(57)【要約】  ＰＣＮＴを発現または分泌する臍帯血または臍帯血由来細胞を有効成分として含む脳神経系疾患を予防または治療するための薬学的組成物、ＰＣＮＴタンパク質のレベルを測定する薬剤を含む脳神経系疾患を診断するための組成物またはキット、ＰＣＮＴタンパク質を利用し、脳神経系疾患診断に必要な情報を分析する方法、及び脳神経系疾患治療剤候補物質をスクリーニングする方法に係わり、一様相によるＰＣＮＴを発現または分泌する臍帯血または臍帯血由来細胞を含む組成物を使用すれば、脳神経系疾患を効果的に予防または治療することができ、またＰＣＮＴタンパク質は、早期に脳神経系疾患を診断し、脳神経系疾患治療剤を開発するための標的として活用することができる。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペリセントリン（ＰＣＮＴ）を発現または分泌する臍帯血または臍帯血由来細胞を有効成分として含む、中枢神経系疾患を予防または治療するための薬学的組成物。
【請求項２】
前記ＰＣＮＴは、配列番号１のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３】
正常個体に比べ、ＰＣＮＴ発現レベルが低減された中枢神経系疾患を予防または治療するためのものであることを特徴とする請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項４】
前記中枢神経系疾患は、脳性マヒ、脳損傷、外傷性脳損傷、虚血性脳損傷、脳震蕩、脳打撲傷、脳卒中、脳梗塞、脳出血、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、脳卒中、痴呆、ルー・ゲーリック病、ピック病、クロイツフェルト・ヤコブ病、筋萎縮性側索硬化症、原発性側索硬化症、退行性運動失調症、多発性硬化症、神経系機能障害、記憶力減退、癲癇、脳炎、プリオン病及び神経病症からなる群から選択されたものであることを特徴とする請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
前記臍帯血は、自家臍帯血または同種異系臍帯血であることを特徴とする請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
前記臍帯血由来細胞は、造血幹細胞であることを特徴とする請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
前記臍帯血由来細胞は、単核球、Ｂ−リンパ球、ＣＤ４ Ｔ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞、ＮＫ細胞、末梢血液単核球細胞、血小板及びリンパ節からなる群から選択されたものであることを特徴とする請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項８】
エリスロポエチン（ＥＰＯ）をさらに含むものであることを特徴とする請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項９】
ペリセントリン（ＰＣＮＴ）タンパク質またはその遺伝子のｍＲＮＡのレベルを測定する薬剤を含む、中枢神経系疾患を診断するための組成物。
【請求項１０】
前記タンパク質を測定する薬剤は、前記ＰＣＮＴタンパク質またはその断片に特異的に結合する抗体であるか、あるいは前記遺伝子のｍＲＮＡレベルを測定する薬剤は、前記ＰＣＮＴタンパク質またはその断片をコーディングする核酸に特異的に結合するプライマーまたはプローブを含むものであることを特徴とする請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記中枢神経系疾患は、脳性マヒ、脳損傷、外傷性脳損傷、虚血性脳損傷、脳震蕩、脳打撲傷、脳卒中、脳梗塞、脳出血、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、脳卒中、痴呆、ルー・ゲーリック病、ピック病、クロイツフェルト・ヤコブ病、筋萎縮性側索硬化症、原発性側索硬化症、退行性運動失調症、多発性硬化症、神経系機能障害、記憶力減退、癲癇、脳炎、プリオン病及び神経病症からなる群から選択されたものであることを特徴とする請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
ペリセントリン（ＰＣＮＴ）タンパク質またはその遺伝子のｍＲＮＡのレベルを測定する薬剤を含む、中枢神経系疾患を診断するためのキット。
【請求項１３】
個体から分離された試料のペリセントリン（ＰＣＮＴ）タンパク質またはその遺伝子の発現量または活性レベルを測定する段階と、
前記測定された発現量または活性レベルを、正常個体から分離された対照試料で測定されたＰＣＮＴタンパク質の発現量または活性レベルと比較する段階と、を含む、中枢神経系疾患診断に必要な情報を分析する方法。
【請求項１４】
前記試料は、血漿であることであることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記測定された発現量または活性レベルが、前記対照試料で測定された発現量または活性レベルより低い場合、中枢神経系疾患があると判断することをさらに含むことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記中枢神経系疾患は、脳性マヒ、脳損傷、外傷性脳損傷、虚血性脳損傷、脳震蕩、脳打撲傷、脳卒中、脳梗塞、脳出血、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、脳卒中、痴呆、ルー・ゲーリック病、ピック病、クロイツフェルト・ヤコブ病、筋萎縮性側索硬化症、原発性側索硬化症、退行性運動失調症、多発性硬化症、神経系機能障害、記憶力減退、癲癇、脳炎、プリオン病及び神経病症からなる群から選択されたことであることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
インビトロで、ペリセントリン（ＰＣＮＴ）タンパク質を発現する細胞と試験物質とを接触させる段階と、
前記細胞において、ＰＣＮＴタンパク質の発現量または活性を測定する段階と、
前記測定されたＰＣＮＴタンパク質の発現量または活性を、対照群で測定された発現量または活性と比較した結果として、ＰＣＮＴタンパク質の発現量または活性を増大させる試験物質を、中枢神経系疾患の治療剤候補物質として選択する段階と、を含む中枢神経系疾患治療剤の候補物質をスクリーニングする方法。
【請求項１８】
前記細胞と試験物質との接触は、前記細胞の成長を維持することができる培地においてなされることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記発現量の測定は、ＰＣＮＴ遺伝子のｍＲＮＡまたはＰＣＮＴタンパク質の量を測定することによってなされることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記中枢神経系疾患は、脳性マヒ、脳損傷、外傷性脳損傷、虚血性脳損傷、脳震蕩、脳打撲傷、脳卒中、脳梗塞、脳出血、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、脳卒中、痴呆、ルー・ゲーリック病、ピック病、クロイツフェルト・ヤコブ病気、筋萎縮性側索硬化症、原発性側索硬化症、退行性運動失調症、多発性硬化症、神経系機能障害、記憶力減退、癲癇、脳炎、プリオン病及び神経病症からなる群から選択されたことであることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＣＮＴを発現または分泌する臍帯血または臍帯血由来細胞を有効成分として含む中枢神経疾患（脳神経系疾患）を予防または治療するための薬学的組成物、ＰＣＮＴタンパク質のレベルを測定する薬剤を含む脳神経系疾患を診断するための組成物またはキット、ＰＣＮＴタンパク質を利用し、脳神経系疾患診断に必要な情報を分析する方法、及び脳神経系疾患治療剤候補物質をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脳神経系は、脳、脊髄、脳神経、脊髄神経、自律神経系などから構成された身体調節システムを意味する。脳神経系疾患は、脳性マヒ、脳損傷、外傷性脳損傷、虚血性脳損傷、脳震蕩、脳打撲傷、脳卒中、脳梗塞、脳出血、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、脳卒中、痴呆、ルー・ゲーリック病、ハンチントン病、ピック（Pick）病、クロイツフェルト・ヤコブ（Creutzfeld−Jakob）病、筋萎縮性側索硬化症、原発性側索硬化症、退行性運動失調症、多発性硬化症、神経系機能障害、記憶力減退、癲癇、脳炎、プリオン病及び神経病症など多様である。脳損傷とは、内的または外的なさまざまな理由で、脳の神経組織に異常が生じ、行動上または機能上で異常をきたす状態を意味する。脳損傷は、開放性頭部損傷、閉鎖性頭部損傷、減速損傷、毒性物質の露出、酸素不足、腫瘍、感染、脳卒中のような脳血管疾患によって発生しうる。
【０００３】
脳性マヒは、１つの疾病ではなく、類似した臨床的特徴を有した症侯群を集合的に表す用語であり、未成熟脳に対する非進行性病変あるいは損傷によって生ずる運動と姿勢との障害を示す臨床症侯群を言う。脳性マヒとは、発達過程中の脳に対する損傷により、筋肉調節能力や、歩行時の姿勢維持などに問題を引き起こす疾患であり、脳損傷は、出生前後や出生途中に主に発生するが、妊娠中にいつでも発生可能であり、甚だしくは、小児期の時にも生じうる。
【０００４】
該脳損傷は、非進行性であるが、経時的に、神経運動障害の様相と、筋骨格系の障害とが変化するので、周期的な診察を介して、変化した臨床様相に最も適するリハビリテーション治療を提供しなければならない。それ以外の他の治療方法があるが、それらを介した画期的で根本的な治療方法がない実情である。
【０００５】
脳性マヒの治療として、脳可塑性の可能性を刺激することにより、潜在的効果を示すことができると報告されており、それは、脳損傷患者において、肯定的な効果を示す。脳可塑性の可能性を刺激するための方法として、細胞治療の方法がある。
【０００６】
韓国登録特許公報第１４０９３３３６号（特許文献１）は、希突起膠前駆細胞の中枢神経系疾患の細胞治療剤としての用途に係わるものであり、Ｏｌｉｇ２遺伝子エンコーディング核酸分子を含む発現ベクターに形質転換された幹細胞である希突起膠前駆細胞を有効成分として含む中枢神経系疾患治療用組成物を開示している。
【０００７】
一方、間葉系幹細胞を含んだ幹細胞を直接移植することになれば、生体内において、分化と生存とに失敗することもあり、定量的な投与が困難であるというう問題点があり、細胞治療剤への使用が困難である。それにより、生体内で拒否反応がなく、運動及び認知の発達に治療効果がある細胞治療剤の開発が必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】韓国登録特許公報第１４０９３３３６号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そのために、本発明者らは、脳神経系疾患の細胞治療剤として、臍帯血を研究している中で、脳神経系疾患の治療または診断のための標的タンパク質としてのＰＣＮＴタンパク質を確認し、本発明を完成した。
【００１０】
一様相は、ぺりせんとりん（ＰＣＮＴ）を発現または分泌する臍帯血または臍帯血由来細胞を有効成分として含む脳神経系疾患を予防または治療するための薬学的組成物を提供する。
【００１１】
他の様相は、ＰＣＮＴタンパク質またはその遺伝子のｍＲＮＡのレベルを測定する薬剤を含む脳神経系疾患を診断するための組成物またはキットを提供する。
【００１２】
他の様相は、個体から分離された試料のＰＣＮＴタンパク質またはその遺伝子の発現量または活性レベルを測定する段階と、前記測定された発現量または活性レベルを、正常個体から分離された対照群試料で測定されたＰＣＮＴタンパク質の発現量または活性レベルと比較する段階と、を含む、脳神経系疾患診断に必要な情報を分析する方法を提供する。
【００１３】
他の様相は、インビトロで、ＰＣＮＴタンパク質を発現する細胞と試験物質とを接触させる段階と、前記細胞において、ＰＣＮＴタンパク質の発現量または活性を測定する段階と、前記測定されたＰＣＮＴタンパク質の発現量または活性を、対照群で測定された発現量または活性と比較し、対照群に比べ、発現量または活性を増大させる試験物質を、脳神経系疾患治療剤候補物質として選択する段階と、を含む脳神経系疾患治療剤候補物質をスクリーニングする方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
一様相は、ＰＣＮＴを発現または分泌する臍帯血または臍帯血由来細胞を有効成分として含む脳神経系疾患を予防または治療するための薬学的組成物を提供する。
【００１５】
他の様相は、ＰＣＮＴタンパク質またはその活性断片を有効成分として含む脳神経系疾患を予防または治療するための薬学的組成物を提供する。
【発明の効果】
【００１６】
一様相によるＰＣＮＴを発現または分泌する臍帯血または臍帯血由来細胞を含む組成物を使用すれば、脳神経系疾患を効果的に予防または治療することができる。また、ＰＣＮＴタンパク質は、早期に脳神経系疾患を診断し、脳神経系疾患治療剤を開発するための標的に活用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１Ａは、臍帯血施術の前（Ｐｒｅ）と該施術１０日後（Ｐｏｓｔ＋１０ｄａｙｓ）との血漿内タンパク質の変化を確認するための二次元ゲル電気泳動結果であり、実験１（４番，９番及び１０番患児のサンプル分析）の結果である。図１Ｂは、臍帯血施術の前（Ｐｒｅ）と該施術１０日後（Ｐｏｓｔ＋１０ｄａｙｓ）との血漿内タンパク質の変化を確認するための二次元ゲル電気泳動結果であり、実験２（６番，７番及び８番患児のサンプル分析）の結果である。
【図２】１３名の脳性マヒ患児の血漿に対して、臍帯血施術の前（Ｐｒｅ）と後（Ｐｏｓｔ）とのＰＣＮＴ発現を確認したウェスタンブロット結果である。
【図３】図２に示された全ての患児の結果を合算し、臍帯血施術前後のＰＣＮＴ発現量の変化を示したグラフである。
【図４】脳性マヒ誘発鼠モデルにおいて、臍帯血単核球（ＵＣＢ）投与後、ＰＣＮＴ発現量をそれぞれ４回繰り返して確認した結果を示した図面である。比較群として、ＥＰＯを投与したモデルを使用した。
【図５】脳性マヒを誘発していないシャム（Sham）モデルに臍帯血を投与していないときを基準にし、図４のＰＣＮＴ発現変化量を％に換算して示したグラフである。
【図６】図６Ａは、臍帯血（ＵＣＢ）血漿、正常人血漿、脳性マヒ患児血漿のサンプルにおけるＰＣＮＴ発現量を示した図面である。図６Ｂは、臍帯血１番サンプルを基準にし、臍帯血（ＵＣＢ）血漿、正常人血漿、脳性マヒ患児血漿のサンプルにおけるＰＣＮＴの相対的な発現量（％）を示したグラフである。
【図７】臍帯血内に存在する成分である血清（Serum）、血漿（Plasma）、単核球（Monocyte）、好中球（Neutrophil）、Ｂ−リンパ球（Ｂ−lymphocyte）、Ｔ−リンパ球（Ｔ−lymphocyte）、ＣＤ４ Ｔ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞、ＮＫ細胞、末梢血液単核球細胞（Peripheral blood mononuclear cell）、血小板（Platelet）、リンパ節（Lymph node）、扁桃腺（Tonsil）、骨髄間質細胞（Bone marrow stromal cell）及び骨髄間葉系幹細胞（Bone marrow mesenchymal stem cell）それぞれのＰＣＮＴ発現量（Ｌｏｇ１０，ｐｐｍ）を示したグラフである。
【図８】５番，１１番及び１３番脳性マヒ患児に対する臍帯血施術前（ＧＭＦＣＳ＿ｐｒｅ）及び該施術後（ＧＭＦＣＳ＿ｐｏｓｔ）のＧＭＦＣＳ評価結果（総ＧＭＦＣＳ（％））を示したグラフである。
【図９】５番，１１番及び１３番脳性マヒ患児に対する臍帯血施術前（ＢＳＩＤ＿Ｍｏｔｏｒ＿ｐｒｅ）及び該施術後（ＢＳＩＤ＿Ｍｏｔｏｒ＿ｐｏｓｔ）のBayley乳幼児発達検査の行動発達領域評価結果（ＢＳＩＤ ＩＩ motor）を示したグラフである。
【図１０】５番，１１番及び１３番脳性マヒ患児に対する臍帯血施術前（ＢＳＩＤ＿Ｍｅｎｔａｌ＿ｐｒｅ）及び該施術後（ＢＳＩＤ＿Ｍｅｎｔａｌ＿ｐｏｓｔ）のBayley乳幼児発達検査の精神発達領域評価結果（ＢＳＩＤ ＩＩ mental）を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
用語「ペリセントリン（ＰＣＮＴ：pericentrin）」は、カルモジュリン（calmodulin）と結合されるタンパク質であり、中心体（centrosome）で発現され、中心小体と共に中心体をなすタンパク質を意味する。ＰＣＮＴタンパク質は、細胞分裂時、重要な役割を行うと知られており（Liu Q et al., Aug 2010, Cell Research. 20 (8): 948-62）、このタンパク質の異常による精神に係わる疾患が報告されている（Unal S et al., Feb 2014, Pediatric Blood & Cancer. 61 (2): 302-5）。前記ＰＣＮＴタンパク質は、臍帯血において、正常人血漿対比で、高い発現レベルを示し、脳性マヒ患者において、正常人血漿対比で、低い発現レベルを示すということを確認した。また、ＰＣＮＴタンパク質は、臍帯血細胞治療を施術された脳性マヒ患者において、施術受け前対比で、高い発現レベルを示すということを確認した。このような結果は、ＰＣＮＴタンパク質が、脳性マヒのような脳神経系疾患を診断するための診断マーカーとしても使用されるという点を示唆するだけでなく、ＰＣＮＴタンパク質が、脳神経系疾患の予防または治療に関与するという点を示唆する。従って、ＰＣＮＴタンパク質の発現率が高い臍帯血または臍帯血由来細胞は、脳神経系疾患を予防または治療するために使用されるであろう。
【００１９】
前記ＰＣＮＴタンパク質は、臍帯血または臍帯血由来細胞から分泌するものでもある。また、前記ＰＣＮＴタンパク質は、哺乳動物に由来したものでもあり、例えば、ヒト、猿または齧歯類に由来したものでもある。一具体例において、前記ＰＣＮＴは、配列番号１のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ Accession Ｎｏ．ＸＰ＿００５２６１１８１）からなるものでもある。
【００２０】
一具体例において、前記脳神経系疾患は、正常に比べ、ＰＣＮＴ発現が低減された脳神経系疾患でもある。他の具体例において、前記脳神経系疾患は、脳神経系を構成する脳、脊髄、脳神経、脊髄神経、自律神経系などのうち一部または全部に、異常や障害が発生した疾患をいずれも含む。他の具体例において、前記脳神経系疾患は、脳損傷疾患でもある。他の具体例において、前記脳神経系疾患は、神経損傷疾患でもある。他の具体例において、前記脳神経系疾患は、脳性マヒ、脳損傷、外傷性脳損傷（traumatic brain injury）、虚血性脳損傷、脳震蕩（concussion）、脳打撲傷（brain contusion）、脳卒中、脳梗塞、脳出血、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、脳卒中、痴呆、ルー・ゲーリック病、ハンチントン病、ピック（Pick）病、クロイツフェルト・ヤコブ（Creutzfeld−Jakob）病気、筋萎縮性側索硬化症、原発性側索硬化症、退行性運動失調症、多発性硬化症、神経系機能障害、記憶力減退、癲癇、脳炎、プリオン病及び神経病症からなる群からも選択されるが、それらに限定されるものではない。他の具体例において、前記脳神経系疾患は、脳性マヒでもある。
【００２１】
用語「脳性マヒ（cerebralpalsy）」とは、未成熟脳に、出生時または出生後、さまざまな原因因子により、非進行性病変や損傷が発生し、臨床的に運動と姿勢との障害を示すことになる疾患を意味する。
【００２２】
用語「臍帯血（cord blood）」は、胎盤内や臍帯内の血液を意味する。該臍帯血は、血液成分である白血球、赤血球、血小板などを作る造血幹細胞（hematopoietic stem cell）と、軟骨、骨、脂肪、筋肉、神経などを作る多様な幹細胞とを多量に含んでいる。用語「幹細胞（stem cell）」とは、原始段階の細胞であり、いかなる器官にも転換される未分化細胞であり、その種類は、胚芽幹細胞（embryonic stem cell）及び成体幹細胞（adult stem cell）を含んでもよい。臍帯血由来幹細胞は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ：mesenchymal stem cell）のような成体幹細胞でもある。該臍帯血は、出産後、臍帯から分離されて得られる。前記臍帯血は、赤血球及び血漿を除外した白血球濃縮液を使用することができる。前記臍帯血の白血球濃縮液は、造血幹細胞、単核球、好中球、Ｂ−リンパ球、Ｔ−リンパ球、ＣＤ４ Ｔ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞、ＮＫ細胞、末梢血液単核球細胞（ＰＢＭＣ：peripheral blood mononuclear cell：ＰＢＭＣ）、血小板、リンパ節、扁桃腺、骨髄間質細胞（bone marrow stromal cell）、骨髄間葉系幹細胞（bone marrow mesenchymal stem cell）など多様な臍帯血由来細胞を含んでもよい。
【００２３】
一具体例において、前記臍帯血は、自家（autologous）臍帯血または同種異系（allogeneic）臍帯血でもある。前記同種異系臍帯血は、兄弟、親など家族の臍帯血を使用することができる。
【００２４】
一具体例において、前記臍帯血由来細胞は、造血幹細胞でもある。他の具体例において、前記臍帯血由来細胞は、ＰＣＮＴを発現または分泌する細胞でもある。他の具体例において、前記臍帯血由来細胞は、単核球、Ｂ−リンパ球、ＣＤ４ Ｔ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞、ＮＫ細胞、末梢血液単核球細胞、血小板及びリンパ節からなる群から選択されたものでもあるが、それらに限定されるものではない。他の具体例において、前記臍帯血由来細胞は、末梢血液単核球細胞でもある。他の具体例において、前記臍帯血由来細胞は、ＰＣＮＴを発現または分泌したり、発現または分泌が増大したりするように遺伝的に操作されたものでもある。
【００２５】
前記薬学的組成物は、エリスロポエチン（ＥＰＯ：erythropoietin）をさらに含んでもよい。前記エリスロポエチンは、骨髄での赤血球生産を調節するホルモンでもある。エリスロポエチンを、臍帯血または臍帯血由来細胞と複合投与する場合、臍帯血の治療効果が増進され、患者の運動機能及び認知機能が一層さらに向上することができる。
【００２６】
用語「治療」は、疾患、障害または病態、またはその１以上の症状の軽減、進行抑制または予防を指称するか、あるいはそれを含み、「有効成分」または「薬剤学的有効量」は、疾患、障害または病態、またはその１以上の症状の軽減、進行抑制または予防に十分な、本願で提供される発明を実施する過程で利用される組成物の任意量を意味する。
【００２７】
用語「投与する」、「投入する」及び「移植する」は、相互交換的に使用され、一具体例による組成物の所望部位への、少なくとも部分的局所化をもたらす方法または経路による個体内への、一具体例による組成物の配置を意味する。一具体例による組成物の細胞、細胞成分の少なくとも一部、または細胞由来分泌成分を、生存する個体内において、所望位置に伝達する任意の適切な経路によっても投与される。個体投与後細胞の生存期間は、短ければ、数時間、例えば、２４時間ないし数日、あるいは長ければ、数年でもある。
【００２８】
前記薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体または希釈剤をさらに含んでもよい。薬学的に許容可能な担体または希釈剤は、当業界に公知のものでもある。前述の担体または希釈剤は、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水（例えば、食塩水及び滅菌水）、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム、ミネラルオイル、リンゲル液、緩衝剤、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール、デキストラン、アルブミン、またはそれらの任意の組み合わせでもある。前記薬学的組成物は、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁液剤または保存剤をさらに含んでもよい。
【００２９】
前記薬学的組成物は、当業者に公知の方法によって、薬剤学的に許容される担体及び／または賦形剤を利用して製剤化することにより、単位容量形態に製造されるか、あるいは多容量容器内に込めても製造される。このとき、剤形は、オイル中または水性溶媒中の溶液、懸濁液、シロップ剤または乳化液形態であるか、あるいはエキス剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤の形態でもあり、分散剤または安定化剤を追加的に含んでもよい。前記水性溶媒は、生理食塩水またはＰＢＳを含むものでもある。一具体例による前記薬学的組成物は、経口または非経口の投与形態、望ましくは、非経口投与形態でも製剤化される。筋肉内、腹腔内、皮下及び静脈内への投与形態の場合、一般的に活性成分の滅菌溶液を製造し、溶液のｐＨを適切に調節することができる緩衝剤を含んでもよく、静脈内投与の場合、製剤に等張性が付与されるように、等張化剤を含んでもよい。
【００３０】
一具体例による薬学的組成物は、臍帯血由来細胞を有核細胞数１ｘ１０７／ｋｇ以上、具体的には、２ｘ１０７／ｋｇ以上、３ｘ１０７／ｋｇ以上、または３ｘ１０７／ｋｇないし１０ｘ１０７／ｋｇ、例えば、３ｘ１０７／ｋｇないし５ｘ１０７／ｋｇに含んでもよい。
【００３１】
一具体例による薬学的組成物の投与量（有効量）は、１日約０．０１ないし２００ｍｌ、具体的には、約０．０１ないし１５０ｍｌ、約０．０１ないし１００ｍｌ、約０．１ないし１５０ｍｌ、約０．１ないし１００ｍｌ、約１ないし１００ｍｌ、約１ないし５０ｍｌ、約５ないし５０ｍｌ、または約１０ないし４０ｍｌ、例えば、１５ないし３０ｍｌでもある。必要な場合、前記臍帯血は、適切に濃縮して投与することにより、全体投与量を減少させることもできる。ただし、投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢・体重・性別・病的状態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度、及び反応感応性のような要因によっても多様に処方され、当業者であるならば、そのような要因を考慮し、投与量を適切に調節することができる。投与回数は、１日１回、または臨床的に容認可能な副作用の範囲内において、２回以上が可能であり、投与部位についても、１ヵ所または２ヵ所以上に投与することができ、毎日、または２日ないし５日間隔で、総投与日数は、１回の治療時、１日から３０日まで投与される。必要な場合、適正時期後、同一治療を反復することができる。ヒト以外の動物についても、ｋｇ当たりヒトと同一投与量にするか、あるいは、例えば、目的の動物とヒトとの器官（心臓など）の容積比（例えば、平均値）などにより、前述の投与量を換算した量を投与することができる。可能な投与経路には、非経口（例えば、皮下、筋肉内、動脈内、腹腔内、硬膜内または静脈内）、局所（経皮含む）、及び注射または移植性装置、または物質の挿入を含んでもよい。一具体例による治療の対象動物としては、ヒト、及びそれ以外の目的とする哺乳動物を例として挙げることができ、具体的には、ヒト、猿、マウス、ラット、兎、羊、牛、犬、馬、豚などが含まれる。
【００３２】
他の様相は、ＰＣＮＴタンパク質またはその遺伝子のｍＲＮＡのレベルを測定する薬剤を含む脳神経系疾患を診断するための組成物またはキットを提供する。
【００３３】
ＰＣＮＴタンパク質及び脳神経系疾患は、前述の通りである。
【００３４】
一実施例において、ＰＣＮＴタンパク質は、脳性マヒ患者において、正常人血漿対比で、低い発現レベルを示すということを確認した。従って、ＰＣＮＴタンパク質の発現や活性レベルを測定し、正常人由来サンプルと比較することにより、脳性マヒのような脳神経系疾患の発病または進行のいかんを診断することができる。それにより、ＰＣＮＴタンパク質は、脳神経系疾患、例えば、脳性マヒの診断マーカーでもある。
【００３５】
用語「診断」は、病理状態の存在または特徴を確認することを意味する。従って、前記「脳神経系疾患の診断」とは、脳神経系疾患の発病いかんまたは発病可能性を確認したり、発病の危険を予測したりすることを意味する。
【００３６】
用語「診断マーカー（diagnosis marker）」は、前記脳神経系疾患の発病いかんまたは発病可能性を診断することができる物質を意味する。
【００３７】
前記タンパク質を測定する薬剤は、前記ＰＣＮＴタンパク質またはその断片に特異的に結合する抗体でもある。
【００３８】
前記遺伝子のｍＲＮＡレベルを測定する薬剤は、前記ＰＣＮＴタンパク質またはその断片をコーディングする核酸に特異的に結合するプライマーまたはプローブを含んでもよい。
【００３９】
公知されたアミノ酸配列を有するＰＣＮＴタンパク質から、それに特異的に結合する抗体を製造することは、当業者が公知された方法を利用し、容易に遂行することができるものである。ＰＣＮＴタンパク質またはその断片に特異的に結合する抗体は、単一クローン抗体、多重クローン抗体及び組み換え抗体を含んでもよく、２個の重鎖と、２個の軽鎖との全体長を有する完全な形態以外にも、少なくとも抗原結合機能を保有する機能性断片であるＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖなどを含んでもよい。
【００４０】
また、当業者であるならば、公知されたＰＣＮＴ遺伝子の配列から、特定領域を特異的に増幅したり認識したりするプライマーまたはプローブを設計することができるのである。
【００４１】
用語「プライマー」とは、短い自由３末端水酸化基（free ３’ hydroxyl group）を有する核酸配列であり、相補的なテンプレート（template）と塩基対（base pair）とを形成することができ、テンプレート鎖複製のための開始地点として機能する７個ないし５０個の核酸配列を意味する。該プライマーは、普通合成するものの、自然に生成された核酸から利用することもできる。該プライマーの配列は、必ずしもテンプレートの配列と正確に同じである必要はなく、十分に相補的であるので、テンプレートと混成化されるものであればよい。該プライマーは、適切な緩衝溶液及び温度において、重合反応（すなわち、ＤＮＡポリメラーゼ（polymerase）または逆転写酵素（reverse transcriptase）のための試薬、及び異なる４種ヌクレオシド三リン酸（nucleoside triphosphate）の存在下で、ＤＮＡ合成を開示することができる。ＰＣＲ条件、センス及びアンチセンスプライマーの長さは、当業界に公知されたところを基に変形することができる。従って、ＰＣＮＴ遺伝子のヌクレオチド配列部位のセンス（sense）プライマー及びアンチセンス（antisense）プライマーを利用し、ＰＣＲ増幅を実施し、脳神経系疾患を診断することができる。
【００４２】
用語「プローブ」とは、ｍＲＮＡと特異的結合をなすことができる、短くは、数塩基、あるいは長くは、数百塩基に該当するＲＮＡまたはＤＮＡなどの核酸断片を意味し、ラベリング（labeling）されており、特定ｍＲＮＡの存在有無を確認することができる。該プローブは、オリゴヌクレオチド（oligonucleotide）プローブ、単鎖ＤＮＡ（single stranded ＤＮＡ）プローブ、二重鎖ＤＮＡ（double stranded ＤＮＡ）プローブ、ＲＮＡプローブなどの形態にも作製される。適切なプローブの選択及び混成化条件は、当業界に公知されたところを基に変形することができる。従って、ＰＣＮＴ遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なプローブを利用して混成化を実施し、混成化いかんを介して、脳神経系疾患を診断することができる。
【００４３】
前述のプライマーまたはプローブは、ホスホロアミダイト（phosphoramidite）固体支持体方法、またはその他広く公知された方法を使用し、化学的に合成することができる。そのような核酸配列は、基本性質を変化させない追加的な特徴を混入させることができる。混入させることができる追加的特徴の例として、メチル化、キャップ化、１以上の核酸の同族体への置換、及び核酸間の変形などがあるが、それらに制限されるものではない。
【００４４】
前記キットは、ＲＴ−ＰＣＲキット、マイクロアレイチップキットまたはタンパク質チップキットでもある。
【００４５】
前記キットは、分析方法に適する１以上の他の構成成分をさらに含んでもよい。該分析方法が、ＲＴ−ＰＣＲである場合、前記キットは、ＰＣＮＴタンパク質に特異的なプライマーセット以外に、必要な容器、反応緩衝液、デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）、ＰＣＲ用ＤＮＡポリメラーゼ及び逆転写酵素などをさらに含んでもよい。また、分析方法がＥＬＩＳＡである場合、結合された抗体検出用試薬、例えば、二次抗体、発色団、酵素及びその基質をさらに含んでもよい。
【００４６】
他の様相は、個体から分離された試料のＰＣＮＴタンパク質またはその遺伝子の発現量または活性レベルを測定する段階と、前記測定された発現量または活性レベルを、正常個体から分離された対照群試料で測定されたＰＣＮＴタンパク質の発現量または活性レベルと比較する段階と、を含む、脳神経系疾患診断に必要な情報を分析する方法を提供する。
【００４７】
ＰＣＮＴタンパク質及び脳神経系疾患は、前述の通りである。
【００４８】
前記方法は、個体から分離された試料のＰＣＮＴタンパク質またはその遺伝子の発現量または活性レベルを測定する段階を含む。
【００４９】
用語「個体」とは、脳神経系疾患の発病いかんまたは発病可能性を確認したり、発病危険度を予測したりしようとする個体を意味する。前記個体は、脳神経系疾患が発病する動物であるならば、その種類を限定するものではないが、具体的には、哺乳動物でもあり、例えば、ヒト（Homo sapiens）でもある。
【００５０】
前記試料は、個体の体外に分離された組織、細胞、全血、血清、血漿、唾液、喀痰、脳脊髄樺液、尿のような試料などを含んでもよいが、それらに限定されるものではない。一具体例において、前記試料は、血漿でもある。
【００５１】
前記ＰＣＮＴタンパク質またはその遺伝子の発現量を測定する段階は、ＰＣＮＴ遺伝子のｍＲＮＡ、またはＰＣＮＴタンパク質の量を測定することによっても遂行される。
【００５２】
前記ＰＣＮＴタンパク質の発現量、すなわち、ｍＲＮＡレベルを測定する段階は、ＲＴ−ＰＣＲ、競争的ＲＴ−ＰＣＲ（competitive ＲＴ−ＰＣＲ）、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（real-time ＲＴ−ＰＣＲ）、ＲＮａｓｅ保護分析法（ＲＰＡ：ＲＮase protection assay）、ノーザンブロッティング（Northern blotting）、ＤＮＡチップなどの方法によっても遂行されるが、それらに限定されるものではない。
【００５３】
前記ＰＣＮＴタンパク質の活性レベルを測定する段階は、ウェスタンブロッティング、磁石ビード・抗体免疫沈降法、ＥＬＩＳＡ、質量分析器、放射線免疫分析法、免疫沈澱法などの方法によっても遂行されるが、それらに限定されるものではない。
【００５４】
前記方法は、試料で測定された発現量または活性レベルを、正常個体から分離された対照群試料で測定されたＰＣＮＴタンパク質の発現量または活性レベルと比較する段階を含む。試料でのＰＣＮＴタンパク質の発現または活性レベルが、正常個体から分離された対照群試料のレベルよりさらに低ければ、前記試料は、脳神経系疾患が発病するか、あるいは進行する確率が高いと判断することができる。従って、前記方法は、前記測定された発現量または活性レベルが、前記対照群試料で測定された発現量または活性レベルより低い場合、脳神経系疾患があると判断することを含んでもよい。
【００５５】
他の様相は、インビトロで、ＰＣＮＴタンパク質を発現する細胞と試験物質とを接触させる段階と、前記細胞において、ＰＣＮＴタンパク質の発現量または活性を測定する段階と、前記測定されたＰＣＮＴタンパク質の発現量または活性を、対照群で測定された発現量または活性と比較し、対照群に比べ、発現量または活性を増大させる試験物質を、脳神経系疾患治療剤候補物質として選択する段階と、を含む脳神経系疾患治療剤候補物質をスクリーニングする方法を提供する。
【００５６】
ＰＣＮＴタンパク質及び脳神経系疾患は、前述の通りである。
【００５７】
ＰＣＮＴタンパク質は、臍帯血細胞治療を施術された脳性マヒ患者において、施術受け前対比で、高い発現レベルを示すということを確認し、それにより、脳性マヒの好転効果を確認した。従って、ＰＣＮＴタンパク質の発現や活性を特異的に増大させる物質は、脳性マヒのような脳神経系疾患の治療効果を発揮することができる。そのような効果は、ＰＣＮＴタンパク質またはその遺伝子が、脳性マヒのような脳神経系疾患治療の標的ということを示す。
【００５８】
前記方法は、インインビトロで、ＰＣＮＴタンパク質を発現する細胞と試験物質とを接触させる段階を含む。
【００５９】
前記ＰＣＮＴタンパク質を発現する細胞は、例えば、血液細胞、脳細胞などでもあるが、その種類を制限するものではない。
【００６０】
前記試験物質との接触は、試験物質の形質感染、形質転換または注入によって行われてもよいる。
【００６１】
前記試験物質との接触は、前記細胞の成長を維持することができる培地中でなされる。
【００６２】
前記方法は、細胞において、ＰＣＮＴタンパク質の発現量または活性を測定する段階を含む。
【００６３】
前記測定は、ＰＣＮＴタンパク質またはその断片を特異的に認識する抗体、またはＰＣＮＴタンパク質またはその断片をコーディングする核酸を特異的に認識するプライマーまたはプローブによっても行われる。
【００６４】
前記発現量の測定は、ＰＣＮＴ遺伝子のｍＲＮＡまたはＰＣＮＴタンパク質の量を測定することによっても行われる。
【００６５】
前記ｍＲＮＡの量は、ＲＴ−ＰＣＲ、競争的ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮａｓｅ保護分析法（ＲＰＡ）、ノーザンブロッティングまたはＤＮＡチップによって測定することができるが、その種類を制限するものではない。
【００６６】
前記タンパク質の量は、ウェスタンブロッティング、磁石ビード・抗体免疫沈降法、ＥＬＩＳＡ、質量分析器放射線免疫分析法または免疫沈澱法によって測定することができるが、その種類を制限するものではない。
【００６７】
前記方法は、測定されたＰＣＮＴタンパク質の発現量または活性を、対照群で測定された発現量または活性と比較し、対照群に比べ、発現量または活性を増大させる試験物質を、脳神経系疾患治療剤候補物質として選択する段階を含む。
【００６８】
試験物質の処理後、ＰＣＮＴタンパク質の発現または活性レベルがさらに増大された場合、前記試験物質をＰＣＮＴタンパク質の発現や活性を増大させ、脳神経系疾患の治療のために使用される物質としても選別される。
【００６９】
前記対照群は、前記試験物質と接触させる段階を除いては、等しい条件にある細胞である。
【００７０】
以下、本発明について、実施例を介してさらに詳細に説明する。しかし、それら実施例は、本発明について例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲は、それら実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００７１】
実施例１：臍帯血施術後、発現レベルが変化したタンパク質スクリーニング
臍帯血細胞治療を受けた脳性マヒ患児の施術前後の血液を採取し、血漿内に存在する特定タンパク質の変化を観察した。該臍帯血細胞治療において、臍帯血は、赤血球と血漿とを除去し、白血球濃縮液を作り、冷凍保管されたものを使用した。冷凍保管された白血球濃縮液は、施術前、３７℃ウォーターバス（water bath）で解凍した後、それを、１０％デキストラン（dextran）４０（１００ｇデキストラン４０／１ｌ水）及び５％アルブミン（５０ｇアルブミン／１ｌ水）を同量で希釈した溶液で洗浄した。洗浄を終えた白血球濃縮液は、１０％デキストラン４０及び５％アルブミンを同量で希釈した混合液１０ｍｌに、最小総有核細胞数が、３ｘ１０７／ｋｇになるように懸濁した後、静脈内注射で、１５ｍｌから３０ｍｌの投与量を投与した。
【００７２】
１−１．スクリーニングに使用する血漿サンプルの準備
表１は、血漿内タンパク質をスクリーニングするために選別された脳性マヒ患児の診断名及び臍帯血施術いかんを示した表である。表１に示された脳性マヒ患児の血液１〜３ｃｃほどをＥＤＴＡチューブに採取し、２，０００ｒｐｍの速度で遠心分離を行った。このとき、血液の層が、最下側に、赤血球、中層に、単核球、最上層に、血漿と分けられ、そのように分けられた血液から血漿のみを分離し、−８０℃超低温冷凍庫で冷凍保管した。
【００７３】
【表１】
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【００７４】
１−２．臍帯血細胞治療前後の血漿内タンパク質のスクリーニング
前記実施例１−１で分離した血漿内に存在している特定タンパク質の変化を確認するために、二次元ゲル電気泳動（２ＤＥ：２−dimensional gel electrophoresis）技法を使用した。準備したサンプルに対する２ＤＥ技法、イメージ分析及び定性分析は、延世大学校内延世プロテオーム研究院を介して進めた。
【００７５】
表１の１０名の脳性マヒ患児中、臍帯血施術を受けた後で好転を示した６名、すなわち、４番，６番，７番，８番，９番及び１０番患児を選別して実験を進めた。
【００７６】
表２は、臍帯血施術を受けた後で好転を示した６名患児の血漿内タンパク質のスクリーニングのための実験サンプルに係わる情報である。実験１においては、臍帯血治療前、血漿に、４番，９番及び１０番患児の血漿を混ぜた混合物を使用し、臍帯血治療１０日後、血漿として４番患児の血漿をサンプルとして使用して分析した。実験２においては、臍帯血治療前、血漿に６番，７番及び８番患児の血漿を混ぜた混合物を使用し、臍帯血治療１０日後、血漿として、６番患児の血漿をサンプルで使用して分析した。
【００７７】
【表２】
2020505344.tif 000004
【００７８】
図１Ａは、臍帯血施術前（Ｐｒｅ）と該施術１０日後（Ｐｏｓｔ＋１０ｄａｙｓ）との血漿内タンパク質の変化を確認するための二次元ゲル電気泳動結果であり、実験１（４番，９番及び１０番患児のサンプル分析）の結果である。図１Ｂは、臍帯血施術前（Ｐｒｅ）と該施術１０日後（Ｐｏｓｔ＋１０ｄａｙｓ）との血漿内タンパク質の変化を確認するための二次元ゲル電気泳動結果であり、実験２（６番，７番及び８番患児のサンプル分析）の結果である。横軸は、ｐＨ、縦軸は、タンパク質サイズを示す。
【００７９】
表３は、２ＤＥ結果により、それぞれのタンパク質を定性分析した結果、臍帯血施術後に好転を示した患児の血漿内において、３倍以上増加すると見られるタンパク質を示したものである。アルファ−２−マクログロブリンアイソフォームの場合、２個の点で示されるものと見られ、一般的に血漿内に存在するタンパク質で実験を進めるとき、サンプルにおいて完璧に濾過されないと見られる。６２６点の結果で出たタンパク質は、フィブリノーゲンに結合する断片（fragment）と見られ、それも、血漿内フィブリノーゲン除去がなされずに示された結果と見られる。従って、ペリセントリン（ＰＣＮＴ）が、臍帯血施術後に血漿内で増加する特定タンパク質であるということを確認した。
【００８０】
【表３】
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【００８１】
実施例２：臍帯血施術を受けた脳性マヒ患児でＰＣＮＴ発現確認
２−１．脳性マヒ患児の血漿サンプル準備
表４は、臨床脳性マヒ患児の名簿、施術した臍帯血の種類、及びエリスロポエチン（ＥＰＯ：erythropoietin）の注入いかんに係わる情報を示した表である。同種異系臍帯血は、兄弟や家族の臍帯血を使用した。表４に示した総１３名の脳性マヒ患児の血液を分離し、血漿のみを採取した。採取した血漿は、ＰＢＳ（phosphate-buffered saline）で５：１に希釈し、ブラッドフォード法（Bradford assay）で定量した。定量したタンパク質は、３０μｇをサンプルバッファに混ぜ、７分間煮沸した後、スピンダウン（spin down）して準備した。
【００８２】
【表４】
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【００８３】
２−２．臍帯血施術後、ＰＣＮＴタンパク質の発現確認
臍帯血施術後、ＰＣＮＴタンパク質の発現をウェスタンブロット（Western blot）技法で確認した。
【００８４】
まず、前記実施例２−１で準備した血漿サンプルを、８％ ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（polyacrylamide gel）に、臍帯血施術前後の順序通り分注して落とした。ゲルに落とされたタンパク質を、ニトロセルロース（ＮＣ；nitrocellulose）メンブレンに移し、ＰＣＮＴ抗体と１６時間以上反応させた後、臍帯血施術前後のＰＣＮＴ発現量をバンドで確認した。
【００８５】
図２は、１３名の脳性マヒ患児の血漿に対し、臍帯血施術前（Ｐｒｅ）とその後（Ｐｏｓｔ）とのＰＣＮＴ発現を確認したウェスタンブロット結果である。
【００８６】
図２に示されているように、各サンプルの施術前後の日付差があるが、臍帯血の種類差なしに、全般的に臍帯血施術後、ＰＣＮＴ量が増えることを確認することができた。
【００８７】
図３は、図２に示された全ての患児の結果を合算し、臍帯血施術前後のＰＣＮＴ発現量の変化を示したグラフである。
【００８８】
図３に示されているように、臍帯血施術後、３日または１０日が経ったとき、ＰＣＮＴ発現量が増加することを確認し、結果に有意性があった。
【００８９】
従って、脳性マヒ患児に臍帯血施術を施したとき、ＰＣＮＴ発現量が大きく増加することを確認することができた。
【００９０】
実施例３：脳神経系疾患動物モデルでのＰＣＮＴ変化の確認
３−１．脳性マヒ誘発鼠モデルの作製
生後７日目になるＩＣＲ鼠を利用し、脳性マヒ誘発鼠モデルである低酵素虚血（ＨＩ：hypoxic ischemia）モデルを作製した。生後７日目になるＩＣＲ鼠の右側総頚動脈を、５−０ブルーナイロン（blue nylon）を利用して縛った後、Ｏ２ ８％、Ｎ２ ９２％に維持される密閉された特殊容器に入れ、３７℃に維持した後、１時間低酸素・脳虚血を誘導した。ＨＩモデルを作製した後、６日後、脳組織の損傷程度を目で確認し、５０％以上損傷されたモデルは除外した。
【００９１】
３−２．脳性マヒ誘発鼠モデルに対する臍帯血投与
臍帯血は、車病院臍帯血銀行アイコード（icord）から寄贈された研究用臍帯血を使用した。該研究用臍帯血は、２，２００ｒｐｍで遠心分離し、赤血球、単核球層、血漿に分離した後、血漿は別途に保管し、フィコール（Ficoll，Pharmacia Corp.，米国）を利用し、単核球層のみを分離した。具体的には、フィコール上に、血漿を除いた赤血球と単核球層とを、ＰＢＳに希釈して載せた後、２，２００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。フィコールの原理により、フィコールより重い赤血球は、下に沈み、フィコール真上に単核球層が分離される。分離された単核球層のみを別途に移した後、４Ｘ１０５cells／１０ｇ濃度を１００μｌサリン（saline）に溶かした。準備した臍帯血単核球は、脳性マヒ誘発鼠モデルを作製した後、７日目になるモデルにランダムに腹腔投与した。
【００９２】
３−３．脳組織内でのＰＣＮＴ発現変化確認
臍 帯血単核球を投与して一週間が経った脳性マヒ誘発鼠モデルに対し、血液を除去して死亡させた後、脳組織を摘出した。摘出した脳組織を、溶解バッファ（lysis buffer）を使用し、破砕した後、遠心分離し、タンパク質を分離した。分離したタンパク質３０μｇに対して、ウェスタンブロット（Western blot）技法で、ＰＣＮＴの変化した発現量を確認した。
【００９３】
図４は、脳性マヒ誘発鼠モデルにおいて、臍帯血単核球（ＵＣＢ）投与後、ＰＣＮＴ発現量をそれぞれ４回反復して確認した結果を示した図面である。比較群として、ＥＰＯを投与したモデルを使用した。
【００９４】
図４に示されているように、臍帯血投与を受けた脳性マヒ誘発鼠モデルにおいて、ＰＣＮＴ発現量が増加することを確認し、比較群として、ＥＰＯを投与したモデルと比較したときにも、臍帯血によるＰＣＮＴ発現量が増加するということを確認することができた。
【００９５】
図５は、脳性マヒを誘発していないシャム（Sham）モデルに、臍帯血を投与していないときを基準にし、図４のＰＣＮＴ発現変化量を％に換算して示したグラフである。
【００９６】
図５に示されているように、臍帯血を投与していない正常鼠であるシャムモデルと比較したときにも、脳性マヒ誘発鼠モデルに臍帯血を投与したとき、ＰＣＮＴ発現量がさらに多かった。
【００９７】
実施例４：臍帯血、正常人及び脳性マヒ患児の血漿内に存在するＰＣＮＴ量差の検証
４−１．臍帯血、正常人血液及び脳性マヒ患児血液内での血漿分離
臍帯血は、アイコード（icord）から寄贈された研究用臍帯血を遠心分離し、血漿のみを分離し、−８０℃超低温冷凍庫に冷凍して保管した。正常人の血液は、２０〜３０代の女性と男性との血液３ｃｃを遠心分離し、血漿のみを分離し、脳性マヒ患児の血液は、入院中の脳性マヒ患児の臍帯血施術前の血液を遠心分離し、血漿のみを分離し、２つの血漿は、冷凍保管した。表５は、臍帯血内に含まれているＰＣＮＴ発現を確認するために、比較群として選定した正常人と脳性マヒ患児との情報を示した表である。
【００９８】
【表５】
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【００９９】
４−２．臍帯血、正常人血漿及び脳性マヒ患児血漿内に含まれたＰＣＮＴ発現量の確認
前記実施例４−１で保管した血漿を、氷上で徐々に融かした後、ＰＢＳで、５：１に希釈した。希釈されたサンプルを、ブラッドフォード（Bradford）試薬を利用して定量し、３０μｇに対してウェスタンブロット（Western blot）技法実験を進めた。
【０１００】
図６Ａは、臍帯血（ＵＣＢ）血漿、正常人血漿、脳性マヒ患児血漿のサンプルにおけるＰＣＮＴ発現量を示した図面である。図６Ｂは、臍帯血１番サンプルを基準にし、臍帯血（ＵＣＢ）血漿、正常人血漿、脳性マヒ患児血漿のサンプルにおけるＰＣＮＴの相対的な発現量（％）を示したグラフである。
【０１０１】
図６Ａ及び図６Ｂに示されているように、脳性マヒ患児の血漿には、ＰＣＮＴ発現量が顕著に少なく示され、その次に正常人であり、ＰＣＮＴを最も多く含んでいるのが臍帯血であると示された。血漿内基準になるタンパク質がないので、ポンソー（Ponceau）で染色したバンドを基準に取り、ＰＣＮＴ発現量を％に換算したときにも、臍帯血内に、ＰＣＮＴが最も多く発現されているということを確認することができた。
【０１０２】
実施例５：ＰＣＮＴを発現する臍帯血内細胞種類の確認
臍帯血は、臍帯の組織にある血液であり、造血幹細胞（造血幹細胞）が多量含有されている。該造血幹細胞は、血液の主要構成成分であり、骨髄で生成される単核球、大食細胞、血小板細胞と、Ｔ−細胞、Ｂ−細胞、ＮＫ細胞のようなリンパ系細胞とに分化することができる潜在的な細胞である。従って、臍帯血内に存在する細胞のうち、どの細胞がＰＣＮＴを発現するかということで、その種類を確認した。ＰＣＮＴを発現する細胞に係わる情報は、ＧｅｎｅＣａｒｄｓウェブサイト（http://www.genecards.org/）から確認した。
【０１０３】
図７は、臍帯血内に存在する成分である血清（Serum）、血漿（Plasma）、単核球（Monocyte）、好中球（Neutrophil）、Ｂ−リンパ球（Ｂ−lymphocyte）、Ｔ−リンパ球（Ｔ−lymphocyte）、ＣＤ４ Ｔ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞、ＮＫ細胞、末梢血液単核球細胞（peripheral blood mononuclear cell：ＰＢＭＣ）、血小板（Platelet）、リンパ節（Lymph node）、扁桃腺（Tonsil）、骨髄間質細胞（bone marrow stromal cell）及び骨髄間葉系幹細胞（bone marrow mesenchymal stem cell）それぞれのＰＣＮＴ発現量（Ｌｏｇ１０，ｐｐｍ）を示したグラフである。
【０１０４】
図７に示されているように、臍帯血内に存在する細胞において、単核球、Ｂ−リンパ球、ＣＤ４ Ｔ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞、ＮＫ細胞、末梢血液単核球細胞、血小板及びリンパ節においてＰＣＮＴが分泌され、そのうち、末梢血液単核球細胞（ＰＢＭＣ）が、最も多くのＰＣＮＴ発現を示すということを確認した。
【０１０５】
実施例６：臍帯血の脳神経系疾患治療効果の確認
臍帯血施術が、実際に脳神経系患者の脳神経系疾患を治療する効果があるか否かということを確認するために、脳性マヒ患児に自家臍帯血施術を進めた。
【０１０６】
該臍帯血細胞治療において、臍帯血は、赤血球と血漿とを除去して白血球濃縮液を作って冷凍保管されたものを使用した。冷凍保管された白血球濃縮液は、施術前、３７℃ウォーターバス（water bath）での解凍後、それを、１０％デキストラン（dextran）４０（１００ｇデキストラン４０／１ｌ水）及び５％アルブミン（５０ｇアルブミン／１ｌ水）を同量で希釈した溶液で洗浄した。洗浄を終えた白血球濃縮液は、１０％デキストラン４０及び５％アルブミンを同量で希釈した混合液１０ｍｌに、最小総有核細胞数が３ｘ１０７／ｋｇになるように懸濁した後、静脈内注射で、１５ｍｌから３０ｍｌまでの間の投与量を投与した。
【０１０７】
表６は、臍帯血の治療効果を確認するために選別された１３名の脳性マヒ患児の性別、診断名、及び臍帯血治療後の機能評価結果を示した表である。
【０１０８】
表６に示されているように、１３名の脳性マヒ患者において、臍帯血施術後、全般的な機能向上が示されるということを確認した。
【０１０９】
【表６】
2020505344.tif 000008
【０１１０】
また、臍帯血施術２〜４ヵ月後、５番，１１番及び１３番患者に対し、粗大運動能力分類システム（ＧＭＦＣＳ：gross motor function classification system：ＧＭＦＣＳ）、Bayley乳幼児発達検査行動発達領域（ＢＳＩＤ（Bayley scales of infant development）ＩＩ motor）及びBayley乳幼児発達検査精神発達領域（ＢＳＩＤ ＩＩ mental）による評価を行った。
【０１１１】
図８は、５番，１１番及び１３番脳性マヒ患児に対する臍帯血施術前（ＧＭＦＣＳ＿ｐｒｅ）及び該施術後（ＧＭＦＣＳ＿ｐｏｓｔ）のＧＭＦＣＳ評価結果（総ＧＭＦＣＳ（％））を示したグラフである。
【０１１２】
図９は、５番，１１番及び１３番脳性マヒ患児に対する臍帯血施術前（ＢＳＩＤ＿Ｍｏｔｏｒ＿ｐｒｅ）及び該施術後（ＢＳＩＤ＿Ｍｏｔｏｒ＿ｐｏｓｔ）のBayley乳幼児発達検査の行動発達領域評価結果（ＢＳＩＤ ＩＩ motor）を示したグラフである。
【０１１３】
図１０は、５番，１１番及び１３番脳性マヒ患児に対する臍帯血施術前（ＢＳＩＤ＿Ｍｅｎｔａｌ＿ｐｒｅ）及び該施術後（ＢＳＩＤ＿Ｍｅｎｔａｌ＿ｐｏｓｔ）のBayley乳幼児発達検査の精神発達領域評価結果（ＢＳＩＤ ＩＩ mental）を示したグラフである。
【０１１４】
図８ないし図１０に示されているように、臍帯血施術前後脳性マヒ患児に対し、ＧＭＦＣＳ、ＢＳＩＤ ＩＩ motor及びＢＳＩＤ ＩＩ mentalの検査を行った結果、臍帯血施術後、好転様相が観察された。
【産業上の利用可能性】
【０１１５】
脳神経系疾患の治療または診断のための標的タンパク質としてのＰＣＮＴタンパク質を確認したが、ＰＣＮＴタンパク質は、初期に、脳神経系疾患を診断し、脳神経系疾患治療剤を開発するための標的として活用することができる。
【０１１６】
従って、ＰＣＮＴを発現または分泌する臍帯血または臍帯血由来細胞を含む組成物を使用すれば、脳神経系疾患を効果的に予防または治療することができる。
【０１１７】
また、ＰＣＮＴタンパク質またはその遺伝子のｍＲＮＡのレベルを測定する薬剤を含む組成物またはキットを使用すれば、脳神経系疾患を診断することができる。
【０１１８】
また、ＰＣＮＴタンパク質またはその遺伝子の発現量または活性レベルを測定することにより、脳神経系疾患診断に必要な情報を分析することができる。
【０１１９】
また、ＰＣＮＴタンパク質を発現する細胞と試験物質とを接触させた後、ＰＣＮＴタンパク質の発現量または活性を測定することにより、脳神経系疾患治療剤候補物質をスクリーニングすることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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