(57)【要約】本開示は、特に、筋ジストロフィーを処置するための改善された組成物及び方法を提供する。例えば、本開示は、有効量のゴロディルセンを投与することによって、エクソン５３スキッピングに適しているＤＭＤ遺伝子の突然変異を有するデュシェンヌ型筋ジストロフィー患者を処置するための方法を提供する。本開示は、少なくとも部分的に、エクソン５３スキッピングアンチセンスオリゴヌクレオチドであるゴロディルセン（ｇｏｌｏｄｉｒｓｅｎ）による処置によって、患者のジストロフィンタンパク質がベースラインを超えて著しく増大されたことを示す臨床的証拠に基づく。
2020532504.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エクソン５３スキッピングに適しているＤＭＤ遺伝子の突然変異を有する、それを必要としている患者において、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を処置するための方法であって、ある用量のゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩を前記患者に投与することを含む方法。
【請求項２】
前記用量が前記患者の体重１ｋｇ当たり４ｍｇの投与量で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記用量が前記患者の体重１ｋｇ当たり１０ｍｇの投与量で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記用量が前記患者の体重１ｋｇ当たり２０ｍｇの投与量で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記用量が前記患者の体重１ｋｇ当たり３０ｍｇの投与量で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記用量が前記患者の体重１ｋｇ当たり４０ｍｇの投与量で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記用量が前記患者の体重１ｋｇ当たり５０ｍｇの投与量で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記用量が単一用量として投与される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記用量が週１回投与される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記用量が静脈内に投与される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記用量が点滴により静脈内に投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記用量が３５〜６０分間にわたって点滴により静脈内に投与される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記用量が皮下注射により静脈内に投与される、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
前記患者が４０歳までである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記患者が３０歳までである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記患者が２１歳までである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記患者が１歳〜２１歳である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記患者が５歳〜２１歳である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記患者が６歳〜１５歳である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記患者が、エクソン３〜５２、４〜５２、５〜５２、６〜５２、９〜５２、１０〜５２、１１〜５２、１３〜５２、１４〜５２、１５〜５２、１６〜５２、１７〜５２、１９〜５２、２１〜５２、２３〜５２、２４〜５２、２５〜５２、２６〜５２、２７〜５２、２８〜５２、２９〜５２、３０〜５２、３１〜５２、３２〜５２、３３〜５２、３４〜５２、３５〜５２、３６〜５２、３７〜５２、３８〜５２、３９〜５２、４０〜５２、４１〜５２、４３〜５２、４２〜５２、４５〜５２、４７〜５２、４８〜５２、４９〜５２、５０〜５２、５４〜５８、５４〜６１、５４〜６３、５４〜６４、５４〜６６、５４〜７６、５４〜７７、及びエクソン５２からなる群から選択されるＤＭＤ遺伝子の突然変異を有する、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記患者がゴロディルセンを慢性的に投与される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記患者が少なくとも４８週間ゴロディルセンを投与される、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記患者が１年を超えてゴロディルセンを投与される、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記患者が２年を超えてゴロディルセンを投与される、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記患者が３年を超えてゴロディルセンを投与される、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記患者が４年を超えてゴロディルセンを投与される、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記患者が５年を超えてゴロディルセンを投与される、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記患者が１０年を超えてゴロディルセンを投与される、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記患者が２０年を超えてゴロディルセンを投与される、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記患者が３０年を超えてゴロディルセンを投与される、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記患者が、ゴロディルセンの投与の前に少なくとも６か月間、副腎皮質ステロイドを安定して投与されている、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記患者が、ゴロディルセンの投与の前に少なくとも６か月間、副腎皮質ステロイドを安定して投与されており、ゴロディルセンの投与の間も副腎皮質ステロイドが続けられる、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
ゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩が医薬組成物として製剤化される、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
ゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩が医薬組成物として製剤化される、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
ゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩が、５０ｍｇ／ｍＬの濃度を有する医薬組成物として製剤化される、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
ゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩が５０ｍｇ／ｍＬの濃度を有する医薬組成物として製剤化され、１００ｍｇ／２ｍＬの剤形で提示される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
ゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩が５０ｍｇ／ｍＬの濃度を有しており、５００ｍｇ／２ｍＬの剤形で提示される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
前記剤形が使い捨てバイアル中に含有される、請求項３５又は３６に記載の方法。
【請求項３９】
ゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩が、ゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物として製剤化される、請求項３３〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記薬学的に許容される担体がリン酸緩衝溶液である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
エクソン５３スキッピングに適しているＤＭＤ遺伝子の突然変異を有する、それを必要としているデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）患者において、エクソンスキッピングを誘発するために、ｍＲＮＡリーディングフレームを回復させる方法であって、ある用量のゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩を前記患者に投与することを含む方法。
【請求項４２】
前記用量が前記患者の体重１ｋｇ当たり４ｍｇの投与量で投与される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記用量が前記患者の体重１ｋｇ当たり１０ｍｇの投与量で投与される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
前記用量が前記患者の体重１ｋｇ当たり２０ｍｇの投与量で投与される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
前記用量が前記患者の体重１ｋｇ当たり３０ｍｇの投与量で投与される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
前記用量が前記患者の体重１ｋｇ当たり４０ｍｇの投与量で投与される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４７】
前記用量が前記患者の体重１ｋｇ当たり５０ｍｇの投与量で投与される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４８】
前記用量が単一用量として投与される、請求項４０〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記用量が週１回投与される、請求項４０〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記用量が静脈内に投与される、請求項４０〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記用量が点滴により静脈内に投与される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記用量が３５〜６０分間にわたって点滴により静脈内に投与される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記用量が皮下注射により静脈内に投与される、請求項４７に記載の方法。
【請求項５４】
前記患者が４０歳までである、請求項１〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記患者が３０歳までである、請求項１〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記患者が２１歳までである、請求項１〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記患者が１歳〜２１歳である、請求項１〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記患者が５歳〜２１歳である、請求項１〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記患者が６歳〜１５歳である、請求項１〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記患者が、エクソン３〜５２、４〜５２、５〜５２、６〜５２、９〜５２、１０〜５２、１１〜５２、１３〜５２、１４〜５２、１５〜５２、１６〜５２、１７〜５２、１９〜５２、２１〜５２、２３〜５２、２４〜５２、２５〜５２、２６〜５２、２７〜５２、２８〜５２、２９〜５２、３０〜５２、３１〜５２、３２〜５２、３３〜５２、３４〜５２、３５〜５２、３６〜５２、３７〜５２、３８〜５２、３９〜５２、４０〜５２、４１〜５２、４３〜５２、４２〜５２、４５〜５２、４７〜５２、４８〜５２、４９〜５２、５０〜５２、５４〜５８、５４〜６１、５４〜６３、５４〜６４、５４〜６６、５４〜７６、５４〜７７、及びエクソン５２からなる群から選択されるＤＭＤ遺伝子の突然変異を有する、請求項１〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記患者がゴロディルセンを慢性的に投与される、請求項１〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記患者が少なくとも４８週間ゴロディルセンを投与される、請求項１〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記患者が１年を超えてゴロディルセンを投与される、請求項１〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記患者が２年を超えてゴロディルセンを投与される、請求項１〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記患者が３年を超えてゴロディルセンを投与される、請求項１〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記患者が４年を超えてゴロディルセンを投与される、請求項１〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記患者が５年を超えてゴロディルセンを投与される、請求項１〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記患者が１０年を超えてゴロディルセンを投与される、請求項１〜６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記患者が２０年を超えてゴロディルセンを投与される、請求項１〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記患者が３０年を超えてゴロディルセンを投与される、請求項１〜６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
前記患者が、ゴロディルセンの投与の前に少なくとも６か月間、副腎皮質ステロイドを安定して投与されている、請求項１〜７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記患者が、ゴロディルセンの投与の前に少なくとも６か月間、副腎皮質ステロイドを安定して投与されており、ゴロディルセンの投与の間も副腎皮質ステロイドが続けられる、請求項１〜７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
ゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩が医薬組成物として製剤化される、請求項１〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
ゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩が医薬組成物として製剤化される、請求項１〜７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
ゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩が、５０ｍｇ／ｍＬの濃度を有する医薬組成物として製剤化される、請求項１〜７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
ゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩が５０ｍｇ／ｍＬの濃度を有する医薬組成物として製剤化され、１００ｍｇ／２ｍＬの剤形で提示される、請求項７２に記載の方法。
【請求項７７】
ゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩が５０ｍｇ／ｍＬの濃度を有しており、５００ｍｇ／２ｍＬの剤形で提示される、請求項７２に記載の方法。
【請求項７８】
前記剤形が使い捨てバイアル中に含有される、請求項７４又は７５に記載の方法。
【請求項７９】
ゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩が、ゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物として製剤化される、請求項７２〜７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
前記薬学的に許容される担体がリン酸緩衝溶液である、請求項７７に記載の方法。
【請求項８１】
エクソンスキッピングが逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって測定される、請求項４０〜７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
前記方法が、前記患者のジストロフィン産生を増大させる、請求項１〜７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
前記ジストロフィン産生がウエスタンブロット分析によって測定される、請求項８０に記載の方法。
【請求項８４】
前記ジストロフィン産生が免疫組織化学（ＩＨＣ）によって測定される、請求項８０に記載の方法。
【請求項８５】
エクソン５３スキッピングに適しているＤＭＤ遺伝子の突然変異を有する、それを必要としているデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）患者において、ジストロフィン産生を増大させるための方法であって、ある用量のゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩を前記患者に投与することを含む方法。
【請求項８６】
前記用量が体重１ｋｇ当たり４ｍｇの投与量で投与される、請求項８０に記載の方法。
【請求項８７】
前記用量が前記患者の体重１ｋｇ当たり１０ｍｇの投与量で投与される、請求項８０に記載の方法。
【請求項８８】
前記用量が前記患者の体重１ｋｇ当たり２０ｍｇの投与量で投与される、請求項８０に記載の方法。
【請求項８９】
前記用量が前記患者の体重１ｋｇ当たり３０ｍｇの投与量で投与される、請求項８０に記載の方法。
【請求項９０】
前記用量が前記患者の体重１ｋｇ当たり４０ｍｇの投与量で投与される、請求項８０に記載の方法。
【請求項９１】
前記用量が前記患者の体重１ｋｇ当たり５０ｍｇの投与量で投与される、請求項８０に記載の方法。
【請求項９２】
前記用量が単一用量として投与される、請求項８０〜８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９３】
前記用量が週１回投与される、請求項８０〜８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９４】
前記用量が静脈内に投与される、請求項８０〜８８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
前記用量が点滴により静脈内に投与される、請求項８９に記載の方法。
【請求項９６】
前記用量が３５〜６０分間にわたって点滴により静脈内に投与される、請求項９０に記載の方法。
【請求項９７】
前記用量が皮下注射により静脈内に投与される、請求項８９に記載の方法。
【請求項９８】
前記患者が４０歳までである、請求項１〜９７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９９】
前記患者が３０歳までである、請求項１〜９８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１００】
前記患者が２１歳までである、請求項１〜９９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０１】
前記患者が１歳〜２１歳である、請求項１〜１００のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０２】
前記患者が５歳〜２１歳である、請求項１〜１０１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０３】
前記患者が６歳〜１５歳である、請求項１〜１０２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０４】
前記患者が、エクソン３〜５２、４〜５２、５〜５２、６〜５２、９〜５２、１０〜５２、１１〜５２、１３〜５２、１４〜５２、１５〜５２、１６〜５２、１７〜５２、１９〜５２、２１〜５２、２３〜５２、２４〜５２、２５〜５２、２６〜５２、２７〜５２、２８〜５２、２９〜５２、３０〜５２、３１〜５２、３２〜５２、３３〜５２、３４〜５２、３５〜５２、３６〜５２、３７〜５２、３８〜５２、３９〜５２、４０〜５２、４１〜５２、４３〜５２、４２〜５２、４５〜５２、４７〜５２、４８〜５２、４９〜５２、５０〜５２、５４〜５８、５４〜６１、５４〜６３、５４〜６４、５４〜６６、５４〜７６、５４〜７７、及びエクソン５２からなる群から選択されるＤＭＤ遺伝子の突然変異を有する、請求項１〜１０３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０５】
前記患者がゴロディルセンを慢性的に投与される、請求項１〜１０４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０６】
前記患者が少なくとも４８週間ゴロディルセンを投与される、請求項１〜１０５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０７】
前記患者が１年を超えてゴロディルセンを投与される、請求項１〜１０６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０８】
前記患者が２年を超えてゴロディルセンを投与される、請求項１〜１０７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０９】
前記患者が３年を超えてゴロディルセンを投与される、請求項１〜１０８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１０】
前記患者が４年を超えてゴロディルセンを投与される、請求項１〜１０９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１１】
前記患者が５年を超えてゴロディルセンを投与される、請求項１〜１１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１２】
前記患者が１０年を超えてゴロディルセンを投与される、請求項１〜１１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１３】
前記患者が２０年を超えてゴロディルセンを投与される、請求項１〜１１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１４】
前記患者が３０年を超えてゴロディルセンを投与される、請求項１〜１１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１５】
前記患者が、ゴロディルセンの投与の前に少なくとも６か月間、副腎皮質ステロイドを安定して投与されている、請求項１〜１１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１６】
前記患者が、ゴロディルセンの投与の前に少なくとも６か月間、副腎皮質ステロイドを安定して投与されており、ゴロディルセンの投与の間も副腎皮質ステロイドが続けられる、請求項１〜１１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１７】
ゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩が医薬組成物として製剤化される、請求項１〜１１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１８】
ゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩が医薬組成物として製剤化される、請求項１〜１１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１９】
ゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩が、５０ｍｇ／ｍＬの濃度を有する医薬組成物として製剤化される、請求項１〜１１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２０】
ゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩が５０ｍｇ／ｍＬの濃度を有する医薬組成物として製剤化され、１００ｍｇ／２ｍＬの剤形で提示される、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１２１】
ゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩が５０ｍｇ／ｍＬの濃度を有しており、５００ｍｇ／２ｍＬの剤形で提示される、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１２２】
前記剤形が使い捨てバイアル中に含有される、請求項１１２又は１１３に記載の方法。
【請求項１２３】
ゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩が、ゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物として製剤化される、請求項１１１〜１１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２４】
前記薬学的に許容される担体がリン酸緩衝溶液である、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２５】
前記ジストロフィン産生がウエスタンブロット分析によって測定される、請求項８０〜１１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２６】
前記ジストロフィン産生が免疫組織化学（ＩＨＣ）によって測定される、請求項８０〜１１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２７】
ゴロディルセンを投与する前に、前記患者がエクソン５３スキッピングに適しているＤＭＤ遺伝子の突然変異を有することを確認することをさらに含む、請求項１〜１２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２８】
それを必要としている患者において、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の処置に使用するためのゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩であって、前記患者が、エクソン５３スキッピングに適しているＤＭＤ遺伝子の突然変異を有し、前記処置が、３０ｍｇ／ｋｇの単回静脈内用量のエテプリルセンを前記患者に週１回投与することを含む、ゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩。
【請求項１２９】
それを必要としているデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）患者において、ｍＲＮＡリーディングフレームを回復させてエクソンスキッピングを誘発するのに使用するためのゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩であって、前記患者が、エクソン５３スキッピングに適しているＤＭＤ遺伝子の突然変異を有し、前記処置が、３０ｍｇ／ｋｇの単回静脈内用量のエテプリルセンを前記患者に週１回投与することを含む、ゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩。
【請求項１３０】
それを必要としているデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）患者において、ジストロフィン産生を増大させるのに使用するためのゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩であって、前記患者が、エクソン５３スキッピングに適しているＤＭＤ遺伝子の突然変異を有し、前記処置が、３０ｍｇ／ｋｇの単回静脈内用量のエテプリルセンを前記患者に週１回投与することを含む、ゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、患者の筋ジストロフィーを処置するための改善された方法に関する。また、ヒトジストロフィン遺伝子におけるエクソン５３スキッピングを促進するのに適した組成物も提供する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
様々な遺伝性疾患において、遺伝子の最終的な発現に対する突然変異の効果は、スプライシングプロセスの間に標的エクソンのスキッピングプロセスを介して調節することができる。正常機能性タンパク質がその中の突然変異のために早期に終結する場合、アンチセンス技術によっていくつかの機能性タンパク質の産生を回復させるための手段が、スプライシングプロセスの間の介入によって可能であることが示されており、そして疾患を引き起こす突然変異に関連するエクソンをいくつかの遺伝子から特異的に欠失させることができれば、天然タンパク質と同様の生物学的特性を有するか、又はエクソンに関連する突然変異によって引き起こされる疾患を改善するのに十分な生物活性を有する短縮タンパク質産物が時折産生され得る（例えば、Ｓｉｅｒａｋｏｗｓｋａ，Ｓａｍｂａｄｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９６；Ｗｉｌｔｏｎ，Ｌｌｏｙｄ  ｅｔ  ａｌ．１９９９；ｖａｎ  Ｄｅｕｔｅｋｏｍ，Ｂｒｅｍｍｅｒ−Ｂｏｕｔ  ｅｔ  ａｌ．２００１；Ｌｕ，Ｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．２００３；Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓ，Ｊａｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２００４を参照）。
【０００３】
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、タンパク質ジストロフィンの発現の欠陥によって引き起こされる。ジストロフィンは棒状の細胞質タンパク質であり、細胞膜を介して筋線維の細胞骨格と周囲の細胞外マトリックスとを接続するタンパク質複合体の極めて重要な部分である。ジストロフィンは筋線維内で重要な構造的役割を果たし、細胞外マトリックス及び細胞骨格を接続する。Ｎ末端領域はアクチンに結合するが、Ｃ末端はジストロフィン糖タンパク質複合体（ＤＧＣ）の一部であり、筋細胞膜に及ぶ。ｍｄｘマウスのジストロフィン欠損筋線維は、収縮で誘発される筋細胞膜破裂に対して増大された感受性を提示することが示されている（Ｐｅｔｒｏｆ  ｅｔ  ａｌ．１９９３；Ｃｉｒａｋ  ｅｔ  ａｌ．２０１２を参照）。
【０００４】
上記タンパク質をコードする遺伝子は、ＤＮＡの２百万を超えるヌクレオチドにわたって広がる７９のエクソンを含有する。エクソンのリーディングフレームを変化させるか、或いは終止コドンを導入するか、或いは全アウトオブフレームエクソンの除去、又は１つ若しくは複数のエクソンの重複を特徴とする、任意のエクソン突然変異は、機能性ジストロフィンの産生を妨害して、ＤＭＤをもたらす可能性を有する。
【０００５】
疾患発症は、出生時にクレアチンキナーゼレベルの上昇で実証することができ、生後１年以内に著しい運動障害がみられる可能性がある。７歳又は８歳までに、ほとんどのＤＭＤ患者は歩行が次第に困難になり、床から立ち上がる、及び階段を上る能力を失っていき、１０歳〜１４歳までに大多数は車椅子に依存する。ＤＭＤは一律に致死的であり、罹患者は、通常、１０代後半又は２０代前半に呼吸不全及び／又は心不全が原因で死亡する。ＤＭＤの連続的な進行は疾患の全ての段階で治療的介入を可能にするが、処置は現在のところグルココルチコイドに限られており、これは、体重増加、行動変化、思春期変化、骨粗鬆症、クッシング様顔貌、成長阻害、及び白内障を含む多数の副作用に関連する。結果的に、この疾患の根本原因を処置するためのより良好な治療法を開発することが不可欠である。
【０００６】
筋ジストロフィーのより低重症度の形態であるベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）は、突然変異、通常は１つ又は複数のエクソンの欠失が、全ジストロフィン転写物に沿って正しいリーディングフレームをもたらし、その結果、ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳が早期に終結しない場合に起こることが分かっている。突然変異したジストロフィンプレｍＲＮＡのプロセシングにおける上流及び下流のエクソンの連結によって遺伝子の正しいリーディングフレームが維持されれば、その結果は、いくらかの活性を保持する短い内部欠失を有するタンパク質をコードするｍＲＮＡであり、ベッカー表現型が生じる。
【０００７】
長年、ジストロフィンタンパク質のリーディングフレームを変化させないエクソンの欠失はＢＭＤ表現型を引き起こし得るが、フレームシフトを生じるエクソン欠失はＤＭＤを引き起こし得ることが知られている（Ｍｏｎａｃｏ，Ｂｅｒｔｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９８８）。一般に、リーディングフレームを変化させ、したがって適切なタンパク質翻訳を妨害する点突然変異及びエクソン欠失を含むジストロフィン突然変異は、ＤＭＤをもたらす。また、一部のＢＭＤ及びＤＭＤ患者が、複数のエクソンをカバーするエクソン欠失を有することにも注意すべきである。
【０００８】
ＤＭＤの処置のためのスプライススイッチングオリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）の安全性及び効力を試験する最近の臨床治験は、スプライソソームの立体的遮断によってプレｍＲＮＡの選択的スプライシングを誘発するためのＳＳＯ技術に基づいている（Ｃｉｒａｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｇｏｅｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｋｉｎａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；ｖａｎ  Ｄｅｕｔｅｋｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。しかしながら、これらの成功にもかかわらず、ＤＭＤの処置に利用可能な薬理学的な選択肢は限られている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、患者においてジストロフィンを産生するため、並びにＤＭＤ及びＢＭＤなどの筋ジストロフィーを処置するために、改善された組成物及び方法が依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の要旨
本開示は、少なくとも部分的に、エクソン５３スキッピングアンチセンスオリゴヌクレオチドであるゴロディルセン（ｇｏｌｏｄｉｒｓｅｎ）による処置によって、患者のジストロフィンタンパク質がベースラインを超えて著しく増大されたことを示す臨床的証拠に基づく。さらに、エクソンスキッピングと、新規のジストロフィンタンパク質との間の正の相関関係が観察された。
【００１１】
したがって、いくつかの態様では、本開示は、エクソン５３スキッピングに適しているＤＭＤ遺伝子の突然変異を有する、それを必要としている患者において、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を処置するための方法であって、ある用量のゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩を患者に投与することを含む方法を提供する。
【００１２】
いくつかの態様では、本開示は、エクソン５３スキッピングに適しているＤＭＤ遺伝子の突然変異を有する、それを必要としているデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）患者において、ｍＲＮＡリーディングフレームを回復させてエクソンスキッピングを誘発するための方法であって、ある用量のゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩を患者に投与することを含む方法を提供する。
【００１３】
いくつかの態様では、本開示は、エクソン５３スキッピングに適しているＤＭＤ遺伝子の突然変異を有する、それを必要としているデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）患者において、ジストロフィン産生を増大させるための方法であって、ある用量のゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩を患者に投与することを含む方法を提供する。
【００１４】
いくつかの態様では、用量は、患者の体重当たり、４ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、又は５０ｍｇ／ｋｇの投与量で投与される。
【００１５】
いくつかの態様では、用量は単一用量として投与される。いくつかの態様では、用量は週１回投与される。いくつかの態様では、用量は静脈内に投与される。いくつかの態様では、用量は点滴により静脈内に投与される。いくつかの態様では、用量は３５〜６０分間にわたって点滴により静脈内に投与される。いくつかの態様では、用量は皮下注射により静脈内に投与される。
【００１６】
いくつかの態様では、患者は４０歳まで、３０歳まで、又は２１歳までである。いくつかの態様では、患者は１歳〜２１歳である。いくつかの態様では、患者は５歳〜２１歳である。いくつかの態様では、患者は６歳〜１５歳である。
【００１７】
いくつかの態様では、本開示は前述又は関連の態様のいずれかに従う方法を提供し、ここで、患者は、エクソン３〜５２、４〜５２、５〜５２、６〜５２、９〜５２、１０〜５２、１１〜５２、１３〜５２、１４〜５２、１５〜５２、１６〜５２、１７〜５２、１９〜５２、２１〜５２、２３〜５２、２４〜５２、２５〜５２、２６〜５２、２７〜５２、２８〜５２、２９〜５２、３０〜５２、３１〜５２、３２〜５２、３３〜５２、３４〜５２、３５〜５２、３６〜５２、３７〜５２、３８〜５２、３９〜５２、４０〜５２、４１〜５２、４３〜５２、４２〜５２、４５〜５２、４７〜５２、４８〜５２、４９〜５２、５０〜５２、５４〜５８、５４〜６１、５４〜６３、５４〜６４、５４〜６６、５４〜７６、５４〜７７、及びエクソン５２を含む群から選択されるＤＭＤ遺伝子の突然変異を有する。
【００１８】
いくつかの態様では、本開示は前述又は関連の態様のいずれかに従う方法を提供し、ここで、患者は、ゴロディルセンを慢性的に投与される。いくつかの態様では、患者は、少なくとも４８週間ゴロディルセンを投与される、いくつかの態様では、患者は、１年を超えて、２年を超えて、３年を超えて、４年を超えて、５年を超えて、１０年を超えて、２０年を超えて、又は３０年を超えてゴロディルセンを投与される。
【００１９】
いくつかの態様では、本開示は前述又は関連の態様のいずれかに従う方法を提供し、ここで、患者は、ゴロディルセンの投与の前に少なくとも６か月間、副腎皮質ステロイドを安定して投与されている。いくつかの態様では、患者は、ゴロディルセンの投与の前に少なくとも６か月間、副腎皮質ステロイドを安定して投与されており、ゴロディルセンの投与の間も副腎皮質ステロイドが続けられる。
【００２０】
いくつかの態様では、本開示は前述又は関連の態様のいずれかに従う方法を提供し、ここで、ゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩は医薬組成物として製剤化される。いくつかの態様では、ゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩は、５０ｍｇ／ｍＬの濃度を有する医薬組成物として製剤化される。いくつかの態様では、ゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩は５０ｍｇ／ｍＬの濃度を有する医薬組成物として製剤化され、１００ｍｇ／２ｍＬの剤形で提示される。いくつかの態様では、ゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩は５０ｍｇ／ｍＬの濃度を有する医薬組成物として製剤化され、５００ｍｇ／２ｍＬの剤形で提示される。いくつかの態様では、剤形は使い捨てバイアル中に含有される。
【００２１】
いくつかの態様では、ゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩は、ゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物として製剤化される。いくつかの態様では、薬学的に許容される担体はリン酸緩衝溶液である。
【００２２】
いくつかの態様では、本開示は前述又は関連の態様のいずれかに従う方法を提供し、ここで、エクソンスキッピングは、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって測定される。
【００２３】
いくつかの態様では、本開示は前述又は関連の態様のいずれかに従う方法を提供し、本方法は、患者のジストロフィン産生を増大させる。いくつかの態様では、ジストロフィン産生は、ウエスタンブロット分析によって測定される。いくつかの態様では、ジストロフィン産生は、免疫組織化学（ＩＨＣ）によって測定される。
【００２４】
いくつかの態様では、本開示は前述又は関連の態様のいずれかに従う方法を提供し、本方法は、ゴロディルセンを投与する前に、患者がエクソン５３スキッピングに適しているＤＭＤ遺伝子の突然変異を有することを確認することをさらに含む。
【００２５】
いくつかの態様では、本開示は、それを必要としている患者において、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の処置に使用するためのゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩を提供し、患者は、エクソン５３スキッピングに適しているＤＭＤ遺伝子の突然変異を有し、ここで、処置は、３０ｍｇ／ｋｇの単回静脈内用量のエテプリルセンを患者に週１回投与することを含む。
【００２６】
いくつかの態様では、本開示は、それを必要としているデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）患者において、ｍＲＮＡリーディングフレームを回復させてエクソンスキッピングを誘発するのに使用するためのゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩を提供し、患者は、エクソン５３スキッピングに適しているＤＭＤ遺伝子の突然変異を有し、ここで、処置は、３０ｍｇ／ｋｇの単回静脈内用量のエテプリルセンを患者に週１回投与することを含む。
【００２７】
いくつかの態様では、本開示は、それを必要としているデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）患者において、ジストロフィン産生を増大させるのに使用するためのゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩を提供し、患者は、エクソン５３スキッピングに適しているＤＭＤ遺伝子の突然変異を有し、ここで、処置は、３０ｍｇ／ｋｇの単回静脈内用量のエテプリルセンを患者に週１回投与することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】ＤＭＤ患者の試験設計におけるＳＲＰ−４０５３の第Ｉ／ＩＩ相試験のフローチャートの概要である。
【図２】上記試験の２５人の患者のそれぞれについて、ＲＴ−ＰＣＲデータ（ベースライン及びＳＲＰ−４０５３処置の４８週間後）を示す。
【図３】上記試験の２５人の患者のそれぞれについて、ウエスタンブロットデータ（ベースライン及びＳＲＰ−４０５３処置の４８週間後）を示す。
【図４Ａ】全筋線維を示すためにラミニンについて染色された、ベースライン及びオントリートメント（ｏｎ−ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）における単一の患者（実施例１）からの筋生検の蛍光免疫染色を示す。
【図４Ｂ】ジストロフィンについて染色された、図４Ａからの筋生検のセクション（１〜３）の蛍光免疫染色を示す。
【図５Ａ】全筋線維を示すためにラミニンについて染色された、ベースライン及びオントリートメントにおける単一の患者（実施例２）からの筋生検の蛍光免疫染色を示す。
【図５Ｂ】ジストロフィンについて染色された、図５Ａからの筋生検のセクション（１〜３）の蛍光免疫染色を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
詳細な説明
本開示の実施形態は、ヒトジストロフィン遺伝子においてエクソン５３スキッピングを誘発するように特別に設計されたアンチセンスオリゴヌクレオチドであるゴロディルセンを投与することによって、ＤＭＤなどの筋ジストロフィーを処置するための方法に関する。ジストロフィンは筋機能において極めて重要な役割を果たし、種々の筋肉関連疾患は、この遺伝子の突然変異型を特徴とする。したがって、特定の実施形態では、本明細書に記載される方法は、ＤＭＤにおいて見出される突然変異したジストロフィン遺伝子などの突然変異型ヒトジストロフィン遺伝子においてエクソン５３スキッピングを誘発するために使用され得る。
【００３０】
したがって、本開示は、患者においてエクソン５３スキッピングを誘発することによって、ＤＭＤなどの筋ジストロフィーを処置するための方法に関する。さらに、本開示は、ＤＭＤ患者においてｍＲＮＡリーディングフレームを回復させてエクソンスキッピングを誘発するための方法に関する。また本開示は、ＤＭＤ患者においてジストロフィン産生を増大させるための方法にも関する。
【００３１】
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本発明の実施又は試験において本明細書に記載されるものと同様又は同等の任意の方法及び材料を使用することができるが、好ましい方法及び材料が記載される。本発明の目的のために、次の用語は以下で定義される。
【００３２】
Ｉ．定義
「約」とは、基準の数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量又は長さに対して３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１％ほど変動する、数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量又は長さを意味する。
【００３３】
対象又は患者に関して本明細書で使用される「エクソン５３スキッピングに適している」は、ジストロフィン遺伝子のエクソン５３のスキッピングがなければリーディングフレームのフレームがずれ、それによりプレｍＲＮＡの翻訳が妨害され、対象又は患者がジストロフィンを産生することができなくなる、ジストロフィン遺伝子の１つ又は複数の突然変異を有する対象及び患者を含むことが意図される。ジストロフィン遺伝子の以下のエクソンの突然変異の非限定的な例はエクソン５３スキッピングに適しており、例えば、エクソン３〜５２、４〜５２、５〜５２、６〜５２、９〜５２、１０〜５２、１１〜５２、１３〜５２、１４〜５２、１５〜５２、１６〜５２、１７〜５２、１９〜５２、２１〜５２、２３〜５２、２４〜５２、２５〜５２、２６〜５２、２７〜５２、２８〜５２、２９〜５２、３０〜５２、３１〜５２、３２〜５２、３３〜５２、３４〜５２、３５〜５２、３６〜５２、３７〜５２、３８〜５２、３９〜５２、４０〜５２、４１〜５２、４３〜５２、４２〜５２、４５〜５２、４７〜５２、４８〜５２、４９〜５２、５０〜５２、５４〜５８、５４〜６１、５４〜６３、５４〜６４、５４〜６６、５４〜７６、５４〜７７、又はエクソン５２の欠失が含まれる。エクソンスキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の突然変異を患者が有するかどうかの決定は、十分に当業者の範囲内である（例えば、Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｈｕｍ  Ｍｕｔａｔ．３０：２９３−２９９、Ｇｕｒｖｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｍｕｔａｔ．２００９；３０（４）６３３−６４０、及びＦｌｅｔｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １８（６）１２１８−１２２３を参照）。
【００３４】
「アンチセンスオリゴマー」及び「アンチセンス化合物」及び「アンチセンスオリゴヌクレオチド」及び「オリゴマー」及び「オリゴヌクレオチド」という用語は本開示では互換的に使用され、サブユニット間結合によって連結された一連の環状サブユニットを指し、各環状サブユニットは、（ｉ）リボース糖又はその誘導体と、（ｉｉ）塩基対形成部分の順序がワトソン・クリック塩基対合によって核酸（通常、ＲＮＡ）内の標的配列に相補的な塩基配列を形成して、標的配列内に核酸：オリゴマーヘテロ二本鎖を形成するように、それに結合した塩基対形成部分とからなる。特定の実施形態では、オリゴマーはＰＭＯである。他の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルホスホロチオアートである。他の実施形態では、本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、又は２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）などの架橋核酸（ＢＮＡ）である。
【００３５】
「相補的」及び「相補性」という用語は、ワトソン・クリック塩基対形成の法則によって互いに関連する２つ以上のオリゴマー（すなわち、それぞれが核酸塩基配列を含む）を指す。例えば、核酸塩基配列「Ｔ−Ｇ−Ａ（５’→３’）」は、核酸塩基配列「Ａ−Ｃ−Ｔ（３’→５’）」に対して相補的である。相補性は「部分的」でもよく、この場合、所与の核酸塩基配列の全部よりも少ない核酸塩基が塩基対合の規則にしたがって他の核酸塩基配列とマッチする。例えば、いくつかの実施形態では、所与の核酸塩基配列と他の核酸塩基配列との間の相補性は、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％又は約９５％であり得る。或いは、例を続けるために、所与の核酸塩基配列と他の核酸塩基配列との間に、「完全」又は「完璧」な（１００％の）相補性が存在してもよい。核酸塩基配列間の相補性の度合いは、配列間のハイブリダイゼーションの効率及び強度に対して著しい効果を有する。
【００３６】
「ジストロフィン」は棒状の細胞質タンパク質であり、細胞膜を介して筋線維の細胞骨格と周囲の細胞外マトリックスとを接続するタンパク質複合体の極めて重要な部分である。ジストロフィンは複数の機能ドメインを含有する。例えば、ジストロフィンは、アミノ酸１４〜２４０付近にアクチン結合ドメインを含有し、アミノ酸２５３〜３０４０付近に中央ロッドドメインを含有する。この大きい中央ドメインは、約１０９のアミノ酸の２４のスペクトリン様三重らせんエレメントによって形成され、これは、アルファ−アクチニン及びスペクトリンとの相同性を有する。リピートは、通常、ヒンジ領域とも呼ばれる４つのプロリンに富んだ非リピートセグメントによって中断される。リピート１５及び１６は、ジストロフィンのタンパク質分解性切断のための主要部位を提供すると思われる１８アミノ酸のストレッチによって分離されている。大部分のリピート間の配列同一性は、１０〜２５％の範囲である。１つのリピートは、３つのアルファ−ヘリックス：１、２及び３を含有する。アルファ−ヘリックス１及び３はそれぞれ７つのヘリックスターンによって形成され、恐らく、疎水性界面を介してコイルドコイルとして相互作用する。アルファ−ヘリックス２はより複雑な構造を有し、グリシン又はプロリン残基により分離された４つ及び３つのヘリックスターンのセグメントによって形成される。各リピートは、通常アルファ−ヘリックス２の最初の部分におけるアミノ酸４７と４８との間のイントロンにより中断された２つのエクソンによってコードされる。他のイントロンは、リピート内の異なる位置において見出され、通常、ヘリックス−３にわたって点在する。またジストロフィンは、ほぼアミノ酸３０８０〜３３６０に、粘菌（ディクチオステリウム・ディスコイデウム（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ  ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ））アルファ−アクチニンのＣ末端ドメインとの相同性を示す、システインに富んだセグメント（すなわち、２８０のアミノ酸中の１５のシステイン）を含む、システインに富んだドメインも含有する。カルボキシ末端ドメインは、ほぼアミノ酸３３６１〜３６８５にある。
【００３７】
ジストロフィンのアミノ末端はＦ−アクチンに結合し、カルボキシ末端は筋細胞膜においてジストロフィン関連タンパク質複合体（ＤＡＰＣ）に結合する。ＤＡＰＣは、ジストログリカン、サルコグリカン、インテグリン及びカベオリンを含み、これらの成分のいずれかにおける突然変異は、常染色体によって遺伝する筋ジストロフィーを引き起こす。ジストロフィンが存在しないときにＤＡＰＣは不安定化しており、これは、メンバータンパク質のレベルの減少をもたらし、次には、進行性の線維損傷及び膜漏出を引き起こす。デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）及びベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）などの筋ジストロフィーの種々の形態において、筋細胞は、主として、不正確なスプライシングをもたらす遺伝子配列の突然変異のために、変化した機能的に欠陥のある形態のジストロフィンを産生するか、又はジストロフィンを全く産生しない。欠陥のあるジストロフィンタンパク質の優勢な発現、又はジストロフィン若しくはジストロフィン様タンパク質の完全な欠乏は、上記のように、筋変性の急速な進行をもたらす。これに関して、「欠陥のある」ジストロフィンタンパク質は、当該技術分野において知られているようにＤＭＤ又はＢＭＤを有する特定の対象において産生されるジストロフィンの形態によって、又は検出可能なジストロフィンが存在しないことによって特徴付けることができる。
【００３８】
「エクソン」は、タンパク質をコードする画定されたセクション、又はプレプロセシングされた（ｐｒｅ−ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ）（又は前駆体）ＲＮＡのいずれかの部分がスプライシングによって除去された後に成熟形態のＲＮＡ分子において表される核酸配列を指す。成熟ＲＮＡ分子は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、又はｒＲＮＡ又はｔＲＮＡなどの非コードＲＮＡの機能形態であり得る。ヒトジストロフィン遺伝子は、約７９のエクソンを有する。
【００３９】
「イントロン」は、タンパク質に翻訳されない核酸領域（遺伝子内）を指す。イントロンは、前駆体ｍＲＮＡ（プレｍＲＮＡ）に翻訳され、続いて成熟ＲＮＡの形成の間にスプライシングにより除去される非コードセクションである。
【００４０】
「有効量」又は「治療的に有効な量」は、単一用量として、又は一連の用量の一部として哺乳類対象に投与され、所望の治療効果を生じさせるのに有効なアンチセンスオリゴマー（例えば、ゴロディルセンを含む）などの治療化合物の量を指す。アンチセンスオリゴマーの場合、この効果は、選択された標的配列の翻訳又は天然のスプライス−プロセシングの阻害、又はエクソンスキッピングにより、ジストロフィンの産生を増大させることによってもたらすことができる。
【００４１】
いくつかの実施形態では、有効量は、対象を処置するためにある期間にわたって少なくとも約４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１０ｍｇ／ｋｇ又は少なくとも２０ｍｇ／ｋｇのアンチセンスオリゴマー又はアンチセンスオリゴマーを含む組成物である。いくつかの実施形態では、対象においてジストロフィン陽性線維の数を増大させるために、有効量は、少なくとも約４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１０ｍｇ／ｋｇ又は少なくとも２０ｍｇ／ｋｇのアンチセンスオリゴマー又はアンチセンスオリゴマーを含む組成物である。種々の実施形態では、有効量は、少なくとも約４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１０ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、又は約３０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、有効量は約３０ｍｇ／ｋｇ又は約５０ｍｇ／ｋｇである。
【００４２】
種々の実施形態では、対象におけるジストロフィンの産生を増大させるために、有効量は、少なくとも約４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１０ｍｇ／ｋｇ又は少なくとも２０ｍｇ／ｋｇのアンチセンスオリゴマー又はアンチセンスオリゴマーを含む組成物である。種々の実施形態では、有効量は、少なくとも約４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１０ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、又は約３０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、有効量は約３０ｍｇ／ｋｇ又は約５０ｍｇ／ｋｇである。
【００４３】
特定の実施形態では、例えば６ＭＷＴにおける患者の歩行距離を、健康な同等者に対して２０％の欠乏から安定化、維持又は改善させるために、有効量は、少なくとも約４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１０ｍｇ／ｋｇ又は少なくとも２０ｍｇ／ｋｇのアンチセンスオリゴマー又はアンチセンスオリゴマーを含む組成物である。種々の実施形態では、有効量は、少なくとも約４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１０ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、又は約３０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、有効量は約３０ｍｇ／ｋｇ又は約５０ｍｇ／ｋｇである。
【００４４】
特定の実施形態では、有効量は、少なくとも２４週間、少なくとも３６週間、又は少なくとも４８週間にわたって少なくとも約４ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、又は約３０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇであり、それにより、対象においてジストロフィン陽性線維の数が増大される。特定の実施形態では、対象におけるジストロフィン陽性線維の増大は、正常の少なくとも２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％である。いくつかの実施形態では、処置は、患者においてジストロフィン陽性線維の数を正常の２０〜６０％、又は３０〜５０％まで増大させる。
【００４５】
特定の実施形態では、例えば６ＭＷＴにおける患者の歩行距離を、健康な同等者に対して２０％の欠乏から安定化又は改善させるために、有効量は、少なくとも２４週間、少なくとも３６週間、又は少なくとも４８週間にわたって少なくとも約４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、又は約３０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇである。
【００４６】
種々の実施形態では、有効量は、少なくとも２４週間、少なくとも３６週間、又は少なくとも４８週間にわたって少なくとも約４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、又は約３０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇであり、それにより患者においてジストロフィン産生が増大される。いくつかの実施形態では、増大したジストロフィン産生は、健康な同等者に対して、約０．１％、０．２％  ０．３％  ０．５％、０．７％、０．９％、１％、１．０１％、１．５％、２％、２．０１％、２．５％、３％、３．０１％、３．５％、４％、４．０１％、４．５％、５％、５．０１％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１０．５％、１１％、１１．５％、１２％、１２．５％、１３％、１３．５％、１４％、１４．５％、１５％、１５．５％、１６％、１６．５％、１７％、１７．５％、１８％、１８．５％、１９％、１９．５％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、又は６０％である。特定の実施形態では、ジストロフィン産生の増大は、健康な同等者に対して、約０．１％〜０．５％、０．５％〜０．９％、０．８％〜１％、０．９％〜１．２％、０．９％〜１．０％、０．９％〜１．０１％、１％〜１．０１％、１％〜１．５％、１．５％〜２％、１．９％〜２．０％、１．９％〜２．０１％、２％〜２．０１％、２％〜２．５％、２．５％〜３％、２．９％〜３．０％、２．９％〜３．０１％、２％〜３．０１％、３％〜３．５％、３．５％〜４％、４％〜４．５％、４．５％〜５％、５％〜６％、６％〜７％、７％〜８％、８％〜９％、９％〜１０％、１％〜２％、１％〜３％、１％〜５％、２％〜４％、２％〜５％、４％〜６％、５％〜８％、８％〜１０％、１％〜５％、２％〜６％、３％〜７％、４％〜８％、５％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１５％、１５％〜２０％、１７％〜２０％、２０％〜２２％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、又は３０％〜３５％であり得る。
【００４７】
「増強する」若しくは「増強すること」又は「増大させる」若しくは「増大させること」又は「刺激する」若しくは「刺激すること」とは一般的に、１つ若しくは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、ゴロディルセンを含む）又はその医薬組成物が、アンチセンスオリゴヌクレオチドがない場合に、又は対照化合物によって引き起こされる反応と比較して、細胞又は対象においてより大きい生理応答（すなわち、下流の効果）を生じさせるか、又は引き起こす能力を指す。測定可能な生理応答は、当該技術分野における理解及び本明細書の記載から明らかな反応の中でも特に、筋組織における機能形態のジストロフィンタンパク質の発現（又は産生）の増大又はジストロフィン関連の生物活性の増大を含み得る。また筋機能の約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％の増大又は改善を含む、筋機能の増大も測定することができる。筋線維の約１％、２％、５％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％におけるジストロフィン発現の増大を含む、機能性ジストロフィンを発現する筋線維の割合を測定することもできる。例えば、線維の２５〜３０％がジストロフィンを発現すれば、約４０％の筋機能の改善が生じ得ることが示されている（例えば、ＤｅｌｌｏＲｕｓｓｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：１２９７９−１２９８４，２００２を参照）。いくつかの実施形態では、増大したジストロフィン産生は、健康な同等者に対して、約０．１％、０．２％  ０．３％  ０．５％、０．７％、０．９％、１％、１．０１％、１．５％、２％、２．０１％、２．５％、３％、３．０１％、３．５％、４％、４．０１％、４．５％、５％、５．０１％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１０．５％、１１％、１１．５％、１２％、１２．５％、１３％、１３．５％、１４％、１４．５％、１５％、１５．５％、１６％、１６．５％、１７％、１７．５％、１８％、１８．５％、１９％、１９．５％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、又は６０％である。特定の実施形態では、ジストロフィン産生の増大は、健康な同等者に対して、約０．１％〜０．５％、０．５％〜０．９％、０．８％〜１％、０．９％〜１．２％、０．９％〜１．０％、０．９％〜１．０１％、１％〜１．０１％、１％〜１．５％、１．５％〜２％、１．９％〜２．０％、１．９％〜２．０１％、２％〜２．０１％、２％〜２．５％、２．５％〜３％、２．９％〜３．０％、２．９％〜３．０１％、２％〜３．０１％、３％〜３．５％、３．５％〜４％、４％〜４．５％、４．５％〜５％、５％〜６％、６％〜７％、７％〜８％、８％〜９％、９％〜１０％、１％〜２％、１％〜３％、１％〜５％、２％〜４％、２％〜５％、４％〜６％、５％〜８％、８％〜１０％、１％〜５％、２％〜６％、３％〜７％、４％〜８％、５％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１５％、１５％〜２０％、１７％〜２０％、２０％〜２２％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、又は３０％〜３５％であり得る。本明細書で使用される場合、「増大したジストロフィン産生」、「ジストロフィンの産生の増大」などは、対象におけるジストロフィン、ジストロフィン様タンパク質、又は機能性ジストロフィンタンパク質の少なくとも１つの産生の増大を指す。
【００４８】
「増大された」又は「増強された」量は、通常、「統計的に有意な」量であり、アンチセンスオリゴヌクレオチドがない（薬剤が存在しない）場合に、又は対照化合物によってもたらされる量の１．１倍、１．２倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍又はそれ以上（例えば、５００倍、１０００倍）（全ての整数及びその間の１を超える小数点、例えば、１．５、１．６、１．７、１．８などを含む）の増大を含み得る。
【００４９】
「低減する」又は「阻害する」という用語は、一般的に、本発明の１つ又は複数のアンチセンス化合物が、診断の技術分野における通例の技術にしたがって測定したときに、本明細書に記載される疾患又は状態の症状などの、関連する生理応答又は細胞応答を「減少させる」能力に関し得る。関連する生理応答又は細胞応答（インビボ又はインビトロ）は当業者には明らかであり、筋ジストロフィーの症状若しくは病態の低減、又はＤＭＤ若しくはＢＭＤを有する個体において発現される変化した形態のジストロフィンなどの欠陥のある形態のジストロフィンの発現の低減を含み得る。応答の「減少」は、アンチセンス化合物がない場合に、又は対照組成物によってもたらされる応答と比較して統計的に有意でよく、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％（その間の全ての整数を含む）の減少を含み得る。
【００５０】
本明細書で使用される場合、「機能」及び「機能性の」などの用語は、生物学的、酵素的、又は治療的機能を指す。
【００５１】
「機能性」ジストロフィンタンパク質は一般に、通常、ＤＭＤ又はＢＭＤを有する特定の対象に存在する変化した形態又は「欠陥のある」形態のジストロフィンタンパク質と比較して、本来なら筋ジストロフィーの特徴である、筋組織の進行性の分解を低減するのに十分な生物活性を有するジストロフィンタンパク質を指す。特定の実施形態では、機能性ジストロフィンタンパク質は、当技術分野における通例の技術にしたがって測定したときに、野生型ジストロフィンの約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％（その間の全ての整数を含む）のインビトロ又はインビボ生物活性を有し得る。一例として、インビトロでの筋肉培養物におけるジストロフィン関連の活性は、筋管サイズ、筋原線維の組織化（又は破壊）、収縮活性、及びアセチルコリン受容体の自発的なクラスター形成にしたがって測定することができる（例えば、Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ．１１２：２０９−２１６，１９９９を参照）。また動物モデルは疾患の病態形成を研究するための価値ある資源であり、ジストロフィン関連の活性を試験するための手段を提供する。ＤＭＤ研究のために最も広範に使用される動物モデルの２つは、ｍｄｘマウス及びゴールデンレトリーバ筋ジストロフィー（ＧＲＭＤ）イヌであり、これらは両方共ジストロフィン陰性である（例えば、Ｃｏｌｌｉｎｓ  ＆  Ｍｏｒｇａｎ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｐａｔｈｏｌ  ８４：１６５−１７２，２００３を参照）。これら及び他の動物モデルを使用して、種々のジストロフィンタンパク質の機能活性を測定することができる。特定の本開示のエクソンスキッピングアンチセンスオリゴヌクレオチドによって産生される形態などのジストロフィンの切断型も含まれる。
【００５２】
「モルホリノ」、「モルホリノオリゴマー」又は「ＰＭＯ」という用語は、Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＆  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，７：１８７−１９５（１９９７）の図２に記載されるように、以下の一般構造：
【化１】
2020532504.tif 000003
を有するホスホロジアミダートモルホリノオリゴマーを指す。本明細書に記載されるモルホリノは、上記の一般構造の全ての立体異性体（及びこれらの混合物）及び立体配置を包含することが意図される。モルホリノオリゴマーの合成、構造、及び結合特徴は、米国特許第５，６９８，６８５号明細書、同第５，２１７，８６６号明細書、同第５，１４２，０４７号明細書、同第５，０３４，５０６号明細書、同第５，１６６，３１５号明細書、同第５，５２１，０６３号明細書、同第５，５０６，３３７号明細書、同第８，０７６，４７６号明細書、及び同第８，２９９，２０６号明細書において詳述されており、これらは全て参照によって本明細書中に援用される。特定の実施形態では、モルホリノはオリゴマーの５’端部又は３’端部において「テール」部分とコンジュゲートされて、その安定性及び／又は溶解性が増大される。例示的なテールには、
【化２】
2020532504.tif 000004
が含まれる。
【００５３】
そのコード名「ＳＲＰ−４０５３」でも知られている「ゴロディルセン」は、塩基配列５’−ＧＴＴＧＣＣＴＣＣＧＧＴＴＣＴＧＡＡＧＧＴＧＴＴＣ−３’（配列番号１）を有するＰＭＯである。ゴロディルセンは、ＣＡＳ登録番号１４２２９５９−９１−８で登録されている。化学名は、ａｌｌ−Ｐ−ａｍｂｏ−［Ｐ，２’，３’−トリデオキシ−Ｐ−（ジメチルアミノ）−２’，３’−イミノ−２’，３’−セコ］（２’ａ→５’）（Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｃ）５’−［４−（｛２−［２−（２−ヒドロキシエトキシ）エトキシ］エトキシ｝カルボニル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルピペラジン−１−ホスホンアミダート］を含む。ゴロディルセンは、以下の構造を有する：
【化３】
2020532504.tif 000005
して以下の化学構造によっても表される：
【化４】
2020532504.tif 000006
【化５】
2020532504.tif 000007
【００５４】
明確にするために、例えば上記のゴロディルセンの構造を含む本開示の構造は、５’から３’に続くものであり、構造全体をコンパクトな形態で示す便宜上、「中断Ａ」及び「中断Ｂ」と表示される種々の図の中断が含まれている。当業者により理解されるように、例えば「中断Ａ」の表示はそれぞれ、これらの点において構造の図が連続することを示す。当業者は、上記の構造の「中断Ｂ」の各場合についても同じことが当てはまることを理解する。しかしながら、図の中断はどれも上記の構造の実際の不連続を示すことは意図されず、当業者もそれらが実際の不連続を意味するものと理解しない。
【００５５】
本明細書で使用される場合、構造式内で使用される１組の括弧は、括弧内の構造特徴が繰り返されることを示す。いくつかの実施形態では、使用される括弧は「［」及び「］」であり得るが、特定の実施形態では、反復される構造特徴を示すために使用される括弧は「（」及び「）」であり得る。いくつかの実施形態では、括弧内の構造特徴の反復回数は、例えば、２、３、４、５、６、７などの、括弧の外側に示される数である。種々の実施形態では、括弧内の構造特徴の反復回数は、「Ｚ」などの括弧の外側に示される変数によって示される。
【００５６】
本明細書で使用される場合、直線状の結合又は曲がりくねった結合の構造式においてキラル炭素又はキラルリン原子に対して描かれる結合は、キラル炭素又はリンの立体化学が定義されておらず、全ての形態のキラル中心を含むことが意図されることを示す。このような図の例は以下に示される：
【化６】
2020532504.tif 000008
【００５７】
本明細書で使用される「非経口投与」及び「非経口的に投与される」という語句は、経腸及び局所投与以外の、通常は注射による投与形態を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、角皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内及び胸骨内への注射及び点滴が含まれるが、これらに限定されない。
【００５８】
「薬学的に許容される」という語句は、物質又は組成物が、製剤を構成する他の成分、及び／又はそれにより処置される対象と、化学的及び／又は毒物学的に適合性でなければならないことを意味する。
【００５９】
本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」という語句は、任意のタイプの無毒性で不活性の固体、半固体又は液体の充填剤、希釈剤、カプセル化材料又は製剤助剤を意味する。薬学的に許容される担体としての役割を果たすことができる材料のいくつかの例は、糖、例えば、ラクトース、グルコース及びスクロース；デンプン、例えば、コーンスターチ及びジャガイモデンプン；セルロース及びその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース及び酢酸セルロース；粉末トラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；賦形剤、例えば、ココアバター及び坐薬ワックス；油、例えば、ピーナッツ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油及び大豆油；グリコール、例えば、プロピレングリコール；エステル、例えば、オレイン酸エチル及びラウリン酸エチル；寒天；緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウム；アルギン酸；パイロジェンフリー水；等張生理食塩水；リンゲル溶液；エチルアルコール、及びリン酸緩衝溶液、並びに、他の無毒性の適合性潤滑剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウムであり、製剤者の判断にしたがって、着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、香味料及び香料、保存料及び抗酸化剤を組成物中に存在させることもできる。
【００６０】
ジストロフィン合成又は産生の「回復」という用語は、一般に、本明細書に記載されるアンチセンスオリゴマーにより処置した後の、筋ジストロフィー患者における切断型のジストロフィンを含むジストロフィンタンパク質の産生を指す。いくつかの実施形態では、処置は、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％（その間の全ての整数を含む）の、患者のジストロフィン産生の増大をもたらす。いくつかの実施形態では、処置は、対象において、ジストロフィン陽性線維の数を正常の少なくとも２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％又は約９５％〜１００％までを増大させる。他の実施形態では、処置は、対象において、ジストロフィン陽性線維の数を正常の約２０％〜約６０％、又は約３０％〜約５０％まで増大させる。処置後の患者におけるジストロフィン陽性線維の割合は、既知の技術を用いる筋生検によって決定することができる。例えば、筋生検は、患者の上腕二頭筋などの適切な筋肉から採取され得る。
【００６１】
陽性ジストロフィン線維の割合の分析は、処置の前及び／又は処置の後、又は処置期間を通じて複数の時点で実施され得る。いくつかの実施形態では、処置後の生検は、処置前の生検とは反対側の筋肉から採取される。処置前及び処置後のジストロフィン発現の研究は、ジストロフィンのための任意の適切なアッセイを用いて実施され得る。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体などのジストロフィンのマーカーである抗体を用いて、筋生検からの組織切片において、免疫組織化学的検出が実施される。例えば、高感受性のジストロフィンのマーカーであるＭＡＮＤＹＳ１０６抗体を使用することができる。任意の適切な二次抗体が使用され得る。
【００６２】
いくつかの実施形態では、ジストロフィン陽性線維パーセントは、陽性線維の数を計数した線維の総数で割ることによって計算される。正常な筋肉サンプルは、１００％のジストロフィン陽性線維を有する。したがって、ジストロフィン陽性線維パーセントは、正常の割合として表すことができる。処置後の筋肉中のジストロフィン陽性線維を計数する際に、処置前の筋肉及び復帰変異体線維中の微量レベルのジストロフィンの存在に対して照らし合わせるために、各患者からの処置前の筋肉の切片を用いてベースラインを設定することができる。これは、その患者の処置後の筋肉の切片においてジストロフィン陽性線維を計数するための閾値として使用され得る。他の実施形態では、Ｂｉｏｑｕａｎｔ画像解析ソフトウェア（Ｂｉｏｑｕａｎｔ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ，ＴＮ）を用いて、ジストロフィンの定量のために抗体染色組織切片を使用することもできる。全ジストロフィン蛍光シグナル強度は、正常の割合として報告され得る。さらに、モノクローナル又はポリクローナル抗ジストロフィン抗体によるウエスタンブロット分析を使用して、ジストロフィン陽性線維の割合を決定することができる。例えば、Ｎｏｖａｃａｓｔｒａからの抗ジストロフィン抗体ＮＣＬ−Ｄｙｓ１が使用され得る。ジストロフィン陽性線維の割合は、サルコグリカン複合体（β、γ）及び／又はニューロンＮＯＳの成分の発現を決定することによって分析することもできる。
【００６３】
いくつかの実施形態では、ゴロディルセンなどの本開示のアンチセンスオリゴマーによる処置は、ＤＭＤ患者において処置をしない場合に予想され得る進行性の呼吸筋機能障害及び／又は呼吸筋不全を減速又は低下させる。いくつかの実施形態では、本開示のアンチセンスオリゴマーによる処置は、処置をしない場合に予想され得る人工呼吸補助の必要性を低減又は除去し得る。いくつかの実施形態では、疾患の経過を追跡するための呼吸機能の測定、及び潜在的な治療的介入の評価には、最大吸気圧（ＭＩＰ）、最大呼気圧（ＭＥＰ）及び努力肺活量（ＦＶＣ）が含まれる。ＭＩＰ及びＭＥＰはそれぞれ、人が吸息及び呼息の間に生じさせることができる圧力のレベルを測定し、呼吸筋力の高感度尺度である。ＭＩＰは、横隔膜の筋力低下の尺度である。
【００６４】
いくつかの実施形態では、ＭＥＰは、ＭＩＰ及びＦＶＣを含む他の肺機能検査の変化の前に低下し得る。特定の実施形態では、ＭＥＰは、呼吸機能障害の早期指標であり得る。特定の実施形態では、ＦＶＣは、最大吸気後の強制呼息の間に排出される空気の総体積を測定するために使用され得る。ＤＭＤ患者では、ＦＶＣは、１０代前半までは身体的成長に伴って増大する。しかしながら、疾患進行により成長が遅くなるか、又は阻止されて、筋力低下が進行すると、肺活量は下降期に入り、１０〜１２歳以降は１年に約８〜８．５パーセントの平均速度で低下する。特定の実施形態では、予測ＭＩＰパーセント（体重で調整したＭＩＰ）、予測ＭＥＰパーセント（年齢で調整したＭＥＰ）及び予測ＦＶＣパーセント（年齢及び伸長で調整したＦＶＣ）は、支持的な分析である。
【００６５】
本明細書で使用される「対象」又は「患者」は、本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置することができる症状を示すか又はその症状を示すリスクがある任意の動物、例えば、ＤＭＤ若しくはＢＭＤ又はこれらの状態に関連する症状のいずれか（例えば、筋線維の喪失）を有するか、或いは有するリスクがある対象を含む。適切な対象（患者）には、実験動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、又はモルモット）、家畜、及び飼育動物又はペット（例えば、ネコ又はイヌ）が含まれる。非ヒト霊長類、そして好ましくは、ヒト患者が含まれる。また、エクソン５３スキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の突然変異を有する対象においてジストロフィンを産生させる方法も含まれる。
【００６６】
本明細書で使用される「小児患者」は、１歳〜２１歳（両端を含む）の患者である。
【００６７】
本明細書で使用される「全身性投与」、「全身に投与される」、「末梢投与」及び「末梢に投与される」という語句は、中枢神経系内への直接的な投与ではなく、患者の身体に入り、したがって、代謝及び他の同様のプロセスを受けるような化合物、薬物又は他の材料の投与、例えば、皮下投与を意味する。
【００６８】
本明細書で使用される「慢性投与」は、連続的で規則的な長期間の治療的投与、すなわち、実質的に中断することのない定期的投与を指す。例えば、患者において筋ジストロフィーを処置するために、少なくとも数週間又は数か月又は数年にわたって毎日である。例えば、患者において筋ジストロフィーを処置するために、少なくとも数か月又は数年にわたって毎週（例えば、少なくとも６週間にわたって毎週、少なくとも１２週間にわたって毎週、少なくとも２４週間にわたって毎週、少なくとも４８週間にわたって毎週、少なくとも７２週間にわたって毎週、少なくとも９６週間にわたって毎週、少なくとも１２０週間にわたって毎週、少なくとも１４４週間にわたって毎週、少なくとも１６８週間にわたって毎週、少なくとも１８０週間にわたって毎週、少なくとも１９２週間にわたって毎週、少なくとも２１６週間にわたって毎週、又は少なくとも２４０週間にわたって毎週）である。
【００６９】
本明細書で使用される「定期的投与」は、投与の間に間隔のある投与を指す。例えば、定期的投与は、繰り返され得る固定間隔（例えば、毎週、毎月）での投与を含む。
【００７０】
本明細書で使用される「プラセボ」は、治療効果を有さず、対照として使用され得る物質を指す。
【００７１】
本明細書で使用される「プラセボ対照」は、併用療法、アンチセンスオリゴヌクレオチド、非ステロイド系抗炎症化合物、及び／又は別の医薬組成物ではなくプラセボを受ける対象又は患者を指す。プラセボ対照は、対象又は患者と同じ突然変異状態、同様の年齢、同様の歩く能力を有することができ、且つ、或いは、同じ併用薬（ステロイドなどを含む）を受けることができる。
【００７２】
「標的配列」、「塩基配列」、又は「核酸塩基配列」という語句は、標的プレｍＲＮＡ中のヌクレオチドの配列と相補的なオリゴマーの核酸塩基の配列を指す。本開示のいくつかの実施形態では、標的プレｍＲＮＡ中のヌクレオチドの配列は、Ｈ５３Ａ（＋３６＋６０）として指定されるジストロフィンのプレｍＲＮＡ中のエクソン５３アニーリング部位である。
【００７３】
対象（例えば、ヒトなどの哺乳類）又は細胞の「処置」は、対象又は細胞の自然経過を変化させるための試みにおいて使用される任意のタイプの介入である。処置はオリゴマー又はその医薬組成物の投与を含むが、これらに限定されず、予防的に、又は病的事象の開始若しくは病原体との接触に続いて実施され得る。処置は、特定の形態の筋ジストロフィーのような、ジストロフィンタンパク質に関する疾患又は状態の症状又は病態に対して任意の望ましい効果を含み、例えば、処置中の疾患又は状態の１つ又は複数の測定可能なマーカーにおける最小限の変化又は改善を含み得る。また、処置中の疾患若しくは状態の進行速度の低減、その疾患若しくは状態の発症の遅延、又はその発症の重症度の低下を目的とすることができる「予防的」処置も含まれる。「処置」又は「予防」は、必ずしも、疾患若しくは状態又はそれに関連する症状の完全な根絶、治癒、又は防止を示さない。
【００７４】
いくつかの実施形態では、本開示のアンチセンスオリゴマーによる処置は、処置をしない場合に予想され得る、又は処置をしない場合に予想され得るジストロフィン産生を増大させ、疾患進行を遅延させ、歩行運動の喪失を減速又は低下させ、筋肉の炎症を低減し、筋損傷を低減し、筋機能を改善し、肺機能の喪失を低減し、及び／又は筋再生を増強する。いくつかの実施形態では、処置は疾患進行を維持、遅延又は減速させる。いくつかの実施形態では、処置は歩行運動を維持するか、又は歩行運動の喪失を低減する。いくつかの実施形態では、処置は肺機能を維持するか、又は肺機能の喪失を低減する。いくつかの実施形態では、処置は、例えば６分間歩行試験（６ＭＷＴ）により測定したときに、患者の安定歩行距離を維持するか、又は増大させる。いくつかの実施形態では、処置は、１０メートル歩行／走行時間（すなわち、１０メートル歩行／走行試験）を維持又は短縮する。いくつかの実施形態では、処置は、仰臥位から立ち上がる時間（すなわち、立ち上がり時間試験）を維持又は短縮する。いくつかの実施形態では、処置は、４段の標準階段を上る時間（すなわち、４段上り試験）を維持又は短縮する。いくつかの実施形態では、処置は、例えばＭＲＩ（例えば、脚筋のＭＲＩ）で測定したときに、患者の筋肉の炎症を維持又は低減する。いくつかの実施形態では、ＭＲＩはＴ２及び／又は脂肪画分を測定して、筋変性を特定する。ＭＲＩは、炎症、浮腫、筋損傷及び脂肪浸潤に起因する、筋肉の構造及び組成の変化を特定することができる。
【００７５】
いくつかの実施形態では、本開示のアンチセンスオリゴマーによる処置はジストロフィン産生を増大させる。いくつかの実施形態では、増大したジストロフィン産生は、健康な同等者に対して、約０．１％、０．２％  ０．３％  ０．５％、０．７％、０．９％、１％、１．０１％、１．５％、２％、２．０１％、２．５％、３％、３．０１％、３．５％、４％、４．０１％、４．５％、５％、５．０１％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１０．５％、１１％、１１．５％、１２％、１２．５％、１３％、１３．５％、１４％、１４．５％、１５％、１５．５％、１６％、１６．５％、１７％、１７．５％、１８％、１８．５％、１９％、１９．５％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、又は６０％である。特定の実施形態では、ジストロフィン産生の増大は、健康な同等者に対して、約０．１％〜０．５％、０．５％〜０．９％、０．８％〜１％、０．９％〜１．２％、０．９％〜１．０％、０．９％〜１．０１％、１％〜１．０１％、１％〜１．５％、１．５％〜２％、１．９％〜２．０％、１．９％〜２．０１％、２％〜２．０１％、２％〜２．５％、２．５％〜３％、２．９％〜３．０％、２．９％〜３．０１％、２％〜３．０１％、３％〜３．５％、３．５％〜４％、４％〜４．５％、４．５％〜５％、５％〜６％、６％〜７％、７％〜８％、８％〜９％、９％〜１０％、１％〜２％、１％〜３％、１％〜５％、２％〜４％、２％〜５％、４％〜６％、５％〜８％、８％〜１０％、１％〜５％、２％〜６％、３％〜７％、４％〜８％、５％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１５％、１５％〜２０％、１７％〜２０％、２０％〜２２％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、又は３０％〜３５％であり得る。
【００７６】
特定の実施形態では、本開示のアンチセンスオリゴマーによる処置は、ジストロフィン産生を増大させ、処置をしない場合に予想され得る歩行運動の喪失を減速又は低下させる。例えば、処置は、対象の歩行能力を安定化、維持、改善又は増大させ得る（例えば、歩行運動の安定化）。いくつかの実施形態では、処置は、例えば、ＭｃＤｏｎａｌｄ，ｅｔ  ａｌ．（Ｍｕｓｃｌｅ  Ｎｅｒｖｅ，２０１０；４２：９６６−７４、参照によって本明細書中に援用される）により記載された６分間歩行試験（６ＭＷＴ）により測定したときに、患者の安定歩行距離を維持又は増大させる。６分間歩行距離（６ＭＷＤ）の変化は、絶対値、変化率、又は予測値％の変化として表され得る。いくつかの実施形態では、処置は、６ＭＷＴにおける対象の安定歩行距離を、健康な同等者に対して２０％の欠乏から維持又は改善する。６ＭＷＴにおけるＤＭＤ患者の能力は、健康な同等者の通常の能力に対して、予測値％を計算することにより決定することができる。例えば、予測６ＭＷＤ％は、男性の場合、以下の式：１９６．７２＋（３９．８１×年齢）−（１．３６×年齢２）＋（１３２．２８×身長（メートル））を用いて計算することができる。女性の場合、予測６ＭＷＤ％は、以下の式：１８８．６１＋（５１．５０×年齢）−（１．８６×年齢２）＋（８６．１０×身長（メートル））を用いて計算することができる（Ｈｅｎｒｉｃｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  Ｃｕｒｒ．，２０１２，バージョン２、参照によって本明細書中に援用される）。
【００７７】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴマーによる処置は、ベースラインから３、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０又は５０メートル（その間の全ての整数を含む）を超えて、患者の安定歩行距離を増大させる。いくつかの実施形態では、増大したジストロフィン産生は、健康な同等者に対して、約０．１％、０．２％  ０．３％  ０．５％、０．７％、０．９％、１％、１．０１％、１．５％、２％、２．０１％、２．５％、３％、３．０１％、３．５％、４％、４．０１％、４．５％、５％、５．０１％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１０．５％、１１％、１１．５％、１２％、１２．５％、１３％、１３．５％、１４％、１４．５％、１５％、１５．５％、１６％、１６．５％、１７％、１７．５％、１８％、１８．５％、１９％、１９．５％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、又は６０％である。特定の実施形態では、ジストロフィン産生の増大は、健康な同等者に対して、約０．１％〜０．５％、０．５％〜０．９％、０．８％〜１％、０．９％〜１．２％、０．９％〜１．０％、０．９％〜１．０１％、１％〜１．０１％、１％〜１．５％、１．５％〜２％、１．９％〜２．０％、１．９％〜２．０１％、２％〜２．０１％、２％〜２．５％、２．５％〜３％、２．９％〜３．０％、２．９％〜３．０１％、２％〜３．０１％、３％〜３．５％、３．５％〜４％、４％〜４．５％、４．５％〜５％、５％〜６％、６％〜７％、７％〜８％、８％〜９％、９％〜１０％、１％〜２％、１％〜３％、１％〜５％、２％〜４％、２％〜５％、４％〜６％、５％〜８％、８％〜１０％、１％〜５％、２％〜６％、３％〜７％、４％〜８％、５％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１５％、１５％〜２０％、１７％〜２０％、２０％〜２２％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、又は３０％〜３５％であり得る。
【００７８】
ＤＭＤ患者の筋機能の喪失は、正常な小児期の成長及び発育を背景にして起こり得る。実際に、進行性筋機能障害にもかかわらず、ＤＭＤを有する低年齢の小児は約１年間にわたって６ＭＷＴ中に歩行距離の増大を示し得る。いくつかの実施形態では、ＤＭＤ患者からの６ＭＷＤは、典型的に発育している対照群、並びに年齢及び性別が一致する対象からの既存の標準データと比較される。いくつかの実施形態では、正常な成長及び発育は、標準データに適合された年齢及び身長に基づいた式を用いて説明することができる。このような式を使用して、ＤＭＤを有する対象において６ＭＷＤを予測パーセント（予測％）値に変換することができる。特定の実施形態では、予測６ＭＷＤ％データの分析は正常な成長及び発育を説明するための方法を表し、低年齢（例えば、７歳以下）での機能の増大が、ＤＭＤ患者の能力の改善ではなく安定を表すことを示し得る（Ｈｅｎｒｉｃｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  Ｃｕｒｒ．，２０１２，バージョン２、参照によって本明細書中に援用される）。
【００７９】
異なるアンチセンス分子を区別するために、アンチセンス分子の命名法が提唱及び公開された（Ｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｊ  Ｇｅｎ  Ｍｅｄ  ４，６４４−６５４を参照）。この命名法は、以下に示されるように、全て同じ標的領域に向けられたわずかに異なるいくつかのアンチセンス分子を試験する際に意味を持つ：
Ｈ＃Ａ／Ｄ（ｘ：ｙ）。
【００８０】
最初の文字は、種（例えば、Ｈ：ヒト、Ｍ：マウス、Ｃ：イヌ）を指定する。「＃」は、標的ジストロフィンエクソンの番号を指定する。「Ａ／Ｄ」はそれぞれ、エクソンの最初及び最後におけるアクセプタースプライス部位又はドナースプライス部位を示す。（ｘ  ｙ）はアニーリング座標を表し、ここで、「−」又は「＋」はそれぞれ、イントロン配列又はエクソン配列を示す。例えば、Ａ（−６＋１８）は、標的エクソンに先行するイントロンの最後の６塩基及び標的エクソンの最初の１８塩基を示し得る。最も近いスプライス部位はアクセプターであり得るので、これらの座標は「Ａ」が前に記載され得る。ドナースプライス部位におけるアニーリング座標の記載はＤ（＋２−１８）であり得るが、ここで、最後の２個のエクソン塩基及び最初の１８個のイントロン塩基はアンチセンス分子のアニーリング部位に対応する。Ａ（＋６５＋８５）で表され得る完全なエクソンアニーリング座標は、そのエクソンの開始から６５番目と８５番目のヌクレオチドの間の部位である。
【００８１】
ＩＩ．アンチセンスオリゴヌクレオチド
エクソン５３のスキッピングをもたらすためにジストロフィン遺伝子のプレｍＲＮＡを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、本開示の方法にしたがって使用される。
【００８２】
このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡの翻訳を遮断又は阻害するように、或いは天然のプレｍＲＮＡスプライスプロセシングを阻害するように設計することができ、ハイブリダイズする標的配列に「向けられる」又は「対して標的化される」と言うことができる。標的配列は、通常、ｍＲＮＡのＡＵＧ開始コドン、翻訳抑制オリゴマー、又はプレプロセシングされたｍＲＮＡのスプライス部位、スプライス抑制オリゴマー（ＳＳＯ）を含む領域である。スプライス部位の標的配列は、プレプロセシングされたｍＲＮＡ内の正常なスプライスアクセプタージャンクションの１〜約２５塩基対下流にその５’端部を有するｍＲＮＡ配列を含み得る。いくつかの実施形態では、標的配列は、スプライス部位を含むか、又はエクソンコード配列内に完全に含有されるか、又はスプライスアクセプター部位若しくはドナー部位にまたがる、プレプロセシングされたｍＲＮＡの任意の領域であり得る。オリゴマーはより一般的には、上記のような方法で標的の核酸に対して標的化される場合、タンパク質、ウィルス、又は細菌などの生物学的に関連する標的に「対して標的化される」と言われる。
【００８３】
特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５３標的領域に特異的にハイブリダイズし、エクソン５３スキッピングを誘発する。特定の実施形態では、ジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５３標的領域にハイブリダイズしてエクソン５３スキッピングを誘発するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロジアミダートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）である。
【００８４】
特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドはゴロディルセンである。
【００８５】
ゴロディルセンは、ホスホロジアミダートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）と呼ばれる明確な種類の新規の合成アンチセンスＲＮＡ治療薬に属し、これは、天然の核酸構造の再設計である。ゴロディルセンは、ジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５３標的領域にハイブリダイズするＰＭＯであり、エクソン５３スキッピングを誘発する。ゴロディルセンは、上記で引用した参考文献において、そして付加的に国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１７／４０３１８号（その全体は、参照によって本明細書中に明示的に援用される）において詳述される方法を用いて、段階的な固相合成によって調製することができる。
【００８６】
ＰＭＯは、インビボの非臨床的観察に基づいて潜在的な臨床的利点を提供する。ＰＭＯは、インビボでの安定性を保証するために、ヌクレアーゼによる酵素分解から保護する修飾をＲＮＡの糖環に組み込む。ＰＭＯは、一つには６員合成モルホリノ環の使用により、天然の核酸及び他のアンチセンスオリゴヌクレオチドの種類とは区別され、６員合成モルホリノ環は、ＲＮＡ、ＤＮＡ及び多数の他の合成アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドにおいて見出される５員リボフラノシル環を置換する。
【００８７】
ＰＭＯに特異的な無電荷ホスホロジアミダート結合は、潜在的に、タンパク質への低減されたオフターゲット結合を付与すると考えられる。ＰＭＯは、他の臨床段階の合成アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドで使用される負電荷を持つホスホロチオアート結合の代わりに、各モルホリノ環を連結する無電荷ホスホロジアミダート結合を有する。
【００８８】
ＤＭＤ遺伝子のアウトオブフレーム突然変異によって生じるＤＭＤの処置に対する潜在的な治療的アプローチは、インフレーム突然変異によって生じるＢＭＤとして知られているより軽症な形態のジストロフィン異常症によって示唆される。アウトオブフレーム突然変異をインフレーム突然変異に変換する能力は、仮説上は、ｍＲＮＡリーディングフレームを保存することができ、内部で短縮されているが機能性のジストロフィンタンパク質を生じさせる。ゴロディルセンは、これを達成するように設計された。
【００８９】
ゴロディルセンはジストロフィンプレｍＲＮＡを標的として、エクソン５３のスキッピングを誘発し、したがってエクソン５３は、スプライスされた成熟ｍＲＮＡ転写物から排除又はスキップされる。エクソン５３をスキップすることにより、破壊されたリーディングフレームはインフレーム突然変異に回復される。ＤＭＤは種々の遺伝子サブタイプから構成されるが、ゴロディルセンは、ジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５３をスキップするように特別に設計された。エクソン５３のスキッピングに適したＤＭＤ突然変異は、エクソン５３に近接するエクソンの欠失（すなわち、エクソン５２又はエクソン５４の欠失を含む）を含み、ＤＭＤ患者のサブグループ（８％）を構成する。
【００９０】
ゴロディルセンの２５の核酸塩基の配列は、ジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５３内の特異的な標的配列に相補的であるように設計される。ゴロディルセンの各モルホリノ環は、ＤＮＡ中に見出される４つの複素環核酸塩基（アデニン、シトシン、グアニン、及びチミン）の１つに連結される。
【００９１】
ゴロディルセンと標的プレｍＲＮＡ配列とのハイブリダイゼーションはプレｍＲＮＡスプライシング複合体の形成を妨げ、成熟ｍＲＮＡからエクソン５３を欠失させる。ゴロディルセンの構造及び立体配座は、相補的配列に対する配列特異的塩基対合を可能にする。例えば、ジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５１をスキップするように設計されたＰＭＯであるエテプリルセンは、ジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５１に含有される相補的配列に対する配列特異的塩基対合を可能にする。
【００９２】
エクソンスキッピングを用いたジストロフィンリーディングフレームの回復
７９のエクソンを全て含有する正常なジストロフィンｍＲＮＡは、正常なジストロフィンタンパク質を生じ得る。
【００９３】
ジストロフィン遺伝子からエクソン全体が失われたジストロフィンｍＲＮＡは、通常、ＤＭＤをもたらす。
【００９４】
別のエクソンスキッピングＰＭＯであるエテプリルセンは、エクソン５１をスキップして、ｍＲＮＡリーディングフレームを回復させる。エクソン４９は完全なコドンで終わり、エクソン５２はコドンの最初のヌクレオチドで始まるので、エクソンスキッピングによるエクソン５１の欠失はリーディングフレームを回復させ、インタクトなジストログリカン結合部位を有する、内部で短縮されたジストロフィンタンパク質の産生がもたらされる。
【００９５】
ジストロフィンｍＲＮＡオープンリーディングフレームを回復させるためにエクソンスキッピングを用いるＤＭＤ表現型の改善の実行可能性は、非臨床試験により支持される。ＤＭＤのジストロフィー動物モデルにおける多数の試験により、エクソンスキッピングによるジストロフィンの回復が筋力及び筋機能の確実な改善をもたらすことが示されている（Ｓｈａｒｐ  ２０１１；Ｙｏｋｏｔａ  ２００９；Ｗｕ  ２００８；Ｗｕ  ２０１１；Ｂａｒｔｏｎ−Ｄａｖｉｓ  １９９９；Ｇｏｙｅｎｖａｌｌｅ  ２００４；Ｇｒｅｇｏｒｅｖｉｃ  ２００６；Ｙｕｅ  ２００６；Ｗｅｌｃｈ  ２００７；Ｋａｗａｎｏ  ２００８；Ｒｅａｙ  ２００８；ｖａｎ  Ｐｕｔｔｅｎ  ２０１２）。このことの説得力のある例は、エクソンスキッピング（ＰＭＯを用いる）治療後のジストロフィンレベルを同じ組織内の筋機能と比較した研究に由来する。ジストロフィーｍｄｘマウスでは、マウス特異的ＰＭＯで処置した前脛骨（ＴＡ）筋は、応力誘発性（ｓｔｒｅｓｓ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ）収縮の後にその最大荷重容量（ｍａｘｉｍｕｍ  ｆｏｒｃｅ  ｃａｐａｃｉｔｙ）の約７５％を維持したが、未処置の反対側のＴＡ筋は、その最大荷重容量の約２５％しか維持しなかった（ｐ＜０．０５）（Ｓｈａｒｐ  ２０１１）。別の研究では、３匹のジストロフィーＣＸＭＤイヌ（２〜５月齢）に、５〜７週間にわたって週１回、又は２２週間にわたって２週間に１回、その遺伝子突然変異に特異的なＰＭＯを用いたエクソンスキッピング治療を受けさせた。エクソンスキッピング治療の後、３匹のイヌは全て、全身に及ぶ広範な骨格筋のジストロフィン発現を実証し、そしてベースラインに対して歩行運動（１５ｍ走行試験）が維持又は改善された。対照的に、未処置の同月齢のＣＸＭＤイヌは、研究を通して、歩行運動の顕著な低下を示した（Ｙｏｋｏｔａ  ２００９）。
【００９６】
ＰＭＯは、ｍｄｘマウスと、全ヒトＤＭＤ転写物を発現するヒト化ＤＭＤ（ｈＤＭＤ）マウスモデルとの両方において、等モル濃度でホスホロチオアートよりも高いエクソンスキッピング活性を有することが示された（Ｈｅｅｍｓｋｉｒｋ  ２００９）。正常ヒト骨格筋細胞、又はエクソン５１スキッピングに適している様々な突然変異を有するＤＭＤ患者からの筋細胞において、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）及びウエスタンブロット（ＷＢ）を用いたインビトロでの実験により、エクソン５１スキッピングの強力な誘発剤としてエテプリルセン（ＰＭＯ）が同定された。エテプリルセン誘発性のエクソン５１スキッピングは、ｈＤＭＤマウスモデルにおいてインビボで確認されている（Ａｒｅｃｈａｖａｌａ−Ｇｏｍｅｚａ  ２００７）。
【００９７】
ジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５３標的領域に特異的にハイブリダイズして、エクソン５３スキッピングを誘発するアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を分析するための臨床結果には、ジストロフィン陽性線維パーセント（ＰＤＰＦ）のベースラインからの増大、６分間歩行試験（６ＭＷＴ）、歩行運動の喪失（ＬＯＡ）、Ｎｏｒｔｈ  Ｓｔａｒ  Ａｍｂｕｌａｔｏｒｙ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ（ＮＳＡＡ）、肺機能検査（ＰＦＴ）、外部支援なしに立ち上がる能力（仰臥位から）、新規のジストロフィン産生及び他の機能尺度が含まれる。
【００９８】
ゴロディルセンは臨床試験において試験された。
【００９９】
試験４０５３−１０１
試験４０５３−１０１は、ＤＭＤ患者におけるＳＲＰ−４０５３（ゴロディルセン）の第Ｉ／ＩＩ相試験である。この試験は、エクソン５３スキッピングに適しているデュシェンヌ型筋ジストロフィー患者におけるＳＲＰ−４０５３の２パート、無作為化、二重盲検、プラセボ対照、用量漸増の安全性、耐容性、及び薬物動態試験（パート１）、並びにその後の非盲検の効力及び安全性評価（パート２）である。主要評価項目には、有害事象の発生［時間枠：約１２週間（パート１）］、６分間歩行試験（６ＭＷＴ）のベースラインからの変化［時間枠：１４４週間（パート２）］、及びジストロフィン陽性線維の割合［時間枠：４８週間（パート２）］が含まれる。副次評価項目には、血漿中の薬物濃度［時間枠：約１２週間（パート１）］、予測最大吸気圧（ＭＩＰ）％、予測最大呼気圧（ＭＥＰ）％［時間枠：１４４週間（パート２）］が含まれる。この試験のさらなる詳細は、ｗｗｗ．ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ（ＮＣＴ０２３１０９０６）において見出される。
【０１００】
ＩＩＩ．製剤及び投与様式
特定の実施形態では、本開示は、本明細書に記載されるようなアンチセンスオリゴヌクレオチドの治療的送達に適した製剤又は医薬組成物を提供する。したがって、特定の実施形態では、本開示は、本明細書に記載されるアンチセンスオリゴヌクレオチドの１つ又は複数を治療的に有効な量で含み、１つ又は複数の薬学的に許容される担体（添加剤）及び／又は希釈剤と一緒に製剤化された、薬学的に許容される組成物を提供する。本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドは単独で投与されることが可能であるが、化合物を医薬製剤（組成物）として投与するのが好ましい。
【０１０１】
核酸分子の送達のための方法は、例えば、Ａｋｈｔａｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．，２：１３９；及びＤｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ａｋｈｔａｒ編；Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＴ国際公開第９４／０２５９５号パンフレットに記載されている。これら及び他のプロトコルは、本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む実質的に任意の核酸分子を送達するために利用することができる。
【０１０２】
以下に詳述されるように、本開示の医薬組成物は、特に、以下のものに適合するものを含む、固体又は液体形態での投与のために製剤化され得る：（１）経口投与、例えば、水薬（水溶液若しくは非水溶液又は懸濁液）、錠剤、例えば、頬側、舌下、及び全身の吸収を標的とするもの、ボーラス、粉末、顆粒、舌に塗布するためのペースト；（２）非経口投与、例えば、無菌溶液若しくは懸濁液、又は持続放出製剤としての、例えば、皮下、筋肉内、静脈内又は硬膜外注射による投与；（３）局所適用、例えば、クリーム、軟膏、又は制御放出パッチ若しくはスプレーとしての、皮膚への適用；（４）腟内又は直腸内、例えば、ペッサリー、クリーム又はフォームとしての適用；（５）舌下；（６）眼内；（７）経皮；或いは（８）経鼻。
【０１０３】
薬学的に許容される担体としての役割を果たすことができる材料のいくつかの例としては、（１）糖、例えば、ラクトース、グルコース及びスクロース；（２）デンプン、例えば、コーンスターチ及びジャガイモデンプン；（３）セルロース及びその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース及び酢酸セルロース；（４）粉末トラガカント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）タルク；（８）賦形剤、例えば、ココアバター及び坐薬ワックス；（９）油、例えば、ピーナッツ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油及び大豆油；（１０）グリコール、例えば、プロピレングリコール；（１１）ポリオール、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレグリコール；（１２）エステル、例えば、オレイン酸エチル及びラウリン酸エチル；（１３）寒天；（１４）緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウム；（１５）アルギン酸；（１６）パイロジェンフリー水；（１７）等張生理食塩水；（１８）リンゲル溶液；（１９）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝溶液；（２１）ポリエステル、ポリカーボネート及び／又はポリ酸無水物；並びに（２２）医薬製剤中で使用される他の無毒性の適合性物質が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０４】
本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む製剤に適した薬剤の追加の非限定的な例としては、種々の組織への薬物の侵入を増強することができる、ＰＥＧコンジュゲート核酸、リン脂質コンジュゲート核酸、親油性部分を含有する核酸、ホスホロチオアート、Ｐ糖タンパク質阻害剤（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ８５など）；生分解性ポリマー、例えば、埋込み後の持続放出送達のためのポリ（ＤＬ−ラクチド−コグリコリド）ミクロスフェア（Ｅｍｅｒｉｃｈ，Ｄ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，８、４７−５８）Ａｌｋｅｒｍｅｓ，Ｉｎｃ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．；及び血液脳関門を横断して薬物を送達することができ、ニューロンの取り込み機構を変更することができる負荷ナノ粒子、例えば、ポリブチルシアノアクリラートで作られたもの（Ｐｒｏｇ  Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，２３，９４１−９４９，１９９９）が挙げられる。
【０１０５】
本開示は、ポリ（エチレングリコール）脂質を含有する表面修飾リポソーム（ＰＥＧ修飾された分枝状及び非分枝状若しくはその組合せ、又は長期循環リポソーム又はステルスリポソーム）を含む組成物の使用も特徴とする。本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、共有結合した種々の分子量のＰＥＧ分子を含むこともできる。これらの製剤は、標的組織における薬物の蓄積を増大させるための方法を提供する。この種類の薬物担体は、オプソニン化及び単核食細胞系（ＭＰＳ又はＲＥＳ）による除去に抵抗し、それにより、カプセル化薬物のより長い血液循環時間、及び増強された組織曝露が可能になる（Ｌａｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１９９５，９５，２６０１−２６２７；Ｉｓｈｉｗａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．１９９５，４３，１００５−１０１１）。このようなリポソームは、恐らく、血管新生した標的組織における血管外漏出及び捕獲によって、腫瘍中に選択的に蓄積することが示されている（Ｌａｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９５，２６７，１２７５−１２７６；Ｏｋｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１２３８，８６−９０）。長期循環リポソームは、特に、ＭＰＳの組織に蓄積することが知られている従来のカチオン性リポソームと比べて、ＤＮＡ及びＲＮＡの薬物動態及び薬力学を増強する（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９５，４２，２４８６４−２４８７０；Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＴ国際公開第９６／１０３９１号パンフレット；Ａｎｓｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＴ国際公開第９６／１０３９０号パンフレット；Ｈｏｌｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＴ国際公開第９６／１０３９２号パンフレット）。また長期循環リポソームは、肝臓及び脾臓などの代謝的に攻撃的なＭＰＳ組織における蓄積を回避するその能力に基づいて、カチオン性リポソームと比べてより大きい程度まで、薬物をヌクレアーゼ分解から保護する可能性もある。
【０１０６】
さらなる実施形態では、本開示は、米国特許第６，６９２，９１１号明細書、同第７，１６３，６９５号明細書及び同第７，０７０，８０７号明細書に記載されるような送達のために調製されたアンチセンスオリゴヌクレオチド医薬組成物を含む。これに関して、一実施形態では、本開示は、リジン及びヒスチジン（ＨＫ）のコポリマーを含む組成物（米国特許第７，１６３，６９５号明細書、同第７，０７０，８０７号明細書、及び同第６，６９２，９１１号明細書に記載される）中において、単独で又はＰＥＧ（例えば、分枝状若しくは非分枝状ＰＥＧ又は両方の混合物）と組み合わせて、ＰＥＧ及び標的部分と組み合わせて、又は上記のいずれかを架橋剤と組み合わせて、本開示のオリゴマーを提供する。特定の実施形態では、本開示は、グルコン酸修飾ポリヒスチジン又はグルコニル化ポリヒスチジン／トランスフェリン−ポリリジンを含む医薬組成物中のアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。当業者は、Ｈｉｓ及びＬｙｓに類似した特性を有するアミノ酸が組成物中で置換され得ることも認識するであろう。
【０１０７】
本明細書に記載されるアンチセンスオリゴヌクレオチドの特定の実施形態はアミノ又はアルキルアミノなどの塩基性官能基を含有することができ、したがって、薬学的に許容される酸と共に薬学的に許容される塩を形成することができる。これに関して、「薬学的に許容される塩」という用語は、本開示の化合物の比較的無毒性の無機酸及び有機酸付加塩を指す。これらの塩は、投与ビヒクル又は剤形の製造過程においてその場で調製することもできるし、或いは精製した遊離塩基形態の本開示の化合物を適切な有機酸又は無機酸と別個に反応させ、このようにして形成された塩をその後の精製の間に単離することによって調製することもできる。代表的な塩には、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、酢酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチル酸塩（ｎａｐｔｈｙｌａｔｅ）、メシル酸塩、グルコヘプトン酸塩、ラクトビオン酸塩、及びラウリルスルホン酸塩などが含まれる（例えば、Ｂｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）”Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ”，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９を参照）。
【０１０８】
本アンチセンスオリゴヌクレオチドの薬学的に許容される塩には、例えば無毒性の有機酸又は無機酸から得られる、化合物の従来の無毒性塩又は第４級アンモニウム塩が含まれる。例えば、このような従来の無毒性塩には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸などの無機酸から誘導された塩と、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パルミチン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、２−アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イソチオン酸などの有機酸から調製された塩とが含まれる。
【０１０９】
特定の実施形態では、本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つ又は複数の酸性官能基を含有することができ、したがって、薬学的に許容される塩基と共に薬学的に許容される塩を形成することができる。これらの例では、「薬学的に許容される塩」という用語は、本開示の化合物の比較的無毒性の無機塩基及び有機塩基付加塩を指す。これらの塩も同様に、投与ビヒクル又は剤形の製造過程においてその場で調製することもできるし、或いは精製した遊離酸形態の本開示の化合物を、適切な塩基、例えば、薬学的に許容される金属カチオンの水酸化物、炭酸塩若しくは重炭酸塩と、アンモニアと、又は薬学的に許容される有機第１級、第２級若しくは第３級アミンと別個に反応させることもできる。代表的なアルカリ塩又はアルカリ土類塩には、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、及びアルミニウム塩などが含まれる。塩基付加塩の形成に有用な代表的な有機アミンには、エチルアミン、ジエチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジンなどが含まれる（例えば、上記のＢｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．を参照）。
【０１１０】
ラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウムなどの湿潤剤、乳化剤及び潤滑剤、並びに着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、香味料及び香料、保存料及び抗酸化剤が組成物中に存在し得る。
【０１１１】
薬学的に許容される抗酸化剤の例としては、（１）水溶性抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど；（２）油溶性抗酸化剤、例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ−トコフェロールなど；及び（３）金属キレート剤、例えば、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などが挙げられる。
【０１１２】
本開示の製剤は、経口、経鼻、局所（頬側及び舌下を含む）、直腸、膣及び／又は非経口投与に適した製剤を含む。製剤は単位剤形で提供されるのが便利であり、薬学分野において周知である任意の方法によって調製することができる。単一の剤形を生じるために担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、処置される宿主、特定の投与様式によって異なる。単一の剤形を生じるために担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、一般的に、治療効果をもたらす化合物の量となる。一般的に、１００パーセントのうち、この量は、約０．１パーセント〜約９９パーセント、好ましくは約５パーセント〜約７０パーセント、最も好ましくは約１０パーセント〜約３０パーセントの活性成分の範囲となる。
【０１１３】
特定の実施形態では、本開示の製剤は、シクロデキストリン、セルロース、リポソーム、ミセル形成剤、例えば、胆汁酸、及び高分子担体、例えば、ポリエステル及びポリ酸無水物から選択される賦形剤と、本開示のオリゴマーとを含む。特定の実施形態では、上述の製剤は、本開示のオリゴマーを経口的に生体利用可能にする。
【０１１４】
これらの製剤又は医薬組成物を調製する方法は、本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドと、担体及び任意選択的に１つ又は複数の補助成分とを関連させるステップを含む。一般的に、製剤は、本開示の化合物と、液体担体、若しくは微粉化した固体担体、又はその両方とを均一且つ密接に関連させ、次に必要であれば、生成物を成形することによって調製される。
【０１１５】
経口投与に適した本開示の製剤は、カプセル、カシェ剤、丸剤、錠剤、ロゼンジ（風味付けされた基剤、通常は、スクロース及びアカシア又はトラガカントを用いる）、粉末、顆粒の形態で、又は水性若しくは非水性液体中の溶液若しくは懸濁液として、又は水中油若しくは油中水液体エマルションとして、又はエリキシル若しくはシロップとして、又は香錠（不活性基剤、例えば、ゼラチン及びグリセリン、又はスクロース及びアカシアを用いる）として、及び／又はマウスウォッシュなどとしての形態でよく、これらはそれぞれ、所定量の本開示の化合物を活性成分として含有する。本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ボーラス、舐剤又はペーストとして投与されてもよい。
【０１１６】
経口投与のための本開示の固体剤形（カプセル、錠剤、丸剤、糖衣錠、粉末、顆粒、トローチ（ｔｒｏｕｃｈｅｓ）など）において、活性成分は、クエン酸ナトリウム若しくはリン酸二カルシウムなどの１つ又は複数の薬学的に許容される担体、及び／又は以下のうちいずれかのものと混合され得る：（１）充填剤又は増量剤、例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、及び／又はケイ酸；（２）結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース及び／又はアカシアなど；（３）保湿剤、例えば、グリセロール；（４）崩壊剤、例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモ又はタピオカデンプン、アルギン酸、特定のケイ酸塩、及び炭酸ナトリウム；（５）溶解遅延剤、例えば、パラフィン；（６）吸収促進剤、例えば、第４級アンモニウム化合物、並びに界面活性剤、例えば、ポロキサマー及びラウリル硫酸ナトリウム；（７）湿潤剤、例えば、セチルアルコール、モノステアリン酸グリセロール、及び非イオン性界面活性剤など；（８）吸収剤、例えば、カオリン及びベントナイトクレイ；（９）潤滑剤、例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸、及びこれらの混合物；（１０）着色剤；並びに（１１）制御放出剤、例えば、クロスポビドン又はエチルセルロース。カプセル、錠剤及び丸剤の場合、医薬組成物は、緩衝剤も含み得る。同様のタイプの固体医薬組成物は、ラクトース又は乳糖のような賦形剤、及び高分子量ポリエチレングリコールなどを用いて、ソフト及びハード殻ゼラチンカプセル中の充填剤として使用されてもよい。
【０１１７】
錠剤は、任意選択的に１つ又は複数の補助成分と共に、圧縮又は成形によって製造され得る。圧縮錠剤は、結合剤（例えば、ゼラチン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース）、潤滑剤、不活性希釈剤、保存料、崩壊剤（例えば、デンプングリコール酸ナトリウム又は架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム）、界面活性剤又は分散剤を用いて調製され得る。成形錠剤は、適切な機械において不活性液体希釈剤で湿潤させた粉末化合物の混合物を成形することによって製造され得る。
【０１１８】
本開示の医薬組成物の錠剤及び他の固体剤形、例えば、糖衣錠、カプセル、丸剤及び顆粒は、任意選択的に、割線が付けられてもよいし、或いはコーティング及び殻、例えば、製薬分野で周知の腸溶コーティング及び他のコーティングを用いて調製されてもよい。これらは、例えば、所望の放出プロファイルを提供するために様々な割合のヒドロキシプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、リポソーム及び／又はミクロスフェアを用いて、その中の活性成分の遅延又は制御放出を提供するように製剤化されてもよい。これらは、急速放出のために製剤化されてもよく、例えば、凍結乾燥されてもよい。これらは、例えば、細菌保持フィルターによるろ過によって、或いは使用の直前に滅菌水、又は何らかの他の無菌注射用媒体中に溶解させることができる無菌の固体医薬組成物の形態の滅菌剤を取り込むことによって滅菌され得る。またこれらの医薬組成物は、任意選択的に乳白剤を含有していてもよく、活性成分を胃腸管の特定の部分においてのみ又はその部分で優先的に、任意選択的に遅延様式で、放出する組成を有していてもよい。使用可能な包埋組成物の例としては、高分子物質及びワックスが挙げられる。活性成分は、適切な場合には上記の賦形剤の１つ又は複数を含む、マイクロカプセル化形態であり得る。
【０１１９】
本開示の化合物の経口投与のための液体剤形には、薬学的に許容されるエマルション、マイクロエマルション、溶液、懸濁液、シロップ及びエリキシルが含まれる。活性成分に加えて、液体剤形は、当該技術分野で一般的に使用される不活性希釈剤、可溶化剤及び乳化剤、例えば、水又は他の溶媒など、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油（特に、綿実油、ラッカセイ油、コーン油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ及びゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール及びソルビタンの脂肪酸エステル、並びにこれらの混合物を含有し得る。
【０１２０】
不活性希釈剤に加えて、経口医薬組成物は、補助剤、例えば、湿潤剤、乳化剤及び懸濁化剤、甘味剤、香味料、着色剤、香料及び保存料を含むこともできる。
【０１２１】
懸濁液は、活性化合物に加えて、例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール及びソルビタンエステル、微結晶性セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天及びトラガカント、並びにこれらの混合物としての懸濁化剤を含有し得る。
【０１２２】
直腸又は膣内投与のための製剤は坐薬として提供されてもよく、これは、１つ又は複数の本開示の化合物と、例えば、ココアバター、ポリエチレングリコール、坐薬ワックス又はサリチラートを含む１つ又は複数の適切な非刺激性の賦形剤又は担体とを混合することにより調製することができ、そして室温で固体であるが、体温では液体であり、したがって、直腸又は膣腔内で融解して活性化合物を放出することになる。
【０１２３】
本明細書で提供されるオリゴマーの局所又は経皮投与のための製剤又は剤形には、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチ及び吸入剤が含まれる。活性アンチセンスオリゴヌクレオチドは、薬学的に許容される担体、及び必要とされ得る任意の保存料、緩衝剤、又は噴射剤と無菌条件下で混合され得る。軟膏、ペースト、クリーム及びゲルは、本開示の活性化合物に加えて、賦形剤、例えば、動物及び植物性脂肪、油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルク及び酸化亜鉛、又はこれらの混合物を含有し得る。
【０１２４】
粉末及びスプレーは、本開示のオリゴマーに加えて、賦形剤、例えば、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム及びポリアミド粉末、又はこれらの物質の混合物を含有することができる。スプレーは、付加的に、通例の噴射剤、例えば、クロロフルオロ炭化水素並びにブタン及びプロパンなどの揮発性非置換炭化水素を含有することができる。
【０１２５】
経皮パッチは、本開示のオリゴマーの身体への制御送達を提供するというさらなる利点を有する。このような剤形は、オリゴマーを適切な媒体中に溶解又は分散させることによって製造することができる。また吸収増強剤を使用して、皮膚を通過する薬剤の流動を増大させることもできる。このような流動の速度は、当該技術分野で知られている方法の中でも特に、速度制御膜を提供するか、又は薬剤をポリマーマトリックス又はゲル中に分散させることによって制御することができる。
【０１２６】
非経口投与に適した医薬組成物は、１つ又は複数の本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、１つ又は複数の薬学的に許容される無菌等張水溶液若しくは非水溶液、分散液、懸濁液又はエマルション、或いは使用の直前に無菌注射用溶液又は分散液中に再構成され得る無菌粉末と組み合わせて含むことができ、これらは、糖、アルコール、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、意図されるレシピエントの血液と製剤を等張にする溶質、又は懸濁化剤若しくは増粘剤を含有し得る。本開示の医薬組成物中で使用され得る適切な水性及び非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、及びこれらの適切な混合物、オリーブ油などの植物油、並びにオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルが挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用により、分散液の場合には必要とされる粒径の維持により、そして界面活性剤の使用により維持することができる。
【０１２７】
またこれらの医薬組成物は、保存料、湿潤剤、乳化剤及び分散剤などの補助剤を含有していてもよい。本アンチセンスオリゴヌクレオチドに対する微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などを包含させることによって保証され得る。また等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウムなどを組成物中に包含させることが望ましいこともある。加えて、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの吸収を遅延させる薬剤を包含させることにより、注射用医薬品形態の長期にわたる吸収がもたらされ得る。
【０１２８】
場合により、薬物の効果を長くするために、皮下又は筋肉内注射からの薬物の吸収を遅くすることが望ましい。これは、当該技術分野で知られている方法の中でも特に、水溶性が乏しい結晶性材料又は非晶質材料の液体懸濁液の使用によって達成され得る。次に、薬物の吸収の速度はその溶解速度に依存し、次には、結晶サイズ及び結晶形態に依存し得る。或いは、非経口投与される薬物形態の遅延吸収は、薬物を油ビヒクル中に溶解又は懸濁させることによって達成される。
【０１２９】
注射用デポー形態は、ポリ乳酸−ポリグリコリドなどの生分解性ポリマー中で本アンチセンスオリゴヌクレオチドのマイクロカプセルマトリックスを形成することによって製造することができる。オリゴマー対ポリマー比、及び使用される特定のポリマーの性質に応じて、オリゴマー放出速度は制御され得る。他の生分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル）及びポリ（酸無水物）が挙げられる。またデポー注射用製剤は、身体組織と適合性のリポソーム又はマイクロエマルション内に薬物を捕捉することによって調製されてもよい。
【０１３０】
本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドを医薬品としてヒト及び動物に投与する場合、それ自体で、又は例えば０．１〜９９％（より好ましくは、１０〜３０％）の活性成分を薬学的に許容される担体と組み合わせて含有する医薬組成物として、与えることができる。
【０１３１】
上記のように、本開示の製剤又は調製物は、経口的、非経口的、局所的、又は経直腸的に与えられてもよい。これらは、通常、各投与経路に適した形態で与えられる。例えば、これらは、錠剤又はカプセル形態で、注射、吸入、目薬、軟膏、坐薬などにより、注射、点滴又は吸入による投与で；ローション又は軟膏により局所的に；及び坐薬により直腸で投与される。
【０１３２】
選択される投与経路に関わらず、適切な水和形態で使用され得る本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチド、及び／又は本開示の医薬組成物は、当業者に知られている従来の方法によって、薬学的に許容される剤形に製剤化され得る。本開示の医薬組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、患者に対して許容されない毒性を伴うことなく、特定の患者、組成物、及び投与様式にとって所望の治療応答を達成するのに有効な活性成分の量を得るように変化され得る。
【０１３３】
選択される投与量レベルは、使用される本開示の特定のオリゴマー又はそのエステル、塩若しくはアミドの活性、投与経路、投与の時間、使用される特定のオリゴマーの排泄又は代謝速度、吸収の速度及び程度、処置の期間、使用される特定のオリゴマーと組み合わせて使用される他の薬物、化合物及び／又は材料、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、一般的健康及び過去の病歴、並びに医学分野で周知の同様の因子を含む様々な因子に依存し得る。
【０１３４】
当該技術分野において通常の技能を有する医師又は獣医は、必要とされる医薬組成物の有効量を容易に決定及び処方することができる。例えば、医師又は獣医は、医薬組成物中で使用される本開示の化合物の用量を、所望の治療効果を達成するために必要とされるレベルよりも低いレベルで開始して、所望の効果が達成されるまで投与量を徐々に増加させることができる。一般に、本開示の化合物の適切な１日の用量は、治療効果を生じるために有効な最小用量である化合物の量となる。このような有効用量は、一般に、上記の因子に依存し得る。一般に、本開示の化合物の患者に対する経口、静脈内、脳室内及び皮下用量は、示される効果のために使用される場合、１日に体重１キログラム当たり約０．０００１〜約１００ｍｇの範囲となる。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、通常、約４〜１６０ｍｇ／ｋｇ、１０〜１６０ｍｇ／ｋｇ、又は２０〜１６０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。場合により、１６０ｍｇ／ｋｇよりも多い用量が必要とされることもある。いくつかの実施形態では、例えばｉ．ｖ．投与などの非経口用量は、約０．５ｍｇ〜１６０ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約４ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１１ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、１４ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、１７ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２１ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、２６ｍｇ／ｋｇ、２７ｍｇ／ｋｇ、２８ｍｇ／ｋｇ、２９ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、３１ｍｇ／ｋｇ、３２ｍｇ／ｋｇ、３３ｍｇ／ｋｇ、３４ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ、３６ｍｇ／ｋｇ、３７ｍｇ／ｋｇ、３８ｍｇ／ｋｇ、３９ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、４１ｍｇ／ｋｇ、４２ｍｇ／ｋｇ、４３ｍｇ／ｋｇ、４４ｍｇ／ｋｇ、４５ｍｇ／ｋｇ、４６ｍｇ／ｋｇ、４７ｍｇ／ｋｇ、４８ｍｇ／ｋｇ、４９ｍｇ／ｋｇ  ５０ｍｇ／ｋｇ、５１ｍｇ／ｋｇ、５２ｍｇ／ｋｇ、５３ｍｇ／ｋｇ、５４ｍｇ／ｋｇ、５５ｍｇ／ｋｇ、５６ｍｇ／ｋｇ、５７ｍｇ／ｋｇ、５８ｍｇ／ｋｇ、５９ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、６５ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、７５ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、８５ｍｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇ、９５ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、１０５ｍｇ／ｋｇ、１１０ｍｇ／ｋｇ、１１５ｍｇ／ｋｇ、１２０ｍｇ／ｋｇ、１２５ｍｇ／ｋｇ、１３０ｍｇ／ｋｇ、１３５ｍｇ／ｋｇ、１４０ｍｇ／ｋｇ、１４５ｍｇ／ｋｇ、１５０ｍｇ／ｋｇ、１５５ｍｇ／ｋｇ、１６０ｍｇ／ｋｇ（その間の全ての整数を含む）の用量で投与される。いくつかの実施形態では、オリゴマーは３０ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態では、オリゴマーは４０ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態では、オリゴマーは６０ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態では、オリゴマーは８０ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態では、オリゴマーは１６０ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態では、オリゴマーは５０ｍｇ／ｋｇで投与される。
【０１３６】
所望により、活性化合物の有効な１日の用量は、任意選択的に単位剤形で、１日の間に適切な間隔を置いて投与される２、３、４、５、６又はそれ以上のサブ用量として投与され得る。特定の状況では、機能性ジストロフィンタンパク質の所望の発現を維持するために、必要に応じて、投薬は、１日当たり１回の投与である。特定の実施形態では、投薬は、２日毎、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎、７日毎、８日毎、９日毎、１０日毎、１１日毎、１２日毎、１３日毎、１４日毎、又は１週間毎、２週間毎、３週間毎、４週間毎、５週間毎、６週間毎、７週間毎、８週間毎、９週間毎、１０週間毎、１１週間毎、１２週間毎、又は１か月毎、２か月毎、３か月毎、４か月毎、５か月毎、６か月毎、７か月毎、８か月毎、９か月毎、１０か月毎、１１か月毎、１２か月毎に、１回又は複数回の投与である。特定の実施形態では、投薬は、毎週１回の１回の投与である。特定の実施形態では、投薬は、２週間に１回の１回又は複数回の投与である。いくつかの実施形態では、投薬は、２週間に１回の１回の投与である。種々の実施形態では、投薬は、毎月の１回又は複数回の投与である。特定の実施形態では、投薬は、毎月の１回の投与である。
【０１３７】
種々の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、毎週４ｍｇ／ｋｇで投与される。種々の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、毎週１０ｍｇ／ｋｇで投与される。種々の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、毎週２０ｍｇ／ｋｇで投与される。種々の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、毎週３０ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、毎週４０ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、毎週６０ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、毎週８０ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、毎週１００ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、毎週１６０ｍｇ／ｋｇで投与される。本明細書で使用される場合、毎週は、当該技術分野で認められる週１回という意味を有すると理解される。
【０１３８】
種々の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、隔週に４ｍｇ／ｋｇで投与される。種々の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、隔週に１０ｍｇ／ｋｇで投与される。種々の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、隔週に２０ｍｇ／ｋｇで投与される。種々の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、隔週に３０ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、隔週に４０ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、隔週に６０ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、隔週に８０ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、隔週に１００ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、隔週に１６０ｍｇ／ｋｇで投与される。本明細書で使用される場合、隔週は、当該技術分野で認められる２週間に１回という意味を有すると理解される。
【０１３９】
種々の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、３週間毎に４ｍｇ／ｋｇで投与される。種々の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、３週間毎に１０ｍｇ／ｋｇで投与される。種々の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、３週間毎に２０ｍｇ／ｋｇで投与される。種々の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、３週間毎に３０ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、３週間毎に４０ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、３週間毎に６０ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、３週間毎に８０ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、３週間毎に１００ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、３週間毎に１６０ｍｇ／ｋｇで投与される。本明細書で使用される場合、３週間毎は、当該技術分野で認められる３週間に１回という意味を有すると理解される。
【０１４０】
種々の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、毎月４ｍｇ／ｋｇで投与される。種々の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、毎月１０ｍｇ／ｋｇで投与される。種々の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、毎月２０ｍｇ／ｋｇで投与される。種々の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、毎月３０ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、毎月４０ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、毎月６０ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、毎月８０ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、毎月１００ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、毎月１６０ｍｇ／ｋｇで投与される。本明細書で使用される場合、毎月は、当該技術分野で認められる月１回という意味を有すると理解される。
【０１４１】
当該技術分野で理解され得るように、毎週、隔週、３週間毎、又は毎月の投与は、１回若しくは複数回の投与又は上記のようなサブ用量でよい。
【０１４２】
核酸分子は、リポソーム中のカプセル化、イオン導入法、又はヒドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプセル、及び生体接着ミクロスフェアなどの本明細書に記載され、そして当該技術分野で知られている他のビヒクルへの組込みを含むがこれらに限定されない、当業者に知られている様々な方法によって細胞に投与することができる。特定の実施形態では、マイクロエマルション化技術用いて、親油性（水に不溶性）医薬品のバイオアベイラビリティを改善し得る。例としては、Ｔｒｉｍｅｔｒｉｎｅ（Ｄｏｒｄｕｎｏｏ，Ｓ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，１７（１２），１６８５−１７１３，１９９１）及びＲＥＶ  ５９０１（Ｓｈｅｅｎ，Ｐ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ８０（７），７１２−７１４，１９９１）が挙げられる。いくつかの利益の中で特に、マイクロエマルション化は、吸収を循環系の代わりにリンパ系に対して優先的に方向付け、それにより肝臓を迂回し、肝胆道循環中の化合物の破壊を防止することによって、バイオアベイラビリティの増強を提供する。
【０１４３】
本開示の１つの態様では、製剤は、本明細書で提供されるオリゴマーと、少なくとも１つの両親媒性担体とから形成されるミセルを含有し、ここで、ミセルは、約１００ｎｍ未満の平均直径を有する。より好ましい実施形態では、約５０ｎｍ未満の平均直径を有するミセルが提供され、さらにより好ましい実施形態では、約３０ｎｍ未満、又はさらに約２０ｎｍ未満の平均直径を有するミセルが提供される。
【０１４４】
全ての適切な両親媒性担体が企図されるが、現在好ましい担体は一般的に、一般に安全と認められる（ＧＲＡＳ）状態を有し、本開示の化合物を可溶すると共に、その後の段階で溶液が複合水相（例えば、ヒト胃腸管において見出されるものなど）と接触するときにそれをマイクロエマルション化することができるものである。通常、これらの要件を満たす両親媒性成分は２〜２０のＨＬＢ（親水性対親油性バランス）値を有し、その構造は、Ｃ−６〜Ｃ−２０の範囲の直鎖脂肪族ラジカルを含有する。例としては、ポリエチレン−グリコール化脂肪グリセリド及びポリエチレングリコールがある。
【０１４５】
両親媒性担体の例としては、飽和及び単不飽和ポリエチレングリコール化脂肪酸グリセリド、例えば、完全又は部分的に水素化された種々の植物油から得られるものが挙げられる。このような油は、有利には、トリ−、ジ−、及びモノ−脂肪酸グリセリド、並びに対応する脂肪酸のジ−及びモノ−ポリエチレングリコールエステルで構成されることができ、特に好ましい脂肪酸組成物は、カプリン酸４〜１０％、カプリン酸３〜９％、ラウリン酸４０〜５０％、ミリスチン酸１４〜２４％、パルミチン酸４〜１４％及びステアリン酸５〜１５％を含む。別の有用な種類の両親媒性担体には、飽和又は単不飽和脂肪酸との部分エステル化ソルビタン及び／又はソルビトール（ＳＰＡＮ（登録商標）シリーズ）、又は対応するエトキシル化類似体（ＴＷＥＥＮ（登録商標）シリーズ）が含まれる。
【０１４６】
Ｇｅｌｕｃｉｒｅシリーズ、Ｌａｂｒａｆｉｌ、Ｌａｂｒａｓｏｌ、又はＬａｕｒｏｇｌｙｃｏｌ（全て、Ｇａｔｔｅｆｏｓｓｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｉｎｔ  Ｐｒｉｅｓｔ，Ｆｒａｎｃｅにより製造及び流通される）、ＰＥＧ−モノ−オレアート、ＰＥＧ−ジ−オレアート、ＰＥＧ−モノ−ラウラート及びジ−ラウラート、レシチン、ポリソルベート８０など（米国及び世界のいくつかの会社により製造及び流通される）を含む市販の両親媒性担体は特に有用であり得る。
【０１４７】
特定の実施形態では、本開示の医薬組成物を適切な宿主細胞に導入するために、送達は、リポソーム、ナノカプセル、微粒子、ミクロスフェア、脂質粒子、ベシクルなどの使用により行うことができる。特に、本開示の医薬組成物は、脂質粒子、リポソーム、ベシクル、ナノスフェア、ナノ粒子などのいずれかにカプセル化された送達のために製剤化され得る。このような送達ビヒクルの製剤化及び使用は、既知の従来の技術を用いて実行することができる。
【０１４８】
本開示における使用に適した親水性ポリマーは、容易に水溶性であり、ベシクル形成脂質と共有結合し、且つ毒性効果を伴うことなくインビボで耐容性を示す（すなわち、生体適合性である）ものである。適切なポリマーには、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ乳酸（ポリラクチドとも呼ばれる）、ポリグリコール酸（ポリグリコリドとも呼ばれる）、ポリ乳酸−ポリグリコール酸コポリマー、及びポリビニルアルコールが含まれる。特定の実施形態では、ポリマーは、約１００若しくは１２０ダルトンから約５，０００若しくは１０，０００ダルトンまで、又は約３００ダルトンから〜約５，０００ダルトンまでの分子量を有する。他の実施形態では、ポリマーは、約１００〜約５，０００ダルトンの分子量を有する、又は約３００〜約５，０００ダルトンの分子量を有するポリエチレングリコールである。特定の実施形態では、ポリマーは、７５０ダルトンのポリエチレングリコール（ＰＥＧ（７５０））である。またポリマーはその中のモノマーの数によっても定義することができ、本開示の好ましい実施形態は少なくとも約３つのモノマーのポリマー、例えば、３つのモノマーからなるＰＥＧポリマー（約１５０ダルトン）を使用する。
【０１４９】
本開示での使用に適し得る他の親水性ポリマーには、ポリビニルピロリドン、ポリメトキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、及びヒドロキシメチルセルロース又はヒドロキシエチルセルロースなどの誘導体化セルロースが含まれる。
【０１５０】
特定の実施形態では、本開示の製剤は、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレン、アクリル酸及びメタクリル酸エステルのポリマー、ポリビニルポリマー、ポリグリコリド、ポリシロキサン、ポリウレタン及びそのコポリマー、セルロース、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、乳酸及びグリコール酸のポリマー、ポリ酸無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリ（酪酸（ｂｕｔｉｃ  ａｃｉｄ））、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド−コ−カプロラクトン）、多糖、タンパク質、ポリヒアルロン酸、ポリシアノアクリラート、並びにこれらのブレンド、混合物、又はコポリマーからなる群から選択される生体適合性ポリマーを含む。
【０１５１】
シクロデキストリンは、６個、７個又は８個のグルコース単位からなる環状オリゴ糖であり、それぞれ、ギリシャ文字α、β、又はγで指定される。グルコース単位は、α−１，４−グルコシド結合によって連結される。糖単位のいす形配座の結果、第２級ヒドロキシル基（Ｃ−２、Ｃ−３にある）は全て環の一方の側に位置し、Ｃ−６の第１級ヒドロキシル基は全て他方の側に位置する。結果として、外面が親水性であり、シクロデキストリンは水溶性になる。対照的に、シクロデキストリンの空洞は、Ｃ−３及びＣ−５原子の水素、及びエーテル様酸素によって覆われているために疎水性である。これらのマトリックスにより、例えば１７α−エストラジオールなどのステロイド化合物を含む様々な比較的疎水性の化合物との複合体形成が可能になる（例えば、ｖａｎ  Ｕｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓ．Ｏｒｇ．Ｃｕｌｔ．３８：１−３−１１３（１９９４）を参照）。複合体形成は、ファンデルワールス相互作用及び水素結合形成によって生じる。シクロデキストリンの化学的性質の概説については、Ｗｅｎｚ，Ａｇｎｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３３：８０３−８２２（１９９４）を参照されたい。
【０１５２】
シクロデキストリン誘導体の物理化学的特性は、その種類及び置換度に強く依存する。例えば、これらの水中での溶解性は、不溶性（例えば、トリアセチル−ベータ−シクロデキストリン）から、１４７％可溶性（ｗ／ｖ）（Ｇ−２−ベータ−シクロデキストリン）までの範囲である。さらに、これらは、多数の有機溶媒に可溶性である。シクロデキストリンの特性は、その溶解性を増大又は低下させることにより、種々の製剤成分の溶解性の制御を可能にする。
【０１５３】
多数のシクロデキストリン及びその調製方法が記載されている。例えば、Ｐａｒｍｅｔｅｒ（Ｉ），ｅｔ  ａｌ．（米国特許第３，４５３，２５９号明細書）及びＧｒａｍｅｒａ，ｅｔ  ａｌ．（米国特許第３，４５９，７３１号明細書）は、電気的に中性のシクロデキストリンを記載した。他の誘導体には、カチオン特性を有するシクロデキストリン［Ｐａｒｍｅｔｅｒ（ＩＩ）、米国特許第３，４５３，２５７号明細書］、不溶性架橋シクロデキストリン（Ｓｏｌｍｓ，米国特許第３，４２０，７８８号明細書）、及びアニオン特性を有するシクロデキストリン［Ｐａｒｍｅｔｅｒ（ＩＩＩ），米国特許第３，４２６，０１１号明細書］が含まれる。アニオン特性を有するシクロデキストリン誘導体の中には、カルボン酸、亜リン酸、亜ホスフィン酸、ホスホン酸、リン酸、チオホスホン酸、チオスルフィン酸、及びスルホン酸が親シクロデキストリンに付加されたものがある［上記のＰａｒｍｅｔｅｒ（ＩＩＩ）を参照］。さらに、Ｓｔｅｌｌａ，ｅｔ  ａｌ．（米国特許第５，１３４，１２７号明細書）によって、スルホアルキルエーテルシクロデキストリン誘導体が記載されている。
【０１５４】
リポソームは、水性内部区画を包囲する少なくとも１つの脂質二重層膜からなる。リポソームは、膜のタイプ及びサイズによって特徴付けることができる。小さい単層ベシクル（ＳＵＶ）は単一の膜を有し、通常、直径が０．０２〜０．０５μｍの範囲であり；大きい単層ベシクル（ＬＵＶ）は通常０．０５μｍよりも大きい。オリゴラメラ（ｏｌｉｇｏｌａｍｅｌｌａｒ）の大きいベシクル及び多重層ベシクルは、通常は同心円状の複数の膜層を有し、通常、０．１μｍよりも大きい。いくつかの非同心円状の膜を有するリポソーム、すなわち、より大きいベシクル内にいくつかのより小さいベシクルが含有されたものは、多胞性ベシクルと呼ばれる。
【０１５５】
本開示の１つの態様は、本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有するリポソームを含む製剤に関し、ここで、リポソーム膜は、積載容量が増大されたリポソームを提供するように配合される。代替的に又は付加的に、本開示の化合物はリポソームのリポソーム二重層内に含有されてもよいし、又はリポソーム二重層上に吸着されてもよい。本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドは脂質界面活性剤により凝集され、リポソームの内部空間に支持され得る；これらの場合、リポソーム膜は、活性剤−界面活性剤凝集体の破壊効果に抵抗するように配合される。
【０１５６】
本開示の一実施形態によると、リポソームの脂質二重層は、ＰＥＧ鎖が脂質二重層の内側表面からリポソームでカプセル化された内部空間内に伸長し、そして脂質二重層の外部から周囲環境に伸長するように、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で誘導体化された脂質を含有する。
【０１５７】
本開示のリポソーム内に含有される活性剤は、可溶化形態である。界面活性剤及び活性剤の凝集体（例えば、目的の活性剤を含有するエマルション又はミセルなど）は、本開示に従うリポソームの内部空間内に捕捉され得る。界面活性剤は活性剤を分散及び可溶化する作用をし、様々な鎖長（例えば、約Ｃ１４〜約Ｃ２０）の生体適合性リゾホスファチジルコリン（ＬＰＧ）を含むがこれらに限定されない、任意の適切な脂肪族、脂環式又は芳香族界面活性剤から選択され得る。またＰＥＧ−脂質などのポリマー誘導体化脂質はミセル／膜融合を阻害する作用をし、ポリマーの界面活性剤分子への添加は界面活性剤のＣＭＣを低下させ、ミセル形成に役立つので、ポリマー誘導体化脂質はミセル形成のために使用され得る。好ましいのは、マイクロモル範囲内のＣＭＯを有する界面活性剤であり；より高いＣＭＣの界面活性剤を用いて、本開示のリポソーム内に捕捉されたミセルを調製してもよい。
【０１５８】
本開示に従うリポソームは、当該技術分野で知られている様々な技術のいずれかによって調製され得る。例えば、米国特許第４，２３５，８７１号明細書；ＰＣＴ国際公開第９６／１４０５７号パンフレット；Ｎｅｗ  ＲＲＣ，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９９０），Ｐａｇｅｓ  ３３−１０４頁；Ｌａｓｉｃ  ＤＤ，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐｈｙｓｉｃｓ  ｔｏ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  ＢＶ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９９３を参照されたい。例えば、本開示のリポソームは、リポソーム中に所望される誘導体化脂質の最終モルパーセントに相当する脂質濃度で、親水性ポリマーで誘導体化された脂質を予め形成したリポソーム内に拡散させることによって、例えば、予め形成したリポソームを、脂質グラフトポリマーからなるミセルに曝露することによって調製され得る。親水性ポリマーを含有するリポソームは、当該技術分野で知られているように、均質化、脂質領域水和、又は押出技術によって形成することもできる。
【０１５９】
別の例示的な製剤化手順では、活性剤はまず音波処理により、疎水性分子を容易に可溶化させるリゾホスファチジルコリン又は他の低ＣＭＣ界面活性剤（ポリマーグラフト脂質を含む）中に分散される。次に、得られた活性剤のミセル懸濁液を用いて、適切なモルパーセントのポリマーグラフト脂質又はコレステロールを含有する乾燥脂質サンプルを再水和させる。次に、当該技術分野で知られている押出技術を用いて、脂質及び活性剤懸濁液はリポソームに形成され、得られたリポソームは、標準的なカラム分離により、非カプセル化溶液から分離される。
【０１６０】
本開示の１つの態様では、リポソームは、選択されたサイズ範囲の実質的に均一なサイズを有するように調製される。１つの効果的なサイジング方法は、選択された均一の細孔径を有する一連のポリカーボネート膜を通してリポソームの水性懸濁液を押し出すことを含み；膜の細孔径は、その膜による押出によって生じるリポソームの最大サイズにほぼ相当する。例えば、米国特許第４，７３７，３２３号明細書（１９８８年４月１２日）を参照されたい。特定の実施形態では、ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ（登録商標）及びリポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ）（登録商標）などの試薬を用いて、ポリヌクレオチド又はタンパク質を細胞内に導入することができる。
【０１６１】
本開示の製剤の放出特性は、カプセル化材料、カプセル化薬物の濃度、及び放出調整剤の存在に依存する。例えば、胃内のように低いｐＨのみで、又は腸内のようにより高いｐＨのみで放出するｐＨ感受性コーティングを用いて、放出は、例えば、ｐＨ依存性であるように操作することができる。腸溶コーティングを使用して、胃を通過するまで放出を起こさせないことができる。多数のコーティング又は様々な材料内にカプセル化されたシアナミドの混合物を使用して、最初に胃内での放出、その後に腸内での放出を得ることができる。水の取込み又はカプセルからの拡散による薬物の放出を増大させることができる塩又は細孔形成剤を包含させることによって、放出を操作することもできる。薬物の溶解性を変更する賦形剤も、放出速度を制御するために使用することができる。マトリックスの分解又はマトリックスからの放出を増強する薬剤も取り込むことができる。これらは化合物に応じて、薬物に添加することも、別個の相として（すなわち、微粒子として）添加することも、又はポリマー相中に共溶解させることもできる。ほとんどの場合、その量は、０．１〜３０パーセント（ｗ／ｗポリマー）にすべきである。分解増強剤のタイプには、硫酸アンモニウム及び塩化アンモニウムなどの無機塩、クエン酸、安息香酸、及びアスコルビン酸などの有機酸、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸カルシウム、炭酸亜鉛、及び水酸化亜鉛などの無機塩基、及び硫酸プロタミン、スペルミン、コリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、及びトリエタノールアミンなどの有機塩基、並びにＴｗｅｅｎ（登録商標）及びＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）などの界面活性剤が含まれる。マトリックスに微細構造を加える細孔形成剤（すなわち、無機塩及び糖などの水溶性化合物）は、微粒子として添加される。その範囲は、通常、１〜３０パーセント（ｗ／ｗポリマー）である。
【０１６２】
取込みは、粒子の腸内の滞留時間を変更することによって操作することもできる。これは、例えば、粘膜接着性ポリマーで粒子をコーティングするか、又は粘膜接着性ポリマーをカプセル化材料として選択することによって達成することができる。例としては、遊離カルボキシル基を有する大部分のポリマー、例えば、キトサン、セルロース、特にポリアクリラート（本明細書で使用される場合、ポリアクリラートは、アクリラート基、並びにシアノアクリラート及びメタクリラートなどの修飾アクリラート基を含むポリマーを指す）が挙げられる。
【０１６３】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、外科若しくは医療デバイス又はインプラント内に含有されるように製剤化されるか、或いは外科若しくは医療デバイス又はインプラントによって放出されるように適合され得る。特定の態様では、インプラントは、アンチセンスオリゴヌクレオチドでコーティングされてもよいし、或いは他の方法で、アンチセンスオリゴヌクレオチドにより処理されてもよい。例えば、ヒドロゲル、又は他のポリマー、例えば、生体適合性及び／又は生分解性ポリマーは、インプラントを本開示の医薬組成物でコーティングするために使用され得る（すなわち、組成物は、ヒドロゲル又は他のポリマーを用いることにより、医療デバイスと共に使用するように適合され得る）。医療デバイスを薬剤でコーティングするためのポリマー及びコポリマーは当該技術分野においてよく知られている。インプラントの例としては、ステント、薬剤溶出ステント、縫合糸、人工器官、血管カテーテル、透析カテーテル、血管移植片、人工心臓弁、心臓ペースメーカー、植込み型除細動器、ＩＶニードル、骨の設置及び形成のためのデバイス、例えば、ピン、スクリュー、プレート、及び他のデバイス、並びに創傷治癒のための人工組織マトリックスが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６４】
本明細書に提供される方法に加えて、本開示に従って使用するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、他の医薬品から類推して、人間医学又は獣医学で使用するのに便利な任意の方法で投与するために製剤化され得る。アンチセンスアンチセンスオリゴヌクレオチド及びその対応する製剤は、単独で、又は筋ジストロフィーの処置における他の治療戦略、例えば、筋芽細胞移植、幹細胞療法、アミノグリコシド抗生物質の投与、プロテアソーム阻害剤、及びアップレギュレーション療法（例えば、ジストロフィンの常染色体パラログであるユートロフィンの上方制御）と組み合わせて投与され得る。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与の前に、同時に、又は後に、付加的な治療薬が投与され得る。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ステロイド及び／又は抗生物質と組み合わせて投与され得る。特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、バックグランドのステロイド理論（ｔｈｅｏｒｙ）（例えば、間欠的又は慢性的／連続的なバックグランドのステロイド療法）を受けている患者に投与される。例えば、いくつかの実施形態では、患者は、アンチセンスオリゴマーの投与の前に副腎皮質ステロイドで処置されており、継続してステロイド療法を受ける。いくつかの実施形態では、ステロイドはグルココルチコイド又はプレドニゾンである。
【０１６６】
当業者は、任意の特定の動物及び状態に対して最適な投与経路及び任意の投与量を容易に決定することができるので、記載される投与経路は単なる参考であることが意図される。機能性の新しい遺伝子材料をインビトロ及びインビボの両方で細胞内に導入するために多数のアプローチが試みられている（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１２７５−１２８０）。これらのアプローチには、発現させる遺伝子の改変レトロウイルスへの組込み（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ（１９８９）上記；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（１９９１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５１（１８），ｓｕｐｐｌ．：５０７４Ｓ−５０７９Ｓ）；非レトロウィルスベクター（例えば、アデノ随伴ウイルスベクター）への組込み（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｃｅｌｌ，６８：１４３−１５５；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２：４３１−４３４）；又は異種プロモーター−エンハンサーエレメントと連結した導入遺伝子のリポソームによる送達（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ（１９８９），上記；Ｂｒｉｇｈａｍ，ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．，２９８：２７８−２８１；Ｎａｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：１２８５−１２８８；Ｈａｚｉｎｓｋｉ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，４：２０６−２０９；及びＷａｎｇ  ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８４：７８５１−７８５５）；リガンド特異的なカチオンベースの輸送系への結合（（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３：１４６２１−１４６２４）又はネイキッドＤＮＡ発現ベクターの使用（Ｎａｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０），上記）；Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７：１４６５−１４６８）が含まれる。導入遺伝子の組織への直接注入は、局所的発現のみを引き起こす（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ（１９９２）上記）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）上記；Ｂｒｉｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）上記；Ｎａｂｅｌ（１９９０）上記；及びＨａｚｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）上記）。Ｂｒｉｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．ｇｒｏｕｐ（Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．（１９８９）２９８：２７８−２８１及びＣｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９１）３９（ａｂｓｔｒａｃｔ））は、ＤＮＡリポソーム複合体の静脈内又は気管内投与の後、インビボでのマウスの肺のみのトランスフェクションを報告している。ヒト遺伝子療法手順の総説の一例は、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２）２５６：８０８−８１３である。
【０１６７】
さらなる実施形態では、その全体が参照によって本明細書中に援用されるＨａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｓ．７，１０９８１（２０１６）において提供されるように、本開示の医薬組成物は付加的に炭水化物を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物は、５％のヘキソース炭水化物を含み得る。例えば、本開示の医薬組成物は、５％のグルコース、５％のフルクトース、又は５％のマンノースを含み得る。特定の実施形態では、本開示の医薬組成物は、２．５％のグルコース及び２．５％のフルクトースを含み得る。いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物は、５体積％の量で存在するアラビノース、５体積％の量で存在するグルコース、５体積％の量で存在するソルビトール、５体積％の量で存在するガラクトース、５体積％の量で存在するフルクトース、５体積％の量で存在するキシリトール、５体積％の量で存在するマンノース、それぞれ２．５体積％の量で存在するグルコース及びフルクトースの組合せ、及び５．７体積％の量で存在するグルコース、２．８６体積％の量で存在するフルクトース、並びに１．４体積％の量で存在するキシリトールの組合せから選択される炭水化物を含み得る。
【０１６８】
ＩＶ．キット
本開示は、遺伝性疾患（例えば、ＤＭＤ）を有する患者の処置のためのキットも提供し、このキットは、少なくとも、適切な容器に包装されたアンチセンス分子（例えば、ゴロディルセン）を、その使用説明書と共に含む。またキットは、緩衝剤、安定剤などの周辺試薬も含有し得る。当業者は、上記の方法の適用が、多数の他の疾患の処置での使用に適したアンチセンス分子を同定するために広範な適用を有することを認識すべきである。
【実施例】
【０１６９】
全ての実施例は、ＳＲＰ−４０５３の安全性及び効力を試験する以下の進行中のファースト・イン・ヒューマン臨床治験から得られる。本明細書で報告される結果は、本試験のパート２の間の４８週目に得られたものである。
【０１７０】
ＤＭＤ患者におけるＳＲＰ−４０５３の第Ｉ／ＩＩ相試験
ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別子：ＮＣＴ０２３１０９０６
これは、エクソン５３スキッピングに適している欠失を有するデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）患者においてＳＲＰ−４０５３の安全性、耐容性、効力、及び薬物動態を評価するためのファースト・イン・ヒューマンの多用量２パート試験である。
試験の種類：介入
試験設計：割付け：  無作為化
介入モデル：  並行群間
マスキング：  四重（参加者、ケア提供者、研究者、結果査定者）
主目的：処置
公式タイトル：エクソン５３スキッピングに適しているデュシェンヌ型筋ジストロフィー患者におけるＳＲＰ−４０５３の２パート、無作為化、二重盲検、プラセボ対照、用量漸増、安全性、耐容性、及び薬物動態試験（パート１）、並びにその後の非盲検の効力及び安全性評価（パート２）
【０１７１】
材料及び方法
試験薬物
原薬のゴロディルセン（ａ／ｋ／ａ  ＳＲＰ−４０５３）は、本明細書に記載される化学構造を有するＰＭＯであり、Ｓａｒｅｐｔａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃにより供給された。ゴロディルセン薬物製品は、使い捨てバイアル内で供給される無菌等張リン酸緩衝水溶液として、５０ｍｇ／ｍＬの濃度で製剤化した。臨床環境におけるＩＶ点滴による投与の前に、通常の生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム注入）により薬物製品を希釈した。
【０１７２】
患者：適格性
適格患者は、エクソン５３スキッピングに適しているＤＭＤ遺伝子のアウトオブフレーム欠失を有する６〜１５歳であった。
選択基準：
・  遺伝子型で確認されたＤＭＤと診断。
・  インタクトな右側及び左側の二頭筋又は別の上腕筋肉群。
・  安定した肺機能及び心機能。
・  ６ＭＷＴ、Ｎｏｒｔｈ  Ｓｔａｒ  Ａｍｂｕｌａｔｏｒｙ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ、及び試験プロトコルで規定される起立（Ｇｏｗｅｒｓ）試験における最低限の能力。
・  少なくとも６か月間にわたって副腎皮質ステロイドを安定して投与されていること。
除外基準：
・  実験的薬剤ＢＭＮ−１９５（ＳＭＴ  Ｃ１１００）又はＰＲＯ０５３による過去の処置。
・  治験登録前の１２週間以内の任意の他の実験的処置を用いた現在又は過去の処置。
・  最近３か月以内の大手術。
・  他の臨床的に重大な病気の存在
・  最近３か月以内の理学療法体制の大きな変化。
その他の選択基準及び除外基準も適用され得る。
【０１７３】
試験設計
試験設計の概要は図１及び直下の表に示される。
【０１７４】
【表７】
2020532504.tif 000009
【０１７５】
詳細な説明：
パート１：エクソン５３スキッピングに適している欠失を有する遺伝子型で確認されたＤＭＤ患者における４用量レベルのＳＲＰ−４０５３の安全性、耐容性及び薬物動態を評価するための、無作為化、プラセボ対照、用量漸増である。
【０１７６】
スクリーニング／ベースライン：
エクソン５３スクリーニングに適している、確認された突然変異を有するＤＭＤ患者は、適格性を保証するために４週〜６週間のスクリーニング期間に参加した。処理前の脚の筋肉ＭＲＩ及び筋肉ＭＲＳ（ＭＲＳ能力を有する選択された部位で）を実施し、皮膚生検及び筋生検を得た。機能試験（６分間歩行試験［６ＭＷＴ］、Ｎｏｒｔｈ  Ｓｔａｒ  Ａｍｂｕｌａｔｏｒｙ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ［ＮＳＡＡ］、及び他の機能尺度）を実施し、潜在的な疾患関連バイオマーカーのための血液サンプルを採取した。肺機能検査（ＰＦＴ）、心エコー図（ＥＣＨＯ）、及びＥＣＧもスクリーニングの間に実施した。
【０１７７】
用量漸増：
患者を無作為化（２：１）して、ＳＲＰ−４０５３又はプラセボを受けさせた。患者は、プラセボ又はＳＲＰ−４０５３の毎週のＩＶ点滴を、それぞれ少なくとも２週間の増大する用量レベルにおいて受けた：１〜２週目は４ｍｇ／ｋｇ／週；３〜４週目は１０ｍｇ／ｋｇ／週；５〜６週目は２０ｍｇ／ｋｇ／週；及び７週目からは３０ｍｇ／ｋｇ／週。最後の患者が２回目の３０ｍｇ／ｋｇの用量を受けた後、パート２における投薬を開始する前に、独立ＤＭＣによりパート１の累積安全性データを審査した。ＤＭＣはパート１からの安全性データを審査し、試験の非盲検セグメント（パート２）において週１回３０ｍｇ／ｋｇのＩＶ点滴に進むことが推奨された。
【０１７８】
パート２：エクソン５３スキッピングに適していない欠失を有する未処置対照のＤＭＤ患者と比較して、エクソン５３スキッピングに適している欠失を有する新たに登録されたＤＭＤ患者と共にパート１からの患者におけるＳＲＰ−４０５３の非盲検評価である。
【０１７９】
パート２は、エクソン５３スキッピングに適していない突然変異を有するＤＭＤ患者の未処置の同時対照群と比較して、患者における週１回のＳＲＰ−４０５３の３０ｍｇ／ｋｇのＩＶ点滴の安全性及び効力についての１４４週間の非盲検評価である。
【０１８０】
スクリーニング／ベースライン：
パート１（ＳＲＰ−４０５３及びプラセボの両方）からの患者にパート２を継続させた。処置群の患者が全部で２５人である非盲検ＳＲＰ−４０５３処置のために、エクソン５３スキッピングに適している欠失を有する新しいＤＭＤ患者を登録した。未処置対照群としての役割を果たすために、エクソン５３スキッピングに適していない欠失を有するがそれ以外は適格性基準を満たす２４人までのＤＭＤ患者もパート２で登録した。新しいパート２患者全員の適格性は、４〜６週間のスクリーニング期間中に確認される。
【０１８１】
１４４週間の非盲検処置：
パート２において、処置群の全ての患者は、１４４週間にわたって週１回の３０ｍｇ／ｋｇのＳＲＰ−４０５３をＩＶ点滴で受ける。新しいパート２の処置患者はベースラインの皮膚生検及び筋生検を受け、全ての処置患者は、パート２の４８週目に２回目の筋生検を受けなければならない。また患者は、１２〜２４週間毎に機能試験（パート１について上記した通り）及びＰＦＴも受け、ＥＣＧを取る。有害事象及び併用薬物療法を、試験期間にわたって継続的にモニターし、収集する。試験適格性を確認した後、未処置対照群の患者は、身体検査及び実験的評価のスケジュールの省略、並びにＰＫサンプリング又は生検がないことを除いて、パート２の処置患者と同じ試験手順を受ける。
主要評価項目：
・  有害事象の発生［時間枠：約１２週間（パート１）］
・  臨床検査異常（血液学、化学、凝固、尿検査）の発生［時間枠：約１２週間（パート１）］
・  バイタルサイン及び身体検査の異常の発生［時間枠：約１２週間（パート１）］
・  ＥＣＧ及びＥＣＨＯにおける異常の発生［時間枠：約１２週間（パート１）］
・  ６分間歩行試験（６ＭＷＴ）のベースラインからの変化［時間枠：ベースライン〜１４４週目（パート２）］
・  ウエスタンブロットにより決定されるジストロフィンタンパク質レベル［時間枠：ベースライン〜４８週目（パート２）］
副次評価項目：
・  血漿中の薬物濃度［時間枠：約１２週間（パート１）］
・  肺機能検査［時間枠：ベースライン〜１４４週目（パート２）］
最大呼気圧（ＭＥＰ）％、最大吸気圧（ＭＩＰ）％
・  ＩＨＣにより決定されるジストロフィン陽性線維の割合［時間枠：ベースライン〜４８週目（パート２）］
・  エクソン５３スキッピング［時間枠：ベースライン〜４８週目（パート２）］
他の評価項目：
・  有害事象の発生［時間枠：１４４週間（パート２）］
・  臨床検査異常の発生（血液学、化学、凝固、尿検査）［時間枠：１４４週間（パート２）］
・  バイタルサイン及び身体検査における異常の発生［時間枠：１４４週間（パート２）］
・  ＥＣＧ及びＥＣＨＯにおける異常の発生［時間枠：１４４週間（パート２）］
・  免疫原性［時間枠：１４４週間（パート２）］
【０１８２】
実施例１：生化学的効力の評価
静脈内点滴により毎週投与される３０ｍｇ／ｋｇのＳＲＰ−４０５３の安全性、耐容性及びジストロフィン産生を評価するマルチサイトのファースト・イン・ヒューマン治験（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別子：ＮＣＴ０２３１０９０６）に参加している２５人の患者から、ベースライン及びオントリートメントにおける上腕二頭筋のペアの筋生検を得た。各手術について、２つの筋肉片：Ａブロック及びＢブロックを切除した。全てのアッセイに対してＡ及びＢブロックを別々に分析した。
【０１８３】
筋生検は、ジストロフィンタンパク質量（ウエスタンブロット、主要生物学的エンドポイント）及びエクソンスキッピング（ＲＴ−ＰＣＲ）を評価するために最適化された方法により検査した。新規の自動画像解析（ＭｕｓｃｌｅＭａｐＴＭ）は免疫組織化学を使用して、ジストロフィンの局在化（平均線維強度）を評価した。
【０１８４】
ウエスタンブロット分析について：Ａ及びＢブロックを２通りのゲルで実行した＝４回検査平均
【０１８５】
ＲＴ−ＰＣＲ分析について：Ａ及びＢブロックを４通りで実行した＝８回検査平均
【０１８６】
ＩＨＣ分析について：Ａ及びＢブロックをレベル１及び２で実行した＝４回検査平均
【０１８７】
ベースライン特徴：
ゴロディルセン処置コホートにおける２５人の患者のベースライン特徴は、表１に要約される。エクソン５３スキッピングに適している５つの異なる遺伝子型（４５〜５２；４８〜５２；４９〜５２；５０〜５２；及び５２における突然変異欠失）を表した。１７人の患者は、最初に試験のパート１でプラセボを受けた後にＳＲＰ−４０５３処置に変更されたか、或いはＳＲＰ−４０５３処置のために試験のパート２で登録された。８人の患者は、試験のパート１及びパート２でＳＲＰ−４０５３を受けた。全部で２５人の患者がＳＲＰ−４０５３を受けた。
【０１８８】
【表１】
2020532504.tif 000010
【０１８９】
エクソンスキッピングの決定：
ＲＴ−ＰＣＲ分析：
試験設計毎にベースライン及び４８週間の時点でＲＴ−ＰＣＲによりエクソンスキッピングを測定した。ＲＴ−ＰＣＲ分析のために、製造業者のプロトコルに従ってＴｒｉｚｏｌ試薬キットを用いて、ＲＮＡを細胞から単離した。ＮａｎｏＤｒｏｐを用いて、ＲＮＡの濃度及び純度を決定した。表２に従う突然変異ペアの順方向プライマー及び逆方向プライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲによりエクソン５３スキッピングを測定した。
【０１９０】
【表２】
2020532504.tif 000011
【０１９１】
スキップ及び非スキップ産物は、表３に従うアンプリコンサイズをもたらした。
【０１９２】
【表３】
2020532504.tif 000012
【０１９３】
ＲＮＡにＲＴ−ＰＣＲを行った後、ゲルキャピラリー電気泳動を使用するＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸを用いてサンプルを分析した。以下の式を用いてエクソンスキッピングパーセントを計算した：（スキップバンドの曲線下面積）／（スキップバンド及び非スキップバンドの曲線下面積の合計）×１００。
【０１９４】
ＲＴ−ＰＣＲ結果の概要は表４に示される。少なくとも４８回の毎週のＳＲＰ−４０５３の投与を受けた２５人の患者は全て、エクソンスキッピングのベースラインレベルを超える増大を示した（ｐ＜０．００１）。
【０１９５】
【表４】
2020532504.tif 000013
【０１９６】
図２は、エクソンスキッピングのベースラインレベルを超える増大があることの決定を導く試験における２５人の患者のそれぞれのＲＴ−ＰＣＲデータ（ベースライン及びＳＲＰ−４０５３処置の４８週間後）を示す（ｐ＜０．００１）。
【０１９７】
ジストロフィン産生の決定：ウエスタンブロット分析
ウエスタンブロット分析のために、均質化緩衝液（４％のＳＤＳ、４Ｍの尿素、１２５ｍＭのｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８））を用いて、１３３μＬの緩衝液中に直径約５ｍｍの９〜１８×２０μｍの組織切片の比率で組織を均質化した。対応するライセートを集め、製造業者の説明書に従ってＲＣ  ＤＣ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＢｉｏＲａｄ  Ｃａｔ．５００−０１２２）を用いてタンパク質の定量化を行った。均質化緩衝液を用いて、ＢＳＡ標準曲線の範囲内に入るように組織抽出物サンプルを１：１０に希釈した。２８μｌのサンプルが、４０μｇのタンパク質、１Ｘ最終濃度のＮｕＰＡＧＥ  ＬＤＳ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃａｔ．ＮＰ０００８，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）、及び１Ｘ最終濃度のＮｕＰＡＧＥ  Ｒｅｄｕｃｉｎｇ  Ａｇｅｎｔ（１０ｘ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃａｔ．ＮＰ０００４）を含有するように、サンプルを調製した。タンパク質サンプルを１０５℃５分間で加熱した後、サンプルを遠心分離し、上清を、１レーン当たり４０μｇの総タンパク質負荷で、ＮｕＰＡＧＥ  Ｎｏｖｅｘ  １２ウェル、１ｍｍ、ミニ３〜８％ポリアクリルアミドのトリス−アセタートゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃａｔ．ＥＡ０３７５）にロードした。色素の前面がゲルから外れるまでゲルを室温１５０ボルトで実行した。得られたタンパク質ゲルを、ＮｕＰＡＧＥ移動緩衝液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＮＰ００６−１）、１０％のメタノール及び０．１％のＮｕＰＡＧＥ抗酸化剤（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＮＰ０００５）を用いて室温３０ボルトで７５分間、ＰＶＤＦ膜（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃａｔ．ＬＣ２００７）に移動させた。
【０１９８】
タンパク質が移動したら、ＰＶＤＦ膜をＴＴＢＳ緩衝液（１ＸＴＢＳ（Ａｍｒｅｓｃｏ  Ｃａｔ．Ｊ６４０−４Ｌ）、０．１％（ｖ／ｖ）ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０）中に浸した。膜を遮断緩衝液（ＴＴＢＳ中５％（ｗ／ｖ）の脱脂粉乳（Ｌａｂ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃａｔ．Ｍ０８４１））に移し、優しく揺らしながら４℃で一晩浸漬させた。遮断した後、遮断緩衝液を用いて１：２０に希釈したＤＹＳ１（Ｌｅｉｃａ  Ｃａｔ．ＮＣＬ−ＤＹＳ１）中室温で６０分間、又は遮断緩衝液を用いて１：１００，０００に希釈した抗−α−アクチニン抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃａｔ．ＮＡ９３１Ｖ）中室温で２０分間のいずれかで、膜をインキュベートした後、６回洗浄した（それぞれＴＴＢＳで５分間）。遮断緩衝液を用いて、西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートされた抗マウスＩｇＧ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃａｔ．ＮＡ９３１Ｖ）を１：４０，０００で希釈し、４５分間（ＤＹＳ１）又は１５分間（α−アクチニン）膜に添加した後、再度６回洗浄した。ＥＣＬ  Ｐｒｉｍｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃａｔ．ＲＰＮ２２３２）を用いて、フィルムをゲルに曝露し、それに応じて現像した。現像したフィルムを、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＴＬ  Ｐｌｕｓソフトウェア（バージョン８．１）を用いてスキャン及び分析し、Ｇｒａｐｈｐａｄソフトウェアを用いて直線回帰分析を実施した。
【０１９９】
各ウエスタンブロットゲルは、４％、２％、１％、０．５％、０．２５％の最終正常対照に対して、正常組織から抽出され、ＤＭＤ組織抽出物に添加された総タンパク質を用いて作製された５点ジストロフィン標準曲線を含む（例えば、図５Ａ及び図５Ｂを参照）。標準曲線サンプルを上記のように処理した。ジストロフィンバンド強度をゲル標準曲線と比較することにより、ジストロフィンタンパク質レベルを正常対照ジストロフィンレベルのパーセント（ＮＣ％）として決定した。
【０２００】
ウエスタンブロットで測定したときの正常ジストロフィンタンパク質の平均％は、ベースラインの０．０９％から、オントリートメントの１．０２％まで増大し（範囲０．０９〜４．３％）、ベースラインからの平均変化が＋０．９３％であることが示された（ｐ＜０．００１）。
【０２０１】
ウエスタンブロット結果の概要は表５に示される。患者は、ウエスタンブロットで測定したときにジストロフィンタンパク質のベースラインを超える統計的に有意な増大を実証した。
【０２０２】
【表５】
2020532504.tif 000014
【０２０３】
図３は、ジストロフィンタンパク質のベースラインを超える統計的に有意な増大があることの決定を導く試験における２５人の患者のそれぞれのウエスタンブロットデータ（ベースライン及びＳＲＰ−４０５３処置の４８週間後）を示す。
【０２０４】
エクソンスキッピングと、新規のジストロフィンタンパク質との間の正の相関関係が観察された（Ｓｐｅａｒｍａｎ−ｒ＝０．５００、ｐ＝０．０１１）。
【０２０５】
平均線維強度の分析は、新規のジストロフィンのベースラインを上回る統計的に有意な増大（ｐ＜０．００１）と、ジストロフィンが正確に筋細胞膜に局在化されたこととを実証した（図４Ａ〜図５Ｂ）。
【０２０６】
エクソンスキッピング及び筋細胞膜ジストロフィン局在化が全患者において観察された。
【０２０７】
ＩＨＣの陽性ジストロフィン線維パーセントの概要は表６に示される。全ての患者は、ＩＨＣで測定したときに陽性ジストロフィン線維パーセントのベースラインを超える統計的に有意な増大を実証した。
【０２０８】
【表６】
2020532504.tif 000015
【０２０９】
表５及び表６並びに図４Ａ〜図５Ｂにおいて見られるように、ウエスタンブロットデータはＰＤＰＦ及び強度と相関し、ＳＲＰ−４０５３により処置から得られるＤＭＤ患者におけるジストロフィン産生が示される。
【０２１０】
本明細書で引用される全ての刊行物及び特許出願は、個々の刊行物又は特許出願がそれぞれ参照によって援用されることを具体的に且つ個々に示したかのように、参照によって本明細書中に援用される。
【図１】
2020532504.tif 000016
【図２】
2020532504.tif 000017
【図３】
2020532504.tif 000018
【図４Ａ】
2020532504.tif 000019
【図４Ｂ】
2020532504.tif 000020
【図５Ａ】
2020532504.tif 000021
【図５Ｂ】
2020532504.tif 000022
【配列表】
2020532504000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年4月22日(2020.4.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エクソン５３スキッピングに適しているＤＭＤ遺伝子の突然変異を有する、それを必要としている患者において、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を処置するための組成物であって、ゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩を含む組成物。
【請求項２】
前記組成物が、前記患者の体重１ｋｇ当たりゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩３０ｍｇの投与量で投与されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物が、前記患者におけるジストロフィン産生を増大させる、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記患者が、エクソン３〜５２、４〜５２、５〜５２、６〜５２、９〜５２、１０〜５２、１１〜５２、１３〜５２、１４〜５２、１５〜５２、１６〜５２、１７〜５２、１９〜５２、２１〜５２、２３〜５２、２４〜５２、２５〜５２、２６〜５２、２７〜５２、２８〜５２、２９〜５２、３０〜５２、３１〜５２、３２〜５２、３３〜５２、３４〜５２、３５〜５２、３６〜５２、３７〜５２、３８〜５２、３９〜５２、４０〜５２、４１〜５２、４３〜５２、４２〜５２、４５〜５２、４７〜５２、４８〜５２、４９〜５２、５０〜５２、５４〜５８、５４〜６１、５４〜６３、５４〜６４、５４〜６６、５４〜７６、５４〜７７、及びエクソン５２からなる群から選択されるＤＭＤ遺伝子の突然変異を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記患者が少なくとも４８週間前記組成物を投与されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記患者が、前記組成物の投与の前に少なくとも６か月間、副腎皮質ステロイドを安定して投与されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記患者が、前記組成物の投与の前に少なくとも６か月間、副腎皮質ステロイドを安定して投与されており、前記組成物の投与の間も副腎皮質ステロイドが続けられる、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
ゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩が医薬組成物として製剤化される、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
エクソン５３スキッピングに適しているＤＭＤ遺伝子の突然変異を有する、それを必要としているデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）患者において、エクソンスキッピングを誘発するために、ｍＲＮＡリーディングフレームを回復させるための組成物であって、ゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩を含む組成物。
【請求項１０】
前記組成物が、前記患者の体重１ｋｇ当たりゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩３０ｍｇの投与量で投与される、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記患者が、エクソン３〜５２、４〜５２、５〜５２、６〜５２、９〜５２、１０〜５２、１１〜５２、１３〜５２、１４〜５２、１５〜５２、１６〜５２、１７〜５２、１９〜５２、２１〜５２、２３〜５２、２４〜５２、２５〜５２、２６〜５２、２７〜５２、２８〜５２、２９〜５２、３０〜５２、３１〜５２、３２〜５２、３３〜５２、３４〜５２、３５〜５２、３６〜５２、３７〜５２、３８〜５２、３９〜５２、４０〜５２、４１〜５２、４３〜５２、４２〜５２、４５〜５２、４７〜５２、４８〜５２、４９〜５２、５０〜５２、５４〜５８、５４〜６１、５４〜６３、５４〜６４、５４〜６６、５４〜７６、５４〜７７、及びエクソン５２からなる群から選択されるＤＭＤ遺伝子の突然変異を有する、請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
前記患者が、少なくとも４８週間前記組成物を投与されることを特徴とする、請求項９に記載の組成物。
【請求項１３】
前記患者が、前記組成物の投与の前に少なくとも６か月間、副腎皮質ステロイドを安定して投与されている、請求項９に記載の組成物。
【請求項１４】
前記患者が、前記組成物の投与の前に少なくとも６か月間、副腎皮質ステロイドを安定して投与されており、前記組成物の投与の間も副腎皮質ステロイドが続けられる、請求項９に記載の組成物。
【請求項１５】
エクソンスキッピングが、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって測定される、請求項９に記載の組成物。
【請求項１６】
前記組成物が、前記患者におけるジストロフィン産生を増大させる、請求項９に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ジストロフィン産生が、ウエスタンブロット分析によって測定される、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記ジストロフィン産生が、免疫組織化学（ＩＨＣ）によって測定される、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１９】
エクソン５３スキッピングに適しているＤＭＤ遺伝子の突然変異を有する、それを必要としているデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）患者において、ジストロフィン産生を増大させるための組成物であって、ゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩を含む組成物。
【請求項２０】
前記組成物が、前記患者の体重１ｋｇ当たりゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩３０ｍｇの投与量で投与されることを特徴とする、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記患者が、エクソン３〜５２、４〜５２、５〜５２、６〜５２、９〜５２、１０〜５２、１１〜５２、１３〜５２、１４〜５２、１５〜５２、１６〜５２、１７〜５２、１９〜５２、２１〜５２、２３〜５２、２４〜５２、２５〜５２、２６〜５２、２７〜５２、２８〜５２、２９〜５２、３０〜５２、３１〜５２、３２〜５２、３３〜５２、３４〜５２、３５〜５２、３６〜５２、３７〜５２、３８〜５２、３９〜５２、４０〜５２、４１〜５２、４３〜５２、４２〜５２、４５〜５２、４７〜５２、４８〜５２、４９〜５２、５０〜５２、５４〜５８、５４〜６１、５４〜６３、５４〜６４、５４〜６６、５４〜７６、５４〜７７、及びエクソン５２からなる群から選択されるＤＭＤ遺伝子の突然変異を有する、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２２】
前記患者が少なくとも４８週間前記組成物を投与されることを特徴とする、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２３】
前記患者が、前記組成物の投与の前に少なくとも６か月間、副腎皮質ステロイドを安定して投与されている、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２４】
前記患者が、前記組成物の投与の前に少なくとも６か月間、副腎皮質ステロイドを安定して投与されており、前記組成物の投与の間も副腎皮質ステロイドが続けられる、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２５】
前記ジストロフィン産生が、ウエスタンブロット分析によって測定される、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２６】
前記ジストロフィン産生が、免疫組織化学（ＩＨＣ）によって測定される、請求項１９に記載の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１７年８月３１日出願の米国特許出願第６２／５５３，０９４号、２０１７年９月２９日出願の米国仮出願第６２／５６５，８２４号及び２０１８年８月３０日出願の米国仮出願第６２／７２５，１２９号の利益を主張する。上記で参照される出願の全教示内容がそれらの全内容の参照により組み入れられる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、患者の筋ジストロフィーを処置するための改善された方法に関する。また、ヒトジストロフィン遺伝子におけるエクソン５３スキッピングを促進するのに適した組成物も提供する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
様々な遺伝性疾患において、遺伝子の最終的な発現に対する突然変異の効果は、スプライシングプロセスの間に標的エクソンのスキッピングプロセスを介して調節することができる。正常機能性タンパク質がその中の突然変異のために早期に終結する場合、アンチセンス技術によっていくつかの機能性タンパク質の産生を回復させるための手段が、スプライシングプロセスの間の介入によって可能であることが示されており、そして疾患を引き起こす突然変異に関連するエクソンをいくつかの遺伝子から特異的に欠失させることができれば、天然タンパク質と同様の生物学的特性を有するか、又はエクソンに関連する突然変異によって引き起こされる疾患を改善するのに十分な生物活性を有する短縮タンパク質産物が時折産生され得る（例えば、Ｓｉｅｒａｋｏｗｓｋａ，Ｓａｍｂａｄｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９６；Ｗｉｌｔｏｎ，Ｌｌｏｙｄ  ｅｔ  ａｌ．１９９９；ｖａｎ  Ｄｅｕｔｅｋｏｍ，Ｂｒｅｍｍｅｒ−Ｂｏｕｔ  ｅｔ  ａｌ．２００１；Ｌｕ，Ｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．２００３；Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓ，Ｊａｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２００４を参照）。
【０００４】
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、タンパク質ジストロフィンの発現の欠陥によって引き起こされる。ジストロフィンは棒状の細胞質タンパク質であり、細胞膜を介して筋線維の細胞骨格と周囲の細胞外マトリックスとを接続するタンパク質複合体の極めて重要な部分である。ジストロフィンは筋線維内で重要な構造的役割を果たし、細胞外マトリックス及び細胞骨格を接続する。Ｎ末端領域はアクチンに結合するが、Ｃ末端はジストロフィン糖タンパク質複合体（ＤＧＣ）の一部であり、筋細胞膜に及ぶ。ｍｄｘマウスのジストロフィン欠損筋線維は、収縮で誘発される筋細胞膜破裂に対して増大された感受性を提示することが示されている（Ｐｅｔｒｏｆ  ｅｔ  ａｌ．１９９３；Ｃｉｒａｋ
ｅｔ  ａｌ．２０１２を参照）。
【０００５】
上記タンパク質をコードする遺伝子は、ＤＮＡの２百万を超えるヌクレオチドにわたって広がる７９のエクソンを含有する。エクソンのリーディングフレームを変化させるか、或いは終止コドンを導入するか、或いは全アウトオブフレームエクソンの除去、又は１つ若しくは複数のエクソンの重複を特徴とする、任意のエクソン突然変異は、機能性ジストロフィンの産生を妨害して、ＤＭＤをもたらす可能性を有する。
【０００６】
疾患発症は、出生時にクレアチンキナーゼレベルの上昇で実証することができ、生後１年以内に著しい運動障害がみられる可能性がある。７歳又は８歳までに、ほとんどのＤＭＤ患者は歩行が次第に困難になり、床から立ち上がる、及び階段を上る能力を失っていき、１０歳〜１４歳までに大多数は車椅子に依存する。ＤＭＤは一律に致死的であり、罹患者は、通常、１０代後半又は２０代前半に呼吸不全及び／又は心不全が原因で死亡する。ＤＭＤの連続的な進行は疾患の全ての段階で治療的介入を可能にするが、処置は現在のところグルココルチコイドに限られており、これは、体重増加、行動変化、思春期変化、骨粗鬆症、クッシング様顔貌、成長阻害、及び白内障を含む多数の副作用に関連する。結果的に、この疾患の根本原因を処置するためのより良好な治療法を開発することが不可欠で
ある。
【０００７】
筋ジストロフィーのより低重症度の形態であるベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）は、突然変異、通常は１つ又は複数のエクソンの欠失が、全ジストロフィン転写物に沿って正しいリーディングフレームをもたらし、その結果、ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳が早期に終結しない場合に起こることが分かっている。突然変異したジストロフィンプレｍＲＮＡのプロセシングにおける上流及び下流のエクソンの連結によって遺伝子の正しいリーディングフレームが維持されれば、その結果は、いくらかの活性を保持する短い内部欠失を有するタンパク質をコードするｍＲＮＡであり、ベッカー表現型が生じる。
【０００８】
長年、ジストロフィンタンパク質のリーディングフレームを変化させないエクソンの欠失はＢＭＤ表現型を引き起こし得るが、フレームシフトを生じるエクソン欠失はＤＭＤを引き起こし得ることが知られている（Ｍｏｎａｃｏ，Ｂｅｒｔｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９８８）。一般に、リーディングフレームを変化させ、したがって適切なタンパク質翻訳を妨害する点突然変異及びエクソン欠失を含むジストロフィン突然変異は、ＤＭＤをもたらす。また、一部のＢＭＤ及びＤＭＤ患者が、複数のエクソンをカバーするエクソン欠失を有することにも注意すべきである。
【０００９】
ＤＭＤの処置のためのスプライススイッチングオリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）の安全性及び効力を試験する最近の臨床治験は、スプライソソームの立体的遮断によってプレｍＲＮＡの選択的スプライシングを誘発するためのＳＳＯ技術に基づいている（Ｃｉｒａｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｇｏｅｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｋｉｎａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；ｖａｎ  Ｄｅｕｔｅｋｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。しかしながら、これらの成功にもかかわらず、ＤＭＤの処置に利用可能な薬理学的な選択肢は限られている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、患者においてジストロフィンを産生するため、並びにＤＭＤ及びＢＭＤなどの筋ジストロフィーを処置するために、改善された組成物及び方法が依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明の要旨
本開示は、少なくとも部分的に、エクソン５３スキッピングアンチセンスオリゴヌクレオチドであるゴロディルセン（ｇｏｌｏｄｉｒｓｅｎ）による処置によって、患者のジストロフィンタンパク質がベースラインを超えて著しく増大されたことを示す臨床的証拠に基づく。さらに、エクソンスキッピングと、新規のジストロフィンタンパク質との間の正の相関関係が観察された。
【００１２】
したがって、いくつかの態様では、本開示は、エクソン５３スキッピングに適しているＤＭＤ遺伝子の突然変異を有する、それを必要としている患者において、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を処置するための方法であって、ある用量のゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩を患者に投与することを含む方法を提供する。
【００１３】
いくつかの態様では、本開示は、エクソン５３スキッピングに適しているＤＭＤ遺伝子の突然変異を有する、それを必要としているデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）患者において、ｍＲＮＡリーディングフレームを回復させてエクソンスキッピングを誘発するための方法であって、ある用量のゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩を患者に投与することを含む方法を提供する。
【００１４】
いくつかの態様では、本開示は、エクソン５３スキッピングに適しているＤＭＤ遺伝子の突然変異を有する、それを必要としているデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）患者において、ジストロフィン産生を増大させるための方法であって、ある用量のゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩を患者に投与することを含む方法を提供する。
【００１５】
いくつかの態様では、用量は、患者の体重当たり、４ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、又は５０ｍｇ／ｋｇの投与量で投与される。
【００１６】
いくつかの態様では、用量は単一用量として投与される。いくつかの態様では、用量は週１回投与される。いくつかの態様では、用量は静脈内に投与される。いくつかの態様では、用量は点滴により静脈内に投与される。いくつかの態様では、用量は３５〜６０分間にわたって点滴により静脈内に投与される。いくつかの態様では、用量は皮下注射により静脈内に投与される。
【００１７】
いくつかの態様では、患者は４０歳まで、３０歳まで、又は２１歳までである。いくつかの態様では、患者は１歳〜２１歳である。いくつかの態様では、患者は５歳〜２１歳である。いくつかの態様では、患者は６歳〜１５歳である。
【００１８】
いくつかの態様では、本開示は前述又は関連の態様のいずれかに従う方法を提供し、ここで、患者は、エクソン３〜５２、４〜５２、５〜５２、６〜５２、９〜５２、１０〜５２、１１〜５２、１３〜５２、１４〜５２、１５〜５２、１６〜５２、１７〜５２、１９〜５２、２１〜５２、２３〜５２、２４〜５２、２５〜５２、２６〜５２、２７〜５２、２８〜５２、２９〜５２、３０〜５２、３１〜５２、３２〜５２、３３〜５２、３４〜５２、３５〜５２、３６〜５２、３７〜５２、３８〜５２、３９〜５２、４０〜５２、４１〜５２、４３〜５２、４２〜５２、４５〜５２、４７〜５２、４８〜５２、４９〜５２、５０〜５２、５４〜５８、５４〜６１、５４〜６３、５４〜６４、５４〜６６、５４〜７６、５４〜７７、及びエクソン５２を含む群から選択されるＤＭＤ遺伝子の突然変異を有する。
【００１９】
いくつかの態様では、本開示は前述又は関連の態様のいずれかに従う方法を提供し、ここで、患者は、ゴロディルセンを慢性的に投与される。いくつかの態様では、患者は、少なくとも４８週間ゴロディルセンを投与される、いくつかの態様では、患者は、１年を超えて、２年を超えて、３年を超えて、４年を超えて、５年を超えて、１０年を超えて、２０年を超えて、又は３０年を超えてゴロディルセンを投与される。
【００２０】
いくつかの態様では、本開示は前述又は関連の態様のいずれかに従う方法を提供し、ここで、患者は、ゴロディルセンの投与の前に少なくとも６か月間、副腎皮質ステロイドを安定して投与されている。いくつかの態様では、患者は、ゴロディルセンの投与の前に少なくとも６か月間、副腎皮質ステロイドを安定して投与されており、ゴロディルセンの投与の間も副腎皮質ステロイドが続けられる。
【００２１】
いくつかの態様では、本開示は前述又は関連の態様のいずれかに従う方法を提供し、ここで、ゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩は医薬組成物として製剤化される。いくつかの態様では、ゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩は、５０ｍｇ／ｍＬの濃度を有する医薬組成物として製剤化される。いくつかの態様では、ゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩は５０ｍｇ／ｍＬの濃度を有する医薬組成物として製剤化され、１００ｍｇ／２ｍＬの剤形で提示される。いくつかの態様では、ゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩は５０ｍｇ／ｍＬの濃度を有する医薬組成物として製剤化され
、５００ｍｇ／２ｍＬの剤形で提示される。いくつかの態様では、剤形は使い捨てバイアル中に含有される。
【００２２】
いくつかの態様では、ゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩は、ゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物として製剤化される。いくつかの態様では、薬学的に許容される担体はリン酸緩衝溶液である。
【００２３】
いくつかの態様では、本開示は前述又は関連の態様のいずれかに従う方法を提供し、ここで、エクソンスキッピングは、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって測定される。
【００２４】
いくつかの態様では、本開示は前述又は関連の態様のいずれかに従う方法を提供し、本方法は、患者のジストロフィン産生を増大させる。いくつかの態様では、ジストロフィン産生は、ウエスタンブロット分析によって測定される。いくつかの態様では、ジストロフィン産生は、免疫組織化学（ＩＨＣ）によって測定される。
【００２５】
いくつかの態様では、本開示は前述又は関連の態様のいずれかに従う方法を提供し、本方法は、ゴロディルセンを投与する前に、患者がエクソン５３スキッピングに適しているＤＭＤ遺伝子の突然変異を有することを確認することをさらに含む。
【００２６】
いくつかの態様では、本開示は、それを必要としている患者において、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の処置に使用するためのゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩を提供し、患者は、エクソン５３スキッピングに適しているＤＭＤ遺伝子の突然変異を有し、ここで、処置は、３０ｍｇ／ｋｇの単回静脈内用量のエテプリルセンを患者に週１回投与することを含む。
【００２７】
いくつかの態様では、本開示は、それを必要としているデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）患者において、ｍＲＮＡリーディングフレームを回復させてエクソンスキッピングを誘発するのに使用するためのゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩を提供し、患者は、エクソン５３スキッピングに適しているＤＭＤ遺伝子の突然変異を有し、ここで、処置は、３０ｍｇ／ｋｇの単回静脈内用量のエテプリルセンを患者に週１回投与することを含む。
【００２８】
いくつかの態様では、本開示は、それを必要としているデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）患者において、ジストロフィン産生を増大させるのに使用するためのゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩を提供し、患者は、エクソン５３スキッピングに適しているＤＭＤ遺伝子の突然変異を有し、ここで、処置は、３０ｍｇ／ｋｇの単回静脈内用量のエテプリルセンを患者に週１回投与することを含む。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
エクソン５３スキッピングに適しているＤＭＤ遺伝子の突然変異を有する、それを必要としている患者において、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を処置するための方法であって、ある用量のゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩を前記患者に投与することを含む方法。
（項目２）
前記用量が前記患者の体重１ｋｇ当たり４ｍｇの投与量で投与される、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記用量が前記患者の体重１ｋｇ当たり１０ｍｇの投与量で投与される、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記用量が前記患者の体重１ｋｇ当たり２０ｍｇの投与量で投与される、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記用量が前記患者の体重１ｋｇ当たり３０ｍｇの投与量で投与される、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記用量が前記患者の体重１ｋｇ当たり４０ｍｇの投与量で投与される、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記用量が前記患者の体重１ｋｇ当たり５０ｍｇの投与量で投与される、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記用量が単一用量として投与される、項目１〜７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記用量が週１回投与される、項目１〜８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記用量が静脈内に投与される、項目１〜９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
前記用量が点滴により静脈内に投与される、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記用量が３５〜６０分間にわたって点滴により静脈内に投与される、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記用量が皮下注射により静脈内に投与される、項目８に記載の方法。
（項目１４）
前記患者が４０歳までである、項目１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記患者が３０歳までである、項目１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
前記患者が２１歳までである、項目１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
前記患者が１歳〜２１歳である、項目１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
前記患者が５歳〜２１歳である、項目１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記患者が６歳〜１５歳である、項目１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
前記患者が、エクソン３〜５２、４〜５２、５〜５２、６〜５２、９〜５２、１０〜５２、１１〜５２、１３〜５２、１４〜５２、１５〜５２、１６〜５２、１７〜５２、１９〜５２、２１〜５２、２３〜５２、２４〜５２、２５〜５２、２６〜５２、２７〜５２、２８〜５２、２９〜５２、３０〜５２、３１〜５２、３２〜５２、３３〜５２、３４〜５２、３５〜５２、３６〜５２、３７〜５２、３８〜５２、３９〜５２、４０〜５２、４１〜５２、４３〜５２、４２〜５２、４５〜５２、４７〜５２、４８〜５２、４９〜５２、５０〜５２、５４〜５８、５４〜６１、５４〜６３、５４〜６４、５４〜６６、５４〜７６、５４〜７７、及びエクソン５２からなる群から選択されるＤＭＤ遺伝子の突然変異を有する、項目１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
前記患者がゴロディルセンを慢性的に投与される、項目１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
前記患者が少なくとも４８週間ゴロディルセンを投与される、項目１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
前記患者が１年を超えてゴロディルセンを投与される、項目１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
前記患者が２年を超えてゴロディルセンを投与される、項目１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記患者が３年を超えてゴロディルセンを投与される、項目１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
前記患者が４年を超えてゴロディルセンを投与される、項目１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記患者が５年を超えてゴロディルセンを投与される、項目１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記患者が１０年を超えてゴロディルセンを投与される、項目１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
前記患者が２０年を超えてゴロディルセンを投与される、項目１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
前記患者が３０年を超えてゴロディルセンを投与される、項目１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
前記患者が、ゴロディルセンの投与の前に少なくとも６か月間、副腎皮質ステロイドを安定して投与されている、項目１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２）
前記患者が、ゴロディルセンの投与の前に少なくとも６か月間、副腎皮質ステロイドを安定して投与されており、ゴロディルセンの投与の間も副腎皮質ステロイドが続けられる、項目１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３３）
ゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩が医薬組成物として製剤化される、項目１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
ゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩が医薬組成物として製剤化される、項目１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
ゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩が、５０ｍｇ／ｍＬの濃度を有する医薬組成物として製剤化される、項目１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
（項目３６）
ゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩が５０ｍｇ／ｍＬの濃度を有する医薬組成物として製剤化され、１００ｍｇ／２ｍＬの剤形で提示される、項目３３に記載の方法。
（項目３７）
ゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩が５０ｍｇ／ｍＬの濃度を有しており、５００ｍｇ／２ｍＬの剤形で提示される、項目３３に記載の方法。
（項目３８）
前記剤形が使い捨てバイアル中に含有される、項目３５又は３６に記載の方法。
（項目３９）
ゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩が、ゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物として製剤化される、項目３３〜３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目４０）
前記薬学的に許容される担体がリン酸緩衝溶液である、項目３８に記載の方法。
（項目４１）
エクソン５３スキッピングに適しているＤＭＤ遺伝子の突然変異を有する、それを必要としているデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）患者において、エクソンスキッピングを誘発するために、ｍＲＮＡリーディングフレームを回復させる方法であって、ある用量のゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩を前記患者に投与することを含む方法。
（項目４２）
前記用量が前記患者の体重１ｋｇ当たり４ｍｇの投与量で投与される、項目４０に記載の方法。
（項目４３）
前記用量が前記患者の体重１ｋｇ当たり１０ｍｇの投与量で投与される、項目４０に記載の方法。
（項目４４）
前記用量が前記患者の体重１ｋｇ当たり２０ｍｇの投与量で投与される、項目４０に記載の方法。
（項目４５）
前記用量が前記患者の体重１ｋｇ当たり３０ｍｇの投与量で投与される、項目４０に記載の方法。
（項目４６）
前記用量が前記患者の体重１ｋｇ当たり４０ｍｇの投与量で投与される、項目４０に記載の方法。
（項目４７）
前記用量が前記患者の体重１ｋｇ当たり５０ｍｇの投与量で投与される、項目４０に記載の方法。
（項目４８）
前記用量が単一用量として投与される、項目４０〜４６のいずれか一項に記載の方法。
（項目４９）
前記用量が週１回投与される、項目４０〜４７のいずれか一項に記載の方法。
（項目５０）
前記用量が静脈内に投与される、項目４０〜４８のいずれか一項に記載の方法。
（項目５１）
前記用量が点滴により静脈内に投与される、項目４９に記載の方法。
（項目５２）
前記用量が３５〜６０分間にわたって点滴により静脈内に投与される、項目５０に記載の方法。
（項目５３）
前記用量が皮下注射により静脈内に投与される、項目４７に記載の方法。
（項目５４）
前記患者が４０歳までである、項目１〜５３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５５）
前記患者が３０歳までである、項目１〜５４のいずれか一項に記載の方法。
（項目５６）
前記患者が２１歳までである、項目１〜５５のいずれか一項に記載の方法。
（項目５７）
前記患者が１歳〜２１歳である、項目１〜５６のいずれか一項に記載の方法。
（項目５８）
前記患者が５歳〜２１歳である、項目１〜５７のいずれか一項に記載の方法。
（項目５９）
前記患者が６歳〜１５歳である、項目１〜５８のいずれか一項に記載の方法。
（項目６０）
前記患者が、エクソン３〜５２、４〜５２、５〜５２、６〜５２、９〜５２、１０〜５２、１１〜５２、１３〜５２、１４〜５２、１５〜５２、１６〜５２、１７〜５２、１９〜５２、２１〜５２、２３〜５２、２４〜５２、２５〜５２、２６〜５２、２７〜５２、２８〜５２、２９〜５２、３０〜５２、３１〜５２、３２〜５２、３３〜５２、３４〜５２、３５〜５２、３６〜５２、３７〜５２、３８〜５２、３９〜５２、４０〜５２、４１〜５２、４３〜５２、４２〜５２、４５〜５２、４７〜５２、４８〜５２、４９〜５２、５０〜５２、５４〜５８、５４〜６１、５４〜６３、５４〜６４、５４〜６６、５４〜７６、５４〜７７、及びエクソン５２からなる群から選択されるＤＭＤ遺伝子の突然変異を有する、項目１〜５９のいずれか一項に記載の方法。
（項目６１）
前記患者がゴロディルセンを慢性的に投与される、項目１〜６０のいずれか一項に記載の方法。
（項目６２）
前記患者が少なくとも４８週間ゴロディルセンを投与される、項目１〜６１のいずれか一項に記載の方法。
（項目６３）
前記患者が１年を超えてゴロディルセンを投与される、項目１〜６２のいずれか一項に記載の方法。
（項目６４）
前記患者が２年を超えてゴロディルセンを投与される、項目１〜６３のいずれか一項に記載の方法。
（項目６５）
前記患者が３年を超えてゴロディルセンを投与される、項目１〜６４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６６）
前記患者が４年を超えてゴロディルセンを投与される、項目１〜６５のいずれか一項に記載の方法。
（項目６７）
前記患者が５年を超えてゴロディルセンを投与される、項目１〜６６のいずれか一項に記載の方法。
（項目６８）
前記患者が１０年を超えてゴロディルセンを投与される、項目１〜６７のいずれか一項に記載の方法。
（項目６９）
前記患者が２０年を超えてゴロディルセンを投与される、項目１〜６８のいずれか一項に記載の方法。
（項目７０）
前記患者が３０年を超えてゴロディルセンを投与される、項目１〜６９のいずれか一項に記載の方法。
（項目７１）
前記患者が、ゴロディルセンの投与の前に少なくとも６か月間、副腎皮質ステロイドを安定して投与されている、項目１〜７０のいずれか一項に記載の方法。
（項目７２）
前記患者が、ゴロディルセンの投与の前に少なくとも６か月間、副腎皮質ステロイドを安定して投与されており、ゴロディルセンの投与の間も副腎皮質ステロイドが続けられる、項目１〜７１のいずれか一項に記載の方法。
（項目７３）
ゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩が医薬組成物として製剤化される、項目１〜７２のいずれか一項に記載の方法。
（項目７４）
ゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩が医薬組成物として製剤化される、項目１〜７３のいずれか一項に記載の方法。
（項目７５）
ゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩が、５０ｍｇ／ｍＬの濃度を有する医薬組成物として製剤化される、項目１〜７４のいずれか一項に記載の方法。
（項目７６）
ゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩が５０ｍｇ／ｍＬの濃度を有する医薬組成物として製剤化され、１００ｍｇ／２ｍＬの剤形で提示される、項目７２に記載の方法。
（項目７７）
ゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩が５０ｍｇ／ｍＬの濃度を有しており、５００ｍｇ／２ｍＬの剤形で提示される、項目７２に記載の方法。
（項目７８）
前記剤形が使い捨てバイアル中に含有される、項目７４又は７５に記載の方法。
（項目７９）
ゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩が、ゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物として製剤化される、項目７２〜７６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８０）
前記薬学的に許容される担体がリン酸緩衝溶液である、項目７７に記載の方法。
（項目８１）
エクソンスキッピングが逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって測定される、項目４０〜７８のいずれか一項に記載の方法。
（項目８２）
前記方法が、前記患者のジストロフィン産生を増大させる、項目１〜７９のいずれか一項に記載の方法。
（項目８３）
前記ジストロフィン産生がウエスタンブロット分析によって測定される、項目８０に記載の方法。
（項目８４）
前記ジストロフィン産生が免疫組織化学（ＩＨＣ）によって測定される、項目８０に記載の方法。
（項目８５）
エクソン５３スキッピングに適しているＤＭＤ遺伝子の突然変異を有する、それを必要としているデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）患者において、ジストロフィン産生を増大させるための方法であって、ある用量のゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩を前記患者に投与することを含む方法。
（項目８６）
前記用量が体重１ｋｇ当たり４ｍｇの投与量で投与される、項目８０に記載の方法。
（項目８７）
前記用量が前記患者の体重１ｋｇ当たり１０ｍｇの投与量で投与される、項目８０に記載の方法。
（項目８８）
前記用量が前記患者の体重１ｋｇ当たり２０ｍｇの投与量で投与される、項目８０に記載の方法。
（項目８９）
前記用量が前記患者の体重１ｋｇ当たり３０ｍｇの投与量で投与される、項目８０に記載の方法。
（項目９０）
前記用量が前記患者の体重１ｋｇ当たり４０ｍｇの投与量で投与される、項目８０に記載の方法。
（項目９１）
前記用量が前記患者の体重１ｋｇ当たり５０ｍｇの投与量で投与される、項目８０に記載の方法。
（項目９２）
前記用量が単一用量として投与される、項目８０〜８６のいずれか一項に記載の方法。
（項目９３）
前記用量が週１回投与される、項目８０〜８７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９４）
前記用量が静脈内に投与される、項目８０〜８８のいずれか一項に記載の方法。
（項目９５）
前記用量が点滴により静脈内に投与される、項目８９に記載の方法。
（項目９６）
前記用量が３５〜６０分間にわたって点滴により静脈内に投与される、項目９０に記載の方法。
（項目９７）
前記用量が皮下注射により静脈内に投与される、項目８９に記載の方法。
（項目９８）
前記患者が４０歳までである、項目１〜９７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９９）
前記患者が３０歳までである、項目１〜９８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１００）
前記患者が２１歳までである、項目１〜９９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０１）
前記患者が１歳〜２１歳である、項目１〜１００のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０２）
前記患者が５歳〜２１歳である、項目１〜１０１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０３）
前記患者が６歳〜１５歳である、項目１〜１０２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０４）
前記患者が、エクソン３〜５２、４〜５２、５〜５２、６〜５２、９〜５２、１０〜５２、１１〜５２、１３〜５２、１４〜５２、１５〜５２、１６〜５２、１７〜５２、１９〜５２、２１〜５２、２３〜５２、２４〜５２、２５〜５２、２６〜５２、２７〜５２、２８〜５２、２９〜５２、３０〜５２、３１〜５２、３２〜５２、３３〜５２、３４〜５２、３５〜５２、３６〜５２、３７〜５２、３８〜５２、３９〜５２、４０〜５２、４１〜５２、４３〜５２、４２〜５２、４５〜５２、４７〜５２、４８〜５２、４９〜５２、５０〜５２、５４〜５８、５４〜６１、５４〜６３、５４〜６４、５４〜６６、５４〜７６、５４〜７７、及びエクソン５２からなる群から選択されるＤＭＤ遺伝子の突然変異を有する、項目１〜１０３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０５）
前記患者がゴロディルセンを慢性的に投与される、項目１〜１０４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０６）
前記患者が少なくとも４８週間ゴロディルセンを投与される、項目１〜１０５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０７）
前記患者が１年を超えてゴロディルセンを投与される、項目１〜１０６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０８）
前記患者が２年を超えてゴロディルセンを投与される、項目１〜１０７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０９）
前記患者が３年を超えてゴロディルセンを投与される、項目１〜１０８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１０）
前記患者が４年を超えてゴロディルセンを投与される、項目１〜１０９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１１）
前記患者が５年を超えてゴロディルセンを投与される、項目１〜１１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１２）
前記患者が１０年を超えてゴロディルセンを投与される、項目１〜１１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１３）
前記患者が２０年を超えてゴロディルセンを投与される、項目１〜１１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１４）
前記患者が３０年を超えてゴロディルセンを投与される、項目１〜１１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１５）
前記患者が、ゴロディルセンの投与の前に少なくとも６か月間、副腎皮質ステロイドを安定して投与されている、項目１〜１１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１６）
前記患者が、ゴロディルセンの投与の前に少なくとも６か月間、副腎皮質ステロイドを安定して投与されており、ゴロディルセンの投与の間も副腎皮質ステロイドが続けられる、項目１〜１１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１７）
ゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩が医薬組成物として製剤化される、請求項１〜１１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１８）
ゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩が医薬組成物として製剤化される、項目１〜１１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１９）
ゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩が、５０ｍｇ／ｍＬの濃度を有する医薬組成物として製剤化される、項目１〜１１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２０）
ゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩が５０ｍｇ／ｍＬの濃度を有する医薬組成物として製剤化され、１００ｍｇ／２ｍＬの剤形で提示される、項目１１３に記載の方法。
（項目１２１）
ゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩が５０ｍｇ／ｍＬの濃度を有しており、５００ｍｇ／２ｍＬの剤形で提示される、項目１１３に記載の方法。
（項目１２２）
前記剤形が使い捨てバイアル中に含有される、項目１１２又は１１３に記載の方法。
（項目１２３）
ゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩が、ゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物として製剤化される、項目１１１〜１１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２４）
前記薬学的に許容される担体がリン酸緩衝溶液である、項目１１７に記載の方法。
（項目１２５）
前記ジストロフィン産生がウエスタンブロット分析によって測定される、項目８０〜１１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２６）
前記ジストロフィン産生が免疫組織化学（ＩＨＣ）によって測定される、項目８０〜１１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２７）
ゴロディルセンを投与する前に、前記患者がエクソン５３スキッピングに適しているＤＭＤ遺伝子の突然変異を有することを確認することをさらに含む、項目１〜１２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２８）
それを必要としている患者において、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の処置に使用するためのゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩であって、前記患者が、エクソン５３スキッピングに適しているＤＭＤ遺伝子の突然変異を有し、前記処置が、３０ｍｇ／ｋｇの単回静脈内用量のエテプリルセンを前記患者に週１回投与することを含む、ゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩。
（項目１２９）
それを必要としているデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）患者において、ｍＲＮＡリーディングフレームを回復させてエクソンスキッピングを誘発するのに使用するためのゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩であって、前記患者が、エクソン５３スキッピングに適しているＤＭＤ遺伝子の突然変異を有し、前記処置が、３０ｍｇ／ｋｇの単回静脈内用量のエテプリルセンを前記患者に週１回投与することを含む、ゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩。
（項目１３０）
それを必要としているデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）患者において、ジストロフィン産生を増大させるのに使用するためのゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩であって、前記患者が、エクソン５３スキッピングに適しているＤＭＤ遺伝子の突然変異を有し、前記処置が、３０ｍｇ／ｋｇの単回静脈内用量のエテプリルセンを前記患者に週１回投与することを含む、ゴロディルセン又はその薬学的に許容される塩。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】ＤＭＤ患者の試験設計におけるＳＲＰ−４０５３の第Ｉ／ＩＩ相試験のフローチャートの概要である。
【図２】上記試験の２５人の患者のそれぞれについて、ＲＴ−ＰＣＲデータ（ベースライン及びＳＲＰ−４０５３処置の４８週間後）を示す。
【図３】上記試験の２５人の患者のそれぞれについて、ウエスタンブロットデータ（ベースライン及びＳＲＰ−４０５３処置の４８週間後）を示す。
【図４Ａ】全筋線維を示すためにラミニンについて染色された、ベースライン及びオントリートメント（ｏｎ−ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）における単一の患者（実施例１）からの筋生検の蛍光免疫染色を示す。
【図４Ｂ】ジストロフィンについて染色された、図４Ａからの筋生検のセクション（１〜３）の蛍光免疫染色を示す。
【図５Ａ】全筋線維を示すためにラミニンについて染色された、ベースライン及びオントリートメントにおける単一の患者（実施例２）からの筋生検の蛍光免疫染色を示す。
【図５Ｂ】ジストロフィンについて染色された、図５Ａからの筋生検のセクション（１〜３）の蛍光免疫染色を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
詳細な説明
本開示の実施形態は、ヒトジストロフィン遺伝子においてエクソン５３スキッピングを誘発するように特別に設計されたアンチセンスオリゴヌクレオチドであるゴロディルセンを投与することによって、ＤＭＤなどの筋ジストロフィーを処置するための方法に関する。ジストロフィンは筋機能において極めて重要な役割を果たし、種々の筋肉関連疾患は、この遺伝子の突然変異型を特徴とする。したがって、特定の実施形態では、本明細書に記載される方法は、ＤＭＤにおいて見出される突然変異したジストロフィン遺伝子などの突然変異型ヒトジストロフィン遺伝子においてエクソン５３スキッピングを誘発するために使用され得る。
【００３１】
したがって、本開示は、患者においてエクソン５３スキッピングを誘発することによって、ＤＭＤなどの筋ジストロフィーを処置するための方法に関する。さらに、本開示は、ＤＭＤ患者においてｍＲＮＡリーディングフレームを回復させてエクソンスキッピングを誘発するための方法に関する。また本開示は、ＤＭＤ患者においてジストロフィン産生を増大させるための方法にも関する。
【００３２】
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本発明の実施又は試験において本明細書に記載されるものと同様又は同等の任意の方法及び材料を使用することができるが、好ましい方法及び材料が記載される。本発明の目的のために、次の用語は以下で定義される。
【００３３】
Ｉ．定義
「約」とは、基準の数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量又は長さに対して３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１％ほど変動する、数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量又は長さを意味する。
【００３４】
対象又は患者に関して本明細書で使用される「エクソン５３スキッピングに適している」は、ジストロフィン遺伝子のエクソン５３のスキッピングがなければリーディングフレームのフレームがずれ、それによりプレｍＲＮＡの翻訳が妨害され、対象又は患者がジストロフィンを産生することができなくなる、ジストロフィン遺伝子の１つ又は複数の突然変異を有する対象及び患者を含むことが意図される。ジストロフィン遺伝子の以下のエクソンの突然変異の非限定的な例はエクソン５３スキッピングに適しており、例えば、エクソン３〜５２、４〜５２、５〜５２、６〜５２、９〜５２、１０〜５２、１１〜５２、１３〜５２、１４〜５２、１５〜５２、１６〜５２、１７〜５２、１９〜５２、２１〜５２、２３〜５２、２４〜５２、２５〜５２、２６〜５２、２７〜５２、２８〜５２、２９〜５２、３０〜５２、３１〜５２、３２〜５２、３３〜５２、３４〜５２、３５〜５２、３６〜５２、３７〜５２、３８〜５２、３９〜５２、４０〜５２、４１〜５２、４３〜５２、４２〜５２、４５〜５２、４７〜５２、４８〜５２、４９〜５２、５０〜５２、５４〜５８、５４〜６１、５４〜６３、５４〜６４、５４〜６６、５４〜７６、５４〜７７、又はエクソン５２の欠失が含まれる。エクソンスキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の突然変異を患者が有するかどうかの決定は、十分に当業者の範囲内である（例えば
、Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｈｕｍ  Ｍｕｔａｔ．３０：２９３−２９９、Ｇｕｒｖｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｍｕｔａｔ．２００９；３０（４）６３３−６４０、及びＦｌｅｔｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １８（６）１２１８−１２２３を参照）。
【００３５】
「アンチセンスオリゴマー」及び「アンチセンス化合物」及び「アンチセンスオリゴヌクレオチド」及び「オリゴマー」及び「オリゴヌクレオチド」という用語は本開示では互換的に使用され、サブユニット間結合によって連結された一連の環状サブユニットを指し、各環状サブユニットは、（ｉ）リボース糖又はその誘導体と、（ｉｉ）塩基対形成部分の順序がワトソン・クリック塩基対合によって核酸（通常、ＲＮＡ）内の標的配列に相補的な塩基配列を形成して、標的配列内に核酸：オリゴマーヘテロ二本鎖を形成するように、それに結合した塩基対形成部分とからなる。特定の実施形態では、オリゴマーはＰＭＯである。他の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルホスホロチオアートである。他の実施形態では、本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、又は２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）などの架橋核酸（ＢＮＡ）である。
【００３６】
「相補的」及び「相補性」という用語は、ワトソン・クリック塩基対形成の法則によって互いに関連する２つ以上のオリゴマー（すなわち、それぞれが核酸塩基配列を含む）を指す。例えば、核酸塩基配列「Ｔ−Ｇ−Ａ（５’→３’）」は、核酸塩基配列「Ａ−Ｃ−Ｔ（３’→５’）」に対して相補的である。相補性は「部分的」でもよく、この場合、所与の核酸塩基配列の全部よりも少ない核酸塩基が塩基対合の規則にしたがって他の核酸塩基配列とマッチする。例えば、いくつかの実施形態では、所与の核酸塩基配列と他の核酸塩基配列との間の相補性は、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％又は約９５％であり得る。或いは、例を続けるために、所与の核酸塩基配列と他の核酸塩基配列との間に、「完全」又は「完璧」な（１００％の）相補性が存在してもよい。核酸塩基配列間の相補性の度合いは、配列間のハイブリダイゼーションの効率及び強度に対して著しい効果を有する。
【００３７】
「ジストロフィン」は棒状の細胞質タンパク質であり、細胞膜を介して筋線維の細胞骨格と周囲の細胞外マトリックスとを接続するタンパク質複合体の極めて重要な部分である。ジストロフィンは複数の機能ドメインを含有する。例えば、ジストロフィンは、アミノ酸１４〜２４０付近にアクチン結合ドメインを含有し、アミノ酸２５３〜３０４０付近に中央ロッドドメインを含有する。この大きい中央ドメインは、約１０９のアミノ酸の２４のスペクトリン様三重らせんエレメントによって形成され、これは、アルファ−アクチニン及びスペクトリンとの相同性を有する。リピートは、通常、ヒンジ領域とも呼ばれる４つのプロリンに富んだ非リピートセグメントによって中断される。リピート１５及び１６は、ジストロフィンのタンパク質分解性切断のための主要部位を提供すると思われる１８アミノ酸のストレッチによって分離されている。大部分のリピート間の配列同一性は、１０〜２５％の範囲である。１つのリピートは、３つのアルファ−ヘリックス：１、２及び３を含有する。アルファ−ヘリックス１及び３はそれぞれ７つのヘリックスターンによって形成され、恐らく、疎水性界面を介してコイルドコイルとして相互作用する。アルファ−ヘリックス２はより複雑な構造を有し、グリシン又はプロリン残基により分離された４つ及び３つのヘリックスターンのセグメントによって形成される。各リピートは、通常アルファ−ヘリックス２の最初の部分におけるアミノ酸４７と４８との間のイントロンにより中断された２つのエクソンによってコードされる。他のイントロンは、リピート内の異なる位置において見出され、通常、ヘリックス−３にわたって点在する。またジストロフィンは、ほぼアミノ酸３０８０〜３３６０に、粘菌（ディクチオステリウム・ディスコイデウム（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ  ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ））アルファ−アクチニンのＣ末端ドメインとの相同性を示す、システインに富んだセグメント（すなわち、２８０
のアミノ酸中の１５のシステイン）を含む、システインに富んだドメインも含有する。カルボキシ末端ドメインは、ほぼアミノ酸３３６１〜３６８５にある。
【００３８】
ジストロフィンのアミノ末端はＦ−アクチンに結合し、カルボキシ末端は筋細胞膜においてジストロフィン関連タンパク質複合体（ＤＡＰＣ）に結合する。ＤＡＰＣは、ジストログリカン、サルコグリカン、インテグリン及びカベオリンを含み、これらの成分のいずれかにおける突然変異は、常染色体によって遺伝する筋ジストロフィーを引き起こす。ジストロフィンが存在しないときにＤＡＰＣは不安定化しており、これは、メンバータンパク質のレベルの減少をもたらし、次には、進行性の線維損傷及び膜漏出を引き起こす。デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）及びベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）などの筋ジストロフィーの種々の形態において、筋細胞は、主として、不正確なスプライシングをもたらす遺伝子配列の突然変異のために、変化した機能的に欠陥のある形態のジストロフィンを産生するか、又はジストロフィンを全く産生しない。欠陥のあるジストロフィンタンパク質の優勢な発現、又はジストロフィン若しくはジストロフィン様タンパク質の完全な欠乏は、上記のように、筋変性の急速な進行をもたらす。これに関して、「欠陥のある」ジストロフィンタンパク質は、当該技術分野において知られているようにＤＭＤ又はＢＭＤを有する特定の対象において産生されるジストロフィンの形態によって、又は検出可能なジストロフィンが存在しないことによって特徴付けることができる。
【００３９】
「エクソン」は、タンパク質をコードする画定されたセクション、又はプレプロセシングされた（ｐｒｅ−ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ）（又は前駆体）ＲＮＡのいずれかの部分がスプライシングによって除去された後に成熟形態のＲＮＡ分子において表される核酸配列を指す。成熟ＲＮＡ分子は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、又はｒＲＮＡ又はｔＲＮＡなどの非コードＲＮＡの機能形態であり得る。ヒトジストロフィン遺伝子は、約７９のエクソンを有する。
【００４０】
「イントロン」は、タンパク質に翻訳されない核酸領域（遺伝子内）を指す。イントロンは、前駆体ｍＲＮＡ（プレｍＲＮＡ）に翻訳され、続いて成熟ＲＮＡの形成の間にスプライシングにより除去される非コードセクションである。
【００４１】
「有効量」又は「治療的に有効な量」は、単一用量として、又は一連の用量の一部として哺乳類対象に投与され、所望の治療効果を生じさせるのに有効なアンチセンスオリゴマー（例えば、ゴロディルセンを含む）などの治療化合物の量を指す。アンチセンスオリゴマーの場合、この効果は、選択された標的配列の翻訳又は天然のスプライス−プロセシングの阻害、又はエクソンスキッピングにより、ジストロフィンの産生を増大させることによってもたらすことができる。
【００４２】
いくつかの実施形態では、有効量は、対象を処置するためにある期間にわたって少なくとも約４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１０ｍｇ／ｋｇ又は少なくとも２０ｍｇ／ｋｇのアンチセンスオリゴマー又はアンチセンスオリゴマーを含む組成物である。いくつかの実施形態では、対象においてジストロフィン陽性線維の数を増大させるために、有効量は、少なくとも約４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１０ｍｇ／ｋｇ又は少なくとも２０ｍｇ／ｋｇのアンチセンスオリゴマー又はアンチセンスオリゴマーを含む組成物である。種々の実施形態では、有効量は、少なくとも約４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１０ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、又は約３０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、有効量は約３０ｍｇ／ｋｇ又は約５０ｍｇ／ｋｇである。
【００４３】
種々の実施形態では、対象におけるジストロフィンの産生を増大させるために、有効量は、少なくとも約４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１０ｍｇ／ｋｇ又は少なくとも２０ｍｇ／ｋ
ｇのアンチセンスオリゴマー又はアンチセンスオリゴマーを含む組成物である。種々の実施形態では、有効量は、少なくとも約４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１０ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、又は約３０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、有効量は約３０ｍｇ／ｋｇ又は約５０ｍｇ／ｋｇである。
【００４４】
特定の実施形態では、例えば６ＭＷＴにおける患者の歩行距離を、健康な同等者に対して２０％の欠乏から安定化、維持又は改善させるために、有効量は、少なくとも約４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１０ｍｇ／ｋｇ又は少なくとも２０ｍｇ／ｋｇのアンチセンスオリゴマー又はアンチセンスオリゴマーを含む組成物である。種々の実施形態では、有効量は、少なくとも約４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１０ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、又は約３０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、有効量は約３０ｍｇ／ｋｇ又は約５０ｍｇ／ｋｇである。
【００４５】
特定の実施形態では、有効量は、少なくとも２４週間、少なくとも３６週間、又は少なくとも４８週間にわたって少なくとも約４ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、又は約３０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇであり、それにより、対象においてジストロフィン陽性線維の数が増大される。特定の実施形態では、対象におけるジストロフィン陽性線維の増大は、正常の少なくとも２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％である。いくつかの実施形態では、処置は、患者においてジストロフィン陽性線維の数を正常の２０〜６０％、又は３０〜５０％まで増大させる。
【００４６】
特定の実施形態では、例えば６ＭＷＴにおける患者の歩行距離を、健康な同等者に対して２０％の欠乏から安定化又は改善させるために、有効量は、少なくとも２４週間、少なくとも３６週間、又は少なくとも４８週間にわたって少なくとも約４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、又は約３０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇである。
【００４７】
種々の実施形態では、有効量は、少なくとも２４週間、少なくとも３６週間、又は少なくとも４８週間にわたって少なくとも約４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、又は約３０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇであり、それにより患者においてジストロフィン産生が増大される。いくつかの実施形態では、増大したジストロフィン産生は、健康な同等者に対して、約０．１％、０．２％  ０．３％  ０．５％、０．７％、０．９％、１％、１．０１％、１．５％、２％、２．０１％、２．５％、３％、３．０１％、３．５％、４％、４．０１％、４．５％、５％、５．０１％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１０．５％、１１％、１１．５％、１２％、１２．５％、１３％、１３．５％、１４％、１４．５％、１５％、１５．５％、１６％、１６．５％、１７％、１７．５％、１８％、１８．５％、１９％、１９．５％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、又は６０％である。特定の実施形態では、ジストロフィン産生の増大は、健康な同等者に対して、約０．１％〜０．５％、０．５％〜０．９％、０．８％〜１％、０．９％〜１．２％、０．９％〜１．０％、０．９％〜１．０１％、１％〜１．０１％、１％〜１．５％、１．５％〜２％、１．９％〜２．０％、１．９％〜２．０１％、２％〜２．０１％、２％〜２．５％、２．５％〜３％、２．９％〜３．０％、２．９％〜３．０１％、２％〜３．０１％、３％〜３．５％、３．５％〜４％、４％〜４．５％、４．５％〜５％、５％〜６％、６％〜７％、７％〜８％、８％〜９％、９％〜１０％、１％〜２％、１％〜３％、１％〜５％、２％〜４％、２
％〜５％、４％〜６％、５％〜８％、８％〜１０％、１％〜５％、２％〜６％、３％〜７％、４％〜８％、５％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１５％、１５％〜２０％、１７％〜２０％、２０％〜２２％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、又は３０％〜３５％であり得る。
【００４８】
「増強する」若しくは「増強すること」又は「増大させる」若しくは「増大させること」又は「刺激する」若しくは「刺激すること」とは一般的に、１つ若しくは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、ゴロディルセンを含む）又はその医薬組成物が、アンチセンスオリゴヌクレオチドがない場合に、又は対照化合物によって引き起こされる反応と比較して、細胞又は対象においてより大きい生理応答（すなわち、下流の効果）を生じさせるか、又は引き起こす能力を指す。測定可能な生理応答は、当該技術分野における理解及び本明細書の記載から明らかな反応の中でも特に、筋組織における機能形態のジストロフィンタンパク質の発現（又は産生）の増大又はジストロフィン関連の生物活性の増大を含み得る。また筋機能の約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％の増大又は改善を含む、筋機能の増大も測定することができる。筋線維の約１％、２％、５％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％におけるジストロフィン発現の増大を含む、機能性ジストロフィンを発現する筋線維の割合を測定することもできる。例えば、線維の２５〜３０％がジストロフィンを発現すれば、約４０％の筋機能の改善が生じ得ることが示されている（例えば、ＤｅｌｌｏＲｕｓｓｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：１２９７９−１２９８４，２００２を参照）。いくつかの実施形態では、増大したジストロフィン産生は、健康な同等者に対して、約０．１％、０．２％  ０．３％  ０．５％、０．７％、０．９％、１％、１．０１％、１．５％、２％、２．０１％、２．５％、３％、３．０１％、３．５％、４％、４．０１％、４．５％、５％、５．０１％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１０．５％、１１％、１１．５％、１２％、１２．５％、１３％、１３．５％、１４％、１４．５％、１５％、１５．５％、１６％、１６．５％、１７％、１７．５％、１８％、１８．５％、１９％、１９．５％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、又は６０％である。特定の実施形態では、ジストロフィン産生の増大は、健康な同等者に対して、約０．１％〜０．５％、０．５％〜０．９％、０．８％〜１％、０．９％〜１．２％、０．９％〜１．０％、０．９％〜１．０１％、１％〜１．０１％、１％〜１．５％、１．５％〜２％、１．９％〜２．０％、１．９％〜２．０１％、２％〜２．０１％、２％〜２．５％、２．５％〜３％、２．９％〜３．０％、２．９％〜３．０１％、２％〜３．０１％、３％〜３．５％、３．５％〜４％、４％〜４．５％、４．５％〜５％、５％〜６％、６％〜７％、７％〜８％、８％〜９％、９％〜１０％、１％〜２％、１％〜３％、１％〜５％、２％〜４％、２％〜５％、４％〜６％、５％〜８％、８％〜１０％、１％〜５％、２％〜６％、３％〜７％、４％〜８％、５％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１５％、１５％〜２０％、１７％〜２０％、２０％〜２２％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、又は３０％〜３５％であり得る。本明細書で使用される場合、「増大したジストロフィン産生」、「ジストロフィンの産生の増大」などは、対象におけるジストロフィン、ジストロフィン様タンパク質、又は機能性ジストロフィンタンパク質の少なくとも１つの産生の増大を指す。
【００４９】
「増大された」又は「増強された」量は、通常、「統計的に有意な」量であり、アンチセンスオリゴヌクレオチドがない（薬剤が存在しない）場合に、又は対照化合物によって
もたらされる量の１．１倍、１．２倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍又はそれ以上（例えば、５００倍、１０００倍）（全ての整数及びその間の１を超える小数点、例えば、１．５、１．６、１．７、１．８などを含む）の増大を含み得る。
【００５０】
「低減する」又は「阻害する」という用語は、一般的に、本発明の１つ又は複数のアンチセンス化合物が、診断の技術分野における通例の技術にしたがって測定したときに、本明細書に記載される疾患又は状態の症状などの、関連する生理応答又は細胞応答を「減少させる」能力に関し得る。関連する生理応答又は細胞応答（インビボ又はインビトロ）は当業者には明らかであり、筋ジストロフィーの症状若しくは病態の低減、又はＤＭＤ若しくはＢＭＤを有する個体において発現される変化した形態のジストロフィンなどの欠陥のある形態のジストロフィンの発現の低減を含み得る。応答の「減少」は、アンチセンス化合物がない場合に、又は対照組成物によってもたらされる応答と比較して統計的に有意でよく、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％（その間の全ての整数を含む）の減少を含み得る。
【００５１】
本明細書で使用される場合、「機能」及び「機能性の」などの用語は、生物学的、酵素的、又は治療的機能を指す。
【００５２】
「機能性」ジストロフィンタンパク質は一般に、通常、ＤＭＤ又はＢＭＤを有する特定の対象に存在する変化した形態又は「欠陥のある」形態のジストロフィンタンパク質と比較して、本来なら筋ジストロフィーの特徴である、筋組織の進行性の分解を低減するのに十分な生物活性を有するジストロフィンタンパク質を指す。特定の実施形態では、機能性ジストロフィンタンパク質は、当技術分野における通例の技術にしたがって測定したときに、野生型ジストロフィンの約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％（その間の全ての整数を含む）のインビトロ又はインビボ生物活性を有し得る。一例として、インビトロでの筋肉培養物におけるジストロフィン関連の活性は、筋管サイズ、筋原線維の組織化（又は破壊）、収縮活性、及びアセチルコリン受容体の自発的なクラスター形成にしたがって測定することができる（例えば、Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ．１１２：２０９−２１６，１９９９を参照）。また動物モデルは疾患の病態形成を研究するための価値ある資源であり、ジストロフィン関連の活性を試験するための手段を提供する。ＤＭＤ研究のために最も広範に使用される動物モデルの２つは、ｍｄｘマウス及びゴールデンレトリーバ筋ジストロフィー（ＧＲＭＤ）イヌであり、これらは両方共ジストロフィン陰性である（例えば、Ｃｏｌｌｉｎｓ  ＆  Ｍｏｒｇａｎ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｐａｔｈｏｌ  ８４：１６５−１７２，２００３を参照）。これら及び他の動物モデルを使用して、種々のジストロフィンタンパク質の機能活性を測定することができる。特定の本開示のエクソンスキッピングアンチセンスオリゴヌクレオチドによって産生される形態などのジストロフィンの切断型も含まれる。
【００５３】
「モルホリノ」、「モルホリノオリゴマー」又は「ＰＭＯ」という用語は、Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＆  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，７：１８７−１９５（１９９７）の図２に記載されるように、以下の一般構造：
【化１】
2020532504.tif 000023
を有するホスホロジアミダートモルホリノオリゴマーを指す。本明細書に記載されるモルホリノは、上記の一般構造の全ての立体異性体（及びこれらの混合物）及び立体配置を包含することが意図される。モルホリノオリゴマーの合成、構造、及び結合特徴は、米国特許第５，６９８，６８５号明細書、同第５，２１７，８６６号明細書、同第５，１４２，０４７号明細書、同第５，０３４，５０６号明細書、同第５，１６６，３１５号明細書、同第５，５２１，０６３号明細書、同第５，５０６，３３７号明細書、同第８，０７６，４７６号明細書、及び同第８，２９９，２０６号明細書において詳述されており、これらは全て参照によって本明細書中に援用される。特定の実施形態では、モルホリノはオリゴマーの５’端部又は３’端部において「テール」部分とコンジュゲートされて、その安定性及び／又は溶解性が増大される。例示的なテールには、
【化２】
2020532504.tif 000024
が含まれる。
【００５４】
そのコード名「ＳＲＰ−４０５３」でも知られている「ゴロディルセン」は、塩基配列５’−ＧＴＴＧＣＣＴＣＣＧＧＴＴＣＴＧＡＡＧＧＴＧＴＴＣ−３’（配列番号１）を有するＰＭＯである。ゴロディルセンは、ＣＡＳ登録番号１４２２９５９−９１−８で登録されている。化学名は、ａｌｌ−Ｐ−ａｍｂｏ−［Ｐ，２’，３’−トリデオキシ−Ｐ−（ジメチルアミノ）−２’，３’−イミノ−２’，３’−セコ］（２’ａ→５’）（Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｃ）５’−［４−（｛２−［２−（２−ヒドロキシエトキシ）エトキシ］エトキシ｝カルボニル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルピペラジン−１−ホスホンアミダート］を含む。ゴロディルセンは、以下の構造を有する：
【化３】
2020532504.tif 000025
して以下の化学構造によっても表される：
【化４】
2020532504.tif 000026
【化５】
2020532504.tif 000027
【００５５】
明確にするために、例えば上記のゴロディルセンの構造を含む本開示の構造は、５’から３’に続くものであり、構造全体をコンパクトな形態で示す便宜上、「中断Ａ」及び「中断Ｂ」と表示される種々の図の中断が含まれている。当業者により理解されるように、例えば「中断Ａ」の表示はそれぞれ、これらの点において構造の図が連続することを示す。当業者は、上記の構造の「中断Ｂ」の各場合についても同じことが当てはまることを理解する。しかしながら、図の中断はどれも上記の構造の実際の不連続を示すことは意図されず、当業者もそれらが実際の不連続を意味するものと理解しない。
【００５６】
本明細書で使用される場合、構造式内で使用される１組の括弧は、括弧内の構造特徴が繰り返されることを示す。いくつかの実施形態では、使用される括弧は「［」及び「］」であり得るが、特定の実施形態では、反復される構造特徴を示すために使用される括弧は「（」及び「）」であり得る。いくつかの実施形態では、括弧内の構造特徴の反復回数は、例えば、２、３、４、５、６、７などの、括弧の外側に示される数である。種々の実施形態では、括弧内の構造特徴の反復回数は、「Ｚ」などの括弧の外側に示される変数によって示される。
【００５７】
本明細書で使用される場合、直線状の結合又は曲がりくねった結合の構造式においてキラル炭素又はキラルリン原子に対して描かれる結合は、キラル炭素又はリンの立体化学が定義されておらず、全ての形態のキラル中心を含むことが意図されることを示す。このような図の例は以下に示される：
【化６】
2020532504.tif 000028
【００５８】
本明細書で使用される「非経口投与」及び「非経口的に投与される」という語句は、経腸及び局所投与以外の、通常は注射による投与形態を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、角皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内及び胸骨内への注射及び点滴が含まれるが、これらに限定されない。
【００５９】
「薬学的に許容される」という語句は、物質又は組成物が、製剤を構成する他の成分、及び／又はそれにより処置される対象と、化学的及び／又は毒物学的に適合性でなければならないことを意味する。
【００６０】
本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」という語句は、任意のタイプの無毒性で不活性の固体、半固体又は液体の充填剤、希釈剤、カプセル化材料又は製剤助剤を意味する。薬学的に許容される担体としての役割を果たすことができる材料のいくつかの例は、糖、例えば、ラクトース、グルコース及びスクロース；デンプン、例えば、コーンスターチ及びジャガイモデンプン；セルロース及びその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース及び酢酸セルロース；粉末トラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；賦形剤、例えば、ココアバター及び坐薬ワックス；油、例えば、ピーナッツ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油及び大豆油；グリコール、例えば、プロピレングリコール；エステル、例えば、オレイン酸エチル及びラウリン酸エチル；寒天；緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウム；アルギン酸；パイロジェンフリー水；等張生理食塩水；リンゲル溶液；エチルアルコール、及びリン酸緩衝溶液、並びに、他の無毒性の適合性潤滑剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウムであり、製剤者の判断にしたがって、着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、香味料及び香料、保存料及び抗酸化剤を組成物中に存在させることもできる。
【００６１】
ジストロフィン合成又は産生の「回復」という用語は、一般に、本明細書に記載される
アンチセンスオリゴマーにより処置した後の、筋ジストロフィー患者における切断型のジストロフィンを含むジストロフィンタンパク質の産生を指す。いくつかの実施形態では、処置は、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％（その間の全ての整数を含む）の、患者のジストロフィン産生の増大をもたらす。いくつかの実施形態では、処置は、対象において、ジストロフィン陽性線維の数を正常の少なくとも２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％又は約９５％〜１００％までを増大させる。他の実施形態では、処置は、対象において、ジストロフィン陽性線維の数を正常の約２０％〜約６０％、又は約３０％〜約５０％まで増大させる。処置後の患者におけるジストロフィン陽性線維の割合は、既知の技術を用いる筋生検によって決定することができる。例えば、筋生検は、患者の上腕二頭筋などの適切な筋肉から採取され得る。
【００６２】
陽性ジストロフィン線維の割合の分析は、処置の前及び／又は処置の後、又は処置期間を通じて複数の時点で実施され得る。いくつかの実施形態では、処置後の生検は、処置前の生検とは反対側の筋肉から採取される。処置前及び処置後のジストロフィン発現の研究は、ジストロフィンのための任意の適切なアッセイを用いて実施され得る。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体などのジストロフィンのマーカーである抗体を用いて、筋生検からの組織切片において、免疫組織化学的検出が実施される。例えば、高感受性のジストロフィンのマーカーであるＭＡＮＤＹＳ１０６抗体を使用することができる。任意の適切な二次抗体が使用され得る。
【００６３】
いくつかの実施形態では、ジストロフィン陽性線維パーセントは、陽性線維の数を計数した線維の総数で割ることによって計算される。正常な筋肉サンプルは、１００％のジストロフィン陽性線維を有する。したがって、ジストロフィン陽性線維パーセントは、正常の割合として表すことができる。処置後の筋肉中のジストロフィン陽性線維を計数する際に、処置前の筋肉及び復帰変異体線維中の微量レベルのジストロフィンの存在に対して照らし合わせるために、各患者からの処置前の筋肉の切片を用いてベースラインを設定することができる。これは、その患者の処置後の筋肉の切片においてジストロフィン陽性線維を計数するための閾値として使用され得る。他の実施形態では、Ｂｉｏｑｕａｎｔ画像解析ソフトウェア（Ｂｉｏｑｕａｎｔ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ，ＴＮ）を用いて、ジストロフィンの定量のために抗体染色組織切片を使用することもできる。全ジストロフィン蛍光シグナル強度は、正常の割合として報告され得る。さらに、モノクローナル又はポリクローナル抗ジストロフィン抗体によるウエスタンブロット分析を使用して、ジストロフィン陽性線維の割合を決定することができる。例えば、Ｎｏｖａｃａｓｔｒａからの抗ジストロフィン抗体ＮＣＬ−Ｄｙｓ１が使用され得る。ジストロフィン陽性線維の割合は、サルコグリカン複合体（β、γ）及び／又はニューロンＮＯＳの成分の発現を決定することによって分析することもできる。
【００６４】
いくつかの実施形態では、ゴロディルセンなどの本開示のアンチセンスオリゴマーによる処置は、ＤＭＤ患者において処置をしない場合に予想され得る進行性の呼吸筋機能障害及び／又は呼吸筋不全を減速又は低下させる。いくつかの実施形態では、本開示のアンチセンスオリゴマーによる処置は、処置をしない場合に予想され得る人工呼吸補助の必要性を低減又は除去し得る。いくつかの実施形態では、疾患の経過を追跡するための呼吸機能の測定、及び潜在的な治療的介入の評価には、最大吸気圧（ＭＩＰ）、最大呼気圧（ＭＥＰ）及び努力肺活量（ＦＶＣ）が含まれる。ＭＩＰ及びＭＥＰはそれぞれ、人が吸息及び呼息の間に生じさせることができる圧力のレベルを測定し、呼吸筋力の高感度尺度である。ＭＩＰは、横隔膜の筋力低下の尺度である。
【００６５】
いくつかの実施形態では、ＭＥＰは、ＭＩＰ及びＦＶＣを含む他の肺機能検査の変化の前に低下し得る。特定の実施形態では、ＭＥＰは、呼吸機能障害の早期指標であり得る。
特定の実施形態では、ＦＶＣは、最大吸気後の強制呼息の間に排出される空気の総体積を測定するために使用され得る。ＤＭＤ患者では、ＦＶＣは、１０代前半までは身体的成長に伴って増大する。しかしながら、疾患進行により成長が遅くなるか、又は阻止されて、筋力低下が進行すると、肺活量は下降期に入り、１０〜１２歳以降は１年に約８〜８．５パーセントの平均速度で低下する。特定の実施形態では、予測ＭＩＰパーセント（体重で調整したＭＩＰ）、予測ＭＥＰパーセント（年齢で調整したＭＥＰ）及び予測ＦＶＣパーセント（年齢及び伸長で調整したＦＶＣ）は、支持的な分析である。
【００６６】
本明細書で使用される「対象」又は「患者」は、本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置することができる症状を示すか又はその症状を示すリスクがある任意の動物、例えば、ＤＭＤ若しくはＢＭＤ又はこれらの状態に関連する症状のいずれか（例えば、筋線維の喪失）を有するか、或いは有するリスクがある対象を含む。適切な対象（患者）には、実験動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、又はモルモット）、家畜、及び飼育動物又はペット（例えば、ネコ又はイヌ）が含まれる。非ヒト霊長類、そして好ましくは、ヒト患者が含まれる。また、エクソン５３スキッピングに適しているジストロフィン遺伝子の突然変異を有する対象においてジストロフィンを産生させる方法も含まれる。
【００６７】
本明細書で使用される「小児患者」は、１歳〜２１歳（両端を含む）の患者である。
【００６８】
本明細書で使用される「全身性投与」、「全身に投与される」、「末梢投与」及び「末梢に投与される」という語句は、中枢神経系内への直接的な投与ではなく、患者の身体に入り、したがって、代謝及び他の同様のプロセスを受けるような化合物、薬物又は他の材料の投与、例えば、皮下投与を意味する。
【００６９】
本明細書で使用される「慢性投与」は、連続的で規則的な長期間の治療的投与、すなわち、実質的に中断することのない定期的投与を指す。例えば、患者において筋ジストロフィーを処置するために、少なくとも数週間又は数か月又は数年にわたって毎日である。例えば、患者において筋ジストロフィーを処置するために、少なくとも数か月又は数年にわたって毎週（例えば、少なくとも６週間にわたって毎週、少なくとも１２週間にわたって毎週、少なくとも２４週間にわたって毎週、少なくとも４８週間にわたって毎週、少なくとも７２週間にわたって毎週、少なくとも９６週間にわたって毎週、少なくとも１２０週間にわたって毎週、少なくとも１４４週間にわたって毎週、少なくとも１６８週間にわたって毎週、少なくとも１８０週間にわたって毎週、少なくとも１９２週間にわたって毎週、少なくとも２１６週間にわたって毎週、又は少なくとも２４０週間にわたって毎週）である。
【００７０】
本明細書で使用される「定期的投与」は、投与の間に間隔のある投与を指す。例えば、定期的投与は、繰り返され得る固定間隔（例えば、毎週、毎月）での投与を含む。
【００７１】
本明細書で使用される「プラセボ」は、治療効果を有さず、対照として使用され得る物質を指す。
【００７２】
本明細書で使用される「プラセボ対照」は、併用療法、アンチセンスオリゴヌクレオチド、非ステロイド系抗炎症化合物、及び／又は別の医薬組成物ではなくプラセボを受ける対象又は患者を指す。プラセボ対照は、対象又は患者と同じ突然変異状態、同様の年齢、同様の歩く能力を有することができ、且つ、或いは、同じ併用薬（ステロイドなどを含む）を受けることができる。
【００７３】
「標的配列」、「塩基配列」、又は「核酸塩基配列」という語句は、標的プレｍＲＮＡ中のヌクレオチドの配列と相補的なオリゴマーの核酸塩基の配列を指す。本開示のいくつ
かの実施形態では、標的プレｍＲＮＡ中のヌクレオチドの配列は、Ｈ５３Ａ（＋３６＋６０）として指定されるジストロフィンのプレｍＲＮＡ中のエクソン５３アニーリング部位である。
【００７４】
対象（例えば、ヒトなどの哺乳類）又は細胞の「処置」は、対象又は細胞の自然経過を変化させるための試みにおいて使用される任意のタイプの介入である。処置はオリゴマー又はその医薬組成物の投与を含むが、これらに限定されず、予防的に、又は病的事象の開始若しくは病原体との接触に続いて実施され得る。処置は、特定の形態の筋ジストロフィーのような、ジストロフィンタンパク質に関する疾患又は状態の症状又は病態に対して任意の望ましい効果を含み、例えば、処置中の疾患又は状態の１つ又は複数の測定可能なマーカーにおける最小限の変化又は改善を含み得る。また、処置中の疾患若しくは状態の進行速度の低減、その疾患若しくは状態の発症の遅延、又はその発症の重症度の低下を目的とすることができる「予防的」処置も含まれる。「処置」又は「予防」は、必ずしも、疾患若しくは状態又はそれに関連する症状の完全な根絶、治癒、又は防止を示さない。
【００７５】
いくつかの実施形態では、本開示のアンチセンスオリゴマーによる処置は、処置をしない場合に予想され得る、又は処置をしない場合に予想され得るジストロフィン産生を増大させ、疾患進行を遅延させ、歩行運動の喪失を減速又は低下させ、筋肉の炎症を低減し、筋損傷を低減し、筋機能を改善し、肺機能の喪失を低減し、及び／又は筋再生を増強する。いくつかの実施形態では、処置は疾患進行を維持、遅延又は減速させる。いくつかの実施形態では、処置は歩行運動を維持するか、又は歩行運動の喪失を低減する。いくつかの実施形態では、処置は肺機能を維持するか、又は肺機能の喪失を低減する。いくつかの実施形態では、処置は、例えば６分間歩行試験（６ＭＷＴ）により測定したときに、患者の安定歩行距離を維持するか、又は増大させる。いくつかの実施形態では、処置は、１０メートル歩行／走行時間（すなわち、１０メートル歩行／走行試験）を維持又は短縮する。いくつかの実施形態では、処置は、仰臥位から立ち上がる時間（すなわち、立ち上がり時間試験）を維持又は短縮する。いくつかの実施形態では、処置は、４段の標準階段を上る時間（すなわち、４段上り試験）を維持又は短縮する。いくつかの実施形態では、処置は、例えばＭＲＩ（例えば、脚筋のＭＲＩ）で測定したときに、患者の筋肉の炎症を維持又は低減する。いくつかの実施形態では、ＭＲＩはＴ２及び／又は脂肪画分を測定して、筋変性を特定する。ＭＲＩは、炎症、浮腫、筋損傷及び脂肪浸潤に起因する、筋肉の構造及び組成の変化を特定することができる。
【００７６】
いくつかの実施形態では、本開示のアンチセンスオリゴマーによる処置はジストロフィン産生を増大させる。いくつかの実施形態では、増大したジストロフィン産生は、健康な同等者に対して、約０．１％、０．２％  ０．３％  ０．５％、０．７％、０．９％、１％、１．０１％、１．５％、２％、２．０１％、２．５％、３％、３．０１％、３．５％、４％、４．０１％、４．５％、５％、５．０１％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１０．５％、１１％、１１．５％、１２％、１２．５％、１３％、１３．５％、１４％、１４．５％、１５％、１５．５％、１６％、１６．５％、１７％、１７．５％、１８％、１８．５％、１９％、１９．５％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、又は６０％である。特定の実施形態では、ジストロフィン産生の増大は、健康な同等者に対して、約０．１％〜０．５％、０．５％〜０．９％、０．８％〜１％、０．９％〜１．２％、０．９％〜１．０％、０．９％〜１．０１％、１％〜１．０１％、１％〜１．５％、１．５％〜２％、１．９％〜２．０％、１．９％〜２．０１％、２％〜２．０１％、２％〜２．５％、２．５％〜３％、２．９％〜３．０％、２．９％〜３．０１％、２％〜３．０１％、３％〜３．５％、３．５％〜４％、４％〜４．５％、４．５％〜５％、５％〜６％、６％〜７％、７％〜８％、８％〜９％、９％〜１０％、１％〜２％、１％〜３％
、１％〜５％、２％〜４％、２％〜５％、４％〜６％、５％〜８％、８％〜１０％、１％〜５％、２％〜６％、３％〜７％、４％〜８％、５％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１５％、１５％〜２０％、１７％〜２０％、２０％〜２２％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、又は３０％〜３５％であり得る。
【００７７】
特定の実施形態では、本開示のアンチセンスオリゴマーによる処置は、ジストロフィン産生を増大させ、処置をしない場合に予想され得る歩行運動の喪失を減速又は低下させる。例えば、処置は、対象の歩行能力を安定化、維持、改善又は増大させ得る（例えば、歩行運動の安定化）。いくつかの実施形態では、処置は、例えば、ＭｃＤｏｎａｌｄ，ｅｔ
ａｌ．（Ｍｕｓｃｌｅ  Ｎｅｒｖｅ，２０１０；４２：９６６−７４、参照によって本明細書中に援用される）により記載された６分間歩行試験（６ＭＷＴ）により測定したときに、患者の安定歩行距離を維持又は増大させる。６分間歩行距離（６ＭＷＤ）の変化は、絶対値、変化率、又は予測値％の変化として表され得る。いくつかの実施形態では、処置は、６ＭＷＴにおける対象の安定歩行距離を、健康な同等者に対して２０％の欠乏から維持又は改善する。６ＭＷＴにおけるＤＭＤ患者の能力は、健康な同等者の通常の能力に対して、予測値％を計算することにより決定することができる。例えば、予測６ＭＷＤ％は、男性の場合、以下の式：１９６．７２＋（３９．８１×年齢）−（１．３６×年齢２）＋（１３２．２８×身長（メートル））を用いて計算することができる。女性の場合、予測６ＭＷＤ％は、以下の式：１８８．６１＋（５１．５０×年齢）−（１．８６×年齢２）＋（８６．１０×身長（メートル））を用いて計算することができる（Ｈｅｎｒｉｃｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  Ｃｕｒｒ．，２０１２，バージョン２、参照によって本明細書中に援用される）。
【００７８】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴマーによる処置は、ベースラインから３、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０又は５０メートル（その間の全ての整数を含む）を超えて、患者の安定歩行距離を増大させる。いくつかの実施形態では、増大したジストロフィン産生は、健康な同等者に対して、約０．１％、０．２％  ０．３％  ０．５％、０．７％、０．９％、１％、１．０１％、１．５％、２％、２．０１％、２．５％、３％、３．０１％、３．５％、４％、４．０１％、４．５％、５％、５．０１％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１０．５％、１１％、１１．５％、１２％、１２．５％、１３％、１３．５％、１４％、１４．５％、１５％、１５．５％、１６％、１６．５％、１７％、１７．５％、１８％、１８．５％、１９％、１９．５％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、又は６０％である。特定の実施形態では、ジストロフィン産生の増大は、健康な同等者に対して、約０．１％〜０．５％、０．５％〜０．９％、０．８％〜１％、０．９％〜１．２％、０．９％〜１．０％、０．９％〜１．０１％、１％〜１．０１％、１％〜１．５％、１．５％〜２％、１．９％〜２．０％、１．９％〜２．０１％、２％〜２．０１％、２％〜２．５％、２．５％〜３％、２．９％〜３．０％、２．９％〜３．０１％、２％〜３．０１％、３％〜３．５％、３．５％〜４％、４％〜４．５％、４．５％〜５％、５％〜６％、６％〜７％、７％〜８％、８％〜９％、９％〜１０％、１％〜２％、１％〜３％、１％〜５％、２％〜４％、２％〜５％、４％〜６％、５％〜８％、８％〜１０％、１％〜５％、２％〜６％、３％〜７％、４％〜８％、５％〜１０％、１０％〜１２％、１２％〜１５％、１５％〜２０％、１７％〜２０％、２０％〜２２％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、又は３０％〜３５％であり得る。
【００７９】
ＤＭＤ患者の筋機能の喪失は、正常な小児期の成長及び発育を背景にして起こり得る。実際に、進行性筋機能障害にもかかわらず、ＤＭＤを有する低年齢の小児は約１年間にわたって６ＭＷＴ中に歩行距離の増大を示し得る。いくつかの実施形態では、ＤＭＤ患者からの６ＭＷＤは、典型的に発育している対照群、並びに年齢及び性別が一致する対象から
の既存の標準データと比較される。いくつかの実施形態では、正常な成長及び発育は、標準データに適合された年齢及び身長に基づいた式を用いて説明することができる。このような式を使用して、ＤＭＤを有する対象において６ＭＷＤを予測パーセント（予測％）値に変換することができる。特定の実施形態では、予測６ＭＷＤ％データの分析は正常な成長及び発育を説明するための方法を表し、低年齢（例えば、７歳以下）での機能の増大が、ＤＭＤ患者の能力の改善ではなく安定を表すことを示し得る（Ｈｅｎｒｉｃｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  Ｃｕｒｒ．，２０１２，バージョン２、参照によって本明細書中に援用される）。
【００８０】
異なるアンチセンス分子を区別するために、アンチセンス分子の命名法が提唱及び公開された（Ｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｊ  Ｇｅｎ  Ｍｅｄ  ４，６４４−６５４を参照）。この命名法は、以下に示されるように、全て同じ標的領域に向けられたわずかに異なるいくつかのアンチセンス分子を試験する際に意味を持つ：
Ｈ＃Ａ／Ｄ（ｘ：ｙ）。
【００８１】
最初の文字は、種（例えば、Ｈ：ヒト、Ｍ：マウス、Ｃ：イヌ）を指定する。「＃」は、標的ジストロフィンエクソンの番号を指定する。「Ａ／Ｄ」はそれぞれ、エクソンの最初及び最後におけるアクセプタースプライス部位又はドナースプライス部位を示す。（ｘ
ｙ）はアニーリング座標を表し、ここで、「−」又は「＋」はそれぞれ、イントロン配列又はエクソン配列を示す。例えば、Ａ（−６＋１８）は、標的エクソンに先行するイントロンの最後の６塩基及び標的エクソンの最初の１８塩基を示し得る。最も近いスプライス部位はアクセプターであり得るので、これらの座標は「Ａ」が前に記載され得る。ドナースプライス部位におけるアニーリング座標の記載はＤ（＋２−１８）であり得るが、ここで、最後の２個のエクソン塩基及び最初の１８個のイントロン塩基はアンチセンス分子のアニーリング部位に対応する。Ａ（＋６５＋８５）で表され得る完全なエクソンアニーリング座標は、そのエクソンの開始から６５番目と８５番目のヌクレオチドの間の部位である。
【００８２】
ＩＩ．アンチセンスオリゴヌクレオチド
エクソン５３のスキッピングをもたらすためにジストロフィン遺伝子のプレｍＲＮＡを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、本開示の方法にしたがって使用される。
【００８３】
このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡの翻訳を遮断又は阻害するように、或いは天然のプレｍＲＮＡスプライスプロセシングを阻害するように設計することができ、ハイブリダイズする標的配列に「向けられる」又は「対して標的化される」と言うことができる。標的配列は、通常、ｍＲＮＡのＡＵＧ開始コドン、翻訳抑制オリゴマー、又はプレプロセシングされたｍＲＮＡのスプライス部位、スプライス抑制オリゴマー（ＳＳＯ）を含む領域である。スプライス部位の標的配列は、プレプロセシングされたｍＲＮＡ内の正常なスプライスアクセプタージャンクションの１〜約２５塩基対下流にその５’端部を有するｍＲＮＡ配列を含み得る。いくつかの実施形態では、標的配列は、スプライス部位を含むか、又はエクソンコード配列内に完全に含有されるか、又はスプライスアクセプター部位若しくはドナー部位にまたがる、プレプロセシングされたｍＲＮＡの任意の領域であり得る。オリゴマーはより一般的には、上記のような方法で標的の核酸に対して標的化される場合、タンパク質、ウィルス、又は細菌などの生物学的に関連する標的に「対して標的化される」と言われる。
【００８４】
特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５３標的領域に特異的にハイブリダイズし、エクソン５３スキッピングを誘発する。特定の実施形態では、ジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５３標的領域にハイブリダイズしてエクソン５３スキッピングを誘発するアンチセンスオリゴヌクレオチド
は、ホスホロジアミダートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）である。
【００８５】
特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドはゴロディルセンである。
【００８６】
ゴロディルセンは、ホスホロジアミダートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）と呼ばれる明確な種類の新規の合成アンチセンスＲＮＡ治療薬に属し、これは、天然の核酸構造の再設計である。ゴロディルセンは、ジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５３標的領域にハイブリダイズするＰＭＯであり、エクソン５３スキッピングを誘発する。ゴロディルセンは、上記で引用した参考文献において、そして付加的に国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１７／４０３１８号（その全体は、参照によって本明細書中に明示的に援用される）において詳述される方法を用いて、段階的な固相合成によって調製することができる。
【００８７】
ＰＭＯは、インビボの非臨床的観察に基づいて潜在的な臨床的利点を提供する。ＰＭＯは、インビボでの安定性を保証するために、ヌクレアーゼによる酵素分解から保護する修飾をＲＮＡの糖環に組み込む。ＰＭＯは、一つには６員合成モルホリノ環の使用により、天然の核酸及び他のアンチセンスオリゴヌクレオチドの種類とは区別され、６員合成モルホリノ環は、ＲＮＡ、ＤＮＡ及び多数の他の合成アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドにおいて見出される５員リボフラノシル環を置換する。
【００８８】
ＰＭＯに特異的な無電荷ホスホロジアミダート結合は、潜在的に、タンパク質への低減されたオフターゲット結合を付与すると考えられる。ＰＭＯは、他の臨床段階の合成アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドで使用される負電荷を持つホスホロチオアート結合の代わりに、各モルホリノ環を連結する無電荷ホスホロジアミダート結合を有する。
【００８９】
ＤＭＤ遺伝子のアウトオブフレーム突然変異によって生じるＤＭＤの処置に対する潜在的な治療的アプローチは、インフレーム突然変異によって生じるＢＭＤとして知られているより軽症な形態のジストロフィン異常症によって示唆される。アウトオブフレーム突然変異をインフレーム突然変異に変換する能力は、仮説上は、ｍＲＮＡリーディングフレームを保存することができ、内部で短縮されているが機能性のジストロフィンタンパク質を生じさせる。ゴロディルセンは、これを達成するように設計された。
【００９０】
ゴロディルセンはジストロフィンプレｍＲＮＡを標的として、エクソン５３のスキッピングを誘発し、したがってエクソン５３は、スプライスされた成熟ｍＲＮＡ転写物から排除又はスキップされる。エクソン５３をスキップすることにより、破壊されたリーディングフレームはインフレーム突然変異に回復される。ＤＭＤは種々の遺伝子サブタイプから構成されるが、ゴロディルセンは、ジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５３をスキップするように特別に設計された。エクソン５３のスキッピングに適したＤＭＤ突然変異は、エクソン５３に近接するエクソンの欠失（すなわち、エクソン５２又はエクソン５４の欠失を含む）を含み、ＤＭＤ患者のサブグループ（８％）を構成する。
【００９１】
ゴロディルセンの２５の核酸塩基の配列は、ジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５３内の特異的な標的配列に相補的であるように設計される。ゴロディルセンの各モルホリノ環は、ＤＮＡ中に見出される４つの複素環核酸塩基（アデニン、シトシン、グアニン、及びチミン）の１つに連結される。
【００９２】
ゴロディルセンと標的プレｍＲＮＡ配列とのハイブリダイゼーションはプレｍＲＮＡスプライシング複合体の形成を妨げ、成熟ｍＲＮＡからエクソン５３を欠失させる。ゴロディルセンの構造及び立体配座は、相補的配列に対する配列特異的塩基対合を可能にする。例えば、ジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５１をスキップするように設計されたＰＭＯであるエテプリルセンは、ジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５１に含有される
相補的配列に対する配列特異的塩基対合を可能にする。
【００９３】
エクソンスキッピングを用いたジストロフィンリーディングフレームの回復
７９のエクソンを全て含有する正常なジストロフィンｍＲＮＡは、正常なジストロフィンタンパク質を生じ得る。
【００９４】
ジストロフィン遺伝子からエクソン全体が失われたジストロフィンｍＲＮＡは、通常、ＤＭＤをもたらす。
【００９５】
別のエクソンスキッピングＰＭＯであるエテプリルセンは、エクソン５１をスキップして、ｍＲＮＡリーディングフレームを回復させる。エクソン４９は完全なコドンで終わり、エクソン５２はコドンの最初のヌクレオチドで始まるので、エクソンスキッピングによるエクソン５１の欠失はリーディングフレームを回復させ、インタクトなジストログリカン結合部位を有する、内部で短縮されたジストロフィンタンパク質の産生がもたらされる。
【００９６】
ジストロフィンｍＲＮＡオープンリーディングフレームを回復させるためにエクソンスキッピングを用いるＤＭＤ表現型の改善の実行可能性は、非臨床試験により支持される。ＤＭＤのジストロフィー動物モデルにおける多数の試験により、エクソンスキッピングによるジストロフィンの回復が筋力及び筋機能の確実な改善をもたらすことが示されている（Ｓｈａｒｐ  ２０１１；Ｙｏｋｏｔａ  ２００９；Ｗｕ  ２００８；Ｗｕ  ２０１１；Ｂａｒｔｏｎ−Ｄａｖｉｓ  １９９９；Ｇｏｙｅｎｖａｌｌｅ  ２００４；Ｇｒｅｇｏｒｅｖｉｃ  ２００６；Ｙｕｅ  ２００６；Ｗｅｌｃｈ  ２００７；Ｋａｗａｎｏ  ２００８；Ｒｅａｙ  ２００８；ｖａｎ  Ｐｕｔｔｅｎ  ２０１２）。このことの説得力のある例は、エクソンスキッピング（ＰＭＯを用いる）治療後のジストロフィンレベルを同じ組織内の筋機能と比較した研究に由来する。ジストロフィーｍｄｘマウスでは、マウス特異的ＰＭＯで処置した前脛骨（ＴＡ）筋は、応力誘発性（ｓｔｒｅｓｓ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ）収縮の後にその最大荷重容量（ｍａｘｉｍｕｍ  ｆｏｒｃｅ  ｃａｐａｃｉｔｙ）の約７５％を維持したが、未処置の反対側のＴＡ筋は、その最大荷重容量の約２５％しか維持しなかった（ｐ＜０．０５）（Ｓｈａｒｐ  ２０１１）。別の研究では、３匹のジストロフィーＣＸＭＤイヌ（２〜５月齢）に、５〜７週間にわたって週１回、又は２２週間にわたって２週間に１回、その遺伝子突然変異に特異的なＰＭＯを用いたエクソンスキッピング治療を受けさせた。エクソンスキッピング治療の後、３匹のイヌは全て、全身に及ぶ広範な骨格筋のジストロフィン発現を実証し、そしてベースラインに対して歩行運動（１５ｍ走行試験）が維持又は改善された。対照的に、未処置の同月齢のＣＸＭＤイヌは、研究を通して、歩行運動の顕著な低下を示した（Ｙｏｋｏｔａ  ２００９）。
【００９７】
ＰＭＯは、ｍｄｘマウスと、全ヒトＤＭＤ転写物を発現するヒト化ＤＭＤ（ｈＤＭＤ）マウスモデルとの両方において、等モル濃度でホスホロチオアートよりも高いエクソンスキッピング活性を有することが示された（Ｈｅｅｍｓｋｉｒｋ  ２００９）。正常ヒト骨格筋細胞、又はエクソン５１スキッピングに適している様々な突然変異を有するＤＭＤ患者からの筋細胞において、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）及びウエスタンブロット（ＷＢ）を用いたインビトロでの実験により、エクソン５１スキッピングの強力な誘発剤としてエテプリルセン（ＰＭＯ）が同定された。エテプリルセン誘発性のエクソン５１スキッピングは、ｈＤＭＤマウスモデルにおいてインビボで確認されている（Ａｒｅｃｈａｖａｌａ−Ｇｏｍｅｚａ  ２００７）。
【００９８】
ジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５３標的領域に特異的にハイブリダイズして、エクソン５３スキッピングを誘発するアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を分析するための臨床結果には、ジストロフィン陽性線維パーセント（ＰＤＰＦ）のベースラインか
らの増大、６分間歩行試験（６ＭＷＴ）、歩行運動の喪失（ＬＯＡ）、Ｎｏｒｔｈ  Ｓｔａｒ  Ａｍｂｕｌａｔｏｒｙ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ（ＮＳＡＡ）、肺機能検査（ＰＦＴ）、外部支援なしに立ち上がる能力（仰臥位から）、新規のジストロフィン産生及び他の機能尺度が含まれる。
【００９９】
ゴロディルセンは臨床試験において試験された。
【０１００】
試験４０５３−１０１
試験４０５３−１０１は、ＤＭＤ患者におけるＳＲＰ−４０５３（ゴロディルセン）の第Ｉ／ＩＩ相試験である。この試験は、エクソン５３スキッピングに適しているデュシェンヌ型筋ジストロフィー患者におけるＳＲＰ−４０５３の２パート、無作為化、二重盲検、プラセボ対照、用量漸増の安全性、耐容性、及び薬物動態試験（パート１）、並びにその後の非盲検の効力及び安全性評価（パート２）である。主要評価項目には、有害事象の発生［時間枠：約１２週間（パート１）］、６分間歩行試験（６ＭＷＴ）のベースラインからの変化［時間枠：１４４週間（パート２）］、及びジストロフィン陽性線維の割合［時間枠：４８週間（パート２）］が含まれる。副次評価項目には、血漿中の薬物濃度［時間枠：約１２週間（パート１）］、予測最大吸気圧（ＭＩＰ）％、予測最大呼気圧（ＭＥＰ）％［時間枠：１４４週間（パート２）］が含まれる。この試験のさらなる詳細は、ｗｗｗ．ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ（ＮＣＴ０２３１０９０６）において見出される。
【０１０１】
ＩＩＩ．製剤及び投与様式
特定の実施形態では、本開示は、本明細書に記載されるようなアンチセンスオリゴヌクレオチドの治療的送達に適した製剤又は医薬組成物を提供する。したがって、特定の実施形態では、本開示は、本明細書に記載されるアンチセンスオリゴヌクレオチドの１つ又は複数を治療的に有効な量で含み、１つ又は複数の薬学的に許容される担体（添加剤）及び／又は希釈剤と一緒に製剤化された、薬学的に許容される組成物を提供する。本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドは単独で投与されることが可能であるが、化合物を医薬製剤（組成物）として投与するのが好ましい。
【０１０２】
核酸分子の送達のための方法は、例えば、Ａｋｈｔａｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．，２：１３９；及びＤｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ａｋｈｔａｒ編；Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＴ国際公開第９４／０２５９５号パンフレットに記載されている。これら及び他のプロトコルは、本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む実質的に任意の核酸分子を送達するために利用することができる。
【０１０３】
以下に詳述されるように、本開示の医薬組成物は、特に、以下のものに適合するものを含む、固体又は液体形態での投与のために製剤化され得る：（１）経口投与、例えば、水薬（水溶液若しくは非水溶液又は懸濁液）、錠剤、例えば、頬側、舌下、及び全身の吸収を標的とするもの、ボーラス、粉末、顆粒、舌に塗布するためのペースト；（２）非経口投与、例えば、無菌溶液若しくは懸濁液、又は持続放出製剤としての、例えば、皮下、筋肉内、静脈内又は硬膜外注射による投与；（３）局所適用、例えば、クリーム、軟膏、又は制御放出パッチ若しくはスプレーとしての、皮膚への適用；（４）腟内又は直腸内、例えば、ペッサリー、クリーム又はフォームとしての適用；（５）舌下；（６）眼内；（７）経皮；或いは（８）経鼻。
【０１０４】
薬学的に許容される担体としての役割を果たすことができる材料のいくつかの例としては、（１）糖、例えば、ラクトース、グルコース及びスクロース；（２）デンプン、例え
ば、コーンスターチ及びジャガイモデンプン；（３）セルロース及びその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース及び酢酸セルロース；（４）粉末トラガカント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）タルク；（８）賦形剤、例えば、ココアバター及び坐薬ワックス；（９）油、例えば、ピーナッツ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油及び大豆油；（１０）グリコール、例えば、プロピレングリコール；（１１）ポリオール、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレグリコール；（１２）エステル、例えば、オレイン酸エチル及びラウリン酸エチル；（１３）寒天；（１４）緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウム；（１５）アルギン酸；（１６）パイロジェンフリー水；（１７）等張生理食塩水；（１８）リンゲル溶液；（１９）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝溶液；（２１）ポリエステル、ポリカーボネート及び／又はポリ酸無水物；並びに（２２）医薬製剤中で使用される他の無毒性の適合性物質が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０５】
本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む製剤に適した薬剤の追加の非限定的な例としては、種々の組織への薬物の侵入を増強することができる、ＰＥＧコンジュゲート核酸、リン脂質コンジュゲート核酸、親油性部分を含有する核酸、ホスホロチオアート、Ｐ糖タンパク質阻害剤（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ８５など）；生分解性ポリマー、例えば、埋込み後の持続放出送達のためのポリ（ＤＬ−ラクチド−コグリコリド）ミクロスフェア（Ｅｍｅｒｉｃｈ，Ｄ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，８、４７−５８）Ａｌｋｅｒｍｅｓ，Ｉｎｃ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．；及び血液脳関門を横断して薬物を送達することができ、ニューロンの取り込み機構を変更することができる負荷ナノ粒子、例えば、ポリブチルシアノアクリラートで作られたもの（Ｐｒｏｇ  Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，２３，９４１−９４９，１９９９）が挙げられる。
【０１０６】
本開示は、ポリ（エチレングリコール）脂質を含有する表面修飾リポソーム（ＰＥＧ修飾された分枝状及び非分枝状若しくはその組合せ、又は長期循環リポソーム又はステルスリポソーム）を含む組成物の使用も特徴とする。本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、共有結合した種々の分子量のＰＥＧ分子を含むこともできる。これらの製剤は、標的組織における薬物の蓄積を増大させるための方法を提供する。この種類の薬物担体は、オプソニン化及び単核食細胞系（ＭＰＳ又はＲＥＳ）による除去に抵抗し、それにより、カプセル化薬物のより長い血液循環時間、及び増強された組織曝露が可能になる（Ｌａｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１９９５，９５，２６０１−２６２７；Ｉｓｈｉｗａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．１９９５，４３，１００５−１０１１）。このようなリポソームは、恐らく、血管新生した標的組織における血管外漏出及び捕獲によって、腫瘍中に選択的に蓄積することが示されている（Ｌａｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９５，２６７，１２７５−１２７６；Ｏｋｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１２３８，８６−９０）。長期循環リポソームは、特に、ＭＰＳの組織に蓄積することが知られている従来のカチオン性リポソームと比べて、ＤＮＡ及びＲＮＡの薬物動態及び薬力学を増強する（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９５，４２，２４８６４−２４８７０；Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＴ国際公開第９６／１０３９１号パンフレット；Ａｎｓｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＴ国際公開第９６／１０３９０号パンフレット；Ｈｏｌｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＴ国際公開第９６／１０３９２号パンフレット）。また長期循環リポソームは、肝臓及び脾臓などの代謝的に攻撃的なＭＰＳ組織における蓄積を回避するその能力に基づいて、カチオン性リポソームと比べてより大きい程度まで、薬物をヌクレアーゼ分解から保護する可能性もある。
【０１０７】
さらなる実施形態では、本開示は、米国特許第６，６９２，９１１号明細書、同第７，１６３，６９５号明細書及び同第７，０７０，８０７号明細書に記載されるような送達の
ために調製されたアンチセンスオリゴヌクレオチド医薬組成物を含む。これに関して、一実施形態では、本開示は、リジン及びヒスチジン（ＨＫ）のコポリマーを含む組成物（米国特許第７，１６３，６９５号明細書、同第７，０７０，８０７号明細書、及び同第６，６９２，９１１号明細書に記載される）中において、単独で又はＰＥＧ（例えば、分枝状若しくは非分枝状ＰＥＧ又は両方の混合物）と組み合わせて、ＰＥＧ及び標的部分と組み合わせて、又は上記のいずれかを架橋剤と組み合わせて、本開示のオリゴマーを提供する。特定の実施形態では、本開示は、グルコン酸修飾ポリヒスチジン又はグルコニル化ポリヒスチジン／トランスフェリン−ポリリジンを含む医薬組成物中のアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。当業者は、Ｈｉｓ及びＬｙｓに類似した特性を有するアミノ酸が組成物中で置換され得ることも認識するであろう。
【０１０８】
本明細書に記載されるアンチセンスオリゴヌクレオチドの特定の実施形態はアミノ又はアルキルアミノなどの塩基性官能基を含有することができ、したがって、薬学的に許容される酸と共に薬学的に許容される塩を形成することができる。これに関して、「薬学的に許容される塩」という用語は、本開示の化合物の比較的無毒性の無機酸及び有機酸付加塩を指す。これらの塩は、投与ビヒクル又は剤形の製造過程においてその場で調製することもできるし、或いは精製した遊離塩基形態の本開示の化合物を適切な有機酸又は無機酸と別個に反応させ、このようにして形成された塩をその後の精製の間に単離することによって調製することもできる。代表的な塩には、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、酢酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチル酸塩（ｎａｐｔｈｙｌａｔｅ）、メシル酸塩、グルコヘプトン酸塩、ラクトビオン酸塩、及びラウリルスルホン酸塩などが含まれる（例えば、Ｂｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）”Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
Ｓａｌｔｓ”，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９を参照）。
【０１０９】
本アンチセンスオリゴヌクレオチドの薬学的に許容される塩には、例えば無毒性の有機酸又は無機酸から得られる、化合物の従来の無毒性塩又は第４級アンモニウム塩が含まれる。例えば、このような従来の無毒性塩には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸などの無機酸から誘導された塩と、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パルミチン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、２−アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イソチオン酸などの有機酸から調製された塩とが含まれる。
【０１１０】
特定の実施形態では、本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つ又は複数の酸性官能基を含有することができ、したがって、薬学的に許容される塩基と共に薬学的に許容される塩を形成することができる。これらの例では、「薬学的に許容される塩」という用語は、本開示の化合物の比較的無毒性の無機塩基及び有機塩基付加塩を指す。これらの塩も同様に、投与ビヒクル又は剤形の製造過程においてその場で調製することもできるし、或いは精製した遊離酸形態の本開示の化合物を、適切な塩基、例えば、薬学的に許容される金属カチオンの水酸化物、炭酸塩若しくは重炭酸塩と、アンモニアと、又は薬学的に許容される有機第１級、第２級若しくは第３級アミンと別個に反応させることもできる。代表的なアルカリ塩又はアルカリ土類塩には、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、及びアルミニウム塩などが含まれる。塩基付加塩の形成に有用な代表的な有機アミンには、エチルアミン、ジエチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジンなどが含まれる（例えば、上記のＢｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．を参照）。
【０１１１】
ラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウムなどの湿潤剤、乳化剤及び潤滑剤、並びに着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、香味料及び香料、保存料及び抗酸化剤が組成物中に存在し得る。
【０１１２】
薬学的に許容される抗酸化剤の例としては、（１）水溶性抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど；（２）油溶性抗酸化剤、例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ−トコフェロールなど；及び（３）金属キレート剤、例えば、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などが挙げられる。
【０１１３】
本開示の製剤は、経口、経鼻、局所（頬側及び舌下を含む）、直腸、膣及び／又は非経口投与に適した製剤を含む。製剤は単位剤形で提供されるのが便利であり、薬学分野において周知である任意の方法によって調製することができる。単一の剤形を生じるために担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、処置される宿主、特定の投与様式によって異なる。単一の剤形を生じるために担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、一般的に、治療効果をもたらす化合物の量となる。一般的に、１００パーセントのうち、この量は、約０．１パーセント〜約９９パーセント、好ましくは約５パーセント〜約７０パーセント、最も好ましくは約１０パーセント〜約３０パーセントの活性成分の範囲となる。
【０１１４】
特定の実施形態では、本開示の製剤は、シクロデキストリン、セルロース、リポソーム、ミセル形成剤、例えば、胆汁酸、及び高分子担体、例えば、ポリエステル及びポリ酸無水物から選択される賦形剤と、本開示のオリゴマーとを含む。特定の実施形態では、上述の製剤は、本開示のオリゴマーを経口的に生体利用可能にする。
【０１１５】
これらの製剤又は医薬組成物を調製する方法は、本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドと、担体及び任意選択的に１つ又は複数の補助成分とを関連させるステップを含む。一般的に、製剤は、本開示の化合物と、液体担体、若しくは微粉化した固体担体、又はその両方とを均一且つ密接に関連させ、次に必要であれば、生成物を成形することによって調製される。
【０１１６】
経口投与に適した本開示の製剤は、カプセル、カシェ剤、丸剤、錠剤、ロゼンジ（風味付けされた基剤、通常は、スクロース及びアカシア又はトラガカントを用いる）、粉末、顆粒の形態で、又は水性若しくは非水性液体中の溶液若しくは懸濁液として、又は水中油若しくは油中水液体エマルションとして、又はエリキシル若しくはシロップとして、又は香錠（不活性基剤、例えば、ゼラチン及びグリセリン、又はスクロース及びアカシアを用いる）として、及び／又はマウスウォッシュなどとしての形態でよく、これらはそれぞれ、所定量の本開示の化合物を活性成分として含有する。本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ボーラス、舐剤又はペーストとして投与されてもよい。
【０１１７】
経口投与のための本開示の固体剤形（カプセル、錠剤、丸剤、糖衣錠、粉末、顆粒、トローチ（ｔｒｏｕｃｈｅｓ）など）において、活性成分は、クエン酸ナトリウム若しくはリン酸二カルシウムなどの１つ又は複数の薬学的に許容される担体、及び／又は以下のうちいずれかのものと混合され得る：（１）充填剤又は増量剤、例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、及び／又はケイ酸；（２）結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース及び／又はアカシアなど；（３）保湿剤、例えば、グリセロール；（４）崩壊剤、例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモ又はタピオカデンプン、アルギン酸、特定
のケイ酸塩、及び炭酸ナトリウム；（５）溶解遅延剤、例えば、パラフィン；（６）吸収促進剤、例えば、第４級アンモニウム化合物、並びに界面活性剤、例えば、ポロキサマー及びラウリル硫酸ナトリウム；（７）湿潤剤、例えば、セチルアルコール、モノステアリン酸グリセロール、及び非イオン性界面活性剤など；（８）吸収剤、例えば、カオリン及びベントナイトクレイ；（９）潤滑剤、例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸、及びこれらの混合物；（１０）着色剤；並びに（１１）制御放出剤、例えば、クロスポビドン又はエチルセルロース。カプセル、錠剤及び丸剤の場合、医薬組成物は、緩衝剤も含み得る。同様のタイプの固体医薬組成物は、ラクトース又は乳糖のような賦形剤、及び高分子量ポリエチレングリコールなどを用いて、ソフト及びハード殻ゼラチンカプセル中の充填剤として使用されてもよい。
【０１１８】
錠剤は、任意選択的に１つ又は複数の補助成分と共に、圧縮又は成形によって製造され得る。圧縮錠剤は、結合剤（例えば、ゼラチン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース）、潤滑剤、不活性希釈剤、保存料、崩壊剤（例えば、デンプングリコール酸ナトリウム又は架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム）、界面活性剤又は分散剤を用いて調製され得る。成形錠剤は、適切な機械において不活性液体希釈剤で湿潤させた粉末化合物の混合物を成形することによって製造され得る。
【０１１９】
本開示の医薬組成物の錠剤及び他の固体剤形、例えば、糖衣錠、カプセル、丸剤及び顆粒は、任意選択的に、割線が付けられてもよいし、或いはコーティング及び殻、例えば、製薬分野で周知の腸溶コーティング及び他のコーティングを用いて調製されてもよい。これらは、例えば、所望の放出プロファイルを提供するために様々な割合のヒドロキシプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、リポソーム及び／又はミクロスフェアを用いて、その中の活性成分の遅延又は制御放出を提供するように製剤化されてもよい。これらは、急速放出のために製剤化されてもよく、例えば、凍結乾燥されてもよい。これらは、例えば、細菌保持フィルターによるろ過によって、或いは使用の直前に滅菌水、又は何らかの他の無菌注射用媒体中に溶解させることができる無菌の固体医薬組成物の形態の滅菌剤を取り込むことによって滅菌され得る。またこれらの医薬組成物は、任意選択的に乳白剤を含有していてもよく、活性成分を胃腸管の特定の部分においてのみ又はその部分で優先的に、任意選択的に遅延様式で、放出する組成を有していてもよい。使用可能な包埋組成物の例としては、高分子物質及びワックスが挙げられる。活性成分は、適切な場合には上記の賦形剤の１つ又は複数を含む、マイクロカプセル化形態であり得る。
【０１２０】
本開示の化合物の経口投与のための液体剤形には、薬学的に許容されるエマルション、マイクロエマルション、溶液、懸濁液、シロップ及びエリキシルが含まれる。活性成分に加えて、液体剤形は、当該技術分野で一般的に使用される不活性希釈剤、可溶化剤及び乳化剤、例えば、水又は他の溶媒など、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油（特に、綿実油、ラッカセイ油、コーン油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ及びゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール及びソルビタンの脂肪酸エステル、並びにこれらの混合物を含有し得る。
【０１２１】
不活性希釈剤に加えて、経口医薬組成物は、補助剤、例えば、湿潤剤、乳化剤及び懸濁化剤、甘味剤、香味料、着色剤、香料及び保存料を含むこともできる。
【０１２２】
懸濁液は、活性化合物に加えて、例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール及びソルビタンエステル、微結晶性セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天及びトラガカント、並びにこれらの混合物としての
懸濁化剤を含有し得る。
【０１２３】
直腸又は膣内投与のための製剤は坐薬として提供されてもよく、これは、１つ又は複数の本開示の化合物と、例えば、ココアバター、ポリエチレングリコール、坐薬ワックス又はサリチラートを含む１つ又は複数の適切な非刺激性の賦形剤又は担体とを混合することにより調製することができ、そして室温で固体であるが、体温では液体であり、したがって、直腸又は膣腔内で融解して活性化合物を放出することになる。
【０１２４】
本明細書で提供されるオリゴマーの局所又は経皮投与のための製剤又は剤形には、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチ及び吸入剤が含まれる。活性アンチセンスオリゴヌクレオチドは、薬学的に許容される担体、及び必要とされ得る任意の保存料、緩衝剤、又は噴射剤と無菌条件下で混合され得る。軟膏、ペースト、クリーム及びゲルは、本開示の活性化合物に加えて、賦形剤、例えば、動物及び植物性脂肪、油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルク及び酸化亜鉛、又はこれらの混合物を含有し得る。
【０１２５】
粉末及びスプレーは、本開示のオリゴマーに加えて、賦形剤、例えば、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム及びポリアミド粉末、又はこれらの物質の混合物を含有することができる。スプレーは、付加的に、通例の噴射剤、例えば、クロロフルオロ炭化水素並びにブタン及びプロパンなどの揮発性非置換炭化水素を含有することができる。
【０１２６】
経皮パッチは、本開示のオリゴマーの身体への制御送達を提供するというさらなる利点を有する。このような剤形は、オリゴマーを適切な媒体中に溶解又は分散させることによって製造することができる。また吸収増強剤を使用して、皮膚を通過する薬剤の流動を増大させることもできる。このような流動の速度は、当該技術分野で知られている方法の中でも特に、速度制御膜を提供するか、又は薬剤をポリマーマトリックス又はゲル中に分散させることによって制御することができる。
【０１２７】
非経口投与に適した医薬組成物は、１つ又は複数の本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、１つ又は複数の薬学的に許容される無菌等張水溶液若しくは非水溶液、分散液、懸濁液又はエマルション、或いは使用の直前に無菌注射用溶液又は分散液中に再構成され得る無菌粉末と組み合わせて含むことができ、これらは、糖、アルコール、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、意図されるレシピエントの血液と製剤を等張にする溶質、又は懸濁化剤若しくは増粘剤を含有し得る。本開示の医薬組成物中で使用され得る適切な水性及び非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、及びこれらの適切な混合物、オリーブ油などの植物油、並びにオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルが挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用により、分散液の場合には必要とされる粒径の維持により、そして界面活性剤の使用により維持することができる。
【０１２８】
またこれらの医薬組成物は、保存料、湿潤剤、乳化剤及び分散剤などの補助剤を含有していてもよい。本アンチセンスオリゴヌクレオチドに対する微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などを包含させることによって保証され得る。また等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウムなどを組成物中に包含させることが望ましいこともある。加えて、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの吸収を遅延させる薬剤を包含させることにより、注射用医薬品形態の長期にわたる吸収がもたらされ得る。
【０１２９】
場合により、薬物の効果を長くするために、皮下又は筋肉内注射からの薬物の吸収を遅くすることが望ましい。これは、当該技術分野で知られている方法の中でも特に、水溶性が乏しい結晶性材料又は非晶質材料の液体懸濁液の使用によって達成され得る。次に、薬物の吸収の速度はその溶解速度に依存し、次には、結晶サイズ及び結晶形態に依存し得る。或いは、非経口投与される薬物形態の遅延吸収は、薬物を油ビヒクル中に溶解又は懸濁させることによって達成される。
【０１３０】
注射用デポー形態は、ポリ乳酸−ポリグリコリドなどの生分解性ポリマー中で本アンチセンスオリゴヌクレオチドのマイクロカプセルマトリックスを形成することによって製造することができる。オリゴマー対ポリマー比、及び使用される特定のポリマーの性質に応じて、オリゴマー放出速度は制御され得る。他の生分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル）及びポリ（酸無水物）が挙げられる。またデポー注射用製剤は、身体組織と適合性のリポソーム又はマイクロエマルション内に薬物を捕捉することによって調製されてもよい。
【０１３１】
本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドを医薬品としてヒト及び動物に投与する場合、それ自体で、又は例えば０．１〜９９％（より好ましくは、１０〜３０％）の活性成分を薬学的に許容される担体と組み合わせて含有する医薬組成物として、与えることができる。
【０１３２】
上記のように、本開示の製剤又は調製物は、経口的、非経口的、局所的、又は経直腸的に与えられてもよい。これらは、通常、各投与経路に適した形態で与えられる。例えば、これらは、錠剤又はカプセル形態で、注射、吸入、目薬、軟膏、坐薬などにより、注射、点滴又は吸入による投与で；ローション又は軟膏により局所的に；及び坐薬により直腸で投与される。
【０１３３】
選択される投与経路に関わらず、適切な水和形態で使用され得る本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチド、及び／又は本開示の医薬組成物は、当業者に知られている従来の方法によって、薬学的に許容される剤形に製剤化され得る。本開示の医薬組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、患者に対して許容されない毒性を伴うことなく、特定の患者、組成物、及び投与様式にとって所望の治療応答を達成するのに有効な活性成分の量を得るように変化され得る。
【０１３４】
選択される投与量レベルは、使用される本開示の特定のオリゴマー又はそのエステル、塩若しくはアミドの活性、投与経路、投与の時間、使用される特定のオリゴマーの排泄又は代謝速度、吸収の速度及び程度、処置の期間、使用される特定のオリゴマーと組み合わせて使用される他の薬物、化合物及び／又は材料、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、一般的健康及び過去の病歴、並びに医学分野で周知の同様の因子を含む様々な因子に依存し得る。
【０１３５】
当該技術分野において通常の技能を有する医師又は獣医は、必要とされる医薬組成物の有効量を容易に決定及び処方することができる。例えば、医師又は獣医は、医薬組成物中で使用される本開示の化合物の用量を、所望の治療効果を達成するために必要とされるレベルよりも低いレベルで開始して、所望の効果が達成されるまで投与量を徐々に増加させることができる。一般に、本開示の化合物の適切な１日の用量は、治療効果を生じるために有効な最小用量である化合物の量となる。このような有効用量は、一般に、上記の因子に依存し得る。一般に、本開示の化合物の患者に対する経口、静脈内、脳室内及び皮下用量は、示される効果のために使用される場合、１日に体重１キログラム当たり約０．０００１〜約１００ｍｇの範囲となる。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、通常、約４〜１６０ｍｇ／ｋｇ、１０〜１６０ｍｇ／ｋｇ、又は２０〜１６０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。場合により、１６０ｍｇ／ｋｇよりも多い用量が必要とされることもある。いくつかの実施形態では、例えばｉ．ｖ．投与などの非経口用量は、約０．５ｍｇ〜１６０ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約４ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１１ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、１４ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、１７ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２１ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、２６ｍｇ／ｋｇ、２７ｍｇ／ｋｇ、２８ｍｇ／ｋｇ、２９ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、３１ｍｇ／ｋｇ、３２ｍｇ／ｋｇ、３３ｍｇ／ｋｇ、３４ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ、３６ｍｇ／ｋｇ、３７ｍｇ／ｋｇ、３８ｍｇ／ｋｇ、３９ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、４１ｍｇ／ｋｇ、４２ｍｇ／ｋｇ、４３ｍｇ／ｋｇ、４４ｍｇ／ｋｇ、４５ｍｇ／ｋｇ、４６ｍｇ／ｋｇ、４７ｍｇ／ｋｇ、４８ｍｇ／ｋｇ、４９ｍｇ／ｋｇ  ５０ｍｇ／ｋｇ、５１ｍｇ／ｋｇ、５２ｍｇ／ｋｇ、５３ｍｇ／ｋｇ、５４ｍｇ／ｋｇ、５５ｍｇ／ｋｇ、５６ｍｇ／ｋｇ、５７ｍｇ／ｋｇ、５８ｍｇ／ｋｇ、５９ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、６５ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、７５ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、８５ｍｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇ、９５ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、１０５ｍｇ／ｋｇ、１１０ｍｇ／ｋｇ、１１５ｍｇ／ｋｇ、１２０ｍｇ／ｋｇ、１２５ｍｇ／ｋｇ、１３０ｍｇ／ｋｇ、１３５ｍｇ／ｋｇ、１４０ｍｇ／ｋｇ、１４５ｍｇ／ｋｇ、１５０ｍｇ／ｋｇ、１５５ｍｇ／ｋｇ、１６０ｍｇ／ｋｇ（その間の全ての整数を含む）の用量で投与される。いくつかの実施形態では、オリゴマーは３０ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態では、オリゴマーは４０ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態では、オリゴマーは６０ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態では、オリゴマーは８０ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態では、オリゴマーは１６０ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態では、オリゴマーは５０ｍｇ／ｋｇで投与される。
【０１３７】
所望により、活性化合物の有効な１日の用量は、任意選択的に単位剤形で、１日の間に適切な間隔を置いて投与される２、３、４、５、６又はそれ以上のサブ用量として投与され得る。特定の状況では、機能性ジストロフィンタンパク質の所望の発現を維持するために、必要に応じて、投薬は、１日当たり１回の投与である。特定の実施形態では、投薬は、２日毎、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎、７日毎、８日毎、９日毎、１０日毎、１１日毎、１２日毎、１３日毎、１４日毎、又は１週間毎、２週間毎、３週間毎、４週間毎、５週間毎、６週間毎、７週間毎、８週間毎、９週間毎、１０週間毎、１１週間毎、１２週間毎、又は１か月毎、２か月毎、３か月毎、４か月毎、５か月毎、６か月毎、７か月毎、８か月毎、９か月毎、１０か月毎、１１か月毎、１２か月毎に、１回又は複数回の投与である。特定の実施形態では、投薬は、毎週１回の１回の投与である。特定の実施形態では、投薬は、２週間に１回の１回又は複数回の投与である。いくつかの実施形態では、投薬は、２週間に１回の１回の投与である。種々の実施形態では、投薬は、毎月の１回又は複数回の投与である。特定の実施形態では、投薬は、毎月の１回の投与である。
【０１３８】
種々の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、毎週４ｍｇ／ｋｇで投与される。種々の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、毎週１０ｍｇ／ｋｇで投与される。種々の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、毎週２０ｍｇ／ｋｇで投与される。種々の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、毎週３０ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、毎週４０ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、毎週６０ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、毎週８０ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、毎週１００ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、毎週１６０ｍｇ／ｋｇで投与される。本明細書で使用される場合、毎週は、当該技術分野で認められる週１回という意味を有する
と理解される。
【０１３９】
種々の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、隔週に４ｍｇ／ｋｇで投与される。種々の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、隔週に１０ｍｇ／ｋｇで投与される。種々の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、隔週に２０ｍｇ／ｋｇで投与される。種々の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、隔週に３０ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、隔週に４０ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、隔週に６０ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、隔週に８０ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、隔週に１００ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、隔週に１６０ｍｇ／ｋｇで投与される。本明細書で使用される場合、隔週は、当該技術分野で認められる２週間に１回という意味を有すると理解される。
【０１４０】
種々の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、３週間毎に４ｍｇ／ｋｇで投与される。種々の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、３週間毎に１０ｍｇ／ｋｇで投与される。種々の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、３週間毎に２０ｍｇ／ｋｇで投与される。種々の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、３週間毎に３０ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、３週間毎に４０ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、３週間毎に６０ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、３週間毎に８０ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、３週間毎に１００ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、３週間毎に１６０ｍｇ／ｋｇで投与される。本明細書で使用される場合、３週間毎は、当該技術分野で認められる３週間に１回という意味を有すると理解される。
【０１４１】
種々の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、毎月４ｍｇ／ｋｇで投与される。種々の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、毎月１０ｍｇ／ｋｇで投与される。種々の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、毎月２０ｍｇ／ｋｇで投与される。種々の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、毎月３０ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、毎月４０ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、毎月６０ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、毎月８０ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、毎月１００ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、毎月１６０ｍｇ／ｋｇで投与される。本明細書で使用される場合、毎月は、当該技術分野で認められる月１回という意味を有すると理解される。
【０１４２】
当該技術分野で理解され得るように、毎週、隔週、３週間毎、又は毎月の投与は、１回若しくは複数回の投与又は上記のようなサブ用量でよい。
【０１４３】
核酸分子は、リポソーム中のカプセル化、イオン導入法、又はヒドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプセル、及び生体接着ミクロスフェアなどの本明細書に記載され、そして当該技術分野で知られている他のビヒクルへの組込みを含むがこれらに限定されない、当業者に知られている様々な方法によって細胞に投与することができる。特定の実施形態では、マイクロエマルション化技術用いて、親油性（水に不溶性）医薬品のバイオアベイラビリティを改善し得る。例としては、Ｔｒｉｍｅｔｒｉｎｅ（Ｄｏｒｄｕｎｏ
ｏ，Ｓ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，１７（１２），１６８５−１７１３，１９９１）及びＲＥＶ  ５９０１（Ｓｈｅｅｎ，Ｐ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ８０（７），７１２−７１４，１９９１）が挙げられる。いくつかの利益の中で特に、マイクロエマルション化は、吸収を循環系の代わりにリンパ系に対して優先的に方向付け、それにより肝臓を迂回し、肝胆道循環中の化合物の破壊を防止することによって、バイオアベイラビリティの増強を提供する。
【０１４４】
本開示の１つの態様では、製剤は、本明細書で提供されるオリゴマーと、少なくとも１つの両親媒性担体とから形成されるミセルを含有し、ここで、ミセルは、約１００ｎｍ未満の平均直径を有する。より好ましい実施形態では、約５０ｎｍ未満の平均直径を有するミセルが提供され、さらにより好ましい実施形態では、約３０ｎｍ未満、又はさらに約２０ｎｍ未満の平均直径を有するミセルが提供される。
【０１４５】
全ての適切な両親媒性担体が企図されるが、現在好ましい担体は一般的に、一般に安全と認められる（ＧＲＡＳ）状態を有し、本開示の化合物を可溶すると共に、その後の段階で溶液が複合水相（例えば、ヒト胃腸管において見出されるものなど）と接触するときにそれをマイクロエマルション化することができるものである。通常、これらの要件を満たす両親媒性成分は２〜２０のＨＬＢ（親水性対親油性バランス）値を有し、その構造は、Ｃ−６〜Ｃ−２０の範囲の直鎖脂肪族ラジカルを含有する。例としては、ポリエチレン−グリコール化脂肪グリセリド及びポリエチレングリコールがある。
【０１４６】
両親媒性担体の例としては、飽和及び単不飽和ポリエチレングリコール化脂肪酸グリセリド、例えば、完全又は部分的に水素化された種々の植物油から得られるものが挙げられる。このような油は、有利には、トリ−、ジ−、及びモノ−脂肪酸グリセリド、並びに対応する脂肪酸のジ−及びモノ−ポリエチレングリコールエステルで構成されることができ、特に好ましい脂肪酸組成物は、カプリン酸４〜１０％、カプリン酸３〜９％、ラウリン酸４０〜５０％、ミリスチン酸１４〜２４％、パルミチン酸４〜１４％及びステアリン酸５〜１５％を含む。別の有用な種類の両親媒性担体には、飽和又は単不飽和脂肪酸との部分エステル化ソルビタン及び／又はソルビトール（ＳＰＡＮ（登録商標）シリーズ）、又は対応するエトキシル化類似体（ＴＷＥＥＮ（登録商標）シリーズ）が含まれる。
【０１４７】
Ｇｅｌｕｃｉｒｅシリーズ、Ｌａｂｒａｆｉｌ、Ｌａｂｒａｓｏｌ、又はＬａｕｒｏｇｌｙｃｏｌ（全て、Ｇａｔｔｅｆｏｓｓｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｉｎｔ  Ｐｒｉｅｓｔ，Ｆｒａｎｃｅにより製造及び流通される）、ＰＥＧ−モノ−オレアート、ＰＥＧ−ジ−オレアート、ＰＥＧ−モノ−ラウラート及びジ−ラウラート、レシチン、ポリソルベート８０など（米国及び世界のいくつかの会社により製造及び流通される）を含む市販の両親媒性担体は特に有用であり得る。
【０１４８】
特定の実施形態では、本開示の医薬組成物を適切な宿主細胞に導入するために、送達は、リポソーム、ナノカプセル、微粒子、ミクロスフェア、脂質粒子、ベシクルなどの使用により行うことができる。特に、本開示の医薬組成物は、脂質粒子、リポソーム、ベシクル、ナノスフェア、ナノ粒子などのいずれかにカプセル化された送達のために製剤化され得る。このような送達ビヒクルの製剤化及び使用は、既知の従来の技術を用いて実行することができる。
【０１４９】
本開示における使用に適した親水性ポリマーは、容易に水溶性であり、ベシクル形成脂質と共有結合し、且つ毒性効果を伴うことなくインビボで耐容性を示す（すなわち、生体適合性である）ものである。適切なポリマーには、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ乳酸（ポリラクチドとも呼ばれる）、ポリグリコール酸（ポリグリコリドとも呼ばれ
る）、ポリ乳酸−ポリグリコール酸コポリマー、及びポリビニルアルコールが含まれる。特定の実施形態では、ポリマーは、約１００若しくは１２０ダルトンから約５，０００若しくは１０，０００ダルトンまで、又は約３００ダルトンから〜約５，０００ダルトンまでの分子量を有する。他の実施形態では、ポリマーは、約１００〜約５，０００ダルトンの分子量を有する、又は約３００〜約５，０００ダルトンの分子量を有するポリエチレングリコールである。特定の実施形態では、ポリマーは、７５０ダルトンのポリエチレングリコール（ＰＥＧ（７５０））である。またポリマーはその中のモノマーの数によっても定義することができ、本開示の好ましい実施形態は少なくとも約３つのモノマーのポリマー、例えば、３つのモノマーからなるＰＥＧポリマー（約１５０ダルトン）を使用する。
【０１５０】
本開示での使用に適し得る他の親水性ポリマーには、ポリビニルピロリドン、ポリメトキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、及びヒドロキシメチルセルロース又はヒドロキシエチルセルロースなどの誘導体化セルロースが含まれる。
【０１５１】
特定の実施形態では、本開示の製剤は、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレン、アクリル酸及びメタクリル酸エステルのポリマー、ポリビニルポリマー、ポリグリコリド、ポリシロキサン、ポリウレタン及びそのコポリマー、セルロース、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、乳酸及びグリコール酸のポリマー、ポリ酸無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリ（酪酸（ｂｕｔｉｃ  ａｃｉｄ））、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド−コ−カプロラクトン）、多糖、タンパク質、ポリヒアルロン酸、ポリシアノアクリラート、並びにこれらのブレンド、混合物、又はコポリマーからなる群から選択される生体適合性ポリマーを含む。
【０１５２】
シクロデキストリンは、６個、７個又は８個のグルコース単位からなる環状オリゴ糖であり、それぞれ、ギリシャ文字α、β、又はγで指定される。グルコース単位は、α−１，４−グルコシド結合によって連結される。糖単位のいす形配座の結果、第２級ヒドロキシル基（Ｃ−２、Ｃ−３にある）は全て環の一方の側に位置し、Ｃ−６の第１級ヒドロキシル基は全て他方の側に位置する。結果として、外面が親水性であり、シクロデキストリンは水溶性になる。対照的に、シクロデキストリンの空洞は、Ｃ−３及びＣ−５原子の水素、及びエーテル様酸素によって覆われているために疎水性である。これらのマトリックスにより、例えば１７α−エストラジオールなどのステロイド化合物を含む様々な比較的疎水性の化合物との複合体形成が可能になる（例えば、ｖａｎ  Ｕｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓ．Ｏｒｇ．Ｃｕｌｔ．３８：１−３−１１３（１９９４）を参照）。複合体形成は、ファンデルワールス相互作用及び水素結合形成によって生じる。シクロデキストリンの化学的性質の概説については、Ｗｅｎｚ，Ａｇｎｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３３：８０３−８２２（１９９４）を参照されたい。
【０１５３】
シクロデキストリン誘導体の物理化学的特性は、その種類及び置換度に強く依存する。例えば、これらの水中での溶解性は、不溶性（例えば、トリアセチル−ベータ−シクロデキストリン）から、１４７％可溶性（ｗ／ｖ）（Ｇ−２−ベータ−シクロデキストリン）までの範囲である。さらに、これらは、多数の有機溶媒に可溶性である。シクロデキストリンの特性は、その溶解性を増大又は低下させることにより、種々の製剤成分の溶解性の制御を可能にする。
【０１５４】
多数のシクロデキストリン及びその調製方法が記載されている。例えば、Ｐａｒｍｅｔｅｒ（Ｉ），ｅｔ  ａｌ．（米国特許第３，４５３，２５９号明細書）及びＧｒａｍｅｒａ，ｅｔ  ａｌ．（米国特許第３，４５９，７３１号明細書）は、電気的に中性のシクロデキストリンを記載した。他の誘導体には、カチオン特性を有するシクロデキストリン［Ｐａｒｍｅｔｅｒ（ＩＩ）、米国特許第３，４５３，２５７号明細書］、不溶性架橋シク
ロデキストリン（Ｓｏｌｍｓ，米国特許第３，４２０，７８８号明細書）、及びアニオン特性を有するシクロデキストリン［Ｐａｒｍｅｔｅｒ（ＩＩＩ），米国特許第３，４２６，０１１号明細書］が含まれる。アニオン特性を有するシクロデキストリン誘導体の中には、カルボン酸、亜リン酸、亜ホスフィン酸、ホスホン酸、リン酸、チオホスホン酸、チオスルフィン酸、及びスルホン酸が親シクロデキストリンに付加されたものがある［上記のＰａｒｍｅｔｅｒ（ＩＩＩ）を参照］。さらに、Ｓｔｅｌｌａ，ｅｔ  ａｌ．（米国特許第５，１３４，１２７号明細書）によって、スルホアルキルエーテルシクロデキストリン誘導体が記載されている。
【０１５５】
リポソームは、水性内部区画を包囲する少なくとも１つの脂質二重層膜からなる。リポソームは、膜のタイプ及びサイズによって特徴付けることができる。小さい単層ベシクル（ＳＵＶ）は単一の膜を有し、通常、直径が０．０２〜０．０５μｍの範囲であり；大きい単層ベシクル（ＬＵＶ）は通常０．０５μｍよりも大きい。オリゴラメラ（ｏｌｉｇｏｌａｍｅｌｌａｒ）の大きいベシクル及び多重層ベシクルは、通常は同心円状の複数の膜層を有し、通常、０．１μｍよりも大きい。いくつかの非同心円状の膜を有するリポソーム、すなわち、より大きいベシクル内にいくつかのより小さいベシクルが含有されたものは、多胞性ベシクルと呼ばれる。
【０１５６】
本開示の１つの態様は、本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有するリポソームを含む製剤に関し、ここで、リポソーム膜は、積載容量が増大されたリポソームを提供するように配合される。代替的に又は付加的に、本開示の化合物はリポソームのリポソーム二重層内に含有されてもよいし、又はリポソーム二重層上に吸着されてもよい。本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドは脂質界面活性剤により凝集され、リポソームの内部空間に支持され得る；これらの場合、リポソーム膜は、活性剤−界面活性剤凝集体の破壊効果に抵抗するように配合される。
【０１５７】
本開示の一実施形態によると、リポソームの脂質二重層は、ＰＥＧ鎖が脂質二重層の内側表面からリポソームでカプセル化された内部空間内に伸長し、そして脂質二重層の外部から周囲環境に伸長するように、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で誘導体化された脂質を含有する。
【０１５８】
本開示のリポソーム内に含有される活性剤は、可溶化形態である。界面活性剤及び活性剤の凝集体（例えば、目的の活性剤を含有するエマルション又はミセルなど）は、本開示に従うリポソームの内部空間内に捕捉され得る。界面活性剤は活性剤を分散及び可溶化する作用をし、様々な鎖長（例えば、約Ｃ１４〜約Ｃ２０）の生体適合性リゾホスファチジルコリン（ＬＰＧ）を含むがこれらに限定されない、任意の適切な脂肪族、脂環式又は芳香族界面活性剤から選択され得る。またＰＥＧ−脂質などのポリマー誘導体化脂質はミセル／膜融合を阻害する作用をし、ポリマーの界面活性剤分子への添加は界面活性剤のＣＭＣを低下させ、ミセル形成に役立つので、ポリマー誘導体化脂質はミセル形成のために使用され得る。好ましいのは、マイクロモル範囲内のＣＭＯを有する界面活性剤であり；より高いＣＭＣの界面活性剤を用いて、本開示のリポソーム内に捕捉されたミセルを調製してもよい。
【０１５９】
本開示に従うリポソームは、当該技術分野で知られている様々な技術のいずれかによって調製され得る。例えば、米国特許第４，２３５，８７１号明細書；ＰＣＴ国際公開第９６／１４０５７号パンフレット；Ｎｅｗ  ＲＲＣ，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９９０），Ｐａｇｅｓ  ３３−１０４頁；Ｌａｓｉｃ  ＤＤ，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐｈｙｓｉｃｓ  ｔｏ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  ＢＶ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９９３を参照されたい。例えば、本開示の
リポソームは、リポソーム中に所望される誘導体化脂質の最終モルパーセントに相当する脂質濃度で、親水性ポリマーで誘導体化された脂質を予め形成したリポソーム内に拡散させることによって、例えば、予め形成したリポソームを、脂質グラフトポリマーからなるミセルに曝露することによって調製され得る。親水性ポリマーを含有するリポソームは、当該技術分野で知られているように、均質化、脂質領域水和、又は押出技術によって形成することもできる。
【０１６０】
別の例示的な製剤化手順では、活性剤はまず音波処理により、疎水性分子を容易に可溶化させるリゾホスファチジルコリン又は他の低ＣＭＣ界面活性剤（ポリマーグラフト脂質を含む）中に分散される。次に、得られた活性剤のミセル懸濁液を用いて、適切なモルパーセントのポリマーグラフト脂質又はコレステロールを含有する乾燥脂質サンプルを再水和させる。次に、当該技術分野で知られている押出技術を用いて、脂質及び活性剤懸濁液はリポソームに形成され、得られたリポソームは、標準的なカラム分離により、非カプセル化溶液から分離される。
【０１６１】
本開示の１つの態様では、リポソームは、選択されたサイズ範囲の実質的に均一なサイズを有するように調製される。１つの効果的なサイジング方法は、選択された均一の細孔径を有する一連のポリカーボネート膜を通してリポソームの水性懸濁液を押し出すことを含み；膜の細孔径は、その膜による押出によって生じるリポソームの最大サイズにほぼ相当する。例えば、米国特許第４，７３７，３２３号明細書（１９８８年４月１２日）を参照されたい。特定の実施形態では、ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ（登録商標）及びリポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ）（登録商標）などの試薬を用いて、ポリヌクレオチド又はタンパク質を細胞内に導入することができる。
【０１６２】
本開示の製剤の放出特性は、カプセル化材料、カプセル化薬物の濃度、及び放出調整剤の存在に依存する。例えば、胃内のように低いｐＨのみで、又は腸内のようにより高いｐＨのみで放出するｐＨ感受性コーティングを用いて、放出は、例えば、ｐＨ依存性であるように操作することができる。腸溶コーティングを使用して、胃を通過するまで放出を起こさせないことができる。多数のコーティング又は様々な材料内にカプセル化されたシアナミドの混合物を使用して、最初に胃内での放出、その後に腸内での放出を得ることができる。水の取込み又はカプセルからの拡散による薬物の放出を増大させることができる塩又は細孔形成剤を包含させることによって、放出を操作することもできる。薬物の溶解性を変更する賦形剤も、放出速度を制御するために使用することができる。マトリックスの分解又はマトリックスからの放出を増強する薬剤も取り込むことができる。これらは化合物に応じて、薬物に添加することも、別個の相として（すなわち、微粒子として）添加することも、又はポリマー相中に共溶解させることもできる。ほとんどの場合、その量は、０．１〜３０パーセント（ｗ／ｗポリマー）にすべきである。分解増強剤のタイプには、硫酸アンモニウム及び塩化アンモニウムなどの無機塩、クエン酸、安息香酸、及びアスコルビン酸などの有機酸、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸カルシウム、炭酸亜鉛、及び水酸化亜鉛などの無機塩基、及び硫酸プロタミン、スペルミン、コリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、及びトリエタノールアミンなどの有機塩基、並びにＴｗｅｅｎ（登録商標）及びＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）などの界面活性剤が含まれる。マトリックスに微細構造を加える細孔形成剤（すなわち、無機塩及び糖などの水溶性化合物）は、微粒子として添加される。その範囲は、通常、１〜３０パーセント（ｗ／ｗポリマー）である。
【０１６３】
取込みは、粒子の腸内の滞留時間を変更することによって操作することもできる。これは、例えば、粘膜接着性ポリマーで粒子をコーティングするか、又は粘膜接着性ポリマーをカプセル化材料として選択することによって達成することができる。例としては、遊離カルボキシル基を有する大部分のポリマー、例えば、キトサン、セルロース、特にポリア
クリラート（本明細書で使用される場合、ポリアクリラートは、アクリラート基、並びにシアノアクリラート及びメタクリラートなどの修飾アクリラート基を含むポリマーを指す）が挙げられる。
【０１６４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、外科若しくは医療デバイス又はインプラント内に含有されるように製剤化されるか、或いは外科若しくは医療デバイス又はインプラントによって放出されるように適合され得る。特定の態様では、インプラントは、アンチセンスオリゴヌクレオチドでコーティングされてもよいし、或いは他の方法で、アンチセンスオリゴヌクレオチドにより処理されてもよい。例えば、ヒドロゲル、又は他のポリマー、例えば、生体適合性及び／又は生分解性ポリマーは、インプラントを本開示の医薬組成物でコーティングするために使用され得る（すなわち、組成物は、ヒドロゲル又は他のポリマーを用いることにより、医療デバイスと共に使用するように適合され得る）。医療デバイスを薬剤でコーティングするためのポリマー及びコポリマーは当該技術分野においてよく知られている。インプラントの例としては、ステント、薬剤溶出ステント、縫合糸、人工器官、血管カテーテル、透析カテーテル、血管移植片、人工心臓弁、心臓ペースメーカー、植込み型除細動器、ＩＶニードル、骨の設置及び形成のためのデバイス、例えば、ピン、スクリュー、プレート、及び他のデバイス、並びに創傷治癒のための人工組織マトリックスが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６５】
本明細書に提供される方法に加えて、本開示に従って使用するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、他の医薬品から類推して、人間医学又は獣医学で使用するのに便利な任意の方法で投与するために製剤化され得る。アンチセンスアンチセンスオリゴヌクレオチド及びその対応する製剤は、単独で、又は筋ジストロフィーの処置における他の治療戦略、例えば、筋芽細胞移植、幹細胞療法、アミノグリコシド抗生物質の投与、プロテアソーム阻害剤、及びアップレギュレーション療法（例えば、ジストロフィンの常染色体パラログであるユートロフィンの上方制御）と組み合わせて投与され得る。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与の前に、同時に、又は後に、付加的な治療薬が投与され得る。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ステロイド及び／又は抗生物質と組み合わせて投与され得る。特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、バックグランドのステロイド理論（ｔｈｅｏｒｙ）（例えば、間欠的又は慢性的／連続的なバックグランドのステロイド療法）を受けている患者に投与される。例えば、いくつかの実施形態では、患者は、アンチセンスオリゴマーの投与の前に副腎皮質ステロイドで処置されており、継続してステロイド療法を受ける。いくつかの実施形態では、ステロイドはグルココルチコイド又はプレドニゾンである。
【０１６７】
当業者は、任意の特定の動物及び状態に対して最適な投与経路及び任意の投与量を容易に決定することができるので、記載される投与経路は単なる参考であることが意図される。機能性の新しい遺伝子材料をインビトロ及びインビボの両方で細胞内に導入するために多数のアプローチが試みられている（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１２７５−１２８０）。これらのアプローチには、発現させる遺伝子の改変レトロウイルスへの組込み（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ（１９８９）上記；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（１９９１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５１（１８），ｓｕｐｐｌ．：５０７４Ｓ−５０７９Ｓ）；非レトロウィルスベクター（例えば、アデノ随伴ウイルスベクター）への組込み（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｃｅｌｌ，６８：１４３−１５５；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２：４３１−４３４）；又は異種プロモーター−エンハンサーエレメントと連結した導入遺伝子のリポソームによる送達（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ（１９８９），上記；Ｂｒｉｇｈａｍ，ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．，２９８：２７８−２８１；Ｎａｂｅｌ，
ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：１２８５−１２８８；Ｈａｚｉｎｓｋｉ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，４：２０６−２０９；及びＷａｎｇ  ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８４：７８５１−７８５５）；リガンド特異的なカチオンベースの輸送系への結合（（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３：１４６２１−１４６２４）又はネイキッドＤＮＡ発現ベクターの使用（Ｎａｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０），上記）；Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７：１４６５−１４６８）が含まれる。導入遺伝子の組織への直接注入は、局所的発現のみを引き起こす（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ（１９９２）上記）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）上記；Ｂｒｉｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）上記；Ｎａｂｅｌ（１９９０）上記；及びＨａｚｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）上記）。Ｂｒｉｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．ｇｒｏｕｐ（Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．（１９８９）２９８：２７８−２８１及びＣｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９１）３９（ａｂｓｔｒａｃｔ））は、ＤＮＡリポソーム複合体の静脈内又は気管内投与の後、インビボでのマウスの肺のみのトランスフェクションを報告している。ヒト遺伝子療法手順の総説の一例は、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２）２５６：８０８−８１３である。
【０１６８】
さらなる実施形態では、その全体が参照によって本明細書中に援用されるＨａｎ  ｅｔ
ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｓ．７，１０９８１（２０１６）において提供されるように、本開示の医薬組成物は付加的に炭水化物を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物は、５％のヘキソース炭水化物を含み得る。例えば、本開示の医薬組成物は、５％のグルコース、５％のフルクトース、又は５％のマンノースを含み得る。特定の実施形態では、本開示の医薬組成物は、２．５％のグルコース及び２．５％のフルクトースを含み得る。いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物は、５体積％の量で存在するアラビノース、５体積％の量で存在するグルコース、５体積％の量で存在するソルビトール、５体積％の量で存在するガラクトース、５体積％の量で存在するフルクトース、５体積％の量で存在するキシリトール、５体積％の量で存在するマンノース、それぞれ２．５体積％の量で存在するグルコース及びフルクトースの組合せ、及び５．７体積％の量で存在するグルコース、２．８６体積％の量で存在するフルクトース、並びに１．４体積％の量で存在するキシリトールの組合せから選択される炭水化物を含み得る。
【０１６９】
ＩＶ．キット
本開示は、遺伝性疾患（例えば、ＤＭＤ）を有する患者の処置のためのキットも提供し、このキットは、少なくとも、適切な容器に包装されたアンチセンス分子（例えば、ゴロディルセン）を、その使用説明書と共に含む。またキットは、緩衝剤、安定剤などの周辺試薬も含有し得る。当業者は、上記の方法の適用が、多数の他の疾患の処置での使用に適したアンチセンス分子を同定するために広範な適用を有することを認識すべきである。
【実施例】
【０１７０】
全ての実施例は、ＳＲＰ−４０５３の安全性及び効力を試験する以下の進行中のファースト・イン・ヒューマン臨床治験から得られる。本明細書で報告される結果は、本試験のパート２の間の４８週目に得られたものである。
【０１７１】
ＤＭＤ患者におけるＳＲＰ−４０５３の第Ｉ／ＩＩ相試験
ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別子：ＮＣＴ０２３１０９０６
これは、エクソン５３スキッピングに適している欠失を有するデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）患者においてＳＲＰ−４０５３の安全性、耐容性、効力、及び薬物動態を評価するためのファースト・イン・ヒューマンの多用量２パート試験である。
試験の種類：介入
試験設計：割付け：  無作為化
介入モデル：  並行群間
マスキング：  四重（参加者、ケア提供者、研究者、結果査定者）
主目的：処置
公式タイトル：エクソン５３スキッピングに適しているデュシェンヌ型筋ジストロフィー患者におけるＳＲＰ−４０５３の２パート、無作為化、二重盲検、プラセボ対照、用量漸増、安全性、耐容性、及び薬物動態試験（パート１）、並びにその後の非盲検の効力及び安全性評価（パート２）
【０１７２】
材料及び方法
試験薬物
原薬のゴロディルセン（ａ／ｋ／ａ  ＳＲＰ−４０５３）は、本明細書に記載される化学構造を有するＰＭＯであり、Ｓａｒｅｐｔａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃにより供給された。ゴロディルセン薬物製品は、使い捨てバイアル内で供給される無菌等張リン酸緩衝水溶液として、５０ｍｇ／ｍＬの濃度で製剤化した。臨床環境におけるＩＶ点滴による投与の前に、通常の生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム注入）により薬物製品を希釈した。
【０１７３】
患者：適格性
適格患者は、エクソン５３スキッピングに適しているＤＭＤ遺伝子のアウトオブフレーム欠失を有する６〜１５歳であった。
選択基準：
・  遺伝子型で確認されたＤＭＤと診断。
・  インタクトな右側及び左側の二頭筋又は別の上腕筋肉群。
・  安定した肺機能及び心機能。
・  ６ＭＷＴ、Ｎｏｒｔｈ  Ｓｔａｒ  Ａｍｂｕｌａｔｏｒｙ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ、及び試験プロトコルで規定される起立（Ｇｏｗｅｒｓ）試験における最低限の能力。
・  少なくとも６か月間にわたって副腎皮質ステロイドを安定して投与されていること。
除外基準：
・  実験的薬剤ＢＭＮ−１９５（ＳＭＴ  Ｃ１１００）又はＰＲＯ０５３による過去の処置。
・  治験登録前の１２週間以内の任意の他の実験的処置を用いた現在又は過去の処置。
・  最近３か月以内の大手術。
・  他の臨床的に重大な病気の存在
・  最近３か月以内の理学療法体制の大きな変化。
その他の選択基準及び除外基準も適用され得る。
【０１７４】
試験設計
試験設計の概要は図１及び直下の表に示される。
【０１７５】
【表７】
2020532504.tif 000029
【０１７６】
詳細な説明：
パート１：エクソン５３スキッピングに適している欠失を有する遺伝子型で確認されたＤＭＤ患者における４用量レベルのＳＲＰ−４０５３の安全性、耐容性及び薬物動態を評価するための、無作為化、プラセボ対照、用量漸増である。
【０１７７】
スクリーニング／ベースライン：
エクソン５３スクリーニングに適している、確認された突然変異を有するＤＭＤ患者は、適格性を保証するために４週〜６週間のスクリーニング期間に参加した。処理前の脚の筋肉ＭＲＩ及び筋肉ＭＲＳ（ＭＲＳ能力を有する選択された部位で）を実施し、皮膚生検及び筋生検を得た。機能試験（６分間歩行試験［６ＭＷＴ］、Ｎｏｒｔｈ  Ｓｔａｒ  Ａｍｂｕｌａｔｏｒｙ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ［ＮＳＡＡ］、及び他の機能尺度）を実施し、潜在的な疾患関連バイオマーカーのための血液サンプルを採取した。肺機能検査（ＰＦＴ）、心エコー図（ＥＣＨＯ）、及びＥＣＧもスクリーニングの間に実施した。
【０１７８】
用量漸増：
患者を無作為化（２：１）して、ＳＲＰ−４０５３又はプラセボを受けさせた。患者は、プラセボ又はＳＲＰ−４０５３の毎週のＩＶ点滴を、それぞれ少なくとも２週間の増大する用量レベルにおいて受けた：１〜２週目は４ｍｇ／ｋｇ／週；３〜４週目は１０ｍｇ／ｋｇ／週；５〜６週目は２０ｍｇ／ｋｇ／週；及び７週目からは３０ｍｇ／ｋｇ／週。最後の患者が２回目の３０ｍｇ／ｋｇの用量を受けた後、パート２における投薬を開始する前に、独立ＤＭＣによりパート１の累積安全性データを審査した。ＤＭＣはパート１からの安全性データを審査し、試験の非盲検セグメント（パート２）において週１回３０ｍ
ｇ／ｋｇのＩＶ点滴に進むことが推奨された。
【０１７９】
パート２：エクソン５３スキッピングに適していない欠失を有する未処置対照のＤＭＤ患者と比較して、エクソン５３スキッピングに適している欠失を有する新たに登録されたＤＭＤ患者と共にパート１からの患者におけるＳＲＰ−４０５３の非盲検評価である。
【０１８０】
パート２は、エクソン５３スキッピングに適していない突然変異を有するＤＭＤ患者の未処置の同時対照群と比較して、患者における週１回のＳＲＰ−４０５３の３０ｍｇ／ｋｇのＩＶ点滴の安全性及び効力についての１４４週間の非盲検評価である。
【０１８１】
スクリーニング／ベースライン：
パート１（ＳＲＰ−４０５３及びプラセボの両方）からの患者にパート２を継続させた。処置群の患者が全部で２５人である非盲検ＳＲＰ−４０５３処置のために、エクソン５３スキッピングに適している欠失を有する新しいＤＭＤ患者を登録した。未処置対照群としての役割を果たすために、エクソン５３スキッピングに適していない欠失を有するがそれ以外は適格性基準を満たす２４人までのＤＭＤ患者もパート２で登録した。新しいパート２患者全員の適格性は、４〜６週間のスクリーニング期間中に確認される。
【０１８２】
１４４週間の非盲検処置：
パート２において、処置群の全ての患者は、１４４週間にわたって週１回の３０ｍｇ／ｋｇのＳＲＰ−４０５３をＩＶ点滴で受ける。新しいパート２の処置患者はベースラインの皮膚生検及び筋生検を受け、全ての処置患者は、パート２の４８週目に２回目の筋生検を受けなければならない。また患者は、１２〜２４週間毎に機能試験（パート１について上記した通り）及びＰＦＴも受け、ＥＣＧを取る。有害事象及び併用薬物療法を、試験期間にわたって継続的にモニターし、収集する。試験適格性を確認した後、未処置対照群の患者は、身体検査及び実験的評価のスケジュールの省略、並びにＰＫサンプリング又は生検がないことを除いて、パート２の処置患者と同じ試験手順を受ける。
主要評価項目：
・  有害事象の発生［時間枠：約１２週間（パート１）］
・  臨床検査異常（血液学、化学、凝固、尿検査）の発生［時間枠：約１２週間（パート１）］
・  バイタルサイン及び身体検査の異常の発生［時間枠：約１２週間（パート１）］
・  ＥＣＧ及びＥＣＨＯにおける異常の発生［時間枠：約１２週間（パート１）］
・  ６分間歩行試験（６ＭＷＴ）のベースラインからの変化［時間枠：ベースライン〜１４４週目（パート２）］
・  ウエスタンブロットにより決定されるジストロフィンタンパク質レベル［時間枠：ベースライン〜４８週目（パート２）］
副次評価項目：
・  血漿中の薬物濃度［時間枠：約１２週間（パート１）］
・  肺機能検査［時間枠：ベースライン〜１４４週目（パート２）］
最大呼気圧（ＭＥＰ）％、最大吸気圧（ＭＩＰ）％
・  ＩＨＣにより決定されるジストロフィン陽性線維の割合［時間枠：ベースライン〜４８週目（パート２）］
・  エクソン５３スキッピング［時間枠：ベースライン〜４８週目（パート２）］
他の評価項目：
・  有害事象の発生［時間枠：１４４週間（パート２）］
・  臨床検査異常の発生（血液学、化学、凝固、尿検査）［時間枠：１４４週間（パート２）］
・  バイタルサイン及び身体検査における異常の発生［時間枠：１４４週間（パート２）］
・  ＥＣＧ及びＥＣＨＯにおける異常の発生［時間枠：１４４週間（パート２）］
・  免疫原性［時間枠：１４４週間（パート２）］
【０１８３】
実施例１：生化学的効力の評価
静脈内点滴により毎週投与される３０ｍｇ／ｋｇのＳＲＰ−４０５３の安全性、耐容性及びジストロフィン産生を評価するマルチサイトのファースト・イン・ヒューマン治験（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別子：ＮＣＴ０２３１０９０６）に参加している２５人の患者から、ベースライン及びオントリートメントにおける上腕二頭筋のペアの筋生検を得た。各手術について、２つの筋肉片：Ａブロック及びＢブロックを切除した。全てのアッセイに対してＡ及びＢブロックを別々に分析した。
【０１８４】
筋生検は、ジストロフィンタンパク質量（ウエスタンブロット、主要生物学的エンドポイント）及びエクソンスキッピング（ＲＴ−ＰＣＲ）を評価するために最適化された方法により検査した。新規の自動画像解析（ＭｕｓｃｌｅＭａｐＴＭ）は免疫組織化学を使用して、ジストロフィンの局在化（平均線維強度）を評価した。
【０１８５】
ウエスタンブロット分析について：Ａ及びＢブロックを２通りのゲルで実行した＝４回検査平均
【０１８６】
ＲＴ−ＰＣＲ分析について：Ａ及びＢブロックを４通りで実行した＝８回検査平均
【０１８７】
ＩＨＣ分析について：Ａ及びＢブロックをレベル１及び２で実行した＝４回検査平均
【０１８８】
ベースライン特徴：
ゴロディルセン処置コホートにおける２５人の患者のベースライン特徴は、表１に要約される。エクソン５３スキッピングに適している５つの異なる遺伝子型（４５〜５２；４８〜５２；４９〜５２；５０〜５２；及び５２における突然変異欠失）を表した。１７人の患者は、最初に試験のパート１でプラセボを受けた後にＳＲＰ−４０５３処置に変更されたか、或いはＳＲＰ−４０５３処置のために試験のパート２で登録された。８人の患者は、試験のパート１及びパート２でＳＲＰ−４０５３を受けた。全部で２５人の患者がＳＲＰ−４０５３を受けた。
【０１８９】
【表１】
2020532504.tif 000030
【０１９０】
エクソンスキッピングの決定：
ＲＴ−ＰＣＲ分析：
試験設計毎にベースライン及び４８週間の時点でＲＴ−ＰＣＲによりエクソンスキッピングを測定した。ＲＴ−ＰＣＲ分析のために、製造業者のプロトコルに従ってＴｒｉｚｏｌ試薬キットを用いて、ＲＮＡを細胞から単離した。ＮａｎｏＤｒｏｐを用いて、ＲＮＡの濃度及び純度を決定した。表２に従う突然変異ペアの順方向プライマー及び逆方向プライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲによりエクソン５３スキッピングを測定した。
【０１９１】
【表２】
2020532504.tif 000031
【０１９２】
スキップ及び非スキップ産物は、表３に従うアンプリコンサイズをもたらした。
【０１９３】
【表３】
2020532504.tif 000032
【０１９４】
ＲＮＡにＲＴ−ＰＣＲを行った後、ゲルキャピラリー電気泳動を使用するＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸを用いてサンプルを分析した。以下の式を用いてエクソンスキッピングパーセントを計算した：（スキップバンドの曲線下面積）／（スキップバンド及び非スキップバンドの曲線下面積の合計）×１００。
【０１９５】
ＲＴ−ＰＣＲ結果の概要は表４に示される。少なくとも４８回の毎週のＳＲＰ−４０５３の投与を受けた２５人の患者は全て、エクソンスキッピングのベースラインレベルを超える増大を示した（ｐ＜０．００１）。
【０１９６】
【表４】
2020532504.tif 000033
【０１９７】
図２は、エクソンスキッピングのベースラインレベルを超える増大があることの決定を導く試験における２５人の患者のそれぞれのＲＴ−ＰＣＲデータ（ベースライン及びＳＲＰ−４０５３処置の４８週間後）を示す（ｐ＜０．００１）。
【０１９８】
ジストロフィン産生の決定：ウエスタンブロット分析
ウエスタンブロット分析のために、均質化緩衝液（４％のＳＤＳ、４Ｍの尿素、１２５ｍＭのｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８））を用いて、１３３μＬの緩衝液中に直径約５ｍｍの９〜１８×２０μｍの組織切片の比率で組織を均質化した。対応するライセートを集め、製造業者の説明書に従ってＲＣ  ＤＣ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＢｉｏＲａｄ  Ｃａｔ．５００−０１２２）を用いてタンパク質の定量化を行った。均質化緩衝液を用いて、ＢＳＡ標準曲線の範囲内に入るように組織抽出物サンプルを１：１０に希釈した。２８μｌのサンプルが、４０μｇのタンパク質、１Ｘ最終濃度のＮｕＰＡＧＥ  ＬＤＳ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃａｔ．ＮＰ０００８，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）、及び１Ｘ最終濃度のＮｕＰＡＧＥ  Ｒｅｄｕｃｉｎｇ  Ａｇｅｎｔ（１０ｘ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｉｅｓ  Ｃａｔ．ＮＰ０００４）を含有するように、サンプルを調製した。タンパク質サンプルを１０５℃５分間で加熱した後、サンプルを遠心分離し、上清を、１レーン当たり４０μｇの総タンパク質負荷で、ＮｕＰＡＧＥ  Ｎｏｖｅｘ  １２ウェル、１ｍｍ、ミニ３〜８％ポリアクリルアミドのトリス−アセタートゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃａｔ．ＥＡ０３７５）にロードした。色素の前面がゲルから外れるまでゲルを室温１５０ボルトで実行した。得られたタンパク質ゲルを、ＮｕＰＡＧＥ移動緩衝液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＮＰ００６−１）、１０％のメタノール及び０．１％のＮｕＰＡＧＥ抗酸化剤（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＮＰ０００５）を用いて室温３０ボルトで７５分間、ＰＶＤＦ膜（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
Ｃａｔ．ＬＣ２００７）に移動させた。
【０１９９】
タンパク質が移動したら、ＰＶＤＦ膜をＴＴＢＳ緩衝液（１ＸＴＢＳ（Ａｍｒｅｓｃｏ
Ｃａｔ．Ｊ６４０−４Ｌ）、０．１％（ｖ／ｖ）ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０）中に浸した。膜を遮断緩衝液（ＴＴＢＳ中５％（ｗ／ｖ）の脱脂粉乳（Ｌａｂ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃａｔ．Ｍ０８４１））に移し、優しく揺らしながら４℃で一晩浸漬させた。遮断した後、遮断緩衝液を用いて１：２０に希釈したＤＹＳ１（Ｌｅｉｃａ  Ｃａｔ．ＮＣＬ−ＤＹＳ１）中室温で６０分間、又は遮断緩衝液を用いて１：１００，０００に希釈した抗−α−アクチニン抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃａｔ．ＮＡ９３１Ｖ）中室温で２０分間のいずれかで、膜をインキュベートした後、６回洗浄した（それぞれＴＴＢＳで５分間）。遮断緩衝液を用いて、西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートされた抗マウスＩｇＧ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃａｔ．ＮＡ９３１Ｖ）を１：４０，０００で希釈し、４５分間（ＤＹＳ１）又は１５分間（α−アクチニン）膜に添加した後、再度６回洗浄した。ＥＣＬ  Ｐｒｉｍｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃａｔ．ＲＰＮ２２３２）を用いて、フィルムをゲルに曝露し、それに応じて現像した。現像したフィルムを、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＴＬ
Ｐｌｕｓソフトウェア（バージョン８．１）を用いてスキャン及び分析し、Ｇｒａｐｈｐａｄソフトウェアを用いて直線回帰分析を実施した。
【０２００】
各ウエスタンブロットゲルは、４％、２％、１％、０．５％、０．２５％の最終正常対照に対して、正常組織から抽出され、ＤＭＤ組織抽出物に添加された総タンパク質を用いて作製された５点ジストロフィン標準曲線を含む（例えば、図５Ａ及び図５Ｂを参照）。標準曲線サンプルを上記のように処理した。ジストロフィンバンド強度をゲル標準曲線と比較することにより、ジストロフィンタンパク質レベルを正常対照ジストロフィンレベルのパーセント（ＮＣ％）として決定した。
【０２０１】
ウエスタンブロットで測定したときの正常ジストロフィンタンパク質の平均％は、ベースラインの０．０９％から、オントリートメントの１．０２％まで増大し（範囲０．０９〜４．３％）、ベースラインからの平均変化が＋０．９３％であることが示された（ｐ＜０．００１）。
【０２０２】
ウエスタンブロット結果の概要は表５に示される。患者は、ウエスタンブロットで測定したときにジストロフィンタンパク質のベースラインを超える統計的に有意な増大を実証した。
【０２０３】
【表５】
2020532504.tif 000034
【０２０４】
図３は、ジストロフィンタンパク質のベースラインを超える統計的に有意な増大があることの決定を導く試験における２５人の患者のそれぞれのウエスタンブロットデータ（ベースライン及びＳＲＰ−４０５３処置の４８週間後）を示す。
【０２０５】
エクソンスキッピングと、新規のジストロフィンタンパク質との間の正の相関関係が観察された（Ｓｐｅａｒｍａｎ−ｒ＝０．５００、ｐ＝０．０１１）。
【０２０６】
平均線維強度の分析は、新規のジストロフィンのベースラインを上回る統計的に有意な増大（ｐ＜０．００１）と、ジストロフィンが正確に筋細胞膜に局在化されたこととを実証した（図４Ａ〜図５Ｂ）。
【０２０７】
エクソンスキッピング及び筋細胞膜ジストロフィン局在化が全患者において観察された。
【０２０８】
ＩＨＣの陽性ジストロフィン線維パーセントの概要は表６に示される。全ての患者は、ＩＨＣで測定したときに陽性ジストロフィン線維パーセントのベースラインを超える統計的に有意な増大を実証した。
【０２０９】
【表６】
2020532504.tif 000035
【０２１０】
表５及び表６並びに図４Ａ〜図５Ｂにおいて見られるように、ウエスタンブロットデータはＰＤＰＦ及び強度と相関し、ＳＲＰ−４０５３により処置から得られるＤＭＤ患者におけるジストロフィン産生が示される。
【０２１１】
本明細書で引用される全ての刊行物及び特許出願は、個々の刊行物又は特許出願がそれぞれ参照によって援用されることを具体的に且つ個々に示したかのように、参照によって本明細書中に援用される。
【国際調査報告】
2020532504.tif 000036
2020532504.tif 000037
2020532504.tif 000038