(57)【要約】  本発明は、グルココルチコイド誘発性ＴＮＦ受容体（ＧＩＴＲ）に対して特異的に結合する抗体分子及びその抗原結合部分に関する。本発明の特定の側面によれば、前記抗体分子は、ヒトＧＩＴＲ及びカニクイザルＧＩＴＲに対して特異的に結合する。本発明の抗−ＧＩＴＲ抗体分子は、ネズミ抗−ＧＩＴＲ抗体６Ｃ８に由来するＣＤＲ配列を用いて開発され、そして最適化されて来た。前記抗体分子の医学的使用が開示されている。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の順序で配列中にアミノ酸を有するＨＣＤＲ１：Ｆ−Ｓ−Ｌ−Ｓ−Ｔ−Ｓ/Ｆ−Ｇ−Ｙ−Ｇ（配列番号７）；
以下の順序で配列中にアミノ酸を有するＨＣＤＲ２：Ｉ−Ｗ−Ｗ−Ｄ−Ｄ−Ｄ−Ｋ−Ｙ−Ｙ−Ｖ−Ｄ−Ｓ−Ｖ−Ｋ−Ｇ（配列番号８）；及び
以下の順序で配列中にアミノ酸を有するＨＣＤＲ３：Ｔ−Ｒ−Ｑ/Ｌ/Ｖ−Ｙ−Ｆ−Ｐ−Ｆ−Ａ（配列番号９）、を有するＨ鎖可変領域を含む、ヒトグルココルチコイド誘発ＴＮＦ受容体（ＧＩＴＲ）及びカニクイザルＧＩＴＲに対して特異的に結合するヒト、ヒト化又はキメラ抗体分子、又はその抗原結合部分。
【請求項２】
前記ＨＣＤＲ１が以下の順序で配列中にアミノ酸を含み：Ｇ−Ｆ−Ｓ−Ｌ−Ｓ−Ｔ−Ｓ/Ｆ−Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｖ−Ｇ（配列番号２５）；前記ＨＣＤＲ２が以下の順序で配列中にアミノ酸を含み：Ｌ−Ａ−Ｈ−Ｉ−Ｗ−Ｗ−Ｄ−Ｄ−Ｄ−Ｋ−Ｙ−Ｙ−Ｖ−Ｄ−Ｓ−Ｖ−Ｋ−Ｇ（配列番号２６）：そして前記ＨＣＤＲ３が以下の順序で配列中にアミノ酸を含む：Ｔ−Ｒ−Ｑ/Ｌ/Ｖ−Ｙ−Ｆ−Ｐ−Ｆ−Ａ−Ｙ（配列番号２７）、請求項１に記載の抗体分子又はその抗原結合部分。
【請求項３】
以下の順序で配列中にアミノ酸を有するＨＣＤＲ１：Ａ−Ｓ−Ｑ−Ｎ/Ｓ−Ｖ−Ｇ−Ｔ/Ｓ−Ｎ（配列番号１６）；
以下の順序で配列中にアミノ酸を有するＨＣＤＲ２：Ｓ/Ｙ−Ａ−Ｓ−Ｙ/Ｎ−Ｒ−Ｙ−Ｓ/Ｔ（配列番号１７）；及び
以下の順序で配列中にアミノ酸を有するＨＣＤＲ３:Ｙ−Ｓ−Ｔ/Ｎ−Ｄ−Ｐ−Ｌ（配列番号１８）を有するＬ鎖可変領域を含む、請求項１又は２に記載の抗体分子又はその抗原結合部分。
【請求項４】
前記ＨＣＤＲ１が以下の順序で配列中にアミノ酸を含み：Ｒ−Ａ−Ｓ−Ｑ−Ｎ/Ｓ−Ｖ−Ｇ−Ｔ/Ｓ−Ｎ−Ｌ−Ａ（配列番号２８）；前記ＨＣＤＲ２が以下の順序で配列中にアミノ酸を含み：Ｓ/Ｙ−Ａ−Ｓ−Ｙ/Ｎ−Ｒ−Ｙ−Ｓ/Ｔ（配列番号１７）：そして前記ＨＣＤＲ３が以下の順序で配列中にアミノ酸を含む：Ｑ−Ｑ−Ｙ−Ｓ−Ｔ/Ｎ−Ｄ−Ｐ−Ｌ−Ｔ（配列番号１７３）、請求項３に記載の抗体分子又はその抗原結合部分。
【請求項５】
(a) アミノ酸配列 ＧＦＳＬＳＴＳＧＹＧＶＧ (配列番号２９) (ＨＣＤＲ１)、 ＬＡＨＩＷＷＤＤＤＫＹＹＶＤＳＶＫＧ (配列番号２６) (ＨＣＤＲ２)、 ＴＲＱＹＦＰＦＡＹ (配列番号３１) (ＨＣＤＲ３)、 ＲＡＳＱＳＶＧＳＮＬＡ (配列番号３２) (ＬＣＤＲ１)、 ＳＡＳＹＲＹＴ (配列番号３３) (ＬＣＤＲ２)及び ＱＱＹＳＴＤＰＬＴ (配列番号３４) (ＬＣＤＲ３) [クローンＤ＿Ａ６];又は
(b) アミノ酸配列ＧＦＳＬＳＴＦＧＹＧＶＧ (配列番号３５) (ＨＣＤＲ１)、 ＬＡＨＩＷＷＤＤＤＫＹＹＶＤＳＶＫＧ (配列番号２６) (ＨＣＤＲ２)、 ＴＲＱＹＦＰＦＡＹ (配列番号３１) (ＨＣＤＲ３)、 ＲＡＳＱＳＶＧＴＮＬＡ (配列番号３６)（ＬＣＤＲ１）、 ＹＡＳＹＲＹＴ (配列番号３７) (ＬＣＤＲ２) 及びＱＱＹＳＮＤＰＬＴ (配列番号３８) (ＬＣＤＲ３) [クローンＧ＿Ｇ１０]; 又は
(c) アミノ酸配列ＧＦＳＬＳＴＳＧＹＧＶＧ (配列番号２９) (ＨＣＤＲ１)、 ＬＡＨＩＷＷＤＤＤＫＹＹＶＤＳＶＫＧ (配列番号２６)  (ＨＣＤＲ２)、 TＲＬＹＦＰＦＡＹ (配列番号３９) (ＨＣＤＲ３)、 ＲＡＳＱＮＶＧＳＮＬＡ (配列番号４０) (ＬＣＤＲ１)、 ＳＡＳＮＲＹＳ (配列番号４１) (ＬＣＤＲ２)及び ＱＱＹＳＴＤＰＬＴ (配列番号３４)  (ＬＣＤＲ３) [クローンＩ＿Ｃ２]; 又は
(d) アミノ酸配列ＧＦＳＬＳＴＳＧＹＧＶＧ (配列番号２９) (ＨＣＤＲ１)、 ＬＡＨＩＷＷＤＤＤＫＹＹＶＤＳＶＫＧ (配列番号２６) (HＣＤＲ２)、 ＴＲＶＹＦＰＦＡＹ (配列番号４２) （ＨＣＤＲ３)、 ＲＡＳＱＮＶＧＴＮＬＡ (配列番号４３) (ＬＣＤＲ１)、 ＳＡＳＹＲＹＴ (配列番号３３) (ＬＣＤＲ２) 及び ＱＱＹＳＴＤＰＬＴ (配列番号３４)  (ＬＣＤＲ３) [クローンＨ＿Ｂ３]; 又は
(e) アミノ酸配列ＧＦＳＬＳＴＳＧＹＧＶＧ (配列番号２９) (ＨＣＤＲ１)、 ＬＡＨＩＷＷＤＤＤＫＹＹＶＤＳＶＫＧ 配列番号２６) (ＨＣＤＲ２)、 ＴＲＱＹＦＰＦＡＹ (配列番号３１) (ＨＣＤＲ３)、 ＲＡＳＱＳＶＧＳＮＬＡ (配列番号３２)  （ＬＣＤＲ１)、 ＳＡＳＮＲＹＴ (配列番号４４) (ＬＣＤＲ２) 及び ＱＱＹＳＴＤＰＬＴ (配列番号３４) (ＬＣＤＲ３) [クローンＡ６．１]を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体分子又はその抗原結合部分。
【請求項６】
アミノ酸配列ＧＦＳＬＳＴＳＧＹＧＶＧ (配列番号２９) (ＨＣＤＲ１)、ＬＡＨＩＷＷＤＤＤＫＹＹＶＤＳＶＫＧ (配列番号２６) (ＨＣＤＲ２)、ＴＲＱＹＦＰＦＡＹ (配列番号３１) (ＨＣＤＲ３)、ＲＡＳＱＳＶＧＳＮＬＡ (配列番号３２) (ＬＣＤＲ１)、ＳＡＳＹＲＹＴ (配列番号３３) (ＬＣＤＲ２) 及び ＱＱＹＳＴＤＰＬＴ (配列番号３４) (ＬＣＤＲ３) [クローンＤ＿Ａ６]を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体分子又はその抗原結合部分。
【請求項７】
国際公開第２００６／１０５０２１号において「ＨｕＮ６Ｃ８−Ａｇｌｙ」として標識されたヒト化ネズミ抗−ＧＩＴＲ  ＩｇＧ抗体と比較して、ＧＩＴＲ活性化が改善されている、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体分子又はその抗原結合部分。
【請求項８】
国際公開第２００６／１０５０２１号において「ＨｕＮ６Ｃ８−Ａｇｌｙ」として標識されたヒト化ネズミ抗−ＧＩＴＲ  ＩｇＧ抗体と比較して、イン・シリコ免疫原性が改善されている、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体分子又はその抗原結合部分。
【請求項９】
国際公開第２００６／１０５０２１号において「ＨｕＮ６Ｃ８−Ａｇｌｙ」として標識されたヒト化ネズミ抗−ＧＩＴＲ  ＩｇＧ抗体と比較して、カニクイザルＧＩＴＲに対する親和性が改善されている、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体分子又はその抗原結合部分。
【請求項１０】
翻訳後修飾部位、例えばグリコシル化部位、脱アミノ化部位、リン酸化部位又は異性化／断片化部位を除去する１又は２以上の置換、欠失又は挿入を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体分子又はその抗原結合部分。
【請求項１１】
ＣＤＲが挿入されている１又は２以上のヒト可変ドメインフレームワーク足場を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗体分子又はその抗原結合部分。
【請求項１２】
対応するＨＣＤＲ配列が挿入されているＩＧＨＶ３−７ヒト生殖系列足場を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体分子又はその抗原結合部分。
【請求項１３】
対応するＨＣＤＲ配列が挿入されているＩＧＫＶ３−１１ヒト生殖系列足場を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体分子又はその抗原結合部分。
【請求項１４】
免疫学的に不活性な定常領域を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗体分子又はその抗原結合部分。
【請求項１５】
Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、四量体抗体、四価抗体、多重特異性抗体（例えば、二価抗体）、ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、モノクローナル抗体 又は融合タンパク質である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体分子又はその抗原結合部分。
【請求項１６】
治療剤に結合された請求項１〜１５のいずれか１項に記載の抗体分子又はその抗原結合部分を含む免疫複合体。
【請求項１７】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の抗体分子又はその抗原結合部分を含む免疫複合体をコードする核酸分子。
【請求項１８】
請求項１７に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１９】
請求項１７に記載の核酸分子又は請求項１８に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２０】
抗−ＧＩＴＲ抗体及び／又はその抗原結合部分の生成方法であって、前記抗体及び／又はその抗原結合部分の発現及び／又は生成をもたらす条件下で、請求項１９に記載の宿主細胞を培養し、そして前記宿主細胞又は培養物から抗体及び／又はその抗原結合部分を単離する方法。
【請求項２１】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の抗体分子又はその抗原結合部分、又は請求項１７に記載の核酸分子、又は請求項１８に記載のベクターを含む医薬組成物。
【請求項２２】
対象における免疫応答を増強するための方法であって、有効量の請求項１〜１５のいずれか１項に記載の抗体分子又はその抗原結合部分、又は請求項１６に記載の免疫複合体、又は請求項１７に記載の核酸分子、又は請求項１８に記載のベクター、又は請求項２１に記載の医薬組成物を投与することを含む方法。
【請求項２３】
対象における癌の治療又は予防方法であって、有効量の請求項１〜１５のいずれか１項に記載の抗体分子又はその抗原結合部分、又は請求項１６に記載の免疫複合体、又は請求項１７に記載の核酸分子、又は請求項１８に記載のベクター、又は請求項２１に記載の医薬組成物を投与することを含む方法。
【請求項２４】
前記癌が、膵臓癌、メラノーマ、乳癌、肺癌、気管支癌、結腸直腸癌、前立腺癌、胃癌、卵巣癌、膀胱癌、脳又は中枢神経系の癌、末梢神経系癌、食道癌、子宮頸癌、子宮癌又は子宮内膜癌、口腔癌又は咽頭癌、肝臓癌、腎臓癌、精巣癌、胆道癌、小腸又は虫垂癌、唾液腺癌、甲状腺癌、副腎癌、骨肉腫、軟骨肉腫、及び血液組織の癌から成る群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
癌の治療への使用のための、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の抗体分子又はその抗原結合部分、又は請求項１６に記載の免疫複合体、又は請求項１７に記載の核酸分子、又は請求項１８に記載のベクター、又は請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
前記抗体、その抗原結合部分、免疫複合体、核酸、ベクター又は医薬組成物が、第２の治療剤、例えば抗癌剤と組合して、別々に、連続して、又は同時に使用するためのものである、請求項２５に記載の抗体分子又はその抗原結合部分、又は免疫複合体、又は核酸分子、又は使用のためのベクター、又は請求項２３又は２４に記載の治療方法。
【請求項２７】
癌の治療のための薬物の製造のためへの、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の抗体分子又はその抗原結合部分、又は請求項１６に記載の免疫複合体、又は請求項１７に記載の核酸分子、又は請求項１８に記載のベクター、又は請求項２１に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２８】
ヒトＧＩＴＲ及びカニクイザルＧＩＴＲに対して特異的結合する抗体分子又はその抗原結合部分の生成方法であって、
（１）ヒト化抗−ＧＩＴＲ抗体分子又はその抗原結合部分を生成するために、非ヒト源からの抗−ＧＩＴＲ  ＣＤＲをヒトｖドメインフレームワークに移植する工程；
（２）ＣＤＲにおいて１又は２以上の変異を含むヒト化抗−ＧＩＴＲ抗体分子又はその抗原結合部分のクローンのファージライブラリーを生成する工程；
（３）ヒトＧＩＴＲ及びカニクイザルＧＩＴＲに結合するためのファージライブラリーをスクリーニングし；
（４）ヒトＧＩＴＲ及びカニクイザルＧＩＴＲに対する結合特異性を有するクローンを、工程（３）から選択する工程；及び
（５）工程（４）から選択されたクローンから、ヒトＧＩＴＲ及びカニクイザルＧＩＴＲ又はその抗原結合部分に対して特異的に結合する抗体分子を生成する工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルココルチコイド誘発ＴＮＦ受容体（ＧＩＴＲ）に対して特異的に結合する抗体、及びその医学的用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＧＩＴＲ（ＴＮＦＲＳＦ１８とも呼ばれる）は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーの共刺激メンバーである。ＧＩＴＲの発現は、主にＴ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞上で、及び程度は低いが、他のいくつかの造血細胞型上でも観察されている。ＧＩＴＲは、静止Ｔ及びＮＫ細胞において低い発現を示しているが、しかしＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）においては構成的に高レベルの発現を示す。ＧＩＴＲリガンド又はアゴニスト抗−ＧＩＴＲ抗体によるＧＩＴＲのインビトロ又はインビボ関与は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の拡大を引起し、そしてＴｒｅｇによる抑制に対するＴ細胞の耐性を改善する。
【０００３】
前臨床証拠は、ＧＩＴＲシグナル伝達の誘導がエフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆｓ）の活性化を増強し、そして実験的腫瘍においてＴｒｅｇｓの活性を低めることを示唆している。アゴニスト抗−ＧＩＴＲ  ｍＡｂｓの投与は、内因性Ｔｅｆｆ応答の増強、腫瘍微小環境におけるＴｒｅｇｓの頻度の低下、及び複数のネズミ腫瘍モデルにおけるその後の腫瘍拒絶につながる。従って、抗−ＧＩＴＲ  ｍＡｂｓは、癌及び他の環境において免疫治療剤として作用する可能性を有し、そしてまた、現在確立されている癌免疫療法の有効性を増強する可能性を有する。
【０００４】
現在承認されている抗体治療薬の大部分は、免疫化された齧歯類に由来している。それらの抗体のほとんどは、ヒトｖ−遺伝子フレームワーク配列へのネズミＣＤＲの「移植」を通して、「ヒト化」として知られている工程を経ている（Nelson et al., 2010, Nat Rev Drug Discov 9: 767-774を参照のこと）。この工程はしばしば不正確であり、そして得られる抗体の標的結合親和性の低下につながります。元の抗体の結合親和性に戻すために、マウス残基が、移植されたｖ−ドメインの可変ドメインフレームワークの重要な位置に通常、導入される（「復帰突然変異（back-mutations）」としても知られている）。
【０００５】
ＣＤＲ移植及び復帰突然変異を介してヒト化された抗体は、完全にネズミｖ−ドメインを有するそれらの抗体に比較して、診療所におけるより低い免疫応答率を誘導することが示されているが、この基本的な移植方法を用いてヒト化された抗体は、移植されたＣＤＲループにまた収容されている潜在的な物理的不安定性及び免疫原性モチーフのために、依然として、重大な臨床開発リスクを抱えている。タンパク質の免疫原性の動物試験はしばしば、ヒトにおいて免疫応答を予測しないので、治療使用のための抗体工学は、精製されたタンパク質における予測されるヒトＴ細胞エピトープ含有量、非ヒト生殖系列アミノ酸含有量及び凝集能力の最小化に焦点を当てている。
【０００６】
従って、理想的なヒト化アゴニスト抗−ＧＩＴＲ抗体は、良く特徴づけられたヒト生殖系列配列のフレームワーク及びＣＤＲの両者に見出されている残基とｖ−ドメインにおいて可能な限り多くの同一の残基を有するであろう。Townsend et al. (2015; PNAS 112: 15354-15359)は、ラット、ウサギ及びマウス抗体に由来するＣＤＲが好ましいヒトフレームワークに移植され、そして次に、「拡張された二元置換（Augmented Binary Substitution）」と呼ばれるヒト生殖系列アプローチを受ける抗体を生成する方法を記載している。このアプローチは元の抗体パラトープに基本的可塑性を示したが、非常に正確な抗体−抗原共結晶構造データの不在下で、いずれか特定の抗体のＣＤＲループ内のどの残基がヒト生殖系列にどのような組合せで変換されるかを確実に予測することはまだ不可能である。
【０００７】
従って、分子の複数の機能特性、この場合、以下の特性が好ましくは、維持されるべきであるので、ＣＤＲ生殖系列は複雑で多因子の問題である：標的結合特異性、ヒト及び動物試験種（例えば、Macaca fascicularisとして知られているカニクイザル）の両方からのＧＩＴＲに対する親和性、ｖ−ドメイン生物物理学的安定性及び／又はＩｇＧ発現収量。抗体工学の研究が、主要なＣＤＲにおける単一の残基位置でさえ、それらのすべての望ましい分子特性に劇的な影響を与えることができることを示している。
【０００８】
国際公開第２００６／１０５０２１号は、「６Ｃ８」と呼ばれるアゴニストマウス抗−ＧＩＴＲ  ＩｇＧ分子及びまた、６Ｃ８のヒト化形の調製を記載している。それらの６Ｃ８のヒト化形は、従来のヒト化技法を用いて、すなわちＫａｂａｔで定義されたネズミＣＤＲを、ヒトＨ及びＬ鎖フレームワーク配列に、及び対応する位置にある６Ｃ８ネズミ残基に戻し突然変異されたヒトフレームワーク残基の一部に移植することにより生成された。潜在的なグリコシル化部位を修飾するために、６Ｃ８のＫａｂａｔ定義のネズミＣＤＲの１つに対する１つのアミノ酸修飾のみが、国際公開第２００６／１０５０２１号に記載されている。上記の理由により、国際公開第２００６／１０５０２１号に記載される６Ｃ８のそのようなヒト化形は理想的ではない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、多数の最適化された抗−ＧＩＴＲ抗体及びその医学的用途を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の１つの側面によれば、ヒトＧＩＴＲ及び任意には、またカニクイザルＧＩＴＲに対して特異的に結合する抗体分子、又はその抗原結合部分が提供され、ここで前記抗体分子又はその抗原結合部分は、以下を有するＨ鎖可変領域を含み：
以下の順序で配列中にアミノ酸を有するＨＣＤＲ１：Ｇ−Ｆ−Ｓ、又はＳ−Ｌの保存的置換、又はＬ−Ｓ−Ｔの保存的置換、又はＴ−Ｓ又は任意のアミノ酸（例えば、Ｆ）−Ｇの保存的置換、又はＧ−Ｍの保存的置換、又は任意のアミノ酸（例えば、Ｙ、Ｆ、Ｌ又はＷ）−Ｇ、又はＧ−Ｖの保存的置換、又はＶ−Ｇの保存的置換、又はＧの保存的置換（配列番号１）；
以下の順序で配列中にアミノ酸を有するＨＣＤＲ２：Ｌ、又はＬ−Ａの保存的置換、又はＡ−Ｈの保存的置換、又はＨ−Ｉの保存的置換、又はＩ−Ｗ−Ｗ−Ｄの保存的置換、又はＤ−Ｄの保存的置換、又はＤ−Ｄの保存的置換、又はＤ−Ｋ−Ｙ−Ｙ−Ｎの保存的置換、又は任意のアミノ酸（例えば、Ｖ）−Ｐ、又は任意のアミノ酸（例えば、Ｄ）−Ｓ−Ｌ、又はＬ−Ｋ−Ｓの保存的置換、又は任意のアミノ酸（例えば、Ｇ）（配列番号２）；及び
以下の順序で配列中にアミノ酸を有するＨＣＤＲ３：Ｔ、又は任意のアミノ酸（例えば、Ｇ，Ａ，Ｎ，Ｓ又はＩ）−Ｒ、又は任意のアミノ酸（例えば、Ｄ、Ｔ又はＶ）−Ｒ、又は任意のアミノ酸（例えば、Ｑ、Ｌ、Ｍ、Ｉ又はＶ）−Ｙ−Ｆ、又はＦ−Ｐ−Ｆ−Ａ−Ｙの保存的置換（配列番号３）；
そしてＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２又はＨＣＤＲ３の少なくとも１つは、それぞれ、アミノ酸配列ＧＦＳＬＳＴＳＧＭＧＶＧ (配列番号４; ６Ｃ８ ネズミＨＣＤＲ１)、 ＬＡＨＩＷＷＤＤＤＫＹＹＮＰＳＬＫＳ (配列番号５; ６Ｃ８ ネズミＨＣＤＲ２)、 ＬＡＨＩＷＷＤＤＤＫＹＹＱＰＳＬＫＳ (配列番号６５; ６Ｃ８ 変異体ＨＣＤＲ２) 及びＴＲＲＹＦＰＦＡＹ (配列番号 ６; ６Ｃ８ ネズミ ＨＣＤＲ３)と比較して許容される、少なくとも１つのアミノ酸の差異を有する。
【００１１】
本発明の別の側面によれば、抗体分子又はその抗体結合部分は、
以下の順序で配列中にアミノ酸を有するＨＣＤＲ１：Ｆ−Ｓ−Ｌ−Ｓ−Ｔ−Ｓ/Ｆ−Ｇ−Ｙ−Ｇ（配列番号７）；
以下の順序で配列中にアミノ酸を有するＨＣＤＲ２：Ｉ−Ｗ−Ｗ−Ｄ−Ｄ−Ｄ−Ｋ−Ｙ−Ｙ−Ｖ−Ｄ−Ｓ−Ｖ−Ｋ−Ｇ（配列番号８）；及び
以下の順序で配列中にアミノ酸を有するＨＣＤＲ３：Ｔ−Ｒ−Ｑ/Ｌ/Ｖ−Ｙ−Ｆ−Ｐ−Ｆ−Ａ（配列番号９）、を有するＨ鎖可変領域を含む。
【００１２】
本発明の好ましい側面によれば、抗体分子は、ヒトＧＩＴＲ及びまた、カニクイザルＧＩＴＲに対して特異的に結合する。
【００１３】
抗体分子又は抗原結合部分はさらに、以下を有するＬ鎖可変領域を含むことがでる：
以下の順序で配列中にアミノ酸を有するＬＣＤＲ１：Ｋ、又はＫ−Ａの保存的置換、又はＡ−Ｓ−Ｑ−Ｎの保存的置換、又はＮ−Ｖ−Ｇの保存的置換、又はＧ−Ｔの保存的置換、又はＴ−Ｎの保存的置換、又は任意のアミノ酸（例えば、Ｙ）−Ｖ、又はＶ−Ａの保存的置換（配列番号１０）；
以下の順序で配列中にアミノ酸を有するＬＣＤＲ２：Ｓ、又は任意のアミノ酸（例えば、Ｙ、Ｅ、Ｄ、Ｆ、Ｌ又はＮ）−Ａ−Ｓ、又は任意のアミノ酸（例えば、Ｙ）−Ｙ、又は任意のアミノ酸（例えば、Ｎ）−Ｒ−Ｙ、又は任意のアミノ酸（例えば、Ａ又はＤ）−Ｓ、又はＳの保存的置換（配列番号１１）；及び
以下の順序で配列中にアミノ酸を有するＬＣＤＲ３：Ｑ−Ｑ、又はＧ−Ｙの保存的置換、又は任意のアミノ酸（例えば、Ｒ又はＨ）−Ｎ、又はＮ−Ｔの保存的置換、又は任意のアミノ酸（例えば；Ｋ又はＮ）−Ｄ、又は任意のアミノ酸（例えば、Ｗ、Ｌ、Ｓ、Ｅ、Ｖ又はＮ）−Ｐ−Ｌ−Ｔ（配列番号１２）：
そしてＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、又はＬＣＤＲ３の少なくとも１つは、それぞれ、アミノ酸配列ＫＡＳＱＮＶＧＴＮＶＡ  (配列番号１３) (６Ｃ８ ネズミ ＬＣＤＲ１)、ＳＡＳＹＲＹＳ (配列番号1４) (６Ｃ８ ネズミ ＬＣＤＲ２) 及び ＱＱＹＮＴＤＰＬＴ (配列番号１５) (６Ｃ８ ネズミ ＬＣＤＲ３)と比較して許容される、少なくとも１つのアミノ酸の差異を有する。
【００１４】
別の側面によれば、本発明の抗体分子又は抗原結合部分は、
以下の順序で配列中にアミノ酸を有するＨＣＤＲ１：Ａ−Ｓ−Ｑ−Ｎ/Ｓ−Ｖ−Ｇ−Ｔ/Ｓ−Ｎ（配列番号１６）；
以下の順序で配列中にアミノ酸を有するＨＣＤＲ２：Ｓ/Ｙ−Ａ−Ｓ−Ｙ/Ｎ−Ｒ−Ｙ−Ｓ/Ｔ（配列番号１７）；及び
以下の順序で配列中にアミノ酸を有するＨＣＤＲ３:Ｙ−Ｓ−Ｔ/Ｎ−Ｄ−Ｐ−Ｌ（配列番号１８）を有するＬ鎖可変領域を含む。
【００１５】
本発明によれば、治療剤に連結された本明細書に定義されるような抗体分子又はその抗原結合部分を含む免疫複合体もまた提供される。
【００１６】
別の側面によれば、本発明は、本明細書において定義されるような抗体分子又はその抗原結合部分をコードする核酸分子を提供する。
【００１７】
本発明の核酸分子を含むベクターが、さらに提供される。
【００１８】
本明細書において定義されるような本発明の核酸分子又はベクターを含む宿主細胞もまた提供される。
【００１９】
さらなる側面によれば、本発明の宿主細胞を、抗体及び／又はその抗原結合部分の発現及び／又は生成をもたらす条件下で培養し、そして前記宿主細胞又は培養物から抗体及び／又はその抗原結合部分を単離することを含む、抗−ＧＩＴＲ抗体及び／又はその抗原結合部分の生成方法が提供される。
【００２０】
本発明の別の側面によれば、本明細書に定義されるような発明の抗体分子又はその抗原結合部分、又は本明細書に定義されるような発明の核酸分子、又は本明細書に定義されるような発明のベクターを含む医薬組成物が提供される。
【００２１】
有効量の本明細書に定義されるような発明の抗体分子又はその抗原結合部分、又は本明細書に定義されるような発明の免疫複合体、又は本明細書に定義されるような発明の核酸分子、又は本明細書に定義されるような発明のベクター、又は本明細書に定義されるような発明の医薬組成物を投与することを含む、対象における免疫応答を増強するための方法がさらに提供される。
【００２２】
さらなる側面によれば、有効量の本明細書に定義されるような発明の抗体分子又はその抗原結合部分、又は本明細書に定義されるような発明の免疫複合体、又は本明細書に定義されるような発明の核酸分子、又は本明細書に定義されるような発明のベクター、又は本明細書に定義されるような発明の医薬組成物を投与することを含む、対象における癌の治療又は予防方法が提供される。
【００２３】
本発明はまた、癌の治療への使用のための、本明細書に定義されるような発明の抗体分子又はその抗原結合部分、又は本明細書に定義されるような発明の免疫複合体、又本明細書に定義されるような発明の核酸分子、又は本明細書に定義されるような発明のベクター、又は本明細書に定義されるような発明の医薬組成物を提供する。
【００２４】
別の側面によれば、本発明は、第２の治療剤、例えば抗癌剤と組合して、別々に、連続して、又は同時に使用するための、抗体分子、又はその抗原結合部分、又は免疫複合体、又は核酸分子、又は使用のためのベクター、又は本明細書に定義されるような発明の治療方法を提供する。
【００２５】
さらなる側面によれば、癌の治療のための薬物の製造のためへの、本明細書に定義されるような発明の抗体分子又はその抗原結合部分、又は本明細書に定義されるような発明の免疫複合体、又は本明細書に定義されるような発明の核酸分子、又は本明細書に定義されるような発明のベクター、又は本明細書に定義されるような発明の医薬組成物の使用が提供される。
【００２６】
本発明はまた、
（１）ヒト化抗−ＧＩＴＲ抗体分子又はその抗原結合部分を生成するために、非ヒト源からの抗−ＧＩＴＲ  ＣＤＲをヒトｖドメインフレームワークに移植する工程；
（２）ＣＤＲにおいて１又は２以上の変異を含むヒト化抗−ＧＩＴＲ抗体分子又はその抗原結合部分のクローンのファージライブラリーを生成する工程；
（３）ヒトＧＩＴＲ及びカニクイザルＧＩＴＲに結合するためのファージライブラリーをスクリーニングし；
（４）ヒトＧＩＴＲ及びカニクイザルＧＩＴＲに対する結合特異性を有するクローンを、工程（３）から選択する工程；及び
（５）工程（４）から選択されたクローンから、ヒトＧＩＴＲ及びカニクイザルＧＩＴＲ又はその抗原結合部分に対して特異的に結合する抗体分子を生成する工程を含む、ヒトＧＩＴＲ及びカニクイザルＧＩＴＲに対して特異的結合する抗体分子又はその抗原結合部分の生成方法も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、ヒトＧＩＴＲ−ＦｃへのＩｇＧ結合についての直接的滴定ＥＬＩＳＡを示す。ヒトＩｇＧ形式でのキメラ抗−ＧＩＴＲ及びヒト生殖系列移植片が、ヒトＧＩＴＲ−Ｆｃタンパク質に対して滴定された（μｇ／ｍｌ）。キメラＩｇＧ（ＶＨ１及びＶＬ３ファミリー）と同等の結合活性を示すクローンをＡで示し、そして結合障害のあるそれら（ＶＨ２及びＶＨ４ファミリー）をＢで示す。各グラフにおいて、Ｘ軸はμｇ／ｍｌでのＩｇＧ濃度を示し、そしてＹ軸は結合シグナル（ＯＤ  ４５０ｎm）を示す。
【００２８】
【図２】図２は、ＧＩＴＲ  Ｊｕｒｋａｔ細胞レポーターアッセイ（ＧＩＴＲアゴニズム）を示す。ヒトＩｇＧ１形式でのヒト生殖系列移植抗体を、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＧＩＴＲ＋Ｊｕｒｋａｔ細胞レポーターアッセイに適用した。このアッセイは、移植片ファミリーＶＨ１、ＶＨ３及びＶＨ４におけるＩｇＧの中で、クローンＶＨ３／ＶＬ２がもっとも強力な濃度依存性アゴニスト活性を示したことを示した。移植片のＶＨ２ファミリーは、ＥＬＩＳＡによる効果的な標的結合の欠如のために省略された。Ｘ軸はｎｇ／ｍｌでのｍＡｂの濃度を示し、そしてＹ軸は誘導倍率を示す。図においては、「ＬＭ」はリガンドマルチマーを示し、そして「Ｃ」は対照を示す。
【００２９】
【図３Ａ】図３は、ヒト及びカニクイザルＧＩＴＲ−Ｆｃタンパク質に対するライブラリー由来抗−ＧＩＴＲ  ｓｃＦｖの直接的結合ＥＬＩＳＡを示す。ＡはブランチＡ ｐｅｒｉｐｒｅｐ ＥＬＩＳＡ（ヒト−カニクイザル−ヒト−カニクイザル）を示し、ＢはブランチＢ ｐｅｒｉｐｒｅｐ ＥＬＩＳＡ（カニクイザル−ヒト−カニクイザル−ヒト）を示しそしてＣはブランチＣ ｐｅｒｉｐｒｅｐ ＥＬＩＳＡ（ヒト−ヒト−ヒト−ヒト）を示す。クローンは、３つの別個のファージ選択ブランチ（Ａ、Ｂ、Ｃ）に由来し、ここでファージ集団んは、各ラウンドでビオチン化ヒト（ｈｕｍ）又はカニクイザル（ｃｙｎｏ）ＧＩＴＲ−Ｆｃタンパク質に基いて選択された。選択の各ラウンドの後、９２のライブラリー由来のクローン（黒丸）及び１ラウンド当たり２つの陽性対照（灰色の星）及び２つの陰性対照ｓｃＦｖ（灰色の正方形）が、ヒト及びカニクイザルＧＩＴＲ−Ｆｃの両方に対してスクリーニングされた。各ラウンドにおける平均±ＳＤ値は、灰色のバーで示されている。各グラフにおいては、Ｘ軸は選択ラウンド（「Ｒ」）を示し、そして「Ｈ」はヒトを示し、そして「Ｃ」は、カニクイザルを示し、そしてＹ軸は結合シグナル（ＯＤ  ４５０ｎｍ）を示す。
【００３０】
【図３Ｂ】図３は、ヒト及びカニクイザルＧＩＴＲ−Ｆｃタンパク質に対するライブラリー由来抗−ＧＩＴＲ  ｓｃＦｖの直接的結合ＥＬＩＳＡを示す。ＡはブランチＡ ｐｅｒｉｐｒｅｐ ＥＬＩＳＡ（ヒト−カニクイザル−ヒト−カニクイザル）を示し、ＢはブランチＢ ｐｅｒｉｐｒｅｐ ＥＬＩＳＡ（カニクイザル−ヒト−カニクイザル−ヒト）を示しそしてＣはブランチＣ ｐｅｒｉｐｒｅｐ ＥＬＩＳＡ（ヒト−ヒト−ヒト−ヒト）を示す。クローンは、３つの別個のファージ選択ブランチ（Ａ、Ｂ、Ｃ）に由来し、ここでファージ集団んは、各ラウンドでビオチン化ヒト（ｈｕｍ）又はカニクイザル（ｃｙｎｏ）ＧＩＴＲ−Ｆｃタンパク質に基いて選択された。選択の各ラウンドの後、９２のライブラリー由来のクローン（黒丸）及び１ラウンド当たり２つの陽性対照（灰色の星）及び２つの陰性対照ｓｃＦｖ（灰色の正方形）が、ヒト及びカニクイザルＧＩＴＲ−Ｆｃの両方に対してスクリーニングされた。各ラウンドにおける平均±ＳＤ値は、灰色のバーで示されている。各グラフにおいては、Ｘ軸は選択ラウンド（「Ｒ」）を示し、そして「Ｈ」はヒトを示し、そして「Ｃ」は、カニクイザルを示し、そしてＹ軸は結合シグナル（ＯＤ  ４５０ｎｍ）を示す。
【００３１】
【図３Ｃ】図３は、ヒト及びカニクイザルＧＩＴＲ−Ｆｃタンパク質に対するライブラリー由来抗−ＧＩＴＲ  ｓｃＦｖの直接的結合ＥＬＩＳＡを示す。ＡはブランチＡ ｐｅｒｉｐｒｅｐ ＥＬＩＳＡ（ヒト−カニクイザル−ヒト−カニクイザル）を示し、ＢはブランチＢ ｐｅｒｉｐｒｅｐ ＥＬＩＳＡ（カニクイザル−ヒト−カニクイザル−ヒト）を示しそしてＣはブランチＣ ｐｅｒｉｐｒｅｐ ＥＬＩＳＡ（ヒト−ヒト−ヒト−ヒト）を示す。クローンは、３つの別個のファージ選択ブランチ（Ａ、Ｂ、Ｃ）に由来し、ここでファージ集団んは、各ラウンドでビオチン化ヒト（ｈｕｍ）又はカニクイザル（ｃｙｎｏ）ＧＩＴＲ−Ｆｃタンパク質に基いて選択された。選択の各ラウンドの後、９２のライブラリー由来のクローン（黒丸）及び１ラウンド当たり２つの陽性対照（灰色の星）及び２つの陰性対照ｓｃＦｖ（灰色の正方形）が、ヒト及びカニクイザルＧＩＴＲ−Ｆｃの両方に対してスクリーニングされた。各ラウンドにおける平均±ＳＤ値は、灰色のバーで示されている。各グラフにおいては、Ｘ軸は選択ラウンド（「Ｒ」）を示し、そして「Ｈ」はヒトを示し、そして「Ｃ」は、カニクイザルを示し、そしてＹ軸は結合シグナル（ＯＤ  ４５０ｎｍ）を示す。
【００３２】
【図４Ａ】図４は、ヒト及びカニクイザルＧＩＴＲ−Ｆｃタンパク質に対する選択された抗−ＧＩＴＲ  ｓｃＦｖについての直接的結合ＥＬＩＳＡの線形回帰相関分析を示す。ラウンド（Ｒ）２、３及び４の後、ヒト（Ｘ軸）及びカニクイザル（Ｙ軸）の両方に対する単一クローンについての結合シグナル（ＣＤ  ４５０ｎｍ）を示す。３つの個別のファージ選択ブランチ（Ａ、Ｂ、Ｃ）からの結合値をプロックする。ライブラリー由来の抗−ＧＩＴＲクローンは、黒丸で表され、そして各分析についての相関傾向線が示されている。ブランチＣ値は、ヒトＧＩＴＲタンパク質のみに基く選択がより偏った集団をもたらし、より多くのクローンがカニクイザルではなく、ヒトに対する反応性を示すことを示唆する。
【００３３】
【図４Ｂ】図４は、ヒト及びカニクイザルＧＩＴＲ−Ｆｃタンパク質に対する選択された抗−ＧＩＴＲ  ｓｃＦｖについての直接的結合ＥＬＩＳＡの線形回帰相関分析を示す。ラウンド（Ｒ）２、３及び４の後、ヒト（Ｘ軸）及びカニクイザル（Ｙ軸）の両方に対する単一クローンについての結合シグナル（ＣＤ  ４５０ｎｍ）を示す。３つの個別のファージ選択ブランチ（Ａ、Ｂ、Ｃ）からの結合値をプロックする。ライブラリー由来の抗−ＧＩＴＲクローンは、黒丸で表され、そして各分析についての相関傾向線が示されている。ブランチＣ値は、ヒトＧＩＴＲタンパク質のみに基く選択がより偏った集団をもたらし、より多くのクローンがカニクイザルではなく、ヒトに対する反応性を示すことを示唆する。
【００３４】
【図４Ｃ】図４は、ヒト及びカニクイザルＧＩＴＲ−Ｆｃタンパク質に対する選択された抗−ＧＩＴＲ  ｓｃＦｖについての直接的結合ＥＬＩＳＡの線形回帰相関分析を示す。ラウンド（Ｒ）２、３及び４の後、ヒト（Ｘ軸）及びカニクイザル（Ｙ軸）の両方に対する単一クローンについての結合シグナル（ＣＤ  ４５０ｎｍ）を示す。３つの個別のファージ選択ブランチ（Ａ、Ｂ、Ｃ）からの結合値をプロックする。ライブラリー由来の抗−ＧＩＴＲクローンは、黒丸で表され、そして各分析についての相関傾向線が示されている。ブランチＣ値は、ヒトＧＩＴＲタンパク質のみに基く選択がより偏った集団をもたらし、より多くのクローンがカニクイザルではなく、ヒトに対する反応性を示すことを示唆する。
【００３５】
【図５Ａ】図５は、生殖系列への突然変異に対するＣＤＲ残基耐性の分析を示す。１３２のユニークＧＩＴＲ結合ｓｃＦｖクローンのＥＬＩＳＡ陽性集団のＣＤＲにおけるマウスアミノ酸保持頻度のプロットを、それぞれ、（Ａ）ＶＬ及び（Ｂ）ＶＨドメインについて示す。ＨＣＤＲ３以外では、ヒト／ネズミ残基の突然変異誘発を標的とした残基のみがプロットされている。各プロットにおいては、Ｙ軸はネズミ残基の保持率を示し、そしてＣＤＲ残基はＸ軸に示される。Ｘ軸の括弧内に記載されるＣＤＲ残基は、移植のために使用されるヒト生殖系列に見出される残基（ＩＧＫＶ３−１１及びＩＧＨＶ３−７）と同一であった。括弧内ではないが、値が０で設定されているそれらの残基は、移植工程の間、ヒト生殖系列に変異された。Ａ及びＢの両方において、７５％での灰色の破線は、ヒト生殖系列によるネズミ残基置換の耐性のカットオフを表す。
【００３６】
【図５Ｂ】図５は、生殖系列への突然変異に対するＣＤＲ残基耐性の分析を示す。１３２のユニークＧＩＴＲ結合ｓｃＦｖクローンのＥＬＩＳＡ陽性集団のＣＤＲにおけるマウスアミノ酸保持頻度のプロットを、それぞれ、（Ａ）ＶＬ及び（Ｂ）ＶＨドメインについて示す。ＨＣＤＲ３以外では、ヒト／ネズミ残基の突然変異誘発を標的とした残基のみがプロットされている。各プロットにおいては、Ｙ軸はネズミ残基の保持率を示し、そしてＣＤＲ残基はＸ軸に示される。Ｘ軸の括弧内に記載されるＣＤＲ残基は、移植のために使用されるヒト生殖系列に見出される残基（ＩＧＫＶ３−１１及びＩＧＨＶ３−７）と同一であった。括弧内ではないが、値が０で設定されているそれらの残基は、移植工程の間、ヒト生殖系列に変異された。Ａ及びＢの両方において、７５％での灰色の破線は、ヒト生殖系列によるネズミ残基置換の耐性のカットオフを表す。
【００３７】
【図６Ａ】図６は、ヒト及びカニクイザルＧＩＴＲ−Ｆｃタンパク質へのＩｇＧ結合の直接的滴定ＥＬＩＳＡを示す。ヒトＩｇＧ１形式でのキメラ抗−ＧＩＴＲ（ｍＶＨ／ｍＶＬ）、ヒト生殖系列移植片（ＶＨ１／ＶＬ１、ＶＨ３／ＶＬ３）及びライブラリー由来クローンを、ヒト（Ａ、Ｃ）及びカニクイザル（Ｂ、Ｄ）ＧＩＴＲ−Ｆｃタンパク質に対する直接的結合ＥＬＩＳＡにより滴定した（μｇ／ｍｌ）。ヒト及びカニクイザルの両方に対するＶＨ１／ＶＬ１及びＶＨ３／ＶＬ２  ＩｇＧと同等の、又はそれら以上に改善された結合活性を示すクローンを、（Ａ）及び（Ｂ）で示している。ヒトＧＩＴＲ−Ｆｃ、カニクイザルＧＩＴＲ−Ｆｃ又は両方に対するＶＨ１／ＶＬ１及びＶＨ３／ＶＬ２  ＩｇＧに劣っている結合活性を示すクローンを、（Ｃ）及び（Ｄ）で示している。各グラフにおいて、Ｘ軸はμｇ／ｍｌでのＩｇＧ濃度を示し、そしてＹ軸は結合シグナル（ＯＤ  ４５０ｎｍ）を示す。
【００３８】
【図６Ｂ】図６は、ヒト及びカニクイザルＧＩＴＲ−Ｆｃタンパク質へのＩｇＧ結合の直接的滴定ＥＬＩＳＡを示す。ヒトＩｇＧ１形式でのキメラ抗−ＧＩＴＲ（ｍＶＨ／ｍＶＬ）、ヒト生殖系列移植片（ＶＨ１／ＶＬ１、ＶＨ３／ＶＬ３）及びライブラリー由来クローンを、ヒト（Ａ、Ｃ）及びカニクイザル（Ｂ、Ｄ）ＧＩＴＲ−Ｆｃタンパク質に対する直接的結合ＥＬＩＳＡにより滴定した（μｇ／ｍｌ）。ヒト及びカニクイザルの両方に対するＶＨ１／ＶＬ１及びＶＨ３／ＶＬ２  ＩｇＧと同等の、又はそれら以上に改善された結合活性を示すクローンを、（Ａ）及び（Ｂ）で示している。ヒトＧＩＴＲ−Ｆｃ、カニクイザルＧＩＴＲ−Ｆｃ又は両方に対するＶＨ１／ＶＬ１及びＶＨ３／ＶＬ２  ＩｇＧに劣っている結合活性を示すクローンを、（Ｃ）及び（Ｄ）で示している。各グラフにおいて、Ｘ軸はμｇ／ｍｌでのＩｇＧ濃度を示し、そしてＹ軸は結合シグナル（ＯＤ  ４５０ｎｍ）を示す。
【００３９】
【図６Ｃ】図６は、ヒト及びカニクイザルＧＩＴＲ−Ｆｃタンパク質へのＩｇＧ結合の直接的滴定ＥＬＩＳＡを示す。ヒトＩｇＧ１形式でのキメラ抗−ＧＩＴＲ（ｍＶＨ／ｍＶＬ）、ヒト生殖系列移植片（ＶＨ１／ＶＬ１、ＶＨ３／ＶＬ３）及びライブラリー由来クローンを、ヒト（Ａ、Ｃ）及びカニクイザル（Ｂ、Ｄ）ＧＩＴＲ−Ｆｃタンパク質に対する直接的結合ＥＬＩＳＡにより滴定した（μｇ／ｍｌ）。ヒト及びカニクイザルの両方に対するＶＨ１／ＶＬ１及びＶＨ３／ＶＬ２  ＩｇＧと同等の、又はそれら以上に改善された結合活性を示すクローンを、（Ａ）及び（Ｂ）で示している。ヒトＧＩＴＲ−Ｆｃ、カニクイザルＧＩＴＲ−Ｆｃ又は両方に対するＶＨ１／ＶＬ１及びＶＨ３／ＶＬ２  ＩｇＧに劣っている結合活性を示すクローンを、（Ｃ）及び（Ｄ）で示している。各グラフにおいて、Ｘ軸はμｇ／ｍｌでのＩｇＧ濃度を示し、そしてＹ軸は結合シグナル（ＯＤ  ４５０ｎｍ）を示す。
【００４０】
【図６Ｄ】図６は、ヒト及びカニクイザルＧＩＴＲ−Ｆｃタンパク質へのＩｇＧ結合の直接的滴定ＥＬＩＳＡを示す。ヒトＩｇＧ１形式でのキメラ抗−ＧＩＴＲ（ｍＶＨ／ｍＶＬ）、ヒト生殖系列移植片（ＶＨ１／ＶＬ１、ＶＨ３／ＶＬ３）及びライブラリー由来クローンを、ヒト（Ａ、Ｃ）及びカニクイザル（Ｂ、Ｄ）ＧＩＴＲ−Ｆｃタンパク質に対する直接的結合ＥＬＩＳＡにより滴定した（μｇ／ｍｌ）。ヒト及びカニクイザルの両方に対するＶＨ１／ＶＬ１及びＶＨ３／ＶＬ２  ＩｇＧと同等の、又はそれら以上に改善された結合活性を示すクローンを、（Ａ）及び（Ｂ）で示している。ヒトＧＩＴＲ−Ｆｃ、カニクイザルＧＩＴＲ−Ｆｃ又は両方に対するＶＨ１／ＶＬ１及びＶＨ３／ＶＬ２  ＩｇＧに劣っている結合活性を示すクローンを、（Ｃ）及び（Ｄ）で示している。各グラフにおいて、Ｘ軸はμｇ／ｍｌでのＩｇＧ濃度を示し、そしてＹ軸は結合シグナル（ＯＤ  ４５０ｎｍ）を示す。
【００４１】
【図７】図７は、優先リードについてのＧＩＴＲ  Jｕｒｋａｔ細胞レポーターアッセイを示す。ヒトＩｇＧ１形式でのリードクローン、Ｄ−Ａ６（Ａ）、Ｉ−Ｃ２（Ｂ）及びＧ−Ｇ１０（Ｃ）について細胞表面でのヒトＧＩＴＲの架橋の重複分析は、すべての３種のクローンが、抗−ＮＡ抗体架橋ヒトＧＩＴＲタンパク質（ｘ−連結［「ｘ−Ｌ」］ＧＩＴＲＬ）と同様の濃度範囲で濃度依存性アゴニスト活性を誘発し、そしてＤ−Ａ６はリガンド活性の最も近い模様体であることを示した。各グラフにおいて、Ｘ軸はｎｇ／ｍｌでのｍＡｂ濃度を示し、Ｙ軸は相対光単位（ＲｌＵ）を示し、そして対照κＩｇＧ１は「ＣκＩｇＧ１」と呼ばれる。
【００４２】
【図８Ａ】図８は、優先リードクローンについての結合特異性分析を示す。ｍＶＨ／ｍＶＬ（Ａ）、ＶＨ３／ＶＬ２（Ｂ）、及びリードエンジニアリングされたＧ−Ｇ１０（Ｃ）、Ｉ−Ｃ２（Ｄ）及びＤ−Ａ６（Ｅ）についてのオフターゲット相同体結合リスクを、ＧＩＴＲ−Ｆｃオーソログ、及び１３のヒトＴＮＦＲＳＦ及び免疫グロブリンスーパーファミリータンパク質のパネル（名Ｘ軸上に標識されている）での直接的ＥＬＩＳＡにより試験した。ヒト、カニクイザル及びネズミＧＩＴＲ−Ｆｃｓ（ｈ／ｃ／ｍＧＩＴＲ−Ｆｃ）への結合を、１μｇ／ｍｌのＩｇＧ濃度で実施した。すべての他のタンパク質への結合を、１０μｇ／ｍｌのＩｇＧ濃度で実施した。各プロットにおいて、Ｙ軸は結合シグナル（ＯＤ４５０ｎｍ）を示す。すべてのＩｇＧについて、ｈＧＩＴＲ−Ｆｃ及びｃＧＩＴＲ−Ｆｃのみへの結合が観察された。ｍＧＩＴＲ−Ｆｃ又は任意の相同ヒトタンパク質については、バックグラウンド以上の結合は観察されなかった。
【００４３】
【図８Ｂ】図８は、優先リードクローンについての結合特異性分析を示す。ｍＶＨ／ｍＶＬ（Ａ）、ＶＨ３／ＶＬ２（Ｂ）、及びリードエンジニアリングされたＧ−Ｇ１０（Ｃ）、Ｉ−Ｃ２（Ｄ）及びＤ−Ａ６（Ｅ）についてのオフターゲット相同体結合リスクを、ＧＩＴＲ−Ｆｃオーソログ、及び１３のヒトＴＮＦＲＳＦ及び免疫グロブリンスーパーファミリータンパク質のパネル（名Ｘ軸上に標識されている）での直接的ＥＬＩＳＡにより試験した。ヒト、カニクイザル及びネズミＧＩＴＲ−Ｆｃｓ（ｈ／ｃ／ｍＧＩＴＲ−Ｆｃ）への結合を、１μｇ／ｍｌのＩｇＧ濃度で実施した。すべての他のタンパク質への結合を、１０μｇ／ｍｌのＩｇＧ濃度で実施した。各プロットにおいて、Ｙ軸は結合シグナル（ＯＤ４５０ｎｍ）を示す。すべてのＩｇＧについて、ｈＧＩＴＲ−Ｆｃ及びｃＧＩＴＲ−Ｆｃのみへの結合が観察された。ｍＧＩＴＲ−Ｆｃ又は任意の相同ヒトタンパク質については、バックグラウンド以上の結合は観察されなかった。
【００４４】
【図８Ｃ】図８は、優先リードクローンについての結合特異性分析を示す。ｍＶＨ／ｍＶＬ（Ａ）、ＶＨ３／ＶＬ２（Ｂ）、及びリードエンジニアリングされたＧ−Ｇ１０（Ｃ）、Ｉ−Ｃ２（Ｄ）及びＤ−Ａ６（Ｅ）についてのオフターゲット相同体結合リスクを、ＧＩＴＲ−Ｆｃオーソログ、及び１３のヒトＴＮＦＲＳＦ及び免疫グロブリンスーパーファミリータンパク質のパネル（名Ｘ軸上に標識されている）での直接的ＥＬＩＳＡにより試験した。ヒト、カニクイザル及びネズミＧＩＴＲ−Ｆｃｓ（ｈ／ｃ／ｍＧＩＴＲ−Ｆｃ）への結合を、１μｇ／ｍｌのＩｇＧ濃度で実施した。すべての他のタンパク質への結合を、１０μｇ／ｍｌのＩｇＧ濃度で実施した。各プロットにおいて、Ｙ軸は結合シグナル（ＯＤ４５０ｎｍ）を示す。すべてのＩｇＧについて、ｈＧＩＴＲ−Ｆｃ及びｃＧＩＴＲ−Ｆｃのみへの結合が観察された。ｍＧＩＴＲ−Ｆｃ又は任意の相同ヒトタンパク質については、バックグラウンド以上の結合は観察されなかった。
【００４５】
【図８Ｄ】図８は、優先リードクローンについての結合特異性分析を示す。ｍＶＨ／ｍＶＬ（Ａ）、ＶＨ３／ＶＬ２（Ｂ）、及びリードエンジニアリングされたＧ−Ｇ１０（Ｃ）、Ｉ−Ｃ２（Ｄ）及びＤ−Ａ６（Ｅ）についてのオフターゲット相同体結合リスクを、ＧＩＴＲ−Ｆｃオーソログ、及び１３のヒトＴＮＦＲＳＦ及び免疫グロブリンスーパーファミリータンパク質のパネル（名Ｘ軸上に標識されている）での直接的ＥＬＩＳＡにより試験した。ヒト、カニクイザル及びネズミＧＩＴＲ−Ｆｃｓ（ｈ／ｃ／ｍＧＩＴＲ−Ｆｃ）への結合を、１μｇ／ｍｌのＩｇＧ濃度で実施した。すべての他のタンパク質への結合を、１０μｇ／ｍｌのＩｇＧ濃度で実施した。各プロットにおいて、Ｙ軸は結合シグナル（ＯＤ４５０ｎｍ）を示す。すべてのＩｇＧについて、ｈＧＩＴＲ−Ｆｃ及びｃＧＩＴＲ−Ｆｃのみへの結合が観察された。ｍＧＩＴＲ−Ｆｃ又は任意の相同ヒトタンパク質については、バックグラウンド以上の結合は観察されなかった。
【００４６】
【図８Ｅ】図８は、優先リードクローンについての結合特異性分析を示す。ｍＶＨ／ｍＶＬ（Ａ）、ＶＨ３／ＶＬ２（Ｂ）、及びリードエンジニアリングされたＧ−Ｇ１０（Ｃ）、Ｉ−Ｃ２（Ｄ）及びＤ−Ａ６（Ｅ）についてのオフターゲット相同体結合リスクを、ＧＩＴＲ−Ｆｃオーソログ、及び１３のヒトＴＮＦＲＳＦ及び免疫グロブリンスーパーファミリータンパク質のパネル（名Ｘ軸上に標識されている）での直接的ＥＬＩＳＡにより試験した。ヒト、カニクイザル及びネズミＧＩＴＲ−Ｆｃｓ（ｈ／ｃ／ｍＧＩＴＲ−Ｆｃ）への結合を、１μｇ／ｍｌのＩｇＧ濃度で実施した。すべての他のタンパク質への結合を、１０μｇ／ｍｌのＩｇＧ濃度で実施した。各プロットにおいて、Ｙ軸は結合シグナル（ＯＤ４５０ｎｍ）を示す。すべてのＩｇＧについて、ｈＧＩＴＲ−Ｆｃ及びｃＧＩＴＲ−Ｆｃのみへの結合が観察された。ｍＧＩＴＲ−Ｆｃ又は任意の相同ヒトタンパク質については、バックグラウンド以上の結合は観察されなかった。
【００４７】
【図９】図９は、ヒトＧＩＴＲ−Ｆｃに結合するＶＨ１／ＶＬ１  ＩｇＧに対するリード及び対照ＩｇＧについてのＨＴＲＦ競争アッセイを示す。ＶＨ１／ＶＬ１  ＩｇＧについてのＨＴＲＦ結合シグナルが、ライブラリー由来のリードＤ−Ａ６、Ｉ−Ｃ２及びＧ−Ｇ１０、陰性対照としてのアイソタイプ（Ｉ）ＩｇＧ１、及び陽性対象としての標識されていないＶＨ１／ＶＬ１を含む滴定された競合ＩｇＧの存在下で試験された。Ｘ軸は、μｇ／ｍｌでのＩｇＧ１濃度を示し、そしてＹ軸はＨＴＲＦ６６５／６１５比を示す。すべてのライブラリー由来のＩｇＧは、ＶＨ１−ＶＬ１結合の濃度依存性低下を示し、このことは、共有エピトープの維持が示唆された。
【００４８】
【図１０】図１０は、ヒト及びカニクイザルＧＩＴＲを安定的にトランスフェクトされたネズミ細胞への結合におけるリード及び対照ＩｇＧのフローサイトメトリー試験を示す。リードライブラリー由来の及び対照ＩｇＧ（「Ｉ  ＩｇＧ１」はアイソタイプＩｇＧ１を表す）を、（Ａ）ヒト及び（Ｂ）カニクイザル  トランスフェクトされたネズミ細胞への特異的結合について試験した。濃度依存性結合は、両方の細胞系に対して観察された。ヒトＧＩＴＲ−トランスフェクトされたヒトJｕｒｋａｔ細胞に対するＧＩＴＲアゴニズムアッセイにおけるように、この実験における最大の結合シグナルは、すべてのヒト化及び移植クローンについて、約１０００ｎｇ／ｍｌで観察された。無関係なヒト受容体によりトランスフェクトされたネズミ細胞に対して、バックグラウンド以上の結合シグナルは観察されなかった（Ｃ）。各グラフにおいて、Ｘ軸はｎｇ／ｍｌでのＩｇＧ１の濃度を示し、そしてＹ軸は平均蛍光光度（ＭＦＩ）を示す。
【００４９】
【図１１】図１１は、ＧＩＴＲ  Jｕｒｋａｔ細胞レポーターアッセイにおけるＤ−Ａ６及びＶＨ１／ＶＬ１  ＩｇＧ１抗体の二重精製されたモノマーバージョンの相対的効力を示す。ヒトＩｇＧ１形式におけるＰｒｏＡ−ＳＥＣ精製Ｄ−Ａ６及びＶＨ１／ＶＬ１抗体を、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＧＩＴＲ＋Jｕｒｋａｔ細胞レポーターアッセイに適用した。このアッセイは、クローンＤ−Ａ６が、ＧＩＴＲシグナル伝達の誘発においてＶＨ１／ＶＬ１よりも有意に強力であったことを示した。Ｘ軸はｎＭでのｍＡｂの濃度を示し、そしてＹ軸はＲＬＵを示す。
【００５０】
【図１２】図１２は、ＧＩＴＲ発現細胞のフローサイトメトリーにおける膜結合の特異性を示す。Ａ）このアッセイにおいては、ＣＨＯ−Ｋ１ヒトＧＩＴＲ＋細胞への抗体結合の特異性が、過剰な可溶性の精製された組換えヒトＧＩＴＲリガンド（ＧＩＴＲＬ）タンパク質の存在又は非存在下でのフローサイトメトリー染色により示された。ＶＨ１／ＶＬ１及びＤ−Ａ６抗体の両方について、１．１μｇ／ｍｌでの抗体に対するＧＩＴＲ＋細胞への結合シグナルは、１０μｇ／ｍｌの可溶性ＧＩＴＲＬタンパク質の存在下で１０倍以上低められた。陰性対照抗−ＧＦＰ抗体は、ＣＨＯ−Ｋ１  ＧＩＴＲ細胞への測定可能な結合を示さなかった。「Ｎ」は、ナイーブ細胞を示し；「Ａ」は活性化された細胞を示す。Ｂ）Ｄ−Ａ６  ＩｇＧ１及びＶＨ１／ＶＬ１  ＩｇＧ１の両方はまた、細胞がＣＤ３／ＣＤ２８刺激により活性化された場合、ヒトＨｕＴ７８  Ｔ細胞系に対して明確な反応性を示したが、しかしナイーブ細胞の場合、そうではなかった。活性化された細胞でのＧＩＴＲアップレギュレーションが、抗−ヒトＧＩＴＲモノクローナル試薬抗体１０８−１７を用いての強い陽性染色により確認された。「Ａｂ」は１．１１μｇ／ｍｌでの抗体を示し；「Ａｂ＋ＧＩＴＲＬ」は１．１１μｇ／ｍｌでの抗体＋１０μｇ／ｍｌでのＧＩＴＲＬを示す。Ｘ軸は抗体を示し、そしてＹ軸は生細胞のＭＦＩを示す。各ブロットにおいては、Ｙ軸は生細胞のＭＦＩを示す。
【００５１】
【図１３】図１３は、ＣＨＯ−Ｋ１ヒト細胞（グラフＡ）及びカニクイザルＧＩＴＲ＋細胞（グラフＢ）を用いてのJｕｒｋａｔ細胞レポーターアッセイでのＦｃγＲIIIのシグナル伝達の誘発におけるＤ−Ａ６ ＶＨ1/ＶＬ１ ＩｇＧ１、Ｄ−Ａ６ ＩｇＧ１−Ｎ２９７Ａ 及びＶＨ１/ＶＬ１ ＩｇＧ１−Ｎ２９７Ａ（非グリコシル化）抗体の相対効力を示す。各グラフにおいて、Ｘ軸はｎｇ／ｍｌでの抗体濃度を示し、そしてＹ軸はＲＬＵを示す。このアッセイは、ＩｇＧ１形式のＤ−Ａ６及びＶＨ１／ＶＬ１抗体がＦｃγＲIIIａシグナル伝達（ＮＫ細胞におけるＡＤＣＣ活性の誘発の代表）を誘発できるが、一方、Ｄ−Ａ６ ＩｇＧ１−Ｎ２９７Ａ もＶＨ１/ＶＬ１ ＩｇＧ１−Ｎ２９７Ａ抗体の何れもシグナル伝達を誘発しなかったことを示した。重要なことには、Ｄ−Ａ６  ＩｇＧ１は、ＶＨ１／Ｖｌ１  ＩｇＧＩよりもシグナル伝達の誘発において有意に強力であった。
【００５２】
【図１４】図１４は、開発リスクＥＬＩＳＡを示す。このアッセイは、ＩｇＧ１及びＩｇＧ１−Ｎ２９７Ａ形式でのＤ−Ａ６抗体は、負に帯電された生体分子インスリン（グラフＡ）、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）（グラフＢ）及び一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）（グラフＣ）への結合が陰性であることを示した。各グラフにおいて、Ｘ軸はμｇ／ｍｌでのＩｇＧ濃度を示し、そしてＹ軸は結合シグナル（ＯＤ  ４５０ｎｍ）を示す。それらの分子への強力なオフターゲット結合は、治療用抗体の低い臨床的性能の高リスク指標であることが示された。
【００５３】
【図１５Ａ】図１５は、優先リードについてのＧＩＴＲ  Jｕｒｋａｔ細胞レポーターアッセイを示す。ＩｇＧ１ｎｕｌｌ及びＩｇＧ１−Ｎ２９７Ａ形式でのリードクローンＤ−Ａ６（Ａ）、Ｄ−Ａ６．１（Ｂ）、及びＩｇＧ１形式でのライブラリー由来のリードＧ−Ｇ１Ｄ（Ｃ）及びＩ−Ｃ２（Ｄ）についての細胞表面でのヒトＧＩＴＲの架橋の重複分析は、全てのクローンが、ＶＨ１／ＶＬ１  ＩｇＧ１に比較して、より強い濃度依存性アゴニスト活性を誘発したことを示した。Ｃ及びＤにおいては、「Ｉ  ＩｇＧ１」はアイソタイプＩｇＧ１を示す。各グラフにおいて、Ｘ軸はｎｇ／ｍｌでのＩｇＧ濃度を示し、そしてＹ軸はＲｌＵを示す。
【００５４】
【図１５Ｂ】図１５は、優先リードについてのＧＩＴＲ  Jｕｒｋａｔ細胞レポーターアッセイを示す。ＩｇＧ１ｎｕｌｌ及びＩｇＧ１−Ｎ２９７Ａ形式でのリードクローンＤ−Ａ６（Ａ）、Ｄ−Ａ６．１（Ｂ）、及びＩｇＧ１形式でのライブラリー由来のリードＧ−Ｇ１Ｄ（Ｃ）及びＩ−Ｃ２（Ｄ）についての細胞表面でのヒトＧＩＴＲの架橋の重複分析は、全てのクローンが、ＶＨ１／ＶＬ１  ＩｇＧ１に比較して、より強い濃度依存性アゴニスト活性を誘発したことを示した。Ｃ及びＤにおいては、「Ｉ  ＩｇＧ１」はアイソタイプＩｇＧ１を示す。各グラフにおいて、Ｘ軸はｎｇ／ｍｌでのＩｇＧ濃度を示し、そしてＹ軸はＲｌＵを示す。
【００５５】
【図１５Ｃ】図１５は、優先リードについてのＧＩＴＲ  Jｕｒｋａｔ細胞レポーターアッセイを示す。ＩｇＧ１ｎｕｌｌ及びＩｇＧ１−Ｎ２９７Ａ形式でのリードクローンＤ−Ａ６（Ａ）、Ｄ−Ａ６．１（Ｂ）、及びＩｇＧ１形式でのライブラリー由来のリードＧ−Ｇ１Ｄ（Ｃ）及びＩ−Ｃ２（Ｄ）についての細胞表面でのヒトＧＩＴＲの架橋の重複分析は、全てのクローンが、ＶＨ１／ＶＬ１  ＩｇＧ１に比較して、より強い濃度依存性アゴニスト活性を誘発したことを示した。Ｃ及びＤにおいては、「Ｉ  ＩｇＧ１」はアイソタイプＩｇＧ１を示す。各グラフにおいて、Ｘ軸はｎｇ／ｍｌでのＩｇＧ濃度を示し、そしてＹ軸はＲｌＵを示す。
【００５６】
【図１５Ｄ】図１５は、優先リードについてのＧＩＴＲ  Jｕｒｋａｔ細胞レポーターアッセイを示す。ＩｇＧ１ｎｕｌｌ及びＩｇＧ１−Ｎ２９７Ａ形式でのリードクローンＤ−Ａ６（Ａ）、Ｄ−Ａ６．１（Ｂ）、及びＩｇＧ１形式でのライブラリー由来のリードＧ−Ｇ１Ｄ（Ｃ）及びＩ−Ｃ２（Ｄ）についての細胞表面でのヒトＧＩＴＲの架橋の重複分析は、全てのクローンが、ＶＨ１／ＶＬ１  ＩｇＧ１に比較して、より強い濃度依存性アゴニスト活性を誘発したことを示した。Ｃ及びＤにおいては、「Ｉ  ＩｇＧ１」はアイソタイプＩｇＧ１を示す。各グラフにおいて、Ｘ軸はｎｇ／ｍｌでのＩｇＧ濃度を示し、そしてＹ軸はＲｌＵを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
本発明の第１の側面によれば、ヒトＧＩＴＲ及び任意には、またカニクイザルＧＩＴＲに対して特異的に結合する抗体分子、又はその抗原結合部分が提供され、ここで前記抗体分子又はその抗原結合部分は、以下を有するＨ鎖可変領域を含み：
以下の順序で配列中にアミノ酸を有するＨＣＤＲ１：Ｇ−Ｆ−Ｓ、又はＳ−Ｌの保存的置換、又はＬ−Ｓ−Ｔの保存的置換、又はＴ−Ｓ又は任意のアミノ酸（例えば、Ｆ）−Ｇの保存的置換、又はＧ−Ｍの保存的置換、又は任意のアミノ酸（例えば、Ｙ、Ｆ、Ｌ又はＷ）−Ｇ、又はＧ−Ｖの保存的置換、又はＶ−Ｇの保存的置換、又はＧの保存的置換（配列番号１）；
以下の順序で配列中にアミノ酸を有するＨＣＤＲ２：Ｌ、又はＬ−Ａの保存的置換、又はＡ−Ｈの保存的置換、又はＨ−Ｉの保存的置換、又はＩ−Ｗ−Ｗ−Ｄの保存的置換、又はＤ−Ｄの保存的置換、又はＤ−Ｄの保存的置換、又はＤ−Ｋ−Ｙ−Ｙ−Ｎの保存的置換、又は任意のアミノ酸（例えば、Ｖ）−Ｐ、又は任意のアミノ酸（例えば、Ｄ）−Ｓ−Ｌ、又はＬ−Ｋ−Ｓの保存的置換、又は任意のアミノ酸（例えば、Ｇ）（配列番号２）；及び
以下の順序で配列中にアミノ酸を有するＨＣＤＲ３：Ｔ、又は任意のアミノ酸（例えば、Ｇ，Ａ，Ｎ，Ｓ又はＩ）−Ｒ、又は任意のアミノ酸（例えば、Ｄ、Ｔ又はＶ）−Ｒ、又は任意のアミノ酸（例えば、Ｑ、Ｌ、Ｍ、Ｉ又はＶ）−Ｙ−Ｆ、又はＦ−Ｐ−Ｆ−Ａ−Ｙの保存的置換（配列番号３）；
そしてＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２又はＨＣＤＲ３の少なくとも１つは、それぞれ、アミノ酸配列ＧＦＳＬＳＴＳＧＭＧＶＧ (配列番号４; ６Ｃ８ ネズミＨＣＤＲ１)、 ＬＡＨＩＷＷＤＤＤＫＹＹＮＰＳＬＫＳ (配列番号５; ６Ｃ８ ネズミＨＣＤＲ２)、 ＬＡＨＩＷＷＤＤＤＫＹＹＱＰＳＬＫＳ (配列番号６５; ６Ｃ８ 変異体ＨＣＤＲ２) 及びＴＲＲＹＦＰＦＡＹ (配列番号 ６; ６Ｃ８ ネズミ ＨＣＤＲ３)と比較して、上記定義に従って許容される、少なくとも１つのアミノ酸の差異、例えば１、２、３、４、５又はそれ以上のアミノ酸の差異を有する。
【００５８】
国際公開第２００６／１０５０２１号に開示されるような６Ｃ８ネズミ抗体由来のＨＣＤＲ２を定義する配列ＬＡＨＩＷＷＤＤＤＫＹＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号５）は、位置ＮにＮを有する野生型ネズミ配列を含む。位置ＮにＱを有する国際公開第２００６／１０５０２１号に開示されるその変異形（ＬＡＨＩＷＷＤＤＤＫＹＹＱＰＳＬＫＳ；配列番号６５）は、推定グリコシル化部位を除去すると述べられている。
【００５９】
抗体分子又はその抗原結合部分のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれ、アミノ酸配列ＧＦＳＬＳＴＳＧＭＧＶＧ (配列番号４; ６Ｃ８ ネズミＨＣＤＲ１)、 ＬＡＨＩＷＷＤＤＤＫＹＹＮＰＳＬＫＳ (配列番号５; ６Ｃ８ ネズミＨＣＤＲ２)、 ＬＡＨＩＷＷＤＤＤＫＹＹＱＰＳＬＫＳ (配列番号６５; ６Ｃ８ 変異体ＨＣＤＲ２) 及びＴＲＲＹＦＰＦＡＹ (配列番号 ６; ６Ｃ８ ネズミ ＨＣＤＲ３)と比較して、上記定義に従って許容される、少なくとも１つのアミノ酸の差異、例えば１、２、３、４、５又はそれ以上のアミノ酸の差異を有する。
【００６０】
本発明の抗体分子又はその抗原結合部分は、さらに、以下を有するＬ鎖可変領域を含むことがでる：
以下の順序で配列中にアミノ酸を有するＬＣＤＲ１：Ｋ、又はＫ−Ａの保存的置換、又はＡ−Ｓ−Ｑ−Ｎの保存的置換、又はＮ−Ｖ−Ｇの保存的置換、又はＧ−Ｔの保存的置換、又はＴ−Ｎの保存的置換、又は任意のアミノ酸（例えば、Ｙ）−Ｖ、又はＶ−Ａの保存的置換（配列番号１０）；
以下の順序で配列中にアミノ酸を有するＬＣＤＲ２：Ｓ、又は任意のアミノ酸（例えば、Ｙ、Ｅ、Ｄ、Ｆ、Ｌ又はＮ）−Ａ−Ｓ、又は任意のアミノ酸（例えば、Ｙ）−Ｙ、又は任意のアミノ酸（例えば、Ｎ）−Ｒ−Ｙ、又は任意のアミノ酸（例えば、Ａ又はＤ）−Ｓ、又はＳの保存的置換（配列番号１１）；及び
以下の順序で配列中にアミノ酸を有するＬＣＤＲ３：Ｑ−Ｑ、又はＧ−Ｙの保存的置換、又は任意のアミノ酸（例えば、Ｒ又はＨ）−Ｎ、又はＮ−Ｔの保存的置換、又は任意のアミノ酸（例えば；Ｋ又はＮ）−Ｄ、又は任意のアミノ酸（例えば、Ｗ、Ｌ、Ｓ、Ｅ、Ｖ又はＮ）−Ｐ−Ｌ−Ｔ（配列番号１２）：
そしてＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、又はＬＣＤＲ３の少なくとも１つは、それぞれ、アミノ酸配列ＫＡＳＱＮＶＧＴＮＶＡ  (配列番号１３) (６Ｃ８ ネズミ ＬＣＤＲ１)、ＳＡＳＹＲＹＳ (配列番号1４) (６Ｃ８ ネズミ ＬＣＤＲ２) 及び ＱＱＹＮＴＤＰＬＴ (配列番号１５) (６Ｃ８ ネズミ ＬＣＤＲ３)と比較して、上記定義に従って許容される、少なくとも１つのアミノ酸の差異、例えば１、２、３、４、５又はそれ以上のアミノ酸の差異を有する。
【００６１】
抗体分子又はその抗原結合部分のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、又はＬＣＤＲ３は、それぞれ、アミノ酸配列ＫＡＳＱＮＶＧＴＮＶＡ  (配列番号１３；６Ｃ８ ネズミ ＬＣＤＲ１)、ＳＡＳＹＲＹＳ (配列番号1４；６Ｃ８ ネズミ ＬＣＤＲ２) 及び ＱＱＹＮＴＤＰＬＴ (配列番号１５；６Ｃ８ ネズミ ＬＣＤＲ３)と比較して、上記定義に従って許容される、少なくとも１つのアミノ酸の差異、例えば１、２、３、４、５又はそれ以上のアミノ酸の差異を有する。
【００６２】
本明細書に述べられるように、本発明者は、国際公開第２００６／１０５０２１号に開示されるネズミ抗−ＧＩＴＲ抗体６Ｃ８由来のＣＤＲ配列を用いて多くの最適化された抗−ＧＩＴＲ抗体分子の生成に最初に成功した。本発明の好ましい抗体分子は、（動物試験種における研究を促進するために）ヒトＧＩＴＲ及びカニクイザルＧＩＴＲの両方に対して結合特異性を有するよう選択されている。本明細書に記載の最適化された抗体分子のさらなる精製により、ＧＩＴＲのカニクイザルオーソログへの改善された結合、ヒトＧＩＴＲシグナル伝達のアゴニスト作用の改善された効力、インビボでのＡＤＣＣ応答を促進するためのＦｃγＲIIIａ受容体の改善された関与、良好な可変ドメインの安定性、高い発現収率、及び／又は低められた免疫原性が提供される。
【００６３】
本発明の好ましい最適化された抗−ＧＩＴＲ抗体分子は、対応するネズミＣＤＲ又は他の（例えば、フレームワーク）アミノ酸位置で最大数のヒト生殖系列置換を必ずしも有さない。下記試験セッションで詳しく説明するように、「最大ヒト化」抗体分子は抗−ＧＩＴＲ結合特性及び／又は他の所望の特徴に関して、必ずしも「最大最適化」する必要はないことが見出された。
【００６４】
本発明は、本明細書に定義されるような抗体分子又はその抗原結合部分のアミノ酸配列に対する修飾を包含する。例えば、本発明は、機能的に同等な可変領域、及びそれらの特性に有意に影響しないＣＤＲ、並びに増強された又は低められた活性及び／又は親和性も有する変異体を含む抗体分子及びその対応する抗原結合部分を含む。例えば、アミノ酸配列は、ＧＩＴＲに対する所望の結合親和性を有する抗体を得るために突然変異誘発され得る。１つの残基から１００又はそれ以上の残基を含むポリペプチド間での長さの範囲のアミノ及び／又はカルボキシル末端融合を含む挿入、及び単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入が想定される。末端挿入の例は、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体分子、又はエピトープ標識に融合される抗体分子を含む。抗体分子の他の挿入変異体は、血液循環における抗体の半減期を高める酵素又はポリペプチドの抗体のＮ−又はＣ−末端への融合を含む。
【００６５】
本発明の抗体分子又はその抗原結合部分は、グリコシル化された及び非グリコシル化されたポリペプチド、及び他の翻訳後修飾、例えば異なる糖でのグリコシル化、アセチル化及びリン酸化を有するポリペプチドを含むことができる。本発明の抗体分子又はその抗原結合部分は、例えば１又は２以上のアミノ酸残基を付加し、除去し、又は置換し、グリコシル化部位を形成するか、又は除去することにより、そのような翻訳後修飾を変更するよう突然変異誘発され得る。
【００６６】
本発明の抗体分子又はその抗原結合部分は、例えば抗原における潜在的なタンパク質分解部位を除去するために、例えばアミノ酸置換により修飾され得る。
【００６７】
抗体分子又はその抗原結合部位においては、
ＨＣＤＲ１は、アミノ酸配列Ｇ−Ｆ−Ｓ/Ｔ−Ｌ/Ｆ−Ｓ−Ｔ/Ａ−Ｓ/Ｆ−Ｇ/Ｓ−Ｍ/Ｙ/Ｆ/Ｌ/Ｗ−Ｇ/Ａ−Ｖ/Ｍ−Ｇ/Ｓ（配列番号１９）を有することができ；
ＨＣＤＲ２は、アミノ酸配列Ｌ/Ｖ−Ａ/Ｓ−Ｈ/Ｎ−Ｉ/Ｖ−Ｗ−Ｗ−Ｄ/Ｅ−Ｄ/Ｓ−Ｄ/Ｅ−Ｋ−Ｙ−Ｙ−Ｎ/Ｖ−Ｐ/Ｄ−Ｓ−Ｌ/Ｖ−Ｋ−Ｓ/Ｇ（配列番号２０）を有することができ；そして
ＨＣＤＲ３は、アミノ酸配列Ｔ/Ｇ/Ａ/Ｎ/Ｓ/Ｉ−Ｒ/Ｄ/Ｔ/Ｖ−Ｒ/Ｑ/Ｌ/Ｍ/Ｉ/Ｖ−Ｙ−Ｆ/Ｙ−Ｐ−Ｆ−Ａ−Ｙ（配列番号２１）を有することができる。
【００６８】
例えば、ＨＣＤＲ１は、アミノ酸配列Ｇ−Ｆ−Ｓ/Ｔ−Ｌ/Ｆ−Ｓ−Ｔ/Ａ−Ｓ/Ｆ−Ｇ/Ｓ−Ｍ/Ｙ/Ｆ/Ｌ/Ｗ−Ｇ/Ａ−Ｖ/Ｍ−Ｇ/Ｓ（配列番号１９）を有することができ；
ＨＣＤＲ２は、アミノ酸配列Ｌ/Ｖ−Ａ/Ｓ−Ｈ/Ｎ−Ｉ/Ｖ−Ｗ−Ｗ−Ｄ/Ｅ−Ｄ/Ｓ−Ｄ/Ｅ−Ｋ−Ｙ−Ｙ−Ｖ−Ｄ−Ｓ−Ｖ−Ｋ−Ｇ（配列番号３０）を有することができ；そして
ＨＣＤＲ３は、アミノ酸配列Ｔ/Ｇ/Ａ/Ｎ/Ｓ/Ｉ−Ｒ/Ｄ/Ｔ/Ｖ−Ｒ/Ｑ/Ｌ/Ｍ/Ｉ/Ｖ−Ｙ−Ｆ/Ｙ−Ｐ−Ｆ−Ａ−Ｙ（配列番号２１）を有することができる。
【００６９】
抗体分子又はその抗原結合部分においては、
ＬＣＤＲ１は、アミノ酸配列Ｋ/Ｒ−Ａ/Ｔ−Ｓ−Ｑ−Ｎ/Ｄ/Ｓ−Ｖ−Ｇ/Ｓ−Ｔ/Ｓ/Ｎ−Ｎ/Ｙ−Ｖ/Ｌ−Ａ（配列番号２２）を有することができ：
ＬＣＤＲ２は、アミノ酸配列Ｓ/Ｙ/Ｅ/Ｄ/Ｆ/Ｌ/Ｎ−Ａ−Ｓ/Ｙ−Ｙ/Ｎ−Ｒ−Ｙ/Ａ/Ｄ−Ｓ/Ｔ（配列番号２３）を有することができ：そして
ＬＣＤＲ３は、アミノ酸配列Ｑ−Ｑ/Ｈ−Ｙ/Ｒ/Ｈ−Ｎ/Ｓ/Ｒ−Ｔ/Ｋ/Ｎ−Ｄ/Ｗ/Ｌ/Ｓ/Ｅ/Ｖ/Ｎ−Ｐ−Ｌ−Ｔ（配列番号２４）を有することができる。
【００７０】
例えば、ＬＣＤＲ１は、アミノ酸配列Ｒ−Ａ/Ｔ−Ｓ−Ｑ−Ｎ/Ｄ/Ｓ−Ｖ−Ｇ/Ｓ−Ｔ/Ｓ/Ｎ−Ｎ/Ｙ−Ｖ/Ｌ−Ａ（配列番号１７４）を有することができ：
ＬＣＤＲ２は、アミノ酸配列Ｓ/Ｙ/Ｅ/Ｄ/Ｆ/Ｌ/Ｎ−Ａ−Ｓ/Ｙ−Ｙ/Ｎ−Ｒ−Ｙ/Ａ/Ｄ−Ｓ/Ｔ（配列番号２３）を有することができ：そして
ＬＣＤＲ３は、アミノ酸配列Ｑ−Ｑ/Ｈ−Ｙ/Ｒ/Ｈ−Ｎ/Ｓ/Ｒ−Ｔ/Ｋ/Ｎ−Ｄ/Ｗ/Ｌ/Ｓ/Ｅ/Ｖ/Ｎ−Ｐ−Ｌ−Ｔ（配列番号２４）を有することができる。
【００７１】
本発明の別の側面によれば、
以下の順序で配列中にアミノ酸を有するＨＣＤＲ１：Ｆ−Ｓ−Ｌ−Ｓ−Ｔ−Ｓ/Ｆ−Ｇ−Ｙ−Ｇ（配列番号７）；
以下の順序で配列中にアミノ酸を有するＨＣＤＲ２：Ｉ−Ｗ−Ｗ−Ｄ−Ｄ−Ｄ−Ｋ−Ｙ−Ｙ−Ｖ−Ｄ−Ｓ−Ｖ−Ｋ−Ｇ（配列番号８）；及び
以下の順序で配列中にアミノ酸を有するＨＣＤＲ３：Ｔ−Ｒ−Ｑ/Ｌ/Ｖ−Ｙ−Ｆ−Ｐ−Ｆ−Ａ（配列番号９）、を有するＨ鎖可変領域を含む、ヒトグルココルチコイド誘発ＴＮＦ受容体（ＧＩＴＲ）及びカニクイザルＧＩＴＲに対して特異的に結合するヒト、ヒト化又はキメラ抗体分子、又はその抗原結合部分が提供される。
【００７２】
上記ＣＤＲ配列は、表１に示されるように、「統一された」定義よりむしろ、より短い「ＡＨo」定義を用いて定義される。ＡＨｏ定義は、構造生物学に基かれており、そして全ての免疫グロブリンｖ−ドメインについての命名法を統一することを目的とする。
【００７３】
Ａｈｏ  ＣＤＲ定義を用いて上記に定義されたような抗体分子又はその抗原結合部分は、以下のような統一された定義を用いて定義され得る：
ＨＣＤＲ１が以下の順序で配列中にアミノ酸を含み：Ｇ−Ｆ−Ｓ−Ｌ−Ｓ−Ｔ−Ｓ/Ｆ−Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｖ−Ｇ（配列番号２５）；
ＨＣＤＲ２が以下の順序で配列中にアミノ酸を含み：Ｌ−Ａ−Ｈ−Ｉ−Ｗ−Ｗ−Ｄ−Ｄ−Ｄ−Ｋ−Ｙ−Ｙ−Ｖ−Ｄ−Ｓ−Ｖ−Ｋ−Ｇ（配列番号２６）：そして
ＨＣＤＲ３が以下の順序で配列中にアミノ酸を含む：Ｔ−Ｒ−Ｑ/Ｌ/Ｖ−Ｙ−Ｆ−Ｐ−Ｆ−Ａ−Ｙ（配列番号２７）。
【００７４】
本発明のこの側面によれば、抗体分子又はその抗原結合部分は、以下を有するＬ鎖可変領域を含むことができる：
以下の順序で配列中にアミノ酸を有するＨＣＤＲ１：Ａ−Ｓ−Ｑ−Ｎ/Ｓ−Ｖ−Ｇ−Ｔ/Ｓ−Ｎ（配列番号１６）；
以下の順序で配列中にアミノ酸を有するＨＣＤＲ２：Ｓ/Ｙ−Ａ−Ｓ−Ｙ/Ｎ−Ｒ−Ｙ−Ｓ/Ｔ（配列番号１７）；及び
以下の順序で配列中にアミノ酸を有するＨＣＤＲ３:Ｙ−Ｓ−Ｔ/Ｎ−Ｄ−Ｐ−Ｌ（配列番号１８）。
【００７５】
再び、上記ＣＤＲ配列は、ＡＨｏ定義を用いて定義される。他方では、統一された定義を用いて、抗体分子又はその抗原結合部分は、以下であるＬ鎖可変領域を含むことができる：
ＨＣＤＲ１が以下の順序で配列中にアミノ酸を含み：Ｒ−Ａ−Ｓ−Ｑ−Ｎ/Ｓ−Ｖ−Ｇ−Ｔ/Ｓ−Ｎ−Ｌ−Ａ（配列番号２８）；
ＨＣＤＲ２が以下の順序で配列中にアミノ酸を含み：Ｓ/Ｙ−Ａ−Ｓ−Ｙ/Ｎ−Ｒ−Ｙ−Ｓ/Ｔ（配列番号１７）：そして
ＨＣＤＲ３が以下の順序で配列中にアミノ酸を含む：Ｑ−Ｑ−Ｙ−Ｓ−Ｔ/Ｎ−Ｄ−Ｐ−Ｌ−Ｔ（配列番号１７３）。
【００７６】
本発明のこの側面の特定の実施形態は、以下を含む抗体分子又は抗原結合部分を含む。：
(a) アミノ酸配列 ＧＦＳＬＳＴＳＧＹＧＶＧ (配列番号２９) (ＨＣＤＲ１)、 ＬＡＨＩＷＷＤＤＤＫＹＹＶＤＳＶＫＧ (配列番号２６) (ＨＣＤＲ２)、 ＴＲＱＹＦＰＦＡＹ (配列番号３１) (ＨＣＤＲ３)、 ＲＡＳＱＳＶＧＳＮＬＡ (配列番号３２) (ＬＣＤＲ１)、 ＳＡＳＹＲＹＴ (配列番号３３) (ＬＣＤＲ２)及び ＱＱＹＳＴＤＰＬＴ (配列番号３４) (ＬＣＤＲ３) [クローンＤ＿Ａ６];又は
(b) アミノ酸配列ＧＦＳＬＳＴＦＧＹＧＶＧ (配列番号３５) (ＨＣＤＲ１)、 ＬＡＨＩＷＷＤＤＤＫＹＹＶＤＳＶＫＧ (配列番号２６) (ＨＣＤＲ２)、 ＴＲＱＹＦＰＦＡＹ (配列番号３１) (ＨＣＤＲ３)、 ＲＡＳＱＳＶＧＴＮＬＡ (配列番号３６)（ＬＣＤＲ１）、 ＹＡＳＹＲＹＴ (配列番号３７) (ＬＣＤＲ２) 及びＱＱＹＳＮＤＰＬＴ (配列番号３８) (ＬＣＤＲ３) [クローンＧ＿Ｇ１０]; 又は
(c) アミノ酸配列ＧＦＳＬＳＴＳＧＹＧＶＧ (配列番号２９) (ＨＣＤＲ１)、 ＬＡＨＩＷＷＤＤＤＫＹＹＶＤＳＶＫＧ (配列番号２６)  (ＨＣＤＲ２)、 TＲＬＹＦＰＦＡＹ (配列番号３９) (ＨＣＤＲ３)、 ＲＡＳＱＮＶＧＳＮＬＡ (配列番号４０) (ＬＣＤＲ１)、 ＳＡＳＮＲＹＳ (配列番号４１) (ＬＣＤＲ２)及び ＱＱＹＳＴＤＰＬＴ (配列番号３４)  (ＬＣＤＲ３) [クローンＩ＿Ｃ２]; 又は
(d) アミノ酸配列ＧＦＳＬＳＴＳＧＹＧＶＧ (配列番号２９) (ＨＣＤＲ１)、 ＬＡＨＩＷＷＤＤＤＫＹＹＶＤＳＶＫＧ (配列番号２６) (HＣＤＲ２)、 ＴＲＶＹＦＰＦＡＹ (配列番号４２) （ＨＣＤＲ３)、 ＲＡＳＱＮＶＧＴＮＬＡ (配列番号４３) (ＬＣＤＲ１)、 ＳＡＳＹＲＹＴ (配列番号３３) (ＬＣＤＲ２) 及び ＱＱＹＳＴＤＰＬＴ (配列番号３４)  (ＬＣＤＲ３) [クローンＨ＿Ｂ３]; 又は
(e) アミノ酸配列ＧＦＳＬＳＴＳＧＹＧＶＧ (配列番号２９) (ＨＣＤＲ１)、 ＬＡＨＩＷＷＤＤＤＫＹＹＶＤＳＶＫＧ 配列番号２６) (ＨＣＤＲ２)、 ＴＲＱＹＦＰＦＡＹ (配列番号３１) (ＨＣＤＲ３)、 ＲＡＳＱＳＶＧＳＮＬＡ (配列番号３２)  （ＬＣＤＲ１)、 ＳＡＳＮＲＹＴ (配列番号４４) (ＬＣＤＲ２) 及び ＱＱＹＳＴＤＰＬＴ (配列番号３４) (ＬＣＤＲ３) [クローンＡ６．１]。
【００７７】
上記で定義されたようなクローンＤ＿Ａ６のＣＤＲ配列を含む抗体分子又はその抗原結合部分は、本発明の特定の特異的実施形態である。
【００７８】
本発明の抗体分子又はその抗原結合部分は、国際公開第２００６／１０５０２１号において「ＨｕＮ６Ｃ８−Ａｇｌｙ」として標識されたヒト化ネズミ抗−ＧＩＴＲ  ＩｇＧ抗体と比較して、改善されたＧＩＴＲ活性化を有することができる。
【００７９】
既知の抗体ＨｕＮ６Ｃ８−Ａｇｌｙは、leap Therapeutics, Inc. により現在開発されている抗体「ＴＲＸ−５１８」（又は「ＴＲＸ５１８」）と同義であると理解されている。ＨｕＮ６Ｃ８−Ａｇｌｙ/ＴＲＸ−５１８抗体は、国際公開第２００６／１０５０２１号に定義されるような「配列番号５３」（及び下記表２における「ＧＩＴＲ−ＶＨ１」配列に応答する）、及び国際公開第２００６／１０５０２１号に定義されるような「配列番号４４」（及び下記表２におけるＧＩＴＲ−ＶＬ１配列に対応する）を含む。ＨｕＮ６Ｃ８−Ａｇｌｙ/ＴＲＸ−５１８Ｌ鎖の完全配列は、国際公開第２００６／１０５０２１号の「配列番号５８」により定義され、そしてＨｕＮ６Ｃ８−Ａｇｌｙ/ＴＲＸ−５１８Ｈ鎖の完全配列は、国際公開第２００６／１０５０２１号の「配列番号６１」により定義される。
【００８０】
本明細書において使用されるような改善されたＧＩＴＲ活性化は、例えば、以下の実施例１に記載されるように、Promega GITR Bioassay Kit (CS184006)において最大のシグナル（ＲＬＵ値又は活性化倍数）を示すとして定義され得、すなわち抗体ＴＲＸ−５１８について観察される倍率よりも少なくとも１．５倍高い。
【００８１】
本発明の抗体分子又はその抗原結合部分は、抗体ＴＲＸ−５１８と比較して、改善されたイン・シリコ免疫原性を有することができる。
【００８２】
イン・シリコ免疫原性は、例えば、下記実施例１に記載されるように、Lonza Epibase ISシステム（バージョン３）を用いて決定され得る。
【００８３】
本発明の抗体分子又はその抗原結合部分は、Lonza Epibase ISシステム（バージョン３）により決定されるように、１６００以下、例えば１５００以下、１１００以下、又は特に９００以下のイン・シリコ免疫原性総ＤＲＢ１スコアを有することができる。
【００８４】
本発明の抗体分子又はその抗原結合部分は、抗体ＴＲＸ−５１８と比較して、カニクイザルＧＩＴＲに対して改善された親和性を有することができる。親和性は、以下の実施例１に記載されるようにＳＰＲ分析を用いて決定され得る。
【００８５】
本発明の他の特定の実施形態によれば、抗体分子又はその抗原結合部分は、以下を含むことができる：
(a) アミノ酸配列 ＧＦＳＬＳＴＳＧＭＧＭＳ (配列番号６１) (ＨＣＤＲ１)、 ＬＡＨＩＷＷＤＤＤＫＹＹＶＤＳＶＫＧ (配列番号２６) （ＨＣＤＲ２）、 ＮＲＲＹＦＰＦＡＹ (配列番号４５) (ＨＣＤＲ３)、 ＲＡＳＱＮＶＧＳＮＬＡ (配列番号 ４０) （ＬＣＤＲ１)、 ＳＡＳＹＲＡＴ (配列番号４６) （ＬＣＤＲ２） 及び ＱＱＹＳＮＤＰＬＴ (配列番号３８) (ＬＣＤＲ３) [クローン Ｃ＿Ｂ１０]; 又は
(b) アミノ酸配列 ＧＦＳＬＳＴＳＧＹＧＶＳ (配列番号 ４７) （ＨＣＤＲ１）、 ＬＡＨＶＷＷＤＤＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧ (配列番号４８) （ＨＣＤＲ２)、 ＮＲＲＹＦＰＦＡＹ (配列番号 ４５) (ＨＣＤＲ３)、 ＲＡＳＱＳＶＧＴＮＶＡ (配列番号 ４９) (ＬＣＤＲ１)、 ＳＡＳＹＲＡＴ (配列番号４６) （ＬＣＤＲ２) 及び ＱＱＹＮＮＷＰＬＴ (配列番号５０) （ＬＣＤＲ３) [クローン Ｃ＿Ｄ５]; 又は
(c) アミノ酸配列 ＧＦＳＦＳＴＳＧＹＧＶＳ (配列番号 ５１) (ＨＣＤＲ１)、 ＬＡＨＩＷＷＤＤＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧ (配列番号 ５２) (ＨＣＤＲ２)、 ＮＲＲＹＦＰＦＡＹ (配列番号 ４５) （ＨＣＤＲ３)、 ＲＡＳＱＮＶＧＴＮＬＡ (配列番号４３) (ＬＣＤＲ１)、 ＳＡＳＹＲＡＳ (配列番号５３) （ＬＣＤＲ２) 及び ＱＱＹＳＴＤＰＬＴ (配列番号 ３４) （ＬＣＤＲ３) [クローン Ｃ＿Ｆ２]; 又は
(d) アミノ酸配列 ＧＦＳＬＳＴＳＧＭＧＶＳ (配列番号 ５４) (ＨＣＤＲ１)、 ＶＡＨＩＷＷＤＤＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧ (配列番号  ５５) (ＨＣＤＲ２)、 ＮＲＲＹＦＰＦＡＹ (配列番号  ４５) (ＨＣＤＲ３)、 ＲＡＳＱＳＶＧＳＮＬＡ (配列番号 ３２) (ＬＣＤＲ１)、 ＳＡＳＹＲＡＴ (配列番号４６) (ＬＣＤＲ２) 及び ＱＱＹＳＴＤＰＬＴ (配列番号３４) (ＬＣＤＲ３) [クローン Ｆ＿Ｂ１１]; 又は
(e) アミノ酸配列 ＧＦＳＦＳＴＳＧＭＧＶＳ (配列番号５６) （ＨＣＤＲ１)、 ＶＡＨＩＷＷＤＤＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧ (配列番号５５) （ＨＣＤＲ２)、 ＮＲＲＹＦＰＦＡＹ (配列番号４５) （ＨＣＤＲ３）、 ＲＡＳＱＳＶＧＳＮＶＡ (配列番号５７) (ＬＣＤＲ１)、 ＳＡＳＮＲＹＴ (配列番号４４) (ＬＣＤＲ２) 及び ＱＱＹＳＴＤＰＬＴ (配列番号 ３４) (ＬＣＤＲ３) [クローン Ｆ＿Ｂ９]; 又は
(f) アミノ酸配列 ＧＦＳＬＳＴＳＧＭＧＭＧ (配列番号 ５８) （ＨＣＤＲ１)、 ＬＡＨＩＷＷＤＤＤＫＹＹＶＤＳＶＫＧ (配列番号２６) (ＨＣＤＲ２)、 ＳＲＲＹＦＰＦＡＹ (配列番号 ５９) (ＨＣＤＲ３)、 ＲＡＳＱＮＶＧＳＮＬＡ (配列番号４０) (ＬＣＤＲ１)、 ＳＡＳＹＲＹＴ (配列番号 ３３) (ＬＣＤＲ２) 及び ＱＱＹＳＴＤＰＬＴ (配列番号 ３４) (ＬＣＤＲ３) [クローン Ｈ＿Ａ３]; 又は
(g) アミノ酸配列 ＧＦＳＬＳＴＳＳＹＧＶＳ (配列番号 ６０) (ＨＣＤＲ１)、 ＶＡＨＩＷＷＤＤＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧ (配列番号５５) (ＨＣＤＲ２)、 ＴＲＬＹＦＰＦＡＹ (配列番号 ３９) (ＨＣＤＲ３)、 ＲＡＳＱＳＶＧＴＮＬＡ (配列番号３６) (ＬＣＤＲ１)、 ＳＡＳＹＲＹＴ (配列番号 ３３) (ＬＣＤＲ２) 及び ＱＱＹＳＮＤＰＬＴ (配列番号: ３８) (ＬＣＤＲ３) [クローン Ｊ＿Ｃ５]; 又は
(h) アミノ酸配列 ＧＦＳＬＳＴＳＧＭＧＭＳ (配列番号６１) (ＨＣＤＲ１)、 ＬＡＨＩＷＷＤＤＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧ (配列番号 ５２) (ＨＣＤＲ２)、 ＮＲＲＹＦＰＦＡＹ (配列番号 ４５) （ＨＣＤＲ３)、 ＲＡＳＱＳＶＧＴＮＶＡ (配列番号４９) (ＬＣＤＲ１)、 ＳＡＳＹＲＡＳ (配列番号 ５３) (ＬＣＤＲ２) 及び ＱＱＹＳＴＤＰＬＴ (配列番号 ３４) (ＬＣＤＲ３) [クローン Ｋ＿Ａ１２]; 又は
(i) アミノ酸配列 ＧＦＳＬＳＴＳＧＹＧＭＳ (配列番号 ６２) （ＨＣＤＲ１)、 ＶＡＨＩＷＷＤＤＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧ (配列番号５５) (ＨＣＤＲ２)、 ＴＲＱＹＦＰＦＡＹ (配列番号 ３１) (ＨＣＤＲ３)、 ＲＡＳＱＳＶＧＳＮＬＡ (配列番号 ３２) (ＬＣＤＲ１)、 ＳＡＳＹＲＡＴ (配列番号 ４６) (ＬＣＤＲ２) 及び ＱＱＹＳＴＤＰＬＴ (配列番号３４) (ＬＣＤＲ３) [クローン ＭＨ]; 又は
(j) アミノ酸配列 ＧＦＳＬＳＴＳＧＭＧＭＳ (配列番号 ６１) （ＨＣＤＲ１)、 ＶＡＨＩＷＷＤＤＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧ (配列番号 ５５) (ＨＣＤＲ２)、 ＴＲＱＹＦＰＦＡＹ (配列番号 ３１) (ＨＣＤＲ３)、 ＲＡＳＱＳＶＧＳＮＬＡ (配列番号 ３２) （ＬＣＤＲ１)、 ＳＡＳＹＲＡＴ (配列番号 ４６) （ＬＣＤＲ２） 及び ＱＱＹＳＴＤＰＬＴ (配列番号 ３４) (ＬＣＤＲ３) [クローン ＭＨ−１]; 又は
(k) アミノ酸配列 ＧＦＳＬＳＴＳＧＹＧＶＳ (配列番号 ４７) (ＨＣＤＲ１)、 ＶＡＨＩＷＷＤＤＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧ (配列番号 ５５) (ＨＣＤＲ２)、 ＴＲＱＹＦＰＦＡＹ (配列番号 ３１) (ＨＣＤＲ３)、 ＲＡＳＱＳＶＧＳＮＬＡ (配列番号 ３２) (ＬＣＤＲ１)、 ＳＡＳＹＲＡＴ (配列番号 ４６) （ＬＣＤＲ２) 及び ＱＱＹＳＴＤＰＬＴ (配列番号 ３４) (ＬＣＤＲ３) [クローン ＭＨ−２]; 又は
(l) アミノ酸配列 ＧＦＳＬＳＴＳＧＹＧＭＳ (配列番号 ６２) （ＨＣＤＲ１)、 ＶＡＨＩＷＷＤＤＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧ (配列番号 ５５) (ＨＣＤＲ２)、 ＴＲＱＹＦＰＦＡＹ (配列番号 ３１) (ＨＣＤＲ３)、 ＲＡＳＱＮＶＧＳＮＬＡ (配列番号 ４０) (ＬＣＤＲ１)、 ＳＡＳＹＲＡＴ (配列番号 ４６) （ＬＣＤＲ２) 及び ＱＱＹＳＴＤＰＬＴ (配列番号３４) （ＬＣＤＲ３) [クローン ＭＨ−３]; 又は
(m) アミノ酸配列 ＧＦＳＬＳＴＳＧＹＧＭＳ (配列番号 ６２) (ＨＣＤＲ１)、 ＶＡＨＩＷＷＤＤＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧ (配列番号 ５５) (ＨＣＤＲ２)、 ＴＲＱＹＦＰＦＡＹ (配列番号 ３１) （ＨＣＤＲ３)、 ＲＡＳＱＳＶＧＳＮＶＡ (配列番号 ５７) (ＬＣＤＲ１)、 ＳＡＳＹＲＡＴ (配列番号 ４６) (ＬＣＤＲ２) 及び ＱＱＹＳＴＤＰＬＴ (配列番号 ３４) （ＬＣＤＲ３) [クローン ＭＨ−４]; 又は
(n) アミノ酸配列 ＧＦＳＬＳＴＳＧＹＧＭＳ (配列番号 ６２) (ＨＣＤＲ１)、 ＶＡＨＩＷＷＤＤＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧ (配列番号５５) (ＨＣＤＲ２)、 ＴＲＱＹＦＰＦＡＹ (配列番号 ３１) (ＨＣＤＲ３)、 ＲＡＳＱＳＶＧＳＮＬＡ (配列番号 ３２) (ＬＣＤＲ１)、 ＳＡＳＹＲＹＴ (配列番号 ３３) (ＬＣＤＲ２) 及び ＱＱＹＳＴＤＰＬＴ (配列番号 ３４) (ＬＣＤＲ３) [クローン ＭＨ−５]; 又は
(o) アミノ酸配列 ＧＦＳＬＳＴＳＧＹＧＶＧ (配列番号 ２９) (ＨＣＤＲ１)、 ＬＡＨＩＷＷＤＤＤＫＹＹＶＤＳＶＫＧ (配列番号 ２６) (ＨＣＤＲ２)、 ＴＲＱＹＦＰＦＡＹ (配列番号 ３１) (ＨＣＤＲ３)、 ＲＡＳＱＳＶＧＳＮＬＡ (配列番号 ３２) （ＬＣＤＲ１）、 ＳＡＳＮＲＹＴ (配列番号 ４４) (ＬＣＤＲ２) 及び ＱＱＹＳＴＮＰＬＴ (配列番号 ６３) (ＬＣＤＲ３) [クローン Ａ６．２]; 又は
(p) アミノ酸配列 ＧＦＳＬＳＴＳＧＹＧＶＳ (配列番号 ４７) (ＨＣＤＲ１)、 ＬＡＨＩＷＷＤＤＤＫＹＹＶＤＳＶＫＧ (配列番号 ２６) (ＨＣＤＲ２)、 ＴＲＱＹＦＰＦＡＹ (配列番号 ３１) (ＨＣＤＲ３)、 ＲＡＳＱＳＶＧＳＮＬＡ (配列番号 ３２) (ＬＣＤＲ１)、 ＳＡＳＮＲＹＴ (配列番号 ４４) (ＬＣＤＲ２) 及び ＱＱＹＳＴＤＰＬＴ (配列番号 ３４) (ＬＣＤＲ３) [クローン Ａ６．３]; 又は
(q) アミノ酸配列 ＧＦＳＬＳＴＳＧＹＧＭＳ (配列番号 ６２) (ＨＣＤＲ１)、 ＬＡＨＩＷＷＤＤＤＫＹＹＶＤＳＶＫＧ (配列番号 ２６) （ＨＣＤＲ２)、 ＴＲＱＹＦＰＦＡＹ (配列番号 ３１) （ＨＣＤＲ３)、 ＲＡＳＱＳＶＧＳＮＬＡ (配列番号 ３２) (ＬＣＤＲ１)、 ＳＡＳＮＲＹＴ (配列番号４４) (ＬＣＤＲ２) 及び ＱＱＹＳＴＤＰＬＴ (配列番号 ３４) （ＬＣＤＲ３) [クローン Ａ６．４]; 又は
(r) アミノ酸配列 ＧＦＳＬＳＴＳＧＹＧＭＧ (配列番号 ６４) （ＨＣＤＲ１)、 ＬＡＨＩＷＷＤＤＤＫＹＹＶＤＳＶＫＧ (配列番号 ２６) (ＨＣＤＲ２)、 ＴＲＱＹＦＰＦＡＹ (配列番号 ３１) (ＨＣＤＲ３)、 ＲＡＳＱＳＶＧＳＮＬＡ (配列番号 ３２) (ＬＣＤＲ１)、 ＳＡＳＮＲＹＴ (配列番号 ４４) (ＬＣＤＲ２) 及び ＱＱＹＳＴＤＰＬＴ (配列番号 ３４) （ＬＣＤＲ３) [クローン Ａ６．５]。
【００８６】
本発明の他の特定の実施形態によれば、抗体分子又はその抗原結合部分は、以下の表３及び４において特定されるさらなる個々のクローンについて列挙されるＨＣＤＲ１−３及びＬＣＤＲ１−３配列を含むことができる。
【００８７】
特定のクローンがそれらの名称に下線を含む場合、その下線は同じクローンのハイフンに置き換えられる。例えば、名称「Ｄ＿Ａ６」及び「Ｄ−Ａ６」は同じクローンを言及し、そしてそれらの名称は本明細書においては、交換可能的に使用される。
【００８８】
本明細書において定義されるような抗体分子又はその抗原結合部分は、翻訳後修飾（ＰＴＭ）部位、例えばグリコシル化部位（Ｎ結合された又はＯ−結合された）、脱アミノ化部位、リン酸化部位又は異性化／断片化部位を除去する、１又は２以上の置換、欠失及び／又は挿入を含むことができる。
【００８９】
３５０種類以上のＰＴＭが知られている。ＰＴＭの主要形は、リン酸化、グリコシル化（Ｎ及びＯ結合）、スモイル化、パルミトイル化、アセチル化、硫酸化、ミリストイル化、プレニル化及びメチル化（Ｋ及びＲ残基の）を含む。特定のＰＴＭを担当する推定アミノ酸部位を同定する統計学的方法は、当業界において良く知られている（Zhou et al., 2016, Nature Protocols 1: 1318-1321を参照のこと）。例えば、置換、欠失及び／又は挿入によるそのような部位の除去、及び次に、（ａ）結合活性及び／又は（ｂ）ＰＴＭの欠失についての任意の試験（実験的に及び／又は理論的に）が企画される。
【００９０】
例えば、６Ｃ８ネズミＬＣＤＲ１（本明細書に定義されるような、すなわちアミノ酸配列ＫＡＳＱＮＶＧＴＮＶＡ（配列番号１３））は、残基８（Ｔ）で推定Ｏ−結合グリコシル化部位を有することが同定されている。例えば、保存的置換（例えば、Ｓ、Ａ又はＮへの）によるこの部位の除去が想定される（例えば、クローンＤ＿Ａ６、及び表３及び４における他のクローンにおけるように）。
【００９１】
同様に、６Ｃ８ネズミＬＣＤＲ３（本明細書において定義されるような、すなわちアミノ酸配列ＱＱＹＮＴＤＰＬＴ（配列番号１５））は、残基４（Ｎ）で推定脱アミド化部位を有することが同定されている。例えば、保存的置換（例えば、Ｓ、Ｈ、Ｄ、Ｔ、Ｋ、Ｇ、Ｅ、Ｑ 又は Ｒへの）によるこの部位の除去が推定される（例えば、クローンＤ＿Ａ６、及び表３及び４における他のクローンにおけるように）。
【００９２】
また、例として、６Ｃ８マウスＨＣＤＲ１（本明細書で定義されるように、すなわちアミノ酸配列ＧＦＳＬＳＴＳＧＭＧＶＧ（配列番号４））は、残基９（Ｍ）に推定酸化部位を有することが同定されている。（Ｙ、Ｆ、Ｌ、又はＷなどの）任意のアミノ酸への置換などによるこの部位の除去が想定されています（例えば、クローンＤ＿Ａ６及び表３及び４の他のクローンにおけるように）。
【００９３】
抗体分子又はその抗原結合部分は、ヒト、ヒト化又はキメラであり得る。
【００９４】
抗体分子又はその抗原結合部分は、ＣＤＲが挿入されている１又は２以上のヒト可変ドメインフレームワーク足場を含むことができる。
【００９５】
抗体分子又はその抗原結合部分は、対応するＨＣＤＲ配列が挿入されているＩＧＨＶ３−７ヒト生殖系列足場を含むことができる。
【００９６】
抗体分子又はその抗原結合部分は、対応するＬＣＤＲ配列が挿入されているＩＧＫＶ３−１１ヒト生殖系列足場を含むことができる。
【００９７】
抗体分子又はその抗原結合部分は、免疫学的に不活性な定常領域を含むことができる。
【００９８】
抗体分子又はその抗原結合部分は、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、四量体抗体、四価抗体、多重特異性抗体（例えば二価抗体）、ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、モノクローナル抗体又は融合タンパク質であり得る。抗体分子及びそれらの構築及び使用方法は、例えばHolliger & Hudson (2005, Nature Biotechnol. 23(9): 1126-1136)に記載されている。
【００９９】
本発明の別の側面によれば、治療剤に結合される、本明細書において定義されるような本発明の抗体分子又はその抗原結合部分を含む免疫複合体が提供される。
【０１００】
適切な治療剤の例は細胞毒素、放射性同位元素、化学療法剤、免疫調節剤、抗血管新生剤、抗増殖剤、プロアポトーシス剤、及び細胞増殖抑制及び細胞溶解酵素（例えば、RNAses）を含む。さらなる治療剤は、治療用核酸、例えば免疫調節薬、抗血管新生薬、抗増殖薬、又はアポトーシス促進薬をコードする遺伝子を含む。それらの薬物記載は、相互的に排他的ではなく、そして従って、治療剤は、１又は２以上の上記用語を用いて説明され得る。
【０１０１】
免疫複合体への使用のための適切な治療剤の例は、タキサン、メイタンシン、CC-1065及びデュオカルマイシン、カリケアマイシン及び他のエンジイン、及びオーリスタチンを含む。他の例は、葉酸拮抗薬、ビンカアルカロイド、及びアントラサイクリンを含む。植物毒素、他の生物活性タンパク質、酵素（すなわち、ＡＤＥＰＴ）、放射性同位体、光増感剤がまた、免疫複合体に使用され得る。さらに、複合体は、リボソーム又はポリマーのような細胞毒性剤として二次担体を用いて製造され得る。適切な細胞毒素は、細胞の機能を阻害するか又は防止し、そして／又は細胞の破壊をもたらす剤を含む。代表的な細胞毒素は、抗生物質、チューブリン重合インヒビター、ＤＮＡに結合し、そして破壊するアルキル化剤、及びタンパク質合成、又はタンパク質キナーゼ、ホスファターゼ、トポイソメラーゼ、酵素及びサイクリンなどの必須細胞タンパク質の機能を破壊する剤を含む。
【０１０２】
代表的な細胞毒素は以下を含むが、但しそれらだけには限定されない：ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、アクラルビシン、ゾルビシン、ミトキサントロン、エピルビシン、カルビシン、ノガラマイシン、メノガリル、ピタルビシン、バルルビシン、シタラビン、ゲムシタビン、トリフルリジン、アンシタビン、エノシタビン、アザシチジン、ドキシフルヒジン、ペントスタチン、ブロクスフジン、カペシタビン、クラドビン、デシタビン、フロクスヒジン、フルダラビン、グゲロチン、ピューロマイシン、テガフール、チアゾフーン、アダマイシン、シスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、ダカルバジン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ミトキサントロン、ブレオマイシン、メクロレタミン、プレドニゾン、プロカルバジン、メトトレキサート、フルオロウラシル、エトポシド、タキソール、タキソール類似体、プラチン、例えばシスプラチン及びカルボプラチン、マイトマイシン、チオテパ、タキサン、ビンクリスチン、ダウノルビシン、エピルビシン、アクチノマイシン、オートラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、タモキシフェン、イダルビシン、ドラスタチン/オーリスタチン、ヘミアステリン、エスペラマイシン、及びメイタンシノイド。
【０１０３】
適切な免疫調節剤は、腫瘍に対するホルモン作用をブロックする抗ホルモン剤、及びサイトカイン産生を抑制し、自己抗原発現をダウンレギュレートするか、又はＭＨＣ抗原をマスクする免疫抑制剤を含む。
【０１０４】
本明細書に記載されるような本発明の抗体分子又はその抗原結合部分をコードする核酸分子がまた提供される。
【０１０５】
本明細書に記載されるような本発明の核酸分子を含むベクターがさらに提供される。
【０１０６】
本明細書に記載されるような本発明の核酸分子又はベクターを含む宿主細胞がまた提供される。
【０１０７】
さらなる側面によれば、抗体及び／又はその抗原結合部分の発現及び／又は生成をもたらす条件下で、本発明の宿主細胞を培養し、そして前記宿主細胞又は培養物から抗体及び／又はその抗原結合部分を単離する、抗−ＧＩＴＲ抗体及び／又はその抗原結合部分の生成方法が提供される。
【０１０８】
本発明の別の側面によれば、本明細書に記載されるような本発明の抗体分子又はその抗原結合部分、又は本明細書に記載されるような本発明の核酸分子、又は本明細書に記載されるような本発明のベクターを含む医薬組成物が提供される。
【０１０９】
さらに、有効量の本明細書に記載されるような本発明の抗体分子又はその抗原結合部分、又は本明細書に記載されるような本発明の免疫複合体、又は本明細書に記載されるような本発明の核酸分子、又は本明細書に記載されるような本発明のベクター、又は本明細書に記載されるような本発明の医薬組成物を投与することを含む、対象における免疫応答を増強するための方法が提供される。
【０１１０】
さらなる側面によれば、有効量の本明細書に記載されるような本発明の抗体分子又はその抗原結合部分、又は本明細書に記載されるような本発明の免疫複合体、又は本明細書に記載されるような本発明の核酸分子、又は本明細書に記載されるような本発明のベクター、又は本明細書に記載されるような本発明の医薬組成物を投与することを含む、対象における癌の治療又は予防方法が提供される。
【０１１１】
癌は例えば、膵臓癌、メラノーマ、乳癌、肺癌、気管支癌、結腸直腸癌、前立腺癌、胃癌、卵巣癌、膀胱癌、脳又は中枢神経系の癌、末梢神経系癌、食道癌、子宮頸癌、子宮癌又は子宮内膜癌、口腔癌又は咽頭癌、肝臓癌、腎臓癌、精巣癌、胆道癌、小腸又は虫垂癌、唾液腺癌、甲状腺癌、副腎癌、骨肉腫、軟骨肉腫、及び血液組織の癌から成る群から選択され得る。
【０１１２】
本発明はまた、癌の治療への使用のための、本明細書に記載されるような本発明の抗体分子又はその抗原結合部分、又は本明細書に記載されるような本発明の免疫複合体、又は本明細書に記載されるような本発明の核酸分子、又は本明細書に記載されるような本発明のベクター、又は本明細書に記載されるような本発明の医薬組成物も提供する。
【０１１３】
別の側面によれば、本発明は、抗体、その抗原結合部分、免疫複合体、核酸、ベクター又は医薬組成物が、第２の治療剤、例えば抗癌剤と組合して、別々に、連続して、又は同時に使用するためのものである、本明細書に記載されるような本発明の使用のための抗体分子又はその抗原結合部分、又は免疫複合体、又は核酸分子、又はベクター、又は本明細書に記載されるような本発明の治療方法を提供する。
【０１１４】
さらなる側面によれば、癌の治療のための薬物の製造のためへの、本明細書に記載されるような本発明の抗体分子又はその抗原結合部分、又は、本明細書に記載されるような本発明の免疫複合体、又は、本明細書に記載されるような本発明の核酸分子、又は、本明細書に記載されるような本発明のベクター、又は、本明細書に記載されるような本発明の医薬組成物の使用が提供される。
【０１１５】
本発明の医薬組成物は、医薬的に許容できる賦形剤を含むことができる。医薬的に許容できる賦形剤は、二次反応を引起さず、そして例えば抗−ＧＩＴＲ抗体分子の投与の促進、その寿命の延長及び／又は体内でのその有効性の上昇、又は溶液へのその溶解度の上昇を可能にする医薬組成物中に入る化合物又は化合物の組合せであり得る。それらの医薬的に許容できるビークルは、周知であり、そして抗−ＧＩＴＲ抗体分子の投与形式の機能として当業者により適合されるであろう。
【０１１６】
いくつかの実施形態によれば、抗−ＧＩＴＲ抗体分子は、投与の前、再構成のために凍結乾燥形で提供され得る。例えば、凍結乾燥された抗体分子は、個体への投与の前、滅菌水において再構成され、そして生理食塩水と共に混合され得る。
【０１１７】
抗−ＧＩＴＲ抗体分子は通常、抗体分子の他に少なくとも１つの成分を含む医薬組成物の形で投与されるであろう。従って、医薬組成物は、抗−ＧＩＴＲ抗体分子の他に、医薬的に許容できる賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤又は当業者に良く知られている他の材料を含むことができる。そのような材料は、非毒性であるべきであり、そして抗−ＧＩＴＲ抗体分子の効力を妨げるべきではない。担体又は他の材料の正確な性質は、以下に論じられるように、ポーラス、注入、注射又は他の適切な経路によってであり得る投与経路に依存するであろう。
【０１１８】
非経口投与、例えば注射による皮下又は静脈内投与に関しては、抗−ＧＩＴＲ抗体分子を含む医薬組成物は、発熱物質を含まず；そして適切なｐＨ、等張性及び安定性を有する非経口的に許容できる水溶液の形であり得る。当業者は、例えば等張性ビークル、例えば塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸加リンゲル注射液を用いて適切な溶液を調製することができる。必要に応じて、緩衝液、例えばリン酸、クエン酸及び他の有機酸を含む、保存剤、安定剤、緩衝剤、酸化防止剤及び／又は他の添加剤；酸化防止剤、例えばアスコルビン酸及びメチオニン；保存剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド; 塩化ヘキサメトニウム; 塩化ベンザルコニウム; 塩化ベンゼトニウム; フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール; アルキルパラベン、例えばメチルまたはプロピルパラベン; カテコール; レゾルシノール; シクロヘキサノール; ３‘−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量ポリペプチド;タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン; アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジン；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース又はデキストリンを含む他の炭水化物; キレート剤、例えばＥＤＴＡ; 糖、例えばスクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール; 塩形成対イオン、例えばナトリウム; 金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；及び/又は非イオン性界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が使用され得る。
【０１１９】
抗−ＧＩＴＲ抗体分子を含む医薬組成物は、単独で又は他の治療と組合して、治療される状態に依存して、同時に又は連続的に投与され得る。
【０１２０】
本明細書に記載されるような抗−ＧＩＴＲ抗体分子は、予防的又は防止的治療（例えば、個体に発生する状態のリスクを低めるために個体における状態の発症前の治療；又は発症後のその重症度の低下）を含む、ヒト又は動物の治療方法に使用され得る。治療方法は、抗−ＧＩＴＲ抗体分子を、その必要な個体に投与することを含むことができる。
【０１２１】
投与は通常、「治療的有効量」であり、これは患者に利点を示すのに十分である。そのような利点は、少なくとも１つの症状の少なくとも改善であり得る。実際の投与量、及び投与の速度及び時間経過は、治療される対象の性質及び重症度、治療される特定の哺乳類、個々の患者の臨床状態、障害の原因、組成物の送達部位、投与方法、投与スケジュール及び開業医に知られている他の要因に依存するであろう。治療の処方、例えば投与量などの決定は、一般開業医及び他の医師の責任の範囲内であり、そして症状の重症度及び／又は治療される疾患の進行に依存する。抗体分子の適切な用量は、当業界における周知である（Ledermann J.A. et al., 1991, Int. J. Cancer 47: 659-664; Bagshawe K.D. et al., 1991, Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4: 915-922）。特定の投与量は、本明細書に示されており、又はPhysician's Desk Reference (2003)に記載されており、投与される医薬の種類に応じて使用されてもよい。抗体分子の治療的有効量又は適切な用量は、動物モデルにおけるそのインビトロ活性及びインビボ活性を比較することにより決定され得る。マウス及び他の試験動物の有効用量をヒトに外挿する方法は知られている。正確な用量は、抗体が予防用か又は治療用か、治療される領域のサイズ及び位置、抗体の正確な性質（例えば、全抗体、断片）、及び抗体に結合される検出可能な標識又は他の分子の性質を含む多くの要因に依存するであろう。
【０１２２】
典型的な抗体用量は、全身投与の場合、１００μｇ〜１ｇ、及び局所投与の場合、１μｇ〜１ｍｇの範囲であろう。最初のより高い負荷用量、続いて１又は２回以上のより低い用量が投与され得る。典型的には、抗体は全抗体、例えばＩｇＧ１又はＩｇＧ４アイソタイプであろう。これは、成人患者の１回の治療のための用量であり、小児及び乳児では、比例して調整され、そしてまたは、分子量に応じて他の抗体形式でも調整され得る。治療は医師の裁量で、毎月、毎週２回、毎週又は毎月の間隔で反復され得る。個体の治療スケジュールは、抗体組成物の薬物動態学的及び薬力学的特性、投与経路及び治療される状態の性質に依存することができる。
【０１２３】
治療は定期的であってもよく、投与間の期間は、約２週間以上、例えば約３週間以上、約４週間以上、約１ヶ月以上、約５週間以上、又は約６週間以上であってもよい。例えば、治療は、２〜４週間ごと、又は４〜８週間ごとであり得る。治療は、手術の前及び／又は後に行われ得、そして／又は外科的治療又は侵襲的手順の解剖学的部位に直接投与又は適用され得る。適切な製剤及び投与経路は上記に記載されている。
【０１２４】
いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載されるような抗−ＧＩＴＲ抗体分子は、皮下注射として投与され得る。皮下注射は、例えば長期の予防／治療のために、自動注射器を用いて投与され得る。
【０１２５】
いくつかの好ましい実施形態によれば、抗−ＧＩＴＲ抗体分子の治療効果は、投与量に依存して、いくつかの半減期にわたって持続することができる。例えば、抗−ＧＩＴＲ抗体分子の１回の用量の治療効果は、個体において、１ヵ月以上、２ヵ月以上、３ヵ月以上、４ヵ月以上、５ヵ月以上、又は６ヵ月以上、持続することができる。
【０１２６】
本発明はまた、
（１）ヒト化抗−ＧＩＴＲ抗体分子又はその抗原結合部分を生成するために、非ヒト源からの抗−ＧＩＴＲ  ＣＤＲをヒトｖドメインフレームワークに移植する工程；
（２）ＣＤＲにおいて１又は２以上の変異を含むヒト化抗−ＧＩＴＲ抗体分子又はその抗原結合部分のクローンのファージライブラリーを生成する工程；
（３）ヒトＧＩＴＲ及びカニクイザルＧＩＴＲに結合するためのファージライブラリーをスクリーニングし；
（４）ヒトＧＩＴＲ及びカニクイザルＧＩＴＲに対する結合特異性を有するクローンを、工程（３）から選択する工程；及び
（５）工程（４）から選択されたクローンから、ヒトＧＩＴＲ及びカニクイザルＧＩＴＲ又はその抗原結合部分に対して特異的に結合する抗体分子を生成する工程を含む、ヒトＧＩＴＲ及びカニクイザルＧＩＴＲに対して特異的結合する抗体分子又はその抗原結合部分の生成方法も提供する。
【０１２７】
上記方法に適用できる改良点は、以下の実施例１に記載される。
【０１２８】
本明細書において使用される場合、用語「グルココルチコイド誘発性ＴＮＦ受容体」及び「ＧＩＴＲ」は、グルココルチコイド誘発性ＴＮＦ受容体、及びＧＩＴＲの生物学的活性の少なくとも一部を保持するその変異体を言及する。本明細書において使用される場合、ＧＩＴＲは、ヒト、ラット、マウス及びニワトリを含む、すべての哺乳類種の生来の配列ＧＲＩＲを含む。用語「ＧＩＴＲ」は、ヒトＧＩＴＲの変異体、アイソフォーム及び種相同体を含むために使用される。本発明の抗体は、ヒト以外の種由来のＧＩＴＲ、特にカニクイザル（Macaca fascicularis）由来のＧＩＴＲと交差反応することができる。特定の実施形態によれば、抗体は、ヒトＧＩＴＲに対して完全に特異的であってもよく、そして非ヒト交差反応性を示さなくてもよい。
【０１２９】
本明細書において使用される場合、本発明の抗体に関して使用される「アンタゴニスト」又は「抗−ＧＩＴＲアンタゴニスト抗体」（互換的に、「抗−ＧＩＴＲ抗体」と呼ばれる）は、ＧＩＴＲに結合することができ、そしてＧＩＴＲシグナル伝達により介在されるＧＩＴＲ生物学的活性及び／又は下流経路を阻害する抗体を言及する。抗−ＧＩＴＲアンタゴニスト抗体は、受容体結合及び／又はＧＩＴＲに対する細胞応答の誘発などのＧＩＴＲシグナル伝達により介在される下流経路を含む、ＧＩＴＲ生物学的活性をブロックし、拮抗し、抑制するか又は低める（有意に含む）ことができる抗体を包含する。本発明の目的のためには、用語「抗−ＧＩＴＲアンタゴニスト抗体」とは、すべての用語、タイトル及び機能的状態及び特徴を包含し、それにより、ＧＩＴＲ自体、及びＧＩＴＲ生物学的活性（Ｔｅｆｆの活性化を促進し、そしてＴｒｅｇの活性を低めるその能力を含むが、但しそれらだけには限定されない）、又は活性又は生物学的活性の結果が、実質的に無効化され、低められるか、又は有意な程度に中和されることが明確に理解されるであろう。
【０１３０】
ＧＩＴＲは、それが他の受容体に結合するよりも、より大きな親和性、結合力、より容易に及び／又はより長い期間、結合する場合、ＧＩＴＲと、「特異的に相互作用し」、「優先的に結合し」、「結合し」又は「相互作用する」。
【０１３１】
「抗体分子」は、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を通して、標的、例えば炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチド等に対して特異的結合できる免疫グロブリン分子である。本明細書において使用される場合、用語「抗体分子」とは、損なわれていないポリクローナル又はモノクローナル抗体のみならず、また任意の抗原結合フラグメント（例えば、「抗原結合部分」又はその一本鎖、抗体を含む融合タンパク質、及びｓｃＦｖ、一本鎖ドメイン抗体（例えば、サメ及びラクダ抗体）、マキシボディ、ミニボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ−ＮＡＲ及びｂｉｓ−ｓｃＦｖ（但し、それらだけには限定されない）を含む抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾されたコンフィギュレーションも含む。
【０１３２】
「抗体分子」は、ＩｇＧ、ＩｇＡ又はＩｇＭ（又はそのサブクラス）などの任意のクラスの抗体を含み、そしてその抗体は、任意の特定のクラスのものである必要はない。Ｈ鎖の定常領域の抗体アミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンは異なったクラスに割り当てられ得る。免疫グロブリンには、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭの５つの主要クラスがあり、そしてそれらのいくつかはさらに、サブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２に分割され得る。異なるクラスの免疫グロブリンに対応するＨ鎖定常領域は、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、及びミューと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元配置は良く知れれている。
【０１３３】
本明細書において使用される場合、用語、抗体の「抗原結合部分」とは、ＧＩＴＲに対して特異的に結合する能力を保持する損なわれていない抗体の１又は２以上のフラグメントを言及する。抗体分子の抗原結合機能は、損なわれていない抗体のフラグメントにより実施され得る。用語、抗体分子の「抗原結合部分」内に含まれる結合フラグメントの例は、Ｆａｂ; Ｆａｂ‘; Ｆ（ａｂ’）２；ＶＨ及びＣＨ１ドメインから成るＦｄフラグメント；抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインから成るＦｖフラグメント；単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）フラグメント；及び単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
【０１３４】
用語「Ｆｃ領域」は、免疫グロブリンＨ鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。「Ｆｃ領域」は、生来の配列Ｆｃ領域又は変異体Ｆｃ領域であり得る。免疫グロブリンＨ鎖のＦｃ領域の境界は異なるかも知れないが、通常、ヒトＩｇＧＨ鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６位置のアミノ酸残基から、又はＰｒｏ２３０からそのカルボキシル末端まで伸びると定義されている。Ｆｃ領域における残基の番号付けは、ＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックスの番号である。免疫グロブリンのＦｃ領域は一般的に、２つの定常ドメインＣＨ２及びＣＨ３を含む。当業界において知られているように、Ｆｃ領域は、ダイマー又はモノマー形で存在し得る。
【０１３５】
抗体の「可変領域」とは、単独で又は組合せて、抗体Ｌ鎖の可変領域又は抗体Ｈ鎖の可変領域を言及する。当業界において知られているように、Ｈ鎖及びＬ鎖の可変領域は、それぞれ、超可変領域としても知られている３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）により結合される４つのフレームワーク領域（ＦＲ）から成り、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。例えば抗体をヒト化又は最適化する際、ＣＤＲに隣接するＦＲを選択する場合、同じ標準クラスのＣＤＲ配列を含む抗体からのＦＲが好ましい。それにもかかわらず、そのようなＦＲは、例えば、必要に応じて長さを増加するか又は短縮することを含む、突然変異又は欠失により修飾され得る。
【０１３６】
本出願で使用される「統一された」ＣＤＲ定義は、免疫グロブリンレパートリー分析、及び抗体の単離及び抗原との共結晶の構造分析の組合せに基かれる、現場で創造された多くの異なる、しばしば矛盾するスキームに使用されるドメインを組合す（Swindells et al., 2016, abYsis: Integrated Antibody Sequence and Structure-Management, Analysis, and Prediction. J Mol Biol. [PMID: 27561707; Epub 22 August 2016]）による再考を参照のこと）。本明細書において使用されるＣＤＲ定義（「統一された」定義又は「私たちのもの」）として言及される場合、そのようなすべての以前の洞察の教訓を組み込み、そして潜在的に標的結合相補性を仲介する完全な残基の景観をサンプリングするために必要とされるすべての適切なループ位置を含む。
【０１３７】
表１は、同じＣＤＲを定義するための周知の代替システムと比較して、「統一された」定義に従って本明細書に定義される６Ｃ８ネズミ抗−ＧＩＴＲ抗体ＣＤＲのアミノ酸配列を示す。本発明のその抗原結合部分の抗体分子は、表１に示されるＣＤＲ定義のいずれかを用いて定義され得る。
【０１３８】
参照のために、Ｃ６８ネズミ抗−ＣＩＴＲ抗体Ｈ鎖及びＬ鎖可変領域についての完全な古典的なＫａｂａｔ番号付け（国際公開第２０１６／１０５０２１号に開示されるような）は、以下の通りである。
可変Ｈ鎖：
【０１３９】
H1 Q, H2 V, H3 T, H4 L, H5 K, H6 E, H7 S, H8 G, H9 P, H10 G, H11 I, H12 L, H13 K, H14 P, H15 S, H16 Q, H17 T, H18 L, H19 S, H20 L, H21 T, H22 C, H23 S, H24 F, H25 S, H26 G, H27 F, H28 S, H29 L, H30 S, H31 T, H32 S, H33 G, H34 M, H35 G, H35A V, H35B G, H36 W, H37 I, H38 R, H39 Q, H40 P, H41 S, H42 G, H43 K, H44 G, H45 L, H46 E, H47 W, H48 L, H49 A, H50 H, H51 I, H52 W, H53 W, H54 D, H55 D, H56 D, H57 K, H58 Y, H59 Y, H60 N, H61 P, H62 S, H63 L, H64 K, H65 S, H66 Q, H67 L, H68 T, H69 I, H70 S, H71 K, H72 D, H73 T, H74 S, H75 R, H76 N, H77 Q, H78 V, H79 F, H80 L, H81 K, H82 I, H82A T, H82B S, H82C V, H83 D, H84 T, H85 A, H86 D, H87 A, H88 A, H89 T, H90 Y, H91 Y, H92 C, H93 A, H94 R, H95 T, H96 R, H97 R, H98 Y, H99 F, H100 P, H100A F, H101 A, H102 Y, H103 W, H104 G, H105 Q, H106 G, H107 T, H108 L, H109 V, H110 T, H111 V, H112 S, H113 S, H114 -。
【０１４０】
可変Ｌ鎖：
L1 D, L2 I, L3 V, L4 M, L5 T, L6 Q, L7 S, L8 Q, L9 K, L10 F, L11 M, L12 S, L13 T, L14 S, L15 V, L16 G, L17 D, L18 R, L19 V, L20 S, L21 V, L22 T, L23 C, L24 K, L25 A, L26 S, L27 Q, L28 N, L29 V, L30 G, L31 T, L32 N, L33 V, L34 A, L35 W, L36 Y, L37 Q, L38 Q, L39 K, L40 P, L41 G, L42 Q, L43 S, L44 P, L45 K, L46 A, L47 L, L48 I, L49 Y, L50 S, L51 A, L52 S, L53 Y, L54 R, L55 Y, L56 S, L57 G, L58 V, L59 P, L60 D, L61 R, L62 F, L63 T, L64 G, L65 S, L66 G, L67 S, L68 G, L69 T, L70 D, L71 F, L72 T, L73 L, L74 T, L75 I, L76 N, L77 N, L78 V, L79 H, L80 S, L81 E, L82 D, L83 L, L84 A, L85 E, L86 Y, L87 F, L88 C, L89 Q, L90 Q, L91 Y, L92 N, L93 T, L94 D, L95 P, L96 L, L97 T, L98 F, L99 G, L100 A, L101 G, L102 T, L103 K, L104 L, L105 E, L106 I, L107 K。
【０１４１】
本明細書において使用される場合、用語「保存的置換」とは、機能的活性を著しく有害に変化させない別のアミノ酸によるアミノ酸の置換を言及する。「保存的置換」の好ましい例は、次のＢＬＯＳＵＭ６２置換マトリックスにおいて値≧０を有する別のアミノ酸による１つのアミノ酸の置換である（Henikoff & Henikoff, 1992, PNAS 89: 10915-10919を参照のこと）：
A  R  N  D  C  Q  E  G  H  I  L  K  M  F  P  S  T  W  Y  V
A  4 -1 -2 -2  0 -1 -1  0 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  1  0 -3 -2  0
R -1  5  0 -2 -3  1  0 -2  0 -3 -2  2 -1 -3 -2 -1 -1 -3 -2 -3
N -2  0  6  1 -3  0  0  0  1 -3 -3  0 -2 -3 -2  1  0 -4 -2 -3
D -2 -2  1  6 -3  0  2 -1 -1 -3 -4 -1 -3 -3 -1  0 -1 -4 -3 -3
C  0 -3 -3 -3  9 -3 -4 -3 -3 -1 -1 -3 -1 -2 -3 -1 -1 -2 -2 -1
Q -1  1  0  0 -3  5  2 -2  0 -3 -2  1  0 -3 -1  0 -1 -2 -1 -2
E -1  0  0  2 -4  2  5 -2  0 -3 -3  1 -2 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2
G  0 -2  0 -1 -3 -2 -2  6 -2 -4 -4 -2 -3 -3 -2  0 -2 -2 -3 -3
H -2  0  1 -1 -3  0  0 -2  8 -3 -3 -1 -2 -1 -2 -1 -2 -2  2 -3
I -1 -3 -3 -3 -1 -3 -3 -4 -3  4  2 -3  1  0 -3 -2 -1 -3 -1  3
L -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3  2  4 -2  2  0 -3 -2 -1 -2 -1  1
K -1  2  0 -1 -3  1  1 -2 -1 -3 -2  5 -1 -3 -1  0 -1 -3 -2 -2
M -1 -1 -2 -3 -1  0 -2 -3 -2  1  2 -1  5  0 -2 -1 -1 -1 -1  1
F -2 -3 -3 -3 -2 -3 -3 -3 -1  0  0 -3  0  6 -4 -2 -2  1  3 -1
P -1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4  7 -1 -1 -4 -3 -2
S  1 -1  1  0 -1  0  0  0 -1 -2 -2  0 -1 -2 -1  4  1 -3 -2 -2
T  0 -1  0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  1  5 -2 -2  0
W -3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1  1 -4 -3 -2 11  2 -3
Y -2 -2 -2 -3 -2 -1 -2 -3  2 -1 -1 -2 -1  3 -3 -2 -2  2  7 -1
V  0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3  3  1 -2  1 -1 -2 -2  0 -3 -1  4
【０１４２】
用語「モノクローナル抗体」（Ｍａｂ）とは、例えば真核生物、原核生物又はファージクローンを含む単一のコピー又はクローンに由来する抗体又はその抗原結合部分を言及し、そしてそれが生成される方法ではない。好ましくは、本発明のモノクローナル抗体は、均質又は実質的に均質な集団に存在する。
【０１４３】
「ヒト化」抗体分子とは、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含む、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はそのフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、 Ｆａｂ‘、Ｆ（ａｂ’）２又は抗体の他の抗原結合配列）である、非ヒト（例えば、ネズミ）抗体分子、又はその抗原結合部分の形を言及する。ヒト化抗体は、受容体のＣＤＲからの残基が、非ヒト種（ドナー抗体）、例えば所望の特異性、親和性及び能力を有するマウス、ラット又はウサギのＣＤＲからの残基により置換されているヒト免疫グロブリン（受容体抗体）であり得る。
【０１４４】
「ヒト抗体又は完全ヒト抗体」とは、ヒト抗体遺伝子を担持するトランスジェニックマウス又はヒト細胞に由来する抗体分子又はその抗原結合部分を言及する。
【０１４５】
用語「キメラ抗体」とは、可変領域配列が１つの種に由来し、そして定常領域配列が別の種に由来する抗体分子又はその抗原結合部分、及び可変領域配列がマウス抗体に由来し、そして定常領域配列がヒト抗体の由来する抗体分子を指すことを意図している。
【０１４６】
「抗体−薬物複合体」及び「免疫複合体」とは、ＧＩＴＲに結合し、そして細胞毒性剤、細胞増殖抑制剤及び／又は治療剤である抗体誘導体を含む、抗体分子又はその抗原結合部分を言及する。
【０１４７】
本発明の抗体分子又はその抗原結合部分は、当業界において周知の技法、例えば組換え技法、ファージディスプレイ技法、合成技法、又はそのような技法又は当業界において容易に知られている他の技法の組合せを用いて生成され得る。
【０１４８】
用語「エピトープ」とは、１又は２以上の抗体分子の抗原結合領域で、抗体分子又はその抗原結合部分により認識され、そして結合されることができる分子の部分を言及する。エピトープは、一次、二次又は三次タンパク質構成の定義された領域から成り、そして抗体の抗原結合領域、又はその抗原結合部分により認識される標的の二次構造単位又は構造ドメインの組合せを含む。同様に、エピトープは、アミノ酸又は糖側鎖などの分子の定義された化学的活性な表面グループから成り、そして特定の三次元構造特性及び特定の電荷特性を有する。用語「抗原性エピトープ」とは、本明細書において使用される場合、抗体分子が、当業界において周知の任意の方法により、例えば従来のイムノアッセイ、抗体競争結合アッセイ、又はｘ線結晶構造解析又は関連する構造決定方法（例えば、ＮＭＲ）により決定されるように特異的に結合できる、ポリペプチドの一部として定義される。
【０１４９】
用語「結合親和性」又は「ＫＤ」とは、特定の抗原−抗体相互作用の解離速度を言及する。ＫＤは、解離速度（「オフレート（Ｋｏｆｆ）」とも呼ばれる）の、結合速度又は「オンレート（Ｋｏｎ）」に対する比である。従って、ＫＤは、Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎに等しく、そしてモル濃度（Ｍ）として表される。ＫＤが小さいほど、結合の親和性は強くなる。従って、１μＭのＫＤは、１ｎＭのＫＤに比較して、弱い結合親和性を示す。抗体のＫＤ値は、当業界において十分に確立された方法を用いて決定され得る。抗体のＫＤを決定するための１つの方法は、通常、バイオセンサーシステム、例えばＢｉａｃoｒｅ（登録商標）システムを用いて、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用することによってである。
【０１５０】
用語「効力」とは、生物学的活性の測定値であり、そしてＴＣ５０、又は本明細書に記載されるようなＧＩＴＲ活性アッセイにおいて測定される活性の５０％を阻害する抗体、又は抗原ＧＩＴＲに対する抗体薬物複合体の有効濃度として指定され得る。
【０１５１】
本明細書において使用される場合、「有効量」又は「治療的有効量」の用語とは、所望の治療結果を達成するのに必要な量（投与量で、及び期間、及び投与手段のための）を言及する。有効量は、対象に治療的利益を与えるのに必要である活性剤の少なくとも最小量であるが、しかし毒性量よりも少ない量である。
【０１５２】
本発明の抗体分子の生物活性に関して本明細書において使用される場合、用語「阻害する」又は「中和する」とは、例えば抗体分子の生物学的活性又はＧＩＴＲへの抗体分子の結合相互作用を含む（但し、それらだけには限定されない）、阻害されているものの進行又は重症度を、抗体が実質的に拮抗、禁止、予防、抑制、減速、破壊、排除、停止、減少又は逆転する能力を意味する。
【０１５３】
「宿主細胞」は、ポリヌクレオチド挿入体の組込みのためのベクターのための受容体であり得るか、又は受容体であった個々の細胞又は細胞培養物を含む。宿主細胞は、単一の宿主細胞の子孫を含み、そして子孫は、自然、偶発的又は意図的な突然変異のために、元の親細胞と必ずしも完全に同一である必要はない（形態又はゲノムＤＮＡ相補体において）。宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチドによりインビボトランスフェクトされた細胞を含む。
【０１５４】
本明細書において使用される場合、「ベクター」とは、宿主細胞において、目的の１又は２以上の遺伝子又は配列を送達し、そして好ましくは発現できるコンストラクトを意味する。ベクターの例は以下を含むが、但しそれらだけには限定されない：ウィルスベクター、裸のＤＮＡ又はＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミド又はファージベクター、カチオン性凝縮剤に関連するＤＮＡ又はＲＮＡ発現ベクター、リポソームにカプセル化されたＤＮＡ又はＲＮＡ発現ベクター、及び一定の真核細胞、例えばプロデューサー細胞。
【０１５５】
用語「治療する」とは、本明細書において使用される場合、特にことわらない限り、そのような用語が適用される障害又は状態、又はそのような障害又は状態の１又は２以上の症状の進行を逆転し、緩和し、阻害し、進行を遅延し、開始を遅延し、又は予防することを意味する。用語「治療」とは、本明細書において使用される場合、特にことわらない限り、上記で定義されるような治療の行為を言及する。用語「治療する」はまた、対照のアジュバント治療も含まれる。疑念を避けるために、本明細書における「治療」への言及は、治療的、緩和的及び予防的治療への言及も含む。疑念を避けるために、本明細書における「治療」への言及はまた、治療的、緩和的及び予防的治療への言及も含む。
【０１５６】
本明細書において、実施形態が、「含む」という文言で記載される場合は常に、「から成る」及び／又は「から本質的に成る」という用語で記載される類似の実施形態もまた提供されることが理解される。
【０１５７】
本発明の側面又は実施形態がマーカッシュグループ又は代替の他のグループに関して記載される場合、本発明は、全体として列挙される全グループのみならず、またグループの各メンバーを個々に、及び主にグループのすべての可能なサブグループも、グループメンバーの１又は２以上の不在の主グループもまた包含する。本発明はまた、請求された発明におけるグループメンバーのいずれか１又は２以上の明示的な除外も想定している。
【０１５８】
特にことわらない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が局する技術分野の当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、定義を含む明細書が支配するであろう。本明細書及び特許請求の範囲を通して、用語「含む（comprise）」、又は変形、例えば「含む（comprises）」又は「含むcpmprising」」とは、言及される整数又は整数のグループの包含を意味するが、しかしいずれか他の整数又は整数のグループの除外を意味するものではないことが理解されるであろう。特に必要とされない限り、単数形の用語とは、複数形が含まれ、複数形の用語には、単数形が含まれる。用語「例えば（ｅ.ｇ.）」又は「例えば（fox example）」に続く任意の例は、網羅的又は限定的であることを意味するものではない。
【０１５９】
本発明の実施は、特にことわらない限り、分子生物学（組換え技法を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の従来の技法を使用し、これは当業者の範囲内である。
【０１６０】
本発明の特定の非限定的な実施形態が、添付の図面を参照して説明されるであろう。
【実施例】
【０１６１】
実施例１．最適化された抗−ＧＩＴＲ治療抗体の生成
前書き
この実施例においては、アゴニスト、最適化された抗−ＧＩＴＲ抗体のパネルの生成に成功した。それらの抗−ＧＩＴＲ抗体は十分に発現し、生物物理学的に安定し、高い溶解性であり、そして好ましいヒト生殖系列との最大の同一性を有する。
【０１６２】
材料及び方法
ＩｇＧクローニング、一過性発現、精製
抗体ｖ−ドメインコードのＤＮＡ配列を、別々のプラスミドベクターの別々のＩｇＧＨ鎖及びＬ鎖発現カセット中に、制限連結クローニングを介してクローニングした。製造業者のプロトコルに従って、エンドトキシンを含まないＩｇＧ発現プラスミド調製物によるトランスフェクションの後、ＩｇＧをＨＥＫ−２３ｅｘｐｉ細胞において一時的に発現した。ＩｇＧを、シングル−ステッププロトコルを用いて以下のようにして精製した：ならし培地を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で前もって平衡化された、１ｍｌのＰｒｏＡセファロースカラム上に負荷した（ニート）。カラムを５カラム容量のＰＢＳ（ｐＨ７．４）により洗浄した後、タンパク質を、１００ｍＭのグリシン（ｐＨ２．７）により溶出し、そして３０ＫＤａのカットオフ透析膜を用いて、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）下で透析した。
【０１６３】
ＩｇＧ滴定結合ＥＬＩＳＡ
Greiner Bio-One High bind ELISAプレートを被覆するために、標的タンパク質を、炭酸緩衝液で１μｇ／ｍｌに希釈し、そしてウェル当たり１００μｌで、４℃、ｏ／ｎで添加した。被覆されたプレートを、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）により３度、洗浄し、ＰＢＳ中、１％ＢＳＡ（３８０μｌ／ウェル）により、ＲＴで１時間ブロックし、次に、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）により３度、洗浄した。次に、ＧＩＴＲ抗体（１００μｌ／ウェル；ＰＢＳＴで希釈された）を添加し、そして次に、ＲＴで１時間インキュベートした。次に、プレートをＰＢＳＴにより３度、洗浄し、そしてヤギ抗−ヒトカッパ鎖−ＨＲＰ（１００μｌ／ウェル）をＲＴで１時間、添加した。次に、プレートをＰＢＳＴにより３度、ＰＢＳにより２度、洗浄し、次にウェル当たり１００μｌのＴＭＢを添加した。反応を、１００μｌの２ＭのＨ２ＳＯ４をウェル当たり添加することにより、停止し、そしてＯＤを４５０ｎｍでプレートリーダー上で読み取った。負に帯電された生体分子表面のＥＬＩＳＡによるＩｇＧ結合分析を、前に記載されたようにして実施した（Mouquet et al., 2010, Nature 467: 591-595を参照のこと）。
【０１６４】
ＧＩＴＲ細胞に基く分析
ＰｒｏｍｅｇａからのＧＩＴＲ  Ｂｉｏａｓｓａｙキット（ＣＳ１８４００６）を用いて、ＧＩＴＲを架橋し、そして受容体を刺激するそれらの能力について抗−ＧＩＴＲ  ＩｇＧを分析した。このアッセイは、「ＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ」 ＮＦｋＢ−ｌｕｃ２/ＧＩＴＲ Ｊｕｒｋａt細胞に基かれる。アッセイを、製造業者の説明書に従って、陽性対照としてＨＡ標識されたヒトＧＩＴＲタンパク質及び抗−ＨＡ標識抗体を用いて実施した。無関係な受容体に対する特異性を有するヒトＩｇＧ１を、アイソタイプ陰性対照として使用した。
【０１６５】
ＰｒｏｍｅｇａからのＡＤＣＣ  Ｂｉｏａｓｓａｙキット（Ｇ７０１５）を用いて、ヒト又はカニクイザルＧＩＴＲ発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞を結合した後、ＡＤＣＣを誘発するそれらの能力について抗−ＧＩＴＲ  ＩｇＧを分析した。このアッセイは、ＦｃγＲIIIａ受容体、Ｖ１５８（高親和性）変異体、及びホタルルシフェラーゼの発現を駆動するＮＦＡＴ応答要素を安定して発現する操作されたＪｕｒｋａｔエフェクター細胞に基かれる。このアッセイを、製造業者の説明に従って、ＩｇＧ１及び非グリコシル化ＩｇＧ１の両方の形の抗−ＧＩＴＲ抗体を用いて実施した。
【０１６６】
Ｇ−ＶＬ１−ＶＨ３ライブラリーの生成及び選択
Ｇ−ＶＬ２−ＶＨ３  ｓｃＦｖレパートリーを、大量オリゴ合成及びＰＣＲによりアセンブリーした。次に、増幅制限−連結により、ファージミドベクターにクローニングし、Ｅ．コリＴＧ−１細胞を形質転換し、特徴付けし、そしてファージレパートリーを、実質的に前に詳細に記載されたようにしてレスキューした（Finlay et al., 2011, Methods Mol Biol 681: 383-401）。
【０１６７】
ファージ選択を、ＧＩＴＲ−Ｆｃタンパク質（ヒト又はカニクイザル）によりストレプトアビジン磁気マイクロビーズを被覆し、ビーズをＰＣＲにより３度、洗浄し、そしてＰＢＳ（ｐＨ７．４）＋５％スキムミルクタンパク質（ＭＰＲＳ）に再懸濁することにより実施した。それらのビーズを、選択のラウンド１で２００ｎＭの標的タンパク質で被覆し、次に、続くラウンドで、１００、５０及び１０ｎＭで被覆した。
【０１６８】
ＨＴＲＦ結合競争アッセイ
競争ＨＴＲＦアッセイを、移植された及びライブラリー由来のクローンによりＶＨ１／ＶＬ１  ＩｇＧに対するエピトープ競争を試験するために確立した。精製されたＶＨ１／ＶＬ１  ＩｇＧを、製造業者の説明書に従って、標識キット（ＣisBio）を用いてテルビウムにより標識した。最終反応混合物は、１×アッセイ緩衝液［５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５、４００ｍＭのフッ化カリウム及び０．１％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）］中、２０μｌの総反応体積で、ビオチン化されたヒトＧＩＴＲ−Ｆｃ、ＳＡ−ＸＬ６６５（Cisbio）、テルビウム標識された親ＸＴ−Ｍ４、及び上記のようにして調製された目的の競争ＩｇＧを含んだ。試薬を、３８４ウェルの低容量ブラックプレート（Ｎｕｎｃ）中に、MiniTrak Liquid Handling Platform (Perkin-Elmer)で連続的に添加した。反応は室温で１時間、進行し、そして続いて、プレートを、３４０ｎｍでの励起読み取り、及び６１５ｎｍ（ＶＨ１−ＶＬ１−クリプレートからの入力ドナー蛍光を測定する）及び６６５ｎｍ（ＳＡＸＬ６６５からの出入受容体蛍光を測定する）での２回の発光読み取りを、プレートリーダー上で読み取った。読み取りは、６６５ｎｍ／６１５ｎｍ比として表された。
【０１６９】
結合特異性の分析
抗−ＧＩＴＲ抗体を、ＥＬＩＳＡにより多反応性について試験した。精製された組換え標的及び非標的抗原を、炭酸緩衝液中、１００ｎｇ／ウェルで９６ウェルＮｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートにおい、４℃で一晩被覆した。次に、プレートを、ＰＢＳにより３度、洗浄し、ＰＢＳ中、１％ＢＳＡによりロックし、次に、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０により３度、洗浄した。次に、一次抗体の希釈系列を適用し、プレートをＰＢＳ０−Ｔｗｅｅｎ２０により３度、洗浄し、続いて１：４，０００のヤギ抗−ヒトカッパ鎖−ＨＲＰ：二次抗体を適用した。次に、ウェルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ２０により３度、及びＰＢＳにより２度、洗浄し、１００μｌのＴＭＢペルオキシダーゼ基質をウェル当たり添加し、反応を、１００μｌの２ＭのＨ２ＳＯ４の添加により停止し、そして吸光度を４５０ｎｍで読み取った。
【０１７０】
抗−ＧＩＴＲ抗体を、フローサイトメトリーにより結合特異性についても試験した。ＨｕＴ７８細胞を、抗−ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビースと共に３日間、インキュベートすることにより活性化した。ナイーブ細胞を、培地のみにおいてインキュベートした。インキュベーションの最後で、細胞を収穫し、そしてビーズを、磁石を用いて、活性化された細胞から除去した。細胞を、生存性色素と共にインキュベートし、そして次に、抗−ＧＩＴＲ抗体により４℃染色した。市販の抗−ヒトＧＩＴＲモノクローナル抗体１０８−１７（ＰＥにより直接標識された；BioLegend Inc. から入手された、カタログ番号371202）もまた、陽性対照として含まれた。ＶＨ１／ＶＬ１及びＤ−Ａ６  ＩｇＧタンパク質の結合を、ＰＥ標識されたヤギ抗−ヒトＩｇＧとの続くインキュベーションにより検出した。細胞を、４％ＰＦＡにより固定し、続いてＰＢＳにおいて４℃で一晩、貯蔵した。次の日、Ｄｉｖａソフトウェアを実行するＢＤ  Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメトリーを用いて、細胞を分析した。分析は、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて実施された。単一細胞が、生存性色素を用いて散乱細胞及び生細胞によりゲート制御された。単一生細胞のＰＥチャネルにおけるメジアン蛍光強度（ＭＦＩ）を決定し、そしてプロットした。各染色条件は、二重反復して実施された。
【０１７１】
抗−ＧＩＴＲ  ＦａｂフラグメントのＢｉａｃｏｒｅ親和性分析
ＩｇＧ１及びＧＩＴＲ−Ｆｃタンパク質の両方は多量体であるので、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を介しての正確な１：１結合親和性測定を達成することは挑戦的である。この問題を最小限にするためには、GingisKHANキット(Genovis)を用いて、ＶＨ１／ＶＬ１及びＤ−Ａ６  ＩｇＧ１タンパク質の両方から単量体Ｆａｂフラグメント（「Ｆａｂ」）を調製した。次に、Ｂｉａｃｏｒｅ分析への使用のために、Ｆａｂを、ＨＢＥ−ＥＰ緩衝液に緩衝液交換した。
【０１７２】
親和性の推定のために、抗−ヒトＩｇＧ  Ｆｃ抗体を、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＣＭ５チップの３つのフローセル（Ｆｃ１〜Ｆｃ３）上にｐＨ５でアミン結合した。チップに固定された抗−Ｆｃ抗体のレベルは約５５０ＲＵであった。次に、８０〜１００ＲＵを補足するために、ヒト及びカニクイザルＧＩＴＲ−Ｆｃ及び無関係な受容体−Ｆｃタンパク質を、抗−Ｆｃ抗体上に補足した（ほぼ／完全に飽和するまで抗体表面上に注入することにより）。次に、Ｆａｂモノマーを、チップ上に補足されたＦｃタンパク質上に、３７℃で５０μ／分の流速で１２０秒間注入し、続いてＢｉａｃｏｒｅランニング緩衝液（ＨＢＳ−ＥＰ）をチップ上に５０μｌ／分で２４０秒間流した。チップを、１０ｍＭのグリシン（ｐＨ２）の２回の１５秒注入を用いて、サイクル間で再生した。試験されるＦａｂサンプルの濃度は、４００、２００、１００、５０、２５、１２．５、及び６．２５ ｎＭであった。Ｂｉａｃｏｒｅランニング緩衝液対照（ＯｎＭ）がまた、対照として含まれた。
【０１７３】
結果及び議論
好ましいヒト生殖系列ｖ−遺伝子へのＣＤＲ移植
アゴニスト性ネズミ抗−ＧＩＴＲ  ＩｇＧ  ６Ｃ８（ｍＶＨ／ｍＶＬ；国際公開第２００６／１０５０２１号及び表２を参照のこと）のＣＤＲを、最初に、ＣＤＲ移植を用いて、ヒト生殖系列免疫グロブリンｖ−ドメインフレームワーク配列足場に導入した。最適な薬物のような特性を有する最終リード治療ＩｇＧ化合物に向けての我々の工学的努力を偏らせるために、我々は、親抗体のＣＤＲを、高い安定性を有することが知られており、そして発現されたヒト抗体レパートリーにおいて高い頻度で使用される「好ましい」生殖系列足場に移植することを選択する。
【０１７４】
参照分子として、我々はまた、最も近い生殖系列フレームワーク（ｈＶＨ１／ＶＬ１）にＣＤＲを移植した。それらの足場及び移植されたＣＤＲ定義は、表２に概説されている。ネズミ抗−ＧＩＴＲ抗体のＨ鎖及びＬ鎖配列もまた、表２に示されている。このＣＤＲ移植方法は良く知られているが、ヒトｖ−ドメイン配列の所定の組が非ヒトＣＤＲ移植のための適切な受容体フレームワークとして作用するかどうかを予測することは依然として問題である。不適切なフレームワークの使用は、標的結合機能の喪失、タンパク質安定性の問題、又はさらに最終的ＩｇＧの発現障害を導く可能性がある。この研究において、この方法は、親抗体が、ヒト抗体レパートリーにおいて低頻度で使用される標準的ＨＣＤＲ構造（Ｈ１−１５−１）を使用している事実によりさらに複雑にされている。この観察は、抗体が「最も近い生殖系列」配列（最も近いアミノ酸相同性を有するそれらのヒト生殖系列）にヒト化されるべきであるが、しかし最も近いＨ鎖生殖系列（ＩＧＨＶ２−７０）は機能的に発現されたヒト抗体レパートリーにはまれにしか使用されず、得られた抗体を、好ましくない薬理学的及び製造上の品質のリスクにさらす仮定に当業者を導く可能性がある。
【０１７５】
７種のｖ−ドメイン移植片（４ＶＨ、３ＶＬ）を、表１に概説されるようなＣＤＲ定義を用いて、イン・シリコで企画した。移植された及びｍＶＨ／ｍＶＬ  ｖ−ドメインのｖ−ドメイン遺伝子配列を、二本鎖ＤＮＡカセットとして合成し、そして全長ヒトＩｇＧ１抗体の発現のために企画されたプラスミドにクローニングした。それらのプラスミドを用いて、ＨＥＫ−２９３細胞の一過性トランスフェクションを行い、そして発現されたＩｇＧを、プロテインＡカラムにより精製した。機能についてＣＤＲ−移植されたｖ−ドメインのすべての可能な組合せを試験するために、すべての４つのヒト化Ｈ鎖を３つのヒト化Ｌ鎖のそれぞれと共発現し、１２のＩｇＧを４つのファミリー（ＶＨ−１−４）にグループ化した。
【０１７６】
精製されたＩｇＧ１タンパク質におけるＧＩＴＲ結合機能の保持は、ヒトＧＩＴＲ−Ｆｃに対する直接的結合ＥＬＩＳＡにおける滴定により最初に試験された。それらの実験は、ＶＨ２及びＶＨ４ファミリーについてのｍＶＨ／ｍＶＬ  ＩｇＧ（ＥＣ５０≧０．００４μｇ／ｍｌ）と比較して、標的結合の障害をし、そしてすべての結合機能はＶＨ２ファミリーにおいては、本質的に除去されている（図１Ｂ）。この発見は、親抗体のＣＤＲが、機能が保持されていた場合、任意のランダムに選択されたヒトｖ−ドメインフレームワークに単純に移植できなかったことを実証した。重要なことには、ＶＨ２  ＩｇＧファミリーにおける結合機能の１００倍以上の損失は、ＨＣＤＲ１が移植のために使用されるフレームワーク（ＩＧＨＶ３−７）に見出されるヒト生殖細胞系列ＨＣＤＲ１の生来の配列と一致するよう事前に完全に生殖細胞系列化できなかったことをさらに示した。ｍＶＨ／ｍＶＬ  ＩｇＧ１と同等、又はそれ以上に改善された結合機能が、ＶＨ１及びＶＨ３ファミリー及びＶＨ３ファミリーにおける抗体に観察された（図１Ａ）。
【０１７７】
ＥＬＩＳＡ結合データに基いて、ｍＶＨ／ｍＶＬ、ＶＨ１、ＶＨ３及びＶＨ４ファミリーＩｇＧを、細胞ベースの組換え受容体レポーターアッセイにおいてＧＩＴＲの濃度依存性アゴニスト活性化について試験した。このアッセイは、ＶＨ３／ＶＬ２の組合せが最も強い濃度依存性受容体活性化を与えることを実証した（図２）。従って、この移植片は、ＣＤＲ突然変異誘発及び改善されたクローンの選択のための鋳型として進められた。
【０１７８】
ライブラリー生成及びスクリーニング
ｖ−ドメイン配列ＶＬ２及びＶＬ３を、ＶＬ−ＶＨ  ｓｃＦｖ形式に組合し、そして突然変異誘発ライブラリーカセットを、大量オリゴ合成及びアセンブリーにより生成した。最終ｓｃＦｖライブラリー（Ｇ−ＶＬ２−ＶＨ３と命名される）を、ファージディスプレイベクターに連結し、そしてエレクトロポレーションによりＥ．コリを形質転換し、３．０×１０８個の独立したクローンを生成した。ライブラリービルドの品質を、１００，０００以上のクローンのデープシーケンスにより検証した。この配列決定データは、各分散位置でネズミ又はヒト生殖細胞系列残基のいずれかをコードする位置が５０％の頻度で効果的にサンプリングされたことを示した。ライブラリーを、ヘルパーファージＭ１３を用いてレスキューし、そしてビオチン化されたヒト及びカニクイザルＧＩＴＲ−Ｆｃタンパク質に基く選択を実施した。
【０１７９】
選択後スクローニング（図３Ａ、Ｂ、Ｃ）及びＤＮＡ配列決定は、ＣＤＲ内に有意に高められたヒト含有物を有する、１３２のユニーク、ヒト及びカニクイザルＧＩＴＲ結合ｓｃＦｖクローンの存在を明らかにしたが、フレームワーク配列は完全に生殖系列のままであった。それらの１３２のクローンのうち、７４のクローンは、すべてのＣＤＲに生殖細胞内突然変異を有することが見出された（表３）。リードクローンが、ヒト及びカニクイザルＧＩＴＲ−Ｆｃの両方への結合について、ＣＤＲ生殖細胞系列のレベル対ＥＬＩＳＡシグナルのレベルに基いてランク付けされた（図４）。次に、このランキングからの上位１１のクローンのＶ−ドメインを、下記のようにさらに試験するためにＩｇＧ発現ベクター中にサブクローニングした（表４を参照のこと）。
【０１８０】
生殖系列内突然変異がライブラリー選択に直接的に由来するリードクローンの全てのＣＤＲに観察されたが、配列分析により、最大のヒト化を有するよう、さらなるクローンの企画を可能にする可能性が残っている。従って、ヒト及びカニクイザルタンパク質に対する結合シグナルを有する１３２の配列固有のヒットを用いて、この機能的に特徴付けられた集団のＣＤＲ中のネズミアミノ酸についての保持頻度（ＲＦ）を分析した。位置的なアミノ酸ＲＦを、ＶＬ及びＶＨドメインに見出される割合として表した（図５Ａ及びＢ）。７５％以下のＲＦを有するネズミ残基は、一連の組合せ企画において、標的結合パラトープに必須ではなく、生殖細胞内に露出されやすい位置として見なされた。
【０１８１】
７５％以上のＲＦを有するネズミ残基のみを含む企画を、「ＭＨ」（ＭＨ＝最大にヒト化された）と指定した。このクローン、及びネズミ残基をＣＤＲ中に戻された５つのさらなるデザイナークローン（ＭＨ−１〜ＭＨ−５；表４を参照のこと）を、上記に概説される１１のライブラリー由来のクローンのように、遺伝子合成により生成し、そして生成のためにヒトＩｇＧ１発現ベクターにクローン化した。全ての１７のＩｇＧを、ＨＥＫ−２９３細胞の一過性トランスフェクションから容易に発現し、そして精製した。単一のプロテインＡカラム精製工程の後、分析ＨＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィーは、すべてのリードが９７．６５〜９９．７５％の範囲のモノマーＩｇＧを有することを示した。
【０１８２】
リードＩｇＧの親和性、安定性及び特異性の特性
次に、上記の１７の精製されたＩｇＧを、直接的滴定ＥＬＩＳＡ形式でヒト及びカニクイザルＧＩＴＲ−Ｆｃへの結合について試験した。驚くべきことには、この分析は、多くの（１４／１７）のクローンがＶＨ１／ＶＬ１及びＶＨ３/ＨＬ２  ＩｇＧ（デザイナークローンＭＨ、ＭＨＬ−４を含む）に匹敵するヒトＧＩＴＲに対する結合親和性を保持しているのに対して、３つのクローン（Ｄ−Ａ６、１−Ｃ２及びＧ−Ｇ１０）のみがカニクイザルＧＩＴＲ−Ｆｃと同等か又はそれ以上の結合を維持したことを実証した（図６）。ＧＩＴＲアゴニズムレポーターアッセイにおいては、Ｄ−Ａ６、Ｉ−Ｃ２及びＧ−Ｇ１０のすべてはまた、抗体架橋ヒトＧＩＴＲと同じ濃度範囲でヒトＧＩＴＲの濃度依存性受容体活性化を示した（図７Ａ−Ｃ）。すべてのＩｇＧ及びＧＩＴＲＬの最大シグナルは、１０００〜２０００ｎｇ／ｍｌで観察された。
【０１８３】
リードクローンが突然変異及び再選択工程の間、標的特異性の損失に悩まされていないことを確認するために、Ｄ−Ａ６、Ｉ−Ｃ２、Ｇ−Ｇ１０、ｍＶＨ／ｍＶＬ及びＶＨ３／ＶＬ２クローンを、ネズミＧＩＴＲ−Ｆｃ及びヒトＴＮＦＲＳＦメンバー及び一般的免疫グロブリンスーパーファミリーメンバーを含み、１４の精製されたタンパク質のパネルへの結合について試験した（図８Ａ−Ｅ）。すべての５つのＩｇＧは、１μｇ／ｍｌでＧＩＴＲ−Ｆｃ（ヒトＯＤ４５０ｎｍ＞３．０、カニクイザル＞１．０）への結合シグナルを示し、そして任意の他のタンパク質に対しては、検出できる結合（ＯＤ４５０ｎｍ＜０．１）を示さなかった。
【０１８４】
ＶＨ１／ＶＬ１ヒトＩｇＧ移植片とのエピトープ競争のＨＴＲＦ分析
ライブラリー由来のクローンと、ＶＨ１／ＶＬ１  ＩｇＧの変更されていない、最も近い生殖系列移植ＣＤＲとの競争を調べるために、均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）アッセイを確立した。このアッセイは、液相結合においてテルビウム標識ＶＨ１／ＶＬ１  ＩｇＧ、ビオチン化ｈＧＩＴＲ−Ｆｃ及びストレプトアビジン−ＸＬ６６５を組込んだ。次に、非標識ＩｇＧ  ＶＨ１／ＶＬ１（陽性対照）、アイソタイプ対照、及びリードＩｇＧ  Ｄ−Ａ６、Ｇ−Ｇ１０及びＩ−Ｃ２を、広い濃度範囲（０．００３〜１００μｇ／ｍｌ）で添加した。ＩｇＧｓ ＶＨ１/ＶＬ１、Ｄ−Ａ６、Ｇ−Ｇ１０及びＩ−Ｃ２はすべて、結合シグナルの濃度依存性減少を示し、このことは、それらがＧＩＴＲへのＶＨ１／ＶＬ１  ＩｇＧの結合をブロックすることを示唆する（図９）。重要なことには、クローンＤ−Ａ６は、直線相で非標識ＶＨ１／ＶＬ１  ＩｇＧの阻害曲線と完全に重複する阻害曲線を示し、このことは、ｍＶＨ／ｍＶＬに比較して、１２のＣＤＲ突然変異（ヒト生殖系列に対する）を有するにもかかわらず、クローンＤ−Ａ６における親和性及びエピトープ特異性の両方の完全な維持を示唆している。
【０１８５】
Ｄ―Ａ６  ＩｇＧ１対ＶＨ１／ＶＬ１  ＩｇＧ１のＧＩＴＲアルゴリズムの効力のインビトロ分析
フローサイトメトリー、エピトープ競争及び受容体アゴニズムデータに基いて、ＩｇＧ  Ｄ−Ａ６を、さらなるインビトロ分析のために優先順位付けした。ＩｇＧ、例えば二量体の活性凝集体を、通常、ＩｇＧ１発現及び精製手順の間、生成した。それらの凝集体は、受容体アゴニズムアッセイにおいて偽陽性又は誇張されたシグナルを創造することができる。正確な比較がＤ−Ａ６とＶＨ１／ＶＬ１  ＩｇＧとの間で行われたことを確証するために、それらをそれぞれ２回精製した：最初に、プロテインＡカラム結合、及び次に、サイズ排除クロマトグラフィーにより、ヒトＩｇＧ１の予想される分子（約１５０ｋＤａ）よりも大きな任意のタンパク質種を除去した。次に、完全に精製されたＩｇＧ１タンパク質を、細胞ベースのレポーターアッセイにおいて、ＧＩＴＲの濃度依存性アゴニスト活性化について試験した。このアッセイは、予想外に、Ｄ−Ａ６  ＩｇＧ１がＶＨ１／ＶＬ１  ＩｇＧよりも有意に強い濃度依存性受容体活性化を示すことを実証した（図１１）。このアッセイにおいては、両方の抗体の重複分析を用いる場合、Ｄ−Ａ６クローンは以下のことを示した：１．ＶＨ１／ＶＬ１のＲＬＵ値が１１６６４であるのに対して、ＤＡ６の最大ＲＬＵ値は２１８７６である高い合計効力を有し；２．ＶＨ１／ＶＬ１に比較して、０．１〜１３３ｎＭで試験されたＤ−Ａ６  ＩｇＧ１のすべての濃度で高いシグナルであった。
【０１８６】
細胞膜でのリードＩｇＧ結合特異性のフローサイトメトリー分析
細胞表面でのＧＩＴＲへの濃度依存性結合を、フローサイトメトリーを用いて分析した。ＩｇＧの何れもマウスＧＩＴＲ−Ｆｃに結合することが観察されなかったので、独自のネズミ芽細胞腫及びＣＨＯ−Ｋ１細胞を、ヒト又はカニクイザルＧＩＴＲ完全長ｃＤＮＡにより安定してトランスフェクトした。次に、ＩｇＧｓ ｍＶＨ/ｍＶＬ、ＶＨ１/ＶＬ１、ＶＨ３/ＶＬ２、Ｄ−Ａ６、Ｇ−Ｇ１０、Ｉ−Ｃ２及びアイソタイプ対照ＩｇＧ１を、ヒト、カニクイザル又は陰性対照（無関係なヒト受容体により安定してトランスフェクトされた）ネズミ芽細胞種細胞への結合について、１０，０００〜１３．７ｎｇ／ｍｌの濃度範囲にわたって試験した（図１０）。アイソタイプ対照以外のすべてのＩｇＧは、ヒト及びカニクイザルＧＩＴＲ＋細胞に対する濃度依存性結合を示し、各場合、最大ＭＦＩは約１１１１ｎｇ／ｍｌであった。いずれの濃度でも、負の対照細胞系への測定できる結合は、任意のＩｇＧに関して観察されなかった。
【０１８７】
リードＩｇＧのＧＩＴＲ＋ヒト細胞への結合を調べるために、ＨｕＴ７８細胞を、抗−ＣＤ３／抗−ＣＤ２８ビーズと共に３日間のインキュベーションにより活性化した。ｔ−細胞の活性化は、ＧＩＴＲ発現のアップレギュレーションに関連する。ナイーブ細胞を、培地のみにおいてインキュベートした。次に、ＩｇＧ  ＶＨ１／ＶＬ１、Ｄ−Ａ６及び抗−ＧＩＴＲ市販対照抗体「１０８−１７」を、活性化された及びナイーブ細胞への結合について１０μｇ／ｍｌで試験した。すべての３種の抗体は、活性化された細胞への強い結合を示したが、ナイーブ細胞への識別可能な結合は示さなかった（図１２Ａ）。次に、同様に、活性化されたＨｕＴ７８細胞を、ＩｇＧ１ｓ ＶＨ１/ＶＬ１、Ｄ−Ａ６及び負の対照、ヒトＩｇＧ１κ抗−ＧＦＰ市販抗体「ＡｂＤ１８７０５＿ｈＩｇＧ１」により１．１μｇ／ｍｌで染色した。それぞれの場合、染色は、１０μｇ／ｍｌのヒトＧＩＴＲリガンドタンパク質の存在又は非存在下で実施された。抗−ＧＦＰ対照は、何れの分析でも活性化された細胞への結合を示さず、ところが、ＩｇＧ  ＶＨ１／ＶＬ１及びＤ−Ａ６の両方は、過剰のＧＩＴＲタンパク質の非存在下で結合を示した（図１２Ｂ）。このアッセイは、クローンＤ−Ａ６が活性化されたヒトＴ細胞上のＧＩＴＲを特異的に結合し、そしてその結合部位がＧＩＴＲの天然の結合パートナーであるＧＩＴＲＬの結合部位と重複することを示した。
【０１８８】
ＩｇＧ１及びＩｇＧ１−Ｎ２９７Ａ抗体による濃度依存性ＦｃγＲIIIａ関与のインビトロ分析
ＴＲＸ−５１８としても知られているモノクローナル６Ｃ８のヒト化形は、非グリコシル化ヒトＩｇＧ１である。正規のｎ−結合されたグルコシル化の除去は、変異Ｎ２９７ＡのヒトＩｇＧ１  Ｆｃ  ＣＨ２領域への付加により達成される。この非グリコシル化Ｆｃ領域は、抗体結合細胞に対するＮＫ細胞によるＡＤＣＣの駆動に関連する、非常に重要なＦｃγＲIIIａ受容体を含む、すべてのヒトＦｃγ受容体への結合に対してヌルにされる。高レベルのＧＩＴＲを発現することが知られている免疫抑制性腫瘍浸潤Ｔｒｅｇ細胞の枯渇を可能にする可能性があるので、抗−ＧＩＴＲアゴニスト抗体におけるＡＤＣＣ活性の存在は非常に有益である可能性がある。
【０１８９】
ＡＤＣＣを駆動するＶＨ１／ＶＬ１（ｖ−ドメインはＴＲＸ−５１８とアミノ酸配列において同一である）及びＤ−Ａ６  ｖ−ドメインの能力を試験するために、両抗体をヒトＩｇＧ１及びＩｇＧ１−Ｎ２９７Ａ形式で発現した。それらの抗体は、上記のようにｐｒｏＡ−ＳＥＣ精製され、そして次に、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＡＤＣＣアッセイに使用され、そしてＣＨＯ−Ｋ１標的細胞はヒト又はカニクイザルＧＩＴＲのいずれかを標的細胞集団として安定して発現する。ヒト（図１３Ａ）及びカニクイザル（図１３Ｂ）ＣＨＯ−Ｋ１細胞の両方で、ＶＨ１／ＶＬ１及びＤ−Ａ６  ＩｇＧ１抗体の両方は、用量依存性ＦｃγＲIIIａ活性化を示したが、ＩｇＧ１−Ｎ２９７Ａ抗体のいずれも、使用される任意の濃度でシグナル伝達を誘導しなかった。重要なことには、Ｄ−Ａ６  ＩｇＧ１は、ＶＨ１／ＶＬ１  ＩｇＧ１よりも有意により強力（２倍以上）であった（図１３Ａ、１３８）。ヒトＧＩＴＲ細胞上で観察されたＥＣ５０値は、Ｄ−Ａ６  ＩｇＧ１で１５．４ｎＭ−対−ＶＨ１／ＶＬ１  ＩｇＧ１で３５．６ｎＭであった。カニクイザルＧＩＴＲ細胞で、観察されたＥＣ５０値は、Ｄ−Ａ６  ＩｇＧ１で５７．９ｎＭ−対−ＶＨ１／ＶＬ１  ＩｇＧ１で１６０、０ｎＭであった。
【０１９０】
「開発可能性」ＥＬＩＳＡアッセイにおけるリードＩｇＧ  ＤＡ６分析
いくつかの指標の生物額的基質への治療使用のために意図されたいｇＧの結合は、不良な生物学的利用能及び短いインビボ半減期のために、患者における不調なパーフォーマンスの高いリスクのインジケーターであることは当業界において知られている。３つのそのような生物学的基質は、インスリン、ｄｓＤＮＡ及びｓｓＤＮＡである。従って、それらの３つの基質を用いて、ＥＬＩＳＡプレートを被覆し、最適化されたリードＤ−Ａ６のＩｇＧ１及びＩｇＧ１−Ｎ２９７Ａバージョンの結合を試験した。それらのヒトＩｇＧベースの抗体の結合シグナルを、臨床試験においてそれらの進行を停止された、多反応性及び不良なパーフォーマンスを有することが見出されている「陽性対照」ヒトＩｇＧ抗体（Bococizumab 及びBriakinumab ヒト IｇＧ１類似体）と比較した。陰性対照ヒトＩｇＧ１抗体に関しては、ＩｇＧ１Ustekinumeb類似体が、それはBriakinumabと同じ治療標的と反応するが、しかし長いｐＫを有するので、使用され、そして治療製品として都合良く承認された。図１４に示されるＥＬＩＳＡ分析においては、陽性対照抗体は３つのすべての基質に対して予想される強い反応性を示したが、陰性対照は低い反応性を示した。重要なことには、Ｄ−Ａ６  ＩｇＧ１及びＩｇＧ１−Ｎ２９７Ａタンパク質の両方は、すべての３つの基質に対して陰性対照以下の結合を示した。この発見は、最適化されたクローンＤ−Ａ６における非常に特異的な標的駆動結合の維持を強調した。
【０１９１】
リードｖ−ドメインのイン・シリコ免疫原性の分析
最近の米国ＦＤＡガイダンスは、治療開発を意図した全ての抗体についてのｔ−細胞エピトープリスクのイン・シリコ免疫原性評価を推薦している（ＵＳＦＤＡ [２０１４] Guidance for Industry - Immunogenicity Assessment for Therapeutic Protein Productsを参照のこと）。ヒトｔ−細胞エピトープ含有物についての抗−ＧＩＴＲ抗体を試験するために、IｇＧｓ ｍＶＨ/ｍＶＬ、ＶＨ３/ＶＬ２、Ｄ−Ａ６、Ｇ−Ｇ１０ 及びＩ−Ｃ２のｖ−ドメイン配列を、世界人口統計に基くＤＲＢ１スコアについてＬonza Epibase IS（登録商標）システム (バージョン３)に提出した（表５）。この分析においては、ヒトｔ−細胞免疫原性リスクが、両ｖ−ドメインを通しての合計スコアで与えられる。開始ネズミクローンｍＶＨ／ｍＶＬは、１６８０．４のスコアーを受け取り、これは、治療薬としての使用が現在承認されているキメラ抗体についての予測される免疫原性範囲の下限である（１５００〜２４００以上）。移植されたクローンＶＨ３／ＶＬ２（フレームワークに復帰突然変異を有さない直接生殖系列移植片）は、治療薬として現在承認されているヒト化抗体についての予測される免疫原性範囲の下限（１０００〜１６００）で、９９４．０の低められたスコアを示した。リードクローンＤ−Ａ６及びＧ−Ｇ１０は、それぞれ９３２．５及び８４２．８のスコアを受け取った。それらのスコアは、治療薬としての使用のために現在承認されている完全ヒト抗体についての予測される免疫原清範囲に含まれる（２５０〜１２００）。
【０１９２】
クローンＤ−Ａ６（完全な機能を保持する）及びＭＨ（カニクイザルＧＩＴＲ結合及びヒトＧＩＴＲアゴニズムが除去されている）の配列の比較は、わずか５つのアミノ酸差異を示した。免疫原性及び機能に対するそれらの突然変異の影響を試験するために、５つのさらなるデザイナー変異体（Ａ６．１〜Ａ６．５、ＣＤＲ配列については表４を参照のこと）がまた、Ｅｐｉｂａｓｅ分析のために提供された（表５）。この評価は、それらの変異体についての合計ＤＲＢ１スコアは、さらに、Ｄ−Ａ６の予測される免疫原性を、クローンＡ６．４で８４５．９の低さまで低めることができたことを示した。しかしながら、ＥＬＩＳＡ結合分析がＡ６．１〜Ａ６．５のＩｇＧ１タンパク質に対して行われた場合、すべてのクローンはヒトＧＩＴＲへの結合を保持したが、しかしＡ６．１のみがＶＨ１／ＶＬ１及びＤ−Ａ６に匹敵するカニクイザルＧＩＴＲへの結合を保持した。カニクイザルＧＩＴＲ結合は、クローンＡ６．２〜Ａ６．５の全てで大幅に低められた。
【０１９３】
抗−ＧＩＴＲ  Ｆａｂフラグメント対ｈＧＩＴＲ−Ｆｃ及びｃＧＩＴＲ−ＦｃについてのＳＰＲ親和性分析
ＧＩＴＲアゴニズム及びＡＤＣＣ分析は全て、リードクローンＤ−Ａ６がＶＨ１／ＶＬ１よりも有意に改善されていることを示したので、我々は、Ｂｉａｃｏｒｅ上でそれらの２つの抗体についての親和性値を分析した。モノマーＦａｂフラグメントを生成し、そしてヒト及びカニクイザルＧＩＴＲ−Ｆｃ被覆されたバイオセンサーチップ上での移動相に流し、１：１の結合値を導いた。このデータは、ＶＨ１／ＶＬ１及びＤ−Ａ６  ＦａｂについてのＫＤ値が、ヒトＧＩＴＲ上でほぼ同一であったことを示したが、しかしＥＬＩＳＡデータと一致して、Ｄ−Ａ６  ＦａｂはカニクイザルＧＩＴＲに対して約４倍の改善された親和性を示した（表６）。すべての分析のＣｈｉ２値は０．１５未満であり、このことは、データが１：１Ｌａｎｇｍｕｉｒ動力学モデルに正確に適に合することを示唆する。
【０１９４】
さらなるリードＩｇＧ対ＶＨ１／ＶＬ１についてのＧＩＴＲアゴニズムの効力のインビトロ分析
ＩｇＧ  Ｄ−Ａ６は、ＩｇＧ形式で受容体アゴニズムの改善された効力を示したので、一連のさらなるリードを、追加のＧＩＴＲアゴニズム分析のために優先した。このアッセイは、ＩｇＧｎｕｌｌ及びＩｇＧ１−Ｎ２９７Ａ形式でのＤ−Ａ６クローン（図１５Ａ）、ＩｇＧ１形式でのＤ−Ａ６．１クローン（図１５Ｂ）及びライブラリー由来のリードＧ−Ｇ１０（図１５Ｃ）及びＩ−Ｃ２（図１５Ｄ）すべて、ＶＨ１／ＶＬ１  ＩｇＧよりも有意に強い濃度依存性受容体活性化を示すことを実証した。このアッセイにおいては、すべての抗体の重複分析を用いて、ＩｇＧクローンは、以下を示した：１．それらの最大ＲＬＵ値におけるより高い合計効力；２．Ｉ−Ｃ２を除き、ＶＨ１／ＶＬ１に比較して、試験されたＩｇＧのすべての濃度でのより高いシグナル。アイソタイプヒトＩｇＧ１もまた、含まれており（図１５Ｃ、１５Ｄ）、これは受容体を刺激する能力を示さなかった。
【０１９５】
好ましいまたは例示的な実施形態を参照して本発明を説明したが、当業者は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく同じものに対する様々な修飾及び変形を達成でき、そしてそのような修飾が明らかに本明細書で考慮されることを認識するであろう。本明細書に開示され、添付の特許請求の範囲に記載されている特定の実施形態に関する限定は意図されておらず、また推測されるべきではない。
【０１９６】
本明細書に引用されるすべての文書は、参照によりその全体が組込まれる。
【０１９７】
下記表１−４のそれぞれにおいては、配列番号は各配列の下に括弧内に示されている。
【０１９８】
表１．代替の定義と比較して、本明細書において定義されたような（「統一された」スキーム）ネズミ抗−ＧＩＴＲ  ＣＤＲのアミノ酸配列。
【表１】
2020505075.tif 000002
【０１９９】
表２．６Ｃ８ネズミ抗−ＧＩＴＲ  ｖ−ドメイン（ＧＩＴＲ−ｍＶＨ／ｍＶＬ）及びヒト生殖系列ＣＤＲ移植片（ＧＩＴＲ−ＶＨ１−４／ＶＬ１−３）のアミノ酸配列。
【表２】
2020505075.tif 000003
【０２００】
表３．７４のユニーク抗−ＧＩＴＲ  ｖ−ドメインのＣＤＲのアミノ酸配列、及びＣＤＲにおけるヒト生殖系列に対する％配列同一性（％ＩＤ）。
【表３−１】
2020505075.tif 000004
【表３−２】
2020505075.tif 000005
【表３−３】
2020505075.tif 000006
【表３−４】
2020505075.tif 000007
【０２０１】
表４．２２のユニークライブラリー由来及びデザイナー抗−ＧＩＴＲ  ＩｇＧのＣＤＲのアミノ酸配列。
【表４−１】
2020505075.tif 000008
【表４−２】
2020505075.tif 000009
【０２０２】
表５．リード抗−ＧＩＴＲ  ＩｇＧ  ＣＤＲについてのＥｐｉｂａｓｅ  ＤＲＢ１スコア。
【表５】
2020505075.tif 000010
【０２０３】
表６．抗−ＧＩＴＲ  Ｆａｂ対ｈＧＩＴＲ及びｃＧＩＴＲについてＳＰＲ由来の親和性値。
【表６】
2020505075.tif 000011
【図１Ａ】
2020505075.tif 000012
【図１Ｂ】
2020505075.tif 000013
【図２】
2020505075.tif 000014
【図３Ａ】
2020505075.tif 000015
【図３Ｂ】
2020505075.tif 000016
【図３Ｃ】
2020505075.tif 000017
【図４Ａ】
2020505075.tif 000018
【図４Ｂ】
2020505075.tif 000019
【図４Ｃ】
2020505075.tif 000020
【図５Ａ】
2020505075.tif 000021
【図５Ｂ】
2020505075.tif 000022
【図６Ａ】
2020505075.tif 000023
【図６Ｂ】
2020505075.tif 000024
【図６Ｃ】
2020505075.tif 000025
【図６Ｄ】
2020505075.tif 000026
【図７Ａ】
2020505075.tif 000027
【図７Ｂ】
2020505075.tif 000028
【図７Ｃ】
2020505075.tif 000029
【図８Ａ】
2020505075.tif 000030
【図８Ｂ】
2020505075.tif 000031
【図８Ｃ】
2020505075.tif 000032
【図８Ｄ】
2020505075.tif 000033
【図８Ｅ】
2020505075.tif 000034
【図９】
2020505075.tif 000035
【図１０Ａ】
2020505075.tif 000036
【図１０Ｂ】
2020505075.tif 000037
【図１０Ｃ】
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【図１１】
2020505075.tif 000039
【図１２】
2020505075.tif 000040
【図１３Ａ】
2020505075.tif 000041
【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
2020505075.tif 000043
【図１４Ｂ】
2020505075.tif 000044
【図１４Ｃ】
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【図１５Ａ】
2020505075.tif 000046
【図１５Ｂ】
2020505075.tif 000047
【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【配列表】
2020505075000001.app
【国際調査報告】
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2020505075.tif 000051
2020505075.tif 000052
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