(57)【要約】  本開示は、癌リボ核酸（ＲＮＡ）ワクチン、ならびに当該ワクチン及び当該ワクチンを含む組成物の使用方法に関する。特に、本開示は、単一のｍＲＮＡ構築物上にいくつかの癌エピトープをコードする、すなわち、ポリエピトープｍＲＮＡ構築物又はポリネオエピトープ構築物である、コンカテマーｍＲＮＡ癌ワクチンに関する。本開示はさらに、ｐ５３及びＫＲＡＳ変異、ならびにＳＴＩＮＧなどの免疫増進剤の組み込みに関し、例えば、ｍＲＮＡ構築物は、免疫刺激剤又はアジュバントをさらにコードする。本開示はさらに、免疫応答の増強を誘発するテタヌス毒素又はジフテリア毒素などのユニバーサルＴ細胞エピトープの包含に関する。
2020506189.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｍＲＮＡ癌ワクチンであって、
次のうちの１つまたは複数：
（ａ）個別化癌抗原である１〜５００のペプチドエピトープと、ユニバーサルタイプＩＩのＴ細胞エピトープとをコードする１つもしくは複数のオープンリーディングフレームをそれぞれ有する１つもしくは複数のｍＲＮＡ、
（ｂ）活性化癌遺伝子変異ペプチドをコードするオープンリーディングフレームをそれぞれ有する１つもしくは複数のｍＲＮＡであって、任意選択で、前記ｍＲＮＡは、ユニバーサルタイプＩＩのＴ細胞エピトープをさらに含む、前記ｍＲＮＡ、
（ｃ）癌抗原ペプチドエピトープをコードするオープンリーディングフレームをそれぞれ有する１つもしくは複数のｍＲＮＡであって、前記ｍＲＮＡワクチンは、５〜１００のペプチドエピトープをコードし、前記ペプチドエピトープのうちの少なくとも２つは、個別化癌抗原であり、任意選択で、前記ｍＲＮＡは、ユニバーサルタイプＩＩのＴ細胞エピトープをさらに含む、前記ｍＲＮＡ、及び／または
（ｄ）癌抗原ペプチドエピトープをコードするオープンリーディングフレームをそれぞれ有する１つもしくは複数のｍＲＮＡであって、前記ｍＲＮＡワクチンは、５〜１００のペプチドエピトープをコードし、前記ペプチドエピトープのうちの少なくとも３つは、複合バリアントであり、前記ペプチドエピトープのうちの少なくとも２つは、点変異であり、任意選択で、前記ｍＲＮＡは、ユニバーサルタイプＩＩのＴ細胞エピトープをさらに含む、前記ｍＲＮＡ
を含む、脂質ナノ粒子を含む、前記ｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項２】
前記ｍＲＮＡ癌ワクチンが、１〜２０のユニバーサルタイプＩＩのＴ細胞エピトープをコードする、請求項１に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項３】
前記ユニバーサルタイプＩＩのＴ細胞エピトープが、ＩＬＭＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩ（テタヌス毒素；配列番号２２６）、ＦＮＮＦＴＶＳＦＷＬＲＶＰＫＶＳＡＳＨＬＥ（テタヌス毒素；配列番号２２７）、ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥ（テタヌス毒素；配列番号２２８）ＱＳＩＡＬＳＳＬＭＶＡＱＡＩＰ（ジフテリア毒素；配列番号２２９）、及びＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ（汎ＤＲエピトープ；配列番号２３０）からなる群から選択される、請求項２に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項４】
前記ユニバーサルタイプＩＩのＴ細胞エピトープが、前記ｍＲＮＡ全体にわたって同じユニバーサルタイプＩＩのＴ細胞エピトープである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項５】
前記ユニバーサルタイプＩＩのＴ細胞エピトープが、前記ｍＲＮＡ中１〜２０回繰り返される、請求項１〜３のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項６】
前記ユニバーサルタイプＩＩのＴ細胞エピトープが、前記ｍＲＮＡ全体にわたって互いに異なる、請求項１〜３のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項７】
前記ユニバーサルタイプＩＩのＴ細胞エピトープが、すべての癌抗原ペプチドエピトープの間に位置する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項８】
前記ユニバーサルタイプＩＩのＴ細胞エピトープが、癌抗原ペプチドエピトープの間に１つおきに位置する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項９】
前記ユニバーサルタイプＩＩのＴ細胞エピトープが、癌抗原ペプチドエピトープの間に２つおきに位置する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項１０】
次の条件のうちの１つまたは複数：
（ｉ）前記活性化癌遺伝子変異が、ＫＲＡＳ変異であること、
（ｉｉ）前記ＫＲＡＳ変異が、Ｇ１２変異であり、任意選択で、前記Ｇ１２  ＫＲＡＳ変異は、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ａ、及びＧ１２Ｒ  ＫＲＡＳ変異から選択されること、
（ｉｉｉ）前記ＫＲＡＳ変異が、Ｇ１３変異であり、任意選択で、前記Ｇ１３  ＫＲＡＳ変異は、Ｇ１３Ｄ  ＫＲＡＳ変異であること、及び／または
（ｉｖ）前記活性化癌遺伝子変異が、Ｈ−ＲＡＳもしくはＮ−ＲＡＳ変異であること
を満たす、請求項１〜９のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項１１】
次の条件のうちの１つまたは複数：
（Ａ）前記ｍＲＮＡが、２つ以上の活性化癌遺伝子変異ペプチドのコンカテマーをコードするオープンリーディングフレームを有すること、
（Ｂ）前記ペプチドエピトープのうちの少なくとも２つが、１つのグリシンによって互いに分離されており、任意選択で、前記ペプチドエピトープのすべてが、１つのグリシンによって互いに分離されていること、
（Ｃ）前記コンカテマーが、３〜１０の活性化癌遺伝子変異ペプチドを含むこと、及び／または
（Ｄ）前記ペプチドエピトープのうちの少なくとも２つが、リンカーなしで互いに直接連結されていること
を満たす、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項１２】
次の条件のうちの１つまたは複数：
（ｉ）前記ペプチドエピトープのうちの少なくとも１つは、従来型癌抗原であること、
（ｉｉ）前記ペプチドエピトープのうちの少なくとも１つは、反復多型であること、
（ｉｉｉ）前記反復多型は、ｐ５３における反復体細胞癌変異を含むこと、
（ｉｖ）前記ｐ５３における反復体細胞癌変異は、
（Ａ）コドン位置Ｔ１２５に隣接する標準５’スプライス部位における変異であって、エピトープＡＶＳＰＣＩＳＦＶＷ（配列番号２３３）（ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５８：０１）、エピトープＨＰＬＡＳＣＱＣＦＦ（配列番号２３４）（ＨＬＡ−Ｂ＊３５：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５３：０１）、エピトープＦＶＷＮＦＧＩＰＬ（配列番号２３５）（ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０６、ＨＬＡ−Ｂ＊３５：０１）を含むペプチド配列ＴＡＫＳＶＴＣＴＶＳＣＰＥＧＬＡＳＭＲＬＱＣＬＡＶＳＰＣＩＳＦＶＷＮＦＧＩＰＬＨＰＬＡＳＣＱＣＦＦＩＶＹＰＬＮＶ（配列番号２３２）を有する保持型イントロンを誘導する前記変異；
（Ｂ）コドン位置３３１に隣接する標準５’スプライス部位における変異であって、エピトープＬＱＶＬＳＬＧＴＳＹ（配列番号２３７）（ＨＬＡ−Ｂ＊１５：０１）、エピトープＦＱＳＮＴＱＮＡＶＦ（配列番号２３８）（ＨＬＡ−Ｂ＊１５：０１）を含むペプチド配列ＥＹＦＴＬＱＶＬＳＬＧＴＳＹＱＶＥＳＦＱＳＮＴＱＮＡＶＦＦＬＴＶＬＰＡＩＧＡＦＡＩＲＧＱ（配列番号２３６）を有する保持型イントロンを誘導する前記変異；
（Ｃ）コドン位置１２６に隣接する標準３’スプライス部位における変異であって、エピトープＣＴＭＦＣＱＬＡＫ（配列番号２４０）（ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１）、エピトープＫＳＶＴＣＴＭＦ（配列番号２４１）（ＨＬＡ−Ｂ＊５８：０１）を含む新規のスパニングペプチド配列ＡＫＳＶＴＣＴＭＦＣＱＬＡＫ（配列番号２３９）を生成する潜在性の代替エクソン３’スプライス部位を誘導する前記変異；及び／または
（Ｄ）コドン位置２２４に隣接する標準５’スプライス部位における変異であって、エピトープＶＰＹＥＰＰＥＶＷ（配列番号２４３）（ＨＬＡ−Ｂ＊５３：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５１：０１）、エピトープＬＴＶＰＰＳＴＡＷ（配列番号２４４）（ＨＬＡ−Ｂ＊５８：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１）を含む新規のスパニングペプチド配列ＶＰＹＥＰＰＥＶＷＬＡＬＴＶＰＰＳＴＡＷＡＡ（配列番号２４２）を生成する潜在性の代替イントロン５’スプライス部位を誘導する前記変異
（転写コドン位置は、Ｅｎｓｅｍｂｌのｖ８３のヒトゲノムアノテーションに由来する標準の全長ｐ５３転写物であるＥＮＳＴ０００００２６９３０５（配列番号２４５）を参照したものである）からなる群から選択されること、
及び／または
（ｖ）前記ｍＲＮＡ癌ワクチンが、安定剤を含まないこと
を満たす、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項１３】
前記１つまたは複数のｍＲＮＡが、免疫増強剤をコードするオープンリーディングフレームをさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項１４】
前記免疫増強剤が、前記脂質ナノ粒子に製剤化される、請求項１３に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項１５】
前記免疫増強剤が、別個の脂質ナノ粒子に製剤化される、請求項１３に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項１６】
前記免疫増強剤が、構造的に活性なヒトＳＴＩＮＧポリペプチドである、請求項１３に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項１７】
前記構造的に活性なヒトＳＴＩＮＧポリペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項１８】
前記構造的に活性なヒトＳＴＩＮＧポリペプチドをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号１７０に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項１３に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項１９】
前記構造的に活性なヒトＳＴＩＮＧポリペプチドをコードする前記ｍＲＮＡが、ｍｉＲ−１２２マイクロＲＮＡ結合部位を有する３’ＵＴＲを含む、請求項１３に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項２０】
前記ｍｉＲ−１２２マイクロＲＮＡ結合部位が、配列番号１７５に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項１９に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項２１】
前記１つまたは複数のｍＲＮＡがそれぞれ、配列番号１７６に示すヌクレオチド配列を含む５’ＵＴＲを含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項２２】
前記１つまたは複数のｍＲＮＡがそれぞれ、ポリＡテールを含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項２３】
前記ポリＡテールが、約１００ヌクレオチドを含む、請求項２２に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項２４】
前記１つまたは複数のｍＲＮＡがそれぞれ、５’キャップ１構造を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項２５】
前記１つまたは複数のｍＲＮＡが、少なくとも１つの化学修飾を含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項２６】
前記化学修飾が、Ｎ１−メチルシュードウリジンである、請求項２５に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項２７】
前記１つまたは複数のｍＲＮＡが、Ｎ１−メチルシュードウリジンで完全に修飾されている、請求項２６に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項２８】
前記１つまたは複数のｍＲＮＡが、４５〜５５の個別化癌抗原をコードする、請求項１〜２７のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項２９】
前記１つまたは複数のｍＲＮＡが、５２の個別化癌抗原をコードする、請求項１〜２７のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項３０】
前記個別化癌抗原のそれぞれが、別個のオープンリーディングフレームによってコードされる、請求項１〜２７のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項３１】
前記ペプチドエピトープが、２〜１００のペプチドエピトープから構成されるコンカテマー癌抗原の形態であり、任意選択で、前記コンカテマー癌抗原は、５〜１００のペプチドエピトープから構成される、請求項１〜２７のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項３２】
前記コンカテマー癌抗原は、
ａ）前記２〜１００のペプチドエピトープもしくは任意選択で５〜１００のペプチドエピトープが、切断感受性部位が間に入ることによって散在していること、
ｂ）それぞれのペプチドエピトープをコードする前記ｍＲＮＡが、リンカーなしで互いに直接連結されていること、
ｃ）それぞれのペプチドエピトープをコードする前記ｍＲＮＡが、単一のヌクレオチドリンカーで互いに連結されていること、
ｄ）それぞれのペプチドエピトープが、２５〜３５アミノ酸を含み、かつ中央に位置するＳＮＰ変異を含むこと、
ｅ）前記ペプチドエピトープの少なくとも３０％が、対象に由来するクラスＩのＭＨＣ分子に対して最も高い親和性を有すること、
ｆ）前記ペプチドエピトープの少なくとも３０％が、対象に由来するクラスＩＩのＭＨＣ分子に対して最も高い親和性を有すること、
ｇ）前記ペプチドエピトープの少なくとも５０％が、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、及び／またはＤＲＢ１に対してＩＣ＞５００ｎＭの予測結合親和性を有すること、
ｈ）前記ｍＲＮＡが、４５〜５５のペプチドエピトープをコードすること、
ｉ）前記ｍＲＮＡが、５２のペプチドエピトープをコードすること、
ｊ）前記ペプチドエピトープの５０％が、クラスＩのＭＨＣに対して結合親和性を有し、かつペプチドエピトープの５０％が、クラスＩＩのＭＨＣに対して結合親和性を有すること、
ｋ）前記ペプチドエピトープをコードする前記ｍＲＮＡが、前記ペプチドエピトープの順序が偽エピトープを最小化する順序になるように配置されること、
ｌ）前記ペプチドエピトープの少なくとも３０％が、１５アミノ酸長のＭＨＣクラスＩ結合ペプチドであること、及び／または
ｍ）前記ペプチドエピトープの少なくとも３０％が、２１アミノ酸長のＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドであること
のうちの１つまたは複数を含む、請求項３１に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項３３】
ｍＲＮＡ癌ワクチンであって、
脂質ナノ粒子に製剤化された、個別化癌抗原である４５〜５５のペプチドエピトープをコードする１つまたは複数のオープンリーディングフレームをそれぞれ有する１つまたは複数のｍＲＮＡを含み、任意選択で、前記ペプチドエピトープのうちの少なくとも１つは、活性化癌遺伝子変異ペプチドまたは従来型癌抗原であり、任意選択で、前記ペプチドエピトープのうちの少なくとも３つは、複合バリアントであり、前記ペプチドエピトープのうちの少なくとも２つは、点変異である、前記ｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項３４】
前記１つまたは複数のｍＲＮＡが、４８〜５４の個別化癌抗原をコードする、請求項３３に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項３５】
前記１つまたは複数のｍＲＮＡが、５２の個別化癌抗原をコードする、請求項３３〜３４のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項３６】
前記個別化癌抗原のそれぞれは、別個のオープンリーディングフレームによってコードされる、請求項３３〜３５のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項３７】
前記ペプチドエピトープが、２〜１００のペプチドエピトープから構成されるコンカテマー癌抗原の形態であり、任意選択で、前記コンカテマー癌抗原は、５〜１００のペプチドエピトープから構成される、請求項３３〜３５のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項３８】
前記コンカテマー癌抗原は、
ａ）前記２〜１００のペプチドエピトープもしくは任意選択で５〜１００のペプチドエピトープが、切断感受性部位が間に入ることによって散在していること、
ｂ）それぞれのペプチドエピトープをコードする前記ｍＲＮＡが、リンカーなしで互いに直接連結されていること、
ｃ）それぞれのペプチドエピトープをコードする前記ｍＲＮＡが、単一のヌクレオチドリンカーで互いに連結されていること、
ｄ）それぞれのペプチドエピトープが、２５〜３５アミノ酸を含み、かつ中央に位置するＳＮＰ変異を含むこと、
ｅ）前記ペプチドエピトープの少なくとも３０％が、対象に由来するクラスＩのＭＨＣ分子に対して最も高い親和性を有すること、
ｆ）前記ペプチドエピトープの少なくとも３０％が、対象に由来するクラスＩＩのＭＨＣ分子に対して最も高い親和性を有すること、
ｇ）前記ペプチドエピトープの少なくとも５０％が、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、及び／またはＤＲＢ１に対してＩＣ＞５００ｎＭの予測結合親和性を有すること、
ｈ）前記ｍＲＮＡが、４５〜５５のペプチドエピトープをコードすること、
ｉ）前記ｍＲＮＡが、５２のペプチドエピトープをコードすること、
ｊ）前記ペプチドエピトープの５０％が、クラスＩのＭＨＣに対して結合親和性を有し、かつペプチドエピトープの５０％が、クラスＩＩのＭＨＣに対して結合親和性を有すること、
ｋ）前記ペプチドエピトープをコードする前記ｍＲＮＡが、前記ペプチドエピトープの順序が偽エピトープを最小化する順序になるように配置されること、
ｌ）前記ペプチドエピトープの少なくとも３０％が、１５アミノ酸長のＭＨＣクラスＩ結合ペプチドであること、及び／または
ｍ）前記ペプチドエピトープの少なくとも３０％が、２１アミノ酸長のＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドであること
のうちの１つまたは複数を含む、請求項３７に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項３９】
前記ペプチドエピトープのうちの少なくとも２つが、ユニバーサルタイプＩＩのＴ細胞エピトープによって互いに分離されている、請求項３３〜３８のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項４０】
前記ペプチドエピトープのすべてが、ユニバーサルタイプＩＩのＴ細胞エピトープによって互いに分離されている、請求項３３〜３８のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項４１】
前記ｍＲＮＡ癌ワクチンが、１〜２０のユニバーサルタイプＩＩのＴ細胞エピトープをコードする、請求項３３〜３８のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項４２】
前記ユニバーサルタイプＩＩのＴ細胞エピトープが、ＩＬＭＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩ（テタヌス毒素；配列番号２２６）、ＦＮＮＦＴＶＳＦＷＬＲＶＰＫＶＳＡＳＨＬＥ（テタヌス毒素；配列番号２２７）、ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥ（テタヌス毒素；配列番号２２８）ＱＳＩＡＬＳＳＬＭＶＡＱＡＩＰ（ジフテリア毒素；配列番号２２９）、及びＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ（汎ＤＲエピトープ；配列番号２３０）からなる群から選択される、請求項４１に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項４３】
前記ユニバーサルタイプＩＩのＴ細胞エピトープが、前記ｍＲＮＡ全体にわたって同じユニバーサルタイプＩＩのＴ細胞エピトープである、請求項３９〜４２のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項４４】
前記ユニバーサルタイプＩＩのＴ細胞エピトープが、前記ｍＲＮＡ中１〜２０回繰り返される、請求項３９〜４２のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項４５】
前記ユニバーサルタイプＩＩのＴ細胞エピトープが、前記ｍＲＮＡ全体にわたって互いに異なる、請求項３９〜４２のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項４６】
前記ユニバーサルタイプＩＩのＴ細胞エピトープが、すべてのペプチドエピトープの間に位置する、請求項３９〜４２のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項４７】
前記ユニバーサルタイプＩＩのＴ細胞エピトープが、すべてのペプチドエピトープの間に１つおきに位置する、請求項３９〜４２のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項４８】
前記ユニバーサルタイプＩＩのＴ細胞エピトープが、すべてのペプチドエピトープの間に２つおきに位置する、請求項３９〜４２のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項４９】
前記１つまたは複数のｍＲＮＡが、免疫増強剤をコードするオープンリーディングフレームをさらに含む、請求項３３〜４８のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項５０】
前記免疫増強剤が、前記脂質ナノ粒子に製剤化される、請求項３８に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項５１】
前記免疫増強剤が、別個の脂質ナノ粒子に製剤化される、請求項３８に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項５２】
前記免疫増強剤が、構造的に活性なヒトＳＴＩＮＧポリペプチドである、請求項３８に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項５３】
前記構造的に活性なヒトＳＴＩＮＧポリペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む、請求項５２に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項５４】
前記構造的に活性なヒトＳＴＩＮＧポリペプチドをコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号１７０に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項５２に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項５５】
次の条件のうちの１つまたは複数：
（ｉ）前記活性化癌遺伝子変異が、ＫＲＡＳ変異であること、
（ｉｉ）前記ＫＲＡＳ変異が、Ｇ１２変異であり、任意選択で、前記Ｇ１２  ＫＲＡＳ変異は、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ａ、及びＧ１２Ｒ  ＫＲＡＳ変異から選択されること、
（ｉｉｉ）前記ＫＲＡＳ変異が、Ｇ１３変異であり、任意選択で、前記Ｇ１３  ＫＲＡＳ変異は、Ｇ１３Ｄ  ＫＲＡＳ変異であること、及び／または
（ｉｖ）前記活性化癌遺伝子変異が、Ｈ−ＲＡＳもしくはＮ−ＲＡＳ変異であること
を満たす、請求項３３〜５４のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項５６】
次の条件のうちの１つまたは複数：
（Ａ）前記ｍＲＮＡが、２つ以上の活性化癌遺伝子変異ペプチドのコンカテマーをコードするオープンリーディングフレームを有すること、
（Ｂ）前記ペプチドエピトープのうちの少なくとも２つが、１つのグリシンによって互いに分離されており、任意選択で、前記ペプチドエピトープのすべてが、１つのグリシンによって互いに分離されていること、
（Ｃ）前記コンカテマーが、３〜１０の活性化癌遺伝子変異ペプチドを含むこと、及び／または
（Ｄ）前記ペプチドエピトープのうちの少なくとも２つが、リンカーなしで互いに直接連結されていること
を満たす、請求項３３〜５５のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項５７】
次の条件のうちの１つまたは複数：
（ｉ）前記ペプチドエピトープのうちの少なくとも１つは、従来型癌抗原であること、
（ｉｉ）前記ペプチドエピトープのうちの少なくとも１つは、反復多型であること、
（ｉｉｉ）前記反復多型は、ｐ５３における反復体細胞癌変異を含むこと、
（ｉｖ）前記ｐ５３における反復体細胞癌変異は、
（Ａ）コドン位置Ｔ１２５に隣接する標準５’スプライス部位における変異であって、エピトープＡＶＳＰＣＩＳＦＶＷ（配列番号２３３）（ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５８：０１）、エピトープＨＰＬＡＳＣＱＣＦＦ（配列番号２３４）（ＨＬＡ−Ｂ＊３５：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５３：０１）、エピトープＦＶＷＮＦＧＩＰＬ（配列番号２３５）（ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０６、ＨＬＡ−Ｂ＊３５：０１）を含むペプチド配列ＴＡＫＳＶＴＣＴＶＳＣＰＥＧＬＡＳＭＲＬＱＣＬＡＶＳＰＣＩＳＦＶＷＮＦＧＩＰＬＨＰＬＡＳＣＱＣＦＦＩＶＹＰＬＮＶ（配列番号２３２）を有する保持型イントロンを誘導する前記変異；
（Ｂ）コドン位置３３１に隣接する標準５’スプライス部位における変異であって、エピトープＬＱＶＬＳＬＧＴＳＹ（配列番号２３７）（ＨＬＡ−Ｂ＊１５：０１）、エピトープＦＱＳＮＴＱＮＡＶＦ（配列番号２３８）（ＨＬＡ−Ｂ＊１５：０１）を含むペプチド配列ＥＹＦＴＬＱＶＬＳＬＧＴＳＹＱＶＥＳＦＱＳＮＴＱＮＡＶＦＦＬＴＶＬＰＡＩＧＡＦＡＩＲＧＱ（配列番号２３６）を有する保持型イントロンを誘導する前記変異；
（Ｃ）コドン位置１２６に隣接する標準３’スプライス部位における変異であって、エピトープＣＴＭＦＣＱＬＡＫ（配列番号２４０）（ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１）、エピトープＫＳＶＴＣＴＭＦ（配列番号２４１）（ＨＬＡ−Ｂ＊５８：０１）を含む新規のスパニングペプチド配列ＡＫＳＶＴＣＴＭＦＣＱＬＡＫ（配列番号２３９）を生成する潜在性の代替エクソン３’スプライス部位を誘導する前記変異；及び／または
（Ｄ）コドン位置２２４に隣接する標準５’スプライス部位における変異であって、エピトープＶＰＹＥＰＰＥＶＷ（配列番号２４３）（ＨＬＡ−Ｂ＊５３：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５１：０１）、エピトープＬＴＶＰＰＳＴＡＷ（配列番号２４４）（ＨＬＡ−Ｂ＊５８：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１）を含む新規のスパニングペプチド配列ＶＰＹＥＰＰＥＶＷＬＡＬＴＶＰＰＳＴＡＷＡＡ（配列番号２４２）を生成する潜在性の代替イントロン５’スプライス部位を誘導する前記変異
（転写コドン位置は、Ｅｎｓｅｍｂｌのｖ８３のヒトゲノムアノテーションに由来する標準の全長ｐ５３転写物であるＥＮＳＴ０００００２６９３０５（配列番号２４５）を参照したものである）からなる群から選択されること、及び／または
（ｖ）前記ｍＲＮＡ癌ワクチンが、安定剤を含まないことを満たす、請求項３３〜５６のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項５８】
ｍＲＮＡ癌ワクチンであって、
（ｉ）個別化癌抗原である１〜５００ペプチドエピトープをコードする１つまたは複数のオープンリーディングフレームをそれぞれ有する１つまたは複数のｍＲＮＡと、
（ｉｉ）前記個別化癌抗原に対する免疫応答を高めるポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡと、を含む、脂質ナノ粒子を含み、
任意選択で、（ｉ）及び（ｉｉ）は、およそ５：１の質量比で存在し、任意選択で、前記ペプチドエピトープのうちの少なくとも１つは、活性化癌遺伝子変異ペプチドまたは従来型癌抗原であり、任意選択で、前記ペプチドエピトープのうちの少なくとも３つは、複合バリアントであり、前記ペプチドエピトープのうちの少なくとも２つは、点変異である、前記ｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項５９】
前記免疫応答が、
（ｉ）Ｉ型インターフェロン経路のシグナル伝達を刺激すること、
（ｉｉ）ＮＦｋＢ経路のシグナル伝達を刺激すること、
（ｉｉｉ）炎症反応を刺激すること、
（ｉｖ）サイトカイン産生を刺激すること、または
（ｖ）樹状細胞の発生、活性もしくは動員を刺激すること、及び
（ｖｉ）（ｉ）〜（ｖｉ）のいずれかの組み合わせを特徴とする細胞性または体液性免疫応答を含む、請求項５８に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項６０】
前記ペプチドエピトープと、前記個別化癌抗原に対する免疫応答を高める前記ポリペプチドとの両方をコードする単一のｍＲＮＡ構築物を含む、請求項５８に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項６１】
前記ペプチドエピトープが、２〜１００のペプチドエピトープから構成されるコンカテマー癌抗原の形態であり、任意選択で、前記コンカテマー癌抗原は、５〜１００のペプチドエピトープから構成される、請求項５８または５９に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項６２】
前記コンカテマー癌抗原は、
ａ）前記２〜１００のペプチドエピトープもしくは任意選択で５〜１００のペプチドエピトープが、切断感受性部位が間に入ることによって散在していること、
ｂ）それぞれのペプチドエピトープをコードする前記ｍＲＮＡが、リンカーなしで互いに直接連結されていること、
ｃ）それぞれのペプチドエピトープをコードする前記ｍＲＮＡが、単一のヌクレオチドリンカーで互いに連結されていること、
ｄ）それぞれのペプチドエピトープが、２５〜３５アミノ酸を含み、かつ中央に位置するＳＮＰ変異を含むこと、
ｅ）前記ペプチドエピトープの少なくとも３０％が、対象に由来するクラスＩのＭＨＣ分子に対して最も高い親和性を有すること、
ｆ）前記ペプチドエピトープの少なくとも３０％が、対象に由来するクラスＩＩのＭＨＣ分子に対して最も高い親和性を有すること、
ｇ）前記ペプチドエピトープの少なくとも５０％が、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、及び／またはＤＲＢ１に対してＩＣ＞５００ｎＭの予測結合親和性を有すること、
ｈ）前記ｍＲＮＡが、４５〜５５のペプチドエピトープをコードすること、
ｉ）前記ｍＲＮＡが、５２のペプチドエピトープをコードすること、
ｊ）前記ペプチドエピトープの５０％が、クラスＩのＭＨＣに対して結合親和性を有し、かつペプチドエピトープの５０％が、クラスＩＩのＭＨＣに対して結合親和性を有すること、
ｋ）前記ペプチドエピトープをコードする前記ｍＲＮＡが、前記ペプチドエピトープの順序が偽エピトープを最小化する順序になるように配置されること、
ｌ）前記ペプチドエピトープの少なくとも３０％が、１５アミノ酸長のＭＨＣクラスＩ結合ペプチドであること、及び／または
ｍ）前記ペプチドエピトープの少なくとも３０％が、２１アミノ酸長のＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドであること
のうちの１つまたは複数を含む、請求項６１に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項６３】
それぞれのペプチドエピトープが、中央に位置するＳＮＰ変異を含み、前記ＳＮＰ変異の両側には７〜１５の隣接アミノ酸が存在する、請求項６２に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項６４】
対象において少なくとも１つの個別化癌抗原に対する免疫応答を高める前記ポリペプチドが、構造的に活性なヒトＳＴＩＮＧポリペプチドである、請求項５８〜６３のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項６５】
前記構造的に活性なヒトＳＴＩＮＧポリペプチドが、Ｖ１４７Ｌ、Ｎ１５４Ｓ、Ｖ１５５Ｍ、Ｒ２８４Ｍ、Ｒ２８４Ｋ、Ｒ２８４Ｔ、Ｅ３１５Ｑ、Ｒ３７５Ａ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される１つまたは複数の変異を含む、請求項６４に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項６６】
前記構造的に活性なヒトＳＴＩＮＧポリペプチドが、Ｖ１５５Ｍ変異を含む、請求項６５に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項６７】
前記構造的に活性なヒトＳＴＩＮＧポリペプチドが、変異Ｒ２８４Ｍ／Ｖ１４７Ｌ／Ｎ１５４Ｓ／Ｖ１５５Ｍを含む、請求項６５に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項６８】
それぞれのｍＲＮＡが、同じまたは異なる脂質ナノ粒子に製剤化される、請求項５８〜６７のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項６９】
癌個別化癌抗原をコードするそれぞれのｍＲＮＡが、同じまたは異なる脂質ナノ粒子に製剤化される、請求項６８に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項７０】
前記個別化癌抗原に対する免疫応答を高めるポリペプチドをコードするそれぞれのｍＲＮＡが、同じまたは異なる脂質ナノ粒子に製剤化される、請求項６９に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項７１】
個別化癌抗原をコードするそれぞれのｍＲＮＡが、同じ脂質ナノ粒子に製剤化され、前記個別化癌抗原に対する免疫応答を高めるポリペプチドをコードするそれぞれのｍＲＮＡが、異なる脂質ナノ粒子に製剤化される、請求項６８〜７０のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項７２】
個別化癌抗原をコードするそれぞれのｍＲＮＡが、同じ脂質ナノ粒子に製剤化され、前記個別化癌抗原に対する免疫応答を高めるポリペプチドをコードするそれぞれのｍＲＮＡが、個別化癌抗原をコードするそれぞれのｍＲＮＡと同じ脂質ナノ粒子に製剤化される、請求項６８〜７０のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項７３】
個別化癌抗原をコードするそれぞれのｍＲＮＡが、異なる脂質ナノ粒子に製剤化され、前記個別化癌抗原に対する免疫応答を高めるポリペプチドをコードするそれぞれのｍＲＮＡが、それぞれの個別化癌抗原をコードするそれぞれのｍＲＮＡと同じ脂質ナノ粒子に製剤化される、請求項６８〜７０のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項７４】
前記ペプチドエピトープが、Ｔ細胞エピトープ及び／またはＢ細胞エピトープである、請求項１〜７３のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項７５】
前記ペプチドエピトープが、Ｔ細胞エピトープとＢ細胞エピトープの組み合わせを含む、請求項１〜７３のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項７６】
前記ペプチドエピトープのうちの少なくとも１つが、Ｔ細胞エピトープである、請求項１〜７３のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項７７】
前記ペプチドエピトープのうちの少なくとも１つが、Ｂ細胞エピトープである、請求項１〜７３のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項７８】
前記ペプチドエピトープが、前記対象のＭＨＣに対する結合強度について最適化されている、請求項１〜７３のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項７９】
それぞれのエピトープのＴＣＲ面が、内因性タンパク質に対する類似性が低い、請求項７８に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項８０】
リコール抗原をさらに含む、請求項１〜７３のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項８１】
前記リコール抗原が、感染性疾患抗原である、請求項８０に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項８２】
１つまたは複数の従来型癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡをさらに含む、請求項１〜７３のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項８３】
次の条件のうちの１つまたは複数：
（ｉ）前記活性化癌遺伝子変異が、ＫＲＡＳ変異であること、
（ｉｉ）前記ＫＲＡＳ変異が、Ｇ１２変異であり、任意選択で、前記Ｇ１２  ＫＲＡＳ変異は、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ａ、及びＧ１２Ｒ  ＫＲＡＳ変異から選択されること、
（ｉｉｉ）前記ＫＲＡＳ変異が、Ｇ１３変異であり、任意選択で、前記Ｇ１３  ＫＲＡＳ変異は、Ｇ１３Ｄ  ＫＲＡＳ変異であること、及び／または
（ｉｖ）前記活性化癌遺伝子変異が、Ｈ−ＲＡＳもしくはＮ−ＲＡＳ変異であること
を満たす、請求項５８〜８２のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項８４】
次の条件のうちの１つまたは複数：
（Ａ）前記ｍＲＮＡが、２つ以上の活性化癌遺伝子変異ペプチドのコンカテマーをコードするオープンリーディングフレームを有すること、
（Ｂ）前記ペプチドエピトープのうちの少なくとも２つが、１つのグリシンによって互いに分離されており、任意選択で、前記ペプチドエピトープのすべてが、１つのグリシンによって互いに分離されていること、
（Ｃ）前記コンカテマーが、３〜１０の活性化癌遺伝子変異ペプチドを含むこと、及び／または
（Ｄ）前記ペプチドエピトープのうちの少なくとも２つが、リンカーなしで互いに直接連結されていること
を満たす、請求項５８〜８３のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項８５】
次の条件のうちの１つまたは複数：
（ｉ）前記ペプチドエピトープのうちの少なくとも１つは、従来型癌抗原であること、
（ｉｉ）前記ペプチドエピトープのうちの少なくとも１つは、反復多型であること、
（ｉｉｉ）前記反復多型は、ｐ５３における反復体細胞癌変異を含むこと、
（ｉｖ）前記ｐ５３における反復体細胞癌変異は、
（Ａ）コドン位置Ｔ１２５に隣接する標準５’スプライス部位における変異であって、エピトープＡＶＳＰＣＩＳＦＶＷ（配列番号２３３）（ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５８：０１）、エピトープＨＰＬＡＳＣＱＣＦＦ（配列番号２３４）（ＨＬＡ−Ｂ＊３５：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５３：０１）、エピトープＦＶＷＮＦＧＩＰＬ（配列番号２３５）（ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０６、ＨＬＡ−Ｂ＊３５：０１）を含むペプチド配列ＴＡＫＳＶＴＣＴＶＳＣＰＥＧＬＡＳＭＲＬＱＣＬＡＶＳＰＣＩＳＦＶＷＮＦＧＩＰＬＨＰＬＡＳＣＱＣＦＦＩＶＹＰＬＮＶ（配列番号２３２）を有する保持型イントロンを誘導する前記変異；
（Ｂ）コドン位置３３１に隣接する標準５’スプライス部位における変異であって、エピトープＬＱＶＬＳＬＧＴＳＹ（配列番号２３７）（ＨＬＡ−Ｂ＊１５：０１）、エピトープＦＱＳＮＴＱＮＡＶＦ（配列番号２３８）（ＨＬＡ−Ｂ＊１５：０１）を含むペプチド配列ＥＹＦＴＬＱＶＬＳＬＧＴＳＹＱＶＥＳＦＱＳＮＴＱＮＡＶＦＦＬＴＶＬＰＡＩＧＡＦＡＩＲＧＱ（配列番号２３６）を有する保持型イントロンを誘導する前記変異；
（Ｃ）コドン位置１２６に隣接する標準３’スプライス部位における変異であって、エピトープＣＴＭＦＣＱＬＡＫ（配列番号２４０）（ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１）、エピトープＫＳＶＴＣＴＭＦ（配列番号２４１）（ＨＬＡ−Ｂ＊５８：０１）を含む新規のスパニングペプチド配列ＡＫＳＶＴＣＴＭＦＣＱＬＡＫ（配列番号２３９）を生成する潜在性の代替エクソン３’スプライス部位を誘導する前記変異；及び／または
（Ｄ）コドン位置２２４に隣接する標準５’スプライス部位における変異であって、エピトープＶＰＹＥＰＰＥＶＷ（配列番号２４３）（ＨＬＡ−Ｂ＊５３：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５１：０１）、エピトープＬＴＶＰＰＳＴＡＷ（配列番号２４４）（ＨＬＡ−Ｂ＊５８：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１）を含む新規のスパニングペプチド配列ＶＰＹＥＰＰＥＶＷＬＡＬＴＶＰＰＳＴＡＷＡＡ（配列番号２４２）を生成する潜在性の代替イントロン５’スプライス部位を誘導する前記変異
（転写コドン位置は、Ｅｎｓｅｍｂｌのｖ８３のヒトゲノムアノテーションに由来する標準の全長ｐ５３転写物であるＥＮＳＴ０００００２６９３０５（配列番号２４５）を参照したものである）からなる群から選択されること、
及び／または
（ｖ）前記ｍＲＮＡ癌ワクチンが、安定剤を含まないこと
を満たす、請求項５８〜８４のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項８６】
前記脂質ナノ粒子が、約２０〜６０％のイオン化可能なアミノ脂質：５〜２５％の中性脂質：２５〜５５％のステロール；０．５〜１５％のＰＥＧ修飾脂質のモル比を含み、任意選択で、前記イオン化可能なアミノ脂質は、カチオン性脂質である、請求項１〜８５のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項８７】
前記脂質ナノ粒子が、約５０％の化合物２５：約１０％のＤＳＰＣ：約３８．５％のコレステロール；約１．５％のＰＥＧ−ＤＭＧのモル比を含む、請求項８６に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項８８】
前記イオン化可能なアミノ脂質が、例えば、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）−ノナ−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）からなる群から選択される、請求項８６に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項８９】
前記脂質ナノ粒子が、式（Ｉ）の化合物を含む、請求項１〜８５のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項９０】
式（Ｉ）の化合物が、化合物２５である、請求項８９に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項９１】
前記脂質ナノ粒子が、０．４未満の多分散値を有する、請求項１〜８５のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項９２】
前記脂質ナノ粒子が、中性のｐＨ値で正味の中性電荷を有する、請求項１〜８５のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項９３】
それぞれのエピトープのＴＣＲ面が、内因性タンパク質に対する類似性が低い、請求項１〜９２のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項９４】
前記ｍＲＮＡが、免疫チェックポイント調節因子をコードするオープンリーディングフレームをさらに含む、請求項１〜９３のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項９５】
追加の癌治療剤をさらに含み、任意選択で、前記追加の癌治療剤は、免疫チェックポイント調節因子である、請求項１〜９３のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項９６】
前記免疫チェックポイント調節因子が、阻害性チェックポイントポリペプチドである、請求項９３または９４に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項９７】
前記阻害性チェックポイントポリペプチドが、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ−３、ＶＩＳＴＡ、Ａ２ＡＲ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、またはそれらの組み合わせを阻害する、請求項９６に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項９８】
前記チェックポイント阻害剤ポリペプチドが、抗体である、請求項９７に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項９９】
前記阻害性チェックポイントポリペプチドが、ＣＴＬＡ４に特異的に結合する抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片、ＰＤ１に特異的に結合する抗ＰＤ１抗体またはその抗原結合断片、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合断片、及びそれらの組み合わせから選択される抗体である、請求項９８に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項１００】
前記チェックポイント阻害剤ポリペプチドが、アテゾリズマブ、アベルマブ、またはデュルバルマブから選択される抗ＰＤ−Ｌ１抗体である、請求項９９に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項１０１】
前記チェックポイント阻害剤ポリペプチドが、トレメリムマブまたはイピリムマブから選択される抗ＣＴＬＡ−４抗体である、請求項９９に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項１０２】
前記チェックポイント阻害剤ポリペプチドが、ニボルマブまたはペンブロリズマブから選択される抗ＰＤ１抗体である、請求項９９に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項１０３】
前記化学修飾が、シュードウリジン、Ｎ１−メチルシュードウリジン、２−チオウリジン、４’−チオウリジン、５−メチルシトシン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−シュードウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオ−ジヒドロシュードウリジン、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−シュードウリジン、４−メトキシ−２−チオ−シュードウリジン、４−メトキシ−シュードウリジン、４−チオ−１−メチル−シュードウリジン、４−チオ−シュードウリジン、５−アザ−ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５−メチルウリジン、５−メチルウリジン、５−メトキシウリジン、及び２’−Ｏ−メチルウリジンからなる群から選択される、請求項２５〜１０２のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
【請求項１０４】
癌を有する対象に、請求項１〜１０３のいずれか１項に記載のｍＲＮＡ癌ワクチンを投与することを含む、対象のワクチン接種方法。
【請求項１０５】
前記ｍＲＮＡワクチンが、１０μｇ〜４００μｇの前記ｍＲＮＡワクチンを送達するために十分な用量レベルで前記対象に投与される、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
前記ｍＲＮＡワクチンが、０．０３３ｍｇ、０．１ｍｇ、０．２ｍｇ、または０．４ｍｇを送達するために十分な用量レベルで前記対象に投与される、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
前記ｍＲＮＡワクチンが、２回、３回、４回またはそれより多い回数で前記対象に投与される、請求項１０４または１０５に記載の方法。
【請求項１０８】
前記ｍＲＮＡワクチンが、３週間ごとに１日１回投与される、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
前記ｍＲＮＡワクチンが、皮内、筋肉内、及び／または皮下投与によって投与される、請求項１０４〜１０８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１０】
前記ｍＲＮＡワクチンが、筋肉内投与によって投与される、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
追加の癌治療剤を投与することをさらに含み、任意選択で、前記追加の癌治療剤は、前記対象に対する免疫チェックポイント調節因子である、請求項１０４〜１１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１２】
前記免疫チェックポイント調節因子が、阻害性チェックポイントポリペプチドである、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
前記阻害性チェックポイントポリペプチドが、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ−３、ＶＩＳＴＡ、Ａ２ＡＲ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、またはそれらの組み合わせを阻害する、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
前記チェックポイント阻害剤ポリペプチドが、抗体である、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１５】
前記阻害性チェックポイントポリペプチドが、ＣＴＬＡ４に特異的に結合する抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片、ＰＤ１に特異的に結合する抗ＰＤ１抗体またはその抗原結合断片、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合断片、及びそれらの組み合わせから選択される抗体である、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
前記チェックポイント阻害剤ポリペプチドが、アテゾリズマブ、アベルマブ、またはデュルバルマブから選択される抗ＰＤ−Ｌ１抗体である、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
前記チェックポイント阻害剤ポリペプチドが、トレメリムマブまたはイピリムマブから選択される抗ＣＴＬＡ−４抗体である、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１８】
前記チェックポイント阻害剤ポリペプチドが、ニボルマブまたはペンブロリズマブから選択される抗ＰＤ１抗体である、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１９】
前記免疫チェックポイント調節因子が、１００〜３００ｍｇを送達するために十分な用量レベルで前記対象に投与される、請求項１１１〜１１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２０】
前記免疫チェックポイント調節因子が、２００ｍｇを送達するために十分な用量レベルで前記対象に投与される、請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２１】
前記免疫チェックポイント調節因子が、静脈内注入によって投与される、請求項１１１〜１２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２２】
前記免疫チェックポイント調節因子が、２回、３回、４回またはそれより多い回数で前記対象に投与される、請求項１１１〜１２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２３】
前記免疫チェックポイント調節因子が、前記ｍＲＮＡワクチン投与と同じ日に前記対象に投与される、請求項１１１〜１２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２４】
前記癌が、
（ｉ）非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺癌、メラノーマ、膀胱尿路上皮癌、ＨＰＶ陰性頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、及び高頻度マイクロサテライト（ＭＳＩ  Ｈ）／ミスマッチ修復（ＭＭＲ）欠損である固形悪性腫瘍からなる群；及び／または
（ｉｉ）膵臓、腹膜、大腸、小腸、胆道、肺、子宮内膜、卵巣、生殖管、胃腸管、子宮頸部、胃、尿路、結腸、直腸、ならびに造血系及びリンパ系組織の癌から選択される、請求項１０４〜１２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２５】
前記ＮＳＣＬＣが、ＥＧＦＲ感受性変異及び／またはＡＬＫ転座がない、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２６】
高頻度マイクロサテライト（ＭＳＩ  Ｈ）／ミスマッチ修復（ＭＭＲ）欠損である前記固形悪性腫瘍が、結腸直腸癌、胃腺癌、食道腺癌、及び子宮内膜癌からなる群から選択される、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２７】
１０００〜３０００ヌクレオチドを含むコンカテマー癌抗原をコードするｍＲＮＡの生成方法であって、
（ａ）請求項１〜１０３のいずれか１項に記載の癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを含む第１のポリヌクレオチド及び５’−ＵＴＲを含む第２のポリヌクレオチドの、固形担体に複合化したポリヌクレオチドへの結合と、
（ｂ）前記第２のポリヌクレオチドの３’末端の、前記第１のポリヌクレオチドの５’末端への適切な条件下でのライゲーションであって、前記適切な条件がＤＮＡリガーゼを含み、それによって、第１のライゲーション産物が生成する前記ライゲーションと、
（ｃ）３’−ＵＴＲを含む第３のポリヌクレオチドの５’末端の、前記第１のライゲーション産物の３’末端への、適切な条件下でのライゲーションであって、前記適切な条件がＲＮＡリガーゼを含み、それによって、第２のライゲーション産物が生成する前記ライゲーションと、
（ｄ）前記固形担体からの前記第２のライゲーション産物の遊離と、
を含み、それによって、前記１０００〜３０００ヌクレオチドを含むコンカテマー癌抗原をコードするｍＲＮＡが生成する、前記方法。
【請求項１２８】
個別化ｍＲＮＡ癌ワクチンでの対象の治療方法であって、患者特異的なミュータノームを生成するためのネオエピトープのセットの同定と、ＭＨＣとの結合強度、ＭＨＣとの結合多様性、免疫原性の予測度合い、自己反応性の低さ、及び／またはＴ細胞反応性に基づく、前記ワクチン向けネオエピトープのセットの前記ミュータノームからの選択と、前記ネオエピトープのセットをコードする前記ｍＲＮＡワクチンの調製と、前記対象からの試料の単離の２ヶ月以内に実施される、前記ｍＲＮＡワクチンの前記対象への投与と、を含む、前記方法。
【請求項１２９】
ネオエピトープのセットをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを有する個別化ｍＲＮＡ癌ワクチンにおける使用を目的とする、前記ネオエピトープのセットの同定方法であって、
（ａ）患者のトランスクリプトーム及び患者のエクソームの解析による患者特異的なミュータノームの同定と、
（ｂ）患者のＲＮＡシークエンシングにおける遺伝子もしくは転写物レベルの発現評価；バリアントコ−ル（ｖａｒｉａｎｔ  ｃａｌｌ）信頼スコア；ＲＮＡシークエンシングに基づく対立遺伝子特異的発現；保存的アミノ酸置換と非保存的アミノ酸置換との比較；点変異の位置（ＴＣＲの関与増加についての中心スコア（Ｃｅｎｔｅｒｉｎｇ  Ｓｃｏｒｅ））；点変異の位置（ＨＬＡとの結合の差異についての固定スコア（Ａｎｃｈｏｒｉｎｇ  Ｓｃｏｒｅ））；独自性（Ｓｅｌｆｎｅｓｓ）：患者のＷＥＳデータとのコアエピトープ相同性（＜１００％）；８マー〜１１マーについてはＨＬＡ−Ａ及びＨＬＡ−Ｂに対するＩＣ５０；１５マー〜２０マーについてはＨＬＡ−ＤＲＢ１に対するＩＣ５０；広範結合スコア（ｐｒｏｍｉｓｃｕｉｔｙ  Ｓｃｏｒｅ）；８マー〜１１マーについてはＨＬＡ−Ｃに対するＩＣ５０；１５マー〜２０マーについてはＨＬＡ−ＤＲＢ３〜５に対するＩＣ５０；１５マー〜２０マーについてはＨＬＡ−ＤＱＢ１／Ａ１に対するＩＣ５０；１５マー〜２０マーについてはＨＬＡ−ＤＰＢ１／Ａ１に対するＩＣ５０；クラスＩとクラスＩＩとの比率比較；患者においてカバーされるＨＬＡ−Ａアロタイプ、ＨＬＡ−Ｂアロタイプ、及びＨＬＡ−ＤＲＢ１アロタイプの多様性；点変異と複合エピトープとの比率比較；偽エピトープＨＬＡ結合スコア；ＲＮＡシークエンシングリードの存在及び／または存在量のうちの少なくとも３つに基づく、前記ネオエピトープに対する加重値を使用する、前記ミュータノームからの１５〜５００のネオエピトープのサブセットの選択と、
（ｃ）最高加重値に基づく、前記サブセットからの、個別化ｍＲＮＡ癌ワクチンにおける使用を目的とする前記ネオエピトープのセットの選択であって、前記ネオエピトープのセットが１５〜４０のネオエピトープを含む前記選択と、を含む、前記方法。
【請求項１３０】
ネオエピトープのセットをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを有する個別化ｍＲＮＡ癌ワクチンにおける使用を目的とする、前記ネオエピトープのセットの同定方法であって、
（ａ）患者の腫瘍からＲＮＡシークエンシング試料を生成して、ＲＮＡシークエンシングリードのセットを生成することと、
（ｂ）すべてのＲＮＡシークエンシングリードからヌクレオチド配列の総数をコンパイルすることと、
（ｃ）前記腫瘍試料と、同じ組織種の正常組織の対応するデータベースとの間で配列情報を比較することと、
（ｄ）最高加重値に基づく、前記サブセットからの、個別化ｍＲＮＡ癌ワクチンにおける使用を目的とするネオエピトープのセットの選択であって、前記ネオエピトープのセットが１５〜４０のネオエピトープを含む前記選択と、を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、２０１７年２月１日出願の「ＲＮＡ  ＣＡＮＣＥＲ  ＶＡＣＣＩＮＥＳ」と題する米国特許仮出願第６２／４５３，４４４号、２０１７年２月１日出願の「ＩＭＭＵＮＯＭＯＤＵＬＡＴＯＲＹ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ  ＭＲＮＡ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＥＮＣＯＤＩＮＧ  ＡＣＴＩＶＡＴＩＮＧ  ＯＮＣＯＧＥＮＥ  ＭＵＴＡＴＩＯＮ  ＰＥＰＴＩＤＥＳ」と題する米国特許仮出願第６２／４５３，４６５号、及び２０１７年９月１３日出願の「ＣＯＮＣＡＴＡＭＥＲＩＣ  ＲＮＡ  ＣＡＮＣＥＲ  ＶＡＣＣＩＮＥＳ」と題する米国特許仮出願第６２／５５８，２３８号の出願日の優先権を主張するものであり、当該出願のそれぞれの内容は、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
癌の進化における最近の理論は、ストレス誘発性のゲノム不安定性、集団の多様性または不均一性、及びゲノム媒介性の大進化を含む３つの段階に焦点を当てている。この理論は、既知の分子機序のほとんどが癌に関与する可能性があるものの、臨床例の大部分に対して優勢な単一の機序がない理由を説明している。しかしながら、一般的な機序は、癌ワクチンが癌治療の普遍的解決策を提供する可能性を示唆している。
【０００３】
癌ワクチンには、防止ワクチンまたは予防ワクチン（健康な人における癌の発症予防が意図される）、及び治療ワクチン（癌に対する体の自然防御力を強化することによる現存する癌の治療が意図される）が含まれる。癌防止ワクチンは、例えば、感染性疾患による癌の誘発を予防するために、癌の発症を誘発またはそれに寄与する感染病原体を標的とし得る。Ｇａｒｄａｓｉｌ（登録商標）及びＣｅｒｖａｒｉｘ（登録商標）は、市販の予防ワクチンの２つの例である。ワクチンはそれぞれ、ＨＰＶによる感染を防ぐものである。他の防止的な癌ワクチンは、未来において個体が癌を発症する可能性を増加させることが予測される宿主タンパク質または断片を標的とし得る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｐｒｉｏｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１２  Ｍａｙ  １５；７２（１０）：２４５７−２４６７
【非特許文献２】Ｄｉａｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｑｕｉｒｅｄ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ＥＧＦＲ  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｉｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒｓ，Ｎａｔｕｒｅ  ４８６：５３７（２０１２）
【非特許文献３】Ｍｉｓａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ  ｏｆ  ＫＲＡＳ  ｍｕａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ａｃｑｕｉｒｅｄ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ４８６：５３２（２０１２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
市販または開発中のワクチン（例えば、癌ワクチン）のほとんどが、微生物全体、タンパク質抗原、ペプチド、多糖、またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ワクチン、及びそれらの組み合わせに基づくものである。ＤＮＡのワクチン接種は、抗原に対する体液性及び細胞性の免疫応答を刺激するために使用される技術の１つである。遺伝子操作されたＤＮＡ（例えば、裸のプラスミドＤＮＡ）を生存宿主に直接注射することにより、少数の宿主細胞から抗原を直接産生し、防御性の免疫応答を生じさせる。しかしながら、この技術には、癌遺伝子の活性化または腫瘍抑制遺伝子の阻害をもたらし得る挿入変異誘発の可能性を含む、ワクチンのゲノムへのＤＮＡ組み込みの潜在的な問題がつきまとう。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
目的とするほぼ任意の癌タンパク質またはその断片を産生するように体の細胞機構を安全に誘導することができるＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））のリボ核酸（ＲＮＡ）癌ワクチンが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、修飾ＲＮＡである。本開示のＲＮＡワクチンを使用すると、例えば、挿入変異誘発が生じ得るというリスクを冒さずに、細胞性免疫と体液性免疫との両方を含む、癌に対するバランスのとれた免疫応答を誘導することができる。
【０００７】
ＲＮＡワクチンは、癌の有病率またはアンメットメディカルニーズの程度もしくはレベルに応じてさまざまな状況において利用してよい。ＲＮＡワクチンは、さまざまなステージまたは転移度の癌を治療及び／または予防するために利用してよい。癌ワクチンを含む代替の抗癌治療と比較して、ＲＮＡワクチンは、はるかに高い抗体価を生じさせ、より早く応答を生成する点で優れた特性を有する。理論に束縛されるものではないが、ＲＮＡワクチンは天然の細胞機構を取り入れているため、ｍＲＮＡポリヌクレオチドであるＲＮＡワクチンは、翻訳時に適切なタンパク質の立体構造を生成するように良好に設計されると考えられる。エクスビボで製造され、望ましくない細胞応答を誘発する可能性のある従来の治療法及びワクチンとは異なり、ＲＮＡワクチンは、より自然な方法で細胞系に提示される。
【０００８】
ＲＮＡワクチンは、少なくとも１つの癌抗原ポリペプチドまたはその免疫原性断片（例えば、癌に対する免疫応答を誘導する能力を有する免疫原性断片）をコードするオープンリーディングフレームを有するリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含み得る。他の実施形態は、癌に対する免疫応答を誘導する能力を有する２つ以上の抗原またはエピトープをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
【０００９】
本開示は、いくつかの態様では、脂質ナノ粒子に製剤化された、癌抗原ペプチドエピトープをコードするオープンリーディングフレームをそれぞれ有する１つまたは複数のｍＲＮＡのｍＲＮＡ癌ワクチン及び薬学的に許容される担体または賦形剤であり、ここで、ｍＲＮＡワクチンは、５〜１００のペプチドエピトープをコードし、ペプチドエピトープのうちの少なくとも２つは、個別化癌抗原である。
【００１０】
本開示、いくつかの態様では、個別化癌抗原である１〜５００のペプチドエピトープと、ユニバーサルタイプＩＩのＴ細胞エピトープとをコードする１つまたは複数のオープンリーディングフレームをそれぞれ有する１つまたは複数のｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子を含む、ｍＲＮＡ癌ワクチンを提供する。
【００１１】
本開示は、いくつかの態様では、次のうちの１つまたは複数を含む脂質ナノ粒子を含む、ｍＲＮＡ癌ワクチンを提供する：（ａ）個別化癌抗原である１〜５００のペプチドエピトープと、ユニバーサルタイプＩＩのＴ細胞エピトープとをコードする１つもしくは複数のオープンリーディングフレームをそれぞれ有する１つもしくは複数のｍＲＮＡ、（ｂ）活性化癌遺伝子変異ペプチドをコードするオープンリーディングフレームをそれぞれ有する１つもしくは複数のｍＲＮＡであって、任意選択で、ｍＲＮＡは、ユニバーサルタイプＩＩのＴ細胞エピトープをさらに含む、ｍＲＮＡ、（ｃ）癌抗原ペプチドエピトープをコードするオープンリーディングフレームをそれぞれ有する１つもしくは複数のｍＲＮＡであって、ｍＲＮＡワクチンは、５〜１００のペプチドエピトープをコードし、ペプチドエピトープのうちの少なくとも２つは、個別化癌抗原であり、任意選択で、ｍＲＮＡは、ユニバーサルタイプＩＩのＴ細胞エピトープをさらに含む、ｍＲＮＡ、及び／または（ｄ）癌抗原ペプチドエピトープをコードするオープンリーディングフレームをそれぞれ有する１つもしくは複数のｍＲＮＡであって、ｍＲＮＡワクチンは、５〜１００のペプチドエピトープをコードし、ペプチドエピトープのうちの少なくとも３つは、複合バリアントであり、ペプチドエピトープのうちの少なくとも２つは、点変異であり、任意選択で、ｍＲＮＡは、ユニバーサルタイプＩＩのＴ細胞エピトープをさらに含む、ｍＲＮＡ。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ癌ワクチンは、１〜２０のユニバーサルタイプＩＩのＴ細胞エピトープをコードする。他の実施形態では、ユニバーサルタイプＩＩのＴ細胞エピトープは、ＩＬＭＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩ（テタヌス毒素；配列番号２２６）、ＦＮＮＦＴＶＳＦＷＬＲＶＰＫＶＳＡＳＨＬＥ（テタヌス毒素；配列番号２２７）、ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥ（テタヌス毒素；配列番号２２８）ＱＳＩＡＬＳＳＬＭＶＡＱＡＩＰ（ジフテリア毒素；配列番号２２９）、及びＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ（汎ＤＲエピトープ；配列番号２３０）からなる群から選択される。
【００１２】
いくつかの実施形態では、ユニバーサルタイプＩＩのＴ細胞エピトープは、ｍＲＮＡ全体にわたって同じユニバーサルタイプＩＩのＴ細胞エピトープである。他の実施形態では、ユニバーサルタイプＩＩのＴ細胞エピトープは、ｍＲＮＡ中１〜２０回繰り返される。１つの実施形態では、ユニバーサルタイプＩＩのＴ細胞エピトープは、ｍＲＮＡ全体にわたって互いに異なる。いくつかの実施形態では、ユニバーサルタイプＩＩのＴ細胞エピトープは、すべての癌抗原ペプチドエピトープの間に位置する。別の実施形態では、ユニバーサルタイプＩＩのＴ細胞エピトープは、癌抗原ペプチドエピトープの間に１つおきに位置する。１つの実施形態では、ユニバーサルタイプＩＩのＴ細胞エピトープは、癌抗原ペプチドエピトープの間に２つおきに位置する。
【００１３】
いくつかの実施形態では、次の条件のうちの１つまたは複数を満たす：（ｉ）活性化癌遺伝子変異は、ＫＲＡＳ変異であること、（ｉｉ）ＫＲＡＳ変異は、Ｇ１２変異であり、任意選択で、Ｇ１２  ＫＲＡＳ変異は、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ａ、及びＧ１２Ｒ  ＫＲＡＳ変異から選択されること、（ｉｉｉ）ＫＲＡＳ変異は、Ｇ１３変異であり、任意選択で、Ｇ１３  ＫＲＡＳ変異は、Ｇ１３Ｄ  ＫＲＡＳ変異であること、及び／または（ｉｖ）活性化癌遺伝子変異は、Ｈ−ＲＡＳもしくはＮ−ＲＡＳ変異であること。
【００１４】
いくつかの実施形態では、次の条件のうちの１つまたは複数を満たす：（Ａ）ｍＲＮＡは、２つ以上の活性化癌遺伝子変異ペプチドのコンカテマーをコードするオープンリーディングフレームを有すること、（Ｂ）ペプチドエピトープのうちの少なくとも２つは、１つのグリシンによって互いに分離されており、任意選択で、ペプチドエピトープのすべてが、１つのグリシンによって互いに分離されていること、（Ｃ）コンカテマーは、３〜１０の活性化癌遺伝子変異ペプチドを含むこと、及び／または（Ｄ）ペプチドエピトープのうちの少なくとも２つは、リンカーなしで互いに直接連結されていること。
【００１５】
ある特定の実施形態では、次の条件のうちの１つまたは複数を満たす：（ｉ）ペプチドエピトープのうちの少なくとも１つは、従来型癌抗原であること、（ｉｉ）ペプチドエピトープのうちの少なくとも１つは、反復多型であること、（ｉｉｉ）反復多型は、ｐ５３における反復体細胞癌変異を含むこと、（ｉｖ）ｐ５３における反復体細胞癌変異は、（Ａ）コドン位置Ｔ１２５に隣接する標準５’スプライス部位における変異であって、エピトープＡＶＳＰＣＩＳＦＶＷ（配列番号２３３）（ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５８：０１）、エピトープＨＰＬＡＳＣＱＣＦＦ（配列番号２３４）（ＨＬＡ−Ｂ＊３５：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５３：０１）、エピトープＦＶＷＮＦＧＩＰＬ（配列番号２３５）（ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０６、ＨＬＡ−Ｂ＊３５：０１）を含むペプチド配列ＴＡＫＳＶＴＣＴＶＳＣＰＥＧＬＡＳＭＲＬＱＣＬＡＶＳＰＣＩＳＦＶＷＮＦＧＩＰＬＨＰＬＡＳＣＱＣＦＦＩＶＹＰＬＮＶ（配列番号２３２）を有する保持型イントロンを誘導する変異；（Ｂ）コドン位置３３１に隣接する標準５’スプライス部位における変異であって、エピトープＬＱＶＬＳＬＧＴＳＹ（配列番号２３７）（ＨＬＡ−Ｂ＊１５：０１）、エピトープＦＱＳＮＴＱＮＡＶＦ（配列番号２３８）（ＨＬＡ−Ｂ＊１５：０１）を含むペプチド配列ＥＹＦＴＬＱＶＬＳＬＧＴＳＹＱＶＥＳＦＱＳＮＴＱＮＡＶＦＦＬＴＶＬＰＡＩＧＡＦＡＩＲＧＱ（配列番号２３６）を有する保持型イントロンを誘導する変異；（Ｃ）コドン位置１２６に隣接する標準３’スプライス部位における変異であって、エピトープＣＴＭＦＣＱＬＡＫ（配列番号２４０）（ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１）、エピトープＫＳＶＴＣＴＭＦ（配列番号２４１）（ＨＬＡ−Ｂ＊５８：０１）を含む新規のスパニングペプチド配列ＡＫＳＶＴＣＴＭＦＣＱＬＡＫ（配列番号２３９）を生成する潜在性の代替エクソン３’スプライス部位を誘導する変異；及び／または（Ｄ）コドン位置２２４に隣接する標準５’スプライス部位における変異であって、エピトープＶＰＹＥＰＰＥＶＷ（配列番号２４３）（ＨＬＡ−Ｂ＊５３：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５１：０１）、エピトープＬＴＶＰＰＳＴＡＷ（配列番号２４４）（ＨＬＡ−Ｂ＊５８：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１）を含む新規のスパニングペプチド配列ＶＰＹＥＰＰＥＶＷＬＡＬＴＶＰＰＳＴＡＷＡＡ（配列番号２４２）を生成する潜在性の代替イントロン５’スプライス部位を誘導する変異（転写コドン位置は、Ｅｎｓｅｍｂｌのｖ８３のヒトゲノムアノテーションに由来する標準の全長ｐ５３転写物であるＥＮＳＴ０００００２６９３０５（配列番号２４５）を参照したものである）からなる群から選択されること、及び／または（ｖ）ｍＲＮＡ癌ワクチンは、安定剤を含まないこと。
【００１６】
いくつかの実施形態では、１つまたは複数のｍＲＮＡは、免疫増強剤をコードするオープンリーディングフレームをさらに含む。他の実施形態では、免疫増強剤は、脂質ナノ粒子に製剤化される。１つの実施形態では、免疫増強剤は、別個の脂質ナノ粒子に製剤化される。いくつかの実施形態では、免疫増強剤は、構造的に活性なヒトＳＴＩＮＧポリペプチドである。１つの実施形態では、構造的に活性なヒトＳＴＩＮＧポリペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、構造的に活性なヒトＳＴＩＮＧポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、配列番号１７０に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、構造的に活性なヒトＳＴＩＮＧポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、ｍｉＲ−１２２マイクロＲＮＡ結合部位を有する３’ＵＴＲを含む。１つの実施形態では、ｍｉＲ−１２２マイクロＲＮＡ結合部位は、配列番号１７５に示されるヌクレオチド配列を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態では、１つまたは複数のｍＲＮＡはそれぞれ、配列番号１７６に示すヌクレオチド配列を含む５’ＵＴＲを含む。１つの実施形態では、１つまたは複数のｍＲＮＡはそれぞれ、ポリＡテールを含む。１つの実施形態では、ポリＡテールは、約１００ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のｍＲＮＡはそれぞれ、５’キャップ１構造を含む。
【００１８】
いくつかの実施形態では、１つまたは複数のｍＲＮＡは、少なくとも１つの化学修飾を含む。１つの実施形態では、化学修飾は、Ｎ１−メチルシュードウリジンである。別の実施形態では、１つまたは複数のｍＲＮＡは、Ｎ１−メチルシュードウリジンで完全に修飾されている。
【００１９】
いくつかの実施形態では、１つまたは複数のｍＲＮＡは、４５〜５５の個別化癌抗原をコードする。１つの実施形態では、１つまたは複数のｍＲＮＡは、５２の個別化癌抗原をコードする。いくつかの実施形態では、個別化癌抗原のそれぞれは、別個のオープンリーディングフレームによってコードされる。別の実施形態では、ペプチドエピトープは、２〜１００のペプチドエピトープから構成されるコンカテマー癌抗原の形態であり、任意選択で、コンカテマー癌抗原は、５〜１００のペプチドエピトープから構成される。
【００２０】
いくつかの実施形態では、コンカテマー癌抗原は、ａ）２〜１００のペプチドエピトープもしくは５〜１００のペプチドエピトープが、切断感受性部位が間に入ることによって散在していること、ｂ）それぞれのペプチドエピトープをコードするｍＲＮＡが、リンカーなしで互いに直接連結されていること、ｃ）それぞれのペプチドエピトープをコードするｍＲＮＡが、単一のヌクレオチドリンカーで互いに連結されていること、ｄ）それぞれのペプチドエピトープが、２５〜３５アミノ酸を含み、かつ中央に位置するＳＮＰ変異を含むこと、ｅ）ペプチドエピトープの少なくとも３０％が、対象に由来するクラスＩのＭＨＣ分子に対して最も高い親和性を有すること、ｆ）ペプチドエピトープの少なくとも３０％が、対象に由来するクラスＩＩのＭＨＣ分子に対して最も高い親和性を有すること、ｇ）ペプチドエピトープの少なくとも５０％が、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、及び／またはＤＲＢ１に対してＩＣ＞５００ｎＭの予測結合親和性を有すること、ｈ）ｍＲＮＡが、４５〜５５のペプチドエピトープをコードすること、ｉ）ｍＲＮＡが、５２のペプチドエピトープをコードすること、ｊ）ペプチドエピトープの５０％が、クラスＩのＭＨＣに対して結合親和性を有し、かつペプチドエピトープの５０％が、クラスＩＩのＭＨＣに対して結合親和性を有すること、ｋ）ペプチドエピトープをコードするｍＲＮＡが、ペプチドエピトープの順序が偽エピトープ（ｐｓｅｕｄｏ−ｅｐｉｔｏｐｅ）を最小化する順序になるように配置されること、ｌ）ペプチドエピトープの少なくとも３０％が、１５アミノ酸長のＭＨＣクラスＩ結合ペプチドであること、及び／またはｍ）ペプチドエピトープの少なくとも３０％が、２１アミノ酸長のＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドであることのうちの１つまたは複数を含む。
【００２１】
いくつかの態様では、本開示は、脂質ナノ粒子に製剤化された、個別化癌抗原である４５〜５５のペプチドエピトープをコードする１つまたは複数のオープンリーディングフレームをそれぞれ有する１つまたは複数のｍＲＮＡを含む、ｍＲＮＡ癌ワクチンを提供する。
【００２２】
いくつかの態様では、本開示は、脂質ナノ粒子に製剤化された、個別化癌抗原である４５〜５５のペプチドエピトープをコードする１つまたは複数のオープンリーディングフレームをそれぞれ有する１つまたは複数のｍＲＮＡを含み、任意選択で、ペプチドエピトープのうちの少なくとも１つは、活性化癌遺伝子変異ペプチドまたは従来型癌抗原であり、任意選択で、ペプチドエピトープのうちの少なくとも３つは、複合バリアントであり、ペプチドエピトープのうちの少なくとも２つは、点変異である、ｍＲＮＡ癌ワクチンを提供する。
【００２３】
いくつかの実施形態では、１つまたは複数のｍＲＮＡは、４８〜５４の個別化癌抗原をコードする。１つの実施形態では、１つまたは複数のｍＲＮＡは、５２の個別化癌抗原をコードする。いくつかの実施形態では、個別化癌抗原のそれぞれは、別個のオープンリーディングフレームによってコードされる。
【００２４】
別の実施形態では、ペプチドエピトープは、２〜１００のペプチドエピトープから構成されるコンカテマー癌抗原の形態であり、任意選択で、コンカテマー癌抗原は、５〜１００のペプチドエピトープから構成される。いくつかの実施形態では、コンカテマー癌抗原は、ａ）２〜１００のペプチドエピトープもしくは５〜１００のペプチドエピトープが、切断感受性部位が間に入ることによって散在していること、ｂ）それぞれのペプチドエピトープをコードするｍＲＮＡが、リンカーなしで互いに直接連結されていること、ｃ）それぞれのペプチドエピトープをコードするｍＲＮＡが、単一のヌクレオチドリンカーで互いに連結されていること、ｄ）それぞれのペプチドエピトープが、２５〜３５アミノ酸を含み、かつ中央に位置するＳＮＰ変異を含むこと、ｅ）ペプチドエピトープの少なくとも３０％が、対象に由来するクラスＩのＭＨＣ分子に対して最も高い親和性を有すること、ｆ）ペプチドエピトープの少なくとも３０％が、対象に由来するクラスＩＩのＭＨＣ分子に対して最も高い親和性を有すること、ｇ）ペプチドエピトープの少なくとも５０％が、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、及び／またはＤＲＢ１に対してＩＣ＞５００ｎＭの予測結合親和性を有すること、ｈ）ｍＲＮＡが、４５〜５５のペプチドエピトープをコードすること、ｉ）ｍＲＮＡが、５２のペプチドエピトープをコードすること、ｊ）ペプチドエピトープの５０％が、クラスＩのＭＨＣに対して結合親和性を有し、かつペプチドエピトープの５０％が、クラスＩＩのＭＨＣに対して結合親和性を有すること、ｋ）ペプチドエピトープをコードするｍＲＮＡが、ペプチドエピトープの順序が偽エピトープ（ｐｓｅｕｄｏ−ｅｐｉｔｏｐｅ）を最小化する順序になるように配置されること、ｌ）ペプチドエピトープの少なくとも３０％が、１５アミノ酸長のＭＨＣクラスＩ結合ペプチドであること、及び／またはｍ）ペプチドエピトープの少なくとも３０％が、２１アミノ酸長のＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドであることのうちの１つまたは複数を含む。
【００２５】
いくつかの実施形態では、ペプチドエピトープのうちの少なくとも２つは、ユニバーサルタイプＩＩのＴ細胞エピトープによって互いに分離されている。１つの実施形態では、ペプチドエピトープのすべてが、ユニバーサルタイプＩＩのＴ細胞エピトープによって互いに分離されている。別の実施形態では、ｍＲＮＡ癌ワクチンは、１〜２０のユニバーサルタイプＩＩのＴ細胞エピトープをコードする。
【００２６】
いくつかの実施形態では、ユニバーサルタイプＩＩのＴ細胞エピトープは、ＩＬＭＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩ（テタヌス毒素；配列番号２２６）、ＦＮＮＦＴＶＳＦＷＬＲＶＰＫＶＳＡＳＨＬＥ（テタヌス毒素；配列番号２２７）、ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥ（テタヌス毒素；配列番号２２８）ＱＳＩＡＬＳＳＬＭＶＡＱＡＩＰ（ジフテリア毒素；配列番号２２９）、及びＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ（汎ＤＲエピトープ；配列番号２３０）からなる群から選択される。
【００２７】
１つの実施形態では、ユニバーサルタイプＩＩのＴ細胞エピトープは、ｍＲＮＡ全体にわたって同じユニバーサルタイプＩＩのＴ細胞エピトープである。いくつかの実施形態では、ユニバーサルタイプＩＩのＴ細胞エピトープは、ｍＲＮＡ中１〜２０回繰り返される。別の実施形態では、ユニバーサルタイプＩＩのＴ細胞エピトープは、ｍＲＮＡ全体にわたって互いに異なる。１つの実施形態では、ユニバーサルタイプＩＩのＴ細胞エピトープは、すべてのペプチドエピトープの間に位置する。いくつかの実施形態では、ユニバーサルタイプＩＩのＴ細胞エピトープは、癌抗原ペプチドエピトープの間に１つおきに位置する。１つの実施形態では、ユニバーサルタイプＩＩのＴ細胞エピトープは、ペプチドエピトープの間に２つおきに位置する。
【００２８】
いくつかの実施形態では、１つまたは複数のｍＲＮＡは、免疫増強剤をコードするオープンリーディングフレームをさらに含む。１つの実施形態では、免疫増強剤は、脂質ナノ粒子に製剤化される。別の実施形態では、免疫増強剤は、別個の脂質ナノ粒子に製剤化される。いくつかの実施形態では、免疫増強剤は、構造的に活性なヒトＳＴＩＮＧポリペプチドである。１つの実施形態では、構造的に活性なヒトＳＴＩＮＧポリペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、構造的に活性なヒトＳＴＩＮＧポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、配列番号１７０に示されるヌクレオチド配列を含む。
【００２９】
いくつかの実施形態では、次の条件のうちの１つまたは複数を満たす：（ｉ）活性化癌遺伝子変異は、ＫＲＡＳ変異であること、（ｉｉ）ＫＲＡＳ変異は、Ｇ１２変異であり、任意選択で、Ｇ１２  ＫＲＡＳ変異は、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ａ、及びＧ１２Ｒ  ＫＲＡＳ変異から選択されること、（ｉｉｉ）ＫＲＡＳ変異は、Ｇ１３変異であり、任意選択で、Ｇ１３  ＫＲＡＳ変異は、Ｇ１３Ｄ  ＫＲＡＳ変異であること、及び／または（ｉｖ）活性化癌遺伝子変異は、Ｈ−ＲＡＳもしくはＮ−ＲＡＳ変異であること。
【００３０】
ある特定の実施形態では、次の条件のうちの１つまたは複数を満たす：（Ａ）ｍＲＮＡは、２つ以上の活性化癌遺伝子変異ペプチドのコンカテマーをコードするオープンリーディングフレームを有すること、（Ｂ）ペプチドエピトープのうちの少なくとも２つは、１つのグリシンによって互いに分離されており、任意選択で、ペプチドエピトープのすべてが、１つのグリシンによって互いに分離されていること、（Ｃ）コンカテマーは、３〜１０の活性化癌遺伝子変異ペプチドを含むこと、及び／または（Ｄ）ペプチドエピトープのうちの少なくとも２つは、リンカーなしで互いに直接連結されていること。
【００３１】
具体的な実施形態では、次の条件のうちの１つまたは複数を満たす：（ｉ）ペプチドエピトープのうちの少なくとも１つは、従来型癌抗原であること、（ｉｉ）ペプチドエピトープのうちの少なくとも１つは、反復多型であること、（ｉｉｉ）反復多型は、ｐ５３における反復体細胞癌変異を含むこと、（ｉｖ）ｐ５３における反復体細胞癌変異は、（Ａ）コドン位置Ｔ１２５に隣接する標準５’スプライス部位における変異であって、エピトープＡＶＳＰＣＩＳＦＶＷ（配列番号２３３）（ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５８：０１）、エピトープＨＰＬＡＳＣＱＣＦＦ（配列番号２３４）（ＨＬＡ−Ｂ＊３５：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５３：０１）、エピトープＦＶＷＮＦＧＩＰＬ（配列番号２３５）（ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０６、ＨＬＡ−Ｂ＊３５：０１）を含むペプチド配列ＴＡＫＳＶＴＣＴＶＳＣＰＥＧＬＡＳＭＲＬＱＣＬＡＶＳＰＣＩＳＦＶＷＮＦＧＩＰＬＨＰＬＡＳＣＱＣＦＦＩＶＹＰＬＮＶ（配列番号２３２）を有する保持型イントロンを誘導する変異；（Ｂ）コドン位置３３１に隣接する標準５’スプライス部位における変異であって、エピトープＬＱＶＬＳＬＧＴＳＹ（配列番号２３７）（ＨＬＡ−Ｂ＊１５：０１）、エピトープＦＱＳＮＴＱＮＡＶＦ（配列番号２３８）（ＨＬＡ−Ｂ＊１５：０１）を含むペプチド配列ＥＹＦＴＬＱＶＬＳＬＧＴＳＹＱＶＥＳＦＱＳＮＴＱＮＡＶＦＦＬＴＶＬＰＡＩＧＡＦＡＩＲＧＱ（配列番号２３６）を有する保持型イントロンを誘導する変異；（Ｃ）コドン位置１２６に隣接する標準３’スプライス部位における変異であって、エピトープＣＴＭＦＣＱＬＡＫ（配列番号２４０）（ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１）、エピトープＫＳＶＴＣＴＭＦ（配列番号２４１）（ＨＬＡ−Ｂ＊５８：０１）を含む新規のスパニングペプチド配列ＡＫＳＶＴＣＴＭＦＣＱＬＡＫ（配列番号２３９）を生成する潜在性の代替エクソン３’スプライス部位を誘導する変異；及び／または（Ｄ）コドン位置２２４に隣接する標準５’スプライス部位における変異であって、エピトープＶＰＹＥＰＰＥＶＷ（配列番号２４３）（ＨＬＡ−Ｂ＊５３：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５１：０１）、エピトープＬＴＶＰＰＳＴＡＷ（配列番号２４４）（ＨＬＡ−Ｂ＊５８：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１）を含む新規のスパニングペプチド配列ＶＰＹＥＰＰＥＶＷＬＡＬＴＶＰＰＳＴＡＷＡＡ（配列番号２４２）を生成する潜在性の代替イントロン５’スプライス部位を誘導する変異（転写コドン位置は、Ｅｎｓｅｍｂｌのｖ８３のヒトゲノムアノテーションに由来する標準の全長ｐ５３転写物であるＥＮＳＴ０００００２６９３０５（配列番号２４５）を参照したものである）からなる群から選択されること、及び／または（ｖ）ｍＲＮＡ癌ワクチンは、安定剤を含まないこと。
【００３２】
本開示の別の態様は、（ｉ）個別化癌抗原である１〜５００のペプチドエピトープをコードする１つまたは複数のオープンリーディングフレームをそれぞれ有する１つまたは複数のｍＲＮＡと、（ｉｉ）個別化癌抗原に対する免疫応答を高めるポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡと、を含む、脂質ナノ粒子を含み、任意選択で、（ｉ）及び（ｉｉ）は、およそ５：１の質量比で存在する、ｍＲＮＡ癌ワクチンである。
【００３３】
本開示の別の態様は、（ｉ）個別化癌抗原である１〜５００のペプチドエピトープをコードする１つまたは複数のオープンリーディングフレームをそれぞれ有する１つまたは複数のｍＲＮＡと、（ｉｉ）個別化癌抗原に対する免疫応答を高めるポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡと、を含む、脂質ナノ粒子を含み、任意選択で、（ｉ）及び（ｉｉ）は、およそ５：１の質量比で存在し、任意選択で、ペプチドエピトープのうちの少なくとも１つは、活性化癌遺伝子変異ペプチドまたは従来型癌抗原であり、任意選択で、ペプチドエピトープのうちの少なくとも３つは、複合バリアントであり、ペプチドエピトープのうちの少なくとも２つは、点変異である、ｍＲＮＡ癌ワクチンである。
【００３４】
いくつかの実施形態では、免疫応答は、（ｉ）Ｉ型インターフェロン経路のシグナル伝達を刺激すること、（ｉｉ）ＮＦｋＢ経路のシグナル伝達を刺激すること、（ｉｉｉ）炎症反応を刺激すること、（ｉｖ）サイトカイン産生を刺激すること、または（ｖ）樹状細胞の発生、活性もしくは動員を刺激すること、及び（ｖｉ）（ｉ）〜（ｖｉ）のいずれかの組み合わせを特徴とする細胞性または体液性免疫応答を含む。
【００３５】
１つの実施形態では、ｍＲＮＡ癌ワクチンは、ペプチドエピトープと、個別化癌抗原に対する免疫応答を高めるポリペプチドとの両方をコードする単一のｍＲＮＡ構築物を含む。別の実施形態では、ペプチドエピトープは、２〜１００のペプチドエピトープから構成されるコンカテマー癌抗原の形態であり、任意選択で、コンカテマー癌抗原は、５〜１００のペプチドエピトープから構成される。
【００３６】
いくつかの実施形態では、コンカテマー癌抗原は、ａ）２〜１００のペプチドエピトープもしくは５〜１００のペプチドエピトープが、切断感受性部位が間に入ることによって散在していること、ｂ）それぞれのペプチドエピトープをコードするｍＲＮＡが、リンカーなしで互いに直接連結されていること、ｃ）それぞれのペプチドエピトープをコードするｍＲＮＡが、単一のヌクレオチドリンカーで互いに連結されていること、ｄ）それぞれのペプチドエピトープが、２５〜３５アミノ酸を含み、かつ中央に位置するＳＮＰ変異を含むこと、ｅ）ペプチドエピトープの少なくとも３０％が、対象に由来するクラスＩのＭＨＣ分子に対して最も高い親和性を有すること、ｆ）ペプチドエピトープの少なくとも３０％が、対象に由来するクラスＩＩのＭＨＣ分子に対して最も高い親和性を有すること、ｇ）ペプチドエピトープの少なくとも５０％が、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、及び／またはＤＲＢ１に対してＩＣ＞５００ｎＭの予測結合親和性を有すること、ｈ）ｍＲＮＡが、４５〜５５のペプチドエピトープをコードすること、ｉ）ｍＲＮＡが、５２のペプチドエピトープをコードすること、ｊ）ペプチドエピトープの５０％が、クラスＩのＭＨＣに対して結合親和性を有し、かつペプチドエピトープの５０％が、クラスＩＩのＭＨＣに対して結合親和性を有すること、ｋ）ペプチドエピトープをコードするｍＲＮＡが、ペプチドエピトープの順序が偽エピトープ（ｐｓｅｕｄｏ−ｅｐｉｔｏｐｅ）を最小化する順序になるように配置されること、ｌ）ペプチドエピトープの少なくとも３０％が、１５アミノ酸長のＭＨＣクラスＩ結合ペプチドであること、及び／またはｍ）ペプチドエピトープの少なくとも３０％が、２１アミノ酸長のＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドであることのうちの１つまたは複数を含む。
【００３７】
いくつかの実施形態では、それぞれのペプチドエピトープは、中央に位置するＳＮＰ変異を含み、ＳＮＰ変異の両側には１５の隣接アミノ酸が存在する。
【００３８】
１つの実施形態では、対象において少なくとも１つの個別化癌抗原に対する免疫応答を高めるポリペプチドは、構造的に活性なヒトＳＴＩＮＧポリペプチドである。１つの実施形態では、構造的に活性なヒトＳＴＩＮＧポリペプチドは、Ｖ１４７Ｌ、Ｎ１５４Ｓ、Ｖ１５５Ｍ、Ｒ２８４Ｍ、Ｒ２８４Ｋ、Ｒ２８４Ｔ、Ｅ３１５Ｑ、Ｒ３７５Ａ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される１つまたは複数の変異を含む。別の実施形態では、構造的に活性なヒトＳＴＩＮＧポリペプチドは、Ｖ１５５Ｍ変異を含む。別の実施形態では、構造的に活性なヒトＳＴＩＮＧポリペプチドは、変異Ｒ２８４Ｍ／Ｖ１４７Ｌ／Ｎ１５４Ｓ／Ｖ１５５Ｍを含む。
【００３９】
いくつかの実施形態では、それぞれのｍＲＮＡは、同じまたは異なる脂質ナノ粒子に製剤化される。別の実施形態では、癌個別化癌抗原をコードするそれぞれのｍＲＮＡは、同じまたは異なる脂質ナノ粒子に製剤化される。いくつかの実施形態では、個別化癌抗原に対する免疫応答を高めるポリペプチドをコードするそれぞれのｍＲＮＡは、同じまたは異なる脂質ナノ粒子に製剤化される。
【００４０】
いくつかの実施形態では、個別化癌抗原をコードするそれぞれのｍＲＮＡは、同じ脂質ナノ粒子に製剤化され、個別化癌抗原に対する免疫応答を高めるポリペプチドをコードするそれぞれのｍＲＮＡは、異なる脂質ナノ粒子に製剤化される。別の実施形態では、個別化癌抗原をコードするそれぞれのｍＲＮＡは、同じ脂質ナノ粒子に製剤化され、個別化癌抗原に対する免疫応答を高めるポリペプチドをコードするそれぞれのｍＲＮＡは、個別化癌抗原をコードするそれぞれのｍＲＮＡと同じ脂質ナノ粒子に製剤化される。いくつかの実施形態では、個別化癌抗原をコードするそれぞれのｍＲＮＡは、異なる脂質ナノ粒子に製剤化され、個別化癌抗原に対する免疫応答を高めるポリペプチドをコードするそれぞれのｍＲＮＡは、それぞれの個別化癌抗原をコードするそれぞれのｍＲＮＡと同じ脂質ナノ粒子に製剤化される。
【００４１】
いくつかの実施形態では、ペプチドエピトープは、Ｔ細胞エピトープ及び／またはＢ細胞エピトープである。他の実施形態では、ペプチドエピトープは、Ｔ細胞エピトープとＢ細胞エピトープの組み合わせを含む。１つの実施形態では、ペプチドエピトープのうちの少なくとも１つは、Ｔ細胞エピトープである。別の実施形態では、ペプチドエピトープのうちの少なくとも１つは、Ｂ細胞エピトープである。
【００４２】
いくつかの実施形態では、ペプチドエピトープは、対象のＭＨＣに対する結合強度について最適化されている。他の実施形態では、それぞれのエピトープのＴＣＲ面は、内因性タンパク質に対する類似性が低い。
【００４３】
別の実施形態では、ｍＲＮＡ癌ワクチンは、リコール抗原をさらに含む。いくつかの実施形態では、リコール抗原は、感染性疾患抗原である。
【００４４】
１つの実施形態では、ｍＲＮＡ癌ワクチンは、１つまたは複数の従来型癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡをさらに含む。
【００４５】
１つの実施形態では、次の条件のうちの１つまたは複数を満たす：（ｉ）活性化癌遺伝子変異は、ＫＲＡＳ変異であること、（ｉｉ）ＫＲＡＳ変異は、Ｇ１２変異であり、任意選択で、Ｇ１２  ＫＲＡＳ変異は、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ａ、及びＧ１２Ｒ  ＫＲＡＳ変異から選択されること、（ｉｉｉ）ＫＲＡＳ変異は、Ｇ１３変異であり、任意選択で、Ｇ１３  ＫＲＡＳ変異は、Ｇ１３Ｄ  ＫＲＡＳ変異であること、及び／または（ｉｖ）活性化癌遺伝子変異は、Ｈ−ＲＡＳもしくはＮ−ＲＡＳ変異であること。
【００４６】
１つの実施形態では、次の条件のうちの１つまたは複数を満たす：（Ａ）ｍＲＮＡは、２つ以上の活性化癌遺伝子変異ペプチドのコンカテマーをコードするオープンリーディングフレームを有すること、（Ｂ）ペプチドエピトープのうちの少なくとも２つは、１つのグリシンによって互いに分離されており、任意選択で、ペプチドエピトープのすべてが、１つのグリシンによって互いに分離されていること、（Ｃ）コンカテマーは、３〜１０の活性化癌遺伝子変異ペプチドを含むこと、及び／または（Ｄ）ペプチドエピトープのうちの少なくとも２つは、リンカーなしで互いに直接連結されていること。
【００４７】
１つの実施形態では、次の条件のうちの１つまたは複数を満たす：（ｉ）ペプチドエピトープのうちの少なくとも１つは、従来型癌抗原であること、（ｉｉ）ペプチドエピトープのうちの少なくとも１つは、反復多型であること、（ｉｉｉ）反復多型は、ｐ５３における反復体細胞癌変異を含むこと、（ｉｖ）ｐ５３における反復体細胞癌変異は、（Ａ）コドン位置Ｔ１２５に隣接する標準５’スプライス部位における変異であって、エピトープＡＶＳＰＣＩＳＦＶＷ（配列番号２３３）（ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５８：０１）、エピトープＨＰＬＡＳＣＱＣＦＦ（配列番号２３４）（ＨＬＡ−Ｂ＊３５：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５３：０１）、エピトープＦＶＷＮＦＧＩＰＬ（配列番号２３５）（ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０６、ＨＬＡ−Ｂ＊３５：０１）を含むペプチド配列ＴＡＫＳＶＴＣＴＶＳＣＰＥＧＬＡＳＭＲＬＱＣＬＡＶＳＰＣＩＳＦＶＷＮＦＧＩＰＬＨＰＬＡＳＣＱＣＦＦＩＶＹＰＬＮＶ（配列番号２３２）を有する保持型イントロンを誘導する変異；（Ｂ）コドン位置３３１に隣接する標準５’スプライス部位における変異であって、エピトープＬＱＶＬＳＬＧＴＳＹ（配列番号２３７）（ＨＬＡ−Ｂ＊１５：０１）、エピトープＦＱＳＮＴＱＮＡＶＦ（配列番号２３８）（ＨＬＡ−Ｂ＊１５：０１）を含むペプチド配列ＥＹＦＴＬＱＶＬＳＬＧＴＳＹＱＶＥＳＦＱＳＮＴＱＮＡＶＦＦＬＴＶＬＰＡＩＧＡＦＡＩＲＧＱ（配列番号２３６）を有する保持型イントロンを誘導する変異；（Ｃ）コドン位置１２６に隣接する標準３’スプライス部位における変異であって、エピトープＣＴＭＦＣＱＬＡＫ（配列番号２４０）（ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１）、エピトープＫＳＶＴＣＴＭＦ（配列番号２４１）（ＨＬＡ−Ｂ＊５８：０１）を含む新規のスパニングペプチド配列ＡＫＳＶＴＣＴＭＦＣＱＬＡＫ（配列番号２３９）を生成する潜在性の代替エクソン３’スプライス部位を誘導する変異；及び／または（Ｄ）コドン位置２２４に隣接する標準５’スプライス部位における変異であって、エピトープＶＰＹＥＰＰＥＶＷ（配列番号２４３）（ＨＬＡ−Ｂ＊５３：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５１：０１）、エピトープＬＴＶＰＰＳＴＡＷ（配列番号２４４）（ＨＬＡ−Ｂ＊５８：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１）を含む新規のスパニングペプチド配列ＶＰＹＥＰＰＥＶＷＬＡＬＴＶＰＰＳＴＡＷＡＡ（配列番号２４２）を生成する潜在性の代替イントロン５’スプライス部位を誘導する変異（転写コドン位置は、Ｅｎｓｅｍｂｌのｖ８３のヒトゲノムアノテーションに由来する標準の全長ｐ５３転写物であるＥＮＳＴ０００００２６９３０５（配列番号２４５）を参照したものである）からなる群から選択されること、及び／または（ｖ）ｍＲＮＡ癌ワクチンは、安定剤を含まないこと。
【００４８】
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約２０〜６０％のイオン化可能なアミノ脂質：５〜２５％の中性脂質：２５〜５５％のステロール；０．５〜１５％のＰＥＧ修飾脂質のモル比を含み、任意選択で、イオン化可能なアミノ脂質は、カチオン性脂質である。１つの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約５０％の化合物２５：約１０％のＤＳＰＣ：約３８．５％のコレステロール；約１．５％のＰＥＧ−ＤＭＧのモル比を含む。別の実施形態では、イオン化可能なアミノ脂質は、例えば、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）−ノナ−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、式（Ｉ）の化合物を含む。１つの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、化合物２５である。別の実施形態では、脂質ナノ粒子は、０．４未満の多分散値を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、中性のｐＨ値で正味の中性電荷を有する。
【００４９】
１つの実施形態では、それぞれのエピトープのＴＣＲ面は、内因性タンパク質に対する類似性が低い。
【００５０】
別の実施形態では、ｍＲＮＡは、免疫チェックポイント調節因子をコードするオープンリーディングフレームをさらに含む。１つの実施形態では、ｍＲＮＡ癌ワクチンは、追加の癌治療剤をさらに含み、任意選択で、追加の癌治療剤は、免疫チェックポイント調節因子である。別の実施形態では、免疫チェックポイント調節因子は、阻害性チェックポイントポリペプチドである。いくつかの実施形態では、阻害性チェックポイントポリペプチドは、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ−３、ＶＩＳＴＡ、Ａ２ＡＲ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、またはそれらの組み合わせを阻害する。
【００５１】
いくつかの実施形態では、チェックポイント阻害剤ポリペプチドは、抗体である。１つの実施形態では、阻害性チェックポイントポリペプチドは、ＣＴＬＡ４に特異的に結合する抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片、ＰＤ１に特異的に結合する抗ＰＤ１抗体またはその抗原結合断片、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合断片、及びそれらの組み合わせから選択される抗体である。１つの実施形態では、チェックポイント阻害剤ポリペプチドは、アテゾリズマブ、アベルマブ、またはデュルバルマブから選択される抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。別の実施形態では、チェックポイント阻害剤ポリペプチドは、トレメリムマブまたはイピリムマブから選択される抗ＣＴＬＡ−４抗体である。いくつかの実施形態では、チェックポイント阻害剤ポリペプチドは、ニボルマブまたはペンブロリズマブから選択される抗ＰＤ１抗体である。
【００５２】
いくつかの実施形態では、化学修飾は、シュードウリジン、Ｎ１−メチルシュードウリジン、２−チオウリジン、４’−チオウリジン、５−メチルシトシン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−シュードウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオ−ジヒドロシュードウリジン、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−シュードウリジン、４−メトキシ−２−チオ−シュードウリジン、４−メトキシ−シュードウリジン、４−チオ−１−メチル−シュードウリジン、４−チオ−シュードウリジン、５−アザ−ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５−メチルウリジン、５−メチルウリジン、５−メトキシウリジン、及び２’−Ｏ−メチルウリジンからなる群から選択される。
【００５３】
本開示は、別の態様では、癌を有する対象に、上記のｍＲＮＡ癌ワクチンを投与することを含む、対象のワクチン接種方法を提供する。
【００５４】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡワクチンは、１０μｇ〜４００μｇのｍＲＮＡワクチンを送達するために十分な用量レベルで対象に投与される。１つの実施形態では、ｍＲＮＡワクチンは、０．０３３ｍｇ、０．１ｍｇ、０．２ｍｇ、または０．４ｍｇを送達するために十分な用量レベルで対象に投与される。別の実施形態では、ｍＲＮＡワクチンは、２回、３回、４回またはそれより多い回数で対象に投与される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡワクチンは、３週間ごとに１日１回投与される。１つの実施形態では、ｍＲＮＡワクチンは、皮内、筋肉内、及び／または皮下投与によって投与される。別の実施形態では、ｍＲＮＡワクチンは、筋肉内投与によって投与される。
【００５５】
いくつかの実施形態では、方法は、追加の癌治療剤を投与することをさらに含み、任意選択で、追加の癌治療剤は、対象に対する免疫チェックポイント調節因子である。１つの実施形態では、免疫チェックポイント調節因子は、阻害性チェックポイントポリペプチドである。別の実施形態では、阻害性チェックポイントポリペプチドは、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ−３、ＶＩＳＴＡ、Ａ２ＡＲ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、またはそれらの組み合わせを阻害する。いくつかの実施形態では、チェックポイント阻害剤ポリペプチドは、抗体である。他の実施形態では、阻害性チェックポイントポリペプチドは、ＣＴＬＡ４に特異的に結合する抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片、ＰＤ１に特異的に結合する抗ＰＤ１抗体またはその抗原結合断片、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合断片、及びそれらの組み合わせから選択される抗体である。いくつかの実施形態では、チェックポイント阻害剤ポリペプチドは、アテゾリズマブ、アベルマブ、またはデュルバルマブから選択される抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。別の実施形態では、チェックポイント阻害剤ポリペプチドは、トレメリムマブまたはイピリムマブから選択される抗ＣＴＬＡ−４抗体である。他の実施形態では、チェックポイント阻害剤ポリペプチドは、ニボルマブまたはペンブロリズマブから選択される抗ＰＤ１抗体である。
【００５６】
１つの実施形態では、免疫チェックポイント調節因子は、１００〜３００ｍｇを送達するために十分な用量レベルで対象に投与される。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント調節因子は、２００ｍｇを送達するために十分な用量レベルで対象に投与される。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント調節因子は、静脈内注入によって投与される。１つの実施形態では、免疫チェックポイント調節因子は、２回、３回、４回またはそれより多い回数で対象に投与される。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント調節因子は、ｍＲＮＡワクチン投与と同じ日に対象に投与される。
【００５７】
いくつかの実施形態では、癌は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺癌、メラノーマ、膀胱尿路上皮癌、ＨＰＶ陰性頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、及び高頻度マイクロサテライト（ＭＳＩ  Ｈ）／ミスマッチ修復（ＭＭＲ）欠損である固形悪性腫瘍からなる群から選択される。１つの実施形態では、ＮＳＣＬＣは、ＥＧＦＲ感受性変異及び／またはＡＬＫ転座がない。別の実施形態では、高頻度マイクロサテライト（ＭＳＩ  Ｈ）／ミスマッチ修復（ＭＭＲ）欠損である固形悪性腫瘍は、結腸直腸癌、胃腺癌、食道腺癌、及び子宮内膜癌からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、癌は、膵臓、腹膜、大腸、小腸、胆道、肺、子宮内膜、卵巣、生殖管、胃腸管、子宮頸部、胃、尿路、結腸、直腸、ならびに造血系及びリンパ系組織の癌から選択される。
【００５８】
本開示は、いくつかの態様では、脂質ナノ粒子に製剤化された、癌抗原ペプチドエピトープをコードするオープンリーディングフレームをそれぞれ有する１つまたは複数のｍＲＮＡのｍＲＮＡ癌ワクチン及び薬学的に許容される担体または賦形剤であり、ここで、ｍＲＮＡワクチンは、５〜１００のペプチドエピトープをコードし、ペプチドエピトープのうちの少なくとも２つは、個別化癌抗原である。
【００５９】
他の態様では、本発明は、癌抗原ペプチドエピトープをコードするオープンリーディングフレームをそれぞれ有する１つまたは複数のｍＲＮＡと、薬学的に許容される担体または賦形剤と、を有するｍＲＮＡ癌ワクチンであって、ｍＲＮＡワクチンは、５〜１００のペプチドエピトープをコードし、ペプチドエピトープのうちの少なくとも３つは、複合バリアントであり、ペプチドエピトープのうちの少なくとも２つは、点変異である、ｍＲＮＡ癌ワクチンである。
【００６０】
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、２０〜６０％のカチオン性脂質：５〜２５％の非カチオン性脂質：２５〜５５％のステロール；０．５〜１５％のＰＥＧ修飾脂質のモル比を含む。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、例えば、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）−ノナ−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）からなる群から選択される。他の実施形態では、脂質ナノ粒子は、式（Ｉ）の化合物を含む。いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、化合物２５である。
【００６１】
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、０．４未満の多分散値を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、中性のｐＨ値で正味の中性電荷を有する。
【００６２】
いくつかの実施形態のワクチンは、５〜１００のペプチドエピトープから構成されるコンカテマー癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有する、ｍＲＮＡである。さらに他の実施形態では、ペプチドエピトープのうちの少なくとも２つは、１つのグリシンによって互いに分離されている。さらに他の実施形態では、コンカテマー癌抗原は、２０〜４０のペプチドエピトープを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドエピトープのすべてが、１つのグリシンによって互いに分離されている。いくつかの実施形態では、ペプチドエピトープのうちの少なくとも２つは、リンカーなしで互いに直接連結されている。
【００６３】
実施形態のそれぞれのペプチドエピトープは、２５〜３５アミノ酸を含み、かつ中央に位置するＳＮＰ変異を含む。
【００６４】
いくつかの実施形態では、ペプチドエピトープの少なくとも３０％は、対象に由来するクラスＩのＭＨＣ分子に対して最も高い親和性を有する。さらに他の実施形態では、ペプチドエピトープの少なくとも３０％は、対象に由来するクラスＩＩのＭＨＣ分子に対して最も高い親和性を有する。さらに他の実施形態では、ペプチドエピトープの少なくとも５０％は、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及び／またはＤＲＢ１に対してＩＣ＞５００ｎＭの予測結合親和性を有する。
【００６５】
いくつかの実施形態では、本発明の１つまたは複数のｍＲＮＡは、最大２０のペプチドエピトープをコードする。いくつかの実施形態では、本発明の１つまたは複数のｍＲＮＡは、最大５０のエピトープをコードする。いくつかの実施形態では、本発明の１つまたは複数のｍＲＮＡは、最大１００のエピトープをコードする。
【００６６】
他の実施形態によれば、ペプチドエピトープをコードするｍＲＮＡは、ペプチドエピトープの順序が偽エピトープ（ｐｓｅｕｄｏ−ｅｐｉｔｏｐｅ）を最小化する順序になるように配置される。
【００６７】
それぞれのペプチドエピトープは、３１アミノ酸を含み得、かつ中央に位置するＳＮＰ変異を含み、ＳＮＰ変異の両側には１５の隣接アミノ酸が存在する。
【００６８】
いくつかの実施形態では、それぞれのエピトープのＴＣＲ面は、内因性タンパク質に対する類似性が低い。
【００６９】
さらに他の実施形態では、ｍＲＮＡは、リコール抗原をさらに含む。リコール抗原は、感染性疾患抗原であり得る。
【００７０】
他の実施形態では、ペプチドエピトープのうちの少なくとも１つは、従来型癌抗原である。ワクチンは、いくつかの実施形態では、１つまたは複数の反復多型をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡを含む。１つまたは複数の反復多型は、ｐ５３における反復体細胞癌変異を含み得る。ｐ５３における１つまたは複数の反復体細胞癌変異は、いくつかの実施形態では、（Ａ）コドン位置Ｔ１２５に隣接する標準５’スプライス部位における変異であって、エピトープＡＶＳＰＣＩＳＦＶＷ（配列番号２３３）（ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５８：０１）、エピトープＨＰＬＡＳＣＱＣＦＦ（配列番号２３４）（ＨＬＡ−Ｂ＊３５：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５３：０１）、エピトープＦＶＷＮＦＧＩＰＬ（配列番号２３５）（ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０６、ＨＬＡ−Ｂ＊３５：０１）を含むペプチド配列ＴＡＫＳＶＴＣＴＶＳＣＰＥＧＬＡＳＭＲＬＱＣＬＡＶＳＰＣＩＳＦＶＷＮＦＧＩＰＬＨＰＬＡＳＣＱＣＦＦＩＶＹＰＬＮＶ（配列番号２３２）を有する保持型イントロンを誘導する変異；（Ｂ）コドン位置３３１に隣接する標準５’スプライス部位における変異であって、エピトープＬＱＶＬＳＬＧＴＳＹ（配列番号２３７）（ＨＬＡ−Ｂ＊１５：０１）、エピトープＦＱＳＮＴＱＮＡＶＦ（配列番号２３８）（ＨＬＡ−Ｂ＊１５：０１）を含むペプチド配列ＥＹＦＴＬＱＶＬＳＬＧＴＳＹＱＶＥＳＦＱＳＮＴＱＮＡＶＦＦＬＴＶＬＰＡＩＧＡＦＡＩＲＧＱ（配列番号２３６）を有する保持型イントロンを誘導する変異；（Ｃ）コドン位置１２６に隣接する標準３’スプライス部位における変異であって、エピトープＣＴＭＦＣＱＬＡＫ（配列番号２４０）（ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１）、エピトープＫＳＶＴＣＴＭＦ（配列番号２４１）（ＨＬＡ−Ｂ＊５８：０１）を含む新規のスパニングペプチド配列ＡＫＳＶＴＣＴＭＦＣＱＬＡＫ（配列番号２３９）を生成する潜在性の代替エクソン３’スプライス部位を誘導する変異；及び／または（Ｄ）コドン位置２２４に隣接する標準５’スプライス部位における変異であって、エピトープＶＰＹＥＰＰＥＶＷ（配列番号２４３）（ＨＬＡ−Ｂ＊５３：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５１：０１）、エピトープＬＴＶＰＰＳＴＡＷ（配列番号２４４）（ＨＬＡ−Ｂ＊５８：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１）を含む新規のスパニングペプチド配列ＶＰＹＥＰＰＥＶＷＬＡＬＴＶＰＰＳＴＡＷＡＡ（配列番号２４２）を生成する潜在性の代替イントロン５’スプライス部位を誘導する変異（転写コドン位置は、Ｅｎｓｅｍｂｌのｖ８３のヒトゲノムアノテーションに由来する標準の全長ｐ５３転写物であるＥＮＳＴ０００００２６９３０５（配列番号２４５）を参照したものである）からなる群から選択される。
【００７１】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、免疫チェックポイント調節因子をコードするオープンリーディングフレームをさらに含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ癌ワクチンは、免疫チェックポイント調節因子を含む。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント調節因子は、阻害性チェックポイントポリペプチドである。いくつかの実施形態では、阻害性チェックポイントポリペプチドは、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、ＶＩＳＴＡ、Ａ２ＡＲ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ−４、ＩＤＯ、ＫＩＲ及びＬＡＧ３からなる群から選択される分子に特異的に結合する抗体またはその断片である。いくつかの実施形態では、阻害性チェックポイントポリペプチドは、抗ＣＴＬＡ４または抗ＰＤ１抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、ペンブロリズマブである。
【００７２】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ癌ワクチンは、安定化剤を含まない。
【００７３】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、少なくとも１つの化学修飾を含む。化学修飾は、シュードウリジン、Ｎ１−メチルシュードウリジン、２−チオウリジン、４’−チオウリジン、５−メチルシトシン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−シュードウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオ−ジヒドロシュードウリジン、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−シュードウリジン、４−メトキシ−２−チオ−シュードウリジン、４−メトキシ−シュードウリジン、４−チオ−１−メチル−シュードウリジン、４−チオ−シュードウリジン、５−アザ−ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５−メチルウリジン、５−メチルウリジン、５−メトキシウリジン、及び２’−Ｏ−メチルウリジンからなる群から選択され得る。
【００７４】
他の態様では、対象のワクチン接種方法が提供される。方法は、癌を有する対象に、本明細書に開示のｍＲＮＡワクチンを投与することを伴う。
【００７５】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡワクチンは、１０μｇ〜４００μｇのｍＲＮＡワクチンを送達するために十分な用量レベルで対象に投与される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡワクチンは、０．０３３ｍｇ、０．１ｍｇ、０．２ｍｇ、または０．４ｍｇを送達するために十分な用量レベルで対象に投与される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡワクチンは、２回、３回、４回またはそれより多い回数で対象に投与される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡワクチンは、３週間ごとに１日１回投与される。
【００７６】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡワクチンは、皮内、筋肉内、及び／または皮下投与によって投与される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡワクチンは、筋肉内投与によって投与される。
【００７７】
いくつかの実施形態では、方法は、追加の癌治療剤を投与することをさらに含み、任意選択で、追加の癌治療剤は、対象に対する免疫チェックポイント調節因子である。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント調節因子は、阻害性チェックポイントポリペプチドである。いくつかの実施形態では、阻害性チェックポイントポリペプチドは、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、ＶＩＳＴＡ、Ａ２ＡＲ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ−４、ＩＤＯ、ＫＩＲ及びＬＡＧ３からなる群から選択される分子に特異的に結合する抗体またはその断片である。いくつかの実施形態では、阻害性チェックポイントポリペプチドは、抗ＰＤ１抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、ペンブロリズマブである。
【００７８】
いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント調節因子は、１００〜３００ｍｇを送達するために十分な用量レベルで対象に投与される。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント調節因子は、２００ｍｇを送達するために十分な用量レベルで対象に投与される。
【００７９】
いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント調節因子は、静脈内注入によって投与される。
【００８０】
いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント調節因子は、２回、３回、４回またはそれより多い回数で対象に投与される。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント調節因子は、ｍＲＮＡワクチン投与と同じ日に対象に投与される。
【００８１】
いくつかの実施形態では、癌は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺癌、メラノーマ、膀胱尿路上皮癌、ＨＰＶ陰性頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、及び高頻度マイクロサテライト（ＭＳＩ  Ｈ）／ミスマッチ修復（ＭＭＲ）欠損である固形悪性腫瘍からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＮＳＣＬＣは、ＥＧＦＲ感受性変異及び／またはＡＬＫ転座がない。いくつかの実施形態では、高頻度マイクロサテライト（ＭＳＩ  Ｈ）／ミスマッチ修復（ＭＭＲ）欠損である固形悪性腫瘍は、結腸直腸癌、胃腺癌、食道腺癌、及び子宮内膜癌からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、癌は、膵臓、腹膜、大腸、小腸、胆道、肺、子宮内膜、卵巣、生殖管、胃腸管、子宮頸部、胃、尿路、結腸、直腸、ならびに造血系及びリンパ系組織の癌から選択される。
【００８２】
ｍＲＮＡ癌ワクチンの調製方法が他の態様では提供される。方法は、対象から試料を単離することと、試料中の複数の癌抗原を同定することと、複数の癌抗原から免疫原性エピトープを決定することと、癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡ癌ワクチンを調製することと、を伴う。本発明の他の態様では、１０００〜３０００ヌクレオチドを含むコンカテマー癌抗原をコードするｍＲＮＡの生成方法が提供される。方法は、
（ａ）先行請求項のいずれか１項に記載の癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを含む第１のポリヌクレオチド及び５’−ＵＴＲを含む第２のポリヌクレオチドの、固形担体に複合化したポリヌクレオチドへの結合と、
（ｂ）第２のポリヌクレオチドの３’末端の、第１のポリヌクレオチドの５’末端への適切な条件下でのライゲーションであって、適切な条件がＤＮＡリガーゼを含み、それによって、第１のライゲーション産物が生成するライゲーションと、
（ｃ）３’−ＵＴＲを含む第３のポリヌクレオチドの５’末端の、第１のライゲーション産物の３’末端への、適切な条件下でのライゲーションであって、適切な条件がＲＮＡリガーゼを含み、それによって、第２のライゲーション産物が生成するライゲーションと、
（ｄ）固形担体からの第２のライゲーション産物の遊離と、
を含み、それによって、１０００〜３０００ヌクレオチドを含むコンカテマー癌抗原をコードするｍＲＮＡが生成する。
【００８３】
他の態様では、本発明は、本明細書に記載の方法に従って調製可能なコンカテマー癌抗原を含む、ｍＲＮＡ癌ワクチンである。
【００８４】
本発明の他の態様に従って、個別化ｍＲＮＡ癌ワクチンでの対象の治療方法が提供される。方法は、患者特異的なミュータノーム（ｍｕｔａｎｏｍｅ）を生成するための、試料に由来する患者のトランスクリプトーム及び／または患者のエクソームの解析によるネオエピトープのセットの同定と、ＭＨＣとの結合強度、ＭＨＣとの結合多様性、免疫原性の予測度合い、自己反応性の低さ、活性化癌遺伝子変異の存在及び／またはＴ細胞反応性に基づく、ワクチン向けネオエピトープのセットのミュータノームからの選択と、ネオエピトープのセットをコードするｍＲＮＡワクチンの調製と、対象からの試料の単離の２ヶ月以内に実施される、ｍＲＮＡワクチンの対象への投与と、を含む。いくつかの実施形態では、同定は、対象由来試料から得た患者トランスクリプトーム及び／または患者エクソームを解析することを含む。いくつかの実施形態では、対象由来試料は、生物学的試料、例えば、生検である。いくつかの実施形態では、方法は、対象から試料を単離することをさらに含む。いくつかの実施形態では、同定は、利用可能なデータベースにおける組織特異的発現を解析することを含む。
【００８５】
本発明の他の態様では、ネオエピトープのセットをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを有する個別化ｍＲＮＡ癌ワクチンにおける使用を目的とする、ネオエピトープのセットの同定方法が提供される。方法は、
ａ．患者のトランスクリプトーム及び患者のエクソームの解析による患者特異的なミュータノームの同定と、
ｂ．患者のＲＮＡシークエンシングにおける遺伝子もしくは転写物レベルの発現評価；バリアントコ−ル（ｖａｒｉａｎｔ  ｃａｌｌ）信頼スコア；ＲＮＡシークエンシングに基づく対立遺伝子特異的発現；保存的アミノ酸置換と非保存的アミノ酸置換との比較；点変異の位置（ＴＣＲの関与増加についての中心スコア（Ｃｅｎｔｅｒｉｎｇ  Ｓｃｏｒｅ））；点変異の位置（ＨＬＡとの結合の差異についての固定スコア（Ａｎｃｈｏｒｉｎｇ  Ｓｃｏｒｅ））；独自性（Ｓｅｌｆｎｅｓｓ）：患者のＷＥＳデータとのコアエピトープ相同性（＜１００％）；８マー〜１１マーについてはＨＬＡ−Ａ及びＨＬＡ−Ｂに対するＩＣ５０；１５マー〜２０マーについてはＨＬＡ−ＤＲＢ１に対するＩＣ５０；広範結合スコア（ｐｒｏｍｉｓｃｕｉｔｙ  Ｓｃｏｒｅ）（すなわち、結合すると予測される患者ＨＬＡの数）；８マー〜１１マーについてはＨＬＡ−Ｃに対するＩＣ５０；１５マー〜２０マーについてはＨＬＡ−ＤＲＢ３〜５に対するＩＣ５０；１５マー〜２０マーについてはＨＬＡ−ＤＱＢ１／Ａ１に対するＩＣ５０；１５マー〜２０マーについてはＨＬＡ−ＤＰＢ１／Ａ１に対するＩＣ５０；クラスＩとクラスＩＩとの比率比較；患者においてカバーされるＨＬＡ−Ａアロタイプ、ＨＬＡ−Ｂアロタイプ、及びＨＬＡ−ＤＲＢ１アロタイプの多様性；点変異と複合エピトープ（例えば、フレームシフト）との比率比較；偽エピトープＨＬＡ結合スコア；ＲＮＡシークエンシングリードの存在及び／または存在量のうちの少なくとも３つに基づく、ネオエピトープに対する加重値を使用する、ミュータノームからの１５〜５００のネオエピトープのサブセットの選択と、
ｃ．最高加重値に基づく、サブセットからの、個別化ｍＲＮＡ癌ワクチンにおける使用を目的とするネオエピトープのセットの選択であって、ネオエピトープのセットが１５〜４０のネオエピトープを含む選択と、を含む。
【００８６】
本開示は、いくつかの態様では、癌抗原ペプチドエピトープをコードするオープンリーディングフレームをそれぞれ有する１つまたは複数のｍＲＮＡのｍＲＮＡ癌ワクチンであり、ここで、ｍＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ結合部位をさらに含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、５〜１００のペプチドエピトープをコードする。
【００８７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸ワクチンは、化学的に修飾される。他の実施形態では、核酸ワクチンは、修飾されない。
【００８８】
さらに他の態様は、癌抗原エピトープをコードするオープンリーディングフレームを有する１つまたは複数のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンの対象への投与を含む、対象のワクチン接種を目的とする組成物及び対象のワクチン接種方法を提供し、ＲＮＡポリヌクレオチドは安定化要素を含まず、ワクチンと共にアジュバントが同時製剤化または同時投与されることはない。
【００８９】
他の態様では、本発明は、第１の癌抗原エピトープをコードするオープンリーディングフレームを有する１つまたは複数のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンの対象への投与を含む、対象のワクチン接種を目的とする組成物または対象のワクチン接種方法であり、対象に投与される核酸ワクチンの用量は、１０μｇ／ｋｇ〜４００μｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドの用量は、用量当たり、１〜５μｇ、５〜１０μｇ、１０〜１５μｇ、１５〜２０μｇ、１０〜２５μｇ、２０〜２５μｇ、２０〜５０μｇ、３０〜５０μｇ、４０〜５０μｇ、４０〜６０μｇ、６０〜８０μｇ、６０〜１００μｇ、５０〜１００μｇ、８０〜１２０μｇ、４０〜１２０μｇ、４０〜１５０μｇ、５０〜１５０μｇ、５０〜２００μｇ、８０〜２００μｇ、１００〜２００μｇ、１２０〜２５０μｇ、１５０〜２５０μｇ、１８０〜２８０μｇ、２００〜３００μｇ、５０〜３００μｇ、８０〜３００μｇ、１００〜３００μｇ、４０〜３００μｇ、５０〜３５０μｇ、１００〜３５０μｇ、２００〜３５０μｇ、３００〜３５０μｇ、３２０〜４００μｇ、４０〜３８０μｇ、４０〜１００μｇ、１００〜４００μｇ、２００〜４００μｇ、または３００〜４００μｇである。いくつかの実施形態では、核酸ワクチンは、皮内注射または筋肉内注射によって対象に投与される。いくつかの実施形態では、核酸ワクチンは、０日目に対象に投与される。いくつかの実施形態では、第２の用量の核酸ワクチンは、２１日目に対象に投与される。
【００９０】
いくつかの実施形態では、対象に投与される核酸ワクチンに含まれるＲＮＡポリヌクレオチドの用量は、２５マイクログラムである。いくつかの実施形態では、対象に投与される核酸ワクチンに含まれるＲＮＡポリヌクレオチドの用量は、１００マイクログラムである。いくつかの実施形態では、対象に投与される核酸ワクチンに含まれるＲＮＡポリヌクレオチドの用量は、５０マイクログラムである。いくつかの実施形態では、対象に投与される核酸ワクチンに含まれるＲＮＡポリヌクレオチドの用量は、７５マイクログラムである。いくつかの実施形態では、対象に投与される核酸ワクチンに含まれるＲＮＡポリヌクレオチドの用量は、１５０マイクログラムである。いくつかの実施形態では、対象に投与される核酸ワクチンに含まれるＲＮＡポリヌクレオチドの用量は、４００マイクログラムである。いくつかの実施形態では、対象に投与される核酸ワクチンに含まれるＲＮＡポリヌクレオチドの用量は、２００マイクログラムである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、遠位リンパ節と比較して局所リンパ節に１００倍高いレベルで蓄積する。他の実施形態では、核酸ワクチンは、化学的に修飾され、他の実施形態では、核酸ワクチンは、化学的に修飾されない。
【００９１】
いくつかの実施形態では、有効量は、１〜１００μｇの総用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、１００μｇの総用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、対象に合計１回または２回投与される２５μｇの用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、対象に合計２回投与される１００μｇの用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、１回もしくは２回またはそれより多い回数で対象に投与され得る、１μｇ〜１０μｇ、１μｇ〜２０μｇ、１μｇ〜３０μｇ、５μｇ〜１０μｇ、５μｇ〜２０μｇ、５μｇ〜３０μｇ、５μｇ〜４０μｇ、５μｇ〜５０μｇ、１０μｇ〜１５μｇ、１０μｇ〜２０μｇ、１０μｇ〜２５μｇ、１０μｇ〜３０μｇ、１０μｇ〜４０μｇ、１０μｇ〜５０μｇ、１０μｇ〜６０μｇ、１５μｇ〜２０μｇ、１５μｇ〜２５μｇ、１５μｇ〜３０μｇ、１５μｇ〜４０μｇ、１５μｇ〜５０μｇ、２０μｇ〜２５μｇ、２０μｇ〜３０μｇ、２０μｇ〜４０μｇ２０μｇ〜５０μｇ、２０μｇ〜６０μｇ、２０μｇ〜７０μｇ、２０μｇ〜７５μｇ、３０μｇ〜３５μｇ、３０μｇ〜４０μｇ、３０μｇ〜４５μｇ３０μｇ〜５０μｇ、３０μｇ〜６０μｇ、３０μｇ〜７０μｇ、３０μｇ〜７５μｇの用量である。
【００９２】
本発明の態様では、第１の抗原ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つまたは複数のＲＮＡポリヌクレオチドと、薬学的に許容される担体または賦形剤と、を含む核酸ワクチンが提供され、ＲＮＡポリヌクレオチドは、安定化要素を含まず、ワクチンは、アジュバントを含まない。いくつかの実施形態では、安定化要素は、ヒストンステムループである。いくつかの実施形態では、安定化要素は、野生型配列と比較してＧＣ含量が高まった核酸配列である。
【００９３】
態様は、少なくとも１つの化学修飾を含むか、または化学修飾を任意選択で含まないオープンリーディングフレームを有する１つまたは複数のＲＮＡポリヌクレオチドを含み、オープンリーディングフレームが第１の抗原ポリペプチドをコードする核酸ワクチンを提供し、ＲＮＡポリヌクレオチドは、対象における抗原発現レベルが、安定化要素を有するか、またはアジュバントとともに製剤化された、第１の抗原ポリペプチドをコードするｍＲＮＡワクチンによってもたらされる抗原発現レベルよりも有意に大きくなるように対象へのインビボ投与のための製剤中に存在する。
【００９４】
他の態様では、少なくとも１つの化学修飾を含むか、または化学修飾を任意選択で含まないオープンリーディングフレームを有する１つまたは複数のＲＮＡポリヌクレオチドを含み、オープンリーディングフレームが第１の抗原ポリペプチドをコードする核酸ワクチンが提供され、非修飾ｍＲＮＡワクチンが同等の抗体価を生成するために必要となるものと比較して、ワクチンで必要になるＲＮＡポリヌクレオチドは少なくとも１０倍少ない。
【００９５】
本発明の態様では、使用ワクチン単位も提供され、当該単位は、少なくとも１つの化学修飾を含むか、または化学修飾を任意選択で含まないオープンリーディングフレームを有し、オープンリーディングフレームが第１の抗原ポリペプチドをコードする１つまたは複数のＲＮＡポリヌクレオチドを１０ｕｇ〜４００ｕｇと、ヒト対象への送達を目的として製剤化された薬学的に許容される担体または賦形剤と、を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、カチオン性脂質ナノ粒子をさらに含む。
【００９６】
本発明の態様は、本明細書に開示のｍＲＮＡ癌ワクチンを含むバイアルを含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、バイアルは、０．１ｍｇ〜１ｍｇのｍＲＮＡを収容する。いくつかの実施形態では、バイアルは、０．３５ｍｇのｍＲＮＡを収容する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡの濃度は、１ｍｇ／ｍＬである。
【００９７】
いくつかの実施形態では、バイアルは、５〜１５ｍｇの総脂質を収容する。いくつかの実施形態では、バイアルは、７ｍｇの総脂質を収容する。いくつかの実施形態では、総脂質の濃度は、２０ｍｇ／ｍＬである。
【００９８】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ癌ワクチンは、液体である。
【００９９】
いくつかの実施形態では、キットは、シリンジをさらに含む。いくつかの実施形態では、シリンジは、筋肉内投与に好適である。
【０１００】
本発明の態様では、対象のワクチン接種方法が提供され、方法は、第１の抗原ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つまたは複数のＲＮＡポリヌクレオチドを対象のワクチン接種に有効な量で含む核酸ワクチンの、２５ｕｇ／ｋｇ〜４００ｕｇ／ｋｇの単回用量での対象への投与を含む。
【０１０１】
いくつかの態様では、本開示は、抗原として活性化癌遺伝子変異を含み得る、ｍＲＮＡ癌ワクチンである。いくつかの実施形態では、活性化癌遺伝子変異は、ＫＲＡＳ変異である。いくつかの実施形態では、ＫＲＡＳ変異は、Ｇ１２変異である。いくつかの実施形態では、Ｇ１２  ＫＲＡＳ変異は、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ａ、及びＧ１２Ｒ  ＫＲＡＳ変異から選択され、例えば、Ｇ１２  ＫＲＡＳ変異は、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、及びＧ１２Ｓ  ＫＲＡＳ変異から選択される。他の実施形態では、ＫＲＡＳ変異は、Ｇ１３変異であり、例えば、Ｇ１３  ＫＲＡＳ変異は、Ｇ１３Ｄ  ＫＲＡＳ変異である。いくつかの実施形態では、活性化癌遺伝子変異は、Ｈ−ＲＡＳまたはＮ−ＲＡＳ変異である。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、当業者は、本明細書に記載の指針に基づいて、ＫＲＡＳ変異、ＨＬＡサブタイプ及び腫瘍の種類を選択し、治療用のＫＲＡＳワクチンを調製するであろう。いくつかの実施形態では、ＫＲＡＳ変異は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１３Ｄから選択される。いくつかの実施形態では、ＨＬＡサブタイプは、Ａ＊０２：０１、Ｃ＊０７：０１、Ｃ＊０４：０１、Ｃ＊０７：０２から選択される。いくつかの実施形態では、腫瘍の種類は、結腸直腸、膵臓、肺、及び類内膜から選択される。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、ＨＲＡＳ変異は、コドン１２、コドン１３、またはコドン６１における変異である。いくつかの実施形態では、ＨＲＡＳ変異は、１２Ｖ、６１Ｌ、または６１Ｒ変異である。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、ＮＲＡＳ変異は、コドン１２、コドン１３、またはコドン６１における変異である。いくつかの実施形態では、ＮＲＡＳ変異は、１２Ｄ、１３Ｄ、６１Ｋ、または６１Ｒ変異である。
【０１０５】
本開示のいくつかの実施形態は、２つ以上の活性化癌遺伝子変異ペプチドのコンカテマーをコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡを含む、ｍＲＮＡ癌ワクチンを提供する。いくつかの実施形態では、ペプチドエピトープのうちの少なくとも２つは、１つのグリシンによって互いに分離されている。いくつかの実施形態では、コンカテマーは、３〜１０の活性化癌遺伝子変異ペプチドを含む。いくつかのそのような実施形態では、ペプチドエピトープのすべてが、１つのグリシンによって互いに分離されている。他の実施形態では、ペプチドエピトープのうちの少なくとも２つは、リンカーなしで互いに直接連結される。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ癌ワクチンは、癌治療剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ癌ワクチンは、阻害性チェックポイントポリペプチドをさらに含む。例えば、いくつかの実施形態では、阻害性チェックポイントポリペプチドは、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、ＶＩＳＴＡ、Ａ２ＡＲ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ−４、ＩＤＯ、ＫＩＲ及びＬＡＧ３からなる群から選択される分子に特異的に結合する抗体またはその断片である。他の実施形態では、ｍＲＮＡ癌ワクチンは、リコール抗原をさらに含む。例えば、いくつかの実施形態では、リコール抗原は、感染性疾患抗原である。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ癌ワクチンは、安定化剤を含まない。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、約２０〜６０％のカチオン性脂質：５〜２５％の非カチオン性脂質：２５〜５５％のステロール；０．５〜１５％のＰＥＧ修飾脂質のモル比を含む脂質ナノ粒子担体などの脂質ナノ粒子担体中に製剤化される。カチオン性脂質は、例えば、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）−ノナ−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）からなる群から選択され得る。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、少なくとも１つの化学修飾を含む。化学修飾は、シュードウリジン、Ｎ１−メチルシュードウリジン、２−チオウリジン、４’−チオウリジン、５−メチルシトシン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−シュードウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオ−ジヒドロシュードウリジン、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−シュードウリジン、４−メトキシ−２−チオ−シュードウリジン、４−メトキシ−シュードウリジン、４−チオ−１−メチル−シュードウリジン、４−チオ−シュードウリジン、５−アザ−ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５−メチルウリジン、５−メチルウリジン、５−メトキシウリジン、及び２’−Ｏ−メチルウリジンからなる群から選択され得る。
【０１１０】
他の態様では、対象の治療方法が提供される。方法は、癌を有する対象に、前述の実施形態のいずれか１つのｍＲＮＡ癌ワクチンを投与することを伴う。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ癌ワクチンは、癌治療剤と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ癌ワクチンは、阻害性チェックポイントポリペプチドと組み合わせて投与される。例えば、いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ癌ワクチンは、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、ＶＩＳＴＡ、Ａ２ＡＲ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ−４、ＩＤＯ、ＫＩＲ及びＬＡＧ３からなる群から選択される分子に特異的に結合する抗体またはその断片である。
【０１１１】
本明細書で提供される方法は、癌を有する対象の治療に使用され得る。いくつかの実施形態では、癌は、膵臓、腹膜、大腸、小腸、胆道、肺、子宮内膜、卵巣、生殖管、胃腸管、子宮頸部、胃、尿路、結腸、直腸、ならびに造血系及びリンパ系組織の癌から選択される。いくつかの実施形態では、癌は、結腸直腸癌である。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、対象に投与されるｍＲＮＡ癌ワクチンの用量は、用量当たり、１〜５μｇ、５〜１０μｇ、１０〜１５μｇ、１５〜２０μｇ、１０〜２５μｇ、２０〜２５μｇ、２０〜５０μｇ、３０〜５０μｇ、４０〜５０μｇ、４０〜６０μｇ、６０〜８０μｇ、６０〜１００μｇ、５０〜１００μｇ、８０〜１２０μｇ、４０〜１２０μｇ、４０〜１５０μｇ、５０〜１５０μｇ、５０〜２００μｇ、８０〜２００μｇ、１００〜２００μｇ、１２０〜２５０μｇ、１５０〜２５０μｇ、１８０〜２８０μｇ、２００〜３００μｇ、５０〜３００μｇ、８０〜３００μｇ、１００〜３００μｇ、４０〜３００μｇ、５０〜３５０μｇ、１００〜３５０μｇ、２００〜３５０μｇ、３００〜３５０μｇ、３２０〜４００μｇ、４０〜３８０μｇ、４０〜１００μｇ、１００〜４００μｇ、２００〜４００μｇ、または３００〜４００μｇである。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ癌ワクチンは、皮内注射または筋肉内注射によって対象に投与される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ癌ワクチンは、０日目に対象に投与される。いくつかの実施形態では、第２の用量のｍＲＮＡ癌ワクチンは、２１日目に対象に投与される。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、２５マイクログラムの用量のｍＲＮＡ癌ワクチンが対象に投与される。いくつかの実施形態では、１００マイクログラムの用量のｍＲＮＡ癌ワクチンが対象に投与される。いくつかの実施形態では、５０マイクログラムの用量のｍＲＮＡ癌ワクチンが対象に投与される。いくつかの実施形態では、７５マイクログラムの用量のｍＲＮＡ癌ワクチンが対象に投与される。いくつかの実施形態では、１５０マイクログラムの用量のｍＲＮＡ癌ワクチンが対象に投与される。いくつかの実施形態では、４００マイクログラムの用量のｍＲＮＡ癌ワクチンが対象に投与される。いくつかの実施形態では、２００マイクログラムの用量のｍＲＮＡ癌ワクチンが対象に投与される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ癌ワクチンは、遠位リンパ節と比較して局所リンパ節に１００倍高いレベルで蓄積する。他の実施形態では、ｍＲＮＡ癌ワクチンは、化学的に修飾され、他の実施形態では、ｍＲＮＡ癌ワクチンは、化学的に修飾されない。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、有効量は、１〜１００μｇの総用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、１００μｇの総用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、対象に合計１回または２回投与される２５μｇの用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、対象に合計２回投与される１００μｇの用量である。いくつかの実施形態では、有効量は、１回もしくは２回またはそれより多い回数で対象に投与され得る、１μｇ〜１０μｇ、１μｇ〜２０μｇ、１μｇ〜３０μｇ、５μｇ〜１０μｇ、５μｇ〜２０μｇ、５μｇ〜３０μｇ、５μｇ〜４０μｇ、５μｇ〜５０μｇ、１０μｇ〜１５μｇ、１０μｇ〜２０μｇ、１０μｇ〜２５μｇ、１０μｇ〜３０μｇ、１０μｇ〜４０μｇ、１０μｇ〜５０μｇ、１０μｇ〜６０μｇ、１５μｇ〜２０μｇ、１５μｇ〜２５μｇ、１５μｇ〜３０μｇ、１５μｇ〜４０μｇ、１５μｇ〜５０μｇ、２０μｇ〜２５μｇ、２０μｇ〜３０μｇ、２０μｇ〜４０μｇ２０μｇ〜５０μｇ、２０μｇ〜６０μｇ、２０μｇ〜７０μｇ、２０μｇ〜７５μｇ、３０μｇ〜３５μｇ、３０μｇ〜４０μｇ、３０μｇ〜４５μｇ３０μｇ〜５０μｇ、３０μｇ〜６０μｇ、３０μｇ〜７０μｇ、３０μｇ〜７５μｇの用量である。
【０１１５】
本発明の態様は、１０００〜３０００ヌクレオチドを含むコンカテマー癌抗原をコードするｍＲＮＡの生成方法であって、（ａ）請求項１〜１０３のいずれか１項に記載の癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを含む第１のポリヌクレオチド及び５’−ＵＴＲを含む第２のポリヌクレオチドの、固形担体に複合化したポリヌクレオチドへの結合と、（ｂ）第２のポリヌクレオチドの３’末端の、第１のポリヌクレオチドの５’末端への適切な条件下でのライゲーションであって、適切な条件がＤＮＡリガーゼを含み、それによって、第１のライゲーション産物が生成するライゲーションと、（ｃ）３’−ＵＴＲを含む第３のポリヌクレオチドの５’末端の、第１のライゲーション産物の３’末端への、適切な条件下でのライゲーションであって、適切な条件がＲＮＡリガーゼを含み、それによって、第２のライゲーション産物が生成するライゲーションと、（ｄ）固形担体からの第２のライゲーション産物の遊離と、を含み、それによって、１０００〜３０００ヌクレオチドを含むコンカテマー癌抗原をコードするｍＲＮＡが生成する、方法を提供する。
【０１１６】
本発明の態様は、個別化ｍＲＮＡ癌ワクチンでの対象の治療方法であって、患者特異的なミュータノームを生成するためのネオエピトープのセットの同定と、ＭＨＣとの結合強度、ＭＨＣとの結合多様性、免疫原性の予測度合い、自己反応性の低さ、及び／またはＴ細胞反応性に基づく、ワクチン向けネオエピトープのセットのミュータノームからの選択と、ネオエピトープのセットをコードするｍＲＮＡワクチンの調製と、対象からの試料の単離の２ヶ月以内に実施される、ｍＲＮＡワクチンの対象への投与と、を含む、方法を提供する。
【０１１７】
本発明の態様は、ネオエピトープのセットをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを有する個別化ｍＲＮＡ癌ワクチンにおける使用を目的とする、ネオエピトープのセットの同定方法であって、（ａ）患者のトランスクリプトーム及び患者のエクソームの解析による患者特異的なミュータノームの同定と、（ｂ）患者のＲＮＡシークエンシングにおける遺伝子もしくは転写物レベルの発現評価；バリアントコ−ル（ｖａｒｉａｎｔ  ｃａｌｌ）信頼スコア；ＲＮＡシークエンシングに基づく対立遺伝子特異的発現；保存的アミノ酸置換と非保存的アミノ酸置換との比較；点変異の位置（ＴＣＲの関与増加についての中心スコア（Ｃｅｎｔｅｒｉｎｇ  Ｓｃｏｒｅ））；点変異の位置（ＨＬＡとの結合の差異についての固定スコア（Ａｎｃｈｏｒｉｎｇ  Ｓｃｏｒｅ））；独自性（Ｓｅｌｆｎｅｓｓ）：患者のＷＥＳデータとのコアエピトープ相同性（＜１００％）；８マー〜１１マーについてはＨＬＡ−Ａ及びＨＬＡ−Ｂに対するＩＣ５０；１５マー〜２０マーについてはＨＬＡ−ＤＲＢ１に対するＩＣ５０；広範結合スコア；８マー〜１１マーについてはＨＬＡ−Ｃに対するＩＣ５０；１５マー〜２０マーについてはＨＬＡ−ＤＲＢ３〜５に対するＩＣ５０；１５マー〜２０マーについてはＨＬＡ−ＤＱＢ１／Ａ１に対するＩＣ５０；１５マー〜２０マーについてはＨＬＡ−ＤＰＢ１／Ａ１に対するＩＣ５０；クラスＩとクラスＩＩとの比率比較；患者においてカバーされるＨＬＡ−Ａアロタイプ、ＨＬＡ−Ｂアロタイプ、及びＨＬＡ−ＤＲＢ１アロタイプの多様性；点変異と複合エピトープとの比率比較；偽エピトープＨＬＡ結合スコア；ＲＮＡシークエンシングリードの存在及び／または存在量のうちの少なくとも３つに基づく、ネオエピトープに対する加重値を使用する、ミュータノームからの１５〜５００のネオエピトープのサブセットの選択と、（ｃ）最高加重値に基づく、サブセットからの、個別化ｍＲＮＡ癌ワクチンにおける使用を目的とするネオエピトープのセットの選択であって、ネオエピトープのセットが１５〜４０のネオエピトープを含む選択と、を含む、方法を提供する。
【０１１８】
本発明の態様は、ネオエピトープのセットをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを有する個別化ｍＲＮＡ癌ワクチンにおける使用を目的とする、ネオエピトープのセットの同定方法であって、（ａ）患者の腫瘍からＲＮＡシークエンシング試料を生成して、ＲＮＡシークエンシングリードのセットを生成することと、（ｂ）すべてのＲＮＡシークエンシングリードからヌクレオチド配列の総数をコンパイルすることと、（ｃ）腫瘍試料と、同じ組織種の正常組織の対応するデータベースとの間で配列情報を比較することと、（ｄ）最高加重値に基づく、サブセットからの、個別化ｍＲＮＡ癌ワクチンにおける使用を目的とするネオエピトープのセットの選択であって、ネオエピトープのセットが１５〜４０のネオエピトープを含む選択と、を含む、方法を提供する。
【０１１９】
本発明のさまざまな実施形態の詳細は、下記の説明において示される。本発明の他の特徴、目的、及び利点は、説明及び図面、ならびに特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【０１２０】
前述及び他の目的、特徴、及び利点は、本発明の特定の実施形態の下記の説明から明らかになり、こうしたことは、添付の図面において例示され、こうした図面の中で同様の参照文字は異なる観点を通して同一の部分を指す。図面は、必ずしも寸法どおりではないが、代わりに、本発明のさまざまな実施形態の原理を例示することに重点が置かれている。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】コンカテマーの完全な読み通しの確認を示す（ＳＩＩＮＦＥＫＬは配列番号２３１である）。
【図２】両方の構築物に認められるクラスＩエピトープに対する抗原特異的応答を示す。
【図３】５２マー構築物に排他的に認められるクラスＩエピトープに対する抗原特異的応答を示す。
【図４】両方の構築物に認められるクラスＩＩエピトープ（左）及び５２マー構築物に認められるクラスＩＩエピトープ（右）に対する抗原特異的応答を示す。
【図５】いくつかの実施形態で実行され得るコンピューターシステムを例示したブロック図である。
【図６】５２のマウスエピトープ（追加エピトープ＿４ａ＿ＤＸ＿ＲＸ＿ｐｅｒｍ）のコンカテマーをコードするｍＲＮＡとＳＴＩＮＧ免疫増強剤ｍＲＮＡを、さまざまな抗原とＳＴＩＮＧの用量及び抗原：ＳＴＩＮＧ比で組み合わせて免疫化したマウスからの抗原特異的応答を示す。示されるデータは、当該コンカテマー内にコードされるクラスＩＩエピトープＲＮＡ２に対応するペプチド配列によるインビトロ再刺激に関するものである。
【図７】５２のマウスエピトープ（追加エピトープ＿４ａ＿ＤＸ＿ＲＸ＿ｐｅｒｍ）のコンカテマーをコードするｍＲＮＡとＳＴＩＮＧ免疫増強剤ｍＲＮＡを、さまざまな抗原とＳＴＩＮＧの用量及び抗原：ＳＴＩＮＧ比で組み合わせて免疫化したマウスからの抗原特異的応答を示す。示されるデータは、当該コンカテマー内にコードされるクラスＩＩエピトープＲＮＡ３に対応するペプチド配列によるインビトロ再刺激に関するものである。
【図８】５２のマウスエピトープ（追加エピトープ＿４ａ＿ＤＸ＿ＲＸ＿ｐｅｒｍ）のコンカテマーをコードするｍＲＮＡとＳＴＩＮＧ免疫増強剤ｍＲＮＡを、さまざまな抗原とＳＴＩＮＧの用量及び抗原：ＳＴＩＮＧ比で組み合わせて免疫化したマウスからの抗原特異的応答を示す。示されるデータは、当該コンカテマー内にコードされるクラスＩエピトープＲＮＡ７に対応するペプチド配列によるインビトロ再刺激に関するものである。
【図９】５２のマウスエピトープ（追加エピトープ＿４ａ＿ＤＸ＿ＲＸ＿ｐｅｒｍ）のコンカテマーをコードするｍＲＮＡとＳＴＩＮＧ免疫増強剤ｍＲＮＡを、さまざまな抗原とＳＴＩＮＧの用量及び抗原：ＳＴＩＮＧ比で組み合わせて免疫化したマウスからの抗原特異的応答を示す。示されるデータは、当該コンカテマー内にコードされるクラスＩエピトープＲＮＡ１３に対応するペプチド配列によるインビトロ再刺激に関するものである。
【図１０】５２のマウスエピトープ（追加エピトープ＿４ａ＿ＤＸ＿ＲＸ＿ｐｅｒｍ）のコンカテマーをコードするｍＲＮＡとＳＴＩＮＧ免疫増強剤ｍＲＮＡを、さまざまな抗原とＳＴＩＮＧの用量及び抗原：ＳＴＩＮＧ比で組み合わせて免疫化したマウスからの抗原特異的応答を示す。示されるデータは、当該コンカテマー内にコードされるクラスＩエピトープＲＮＡ２２に対応するペプチド配列によるインビトロ再刺激に関するものである。
【図１１】５２のマウスエピトープ（追加エピトープ＿４ａ＿ＤＸ＿ＲＸ＿ｐｅｒｍ）のコンカテマーをコードするｍＲＮＡとＳＴＩＮＧ免疫増強剤ｍＲＮＡを、さまざまな抗原とＳＴＩＮＧの用量及び抗原：ＳＴＩＮＧ比で組み合わせて免疫化したマウスからの抗原特異的応答を示す。示されるデータは、当該コンカテマー内にコードされるクラスＩＩエピトープＲＮＡ１０に対応するペプチド配列によるインビトロ再刺激に関するものである。
【図１２】２０のマウスエピトープ（ＲＮＡ３１）のコンカテマーをコードするｍＲＮＡをＳＴＩＮＧ免疫増強剤ｍＲＮＡと組み合わせて免疫化したマウスからの抗原特異的ＩＦＮ−γ  Ｔ応答を、標準アジュバントまたは非製剤化（ＬＮＰに封入してないもの）と比較して示す棒グラフである。示されるデータは、当該コンカテマー内にコードされるクラスＩＩエピトープ（ＲＮＡ２及びＲＮＡ３）によるインビトロペプチド再刺激に関するものである。
【図１３】２０のマウスエピトープ（ＲＮＡ３１）のコンカテマーをコードするｍＲＮＡをＳＴＩＮＧ免疫増強剤ｍＲＮＡと組み合わせて免疫化したマウスからの抗原特異的ＩＦＮ−γ  Ｔ応答を、標準アジュバントまたは非製剤化（ＬＮＰに封入してないもの）と比較して示す棒グラフである。示されるデータは、当該コンカテマー内にコードされるクラスＩエピトープ（ＲＮＡ７、ＲＮＡ１０、及びＲＮＡ１３）によるインビトロペプチド再刺激に関するものである。
【図１４】２０のマウスエピトープ（ＲＮＡ３１）のコンカテマーをコードするｍＲＮＡをＳＴＩＮＧ免疫増強剤ｍＲＮＡと組み合わせて免疫化したマウスからの抗原特異的ＩＦＮ−γ  Ｔ応答を示す棒グラフである。ここで、ＳＴＩＮＧ構築物は、ワクチンと同時か、２４時間後または４８時間後に投与された。示されるデータは、当該コンカテマー内にコードされるクラスＩＩエピトープ（ＲＮＡ２及びＲＮＡ３）またはクラスＩエピトープ（ＲＮＡ７、ＲＮＡ１０、ＲＮＡ１３）のいずれかによるインビトロペプチド再刺激に関するものである。
【図１５】ＣＯＳＭＩＣ（２０１２）データセットで同定されている結腸直腸癌のＫＲＡＳ変異を示す。
【図１６】ＨＲＡＳに関するアイソフォームに特異的な点変異の特異性を示す。各点変異を有する腫瘍の総数を表すデータは、ＣＯＳＭＩＣ  ｖ５２リリースから照合した。それぞれのアミノ酸置換を生じさせる単一の塩基変異を示す。各癌種の各アイソフォームの最も高頻度の変異を灰色の網掛けで強調表示する。Ｈ／Ｌ：造血細胞／リンパ組織。（Ｐｒｉｏｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１２  Ｍａｙ  １５；７２（１０）：２４５７−２４６７）。
【図１７−１】ＫＲＡＳに関するアイソフォームに特異的な点変異の特異性を示す。各点変異を有する腫瘍の総数を表すデータは、ＣＯＳＭＩＣ  ｖ５２リリースから照合した。それぞれのアミノ酸置換を生じさせる単一の塩基変異を示す。各癌種の各アイソフォームの最も高頻度の変異を灰色の網掛けで強調表示する。Ｈ／Ｌ：造血細胞／リンパ組織。（Ｐｒｉｏｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１２  Ｍａｙ  １５；７２（１０）：２４５７−２４６７）。
【図１７−２】図１７−１の続きである。
【図１８】ＮＲＡＳに関するアイソフォームに特異的な点変異の特異性を示す。各点変異を有する腫瘍の総数を表すデータは、ＣＯＳＭＩＣ  ｖ５２リリースから照合した。それぞれのアミノ酸置換を生じさせる単一の塩基変異を示す。各癌種の各アイソフォームの最も高頻度の変異を灰色の網掛けで強調表示する。Ｈ／Ｌ：造血細胞／リンパ組織。（Ｐｒｉｏｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１２  Ｍａｙ  １５；７２（１０）：２４５７−２４６７）。
【図１９−１】ＥＧＦＲ遮断耐性を獲得した後の二次ＫＲＡＳ変異を示す。（Ｄｉａｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｑｕｉｒｅｄ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ＥＧＦＲ  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｉｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒｓ，Ｎａｔｕｒｅ  ４８６：５３７（２０１２））。
【図１９−２】図１９−１の続きである。
【図２０】ＥＧＦＲ遮断後の二次ＫＲＡＳ変異を示す。（Ｍｉｓａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ  ｏｆ  ＫＲＡＳ  ｍｕａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ａｃｑｕｉｒｅｄ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ４８６：５３２（２０１２））。
【図２１】ｃＢｉｏＰｏｒｔａｌを使用して同定した結腸直腸癌におけるＮＲＡＳ及びＫＲＡＳ変異頻度を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１２２】
本開示の実施形態では、癌抗原をコードするポリヌクレオチドを含むＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンが提供される。本明細書で提供される癌ＲＮＡワクチンを使用すると、ＤＮＡでのワクチン接種と関連するリスクの多くを伴うことなく、細胞性免疫及び／または体液性免疫を含むバランスのとれた免疫応答を誘導することができる。いくつかの実施形態では、ワクチンは、癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、癌抗原をコードする少なくとも１つのオープンリーディングフレームと、ユニバーサルタイプＩＩのＴ細胞エピトープをコードする少なくとも１つのオープンリーディングフレームと、を有する、少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。別の実施形態では、ワクチンは、癌抗原をコードする少なくとも１つのオープンリーディングフレームと、免疫増強剤（例えば、アジュバント）をコードする少なくとも１つのオープンリーディングフレームと、を有する、少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、癌抗原（例えば、活性化癌遺伝子変異ペプチド）をコードするオープンリーディングフレームを有する、少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
【０１２３】
ｍＲＮＡ癌ワクチンを含む機能性ＲＮＡワクチンを生成するための試みがいくつもなされてきたが、こうしたＲＮＡワクチンの治療効果は、依然として完全には確立されていない。非常に驚くべきことに、Ｔ細胞応答の増進を含む、顕著に増進しており、多くの点で相乗的な免疫応答を引き起こす、ｍＲＮＡワクチンを送達するための製剤クラスを発明者らは発見した。本発明のワクチンには、従来型癌ワクチンならびに個別化癌ワクチンが含まれる。いくつかの態様では、本発明は、化学的に修飾及び非修飾のｍＲＮＡワクチンを含むｍＲＮＡワクチンの有効性を脂質ナノ粒子製剤が顕著に増進するという驚くべき知見を含む。
【０１２４】
本明細書に記載の試験において使用した脂質ナノ粒子は、さまざまな動物モデルならびにヒトにおけるｓｉＲＮＡの送達に以前に使用されたものである。脂質ナノ粒子製剤によるｓｉＲＮＡの送達と関連して得られた知見を考慮すると、リポソームとは対照的に、脂質ナノ粒子が癌ワクチンにおいて有用であるという事実は非常に驚くべきものである。脂質ナノ粒子において製剤化されたｓｉＲＮＡの治療的な送達では、一過性のＩｇＭ応答と関連する望ましくない炎症応答が生じる結果として、典型的には、抗原産生が減少し、免疫応答が損なわれることが観測されている。ｓｉＲＮＡで観測された知見とは対照的に、本明細書に記載の脂質ナノ粒子−ｍＲＮＡ癌ワクチン製剤では、一過性のＩｇＭ応答ではなく、予防方法及び治療方法に十分となるＩｇＧレベルの増進が生じることが示されている。本発明の脂質ナノ粒子は、リポソームではない。本明細書で使用されるリポソームは、脂質二重層または単層シェルを有し、コア内に核酸ペイロードを含む、脂質ベースの構造である。
【０１２５】
ワクチン開発において標的ポリペプチド配列に対する所望の免疫応答（例えば、Ｔ細胞応答）を誘発する癌抗原の生成は、依然として難易度の高い課題である。本発明は、そのようなワクチン開発と関連するハードルを克服する技術を含むものである。本発明の技術を使用することで、適切なＴ細胞癌エピトープまたはＢ細胞癌エピトープを選択し、インビボでの有効な送達に向けてエピトープまたは抗原を製剤化することによって、所望の免疫応答を整えて導くことが可能である。追加的または代替的に、免疫応答は、適切なＴ細胞及び／またはＢ細胞癌エピトープまたは抗原に加えて送達される、１つまたは複数のユニバーサルタイプＩＩのＴ細胞エピトープを選択することによって、さらに増強することができる。
【０１２６】
追加的または代替的に、ｍＲＮＡワクチンは、活性化癌遺伝子変異ペプチド（例えば、ＫＲＡＳ変異ペプチド）を含み得る。以前の研究では、発癌性変異に特異的なＴ細胞を生産する能力には制限があることが示された。この研究のほとんどは、最も一般的なＨＬＡ対立遺伝子の環境（白色人種の約５０％で生じるＡ２）で実施された。より最近の研究では、あまり一般的でないＨＬＡ対立遺伝子の環境（Ａ１１，Ｃ８）で、点変異に特異的なＴ細胞の生成が探究されている。これらの所見は、癌の治療に関して、重要な意味を有している。発癌性変異が多くの癌で認められている。これらの変異を標的にし、腫瘍を殺傷するのに十分なＴ細胞を生成する能力は、癌治療に広く適用することができる。ペプチドワクチンの送達に比べて、ｍＲＮＡを使用した抗原の送達がこのような大きな利点を有することは、極めて驚くべきことである。したがって、本発明は、いくつかの態様では、ｍＲＮＡの形態でインビボで送達される活性化発癌性変異抗原が、癌治療の有効性を顕著に増進するという驚くべき知見を含む。
【０１２７】
ＨＬＡクラスＩ分子は、２つのポリペプチド鎖（重鎖及び軽鎖）から構成される、高度に多型の膜貫通糖タンパク質である。ヒト白血球型抗原であるヒト主要組織適合遺伝子複合体は、各個体に特異的であり、遺伝的特徴を有する。クラスＩの重鎖は、３つの遺伝子：ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−Ｃによってコードされている。ＨＬＡクラスＩ分子は、内因性抗原をＴリンパ球に提示することによって、免疫応答を確立するのに重要であり、それにより、細胞傷害性Ｔ細胞による腫瘍細胞の排除につながる一連の免疫応答が開始する。ＨＬＡクラスＩ抗原の産生レベルの変化は、悪性腫瘍で広く見られる現象であり、抗腫瘍Ｔ細胞機能の著しい抑制を伴う。これは、癌細胞が免疫監視機構を回避するために使用する主な機序の１つである。ＨＬＡクラスＩ抗原レベルの下方制御がＮＳＣＬＣ腫瘍の９０％で検出された（ｎ＝６５）。ＨＬＡの減少または喪失が膵臓腫瘍試料の７６％で検出された（ｎ＝１９）。結腸癌におけるＨＬＡクラスＩ抗原の発現は、腫瘍試料（ｎ＝２５）の９６％で劇的に低下するか、または検出不可能であった。
【０１２８】
多くの証拠は、腫瘍細胞が免疫監視機構を回避するために、免疫選択（免疫原性の低い腫瘍細胞バリアント）及び免疫破壊（免疫系の破壊）という２つの一般的な戦略を利用していることを示唆している。ＨＬＡクラスＩ抗原の変化と１２のＫＲＡＳコドン変異の存在との間には相関関係が示されており、これは、１２のＫＲＡＳコドン変異が癌進行におけるＨＬＡクラスＩ抗原制御に対する誘導的作用を持つ可能性を示唆している。高頻度の癌変異は、高親和性（ＩＣ５０≦５０ｎＭ）７でＨＬＡクラスＩ対立遺伝子に結合することが予測されており、予防用癌ワクチンに好適であり得る。
【０１２９】
治療用ｍＲＮＡは、単独で、または腫瘍に対する免疫応答を顕著に高めるチェックポイント阻害剤などの他の癌治療剤と組み合わせて送達することができる。チェックポイント阻害剤は、免疫応答の促進に対する障害のいくつかを排除することによって、活性化発癌性ペプチドをコードするｍＲＮＡの作用を高め、それにより、活性化Ｔ細胞が腫瘍に対する免疫応答を効率的に促進できるようになる。
【０１３０】
本明細書に記載のｍＲＮＡワクチンは、現在のワクチンと比較していくつかの点で優れていることが発見された。第１に、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）による送達は、文献に記載のリポソームまたはプロタミンに基づく手法を含む他の製剤より優れている。ＬＮＰを使用すると、化学的に修飾または非修飾のｍＲＮＡワクチンを効率的に送達することが可能になる。修飾及び非修飾のＬＮＰ製剤化ｍＲＮＡワクチンは両方共、通常のワクチンより顕著に優れている。いくつかの実施形態では、本発明のｍＲＮＡワクチンは、通常のワクチンと比較して、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、または少なくとも１，０００倍優れている。
【０１３１】
ｍＲＮＡワクチン及び自己複製ＲＮＡワクチンを含む機能性ＲＮＡワクチンを生成するための試みがいくつもなされてきたが、こうしたＲＮＡワクチンの治療効果は、依然として完全には確立されていない。非常に驚くべきことに、抗原産生の増進及び中和能力を有する機能性抗体の産生を含む、顕著に増進しており、多くの点で相乗的な免疫応答を引き起こす、インビボでｍＲＮＡワクチンを送達するための製剤クラスを、本発明の態様に従って発明者らは発見した。こうした結果は、脂質に基づく他のクラスの製剤において使用されるｍＲＮＡ用量と比較して顕著に低い用量のｍＲＮＡが投与されるときでさえ達成することができる。本発明の製剤は、予防剤及び治療剤としての機能性ｍＲＮＡワクチンの効果を確立するために十分な、顕著な免疫応答をインビボで予想外に引き起こすことが示された。さらに、自己複製ＲＮＡワクチンでは、細胞に十分なＲＮＡを送達するためにウイルスの複製経路を利用することで免疫応答が生成する。本発明の製剤では、ウイルス複製を必要とすることなく、強力な免疫応答の誘発に十分なタンパク質が産生する。したがって、本発明のｍＲＮＡは、自己複製ＲＮＡではなく、ウイルス複製に必要な要素を含まない。
【０１３２】
いくつかの態様では、本発明は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤が、化学的に修飾及び非修飾のｍＲＮＡワクチンを含むｍＲＮＡワクチンの有効性を顕著に増進するという驚くべき知見を含む。さらに、エピトープに対する免疫原性は、構築物内に含まれるエピトープの総数に関係なく、類似することがわかった。５２マー構築物に含まれるエピトープは、エピトープ特異的ＩＦＮγ応答によって測定したとき、２０マー構築物と比較して、同様の免疫原性を有する。ｍＲＮＡの長さを増やすことが、エピトープの免疫原性に対して有害な影響がないと示されたことは、全く予想外であった。２０マー及び５２マー（ＳＩＩＮＦＥＫＬ、配列番号２３１）にコードされた最後のエピトープが同等のものであったことから、これは、コンカテマーの完全な読み通しも示している。また、驚くべきことに、クラスＩエピトープに対する抗原特異的応答は、ワクチンが構造的に活性な免疫増強剤とともに処方された場合、増大することがわかった。
【０１３３】
本明細書に記載の試験において使用したＬＮＰは、さまざまな動物モデルならびにヒトにおけるｓｉＲＮＡの送達に以前に使用されたものである。ＬＮＰ製剤によるｓｉＲＮＡの送達と関連して得られた知見を考慮すると、ＬＮＰがワクチンにおいて有用であるという事実は非常に驚くべきものである。ＬＮＰにおいて製剤化されたｓｉＲＮＡの治療的な送達では、一過性のＩｇＭ応答と関連する望ましくない炎症応答が生じる結果として、典型的には、抗原産生が減少し、免疫応答が損なわれることが観測されている。ｓｉＲＮＡで観測された知見とは対照的に、本発明のＬＮＰ−ｍＲＮＡ製剤では、一過性のＩｇＭ応答ではなく、予防方法及び治療方法に十分となるＩｇＧレベルの増進が生じることが本明細書に示されている。
【０１３４】
ｍＲＮＡ癌ワクチンは、ペプチドに基づくワクチンまたはＤＮＡワクチンの代わりとなる特有の治療選択肢を与えるものである。ｍＲＮＡ癌ワクチンが細胞に送達されると、ｍＲＮＡは、細胞内機構によって処理されることでポリペプチドを生成し、この細胞内機構による処理を受けることで、生成したポリペプチドは腫瘍に対する免疫応答を刺激する能力を有する免疫感受性断片となることができる。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ癌ワクチンは、限定するものではないが、従来型癌ワクチンを含む、抗癌治療剤とともに投与され得る。ｍＲＮＡ癌ワクチン及び抗癌治療剤は、免疫治療応答をさらに増進するために組み合わせることができる。ｍＲＮＡ癌ワクチン及び他の治療剤は、同時または連続的に投与してよい。他の治療剤が同時に投与されるとき、それを同一の製剤または別々の製剤において投与することができるが、投与は同時に実施される。他の治療剤及びｍＲＮＡ癌ワクチンの投与が時間的に別々であるとき、他の治療剤は、互いに連続的に投与され、かつｍＲＮＡ癌ワクチンと連続的に投与される。こうした化合物の投与の時間間隔は、数分程度であり得るか、または例えば、数時間、数日、数週間、数ヶ月などの、より長い時間であり得る。他の治療剤には、限定はされないが、抗癌治療剤、アジュバント、サイトカイン、抗体、抗原などが含まれる。
【０１３６】
本明細書に記載の癌ワクチンは、少なくとも１つの癌抗原ポリペプチドまたはその免疫原性断片（例えば、癌に対する免疫応答を誘導する能力を有する免疫原性断片）をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。抗原ペプチドは、個別化癌抗原エピトープ、及び／または再発性抗原であり得る。いくつかの好ましい実施形態では、ワクチンは、上記のそれぞれの組み合わせの複数のエピトープである。したがって、癌ワクチンは、従来型癌ワクチンもしくは個別化癌ワクチンまたはそれらの混合物であり得る。従来型癌ワクチンは、癌もしくは腫瘍に一般に見られることが知られる癌抗原、または特定の型の癌もしくは腫瘍において見られることが知られる癌抗原を含むワクチンである。腫瘍細胞においてまたは腫瘍細胞によって発現する抗原は、「腫瘍関連抗原」と称される。特定の腫瘍関連抗原は、非癌性細胞に発現し得るか、または発現し得ないこともある。多くの腫瘍変異が当該技術分野において知られている。
【０１３７】
驚くべきことに、ＲＮＡベースのマルチエピトープ癌ワクチンが、個々のエピトープまたはコンカテマーとして製剤化されるかどうかに関係なく、ＭＨＣクラスＩエピトープとＭＨＣクラスＩＩエピトープの慎重なバランスにより、最適な免疫刺激をもたらすことができることが発見された。両方の構成成分をコードするＲＮＡワクチンは、免疫原性が高い。
【０１３８】
個別化ワクチンは、例えば、腫瘍に特異的な１つもしくは複数の既知の癌抗原または各対象に特異的な癌抗原をコードするＲＮＡを含み得、こうした抗原は、ネオエピトープまたは対象特異的エピトープもしくは対象特異的抗原と称される（個別化抗原と称される）。「対象特異的癌抗原」は、特定の患者の腫瘍に発現することが同定された抗原である。対象特異的癌抗原は、典型的には、腫瘍試料に存在し得たり、または存在し得なかったりすることが一般的である。非癌性細胞では発現しないか、もしくはめったに発現しないか、または非癌性細胞におけるその発現が、癌性細胞におけるものと比較して顕著に減少しており、ワクチン接種時に誘導される免疫応答を誘導する腫瘍関連抗原は、ネオエピトープと称される。腫瘍関連抗原のようなネオエピトープは、体に対して完全に外来性であるため、健康な組織に対する免疫応答を生成しないか、または免疫系の防御成分によって遮蔽されると想定される。いくつかの実施形態では、ネオエピトープに基づく個別化ワクチンが望ましく、この理由は、そのようなワクチン製剤によって、患者特異的な腫瘍に対する特異性が最大化することになるためである。変異によって得られるネオエピトープは、タンパク質に異なるアミノ酸が生じる非同義変異である点変異、終止コドンが修飾または欠失し、Ｃ末端に新規の腫瘍特異的配列を有する長鎖化タンパク質の翻訳を引き起こすリードスルー変異、成熟ｍＲＮＡにイントロンが含められるために、特有の腫瘍特異的タンパク質配列が生じるスプライス部位変異、２つのタンパク質のジャンクションに腫瘍特異的配列を有するキメラタンパク質が生じる染色体再編（すなわち、遺伝子融合）、新規の腫瘍特異的タンパク質配列を有する新たなオープンリーディングフレームが生じるフレームシフト変異または欠失、及び転座から生じ得る。したがって、いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ癌ワクチンは、フレームシフト変異及び組換えまたは本明細書に記載の他の変異のいずれかからなる群から選択される変異を含む少なくとも２つの癌抗原を含む。
【０１３９】
個別化癌ワクチンの生成方法は、一般に、例えば核酸またはタンパク質のディープシークエンシング技術を使用する変異の同定と、例えば有効なペプチド−ＭＨＣ結合予測アルゴリズム、または患者のＨＬＡ対立遺伝子に結合し得、腫瘍に存在する変異に基づく候補Ｔ細胞エピトープのセットを生成するための他の分析技術を適用するネオエピトープの同定と、選択されるネオエピトープを抗原特異的Ｔ細胞が標的とすることの任意選択の実証または候補ネオエピトープが腫瘍表面に存在するＨＬＡタンパク質に結合することの任意選択の実証と、ワクチンの開発と、を含む。本発明のｍＲＮＡ癌ワクチンは、単一のネオエピトープの複数のコピー、単一の型の変異、すなわち点変異に基づく複数の異なるネオエピトープ、さまざまな変異型に基づく複数の異なるネオエピトープ、腫瘍関連抗原またはリコール抗原などのネオエピトープ及び他の抗原を含み得る。
【０１４０】
変異の同定技術の例には、限定はされないが、動的対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション（ＤＡＳＨ）、マイクロプレートアレイダイアゴナルゲル電気泳動（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ａｒｒａｙ  ｄｉａｇｏｎａｌ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）（ＭＡＤＧＥ）、パイロシークエンシング、オリゴヌクレオチド特異的ライゲーション、ＴａｑＭａｎシステム、ならびにさまざまなＤＮＡ「チップ」技術、すなわちＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＳＮＰチップ、ならびに浸潤性の切断によって小型シグナル分子を生成させた後、質量分析法、または固定化パドロックプローブ及びローリングサークル増幅を実施することに基づく方法が含まれる。
【０１４１】
核酸またはタンパク質のディープシークエンシング技術は、当該技術分野において知られている。任意の型の配列解析方法を使用することができる。核酸シークエンシングは、全腫瘍ゲノム、腫瘍エクソーム（タンパク質コードＤＮＡ）、腫瘍トランスクリプトーム、またはエキソソームに対して実施してよい。合成ごとのリアルタイム１分子シークエンシング技術は、シークエンシングされる鋳型に相補的なＤＮＡ新生鎖に蛍光ヌクレオチドが組み込まれるたびにそれが検出されるということを利用するものである。迅速なハイスループットシークエンシング方法は他にも存在する。タンパク質シークエンシングは、腫瘍プロテオームに対して実施してよい。さらに、腫瘍細胞に存在するＭＨＣタンパク質に結合した変異ペプチドが存在することを同定または検証をするために、タンパク質質量分析法を使用してよい。ペプチドは、腫瘍細胞から酸によって溶出させるか、または腫瘍から免疫沈降させたＨＬＡ分子から酸によって溶出させた後、質量分析法を使用して同定することができる。シークエンシングの結果は、既知の対照セットと比較するか、または患者の正常組織に対して実施されたシークエンシング解析と比較してよい。
【０１４２】
したがって、本発明は、抗原のネオエピトープの同定方法及び／または検出方法に関する。具体的には、本発明は、対象における腫瘍特異的免疫応答の誘導において有用な腫瘍特異的ネオエピトープの同定方法及び／または検出方法を提供する。任意選択で、こうしたネオエピトープのいくつかは、野生型ペプチドと比較してクラスＩのＨＬＡタンパク質に強い親和性で結合し、及び／または抗腫瘍ＣＤ８  Ｔ細胞を活性化する能力を有する。他の物は、クラスＩＩに結合し、ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞を活性化する。ワクチンにおいてクラスＩ抗原が果たす重要な役割は認識されているが、クラスＩ抗原とクラスＩＩ抗原のバランスから構成されるワクチンが、クラスＩまたはクラスＩＩのみに基づくワクチンよりも強力な免疫応答を実際にもたらすことが本発明で発見された。
【０１４３】
ＭＨＣクラスＩタンパク質は、ほとんどの腫瘍細胞を含む、体のほとんどすべての細胞の表面に存在する。内在性タンパク質または細胞内に存在する病原体に通常は起源を有する抗原は、ＭＨＣクラスＩタンパク質に負荷され、その後、こうした抗原は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）に提示される。Ｔ細胞受容体は、ＭＨＣクラスＩ分子と複合化したペプチドを認識してそれに結合する能力を有する。細胞傷害性Ｔリンパ球はそれぞれ、ＭＨＣ／ペプチド複合体に特異的に結合する能力を有する特有のＴ細胞受容体を発現する。
【０１４４】
コンピューターアルゴリズムを使用すると、潜在的なネオエピトープを予測することが可能であり、こうしたネオエピトープは、すなわち、ペプチド提示複合体の形態のクラスＩまたはクラスＩＩのＭＨＣ分子が結合した後、この形態においてＴリンパ球のＴ細胞受容体によって認識されるペプチド配列である。ＭＨＣに結合することになるペプチドの同定に有用なプログラムの例には、例えば、Ｌｏｎｚａ  Ｅｐｉｂａｓｅ、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ（Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，５０（１９９９），２１３−２１９）、及びＨＬＡ＿ＢＩＮＤ（Ｐａｒｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２（１９９４），１６３−１７５）が含まれる。
【０１４５】
推定ネオエピトープが選択されると、インビトロ及び／またはインビトロのアッセイを使用してそれをさらに試験することができる。それぞれの患者からの単離物を用いて、Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイなどの、研究室において実施される通常のインビトロアッセイを使用することで、アルゴリズムによる予測に基づいて選択されたネオエピトープのリストを洗練してよい。
【０１４６】
本発明のｍＲＮＡ癌ワクチンは、医薬組成物を含む組成物である。本発明は、ｍＲＮＡ癌ワクチンの選択方法、設計方法、調製方法、製造方法、製剤化方法、及び／または使用方法も包含する。本明細書に記載のｍＲＮＡ癌ワクチンの選択、設計、及び／または利用を目的とするシステム、プロセス、機器、及びキットも提供される。
【０１４７】
本発明のｍＲＮＡワクチンは、１つまたは複数の癌抗原を含み得る。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡワクチンは、４５以上、４６以上、４７以上、４８以上、４９以上、５０以上、５１以上、５２以上、５３以上、５４以上、または５５以上の抗原から構成される。他の実施形態では、ｍＲＮＡワクチンは、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、または９以上の抗原から構成される。他の実施形態では、ｍＲＮＡワクチンは、１０００以下、９００以下、５００以下、１００以下、７５以下、５０以下、４０以下、３０以下、２０以下、または１００以下の癌抗原から構成される。さらに他の実施形態では、ｍＲＮＡワクチンは、３〜１００、５〜１００、１０〜１００、１５〜１００、２０〜１００、２５〜１００、３０〜１００、３５〜１００、４０〜１００、４５〜１００、５０〜１００、５５〜１００、６０〜１００、６５〜１００、７０〜１００、７５〜１００、８０〜１００、９０〜１００、５〜５０、１０〜５０、１５〜５０、２０〜５０、２５〜５０、３０〜５０、３５〜５０、４０〜５０、４５〜５０、１００〜１５０、１００〜２００、１００〜３００、１００〜４００、１００〜５００、５０〜５００、５０〜８００、５０〜１，０００、または１００〜１，０００の癌抗原を有する。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ癌ワクチン及びワクチン接種方法は、特定の変異に基づくエピトープまたは抗原（ネオエピトープ）及び癌−生殖系列遺伝子が発現するもの（複数の患者に見られる腫瘍に共通する抗原）を含む。
【０１４９】
本明細書で使用されるエピトープは、抗原決定基としても知られ、適切な状況では免疫系によって認識される抗原の一部分であり、具体的には、抗体、Ｂ細胞、またはＴ細胞によって認識される抗原の一部分である。エピトープには、Ｂ細胞エピトープ及びＴ細胞エピトープが含まれる。Ｂ細胞エピトープは、特定の抗体産生Ｂ細胞による認識に必要なペプチド配列である。Ｂ細胞エピトープは、抗体によって認識される抗原の特定領域を指す。エピトープに結合する抗体の一部分は、パラトープと呼ばれる。エピトープは、構造及びパラトープとの相互作用に基づく立体構造エピトープまたは直線状エピトープであり得る。直線状または連続的なエピトープは、タンパク質の特定領域の一次アミノ酸配列によって定義される。抗体と相互作用する配列は、連続的に互いに隣り合ってタンパク質に位置しており、エピトープは、通常、単一のペプチドによって模倣することができる。立体構造エピトープは、天然のタンパク質の立体構造によって定義されるエピトープである。こうしたエピトープは、連続的または非連続的であり得、すなわち、エピトープの構成要素は、タンパク質の異なる部分に位置し得、こうした異なる部分は、折り畳まれた天然のタンパク質構造において互いに近接化している。
【０１５０】
Ｔ細胞エピトープは、ＡＰＣに存在するタンパク質と会合し、特定のＴ細胞による認識に必要なペプチド配列である。Ｔ細胞エピトープは、細胞内でプロセシングを受けてからＡＰＣの表面に提示され、ＡＰＣ表面で、ＭＨＣクラスＩＩ及びＭＨＣクラスＩを含むＭＨＣ分子に結合する。ペプチドエピトープは、エピトープとして適切な任意の長さであり得る。いくつかの実施形態では、ペプチドエピトープは、９〜３０のアミノ酸である。他の実施形態では、長さは、９〜２２、９〜２９、９〜２８、９〜２７、９〜２６、９〜２５、９〜２４、９〜２３、９〜２１、９〜２０、９〜１９、９〜１８、１０〜２２、１０〜２１、１０〜２０、１１〜２２、２２〜２１、１１〜２０、１２〜２２、１２〜２１、１２〜２０、１３〜２２、１３〜２１、１３〜２０、１４〜１９、１５〜１８、または１６〜１７のアミノ酸である。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、ペプチドエピトープは、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、及び少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープを含む。いくつかの実施形態では、エピトープの少なくとも１０％は、ＭＨＣクラスＩエピトープである。いくつかの実施形態では、エピトープの少なくとも２０％は、ＭＨＣクラスＩエピトープである。いくつかの実施形態では、エピトープの少なくとも３０％は、ＭＨＣクラスＩエピトープである。いくつかの実施形態では、エピトープの少なくとも４０％は、ＭＨＣクラスＩエピトープである。いくつかの実施形態では、エピトープの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％は、ＭＨＣクラスＩエピトープである。いくつかの実施形態では、エピトープの少なくとも１０％は、ＭＨＣクラスＩＩエピトープである。いくつかの実施形態では、エピトープの少なくとも２０％は、ＭＨＣクラスＩＩエピトープである。いくつかの実施形態では、エピトープの少なくとも３０％は、ＭＨＣクラスＩＩエピトープである。いくつかの実施形態では、エピトープの少なくとも４０％は、ＭＨＣクラスＩＩエピトープである。いくつかの実施形態では、エピトープの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％は、ＭＨＣクラスＩＩエピトープである。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩエピトープとＭＨＣクラスＩＩエピトープとの比率は、約１０％：約９０％、約２０％：約８０％、約３０％：約７０％、約４０％：約６０％、約５０％：約５０％、約６０％：約４０％、約７０％：約３０％、約８０％：約２０％、約９０％：約１０％のＭＨＣクラス１エピトープ：ＭＨＣクラスＩＩエピトープから選択される比率である。１つの実施形態では、ＭＨＣクラスＩエピトープ：ＭＨＣクラスＩＩエピトープの比率は、３：１である。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩエピトープとＭＨＣクラスＩエピトープとの比率は、約１０％：約９０％、約２０％：約８０％、約３０％：約７０％、約４０％：約６０％、約５０％：約５０％、約６０％：約４０％、約７０％：約３０％、約８０％：約２０％、約９０％：約１０％のＭＨＣクラスＩＩエピトープ：ＭＨＣクラスＩエピトープから選択される比率である。１つの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩエピトープ：ＭＨＣクラスＩエピトープの比率は、１：３である。いくつかの実施形態では、癌ワクチンのペプチドエピトープのうちの少なくとも１つは、Ｂ細胞エピトープである。いくつかの実施形態では、癌ワクチンのＴ細胞エピトープは、８〜１１のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、癌ワクチンのＢ細胞エピトープは、１３〜１７のアミノ酸を含む。
【０１５２】
他の態様では、本発明の癌ワクチンは、１つまたは複数のユニバーサルタイプＩＩのＴ細胞エピトープが散在して配置された、複数のペプチドエピトープ抗原をコードするｍＲＮＡワクチンを含む。ユニバーサルタイプＩＩのＴ細胞エピトープには、ＩＬＭＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩ（テタヌス毒素；配列番号２２６）、ＦＮＮＦＴＶＳＦＷＬＲＶＰＫＶＳＡＳＨＬＥ（テタヌス毒素；配列番号２２７）、ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥ（テタヌス毒素；配列番号２２８）ＱＳＩＡＬＳＳＬＭＶＡＱＡＩＰ（ジフテリア毒素；配列番号２２９）、及びＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ（汎ＤＲエピトープ（ＰＡＤＲＥ）；配列番号２３０）が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡワクチンは、同じユニバーサルタイプＩＩのＴ細胞エピトープを含む。他の実施形態では、ｍＲＮＡワクチンは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、または２０の異なるユニバーサルタイプＩＩのＴ細胞エピトープを含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のユニバーサルタイプＩＩのＴ細胞エピトープ（複数可）は、すべての癌抗原の間に散在している。他の実施形態では、１つまたは複数のユニバーサルタイプＩＩのＴ細胞エピトープ（複数可）は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または１００癌抗原ごとに散在している。
【０１５３】
いくつかの態様では、本発明の癌ワクチンは、エピトープの間に単一のヌクレオチドスペーサーを挟んで配置されるか、またはエピトープの間にスペーサーを挟まずに互いに直接配置される複数のペプチドエピトープ抗原をコードするｍＲＮＡワクチンを含む。複数のエピトープ抗原には、ＭＨＣクラスＩエピトープとＭＨＣクラスＩＩエピトープとの混合物が含まれる。例えば、複数のペプチドエピトープ抗原は、次の構造：
（Ｘ−Ｇ−Ｘ）１−１０（Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｙ）１−１０（Ｇ−Ｘ−Ｇ−Ｘ）０−１０（Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｙ）０−１０、（Ｘ−Ｇ）１−１０（Ｇ−Ｙ）１−１０（Ｇ−Ｘ）０−１０（Ｇ−Ｙ）０−１０、（Ｘ−Ｇ−Ｘ−Ｇ−Ｘ）１−１０（Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｙ）１−１０（Ｘ−Ｇ−Ｘ）０−１０（Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｙ）０−１０、（Ｘ−Ｇ−Ｘ）１−１０（Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｙ）１−１０（Ｘ−Ｇ−Ｘ）０−１０（Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｙ）０−１０、（Ｘ−Ｇ−Ｘ−Ｇ−Ｘ−Ｇ−Ｘ）１−１０（Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｙ）１−１０（Ｘ−Ｇ−Ｘ）０−１０（Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｙ）０−１０、（Ｘ−Ｇ−Ｘ）１−１０（Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｙ）１−１０（Ｘ−Ｇ−Ｘ）０−１０（Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｙ）０−１０、（Ｘ）１−１０（Ｙ）１−１０（Ｘ）０−１０（Ｙ）０−１０、（Ｙ）１−１０（Ｘ）１−１０（Ｙ）０−１０（Ｘ）０−１０、（ＸＸ）１−１０（Ｙ）１−１０（Ｘ）０−１０（Ｙ）０−１０、（ＹＹ）１−１０（ＸＸ）１−１０（Ｙ）０−１０（Ｘ）０−１０、（Ｘ）１−１０（ＹＹ）１−１０（Ｘ）０−１０（Ｙ）０−１０、（ＸＸＸ）１−１０（ＹＹＹ）１−１０（ＸＸ）０−１０（ＹＹ）０−１０、（ＹＹＹ）１−１０（ＸＸＸ）１−１０（ＹＹ）０−１０（ＸＸ）０−１０、（ＸＹ）１−１０（Ｙ）１−１０（Ｘ）１−１０（Ｙ）１−１０、（ＹＸ）１−１０（Ｙ）１−１０（Ｘ）１−１０（Ｙ）１−１０、（ＹＸ）１−１０（Ｘ）１−１０（Ｙ）１−１０（Ｙ）１−１０、（Ｙ−Ｇ−Ｙ）１−１０（Ｇ−Ｘ−Ｇ−Ｘ）１−１０（Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｙ）０−１０（Ｇ−Ｘ−Ｇ−Ｘ）０−１０、（Ｙ−Ｇ）１−１０（Ｇ−Ｘ）１−１０（Ｇ−Ｙ）０−１０（Ｇ−Ｘ）０−１０、（Ｙ−Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｙ）１−１０（Ｇ−Ｘ−Ｇ−Ｘ）１−１０（Ｙ−Ｇ−Ｙ）０−１０（Ｇ−Ｘ−Ｇ−Ｘ）０−１０、（Ｙ−Ｇ−Ｙ）１−１０（Ｇ−Ｘ−Ｇ−Ｘ−Ｇ−Ｘ）１−１０（Ｙ−Ｇ−Ｙ）０−１０（Ｇ−Ｘ−Ｇ−Ｘ）０−１０、（Ｙ−Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｙ）１−１０（Ｇ−Ｘ−Ｇ−Ｘ）１−１０（Ｙ−Ｇ−Ｙ）０−１０（Ｇ−Ｘ−Ｇ−Ｘ）０−１０、（Ｙ−Ｇ−Ｙ）１−１０（Ｇ−Ｘ−Ｇ−Ｘ−Ｇ−Ｘ−Ｇ−Ｘ）１−１０（Ｙ−Ｇ−Ｙ）０−１０（Ｇ−Ｘ−Ｇ−Ｘ）０−１０、（ＸＹ）１−１０（ＹＸ）１−１０（ＸＹ）０−１０（ＹＸ）０−１０、（ＹＸ）１−１０（ＸＹ）１−１０（Ｙ）０−１０（Ｘ）０−１０、（ＹＹ）１−１０（Ｘ）１−１０（Ｙ）０−１０（Ｘ）０−１０、（ＸＹ）１−１０（ＸＹ）１−１０（Ｘ）０−１０（Ｘ）０−１０、（Ｙ）１−１０（ＹＸ）１−１０（Ｘ）０−１０（Ｙ）０−１０、（ＸＹＸ）１−１０（ＹＸＸ）１−１０（ＹＸ）０−１０（ＹＹ）０−１０、または（ＹＹＸ）１−１０（ＸＸＹ）１−１０（ＹＸ）０−１０（ＸＹ）０−１０
（Ｘは、１０〜４０のアミノ酸長のＭＨＣクラスＩエピトープであり、Ｙは、１０〜４０のアミノ酸長のＭＨＣクラスＩＩエピトープであり、Ｇは、グリシンである）を有するポリペプチドであり得る。
【０１５４】
本発明の癌ワクチンは、いくつかの態様では、中央に位置する一塩基多型（ＳＮＰ）変異が配置され、ＳＮＰ変異の両側には隣接アミノ酸が存在する、複数のペプチドエピトープ抗原をコードするｍＲＮＡワクチンを含む。いくつかの実施形態では、中央に位置するＳＮＰ変異の両側の隣接アミノ酸の数は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２６、２８、または３０である。１つの実施形態では、癌ワクチンのエピトープは、各配列が７アミノ酸を含む２つのクラスＩ配列に挟まれたＳＮＰを含む。別の実施形態では、癌ワクチンのエピトープは、各配列が１０アミノ酸を含む２つのクラスＩＩ配列に挟まれたＳＮＰを含む。いくつかの実施形態では、エピトープは、中央に位置するＳＮＰと、クラスＩ配列の両方、クラスＩＩ配列の両方、または１つのクラスＩ及び１つのクラスＩＩ配列である隣接配列と、を含み得る。
【０１５５】
免疫増強剤ｍＲＮＡ
本開示の１つの態様は、目的の癌抗原のうちの１つまたは複数に対する免疫応答を刺激または増進させるポリペプチドをコードするｍＲＮＡに関する。目的の癌抗原（複数可）に対する免疫応答を増進するそのようなｍＲＮＡは、本明細書で、免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物または免疫増強剤ｍＲＮＡと称され、化学的に修飾されたｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）を含む。本開示の免疫増強剤は、対象において、目的の抗原に対する免疫応答を増進する。増進される免疫応答は、細胞性応答、体液性応答またはその両方であってよい。本明細書で使用されるとき、「細胞性」免疫応答は、Ｔ細胞が関与または媒介する免疫応答を包含することが意図され、一方、「体液性」免疫応答は、Ｂ細胞が関与または媒介する免疫応答を包含することが意図される。免疫増強剤は、例えば、
（ｉ）Ｉ型インターフェロン経路のシグナル伝達を刺激すること、
（ｉｉ）ＮＦｋＢ経路のシグナル伝達を刺激すること、
（ｉｉｉ）炎症反応を刺激すること、
（ｉｖ）サイトカイン産生を刺激すること、または
（ｖ）樹状細胞の発生、活性もしくは動員を刺激すること、及び
（ｖｉ）（ｉ）〜（ｖｉ）のいずれかの組み合わせによって、免疫応答を増強し得る。
【０１５６】
本明細書で使用されるとき、「Ｉ型インターフェロン経路のシグナル伝達を刺激すること」とは、Ｉ型インターフェロンシグナル伝達経路の１つもしくは複数の構成成分を活性化すること（例えば、そのような構成成分のリン酸化、二量体化などを変更することによって経路を活性化すること）、インターフェロン感受性応答要素（ＩＳＲＥ）からの転写を刺激すること及び／またはＩ型インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−ε、ＩＦＮ−κ及び／またはＩＦＮ−ω）の産生もしくは分泌を刺激することを包含することが意図される。本明細書で使用されるとき、「ＮＦｋＢ経路のシグナル伝達を刺激すること」とは、ＮＦｋＢシグナル伝達経路の１つもしくは複数の構成成分を活性化すること（例えば、そのような構成成分のリン酸化、二量体化などを変更することによって経路を活性化すること）、ＮＦｋＢ部位からの転写を刺激すること及び／またはＮＦｋＢによって発現が制御されている遺伝子産物の産生を刺激することを包含することが意図される。本明細書で使用されるとき、「炎症反応を刺激すること」とは、炎症性サイトカイン（限定するものではないがＩ型インターフェロン、ＩＬ−６及び／またはＴＮＦαを含む）の産生を刺激することを包含することが意図される。本明細書で使用されるとき、「樹状細胞の発生、活性もしくは動員を刺激すること」とは、樹状細胞の成熟、増殖及び／または機能活性を直接的または間接的に刺激することを包含することが意図される。
【０１５７】
いくつかの態様では、本開示は、例えば、対象において、適応免疫を誘導すること（例えば、Ｉ型インターフェロン産生を刺激することによる）、炎症反応を刺激すること、ＮＦｋＢシグナル伝達を刺激すること及び／または樹状細胞（ＤＣ）の発生、活性もしくは動員を刺激することによって、免疫応答を刺激または増進させることを、それを必要とする対象において行う（例えば、対象の免疫応答を増強する）ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを提供する。いくつかの態様では、免疫増強剤ｍＲＮＡの投与を、それを必要とする対象において行うと、対象の細胞性免疫（例えば、Ｔ細胞媒介性免疫）、体液性免疫（例えば、Ｂ細胞媒介性免疫）または細胞性免疫と体液性免疫の両方が増進する。いくつかの態様では、免疫増強剤ｍＲＮＡの投与は、サイトカイン産生（例えば、炎症性サイトカイン産生）を刺激し、癌抗原特異的ＣＤ８＋エフェクター細胞応答を刺激し、抗原特異的ＣＤ４＋ヘルパー細胞応答を刺激し、エフェクターメモリーＣＤ６２ＬｌｏＴ細胞集団を増加させ、Ｂ細胞活性を刺激し、または抗原特異的抗体産生を刺激する（前述の応答の組み合わせを含む）。いくつかの態様では、免疫増強剤ｍＲＮＡの投与は、サイトカイン産生（例えば、炎症性サイトカイン産生）を刺激し、かつ抗原特異的ＣＤ８＋エフェクター細胞応答を刺激する。いくつかの態様では、免疫増強剤ｍＲＮＡの投与は、サイトカイン産生（例えば、炎症性サイトカイン産生）を刺激し、かつ抗原特異的ＣＤ４＋ヘルパー細胞応答を刺激する。いくつかの態様では、免疫増強剤ｍＲＮＡの投与は、サイトカイン産生（例えば、炎症性サイトカイン産生）を刺激し、かつエフェクターメモリーＣＤ６２ＬｌｏＴ細胞集団を増加させる。いくつかの態様では、免疫増強剤ｍＲＮＡの投与は、サイトカイン産生（例えば、炎症性サイトカイン産生）を刺激し、かつＢ細胞活性を刺激するか、抗原特異的抗体産生を刺激する。
【０１５８】
１つの実施形態では、免疫増強剤は、癌抗原特異的ＣＤ８＋エフェクター細胞応答（細胞性免疫）を増大させる。例えば、免疫増強剤は、限定するものではないが、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖及びＣＤ８＋Ｔ細胞のサイトカイン産生を含む、抗原特異的ＣＤ８＋エフェクター細胞活性の１つまたは複数の指標を増加させることができる。例えば、１つの実施形態では、免疫増強剤は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ、ＴＮＦα及び／またはＩＬ−２の産生を増加させる。種々の実施形態では、免疫増強剤は、ＣＤ８＋Ｔ細胞サイトカイン産生（例えば、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα及び／またはＩＬ−２産生）を、抗原に応答して、少なくとも５％または少なくとも１０％または少なくとも１５％または少なくとも２０％または少なくとも２５％または少なくとも３０％または少なくとも３５％または少なくとも４０％または少なくとも４５％または少なくとも５０％増加させることができる（免疫増強剤がない状態でのＣＤ８＋Ｔ細胞サイトカイン産生と比較して）。例えば、治療対象から得られたＴ細胞を癌抗原を用いてインビトロで刺激することができ、ＣＤ８＋Ｔ細胞サイトカイン産生をインビトロで評価することができる。ＣＤ８＋Ｔ細胞サイトカイン産生は、当該技術分野において知られている標準的な方法によって決定することができ、これらには、限定するものではないが、サイトカイン産生の分泌量の測定（例えば、ＥＬＩＳＡまたは当該技術分野において知られている上清中のサイトカインの量を決定するための他の好適な方法によるもの）及び／またはサイトカインに関する細胞内染色（ＩＣＳ）が陽性であるＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージの決定が含まれる。例えば、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα及び／またはＩＬ−２の発現に関するＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞内染色（ＩＣＳ）は、当該技術分野において知られている方法によって実施することができる（例えば、実施例を参照のこと）。１つの実施形態では、免疫増強剤は、１つまたは複数のサイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα及び／またはＩＬ−２）に関するＩＣＳが陽性であるＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、抗原に応答して、少なくとも５％または少なくとも１０％または少なくとも１５％または少なくとも２０％または少なくとも２５％または少なくとも３０％または少なくとも３５％または少なくとも４０％または少なくとも４５％または少なくとも５０％増加させることができる（免疫増強剤がない状態でのサイトカイン（複数可）に関するＩＣＳが陽性であるＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージと比較して）。
【０１５９】
さらに別の実施形態では、免疫増強剤は、免疫増強剤がない状態でのＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージと比較して、総Ｔ細胞集団（例えば、脾臓のＴ細胞及び／またはＰＢＭＣ）中におけるＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを増加させる。例えば、免疫増強剤は、免疫増強剤がない状態でのＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージと比較して、総Ｔ細胞集団中におけるＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、少なくとも５％または少なくとも１０％または少なくとも１５％または少なくとも２０％または少なくとも２５％または少なくとも３０％または少なくとも３５％または少なくとも４０％または少なくとも４５％または少なくとも５０％増加させることができる。総Ｔ細胞集団中におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の総パーセンテージは、当該技術分野において知られている標準的な方法によって決定することができ、これらには、限定するものではないが、蛍光標識細胞分取法（ＦＡＣＳ）または磁気標識細胞分離法（ＭＡＣＳ）が含まれる。
【０１６０】
別の実施形態では、免疫増強剤は、免疫増強剤がない状態での腫瘍体積と比較して、免疫増強剤の存在下でのインビボにおける腫瘍体積の減少によって決定されるように、腫瘍特異的免疫細胞応答を増大させる。例えば、免疫増強剤は、腫瘍体積を、免疫増強剤がない状態での腫瘍体積と比較して、少なくとも５％または少なくとも１０％または少なくとも１５％または少なくとも２０％または少なくとも２５％または少なくとも３０％または少なくとも３５％または少なくとも４０％または少なくとも４５％または少なくとも５０％減少させることができる。腫瘍体積の測定は、当該技術分野において十分に確立された方法によって、決定することができる。
【０１６１】
別の実施形態では、免疫増強剤は、Ｂ細胞活性（体液性免疫応答）を、免疫増強剤がない状態での抗原特異的抗体産生と比較して、例えば、抗原特異的抗体産生の量を増加させることによって、増大させる。例えば、免疫増強剤は、抗原特異的抗体産生を、免疫増強剤がない状態での抗原特異的抗体産生と比較して、少なくとも５％または少なくとも１０％または少なくとも１５％または少なくとも２０％または少なくとも２５％または少なくとも３０％または少なくとも３５％または少なくとも４０％または少なくとも４５％または少なくとも５０％増加させることができる。１つの実施形態では、抗原特異的ＩｇＧ産生が評価される。抗原特異的抗体産生は、例えば、限定するものではないがＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ及び試料（例えば、血清試料）中の抗原特異的抗体（例えば、ＩｇＧ）レベルを測定する同様のものを含む、当該技術分野において十分に確立された方法によって、評価することができる。
【０１６２】
別の実施形態では、免疫増強剤は、エフェクターメモリーＣＤ６２ＬｌｏＴ細胞集団を増加させる。例えば、免疫増強剤は、ＣＤ８＋Ｔ細胞中におけるＣＤ６２ＬｌｏＴ細胞の総％を増加させることができる。他の機能のなかでも、エフェクターメモリーＣＤ６２ＬｌｏＴ細胞集団は、リンパ球の輸送において重要な機能を有することが示されている（例えば、Ｓｃｈｅｎｋｅｌ，Ｊ．Ｍ．ａｎｄ  Ｍａｓｏｐｕｓｔ，Ｄ．（２０１４）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ４１：８８６−８９７を参照のこと）。種々の実施形態では、免疫増強剤は、抗原に応答して、ＣＤ８＋Ｔ細胞中におけるエフェクターメモリーＣＤ６２ＬｌｏＴ細胞の総パーセンテージを（免疫増強剤がない状態でのＣＤ８＋Ｔ細胞集団中におけるＣＤ６２ＬｌｏＴ細胞の総パーセンテージと比較して）少なくとも５％または少なくとも１０％または少なくとも１５％または少なくとも２０％または少なくとも２５％または少なくとも３０％または少なくとも３５％または少なくとも４０％または少なくとも４５％または少なくとも５０％増加させることができる。ＣＤ８＋Ｔ細胞中におけるエフェクターメモリーＣＤ６２ＬｌｏＴ細胞の総パーセンテージは、当該技術分野において知られている標準的な方法によって決定することができ、これらには、限定するものではないが、蛍光標識細胞分取法（ＦＡＣＳ）または磁気標識細胞分離法（ＭＡＣＳ）が含まれる。
【０１６３】
癌抗原への免疫応答を増進させる免疫増強剤ｍＲＮＡ構築物の能力は、当該技術分野において知られているマウスモデル系で評価することができる。１つの実施形態では、免疫正常マウスモデル系が使用される。１つの実施形態では、マウスモデル系は、Ｃ５７／Ｂｌ６マウスを含む（例えば、実施例に記載するものなどの癌抗原に対する抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を評価するため）。別の実施形態では、マウスモデル系は、ＢａｌｂＣマウスまたはＣＤ１マウスを含む（例えば、抗原特異的抗体応答などのＢ細胞応答を評価するため）。
【０１６４】
１つの実施形態では、本開示の免疫増強剤ポリペプチドは、少なくとも１つのＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）の下流で機能し、それにより、免疫応答を増進させる。したがって、１つの実施形態では、免疫増強剤は、ＴＬＲではなく、受容体自体から下流のＴＬＲシグナル伝達経路内の分子である。
【０１６５】
１つの実施形態では、免疫増強剤をコードする本開示のｍＲＮＡは、１つまたは複数の修飾核酸塩基を含み得る。好適な修飾については、以下にさらに考察される。
【０１６６】
１つの実施形態では、免疫増強剤をコードする本開示のｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子内に製剤化される。１つの実施形態では、脂質ナノ粒子は、癌抗原をコードするｍＲＮＡをさらに含む。１つの実施形態では、脂質ナノ粒子は、対象において、癌抗原に対する免疫応答を増進させるために、対象に投与される。好適なナノ粒子及び使用方法については、以下にさらに考察される。
【０１６７】
Ｉ型インターフェロンを刺激する免疫増強剤ｍＲＮＡ
いくつかの態様では、本開示は、Ｉ型インターフェロン経路のシグナル伝達を刺激または増進させ、それにより、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）の産生を刺激または増進させることによって、目的の抗原に対する免疫応答を刺激または増進させるポリペプチドをコードする、免疫増強剤ｍＲＮＡを提供する。抗腫瘍または抗微生物適応免疫の誘導を成功させるには、Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達が必要であることが確立されている（例えば、Ｆｕｅｒｔｅｓ，Ｍ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３４：６７−７３を参照のこと）。Ｉ型ＩＦＮの産生（ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−ε、ＩＦＮ−κ及びＩＦＮ−ωを含む）は、ウイルス感染などの微生物感染の排除に関与する。また、宿主細胞ＤＮＡ（例えば、損失を受けた細胞または瀕死の細胞に由来するもの）がＩ型インターフェロン産生を誘導することができ、Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達経路が抗腫瘍適応免疫の発生に関与することも認識されている。しかしながら、多くの病原体及び癌細胞は、Ｉ型インターフェロン応答を減少または抑制する機序を進化させてきた。したがって、Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達経路の活性化（刺激及び／または増進を含む）を、それを必要とする対象において、本開示の免疫増強剤ｍＲＮＡを当該対象に提供することによって行うことは、癌及び病原性感染の治療を含む多様な臨床状況において、また防御免疫をもたらすワクチン応答の増強において、対象の免疫応答を刺激または増進させる。
【０１６８】
Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）は、典型的にはウイルス感染時に複数の異なる細胞型で急速に産生される、炎症促進性サイトカインであり、多様な作用を持つことが知られている。Ｉ型ＩＦＮのインビボ産生の標準的な帰結は、抗菌細胞プログラムの活性化ならびに自然免疫応答及び適応免疫応答の発生である。Ｉ型ＩＦＮは、感染細胞及び隣接細胞において、細胞固有の抗菌状態を誘導し、病原菌、特にウイルス性病原体の拡散を制限する。Ｉ型ＩＦＮはまた、自然免疫細胞活性化（例えば、樹状細胞の成熟）を調節して、抗原提示及びナチュラルキラー細胞の機能を促進する。Ｉ型ＩＦＮはまた、親和性の高い抗原特異的Ｔ細胞及びＢ細胞の応答ならびに免疫記憶の発生を促進する（Ｉｖａｓｈｋｉｖ  ａｎｄ  Ｄｏｎｌｉｎ（２０１４）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４（１）：３６−４９）。
【０１６９】
Ｉ型ＩＦＮは、樹状細胞（ＤＣ）を活性化し、オートクラインシグナル伝達を介して、自身のＴ細胞刺激能力を促す（Ｍｏｎｔｏｙａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｂｌｏｏｄ  ９９：３２６３−３２７１）。Ｉ型ＩＦＮ曝露は、ケモカイン受容体及び接着分子（例えば、流入領域リンパ節へのＤＣの遊走を促進する）、共刺激分子、ならびにＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ抗原提示の発現を増加させることにより、ＤＣの成熟を助長する。Ｉ型ＩＦＮ曝露後に成熟するＤＣは、防御的Ｔ細胞応答を効果的に刺激することができる（Ｗｉｊｅｓｕｎｄａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１４）Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２９（４１２）及び当該文献中の参考文献）。
【０１７０】
Ｉ型ＩＦＮは、Ｔ細胞受容体シグナル伝達に対するＩ型ＩＦＮシグナル伝達のタイミングに大きく依存して、Ｔ細胞の活性化、増殖、分化及び生存を促進または阻害することができる（Ｃｒｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１５）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５：２３１−２４２）。初期の研究では、最適なＴ細胞刺激、分化、拡大及び細胞溶解活性の要件であるＭＨＣ−Ｉの発現が、複数の細胞種において、Ｉ型ＩＦＮに応答して上方制御されることが明らかにされた（Ｌｉｎｄａｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７６），Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １３３（Ｓｕｐｐｌ）：Ａ６６−Ａ６８；Ｌｉｎｄａｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７６）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １７：１２８４−１２８７）。Ｉ型ＩＦＮは、ＣＤ８  Ｔ細胞に対して強力な共刺激作用を発揮することができ、ＣＤ８  Ｔ細胞の増殖及び分化を増進させる（Ｃｕｒｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７４：４４６５−４４６９；Ｋｏｌｕｍａｍ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０２：６３７−６５０）。
【０１７１】
Ｔ細胞に対する作用と同様に、Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達は、Ｂ細胞応答に対し、曝露のタイミング及び状況に応じて、正と負の両方の作用を有する（Ｂｒａｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４（４）：４１１−４１９；Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ，（１９９８）１８７（１）：７９−８７）。未熟Ｂ細胞の生存及び成熟は、Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達によって、抑制され得る。未熟Ｂ細胞とは対照的に、Ｉ型ＩＦＮ曝露は、ウイルス感染後または実験的免疫付与後におけるＢ細胞の活性化、抗体産生及びアイソタイプスイッチを促進することが示されている（Ｌｅ  Ｂｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７６：４：２０７４−２０７８；Ｓｗａｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１０）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０７：１４８５−１５００）。
【０１７２】
Ｉ型ＩＦＮ経路のシグナル伝達に関与する構成成分は、ＳＴＩＮＧ、インターフェロン制御因子（ＩＲＦ１、ＩＲＦ３、ＩＲＦ５、ＩＲＦ７、ＩＲＦ８、及びＩＲＦ９など）、ＴＢＫ１、ＩＫＫｉ、ＭｙＤ８８ならびにＴＲＡＭを含む多数の構成成分が確立されている。Ｉ型ＩＦＮ経路のシグナル伝達に関与するさらなる構成成分には、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ６、ＩＲＡＫ−１、ＩＲＡＫ−４、ＴＲＩＦ、ＩＰＳ−１、ＴＬＲ−３、ＴＬＲ−４、ＴＬＲ−７、ＴＬＲ−８、ＴＬＲ−９、ＲＩＧ−１、ＤＡＩ、及びＩＦＩ１６が含まれる。
【０１７３】
したがって、１つの実施形態では、免疫増強剤ｍＲＮＡは、Ｉ型ＩＦＮ経路のシグナル伝達に関与する前述の構成成分のいずれかをコードする。
【０１７４】
ＳＴＩＮＧをコードする免疫増強剤ｍＲＮＡ
本開示は、免疫増強剤として、構造的に活性な形態のＳＴＩＮＧを含むＳＴＩＮＧをコードするｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡを含む）を包含する。ＳＴＩＮＧ（インターフェロン遺伝子刺激因子；膜貫通タンパク質１７３（ＴＭＥＭ１７３）、ＩＲＦ３活性化調節因子（ＭＩＴＡ）、メチオニン−プロリン−チロシン−セリン（ＭＰＹＳ）、及びＥＲ  ＩＦＮ刺激因子（ＥＲＩＳ）としても知られる）は、３７９アミノ酸の小胞体（ＥＲ）局在膜貫通タンパク質であり、Ｉ型ＩＦＮ及び炎症促進性サイトカインを含む免疫応答遺伝子の転写を調整するシグナル伝達分子として機能する（Ｉｓｈｉｋａｗａ  ＆  Ｂａｒｂｅｒ，（２００８）Ｎａｔｕｒｅ  ４５５：６４７−６７８；Ｉｓｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００９）Ｎａｔｕｒｅ  ４６１：７８８−７９２；Ｂａｒｂｅｒ（２０１０）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５（１２）：７６０−７７０）。
【０１７５】
ＳＴＩＮＧは、ＤＮＡのサイトゾル検出をＴＢＫ１／ＩＲＦ３／Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達軸につなげるシグナル伝達アダプターとして機能する。ＳＴＩＮＧのシグナル伝達アダプター機能は、環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）の直接的な感知を介して活性化される。ＣＤＮの例には、環状ジＧＭＰ（グアノシン５’−一リン酸）、環状ジＡＭＰ（アデノシン５’−一リン酸）及び環状ＧＭＰ−ＡＭＰ（ｃＧＡＭＰ）が挙げられる。ＣＤＮは、当初は、偏在的な細菌セカンドメッセンジャーとして特徴付けられていたが、現在では、ＳＴＩＮＧとの直接的相互作用を介してＴＢＫ１／ＩＲＦ３／Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達軸を活性化する病原体関連分子パターン分子（ＰＡＭＰ）のクラスを構成することがわかっている。ＳＴＩＮＧは、細菌に由来するＣＤＮ、及び／または宿主タンパク質環状ＧＭＰ−ＡＭＰシンターゼ（ｃＧＡＳ）に由来するＣＤＮを含む、細胞のサイトゾル中の異常なＤＮＡ種及び／またはＣＤＮを感知することができる。ｃＧＡＳタンパク質は、サイトゾル中のＤＮＡの検出に応答して、ｃＧＡＭＰを産生するＤＮＡセンサーである（Ｂｕｒｄｅｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  ４７８：５１５−５１８；Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９：７８６−７９１；Ｄｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１３）Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ  ３：１３５５−１３６１；Ａｂｌａｓｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ  ４９８：３８０−３８４）。
【０１７６】
ＣＤＮに結合すると、ＳＴＩＮＧは二量体化し、立体構造変化を受け、ＴＡＮＫ結合キナーゼ１（ＴＢＫ１）との複合体形成が促進される（Ｏｕｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３６（６）：１０７３−１０８６）。この複合体は、核周囲のゴルジ体に移行し、ＴＢＫ１をエンドリソソームコンパートメントに送達し、そこでＩＲＦ３及びＮＦ−κＢ転写因子をリン酸化する（Ｚｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（２００８）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２９：５３８−５５０）。最近の研究では、ＳＴＩＮＧがＴＢＫ１及びＩＲＦ３の両方に結合することによって足場として機能して、ＴＢＫ１によるＩＲＦ３のリン酸化を特異的に促進することが示された（Ｔａｎａｋａ  ＆  Ｃｈｅｎ，（２０１２）Ｓｃｉ  Ｓｉｇｎａｌ  ５（２１４）：ｒａ２０）。ＩＲＦ３、ＩＲＦ７及びＮＦ−κＢ依存性シグナル伝達経路の活性化は、Ｉ型ＩＦＮなどのサイトカイン及び他の免疫応答関連タンパク質の産生を誘導し、抗病原体及び／または抗腫瘍活性を促進する。
【０１７７】
多数の研究が、体液性及び細胞性免疫応答を誘発する可能性のあるワクチンアジュバントまたは免疫調節剤として、ＳＴＩＮＧのＣＤＮアゴニストの使用を探究している（Ｄｕｂｅｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１３）Ｔｈｅｒ  Ａｄｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  １（４）：１３１−１４３及び当該文献中の参考文献）。初期の研究では、ＣＤＮのｃ−ジ−ＧＭＰの投与により、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ感染がインビボで緩和し、マウス感染モデルで回収された細菌細胞の数が減少したのに対し、インビトロでは、ｃ−ジ−ＧＭＰは、細菌細胞に対する観察可能な阻害効果または殺菌効果はないことが示された。これは、細菌細胞の減少が、宿主免疫系に対する作用に起因することを示唆している（Ｋａｒａｏｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ４９：１０２９−１０３８；Ｋａｒａｏｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７５：４９４２−４９５０）。最近の研究では、合成ＣＤＮ誘導体分子を顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）産生癌ワクチンとともに製剤化すると（ＳＴＩＮＧＶＡＸと呼ばれる）、ＧＭ−ＣＳＦワクチン単独での免疫化と比較して、癌治療用動物モデルにおいてインビボで増進された抗腫瘍効果を誘発することが示された（Ｆｕ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１５）Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ７（２８３）：２８３ｒａ５２）。これは、ＣＤＮが強力なワクチンアジュバントであることを示唆している。
【０１７８】
ヒトＴＭＥＭ１７３遺伝子にマッピングされた多型に起因する変異型ＳＴＩＮＧタンパク質は、機能獲得または構造的に活性な表現型を呈示することが記載されている。インビトロで発現させた場合、変異型ＳＴＩＮＧ対立遺伝子は、Ｉ型ＩＦＮの誘導を強力に刺激することが示された（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１４）Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３７１：５０７−５１８；Ｊｅｒｅｍｉａｈ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１４）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １２４：５５１６−５５２０；Ｄｏｂｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１５）Ｃｅｌｌ  Ｈｏｓｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅ  １８（２）：１５７−１６８；Ｔａｎｇ  ＆  Ｗａｎｇ，（２０１５）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  １０（３）：ｅ０１２００９０；Ｍｅｌｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１７）Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｎ  Ｐｒｅｓｓ；Ｋｏｎｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１７）Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ  ７６（２）：４６８−４７２；Ｂｕｒｄｅｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  ４７８：５１５−５１８）。
【０１７９】
本明細書で提供されるのは、本明細書に記載の免疫増強剤として使用するための、変異型ヒトＳＴＩＮＧアイソフォームを含む構造的に活性な形態のＳＴＩＮＧをコードする、修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）である。変異型ヒトＳＴＩＮＧアイソフォームを含む構造的に活性な形態のＳＴＩＮＧをコードするｍｍＲＮＡは、本明細書の配列表に記載される。本明細書で使用される変異型ヒトＳＴＩＮＧポリペプチドのアミノ酸残基ナンバリングは、当該技術分野でＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿９３８０２３として入手可能な３７９アミノ酸残基の野生型ヒトＳＴＩＮＧ（アイソフォーム１）に使用されているものに対応する。
【０１８０】
したがって、１つの態様では、本開示は、アミノ酸残基１５５における変異、特にＶ１５５Ｍ変異などのアミノ酸置換を有する変異型ヒトＳＴＩＮＧタンパク質をコードする、ｍｍＲＮＡを提供する。１つの実施形態では、ｍｍＲＮＡは、配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードする。１つの実施形態では、ＳＴＩＮＧ  Ｖ１５５Ｍ変異体は、配列番号１９９に示されるヌクレオチド配列によってコードされる。１つの実施形態では、ｍｍＲＮＡは、配列番号２０９に示されるｍｉＲ１２２結合部位を含む３’ＵＴＲ配列を含む。
【０１８１】
他の態様では、本開示は、アミノ酸残基２８４におけるアミノ酸置換などの変異を有する変異型ヒトＳＴＩＮＧタンパク質をコードする、ｍｍＲＮＡを提供する。残基２８４置換の非限定的な例には、Ｒ２８４Ｔ、Ｒ２８４Ｍ及びＲ２８４Ｋが挙げられる。ある特定の実施形態では、変異型ヒトＳＴＩＮＧタンパク質は、Ｒ２８４Ｔ変異を有し、例えば、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するか、または配列番号２００に示されるヌクレオチド配列によってコードされる。ある特定の実施形態では、変異型ヒトＳＴＩＮＧタンパク質は、Ｒ２８４Ｍ変異を有し、例えば、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するか、または配列番号２０１に示されるヌクレオチド配列によってコードされる。ある特定の実施形態では、変異型ヒトＳＴＩＮＧタンパク質は、Ｒ２８４Ｋ変異を有し、例えば、配列番号４もしくは２２４に記載のアミノ酸配列を有するか、または配列番号２０２もしくは２２５に示されるヌクレオチド配列によってコードされる。
【０１８２】
他の態様では、本開示は、Ｎ１５４Ｓ変異などのアミノ酸残基１５４におけるアミノ酸置換などの変異を有する変異型ヒトＳＴＩＮＧタンパク質をコードする、ｍｍＲＮＡを提供する。ある特定の実施形態では、変異型ヒトＳＴＩＮＧタンパク質は、Ｎ１５４Ｓ変異を有し、例えば、配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するか、または配列番号２０３に示されるヌクレオチド配列によってコードされる。
【０１８３】
さらなる他の態様では、本開示は、Ｖ１４７Ｌ変異などのアミノ酸残基１４７におけるアミノ酸置換などの変異を有する変異型ヒトＳＴＩＮＧタンパク質をコードする、ｍｍＲＮＡを提供する。ある特定の実施形態では、Ｖ１４７Ｌ変異を有する変異型ヒトＳＴＩＮＧタンパク質は、配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するか、または配列番号２０４に示されるヌクレオチド配列によってコードされる。
【０１８４】
他の態様では、本開示は、Ｅ３１５Ｑ変異などのアミノ酸残基３１５におけるアミノ酸置換などの変異を有する変異型ヒトＳＴＩＮＧタンパク質をコードする、ｍｍＲＮＡを提供する。ある特定の実施形態では、Ｅ３１５Ｑ変異を有する変異型ヒトＳＴＩＮＧタンパク質は、配列番号７に記載のアミノ酸配列を有するか、または配列番号２０５に示されるヌクレオチド配列によってコードされる。
【０１８５】
他の態様では、本開示は、Ｒ３７５Ａ変異などのアミノ酸残基３７５におけるアミノ酸置換などの変異を有する変異型ヒトＳＴＩＮＧタンパク質をコードする、ｍｍＲＮＡを提供する。ある特定の実施形態では、Ｒ３７５Ａ変異を有する変異型ヒトＳＴＩＮＧタンパク質は、配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するか、または配列番号２０６に示されるヌクレオチド配列によってコードされる。
【０１８６】
他の態様では、本開示は、前述の変異の１つもしくは複数または２、３、４もしくはそれ以上の組み合わせを有する変異型ヒトＳＴＩＮＧタンパク質をコードする、ｍｍＲＮＡを提供する。したがって、１つの態様では、本開示は、Ｖ１４７Ｌ、Ｎ１５４Ｓ、Ｖ１５５Ｍ、Ｒ２８４Ｔ、Ｒ２８４Ｍ、Ｒ２８４Ｋ、Ｅ３１５Ｑ及びＲ３７５Ａ、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される１つまたは複数の変異を有する変異型ヒトＳＴＩＮＧタンパク質をコードする、ｍｍＲＮＡを提供する。他の態様では、本開示は、Ｖ１５５ＭとＲ２８４Ｔ；Ｖ１５５ＭとＲ２８４Ｍ；Ｖ１５５ＭとＲ２８４Ｋ；Ｖ１５５ＭとＶ１４７Ｌ；Ｖ１５５ＭとＮ１５４Ｓ；Ｖ１５５ＭとＥ３１５Ｑ；及びＶ１５５ＭとＲ３７５Ａからなる群から選択される変異の組み合わせを有する変異型ヒトＳＴＩＮＧタンパク質をコードする、ｍｍＲＮＡを提供する。
【０１８７】
他の態様では、本開示は、Ｖ１５５Ｍと、次の変異：Ｒ２８４Ｔ；Ｒ２８４Ｍ；Ｒ２８４Ｋ；Ｖ１４７Ｌ；Ｎ１５４Ｓ；Ｅ３１５Ｑ；及びＲ３７５Ａのうちの１、２、３またはそれ以上と、を有する変異型ヒトＳＴＩＮＧタンパク質をコードする、ｍｍＲＮＡを提供する。他の態様では、本開示は、Ｖ１５５Ｍ、Ｖ１４７Ｌ及びＮ１５４Ｓ変異を有する変異型ヒトＳＴＩＮＧタンパク質をコードする、ｍｍＲＮＡを提供する。他の態様では、本開示は、Ｖ１５５Ｍ、Ｖ１４７Ｌ、Ｎ１５４Ｓ変異と、任意選択で、アミノ酸２８４における変異と、を有する変異型ヒトＳＴＩＮＧタンパク質をコードする、ｍｍＲＮＡを提供する。さらなる他の態様では、本開示は、Ｖ１５５Ｍ、Ｖ１４７Ｌ、Ｎ１５４Ｓ変異と、Ｒ２８４Ｔ、Ｒ２８４Ｍ及びＲ２８４Ｋから選択されるアミノ酸２８４における変異と、を有する変異型ヒトＳＴＩＮＧタンパク質をコードする、ｍｍＲＮＡを提供する。他の態様では、本開示は、Ｖ１５５Ｍ、Ｖ１４７Ｌ、Ｎ１５４Ｓ、及びＲ２８４Ｔ変異を有する変異型ヒトＳＴＩＮＧタンパク質をコードする、ｍｍＲＮＡを提供する。他の態様では、本開示は、Ｖ１５５Ｍ、Ｖ１４７Ｌ、Ｎ１５４Ｓ、及びＲ２８４Ｍ変異を有する変異型ヒトＳＴＩＮＧタンパク質をコードする、ｍｍＲＮＡを提供する。他の態様では、本開示は、Ｖ１５５Ｍ、Ｖ１４７Ｌ、Ｎ１５４Ｓ、及びＲ２８４Ｋ変異を有する変異型ヒトＳＴＩＮＧタンパク質をコードする、ｍｍＲＮＡを提供する。
【０１８８】
他の実施形態では、本開示は、アミノ酸残基１４７、１５４、１５５と、任意選択で、２８４とにおける変異の組み合わせ、特にＶ１４７Ｌ、Ｎ１５４Ｓ、Ｖ１５５Ｍ、任意選択で、Ｒ２８４Ｍなどのアミノ酸置換を有する変異型ヒトＳＴＩＮＧタンパク質をコードする、ｍｍＲＮＡを提供する。ある特定の実施形態では、変異型ヒトＳＴＩＮＧタンパク質は、配列番号９に記載のアミノ酸配列などのＶ１４７Ｎ、Ｎ１５４Ｓ及びＶ１５５Ｍ変異を有するか、または配列番号２０７に示されるヌクレオチド配列によってコードされる。ある特定の実施形態では、変異型ヒトＳＴＩＮＧタンパク質は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列などのＲ２８４Ｍ、Ｖ１４７Ｎ、Ｎ１５４Ｓ及びＶ１５５Ｍ変異を有するか、または配列番号２０８に示されるヌクレオチド配列によってコードされる。
【０１８９】
別の実施形態では、本開示は、アミノ酸１３７〜３７９からなる構造的に活性なヒトＳＴＩＮＧポリペプチドなどの、全長３７９アミノ酸の野生型タンパク質の構造的に活性な切断形態である変異型ヒトＳＴＩＮＧタンパク質をコードする、ｍｍＲＮＡを提供する。
【０１９０】
抗原提示細胞の促進剤
いくつかの実施形態では、ＲＮＡワクチンは、例えば、非ＡＰＣから偽ＡＰＣ（シュード−ＡＰＣ）への変換によって抗原提示細胞（ＡＰＣ）の産生を促進するための薬剤と組み合わせることができる。抗原提示は、免疫応答の開始、増幅、及び持続時間における重要な段階である。このプロセスでは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）またはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）を介して抗原の断片がＴ細胞に提示されることで、抗原特異的な免疫応答が推進される。免疫予防及び免疫治療については、この応答の増進が効果の改善に重要である。本発明のＲＮＡワクチンは、効率的な抗原提示を推進するために設計または増強してよい。ＡＰＣによるプロセシング及び提示の増進方法の１つは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）へのＲＮＡワクチンの標的指向性を向上させることである。別の手法は、免疫賦活性の製剤及び／または成分によるＡＰＣ細胞の活性化を含むものである。
【０１９１】
あるいは、非ＡＰＣを再プログラム化してＡＰＣになりつつある状態にする方法を本発明のＲＮＡワクチンとともに使用してよい。重要なことに、ｍＲＮＡ製剤を取り込み、かつその治療作用の標的である細胞のほとんどがＡＰＣではない。それ故に、こうした細胞をＡＰＣに変換する方法を設計すれば、効果にとって有利なものとなるであろう。非ＡＰＣからＡＰＣへのシフトも促進しつつ、例えばｍＲＮＡワクチンなどのＲＮＡワクチンを細胞に送達する方法及び手法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、ＡＰＣ再プログラム化分子をコードするｍＲＮＡは、ＲＮＡワクチンに含められるか、またはＲＮＡワクチンとともに同時投与される。
【０１９２】
本明細書で使用されるＡＰＣ再プログラム化分子は、非ＡＰＣ細胞からＡＰＣ様フェノタイプへの移行を促進する分子である。ＡＰＣ様フェノタイプは、ＭＨＣクラスＩＩプロセシングを可能にする特性である。したがって、ＡＰＣ様フェノタイプを有するＡＰＣ細胞は、１つまたは複数の外来性分子（ＡＰＣ再プログラム化分子）を有さない同一の細胞と比較してＭＨＣクラスＩＩプロセシング能力が増進した、１つまたは複数の外来性分子を有する細胞である。いくつかの実施形態では、ＡＰＣ再プログラム化分子は、ＣＩＩＴＡ（ＭＨＣクラスＩＩ発現の中心制御因子）、ＣＬＩＰ、ＨＬＡ−ＤＯ、ＨＬＡ−ＤＭなどのシャペロンタンパク質（ＭＨＣクラスＩＩへの抗原断片負荷のエンハンサー）、及び／またはＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６などのような共刺激分子（Ｔ細胞の抗原認識及びＴ細胞活性化のエンハンサー）である。
【０１９３】
ＣＩＩＴＡタンパク質は、クラスＩＩのプロモーター領域と会合するＤＮＡ結合タンパク質の保存されたセットと相互作用することによってＭＨＣクラスＩＩ遺伝子の転写活性化を増進するトランス活性化因子である（Ｓｔｅｉｍｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｃｅｌｌ  ７５：１３５−１４６）。ＣＩＩＴＡの転写活性化機能は、アミノ末端の酸性ドメイン（アミノ酸２６〜１３７）に位置するとされている。ＣＩＩＴＡと相互作用するタンパク質は、ＣＩＩＴＡ相互作用タンパク質１０４（本明細書ではＣＩＰ１０４とも称される）と呼ばれ、核酸分子にコードされる。ＣＩＴＴＡとＣＩＰ１０４との両方が、ＭＨＣクラスＩＩのプロモーターからの転写を増進することが示されており、したがって本発明のＡＰＣ再プログラム化分子として有用である。いくつかの実施形態では、ＡＰＣ再プログラム化分子は、全長のＣＩＩＴＡ、ＣＩＰ１０４、もしくは他の関連分子、またはその活性断片であり、こうした活性断片は、ＣＩＩＴＡのアミノ酸２６〜１３７、またはそれとの配列同一性が少なくとも８０％であり、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子の転写活性化を増進する能力を維持するアミノ酸などである。
【０１９４】
好ましい実施形態では、ＡＰＣ再プログラム化分子は、ＡＰＣ再プログラム化分子をコードするｍＲＮＡの形態で対象に送達される。したがって、本発明のＲＮＡワクチンは、ＡＰＣ再プログラム化分子をコードするｍＲＮＡを含み得る。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、モノシストロニックである。他の実施形態では、ｍＲＮＡは、ポリシストロニックである。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の抗原をコードするｍＲＮＡは、ＡＰＣ再プログラム化分子をコードするｍＲＮＡとは別の製剤に存在する。他の実施形態では、１つまたは複数の抗原をコードするｍＲＮＡは、ＡＰＣ再プログラム化分子をコードするｍＲＮＡと同一の製剤に存在する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の抗原をコードするｍＲＮＡは、ＡＰＣ再プログラム化分子をコードするｍＲＮＡと同一回数、対象に投与される。他の実施形態では、１つまたは複数の抗原をコードするｍＲＮＡは、ＡＰＣ再プログラム化分子をコードするｍＲＮＡとは異なる回数、対象に投与される。例えば、ＡＰＣ再プログラム化分子をコードするｍＲＮＡは、１つまたは複数の抗原をコードするｍＲＮＡの前に投与してよい。ＡＰＣ再プログラム化分子をコードするｍＲＮＡは、抗原をコードするｍＲＮＡの直前、少なくとも１時間前、少なくとも１日前、少なくとも１週間前、または少なくとも１ヶ月前に投与してよい。
【０１９５】
あるいは、ＡＰＣ再プログラム化分子をコードするｍＲＮＡは、１つまたは複数の抗原をコードするｍＲＮＡの後に投与してよい。ＡＰＣ再プログラム化分子をコードするｍＲＮＡは、抗原をコードするｍＲＮＡの直後、少なくとも１時間後、少なくとも１日後、少なくとも１週間後、または少なくとも１ヶ月後に投与してよい。いくつかの実施形態では、抗原は、患者特異的な抗原などの癌抗原である。他の実施形態では、抗原は、感染性疾患の抗原である。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡワクチンは、リコール抗原を含み得、リコール抗原は、メモリー抗原と称されることもある。リコール抗原は、個体が以前に遭遇したことのある抗原であり、その個体には、メモリーリンパ球が既に存在する。いくつかの実施形態では、リコール抗原は、インフルエンザ抗原などの、個体が遭遇した可能性のある感染性疾患抗原であり得る。リコール抗原は、より強固な免疫応答の促進に役立つ。
【０１９７】
ｍＲＮＡワクチンに含めるために選択される抗原またはネオエピトープとしては、典型的には、高親和性を有する結合ペプチドを選択することになる。いくつかの態様では、抗原またはネオエピトープは、野生型ペプチドと比較して高親和性でＨＬＡタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、抗原またはネオエピトープが有するＩＣ５０は、少なくとも５０００ｎＭ未満、少なくとも５００ｎＭ未満、少なくとも２５０ｎＭ未満、少なくとも２００ｎＭ未満、少なくとも１５０ｎＭ未満、少なくとも１００ｎＭ未満、少なくとも５０ｎＭ、またはそれ未満である。典型的には、予測ＩＣ５０が５０ｎＭ未満であるペプチドは、中程度から高度の親和性を有する結合ペプチドであると一般に考えられ、ＨＬＡ結合の生化学的アッセイを使用してその親和性を実験的に試験するために選択されることになる。癌抗原は、個別化癌抗原であり得る。個別化ＲＮＡ癌ワクチンは、例えば、それぞれの対象に特異的な腫瘍抗原または癌抗原に特異的な既知の癌抗原を１つまたは複数コードするＲＮＡを含み得、こうした抗原は、ネオエピトープまたは対象特異的エピトープもしくは対象特異的抗原と称される。「対象特異的癌抗原」は、特定の患者の腫瘍に発現することが同定された抗原である。対象特異的癌抗原は、典型的には、腫瘍試料に存在し得たり、または存在し得なかったりすることが一般的である。非癌性細胞では発現しないか、もしくはめったに発現しないか、または非癌性細胞におけるその発現が、癌性細胞におけるものと比較して顕著に減少しており、ワクチン接種時に誘導される免疫応答を誘導する腫瘍関連抗原は、ネオエピトープと称される。腫瘍関連抗原のようなネオエピトープは、体に対して完全に外来性であるため、健康な組織に対する免疫応答を生成しないか、または免疫系の防御成分によって遮蔽されると想定される。いくつかの実施形態では、ネオエピトープに基づく個別化ＲＮＡ癌ワクチンが望ましく、この理由は、そのようなワクチン製剤によって、患者特異的な腫瘍に対する特異性が最大化することになるためである。変異によって得られるネオエピトープは、タンパク質に異なるアミノ酸が生じる非同義変異である点変異、終止コドンが修飾または欠失し、Ｃ末端に新規の腫瘍特異的配列を有する長鎖化タンパク質の翻訳を引き起こすリードスルー変異、成熟ｍＲＮＡにイントロンが含められるために、特有の腫瘍特異的タンパク質配列が生じるスプライス部位変異、２つのタンパク質のジャンクションに腫瘍特異的配列を有するキメラタンパク質が生じる染色体再編（すなわち、遺伝子融合）、新規の腫瘍特異的タンパク質配列を有する新たなオープンリーディングフレームが生じるフレームシフト変異または欠失、及び転座から生じ得る。したがって、いくつかの実施形態では、ＲＮＡ癌ワクチンは、フレームシフト変異及び組換えまたは本明細書に記載の他の変異のいずれかからなる群から選択される変異を含む少なくとも１つの癌抗原を含む。
【０１９８】
個別化ＲＮＡ癌ワクチンの生成方法は、一般に、例えば核酸またはタンパク質のディープシークエンシング技術を使用する変異の同定と、例えば有効なペプチド−ＭＨＣ結合予測アルゴリズム、または患者のＨＬＡ対立遺伝子に結合し得、腫瘍に存在する変異に基づく候補Ｔ細胞エピトープのセットを生成するための他の分析技術を適用するネオエピトープの同定と、選択されるネオエピトープを抗原特異的Ｔ細胞が標的とすることの任意選択の実証または候補ネオエピトープが腫瘍表面に存在するＨＬＡタンパク質に結合することの任意選択の実証と、ワクチンの開発と、を含む。本発明のＲＮＡ癌ワクチンは、単一のネオエピトープの複数のコピー、単一の型の変異、すなわち点変異に基づく複数の異なるネオエピトープ、さまざまな変異型に基づく複数の異なるネオエピトープ、腫瘍関連抗原またはリコール抗原などのネオエピトープ及び他の抗原を含み得る。
【０１９９】
変異の同定技術の例には、限定はされないが、動的対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション（ＤＡＳＨ）、マイクロプレートアレイダイアゴナルゲル電気泳動（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ａｒｒａｙ  ｄｉａｇｏｎａｌ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）（ＭＡＤＧＥ）、パイロシークエンシング、オリゴヌクレオチド特異的ライゲーション、ＴａｑＭａｎシステム、ならびにさまざまなＤＮＡ「チップ」技術、すなわちＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＳＮＰチップ、ならびに浸潤性の切断によって小型シグナル分子を生成させた後、質量分析法、または固定化パドロックプローブ及びローリングサークル増幅を実施することに基づく方法が含まれる。
【０２００】
核酸またはタンパク質のディープシークエンシング技術は、当該技術分野において知られている。任意の型の配列解析方法を使用することができる。核酸シークエンシングは、全腫瘍ゲノム、腫瘍エクソーム（タンパク質コードＤＮＡ）、腫瘍トランスクリプトーム、またはエキソソームに対して実施してよい。合成ごとのリアルタイム１分子シークエンシング技術は、シークエンシングされる鋳型に相補的なＤＮＡ新生鎖に蛍光ヌクレオチドが組み込まれるたびにそれが検出されるということを利用するものである。迅速なハイスループットシークエンシング方法は他にも存在する。タンパク質シークエンシングは、腫瘍プロテオームに対して実施してよい。さらに、腫瘍細胞に存在するＭＨＣタンパク質に結合した変異ペプチドが存在することを同定または検証をするために、タンパク質質量分析法を使用してよい。ペプチドは、腫瘍細胞から酸によって溶出させるか、または腫瘍から免疫沈降させたＨＬＡ分子から酸によって溶出させた後、質量分析法を使用して同定することができる。シークエンシングの結果は、既知の対照セットと比較するか、または患者の正常組織に対して実施されたシークエンシング解析と比較してよい。
【０２０１】
したがって、本発明は、Ｔ細胞エピトープなどの、抗原のネオエピトープの同定方法及び／または検出方法に関する。具体的には、本発明は、対象における腫瘍特異的免疫応答の誘導において有用な腫瘍特異的ネオエピトープの同定方法及び／または検出方法を提供する。任意選択で、こうしたネオエピトープは、野生型ペプチドと比較してクラスＩのＨＬＡタンパク質に強い親和性で結合し、及び／または抗腫瘍ＣＤ８  Ｔ細胞を活性化する能力を有する。任意の特定の遺伝子に同一の変異が腫瘍全体にみられることはめったにない。
【０２０２】
ＭＨＣクラスＩタンパク質は、ほとんどの腫瘍細胞を含む、体のほとんどすべての細胞の表面に存在する。内在性タンパク質または細胞内に存在する病原体に通常は起源を有する抗原は、ＭＨＣクラスＩタンパク質に負荷され、その後、こうした抗原は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）に提示される。Ｔ細胞受容体は、ＭＨＣクラスＩ分子と複合化したペプチドを認識してそれに結合する能力を有する。細胞傷害性Ｔリンパ球はそれぞれ、ＭＨＣ／ペプチド複合体に特異的に結合する能力を有する特有のＴ細胞受容体を発現する。
【０２０３】
コンピューターアルゴリズムを使用すると、Ｔ細胞エピトープなどの潜在的なネオエピトープを予測することが可能であり、こうしたネオエピトープは、すなわち、ペプチド提示複合体の形態のクラスＩまたはクラスＩＩのＭＨＣ分子が結合した後、この形態においてＴリンパ球のＴ細胞受容体によって認識されるペプチド配列である。ＭＨＣに結合することになるペプチドの同定に有用なプログラムの例には、例えば、Ｌｏｎｚａ  Ｅｐｉｂａｓｅ、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ（Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，５０（１９９９），２１３−２１９）、及びＨＬＡ＿ＢＩＮＤ（Ｐａｒｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２（１９９４），１６３−１７５）が含まれる。
【０２０４】
推定ネオエピトープが選択されると、インビトロ及び／またはインビボのアッセイを使用してそれをさらに試験することができる。それぞれの患者からの単離物を用いて、Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイなどの、研究室において実施される通常のインビトロアッセイを使用することで、アルゴリズムによる予測に基づいて選択されたネオエピトープのリストを洗練してよい。ネオエピトープワクチン、その使用方法及び調製方法は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４４９１８にすべて記載されており、当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０２０５】
ＲＮＡ癌ワクチンに含めるために選択される活性化癌遺伝子変異ペプチドは、典型的には、高親和性結合ペプチドである。いくつかの態様では、活性化癌遺伝子変異ペプチドは、野生型ペプチドと比較して高親和性でＨＬＡタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、活性化癌遺伝子変異ペプチドは、少なくとも５０００ｎＭ未満、少なくとも５００ｎＭ未満、少なくとも２５０ｎＭ未満、少なくとも２００ｎＭ未満、少なくとも１５０ｎＭ未満、少なくとも１００ｎＭ未満、少なくとも５０ｎＭ未満、またはそれ未満のＩＣ５０を有する。典型的には、予測ＩＣ５０が５０ｎＭ未満であるペプチドは、中程度から高度の親和性を有する結合ペプチドであると一般に考えられ、ＨＬＡ結合の生化学的アッセイを使用してその親和性を実験的に試験するために選択されることになる。
【０２０６】
個別化癌ワクチンでは、対象特異的癌抗原は、患者の試料において同定してよい。例えば、試料は、組織試料または腫瘍試料であり得る。例えば、１つまたは複数の腫瘍細胞の試料において対象特異的癌抗原の存在を調べてよい。腫瘍試料は、対象特異的癌抗原を同定するために、全ゲノム、エクソーム、またはトランスクリプトームの解析を使用して調べてよい。
【０２０７】
あるいは、対象特異的癌抗原は、対象のエキソソームにおいて同定してよい。ワクチン向けの抗原が、対象のエキソソームにおいて同定されると、そのような抗原は、対象のエキソソーム抗原の代表物であると言われる。
【０２０８】
エキソソームは、細胞によって分泌される小さなマイクロベシクルであり、典型的には、およそ３０〜１００ｎｍの直径を有する。エキソソームは、古典的には内向きの陥入から形成され、最後のエンドソーム膜がくびれて切り離される結果、脂質二重層を有する小ベシクルを多く含む多胞体（ＭＶＢ）が形成され、こうした小ベシクルのそれぞれが、親細胞の細胞質の試料を含む。ＭＶＢが細胞膜と融合すると、こうしたエキソソームが細胞から放出され、放出されたエキソソームは、血液、尿、脳脊髄液、または他の体液へと送達される。エキソソームは、こうした生体液のいずれからでも、さらなる分析に向けて回収することができる。
【０２０９】
エキソソーム内の核酸は、腫瘍抗原のバイオマーカーとしての役割を有する。対象特異的癌抗原を同定するためのエキソソーム分析の利点は、この方法によれば生検を実施する必要がなくなることである。このことは、癌抗原の同定及びワクチン接種を含む数ラウンドの治療を患者が受ける必要があるときに特に有益であり得る。
【０２１０】
生体試料からのエキソソームの単離方法については、当該技術分野において多くのものが説明されてきた。例えば、下記の方法を使用することができる：分画遠心、低速遠心、アニオン交換、及び／またはゲル浸透クロマトグラフィー、スクロース密度勾配もしくはオルガネラ電気泳動、磁気活性化細胞選別（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）（ＭＡＣＳ）、ナノ膜限外濾過遠心、パーコール（Ｐｅｒｃｏｌｌ）を用いた密度勾配による単離、及びマイクロ流体デバイスの使用。方法の例は、例えば、米国特許公開第２０１４／０２１２８７１号に記載されている。
【０２１１】
「生体試料」という用語は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びタンパク質などの生体材料を含む試料を指す。いくつかの実施形態では、生体試料は、対象に由来する体液を適切に含み得る。体液は、対象の体の任意の位置、好ましくは末梢位置から単離される液体であり得、こうした液体には、限定はされないが、例えば、血液、血漿、血清、尿、痰、髄液、脳脊髄液、胸水、乳頭吸引液、リンパ液、気道、腸管、及び尿生殖器に由来する液体、涙液、唾液、母乳、リンパ系に由来する液体、精液、脳脊髄液、臓器内系液、腹水、腫瘍嚢胞液（ｔｕｍｏｒ  ｃｙｓｔ  ｆｌｕｉｄ）、羊水、ならびにそれらの組み合わせが含まれる。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、発現抗原の変化を同定するために癌の進行を監視することができる。したがって、いくつかの実施形態では、方法ではさらに、第２のセットの癌抗原を得るための、対象の試料に由来する少なくとも２つの癌抗原の同定と、対象に対する第２のセットの癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡワクチンの対象への投与とが、癌ｍＲＮＡワクチンの投与から少なくとも１ヶ月後に実施される。いくつかの実施形態では、第２のセットの抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡワクチンは、第１のセットの癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡワクチンの２ヶ月後、３ヶ月後、４ヶ月後、５ヶ月後、６ヶ月後、８ヶ月後、１０ヶ月後、または１年後に対象に投与される。他の実施形態では、第２のセットの抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡワクチンは、第１のセットの癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡワクチンの１年半後、２年後、２年半後、３年後、３年半後、４年後、４年半後、または５年後に対象に投与される。
【０２１３】
ネオ抗原としてのホットスポット変異
癌の集団解析では、偶発するであろうと予測されるより高い割合の患者にある特定の変異が生じる。こうした「反復」変異または「ホットスポット」変異は、腫瘍において「ドライバー」の役割を有すると示されたことが多く、腫瘍の開始、維持、または転移に重要な癌細胞機能に何らかの変化をもたらし、それ故に、腫瘍が進化するために選択されるものである。腫瘍の生物学及び治療におけるその重要性に加えて、反復変異からは精密医療の機会が得られ、こうした精密医療では、患者集団は特定の治療に応答する可能性が高い群へと分類される。こうした特定の治療には、限定はされないが、変異タンパク質自体を標的とするものが含まれる。
【０２１４】
反復変異については、非同義（または「ミスセンス」）の単一ヌクレオチド変異体（ＳＮＶ）に重点が置かれ、多大な努力及び研究がなされてきたが、同義（または「サイレント」）、スプライス部位、複数ヌクレオチド変異体、挿入、及び欠失などの、さまざまな複雑性の高い（非ＳＮＶ）変異分類のものも高頻度で生じ得ることが集団解析によって明らかになってきた。
【０２１５】
ｐ５３遺伝子（正式記号ＴＰ５３）は、ヒトの癌において他のどの遺伝子よりも高い頻度で変異する。ｐ５３に生じる変異のほとんどで、そのゲノム位置は１人または少数の患者のみに特有であるため、こうした変異は、特定の患者集団向けに設計される治療ワクチンのための反復ネオ抗原として使用できないことが大規模コホート研究によって示された。驚くべきことに、しかしながら、ｐ５３遺伝子座の小サブセットは実に「ホットスポット」のパターンを示しており、そこでは、遺伝子のいくつかの位置が相対的に高い頻度で変異するのである。際だったことに、反復して変異するこうした領域の大部分が、エクソンとイントロンとの境界付近に存在し、ｍＲＮＡのスプライシング機構によって認識される標準のヌクレオチド配列モチーフを破壊する。スプライシングモチーフが変異すると、局所的なアミノ酸配列には変化が生じない（すなわち、同義変異またはイントロン変異）と予測されるとしても、最終的なｍＲＮＡ配列には変化が生じ得る。それ故に、こうした変異によって予測不可能な様式でｍＲＮＡのスプライシングに変化が生じ得、翻訳されるタンパク質が著しい機能的影響を受け得るにもかかわらず、こうした変異は、一般的なアノテーションツールによって「ノンコーディング」として注解されてしまい、さらに解析されることなく無視されることが多い。代替的にスプライシングを受けたアイソフォームにインフレームの配列変化が生じる（すなわち、ＰＴＣが生じない）のであれば、こうしたアイソフォームはＮＭＤによる排除を免れることができ、速やかに発現し、プロセシングを受けてＨＬＡ系によって細胞表面に提示される。さらに、変異に由来する代替的なスプライシングは、通常、「潜在性」であって、すなわち、正常組織では発現しないものであり、それ故に、Ｔ細胞によって非自己のネオ抗原として認識され得る。
【０２１６】
いくつかの態様では、本発明は、ｐ５３におけるある特定の反復体細胞癌変異（限定はされないが、ミスセンスＳＮＶ）から得られ、代替的なスプライシングを引き起こすことが多いネオ抗原ペプチド配列を提供し、こうしたネオ抗原ペプチド配列は、治療的なワクチン接種のための標的としての使用を目的とする。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡのスプライシング事象でネオ抗原ペプチド及び／またはＨＬＡ拘束性エピトープを生じさせる変異には、コドン位置Ｔ１２５に隣接する標準５’スプライス部位における変異であって、エピトープＡＶＳＰＣＩＳＦＶＷ（配列番号２３３）（ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５８：０１）、エピトープＨＰＬＡＳＣＱＣＦＦ（配列番号２３４）（ＨＬＡ−Ｂ＊３５：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５３：０１）、エピトープＦＶＷＮＦＧＩＰＬ（配列番号２３５）（ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０６、ＨＬＡ−Ｂ＊３５：０１）を含むペプチド配列ＴＡＫＳＶＴＣＴＶＳＣＰＥＧＬＡＳＭＲＬＱＣＬＡＶＳＰＣＩＳＦＶＷＮＦＧＩＰＬＨＰＬＡＳＣＱＣＦＦＩＶＹＰＬＮＶ（配列番号２３２）を有する保持型イントロンを誘導する変異が含まれる。
【０２１７】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡのスプライシング事象でネオ抗原ペプチド及び／またはＨＬＡ拘束性エピトープを生じさせる変異には、コドン位置３３１に隣接する標準５’スプライス部位における変異であって、エピトープＬＱＶＬＳＬＧＴＳＹ（配列番号２３７）（ＨＬＡ−Ｂ＊１５：０１）、エピトープＦＱＳＮＴＱＮＡＶＦ（配列番号２３８）（ＨＬＡ−Ｂ＊１５：０１）を含むペプチド配列ＥＹＦＴＬＱＶＬＳＬＧＴＳＹＱＶＥＳＦＱＳＮＴＱＮＡＶＦＦＬＴＶＬＰＡＩＧＡＦＡＩＲＧＱ（配列番号２３６）を有する保持型イントロンを誘導する変異が含まれる。
【０２１８】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡのスプライシング事象でネオ抗原ペプチド及び／またはＨＬＡ拘束性エピトープを生じさせる変異には、コドン位置１２６に隣接する標準３’スプライス部位における変異であって、エピトープＣＴＭＦＣＱＬＡＫ（配列番号２４０）（ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１）、エピトープＫＳＶＴＣＴＭＦ（配列番号２４１）（ＨＬＡ−Ｂ＊５８：０１）を含む新規のスパニングペプチド配列ＡＫＳＶＴＣＴＭＦＣＱＬＡＫ（配列番号２３９）を生成する潜在性の代替エクソン３’スプライス部位を誘導する変異が含まれる。
【０２１９】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡのスプライシング事象でネオ抗原ペプチド及び／またはＨＬＡ拘束性エピトープを生じさせる変異には、コドン位置２２４に隣接する標準５’スプライス部位における変異であって、エピトープＶＰＹＥＰＰＥＶＷ（配列番号２４３）（ＨＬＡ−Ｂ＊５３：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５１：０１）、エピトープＬＴＶＰＰＳＴＡＷ（配列番号２４４）（ＨＬＡ−Ｂ＊５８：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１）を含む新規のスパニングペプチド配列ＶＰＹＥＰＰＥＶＷＬＡＬＴＶＰＰＳＴＡＷＡＡ（配列番号２４２）を生成する潜在性の代替イントロン５’スプライス部位を誘導する変異が含まれる。
【０２２０】
前述の配列では、転写コドン位置は、Ｅｎｓｅｍｂｌのｖ８３のヒトゲノムアノテーションに由来する標準の全長ｐ５３転写物であるＥＮＳＴ０００００２６９３０５（配列番号２４５）を参照したものである。
【０２２１】
先行技術のペプチドワクチンのネオエピトープを得るための変異は、典型的には、患者のＤＮＡシークエンシングデータから得られる。一方、ｍＲＮＡ発現は、考えられるネオエピトープのグローバル空間をより直接的に測定するものである。例えば、いくつかの腫瘍特異的ネオエピトープは、スプライシングの変化、フレームシフトをもたらす挿入／欠失（ＩｎＤｅｌ）、代替プロモーター、またはエピジェネティック修飾から生じ得、エクソームシークエンシングデータを使用するだけでは容易に同定されない。ネオ抗原ワクチンのために、これらの複雑な変異の種類を同定することは、患者固有のＨＬＡアロタイプに結合することができるエピトープ数が増えることから、潜在的な価値がある。さらに、複合バリアントは、免疫原性がより高く、単一のアミノ酸変化から生じるバリアントと比較して、自己タンパク質との違いから、腫瘍に対して、より効果的な免疫応答をもたらし得る。
【０２２２】
いくつかの態様では、本発明は、複雑な患者特異的変異を同定し、これらの変異を効果的な個別化ｍＲＮＡワクチンに製剤化する方法を伴う。方法は、ショートリードＲＮＡシークエンシングの使用を伴う。ＲＮＡシークエンシングにショートリードを使用することにおける固有の主な課題は、選択的スプライシング及び他の機序により、同じゲノム遺伝子座から複数のｍＲＮＡ転写物アイソフォームが取得され得るという事実である。シークエンシングリードが全長ｍＲＮＡ転写物よりもかなり短いため、リードセットを既知の遺伝子アノテーションモデル内の正しい対応アイソフォームにマッピングすることが難しくなる。結果として、既知の遺伝子アノテーションから逸れる複合バリアント（癌では一般的）は、標準的なアプローチで発見するのは困難であり得る。しかし、本開示は、全長転写物の正確なエクソン組成ではなく、短いペプチドの同定を伴うものである。これらの複雑な変異を代表する短いペプチドを同定する方法は、複雑なバリアントのネオエピトープ予測に対する短いｋマーカウントアプローチを伴う。
【０２２３】
典型的な次世代シークエンシングのリードは、１５０塩基対であり、これは、コーディング領域をキャプチャする場合、５０コドン、または長さ９（２７ヌクレオチド）の４１の異なるペプチドエピトープを分析することができる。したがって、簡単で計算可能なスケーラブル操作を使用してＲＮＡシークエンシング試料からすべての２７マーをカウントし、結果を、同じ試料に由来する正常組織に対して、または正常組織のＲＮＡシークエンシングから得た２７マーの事前に計算されたデータベース（例えば、ＧＴＥｘ）に対して比較することができる。
【０２２４】
ＲＮＡシークエンシングデータから予想されたネオエピトープを含有するｍＲＮＡワクチンは、１）腫瘍試料のＲＮＡシークエンシングのすべてのリードからすべての可能な２７マーをカウントすることと、２）各リードのオープンリーディングフレームを、そのリード全体の任意の部分とトランスクリプトームとをアラインメントすることによって予測することと、３）２７マーのカウントを、整合する正常試料及び／または同じ組織種に由来する正常組織のデータベースの対応する２７マーのカウントと比較することと、４）同じ腫瘍から得たＤＮＡシークエンシングデータを使用して、同じ遺伝子にみられる体細胞変異が存在する場合、ネオエピトープ予測に信頼度を追加することと、により、創出することができる。ポイント（４）に関して、多くの場合、変異は、転写変化またはスプライシング変化を引き起こすことがあり、変異自体から直接予測することができない、ｍＲＮＡ配列の変化が生じる。例えば、スプライス部位の変異は、エクソンスキッピングを引き起こすことが予想され得るが、その場所のスプライシング機序によってどの下流エクソンが選択されるかを確実に知ることはできない。
【０２２５】
１つの実施形態では、本発明は、ネオ抗原ペプチド１〜４をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むコンカテマーポリエピトープ構築物または個々のエピトープ構築物のセットを含むｍＲＮＡワクチンを提供する。
【０２２６】
１つの実施形態では、本発明は、患者の腫瘍が上記の変異のいずれを含むかということに基づく、ペプチド１〜４を含むか、またはコードするワクチンの選択投与を提供する。
【０２２７】
１つの実施形態では、本発明は、１）患者の腫瘍が上記の変異のいずれを含むか、及び２）患者の正常なＨＬＡ型が、得られるネオ抗原に結合すると予測される対応ＨＬＡ対立遺伝子を含むか、という二重の判断基準に基づく、ワクチンの選択投与を提供する。
【０２２８】
本明細書に記載のｍＲＮＡワクチンは、現在のワクチンと比較していくつかの点で優れていることが発見された。第１に、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）による送達は、文献に記載のリポソームまたはプロタミンに基づく手法を含む他の製剤より優れており、追加のアジュバントが必要になることはない。ＬＮＰを使用すると、化学的に修飾または非修飾のｍＲＮＡワクチンを効率的に送達することが可能になる。修飾及び非修飾のＬＮＰ製剤化ｍＲＮＡワクチンは両方共、通常のワクチンより顕著に優れている。いくつかの実施形態では、本発明のｍＲＮＡワクチンは、通常のワクチンと比較して、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、または少なくとも１，０００倍優れている。
【０２２９】
ｍＲＮＡワクチン及び自己複製ＲＮＡワクチンを含む機能性ＲＮＡワクチンを生成するための試みがいくつもなされてきたが、こうしたＲＮＡワクチンの治療効果は、依然として完全には確立されていない。非常に驚くべきことに、抗原産生の増進及び中和能力を有する機能性抗体の産生を含む、顕著に増進しており、多くの点で相乗的な免疫応答を引き起こす、インビボでｍＲＮＡワクチンを送達するための製剤クラスを、本発明の態様に従って発明者らは発見した。こうした結果は、脂質に基づく他のクラスの製剤において使用されるｍＲＮＡ用量と比較して顕著に低い用量のｍＲＮＡが投与されるときでさえ達成することができる。本発明の製剤は、予防剤及び治療剤としての機能性ｍＲＮＡワクチンの効果を確立するために十分な、顕著な免疫応答をインビボで予想外に引き起こすことが示された。さらに、自己複製ＲＮＡワクチンでは、細胞に十分なＲＮＡを送達するためにウイルスの複製経路を利用することで免疫応答が生成する。本発明の製剤では、ウイルス複製を必要とすることなく、強力な免疫応答の誘発に十分なタンパク質が産生する。したがって、本発明のｍＲＮＡは、自己複製ＲＮＡではなく、ウイルス複製に必要な要素を含まない。
【０２３０】
いくつかの態様では、本発明は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤が、化学的に修飾及び非修飾のｍＲＮＡワクチンを含むｍＲＮＡワクチンの有効性を顕著に増進するという驚くべき知見を含む。ＬＮＰにおいて製剤化されたｍＲＮＡワクチンの効果を、異なる腫瘍抗原をいくつか使用してインビボで調べた。免疫応答の増進誘発に加えて、本発明の製剤は、他の試験ワクチンと比較して少ない用量の抗原で、より迅速に免疫応答を生成する。さらに、異なる担体において製剤化されたワクチンと比較して、本発明のｍＲＮＡ−ＬＮＰ製剤は、量的かつ質的に優れた免疫応答を生成する。さらに、本発明のｍＲＮＡ−ＬＮＰ製剤は、他のワクチンと比較してｍＲＮＡの用量が少ないときでさえ、他のワクチンより優れている。
【０２３１】
本明細書に記載の試験において使用したＬＮＰは、さまざまな動物モデルならびにヒトにおけるｓｉＲＮＡの送達に以前に使用されたものである。ＬＮＰ製剤によるｓｉＲＮＡの送達と関連して得られた知見を考慮すると、ＬＮＰがワクチンにおいて有用であるという事実は非常に驚くべきものである。ＬＮＰにおいて製剤化されたｓｉＲＮＡの治療的な送達では、一過性のＩｇＭ応答と関連する望ましくない炎症応答が生じる結果として、典型的には、抗原産生が減少し、免疫応答が損なわれることが観測されている。ｓｉＲＮＡで観測された知見とは対照的に、本発明のＬＮＰ−ｍＲＮＡ製剤では、一過性のＩｇＭ応答ではなく、予防方法及び治療方法に十分となるＩｇＧレベルの増進が生じることが本明細書に示されている。
【０２３２】
核酸／ポリヌクレオチド
本明細書で提供される癌ワクチンは、少なくとも１つの癌抗原ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つ（１つまたは複数）のリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。「核酸」という用語は、その最も広い意味では、ヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物及び／または物質を含む。こうしたポリマーは、ポリヌクレオチドと称される。
【０２３３】
核酸（ポリヌクレオチドとも称される）は、例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（β−Ｄ−リボ配置を有するＬＮＡ、α−Ｌ−リボ配置を有するα−ＬＮＡ（ＬＮＡのジアステレオマー）、２’−アミノ官能化された２’−アミノ−ＬＮＡ、及び２’−アミノ官能化された２’−アミノ−α−ＬＮＡを含むＬＮＡ）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）、またはそのキメラもしくは組み合わせであり得るか、またはそれを含み得る。
【０２３４】
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）として機能する。「メッセンジャーＲＮＡ」（ｍＲＮＡ）は、（少なくとも１つの）ポリペプチド（天然起源のアミノ酸ポリマー、非天然起源のアミノ酸ポリマー、または修飾されたアミノ酸ポリマー）をコードし、翻訳されることで、コードされるポリペプチドをインビトロ、インビボ、インサイチュ、またはエクスビボで生成することができる任意のポリヌクレオチドを指す。
【０２３５】
ｍＲＮＡ分子の基本構成要素には、典型的には、少なくとも１つのコード領域、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、３’ＵＴＲ、５’キャップ、及びポリＡ尾部が含まれる。本開示のポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡとして機能し得るが、核酸に基づく治療剤を使用してポリペプチドを効率的に発現させるという現存する問題の克服に役立つ機能的特徴及び／または構造設計特徴をそれが有している点において野生型ｍＲＮＡとは区別することができる。
【０２３６】
いくつかの実施形態では、癌ワクチンのＲＮＡポリヌクレオチドは、２〜１０、２〜９、２〜８、２〜７、２〜６、２〜５、２〜４、２〜３、３〜１０、３〜９、３〜８、３〜７、３〜６、３〜５、３〜４、４〜１０、４〜９、４〜８、４〜７、４〜６、４〜５、５〜１０、５〜９、５〜８、５〜７、５〜６、６〜１０、６〜９、６〜８、６〜７、７〜１０、７〜９、７〜８、８〜１０、８〜９または９〜１０の抗原ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、癌ワクチンのＲＮＡポリヌクレオチドは、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００の抗原ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、癌ワクチンのＲＮＡポリヌクレオチドは、少なくとも１００または少なくとも２００の抗原ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、癌ワクチンのＲＮＡポリヌクレオチドは、１〜１０、５〜１５、１０〜２０、１５〜２５、２０〜３０、２５〜３５、３０〜４０、３５〜４５、４０〜５０、５５〜６５、６０〜７０、６５〜７５、７０〜８０、７５〜８５、８０〜９０、８５〜９５、９０〜１００、１〜５０、１〜１００、２〜５０または２〜１００の抗原ポリペプチドをコードする。
【０２３７】
いくつかの実施形態では、癌ワクチンのＲＮＡポリヌクレオチドは、２〜１０、２〜９、２〜８、２〜７、２〜６、２〜５、２〜４、２〜３、３〜１０、３〜９、３〜８、３〜７、３〜６、３〜５、３〜４、４〜１０、４〜９、４〜８、４〜７、４〜６、４〜５、５〜１０、５〜９、５〜８、５〜７、５〜６、６〜１０、６〜９、６〜８、６〜７、７〜１０、７〜９、７〜８、８〜１０、８〜９または９〜１０の活性化癌遺伝子変異ペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、癌ワクチンのＲＮＡポリヌクレオチドは、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００の活性化癌遺伝子変異ペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、癌ワクチンのＲＮＡポリヌクレオチドは、少なくとも１００または少なくとも２００の活性化癌遺伝子変異ペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、癌ワクチンのＲＮＡポリヌクレオチドは、１〜１０、５〜１５、１０〜２０、１５〜２５、２０〜３０、２５〜３５、３０〜４０、３５〜４５、４０〜５０、５５〜６５、６０〜７０、６５〜７５、７０〜８０、７５〜８５、８０〜９０、８５〜９５、９０〜１００、１〜５０、１〜１００、２〜５０または２〜１００の活性化癌遺伝子変異ペプチドをコードする。
【０２３８】
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、コドンが最適化される。コドンの最適化方法は、当該技術分野において知られており、本明細書で提供されるように使用してよい。いくつかの実施形態では、適切な折り畳みを維持するための、標的のコドン頻度と宿主生物のコドン頻度との整合、ｍＲＮＡの安定性の向上もしくは二次構造の低減のためのＧＣ含量の偏向化、遺伝子の構築もしくは発現を損ない得るタンデムリピートコドン及び塩基配列の最小化、転写制御領域及び翻訳制御領域のカスタマイズ、タンパク質輸送配列の挿入もしくは除去、コードされるタンパク質における翻訳後修飾部位（例えば、グリコシル化部位）の除去／付加、タンパク質ドメインの付加、除去、もしくはシャッフル、制限酵素部位の挿入もしくは除去、リボソーム結合部位及びｍＲＮＡ分解部位の修飾、タンパク質のさまざまなドメインの適切な折り畳みを可能にするための翻訳速度の調節、またはポリヌクレオチド内の問題の二次構造の低減もしくは除外、を目的としてコドンの最適化を使用してよい。コドンの最適化するツール、アルゴリズム、及びサービスは、当該技術分野において知られており、例には限定はされないが、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から提供されるサービス、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ  ＣＡ）、及び／または独自の方法が含まれる。いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列は、最適化アルゴリズムを使用して最適化される。
【０２３９】
いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然起源または野生型の配列（例えば、目的とするポリペプチドまたはタンパク質（例えば、抗原性のタンパク質またはポリペプチド）をコードする天然起源または野生型のｍＲＮＡ配列）と９５％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然起源または野生型の配列（例えば、目的とするポリペプチドまたはタンパク質（例えば、抗原性のタンパク質またはポリペプチド）をコードする天然起源または野生型のｍＲＮＡ配列）と９０％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然起源または野生型の配列（例えば、目的とするポリペプチドまたはタンパク質（例えば、抗原性のタンパク質またはポリペプチド）をコードする天然起源または野生型のｍＲＮＡ配列）と８５％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然起源または野生型の配列（例えば、目的とするポリペプチドまたはタンパク質（例えば、抗原性のタンパク質またはポリペプチド）をコードする天然起源または野生型のｍＲＮＡ配列）と８０％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然起源または野生型の配列（例えば、目的とするポリペプチドまたはタンパク質（例えば、抗原性のタンパク質またはポリペプチド）をコードする天然起源または野生型のｍＲＮＡ配列）と７５％未満の配列同一性を共有する。
【０２４０】
いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然起源または野生型の配列（例えば、目的とするポリペプチドまたはタンパク質（例えば、抗原性のタンパク質またはポリペプチド）をコードする天然起源または野生型のｍＲＮＡ配列）と６５％〜８５％（例えば、約６７％〜約８５％または約６７％〜約８０％）の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然起源または野生型の配列（例えば、目的とするポリペプチドまたはタンパク質（例えば、抗原性のタンパク質またはポリペプチド）をコードする天然起源または野生型のｍＲＮＡ配列）と６５％〜７５％または約８０％の配列同一性を共有する。
【０２４１】
いくつかの実施形態では、コドン最適化ＲＮＡは、例えば、Ｇ／Ｃのレベルが増強されたものであり得る。核酸分子のＧ／Ｃ含量は、ＲＮＡの安定性に影響を与え得る。グアニン（Ｇ）残基及び／またはシトシン（Ｃ）残基の量が増加したＲＮＡは、アデニン（Ａ）ヌクレオチド及びチミン（Ｔ）ヌクレオチドまたはウラシル（Ｕ）ヌクレオチドを大量に含む核酸と比較して機能的により安定であり得る。ＷＯ０２／０９８４４３では、翻訳領域の配列改変によって安定化したｍＲＮＡを含む医薬組成物が開示されている。遺伝コードは縮重しているため、得られるアミノ酸を変えることなくＲＮＡの安定性向上を促進するコドンで現存コドンを置換することによって改変は機能する。この手法は、ＲＮＡのコード領域に限ったものではない。
【０２４２】
抗原／抗原ポリペプチド
いくつかの実施形態では、癌ポリペプチド（例えば、活性化癌遺伝子変異ペプチド）は、５アミノ酸より長く、かつ５０アミノ酸より短い。いくつかの実施形態では、癌ポリペプチドは、２５アミノ酸より長く、かつ５０アミノ酸よりも短い。したがって、ポリペプチドには、遺伝子産物、天然起源のポリペプチド、合成ポリペプチド、前述のもののホモログ、オルソログ、パラログ、断片及び他の同等形態、変異体、ならびに類似体が含まれる。ポリペプチドは、単一分子であり得るか、または二量体、三量体、もしくは四量体などの複数分子の複合体であり得る。ポリペプチドには、一本鎖のポリペプチド、または抗体もしくはインスリンなどの複数鎖のポリペプチドも含まれ得、ポリペプチドは、会合し得るか、または連結され得る。最も一般的には、複数鎖のポリペプチドにはジスルフィド結合が見られる。ポリペプチドという用語は、少なくとも１つのアミノ酸残基が、対応する天然起源のアミノ酸の人工的な化学類似体であるアミノ酸ポリマーにも適用され得る。
【０２４３】
「ポリペプチド変異体」という用語は、天然配列または参照配列とはそのアミノ酸配列が異なる分子を指す。アミノ酸配列変異体は、天然配列または参照配列と比較して、アミノ酸配列内のある特定の位置に置換、欠失、及び／または挿入を有し得る。通常、変異体は、天然配列または参照配列に対して少なくとも５０％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、変異体は、天然配列または参照配列と少なくとも８０％または少なくとも９０％の同一性を共有する。
【０２４４】
いくつかの実施形態では、「変異体模倣体」が提供される。本明細書で使用される「変異体模倣体」という用語は、活性化配列を模倣すると想定される少なくとも１つのアミノ酸を含むものである。例えば、グルタメートは、ホスホロ−スレオニン及び／またはホスホロ−セリンの模倣体として働き得る。あるいは、変異体模倣体は、活性を失うか、またはその模倣体を含む不活性化産物となり得るものであり、例えば、フェニルアラニンは、チロシンの不活性化置換として働き得、またはアラニンは、セリンの不活性化置換として働き得る。
【０２４５】
「オルソログ」は、種分化によって共通の先祖遺伝子から進化した異なる種の遺伝子を指す。通常、オルソログは、進化の過程において同一の機能を保持する。オルソログの同定は、シークエンシングが新たに実施されたゲノムにおいて信頼できる遺伝子機能予測を実施するために極めて重要である。
【０２４６】
「類似体」は、１つまたは複数のアミノ酸の変更によって異なるポリペプチド変異体を含むことが意図され、こうしたアミノ酸の変更は、例えば、親ポリペプチドまたは出発ポリペプチドの特性の１つまたは複数を依然として維持する、アミノ酸残基の置換、付加、または欠失である。
【０２４７】
本開示は、変異体及び誘導体を含むポリヌクレオチドまたはポリペプチドに基づくいくつかの型の組成物を提供する。こうしたものには、例えば、置換、挿入、欠失、及び共有結合を有する変異体及び誘導体が含まれる。「誘導体」という用語は、「変異体」という用語と同義的に使用されるが、一般に、参照分子または出発分子と比較して任意の様式で修飾及び／または変更された分子を指す。
【０２４８】
したがって、参照配列、具体的には、本明細書に開示のポリペプチド配列に関して置換、挿入、及び／または付加、欠失、ならびに共有結合修飾を含むペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、本開示の範囲内に含まれる。例えば、配列タグまたは１つもしくは複数のリジンなどのアミノ酸を（例えば、Ｎ末端またはＣ末端で）ペプチド配列に付加することができる。配列タグは、ペプチドの検出、精製、または位置決めに使用することができる。リジンは、ペプチドの溶解性の向上またはビオチン標識の実現に使用することができる。あるいは、ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列のカルボキシ末端領域及びアミノ末端領域に位置するアミノ酸残基を任意選択で欠失させることで切断型配列としてよい。例えば、可溶性のより長い配列の一部としての配列の発現または固形担体に連結されるより長い配列の一部としての配列の発現などの、配列の用途に応じて、ある特定のアミノ酸（例えば、Ｃ末端残基またはＮ末端残基）を代替的に欠失させてよい。
【０２４９】
ポリペプチドを指すとき、「置換変異体」は、天然配列または出発配列におけるアミノ酸残基の少なくとも１つが除去され、それが存在した位置と同一の位置に異なるアミノ酸が挿入されたものである。置換は、単一であり得、この場合、分子における１つのアミノ酸のみが置換されており、または置換は、複数であり得、この場合、２つ以上のアミノ酸が同一分子において置換されている。
【０２５０】
本明細書で使用される「保存的アミノ酸置換」という用語は、配列に通常存在するアミノ酸と、同様のサイズ、電荷、または極性を有する異なるアミノ酸と、の置換を指す。保存的置換の例には、イソロイシン、バリン、及びロイシンなどの非極性（疎水性）残基と、別の非極性残基との置換が含まれる。同様に、保存的置換の例には、アルギニンとリジンとの置換、グルタミンとアスパラギンとの置換、及びグリシンとセリンとの置換などの、ある極性（親水性）残基と別のものとの置換が含まれる。さらに、リジン、アルギニン、もしくはヒスチジンなどの塩基性残基と別のものとの置換、またはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸などの、ある酸性残基と別の酸性残基との置換が保存的置換の追加の例である。非保存的置換の例には、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、メチオニンなどの非極性（疎水性）アミノ酸残基と、システイン、グルタミン、グルタミン酸、もしくはリジンなどの極性（親水性）残基と、の置換、及び／または極性残基と非極性残基との置換が含まれる。
【０２５１】
ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを指すとき、「特徴」は、それぞれ異なるアミノ酸配列に基づく分子構成要素または異なるヌクレオチドに基づく分子構成要素として定義される。ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの特徴には、表面出現部、局所的な立体構造形状、折り畳み、ループ、ハーフループ、ドメイン、ハーフドメイン、部位、末端、またはそれらの任意の組み合わせが含まれる。
【０２５２】
ポリペプチドを指すとき、本明細書で使用される「ドメイン」という用語は、１つまたは複数の同定可能な構造的または機能的な特徴または特性（例えば、タンパク質−タンパク質相互作用のための部位として働く結合能力）を有するポリペプチドのモチーフを指す。
【０２５３】
ポリペプチドを指すとき、アミノ酸に基づく実施形態に関して本明細書で使用される「部位」という用語は、「アミノ酸残基」及び「アミノ酸側鎖」と同義的に使用される。ポリヌクレオチドを指すとき、ヌクレオチドに基づく実施形態に関して本明細書で使用される「部位」という用語は、「ヌクレオチド」と同義的に使用される。部位は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに基づく分子内で修飾、操作、改変、誘導体化、または変更され得るペプチド内またはポリペプチド内またはポリヌクレオチド内の位置に相当する。
【０２５４】
ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを指すとき、本明細書で使用される「ｔｅｒｍｉｎｉ（末端）」または「ｔｅｒｍｉｎｕｓ（末端）」という用語は、それぞれポリペプチドまたはポリヌクレオチドの末端を指す。そのような末端は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの最初の部位または最後の部位のみに限定されず、末端領域のアミノ酸またはヌクレオチドを追加で含み得る。ポリペプチドに基づく分子は、Ｎ末端（遊離のアミノ基（ＮＨ２）を有するアミノ酸によって終結する）とＣ末端（遊離のカルボキシル基（ＣＯＯＨ）を有するアミノ酸によって終結する）との両方を有するものとして特徴付けることができる。場合によっては、タンパク質は、ジスルフィド結合または非共有結合性の力によって共にまとまった複数のポリペプチド鎖から構成される（多量体、オリゴマー）。こうしたタンパク質は、複数のＮ末端及びＣ末端を有する。あるいは、ポリペプチドの末端は、修飾され得る結果として、場合によっては、有機複合体などの非ポリペプチドに基づく部分から始まるか、またはそれで終結し得る。
【０２５５】
当業者によって認識されるタンパク質断片、機能性タンパク質ドメイン、及び相同タンパク質もまた、目的とするポリペプチドの範囲に含まれると考えられる。例えば、アミノ酸長が５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、または１００を超える参照タンパク質の任意のタンパク質断片（参照ポリペプチド配列と比較してアミノ酸残基が少なくとも１つ少ない分短いということ以外は同一であるポリペプチド配列を意味する）が本明細書で提供される。別の例では、本明細書に記載の配列のいずれかに対する同一性が４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％である１０、２０、３０、４０、５０、または１００のアミノ酸のストレッチを含む任意のタンパク質を本開示に従って利用することができる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、本明細書で提供または参照される配列のいずれかに示される変異を２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、または１１以上含む。別の例では、本明細書に記載の配列のいずれかに対する同一性が８０％超、９０％超、９５％超、または１００％である２０、３０、４０、５０、または１００のアミノ酸のストレッチを含む任意のタンパク質であって、本明細書に記載の配列のいずれかに対する同一性が８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、または６０％未満である５、１０、１５、２０、２５、または３０のアミノ酸のストレッチを有するタンパク質を本開示に従って利用することができる。
【０２５６】
本開示のポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子は、例えば、当該技術分野において説明される分子（例えば、操作もしくは設計された分子または野生型分子）などの参照分子（例えば、参照ポリペプチドまたは参照ポリヌクレオチド）とある程度の配列類似性または配列同一性を共有し得る。当該技術分野において知られる「同一性」という用語は、２つ以上のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの配列間の関連性を指し、こうした関連性は、配列比較によって決定される。当該技術分野では、同一性は、それらの間の配列関連度も意味し、こうした関連度は、２つ以上のアミノ酸残基または核酸残基のストリング間の一致数によって決定される。同一性は、特定の数学モデルまたはコンピュータープログラム（例えば、「アルゴリズム」）によって実行されるアライメントでギャップ（存在する場合）を少なくした２つの配列間の同一一致パーセントの尺度である。関連ペプチドの同一性は、既知の方法によって容易に計算することができる。ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列に適用される「同一性％」は、最大同一性パーセントを達成するために配列のアライメント及び必要であればギャップの導入が実施された後に、候補アミノ酸配列または候補核酸配列における残基（アミノ酸残基または核酸残基）が、第２の配列のアミノ酸配列または核酸配列における残基と同一である割合として定義される。アライメントを目的とする方法及びコンピュータープログラムは、当該技術分野においてよく知られている。同一性は、同一性パーセントの計算に依存するが、計算で導入されるギャップ及びペナルティに起因して値が変わり得ると理解される。一般に、特定のリヌクレオチドまたはポリペプチドの変異体は、特定の参照ポリヌクレオチドまたは参照ポリペプチドに対して、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％であるが１００％未満の配列同一性を有し、こうした配列同一性は、本明細書に記載及び当業者に知られる配列アライメントのプログラム及びパラメーターによって決定される。そのようなアライメントツールには、ＢＬＡＳＴスイートのもの（Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｆ．Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ（１９９７），“Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）が含まれる。別の一般的な局所アライメント技術は、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ，Ｔ．Ｆ．＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｍ．Ｓ．（１９８１）“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｍｍｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７）に基づくものである。動的プログラミングに基づく���般的なグローバルアライメント技術は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．＆  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（１９７０）“Ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３．）である。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを含む他の最適グローバルアライメント方法と比較してヌクレオチド配列及びタンパク質配列のグローバルアライメントを高速で実施するとされる高速最適グローバル配列アライメントアルゴリズム（ＦＯＧＳＡＡ）がごく最近開発された。ツールは、本明細書で他にも記載され、特に、下記の「同一性」の定義に記載される。
【０２５７】
本明細書に記載の「相同性」という用語は、例えば、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子及び／またはＲＮＡ分子）及び／またはポリペプチド分子などのポリマー分子の間の全体的な関連性を指す。残基の一致を見出すアライメントによって決定される類似性または同一性を許容限界レベルで共有するポリマー分子（例えば、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子及び／またはＲＮＡ分子）及び／またはポリペプチド分子）は、相同的であると呼ばれる。相同性は、分子間の関連性を説明する定性的な用語であり、定量的な類似性または同一性に基づくことができる。類似性または同一性は、２つの比較配列の間の配列一致度を定義する定量的な用語である。いくつかの実施形態では、ポリマー分子は、それらの配列が少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一または類似しているのであれば、互いに「相同的」であると考えられる。「相同的」という用語は、必然的に、少なくとも２つの配列（ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列）の間の比較を指す。２つのポリヌクレオチド配列がコードするポリペプチドが、少なくとも２０のアミノ酸を含む少なくとも１つのストレッチについて、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または９９％でさえも同一であるならば、２つのポリヌクレオチド配列は相同的であると考えられる。いくつかの実施形態では、相同的ポリヌクレオチド配列は、一意的に特定されたアミノ酸を少なくとも４〜５つ含むストレッチをコードする能力によって特徴付けられる。ヌクレオチド長が６０未満のポリヌクレオチド配列については、相同性は、一意的に特定されたアミノ酸を少なくとも４〜５つ含むストレッチをコードする能力によって決定される。少なくとも２０のアミノ酸を含む少なくとも１つのストレッチについて、タンパク質が少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％同一であるならば、２つのタンパク質配列は、相同的であると考えられる。
【０２５８】
相同性は、比較される配列が共通の起源からの進化において分岐したことを暗示する。「ホモログ」という用語は、共通の祖先配列に由来する系統によって第２のアミノ酸配列または核酸配列と関連する第１のアミノ酸配列または核酸配列（例えば、遺伝子（ＤＮＡもしくはＲＮＡ）配列またはタンパク質配列）を指す。「ホモログ」という用語は、種分化の事象によって別れた遺伝子及び／またはタンパク質の間の関連性、または遺伝子重複の事象によって別れた遺伝子及び／またはタンパク質の間の関連性にも適用され得る。「オルソログ」は、種分化によって共通の先祖遺伝子（またはタンパク質）から進化した異なる種の遺伝子（またはタンパク質）である。典型的には、オルソログは、進化の過程において同一の機能を保持する。「パラログ」は、ゲノム内での重複によって関連する遺伝子（またはタンパク質）である。オルソログは、進化の過程において同一の機能を保持する一方で、パラログは、例え起源のものとの関連性が存在するとしても、新しい機能を発達させる。
【０２５９】
「同一性」という用語は、例えば、ポリヌクレオチド分子（例えば、ＤＮＡ分子及び／またはＲＮＡ分子）及び／またはポリペプチド分子などのポリマー分子の間の全体的な関連性を指す。２つのポリ核酸配列の同一性パーセントの計算は、例えば、比較の最適化を目的として２つの配列のアライメントをとることによって実施することができる（例えば、アライメントが最適化するように第１の核酸配列及び第２の核酸配列の１つまたは両方にギャップを導入することができ、比較を目的として同一でない配列は無視することができる）。ある特定の実施形態では、比較を目的としてアライメントされる配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％である。続いて、対応するヌクレオチド位置でヌクレオチドが比較される。第１の配列における位置が、第２の配列において対応する位置のものと同一のヌクレオチドによって占有されているとき、分子はその位置で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列のアライメントが最適化するように導入する必要があるギャップの数及びそれぞれのギャップの長さを考慮すると、配列が共有する同一位置の数の関数となる。２つの配列間の配列比較及び同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。例えば、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８、Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４、及びＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１に記載されるものなどの方法を使用して２つの核酸配列の間の同一性パーセントを決定することができ、これらの文献はそれぞれ、参照によって本明細書に組み込まれる。例えば、２つの核酸配列の間の同一性パーセントは、Ｍｅｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ，１９８９，４：１１−１７）のアルゴリズムを使用して決定することができ、このアルゴリズムは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれており、ＰＡＭ１２０加重残基表、１２のギャップ長ペナルティ、及び４のギャップペナルティが使用される。あるいは、２つの核酸配列の間の同一性パーセントは、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスを使用し、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプロ��ラムを使用して決定することができる。配列間の同一性パーセントを決定するために一般に用いられる方法には、限定はされないが、Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ  Ｊ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）に開示されるものが含まれ、当該文献は、参照によって本明細書に組み込まれる。同一性の決定技術は、公的に利用可能なコンピュータープログラムに組み込まれている。２つの配列間の相同性を決定するためのコンピューターソフトウェアの例には、限定はされないが、ＧＣＧプログラムパッケージ、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２（１），３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、及びＦＡＳＴＡ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０））が含まれる。
【０２６０】
化学修飾
エピトープ抗原ポリペプチドをコードする修飾ヌクレオチド配列
いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、少なくとも１つの呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）抗原ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含み、上記ＲＮＡは、少なくとも１つの化学修飾を含む。
【０２６１】
「化学修飾」及び「化学的に修飾された」という用語は、アデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、ウリジン（Ｕ）、チミジン（Ｔ）、またはシチジン（Ｃ）を含むリボヌクレオシドまたはデオキシリボヌクレオシドに関する、その位置、パターン、パーセント、または集団の少なくとも１つにおける修飾を指す。一般に、こうした用語は、ｍＲＮＡの５’末端に天然に生じるキャップ部分におけるリボヌクレオチド修飾は指さない。
【０２６２】
ポリヌクレオチドの修飾には、限定はされないが、本明細書に記載のものが含まれ、明確に限定されるわけではないが、化学修飾を含む修飾が含まれる。ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、天然起源、非天然起源の修飾を含み得るか、またはポリヌクレオチドは、天然起源の修飾と非天然起源の修飾とを組み合わせて含み得る。ポリヌクレオチドは、例えば、糖、核酸塩基、またはヌクレオシド間結合の任意の有用な修飾（例えば、連結ホスフェート、ホスホジエステル結合、またはホスホジエステル骨格に対するもの）を含み得る。
【０２６３】
ポリペプチドに関する「修飾」という用語は、標準セットの２０のアミノ酸に対する修飾を指す。本明細書で提供されるポリペプチドは、それがアミノ酸の置換、挿入、または置換と挿入との組み合わせを含むこともまた、「修飾された」と考えられる。
【０２６４】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、さまざまな（複数の）異なる修飾を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの特定領域は、１つ、２つ、またはそれを超える数の（任意選択で異なる）ヌクレオシド修飾またはヌクレオチド修飾を含む。いくつかの実施形態では、細胞または生物に導入される修飾ＲＮＡポリヌクレオチド（例えば、修飾ｍＲＮＡポリヌクレオチド）は、非修飾ポリヌクレオチドと比較して、それぞれ細胞または生物における分解の低減を示す。いくつかの実施形態では、細胞または生物に導入される修飾ＲＮＡポリヌクレオチド（例えば、修飾ｍＲＮＡポリヌクレオチド）は、それぞれ細胞または生物における免疫原性の低減（例えば、自然応答の低減）を示し得る。
【０２６５】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、所望の機能または特性を達成するためにポリヌクレオチドの合成中または合成後に導入される非天然の修飾ヌクレオチドを含む。修飾は、ヌクレオチド間結合、プリン塩基もしくはピリミジン塩基、または糖に存在し得る。修飾は、鎖の末端または鎖の他の任意の場所に化学合成またはポリメラーゼ酵素を用いて導入してよい。ポリヌクレオチドの領域はいずれも、化学的に修飾してよい。
【０２６６】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、化学的に修飾された核酸塩基を含む。本発明は、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、１つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む、修飾ポリヌクレオチドを含む。修飾ポリヌクレオチドは、化学的に修飾され得、及び／または構造的に修飾され得る。本発明のポリヌクレオチドが化学的及び／または構造的に修飾されている場合、当該ポリヌクレオチドは、「修飾ポリヌクレオチド」と称され得る。
【０２６７】
本開示は、１つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードする修飾されたヌクレオシド及びヌクレオチドのポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）を提供する。「ヌクレオシド」は、有機塩基（例えば、プリンもしくはピリミジン）またはその誘導体（本明細書では「核酸塩基」とも称される）と組み合わせて糖分子（例えば、ペントースもしくはリボース）またはその誘導体を含む化合物を指す。「ヌクレオチド」は、ホスフェート基を含むヌクレオシドを指す。修飾ヌクレオチドは、１つまたは複数の修飾または非天然のヌクレオシドを含めるための、例えば、化学的、酵素的、または組換え的なものなどの任意の有用な方法によって合成することができる。ポリヌクレオチドは、ヌクレオシドが連結された領域を１つまたは複数含み得る。そのような領域は、さまざまな骨格結合を有し得る。結合は、標準的なホスホジエステル結合であり得、この場合、ポリヌクレオチドはヌクレオチドの領域を含むと想定される。
【０２６８】
本明細書に開示の修飾ポリヌクレオチドは、さまざまな異なる修飾を含み得る。いくつかの実施形態では、修飾ポリヌクレオチドは、１つ、２つ、またはそれを超える数の（任意選択で異なる）ヌクレオシドまたはヌクレオチド修飾を含有する。いくつかの実施形態では、細胞に導入される修飾ポリヌクレオチドは、非修飾ポリヌクレオチドと比較して、１つまたは複数の所望の特性、例えば、タンパク質発現の改善、免疫原性の低下、または細胞における分解の低減を示し得る。
【０２６９】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、１つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、構造的に修飾される。本明細書で使用されるとき、「構造的」修飾は、ヌクレオチド自体に有意な化学修飾を行うことなく、２つ以上の連結されたヌクレオシドが、ポリヌクレオチドにおいて、挿入、欠失、複製、反転またはランダム化される修飾である。構造的修飾をもたらすために化学結合が必然的に破壊され再構築されるので、構造的修飾は、化学的性質のものであり、したがって、化学的修飾である。しかしながら、構造的修飾により、異なるヌクレオチド配列になる。例えば、ポリヌクレオチド「ＡＴＣＧ」は、「ＡＴ−５ｍｅＣ−Ｇ」に化学的に修飾され得る。同じポリヌクレオチドを「ＡＴＣＧ」から「ＡＴＣＣＣＧ」に構造的に修飾することができる。この場合、ジヌクレオチド「ＣＣ」が挿入された結果として、ポリヌクレオチドに構造的修飾が生じている。
【０２７０】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、化学的に修飾される。ポリヌクレオチドに関して本明細書で使用されるとき、「化学修飾」または適宜「化学的に修飾された」という用語は、アデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、ウリジン（Ｕ）、またはシチジン（Ｃ）を含むリボヌクレオシドまたはデオキシリボヌクレオシドに関する、その位置、パターン、パーセントまたは集団の１つまたは複数における修飾を指す。一般に、本明細書では、こうした用語は、ｍＲＮＡの５’末端に天然に生じるキャップ部分におけるリボヌクレオチド修飾を指すことは意図されない。
【０２７１】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、同じヌクレオシド型のすべてもしくはいずれかの一様な化学修飾、または同じヌクレオシド型のすべてもしくはいずれかにおける同じ出発修飾の単純な下方滴定によって産生される修飾の集団、またはランダム組み込みを有する同じヌクレオシド型のすべての任意の化学修飾（すべてのウリジンがウリジン類似体、例えば、シュードウリジンまたは５−メトキシウリジンによって置き換えられる場合など）の測定パーセントを有し得る。別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド全体を通して２つ、３つ、または４つの同じヌクレオシド型が一様な化学修飾を有し得る（例えば、すべてのウリジン及びすべてのシトシンなどが同じように修飾される）。
【０２７２】
修飾ヌクレオチド塩基対形成は、標準的なアデノシン−チミン、アデノシン−ウラシル、またはグアノシン−シトシンという塩基対だけでなく、非標準塩基または修飾塩基を含むヌクレオチド及び／または修飾ヌクレオチドの間に形成される塩基対も包含し、水素結合ドナーと水素結合アクセプターとの配置によって、非標準塩基と標準塩基との間での水素結合、または例えば少なくとも１つの化学修飾を有するポリヌクレオチドなどにおける２つの相補的非標準塩基構造の間での水素結合が可能になる。非標準塩基のそのような対形成の例の１つは、修飾ヌクレオチドであるイノシンと、アデニン、シトシン、またはウラシルとの間の塩基対形成である。塩基／糖またはリンカーの任意の組み合わせを本開示のポリヌクレオチドに組み込んでよい。
【０２７３】
当業者であれば、特に記載しない限り、本出願に記載のポリヌクレオチド配列は、代表的なＤＮＡ配列において「Ｔ」を列挙しているが、その配列がＲＮＡを表す場合には、「Ｔ」は、「Ｕ」に置き換えられることを認識するであろう。
【０２７４】
本開示の組成物、方法、及び合成プロセスにおいて有用な、限定はされないが、化学修飾を含む、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）の修飾には、限定はされないが、下記のものが含まれる：一様なヌクレオチド、ヌクレオシド、及び核酸塩基：２−メチルチオ−Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２−メチルチオ−Ｎ６−メチルアデノシン、２−メチルチオ−Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６−グリシニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、Ｎ６−メチルアデノシン、Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン、１，２’−Ｏ−ジメチルアデノシン、１−メチルアデノシン、２’−Ｏ−メチルアデノシン、２’−Ｏ−リボシルアデノシン（ホスフェート）、２−メチルアデノシン、２−メチルチオ−Ｎ６イソペンテニルアデノシン、２−メチルチオ−Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン、２’−Ｏ−メチルアデノシン、２’−Ｏ−リボシルアデノシン（ホスフェート）、イソペンテニルアデノシン、Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６，２’−Ｏ−ジメチルアデノシン、Ｎ６，２’−Ｏ−ジメチルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６，２’−Ｏ−トリメチルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデノシン、Ｎ６−アセチルアデノシン、Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン、Ｎ６−メチル−Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン、２−メチルアデノシン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、７−デアザ−アデノシン、Ｎ１−メチル−アデノシン、Ｎ６，Ｎ６（ジメチル）アデニン、Ｎ６−シス−ヒドロキシ−イソペンテニル−アデノシン、α−チオ−アデノシン、２（アミノ）アデニン、２（アミノプロピル）アデニン、２（メチルチオ）Ｎ６（イソペンテニル）アデニン、２−（アルキル）アデニン、２−（アミノアルキル）アデニン、２−（アミノプロピル）アデニン、２−（ハロ）アデニン、２−（ハロ）アデニン、２−（プロピル）アデニン、２’−アミノ−２’−デオキシ−ＡＴＰ、２’−アジド−２’−デオキシ−ＡＴＰ、２’−デオキシ−２’−ａ−アミノアデノシンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ａ−アジドアデノシンＴＰ、６（アルキル）アデニン、６（メチル）アデニン、６−（アルキル）アデニン、６−（メチル）アデニン、７（デアザ）アデニン、８（アルケニル）アデニン、８（アルキニル）アデニン、８（アミノ）アデニン、８（チオアルキル）アデニン、８−（アルケニル）アデニン、８−（アルキル）アデニン、８−（アルキニル）アデニン、８−（アミノ）アデニン、８−（ハロ）アデニン、８−（ヒドロキシル）アデニン、８−（チオアルキル）アデニン、８−（チオール）アデニン、８−アジド−アデノシン、アザアデニン、デアザアデニン、Ｎ６（メチル）アデニン、Ｎ６−（イソペンチル）アデニン、７−デアザ−８−アザ−アデノシン、７−メチルアデニン、１−デアザアデノシンＴＰ、２’フルオロ−Ｎ６−Ｂｚ−デオキシアデノシンＴＰ、２’−ＯＭｅ−２−アミノ−ＡＴＰ、２’Ｏ−メチル−Ｎ６−Ｂｚ−デオキシアデノシンＴＰ、２’−ａ−エチニルアデノシンＴＰ、２−アミノアデニ���、２−アミノアデノシンＴＰ、２−アミノ−ＡＴＰ、２’−ａ−トリフルオロメチルアデノシンＴＰ、２−アジドアデノシンＴＰ、２’−ｂ−エチニルアデノシンＴＰ、２−ブロモアデノシンＴＰ、２’−ｂ−トリフルオロメチルアデノシンＴＰ、２−クロロアデノシンＴＰ、２’−デオキシ−２’，２’−ジフルオロアデノシンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ａ−メルカプトアデノシンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ａ−チオメトキシアデノシンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ｂ−アミノアデノシンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ｂ−アジドアデノシンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ｂ−ブロモアデノシンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ｂ−クロロアデノシンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ｂ−フルオロアデノシンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ｂ−ヨードアデノシンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ｂ−メルカプトアデノシンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ｂ−チオメトキシアデノシンＴＰ、２−フルオロアデノシンＴＰ、２−ヨードアデノシンＴＰ、２−メルカプトアデノシンＴＰ、２−メトキシ−アデニン、２−メチルチオ−アデニン、２−トリフルオロメチルアデノシンＴＰ、３−デアザ−３−ブロモアデノシンＴＰ、３−デアザ−３−クロロアデノシンＴＰ、３−デアザ−３−フルオロアデノシンＴＰ、３−デアザ−３−ヨードアデノシンＴＰ、３−デアザアデノシンＴＰ、４’−アジドアデノシンＴＰ、４’−炭素環式アデノシンＴＰ、４’−エチニルアデノシンＴＰ、５’−ホモ−アデノシンＴＰ、８−アザ−ＡＴＰ、８−ブロモ−アデノシンＴＰ、８−トリフルオロメチルアデノシンＴＰ、９−デアザアデノシンＴＰ、２−アミノプリン、７−デアザ−２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−８−アザ−アデニン，７−デアザ−２−アミノプリン、２−チオシチジン、３−メチルシチジン、５−ホルミルシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、５−メチルシチジン、Ｎ４−アセチルシチジン、２’−Ｏ−メチルシチジン、２’−Ｏ−メチルシチジン、５，２’−Ｏ−ジメチルシチジン、５−ホルミル−２’−Ｏ−メチルシチジン、ライシジン、Ｎ４，２’−Ｏ−ジメチルシチジン、Ｎ４−アセチル−２’−Ｏ−メチルシチジン、Ｎ４−メチルシチジン、Ｎ４，Ｎ４−ジメチル−２’−ＯＭｅ−シチジンＴＰ、４−メチルシチジン、５−アザ−シチジン、シュード−イソ−シチジン、ピロロ−シチジン、α−チオ−シチジン、２−（チオ）シトシン、２’−アミノ−２’−デオキシ−ＣＴＰ、２’−アジド−２’−デオキシ−ＣＴＰ、２’−デオキシ−２’−ａ−アミノシチジンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ａ−アジドシチジンＴＰ、３（デアザ）５（アザ）シトシン、３（メチル）シトシン、３−（アルキル）シトシン、３−（デアザ）５（アザ）シトシン、３−（メチル）シチジン、４，２’−Ｏ−ジメチルシチジン、５（ハロ）シトシン、５（メチル）シトシン、５（プロピニル）シトシン、５（トリフルオロメチル）シトシン、５−（アルキル）シトシン、５−（アルキニル）シトシン、５−（ハロ）シトシン、５−（プロピニル）シトシン、５−（トリフルオロメチル）シトシ��、５−ブロモ−シチジン、５−ヨード−シチジン、５−プロピニルシトシン、６−（アゾ）シトシン、６−アザ−シチジン、アザシトシン、デアザシトシン、Ｎ４（アセチル）シトシン、１−メチル−１−デアザ−シュードイソシチジン、１−メチル−シュードイソシチジン、２−メトキシ−５−メチル−シチジン、２−メトキシ−シチジン、２−チオ−５−メチル−シチジン、４−メトキシ−１−メチル−シュードイソシチジン、４−メトキシ−シュードイソシチジン、４−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードイソシチジン、４−チオ−１−メチル−シュードイソシチジン、４−チオ−シュードイソシチジン、５−アザ−ゼブラリン、５−メチル−ゼブラリン、ピロロ−シュードイソシチジン、ゼブラリン、（Ｅ）−５−（２−ブロモ−ビニル）シチジンＴＰ、２，２’−アンヒドロ−シチジンＴＰ塩酸塩、２’フルオロ−Ｎ４−Ｂｚ−シチジンＴＰ、２’フルオロ−Ｎ４−アセチル−シチジンＴＰ、２’−Ｏ−メチル−Ｎ４−アセチル−シチジンＴＰ、２’Ｏ−メチル−Ｎ４−Ｂｚ−シチジンＴＰ、２’−ａ−エチニルシチジンＴＰ、２’−ａ−トリフルオロメチルシチジンＴＰ、２’−ｂ−エチニルシチジンＴＰ、２’−ｂ−トリフルオロメチルシチジンＴＰ、２’−デオキシ−２’，２’−ジフルオロシチジンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ａ−メルカプトシチジンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ａ−チオメトキシシチジンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ｂ−アミノシチジンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ｂ−アジドシチジンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ｂ−ブロモシチジンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ｂ−クロロシチジンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ｂ−フルオロシチジンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ｂ−ヨードシチジンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ｂ−メルカプトシチジンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ｂ−チオメトキシシチジンＴＰ、２’−Ｏ−メチル−５−（１−プロピニル）シチジンＴＰ、３’−エチニルシチジンＴＰ、４’−アジドシチジンＴＰ、４’−炭素環式シチジンＴＰ、４’−エチニルシチジンＴＰ、５−（１−プロピニル）アラ−シチジンＴＰ、５−（２−クロロ−フェニル）−２−チオシチジンＴＰ、５−（４−アミノ−フェニル）−２−チオシチジンＴＰ、５−アミノアリル−ＣＴＰ、５−シアノシチジンＴＰ、５−エチニルアラ（Ｅｔｈｙｎｙｌａｒａ）−シチジンＴＰ、５−エチニルシチジンＴＰ、５’−ホモ−シチジンＴＰ、５−メトキシシチジンＴＰ、５−トリフルオロメチル−シチジンＴＰ、Ｎ４−アミノ−シチジンＴＰ、Ｎ４−ベンゾイル−シチジンＴＰ、シュードイソシチジン、７−メチルグアノシン、Ｎ２，２’−Ｏ−ジメチルグアノシン、Ｎ２−メチルグアノシン、ワイオシン、１，２’−Ｏ−ジメチルグアノシン、１−メチルグアノシン、２’−Ｏ−メチルグアノシン、２’−Ｏ−リボシルグアノシン（ホスフェート）、２’−Ｏ−メチルグアノシン、２’−Ｏ−リボシルグアノシン（ホスフェート）、７−アミノメチル−７−デアザグアノシン、７−シアノ−７−デアザグアノシン、アルカエオシン、メチルワイオシン、Ｎ２，７−ジメチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２，２’−Ｏ−トリメチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２，７−トリメチルグアノシン、Ｎ２，��２−ジメチルグアノシン、Ｎ２，７，２’−Ｏ−トリメチルグアノシン、６−チオ−グアノシン、７−デアザ−グアノシン、８−オキソ−グアノシン、Ｎ１−メチル−グアノシン、α−チオ−グアノシン、２（プロピル）グアニン、２−（アルキル）グアニン、２’−アミノ−２’−デオキシ−ＧＴＰ、２’−アジド−２’−デオキシ−ＧＴＰ、２’−デオキシ−２’−ａ−アミノグアノシンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ａ−アジドグアノシンＴＰ、６（メチル）グアニン、６−（アルキル）グアニン、６−（メチル）グアニン、６−メチル−グアノシン、７（アルキル）グアニン、７（デアザ）グアニン、７（メチル）グアニン、７−（アルキル）グアニン、７−（デアザ）グアニン、７−（メチル）グアニン、８（アルキル）グアニン、８（アルキニル）グアニン、８（ハロ）グアニン、８（チオアルキル）グアニン、８−（アルケニル）グアニン、８−（アルキル）グアニン、８−（アルキニル）グアニン、８−（アミノ）グアニン、８−（ハロ）グアニン、８−（ヒドロキシル）グアニン、８−（チオアルキル）グアニン、８−（チオール）グアニン、アザグアニン、デアザグアニン、Ｎ（メチル）グアニン、Ｎ−（メチル）グアニン、１−メチル−６−チオ−グアノシン、６−メトキシ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−８−アザ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−グアノシン、６−チオ−７−メチル−グアノシン、７−デアザ−８−アザ−グアノシン、７−メチル−８−オキソ−グアノシン、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−６−チオ−グアノシン、Ｎ２−メチル−６−チオ−グアノシン、１−Ｍｅ−ＧＴＰ、２’フルオロ−Ｎ２−イソブチル−グアノシンＴＰ、２’Ｏ−メチル−Ｎ２−イソブチル−グアノシンＴＰ、２’−ａ−エチニルグアノシンＴＰ、２’−ａ−トリフルオロメチルグアノシンＴＰ、２’−ｂ−エチニルグアノシンＴＰ、２’−ｂ−トリフルオロメチルグアノシンＴＰ、２’−デオキシ−２’，２’−ジフルオログアノシンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ａ−メルカプトグアノシンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ａ−チオメトキシグアノシンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ｂ−アミノグアノシンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ｂ−アジドグアノシンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ｂ−ブロモグアノシンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ｂ−クロログアノシンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ｂ−フルオログアノシンＴＰ、２’−デオキシ−２’
−ｂ−ヨードグアノシンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ｂ−メルカプトグアノシンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ｂ−チオメトキシグアノシンＴＰ、４’−アジドグアノシンＴＰ、４’−炭素環式グアノシンＴＰ、４’−エチニルグアノシンＴＰ、５’−ホモ−グアノシンＴＰ、８−ブロモ−グアノシンＴＰ、９−デアザグアノシンＴＰ、Ｎ２−イソブチル−グアノシンＴＰ、１−メチルイノシン、イノシン、１，２’−Ｏ−ジメチルイノシン、２’−Ｏ−メチルイノシン、７−メチルイノシン、２’−Ｏ−メチルイノシン、エポキシキューオシン、ガラクトシル−キューオシン、マンノシルキューオシン、キューオシン、アリアミノ（ａｌｌｙアミノ）−チミジン、アザチミジン、デアザチミジン、デオキシ−チミジン、２’−Ｏ−メチルウリジン、２−チオウリジン、３−メチルウリジン、５−カルボキシメチルウリジン、５−ヒドロキシウリジン、５−メチルウリジン、５−タウリノメチル−２−チオウリジン、５−タウリノメチルウリジン、ジヒドロウリジン、シュードウリジン、（３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン、１−メチル−３−（３−アミノ−５−カルボキシプロピル）シュードウリジン、１−メチルシュードウリジン、１−エチル−シュードウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルシュードウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジン、２−チオ−２’−Ｏ−メチルウリジン、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン、３，２’−Ｏ−ジメチルウリジン、３−メチル−シュード−ウリジンＴＰ、４−チオウリジン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジンメチルエステル、５，２’−Ｏ−ジメチルウリジン、５，６−ジヒドロ−ウリジン、５−アミノメチル−２−チオウリジン、５−カルバモイルメチル−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−カルバモイルメチルウリジン、５−カルボキシヒドロキシメチルウリジン、５−カルボキシヒドロキシメチルウリジンメチルエステル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン、５−カルバモイルメチルウリジンＴＰ、５−メトキシカルボニルメチル−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウリジン、５−メトキシカルボニルメチルウリジン、５−メチルウリジン、）、５−メトキシウリジン、５−メチル−２−チオウリジン、５−メチルアミノメチル−２−セレノウリジン、５−メチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−メチルアミノメチルウリジン、５−メチルジヒドロウリジン、５−オキシ酢酸−ウリジンＴＰ、５−オキシ酢酸−メチルエステル−ウリジンＴＰ、Ｎ１−メチル−シュード−ウラシル、Ｎ１−エチル−シュード−ウラシル、ウリジン５−オキシ酢酸、ウリジン５−オキシ酢酸メチルエステル、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）−ウリジンＴＰ、５−（イソ−ペンテニルアミノメチル）−２−チオウリジンＴＰ、５−（イソ−ペンテニルアミノメチル）−２’−Ｏ−メチルウリジンＴＰ、５−（イソ−ペンテニルアミノメチル）ウリジンＴＰ、５−プロピニルウラシル、α−チオ−ウリジン、１（アミノアルキルアミノ−カルボニルエチレニル）−２（チオ）−シュードウラシル、１（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）−２，４−（ジチオ）シュードウラシル、１（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）−４（チオ）シュードウラシル、１（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）−シュードウラシル、１（アミノカルボニルエチレニル）−２（チオ）−シュードウラシル、１（アミノカルボニルエチレニル）−２，４−（ジチオ）シュードウラシル、１（アミノカルボニルエチレニル）−４（チオ）シュードウラシル、１（アミノカルボニルエチレニル）−シュードウラシル、１置換２（チオ）−シュードウラシル、１置換２，４−（ジチオ）シュードウラシル、１置換４（チオ）シュードウラシル、１置換シュードウラシル、１−（アミノアルキルアミノ−カルボニルエチレニル）−２−（チオ）−シュードウラシル、１−メチル−３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）シュードウリジンＴＰ、１−メチル−３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）シュード−ＵＴＰ、１−メチル−シュード−ＵＴＰ、１−エチル−シュード−ＵＴＰ、２（チオ）シュードウラシル、２’デオキシウリジン、２’フルオロウリジン、２−（チオ）ウラシル、２，４−（ジチオ）シュードウラシル、２’メチル、２’アミノ、２’アジド、２’フルロ−グアノシン、２’−アミノ−２’−デオキシ−ＵＴＰ、２’−アジド−２’−デオキシ−ＵＴＰ、２’−アジド−デオキシウリジンＴＰ、２’−Ｏ−メチルシュードウリジン、２’デオキシウリジン、２’フルオロウリジン、２’−デオキシ−２’−ａ−アミノウリジンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ａ−アジドウリジンＴＰ、２−メチルシュードウリジン、３（３アミノ−３カルボキシプロピル）ウラシル、４（チオ）シュードウラシル、４−（チオ）シュードウラシル、４−（チオ）ウラシル、４−チオウラシル、５（１，３−ジアゾール−１−アルキル）ウラシル、５（２−アミノプロピル）ウラシル、５（アミノアルキル）ウラシル、５（ジメチルアミノアルキル）ウラシル、５（グアニジニウムアルキル）ウラシル、５（メトキシカルボニルメチル）−２−（チオ）ウラシル、５（メトキシカルボニル−メチル）ウラシル、５（メチル）２（チオ）ウラシル、５（メチル）２，４（ジチオ）ウラシル、５（メチル）４（チオ）ウラシル、５（メチルアミノメチル）−２（チオ）ウラシル、５（メチルアミノメチル）−２，４（ジチオ）ウラシル、５（メチルアミノメチル）−４（チオ）ウラシル、５（プロピニル）ウラシル、５（トリフルオロメチル）ウラシル、５−（２−アミノプロピル）ウラシル、５−（アルキル）−２−（チオ）シュードウラシル、５−（アルキル）−２，４（ジチオ）シュードウラシル、５−（アルキル）−４（チオ）シュードウラシル、５−（アルキル）シュードウラシル、５−（アルキル）ウラシル、５−（アルキニル）ウラシル、５−（アリルアミノ）ウラシル、５−（シアノアルキル）ウラシル、５−（ジアルキルアミノアルキル）ウラシル、５−（ジメチルアミノアルキル���ウラシル、５−（グアニジニウムアルキル）ウラシル、５−（ハロ）ウラシル、５−（１，３−ジアゾール−１−アルキル）ウラシル、５−（メトキシ）ウラシル、５−（メトキシカルボニルメチル）−２−（チオ）ウラシル、５−（メトキシカルボニル−メチル）ウラシル、５−（メチル）２（チオ）ウラシル、５−（メチル）２，４（ジチオ）ウラシル、５−（メチル）４（チオ）ウラシル、５−（メチル）−２−（チオ）シュードウラシル、５−（メチル）−２，４（ジチオ）シュードウラシル、５−（メチル）−４（チオ）シュードウラシル、５−（メチル）シュードウラシル、５−（メチルアミノメチル）−２（チオ）ウラシル、５−（メチルアミノメチル）−２，４（ジチオ）ウラシル、５−（メチルアミノメチル）−４−（チオ）ウラシル、５−（プロピニル）ウラシル、５−（トリフルオロメチル）ウラシル、５−アミノアリル−ウリジン、５−ブロモ−ウリジン、５−ヨード−ウリジン、５−ウラシル、６（アゾ）ウラシル、６−（アゾ）ウラシル、６−アザ−ウリジン、アリアミノ（ａｌｌｙアミノ）−ウラシル、アザウラシル、デアザウラシル、Ｎ３（メチル）ウラシル、シュード−ＵＴＰ−１−２−エタン酸、シュードウラシル、４−チオ−シュード−ＵＴＰ、１−カルボキシメチル−シュードウリジン、１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、１−プロピニル−ウリジン、１−タウリノメチル−１−メチル−ウリジン、１−タウリノメチル−４−チオ−ウリジン、１−タウリノメチル−シュードウリジン、２−メトキシ−４−チオ−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−シュードウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオ−ジヒドロシュードウリジン、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−シュードウリジン、４−メトキシ−２−チオ−シュードウリジン、４−メトキシ−シュードウリジン、４−チオ−１−メチル−シュードウリジン、４−チオ−シュードウリジン、５−アザ−ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、（±）１−（２−ヒドロキシプロピル）シュードウリジンＴＰ、（２Ｒ）−１−（２−ヒドロキシプロピル）シュードウリジンＴＰ、（２Ｓ）−１−（２−ヒドロキシプロピル）シュードウリジンＴＰ、（Ｅ）−５−（２−ブロモ−ビニル）アラ−ウリジンＴＰ、（Ｅ）−５−（２−ブロモ−ビニル）ウリジンＴＰ、（Ｚ）−５−（２−ブロモ−ビニル）アラ−ウリジンＴＰ、（Ｚ）−５−（２−ブロモ−ビニル）ウリジンＴＰ、１−（２，２，２−トリフルオロエチル）−シュード−ＵＴＰ、１−（２，２，３，３，３−ペンタフルオロプロピル）シュードウリジンＴＰ、１−（２，２−ジエトキシエチル）シュードウリジンＴＰ、１−（２，４，６−トリメチルベンジル）シュードウリジンＴＰ、１−（２，４，６−トリメチル−ベンジル）シュード−ＵＴＰ、１−（２，４，６−トリメチル−フェニル）シュード−ＵＴＰ、１−（２−アミノ−２−カルボキシエチル）シュード−ＵＴＰ、１−（２−アミノ−エチル）シュード−ＵＴＰ、１−（２−ヒドロキシエチル）シュードウリジンＴＰ、１−（２−メトキシエチル）シュードウリジンＴＰ、１−（３，４−ビス−トリフルオロメトキシベ��ジル）シュードウリジンＴＰ、１−（３，４−ジメトキシベンジル）シュードウリジンＴＰ、１−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）シュード−ＵＴＰ、１−（３−アミノ−プロピル）シュード−ＵＴＰ、１−（３−シクロプロピル−プロパ−２−イニル）シュードウリジンＴＰ、１−（４−アミノ−４−カルボキシブチル）シュード−ＵＴＰ、１−（４−アミノ−ベンジル）シュード−ＵＴＰ、１−（４−アミノ−ブチル）シュード−ＵＴＰ、１−（４−アミノ−フェニル）シュード−ＵＴＰ、１−（４−アジドベンジル）シュードウリジンＴＰ、１−（４−ブロモベンジル）シュードウリジンＴＰ、１−（４−クロロベンジル）シュードウリジンＴＰ、１−（４−フルオロベンジル）シュードウリジンＴＰ、１−（４−ヨードベンジル）シュードウリジンＴＰ、１−（４−メタンスルホニルベンジル）シュードウリジンＴＰ、１−（４−メトキシベンジル）シュードウリジンＴＰ、１−（４−メトキシ−ベンジル）シュード−ＵＴＰ、１−（４−メトキシ−フェニル）シュード−ＵＴＰ、１−（４−メチルベンジル）シュードウリジンＴＰ、１−（４−メチル−ベンジル）シュード−ＵＴＰ、１−（４−ニトロベンジル）シュードウリジンＴＰ、１−（４−ニトロ−ベンジル）シュード−ＵＴＰ、１（４−ニトロ−フェニル）シュード−ＵＴＰ、１−（４−チオメトキシベンジル）シュードウリジンＴＰ、１−（４−トリフルオロメトキシベンジル）シュードウリジンＴＰ、１−（４−トリフルオロメチルベンジル）シュードウリジンＴＰ、１−（５−アミノ−ペンチル）シュード−ＵＴＰ、１−（６−アミノ−ヘキシル）シュード−ＵＴＰ、１，６−ジメチル−シュード−ＵＴＰ、１−［３−（２−｛２−［２−（２−アミノエトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−プロピオニル］シュードウリジンＴＰ、１−｛３−［２−（２−アミノエトキシ）−エトキシ］−プロピオニル｝シュードウリジンＴＰ、１−アセチルシュードウリジンＴＰ、１−アルキル−６−（１−プロピニル）−シュード−ＵＴＰ、１−アルキル−６−（２−プロピニル）−シュード−ＵＴＰ、１−アルキル−６−アリル−シュード−ＵＴＰ、１−アルキル−６−エチニル−シュード−ＵＴＰ、１−アルキル−６−ホモアリル−シュード−ＵＴＰ、１−アルキル−６−ビニル−シュード−ＵＴＰ、１−アリルシュードウリジンＴＰ、１−アミノメチル−シュード−ＵＴＰ、１−ベン
ゾイルシュードウリジンＴＰ、１−ベンジルオキシメチルシュードウリジンＴＰ、１−ベンジル−シュード−ＵＴＰ、１−ビオチニル−ＰＥＧ２−シュードウリジンＴＰ、１−ビオチニルシュードウリジンＴＰ、１−ブチル−シュード−ＵＴＰ、１−シアノメチルシュードウリジンＴＰ、１−シクロブチルメチル−シュード−ＵＴＰ、１−シクロブチル−シュード−ＵＴＰ、１−シクロヘプチルメチル−シュード−ＵＴＰ、１−シクロヘプチル−シュード−ＵＴＰ、１−シクロヘキシルメチル−シュード−ＵＴＰ、１−シクロヘキシル−シュード−ＵＴＰ、１−シクロオクチルメチル−シュード−ＵＴＰ、１−シクロオクチル−シュード−ＵＴＰ、１−シクロペンチルメチル−シュード−ＵＴＰ、１−シクロペンチル−シュード−ＵＴＰ、１−シクロプロピルメチル−シュード−ＵＴＰ、１−シクロプロピル−シュード−ＵＴＰ、１−エチル−シュード−ＵＴＰ、１−ヘキシル−シュード−ＵＴＰ、１−ホモアリルシュードウリジンＴＰ、１−ヒドロキシメチルシュードウリジンＴＰ、１−イソ−プロピル−シュード−ＵＴＰ、１−Ｍｅ−２−チオ−シュード−ＵＴＰ、１−Ｍｅ−４−チオ−シュード−ＵＴＰ、１−Ｍｅ−アルファ−チオ−シュード−ＵＴＰ、１−メタンスルホニルメチルシュードウリジンＴＰ、１−メトキシメチルシュードウリジンＴＰ、１−メチル−６−（２，２，２−トリフルオロエチル）シュード−ＵＴＰ、１−メチル−６−（４−モルホリノ）−シュード−ＵＴＰ、１−メチル−６−（４−チオモルホリノ）−シュード−ＵＴＰ、１−メチル−６−（置換フェニル）シュード−ＵＴＰ、１−メチル−６−アミノ−シュード−ＵＴＰ、１−メチル−６−アジド−シュード−ＵＴＰ、１−メチル−６−ブロモ−シュード−ＵＴＰ、１−メチル−６−ブチル−シュード−ＵＴＰ、１−メチル−６−クロロ−シュード−ＵＴＰ、１−メチル−６−シアノ−シュード−ＵＴＰ、１−メチル−６−ジメチルアミノ−シュード−ＵＴＰ、１−メチル−６−エトキシ−シュード−ＵＴＰ、１−メチル−６−エチルカルボキシレート−シュード−ＵＴＰ、１−メチル−６−エチル−シュード−ＵＴＰ、１−メチル−６−フルオロ−シュード−ＵＴＰ、１−メチル−６−ホルミル−シュード−ＵＴＰ、１−メチル−６−ヒドロキシアミノ−シュード−ＵＴＰ、１−メチル−６−ヒドロキシ−シュード−ＵＴＰ、１−メチル−６−ヨード−シュード−ＵＴＰ、１−メチル−６−イソ−プロピル−シュード−ＵＴＰ、１−メチル−６−メトキシ−シュード−ＵＴＰ、１−メチル−６−メチルアミノ−シュード−ＵＴＰ、１−メチル−６−フェニル−シュード−ＵＴＰ、１−メチル−６−プロピル−シュード−ＵＴＰ、１−メチル−６−ｔｅｒｔ−ブチル−シュード−ＵＴＰ、１−メチル−６−トリフルオロメトキシ−シュード−ＵＴＰ、１−メチル−６−トリフルオロメチル−シュード−ＵＴＰ、１−モルホリノメチルシュードウリジンＴＰ、１−ペンチル−シュード−ＵＴＰ、１−フェニル−シュード−ＵＴＰ、１−ピバロイルシュードウリジンＴＰ、１−プロパルギルシュードウリジンＴＰ、１−プロピル−シュード−ＵＴＰ、１−プロピニル−シュードウリジン、１−ｐ−トリル−シュード−ＵＴＰ、１−ｔｅｒｔ−ブチル−シュード−ＵＴＰ、１−チオメトキシメチルシュードウリジンＴＰ、１−チオモルホリノメチルシュードウリジンＴＰ、１−トリフルオロアセチルシュードウリジンＴＰ、１−トリフルオロメチル−シュード−ＵＴＰ、１−ビニルシュードウリジンＴＰ、２，２’−アンヒドロ−ウリジンＴＰ、２’−ブロモ−デオキシウリジンＴＰ、２’−Ｆ−５−メチル−２’−デオキシ−ＵＴＰ、２’−ＯＭｅ−５−Ｍｅ−ＵＴＰ、２’−ＯＭｅ−シュード−ＵＴＰ、２’−ａ−エチニルウリジンＴＰ、２’−ａ−トリフルオロメチルウリジンＴＰ、２’−ｂ−エチニルウリジンＴＰ、２’−ｂ−トリフルオロメチルウリジンＴＰ、２’−デオキシ−２’，２’−ジフルオロウリジンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ａ−メルカプトウリジンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ａ−チオメトキシウリジンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ｂ−アミノウリジンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ｂ−アジドウリジンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ｂ−ブロモウリジンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ｂ−クロロウリジンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ｂ−フルオロウリジンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ｂ−ヨードウリジンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ｂ−メルカプトウリジンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ｂ−チオメトキシウリジンＴＰ、２−メトキシ−４−チオ−ウリジン、２−メトキシウリジン、２’−Ｏ−メチル−５−（１−プロピニル）ウリジンＴＰ、３−アルキル−シュード−ＵＴＰ、４’−アジドウリジンＴＰ、４’−炭素環式ウリジンＴＰ、４’−エチニルウリジンＴＰ、５−（１−プロピニル）アラ−ウリジンＴＰ、５−（２−フラニル）ウリジンＴＰ、５−シアノウリジンＴＰ、５−ジメチルアミノウリジンＴＰ、５’−ホモ−ウリジンＴＰ、５−ヨード−２’−フルオロ−デオキシウリジンＴＰ、５−フェニルエチニルウリジンＴＰ、５−トリジュウテロメチル−６−ジュウテロウリジンＴＰ、５−トリフルオロメチル−ウリジンＴＰ、５−ビニルアラウリジンＴＰ、６−（２，２，２−トリフルオロエチル）−シュード−ＵＴＰ、６−（４−モルホリノ）−シュード−ＵＴＰ、６−（４−チオモルホリノ）−シュード−ＵＴＰ、６−（置換−フェニル）−シュード−ＵＴＰ、６−アミノ−シュード−ＵＴＰ、６−アジド−シュード−ＵＴＰ、６−ブロモ−シュード−ＵＴＰ、６−ブチル−シュード−ＵＴＰ、６−クロロ−シュード−ＵＴＰ、６−シアノ−シュード−ＵＴＰ、６−ジメチルアミノ−シュード−ＵＴＰ、６−エトキシ−シュード−ＵＴＰ、６−エチルカルボキシレート−シュード−ＵＴＰ、６−エチル−シュード−ＵＴＰ、６−フルオロ−シュード−ＵＴＰ、６−ホルミル−シュード−ＵＴＰ、６−ヒドロキシアミノ−シュード−ＵＴＰ、６−ヒドロキシ−シュード−ＵＴＰ、６−ヨード−シュード−ＵＴＰ、６−イソ−プロピル−シュード−ＵＴＰ、６−メトキシ−シュード−ＵＴＰ、６−メチルアミノ−シュード−ＵＴＰ、６−メチル−シュード−ＵＴＰ、６−フェニル−シュード−ＵＴＰ、６−フェニル−シュード−ＵＴＰ、６−プロピル−シュード−ＵＴＰ、６−ｔｅｒｔ−ブチル−シュード−ＵＴＰ、６−トリフルオロメトキシ−シュード−ＵＴＰ、６−トリフルオロメチル−シュード−ＵＴＰ、アルファ−チオ−シュード−ＵＴＰ、シュードウリジン１−（４−メチルベンゼンスルホン酸）ＴＰ、シュードウリジン１−（４−メチル安息香酸）ＴＰ、シュードウリジンＴＰ１−［３−（２−エトキシ）］プロピオン酸、シュードウリジンＴＰ１−［３−｛２−（２−［２−（２−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ）−エトキシ｝］プロピオン酸、シュードウリジンＴＰ１−［３−｛２−（２−［２−｛２（２−エトキシ）−エトキシ｝−エトキシ］−エトキシ）−エトキシ｝］プロピオン酸、シュードウリジンＴＰ１−［３−｛２−（２−［２−エトキシ］−エトキシ）−エトキシ｝］プロピオン酸、シュードウリジンＴＰ１−［３−｛２−（２−エトキシ）−エトキシ｝］プロピオン酸、シュードウリジンＴＰ１−メチルホスホン酸、シュードウリジンＴＰ１−メチルホスホン酸ジエチルエステル、シュード−ＵＴＰ−Ｎ１−３−プロピオン酸、シュード−ＵＴＰ−Ｎ１−４−ブタン酸、シュード−ＵＴＰ−Ｎ１−５−ペンタン酸、シュード−ＵＴＰ−Ｎ１−６−ヘキサン酸、シュード−ＵＴＰ−Ｎ１−７−ヘプタン酸、シュード−ＵＴＰ−Ｎ１−メチル−ｐ−安息香酸、シュード−ＵＴＰ−Ｎ１−ｐ−安息香酸、ワイブトシン、ヒドロキシワイブトシン、イソワイオシン、ペルオキシワイブトシン、中間体ヒドロキシワイブトシン、４−デメチルワイオシン、２，６−（ジアミノ）プリン、１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１−イル：１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェンチアジン（ｐｈｅｎｔｈｉａｚｉｎ）−１−イル、１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル、１，３，５−（トリアザ）−２，６−（ジオキサ）−ナフタレン、２（アミノ）プリン、２，４，５−（トリメチル）フェニル、２’メチル、２’アミノ、２’アジド、２’フルロ−シチジン、２’メチル、２’アミノ、２’アジド、２’フルロ−アデニン、２’メチル、２’アミノ、２’アジド、２’フルロ−ウリジン、２’−アミノ−２’−デオキシリボース、２−アミノ−６−クロロ−プリン、２−アザ−イノシニル、２’−アジド−２’−デオキシリボース、２’フルオロ−２’−デオキシリボース、２’−フルオロ−修飾塩基、２’−Ｏ−メチル−リボース、２−オキソ−７−アミノピリドピリミジン−３−イル、２−オキソ−ピリドピリミジン−３−イル、２−ピリジノン、３ニトロピロール、３−（メチル）−７−（プロピニル）イソカルボスチリル、３−（メチル）イソカルボスチリル、４−（フルオロ）−６−（メチル）ベンゾイミダゾール、４−（メチル）ベンゾイミダゾール、４−（メチル）インドリル、４，６−（ジメチル）インドリル、５ニトロインドール、５置換ピリミジン、５−（メチル）イソカルボスチリル、５−ニトロインドール、６−（アザ）ピリミジン、６−（アゾ）チミン、６−（メチル）−７−（アザ）インドリル、６−クロロ−プリン、６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェンチアジン（ｐｈｅｎｔｈｉａｚｉｎ）−１−イル、７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１−イル、７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル、７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェンチアジン（ｐｈｅｎｔｈｉａｚｉｎ）−１−イル、７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル、７−（アザ）インドリル、７−（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジニル（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｌ）−イル、７−（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェンチアジン（ｐｈｅｎｔｈｉａｚｉｎ）−１−イル、７−（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１−イル、７−（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル、７−（グアニジニウムアルキル−ヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェンチアジン（ｐｈｅｎｔｈｉａｚｉｎ）−１−イル、７−（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル、７−（プロピニル）イソカルボスチリル、７−（プロピニル）イソカルボスチリル、プロピニル−７−（アザ）インドリル、７−デアザ−イノシニル、７−置換１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１−イル、７−置換１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル、９−（メチル）−イミジゾピリジニル、アミノインドリル、アントラセニル、ビス−オルト−（アミノアルキルヒドロキシ）−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、ビス−オルト−置換−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、ジフルオロトリル、ヒポキサンチン、イミジゾピリジニル、イノシニル、イソカルボスチリル、イソグアニシン（Ｉｓｏｇｕａｎｉｓｉｎｅ）、Ｎ２−置換プリン、Ｎ６−メチル−２−アミノ−プリン、Ｎ６−置換プリン、Ｎ−アルキル化誘導体、ナフタレニル、ニトロベンゾイミダゾリル、ニトロイミダゾリル、ニトロインダゾリル、ニトロピラゾリル、ヌブラリン（Ｎｕｂｕｌａｒｉｎｅ）、Ｏ６−置換プリン、Ｏ−アルキル化誘導体、オルト−（アミノアルキルヒドロキシ）−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−
オン−３−イル、オルト−置換−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、オキソホルマイシンＴＰ、パラ−（アミノアルキルヒドロキシ）−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、パラ−置換−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、ペンタセニル、フェナントラセニル（Ｐｈｅｎａｎｔｈｒａｃｅｎｙｌ）、フェニル、プロピニル−７−（アザ）インドリル、ピレニル、ピリドピリミジン−３−イル、ピリドピリミジン−３−イル、２−オキソ−７−アミノ−ピリドピリミジン−３−イル、ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、ピロロピリミジニル、ピロロピリジニル、スチルベンジル（Ｓｔｉｌｂｅｎｚｙｌ）、置換１，２，４−トリアゾール、テトラセニル、ツベルシジン（Ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎｅ）、キサンチン、キサントシン−５’−ＴＰ、２−チオ−ゼブラリン、５−アザ−２−チオ−ゼブラリン、７−デアザ−２−アミノ−プリン、ピリジン−４−オンリボヌクレオシド、２−アミノ−リボシド−ＴＰ、ホルマイシンＡ  ＴＰ、ホルマイシンＢ  ＴＰ、ピロロシン（Ｐｙｒｒｏｌｏｓｉｎｅ）ＴＰ、２’−ＯＨ−アラ−アデノシンＴＰ、２’−ＯＨ−アラ−シチジンＴＰ、２’−ＯＨ−アラ−ウリジンＴＰ、２’−ＯＨ−アラ−グアノシンＴＰ、５−（２−カルボメトキシビニル）ウリジンＴＰ、及びＮ６−（１９−アミノ−ペンタオキサノナデシル）アデノシンＴＰ。
【０２７５】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、前述の修飾核酸塩基の少なくとも２つ（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれを超える数）の組み合わせを含む。
【０２７６】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、少なくとも１つの化学修飾ヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの化学修飾ヌクレオシドは、シュ−ドウリジン（ψ）、２−チオウリジン（ｓ２Ｕ）、４’−チオウリジン、５−メチルシトシン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュ−ドウリジン、２−チオ−１−メチル−シュ−ドウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオ−ジヒドロシュ−ドウリジン、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−シュ−ドウリジン、４−メトキシ−２−チオ−シュ−ドウリジン、４−メトキシ−シュ−ドウリジン、４−チオ−１−メチル−シュ−ドウリジン、４−チオ−シュ−ドウリジン、５−アザ−ウリジン、ジヒドロシュ−ドウリジン、５−メチルウリジン、５−メトキシウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジン、１−メチル−シュ−ドウリジン（ｍ１ψ）、１−エチル−シュ−ドウリジン（ｅ１ψ）、５−メトキシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）、α−チオ−グアノシン、α−チオ−アデノシン、５−シアノウリジン、４’−チオウリジン７−デアザ−アデニン、１−メチル−アデノシン（ｍ１Ａ）、２−メチル−アデニン（ｍ２Ａ）、Ｎ６−メチル−アデノシン（ｍ６Ａ）、及び２，６−ジアミノプリン，（Ｉ）、１−メチル−イノシン（ｍ１Ｉ）、ワイオシン（ｉｍＧ）、メチルワイオシン（ｍｉｍＧ）、７−デアザ−グアノシン、７−シアノ−７−デアザ−グアノシン（ｐｒｅＱ０）、７−アミノメチル−７−デアザ−グアノシン（ｐｒｅＱ１）、７−メチル−グアノシン（ｍ７Ｇ）、１−メチル−グアノシン（ｍ１Ｇ）、８−オキソ−グアノシン、７−メチル−８−オキソ−グアノシン、２，８−ジメチルアデノシン、２−ゲラニルチオウリジン、２−ライシジン、２−セレノウリジン、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）−５，６−ジヒドロウリジン、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）シュ−ドウリジン、３−メチルシュ−ドウリジン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）−２’−Ｏ−メチルウリジンメチルエステル、５−アミノメチル−２−ゲラニルチオウリジン、５−アミノメチル−２−セレノウリジン、５−アミノメチルウリジン、５−カルバモイルヒドロキシメチルウリジン、５−カルバモイルメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−ゲラニルチオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−セレノウリジン、５−シアノメチルウリジン、５−ヒドロキシシチジン、５−メチルアミノメチル−２−ゲラニルチオウリジン、７−アミノカルボキシプロピル−デメチルワイオシン、７−アミノカルボキシプロピルワイオシン、７−アミノカルボキシプロピルワイオシンメチルエステル、８−メチルアデノシン、Ｎ４，Ｎ４−ジメチルシチジン、Ｎ６−ホルミルアデノシン、Ｎ６−ヒドロキシメチルアデノシン、アグマチジン、環式Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン、グルタミル−キュ−オシン、メチル化中間体ヒドロキシワイブトシン、Ｎ４，Ｎ４，２’−Ｏ−トリメチルシチジン、ゲラニル化５−メチルアミノメチル−２−チオウリジン、ゲラニル化５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオ��リジン、Ｑ塩基、ｐｒｅＱ０塩基、ｐｒｅＱ１塩基、ならびにそれらの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの化学的に修飾されたヌクレオシドは、シュードウリジン、１−メチル−シュードウリジン、１−エチル−シュードウリジン、５−メチルシトシン、５−メトキシウリジン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、前述の修飾核酸塩基の少なくとも２つ（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれを超える数）の組み合わせを含む。
【０２７７】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、１つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードするＯＲＦを含むウラシル修飾配列であり、ここで、ｍＲＮＡは、化学的に修飾された核酸塩基、例えば、５−メトキシウラシルを含む。本発明のある特定の態様では、ポリヌクレオチドの場合と同様に、５−メトキシウラシル塩基がリボース糖に接続されている場合、結果として得られる修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドは、５−メトキシウリジンと称される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド中のウラシルは、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または約１００％が５−メトキシウラシルである。１つの実施形態では、ポリヌクレオチド中のウラシルは、少なくとも９５％が５−メトキシウラシルである。別の実施形態では、ポリヌクレオチド中のウラシルは、１００％が５−メトキシウラシルである。
【０２７８】
ポリヌクレオチド中のウラシルの少なくとも９５％が５−メトキシウラシルである実施形態では、全体的なウラシル含量は、ｍＲＮＡが好適なタンパク質発現レベルを提供しつつも、免疫応答をほとんどまたは全く誘発しないように調節することができる。いくつかの実施形態では、ＯＲＦのウラシル含量は、対応する野生型ＯＲＦ中の理論的最小ウラシル含量（％Ｕｔｍ）の約１０５％〜約１４５％、約１０５％〜約１４０％、約１１０％〜約１４０％、約１１０％〜約１４５％、約１１５％〜約１３５％、約１０５％〜約１３５％、約１１０％〜約１３５％、約１１５％〜約１４５％、または約１１５％〜約１４０％である。他の実施形態では、ＯＲＦのウラシル含量は、％ＵＴＭの約１１７％〜約１３４％または１１８％〜１３２％である。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードするＯＲＦのウラシル含量は、％Ｕｔｍの約１１５％、約１２０％、約１２５％、約１３０％、約１３５％、約１４０％、約１４５％、または約１５０％である。この文脈において、「ウラシル」という用語は、５−メトキシウラシル及び／または天然ウラシルを指し得る。
【０２７９】
いくつかの実施形態では、本発明の１つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦ中のウラシル含量は、ＯＲＦ中の総核酸塩基含量の約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満、約１５％未満、または約１２％未満である。いくつかの実施形態では、ＯＲＦ中のウラシル含量は、ＯＲＦの総核酸塩基含量の約１２％〜約２５％である。他の実施形態では、ＯＲＦ中のウラシル含量は、ＯＲＦの総核酸塩基含量の約１５％〜約１７％である。１つの実施形態では、１つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦ中のウラシル含量は、オープンリーディングフレーム中の総核酸塩基含量の約２０％未満である。この文脈において、「ウラシル」という用語は、５−メトキシウラシル及び／または天然ウラシルを指し得る。
【０２８０】
さらなる実施形態では、本発明の１つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦは、５−メトキシウラシルを含み、１つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードする対応する野生型ヌクレオチド配列よりもウラシルペア（ＵＵ）及び／またはウラシルトリプレット（ＵＵＵ）及び／またはウラシルクワドラプレット（ＵＵＵＵ）を少ない量で含有する調節されたウラシル含量を有する。いくつかの実施形態では、本発明の１つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦは、ウラシルペア及び／またはウラシルトリプレット及び／またはウラシルクワドラプレットを全く含有しない。いくつかの実施形態では、ウラシルペア及び／またはウラシルトリプレット及び／またはウラシルクワドラプレットは、ある特定の閾値未満、例えば、１つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦ中における出現数が、１以下、２以下、３以下、４以下、５以下、６以下、７以下、８以下、９以下、１０以下、１１以下、１２以下、１３以下、１４以下、１５以下、１６以下、１７以下、１８以下、１９以下、または２０以下に低減される。具体的な実施形態では、本発明の１つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦは、２０未満、１９未満、１８未満、１７未満、１６未満、１５未満、１４未満、１３未満、１２未満、１１未満、１０未満、９未満、８未満、７未満、６未満、５未満、４未満、３未満、２未満もしくは１未満の非フェニルアラニンウラシルペア及び／またはトリプレットを含有する。別の実施形態では、１つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦは、非フェニルアラニンウラシルペア及び／またはトリプレットを全く含有しない。
【０２８１】
さらなる実施形態では、本発明の１つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦは、５−メトキシウラシルを含み、１つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードする対応する野生型ヌクレオチド配列よりもウラシルリッチクラスタを少ない量で含有する調節されたウラシル含量を有する。いくつかの実施形態では、本発明の１つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦは、１つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードする対応する野生型ヌクレオチド配列中の対応するウラシルリッチクラスタの長さよりも短いウラシルリッチクラスタを含有する。
【０２８２】
さらなる実施形態では、低頻度の代替コドンが用いられる。１つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードする５−メトキシウラシルを含むｍＲＮＡのＯＲＦ中のコドンの少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％は、同義コドンセット中の置換コドンのコドン頻度よりもコドン頻度が低い代替コドンでそれぞれ置換される。ＯＲＦはまた、上記のとおり、ウラシル含量が調節されている。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦ中の少なくとも１つのコドンは、同義コドンセット中の置換コドンのコドン頻度よりもコドン頻度が低い代替コドンで置換される。
【０２８３】
いくつかの実施形態では、１つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードする５−メトキシウラシルを含むｍＲＮＡのＯＲＦのウラシル含量を調節すると、哺乳類細胞に投与された場合における、１つまたは複数の癌エピトープポリペプチドの発現レベルが、対応する野生型ｍＲＮＡに由来する１つまたは複数の癌エピトープポリペプチドの発現レベルよりも高くなる。他の実施形態では、哺乳類細胞に投与された場合における、１つまたは複数の癌エピトープポリペプチドの発現レベルは、５−メトキシウラシルを少なくとも９５％含有し、かつウラシル含量が理論的最小値の約１６０％、約１７０％、約１８０％、約１９０％、または約２００％である対応するｍＲＮＡと比較して増加する。さらに他の実施形態では、哺乳類細胞に投与された場合における、１つまたは複数の癌エピトープポリペプチドの発現レベルは、対応するｍＲＮＡと比較して増加し、ここで、ウラシルの少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または約１００％が１−メチルシュードウラシルまたはシュードウラシルである。いくつかの実施形態では、哺乳類細胞は、マウス細胞、ラット細胞、またはウサギ細胞である。他の実施形態では、哺乳類細胞は、サル細胞またはヒト細胞である。いくつかの実施形態では、ヒト細胞は、ＨｅＬａ細胞、ＢＪ線維芽細胞、または末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）である。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の癌エピトープポリペプチドは、ｍＲＮＡがインビボで哺乳類細胞に投与された場合、発現する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、マウス、ウサギ、ラット、サル、またはヒトに投与される。１つの実施形態では、マウスは、ヌルマウスである。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ、または約０．１５ｍｇ／ｋｇの量でマウスに投与される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、静脈内投与または筋肉内投与される。他の実施形態では、１つまたは複数の癌エピトープポリペプチドは、ｍＲＮＡがインビトロで哺乳類細胞に投与された場合、発現する。いくつかの実施形態では、発現は、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約１５００倍、または少なくとも約３０００倍増加する。他の実施形態では、発現は、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％増加する。
【０２８４】
いくつかの実施形態では、１つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードする５−メトキシウラシルを含むｍＲＮＡのＯＲＦは、ウラシル含量を調節すると、安定性の増加を示す。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、同じ条件下における対応する野生型ｍＲＮＡの安定性と比べて、細胞内の安定性の増加を示す。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、ヌクレアーゼ耐性、熱安定性、及び／または二次構造の安定化の向上を含む、安定性の増加を示す。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡが示す安定性の増加は、ｍＲＮＡの半減期（例えば、血漿、細胞、または組織試料中）を決定すること及び／またはｍＲＮＡによる経時的なタンパク質発現の曲線下面積（ＡＵＣ）（例えば、インビトロまたはインビボ）を決定することによって測定される。ｍＲＮＡは、その半減期及び／またはＡＵＣが、同じ条件下における対応する野生型ｍＲＮＡの半減期及び／またはＡＵＣを超える場合、安定性が増加したと特定される。
【０２８５】
いくつかの実施形態では、本発明のｍＲＮＡは、同じ条件下における対応する野生型ｍＲＮＡによって誘導される免疫応答と比較して、検出可能に低い免疫応答（例えば、自然免疫または獲得免疫）を誘導する。他の実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、１つもしくは複数の癌エピトープポリペプチドをコードするが、５−メトキシウラシルを含まないｍＲＮＡによって同じ条件下で誘導される免疫応答と比較して、または１つもしくは複数の癌エピトープポリペプチドをコードし、５−メトキシウラシルを含むが、ウラシル含量が調節されていないｍＲＮＡによって同じ条件下で誘導される免疫応答と比較して、検出可能に低い免疫応答（例えば、自然免疫または獲得免疫）を誘導する。自然免疫応答は、炎症促進性サイトカインの発現増加、細胞内ＰＲＲ（ＲＩＧ−Ｉ、ＭＤＡ５など）の活性化、細胞死、及び／またはタンパク質翻訳の停止もしくは減少によって顕在化され得る。いくつかの実施形態では、自然免疫応答の低下は、本発明のｍＲＮＡを細胞に１回以上投与した後における、１型インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−κ、ＩＦＮ−δ、ＩＦＮ−ε、ＩＦＮ−τ、ＩＦＮ−ω、及びＩＦＮ−ζ）の発現もしくは活性レベル、またはｔｏｌｌ様受容体（例えば、ＴＬＲ７及びＴＬＲ８）などのインターフェロン調節遺伝子の発現によって、及び／または細胞死の減少によって、測定することができる。
【０２８６】
いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡに応答した哺乳類細胞による１型インターフェロンの発現は、対応する野生型ｍＲＮＡ、１つもしくは複数の癌エピトープポリペプチドをコードするが、５−メトキシウラシルを含まないｍＲＮＡ、または１つもしくは複数の癌エピトープポリペプチドをコードし、５−メトキシウラシルを含むが、ウラシル含量が調節されていないｍＲＮＡと比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、９９．９％、または９９．９％を超えて低下する。いくつかの実施形態では、インターフェロンは、ＩＦＮ−βである。いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡの哺乳類細胞への投与によってもたらされる細胞死の頻度は、対応する野生型ｍＲＮＡ、１つもしくは複数の癌エピトープポリペプチドをコードするが、５−メトキシウラシルを含まないｍＲＮＡ、または１つもしくは複数の癌エピトープポリペプチドをコードし、５−メトキシウラシルを含むが、ウラシル含量が調節されていないｍＲＮＡで観察される細胞死の頻度よりも１０％、２５％、５０％、７５％、８５％、９０％、９５％、または９５％を超えて少ない。いくつかの実施形態では、哺乳類細胞は、ＢＪ線維芽細胞である。他の実施形態では、哺乳類細胞は、脾細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳類細胞は、マウスまたはラットの細胞である。他の実施形態では、哺乳類細胞は、ヒトの細胞である。１つの実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、ｍＲＮＡが導入される哺乳類細胞の自然免疫応答を実質的に誘導しない。
【０２８７】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、１つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードするＯＲＦを含むｍＲＮＡであり、ここで、ｍＲＮＡ中のウラシルは、少なくとも約９５％が５−メトキシウラシルであり、ＯＲＦのウラシル含量は、対応する野生型ＯＲＦ中の理論的最小ウラシル含量の約１１５％〜約１３５％であり、１つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードするＯＲＦ中のウラシル含量は、ＯＲＦ中の総核酸塩基含量の約２３％未満である。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードするＯＲＦは、対応する野生型ＯＲＦと比較して、ＯＲＦのＧ／Ｃ含量（絶対量または相対量）が少なくとも約４０％減少するようにさらに修飾される。さらに他の実施形態では、１つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードするＯＲＦは、２０未満の非フェニルアラニンウラシルペア及び／またはトリプレットを含有する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦ中の少なくとも１つのコドンは、同義コドンセット中の置換コドンのコドン頻度よりもコドン頻度が低い代替コドンでさらに置換される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ中のウラシルの少なくとも約９５％が５−メトキシウラシルであり、ＯＲＦのウラシル含量が対応する野生型ＯＲＦ中の理論的最小ウラシル含量の約１１５％〜約１３５％である、ＯＲＦを含むｍＲＮＡによってコードされる１つまたは複数の癌エピトープポリペプチドの発現は、対応する野生型ｍＲＮＡ由来の１つまたは複数の癌エピトープポリペプチドの発現と比較したとき、少なくとも約１０倍増加する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、オープンＯＲＦを含み、ここで、ｍＲＮＡ中のウラシルは、少なくとも約９５％が５−メトキシウラシルであり、ＯＲＦのウラシル含量は、対応する野生型ＯＲＦ中の理論的最小ウラシル含量の約１１５％〜約１３５％であり、ｍＲＮＡは、ｍＲＮＡが導入される哺乳類細胞の自然免疫応答を実質的に誘導しない。
【０２８８】
ある特定の実施形態では、化学修飾は、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）中の核酸塩基に存在する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）中の修飾核酸塩基は、１−メチル−シュードウリジン（ｍ１ψ）、１−エチル−シュードウリジン（ｅ１ψ）、５−メトキシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）、シュードウリジン（ψ）、α−チオ−グアノシン及びα−チオ−アデノシンからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、前述の修飾核酸塩基の少なくとも２つ（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれを超える数）の組み合わせを含む。
【０２８９】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、シュードウリジン（ψ）及び５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、１−メチル−シュードウリジン（ｍ１ψ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、１−エチル−シュードウリジン（ｅ１ψ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、１−メチル−シュードウリジン（ｍ１ψ）及び５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、１−エチル−シュードウリジン（ｅ１ψ）及び５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、２−チオウリジン（ｓ２Ｕ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、２−チオウリジン及び５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、メトキシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、５−メトキシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ）及び５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、２’−Ｏ−メチルウリジンを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、２’−Ｏ−メチルウリジン及び５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、Ｎ６−メチル−アデノシン（ｍ６Ａ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、Ｎ６−メチル−アデノシン（ｍ６Ａ）及び５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。
【０２９０】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、特定の修飾を得るように、一様に修飾される（例えば、完全に修飾される、配列全体を通して修飾される）。例えば、ポリヌクレオチドは、５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）で一様に修飾することができ、このことは、ｍＲＮＡ配列におけるシトシン残基のすべてが、５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）と交換されることを意味する。別の例として、ポリヌクレオチドは、１−メチル−シュードウリジンで一様に修飾することができ、このことは、ｍＲＮＡ配列におけるウリジン残基のすべてが、１−メチル−シュードウリジンと交換されることを意味する。同様に、ポリヌクレオチドは、上記のもののいずれかなどの修飾残基を用いた交換によって任意の型のヌクレオシド残基が配列に存在するように一様に修飾することができる。
【０２９１】
いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレーム中の化学修飾ヌクレオシドは、ウリジン、アデニン、シトシン、グアニン、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
【０２９２】
いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾シトシンである。修飾シトシンを有する核酸塩基及びヌクレオシドの例には、Ｎ４−アセチル−シチジン（ａｃ４Ｃ）、５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）、５−ハロ−シチジン（例えば、５−ヨード−シチジン）、５−ヒドロキシメチル−シチジン（ｈｍ５Ｃ）、１−メチル−シュードイソシチジン、２−チオ−シチジン（ｓ２Ｃ）、及び２−チオ−５−メチル−シチジンが含まれる。
【０２９３】
いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾ウリジンである。修飾ウリジンを有する核酸塩基及びヌクレオシドの例には、１−メチル−シュードウリジン（ｍ１ψ）、１−エチル−シュードウリジン（ｅ１ψ）、５−メトキシウリジン、２−チオウリジン、５−シアノウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジン、及び４’−チオウリジンが含まれる。
【０２９４】
いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾アデニンである。修飾アデニンを有する核酸塩基及びヌクレオシドの例には、７−デアザ−アデニン、１−メチル−アデノシン（ｍ１Ａ）、２−メチル−アデニン（ｍ２Ａ）、Ｎ６−メチル−アデノシン（ｍ６Ａ）及び２，６−ジアミノプリンが含まれる。
【０２９５】
いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾グアニンである。修飾グアニンを有する核酸塩基及びヌクレオシドの例には、イノシン（Ｉ）、１−メチル−イノシン（ｍ１Ｉ）、ワイオシン（ｉｍＧ）、メチルワイオシン（ｍｉｍＧ）、７−デアザ−グアノシン、７−シアノ−７−デアザ−グアノシン（ｐｒｅＱ０）、７−アミノメチル−７−デアザ−グアノシン（ｐｒｅＱ１）、７−メチル−グアノシン（ｍ７Ｇ）、１−メチル−グアノシン（ｍ１Ｇ）、８−オキソ−グアノシン、７−メチル−８−オキソ−グアノシンが含まれる。
【０２９６】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）中の核酸塩基修飾ヌクレオチドは、５−メトキシウリジンである。
【０２９７】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、修飾核酸塩基の少なくとも２つ（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれを超える数）の組み合わせを含む。
【０２９８】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、５−メトキシウリジン（５ｍｏ５Ｕ）及び５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。
【０２９９】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、特定の修飾を得るように、一様に修飾される（例えば、完全に修飾される、配列全体を通して修飾される）。例えば、ポリヌクレオチドは、５−メトキシウリジンで一様に修飾することができ、このことは、ｍＲＮＡ配列におけるウリジン残基の実質的にすべてが、５−メトキシウリジンと交換されることを意味する。同様に、ポリヌクレオチドは、上記のもののいずれかなどの修飾残基を用いた交換によって任意の型のヌクレオシド残基が配列に存在するように一様に修飾することができる。
【０３００】
いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾シトシンである。
【０３０１】
いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾ウラシルである。修飾ウラシルを有する核酸塩基及びヌクレオシドの例は、５−メトキシウラシルが挙げられる。
【０３０２】
いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾アデニンである。
【０３０３】
いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾グアニンである。
【０３０４】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ヌクレオシド間に任意の有用なリンカーを含むことができる。骨格修飾を含む、本開示の組成物に有用であるそのようなリンカーには、次のもの：３’−アルキレンホスホネート、３’−アミノホスホロアミデート、アルケン含有骨格、アミノアルキルホスホロアミデート、アミノアルキルホスホトリエステル、ボラノホスフェート、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−、キラルホスホネート、キラルホスホロチオエート、ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格、メチレン（メチルイミノ）、メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格、メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格、モルホリノ結合、−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−、ヘテロ原子含有オリゴヌクレオシドヌクレオシド間結合、ホスフィネート、ホスホロアミデート、ホスホロジチオエート、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、ＰＮＡ、シロキサン骨格、スルファメート骨格、スルフィドスルホキシド及びスルホン骨格、スルホネート及びスルホンアミド骨格、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、ならびにチオノホスホロアミデートが含まれるが、これらに限定されない。
【０３０５】
ポリヌクレオチド（例えば、本明細書に記載のＲＮＡまたはｍＲＮＡ）に組み込むことができる、修飾されたヌクレオシド及びヌクレオチド（例えば、構成要素分子）は、リボ核酸の糖上で修飾され得る。例えば、２’ヒドロキシル基（ＯＨ）は、多数の異なる置換基で修飾または交換され得る。２’位での置換の例には、Ｈ、ハロ、任意選択で置換されたＣ１−６アルキル；任意選択で置換されたＣ１−６アルコキシ；任意選択で置換されたＣ６−１０アリールオキシ；任意選択で置換されたＣ３−８シクロアルキル；任意選択で置換されたＣ３−８シクロアルコキシ；任意選択で置換されたＣ６−１０アリールオキシ；任意選択で置換されたＣ６−１０アリール−Ｃ１−６アルコキシ、任意選択で置換されたＣ１−１２（ヘテロシクリル）オキシ；糖（例えば、リボース、ペントース、または本明細書に記載のいずれか）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲ（式中、Ｒは、Ｈまたは任意選択で置換されたアルキルであり、ｎは、０〜２０の整数（例えば、０〜４、０〜８、０〜１０、０〜１６、１〜４、１〜８、１〜１０、１〜１６、１〜２０、２〜４、２〜８、２〜１０、２〜１６、２〜２０、４〜８、４〜１０、４〜１６、及び４〜２０）である）；２’−ヒドロキシルがＣ１−６アルキレン架橋またはＣ１−６ヘテロアルキレン架橋によって同じリボース糖の４’−炭素に接続されている「ロックド」核酸（ＬＮＡ）（架橋の例には、メチレン、プロピレン、エーテル、またはアミノ架橋が挙げられる）；本明細書に定義されるアミノアルキル；本明細書に定義されるアミノアルコキシ；本明細書に定義されるアミノ；及び本明細書に定義されるアミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３０６】
一般に、ＲＮＡは、酸素を有する５員環である糖基のリボースを含む。非限定的な修飾ヌクレオチドの例には、リボース中の酸素の置換（例えば、Ｓ、Ｓｅ、またはメチレンもしくはエチレンなどのアルキレンによる置換）；二重結合の付加（例えば、シクロペンテニルまたはシクロヘキセニルでリボースを置換する）；リボースの環縮小（例えば、４員環のシクロブタンまたはオキセタンを形成する）；リボースの環拡大（例えば、アンヒドロヘキシトール、アルトリトール、マンニトール、シクロヘキサニル、シクロヘキセニル、及びモルホリノなどの追加の炭素またはヘテロ原子を有し、またホスホロアミデート骨格を有する６員環または７員環を形成する）；多環式形態（例えば、トリシクロ；及び「アンロックド」形態、例えば、グリコール核酸（ＧＮＡ）（例えば、リボースがホスホジエステル結合に結合したグリコール単位によって置換されている、Ｒ−ＧＮＡまたはＳ−ＧＮＡ）、トレオース核酸（リボースがα−Ｌ−トレオフラノシル−（３’→２’）で置換されている、ＴＮＡ）、及びペプチド核酸（２−アミノ−エチル−グリシン結合でリボース及びホスホジエステル骨格が置き換えられるＰＮＡ）が挙げられる。糖基はまた、リボース中の対応する炭素の立体化学配置とは反対の立体化学配置を有する１つまたは複数の炭素を含有し得る。したがって、ポリヌクレオチド分子は、例えば、アラビノースを含有するヌクレオチドを糖として含み得る。そのような糖修飾は、国際特許公開第ＷＯ２０１３０５２５２３号及び同第ＷＯ２０１４０９３９２４号に教示されており、これらの文献のそれぞれの内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０３０７】
本発明のポリヌクレオチド（例えば、１つもしくは複数の癌エピトープポリペプチドまたはその機能性断片もしくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、糖、核酸塩基、及び／またはヌクレオシド間結合に対する修飾の組み合わせを含み得る。それらの組み合わせは、本明細書に記載のいずれか１つまたは複数の修飾を含み得る。
【０３０８】
本開示のポリヌクレオチドは、部分的に修飾するか、または分子の全長にわたって完全に修飾してよい。例えば、１つもしくは複数もしくはすべてまたは所与の型のヌクレオチド（例えば、プリンもしくはピリミジン、またはＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのいずれか１つもしくは複数もしくはすべて）を、本発明のポリヌクレオチドまたはその所与の所定配列領域（例えば、ポリＡ尾部を含むｍＲＮＡまたはポリＡ尾部を除外したｍＲＮＡ）において一様に修飾してよい。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（またはその所与の配列領域）におけるヌクレオチドＸはすべて、修飾ヌクレオチドであり、Ｘは、ヌクレオチドＡ、ヌクレオチドＧ、ヌクレオチドＵ、ヌクレオチドＣのいずれか１つ、またはＡ＋Ｇ、Ａ＋Ｕ、Ａ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ、Ｇ＋Ｃ、Ｕ＋Ｃ、Ａ＋Ｇ＋Ｕ、Ａ＋Ｇ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ＋Ｃ、もしくはＡ＋Ｇ＋Ｃという組み合わせのいずれか１つであり得る。
【０３０９】
ポリヌクレオチドは、（全ヌクレオチド含量に関するか、または１つもしくは複数の型のヌクレオチド、すなわちＡ、Ｇ、Ｕ、もしくはＣのいずれか１つもしくは複数に関して）修飾ヌクレオチドを、約１％〜約１００％または介在する任意の割合（例えば、１％〜２０％、１％〜２５％、１％〜５０％、１％〜６０％、１％〜７０％、１％〜８０％、１％〜９０％、１％〜９５％、１０％〜２０％、１０％〜２５％、１０％〜５０％、１０％〜６０％、１０％〜７０％、１０％〜８０％、１０％〜９０％、１０％〜９５％、１０％〜１００％、２０％〜２５％、２０％〜５０％、２０％〜６０％、２０％〜７０％、２０％〜８０％、２０％〜９０％、２０％〜９５％、２０％〜１００％、５０％〜６０％、５０％〜７０％、５０％〜８０％、５０％〜９０％、５０％〜９５％、５０％〜１００％、７０％〜８０％、７０％〜９０％、７０％〜９５％、７０％〜１００％、８０％〜９０％、８０％〜９５％、８０％〜１００％、９０％〜９５％、９０％〜１００％、及び９５％〜１００％）で含み得る。任意の残りの割合は、非修飾のＡ、Ｇ、Ｕ、またはＣの存在に相当することを理解されたい。
【０３１０】
ポリヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドを最小１％〜最大１００％含むか、または修飾ヌクレオチドを少なくとも５％、修飾ヌクレオチドを少なくとも１０％、修飾ヌクレオチドを少なくとも２５％、修飾ヌクレオチドを少なくとも５０％、修飾ヌクレオチドを少なくとも８０％、もしくは修飾ヌクレオチドを少なくとも９０％含むなど、介在する任意の割合で修飾ヌクレオチドを含み得る。例えば、ポリヌクレオチドは、修飾ウラシルまたは修飾シトシンなどの修飾ピリミジンを含み得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドにおけるウラシルの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％が、修飾ウラシル（例えば、５−置換ウラシル）と交換される。修飾ウラシルは、単一の特有構造を有する化合物によって交換することができるか、または異なる構造（例えば、２つ、３つ、４つ、もしくはそれを超える数の特有構造）を有する複数の化合物によって交換することができる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドにおけるシトシンの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％が修飾シトシン（例えば、５−置換シトシン）と交換される。修飾シトシンは、単一の特有構造を有する化合物によって交換することができるか、または異なる構造（例えば、２つ、３つ、４つ、もしくはそれを超える数の特有構造）を有する複数の化合物によって交換することができる。
【０３１１】
したがって、いくつかの実施形態では、ＲＮＡワクチンは、５’ＵＴＲ要素、任意選択でコドン最適化オープンリーディングフレーム、及び３’ＵＴＲ要素、ポリ（Ａ）配列及び／またはポリアデニル化シグナルを含み、ＲＮＡは、化学的に修飾されない。
【０３１２】
いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾ウラシルである。修飾ウラシルを有する核酸塩基及びヌクレオシドの例には、シュードウリジン（ψ）、ピリジン−４−オンリボヌクレオシド、５−アザ−ウリジン、６−アザ−ウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオ−ウリジン（ｓ２Ｕ）、４−チオ−ウリジン（ｓ４Ｕ）、４−チオ−シュードウリジン、２−チオ−シュードウリジン、５−ヒドロキシ−ウリジン（ｈｏ５Ｕ）、５−アミノアリル−ウリジン、５−ハロ−ウリジン（例えば、５−ヨード−ウリジンまたは５−ブロモ−ウリジン）、３−メチル−ウリジン（ｍ３Ｕ）、５−メトキシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、ウリジン５−オキシ酢酸（ｃｍｏ５Ｕ）、ウリジン５−オキシ酢酸メチルエステル（ｍｃｍｏ５Ｕ）、５−カルボキシメチル−ウリジン（ｃｍ５Ｕ）、１−カルボキシメチル−シュードウリジン、５−カルボキシヒドロキシメチル−ウリジン（ｃｈｍ５Ｕ）、５−カルボキシヒドロキシメチル−ウリジンメチルエステル（ｍｃｈｍ５Ｕ）、５−メトキシカルボニルメチル−ウリジン（ｍｃｍ５Ｕ）、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオ−ウリジン（ｍｃｍ５ｓ２Ｕ）、５−アミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−メチルアミノメチル−ウリジン（ｍｎｍ５Ｕ）、５−メチルアミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−メチルアミノメチル−２−セレノ−ウリジン（ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ）、５−カルバモイルメチル−ウリジン（ｎｃｍ５Ｕ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−プロピニル−ウリジン、１−プロピニル−シュードウリジン、５−タウリノメチル−ウリジン（τｍ５Ｕ）、１−タウリノメチル−シュードウリジン、５−タウリノメチル−２−チオ−ウリジン（τｍ５ｓ２Ｕ）、１−タウリノメチル−４−チオ−シュードウリジン、５−メチル−ウリジン（ｍ５Ｕ、すなわち、核酸塩基であるデオキシチミンを有する）、１−メチル−シュードウリジン（ｍ１ψ）、１−エチル−シュードウリジン（ｅ１ψ）、５−メチル−２−チオ−ウリジン（ｍ５ｓ２Ｕ）、１−メチル−４−チオ−シュードウリジン（ｍ１ｓ４ψ）、４−チオ−１−メチル−シュードウリジン、３−メチル−シュードウリジン（ｍ３ψ）、２−チオ−１−メチル−シュードウリジン、１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、ジヒドロウリジン（Ｄ）、ジヒドロシュードウリジン、５，６−ジヒドロウリジン、５−メチル−ジヒドロウリジン（ｍ５Ｄ）、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−ジヒドロシュードウリジン、２−メトキシ−ウリジン、２−メトキシ−４−チオ−ウリジン、４−メトキシ−シュードウリジン、４−メトキシ−２−チオ−シュードウリジン、Ｎ１−メチル−シュードウリジン、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン（ａｃｐ３Ｕ）、１−メチル−３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）シュードウリジン（ａｃｐ３ψ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）ウリジン（ｉｎｍ５Ｕ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）−２−チオ−ウリジ��（ｉｎｍ５ｓ２Ｕ）、α−チオ−ウリジン、２’−Ｏ−メチル−ウリジン（Ｕｍ）、５、２’−Ｏ−ジメチル−ウリジン（ｍ５Ｕｍ）、２’−Ｏ−メチル−シュードウリジン（ψｍ）、２−チオ−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｓ２Ｕｍ）、５−メトキシカルボニルメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｍｃｍ５Ｕｍ）、５−カルバモイルメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｎｃｍ５Ｕｍ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕｍ）、３、２’−Ｏ−ジメチル−ウリジン（ｍ３Ｕｍ）、及び５−（イソペンテニルアミノメチル）−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｉｎｍ５Ｕｍ）、１−チオ−ウリジン、デオキシチミジン、２’−Ｆ−アラ−ウリジン、２’−Ｆ−ウリジン、２’−ＯＨ−アラ−ウリジン、５−（２−カルボメトキシビニル）ウリジン、ならびに５−［３−（１−Ｅ−プロペニルアミノ）］ウリジンが含まれる。
【０３１３】
いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾シトシンである。修飾シトシンを有する核酸塩基及びヌクレオシドの例には、５−アザ−シチジン、６−アザ−シチジン、シュードイソシチジン、３−メチル−シチジン（ｍ３Ｃ）、Ｎ４−アセチル−シチジン（ａｃ４Ｃ）、５−ホルミル−シチジン（ｆ５Ｃ）、Ｎ４−メチル−シチジン（ｍ４Ｃ）、５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）、５−ハロ−シチジン（例えば、５−ヨード−シチジン）、５−ヒドロキシメチル−シチジン（ｈｍ５Ｃ）、１−メチル−シュードイソシチジン、ピロロ−シチジン、ピロロ−シュードイソシチジン、２−チオ−シチジン（ｓ２Ｃ）、２−チオ−５−メチル−シチジン、４−チオ−シュードイソシチジン、４−チオ−１−メチル−シュードイソシチジン、４−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードイソシチジン、１−メチル−１−デアザ−シュードイソシチジン、ゼブラリン、５−アザ−ゼブラリン、５−メチル−ゼブラリン、５−アザ−２−チオ−ゼブラリン、２−チオ−ゼブラリン、２−メトキシ−シチジン、２−メトキシ−５−メチル−シチジン、４−メトキシ−シュードイソシチジン、４−メトキシ−１−メチル−シュードイソシチジン、ライシジン（ｋ２Ｃ）、α−チオ−シチジン、２’−Ｏ−メチル−シチジン（Ｃｍ）、５、２’−Ｏ−ジメチル−シチジン（ｍ５Ｃｍ）、Ｎ４−アセチル−２’−Ｏ−メチル−シチジン（ａｃ４Ｃｍ）、Ｎ４、２’−Ｏ−ジメチル−シチジン（ｍ４Ｃｍ）、５−ホルミル−２’−Ｏ−メチル−シチジン（ｆ５Ｃｍ）、Ｎ４，Ｎ４，２’−Ｏ−トリメチル−シチジン（ｍ４２Ｃｍ）、１−チオ−シチジン、２’−Ｆ−アラ−シチジン、２’−Ｆ−シチジン、及び２’−ＯＨ−アラ−シチジンが含まれる。
【０３１４】
いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾アデニンである。修飾アデニンを有する核酸塩基及びヌクレオシドの例には、２−アミノ−プリン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノ−６−ハロ−プリン（例えば、２−アミノ−６−クロロ−プリン）、６−ハロ−プリン（例えば、６−クロロ−プリン）、２−アミノ−６−メチル−プリン、８−アジド−アデノシン、７−デアザ−アデニン、７−デアザ−８−アザ−アデニン、７−デアザ−２−アミノ−プリン、７−デアザ−８−アザ−２−アミノ−プリン、７−デアザ−２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノプリン、１−メチル−アデノシン（ｍ１Ａ）、２−メチル−アデニン（ｍ２Ａ）、Ｎ６−メチル−アデノシン（ｍ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−メチル−アデノシン（ｍｓ２ｍ６Ａ）、Ｎ６−イソペンテニル−アデノシン（ｉ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニル−アデノシン（ｍｓ２ｉ６Ａ）、Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン（ｉｏ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン（ｍｓ２ｉｏ６Ａ）、Ｎ６−グリシニルカルバモイル−アデノシン（ｇ６Ａ）、Ｎ６−スレオニルカルバモイル−アデノシン（ｔ６Ａ）、Ｎ６−メチル−Ｎ６−スレオニルカルバモイル−アデノシン（ｍ６ｔ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−スレオニルカルバモイル−アデノシン（ｍｓ２ｇ６Ａ）、Ｎ６，Ｎ６−ジメチル−アデノシン（ｍ６２Ａ）、Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイル−アデノシン（ｈｎ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイル−アデノシン（ｍｓ２ｈｎ６Ａ）、Ｎ６−アセチル−アデノシン（ａｃ６Ａ）、７−メチル−アデニン、２−メチルチオ−アデニン、２−メトキシ−アデニン、α−チオ−アデノシン、２’−Ｏ−メチル−アデノシン（Ａｍ）、Ｎ６，２’−Ｏ−ジメチル−アデノシン（ｍ６Ａｍ）、Ｎ６，Ｎ６，２’−Ｏ−トリメチル−アデノシン（ｍ６２Ａｍ）、１，２’−Ｏ−ジメチル−アデノシン（ｍ１Ａｍ）、２’−Ｏ−リボシルアデノシン（ホスフェート）（Ａｒ（ｐ））、２−アミノ−Ｎ６−メチル−プリン、１−チオ−アデノシン、８−アジド−アデノシン、２’−Ｆ−アラ−アデノシン、２’−Ｆ−アデノシン、２’−ＯＨ−アラ−アデノシン、及びＮ６−（１９−アミノ−ペンタオキサノナデシル）−アデノシンが含まれる。
【０３１５】
いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾グアニンである。修飾グアニンを有する核酸塩基及びヌクレオシドの例には、イノシン（Ｉ）、１−メチル−イノシン（ｍ１Ｉ）、ワイオシン（ｉｍＧ）、メチルワイオシン（ｍｉｍＧ）、４−デメチル−ワイオシン（ｉｍＧ−１４）、イソワイオシン（ｉｍＧ２）、ワイブトシン（ｙＷ）、ペルオキシワイブトシン（ｏ２ｙＷ）、ヒドロキシワイブトシン（ＯｈｙＷ）、中間体ヒドロキシワイブトシン（ＯｈｙＷ＊）、７−デアザ−グアノシン、キューオシン（Ｑ）、エポキシキューオシン（ｏＱ）、ガラクトシル−キューオシン（ｇａｌＱ）、マンノシル−キューオシン（ｍａｎＱ）、７−シアノ−７−デアザ−グアノシン（ｐｒｅＱ０）、７−アミノメチル−７−デアザ−グアノシン（ｐｒｅＱ１）、アルカエオシン（Ｇ＋）、７−デアザ−８−アザ−グアノシン、６−チオ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−８−アザ−グアノシン、７−メチル−グアノシン（ｍ７Ｇ）、６−チオ−７−メチル−グアノシン、７−メチル−イノシン、６−メトキシ−グアノシン、１−メチル−グアノシン（ｍ１Ｇ）、Ｎ２−メチル−グアノシン（ｍ２Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−グアノシン（ｍ２２Ｇ）、Ｎ２，７−ジメチル−グアノシン（ｍ２，７Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２，７−ジメチル−グアノシン（ｍ２，２，７Ｇ）、８−オキソ−グアノシン、７−メチル−８−オキソ−グアノシン、１−メチル−６−チオ−グアノシン、Ｎ２−メチル−６−チオ−グアノシン、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−６−チオ−グアノシン、α−チオ−グアノシン、２’−Ｏ−メチル−グアノシン（Ｇｍ）、Ｎ２−メチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ２Ｇｍ）、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ２２Ｇｍ）、１−メチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ１Ｇｍ）、Ｎ２，７−ジメチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ２，７Ｇｍ）、２’−Ｏ−メチル−イノシン（Ｉｍ）、１，２’−Ｏ−ジメチル−イノシン（ｍ１Ｉｍ）、２’−Ｏ−リボシルグアノシン（ホスフェート）（Ｇｒ（ｐ））、１−チオ−グアノシン、Ｏ６−メチル−グアノシン、２’−Ｆ−アラ−グアノシン、及び２’−Ｆ−グアノシンが含まれる。
【０３１６】
ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）のインビトロでの転写
本開示の癌ワクチンは、ｍＲＮＡ（例えば、修飾ｍＲＮＡ）などのＲＮＡポリヌクレオチドを少なくとも１つ含む。ｍＲＮＡは、例えば、鋳型ＤＮＡからインビトロで転写され、こうした鋳型ＤＮＡは、「インビトロの転写鋳型」と称される。いくつかの実施形態では、インビトロの転写鋳型は、５’非翻訳（ＵＴＲ）領域をコードし、オープンリーディングフレームを含み、３’ＵＴＲ及びポリＡ尾部をコードする。インビトロの転写鋳型の特定の核酸配列組成及び長さは、鋳型によってコードされるｍＲＮＡに依存することになる。
【０３１７】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、２００〜３，０００ヌクレオチドを含む。例えば、ポリヌクレオチドは、２００〜５００、２００〜１０００、２００〜１５００、２００〜３０００、５００〜１０００、５００〜１５００、５００〜２０００、５００〜３０００、１０００〜１５００、１０００〜２０００、１０００〜３０００、１５００〜３０００、または２０００〜３０００ヌクレオチドを含み得る。
【０３１８】
他の態様では、本発明は、ＩＶＴ法によるｍＲＮＡ癌ワクチンの調製方法に関する。インビトロ転写（ＩＶＴ）法では、ほとんど任意の配列のＲＮＡ分子の鋳型誘導型の合成が可能になる。ＩＶＴ法を使用して合成することができるＲＮＡ分子のサイズ範囲は、短いオリゴヌクレオチドから数千塩基という長い核酸ポリマーにまで及ぶ。ＩＶＴ法では、大量（例えば、マイクログラム量〜ミリグラム量）のＲＮＡ転写物の合成が可能になる（Ｂｅｃｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｂｙ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．７０３：２９−４１（２０１１）、Ｒｉｏ  ｅｔ  ａｌ．ＲＮＡ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０１１，２０５−２２０．、Ｃｏｏｐｅｒ，Ｇｅｏｆｆｅｒｙ  Ｍ．Ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ：Ａ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｐｐｒｏａｃｈ．４ｔｈ  ｅｄ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．：ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，２００７．２６２−２９９）。一般に、ＩＶＴでは、目的とする配列の上流に位置するプロモーター配列を特徴とするＤＮＡ鋳型が利用される。プロモーター配列は、バクテリオファージ起源のもの（例えば、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６のプロモーター配列）が最も一般的であるが、デノボ設計されたものを含む多くの他のプロモーター配列も許容可能である。典型的には、特定のバクテリオファージプロモーター配列に対応するＲＮＡポリメラーゼを使用することによってＤＮＡ鋳型の転写を達成することが最良である。ＲＮＡポリメラーゼの例には、限定はされないが、数ある中でも特に、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ、またはＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼが含まれる。ＩＶＴは、一般に、二本鎖ＤＮＡにおいて開始されるが、一本鎖ででも進行可能である。
【０３１９】
癌抗原、または例えば、活性化癌遺伝子変異ペプチドをコードする、例えば、ｍＲＮＡなどの、本開示のｍＲＮＡワクチンは、任意の適切な合成方法を使用して調製してよいことを理解されたい。例えば、いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡワクチンは、鋳型としての一本鎖のボトム鎖ＤＮＡ、及びプロモーターとして働く相補的オリゴヌクレオチドからＩＶＴを使用して調製される。一本鎖のボトム鎖ＤＮＡは、ＲＮＡをインビトロで転写するためのＤＮＡ鋳型として働き得るものであり、例えば、プラスミド、ＰＣＲ産物、または化学合成から得てよい。いくつかの実施形態では、一本鎖のボトム鎖ＤＮＡは、環状の鋳型から直鎖化される。一本鎖のボトム鎖ＤＮＡ鋳型は、一般に、ＩＶＴが容易になるように、例えば、バクテリオファージのプロモーター配列などのプロモーター配列を含む。一本鎖のボトム鎖ＤＮＡと、プロモーター相補的オリゴヌクレオチドであるトップ鎖と、を使用するＲＮＡの調製方法は、当該技術分野において知られている。例示の方法では、限定はされないが、鋳型であるＤＮＡボトム鎖と、プロモーター相補的オリゴヌクレオチドであるトップ鎖（例えば、Ｔ７プロモーター相補的オリゴヌクレオチド、Ｔ３プロモーター相補的オリゴヌクレオチド、またはＳＰ６プロモーター相補的オリゴヌクレオチド）と、のアニーリングが実施された後、例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ、またはＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼなどの、プロモーター配列に対応するＲＮＡポリメラーゼを使用するＩＶＴが実施される。
【０３２０】
ＩＶＴ法は、二本鎖のＤＮＡ鋳型を使用しても実施することができる。例えば、いくつかの実施形態では、二本鎖のＤＮＡ鋳型は、当該技術分野において利用可能な鎖伸長技術を使用し、相補的オリゴヌクレオチドを伸長させて相補的ＤＮＡ鎖を生成することによって調製される。いくつかの実施形態では、プロモーター配列、及び目的とするエピトープを１つまたは複数コードする配列を含む一本鎖のボトム鎖ＤＮＡ鋳型が、プロモーター相補的オリゴヌクレオチドであるトップ鎖へとアニーリングされ、ＰＣＲ様プロセスに供されることでトップ鎖が伸長して二本鎖のＤＮＡ鋳型が生成する。あるいは、またはさらに、ボトム鎖プロモーター配列に相補的であり、かつ目的とするエピトープを１つまたは複数コードする配列に相補的な配列を含むトップ鎖ＤＮＡが、ボトム鎖プロモーターオリゴヌクレオチドへとアニーリングされ、ＰＣＲ様プロセスに供されることでボトム鎖が伸長して二本鎖のＤＮＡ鋳型が生成する。いくつかの実施形態では、ＰＣＲ様サイクルの回数範囲は、１〜２０サイクルであり、例えば、３〜１０サイクルである。いくつかの実施形態では、二本鎖のＤＮＡ鋳型は、完全または部分的に化学合成法によって合成される。二本鎖のＤＮＡ鋳型は、本明細書に記載のインビトロでの転写に供すことができる。
【０３２１】
別の態様では、例えば、癌抗原またはエピトープをコードするｍＲＮＡなどの、本開示のｍＲＮＡワクチンは、それらの配列が重なり合う部分全体が相補的な２つのＤＮＡ鎖を使用して調製し、相補部分がアニーリングしたときに一本鎖のオーバーハング（すなわち、粘着末端）を残してよい。こうした一本鎖オーバーハングは、もう一方の鎖を鋳型として使用して伸長し、それによって二本鎖ＤＮＡを生成することによって二本鎖にすることができる。場合によっては、このプライマー伸長法では、例えば、トップ鎖ＤＮＡ合成法によって得られる鋳型ＤＮＡ配列に組み込まれるサイズと比較して、鋳型ＤＮＡ配列に組み込まれることになるＯＲＦを長鎖化することが可能である。プライマー伸長法では、第１の鎖（５”から３’の方向）の３’末端の一部が、第２の鎖（３’から５’の方向）３’末端の一部に相補的である。そのような実施形態のいくつかでは、一本鎖の第１鎖ＤＮＡは、プロモーター（例えば、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６）の配列、任意選択で５’−ＵＴＲ、及びＯＲＦの一部またはすべて（例えば、ＯＲＦの５’末端の一部）を含み得る。いくつかの実施形態では、一本鎖の第２鎖ＤＮＡは、ＯＲＦの一部またはすべてに相補的な配列（例えば、ＯＲＦの３’末端に相補的な部分）、及び任意選択で３’−ＵＴＲ、終始配列、及び／またはポリ（Ａ）尾部を含み得る。２つの合成ＤＮＡ鎖を使用するＲＮＡの調製方法では、重なり合う相補部分を有する２つの鎖のアニーリングが実施された後、１回または複数回のＰＣＲ様サイクルを使用することで鎖が伸長して二本鎖のＤＮＡ鋳型が生成するプライマー伸長が実施され得る。いくつかの実施形態では、ＰＣＲ様サイクルの回数範囲は、１〜２０サイクルであり、例えば、３〜１０サイクルである。そのような二本鎖ＤＮＡは、本明細書に記載のインビトロでの転写に供すことができる。
【０３２２】
別の態様では、例えば、癌抗原またはエピトープをコードするｍＲＮＡなどの、本開示のｍＲＮＡワクチンは、ｇＢｌｏｃｋｓ（登録商標）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，Ｉｏｗａ）などの合成の二本鎖直鎖ＤＮＡ分子を二本鎖のＤＮＡ鋳型として使用して調製してよい。そのような合成二本鎖直鎖ＤＮＡ分子の利点は、そうしたものによって、ｍＲＮＡがそこから生成するための、より長い鋳型が与えられることである。例えば、ｇＢｌｏｃｋｓ（登録商標）のサイズ範囲は、４５〜１０００（例えば、１２５〜７５０ヌクレオチド）であり得る。いくつかの実施形態では、合成の二本鎖直鎖ＤＮＡ鋳型は、全長の５’−ＵＴＲ、全長の３’−ＵＴＲ、または両方を含む。全長の５’−ＵＴＲは、最大で１００ヌクレオチド長であり得、例えば、約４０〜６０ヌクレオチド長である。全長の３’−ＵＴＲは、最大で３００ヌクレオチド長であり得、例えば、約１００〜１５０ヌクレオチド長である。
【０３２３】
より長い構築物の生成を容易にするために、３’側の鎖に重複配列を有するように設計された２つ以上の二本鎖直鎖ＤＮＡ分子及び／または遺伝子断片を、当該技術分野において知られる方法を使用して共に会合させてよい。例えば、こうした二本鎖ＤＮＡ断片の５’末端から塩基を切断する中温性エキソヌクレアーゼを使用した後、新たに形成された相補的な一本鎖３’末端をアニーリングさせてから、ポリメラーゼ依存性の伸長によって任意の一本鎖ギャップを埋め、最終的に、ＤＮＡリガーゼによってＤＮＡセグメントを共有結合で連結してＧｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ（商標）法（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を実施してよい。
【０３２４】
別の態様では、例えば、癌抗原またはエピトープをコードするｍＲＮＡなどの、本開示のｍＲＮＡワクチンは、ＲＮＡの化学合成を使用して調製してよい。方法は、ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む第１のポリヌクレオチド、及び５’−ＵＴＲを含む第２のポリヌクレオチドの、固形担体に複合化した相補的ポリヌクレオチドへのアニーリングを含む。その後、第１のポリヌクレオチドの５’末端に対して、第２のポリヌクレオチドの３’末端が適切な条件下でライゲーションされる。適切な条件には、ＤＮＡリガーゼの使用が含まれる。ライゲーション反応によって第１のライゲーション産物が生成する。その後、第１のライゲーション産物の３’末端に対して、３’−ＵＴＲを含む第３のポリヌクレオチドの５’末端が適切な条件下でライゲーションされる。第２のライゲーション反応に適切な条件には、ＲＮＡリガーゼが含まれる。第２のライゲーション反応では、第２のライゲーション産物が生成する。第２のライゲーション産物を固形担体から遊離させることで、目的とするポリペプチドをコードするｍＲＮＡが生成する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、３０〜１０００ヌクレオチドである。
【０３２５】
目的とするポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む第１のポリヌクレオチド、及び３’−ＵＴＲを含む第２のポリヌクレオチドを、固形担体に複合化した相補的ポリヌクレオチドに結合することによって調製してもよい。第１のポリヌクレオチドの３’末端に対して、第２のポリヌクレオチドの５’末端が適切な条件下でライゲーションされる。適切な条件には、ＤＮＡリガーゼが含まれる。方法によって、第１のライゲーション産物が生成する。第１のライゲーション産物に対して、５’−ＵＴＲを含む第３のポリヌクレオチドが適切な条件でライゲーションされることで第２のライゲーション産物が生成する。適切な条件には、Ｔ４ＲＮＡなどのＲＮＡリガーゼが含まれる。第２のライゲーション産物を固形担体から遊離させることで、目的とするポリペプチドをコードするｍＲＮＡが生成する。
【０３２６】
いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、５’−トリホスフェート及び３’−ＯＨを特徴とする。他の実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、３’−ＯＨを含む。さらに他の実施形態では、第３のポリヌクレオチドは、５’−トリホスフェート及び３’−ＯＨを含む。第２のポリヌクレオチドは、５’−キャップ構造も含み得る。方法は、第３のポリヌクレオチドの３’末端に対する、ポリ−Ａ領域を含む第４のポリヌクレオチドのライゲーション段階もさらに含み得る。第４のポリヌクレオチドは、５’−トリホスフェートを含み得る。
【０３２７】
方法は、逆相精製を含んでも含まなくてもよい。方法は、洗浄段階も含み得、固形担体は、未反応のポリヌクレオチドを除去するために洗浄される。固形担体は、例えば、捕捉樹脂であり得る。いくつかの実施形態では、方法は、ｄＴによる精製を含む。
【０３２８】
本開示によれば、本開示のｍＲＮＡワクチンをコードする鋳型ＤＮＡは、１つまたは複数の癌エピトープをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。いくつかの実施形態では、鋳型ＤＮＡは、最大で１０００ヌクレオチドのＯＲＦを含み、例えば、約１０〜３５０ヌクレオチド、約３０〜３００ヌクレオチド、または約５０〜２５０ヌクレオチドのＯＲＦを含む。いくつかの実施形態では、鋳型ＤＮＡは、約１５０ヌクレオチドのＯＲＦを含む。いくつかの実施形態では、鋳型ＤＮＡは、約２００ヌクレオチドのＯＲＦを含む。
【０３２９】
いくつかの実施形態では、ＩＶＴ転写物は、反応が生じた後のＩＶＴ反応混合物の構成成分から精製される。例えば、未精製のＩＶＴ混合物は、元の鋳型を消化するために、ＲＮＡｓｅを含まないＤＮａｓｅで処理してよい。ｍＲＮＡは、当該技術分野において知られる方法を使用して精製することができ、こうした方法には、限定はされないが、有機溶媒を使用する沈殿、またはカラムに基づく精製方法が含まれる。ＲＮＡを精製するためには、例えば、ＭＥＧＡＣＬＥＡＲ（商標）キット（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）などの市販のキットが利用可能である。ｍＲＮＡは、当該技術分野において知られる方法を使用して定量化することができ、こうした方法には、限定はされないが、例えば、ＮａｎｏＤｒｏｐなどの市販の機器を用いるものが含まれる。精製されたｍＲＮＡは、例えば、ＲＮＡのサイズが正しいかの確認、及び／またはＲＮＡに分解が生じていないかの確認を行うためにアガロースゲル電気泳動によって分析することができる。
【０３３０】
非翻訳領域（ＵＴＲ）
非翻訳領域（ＵＴＲ）は、開始コドン（５’ＵＴＲ）の前と終止コドン（３’ＵＴＲ）の後の翻訳されないポリヌクレオチドの核酸領域である。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の癌抗原またはエピトープをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む本発明のポリヌクレオチド（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））は、ＵＴＲ（例えば、５’ＵＴＲもしくはその機能性断片、３’ＵＴＲもしくはその機能性断片、またはそれらの組み合わせ）をさらに含む。
【０３３１】
ＵＴＲは、ポリヌクレオチド中のコーディング領域に対して相同または異種であってよい。いくつかの実施形態では、ＵＴＲは、１つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードするＯＲＦに対して相同である。いくつかの実施形態では、ＵＴＲは、１つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードするＯＲＦに対して異種である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、２つ以上の５’ＵＴＲまたはその機能性断片を含み、そのそれぞれは、同じまたは異なるヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、２つ以上の３’ＵＴＲまたはその機能性断片を含み、そのそれぞれは、同じまたは異なるヌクレオチド配列を有する。
【０３３２】
いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲもしくはその機能性断片、３’ＵＴＲもしくはその機能性断片、またはこれらの任意の組み合わせは、配列最適化される。
【０３３３】
いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲもしくはその機能性断片、３’ＵＴＲもしくはその機能性断片、またはこれらの任意の組み合わせは、少なくとも１つの化学的に修飾された核酸塩基、例えば、５−メトキシウラシルを含む。
【０３３４】
ＵＴＲは、調節的役割、例えば、安定性、局在化及び／または翻訳効率の向上または低下をもたらす特徴を有し得る。ＵＴＲを含むポリヌクレオチドは、細胞、組織、または器官に投与することができ、１つまたは複数の調節的特徴は、常法を使用して測定することができる。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲの機能性断片は、全長５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲの１つまたは複数の調節的特徴をそれぞれ含む。
【０３３５】
天然５’ＵＴＲは、翻訳開始に関与するという特徴を持つ。天然５’ＵＴＲは、リボソームによって多くの遺伝子の翻訳が開始されるプロセスに関与することが一般的に知られているコザック配列のような特徴を保持する。コザック配列は、コンセンサスＣＣＲ（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＵＧＧ（配列番号２４６）（配列中、Ｒは、後ろに「Ｇ」がもう１つ続く開始コドン（ＡＵＧ）の３塩基上流にあるプリン（アデニンまたはグアニン）である）を有する。５’ＵＴＲはまた、伸長因子の結合に関与する二次構造を形成することが知られている。
【０３３６】
特定の標的器官に豊富に発現される遺伝子に典型的に見出される特徴を操作することによって、ポリヌクレオチドの安定性及びタンパク質の産生を増強することができる。例えば、アルブミン、血清アミロイドＡ、アポリポタンパク質Ａ／Ｂ／Ｅ、トランスフェリン、αフェトプロテイン、エリスロポエチン、または第ＶＩＩＩ因子などの、肝臓に発現されるｍＲＮＡの５’ＵＴＲを導入すると、肝細胞株または肝臓でのポリヌクレオチドの発現を増強することができる。同様に、筋肉（例えば、ＭｙｏＤ、ミオシン、ミオグロビン、ミオゲニン、ヘルクリン）、内皮細胞（例えば、Ｔｉｅ−１、ＣＤ３６）、骨髄細胞（例えば、Ｃ／ＥＢＰ、ＡＭＬ１、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＤ１１ｂ、ＭＳＲ、Ｆｒ−１、ｉ−ＮＯＳ）、白血球（例えば、ＣＤ４５、ＣＤ１８）、脂肪組織（例えば、ＣＤ３６、ＧＬＵＴ４、ＡＣＲＰ３０、アディポネクチン）及び肺上皮細胞（例えば、ＳＰ−Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ）に対しては、その組織における発現を改善するために、他の組織特異的ｍＲＮＡに由来する５’ＵＴＲを使用することができる。
【０３３７】
いくつかの実施形態では、ＵＴＲは、転写物のファミリーであって、そのタンパク質が共通の機能、構造、特徴または特性を有する転写物のファミリーから選択される。例えば、コードされたポリペプチドは、特定の細胞内、組織内または発達中のある時期に発現するタンパク質のファミリー（すなわち、少なくとも１つの機能、構造、特徴、局在化、起点、または発現パターンを共有するファミリー）に属し得る。遺伝子またはｍＲＮＡのいずれかに由来するＵＴＲを、同じまたは異なるタンパク質ファミリーの任意の他のＵＴＲと交換することによって、新しいポリヌクレオチドを作ることができる。
【０３３８】
いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲは、異種であり得る。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲは、３’ＵＴＲとは異なる種に由来し得る。いくつかの実施形態では、３’ＵＴＲは、５’ＵＴＲとは異なる種に由来し得る。
【０３３９】
共同所有の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２１５２２号（国際公開第ＷＯ／２０１４／１６４２５３号、当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）は、ＯＲＦに対する隣接領域として本発明のポリヌクレオチドに利用することができるＵＴＲの例の一覧を提供する。
【０３４０】
本出願のＵＴＲの例には、限定するものではないが、次の核酸配列に由来する１つまたは複数の５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲが挙げられる：α−グロビンまたはβ−グロビンなどのグロビン（例えば、Ｘｅｎｏｐｕｓ、マウス、ウサギ、またはヒトグロビン）；強力なコザック翻訳開始シグナル；ＣＹＢＡ（例えば、ヒトシトクロムｂ−２４５αポリペプチド）；アルブミン（例えば、ヒトアルブミン７）；ＨＳＤ１７Ｂ４（ヒドロキシステロイド（１７−β）デヒドロゲナーゼ）；ウイルス（例えば、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、デング熱ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えば、ＣＭＶ前初期１（ＩＥ１））、肝炎ウイルス（例えば、Ｂ型肺炎ウイルス）、シンドビスウイルス、またはＰＡＶオオムギ黄萎ウイルス）；熱ショックタンパク質（例えば、ｈｓｐ７０）；翻訳開始因子（例えば、ｅｌＦ４Ｇ）；グルコース輸送体（例えば、ｈＧＬＵＴ１（ヒトグルコース輸送体１））；アクチン（例えば、ヒトαアクチンまたはβアクチン）；ＧＡＰＤＨ；チューブリン；ヒストン；クエン酸回路酵素；トポイソメラーゼ（例えば、５’ＴＯＰモチーフ（オリゴピリミジントラクト）を欠くＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲ）；リボソームタンパク質大型３２（Ｌ３２）；リボソームタンパク質（例えば、ヒトまたはマウスリボソームタンパク質、例えば、ｒｐｓ９など）；ＡＴＰシンターゼ（例えば、ＡＴＰ５Ａ１またはミトコンドリアＨ＋−ＡＴＰシンターゼのβサブユニット）；成長ホルモン（例えば、ウシ（ｂＧＨ）またはヒト（ｈＧＨ））；伸長因子（例えば、伸長因子１  α１（ＥＥＦ１Ａ１））；マンガンスーパーオキシドジスムターゼ（ＭｎＳＯＤ）；筋細胞エンハンサー因子２Ａ（ＭＥＦ２Ａ）；β−Ｆ１−ＡＴＰａｓｅ、クレアチンキナーゼ、ミオグロビン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）；コラーゲン（例えば、Ｉ型コラーゲンα２（Ｃｏｌ１Ａ２）、Ｉ型コラーゲンα１（Ｃｏｌ１Ａ１）、ＶＩ型コラーゲンα２（Ｃｏｌ６Ａ２）、ＶＩ型コラーゲンα１（Ｃｏｌ６Ａ１））；リボフォリン（例えば、リボフォリンＩ（ＲＰＮＩ））；低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質（例えば、ＬＲＰ１）；カルジオトロフィン様サイトカイン因子（例えば、Ｎｎｔ１）；カルレティキュリン（Ｃａｌｒ）；プロコラーゲン−リジン，２−オキソグルタル酸５−ジオキシゲナーゼ１（Ｐｌｏｄ１）；及びヌクレオバインディン（例えば、Ｎｕｃｂ１）。
【０３４１】
５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲの他の例には、Ｋａｒｉｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２００８  １６（１１）：１８３３−１８４０；Ｋａｒｉｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１２  ２０（５）：９４８−９５３；Ｋａｒｉｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１１  ３９（２１）：ｅ１４２；Ｓｔｒｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １９９７  ４：６２４−６２７；Ｈａｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０１５  ２９０（９）：５６６１−５６７２；Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２００７  ２５（１０）：１７０１−１７１１；Ｃａｆｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１５  ２３（８）：１３９１−１４００；Ａｎｄｒｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．２０１２  ９（８）：２１３６−２１４５；Ｃｒｏｗｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２０１５  Ｊｕｎ  ３０，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｇｔ．２０１５．６８；Ｒａｍｕｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．２０１５  ２９（５）：１９３０−１９３９；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２０１５  １５（４）：４２８−４３５；Ｈｏｌｔｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ２００６  １０８（１３）：４００９−４０１７；Ｋｏｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１  ２９（２）：１５４−１５７；Ｐｏｌｅｇａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．２０１５  ２６（１１）：７５１−７６６；Ｗａｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ２０１０  ７（５）：６１８−６３０；Ｍａｎｄａｌ  ａｎｄ  Ｒｏｓｓｉ，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２０１３  ８（３）：５６８−５８２；Ｈｏｌｃｉｋ  ａｎｄ  Ｌｉｅｂｈａｂｅｒ，ＰＮＡＳ  １９９７  ９４（６）：２４１０−２４１４；Ｆｅｒｉｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ．２０１５  １５（１７）：３５６１−３５７１；Ｔｈｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１５  ２３（９）：１４５６−１４６４；Ｂｏｒｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２０１５  １０（６）：ｅ０１３１１４１；Ｂｏｒｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．Ｂ．２０１３  １２９：９３−９９；Ａｎｄｒｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ  ２０１５  ２１７：３３７−３４４；Ｚｉｎｃｋｇｒａｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２００３  ２１（１５）：１６４０−９；Ｇａｒｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００８  ８２（２）：８８０−８９２；Ｈｏｌｄｅｎ  ａｎｄ  Ｈａｒｒｉｓ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２００４  ３２９（１）：１１９−１３３；Ｃｈｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００５  ７９（１３）：８３０３−８３１５；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１９９７  １６（１３）：４１０７−４１１６；Ａｌ−Ｚｏｇｈａｉｂｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ２００７  ３９１（１−２）：１３０−９；Ｖｉｖｉｎｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００１  ２６８（７）：１９０８−１９１７；Ｇａｎ  ａｎｄ  Ｒｈｏａｄｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９６  ２７１（２）：６２３−６２６；Ｂｏａｄ���  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．１９９６  ６７（４）：１３３５−１３４３；Ｋｎｉｒｓｃｈ  ａｎｄ  Ｃｌｅｒｃｈ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０００  ２７２（１）：１６４−１６８；Ｃｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９８  ３７（４６）：１６２９８−１６３０６；Ｉｚｑｕｉｅｒｄｏ  ａｎｄ  Ｃｕｅｖｚａ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２０００  ３４６  Ｐｔ  ３：８４９−８５５；Ｄｗｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．１９９６  ６６（２）：４４９−４５８；Ｂｌａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９９７  １７（５）：２７５６−２７６３；Ｉｚｑｕｉｅｒｄｏ  ａｎｄ  Ｃｕｅｖｚａ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９９７  １７（９）：５２５５−５２６８；ＵＳ８２７８０３６；ＵＳ８７４８０８９；ＵＳ８８３５１０８；ＵＳ９０１２２１９；ＵＳ２０１０／０１２９８７７；ＵＳ２０１１／００６５１０３；ＵＳ２０１１／００８６９０４；ＵＳ２０１２／０１９５９３６；ＵＳ２０１４／０２０６７５；ＵＳ２０１３／０１９５９６７；ＵＳ２０１４／０２９４９０；ＵＳ２０１４／０２０６７５３；ＷＯ２００７／０３６３６６；ＷＯ２０１１／０１５３４７；ＷＯ２０１２／０７２０９６；ＷＯ２０１３／１４３５５５；ＷＯ２０１４／０７１９６３；ＷＯ２０１３／１８５０６７；ＷＯ２０１３／１８２６２３；ＷＯ２０１４／０８９４８６；ＷＯ２０１３／１８５０６９；ＷＯ２０１４／１４４１９６；ＷＯ２０１４／１５２６５９；２０１４／１５２６７３；ＷＯ２０１４／１５２９４０；ＷＯ２０１４／１５２７７４；ＷＯ２０１４／１５３０５２；ＷＯ２０１４／１５２９６６、ＷＯ２０１４／１５２５１３；ＷＯ２０１５／１０１４１４；ＷＯ２０１５／１０１４１５；ＷＯ２０１５／０６２７３８；及びＷＯ２０１５／０２４６６７に記載のものが挙げられるが、これらに限定されない。これらの文献のそれぞれの内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０３４２】
いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲは、β−グロビンの５’ＵＴＲ；強力なコザック翻訳開始シグナルを含有する５’ＵＴＲ；シトクロムｂ−２４５  αポリペプチド（ＣＹＢＡ）の５’ＵＴＲ；ヒドロキシステロイド（１７−β）デヒドロゲナーゼ（ＨＳＤ１７Ｂ４）の５’ＵＴＲ；タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）の５’ＵＴＲ；ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＴＥＥＶ）の５’ＵＴＲ；非構造タンパク質をコードする風疹ウイルス（ＲＶ）ＲＮＡの５側オープンリーディングフレーム；デング熱ウイルス（ＤＥＮ）の５’ＵＴＲ；熱ショックタンパク質７０（Ｈｓｐ７０）の５’ＵＴＲ；ｅＩＦ４Ｇの５’ＵＴＲ；ＧＬＵＴ１の５’ＵＴＲ；その機能性断片及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
【０３４３】
いくつかの実施形態では、３’ＵＴＲは、β−グロビンの３’ＵＴＲ；ＣＹＢＡの３’ＵＴＲ；アルブミンの３’ＵＴＲ；成長ホルモン（ＧＨ）の３’ＵＴＲ；ＶＥＥＶの３’ＵＴＲ；Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の３’ＵＴＲ；α−グロビンの３’ＵＴＲ；ＤＥＮの３’ＵＴＲ；ＰＡＶオオムギ黄萎ウイルス（ＢＹＤＶ−ＰＡＶ）の３’ＵＴＲ；伸長因子１  α１（ＥＥＦ１Ａ１）の３’ＵＴＲ；マンガンスーパーオキシドジスムターゼ（ＭｎＳＯＤ）の３’ＵＴＲ；ミトコンドリアＨ（＋）−ＡＴＰシンターゼのβサブユニット（β−ｍＲＮＡ）の３’ＵＴＲ；ＧＬＵＴ１の３’ＵＴＲ；ＭＥＦ２Ａの３’ＵＴＲ；β−Ｆ１−ＡＴＰａｓｅの３’ＵＴＲ；その機能性断片及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
【０３４４】
ＵＴＲの他の例には、ＷＯ２０１４／１６４２５３に開示されているＵＴＲの１つまたは複数（ＵＴＲの任意の組み合わせを含む）が挙げられるが、これらに限定されない。当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。米国特許仮出願第６１／７７５，５０９号の表２１及び米国特許仮出願第６１／８２９，３７２号の表２２には、５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲの開始部位及び終了部位の一覧が示されおり、これらの文献のそれぞれの内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。表２１には、それぞれの５’ＵＴＲ（５’−ＵＴＲ−００５〜５’−ＵＴＲ６８５１１）が、その天然または野生型（相同）転写物に対して、その開始部位及び終了部位で特定されている（ＥＮＳＴ；ＥＮＳＥＭＢＬデータベースで使用されている識別子）。
【０３４５】
任意の遺伝子またはｍＲＮＡに由来する野生型ＵＴＲを本発明のポリヌクレオチドに組み込むことができる。いくつかの実施形態では、ＵＴＲは、野生型または天然ＵＴＲに対して変更を加え、バリアントＵＴＲを生成することができ、例えば、ＵＴＲの配向もしくは位置をＯＲＦに対して変えることによって、または追加のヌクレオチドの組み込み、ヌクレオチドの欠失、ヌクレオチドの入れ替えもしくは転移によって行われる。いくつかの実施形態では、５’または３’ＵＴＲのバリアントには、例えば、野生型ＵＴＲの変異体、または１つもしくは複数のヌクレオチドがＵＴＲの末端に付加されているか、ＵＴＲの末端から除去されているバリアントを利用することができる。
【０３４６】
加えて、１つまたは複数の合成ＵＴＲを１つまたは複数の非合成ＵＴＲと組み合わせて使用することもできる。例えば、Ｍａｎｄａｌ  ａｎｄ  Ｒｏｓｓｉ，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２０１３  ８（３）：５６８−８２及びｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／Ｄｅｒｒｉｃｋ＿Ｒｏｓｓｉ／から入手可能な配列を参照のこと。これらのそれぞれの内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。ＵＴＲまたはその部分は、その選択元の転写物と同じ配向に配置してもよいし、配向または位置を変更してもよい。したがって、５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲは、反転、短縮、延長されてもよいし、１つまたは複数の他の５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲと組み合わせてもよい。
【０３４７】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、複数のＵＴＲ、例えば、ダブル、トリプルまたはクアドルプルで５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲを含む。例えば、ダブルＵＴＲは、同じＵＴＲの２つのコピーを直列または実質的に直列のいずれかで含む。例えば、ダブルβ−グロビンの３’ＵＴＲを使用することができる（ＵＳ２０１０／０１２９８７７を参照のこと。当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。
【０３４８】
ある特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に開示のＵＴＲのいずれかから選択される５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲは、以下を含む。
【表１−１】
2020506189.tif 000003
【表１−２】
2020506189.tif 000004
【０３４９】
ある特定の実施形態では、本発明の５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲ配列は、配列番号２４７〜２７１のいずれかを含む５’ＵＴＲ配列及び／または配列番号２７２〜３０２のいずれかを含む３’ＵＴＲ配列ならびにこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される配列に対して、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。
【０３５０】
本発明のポリヌクレオチドは、特徴の組み合わせを含み得る。例えば、ＯＲＦは、強力なコザック翻訳開始シグナルを含む５’ＵＴＲ及び／またはポリＡテールの鋳型付加のためのオリゴ（ｄＴ）配列を含む３’ＵＴＲに隣接し得る。５’ＵＴＲは、同じ及び／または異なるＵＴＲに由来する第１のポリヌクレオチド断片及び第２のポリヌクレオチド断片を含む（例えば、ＵＳ２０１０／０２９３６２５を参照のこと。当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。
【０３５１】
また、パターン化されたＵＴＲを有することも本発明の範囲内である。本明細書で使用されるとき、「パターン化されたＵＴＲ」は、ＡＢＡＢＡＢもしくはＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢもしくはＡＢＣＡＢＣＡＢＣまたはその変形などの、１回、２回、または３回以上反復する繰り返しまたは交互のパターンを含む。これらのパターンにおいて、それぞれの文字Ａ、Ｂ、またはＣは、異なるＵＴＲ核酸配列を表す。
【０３５２】
本発明のポリヌクレオチド内の領域またはサブ領域として、他の非ＵＴＲ配列を使用することができる。例えば、イントロンまたはイントロン配列の部分を本発明のポリヌクレオチドに組み込むことができる。イントロン配列を組み込むと、タンパク質産生及びポリヌクレオチド発現レベルを増やすことができる。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＵＴＲの代わりに、またはＵＴＲに加えて、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む（例えば、Ｙａｋｕｂｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１０  ３９４（１）：１８９−１９３を参照のこと。当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、非構造タンパク質をコードする風疹ウイルス（ＲＶ）ＲＮＡの５’側オープンリーディングフレームを含む、風疹ウイルス（ＲＶ）ゲノムＲＮＡの５’末端及び／または３’末端にそれぞれ関連する５’配列及び／または３’配列、またはその欠失誘導体を含む（例えば、Ｐｏｇｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７（１２）：７１０６−７１１７を参照のこと。当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。翻訳エンハンサーとして、ウイルスカプシド配列、例えば、カプシド配列の５’部分を使用することもできる（例えば、Ｓｊｏｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）１９９４  １２（１１）：１１２７−１１３１及びＦｒｏｌｏｖ  ａｎｄ  Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９６  ７０（２）：１１８２−１１９０に記載のセムリキ森林ウイルス及びシンドビスウイルスのカプシドＲＮＡ。これらの文献のそれぞれの内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、５’ＵＴＲ配列の代わりにＩＲＥＳを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＯＲＦ及びウイルスカプシド配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、合成５’ＵＴＲを非合成３’ＵＴＲと組み合わせて含む。
【０３５３】
いくつかの実施形態では、ＵＴＲはまた、少なくとも１つの翻訳エンハンサーポリヌクレオチド、翻訳エンハンサー要素、または翻訳のエンハンサー要素（「ＴＥＥ」と総称される、ポリヌクレオチドから生成されるポリペプチドまたはタンパク質の量を増加させる核酸配列）も含み得る。非限定的な例として、ＴＥＥは、ＵＳ２００９／０２２６４７０に記載のものが挙げられ、当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれ、他は当該技術分野において知られている。非限定的な例として、ＴＥＥは、転写プロモーターと開始コドンとの間に位置し得る。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲは、ＴＥＥを含む。
【０３５４】
一態様では、ＴＥＥは、限定するものではないが、キャップ依存的翻訳またはキャップ非依存的翻訳などの核酸の翻訳活性を促進することができるＵＴＲ中の保存要素である。これらの配列の保存は、ヒトを含む１４種で判明している。例えば、Ｐａｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｎ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｐａｔｔｅｒｎ  ｏｆ  １８Ｓ  ｒＲＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｔｏ  ｍＲＮＡ  ５’ＵＴＲｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，”  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０１３，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｔ５４８を参照のこと。当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０３５５】
１つの非限定的な例では、ＴＥＥは、Ｇｔｘホメオドメインタンパク質の５’−リーダー中のＴＥＥ配列を含む。Ｃｈａｐｐｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ２００４  １０１：９５９０−９５９４を参照のこと。当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０３５６】
別の非限定的な例では、ＴＥＥは、ＵＳ２００９／０２２６４７０、ＵＳ２０１３／０１７７５８１、及びＷＯ２００９／０７５８８６の配列番号１〜３５；ＷＯ２０１２／００９６４４の配列番号１〜５及び７〜６４５；ならびにＷＯ１９９９／０２４５９５、ＵＳ６３１０１９７、及びＵＳ６８４９４０５の配列番号１の配列のうちの１つまたは複数を有するＴＥＥを含み、これらの文献のそれぞれの内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０３５７】
いくつかの実施形態では、ＴＥＥは、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、ＨＣＶ−ＩＲＥＳ、またはＩＲＥＳ要素、例えば、限定するものではないが、ＵＳ７４６８２７５、ＵＳ２００７／００４８７７６、ＵＳ２０１１／０１２４１００、ＷＯ２００７／０２５００８、及びＷＯ２００１／０５５３６９に記載のものなどであり、これらの文献のそれぞれの内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。ＩＲＥＳ要素は、Ｃｈａｐｐｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ２００４  １０１：９５９０−９５９４、Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ２００５  １０２：６２７３−６２７８、ＵＳ２００７／００４８７７６、ＵＳ２０１１／０１２４１００及びＷＯ２００７／０２５００８に記載のＧｔｘ配列（例えば、Ｇｔｘ９−ｎｔ、Ｇｔｘ８−ｎｔ、Ｇｔｘ７−ｎｔ）を含み得るが、これらに限定されず、これらの文献のそれぞれの内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０３５８】
「翻訳エンハンサーポリヌクレオチド」または「翻訳エンハンサーポリヌクレオチド配列」は、本明細書で提供されるＴＥＥ及び／または当該技術分野において知られているＴＥＥ（例えば、ＵＳ６３１０１９７、ＵＳ６８４９４０５、ＵＳ７４５６２７３、ＵＳ７１８３３９５、ＵＳ２００９／０２２６４７０、ＵＳ２００７／００４８７７６、ＵＳ２０１１／０１２４１００、ＵＳ２００９／００９３０４９、ＵＳ２０１３／０１７７５８１、ＷＯ２００９／０７５８８６、ＷＯ２００７／０２５００８、ＷＯ２０１２／００９６４４、ＷＯ２００１／０５５３７１、ＷＯ１９９９／０２４５９５、ＥＰ２６１０３４１Ａ１、及びＥＰ２６１０３４０Ａ１を参照のこと；これらの文献のそれぞれの内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）のうちの１つまたは複数を含む、ポリヌクレオチド、またはそのバリアント、ホモログ、もしくは機能性誘導体を指す。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＴＥＥの１つまたは複数のコピーを含む。翻訳エンハンサーポリヌクレオチド中のＴＥＥは、１つまたは複数の配列セグメント中に編成することができる。配列セグメントは、本明細書で提供されるＴＥＥのうちの１つまたは複数を保持することができ、それぞれのＴＥＥは、１つまたは複数のコピーで存在する。複数の配列セグメントが翻訳エンハンサーポリヌクレオチド中に存在する場合、当該配列セグメントは、均一であっても不均一であってもよい。したがって、翻訳エンハンサーポリヌクレオチド中の複数の配列セグメントは、同一もしくは異なるタイプの本明細書で提供されるＴＥＥ、同一もしくは異なる数のＴＥＥのそれぞれのコピー、及び／または各配列セグメント内の同一もしくは異なるＴＥＥの編成を保持し得る。１つの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、翻訳エンハンサーポリヌクレオチド配列を含む。
【０３５９】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドの５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲは、ＷＯ１９９９／０２４５９５、ＷＯ２０１２／００９６４４、ＷＯ２００９／０７５８８６、ＷＯ２００７／０２５００８、ＷＯ１９９９／０２４５９５、ＷＯ２００１／０５５３７１、ＥＰ２６１０３４１Ａ１、ＥＰ２６１０３４０Ａ１、ＵＳ６３１０１９７、ＵＳ６８４９４０５、ＵＳ７４５６２７３、ＵＳ７１８３３９５、ＵＳ２００９／０２２６４７０、ＵＳ２０１１／０１２４１００、ＵＳ２００７／００４８７７６、ＵＳ２００９／００９３０４９、またはＵＳ２０１３／０１７７５８１に開示されている少なくとも１つのＴＥＥまたはその部分を含み、これらの文献のそれぞれの内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０３６０】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドの５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲは、ＵＳ２００９／０２２６４７０、ＵＳ２００７／００４８７７６、ＵＳ２０１３／０１７７５８１、ＵＳ２０１１／０１２４１００、ＷＯ１９９９／０２４５９５、ＷＯ２０１２／００９６４４、ＷＯ２００９／０７５８８６、ＷＯ２００７／０２５００８、ＥＰ２６１０３４１Ａ１、ＥＰ２６１０３４０Ａ１、ＵＳ６３１０１９７、ＵＳ６８４９４０５、ＵＳ７４５６２７３、ＵＳ７１８３３９５、Ｃｈａｐｐｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ２００４  １０１：９５９０−９５９４、Ｚｈｏｕｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ２００５  １０２：６２７３−６２７８及びＷｅｌｌｅｎｓｉｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃａｐ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ−ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ，”  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０１３、ＤＯＩ：１０．１０３８／ＮＭＥＴＨ．２５２２（付録表１及び付録表２）に開示されているＴＥＥに対して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるＴＥＥを含み、これらの文献のそれぞれの内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０３６１】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドの５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲは、ＵＳ２００９／０２２６４７０、ＵＳ２００７／００４８７７６、ＵＳ２０１３／０１７７５８１、ＵＳ２０１１／０１２４１００、ＷＯ１９９９／０２４５９５、ＷＯ２０１２／００９６４４、ＷＯ２００９／０７５８８６、ＷＯ２００７／０２５００８、ＥＰ２６１０３４１Ａ１、ＥＰ２６１０３４０Ａ１、ＵＳ６３１０１９７、ＵＳ６８４９４０５、ＵＳ７４５６２７３、ＵＳ７１８３３９５、Ｃｈａｐｐｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ２００４  １０１：９５９０−９５９４、Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ２００５  １０２：６２７３−６２７８及びＷｅｌｌｅｎｓｉｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃａｐ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ−ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ，”  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０１３，ＤＯＩ：１０．１０３８／ＮＭＥＴＨ．２５２２（付録表１及び付録表２）に開示されているＴＥＥ配列の５〜３０ヌクレオチド断片、５〜２５ヌクレオチド断片、５〜２０ヌクレオチド断片、５〜１５ヌクレオチド断片、または５〜１０ヌクレオチド断片（５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチドの断片を含む）から選択されるＴＥＥを含む。
【０３６２】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドの５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲは、ＵＳ７４５６２７３、ＵＳ７１８３３９５、ＵＳ２００９／００９３０４９、及びＷＯ２００１／０５５３７１のいずれかに記載の転写調節エレメントであるＴＥＥを含み、これらの文献のそれぞれの内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。転写調節エレメントは、限定するものではないが、ＵＳ７４５６２７３、ＵＳ７１８３３９５、ＵＳ２００９／００９３０４９、及びＷＯ２００１／０５５３７１に記載の方法などの当該技術分野において知られている方法によって特定することができる。
【０３６３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つのＴＥＥを含む５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲは、限定するものではないが、ベクター系または核酸ベクターなどのモノシストロニック配列中に組み込むことができる。非限定的な例として、ベクター系及び核酸ベクターには、ＵＳ７４５６２７３、ＵＳ７１８３３９５、ＵＳ２００７／００４８７７６、ＵＳ２００９／００９３０４９、ＵＳ２０１１／０１２４１００、ＷＯ２００７／０２５００８、及びＷＯ２００１／０５５３７１に記載のものを挙げることができる。
【０３６４】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドの５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲは、本明細書に記載のＴＥＥまたはその部分を含む。いくつかの実施形態では、３’ＵＴＲ中のＴＥＥは、５’ＵＴＲに位置するＴＥＥと同じであり得、及び／または異なり得る。
【０３６５】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドの５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５または６０個を超えるＴＥＥ配列を含み得る。１つの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドの５’ＵＴＲは、１〜６０、１〜５５、１〜５０、１〜４５、１〜４０、１〜３５、１〜３０、１〜２５、１〜２０、１〜１５、１〜１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１個のＴＥＥ配列を含み得る。本発明のポリヌクレオチドの５’ＵＴＲ中のＴＥＥ配列は、同じＴＥＥ配列であっても、異なるＴＥＥ配列であってもよい。本発明のポリヌクレオチドの５’ＵＴＲ中の異なるＴＥＥ配列の組み合わせは、異なるＴＥＥ配列のいずれかの２つ以上のコピーが組み込まれる組み合わせを含み得る。ＴＥＥ配列は、ＡＢＡＢＡＢもしくはＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢもしくはＡＢＣＡＢＣＡＢＣまたはその変形などの、１回、２回、３回、または３回を超えて反復するパターンであり得る。これらのパターンにおいて、それぞれの文字Ａ、Ｂ、またはＣは、異なるＴＥＥヌクレオチド配列を表す。
【０３６６】
いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲは、２つのＴＥＥ配列を分離するスペーサーを含む。非限定的な例として、スペーサーは、１５ヌクレオチドスペーサー及び／または当該技術分野において知られている他のスペーサーであり得る。別の非限定的な例として、５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲは、５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲでそれぞれ少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、少なくとも１０回、または１０回を超えて反復するＴＥＥ配列−スペーサーモジュールを含む。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回反復するＴＥＥ配列−スペーサーモジュールを含む。
【０３６７】
いくつかの実施形態では、２つのＴＥＥ配列を分離するスペーサーは、本発明のポリヌクレオチド、例えば、本明細書に記載のｍｉＲ配列（例えば、ｍｉＲ結合部位及びｍｉＲシード）の翻訳を制御することができる、当該技術分野において知られている他の配列を含み得る。非限定的な例として、２つのＴＥＥ配列を分離するために使用される各スペーサーは、異なるｍｉＲ配列またはｍｉＲ配列の構成要素（例えば、ｍｉＲシード配列）を含み得る。
【０３６８】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ｍｉＲ及び／またはＴＥＥ配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ配列及び／またはＴＥＥ配列を本発明のポリヌクレオチドに組み込むことで、ステムループ領域の形状を変化させ、翻訳を増加及び／または減少させることができる。例えば、Ｋｅｄｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１０  １２（１０）：１０１４−２０を参照のこと。当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０３６９】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位
本発明のポリヌクレオチドは、調節エレメント、例えば、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位、転写因子結合部位、構造化ｍＲＮＡ配列及び／またはモチーフ、内因性核酸結合分子に対する偽受容体として機能するように操作された人工結合部位、ならびにそれらの組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態では、そのような調節エレメントを含むポリヌクレオチドは、「センサー配列」を含むものと称される。センサー配列の非限定的な例は、米国特許公開第２０１４／０２００２６１号に記載されており、当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０３７０】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））は、目的のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、１つまたは複数のｍｉＲＮＡ結合部位（複数可）をさらに含む。ｍｉＲＮＡ結合部位（複数可）の包含または組み込みにより、天然ｍｉＲＮＡの組織特異的発現及び／または細胞型特異的発現に基づき、本発明のポリヌクレオチドの制御がなされ、その結果、ポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドの制御がなされる。
【０３７１】
ｍｉＲＮＡ、例えば、天然ｍｉＲＮＡは、ポリヌクレオチドに結合し、ポリヌクレオチドの安定性を低下させることまたはポリヌクレオチドの翻訳を阻害することのいずれかによって遺伝子発現を下方制御する、１９〜２５ヌクレオチド長のノンコーティングＲＮＡである。ｍｉＲＮＡ配列は、「シード」領域、すなわち、成熟ｍｉＲＮＡの位置２〜８の領域の配列を含む。ｍｉＲＮＡシードは、成熟ｍｉＲＮＡの位置２〜８または２〜７を含み得る。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡシードは、７ヌクレオチド（例えば、成熟ｍｉＲＮＡのヌクレオチド２〜８）を含み得、対応するｍｉＲＮＡ結合部位中のシード相補部位には、ｍｉＲＮＡの位置１に対向するアデノシン（Ａ）が隣接する。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡシードは、６ヌクレオチド（例えば、成熟ｍｉＲＮＡのヌクレオチド２〜７）を含み得、対応するｍｉＲＮＡ結合部位中のシード相補部位には、ｍｉＲＮＡの位置１に対向するアデノシン（Ａ）が隣接する。例えば、Ｇｒｉｍｓｏｎ  Ａ，Ｆａｒｈ  ＫＫ，Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ＷＫ，Ｇａｒｒｅｔｔ−Ｅｎｇｅｌｅ  Ｐ，Ｌｉｍ  ＬＰ，Ｂａｒｔｅｌ  ＤＰ；Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．２００７  Ｊｕｌ  ６；２７（１）：９１−１０５を参照のこと。標的細胞または組織のｍｉＲＮＡプロファイリングを実施して、その細胞または組織中にｍｉＲＮＡが存在するか存在しないかを決定することができる。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））は、１つまたは複数のマイクロＲＮＡ結合部位、マイクロＲＮＡ標的配列、マイクロＲＮＡ相補配列、またはマイクロＲＮＡシード相補配列を含む。そのような配列は、米国特許公開第ＵＳ２００５／０２６１２１８号及び米国特許公開第ＵＳ２００５／００５９００５号に教示されているものなどの任意の既知のマイクロＲＮＡに対応し、例えば、当該マイクロＲＮＡに対して相補性を有し得る。これらの文献のそれぞれの内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０３７２】
本明細書で使用されるとき、「マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲ）結合部位」という用語は、ｍｉＲＮＡのすべてまたは一領域に対して、ｍｉＲＮＡと相互作用、会合、または結合するのに十分な相補性を有する、５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲ中に含まれるポリヌクレオチド内の配列、例えば、ＤＮＡ内の配列またはＲＮＡ転写物内の配列を指す。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、目的のポリペプチドをコードするＯＲＦを含み、１つまたは複数のｍｉＲＮＡ結合部位（複数可）をさらに含む。例示の実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））の５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲは、１つまたは複数のｍｉＲＮＡ結合部位（複数可）を含む。
【０３７３】
ｍｉＲＮＡ結合部位がｍｉＲＮＡに対して十分な相補性を有するとは、ポリヌクレオチドのｍｉＲＮＡ媒介性制御、例えば、ポリヌクレオチドのｍｉＲＮＡ媒介性翻訳抑制または分解を促進するのに、相補性の程度が十分であることを指す。本発明の例示的な態様では、ｍｉＲＮＡ結合部位がｍｉＲＮＡに対して十分な相補性を有するとは、ポリヌクレオチドのｍｉＲＮＡ媒介性分解、例えば、ｍｉＲＮＡガイド付きＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）によるｍＲＮＡの切断を促進するのに、相補性の程度が十分であることを指す。ｍｉＲＮＡ結合部位は、例えば、１９〜２５ヌクレオチドのｍｉＲＮＡ配列、１９〜２３ヌクレオチドのｍｉＲＮＡ配列、または２２ヌクレオチドのｍｉＲＮＡ配列に対して相補性を有し得る。ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡの一部分のみ、例えば、全長天然ｍｉＲＮＡ配列のうちの１、２、３、または４ヌクレオチド少ない部分に対して相補的であり得る。所望の制御がｍＲＮＡ分解である場合、十分な相補性または完全な相補性（例えば、天然ｍｉＲＮＡの長さ全体または有意な部分にわたる十分な相補性または完全な相補性）が好ましい。
【０３７４】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡシード配列と相補性（例えば、部分的または完全な相補性）を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡシード配列と完全な相補性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡ配列と相補性（例えば、部分的または完全な相補性）を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡ配列と完全な相補性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、１、２、または３ヌクレオチドの置換、末端付加、及び／または末端切断を除いて、ｍｉＲＮＡ配列と完全な相補性を有する。
【０３７５】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡと同じ長さである。他の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、５’末端、３’末端、またはその両方で、対応するｍｉＲＮＡよりも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２ヌクレオチド短い。さらに他の実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位は、５’末端、３’末端、またはその両方で、対応するマイクロＲＮＡよりも２ヌクレオチド短い。対応するｍｉＲＮＡよりも短いｍｉＲＮＡ結合部位は、依然として、ｍｉＲＮＡ結合部位の１つもしくは複数を組み込んだｍＲＮＡを分解させることができ、またはｍＲＮＡの翻訳を妨げることができる。
【０３７６】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ダイサーを含有する活性型ＲＩＳＣの一部である対応する成熟ｍｉＲＮＡに結合する。別の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位がＲＩＳＣ中の対応するｍｉＲＮＡに結合すると、ｍｉＲＮＡ結合部位を含有するｍＲＮＡが分解されるか、またはｍＲＮＡの翻訳が妨げられる。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡに対し、ｍｉＲＮＡを含むＲＩＳＣ複合体が、ｍｉＲＮＡ結合部位を含むポリヌクレオチドを切断するのに十分な相補性を有する。他の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、不完全な相補性を有し、それにより、ｍｉＲＮＡを含むＲＩＳＣ複合体が、ｍｉＲＮＡ結合部位を含むポリヌクレオチドに不安定性を誘導する。別の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、不完全な相補性を有し、それにより、ｍｉＲＮＡを含むＲＩＳＣ複合体は、ｍｉＲＮＡ結合部位を含むポリヌクレオチドの翻訳を抑制する。
【０３７７】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡに対して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２のミスマッチを有する。
【０３７８】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡの少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、または少なくとも約２１の連続ヌクレオチドに対して相補的である、それぞれ少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、または少なくとも約２１の連続ヌクレオチドを有する。
【０３７９】
１つまたは複数のｍｉＲＮＡ結合部位を本発明のポリヌクレオチドに操作することによって、対象のｍｉＲＮＡが利用可能であれば、当該ポリヌクレオチドを分解または翻訳減少の標的にすることができる。これにより、ポリヌクレオチドの送達時におけるオフターゲット効果を減らすことができる。例えば、本発明のポリヌクレオチドがある組織または細胞に送達されることを意図しないものの、当該組織または細胞に行き着いてしまう場合、その組織または細胞に豊富に存在するｍｉＲＮＡの１つまたは複数の結合部位をポリヌクレオチドの５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲに操作すれば、そのｍｉＲＮＡが目的遺伝子の発現を阻害し得る。
【０３８０】
逆に、特定の組織におけるタンパク質発現を上昇させるために、ｍｉＲＮＡ結合部位を天然起源のポリヌクレオチド配列から除去することができる。例えば、特定のｍｉＲＮＡに対する結合部位をポリヌクレオチドから除去することで、当該ｍｉＲＮＡを含有する組織または細胞におけるタンパク質発現を改善することができる。
【０３８１】
１つの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、限定するものではないが、正常細胞及び／または癌性細胞などの特定の細胞に対する細胞傷害性または細胞保護性ｍＲＮＡ治療剤を制御するために、５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲ中に、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位を含み得る。別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、限定するものではないが、正常細胞及び／または癌性細胞などの特定の細胞に対する細胞傷害性または細胞保護性ｍＲＮＡ治療剤を制御するために、５’−ＵＴＲ及び／または３’−ＵＴＲ中に、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより多くのｍｉＲＮＡ結合部位を含み得る。
【０３８２】
複数の組織における発現の制御は、１つまたは複数のｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、１つまたは複数の別個のｍｉＲＮＡ結合部位の導入または除去により達成することができる。ｍｉＲＮＡ結合部位を除去するか、または挿入するかどうかの決定は、発症及び／または疾患状態の組織及び／または細胞におけるｍｉＲＮＡ発現パターン及び／またはそのプロファイリングに基づいて行うことができる。ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ結合部位、ならびにその発現パターン及び生物学的役割の特定は、報告されている（例えば、Ｂｏｎａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ２０１０  １１：９４３−９４９；Ａｎａｎｄ  ａｎｄ  Ｃｈｅｒｅｓｈ  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ２０１１  １８：１７１−１７６；Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ  ａｎｄ  Ｒａｏ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ２０１２  ２６：４０４−４１３（２０１１  Ｄｅｃ  ２０．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｌｅｕ．２０１１．３５６）；Ｂａｒｔｅｌ  Ｃｅｌｌ  ２００９  １３６：２１５−２３３；Ｌａｎｄｇｒａｆ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ，２００７  １２９：１４０１−１４１４；Ｇｅｎｔｎｅｒ  ａｎｄ  Ｎａｌｄｉｎｉ，Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ．２０１２  ８０：３９３−４０３及び当該文献中の全参考文献；これらの文献のそれぞれは、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。
【０３８３】
ｍｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ結合部位は、米国特許公開第２０１４／０２００２６１号、同第２００５／０２６１２１８号、及び同第２００５／００５９００５号に記載の非限定的な例を含む、任意の既知の配列に対応し得、これらの文献のそれぞれは、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０３８４】
ｍｉＲＮＡがｍＲＮＡを制御し、それにより、タンパク質発現を制御することが知られている組織の例には、肝臓（ｍｉＲ−１２２）、筋肉（ｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２０８）、内皮細胞（ｍｉＲ−１７−９２、ｍｉＲ−１２６）、骨髄細胞（ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２７）、脂肪組織（ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−３０ｃ）、心臓（ｍｉＲ−１ｄ、ｍｉＲ−１４９）、腎臓（ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−２０４）、及び肺上皮細胞（ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−１２６）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３８５】
具体的に、ｍｉＲＮＡは、抗原組織提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、樹状細胞及びマクロファージ）、マクロファージ、単球、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、顆粒球、ナチュラルキラー細胞などの免疫細胞（造血細胞とも呼ばれる）において差次的に発現することが知られている。免疫細胞特異的ｍｉＲＮＡは、免疫原性、自己免疫、感染に対する免疫応答、炎症、ならびに遺伝子治療及び組織／臓器移植後の望ましくない免疫応答に関与する。免疫細胞特異的ｍｉＲＮＡはまた、造血細胞（免疫細胞）の発生、増殖、分化及びアポトーシスの多くの局面を制御する。例えば、ｍｉＲ−１４２及びｍｉＲ−１４６は、免疫細胞内で排他的に発現し、特に、骨髄性樹状細胞で豊富である。ポリヌクレオチドの３’−ＵＴＲにｍｉＲ−１４２結合部位を付加することによって、ポリヌクレオチドに対する免疫応答を遮断することができ、それにより、組織及び細胞内での安定した遺伝子導入が可能になることが示されている。ｍｉＲ−１４２は、抗原提示細胞において外因性ポリヌクレオチドを効率的に分解することから、形質導入細胞の細胞傷害性排除を抑制する（例えば、Ａｎｎｏｎｉ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，ｂｌｏｏｄ，２００９，１１４，５１５２−５１６１；Ｂｒｏｗｎ  ＢＤ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  ｍｅｄ．２００６，１２（５），５８５−５９１；Ｂｒｏｗｎ  ＢＤ，ｅｔ  ａｌ．，ｂｌｏｏｄ，２００７，１１０（１３）：４１４４−４１５２，これらの文献のそれぞれは、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。
【０３８６】
抗原媒介性免疫応答は、生物に侵入すると、抗原提示細胞によって処理され、抗原提示細胞の表面上に提示される外来抗原によって惹起される免疫応答を指し得る。Ｔ細胞は、提示された抗原を認識し、抗原を発現する細胞の細胞傷害性排除を誘導することができる。
【０３８７】
本発明のポリヌクレオチドの５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲにｍｉＲ−１４２結合部位を導入することで、抗原提示細胞における遺伝子発現をｍｉＲ−１４２媒介性分解を介して選択的に抑制して、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）の抗原提示を制限することにより、ポリヌクレオチド送達後の抗原媒介性免疫応答を防ぐことができる。それにより、ポリヌクレオチドは、細胞傷害性排除を惹起することなく、標的の組織または細胞内で安定的に発現する。
【０３８８】
１つの実施形態では、免疫細胞、特に、抗原提示細胞で発現することが知られているｍｉＲＮＡに対する結合部位を本発明のポリヌクレオチド中に操作することで、抗原提示細胞におけるポリヌクレオチドの発現をｍｉＲＮＡ媒介性ＲＮＡ分解を介して抑制し、抗原媒介性免疫応答を軽減することができる。ポリヌクレオチドの発現は、免疫細胞特異的ｍｉＲＮＡが発現しない非免疫細胞では、維持される。例えば、いくつかの実施形態では、肝臓特異的タンパク質に対する免疫原性応答を防ぐために、任意のｍｉＲ−１２２結合部位を除去することができ、ｍｉＲ−１４２（及び／またはｍｉｒＲ−１４６）結合部位を本発明のポリヌクレオチドの５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲ中に操作することができる。
【０３８９】
１つの実施形態では、肝臓細胞で発現することが知られているｍｉＲＮＡに対する結合部位を本発明のポリヌクレオチド中に操作して、肝臓におけるポリヌクレオチドの発現を抑制することができる。例えば、いくつかの実施形態では、肝臓における抗原の発現を防ぐために、任意の肝臓特異的ｍｉＲ結合部位を本発明のポリヌクレオチドの５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲ中に操作することができる。
【０３９０】
ＡＰＣ及びマクロファージにおける選択的分解及び抑制をさらに誘導するために、本発明のポリヌクレオチドは、５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲ中に、単独で、あるいはｍｉＲ−１４２及び／またはｍｉＲ−１４６結合部位との組み合わせのいずれかで、さらなる負の制御要素を含み得る。非限定的な例として、さらなる負の制御要素は、構造的崩壊要素（ＣＤＥ）である。
【０３９１】
免疫細胞特異的ｍｉＲＮＡには、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−２−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−３ｐ、ｈｓａ−７ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｃ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ−５ｐ、ｍｉＲ−１０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１１８４、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−１−−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−２−−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−１−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１２７９、ｍｉＲ−１３０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１３２−３ｐ、ｍｉＲ−１３２−５ｐ、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１４３−３ｐ、ｍｉＲ−１４３−５ｐ、ｍｉＲ−１４６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１４６ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１４７ａ、ｍｉＲ−１４７ｂ、ｍｉＲ−１４８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５０−３ｐ、ｍｉＲ−１５０−５ｐ、ｍｉＲ−１５１ｂ、ｍｉＲ−１５５−３ｐ、ｍｉＲ−１５５−５ｐ、ｍｉＲ−１５ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１５ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１６−１−３ｐ、ｍｉＲ−１６−２−３ｐ、ｍｉＲ−１６−５ｐ、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ａ−２−３ｐ、ｍｉＲ−１８２−３ｐ、ｍｉＲ−１８２−５ｐ、ｍｉＲ−１９７−３ｐ、ｍｉＲ−１９７−５ｐ、ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｍｉＲ−２１−３ｐ、ｍｉＲ−２１４−３ｐ、ｍｉＲ−２１４−５ｐ、ｍｉＲ−２２３−３ｐ、ｍｉＲ−２２３−５ｐ、ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｍｉＲ−２２１−５ｐ、ｍｉＲ−２３ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２３ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２４−１−５ｐ、ｍｉＲ−２４−２−５ｐ、ｍｉＲ−２４−３ｐ、ｍｉＲ−２６ａ−１−３ｐ、ｍｉＲ−２６ａ−２−３ｐ、ｍｉＲ−２６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２６ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２７ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２８−３ｐ、ｍｉＲ−２８−５ｐ、ｍｉＲ−２９０９、ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｂ−１−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｂ−２−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−２９ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−３３１−５ｐ、ｍｉＲ−３３９−３ｐ、ｍｉＲ−３３９−５ｐ、ｍｉＲ−３４５−３ｐ、ｍｉＲ−３４５−５ｐ、ｍｉＲ−３４６、ｍｉＲ−３４ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ、、ｍｉＲ−３６３−３ｐ、ｍｉＲ−３６３−５ｐ、ｍｉＲ−３７２、ｍｉＲ−３７７−３ｐ、ｍｉＲ−３７７−５ｐ、ｍｉＲ−４９３−３ｐ、ｍｉＲ−４９３−５ｐ、ｍｉＲ−５４２、ｍｉＲ−５４８ｂ−５ｐ、ｍｉＲ５４８ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−５４８ｉ、ｍｉＲ−５４８ｊ、ｍｉＲ−５４８ｎ、ｍｉＲ−５７４−３ｐ、ｍｉＲ−５９８、ｍｉＲ−７１８、ｍｉＲ−９３５、ｍｉＲ−９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−９９ｂ−３ｐ、及びｍｉＲ−９９ｂ−５ｐが含まれるが、これらに限定されない。さらに、マイクロアレイハイブリダイゼーション及びミクロトーム解析により、免疫細胞中の新規ｍｉＲＮＡを特定することができる（例えば、Ｊｉｍａ  ＤＤ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ，２０１０，１１６：ｅ１１８−ｅ１２７；Ｖａｚ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２０１０，１１，２８８；これらの文献のそれぞれの内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。
【０３９２】
肝臓で発現することが知られているｍｉＲＮＡには、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−１２２−３ｐ、ｍｉＲ−１２２−５ｐ、ｍｉＲ−１２２８−３ｐ、ｍｉＲ−１２２８−５ｐ、ｍｉＲ−１２４９、ｍｉＲ−１２９−５ｐ、ｍｉＲ−１３０３、ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５１ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１５２、ｍｉＲ−１９４−３ｐ、ｍｉＲ−１９４−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２９６−５ｐ、ｍｉＲ−５５７、ｍｉＲ−５８１、ｍｉＲ−９３９−３ｐ、及びｍｉＲ−９３９−５ｐが含まれるが、これらに限定されない。任意の肝臓特異的ｍｉＲＮＡに由来するｍｉＲＮＡ結合部位を本発明のポリヌクレオチドに導入するか、または除去することで、肝臓におけるポリヌクレオチドの発現を制御することができる。肝臓特異的ｍｉＲＮＡ結合部位は、単独で操作されてもよいし、本発明のポリヌクレオチド中の免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位とさらに組み合わせて操作されてもよい。
【０３９３】
肺で発現することが知られているｍｉＲＮＡには、ｌｅｔ−７ａ−２−３ｐ、ｌｅｔ−７ａ−３ｐ、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１２６−３ｐ、ｍｉＲ−１２６−５ｐ、ｍｉＲ−１２７−３ｐ、ｍｉＲ−１２７−５ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１３０ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１３０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１３３ｂ、ｍｉＲ−１３４、ｍｉＲ−１８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１８ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１８ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２４−１−５ｐ、ｍｉＲ−２４−２−５ｐ、ｍｉＲ−２４−３ｐ、ｍｉＲ−２９６−３ｐ、ｍｉＲ−２９６−５ｐ、ｍｉＲ−３２−３ｐ、ｍｉＲ−３３７−３ｐ、ｍｉＲ−３３７−５ｐ、ｍｉＲ−３８１−３ｐ、及びｍｉＲ−３８１−５ｐが含まれるが、これらに限定されない。任意の肺特異的ｍｉＲＮＡに由来するｍｉＲＮＡ結合部位を本発明のポリヌクレオチドに導入するか、または除去することで、肺におけるポリヌクレオチドの発現を制御することができる。肺特異的ｍｉＲＮＡ結合部位は、単独で操作されてもよいし、本発明のポリヌクレオチド中の免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位とさらに組み合わせて操作されてもよい。
【０３９４】
心臓で発現することが知られているｍｉＲＮＡには、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１３３ｂ、ｍｉＲ−１４９−３ｐ、ｍｉＲ−１４９−５ｐ、ｍｉＲ−１８６−３ｐ、ｍｉＲ−１８６−５ｐ、ｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２９６−３ｐ、ｍｉＲ−３２０、ｍｉＲ−４５１ａ、ｍｉＲ−４５１ｂ、ｍｉＲ−４９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−４９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４９９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−４９９ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−７４４−３ｐ、ｍｉＲ−７４４−５ｐ、ｍｉＲ−９２ｂ−３ｐ、及びｍｉＲ−９２ｂ−５ｐが含まれるが、これらに限定されない。任意の心臓特異的マイクロＲＮＡに由来するｍｍｉＲＮＡ結合部位を本発明のポリヌクレオチドに導入するか、または除去することで、心臓におけるポリヌクレオチドの発現を制御することができる。心臓特異的ｍｉＲＮＡ結合部位は、単独で操作されてもよいし、本発明のポリヌクレオチド中の免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位とさらに組み合わせて操作されてもよい。
【０３９５】
神経系で発現することが知られているｍｉＲＮＡには、ｍｉＲ−１２４−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−１−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１２７１−３ｐ、ｍｉＲ−１２７１−５ｐ、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１３２−５ｐ、ｍｉＲ−１３５ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１３５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１３５ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１３５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−１３９−５ｐ、ｍｉＲ−１３９−３ｐ、ｍｉＲ−１４９−３ｐ、ｍｉＲ−１４９−５ｐ、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−１８１ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−１８１ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−１８３−３ｐ、ｍｉＲ−１８３−５ｐ、ｍｉＲ−１９０ａ、ｍｉＲ−１９０ｂ、ｍｉＲ−２１２−３ｐ、ｍｉＲ−２１２−５ｐ、ｍｉＲ−２１９−１−３ｐ、ｍｉＲ−２１９−２−３ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−１−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−２−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐ、ｍｉＲ−３２９、ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｍｉＲ−３６６５、ｍｉＲ−３６６６、ｍｉＲ−３８０−３ｐ、ｍｉＲ−３８０−５ｐ、ｍｉＲ−３８３、ｍｉＲ−４１０、ｍｉＲ−４２５−３ｐ、ｍｉＲ−４２５−５ｐ、ｍｉＲ−４５４−３ｐ、ｍｉＲ−４５４−５ｐ、ｍｉＲ−４８３、ｍｉＲ−５１０、ｍｉＲ−５１６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−５４８ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−５４８ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−５７１、ｍｉＲ−７−１−３ｐ、ｍｉＲ−７−２−３ｐ、ｍｉＲ−７−５ｐ、ｍｉＲ−８０２、ｍｉＲ−９２２、ｍｉＲ−９−３ｐ、及びｍｉＲ−９−５ｐが含まれるが、これらに限定されない。神経系内に豊富なｍｉＲＮＡには、限定するものではないが、ｍｉＲ−１３２−３ｐ、ｍｉＲ−１３２−３ｐ、ｍｉＲ−１４８ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１４８ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５１ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２１２−３ｐ、ｍｉＲ−２１２−５ｐ、ｍｉＲ−３２０ｂ、ｍｉＲ−３２０ｅ、ｍｉＲ−３２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３２３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３２４−５ｐ、ｍｉＲ−３２５、ｍｉＲ−３２６、ｍｉＲ−３２８、ｍｉＲ−９２２を含む、ニューロンに特異的に発現するもの、ならびにｍｉＲ−１２５０、ｍｉＲ−２１９−１−３ｐ、ｍｉＲ−２１９−２−３ｐ、ｍｉＲ−２１９−５ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０６５−３ｐ、ｍｉＲ−３０６５−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−３２−５ｐ、ｍｉＲ−３３８−５ｐ、及びｍｉＲ−６５７を含む、グリア細胞に特異的に発現するものがさらに含まれる。任意のＣＮＳ特異的ｍｉＲＮＡに由来するｍｉＲＮＡ結合部位を本発明のポリヌクレオチドに導入するか、または除去することで、神経系におけるポリヌクレオチドの発現を制御することができる。神経系特異的ｍｉＲＮＡ結合部位は、単独で操作されてもよいし、本発明のポリヌクレオチド中の免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位とさらに組み合わせて操作されてもよい。
【０３９６】
膵臓で発現することが知られているｍｉＲＮＡには、ｍｉＲ−１０５−３ｐ、ｍｉＲ−１０５−５ｐ、ｍｉＲ−１８４、ｍｉＲ−１９５−３ｐ、ｍｉＲ−１９５−５ｐ、ｍｉＲ−１９６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２１４−３ｐ、ｍｉＲ−２１４−５ｐ、ｍｉＲ−２１６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２１６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３７５、ｍｉＲ−７−１−３ｐ、ｍｉＲ−７−２−３ｐ、ｍｉＲ−４９３−３ｐ、ｍｉＲ−４９３−５ｐ、及びｍｉＲ−９４４が含まれるが、これらに限定されない。任意の膵臓特異的ｍｉＲＮＡに由来するｍｉＲＮＡ結合部位を本発明のポリヌクレオチドに導入するか、または除去することで、膵臓におけるポリヌクレオチドの発現を制御することができる。膵臓特異的ｍｉＲＮＡ結合部位は、単独で操作されてもよいし、本発明のポリヌクレオチド中の免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位とさらに組み合わせて操作されてもよい。
【０３９７】
腎臓で発現することが知られているｍｉＲＮＡには、ｍｉＲ−１２２−３ｐ、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１９２−３ｐ、ｍｉＲ−１９２−５ｐ、ｍｉＲ−１９４−３ｐ、ｍｉＲ−１９４−５ｐ、ｍｉＲ−２０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２０４−３ｐ、ｍｉＲ−２０４−５ｐ、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２１６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２１６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２９６−３ｐ、ｍｉＲ−３０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−１−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−２−３ｐ、ｍｉＲ３０ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３２４−３ｐ、ｍｉＲ−３３５−３ｐ、ｍｉＲ−３３５−５ｐ、ｍｉＲ−３６３−３ｐ、ｍｉＲ−３６３−５ｐ、及びｍｉＲ−５６２が含まれるが、これらに限定されない。任意の腎臓特異的ｍｉＲＮＡに由来するｍｉＲＮＡ結合部位を本発明のポリヌクレオチドに導入するか、または除去することで、腎臓におけるポリヌクレオチドの発現を制御することができる。腎臓特異的ｍｉＲＮＡ結合部位は、単独で操作されてもよいし、本発明のポリヌクレオチド中の免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位とさらに組み合わせて操作されてもよい。
【０３９８】
筋肉で発現することが知られているｍｉＲＮＡには、ｌｅｔ−７ｇ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｇ−５ｐ、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１２８６、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１３３ｂ、ｍｉＲ−１４０−３ｐ、ｍｉＲ−１４３−３ｐ、ｍｉＲ−１４３−５ｐ、ｍｉＲ−１４５−３ｐ、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−１８８−３ｐ、ｍｉＲ−１８８−５ｐ、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、ｍｉＲ−２５−３ｐ、及びｍｉＲ−２５−５ｐが含まれるが、これらに限定されない。任意の筋肉特異的ｍｉＲＮＡに由来するｍｉＲＮＡ結合部位を本発明のポリヌクレオチドに導入するか、または除去することで、筋肉におけるポリヌクレオチドの発現を制御することができる。筋肉特異的ｍｉＲＮＡ結合部位は、単独で操作されてもよいし、本発明のポリヌクレオチド中の免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位とさらに組み合わせて操作されてもよい。
【０３９９】
ｍｉＲＮＡはまた、限定するものではないが、内皮細胞、上皮細胞、及び脂肪細胞などの異なる細胞種で差次的に発現される。
【０４００】
内皮細胞で発現することが知られているｍｉＲＮＡには、ｌｅｔ−７ｂ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１００−３ｐ、ｍｉＲ−１００−５ｐ、ｍｉＲ−１０１−３ｐ、ｍｉＲ−１０１−５ｐ、ｍｉＲ−１２６−３ｐ、ｍｉＲ−１２６−５ｐ、ｍｉＲ−１２３６−３ｐ、ｍｉＲ−１２３６−５ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１７−３ｐ、ｍｉＲ−１８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９ｂ−１−５ｐ、ｍｉＲ−１９ｂ−２−５ｐ、ｍｉＲ−１９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２１−３ｐ、ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｍｉＲ−２２１−５ｐ、ｍｉＲ−２２２−３ｐ、ｍｉＲ−２２２−５ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２９６−５ｐ、ｍｉＲ−３６１−３ｐ、ｍｉＲ−３６１−５ｐ、ｍｉＲ−４２１、ｍｉＲ−４２４−３ｐ、ｍｉＲ−４２４−５ｐ、ｍｉＲ−５１３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−９２ａ−１−５ｐ、ｍｉＲ−９２ａ−２−５ｐ、ｍｉＲ−９２ａ−３ｐ、ｍｉＲ−９２ｂ−３ｐ、及びｍｉＲ−９２ｂ−５ｐが含まれるが、これらに限定されない。新規ｍｉＲＮＡは、ディープシークエンシング解析より、内皮細胞で多く発見されている（例えば、Ｖｏｅｌｌｅｎｋｌｅ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ，２０１２，１８，４７２−４８４；当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。任意の内皮細胞特異的ｍｉＲＮＡに由来するｍｉＲＮＡ結合部位を本発明のポリヌクレオチドに導入するか、または除去することで、内皮細胞におけるポリヌクレオチドの発現を制御することができる。
【０４０１】
上皮細胞で発現することが知られているｍｉＲＮＡには、呼吸繊毛上皮細胞に特異的なｌｅｔ−７ｂ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１２４６、ｍｉＲ−２００ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２００ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２００ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２００ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２００ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−２００ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３３８−３ｐ、ｍｉＲ−４２９、ｍｉＲ−４５１ａ、ｍｉＲ−４５１ｂ、ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−８０２及びｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３４ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３４ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−４４９ａ、ｍｉＲ−４４９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−４４９ｂ−５ｐ、肺上皮細胞に特異的なｌｅｔ−７ファミリー、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１３３ｂ、ｍｉＲ−１２６、腎臓上皮細胞に特異的なｍｉＲ−３８２−３ｐ、ｍｉＲ−３８２−５ｐ、ならびに角膜上皮細胞に特異的なｍｉＲ−７６２が含まれるが、これらに限定されない。任意の上皮細胞特異的ｍｉＲＮＡに由来するｍｉＲＮＡ結合部位を本発明のポリヌクレオチドに導入するか、または除去することで、上皮細胞におけるポリヌクレオチドの発現を制御することができる。
【０４０２】
加えて、大きなｍｉＲＮＡ群が胚幹細胞内に多く存在し、幹細胞の自己再生を制御するとともに、神経細胞、心細胞、造血細胞、皮膚細胞、骨形成原細胞及び筋肉細胞などのさまざまな細胞系統の発生及び／または分化を制御している（例えば、Ｋｕｐｐｕｓａｍｙ  ＫＴ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｍｏｌ  Ｍｅｄ，２０１３，１３（５），７５７−７６４；Ｖｉｄｉｇａｌ  ＪＡ  ａｎｄ  Ｖｅｎｔｕｒａ  Ａ，Ｓｅｍｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．２０１２，２２（５−６），４２８−４３６；Ｇｏｆｆ  ＬＡ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２００９，４：ｅ７１９２；Ｍｏｒｉｎ  ＲＤ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ，２００８，１８，６１０−６２１；Ｙｏｏ  ＪＫ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ．２０１２，２１（１１），２０４９−２０５７；これらの文献のそれぞれは、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。胚幹細胞に豊富に存在するｍｉＲＮＡには、ｌｅｔ−７ａ−２−３ｐ、ｌｅｔ−ａ−３ｐ、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｌｅｔ７ｄ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｄ−５ｐ、ｍｉＲ−１０３ａ−２−３ｐ、ｍｉＲ−１０３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１０６ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１０６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１２４６、ｍｉＲ−１２７５、ｍｉＲ−１３８−１−３ｐ、ｍｉＲ−１３８−２−３ｐ、ｍｉＲ−１３８−５ｐ、ｍｉＲ−１５４−３ｐ、ｍｉＲ−１５４−５ｐ、ｍｉＲ−２００ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−２００ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−２９０、ｍｉＲ−３０１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３０１ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０２ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３０２ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０２ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−３０２ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３０２ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−３０２ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３０２ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−３０２ｄ−５ｐ、ｍｉＲ−３０２ｅ、ｍｉＲ−３６７−３ｐ、ｍｉＲ−３６７−５ｐ、ｍｉＲ−３６９−３ｐ、ｍｉＲ−３６９−５ｐ、ｍｉＲ−３７０、ｍｉＲ−３７１、ｍｉＲ−３７３、ｍｉＲ−３８０−５ｐ、ｍｉＲ−４２３−３ｐ、ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｍｉＲ−４８６−５ｐ、ｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−５４８ｅ、ｍｉＲ−５４８ｆ、ｍｉＲ−５４８ｇ−３ｐ、ｍｉＲ−５４８ｇ−５ｐ、ｍｉＲ−５４８ｉ、ｍｉＲ−５４８ｋ、ｍｉＲ−５４８ｌ、ｍｉＲ−５４８ｍ、ｍｉＲ−５４８ｎ、ｍｉＲ−５４８ｏ−３ｐ、ｍｉＲ−５４８ｏ−５ｐ、ｍｉＲ−５４８ｐ、ｍｉＲ−６６４ａ−３ｐ、ｍｉＲ−６６４ａ−５ｐ、ｍｉＲ−６６４ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−６６４ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−７６６−３ｐ、ｍｉＲ−７６６−５ｐ、ｍｉＲ−８８５−３ｐ、ｍｉＲ−８８５−５ｐ、ｍｉＲ−９３−３ｐ、ｍｉＲ−９３−５ｐ、ｍｉＲ−９４１、ｍｉＲ−９６−３ｐ、ｍｉＲ−９６−５ｐ、ｍｉＲ−９９ｂ−３ｐ及びｍｉＲ−９９ｂ−５ｐが含まれるが、これらに限定されない。ヒト胚幹細胞のディープシークエンシングにより、新規予測ｍｉＲＮＡが多く発見されている（例えば、Ｍｏｒｉｎ  ＲＤ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ，２００８，１８，６１０−６２１；Ｇｏｆｆ  ＬＡ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２００９，４：ｅ７１９２；Ｂａｒ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ，２００８，２６，２４９６−２５０５；これらの文献のそれぞれの内容は、その全体が参照によって本明細書��組み込まれる）。
【０４０３】
多くのｍｉＲＮＡ発現研究は、さまざまな癌細胞／癌組織及び他の疾患におけるｍｉＲＮＡの発現差をプロファイリングするために実施される。いくつかのｍｉＲＮＡは、ある特定の癌細胞で異常に過剰発現し、他の細胞では発現が少ない。例えば、ｍｉＲＮＡは、癌細胞（ＷＯ２００８／１５４０９８、ＵＳ２０１３／００５９０１５、ＵＳ２０１３／００４２３３３、ＷＯ２０１１／１５７２９４）；癌幹細胞（ＵＳ２０１２／００５３２２４）；膵癌及び膵疾患（ＵＳ２００９／０１３１３４８、ＵＳ２０１１／０１７１６４６、ＵＳ２０１０／０２８６２３２、ＵＳ８３８９２１０）；喘息及び炎症（ＵＳ８４１５０９６）；前立腺癌（ＵＳ２０１３／００５３２６４）；肝細胞癌（ＷＯ２０１２／１５１２１２、ＵＳ２０１２／０３２９６７２、ＷＯ２００８／０５４８２８、ＵＳ８２５２５３８）；肺癌細胞（ＷＯ２０１１／０７６１４３、ＷＯ２０１３／０３３６４０、ＷＯ２００９／０７０６５３、ＵＳ２０１０／０３２３３５７）；皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＷＯ２０１３／０１１３７８）；結腸直腸癌細胞（ＷＯ２０１１／０２８１７５６、ＷＯ２０１１／０７６１４２）；癌陽性リンパ節（ＷＯ２００９／１００４３０、ＵＳ２００９／０２６３８０３）；鼻咽腔癌（ＥＰ２１１２２３５）；慢性閉塞性肺疾患（ＵＳ２０１２／０２６４６２６、ＵＳ２０１３／００５３２６３）；甲状腺癌（ＷＯ２０１３／０６６６７８）；卵巣癌細胞（ＵＳ２０１２／０３０９６４５、ＷＯ２０１１／０９５６２３）；乳癌細胞（ＷＯ２００８／１５４０９８、ＷＯ２００７／０８１７４０、ＵＳ２０１２／０２１４６９９）、白血病及びリンパ腫（ＷＯ２００８／０７３９１５、ＵＳ２００９／００９２９７４、ＵＳ２０１２／０３１６０８１、ＵＳ２０１２／０２８３３１０、ＷＯ２０１０／０１８５６３、これらの文献のそれぞれの内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）で差次的に発現する。
【０４０４】
非限定的な例として、ある特定の癌細胞及び／または腫瘍細胞で過剰発現しているｍｉＲＮＡに対するｍｉＲＮＡ結合部位を本発明のポリヌクレオチドの３’ＵＴＲから除去し、癌細胞で過剰発現しているｍｉＲＮＡによって抑制された発現を回復させ、それにより、対応する生物学的機能、例えば、転写の刺激及び／または抑制、細胞周期停止、アポトーシスならびに細胞死を改善することができる。ｍｉＲＮＡ発現が上方制御されていない正常な細胞及び組織は、影響を受けない。
【０４０５】
ｍｉＲＮＡは、血管新生などの複雑な生物学的過程を制御することもできる（例えば、ｍｉＲ−１３２）（Ａｎａｎｄ  ａｎｄ  Ｃｈｅｒｅｓｈ  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ２０１１  １８：１７１−１７６）。本発明のポリヌクレオチドにおいて、そのような過程に関与するｍｉＲＮＡ結合部位を除去または導入して、当該ポリヌクレオチドの発現を、生物学的に関連する細胞型または関連する生物学的過程に合うように調整することができる。この文脈において、本発明のポリヌクレオチドは、栄養要求性ポリヌクレオチドと定義される。
【０４０６】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ結合部位を含み、当該ｍｉＲＮＡ結合部位は、表１から選択されるか、または本明細書に別途記載される１つまたは複数のヌクレオチド配列を含み、ｍｉＲＮＡ結合部位配列のうちのいずれか１つまたは複数の１つまたは複数のコピーを含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、表１から選択されるか、または本明細書に別途記載される、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより多くの同じまたは異なるｍｉＲＮＡ結合部位（これらの任意の組み合わせを含む）をさらに含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ−１４２に結合するか、またはｍｉＲ−１４２に対して相補的である。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−１４２は、配列番号３０３を含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ−１４２−３ｐまたはｍｉＲ−１４２−５ｐに結合する。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位は、配列番号３０５を含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−１４２−５ｐ結合部位は、配列番号３０７を含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、配列番号３０５または３０７に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。
【表２】
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【０４０７】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ポリヌクレオチドの任意の位置（例えば、５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲ）で、本発明のポリヌクレオチド中に挿入される。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲは、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。いくつかの実施形態では、３’ＵＴＲは、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲは、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。ポリヌクレオチドへの挿入部位は、ポリヌクレオチドへのｍｉＲＮＡ結合部位の挿入が、対応するｍｉＲＮＡの非存在下で機能性ポリペプチドの翻訳に干渉せず、またｍｉＲＮＡの存在下では、ポリヌクレオチドへのｍｉＲＮＡ結合部位の挿入及びｍｉＲＮＡ結合部位の対応するｍｉＲＮＡへの結合により、ポリヌクレオチドを分解することができ、またはポリヌクレオチドの翻訳を妨げることができる限り、ポリヌクレオチド内のどこの位置であってもよい。
【０４０８】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ＯＲＦを含む本発明のポリヌクレオチド中のＯＲＦの終止コドンから少なくとも約３０ヌクレオチド下流に挿入される。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、本発明のポリヌクレオチド中のＯＲＦの終止コドンから少なくとも約１０ヌクレオチド、少なくとも約１５ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約２５ヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約３５ヌクレオチド、少なくとも約４０ヌクレオチド、少なくとも約４５ヌクレオチド、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約５５ヌクレオチド、少なくとも約６０ヌクレオチド、少なくとも約６５ヌクレオチド、少なくとも約７０ヌクレオチド、少なくとも約７５ヌクレオチド、少なくとも約８０ヌクレオチド、少なくとも約８５ヌクレオチド、少なくとも約９０ヌクレオチド、少なくとも約９５ヌクレオチド、または少なくとも約１００ヌクレオチド下流に挿入される。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、本発明のポリヌクレオチド中のＯＲＦの終止コドンから約１０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド〜約９０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド〜約８０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド〜約６０ヌクレオチド、約４５ヌクレオチド〜約６５ヌクレオチド下流に挿入される。
【０４０９】
ｍｉＲＮＡ遺伝子制御は、限定するものではないが、周辺配列の種、配列のタイプ（例えば、異種、相同、外因性、内因性、または人工）、周辺配列内の制御要素及び／または周辺配列内の構造要素などの、ｍｉＲＮＡの周辺にある配列から影響を受け得る。ｍｉＲＮＡは、５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲによる影響を受け得る。非限定的な例として、非ヒト３’ＵＴＲは、同じ配列タイプのヒト３’ＵＴＲと比較して、目的のポリペプチドの発現に対する当該ｍｉＲＮＡ配列の制御的作用を増加させることができる。
【０４１０】
１つの実施形態では、５’ＵＴＲの他の制御要素及び／または構造要素は、ｍｉＲＮＡ媒介性遺伝子制御に影響を与え得る。制御要素及び／または構造要素の一例は、５’ＵＴＲ中の構造化ＩＲＥＳ（配列内リボソーム進入部位）であり、これは、タンパク質翻訳を開始するための翻訳伸長因子の結合に必要である。５’−ＵＴＲ中のこの二次構造化要素へのＥＩＦ４Ａ２の結合は、ｍｉＲＮＡ媒介性遺伝子発現に必要である（Ｍｅｉｊｅｒ  ＨＡ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１３，３４０，８２−８５、当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。本発明のポリヌクレオチドは、マイクロＲＮＡ媒介性遺伝子制御を高めるために、この構造化５’ＵＴＲをさらに含み得る。
【０４１１】
少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位が本発明のポリヌクレオチドの３’ＵＴＲ中に操作され得る。この文脈において、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、またはそれより多くのＲＮＡ結合部位が本発明のポリヌクレオチドの３’ＵＴＲ中に操作され得る。例えば、１〜１０、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、２、または１つのｍｉＲＮＡ結合部位が本発明のポリヌクレオチドの３’ＵＴＲ中に操作され得る。１つの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドに組み込まれるｍｉＲＮＡ結合部位は、同じｍｉＲＮＡ部位であってもよいし、異なるｍｉＲＮＡ部位であってもよい。本発明のポリヌクレオチドに組み込まれる異なるｍｉＲＮＡ結合部位の組み合わせは、異なるｍｉＲＮＡ部位のいずれかの２つ以上のコピーが組み込まれる組み合わせを含み得る。別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドに組み込まれるｍｉＲＮＡ結合部位は、体内の同じ組織または異なる組織を標的にすることができる。非限定的な例として、本発明のポリヌクレオチドの３’−ＵＴＲに組織特異的、細胞種特異的、または疾患特異的ｍｉＲＮＡ結合部位を導入することにより、特定の細胞種（例えば、肝細胞、骨髄細胞、内皮細胞、癌細胞など）における発現の程度を低下させることができる。
【０４１２】
１つの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、本発明のポリヌクレオチドの３’ＵＴＲの５’末端近傍、３’ＵＴＲの５’末端と３’末端の約半分のところ、及び／または３’ＵＴＲの３’末端近傍に操作され得る。非限定的な例として、ｍｉＲＮＡ結合部位は、３’ＵＴＲの５’末端近傍、及び３’ＵＴＲの５’末端と３’末端の約半分のところに操作され得る。別の非限定的な例として、ｍｉＲＮＡ結合部位は、３’ＵＴＲの３’末端近傍、及び３’ＵＴＲの５’末端と３’末端の約半分のところに操作され得る。さらに別の非限定的な例として、ｍｉＲＮＡ結合部位は、３’ＵＴＲの５’末端近傍及び３’ＵＴＲの３’末端近傍に操作され得る。
【０４１３】
別の実施形態では、３’ＵＴＲは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のｍｉＲＮＡ結合部位を含み得る。ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡシード配列、及び／またはシード配列に隣接するｍｉＲＮＡ配列に対して相補的であり得る。
【０４１４】
１つの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、対象の異なる組織または異なる細胞種において発現するｍｉＲＮＡ部位を２つ以上含むように操作することができる。非限定的な例として、本発明のポリヌクレオチドは、対象の肝臓及び腎臓におけるポリヌクレオチドの発現を制御するために、ｍｉＲ−１９２及びｍｉＲ−１２２を含むように操作することができる。別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、同じ組織に対するｍｉＲＮＡ部位を２つ以上含むように操作することができる。
【０４１５】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに関係する治療濃度域及びまたは発現差を、ｍｉＲＮＡ結合部位により変更することができる。例えば、癌細胞のｍｉＲＮＡの特徴により、死亡シグナルをもたらすポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが癌細胞でより高度に発現されるように設計することができる。癌細胞が特定のｍｉＲＮＡを低レベルで発現する場合、当該ｍｉＲＮＡ（または複数のｍｉＲＮＡ）に対する結合部位をコードするポリヌクレオチドは、より高度に発現される。したがって、死亡シグナルをもたらすポリペプチドは、癌細胞の細胞死を惹起または誘導する。同じｍｉＲＮＡを高度に発現する、隣接する非癌細胞は、そのｍｉＲＮＡが３’ＵＴＲにコードされる結合部位または「センサー」に結合する作用により当該ポリヌクレオチドが低レベルで発現されるので、コードされた死亡シグナルによる影響を受けにくい。逆に、あるｍｉＲＮＡが癌細胞で高度に発現する場合には、細胞生存シグナルまたは細胞保護性シグナルを癌含有組織及び非癌性細胞に送達することができ、その結果、癌細胞に対する生存シグナルが低くなり、正常細胞に対する生存シグナルが大きくなる。本明細書に記載のｍｉＲＮＡ結合部位の使用に基づいて、異なるシグナルを有する複数のポリヌクレオチドを設計及び投与することができる。
【０４１６】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドの発現は、少なくとも１つのｍｉＲ結合部位またはセンサー配列をポリヌクレオチドに組み込み、投与用にポリヌクレオチドを製剤化することによって、制御することができる。非限定的な例として、本発明のポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ結合部位を組み込み、本明細書に記載の脂質のいずれかを含むイオン化可能な脂質（例えば、カチオン性脂質）を含む脂質ナノ粒子中にポリヌクレオチドを製剤化することによって、組織または細胞に標的化することができる。
【０４１７】
本発明のポリヌクレオチドは、異なる組織、細胞種、または生物学的条件におけるｍｉＲＮＡの発現パターンに基づいて、特定の組織、細胞種、または生物学的条件においてより標的化された発現がなされるように操作することができる。組織特異的ｍｉＲＮＡ結合部位を導入することで、本発明のポリヌクレオチドは、組織もしくは細胞において、または生物学的条件の点で、最適のタンパク質発現を得るように設計することができる。
【０４１８】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、既知のｍｉＲＮＡシード配列に対して１００％の同一性またはｍｉＲＮＡシード配列に対して１００％未満の同一性のいずれかを有するｍｉＲＮＡ結合部位が組み込まれるように設計することができる。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、既知のｍｉＲＮＡシード配列に対して、少なくとも：６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するｍｉＲＮＡ結合部位が組み込まれるように設計することができる。ｍｉＲＮＡシード配列は、ｍｉＲＮＡ結合親和性を低下させるように部分的に変異させてもよく、それにより、ポリヌクレオチドの下方調節が減少する。本質的に、ｍｉＲＮＡ結合部位とｍｉＲＮＡシードとの間の一致または不一致の程度は、タンパク質発現を調節するｍｉＲＮＡの能力をより細かく調整するレオスタットとして機能し得る。加えて、ｍｉＲＮＡ結合部位の非シード領域内の変異も、タンパク質発現を調節するｍｉＲＮＡの能力に影響を与え得る。
【０４１９】
１つの実施形態では、ｍｉＲＮＡ配列は、ステムループのループ内に組み込むことができる。
【０４２０】
別の実施形態では、ｍｉＲＮＡシード配列は、ステムループのループ内に組み込むことができ、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ステムループの５’ステム内または３’ステム内に組み込むことができる。。
【０４２１】
１つの実施形態では、翻訳エンハンサー要素（ＴＥＥ）は、ステムループのステムの５’末端に組み込むことができ、ｍｉＲＮＡシードは、ステムループのステム内に組み込むことができる。別の実施形態では、ＴＥＥは、ステムループのステムの５’末端に組み込むことができ、ｍｉＲＮＡシードは、ステムループのステム内に組み込むことができ、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ステムループのステムの３’末端またはステムループ後の配列内に組み込むことができる。ｍｉＲＮＡシード及びｍｉＲＮＡ結合部位は、同じ及び／または異なるｍｉＲＮＡ配列に対するものであってよい。
【０４２２】
１つの実施形態では、ｍｉＲＮＡ配列及び／またはＴＥＥ配列を組み込むことにより、ステムループ領域の形状を変化させ、翻訳を増加及び／または減少させることができる（例えば、Ｋｅｄｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａ  Ｐｕｍｉｌｉｏ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ＲＮＡ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｓｗｉｔｃｈ  ｉｎ  ｐ２７−３’ＵＴＲ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｍｉＲ−２２１  ａｎｄ  ｍｉＲ−２２  ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ．”  Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．２０１０を参照のこと。当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。
【０４２３】
１つの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドの５’−ＵＴＲは、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ配列を含み得る。ｍｉＲＮＡ配列は、限定するものではないが、１９または２２ヌクレオチド配列及び／またはシードを含まないｍｉＲＮＡ配列であり得る。
【０４２４】
１つの実施形態では、５’ＵＴＲ中のｍｉＲＮＡ配列は、本明細書に記載の本発明のポリヌクレオチドを安定化するために使用することができる。
【０４２５】
別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドの５’ＵＴＲ中のｍｉＲＮＡ配列は、限定するものではないが、開始コドンなどの翻訳開始部位へのアクセス可能性を低下させるために使用することができる。例えば、最初の開始コドン（ＡＵＧ）へのアクセス可能性を低下させるために、開始コドン（−４〜＋３７、ここでＡＵＧコドンのＡが＋１）の周りにアンチセンスロックド核酸（ＬＮＡ）オリゴヌクレオチド及びエクソンジャンクション複合体（ＥＪＣ）を使用した、Ｍａｔｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１０  １１（５）：ｅ１５０５７を参照のこと。当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。Ｍａｔｓｕｄａにより、ＬＮＡまたはＥＪＣを用いて開始コドン周辺の配列を変えることは、ポリヌクレオチドの効率、長さ及び構造安定性に影響することが示された。本発明のポリヌクレオチドは、翻訳開始部位へのアクセス可能性を低下させるために、Ｍａｔｓｕｄａらによって記載されたＬＮＡ配列またはＥＪＣ配列の代わりに、翻訳開始部位近傍にｍｉＲＮＡ配列を含み得る。翻訳開始部位は、ｍｉＲＮＡ配列の前、配列の後、または配列内にあってよい。非限定的な例として、翻訳開始部位は、シード配列または結合部位などのｍｉＲＮＡ配列内に位置し得る。別の非限定的な例として、翻訳開始部位は、シード配列またはｍｉｒ−１２２結合部位などのｍｉＲ−１２２配列内に位置し得る。
【０４２６】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、抗原提示細胞による抗原提示を減らすために、少なくとも１つのｍｉＲＮＡを含み得る。ｍｉＲＮＡは、完全なｍｉＲＮＡ配列、ｍｉＲＮＡシード配列、シードを含まないｍｉＲＮＡ配列、またはそれらの組み合わせであり得る。非限定的な例として、本発明のポリヌクレオチドを組み込んだｍｉＲＮＡは、造血系に特異的であり得る。別の非限定的な例として、抗原提示を減らすために本発明のポリヌクレオチドに組み込まれるｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１４２−３ｐである。
【０４２７】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、目的の組織または細胞におけるコードされたポリペプチドの発現を減らすために、少なくとも１つのｍｉＲＮＡを含み得る。非限定的な例として、本発明のポリヌクレオチドは、肝臓におけるコードされた目的ポリペプチドの発現を減らすために、少なくとも１つのｍｉＲ−１２２結合部位を含み得る。別の非限定的な例として、本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも１つのｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位、ｍｉＲ−１４２−３ｐシード配列、シードを含まないｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位、ｍｉＲ−１４２−５ｐ結合部位、ｍｉＲ−１４２−５ｐシード配列、シードを含まないｍｉＲ−１４２−５ｐ結合部位、ｍｉＲ−１４６結合部位、ｍｉＲ−１４６シード配列及び／またはシード配列を含まないｍｉＲ−１４６結合部位を含み得る。
【０４２８】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、免疫細胞においてｍＲＮＡ治療剤を選択的に分解し、治療剤の送達によって引き起こされる望ましくない免疫原性応答を抑制するために、３’ＵＴＲ中に少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位を含み得る。非限定的な例として、ｍｉＲＮＡ結合部位は、抗原提示細胞において、本発明のポリヌクレオチドをより不安定にすることができる。これらのｍｉＲＮＡの非限定的な例には、ｍｉｒ−１４２−５ｐ、ｍｉｒ−１４２−３ｐ、ｍｉｒ−１４６ａ−５ｐ、及びｍｉｒ−１４６−３ｐが挙げられる。
【０４２９】
１つの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ結合タンパク質と相互作用することができるポリヌクレオチドの領域内に少なくとも１つのｍｉＲＮＡ配列を含む。
【０４３０】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、（ｉ）１つまたは複数の野生型エピトープ抗原をコードする配列最適化されたヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）と、（ｉｉ）ｍｉＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ−１４２に結合するｍｉＲＮＡ結合部位）と、を含む。
【０４３１】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に開示の１つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードするウラシル修飾配列と、本明細書に開示のｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、ｍｉＲ−１４２に結合するｍｉＲＮＡ結合部位と、を含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードするウラシル修飾配列は、少なくとも１つの化学的に修飾された核酸塩基、例えば、５−メトキシウラシルを含む。いくつかの実施形態では、本発明の１つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードするウラシル修飾配列中の核酸塩基の一種（例えば、ウラシル）の少なくとも９５％は、修飾された核酸塩基である。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードするウラシル修飾配列中のウラシルの少なくとも９５％は、５−メトキシウリジンである。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の１つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、ｍｉＲＮＡ結合部位と、を含む、ポリヌクレオチドは、送達剤、例えば、式（Ｉ）、（ＩＡ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）または（ＩＩｅ）、例えば、化合物１〜２３２のいずれかを有する脂質を含む、ＬＮＰを用いて製剤化される。
【０４３２】
３’ＵＴＲ及びＡＵリッチ要素
ある特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、本発明の癌抗原エピトープをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、３’ＵＴＲをさらに含む。ある特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、本発明の活性化癌遺伝子変異ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、３’ＵＴＲをさらに含む。
【０４３３】
３’−ＵＴＲは、翻訳終止コドンのすぐ後に続くｍＲＮＡのセクションであり、多くの場合、転写後の遺伝子発現に影響を与える制御領域を含有する。３’−ＵＴＲ内の制御領域は、ｍＲＮＡのポリアデニル化、翻訳効率、局在化、及び安定性に影響し得る。１つの実施形態では、本発明に有用な３’−ＵＴＲは、制御タンパク質またはマイクロＲＮＡに対する結合部位を含む。いくつかの実施形態では、３’−ＵＴＲは、リプレッサータンパク質に結合し、ｍＲＮＡの発現を阻害する、サイレンサー領域を有する。他の実施形態では、３’−ＵＴＲは、ＡＵリッチ要素を含む。タンパク質は、ＡＲＥに結合し、局所的に転写物の安定性もしくは崩壊率に影響を与えるか、または翻訳開始に影響を与える。他の実施形態では、３’−ＵＴＲは、ｍＲＮＡ転写物の末端にポリ（Ａ）テールと呼ばれる数百のアデニン残基の付加を導く、配列ＡＡＵＡＡＡを含む。
【０４３４】
天然または野生型３’ＵＴＲは、アデノシン及びウリジンのストレッチが埋め込まれていることが知られている。これらのＡＵが豊富という特徴は、特に、代謝率の高い遺伝子に一般にみられる。この配列の特徴及び機能特性に基づいて、ＡＵリッチ要素（ＡＲＥ）は、次の３つのクラスに分類することができる（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９５）：クラスＩのＡＲＥは、Ｕリッチ領域内にＡＵＵＵＡモチーフの分散コピーをいくつか含有する。Ｃ−Ｍｙｃ及びＭｙｏＤは、クラスＩのＡＲＥを含有する。クラスＩＩのＡＲＥは、２つ以上の重複するＵＵＡＵＵＵＡ（Ｕ／Ａ）（Ｕ／Ａ）九量体を保有する。このタイプのＡＲＥを含有する分子には、ＧＭ−ＣＳＦ及びＴＮＦ−ａが含まれる。クラスＩＩＩのＡＲＥは、あまり明確にされていない。これらのＵリッチ領域は、ＡＵＵＵＡモチーフを含有しない。よく研究されているこのクラスの例には、ｃ−Ｊｕｎとミオゲニンの２つがある。ＡＲＥに結合するタンパク質のほとんどは、メッセンジャーを不安定にすることが知られているが、ＥＬＡＶファミリーのメンバー、特にＨｕＲは、ｍＲＮＡの安定性を高めることが実証されている。ＨｕＲは、ＡＲＥのすべての３つのクラスに結合する。核酸分子の３’ＵＴＲ中にＨｕＲ特異的結合部位を操作すると、ＨｕＲ結合が生じ、それにより、インビボにおけるメッセージの安定化につながる。
【０４３５】
３’ＵＴＲ  ＡＵリッチ要素（ＡＲＥ）の導入、除去または修飾は、本発明のポリヌクレオチドの安定性を調節するために使用することができる。特定のポリヌクレオチドを操作する場合、ＡＲＥの１つまたは複数のコピーは、本発明のポリヌクレオチドの安定性が低下するように導入され得、それにより、翻訳を抑制し、結果として生じるタンパク質の産生を減少させる。同様に、細胞内安定性を高めるＡＲＥを特定し、除去または変異させることで、翻訳及び結果として生じるタンパク質の産生を増加させる。本発明のポリヌクレオチドを使用したトランスフェクション実験を関連細胞株で実施することができ、タンパク質産生を、トランスフェクション後のさまざまな時点でアッセイすることができる。例えば、異なるＡＲＥ操作分子を細胞にトランスフェクトすることができ、関連タンパク質に対するＥＬＩＳＡキットを使用し、トランスフェクションから６時間後、１２時間後、２４時間後、４８時間後、及び７日後に産生されたタンパク質をアッセイすることができる。
【０４３６】
５’キャップを有する領域
本発明はまた、５’キャップと、本発明のポリヌクレオチド（例えば、活性化癌遺伝子変異ペプチドなどの癌抗原エピトープをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）の両方を含む、ポリヌクレオチドを含む。
【０４３７】
天然ｍＲＮＡの５’キャップ構造は、ｍＲＮＡ安定性を高める核輸送に関与し、ｍＲＮＡキャップ結合タンパク質（ＣＢＰ）に結合する。これは、ＣＢＰとポリ（Ａ）結合タンパク質との会合を介して、細胞におけるｍＲＮＡ安定性及び翻訳能力に関与し、成熟した環状ｍＲＮＡ種を形成する。キャップは、さらに、ｍＲＮＡスプライシング中の５’側イントロンの除去も補助する。
【０４３８】
内因性ｍＲＮＡ分子は、５’−末端がキャップされ得、それにより、ｍＲＮＡ分子の末端のグアノシンキャップ残基と５’−末端転写センスヌクレオチドとの間に５’−ｐｐｐ−５’−トリホスフェート結合が生じる。次いで、この５’−グアニル酸キャップがメチル化されて、Ｎ７−メチル−グアニル酸残基が生じ得る。ｍＲＮＡの５’末端の末端及び／または末端前の転写ヌクレオチドのリボース糖も、任意選択で２’−Ｏ−メチル化され得る。グアニル酸キャップ構造の加水分解及び切断による５’−脱キャップは、ｍＲＮＡ分子などの核酸分子を分解の標的にし得る。
【０４３９】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、癌抗原エピトープをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）には、キャップ部分を組み込む。
【０４４０】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、活性化癌遺伝子変異ペプチドなどの癌抗原エピトープをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、非加水分解型キャップ構造を含み、それにより、脱キャップが防止され、ｍＲＮＡ半減期が長くなる。キャップ構造の加水分解は、５’−ｐｐｐ−５’ホスホロジエステル結合の切断を必要とするので、キャッピング反応中に修飾ヌクレオチドを使用することができる。例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）のワクシニアキャッピング酵素をα−チオ−グアノシンヌクレオチドとともに製造元の説明書に従って使用して、５’−ｐｐｐ−５’キャップ中にホスホロチオエート結合を作ることができる。α−メチル−ホスホネート及びセレノ−ホスフェートヌクレオチドなどの追加の修飾グアノシンヌクレオチドを使用することもできる。
【０４４１】
追加の修飾には、糖環の２’−ヒドロキシル基上における、ポリヌクレオチド（上記のもの）の５’−末端及び／または５’−末端前のヌクレオチドのリボース糖の２’−Ｏ−メチル化が含まれるが、これらに限定されない。複数の異なる５’−キャップ構造を使用して、ｍＲＮＡ分子として機能するポリヌクレオチドなどの核酸分子の５’−キャップを生成してもよい。キャップ類似体は、本明細書において、合成キャップ類似体、化学的キャップ、化学的キャップ類似体、または構造的もしくは機能的キャップ類似体とも呼ばれ、その化学構造は、天然（すなわち、内因性、野生型または生理学的）５’−キャップとは異なるが、キャップ機能は保持している。キャップ類似体は、化学的（すなわち、非酵素的）にまたは酵素的に合成し、及び／または本発明のポリヌクレオチドに連結することができる。
【０４４２】
例えば、抗リバースキャップ類似体（ＡＲＣＡ）のキャップは、５’−５’−トリホスフェート基によって連結された２つのグアニンを含有し、１つのグアニンは、Ｎ７メチル基及び３’−Ｏ−メチル基を含有する（すなわち、Ｎ７，３’−Ｏ−ジメチル−グアノシン−５’−トリホスフェート−５’−グアノシン（ｍ７Ｇ−３’ｍｐｐｐ−Ｇ；これは、等価的に３’Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇとも記述され得る）。他方の修飾されていないグアニンの３’−Ｏ原子は、キャップされたポリヌクレオチドの５’−末端ヌクレオチドに連結される。Ｎ７−及び３’−Ｏ−メチル化グアニンは、キャップされたポリヌクレオチドの末端部分を提供する。
【０４４３】
別のキャップの例は、ｍＣＡＰである。これは、ＡＲＣＡに類似しているが、グアノシンに２’−Ｏ−メチル基を有する（すなわち、Ｎ７，２’−Ｏ−ジメチル−グアノシン−５’−トリホスフェート−５’−グアノシン、ｍ７Ｇｍ−ｐｐｐ−Ｇ）。
【０４４４】
いくつかの実施形態では、キャップは、ジヌクレオチドキャップ類似体である。非限定的な例として、ジヌクレオチドキャップ類似体は、米国特許第ＵＳ８，５１９，１１０号に記載のジヌクレオチドキャップ類似体のように、異なるホスフェート位置をボラノホスフェート基またはホスホロセレノエート基で修飾することができ、当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０４４５】
別の実施形態では、キャップは、キャップ類似体であり、当該技術分野において知られている及び／または本明細書に記載のＮ７−（４−クロロフェノキシエチル）置換ジヌクレオチド形態のキャップ類似体である。Ｎ７−（４−クロロフェノキシエチル）置換ジヌクレオチド形態のキャップ類似体の非限定的な例には、Ｎ７−（４−クロロフェノキシエチル）−Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップ類似体及びＮ７−（４−クロロフェノキシエチル）−ｍ３’−ＯＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップ類似体が挙げられる（例えば、Ｋｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０１３  ２１：４５７０−４５７４に記載されているさまざまなキャップ類似体及びキャップ類似体の合成方法を参照のこと；当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。別の実施形態では、本発明のキャップ類似体は、４−クロロ／ブロモフェノキシエチル類似体である。
【０４４６】
キャップ類似体により、ポリヌクレオチドまたはその領域の付随するキャップ付加が可能になるのに対し、インビトロ転写反応では、転写物の最大２０％がキャップされないまま残り得る。これは、内因性細胞転写機構によって産生される核酸の内因性５’−キャップ構造とキャップ類似体との構造的相違に加え、翻訳能力の低下及び細胞安定性の低下をもたらし得る。
【０４４７】
本発明のポリヌクレオチド（例えば、癌抗原エピトープをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）はまた、より真正な５’−キャップ構造を生成するために、製造後に酵素を使用してキャップ付加することができる（ＩＶＴまたは化学合成を問わない）。本明細書で使用されるとき、「より真正な」という語句は、構造的または機能的に内因性または野生型の特徴を厳密に反映または模倣する特徴を指す。すなわち、「より真正な」特徴は、先行技術の合成的な特徴または類似体などと比較して、内因性、野生型、天然または生理学的な細胞機能及び／または構造をよりよく表すものであるか、あるいは、１つまたは複数の点で対応する内因性、野生型、天然または生理学的な特徴よりも優れているものである。本発明のより真正な５’キャップ構造の非限定的な例は、とりわけ、当該技術分野において知られている合成５’キャップ構造（または野生型、天然もしくは生理学的な５’キャップ構造）と比較して、キャップ結合タンパク質の結合の増強、半減期の延長、５’エンドヌクレアーゼに対する感受性の低下及び／または５’脱キャップの低下がなされているものである。例えば、組み換えワクシニアウイルスキャッピング酵素及び組み換え２’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ酵素は、ポリヌクレオチドの５’−末端ヌクレオチドとグアニンキャップヌクレオチドとの間に標準型５’−５’−トリホスフェート結合を生成することができる。ここで、キャップグアニンは、Ｎ７メチル化を含有し、ｍＲＮＡの５’−末端ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルを含有する。そのような構造は、キャップ１構造と呼ばれる。このキャップは、例えば、当該技術分野において知られている他の５’キャップ類似体構造と比較して、翻訳能力及び細胞安定性の向上、ならびに細胞炎症促進性サイトカインの活性化の低下をもたらす。キャップ構造には、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ，ｐＮ２ｐ（キャップ０）、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐ（キャップ１）、及び７ｍＧ（５’）−ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮ２ｍｐ（キャップ２）が含まれるが、これらに限定されない。
【０４４８】
非限定的な例として、製造後のキメラポリヌクレオチドのキャップ付加は、キメラポリヌクレオチドのほぼ１００％をキャップ付加できるため、より効率的であり得る。これは、キャップ類似体がインビトロ転写反応の過程でキメラポリヌクレオチドに結合する場合の約８０％とは対照的である。
【０４４９】
本発明によれば、５’末端キャップは、内因性キャップまたはキャップ類似体を含み得る。本発明によれば、５’末端キャップは、グアニン類似体を含み得る。有用なグアニン類似体には、イノシン、Ｎ１−メチル−グアノシン、２’フルオロ−グアノシン、７−デアザ−グアノシン、８−オキソ−グアノシン、２−アミノ−グアノシン、ＬＮＡ−グアノシン、及び２−アジド−グアノシンが含まれるが、これらに限定されない。
【０４５０】
ポリＡテール
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、活性化癌遺伝子変異ペプチドなどの癌抗原エピトープをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、ポリＡテールをさらに含む。さらなる実施形態では、安定化のために、ポリＡテールの末端基を組み込むことができる。他の実施形態では、ポリＡテールは、ｄｅｓ−３’ヒドロキシルテールを含む。
【０４５１】
ＲＮＡプロセシング中には、安定性を高めるために、長鎖アデニンヌクレオチド（ポリＡテール）がｍＲＮＡ分子などのポリヌクレオチドに付加され得る。転写直後に、転写物の３’末端が切断され、３’ヒドロキシルを遊離させることができる。次いで、ポリＡポリメラーゼがアデニンヌクレオチド鎖をＲＮＡに付加する。ポリアデニル化と呼ばれるこのプロセスは、例えば、およそ８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０または２５０残基長を含む、およそ８０〜およそ２５０残基長であり得るポリＡテールを付加する。
【０４５２】
ポリＡテールはまた、構築物が核から輸出された後に付加され得る。
【０４５３】
本発明によれば、ポリＡテールの末端基は、安定化のために組み込むことができる。本発明のポリヌクレオチドは、ｄｅｓ−３’ヒドロキシルテールを含み得る。本発明のポリヌクレオチドはまた、Ｊｕｎｊｉｅ  Ｌｉ，ｅｔ  ａｌ．（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５，１５０１−１５０７，Ａｕｇｕｓｔ  ２３，２００５；当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）によって教示される構造部分または２’−Ｏメチル修飾を含み得る。
【０４５４】
本発明のポリヌクレオチドは、ヒストンｍＲＮＡを含む代替ポリＡテール構造を持つ転写物をコードするように設計され得る。Ｎｏｒｂｕｒｙによれば、「末端ウリジル化は、ヒト複製依存性ヒストンｍＲＮＡでも検出されている。これらのｍＲＮＡの代謝は、染色体ＤＮＡ複製の完了または阻害後に、潜在的に有毒なヒストンが蓄積するのを防ぐのに重要だと考えられている。これらのｍＲＮＡは、３’ポリ（Ａ）テールの欠如により区別され、その機能は、安定なステムループ構造及びその同族のステムループ結合タンパク質（ＳＬＢＰ）が代わりに担い、後者は、ポリアデニル化ｍＲＮＡに対するＰＡＢＰの機能と同じ機能を果たす」（Ｎｏｒｂｕｒｙ，“Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ＲＮＡ：ａ  ｃａｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔａｉｌ  ｗａｇｇｉｎｇ  ｔｈｅ  ｄｏｇ，”  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ；ＡＯＰ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ２９  Ａｕｇｕｓｔ  ２０１３；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｍ３６４５）当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０４５５】
特有のポリＡテール長は、本発明のポリヌクレオチドにある特定の利点を与える。一般に、ポリＡテールの長さは、存在する場合、３０ヌクレオチド長を超える。別の実施形態では、ポリＡテールは、３５ヌクレオチド長を超える（例えば、少なくとも約３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，５００、及び３，０００ヌクレオチド、またはそれを超える）。
【０４５６】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドまたはその領域は、約３０〜約３，０００ヌクレオチド（例えば、３０〜５０、３０〜１００、３０〜２５０、３０〜５００、３０〜７５０、３０〜１，０００、３０〜１，５００、３０〜２，０００、３０〜２，５００、５０〜１００、５０〜２５０、５０〜５００、５０〜７５０、５０〜１，０００、５０〜１，５００、５０〜２，０００、５０〜２，５００、５０〜３，０００、１００〜５００、１００〜７５０、１００〜１，０００、１００〜１，５００、１００〜２，０００、１００〜２，５００、１００〜３，０００、５００〜７５０、５００〜１，０００、５００〜１，５００、５００〜２，０００、５００〜２，５００、５００〜３，０００、１，０００〜１，５００、１，０００〜２，０００、１，０００〜２，５００、１，０００〜３，０００、１，５００〜２，０００、１，５００〜２，５００、１，５００〜３，０００、２，０００〜３，０００、２，０００〜２，５００、及び２，５００〜３，０００）を含む。
【０４５７】
いくつかの実施形態では、ポリＡテールは、ポリヌクレオチド全体の長さまたはのポリヌクレオチドの特定の領域の長さに関連して設計される。この設計は、コーディング領域の長さ、特定の特徴もしくは領域の長さに基づいてもよいし、またはポリヌクレオチドから発現される最終産物の長さに基づいてもよい。
【０４５８】
これに関し、ポリＡテールは、長さが、ポリヌクレオチドまたはその特徴よりも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００％長くてもよい。ポリＡテールはまた、そのポリＡテールが属するポリヌクレオチドの一部として設計することができる。これに関し、ポリＡテールは、構築物の全長、構築物領域または構築物の全長からポリＡテールを差し引いた長さに対して、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、もしくは９０％またはそれより長くてもよい。さらに、結合部位の操作及びポリヌクレオチドのポリＡ結合タンパク質への結合は、発現を増強し得る。
【０４５９】
加えて、複数の異なるポリヌクレオチドが、ＰＡＢＰ（ポリＡ結合タンパク質）を介して、ポリＡテールの３’末端にある修飾ヌクレオチドを使用して、３’−末端で一緒に連結され得る。関連細胞株でトランスフェクション実験を実施することができ、タンパク質産生を、トランスフェクションから１２時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後及び７日後にＥＬＩＳＡによってアッセイすることができる。
【０４６０】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ポリＡ−Ｇカルテット領域を含むように設計される。Ｇカルテットは、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方でＧリッチ配列によって形成され得る、４つのグアニンヌクレオチドの環状水素結合アレイである。本実施形態では、Ｇカルテットは、ポリＡテールの末端に組み込まれる。結果として得られるポリヌクレオチドは、さまざまな時点における、安定性、タンパク質産生及び半減期を含む他のパラメータについて、アッセイすることができる。ポリＡ−Ｇカルテットによって生じるｍＲＮＡからのタンパク質産生は、１２０ヌクレオチドのみのポリＡテールを使用したときにみられるタンパク質産生の少なくとも７５％に相当することが発見されている。
【０４６１】
開始コドン領域
本発明はまた、開始コドン領域と、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、活性化癌遺伝子変異ペプチドなどの癌抗原エピトープをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）の両方を含む、ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、開始コドン領域に類似する領域または開始コドン領域と同様に機能する領域を有し得る。
【０４６２】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの翻訳は、開始コドンＡＵＧではないコドンから開始され得る。ポリヌクレオチドの翻訳は、限定するものではないが、ＡＣＧ、ＡＧＧ、ＡＡＧ、ＣＴＧ／ＣＵＧ、ＧＴＧ／ＧＵＧ、ＡＴＡ／ＡＵＡ、ＡＴＴ／ＡＵＵ、ＴＴＧ／ＵＵＧなどの代替開始コドンから開始され得る（Ｔｏｕｒｉｏｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ  ９５（２００３）１６９−１７８及びＭａｔｓｕｄａ  ａｎｄ  Ｍａｕｒｏ  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ，２０１０  ５：１１を参照のこと；これらの文献のそれぞれの内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。
【０４６３】
非限定的な例として、ポリヌクレオチドの翻訳は、代替開始コドンＡＣＧから開始する。別の非限定的な例として、ポリヌクレオチド翻訳は、代替開始コドンＣＴＧまたはＣＵＧから開始する。さらなる別の非限定的な例として、ポリヌクレオチドの翻訳は、代替開始コドンＧＴＧまたはＧＵＧから開始する。
【０４６４】
翻訳を開始するコドン、例えば、限定するものではないが、開始コドンまたは代替開始コドンに隣接するヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの翻訳効率、長さ及び／または構造に影響を与えることが知られている（例えば、Ｍａｔｓｕｄａ  ａｎｄ  Ｍａｕｒｏ  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ，２０１０  ５：１１を参照のこと；当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。翻訳を開始するコドンに隣接するヌクレオチドのいずれかをマスキングすることを利用して、ポリヌクレオチドの翻訳開始位置、翻訳効率、長さ及び／または構造を変更することができる。
【０４６５】
いくつかの実施形態では、開始コドンまたは代替開始コドンの近傍でマスキング剤を使用して当該コドンをマスキングまたは遮蔽し、マスキングされた開始コドンまたは代替開始コドンで翻訳が開始される確率を低下させることができる。マスキング剤の非限定的な例には、アンチセンスロックド核酸（ＬＮＡ）ポリヌクレオチド及びエクソンジャンクション複合体（ＥＪＣ）が挙げられる（例えば、マスキング剤であるＬＮＡポリヌクレオチド及びＥＪＣについて記載するＭａｔｓｕｄａ  ａｎｄ  Ｍａｕｒｏ（ＰＬｏＳ  ＯＮＥ，２０１０５：１１）を参照のこと；当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。
【０４６６】
別の実施形態では、ポリヌクレオチドの開始コドンをマスキング剤を使用してマスキングし、代替開始コドンで翻訳が開始される可能性を高めることができる。いくつかの実施形態では、第１の開始コドンまたは代替開始コドンをマスキング剤を使用してマスキングし、マスキングされた開始コドンまたは代替開始コドンの下流にある開始コドンまたは代替開始コドンで翻訳が開始される可能性を高めることができる。
【０４６７】
いくつかの実施形態では、開始コドンまたは代替開始コドンは、ｍｉＲ結合部位に対する完全な相補体内に位置し得る。ｍｉＲ結合部位の完全な相補体は、マスキング剤と同様に、ポリヌクレオチドの翻訳、長さ及び／または構造を制御する助けとなり得る。非限定的な例として、開始コドンまたは代替開始コドンは、ｍｉＲＮＡ結合部位に対する完全な相補体の中央に位置し得る。開始コドンまたは代替開始コドンは、第１ヌクレオチド、第２ヌクレオチド、第３ヌクレオチド、第４ヌクレオチド、第５ヌクレオチド、第６ヌクレオチド、第７ヌクレオチド、第８ヌクレオチド、第９ヌクレオチド、第１０ヌクレオチド、第１１ヌクレオチド、第１２ヌクレオチド、第１３ヌクレオチド、第１４ヌクレオチド、第１５ヌクレオチド、第１６ヌクレオチド、第１７ヌクレオチド、第１８ヌクレオチド、第１９ヌクレオチド、第２０ヌクレオチドまたは第２１ヌクレオチドの後に位置し得る。
【０４６８】
別の実施形態では、ポリヌクレオチドの翻訳を開始コドンではないコドンから開始させるために、ポリヌクレオチドの開始コドンをポリヌクレオチド配列から除去してもよい。ポリヌクレオチドの翻訳は、除去された開始コドンの後にあるコドンまたは下流の開始コドンもしくは代替開始コドンで開始され得る。非限定的な例では、翻訳を下流の開始コドンまたは代替開始コドンから開始させるために、ポリヌクレオチド配列の最初の３ヌクレオチドである開始コドンＡＴＧまたはＡＵＧが除去される。開始コドンが除去されたポリヌクレオチド配列は、翻訳の開始、ポリヌクレオチドの長さ及び／またはポリヌクレオチドの構造を制御または制御を試みるために、下流の開始コドン及び／または代替開始コドンに対する少なくとも１つのマスキング剤をさらに含み得る。
【０４６９】
終止コドン領域
本発明はまた、終止コドン領域と、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、活性化癌遺伝子変異ペプチドなどの癌抗原エピトープをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）の両方を含む、ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の前に少なくとも２つの終止コドンを含み得る。終止コドンは、ＤＮＡの場合はＴＧＡ、ＴＡＡ及びＴＡＧから、またはＲＮＡの場合はＵＧＡ、ＵＡＡ及びＵＡＧから選択することができる。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡの場合は終止コドンＴＧＡ、またはＲＮＡの場合は終止コドンＵＧＡと、１つの追加の終止コドンと、を含む。さらなる実施形態では、追加の終止コドンは、ＴＡＡまたはＵＡＡであり得る。別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、３つの連続する終止コドン、４つの終止コドン、またはそれより多くの終止コドンを含む。
【０４７０】
挿入及び置換
本発明はまた、挿入及び／または置換をさらに含む、本開示のポリヌクレオチドを含む。
【０４７１】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの５’ＵＴＲは、同一塩基のヌクレオシドの少なくとも１つの領域及び／またはストリングの挿入によって置換され得る。ヌクレオチドの領域及び／またはストリングは、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７または少なくとも８ヌクレオチドを含み得るが、これらに限定されず、ヌクレオチドは、天然及び／または非天然であってよい。非限定的な例として、ヌクレオチド基は、５〜８個のアデニン、シトシン、チミン、本明細書に開示の他のヌクレオチドのいずれかのストリング及び／またはその組み合わせを含み得る。
【０４７２】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの５’ＵＴＲは、限定するものではないが、アデニン、シトシン、チミン、本明細書に開示の他のヌクレオチドのいずれか及び／またはそれらの組み合わせなどの２つの異なる塩基のヌクレオチドの少なくとも２つの領域及び／またはストリングの挿入によって置換され得る。例えば、５’ＵＴＲは、５〜８個のアデニン塩基を挿入し、それに続いて５〜８個のシトシン塩基を挿入することによって置換され得る。別の例では、５’ＵＴＲは、５〜８個のシトシン塩基を挿入し、それに続いて５〜８個のアデニン塩基を挿入することによって置換され得る。
【０４７３】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡポリメラーゼによって認識され得る転写開始部位の下流に、少なくとも１つの置換及び／または挿入を含み得る。非限定的な例として、少なくとも１つの置換及び／または挿入は、転写開始部位の下流に存在し得、これは、転写開始部位のすぐ下流の領域内（限定するものではないが、＋１〜＋６など）の少なくとも１つの核酸が置換されることによる。転写開始部位のすぐ下流にあるヌクレオチド領域を変化させることは、開始速度に影響を与え、見かけのヌクレオチドトリホスフェート（ＮＴＰ）反応定数値を大きくし、初期転写をキュアリングする転写複合体からの短い転写物の解離を増加させ得る（Ｂｒｉｅｂａ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００２）４１：５１４４−５１４９；当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。少なくとも１つのヌクレオシドの修飾、置換及び／または挿入は、配列のサイレント変異をもたらし得るか、またはアミノ酸配列の変異をもたらし得る。
【０４７４】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、転写開始部位の下流に、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２または少なくとも１３個のグアニン塩基の置換を含み得る。
【０４７５】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、転写開始部位のすぐ下流の領域内に、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５または少なくとも６個のグアニン塩基の置換を含み得る。非限定的な例として、領域内のヌクレオチドがＧＧＧＡＧＡである場合、グアニン塩基は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３または少なくとも４個のアデニンヌクレオチドで置換され得る。別の非限定的な例では、領域内のヌクレオチドがＧＧＧＡＧＡである場合、グアニン塩基は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３または少なくとも４個のシトシン塩基で置換され得る。別の非限定的な例では、領域内のヌクレオチドがＧＧＧＡＧＡである場合、グアニン塩基は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３もしくは少なくとも４個のチミン、及び／または本明細書に記載のヌクレオチドのいずれかで置換され得る。
【０４７６】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、開始コドンの上流に少なくとも１つの置換及び／または挿入を含み得る。明確さを期すために記すが、当業者であれば、開始コドンは、タンパク質コーディング領域の最初のコドンであり、転写開始部位は、転写が開始される部位であることを理解するであろう。ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド塩基の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つまたは少なくとも８つの置換及び／または挿入を含み得るが、これらに限定されない。ヌクレオチド塩基は、開始コドンの上流の１つ、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つまたは少なくとも５つの位置に挿入または置換され得る。挿入及び／または置換されるヌクレオチドは、同じ塩基（例えば、すべてＡまたはすべてＣまたはすべてＴまたはすべてＧ）、２つの異なる塩基（例えば、Ａ及びＣ、Ａ及びＴ、またはＣ及びＴ）、３つの異なる塩基（例えば、Ａ、Ｃ及びＴまたはＡ、Ｃ及びＴ）または少なくとも４つの異なる塩基であってよい。
【０４７７】
非限定的な例として、ポリヌクレオチド内のコーディング領域の上流にあるグアニン塩基は、アデニン、シトシン、チミン、または本明細書に記載のヌクレオチドのいずれかで置換され得る。別の非限定的な例では、ポリヌクレオチド内のグアニン塩基の置換は、グアニン塩基が、転写開始部位の下流かつ開始コドンの前にある領域内に１つ残るように設計され得る（Ｅｓｖｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ（２０１１）４７２（７３４４）：４９９−５０３を参照のこと；当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。非限定的な例として、転写開始部位の下流であるが、開始コドンの上流である１つの位置に少なくとも５個のヌクレオチドが挿入され得、少なくとも５個のヌクレオチドは、同じ塩基型であってよい。
【０４７８】
本開示に従って、例えばトリホスフェートケミストリーを使用し、キメラポリヌクレオチドの２つの領域または部分を連結またはライゲーションしてよい。いくつかの実施形態では、１００以下のヌクレオチドの第１の領域または部分は、化学的に合成され、５’はモノホスフェートとなり、末端の３’−ＯＨは除去または遮断される。領域が８０ヌクレオチドより長いのであれば、後にライゲーションによって化学的に連結されることになる２つ以上の鎖として合成してよい。第１の領域または部分が、ＩＶＴを使用して、非位置的に修飾された領域または部分として合成されるのであれば、その後に、５’−モノホスフェートへと変換し、続けて３’末端のキャッピングを実施してよい。モノホスフェート保護基は、当該技術分野で知られるもののいずれから選択してもよい。キメラポリヌクレオチドの第２の領域または部分は、例えば本明細書に記載の、化学合成法またはＩＶＴ法のいずれを使用して合成してもよい。ＩＶＴ法は、修飾されたキャップを有するプライマーを利用することができるＲＮＡポリメラーゼの使用を含み得る。あるいは、キャップは、化学的に合成し、ＩＶＴの領域または部分にカップリングさせてよい。
【０４７９】
ライゲーション方法については、ＤＮＡ  Ｔ４リガーゼでのライゲーションの後に、（ＤＮＡ  Ｔ４リガーゼの活性に必要になるＤＮＡスプリントを除去するために）ＤＮＡｓｅで処理することで、望ましくない連結産物形成が容易に阻止されるであろうことに留意されたい。
【０４８０】
キメラポリヌクレオチド全体がホスフェート−糖骨格で製造される必要はない。領域または部分の１つがポリペプチドをコードするのであれば、そのような領域または部分は、ホスフェート−糖骨格を含むことが好ましい。
【０４８１】
ライゲーションは、酵素的ライゲーション、クリックケミストリー、オルトクリックケミストリー、ソルリンク（ｓｏｌｕｌｉｎｋ）、または当業者に知られる他の生体複合化ケミストリーなどの、任意の適切な技術を使用して実施してよい。いくつかの実施形態では、ライゲーションは、相補的オリゴヌクレオチドスプリントによって誘導される。いくつかの実施形態では、ライゲーションは、相補的オリゴヌクレオチドスプリントなしで実施される。
【０４８２】
他の態様では、本発明は、ＩＶＴ法によるｍＲＮＡ癌ワクチンの調製を目的とするキットに関する。個別化癌ワクチンでは、患者特異的変異を同定し、１つまたは複数のネオエピトープで患者にワクチン接種を施すことが重要である。そのようなワクチンでは、ｍＲＮＡのＯＲＦによってコードされる抗原（複数可）は、患者特異的ということになる。抗原（複数可）をコードするＲＮＡの５’末端及び３’末端は、多くのＲＮＡに共通する非翻訳領域及び安定化領域を含むため、より広く適用可能であり得る。数ある中でも特に、本開示は、ＲＮＡの１つまたは複数の５’領域及び／３’領域などの、キメラポリヌクレオチドの１つまたは複数の部分を含むキットを提供し、こうした１つまたは複数の部分は、患者特異的エピトープをコードするＯＲＦと組み合わせてよい。例えば、キットは、５’−ＯＲＦ、３’−ＯＲＦ、及びポリ（Ａ）尾部の１つまたは複数を含むポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、それぞれのポリヌクレオチド構成要素は、個々の容器に存在する。他の実施形態では、複数のポリヌクレオチド構成要素が単一の容器に共に存在する。いくつかの実施形態では、キットは、リガーゼ酵素を含む。いくつかの実施形態では、提供されるキットは、使用のための説明を含む。いくつかの実施形態では、説明は、ＯＲＦをコードするエピトープと、例えば、５’−ＯＲＦ、３’−ＯＲＦ、及び／またはポリ（Ａ）尾部などの、キットに含まれる１つまたは複数の他の構成要素と、のライゲーションについての説明を含む。
【０４８３】
本発明による個別化癌ワクチンの生成方法は、組織試料に対して本明細書に記載の核酸またはタンパク質のディープシークエンシング法などの技術を使用する変異の同定を含む。いくつかの実施形態では、患者のトランスクリプトームにおける変異の最初の同定が実施される。患者のトランスクリプトームに由来するデータは、患者特異的かつ腫瘍特異的な発現変異を同定するために、患者のエクソームに由来する配列情報と比較される。比較によって推定ネオエピトープのデータセットが得られ、このデータセットは、ミュータノームと称される。ミュータノームは、患者当たり約１００〜１０，０００の候補変異を含み得る。ミュータノームは、ネオ抗原ワクチンの生成を目的とする最適変異セットを同定するために、問い合わせまたはアルゴリズムのセットを使用するデータ探索解析に供される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡネオ抗原ワクチンが設計され、製造される。その後、患者はそのワクチンで治療される。
【０４８４】
ネオ抗原ワクチンは、複数のネオエピトープ、または１つもしくは複数の単一のＲＮＡワクチン、またはそれらの組み合わせを含むポリシストロニックワクチンであり得る。
【０４８５】
いくつかの実施形態では、変異同定プロセスを開始してから、患者の治療を開始するまでの全方法は、２ヶ月未満で達成される。他の実施形態では、全プロセスは、７週間以内、６週間以内、５週間以内、４週間以内、３週間以内、２週間以内、または１週間未満で達成される。いくつかの実施形態では、全方法は、３０日未満で実施される。
【０４８６】
変異同定プロセスは、トランスクリプトーム解析とエクソーム解析との両方、またはトランスクリプトーム解析のみ、もしくはエクソーム解析のみを含み得る。いくつかの実施形態では、トランスクリプトーム解析が最初に実施され、エクソーム解析は２番目に実施される。解析は、生体試料または組織試料に対して実施される。いくつかの実施形態では、生体試料または組織試料は、血液試料または血清試料である。他の実施形態では、試料は、組織バンクの試料であるか、またはＥＢＶで形質転換したＢ細胞である。
【０４８７】
癌関連変異のある特定の特性を解析することによって、ｍＲＮＡワクチンに含めるために最適なネオエピトープを評価及び／または選択し得るということが認識及び理解されてきた。例えば、所与の時点で、ワクチンに含めるためのネオエピトープのセットを選択されるために、いくつかの特性の１つまたは複数を評価または重み付けしてよい。１つのネオエピトープまたはネオエピトープのセットの特性には、例えば、患者のＲＮＡシークエンシングもしくは他の核酸分析における遺伝子もしくは転写物レベルの発現評価、利用可能なデータベースにおける組織特異的発現、既知の癌遺伝子／腫瘍抑制因子、バリアントコール（ｖａｒｉａｎｔ  ｃａｌｌ）信頼スコア、ＲＮＡシークエンシングに基づく対立遺伝子特異的発現、保存的アミノ酸置換と非保存的アミノ酸置換との比較、点変異の位置（ＴＣＲの関与増加についての中心スコア（Ｃｅｎｔｅｒｉｎｇ  Ｓｃｏｒｅ））、点変異の位置（ＨＬＡとの結合の差異についての固定スコア（Ａｎｃｈｏｒｉｎｇ  Ｓｃｏｒｅ））、独自性（Ｓｅｌｆｎｅｓｓ）：患者のＷＥＳデータとのコアエピトープ相同性（＜１００％）、８マー〜１１マーについてはＨＬＡ−Ａ及びＨＬＡ−Ｂに対するＩＣ５０、１５マー〜２０マーについてはＨＬＡ−ＤＲＢ１に対するＩＣ５０、広範結合スコア（ｐｒｏｍｉｓｃｕｉｔｙ  Ｓｃｏｒｅ）（すなわち、結合すると予測される患者ＨＬＡの数）、８マー〜１１マーについてはＨＬＡ−Ｃに対するＩＣ５０、１５マー〜２０マーについてはＨＬＡ−ＤＲＢ３〜５に対するＩＣ５０、１５マー〜２０マーについてはＨＬＡ−ＤＱＢ１／Ａ１に対するＩＣ５０、１５マー〜２０マーについてはＨＬＡ−ＤＰＢ１／Ａ１に対するＩＣ５０、クラスＩとクラスＩＩとの比率比較、患者においてカバーされるＨＬＡ−Ａアロタイプ、ＨＬＡ−Ｂアロタイプ、及びＨＬＡ−ＤＲＢ１アロタイプの多様性、点変異と複合エピトープ（例えば、フレームシフト）との比率比較、及び／または偽エピトープＨＬＡ結合スコアが含まれ得る。
【０４８８】
いくつかの実施形態では、最適なオエピトープの同定に使用される癌関連変異癌の特性は、変異の型、患者試料における変異の存在量、免疫原性、自己反応性の欠如、ペプチド組成の性質と関連する特性である。
【０４８９】
変異の型が決定され、推定エピトープをワクチンに含めるべきかどうかの決定要素として考慮されるべきである。変異の型は、変わり得るものである。いくつかの実例では、単一のワクチンに異なる型の変異を複数含めることが望ましくあり得る。他の実例では、単一の型の変異がより望ましくあり得る。特定の変異に対する値を重み付け及び計算することができる。いくつかの実施形態では、特定の変異は、一塩基多型（ＳＮＰ）である。いくつかの実施形態では、特定の変異は、複合変異体であり、例えば、イントロンの保持、複合的なスプライシング事象、または配列のリーディングフレームを変化させる挿入／欠失変異から生じるペプチド配列である。
【０４９０】
患者試料における変異の存在量もスコア化し、推定エピトープをワクチンに含めるべきかどうかの決定要素としてよい。大量に存在する変異は、より強固な免疫応答を促進し得る。
【０４９１】
免疫原性の考慮は、ワクチンに含めるための最適なネオエピトープの選択における重要な要素である。免疫原性は、例えば、ネオエピトープのＭＨＣ結合能力、ＨＬＡ広範結合度、変異位置、Ｔ細胞の予測される反応性、Ｔ細胞の実際の反応性、特定の立体構造及び結果的な溶媒への露出につながる構造、ならびに特定のアミノ酸の表現状態（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）を解析することによって評価してよい。ＮｅｔＭＨＣ予測アルゴリズムなどの既知のアルゴリズムを使用することで、一般的なＨＬＡ−Ａ対立遺伝子及びＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子にペプチドが結合する能力を予測することができる。インシリコの３次元解析及び／またはタンパク質ドッキングプログラムによってＭＨＣと結合したペプチドの構造評価を実施してもよい。エピトープがＭＨＣ分子に結合したときにエピトープのアミノ酸残基が溶媒に露出する度合いを評価するために、Ｒｏｓｅｔｔａアルゴリズムから得たものなどの、ＭＨＣ分子への結合時の予測エピトープ構造を使用してよい。Ｔ細胞反応性は、エピトープ及びＴ細胞をインビトロで用いて実験的に評価してよい。あるいは、Ｔ細胞反応性は、Ｔ細胞応答／配列データセットを使用して評価してよい。
【０４９２】
ワクチンに含まれるネオエピトープに重要な要素は、自己反応性が存在しないことである。推定ネオエピトープは、そのエピトープが、例えば、悪性細胞内で遺伝子変化の結果として生じ、腫瘍組織に限ったものであることを確認するためにスクリーニングしてよい。理想的には、エピトープは、患者の正常組織には存在するべきではなく、したがって、自己に類似したエピトープは、データセットから除外される。自己反応性が存在しないことを決定するために、ネオ抗原候補の比較のための参照として個別化コードゲノムを使用してよい。いくつかの実施形態では、個別化コードゲノムは、個別化されたトランスクリプトーム及び／またはエクソームから生成される。
【０４９３】
エピトープの設計においてペプチド組成の性質を考慮してもよい。例えば、エピトープに見られる保存アミノ酸と非保存アミノ酸とを比較した値に対するスコアをそれぞれの推定エピトープに与えることができる。
【０４９４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のツールによって実施される解析は、異なる時間、すなわち、治療行為の前及び後に患者から得られる異なる特性セット、異なる組織試料から得られる異なる特性セット、同様の腫瘍を有する異なる患者から得られる異なる特性セットなどの比較を含み得る。いくつかの実施形態では、あるセットの特性に由来するピーク値の平均を別のセットの特性に由来するピーク値の平均と比較してよい。例えば、２つの異なるセットの分布の間でＨＬＡ結合の平均値を比較してよい。２つのセットの分布は、例えば、日数、月数、または年数によって区切られた期間について決定してよい。
【０４９５】
さらに、発明者らは、本明細書に記載のアルゴリズムを使用することで、癌変異の特性に対するそのようなデータを収集し、解析し得ることを認識及び理解している。データは、個別化癌ワクチンを開発するためのネオエピトープ及びネオエピトープのセットの同定に有用である。
【０４９６】
いくつかの実施形態では、腫瘍変異ペプチドの注解された転写物はすべて、本発明に従ってワクチンに含められる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡシークエンシングにおいて同定されたＲＮＡの翻訳物が、本発明に従ってワクチンに含められる。
【０４９７】
例えば、２つ以上のネオ抗原などの、２つ以上のペプチドのコンカテマーによって、ペプチドの境界に、意図されない新たなエピトープ（偽エピトープ）が創出され得ることを理解されたい。そのような偽エピトープを阻止または除外するために、クラスＩ対立遺伝子がヒットするかを、コンカテマーにおけるペプチド境界にわたってスクリーニングしてよい。いくつかの実施形態では、偽エピトープの形成を低減または除外するために、コンカテマー内のペプチドの順序がシャッフルされる。いくつかの実施形態では、偽エピトープの形成を低減または除外するために、ペプチド間にリンカーを使用してよく、こうしたリンカーは、例えば、グリシンなどの単一アミノ酸のリンカーである。いくつかの実施形態では、偽エピトープの形成を低減または除外することになる他のアミノ酸でアンカーアミノ酸を交換することができる。いくつかの実施形態では、偽エピトープの形成を低減または除外するために、コンカテマー内のペプチド境界でペプチドが切り詰められる。
【０４９８】
いくつかの実施形態では、複数のペプチドエピトープ抗原は、偽エピトープが最小化するように配置及び順序決定される。他の実施形態では、複数のペプチドエピトープ抗原は、偽エピトープを含まないポリペプチドである。癌抗原エピトープが、コンカテマー構造においてヘッドトゥーテール編成で配置されると、それぞれの癌抗原エピトープの間にジャンクションが形成される。このジャンクションは、ペプチドのＮ末端に存在するエピトープに由来するいくつかのアミノ酸、すなわち１〜１０のアミノ酸と、直接連結される隣接エピトープのＣ末端のいくつかのアミノ酸、すなわち１〜１０のアミノ酸と、を含む。ジャンクションは、免疫応答を生成し得る免疫原性ペプチドではないことが重要である。いくつかの実施形態では、ジャンクションは、個別化癌ワクチンの設計対象である対象のＨＬＡタンパク質に対して、約５０ｎＭを超えるＩＣ５０で結合するペプチド配列を形成する。他の実施形態では、ジャンクションのペプチド配列は、対象のＨＬＡタンパク質に対して、約１０ｎＭ、約１５０ｎＭ、約２００ｎＭ、約２５０ｎＭ、約３００ｎＭ、約３５０ｎＭ、約４００ｎＭ、約４５０ｎｍ、または約５００ｎＭを超えるＩＣ５０で結合する。
【０４９９】
本明細書に記載の技術に従ってネオエピトープを特徴付けるシステムは、任意の適切な形態をとり得るものであり、この点に関して実施形態は限定されない。いくつかの実施形態と関連させて使用してよいコンピューターシステム９００の実施態様の例は、図５に示される。上記の機能性のいずれを実施するためにも、コンピューターシステム９００などの、１つまたは複数のコンピューターシステムを使用してよい。コンピューターシステム９００は、１つまたは複数のプロセッサ９１０と、例えば、揮発性記憶装置９２０及び１つまたは複数の不揮発性記憶媒体９３０などの１つまたは複数のコンピューター可読記憶媒体（すなわち、有形かつ非一過性のコンピューター可読媒体）と、を含み得、こうした記憶媒体は、任意の適切なデータ記憶媒体から形成し得る。プロセッサ９１０は、任意の適切な様式で揮発性記憶装置９２０及び不揮発性記憶装置機器９３０からのデータ書き込み及びデータ読み込みを制御し得、この点に関して実施形態は限定されない。本明細書に記載の機能性のいずれを実施するためにも、プロセッサ９１０は、１つまたは複数のコンピューター可読記憶媒体（例えば、揮発性記憶装置９２０及び／または不揮発性記憶装置９３０）に記憶される１つまたは複数の命令を実行し得、こうした記憶媒体は、プロセッサ９１０によって実行するための命令を記憶する有形かつ非一過性のコンピューター可読媒体として働き得る。
【０５００】
上記の実施形態は、多くの様式のいずれで実施することもできる。例えば、実施形態は、ハードウェア、ソフトウェア、またはそれらの組み合わせを使用して実施してよい。ソフトウェアにおいて実施されるとき、任意の適切なプロセッサまたはプロセッサの集合体でソフトウェアコードを実行することができ、こうしたプロセッサが、単一のコンピューターにおいて提供されるか、または複数のコンピューター間に分散しているかは問われない。上記の機能を実施する任意の要素または要素の集合体が、一般に、上で議論される機能を制御する１つまたは複数の制御装置であると考え得ることを理解されるべきである。１つまたは複数の制御装置は、専用のハードウェア、または上記の機能を実施するためのマイクロコードもしくはソフトウェアを使用してプログラム化された汎用ハードウェア（例えば、１つもしくは複数のプロセッサ）などを用いてさまざまな様式で実施することができる。
【０５０１】
この点に関して、１つの実施態様は、少なくとも１つのコンピューター可読記憶媒体（すなわち、少なくとも１つの有形かつ非一過性のコンピューター可読媒体）を含むと理解されるべきであり、こうしたコンピューター可読記憶媒体は、１つまたは複数のプロセッサで実行されると、上で議論される機能を実施するコンピュータープログラム（すなわち、複数の命令）がコードされるコンピューターメモリー（例えば、ハードドライブ、フラッシュメモリー、プロセッサワーキングメモリーなど）、フロッピーディスク、光ディスク、磁気テープ、または他の有形かつ非一過性のコンピューター可読媒体などである。コンピューター可読記憶媒体は持ち運び可能であり、その結果、そこに記憶されるプログラムは、本明細書で議論される技術を実施するために任意のコンピューターリソースに読み込ませることができる。さらに、実行されると上で議論される機能を実施するコンピュータープログラムに対する参照は、ホストコンピューターで動くアプリケーションプログラムに限定されないことを理解されるべきである。むしろ、本明細書では、「コンピュータープログラム」という用語は、上記の技術を実施する１つまたは複数のプロセッサをプログラムするために用いることができる任意の型のコンピューターコード（例えば、ソフトウェアまたはマイクロコード）を参照するために一般的な意味において使用される。
【０５０２】
ＧＣリッチドメイン
定義
ＧＣリッチ：本明細書で使用されるとき、「ＧＣリッチ」という用語は、グアニン（Ｇ）及び／またはシトシン（Ｃ）核酸塩基、またはその誘導体もしくは類似体を含み、ＧＣ含量が約５０％を超える、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）、またはその任意の部分（例えば、ＲＮＡ要素）の核酸塩基の組成を指す。「ＧＣリッチ」という用語は、約５０％のＧＣ含量を含む、ポリヌクレオチドのすべて、またはその部分、限定するものではないが、遺伝子、非コーディング領域、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、オープンリーディングフレーム、ＲＮＡ要素、配列モチーフ、またはその任意の個々の配列、断片、もしくはセグメントなどを指す。本開示のいくつかの実施形態では、ＧＣリッチポリヌクレオチド、またはその任意の部分は、排他的に、グアニン（Ｇ）及び／またはシトシン（Ｃ）核酸塩基から構成されるる。
【０５０３】
ＧＣ含量：本明細書で使用されるとき、「ＧＣ含量」という用語は、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）、またはその部分（例えば、ＲＮＡ要素）における、グアニン（Ｇ）及びシトシン（Ｃ）核酸塩基のいずれか、またはその誘導体もしくは類似体である核酸塩基のパーセンテージ（ＤＮＡ及びＲＮＡ中のアデニン（Ａ）及びチミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ）ならびにその誘導体または類似体を含む可能性のある核酸塩基の総数からのパーセンテージ）を指す。「ＧＣ含量」という用語は、ポリヌクレオチドのすべて、またはその部分、限定するものではないが、遺伝子、非コーディング領域、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、オープンリーディングフレーム、ＲＮＡ要素、配列モチーフ、またはその任意の個々の配列、断片、もしくはセグメントなどを指す。
【０５０４】
開始コドン：本明細書で使用されるとき、「開始コドン（ｓｔａｒｔ  ｃｏｄｏｎ）」という用語と互換的に使用される「開始コドン（ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｃｏｄｏｎ）」という用語は、リボソームによって翻訳され、連結したアデニン−ウラシル−グアニン核酸塩基のトリプレットから構成される、オープンリーディングフレームの最初のコドンを指す。開始コドンは、アデニン（Ａ）、ウラシル（Ｕ）、及びグアニン（Ｇ）の最初の文字コードによって記述され、多くの場合、単純に「ＡＵＧ」と記載される。天然ｍＲＮＡは、本明細書において「代替開始コドン」と称されるＡＵＧ以外のコドンを開始コドンに使用することもあるが、本明細書に記載のポリヌクレオチドの開始コドンは、ＡＵＧコドンを使用する。翻訳開始のプロセス中に、開始コドンを含む配列は、リボソームが結合する開始ｔＲＮＡ（Ｍｅｔ−ｔＲＮＡｉＭｅｔ）のアンチコドンとの相補的な塩基対合を介して認識される。オープンリーディングフレームは、２つ以上のＡＵＧ開始コドンを含有してもよく、これは、本明細書において「代替開始コドン」と称される。
【０５０５】
開始コドンは、翻訳開始に重要な役割を果たす。開始コドンは、リボソームによって翻訳されるオープンリーディングフレームの最初のコドンである。典型的には、開始コドンは、ＡＵＧのヌクレオチドトリプレットを含むが、いくつかの場合、異なるヌクレオチドから構成される他のコドンで翻訳開始が生じることもある。真核生物における翻訳の開始は、多段階の生化学的プロセスであり、メッセンジャーＲＮＡ分子（ｍＲＮＡ）、４０Ｓリボソームサブユニット、翻訳機構の他の構成要素（例えば、真核生物の開始因子；ｅＩＦ）の間の多数のタンパク質−タンパク質、タンパク質−ＲＮＡ、及びＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用を伴う。ｍＲＮＡ翻訳開始の現行モデルでは、開始前複合体（あるいは「４３Ｓ開始前複合体」；「ＰＩＣ」と略される）が、特定の翻訳促進ヌクレオチド環境（コザック配列）（Ｋｏｚａｋ（１９８９）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １０８：２２９−２４１）内に存在する最初のＡＵＧコドンに遭遇するまで５’〜３’方向にヌクレオチドをスキャニングすることで、ｍＲＮＡ上の動員部位（典型的には、５’キャップ）から開始コドンまで移動すると仮定されている。ＰＩＣによるスキャニングは、Ｍｅｔ−ｔＲＮＡｉＭｅｔの開始転移ＲＮＡのアンチコドンを含むヌクレオチドと、ｍＲＮＡの開始コドンを含むヌクレオチドとの間の相補的な塩基対合で終了する。ＡＵＧコドンとＭｅｔ−ｔＲＮＡｉＭｅｔアンチコドンとの間の生産的な塩基対合により、一連の構造的及び生化学的イベントが誘発され、最終的に６０Ｓリボソーム大サブユニットのＰＩＣへの結合が生じ、翻訳伸長を行う活性リボソームが形成される。
【０５０６】
コザック配列：「コザック配列」（「コザックコンセンサス配列」とも称される）という用語は、遺伝子またはオープンリーディングフレームの発現を強める翻訳開始エンハンサー要素を指し、真核生物では５’ＵＴＲ内に位置する。コザックコンセンサス配列は、当初、プレプロインスリン遺伝子の翻訳に対する、開始コドン（ＡＵＧ）を囲む単一変異の作用を解析した結果、配列ＧＣＣＲＣＣ（配列中、Ｒ＝プリン）と定義された（Ｋｏｚａｋ（１９８６）Ｃｅｌｌ  ４４：２８３−２９２）。本明細書に開示のポリヌクレオチドは、コザックコンセンサス配列、またはその誘導体もしくは修飾を含む。（翻訳エンハンサー組成物及びその使用方法の例は、全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第５，８０７，７０７号（Ａｎｄｒｅｗｓ  ｅｔ  ａｌ．）；全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第５，７２３，３３２号（Ｃｈｅｒｎａｊｏｖｓｋｙ）；全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第５，８９１，６６５号（Ｗｉｌｓｏｎ）を参照のこと。）
【０５０７】
スキャニング漏れ：「スキャニング漏れ」として知られる現象は、ＰＩＣが開始コドンを読み飛ばし、代わりに下流へのスキャニングを代わりの開始コドンまたは代替開始コドンを認識するまで継続することによって生じ得る。その発生頻度によっては、ＰＩＣによる開始コドンの読み飛ばしにより、翻訳効率が低下することがある。さらに、この下流のＡＵＧコドンからの翻訳が生じ得、それにより、所望の治療応答を誘発することができない可能性のある望ましくない異常な翻訳産物が生成される。いくつかの場合では、異常な翻訳産物は、事実、有害な応答を引き起こすこともある（Ｋｒａｃｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１７）Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２３（４）：５０１−５０７）。
【０５０８】
修飾された：本明細書で使用されるとき、「修飾された」または「修飾」は、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の組成または構造が変化した状態またはその変化を指す。ポリヌクレオチドは、化学的、構造的、及び／または機能的を含む、さまざまな様式で修飾され得る。例えば、ポリヌクレオチドは、１つまたは複数のＲＮＡ要素を組む混むことによって、構造的に修飾され得る。ここで、このＲＮＡ要素は、１つまたは複数の機能（例えば、翻訳制御活性）を提供する配列及び／またはＲＮＡ二次構造（複数可）を含む。したがって、本開示のポリヌクレオチドは、１つまたは複数の修飾から構成され得る（例えば、１つまたは複数の化学的、構造的、または機能的修飾（これらの任意の組み合わせを含む）を含み得る）。
【０５０９】
核酸塩基：本明細書で使用されるとき、「核酸塩基」（あるいは「ヌクレオチド塩基」または「窒素塩基」）という用語は、核酸中に認められるプリンまたはピリミジン複素環式化合物を指し、核酸またはその部分もしくはセグメントに改善された特性（例えば、結合親和性、ヌクレアーゼ耐性、化学安定性）を付与する天然プリン及び天然ピリミジンのあらゆる誘導体または類似体を含む。アデニン、シトシン、グアニン、チミン、及びウラシルが天然核酸中に主に認められる核酸塩基である。当該技術分野において知られている及び／または本明細書に記載の他の天然、非天然及び／または合成核酸塩基が核酸に組み込まれてもよい。
【０５１０】
ヌクレオシド／ヌクレオチド：本明細書で使用されるとき、「ヌクレオシド」という用語は、核酸塩基（例えば、プリンまたはピリミジン）、またはその誘導体もしくは類似体（本明細書では「核酸塩基」とも称される）に共有結合しているが、ヌクレオシド間連結基（例えば、リン酸基）を欠く、糖分子（例えば、ＲＮＡではリボースまたはＤＮＡではデオキシリボース）、またはその誘導体もしくは類似体を含有する化合物を指す。本明細書で使用されるとき、「ヌクレオチド」という用語は、ヌクレオシド間連結基（例えば、リン酸基）に共有結合したヌクレオシド、または核酸もしくはその部分もしくはセグメントに改善された化学的及び／または機能的特性（例えば、結合親和性、ヌクレアーゼ耐性、化学安定性）を付与するそのあらゆる誘導体、類似体もしくは修飾体を指す。
【０５１１】
核酸：本明細書で使用されるとき、「核酸」という用語は、その最も広い意味で使用され、ヌクレオチドのポリマー、またはその誘導体もしくは類似体を含む任意の化合物及び／または物質を包含する。こうしたポリマーは、多くの場合、「ポリヌクレオチド」と称される。したがって、本明細書で使用されるとき、「核酸」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、同等であり、互換的に使用される。本開示の核酸またはポリヌクレオチドの例には、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、ＲＮＡｉ誘導剤、ＲＮＡｉ剤、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍＲＮＡ、修飾ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、触媒ＤＮＡ、三重らせん形成を誘導するＲＮＡ、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（β−Ｄ−リボ配置を有するＬＮＡ、α−Ｌ−リボ配置を有するα−ＬＮＡ（ＬＮＡのジアステレオマー）を含むＬＮＡ、２’−アミノ官能化された２’−アミノ−ＬＮＡ、及び２’−アミノ官能化された２’−アミノ−α−ＬＮＡ）またはそのハイブリッドが挙げられるが、これらに限定されない。
【０５１２】
核酸構造：本明細書で使用されるとき、「核酸構造」（「ポリヌクレオチド構造」と互換可能に使用される）という用語は、核酸（例えば、ｍＲＮＡ）に含まれる、原子、化学成分、要素、モチーフ、及び／または連結ヌクレオチドまたはその誘導体もしくは類似体の配列の配置または編成を指す。この用語は、核酸の二次元または三次元の状態も指す。したがって、「ＲＮＡ構造」という用語は、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）に含まれる、原子、化学成分、要素、モチーフ、及び／または連結ヌクレオチドまたはその誘導体もしくは類似体の配列の配置または編成を指し、及び／またはＲＮＡ分子の二次元及び／または三次元の状態を指す。核酸構造は、編成上の複雑さの増大に基づいて、本明細書で「分子構造」、「一次構造」、「二次構造」、及び「三次構造」と称される４つの編成分類にさらに分類され得る。
【０５１３】
オープンリーディングフレーム：本明細書で使用されるとき、「オープンリーディングフレーム」という用語は、「ＯＲＦ」と略され、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ分子のセグメントまたは領域を指す。ＯＲＦは、開始コドンから始まり、終止コドンで終わる、重複しないインフレームのコドンの連続ストレッチを含み、リボソームによって翻訳される。
【０５１４】
開始前複合体（ＰＩＣ）：本明細書で使用されるとき、「開始前複合体」（あるいは「４３Ｓ開始前複合体」；「ＰＩＣ」と略される）という用語は、４０Ｓリボソームサブユニット、真核生物の開始因子（ｅＩＦ１、ｅＩＦ１Ａ、ｅＩＦ３、ｅＩＦ５）、及びｅＩＦ２−ＧＴＰ−Ｍｅｔ−ｔＲＮＡｉＭｅｔの３つから構成される複合体を含み、ｍＲＮＡ分子の５’キャップに本質的に結合し、結合後に、５’ＵＴＲのリボソームスキャニングを実施することができる、リボ核タンパク質複合体を指す。
【０５１５】
ＲＮＡ要素：本明細書で使用されるとき、「ＲＮＡ要素」という用語は、生物学的機能を与え、及び／または生物学的活性（例えば、翻訳制御活性）を有する、ＲＮＡ分子の部分、断片、またはセグメントを指す。本明細書に記載のものなどの１つまたは複数のＲＮＡ要素を組み込むことによるポリヌクレオチドの修飾は、修飾ポリヌクレオチドに１つまたは複数の所望の機能的特性を提供する。本明細書に記載のＲＮＡ要素は、天然のもの、非天然のもの、合成のもの、操作されたもの、またはこれらの任意の組み合わせであってよい。例えば、制御活性を提供する天然ＲＮＡ要素には、ウイルス、原核生物及び真核生物（例えば、ヒト）のトランスクリプトーム全体に認められる要素が含まれる。ＲＮＡ要素、特に真核生物のｍＲＮＡ及び翻訳されたウイルスＲＮＡは、細胞内で多くの機能の媒介に関与することが示されている。天然ＲＮＡ要素の例には、翻訳開始要素（例えば、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、Ｋｉｅｆｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）ＲＮＡ  ７（２）：１９４−２０６を参照のこと）、翻訳エンハンサー要素（例えば、ＡＰＰ  ｍＲＮＡ翻訳エンハンサー要素、Ｒｏｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４（１０）：６４２１−６４３１を参照のこと）、ｍＲＮＡ安定性要素（例えば、ＡＵリッチ要素（ＡＲＥ）、Ｇａｒｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ８（２）：１１３−１２６を参照のこと）、翻訳抑制要素（例えば、Ｂｌｕｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｍｅｃｈ  Ｄｅｖ  １１０（１−２）：９７−１１２を参照のこと）、タンパク質結合ＲＮＡ要素（例えば、鉄応答性要素、Ｓｅｌｅｚｎｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１３）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４２５（１８）：３３０１−３３１０を参照のこと）、細胞質ポリアデニル化要素（Ｖｉｌｌａｌｂａ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｇｅｎｅｔ  Ｄｅｖ  ２１（４）：４５２−４５７）、及び触媒ＲＮＡ要素（例えば、リボザイム、Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２００９）Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １７８９（９−１０）：６３４−６４１を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０５１６】
滞留時間：本明細書で使用されるとき、「滞留時間」という用語は、開始前複合体（ＰＩＣ）またはリボソームによるｍＲＮＡ分子に沿った別々の位置または場所の占有時間を指す。
【０５１７】
翻訳制御活性：本明細書で使用されるとき、「翻訳制御活性」（「翻訳制御機能」と互換的に使用される）という用語は、ＰＩＣ及び／またはリボソームの活性を含む、翻訳装置の活性を調節する（例えば、制御する、影響を与える、調整する、変化をもたらす）生物学的な機能、機序、またはプロセスを指す。いくつかの態様では、所望の翻訳制御活性は、ｍＲＮＡ翻訳の翻訳忠実度を上昇及び／または向上させる。いくつかの態様では、所望の翻訳制御活性は、スキャニング漏れを減少及び／または抑制する。
【０５１８】
ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドの翻訳は、さまざまなシス作用性核酸構造によってもたらされるさまざまな機序によって調整及び制御され得る。例えば、ヘアピンまたは他の高次（例えば、シュードノット）分子内ｍＲＮＡ二次構造を形成する天然シス作用性ＲＮＡ要素は、ポリヌクレオチドに翻訳制御活性を提供することができ、ここで、特にＲＮＡ要素が５’−キャップ構造に近い５’ＵＴＲに位置する場合、ＲＮＡ要素は、ポリヌクレオチドの翻訳開始に影響するか、またはこれを調節する（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ  ａｎｄ  Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ（１９８５）Ｃｅｌｌ  ４０（３）：５１５−５２６；Ｋｏｚａｋ（１９８６）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８３：２８５０−２８５４）。シス作用性ＲＮＡ要素はまた、翻訳伸長に影響し得、多数のフレームシフトイベントに関与する（Ｎａｍｙ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  １３（２）：１５７−１６８）。配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）は、別のタイプのシス作用性ＲＮＡ要素であり、典型的には、５’ＵＴＲ内に位置するが、天然ｍＲＮＡのコーディング領域内に認められることも報告されている（Ｈｏｌｃｉｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ  １６（１０）：４６９−４７３）。細胞ｍＲＮＡでは、ＩＲＥＳは、多くの場合、５’−キャップ構造とともに存在し、キャップ依存性翻訳が損なわれた条件下で翻訳される、機能的能力をｍＲＮＡに提供する（Ｇｅｂａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ  Ｂｉｏｌ  ４（７）：ａ０１２２４５）。別のタイプの天然シス作用性ＲＮＡ要素には、上流オープンリーディングフレーム（ｕＯＲＦ）が含まれる。天然ｕＯＲＦは、多数のｍＲＮＡの５’ＵＴＲ内に単独または複数で存在し、主要な下流ＯＲＦの翻訳に対して、通常は負の影響を与える（酵母のＧＣＮ４  ｍＲＮＡ及び哺乳類のＡＴＦ４  ｍＲＮＡの顕著な例外を除く。ここで、ｕＯＲＦは、ｅＩＦ２リン酸化が増加した条件下で、主要な下流ＯＲＦの翻訳を促進する働きをする（Ｈｉｎｎｅｂｕｓｃｈ（２００５）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ５９：４０７−４５０））。ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）に含まれる構成成分、構造、要素、モチーフ、及び／または特定配列によって提供されるさらなる翻訳制御活性の例には、ｍＲＮＡの安定化または不安定化（Ｂａｋｅｒ  ＆  Ｐａｒｋｅｒ（２００４）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １６（３）：２９３−２９９）、翻訳活性化（Ｖｉｌｌａｌｂａ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｇｅｎｅｔ  Ｄｅｖ  ２１（４）：４５２−４５７）、及び翻訳抑制（Ｂｌｕｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｍｅｃｈ  Ｄｅｖ  １１０（１−２）：９７−１１２）が挙げられるが、これらに限定されない。研究により、天然シス作用性ＲＮＡ要素は、当該要素を使用して、組み込みにより異種ポリヌクレオチドを修飾する場合、それぞれの機能を付与することができることが示されている（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ−Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７（１６）：１３６３５−１３６４０）。
【０５１９】
機能性ＲＮＡ要素を含む修飾ポリヌクレオチド
本開示は、修飾（例えば、ＲＮＡ要素）を含む合成ポリヌクレオチドを提供し、ここで、修飾は、所望の翻訳制御活性を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、開始コドン、ポリペプチドをコードする完全なオープンリーディングフレーム、３’ＵＴＲ、及び少なくとも１つの修飾を含むポリヌクレオチドであって、少なくとも１つの修飾は、所望の翻訳制御活性を提供し、例えば、ｍＲＮＡ翻訳の翻訳忠実度を上昇及び／または向上させる修飾である、ポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、所望の翻訳制御活性は、シス作用性制御活性である。いくつかの実施形態では、所望の翻訳制御活性は、開始コドンまたは開示コドン近傍における、４３Ｓ開始前複合体（ＰＩＣ）またはリボソームの滞留時間の増加である。いくつかの実施形態では、所望の翻訳制御活性は、開始コドンでの、または開始コドンからのポリペプチド合成の開始の増加である。いくつかの実施形態では、所望の翻訳制御活性は、完全なオープンリーディングフレームから翻訳されるポリペプチドの量の増加である。いくつかの実施形態では、所望の翻訳制御活性は、ＰＩＣまたはリボソームによる開始コドン解読の忠実度の向上である。いくつかの実施形態では、所望の翻訳制御活性は、ＰＩＣまたはリボソームによるスキャニング漏れの抑制または減少である。いくつかの実施形態では、所望の翻訳制御活性は、ＰＩＣまたはリボソームによる開始コドン解読速度の低下である。いくつかの実施形態では、所望の翻訳制御活性は、ｍＲＮＡ内の開始コドン以外の任意のコドンでのポリペプチド合成の開始の阻害または低減である。いくつかの実施形態では、所望の翻訳制御活性は、ｍＲＮＡ内の完全なオープンリーディングフレーム以外の任意のオープンリーディングフレームから翻訳されるポリペプチドの量の阻害または低減である。いくつかの実施形態では、所望の翻訳制御活性は、異常な翻訳産物の生産の阻害または低減である。いくつかの実施形態では、所望の翻訳制御活性は、前述の翻訳制御活性のうちの１つまたは複数の組み合わせである。
【０５２０】
したがって、本開示は、本明細書に記載の所望の翻訳制御活性を提供する配列及び／またはＲＮＡ二次構造（複数可）を含むＲＮＡ要素を含む、ポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡを提供する。いくつかの態様では、ｍＲＮＡは、ｍＲＮＡ翻訳の翻訳忠実度を上昇及び／または向上させる配列及び／またはＲＮＡ二次構造（複数可）を含む、ＲＮＡ要素を含む。いくつかの態様では、ｍＲＮＡは、スキャニング漏れの抑制及び／または減少などの所望の翻訳制御活性を提供する配列及び／またはＲＮＡ二次構造（複数可）を含む、ＲＮＡ要素を含む。いくつかの態様では、本開示は、スキャニング漏れを抑制し、及び／または減少させ、それにより、ｍＲＮＡの翻訳忠実度を上昇させる配列及び／またはＲＮＡ二次構造（複数可）を含むＲＮＡ要素を含む、ｍＲＮＡを提供する。
【０５２１】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ要素は、天然ヌクレオチド及び／または修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ要素は、本明細書に記載の所望の翻訳制御活性を提供する連結ヌクレオチド、またはその誘導体もしくは類似体の配列から構成される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ要素は、安定なＲＮＡ二次構造を形成するか、または安定なＲＮＡ二次構造に折りたたまれる、連結ヌクレオチド、またはその誘導体もしくは類似体の配列を含み、ここで、ＲＮＡ二次構造は、本明細書に記載の所望の翻訳制御活性を提供する。ＲＮＡ要素は、当該要素の一次配列（例えば、ＧＣリッチ要素）に基づいて、当該要素によって形成されるＲＮＡ二次構造（例えば、ステムループ）、当該要素のＲＮＡ分子内の位置（例えば、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ内に位置する）、当該要素の生物学的機能及び／または活性（例えば、「翻訳エンハンサー要素」）、ならびにこれらの任意の組み合わせによって、同定及び／または特徴付けされ得る。
【０５２２】
いくつかの態様では、本開示は、スキャニング漏れを抑制し、及び／またはｍＲＮＡ翻訳の翻訳忠実度を向上させる１つまたは複数の構造的修飾を有するｍＲＮＡであって、構造的修飾のうちの少なくとも１つは、ＧＣリッチＲＮＡ要素である、ｍＲＮＡを提供する。いくつかの態様では、本開示は、少なくとも１つの修飾を含む修飾ｍＲＮＡであって、少なくとも１つの修飾は、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ中のコザックコンセンサス配列に先行する、連結ヌクレオチド、またはその誘導体もしくは類似体の配列を含むＧＣリッチＲＮＡ要素である、修飾ｍＲＮＡを提供する。１つの実施形態では、ＧＣリッチＲＮＡ要素は、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ中のコザックコンセンサス配列の約３０、約２５、約２０、約１５、約１０、約５、約４、約３、約２、または約１ヌクレオチド上流に位置する。別の実施形態では、ＧＣリッチＲＮＡ要素は、コザックコンセンサス配列の１５〜３０、１５〜２０、１５〜２５、１０〜１５、または５〜１０ヌクレオチド上流に位置する。別の実施形態では、ＧＣリッチＲＮＡ要素は、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ中のコザックコンセンサス配列のすぐ隣に位置する。
【０５２３】
前述の態様または関連する態様のいずれかにおいて、本開示は、任意の順序で連結された３〜３０、５〜２５、１０〜２０、１５〜２０、約２０、約１５、約１２、約１０、約７、約６もしくは約３ヌクレオチド、その誘導体または類似体の配列を含む、ＧＣリッチＲＮＡ要素であって、配列組成が、７０〜８０％シトシン、６０〜７０％シトシン、５０％〜６０％シトシン、４０〜５０％シトシン、３０〜４０％シトシン塩基である、ＧＣリッチＲＮＡ要素を提供する。前述の態様または関連する態様のいずれかにおいて、本開示は、任意の順序で連結された３〜３０、５〜２５、１０〜２０、１５〜２０、約２０、約１５、約１２、約１０、約７、約６もしくは約３ヌクレオチド、その誘導体または類似体の配列を含む、ＧＣリッチＲＮＡ要素であって、配列組成が、約８０％シトシン、約７０％シトシン、約６０％シトシン、約５０％シトシン、約４０％シトシン、または約３０％シトシンである、ＧＣリッチＲＮＡ要素を提供する。
【０５２４】
前述の態様または関連する態様のいずれかにおいて、本開示は、任意の順序で連結された２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、もしくは３ヌクレオチド、またはその誘導体もしくは類似体の配列を含む、ＧＣリッチＲＮＡ要素であって、配列組成が、７０〜８０％シトシン、６０〜７０％シトシン、５０％〜６０％シトシン、４０〜５０％シトシン、または３０〜４０％シトシンである、ＧＣリッチＲＮＡ要素を提供する。前述の態様または関連する態様のいずれかにおいて、本開示は、任意の順序で連結された２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、もしくは３ヌクレオチド、またはその誘導体もしくは類似体の配列を含む、ＧＣリッチＲＮＡ要素であって、配列組成が、約８０％シトシン、約７０％シトシン、約６０％シトシン、約５０％シトシン、約４０％シトシン、または約３０％シトシンである、ＧＣリッチＲＮＡ要素を提供する。
【０５２５】
いくつかの態様では、本開示は、少なくとも１つの修飾を含む修飾ｍＲＮＡであって、少なくとも１つの修飾は、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ中のコザックコンセンサス配列に先行する、連結ヌクレオチド、またはその誘導体もしくは類似体の配列を含むＧＣリッチＲＮＡ要素であり、ＧＣリッチＲＮＡ要素は、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ中のコザックコンセンサス配列の約３０、約２５、約２０、約１５、約１０、約５、約４、約３、約２、または約１ヌクレオチド上流に位置し、ＧＣリッチＲＮＡ要素は、任意の順序で連結された３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド、またはその誘導体もしくは類似体の配列を含み、配列組成は、＞５０％シトシンである、修飾ｍＲＮＡを提供する。いくつかの実施形態では、配列組成は、＞５５％シトシン、＞６０％シトシン、＞６５％シトシン、＞７０％シトシン、＞７５％シトシン、＞８０％シトシン、＞８５％シトシン、または＞９０％シトシンである。
【０５２６】
他の態様では、本開示は、少なくとも１つの修飾を含む修飾ｍＲＮＡであって、少なくとも１つの修飾は、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ中のコザックコンセンサス配列に先行する、連結ヌクレオチド、またはその誘導体もしくは類似体の配列を含むＧＣリッチＲＮＡ要素であり、ＧＣリッチＲＮＡ要素は、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ中のコザックコンセンサス配列の約３０、約２５、約２０、約１５、約１０、約５、約４、約３、約２、または約１ヌクレオチド上流に位置し、ＧＣリッチＲＮＡ要素は、約３〜３０、５〜２５、１０〜２０、１５〜２０または約２０、約１５、約１２、約１０、約６もしくは約３ヌクレオチド、またはその誘導体もしくは類似体の配列を含み、配列は、反復ＧＣモチーフを含み、反復ＧＣモチーフは、［ＣＣＧ］ｎ（配列中、ｎ＝１〜１０、ｎ＝２〜８、ｎ＝３〜６、またはｎ＝４〜５）である、修飾ｍＲＮＡを提供する。いくつかの実施形態では、配列は、反復ＧＣモチーフ［ＣＣＧ］ｎ（配列中、ｎ＝１、２、３、４または５）を含む。いくつかの実施形態では、配列は、反復ＧＣモチーフ［ＣＣＧ］ｎ（配列中、ｎ＝１、２、または３）を含む。いくつかの実施形態では、配列は、反復ＧＣモチーフ［ＣＣＧ］ｎ（配列中、ｎ＝１）を含む。いくつかの実施形態では、配列は、反復ＧＣモチーフ［ＣＣＧ］ｎ（配列中、ｎ＝２）を含む。いくつかの実施形態では、配列は、反復ＧＣモチーフ［ＣＣＧ］ｎ（配列中、ｎ＝３）を含む。いくつかの実施形態では、配列は、反復ＧＣモチーフ［ＣＣＧ］ｎ（配列中、ｎ＝４）（配列番号３０８）を含む。いくつかの実施形態では、配列は、反復ＧＣモチーフ［ＣＣＧ］ｎ（配列中、ｎ＝５）（配列番号３０９）を含む。
【０５２７】
別の態様では、本開示は、少なくとも１つの修飾を含む修飾ｍＲＮＡであって、少なくとも１つの修飾は、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ中のコザックコンセンサス配列に先行する、連結ヌクレオチド、またはその誘導体もしくは類似体の配列を含むＧＣリッチＲＮＡ要素であり、ＧＣリッチＲＮＡ要素は、表２に記載の配列のいずれか１つを含む、修飾ｍＲＮＡを提供する。１つの実施形態では、ＧＣリッチＲＮＡ要素は、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ中のコザックコンセンサス配列の約３０、約２５、約２０、約１５、約１０、約５、約４、約３、約２、または約１ヌクレオチド上流に位置する。別の実施形態では、ＧＣリッチＲＮＡ要素は、コザックコンセンサス配列の約１５〜３０、１５〜２０、１５〜２５、１０〜１５、または５〜１０ヌクレオチド上流に位置する。別の実施形態では、ＧＣリッチＲＮＡ要素は、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ中のコザックコンセンサス配列のすぐ隣に位置する。
【０５２８】
他の態様では、本開示は、少なくとも１つの修飾を含む修飾ｍＲＮＡであって、少なくとも１つの修飾は、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ中のコザックコンセンサス配列に先行する、表２に記載の配列Ｖ１［ＣＣＣＣＧＧＣＧＣＣ］（配列番号３１０）、またはその誘導体もしくは類似体を含むＧＣリッチＲＮＡ要素である、修飾ｍＲＮＡを提供する。いくつかの実施形態では、ＧＣリッチ要素は、表２に記載の配列Ｖ１を含み、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ中のコザックコンセンサス配列の上流のすぐ隣に位置する。いくつかの実施形態では、ＧＣリッチ要素は、表２に記載の配列Ｖ１を含み、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ中のコザックコンセンサス配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０塩基上流に位置する。他の実施形態では、ＧＣリッチ要素は、表２に記載の配列Ｖ１を含み、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ中のコザックコンセンサス配列の１〜３、３〜５、５〜７、７〜９、９〜１２、または１２〜１５塩基上流に位置する。
【０５２９】
他の態様では、本開示は、少なくとも１つの修飾を含む修飾ｍＲＮＡであって、少なくとも１つの修飾は、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ中のコザックコンセンサス配列に先行する、表２に記載の配列Ｖ２［ＣＣＣＣＧＧＣ］、またはその誘導体もしくは類似体を含むＧＣリッチＲＮＡ要素である、修飾ｍＲＮＡを提供する。いくつかの実施形態では、ＧＣリッチ要素は、表２に記載の配列Ｖ２を含み、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ中のコザックコンセンサス配列の上流のすぐ隣に位置する。いくつかの実施形態では、ＧＣリッチ要素は、表２に記載の配列Ｖ２を含み、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ中のコザックコンセンサス配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０塩基上流に位置する。他の実施形態では、ＧＣリッチ要素は、表２に記載の配列Ｖ２を含み、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ中のコザックコンセンサス配列の１〜３、３〜５、５〜７、７〜９、９〜１２、または１２〜１５塩基上流に位置する。
【０５３０】
他の態様では、本開示は、少なくとも１つの修飾を含む修飾ｍＲＮＡであって、少なくとも１つの修飾は、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ中のコザックコンセンサス配列に先行する、表２に記載の配列ＥＫ［ＧＣＣＧＣＣ］、またはその誘導体もしくは類似体を含むＧＣリッチＲＮＡ要素である、修飾ｍＲＮＡを提供する。いくつかの実施形態では、ＧＣリッチ要素は、表２に記載の配列ＥＫを含み、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ中のコザックコンセンサス配列の上流のすぐ隣に位置する。いくつかの実施形態では、ＧＣリッチ要素は、表２に記載の配列ＥＫを含み、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ中のコザックコンセンサス配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０塩基上流に位置する。他の実施形態では、ＧＣリッチ要素は、表２に記載の配列ＥＫを含み、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ中のコザックコンセンサス配列の１〜３、３〜５、５〜７、７〜９、９〜１２、または１２〜１５塩基上流に位置する。
【０５３１】
さらなる他の態様では、本開示は、少なくとも１つの修飾を含む修飾ｍＲＮＡであって、少なくとも１つの修飾は、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ中のコザックコンセンサス配列に先行する、表２に記載の配列Ｖ１［ＣＣＣＣＧＧＣＧＣＣ］（配列番号３１０）、またはその誘導体もしくは類似体を含むＧＣリッチＲＮＡ要素であり、５’ＵＴＲは、表２に記載の次の配列：
ＧＧＧＡＡＡＴＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＴＡＡＧＡＡＧＡＡＡＴＡＴＡＡＧＡ（配列番号３１１）を含む、修飾ｍＲＮＡを提供する。
【０５３２】
いくつかの実施形態では、ＧＣリッチ要素は、表２に記載の配列Ｖ１を含み、表２に示す５’ＵＴＲ配列中のコザックコンセンサス配列の上流のすぐ隣に位置する。いくつかの実施形態では、ＧＣリッチ要素は、表２に記載の配列Ｖ１を含み、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ中のコザックコンセンサス配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０塩基上流に位置し、５’ＵＴＲは、表２に記載の次の配列：
ＧＧＧＡＡＡＴＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＴＡＡＧＡＡＧＡＡＡＴＡＴＡＡＧＡ（配列番号３１２）を含む。
【０５３３】
他の実施形態では、ＧＣリッチ要素は、表１に記載の配列Ｖ１を含み、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ中のコザックコンセンサス配列の１〜３、３〜５、５〜７、７〜９、９〜１２、または１２〜１５塩基上流に位置し、５’ＵＴＲは、表２に記載の次の配列：
ＧＧＧＡＡＡＴＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＴＡＡＧＡＡＧＡＡＡＴＡＴＡＡＧＡ（配列番号３１２）を含む。
【０５３４】
いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲは、表２に記載の次の配列：
ＧＧＧＡＡＡＴＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＴＡＡＧＡＡＧＡＡＡＴＡＴＡＡＧＡＣＣＣＣＧＧＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣ（配列番号３１３）を含む。
【表３】
2020506189.tif 000006
【０５３５】
別の態様では、本開示は、少なくとも１つの修飾を含む修飾ｍＲＮＡであって、少なくとも１つの修飾は、ヘアピンまたはステムループを形成する順序で連結したヌクレオチド、またはその誘導体もしくは類似体の配列を含む安定なＲＮＡ二次構造を含む、ＧＣリッチＲＮＡ要素である、修飾ｍＲＮＡを提供する。１つの実施形態では、安定したＲＮＡ二次構造は、コザックコンセンサス配列の上流にある。別の実施形態では、安定したＲＮＡ二次構造は、コザックコンセンサス配列の約３０、約２５、約２０、約１５、約１０、または約５ヌクレオチド上流に位置する。別の実施形態では、安定したＲＮＡ二次構造は、コザックコンセンサス配列の約２０、約１５、約１０または約５ヌクレオチド上流に位置する。別の実施形態では、安定したＲＮＡ二次構造は、コザックコンセンサス配列の約５、約４、約３、約２、約１ヌクレオチド上流に位置する。別の実施形態では、安定したＲＮＡ二次構造は、コザックコンセンサス配列の約１５〜３０、約１５〜２０、約１５〜２５、約１０〜１５、または約５〜１０ヌクレオチド上流に位置する。別の実施形態では、安定したＲＮＡ二次構造は、コザックコンセンサス配列の１２〜１５ヌクレオチド上流に位置する。別の実施形態では、安定したＲＮＡ二次構造は、約−３０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、約−２０〜−３０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、約−２０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、約−１０〜−２０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、約−１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、約−５〜−１０ｋｃａｌ／ｍｏｌのΔＧを有する。
【０５３６】
別の実施形態では、修飾は、ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームに作動可能に連結され、ここで、修飾及びオープンリーディングフレームは、異種である。
【０５３７】
別の実施形態では、ＧＣリッチＲＮＡ要素の配列は、排他的に、グアニン（Ｇ）及びシトシン（Ｃ）核酸塩基から構成される。
【０５３８】
本明細書に記載の所望の翻訳制御活性を提供するＲＮＡ要素は、リボソームプロファイリングなどの既知の技術を使用して、同定及び特徴付けを行うことができる。リボソームプロファイリングは、ＰＩＣ及び／またはリボソームがｍＲＮＡに結合する位置を決定することができる技術である（例えば、Ｉｎｇｏｌｉａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２４（５９２４）：２１８−２３を参照のこと；当該文献は、参照によって本明細書に組み込まれる）。この技術は、ＰＩＣ及び／またはリボソームによって、ｍＲＮＡの領域またはセグメントがヌクレアーゼ消化から保護されることに基づく。保護することで、「フットプリント」と呼ばれる３０ｂｐのＲＮＡ断片が生成される。ＲＮＡフットプリントの配列及び頻度を当該技術分野において知られている方法（例えば、ＲＮＡシークエンシング）によって解析することができる。フットプリントは、リボソームのＡ部位のほぼ中央にある。ＰＩＣまたはリボソームがｍＲＮＡに沿った特定の位置または場所に留まる場合、これらの位置で生成されるフットプリントは、比較的よく生じるものである。研究では、ＰＩＣ及び／またはリボソームの処理能力が低くなる位置では、より多くのフットプリントが生成され、ＰＩＣ及び／またはリボソームの処理能力が上がる位置では、フットプリントが少なくなることが示された（Ｇａｒｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１４）ｅＬｉｆｅ  ３：ｅ０３７３５）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡ要素のうちのいずれか１つまたは複数を含むポリヌクレオチドに沿った別々の位置または場所におけるＰＩＣまたはリボソームの滞留時間または占有時間は、リボソームプロファイリングによって決定される。
【０５３９】
治療方法
ヒト及び他の哺乳類における癌の予防及び／または治療を目的とする組成物（例えば、医薬組成物）、方法、キット、及び試薬が本明細書で提供される。癌ＲＮＡワクチンは、治療剤または予防剤として使用することができる。癌ＲＮＡワクチンは、癌を予防及び／または治療するための医療において使用してよい。例示の態様では、本開示の癌ＲＮＡワクチンは、癌からの予防的保護を与えるために使用される。癌からの予防的保護は、本開示の癌ＲＮＡワクチンの投与後に達成することができる。ワクチンは、１回、２回、３回、４回、またはそれより多い回数投与することができるが、１回のワクチン投与（続いて任意選択でブースターの単回投与）で十分である可能性を有している。治療応答を達成するために、癌を有する個体にワクチンを投与することがより望ましい。投薬は、状況に応じて調節する必要があり得る。
【０５４０】
ｍＲＮＡワクチンが合成されると、患者に投与される。いくつかの実施形態では、ワクチンは、最大２ヶ月、最大３ヶ月、最大４ヶ月、最大５ヶ月、最大６ヶ月、最大７ヶ月、最大８ヶ月、最大９ヶ月、最大１０ヶ月、最大１１ヶ月、最大１年、最大１年半、最大２年、最大３年、または最大４年のスケジュールで投与される。スケジュールは、同一であるか、または変更され得る。いくつかの実施形態では、スケジュールは、最初の３ヶ月は１週間に１回であり、その後は１ヶ月に１回となる。ワクチンは、任意の経路によって投与してよい。いくつかの実施形態では、ワクチンは、筋肉内または静脈内の経路によって投与される。
【０５４１】
ワクチンは、任意の経路によって投与してよい。いくつかの実施形態では、ワクチンは、筋肉内または静脈内の経路によって投与される。
【０５４２】
ワクチンにおける変異が依然として適切であるかどうかを決定するために、治療の任意の時点で患者を調べてよい。その分析に基づいてワクチンを調節または再形成することで、１つもしくは複数の異なる変異を含めるか、または１つもしくは複数の変異を除去してよい。
【０５４３】
治療組成物及び予防組成物
例えば、ヒトまたは哺乳類における癌の予防、治療、または診断を目的とする組成物（例えば、医薬組成物）、方法、キット、及び試薬が本明細書で提供される。癌ＲＮＡワクチンは、治療剤または予防剤として使用することができる。癌ＲＮＡワクチンは、癌を予防及び／または治療するための医療において使用してよい。いくつかの実施形態では、本発明の癌ワクチンは、例えば、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）をエクスビボで活性化するための、免疫エフェクター細胞のプライミングにおける使用を想定することができ、当該末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は、その後、対象へと注入（再注入）される。
【０５４４】
例示の実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡポリヌクレオチドを含む癌ワクチンは、対象（例えば、ヒト対象などの哺乳類対象）に投与することができ、ＲＮＡポリヌクレオチドは、インビボで翻訳されることで抗原ポリペプチドを生成する。
【０５４５】
癌ＲＮＡワクチンは、細胞、組織、または生物においてポリペプチド（例えば、抗原または免疫原）の翻訳を誘導し得る。例示の実施形態では、そのような翻訳はインビボで生じるが、そのような翻訳がエクスビボ、培養物中、またはインビトロで生じる実施形態を想定することができる。例示の実施形態では、細胞、組織、または生物は、抗原ポリペプチドをコードする少なくとも１つの翻訳可能領域を有するポリヌクレオチドを含む癌ＲＮＡワクチンを含む有効量の組成物と接触する。
【０５４６】
「有効量」の癌ＲＮＡワクチンは、ポリヌクレオチドの標的組織、標的細胞型、投与手段、物理的特徴（例えば、ヌクレオシドのサイズ及び修飾度）、ならびに癌ＲＮＡワクチンの他の成分、ならびに他の決定要素に少なくとも部分的に基づいて提供される。一般に、有効量の癌ＲＮＡワクチン組成物は、細胞における抗原産生に応じて免疫応答を誘導または強化し、こうした抗原産生は、好ましくは、同一の抗原またはペプチド抗原をコードする対応する非修飾ポリヌクレオチドを含む組成物と比較してより効率的である。抗原産生の増加は、細胞トランスフェクション（ＲＮＡワクチンが細胞にトランスフェクトされる割合）の増加、ポリヌクレオチドからのタンパク質の翻訳の増加、核酸分解の減少（例えば、修飾ポリヌクレオチドからのタンパク質の翻訳持続期間の増加によって示される）、または宿主細胞の抗原特異的免疫応答の変化によって示され得る。
【０５４７】
いくつかの実施形態では、本開示によるＲＮＡワクチン（ポリヌクレオチド及びそれがコードするポリペプチドを含む）は、癌の治療に使用してよい。
【０５４８】
癌ＲＮＡワクチンは、健康な個体または早期癌もしくは症状発症後の活性期の癌を有する個体に対する活性免疫化スケジュールの一部として予防的または治療的に投与してよい。いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡワクチンが細胞、組織、または対象に提供される量は、免疫予防に有効な量であり得る。
【０５４９】
癌ＲＮＡワクチンは、他の予防化合物または治療化合物と共に投与してよい。非限定的な例として、予防化合物または治療化合物は、免疫増強剤、アジュバントまたはブースターであり得る。ワクチンなどの組成物を指すとき、本明細書で使用される「ブースター」という用語は、予防（ワクチン）組成物の追加投与を指す。ブースター（またはブースターワクチン）は、予防組成物が先に投与された後に与えてよい。予防組成物の初回投与とブースターとの投与時間間隔は、限定はされないが、１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１５分、２０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、１日、３６時間、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、１０日、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１年、１８ヶ月、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、１０年、１１年、１２年、１３年、１４年、１５年、１６年、１７年、１８年、１９年、２０年、２５年、３０年、３５年、４０年、４５年、５０年、５５年、６０年、６５年、７０年、７５年、８０年、８５年、９０年、９５年、または９９年超であり得る。例示の実施形態では、予防組成物の初回投与とブースターとの投与時間間隔は、限定はされないが、１週間、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、または１年であり得る。
【０５５０】
１つの実施形態では、ポリヌクレオチドは、当該技術分野において知られるワクチンの投与と同様に筋肉内または皮内に投与してよい。
【０５５１】
ｍＲＮＡ癌ワクチンは、癌の重症度またはアンメットメディカルニーズの程度もしくはレベルに応じてさまざまな状況において利用してよい。非限定例として、ｍＲＮＡ癌ワクチンは、任意のステージの癌の治療に利用してよい。ｍＲＮＡ癌ワクチンは、市販の抗癌ワクチンと比較して、生成抗体価がはるかに高く、Ｔ細胞応答を生成し、応答生成が早いという点において優れた特性を有する。理論に束縛されるものではないが、ｍＲＮＡ癌ワクチンは天然の細胞機構を取り入れているため、ｍＲＮＡであるｍＲＮＡ癌ワクチンは、翻訳時に適切なタンパク質の立体構造を生成するように良好に設計されると発明者らは仮定する。エクスビボで製造され、望ましくない細胞応答を誘発する可能性のある従来型ワクチンとは異なり、ｍＲＮＡ癌ワクチンは、より自然な方法で細胞系に提示される。
【０５５２】
ｍＲＮＡ癌ワクチンが治療し得る癌のリストが以下に示されるが、そのリストに限定はされない。ペプチドエピトープまたは抗原は、こうした癌または腫瘍の任意の抗原に由来し得る。そのようなエピトープは、癌抗原または腫瘍抗原と称される。癌細胞は、腫瘍進行の異なるフェーズの間に細胞表面分子を異なって発現し得る。例えば、癌細胞は、良性状態では細胞表面抗原を発現し得るが、転位時にその特定の細胞表面抗原を下方制御し得る。したがって、腫瘍抗原または癌抗原は、癌の進行の任意のステージの間に産生する抗原を包含し得ると想定される。本発明の方法は、こうした変化に適合するように調整してよい。例えば、特定の患者向けに異なるｍＲＮＡワクチンをいくつか生成してよい。例えば、治療の開始時点で最初のワクチンを使用してよい。その後のある時点で、新たなｍＲＮＡワクチンを生成し、患者に投与することで、発現中の異なる抗原を網羅してよい。
【０５５３】
いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、下記の抗原のうちの１つである：ＣＤ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７９、ＣＤ１３７、４−ＩＢＢ、５Ｔ４、ＡＧＳ−５、ＡＧＳ−１６、アンジオポエチン２、Ｂ７．１、Ｂ７．２、Ｂ７ＤＣ、Ｂ７Ｈ１、Ｂ７Ｈ２、Ｂ７Ｈ３、ＢＴ−０６２、ＢＴＬＡ、ＣＡＩＸ、癌胎児抗原、ＣＴＬＡ４、クリプト（Ｃｒｉｐｔｏ）、ＥＤ−Ｂ、ＥｒｂＢｌ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＥＧＦＬ７、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＢ２、ＦＡＰ、フィブロネクチン、葉酸受容体、ガングリオシドＧＭ３、ＧＤ２、グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体（ＧＩＴＲ）、ｇｐｌＯＯ、ｇｐＡ３３、ＧＰＮＭＢ、ＩＣＯＳ、ＩＧＦ１Ｒ、インテグリンａｖ、インテグリンανβ、ＬＡＧ−３、ルイスＹ、メソテリン、ｃ−ＭＥＴ、ＭＮ炭酸脱水酵素ＩＸ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ネクチン−４、ＮＫＧＤ２、ＮＯＴＣＨ、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＰＤ−１、ＰＤＬ１、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＡＮＫＬ、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＳＬＣ４４Ａ４、シンデカン−１、ＴＡＣＩ、ＴＡＧ−７２、テネイシン、ＴＩＭ３、ＴＲＡＩＬＲｌ、ＴＲＡＩＬＲ２、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３、及びそれらの変異体。
【０５５４】
癌または腫瘍には、限定はされないが、新生物、悪性腫瘍、転移癌、または無制御の細胞増殖によって特徴付けられ、結果的に癌性であると想定される任意の疾患もしくは障害が含まれる。癌は、原発性または転移性の癌であり得る。本発明に従って治療することができる特定の癌には、限定はされないが、下記のものが含まれる（そのような障害の概説については、Ｆｉｓｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａを参照のこと）。癌には、限定はされないが、胆道癌、膀胱癌、神経膠芽腫及び髄芽腫を含む脳癌、乳癌、子宮頸癌、絨毛癌、結腸癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、急性リンパ性白血病及び急性骨髄性白血病を含む血液新生物、多発性骨髄腫、ＡＩＤＳ関連白血病及び成人Ｔ細胞白血病リンパ腫、ボーエン病及びパジェット病を含む上皮内新生物、肝癌、肺癌、ホジキン病及びリンパ球性リンパ腫を含むリンパ腫、神経芽細胞腫、扁平上皮癌を含む口腔癌、上皮細胞、間質細胞、生殖細胞、及び間葉系細胞から生じるものを含む卵巣癌、膵癌、前立腺癌、直腸癌、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫、及び骨肉腫を含む肉腫、メラノーマ、カポジ肉腫、基底細胞癌、及び扁平上皮癌を含む皮膚癌、セミノーマ、非セミノーマ、奇形腫、絨毛癌などの胚腫瘍を含む精巣癌、間質性腫瘍及び生殖細胞腫瘍、甲状腺の腺癌及び髄様癌を含む甲状腺癌、ならびに腺癌及びウィルムス腫瘍を含む腎癌が含まれる。一般に経験する癌には、乳癌、前立腺癌、肺癌、卵巣癌、結腸直腸癌、及び脳癌が含まれる。
【０５５５】
いくつかの実施形態では、癌は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺癌、メラノーマ、膀胱尿路上皮癌、ＨＰＶ陰性頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、及び高頻度マイクロサテライト（ＭＳＩ  Ｈ）／ミスマッチ修復（ＭＭＲ）欠損である固形悪性腫瘍からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＮＳＣＬＣは、ＥＧＦＲ感受性変異及び／またはＡＬＫ転座がない。いくつかの実施形態では、高頻度マイクロサテライト（ＭＳＩ  Ｈ）／ミスマッチ修復（ＭＭＲ）欠損である固形悪性腫瘍は、結腸直腸癌、胃腺癌、食道腺癌、及び子宮内膜癌からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、癌は、膵臓、腹膜、大腸、小腸、胆道、肺、子宮内膜、卵巣、生殖管、胃腸管、子宮頸部、胃、尿路、結腸、直腸、ならびに造血系及びリンパ系組織の癌から選択される。いくつかの実施形態では、癌は、結腸直腸癌である。
【０５５６】
癌ＲＮＡワクチン及びＲＮＡワクチン組成物及び／または複合物を、１つもしくは複数の薬学的に許容される賦形剤と任意選択で組み合わせて含む医薬組成物が本明細書で提供される。
【０５５７】
癌ＲＮＡワクチンは、単独で製剤化もしくは投与するか、または１つもしくは複数の他の成分と組み合わせて製剤化もしくは投与してよい。例えば、癌ＲＮＡワクチン（ワクチン組成物）は、限定するものではないが、免疫増強剤（例えば、アジュバント）を含む他の成分を含み得る。いくつかの実施形態では、癌ＲＮＡワクチンは、免疫増強剤またはアジュバントを含まない（すなわち、免疫増強剤不含またはアジュバント不含である）。
【０５５８】
他の実施形態では、本明細書に記載のｍＲＮＡ癌ワクチンは、患者の治療に有用な任意の他の治療と組み合わせてよい。例えば、患者は、ｍＲＮＡ癌ワクチン及び抗癌剤で治療してよい。したがって、１つの実施形態では、本発明の方法は、１つまたは複数の癌治療と組み合わせて使用することができ、例えば、抗癌剤、従来型癌ワクチン、化学療法、放射線療法などと（例えば、同時に、または全治療手順の一部として）組み合わせて使用することができる。変動し得る癌治療のパラメーターには、限定はされないが、用量、投与タイミング、または期間もしくは治療が含まれ、癌治療は、用量、タイミング、または期間で変わり得る。癌の別の治療は手術であり、手術は、単独または前述の治療方法のいずれかと組み合わせて利用することができる。有用であることが知られているか、または癌の予防もしくは治療に使用されたことがあるか、もしくは現在使用されている任意の薬剤または治療（例えば、従来型癌ワクチン、化学療法、放射線療法、手術、ホルモン療法及び／または生物学的治療／免疫療法）を本発明の組成物と共に、本明細書に記載の発明に従って組み合わせて使用することができる。医療分野の当業者であれば、対象に適した治療を決定することができる。
【０５５９】
そのような薬剤（すなわち、抗癌剤）の例には、限定はされないが、ＤＮＡ相互作用性の薬剤（限定はされないが、アルキル化剤（例えば、ナイトロジェンマスタード（例えば、クロラムブシル、シクロホスファミド、イソファミド（Ｉｓｏｆａｍｉｄｅ）、メクロレタミン、メルファラン、ウラシルマスタード）；チオテパなどのアジリジン；ブスルファンなどのメタンスルホン酸エステル；カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシンなどのニトロソウレア；シスプラチン、カルボプラチンなどの白金錯体；マイトマイシン、及びプロカルバジン、ダカルバジン及びアルトレタミンなどの生体内還元性アルキル化剤）；例えばブレオマイシンなどのＤＮＡ鎖切断剤；例えばアムサクリン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、ミトキサントロンなどのインターカレーターなどの挿入性のトポイソメラーゼＩＩ阻害剤、ならびにエトポシド及びテニポシドなどの非インターカレーター；例えばエトポシド及びテニポシド（Ｔｅｎｉｐｏｓｄｅ）などの非挿入性のトポイソメラーゼＩＩ阻害剤；ならびに例えばプリカマイジン（Ｐｌｉｃａｍｙｄｉｎ）などのＤＮＡ副溝結合剤を含む）；代謝拮抗剤（限定はされないが、メトトレキサート及びトリメトレキサートなどの葉酸アンタゴニスト；フルオロウラシル、フルオロデオキシウリジン、ＣＢ３７１７、アザシチジン、及びフロクスウリジンなどのピリミジンアンタゴニスト；メルカプトプリン、６−チオグアニン、ペントスタチンなどのプリンアンタゴニスト；シタラビン及びフルダラビンなどの糖修飾類似体；ならびにヒドロキシウレアなどのリボヌクレオチド還元酵素阻害剤を含む）；チューブリン相互作用性の薬剤（限定はされないが、コルビチン（ｃｏｌｃｂｉｃｉｎｅ）、ビンクリスチン及びビンブラスチン、両方のアルカロイド、ならびにパクリタキセル及びシトキサン（ｃｙｔｏｘａｎ）を含む）；ホルモン剤（限定はされないが、エストロゲン、複合化エストロゲン及びエチニルエストラジオール及びジエチルスチルベステロール（Ｄｉｅｔｈｙｌｓｔｉｌｂｅｓｔｅｒｏｌ）、クロロトリアニセン（Ｃｈｌｏｒｔｒｉａｎｉｓｅｎ）及びイデンエストロール（Ｉｄｅｎｅｓｔｒｏｌ）；カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、メドロキシプロゲステロン、及びメゲストロールなどのプロゲスチン；ならびにテストステロン、プロピオン酸テストステロンなどのアンドロゲン；フルオキシメステロン、メチルテストステロン；例えば、プレドニゾン、デキサメタゾン、メチルプレドニゾロン、及びプレドニゾロンなどの副腎皮質ステロイド；例えば、酢酸ロイプロリド及び酢酸ゴセレリンなどの黄体化ホルモン放出ホルモン剤または性腺刺激ホルモン放出ホルモンアンタゴニストを含む）；抗ホルモン抗原（ａｎｔｉｈｏｒｍｏｎａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ）（限定はされないが、タモキシフェンなどの抗エストロゲン剤、フルタミドなどの抗アンドロゲン剤；ならびにミトタン及びアミノグルテチミドなどの抗副腎剤を含む）；サイトカイン（限定はされないが、ＩＬ−１．アルファ．、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２��ＩＬ−１３、ＩＬ−１８、ＴＧＦ−β、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＬＡＦ、ＴＣＧＦ、ＢＣＧＦ、ＴＲＦ、ＢＡＦ、ＢＤＧ、ＭＰ、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＴＭＦ、ＰＤＧＦ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−．γ、及びウテログロビン（米国特許第５，６９６、０９２号）を含む）；抗血管新生剤（限定はされないが、ＶＥＧＦを阻害する薬剤（例えば、他の中和抗体）、可溶性受容体構築物、チロシンキナーゼ阻害剤、アンチセンス戦略、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ受容体に対するＲＮＡアプタマー及びリボザイム、免疫毒素及びコアグリガンド（ｃｏａｇｕｌｉｇａｎｄ）、腫瘍ワクチン、ならびに抗体を含む）が含まれる。
【０５６０】
本発明の方法に従って使用することができる抗癌剤の特定の例には、限定はされないが、アシビシン、アクラルビシン、アコダゾール塩酸塩、アクロニン、アドゼレシン、アルデスロイキン、アルトレタミン、アンボマイシン、酢酸アメタントロン、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アントラマイシン、アスパラギナーゼ、アスペルリン、アザシチジン、アゼテパ、アゾトマイシン、バチマスタット、ベンゾデパ、ビカルタミド、ビサントレン塩酸塩、メシル酸ビスナフィド、ビセレシン、ブレオマイシン硫酸塩、ブレキナルナトリウム、ブロピリミン、ブスルファン、カクチノマイシン、カルステロン、カラセミド、カルベチマー、カルボプラチン、カルムスチン、カルビシン塩酸塩、カルゼレシン、セデフィンゴール、クロラムブシル、シロレマイシン、シスプラチン、クラドリビン、メシル酸クリスナトール、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン塩酸塩、デシタビン、デキソルマプラチン、デザグアニン、メシル酸デザグアニン、ジアジコン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ドキソルビシン塩酸塩、ドロロキシフェン、ドロロキシフェンクエン酸塩、プロピオン酸ドロモスタノロン、デュアゾマイシン、エダトレキサート、エフロミチン塩酸塩（ｅｆｌｏｍｉｔｈｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、エルサミトルシン、エンロプラチン、エンプロマート、エピプロピジン、エピルビシン塩酸塩、エルブロゾール、エソルビシン塩酸塩、エストラムスチン、エストラムスチンホスフェートナトリウム、エタニダゾール、エトポシド、エトポシドホスフェート、エトプリン、ファドロゾール塩酸塩、ファザラビン、フェンレチニド、フロクスウリジン、フルダラビンホスフェート、フルオロウラシル、フルロシタビン、ホスキドン、ホストリエシンナトリウム、ゲムシタビン、ゲムシタビン塩酸塩、ヒドロキシウレア、イダルビシン塩酸塩、イホスファミド、イルモホシン、インターロイキンＩＩ（組換えインターイエキン（ｉｎｔｅｒｉｅｕｋｉｎ）ＩＩまたはｒＩＬ２を含む）、インターフェロンアルファ−２ａ、インターフェロンアルファ−２ｂ、インターフェロンアルファ−ｎ１、インターフェロンアルファ−ｎ３、インターフェロンベータ−Ｉａ、インターフェロンガンマ−Ｉｂ、イプロプラチン、イリノテカン塩酸塩、酢酸ランレオチド、レトロゾール、酢酸リュープロリド、リアロゾール塩酸塩、ロメトレキソールナトリウム、ロムスチン、ロソキサントロン塩酸塩、マソプロコール、マイタンシン、メクロレタミン塩酸塩、酢酸メゲストロール、酢酸メレンゲストロール、メルファラン、メノガリル、メルカプトプリン、メトトレキサート、メトトレキサートナトリウム、メトプリン、メツレデパ、ミチンドミド、ミトカルシン、ミトクロミン、ミトギリン、ミトマルシン、マイトマイシン、ミトスペル、ミトタン、ミトキサントロン塩酸塩、ミコフェノール酸、ノコダゾール、ノガラマイシン、オルマプラチン、オキシスラン、パクリタキセル、ペグアスパルガーゼ、ペリオマイシン、ペンタムスチン、硫酸ペプロマイシン、ペルホスファミド、ピポブロマン、ピポスルファン、ピロキサントロン塩酸塩、プリカマイシン、プロ���スタン、ポルフィマーナトリウム、ポルフィロマイシン、プレドニムスチン、プロカルバジン塩酸塩、ピューロマイシン、ピューロマイシン塩酸塩、ピラゾフリン、リボプリン、ログレチミド、サフィンゴール、サフィンゴール塩酸塩、セムスチン、シムトラゼン、スパルフォセートナトリウム、スパルソマイシン、スピロゲルマニウム塩酸塩、スピロムスチン、スピロプラチン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、スロフェヌル、タリソマイシン、テコガランナトリウム、テガフール、テロキサントロン塩酸塩、テモポルフィン、テニポシド、テロキシロン、テストラクトン、チアミプリン、チオグアニン、チオテパ、チアゾフリン、チラパザミン、クエン酸トレミフェン、酢酸トレストロン、リン酸トリシリビン、トリメトレキサート、グルクロン酸トリメトレキサート、トリプトレリン、ツブロゾール塩酸塩、ウラシルマスタード、ウレデパ、バプレオチド、ベルテポルフィン、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、ビンデシン、硫酸ビンデシン、硫酸ビネピジン、硫酸ビングリシナート、硫酸ビンロイロシン、ビノレルビン酒石酸塩、硫酸ビンロシジン、硫酸ビンゾリジン、ボロゾール、ゼニプラチン、ジノスタチン、及びゾルビシン塩酸塩が含まれる。
【０５６１】
他の抗癌剤には、限定はされないが、２０−エピ−１，２５ジヒドロキシビタミンＤ３、５−エチニルウラシル、血管新生阻害剤、抗背側化形態形成タンパク質―１（ａｎｔｉ−ｄｏｒｓａｌｉｚｉｎｇ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１）、アラ−ＣＤＰ−ＤＬ−ＰＴＢＡ、ＢＣＲ／ＡＢＬアンタゴニスト、ＣａＲｅｓｔＭ３、ＣＡＲＮ７００、カゼインキナーゼ阻害剤（ＩＣＯＳ）、クロトリマゾール、コリスマイシンＡ、コリスマイシンＢ、コンブレタスタチンＡ４、クランベシジン８１６、クリプトフィシン８、クラシンＡ、デヒドロジデムニンＢ、ジデムニンＢ、ジヒドロ−５−アザシチジン、ジヒドロタキソール，デュオカルマイシンＳＡ、カハラリドＦ、ラメラリン−Ｎトリアセテート、リュープロリド＋エストロゲン＋プロゲステロン、リッソクリナミド７、モノホスホリルリピドＡ＋マイオバクテリウム（ｍｙｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）細胞壁ｓｋ、Ｎ−アセチルジナリン、Ｎ−置換ベンズアミド、Ｏ６−ベンジルグアニン、プラセチンＡ、プラセチンＢ、白金錯体、白金化合物、白金−トリアミン複合体、レニウムＲｅ１８６エチドロネート、ＲＩＩレチンアミド、ルビギノンＢ１、ＳａｒＣＮＵ、サルコフィトールＡ、サルグラモスチム、老化由来阻害剤１（ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ１）、スピカマイシンＤ、タリムスチン、５−フルオロウラシル、トロンボポエチン、チモトリナン、甲状腺刺激ホルモン、バリオリンＢ、サリドマイド、ベラレソール、ベラミン（ｖｅｒａｍｉｎｅ）、ベルジン（ｖｅｒｄｉｎ）、ベルテポルフィン、ビノレルビン、ビンキサルチン（ｖｉｎｘａｌｔｉｎｅ）、ビタキシン（ｖｉｔａｘｉｎ）、ザノテロン、ゼニプラチン、及びジラスコルブが含まれる。
【０５６２】
本発明は、癌細胞を破壊するためのＸ線、ガンマ線、及び他の線源の使用を含む放射線療法と組み合わせた、ｍＲＮＡ癌ワクチンを含む組成物の投与も包含する。好ましい実施形態では、放射線治療は、外照射または遠隔療法として実施され、放射線は、遠隔の線源から向けられる。他の好ましい実施形態では、放射線治療は、内療法または密封小線源療法として実施され、放射能源は、癌細胞または腫瘤に近接して体内に設置される。
【０５６３】
特定の実施形態では、癌の型に応じて適切な抗原レジメンが選択される。例えば、卵巣癌を有する患者には、卵巣癌治療に有用な１つまたは複数の他の薬剤を予防的または治療的に有効な量で組み合わせて、ｍＲＮＡ癌ワクチンを含む予防的または治療的に有効な量の組成物を投与してよく、卵巣癌治療に有用なこうした他の薬剤には、限定はされないが、Ｐ３２療法などの腹腔内放射線療法、複部及び骨盤全体の放射線療法、シスプラチン、パクリタキセル（タキソール）もしくはドセタキセル（タキソテール）とシスプラチンもしくはカルボプラチンとの組み合わせ、シクロホスファミドとシスプラチンとの組み合わせ、シクロホスファミドとカルボプラチンとの組み合わせ、５−ＦＵとロイコボリンとの組み合わせ、エトポシド、リポソームドキソルビシン、ゲムシタビン、またはトポテカンが含まれる。癌治療及びその用量、投与経路、ならびに推奨用法は、当該技術分野において知られており、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（５６ｔｈ  ｅｄ．，２００２）などの文献に記載されている。
【０５６４】
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、ｍＲＮＡ癌ワクチンは、免疫チェックポイント調節因子などのＴ細胞活性化因子と共に投与される。免疫チェックポイント調節因子には、刺激性チェックポイント分子と阻害性チェックポイント分子（すなわち、抗ＣＴＬＡ４抗体及び抗ＰＤ１抗体）との両方が含まれる。
【０５６５】
刺激性チェックポイント阻害剤は、チェックポイントプロセスを促進することによって機能する。いくつかの刺激性チェックポイント分子は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体スーパーファミリーのメンバー（ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、及びＣＤ１３７）であり、他のものは、Ｂ７−ＣＤ２８スーパーファミリーに属する（ＣＤ２８及びＩＣＯＳ）。ＯＸ４０（ＣＤ１３４）は、エフェクターＴ細胞及びメモリーＴ細胞の増殖に関与する。抗ＯＸ４０モノクローナル抗体は、進行癌の治療に有効であることが示されている。ＭＥＤＩ０５６２は、ヒト化ＯＸ４０アゴニストである。ＧＩＴＲは、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲファミリー関連遺伝子であり、Ｔ細胞の増殖に関与する。ＧＩＴＲに対するいくつかの抗体は、抗癌応答を促進することが示されている。ＩＣＯＳは、誘導性のＴ細胞共刺激因子であり、Ｔ細胞のエフェクター機能において重要である。ＣＤ２７は、ナイーブＴ細胞の抗原特定的な増殖を支持し、Ｔ細胞及びＢ細胞のメモリー生成に関与する。アゴニストである抗ＣＤ２７抗体がいくつか開発中である。ＣＤ１２２は、インターロイキン−２受容体ベータサブユニットである。ＮＫＴＲ−２１４は、ＣＤ１２２偏向結合性免疫賦活性サイトカインである。
【０５６６】
阻害性チェックポイント分子には、限定はされないが、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、ＶＩＳＴＡ、Ａ２ＡＲ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ−４、ＩＤＯ、ＫＩＲ、及びＬＡＧ３が含まれる。ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、及びそのリガンドは、Ｔ細胞機能及び他の細胞機能のすべての段階を通して重要な役割を担う共刺激分子のＣＤ２８−Ｂ７ファミリーのメンバーである。ＣＴＬＡ−４は、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＤ１５２）であり、Ｔ細胞の増殖制御に関与する。
【０５６７】
ＰＤ−１受容体は、活性化したＴ細胞（及びＢ細胞）の表面に発現し、通常の状況下では、樹状細胞またはマクロファージなどの抗原提示細胞の表面に発現するそのリガンド（ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２）に結合する。この相互作用は、Ｔ細胞にシグナルを送り込み、Ｔ細胞を阻害する。癌細胞は、その表面に高レベルのＰＤ−Ｌ１発現を誘導することによって、このシステムを悪用する。これによって、癌細胞によるＰＤ−１経路の支配が可能になり、腫瘍微小環境に侵入し得るＰＤ−１発現Ｔ細胞のスイッチが切れることによって抗癌免疫応答が抑制される。ペンブロリズマブ（以前の名称はＭＫ−３４７５及びランブロリズマブであり、商品名はＫｅｙｔｒｕｄａである）は、癌免疫療法において使用されるヒト抗体である。この抗体は、ＰＤ−１受容体を標的とする。
【０５６８】
ＩＤＯ（インドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ）は、Ｔ細胞及びＮＫ細胞を抑制するトリプトファン分解酵素であり、Ｔｒｅｇ及び骨髄系由来サプレッサー細胞を生成及び活性化すると共に、腫瘍の血管新生を促進する。ＴＩＭ−３（Ｔ細胞免疫グロブリンドメイン及びムチンドメイン３）は、そのリガンドであるガレクチン−９と相互作用すると細胞死を引き起こすことによってＴｈ１／Ｔｃ１機能の負の制御因子として働く。ＶＩＳＴＡは、Ｔ細胞活性化のＶ−ドメインＩｇサプレッサーである。
【０５６９】
チェックポイント阻害剤は、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、融合タンパク質もしくはそれらの組み合わせ、または小分子などの分子である。例えば、チェックポイント阻害剤は、チェックポイントタンパク質を阻害するものであり、こうしたチェックポイントタンパク質は、ＣＴＬＡ−４、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＰＤ１、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、２Ｂ４、ＣＤ１６０、ＣＧＥＮ−１５０４９、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、Ａ２ａＲ、Ｂ−７ファミリーのリガンド、またはそれらの組み合わせであり得る。チェックポイントタンパク質のリガンドには、限定はされないが、ＣＴＬＡ−４、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＰＤ１、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、２Ｂ４、ＣＤ１６０、ＣＧＥＮ−１５０４９、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、Ａ２ａＲ、及びＢ−７ファミリーのリガンドが含まれる。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、ＢＭＳ−９３６５５８（ニボルマブ）である。他の実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４抗体は、イピリムマブ（商品名はＹｅｒｖｏｙであり、以前はＭＤＸ−０１０及びＭＤＸ−１０１として知られる）である。
【０５７０】
いくつかの好ましい実施形態では、チェックポイント調節因子を含む癌治療剤は、例えば、抗ＰＤ１、サイトカイン、ケモカイン、または刺激性受容体／リガンド（例えば、ＯＸ４０）などの癌治療剤をコードするｍＲＮＡの形態で送達される。
【０５７１】
いくつかの実施形態では、癌治療剤は、標的治療である。標的治療は、ベムラフェニブ（ＰＬＸ４０３２）またはダブラフェニブなどのＢＲＡＦ阻害剤であり得る。ＢＲＡＦ阻害剤は、ＰＬＸ４０３２、ＰＬＸ４７２０、ＰＬＸ４７３４、ＧＤＣ−０８７９、ＰＬＸ４０３２、ＰＬＸ−４７２０、ＰＬＸ４７３４、及びトシル酸ソラフェニブであり得る。ＢＲＡＦは、Ｂ−Ｒａｆと呼ばれるタンパク質をつくるヒト遺伝子であり、癌原遺伝子Ｂ−Ｒａｆ及びｖ−Ｒａｆマウス肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログＢ１とも称される。Ｂ−Ｒａｆタンパク質は、細胞増殖の誘導に関与する細胞内でのシグナル送達に関与する。ベムラフェニブは、ＢＲＡＦ阻害剤であり、後期のメラノーマの治療を対象としてＦＤＡによって認可された。
【０５７２】
他の実施形態では、Ｔ細胞治療剤は、ＯＸ４０Ｌである。ＯＸ４０は、腫瘍壊死因子／神経成長因子受容体（ＴＮＦＲ／ＮＧＦＲ）ファミリーのメンバーである。ＯＸ４０は、Ｔ細胞活性化ならびに正常及び悪性のリンパ球系細胞の分化、増殖、またはアポトーシスの制御において一定の役割を担い得る。
【０５７３】
一態様では、本発明の方法は、ＰＤ−１アンタゴニストを対象に投与することをさらに含む。いくつかの態様では、ＰＤ−１アンタゴニストは、ＰＤ−１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分である。具体的な態様では、ＰＤ−１アンタゴニストは、モノクローナル抗体である。いくつかの態様では、ＰＤ−１アンタゴニストは、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ピジリズマブ、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
【０５７４】
別の態様では、本発明の方法は、ＰＤＬ−１アンタゴニストを対象に投与することをさらに含む。いくつかの態様では、ＰＤ−Ｌ１アンタゴニストは、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分である。具体的な態様では、ＰＤ−Ｌ１アンタゴニストは、モノクローナル抗体である。いくつかの態様では、ＰＤ−Ｌ１アンタゴニストは、デュルバルマブ、アベルマブ、ＭＥＤＩ４７３、ＢＭＳ−９３６５５９、アテゾリズマブ、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
【０５７５】
別の態様では、本発明の方法は、ＣＴＬＡ−４アンタゴニストを対象に投与することをさらに含む。いくつかの態様では、ＣＴＬＡ−４アンタゴニストは、ＣＴＬＡ−４に特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分である。具体的な態様では、ＣＴＬＡ−４アンタゴニストは、モノクローナル抗体である。いくつかの態様では、ＣＴＬＡ−４アンタゴニストは、イピリムマブ、トレメリムマブ、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
【０５７６】
本発明のある特定の実施形態は、癌の治療を必要とする対象の癌の治療方法であって、ポリヌクレオチド、特に、ＫＲＡＳワクチンペプチドをコードするｍＲＮＡを、１つまたは複数の抗癌剤とともに対象に投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の抗癌剤は、１つまたは複数のチェックポイント阻害剤抗体である。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の抗癌剤は、１つまたは複数のチェックポイント阻害剤抗体をコードするｍＲＮＡである。
【０５７７】
一態様では、対象は、本開示のポリヌクレオチドの前に、ＰＤ−１アンタゴニストで先に治療されている。別の態様では、対象は、本開示のポリヌクレオチドの前に、ＰＤ−１に結合するモノクローナル抗体で治療されている。別の態様では、対象は、本方法のポリヌクレオチドの前に、抗ＰＤ−１モノクローナル抗体療法で治療されている。他の態様では、抗ＰＤ−１モノクローナル抗体療法は、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ピジリズマブ、またはこれらの任意の組み合わせを含む。
【０５７８】
別の態様では、対象は、本開示のポリヌクレオチドの前に、ＰＤＬ−１に結合するモノクローナル抗体で治療されている。別の態様では、対象は、本方法のポリヌクレオチドの前に、抗ＰＤＬ−１モノクローナル抗体療法で治療されている。他の態様では、抗ＰＤＬ−１モノクローナル抗体療法は、デュルバルマブ、アベルマブ、ＭＥＤＩ４７３、ＢＭＳ−９３６５５９、アテゾリズマブ、またはこれらの任意の組み合わせを含む。
【０５７９】
いくつかの態様では、対象は、本開示のポリヌクレオチドの前に、ＣＴＬＡ−４アンタゴニストで治療されている。別の態様では、対象は、本開示のポリヌクレオチドの前に、ＣＴＬＡ−４に結合するモノクローナル抗体で先に治療されている。別の態様では、対象は、本発明のポリヌクレオチドの前に、抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体で治療されている。他の態様では、抗ＣＴＬＡ−４抗体療法は、イピリムマブまたはトレメリムマブを含む。
【０５８０】
１つの実施形態では、本開示に有用な抗ＰＤ−１抗体（またはその抗原結合部分）は、ペンブロリズマブである。ペンブロリズマブ（「ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）」、ランブロリズマブ、及びＭＫ−３４７５としても知られる）は、ヒト細胞表面受容体ＰＤ−１（プログラム死１またはプログラム細胞死１）に対するヒト化モノクローナルＩｇＧ４抗体である。ペンブロリズマブは、例えば、米国特許第８，９００，５８７号に記載されており、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／ｄｒｕｇｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ？ｃｄｒｉｄ＝６９５７８９（最終アクセス：２０１４年１２月１４日）も参照のこと。ペンブロリズマブは、再発または難治性メラノーマ及び進行性ＮＳＣＬＣの治療に対し、ＦＤＡの承認を受けている。
【０５８１】
別の実施形態では、本開示に有用な抗ＰＤ−１抗体は、ニボルマブである。ニボルマブ（「ＯＰＤＩＶＯ（登録商標）」としても知られ、以前の名称は５Ｃ４、ＢＭＳ−９３６５５８、ＭＤＸ−１１０６、またはＯＮＯ−４５３８である）は、ＰＤ−１リガンド（ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２）との相互作用を選択的に阻害することにより、抗腫瘍Ｔ細胞機能の下方制御を妨げる、完全ヒトＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）ＰＤ−１免疫チェックポイント阻害剤抗体である（米国特許第８，００８，４４９号；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ．２（９）：８４６−５６）。ニボルマブは、腎細胞癌（腎腺癌、または副腎腫）、メラノーマ、及び非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を含む、さまざまな進行性固形腫瘍に活性を示している（Ｔｏｐａｌｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２ａ；Ｔｏｐａｌｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｄｒａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；ＷＯ  ２０１３／１７３２２３。
【０５８２】
他の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、ＰＤ−１受容体に対するモノクローナル抗体であるＭＥＤＩ０６８０（以前の名称はＡＭＰ−５１４である）である。ＭＥＤＩ０６８０は、例えば、米国特許第８，６０９，０８９Ｂ２号またはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／ｄｒｕｇｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ？ｃｄｒｉｄ＝７５６０４７（２０１４年１２月１４日に最終アクセス）に記載されている。
【０５８３】
ある特定の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、ヒト化モノクローナル抗体であるＢＧＢ−Ａ３１７である。ＢＧＢ−Ａ３１７は、米国特許公開第２０１５／００７９１０９号に記載されている。
【０５８４】
ある特定の実施形態では、ＰＤ−１アンタゴニストは、Ｂ７−ＤＣ  Ｆｃ融合タンパク質であるＡＭＰ−２２４である。ＡＭＰ−２２４は、米国特許公開第２０１３／００１７１９９号またはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｄｉｃｔｉｏｎａｒｉｅｓ／ｃａｎｃｅｒ−ｄｒｕｇ？ｃｄｒｉｄ＝７００５９５（２０１５年７月８日に最終アクセス）に考察されている。
【０５８５】
ある特定の実施形態では、本開示に有用な抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ（アベルマブとも呼ばれる；ＵＳ２０１４／０３４１９１７を参照のこと）またはＢＭＳ−９３６５５９（以前の名称は１２Ａ４またはＭＤＸ−１１０５である）（例えば、米国特許第７，９４３，７４３号；ＷＯ２０１３／１７３２２３を参照のこと）である。他の実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（ＲＧ７４４６としても知られる）（例えば、Ｈｅｒｂｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ３１（ｓｕｐｐｌ）：３０００．Ａｂｓｔｒａｃｔ；米国特許第８，２１７，１４９号を参照のこと）、ＭＥＤＩ４７３６（デュルバルマブとしても知られる；Ｋｈｌｅｉｆ（２０１３）Ｉｎ：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ２０１３；Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２７−Ｏｃｔｏｂｅｒ  １，２０１３；Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓである。
【０５８６】
臨床的な抗ＣＴＬＡ−４抗体の例は、米国特許第６，９８４，７２０号に開示されているヒトｍＡｂ  １０Ｄ１（現在はイピリムマブとして知られ、ＹＥＲＶＯＹ（登録商標）として上市されている）である。本方法に有用な別の抗ＣＴＬＡ−４抗体は、トレメリムマブ（ＣＰ−６７５，２０６としても知られる）である。トレメリムマブは、ヒトＩｇＧ２モノクローナル抗ＣＴＬＡ−４抗体である。トレメリムマブは、ＷＯ／２０１２／１２２４４４、米国特許公開第２０１２／２６３６７７号、または国際公開第ＷＯ２００７／１１３６４８Ａ２号に記載されている。
【０５８７】
以下の表（表１０）は、特定の腫瘍の種類、ならびに使用中及び試験中の治療法の種類におけるＫＲＡＳ変異の例を提供する。本発明の組成物は、これらの治療法のいずれかとの組み合わせにおいて有用である。
【表４−１】
2020506189.tif 000007
【表４−２】
2020506189.tif 000008
【０５８８】
他の実施形態では、癌治療剤は、サイトカインである。さらに他の実施形態では、癌治療剤は、集団ベースの腫瘍特異的抗原を含むワクチンである。
【０５８９】
他の実施形態では、癌治療剤は、癌−生殖系列遺伝子が発現する１つまたは複数の従来型抗原（複数の患者に見られる腫瘍に共通する抗原であり、「共通癌抗原」とも称される）を含むワクチンである。いくつかの実施形態では、従来型抗原は、癌もしくは腫瘍に一般に見られることが知られるものであるか、または特定の型の癌もしくは腫瘍において見られることが知られるものである。いくつかの実施形態では、従来型癌抗原は、変異していない腫瘍抗原である。いくつかの実施形態では、従来型癌抗原は、変異した腫瘍抗原である。
【０５９０】
ｐ５３遺伝子（正式記号ＴＰ５３）は、ヒトの癌において他のどの遺伝子よりも高い頻度で変異する。ｐ５３に生じる変異のほとんどで、そのゲノム位置は１人または少数の患者のみに特有であるため、こうした変異は、特定の患者集団向けに設計される治療ワクチンのための反復ネオ抗原として使用できないことが大規模コホート研究によって示された。しかしながら、ｐ５３遺伝子座の小サブセットは実に「ホットスポット」のパターンを示しており、そこでは、遺伝子のいくつかの位置が相対的に高い頻度で変異するのである。際だったことに、反復して変異するこうした領域の大部分が、エクソンとイントロンとの境界付近に存在し、ｍＲＮＡのスプライシング機構によって認識される標準のヌクレオチド配列モチーフを破壊する。
【０５９１】
スプライシングモチーフが変異すると、局所的なアミノ酸配列には変化が生じない（すなわち、同義変異またはイントロン変異）と予測されるとしても、最終的なｍＲＮＡ配列には変化が生じ得る。それ故に、こうした変異によって予測不可能な様式でｍＲＮＡのスプライシングに変化が生じ得、翻訳されるタンパク質が著しい機能的影響を受け得るにもかかわらず、こうした変異は、一般的なアノテーションツールによって「ノンコーディング」として注解されてしまい、さらに解析されることなく無視されることが多い。代替的にスプライシングを受けたアイソフォームにインフレームの配列変化が生じる（すなわち、中途終始コドン（ｐｒｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｃｏｄｏｎ）（ＰＴＣ）が生じない）のであれば、こうしたアイソフォームはナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解機構（ＮＭＤ）による排除を免れることができ、速やかに発現し、プロセシングを受けてＨＬＡ系によって細胞表面に提示される。さらに、変異に由来する代替的なスプライシングは、通常、「潜在性」であって、すなわち、正常組織では発現しないものであり、それ故に、Ｔ細胞によって非自己のネオ抗原として認識され得る。
【０５９２】
いくつかの実例では、癌治療剤は、癌治療剤は、反復多型（「ホットスポット変異」）であるネオ抗原を１つまたは複数含むワクチンである。例えば、数ある中でも特に、本発明は、ｐ５３におけるある特定の反復体細胞癌変異から得られるネオ抗原ペプチド配列を提供する。ネオ抗原ペプチド及びＨＬＡ拘束性エピトープが生じる変異及びｍＲＮＡのスプライシング事象の例には、限定はされないが、下記のものが含まれる：
（１）コドン位置Ｔ１２５に隣接する標準５’スプライス部位における変異であって、エピトープＡＶＳＰＣＩＳＦＶＷ（配列番号２３３）（ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５８：０１）、エピトープＨＰＬＡＳＣＱＣＦＦ（配列番号２３４）（ＨＬＡ−Ｂ＊３５：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５３：０１）、エピトープＦＶＷＮＦＧＩＰＬ（配列番号２３５）（ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０６、ＨＬＡ−Ｂ＊３５：０１）を含むペプチド配列ＴＡＫＳＶＴＣＴＶＳＣＰＥＧＬＡＳＭＲＬＱＣＬＡＶＳＰＣＩＳＦＶＷＮＦＧＩＰＬＨＰＬＡＳＣＱＣＦＦＩＶＹＰＬＮＶ（配列番号２３２）を有する保持型イントロンを誘導する変異；
（２）コドン位置３３１に隣接する標準５’スプライス部位における変異であって、エピトープＬＱＶＬＳＬＧＴＳＹ（配列番号２３７）（ＨＬＡ−Ｂ＊１５：０１）、エピトープＦＱＳＮＴＱＮＡＶＦ（配列番号２３８）（ＨＬＡ−Ｂ＊１５：０１）を含むペプチド配列ＥＹＦＴＬＱＶＬＳＬＧＴＳＹＱＶＥＳＦＱＳＮＴＱＮＡＶＦＦＬＴＶＬＰＡＩＧＡＦＡＩＲＧＱ（配列番号２３６）を有する保持型イントロンを誘導する変異；
（３）コドン位置１２６に隣接する標準３’スプライス部位における変異であって、エピトープＣＴＭＦＣＱＬＡＫ（配列番号２４０）（ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１）、エピトープＫＳＶＴＣＴＭＦ（配列番号２４１）（ＨＬＡ−Ｂ＊５８：０１）を含む新規のスパニングペプチド配列ＡＫＳＶＴＣＴＭＦＣＱＬＡＫ（配列番号２３９）を生成する潜在性の代替エクソン３’スプライス部位を誘導する変異；及び／または
（４）コドン位置２２４に隣接する標準５’スプライス部位における変異であって、エピトープＶＰＹＥＰＰＥＶＷ（配列番号２４３）（ＨＬＡ−Ｂ＊５３：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５１：０１）、エピトープＬＴＶＰＰＳＴＡＷ（配列番号２４４）（ＨＬＡ−Ｂ＊５８：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１）を含む新規のスパニングペプチド配列ＶＰＹＥＰＰＥＶＷＬＡＬＴＶＰＰＳＴＡＷＡＡ（配列番号２４２）を生成する潜在性の代替イントロン５’スプライス部位を誘導する変異
（転写コドン位置は、Ｅｎｓｅｍｂｌのｖ８３のヒトゲノムアノテーションに由来する標準の全長ｐ５３転写物であるＥＮＳＴ０００００２６９３０５（配列番号２４５）を参照したものである）。
【０５９３】
１つの実施形態では、本発明は、ネオ抗原ペプチド（１）〜（４）の１つまたは複数をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードするｍＲＮＡを含む癌治療ワクチンを提供する。１つの実施形態では、本発明は、患者の腫瘍が上記の変異のいずれを含むかということに基づく、ペプチド（１）〜（４）の１つまたは複数を含むか、またはコードするワクチンの選択投与を提供する。１つの実施形態では、本発明は、対象の腫瘍が上記の変異のいずれを含むか、及び対象の正常なＨＬＡ型が、得られるネオ抗原に結合すると予測される対応ＨＬＡ対立遺伝子を含むかという二重の判断基準に基づく、ワクチンの選択投与を提供する。
【０５９４】
いくつかの実施形態では、癌治療ワクチンは、１つまたは複数の反復多型をコードする１つまたは複数のｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、癌治療ワクチンは、１つまたは複数の患者特異的ネオ抗原をコードする１つまたは複数のｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、癌治療ワクチンは、免疫チェックポイント調節因子をコードする１つまたは複数のｍＲＮＡを含む。１つもしくは複数の反復多型、１つもしくは複数の患者特異的ネオ抗原、及び／または１つもしくは複数の免疫チェックポイント調節因子は、任意の様式で組み合わせることができる。例えば、１つまたは複数のコンカテマー構築物が１つもしくは複数の反復多型、１つもしくは複数の患者特異的ネオ抗原、及び／または１つもしくは複数の免疫チェックポイント調節因子をコードすることが望ましくあり得る。他の実例では、１つもしくは複数の反復多型、１つもしくは複数の患者特異的ネオ抗原、及び／または１つもしくは複数の免疫チェックポイント調節因子は、別々のｍＲＮＡ構築物によってコードされることが望ましくあり得る。１つもしくは複数の反復多型、１つもしくは複数の患者特異的ネオ抗原、及び／または１つもしくは複数の免疫チェックポイント調節因子は、同時に投与するか、または連続的に投与することができることを理解されたい。
【０５９５】
ｍＲＮＡ癌ワクチン及び抗癌治療剤は、免疫治療応答をさらに増進するために組み合わせることができる。ｍＲＮＡ癌ワクチン及び他の治療剤は、同時または連続的に投与してよい。他の治療剤が同時に投与されるとき、それを同一の製剤または別々の製剤において投与することができるが、投与は同時に実施される。他の治療剤及びｍＲＮＡ癌ワクチンの投与が時間的に別々であるとき、他の治療剤は、互いに連続的に投与され、かつｍＲＮＡ癌ワクチンと連続的に投与される。こうした化合物の投与の時間間隔は、数分程度であり得るか、または例えば、数時間、数日、数週間、数ヶ月などの、より長い時間であり得る。例えば、いくつかの実施形態では、こうした化合物の投与の時間間隔は、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、８時間、１２時間、２４時間、またはそれより長い時間である。いくつかの実施形態では、こうした化合物の投与の時間間隔は、２日、３日、４日、５日、６日、または７日以上である。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ癌ワクチンは、抗癌治療剤の前に投与される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ癌ワクチンは、抗癌治療剤の後に投与される。
【０５９６】
他の治療剤には、限定はされないが、抗癌治療剤、アジュバント、サイトカイン、抗体、抗原などが含まれる。
【０５９７】
いくつかの態様では、提供される方法は、ｍＲＮＡ癌ワクチンを、免疫チェックポイント調節因子と組み合わせて投与することを含む。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント調節因子、例えば、抗ＰＤ−１抗体などのチェックポイント阻害剤は、１００〜３００ｍｇを送達するために十分な用量レベルで対象に投与される。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント調節因子、例えば、抗ＰＤ−１抗体などのチェックポイント阻害剤は、２００ｍｇを送達するために十分な用量レベルで対象に投与される。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント調節因子、例えば、抗ＰＤ−１抗体などのチェックポイント阻害剤は、静脈内注入によって投与される。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント調節因子は、２回、３回、４回またはそれより多い回数で対象に投与される。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント調節因子は、ｍＲＮＡワクチン投与と同じ日に対象に投与される。
【０５９８】
ＲＮＡワクチンは、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて製剤化または投与してよい。いくつかの実施形態では、ワクチン組成物は、例えば、治療的に活性な物質、予防的に活性な物質、または両方の組み合わせなどの追加の活性物質を少なくとも１つ含む。ワクチン組成物は、無菌、発熱物質非含有、または無菌かつ発熱物質非含有であり得る。ワクチン組成物などの医薬剤の製剤化及び／または製造における一般的な考慮事項は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ２１ｓｔ  ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）において見つけてよい。
【０５９９】
いくつかの実施形態では、癌ＲＮＡワクチンは、ヒト、ヒト患者、または対象に投与される。本開示の目的では、「活性成分」という語句は、一般に、例えば、抗原ポリペプチドをコードするＲＮＡポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）などの、そこに含まれるＲＮＡワクチンまたはポリヌクレオチドを指す。
【０６００】
本明細書に記載のワクチン組成物の製剤は、既に知られている任意の方法、または薬理学の分野において今後開発される任意の方法によって調製してよい。一般に、そのような調製方法は、活性成分（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）を賦形剤及び／または１つもしくは複数の他の付属成分と結びつける段階と、必要及び／または望ましいのであれば、その後に実施される、所望の単一用量単位または複数用量単位への製造物の分割段階、成形段階、及び／または充填段階と、を含む。
【０６０１】
癌ＲＮＡワクチンは、下記のことを達成するために、１つまたは複数の賦形剤を使用して製剤化することができる：（１）安定性の向上、（２）細胞へのトランスフェクションの増加、（３）（例えば、デポ製剤からの）持続放出もしくは遅延放出の実現（４）生体内分布（例えば、特定の組織もしくは細胞型への標的指向化）の改変、（５）コードタンパク質のインビボでの翻訳の増加、及び／または（６）コードタンパク質（抗原）のインビボでの放出プロファイルの改変。任意及びすべての溶媒、分散媒体、希釈剤、または他の液体媒体、分散助剤または懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、保存剤などの従来型賦形剤に加えて、賦形剤には、限定はされないが、リピドイド（ｌｉｐｉｄｏｉｄ）、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー、リポプレックス、コアシェルナノ粒子、ペプチド、タンパク質、癌ＲＮＡワクチンをトランスフェクトした細胞（例えば、対象への移植向け）、ヒアルロニダーゼ、ナノ粒子模倣体、及びそれらの組み合わせが含まれ得る。
【０６０２】
急速血中クリアランス
本発明は、反復投与される生物学的に活性な剤などの活性剤に対するＡＢＣ作用を低下させるための化合物、組成物及びその使用方法を提供する。容易に明らかとなるように、投与される活性剤に対するＡＢＣの作用を全体的に低下させ、または排除することで、活性剤の半減期及び有効性が効果的に向上する。
【０６０３】
いくつかの実施形態では、ＡＢＣの低下という用語は、ＭＣ３  ＬＮＰなどの、陽性参照対照であるＡＢＣ誘導ＬＮＰと比較したＡＢＣの任意の低下を指す。ＡＢＣ誘導ＬＮＰは、所与の時間枠内での２回目またはそれ以後の投与時に、活性剤の循環レベルの低下をもたらす。したがって、ＡＢＣの低下は、剤の２回目またはそれ以後の投与時に、循環する剤のクリアランスが標準ＬＮＰに対して低いことを指す。低下は、例えば、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％であり得る。いくつかの実施形態では、低下は、１０〜１００％、１０〜５０％、２０〜１００％、２０〜５０％、３０〜１００％、３０〜５０％、４０％〜１００％、４０〜８０％、５０〜９０％、または５０〜１００％である。あるいは、ＡＢＣの低下は、２回目もしくはそれ以降に、循環する剤が少なくとも検出可能なレベルであること、または標準ＬＮＰの投与後における循環する剤に対して、循環する剤が少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍増加することを特徴とし得る。いくつかの実施形態では、低下は、２〜１００倍、２〜５０倍、３〜１００倍、３〜５０倍、３〜２０倍、４〜１００倍、４〜５０倍、４〜４０倍、４〜３０倍、４〜２５倍、４〜２０倍、４〜１５倍、４〜１０倍、４〜５倍、５〜１００倍、５〜５０倍、５〜４０倍、５〜３０倍、５〜２５倍、５〜２０倍、５〜１５倍、５〜１０倍、６〜１００倍、６〜５０倍、６〜４０倍、６〜３０倍、６〜２５倍、６〜２０倍、６〜１５倍、６〜１０倍、８〜１００倍、８〜５０倍、８〜４０倍、８〜３０倍、８〜２５倍、８〜２０倍、８〜１５倍、８〜１０倍、１０〜１００倍、１０〜５０倍、１０〜４０倍、１０〜３０倍、１０〜２５倍、１０〜２０倍、１０〜１５倍、２０〜１００倍、２０〜５０倍、２０〜４０倍、２０〜３０倍、または２０〜２５倍である。
【０６０４】
本開示は、クリアランスの影響を受けにくく、したがって、インビボでより長い半減期を有する、脂質含有化合物及び組成物を提供する。これは、特に、組成物が、長期投与を含む反復投与を意図している場合であり、さらにより詳細には、そのような反復投与が数日以内または数週間以内に生じる場合である。
【０６０５】
重大なことには、これらの組成物は、急速血中クリアランス（ＡＢＣ）の影響をうけにくく、または観察される当該現象を完全に回避する。ＡＢＣは、ある特定の外因的に投与された剤が２回目以降の投与で血液から急速に排除される現象である。この現象は、部分的には、限定するものではないが、脂質化剤、リポソームまたは他の脂質ベースの送達ビヒクル、及び脂質封入剤を含む、さまざまな脂質含有組成物で観察されている。従来、ＡＢＣの原理は、あまり理解されておらず、いくつかの場合、体液性免疫応答に起因し得、したがって、インビボ、特に臨床状況において、その影響を制限する戦略は、いまだ得られていない。
【０６０６】
本開示は、ＡＢＣの影響を受けたとしても、その影響が小さい化合物及び組成物を提供する。いくつかの重要な態様では、そのような化合物及び組成物は、脂質含有化合物または組成物である。驚くべきことに、本開示の脂質含有化合物または組成物は、インビボにおいて、２回目以降の投与時にＡＢＣを経験しない。ＡＢＣに対するこの耐性により、これらの化合物及び組成物は、数日または１〜２週間を含む短期間内の反復使用を含む、インビボでの反復使用に特に適したものになる。この安定性及び／または半減期の向上は、部分的には、これらの組成物が、Ｂ１ａ細胞及び／またはＢ１ｂ細胞及び／または通常型Ｂ細胞、ｐＤＣ及び／または血小板を活性化することがないことに起因する。
【０６０７】
したがって、本開示は、急速血中クリアランス（ＡＢＣ）の根底にある機序の解明を提供する。本開示及び本明細書で提供される本発明によれば、ＡＢＣ現象は、少なくとも脂質及び脂質ナノ粒子に関する限り、少なくとも部分的にはＢ１ａ細胞及び／またはＢ１ｂ細胞、ｐＤＣ及び／または血小板が関与する自然免疫応答に媒介されることが見出された。Ｂ１ａ細胞は、通常、循環ＩｇＭの形態の天然抗体の分泌に関与する。このＩｇＭは、多反応性であり、これは、各抗原に対する親和性は比較的低いものの、さまざまな抗原に結合することができることを意味する。
【０６０８】
本発明によれば、インビボで投与される脂質ナノ粒子などのいくつかの脂質化剤または脂質含有製剤は、ＡＢＣを誘発し、ＡＢＣの影響を受けることが判明した。本発明によれば、ＬＮＰの初回用量の投与時に、自然免疫応答の発生に関与する１つまたは複数の細胞（本明細書ではセンサーと称される）がかかる剤に結合し、活性化され、次いで、ＡＢＣ及び毒性を促進する免疫因子（本明細書ではエフェクターと称される）のカスケードを開始することがわかった。例えば、Ｂ１ａ細胞及びＢ１ｂ細胞は、ＬＮＰに結合し、活性化され（単独で、あるいはｐＤＣなどの他のセンサー及び／またはＩＬ６などのエフェクターの存在下で）、ＬＮＰに結合する天然ＩｇＭを分泌し得る。対象内の既存の天然ＩｇＭもまた、ＬＮＰを認識して結合し、それにより、補体結合を誘発し得る。初回用量の投与後、天然ＩｇＭの産生は、ＬＮＰの投与の１〜２時間内に開始する。典型的には、天然ＩｇＭは、約２〜３週間までに、ＩｇＭの自然半減期に起因して、系から排除される。天然ＩｇＧは、ＬＮＰの投与から最初の約９６時間後に産生される。剤は、ナイーブ環境で投与された場合、Ｂ１ａ細胞もしくはＢ１ｂ細胞の活性化後に産生される天然ＩｇＭまたは天然ＩｇＧによって比較的妨げられない生物学的作用を発揮することができる。天然ＩｇＭ及び天然ＩｇＧは、非特異的であるため、抗ＰＥＧ  ＩｇＭ及び抗ＰＥＧ  ＩｇＧとは異なる。
【０６０９】
出願人は機序に拘束されるものではないが、ＬＮＰが、次の機序により、ＡＢＣ及び／または毒性を誘発することが提案される。ＬＮＰは、対象に投与されると、血液を通して脾臓に迅速に輸送されると考えられる。ＬＮＰは、血液及び／または脾臓中で免疫細胞に遭遇し得る。血液及び／または脾臓内のＬＮＰの存在に応答して、迅速な自然免疫応答が誘発される。出願人は、ＬＮＰの投与から数時間以内に、いくつかの免疫センサーがＬＮＰの存在に反応することを本明細書で示している。これらのセンサーには、免疫応答の発生に関与するＢ細胞、ｐＤＣ、及び血小板などの免疫細胞が含まれるが、これらに限定されない。センサーは、脾臓辺縁帯などの脾臓中及び／または血液中に存在し得る。ＬＮＰは、他のセンサーと相互作用し得る１つまたは複数のセンサーと物理的に相互作用し得る。そのような場合、ＬＮＰは、センサーと直接的または間接的に相互作用する。センサーは、ＬＮＰの認識に応答して、互いに直接相互作用し得る。例えば、多くのセンサーは、脾臓中に位置しており、互いに容易に相互作用することができる。あるいは、センサーのうちの１つまたは複数は、血中のＬＮＰと相互作用し、活性化され得る。次に、活性化されたセンサーは、他のセンサーと直接的に相互作用するか、または間接的に（例えば、メッセンジャー、例えば、ＩＬ６などのサイトカインの刺激または産生を介して）相互作用し得る。
【０６１０】
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、次のセンサー：ｐＤＣ、Ｂ１ａ細胞、Ｂ１ｂ細胞、及び血小板のそれぞれと直接相互作用し、これを活性化し得る。次いで、これらの細胞は、互いに直接的または間接的に相互作用して、最終的にＬＮＰの反復投与に伴うＡＢＣ及び／または毒性につながるエフェクターの産生を開始し得る。例えば、出願人は、ＬＮＰ投与が、ｐＤＣの活性化、血小板の凝集及び活性化ならびにＢ細胞の活性化をもたらすことを示した。ＬＮＰに応答して、血小板も凝集し、活性化され、Ｂ細胞と凝集し、ｐＤＣ細胞が活性化される。ＬＮＰは、比較的迅速に血小板及びＢ細胞の表面と相互作用することがわかった。これらのセンサーのいずれか１つまたは組み合わせのＬＮＰに応答した活性化を遮断することは、通常生じる免疫応答を軽減させるのに有用である。免疫応答のこの軽減は、ＡＢＣ及び／または毒性の回避をもたらす。
【０６１１】
センサーは、一旦活性化されると、エフェクターを産生する。本明細書で使用されるエフェクターは、Ｂ細胞などの免疫細胞によって産生される免疫分子である。エフェクターには、天然ＩｇＭ及び天然ＩｇＧなどの免疫グロブリンならびにＩＬ６などのサイトカインが含まれるが、これらに限定されない。Ｂ１ａ細胞及びＢ１ｂ細胞は、ＬＮＰの投与後２〜６時間以内に、天然ＩｇＭの産生を刺激する。天然ＩｇＧは、９６時間以内に検出され得る。ＩＬ６レベルは、数時間以内に上昇する。天然ＩｇＭ及び天然ＩｇＧは、体内を数日〜数週間循環する。この時間中、循環するエフェクターは、新しく投与されたＬＮＰと相互作用して、これらのＬＮＰの身体によるクリアランスが誘発され得る。例えば、エフェクターは、ＬＮＰを認識して、これに結合し得る。エフェクターのＦｃ領域は、マクロファージによって認識され、装飾されたＬＮＰの取り込みを誘発する。次いで、マクロファージが脾臓に輸送される。免疫センサーによるエフェクターの産生は、ＡＢＣについて観察されるタイミングと相関する一過性の応答である。
【０６１２】
投与回が２回目またはそれ以降の投与回である場合、かつかかる２回目またはそれ以降の投与量が、先に誘導された天然ＩｇＭ及び／または天然ＩｇＧが系から排除される前（例えば、２〜３ウィンドウ期間前）に投与される場合、かかる２回目またはそれ以降の投与が、循環する天然ＩｇＭ及び／または天然ＩｇＧまたはＦｃの標的にされ、補体副経路の活性化を誘発し、それ自体が迅速に排除される。エフェクターが体内からクリアランスされた後、またはその数が減少した後に、ＬＮＰが投与される時、ＡＢＣは、観察されない。
【０６１３】
したがって，本発明の態様によれば、ＬＮＰと１つもしくは複数のセンサーとの間の相互作用を阻害すること、ＬＮＰによる１つもしくは複数のセンサーの活性化を阻害すること（直接的または間接的に）、１つもしくは複数のエフェクターの産生を阻害すること、及び／または１つもしくは複数のエフェクターの活性を阻害することが有用である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ＬＮＰとセンサーとの相互作用を制限または遮断するように設計される。例えば、ＬＮＰは、センサーとの相互作用を防ぐために、変更されたＰＣ及び／またはＰＥＧを有し得る。代替的または追加的に、ＬＮＰによって誘導される免疫応答を阻害する剤を使用して、これらの作用のうちのいずれか１つまたは複数を達成してもよい。
【０６１４】
また、通常型Ｂ細胞もＡＢＣに関与していることが判明した。具体的には、剤の初回投与時に、本明細書でＣＤ１９（＋）と称される通常型Ｂ細胞が剤に結合し、これに応答する。Ｂ１ａ細胞及びＢ１ｂ細胞とは異なるが、通常型Ｂ細胞は、最初にＩｇＭ応答を開始することができ（ＬＮＰ投与の約９６時間後に開始する）、続いて、記憶応答に付随するＩｇＧ応答が生じる（ＬＮＰ投与の約１４日後に開始する）。したがって、通常型Ｂ細胞は、投与された剤に応答し、ＡＢＣを媒介するＩｇＭ（及び最終的にはＩｇＧ）に寄与する。ＩｇＭ及びＩｇＧは、典型的には、抗ＰＥＧ  ＩｇＭ及び抗ＰＥＧ  ＩｇＧである。
【０６１５】
いくつかの場合では、ＡＢＣ応答の大部分が、Ｂ１ａ細胞及びＢ１ａ媒介性免疫応答を介して媒介されることが企図される。いくつかの場合では、通常型Ｂ細胞とＢ１ａ細胞の両方がそのような作用を媒介しながら、ＩｇＭとＩｇＧの両方によってＡＢＣ応答が媒介されることがさらに企図される。またさらに他の場合では、ＡＢＣ応答は、天然ＩｇＭ分子によって媒介され、これらの一部は、活性化されたＢ１ａ細胞によって産生され得る天然ＩｇＭに結合することができる。天然ＩｇＭは、ＬＮＰの１つまたは複数の構成要素に結合し得る（例えば、ＬＮＰのリン脂質構成要素への結合（リン脂質のＰＣ部分への結合など）及び／またはＬＮＰのＰＥＧ脂質構成要素への結合（ＰＥＧ−ＤＭＧへの結合、特に、ＰＥＧ−ＤＭＧのＰＥＧ部分への結合など））。Ｂ１ａは、ホスファチジルコリンのリガンドであるＣＤ３６を発現するので、ＣＤ３６受容体は、Ｂ１ａ細胞の活性化及び天然ＩｇＭの産生を媒介し得ることが企図される。またさらに他の場合では、ＡＢＣ応答は、主に、通常型Ｂ細胞によって媒介される。
【０６１６】
本発明によれば、ＡＢＣ現象は、少なくとも部分的には、Ｂ１ａ細胞を活性化しない化合物及び組成物（剤、送達ビヒクル、及び製剤など）の使用を介して、減少または無効化できることが判明した。Ｂ１ａ細胞を活性化しない化合物及び組成物は、本明細書では、Ｂ１ａ不活性化合物及び組成物と称され得る。本発明によれば、ＡＢＣ現象は、少なくとも部分的には、通常型Ｂ細胞を活性化しない化合物及び組成物の使用を介して、減少または無効化できることが判明した。いくつかの実施形態では、通常型Ｂ細胞を活性化しない化合物及び組成物は、本明細書では、ＣＤ１９不活性化合物及び組成物と称され得る。したがって、本明細書で提供されるいくつかの実施形態では、化合物及び組成物は、Ｂ１ａ細胞を活性化せず、従来型Ｂ細胞を活性化しない。いくつかの実施形態では、Ｂ１ａ細胞も通常型Ｂ細胞も活性化しない化合物及び組成物は、本明細書では、Ｂ１ａ／ＣＤ１９不活性化合物及び組成物と称され得る。
【０６１７】
これらの根底にある機序は、これまでに理解されておらず、当該現象におけるＢ１ａ細胞及びＢ１ｂ細胞の役割ならびに通常型Ｂ細胞との相互作用も認識されていなかった。
【０６１８】
したがって、本開示は、ＡＢＣを促進しない化合物及び組成物を提供する。また、これらは、Ｂ１ａ細胞及び／またはＢ１ｂ細胞、血小板及び／またはｐＤＣ、ならびに任意選択で通常型Ｂ細胞を活性化することがないことをさらに特徴とし得る。これらの化合物（例えば、予防剤、治療剤及び診断剤などの生物学的に活性な剤を含む剤、リポソーム、脂質ナノ粒子及び他の脂質ベース封入構造を含む送達ビヒクルなど）及び組成物（例えば、製剤など）は、反復投与、特に短期間内（例えば、１〜２週間内）で行われる反復投与を要する用途に特に望ましい。これは、例えば、剤が規則的で狭い間隔で対象に提供される核酸ベースの治療剤である場合である。本明細書で提供される知見は、同様に投与される及び／またはＡＢＣを受けるこれらの剤及び他の薬に該当し得る。
【０６１９】
特に関心が高いものは、ＡＢＣの影響を受けやすいことが知られている脂質含有化合物、脂質含有粒子、及び脂質含有組成物である。そのような脂質含有化合物粒子及び組成物は、生物学的に活性な剤としてまたはそのような剤の送達ビヒクルとして広範囲に使用されている。したがって、そのような剤の有効性を向上させる能力は、剤自体またはその送達ビヒクルに対するＡＢＣの作用を低下させるかどうかに関わらず、多種多様な活性剤にとって有益である。
【０６２０】
本明細書では、１つまたは複数の生物学的に活性な剤の反復投与と関係する急性期応答（ＡＲＰ）を刺激または増強しない組成物もまた提供される。
【０６２１】
組成物は、いくつかの場合では、限定するものではないが、天然ＩｇＭを含むＩｇＭに結合し得ない。
【０６２２】
組成物は、いくつかの場合では、限定されないが、Ｃ反応性タンパク質などの急性期タンパク質に結合し得ない。
【０６２３】
組成物は、いくつかの場合では、ＣＤ５（＋）媒介免疫応答を誘発し得ない。本明細書で使用されるとき、ＣＤ５（＋）媒介性免疫応答は、Ｂ１ａ細胞及び／またはＢ１ｂ細胞によって媒介される免疫応答である。そのような応答には、ＡＢＣ応答、急性期応答、天然ＩｇＭ及び／または天然ＩｇＧの誘導などが含まれ得る。
【０６２４】
組成物は、いくつかの場合では、ＣＤ１９（＋）媒介免疫応答を誘発し得ない。本明細書で使用されるとき、ＣＤ１９（＋）媒介性免疫応答は、通常型ＣＤ１９（＋），ＣＤ５（−）Ｂ細胞によって媒介される免疫応答である。そのような応答には、ＩｇＭの誘導、ＩｇＧの誘導、メモリーＢ細胞の誘導、ＡＢＣ応答、抗タンパク質応答を含む抗薬物抗体（ＡＤＡ）応答（ここで、タンパク質は、ＬＮＰ内に封入され得る）などが含まれ得る。
【０６２５】
Ｂ１ａ細胞は、自然免疫に関与するＢ細胞のサブセットである。これらの細胞は、天然抗体または天然血清抗体と呼ばれる循環ＩｇＭの供給源である。天然ＩｇＭ抗体は、多数の抗原に対して親和性が弱いことを特徴とし、したがって、「多特異性」または「多反応性」と称される。これは、２つ以上の抗原に結合する能力を示す。Ｂ１ａ細胞は、ＩｇＧを産生することができない。さらに、Ｂ１ａ細胞は、メモリー細胞に発達しないことから、適応免疫応答に寄与しない。しかしながら、Ｂ１ａ細胞は、活性化時に、ＩｇＭを分泌することができる。分泌されたＩｇＭは、典型的には、約２〜３週間以内に排除され、この時点で、免疫系は、それまでに投与された抗原に対して比較的ナイーブになる。この期間後（例えば、最初の曝露から約３週間後）に同じ抗原が提示された場合であれば、当該抗原は、急速に排除されない。しかしながら、重大なことに、この期間内（例えば、１週間以内または数日以内を含む２週間以内）に抗原が提示される場合、当該抗原は、急速に排除される。この連続投与間の遅延により、ある特定の脂質含有治療剤または診断剤は、使用に適さなくなる。
【０６２６】
ヒトでは、Ｂ１ａ細胞は、ＣＤ１９（＋）、ＣＤ２０（＋）、ＣＤ２７（＋）、ＣＤ４３（＋）、ＣＤ７０（−）及びＣＤ５（＋）である。マウスでは、Ｂ１ａ細胞は、ＣＤ１９（＋）、ＣＤ５（＋）、及びＣＤ４５Ｂ細胞アイソフォームＢ２２０（＋）である。Ｂ１ａ細胞と他の通常型Ｂ細胞とを区別するのは、典型的には、ＣＤ５の発現である。Ｂ１ａ細胞は、ＣＤ５を高レベルで発現し得、これに基づき、Ｂ１ａ細胞は、ＣＤ５を低レベルまたは検出不可能なレベルで発現するＢ−１ｂ細胞などの他のＢ−１細胞と区別され得る。ＣＤ５は、汎Ｔ細胞表面糖タンパク質である。Ｂ１ａ細胞はまた、脂肪酸トランスロカーゼとしても知られているＣＤ３６を発現する。ＣＤ３６は、クラスＢスカベンジャー受容体ファミリーのメンバーである。ＣＤ３６は、酸化した低密度リポタンパク質、天然リポタンパク質、酸化リン脂質、及び長鎖脂肪酸を含む、多くのリガンドに結合することができる。
【０６２７】
Ｂ１ｂ細胞は、自然免疫に関与するＢ細胞の別のサブセットである。これらの細胞は、循環天然ＩｇＭの別の供給源である。ＰＳを含むいくつかの抗原は、Ｂ１ｂ活性化を介してＴ細胞非依存の免疫を誘導することができる。ＣＤ２７は、典型的には、抗原活性化に応答して、Ｂ１ｂ細胞で上方制御される。Ｂ１ａ細胞と同様に、Ｂ１ｂ細胞は、典型的には、脾臓及び腹膜腔などの身体の特定の場所に存在し、血液中の存在量は非常に少ない。Ｂ１ｂから分泌された天然ＩｇＭは、典型的には、約２〜３週間以内に排除され、この時点で、免疫系は、それまでに投与された抗原に対して比較的ナイーブになる。この期間後（例えば、最初の曝露から約３週間後）に同じ抗原が提示された場合であれば、当該抗原は、急速に排除されない。しかしながら、重大なことに、この期間内（例えば、１週間以内または数日以内を含む２週間以内）に抗原が提示される場合、当該抗原は、急速に排除される。この連続投与間の遅延により、ある特定の脂質含有治療剤または診断剤は、使用に適さなくなる。
【０６２８】
いくつかの実施形態では、Ｂ１ａ細胞及び／またはＢ１ｂ細胞の活性化を遮断することが望ましい。Ｂ１ａ細胞及び／またはＢ１ｂ細胞の活性化を遮断する１つの戦略は、脂質ナノ粒子のどの構成要素がＢ細胞の活性化を促進するかを決定し、それらの構成要素を中和することを伴う。少なくともＰＥＧ及びホスファチジルコリン（ＰＣ）が、Ｂ１ａ及びＢ１ｂ細胞と他の細胞との相互作用及び／または活性化に寄与することが本発明で発見された。ＰＥＧは、Ｂ１細胞と血小板との間の凝集を促進する役割を果たし得、それにより、活性化に至り得る。ＰＣ（ＬＮＰ中のヘルパー脂質）はまた、おそらくＢ細胞表面上のＣＤ３６受容体との相互作用を介して、Ｂ１細胞の活性化に関与する。多数の粒子は、ＰＥＧ脂質代替物を有し、ＰＥＧレス、及び／またはＰＣ置換脂質（例えば、オレイン酸またはその類似体）が設計され試験されている。出願人は、反復投与時にＡＢＣをいずれにせよ促進するＬＮＰ内のこれらの構成要素のうちの１つまたは複数を置換することが、天然ＩｇＭの産生及び／またはＢ細胞活性化を低下させることにより、ＡＢＣを防ぐのに有用であることを確立した。したがって、本発明は、Ｂ細胞トリガーの包含を排除する設計の結果として、ＡＢＣを低下させたＬＮＰを包含する。
【０６２９】
Ｂ１ａ細胞及び／またはＢ１ｂ細胞の活性化を遮断する別の戦略は、ＬＮＰによって誘導される免疫応答を阻害する剤を使用することを伴う。これらのタイプの剤は、以下でより詳細に考察される。いくつかの実施形態では、これらの剤は、Ｂ１ａ／Ｂ１ｂ細胞とＬＮＰまたは血小板またはｐＤＣとの間の相互作用を遮断する。例えば、剤は、抗体であってもよいし、または相互作用を物理的に遮断する他の結合剤であってよい。この一例は、ＣＤ３６またはＣＤ６に結合する抗体である。剤は、Ｂ１ａ／Ｂ１ｂ細胞が一旦活性化されるか、または活性化される前に、シグナル伝達することを阻止または無効にする化合物であってもよい。例えば、Ｂ細胞とＬＮＰまたは他の免疫細胞との相互作用の結果として生じるＢ１ａ／Ｂ１ｂシグナル伝達カスケード中の１つまたは複数の構成要素を遮断することが可能である。さらに他の実施形態では、剤は、活性化後のＢ１ａ／Ｂ１ｂ細胞によって産生される１つまたは複数のエフェクターに作用し得る。これらのエフェクターには、例えば、天然ＩｇＭ及びサイトカインが含まれる。
【０６３０】
本発明の態様によれば、ｐＤＣ細胞の活性化が遮断された場合、ＬＮＰに応答したＢ細胞の活性化が減少することが示された。したがって、ＡＢＣ及び／または毒性を回避するために、ｐＤＣの活性化を阻止することが望ましいことがある。上で考察した戦略と同様に、ｐＤＣ細胞の活性化は、ｐＤＣとＬＮＰ及び／またはＢ細胞／血小板との間の相互作用を妨害する剤によって遮断され得る。あるいは、ｐＤＣに作用してその活性化能力を遮断するか、またはそのエフェクターに作用する剤をＬＮＰとともに使用してＡＢＣを回避することができる。
【０６３１】
血小板もまた、ＡＢＣ及び毒性に重要な役割を果たし得る。血小板は、ＬＮＰの初回用量が対象に投与された後、極めて迅速に、ＬＮＰと会合し、凝集し、活性化される。いくつかの実施形態では、血小板の凝集及び／または活性化を遮断することが望ましい。血小板の凝集及び／または活性化を遮断する１つの戦略は、脂質ナノ粒子のどの構成要素が血小板の凝集を促進するかを決定し、それらの構成要素を中和することを伴う。少なくともＰＥＧが、血小板の凝集、活性化、及び／または他の細胞との相互作用に寄与することが本発明で発見された。多数の粒子は、ＰＥＧ脂質代替物を有し、ＰＥＧレスが設計され試験されている。出願人は、反復投与時にＡＢＣをいずれにせよ促進するＬＮＰ内のこれらの構成要素のうちの１つまたは複数を置換することが、天然ＩｇＭの産生及び／または血小板の凝集を低下させることにより、ＡＢＣを防ぐのに有用であることを確立した。したがって、本発明は、血小板トリガーの包含を排除する設計の結果として、ＡＢＣを低下させたＬＮＰを包含する。あるいは、血小板に作用して、一旦活性化したその能力を遮断するか、またはそのエフェクターに作用する剤をＬＮＰとともに使用してＡＢＣを回避することができる。
【０６３２】
ＡＢＣ活性及び関連活性の測定
本明細書で提供されるＬＮＰを含むさまざまな化合物及び組成物は、インビボ投与時にＡＢＣ活性を促進しない。これらのＬＮＰは、多数のアッセイのいずれか、限定するものではないが、以下に記載されるものなどにより、特徴付け及び／または同定がなされ得る。
【０６３３】
いくつかの実施形態では、方法は、ＡＢＣを促進する免疫応答を生ずることなく、ＬＮＰを投与することを伴う。ＡＢＣを促進する免疫応答は、Ｂ１細胞、ｐＤＣ、または血小板などの１つまたは複数のセンサー、及び天然ＩｇＭ、天然ＩｇＧまたはＩＬ６などのサイトカインなどの１つまたは複数のエフェクターの活性化を伴う。したがって、ＡＢＣを促進する免疫応答を生ずることのないＬＮＰの投与は、１つまたは複数のセンサーの有意な活性化及び１つまたは複数のエフェクターの有意な産生のないＬＮＰの投与を最低限伴う。本文脈中で使用される有意とは、ＡＢＣ誘発ＬＮＰの２回目の投与について予想される血中クリアランスのレベルに対して、２回目の投与のすべてまたは一部の急速血中クリアランスという生理学的結果をもたらす量を指す。例えば、免疫応答は、２回目の投与後に観察されるＡＢＣが、ＡＢＣ誘発ＬＮＰについて予想されるＡＢＣよりも低くなるように減少されるものである。
【０６３４】
Ｂ１ａまたはＢ１ｂ活性化アッセイ
本開示で提供される特定の組成物は、Ｂ１ａ細胞またはＢ１ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ５＋）及び／または通常型Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ５−）などのＢ細胞を活性化しない。Ｂ１ａ細胞、Ｂ１ｂ細胞、または通常型Ｂ細胞の活性化は、多くの方法で決定することができ、そのいくつかを以下に提供する。Ｂ細胞集団は、Ｂ細胞集団分画または脾細胞もしくは末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の未分画集団として提供され得る。後者の場合、細胞集団は、最適なＬＮＰと一定の期間インキュベートされ、次いで、さらなる分析のために採取され得る。あるいは、上清が採取及び分析され得る。
【０６３５】
活性化マーカーの細胞表面発現の上方制御
Ｂ１ａ細胞、Ｂ１ｂ細胞、または通常型Ｂ細胞の活性化は、ＣＤ８６などの後期活性化マーカーを含むＢ細胞活性化マーカーの発現上昇として決定され得る。例示的な非限定的なアッセイでは、未分画Ｂ細胞は、脾細胞集団またはＰＢＭＣ集団として提供され、最適なＬＮＰとともに特定の期間インキュベートされ、ついで、ＣＤ１９などの標準Ｂ細胞マーカー及びＣＤ８６などの活性化マーカーについて染色され、例えば、フローサイトメトリーを使用して分析される。好適な陰性対照は、同じ集団を培地とともにインキュベートし、次いで、同じ染色及び可視化のステップを実施することを伴う。陰性対照と比較した試験集団におけるＣＤ８６発現の上昇は、Ｂ細胞の活性化を示す。
【０６３６】
炎症促進性サイトカイン放出
Ｂ細胞の活性化は、サイトカイン放出アッセイによっても評価することができる。例えば、活性化は、目的のＬＮＰとともに曝露された際のＩＬ−６及び／またはＴＮＦ−αなどのサイトカインの産生及び／または分泌を介して評価され得る。
【０６３７】
そのようなアッセイは、当該技術分野においてよく知られている常法のサイトカイン分泌アッセイを使用して実施することができる。サイトカイン分泌の増加は、Ｂ細胞活性化を示す。
【０６３８】
Ｂ細胞へのＬＮＰの結合／会合及び／またはＢ細胞による取り込み
ＬＮＰのＢ細胞への会合または結合は、目的のＬＮＰの評価及び当該ＬＮＰのさらなる特徴付けのためにも使用することができる。会合／結合及び／または取り込み／内在化は、蛍光標識されたＬＮＰなどの検出可能に標識されたＬＮＰを使用し、さまざまなインキュベーション期間後における当該ＬＮＰのＢ細胞内またはＢ細胞上の場所を追跡することで評価され得る。
【０６３９】
本発明は、本明細書で提供される組成物が認識または検出を回避することができ、任意選択で、循環ＩｇＭなどのＡＢＣの下流のメディエーター及び／または急性期タンパク質（例えば、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）などの急性期応答メディエーターによる結合を回避することができることをさらに企図する。
【０６４０】
ＡＢＣを低下させるための使用方法
本明細書ではまた、治療剤などの剤を封入し得るＬＮＰを、ＡＢＣを促進することなく対象に送達するための方法も提供される。
【０６４１】
いくつかの実施形態では、方法は、ＡＢＣを促進しない本明細書に記載のＬＮＰのいずれか、例えば、ＬＮＰに結合する天然ＩｇＭの産生を誘導しないもの、Ｂ１ａ及び／またはＢ１ｂ細胞を活性化しないものを投与することを含む。本明細書で使用されるとき、「ＡＢＣを促進しない」ＬＮＰとは、実質的なＡＢＣをもたらす免疫応答を誘導しないか、または実質的なＡＢＣをもたらすには不十分な実質的に低いレベルの免疫応答を誘導するＬＮＰを指す。ＬＮＰに結合する天然ＩｇＭの産生を誘導しないＬＮＰとは、ＬＮＰに結合する天然ＩｇＭを誘導しないか、または実質的なＡＢＣをもたらすには不十分な実質的に低いレベルの天然ＩｇＭ分子を誘導するＬＮＰを指す。Ｂ１ａ細胞及び／またはＢ１ｂ細胞を活性化しないＬＮＰとは、ＬＮＰに結合する天然ＩｇＭを産生するＢ１ａ細胞及び／またはＢ１ｂ細胞の応答を誘導しないか、または実質的なＡＢＣをもたらすには不十分な実施的に低いレベルのＢ１ａ及び／またはＢ１ｂ応答を誘導するＬＮＰを指す。
【０６４２】
いくつかの実施形態では、産生を活性化しない及び誘導しないという用語は、参照値または参照条件に対する相対的な低下である。いくつかの実施形態では、参照値または参照条件は、ＭＣ３  ＬＮＰなどの標準ＬＮＰによる、ＩｇＭなどの分子の産生の活性化または誘導の量である。いくつかの実施形態では、相対的な低下は、少なくとも３０％、例えば、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の低下である。他の実施形態では、Ｂ細胞などの細胞を活性化しないという用語、及びＩｇＭなどのタンパクの産生を誘導しないという用語は、活性細胞または特定のタンパク質の量が検出不可能であることを指し得る。
【０６４３】
血小板作用及び毒性
本発明はさらに、ＬＮＰ投与に関連する用量制限毒性の根底にある機序の解明を一部前提とする。そのような毒性は、凝固障害、急性もしくは慢性かどうかに関わらず、播種性血管内凝固（ＤＩＣ、消費性凝固障害とも称される）及び／または血管血栓症を含み得る。いくつかの場合では、ＬＮＰに関連する用量制限毒性は、急性期応答（ＡＰＲ）または補体活性化関連偽アレルギー反応（ＣＡＲＰＡ）である。
【０６４４】
本明細書で使用されるとき、凝固障害は、インビボでの凝固（血液凝固）の増加を指す。本開示で報告された知見は、そのような凝固の増加と一致し、根底にある機序についての洞察を多く提供する。凝固は、多数の異なる因子及び細胞型が関係するプロセスであり、この点に関して、ＬＮＰと血小板との間の関係及び相互作用はこれまで理解されていない。本開示は、そのような相互作用の証拠を提供するものであり、また、血小板会合の減少、血小板凝集の減少、及び／または血小板凝集の減少を含む、血小板の作用が低くなるように改変された化合物及び組成物を提供する。そのような血小板作用を調節する能力、好ましくは、下方調節する能力により、ＬＮＰ投与後の凝固障害の発生率及び／または重症度を低減することができる。これは、次に、そのようなＬＮＰに関連する毒性を低減させ、それにより、より高い用量のＬＮＰが可能になり、また、重要なことに、それらのカーゴを、それを必要とする患者に投与することが可能になる。
【０６４５】
ＣＡＲＰＡは、ナノ医薬品及び生物製剤によって誘発されることがある、過敏反応（ＨＳＲ）で現れる急性免疫毒性のクラスである。アレルギー反応とは異なり、ＣＡＲＰＡは、典型的には、ＩｇＥを伴わないが、病原体を排除する身体能力を高める自然免疫系の一部である補体系の活性化の結果として生じる。次の経路：古典補体経路（ＣＰ）、副経路（ＡＰ）、及びレクチン経路（ＬＰ）の１つまたは複数がＣＡＲＰＡに関与し得る。Ｓｚｅｂｅｎｉ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６１：１６３−１７３（２０１４）。
【０６４６】
古典経路は、Ｃ１ｑ、Ｃ１ｒ、Ｃ１ｓ、またはＣ１ｑｒ２ｓ２を含有するＣ１複合体の活性化によって誘発される。Ｃ１複合体の活性化は、抗原と複合化したＩｇＭもしくはＩｇＧにＣ１ｑが結合する場合、またはＣ１ｑが病原体の表面に直接結合する場合に生じる。そのような結合は、次いで、Ｃ１ｑ分子の高次構造に変化をもたらし、それにより、Ｃ１ｓを切断するＣ１ｒの活性化が生じる。ここで、Ｃ１ｒ２ｓ２構成要素は、Ｃ４、次にＣ２を分解し、Ｃ４ａ、Ｃ４ｂ、Ｃ２ａ、及びＣ２ｂを生じる。Ｃ４ｂ及びＣ２ｂが結合して古典経路Ｃ３転換酵素（Ｃ４ｂ２ｂ複合体）を形成し、これがＣ３のＣ３ａ及びＣ３ｂへの開裂を促進する。次いで、Ｃ３ｂは、Ｃ３転換酵素に結合してＣ５転換酵素（Ｃ４ｂ２ｂ３ｂ複合体）を形成する。副経路は、自発的なＣ３加水分解の結果として連続的に活性化される。因子Ｐ（プロペルジン）は、副経路の正の制御因子である。プロペルジンのオリゴマー化により、Ｃ３転換酵素が安定化し、次いで、より多くのＣ３が切断され得る。Ｃ３分子は、表面に結合し、より多くのＢ、Ｄ、及びＰ活性をリクルートして、補体活性化の増幅が生じ得る。
【０６４７】
急性期反応（ＡＰＲ）は、感染の防止及び潜在的な病原体の排除を行う複雑な全身性の自然免疫応答である。多数のタンパク質がＡＰＲに関与しており、十分に特徴付けがなされているタンパク質は、Ｃ反応性タンパク質である。
【０６４８】
本発明によれば、ある特定のＬＮＰは、インビボ投与のほぼ直後に、血小板と物理的に会合することができるが、他のＬＮＰは、血小板と全く会合しないか、またはバックグラウンドレベルでしか会合しないことが見出された。重大なことに、血小板と会合するＬＮＰは、その後形成される血小板凝集も安定させるようである。血小板とある特定のＬＮＰの物理的接触は、当該血小板が凝集した状態を維持する能力、または当該血小板が投与後の長期間にわたり凝集体を継続的に形成する能力と相関する。そのような凝集体は、活性化した血小板を含み、さらに、マクロファージ及びＢ細胞などの自然免疫細胞も含む。
【０６４９】
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）
実施形態の１つのセットでは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）が提供される。１つの実施形態では、脂質ナノ粒子は、イオン化可能な脂質、構造脂質、リン脂質を含む脂質と、ｍＲＮＡと、を含む。本明細書に記載のＬＮＰのそれぞれは、本明細書に記載のｍＲＮＡの製剤として使用され得る。１つの実施形態では、脂質ナノ粒子は、イオン化可能な脂質、構造脂質、リン脂質、及びｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、イオン化可能な脂質、ＰＥＧ修飾脂質、リン脂質及び構造脂質を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、約２０〜６０％のイオン化可能な脂質：約５〜２５％のリン脂質：約２５〜５５％の構造脂質；約０．５〜１５％のＰＥＧ修飾脂質のモル比を有する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、約５０％のイオン化可能な脂質、約１．５％のＰＥＧ修飾脂質、約３８．５％の構造脂質及び約１０％のリン脂質のモル比を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、約５５％のイオン化可能な脂質、約２．５％のＰＥＧ脂質、約３２．５％の構造脂質及び約１０％のリン脂質のモル比を含む。いくつかの実施形態では、イオン化可能な脂質は、イオン化可能なアミノ脂質またはカチオン性脂質であり、リン脂質は、中性脂質であり、構造脂質は、コレステロールである。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、イオン化可能な脂質：コレステロール：ＤＳＰＣ：ＰＥＧ２０００−ＤＭＧが５０：３８．５：１０：１．５であるモル比を有する。
【０６５０】
イオン化可能なアミノ脂質
本開示は、有利な性質を持つ医薬組成物を提供する。例えば、本明細書に記載の脂質（例えば、式（Ｉ）、（ＩＡ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、（ＩＩｅ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、または（ＶＩ）のいずれかを有する脂質は、哺乳類の細胞または器官に治療剤及び／または予防剤を送達するための脂質ナノ粒子組成物に有利に使用することができる。例えば、本明細書に記載の脂質は、免疫原性がほとんどないか、まったくない。例えば、本明細書に開示の脂質化合物は、参照脂質（例えば、ＭＣ３、ＫＣ２、またはＤＬｉｎＤＭＡ）と比較して、より低い免疫原性を有する。例えば、本明細書に開示の脂質及び治療剤または予防剤を含む製剤は、参照脂質（例えば、ＭＣ３、ＫＣ２、またはＤＬｉｎＤＭＡ）及び同じ治療剤または予防剤を含む対応する製剤と比較して、治療指数が上昇する。特に、本出願は、
（ａ）１つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドと、
（ｂ）送達剤と、を含む、医薬組成物を提供する。
【０６５１】
いくつかの実施形態では、送達剤は、式（Ｉ）を有する脂質化合物
【化１】
2020506189.tif 000009
（式中、
Ｒ１は、Ｃ５−３０アルキル、Ｃ５−２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３は、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、Ｃ２−１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から独立して選択されるか、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になってヘテロ環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４は、Ｃ３−６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、−ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１−６アルキルからなる群から選択され、Ｑは、炭素環、ヘテロ環、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、及び−Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、ｎはそれぞれ、１、２、３、４、及び５から独立して選択され、
Ｒ５はそれぞれ、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｒ６はそれぞれ、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｍ及びＭ’は、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ−Ｓ−、アリ−ル基、及びヘテロアリ−ル基から独立して選択され、
Ｒ７は、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｒ８は、Ｃ３−６炭素環及びヘテロ環からなる群から選択され、
Ｒ９は、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１−６アルキル、−ＯＲ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ３−６炭素環及びヘテロ環からなる群から選択され、
Ｒはそれぞれ、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｒ’はそれぞれ、Ｃ１−１８アルキル、Ｃ２−１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｒ”はそれぞれ、Ｃ３−１４アルキル及びＣ３−１４アルケニルからなる群から独立して選択され、
Ｒ＊はそれぞれ、Ｃ１−１２アルキル及びＣ２−１２アルケニルからなる群から独立して選択され、
Ｙはそれぞれ、独立してＣ３−６炭素環であり、
Ｘはそれぞれ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から独立して選択され、ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される）
またはその塩もしくは立体異性体を含む。
【０６５２】
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、
Ｒ１が、Ｃ５−２０アルキル、Ｃ５−２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３が、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、Ｃ２−１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から独立して選択されるか、またはＲ２及びＲ３が、それらが結合している原子と一緒になってヘテロ環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４が、Ｃ３−６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、−ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１−６アルキルからなる群から選択され、Ｑが、炭素環、ヘテロ環、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、及び−Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、ｎのそれぞれが、１、２、３、４、及び５から独立して選択され、
Ｒ５がそれぞれ、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｒ６がそれぞれ、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｍ及びＭ’が、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、アリ−ル基、及びヘテロアリ−ル基から独立して選択され、
Ｒ７が、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｒがそれぞれ、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｒ’がそれぞれ、Ｃ１−１８アルキル、Ｃ２−１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｒ”がそれぞれ、Ｃ３−１４アルキル及びＣ３−１４アルケニルからなる群から独立して選択され、
Ｒ＊がそれぞれ、Ｃ１−１２アルキル及びＣ２−１２アルケニルからなる群から独立して選択され、
Ｙがそれぞれ、独立してＣ３−６炭素環であり、
Ｘがそれぞれ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から独立して選択され、ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される、化合物
またはその塩もしくは立体異性体を含み、ここで、アルキル基及びアルケニル基は、直鎖または分岐鎖であってよい。
【０６５３】
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、Ｒ４が、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、または−ＣＱ（Ｒ）２であるとき、（ｉ）ｎが、１、２、３、４、もしくは５であるとき、Ｑが、−Ｎ（Ｒ）２ではない化合物、または（ｉｉ）ｎが、１もしくは２であるとき、Ｑが、５員、６員、もしくは７員のヘテロシクロアルキルではない化合物を含む。
【０６５４】
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットは、
Ｒ１が、Ｃ５−３０アルキル、Ｃ５−２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３が、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、Ｃ２−１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から独立して選択されるか、またはＲ２及びＲ３が、それらが結合している原子と一緒になってヘテロ環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４が、Ｃ３−６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、−ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１−６アルキルからなる群から選択され、Ｑが、Ｃ３−６炭素環、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つまたは複数のヘテロ原子を有する５〜１４員のヘテロアリ−ル、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、ならびにオキソ（＝Ｏ）、ＯＨ、アミノ、及びＣ１−３アルキルから選択される１つまたは複数の置換基で置換されており、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つまたは複数のヘテロ原子を有する５〜１４員のヘテロシクロアルキルから選択され、ｎがそれぞれ、１、２、３、４、及び５から独立して選択され、
Ｒ５がそれぞれ、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｒ６がそれぞれ、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｍ及びＭ’は、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ−Ｓ−、アリ−ル基、及びヘテロアリ−ル基から独立して選択され、
Ｒ７が、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｒ８が、Ｃ３−６炭素環及びヘテロ環からなる群から選択され、
Ｒ９が、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１−６アルキル、−ＯＲ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ３−６炭素環及びヘテロ環からなる群から選択され、
Ｒがそれぞれ、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｒ’がそれぞれ、Ｃ１−１８アルキル、Ｃ２−１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｒ”がそれぞれ、Ｃ３−１４アルキル及びＣ３−１４アルケニルからなる群から独立して選択され、
Ｒ＊がそれぞれ、Ｃ１−１２アルキル及びＣ２−１２アルケニルからなる群から独立して選択され、
Ｙがそれぞれ、独立してＣ３−６炭素環であり、
Ｘがそれぞれ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から独立して選択され、
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される、化合物
またはその塩もしくは立体異性体を含む。
【０６５５】
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットは、
Ｒ１が、Ｃ５−３０アルキル、Ｃ５−２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３が、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、Ｃ２−１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から独立して選択されるか、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になってヘテロ環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４が、Ｃ３−６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、−ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１−６アルキルからなる群から選択され、Ｑが、Ｃ３−６炭素環、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つまたは複数のヘテロ原子を有する５〜１４員のヘテロ環、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、及び−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２から選択され、ｎがそれぞれ、１、２、３、４、及び５から独立して選択され、Ｑが、５〜１４員のヘテロ環であり、かつ（ｉ）Ｒ４が、−（ＣＨ２）ｎＱ（ｎは、１もしくは２である）であるか、または（ｉｉ）Ｒ４が、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ（ｎは、１である）であるか、または（ｉｉｉ）Ｒ４が、−ＣＨＱＲ、及び−ＣＱ（Ｒ）２であるとき、Ｑが、５〜１４員のヘテロアリ−ル、もしくは８〜１４員のヘテロシクロアルキルのいずれかであり、
Ｒ５がそれぞれ、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｒ６がそれぞれ、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｍ及びＭ’が、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ−Ｓ−、アリ−ル基、及びヘテロアリ−ル基から独立して選択され、
Ｒ７が、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｒ８が、Ｃ３−６炭素環及びヘテロ環からなる群から選択され、
Ｒ９が、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１−６アルキル、−ＯＲ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ３−６炭素環及びヘテロ環からなる群から選択され、
Ｒがそれぞれ、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｒ’がそれぞれ、Ｃ１−１８アルキル、Ｃ２−１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｒ”がそれぞれ、Ｃ３−１４アルキル及びＣ３−１４アルケニルからなる群から独立して選択され、
Ｒ＊がそれぞれ、Ｃ１−１２アルキル及びＣ２−１２アルケニルからなる群から独立して選択され、
Ｙがそれぞれ、独立してＣ３−６炭素環であり、
Ｘがそれぞれ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から独立して選択され、
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される、化合物
またはその塩もしくは異性体を含む。
【０６５６】
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットは、
Ｒ１が、Ｃ５−３０アルキル、Ｃ５−２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３が、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、Ｃ２−１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から独立して選択されるか、またはＲ２及びＲ３が、それらが結合している原子と一緒になってヘテロ環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４が、Ｃ３−６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、−ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１−６アルキルからなる群から選択され、Ｑが、Ｃ３−６炭素環、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つまたは複数のヘテロ原子を有する５〜１４員のヘテロアリ−ル、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、ならびに−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、ならびにオキソ（＝Ｏ）、ＯＨ、アミノ、及びＣ１−３アルキルから選択される１つまたは複数の置換基で置換されており、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つまたは複数のヘテロ原子を有する５〜１４員のヘテロシクロアルキルから選択され、ｎがそれぞれ、１、２、３、４、及び５から独立して選択され、
Ｒ５がそれぞれ、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｒ６がそれぞれ、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｍ及びＭ’が、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、アリ−ル基、及びヘテロアリ−ル基から独立して選択され、
Ｒ７が、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｒ８が、Ｃ３−６炭素環及びヘテロ環からなる群から選択され、
Ｒ９が、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１−６アルキル、−ＯＲ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ３−６炭素環及びヘテロ環からなる群から選択され、
Ｒがそれぞれ、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｒ’がそれぞれ、Ｃ１−１８アルキル、Ｃ２−１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｒ”がそれぞれ、Ｃ３−１４アルキル及びＣ３−１４アルケニルからなる群から独立して選択され、
Ｒ＊がそれぞれ、Ｃ１−１２アルキル及びＣ２−１２アルケニルからなる群から独立して選択され、
Ｙがそれぞれ、独立してＣ３−６炭素環であり、
Ｘがそれぞれ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から独立して選択され、
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される、化合物
またはその塩もしくは異性体を含む。
【０６５７】
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットは、
Ｒ１が、Ｃ５−２０アルキル、Ｃ５−２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３が、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、Ｃ２−１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から独立して選択されるか、またはＲ２及びＲ３が、それらが結合している原子と一緒になってヘテロ環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４が、Ｃ３−６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、−ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１−６アルキルからなる群から選択され、Ｑが、Ｃ３−６炭素環、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つまたは複数のヘテロ原子を有する５〜１４員のヘテロ環、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、−Ｎ（Ｒ）２及び−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２から選択され、ｎがそれぞれ、１、２、３、４、及び５から独立して選択され、Ｑが、５〜１４員のヘテロ環であり、かつ（ｉ）Ｒ４が、−（ＣＨ２）ｎＱ（ｎは、１もしくは２である）であるか、または（ｉｉ）Ｒ４が、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ（ｎは、１である）であるか、または（ｉｉｉ）Ｒ４が、−ＣＨＱＲ、及び−ＣＱ（Ｒ）２であるとき、Ｑが、５〜１４員のヘテロアリ−ル、もしくは８〜１４員のヘテロシクロアルキルのいずれかであり、
Ｒ５がそれぞれ、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｒ６がそれぞれ、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｍ及びＭ’は、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ−Ｓ−、アリ−ル基、及びヘテロアリ−ル基から独立して選択され、
Ｒ７が、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｒ８が、Ｃ３−６炭素環及びヘテロ環からなる群から選択され、
Ｒ９が、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１−６アルキル、−ＯＲ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ３−６炭素環及びヘテロ環からなる群から選択され、
Ｒがそれぞれ、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｒ’がそれぞれ、Ｃ１−１８アルキル、Ｃ２−１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ、−ＹＲ”、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｒ”がそれぞれ、Ｃ３−１４アルキル及びＣ３−１４アルケニルからなる群から独立して選択され、
Ｒ＊がそれぞれ、Ｃ１−１２アルキル、Ｃ１−１２アルケニル、及びＣ２−１２アルケニルからなる群から独立して選択され、
Ｙがそれぞれ、独立してＣ３−６炭素環であり、
Ｘがそれぞれ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から独立して選択され、
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される、化合物
またはその塩もしくは立体異性体を含む。
【０６５８】
さらにいくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットは、
Ｒ１が、Ｃ５−２０アルキル、Ｃ５−２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３が、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、Ｃ２−１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から独立して選択されるか、またはＲ２及びＲ３が、それらが結合している原子と一緒になってヘテロ環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４が、Ｃ３−６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、−ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１−６アルキルからなる群から選択され、Ｑが、−Ｎ（Ｒ）２、Ｃ３−６炭素環、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つまたは複数のヘテロ原子を有する５〜１４員のヘテロ環、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、ｎがそれぞれ、１、２、３、４、及び５から独立して選択され、Ｑが、５〜１４員のヘテロ環であり、かつ（ｉ）Ｒ４が、−（ＣＨ２）ｎＱ（ｎは、１もしくは２である）であるか、または（ｉｉ）Ｒ４が、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ（ｎは、１である）であるか、または（ｉｉｉ）Ｒ４が、−ＣＨＱＲ、及び−ＣＱ（Ｒ）２であるとき、Ｑが、５〜１４員のヘテロアリール、もしくは８〜１４員のヘテロシクロアルキルのいずれかであり、
Ｒ５がそれぞれ、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｒ６がそれぞれ、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｍ及びＭ’が、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、アリ−ル基、及びヘテロアリ−ル基から独立して選択され、
Ｒ７が、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｒがそれぞれ、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｒ’がそれぞれ、Ｃ１−１８アルキル、Ｃ２−１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｒ”がそれぞれ、Ｃ３−１４アルキル及びＣ３−１４アルケニルからなる群から独立して選択され、
Ｒ＊がそれぞれ、Ｃ１−１２アルキル及びＣ２−１２アルケニルからなる群から独立して選択され、
Ｙがそれぞれ、独立してＣ３−６炭素環であり、
Ｘがそれぞれ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から独立して選択され、
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される、化合物
またはその塩もしくは立体異性体を含む。
【０６５９】
さらにいくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットは、
Ｒ１が、Ｃ５−３０アルキル、Ｃ５−２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３が、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、Ｃ２−１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から独立して選択されるか、またはＲ２及びＲ３が、それらが結合している原子と一緒になってヘテロ環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４が、Ｃ３−６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、−ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１−６アルキルからなる群から選択され、Ｑが、Ｃ３−６炭素環、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つまたは複数のヘテロ原子を有する５〜１４員のヘテロアリ−ル、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、及び−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２から選択され、ｎがそれぞれ、１、２、３、４、及び５から独立して選択され、
Ｒ５がそれぞれ、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｒ６がそれぞれ、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｍ及びＭ’が、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ−Ｓ−、アリ−ル基、及びヘテロアリ−ル基から独立して選択され、
Ｒ７が、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｒ８が、Ｃ３−６炭素環及びヘテロ環からなる群から選択され、
Ｒ９が、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１−６アルキル、−ＯＲ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ３−６炭素環及びヘテロ環からなる群から選択され、
Ｒがそれぞれ、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｒ’がそれぞれ、Ｃ１−１８アルキル、Ｃ２−１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｒ”がそれぞれ、Ｃ３−１４アルキル及びＣ３−１４アルケニルからなる群から独立して選択され、
Ｒ＊がそれぞれ、Ｃ１−１２アルキル及びＣ２−１２アルケニルからなる群から独立して選択され、
Ｙがそれぞれ、独立してＣ３−６炭素環であり、
Ｘがそれぞれ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から独立して選択され、
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される、化合物
またはその塩もしくは立体異性体を含む。
【０６６０】
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットは、
Ｒ１が、Ｃ５−２０アルキル、Ｃ５−２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３が、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、Ｃ２−１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から独立して選択されるか、またはＲ２及びＲ３が、それらが結合している原子と一緒になってヘテロ環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４が、Ｃ３−６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、−ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１−６アルキルからなる群から選択され、Ｑが、Ｃ３−６炭素環、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つまたは複数のヘテロ原子を有する５〜１４員のヘテロアリ−ル、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、ｎがそれぞれ、１、２、３、４、及び５から独立して選択され、
Ｒ５がそれぞれ、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｒ６がそれぞれ、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｍ及びＭ’が、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、アリ−ル基、及びヘテロアリ−ル基から独立して選択され、
Ｒ７が、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｒがそれぞれ、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｒ’がそれぞれ、Ｃ１−１８アルキル、Ｃ２−１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｒ”がそれぞれ、Ｃ３−１４アルキル及びＣ３−１４アルケニルからなる群から独立して選択され、
Ｒ＊がそれぞれ、Ｃ１−１２アルキル及びＣ２−１２アルケニルからなる群から独立して選択され、
Ｙがそれぞれ、独立してＣ３−６炭素環であり、
Ｘがそれぞれ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から独立して選択され、
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される、化合物
またはその塩もしくは立体異性体を含む。
【０６６１】
さらにいくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットは、
Ｒ１が、Ｃ５−３０アルキル、Ｃ５−２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３が、Ｈ、Ｃ２−１４アルキル、Ｃ２−１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から独立して選択されるか、またはＲ２及びＲ３が、それらが結合している原子と一緒になってヘテロ環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４が、−（ＣＨ２）ｎＱまたは−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲであり、Ｑが、−Ｎ（Ｒ）２であり、ｎが、３、４、及び５から選択され、
Ｒ５がそれぞれ、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｒ６がそれぞれ、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｍ及びＭ’が、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ−Ｓ−、アリ−ル基、及びヘテロアリ−ル基から独立して選択され、
Ｒ７が、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｒがそれぞれ、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｒ’がそれぞれ、Ｃ１−１８アルキル、Ｃ２−１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｒ”がそれぞれ、Ｃ３−１４アルキル及びＣ３−１４アルケニルからなる群から独立して選択され、
Ｒ＊がそれぞれ、Ｃ１−１２アルキル及びＣ１−１２アルケニルからなる群から独立して選択され、
Ｙがそれぞれ、独立してＣ３−６炭素環であり、
Ｘがそれぞれ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から独立して選択され、
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される、化合物
またはその塩もしくは立体異性体を含む。
【０６６２】
さらにいくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットは、
Ｒ１が、Ｃ５−２０アルキル、Ｃ５−２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３が、Ｈ、Ｃ２−１４アルキル、Ｃ２−１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から独立して選択されるか、またはＲ２及びＲ３が、それらが結合している原子と一緒になってヘテロ環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４が、−（ＣＨ２）ｎＱまたは−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲであり、Ｑが、−Ｎ（Ｒ）２であり、ｎが、３、４、及び５から選択され、
Ｒ５がそれぞれ、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｒ６がそれぞれ、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｍ及びＭ’が、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、アリ−ル基、及びヘテロアリ−ル基から独立して選択され、
Ｒ７が、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｒがそれぞれ、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｒ’がそれぞれ、Ｃ１−１８アルキル、Ｃ２−１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｒ”がそれぞれ、Ｃ３−１４アルキル及びＣ３−１４アルケニルからなる群から独立して選択され、
Ｒ＊がそれぞれ、Ｃ１−１２アルキル及びＣ１−１２アルケニルからなる群から独立して選択され、
Ｙがそれぞれ、独立してＣ３−６炭素環であり、
Ｘがそれぞれ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から独立して選択され、
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される、化合物
またはその塩もしくは立体異性体を含む。
【０６６３】
さらに他の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットは、
Ｒ１が、Ｃ５−３０アルキル、Ｃ５−２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３が、Ｃ１−１４アルキル、Ｃ２−１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から独立して選択されるか、またはＲ２及びＲ３が、それらが結合している原子と一緒になってヘテロ環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４が、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、及び−ＣＱ（Ｒ）２からなる群から選択され、Ｑが、−Ｎ（Ｒ）２であり、ｎが、１、２、３、４、及び５から選択され、
Ｒ５がそれぞれ、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｒ６がそれぞれ、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｍ及びＭ’が、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ−Ｓ−、アリ−ル基、及びヘテロアリ−ル基から独立して選択され、
Ｒ７が、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｒがそれぞれ、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｒ’がそれぞれ、Ｃ１−１８アルキル、Ｃ２−１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｒ”がそれぞれ、Ｃ３−１４アルキル及びＣ３−１４アルケニルからなる群から独立して選択され、
Ｒ＊がそれぞれ、Ｃ１−１２アルキル及びＣ１−１２アルケニルからなる群から独立して選択され、
Ｙがそれぞれ、独立してＣ３−６炭素環であり、
Ｘがそれぞれ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から独立して選択され、
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される、化合物
またはその塩もしくは立体異性体を含む。
【０６６４】
さらに他の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットは、
Ｒ１が、Ｃ５−２０アルキル、Ｃ５−２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３が、Ｃ１−１４アルキル、Ｃ２−１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から独立して選択されるか、またはＲ２及びＲ３が、それらが結合している原子と一緒になってヘテロ環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４が、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、及び−ＣＱ（Ｒ）２からなる群から選択され、Ｑが、−Ｎ（Ｒ）２であり、ｎが、１、２、３、４、及び５から選択され、
Ｒ５がそれぞれ、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｒ６がそれぞれ、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｍ及びＭ’が、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、アリ−ル基、及びヘテロアリ−ル基から独立して選択され、
Ｒ７が、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｒがそれぞれ、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｒ’がそれぞれ、Ｃ１−１８アルキル、Ｃ２−１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｒ”がそれぞれ、Ｃ３−１４アルキル及びＣ３−１４アルケニルからなる群から独立して選択され、
Ｒ＊がそれぞれ、Ｃ１−１２アルキル及びＣ１−１２アルケニルからなる群から独立して選択され、
Ｙがそれぞれ、独立してＣ３−６炭素環であり、
Ｘがそれぞれ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から独立して選択され、
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される、化合物
またはその塩もしくは立体異性体を含む。
【０６６５】
ある特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、式（ＩＡ）の化合物：
【化２】
2020506189.tif 000010
（式中、ｌは、１、２、３、４、及び５から選択され、ｍは、５、６、７、８、及び９から選択され、Ｍ１は、単結合またはＭ’であり、Ｒ４は、非置換Ｃ１−３アルキル、または−（ＣＨ２）ｎＱであり、Ｑは、ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、−ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリ−ル、またはヘテロシクロアルキルであり、Ｍ及びＭ’は、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ−Ｓ−、アリ−ル基、及びヘテロアリ−ル基から独立して選択され、
Ｒ２及びＲ３は、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、及びＣ２−１４アルケニルからなる群から独立して選択される）またはその塩もしくは立体異性体を含む。
【０６６６】
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、式（ＩＡ）、式（ＩＩ）の化合物、またはその塩もしくは立体異性体
（式中、
ｌは、１、２、３、４、及び５から選択され、ｍは、５、６、７、８、及び９から選択され、
Ｍ１は、単結合またはＭ’であり、
Ｒ４は、非置換Ｃ１−３アルキル、または−（ＣＨ２）ｎＱであり、Ｑは、ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、または−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２であり、
Ｍ及びＭ’は、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、アリ−ル基、及びヘテロアリ−ル基から独立して選択され、
Ｒ２及びＲ３は、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、及びＣ２−１４アルケニルからなる群から独立して選択される）を含む。
【０６６７】
ある特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、式（ＩＩ）の化合物：
【化３】
2020506189.tif 000011
またはその塩もしくは立体異性体（式中、ｌは、１、２、３、４、及び５から選択され、Ｍ１は、単結合またはＭ’であり、Ｒ４は、非置換Ｃ１−３アルキル、または−（ＣＨ２）ｎＱであり、ｎは、２、３、または４であり、Ｑは、ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、−ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリ−ル、またはヘテロシクロアルキルであり、Ｍ及びＭ’は、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ−Ｓ−、アリ−ル基、及びヘテロアリ−ル基から独立して選択され、
Ｒ２及びＲ３は、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、及びＣ２−１４アルケニルからなる群から独立して選択される）を含む。
【０６６８】
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、式（ＩＩ）の化合物、またはその塩もしくは立体異性体（式中、
ｌは、１、２、３、４、及び５から選択され、
Ｍ１は、単結合またはＭ’であり、
Ｒ４は、非置換Ｃ１−３アルキル、または−（ＣＨ２）ｎＱであり、ｎは、２、３、または４であり、Ｑは、ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、または−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２であり、
Ｍ及びＭ’は、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、アリ−ル基、及びヘテロアリ−ル基から独立して選択され、
Ｒ２及びＲ３は、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、及びＣ２−１４アルケニルからなる群から独立して選択される）を含む。
【０６６９】
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩａ）、
【化４】
2020506189.tif 000012
またはその塩（式中、Ｒ４は、上記のとおりである）のものである。
【０６７０】
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｂ）の化合物
【化５】
2020506189.tif 000013
またはその塩（式中、Ｒ４は、上記のとおりである）のものである。
【０６７１】
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｃ）の化合物
【化６】
2020506189.tif 000014
またはその塩（式中、Ｒ４は、上記のとおりである）のものである。
【０６７２】
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｅ）の化合物：
【化７】
2020506189.tif 000015
またはその塩（式中、Ｒ４は、上記のとおりである）のものである。
【０６７３】
いくつかの実施形態では、式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、または（ＩＩｅ）の化合物は、（ＣＨ２）ｎＱ及び（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲから選択されるＲ４を含み、Ｑ、Ｒ及びｎは、上に定義するとおりである。
【０６７４】
いくつかの実施形態では、Ｑは、−ＯＲ、−ＯＨ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＮ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）、及びヘテロ環からなる群から選択され、Ｒは、上に定義するとおりである。いくつかの態様では、ｎは、１または２である。いくつかの実施形態では、Ｑは、ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、または−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２である。
【０６７５】
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｄ）の化合物
【化８】
2020506189.tif 000016
またはその塩もしくは異性体（式中、ｎは、２、３、または４であり、ｍ、Ｒ’、Ｒ”、及びＲ２〜Ｒ６は、上に定義するとおりである）である。例えば、Ｒ２及びＲ３のそれぞれは、Ｃ５−１４アルキル及びＣ５−１４アルケニルからなる群から独立して選択され得、ｎは、２、３、及び４から選択され、Ｒ’、Ｒ”、Ｒ５、Ｒ６及びｍは、上に定義するとおりである。
【０６７６】
式（ＩＩｄ）の化合物のいくつかの態様では、Ｒ２は、Ｃ８アルキルである。式（ＩＩｄ）の化合物のいくつかの態様では、Ｒ３は、Ｃ５−Ｃ９アルキルである。式（ＩＩｄ）の化合物のいくつかの態様では、ｍは、５、７、または９である。式（ＩＩｄ）の化合物のいくつかの態様では、Ｒ５はそれぞれ、Ｈである。式（ＩＩｄ）の化合物のいくつかの態様では、Ｒ６はそれぞれ、Ｈである。
【０６７７】
別の態様では、本出願は、（１）式（Ｉ）を有する化合物と、（２）任意選択でヘルパー脂質（例えば、リン脂質）と、（３）任意選択で構造脂質（例えば、ステロール）と、（４）任意選択で脂質複合体（例えば、ＰＥＧ脂質）と、を含む、脂質組成物（例えば、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ））を提供する。例示の実施形態では、脂質組成物（例えば、ＬＮＰ）は、１つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば、脂質組成物に封入されたポリヌクレオチドをさらに含む。
【０６７８】
本明細書で使用されるとき、「アルキル」または「アルキル基」という用語は、１個または複数の炭素原子（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個またはそれより多い炭素原子）を含む、直鎖または分岐鎖の飽和炭化水素を意味する。
【０６７９】
「Ｃ１−１４アルキル」という表記は、１〜１４個の炭素原子を含む、直鎖または分岐鎖の飽和炭化水素を意味する。アルキル基は、任意選択で置換されてもよい。
【０６８０】
本明細書で使用されるとき、「アルケニル」または「アルケニル基」という用語は、２個またはそれ以上の炭素原子（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個またはそれより多い炭素原子）及び少なくとも１つの二重結合を含む、直鎖または分岐鎖の炭化水素を意味する。
【０６８１】
「Ｃ２−１４アルケニル」という表記は、２〜１４個の炭素原子及び少なくとも１つの二重結合を含む、直鎖または分岐鎖の炭化水素を意味する。アルケニル基は、１、２、３、４またはそれ以上の二重結合を含み得る。例えば、Ｃ１８アルケニルは、１つまたは複数の二重結合を含み得る。２つの二重結合を含むＣ１８アルケニル基は、リノレイル基であり得る。アルケニル基は、任意選択で置換されてもよい。
【０６８２】
本明細書で使用されるとき、「炭素環」または「炭素環式基」という用語は、炭素原子の１つまたは複数の環を含む、単環系または多環系を意味する。環は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５員環であり得る。
【０６８３】
「Ｃ３−６炭素環」という表記は、３〜６個の炭素原子を有する単環を含む、炭素環を意味する。炭素環は、１つまたは複数の二重結合を含み得、芳香族であり得る（例えば、アリール基）。炭素環の例には、シクロプロピル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、フェニル基、ナフチル基及び１，２−ジヒドロナフチル基が挙げられる。炭素環は、任意選択で置換されてもよい。
【０６８４】
本明細書で使用されるとき、「ヘテロ環」または「複素環基」という用語は、１つまたは複数の環を含み、少なくとも１つの環は、少なくとも１つのヘテロ原子を含む、単環系または多環系を意味する。ヘテロ原子は、例えば、窒素、酸素または硫黄原子であり得る。環は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２員環であり得る。ヘテロ環は、１つまたは複数の二重結合を含み得、芳香族であり得る（例えば、ヘテロアリール基）。ヘテロ環の例には、イミダゾリル、イミダゾリジニル、オキサゾリル、オキサゾリジニル、チアゾリル、チアゾリジニル、ピラゾリジニル、ピラゾリル、イソオキサゾリジニル、イソオキサゾリル、イソチアゾリジニル、イソチアゾリル、モルホリニル、ピロリル、ピロリジニル、フリル、テトラヒドロフリル、チオフェニル、ピリジニル、ピペリジニル、キノリル、及びイソキノリル基が挙げられる。ヘテロ環は、任意選択で置換されてもよい。
【０６８５】
本明細書で使用されるとき、「生分解性基」は、対象において脂質のより速い代謝を促進することができる基である。生分解性基は、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、アリール基、及びヘテロアリール基であり得るが、これらに限定されない。
【０６８６】
本明細書で使用されるとき、「アリール基」は、１つまたは複数の芳香環を含む、炭素環式基である。アリール基の例には、フェニル基及びナフチル基が挙げられる。
【０６８７】
本明細書で使用されるとき、「ヘテロアリール基」は、１つまたは複数の芳香環を含む、ヘテロ環基である。ヘテロアリール基の例には、ピロリル、フリル、チオフェニル、イミダゾリル、オキサゾリル、及びチアゾリルが挙げられる。アリール基及びヘテロアリール基はいずれも任意選択で置換されてもよい。例えば、Ｍ及びＭ’は、任意選択で置換されたフェニル、オキサゾール、及びチアゾールからなる非限定的な群から選択することができる。本明細書の式において、Ｍ及びＭ’は、上記の生分解性基の一覧から独立して選択することができる。
【０６８８】
アルキル基、アルケニル基、及びシクリル基（例えば、カルボシクリル及びヘテロシクリル）は、特に指定されない限り、任意選択で置換されてもよい。任意の置換基は、限定するものではないが、ハロゲン原子（例えば、塩素、臭素、フッ素、またはヨウ素の基）、カルボン酸（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ）、アルコール（例えば、ヒドロキシル、−ＯＨ）、エステル（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＯＲまたは−ＯＣ（Ｏ）Ｒ）、アルデヒド（例えば、−Ｃ（Ｏ）Ｈ）、カルボニル（例えば、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、あるいはＣ＝Ｏと表される）、酸ハロゲン化物（例えば、−Ｃ（Ｏ）Ｘ、式中、Ｘは、臭素、フッ素、塩素、及びヨウ素から選択されるハライド）、炭酸塩（例えば、−ＯＣ（Ｏ）ＯＲ）、アルコキシ（例えば、−ＯＲ）、アセタール（例えば、−Ｃ（ＯＲ）２Ｒ””、式中、ＯＲはそれぞれ同じであっても異なってもよいアルコキシ基であり、Ｒ””は、アルキル基またはアルケニル基である）、リン酸塩（例えば、Ｐ（Ｏ）４３−）、チオール（例えば、−ＳＨ）、スルホキシド（例えば、−Ｓ（Ｏ）Ｒ）、スルフィン酸（例えば、−Ｓ（Ｏ）ＯＨ）、スルホン酸（例えば、−Ｓ（Ｏ）２ＯＨ）、チアール（例えば、−Ｃ（Ｓ）Ｈ）、硫酸塩（例えば、Ｓ（Ｏ）４２−）、スルホニル（例えば、−Ｓ（Ｏ）２−）、アミド（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、または−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ）、アジド（例えば、−Ｎ３）、ニトロ（例えば、−ＮＯ２）、シアノ（例えば、−ＣＮ）、イソシアノ（例えば、−ＮＣ）、アシルオキシ（例えば、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ）、アミノ（例えば、−ＮＲ２、−ＮＲＨ、または−ＮＨ２）、カルバモイル（例えば、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ２、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲＨ、または−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ２）、スルホンアミド（例えば、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲＨ、−Ｓ（Ｏ）２ＮＨ２、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｈ、または−Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｈ）、アルキル基、アルケニル基、及びシクリル（例えば、カルボシクリルまたはヘテロシクリル）基からなる群から選択することができる。
【０６８９】
前述のいずれにおいても、Ｒは、本明細書に定義される、アルキル基またはアルケニル基である。いくつかの実施形態では、置換基自体も、例えば、本明細書で定義される１、２、３、４、５、または６つの置換基でさらに置換されてもよい。例えば、Ｃ１−６アルキル基は、本明細書で定義される１、２、３、４、５、または６つの置換基でさらに置換されてもよい。
【０６９０】
式（Ｉ）、（ＩＡ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、及び（ＩＩｅ）のいずれか１つの化合物は、該当する場合、以下の特徴のうちの１つまたは複数を含む。
【０６９１】
いくつかの実施形態では、Ｒ４は、Ｃ３−６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、及び−ＣＱ（Ｒ）２からなる群から選択され、Ｑは、Ｃ３−６炭素環、Ｎ、Ｏ、Ｓ、及びＰから選択される１つまたは複数のヘテロ原子を有する５〜１４員の芳香族または非芳香族ヘテロ環、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、及び−Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、ｎはそれぞれ、１、２、３、４、及び５から独立して選択される。
【０６９２】
別の実施形態では、Ｒ４は、Ｃ３−６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、及び−ＣＱ（Ｒ）２からなる群から選択され、Ｑが、Ｃ３−６炭素環、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つまたは複数のヘテロ原子を有する５〜１４員のヘテロアリ−ル、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ならびにオキソ（＝Ｏ）、ＯＨ、アミノ、及びＣ１−３アルキルから選択される１つまたは複数の置換基で置換されており、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つまたは複数のヘテロ原子を有する５〜１４員のヘテロシクロアルキルから選択され、ｎはそれぞれ、１、２、３、４、及び５から独立して選択される。
【０６９３】
別の実施形態では、Ｒ４は、Ｃ３−６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、及び−ＣＱ（Ｒ）２からなる群から選択され、Ｑは、Ｃ３−６炭素環、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つまたは複数のヘテロ原子を有する５〜１４員のヘテロ環、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、ｎはそれぞれ、１、２、３、４、及び５から独立して選択され、Ｑが、５〜１４員のヘテロ環であり、かつ（ｉ）Ｒ４が、−（ＣＨ２）ｎＱ（ｎは、１もしくは２である）であるか、または（ｉｉ）Ｒ４が、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ（ｎは、１である）であるか、または（ｉｉｉ）Ｒ４が、−ＣＨＱＲ、及び−ＣＱ（Ｒ）２であるとき、Ｑが、５〜１４員のヘテロアリール、もしくは８〜１４員のヘテロシクロアルキルのいずれかである。
【０６９４】
別の実施形態では、Ｒ４は、Ｃ３−６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、及び−ＣＱ（Ｒ）２からなる群から選択され、Ｑは、Ｃ３−６炭素環、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つまたは複数のヘテロ原子を有する５〜１４員のヘテロアリール、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、ｎはそれぞれ、１、２、３、４、及び５から独立して選択される。
【０６９５】
別の実施形態では、Ｒ４は、非置換Ｃ１−４アルキル、例えば、非置換メチルである。
【０６９６】
ある特定の実施形態では、本開示は、式（Ｉ）を有する化合物（式中、Ｒ４は、−（ＣＨ２）ｎＱまたは−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲであり、Ｑは、−Ｎ（Ｒ）２であり、ｎは、３、４、及び５から選択される）を提供する。
【０６９７】
ある特定の実施形態では、本開示は、式（Ｉ）を有する化合物（式中、Ｒ４は、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、及び−ＣＱ（Ｒ）２からなる群から選択され、Ｑは、−Ｎ（Ｒ）２であり、ｎは、１、２、３、４、及び５から選択される）を提供する。
【０６９８】
ある特定の実施形態では、本開示は、式（Ｉ）を有する化合物（式中、Ｒ２及びＲ３は、Ｃ２−１４アルキル、Ｃ２−１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から独立して選択されるか、またはＲ２及びＲ３が、それらが結合している原子と一緒になってヘテロ環もしくは炭素環を形成し、Ｒ４は、−（ＣＨ２）ｎＱまたは−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲであり、Ｑは、−Ｎ（Ｒ）２であり、ｎは、３、４、及び５から選択される）を提供する。
【０６９９】
ある特定の実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、Ｃ２−１４アルキル、Ｃ２−１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から独立して選択されるか、またはＲ２及びＲ３が、それらが結合している原子と一緒になってヘテロ環もしくは炭素環を形成する。
【０７００】
いくつかの実施形態では、Ｒ１は、Ｃ５−２０アルキル及びＣ５−２０アルケニルからなる群から選択される。
【０７０１】
他の実施形態では、Ｒ１は、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択される。
【０７０２】
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、−Ｒ＊ＹＲ”及び−ＹＲ”から選択される。いくつかの実施形態では、Ｙは、シクロプロピル基である。いくつかの実施形態では、Ｒ＊は、Ｃ８アルキルまたはＣ８アルケニルである。ある特定の実施形態では、Ｒ”は、Ｃ３−１２アルキルである。例えば、Ｒ”は、Ｃ３アルキルであり得る。例えば、Ｒ”は、Ｃ４−８アルキル（例えば、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、またはＣ８アルキル）であり得る。
【０７０３】
いくつかの実施形態では、Ｒ１は、Ｃ５−２０アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ１は、Ｃ６アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ１は、Ｃ８アルキルである。他の実施形態では、Ｒ１は、Ｃ９アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１は、Ｃ１４アルキルである。他の実施形態では、Ｒ１は、Ｃ１８アルキルである。
【０７０４】
いくつかの実施形態では、Ｒ１は、Ｃ５−２０アルケニルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１は、Ｃ１８アルケニルである。いくつかの実施形態では、Ｒ１は、リノレイルである。
【０７０５】
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、分枝鎖である（例えば、デカン−２−イル、ウンデカン−３−イル、ドデカン−４−イル、トリデカン−５−イル、テトラデカン−６−イル、２−メチルウンデカン−３−イル、２−メチルデカン−２−イル、３−メチルウンデカン−３−イル、４−メチルドデカン−４−イル、またはヘプタデカン−９−イル）。ある特定の実施形態では、Ｒ１は、
【化９】
2020506189.tif 000017
である。
【０７０６】
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、非置換Ｃ５−２０アルキルまたはＣ５−２０アルケニルである。ある特定の実施形態では、Ｒ’は、置換されたＣ５−２０アルキルまたはＣ５−２０アルケニル（例えば、１−シクロプロピルノニルなどの、Ｃ３−６炭素環での置換）である。
【０７０７】
他の実施形態では、Ｒ１は、−Ｒ”Ｍ’Ｒ’である。
【０７０８】
いくつかの実施形態では、Ｒ’は、−Ｒ＊ＹＲ”及び−ＹＲ”から選択される。いくつかの実施形態では、Ｙは、Ｃ３−８シクロアルキルである。いくつかの実施形態では、Ｙは、Ｃ６−１０アリ−ルである。いくつかの実施形態では、Ｙは、シクロプロピル基である。いくつかの実施形態では、Ｙは、シクロヘキシル基である。ある特定の実施形態では、Ｒ＊は、Ｃ１アルキルである。
【０７０９】
いくつかの実施形態では、Ｒ”は、Ｃ３−１２アルキル及びＣ３−１２アルケニルからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｙに隣接するＲ”は、Ｃ１アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｙに隣接するＲ”は、Ｃ４−９アルキル（例えば、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７またはＣ８またはＣ９アルキル）である。
【０７１０】
いくつかの実施形態では、Ｒ’は、Ｃ４アルキル及びＣ４アルケニルから選択される。ある特定の実施形態では、Ｒ’は、Ｃ５アルキル及びＣ５アルケニルから選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ’は、Ｃ６アルキル及びＣ６アルケニルから選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ’は、Ｃ７アルキル及びＣ７アルケニルから選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ’は、Ｃ９アルキル及びＣ９アルケニルから選択される。
【０７１１】
他の実施形態では、Ｒ’は、Ｃ１１アルキル及びＣ１１アルケニルから選択される。他の実施形態では、Ｒ’は、Ｃ１２アルキル、Ｃ１２アルケニル、Ｃ１３アルキル、Ｃ１３アルケニル、Ｃ１４アルキル、Ｃ１４アルケニル、Ｃ１５アルキル、Ｃ１５アルケニル、Ｃ１６アルキル、Ｃ１６アルケニル、Ｃ１７アルキル、Ｃ１７アルケニル、Ｃ１８アルキル、及びＣ１８アルケニルから選択される。ある特定の実施形態では、Ｒ’は、分枝鎖である（例えば、デカン−２−イル、ウンデカン−３−イル、ドデカン−４−イル、トリデカン−５−イル、テトラデカン−６−イル、２−メチルウンデカン−３−イル、２−メチルデカン−２−イル、３−メチルウンデカン−３−イル、４−メチルドデカン−４−イル、またはヘプタデカン−９−イル）。ある特定の実施形態では、Ｒ’は、
【化１０】
2020506189.tif 000018
である。
【０７１２】
ある特定の実施形態では、Ｒ’は、非置換Ｃ１−１８アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ’は、置換されたＣ１−１８アルキル（例えば、１−シクロプロピルノニルなどの、Ｃ３−６炭素環で置換されたＣ１−１５アルキル）である。
【０７１３】
いくつかの実施形態では、Ｒ”は、Ｃ３−１４アルキル及びＣ３−１４アルケニルからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ”は、Ｃ３アルキル、Ｃ４アルキル、Ｃ５アルキル、Ｃ６アルキル、Ｃ７アルキル、またはＣ８アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ”は、Ｃ９アルキル、Ｃ１０アルキル、Ｃ１１アルキル、Ｃ１２アルキル、Ｃ１３アルキル、またはＣ１４アルキルである。
【０７１４】
いくつかの実施形態では、Ｍ’は、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−である。いくつかの実施形態では、Ｍ’は、−ＯＣ（Ｏ）−である。
【０７１５】
他の実施形態では、Ｍ’は、アリール基またはヘテロアリール基である。例えば、Ｍ’は、フェニル、オキサゾール、及びチアゾールからなる群から選択することができる。
【０７１６】
いくつかの実施形態では、Ｍは、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−である。いくつかの実施形態では、Ｍは、−ＯＣ（Ｏ）−である。いくつかの実施形態では、Ｍは、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−である。いくつかの実施形態では、Ｍは、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−である。
【０７１７】
他の実施形態では、Ｍは、アリール基またはヘテロアリール基である。例えば、Ｍは、フェニル、オキサゾール、及びチアゾールからなる群から選択することができる。
【０７１８】
いくつかの実施形態では、Ｍは、Ｍ’と同じである。他の実施形態では、Ｍは、Ｍ’とは異なる。
【０７１９】
いくつかの実施形態では、Ｒ５はそれぞれＨである。ある特定のこのような実施形態では、Ｒ６もそれぞれＨである。
【０７２０】
いくつかの実施形態では、Ｒ７は、Ｈである。他の実施形態では、Ｒ７は、Ｃ１−３アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル、またはｉ−プロピル）である。
【０７２１】
いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、独立してＣ５−１４アルキルまたはＣ５−１４アルケニルである。
【０７２２】
いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、同じである。いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、Ｃ８アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、Ｃ２アルキルである。他の実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、Ｃ３アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、Ｃ４アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、Ｃ５アルキルである。他の実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、Ｃ６アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、Ｃ７アルキルである。
【０７２３】
他の実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、異なる。ある特定の実施形態では、Ｒ２は、Ｃ８アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ３は、Ｃ１−７（例えば、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、またはＣ７アルキル）またはＣ９アルキルである。
【０７２４】
いくつかの実施形態では、Ｒ７及びＲ３は、Ｈである。
【０７２５】
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、Ｈである。
【０７２６】
いくつかの実施形態では、ｍは、５、７、または９である。
【０７２７】
いくつかの実施形態では、Ｒ４は、−（ＣＨ２）ｎＱ及び−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲから選択される。
【０７２８】
いくつかの実施形態では、Ｑは、−ＯＲ、−ＯＨ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＮ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）、−Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、炭素環、及びヘテロ環からなる群から選択される。
【０７２９】
ある特定の実施形態では、Ｑは、−ＯＨである。
【０７３０】
ある特定の実施形態では、Ｑは、置換または非置換の５〜１０員ヘテロアリールであり、例えば、Ｑは、イミダゾール、ピリミジン、プリン、２−アミノ−１，９−ジヒドロ−６Ｈ−プリン−６−オン−９−イル（もしくはグアニン−９−イル）、アデニン−９−イル、シトシン−１−イル、またはウラシル−１−イルである。ある特定の実施形態では、Ｑは、例えば、オキソ（＝Ｏ）、ＯＨ、アミノ、及びＣ１−３アルキルから選択される１つまたは複数の置換基で置換された、置換５〜１４員ヘテロシクロアルキルである。例えば、Ｑは、４−メチルピペラジニル、４−（４−メトキシベンジル）ピペラジニル、またはイソインドリン−２−イル−１，３−ジオンである。
【０７３１】
ある特定の実施形態では、Ｑは、非置換または置換のＣ６−１０アリール（フェニルなど）またはＣ３−６シクロアルキルである。
【０７３２】
いくつかの実施形態では、ｎは、１である。他の実施形態では、ｎは、２である。さらなる実施形態では、ｎは、３である。ある特定の他の実施形態では、ｎは、４である。例えば、Ｒ４は、−（ＣＨ２）２ＯＨであり得る。例えば、Ｒ４は、−（ＣＨ２）３ＯＨであり得る。例えば、Ｒ４は、−（ＣＨ２）４ＯＨであり得る。例えば、Ｒ４は、ベンジルであり得る。例えば、Ｒ４は、４−メトキシベンジルであり得る。
【０７３３】
いくつかの実施形態では、Ｒ４は、Ｃ３−６炭素環である。いくつかの実施形態では、Ｒ４は、Ｃ３−６シクロアルキルである。例えば、Ｒ４は、例えば、ＯＨ、ハロ、Ｃ１−６アルキルなどで任意選択で置換されたシクロヘキシルであり得る。例えば、Ｒ４は、２−ヒドロキシシクロヘキシルであり得る。
【０７３４】
いくつかの実施形態では、Ｒは、Ｈである。
【０７３５】
いくつかの実施形態では、Ｒは、非置換Ｃ１−３アルキルまたは非置換Ｃ２−３アルケニルである。例えば、Ｒ４は、−ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３または−ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＣＨ３であり得る。
【０７３６】
いくつかの実施形態では、Ｒは、置換されたＣ１−３アルキル、例えば、ＣＨ２ＯＨである。例えば、Ｒ４は、−ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＯＨであり得る。
【０７３７】
いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になってヘテロ環または炭素環を形成する。いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、Ｎ、Ｏ、Ｓ、及びＰから選択される１つまたは複数のヘテロ原子を有する５〜１４員の芳香族または非芳香族ヘテロ環を形成する。いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、芳香族または非芳香族のいずれかである、任意選択で置換されたＣ３−２０炭素環（例えば、Ｃ３−１８炭素環、Ｃ３−１５炭素環、Ｃ３−１２炭素環、またはＣ３−１０炭素環）を形成する。いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になってＣ３−６炭素環を形成する。他の実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、シクロヘキシル基またはフェニル基などのＣ６炭素環を形成する。ある特定の実施形態では、ヘテロ環またはＣ３−６炭素環は、１つまたは複数のアルキル基で置換される（例えば、同じ環原子または隣接環原子もしくは非隣接環原子において）。例えば、Ｒ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、１つまたは複数のＣ５アルキル置換を有するシクロヘキシル基またはフェニル基を形成し得る。ある特定の実施形態では、Ｒ２及びＲ３によって形成されるヘテロ環またはＣ３−６炭素環は、炭素環基で置換される。例えば、Ｒ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、シクロヘキシルで置換されたシクロヘキシル基またはフェニル基を形成し得る。いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、シクロヘプチル基、シクロペンタデカニル基、またはナフチル基などのＣ７−１５炭素環を形成する。
【０７３８】
いくつかの実施形態では、Ｒ４は、−（ＣＨ２）ｎＱ及び−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲから選択される。いくつかの実施形態では、Ｑは、−ＯＲ、−ＯＨ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＮ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）、及びヘテロ環からなる群から選択される。他の実施形態では、Ｑは、イミダゾール、ピリミジン、及びプリンからなる群から選択される。
【０７３９】
いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になってヘテロ環または炭素環を形成する。いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、フェニル基などのＣ３−６炭素環を形成する。ある特定の実施形態では、ヘテロ環またはＣ３−６炭素環は、１つまたは複数のアルキル基で置換される（例えば、同じ環原子または隣接環原子もしくは非隣接環原子において）。例えば、Ｒ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、１つまたは複数のＣ５アルキル置換を有するフェニル基を形成し得る。
【０７４０】
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、もしくは（ＩＩｅ）の化合物：
【化１１】
2020506189.tif 000019
またはその塩もしくは異性体（式中、Ｒ４は、上記のとおりである）を含む。
【０７４１】
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、式（ＩＩｄ）の化合物：
【化１２】
2020506189.tif 000020
またはその塩もしくは異性体（式中、ｎは、２、３、または４であり、ｍ、Ｒ’、Ｒ”、及びＲ２〜Ｒ６は、上に定義するとおりである）を含む。例えば、Ｒ２及びＲ３のそれぞれは、Ｃ５−１４アルキル及びＣ５−１４アルケニルからなる群から独立して選択され得る。
【０７４２】
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物の本開示の医薬組成物は、
【化１３】
2020506189.tif 000021
【化１４】
2020506189.tif 000022
【化１５】
2020506189.tif 000023
【化１６】
2020506189.tif 000024
【化１７】
2020506189.tif 000025
【化１８】
2020506189.tif 000026
【化１９】
2020506189.tif 000027
【化２０】
2020506189.tif 000028
【化２１】
2020506189.tif 000029
【化２２】
2020506189.tif 000030
【化２３】
2020506189.tif 000031
【化２４】
2020506189.tif 000032
【化２５】
2020506189.tif 000033
【化２６】
2020506189.tif 000034
【化２７】
2020506189.tif 000035
【化２８】
2020506189.tif 000036
【化２９】
2020506189.tif 000037
【化３０】
2020506189.tif 000038
【化３１】
2020506189.tif 000039
【化３２】
2020506189.tif 000040
【化３３】
2020506189.tif 000041
【化３４】
2020506189.tif 000042
【化３５】
2020506189.tif 000043
【化３６】
2020506189.tif 000044
【化３７】
2020506189.tif 000045
【化３８】
2020506189.tif 000046
【化３９】
2020506189.tif 000047
【化４０】
2020506189.tif 000048
【化４１】
2020506189.tif 000049
【化４２】
2020506189.tif 000050
【化４３】
2020506189.tif 000051
【化４４】
2020506189.tif 000052
【化４５】
2020506189.tif 000053
【化４６】
2020506189.tif 000054
及びその塩または立体異性体からなる群から選択される。
【０７４３】
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、次の化合物：
【化４７】
2020506189.tif 000055
またはその塩もしくは立体異性体を含む。
【０７４４】
他の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、化合物１〜化合物１４７、またはその塩もしくは立体異性体からなる群から選択される。
【０７４５】
いくつかの実施形態では、中央のピペラジン部分を含むイオン化可能な脂質が提供される。本明細書に記載の脂質は、哺乳類の細胞または器官に治療剤及び／または予防剤を送達するための脂質ナノ粒子組成物に有利に使用することができる。例えば、本明細書に記載の脂質は、免疫原性がほとんどないか、まったくない。例えば、本明細書に開示の脂質化合物は、参照脂質（例えば、ＭＣ３、ＫＣ２、またはＤＬｉｎＤＭＡ）と比較して、より低い免疫原性を有する。例えば、本明細書に開示の脂質及び治療剤または予防剤を含む製剤は、参照脂質（例えば、ＭＣ３、ＫＣ２、またはＤＬｉｎＤＭＡ）及び同じ治療剤または予防剤を含む対応する製剤と比較して、治療指数が上昇する。
【０７４６】
いくつかの実施形態では、送達剤は、式（ＩＩＩ）を有する脂質化合物
【化４８】
2020506189.tif 000056
またはその塩もしくは立体異性体（式中、
環Ａは、
【化４９】
2020506189.tif 000057
であり、
ｔは、１または２であり、
Ａ１及びＡ２は、ＣＨまたはＮからそれぞれ独立して選択され、
Ｚは、ＣＨ２または非存在であり、ＺがＣＨ２であるとき、破線（１）及び（２）はそれぞれ単結合を表し、Ｚが非存在であるとき、破線（１）及び（２）は両方とも非存在であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、Ｃ５−２０アルキル、Ｃ５−２０アルケニル、−Ｒ”ＭＲ’、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から独立して選択され、
Ｍはそれぞれ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、アリール基、及びヘテロアリール基からなる群から独立して選択され、
Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３は、単結合、−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２−、−ＣＨＲ−、−ＣＨＹ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ＣＨ２−、−ＯＣ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＣＨ２−ＯＣ（Ｏ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｃ（Ｓ）−、及び−ＣＨ（ＳＨ）−からなる群から独立して選択され、
Ｙはそれぞれ、独立してＣ３−６炭素環であり、
Ｒ＊はそれぞれ、Ｃ１−１２アルキル及びＣ２−１２アルケニルからなる群から独立して選択され、
Ｒはそれぞれ、Ｃ１−３アルキル及びＣ３−６炭素環からなる群から独立して選択され、
Ｒ’はそれぞれ、Ｃ１−１２アルキル、Ｃ２−１２アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｒ”はそれぞれ、Ｃ３−１２アルキル及びＣ３−１２アルケニルからなる群から独立して選択され、
環Ａが
【化５０】
2020506189.tif 000058
であるとき、
ｉ）Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３のうちの少なくとも１つは、−ＣＨ２−ではなく、及び／または
ｉｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも１つは、−Ｒ”ＭＲ’である）を含む。
【０７４７】
いくつかの実施形態では、化合物は、式（ＩＩＩａ１）〜（ＩＩＩａ６）：
【化５１】
2020506189.tif 000059
のいずれかのものである。
【０７４８】
式（ＩＩＩ）または（ＩＩＩａ１）〜（ＩＩＩａ６）のいずれかの化合物は、該当する場合、以下の特徴のうちの１つまたは複数を含む。
【０７４９】
いくつかの実施形態では、環Ａは、
【化５２】
2020506189.tif 000060
である。
【０７５０】
いくつかの実施形態では、環Ａは、
【化５３】
2020506189.tif 000061
である。
【０７５１】
いくつかの実施形態では、環Ａは、
【化５４】
2020506189.tif 000062
である。
【０７５２】
いくつかの実施形態では、環Ａは、
【化５５】
2020506189.tif 000063
である。
【０７５３】
いくつかの実施形態では、環Ａは、
【化５６】
2020506189.tif 000064
である。
【０７５４】
いくつかの実施形態では、環Ａは、
【化５７】
2020506189.tif 000065
であり、環中のＮ原子は、Ｘ２に接続している。
【０７５５】
いくつかの実施形態では、Ｚは、ＣＨ２である。
【０７５６】
いくつかの実施形態では、Ｚは、非存在である。
【０７５７】
いくつかの実施形態では、Ａ１及びＡ２のうちの少なくとも１つは、Ｎである。
【０７５８】
いくつかの実施形態では、Ａ１及びＡ２のそれぞれは、Ｎである。
【０７５９】
いくつかの実施形態では、Ａ１及びＡ２のそれぞれは、ＣＨである。
【０７６０】
いくつかの実施形態では、Ａ１はＮであり、Ａ２はＣＨである。
【０７６１】
いくつかの実施形態では、Ａ１はＣＨであり、Ａ２はＮである。
【０７６２】
いくつかの実施形態では、Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３のうちの少なくとも１つは、−ＣＨ２−ではない。例えば、ある特定の実施形態では、Ｘ１は、−ＣＨ２−ではない。いくつかの実施形態では、Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３のうちの少なくとも１つは、−Ｃ（Ｏ）−である。
【０７６３】
いくつかの実施形態では、Ｘ２は、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ＣＨ２−、−ＯＣ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、または−ＣＨ２−ＯＣ（Ｏ）−である。
【０７６４】
いくつかの実施形態では、Ｘ３は、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ＣＨ２−、−ＯＣ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、または−ＣＨ２−ＯＣ（Ｏ）−である。他の実施形態では、Ｘ３は、−ＣＨ２−である。
【０７６５】
いくつかの実施形態では、Ｘ３は、単結合または−（ＣＨ２）２−である。
【０７６６】
いくつかの実施形態では、Ｒ１及びＲ２は、同じである。ある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、同じである。いくつかの実施形態では、Ｒ４及びＲ５は、同じである。ある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、同じである。
【０７６７】
いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも１つは、−Ｒ”ＭＲ’である。いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの多くても１つが、−Ｒ”ＭＲ’である。例えば、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３のうちの少なくとも１つは、−Ｒ”ＭＲ’であり得、及び／またはＲ４及びＲ５のうち少なくとも１つは、−Ｒ”ＭＲ’である。ある特定の実施形態では、少なくとも１つのＭは、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−である。いくつかの実施形態では、Ｍはそれぞれ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＭは、−ＯＣ（Ｏ）−である。いくつかの実施形態では、Ｍはそれぞれ−ＯＣ（Ｏ）−である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＭは、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−である。いくつかの実施形態では、Ｍはそれぞれ−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲ”は、Ｃ３アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ”はそれぞれＣ３アルキルである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲ”は、Ｃ５アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ”はそれぞれＣ５アルキルである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲ”は、Ｃ６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ”はそれぞれＣ６アルキルである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲ”は、Ｃ７アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ”はそれぞれＣ７アルキルである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲ’は、Ｃ５アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ’はそれぞれＣ５アルキルである。他の実施形態では、少なくとも１つのＲ’は、Ｃ１アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ’はそれぞれＣ１アルキルである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲ’は、Ｃ２アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ’はそれぞれＣ２アルキルである。
【０７６８】
いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも１つは、Ｃ１２アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のそれぞれは、Ｃ１２アルキルである。
【０７６９】
ある特定の実施形態では、化合物は、
【化５８】
2020506189.tif 000066
【化５９】
2020506189.tif 000067
【化６０】
2020506189.tif 000068
【化６１】
2020506189.tif 000069
【化６２】
2020506189.tif 000070
【化６３】
2020506189.tif 000071
【化６４】
2020506189.tif 000072
【化６５】
2020506189.tif 000073
【化６６】
2020506189.tif 000074
【化６７】
2020506189.tif 000075
【化６８】
2020506189.tif 000076
【化６９】
2020506189.tif 000077
からなる群から選択される。
【０７７０】
いくつかの実施形態では、送達剤は、化合物２３６を含む。
【０７７１】
いくつかの実施形態では、送達剤は、式（ＩＶ）を有する化合物
【化７０】
2020506189.tif 000078
またはその塩もしくは立体異性体（式中、
Ａ１及びＡ２は、ＣＨまたはＮからそれぞれ独立して選択され、Ａ１及びＡ２のうちの少なくとも１つは、Ｎであり、
Ｚは、ＣＨ２または非存在であり、ＺがＣＨ２であるとき、破線（１）及び（２）はそれぞれ単結合を表し、Ｚが非存在であるとき、破線（１）及び（２）は両方とも非存在であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、Ｃ６−２０アルキル及びＣ６−２０アルケニルからなる群から独立して選択され、
環Ａが
【化７１】
2020506189.tif 000079
であるとき、
ｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、同じであり、ここで、Ｒ１は、Ｃ１２アルキル、Ｃ１８アルキル、もしくはＣ１８アルケニルではなく、
ｉｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの１つのみがＣ６−２０アルケニルから選択され、
ｉｉｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも１つは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの他の少なくとも１つとは異なる数の炭素原子を有し、
ｉｖ）Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、Ｃ６−２０アルケニルから選択され、Ｒ４及びＲ５は、Ｃ６−２０アルキルから選択され、または、
ｖ）Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、Ｃ６−２０アルキルから選択され、Ｒ４及びＲ５は、Ｃ６−２０アルケニルから選択される）を含む。
【０７７２】
いくつかの実施形態では、化合物は、式（ＩＶａ）の化合物：
【化７２】
2020506189.tif 000080
のものである。
【０７７３】
式（ＩＶ）または（ＩＶａ）の化合物は、該当する場合、以下の特徴のうちの１つまたは複数を含む。
【０７７４】
いくつかの実施形態では、Ｚは、ＣＨ２である。
【０７７５】
いくつかの実施形態では、Ｚは、非存在である。
【０７７６】
いくつかの実施形態では、Ａ１及びＡ２のうちの少なくとも１つは、Ｎである。
【０７７７】
いくつかの実施形態では、Ａ１及びＡ２のそれぞれは、Ｎである。
【０７７８】
いくつかの実施形態では、Ａ１及びＡ２のそれぞれは、ＣＨである。
【０７７９】
いくつかの実施形態では、Ａ１はＮであり、Ａ２はＣＨである。
【０７８０】
いくつかの実施形態では、Ａ１はＣＨであり、Ａ２はＮである。
【０７８１】
いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、同じであり、Ｃ１２アルキル、Ｃ１８アルキル、またはＣ１８アルケニルではない。いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、同じであり、Ｃ９アルキルまたはＣ１４アルキルである。
【０７８２】
いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの１つのみがＣ６−２０アルケニルから選択される。ある特定のそのような実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、同じ数の炭素原子を有する。いくつかの実施形態では、Ｒ４は、Ｃ５−２０アルケニルから選択される。例えば、Ｒ４は、Ｃ１２アルケニルまたはＣ１８アルケニルであり得る。
【０７８３】
いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも１つは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの他の少なくとも１つとは異なる数の炭素原子を有する。
【０７８４】
ある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、Ｃ６−２０アルケニルから選択され、Ｒ４及びＲ５は、Ｃ６−２０アルキルから選択される。他の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、Ｃ６−２０アルキルから選択され、Ｒ４及びＲ５は、Ｃ６−２０アルケニルから選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、同じ数の炭素原子を有し、及び／またはＲ４及びＲ５は、同じ数の炭素原子を有する。例えば、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３、またはＲ４及びＲ５は、６、８、９、１２、１４、または１８個の炭素原子を有し得る。いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３、またはＲ４及びＲ５は、Ｃ１８アルケニル（例えば、リノレイル）である。いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３、またはＲ４及びＲ５は、６、８、９、１２、または１４個の炭素原子を含むアルキル基である。
【０７８５】
いくつかの実施形態では、Ｒ１は、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５とは異なる数の炭素原子を有する。他の実施形態では、Ｒ３は、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、及びＲ５とは異なる数の炭素原子を有する。さらなる実施形態では、Ｒ４は、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ５とは異なる数の炭素原子を有する。
【０７８６】
いくつかの実施形態では、化合物は、
【化７３】
2020506189.tif 000081
【化７４】
2020506189.tif 000082
【化７５】
2020506189.tif 000083
からなる群から選択される。
【０７８７】
他の実施形態では、送達剤は、式（Ｖ）を有する化合物：
【化７６】
2020506189.tif 000084
またはその塩もしくは立体異性体（式中、
Ａ３は、ＣＨまたはＮであり、
Ａ４は、ＣＨ２またはＮＨであり、Ａ３及びＡ４のうちの少なくとも１つは、ＮまたはＮＨであり、
Ｚは、ＣＨ２または非存在であり、ＺがＣＨ２であるとき、破線（１）及び（２）はそれぞれ単結合を表し、Ｚが非存在であるとき、破線（１）及び（２）は両方とも非存在であり、
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、Ｃ５−２０アルキル、Ｃ５−２０アルケニル、−Ｒ”ＭＲ’、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から独立して選択され、
Ｍはそれぞれ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、アリ−ル基、及びヘテロアリ−ル基から独立して選択され、
Ｘ１及びＸ２は、−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２−、−ＣＨＲ−、−ＣＨＹ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ＣＨ２−、−ＯＣ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＣＨ２−ＯＣ（Ｏ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｃ（Ｓ）−、及び−ＣＨ（ＳＨ）−からなる群から独立して選択され、
Ｙはそれぞれ、独立してＣ３−６炭素環であり、
Ｒ＊はそれぞれ、Ｃ１−１２アルキル及びＣ２−１２アルケニルからなる群から独立して選択され、
Ｒはそれぞれ、Ｃ１−３アルキル及びＣ３−６炭素環からなる群から独立して選択され、
Ｒ’はそれぞれ、Ｃ１−１２アルキル、Ｃ２−１２アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｒ”はそれぞれ、Ｃ３−１２アルキル及びＣ３−１２アルケニルからなる群から独立して選択される）を含む。
【０７８８】
いくつかの実施形態では、化合物は、式（Ｖａ）の化合物：
【化７７】
2020506189.tif 000085
のものである。
【０７８９】
式（Ｖ）または（Ｖａ）の化合物は、該当する場合、以下の特徴のうちの１つまたは複数を含む。
【０７９０】
いくつかの実施形態では、Ｚは、ＣＨ２である。
【０７９１】
いくつかの実施形態では、Ｚは、非存在である。
【０７９２】
いくつかの実施形態では、Ａ３及びＡ４のうちの少なくとも１つは、ＮまたはＮＨである。
【０７９３】
いくつかの実施形態では、Ａ３はＮであり、Ａ４はＮＨである。
【０７９４】
いくつかの実施形態では、Ａ３はＮであり、Ａ４はＣＨ２である。
【０７９５】
いくつかの実施形態では、Ａ３はＣＨであり、Ａ４はＮＨである。
【０７９６】
いくつかの実施形態では、Ｘ１及びＸ２のうちの少なくとも１つは、−ＣＨ２−ではない。例えば、ある特定の実施形態では、Ｘ１は、−ＣＨ２−ではない。いくつかの実施形態では、Ｘ１及びＸ２のうちの少なくとも１つは、−Ｃ（Ｏ）−である。
【０７９７】
いくつかの実施形態では、Ｘ２は、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ＣＨ２−、−ＯＣ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、または−ＣＨ２−ＯＣ（Ｏ）−である。
【０７９８】
いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、Ｃ５−２０アルキル及びＣ５−２０アルケニルからなる群から独立して選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、同じである。ある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、Ｃ６、Ｃ９、Ｃ１２、またはＣ１４アルキルである。他の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、Ｃ１８アルケニルである。例えば、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、リノレイルであってよい。
【０７９９】
いくつかの実施形態では、化合物は、
【化７８】
2020506189.tif 000086
からなる群から選択される。
【０８００】
他の実施形態では、送達剤は、式（ＶＩ）を有する化合物：
【化７９】
2020506189.tif 000087
またはその塩もしくは立体異性体（式中、
Ａ６及びＡ７は、ＣＨまたはＮからそれぞれ独立して選択され、ここで、Ａ６及びＡ７のうちの少なくとも１つはＮであり、
Ｚは、ＣＨ２または非存在であり、ＺがＣＨ２であるとき、破線（１）及び（２）はそれぞれ単結合を表し、Ｚが非存在であるとき、破線（１）及び（２）は両方とも非存在であり、
Ｘ４及びＸ５は、−ＣＨ２−、−ＣＨ２）２−、−ＣＨＲ−、−ＣＨＹ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ＣＨ２−、−ＯＣ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＣＨ２−ＯＣ（Ｏ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｃ（Ｓ）−、及び−ＣＨ（ＳＨ）−からなる群から独立して選択され、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５はそれぞれ、Ｃ５−２０アルキル、Ｃ５−２０アルケニル、−Ｒ”ＭＲ’、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から独立して選択され、
Ｍはそれぞれ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、アリ−ル基、及びヘテロアリ−ル基からなる群から独立して選択され、
Ｙはそれぞれ、独立してＣ３−６炭素環であり、
Ｒ＊はそれぞれ、Ｃ１−１２アルキル及びＣ２−１２アルケニルからなる群から独立して選択され、
Ｒはそれぞれ、Ｃ１−３アルキル及びＣ３−６炭素環からなる群から独立して選択され、
Ｒ’はそれぞれ、Ｃ１−１２アルキル、Ｃ２−１２アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｒ”はそれぞれ、Ｃ３−１２アルキル及びＣ３−１２アルケニルからなる群から独立して選択される）を含む。
【０８０１】
いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５はそれぞれ、Ｃ６−２０アルキル及びＣ６−２０アルケニルからなる群から独立して選択される。
【０８０２】
いくつかの実施形態では、Ｒ１及びＲ２は、同じである。ある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、同じである。いくつかの実施形態では、Ｒ４及びＲ５は、同じである。ある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、同じである。
【０８０３】
いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも１つは、Ｃ９−１２アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のそれぞれは、独立して、Ｃ９、Ｃ１２またはＣ１４アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のそれぞれは、Ｃ９アルキルである。
【０８０４】
いくつかの実施形態では、Ａ６はＮであり、Ａ７はＮである。いくつかの実施形態では、Ａ６はＣＨであり、Ａ７はＮである。
【０８０５】
いくつかの実施形態では、Ｘ４は−ＣＨ２−であり、Ｘ５は−Ｃ（Ｏ）−である。いくつかの実施形態では、Ｘ４及びＸ５は、−Ｃ（Ｏ）−である。
【０８０６】
いくつかの実施形態では、Ａ６がＮであり、Ａ７がＮであるとき、Ｘ４及びＸ５のうちの少なくとも１つは、−ＣＨ２−ではなく、例えば、Ｘ４及びＸ５のうちの少なくとも１つは、−Ｃ（Ｏ）−である。いくつかの実施形態では、Ａ６がＮであり、Ａ７がＮであるとき、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも１つは、−Ｒ”ＭＲ’である。
【０８０７】
いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも１つは、−Ｒ”ＭＲ’ではない。
【０８０８】
いくつかの実施形態では、化合物は、
【化８０】
2020506189.tif 000088
である。
【０８０９】
他の実施形態では、送達剤は、次式を有する化合物：
【化８１】
2020506189.tif 000089
を含む。
【０８１０】
本明細書に開示の脂質化合物のアミン部分は、ある特定の条件下でプロトン化することができる。例えば、式（Ｉ）による脂質の中央のアミン部分は、典型的に、アミノ部分のｐＫａを下回るｐＨでプロトン化し（すなわち、正電荷を有し）、ｐＫａを上回るｐＨでは実質的に帯電しない。そのような脂質は、イオン化可能なアミノ脂質と称され得る。
【０８１１】
具体的な１つの実施形態では、イオン化可能なアミノ脂質は、化合物１８である。別の実施形態では、イオン化可能なアミノ脂質は、化合物２３６である。
【０８１２】
いくつかの実施形態では、イオン化可能なアミノ脂質、例えば、式（Ｉ）の化合物の量は、脂質組成物中、約１モル％〜９９モル％の範囲である。
【０８１３】
１つの実施形態では、イオン化可能なアミノ脂質、例えば、式（Ｉ）の化合物の量は、脂質組成物中、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９モル％である。
【０８１４】
１つの実施形態では、イオン化可能なアミノ脂質、例えば、式（Ｉ）の化合物の量は、脂質組成物中、約３０モル％〜約７０モル％、約３５モル％〜約６５モル％、約４０モル％〜約６０モル％、及び約４５モル％〜約５５モル％の範囲である。
【０８１５】
具体的な１つの実施形態では、イオン化可能なアミノ脂質、例えば、式（Ｉ）の化合物の量は、脂質組成物中、約５０モル％である。
【０８１６】
本明細書に開示のイオン化可能なアミノ脂質、例えば、式（Ｉ）の化合物に加えて、本明細書に開示の医薬組成物の脂質組成物は、リン脂質、構造脂質、ＰＥＧ脂質、及びこれらの任意の組み合わせなどの追加成分を含み得る。
【０８１７】
リン脂質
本明細書に開示の医薬組成物の脂質組成物は、１つまたは複数のリン脂質、例えば、１つまたは複数の飽和もしくは（ポリ）不飽和リン脂質またはそれらの組み合わせを含み得る。一般に、リン脂質は、１つのリン脂質部分及び１つまたは複数の脂肪酸部分を含む。
【０８１８】
リン脂質部分は、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、２−リゾホスファチジルコリン、及びスフィンゴミエリンからなる非限定的な群から選択することができる。
【０８１９】
脂肪酸部分は、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、ミリストレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、α−リノレン酸、エルカ酸、フィタン酸、アラキジン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ベヘン酸、ドコサペンタエン酸、及びドコサヘキサエン酸からなる非限定的な群から選択することができる。
【０８２０】
特定のリン脂質は、膜への融合を促進することができる。例えば、カチオン性リン脂質は、膜（例えば、細胞膜または細胞内膜）の１つまたは複数の負電荷を帯びたリン脂質と相互作用することができる。リン脂質の膜への融合は、脂質含有組成物（例えば、ＬＮＰ）の１つまたは複数の要素（例えば、治療剤）が膜を通過するのを可能にし、例えば、１つまたは複数の要素の標的組織への送達を可能にする。
【０８２１】
分岐、酸化、環化、及びアルキンを含む修飾及び置換を有する天然種を含む、非天然リン脂質種もまた企図される。例えば、リン脂質は、１つまたは複数のアルキン（例えば、１つまたは複数の二重結合が三重結合によって置き換えられているアルケニル基）で官能化されてもよいし、１つまたは複数のアルキンに架橋されてもよい。アルキン基は、適切な反応条件下で、アジドに曝されると、銅触媒による付加環化を受け得る。そのような反応は、ナノ粒子組成物の脂質二重層を官能化して膜透過もしくは細胞認識を促進すること、またはナノ粒子組成物を標的化部分もしくはイメージング部分（例えば、色素）などの有用な成分に結合させることに有用であり得る。
【０８２２】
リン脂質には、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジグリセロール、及びホスファチジン酸などのグリセロリン脂質が含まれるが、これらに限定されない。リン脂質はまた、スフィンゴミエリンなどのスフィンゴリン脂質も含み得る。
【０８２３】
リン脂質の例には、次のものが挙げられるが、これらに限定されない。
【化８２】
2020506189.tif 000090
【化８３】
2020506189.tif 000091
【０８２４】
ある特定の実施形態では、本発明に有用なまたは潜在的に有用であるリン脂質は、ＤＳＰＣの類似体またはバリアントである。ある特定の実施形態では、本発明に有用なまたは潜在的に有用であるリン脂質は、式（ＩＸ）の化合物：
【化８４】
2020506189.tif 000092
またはその塩（式中、
Ｒ１はそれぞれ、独立して、任意選択で置換されたアルキルであり、または任意選択で２つのＲ１は、介在する原子と一緒になって、任意選択で置換された単環式カルボシクリルもしくは任意選択で置換された単環式ヘテロシクリルを形成し、または任意選択で３つのＲ１は、介在する原子と一緒になって、任意選択で置換された二環式カルボシクリルもしくは任意選択で置換された二環式ヘテロシクリルを形成し、
ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
ｍは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
Ａは、式：
【化８５】
2020506189.tif 000093
からなり、
Ｌ２はぞれぞれの場合において、独立して、単結合または任意選択で置換されたＣ１−６アルキレンであり、ここで、任意選択で置換されたＣ１−６アルキレンの１つのメチレン単位は、任意選択で−Ｏ−、−Ｎ（ＲＮ）−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ−、または−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−で置き換えられ、
Ｒ２はぞれぞれの場合において、独立して、任意選択で置換されたＣ１−３０アルキル、任意選択で置換されたＣ１−３０アルケニル、または任意選択で置換されたＣ１−３０アルキニルであり、ここで、任意選択で、Ｒ２の１つまたは複数のメチレン単位は、任意選択で置換されたカルボシクリレン、任意選択で置換されたヘテロシクリレン、任意選択で置換されたアリーレン、任意選択で置換されたヘテロアリーレン、−Ｎ（ＲＮ）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｏ）−、−Ｃ（＝ＮＲＮ）−、−Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｓ）−、−ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＯＳ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）２Ｏ−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）−、−ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）−、または−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏ−で独立して置き換えられ、
ＲＮはぞれぞれの場合において、独立して、水素、任意選択で置換されたアルキル、または窒素保護基であり、
環Ｂは、任意選択で置換されたカルボシクリル、任意選択で置換されたヘテロシクリル、任意選択で置換されたアリール、または任意選択で置換されたヘテロアリールであり、
ｐは、１または２であり、
ただし、化合物は、次式：
【化８６】
2020506189.tif 000094
のものではなく、
ここで、Ｒ２はぞれぞれの場合において、独立して、非置換アルキル、非置換アルケニル、または非置換アルキニルである）である。
【０８２５】
ｉ）リン脂質頭部の修飾
ある特定の実施形態では、本発明に有用なまたは潜在的に有用であるリン脂質は、修飾されたリン脂質頭部（例えば、修飾されたコリン基）を含む。ある特定の実施形態では、修飾された頭部を有するリン脂質は、修飾された四級アミンを有するＤＳＰＣ、またはその類似体である。例えば、式（ＩＸ）の実施形態では、Ｒ１のうちの少なくとも１つは、メチルではない。ある特定の実施形態では、Ｒ１のうちの少なくとも１つは、水素でもメチルでもない。ある特定の実施形態では、式（ＩＸ）の化合物は、次式：
【化８７】
2020506189.tif 000095
またはその塩（式中、
ｔはそれぞれ、独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
ｕはそれぞれ、独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
ｖはそれぞれ、独立して、１、２、または３である）のうちの１つのものである。
【０８２６】
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ）の化合物は、次式：
【化８８】
2020506189.tif 000096
またはその塩のうちの１つのものである。
【０８２７】
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ）の化合物は、次のうちの１つである。
【化８９】
2020506189.tif 000097
【化９０】
2020506189.tif 000098
またはその塩のうちの１つである。
【０８２８】
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ）の化合物は、式（ＩＸ−ａ）：
【化９１】
2020506189.tif 000099
またはその塩のものである。
【０８２９】
ある特定の実施形態では、本発明に有用なまたは潜在的に有用であるリン脂質は、修飾されたコアを含む。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の修飾されたコアを有するリン脂質は、修飾されたコア構造を有するＤＳＰＣ、またはその類似体である。例えば、式（ＩＸ−ａ）のある特定の実施形態では、基Ａは、次式：
【化９２】
2020506189.tif 000100
のものではない。
【０８３０】
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ−ａ）の化合物は、次式：
【化９３】
2020506189.tif 000101
またはその塩のうちの１つのものである。
【０８３１】
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ）の化合物は、次式：
【化９４】
2020506189.tif 000102
またはその塩のうちの１つである。
【０８３２】
ある特定の実施形態では、本発明に有用なまたは潜在的に有用であるリン脂質は、グリセリド部分の代わりに環式部分を含む。ある特定の実施形態では、本発明に有用なリン脂質は、グリセリド部分の代わりに環式部分を有するＤＳＰＣ、またはその類似体である。ある特定の実施形態では、式（ＩＸ）の化合物は、式（ＩＸ−ｂ）：
【化９５】
2020506189.tif 000103
またはその塩のものである。
【０８３３】
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ−ｂ）の化合物は、式（ＩＸ−ｂ−１）：
【化９６】
2020506189.tif 000104
またはその塩（式中、
ｗは、０、１、２または３である）のものである。
【０８３４】
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ−ｂ）の化合物は、式（ＩＸ−ｂ−２）：
【化９７】
2020506189.tif 000105
またはその塩のものである。
【０８３５】
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ−ｂ）の化合物は、式（ＩＸ−ｂ−３）：
【化９８】
2020506189.tif 000106
またはその塩のものであるからなる。
【０８３６】
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ−ｂ）の化合物は、式（ＩＸ−ｂ−４）：
【化９９】
2020506189.tif 000107
またはその塩のものであるからなる。
【０８３７】
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ−ｂ）の化合物は、次式：
【化１００】
2020506189.tif 000108
またはその塩のうちの１つである。
【０８３８】
（ｉｉ）リン脂質尾部の修飾
ある特定の実施形態では、本発明に有用なまたは潜在的に有用であるリン脂質は、修飾された尾部を含む。ある特定の実施形態では、本発明に有用なまたは潜在的に有用であるリン脂質は、修飾された尾部を有するＤＳＰＣ、またはその類似体である。本明細書に記載されるように、「修飾された尾部」は、短いもしくは長い脂肪族鎖、分岐が導入された脂肪族鎖、置換基が導入された脂肪族鎖、１つもしくは複数のメチレンが環式基もしくはヘテロ原子基によって置き換えられている脂肪族鎖、またはこれらの任意の組み合わせを有する尾部であってよい。例えば、ある特定の実施形態では、（ＩＸ）の化合物は、式（ＩＸ−ａ）、またはその塩（式中、Ｒ２の少なくとも１つの場合において、Ｒ２はそれぞれの場合において、任意選択で置換されたＣ１−３０アルキルであり、ここで、Ｒ２の１つまたは複数のメチレン単位は、任意選択で置換されたカルボシクリレン、任意選択で置換されたヘテロシクリレン、任意選択で置換されたアリーレン、任意選択で置換されたヘテロアリーレン、−Ｎ（ＲＮ）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｏ）−、−Ｃ（＝ＮＲＮ）−、−Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｓ）−、−ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＯＳ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）２Ｏ−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）−、−ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）−、または−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏ−で独立して置き換えられる）のものである。
【０８３９】
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ）の化合物は、式（ＩＸ−ｃ）：
【化１０１】
2020506189.tif 000109
またはその塩（式中、
ｘはそれぞれ、独立して、０以上３０以下の整数であり、
ここで、それぞれの場合において、Ｇは、任意選択で置換されたカルボシクリレン、任意選択で置換されたヘテロシクリレン、任意選択で置換されたアリーレン、任意選択で置換されたヘテロアリーレン、−Ｎ（ＲＮ）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｏ）−、−Ｃ（＝ＮＲＮ）−、−Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｓ）−、−ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＯＳ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）２Ｏ−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）−、−ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）−、または−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏ−からなる群から独立して選択される）のものである。それぞれの可能性が本発明の別個の実施形態を表す。
【０８４０】
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ−ｃ）の化合物は、式（ＩＸ−ｃ−１）：
【化１０２】
2020506189.tif 000110
またはその塩（式中、
ｖはぞれぞれの場合において、独立して、１、２、または３である）のものである。
【０８４１】
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ−ｃ）の化合物は、式（ＩＸ−ｃ−２）：
【化１０３】
2020506189.tif 000111
またはその塩のものである。
【０８４２】
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ−ｃ）の化合物は、次式：
【化１０４】
2020506189.tif 000112
またはその塩のものである。
【０８４３】
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ−ｃ）の化合物は、次式：
【化１０５】
2020506189.tif 000113
またはその塩である。
【０８４４】
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ−ｃ）の化合物は、式（ＩＸ−ｃ−３）：
【化１０６】
2020506189.tif 000114
またはその塩のものである。
【０８４５】
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ−ｃ）の化合物は、次式：
【化１０７】
2020506189.tif 000115
またはその塩のものである。
【０８４６】
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ−ｃ）の化合物は、次式：
【化１０８】
2020506189.tif 000116
またはその塩である。
【０８４７】
ある特定の実施形態では、本発明に有用なまたは潜在的に有用であるリン脂質は、修飾されたホスホコリン部分を含み、ここで、四級アミンをホスホリル基に連結するアルキル鎖は、エチレンではない（例えば、ｎは、２ではない）。したがって、ある特定の実施形態では、本発明に有用なまたは潜在的に有用であるリン脂質は、式（ＩＸ）の化合物（式中、ｎは、１、３、４、５、６、７、８、９、または１０である）である。例えば、ある特定の実施形態では、式（ＩＸ）の化合物は、次式：
【化１０９】
2020506189.tif 000117
またはその塩のうちの１つのものである。
【０８４８】
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ）の化合物は、次式：
【化１１０】
2020506189.tif 000118
【化１１１】
2020506189.tif 000119
またはその塩のうちの１つである。
【０８４９】
代替的な脂質
ある特定の実施形態では、本発明のリン脂質の代わりに、代替的な脂質が使用される。そのような代替的な脂質の非限定的な例には、次のものが挙げられる。
【化１１２】
2020506189.tif 000120
【０８５０】
構造脂質
本明細書に開示の医薬組成物の脂質組成物は、１つまたは複数の構造脂質を含み得る。本明細書で使用されるとき、「構造脂質」という用語は、ステロールを指し、また脂質含有ステロール部分も指す。
【０８５１】
脂質ナノ粒子に構造脂質を組み込むことは、粒子内における他の脂質の凝集を緩和するのに役立ち得る。構造脂質は、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、トマチン、ウルソル酸、α−トコフェロール、ホパノイド、フィトステロール、ステロイド、及びこれらの混合物を含むが、これらに限定されない群から選択することができる。いくつかの実施形態では、構造脂質は、ステロールである。本明細書で定義するように、「ステロール」は、ステロイドアルコールからなるステロイドのサブグループである。ある特定の実施形態では、構造脂質は、ステロイドである。ある特定の実施形態では、構造脂質は、コレステロールである。ある特定の実施形態では、構造脂質は、コレステロールの類似体である。ある特定の実施形態では、構造脂質は、α−トコフェロールである。構造脂質の例には、次のものが挙げられるが、これらに限定されない：
【化１１３】
2020506189.tif 000121
【０８５２】
１つの実施形態では、本明細書に開示の医薬組成物の脂質組成物中の構造脂質（例えば、コレステロールなどのステロール）の量は、約２０モル％〜約６０モル％、約２５モル％〜約５５モル％、約３０モル％〜約５０モル％、または約３５モル％〜約４５モル％の範囲である。
【０８５３】
１つの実施形態では、本明細書に開示の脂質組成物中の構造脂質（例えば、コレステロールなどのステロール）の量は、約２５モル％〜約３０モル％、約３０モル％〜約３５モル％、または約３５モル％〜約４０モル％の範囲である。
【０８５４】
１つの実施形態では、本明細書に開示の脂質組成物中の構造脂質（例えば、コレステロールなどのステロール）の量は、約２４モル％、約２９モル％、約３４モル％、または約３９モル％である。
【０８５５】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示の脂質組成物中の構造脂質（例えば、コレステロールなどのステロール）の量は、少なくとも約２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または６０モル％である。
【０８５６】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質
本明細書に開示の医薬組成物の脂質組成物は、１つまたは複数のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質を含み得る。
【０８５７】
本明細書で使用されるとき、「ＰＥＧ脂質」という用語は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で修飾された脂質を指す。ＰＥＧ脂質の非限定的な例には、ＰＥＧ修飾されたホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジン酸、ＰＥＧ−セラミド複合体（例えば、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４またはＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０）、ＰＥＧ修飾されたジアルキルアミン及びＰＥＧ修飾された１，２−ジアシルオキシプロパン−３−アミンが挙げられる。そのような脂質は、ＰＥＧ化脂質とも呼ばれる。例えば、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ、ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−ＤＬＰＥ、ＰＥＧ−ＤＭＰＥ、ＰＥＧ−ＤＰＰＣ、またはＰＥＧ−ＤＳＰＥ脂質であってよい。
【０８５８】
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質は、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロールメトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＤＭＧ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［アミノ（ポリエチレングリコール）］（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）、ＰＥＧ−ジステリルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＳＧ）、ＰＥＧ−ジパルメトレイル、ＰＥＧ−ジオレイル、ＰＥＧ−ジステアリル、ＰＥＧ−ジアシルグリカミド（ＰＥＧ−ＤＡＧ）、ＰＥＧ−ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＤＰＰＥ）、またはＰＥＧ−１，２−ジミリスチルオキシルプロピル−３−アミン（ＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡ）を含むが、これらに限定されない。
【０８５９】
１つの実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びこれらの混合物からなる群から選択される。
【０８６０】
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質の脂質部分は、約Ｃ１４〜約Ｃ２２、好ましくは、約Ｃ１４〜約Ｃ１６の長さを有する部分を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ部分、例えば、ｍＰＥＧ−ＮＨ２は、約１０００、２０００、５０００、１０，０００、１５，０００または２０，０００ダルトンのサイズを有する。１つの実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧである。
【０８６１】
１つの実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子は、非拡散性ＰＥＧであるＰＥＧ脂質を含み得る。非拡散性ＰＥＧの非限定的な例には、ＰＥＧ−ＤＳＧ及びＰＥＧ−ＤＳＰＥが挙げられる。
【０８６２】
ＰＥＧ脂質は、当該技術分野において知られており、米国特許第８１５８６０１号及び国際公開第ＷＯ２０１５／１３０５８４Ａ２号に記載のものなどがあり、これらの文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０８６３】
一般に、本明細書に記載のさまざまな式の他の脂質成分（例えば、ＰＥＧ脂質）のいくつかは、２０１６年１２月１０日出願の「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ」と題する国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０００１２９号に記載のとおりに合成され得、当該文献は、その全体が参照によって組み込まれる。
【０８６４】
脂質ナノ粒子組成物の脂質成分は、ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質などの、ポリエチレングリコールを含む１つまたは複数の分子を含み得る。そのような種は、代替的に、ＰＥＧ化脂質とも呼ばれ得る。ＰＥＧ脂質は、ポリエチレングリコールで修飾された脂質である。ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びこれらの混合物を含む非限定的な群から選択され得る。例えば、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ、ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−ＤＬＰＥ、ＰＥＧ−ＤＭＰＥ、ＰＥＧ−ＤＰＰＣ、またはＰＥＧ−ＤＳＰＥ脂質であり得る。
【０８６５】
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、ＰＥＧ  ＤＭＧの修飾形態である。ＰＥＧ−ＤＭＧは、次の構造を有する。
【化１１４】
2020506189.tif 000122
【０８６６】
１つの実施形態では、本発明に有用なＰＥＧ脂質は、国際公開第ＷＯ２０１２０９９７５５号に記載のＰＥＧ化脂質であってよく、当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。本明細書に記載のこれらの例示的なＰＥＧ脂質はいずれも、ＰＥＧ鎖上にヒドロキシル基を含むように修飾されてもよい。ある特定の実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ−ＯＨ脂質である。本明細書で概して定義するように、「ＰＥＧ−ＯＨ脂質」（本明細書において「ヒドロキシ−ＰＥＧ化脂質」とも称される）は、脂質上に１つまたは複数のヒドロキシル（−ＯＨ）基を有するＰＥＧ化脂質である。ある特定の実施形態では、ＰＥＧ−ＯＨ脂質は、ＰＥＧ鎖上に１つまたは複数のヒドロキシル基を含む。ある特定の実施形態では、ＰＥＧ−ＯＨまたはヒドロキシ−ＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ鎖の末端に−ＯＨ基を含む。それぞれの可能性が本発明の別個の実施形態を表す。
【０８６７】
ある特定の実施形態では、本発明に有用なＰＥＧ脂質は、式（ＶＩＩ）の化合物である。本明細書で提供されるのは、式（ＶＩＩ）の化合物：
【化１１５】
2020506189.tif 000123
またはその塩（式中、
Ｒ３は、−ＯＲＯであり、
ＲＯは、水素、任意選択で置換されたアルキル、または酸素保護基であり、
ｒは、１以上１００以下の整数であり、
Ｌ１は、任意選択で置換されたＣ１−１０アルキレンであり、ここで、任意選択で置換されたＣ１−１０アルキレンのうちの少なくとも１つのメチレンは、任意選択で置換されたカルボシクリレン、任意選択で置換されたヘテロシクリレン、任意選択で置換されたアリーレン、任意選択で置換されたヘテロアリーレン、Ｏ、Ｎ（ＲＮ）、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、−ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、またはＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）で独立して置き換えられ、
Ｄは、クリックケミストリーによって得られる部分または生理学的条件下で切断可能な部分であり、
ｍは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
Ａは、式：
【化１１６】
2020506189.tif 000124
からなり、
Ｌ２はぞれぞれの場合において、独立して、単結合または任意選択で置換されたＣ１−６アルキレンであり、ここで、任意選択で置換されたＣ１−６アルキレンの１つのメチレン単位は、Ｏ、Ｎ（ＲＮ）、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、またはＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）で任意選択で置き換えられ、
Ｒ２はぞれぞれの場合において、独立して、任意選択で置換されたＣ１−３０アルキル、任意選択で置換されたＣ１−３０アルケニル、または任意選択で置換されたＣ１−３０アルキニルであり、ここで、任意選択で、Ｒ２の１つまたは複数のメチレン単位は、任意選択で置換されたカルボシクリレン、任意選択で置換されたヘテロシクリレン、任意選択で置換されたアリーレン、任意選択で置換されたヘテロアリーレン、Ｎ（ＲＮ）、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）、−Ｃ（＝ＮＲＮ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、Ｓ（Ｏ）、ＯＳ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２Ｏ、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）、−Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ、Ｓ（Ｏ）２、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、またはＮ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏで独立して置き換えられ、
ＲＮはぞれぞれの場合において、独立して、水素、任意選択で置換されたアルキル、または窒素保護基であり、
環Ｂは、任意選択で置換されたカルボシクリル、任意選択で置換されたヘテロシクリル、任意選択で置換されたアリール、または任意選択で置換されたヘテロアリールであり、
ｐは、１または２である）である。
【０８６８】
ある特定の実施形態では、式（ＶＩＩ）の化合物は、ＰＥＧ−ＯＨ脂質である（すなわち、Ｒ３は、−ＯＲＯであり、ＲＯは、水素である）。ある特定の実施形態では、式（ＶＩＩ）の化合物は、式（ＶＩＩ−ＯＨ）：
【化１１７】
2020506189.tif 000125
またはその塩のものである。
【０８６９】
ある特定の実施形態では、Ｄは、クリックケミストリーによって得られる部分である（例えば、トリアゾール）。ある特定の実施形態では、式（ＶＩＩ）の化合物は、式（ＶＩＩ−ａ−１）または（ＶＩＩ−ａ−２）：
【化１１８】
2020506189.tif 000126
またはその塩のものである。
【０８７０】
ある特定の実施形態では、式（ＶＩＩ）の化合物は、次式：
【化１１９】
2020506189.tif 000127
またはその塩（式中、
ｓは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である）のうちの１つのものである。
【０８７１】
ある特定の実施形態では、式（ＶＩＩ）の化合物は、次式：
【化１２０】
2020506189.tif 000128
またはその塩のうちの１つのものである。
【０８７２】
ある特定の実施形態では、式（ＶＩＩ）の化合物は、次式：
【化１２１】
2020506189.tif 000129
またはその塩のうちの１つのものである。
【０８７３】
ある特定の実施形態では、式（ＶＩＩ）の化合物は、次式：
【化１２２】
2020506189.tif 000130
またはその塩のうちの１つのものである。
【０８７４】
ある特定の実施形態では、Ｄは、生理学的条件下で切断可能な部分である（例えば、エステル、アミド、カーボネート、カルバメート、ウレア）。ある特定の実施形態では、式（ＶＩＩ）の化合物は、式（ＶＩＩ−ｂ−１）または（ＶＩＩ−ｂ−２）：
【化１２３】
2020506189.tif 000131
またはその塩のものである。
【０８７５】
ある特定の実施形態では、式（ＶＩＩ）の化合物は、式（ＶＩＩ−ｂ−１−ＯＨ）または（ＶＩＩ−ｂ−２−ＯＨ）：
【化１２４】
2020506189.tif 000132
またはその塩のものである。
【０８７６】
ある特定の実施形態では、式（ＶＩＩ）の化合物は、次式：
【化１２５】
2020506189.tif 000133
またはその塩のうちの１つのものである。
【０８７７】
ある特定の実施形態では、式（ＶＩＩ）の化合物は、次式：
【化１２６】
2020506189.tif 000134
またはその塩のうちの１つのものである。
【０８７８】
ある特定の実施形態では、式（ＶＩＩ）の化合物は、次式
【化１２７】
2020506189.tif 000135
またはその塩のうちの１つのものである。
【０８７９】
ある特定の実施形態では、式（ＶＩＩ）の化合物は、次式：
【化１２８】
2020506189.tif 000136
またはその塩のうちの１つのものである。
【０８８０】
ある特定の実施形態では、本発明に有用なＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ化脂肪酸である。ある特定の実施形態では、本発明に有用なＰＥＧ脂質は、式（ＶＩＩＩ）の化合物である。本明細書で提供されるのは、式（ＶＩＩＩ）の化合物：
【化１２９】
2020506189.tif 000137
またはその塩（式中、
Ｒ３は、−ＯＲＯであり、
ＲＯは、水素、任意選択で置換されたアルキル、または酸素保護基であり、
ｒは、１以上１００以下の整数であり、
Ｒ５は、任意選択で置換されたＣ１０−４０アルキル、任意選択で置換されたＣ１０−４０アルケニル、または任意選択で置換されたＣ１０−４０アルキニルであり、任意選択で、Ｒ５の１つまたは複数のメチレン基は、任意選択で置換されたカルボシクリレン、任意選択で置換されたヘテロシクリレン、任意選択で置換されたアリーレン、任意選択で置換されたヘテロアリーレン、Ｎ（ＲＮ）、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、−Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、Ｓ（Ｏ）、ＯＳ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２、−Ｓ（Ｏ）２Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２Ｏ、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ、−Ｓ（Ｏ）２、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、またはＮ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏで置き換えられ、
ＲＮはぞれぞれの場合において、独立して、水素、任意選択で置換されたアルキル、または窒素保護基である）である。
【０８８１】
ある特定の実施形態では、式（ＶＩＩＩ）の化合物は、式（ＶＩＩＩ−ＯＨ）：
【化１３０】
2020506189.tif 000138
またはその塩のものである。いくつかの実施形態では、ｒは、４５である。さらに他の実施形態では、ｒは、１である。
【０８８２】
ある特定の実施形態では、式（ＶＩＩＩ）の化合物は、次式：
【化１３１】
2020506189.tif 000139
またはその塩のうちの１つのものである。いくつかの実施形態では、ｒは、４５である。
【０８８３】
さらに他の実施形態では、式（ＶＩＩＩ）の化合物は、
【化１３２】
2020506189.tif 000140
またはその塩である。
【０８８４】
１つの実施形態では、式（ＶＩＩＩ）の化合物は、
【化１３３】
2020506189.tif 000141
である。
【０８８５】
１つの実施形態では、本明細書に開示の医薬組成物の脂質組成物中のＰＥＧ脂質の量は、約０．１モル％〜約５モル％、約０．５モル％〜約５モル％、約１モル％〜約５モル％、約１．５モル％〜約５モル％、約２モル％〜約５モル％モル％、約０．１モル％〜約４モル％、約０．５モル％〜約４モル％、約１モル％〜約４モル％、約１．５モル％〜約４モル％、約２モル％〜約４モル％、約０．１モル％〜約３モル％、約０．５モル％〜約３モル％、約１モル％〜約３モル％、約１．５モル％〜約３モル％、約２モル％〜約３モル％、約０．１モル％〜約２モル％、約０．５モル％〜約２モル％、約１モル％〜約２モル％、約１．５モル％〜約２モル％、約０．１モル％〜約１．５モル％、約０．５モル％〜約１．５モル％、または約１モル％〜約１．５モル％の範囲である。
【０８８６】
１つの実施形態では、本明細書に開示の脂質組成物中のＰＥＧ脂質の量は、約２モル％である。１つの実施形態では、本明細書に開示の脂質組成物中のＰＥＧ脂質の量は、約１．５モル％である。
【０８８７】
１つの実施形態では、本明細書に開示の脂質組成物中のＰＥＧ脂質の量は、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、または５モル％である。
【０８８８】
いくつかの態様では、本明細書に開示の医薬組成物の脂質組成物は、ＰＥＧ脂質を含まない。
【０８８９】
他のイオン化可能なアミノ脂質
本明細書に開示の医薬組成物の脂質組成物は、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、または（ＶＩ）に従う脂質に加えて、またはこれに代えて、１つまたは複数のイオン化可能なアミノ脂質を含み得る。
【０８９０】
イオン化可能な脂質は、３−（ジドデシルアミノ）−Ｎ１，Ｎ１，４−トリドデシル−１−ピペラジンエタンアミン（ＫＬ１０）、Ｎ１−［２−（ジドデシルアミノ）エチル］−Ｎ１，Ｎ４，Ｎ４−トリドデシル−１，４−ピペラジンジエタンアミン（ＫＬ２２）、１４，２５−ジトリデシル−１５，１８，２１，２４−テトラアザ−オクタトリアコンタン（ＫＬ２５）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）、ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、（１３Ｚ，１６５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−ノニドコサ−１３−１６−ジエン−１−アミン（Ｌ６０８）、２−（｛８−［（３β）−コレスト−５−エン−３−イルオキシ］オクチル｝オキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−１−アミン（オクチル−ＣＬｉｎＤＭＡ）、（２Ｒ）−２−（｛８−［（３β）−コレスト−５−エン−３−イルオキシ］オクチル｝オキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−１−アミン（オクチル−ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｒ））、及び（２Ｓ）−２−（｛８−［（３β）−コレスト−５−エン−３−イルオキシ］オクチル｝オキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−１−アミン（オクチル−ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｓ））からなる非限定的な群から選択することができる。これらに加えて、イオン化可能なアミノ脂質は、環式アミン基を含む脂質であってもよい。
【０８９１】
イオン化可能な脂質はまた、国際公開第ＷＯ２０１７／０７５５３１Ａ１号に開示の化合物であり得、当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。例えば、イオン化可能なアミノ脂質は、限定するものではないが、
【化１３４】
2020506189.tif 000142
及びこれらの任意の組み合わせを含む。
【０８９２】
イオン化可能な脂質はまた、国際公開第ＷＯ２０１５／１９９９５２Ａ１号に開示の化合物であり得、当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。例えば、イオン化可能なアミノ脂質は、限定するものではないが、
【化１３５】
2020506189.tif 000143
【化１３６】
2020506189.tif 000144
及びこれらの任意の組み合わせを含む。
【０８９３】
ナノ粒子組成物
本明細書に開示の医薬組成物の脂質組成物は、上記のものに加えて、１つまたは複数の成分を含み得る。例えば、脂質組成物は、１つまたは複数の透過性エンハンサー分子、炭水化物、ポリマー、表面改質剤（例えば、界面活性剤）、または他の成分を含み得る。例えば、透過性エンハンサー分子は、米国特許出願公開第２００５／０２２２０６４号に記載されている分子であってよい。炭水化物は、単糖（例えば、グルコース）及び多糖（例えば、グリコーゲンならびにその誘導体及び類似体）を含み得る。
【０８９４】
本明細書に開示の医薬組成物を封入または部分的に封入するために、ポリマーを含めること及び／または使用することができる（例えば、脂質ナノ粒子形態の医薬組成物）。ポリマーは、生分解性及び／または生体適合性であり得る。ポリマーは、ポリアミン、ポリエーテル、ポリアミド、ポリエステル、ポリカーバメート、ポリ尿素、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリイミド、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリアセチレン、ポリエチレン、ポリエチレンイミン、ポリイソシアネート、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリロニトリル、及びポリアリレートから選択することができるが、これらに限定されない。
【０８９５】
脂質組成物とポリヌクレオチドの比の範囲は、約１０：１〜約６０：１（ｗｔ／ｗｔ）であり得る。
【０８９６】
いくつかの実施形態では、脂質組成物とポリヌクレオチドの比は、約１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０：１、３１：１、３２：１、３３：１、３４：１、３５：１、３６：１、３７：１、３８：１、３９：１、４０：１、４１：１、４２：１、４３：１、４４：１、４５：１、４６：１、４７：１、４８：１、４９：１、５０：１、５１：１、５２：１、５３：１、５４：１、５５：１、５６：１、５７：１、５８：１、５９：１または６０：１（ｗｔ／ｗｔ）であり得る。いくつかの実施形態では、脂質組成物と治療剤をコードするポリヌクレオチドとの重量／重量比は、約２０：１または約１５：１である。
【０８９７】
１つの実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子は、５：１、１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１、５５：１、６０：１もしくは７０：１の脂質：ポリヌクレオチド重量比、または限定するものではないが、５：１〜約１０：１、約５：１〜約１５：１、約５：１〜約２０：１、約５：１〜約２５：１、約５：１〜約３０：１、約５：１〜約３５：１、約５：１〜約４０：１、約５：１〜約４５：１、約５：１〜約５０：１、約５：１〜約５５：１、約５：１〜約６０：１、約５：１〜約７０：１、約１０：１〜約１５：１、約１０：１〜約２０：１、約１０：１〜約２５：１、約１０：１〜約３０：１、約１０：１〜約３５：１、約１０：１〜約４０：１、約１０：１〜約４５：１、約１０：１〜約５０：１、約１０：１〜約５５：１、約１０：１〜約６０：１、約１０：１〜約７０：１、約１５：１〜約２０：１、約１５：１〜約２５：１，約１５：１〜約３０：１、約１５：１〜約３５：１、約１５：１〜約４０：１、約１５：１〜約４５：１、約１５：１〜約５０：１、約１５：１〜約５５：１、約１５：１〜約６０：１もしくは約１５：１〜約７０：１などの範囲もしくはこれらの比のいずれかで、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）を含み得る。
【０８９８】
１つの実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子は、およそ０．１ｍｇ／ｍｌ〜２ｍｇ／ｍｌ、例えば、限定するものではないが、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、０．３ｍｇ／ｍｌ、０．４ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｇ／ｍｌ、０．７ｍｇ／ｍｌ、０．８ｍｇ／ｍｌ、０．９ｍｇ／ｍｌ、１．０ｍｇ／ｍｌ、１．１ｍｇ／ｍｌ、１．２ｍｇ／ｍｌ、１．３ｍｇ／ｍｌ、１．４ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ、１．６ｍｇ／ｍｌ、１．７ｍｇ／ｍｌ、１．８ｍｇ／ｍｌ、１．９ｍｇ／ｍｌ、２．０ｍｇ／ｍｌまたは２．０ｍｇ／ｍｌを超える濃度で、ポリヌクレオチドを含むことができる。
【０８９９】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示の医薬組成物は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）として製剤化される。したがって、本開示はまた、（ｉ）本明細書に記載の式（Ｉ）または（ＩＩＩ）の化合物などの送達剤を含む脂質組成物と、（ｉｉ）１つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、を含む、ナノ粒子組成物を提供する。そのようなナノ粒子組成物において、本明細書に開示の脂質組成物は、１つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを封入することができる。
【０９００】
ナノ粒子組成物は、典型的に、マイクロメートルまたはそれより小さいサイズであり、脂質二重層を含み得る。ナノ粒子組成物は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リポソーム（例えば、脂質ベシクル）、及びリポプレックスを包含する。例えば、ナノ粒子組成物は、直径が５００ｎｍ以下の脂質二重層を有するリポソームであり得る。
【０９０１】
ナノ粒子組成物は、例えば、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リポソーム、及びリポプレックスを含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、１つまたは複数の脂質二重層を含むベシクルである。ある特定の実施形態では、ナノ粒子組成物は、水性コンパートメントによって分離された２つ以上の同心円状二重層を含む。脂質二重層は、官能化されてもよいし、及び／または互いに架橋されてもよい。脂質二重層は、１つまたは複数のリガンド、タンパク質、またはチャネルを含み得る。
【０９０２】
いくつかの実施形態では、本開示のナノ粒子組成物は、式（Ｉ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、または（ＶＩ）に従う少なくとも１つの化合物を含む。例えば、ナノ粒子組成物は、化合物１〜１４７のうちの１つもしくは複数、または化合物１〜３４２のうちの１つもしくは複数を含み得る。ナノ粒子組成物はまた、さまざまな他の成分も含むことができる。例えば、ナノ粒子組成物は、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、または（ＶＩ）に従う脂質に加えて、（ｉ）少なくとも１つのリン脂質、（ｉｉ）少なくとも１つの構造脂質、（ｉｉｉ）少なくとも１つのＰＥＧ脂質、または（ｉｖ）これらの任意の組み合わせなどの１つまたは複数の他の脂質を含み得る。構造脂質の組み込みは、例えば、式ＩＩＩに従う脂質が本発明の脂質ナノ粒子組成物に使用される場合、任意選択であってよい。
【０９０３】
いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、式（Ｉ）の化合物（例えば、化合物１８、２５、２６または４８）を含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、式（Ｉ）の化合物（例えば、化合物１８、２５、２６または４８）と、リン脂質（例えば、ＤＳＰＣ）と、を含む。
【０９０４】
いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、式（ＩＩＩ）の化合物（例えば、化合物２３６）を含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、式（ＩＩＩ）の化合物（例えば、化合物２３６）と、リン脂質（例えば、ＤＯＰＥまたはＤＳＰＣ）と、を含む。
【０９０５】
いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、式（Ｉ）の化合物（例えば、化合物１８、２５、２６または４８）からなるか、または本質的になる脂質組成物を含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、式（Ｉ）の化合物（例えば、化合物１８、２５、２６または４８）からなるか、または本質的になる脂質組成物と、リン脂質（例えば、ＤＳＰＣ）と、を含む。
【０９０６】
いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、式（ＩＩＩ）の化合物（例えば、化合物２３６）からなるか、または本質的になる脂質組成物を含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、式（ＩＩＩ）の化合物（例えば、化合物２３６）からなるか、または本質的になる脂質組成物と、リン脂質（例えば、ＤＯＰＥまたはＤＳＰＣ）と、を含む。
【０９０７】
１つの実施形態では、脂質ナノ粒子は、イオン化可能な脂質、構造脂質、リン脂質、及びｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、イオン化可能な脂質、ＰＥＧ修飾脂質、リン脂質及び構造脂質を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、約２０〜６０％のイオン化可能な脂質：約５〜２５％のリン脂質：約２５〜５５％の構造脂質；約０．５〜１５％のＰＥＧ修飾脂質のモル比を有する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、約５０％のイオン化可能な脂質、約１．５％のＰＥＧ修飾脂質、約３８．５％の構造脂質及び約１０％リン脂質のモル比を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、約５５％のイオン化可能な脂質、約２．５％のＰＥＧ脂質、約３２．５％の構造脂質及び約１０％のリン脂質のモル比を含む。いくつかの実施形態では、イオン化可能な脂質は、イオン化可能なアミノ脂質であり、リン脂質は、中性脂質であり、構造脂質は、コレステロールである。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、イオン化可能な脂質：コレステロール：ＤＳＰＣ：ＰＥＧ脂質が５０：３８．５：１０：１．５であるモル比を有する。いくつかの実施形態では、イオン化可能な脂質は、化合物１８または化合物２３６であり、ＰＥＧ脂質は、化合物４２８である。
【０９０８】
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、化合物１８：コレステロール：リン脂質：化合物４２８が５０：３８．５：１０：１．５であるモル比を有する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、化合物１８：コレステロール：ＤＳＰＣ：化合物４２８が５０：３８．５：１０：１．５であるモル比を有する。
【０９０９】
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、化合物２３６：コレステロール：リン脂質：化合物４２８が５０：３８．５：１０：１．５であるモル比を有する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、化合物２３６：コレステロール：ＤＳＰＣ：化合物４２８が５０：３８．５：１０：１．５であるモル比を有する。
【０９１０】
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、０．４未満の多分散値を有する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、中性のｐＨで正味の中性電荷を有する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、５０〜１５０ｎｍの平均直径を有する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、８０〜１００ｎｍの平均直径を有する。
【０９１１】
本明細書で概して定義するように、「脂質」という用語は、疎水性または両親媒性の性質を有する小分子を指す。脂質は、天然であっても合成であってもよい。脂質の種類の例には、脂肪、ろう、ステロール含有代謝産物、ビタミン、脂肪酸、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、糖脂質、及びポリケチド、及びプレノール脂質が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの場合では、いくつかの脂質は、その両親媒性の性質により、水性媒体中でリポソーム、ベシクル、または膜を形成する。
【０９１２】
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、イオン化可能な脂質を含み得る。本明細書で使用されるとき、「イオン化可能な脂質」という用語は、当該技術分野における通常の意味を有し、１つまたは複数の荷電性部分を含む脂質を指し得る。いくつかの実施形態では、イオン化可能な脂質は、正電荷を有してもよいし、負電荷を有してもよい。イオン化可能な脂質は、正電荷を有し得、その場合、「カチオン性脂質」と称され得る。ある特定の実施形態では、イオン化可能な脂質分子は、アミン基を含み得、イオン化可能なアミノ脂質と称され得る。本明細書で使用されるとき、「荷電性部分」は、形式電荷、例えば、一価（＋１、または−１）、二価（＋２、または−２）、三価（＋３、または−３）などを所有する化学部分である。荷電性部分は、アニオン性（すなわち、負荷電性）またはカチオン性（すなわち、正荷電性）であり得る。正荷電性部分の例には、アミン基（例えば、一級、二級、及び／または三級アミン）、アンモニウム基、ピリジニウム基、グアニジン基、及びイミジゾリウム基が挙げられる。具体的な実施形態では、荷電性部分は、アミン基を含む。負荷電性基またはその前駆体の例には、カルボキシレート基、スルホネート基、サルフェート基、ホスホネ−ト基、ホスフェート基、ヒドロキシル基などが挙げられる。荷電性部分の電荷は、場合により、環境条件で変化し得、例えば、ｐＨの変化により当該部分の電荷が変わり、及び／または当該部分が帯電したり、非帯電になったりする。一般に、分子の電荷密度は、一般に、分子の電荷密度は、所望のとおりに選択することができる。
【０９１３】
「帯電した」または「荷電性部分」という用語は、分子上の「部分的な負電荷」または「部分的な正電荷」を指さないことを理解されたい。「部分的な負電荷」及び「部分的な正電荷」という用語は、当該技術分野におけるその通常の意味が与えられる。「部分的な負電荷」は、電子密度が結合の１つの原子に向かって引き抜かれるように分極し、原子上に部分的な負電荷を生成する結合を官能基が有する場合に生じ得る。当業者であれば、一般に、このように分極し得る結合を認識するであろう。
【０９１４】
いくつかの実施形態では、イオン化可能な脂質は、イオン化可能なアミノ脂質であり、当該技術分野において「イオン化可能なカチオン性脂質」と称されることもある。１つの実施形態では、イオン化可能なアミノ脂質は、正電荷を有する親水性頭部と、リンカー構造を介して連結された疎水性尾部とを有し得る。
【０９１５】
これらに加えて、イオン化可能な脂質は、環式アミン基を含む脂質であってもよい。
【０９１６】
１つの実施形態では、イオン化可能な脂質は、限定するものではないが、国際公開第ＷＯ２０１３０８６３５４号及び同第ＷＯ２０１３１１６１２６号に記載のイオン化可能な脂質から選択され得、これらの文献のそれぞれの内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０９１７】
さらに別の実施形態では、イオン化可能な脂質は、限定するものではないが、米国特許第７，４０４，９６９号の式ＣＬＩ−ＣＬＸＸＸＸＩＩから選択され得、当該文献のそれぞれは、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０９１８】
１つの実施形態では、脂質は、国際公開第ＷＯ２０１２／１７０８８９号に記載のものなどの切断可能な脂質であり得、当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。１つの実施形態では、脂質は、当該技術分野において知られている方法及び／または国際公開第ＷＯ２０１３／０８６３５４号に記載の方法によって合成され得、当該文献のそれぞれの内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０９１９】
ナノ粒子組成物は、さまざまな方法によって特徴付けることができる。例えば、顕微鏡検査法（例えば、透過型電子顕微鏡検査法または走査型電子顕微鏡検査法）を使用して、ナノ粒子組成物のモルホロジー及び粒径分布を調べることができる。動的光散乱法または電位差測定法（例えば、電位差滴定法）を使用して、ゼータ電位を測定することができる。動的光散乱法はまた、粒径を決定するために利用することもできる。また、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ（Ｍａｌｖｅｒｎ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ））などの機器を使用して、粒径、多分散指数、及びゼータ電位などの、ナノ粒子組成物の複数の特徴を測定することができる。
【０９２０】
いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、式（Ｉ）の化合物（例えば、化合物１８、２５、２６または４８）からなるか、または本質的になる脂質組成物を含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、式（Ｉ）の化合物（例えば、化合物１８、２５、２６または４８）からなるか、または本質的になる脂質組成物と、リン脂質（例えば、ＤＳＰＣまたはＭＳＰＣ）と、を含む。
【０９２１】
ナノ粒子組成物は、さまざまな方法によって特徴付けることができる。例えば、顕微鏡検査法（例えば、透過型電子顕微鏡検査法または走査型電子顕微鏡検査法）を使用して、ナノ粒子組成物のモルホロジー及び粒径分布を調べることができる。動的光散乱法または電位差測定法（例えば、電位差滴定法）を使用して、ゼータ電位を測定することができる。動的光散乱法はまた、粒径を決定するために利用することもできる。また、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ（Ｍａｌｖｅｒｎ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ））などの機器を使用して、粒径、多分散指数、及びゼータ電位などの、ナノ粒子組成物の複数の特徴を測定することができる。
【０９２２】
ナノ粒子のサイズは、限定するものではないが、炎症などの生物学的応答を阻止するのに役立ち得、またはポリヌクレオチドの生物学的作用を高め得る。
【０９２３】
本明細書で使用されるとき、ナノ粒子組成物との関係における「（粒）径」または「平均（粒）径」は、ナノ粒子組成物の平均直径を指す。
【０９２４】
１つの実施形態では、１つまたは複数の癌エピトープポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、限定するものではないが、約１０〜約２０ｎｍ、約１０〜約３０ｎｍ、約１０〜約４０ｎｍ、約１０〜約５０ｎｍ、約１０〜約６０ｎｍ、約１０〜約７０ｎｍ、約１０〜約８０ｎｍ、約１０〜約９０ｎｍ、約２０〜約３０ｎｍ、約２０〜約４０ｎｍ、約２０〜約５０ｎｍ、約２０〜約６０ｎｍ、約２０〜約７０ｎｍ、約２０〜約８０ｎｍ、約２０〜約９０ｎｍ、約２０〜約１００ｎｍ、約３０〜約４０ｎｍ、約３０〜約５０ｎｍ、約３０〜約６０ｎｍ、約３０〜約７０ｎｍ、約３０〜約８０ｎｍ、約３０〜約９０ｎｍ、約３０〜約１００ｎｍ、約４０〜約５０ｎｍ、約４０〜約６０ｎｍ、約４０〜約７０ｎｍ、約４０〜約８０ｎｍ、約４０〜約９０ｎｍ、約４０〜約１００ｎｍ、約５０〜約６０ｎｍ、約５０〜約７０ｎｍ、約５０〜約８０ｎｍ、約５０〜約９０ｎｍ、約５０〜約１００ｎｍ、約６０〜約７０ｎｍ、約６０〜約８０ｎｍ、約６０〜約９０ｎｍ、約６０〜約１００ｎｍ、約７０〜約８０ｎｍ、約７０〜約９０ｎｍ、約７０〜約１００ｎｍ、約８０〜約９０ｎｍ、約８０〜約１００ｎｍ及び／または約９０〜約１００ｎｍなどの約１０〜約１００ｎｍの直径を有する脂質ナノ粒子に製剤化される。
【０９２５】
１つの実施形態では、ナノ粒子は、約１０〜５００ｎｍの直径を有する。１つの実施形態では、ナノ粒子は、１００ｎｍ超、１５０ｎｍ超、２００ｎｍ超、２５０ｎｍ超、３００ｎｍ超、３５０ｎｍ超、４００ｎｍ超、４５０ｎｍ超、５００ｎｍ超、５５０ｎｍ超、６００ｎｍ超、６５０ｎｍ超、７００ｎｍ超、７５０ｎｍ超、８００ｎｍ超、８５０ｎｍ超、９００ｎｍ超、９５０ｎｍ超または１０００ｎｍ超の直径を有する。
【０９２６】
いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物の最大寸法は、１μｍまたはそれより小さい（例えば、１μｍ、９００ｎｍ、８００ｎｍ、７００ｎｍ、６００ｎｍ、５００ｎｍ、４００ｎｍ、３００ｎｍ、２００ｎｍ、１７５ｎｍ、１５０ｎｍ、１２５ｎｍ、１００ｎｍ、７５ｎｍ、５０ｎｍまたはそれより小さい）。
【０９２７】
ナノ粒子組成物は、比較的均一であり得る。多分散指数を使用して、ナノ粒子組成物の均一性、例えば、ナノ粒子組成物の粒径分布を示すことができる。小さい（例えば、０．３未満の）多分散指数は、一般に、狭い粒径分布を示す。ナノ粒子組成物は、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１０、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、０．１９、０．２０、０．２１、０．２２、０．２３、０．２４、または０．２５などの約０〜約０．２５の多分散指数を有し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示のナノ粒子組成物の多分散指数は、約０．１０〜約０．２０であり得る。
【０９２８】
ナノ粒子組成物のゼータ電位を使用して、組成物の界面動電位を示すことができる。例えば、ゼータ電位は、ナノ粒子組成物の表面電荷を記述することができる。電荷の高い種は、細胞、組織、及び体内の他の要素と望ましくない相互作用を起こすことがあるので、比較的に小さい正または負の電荷を有するナノ粒子組成物が一般に望ましい。いくつかの実施形態では、本明細書に開示のナノ粒子組成物のゼータ電位は、約−１０ｍＶ〜約＋２０ｍＶ、約−１０ｍＶ〜約＋１５ｍＶ、約１０ｍＶ〜約＋１０ｍＶ、約−１０ｍＶ〜約＋５ｍＶ、約−１０ｍＶ〜約０ｍＶ、約−１０ｍＶ〜約−５ｍＶ、約−５ｍＶ〜約＋２０ｍＶ、約−５ｍＶ〜約＋１５ｍＶ、約−５ｍＶ〜約＋１０ｍＶ、約−５ｍＶ〜約＋５ｍＶ、約−５ｍＶ〜約０ｍＶ、約０ｍＶ〜約＋２０ｍＶ、約０ｍＶ〜約＋１５ｍＶ、約０ｍＶ〜約＋１０ｍＶ、約０ｍＶ〜約＋５ｍＶ、約＋５ｍＶ〜約＋２０ｍＶ、約＋５ｍＶ〜約＋１５ｍＶ、または約＋５ｍＶ〜約＋１０ｍＶであり得る。
【０９２９】
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子のゼータ電位は、約０ｍＶ〜約１００ｍＶ、約０ｍＶ〜約９０ｍＶ、約０ｍＶ〜約８０ｍＶ、約０ｍＶ〜約７０ｍＶ、約０ｍＶ〜約６０ｍＶ、約０ｍＶ〜約５０ｍＶ、約０ｍＶ〜約４０ｍＶ、約０ｍＶ〜約３０ｍＶ、約０ｍＶ〜約２０ｍＶ、約０ｍＶ〜約１０ｍＶ、約１０ｍＶ〜約１００ｍＶ、約１０ｍＶ〜約９０ｍＶ、約１０ｍＶ〜約８０ｍＶ、約１０ｍＶ〜約７０ｍＶ、約１０ｍＶ〜約６０ｍＶ、約１０ｍＶ〜約５０ｍＶ、約１０ｍＶ〜約４０ｍＶ、約１０ｍＶ〜約３０ｍＶ、約１０ｍＶ〜約２０ｍＶ、約２０ｍＶ〜約１００ｍＶ、約２０ｍＶ〜約９０ｍＶ、約２０ｍＶ〜約８０ｍＶ、約２０ｍＶ〜約７０ｍＶ、約２０ｍＶ〜約６０ｍＶ、約２０ｍＶ〜約５０ｍＶ、約２０ｍＶ〜約４０ｍＶ、約２０ｍＶ〜約３０ｍＶ、約３０ｍＶ〜約１００ｍＶ、約３０ｍＶ〜約９０ｍＶ、約３０ｍＶ〜約８０ｍＶ、約３０ｍＶ〜約７０ｍＶ、約３０ｍＶ〜約６０ｍＶ、約３０ｍＶ〜約５０ｍＶ、約３０ｍＶ〜約４０ｍＶ、約４０ｍＶ〜約１００ｍＶ、約４０ｍＶ〜約９０ｍＶ、約４０ｍＶ〜約８０ｍＶ、約４０ｍＶ〜約７０ｍＶ、約４０ｍＶ〜約６０ｍＶ、及び約４０ｍＶ〜約５０ｍＶであり得る。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子のゼータ電位は、約１０ｍＶ〜約５０ｍＶ、約１５ｍＶ〜約４５ｍＶ、約２０ｍＶ〜約４０ｍＶ、及び約２５ｍＶ〜約３５ｍＶであり得る。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子のゼータ電位は、約１０ｍＶ、約２０ｍＶ、約３０ｍＶ、約４０ｍＶ、約５０ｍＶ、約６０ｍＶ、約７０ｍＶ、約８０ｍＶ、約９０ｍＶ、及び約１００ｍＶであり得る。
【０９３０】
ポリヌクレオチドに関する「封入効率」という用語は、調製後における、提供された初期量と比較した、ナノ粒子組成物によって封入されたまたは別様に会合しているポリヌクレオチドの量を記述するものである。本明細書で使用されるとき、「封入」は、完全な、実質的なまたは部分的な囲い込み、閉じ込め、取り囲み、または包み込みを指し得る。
【０９３１】
封入効率は、望ましくは高い（例えば、１００％に近い）。封入効率は、例えば、ナノ粒子組成物を含む溶液中のポリヌクレオチドの量を、１つまたは複数の有機溶媒または界面活性剤によって当該ナノ粒子組成物を破壊する前と後で比較することによって、測定することができる。
【０９３２】
蛍光を使用して、溶液中の遊離ポリヌクレオチドの量を測定することができる。本明細書に記載のナノ粒子組成物について、ポリヌクレオチドの封入効率は、少なくとも５０％、例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。いくつかの実施形態では、封入効率は、少なくとも８０％であり得る。ある特定の実施形態では、封入効率は、少なくとも９０％であり得る。
【０９３３】
本明細書に開示の医薬組成物中に存在するポリヌクレオチドの量は、ポリヌクレオチドのサイズ、所望の標的及び／または用途、またはナノ粒子組成物の他の性質ならびにポリヌクレオチドの性質に依存し得る。
【０９３４】
例えば、ナノ粒子組成物に有用なｍＲＮＡの量は、ｍＲＮＡのサイズ（長さ、または分子量として表される）、配列、及び他の特徴に依存し得る。ナノ粒子組成物中のポリヌクレオチドの相対量も変動し得る。
【０９３５】
本開示の脂質ナノ粒子組成物中に存在する脂質組成物とポリヌクレオチドの相対量は、有効性及び忍容性の考察に従って最適化することができる。ポリヌクレオチドとしてｍＲＮＡを含む組成物の場合、Ｎ：Ｐ比が有用な指標として役立ち得る。
【０９３６】
ナノ粒子組成物のＮ：Ｐ比は、発現と忍容性の両方を制御するので、Ｎ：Ｐ比が低く、発現が強いナノ粒子組成物が望ましい。Ｎ：Ｐ比は、ナノ粒子組成物中の脂質とＲＮＡの比によって変動する。
【０９３７】
一般に、より小さいＮ：Ｐ比が好ましい。１つまたは複数のＲＮＡ、脂質、及びその量は、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１２：１、１４：１、１６：１、１８：１、２０：１、２２：１、２４：１、２６：１、２８：１、または３０：１などの約２：１〜約３０：１のＮ：Ｐ比を提供するように選択することができる。ある特定の実施形態では、Ｎ：Ｐ比は、約２：１〜約８：１であり得る。他の実施形態では、Ｎ：Ｐ比は、約５：１〜約８：１である。ある特定の実施形態では、Ｎ：Ｐ比は、５：１〜６：１である。具体的な１つの態様では、Ｎ：Ｐ比は、約５．６７：１である。
【０９３８】
ナノ粒子組成物を提供することに加えて、本開示はまた、ポリヌクレオチドを封入することを含む、脂質ナノ粒子の作製方法も提供する。当該方法は、本明細書に開示の医薬組成物のいずれかを使用することと、当該技術分野において知られている脂質ナノ粒子の作製方法に従って脂質ナノ粒子を作製することと、を含む。例えば、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）“Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｗｉｔｈ  ｌｉｐｉｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ”  Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．８７：６８−８０；Ｓｉｌｖａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）“Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．Ｐａｒｔ  Ｉ：Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ”  Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１６：９４０−９５４；Ｎａｓｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）“Ｓｏｌｉｄ  Ｌｉｐｉｄ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｎｄ  Ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ  Ｌｉｐｉｄ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ”  Ａｄｖ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．５：３０５−１３；Ｓｉｌｖａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）“Ｌｉｐｉｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ”  Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：２９１−３０２及び当該文献で引用されている参考文献を参照のこと。
【０９３９】
キット製剤
本発明の他の態様では、こうした方法の達成を目的とするキットも提供される。キットは、脂質ナノ粒子製剤を収容する容器と、ワクチン製剤を収容する容器と、対象への投与までの２４時間以内に、個別化ｍＲＮＡ癌ワクチンをワクチン製剤に添加して個別化ｍＲＮＡ癌ワクチン製剤を生成し、個別化ｍＲＮＡ癌ワクチン製剤と脂質ナノ粒子製剤とを混合することについての説明と、を含む。いくつかの実施形態では、キットは、２〜１００の癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡを含む。
【０９４０】
物品は、１つまたは複数の容器に医薬グレードまたは診断グレードの本発明の化合物を含む。物品は、本発明の化合物の使用を促進または記載する説明またはラベルを含み得る。
【０９４１】
本明細書に記載の「促進」は、教育、病院的及び他の臨床的説明、医薬販売を含む医薬業界活動、ならびに任意の形態の文書的、口頭的、及び電子的なコミュニケーションを含む任意の宣伝活動または他の販売促進活動を行う方法を含む、癌の治療に関して本発明の組成物と関連してビジネスを実施するすべての方法を含む。
【０９４２】
「説明」は、販売促進の構成要素であると定義することができ、典型的には、本発明の組成物の梱包に対する文書的説明またはそれと関連する文書的説明を含む。説明は、任意の様式で提供される任意の口頭的または電子的な説明も含み得る。
【０９４３】
したがって、いくつかの実施形態では、治療的、診断的、または研究的な用途におけるその使用を促進するための、医薬的または診断的または研究的なキットを、本明細書に記載の薬剤から構築してよい。キットは、本発明の構成要素及び使用説明を収容する１つまたは複数の容器を含み得る。具体的には、そのようなキットは、意図される治療用途及びこうした薬剤の適切な投与について記載する説明と共に、本明細書に記載の薬剤を１つまたは複数含み得る。ある特定の実施形態では、キットにおける薬剤は、特定の用途及び薬剤の投与方法に適した医薬製剤及び用量であり得る。
【０９４４】
キットは、医師による本明細書に記載の方法の使用が容易になるように設計してよく、多くの形態をとることができる。キットの組成物はそれぞれ、適用可能な場合、液体形態（例えば、溶液）または固体形態（例えば、乾燥粉末）で提供してよい。ある特定の場合では、組成物のいくつかは、（例えば、活性形態にするために）例えば、適切な溶媒もしくは他の種類のもの（例えば、水もしくは細胞培養培地）を添加することによって構成可能であるか、または別の形で処理可能であり得、こうした溶媒または他の種類のものは、キットに付属して提供されてもされなくてもよい。本明細書で使用される「説明」は、説明及び／または販売促進の構成要素であると定義することができ、典型的には、本発明の梱包に対する文書的説明またはそれと関連する文書的説明を含む。説明は、任意の様式で提供される任意の口頭的または電子的な説明も含み得、その結果、使用者は、例えば、視聴覚的なもの（例えば、ビデオテープ、ＤＶＤなど）、インターネット、及び／またはウェブに基づくコミュニケーションなどを通して、説明がキットと関連することになると明確に認識することになる。文書的説明は、医薬物または生物学的産物の製造、使用、または販売を規制する政府機関によって規定された形態であり得、当該説明は、ヒトへの投与を目的とする製造、使用、または販売の機関による承認を反映したものでもあり得る。
【０９４５】
キットは、本明細書に記載の要素のいずれか１つまたは複数を１つまたは複数の容器に含み得る。例として、１つの実施形態では、キットは、キットの１つまたは複数の構成要素の混合、及び／または試料の単離及び混合、ならびに対象への適用のための説明を含み得る。キットは、本明細書に記載の薬剤を収容する容器を含み得る。薬剤は、無菌的に調製し、シリンジに充填し、冷蔵配送してよい。あるいは、バイアルまたは他の貯蔵用容器に薬剤を収容してもよい。無菌的に調製された他の薬剤を第２の容器に収容してよい。あるいは、シリンジ、バイアル、チューブ、または他の容器において配送される事前混合済の活性剤をキットに含めてもよい。
【０９４６】
キットは、ブリスターパウチ、収縮包装パウチ、真空密封可能なパウチ、密封可能な熱形成トレイ、または同様のパウチ形態もしくはトレイ形態などのさまざまな形態を有し得、パウチ、１つまたは複数のチューブ、容器、箱、またはバッグの中に緩く梱包された付属物を共に含む。キットは、付属物を追加した後に無菌化してよく、それによって容器内の個々の付属品を通常なら未包装となる状態にしておくことが可能になる。キットは、放射線滅菌法、加熱滅菌法、または当該技術分野において知られる他の滅菌法などの、任意の適切な滅菌技術を使用して無菌化することができる。キットは、特定の用途に応じて他の構成要素も含み得、こうした構成要素は、例えば、容器、細胞培地、塩、緩衝剤、試薬、シリンジ、針、消毒剤の適用または除去のためのガーゼなどの布、使い捨ての手袋、投与前の薬剤支持体などである。
【０９４７】
キットの組成物は、例えば、液体溶液または乾燥粉末などの任意の適切な形態として提供してよい。提供される組成物が乾燥粉末であるとき、粉末は、併せて提供され得る適切な溶媒を添加することによって再構成してよい。液体形態の組成物が使用される実施形態では、液体形態は、濃縮するか、またはすぐ使用可能な状態にしてよい。溶媒は、使用または投与される化合物及び様式に依存することになる。薬物組成物に適した溶媒はよく知られており、文献から情報を入手することが可能である。溶媒は、使用または投与される化合物及び様式に依存することになる。
【０９４８】
実施形態の１つのセットでは、キットは、バイアル、チューブ、及び同様のものなどの１つまたは複数の容器手段を密閉受容する区分けされた運搬手段を含み得、容器手段はそれぞれ、方法において使用されることになる別々の要素のうちの１つを含む。例えば、容器の１つは、アッセイに対する正の対照を含み得る。さらに、キットは、例えば、アッセイにおいて有用な緩衝液などの他の構成要素のための容器を含み得る。
【０９４９】
本発明は、梱包及びラベル添付が終了した医薬製品も包含する。この製造物品は、ガラスバイアルまたは密閉される他の容器などの適切なベッセルまたは容器に、適切な単位用量形態を含む。非経口投与に適した用量形態の場合、活性成分は無菌であり、微粒子を含有しない溶液としての投与に適している。言い換えれば、本発明は、非経口溶液と凍結乾燥粉末との両方を包含し、これらはそれぞれ無菌であり、後者は注射前の再構成に適するものである。あるいは、単位用量形態は、経口送達、経皮送達、局所送達、または経粘膜送達に適した固体であり得る。
【０９５０】
好ましい実施形態では、単位用量形態は、静脈内送達、筋肉内送達、または皮下送達に適する。したがって、本発明は、溶液を包含し、こうした溶液は、好ましくは、無菌でありそれぞれの送達経路に適したものである。
【０９５１】
別の好ましい実施形態では、本発明の組成物は、生体適合性界面活性剤または他のタンパク質と共に容器に貯蔵され、こうした界面活性剤には、限定はされないが、レシチン、タウロコール酸、及びコレステロールが含まれ、こうした他のタンパク質には、限定はされないが、ガンマグロブリン及び血清アルブミンが含まれる。より好ましくは、本発明の組成物は、ヒトにおける使用目的ではヒト血清アルブミンと共に貯蔵され、獣医学的な使用目的ではウシ血清アルブミンと共に貯蔵される。
【０９５２】
任意の医薬製品と同様に、梱包材料及び容器は、貯蔵及び発送の間に製品の安定性が保護されるように設計される。さらに、本発明の製品は、使用説明、または問題の疾患もしくは障害をどのように適切に予防もしくは治療するかについて医師、専門技師、もしくは患者に通知する他の情報材料を含む。言い換えれば、製造物品は、投薬レジメンを指示または提案する説明手段を含み、こうした投薬レジメンには、限定はされないが、実際用量、監視手順（平均絶対リンパ球数、腫瘍細胞数、及び腫瘍サイズの監視方法など）ならびに他の監視情報が含まれる。
【０９５３】
より具体的には、本発明は、箱、ボトル、チューブ、バイアル、容器、噴霧器、吸入器、静注輸液（静注）バッグ、エンベロープ、及び同様のものなどの梱包材料と、当該梱包材料内に含まれる少なくとも１つの単位用量形態の医薬剤と、を含む製造物品を提供する。本発明は、箱、ボトル、チューブ、バイアル、容器、噴霧器、吸入器、静注輸液（静注）バッグ、エンベロープ、及び同様のものなどの梱包材料と、当該梱包材料内に含まれる少なくとも１つの単位用量形態のそれぞれの医薬剤と、を含む製造物品も提供する。本発明は、箱、ボトル、チューブ、バイアル、容器、噴霧器、吸入器、静注輸液（静注）バッグ、エンベロープ、及び同様のものなどの梱包材料と、当該梱包材料内に含まれる少なくとも１つの単位用量形態のそれぞれの医薬剤と、を含む製造物品をさらに提供する。本発明は、製剤の注射を目的とする針もしくはシリンジ（好ましくは、無菌形態で梱包される）、及び／または梱包されたアルコールパッドを含む製造物品をさらに提供する。
【０９５４】
ワクチン組成物における活性成分、薬学的に許容される賦形剤、及び／または任意の追加成分の相対量は、治療中の対象の独自性、サイズ、及び／または病状、さらにこれらに加えて、組成物が投与されることになる経路に応じて変わり得るものである。例えば、組成物は、活性成分を０．１％〜９９％（ｗ／ｗ）含み得る。例として、組成物は、活性成分を０．１％〜１００％（ｗ／ｗ）含み得、例えば、．５〜５０％（ｗ／ｗ）、１〜３０％（ｗ／ｗ）、５〜８０％（ｗ／ｗ）、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）含む。
【０９５５】
いくつかの実施形態では、医薬製品を含むパッケージは、０．１ｍｇ〜１ｍｇのｍＲＮＡを含有する。いくつかの実施形態では、医薬製品を含むパッケージは、０．３５ｍｇのｍＲＮＡを含有する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡの濃度は、１ｍｇ／ｍＬである。
【０９５６】
いくつかの実施形態では、医薬製品を含むパッケージは、５〜１５ｍｇの総脂質を含有する。いくつかの実施形態では、医薬製品を含むパッケージは、７ｍｇの総脂質を含有する。いくつかの実施形態では、総脂質の濃度は、２０ｍｇ／ｍＬである。
【０９５７】
いくつかの実施形態では、所望の治療効果、診断効果、予防効果、または造影効果を得るために、対象の体重当たりとして１日当たり０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．００５ｍｇ／ｋｇ〜０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ〜０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ〜４０ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、または１ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇを送達するために十分な用量レベルでＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチン組成物を、１日当たり、１週間当たり、１ヶ月当たりなどに１回または複数回投与してよい（例えば、国際公開第ＷＯ２０１３／０７８１９９号に記載の単位用量の範囲を参照のこと。当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、０．０１００ｍｇ、０．０２５ｍｇ、０．０５０ｍｇ、０．０７５ｍｇ、０．１００ｍｇ、０．１２５ｍｇ、０．１５０ｍｇ、０．１７５ｍｇ、０．２００ｍｇ、０．２２５ｍｇ、０．２５０ｍｇ、０．２７５ｍｇ、０．３００ｍｇ、０．３２５ｍｇ、０．３５０ｍｇ、０．３７５ｍｇ、０．４００ｍｇ、０．４２５ｍｇ、０．４５０ｍｇ、０．４７５ｍｇ、０．５００ｍｇ、０．５２５ｍｇ、０．５５０ｍｇ、０．５７５ｍｇ、０．６００ｍｇ、０．６２５ｍｇ、０．６５０ｍｇ、０．６７５ｍｇ、０．７００ｍｇ、０．７２５ｍｇ、０．７５０ｍｇ、０．７７５ｍｇ、０．８００ｍｇ、０．８２５ｍｇ、０．８５０ｍｇ、０．８７５ｍｇ、０．９００ｍｇ、０．９２５ｍｇ、０．９５０ｍｇ、０．９７５ｍｇ、または１．０ｍｇを送達するために十分な用量レベルで投与される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、１０μｇ〜４００μｇのｍＲＮＡワクチンを送達するために十分な用量レベルで対象に投与される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、０．０３３ｍｇ、０．１ｍｇ、０．２ｍｇ、または０．４ｍｇを送達するために十分な用量レベルで対象に投与される。
【０９５８】
所望の用量は、１日に３回、１日に２回、１日に１回、２日ごとに１回、３日ごとに１回、１週間ごとに１回、２週間ごとに１回、３週間ごとに１回、４週間ごとに１回、２ヶ月ごとに１回、３ヶ月ごとに１回、６ヶ月ごとに１回などの頻度で送達してよい。ある特定の実施形態では、所望の用量は、複数回の投与（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、またはそれを超える回数の投与）を使用して送達してよい。複数回投与が用いられるときは、本明細書に記載のものなどの分割投薬レジメンを使用してよい。いくつかの実施形態では、ＲＮＡワクチン組成物は、０．０００５ｍｇ／ｋｇ〜０．０１ｍｇ／ｋｇを送達するために十分な用量レベルで投与してよく、例えば、約０．０００５ｍｇ／ｋｇ〜約０．００７５ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．０００５ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ、約０．００２ｍｇ／ｋｇ、約０．００３ｍｇ／ｋｇ、約０．００４ｍｇ／ｋｇ、または約０．００５ｍｇ／ｋｇを送達するために十分な用量レベルで投与してよい。いくつかの実施形態では、ＲＮＡワクチン組成物は、０．０２５ｍｇ／ｋｇ〜０．２５０ｍｇ／ｋｇ、０．０２５ｍｇ／ｋｇ〜０．５００ｍｇ／ｋｇ、０．０２５ｍｇ／ｋｇ〜０．７５０ｍｇ／ｋｇ、または０．０２５ｍｇ／ｋｇ〜１．０ｍｇ／ｋｇを送達するために十分な用量レベルで１回または２回（またはそれを超える回数）投与してよい。
【０９５９】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡワクチン組成物は、０．０１００ｍｇ、０．０２５ｍｇ、０．０５０ｍｇ、０．０７５ｍｇ、０．１００ｍｇ、０．１２５ｍｇ、０．１５０ｍｇ、０．１７５ｍｇ、０．２００ｍｇ、０．２２５ｍｇ、０．２５０ｍｇ、０．２７５ｍｇ、０．３００ｍｇ、０．３２５ｍｇ、０．３５０ｍｇ、０．３７５ｍｇ、０．４００ｍｇ、０．４２５ｍｇ、０．４５０ｍｇ、０．４７５ｍｇ、０．５００ｍｇ、０．５２５ｍｇ、０．５５０ｍｇ、０．５７５ｍｇ、０．６００ｍｇ、０．６２５ｍｇ、０．６５０ｍｇ、０．６７５ｍｇ、０．７００ｍｇ、０．７２５ｍｇ、０．７５０ｍｇ、０．７７５ｍｇ、０．８００ｍｇ、０．８２５ｍｇ、０．８５０ｍｇ、０．８７５ｍｇ、０．９００ｍｇ、０．９２５ｍｇ、０．９５０ｍｇ、０．９７５ｍｇ、または１．０ｍｇの総用量またはその総用量を送達するために十分な用量レベルで、２回（例えば、０日目と７日目、０日目と１４日目、０日目と２１日目、０日目と２８日目、０日目と６０日目、０日目と９０日目、０日目と１２０日目、０日目と１５０日目、０日目と１８０日目、０日目と３ヶ月後、０日目と６ヶ月後、０日目と９ヶ月後、０日目と１２ヶ月後、０日目と１８ヶ月後、０日目と２年後、０日目と５年後、または０日目と１０年後）投与してよい。本開示は、投与用量を上げたもの及び下げたもの、ならびに投与頻度を上げたもの及び下げたものを包含する。例えば、ＲＮＡワクチン組成物は、３回もしくは４回またはそれより多い回数投与してよい。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡワクチン組成物は、３週間ごとに１日１回投与される。
【０９６０】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡワクチン組成物は、０．０１０ｍｇ、０．０２５ｍｇ、０．１００ｍｇ、または０．４００ｍｇの総用量またはその総用量を送達するために十分な用量レベルで、２回（例えば、０日目と７日目、０日目と１４日目、０日目と２１日目、０日目と２８日目、０日目と６０日目、０日目と９０日目、０日目と１２０日目、０日目と１５０日目、０日目と１８０日目、０日目と３ヶ月後、０日目と６ヶ月後、０日目と９ヶ月後、０日目と１２ヶ月後、０日目と１８ヶ月後、０日目と２年後、０日目と５年後、または０日目と１０年後）投与してよい。
【０９６１】
いくつかの実施形態では、対象のワクチン接種方法における使用を目的とするＲＮＡワクチンでは、対象のワクチン接種に有効な量で、１０μｇ／ｋｇ〜４００μｇ／ｋｇの単回用量の核酸ワクチンが対象に投与される。いくつかの実施形態では、対象のワクチン接種方法における使用を目的とするＲＮＡワクチンでは、対象のワクチン接種に有効な量で、１０μｇ〜４００μｇの単回用量の核酸ワクチンが対象に投与される。
【０９６２】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡワクチン組成物は、ＭＣ３、コレステロール、ＤＳＰＣ、及びＰＥＧ２０００−ＤＭＧを含む脂質ナノ粒子において製剤化された本明細書に記載のポリヌクレオチド、クエン酸三ナトリウム緩衝剤、スクロース、ならびに注射用水を含み得る。非限定例として、組成物は、２．０ｍｇ／ｍＬの薬物物質（例えば、癌抗原をコードするポリヌクレオチド）、２１．８ｍｇ／ｍＬのＭＣ３、１０．１ｍｇ／ｍＬのコレステロール、５．４ｍｇ／ｍＬのＤＳＰＣ、２．７ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ２０００−ＤＭＧ、５．１６ｍｇ／ｍＬのクエン酸三ナトリウム、７１ｍｇ／ｍＬのスクロース、及び１．０ｍＬの注射用水を含む。
【０９６３】
いくつかの実施形態では、ナノ粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、１０〜５００ｎｍ、２０〜４００ｎｍ、３０〜３００ｎｍ、４０〜２００ｎｍの平均直径を有する。いくつかの実施形態では、ナノ粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、５０〜１５０ｎｍ、５０〜２００ｎｍ、８０〜１００ｎｍ、または８０〜２００ｎｍの平均直径を有する。
【０９６４】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡワクチンは、５〜１５ｍｇの総脂質、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５ｍｇの総脂質を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡワクチンは、７ｍｇの総脂質を含む。いくつかの実施形態では、ワクチン製剤中の総脂質の濃度は、１０〜３０ｍｇ／ｍＬ、例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ｍｇ／ｍＬである。
【０９６５】
フラゲリンは、約５００のアミノ酸の単量体タンパク質であり、このタンパク質が重合することで、細菌の動きと関連する鞭毛が形成される。さまざまな鞭毛細菌（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ならびに非鞭毛細菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉなど）がフラゲリンを発現する。自然免疫系の細胞（樹状細胞、マクロファージなど）によるフラゲリンの感知は、Ｔｏｌｌ様受容体５（ＴＬＲ５）ならびにＮｏｄ様受容体（ＮＬＲ）であるＩｐａｆ及びＮａｉｐ５によって媒介される。ＴＬＲ及びＮＬＲは、自然免疫応答及び適応免疫応答の活性化において一定の役割を担うことが同定されている。したがって、フラゲリンは、ワクチンにおいてアジュバント効果を発揮する。
【０９６６】
既知のフラゲリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋデータベースにおいて公的に利用可能である。フラゲリン配列としては、数ある中でも特に、Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｈ．Ｐｙｌｏｒｉ、Ｖ．Ｃｈｏｌｅｒａ、Ｓ．ｍａｒｃｅｓｅｎｓ、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｅｉ、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｒ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｒ．ｌｕｐｉｎｉ、Ｂ．ｃｌａｒｒｉｄｇｅｉａｅ、Ｐ．Ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｕｓ、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、及びＥ．ｃｏｌｉに由来するものが知られている。
【０９６７】
本明細書で使用されるフラゲリンポリペプチドは、全長フラゲリンタンパク質、その免疫原性断片、及びフラゲリンタンパク質またはその免疫原性断片に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するペプチドを指す。フラゲリンタンパク質の例には、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ（ＵｎｉＰｒｏ登録番号：Ｑ５６０８６）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（Ａ０Ａ０Ｃ９ＤＧ０９）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ（Ａ０Ａ０Ｃ９ＢＡＢ７）、及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ（Ｑ６Ｖ２Ｘ８）に由来するフラゲリンが含まれる。いくつかの実施形態では、フラゲリンポリペプチドは、フラゲリンタンパク質またはその免疫原性断片に対して、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【０９６８】
いくつかの実施形態では、フラゲリンポリペプチドは、免疫原性断片である。免疫原性断片は、免疫応答を誘発するフラゲリンタンパク質の一部分である。いくつかの実施形態では、免疫応答は、ＴＬＲ５を介する免疫応答である。免疫原性断片の例は、ヒンジ領域のすべてまたは一部が、欠失または他のアミノ酸と交換されたフラゲリンタンパク質である。例えば、抗原ポリペプチドをヒンジ領域に挿入してよい。ヒンジ領域は、フラゲリンの超可変領域である。フラゲリンのヒンジ領域は、「Ｄ３ドメインまたはＤ３領域」、「プロペラドメインまたはプロペラ領域」、「超可変ドメインまたは超可変領域」、及び「可変ドメインまたは可変領域」とも称される。本明細書で使用される「ヒンジ領域の少なくとも一部」は、フラゲリンのヒンジ領域の任意の部分、またはヒンジ領域全体を指す。他の実施形態では、フラゲリンの免疫原性断片は、２０、２５、３０、３５、または４０のアミノ酸のフラゲリンＣ末端断片である。
【０９６９】
フラゲリン単量体は、ドメインＤ０〜Ｄ３によって形成される。Ｄ０及びＤ１は、ステムを形成するものであり、タンデム型の長いアルファヘリックスから構成され、異なる細菌の間で高度に保存されている。Ｄ１ドメインは、ＴＬＲ５の活性化に有用なアミノ酸ストレッチをいくつか含む。Ｄ１ドメイン全体またはドメイン内の活性領域の１つもしくは複数が、フラゲリンの免疫原性断片である。Ｄ１ドメイン内の免疫原性領域の例には、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのフラゲリンであるＦｌｉＣにおける残基８８〜１１４及び残基４１１〜４３１が含まれる。８８〜１００の領域における１３のアミノ酸の中では、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａのフラゲリン及び他のフラゲリンの間で少なくとも６つの置換が許容され、こうした置換が存在してもＴＬＲ５の活性化は依然として保存される。したがって、フラゲリンの免疫原性断片には、ＴＬＲ５を活性化すると共に、ＦｌｉＣの８８〜１００のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ配列（ＬＱＲＶＲＥＬＡＶＱＳＡＮ（配列番号３５６））に対する同一性が５３％以上である１３のアミノ酸のモチーフを含むフラゲリン様配列が含まれる。
【０９７０】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、フラゲリンと１つまたは複数の抗原ポリペプチドとの融合タンパク質をコードするＲＮＡを含む。本明細書で使用される「融合タンパク質」は、構築物の２つの構成要素が連結されたものを指す。いくつかの実施形態では、抗原ポリペプチドのカルボキシ末端は、フラゲリンポリペプチドのアミノ末端に融合または連結される。他の実施形態では、抗原ポリペプチドのアミノ末端は、フラゲリンポリペプチドのカルボキシ末端に融合または連結される。融合タンパク質には、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれを超える数のフラゲリンポリペプチドと、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれを超える数の抗原ポリペプチドと、が連結されたものが含まれ得る。２つ以上のフラゲリンポリペプチド及び／または２つ以上の抗原ポリペプチドが連結されると、そのような構築物は、「多量体」と称され得る。
【０９７１】
融合タンパク質の構成要素はそれぞれ、互いに直接連結するか、またはリンカーを介して連結してよい。例えば、リンカーは、アミノ酸リンカーであり得る。融合タンパク質の構成要素を連結するためにＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンによってコードされるアミノ酸リンカーには、例えば、リジン残基、グルタミン酸残基、セリン残基、及びアルギニン残基からなる群から選択される少なくとも１つのメンバーが含まれ得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、１〜３０、１〜２５、１〜２５、５〜１０、５、１５、または５〜２０のアミノ酸長である。
【０９７２】
ワクチンの投与様式
癌ＲＮＡワクチンは、治療的に有効な結果をもたらす任意の経路によって投与してよい。こうしたものには、限定はされないが、皮内投与、筋肉内投与、及び／または皮下投与が含まれる。本開示は、ＲＮＡワクチンを必要とする対象へのその投与を含む方法を提供する。正確な必要量は、対象の種、年齢、及び全身状態、疾患の重症度、特定の組成物、その投与様式、その活性様式、ならびに同様のものに応じて対象ごとに変わることになる。癌ＲＮＡワクチン組成物は、典型的には、投与を容易化し、用量を均一にするための単位剤形において製剤化される。しかしながら、癌ＲＮＡワクチン組成物の全体的な日々の用法は、健全な医学的判断の範囲内で主治医によって決定され得ることを理解されたい。任意の特定の患者を対象とする治療的に有効、予防的に有効、または適切な造影の特定用量レベルは、さまざまな因子に依存することになり、こうした因子には、治療中の障害及び障害の重症度、用いられる特定の化合物の活性、用いられる特定の組成物、年齢、体重、総体的な健康、患者の性別及び食事、投与時間、投与経路、及び用いられる特定の化合物の排出速度、治療の期間、用いられる特定の化合物と組み合わせられるか、または同時発生的に使用される薬物、ならびに医学分野においてよく知られる同様の因子が含まれる。
【０９７３】
いくつかの実施形態では、所望の治療効果、診断効果、予防効果、または造影効果を得るために、対象の体重当たりとして１日当たり０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．００５ｍｇ／ｋｇ〜０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ〜０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ〜４０ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、または１ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇを送達するために十分な用量レベルで癌ＲＮＡワクチン組成物を、１日当たり、１週間当たり、１ヶ月当たりなどに１回または複数回投与してよい（例えば、国際公開第ＷＯ２０１３／０７８１９９号に記載の単位用量の範囲を参照のこと。当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。所望の用量は、１日に３回、１日に２回、１日に１回、２日ごとに１回、３日ごとに１回、１週間ごとに１回、２週間ごとに１回、３週間ごとに１回、４週間ごとに１回、２ヶ月ごとに１回、３ヶ月ごとに１回、６ヶ月ごとに１回などの頻度で送達してよい。ある特定の実施形態では、所望の用量は、複数回の投与（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、またはそれを超える回数の投与）を使用して送達してよい。複数回投与が用いられるときは、本明細書に記載のものなどの分割投薬レジメンを使用してよい。例示の実施形態では、癌ＲＮＡワクチン組成物は、０．０００５ｍｇ／ｋｇ〜０．０１ｍｇ／ｋｇを送達するために十分な用量レベルで投与してよく、例えば、約０．０００５ｍｇ／ｋｇ〜約０．００７５ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．０００５ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ、約０．００２ｍｇ／ｋｇ、約０．００３ｍｇ／ｋｇ、約０．００４ｍｇ／ｋｇ、または約０．００５ｍｇ／ｋｇを送達するために十分な用量レベルで投与してよい。
【０９７４】
本明細書に記載のＲＮＡワクチン医薬組成物は、鼻腔内へのもの、気管内へのもの、または注射用のもの（例えば、静脈内、眼内、硝子体内、筋肉内、皮内、心臓内、腹腔内、及び皮下へのもの）などの、本明細書に記載の剤形へと製剤化することができる。
【０９７５】
本発明は、下記の説明に示されるか、または図面に例示される構成の詳細及び構成要素の配置にその用途が限定されることはない。本発明は、他の実施形態が可能であり、さまざまな様式において実施または実行することが可能である。また、本明細書で使用される用語表現及び専門用語は、説明を目的とするものであり、限定であると見なされるべきではない。「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（含む）」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」、または「ｈａｖｉｎｇ（有する）」、「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ（含む）」、「ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ（含む）」、及びその変形形態の本明細書での使用は、その後に列挙される項目及びその同等形態ならびに追加の項目を包含することが意図される。
【実施例】
【０９７６】
実施例１．ポリヌクレオチドの製造
本開示によれば、ポリヌクレオチド及びまたはその一部もしくは領域の製造は、「ＲＮＡ転写物の生成を目的とする製造方法」と題する国際出願ＷＯ２０１４／１５２０２７に教示される方法を利用して達成してよく、当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０９７７】
精製方法には、国際出願ＷＯ２０１４／１５２０３０及びＷＯ２０１４／１５２０３１に教示されるものが含まれ得、これらの文献はそれぞれ、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０９７８】
ポリヌクレオチドの検出方法及び特徴付け方法は、ＷＯ２０１４／１４４０３９に教示されるように実施してよく、当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０９７９】
本開示のポリヌクレオチドの特徴付けは、ポリヌクレオチドマッピング、逆転写酵素によるシークエンシング、電荷分布解析、及びＲＮＡ不純物の検出からなる群から選択される手順を使用して達成してよく、特徴付けは、ＲＮＡ転写物の配列決定、ＲＮＡ転写物の純度決定、またはＲＮＡ転写物の電荷不均一性の決定を含む。そのような方法は、例えば、ＷＯ２０１４／１４４７１１及びＷＯ２０１４／１４４７６７に教示されており、これらの文献のそれぞれの内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０９８０】
実施例２  キメラポリヌクレオチドの合成
序論
本開示によれば、トリホスフェートケミストリーを使用し、キメラポリヌクレオチドの２つの領域または部分を連結またはライゲーションしてよい。
【０９８１】
この方法によれば、１００以下のヌクレオチドの第１の領域または部分は、化学的に合成され、５’はモノホスフェートとなり、末端の３’ＯＨは除去または遮断される。領域が８０ヌクレオチドより長いのであれば、ライゲーションするための２つの鎖として合成してよい。
【０９８２】
第１の領域または部分が、インビトロ転写（ＩＶＴ）を使用して、非位置的に修飾された領域または部分として合成されるのであれば、その後に、５’モノホスフェートへの変換、続いて３’末端のキャッピングを実施してよい。
【０９８３】
モノホスフェート保護基は、当該技術分野で知られるもののいずれから選択してもよい。
【０９８４】
キメラポリヌクレオチドの第２の領域または部分は、化学合成法またはＩＶＴ法のいずれを使用して合成してもよい。ＩＶＴ法は、修飾されたキャップを有するプライマーを利用することができるＲＮＡポリメラーゼの使用を含み得る。あるいは、１３０までのヌクレオチドのキャップは、化学的に合成し、ＩＶＴの領域または部分にカップリングさせてよい。
【０９８５】
キメラポリヌクレオチド全体がホスフェート−糖骨格で製造される必要はない。領域または部分の１つがポリペプチドをコードするのであれば、そのような領域または部分は、ホスフェート−糖骨格を含むことが好ましい。
【０９８６】
その後、ライゲーションは、任意の既知のクリックケミストリー、オルトクリックケミストリー、ソルリンク（ｓｏｌｕｌｉｎｋ）、または当業者に知られる他の生体複合化ケミストリーを使用して実施される。
【０９８７】
合成経路
キメラポリヌクレオチドは、一連の出発セグメントを使用して調製される。そのようなセグメントは、
（ａ）通常の３’ＯＨを含み、５’がキャップされて保護されたセグメント（セグメント１）
（ｂ）ポリペプチドのコード領域を含み得、通常の３’ＯＨを含み、５’にトリホスフェートを有するセグメント（セグメント２）
（ｃ）キメラポリヌクレオチドの３’末端（例えば、尾部）向けに５’にモノホスフェートを有し、コーディセピンを含むか、または３’ＯＨを含まないセグメント（セグメント３）
合成（化学的またはＩＶＴ）の後、セグメント３（セグメント３）は、コーディセピンで処理され、その後、ピロホスファターゼで処理されることで５’モノホスフェートが創出される。
【０９８８】
その後、セグメント２（セグメント２）は、ＲＮＡリガーゼを使用してセグメント３にライゲーションされる。その後、ライゲーションされたポリヌクレオチドは、精製され、ピロホスファターゼで処理されることでジホスフェートが切断される。その後、処理されたセグメント２−セグメント３構築物は精製され、その５’末端にセグメント１がライゲーションされる。キメラポリヌクレオチドの精製段階をさらに実施してよい。
【０９８９】
それぞれの段階の収率は、９０〜９５％にもなり得る。
【０９９０】
実施例３：ｃＤＮＡの生成を目的とするＰＣＲ
ｃＤＮＡを調製するためのＰＣＲ手順は、Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）による２ｘのＫＡＰＡ  ＨＩＦＩ（商標）ＨｏｔＳｔａｒｔ  ＲｅａｄｙＭｉｘを使用して実施される。このシステムは、２ｘのＫＡＰＡ  ＲｅａｄｙＭｉｘを１２．５μｌ、フォワードプライマー（１０μＭ）を０．７５μｌ、リバースプライマー（１０μＭ）を０．７５μｌ、鋳型ｃＤＮＡを〜１００ｎｇ、及び２５．０μｌに希釈したｄＨ２０を含む。反応条件は、９５℃で５分間保持した後、９８℃２０秒、続いて５８℃１５秒、続いて７２℃４５秒というサイクルを２５回実施した後、７２℃で５分間保持し、その後終了まで４℃で保持するというものである。
【０９９１】
ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＰＵＲＥＬＩＮＫ（商標）ＰＣＲマイクロキット（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を製造者の説明に記載の量（最大５μｇ）ごとに使用して、反応に対する浄化処理が実施される。反応のスケールが大きくなればなるほど、より大きな能力を有する製品を使用して浄化処理を実施する必要が生じることになる。浄化処理の後、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（商標）を使用してｃＤＮＡが定量化され、ｃＤＮＡが予想サイズであることがアガロースゲル電気泳動による分析によって確認される。その後、ｃＤＮＡは、インビトロでの転写反応を行う前にシークエンシング解析に供される。
【０９９２】
実施例４．インビトロ転写（ＩＶＴ）
インビトロでの転写反応では、一様に修飾されたポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドが生成する。そのような一様に修飾されたポリヌクレオチドは、本開示のポリヌクレオチドの領域または一部を含み得る。投入用のヌクレオチドトリホスフェート（ＮＴＰ）混合物は、天然のＮＴＰ及び非天然のＮＴＰを使用して社内で調製される。
【０９９３】
インビトロでの典型的な転写反応は、下記のものを含む：
１  鋳型ｃＤＮＡ  １．０μｇ
２  １０ｘ転写緩衝液（４００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１９０ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＤＴＴ、１０ｍＭのスペルミジン）  ２．０μｌ
３  カスタムＮＴＰ（それぞれ２５ｍＭ）  ７．２μｌ
４  ＲＮＡｓｅ阻害剤  ２０Ｕ
５  Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ  ３０００Ｕ
６  ｄＨ２０  最大２０．０μｌ、及び
７  ３時間〜５時間の３７℃でのインキュベート。
【０９９４】
未精製のＩＶＴ混合物は、翌日の浄化処理に向けて４℃で一晩貯蔵してよい。その後、ＲＮＡｓｅを含まないＤＮａｓｅを１Ｕ使用することで元の鋳型が消化される。ｍＲＮＡは、３７℃で１５分間インキュベートした後、ＡｍｂｉｏｎのＭＥＧＡＣＬＥＡＲ（商標）キット（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を製造者の説明に従って使用して精製される。このキットによって最大５００μｇのＲＮＡを精製することができる。浄化処理の後、ＮａｎｏＤｒｏｐを使用してＲＮＡが定量化され、ＲＮＡのサイズが適切であり、ＲＮＡに分解が生じていないことがアガロースゲル電気泳動による分析によって確認される。
【０９９５】
実施例５．ＳＴＩＮＧ研究
本実施例では、構造的に活性なＳＴＩＮＧなどの免疫増強剤がコンカテマーワクチンに対するＴ細胞応答を増強することができるかどうかを調べた。ＲＮＡ３１コンカテマーをコードするｍＲＮＡ構築物（クラスＩ及びクラスＩＩエピトープをコードする）をワクチンとして使用し、クラスＩ及びクラスＩＩエピトープに対するＴ細胞応答へのＳＴＩＮＧの作用を調べた。ＲＮＡ３１及びＳＴＩＮＧ  ｍＲＮＡは、共製剤化して同時に送達するか、または共製剤化せずにＳＴＩＮＧ  ｍＲＮＡを遅らせて送達した。動物に１日目に初回用量を投与し、１５日目に追加免疫を与えた。脾細胞を２２日目に回収した。
【０９９６】
異なる材料を試験して、ＳＴＩＮＧをさまざまな比率でコンカテマーワクチンに加えた場合の免疫原性を決定し、ＳＴＩＮＧをトップランクの市販のアジュバントと比較し、免疫原性がＳＴＩＮＧ投与のタイミングに依存するかどうかを決定し、ＳＴＩＮＧとともに投与した場合の非製剤化ｍＲＮＡの免疫原性を調べた。以下の材料／条件で試験した：ＲＮＡ３１（３μｇ）、ポリＩ：Ｃ（１０μｇ）含有ＲＮＡ３１（３μｇ）、ＭＰＬＡ（５μｇ）含有ＲＮＡ３１（３μｇ）、ＳＴＩＮＧ（１μｇ）／ＲＮＡ３１（３μｇ）、ＳＴＩＮＧ（０．６μｇ）／ＲＮＡ３１（３μｇ）、ＳＴＩＮＧ（０．６μｇ）／ＲＮＡ５４（３μｇ）、ＳＴＩＮＧ（０．６μｇ）／ＲＮＡ３１（３μｇ）（２４時間後）、ＳＴＩＮＧ（０．６μｇ）／ＲＮＡ３１（３μｇ）（４８時間後）、ＳＴＩＮＧ（０．６μｇ）／ＲＮＡ３１（３μｇ）（非製剤化）、及びＳＴＩＮＧ（６μｇ）／ＲＮＡ３１（３０μｇ）（非製剤化）。ＣＡ−５４は、５つのクラスＩＩエピトープのコンカテマーである（そのすべてがＲＮＡ３１内に含まれる）。
【０９９７】
結果を図１２〜１３に示す。抗原特異的ＩＦＮγ応答をクラスＩＩエピトープで調べた場合、ＳＴＩＮＧは、ｍＲＮＡによってコードされたＭＨＣクラスＩＩエピトープに対する免疫応答を高めることがわかった。ＳＴＩＮＧは、市販のアジュバントと同等の挙動を示した（５〜１０倍の用量差）。試験した両方の比で作用したが、ＳＴＩＮＧ：抗原比が１：５のほうが１：３での組み合わせよりも良好に機能した（図１２）。上記のクラスＩエピトープを使用すると同様の結果が得られた。これを図１３に示す。同様に、クラスＩエピトープの場合、ＳＴＩＮＧ：抗原比が１：５のほうが１：３での組み合わせよりも良好に機能することがわかった。
【０９９８】
さらに、後の時点（２４時間）でのＳＴＩＮＧ投与も共送達と同様の免疫原性を有することがわかった（図１４）。
【０９９９】
さらなる実験では、ＳＴＩＮＧと抗原の異なる比の作用を５２のマウスエピトープを使用して試験した（追加エピトープ＿４ａ＿ＤＸ＿ＲＸ＿ｐｅｒｍ）。マウスに１日目に初回用量を投与し、８日目に追加用量を投与し、脾細胞を１５日目に回収した。再刺激に対するＴ細胞応答をＥＬＩＳｐｏｔ及びＦＡＣＳの使用により評価した。再刺激は、コンカテマーをコードするエピトープに対応するペプチド配列を用いて行った。２つのクラスＩＩエピトープ（ＲＮＡ２、ＲＮＡ３）及び４つのクラスＩエピトープ（ＲＮＡ７、ＲＮＡ１０、ＲＮＡ１３、ＲＮＡ２２）に対するＴ細胞応答を試験した。
【１０００】
極めて驚くべきことに、試験した比の大部分で、ＳＴＩＮＧを加えることにより、抗原単独と比較してＴ細胞応答が向上し、抗原単独よりも機能が悪くなることはないことがわかった。応答性の幅は、予想外であった。試験した６つの抗原（エピトープ）のうちの４つについて、抗原に総用量１０〜３０ｕｇでＳＴＩＮＧを加えると、用量５０ｕｇの抗原単独の場合よりも高いＴ細胞応答が一貫してもたらされた。したがって、免疫原性の向上には、ＳＴＩＮＧ：抗原の比に大きなベルカーブがある。
【１００１】
試験グループを次の表に示した。
【表５】
2020506189.tif 000145
【１００２】
クラスＩＩエピトープのうち、ＲＮＡ２（図６に示される結果）及びＲＮＡ３（図７に示される結果）は、ＳＴＩＮＧを加えると、抗原のみの群（最大５０μｇ用量の抗原単独を含む）と比較して、１：１（ＳＴＩＮＧ：抗原）未満の比で、Ｔ細胞応答が増大することを示した。図７の左パネルは、ＳＴＩＮＧを加えると、抗原のみの群と比較して、すべての比で、Ｔ細胞応答が増大することを示している。
【１００３】
同様の結果がクラスＩエピトープでもみられた。ＲＮＡ７（図８に示される結果）、ＲＮＡ１３（図９に示される結果）、ＲＮＡ２２（図１０に示される結果）、及びＲＮＡ１０（図１１に示される結果）はすべて、ＳＴＩＮＧ：抗原の比が、総ｍＲＮＡ用量と比較した場合、抗原のみの群と比較して、より高いＴ細胞応答をもたらすことを示した。
【１００４】
実施例６．コンカテマー研究
長い構築物の完全な読み取りが可能かどうかを調べ、２０及び５２エピトープ構築物を含有するエピトープに対する免疫原性を比較するための研究を実施した。実験では、５つの異なる製剤グループを、化合物２５７を含有するＬＮＰで試験した。
【表６】
2020506189.tif 000146
【１００５】
投与量は等ピコモルであり、これは、構築物の長さにかかわらず、すべての群が個々のエピトープをそれぞれ同じ濃度で投与されたことを意味する。動物に０日目に１回目の用量（初回用量）を投与し、６日目に２回目の用量（追加用量）を投与し、次に、脾細胞を１２日目に回収し、試料に対するＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔを実施した。
【１００６】
５２のエピトープを含有するワクチンの免疫原性を調べた。ＲＮＡ１／ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号２３１）が、試験した４つの構築物のそれぞれの最終エピトープであった。ＲＮＡ１／ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号２３１）で再刺激を実施した場合に、すべての試験群からＩＮＦγ応答が観察されたように、５２のエピトープ構築物におけるＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号２３１）Ｔ細胞応答は、コンカテマーの完全な読み通しを確認するものである（図１）。予想した通り、ＲＮＡ３１コンカテマーでは、当該コンカテマーがＲＮＡ１／ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号２３１）エピトープを有しないため、ＲＮＡ１は認められなかった。
【１００７】
５２マー構築物と２０マー構築物との間の免疫原性は、類似していた。例えば、クラスＩエピトープで再刺激した場合には、２つとも同様の挙動を示す（図２）。クラスＩＩエピトープの長さを削ると免疫原性が向上し得るが、クラスＩエピトープを２１アミノ酸から１５アミノ酸に削った場合は免疫原性に影響はなかった。さらに、追加のエピトープに対する免疫原性が５２エピトープ構築物で検出された（図３）。クラスＩＩエピトープで再刺激した場合、５２マー構築物と２０マー構築物の両方が同様の挙動を示した（図４）。
【表７−１】
2020506189.tif 000147
【表７−２】
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【表７−３】
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【表７−４】
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【表７−５】
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【表７−６】
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【表７−７】
2020506189.tif 000153
【表７−８】
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【表７−９】
2020506189.tif 000155
【１００８】
実施例７．活性化癌遺伝子ＫＲＡＳ変異
ＫＲＡＳは、ヒト癌において最も高頻度の変異型癌遺伝子である（約１５％）。ＫＲＡＳ変異は、ほとんどの場合、単一の「ホットスポット」に保存されており、癌遺伝子を活性化させる。以前の研究では、発癌性変異に特異的なＴ細胞を生産する能力には制限があることが示された。しかしながら、この研究のほとんどは、最も一般的なＨＬＡ対立遺伝子の環境（白色人種の約５０％で生じるＡ２）で実施された。より最近では、（ａ）あまり一般的でな臣ꢼ볯ꆼ꿥讫臩鶼귥꺁鋧莢볯ꆼ볯醼볯ꎼ볯覼臣膀觧骮臣뒼듧麃臣릂ꓥ낕臣뺯臣ꚁ铧邈臣貂뻥讂臣ꢁ胣ꪁ苣뎁臣袼뷯覼臣貂苣꺁듧麃臣ꢂ苣릂菣鲃臣꺁裦랕迥뎁뷥늩듧麃臣ꎂ胨뢁臣趆냥ꖅ臣膀苨貙苦薀臣誁臣ꚁ胣螊髧ꪁ藨趘뿥钭苣銪믤馁苣鎁臣貁껥벨臣貂臣蒁苣芀볯꺼†볯躽뷯貽†볯₪궼뷯蒽†볯邼볯隼볯鎼볯閼볯銼볯閼볯銈볯銼볯銼볯薽뷯薽뷯芽뷯銽†볯貼볯邼볯隼볯꾼볯骼볯邼볯醼볯閼볯込볯ꖼ볯궼뷯膽볯隼볯馼볯鞼볯覼胣ં䐼噉邀볯邼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†믤许臣ꢡ볯ꮁꓧ馁苣蚁臣膀볯늼볯袼뗧뢅鯧뢅駧覼臣꾁胣鎼臣꺁ꓥ낕臣뾁볯Ꞽ볯銼볯膀볯醼볯꒼胣誏臣Ꞽ볯鎼볯覼臣螗뻤꺁볯隼볯銂跥膂臣蒁苣芀臣覂臣膀꣦隺닦芙臣鞁臣膀臣릁臣꺁볯늼볯ꎂ胨꺁볯늼볯뎼ꓥ낕苣ꒂ菣銂뻥龁胣㲂牢ਾ䐼噉邀ꇨ颼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲〵ㄶ㤸琮晩㸢〲〲〵ㄶ㤸琮晩ꃂ〰㄰㘵⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀볯邼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†裥꺁볯꾼볯궼볯ꎼ菣벃苣뮂菣袃臣节胣邵藨뒛藨貙臣誁臣讂볯늼볯뎼ꓥ낕臣鞼볯躼볯颼볯貁胣鎁苣覂臣鎼臣꺁ꓥ낕볯Ꞽ볯銼볯膀볯醼볯꒼胣誏臣Ꞽ볯鎼볯覼臣ꂍ苣覂苣ꚁ臣讂볯뎛볯閼迥뎁ꇨ閼볯芀戼㹲㰊䥄㹖胣ꢡ볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔰㘰㠱⸹楴≦㈾㈰㔰㘰㠱⸹楴쉦゠〰㔱㰷愯㰾䐯噉ਾ㰊䥄㹖胣醼볯醼볯醀⼼䥄㹖 뎛볯隼胣醼볯膀迥뎁볯颼臣膀볯늼볯뎼胣ꮼ볯ꆼ볯膀迥뎁볯늼볯뎼臣ꊂ苣붂菣ꦂ菣ꂃ臣릉闧蒚臣릂ꓥ낕臣릉闧Ꞁ苣鶁苣麁苣몤臣芀郥릂ꓥ낕苣覜臣讂藨趘臣辷闦銂ꇨ馁菣벃苣꾁胣ꎼ볯뎼볯ꦼ볯₣隽볯銼菣ꪃ菣릂臣覂藧袐臣龁胣鶁苣麁苣꺁苣龃菣뢅뷧鮏苣龔臣閁臣讂跥肸臣ꦡ鿥覤闧銂ꓧ馁胣蒐駧꺨臣蒐苣ꒂ苣閃苣벃菣꺁鳦节ꯩ뮠뫥꺁ꓥ낕苣낁觨꺁뛧鮎臣ꞁ볥뾪ꇨ몤臣讂胣ꢼ볯겼볯ꂀꇨ내菨込菣뎃菣蒵맧芀볯낼뷯覽뷯銽†뷯钽†뷯貽볯ꎼ뷯躽뷯薽뷯ₒ늼뷯鎽볯銼볯醼볯ₒ궼뷯馽†볯閼볯鞼볯袼볯邼볯骼볯钼볯鞼裢銼볯隼볯覼胣ં䐼噉邀볯邼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†諥袁臣膀볯Ꞽ볯늼臩궖胨Ꞁ苦薀臣꾁胣貺곦ꮼ볯ꆼ볯覤闧貁郥骮臣貂臣蒁苣芀볯ꆼ볯꾁胣ꖼ볯ꚼ볯꺁룤膵臣芁苣膀볯Ꞽ볯늼臩궖駧閳臣뺯臣讂胨Ꞁ臣龩뫥銂꟦邈臣讂臣ꢁ臣辂臣ꎁ臣蒁苣芀볯Ꞽ볯늼臩궖胨Ꞁ볯늼볯뎼ꓥ낕藨趘臣膀鳦躘듧뢛臣讖ꓧ꺁뗧邈觧誏臣릖돦銂뷤ꢔ臣ꚁ胣馨髧隌臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣醰闦꺁韧设臣꾁胣貐臣ꎂ胨ꞁ볯ꒁ믤誸臣ꮼ볯ꆼ볯覤闧貁郥骮臣貂臣袼鳦Ꞥ볯ꒁ臣낕臣讂ꓥ낕臣貐駦ꮁ駧龔볯芀臣꺁ꓥ낕꿧늛臣膀뗧뢅鯧뢅駧꺁룤ꆬ藨趘菣릂苣뎃苣覤闧鎽臣꾁냥ꪁ臣ꢁ苣蒁臣覂臣낕臣讂苣蚁臣芁苣袼볯覽뷯骽†뷯钽†뷯貽볯뒼뷯薽†뷯辽뷯薽뷯閽뷯膽뷯ₒ薽뷯辽뷯閽뷯覽뷯躽†뷯蚽†뷯莽뷯閽뷯銽뷯蒽†뷯薽뷯覽뷯钽뷯躽뷯薽†뷯辽†뷯膽뷯螽뷯钽뷯蒽†볯Ꞽ볯늼†뷯貽뷯莽뷯膽뷯薽†뷯躽†뷯辽뷯辽뷯薽뷯钽뷯貽†뷯膽뷯莽뷯銽뷯貼볯膽뷯閽뷯薽†볯颼볯骼볯鎼볯袼볯邼볯銼볯鮼볯覽뷯膽뷯薽†뷯钽†뷯貽볯ꖼ뷯薽뷯螽뷯躽뷯薽†뷯蚽†볯늼볯뎼†뷯閽뷯钽뷯辽뷯鎽†뷯躽뷯₄膽뷯醽뷯覽뷯薽뷯₄銽뷯鎽뷯鎽뷯膽뷯莽뷯₅钽뷯₏膽뷯钽뷯銈볯Ꞽ볯늼†뷯袽뷯銽뷯邽뷯ₙ覽뷯₎莽뷯貽뷯銽뷯莽뷯膽뷯₌莽뷯躽뷯薽뷯貼볯膽뷯閽뷯薽†볯颼볯骼볯鎼볯袼볯邼볯銼볯覼胣뎛볯馼臣膀볯Ꞽ볯늼臩궖胨Ꞁ苣늍뻥鞁臣貾臣貺곦ꮼ볯ꆼ볯覤闧銂ꓧ馁볯꒼뷯膽뷯ₚ薽뷯ₔ膽뷯躼볯袽뷯₅趽뷯貽뷯莽뷯貽뷯銽†뷯隽뷯貽뷯钽뷯辽뷯₎辽뷯₆膽뷯醽뷯覽뷯薽뷯₄銽뷯鎽뷯鎽뷯膽뷯莽뷯₅钽뷯₏钽뷯銽뷯薽뷯薽뷯₄ꖼ볯ꚼ볯₲芽뷯辽뷯讽뷯蒽뷯₅覽뷯₎莽뷯貽뷯銽뷯莽뷯膽뷯₌莽뷯躽뷯薽뷯鎽볯꺼뷯钽뷯銽뷯₅钼볯隼볯閼볯鞼볯銼볯醼볯覼볯芀鯥銼볯꾁胣ꖼ볯ꚼ볯꺁雦貾臣貺곦ꮼ볯ꆼ볯覤闧銂ꓧ馁볯궼뷯鎽뷯貽뷯₅薽뷯ₔ膽뷯躼볯趽뷯銽뷯薽뷯莽뷯₅辽뷯₆ꮼ볯ꆼ볯₳趽뷯膽뷯覽뷯躽뷯ₓ膽뷯蒽†뷯莽뷯閽뷯銽뷯蒽†뷯薽뷯覽뷯钽뷯躽뷯薽†뷯辽†뷯躽뷯覽裢ꖼ볯ꚼ볯₲钽뷯薽뷯膽뷯馽†뷯躽†뷯辽뷯辽뷯薽뷯钽뷯貽†뷯膽뷯莽뷯銽볯꺼뷯钽뷯銽뷯₅钼볯隼볯閼볯銼볯銼볯醼볯覼볯芀㰊䥄㹖胣醼볯醼볯醀⼼䥄㹖 뎛볯醼臣몤臣袂臣ꮁ胣꺼볯ꆼ볯节뗧뢅鯧뢅駧ꞁꓥ낕臣讂臣膀볯늼볯뎼苣誂苣뮠뫥貁뷤蒁胣ં䐼噉邀볯邼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†鳦龮雦设臣꾁胣醰臣辁臣节볯ꒁ臣뮴胦隌駧몁볤邭ꓥ낕菣鞃菣覃胣设臣낁胣醰臣辁臣节볯ꒁ臣뮴胦隌볯늼볯뎼ꓥ낕苣뎂菣覃臣讂뷯늼볯ꆼ苣ꮐ苣膀볯꺼볯貙菣꾂菣뎃苣開觧ꮁ諦躸臣讂胣ꢼ볯ꆼ猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰誼⼼畳㹰볯㲡畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯㲊猯灵醼볯骼볯醼†볯螽菣Ꚃ苣袼볯膽뷯辽뷯覽뷯膀돧놵볯隼볯邼볯膀뷯鶼볯覼臣龁臣ꢼ볯ꆼ裢ꆼ猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰誼⼼畳㹰볯骼볯醼†볯螽菣Ꚃ苣袼볯膽뷯辽뷯覽뷯膀돧놵볯隼볯馼볯膀뷯鶼볯覼臣覤闧讞볯늼볯뎼苣뎂菣覃臣讂뷯늼볯ꆼ苣ꆬ臣ꢁ臣誂諦躸臣讂胣醼韦꺛臣覤闧讞볯늼볯뎼苣뎂菣覃臣讂뷯늼볯ꆼ苣閊룤鞁胣颼韦꺛臣ꆎꇨ鞁胣醼볯ꖗ鯧ꮁꓥ낕黥ꮼ볯ꆼ볯銂苣벃菣馁苣趽볯꺼볯銂諦躸臣膀볯銼韦꺛臣開觧銂뇥몮臣龁胣ꚩ꣩꒾苣ꖻ룤꺁ꇨ隼臣몤臣芀戼㹲㰊䥄㹖胣ꢡ볯邼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲〵ㄶ㤸琮晩㸢〲〲〵ㄶ㤸琮晩ꃂ〰㄰㠵⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀볯邼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†뷯늼볯ꆼ臣膀볯躼볯趽뷯込뷯螽볯開觧銼볯螽뷥龁苣醼볯閽뷯覼臣ꢔ蟩ꞁ该ꦉ臣閊룤馁苣芀苣꾂苣鎃菣ꞁ臣趆裥肿볯骃菣膃菣鎽臣誂볯閽뷯込뷯貽볯銂胣Ꞽ뷯貽뷯覽볯貽뷯螽볯隃菣閃苣ꮃ苣뎃볯覼臣颭鳥许胣芑냦鎼볯ꚺ臣钼駦鎖胣ꚩ꣩馁苣芀듧麃蛥떂苣袃苣ꒂ菣鎟觨袼볯ꎼ볯覼苣膀볯늼볯뎼†볯醼볯꒼胣ꮼ볯ꆼ볯₳Ꞽ볯銼볯膀볯늼볯뎼†볯醼볯꒼胣ꮼ볯ꆼ볯₳Ꞽ볯銼볯뒼胣ꮼ볯ꆼ볯₳Ꞽ볯鎼볯뒼胣誏臣骃菣膃菣ꪁ臣ꮁ臣蒁臣ꚩ꣩馁苣芀㰊䥄㹖胣醼볯醼볯醀⼼䥄㹖 ꮼ볯ꆼ볯覤闧銂苣벃菣馁苣趽볯꺼볯貁볯내菨銂铧邈臣讂菨鮊苣ꚩ꣩馁苣芀볯늼볯뎼ꓥ낕苣뎂菣覃臣讂뷯늼볯ꆼ臣覜諥Ꞁ苣膀뻤袁臣膀菣鞃菣覃軦꺨臣钯볨馁苣芀㰊䥄㹖胣醼볯醼볯醀⼼䥄㹖 ꮼ볯ꆼ볯覤闧骃菣膃菣超裥誏臣趽볯꺼볯讧꿧ꦉ臣设苣ꢡ볯鲀볯ꮁꓧ馁胣㲂牢ਾ䐼噉邀ꇨ醼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔰㘰㠱⸹楴≦㈾㈰㔰㘰㠱⸹楴쉦゠〰㔱㰹愯㰾䐯噉ਾ㰊䥄㹖胣ꢡ볯銼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲〵ㄶ㤸琮晩㸢〲〲〵ㄶ㤸琮晩ꃂ〰㄰〶⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀ꇨ醼볯銈볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔰㘰㠱⸹楴≦㈾㈰㔰㘰㠱⸹楴쉦゠〰㘱㰱愯㰾䐯噉ਾ㰊䥄㹖胣ꢡ볯鎼裢銼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲〵ㄶ㤸琮晩㸢〲〲〵ㄶ㤸琮晩ꃂ〰㄰㈶⼼㹡⼼䥄㹖ਊ賥ꚭ髧Ꞁ돨骼뿤뺣苣ꪃ苣뎃볯醼裢ꆃ菣ꮃ苣ꖃ菣覃苣ꪃ苣뎃볯趽볯캑覼戼㹲궂菣莃菣骼볯醼戼㹲蚃菣ꮃ볯뒼볯邼볯㲐牢ਾ볯馀볯뒼볯超裥袼꣦隺볯馀菣ꦃ菣꾂볯ꚼ볯ꎔ铧讼볯鞼菩趽볯閼胢떼볯늼苣ꮐ苣覼볯骼볯ꎼ볯ꆼ볯ꎼ볯뒼볯뒼볯Ꞽ볯ꎼ볯ꎼ볯ꎼ볯뒼볯ꎼ볯Ꞽ볯ꆼ볯ꎼ볯ꆼ볯뒼볯ꎼ볯ꆼ볯뒼볯ꆼ볯뒼볯뒼볯Ꞽ볯Ꞽ볯ꆼ볯뒼볯ꆼ볯ꆼ볯ꆼ볯ꆼ볯ꆼ볯Ꞽ볯ꆼ볯ꆼ볯뒼볯ꆼ볯ꆼ볯Ꞽ볯ꆼ볯뒼볯뒼볯ꆼ볯ꆼ볯ꎼ볯ꆼ볯ꎼ볯超裥ꪕ迥鎼볯鎼볯㲉牢ਾ볯馀볯뒼볯超裥袼菣궃菣벃苣벃臣鞁볯骼볯Ꞽ볯ꆼ볯ꆼ볯ꆼ볯Ꞽ볯Ꞽ볯Ꞽ볯ꆼ볯ꆼ볯ꆼ볯Ꞽ볯Ꞽ볯ꆼ볯Ꞽ볯ꆼ볯ꆼ볯ꆼ볯ꆼ볯ꆼ볯Ꞽ볯Ꞽ볯ꎼ볯ꎼ볯袼藩鞈闧랏볯閼볯覼戼㹲鎼胢떼볯늼藩鞈볯銃菣鎼胢떼볯늼†볯芽뷯ꦼ臣鞁볯骼볯Ꞽ볯뒼볯ꆼ볯ꆼ볯Ꞽ볯뒼볯Ꞽ볯Ꞽ볯ꎼ볯ꎼ볯Ꞽ볯Ꞽ볯ꎼ볯ꆼ볯Ꞽ볯뒼볯ꎼ볯뒼볯ꎼ볯ꎼ볯뒼볯Ꞽ볯Ꞽ볯ꎼ볯ꎼ볯ꎼ볯ꎼ볯ꆼ볯ꎼ볯ꎼ볯뒼볯ꎼ볯ꎼ볯ꎼ볯뒼볯ꎼ볯뒼볯ꎼ볯ꎼ볯ꎼ볯뒼볯ꎼ볯ꎼ볯ꎼ볯뒼볯Ꞽ볯ꎼ볯뒼볯Ꞽ볯ꆼ볯ꆼ볯ꆼ볯뒼볯뒼볯ꆼ볯뒼볯Ꞽ볯ꎼ볯Ꞽ볯袼藩鞈闧랏볯閼볯覼㰊䥄㹖胣醼볯醼볯醀⼼䥄㹖 龮雦设볯躼뷯閼볯ꮁ臣蒁臣릂菣ꦃ苣릂菩趽臣覤闧誏臣떂苣것菣袃ꓥ낕臣趏뻥鞁臣龔臣讂胣鮃菣袃苣鶃菣袃胣㲍牢ਾ†볯閼볯몁볤邭볯ꎭ볥風迥뒼볯閼볯覼臣膀菣袃臣貙臣誁臣ꚁ臣讁臣ꦁ臣몁볤邭苣誂苣颫臣뮠뫥ꞁꓥ낕臣讂胣邽볯鎼臣龔臣讂ꓥ낕臣뮁臣鎂臣ꞁ胣鶁臣늂菣ꂃ뷤꺽臣醼뫤뺁臣꾁냥낕臣ꎂ胨꺁臣ꮁ觧覜臣芁苣龁苣膀臣蚁臣龁ꓥ낕臣膀觧骮臣ꎂ胨蚛鯥醐臣ꮁ꣨袨臣貂苣뮲駧꾃苣膃菣꺁臣膂臣趏뻥趃苣鞊軥ꢁ臣ꚁ뷤ꢔ臣趁臣蒁臣ꢁ臣Ꞥꛨꆨ苣鮃菣袃ꃧ뚩臣袂臣ꚁꓧ閁苣龁胣鞁臣鞁臣貁苣膀뷯閼볯몁볤邭뫥꺁냥떂菣뮂菣袃臣龮臣貀菣莃菣릂菣莃菣趀臣醃苣벃菣銂ꓧ鞁臣誁苣膀臣鎁臣꾁胣몁볤邭臣蒁臣ꒁ臣꺁뷤꺽臣뢛꿥蒚臣颫臣뮠뫥ꞁꓥ낕臣讂臣ꞁ臣讂胣鮚臣ꎁ臣鎁臣ꮁ胣趏뻥鞁臣覤闧馁苣鎁臣鞁臣颠鿥꺁ꓥꢃ裥貁胣ꢂ苣붂菣ꢁ苣뎃菣궃菣ꢁ臣莢闧颻뿨ꮁ귥ꢜ臣膀뷯늼볯ꆼ臣릂菣ꦃ苣랂菣낂ꧦ讧臣袂臣ꚁꫨ颭臣貂苣馨뫦꺁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈菣膃菣閃苣뒠ꏥ馁苣芀苣鞃菣ꒂ苣뎃苣ꊃ菣벃菣貁ꓥ낕臣讂臣膀뇥肉髧ꪁ苣龃菣뢅藩鞈臣꾁ꓥ隌臣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