な核酸モノマーを含み、前記モノマーのうちの少なくとも１つは、請求項１、請求項２、請求項３、請求項４、請求項５、請求項６、請求項７、請求項８、請求項９、請求項１０、請求項１１、請求項１２、請求項１３、請求項１４、請求項１５、請求項１６、請求項１７、請求項１８、請求項１９、請求項２０、請求項２１、請求項２２、請求項２３、請求項２４又は請求項２５に記載のポリインに結合されているキット。
【請求項１４１】
第１の準安定な核酸モノマーの一部分に相補的な領域を含む１以上の準安定な核酸モノマーをさらに含む請求項１４０に記載のキット。
【請求項１４２】
ハイブリダイゼーション連鎖反応増幅を実施するためのキットであって、イニシエータに曝露されると自己組織化する１以上の準安定な核酸モノマーを含み、前記モノマーのうちの少なくとも１つは、請求項１、請求項２、請求項３、請求項４、請求項５、請求項６、請求項７、請求項８、請求項９、請求項１０、請求項１１、請求項１２、請求項１３、請求項１４、請求項１５、請求項１６、請求項１７、請求項１８、請求項１９、請求項２０、請求項２１、請求項２２、請求項２３、請求項２４又は請求項２５に記載のポリインに結合されており、前記モノマーは、ループ領域及び二本鎖領域を含むヘアピン核酸構造を含むキット。
【請求項１４３】
イニシエータをさらに含む請求項１４２に記載のキット。
【請求項１４４】
前記イニシエータが核酸を含む請求項１４３に記載のキット。
【請求項１４５】
注目する抗原に結合する一次抗体をさらに含む請求項１４２に記載のキット。
【請求項１４６】
前記一次抗体が注目する抗原と複合体を形成した場合にのみ前記一次抗体と複合体を形成するＤＮＡイニシエータ結合二次抗体をさらに含む請求項１４５に記載のキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
連邦政府により資金提供を受けた研究に関する記載
本発明は、米国国立衛生研究所により授与されたＥＢ０２０８９２のもとでの政府助成によって為されたものである。政府は、本発明において所定の権利を有する。
【手続補正書】
【提出日】令和2年3月31日(2020.3.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２〜約２００の下記式を有するポリインを含むライブラリーであって、
【化１】
2020532497.tif 000083
上記式中、ｎは１〜１９の整数であり、
Ｒ１及びＲ２は、独立に、アリール、Ｃ１〜２０アルキル、トリアルキルシリル、アリールジアルキルシリル、ジアリールアルキルシリル、金属、金属錯体、アリール−Ｃ１〜２０アルキル、Ｃ１〜２０アルキル−アリール、ヘテロアリール、ヘテロアリール−Ｃ１〜２０アルキル又はＣ１〜２０アルキル−ヘテロアリールであり、これらの基の各々は、任意に１以上の置換基で置換されていてもよく、
これらの基における水素のうちの１以上は、任意に重水素化されていてもよく、
前記アルキン部分における炭素のうちの１以上は、任意に１３Ｃ標識されていてもよく、
前記アリール、Ｃ１〜２０アルキル、アリール−Ｃ１〜２０アルキル、Ｃ１〜２０アルキル−アリール、ヘテロアリール、ヘテロアリール−Ｃ１〜２０アルキル又はＣ１〜２０アルキル−ヘテロアリール基のうちの１以上にある前記置換基は、蛍光標識、抗原、抗体、抗体断片、抗体模倣体、ペプチド、タンパク質、核酸、脂質、炭水化物、ビオチン、ストレプトアビジン、アビジン、抗ビオチン、葉酸、葉酸結合タンパク質、ＩｇＧ、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、炭水化物、レクチン、脂質、核酸、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシル、カルボキシル、アシル、アリール、アシルオキシ、アミノ、アミド、カルボキシル誘導体、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、アルコキシ、アリールオキシ、ニトロ、シアノ、スルホン酸、チオール、イミン、スルホニル、スルファニル、スルフィニル、スルファモイル、エステル、カルボン酸、アミド、ホスホニル、ホスフィニル、ホスホリル、ホスフィン、チオエステル、チオエーテル、酸ハロゲン化物、無水物、オキシム、ヒドラジン、カルバメート、カーボネート、尿素、ホスホン酸、及びホスホネートからなる群から選択されるライブラリー。
【請求項２】
前記アリール、Ｃ１〜２０アルキル、アリール−Ｃ１〜２０アルキル、Ｃ１〜２０アルキル−アリール、ヘテロアリール、ヘテロアリール−Ｃ１〜２０アルキル又はＣ１〜２０アルキル−ヘテロアリール基にある前記置換基の１以上が、（ｉ）ナノ粒子、微小粒子、抗体、ペプチド、タンパク質、核酸、脂質、若しくは炭水化物上にある官能基に結合されることが可能である置換基、（ｉｉ）前記ポリインのラマンスペクトルを非置換の基に対してシフトさせることができる電子吸引性基若しくは電子供与性基、及び／又は（ｉｉｉ）特定の小器官若しくは細胞区画を標的とする置換基、のうちの少なくとも１つである請求項１に記載のライブラリー。
【請求項３】
ｎが２〜１９、又は好ましくは３〜５の整数である請求項１に記載のライブラリー。
【請求項４】
ポリインの数が２〜約１００、又は好ましくは４〜約５０である請求項１に記載のライブラリー。
【請求項５】
前記ポリインのうちの１以上が、ナノ粒子若しくは微小粒子であってもよい固体支持体中又はナノ粒子若しくは微小粒子であってもよい固体支持体上に存在する請求項１に記載のライブラリー。
【請求項６】
前記ナノ粒子又は微小粒子が、（ｉ）複数の官能基を含むポリマーから形成されており、前記複数の官能基の２以上がポリインに結合されている、（ｉｉ）１以上の蛍光標識、抗原、抗体、抗体断片、抗体模倣体、ペプチド、タンパク質、核酸、脂質、炭水化物、ビオチン、ストレプトアビジン、アビジン、抗ビオチン、葉酸、葉酸結合タンパク質、ＩｇＧ、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、炭水化物、レクチン、脂質、若しくは核酸に結合されている、及び／又は（ｉｉｉ）ポリマーから形成されており、２以上のポリインが前記ポリマーナノ粒子若しくはポリマー微小粒子の内部に封入されている、のうちの少なくとも１つを満たす請求項５に記載のライブラリー。
【請求項７】
前記ナノ粒子が約２〜約１００ｎｍ、好ましくは約５〜約５０ｎｍ、より好ましくは約５〜約２０ｎｍの直径を有し、前記微小粒子が約１００ｎｍ超約１００μｍ未満の直径を有する請求項５に記載のライブラリー。
【請求項８】
前記ナノ粒子が、ナノボディ、ナノビーズ、ナノロッド、ナノスター、ナノワイヤ、金属ナノ構造体及びカーボンナノチューブからなる群から選択されるか、又は好ましくは金属ナノ粒子である請求項５に記載のライブラリー。
【請求項９】
前記固体支持体が、チップ、又は微小粒子、例えばポリマー微小粒子のうちの少なくとも１つである請求項５に記載のライブラリー。
【請求項１０】
（ｉ）Ｃａｒｂｏｗ２１７２、Ｃａｒｂｏｗ２１４１、Ｃａｒｂｏｗ２１２８、Ｃａｒｂｏｗ２１００、Ｃａｒｂｏｗ２０８６、Ｃａｒｂｏｗ２０６６、Ｃａｒｂｏｗ２０４９、及びＣａｒｂｏｗ２０１７からなる群から選択される１以上のポリインを含む、並びに／又は（ｉｉ）Ｃａｒｂｏｗ２１７２、Ｃａｒｂｏｗ２１４１、Ｃａｒｂｏｗ２１２８、Ｃａｒｂｏｗ２１００、Ｃａｒｂｏｗ２０８６、Ｃａｒｂｏｗ２０６６、Ｃａｒｂｏｗ２０４９、及びＣａｒｂｏｗ２０１７からなる群から選択されるポリインのいずれも含まない、の少なくとも１つを満たす請求項１に記載のライブラリー。
【請求項１１】
前記ポリインが、１０％未満のクロストークで十分に分解された表面増強ラマンピークを有する請求項１から請求項１０のいずれか一項に記載のライブラリー。
【請求項１２】
標識を含む製造品であって、前記標識は、１〜２００の請求項１から請求項１０のいずれか一項に記載のポリインを含む製造品。
【請求項１３】
培養された生細胞をイメージングするためのキットであって、
非特異的に標的化されたポリインと、
小器官標的ポリインと、
スペクトル的にバーコード化されたポリインであって、前記ポリインは、１以上の請求項１から請求項１０のいずれか一項に記載のポリインを含むスペクトル的にバーコード化されたポリインと、
培養された生細胞のイメージングにおいて前記ポリインを使用するための説明書と
を含むキット。
【請求項１４】
粒子であって、
担体と、
請求項１から請求項１０のいずれか一項に記載の少なくとも１つのポリインを含む１以上の標識と
を含む粒子。
【請求項１５】
粒子のアレイであって、
請求項１から請求項１０のいずれか一項に記載の１以上のポリインを含む第１組成物を含む１以上の第１粒子
を含む粒子のアレイ。
【国際調査報告】
2020532497.tif 000084
2020532497.tif 000085
2020532497.tif 000086