(57)【要約】  本発明は、皮膚損傷の処置、さらに特に傷の治癒の分野における細菌セクレトームの新規の使用に関する。本発明はまた、有効成分としての細菌セクレトームからなる美容的もしくは皮膚科学的組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１又は配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む１６Ｓ  ｒＲＮＡを含み、皮膚損傷の処置に使用するための、ベータプロテオバクテリア鋼、サブファミリー  ナイセリア科に属する非病原性のグラム陰性細菌の細菌セクレトームであって、以下の工程を含む方法によって得られる、セクレトーム：
ａ）前記細菌をその生育に適切な培地及び条件下で培養し、
ｂ）固液分離し、かつ液相を回収し、
ｃ）液相中の前記細菌により分泌された生体分子を含む前記セクレトームを得る。
【請求項２】
工程ｂ）において得られる液相に基本バッファーが加えられ、かつ好ましくは１〜６℃の温度で、得られた緩衝液相が場合により１〜７時間接触して静置することを特徴とする、請求項１に記載の皮膚損傷の処置に使用するための細菌セクレトーム。
【請求項３】
基本バッファーがトリスバッファー、アルギニンバッファーもしくはその混合物から選択されることを特徴とする、請求項２に記載の皮膚損傷の処置に使用するための細菌セクレトーム。
【請求項４】
固液分離の工程ｂ）の後、工程ｃ）より前に、液相又は緩衝液相を濾過により清澄化する工程ｂ’）を含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の皮膚損傷の処置に使用するための細菌セクレトーム。
【請求項５】
濾過がカットオフ０．２μｍで行われることを特徴とする、請求項４に記載の皮膚損傷の処置に使用するための細菌セクレトーム。
【請求項６】
生体分子が、前記細菌から分泌されるペプチド、タンパク質、及び二次代謝物からなることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の皮膚損傷の処置に使用するための細菌セクレトーム。
【請求項７】
細菌が、配列番号２又は配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む少なくとも１つのプラスミドを含むことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の皮膚損傷の処置に使用するための細菌セクレトーム。
【請求項８】
細菌が、２０１０年４月８日にＩ−４９２０の番号でＣＮＣＭに寄託された細菌であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の皮膚損傷の処置に使用するための細菌セクレトーム。
【請求項９】
皮膚損傷が、擦過傷、火傷、日焼け、かき傷、切り傷、すり傷、縫合からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の皮膚損傷の処置に使用するための細菌セクレトーム。
【請求項１０】
皮膚損傷が、外傷、手術、皮膚科学的処置、又は美容医療的処置の後に生じるものであることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の皮膚損傷の処置に使用するための細菌セクレトーム。
【請求項１１】
皮膚損傷の処置が治療及び皮膚修復の改善からなることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の皮膚損傷の処置に使用するための細菌セクレトーム。
【請求項１２】
銅塩及び／又は亜鉛塩と組み合わせることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の皮膚損傷の処置に使用するための細菌セクレトーム。
【請求項１３】
皮膚損傷の処置に使用するための、請求項１〜８のいずれか一項に記載の細菌セクレトームと、局所投与に適する皮膚科学的な賦形剤とを含む、皮膚科学的組成物。
【請求項１４】
銅塩及び／又は亜鉛塩と、局所投与に適する皮膚科学的な賦形剤と、請求項１〜８のいずれか一項に定義された細菌セクレトームとを含む、皮膚科学的組成物。
【請求項１５】
皮膚損傷の処置に使用するための、請求項１４に記載の皮膚科学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は皮膚損傷の処置、さらに特には傷の治癒の分野における細菌セクレトーム(secretome)の新しい使用に関する。この発明は、また、有効成分として細菌セクレトームを含む美容又は皮膚科学的組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
傷の治癒は、通常の組織修復における多くの局所的で体系的な因子の相互作用が関与する複雑かつ動的な生物学的処理である。治癒は次の３つの相互依存の段階（止血及び炎症、増殖、組織修復）により進行する(General principles of wound healing. Witte MB, Barbul A. Surg Clin North Am. 1997 June; 77(3):509−28)。増殖には３つの明確に観察可能な工程（肉芽形成、収縮、上皮再形成）が関与する。
【０００３】
肉芽形成の間、修復過程に関与する細胞は増殖し、創傷床に向かって遊走することが観察される。例えば、マクロファージ、線維芽細胞、内皮細胞がそこで見られる。マクロファージは着実に走化性因子と増殖因子を放出する。線維芽細胞は創底で細胞増殖に必要な新しい細胞外マトリクスを構築する。この足場は細胞遊走を支援する。最後に、内皮細胞が毛細血管を新生する血管芽細胞形成を引き起こす。それによって、血流を回復し、傷口における細胞の代謝活性に必須な酸素及び栄養素の供給を確保する。
【０００４】
創面収縮が、傷口の大きさが減少するメカニズムである。そして、線維芽細胞がこの収縮において主要な役割を担っている。
【０００５】
上皮再形成は、外界に対して効果的なバリアを形成するために傷口を覆っている表皮の再生からなり、色素沈着をすることができ、その感覚及び免疫機能を回復することができる。そのようにして、細胞外の角化細胞の遊走や増殖過程に関与している。しかし、また、この新しい上皮の分化にも関与しており、表皮と真皮を接続している基底膜の回復にも関与している。傷の中心への基底細胞の遊走により傷の端の２カ所を会合することができた場合、細胞の有糸分裂の波が生じ、遊走によってそのままとなっている空間を埋め、３次元的に再生して上皮組織に細胞を提供する。
【０００６】
角化細胞、線維芽細胞、内皮細胞の増殖工程は、活性物質の修復活動を示す機能的な現象の一つであるとみなすことができる。増大した線維芽細胞の増殖は深い傷（真皮まで到達する）の治療に関与し、一方で、増大した角化細胞の増殖は上皮再形成に関与する。
【０００７】
治癒欠陥、あるいは不十分な治癒が、厚い傷、又はケロイドのような醜く、そしてたいていは永続的な目に見える跡の原因になった時、治癒はまた美容上の問題を引き起こす。
【０００８】
全ての美容で皮膚の外科的な処置は、病理的及び非医学的な外傷の創傷（かき傷、切り傷、擦り傷、火傷）と同様に、傷をそのままにする。形成外科の主要技術の一つは傷の構築を制御することである。
【０００９】
圧力は、例えば、長年の間、火傷の傷に対して使用されており、最近では、傷に直接に置かれたシリコンシートと組み合わされている。
【００１０】
損傷した皮膚の治癒を促進するため、及び傷の美容の外観の改善のための新規組成物を提案することへのニーズは依然として存する。
【００１１】
初めて、そして驚くべきことに、出願人は、地下水から単離された菌株（あるいは細菌）ＬＭＢ６４に由来する細菌セクレトームに組織再生及び皮膚損傷の治癒に対する有益な効果があることを示した。
【００１２】
この細菌は、出願人の特許出願ＷＯ２０１２／０８５１８２により開示されている。さらに特には、その細菌の抗炎症活性について開示されている。さらに具体的には、Ｓ０、Ｅ０、ＥＳ０と名付けられた抽出物が開示され、例示され、それぞれ、当該抽出物はバイオマスから分離した培養上澄み液からなり、溶解細胞のバイオマスで、塩基性のｐＨで数時間の培養条件で培養した後の上澄み液である。抽出物Ｅ０、ＥＳ０の薬理活性のみが試験され、これらの抽出物Ｅ０及びＥＳ０は、ＴＬＲ２／ＴＬＲ４／ＴＬＲ５の活性化、ＰＡＲｓのアンタゴニストと同様に、サイトカインの誘導とランゲルハンス細胞の成熟化をすることができ（Ｅ０）、抗菌ペプチドの誘導をすることができる（ＥＳ０）ことが示された。これらの結果は、これらの抽出物の、掻痒症、乾癬、湿疹あるいはアトピー性皮膚炎等の炎症性疾患への処置における使用を提案している。
【００１３】
全ての予想に反して、出願人は、ここで、上述の抽出物ＥＳ０及びＥ０と同じ成分でなく、主に、当該細菌ＬＭＢ６４により培養上澄み液に分泌され、外在化された生体分子からなるセクレトームが、驚くべき治癒効果を有することを示した。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】セクレトームタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。レーン１：（Ｍ、分子量マーカー、Ｓｅａ  Ｂｌｕｅ）。レーン２〜５：（Ｓｅｃ、アルギニンバッファー添加前セクレトーム）−それぞれ１０μｌ、１５μｌ、２０μｌ及び３０μｌのロード量。レーン６〜９：（Ｓｅｃ＋Ａｒｇ、アルギニンバッファー添加後セクレトーム）−それぞれ１０μｌ、１５μｌ、２０μｌ及び３０μｌのロード量。
【図２】対照細胞との比較における、様々な産物で処置されたヒト正常線維芽細胞の増殖刺激（％）（平均値±標準誤差）（ｎ＝３、ドナープール）
【図３】対照細胞との比較における、様々な化合物で処置されたＨａＣａＴ角化細胞の走化刺激（％）（平均値±標準誤差）（ｎ＝２）
【図４】対照修復クリームとの比較における、様々な産物で４８時間処置された後のブタ耳組織片における傷の上皮再形成（平均値±標準誤差）（ｎ＝１０、個別ドナー）
【発明の具体的説明】
【００１５】
第一の実施態様（１）によると、本発明は、配列番号１又は配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む１６Ｓ  ｒＲＮＡを含み、皮膚損傷の処置に使用するための、ベータプロテオバクテリア鋼(class Betaproteobacteria)、サブファミリー  ナイセリア科（subfamily Neisseriaceae）に属する非病原性のグラム陰性細菌の細菌セクレトームに関する。
【００１６】
前記セクレトームは以下の工程を含む方法により得られるか、得られる可能性が高い：
ａ）前記細菌をその生育に適切な培地及び条件下で培養し、
ｂ）固液分離し、かつ液相を回収し、
ｃ）液相中の前記細菌により分泌された生体分子を含む前記セクレトームを得る。
【００１７】
本発明の第二の実施態様によると、本発明による皮膚損傷の処置に使用するための細菌セクレトームは、工程ｂ）において得られる液相に基本バッファー（緩衝液）が加えられ、かつ好ましくは１〜６℃の温度で、得られた緩衝液相が場合により１〜７時間接触して静置することを特徴とする。
【００１８】
細菌ＬＭＢ６４は、ベータプロテオバクテリア鋼、サブファミリー  ナイセリア科、及びおそらく未だ規定されていない新規の属に属することにより定義され、特徴付けられている。１６Ｓ  リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）をコードする遺伝子配列の解析により、この細菌を９５％の配列類似性を共有するＣｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐａｌｕｄｉｍｏｎａｓ属、Ｌｕｔｅｌｉａ属及びＧｌｕｂｅｎｋｉａｎａ属に近付けることを可能にした。
【００１９】
この非病原性細菌はグラム陰性であり、地下水から単離された。
【００２０】
さらに特には、細菌ＬＭＢ６４は約２．３μｍ（±０．３）の長さ及び約１．０μｍ（±０．１）の幅を持った桿菌である。この細菌の特徴は極鞭毛が存在することである。
【００２１】
１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードしている遺伝子はほとんど完全に配列決定されている（１４８７ｂｐ、配列番号１に相当する）。細菌ＬＭＢ６４は１０９４８ｂｐの環状プラスミドを有する。このプラスミドは完全に配列決定されており、その配列は配列番号２に表される。
【００２２】
他の実施態様によれば、本発明のセクレトームが由来されている細菌は、配列番号２又は配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有する、有利には、配列番号２と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、一層有利には少なくとも９７％、更に一層好ましくは少なくとも９８％の同一性を有する配列を含む少なくとも１つのプラスミドを含む。
【００２３】
加えて、セクレトームが由来されている細菌はベータプロテオバクテリア鋼、サブファミリー  ナイセリア科の非病原性のグラム陰性菌で１６Ｓ  ｒＲＮＡを含み、配列番号１、又は、配列番号１と少なくとも８０％、有利には少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％の同一性を有する配列を含み、かつ配列番号２、又は、配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有する、有利には、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、一層有利には少なくとも９７％、更に一層好ましくは少なくとも９８％の同一性を有する配列を含む少なくとも１つのプラスミドを含む。
【００２４】
例として、そのような細菌は菌株ＬＭＢ６４と表され、出願人の名前で２０１０年４月８日、番号Ｉ−４２９０でパリのパスツール研究所にあるＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ  （ＣＮＣＭ）に寄託されている。
【００２５】
この遺伝子型の情報を、この細菌の硫黄を含まない培地での生育及び非糸状性の性質に関する特徴を組み合わせることにより、当業者であれば、本発明のセクレトームを得ることを可能にする別の細菌を見出す／同定することに困難性はない。そのような別の細菌の同定は、当然わずかに遺伝子型に異なるが、セクレトームに関する本発明の全ての表現型の基準を保持しており、選定研究の後で実施することが可能であり、決して克服できないものではなく、そしてこれは、当業者の一般的な知識と組み合わせて、本発明に含まれる情報及び出願ＷＯ２０１２／０８５１８２号に含まれる情報に基づくものである。
【００２６】
本発明の文脈において、２つの核酸の間の「割合  同一性」とは、最良アラインメント（最適アラインメント）後に得られた２つの配列を比較した際の同一なヌクレオチドの割合を示しており、この割合とは純粋に統計的なものであって、２つの配列の間の違いは、ランダムに、全長にわたって、割り振られている。２つの核酸配列の比較は通常それらの配列を最適な手法で並べた後でこれらの配列を比較し、行われるが、一方で、当該比較は区分ごと、あるいは「比較窓（comparison window）」ごとに行われてもよい。比較のための配列の最適な整列は、手動によるものに加えて、SmithとWatermanの局地的相同性アルゴリズム(1981) [Ad. App. Math. 2:482]、NeedlemanとWunschの局地的相同性アルゴリズム(1970) [J. Mol. Biol. 48:443]、PearsonとLipmanの類似検索法(1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444]、もしくは、これらのアルゴリズムを用いたコンピューターソフトウェア(GAP, BESTFIT, FASTA and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, or the BLAST N or BLAST P comparison software)により実行することができる。
【００２７】
２つの核酸配列の割合同一性は、最適な手法によりこれら２つの整理された配列を比較することで決定されるが、一方で、比較された核酸配列は、これら２つの配列最適な整理のための参照配列に関連する追加もしくは削除を含んでいてもよい。割合同一性は、２つの配列におけるヌクレオチドの同一性のための位置の数を決定することで計算される。比較窓における同じ位置の数を全位置の数で割り、得られた値に１００を掛けることで２つの配列の間の割合同一性を得る。
【００２８】
例えば、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/b12.htmlにおいて利用可能なBLASTプログラム「BLAST2配列」(Tatusova et al., “Blast 2 sequences − a new tool for comparing protein and nucleotide sequences,”FEMS Microbiol Lett. 174:247−250)は、デフォルトパラメータ（特に、例えば、プログラムにより提案される“ＢＬＯＳＵＭ６２”マトリクスが選択されたマトリクスであって、ギャップ開始ペナルティが５、ギャップ伸張ペナルティが２のパラメータ）とともに使用されるかもしれない。比較する２つの配列の割合同一性はプログラムにより直接的に計算される。“ＡＬＩＧＮ”もしくは“Ｍｅｇａｌｉｇｎ”のような他のソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ）を使用することもまた可能である。
【００２９】
本発明の細菌には、配列番号２、又は、配列番号２と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％、９８％の同一性を有する配列を含む少なくとも１つのプラスミドを有するＬＭＢ６４細菌が含まれる。当該ＬＭＢ６４細菌の他の特徴については、以下の例に詳述されている。
【００３０】
さらに細菌ＬＭＢ６４は、出願人の名前で２０１０年４月８日、番号Ｉ−４２９０でパリのパスツール研究所にあるＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）に寄託されている。
【００３１】
他の実施態様によれば、本発明はまた、基本バッファーがトリスバッファー、アルギニンバッファーもしくはその混合物から選択されることを特徴とする、皮膚損傷の処置に使用するための、本発明の第二の実施態様による、細菌セクレトームに関する。
【００３２】
他の実施態様において、本発明は、固液分離の工程ｂ）の後、工程ｃ）より前に、液相又は緩衝液相を濾過により清澄化する工程ｂ’）を含むことを特徴とする、皮膚損傷の処置に使用するための、上記の実施態様のいずれか１つによる、細菌セクレトームに関する。
【００３３】
他の実施態様において、本発明は、濾過がカットオフ０．２μｍで行われることを特徴とし、皮膚損傷の処置に使用するための、上記の実施態様のいずれか１つによる、細菌セクレトームに関する。
【００３４】
他の実施態様によれば、本発明は、生体分子が、前記細菌から分泌されるペプチド、タンパク質、及び二次代謝物からなることを特徴とする、皮膚損傷の処置に使用するための、上記の実施態様のいずれか１つによる、細菌セクレトームに関する。
【００３５】
本発明の他の実施態様はまた、細菌が、配列番号２、又は、配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む少なくとも１つのプラスミドを含むことに特徴とし、皮膚損傷の処置に使用するための、上記の実施態様のいずれか１つによる、細菌セクレトームを提供することである。
【００３６】
他の実施態様によれば、本発明は、細菌が、２０１０年４月８日にＩ−４９２０の番号でＣＮＣＭに寄託された細菌であることを特徴とし、皮膚損傷の処置に使用するための、上記の実施態様のいずれか１つによる、細菌セクレトームに関する。
【００３７】
一般的に、用語「セクレトーム」は細胞、組織、もしくは個体により培養培地に分泌され、排泄され、この培地において可溶化している全ての生体分子を説明するために使用される。本願においては、セクレトームは細菌ＬＭＢ６４により分泌され、外在化された全ての生体分子のことを示し、修飾や劣化は伴わず、細菌が溶解したものでもないと理解しなければならない。特に、これらの生体分子は、バクテリアにより培養培地に分泌され、外在化されるタンパク質、ペプチド、及び二次代謝物から主になる。
【００３８】
細菌は二分裂により増殖する。すなわち、それぞれの細菌は成長し、細胞壁により形成された分割隔壁により分離された２つの娘細胞に分割する。分割の間、ＤＮＡ及び他の器官は複製される。合成と分解の様々な酵素的な体系が細胞分裂に関与する。
【００３９】
細菌の生育は細菌の全ての器官の順序立てた増加である。これは細菌数の増加という結果をもたらす。生育の間、一方では、培養培地からの栄養素の枯渇があり、一方では、細菌により、代謝副産物と同様に、培養培地へ放出し、外在化され、この培地で可溶化した、生体分子の充実がある。
【００４０】
「培養培地」もしくは「培地」という表現は、少なくとも細菌の成長及び増殖に必要な栄養素からなるあらゆる培地のことを示すと理解されなければならない。細菌は、液体、固体、半流動体の培地において成長してもよい。好ましくは、培養培地は、セクレトーを含む培養上澄み液の回収が可能な液体培地である。
【００４１】
適切な培地は、細菌の成長と増殖を促進する栄養素を含む。一般的に、適切な培養培地は、水、炭素源、窒素源、塩を含む。実例として、特に例示的な培養培地を以下の例に記載する。
【００４２】
「二次代謝物」という表現は、本発明の細菌、特に細菌ＬＭＢ６４が培養培地に、生産し、分泌し、外在化した小さな分子であることを示すと理解されなければならない。実例として、そのような二次代謝物は、バクテリオシン、非リボソームペプチド、シデロフォア、リポペプチド、もしくはポリケチドのような可溶化分子、もしくは、テルペン、ピラジン、インドール、もしくはスルフィド誘導体のような分子であってもよい。セクレトームに存在するタンパク質は１０〜１００ｋＤａの大きさであり、優先的には１８〜９８ｋＤａであり、好ましくは大部分のタンパク質の大きさが約３８ｋＤａである。
【００４３】
実際には、本発明の細菌のセクレトームは、例として特に細菌ＬＭＢ６４であるが、細菌（以下に開示するもの等）の成長、改変及び増殖を可能にする培養培地における培養により、本発明のセクレトームを構成する分泌された生体分子を含む培養上澄み液を単純に回収することにより、得ることができる。具体的には、これらの生体分子が細菌により分泌され、外在化され、培地中で可溶化されるという事実があるため、前記細菌を処置する工程を実行する必要がない（機械的、あるいは化学的な、全体的、あるいは部分的な細胞溶解の誘導、もしくはタンパク質、もしくは細胞壁、細胞膜、もしくはペリプラズムの成分の放出）。培養上澄み液（これ以降、セクレトーム）の成分は、あらゆる液体／固体分離手段により不溶な固体細胞成分より回収できる。さらに特に、結果として、当業者の技術により、主に細菌の全細胞及び、表面タンパク質及び／もしくはペリプラズムに局在するタンパク質を含む固体分画から可溶化している生体分子を含む液体分画を単離することが可能である。
【００４４】
実例として、液体／固体分離は、例えば、遠心分離、沈降、限外濾過、デカンテーション、脱水から選択される技術により行うことができる。
【００４５】
好ましくは、液体／固体分離は、固体相、つまり細胞及び細胞断片を含むペレットと液相、つまり可溶化分子、すなわちセクレトームを含む上澄み液を分離するために、細胞培養液を遠心分離することにより行われる。
【００４６】
上澄み液、つまり液相はそのまま使用されることができ、もしくは存在する可能性がある細胞断片を除去し、殺菌するために単純な濾過を行った後で使用されることができる。それは、また、例えば濾過によって濃縮されることが想定される。セクレトームを構成するタンパク質は、また、硫酸アンモニウムを使った沈殿より回収することができる。
【００４７】
上記で示された通り、本発明の細菌セクレトームを調整する工程は、工程ｂ）において得られる液相に基本バッファーが加えられ、かつ、特に低い温度、好ましくは１〜６℃の温度で、得られた緩衝液相が、場合により、そのようなバッファーと１〜７時間接触して静置することを特徴とする。
【００４８】
基本バッファーの上澄み液への添加は溶解性及び／又は溶解中のタンパク質及びペプチドの安定性を改善する。
【００４９】
好ましくは、この基本バッファーはトリスバッファー、もしくはアルギニンバッファー、もしくはトリス−アルギニン混合物である。好ましくは、それはトリス−アルギニンバッファーである。
【００５０】
得られた緩衝液相に添加する基本バッファー、優先的にトリス−アルギニンの量は、そのようにして得られる基本バッファーを加えた液相のアルギニン濃度が１００〜５００ｍＭ及び／又はトリス濃度が１０〜９０ｍＭである。
【００５１】
バッファーを加えた液相のｐＨは８〜１２になるだろう、そして好ましくは９〜１１である。
【００５２】
基本バッファー（トリス、アルギニン、トリス−アルギニン）の使用は溶液中のタンパク質の安定化を可能にし、長期の保存にわたるそれらの凝集を避けることができる。
【００５３】
本発明の細菌、特に菌株ＬＭＢ６４、を培養するための好ましい方法は、３つの工程を含むことができる。
・第一の接種は、この前培養に適切なミネラル、タンパク質、及び糖質を含む適切な培地が入った三角フラスコの中で調製することができる。
・その後、バッチ方式で、第一の培地（もしくは相当する培地）と類似、もしくは同一の第二の培地で予備発酵培養が調製される。
・最後に、高い細胞濃度を得るため、流加培養(fed-batch mode)で、第二の培地と類似、もしくは同一の培地で発酵する。
【００５４】
遠心分離工程は細胞及び細胞断片の除去及び培養上澄み液の回収を可能にする。
【００５５】
バッファーを添加した上澄み液、もしくはバッファーを添加した液相は濾過によりその後に清澄化することができる。
【００５６】
上記に示した通り、固液分離の工程ｂ）は、液相もしくはバッファー加えた液相を濾過により清澄化する工程ｂ’）、例えば、工程ｃ）の前、濾過により行われる。
【００５７】
濾過は、液相、もしくは該当すれば、バッファーを添加した液相の清澄を可能にする適切な手段により実行してもよい。そのような濾過による清澄化は、固液分離工程の間に除去されなかった浮遊粒子を除去し、クリアーなセクレトームの製造に向けられる。
【００５８】
濾過は、限外濾過や透析濾過の方法のようなあらゆる濾過により実行されることができる。
【００５９】
有利には、濾過は、カットオフ０．４μｍ、好ましくはカットオフ０．２μｍフィルター、もしくはカートリッジフィルターを通した濾過により行うことができる。この場合において、細菌セクレトームは０．２μｍ、もしくはより小さい大きさの分泌されたペプチド、タンパク質、及び二次代謝物であることに特徴付けられる。
【００６０】
好ましくは、非帯電性フィルター、もしくはプレフィルターを、全部もしくは一部の活性が原因である生体分子の吸収を避けるために、使用することができる。
【００６１】
培地及び様々な工程の正確な性質は、実施例においてより詳細に開示されるであろう。本詳細な説明に関する当業者にとって自明である、どのような処理、培地及び工程の順番の変更も本特許出願の範囲内であるとみなさなければならないと、理解されるべきである。
【００６２】
上記で述べたように、本発明はまた、他の実施態様において、皮膚損傷が、擦過傷(abrasions)、火傷(burns)、日焼け(sunburns)、かき傷(scratches)、切り傷(cuts)、すり傷(scrapes)、縫合(stitches)からなる群から選択されることが特徴付けられる、皮膚損傷の処置に使用するための、上記の実施態様のいずれか１つによる、細菌セクレトームに関する。
【００６３】
本発明はまた、皮膚損傷の処置に使用するための、治療障害の緩和に使用するための、上記の実施態様のいずれか１つによる、細菌セクレトームに関する。
【００６４】
本発明はまた、他の実施態様において、皮膚損傷が、外傷、手術、皮膚科学的処置、美容医療的処置の後に生じるものであることを特徴とする、皮膚損傷の処置に使用するための、上記の実施態様のいずれか１つによる、細菌セクレトームに関する。
【００６５】
有利には、本発明はまた、他の実施態様において、細菌セクレトームが銅塩及び／又は亜鉛塩と組み合わせることを特徴とする、皮膚損傷の処置に使用するための、上記の実施態様のいずれか１つによる、細菌セクレトームに関する。
【００６６】
他の実施態様において、本発明はまた、皮膚損傷の処置が治療及び皮膚修復の改善からなることを特徴とする、皮膚損傷の処置に使用するための、上記の実施態様のいずれか１つによる、細菌セクレトームに関する。
【００６７】
本発明はさらに、他の実施態様において、上記の実施態様のいずれか１つに規定された有効な量の細菌セクレトームと、美容的に許容可能な賦形剤とを含み、局所投与のために適切に形成された組成物の有効な量の投与からなる、皮膚治癒障害の緩和のための美容的処置の方法に関する。
【００６８】
有利には、本発明はまた、上記の実施態様のいずれか１つによる、細菌セクレトームが銅塩及び／又は亜鉛塩を含む塩であることを特徴とする、治癒障害の処置のための細菌セクレトームに関する。
【００６９】
従って、本発明はさらに、他の実施態様において、上記の実施態様のいずれか１つに規定された、皮膚治癒障害の美容的処置の緩和のための、細菌セクレトームの使用に関する。特定の態様によれば、本発明のセクレトームは銅塩及び／又は亜鉛塩を組み合わせて使用される。
【００７０】
他の実施態様において、本発明は上記の実施態様のいずれか１つに規定された細菌セクレトームを含み、局所投与に適した皮膚科学的な賦形剤を含む皮膚科学的組成物に関する。有利な実施態様において、皮膚科学的組成物は、さらに亜鉛塩及び／又は銅塩を含む。
【００７１】
他の実施態様において、本発明はさらに皮膚損傷の処置に使用される、上記の実施態様のいずれか１つによる皮膚科学的組成物に関する。有利な実施態様において、皮膚科学的組成物はさらに亜鉛塩及び／又は銅塩を含む。
【００７２】
他の実施態様において、本発明は上記の実施態様のいずれか１つに規定された細菌セクレトーム及び局所投与に適した美容的な賦形剤を含む美容組成物に関する。美容的組成物はさらに亜鉛塩及び／又は銅塩を含む。
【００７３】
最後に、他の実施態様において、本発明は上記の実施態様による、皮膚治療障害の美容的処置の緩和のための、美容的組成物の使用に関する。
【００７４】
一つの実施態様によれば、本発明は、上記の実施態様のいずれか１つに規定された、線維芽細胞増殖促進のための、局所使用のための、細菌セクレトームに関する。
【００７５】
一つの実施態様によれば、本発明は、上記の実施態様のいずれか１つに規定された、角化細胞増殖もしくは／又は走化促進のための、局所使用のための、細菌セクレトームに関する。
【００７６】
一つの実施態様によれば、本発明は、上記の実施態様のいずれか１つに規定された、皮膚損傷処置のための、局所使用のための、細菌セクレトームに関する。
【００７７】
一つの実施態様によれば、本発明は、上記の実施態様のいずれか１つに規定された、皮膚の治療及び回復の改善のための、局所使用のための、細菌セクレトームに関する。
【００７８】
本発明はまた、皮膚を完全かつ高品質に修復するために、有効成分として上記の実施態様のいずれか１つで規定されるセクレトームを含む、皮膚の修復を促進するための組成物に関する。さらに有利には、さらにこの組成物は亜鉛塩及び／又は銅塩を含むことができる。
【００７９】
好ましくは、本発明による組成物中のセクレトームの濃度は０．０５〜１０％である。さらに好ましくは、それは０．１〜５％である。
【００８０】
本発明の組成物はさらに、局所投与のための組成物を得るために、乳化剤、増粘剤、ゲル化剤、水結合剤、展着剤、安定剤、染料、香料、防腐剤等の、当業者に知られている１つもしくはそれ以上の従来からの皮膚科学的及び／又は美容的に適合する賦形剤を含むことができる。
【００８１】
本発明において、「皮膚科学的にあるいは美容的に許容可能な」という表現は、一般的に、安全、無毒性で、生物学的にあるいはその他の意味においても有害でなく、皮膚科学的あるいは美容的の使用に許容可能で、特に、皮膚科学的あるいは皮膚化粧的使用で、特に、局所投与による、皮膚科学的あるいは美容的組成物の調整に使用可能であることを意味することを示している。
【００８２】
本発明による組成物は、有利には、局所投与のためのもの、特に皮膚に対するものである。
【００８３】
本発明の組成物は、エマルション、分散、あるいは水性あるいは油性ローションの形態で調製されることができる。
【００８４】
他の実施態様において、本発明の皮膚科学的もしくは美容的組成物は少なくとも１つの別の有効成分を含む。さらに特には、少なくとも１つの保湿の有効成分を含む。
【００８５】
この他の有効成分は、そのようにして特に、以下からなる群から選択されてもよい：
・よく知られた治療もしくは修復成分：パンテノール、マデカソサイド、アラントイン、アロエベラ、はちみつ；
・抗感染成分：銅−亜鉛−型微量元素、はちみつ；
・保湿及び栄養成分：グリセリン、シアバター、天然ワックス、ヒアルロン酸、脂肪酸；
・無痛化剤：アラントイン、ビサボロール、パンテノール、エノキソロン；
・ＵＶフィルター。
【００８６】
好ましくは、第二の有効成分は銅-亜鉛-型微量元素である。従って、この好ましい実施態様において、本発明の組成物はそのようにしてセクレトーム及び銅-亜鉛-型微量元素を含むだろう。
【００８７】
述べたように、セクレトームからなる本発明の皮膚科学的もしくは美容的組成物は銅−亜鉛−型微量元素を含んでいてもよい。好ましくは、銅塩は硫酸銅である。有利には、亜鉛塩は酸化亜鉛及び硫酸亜鉛から選択されるだろう。
【００８８】
本発明の組成物における硫酸銅の量は、組成物に対して、０．０５〜０．５ｗｔ％の間で変更されてもよく、好ましくは、組成物に対して、０．１〜０．２５ｗｔ％、さらに好ましくは、組成物に対して、約０．２ｗｔ％である。
【００８９】
本発明の組成物における硫酸亜鉛の量は、組成物に対して、０．０５〜０．５ｗｔ％の間で変更されてもよく、好ましくは、組成物に対して、０．１〜０．４ｗｔ％、さらに好ましくは、組成物に対して、０．１〜０．２ｗｔ％である。
【００９０】
本発明の組成物における酸化亜鉛の量は、組成物に対して、０．５〜１０ｗｔ％の間で変更されてもよく、好ましくは、組成物に対して、１〜５ｗｔ％、さらに好ましくは、組成物に対して、約２〜４ｗｔ％である。
【００９１】
本発明の一つの実施態様は、さらに治癒成分、抗感染成分、保湿成分、無痛化成分及びそれらの混合物から選択される少なくとも１つの他の有効成分を含むことにより特徴付けられる、上記の実施態様のいずれか一つによる組成物を構想する。特に他の実施態様によれば、少なくとも１つの他の有効成分が、保湿成分、治療成分、無痛化成分及びそれらの混合物から選択され、好ましくは、保湿成分である。そのような有効成分は、好ましくは、皮膚科学的組成物において使用される。
【００９２】
本発明はまた、好ましくは局所の、有効成分として本発明のセクレトームを含む組成物の有効量を投与することを含む、皮膚損傷の処置及び治療のための方法に関する。
【００９３】
本発明によれば、組成物は、特に、長引く損傷を有する皮膚の治療のためのものである。
【００９４】
皮膚損傷は、侵襲的か非侵襲的か、治療もしくは美容目的のためかどうかによらず、外傷、あるいは医療上、あるいは外科的な処置の後に表れてもよい。
【００９５】
侵襲的な医療上もしくは外科的な処置は次のものを含む：例えば、縫合を伴うあるいは伴わない外科的な処置（切除、表層切除）、凍結療法、レーザー治療、適度なもしくは強力な化学剥離、縫合、非外科的美容療法、掻爬術。
【００９６】
外傷後の、例えば、皮膚への強くない外部の損傷の後の皮膚損傷は、例えば、切り傷、かり傷、すり傷及び表面上の火傷、日焼けを含む。
【００９７】
皮膚の回復を促進し、長期間（皮膚が完全に修復するまで）の使用に適している治癒製品が必要となる表面的な非侵襲的な医療上の処置は、例えば、強くない化学剥離、レーザー脱毛、及び表在血管（酒さ）治療が含まれる。
【００９８】
本発明の皮膚及び粘膜損傷の治療には、特に、切り傷、縫合、擦過傷、すり傷、かき傷、外科的もしくは美容皮膚処置後の傷跡、表面的な火傷、日焼けの治療が含まれる。
【００９９】
本発明はさらに、治癒及び皮膚再生を改善する、特に、治癒障害を緩和する本発明の美容的組成物の使用に関する。
【実施例】
【０１００】
本発明は、下記の例に基づき更に理解されるものであるが、それらの例に本発明の範囲が限定されるものではない。
【０１０１】
例１：細菌ＬＭＢ６４の培養
非限定の例示として、好ましい培養培地は塩化アンモニウム、硫酸マグネシウム、酵母エキスを含む。出願ＷＯ２０１２／０８５１８２号より生じるように、とりわけ、他の類似の培地は使用されるかもしれず、そのようにして、本詳細な説明に不可欠な要素を形成するとみなさなければならないこともまた、明記されるべきである。当業者によるいかなる改変もまた、本発明の開示の一部であるとみなさなければならない。
【０１０２】
１つの例示的な培養工程を以下に開示する。ここで、この例は単なる説明目的のためのものであって、決して限定とみなされてはならないことは想起されるべきである。
【０１０３】
菌株ＬＭＢ６４は３つの手順で生育される。つまり、最初の接種、バッチ方式での前培養（もしくは、前発酵）、流加培養方式（グルコース添加）での培養である。
【０１０４】
接種：１０００ｍＬの無菌培地を含む三角フラスコに接種するために、ＷＣＢ  ＬＭＢ６４のチューブが使用される。それから、三角フラスコは恒温振とう機に置かれ、振とうされる。ブロスの細胞濃度が十分になったとき、培養は中止する。それから、前発酵に移されるまで細胞は冷却される。
【０１０５】
前培養：それから、前発酵槽は約１６Ｌの培地で満たされ、完全に殺菌される。
【０１０６】
２つのサテライトフラスコ（satellite flasks）は、前発酵槽及びその追加ブロックの殺菌後に、前発酵槽に接続される。
・無菌の５０％グルコース溶液を含むフラスコ。この溶液（グルコース前培養バッチ）は、最初のグルコース濃度である２０ｇ／Ｌを達成するため、すぐに培養培地に移される。
・上記の接種工程で開示された接種液を含む三角フラスコは、前発酵槽において接種される。
【０１０７】
前培養は開始され、それから自動的に抑制される。例として、以下のパラメータが言及されてもよい：気温、振とう速度、圧力、空気流量、もしくはＰＯ２。
【０１０８】
細胞の生育は６２０ｎｍの光学密度を測定することにより観察される。前培養は、十分な濃度に達したとき、冷却することで中止する。
・培養：それから、発酵槽はｐＨ７．０に調整された１２７Ｌの培地で満たされ、それから完全に殺菌される。３つのサテライトフラスコが使用される。
・無菌のグルコース溶液が含まれるフラスコ。この溶液は最初のグルコース濃度である２０ｇ／Ｌを達成するため、すぐに培養溶媒に移される。
・アンチフォームのフラスコ。このアンチフォームは、槽中のフォームの水位を調整するために、培養中、自動的に加えられるだろう。
・流加回分のグルコースのフラスコ。この溶液は細胞の生育を促進するため、培養中、加えられるだろう。
【０１０９】
培養は開始され、それから自動的に抑制される。例として、以下のパラメータについてまた言及されるかもしれない：気温、振とう速度、圧力、空気流量、もしくはＰＯ２である。
【０１１０】
培地中に最初に存在するグルコースの枯渇（ＰＯ２が上昇する）後、流加回分のグルコース溶液の添加が引き起こされ、そのようにして、高濃度の細胞生育を可能にしている。発酵は全グルコースの消費後に中止される。この工程において、発酵は自動的に冷却されなければならない。培養の間中、細胞の生育は６２０ｎｍの光学密度を測定することにより観察される。培養の終了時に得られる乾燥バイオマス（ｇ／Ｌ）の量は、重量法を用いて決定される。
【０１１１】
例２：セクレトームの抽出
好ましい実施態様の説明として、以下の例により示されるが、本発明を限定するものとみなしてはならない。
【０１１２】
セクレトームは、一般的に、細菌の細胞、表面タンパク質、ペリプラズムに局在するタンパク質を除去するために、培養工程の後の成果物の遠心分離を行った後で得られる。この遠心分離工程の後に、トリス−アルギニン基本バッファーの上澄み液の添加が続く。上澄み液の濾過の最終工程もまた可能である。当業者によるいかなる改変もまた、本発明の開示の一部であるとみなさなければならない。
【０１１３】
遠心分離：発酵槽から遠心分離機までの移送ラインは滅菌されている。発酵は、それから、続く遠心分離機による遠心と分離されていなければならない。遠心分離は、１５０Ｌ／ｈ（±３０Ｌ／ｈ）で、１０９００±１０００ｒｐｍの回転速度で実施される。上澄み液は、使い捨て小袋を備えたコンテナに集められる。上澄み液の重量ははかり台の上で測定される。
【０１１４】
アルギニンの添加：トリスアルギニン抽出バッファーは滅菌され、それから培養上澄み液を含む使い捨て小袋に移される。必要な接触時間は、１〜７時間である。使い捨て小袋に添加後のトリス−アルギニンの目標濃度は、Ｌ−アルギニンが約０．３Ｍであり、トリスが約２０ｍＭである。
【０１１５】
抽出バッファー添加後の総量は約２４０Ｌである。
【０１１６】
濾過：２つの濾過工程は、上澄み液を清澄にするため、及び清澄で無菌なセクレトームを作製するために、オンラインで実行される。濾過は、濾過／分配システムにより管理される。使い捨て深層濾過カートリッジは、そのフィルターケース内に設置されている。全ての濾過された生成物は、無菌で、使い捨て小袋が備えられたコンテナに回収される。濾過された生成物の入った小袋ははかり台で測量され、それから、分配まで、＋５℃で保管される。
【０１１７】
セクレトームタンパク質のゲル電気泳動（図１を参照）
Ｂｉｓ−ＴｒｉｓＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（４〜１２％）、変性及び還元条件下で、アルギニンバッファー前及び後の培養上澄み液の様々な量のロード量（それぞれ１０、１５、２０、３０μｌ）のクマシーブルーによる検出。いずれの場合においても、１４〜１００ｋＤａの間で、約３８ｋＤａの主要なバンドを含む、様々なタンパク質のバンドが観察された。
【０１１８】
例３：ヒト正常線維芽細胞の増殖に対するセクレトームの効果
使用した技術は、３７℃での、Ｓ期の細胞のＤＮＡへの、ヌクレオチドである、チミジンアナログである５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の取り込みである。この技術は、細胞周期における増殖細胞（ＳもしくはＤＮＡ合成期）の進行状態の特徴を持つ細胞の定量化を可能にする。
【０１１９】
線維芽細胞は９６ウェルプレートに播種され、それから、試験されるための化合物、ポジティブコントロールとしてのＥＧＦ、０．４、０．６、１％のセクレトームの存在下で、７２時間培養される。ＢｒｄＵの取り込みは最後の２４時間で実行され、ＢｒｄＵ  ＥＬＩＳＡキット（ｉｔｅｍ  ｎｏ．１１６４７２２９００１，Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して、定量化される。
【０１２０】
対照の割合は次の式により計算される：
【数１】
2020513007.tif 000002
【０１２１】
統計解析はスチューデントのｔ検定を用いて実行される。この研究は３つのドナーのプールにより実行された。
【０１２２】
ポジティブコントロールであるＥＧＦは、線維芽細胞の増殖を強く、顕著に、３つのドナーのプールにより、再現可能な方法で刺激した（９５％刺激）。このことが、実験の正当性を立証している。この結果は、０．４％、０．６％及び１％で試験されたセクレトームが顕著にヒト線維芽細胞の増殖を刺激したことを示している。以下の表１は、試験された化合物の存在下で７２時間培養後のヒト正常線維芽細胞によるＢｒｄＵの取り込み（ＥＬＩＳＡによる）（平均値±標準誤差）を要約している（ｎ＝３  ドナープール）。結果は図２に示されている。
【０１２３】
【表１】
2020513007.tif 000003
【０１２４】
例４：ＨａＣａＴ角化細胞の走化に対するセクレトームの効果
本研究は、Ｏｒｉｓ  Ｃｅｌｌ  Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ｐｌａｔｙｐｕｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、メーカーにより推奨されている基本的な試験法で行った。主に、ＨａＣａＴ（ヒト角化細胞）細胞は９６ウェルプレートに播種されている。Ｏｒｉｓ（商標）ストッパーを取り外し、評価される化合物が培養培地に添加される。細胞走化が可能なように２４時間、培養が続く。ストッパーにより区切られた区域における細胞の可視可を可能にするため、細胞侵襲性蛍光トレーサー、カルセインが、それから、添加される。
【０１２５】
細胞の走化は、ウェルの写真撮影及び走化表面区域をｍｍ２で定量化することにより評価する。
【０１２６】
対照の割合は次の式により計算される：
【数２】
2020513007.tif 000004
【０１２７】
研究は、６回の技術的反復により実行され、ｎ＝２の個別の試験において実行された。
【０１２８】
ポジティブコントロールであるＴＧＦ−ｂ及びウシ胎児血清（ＦＣＳ）は、細胞の走化を強く、顕著に、再現可能な方法で刺激した（それぞれ５１％及び１７６％の刺激）。このことが、実験の正当性を立証している。この結果は、０．４％、０．６％及び１％で試験されたセクレトームが顕著にＨａＣａＴ角化細胞の走化を刺激したことを示している。以下の表２は、様々な化合物の存在下で２４時間培養後のＨａＣａＴ細胞による走化を要約する（ｎ＝２）。結果は図３に示す。
【０１２９】
【表２】
2020513007.tif 000005
【０１３０】
例５：生体外治癒モデルにおける傷口を塞ぐことに対するセクレトームの効果
ブタ耳の皮膚移植片は生存条件で維持される。丸い３ミリの傷が作製されている中心において、６ミリメートルの生検が実行される。傷は全体の上皮及び上方の真皮を損傷する。評価のための生成物は局所的に適用される。４８時間後、生検は凍結され、部分ごとにヘマトキシリン・エオジン染色が実行される。上皮再形成の速度論は以下の工程によって評価される。
１）J.Brandnerにより開発された試験法（Pollok et al., 2010, J Cell Mol Med）により、０〜３まで規定した評点を帰属。傷の端から上皮再形成の区域の範囲のμｍでの正確な測定。有意性のために、スチューデントのｔ検定を適用する。
２）組織保存の質を評価するために、傷の端における形態学的な外見もまた評価される。
【０１３１】
適用される生成物の調整：同時に試験される対照修復クリーム（Ｃｉｃａｌｆａｔｅ（商標）ｃｒｅａｍ）と同じ基剤に０．４、０．６及び１ｗｔ％のセクレトームを添加する。上皮再形成はこの対照クリームとの比較により評価する。
【０１３２】
結果は、セクレトームの傷の上皮再形成の進行に対する線量効果を示した。１％のセクレトームを含む処方は、対照修復クリームと比較して、傷口を塞ぐことを著しく促進する（ｐ＝０．０４３）。さらに、組織の形態学的な分析は、セクレトームを含む組成物の優れた耐久力を示した。結果を図４に示す。
【０１３３】
例示的な組成物：水中油型エマルション
例２によるセクレトーム：          ０．１−５％
グリセリン：                      １−３０％
ヘキシレングリコール：            ０．１−７％
セテアリルグリコシド：            ０．１−１％
セテアリルアルコール：            ０．９−４％
ステアリン酸：                    ０．５−４％
ステアリン酸グリセリル：          ０．１−４％
植物油：                          ０．１−１０％
水：                              適量１００％
【図１】
2020513007.tif 000006
【図２】
2020513007.tif 000007
【図３】
2020513007.tif 000008
【図４】
2020513007.tif 000009
【配列表】
2020513007000001.app
【国際調査報告】
2020513007.tif 000010
2020513007.tif 000011
2020513007.tif 000012
2020513007.tif 000013
2020513007.tif 000014
2020513007.tif 000015
2020513007.tif 000016
2020513007.tif 000017