(57)【要約】  本発明は、中央のトリプトファン部分に結合したＯＨ基を有するアマニチン誘導体を合成するための新規な方法に関する。  本発明は、さらに、中央のトリプトファン部分の、４’、５’または７’位に結合したＯＨ基を有する新規アマニチン誘導体、そのようなアマニチン誘導体の新規複合体、およびそのような複合体を含む医薬組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉに示される、２−カルボキシ−３ａ−ヒドロキシ−１，２，３，３ａ，８，８ａ−ヘキサヒドロピロロ［２，３−ｂ］インドールのヒドロキシ基で置換された誘導体。
【化３８】
2020529452.tif 000039
式中、  
Ｒ１は、アルキル、アリール、ヘテロアリール、置換アルキル、置換アリール、および置換ヘテロアリールから選択され；
Ｐ1は、水素および保護基であり；
Ｐ2は、水素および保護基であり、特に、保護基であり；そして、
Ｒ２は、ＯＨ、ＯＲ１、および１〜７個のアミノ酸残基からなるポリペプチド鎖から選択される。
【請求項２】
保護基が存在する場合、該保護基が、Ｂｏｃ、ＰｈＣＨ2ＯＣＯ−、ＣＨ2＝ＣＨＣＨ2Ｏ−ＣＯ−、およびトリチルから、独立して選択される、請求項１に記載の、２−カルボキシ−３ａ−ヒドロキシ−１，２，３，３ａ，８，８ａ−ヘキサヒドロピロロ［２，３−ｂ］インドールのＯＨ置換誘導体。
【請求項３】
置換基Ｒ１−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−が、式Ｉの５位に置換している、請求項１または２に記載の、２−カルボキシ−３ａ−ヒドロキシ−１，２，３，３ａ，８，８ａ−ヘキサヒドロピロロ［２，３−ｂ］インドールのＯＨ置換誘導体。
【請求項４】
置換基Ｒ１−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−が、式Ｉの６位に置換している、請求項１または２に記載の、２−カルボキシ−３ａ−ヒドロキシ−１，２，３，３ａ，８，８ａ−ヘキサヒドロピロロ［２，３−ｂ］インドールのＯＨ置換誘導体。
【請求項５】
ヒドロキシ化されたトリプトファン部分を含むアマニチン誘導体の、８個のアミノ酸残基を含む、直鎖状前駆体の合成のための方法であって、
前記前駆体のペプチド合成において、請求項１〜４のいずれか一項に記載の、２−カルボキシー３ａ−ヒドロキシ−１，２，３，３ａ，８，８ａ−ヘキサヒドロピロロ［２，３−ｂ］インドールのＯＨ置換誘導体を使用するステップを含む方法。
【請求項６】
ヒドロキシ化されたトリプトファン部分を含むアマニチン誘導体の合成方法であって、
（ｉ）システイン残基と、請求項５に記載された直鎖状前駆体のトリプトファン部分との間の結合の形成を引き起こすか、または可能にし、そして
（ｉｉ）請求項５に記載の直鎖状前駆体のＮ末端を、前記前駆体のＣ末端と反応させることにより、前記アマニチン誘導体の形成を引き起こすかまたは可能にするステップを含む。
【請求項７】
システイン部分の硫黄原子を酸化して、スルホキシドまたはスルホン、特に、スルホキシドを形成することをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
（ｉ）Ｓ−デスオキシ−４’−ＯＨ−アマニン、４’−ＯＨ−アマニン、Ｓ−デスオキシ−５’−ＯＨ−アマニン、５’−ＯＨ−アマニン、Ｓ−デスオキシ−７’−ＯＨ−アマニン、７’−ＯＨ−アマニン、
（ｉｉ）Ｓ−デスオキシ−４’−ＯＨーアマニンアミド、４’−ＯＨ−アマニンアミド、Ｓ−デスオキシ−５’−ＯＨーアマニンアミド、５’−ＯＨ−アマニンアミド、Ｓ−デスオキシ−７’−ＯＨーアマニンアミド、７’−ＯＨ−アマニンアミド、
（ｉｉｉ）（ｉ）のアマニチン誘導体、
から選択される、ヒドロキシ化されたトリプトファン部分を含むアマニチン誘導体であって、ここで、
アミノ酸１の遊離カルボン酸部分が、カルボン酸エステル−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ１または部分−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−ＯＲ１に変換され、
Ｒ１は、アルキル、アリール、ヘテロアリール、置換アルキル、置換アリール、および置換ヘテロアリールから選択される。
【請求項９】
Ｓ−デスオキシ−５’−ＯＨ−アマニン、５’−ＯＨ−アマニン、Ｓ−デスオキシ−５’−ＯＨ−アマニンアミド、および５’−ＯＨ−アマニンアミドから選択される、請求項８に記載のアマニチン誘導体。
【請求項１０】
（ａ）請求項８または９のヒドロキシ化されたトリプトファン部分を含むアマニチン誘導体；
（ｂ）標的結合部分；および、
（ｃ）所望により、前記アマニチン誘導体と前記標的結合部分を連結するリンカー；
を含む複合体。
【請求項１１】
請求項８または９に記載のアマニチン誘導体または請求項１０に記載の複合体を含む医薬組成物。
【請求項１２】
請求項８または９に記載のアマニチン誘導体、請求項１０に記載の複合体、または、請求項１１に記載の、患者における癌の治療に使用するための医薬組成物（特に、癌は、乳癌、膵臓癌、胆管癌、結腸直腸癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、腎臓癌、悪性黒色腫、白血病、および悪性リンパ腫から選択される。）。
【請求項１３】
（ａ）請求項８または９に記載のアマニチン誘導体；および
（ｂ）前記アマニチン誘導体を標的結合部分に結合するための反応性基Ｙを有するリンカー部分；を含む、構築物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、中央のトリプトファン部分に結合したＯＨ基を有するアマニチン誘導体を合成するための新規方法に関する。
本発明はさらに、中央のトリプトファン部分の４’、５’または７’位に結合するＯＨ基を有する、新規なアマニチン誘導体、そのようなアマニチン誘導体の新規な複合体、およびそのような複合体を含む医薬組成物に関する。
【０００２】
発明の背景
アマトキシンは、Ａｍａｎｉｔａｐｈａｌｌｏｉｄｅｓのキノコに見られる８個のアミノ酸で構成される環状ペプチドである（図１を参照）。
アマトキシンは、哺乳類細胞のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼＩＩを特異的に阻害し、それにより影響を受ける細胞の転写およびタンパク質生合成も阻害する。
細胞での転写の阻害は、成長と増殖の停止を引き起こす。
共有結合はしないが、アマニチンとＲＮＡポリメラーゼＩＩの複合体は非常に強固である（ＫD＝３ナノモル）。
酵素からのアマニチンの解離は非常に遅いプロセスであるため、影響を受けた細胞の回復はほとんどない。
転写の阻害が長すぎると、細胞はプログラムされた細胞死（アポトーシス）を起こす。
【０００３】
腫瘍治療のための細胞毒性部分としてのアマトキシンの使用は、１９８１年に、ジアゾ化を介して、Ｔｒｐ（アミノ酸４；図１を参照）のインドールリングに結合したリンカーを使用して、抗Ｔｈｙ１．２抗体をα−アマニチンに結合することによって、既に検討されていた（Ｄａｖｉｓ  ＆    Ｐｒｅｓｔｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１３（１９８１）１３８５−１３８８）。
Ｄａｖｉｓ  ＆  Ｐｒｅｓｔｏｎは、結合位置を、７’位と特定した。
Ｍｏｒｒｉｓ  ＆  Ｖｅｎｔｏｎは、７’位での置換が、細胞傷害活性を維持する誘導体を齎すことも実証した（Ｍｏｒｒｉｓ  ＆  Ｖｅｎｔｏｎ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．２１（１９８３）４１９−４３０）。
【０００４】
特許出願ＥＰ  １  ８５９  ８１１  Ａ１（２００７年１１月２８日公開）は、β−アマニチンのアマトキシンアミノ酸１のγＣ−原子が、アルブミンまたはモノクローナル抗体ＨＥＡ１２５、ＯＫＴ３、またはＰＡ−１に直接、すなわちリンカー構造なしで結合した、複合体を記載した。
さらに、乳癌細胞（ＭＣＦ−７）、バーキットリンパ腫細胞（Ｒａｊｉ）およびＴリンパ腫細胞（Ｊｕｒｋａｔ）の増殖に対するこれらの複合体の阻害効果を示した。
アミド、エステル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、尿素、チオ尿素、炭化水素部分などの要素を含むリンカーを含む、リンカーの使用が提案されたが、そのような構築物は実際には示されておらず、結合部位などの詳細は、アマトキシンでは、提供されなかった。
【０００５】
特許出願ＷＯ  ２０１０／１１５６２９およびＷＯ  ２０１０／１１５６３０（両方とも、２０１０年１０月１４日公開）は、ヒト化抗体ｈｕＨＥＡ１２５などの抗ＥｐＣＡＭ抗体などの抗体が、
（ｉ）アマトキシンアミノ酸１のγＣ−原子、
（ｉｉ）アマトキシンアミノ酸４の６’Ｃ−原子、または
（ｉｉｉ）アマトキシンアミノ酸３のδＣ−原子、
を介してアマトキシンに結合している複合体を記載しており、それぞれの場合、当該抗体は、アマトキシンと、直接またはリンカーを介して抗体と結合する。
提案されたリンカーは、アミド、エステル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、尿素、チオ尿素、炭化水素部分等の要素を含む。
さらに、乳がん細胞（細胞株ＭＣＦ−７）、膵臓がん（細胞株Ｃａｐａｎ−１）、結腸癌（細胞株Ｃｏｌｏ２０５）、および胆管癌（細胞株ＯＺ）の増殖に対するこれらの複合体の阻害効果が示された。
【０００６】
特許出願ＷＯ  ２０１２／１１９７８７は、そのようなアマトキシンと、その標的である哺乳類細胞のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼＩＩとの相互作用を妨げることなく、トリプトファンアミノ酸４の追加の付着部位、すなわち、１’−Ｎ位で、リンカーを介して、標的結合部分をアマトキシンに結合できることを記載している。
【０００７】
特許出願ＷＯ  ２０１４／００９０２５は、出発物質の１つとして、γ，δ−ジヒドロキシイソロイシンの新規シントンを使用したアマニチン誘導体の全合成を記載している。
さらに、特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０７８９８４［ＷＯ  ２０１７／０８９６０７として公開］は、容易に入手可能な（２Ｓ、３Ｒ、４Ｓ）−Ｌ−４−ヒドロキシイソロイシンを、出発材料の１つとして使用した、γ−およびε−アマニチンの誘導体の全合成について記述している。
しかしながら、これらの方法、および、これまで追求してきた、他のすべての完全な、または部分的な合成アプローチは、Ｓａｖｉｇｅ−Ｆｏｎｔａｎａに記載の方法を用いて、アマトキシンのコアに、中央のトリプトファン部分を組み込むものである。
この方法では、シス−２−カルボキシ−３ａ−ヒドロキシ−１，２，３，３ａ，８，８ａ−ヘキサヒドロピロロ［２，３−ｂ］インドール（「Ｈｐｉ」）が、直鎖アマニチン前駆体構造に組み込まれる。
酸触媒Ｈｐｉ−システインカップリング反応では、中心のトリプトファン部分を有するアマンチニ環系が形成される。
【０００８】
ただし、Ｈｐｉは、Ｈｐｉのインドール部分のフェニル環に結合した官能基部分を持たない。
したがって、Ｓａｖｉｇｅ−Ｆｏｎｔａｎａによる方法から得られるアマニチン生成物は、さらなる置換基のない中心トリプトファン部分を含む。
天然に存在する、α−、β−、γ−、およびε−アマニチンは、しかしながら、中心の６’−ヒドロキシ−トリプトファン部分を含み、その６’−ヒドロキシ基は、アマニチンの官能化のための官能基として、たとえば、直接またはリンカーを介して、標的部分に結合することによって、成功裏に使用されてきた（たとえば、ＷＯ  ２０１０／１１５６２９、ＷＯ  ２０１０／１１５６３０、およびＷＯ２０１２／０４１５０４を参照）。
したがって、合成アマニチンの場合、上記のように、
（ｉ）アマトキシンアミノ酸１のγＣ−原子を介して、または
（ｉｉ）アマトキシンアミノ酸３のδＣ−原子を介して、あるいは、
ＷＯ  ２０１２／１１９７８７に記載されているように、トリプトファン部分の窒素原子を介して官能化を行う必要があった。
【０００９】
Ｈｐｉは、トリプトファンを、過酢酸または光化学で、一重項酸素と反応させることによって得ることができる。
しかし、Ｈｐｉのインドール部分のフェニル環に結合した置換基を有する誘導体は、これまでに記載されていない。
【００１０】
アマトキシンへの完全合成経路の使用は、治療用途に必要な大量のアマトキシンの供給のオプションを提供し、そして、ビルディングブロックとして適切な出発材料を使用することにより、さまざまな新規アマトキシン変異体の構築物を提供することができる。
過去に追行したアプローチは、これらのアマニチンにおいて、コアのトリプトファン部分に結合している６’−ヒドロキシ部分が、組み込まれないので、α−、β−、γー、および／またはε−アマニチンの天然構造は、まだ得られなかったという事実によって制限されていた。
したがって、合成アマニチンを官能化するためのオプションはこれまでかなり制限されてきた。
さらに、官能化に利用可能なオプションの範囲を拡大することが非常に望ましいからである。
なぜなら、立体障害や反応性のような因子は、合成アマニチンおよびその複合体の反応性、生物活性および／または安定性に強い影響を与える可能性があるからである。
しかし、非常に有毒のアマニチンを含む複合体の安定性および有効性は、ヒトへの投与のための治療分子として想定される使用のために最も重要である。
【００１１】
発明の目的
従って、中央のトリプトファン部分のフェニル環に結合したＯＨ基を有するアマトキシンを合成する、コスト効率的かつ堅牢な方法の大きな必要性が依然として存在する。
特に、確立されたＳａｖｉｇｅ−Ｆｏｎｔａｎａ反応において使用でき、そして、そのようなＯＨ基の取り込みを引き起こすことができるようにセットアップされた出発物質を特定する、強い必要性がある。
【００１２】
発明の概要
本発明は、アマニチン誘導体の合成において、ＯＨ基の導入を可能にする、Ｈｐｉの変異体を合成できるという予想外の観察に基づいている。
【００１３】
したがって、本発明は、一の態様において、式Ｉの、２−カルボキシ‐３ａ−ヒドロキシ−１，２，３，３ａ，８，８ａ−ヘキサヒドロピロロ［２，３−ｂ］インドールのＯＨ置換誘導体に関する。
【化１】
2020529452.tif 000002
式中、
Ｒ１は、アルキル、アリール、ヘテロアリール、置換アルキル、置換アリール、および置換ヘテロアリールから選択され；
Ｐ1は、水素または保護基、特に、Ｂｏｃ、ＰｈＣＨ2ＯＣＯ−、ＣＨ2＝ＣＨＣＨ2Ｏ−ＣＯ−、およびトリチルから選択される保護基であり、
Ｐ2は、水素または保護基、特に、保護基であり、特に、Ｂｏｃ、ＰｈＣＨ2ＯＣＯ−、ＣＨ2＝ＣＨＣＨ2Ｏ−ＣＯ−、およびトリチルから選択される保護基であり、および、
Ｒ２は、ＯＨ、ＯＲ１、および１〜７個のアミノ酸残基からなるポリペプチド鎖から選択される。
【００１４】
第２の態様において、本発明は、水酸化されたトリプトファン部分を含む、アマニチン誘導体の８個のアミノ酸残基を含む直鎖状前駆体の合成方法に関し、前記前駆体のペプチド合成における本発明の、いずれか１つの２−カルボキシ−３ａ−ヒドロキシ−１，２，３，３ａ，８，８ａ−ヘキサヒドロピロロ［２，３−ｂ］インドールのＯＨ置換誘導体使用を使用するステップを含む。
【００１５】
第３の態様では、本発明は、水酸化されたトリプトファン部分を含む、アマニチン誘導体の合成方法に関し、以下のステップを含む。
（ｉ）システイン残基と本発明の直鎖状前駆体のトリプトファン部分との間の結合の形成を引き起こすまたは可能にする；そして、
（ｉｉ）本発明の直鎖状前駆体のＮ‐末端を、前記前駆体のＣ‐末端と反応させることにより、前記アマニチン誘導体の形成を引き起こすかまたは可能にする。
【００１６】
第４の局面において、本発明は、
（ｉ）Ｓ−デスオキシ−４’−ＯＨ−アマニン、４’−ＯＨ−アマニン、Ｓ−デスオキシ−５’−ＯＨ−アマニン、５’−ＯＨ−アマニン、Ｓ−デスオキシ−７’−ＯＨ−アマニン、７’−ＯＨ−アマニン、
（ｉｉ）Ｓ−デスオキシ−４’−ＯＨ−アマニンアミド、４’−ＯＨ−アマニンアミド、Ｓ−デスオキシ−５’−ＯＨ−アマニンアミド、５’−ＯＨ−アマニンアミド、Ｓ−デスオキシ−７’−ＯＨ−アマニンアミド、および７’−ＯＨ−アマニンアミド、
（ｉｉｉ）（ｉ）に記載のアマニチンの誘導体、
から選択された、水酸化されたトリプトファン部分を含むアマニチン誘導体に関し、
ここで、アミノ酸１の遊離カルボン酸部分は、カルボン酸エステル、‐Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ１または、部分−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−ＯＲ１へ変換され、
Ｒ１は、アルキル、アリール、ヘテロアリール、置換アルキル、置換アリール、および置換ヘテロアリールから選択される。
【００１７】
第５の態様において、本発明は、
（ａ）本発明の水酸化されたトリプトファン部分を含むアマニチン誘導体；
（ｂ）標的結合部分、および；
（ｃ）所望により、前記アマニチン誘導体と前記標的結合部分を連結するリンカー；
を含む複合体に関する。
【００１８】
第６の態様では、本発明は、本発明のアマニチンまたは本発明の複合体を含む医薬組成物に関する。
【００１９】
第７の態様において、本発明は、本発明のアマニチン誘導体、本発明の複合体、または患者における癌（特に、前記の癌は、乳癌、膵臓癌、胆管癌、結腸直腸癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、腎臓癌、悪性黒色腫、白血病、および悪性リンパ腫からなる群から選択される。）の治療において使用するための本発明の医薬組成物に関する。
【００２０】
第８の態様では、本発明は、
（ａ）本発明のアマニチン誘導体；および
（ｂ）前記アマニチン誘導体を標的結合部分に連結するための反応性基Ｙを担持するリンカー部分、を含む構築物に関連する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】は、さまざまなアマトキシンの構造式を示す。  太字の数字（１〜８）は、アマトキシンを形成する８つのアミノ酸の標準ナンバーリングを示す。  アミノ酸１、３、および４の原子の標準的な名称も表示されている（それぞれ、ギリシャ文字α〜γ、ギリシャ文字α〜δ、および１’〜７’の数字）。
【００２２】
【図２】は、化合物Ｓ−デオキシ−α−アマニチン（ＨＤＰ  ３０．０７３５）およびα−アマニチンの構造を示す。
【００２３】
【図３】は、Ｂｏｃ−Ｌ−トリプトファンから出発して、Ｈｐｉ（ＨＤＰ  ３０．００７９）が、ワンステップ合成で、調製されることを示す。
【００２４】
【図４】は、化合物Ｓ−デオキシ−α−アマニチン（ＨＤＰ  ３０．０７３５）が、Ｈｐｉ誘導体ＨＤＰ  ３０．２５５５を組み込んだ固相ペプチド合成によって生成されることを示す。
【００２５】
【図５】は、ＨＥＫ２９３細胞およびＨＥＫ２９３  ＯＡＴＰ１Ｂ３細胞に対するＳ−デオキシ−α−アマニチン（ＨＤＰ  ３０．０７３５）およびＳ−デオキシ−５’−ヒドロキシ−アマニンアミドＨＤＰ  ３０．２５４８）の細胞毒性を示す。
【００２６】
【図６】は、前記構築物を標的連結部位にリンクするための反応基Ｙの例として、６’−ヒドロキシ基および末端マレイミド基に結合した切断可能なリンカーを有する、Ｓ−デオキシ−α−アマニチン（ＨＤＰ  ３０．０７３５）に基づく構築物を示す
【００２７】
【図７】は、前記構築物を標的結合部分に連結するための反応基Ｙの例として、アミノ酸残基１のカルボキシル基および末端マレイミド基に結合した切断可能なリンカーを有するＳ−デオキシ−α−アマニチン（ＨＤＰ  ３０．０７３５）に基づく代替構築物を示す。
【００２８】
【図８】は、ヒドロキシル化されたＨｐｉ誘導体ＨＤＰ  ３０．２５５６が、５’−ヒドロキシ−Ｌ−トリプトファンから始まる多段階合成で生成されることを示す。
【００２９】
【図９】は、アマニチン前駆体ＨＤＰ  ３０．２５４４の化合物が、Ｈｐｉ誘導体であるＨＤＰ  ３０．２５３６を組み込んだ固相ペプチド合成によって生成されることを示す。
【００３０】
【図１０】は、アマニチン誘導体ＨＤＰ  ３０．２５４６の化合物が、アマニチン前駆体ＨＤＰ  ３０．２５４４からの閉環によって生成されることを示す。
【００３１】
【図１１】は、アマニチン誘導体ＨＤＰ  ３０．２５４８（Ｓ−デスオキシ−５’−ヒドロキシ−アマニンアミド）が、アマニチン誘導体ＨＤＰ  ３０．２５４６から保護基を除去することにより生成されることを示す。
【００３２】
【図１２】は、前記構築物を標的結合部分に連結するための反応性基Ｙの例として、５’−ヒドロキシ基および末端マレイミド基に結合した切断可能なリンカーを有するアマニチン誘導体ＨＤＰ  ３０．２５４８（Ｓ−デスオキシ−５’−ヒドロキシ−アマニンアミド）に基づく構築物を示す。
【００３３】
【図１３Ａ】図１３は、Ａ）ＳＫＢＲ−３細胞（ＨＥＲ−２／ｎｅｕ＋＋＋）とＪＩＭＴ−１細胞（ＨＥＲ−２／ｎｅｕ＋）におけるＨＥＲ−２／ｎｅｕ、Ｂ）ＬｎＣａｐ細胞（ＰＳＭＡ＋＋＋）および２２ｒｖ１細胞（ＰＳＭＡ＋＋）におけるＰＳＭＡ、およびＣ）Ｒａｊｉ細胞（ＣＤ１９＋＋＋）およびＮａｌｍ−６細胞（ＣＤ１９＋＋）におけるＣＤ１９；を標的とする、ＨＤＰ  ３０．２３４７、ＨＤＰ  ３０．２３７１およびＨＤＰ  ３０．２６０２のＡＤＣの細胞毒性を、ＨＤＰ  ３０．１６９９のＡＤＣ（ＨＤＰ  ３０．２３４７、ＨＤＰ  ３０．２３７１およびＨＤＰ  ３０．２６０２と同じ切断可能なリンカーを含むが、上記のアマニチン誘導体の代わりにα−アマニチンを含む）と比較して示す。
【図１３Ｂ】図１３は、Ａ）ＳＫＢＲ−３細胞（ＨＥＲ−２／ｎｅｕ＋＋＋）とＪＩＭＴ−１細胞（ＨＥＲ−２／ｎｅｕ＋）におけるＨＥＲ−２／ｎｅｕ、Ｂ）ＬｎＣａｐ細胞（ＰＳＭＡ＋＋＋）および２２ｒｖ１細胞（ＰＳＭＡ＋＋）におけるＰＳＭＡ、およびＣ）Ｒａｊｉ細胞（ＣＤ１９＋＋＋）およびＮａｌｍ−６細胞（ＣＤ１９＋＋）におけるＣＤ１９；を標的とする、ＨＤＰ  ３０．２３４７、ＨＤＰ  ３０．２３７１およびＨＤＰ  ３０．２６０２のＡＤＣの細胞毒性を、ＨＤＰ  ３０．１６９９のＡＤＣ（ＨＤＰ  ３０．２３４７、ＨＤＰ  ３０．２３７１およびＨＤＰ  ３０．２６０２と同じ切断可能なリンカーを含むが、上記のアマニチン誘導体の代わりにα−アマニチンを含む）と比較して示す。
【図１３Ｃ】図１３は、Ａ）ＳＫＢＲ−３細胞（ＨＥＲ−２／ｎｅｕ＋＋＋）とＪＩＭＴ−１細胞（ＨＥＲ−２／ｎｅｕ＋）におけるＨＥＲ−２／ｎｅｕ、Ｂ）ＬｎＣａｐ細胞（ＰＳＭＡ＋＋＋）および２２ｒｖ１細胞（ＰＳＭＡ＋＋）におけるＰＳＭＡ、およびＣ）Ｒａｊｉ細胞（ＣＤ１９＋＋＋）およびＮａｌｍ−６細胞（ＣＤ１９＋＋）におけるＣＤ１９；を標的とする、ＨＤＰ  ３０．２３４７、ＨＤＰ  ３０．２３７１およびＨＤＰ  ３０．２６０２のＡＤＣの細胞毒性を、ＨＤＰ  ３０．１６９９のＡＤＣ（ＨＤＰ  ３０．２３４７、ＨＤＰ  ３０．２３７１およびＨＤＰ  ３０．２６０２と同じ切断可能なリンカーを含むが、上記のアマニチン誘導体の代わりにα−アマニチンを含む）と比較して示す。
【００３４】
発明の詳細な説明
本発明を以下に詳細に説明する前に、本発明は、本明細書に記載の、特定の方法論、プロトコル、および試薬に限定されず、これらは異なる場合があることを理解されたい。
本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図するものではないことも理解されたい。
別に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
【００３５】
特に、本明細書で使用する用語は、「バイオテクノロジー用語の多言語用語集：（ＩＵＰＡＣ勧告）」、Ｌｅｕｅｎｂｅｒｇｅｒ、ＨＧＷ、Ｎａｇｅｌ、Ｂ．、Ｋoｌｂｌ、Ｈ．ｅｄｓ．（１９９５）、Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ、スイス、バーゼル、ＣＨ−４０１０）に記載されているように定義される。
【００３６】
本明細書および以下の特許請求の範囲を通して、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および、たとえば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、文脈がそうでない場合を必要としない限り、述べられた整数、組成物または工程あるいは、整数または工程の群の包含を意味すると理解されるであろう。
一方、任意の追加の、整数、組成物または工程あるいは、整数、組成物または工程の群も、追加の、整数、組成物または工程あるいは、整数、組成物または工程の群が存在しない実施態様を含めて、所望により、存在していてもよい。
そのような後者の実施形態では、「含む」という用語は、「からなる」と隣接して使用される。
【００３７】
いくつかのドキュメントがこの明細書のテキスト中で引用される。
ここで引用された各文書（すべての特許、特許出願、科学刊行物、製造業者の仕様書、説明書、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号シーケンス・サブミッションなどを含む）は、上記または下記にかかわらず、それぞれの特許法において、可能な範囲でその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書のいかなるものも、本発明が、先行発明によって、そのような開示に先行する権利を与えられないことの承認として解釈されるべきではない。
【００３８】
本発明についてさらに説明する。
以下の節で、本発明の異なる側面をより詳細に定義する。
そのように定義された各局面は、明確に反対に示されない限り、他の任意の局面と組み合わすことができる。
特に、好ましいまたは有利であると示されている特徴は、好ましいまたは有利であると示されている他の特徴と組み合わせることができる。
【００３９】
本発明は、アマニチン誘導体の合成中に、ＯＨ基の導入を可能にする、Ｈｐｉの変異体を合成できるという予想外の観察に基づいている。
【００４０】
したがって、本発明は、一の態様において、式Ｉの、２−カルボキシ‐３ａ−ヒドロキシ−１，２，３，３ａ，８，８ａ−ヘキサヒドロピロロ［２，３−ｂ］インドールのＯＨ置換誘導体に関する。
【化２】
2020529452.tif 000003
式中、
Ｒ１は、アルキル、アリール、ヘテロアリール、置換アルキル、置換アリール、および置換ヘテロアリールから選択され；
Ｐ1は、水素または保護基であり；
Ｐ2は、水素または保護基であり；および、
Ｒ２は、ＯＨ、ＯＲ１、および１〜７個のアミノ酸残基からなるポリペプチド鎖から選択される。
【００４１】
本発明の文脈において、「保護基」という用語は、式Ｉに係る化合物を、合成および／または更なる官能化をするために使用される他の試薬との反応から、窒素原子をブロックするために、中央のヘキサヒドロピロロ［２，３−ｂ］インドール部分の１位または８位の窒素原子に結合している基を意味する。
当業者は、当技術分野で利用可能であり、窒素原子を保護する必要がある場合には、対応する窒素原子に結合することができ、Ｎ−保護はもはや必要でないときには除去することができる、異なる保護基に非常に詳しい。
特定の実施形態では、Ｎ‐保護は、Ｎ‐アシル化試薬を使用する。
したがって、そのような実施形態では、Ｐ１および／またはＰ２はアシル基である。
特定の他の実施形態では、Ｎ‐保護は、Ｎ‐アルキル化試薬を使用する。
したがって、そのような実施形態では、Ｐ１および／またはＰ２はアルキル基である。
【００４２】
特定の実施形態では、保護基Ｐ１またはＰ２は存在する場合、Ｂｏｃ、ＰｈＣＨ2ＯＣＯ−、ＣＨ2＝ＣＨＣＨ2Ｏ−ＣＯ−、およびトリチルから独立して選択される。
【００４３】
特定の実施形態では、２位に結合した官能基に関して、位置３ａのヒドロキシ基と位置８ａの水素原子はシス配置である。
別の特定の実施形態では、２位に結合した官能基に関して、位置３ａのヒドロキシ基と位置８ａの水素原子がトランス配置である。
特定の実施形態では、本発明によるアミノ置換誘導体は、シスーおよびトランスー配置を有する化合物の混合物である。
【００４４】
特定の実施形態では、置換基Ｒ１−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−は、式Ｉの４位に結合している。
【００４５】
特定の実施形態では、置換基Ｒ１−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−は、式Ｉの５位に結合している。
【００４６】
特定の実施形態では、置換基Ｒ１−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−は、式Ｉの６位に結合している。
【００４７】
特定の実施形態では、置換基Ｒ１−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−は、式Ｉの位置７に結合している。
【００４８】
第２の態様において、本発明は、ヒドロキシ化されたトリプトファン部分を含む、アマニチン誘導体の８個のアミノ酸残基を含む、直鎖状前駆体の合成のための方法に関し、前記前駆体のペプチド合成における本発明の２−カルボキシ−３ａ−ヒドロキシ−１，２，３，３ａ，８，８ａ−ヘキサヒドロピロロ［２，３−ｂ］インドールのＯＨ置換誘導体を使用する工程を含む。
【００４９】
第３の態様では、本発明は、ヒドロキシ化されたトリプトファン部分を含むアマニチン誘導体の合成方法に関し、以下のステップを含む。
（ｉ）システイン残基と本発明の直鎖状前駆体のトリプトファン部分との間の結合の形成を引き起こすまたは可能にする；そして
（ｉｉ）本発明の直鎖状前駆体のＮ‐末端を、前記前駆体のＣ‐末端と反応させることにより、前記アマニチン誘導体の形成を引き起こすまたは可能にする。
【００５０】
さらなる態様では、本発明は、実施例に示すように合成された、個々のアマニチン前駆体、特に、化合物ＨＤＰ  ３０．２５６９、ＨＤＰ  ３０．２５７２、および［０１４５］に従って合成された、固相ベースの中間体に関係する。
【００５１】
特定の実施形態では、本発明の方法は、システイン部分の硫黄原子を酸化して、スルホキシドまたはスルホン、特にスルホキシドを形成することをさらに含む。
【００５２】
第４の態様では、本発明は、ヒドロキシ化されたトリプトファン部分を含むアマニチン誘導体に関し、
（ｉ）Ｓ−デスオキシ−４’−ＯＨ−アマニン、４’−ＯＨ−アマニン、Ｓ−デスオキシ−５’−ＯＨ−アマニン、５’−ＯＨ−アマニン、Ｓ−デスオキシ−７’−ＯＨ−アマニン、７’−ＯＨ−アマニン、
（ｉｉ）Ｓ−デスオキシ−４’−ＯＨ−アマニンアミド、４’−ＯＨ−アマニンアミド、Ｓ−デスオキシ−５’−ＯＨ−アマニンアミド、５’−ＯＨ−アマニンアミド、Ｓ−デスオキシ−７’−ＯＨ−アマニンアミド、７’−ＯＨ−アマニンアミド、
（ｉｉｉ）（ｉ）に記載のアマニチン誘導体；
から選択され、ここで、アミノ酸１の遊離カルボン酸部分は、カルボン酸エステルＣ（＝Ｏ）ＯＲ１または−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−ＯＲ１部分に変換される。
ここで、Ｒ１は、アルキル、アリール、ヘテロアリール、置換されたアルキル、置換されたアリール、および置換されたヘテロアリールから選択される。
【００５３】
特定の実施形態において、本発明のアマニチン誘導体は、Ｓ−デスオキシ−５’−ＯＨ−アマニン、５’−ＯＨ−アマニン、Ｓ−デスオキシ−５’−ＯＨ−アマニンアミド、および５’−ＯＨ−アマニンアミドから選択される。
【００５４】
第５の局面において、本発明は、以下を含む、複合体に関する。
（ａ）本発明のヒドロキシ化されたトリプトファン部分を含む、アマニチン誘導体；
（ｂ）標的結合部分；および
（ｃ）所望により、前記アマニチン誘導体と前記標的結合部分を連結するリンカー。
【００５５】
第６の態様では、本発明は、本発明のアマニチンまたは本発明の複合体を含む医薬組成物に関する。
【００５６】
第７の態様において、本発明は、本発明のアマニチン誘導体、本発明の複合体、または患者における癌（特に、前記の癌は、乳癌、膵臓癌、胆管癌、結腸直腸癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、腎臓癌、悪性黒色腫、白血病、および悪性リンパ腫からなる群から選択される。）の治療において使用するための本発明の医薬組成物に関する。
【００５７】
第８の態様では、本発明は、
（ａ）本発明のアマニチン誘導体；および
（ｂ）前記アマニチン誘導体を標的結合部分に連結するための反応性基Ｙを担持するリンカー部分、
を含む構築物に関連する。
【００５８】
本発明の文脈において、用語「アマニチン」は、アマトキシン（ａｍａｔｏｘｉｎｓ）の特定の群を指す。
本発明の文脈において、用語「アマトキシン」は、アマニタ属から単離された、８個のアミノ酸から構成されるすべての環状ペプチドを含み、Ｗｉｅｌａｎｄ，Ｔ．およびＦａｕｌｓｔｉｃｈ  Ｈ．（ＷｉｅｌａｎｄＴ，Ｆａｕｌｓｔｉｃｈ  Ｈ．，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．５（１９７８）１８５−２６０）に記載されている、
本発明の文脈において、用語「アマニチン」は、以下に基いた、二環式構造を指す。
１位のアスパラギン酸またはアスパラギン残基、
２位のプロリン残基、特に、ヒドロキシプロリン残基、
３位のイソロイシン、ヒドロキシイソロイシンまたはジヒドロキシイソロイシン、
４位のヒドロキシトリプトファン残基、
５位および７位のグリシン残基、
６位のイソロイシン残基、および
８位のシステイン残基、特に、酸化されてスルホキシドまたはスルホン誘導体になったシステイン誘導体（アマニチンの番号付けと代表例については、図１を参照してください）。
さらに、そのすべての化学誘導体を含み、
さらにそのすべての半合成類似体；
さらに、天然化合物（環状、８個のアミノ酸）のマスター構造によるビルディングブロックから構築されたそのすべての合成類似体、
さらに、ヒドロキシル化アミノ酸の代わりに、非ヒドロキシル化アミノ酸を含むすべての合成または半合成類似体（ただし、トリプトファン部分のフェニル環に少なくとも１つのヒドロキシ基が存在する）、さらに、哺乳類のＲＮＡポリメラーゼＩＩを阻害することによる、任意のそのような誘導体または類似体が機能的に活性である各場合の、すべての合成または半合成類縁体。
【００５９】
したがって、本発明の文脈において、「アマニチン誘導体の８個のアミノ酸残基」という用語は、二環式アマニチンポリペプチド構造を形成する特定のアミノ酸を指す。
【００６０】
機能的には、アマトキシンは、哺乳類のＲＮＡポリメラーゼＩＩを阻害するペプチドまたはデプシペプチドとして定義される。
好ましいアマトキシンは、上に定義した、リンカー分子または標的結合部分と反応できる官能基（たとえば、カルボキサミドまたはヒドロキサム酸などのカルボン酸基またはカルボン酸誘導体、アミノ基、ヒドロキシ基、チオールまたはチオール捕捉基）を有するものである。
本発明の複合体に特に適しているアマトキシンは、図１に示すように、α−アマニチン、β−アマニチン、γ−アマニチン、ε−アマニチン、アマヌリン、またはアマヌリン酸のジデオキシ変異体、あるいは、アマニン、アマニンアミド、γ−アマニン、またはγ−アマニンアミドのモノデオキシ変異体ならびにその塩、化学誘導体、半合成類似体、および合成類似体である。
【００６１】
特定の実施形態において、ＯＨ置換誘導体、ヒドロキシ化されたトリプトファン部分を含むアマニチン誘導体および／または本発明の複合体は、９０％を超える、特に９５％を超える、より好ましくは９８％を超える、または、９９％を超える純度を有する。
【００６２】
本発明の文脈において、「純度」という用語は、たとえば、存在する複合体の総量を指す。
たとえば、９０％を超える純度は、本発明の複合体を、９０％を超えて含む組成物１ミリグラムを意味し、すなわち、９００マイクログラムを超えるそのような複合体を含むことを意味する。
残りの部分、すなわち不純物には、未反応の出発物質と他の試薬、溶媒、切断生成物および／または副産物が含まれる可能性がある。
【００６３】
特定の実施形態では、ＯＨ置換誘導体、ヒドロキシ化されたトリプトファン部分を含むアマニチン誘導体、および／または本発明の複合体を含む組成物は、そのようなＯＨ置換誘導体、ヒドロキシ化されたトリプトファン部分を含むアマニチン誘導体、および／または複合体の、１００ミリグラム超、特に５００ミリグラム超、および更に特に、１グラム超を含む。
したがって、たとえば、従来技術の複合体の複雑な調製物におそらく存在する可能性がある本発明の複合体の微量は、明示的に除外される。
【００６４】
本明細書で使用される「標的結合部分」という用語は、標的分子または標的エピトープに特異的に結合することができる任意の分子または分子の一部を指す。
本出願の文脈における好ましい標的結合部分は、
（ｉ）抗体またはその抗原結合フラグメント；
（ｉｉ）抗体様タンパク質；および
（ｉｉｉ）核酸アプタマー、である。
本発明における使用に適した「標的結合部位」は、典型的に、分子量４００００Ｄａ（４０ｋＤａ）以上を有する。
【００６５】
本明細書で使用されるように、もし、それが、１００マイクロモル以下、特に、５０マイクロモル以下、特に、３０マイクロモル以下、特に、２０マイクロモル以下、特に、１０マイクロモル以下、特に、５マイクロモル以下、より特に、１マイクロモル以下、より特に、９００ナノモル以下、より特に、８００ナノモル以下、より特に、７００ナノモル以下、より特に、６００ナノモル以下、より特に、５００ナノモル以下、より特に、４００ナノモル以下、より特に、３００ナノモル以下、より特に、２００ナノモル以下、さらにより特には、１００ナノモル以下、さらにより特に、９０ナノモル以下、さらにより特に、８０ナノモル以下、さらにより特に、７０ナノモル以下、さらにより特に、６０ナノモル以下、さらにより特に、５０ナノモル以下、さらにより特に、４０ナノモル以下、さらに特に、３０ナノモル以下、さらに特に、２０ナノモル以下、および、さらにより特に、１０ナノモル以下、の前記第二の化合物に対する解離定数ＫDを有する場合、第一の化合物（たとえば、抗体）は、第二の化合物（たとえば、標的タンパク質のような抗原）に、「特異的に結合する」と考えられる。
【００６６】
本出願の文脈において、用語「標的分子」および「標的エピトープ」は、それぞれ、標的結合部分により特異的に結合される、抗原および抗原のエピトープをそれぞれ指す。
特に、標的分子は、腫瘍関連抗原、特に、１つまたは複数の腫瘍細胞タイプの表面に、非腫瘍細胞の表面と比較して、増加した濃度および／または異なる立体配置で存在する抗原またはエピトープである、
特に、前記抗原またはエピトープは、１つまたは複数の腫瘍細胞タイプの表面に存在するが、非腫瘍細胞の表面には存在しない。
特定の実施形態では、標的結合部分は、ＰＳＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２６９、シアリルルイスa（ｓｉａｌｙｌ Ｌｅｗｉｓa）、ＨＥＲ−２／ｎｅｕおよび上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）から選択される抗原のエピトープに特異的に結合する。
他の実施形態において、前記抗原またはエピトープは、自己免疫疾患に関与する細胞上で優先的に発現される。
特定のそのような実施形態では、標的結合部分は、ＩＬ−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）のエピトープに特異的に結合する。
【００６７】
本明細書で使用される、「抗体またはその抗原結合フラグメント」という用語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、抗原に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子を指す。
したがって、「その抗原結合フラグメント」という用語は、少なくとも機能的な抗原結合ドメインを含む抗体のフラグメントを指す。
また、含まれるのは、標的タンパク質、たとえば、ＰＳＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２６９、ｓｉａｌｙｌＬｅｗｉｓa、ＨＥＲ−２／ｎｅｕおよびＥｐＣＡＭから選択される標的タンパク質に、特異的に結合する、たとえば、ファージディスプレイを含む技術を介して選択される、免疫グロブリン様タンパク質である。
本発明の免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子の任意のタイプ（たとえば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスであり得る。
本発明での使用に適した「抗体およびその抗原結合フラグメント」には、ポリクローナル、モノクローナル、一価、二重特異性、ヘテロ複合体、多重特異性、ヒト、ヒト化（特に、ＣＤＲ移植）、脱免疫、または、キメラ抗体、単鎖抗体（たとえば、ｓｃＦｖ）、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって生成されたフラグメント、ダイアボディまたはテトラボディ（ＨｏｌｌｉｇｅｒＰ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．９０（１９９３）６４４４−８）、ナノボディ、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（anti-idiotypic (anti-Id) antibodies）（たとえば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）、および上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントを含むが、これらに限定されない。
【００６８】
いくつかの実施形態では、抗原結合フラグメントは、本発明のヒト抗原結合抗体フラグメントであり、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）2、Ｆｄ、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｄｓＦｖ）、および、ＶＬまたはＶＨドメインのいずれかを含むフラグメントを含むが、これらに限定されない。
単鎖抗体を含む抗原結合抗体フラグメントは、可変ドメインを、単独で、または以下の全体または一部と組み合わせて含んでもよい：ヒンジ領域、ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメイン。
また、ヒンジ領域、ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインと可変ドメインの任意の組み合わせを含む抗原結合フラグメントも本発明に含まれる。
【００６９】
本発明で使用可能な抗体は、鳥類および哺乳動物を含む任意の動物起源のものであり得る。
特に、抗体は、ヒト、げっ歯類（たとえば、マウス、ラット、モルモット、またはウサギ）、ニワトリ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ウシ、ウマ、ロバ、ネコ、またはイヌの起源からです。
抗体が、ヒトまたはマウス起源であることが特に好ましい。
本明細書で使用される、「ヒト抗体」には、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体が含まれ、そして、ヒト免疫グロブリンライブラリーから、または、１つ以上のヒト免疫グロブリンに対してトランスジェニックであって、そして、内因性免疫グロブリンを発現しない動物から単離される抗体が含まれる（たとえば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ  ＆  Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓによる米国特許第５，９３９，５９８号に記載されている。）。
【００７０】
「抗体様タンパク質」という用語は、標的分子に特異的に結合するように（たとえば、ループの突然変異誘発によって）操作されたタンパク質を指す。
典型的には、そのような抗体様タンパク質は、両端でタンパク質足場に結合した、少なくとも１つの可変ペプチドループを含む。
この二重の構造上の制約により、抗体様タンパク質の結合親和性が、抗体のそれに匹敵するレベルまで大幅に増加する。
可変ペプチドループの長さは、通常、１０〜２０個のアミノ酸から成る。
足場タンパク質は、良好な溶解特性を有する任意のタンパク質であり得る。
特に、足場タンパク質は小さな球状タンパク質である。
抗体様タンパク質には、アフィボディ、アンチカリン、および設計されたアンキリンリピートタンパク質が含まれるが、これらに限定されない（レビューについては、Ｂｉｎｚら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５、１２５７−６８を参照）。
抗体様タンパク質は、変異体の大きなライブラリーに由来し、たとえば、大きなファージディスプレイライブラリーからパニングされ（ｐａｎｎｅｄ）、通常の抗体と同様に単離されうる。
また、抗体様結合タンパク質は、球状タンパク質の表面に露出した残基のコンビナトリアル変異誘発によって得ることができる。
【００７１】
「核酸アプタマー」という用語は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択またはＳＥＬＥＸ（指数関数的濃縮によるリガンドの体系的進化）を繰り返して、標的分子に結合するように操作された核酸分子を指す（レビューについては、ＢｒｏｄｙおよびＧｏｌｄ、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４（２０００）５−１３を参照）。
核酸アプタマーは、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子であり得る。
アプタマーは、修飾、たとえば、２’−フッ素置換ピリミジンなどの修飾ヌクレオチドを含んでもよい。
【００７２】
本発明の文脈における、「リンカー」は、それぞれがリンカーの一端に結合している２つの成分を接続している構造を指す。
リンカーが結合の場合、アマトキシンの抗体への直接結合により、アマトキシンがＲＮＡポリメラーゼＩＩと相互作用する能力が低下する可能性がある。
特定の実施形態では、リンカーは、２つの成分間の距離を増加させ、本事例では、抗体とアマトキシンとの間など、これらの成分間の立体干渉を軽減する。
特定の実施形態では、リンカーは、その主鎖において、１〜３０個の原子の連続鎖（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０原子）を有する。
つまり、リンカーの長さは、アマトキシン部分と抗体の間の原子または結合の数によって測られる最も短い結合として定義される。
ここで、リンカー主鎖の一方の側はアマトキシンと反応し、他方の側は抗体と反応しうるか、または反応した。
本発明の文脈において、リンカーは、特に、所望により置換された、Ｃ1-20−アルキレン、Ｃ1-20−ヘテロアルキレン、Ｃ2-20−アルケニレン、Ｃ2-20−ヘテロアルケニレン、Ｃ2-20−アルキニレン、Ｃ2-20−ヘテロアルキニレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリレン、ヘテロアリレン、アラルキレン、またはヘテロアラルキレン基である。
リンカーは、カルボキサミド、エステル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、尿素、チオ尿素、炭化水素部分などの１つまたは複数の構造要素を含んでもよい。
リンカーは、これらの構造要素の２つ以上の組み合わせを含むこともできる。
これらの構造要素のそれぞれは、リンカー内に１回以上、たとえば、２回、３回、４回、５回、または６回存在してもよい。
いくつかの実施形態では、リンカーはジスルフィド結合を含んでもよい。
リンカーは、アマトキシンおよび抗体に対して、単一のステップで、またはその後の２つ以上のステップで結合する必要があることが理解されている。
そのために、リンカーは、特に近位端と遠位端に２つの基を持つ。これは、
（ｉ）リンクされる成分の１つに存在する基、特にアマトキシンまたは標的結合ペプチドの活性化された基に共有結合を形成できるか、または
（ｉｉ）アマトキシン上の基と共有結合を形成するために活性化されているか、または活性化できる。
したがって、そのようなカップリング反応の結果である化学基、たとえば、エステル、エーテル、ウレタン、ペプチド結合などが、リンカーの遠位端および近位端にあることが好ましい。
【００７３】
特定の実施形態では、リンカーＬは、Ｃ、Ｏ、ＮおよびＳから独立して選択される、１〜２０原子、特に、２〜１８原子、より特に、５〜１６原子、さらにより特に、６〜１５原子の直鎖である。
特定の実施形態では、直鎖中の原子の少なくとも６０％がＣ原子である。
特定の実施形態では、直鎖中の原子は単結合により連結されている。
【００７４】
特定の実施形態において。リンカーＬは、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される、１から４個のヘテロ原子を含む、アルキレン、ヘテロアルキレン、アルケニレン、ヘテロアルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキニレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリレン、ヘテロアリレン、アラルキレン、またはヘテロアラルキレン基であり、ここで、前記リンカーは、所望により置換される。
【００７５】
「アルキレン」という用語は、１〜１０個の炭素原子を有する基を含む、１〜２０個の炭素原子を有する二価の直鎖飽和炭化水素基を指す。
特定の実施形態において、アルキレン基は、低級アルキレン基であってもよい。
「低級アルキレン」という用語は、１〜６個の炭素原子、特定の実施形態では、１〜５個または１〜４個の炭素原子を有するアルキレン基を指す。
アルキレン基の例には、メチレン（−ＣＨ2−）、エチレン（−ＣＨ2−ＣＨ2−）、ｎ−プロピレン、ｎ−ブチレン、ｎ−ペンチレン、およびｎ−ヘキシレンが含まれるが、これらに限定されない。
【００７６】
「アルケニレン」という用語は、炭素−炭素結合の少なくとも１つが二重結合であり、他の結合が単結合またはさらなる二重結合であり得る、２〜２０個の炭素原子を有する二価の直鎖基を指す。
本明細書における「アルキニレン」という用語は、炭素−炭素結合の少なくとも１つが三重結合であり、他の結合が、単結合、二重結合、またはさらなる三重結合であってもよい、２〜２０個の炭素原子を有する基を指す。
アルケニレン基の例には、エテニレン（−ＣＨ＝ＣＨ−）、１−プロペニレン、２−プロペニレン、１−ブテニレン、２−ブテニレン、３−ブテニレンなどが含まれる。
アルキニレン基の例には、エチニレン、１−プロピニレン、２−プロピニレンなどが含まれる。
【００７７】
本明細書で使用する、「シクロアルキレン」は、任意の安定な単環式または多環式系の一部である二価の環を指すことを意図し、そのような環は、３〜１２個の炭素原子を有するが、ヘテロ原子を含まず、そして、そのような環は完全に飽和している。
そして、「シクロアルケニレン」という用語は、任意の安定な単環式または多環式系の一部である二価の環を指すことを意図し、そのような環は３〜１２個の炭素原子を有するが、ヘテロ原子を含まず、そして、そのような環は少なくとも部分的に不飽和である（ただし、任意のアリレン環を除く）。
シクロアルキレンの例には、シクロプロピレン、シクロブチレン、シクロペンチレン、シクロヘキシレン、およびシクロヘプチレンが含まれるが、これらに限定されない。
シクロアルケニレンの例には、シクロペンテニレンおよびシクロヘキセニレンが含まれるが、これらに限定されない。
【００７８】
本明細書で使用される、「ヘテロシクロアルキレン」および「ヘテロシクロアルケニレン」という用語は、任意の安定な単環式または多環式環系の一部である二価の環を指す意図であり、そのような環は、３〜約１２個の原子を有し、そして、そのような環は、炭素原子および少なくとも１つのヘテロ原子、特に、Ｎ、ＯおよびＳからなる群から独立して選択される少なくとも１つのヘテロ原子からなり、ヘテロシクロアルキレンは完全に飽和した環を指し、そして、ヘテロシクロアルケニレンは、少なくとも部分的に不飽和の環を指す（ただし、任意のアリレンまたはヘテロアリレン環を除く）。
【００７９】
「アリレン」という用語は、任意の安定な単環式または多環式系の一部である二価の環または環系を意味することを意図しており、そのような環または環系は、３〜２０個の炭素原子を有するが、ヘテロ原子を含まず、その環または環系は、フェニレンを含む、「４ｎ＋２」π電子則で定義される芳香族部分からなる。
【００８０】
本明細書で使用される、「ヘテロアリレン」という用語は、任意の安定な単環式または多環式系の一部である二価の環または環系を指し、そのような環または環系は３〜２０個の原子を有し、その環または環系は、「４ｎ＋２」π電子則によって定義される芳香族部分からなり、炭素原子と１つ以上の窒素、硫黄、および／または酸素ヘテロ原子を含む。
【００８１】
本発明の文脈において、「置換された」という用語は、リンカーの骨格に存在する、１つまたは複数の水素が、示された群から選択された基で置換されていることを意図している。ただし、示された原子の通常の原子価または、置換されるグループの適切な原子の原子価を超えず、置換により安定な化合物が生成される。
「所望により置換された」という用語は、本明細書で定義されるように、リンカーが非置換であるか、１つ以上の置換基で、本明細書で定義されるように置換されることを意味するものとする。
置換基が、ケト（またはオキソ、すなわち＝Ｏ）基、チオまたはイミノ基などである場合、リンカー骨格原子上の２つの水素が置き換えられる。
例示的な置換基には、たとえば、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、ヘテロアラルキル、アシル、アロイル、ヘテロアロイル、カルボキシル、アルコキシ、アリールオキシ、アシルオキシ、アロイルオキシ、ヘテロアロイルオキシ、アルコキシカルボニル、ハロゲン、（チオ）エステル、シアノ、ホスホリル、アミノ、イミノ、（チオ）アミド、スルフヒドリル、アルキルチオ、アシルチオ、スルホニル、スルフェート、スルホネート、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、アジド、ペルフルオロアルキル（トリフルオロメチルなど）を含むハロアルキル、ハロアルコキシ、アルキルスルファニル、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルスルホニルアミノ、アリールスルホノアミノ、ホスホリル、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、アルキルカルボキシ、アルキルカルボキシアミド、オキソ、ヒドロキシ、メルカプト、アミノ（所望により、たとえばアルキル、アリール、またはヘテロアリールにより一置換または二置換）、イミノ、カルボキサミド、カルバモイル（所望により、アルキル、アリール、またはヘテロアリールによりモノまたはジ置換）、アミジノ、アミノスルホニル、アシルアミノ、アロイルアミノ、（チオ）ウレイド、（アリールチオ）ウレイド、アルキル（チオ）ウレイド、シクロアルキル（チオ）ウレイド、アリールオキシ、アラルコキシ、または−Ｏ（ＣＨ2）n−ＯＨ、−Ｏ（ＣＨ2）n−ＮＨ2、−Ｏ（ＣＨ2）nＣＯＯＨ、−（ＣＨ2）nＣＯＯＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（ＣＨ2）nＲ、−（ＣＨ2）nＮ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、または−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）2Ｒ（ここで、ｎは１−４、そして、Ｒは、独立して、水素、−アルキル、−アルケニル、−アルキニル、−シクロアルキル、−シクロアルケニル、−（Ｃ‐リンクヘテロシクロアルキル）、−（Ｃ‐リンクヘテロシクロアルケニル）、−アリール、および−ヘテロアリールを含み、複数の置換度が許可される。
適切な場合、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルキルなどの置換基、または−ＯＨ、−ＮＨＲなどの官能基をそれ自体が置換されることは、当業者には理解されよう。
適切な場合には、置換部分自体も、同様に置換されることも当業者には理解されよう。
【００８２】
特定の実施形態では、リンカーＬは、以下の部分の１つから選択される部分を含む：ジスルフィド（−Ｓ‐Ｓ−）、エーテル（−Ｏ−）、チオエーテル（−Ｓ−）、アミン（−ＮＨ−）、エステル（−ＯＣ（＝Ｏ）−または−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−）、カルボキサミド（−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−または−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）、ウレタン（−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−または−ＯＣ（＝Ｏ）−ＮＨ−）、および尿素部分（−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）。
【００８３】
本発明の特定の実施形態では、リンカーＬは、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、シクロアルキレン、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニレン、ヘテロアルキニレン、ヘテロシクロアルキレン、アリレン、ヘテロアリレン、アラルキレン、およびヘテロアラルキレン基のリストから選択される、ｍ個の群を含む。
式中、各基は、所望により、独立して置換されていてもよく、リンカーはさらに、以下の部分の１つから独立して選択される、ｎ個の部分を含む：ジスルフィド（−Ｓ‐Ｓ−）、エーテル（−Ｏ−）、チオエーテル（−Ｓ−）、アミン（−ＮＨ−）、エステル（−ＯＣ（＝Ｏ）−または−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−）、カルボキサミド（−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−または−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）、ウレタン（−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−または−ＯＣ（＝Ｏ）−ＮＨ−）、および尿素部分（−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）、ここで、ｍ＝ｎ＋１である。
特定の実施形態では、ｍは２であり、ｎは１であり、または、ｍは３であり、ｎは２である。
特定の実施形態において、リンカーは、２または３個の非置換アルキレン基、および、それぞれ、前記非置換アルキレン基をリンクする、１または２個の、ジスルフィド、エーテル、チオエーテル、アミン、エステル、カルボキサミド、ウレタンまたは尿素部分を含む。
【００８４】
特定の実施形態では、リンカーＬはヘテロアリレン基を含まない。
【００８５】
特定の実施形態では、直鎖中のＣ原子は独立して、所望により置換されたメチレン基（−ＣＨ2−）の一部である。
特定のこのような実施形態では、所望の置換基は、ハロゲンおよびＣ1-6−アルキル、特にメチルから独立して選択される。
【００８６】
特定の実施形態では、リンカーＬは安定したリンカーである。
【００８７】
本発明の文脈において、「安定なリンカー」という用語は、
（ｉ）酵素の存在下で、および
（ｉｉ）細胞内還元環境で、
安定しているリンカーを指す。
【００８８】
特定の実施形態では、安定したリンカーは、
（ｉ）酵素切断可能な基本構造、および／または
（ｉｉ）ジスルフィド基
を含まない。
特定のそのような実施形態では、リンカーは、最長１２原子、特に、２〜１０原子、より特に、４〜９原子、そして、最も特に、６〜８原子の長さを有する。
【００８９】
特定の他の実施形態では、リンカーは切断可能なリンカーである。
【００９０】
本発明の文脈において、「切断可能なリンカー」という用語は、
（ｉ）酵素によって切断可能な、または
（ｉｉ）還元可能な
リンカーを指す。
特定の実施形態では、この用語は、酵素により切断可能なリンカーのみを指す（還元可能なリンカーではない）。
【００９１】
本発明の文脈において、用語「酵素により切断可能なリンカー」とは、酵素、特にリソソームペプチダーゼ（たとえば、カテプシンＢのような）により切断され得、内在化後に標的抗体に結合した毒素カーゴの細胞内放出をもたらすリンカーを指す（Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．１３（２００２）８５５−６９を参照）。
特定の実施形態では、切断可能なリンカーは、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ｖａｌ−Ａｌａ、Ｐｈｅ−Ｃｉｔ、およびＶａｌ−Ｃｉｔから選択されるジペプチドを含み、特に、切断可能なリンカーは、ジペプチドとアマトキシンの間のｐ−アミノベンジル（ＰＡＢ）スペーサーをさらに含む。
【００９２】
特定のそのような実施形態では、切断可能なリンカーは、構造Ｌ1−Ｌ*−Ｌ2を含み、ここで、
Ｌ*は、ｐ−アミノベンジルジペプチド部分であり、
Ｌ1は、Ｌ*をアマトキシンに結合するリンカーの一部であり、特に、ここで、
Ｌ1は、−ＮＨ−または−Ｏ−基、特に−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｏ−または−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−基を介して、Ｌ*に結合する。そして、ここで、
Ｌ2は、Ｌ*を標的結合部分に接続するリンカーの一部であり、特に、
Ｌ2は、−（ＣＨ2）m−部分（ｍは、１から８、特に、１〜５から選択される整数である）を介して、または−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n−部分（ｎは１〜３、特に、１〜２から選択される整数である）を介して、Ｌ*に接続する。
たとえば、ジペプチドのＶａｌ−Ａｌａを含む切断可能なリンカーの場合には、Ｌ１−Ｌ＊−Ｌ２の構造は以下の通りである。
【化３】
2020529452.tif 000004
【００９３】
特定の他のこのような実施形態では、Ｌ*は、以下の構造として、ジペプチドＶａｌ−Ｌｙｓを含む：
【化４】
2020529452.tif 000005
【００９４】
特定の実施形態では、リンカーＬ1は、Ｃ、Ｏ、Ｎ、およびＳから独立して選択される１〜４原子、特に、１〜３原子、より特に、１〜２原子、さらには単に１原子の直鎖である。
特定の実施形態では、直鎖中の原子の少なくとも５０％が、炭素原子である。
特定の実施形態では、直鎖中の原子は単結合により連結されている。
特定の実施形態では、Ｌ1は、アマトキシンの一部である−ＮＨ−または−Ｏ−基である。
特定の実施形態では、Ｌ1は、中央のトリプトファン部分の４’、５’、６’または７’位に結合したＯＨ基に由来する−Ｏ−基である。
特定の実施形態では、Ｌ1は、本発明によるアマニン誘導体のアミノ酸残基１のカルボン酸基の一部であるヒドロキシル基に由来する−Ｏ−基である。
特定の実施形態では、Ｌ1は、本発明によるアマニンアミド誘導体のアミノ酸残基１のカルボキサミド基の一部であるアミノ基に由来する−ＮＨ−基である。
特定の実施形態では、Ｌ1は、本発明によるアマニンまたはアマニンアミド誘導体のアミノ酸残基３の一部であるヒドロキシル基に由来する−Ｏ−基である。
【００９５】
本発明の文脈において、用語「還元可能なリンカー」は、細胞内還元環境で切断できるリンカー、特に、ジスルフィド基を含むリンカーを指し、細胞内還元環境によって内在化後に、標的結合部分に結合した毒素カーゴの細胞内放出を齎すリンカーを指す（Ｓｈｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０（１９８５）１０９０５から１０９０８参照）。
特定の実施形態では、還元性リンカーは、以下の部分を含む。
【化５】
2020529452.tif 000006
式中、Ｒ１からＲ４は、独立して、Ｈおよびメチルから選択される。
【００９６】
特定のそのような実施形態では、そのような切断可能なリンカーは、最長２０原子、特に、６〜１８原子、より特に、８〜１６原子、そして、最も特に、１０〜１５原子の長さを有する。
特定のこのような実施形態では、本発明による、アマトキシンに連結するリンカーの部分、および切断可能なジスルフィド基は、３または４個のＣ原子、特に、３個のＣ原子の直線鎖である。
特定の実施形態では、直鎖中の３または４個のＣ原子は単結合により結合している。
特定の実施形態では、リンカーは、ｎ−プロピレン基である。
【００９７】
特定の実施形態において、前記リンカーは存在し、片側で、中央のトリプトファン部分のフェニル環に結合したＯＨ基、すなわち、４’、５’または７’−ＯＨ置換基に結合する。
【００９８】
特定の他の実施形態では、前記リンカーは存在し、そして、本発明のアマニチン誘導体中の位置に片側で接続され、ここで、前記位置は、以下から選択される。
（ｉ）Ｓ−デスオキシ−４’−ＯＨ−アマニンアミド（ａｍａｎｉｎａｍｉｄｅ）、４’−ＯＨ−アマニンアミド（ａｍａｎｉｎａｍｉｄｅ）、Ｓ−デスオキシ−５’−ＯＨ−アマニンアミド（ａｍａｎｉｎａｍｉｄｅ）、５’−ＯＨ−アマニンアミド（ａｍａｎｉｎａｍｉｄｅ）、Ｓ−デスオキシ−７’−ＯＨ−アマニンアミド（ａｍａｎｉｎａｍｉｄｅ）および７’−ＯＨ−アマニンアミド（ａｍａｎｉｎａｍｉｄｅ）の場合、アマトキシン（ａｍａｔｏｘｉｎ）アミノ酸１のγＣ原子のカルボキサミド基の窒素原子（アミド結合）；
（ｉｉ）Ｓ−デスオキシ−４’−ＯＨ−アマニン、４’−ＯＨ−アマニン、Ｓ−デスオキシ−５’−ＯＨ−アマニン、５’−ＯＨ−アマニン、Ｓ−デスオキシ−７’−ＯＨ−アマニンおよび７’−ＯＨ−アマニンの場合、アマトキシン（ａｍａｔｏｘｉｎ）アミノ酸１のγＣ原子における酸基の酸素原子（エステル結合）；
（ｉｉｉ）アミノ酸１の遊離カルボン酸部分が、部分−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−ＯＲ1に変換された、前記本発明のアマニチンの誘導体の場合には、アマトキシンアミノ酸１のγＣ原子でのヒドロキサム酸基の酸素原子；
（ｉｖ）アマトキシンアミノ酸３のδＣ原子のヒドロキシ基の酸素原子（特に、エステル結合、エーテル結合またはウレタン結合を介した）；または、
（ｖ）アミノ酸４の環窒素。
【００９９】
リンカーの標的結合部分への結合は、当業者、特に抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）の分野の当業者に周知の様々な方法によって達成することができる。
【０１００】
特定の実施形態では、前記リンカーは、尿素部分（…−リンカー−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−標的結合部分）を介して標的結合部分に結合する。
特定のそのような実施形態では、尿素部分は、リジン側鎖のアミノ基などの標的結合部分に元々存在する一級アミンとカルバミン酸誘導体…−リンカー−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｚ（ここで、Ｚは、第一級アミンで置換することができる脱離基である）との反応から齎される。
【０１０１】
特定の他の実施形態では、前記リンカーが存在し、チオエーテル部分（…−リンカー−Ｓ−標的結合部分）を介して標的結合部分に結合している。
したがって、そのような実施形態では、本発明は、下記一般式の複合体に関係する。
アマニチン−Ｌ−Ｘ*−Ｓ−Ｔｂｍ、
式中、
アマニチンは、本発明によるアマニチン誘導体であり、
Ｌは、リンカーであり、
Ｘ*は、チオール反応性基へのチオール基のカップリングから生じる部分であり、
Ｓは、前記チオール基の硫黄原子、特に、システインアミノ酸残基のチオール基であり、そして、
Ｔｂｍは標的結合部分、特に、前記システインアミノ酸残基を含む抗体または機能的抗体フラグメントである。
特定の実施形態では、前記システインアミノ酸残基は、
（ｉ）ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３から選択される抗体ドメインに位置し、
（ｉｉ）前記抗体ドメインの配列に最も近い相同性を示す、生殖系列配列が、システインとは異なるアミノ酸残基を含む位置に存在し、そして、
（ｉｉｉ）溶剤に曝される位置に存在する。
【０１０２】
本発明の文脈において、「チオール反応性基」という用語は、たとえば、特に、６．０〜８．０の範囲のｐＨ値で、より特に、６．５〜７．５の範囲のｐＨ値において、抗体の遊離システインのチオール基と選択的に反応する基を指す。
特に、「選択的に」という用語は、チオール反応性基を含む分子と、少なくとも１つの遊離システイン残基を含む抗体とのカップリング反応の１０％未満（特に５％未満、より特に２％未満）が、抗体の非システイン残基（たとえば、リジン残基）とのカップリング反応であることを意味する。
特定の実施形態では、チオール反応性基は、ブロモアセトアミド、ヨードアセトアミド、マレイミド、３位に脱離基（特に、脱離基は、−Ｂｒおよび置換チオールから選択される）を有するマレイミド（たとえば、ＵＳ９，２９５，７２９を参照）、４位に脱離基（特に、−Ｂｒおよび置換チオールから選択される脱離基）を有する１，２−ジヒドロピリダジン−３，６−ジオン（たとえば、ＵＳ９，２９５，７２９を参照）、メチルスルホニルベンゾチアゾール、メチルスルホニルフェニルテトラゾール、メチルスルホニルフェニルオキサジアゾール（Ｔｏｄａら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、５２（２０１３）１２５９２−６参照）、３−アリールプロピオニトリル（Ｋｏｌｏｄｙｃｈら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２０１５、２６、１９７−２００を参照）、および５−ニトロ−ピリジン−２−イル−ジスルフィド（…−Ｌ―Ｓ−Ｓ−（５−ニトロ−ピリジン−２−イル）から選択される。
【０１０３】
特定の実施形態では、リンカーに接続された一方の側にあり、そして、標的結合部分に存在する位置または官能基に、直接または間接的に接続できる、前記位置または官能基は、１つの標的結合部分または２つの標的結合部分に存在する、２つのチオール基と反応できる部分である。
特定の実施形態において、チオール反応性基は、３および４位に２つの脱離基を有するマレイミドであり、特に、３，４−ジブロモマレイミド、３，４−ビス（アリールチオ）−マレイミド、特に、３，４−ジフェニルチオ−マレイミド、および３，４−ビス（ヘテロアリールチオ）−マレイミド、特に、３，４−ビス（２−ピリジニル−スルファニル）−マレイミドから選択され、
特定の他の実施形態では、チオール反応性基は、特に、４，５−ブロモ−１，２−ジヒドロピリダジン−３、６−ジオン、４，５−ビス（アリールチオ）−１，２−ジヒドロピリダジン−３，６−ジオン、特に、４，５−ジフェニルチオ−１，２−ジヒドロピリダジン−３，６−ジオン、および４，５−ビス（ヘテロアリールチオ）−１，２−ジヒドロピリダジン−３，６−ジオン、特に、４，５−ビス（２−ピリジニル−スルファニル）−１，２−ジヒドロピリダジン−３，６−ジオンから選択される、４および５位に２つの脱離基を有する、１，２−ジヒドロピリダジン−３，６−ジオンである。
【０１０４】
特定の実施形態では、チオール基のチオール反応性基へのカップリングから生じる部分は、以下から選択される：
・チオール置換アセトアミド；
・チオール置換スクシンイミド；
・チオール置換スクシンアミド酸；
・チオール置換ヘテロアリール；特に、チオール−置換ベンゾチアゾール、チオール置換フェニルテトラゾールおよびチオール置換フェニルオキサジアゾール；および
・ジスルフィド。
但し、１つの硫黄原子が抗体のシステイン残基に由来する。
特定の実施形態において、チオール基のチオール反応性基へのカップリングから生じる部分は、チオール置換スクシンイミドである。
【０１０５】
特定の実施形態では、段落［０１０１］の一般式に存在する、部分Ｌ‐Ｘ*−Ｓにおける、リンカーＬは、部分の以下の群から選択される。
（アマニチン側）−（ＣＨ2）2−Ｓ‐Ｓ−（ＣＨ2）2−Ｘ−Ｓ−      （Ｔｂｍ側）；
（アマニチン側）−（ＣＨ2）3−Ｓ‐Ｓ−（ＣＨ2）2−ＸーＳ−      （Ｔｂｍ側）；
（アマニチン側）−（ＣＨ2）2−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ2）3−Ｘ−Ｓ−      （Ｔｂｍ側）；
（アマニチン側）−（ＣＨ2）3−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ2）3−Ｘ−Ｓ−      （Ｔｂｍ側）；
（アマニチン側）−（ＣＨ2）4−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ2）4−Ｘ−Ｓ−      （Ｔｂｍ側）；
（アマニチン側）−（ＣＨ2）2−ＣＭｅ2−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ2）2−Ｘ−Ｓ−（Ｔｂｍ側）；
（アマニチン側）−（ＣＨ2）2−Ｓ−Ｓ−ＣＭｅ2−（ＣＨ2）2−Ｘ−Ｓ−（Ｔｂｍ側）；
（アマニチン側）−（ＣＨ2）3−Ｓ−Ｓ−                          （Ｔｂｍ側）；
（アマニチン側）−ＣＨ2−Ｃ6Ｈ4−ＮＨ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＣＯ（ＣＨ2）5−Ｘ−Ｓ−（Ｔｂｍ側）
（アマニチン側）−ＣＨ2−Ｃ6Ｈ4−ＮＨ−Ａｌａ−Ｖａｌ−ＣＯ（ＣＨ2）5−Ｘ−Ｓ−（Ｔｂｍ側）；
（アマニチン側）−ＣＨ2−Ｃ6Ｈ4−ＮＨ−Ａｌａ−Ｖａｌ−ＣＯ（ＣＨ2）2−Ｘ−Ｓ−（Ｔｂｍ側）；
（アマニチン側）−ＣＨ2−Ｃ6Ｈ4−ＮＨ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−ＣＯ（ＣＨ2）2−Ｘ−Ｓ−（Ｔｂｍ側）；
（アマニチン側）−ＣＨ2−Ｃ6Ｈ4−ＮＨ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＣＯ（ＣＨ2）2−Ｘ−Ｓ−（Ｔｂｍ側）；
（アマニチン側）−ＣＨ2−Ｃ6Ｈ4−ＮＨ−Ｃｉｔ−Ｐｈｅ−ＣＯ（ＣＨ2）2−Ｘ−Ｓ−（Ｔｂｍ側）；
（アマニチン側）−ＣＨ2−Ｃ6Ｈ4−ＮＨ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−ＣＯ（ＣＨ2）2−Ｘ−Ｓ−（Ｔｂｍ側）；
（アマニチン側）−ＣＨ2−Ｃ6Ｈ4−ＮＨ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−ＣＯ（ＣＨ2）2−Ｘ−Ｓ−（Ｔｂｍ側）；
（アマニチン側）−ＣＨ2−Ｃ6Ｈ4−ＮＨ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−ＣＯ（ＣＨ2）2−Ｘ−Ｓ−（Ｔｂｍ側）；
（アマニチン側）−ＣＨ2−Ｃ6Ｈ4−ＮＨ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−ＣＯ（ＣＨ2）2−Ｘ−Ｓ−（Ｔｂｍ側）；
（アマニチン側）−ＣＨ2−Ｃ6Ｈ4−ＮＨ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−ＣＯ（ＣＨ2）2−Ｘ−Ｓ−（Ｔｂｍ側）；
そして、ここで、ジペプチド配列に隣接する−ＮＨ−および−ＣＯ−は、それぞれ、ジペプチドのカルボキシ末端およびアミノ末端にアミド結合を形成するリンカーのアミノおよびカルボニル部分を表す。
【０１０６】
本発明の文脈において、「チオール基のチオール反応性基へのカップリングから生じる部分」という用語は、以下の反応から生じる構造を指す。
（ｉ）チオール反応性基に存在する脱離基Ｙの、システイン残基の硫黄原子による求核置換、たとえば、ブロモアセトアミド基、ヨードアセトアミド、４，６−ジクロロ−１，３，５−トリアジン−２−イルアミノ基、アルキルスルホンまたはヘテロアリールスルホン；
（ｉｉ）チオール反応性基の活性化二重結合へのシステイン残基のＨＳ基の付加、たとえば、マレイミド；または、
（ｉｉｉ）システインの残基の硫黄原子（たとえば、脱離基として、ピリジン−２−チオール、５−ニトロピリジン−２−チオールまたはメタンスルフィネート）と、活性化ジスルフィドまたはメタンチオスルホネートのジスルフィド交換、；または
（ｉｖ）システイン残基の硫黄原子とチオール反応性基の一部である反応性部分との間に安定した結合をもたらす他の化学反応。
【０１０７】
チオール基のカップリングから生じる一次部分は、所望により、さらに誘導体化されてもよく、たとえば、マレイミドから生じるスクシンイミジルチオエーテルは、次の一般構造のスクシンアミド酸チオエーテルに加水分解され得る。
【化６】
2020529452.tif 000007
【０１０８】
特定の他の実施形態では、部位特異的カップリングは、標的結合部分に存在するジスルフィド架橋を還元させ、そして、アマニチン−Ｌ−Ｘ*構築物に存在する架橋部分Ｘ*と、２つのシステイン残基を反応させることにより、達成することができる（Ｂａｄｅｓｃｕら、安定で、明確な（ｄｅｆｉｎｅｄ）抗体薬物複合体のためのジスルフィドの架橋、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２５（２０１４）１１２４−１１３６参照）。
【０１０９】
同様の実施形態において、部位特異的カップリングは、標的結合部分に存在するジスルフィド架橋を還元させ、そして、２つのシステイン残基を、アマニチン−Ｌ−Ｘ*構築物に存在する架橋部分Ｘ*と反応させることにより達成できる。特に、ここで、Ｘ*は
【化７】
2020529452.tif 000008
である（Ｂｒｙｄｅｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ、２５（２０１４）６１１−６１７；Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒら、Ｏｒｇ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｃｈｅｍ、２０１４、７２６１−７２６９を参照）
【０１１０】
特定の他の実施形態では、カップリングは、特に、抗体のグルタミンＱ２９５への結合により、トランスアミナーゼを介して、リンカーに存在するアミノ基を、標的結合部分に存在するグルタミン残基へ、位置特異的カップリングにより達成される。
【化８】
2020529452.tif 000009
【０１１１】
特定の実施形態では、カップリングは、Ｎ−グリカン側鎖を含む標的結合部分への、部位特異的コンジュゲーションにより達成される。
特に、Ｎ−グリカン側鎖は酵素的に分解されることができ、続いて、アジド−ガラクトースによる糖転移が起こる。
クリック  ケミストリーを使用して、そのような修飾された標的結合部分は、適宜変更された構築物であるアマニチン−Ｌ−Ｘ*（Ｘ*は、たとえば、ジベンゾシクロオクチン（ＤＩＢＯ）またはＣ−Ｃ三重結合を含む類似の部分である。）にカップリングさせることができる。
たとえば、構築物である、アマニチン−Ｌ−ＮＨ2は、ヒドロキシスクシンイミド部分の求核置換によって、ＤＩＢＯ−ＳＥに結合させることができる。
【化９】
2020529452.tif 000010
次に、得られたＤＩＢＯ修飾リンカー構築物を、上記のアジド誘導体に結合させることができる。
別の実施形態において、標的結合部分は、クリック  ケミストリーを可能にする非天然アミノ酸の取り込みにより、特に、パラアジドメチル−Ｌ−フェニルアラニン（ｐＡＭＦ）の取り込みにより、修飾され得る。
【０１１２】
特定の実施形態では、−Ｌ−Ｘ*のリンカーＬは、少なくとも、５個、特に少なくとも１０個、より具体的には、Ｃ、Ｏ、ＮおよびＳから独立して選択される１０〜２０原子、特に１０〜１８原子、より具体的には、１０〜１６原子、さらにより具体的には、１０〜１５原子の直鎖である。
特定の実施形態では、直鎖中の原子の少なくとも６０％がＣ原子である。
特定の実施形態では、直鎖中の原子は単結合により連結されている。
【０１１３】
別の実施形態では、標的結合部分に存在する、位置または官能基に直接または間接的に結合できる位置または官能基は、エチニル基ではなく、または、より一般的にはアルキニル基ではない、または、１，３−双極子環状付加（クリック  ケミストリー）における、１，３双極子と反応できる基ではない。
【０１１４】
特定の他の実施形態では、ケト基、特に、ｐ−アセチルフェニルアラニン（ｐＡｃＰｈｅ）を含む非天然アミノ酸を、標的結合部分に組み込むことにより、および、そのような修飾された標的結合部分を、アマニチン−Ｌ−Ｘ*構築物と反応させることにより、アマニチン−Ｌ−Ｘ*構築物の標的結合部分への部位特異的カップリングを達成することができる。ここで、Ｘ*はヒドロキシルアミン部分である。
【０１１５】
さらなる実施形態において、ホルミル基は、ホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）によって導入することができ、これは、アルデヒドタグを生成するための認識配列ＣｘＰｘＲ中のシステイン基に対して高度に選択的である。
このようなアルデヒドタグは、アマニチン−Ｌ−Ｘ*構築物に存在する適切な基Ｘ*と反応することができる。
特に、Ｘ*は
【化１０】
2020529452.tif 000011
である（Ａｇａｒｗａｌら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ  ２４（２０１３）８４６‐８５１を参照）。
【０１１６】
第２の態様では、本発明は、本発明の複合体を含む医薬組成物に関する。
【０１１７】
第３の態様では、本発明は、患者における癌の治療に使用するための、本発明の複合体に関する。
特に、前記癌は、乳癌、膵臓癌、胆管癌、結腸直腸癌、肺癌、前立腺がん、卵巣がん、前立腺がん、胃がん、腎臓がん、悪性黒色腫、白血病、および悪性リンパ腫からなる群から選択される。
【０１１８】
本明細書で使用する場合、疾患または障害の「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、以下のうちの１つまたは複数を達成することを意味する。
（ａ）障害の重症度を軽減すること；
（ｂ）治療中の障害に特徴的な症状の発現を制限または防止すること；
（ｃ）治療中の障害に特徴的な症状の悪化を抑制すること；
（ｄ）以前に障害を患っていた患者の障害の再発を制限または防止すること；および
（ｅ）以前に障害の症状を示していた患者の症状の再発を制限または防止すること。
【０１１９】
本明細書で使用する場合、治療は、本発明による複合体または医薬組成物を患者に投与することを含んでもよく、ここで、「投与」には、インビボ投与、ならびに静脈グラフトなどのエクスビボで、組織への直接投与が含まれる。
【０１２０】
特定の実施形態では、治療有効量の本発明の複合体が使用される。
【０１２１】
「治療有効量」は、意図された目的を達成するのに十分な治療薬の量である。
所定の治療薬の有効量は、薬剤の性質、投与経路、治療薬を受領する動物のサイズと種、および投与の目的などの要因によって異なる。
各個々の場合の有効量は、当技術分野で確立された方法に従って当業者によって経験的に決定され得る。
【０１２２】
別の態様において、本発明は、本発明による、アマニチン誘導体を含む医薬組成物、またはアマニチン誘導体と標的結合部分との本発明の複合体に関する。そして、さらに、１種以上の薬学的に許容される、希釈剤、担体、賦形剤、充填剤、結合剤、潤滑剤、流動促進剤、崩壊剤、吸着剤；および／または防腐剤を含む。
【０１２３】
「薬学的に許容される」とは、連邦政府または州政府の規制機関によって承認されたもの、または米国薬局方または動物、より特にヒトで使用される、他の一般に認められた薬局方にリストされたものを意味する。
【０１２４】
特定の実施形態において、医薬組成物は、全身投与される薬剤の形態で使用される。
これには、特に、注射剤と輸液を含む非経口剤が含まれる。
注射剤は、アンプルの形または、いわゆる即使用可能な注射剤、たとえば、すぐに使える注射器または使い捨て注射器のいずれかで処方され、これとは別に、複数回の引出しのための穿刺可能なフラスコに製剤化される。
注射剤の投与は、皮下（ｓｃ）、筋肉内（ｉｍ）、静脈内（ｉｖ）または皮内（ｉｃ）投与の形態であり得る。
特に、結晶、溶液、ナノ粒子、またはたとえばヒドロゾルなどのコロイド分散系の懸濁液として、それぞれ適切な注射製剤を製造することが可能である。
【０１２５】
注射可能な製剤は、濃縮物としてさらに製造することができ、これは水性等張性希釈剤で溶解または分散させることができる。
輸液は、等張液、脂肪乳剤、リポソーム製剤およびマイクロエマルジョンの形態で調製することもできる。
注射剤と同様に、輸液製剤は希釈用の濃縮液の形で調製することもできる。
注射製剤は、たとえば、ミニポンプを介して、入院治療と外来治療の両方で永続的な輸液の形で適用することもできる。
【０１２６】
たとえば、アルブミン、血漿、エキスパンダー、界面活性物質、有機希釈剤、ｐＨ影響物質、錯化物質または高分子物質などの非経口製剤に、特に、本発明の標的結合部分毒素複合体のタンパク質またはポリマーへの吸収に影響を与える物質として添加することができるか、または、それらはまた、本発明の標的結合部分毒素複合体の、注射器具または包装材料、たとえば、プラスチックまたはガラスなどの材料への吸収を低減する目的でも加えることができる。
【０１２７】
標的結合部分を含む本発明のアマニチン誘導体は、たとえば、ポリ（メタ）アクリレート、ポリラクテート、ポリグリコレート、ポリアミノ酸またはポリエーテルウレタンに基づく、微細分散粒子のような非経口でマイクロキャリアまたはナノ粒子に結合することができる。
また、非経口製剤は、本発明の標的結合部分毒素複合体が、それぞれ、微細に、分散、分散および懸濁した形態で導入される場合、たとえば、「複数ユニット原理」に基づいた、デポー製剤として改変することもできる。
または、本発明の標的結合部分毒素複合体が、製剤中、たとえば、錠剤または後に埋め込まれるロッドに封入される場合、薬剤中の結晶の懸濁液として、または。「単一ユニット原理」に基づき、改変することもできる。
単一ユニットおよび複数ユニット製剤の、これらのインプラントまたはデポー薬剤は、多くの場合、たとえば、乳酸とグリコール酸のポリエステル、ポリエーテル、ウレタン、ポリアミノ酸、ポリ（メタ）アクリレートまたは多糖類などの、いわゆる生分解性ポリマーで構成される。
【０１２８】
非経口製剤として製剤化された本発明の医薬組成物の製造中に添加される、アジュバントおよび担体は、特に、それぞれ、
アクア  ステリリサタ（滅菌水）、
ｐＨ値に影響を与える物質（たとえば、有機または無機酸または塩基ならびにその塩など）、
ｐＨ値調整用の緩衝物質、
等張化のための物質（たとえば、塩化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、グルコースおよびフルクトースなど）、
界面活性剤および界面活性剤、および、
乳化剤（たとえば、ポリオキシエチレンソルビタンの脂肪酸の部分エステル（たとえば、Ｔｗｅｅｎ(R)）または、たとえば、ポリオキシエチレンの脂肪酸エステル（たとえばＣｒｅｍｏｐｈｏｒ(R))など）
脂肪油（たとえば、ピーナッツ油、大豆油、ヒマシ油など）
脂肪酸の合成エステル（たとえば、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、および、中性油（たとえば、Ｍｉｇｌｙｏｌ(R)）、）、および、
高分子アジュバント（たとえば、ゼラチン、デキストラン、ポリビニルピロリドンなど）、
有機溶媒の溶解度を高める添加剤（たとえば、プロピレングリコール、エタノール、Ｎ、Ｎ−ジメチルアセトアミド、プロピレングリコールなど）、または、
複合体形成物質（たとえば、クエン酸や尿素など）、
防腐剤（たとえば、安息香酸ヒドロキシプロピルエステルやメチルエステルなど）、ベンジルアルコールなど）、
たとえば、亜硫酸ナトリウムなどの酸化防止剤、および、
ＥＤＴＡなどの安定剤である。
【０１２９】
好ましい実施形態において、本発明の医薬組成物を懸濁液として製剤する場合、本発明の標的結合部分毒素複合体のセッティング（ｓｅｔｔｉｎｇ）を防ぐために、増粘剤、または、沈殿物（ｓｅｄｉｍｅｎｔｓ）および／または複合体形成剤の再懸濁性を保証するために、界面活性剤（ｔｅｎｓｉｄｅｓ）および高分子電解質（ｐｏｌｙｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅｓ）、たとえば、ＥＤＴＡが添加される。
活性成分とさまざまなポリマーの複合体を実現することも可能である。
そのようなポリマーの例は、ポリエチレングリコール、ポリスチレン、カルボキシメチルセルロース、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ(R)またはポリエチレングリコール  ソルビット脂肪酸エステルである。
本発明の標的結合部分毒素複合体は、たとえば、シクロデキストリンを含む包接化合物（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）の形態で液体製剤に組み込むこともできる。
特定の実施形態では、さらなるアジュバントとして、分散剤を加えることができる。
凍結乾燥物の製造には、マンニット、デキストラン、サッカロース、ヒトアルブミン、ラクトース、ＰＶＰ、または様々なゼラチンなどの足場剤を使用できる。
【０１３０】
実施例
以下において、本発明を非限定的な実施例によりさらに詳細に説明する。
Ａ．  Ｓ−デスオキシ−α−アマニチン（ＨＤＰ３０．０７３５）の全合成
【化１１】
2020529452.tif 000012
１.Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−６−アセトキシ−トリプトファン  ＨＤＰ３０．２５５０の調製
【化１２】
2020529452.tif 000013
【０１３１】
５９０．０ミリグラム（２．６８ミリモル）の６−ＯＨ−Ｌ−トリプトファン（ＣＡＳ：１３５６７−１４−１）を、１，４−ジオキサン／水１：１（ｖ．ｖ）３０ミリリットルの混合液に懸濁させた。
アルゴン下、２．６８ミリリットル（２．６８ミリモル）の１ＮのＮａＯＨを、周囲温度で、一挙に加えた。
得られた黄色溶液を、無水Ｂｏｃ（Ｂｏｃ2Ｏ）５７４．６マイクロリットル（２．６８ミリモル）で処理し、そして、２４時間、室温で、撹拌した。
１Ｎの塩酸で、ｐＨ２．４に酸性化し、酢酸エチル２５ミリリットルで、３回抽出した
合わせた酢酸エチル抽出液を、飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥させた。
ろ過と蒸発乾固により、７８５．０ミリグラムの粗物質が得られた。
粗Ｎ−Ｂｏｃ−６−ＯＨ−Ｌ−トリプトファンを、１Ｎ水酸化ナトリウム４．９１ミリリットル（４．９１ミリモル）に溶解し、そして、４６３．２ミリリットル（５００．３ミリグラム、４．９０ミリモル）無水酢酸で処理した。
反応混合物を、３時間、アルゴン下に撹拌し、そして、５％クエン酸で酸性にした。
水相を、２５ミリリットルの酢酸エチルで３回抽出し、飽和ＮａＣｌで洗浄し、そして、ＭｇＳＯ4で乾燥させた。
濾過および蒸発により、６３５ミリグラムの粗固体を得た。
【０１３２】
ＣＨ2Ｃｌ2＋１％酢酸から、ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ（１５：１）＋１％酢酸の勾配を用い、３３０グラムのシリカゲルカラム（検出波長２５４ナノメートル）でのフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、そして、トルエンとの共蒸発後に、５６４．４ミリグラム（５６％の収率）で、白色粉末として得た。
ＭＳ（ＥＳＩ-） 実測値：３６１．０８［Ｍ−Ｈ］-；
計算値：３６２．１５（Ｃ18Ｈ22Ｎ2Ｏ6）
２．  ｃｉｓ、ｔｒａｎｓ−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−２−カルボキシ−３ａ−ヒドロキシ−６−アセトキシ−１，２，３，３ａ，８，８ａ−ヘキサヒドロピロロ［２，３−ｂ］インドール（ｃｉｓ−ＨＤＰ  ３０．２５５５およびｔｒａｎｓ  ＨＤＰ  ３０．２５５５（ｃｉｓ、ｔｒａｎｓ−６−アセトキシ−Ｈｐｉ））の調製
【化１３】
2020529452.tif 000014
【０１３３】
光酸素付加（Ｐｈｏｔｏｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ）
光酸素付加は、４００Ｗの高圧ナトリウム蒸気ランプ（シリウス  Ｘ４００  ランプ  ２３０Ｖ、４００Ｗ；１．３メーターの距離で、５５，０００ルーメン）または代替的に、タングステン−ハロゲンランプ（５００Ｗ）を用いて行われた。
タングステンーハロゲンランプには、λ＜４９０ナノメートルの光を遮断するフィルター溶液（ＣｕＣｌ2−ＣａＣＯ3）を使用する。
【０１３４】
メチレンブルーまたはローズベンガルが、色素増感剤として使用される。
【０１３５】
反応は、ＧＬ１８スレッドを備えた２つのコネクタを備えた、ＤＵＲＡＮ(R)ホウケイ酸ガラス製の熱交換ジャケット、平底、およびフラットラボフランジ（ＤＮ）を備えた、５００ミリリットルの円筒形反応容器で行った。
ランプから反応容器までの距離は、１５センチメーターであり、反応温度は３〜４℃の範囲であった。
【０１３６】
最終生成物は、３３０グラムの、Ｓｉｌｉｃａ  Ｒｅｄｉ  Ｓｅｐｔ  Ｆｌａｓｈカラム（Ｔｅｌｅｄｙｎｅ  ＩＳＣＯ  ｃａｔ．６９−２２０３−３３０）を備えた、Ｔｅｌｅｄｙｎｅ  ＩＳＣＯ  Ｆｌａｓｈクロマトグラフィーシステムで精製した。
溶媒ＣＨ2Ｃｌ2、ＣＨ3ＯＨ、ＣＨ3ＣＯＯＨは、標準的なＨＰＬＣまたはＢＰ等級であった。
【０１３７】
乾燥酸素（純度９９．５％）を、１分あたり２〜４リットルの速度で、反応混合物に吹き込んだ。
【０１３８】
９４３．０ミリグラム（２．６０ミリモル）の、Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）―Ｌ−６−アセトキシ−トリプトファン  ＨＤＰ  ３０．２５５０および１００ミリグラムのローズベンガルを、５００ミリリットルのメタノールに溶解し、そして、冷却媒体としてのグリコール／水を用いたフーバー  クライオスタット（Ｈｕｂｅｒ  ｃｒｙｏｓｔａｔ）を使用して、３℃に冷却した。
反応溶液に、４００Ｗ高圧ナトリウム蒸気ランプを照射した。照射中、酸素のゆっくりした流れを反応溶液に吹き込んだ。５時間照射した後、酸素付加および冷却は停止し、そして、反応媒体を、１０ミリリットルのジメチルスルフィドで処理した。
混合物を、２時間撹拌し、そして、水浴温度が３５℃のロータリーエバポレーターを使用して蒸発乾固させた。
暗赤色残渣を、高真空中で、さらに乾燥させ、結晶性固体（１．２０グラム）を得た。
粗生成物を、ＣＨ2Ｃｌ2＋５％酢酸から、ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ（３０：１）＋５％酢酸の勾配で、３３０グラムのシリカゲルカラム（検出波長２５４ナノメートル）で精製した。
３８０ミリグラムのｃｉｓ−ＨＤＰ  ３０．２５５５と２９０ミリグラムのｔｒａｎｓ−ＨＤＰ  ３０．２５５５が溶出し、トルエンと共蒸発した。ｔｅｒｔ−ブタノール中で凍結乾燥した後、両方の異性体がオフホワイトの粉末として得られた。
シス−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−２−カルボキシ−３ａ−ヒドロキシ−６−アセトキシ−１，２，３，３ａ，８，８ａ−ヘキサヒドロピロロ［２，３−ｂ］インドール（ｃｉｓ−ＨＤＰ  ３０．２５５５）
３８０ミリグラムのシスーＨＤＰ  ３０．２５５５を得た（収率３９％）
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ3ＯＤ、δ＝ｐｐｍ）
δ＝１．２２，１．４４，１．５４［ｓ，９Ｈ，Ｃ（ＣＨ3）3］；２．２３（ｓ，３Ｈ，ＯＣＯＣＨ３）；２．４６−２．６３（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）；４．１４−４．２９（ｍ，１Ｈ，２−Ｈ）；５．３５（ｓ，１Ｈ，８ａ−Ｈ）；６．３９−６．４６（ｍ，２Ｈ，７−Ｈ，５−Ｈ）；７．２０−７．２４（ｍ，１Ｈ，４−Ｈ）
13Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤ3ＯＤ，δ＝ｐｐｍ）
δ＝２０．９３，２８．４５，３１．１２，４２．８０，６１．１２，６９．４４，８２．２１，８５．８２，８７．９３，１０４．９７，１１２．９８，１２４．８４，１２９．４２，１５１．５１，１５４．０４，１５５．９７，１７１．３４，１７５．７９
ＭＳ（ＥＳＩ+）                 実測値：３７８．９２［ＭＨ］+；
計算値：３７８．１４（Ｃ18Ｈ22Ｎ2Ｏ7）
ＭＳ（ＥＳＩ+）                 実測値：４０１．１７［Ｍ＋Ｎａ］+；
計算値：４０１．１４（Ｃ18Ｈ22Ｎ2ＮａＯ7）
ＵＶ／ＶＩＳ（ＣＨ3ＯＨ）：λmax＝２９６ナノメートル，２３９ナノメートル、２１５ナノメートル
λmin＝２６６ナノメートル、２２７ナノメートル
トランス−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−２−カルボキシ−３ａ−ヒドロキシ−６−アセトキシ−１，２，３，３ａ，８，８ａ−ヘキサヒドロピロロ［２，３−ｂ］インドール（トランスーＨＤＰ  ３０．２５５５）
２９０ｍｇのトランスーＨＤＰ  ３０．２５５５を得た（収率３０％）
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ3ＯＤ，δ＝ｐｐｍ）
δ＝１．２２，１．４５，１．５４［ｓ，９Ｈ，Ｃ（ＣＨ3）3］；２．２２（ｓ，３Ｈ，ＯＣＯＣＨ3）；２．５５−２．７３（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2）；４．５１−４．５７（ｍ，１Ｈ，２−Ｈ）；５．２１−５．２４（ｓ，１Ｈ，８ａ−Ｈ）；６．３６−６．４１（ｍ，２Ｈ，７−Ｈ，５−Ｈ）；７．１７−７．１８（ｍ，１Ｈ，４−Ｈ）
13Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤ3ＯＤ，δ＝ｐｐｍ）
δ＝２０．９５，２８．５０，３１．１２，４２．４７，６０．９７，６９．４４，８２．０６，８４．８４，８７．５４，１０４．７４，１１２．６７，１２５．０３，１２８．７０，１５２．３１，１５４．２２，１５６．００，１７１．２３，１７４．６７
ＭＳ（ＥＳＩ+）                 実測値：３７９．００［ＭＨ］+；
計算値：３７８．１４（Ｃ18Ｈ22Ｎ2Ｏ7）
ＭＳ（ＥＳＩ+）                 実測値：４０１．１７［Ｍ＋Ｎａ］+；
計算値：４０１．１４（Ｃ18Ｈ22Ｎ2ＮａＯ7）
ＭＳ（ＥＳＩ+）                 実測値：７７９．００［２Ｍ＋Ｎａ］+；
計測値：７７９．２８（Ｃ36Ｈ44Ｎ4Ｎａ2Ｏ14）
ＵＶ／ＶＩＳ（ＣＨ3ＯＨ）：λmax＝２９９ナノメートル、２４１ナノメートル、２１５ナノメートル
λmin＝２６８ナノメートル、２２８ナノメートル
３．  Ｓ−デスオキシ−α―アマニチン  ＨＤＰ  ３０．０７３５の調製
ステップ１：ＨＤＰ  ３０．００１３
【化１４】
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【０１３９】
ＦｍｏｃＨｙｐＯＨ（１０．０グラム、２８．３ミリモル）を、１００ミリリットルの８０％ＭｅＯＨに懸濁し、そして、Ｃｓ2ＣＯ3（４．６グラム、１４．１ミリモル）を加えた。
完全に溶解するまで、懸濁液を５０℃で、３０分間撹拌した。
反応混合物を、濃縮乾固し、そして、ＤＭＦ１００ミリリットルに再溶解した。
臭化アリル（１．６ミリリットル、３．６グラム、２９．７ミリモル）を滴下し、そして、反応物を、室温で、一晩撹拌した。
ＤＭＦを留去し、そして、残渣を、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルに溶解した。
沈殿物をろ過し、そして、透明な溶液を、カラムクロマトグラフィーの前にセライトに吸収させた。化合物を、ｎ−ヘキサン／酢酸エチル勾配を用いて、２２０グラムのシリカゲルで精製した。
収率：１１．５グラム、１００％
ステップ２：ＨＤＰ  ３０．０４００
【化１５】
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【０１４０】
ＨＤＰ  ３０．００１３（５．０グラム、１４．１ミリモル）、ピリジニウム  ４−トルエンスルホネート（１．３３グラム、５．３ミリモル）を、４０ミリリットルのジクロロエタンに、１，３−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イルメトキシメチル樹脂（５．０グラム、１．０ミリモル／グラム  ＴＨＰ樹脂）懸濁液に添加した。
反応物を、８０℃で、一晩撹拌した。
冷却した後、樹脂を濾過し、そして、広範囲に、ジクロロエタン、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、ジクロロメタンおよびｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルで洗浄した。
【０１４１】
負荷は０．６２ミリモル／グラムであった（脱保護後のフルオレンメチル基のＵＶ分光法で測定）。
ステップ３：ＨＤＰ ３０．２５６９（固相合成）
【化１６】
2020529452.tif 000017
【０１４２】
樹脂の前処理：
ＨＤＰ ３０．０４００（０．３１グラム、０．２５ミリモル）を、Ｎ、Ｎ−ジメチルバルビツール酸（２４１ミリグラム、１．５５ミリモル）およびＰｄ（ＰＰｈ3）4（３５ミリグラム、０．０３ミリモル）で処理した。
樹脂を、室温で一晩振盪した。その後、樹脂を、ジクロロメタン、ＤＭＦ、アセトニトリル、ジクロロメタンおよびｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルで徹底的に洗浄し、そして、減圧下で乾燥させた。
【０１４３】
カップリング手順：
すべての反応物と試薬は、ジクロロメタン／ＤＭＦ（１：１、ｖ／ｖ）に溶解した。
ＨＤＰ３０．０４７７（ＷＯ２０１４／００９０２５参照）（１０２ミリグラム、０．３０ミリモル）を、６．０ミリリットルのジクロロメタン／Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解し、そして、０．２Ｎ溶液のＰｙＢＯＰ／ＨＯＢｔの４．０ミリリットルおよび２ミリリットルのＤＩＥＡ（４０％ＤＭＦ）で処理した。
２．０ミリリットルのＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミドを添加後、反応物をマイクロ波照射（２０Ｗ、ＣＥＭマイクロ波反応器）で、８分間、５０℃に加熱し、そして、カップリングした後、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミドで洗浄した。
【０１４４】
Ｆｍｏｃ−脱保護：
脱保護は、２０％ピペリジンのＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液６．０ミリリットルを、５０℃で、１０分間添加した。樹脂を、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミドで洗浄した（最後のアミノ酸のカップリングの後、脱保護しない）。
【０１４５】
上記のプロトコルに従って、他のすべてのアミノ酸を結合した。重さを以下に示す。
(0.102グラム、0.30ミリモル  1.5当量HDP30.0477           分子量:339.6、上記参照)
0.72グラム、  1.2ミリモル   5.0当量FmocAsn(Trt)OH       分子量:599.7
0.71グラム、  1.2ミリモル   5.0当量FmocCys(OTrt)OH      分子量:586.7
0.36グラム、  1.2ミリモル   5.0当量FmocGlyOH            分子量:297.3
0.36グラム、  1.2ミリモル   5.0当量FmoclleOH            分子量:353.4
0.36グラム、  1.2ミリモル   5.0当量FmocGlyOH            分子量:297.3
0.114グラム、 0.30ミリモル  1.5当量HDP30.2555           分子量:378.4
【０１４６】
完了後、樹脂を、最終的に底部フリットを備えたシリンジに移し、ＤＣＭで洗浄し、減圧下で乾燥させた。
【０１４７】
樹脂放出とＢリング形成
５ミリリットルのＴＦＡ、５ミリリットルのＤＣＭ＋１０％ＭｅＯＨの溶液を樹脂に吸引し、周囲温度で、１５分間振盪した。
溶液を、５０ミリリットルの反応フラスコに分注し、樹脂をＴＦＡ／ＤＣＭ１：１＋１０％ＭｅＯＨで１回洗浄し、同じフラスコに注いだ。
反応フラスコを１６時間撹拌した。
トリイソプロピルシラン（０．５ミリリットル）を加え、反応物を真空で濃縮した。
残渣を、５００マイクロリットルのＭｅＯＨに溶解し、ペプチドを５０ミリリットルの氷冷ＴＢＭＥに沈殿させた。
遠心分離後、上清をデカントし、沈殿物を５０ミリリットルのＴＢＭＥで１回洗浄し、減圧下で乾燥させた。
【０１４８】
沈殿物を、２ミリリットルのメタノールに可溶化し、分取逆相カラムクロマトグラフィーにより精製した。メタノールを減圧下で留去し、残った水相を凍結乾燥させた。
収量：１３６．５ミリグラム、６２．５％
ＭＳ（ＥＳＩ＋）        実測値：１０４７．４［Ｍ＋Ｈ］+；
計算値：１０４７．４（Ｃ45Ｈ63Ｎ10Ｏ17Ｓ）
ＨＰＬＣ：９１．９面積％
ステップ４：環化（Ａ環形成、ＨＤＰ  ３０．２５７２）
【化１７】
2020529452.tif 000018
【０１４９】
上記凍結乾燥した単環式中間体（１３６ミリグラム、１３０マイクロモル）を、１６ミリリットルのＤＭＦに溶解し、ジフェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ、１３１マイクロリットル、１３００マイクロモル、１０当量）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、１６２マイクロリットル、１３００マイクロモル、１０当量）で処理した。
反応物を、１６時間攪拌し、完了したら、５００マイクロリットルの水でクエンチした。
変換を、ＨＰＬＣで監視した。混合物を減圧により濃縮し、１ミリリットルのメタノールに再溶解し、分取逆相カラムクロマトグラフィーにより精製した。
収量：５５．３ミリグラム、４１％
ＭＳ（ＥＳＩ＋）        実測値：１０２９．３３［Ｍ＋Ｎａ］+；
計算値：１０３０１０（Ｃ45Ｈ61Ｎ10Ｏ16Ｓ）
ＨＰＬＣ：９９．２面積％
ステップ５：酢酸脱保護（ＨＤＰ  ３０．０７３５）
【化１８】
2020529452.tif 000019
【０１５０】
ＨＤＰ  ３０．２５７２（５５．３ミリグラム、５３．７マイクロモル）を、７Ｎメタノール−ＮＨ3溶液（３．０ミリリットル）に溶解し、攪拌した。
変換は、ＨＰＬＣ／ＭＳで確認した。完了後（６〜８時間）、反応物を真空濃縮し、１００マイクロリットルのＭｅＯＨに再懸濁し、分取ＨＰＬＣで精製した。
収量：１４．１ミリグラム、２９％
ＨＰＬＣ：１００％
ＭＳ（ＥＳＩ＋）        実測値：９０３．３［Ｍ＋Ｈ］+；
計算値：９０２．９（Ｃ39Ｈ５４Ｎ１０Ｏ１３Ｓ）
実測値：９２５．３３［Ｍ＋Ｎａ］+
４．  ６’−（（３−マレイミドプロパンアミド−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＰＡＢ）−Ｓ−デオキシ−α−アマニチン（ＨＤＰ  ３０．２３７１）の調製
ステップ１：ＨＤＰ  ３０．２３６４
【化１９】
2020529452.tif 000020
【０１５１】
Ｓ−デスオキシ−α−アマニチン  ＨＤＰ  ３０．０７３５（３０ミリグラム、３３．２マイクロモル）およびＨＤＰ  ３０．１６９０（ＷＯ  ２０１６／１４２０４９、７８ミリグラム、１３３マイクロモル＝４．０当量）を１５００マイクロリットルの乾燥ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）に溶解した。０．２モルの炭酸水素セシウム水溶液（１９９マイクロリットル、１．２当量）を一度に加え、そして、混合物を室温で撹拌する。１．５および４時間後、９９マイクロリットル（０．６当量）の炭酸セシウム溶液を追加した。
【０１５２】
１８時間後、溶媒を高真空で蒸発させた。
【０１５３】
残渣を、４００マイクロリットルのメタノールに溶解し、そして、氷冷したＭＴＢＥ（１０ミリリットル）に滴下した。
０℃で１０分間放置した後、得られた沈殿物を、遠心分離（４分、４０００×ｇ）により分離した。
上清を排出し、そして、ペレットを、追加のＭＴＢＥ（１０ミリリットル）に再懸濁し、そして、遠心分離を繰り返した。
真空乾燥した粗生成物を、４００マイクロリットルのメタノールに溶解し、そして、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ−Ｃ18（２）、１０マイクロメートルのカラム（２５０ｘ２１．２ミリメートル）で、５％〜１００％のメタノール水溶液により、分取ＨＰＬＣにより精製した。生成物画分を合わせて、非晶質固体として２３ミリグラム（７０％）の生成物を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ＋）        実測値：１４３０．５８［Ｍ＋Ｎａ］+；
計算値：１４３０．６５（Ｃ65Ｈ97Ｎ13ＮａＯ18ＳＳｉ）
【０１５４】
初期溶出ピークの蒸発により、５ミリグラム（１７％）の出発物質が回収された。
ステップ２：ＨＤＰ  ３０．２３６６
【化２０】
2020529452.tif 000021
【０１５５】
ＨＤＰ  ３０．２３６４（９．４７ミリグラム、６．７２マイクロモル）を、７５０マイクロリットルのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）に溶解した。
２分後、揮発物を真空で除去し、そして、残留物を、７５０マイクロリットルの水に溶解し、そして、ｐＨ１０に到達して、沈殿が生じるまで、３％アンモニアを滴下する。
【０１５６】
溶液を凍結乾燥し、そして、続いて、分取ＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ−Ｃ18（２）、１０マイクロメーターのカラム、２５０ｘ２１．２ミリメートル、水（０．０５％ＴＦＡ）中の５〜１００％のメタノール（０．０５％ＴＦＡ）の勾配により精製し、７．７２ミリグラム（ＴＦＡ塩に基づいて８９％）を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ+） 実測値：１１７８．４２［ＭＨ］+；
計算値：１１７８．５３（Ｃ54Ｈ76Ｎ13Ｏ15Ｓ）
ステップ３：ＨＤＰ３０．２３７１
【化２１】
2020529452.tif 000022
ＨＤＰ３０．２３６６（４．０１ミリグラム、３．１０マイクロモル）を、５００マイクロリットルの乾燥ＤＭＦに溶解した。
【０１５７】
３−（マレイミド）プロピオン酸  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＢＭＰＳ、１．６５ミリグラム、２当量）を、ＤＭＦ１００マイクロリットルに溶解した後、ＤＩＰＥＡ  ２．１マイクロリットルを添加した。
【０１５８】
１時間撹拌した後、反応混合物を、１０ミリリットルの氷冷したメチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテルに滴下した。
チューブを氷上で１０分間保持し、そして、４０００×ｇで遠心分離した。
上清を除去し、そして、ペレットを１０ミリリットルの新鮮なメチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテルで洗浄した。
【０１５９】
真空乾燥ペレットを、水中の勾配５−１００％のメタノールを用いて、ＲＰ−１８  ＨＰＬＣにより精製した。
純粋な画分を蒸発乾固させ、そして、１ミリリットルのｔｅｒｔ−ブタノール／水から凍結乾燥させて、２．７０ミリグラム（６５％）の生成物を無色の粉末として得た。
ＭＳ（ＥＳＩ＋）        実測値：１３２９．３    ［ＭＨ］+；
計算値：１３２９．６（Ｃ61Ｈ81Ｎ14Ｏ18Ｓ）
実測値：１３５１．５    ［Ｍ＋Ｎａ］+；
計算値：１３５１．５（Ｃ61Ｈ80Ｎ14ＮａＯ18Ｓ）
Ｂ．  Ｓ−デスオキシ−５’−ヒドロキシ−アマニンアミド  ＨＤＰ  ３０．２５４８の全合成
【化２２】
2020529452.tif 000023
１．Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−５−アセトキシ−トリプトファンＨＤＰ  ３０．２５３１の調製
【化２３】
2020529452.tif 000024
【０１６０】
８００．０ミリグラム（３．６３ミリモル）の５−ヒドロキシ−Ｌ−トリプトファン（ＣＡＳ：４３５０−０９−８）を、４０ミリリットルの１，４−ジオキサン／水１：１（ｖ：ｖ）の混合液に懸濁した。
アルゴン下に、３．６４ミリリットル（３．６４ミリモル）の１Ｎ  ＮａＯＨを、周囲温度で、一度に加えた。
次に、得られた黄色の溶液を、７７９．０マイクロリットル（７９４．０ミリグラム、３．６３ミリモル）の無水Ｂｏｃ（Ｂｏｃ2Ｏ）で処理し、そして、室温で、２４時間、攪拌した。
溶液を、１Ｎ塩酸でｐＨ２．４に酸性化し、そして、酢酸エチル３５ミリリットルで、３回抽出した。
合わせた酢酸エチル抽出液を、飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄し、そして、ＭｇＳＯ4で乾燥させた。
濾過および蒸発乾固により、１．２６グラムの粗物質を得た。
粗製Ｎ−Ｂｏｃ−６−ヒドロキシ−Ｌ−トリプトファンを、７．８７ミリリットル（７．８７ミリモル）の１Ｎ  ＮａＯＨに溶解し、そして、７４３．０マイクロリットル（８０２．４ミリグラム、７．８６ミリモル）無水酢酸で処理した。
反応混合物を、アルゴン下で３時間撹拌し、そして、５％クエン酸で酸性化した。
水相を、２５ミリリットルの酢酸エチルで３回抽出し、飽和ＮａＣｌで洗浄し、そして、ＭｇＳＯ4で乾燥させた。ろ過と蒸発をした。
【０１６１】
粗固体を、ＣＨ2Ｃｌ2＋１％酢酸から、ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ（１５：１）＋１％酢酸の勾配を用いた、３３０グラムのシリカゲルカラム（検出波長２５４ナノメートル）でのフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、そして、トルエンとの共蒸発後に、１０２０．０ミリグラム（収率７８％）の白色粉末が得られた。
ＭＳ（ＥＳＩ-） 実測値：３６１．０８［Ｍ−Ｈ］-；
計算値：３６２．１５（Ｃ18Ｈ22Ｎ2Ｏ6）
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ3ＯＤ，δ＝ｐｐｍ）
δ＝１．３９（ｓ，９Ｈ，Ｃ（ＣＨ3）3）；２．２７（ｓ，３Ｈ，ＯＣＯＣＨ3）；３．０８−３．３１（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2）；４．３９−４．４１（ｍ，１Ｈ，２−Ｈ）；６．８１−６．８３；７．１３；７．２４−７．２６（ｍ，２Ｈ，６−Ｈ，７−Ｈ）；７．３０−７．３２（１Ｈ，４−Ｈ）
２．  ｃｉｓ、ｔｒａｎｓ−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−２−カルボキシ−３ａ−ヒドロキシ−５−アセトキシ−１，２，３，８，８ａ−ヘキサヒドロピロロ［２，３−ｂ］インドール  ｃｉｓ−ＨＤＰ  ３０．２５３６およびｔｒａｎｓ  ＨＤＰ  ３０．２５３６（ｃｉｓ、ｔｒａｎｓ−５−アセトキシ−Ｈｐｉ）の調製
【化２４】
2020529452.tif 000025
【０１６２】
光酸素付加
光酸素付加は、４００Ｗの高圧ナトリウム蒸気ランプ（Ｓｉｒｉｕｓ  Ｘ４００  ランプ  ２３０Ｖ、４００Ｗ、１．３メーターの距離で、５５，０００ルーメン）または代替で、タングステン−ハロゲンランプ（５００Ｗ）で行った。
タングステンハロゲンランプには、λ＜４９０ナノメートルの光を遮断するフィルターソリューション（ＣｕＣｌ2−ＣａＣＯ3）が使用される。
【０１６３】
色素増感剤として、メチレンブルーまたはローズベンガルが使用される。
反応は、ＧＬ  １８スレッドを備えた２つのコネクタを備えた、ＤＵＲＡＮ(R)ホウケイ酸ガラス製の熱交換ジャケット、平底、およびフラットラボフランジ（ＤＮ）を備えた、５００ミリリットルの円筒形反応容器で実施した。
ランプから反応容器までの距離は１５ｃｍで、そして、反応温度は、３〜４℃の範囲であった。
【０１６４】
最終生成物を、３３０グラムのＳｉｌｉｃａ  Ｒｅｄｉ  Ｓｅｐｔ  Ｆｌａｓｈ  カラム（Ｔｅｌｅｄｙｎｅ  ＩＳＣＯ  ｃａｔ．６９−２２０３−３３０）を備えたＴｅｌｅｄｙｎｅ  ＩＳＣＯ  Ｆｌａｓｈクロマトグラフィーシステムで精製した。
溶媒、ＣＨ2Ｃｌ2、ＣＨ3ＯＨ、ＣＨ3ＣＯＯＨは、標準ＨＰＬＣまたはＢＰグレードであった。
乾燥酸素（純度９９．５％）を、１分あたり、２〜４リットルの速度で、反応混合物に吹き込んだ。
【０１６５】
１．２０グラム（３．１７ミリモル）のＮ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−５−アセトキシ−トリプトファン  ＨＤＰ  ３０．２５３１および１００ミリグラムのローズベンガルを、５００ミリリットルのメタノールに溶解し、そして、冷却媒体としてグリコール／水を用いる、フーバー  クライオスタットを使用して、３℃に冷却した。
反応溶液に、４００Ｗの高圧ナトリウム蒸気ランプを照射した。
照射中、反応溶液にゆっくりした酸素の流れを吹き込んだ。
４時間の照射後、酸素付加と冷却を停止し、そして、反応媒体を、２０ミリリットルのジメチルスルフィドで処理した。
混合物を、２時間撹拌し、そして、３５℃の水浴温度でロータリーエバポレーターを使用して蒸発乾固させた。
暗赤色の残留物を、高真空でさらに乾燥させて、結晶性固体を得た。
粗生成物を、ＣＨ2Ｃｌ2＋５％酢酸からＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ（３０：１）＋５％酢酸の勾配で、３３０グラムのシリカゲルカラム（検出波長２５４ナノメートル）で精製した。
【０１６６】
１７８ミリグラムのｃｉｓ−ＨＤＰ  ３０．２５３６と１３２ミリグラムのｔｒａｎｓ−ＨＤＰ３０．２５３６が溶出し、そして、トルエンと共蒸発した。
ｔｅｒｔ−ブタノール中で凍結乾燥した後、両方の異性体が、オフホワイトの粉末として得られた。
シス−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−２−カルボキシ−３ａ−ヒドロキシ−５−アセトキシ−１，２，３，３ａ，８，８ａ−ヘキサヒドロピロロ［２，３−ｂ］インドール（ｃｉｓ−ＨＤＰ  ３０．２５３６）
１７８ミリグラムのｃｉｓ−ＨＤＰ  ３０．２５３６    収率：１５％
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ3ＯＤ，δ＝ｐｐｍ）
δ＝１．４４，１．５４（ｓ，９Ｈ，Ｃ（ＣＨ3）3）；２．２３（ｓ，３Ｈ，ＯＣＯＣＨ3）；２．４５−２．６２（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2）；４．１８−４．３３（ｍ，１Ｈ，２−Ｈ）；５．３７（ｓ，１Ｈ，８ａ−Ｈ）；６．６３−６．６７；６．８２−６．８４；（ｍ，２Ｈ，７−Ｈ，６−Ｈ）；６．９６−６．９８（ｍ，１Ｈ，４−Ｈ）
13Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤ3ＯＤ，δ＝ｐｐｍ）
δ＝２０．８６，２８．４６，３１．１２，４２．８１，６１．２１，８２．１４，８５．６０，１１１．４９，１１７．８３，１２３．９８，１３２．７７，１４４．９９，１４８．０３，１５６．０７，１７２．０１，１７５．８９
ＭＳ（ＥＳＩ+） 実測値：３７９．００［ＭＨ］+；
計算値：３７８．１４（Ｃ18Ｈ22Ｎ2Ｏ7）
ＭＳ（ＥＳＩ+） 実測値：４０１．１７［Ｍ＋Ｎａ］+；
計算値：４０１．１４（Ｃ18Ｈ22Ｎ2ＮａＯ7）
ＭＳ（ＥＳＩ-） 実測値：３７７．１７［Ｍ−Ｈ］-；
計算値：３７８．１４（Ｃ18Ｈ22Ｎ2Ｏ7）
ＵＶ／ＶＩＳ（ＣＨ3ＯＨ）：λmax＝２９９ナノメートル，２４２ナノメートル，２０７ナノメートル
λmin＝２７０ナノメートル，２２２ナノメートル                        
トランス−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−２−カルボキシ−３ａ−ヒドロキシ−５−アセトキシ−１，２，３，３ａ，８，８ａ−ヘキサヒドロピロロ［２，３−ｂ］インドール（ｔｒａｎｓ−ＨＤＰ３０．２５３６）
１３２ミリグラムのｔｒａｎｓ−ＨＤＰ  ３０．２５３６    収率：１１％
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ3ＯＤ，δ＝ｐｐｍ）
δ＝１．４７，１．５４［ｓ，９Ｈ，Ｃ（ＣＨ3）3］；２．２１（ｓ，３Ｈ，ＯＣＯＣＨ3）；２．５０−２．７０（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2）；４．５１−４．５６（ｍ，１Ｈ，２−Ｈ）；５．２２−５．２６（ｓ，１Ｈ，８ａ−Ｈ）；６．５８−６．６３；６．８０−６．８１（ｍ，６−Ｈ，７−Ｈ）；６．９２（ｓ，１Ｈ，４−Ｈ）
13Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤ3ＯＤ，δ＝ｐｐｍ）
δ＝２０．８８，２８．５０，３１．１２，４２．６０，６１．１１，８２．０５，８５．３８，１１１．２６，１１７．８８，１２４．０７，１３１．９４１４４．６６，１４８．９５，１５６．１１，１７２．０１，１７４．８１
ＭＳ（ＥＳＩ+） 実測値：３７９．００［ＭＨ］+；
計算値：３７８．１４（Ｃ18Ｈ22Ｎ2Ｏ7）
ＭＳ（ＥＳＩ+） 実測値：４０１．１７［Ｍ＋Ｎａ］+；
計算値：４０１．１４（Ｃ18Ｈ22Ｎ2ＮａＯ7）
ＭＳ（ＥＳＩ-） 実測値：３７７．１７［Ｍ−Ｈ］-；
計算値：３７８．１４（Ｃ18Ｈ22Ｎ2Ｏ7）
ＵＶ／ＶＩＳ（ＣＨ3ＯＨ）：λmax＝３０２ナノメートル，２４４ナノメートル，２０８ナノメートル
λmin＝２７２ナノメートル，２２４ナノメートル
３．  Ｓ−デスオキシ−５’−ヒドロキシ−アマニンアミド ＨＤＰ ３０．２５４８の調製
ステップ１：ＨＤＰ ３０．００１３
【化２５】
2020529452.tif 000026
【０１６７】
ＦｍｏｃＨｙｐＯＨ（１０．０グラム、２８．３ミリモル）を、１００ミリリットルの８０％ＭｅＯＨに懸濁し、そして、Ｃｓ2ＣＯ3（４．６グラム、１４．１ミリモル）を加えた。
完全に溶解するまで、懸濁液を、５０℃で、３０分間撹拌した。
反応混合物を濃縮乾固し、ＤＭＦ１００ミリリットルに再溶解した。
臭化アリル（１．６ミリリットル、３．６グラム、２９．７ミリモル）を滴下し、そして、反応物を、室温で、一晩撹拌した。
ＤＭＦを留去し、そして、残渣をｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルに溶解した。
沈殿物をろ過し、そして、透明な溶液をカラムクロマトグラフィーの前にセライトに吸収させた。
化合物を、ｎ−ヘキサン／酢酸エチル勾配を用いて、２２０グラムのシリカゲルで精製した。
収率：１１．５グラム，１００％
ステップ２：ＨＤＰ  ３０．０４００
【化２６】
2020529452.tif 000027
【０１６８】
ＨＤＰ  ３０．００１３（５．０グラム、１４．１ミリモル）、ピリジニウム  ４−トルエンスルホネート（１．３３グラム、５．３ミリモル）を、１，３−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル−メトキシメチル樹脂（５．０グラム、１．０ミリモル／グラム  ＴＨＰ樹脂）の４０ミリリットルのジクロロエタンの懸濁液に、
加えた。反応液を、８０℃で一晩撹拌した。冷却後、樹脂をろ過し、ジクロロエタン、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、ジクロロメタンおよびｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルで徹底的に洗浄した。
【０１６９】
負荷は、０．６２ミリモル／グラム（脱保護後のフルオレニルメチル基のＵＶ分光法により決定）
ステップ３：ＨＤＰ  ３０．２５４４（固相合成）
【化２７】
2020529452.tif 000028
【０１７０】
樹脂の前処理：
ＨＤＰ  ３０．０４００（０．３１グラム、０．２５ミリモル）を、Ｎ，Ｎ−ジメチルバルビツール酸（２４１ミリグラム、１．５５ミリモル）およびＰｄ（ＰＰｈ3）4（３５ミリグラム、０．０３ミリモル）で処理した。
樹脂を、室温で、一晩振盪した。
その後、樹脂を、ジクロロメタン、ＤＭＦ、アセトニトリル、ジクロロメタンおよびｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルで徹底的に洗浄し、減圧下で乾燥させた。
【０１７１】
カップリング手順：
すべての反応物と試薬を、ジクロロメタン／ＤＭＦ（１：１、ｖ／ｖ）に溶解した。
ＨＤＰ  ３０．０４７７［ＷＯ  ２０１４／００９０２５を参照］（１０２ミリグラム、０．３０ミリモル）を、６．０ミリリットルのジクロロメタン／Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解し、０．２ＮのＰｙＢＯＰ／ＨＯＢｔ溶液４．０ミリリットルおよび２ミリリットルのＤＩＥＡ（ＤＭＦ中４０％）で処理した。
２．０ミリリットルのＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミドの添加後、反応物をマイクロ波照射（２０Ｗ、ＣＥＭマイクロ波反応器）により、８分間、５０℃に加熱し、カップリング後に、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミドで洗浄した。
【０１７２】
Ｆｍｏｃ−脱保護：
脱保護は、５０℃で、１０分間、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド中の２０％ピペリジン６．０ミリリットルの添加により実施された。
樹脂を、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミドで洗浄した（最終アミノ酸のカップリング後に脱保護なし）。
【０１７３】
他のすべてのアミノ酸は、上記のプロトコルに従って結合され、重みは以下に示される。
(0.102グラム,  0.30ミリモル        1.5当量 HDP30.0477        MW:339.6,上記参照)
0.72グラム,    1.2ミリモル         5.0当量 FmocAsn(Trt)OH    MW:599.7
0.71グラム,    1.2ミリモル         5.0当量 FmocCys(OTrt)OH   MW:586.7
0.36グラム,    1.2ミリモル         5.0当量 FmocGlyOH         MW:297.3
0.36グラム,    1.2ミリモル         5.0当量 FmocIleOH         MW:353.4
0.36グラム,    1.2ミリモル         5.0当量 FmocGlyOH         MW:297.3
0.114グラム,   0.30ミリモル        1.5当量 HDP30.2536        MW:378.4
【０１７４】
完了後、樹脂を、最終的に底部フリットを備えたシリンジに移し、ＤＣＭで洗浄し、そして、減圧下で乾燥させた。
【０１７５】
樹脂放出とＢ−リング形成
５ミリリットルのＴＦＡ、５ミリリットルのＤＣＭ＋１０％ＭｅＯＨの溶液を、樹脂に吸引し、そして、周囲温度で、１５分間振盪した。
溶液を５０ミリリットルの反応フラスコに分注し、そして、樹脂を、ＴＦＡ／ＤＣＭ１：１＋１０％ＭｅＯＨで１回洗浄し、そして、同じフラスコに注いだ。
反応フラスコを、１６時間撹拌した。トリイソプロピルシラン（０．５ミリリットル）を加え、そして、反応液を真空で濃縮した。
残渣を、５００マイクロリットルのＭｅＯＨに溶解し、そして、ペプチドを、５０ミリリットルの氷冷ＴＢＭＥに沈殿させた。
遠心分離後、上清をデカントし、そして、沈殿物を、５０ミリリットルのＴＢＭＥで１回洗浄し、そして、減圧下で乾燥させた。
【０１７６】
沈殿物を、２ミリリットルのメタノールに可溶化し、そして、分取逆相カラムクロマトグラフィーにより精製した。メタノールを減圧下で留去し、残った水相を凍結乾燥させた。
融点：７５．１ミリグラム，３５．９％
ＭＳ（ＥＳＩ+） 実測値：１０４７．４［Ｍ＋Ｈ］+；
計算値：１０４７．４（Ｃ45Ｈ63Ｎ10Ｏ17Ｓ）
ＨＰＬＣ：９９．３面積％
ステップ４：環化（Ａ環形成，ＨＤＰ  ３０．２５４６）
【化２８】
2020529452.tif 000029
【０１７７】
上記の凍結乾燥した単環式中間体（４９．４ミリグラム、４７．２マイクロモル）を、３ミリリットルＤＭＦに溶解し、そして、ジフェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ、１３マイクロリットル、２３７マイクロモル、５当量）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、４０マイクロリットル、２３７マイクロリットル、５当量）で処理した。
反応物を、１６時間攪拌し、完了したら、５００マイクロリットルの水でクエンチした。変換をＨＰＬＣで監視した。混合物を減圧により濃縮し、１ミリリットルのメタノールに再溶解し、そして、分取逆相カラムクロマトグラフィーにより精製した。
融点：３２．５ミリグラム，６７．９％
ＭＳ（ＥＳＩ+）実測値：［Ｍ＋Ｈ］+１０２９．３３［ＭＨ］+１０５１．３［Ｍ＋Ｎａ］+；
計算値：１０２９．３９；１０５１．４２（Ｃ45Ｈ61Ｎ10Ｏ16Ｓ；Ｃ45Ｈ60Ｎ10Ｏ16ＳＮａ）
ＨＰＬＣ：８８．３面積％
ステップ５：アセテートの脱保護（ＨＤＰ  ３０．２５４８）
【化２９】
2020529452.tif 000030
【０１７８】
ＨＤＰ  ３０．２５４６（２３．４ミリグラム、２２．７マイクロモル）を、７Ｎ  メタノール−ＮＨ3溶液（２．３ミリリットル）に溶解し、攪拌した。変換は、ＨＰＬＣ／ＭＳで確認した。
完了後（６〜８時間）、反応物を真空濃縮し、１００マイクロリットルのＭｅＯＨに再懸濁し、分取ＨＰＬＣで精製した。
収率：１２．５ミリグラム，５３．３％
ＨＰＬＣ：９９％
ＭＳ（ＥＳＩ+） 実測値：９０３．４［Ｍ＋Ｈ］+；
計算値：９０２．９（Ｃ39Ｈ54Ｎ10Ｏ13Ｓ）
実測値：９２５．４［Ｍ＋Ｎａ］+
５．  ５’−（（３−マレイドプロパンアミド）−Ｖａｌ−Ａｌａ−ｐ−アミニノベンジルオキシ）−Ｓ−デオキシ−アマニンアミド（ＨＤＰ  ３０．２６０２）の調製
ステップ１：ＨＤＰ  ３０．２５６３
【化３０】
2020529452.tif 000031
【０１７９】
Ｓ−デスオキシ−５’−ヒドロキシ−アマニンアミド  ＨＤＰ  ３０．２５４８（９．６６ミリグラム、１０．７マイクロモル）およびＨＤＰ  ３０．１６９０（ＷＯ  ２０１６／１４２０４９、５０．２ミリグラム、８５．６マイクロモル＝８．０当量）を、５００マイクロリットルの乾燥ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）に溶解した。
１．０モルの炭酸水素セシウム水溶液（１７．１２マイクロリットル、１．６当量）を、一度に加え、混合物を室温で撹拌した。
【０１８０】
１．５時間後、１７．１２マイクロリットル（１．６当量）の炭酸セシウム溶液を追加した。
【０１８１】
８時間後、反応混合物を酢酸で中和し、遠心フィルター（０．２マイクロメーター）を通過させ、水中のアセトニトリルの勾配（５−１００％）で、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ−Ｃ18（２）、１０マイクロメーターのカラム（２５０ｘ２１．２ミリメーター）で、ＨＰＬＣにより精製した。
生成物の画分を合わせて、非晶質固体として、４．００ミリグラム（２６％）の生成物を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ+） 実測値：１４３０．５８［Ｍ＋Ｎａ］+
計算値：１４３０．６５（Ｃ65Ｈ97Ｎ13ＮａＯ18ＳＳｉ）
ステップ２：ＨＤＰ  ３０．２３７８
【化３１】
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【０１８２】
ＨＤＰ  ３０．２５６３（７．５３ミリグラム、５．３４マイクロモル）を、トリフルオロ酢酸／水／トリイソプロピルシラン９５：５：５の混合物の５００マイクロリットルに溶解した。
５分後、揮発物を真空で除去し、残留物を１０００マイクロリットルの水に溶解し、そして、ｐＨ１０に達するまで、３％アンモニアを滴下した。
【０１８３】
溶液を凍結乾燥し、続いて、分取ＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ−Ｃ18（２）、１０マイクロメーターのカラム２５０ｘ２１．２ミリメーター、水中アセトニトリル（０．０５％ＴＦＡ）で、１６分間、２０−３０％の勾配で精製し、３．９５ミリグラム（ＴＦＡ塩に基づいて５７％）の生成物を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ+） 実測値：１１７８．５０［Ｍ＋Ｈ］+
計算値：１１７８．５３（Ｃ54Ｈ76Ｎ13Ｏ15Ｓ）
ステップ３：ＨＤＰ  ３０．２６０２
【化３２】
2020529452.tif 000033
【０１８４】
ＨＤＰ  ３０．２５７８（３．９５ミリグラム、３．０６マイクロモル）を、４００マイクロリットルの乾燥ＤＭＦに溶解した。
【０１８５】
３−（マレイミド）プロピオン酸  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＢＭＰＳ、１．６３ミリグラム、２当量）を、８１．４マイクロリットルのＤＭＦに溶解し、続いて２．１マイクロリットル（２当量）のＤＩＰＥＡを加えた。
【０１８６】
２時間撹拌した後、反応混合物を遠心フィルター（０．２マイクロメーター）に通し、５−７０％の勾配のアセトニトリル水＋０．０５％ＴＦＡを用いて、ＲＰ−１８  ＨＰＬＣにより精製した。
純粋な画分を蒸発乾固させ、２ミリリットルのアセトニトリル／水１：１から凍結乾燥させて、２．７３ミリグラム（６７％）の生成物を無色の粉末として得た。
ＭＳ（ＥＳＩ＋）                実測値：１３２９．３３；［Ｍ＋Ｈ］+
計算値：１３２９．５６（Ｃ61Ｈ81Ｎ14Ｏ18Ｓ）
Ｃ．  Ｓ−デスオキシ−４’−ヒドロキシ−アマニンアミドの全合成
【化３３】
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１．  ｃｉｓ、ｔｒａｎｓ−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−２−カルボキシ−３ａ−ヒドロキシ−４−アセトキシ−１，２，３，３ａ，８，８ａ−ヘキサヒドロピロロ［２，３−ｂ］インドール：シスおよびトランス（シス、トランス−４−アセトキシ−Ｈｐｉ）の合成の概略図；
【化３４】
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２．  Ｓ−デスオキシ−４’−ヒドロキシ−アマニンアミドの合成の概略図
【化３５】
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【０１８７】
Ｄ．  Ｓ−デスオキシ−７’−ヒドロキシ−アマニンアミドの全合成
１．ｃｉｓ、ｔｒａｎｓ−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−２−カルボキシ−３ａ−ヒドロキシ−４−アセトキシ−１，２，３，３ａ，８，８ａ−ヘキサヒドロピロロ［２，３−ｂ］インドール（シス、トランス−４−アセトキシ−Ｈｐｉ）の合成；
ｃｉｓ、ｔｒａｎｓ−７−アセトキシ−Ｈｐｉの合成は、４−ヒドロキシ−Ｌ−トリプトファンの代わりに、市販の７−ヒドロキシ−Ｌ−トリプトファンから開始して、ｃｉｓ、ｔｒａｎｓ−４−アセトキシ−Ｈｐｉの合成と同様に行う。
【化３６】
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【０１８８】
２．  Ｓ−デスオキシ−７’−ヒドロキシ−アマニンアミドの合成の概略図
Ｓ−デスオキシ−７’−ヒドロキシ−アマニンアミドの合成は、シス、トランス−４−アセトキシ−Ｈｐｉの代わりにシス、トランス−７−アセトキシ−Ｈｐｉを使用して、Ｓ−デスオキシ−４’−ヒドロキシ−アマニンアミドの合成と同様に行う。
【化３７】
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【０１８９】
６．  Ｓ−デスオキシ−α−アマニチン  ＨＤＰ  ３０．０７３５およびＳ−デスオキシ−５’−ヒドロキシ−アマニンアミド  ＨＤＰ  ３０．２５４８のｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞毒性
ＨＥＫ２９３およびＨＥＫ２９３  ＯＡＴＰ１Ｂ３細胞でのＢｒｄＵ細胞増殖アッセイ
ＨＥＫ２９３−ＯＡＴＰ１Ｂ３細胞培養プレートを、ポリ−Ｄ−リジンでコーティングした。
ポリ−Ｄ−リジンによるコーティング：
〇５０ミリリットルの滅菌水中、５ミリグラムのポリ  Ｄ−リジン
〇９６ウェルプレートの各ウェルに５０マイクロリットル
〇室温で、１時間のインキュベーション
〇ウェルを、２００マイクロリットルの滅菌水で２回洗浄する。
〇少なくとも２時間の乾燥（室温）
【０１９０】
２．０ｘ１０3のＨＥＫ２９３およびＨＥＫ２９３  ＯＡＴＰ１Ｂ３細胞／ウェルと、１０％ＦＣＳおよびサプリメントを含む、ウェルあたり９０マイクロリットルの増殖培地を含む、透明な底の黒い９６ウェルプレートを調製した。
対照：「ブランク」は、細胞なしの培地１００マイクロリットルで設定し、「背景」および「１００％」は、培地１００マイクロリットル中の細胞で設定した。
●３７℃、５％ＣＯ2で、２４時間のインキュベーション
【０１９１】
ＨＤＰ  ３０．０７３５、ＨＤＰ  ３０．２５４８およびα−アマニチンの希釈スキーム：
ストック原液を、培地で、１：１０００（１：１０および１：１００希釈）に希釈した：
１０マイクロリットルのアマニチン誘導体ストック溶液（１．０ｘ１０-2モル）＋９０マイクロリットルのＰＢＳ＝１００マイクロリットル  １．０ｘ１０-3モル
２マイクロリットルの希釈＋１９８マイクロリットルの培地＝２００マイクロリットル  １ｘ１０-5モル
さらなる希釈：
Ａ：２００マイクロリットル  １．０ｘ１０-5モル
Ｂ：増殖培地の８０マイクロリットル＋溶液Ａの２０マイクロリットル（１：５希釈）
Ｃ：増殖培地の８０マイクロリットル＋溶液Ｂの２０マイクロリットル（１：５希釈）
Ｄ：増殖培地の８０マイクロリットル＋溶液Ｃの２０マイクロリットル（１：５希釈）
Ｅ：増殖培地の８０マイクロリットル＋溶液Ｄの２０マイクロリットル（１：５希釈）
Ｆ：増殖培地の８０マイクロリットル＋溶液Ｅの２０マイクロリットル（１：５希釈）
Ｇ：増殖培地の８０マイクロリットル＋溶液Ｆの２０マイクロリットル（１：５希釈）
Ｈ：増殖培地の８０マイクロリットル＋溶液Ｇの２０マイクロリットル（１：５希釈）
【０１９２】
１０マイクロリットルの各溶液を、ウェル３個に加えた。
最終容量：１００マイクロリットル／ウェル
最終用量：１×１０-6モルで開始：１：５希釈系列。
●３７℃、５％ＣＯ2で９６時間のインキュベーション。
●９６時間後：ロシュ細胞増殖アッセイ、メーカーの指示に従って発光。
●ＥＣ50−濃度は、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４．０  データ分析ソフトウェアを使用して決定した。
【０１９３】
７．：ＨＤＰ  ３０．２３４７、ＨＤＰ  ２３７１および３０．２６０２複合体の合成
実施例：Ｔ−Ｄ２６５Ｃ−３０．２３７１の合成：
ＰＢＳ緩衝液中の、１０ミリグラムのチオマブ  Ｔ−Ｄ２６５Ｃは、ＨＤＰ  ３０．２３７１への結合のために使用された。
抗体溶液を、１ミリモルのＥＤＴＡに調整：
２ミリリットルの抗体溶液（１０．０ミリグラム）＋２０マイクロリットルの１００ミリモルのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０
抗体量：１０ミリグラム＝６．９ｘ１０-8モル
【０１９４】
抗体と４０当量のＴＣＥＰとの反応による、システインのアンキャッピング（Ｕｎｃａｐｐｉｎｇ）：
−２ミリリットルの抗体溶液（６．９ｘ１０-8モル）＋５５．２マイクロリットルの５０ミリモルのＴＣＥＰ溶液（２．７６×１０-6モル）
−シェーカー上、３７℃で、３時間インキュベート。
−スライド−Ａ−Ｌｙｚｅｒ透析カセット  ２００００  ＭＷＣＯで、２．０リットルの１×ＰＢＳ、１ミリモルのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４で、４℃にて２回の連続透析：最初の透析  約４時間、２回目の透析は一晩
【０１９５】
抗体と２０当量のデヒドロアスコルビン酸（ｄｈＡＡ）との反応による酸化：
−約２ミリリットルの抗体溶液（６．９ｘ１０-8モル）＋２７．６マイクロリットルの新しい５０ミリモルのｄｈＡＡ溶液（１．３８ｘ１０-6モル）
−シェーカーで、ＲＴで、３時間インキュベートする。
【０１９６】
６当量のＨＤＰ  ３０．２３７１を使用して、アマニチンとの結合、および２５当量のＮ−アセチル−Ｌ−システインでクエンチ：
２００マイクロリットルのＤＭＳＯに、２ミリグラムのＨＤＰ  ３０．２３７１を可溶化する＝１０マイクログラム／マイクロリットル
−約２ミリリットルの抗体溶液（＝９．５ミリグラム；６．５３ｘ１０-8モル）＋５２．１マイクロリットルのＨＤＰ  ３０．２３７１（＝５２０．８マイクログラム；３．９２ｘ１０-7モル）。
−ＲＴで、インキュベート、１時間。
−１６．３マイクロリットルの１００ミリモルのＮ−アセチル−Ｌ−システイン（１．６３×１０-6モル）の添加によってクエンチ。
−ＲＴで、１５分間インキュベート（または、一晩、４℃）。
−１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４で平衡化した、１ＸＰＤ−１０カラムを使って反応混合物を精製。
パラフィルム上のブラッドフォード試薬でタンパク質含有画分を特定し、タンパク質含有画分をまとめる。
−２．０リットルのＰＢＳ、ｐＨ７．４とスライド−Ａ−Ｌｙｚｅｒ透析セット  ２００  ００ＭＷＣＯで、４℃で、一晩、抗体溶液の透析。
【０１９７】
ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ分析によるＤＡＲの決定
タンパク質濃度を、５．０ミリグラム／ミリリットル（３．４ｘ１０-5モル）に調整し、ろ過により無菌状態にする。４℃で保管。
【０１９８】
異なる抗体または異なるアマニチン誘導体とのＡＤＣは、同様にして、製造した。
抗体の分子量は、それぞれの抗体の分子量に従って計算された。それに応じて、リンカー毒素、ＴＣＥＰ、ｄｈＡＡ、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインの量を調整して、それぞれの当量に到達させた。
【０１９９】
８．  ＨＤＰ  ３０．２３４７、ＨＤＰ  ２３７１および３０．２６０２コンジュゲー トのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性
ＳＫＢＲ−３、ＪＩＭＴ−１、ＬｎＣａｐ、および２２ｒｖ１細胞でのＢｒｄＵ細胞増殖アッセイ：
アッセイは、以下の変更を加えて、上記（６．）のように行った。
【０２００】
細胞培養プレートは、ポリ−Ｄ−リジンでコーティングしなかった。
●ＡＤＣの希釈スキーム：
●ストック溶液を、成長培地で、１．０ｘ１０-6モルに希釈した
さらなる希釈：
Ａ：１００マイクロリットル  １．０ｘ１０-6モル
Ｂ：８０マイクロリットルの増殖培地＋２０マイクロリットル  溶液Ａ（１：５希釈）
Ｃ：８０マイクロリットルの増殖培地＋２０マイクロリットル  溶液Ｂ（１：５希釈）
Ｄ：８０マイクロリットルの増殖培地＋２０マイクロリットル  溶液Ｃ（１：５希釈）
Ｅ：８０マイクロリットルの増殖培地＋２０マイクロリットル  溶液Ｄ（１：５希釈）
Ｆ：８０マイクロリットルの増殖培地＋２０マイクロリットル  溶液Ｅ（１：５希釈）
Ｇ：８０マイクロリットルの増殖培地＋２０マイクロリットル  溶液Ｆ（１：５希釈）
Ｈ：８０マイクロリットルの増殖培地＋２０マイクロリットル  溶液Ｇ（１：５希釈）
●各溶液１０マイクロリットルをウェル３個に加えた。
最終容量：１００マイクロリットル／ウェル。
最終用量：１×１０-7モルで開始；１：５希釈系列
Ｒａｊｉ細胞およびＮａｌｍ−６細胞についてのＷＳＴ−Ｉアッセイ：
●２．０ｘ１０3細胞／ウェルおよび１０％ＦＣＳおよびサプリメントを含むウェルあたり９０マイクロリットルの各増殖培地を含む、透明な、Ｆ底、９６ウェルプレートを調製した。
対照：「ブランク」は、細胞を含まない１００マイクロリットルの培地で設定した。
「細胞のみ」は、１００マイクロリットルの培地中の細胞で設定された。
●３７℃、５％ＣＯ2で２４時間のインキュベーション。
●ＡＤＣの希釈スキーム：
●ストック溶液を、増殖培地で１．０ｘ１０-6モルに希釈した
さらなる希釈：
Ａ：１００マイクロリットル  １．０ｘ１０-6モル
Ｂ：８０マイクロリットルの増殖培地＋２０マイクロリットルの溶液Ａ（１：５希釈）
Ｃ：８０マイクロリットルの増殖培地＋２０マイクロリットルの溶液Ｂ（１：５希釈）
Ｄ：８０マイクロリットルの増殖培地＋２０マイクロリットルの溶液Ｃ（１：５希釈）
Ｅ：８０マイクロリットルの増殖培地＋２０マイクロリットルの溶液Ｄ（１：５希釈）
Ｆ：８０マイクロリットルの増殖培地＋２０マイクロリットルの溶液Ｅ（１：５希釈）
Ｇ：８０マイクロリットルの増殖培地＋２０マイクロリットルの溶液Ｆ（１：５希釈）
Ｈ：８０マイクロリットルの増殖培地＋２０マイクロリットルの溶液Ｇ（１：５希釈）
●各溶液１０マイクロリットルをウェル３個に加えた。
最終容量：１００マイクロリットル／ウェル。
最終用量：１×１０-7モルで開始：１：５希釈系列
●３７℃、５％ＣＯ2で９６時間のインキュベーション。
●９６時間後：製造元の指示に従って、Ｒｏｃｈｅ  ＷＳＴ−１細胞増殖アッセイ。
●ＥＣ50−濃度は、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４．０データ分析ソフトウェアを使用して決定した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2020529452.tif 000049
【図１１】
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【図１２】
2020529452.tif 000051
【図１３Ａ】
2020529452.tif 000052
【図１３Ｂ】
2020529452.tif 000053
【図１３Ｃ】
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【国際調査報告】
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