(57)【要約】  本発明の開示は、患者が、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）を阻害する治療剤での処置によって利益を得るかどうかを決定するための迅速で非侵襲的な方法を提供する。これらの方法は、マイクロサンプリングデバイスを使用して収集される少量の乾燥生体液サンプル中のＨＣＶ  ＲＮＡおよび／または抗ＨＣＶ抗体を検出することに基づく。本方法の実施において使用するためのキットも提供される。【選択図】図１
2020511956.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
乾燥生体液サンプルにおけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）を検出するための方法であって、
（ａ）マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップから溶出させた乾燥生体液サンプルから、リボ核酸を抽出すること；
（ｂ）抽出されたリボ核酸を逆転写して、複数のｃＤＮＡ：ＲＮＡハイブリダイゼーション複合体を生成すること；
（ｃ）ｃＤＮＡ：ＲＮＡハイブリダイゼーション複合体を、ＨＣＶゲノムの５’ＵＴＲに特異的にハイブリダイズするプライマー対を用いて増幅して、ＨＣＶアンプリコンを産生すること；および
（ｄ）工程（ｃ）で産生されたＨＣＶアンプリコンが検出される場合、乾燥生体液サンプルにおけるＨＣＶを検出すること
を含む、方法。
【請求項２】
乾燥生体液サンプル中のＨＣＶが、遺伝子型１ａ、遺伝子型１ｂ、遺伝子型２ａ、遺伝子型２ｂ、遺伝子型２ｃ、遺伝子型２ｄ、遺伝子型３ａ、遺伝子型３ｂ、遺伝子型３ｃ、遺伝子型３ｄ、遺伝子型３ｅ、遺伝子型３ｆ、遺伝子型４ａ、遺伝子型４ｂ、遺伝子型４ｃ、遺伝子型４ｄ、遺伝子型４ｅ、遺伝子型４ｆ、遺伝子型４ｇ、遺伝子型４ｈ、遺伝子型４ｉ、遺伝子型４ｊ、遺伝子型５ａ、および遺伝子型６ａからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子型を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
乾燥生体液サンプルが、乾燥血漿、乾燥血清、または乾燥全血である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップ上の乾燥生体液サンプルが、指先穿刺を介して患者から収集される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
乾燥生体液サンプルの溶出が、マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップを溶解緩衝液と接触させることによって実行される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
溶解緩衝液が、グアニジンイソチオシアネート、および任意選択でβ−メルカプトエタノールを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
乾燥生体液サンプルの溶出が、マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップを、溶解緩衝液と、３７℃で少なくとも３０分接触させることによって実行される、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
マイクロサンプリングデバイスが、ＭＩＴＲＡ（登録商標）チップである、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
マイクロサンプリングデバイスのサンプル体積が、３０μＬ以下、２５μＬ以下、２０μＬ以下、１５μＬ以下、または１０μＬ以下である、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
乾燥生体液サンプルが、肝炎の徴候または症状を示す患者、またはＨＣＶ感染のリスクがある患者から単離される、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
乾燥生体液サンプル中のＨＣＶのウイルス負荷量が、少なくとも１〜５ＩＵ／ｍＬ、少なくとも５〜１０ＩＵ／ｍＬ、少なくとも１０〜１５ＩＵ／ｍＬ、少なくとも１５〜２０ＩＵ／ｍＬ、少なくとも２０〜４０ＩＵ／ｍＬ、少なくとも４０〜６０ＩＵ／ｍＬ、少なくとも６０〜８０ＩＵ／ｍＬ、少なくとも８０〜１００ＩＵ／ｍＬ、少なくとも１００〜１５０ＩＵ／ｍＬ、少なくとも１５０〜２００ＩＵ／ｍＬ、少なくとも２００〜２５０ＩＵ／ｍＬ、少なくとも２５０〜３００ＩＵ／ｍＬ、少なくとも３００〜３５０ＩＵ／ｍＬ、少なくとも３５０〜４００ＩＵ／ｍＬ、少なくとも４００〜５００ＩＵ／ｍＬ、少なくとも５００〜６００ＩＵ／ｍＬ、少なくとも６００〜７００ＩＵ／ｍＬ、少なくとも７００〜８００ＩＵ／ｍＬ、少なくとも８００〜８５０ＩＵ／ｍＬ、少なくとも８５０ＩＵ／ｍＬ、または少なくとも９００ＩＵ／ｍＬである、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ｃＤＮＡ：ＲＮＡハイブリダイゼーション複合体を、検出可能に標識されたプローブと接触させることをさらに含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
検出可能な標識が、４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’ジスルホン酸、アクリジンおよび誘導体（アクリジン、アクリジンイソチオシアネート）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ））、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、４−アミノ−Ｎ−［３−ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド−３，５ジスルホネート（ルシファーイエローＶＳ）、Ｎ−（４−アニリノ−１−ナフチル）マレイミド、アントラニルアミド、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）Ｒ−６Ｇ、ＢＯＰＩＰＹ（登録商標）５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ、ブリリアントイエロー、Ｃａｌ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ  ６１０（登録商標）（ＣＦＲ６１０）、クマリンおよび誘導体（クマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ、クマリン１２０）、７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（クマリン１５１））、Ｃｙ２（登録商標）、Ｃｙ３（登録商標）、Ｃｙ３．５（登録商標）、Ｃｙ５（登録商標）、Ｃｙ５．５（登録商標）、シアノシン、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、５’，５”−ジブロモピロガロール−スルホンフタレイン（ブロモピロガロールレッド）、７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリン、ジエチレントリアミン五酢酸、４，４’−ジイソチオシアナトジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸、４，４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸、５−［ジメチルアミノ］ナフタレン−１−スルホニルクロリド（ＤＮＳ、ダンシルクロリド）、４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）、Ｅｃｌｉｐｓｅ（商標）（Ｅｐｏｃｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．）、エオシンおよび誘導体（エオシン、エオシンイソチオシアネート）、エリスロシンおよび誘導体（エリスロシンＢ、エリスロシンイソチオシアネート）、エチジウム、フルオレセインおよび誘導体（５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、２’，７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ヘキサクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＨＥＸ）、ＱＦＩＴＣ（ＸＲＩＴＣ）、テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、フルオレサミン、ＩＲ１４４、ＩＲ１４４６、ランタニド系蛍光体、マラカイトグリーンイソチオシアネート、４−メチルウンベリフェロン、オルトクレゾールフタレイン、ニトロチロシン、パラローズアニリン、フェノールレッド、Ｂ−フィコエリトリン、Ｒ−フィコエリトリン��アロフィコシアニン、ｏ−フタルジアルデヒド、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）、ヨウ化プロピジウム、ピレンおよび誘導体（ピレン、ピレンブチレート、スクシンイミジル１−ピレンブチレート）、ＱＳＹ（登録商標）７、ＱＳＹ（登録商標）９、ＱＳＹ（登録商標）２１、ＱＳＹ（登録商標）３５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、リアクティブレッド４（Ｃｉｂａｃｒｏｎ（登録商標）ブリリアントレッド３Ｂ−Ａ）、ローダミンおよび誘導体（６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、リサミンローダミンＢスルホニルクロリド、ローダミン（Ｒｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミングリーン、ローダミンＸイソチオシアネート、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１、スルホローダミン１０１の塩化スルホニル誘導体（テキサスレッド）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、テトラメチルローダミン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、リボフラビン、ロゾール酸、テルビウムキレート誘導体、Ｑｕａｓａｒ  ６７０（登録商標）、ならびにＶＩＣ（登録商標）からなる群から選択される蛍光性レポーターである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ｃＤＮＡ：ＲＮＡハイブリダイゼーション複合体が、Ｚ０５またはＺ０５Ｄ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅される、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
乾燥生体液サンプルにおけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）を検出するための方法であって、
（ａ）マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップから、乾燥生体液サンプルを溶出させること；および
（ｂ）溶出させた乾燥生体液サンプル中で、少なくとも１つのＨＣＶがコードする抗原に対する抗ＨＣＶ抗体が検出される場合、乾燥生体液サンプルにおけるＨＣＶを検出すること
を含む、方法。
【請求項１６】
少なくとも１つのＨＣＶがコードする抗原が、ｃ２２−３、ｃ２００、およびＮＳ５からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
乾燥生体液サンプル中のＨＣＶが、遺伝子型１ａ、遺伝子型１ｂ、遺伝子型２ａ、遺伝子型２ｂ、遺伝子型２ｃ、遺伝子型２ｄ、遺伝子型３ａ、遺伝子型３ｂ、遺伝子型３ｃ、遺伝子型３ｄ、遺伝子型３ｅ、遺伝子型３ｆ、遺伝子型４ａ、遺伝子型４ｂ、遺伝子型４ｃ、遺伝子型４ｄ、遺伝子型４ｅ、遺伝子型４ｆ、遺伝子型４ｇ、遺伝子型４ｈ、遺伝子型４ｉ、遺伝子型４ｊ、遺伝子型５ａ、および遺伝子型６ａからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子型を有する、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
乾燥生体液サンプルが、乾燥血漿、乾燥血清、または乾燥全血である、請求項１５から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップ上の乾燥生体液サンプルが、指先穿刺を介して患者から収集される、請求項１５から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
乾燥生体液サンプルの溶出が、マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップを、リン酸緩衝食塩水および０．５％ＢＳＡを含む混合物と接触させることによって実行される、請求項１５から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
乾燥生体液サンプルの溶出が、マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップを、リン酸緩衝食塩水および０．５％ＢＳＡを含む混合物と、室温で少なくとも２時間、または２〜８℃で一晩接触させることによって実行される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
マイクロサンプリングデバイスが、ＭＩＴＲＡ（登録商標）チップである、請求項１５から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
マイクロサンプリングデバイスのサンプル体積が、３０μＬ以下、２５μＬ以下、２０μＬ以下、１５μＬ以下、または１０μＬ以下である、請求項１５から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
乾燥生体液サンプルが、肝炎の徴候または症状を示す患者、またはＨＣＶ感染のリスクがある患者から単離される、請求項１５から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
乾燥生体液サンプルにおけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の存在を検出するためのキットであって、マイクロサンプリングデバイス、溶解緩衝液、逆転写酵素、および任意選択でＨＣＶゲノムの５’ＵＴＲに特異的にハイブリダイズするプライマー対を含む、キット。
【請求項２６】
ＨＣＶゲノムの５’ＵＴＲに特異的にハイブリダイズする検出可能に標識されたプローブをさらに含む、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
乾燥生体液サンプルにおけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の存在を検出するためのキットであって、マイクロサンプリングデバイス、０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液、および抗ＨＣＶ一次抗体に特異的に結合する検出可能に標識された二次抗体を含む、キット。
【請求項２８】
ｃ２２−３、ｃ２００、およびＮＳ５からなる群から選択される少なくとも１つのＨＣＶがコードする抗原でコーティングされたウェルを含む固体基層をさらに含む、請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
マイクロサンプリングデバイスが、ＭＩＴＲＡ（登録商標）チップである、請求項２５から２８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３０】
ＨＣＶ感染を阻害する治療剤での処置のために、肝炎の症状を示す患者を選択するための方法であって、
（ａ）血液細胞からのリボ核酸の放出が起こる条件下で、乾燥血液サンプルを溶出させることであって、乾燥血液サンプルは、マイクロサンプリングデバイスを用いて患者から収集される、溶出させること；
（ｂ）溶出させた乾燥血液サンプルから、リボ核酸を単離すること；
（ｃ）単離したリボ核酸を逆転写して、複数のｃＤＮＡ：ＲＮＡハイブリダイゼーション複合体を生成すること；
（ｄ）ｃＤＮＡ：ＲＮＡハイブリダイゼーション複合体を、ＨＣＶゲノムの５’ＵＴＲに特異的にハイブリダイズするプライマー対を用いて増幅して、蛍光標識されたＨＣＶアンプリコンを産生すること；
（ｅ）工程（ｄ）で産生された蛍光標識されたＨＣＶアンプリコンを検出すること；および
（ｆ）蛍光標識されたＨＣＶアンプリコンが検出される場合、ＨＣＶ感染を阻害する治療剤での処置のために患者を選択すること
を含む、方法。
【請求項３１】
ＨＣＶ感染を阻害する治療剤での処置のために、肝炎の症状を示す患者を選択するための方法であって、
（ａ）乾燥血液サンプルを、０．５％ＢＳＡを含む緩衝溶液を用いて溶出させることであって、乾燥血液サンプルは、マイクロサンプリングデバイスを用いて患者から収集される、溶出させること；
（ｂ）溶出させた乾燥血液サンプルにおいて、少なくとも１つのＨＣＶがコードする抗原に対する抗ＨＣＶ抗体を検出すること；および
（ｃ）抗ＨＣＶ抗体が検出される場合、ＨＣＶ感染を阻害する治療剤での処置のために患者を選択すること
を含む、方法。
【請求項３２】
マイクロサンプリングデバイスが、ＭＩＴＲＡ（登録商標）チップである、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３３】
ＨＣＶ感染を阻害する治療剤が、インターフェロンアルファコン−１、ペグ化および／または非ペグ化インターフェロンアルファ−２ｂ、ペグインターフェロンアルファ−２ａ、リバビリン、テラプレビル、ボセプレビル、ソホスブビル、シメプレビル、ダクラタスビル、ベルパタスビル、オムビタスビル、パリタプレビル、リトナビル、ダサブビル、レジパスビル、エルバスビル、ダノプレビル、グラゾプレビル、ＧＳ−７９７７、β−インターフェロン、γ−インターフェロン、アマンタジン、ならびに３ＴＣからなる群から選択される１種または複数の薬剤である、請求項３０から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
乾燥血液サンプル中のＨＣＶが、遺伝子型１ａ、遺伝子型１ｂ、遺伝子型２ａ、遺伝子型２ｂ、遺伝子型２ｃ、遺伝子型２ｄ、遺伝子型３ａ、遺伝子型３ｂ、遺伝子型３ｃ、遺伝子型３ｄ、遺伝子型３ｅ、遺伝子型３ｆ、遺伝子型４ａ、遺伝子型４ｂ、遺伝子型４ｃ、遺伝子型４ｄ、遺伝子型４ｅ、遺伝子型４ｆ、遺伝子型４ｇ、遺伝子型４ｈ、遺伝子型４ｉ、遺伝子型４ｊ、遺伝子型５ａ、および遺伝子型６ａからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子型を有する、請求項３０から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
少なくとも１つのＨＣＶがコードする抗原が、ｃ２２−３、ｃ２００、およびＮＳ５からなる群から選択される、請求項３０から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
乾燥生体液サンプルにおけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）を検出するための方法であって、マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップから溶解緩衝液を用いて溶出させた乾燥生体液サンプルから、ＨＣＶ  ＲＮＡを単離することを含む、方法。
【請求項３７】
ＨＣＶ  ＲＮＡが、逆転写およびリアルタイムＰＣＲを使用して検出される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
溶解緩衝液が、グアニジンイソチオシアネート、および任意選択でβ−メルカプトエタノールを含む、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項３９】
乾燥生体液サンプルにおけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）を検出するための方法であって、マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップから０．５％ＢＳＡを含む緩衝溶液を用いて溶出させた乾燥生体液サンプルから、抗ＨＣＶ抗体を単離することを含む、方法。
【請求項４０】
緩衝溶液が、リン酸緩衝食塩水を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
抗ＨＣＶ抗体が、ＥＬＩＳＡを使用して検出される、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項４２】
抗ＨＣＶ抗体が、ｃ２２−３、ｃ２００、およびＮＳ５からなる群から選択されるＨＣＶ抗原に結合する、請求項３９から４１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の開示は、患者が、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）を阻害する治療剤での処置によって利益を得るかどうかを決定するための方法を提供する。これらの方法は、マイクロサンプリングデバイスを使用して収集される少量の乾燥生体液サンプル中のＨＣＶ  ＲＮＡおよび／または抗ＨＣＶ抗体を検出することに基づく。本方法の実施において使用するためのキットも提供される。
【背景技術】
【０００２】
以下の本発明の開示の背景の記載は、単に読者が本開示を理解するのを助けるために提供され、本発明の開示に対する従来技術を記載または構成することを認めるものではない。
【０００３】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、輸注後肝炎の症例の９０％から９５％に関与する主要な病原体とみなされ（Ｒｕｓｔｇｉ  ＶＫ．Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．４２：５１３−５２１（２００７））、全てではないがほとんどの血液媒介性の非Ａ、非Ｂ肝炎（ＮＡＮＢＨ）原因因子とみなされている。抗ＨＣＶ抗体の存在は、個体が、ＨＣＶに感染している可能性があること、およびＨＣＶ感染を伝染させる能力を有する可能性があることを示す。
【０００４】
ＨＣＶは、３，０００のアミノ酸をコードするおよそ９，５００ヌクレオチドのゲノムを有する一本鎖のプラス鎖ＲＮＡウイルスである。ＨＣＶは、血液媒介性ウイルスとして、血液や血液製剤によって伝染する。ＨＣＶ感染の発生率は、静注薬物乱用に関して最大であり、それより低い程度であるが他の経皮曝露でも起こっている（Ｌａｕｅｒ  ＧＭ  ＆  Ｗａｌｋｅｒ  ＢＤ，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４５：４１−５２（２００１））。世界保健機関によれば、約１億３０００万〜１億７０００万の人がＨＣＶに慢性的に感染しており、毎年３５０，０００人を超える人がＣ型肝炎関連の肝疾患で死亡している。疾病管理センターは、１．８％または３９０万人の米国人がＣ型肝炎に感染しており、そのうち２７０万人が慢性的に感染していると見積もっている。未処置のままの場合、Ｃ型肝炎は、肝臓がん、肝臓の傷害、最終的には肝不全に至る可能性がある。
【０００５】
したがって、Ｃ型肝炎感染のリスクがある患者において迅速にＨＣＶを検出することができる、よりロバストで高感度の方法への実質的な必要性がある。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の開示は、肝炎の徴候または症状を有する患者、およびＣ型肝炎感染のリスクがある患者においてＨＣＶ感染を検出するための方法を提供する。本発明の技術の方法はまた、出生前期の間にＨＣＶに罹る高いリスクがある新生児を同定するために、妊娠した女性においてＣ型肝炎感染に関してスクリーニングするために使用することもできる。
【０００７】
一態様において、本発明の開示は、乾燥生体液サンプルにおけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）を検出するための方法であって、（ａ）マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップから溶出させた乾燥生体液サンプルから、リボ核酸を抽出すること；（ｂ）抽出されたリボ核酸を逆転写して、複数のｃＤＮＡ：ＲＮＡハイブリダイゼーション複合体を生成すること；（ｃ）ｃＤＮＡ：ＲＮＡハイブリダイゼーション複合体を、ＨＣＶゲノムの５’ＵＴＲに特異的にハイブリダイズするプライマー対を用いて増幅して、ＨＣＶアンプリコンを産生すること；および（ｄ）工程（ｃ）で産生されたＨＣＶアンプリコンが検出される場合、乾燥生体液サンプルにおけるＨＣＶを検出することを含む、方法を提供する。一部の実施形態において、乾燥生体液サンプルは、乾燥血漿、乾燥血清、または乾燥全血である。乾燥生体液サンプル中に存在するＨＣＶの遺伝子型は、遺伝子型１ａ、遺伝子型１ｂ、遺伝子型２ａ、遺伝子型２ｂ、遺伝子型２ｃ、遺伝子型２ｄ、遺伝子型３ａ、遺伝子型３ｂ、遺伝子型３ｃ、遺伝子型３ｄ、遺伝子型３ｅ、遺伝子型３ｆ、遺伝子型４ａ、遺伝子型４ｂ、遺伝子型４ｃ、遺伝子型４ｄ、遺伝子型４ｅ、遺伝子型４ｆ、遺伝子型４ｇ、遺伝子型４ｈ、遺伝子型４ｉ、遺伝子型４ｊ、遺伝子型５ａ、および遺伝子型６ａからなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子型であり得る。特定の実施形態において、乾燥生体液サンプルは、肝炎の徴候または症状を示す患者、またはＨＣＶ感染のリスクがある患者から単離される。一部の実施形態において、ｃＤＮＡ：ＲＮＡハイブリダイゼーション複合体は、Ｚ０５またはＺ０５Ｄ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅される。
【０００８】
加えて、または代替として、一部の実施形態において、マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップ上の乾燥生体液サンプルは、指先穿刺を介して患者から収集される。特定の実施形態において、マイクロサンプリングデバイスは、ＭＩＴＲＡ（登録商標）チップである。乾燥生体液サンプルの溶出は、マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップを溶解緩衝液と接触させることによって実行することができる。一部の実施形態において、溶解緩衝液は、グアニジンイソチオシアネート、および任意選択でβ−メルカプトエタノールを含む。加えて、または代替として、一部の実施形態において、乾燥生体液サンプルの溶出は、マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップを、溶解緩衝液と、３７℃で少なくとも３０分接触させることによって実行される。一部の実施形態において、マイクロサンプリングデバイスのサンプル体積は、３０μＬ以下、２５μＬ以下、２０μＬ以下、１５μＬ以下、または１０μＬ以下である。
【０００９】
特定の実施形態において、本方法は、ｃＤＮＡ：ＲＮＡハイブリダイゼーション複合体を、検出可能に標識されたプローブと接触させることをさらに含む。一部の実施形態において、検出可能な標識は、４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’ジスルホン酸、アクリジンおよび誘導体（アクリジン、アクリジンイソチオシアネート）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ））、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、４−アミノ−Ｎ−［３−ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド−３，５ジスルホネート（ルシファーイエローＶＳ）、Ｎ−（４−アニリノ−１−ナフチル）マレイミド、アントラニルアミド、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）Ｒ−６Ｇ、ＢＯＰＩＰＹ（登録商標）５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ、ブリリアントイエロー、Ｃａｌ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ  ６１０（登録商標）（ＣＦＲ６１０）、クマリンおよび誘導体（クマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ、クマリン１２０）、７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン〔trifluoromethylcouluarin〕（クマリン１５１））、Ｃｙ２（登録商標）、Ｃｙ３（登録商標）、Ｃｙ３．５（登録商標）、Ｃｙ５（登録商標）、Ｃｙ５．５（登録商標）、シアノシン〔cyanosine〕、４’，６−ジアミジノ〔diaminidino〕−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、５’，５”−ジブロモピロガロール−スルホンフタレイン（ブロモピロガロールレッド）、７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリン、ジエチレントリアミン五酢酸、４，４’−ジイソチオシアナトジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸、４，４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸、５−［ジメチルアミノ］ナフタレン−１−スルホニルクロリド（ＤＮＳ、ダンシルクロリド）、４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）、Ｅｃｌｉｐｓｅ（商標）（Ｅｐｏｃｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．）、エオシンおよび誘導体（エオシン、エオシンイソチオシアネート）、エリスロシンおよび誘導体（エリスロシンＢ、エリスロシンイソチオシアネート）、エチジウム、フルオレセインおよび誘導体（５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、２’，７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ヘキサクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＨＥＸ）、ＱＦＩＴＣ（ＸＲＩＴＣ）、テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、フルオレサミン、ＩＲ１４４、ＩＲ１４４６、ランタニド系〔lanthamide〕蛍光体、マラカイトグリーンイソチオシアネート、４−メチルウンベリフェロン、オルトクレゾールフタレイン、ニトロチロシン、パラローズアニリン、フェノールレッド、Ｂ−フィコエリトリン、Ｒ−フィコエリトリン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルジアルデヒド、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）、ヨウ化プロピジウム、ピレンおよび誘導体（ピレン、ピレンブチレート、スクシンイミジル１−ピレンブチレート）、ＱＳＹ（登録商標）７、ＱＳＹ（登録商標）９、ＱＳＹ（登録商標）２１、ＱＳＹ（登録商標）３５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、リアクティブレッド４（Ｃｉｂａｃｒｏｎ（登録商標）ブリリアントレッド３Ｂ−Ａ）、ローダミンおよび誘導体（６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、リサミンローダミンＢスルホニルクロリド、ローダミン（Ｒｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミングリーン、ローダミンＸイソチオシアネート、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１、スルホローダミン１０１の塩化スルホニル誘導体（テキサスレッド）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、テトラメチルローダミン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、リボフラビン、ロゾール酸、テルビウムキレート誘導体、Ｑｕａｓａｒ  ６７０（登録商標）、ならびにＶＩＣ（登録商標）からなる群から選択される蛍光性レポーターである。
【００１０】
上記実施形態のいずれかにおいて、乾燥生体液サンプル中のＨＣＶのウイルス負荷量は、少なくとも１〜５ＩＵ／ｍＬ、少なくとも５〜１０ＩＵ／ｍＬ、少なくとも１０〜１５ＩＵ／ｍＬ、少なくとも１５〜２０ＩＵ／ｍＬ、少なくとも２０〜４０ＩＵ／ｍＬ、少なくとも４０〜６０ＩＵ／ｍＬ、少なくとも６０〜８０ＩＵ／ｍＬ、少なくとも８０〜１００ＩＵ／ｍＬ、少なくとも１００〜１５０ＩＵ／ｍＬ、少なくとも１５０〜２００ＩＵ／ｍＬ、少なくとも２００〜２５０ＩＵ／ｍＬ、少なくとも２５０〜３００ＩＵ／ｍＬ、少なくとも３００〜３５０ＩＵ／ｍＬ、少なくとも３５０〜４００ＩＵ／ｍＬ、少なくとも４００〜５００ＩＵ／ｍＬ、少なくとも５００〜６００ＩＵ／ｍＬ、少なくとも６００〜７００ＩＵ／ｍＬ、少なくとも７００〜８００ＩＵ／ｍＬ、少なくとも８００〜８５０ＩＵ／ｍＬ、少なくとも８５０ＩＵ／ｍＬ、または少なくとも９００ＩＵ／ｍＬである。
【００１１】
別の態様において、本発明の開示は、乾燥生体液サンプルにおけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）を検出するための方法であって、（ａ）マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップから、乾燥生体液サンプルを溶出させること；および（ｂ）溶出させた乾燥生体液サンプル中で、少なくとも１つのＨＣＶがコードする抗原に対する抗ＨＣＶ抗体が検出される場合、乾燥生体液サンプルにおけるＨＣＶを検出することを含む、方法を提供する。一部の実施形態において、乾燥生体液サンプルは、乾燥血漿、乾燥血清、または乾燥全血である。乾燥生体液サンプル中に存在するＨＣＶの遺伝子型は、遺伝子型１ａ、遺伝子型１ｂ、遺伝子型２ａ、遺伝子型２ｂ、遺伝子型２ｃ、遺伝子型２ｄ、遺伝子型３ａ、遺伝子型３ｂ、遺伝子型３ｃ、遺伝子型３ｄ、遺伝子型３ｅ、遺伝子型３ｆ、遺伝子型４ａ、遺伝子型４ｂ、遺伝子型４ｃ、遺伝子型４ｄ、遺伝子型４ｅ、遺伝子型４ｆ、遺伝子型４ｇ、遺伝子型４ｈ、遺伝子型４ｉ、遺伝子型４ｊ、遺伝子型５ａ、および遺伝子型６ａからなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子型であり得る。特定の実施形態において、乾燥生体液サンプルは、肝炎の徴候または症状を示す患者、またはＨＣＶ感染のリスクがある患者から単離される。一部の実施形態において、少なくとも１つのＨＣＶがコードする抗原は、ｃ２２−３、ｃ２００、およびＮＳ５からなる群から選択される。
【００１２】
加えて、または代替として、一部の実施形態において、マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップ上の乾燥生体液サンプルは、指先穿刺を介して患者から収集される。特定の実施形態において、マイクロサンプリングデバイスは、ＭＩＴＲＡ（登録商標）チップである。乾燥生体液サンプルの溶出は、マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップを、リン酸緩衝食塩水および０．５％ＢＳＡを含む混合物と接触させることによって実行することができる。特定の実施形態において、乾燥生体液サンプルの溶出は、マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップを、リン酸緩衝食塩水および０．５％ＢＳＡを含む混合物と、室温で少なくとも２時間、または２〜８℃で一晩接触させることによって実行される。一部の実施形態において、マイクロサンプリングデバイスのサンプル体積は、３０μＬ以下、２５μＬ以下、２０μＬ以下、１５μＬ以下、または１０μＬ以下である。
【００１３】
一態様において、本発明の開示は、ＨＣＶ感染を阻害する治療剤での処置のために、肝炎の症状を示す患者を選択するための方法であって、（ａ）血液細胞からのリボ核酸の放出が起こる条件下で、乾燥血液サンプルを溶出させることであって、乾燥血液サンプルは、マイクロサンプリングデバイスを用いて患者から収集される、溶出させること；（ｂ）溶出させた乾燥血液サンプルから、リボ核酸を単離すること；（ｃ）単離したリボ核酸を逆転写して、複数のｃＤＮＡ：ＲＮＡハイブリダイゼーション複合体を生成すること；（ｄ）ｃＤＮＡ：ＲＮＡハイブリダイゼーション複合体を、ＨＣＶゲノムの５’ＵＴＲに特異的にハイブリダイズするプライマー対を用いて増幅して、蛍光標識されたＨＣＶアンプリコンを産生すること；（ｅ）工程（ｄ）で産生された蛍光標識されたＨＣＶアンプリコンを検出すること；および（ｆ）蛍光標識されたＨＣＶアンプリコンが検出される場合、ＨＣＶ感染を阻害する治療剤での処置のために患者を選択することを含む、方法を提供する。
【００１４】
加えて、または代替として、別の態様において、本発明の開示は、ＨＣＶ感染を阻害する治療剤での処置のために、肝炎の症状を示す患者を選択するための方法であって、（ａ）乾燥血液サンプルを、０．５％ＢＳＡを含む緩衝溶液を用いて溶出させることであって、乾燥血液サンプルは、マイクロサンプリングデバイスを用いて患者から収集される、溶出させること；（ｂ）溶出させた乾燥血液サンプルにおいて、少なくとも１つのＨＣＶがコードする抗原に対する抗ＨＣＶ抗体を検出すること；および（ｃ）抗ＨＣＶ抗体が検出される場合、ＨＣＶ感染を阻害する治療剤での処置のために患者を選択することを含む、方法を提供する。一部の実施形態において、少なくとも１つのＨＣＶがコードする抗原は、ｃ２２−３、ｃ２００、およびＮＳ５からなる群から選択される。一部の実施形態において、緩衝溶液は、リン酸緩衝食塩水をさらに含む。
【００１５】
上記実施形態のいずれかにおいて、ＨＣＶ感染を阻害する治療剤は、インターフェロンアルファコン−１、ペグ化および／または非ペグ化インターフェロンアルファ−２ｂ、ペグインターフェロンアルファ−２ａ、リバビリン、テラプレビル、ボセプレビル、ソホスブビル、シメプレビル、ダクラタスビル、ベルパタスビル、オムビタスビル、パリタプレビル、リトナビル、ダサブビル、レジパスビル、エルバスビル、ダノプレビル、グラゾプレビル、ＧＳ−７９７７、β−インターフェロン、γ−インターフェロン、アマンタジン、ならびに３ＴＣからなる群から選択される１種または複数の薬剤である。一部の実施形態において、マイクロサンプリングデバイスは、ＭＩＴＲＡ（登録商標）チップである。乾燥血液サンプル中に存在するＨＣＶの遺伝子型は、遺伝子型１ａ、遺伝子型１ｂ、遺伝子型２ａ、遺伝子型２ｂ、遺伝子型２ｃ、遺伝子型２ｄ、遺伝子型３ａ、遺伝子型３ｂ、遺伝子型３ｃ、遺伝子型３ｄ、遺伝子型３ｅ、遺伝子型３ｆ、遺伝子型４ａ、遺伝子型４ｂ、遺伝子型４ｃ、遺伝子型４ｄ、遺伝子型４ｅ、遺伝子型４ｆ、遺伝子型４ｇ、遺伝子型４ｈ、遺伝子型４ｉ、遺伝子型４ｊ、遺伝子型５ａ、および遺伝子型６ａからなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子型であり得る。
【００１６】
また、乾燥生体液サンプルにおけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の存在を検出するためのキットも本明細書で開示される。一部の実施形態において、キットは、マイクロサンプリングデバイス、溶解緩衝液、逆転写酵素、および任意選択でＨＣＶゲノムの５’ＵＴＲに特異的にハイブリダイズするプライマー対を含む。特定の実施形態において、キットは、ＨＣＶゲノムの５’ＵＴＲに特異的にハイブリダイズする検出可能に標識されたプローブを含む。
【００１７】
加えて、または代替として、一部の実施形態において、キットは、マイクロサンプリングデバイス、０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液、および抗ＨＣＶ一次抗体に特異的に結合する検出可能に標識された二次抗体を含む。特定の実施形態において、キットは、ｃ２２−３、ｃ２００、およびＮＳ５からなる群から選択される少なくとも１つのＨＣＶがコードする抗原でコーティングされたウェルを含む固体基層をさらに含む。
【００１８】
本発明の技術のキットの上記実施形態のいずれかにおいて、マイクロサンプリングデバイスは、ＭＩＴＲＡ（登録商標）チップである。
【００１９】
一態様において、本発明の開示は、乾燥生体液サンプルにおけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）を検出するための方法であって、マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップ（例えば、ＭＩＴＲＡ（登録商標）チップ）から溶解緩衝液を用いて溶出させた乾燥生体液サンプルから、ＨＣＶ  ＲＮＡを単離することを含む、方法を提供する。一部の実施形態において、ＨＣＶ  ＲＮＡは、逆転写およびリアルタイムＰＣＲを使用して検出される。特定の実施形態において、溶解緩衝液は、グアニジンイソチオシアネート、および任意選択でβ−メルカプトエタノールを含む。
【００２０】
別の態様において、本発明の開示は、乾燥生体液サンプルにおけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）を検出するための方法であって、マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップ（例えば、ＭＩＴＲＡ（登録商標）チップ）から０．５％ＢＳＡを含む緩衝溶液を用いて溶出させた乾燥生体液サンプルから、抗ＨＣＶ抗体を単離することを含む、方法を提供する。一部の実施形態において、緩衝溶液は、リン酸緩衝食塩水をさらに含む。特定の実施形態において、抗ＨＣＶ抗体は、ｃ２２−３、ｃ２００、およびＮＳ５からなる群から選択されるＨＣＶ抗原に結合する。抗ＨＣＶ抗体は、酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）を使用して検出してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、指先穿刺を介して１２人の患者からＭＩＴＲＡ（登録商標）チップ収集デバイス上に収集された乾燥血液サンプルにおけるＨＣＶ  ＲＮＡ検出と、従来の血液採取を使用して収集された同じ患者からの全血サンプルにおけるＨＣＶ  ＲＮＡ検出との一致を示す。
【図２】図２は、指先穿刺から回収されたＨＣＶと、血清から回収されたＨＣＶとの、回収されたウイルス負荷量の相関を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明の開示は、患者が、ＨＣＶを阻害する治療剤での処置によって利益を得るかどうかを決定するための方法を提供する。これらの方法は、マイクロサンプリングデバイスを使用して収集される少量の乾燥生体液サンプル中のＨＣＶ  ＲＮＡおよび／または抗ＨＣＶ抗体を検出することに基づく。本方法の実施において使用するためのキットも提供される。本明細書で開示される方法は、指先穿刺を介してＭＩＴＲＡ（登録商標）チップ収集デバイスを用いて得られた少量の乾燥生体液サンプル中の低いウイルス負荷量を検出することが可能である。さらに、ＭＩＴＲＡ（登録商標）チップから溶出させた乾燥生体液サンプル中のＨＣＶ  ＲＮＡは、指先穿刺を介した収集から１カ月後に溶出を実行した場合でも、安定なままであったことが決定された。本発明の技術の方法は、ＲＮＡ分解を予防するように、ＭＩＴＲＡ（登録商標）チップを、尿素、塩、キレート化剤、またはＲＮアーゼ阻害剤などの添加剤で事前処置することを必要としないため、この結果は予想外であった。
【００２３】
定義
別段の指定がない限り、本明細書において使用される全ての専門用語や科学用語は、本発明の技術が属する分野の当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で使用される場合、別段の指定がない限り、単数形「１つの〔a〕」、「１つの〔an〕」、および「その〔the〕」は、複数形の指示対象を包含する。したがって、例えば、「オリゴヌクレオチド〔an oligonucleotide〕」への言及は、複数のオリゴヌクレオチド分子を包含し、「核酸〔a nucleic acid〕」への言及は、１つまたは複数の核酸への言及である。
【００２４】
数値への言及における用語「約」は、本明細書で使用される場合、一般的に、別段の指定がない限り、または文脈からそうではないことが明白でない限り、その数値のいずれかの方向で（それより大きいかまたはそれより小さい方向で）１％〜１０％の範囲内に入る数値を包含すると解釈される。
【００２５】
対象への治療剤または薬物の「投与」は、本明細書で使用される場合、化合物を、その意図した機能を発揮させるために対象に導入または送達するあらゆる経路を包含する。投与は、経口、鼻腔内、非経口（静脈内、筋肉内、腹腔内、または皮下）、または局所などのあらゆる好適な経路によって行うことができる。投与は、自己投与および他者による投与を包含する。
【００２６】
核酸配列に関する用語「増幅する」または「増幅」は、本明細書で使用される場合、サンプル中の核酸配列の集団としてあるものを増加させる方法を指す。増幅反応においてインビトロで生成した特定の標的核酸配列のコピーは、「アンプリコン」または「増幅生成物」と呼ばれる。増幅は、指数関数的であってもよいし、または一次関数的であってもよい。標的核酸は、ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡなど）であってもよいし、またはＲＮＡであってもよい。後述される例示的な方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用した増幅に関するが、例えば等温法、ローリングサークル方法などの多数の他の方法が当業者周知である。当業者は、これらの他の方法が、ＰＣＲ方法の代わりに、またはそれと一緒に使用できることを理解するであろう。例えば、Ｓａｉｋｉ，“Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ”ｉｎ  ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ  １９９０，ｐｐ  １３−２０；Ｗｈａｒａｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９（１１）：Ｅ５４−Ｅ５４（２００１）を参照されたい。
【００２７】
用語「相補物」、「相補的」または「相補性」は、本明細書でポリヌクレオチド（すなわち、オリゴヌクレオチドまたは標的核酸などのヌクレオチドの配列）の言及において使用される場合、ワトソン／クリックの塩基対合ルールを指す。核酸配列の相補物は、本明細書で使用される場合、一方の配列の５’末端が他方の３’末端と対合するように核酸配列と並べた場合に「逆平行会合」の状態であるオリゴヌクレオチドを指す。例えば、配列「５’−Ａ−Ｇ−Ｔ−３’」は、配列「３’−Ｔ−Ｃ−Ａ−５’」に相補的である。本明細書に記載される核酸中に、天然に存在する核酸に一般的に見出されない特定の塩基が包含されていてもよい。そのようなものとしては、例えば、イノシン、７−デアザグアニン、ロックド核酸（ＬＮＡ）、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。相補性は必ずしも完全でなくてもよく、安定な二重鎖は、ミスマッチした塩基対、変性性の、またはマッチしない塩基を含有する場合もある。核酸技術分野の当業者は、例えば、オリゴヌクレオチドの長さ、オリゴヌクレオチドの塩基組成および配列、ミスマッチした塩基対のイオン強度および発生率などの可変値の数を経験的に検討して、二重鎖の安定性を決定することができる。また相補配列は、ＤＮＡ配列に相補的なＲＮＡ配列またはその相補配列であってもよいし、ｃＤＮＡであってもよい。
【００２８】
用語「実質的に相補的な」は、本明細書で使用される場合、２つの配列が、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを意味する。当業者は、実質的に相補的な配列が、必ずしもそれらの全長にわたりハイブリダイズしていなくてもよいことを理解するであろう。特に、実質的に相補的な配列は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列にハイブリダイズする隣接する塩基配列に対して３’または５’に位置する標的配列にハイブリダイズしない隣接する塩基配列を含んでいてもよい。
【００２９】
用語「検出すること」は、本明細書で使用される場合、サンプル中の標的ＨＣＶ核酸または標的ＨＣＶ抗原に特異的に結合する抗体の存在を決定することを指す。検出は、１００％の感度および／または１００％の特異性をもたらすための方法を必要としない。
【００３０】
「早期ウイルス陰性化〔early virologic response〕（ＥＶＲ）」は、本明細書で使用される場合、１２週間の療法後に、ＨＣＶ  ＲＮＡレベルにおける２ｌｏｇまたはそれより大きい減少、またはＨＣＶ  ＲＮＡの検出不可能なレベルが患者において観察されることを意味する。
【００３１】
用語「有効量」は、本明細書で使用される場合、所望の治療および／または予防作用を達成するのに十分な量を指し、例えば、ＨＣＶ感染またはＨＣＶ感染に関連する１つもしくは複数の症状の予防、またはそれらの減少をもたらす量を指す。治療または予防的適用の状況において、対象に投与される治療剤の量は、疾患のタイプおよび重症度、ならびに個体の特徴、例えば全身の健康状態、年齢、性別、体重および薬物耐性によって決まる。またこのような量は、疾患の程度、重症度およびタイプによっても決まる。当業者は、これらおよび他の要因に応じて適切な投薬量を決定できるであろう。治療薬物または薬剤の「治療有効量」は、本明細書で使用される場合、ＨＣＶ感染の生理学的作用が最低限でも改善されるレベルを意味する。治療有効量は、１回または複数の投与で与えることができる。
【００３２】
用語「抽出」または「単離」は、本明細書で使用される場合、サンプル中に存在する他の細胞性物質から核酸またはタンパク質を分離すると解釈されるあらゆる作用を指す。抽出または単離という用語は、機械的または化学的な溶解、界面活性物質またはプロテアーゼの添加、または他の細胞性物質の沈殿および除去を包含する。
【００３３】
用語「フルオロフォア」は、本明細書で使用される場合、特定の波長（励起周波数）で光を吸収し、その後より長い波長の光（放出周波数）を放出する分子を指す。用語「ドナーフルオロフォア」は、本明細書で使用される場合、クエンチャー部分に近接すると、放出エネルギーをクエンチャーに供与するまたは移動させるフルオロフォアを意味する。クエンチャー部分にエネルギーを供与する結果として、ドナーフルオロフォアそれ自体は、近接して位置するクエンチャー部分の非存在下で有する特定の放出周波数で、より少ない光を放出する。
【００３４】
用語「ハイブリダイズする」は、本明細書で使用される場合、２つの実質的に相補的な（少なくとも１４から２５ヌクレオチドのストレッチにわたり、少なくとも約６５％相補的な、少なくとも約７５％、または少なくとも約９０％相補的な）核酸鎖が適切にストリンジェントな条件下で互いにアニールして、相補的塩基対間の水素結合の形成を介して二重鎖またはヘテロ二重鎖を形成するプロセスを指す。ハイブリダイゼーションは、典型的には、さらに好ましくは、プローブの長さの核酸分子、好ましくは１５〜１００ヌクレオチドの長さ、より好ましくは１８〜５０ヌクレオチドの長さの核酸分子を用いて実行される。核酸ハイブリダイゼーション技術は当技術分野において周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．を参照されたい。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの強度（すなわち、核酸間の会合の強度）は、核酸間の相補性の程度、関与する条件のストリンジェンシー、および形成されたハイブリッドの熱融点（Ｔｍ）のような要因の影響を受ける。当業者は、少なくとも所望のレベルの相補性を有する配列が、安定してハイブリダイズするが、より低い相補性を有するものはハイブリダイズしないようなハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーをどのように推測し調整するかを理解している。ハイブリダイゼーション条件およびパラメーターの例については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｓｅｃａｕｃｕｓ，Ｎ．Ｊ．を参照されたい。一部の実施形態において、特異的なハイブリダイゼーションは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で起こる。標的核酸に特異的なオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド（例えば、プローブまたはプライマー）は、好適な条件下で標的核酸に「ハイブリダイズする」ことになる。
【００３５】
用語「個体」、「患者」、または「対象」は、本明細書で使用される場合、個々の生物、脊椎動物、哺乳動物、またはヒトであり得る。好ましい実施形態において、個体、患者または対象は、ヒトである。
【００３６】
「オリゴヌクレオチド」は、本明細書で使用される場合、主として規定の間隔の同一な単量体単位で構成される骨格上に核酸塩基の配列を有する分子を指す。塩基は、それらがオリゴヌクレオチドの塩基に相補的な塩基配列を有する核酸と結合できるような様式で骨格上に配置される。最も一般的なオリゴヌクレオチドは、糖リン酸単位の骨格を有する。２’位にヒドロキシル基を有さないオリゴデオキシリボヌクレオチドと、２’位にヒドロキシル基を有するオリゴリボヌクレオチドとは、区別することができる。またオリゴヌクレオチドは、ヒドロキシル基の水素が有機基、例えばアリル基で置き換えられた誘導体を包含する場合もある。プライマーまたはプローブとして機能するオリゴヌクレオチドは、一般的に、少なくとも約１０〜１５ヌクレオチドの長さ、または最大約７０、１００、１１０、１５０または２００ヌクレオチドの長さ、より好ましくは少なくとも約１５から２５ヌクレオチドの長さである。特定の標的核酸を特異的に増幅したり、または特異的に検出したりするためのプライマーまたはプローブとして使用されるオリゴヌクレオチドは、一般的に、標的核酸に特異的にハイブリダイズすることが可能である。
【００３７】
用語「プライマー」は、本明細書で使用される場合、標的核酸鎖に相補的なプライマーの伸長生成物の合成が誘導される条件下、すなわち、適切な緩衝液（「緩衝液」は、ｐＨ、イオン強度、補因子などを包含する）および好適な温度で、異なるヌクレオチド三リン酸およびポリメラーゼの存在下に配置された場合、核酸配列合成の開始点として作用することができるオリゴヌクレオチドを指す。プライマーのヌクレオチドの１つまたは複数は、例えばメチル基、ビオチンもしくはジゴキシゲニン部分、蛍光性タグの付加によって、または放射性ヌクレオチドを使用することによって修飾されていてもよい。プライマー配列は、必ずしもテンプレートの正確な配列を反映していなくてもよい。例えば、非相補的ヌクレオチド断片が、プライマーの５’末端に付着されており、プライマー配列の残りが、鎖に実質的に相補的であってもよい。本明細書で使用されるプライマーという用語は、合成することができるプライマーの全ての形態、例えばペプチド核酸プライマー、ロックド核酸プライマー、ホスホロチオエートで修飾されたプライマー、標識されたプライマーなどを包含する。用語「フォワードプライマー」は、本明細書で使用される場合、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）のアンチセンス鎖にアニールするプライマーを意味する。「リバースプライマー」は、ｄｓＤＮＡのセンス鎖にアニールする。
【００３８】
プライマーは、典型的には、少なくとも１０、１５、１８、または３０ヌクレオチドの長さ、または最大約１００、１１０、１２５、または２００ヌクレオチドの長さである。一部の実施形態において、プライマーは、好ましくは約１５から約６０ヌクレオチドの間の長さであり、最も好ましくは約２５から約４０ヌクレオチドの間の長さである。一部の実施形態において、プライマーは、１５から３５ヌクレオチドの長さである。最適なハイブリダイゼーションまたはポリメラーゼ連鎖反応増幅にとって標準的な長さはない。特定のプライマーの適用にとって最適な長さは、Ｈ．Ｅｒｌｉｃｈ，ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＡＮＤ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ  ＦＯＲ  ＤＮＡ  ＡＭＰＬＩＦＩＣＡＴＩＯＮ，（１９８９）に記載される方式で容易に決定することができる。
【００３９】
用語「プライマー対」は、本明細書で使用される場合、目的の核酸の所与の領域を増幅するのに一緒に使用できるフォワードプライマーとリバースプライマーとの対（すなわち、左側のプライマーと右側のプライマーとの対）を指す。
【００４０】
「プローブ」は、本明細書で使用される場合、ハイブリダイゼーションを介して標的核酸と相互作用する核酸を指す。プローブは、標的核酸配列に完全に相補的であってもよいし、または部分的に相補的であってもよい。相補性のレベルは、一般的にプローブの機能に基づく多くの要因によって決まる。プローブは、標識されていてもよいし、もしくは非標識でもよく、または当技術分野において周知の様々な方法のいずれかで修飾されていてもよい。プローブは、標的核酸に特異的にハイブリダイズすることができる。プローブは、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドであり得る。プローブは、オリゴヌクレオチド、人工染色体、断片化した人工染色体、ゲノム核酸、断片化したゲノム核酸、ＲＮＡ、組換え核酸、断片化した組換え核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸、環状の複素環のオリゴマー、または核酸のコンジュゲートであり得る。プローブは、修飾された核酸塩基、修飾された糖部分、および修飾されたインターヌクレオチド結合を含んでいてもよい。プローブは、典型的には、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７５、１００ヌクレオチドの長さであるか、またはそれより長い。
【００４１】
用語「クエンチャー部分」は、本明細書で使用される場合、ドナーフルオロフォアに近接すると、ドナーによって生成した放出エネルギーを吸収し、エネルギーを熱として放散させるか、またはドナーの発光波長より長い波長の光を放出するかのいずれかである分子を意味する。後者の場合、クエンチャーは、アクセプターフルオロフォアであるとみなされる。消光部分は、近位の（すなわち衝突）消光を介して、またはフォースターまたは蛍光共鳴エネルギー移動（「ＦＲＥＴ」）によって作用し得る。ＦＲＥＴによる消光は、一般的に、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブで使用されるが、近位の消光は、分子ビーコンおよびＳｃｏｒｐｉｏｎ（商標）タイプのプローブで使用される。
【００４２】
「迅速ウイルス陰性化〔rapid viral response〕（ＲＶＲ）」は、本明細書で使用される場合、４週間の療法後に、患者において検出不可能なレベルのＨＣＶ  ＲＮＡが観察されることを意味する。
【００４３】
用語「サンプル」は、本明細書で使用される場合、患者または単離された微生物から得られた臨床サンプルを指す。好ましい実施形態において、サンプルは、対象から収集される組織、体液、または微生物などの生物学的な源から得られる（すなわち、「生体サンプル」）。サンプル源としては、これらに限定されないが、粘液、痰（処理済みまたは未処理）、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）、気管支洗浄液（ＢＷ）、血液、体液、髄液（ＣＳＦ）、尿、血漿、血清、または組織（例えば、生検材料）が挙げられる。好ましいサンプル源としては、指先穿刺による全血が挙げられる。
【００４４】
用語「感度」は、本明細書で本発明の技術の方法への言及において使用される場合、配列のヘテロジニアスな集団中で予め選択された配列バリアントを検出する方法の能力の尺度である。予め選択された配列バリアントがサンプル中の配列の少なくともＦ％として存在するサンプルと仮定して、方法が、予め選択されたＣ％の信頼性、時間のＳ％で予め選択された配列を検出することができる場合、その方法は、Ｆ％のバリアントに対してＳ％の感度を有する。一例として、予め選択されたバリアント配列がサンプル中の配列の少なくとも５％として存在するサンプルと仮定して、方法が、予め選択された９９％の信頼性、１０回のうち９回（Ｆ＝５％；Ｃ＝９９％；Ｓ＝９０％）で予め選択された配列を検出することができる場合、その方法は、５％のバリアントに対して９０％の感度を有する。例示的な感度としては、少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９８、および９９％が挙げられる。
【００４５】
用語「特異的な」は、本明細書でオリゴヌクレオチドプライマーへの言及において使用される場合、オリゴヌクレオチドと核酸とを並べたときに、プライマーのヌクレオチド配列が、増幅しようとする核酸の一部と少なくとも１２塩基の配列同一性を有することを意味する。核酸に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーは、ストリンジェントなハイブリダイゼーションまたは洗浄条件下で、目的の標的にハイブリダイズできるが、目的ではない核酸に実質的にハイブリダイズしないものである。より高いレベルの配列同一性が好ましく、例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも８５〜９５％であり、より好ましくは、少なくとも９８％の配列同一性である。配列同一性は、市販のコンピュータープログラムを、当技術分野において周知のアルゴリズムを採用するデフォルト設定で使用して決定することができる。「高い配列同一性」を有する配列は、本明細書で使用される場合、並べられたヌクレオチド位置の少なくとも約５０％、好ましくは並べられたヌクレオチド位置の少なくとも約６０％、より好ましくは並べられたヌクレオチド位置の少なくとも約７５％に、同一なヌクレオチドを有する。
【００４６】
「特異性」は、本明細書で使用される場合、実際に存在する予め選択された配列バリアントを、シーケンシングアーティファクトまたは他の密接に関連した配列から区別する方法の能力の尺度である。これは、偽陽性検出を回避する能力である。偽陽性検出は、サンプル調製中に目的の配列に導入されたエラー、シーケンシングのエラー、または偽遺伝子もしくは遺伝子ファミリーのメンバーのような密接に関連した配列の不注意なシーケンシングに起因する可能性がある。ＸＴｒｕｅ種の配列が実際にバリアントであり、ＸＮｏｔ  ｔｒｕｅ種が実際にバリアントではない、ＮＴｏｔａｌ種の配列のサンプルセットに適用されたとき、方法が、実際にバリアントではないものの少なくともＸ％をバリアントではないとして選択する場合、その方法は、Ｘ％の特異性を有する。例えば、５００種の配列が実際にバリアントであり、５００種が実際にバリアントではない、１，０００種の配列のサンプルセットに適用されたとき、方法が、５００種の実際にバリアント配列ではないものの９０％をバリアントではないとして選択する場合、その方法は、９０％の特異性を有する。例示的な特異性としては、少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９８、および９９％が挙げられる。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「特異的に結合する」は、別の分子（例えば、標的ＨＣＶ抗原）を認識しそれと結合するが、他の分子を実質的に認識したりそれと結合したりしない分子（例えば、抗ＨＣＶ抗体）を指す。特定の分子（例えば、標的ＨＣＶ抗原）への「特異的な結合」、それに「特異的に結合する」、またはそれに「特異的な」という用語は、本明細書で使用される場合、例えば、分子が、それに結合する分子に関して、少なくとも約１０−４Ｍ、１０−５Ｍ、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍの、またはそれより大きいＫｄを有することによって示すことができる。
【００４８】
用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、本明細書で使用される場合、以下：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ６．８、０．５％ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍＬの超音波破砕したサケ精子ＤＮＡ、および５×デンハルト溶液中での、４２℃で一晩のハイブリダイゼーション；２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを用いた、４５℃での洗浄；および０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを用いた、４５℃での洗浄と、少なくとも同程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を指す。別の例において、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、２０個の隣接するヌクレオチドのストレッチにわたり２つより多くの塩基が異なる、２つの核酸のハイブリダイゼーションを許容しないはずである。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「持続的ウイルス陰性化〔sustained virologic response〕（ＳＶＲ）」は、治療レジメンの終了から２４週間の後に、患者において検出不可能なレベルのＨＣＶ  ＲＮＡが観察されることを意味する。
【００５０】
「ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲ検出システム」は、本明細書で使用される場合、リアルタイムＰＣＲのための方法を指す。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、プローブのどちらかの末端に、ドナーの蛍光がクエンチャーによって吸収されるように十分互いに近接してドナーおよびクエンチャーフルオロフォアを含む。しかしながら、プローブが増幅したセグメントにハイブリダイズする場合、Ｔａｑポリメラーゼの５’−エキソヌクレアーゼ活性は、プローブを切断し、それによってドナーフルオロフォアが検出可能な蛍光を放出することを可能にする。
【００５１】
用語「標的核酸」または「標的配列」は、本明細書で使用される場合、分析しようとするサンプル中の、検出および／または定量化しようとする目的の核酸配列を指す。標的核酸は、染色体のセグメント、遺伝子間配列を有するまたは有さない完全な遺伝子、遺伝子間配列を有するまたは有さない遺伝子のセグメントもしくは一部、またはプローブまたはプライマーが設計される核酸の配列で構成されていてもよい。標的核酸としては、野生型配列、変異、欠失、挿入もしくは重複、タンデムリピートエレメント、目的の遺伝子、目的の遺伝子の領域、またはそれらのあらゆる上流もしくは下流の領域を挙げることができる。標的核酸は、特定の遺伝子の代替配列または対立遺伝子を表す場合もある。標的核酸は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡから誘導されたものでもよい。
【００５２】
ＨＣＶ
ＨＣＶビリオンは、約３，０１０アミノ酸のポリタンパク質をコードする約９６００塩基のゲノム配列を有するフラビウイルス科に属するエンベローププラス鎖ＲＮＡウイルスである。感染細胞において、ポリタンパク質は、細胞およびウイルスのプロテアーゼによって複数の部位で切断されて、構造および非構造（ＮＳ）タンパク質を産生する。ＨＣＶのタンパク質生成物としては、構造タンパク質Ｃ、Ｅ１、およびＥ２、ならびに非構造タンパク質ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ＡおよびＮＳ４Ｂ、ならびにＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂが挙げられる。
【００５３】
非構造（「ＮＳ」）タンパク質は、ウイルス複製のための触媒機構を提供すると考えられる。ＨＣＶのケースにおいて、成熟非構造タンパク質（ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、およびＮＳ５Ｂ）の生成は、２つのウイルスプロテアーゼによって実行される。第１のプロテアーゼは、ＮＳ２−ＮＳ３ジャンクションで切断を行い、第２のプロテアーゼは、ＮＳ３のＮ末端領域内に含有されるセリンプロテアーゼ（以降、ＮＳ３プロテアーゼと称される）であり、それに続く全てのＮＳ３下流の切断を媒介し、どちらもＮＳ３−ＮＳ４Ａ切断部位ではシス、残りのＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ、ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ、ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂ部位ではトランスの形態である。
【００５４】
ＮＳ４Ａタンパク質は、複数の機能を担うと考えられ、ＮＳ３プロテアーゼの補因子として作用し、場合によってはＮＳ３および他のウイルスレプリカーゼ要素の膜局在化を補助する。ＮＳ３タンパク質とＮＳ４Ａとの複合体形成は、あらゆる場所でタンパク質分解効率を強化するプロセシング事象に必要のようである。またＮＳ３タンパク質は、ヌクレオシドトリホスファターゼおよびＲＮＡヘリカーゼ活性も呈する。ｃ２００タンパク質は、ＨＣＶゲノムの推定のＮＳ３およびＮＳ４領域によってコードされる。
【００５５】
ＮＳ５Ｂは、ＨＣＶ複製に関与するＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである。ＨＣＶ  ＮＳ５Ｂポリメラーゼは、ＨＣＶの複製サイクルにおけるテンプレートとして役立つ一本鎖ウイルスＲＮＡからの二本鎖ＲＮＡの合成に必要である。それゆえに、ＮＳ５Ｂポリメラーゼは、ＨＣＶ複製複合体における必須の要素とみなされる。（Ｋ．Ｉｓｈｉ，ｅｔ  ａｌ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２９：１２２７−１２３５（１９９９）；Ｖ．Ｌｏｈｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２４９：１０８−１１８（１９９８））。ｃ２２−３タンパク質は、ＨＣＶゲノムの推定のコア領域によってコードされる。
【００５６】
本発明の技術の方法で採用されるマイクロサンプリングデバイス
従来の乾燥血液のスポット技術は、不正確なサンプル体積や、一定のサンプル粘度への依存（すなわち、サンプルがサンプルカード上に均一に塗り広げられるという見込み）などの多数の欠点が付随する。カード上に等しい体積サンプルが投与される場合、粘度が一定であれば、血液スポットの直径は一定のままになる。しかしながら、粘度は、血液中のヘマトクリット（ＨＣＴ）またはパック細胞容積（ＰＣＶ）レベルが異なるために、血液サンプル間で顕著に変動する。高いヘマトクリットレベルを有するサンプルは、血液スポット紙上により小さい直径のスポットを形成することから、サンプリングしたスポットの固定した直径内に異なる濃度の血液をもたらす。ＰＣＶレベルは、スポット直径において約４５％の変動を示すと考えられる。内部標準はスポットされた血液上に噴霧されるため、これは、定量化において４５％のエラーを引き起こす可能性がある。本明細書で開示された方法で採用されるマイクロサンプリングデバイスは、より正確な血液体積を回収できること、ヘマトクリットの偏りがないこと、および実験室での処理のために標準的な液体を取り扱う者でも簡単に自動化できる能力などの数々の利点を付与する。
【００５７】
加えて、従来の血液スポット技術は、開示されたマイクロサンプリングデバイスと比べて比較的大量の血液を必要とする。乾燥血液スポットは、一般的に、スポット１つ当たり５０〜７５μｌを必要とするが、マイクロサンプリングデバイスは、およそ２０μｌから結果を得ることができる。乾燥血液スポットはしばしば、ウイルス負荷量を検出する場合、血漿などの他のサンプルタイプと比較して性能が一定しない問題を有すること（Ｐａｎｎｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，９５：４８（ｅ５４７５）（２０１６））、さらに、特定のタイプの評価（例えば、光学密度）の場合、乾燥血液スポットの体積を、血清などの他のサンプルタイプと比較して著しく多くする必要性がある場合があること（Ｂｒａｎｄａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｖｉｒｏｌ．，５７：９８−１０２（２０１３））が当技術分野において認識されている。実際に、抗レトロウイルス剤療法を受けているＨＩＶ患者においてウイルス負荷量および処置の失敗を検出するための乾燥血液スポットと血漿スポットの両方のスクリーニングを使用したところ、どちらも高い割合の偽陽性を生じたことが見出された（Ｓａｗａｄｏｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５２（１１）：３８７８−８３（２０１４））。
【００５８】
本発明の技術の方法において有用なマイクロサンプリングデバイスは、遠位端および近位端を有する吸収性チップを含む。吸収性チップの遠位端の幅は、近位端の幅と比較して狭い。近位端は、ホルダーに取り付けられ、それに対して遠位端は、血液などの吸収させようとする流体と接触するように設計される。マイクロサンプリングデバイスは、血液などの生体液サンプルを、容易に乾燥させ、輸送し、次いで後で分析することを可能にする。特定の実施形態において、生体液は、指先穿刺による血液である。
【００５９】
吸い上げ作用により、血液は吸収性チップに吸い込まれる。吸収性チップとホルダーとの間に任意選択の障壁があってもよく、それにより血液がホルダーに通過したりまたは吸い上げられたりすることを防ぐ。吸収性チップは、過量の流体が利用可能であっても、実質的に同じ体積の流体を吸い上げる材料で構成される（容量測定式の吸収性マイクロサンプリングまたはＶＡＭＳ（商標））。吸収性チップの体積は、吸収された流体の体積に影響を与える。吸収性チップのサイズおよび形状は、吸収される血液の体積および吸収の速度を調整するために、変更することができる。約７〜１５μＬ、約２０μＬ、さらには最大約３０μＬもの血液体積を受け入れることができる。サンプリング時間は、約２秒、約３秒、約５秒、または最大約１０秒であり得る。
【００６０】
一部の実施形態において、吸収性チップに使用される材料は、親水性である（例えば、ポリエステル）。代替として、材料は、最初のうちは疎水性であってもよく、その後、それを親水性になるように処理してもよい。疎水性マトリックスは、様々な公知の方法、例えばマトリックスのプラズマ処理または界面活性剤処理（例えば、Ｔｗｅｅｎ−４０またはＴｗｅｅｎ−８０）によって親水性にすることができる。一部の実施形態において、プラズマ処理は、ポリオレフィン、例えばポリエチレンなどの疎水性材料を親水性にするのに使用される。代替として、表面への親水性ポリマーのグラフト化、および糖などの極性または親水性分子での表面上の活性基の化学的官能化が、吸収性チップのために親水性表面を達成するのに使用することができる。また共有結合による改変も、吸収性チップの表面に極性または親水性官能基を付加するのに使用することができる。
【００６１】
一部の実施形態において、マイクロサンプリングデバイスは、約２〜５秒で最大約２０μＬの血液を吸収するのに十分なサイズを有し、約５ｍｍ（０．２インチ）未満の長さ、および約２０ｍｍ２未満の断面積、および約４ｇ／ｃｃ未満の密度を有する、親水性のポリマー性材料で作製された吸収性チップを含む。一部の実施形態において、吸収性チップは、ポリエチレンで構成され、好ましくは１〜７秒以内、より好ましくは約１〜５秒以内に約１〜２０マイクロリットルの血液を吸収するように設計される。吸収性チップは、乾燥血液、または内部標準の１つまたは複数を含有していてもよい。
【００６２】
特定の実施形態において、吸収性チップは、約３５ｍｍ３の体積を有し、約３秒で約１３〜１４マイクロリットルの血液を吸収し、約２．５秒で９〜１０マイクロリットルの血液を吸収し、約３８％の細孔容積を有する。他の実施形態において、吸収性チップは、約２４マイクロリットルの体積、約０．６ｇ／ｃｃの密度を有し、約２．５秒で約１０マイクロリットルの血液を吸収し、約４０％の細孔容積を有する。一部の実施形態において、マイクロサンプリングデバイスは、参照によりその全体が本明細書に組み入れられるＵＳ２０１３／０１１６５９７に記載されるようなＭＩＴＲＡ（登録商標）チップである。
【００６３】
吸収性チップは、狭く丸い遠位端を有する円錐台に似た外形に成形されてもよい。一部の実施形態において、ホルダーは、吸収性チップの中心内部の凹部にはまり、吸収性チップとホルダーの縦軸に沿って伸びる円筒状の柱を有する。吸収性チップの円錐型の形状は、サンプルを迅速かつ均一に吸い上げることを助ける。
【００６４】
ホルダーは、ピペットとの使用に適合させることができる。一部の実施形態において、管状の円錐型の形状のホルダーが好ましく、吸収性チップは、ホルダーの狭い末端上にある。ホルダーのより幅広な逆の末端は、閉じていてもよいし、または開いていて中空であってもよく、任意選択で、ピペットチップに取り付けられるように設計されていてもよい。ホルダーは、外側に伸長するフランジを有していてもよく、このようなフランジは、ホルダー、乾燥棚または試験器具中の合わせ構造を突き合わせて、このようなホルダー、乾燥棚および試験器具中の所望の位置に吸収性チップを位置決めするのを助けるように配置される。
【００６５】
特定の実施形態において、ホルダーは、ピペットチップ、またはピペットチップと入れ子になるように設計された先細の管状構造を包含していてもよい。吸収性チップは、ポリエチレンで構成されていてもよく、吸収性チップとホルダーはどちらも、無菌条件下で作製されるか、または最後に滅菌される。吸収性チップは、乾燥抗凝血剤を含有していてもよい。一部の実施形態において、ホルダーは、ホルダーの長さに沿って伸長する複数のリブを有する。リブは、輸送のために、または吸収性チップ中の乾燥血液の抽出のために、吸収性チップが、ホルダーおよび吸収性チップが設置されている凹部の壁と接触することを防ぐように選択された高さおよび長さを有していてもよい。
【００６６】
少量のサンプルを吸収した後、吸収性チップを乾燥させる。一部の実施形態において、少量の血液サンプルは、少なくとも１０分、少なくとも２０分、少なくとも３０分、少なくとも４０分、少なくとも５０分、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも６時間、少なくとも８時間、少なくとも１２時間、少なくとも１６時間、少なくとも２０時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、または少なくとも９６時間、または少なくとも１週間、または少なくとも２週間、または少なくとも３週間、または少なくとも４週間、または少なくとも１カ月、周囲温度または室温で乾燥させる。特定の実施形態において、少量の血液サンプルは、約２〜３時間乾燥させる。
【００６７】
乾燥は、好適な棚またはホルダー上で行ってもよいし、または好ましくは、吸収性チップおよびホルダーは、吸収性チップと乾燥容器の壁または他の可能性のある汚染物質表面との接触を最小化しながら、乾燥を促進するように設計された特殊な乾燥容器に移してもよい。乾燥容器は、乾燥を促進するために、乾燥剤を有していてもよい。また乾燥容器は、汚染を防ぐために、運送のために密封できる保護カバーを備えていてもよい。一部の実施形態において、カバーは、表面を有し、その上に、乾燥血液サンプルの源を識別し、他の関連情報を提供するために、印刷された表示が記載されていてもよい。一部の実施形態において、容器の寸法、および容器内のホルダーの相対的な位置は、ＳＢＳ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌのプレートの仕様に従うものとする。マイクロサンプリングデバイスおよび乾燥容器は、乾燥を助けるために乾燥剤と共にプラスチックバッグ中に入れてもよく、さらに、この様式で輸送されるか、または乾燥剤を除去した後に輸送されるかのいずれでもよい。
【００６８】
一部の実施形態において、ホルダーのより幅広な逆の末端は、中空であり、容器は、ホルダーの中空の末端にはまり、取り外し可能にかみ合う大きさの、据え付けの突出部分を有する第１の部分を有する。加えて、または代替として、容器は、第１の部分に取り外し可能に留められた第２の部分を有し、さらに、ホルダーの運送のために、ホルダーの一部を内包するように設計された凹部を有する。容器は、空気をマイクロサンプリングデバイスの吸収性チップと接触させる複数の開口部を含んでいてもよい。さらに、第１の部分は、その中にアクセスポートを有する面を有していてもよく、このような面は、ポート全体に、さらにホルダーが据え付けの突出部上にある場合はホルダー上に表示を適用できるように、十分なサイズを有し、そのように配置される。
【００６９】
吸収性チップは、試験場所で受け取ったら、手作業かまたは自動化手段を介するかのいずれかで、予め決定された体積の好適な緩衝液（本明細書に記載されるように）中で溶出させて、乾燥血液から目的の核酸またはタンパク質を抽出することができる。流体および／または吸収性チップの物理的なかき混ぜ技術、例えば超音波破砕またはボルテックス混合は、乾燥血液から液体サンプルマトリックスへの抽出プロセスを促進することができる。さらなる分析のためのサンプルマトリックスをさらに簡易化にするために、物理的な分離技術、例えば遠心分離、蒸発／再溶解、濃縮、沈殿、液体／液体抽出、および固相抽出を使用することができる。
【００７０】
各容器が複数のホルダーを内包していてもよく、その場合、各ホルダーは、その遠位端に吸収性チップを含み、中空の近位端を有する。容器は同様に、それぞれ複数のホルダーの中空の末端にはまり、取り外し可能にかみ合う大きさの、複数の細長い据え付けの突出部を有する。容器の第２の部分は、容器内の別々の囲いの中に、複数のホルダーのそれぞれを別々に内包するように設計された凹部を有する。特定の実施形態において、複数のホルダーのそれぞれは、ホルダーの長さに沿って伸長する複数のリブを有し、リブは、吸収性チップが容器の壁と接触することを防ぐように設計されている。要求に応じて、吸収性チップ中の血液の乾燥または乾燥の維持を助けるために、容器の内部に乾燥剤が入れられていてもよい。各ホルダーは、シリアルナンバーなどの、ホルダーを容器や少なくとも１つの他のホルダーと関連付ける可視的な表示を有していてもよく、シリアルナンバーの様々な部分は、関連するホルダー／吸収性チップおよびその中にホルダーを輸送する容器を示す。
【００７１】
リアルタイムＰＣＲ
標的核酸（例えば、ＨＣＶ  ＲＮＡ）の増幅は、ゲル電気泳動、カラムクロマトグラフィー、プローブを用いるハイブリダイゼーション、シーケンシング、融解曲線分析、または「リアルタイム」検出などの、当技術分野において周知の多数の方法のいずれかによって検出することができる。
【００７２】
リアルタイム検出に関して、プライマーおよび／またはプローブは、例えば、プライマーが取り込まれた状態になるか、またはプローブがハイブリダイズして、反応中に蛍光の変化をモニターすることが可能な機器で増幅されると、蛍光の差が生じるように検出可能に標識されていてもよい。核酸増幅のためのリアルタイム検出方法は周知であり、そのようなものとしては、例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）システム、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（商標）プライマーシステムおよび二本鎖核酸のためのインターカレート色素の使用が挙げられる。
【００７３】
リアルタイム定量ＰＣＲにおいて、増幅生成物の蓄積は、標的ＤＮＡ標準希釈液と未知量の標的ＤＮＡを含有するサンプルの両方において連続的に測定される。標準曲線は、標準サンプル中の最初のテンプレート濃度を、生成物の具体的な閾値濃度を産生するのに必要なＰＣＲ（商標）サイクルの数（Ｃｔ）と相関させることによって構築される。試験サンプルにおいて、ｔａｒｇｅｔ  ＰＣＲ（商標）生成物の蓄積を、同じＣｔの後に測定することにより、標準曲線からの標的ＤＮＡ濃度の補間が可能になる。
【００７４】
一部の実施形態において、増幅した核酸は、特異的なプローブを用いたハイブリダイゼーションによって検出される。増幅した標的配列の一部に相補的なプローブオリゴヌクレオチドを使用して、増幅した断片を検出することができる。一部の実施形態において、ハイブリダイゼーションは、リアルタイムで検出してもよい。代替の実施形態において、ハイブリダイゼーションは、リアルタイムで検出されない。標的配列のそれぞれにつき増幅した核酸は、同時に（すなわち、マルチプレックスＰＣＲなどの同じ反応容器中で）または個々に（すなわち、別々の反応容器で）検出してもよい。特定の実施形態において、複数の標的核酸が、２つ以上の区別可能に標識された（例えば、色などの異なる検出可能な部分を介して）遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用して同時に検出され、このようなプローブの一方は、第１の標的配列にハイブリダイズし、他方は、第２の標的配列にハイブリダイズする。
【００７５】
一部の実施形態において、異なるプライマー対は、異なる区別可能な検出可能な部分で標識される。したがって、マルチプレックスＰＣＲにおいて、例えばＨＥＸおよびＦＡＭ蛍光色素が異なるプライマー対に存在し、得られたアンプリコンと会合される。他の実施形態において、フォワードプライマーは、１つの検出可能な部分で標識され、一方でリバースプライマーは、異なる検出可能な部分で標識され、例えば、フォワードプライマーはＦＡＭ色素で、リバースプライマーはＨＥＸ色素で標識される。異なる検出可能な部分の使用は、同じ長さを有するかまたは長さが非常に類似している増幅生成物を識別するのに有用である。
【００７６】
配列が改変された核酸の場合、標的は、独立して上の鎖または下の鎖から選択してもよい。したがって、検出しようとする全ての標的は、上の鎖、下の鎖、または上の鎖および下の鎖の標的の組合せを含んでいてもよい。
【００７７】
リアルタイムＰＣＲの１つの一般的な方法は、蛍光性のプローブ、例えばＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ、分子ビーコン、およびＳｃｏｒｐｉｏｎプライマー−プローブを使用する。リアルタイムＰＣＲは、最終的な増幅した生成物の量を検出する他の形態の定量ＰＣＲより高い特異性、感度および再現性で、テンプレートの最初の量を定量化する。リアルタイムＰＣＲは、アンプリコンのサイズを検出しない。Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（商標）およびＴａｑＭａｎ（登録商標）技術で採用されるプローブは、蛍光消光の原理に基づいており、ドナーフルオロフォアおよび消光部分を含む。
【００７８】
リアルタイムＰＣＲは、ＰＣＲ増幅生成物の蓄積を検出することが可能なあらゆる好適な機器を使用して実行される。このような機器は、最も一般的には、１つまたは複数の蛍光標識からの蛍光を検出することが可能である。例えば、このような機器（例えば、ＡＢＩ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ７５００（登録商標）配列検出器）でのリアルタイム検出は、蛍光をモニターし、各ＰＣＲサイクル中にレポーターシグナルの測定値またはＲｎ値を計算する。閾値サイクル、またはＣｔ値は、蛍光が閾値と交差するサイクルである。閾値は、配列検出システムソフトウェアで決定してもよいし、または手動で決定してもよい。
【００７９】
一部の実施形態において、採用されたプローブは、検出可能に標識され、検出は、各増幅生成物につきプローブ標識を検出することによって達成される。クエンチャーは、プローブの標的が増幅される前に標識が検出されることを防ぐ検出可能な標識とさらに会合していてもよい。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、このようなプローブの例である。
【００８０】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ（Ｈｅｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．６：９８６−９９４，１９９６）は、Ｔａｑポリメラーゼの蛍光を発生させる５’エキソヌクレアーゼ活性を使用して、ＤＮＡサンプル中の標的配列の量を測定する。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、通常５’塩基またはその近くにあるドナーフルオロフォアと、典型的には３’塩基またはその近くにある消光部分とを含有するオリゴヌクレオチドである。クエンチャー部分は、ＴＡＭＲＡなどの色素であってもよいし、または４−（４−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）などの非蛍光分子であってもよい。Ｔｙａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，１６  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４９−５３（１９９８）を参照されたい。照射されると、励起された蛍光性のドナーは、蛍光を発するのではなく、ＦＲＥＴによってエネルギーをすぐ近くの消光部分に移動させる。したがって、ドナーとクエンチャーとが近接すると、ドナー蛍光の放出が防がれ、同時にプローブは無傷のままとなる。
【００８１】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、ＰＣＲ生成物の内部領域にアニールするように設計される。ポリメラーゼが、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブが結合しているテンプレートを複製すると、その５’エキソヌクレアーゼ活性によってプローブが切断される。それによりクエンチャー（ＦＲＥＴではない）の活性を終わらせ、ドナーフルオロフォアは蛍光を放出し始め、この蛍光はプローブ切断の速度に比例して各サイクルで増加する。ＰＣＲ生成物の蓄積は、レポーター色素の蛍光の増加をモニターすることによって検出される。クエンチャーがアクセプターフルオロフォアである場合、ＰＣＲ生成物の蓄積は、アクセプターフルオロフォアの蛍光の減少をモニターすることによって検出することができる。
【００８２】
特定の実施形態において、リアルタイムＰＣＲは、二官能性プライマー−プローブ検出システム（例えば、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（商標）プライマー）を使用して実行される。Ｓｃｏｒｐｉｏｎプライマーでは、配列特異的なプライミングおよびＰＣＲ生成物の検出は、単一分子を使用して達成される。Ｓｃｏｒｐｉｏｎプライマーは、ハイブリダイズしていない状況でステム−ループ立体配置を維持する。フルオロフォアは５’末端に付着し、３’末端とカップリングした部分によって消光されるが、特定の実施形態において、この配置は交換されていてもよい。またステムおよび／またはループの３’部分は、プライマーの伸長生成物に相補的な配列も含有し、増幅不可能な単量体を介して特異的なプライマーの５’末端に連結される。プライマー部分の伸長後、特異的なプローブ配列は、伸長したアンプリコン内でその相補物に結合することができ、そのようにしてヘアピンループを開くことができる。それによって蛍光が消光されることを防ぎ、シグナルが観察される。特異的な標的は、リバースプライマーおよびＳｃｏｒｐｉｏｎ（商標）プライマーのプライマー部分によって増幅され、結果として伸長生成物が生じる。蛍光シグナルは、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（商標）プライマーのプローブエレメントが伸長生成物に結合することによって起こる、クエンチャーからのフルオロフォアの分離によって生成する。
【００８３】
一部の実施形態において、開示された方法で採用されるプローブは、遺伝学的変異を有するＤＮＡ配列のセクションを検出するように設計された、短い蛍光標識したＤＮＡ配列を含むかまたはそれからなり、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み入れられるＦｒｅｎｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｂｅｓ，５（６）：３６３−７４（２００１）で開示されたものなどである。ＨｙＢｅａｃｏｎｓ（登録商標）は、このタイプのプローブの例である。
【００８４】
本方法の一部の実施形態において、増幅反応における各プライマー対の少なくとも１つのプライマーまたは少なくとも１つのプローブは、検出可能な部分を含む。代替として、検出可能な部分は、プライマーに付着した、例えばプライマー−プローブの形態でプローブ上にあってもよい。一部の実施形態において、検出可能な部分または標識は、フルオロフォアである。好適な蛍光性の部分としては、これらに限定されないが、以下のフルオロフォア：４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’ジスルホン酸、アクリジンおよび誘導体（アクリジン、アクリジンイソチオシアネート）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ））、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、４−アミノ−Ｎ−［３−ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド−３，５ジスルホネート（ルシファーイエローＶＳ）、Ｎ−（４−アニリノ−１−ナフチル）マレイミド、アントラニルアミド、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）Ｒ−６Ｇ、ＢＯＰＩＰＹ（登録商標）５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ、ブリリアントイエロー、Ｃａｌ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ  ６１０（登録商標）（ＣＦＲ６１０）、クマリンおよび誘導体（クマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ、クマリン１２０）、７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（クマリン１５１））、Ｃｙ２（登録商標）、Ｃｙ３（登録商標）、Ｃｙ３．５（登録商標）、Ｃｙ５（登録商標）、Ｃｙ５．５（登録商標）、シアノシン、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、５’，５”−ジブロモピロガロール−スルホンフタレイン（ブロモピロガロールレッド）、７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリン、ジエチレントリアミン五酢酸、４，４’−ジイソチオシアナトジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸、４，４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸、５−［ジメチルアミノ］ナフタレン−１−スルホニルクロリド（ＤＮＳ、ダンシルクロリド）、４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）、Ｅｃｌｉｐｓｅ（商標）（Ｅｐｏｃｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．）、エオシンおよび誘導体（エオシン、エオシンイソチオシアネート）、エリスロシンおよび誘導体（エリスロシンＢ、エリスロシンイソチオシアネート）、エチジウム、フルオレセインおよび誘導体（５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、２’，７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネ��ト（ＦＩＴＣ）、ヘキサクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＨＥＸ）、ＱＦＩＴＣ（ＸＲＩＴＣ）、テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、フルオレサミン、ＩＲ１４４、ＩＲ１４４６、ランタニド系蛍光体、マラカイトグリーンイソチオシアネート、４−メチルウンベリフェロン、オルトクレゾールフタレイン、ニトロチロシン、パラローズアニリン、フェノールレッド、Ｂ−フィコエリトリン、Ｒ−フィコエリトリン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルジアルデヒド、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）、ヨウ化プロピジウム、ピレンおよび誘導体（ピレン、ピレンブチレート、スクシンイミジル１−ピレンブチレート）、ＱＳＹ（登録商標）７、ＱＳＹ（登録商標）９、ＱＳＹ（登録商標）２１、ＱＳＹ（登録商標）３５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、リアクティブレッド４（Ｃｉｂａｃｒｏｎ（登録商標）ブリリアントレッド３Ｂ−Ａ）、ローダミンおよび誘導体（６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、リサミンローダミンＢスルホニルクロリド、ローダミン（Ｒｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミングリーン、ローダミンＸイソチオシアネート、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１、スルホローダミン１０１の塩化スルホニル誘導体（テキサスレッド）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、テトラメチルローダミン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、リボフラビン、ロゾール酸、テルビウムキレート誘導体、Ｑｕａｓａｒ  ６７０（登録商標）、ならびにＶＩＣ（登録商標）が挙げられる。
【００８５】
好適なクエンチャーは、特定のフルオロフォアの蛍光スペクトルに基づき選択される。有用なクエンチャーとしては、例えば、Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ（商標）クエンチャーＢＨＱ−１、ＢＨＱ２、およびＢＨＱ−３（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、ならびにＡＴＴＯ−シリーズのクエンチャー（ＡＴＴＯ５４０Ｑ、ＡＴＴＯ５８０Ｑ、およびＡＴＴＯ６１２Ｑ；Ａｔｔｏ−Ｔｅｃ  ＧｍｂＨ）が挙げられる。
【００８６】
標的核酸を検出する代替方法
代替として、標的核酸（例えば、ＨＣＶ  ＲＮＡ）の検出は、反応のエンドポイントを測定することによって行うことができる。エンドポイント検出において、アンプリコンは、最初にアンプリコンをサイズ分離し、次いでサイズ分離したアンプリコンを検出することによって検出することができる。異なるサイズのアンプリコンの分離は、ゲル電気泳動、カラムクロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動、または当技術分野において公知の他の分離方法によって達成することができる。
【００８７】
検出可能な標識は、核酸に取り込まれていてもよいし、核酸と会合していてもよいし、または核酸とコンジュゲートしていてもよい。検出可能な標識は、起こり得る立体障害または他の有用なまたは所望の特性への影響を低減するために、様々な長さのスペーサーアームによって付着させてもよい。例えば、Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ，９  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  １４５−１５６（１９９５）を参照されたい。検出可能な標識は、共有結合または非共有結合の手段によって、例えば転写によって、例えば、クレノーポリメラーゼを使用するランダムプライマーでの標識付け、またはニックトランスレーション、または増幅、またはそれに匹敵する当技術分野において公知のものによって、核酸に取り込むことができる。例えば、ヌクレオチド塩基は、蛍光色素などの検出可能な部分にコンジュゲートされ、次いで核酸の合成または増幅中に核酸に取り込まれる。
【００８８】
標的核酸の検出に役立つ他の有用な標識の例としては、放射性同位体（例えば、３２Ｐ、３５Ｓ、３Ｈ、１４Ｃ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、電子高密度の試薬（例えば、金）、酵素（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、比色標識（例えば、コロイド金）、磁気標識（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標））、ビオチン、ジゴキシゲニン〔dioxigenin〕、またはハプテン、および抗血清またはモノクローナル抗体が利用可能なタンパク質が挙げられる。他の標識としては、それぞれ対応する受容体またはオリゴヌクレオチド相補物と複合体を形成することが可能なリガンドまたはオリゴヌクレオチドが挙げられる。標識は、検出しようとする核酸に直接的に取り込んでもよいし、または検出しようとする核酸にハイブリダイズまたは結合するプローブ（例えば、オリゴヌクレオチド）または抗体に付着させてもよい。
【００８９】
他の実施形態において、核酸を標識するために、蛍光性のヌクレオチド類似体を使用することができる。例えば、Ｊａｍｅｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２７８：３６３−３９０（１９９７）；Ｚｈｕ，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２２：３４１８−３４２２（１９９４）を参照されたい。また米国特許第５，６５２，０９９号および６，２６８，１３２号も、蛍光性のオリゴヌクレオチドを産生するために、酵素による合成または化学合成のいずれかを介して、核酸、例えばＤＮＡおよび／もしくはＲＮＡ、またはオリゴヌクレオチドに取り込ませるためのヌクレオシド類似体を記載している。米国特許第５，１３５，７１７号は、蛍光標識として使用するためのフタロシアニンおよびテトラベンゾトリアザポルフィリン試薬を記載している。
【００９０】
一部の実施形態において、検出可能に標識されたプローブは、生体サンプル中の標的核酸配列を検出するために、ハイブリダイゼーションアッセイ、例えば、これらに限定されないが、ノーザンブロット、サザンブロット、マイクロアレイ、ドットまたはスロットブロットなど、およびインサイチュハイブリダイゼーションアッセイ、例えば蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）で使用することができる。特定の実施形態は、ｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド遺伝子産物の発現を測定するために、ハイブリダイゼーション方法を採用することができる。ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイを実行するための方法は、当技術分野において十分な開発が進んでいる。ハイブリダイゼーションアッセイの手順および条件は、用途に応じて様々であり、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  Ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）；Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５２，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ，１９８７）；Ｙｏｕｎｇ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ，ＰＮＡＳ．８０：１１９４（１９８３）で述べられているものなどの公知の一般的な結合方法に従って選択される。
【００９１】
本発明の技術のＨＣＶ検出アッセイ
乾燥生体液サンプルにおけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）を検出するための方法であって、マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップ（例えば、ＭＩＴＲＡ（登録商標）チップ）から溶解緩衝液を用いて溶出させた乾燥生体液サンプルから、ＨＣＶ  ＲＮＡを単離することを含む、方法が本明細書で提供される。一部の実施形態において、ＨＣＶ  ＲＮＡは、逆転写およびリアルタイムＰＣＲを使用して検出される。特定の実施形態において、溶解緩衝液は、グアニジンイソチオシアネート、および任意選択でβ−メルカプトエタノールを含む。
【００９２】
乾燥生体液サンプルにおけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）を検出するための方法であって、マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップ（例えば、ＭＩＴＲＡ（登録商標）チップ）から０．５％ＢＳＡを含む緩衝溶液を用いて溶出させた乾燥生体液サンプルから、抗ＨＣＶ抗体を単離することを含む、方法も本明細書で開示される。一部の実施形態において、緩衝溶液は、リン酸緩衝食塩水をさらに含む。特定の実施形態において、抗ＨＣＶ抗体は、ｃ２２−３、ｃ２００、およびＮＳ５からなる群から選択されるＨＣＶ抗原に結合する。抗ＨＣＶ抗体は、酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）を使用して検出してもよい。
【００９３】
一態様において、本発明の技術は、乾燥生体液サンプルにおけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）を検出するための方法であって、（ａ）マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップから溶出させた乾燥生体液サンプルから、リボ核酸を抽出すること；（ｂ）抽出されたリボ核酸を逆転写して、複数のｃＤＮＡ：ＲＮＡハイブリダイゼーション複合体を生成すること；（ｃ）ｃＤＮＡ：ＲＮＡハイブリダイゼーション複合体を、ＨＣＶゲノムの５’ＵＴＲに特異的にハイブリダイズするプライマー対を用いて増幅して、ＨＣＶアンプリコンを産生すること；および（ｄ）工程（ｃ）で産生されたＨＣＶアンプリコンが検出される場合、乾燥生体液サンプルにおけるＨＣＶを検出することを含む、方法を提供する。一部の実施形態において、乾燥生体液サンプルは、乾燥血漿、乾燥血清、または乾燥全血である。乾燥生体液サンプル中に存在するＨＣＶの遺伝子型は、遺伝子型１ａ、遺伝子型１ｂ、遺伝子型２ａ、遺伝子型２ｂ、遺伝子型２ｃ、遺伝子型２ｄ、遺伝子型３ａ、遺伝子型３ｂ、遺伝子型３ｃ、遺伝子型３ｄ、遺伝子型３ｅ、遺伝子型３ｆ、遺伝子型４ａ、遺伝子型４ｂ、遺伝子型４ｃ、遺伝子型４ｄ、遺伝子型４ｅ、遺伝子型４ｆ、遺伝子型４ｇ、遺伝子型４ｈ、遺伝子型４ｉ、遺伝子型４ｊ、遺伝子型５ａ、および遺伝子型６ａからなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子型であり得る。特定の実施形態において、乾燥生体液サンプルは、肝炎の徴候または症状を示す患者、またはＨＣＶ感染のリスクがある患者から単離される。一部の実施形態において、ｃＤＮＡ：ＲＮＡハイブリダイゼーション複合体は、Ｚ０５またはＺ０５Ｄ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅される。
【００９４】
加えて、または代替として、一部の実施形態において、マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップ上の乾燥生体液サンプルは、指先穿刺を介して患者から収集される。特定の実施形態において、マイクロサンプリングデバイスは、ＭＩＴＲＡ（登録商標）チップである。乾燥生体液サンプルの溶出は、マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップを溶解緩衝液と接触させることによって実行することができる。一部の実施形態において、溶解緩衝液は、グアニジンイソチオシアネート、および任意選択でβ−メルカプトエタノールを含む。加えて、または代替として、一部の実施形態において、乾燥生体液サンプルの溶出は、マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップを、溶解緩衝液と、３７℃で少なくとも３０分接触させることによって実行される。一部の実施形態において、マイクロサンプリングデバイスのサンプル体積は、３０μＬ以下、２５μＬ以下、２０μＬ以下、１５μＬ以下、または１０μＬ以下である。さらに、ＭＩＴＲＡ（登録商標）チップから溶出させた乾燥生体液サンプル中のＨＣＶ  ＲＮＡは、指先穿刺を介した収集から１カ月後に溶出を実行した場合でも、安定なままであったことが決定された。本発明の技術の方法は、ＲＮＡ分解を予防するように、ＭＩＴＲＡ（登録商標）チップを、尿素、塩、キレート化剤、またはＲＮアーゼ阻害剤などの添加剤で事前処置することを必要としないため、この結果は予想外であった。
【００９５】
特定の実施形態において、本方法は、ｃＤＮＡ：ＲＮＡハイブリダイゼーション複合体を、検出可能に標識されたプローブと接触させることをさらに含む。一部の実施形態において、検出可能な標識は、４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’ジスルホン酸、アクリジンおよび誘導体（アクリジン、アクリジンイソチオシアネート）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ））、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、４−アミノ−Ｎ−［３−ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド−３，５ジスルホネート（ルシファーイエローＶＳ）、Ｎ−（４−アニリノ−１−ナフチル）マレイミド、アントラニルアミド、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）Ｒ−６Ｇ、ＢＯＰＩＰＹ（登録商標）５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ、ブリリアントイエロー、Ｃａｌ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ  ６１０（登録商標）（ＣＦＲ６１０）、クマリンおよび誘導体（クマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ、クマリン１２０）、７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（クマリン１５１））、Ｃｙ２（登録商標）、Ｃｙ３（登録商標）、Ｃｙ３．５（登録商標）、Ｃｙ５（登録商標）、Ｃｙ５．５（登録商標）、シアノシン、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、５’，５”−ジブロモピロガロール−スルホンフタレイン（ブロモピロガロールレッド）、７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリン、ジエチレントリアミン五酢酸、４，４’−ジイソチオシアナトジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸、４，４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸、５−［ジメチルアミノ］ナフタレン−１−スルホニルクロリド（ＤＮＳ、ダンシルクロリド）、４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）、Ｅｃｌｉｐｓｅ（商標）（Ｅｐｏｃｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．）、エオシンおよび誘導体（エオシン、エオシンイソチオシアネート）、エリスロシンおよび誘導体（エリスロシンＢ、エリスロシンイソチオシアネート）、エチジウム、フルオレセインおよび誘導体（５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、２’，７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ヘキサクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＨＥＸ）、ＱＦＩＴＣ（ＸＲＩＴＣ）、テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、フルオレサミン、ＩＲ１４４、ＩＲ１４４６、ランタニド系蛍光体、マラカイトグリーンイソチオ��アネート、４−メチルウンベリフェロン、オルトクレゾールフタレイン、ニトロチロシン、パラローズアニリン、フェノールレッド、Ｂ−フィコエリトリン、Ｒ−フィコエリトリン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルジアルデヒド、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）、ヨウ化プロピジウム、ピレンおよび誘導体（ピレン、ピレンブチレート、スクシンイミジル１−ピレンブチレート）、ＱＳＹ（登録商標）７、ＱＳＹ（登録商標）９、ＱＳＹ（登録商標）２１、ＱＳＹ（登録商標）３５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、リアクティブレッド４（Ｃｉｂａｃｒｏｎ（登録商標）ブリリアントレッド３Ｂ−Ａ）、ローダミンおよび誘導体（６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、リサミンローダミンＢスルホニルクロリド、ローダミン（Ｒｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミングリーン、ローダミンＸイソチオシアネート、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１、スルホローダミン１０１の塩化スルホニル誘導体（テキサスレッド）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、テトラメチルローダミン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、リボフラビン、ロゾール酸、テルビウムキレート誘導体、Ｑｕａｓａｒ  ６７０（登録商標）、ならびにＶＩＣ（登録商標）からなる群から選択される蛍光性レポーターである。
【００９６】
上記実施形態のいずれかにおいて、乾燥生体液サンプル中のＨＣＶのウイルス負荷量は、少なくとも１〜５ＩＵ／ｍＬ、少なくとも５〜１０ＩＵ／ｍＬ、少なくとも１０〜１５ＩＵ／ｍＬ、少なくとも１５〜２０ＩＵ／ｍＬ、少なくとも２０〜４０ＩＵ／ｍＬ、少なくとも４０〜６０ＩＵ／ｍＬ、少なくとも６０〜８０ＩＵ／ｍＬ、少なくとも８０〜１００ＩＵ／ｍＬ、少なくとも１００〜１５０ＩＵ／ｍＬ、少なくとも１５０〜２００ＩＵ／ｍＬ、少なくとも２００〜２５０ＩＵ／ｍＬ、少なくとも２５０〜３００ＩＵ／ｍＬ、少なくとも３００〜３５０ＩＵ／ｍＬ、少なくとも３５０〜４００ＩＵ／ｍＬ、少なくとも４００〜５００ＩＵ／ｍＬ、少なくとも５００〜６００ＩＵ／ｍＬ、少なくとも６００〜７００ＩＵ／ｍＬ、少なくとも７００〜８００ＩＵ／ｍＬ、少なくとも８００〜８５０ＩＵ／ｍＬ、少なくとも８５０ＩＵ／ｍＬ、または少なくとも９００ＩＵ／ｍＬである。
【００９７】
別の態様において、本発明の開示は、乾燥生体液サンプルにおけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）を検出するための方法であって、（ａ）マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップから、乾燥生体液サンプルを溶出させること；および（ｂ）溶出させた乾燥生体液サンプル中で、少なくとも１つのＨＣＶがコードする抗原に対する抗ＨＣＶ抗体が検出される場合、乾燥生体液サンプルにおけるＨＣＶを検出することを含む、方法を提供する。一部の実施形態において、乾燥生体液サンプルは、血漿、血清、または全血である。乾燥生体液サンプル中に存在するＨＣＶの遺伝子型は、遺伝子型１ａ、遺伝子型１ｂ、遺伝子型２ａ、遺伝子型２ｂ、遺伝子型２ｃ、遺伝子型２ｄ、遺伝子型３ａ、遺伝子型３ｂ、遺伝子型３ｃ、遺伝子型３ｄ、遺伝子型３ｅ、遺伝子型３ｆ、遺伝子型４ａ、遺伝子型４ｂ、遺伝子型４ｃ、遺伝子型４ｄ、遺伝子型４ｅ、遺伝子型４ｆ、遺伝子型４ｇ、遺伝子型４ｈ、遺伝子型４ｉ、遺伝子型４ｊ、遺伝子型５ａ、および遺伝子型６ａからなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子型であり得る。特定の実施形態において、乾燥生体液サンプルは、肝炎の徴候または症状を示す患者、またはＨＣＶ感染のリスクがある患者から単離される。一部の実施形態において、少なくとも１つのＨＣＶがコードする抗原は、ｃ２２−３、ｃ２００、およびＮＳ５からなる群から選択される。
【００９８】
加えて、または代替として、一部の実施形態において、マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップ上の乾燥生体液サンプルは、指先穿刺を介して患者から収集される。特定の実施形態において、マイクロサンプリングデバイスは、ＭＩＴＲＡ（登録商標）チップである。乾燥生体液サンプルの溶出は、マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップを、リン酸緩衝食塩水および０．５％ＢＳＡを含む混合物と接触させることによって実行することができる。特定の実施形態において、乾燥生体液サンプルの溶出は、マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップを、リン酸緩衝食塩水および０．５％ＢＳＡを含む混合物と、室温で少なくとも２時間、または２〜８℃で一晩接触させることによって実行される。一部の実施形態において、マイクロサンプリングデバイスのサンプル体積は、３０μＬ以下、２５μＬ以下、２０μＬ以下、１５μＬ以下、または１０μＬ以下である。
【００９９】
開示された方法の目的に関して、生体液サンプルは血漿、血清、または全血を含んでいてもよいことが理解されるべきであるが、当業者であれば、一部の場合において、あるサンプルのタイプが他のものより好ましい場合があることを認識しているであろう。例えば、著しく溶血した全血サンプルは、イムノアッセイにおいてアッセイの結果の信頼を損なう可能性がある干渉の原因となる可能性がある（Ｓｃｈｉｅｔｔｅｃａｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ  ｉｎ  ＡＤＶＡＮＣＥＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＡＳＳＡＹ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，（Ｎｏｒｍａｎ  Ｈ．Ｌ．Ｃｈｉｕ  ｅｄ．２０１２）。したがって、特定のイムノアッセイを実行する場合、血漿または血清が全血より好ましい場合がある。しかしながら、以下の表３の結果で示されるように、全血サンプルは、マイクロサンプリングデバイスを使用してサンプルを収集した場合、室温での長期貯蔵後でさえも安定である。
【０１００】
ＨＣＶ感染の処置
患者が、ＨＣＶを阻害する治療剤での処置によって利益を得るかどうかを決定するための方法が本明細書で開示される。
【０１０１】
ＨＣＶを阻害する治療剤の例としては、インターフェロンアルファコン−１、ペグ化および／または非ペグ化インターフェロンアルファ−２ｂ、ペグインターフェロンアルファ−２ａ、リバビリン、テラプレビル、ボセプレビル、ソホスブビル、シメプレビル、ダクラタスビル、ベルパタスビル、オムビタスビル、パリタプレビル、リトナビル、ダサブビル、レジパスビル、エルバスビル、ダノプレビル、グラゾプレビル、ＧＳ−７９７７、β−インターフェロン、γ−インターフェロン、アマンタジン、３ＴＣ（ヌクレオシド類似体であるシトシン−１，３−オキサチオランの（−）エナンチオマーとしても公知である）、およびＨＣＶの生活環を標的化する阻害剤、例えば、これらに限定されないが、ヘリカーゼ、ポリメラーゼ、メタロプロテアーゼまたは内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）などが挙げられる。
【０１０２】
ＨＣＶの生活環を標的化する阻害剤の例としては、ＮＳ３タンパク質のヘリカーゼ活性に干渉する複素環式の置換されたカルボキサミド（米国特許第５，６３３，３８８号に記載される）；Ｃｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．７２２９−７２３２（１９９６）で報告された、インビトロでＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼを阻害するフェナントレンキノン；モルホリニルカルボニル−ベンゾイル−ペプチド類似体（ＷＯ１９９５／３３７６４）；ＮＳ５Ａ／５Ｂ基質ベースのペプチド類似体（ＷＯ１９９８／１７６７９）；ＨＣＶプロテアーゼを阻害するチアゾリジン誘導体（Ｂｒｏｗｎ−Ｄｒｉｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３０（１），Ａ２３（１９９６））；およびＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼの他のペプチド阻害剤（Ｓｔｅｉｎｋｕｅｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７：８８９９−８９０５（１９９８）；Ｉｎｇａｌｌｉｎｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７：８９０６−８９１４（１９９８））が挙げられる。
【０１０３】
一態様において、本発明の開示は、少なくとも１種のＨＣＶ感染を阻害する治療剤での処置のために、肝炎の症状を示す患者を選択するための方法であって、（ａ）血液細胞からのリボ核酸の放出が起こる条件下で、乾燥血液サンプルを溶出させることであって、乾燥血液サンプルは、マイクロサンプリングデバイスを用いて患者から収集される、溶出させること；（ｂ）溶出させた乾燥血液サンプルから、リボ核酸を単離すること；（ｃ）単離したリボ核酸を逆転写して、複数のｃＤＮＡ：ＲＮＡハイブリダイゼーション複合体を生成すること；（ｄ）ｃＤＮＡ：ＲＮＡハイブリダイゼーション複合体を、ＨＣＶゲノムの５’ＵＴＲに特異的にハイブリダイズするプライマー対を用いて増幅して、蛍光標識されたＨＣＶアンプリコンを産生すること；（ｅ）工程（ｄ）で産生された蛍光標識されたＨＣＶアンプリコンを検出すること；および（ｆ）蛍光標識されたＨＣＶアンプリコンが検出される場合、ＨＣＶ感染を阻害する治療剤での処置のために患者を選択することを含む、方法を提供する。
【０１０４】
加えて、または代替として、一態様において、本発明の開示は、ＨＣＶ感染を阻害する治療剤での処置のために、肝炎の症状を示す患者を選択するための方法であって、（ａ）乾燥血液サンプルを、０．５％ＢＳＡを含む緩衝溶液を用いて溶出させることであって、乾燥血液サンプルは、マイクロサンプリングデバイスを用いて患者から収集される、溶出させること；（ｂ）溶出させた乾燥血液サンプルにおいて、少なくとも１つのＨＣＶがコードする抗原に対する抗ＨＣＶ抗体を検出すること；および（ｃ）抗ＨＣＶ抗体が検出される場合、ＨＣＶ感染を阻害する治療剤での処置のために患者を選択することを含む、方法を提供する。一部の実施形態において、少なくとも１つのＨＣＶがコードする抗原は、ｃ２２−３、ｃ２００、およびＮＳ５からなる群から選択される。一部の実施形態において、緩衝溶液は、リン酸緩衝食塩水をさらに含む。
【０１０５】
上記実施形態のいずれかにおいて、ＨＣＶ感染を阻害する治療剤は、インターフェロンアルファコン−１、ペグ化および／または非ペグ化インターフェロンアルファ−２ｂ、ペグインターフェロンアルファ−２ａ、リバビリン、テラプレビル、ボセプレビル、ソホスブビル、シメプレビル、ダクラタスビル、ベルパタスビル、オムビタスビル、パリタプレビル、リトナビル、ダサブビル、レジパスビル、エルバスビル、ダノプレビル、グラゾプレビル、ＧＳ−７９７７、β−インターフェロン、γ−インターフェロン、アマンタジン、３ＴＣ、およびＨＣＶの生活環を標的化する阻害剤からなる群から選択される１種または複数の薬剤である。上記実施形態のいずれかにおいて、マイクロサンプリングデバイスは、ＭＩＴＲＡ（登録商標）チップである。
【０１０６】
特定の実施形態において、乾燥血液サンプル中のＨＣＶは、遺伝子型１ａ、遺伝子型１ｂ、遺伝子型２ａ、遺伝子型２ｂ、遺伝子型２ｃ、遺伝子型２ｄ、遺伝子型３ａ、遺伝子型３ｂ、遺伝子型３ｃ、遺伝子型３ｄ、遺伝子型３ｅ、遺伝子型３ｆ、遺伝子型４ａ、遺伝子型４ｂ、遺伝子型４ｃ、遺伝子型４ｄ、遺伝子型４ｅ、遺伝子型４ｆ、遺伝子型４ｇ、遺伝子型４ｈ、遺伝子型４ｉ、遺伝子型４ｊ、遺伝子型５ａ、および遺伝子型６ａからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子型を有する。
【０１０７】
肝炎の症状としては、これらに限定されないが、インフルエンザ様の症状、関節および筋肉の疼痛、軽度の皮膚の発疹、食欲不振、腹痛、暗色尿、灰色の便、黄疸、慢性肝疾患、クリオグロブリン血症、肝臓の領域における疼痛および圧痛、発熱、体重の減少、うつ病、ならびに疲労が挙げられる。ＨＣＶ感染のリスクがある患者としては、感染を起こす可能性がある血液または血液製剤に曝露された者、輸血を受けている者、１９９２年より前に臓器移植を受けた者、ＨＩＶ患者、長期にわたる血液透析患者、無防備な性行為の過去を有する対象、入れ墨やボディピアスを有する個体、肝疾患の徴候または症状を示す患者、違法薬物の使用者、およびＨＣＶに感染している母親から生まれた患者が挙げられる。
【０１０８】
ベースラインのウイルス負荷量を測定するための、および処置をモニターするためのＨＣＶ  ＲＮＡの定量化は、一部の併用療法レジメンに対する抗ウイルス剤応答の効能の実証において十分に確立されている（ＭｃＨｕｔｃｈｉｓｏｎ  ＪＧ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３３９：１４８５−１４９２（１９９８）；Ｄａｖｉｓ  ＧＬ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３３９：１４９３−１４９９（１９９８）；Ｍａｎｎｓ  ＭＰ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  ３５８：９５８−９６５（２００１）；Ｆｒｉｅｄ  ＭＷ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４７：９７５−９８２（２００２）；Ｈａｄｚｉｙａｎｎｉｓ  ＳＪ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ  １４０：３４６−３５５（２００４））。現在のＨＣＶの管理および処置に関するガイドラインは、抗ウイルス剤療法の開始の前、療法中（応答ガイド療法〔response guided therapy〕）、および一般的に処置終了後１２から２４週間、ＨＣＶ  ＲＮＡを定量試験することを推奨している。早期ウイルス陰性化（ＥＶＲ）達成の失敗は、持続的ウイルス陰性化（ＳＶＲ）達成のための高い陰性適中率を有し、患者にとって特定の療法を終わらせるべきかどうかを決定するときに考慮される。迅速ウイルス陰性化（ＲＶＲ）は、ＳＶＲに関して高い陽性適中率を有する。
【０１０９】
本発明の開示は、マイクロサンプリングデバイスで（例えば、指先穿刺を介して）患者から収集された乾燥生体液サンプル（例えば、血液）中のＨＣＶ  ＲＮＡまたは抗ＨＣＶ抗体のレベルを繰り返してモニターすることによって、ＨＣＶの徴候または症状を示す患者、またはＨＣＶ感染のリスクがある患者における治療レジメンの効能を評価するための方法を提供する。一部の実施形態において、マイクロサンプリングデバイスは、ＭＩＴＲＡ（登録商標）チップである。
【０１１０】
一態様において、本発明の開示は、患者におけるＨＣＶ感染に対するＨＣＶ治療レジメンの効能を評価するための方法であって、（ａ）血液細胞からのリボ核酸の放出が起こる条件下で、第１の乾燥血液サンプルを溶出させることであって、第１の乾燥血液サンプルは、患者にＨＣＶ治療レジメンを施す前に、マイクロサンプリングデバイスで患者から収集される、溶出させること；（ｂ）溶出させた第１の乾燥血液サンプル中のＨＣＶ  ＲＮＡを、逆転写およびリアルタイムＰＣＲを介して検出すること；（ｃ）血液細胞からのリボ核酸の放出が起こる条件下で、第２の乾燥血液サンプルを溶出させることであって、第２の乾燥血液サンプルは、患者にＨＣＶ治療レジメンを施した後に、マイクロサンプリングデバイスで患者から収集される、溶出させること；および（ｄ）溶出させた第２の乾燥血液サンプル中のＨＣＶ  ＲＮＡを、逆転写およびリアルタイムＰＣＲを介して検出することを含み、ＨＣＶ治療レジメンを施した後の第２の乾燥血液サンプル中のＨＣＶ  ＲＮＡレベルが、工程（ｂ）で観察されたＨＣＶ  ＲＮＡレベルと比較して低減されている場合、ＨＣＶ治療レジメンは、ＨＣＶ感染に対して治療作用を有すると同定される、方法を提供する。特定の実施形態において、患者は、早期ウイルス陰性化（ＥＶＲ）、迅速ウイルス陰性化（ＲＶＲ）、および／または持続的ウイルス陰性化（ＳＶＲ）を呈する可能性がある。
【０１１１】
加えて、または代替として、本発明の開示は、患者におけるＨＣＶ感染に対するＨＣＶ治療レジメンの効能を評価するための方法であって、（ａ）第１の乾燥血液サンプルを、０．５％ＢＳＡを含む緩衝溶液を用いて溶出させることであって、第１の乾燥血液サンプルは、患者にＨＣＶ治療レジメンを施す前に、マイクロサンプリングデバイスで患者から収集される、溶出させること；（ｂ）溶出させた第１の乾燥血液サンプル中の少なくとも１種のＨＣＶがコードする抗原に対する少なくとも１種の抗ＨＣＶ抗体を検出すること；（ｃ）第２の乾燥血液サンプルを、０．５％ＢＳＡを含む緩衝溶液を用いて溶出させることであって、第２の乾燥血液サンプルは、患者にＨＣＶ治療レジメンを施した後に、マイクロサンプリングデバイスで患者から収集される、溶出させること；（ｄ）溶出させた第２の乾燥血液サンプル中の少なくとも１種のＨＣＶがコードする抗原に対する少なくとも１種の抗ＨＣＶ抗体を検出することを含み、ＨＣＶ治療レジメンを施した後の第２の乾燥血液サンプル中の抗ＨＣＶ抗体レベルが、工程（ｂ）で観察された抗ＨＣＶ抗体レベルと比較して低減されている場合、ＨＣＶ治療レジメンは、ＨＣＶ感染に対して治療作用を有すると同定される、方法を提供する。一部の実施形態において、緩衝溶液は、リン酸緩衝食塩水をさらに含む。
【０１１２】
上記実施形態のいずれかにおいて、ＨＣＶ治療レジメンは、本明細書で開示された１種または複数のＨＣＶ阻害剤および／または当技術分野において公知の他のＨＣＶ阻害剤を含む。
【０１１３】
キット
乾燥生体液サンプルにおけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の存在を検出するためのキットも本明細書で開示される。一部の実施形態において、キットは、マイクロサンプリングデバイス、溶解緩衝液、逆転写酵素、および任意選択でＨＣＶゲノムの５’ＵＴＲに特異的にハイブリダイズするプライマー対を含む。特定の実施形態において、キットは、ＨＣＶゲノムの５’ＵＴＲに特異的にハイブリダイズする検出可能に標識されたプローブを含む。
【０１１４】
加えて、または代替として、一部の実施形態において、キットは、マイクロサンプリングデバイス、０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液、および抗ＨＣＶ一次抗体に特異的に結合する検出可能に標識された二次抗体を含む。特定の実施形態において、キットは、ｃ２２−３、ｃ２００、およびＮＳ５からなる群から選択される少なくとも１つのＨＣＶがコードする抗原でコーティングされたウェルを含む固体基層をさらに含む。
【０１１５】
本発明の技術のキットの上記実施形態のいずれかにおいて、マイクロサンプリングデバイスは、ＭＩＴＲＡ（登録商標）チップである。
【０１１６】
一部の実施形態において、キットは、ＨＣＶゲノムの５’ＵＴＲに特異的にハイブリダイズすることが可能なプライマー対を含む。加えて、または代替として、一部の実施形態において、キットは、プライマー対によって増幅される領域内に配置された配列に特異的にハイブリダイズする、検出可能に標識された核酸プローブを提供する。
【０１１７】
一部の実施形態において、キットは、それぞれ近位端に中空のホルダーおよび遠位端に吸収性チップを有する複数のマイクロサンプリングデバイスを含んでいてもよい。吸収性チップは、約１０秒以内またはそれ未満で３０マイクロリットルまたはそれ未満の血液を吸収するように設計された親水性のポリマー性材料を含む。キットはまた、複数の区画を有する容器も包含する。各区画は、マイクロサンプリングデバイスと取り外し可能にかみ合うように設計されている。容器は、マイクロサンプリングデバイスの吸収性チップが、中にマイクロサンプリングデバイスが設置される区画と隣り合わないように設計されている。
【０１１８】
加えて、または代替として、特定の実施形態において、キットは、複数のアクセスポートを包含していてもよく、各ポートは、個々の区画と関連付けられる。各ポートは、ポートが関連付けられる区画内に存在するマイクロサンプリングデバイスのホルダー上への印刷が可能になるように配置される。特定の実施形態において、マイクロサンプリングデバイスのホルダーは、ホルダーの長さに沿って伸長する複数のリブを有し、リブは、吸収性チップが容器の壁と接触することを防ぐように設計されている。容器は、好ましくは、管状の形態の区画を形成するように設計された２つのパートを有する。容器は、それぞれ異なる区画の一部に沿って伸長する複数の細長い据え付けの突起を有する第１のパートを有していてもよい。マイクロサンプリングデバイスのホルダーの中空の末端が据え付けの突起上にはまると、ホルダーが据え付けの突起上に取り外し可能に固定される。
【０１１９】
一部の実施形態において、キットは、少なくとも１種の標的に特異的な核酸プローブを２５０ｎＭまたはそれ未満の濃度で含有する液状媒体を含む。このようなキットを用いる場合、プローブは、本発明の技術に従って信頼できるマルチプレックス検出反応を実行するのに必要な量で提供される。
【０１２０】
一部の実施形態において、キットは、ＨＣＶに対応する標的核酸配列の増幅および／または検出などのアッセイまたは反応を行うのに必要な、緩衝液、ポリメラーゼ活性を有する酵素、ポリメラーゼ活性を有し、５’から３’のエキソヌクレアーゼ活性または５’から３’および３’から５’のエキソヌクレアーゼ活性の両方が欠失した酵素、酵素補因子、例えばマグネシウムまたはマンガン、塩、鎖伸長ヌクレオチド、例えばデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、修飾されたｄＮＴＰ、ヌクレアーゼ耐性ｄＮＴＰまたは標識されたｄＮＴＰをさらに含む。
【０１２１】
一実施形態において、本発明の技術のキットは、陽性対照核酸配列（例えば、ＨＣＶ定量標準（ＱＳ）ＲＮＡ分子、例えばＣＯＢＡＳ（登録商標）ＡｍｐｌｉＰｒｅｐ／ＣＯＢＡＳ（登録商標）ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＨＣＶ試験で使用されるもの）、および実験処理中のアッセイの完全性を確認するための陰性対照核酸配列をさらに含む。加えて、または代替として、一部の実施形態において、本発明の技術のキットは、抗ＨＣＶ陽性対照生体サンプルおよび抗ＨＣＶ陰性対照生体サンプルをさらに含む。またキットは、使用説明書、自動分析のためのソフトウェア、容器、パッケージ、例えば市販を意図したパッケージングなどを含んでいてもよい。
【０１２２】
キットは、洗浄緩衝液および／または試薬、ハイブリダイゼーション緩衝液および／または試薬、標識付けの緩衝液および／または試薬、ならびに検出手段の１種または複数をさらに含んでいてもよい。緩衝液および／または試薬は通常、キットが意図される特定の増幅／検出技術に最適化される。また、手順の様々な工程を実行するためのこれらの緩衝液および試薬を使用するためのプロトコールがキットに包含されていてもよい。
【実施例】
【０１２３】
［実施例１］
ＭＩＴＲＡ（登録商標）チップを用いたＨＣＶの検出
ＨＣＶ  ＲＮＡを検出するための方法。合計７９人のヒト対象を研究に登録した。各対象から、少なくとも１ｍＬの体積で従来通り血漿または血清を採取した。さらに、２０μＬの血液を、ＭＩＴＲＡ（登録商標）チップ収集デバイスを用いて指先穿刺を介して各対象から収集した。次いでＭＩＴＲＡ（登録商標）チップ収集デバイスの吸収性チップを、０．７ｍＬのＲＬＴ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）中に３７℃で少なくとも３０分、８００ｒｐｍで振盪しながら置いて、乾燥血液サンプルを溶出させた。緩衝液ＲＬＴは、高濃度のグアニジンイソチオシアネートを含む溶解緩衝液であり、ＲＮＡ単離前に細胞および組織を溶解させるのに使用される。その後吸収性チップをＲＬＴ緩衝液から取り出し、０．６５ｍＬのそれぞれの溶出させた乾燥血液サンプルを、ＣＯＢＡＳ（登録商標）ＡｍｐｌｉＰｒｅｐ／ＣＯＢＡＳ（登録商標）ＴａｑＭａｎ（登録商標）機器上での試験のために、サンプルインプットチューブに移した。各サンプル（ＭＩＴＲＡ（登録商標）チップおよび従来の血液採取によるサンプル）につき試料調製、逆転写、およびＰＣＲ増幅をＣＯＢＡＳ（登録商標）ＡｍｐｌｉＰｒｅｐ／ＣＯＢＡＳ（登録商標）ＴａｑＭａｎ（登録商標）プラットフォーム上で製造元の説明書に従って行った。
【０１２４】
簡単に言えば、ＨＣＶウイルス粒子がサンプル中に存在する場合、ＨＣＶウイルス粒子をプロテアーゼおよびカオトロピックな溶解／結合緩衝液と共に高温でインキュベートすることにより溶解して、核酸を放出させ、放出されたＨＣＶ  ＲＮＡをＲＮアーゼから保護した。プロテアーゼおよび数がわかっているＨＣＶ定量標準（ＱＳ）ＲＮＡ分子を、溶解試薬および磁気ガラス粒子と共に各試料に導入した。その後、混合物をインキュベートしたところ、ＨＣＶ  ＲＮＡ（存在する場合）およびＨＣＶ  ＱＳ  ＲＮＡが磁気ガラス粒子の表面に結合した。未結合の物質、例えば塩、タンパク質および他の細胞性不純物を、磁気ガラス粒子を洗浄することによって除去した。磁気ガラス粒子を分離し、洗浄工程を終えた後、吸着した核酸を水溶液を用いて高温で溶出させた。それぞれの処理した試料は、磁気ガラス粒子に加えて放出されたＨＣＶ  ＲＮＡおよびＨＣＶ  ＱＳ  ＲＮＡを含有しており、これを増幅混合物に添加し、ＣＯＢＡＳ（登録商標）ＴａｑＭａｎ（登録商標）分析器に移した。
【０１２５】
ＣＯＢＡＳ（登録商標）ＡｍｐｌｉＰｒｅｐ／ＣＯＢＡＳ（登録商標）ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＨＣＶアッセイは、ＨＣＶ  ＲＮＡの相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）への逆転写と、ＨＣＶゲノムの５’−非翻訳領域の高度に保存された領域内の配列を定義するプライマーおよびプライマー対によって定義された配列にもハイブリダイズする検出可能に標識されたプローブを使用したｃＤＮＡのＰＣＲ増幅とを使用する。プライマーのヌクレオチド配列は、ＨＣＶ遺伝子型１〜６の同等の増幅が起こるように最適化されている。逆転写およびＰＣＲ増幅反応を、マンガン（Ｍｎ２＋）の存在下および適切な緩衝液条件下で、逆転写酵素活性とＤＮＡポリメラーゼ活性の両方を有する熱安定性のＺ０５およびＺ０５Ｄ  ＤＮＡポリメラーゼの最適化したブレンドを用いて実行した。
【０１２６】
処理した試料を、増幅チューブ（Ｋ−チューブ）中の増幅混合物に添加し、そこで逆転写とＰＣＲ増幅の両方を行った。反応混合物を加熱して、下流のプライマーを、ＨＣＶ標的ＲＮＡおよびＨＣＶ  ＱＳ  ＲＮＡに特異的にアニールさせた。ＨＣＶ標的ＲＮＡおよびＨＣＶ  ＱＳ  ＲＮＡの逆転写後、反応混合物を加熱して、ＲＮＡ：ｃＤＮＡハイブリッドを変性させ、特異的なプライマー標的配列を露出させた。反応混合物を冷却すると、標的ＨＣＶ  ＤＮＡにアニールしたプライマーおよび熱安定性のＤＮＡポリメラーゼ（Ｚ０５およびＺ０５Ｄ）は、Ｍｎ２＋および過量のデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）の存在下で、アニールしたプライマーを標的テンプレートに沿って伸長させて、二本鎖ＤＮＡアンプリコンを産生した。必要なサイクル数を、ＣＯＢＡＳ（登録商標）ＴａｑＭａｎ（登録商標）分析器またはＣＯＢＡＳ（登録商標）ＴａｑＭａｎ（登録商標）４８分析器に事前にプログラムした。
【０１２７】
抗ＨＣＶ抗体を検出するための方法。合計２４２人のヒト対象を研究に登録した。各対象から、少なくとも１ｍＬの体積で従来通り血液採取した。さらに、２０μＬの血液を、指先穿刺を介してＭＩＴＲＡ（登録商標）チップ収集デバイスで各対象から収集した。次いでＭＩＴＲＡ（登録商標）チップ収集デバイスの吸収性チップを、０．３５ｍＬのＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ中に２〜８℃で一晩置いて、乾燥血液サンプルを溶出させた。その後吸収性チップを緩衝液から取り出し、それぞれの溶出させた乾燥血液サンプルを、試験のためにＶＩＴＲＯＳ  ＥＣｉ／ＥＣｉＱ免疫診断システム（Ｏｒｔｈｏ−Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｕ．Ｋ．）上に置いた。１０個の模擬の指先穿刺サンプルを陰性対照として使用した。各サンプル（ＭＩＴＲＡ（登録商標）チップおよび従来の血液採取によるサンプル）につきイムノアッセイを、ＶＩＴＲＯＳ  ＥＣｉ／ＥＣｉＱ免疫診断システム上で製造元の説明書に従って行った。
【０１２８】
簡単に言えば、サンプルをＨＣＶ組換え抗原ｃ２２−３、ｃ２００、およびＮＳ５でコーティングされたウェルに移し、サンプル中のＨＣＶ抗体（存在する場合）をＨＣＶ組換え抗原の１種または複数に特異的に結合させた。未結合のサンプルを洗浄工程によって除去した。次いでサンプルを、ウェル上に補捉されたいずれかのヒトＩｇＧに結合する、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識した抗体コンジュゲート（マウスモノクローナル抗ヒトＩｇＧ）と共にインキュベートした。未結合のコンジュゲートを洗浄工程によって除去した。発光性基質（ルミノール誘導体および過酸塩）および電子移動剤を含有する試薬をウェルに添加し、結合したＨＲＰコンジュゲートを発光反応によって測定した。結合したＨＲＰコンジュゲートの量は、サンプル中に存在する抗ＨＣＶのレベルの指標であった。結果を、カットオフ値に対する正規化したシグナルの比率（シグナル／カットオフ、ｓ／ｃ）として計算した。＜０．９０の比率が陰性結果とみなされ、≧１．００の比率が陽性結果であり、０．９から０．９９の間の比率があいまいとみなされる。
【０１２９】
結果。表１および図１はどちらも、７９人の対象のうち３２人からのデータのサンプリングを提供し、それによれば、患者の指先穿刺を介してＭＩＴＲＡ（登録商標）チップ収集デバイス上に収集された乾燥血液サンプルにおけるＨＣＶ  ＲＮＡ検出と、従来の血液採取を使用して収集された同じ患者からの全血サンプルにおけるＨＣＶ  ＲＮＡ検出との完全な一致が実証される（Ｒ２＝０．９８）。また表１は、本発明の技術のＨＣＶ検出方法は、指先穿刺を介してＭＩＴＲＡ（登録商標）チップ収集デバイスで得られた少量の乾燥血液サンプル中で、少なくとも１２６ＩＵ／ｍＬもの低さでもウイルス負荷量を確実に検出することが可能であることも実証する。これらの結果は、サンプル体積が少なくなるにつれアッセイの感度および精度が低下することが予測されることを考えれば、驚くべきことである。Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．５３：１９６２−１９６５（２００７）を参照されたい。以前の研究は、１０μＬの指先穿刺による毛細血管の全血サンプルにおけるＨＣＶ  ＲＮＡ定量が、＞９００ＩＵ／ｍＬのウイルス負荷量をモニターするのに適切であると報告している。Ｂｒｕｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４７（１０）：３２３１−３２４０（２００９）。図２は、指先穿刺から回収されたＨＣＶと、血清から回収されたＨＣＶとの、回収されたウイルス負荷量の相関を示す。
【０１３０】
表２は、２４２人の対象のうち４５人からのデータのサンプリングを提供し、それによれば、指先穿刺を介してＭＩＴＲＡ（登録商標）チップ収集デバイス上に収集された乾燥血液サンプルにおける抗ＨＣＶ抗体検出と、従来の血液採取を使用して収集された同じ患者からの全血サンプルにおける抗ＨＣＶ抗体検出との一致が実証される。
【０１３１】
表３は、ＭＩＴＲＡ（登録商標）チップ収集デバイス上に収集されたサンプルは、意外なことに、収集された流体が血清／血漿または全血であるかどうかに関係なく、長期にわたり室温（１８〜２４℃）で安定でもあることを示す。生体サンプルは通常、室温で長期間貯蔵される場合、安定ではないため、これは、有用な技術的利益である。本発明の結果は、室温で２カ月貯蔵した後でさえも、サンプルがそれでもなお正確な再現可能な結果を提供できることを示す。
【０１３２】
【表１】
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【０１３３】
【表２−１】
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【表２−２】
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【０１３４】
【表３】
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【０１３５】
これらの結果は、本発明の技術の方法が、マイクロサンプリングデバイス（例えば、ＭＩＴＲＡ（登録商標）チップ）を用いて収集された少量の乾燥生体液サンプル中のＨＣＶ  ＲＮＡおよび／または抗ＨＣＶ抗体を検出することが可能であることを実証する。本明細書で開示される方法は、従来の血液採取を採用するＨＣＶ検出方法で観察された結果と一致する結果をもたらした。
【０１３６】
均等物
本発明の技術は、本出願に記載された特定の実施形態の観点で限定されないものとし、それらは本発明の技術の個々の態様の単なる例示であることが意図される。当業者には明らかであろうが、本発明の技術の多くの改変およびバリエーションを、その本質および範囲から逸脱することなく作製することができる。本明細書で列挙されたものに加えて、本発明の技術の範囲内の機能的に同等な方法および装置が、前述の説明から当業者には明らかであろう。このような改変およびバリエーションは、本発明の技術の範囲内に含まれることが意図される。本発明の技術は特定の方法、試薬、化合物の組成または生物系に限定されず、当然ながら様々であってもよいことが理解されるものとする。また、本明細書において使用される用語は、単に特定の実施形態を説明する目的のためであり、限定することを意図しないことも理解されるものとする。
【０１３７】
用語「含む」、「包含する」、「含有する」などは、拡張的に非限定的に解釈されるものとする。加えて、本明細書で採用される用語および表現は、限定ではなく説明の用語として使用されており、このような用語および発現の使用において、示された、および記載された特徴またはそれらの一部のあらゆる均等物を排除する意図はないが、特許請求された開示の範囲内で様々な改変が可能であることが認識されている。
【０１３８】
加えて、本開示の特徴または態様がマーカッシュ群の形式で記載される場合、それにより本開示は、マーカッシュ群のいずれの個々のメンバーまたはメンバーの下位群の形式でも記載されることを当業者は認識するであろう。
【０１３９】
当業者であれば理解するであろうが、ありとあらゆる目的に関して、特に記載された説明の提供に関して、本明細書で開示される全ての範囲はまた、ありとあらゆる可能な部分範囲およびそれらの部分範囲の組合せも包含する。あらゆる列挙された範囲は、同じ範囲が、少なくとも等しく２分の１、３分の１、４分の１、５分の１、１０分の１などに分割されることを十分に記載し、それが可能であるとして、容易に認識することができる。非限定的な例として、本明細書で論じられたそれぞれの範囲は、下部３分の１、中央３分の１および上部３分の１などに容易に分割できる。やはり当業者であれば理解するであろうが、例えば「最大」、「少なくとも」、「より大きい」、「より小さい」などの全ての言語は、列挙された数値を包含し、上記で論じられたようにそれに続いて部分範囲に分割できる範囲を指す。結論として、当業者には理解されるであろうが、範囲は、それぞれ個々の要素を包含する。したがって、例えば、１〜３個の細胞を有する群は、１、２、または３個の細胞を有する群を指す。同様に、１〜５個の細胞を有する群は、１、２、３、４、または５個の細胞を有する群などを指す。
【０１４０】
本明細書で言及または引用された全ての特許、特許出願、仮出願、および公報は、それらが本明細書の明確な教示と矛盾しない程度に、参照により全ての図面および表を含めそれら全体が本明細書に組み入れられる。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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