(57)【要約】  本開示は、リンカーを経て抗ＥＧＦＲ抗体に連結された細胞傷害性又は細胞分裂阻害剤を含む抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）、ＡＤＣを含む組成物、ＡＤＣを作成する方法及びがんに罹っている対象にＡＤＣを投与することを含むがんを処置する方法を提供する。本開示は、ＥＧＦＲ、特にヒトＥＧＦＲ（ｈＥＧＦＲ）に特異的に結合するＡＤＣを提供する。本明細書に記載される抗ＥＧＦＲ  Ａｂは、重鎖定常領域にＳ２３９Ｃ突然変異を含み、番号付けはＫａｂａｔに従う。ある特定の実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体の重鎖定常領域は、Ｃ終端リジンを欠く又は重鎖定常領域のＣ終端にリジン以外のアミノ酸を含む。
2020532523.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｘ）の構造、又はその塩を含む抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）であって、
【化１】
2020532523.tif 000034
式（Ｘ）は細胞傷害性弾頭にコンジュゲートされた抗ＥＧＦＲ抗体（Ａｂ）を含み、
抗ＥＧＦＲ抗体は
配列番号３を含むＣＤＲＨ１配列、配列番号４を含むＣＤＲＨ２配列、及び配列番号５を含むＣＤＲＨ３配列を含む重鎖可変領域；
配列番号８を含むＣＤＲＬ１配列、配列番号９を含むＣＤＲＬ２配列、及び配列番号１０を含むＣＤＲＬ３配列を含む軽鎖可変領域；並びに
重鎖定常領域にＳ２３９Ｃを含む突然変異
を含み、番号付けはＫａｂａｔに従い、
抗ＥＧＦＲ抗体はＳ２３９Ｃを含む突然変異を通じて細胞障害性弾頭にコンジュゲートされており、
ｎは２である、
抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項２】
重鎖可変領域が配列番号２を含み、軽鎖可変領域が配列番号７を含む、請求項１に記載のＡＤＣ。
【請求項３】
配列番号１を含む完全重鎖、及び配列番号６を含む完全軽鎖を含む、請求項１に記載のＡＤＣ。
【請求項４】
抗ＥＧＦＲ抗体がＩｇＧ１アイソタイプを含む、請求項１に記載のＡＤＣ。
【請求項５】
抗ＥＧＦＲ抗体がＩｇＧ１アイソタイプを含む、請求項２に記載のＡＤＣ。
【請求項６】
抗ＥＧＦＲ抗体の重鎖定常領域が、Ｃ終端リジンを欠く又は重鎖定常領域のＣ終端にリジン以外のアミノ酸を含む、請求項１に記載のＡＤＣ。
【請求項７】
抗ＥＧＦＲ抗体の重鎖定常領域が、Ｃ終端リジンを欠く又は重鎖定常領域のＣ終端にリジン以外のアミノ酸を含む、請求項２に記載のＡＤＣ。
【請求項８】
抗ＥＧＦＲ抗体の重鎖定常領域が、Ｃ終端リジンを欠く又は重鎖定常領域のＣ終端にリジン以外のアミノ酸を含む、請求項３に記載のＡＤＣ。
【請求項９】
抗ＥＧＦＲ抗体がヒト化抗体である、請求項１に記載のＡＤＣ。
【請求項１０】
抗ＥＧＦＲ抗体がヒト化抗体である、請求項２に記載のＡＤＣ。
【請求項１１】
少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤、担体又は希釈剤と組み合わせた請求項１に記載のＡＤＣを含む医薬組成物。
【請求項１２】
医薬組成物の薬物−抗体比が約２である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
式（ＩＸ）の構造、又はその塩を含む抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）であって、
【化２】
2020532523.tif 000035
Ｄはピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）ダイマーを含み、Ａｂは抗ＥＧＦＲ抗体であり、ＹはＶａｌであり、ＺはＡｌａであり、ｑは１、２、３、４、５、６、７又は８であり、抗ＥＧＦＲ抗体は、
配列番号３を含むＣＤＲＨ１配列、配列番号４を含むＣＤＲＨ２配列、及び配列番号５を含むＣＤＲＨ３配列を含む重鎖可変領域；
配列番号８を含むＣＤＲＬ１配列、配列番号９を含むＣＤＲＬ２配列、及び配列番号１０を含むＣＤＲＬ３配列を含む軽鎖可変領域；
重鎖定常領域にＳ２３９Ｃを含む突然変異、
を含み、番号付けはＫａｂａｔに従い、
抗ＥＧＦＲ抗体ＡｂはＳ２３９Ｃを含む突然変異を通じて式（ＩＸ）の構造にコンジュゲートされており、
ｎは２である、
抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項１４】
ｑが５である、請求項１３に記載のＡＤＣ。
【請求項１５】
重鎖可変領域が配列番号２を含み、軽鎖可変領域が配列番号７を含む、請求項１３に記載のＡＤＣ。
【請求項１６】
重鎖が配列番号１を含み、軽鎖が配列番号６を含む、請求項１３に記載のＡＤＣ。
【請求項１７】
抗ＥＧＦＲ抗体がＩｇＧ１アイソタイプを含む、請求項１３に記載のＡＤＣ。
【請求項１８】
抗ＥＧＦＲ抗体の重鎖定常領域が、Ｃ終端リジンを欠く又は重鎖定常領域のＣ終端にリジン以外のアミノ酸を含む、請求項１４に記載のＡＤＣ。
【請求項１９】
少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤、担体又は希釈剤と組み合わせた請求項１３に記載のＡＤＣを含む医薬組成物。
【請求項２０】
医薬組成物の薬物−抗体比が約２である、請求項１９に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１７年９月２日提出の米国特許仮出願第６２／５５３，８３７号の利益を主張し、前記開示は参照によりその全体をここに組み込む。
【０００２】
本開示は、とりわけ、ヒト上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ、ＨＥＲ−１又はＥｒｂ−Ｂ１としても知られる）抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）、そのようなＡＤＣを含む組成物、ＡＤＣを作成する方法、及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
がん療法は、手術、放射線及び化学療法を含む広範囲の治療手法を含む。多くの場合、補完的な手法のおかげで、がんを処置する医師は広い選択を利用可能になるが、既存の療法は、正常で健康な細胞よりもがん細胞のほうを標的にする選択性がないこと、及び処置に対するがんの抵抗性の発現などの、いくつかの不都合を被っている。
【０００４】
抗体などの標的療法に基づくがんを処置する最近の手法は、放射線処置などの非標的療法と比べて、副作用が少ない化学療法レジメンをもたらした。抗体の抗腫瘍能力を増強するための１つの効果的な手法は、標的細胞が内部移行させることができるモノクローナル抗体に細胞傷害性薬物又は毒素を連結させることである。これらの作用物質は、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）と名付けられている。患者に投与すると、ＡＤＣはその抗体部分を介して標的細胞に結合し、内部移行されて、薬物又は毒素はその効果を発揮できるようになる（例えば、米国特許出願公開第２００５／０１８０９７２号及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５３６号参照）。
【０００５】
ヒト上皮成長因子受容体は、ｃ−ｅｒｂＢプロトオンコジーンによりコードされた１７０ｋＤａの膜貫通型受容体であり、固有のチロシンキナーゼ活性を示す（Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７３：２２８〜２３５頁（１９９６）；Ｈｅｒｂｓｔ  ａｎｄ  Ｓｈｉｎ、Ｃａｎｃｅｒ  ９４：１５９３〜１６１１頁（２００２））。ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベース登録Ｐ００５３３は、ヒトＥＧＦＲの配列を提供する。ＥＧＦＲは、細胞増殖、分化、細胞生存、アポトーシス、血管新生、有糸分裂誘発及び転移を制御するシグナル伝達経路の活性化を含むがこれに限定されないチロシンキナーゼ媒介シグナル伝達経路を通じて数多くの細胞過程を調節する（Ａｔａｌａｙら、Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １４：１３４６〜１３６３頁（２００３）；Ｔｓａｏ  ａｎｄ  Ｈｅｒｂｓｔ、Ｓｉｇｎａｌ  ４：４〜９頁（２００３）；Ｈｅｒｂｓｔ  ａｎｄ  Ｓｈｉｎ、Ｃａｎｃｅｒ  ９４：１５９３〜１６１１頁（２００２）；Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７３：２２８〜２３５頁（１９９６））。
【０００６】
ＥＧＦＲの既知のリガンドは、ＥＧＦ、ＴＧＦＡ／ＴＧＦアルファ、アンフィレギュリン、エピジェン／ＥＰＧＮ、ＢＴＣ／ベータセルリン、エピレギュリン／ＥＲＥＧ及びＨＢＥＧＦ／ヘパリン結合ＥＧＦを含む。ＥＧＦＲによるリガンド結合は、受容体ホモ−及び／又はヘテロ二量体化並びに重要な細胞質残基の自己リン酸化のきっかけとなる。リン酸化ＥＧＦＲはＧＲＢ２のようなアダプタータンパク質を動員し、これが今度は、少なくとも以下の主要な下流シグナル伝達カスケード：ＲＡＳ−ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ、ＰＩ３キナーゼ−ＡＫＴ、ＰＬＣガンマ−ＰＫＣ及びＳＴＡＴモジュールを含む複雑な下流シグナル伝達カスケードを活性化する。この自己リン酸化は、それ自体のホスホチロシン結合ＳＨ２ドメインを通じてリン酸化チロシンと会合する他のいくつかのタンパク質による下流活性化及びシグナル伝達も誘発する。これらの下流シグナル伝達タンパク質は、いくつかのシグナル伝達カスケード、主にＭＡＰＫ、Ａｋｔ及びＪＮＫ経路を開始し、細胞増殖をもたらす。ＥＧＦＲによるリガンド結合は、ＮＦ−カッパ−Ｂシグナル伝達カスケードも活性化する可能性がある。リガンド結合はＲＧＳ１６のような他のタンパク質も直接リン酸化し、そのＧＴＰアーゼ活性を活性化し、潜在的にＥＧＦ受容体シグナル伝達をＧタンパク質結合受容体シグナル伝達に連結させる。リガンド結合はＭＵＣ１もリン酸化し、ＳＲＣ及びＣＴＮＮＢ１／ベータカテニンとのその相互作用を増やす。
【０００７】
膀胱がん、脳がん、頭頚部がん、膵臓がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、結腸がん、前立腺がん及び腎臓がんを含む、数多くのヒト悪性状態においてＥＧＦＲの過剰発現が報告されている（Ａｔａｌａｙら、Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １４：１３４６〜１３６３頁（２００３）；Ｈｅｒｂｓｔ  ａｎｄ  Ｓｈｉｎ、Ｃａｎｃｅｒ  ９４：１５９３〜１６１１頁（２００２）；ａｎｄ  Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７３：２２８〜２３５頁（１９９６））。これらの状態の多くで、ＥＧＦＲの過剰発現は患者の予後不良と相関している又は関連している（Ｈｅｒｂｓｔ  ａｎｄ  Ｓｈｉｎ、Ｃａｎｃｅｒ  ９４：１５９３〜１６１１頁（２００２）；ａｎｄ  Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７３：２２８〜２３５頁（１９９６））。ＥＧＦＲは、正常な組織、特に皮膚、肝臓及び消化管の上皮組織の細胞でも発現されるが、その発現レベルは悪性細胞よりも一般的に低い（Ｈｅｒｂｓｔ  ａｎｄ  Ｓｈｉｎ、Ｃａｎｃｅｒ  ９４：１５９３〜１６１１頁（２００２））。
【０００８】
ＥＧＦＲ遺伝子の増幅（すなわち、ＥＧＦＲ遺伝子の複数のコピー）を含有する腫瘍のかなりの割合が、ｄｅ２−７  ＥＧＦＲ、ΔＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ又はΔ２−７（本明細書では互換的に使用される用語）として知られる受容体の切断型（Ｗｉｋｓｔｒａｎｄら、（１９９８）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｖｉｒｏｌ．４、１４８〜１５８頁）も共発現する（Ｏｌａｐａｄｅ−Ｏｌａｏｐａら、（２０００）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．８２、１８６〜９４頁）。ｄｅ２−７  ＥＧＦＲに見られる再編成により、エキソン２〜７にまたがる８０１のヌクレオチドを欠くインフレーム成熟ｍＲＮＡが生じる（Ｗｏｎｇら、（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９、２９６５〜９頁；Ｙａｍａｚａｋｉら、（１９９０）Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．８１、７７３〜９頁；Ｙａｍａｚａｋｉら、（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８、１８１６〜２０頁；ａｎｄ  Ｓｕｇａｗａら、（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７、８６０２〜６頁）。対応するＥＧＦＲタンパク質は、細胞外ドメインの残基６〜２７３を含む２６７アミノ酸の欠失及び融合接合点の新規のグリシン残基を有する（Ｓｕｇａｗａら、１９９０年）。この欠失は、グリシン残基の挿入と併せて、欠失境界面で独特の接合ペプチドを産生する（Ｓｕｇａｗａら、１９９０年）。
【０００９】
ＥＧＦＲｖＩＩＩは、神経膠腫、乳がん、肺がん、卵巣がん及び前立腺がんを含むいくつかの腫瘍タイプにおいて報告されている（Ｗｉｋｓｔｒａｎｄら、（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７、４１３０〜４０頁；Ｏｌａｐａｄｅ−Ｏｌａｏｐａら、（２０００）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．８２、１８６〜９４頁；Ｗｉｋｓｔｒａｎｄら、（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５、３１４０〜８頁；Ｇａｒｃｉａ  ｄｅ  Ｐａｌａｚｚｏら、（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３、３２１７〜２０頁）。この切断型受容体はリガンドには結合しないが、低い構成的活性を有し、ヌードマウスにおいて腫瘍異種移植片として成長させた神経膠腫細胞に著しい増殖優位性を分け与え（Ｎｉｓｈｉｋａｗａら、（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１、７７２７〜３１頁）、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（Ｂａｔｒａら、（１９９５）Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．６、１２５１〜９頁）及びＭＣＦ−７細胞を形質転換することができる。神経膠腫細胞中でｄｅ２−７  ＥＧＦＲが利用する細胞機構は十分には定義されていないが、アポトーシスの減少（Ｎａｇａｎｅら、（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６、５０７９〜８６頁）及び増殖のわずかな増強（Ｎａｇａｎｅら、１９９６年）を含むことが報告されている。この切断型受容体の発現は腫瘍細胞に制限されているので、この受容体は抗体療法のための高度に特異的な標的を表している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００５／０１８０９７２号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００５／０１２３５３６号明細書
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７３：２２８〜２３５頁（１９９６）
【非特許文献２】Ｈｅｒｂｓｔ  ａｎｄ  Ｓｈｉｎ、Ｃａｎｃｅｒ  ９４：１５９３〜１６１１頁（２００２）
【非特許文献３】Ａｔａｌａｙら、Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １４：１３４６〜１３６３頁（２００３）
【非特許文献４】Ｔｓａｏ  ａｎｄ  Ｈｅｒｂｓｔ、Ｓｉｇｎａｌ  ４：４〜９頁（２００３）
【非特許文献５】Ｗｉｋｓｔｒａｎｄら、（１９９８）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｖｉｒｏｌ．４、１４８〜１５８頁
【非特許文献６】Ｏｌａｐａｄｅ−Ｏｌａｏｐａら、（２０００）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．８２、１８６〜９４頁
【非特許文献７】Ｗｏｎｇら、（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９、２９６５〜９頁
【非特許文献８】Ｙａｍａｚａｋｉら、（１９９０）Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．８１、７７３〜９頁
【非特許文献９】Ｙａｍａｚａｋｉら、（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８、１８１６〜２０頁
【非特許文献１０】Ｓｕｇａｗａら、（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７、８６０２〜６頁
【非特許文献１１】Ｗｉｋｓｔｒａｎｄら、（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７、４１３０〜４０頁
【非特許文献１２】Ｗｉｋｓｔｒａｎｄら、（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５、３１４０〜８頁
【非特許文献１３】Ｇａｒｃｉａ  ｄｅ  Ｐａｌａｚｚｏら、（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３、３２１７〜２０頁
【非特許文献１４】Ｎｉｓｈｉｋａｗａら、（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１、７７２７〜３１頁
【非特許文献１５】Ｂａｔｒａら、（１９９５）Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．６、１２５１〜９頁
【非特許文献１６】Ｎａｇａｎｅら、（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６、５０７９〜８６頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、がんの処置における治療目的で使用することが可能な抗ＥＧＦＲ抗体及びＡＤＣの必要性が当技術分野には残されている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の要旨）
本開示は、リンカーを経て抗ＥＧＦＲ抗体に連結された細胞傷害性又は細胞分裂阻害剤を含む抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）、ＡＤＣを含む組成物、ＡＤＣを作成する方法及びがんに罹っている対象にＡＤＣを投与することを含むがんを処置する方法を提供する。実施例においてさらに詳細に記載されるように、かついかなる特定の動作理論にも縛られるつもりもないが、本明細書に含まれるデータは、特定のリンカー並びに特定の細胞傷害性及び／又は細胞分裂阻害剤（すなわち、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）ダイマー）を含む抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣが強力な抗腫瘍活性を発揮することを実証している。さらに、本開示の抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣは、固定された低い薬物負荷を特徴とし、これが驚くべきことに高度に効果的なＡＤＣを提供する。
【００１４】
したがって、実施形態では、本開示は、ＥＧＦＲ、特にヒトＥＧＦＲ（ｈＥＧＦＲ）に特異的に結合するＡＤＣを提供する。
【００１５】
実施形態では、本開示は、リンカーを経て抗体に連結された細胞傷害性及び／又は細胞分裂阻害剤を含む抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を提供し、ＡＤＣは構造式（Ｉ）：
［Ｄ−Ｌ−ＸＹ］ｎ−Ａｂ
（Ｉ）
に従った化合物、又はその塩であり、Ｄはピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）ダイマーを含み、Ｌはリンカーであり、Ａｂは抗ヒト上皮成長因子受容体抗体である。実施形態では、抗ＥＧＦＲ  Ａｂは、（ｉ）配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲＨ１ドメイン；配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲＨ２ドメイン；配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲＨ３ドメイン；（ｉｉ）配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲＬ１ドメイン；配列番号９に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲＬ２ドメイン；配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲＬ３ドメイン；及び（ｉｉｉ）重鎖定常領域にＳ２３９Ｃを含む突然変異を含み、番号付けはＫａｂａｔに従っている。ＸＹは、Ｓ２３９Ｃ突然変異を通じてリンカーＬを抗体Ａｂに連結する共有結合を表す。実施形態では、ｎは任意の整数である。実施形態では、ｎは２である。実施形態では、抗体Ａｂは、配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する。実施形態では、抗体Ａｂは、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する。実施形態では、ＸＹはマレイミド−スルフヒドリル連鎖である。実施形態では、Ｌは、式ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ又はＩＸに記載されるリンカーを含む。例えば、実施形態では、Ｌは式ＩＸに記載されるリンカーを含む。実施形態では、リンカーは、マレイミドカプロイル−バリン−アラニン（ｍｃ−Ｖａｌ−Ａｌａ）リンカーである。実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体はＩｇＧ１アイソタイプを含む。ある特定の実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体の重鎖定常領域は、Ｃ終端リジンを欠く又は重鎖定常領域のＣ終端にリジン以外のアミノ酸を含む。実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体はヒト化抗体である。
【００１６】
実施形態では、本開示は、リンカーを経て抗体に連結された細胞傷害性及び／又は細胞分裂阻害剤を含む抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を提供し、抗体薬物コンジュゲートは構造式（Ｉ）：
［Ｄ−Ｌ−ＸＹ］ｎ−Ａｂ
（Ｉ）
に従った化合物、又はその塩であり、Ｄはピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）ダイマーを含み、Ｌはリンカーであり、Ａｂは（ｉ）配列番号２を含む重鎖可変領域、（ｉｉ）配列番号７を含む軽鎖可変領域、及び（ｉｉｉ）重鎖定常領域にＳ２３９Ｃを含む突然変異を含む抗ＥＧＦＲ抗体であり、番号付けはＫａｂａｔに従い、ＸＹはリンカーＬを抗体Ａｂに連結する共有結合を表し、ｎは任意の整数である。実施形態では、ｎは２又は４である。実施形態では、ｎは２である。実施形態では、ＸＹは、抗体Ａｂ上のスルフヒドリル基で形成される連鎖である。実施形態では、ＸＹはマレイミド−スルフヒドリル連鎖である。実施形態では、Ｌは、式ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ又はＩＸに記載されるリンカーを含む。実施形態では、Ｌは式ＩＸに記載されるリンカーを含む。実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体はＩｇＧ１アイソタイプを含む。実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体の重鎖定常領域は、Ｃ終端リジンを欠く又は重鎖定常領域のＣ終端にリジン以外のアミノ酸を含む。実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体はヒト化抗体である。
【００１７】
実施形態では、本開示は、リンカーを経て抗体に連結された細胞傷害性及び／又は細胞分裂阻害剤を含む抗体薬物コンジュゲートを提供し、抗体薬物コンジュゲートは構造式（Ｉ）：
［Ｄ−Ｌ−ＸＹ］ｎ−Ａｂ
（Ｉ）
に従った化合物、又はその塩であり、Ｄはピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）ダイマーを含み、Ｌはリンカーであり、Ａｂは（ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む重鎖、（ｉｉ）配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗ＥＧＦＲ抗体であり、ＸＹはリンカーＬを抗体Ａｂに連結する共有結合を表し、ｎは任意の整数である。実施形態では、ｎは２又は４である。実施形態では、ｎは２である。実施形態では、ＸＹは、抗体Ａｂ上のスルフヒドリル基で形成される連鎖である。実施形態では、ＸＹはマレイミド−スルフヒドリル連鎖である。実施形態では、Ｌは、式ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ又はＩＸに記載されるリンカーを含む。実施形態では、Ｌは式ＩＸに記載されるリンカーを含む。実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体はＩｇＧ１アイソタイプを含む。実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体の重鎖定常領域は、Ｃ終端リジンを欠く又は重鎖定常領域のＣ終端にリジン以外のアミノ酸を含む。実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体はヒト化抗体である。
【００１８】
実施形態では、本開示は、式（Ｘ）：
【００１９】
【化１】
2020532523.tif 000003
の構造を含むＡＤＣ、又はその塩を特色とし、Ａｂは、（ｉ）配列番号３を含むＣＤＲＨ１配列、配列番号４を含むＣＤＲＨ２配列、及び配列番号５を含むＣＤＲＨ３配列を含む重鎖可変領域；（ｉｉ）配列番号８を含むＣＤＲＬ１配列、配列番号９を含むＣＤＲＬ２配列、及び配列番号１０を含むＣＤＲＬ３配列を含む軽鎖可変領域；（ｉｉｉ）重鎖定常領域にＳ２３９Ｃを含む突然変異を含む抗ＥＧＦＲ抗体を含み、番号付けはＫａｂａｔに従い、ｎは２である。実施形態では、重鎖可変領域は配列番号２を含み、軽鎖可変領域は配列番号７を含む。実施形態では、ＡＤＣは、配列番号１を含む完全重鎖、及び配列番号６を含む完全軽鎖を含む。実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体はＩｇＧ１アイソタイプを含む。実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体の重鎖定常領域は、Ｃ終端リジンを欠く又は重鎖定常領域のＣ終端にリジン以外のアミノ酸を含む。実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体はヒト化抗体である。
【００２０】
実施形態では、本開示は、式（Ｘ）：
【００２１】
【化２】
2020532523.tif 000004
の構造を含むＡＤＣ、又はその塩を特色とし、Ａｂは、（ｉ）配列番号２を含む重鎖可変領域、（ｉｉ）配列番号７を含む軽鎖可変領域、（ｉｉｉ）重鎖定常領域にＳ２３９Ｃを含む突然変異を含む抗ＥＧＦＲ抗体を含み、番号付けはＫａｂａｔに従い、ｎは２である。実施形態では、重鎖可変領域は配列番号２を含み、軽鎖可変領域は配列番号７を含む。実施形態では、ＡＤＣは、配列番号１を含む完全重鎖、及び配列番号６を含む完全軽鎖を含む。実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体はＩｇＧ１アイソタイプを含む。実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体の重鎖定常領域は、Ｃ終端リジンを欠く又は重鎖定常領域のＣ終端にリジン以外のアミノ酸を含む。実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体はヒト化抗体である。
【００２２】
実施形態では、本開示は、式（Ｘ）：
【００２３】
【化３】
2020532523.tif 000005
の構造を含むＡＤＣ、又はその塩を特色とし、Ａｂは、（ｉ）配列番号１を含む重鎖；（ｉｉ）配列番号６を含む軽鎖を含む抗ＥＧＦＲ抗体を含み、ｎは２である。
【００２４】
実施形態では、本開示は、本明細書に記載されるＡＤＣを含む組成物を提供する。実施形態では、組成物は、少なくとも１つの賦形剤、担体及び／又は希釈剤をさらに含む。実施形態では、本開示の組成物はヒトにおける製薬学的使用のために処方される。
【００２５】
実施形態では、本開示はＡＤＣを作成する方法であって、抗ＥＧＦＲ抗体を構造式（Ｉａ）Ｄ−Ｌ−ＲＸに従ったシントンに接触させることを含み、Ｄは細胞膜を横切ることができる細胞傷害性及び／又は細胞分裂阻害剤であり、Ｌはリソソーム酵素により切断することができるリンカーであり、ＲＸはシントンがシントンを抗体に共有結合させる条件下でシントンを抗体に共有結合させることができる官能基を含み、ＤはＰＢＤダイマーであり、抗体は配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む方法を提供する。
【００２６】
実施形態では、本開示はＡＤＣを作成する方法であって、抗ＥＧＦＲ抗体を構造式（Ｉａ）Ｄ−Ｌ−ＲＸに従ったシントンに接触させることを含み、Ｄは細胞膜を横切ることができる細胞傷害性及び／又は細胞分裂阻害剤であり、Ｌはリソソーム酵素により切断することができるリンカーであり、ＲＸはシントンがシントンを抗体に共有結合させる条件下でシントンを抗体に共有結合させることができる官能基を含み、ＤはＰＢＤダイマーであり、抗体は（ｉ）配列番号３を含むＣＤＲＨ１配列、配列番号４を含むＣＤＲＨ２配列、及び配列番号５を含むＣＤＲＨ３配列を含む重鎖可変領域；（ｉｉ）配列番号８を含むＣＤＲＬ１配列、配列番号９を含むＣＤＲＬ２配列、及び配列番号１０を含むＣＤＲＬ３配列を含む軽鎖可変領域；並びに（ｉｉｉ）重鎖定常領域にＳ２３９Ｃを含む突然変異を含み、番号付けはＫａｂａｔに従う方法を提供する。実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体はＩｇＧ１アイソタイプを含む。実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体の重鎖定常領域は、Ｃ終端リジンを欠く又は重鎖定常領域のＣ終端にリジン以外のアミノ酸を含む。実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体はヒト化抗体である。
【００２７】
実施形態では、本開示はＡＤＣを作成する方法であって、抗ＥＧＦＲ抗体を構造式（Ｉａ）Ｄ−Ｌ−ＲＸに従ったシントンに接触させることを含み、Ｄは細胞膜を横切ることができる細胞傷害性及び／又は細胞分裂阻害剤であり、Ｌはリソソーム酵素により切断することができるリンカーであり、ＲＸはシントンがシントンを抗体に共有結合させる条件下でシントンを抗体に共有結合させることができる官能基を含み、ＤはＰＢＤダイマーであり、抗体は（ｉ）配列番号３を含むＣＤＲＨ１配列、配列番号４を含むＣＤＲＨ２配列、及び配列番号５を含むＣＤＲＨ３配列を含む重鎖可変領域；（ｉｉ）配列番号８を含むＣＤＲＬ１配列、配列番号９を含むＣＤＲＬ２配列、及び配列番号１０を含むＣＤＲＬ３配列を含む軽鎖可変領域；並びに（ｉｉｉ）重鎖定常領域にＳ２３９Ｃを含む突然変異を含み、番号付けはＫａｂａｔに従い、ＲＸはスルフヒドリル基又はマレイミド−スルフヒドリル基である、方法を提供する。実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体はＩｇＧ１アイソタイプを含む。実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体の重鎖定常領域は、Ｃ終端リジンを欠く又は重鎖定常領域のＣ終端にリジン以外のアミノ酸を含む。実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体はヒト化抗体である。
【００２８】
実施形態では、本開示はＡＤＣを作成する方法であって、抗ＥＧＦＲ抗体を構造式（Ｉａ）Ｄ−Ｌ−ＲＸに従ったシントンに接触させることを含み、Ｄは細胞膜を横切ることができる細胞傷害性及び／又は細胞分裂阻害剤であり、Ｌはリソソーム酵素により切断することができるリンカーであり、ＲＸはシントンを抗体に連結させることができる官能基を含み、ＤはＰＢＤダイマーであり、Ｌは式ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ又はＩＸに記載されるリンカーを含み、抗体は（ｉ）配列番号３を含むＣＤＲＨ１配列、配列番号４を含むＣＤＲＨ２配列、及び配列番号５を含むＣＤＲＨ３配列を含む重鎖可変領域；（ｉｉ）配列番号８を含むＣＤＲＬ１配列、配列番号９を含むＣＤＲＬ２配列、及び配列番号１０を含むＣＤＲＬ３配列を含む軽鎖可変領域；並びに（ｉｉｉ）重鎖定常領域にＳ２３９Ｃを含む突然変異を含み、番号付けはＫａｂａｔに従い、ＲＸはスルフヒドリル基又はマレイミド−スルフヒドリル基である、方法を提供する。実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体はＩｇＧ１アイソタイプを含む。実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体の重鎖定常領域は、Ｃ終端リジンを欠く又は重鎖定常領域のＣ終端にリジン以外のアミノ酸を含む。実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体はヒト化抗体である。
【００２９】
実施形態では、本開示はＡＤＣを作成する方法であって、抗ＥＧＦＲ抗体を構造式（Ｉａ）Ｄ−Ｌ−ＲＸに従ったシントンに接触させることを含み、Ｄは細胞膜を横切ることができる細胞傷害性及び／又は細胞分裂阻害剤であり、Ｌはリソソーム酵素により切断することができるリンカーであり、ＲＸはシントンを抗体に連結させることができる官能基を含み、ＤはＰＢＤダイマーであり、Ｌは式ＩＸに記載されるリンカーを含み、抗体は（ｉ）配列番号３を含むＣＤＲＨ１配列、配列番号４を含むＣＤＲＨ２配列、及び配列番号５を含むＣＤＲＨ３配列を含む重鎖可変領域；（ｉｉ）配列番号８を含むＣＤＲＬ１配列、配列番号９を含むＣＤＲＬ２配列、及び配列番号１０を含むＣＤＲＬ３配列を含む軽鎖可変領域；並びに（ｉｉｉ）重鎖定常領域にＳ２３９Ｃを含む突然変異を含み、番号付けはＫａｂａｔに従い、ＲＸはスルフヒドリル基又はマレイミド−スルフヒドリル基である、方法を提供する。実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体はＩｇＧ１アイソタイプを含む。実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体の重鎖定常領域は、Ｃ終端リジンを欠く又は重鎖定常領域のＣ終端にリジン以外のアミノ酸を含む。実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体はヒト化抗体である。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】ＥＧＦＲ並びにＡｂ１及びＡｂ２（セツキシマブの同じ６つのＣＤＲアミノ酸配列を有する抗体）が結合している領域の模式図を示す図である。
【図２】ＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤの調製物を示す図である。コンジュゲーション過程は、実施例２に記載されるように、鎖間ジスルフィドの還元、量的酸化及び過剰なＰＢＤ薬物リンカーとのコンジュゲーションからなる。
【図３】Ａｂ１及びＡｂＡの可変重（ＶＨ）及び可変軽（ＶＬ）鎖領域アミノ酸配列を提供する図である。ＶＨ及びＶＬ領域内のＣＤＲ配列はボックスに入っており、Ａｂ１  ＶＨ配列とＡｂＡ  ＶＨ配列の違いはシェードを付けている。
【図４】Ａｂ１及びＡｂＡの完全長軽及び重鎖を記載する図である。重鎖中のＡｂ１配列とＡｂＡ配列の違いは強調されている。
【図５】ヒト細胞へのＡｂ１及びＡｂＡ、Ｓ２３９Ｃ変異型Ａｂ１（Ｓ２３９Ｃ）及びＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）、並びにＰＢＤコンジュゲートＡｂ１（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤ及びＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤのフローサイトメトリー分析を示す図である。増加する濃度の抗体を、Ａｂ１及びＡｂＡにより認識されるＥＧＦＲエピトープが露出している野生型ＥＧＦＲ過剰発現（図５Ａ）及びＥＧＦＲ  ＣＡ変異体過剰発現（図５Ｂ）ＮＲ６細胞に添加した。実施例３に示され記載されるように、Ｃｙｓ−操作ＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）をＰＢＤにコンジュゲートしても、親抗体ＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）又はＡｂＡと比べて、結合特性は変更されない。
【図６】いくつかの他のＥＧＦＲ過剰発現細胞株と比べた、ＳＷ−４８（ＥＧＦＲを発現する結腸直腸腺癌細胞株、細胞あたり＞２００，０００受容体、ＩＨＣ  Ｈ−スコア２２８）、ＮＣＩ−Ｈ４４１（中程度から低ＥＧＦＲ発現の肺腺腫異種移植片、細胞あたり約１００，０００受容体；ＩＨＣ  Ｈ−スコア１５０）及びＬｏＶｏ（ＥＧＦＲ発現がさらに低いＫＲＡＳ変異結腸直腸腺癌、細胞あたり＜１００，０００受容体；ＩＨＣ  Ｈ−スコア１４０）についてのＥＧＦＲ数を示す図である。細胞表面密度（細胞あたりの抗原結合力）は、セツキシマブでのＱＩＦＩＴアッセイを使用する培養細胞上での細胞表面抗原のＦＡＣＳ分析により決定した。
【図７Ａ】異なるレベルの表面ＥＧＦＲ（すなわち、低、中程度又は高発現のＥＧＦＲ）を発現する腫瘍細胞株のパネルに対する対応するオーリスタチンコンジュゲート（ＡｂＡ−ＭＭＡＥ）と比べたＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤの改善された細胞障害活性を示す図である。ＳＷ−４８（図７Ａ）、ＮＣＩ−Ｈ４４１（図７Ｂ）、ＬｏＶｏ（図７Ｃ）及びＡ４３１（図７Ｄ）腫瘍細胞は９６ウェルプレートに蒔き、ＡＤＣを示されている濃度で添加した。３７℃で７２時間後、ＡＴＰｌｉｔｅ発光アッセイを使用して細胞生存率を評価した。図７Ａ〜Ｄに示されるように、ＥＧＦＲ発現レベルごとに、対応するオーリスタチンコンジュゲート（ＡｂＡ−ＭＭＡＥ  ＡＤＣ）と比べた場合、ＰＢＤコンジュゲートＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤを用いた処置に続く４つの細胞株すべてにおいて細胞障害活性が改善されていた。
【図７Ｂ】異なるレベルの表面ＥＧＦＲ（すなわち、低、中程度又は高発現のＥＧＦＲ）を発現する腫瘍細胞株のパネルに対する対応するオーリスタチンコンジュゲート（ＡｂＡ−ＭＭＡＥ）と比べたＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤの改善された細胞障害活性を示す図である。ＳＷ−４８（図７Ａ）、ＮＣＩ−Ｈ４４１（図７Ｂ）、ＬｏＶｏ（図７Ｃ）及びＡ４３１（図７Ｄ）腫瘍細胞は９６ウェルプレートに蒔き、ＡＤＣを示されている濃度で添加した。３７℃で７２時間後、ＡＴＰｌｉｔｅ発光アッセイを使用して細胞生存率を評価した。図７Ａ〜Ｄに示されるように、ＥＧＦＲ発現レベルごとに、対応するオーリスタチンコンジュゲート（ＡｂＡ−ＭＭＡＥ  ＡＤＣ）と比べた場合、ＰＢＤコンジュゲートＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤを用いた処置に続く４つの細胞株すべてにおいて細胞障害活性が改善されていた。
【図７Ｃ】異なるレベルの表面ＥＧＦＲ（すなわち、低、中程度又は高発現のＥＧＦＲ）を発現する腫瘍細胞株のパネルに対する対応するオーリスタチンコンジュゲート（ＡｂＡ−ＭＭＡＥ）と比べたＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤの改善された細胞障害活性を示す図である。ＳＷ−４８（図７Ａ）、ＮＣＩ−Ｈ４４１（図７Ｂ）、ＬｏＶｏ（図７Ｃ）及びＡ４３１（図７Ｄ）腫瘍細胞は９６ウェルプレートに蒔き、ＡＤＣを示されている濃度で添加した。３７℃で７２時間後、ＡＴＰｌｉｔｅ発光アッセイを使用して細胞生存率を評価した。図７Ａ〜Ｄに示されるように、ＥＧＦＲ発現レベルごとに、対応するオーリスタチンコンジュゲート（ＡｂＡ−ＭＭＡＥ  ＡＤＣ）と比べた場合、ＰＢＤコンジュゲートＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤを用いた処置に続く４つの細胞株すべてにおいて細胞障害活性が改善されていた。
【図７Ｄ】異なるレベルの表面ＥＧＦＲ（すなわち、低、中程度又は高発現のＥＧＦＲ）を発現する腫瘍細胞株のパネルに対する対応するオーリスタチンコンジュゲート（ＡｂＡ−ＭＭＡＥ）と比べたＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤの改善された細胞障害活性を示す図である。ＳＷ−４８（図７Ａ）、ＮＣＩ−Ｈ４４１（図７Ｂ）、ＬｏＶｏ（図７Ｃ）及びＡ４３１（図７Ｄ）腫瘍細胞は９６ウェルプレートに蒔き、ＡＤＣを示されている濃度で添加した。３７℃で７２時間後、ＡＴＰｌｉｔｅ発光アッセイを使用して細胞生存率を評価した。図７Ａ〜Ｄに示されるように、ＥＧＦＲ発現レベルごとに、対応するオーリスタチンコンジュゲート（ＡｂＡ−ＭＭＡＥ  ＡＤＣ）と比べた場合、ＰＢＤコンジュゲートＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤを用いた処置に続く４つの細胞株すべてにおいて細胞障害活性が改善されていた。
【図８Ａ】ＮＣＩ−Ｈ４４１肺腺腫異種移植片モデルにおけるＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤのインビボ有効性を示すグラフである。丸カッコ内の数字は、ｍｇ／ｋｇでの用量を表している。矢印は投与日を表している。図８Ａに示され実施例５に記載されるように、ＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤは、０．３ｍｇ／ｋｇで投与され、動物の１００％で完全な及び永続的後退を誘導した。
【図８Ｂ】ＬｏＶｏ結腸直腸腺癌異種移植片腫瘍モデルにおけるＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤのインビボ有効性を示すグラフである。丸カッコ内の数字は、ｍｇ／ｋｇでの用量を表している。矢印は投与日を表している。図８Ｂに示され実施例５に記載されるように、対応するＥＧＦＲ  ＡＤＣ（ＡｂＡ−ＭＭＡＥ）はこのモデルにおいて活性を示したが、ＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤよりもはるかに高用量（具体的には、１０倍の用量）での投与が必要であった。
【図９Ａ】ＳＷ−４８結腸直腸がん異種移植片腫瘍モデルにおけるＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤ及びＡｂ１（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤのインビボ有効性を示す図である。丸カッコ内の数字は、ｍｇ／ｋｇでの用量を表している。矢印は投与日を表している。
【図９Ｂ】ＳＷ−４８結腸直腸がん異種移植片腫瘍モデルにおけるＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤ及びＡｂ１（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤのインビボ有効性を示す図である。丸カッコ内の数字は、ｍｇ／ｋｇでの用量を表している。矢印は投与日を表している。
【図１０Ａ】患者由来異種移植片モデルＣＴＧ−０１６２（ＮＳＣＬＣ）（図１０Ａ）におけるＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤ及びＡｂ１（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤのインビボ有効性を示す図である。丸カッコ内の数字は、ｍｇ／ｋｇでの用量を表し、矢印は投与日を表している。図１０Ａに示され実施例５で考察されるように、ＣＴＧ−０１６２  ＮＳＣＬＣモデルでは、ＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤ及びＡｂ１（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤは腫瘍成長を阻害するのに非常に効果的であり、ＡｂＡ−ＭＭＡＥは、ＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤ又はＡｂ１（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤの１０倍投与されたにもかかわらず、有効性は低かった。
【図１０Ｂ】患者由来異種移植片ＣＴＧ−０７８６頭頚部がん（ＨＮＣ）モデルにおけるＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤ及びＡｂ１（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤのインビボ有効性を示す図である。丸カッコ内の数字は、ｍｇ／ｋｇでの用量を表し、矢印は投与日を表している。図１０Ｂに示され実施例５で考察されるように、ＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤ及びＡｂ１（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤは腫瘍成長を阻害するのに効果的であり、オーリスタチンベースのＡＤＣ  ＡｂＡ−ＭＭＡＥは効力を達成するのにはるかに高用量を必要とした。
【図１１Ａ】ＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）についてのタンパク質凝集及び断片化を示すグラフである。パーセント（％）凝集体及び％断片は時間「０」（ｔ０）で、並びに１日あたりのパーセント断片増加及び１日あたりのパーセント凝集体増加として示される。実施例６に示され記載されているように、ＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）ｍＡｂ及びＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤ  ＤＡＲ２のインビトロ血漿安定性は、ＡｂＡ−ｖｃＭＭＡＥよりよいわけではないにしても類似していた。
【図１１Ｂ】ＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤ  ＤＡＲ２についてのタンパク質凝集及び断片化を示すグラフである。パーセント（％）凝集体及び％断片は時間「０」（ｔ０）で、並びに１日あたりのパーセント断片増加及び１日あたりのパーセント凝集体増加として示される。実施例６に示され記載されているように、ＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）ｍＡｂ及びＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤ  ＤＡＲ２のインビトロ血漿安定性は、ＡｂＡ−ｖｃＭＭＡＥよりよいわけではないにしても類似していた。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本開示は、ＥＧＦＲを標的にする抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）及びその使用に関する。本開示のＡＤＣは、先行技術で開示された他のＡＤＣよりも明確な利点を提供する有利な属性を有する。例えば、本開示のＡＤＣは、下の実施例３〜５に示されるように、本質的に同じ抗体骨格を使用するオーリスタチンベースのＡＤＣよりも相当強力である。すなわち、本開示のＡＤＣは、（１）同じ用量を投与された場合対応するオーリスタチンＡＤＣよりも大きな効力を示し、（２）かなり低い（すなわち、１０分の１）用量で投与される場合、対応するオーリスタチンＡＤＣに類似する効力を示す。さらに、本開示のＡＤＣは、下の実施例６に示されるように、種々の条件下で安定している。本開示の抗体は、高い程度の効力を保持しつつ、約２（又は約２の平均薬物対抗体比）の低単一種薬物負荷も有する。
【００３２】
したがって、本開示は、リンカーを経て抗ＥＧＦＲ抗体に連結された細胞傷害性及び／又は細胞分裂阻害剤（例えば、ＰＢＤ）を含む抗体薬物コンジュゲート、本開示のＡＤＣを含む組成物、本開示のＡＤＣを作成する方法及びＥＧＦＲの過剰発現又は増殖に関連するがんなどのがんを処置するためにＡＤＣを使用する方法に関する。
【００３３】
実施形態では、本開示は、式（Ｘ）：
【００３４】
【化４】
2020532523.tif 000006
の構造を含むＡＤＣ、又はその塩を特色とし、Ａｂは、（ｉ）配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲＨ１ドメイン；配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲＨ２ドメイン；配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲＨ３ドメインを含む重鎖可変領域；（ｉｉ）配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲＬ１ドメイン；配列番号９に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲＬ２ドメイン；配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲＬ３ドメインを含む軽鎖可変領域；（ｉｉｉ）重鎖定常領域にＳ２３９Ｃを含む突然変異、番号付けはＫａｂａｔに従い、及び（ｉｖ）ｎは２である、を含む抗ＥＧＦＲ抗体を含む。
【００３５】
実施形態では、本開示は、式（Ｘ）：
【００３６】
【化５】
2020532523.tif 000007
の構造を含むＡＤＣ、又はその塩を特色とし、Ａｂは、（ｉ）配列番号２を含む重鎖可変領域、（ｉｉ）配列番号７を含む軽鎖可変領域；（ｉｉｉ）重鎖定常領域にＳ２３９Ｃを含む突然変異、番号付けはＫａｂａｔに従い、及び（ｉｖ）ｎは２である、を含む抗ＥＧＦＲ抗体を含む。
【００３７】
実施形態では、本開示は、式（Ｘ）：
【００３８】
【化６】
2020532523.tif 000008
の構造を含むＡＤＣ、又はその塩を特色とし、Ａｂは、（ｉ）配列番号１を含む重鎖、（ｉｉ）配列番号６を含む軽鎖；及び（ｉｉｉ）ｎは２である、を含む抗ＥＧＦＲ抗体を含む。
【００３９】
実施形態では、本開示は、リンカーを経て抗ＥＧＦＲ抗体に連結された細胞傷害性及び／又は細胞分裂阻害剤を含むＡＤＣを特色とし、ＡＤＣは構造式（Ｉ）：
［Ｄ−Ｌ−ＸＹ］ｎＡｂ
（Ｉ）
に従った化合物、又はその塩であり、Ｄはピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）ダイマーを含み、Ｌはリンカーであり、Ａｂは配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号６を含む軽鎖を含む抗ＥＧＦＲ抗体であり、ＸＹはリンカーＬを抗体Ａｂに連結する共有結合を表し、ｎは整数である。特に、本明細書に記載される特定のリンカー並びに特定の細胞傷害性及び／又は細胞分裂阻害剤（例えば、ＰＢＤダイマー）を含む抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣは、特に、オーリスタチンに連結された本質的に同じ抗体を含むＡＤＣと比べた場合、驚くほど強力な抗腫瘍活性を発揮する。さらに、本開示の抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣは低い固定単一種薬物負荷を特徴とし、これにより、驚くべきことに、例えば、高又は低レベルのＥＧＦＲ発現と関連するがんを処置するのに高度に効果的なＡＤＣが得られる。本明細書の実施例に記載されているように、ＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤは、対応するＡｂＡオーリスタチンＡＤＣよりも強力なコンジュゲートである。本明細書で使用される場合、「ＡｂＡ」とは、配列番号１１を含む重鎖及び配列番号６を含む軽鎖を有する抗体のことである。「ＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）」とは、配列番号１を含む重鎖及び配列番号６を含む軽鎖を有する抗体のことである。ＡｂＡはＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）と同じ重鎖配列を有するが、２９３位（Ｋａｂａｔ番号付け）にセリンがある。
【００４０】
当業者であれば認識するように、抗体及び／又は結合断片は実際には「モジュラー」である。本開示全体を通じて、抗体及び／又は結合断片を含む種々の「モジュール」の様々な特定の実施形態が記載される。特定の非限定的例として、可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ、ＶＨ鎖、可変軽鎖（ＶＬ）ＣＤＲ及びＶＬ鎖の様々な特定の実施形態が記載される。本明細書に開示されるＡＤＣも実際には「モジュラー」である。本開示全体を通じて、ＡＤＣを含む種々の「モジュール」の様々な特定の実施形態が記載される。特定の非限定的例として、ＡＤＣを構成してもよい抗体、リンカー並びに細胞傷害性及び／又は細胞分裂阻害剤の特定の実施形態が記載される。
【００４１】
本明細書に記載されるＡＤＣは、塩、及び一部の特定の実施形態では、薬学的に許容される塩の形態でもよい。十分に酸性の、十分に塩基性の、又は両方の官能基を有する本開示のＡＤＣは、いくつかの無機塩、並びに無機及び有機酸のいずれかと反応して塩を形成することが可能である。
【００４２】
本明細書で別段に定義されなければ、本開示に関連して使用される科学及び専門用語は、当業者が一般に理解している意味を有するものとする。
【００４３】
用語「抗上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体抗体」又は「抗ＥＧＦＲ抗体」は、本明細書では互換的に使用されるが、ＥＧＦＲに特異的に結合する抗体のことである。目的の抗原、すなわち、ＥＧＦＲ「に結合する」抗体とは、抗体が抗原を発現している細胞を標的にするのに有用であるように、十分な親和性でその抗原に結合することができる抗体である。好ましい実施形態では、抗体はヒトＥＧＦＲ（ｈＥＧＦＲ）に特異的に結合する。抗ＥＧＦＲ抗体の例は、下の実施例１に開示されている。別段に指示されなければ、用語「抗ＥＧＦＲ抗体」は、野生型ＥＧＦＲ又はＥＧＦＲｖＩＩＩなどのＥＧＦＲの任意の変異体に結合する抗体を指すことが意図されている。
【００４４】
野生型ヒトＥＧＦＲのアミノ酸配列は、配列番号１２として下に提供されており、シグナルペプチド（アミノ酸残基１〜２４）は下線が施されており、細胞外ドメインのアミノ酸残基（ＥＣＤ、アミノ酸残基２５〜６４５）は太字で強調されている。ＥＧＦＲの切断された野生型ＥＣＤ（本明細書ではＥＧＦＲ（１〜５２５）とも呼ばれる）は、配列番号１２のアミノ酸１〜５２５と等価である。野生型ＥＧＦＲの成熟型は、シグナルペプチドなしのタンパク質、すなわち、配列番号１２のアミノ酸残基２５〜１２１０に一致する。
【００４５】
【化７】
2020532523.tif 000009
2020532523.tif 000010
【００４６】
ヒトＥＧＦＲのＥＣＤのアミノ酸配列は配列番号１３として下に提供されており、シグナル配列（下線部）を含む。
【００４７】
【化８】
2020532523.tif 000011
【００４８】
ＥＧＦＲの全体構造は図１に記載されている。ＥＧＦＲのＥＣＤは４つのドメインを有する（Ｃｏｃｈｒａｎら、（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２８７、１４７〜１５８頁）。ドメインＩ及びＩＩＩは、リガンドに対する高親和性結合部位の形成に寄与すると示唆されてきた。ドメインＩＩ及びＩＶは、タンパク質フォールディングを安定化し可能なＥＧＦＲ二量体境界面を含有するシステイン豊富なラミニン様領域である。図は、Ａｂ１及びＡｂ２が結合している領域をさらに示している。Ａｂ１は、配列番号１５で提供される重鎖可変領域（ＶＨ）配列（それぞれ配列番号１６、１７及び１８に示されているＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３セットを有する）及び配列番号７で提供される軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列（それぞれ配列番号８、９及び１０に示されているＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３セットを有する）を有するヒト化ＥＧＦＲ抗体である。Ａｂ２は、セツキシマブの同じ６つのＣＤＲアミノ酸配列を有する抗体である。
【００４９】
ＥＧＦＲ変異体は、ＥＧＦＲ遺伝子増幅に伴う遺伝子再構成から生じる場合がある。ＥＧＦＲｖＩＩＩはヒトがんにおいてＥＧＦＲの最もよく生じる変異体である（Ｋｕａｎら、Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｌａｔ  Ｃａｎｃｅｒ．８（２）：８３〜９６頁（２００１））。遺伝子増幅の進行中、２６７アミノ酸欠失がＥＧＦＲの細胞外ドメインで起こり、グリシン残基が融合接合部で挿入されている。したがって、ＥＧＦＲｖＩＩＩは野生型ＥＧＦＲの細胞外ドメインのアミノ酸６〜２７３を欠き、接合部にグリシン残基挿入を含む。ＥＧＦＲのＥＧＦＲｖＩＩＩ変異体は、グリシンが欠失接合部に挿入されている細胞外ドメインに２６７アミノ酸残基の欠失を含有する。ＥＧＦＲｖＩＩＩアミノ酸配列は配列番号１４として下に示されている（ＥＣＤは太字で強調されておりシグナル配列は下線が施されている）。
【００５０】
【化９】
2020532523.tif 000012
【００５１】
ＥＧＦＲｖＩＩＩは、構成的シグナル伝達を通じてリガンド非依存的に腫瘍進行に寄与する。ＥＧＦＲｖＩＩＩは正常な組織において発現されることは知られていない（Ｗｉｋｓｔｒａｎｄら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５５（１４）：３１４０〜３１４８頁（１９９５）；Ｏｌａｐａｄｅ−Ｏｌａｏｐａら、Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．８２（１）：１８６〜９４頁（２０００））が、腫瘍細胞において、特に、多形神経膠芽腫において著しい発現を示す（Ｗｉｋｓｔｒａｎｄら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５５（１４）：３１４０〜３１４８頁（１９９５）；Ｇｅら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．９８（３）：３５７〜６１頁（２００２）；Ｗｉｋｓｔｒａｎｄら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５５（１４）：３１４０〜３１４８（１９９５）；Ｍｏｓｃａｔｅｌｌｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５（２３）：５５３６〜９頁（１９９５）；Ｇａｒｃｉａ  ｄｅ  Ｐａｌａｚｚｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３（１４）：３２１７〜２０（１９９３）；Ｍｏｓｃａｔｅｌｌｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５（２３）：５５３６〜９頁（１９９５）；ａｎｄ  Ｏｌａｐａｄｅ−Ｏｌａｏｐａら、２（１）：１８６〜９４頁（２０００））。
【００５２】
本明細書で使用される場合、用語「抗体」（Ａｂ）とは、特定の抗原、すなわち、ｈＥＧＦＲに特異的に結合する、又はこれと免疫学的に反応性である免疫グロブリン分子のことである。抗体は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインの両方に、高頻度可変領域としても知られる相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。可変ドメインのより高度に保存された部分はフレームワーク（ＦＲ）と呼ばれる。当技術分野で知られているように、抗体の高頻度可変領域を描写するアミノ酸位置／境界は、文脈及び当技術分野で公知の種々の定義に応じて変動することがある。可変領域内の一部の位置は、これらの位置が基準の１つのセットの下では高頻度可変領域内にあると見なすことができ、基準の異なるセットの下では高頻度可変領域の外側にあると見なされる点で、ハイブリッド高頻度可変位置と見なされる場合がある。これらの位置のうちの１つ以上は、伸長された高頻度可変領域に見出すことも可能である。天然の重及び軽鎖の可変ドメインはそれぞれが、大部分が、３つのＣＤＲにより連結された、βシート立体構造をとることにより、４つのＦＲ領域を含み、この３つのＣＤＲは、βシート構造を連結し、いくつかの場合にはβシート構造の一部を形成するループを形成する。それぞれの鎖中のＣＤＲはＦＲ領域により極めて接近して互いに保持され、もう一方の鎖由来のＣＤＲと一緒に抗体の抗原結合部位の形成に寄与している。Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．１９８７年）を参照されたい。本明細書で使用される場合、免疫グロブリンアミノ酸残基の番号付けは、別段に指示がなければ、Ｋａｂａｔらの免疫グロブリンアミノ酸残基番号付け方式に従って行われる。
【００５３】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ技術により産生される抗体に限定されない。モノクローナル抗体は、当技術分野で利用可能な又は公知であるいかなる手段によっても、任意の真核、原核又はファージクローンを含む、単一クローンに由来する。本開示に関して有用であるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え及びファージディスプレイ技術、又はこれらの組合せの使用を含む、当技術分野で公知の多種多様な技法を使用して調製することが可能である。ヒトにおける抗ＥＧＦＲ抗体を含むＡＤＣのインビボ使用を含む、本開示の多くの使用において、キメラ、霊長類化、ヒト化又はヒト抗体は好適に使用可能である。実施形態では、本開示の抗ＥＧＦＲ抗体はヒト化されている。
【００５４】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含有するキメラ免疫グロブリンである。一般に、ヒト化抗体は少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、ＣＤＲ領域のすべて又は実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域と一致し、ＦＲ領域のすべて又は実質的にすべてがヒト免疫グロブリン配列のＦＲ領域である。ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的には、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列の一部も含むことが可能である。抗体ヒト化の方法は当技術分野では公知である。
【００５５】
本開示の抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣは、ＥＧＦＲに特異的に結合することができる完全長（無傷の）抗体分子を含んでいてもよい。実施形態では、本開示のＡＤＣは完全長ＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）抗体を含む。
【００５６】
用語「細胞傷害性及び／又は細胞分裂阻害剤」は、本明細書で使用される場合、細胞の成長及び／若しくは複製を阻害する、並びに／又は細胞を殺傷することが知られている任意の作用物質又は薬物を指すことが意図されている。一実施形態では、細胞傷害性及び／又は細胞分裂阻害剤は、ピロロベンゾジアゼピン（「ＰＢＤ」）及びＰＢＤダイマーなどの細胞浸透性ＤＮＡ副溝結合剤である。
【００５７】
用語「抗体薬物コンジュゲート」又は「ＡＤＣ」とは、１種以上の細胞傷害性及び／又は細胞分裂阻害剤に化学的に連結された抗体のことである。実施形態では、ＡＤＣは抗体、細胞傷害性及び／又は細胞分裂阻害剤並びに細胞傷害性及び／又は細胞分裂阻害剤を抗体に結合させる又はコンジュゲートさせることができるリンカーを含む。本開示のＡＤＣは典型的には、１、２又は３つの薬物負荷種を含む、抗体にコンジュゲートされた１〜３の細胞傷害性及び／又は細胞分裂阻害剤を有する。
【００５８】
本明細書に開示されるＡＤＣは、抗体の立体配置に及び少なくとも一部分、立体配置をもたらすのに使用される方法に応じて、様々な化学量論的モル比で薬物分子及び抗体部分を含んでもよい。
【００５９】
本開示の目的では、当業者であれば、「薬物負荷」と「薬物対抗体比」（ＤＡＲとも呼ばれる）は異なることを理解する。ＤＡＲとは、少なくとも２つのＡＤＣ分子の集団中の抗体あたりの薬物分子の平均モル比のことであり、薬物負荷とは、個々のＡＤＣ分子中の抗体あたりの薬物分子のモル比のことである。薬物負荷は主に、ＡＤＣの構築及び設計に関連性を有し、ＤＡＲは主に患者に投与されることになる治療ＡＤＣ組成物に関連性を有する。
【００６０】
用語「薬物負荷（ｄｒｕｇ  ｌｏａｄ）」又は「薬物負荷（ｄｒｕｇ  ｌｏａｄｉｎｇ）」とは、個々のＡＤＣ分子中の抗体あたりの薬物分子のモル比のことである。ある特定の実施形態では、薬物負荷は１〜２、１〜４薬物分子、２〜４薬物分子、１〜３薬物分子又は２〜３薬物分子を含んでいてもよい（すなわち、前述ごとに、ＡＤＣ分子の一般式はＡ（−Ｌ−Ｄ）ｎであり、ｎは整数又は列挙された薬物分子の範囲を表すある範囲の整数である）。
【００６１】
用語「薬物対抗体比」又は「ＤＡＲ」とは、少なくとも２つのＡＤＣ分子の集団中の抗体あたりの薬物分子の加重平均モル比のことである。操作された抗体構築物、選択システイン還元及び製作後精製などの技術により提供される相対的コンジュゲート特異性にもかかわらず、ＡＤＣの所与の集団は異なる薬物負荷（例えば、ＩｇＧ１抗体の場合は１〜８にわたる）を有するＡＤＣ分子を含んでもよい。すなわち、コンジュゲーションに続いて、本発明のＡＤＣ組成物は、薬物負荷が異なるＡＤＣの混合物を含んでもよい。そのような集団は種々の理由で生じる場合があるが、とりわけ、バッチ間変動及び化学コンジュゲーション反応が完全に終了するまで進行することができなかった場合を含んでもよい。したがって、ＤＡＲはＡＤＣ集団全体（すなわち、すべてのＡＤＣ分子をまとめる）についての薬物負荷の加重平均を表す。ＡＤＣ集団は、優勢ではない又は好ましくないＡＤＣ種（例えば、薬物負荷１、２、３又は４、等のＡＤＣ）のレベルが比較的低い単一の優勢な又は好ましいＡＤＣ種（例えば、薬物負荷２のＡＤＣ）を含有してもよく、又はＡＤＣ集団は、変動する割合の薬物負荷を有する任意の多様な種（例えば、薬物負荷２．０±０．１、±０．２、±０．３、±０．４、±０．５、等のＤＡＲ）を含有してもよい。
【００６２】
実施形態では、本開示のＡＤＣは、細胞傷害性又は細胞分裂阻害剤（例えば、ＰＢＤ）にコンジュゲートされた抗ＥＧＦＲ抗体（例えば、ＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ））を含み、薬物負荷２を有する。実施形態では、本開示のＡＤＣ組成物又は調製物は、細胞傷害性又は細胞分裂阻害剤（例えば、ＰＢＤ）にコンジュゲートされた抗ＥＧＦＲ抗体（例えば、ＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ））を含み、ＤＡＲは約２である。
【００６３】
実施形態では、本開示のＡＤＣは、配列番号３、４及び５に示されるＣＤＲセット（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３）を含む重鎖可変領域、並びに配列番号８、９及び１０に示されるＣＤＲセット（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３）を含む軽鎖可変領域を含む抗ＥＧＦＲ抗体を含む。実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体は、ＰＢＤにコンジュゲーション部位を提供するように操作されたシステイン突然変異を有する重鎖定常領域を有するＩｇＧ１アイソタイプである。実施形態では、システイン突然変異は重鎖の２３９位にある。実施形態では、突然変異はＳ２３９Ｃであり、Ｋａｂａｔに従って番号付けされている。本明細書に記載される、抗ＥＧＦＲ抗体ＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）は、それぞれ配列番号３、４及び５に示されるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域、並びに、それぞれ配列番号８、９及び１０に示されるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を有する。実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体はＣ終端リジンを欠く又は重鎖定常領域のＣ終端にリジン以外のアミノ酸を含む。
【００６４】
実施形態では、本開示のＡＤＣは、配列番号２を含む重鎖可変領域及び配列番号７を含む軽鎖可変領域を含む抗ＥＧＦＲ抗体を含む。実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体は、ＰＢＤにコンジュゲーション部位を提供するように操作されたシステイン突然変異を有する重鎖定常領域を有するＩｇＧ１アイソタイプである。実施形態では、システイン突然変異は重鎖の２３９位にある。実施形態では、突然変異はＳ２３９Ｃであり、Ｋａｂａｔに従って番号付けされている。本明細書に記載される、抗ＥＧＦＲ抗体ＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）は、配列番号２を含む重鎖可変領域及び配列番号７を含む軽鎖可変領域を有する。実施形態では、本開示の抗ＥＧＦＲ抗体はＣ終端リジンを欠く又は重鎖定常領域のＣ終端にリジン以外のアミノ酸を含む。
【００６５】
実施形態では、本開示のＡＤＣは、配列番号１を含む重鎖及び配列番号６を含む軽鎖を含む抗ＥＧＦＲ抗体を含む。本明細書に記載される抗ＥＧＦＲ抗体ＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を有する。配列番号１は、配列番号１がＳ２３９Ｃ突然変異を含有する点でのみ配列番号１１とは異なる。
【００６６】
本明細書に記載される抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣの実施形態は、配列が、少なくとも１つの定常領域媒介生物学的エフェクター機能を変更するように改変されている抗体又は断片であってもよい。例えば、実施形態では、抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣは、非改変抗体と比べて少なくとも１つの定常領域媒介生物学的エフェクター機能を減らす、例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃγＲ）への結合を減らすように改変されてもよい。ＦｃγＲ結合は、抗体の免疫グロブリン定常領域セグメントをＦｃγＲ相互作用に必要な特定の領域で突然変異させることにより減らしてもよい（例えば、Ｃａｎｆｉｅｌｄ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、１９９１年、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１４８３〜１４９１頁；ａｎｄ  Ｌｕｎｄら、１９９１年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：２６５７〜２６６２頁参照）。ＦｃγＲ結合を減らして、オプソニン作用、食作用及び抗原依存性細胞傷害性（「ＡＤＣＣ」）などのＦｃγＲ相互作用に頼っている他のエフェクター機能を減らしてもよい。
【００６７】
抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣに含まれる抗体は、低レベルのフコースを有する、又はフコースを欠く場合がある。フコースを欠く抗体は、特に、低用量の抗体で増強されたＡＤＣＣ活性と相関付けられてきた。Ｓｈｉｅｌｄｓら、２００２年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３〜２６７４０頁；Ｓｈｉｎｋａｗａら、２００３年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３４６６〜７３頁を参照されたい。フコースのない抗体を調製する方法は、ラット骨髄腫ＹＢ２／０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６６２）での成長を含む。ＹＢ２／０細胞は低レベルのＦＵＴ８  ｍＲＮＡを発現し、このｍＲＮＡは、ポリペプチドのフコシル化に必要な酵素である、α−１，６−フコシル基転移酵素をコードする。
【００６８】
抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣに含まれる抗体は、例えば、免疫グロブリン定常領域セグメントをＦｃＲｎ相互作用に関与する特定の領域で突然変異させることにより新生児Ｆｃ受容体、ＦｃＲｎに対するその結合親和性を増加させる又は減少させる改変を含んでもよい（例えば、国際公開第２００５／１２３７８０号参照）。抗ＥＧＦＲ抗体及び／又は結合断片は、例えば、Ｊｕｎｇ＆Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、１９９７年、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １０：９、９５９〜９６６頁；Ｙａｚａｋｉら、２００４年、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓ  Ｓｅｌ．１７（５）：４８１〜９頁；及び米国特許出願公開第２００７／０２８０９３１号に記載されているように、その高頻度可変領域の１つ以上に１つ以上のアミノ酸が挿入されていてもよい。
【００６９】
抗体は、例えば、国際公開第２０１５／１４３３８２号及び国際公開第２０１０／０９６４３４号に記載されているように、いくつかの技法のうちのいずれかにより産生してもよい。前記特許文献は、参照によりその全体を本明細書に組み込む。
【００７０】
ＥＧＦＲ、例えば、ヒトＥＧＦＲに対して高親和性のある抗ＥＧＦＲ抗体及び／又は結合断片は、治療用途に望ましい可能性がある。したがって、本開示は、ＥＧＦＲ、特に、ヒトＥＧＦＲに対して高結合親和性のある抗ＥＧＦＲ抗体及び／又は結合断片を含むＡＤＣを想定している。特定の実施形態では、抗体及び／又は結合断片は、少なくとも約１００ｎＭの親和性でＥＧＦＲに結合するが、もっと高い親和性、例えば、少なくとも約９０ｎＭ、８０ｎＭ、７０ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２５ｎＭ、２０ｎＭ、１５ｎＭ、１０ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０１ｎＭ、又はそれよりもずっと高い親和性を示してもよい。一部の実施形態では、抗体はＥＧＦＲに、約１ｐＭ〜約１００ｎＭの範囲の親和性で、又は前述の値のいずれかの間にわたる親和性で結合する。
【００７１】
ＥＧＦＲに対する抗体及び／又は結合断片の親和性は、例えば、ＥＬＩＳＡ、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）、表面プラズモン共鳴、フローサイトメトリー又は蛍光偏光アッセイなどのしかし限定するためではない、当技術分野で周知の又は本明細書に記載される技法を使用して決定することが可能である。
【００７２】
抗ＥＧＦＲ抗体は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ（ｅｄｓ）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９年）に記載される方法などの当技術分野で公知の標準組換えＤＮＡ法を使用して宿主細胞において免疫グロブリン軽及び重鎖遺伝子の組換え発現により調製することが可能である。例えば、部分又は完全長軽及び重鎖をコードするＤＮＡは、遺伝子が転写及び翻訳制御配列に作動可能に連結され宿主細胞に形質転換されるように、発現ベクター中に挿入される。抗体軽鎖遺伝子及び抗体重鎖遺伝子は別々のベクターに挿入することが可能であり、又はより典型的には、両方の遺伝子は同じ発現ベクターに挿入され、当技術分野では公知の方法により達成される。抗体は化学合成によっても産生することが可能である（例えば、Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第２版、１９８４年  Ｔｈｅ  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬに記載される方法により）。
【００７３】
本開示の抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣは一般に、これに、こちらも同じでも異なっていてもよい１つ以上のリンカーを経て連結された同じでも異なっていてもよい１つ以上の細胞傷害性及び／又は細胞分裂阻害剤を有する抗ＥＧＦＲ抗体（例えば、ＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ））を含む。実施形態では、抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣは構造式Ｉ：
［Ｄ−Ｌ−ＸＹ］ｎ−Ａｂ
（Ｉ）
に従った化合物、又はその塩であり、それぞれの「Ｄ」は、その他のものとは無関係に、細胞傷害性及び／又は細胞分裂阻害剤（「薬物」）を表し；それぞれの「Ｌ」は、その他のものとは無関係に、リンカーを表し；「Ａｂ」は抗ＥＧＦＲ抗体を表し；それぞれの「ＸＹ」はリンカー上の官能基Ｒｘと抗原結合部分上の「補完的」官能基Ｒｙの間に形成される連鎖を表し；ｎはＡｂに連結された薬物の数（すなわち、単一種薬物負荷）を表す。構造式（Ｉ）に従ってＡＤＣを構成しうる種々の抗ＥＧＦＲ抗体の特定の実施形態は上に記載されている。
【００７４】
構造式（Ｉ）のＡＤＣ又は塩の実施形態では、それぞれのＤは同じである及び／又はそれぞれのＬは同じである。
【００７５】
抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣを構成しうる細胞傷害性及び／又は細胞分裂阻害剤（Ｄ）並びにリンカー（Ｌ）の特定の実施形態は下にさらに詳細に記載されている。
【００７６】
実施形態では、ＡＤＣは式（Ｉ）の構造、又はその塩を有し、Ｄはピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）ダイマーを含み、Ｌはリンカーであり、Ａｂは配列番号１を含む抗体であり、ＸＹはリンカーＬを抗体Ａｂに連結させる共有結合を表し、ｎは任意の整数である。実施形態では、ｎは２又は４である。実施形態では、ｎは２である。
【００７７】
実施形態では、ＡＤＣのＤＡＲとは、少なくとも２つのＡＤＣ分子の集団中の抗体あたりの薬物分子の平均モル比のことである場合、ＤＡＲは約２である。この文脈では、用語「約（ａｂｏｕｔ）」は実測値の±７．５％内の量を意味する。すなわち、「約２」は、１．８５、１．８６、１．８７、１．８８、１．８９、１．９０、１．９１、１．９２、１．９３、１．９４、１．９５、１．９６、１．９７、１．９８、１．９９、２．００、２．０１、２．０２、２．０３、２．０４、２．０５、２．０６、２．０７、２．０８、２．０９、２．１０、２．１１、２．１２、２．１３、２．１４、２．１５及び任意の間の範囲を意味する。
【００７８】
本開示のＡＤＣ、並びに別のＡＤＣ構造体において使用しうる薬物（式ＩのＤ）及びリンカー（式ＩのＬ）に関して追加の詳細は下に記載されている。実施形態では、細胞傷害性及び／又は細胞分裂阻害剤は、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、例えば、ＰＢＤダイマーである。
【００７９】
ＰＢＤの構造は、例えば、米国特許出願公開第２０１３／００２８９１７号及び米国特許出願公開第２０１３／００２８９１９号に、並びに国際公開第２０１１／１３０５９８号に見出すことができ、前記特許文献のそれぞれは参照によりその全体を本明細書に組み込む。ＰＢＤの包括的構造は式（ＩＩ）として下に提供されている。
【００８０】
【化１０】
2020532523.tif 000013
【００８１】
ＰＢＤは、その芳香族Ａ環とピロロＣ環の両方で置換基の数、種類及び位置が、並びにＣ環の飽和の程度が異なる。Ｂ環では、一般に、ＤＮＡをアルキル化する原因になる求電子中心であるＮ１０−Ｃ１１位に、イミン（Ｎ＝Ｃ）、カルビノールアミン（ＮＨ−ＣＨ（ＯＨ））又はカルビノールアミンメチルエーテル（ＮＨ−ＣＨ（ＯＭｅ））が存在する。既知の天然産物のすべてが、Ｃ環からＡ環の方を見た場合右回りねじれを提供するキラルＣ１１ａ位に（Ｓ）−立体配置を有する。本明細書で提供されるＰＢＤ例は本開示の抗ＥＧＦＲ抗体にコンジュゲートされていてもよい。本開示の抗ＥＧＦＲ抗体にコンジュゲートされてもよいＰＢＤのさらなる例は、例えば、米国特許出願公開第２０１３／００２８９１７号及び米国特許出願公開第２０１３／００２８９１９号に、米国特許第７，７４１，３１９号に、並びに国際公開第２０１１／１３０５９８号及び国際公開第２００６／１１１７５９号に見出すことが可能であり、前記特許文献のそれぞれは参照によりその全体を本明細書に組み込む。
【００８２】
本明細書に記載される抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣでは、細胞傷害性及び／又は細胞分裂阻害剤はリンカーを経て抗体に連結されている。リンカーは短い、長い、疎水性、親水性、柔軟な又は硬直していてもよく、リンカーが異なる特性を有するセグメントを含むように、上記の特性のうちの１つ以上を独立して有するセグメントで構成されていてもよい。リンカーは、１つよりも多い作用物質を抗体上の単一部位に共有結合させるように多価でも、又は単一作用物質を抗体上の単一部位に共有結合させるように一価でもよい。
【００８３】
ある特定の実施形態では、選択されるリンカーはインビボで切断可能である。切断可能なリンカーは、化学的に又は酵素的に不安定である又は分解可能な連鎖を含んでいてもよい。切断可能なリンカーは一般に、細胞質での還元、リソソームにおける酸性条件への曝露又は細胞内での特定にプロテアーゼ若しくは他の酵素による切断などの、細胞内部でのプロセスに頼って薬物を遊離させる。切断可能なリンカーは一般に、化学的に又は酵素的に切断可能である１つ以上の化学結合を組み込み、リンカーの残りは非切断性である。ある特定の実施形態では、リンカーは、ヒドラゾン及び／又はジスルフィド基などの化学的に不安定な基を含む。化学的に不安定な基を含むリンカーは、血漿と一部の細胞質区画の間で差示的特性を活用する。ヒドラゾン含有リンカーについて薬物放出を促進する細胞内条件は、エンドソーム及びリソソームの酸性環境であり、ジスルフィド含有リンカーはサイトゾルで還元され、サイトゾルは高チオール濃度、例えば、グルタチオンを含有する。ある特定の実施形態では、化学的に不安定な基近くに置換基を使用して立体障害を導入することにより、化学的に不安定な基を含むリンカーの血漿安定性を増やしてもよい。
【００８４】
ヒドラゾンなどの酸不安定基は、血液中性ｐＨ環境（ｐＨ７．３〜７．５）での体循環中は無傷のままであり、ＡＤＣが細胞の弱酸性エンドソーム（ｐＨ５．０〜６．５）及びリソソーム（ｐＨ４．５〜５．０）区画に内部移行した後は加水分解を受け薬物を放出する。このｐＨ依存性放出機構は薬物の非特異的放出と関連付けられてきた。リンカーのヒドラゾン基の安定性を高めるため、リンカーは、循環での消失を最小限に抑えてリソソームでより効率的な放出を達成する調整を可能にする化学修飾、例えば、置換により変化させてもよい。
【００８５】
ヒドラゾン含有リンカーは、追加の酸不安定切断部位及び／又は酵素不安定切断部位などの、追加の切断部位を含有していてもよい。例示的ヒドラゾン含有リンカーを含むＡＤＣは、式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）及び（Ｖ）の以下の構造
【００８６】
【化１１】
2020532523.tif 000014
又はその塩を含み、Ｄ及びＡｂはそれぞれ細胞傷害性及び／又は細胞分裂阻害剤（薬物）並びに抗体を表し、ｎは抗体に連結されている薬物−リンカーの数を表す。（式（ＩＩＩ））のリンカーなどのある特定のリンカーでは、リンカーは２つの切断基、ジスルフィド及びヒドラゾン部分を含む。そのようなリンカーでは、非修飾遊離の薬物の効果的な放出は、酸性ｐＨ又はジスルフィド還元と酸性ｐＨを必要とする。式（ＩＶ）及び（Ｖ）のリンカーなどのリンカーは、単一ヒドラゾン切断部位で効果的であることが示されている。
【００８７】
リンカーに含まれてもよい他の酸不安定基は、シスアコニチル含有リンカーを含む。シスアコニチル化学はアミド結合に並置されたカルボン酸を使用して、酸性条件下でアミド加水分解を加速させる。
【００８８】
切断可能リンカーはジスルフィド基を含んでもよい。ジスルフィドは、生理的ｐＨでは熱力学的に安定しており、細胞内に内部移行されると薬物を放出するように設計されており、そこではサイトゾルは細胞外環境と比べて著しく還元性の環境を提供する。ジスルフィド結合の切断には一般に、ジスルフィド含有リンカーが循環では適度に安定しており、サイトゾルでは薬物を選択的に放出するように、（還元）グルタチオン（ＧＳＨ）などの、細胞質チオール補因子の存在が必要である。ジスルフィド結合を切断することができる細胞内酵素タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ又は類似の酵素は、細胞内でのジスルフィド結合の優先的切断にも寄与し得る。ＧＳＨは、循環ではおおよそ５μＭである著しく低濃度のＧＳＨ又は最も豊富な低分子量チオールであるシステインと比べて、０．５〜１０ｍＭの濃度範囲で細胞内に存在することが報告されている。腫瘍細胞は、不規則な血流のせいで低酸素状態になるが、還元性酵素の活性が増強され、したがって、グルタチオンの濃度がはるかに高くなる。ある特定の実施形態では、ジスルフィド含有リンカーのインビボ安定性は、リンカーの化学修飾、例えば、ジスルフィド結合に隣接する立体障害の使用により増強してもよい。
【００８９】
例示的ジスルフィド含有リンカーを含むＡＤＣは、式（ＶＩ）、（ＶＩＩ）及び（ＶＩＩＩ）の以下の構造
【００９０】
【化１２】
2020532523.tif 000015
又はその塩を含み、Ｄ及びＡｂはそれぞれ薬物及び抗体を表し、ｎは抗体に連結されている薬物−リンカーの数を表し、Ｒはそれぞれの所在で、例えば、水素又はアルキルから独立して選択される。ある特定の実施形態では、ジスルフィド結合に隣接する立体障害が増加すると、リンカーの安定性は増加する。（ＶＩ）及び（ＶＩＩＩ）などの構造は、１つ以上のＲ基がメチルなどの低アルキルから選択された場合、インビボ安定性の増加を示す。
【００９１】
使用してもよい別の種類の切断可能リンカーは、酵素により特異的に切断されるリンカーである。そのようなリンカーは典型的にはペプチドベースである又は酵素に対する基質として作用するペプチド領域を含む。ペプチドベースのリンカーは、血漿及び細胞外環境において、化学的に不安定なリンカーよりも安定している傾向がある。ペプチド結合は一般に、血清安定性が良好である。なぜならば、リソソームタンパク質分解酵素は、内在性阻害因子及び血液の不利に高いｐＨ値のせいで、リソソームと比べて血液中では活性が極めて低いからである。抗体からの薬物の放出は、特にリソソームプロテアーゼ、例えば、カテプシン及びプラスミンの作用のせいで起こる。これらのプロテアーゼはある特定の腫瘍細胞においては上昇したレベルで存在する場合がある。
【００９２】
例示的実施形態では、切断可能ペプチドは、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕなどのテトラペプチド、又はＶａｌ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ａｌａ、Ｍｅｔ−（Ｄ）Ｌｙｓ、Ａｓｎ−（Ｄ）Ｌｙｓ、Ｖａｌ−（Ｄ）Ａｓｐ、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｉｌｅ−Ｖａｌ、Ａｓｐ−Ｖａｌ、Ｈｉｓ−Ｖａｌ、ＮｏｒＶａｌ−（Ｄ）Ａｓｐ、Ａｌａ−（Ｄ）Ａｓｐ、Ｍｅｔ−Ｌｙｓ、Ａｓｎ−Ｌｙｓ、Ｉｌｅ−Ｐｒｏ、Ｍｅ３Ｌｙｓ−Ｐｒｏ、ＰｈｅｎｙｌＧｌｙ−（Ｄ）Ｌｙｓ、Ｍｅｔ−（Ｄ）Ｌｙｓ、Ａｓｎ−（Ｄ）Ｌｙｓ、Ｐｒｏ−（Ｄ）Ｌｙｓ、Ｍｅｔ−（Ｄ）Ｌｙｓ、Ａｓｎ−（Ｄ）Ｌｙｓ、Ｍｅｔ−（Ｄ）Ｌｙｓ、Ａｓｎ−（Ｄ）Ｌｙｓなどのジペプチドから選択される。実施形態では、切断可能ペプチドはＶａｌ−Ａｌａである。実施形態では、リンカーは、マレイミドカプロイル−バリン−アラニン（ｍｃ−Ｖａｌ−Ａｌａ）リンカーである。ある特定の実施形態では、ジペプチドは、もっと長いペプチドの疎水性のせいで、もっと長いポリペプチドよりも好ましい。
【００９３】
ドキソルビシン、マイトマイシン、カンプトテシン、タリソマイシン及びオーリスタチン／オーリスタチンファミリーメンバーなどの薬物を抗体に連結するのに有用な様々なジペプチドベースの切断可能リンカーは記載されている（Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋら、１９９８年、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６７：１８６６〜１８７２頁；Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋら、１９９８年、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．８（２１）：３３４１〜３３４６頁；Ｗａｌｋｅｒら、２００２年、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１２：２１７〜２１９頁；Ｗａｌｋｅｒら、２００４年、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１４：４３２３〜４３２７頁；ａｎｄ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏら、２００３年、Ｂｌｏｏｄ  １０２：１４５８〜１４６５頁、Ｄｏｒｎｉｎａら、２００８年、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９：１９６０〜１９６３頁参照、前記文献のそれぞれは参照により本明細書に組み込む。）。これらのジペプチドリンカー、又はこれらのジペプチドリンカーの改変版はすべて、本明細書に記載されるＡＤＣに使用してもよい。使用してもよい他のジペプチドリンカーは、Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ’Ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ  Ｖｅｎｄｏｔｉｎ  ＳＧＮ−３５（Ａｄｃｅｔｒｉｓ（商標））、Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ＳＧＮ−７５（抗−ＣＤ−７０、Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＭＭＡＦ）、Ｃｅｌｌｄｅｘ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  グレンバツムマブ（ＣＤＸ−０１１）（抗−ＮＭＢ、Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＭＭＡＥ）、及びＣｙｔｏｇｅｎ  ＰＳＭＡ−ＡＤＣ（ＰＳＭＡ−ＡＤＣ−１３０１）（抗−ＰＳＭＡ、Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＭＭＡＥ）などのＡＤＣに見出せるリンカーを含む。
【００９４】
酵素的に切断可能なリンカーは、薬物を酵素的切断部位と空間的に分離するための自壊性スペーサーを含んでもよい。ペプチドリンカーへの薬物の直接結合により、薬物のアミノ酸付加体をタンパク質分解性放出させ、それによりその活性を損なうことが可能になる。自壊性スペーサーを使用すれば、アミド結合の加水分解により完全活性な化学的に修飾されていない薬物を除去することが可能になる。
【００９５】
１つの自壊性スペーサーは、二機能性パラアミノベンジルアルコール基であり、これはアミノ基を通じてペプチドに連結されてアミド結合を形成し、アミン含有薬物はカルバミン酸官能性を通じて、リンカーのベンジルヒドロキシル基に結合されてもいい（ＰＡＢＣ）。得られたプロドラッグはプロテアーゼ媒介切断により活性化され、１，６−脱離反応を起こし、非修飾薬物、二酸化炭素及びリンカー基の残りを放出する。以下の図式は、ｐ−アミドベンジルエーテルの断片化及び薬物の放出を描いており：
【００９６】
【化１３】
2020532523.tif 000016
Ｘ−Ｄは非修飾薬物を表す。
【００９７】
この自壊性基の複素環式変異体も記載されている。例えば、米国特許第７，９８９，４３４号を参照されたい。この特許文献は参照により本明細書に組み込む。
【００９８】
一部の実施形態では、酵素的切断可能リンカーはβグルクロン酸ベースのリンカーである。薬物の容易な放出は、リソソーム酵素βグルクロニダーゼによるβグルクロニドグリコシド結合の切断を通じて実現してもよい。この酵素は、リソソーム内に豊富に存在しており、一部の腫瘍型では過剰発現され、細胞外での酵素活性は低い。βグルクロン酸ベースのリンカーを使用して、βグルクロニドの親水性のせいでＡＤＣが凝集を受ける傾向を回避してもよい。一部の実施形態では、βグルクロン酸ベースのリンカーは、疎水性薬物に連結されたＡＤＣのリンカーとして好ましい。以下の図式は、βグルクロン酸ベースのリンカーからの薬物の放出及びβグルクロン酸ベースのリンカーを含有するＡＤＣを描いている。
【００９９】
【化１４】
2020532523.tif 000017
【０１００】
オーリスタチン、カンプトテシン及びドキソルビシン類似物、ＣＢＩ副溝結合剤、並びにプシンベリンなどの薬物を抗体に連結させるのに有用な様々な切断可能βグルクロン酸ベースのリンカーは記載されている（Ｎｏｌｔｉｎｇ、Ｃｈａｐｔｅｒ  ５「Ｌｉｎｋｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」、Ｉｎ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１０４５巻、７１〜１００頁、Ｌａｕｒｅｎｔ  Ｄｕｃｒｙ（Ｅｄ．）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｍｅｄｉｃａ、ＬＬＣ、２０１３年；Ｊｅｆｆｒｅｙら、２００６年、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１７：８３１〜８４０頁；Ｊｅｆｆｒｅｙら、２００７年、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１７：２２７８〜２２８０頁；ａｎｄ  Ｊｉａｎｇら、２００５年、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２７：１１２５４〜１１２５５頁参照、前記文献のそれぞれは参照により本明細書に組み込む。）。これらのβグルクロン酸ベースのリンカーはすべて、本明細書に記載される抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣにおいて使用してよい。
【０１０１】
一実施形態では、本開示のＡＤＣに使用されるリンカーは、式（ＩＸ）、ＹはＶａｌであり、ＺはＡｌａであり、Ｄは薬物（例えば、ＰＢＤダイマー）であり、ｑは１、２、３、４、５、６、７又は８である：
【０１０２】
【化１５】
2020532523.tif 000018
又はその塩として下に示されている。実施形態では、ｑは５である。
【０１０３】
一態様では、本開示はリンカー経由で抗体に連結されている細胞傷害性及び／又は細胞分裂阻害剤を含むＡＤＣを記載しており、抗体薬物コンジュゲートは、構造式（Ｉ）に従った化合物又はその塩であり、Ｄはピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）ダイマーを含み；Ｌはリンカーであり；Ａｂは配列番号１を含む抗体であり；ＸＹはリンカーＬを抗体Ａｂに連結させる共有結合を表し；ｎは任意の整数である。一実施形態では、ＸＹはリンカーＬを抗体Ａｂに連結させる共有結合を表し、ＸＹは抗体Ａｂ上のスルフヒドリル基で形成される連鎖である。別の実施形態では、ＸＹはマレイミド−スルフヒドリル連鎖である。
【０１０４】
ある特定の実施形態では、本開示のＡＤＣは、式（Ｘ）の構造：
【０１０５】
【化１６】
2020532523.tif 000019
又はその塩を含み、Ａｂは、配列番号３、４及び５に示されるＣＤＲセット（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３）を含む重鎖可変領域、並びに配列番号８、９及び１０に示されるＣＤＲセット（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３）を含む軽鎖可変領域を含む抗体であり、ｎは２又は４である。実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体は、ＰＢＤにコンジュゲーション部位を提供するように操作されているシステイン突然変異のある定常領域を有するＩｇＧ１アイソタイプである。一実施形態では、システイン突然変異は重鎖の２３９位にある。実施形態では、突然変異はＳ２３９Ｃであり、番号付けはＫａｂａｔに従う。一実施形態では、ｎは約２又は約４である。実施形態では、ｎは約２である。実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体の重鎖定常領域はＣ終端リジンを欠く又は重鎖定常領域のＣ終端にリジン以外のアミノ酸を含む。
【０１０６】
実施形態では、本開示のＡＤＣは、式（Ｘ）の構造、
【０１０７】
【化１７】
2020532523.tif 000020
又はその塩を含み、Ａｂは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号７に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体である。実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体は、ＰＢＤにコンジュゲーション部位を提供するように操作されているシステイン突然変異のある定常領域を有するＩｇＧ１アイソタイプである。実施形態では、システイン突然変異は重鎖の２３９位にある。実施形態では、システイン突然変異はＳ２３９Ｃであり、番号付けはＫａｂａｔに従う。一実施形態では、ｎは約２又は約４である。別の実施形態では、ｎは約２である。実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体の重鎖定常領域はＣ終端リジンを欠く又は重鎖定常領域のＣ終端にリジン以外のアミノ酸を含む。
【０１０８】
実施形態では、本開示のＡＤＣは、式（Ｘ）の構造、
【０１０９】
【化１８】
2020532523.tif 000021
又はその塩を含み、Ａｂは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体である。実施形態では、ｎは約２又は約４である。実施形態では、ｎは約２である。
【０１１０】
本開示のＡＤＣは、当技術分野で公知の化学を使用して合成してもよい。選択される化学は、とりわけ、細胞傷害性及び／又は細胞分裂阻害剤（複数可）の正体、リンカー並びに抗体にリンカーを結合させるのに使用される基に依存することになる。一般的に、式（Ｉ）に従ったＡＤＣは以下の図式：
Ｄ−Ｌ−ＲＸ＋Ａｂ−ＲＹ→［Ｄ−Ｌ−ＸＹ］ｎ−Ａｂ
（Ｉａ）    （Ｉｂ）            （Ｉ）
に従って調製してもよく、Ｄ、Ｌ、Ａｂ、ＸＹ及びｎは以前に上で定義されており、ＲＸ及びＲＹは、上で考察したように、互いと共有結合を形成することができる補完的基を表す。
【０１１１】
基ＲＸ及びＲＹの正体は、シントンＤ−Ｌ−ＲＸを抗体に連結するのに使用される化学に依存することになる。一般的に、使用される化学は、抗体の完全性、例えば、その標的に結合する能力を変更すべきではない。好ましくは、コンジュゲートされた抗体の結合特性はコンジュゲートされていない抗体の結合特性と酷似している。分子を抗体などの生体分子にコンジュゲートさせるための様々な化学及び技法は、当技術分野では公知であり、特に抗体にコンジュゲートさせるための様々な化学及び技法は周知である。例えば、Ａｍｏｎら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｒｅｉｓｆｅｌｄら、Ｅｄｓ．、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．、１９８５年；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、ｉｎ：Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、Ｅｄｓ．、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、第２版、１９８７年；Ｔｈｏｒｐｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：  Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ」ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ‘８４：  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｎｃｈｅｒａら、Ｅｄｓ．、１９８５年；「Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｒｅｓｕｌｔｓ、ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｂａｌｄｗｉｎら、Ｅｄｓ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８５年；Ｔｈｏｒｐｅら、１９８２年、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９〜５８頁；国際公開第８９／１２６２４号を参照されたい。これらの化学はいずれもシントンを抗体に連結するのに使用しうる。
【０１１２】
シントンを接近可能なリジン残基に連結するのに有用ないくつかの官能基ＲＸ及び化学は知られており、例として及び限定せずにＮＨＳ−エステル及びイソチオシアネートを含む。
【０１１３】
シントンをシステイン残基の接近可能な遊離のスルフヒドリル基に連結するのに有用ないくつかの官能基ＲＸ及び化学は知られており、例として及び限定せずにハロアセチル及びマレイミドを含む。
【０１１４】
しかし、コンジュゲーション化学は利用可能な側鎖基に限定されない。アミンなどの側鎖は、適切な小分子をアミンに連結することにより、ヒドロキシルなどの他の有用な基に変換してもよい。この戦略を使用すれば、多機能性小分子を抗体の接近可能なアミノ酸残基の側鎖にコンジュゲートすることにより、抗体上の利用可能な連結部位の数を増やすことが可能である。次に、シントンをこれらの「変換された」官能基に共有結合させるのに適した官能基ＲＸはシントンに含まれている。
【０１１５】
抗体はコンジュゲーションのためのアミノ酸残基を含むように操作されていてもよい。シントンを非コードアミノ酸に連結するのに有用である化学及び官能基と同様に、ＡＤＣという文脈で薬物をコンジュゲートするのに有用である遺伝的にコードされていないアミノ酸残基を含むように抗体を操作するためのアプローチはＡｘｕｐら、２０１２年、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１０９（４０）：１６１０１〜１６１０６頁により記載されている。
【０１１６】
典型的には、シントンは、例えば、接近可能なリジン残基の一次アミノ基又は接近可能なシステイン残基のスルフヒドリル基を含む、抗体のアミノ酸残基の側鎖に連結される。遊離のスルフヒドリル基は、鎖内ジスルフィド結合を還元することにより得てもよい。
【０１１７】
ＲＹがスルフヒドリル基である連鎖では（例えば、ＲＸがマレイミドである場合）、抗体は一般的に、先ず完全に又は部分的に還元されて、システイン残基間の鎖内ジスルフィド架橋を破壊する。特定のシステイン残基及び鎖間ジスルフィド架橋は、抗体重鎖に存在する場合、スルフヒドリル基へのコンジュゲーションに適した基を含む薬物−リンカーシントンの結合のために還元してもよく、例として及び限定せずに、ヒトＩｇＧ１重鎖状の残基Ｃ２３３、Ｃ２３９及びＣ２４２（Ｋａｂａｔ番号付け方式；残基Ｃ２２０、Ｃ２２６及びＣ２２９Ｅｕ番号付けに対応する）並びにヒトＩｇカッパ軽鎖上の残基Ｃ２１４（Ｋａｂａｔ番号付け方式）を含む。しかし、抗体重鎖が結合部位にシステイン残基を含有しない場合には、抗体は、所与の位置、例えば、２３９位にシステインを含有するように操作することが可能である。
【０１１８】
シントン結合のための、ジスルフィド架橋に関与していないシステイン残基を、１つ以上のコドンの突然変異により抗体中に操作してもよい。これらの不対システインを還元するとコンジュゲーションに適したスルフヒドリル基が得られる。操作されたシステインを組み込むのに好ましい位置は、例として及び限定せずに、ヒトＩｇＧ１重鎖上の位置Ｓ１１２Ｃ、Ｓ１１３Ｃ、Ａ１１４Ｃ、Ｓ１１５Ｃ、Ａ１７６Ｃ、Ｓ１８０Ｃ、Ｓ２３９Ｃ、Ｓ２５２Ｃ、Ｖ２８６Ｃ、Ｖ２９２Ｃ、Ｓ３５７Ｃ、Ａ３５９Ｃ、Ｓ３９８Ｃ、Ｓ４２８Ｃ（Ｋａｂａｔ番号付け）及びヒトＩｇカッパ軽鎖上の位置Ｖ１１０Ｃ、Ｓ１１４Ｃ、Ｓ１２１Ｃ、Ｓ１２７Ｃ、Ｓ１６８Ｃ、Ｖ２０５Ｃ（Ｋａｂａｔ番号付け）を含む（例えば、米国特許第７，５２１，５４１号、米国特許第７，８５５，２７５号及び米国特許第８，４５５，６２２号参照）。一実施形態では、残基Ｓ２３９（Ｋａｂａｔ番号付け方式）はシステインに突然変異され、抗体ＡｂＡへのＰＢＤのコンジュゲーションを可能にする。この突然変異は本明細書では「Ｓ２３９Ｃ」と呼ばれる。
【０１１９】
ある特定の実施形態では、本開示のＡＤＣは、操作されたシステインを介して薬物負荷２を有する。
【０１２０】
ある特定の実施形態では、本開示は、ＡＤＣを作成する方法であって、それぞれ配列番号１及び６に示される抗体重鎖及び軽鎖を、構造式（Ｉａ）に従ったシントンに接触させることを含む方法を特色とし、Ｄは細胞膜を横切ることができる細胞傷害性及び／又は細胞分裂阻害剤であり、Ｌはリソソーム酵素により切断することができるリンカーであり、ＲＸは、シントンがシントンを抗体に共有結合させる条件下で、シントンを抗体に共有結合させることができる官能基を含み、Ｄは、例えば、ＰＢＤダイマーである。
【０１２１】
当業者であれば認識するように、抗体分子に連結される細胞傷害性及び／又は細胞分裂阻害剤の数は、ＡＤＣ調製物が不均一な性質であり、調製物中の一部の抗体は１つの連結された作用物質、一部は２つ、一部は３つ、等を含有する（及び一部はない）ように、変動してもよい。不均一の程度は、とりわけ、細胞傷害性及び／又は細胞分裂阻害剤を連結するのに使用される化学に依存することになる。例えば、抗体が還元されて結合のためのスルフヒドリル基を生じる場合、１分子あたりゼロ、２、４、６又は８個の連結された作用物質を有する抗体の不均一な混合物が産生されることが多い。さらに、結合化合物のモル比を制限することにより、１分子あたりゼロ、１、２、３、４、５、６、７又は８個の連結された作用物質を有する抗体が産生されることが多い。したがって、文脈次第で、所定の薬物抗体比（ＤＡＲ）は抗体のコレクションについての平均でもよいことは理解される。例えば、「ＤＡＲ４」とは、特定のＤＡＲピークを単離するための精製を受けたことがなく、抗体あたり異なる数の細胞分裂阻害剤及び／又は細胞傷害性剤が結合しているＡＤＣ分子の不均一な混合物を含むが（例えば、抗体あたりの単一種薬物負荷が、０、２、４、６、８の阻害剤）、４の平均薬物対抗体比を有するＡＤＣ調製物のことである。
【０１２２】
不均一なＡＤＣ調製物は、例えば、疎水性相互作用クロマトグラフィー（「ＨＩＣ」）により処理して、目的の特定のＤＡＲ（又は２つ以上の特定のＤＡＲの混合物）を有するＡＤＣが濃縮された調製物を得てもよい。そのような濃縮された調製物は本明細書では「ＥＸ」と名付けられ、「Ｅ」はＡＤＣ調製物が処理されており特定のＤＡＲを有するＡＤＣ集団が濃縮されていることを示しており、「Ｘ」はＡＤＣ分子あたり連結された細胞分裂阻害剤及び／又は細胞傷害性剤の数を表す。２つの特定のＤＡＲを有するＡＤＣの混合物が濃縮された調製物は「ＥＸ／ＥＹ」、３つの特定のＤＡＲは「ＥＸ／ＥＹ／ＥＺ」、等と名付けられ、「Ｅ」はＡＤＣ調製物が処理されて特定の種を濃縮していることを示しており、「Ｘ」、「Ｙ」及び「Ｚ」は濃縮された種を表す。特定の例として、「Ｅ２」とは、濃縮されて、主にＡＤＣ分子あたり２つの細胞分裂阻害剤及び／又は細胞傷害性剤が連結されているＡＤＣを含有するＡＤＣ調製物のことである。「Ｅ４」とは、濃縮されて、主にＡＤＣ分子あたり４つの細胞分裂阻害剤及び／又は細胞傷害性剤が連結されているＡＤＣを含有するＡＤＣ調製物のことである。「Ｅ２／Ｅ４」とは、濃縮されて、１つはＡＤＣ分子あたり２つの細胞分裂阻害剤及び／又は細胞傷害性剤が連結されており、もう１つはＡＤＣ分子あたり４つの細胞分裂阻害剤及び／又は細胞傷害性剤が連結されている２つのＡＤＣ集団を主に含有するＡＤＣ調製物のことである。
【０１２３】
本明細書で使用される場合、濃縮された「Ｅ」調製物は一般に、所定のＤＡＲ  ＡＤＣで少なくとも約８０％純粋であるが、少なくとも約８５％、９０％、９５％、９８％又はそれよりもはるかに高い純度などのもっと高いレベルの純度が入手可能であり、望ましい場合がある。例えば、「ＥＸ」調製物は一般に、ＡＤＣ分子あたりＸの細胞分裂阻害剤及び／又は細胞傷害性剤が連結されているＡＤＣでは少なくとも約８０％純粋になる。例えば、「ＥＸ／ＥＹ」調製物などの、もっと高次の濃縮調製物では、ＡＤＣ分子あたりＸとＹの細胞分裂阻害剤及び／又は細胞傷害性剤が連結されているＡＤＣの総数は一般に、調製物中全ＡＤＣの少なくとも約８０％を占める。同様に、濃縮「ＥＸ／ＥＹ／ＥＺ」調製物では、ＡＤＣ分子あたりＸ、ＹとＺの細胞分裂阻害剤及び／又は細胞傷害性剤が連結されているＡＤＣの総数は、調製物中全ＡＤＣの少なくとも約８０％を占める。
【０１２４】
当技術分野では公知であるように、純度は様々な方法により評価しうる。特定の例として、ＡＤＣ調製物はＨＰＬＣ又は他のクロマトグラフィーにより分析し、得られたピークの曲線下の面積を分析することにより純度を評価してもよい。
【０１２５】
実施形態では、本開示は、２のＤＡＲ（ＤＡＲ  Ｅ２）を有するＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤ  ＡＤＣを含む不均一な組成物を含み、ＤＡＲ  Ｅ２種は組成物中すべてのＡＤＣの＞８０％（＞８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９パーセント）で存在している。例えば、実施形態では、適用は、２のＤＡＲ（ＤＡＲ  Ｅ２）を有するＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤ  ＡＤＣを含む不均一な組成物を含み、ＤＡＲ  Ｅ２種は組成物中すべてのＡＤＣの集団の＞８５％（＞８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９パーセント）で存在している。実施形態では、適用は、２のＤＡＲ（ＤＡＲ  Ｅ２）を有するＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤ  ＡＤＣを含む不均一な組成物を含み、ＤＡＲ  Ｅ２種は組成物中すべてのＡＤＣの集団の＞９０％（＞９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９パーセント）で存在している。
【０１２６】
ある特定の実施形態では、本開示のＡＤＣのＤＡＲは約２又は約４である。さらなる実施形態では、本開示のＡＤＣのＤＡＲは約２である。
【０１２７】
本明細書に記載されるＡＤＣは、ＡＤＣ並びに１つ以上の担体、賦形剤及び／又は希釈剤を含む医薬組成物の形態でもよい。組成物は、獣医用途又はヒトにおける医薬用途のためなどの、特定の用途のために処方してもよい。
配列の簡単な説明
配列番号１から配列番号２０まで通して含む、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿１２３８９と表題を付けた配列表は参照によりその全体を本明細書に組み込み、この配列表には本明細書で開示される核酸及び／又はアミノ酸配列を含む。配列表は、本明細書に添えてＡＳＣＩＩテキスト形式で提出している。配列は最初、２０１８年８月３１日に作成し、サイズは４５．１ＫＢである。
【実施例】
【０１２８】
以下の実施例は、抗ＥＧＦＲ  ＡＤＣの例示的実施形態のある特定の特色及び特性に光を当てているが、限定ではなく、説明の目的で提供されている。
【０１２９】
別段に記載されていなければ、実施例に記載されるＰＢＤ  ＡＤＣのおおよそのＤＡＲは約２である。
［実施例１］  抗ＥＧＦＲ  ＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）の作成
抗体１（Ａｂ１）はヒト化抗ＥＧＦＲ抗体である。Ａｂ１の重鎖アミノ酸配列は配列番号２０に記載されている。重鎖可変領域はイタリック体にされており（配列番号１５）、ＣＤＲは下線が施されている。
【０１３０】
【化１９】
2020532523.tif 000022
【０１３１】
Ａｂ１の重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列は配列番号１５として下に提供されている。Ａｂ１のＶＨ  ＣＤＲアミノ酸配列は下で下線が施されており、以下の通りである：ＧＹＳＩＳＳＤＦＡＷＮ（ＶＨ  ＣＤＲ１；配列番号１６）；ＹＩＳＹＳＧＮＴＲＹＱＰＳＬＫＳ（ＶＨ  ＣＤＲ２；配列番号１７）；及びＡＧＲＧＦＰＹ（ＶＨ  ＣＤＲ３；配列番号１８）。
Ａｂ１  ＶＨ配列
【０１３２】
【化２０】
2020532523.tif 000023
【０１３３】
Ａｂ１の軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列は配列番号７として下に提供されている。Ａｂ１のＶＬ  ＣＤＲアミノ酸配列は下で下線が施されており、以下の通りである：ＨＳＳＱＤＩＮＳＮＩＧ（ＶＬ  ＣＤＲ１；配列番号８）；ＨＧＴＮＬＤＤ（ＶＬ  ＣＤＲ２；配列番号９）；及びＶＱＹＡＱＦＰＷＴ（ＶＬ  ＣＤＲ３；配列番号１０）。
Ａｂ１  ＶＬ配列
【０１３４】
【化２１】
2020532523.tif 000024
【０１３５】
Ａｂ１よりも特性が改良されている抗ＥＧＦＲ抗体を同定するためにスクリーニングが実施された。Ａｂ１変異体の同定の詳細は、例えば、国際公開第２０１５／１４３３８２号に記載されており、前記特許文献は参照によりその全体を本明細書に組み込む。
【０１３６】
同定されたＡｂ１変異体抗体の１つはＡｂＡであった。ＡｂＡは、同じＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３アミノ酸配列（それぞれ配列番号８、９及び１０に記載されている）を含む、Ａｂ１（配列番号７）と同じ可変軽鎖配列を有する。ＡｂＡのＶＨアミノ酸配列は下の配列番号２に提供されている。ＡｂＡのＶＨ  ＣＤＲアミノ酸配列は以下の通りであり：ＧＹＳＩＳＲＤＦＡＷＮ（ＣＤＲ１；配列番号３）；ＹＩＳＹＮＧＮＴＲＹＱＰＳＬＫＳ（ＣＤＲ２；配列番号４）；及びＡＳＲＧＦＰＹ（ＣＤＲ３；配列番号５）、下では下線が施されている。ＡｂＡ対Ａｂ１の重鎖可変領域で異なる残基は下では太字で示されている。
ＡｂＡ  ＶＨアミノ酸配列
【０１３７】
【化２２】
2020532523.tif 000025
【０１３８】
図３及び図４は、Ａｂ１及びＡｂＡのＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列（図３）並びに完全重及び軽鎖（図４）のアライメントを提供している。Ａｂ１及びＡｂＡの軽鎖アミノ酸配列は同じである（配列番号６）。しかし、Ａｂ１及びＡｂＡの重鎖アミノ酸配列は２つの配列間に６つのアミノ酸差異があり、その差異のうちの３つはＣＤＲにある。Ａｂ１  ＶＨアミノ酸配列とＡｂＡ  ＶＨアミノ酸配列の間の差異は図３ではシェードを付けられＶＨ  ＣＤＲのそれぞれに見出せる。ＡｂＡの可変重鎖のＣＤＲ１ドメインはセリン（Ａｂ１）からアルギニンへのアミノ酸変化を含んでいた。可変重鎖のＣＤＲ２ドメインは、Ａｂ１でのセリンからＡｂＡでのアスパラギンへのアミノ酸変化を含んでいた。最後に、可変重鎖のＣＤＲ３ドメインは、Ａｂ１でのグリシンからＡｂＡでのセリンへのアミノ酸変化を含んでいた。ＡｂＡ内のアミノ酸変化のうちの２つは重鎖の定常領域にある（Ｄ３５４Ｅ及びＬ３５６Ｍ）。ＡｂＡでのＦｃ領域アミノ酸突然変異は、ａ  ｚ、ａアロタイプからａ  ｚ、非ａアロタイプへのヒトＩｇＧアロタイプ変化を表している。そのほかの変化に加えて、第１のアミノ酸は、例えば、図３に記載されているように、グルタミン（Ｑ）からグルタミン酸（Ｅ）に変更された。したがって、ＡｂＡ抗体はＡｂ１抗体と比べて相補性決定領域に３つのアミノ酸差異を含有する。しかし、ＡｂＡはＥＧＦＲに対してＡｂ１よりも改善された結合親和性を有し、例えば、国際出願番号ＷＯ２０１５／１４３３８２号に記載されるように、Ａｂ１と比べて独特なインビトロ及びインビボ特徴も示す。
【０１３９】
抗ＥＧＦＲ抗体ＡｂＡの同定に続いて、抗体は、弾頭ＰＢＤの部位特異的コンジュゲーション部位を操作するために改変された。具体的には、操作されたシステイン抗体（Ｃ２３９）は、ＤＡＲ２を有するＰＢＤダイマーの部位特異的コンジュゲーションを可能にするため当業者の一般的な技法を使用して作成された。この突然変異された抗体は本明細書ではＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）と呼ばれ、ＡｂＡ軽鎖及び改変されたＡｂＡ（Ｃ２３９）重鎖配列を含む。ＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）の重鎖アミノ酸配列は下で配列番号１に記載されている。ＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）（それぞれ配列番号３、４及び５）は下線を施され、可変領域（配列番号２）はイタリック体にされている。
【０１４０】
【化２３】
2020532523.tif 000026
【０１４１】
ＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）の重鎖定常領域は、その親抗体ＡｂＡと比べて改変された残基を含有する。具体的には、残基２３９（Ｋａｂａｔ番号付け）は、ＡｂＡの重鎖と比べてＳからＣに突然変異された。この残基は上の配列番号１では下線が施され／太字にされている。Ｓ２３９Ｃ（Ｋａｂａｔ番号付け）は、配列番号１のアミノ酸残基２３８（Ｓ２３８Ｃ）に対応していることに留意すべきである。
【０１４２】
ＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）の軽鎖アミノ酸配列（配列番号６）は下に提供されており、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３（それぞれ配列番号８、９及び１０）は下線が施されており、可変領域（配列番号７）はイタリック体にされている。
【０１４３】
【化２４】
2020532523.tif 000027
【０１４４】
ＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）は、下の実施例に記載されているように、ＰＢＤダイマーにさらにコンジュゲートされてＡＤＣとして試験された。
【０１４５】
Ａｂ１も、弾頭ＰＢＤの部位特異的コンジュゲーション部位を操作するために改変された。具体的には、操作されたシステイン抗体（Ｃ２３９）は、ＤＡＲ２を有するＰＢＤダイマーの部位特異的コンジュゲーションを可能にするため当技術分野で公知の一般的な技法を使用して作成された。この突然変異された抗体は本明細書ではＡｂ１（Ｓ２３９Ｃ）と呼ばれ、Ａｂ１軽鎖及び改変されたＡｂ１（Ｃ２３９）重鎖配列を含む。Ａｂ１（Ｓ２３９Ｃ）の重鎖アミノ酸配列は下で配列番号１９に記載されている。ＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）（配列番号１６〜１８）は下線を施され、可変領域（配列番号１５）はイタリック体にされている。
【０１４６】
【化２５】
2020532523.tif 000028
【０１４７】
Ａｂ１（Ｓ２３９Ｃ）の重鎖定常領域は、その親抗体ＡｂＡと比べて改変された残基を含有する。具体的には、残基２３９（Ｋａｂａｔ番号付け）は、Ａｂ１の重鎖と比べてＳからＣに突然変異された。この残基は上の配列番号１９では下線が施され／太字にされている。Ｓ２３９Ｃ（Ｋａｂａｔ番号付け）は、配列番号１９のアミノ酸残基２３８（Ｓ２３８Ｃ）に対応していることに留意すべきである。
【０１４８】
Ａｂ１（Ｓ２３９Ｃ）は、ＰＢＤダイマーにさらにコンジュゲートされてＡＤＣとして試験され、Ａｂ１（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤは、Ｃｙｓ操作された抗ＥＧＦＲ抗体Ａｂ１（Ｓ２３９Ｃ）にコンジュゲートされた２つのＰＢＤ薬物−リンカー分子で構成されている。
【０１４９】
実施例２：ＰＢＤコンジュゲートの作成及び生理化学的特徴付け
ＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤは、Ｃｙｓ操作された抗ＥＧＦＲ抗体ＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）にコンジュゲートされた２つのＰＢＤ薬物−リンカー分子で構成されている。ＰＢＤ及びリンカーの構造は図２に記載されている。図２はＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤを調製する工程も記載している。コンジュゲーション工程は、鎖間ジスルフィドの還元、量的酸化及び過剰なＰＢＤ薬物リンカーとのコンジュゲーションを含んでいた。コンジュゲーション工程は操作されたジスルフィドと鎖間ジスルフィドの両方の量的還元からなっていた。次に、還元混合物は精製して過剰な試薬及びその副産物を取り除き、続いて鎖間ジスルフィドの量的酸化、次に過剰なＰＢＤ薬物リンカーとのコンジュゲーションを行った。図２に記載されるように、クエンチング後、反応混合物を精製しバッファー交換して、＞８５％ＤＡＲ２薬物負荷のＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤを得た。精製後のＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤ  ＡＤＣの全収率はおおよそ９０％であった。コンジュゲーション工程には、おおよそ２．５％ｗｔ負荷（約２ｇ）のＰＢＤ薬物リンカーが必要であった。
【０１５０】
Ｃｙｓ操作された抗ＥＧＦＲ抗体Ａｂ１（Ｓ２３９Ｃ）にコンジュゲートされた２つのＰＢＤ薬物リンカー分子で構成されたＡｂ１（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤも、上に記載され図２に示される工程に従って調製された。
【０１５１】
実施例３：フローサイトメトリー分析
ＰＢＤへのＣｙｓ操作されたＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）のコンジュゲーションは、親抗体ＡｂＡと比べて結合特性を変更しないことを確かめるため、フローサイトメトリーベースのアッセイを、野生型ＥＧＦＲ又は、Ａｂ１及びＡｂＡにより認識される潜在エピトープを露出させることが知られている点突然変異体である、ＥＧＦＲのＣＡ突然変異版（ＥＧＦＲＣ２７１Ａ、Ｃ２８３Ａ）を発現するように操作されたＮＲ６ヒト線維芽細胞を用いて実施した。Ａｂ１及びＡｂＡ、Ｃｙｓ操作されたＡｂ１（Ｓ２３９Ｃ）及びＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）突然変異体並びにＰＢＤ−コンジュゲートＡｂ１（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤ及びＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤを含む、６つの抗体／ＡＤＣが分析には含まれた。増加する濃度の抗体を、野生型ＥＧＦＲ過剰発現（図５Ａ）及びＥＧＦＲ  ＣＡ突然変異体過剰発現（図５Ｂ）ＮＲ６細胞に添加した。
【０１５２】
図５に示されるように、過剰発現されたＥＧＦＲを用いた結合曲線はＡｂＡ、ＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）及びＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤについて類似している。全結合は、野生型ＥＧＦＲ発現ＮＲ６細胞と比べてＣＡ突然変異体の方が大きい。図５Ｂに示されるように、６つの抗体／ＡＤＣはすべてＥＧＦＲ  ＣＡ突然変異体発現細胞に結合した。これらの結果は、ＰＢＤへのＣｙｓ操作されたＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）のコンジュゲーションが親抗体と比べて結合特性を変更していないことを示している。
【０１５３】
実施例４：ＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤ  ＡＤＣ対ＡｂＡ−ＭＭＡＥ  ＡＤＣのインビトロ比較
ＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤの細胞障害活性は、Ａｂ１（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤと共に、細胞殺傷アッセイにおいて異なるレベルの表面ＥＧＦＲを発現する腫瘍細胞株のパネルに対して評価した。特に、Ａ４３１、ＳＷ４８、ＮＣ１−Ｈ４４１及びＬｏＶｏ腫瘍細胞は、示される濃度で添加したＡＤＣ（ＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤ及びＡｂＡ−ＭＭＡＥを含む）を有する９６ウェルプレートに播種した。細胞生存率は、３７℃で７２時間のインキュベーション後ＡＴＰｌｉｔｅ発光アッセイを用いて評価した。この分析の結果は図７に示されている。図７に示されるように、対応するオーリスタチンコンジュゲート、ＡｂＡ−ＭＭＡＥ  ＡＤＣと比べて、ＰＢＤコンジュゲートＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤの処置に続いて４つの細胞株すべてにおいて細胞障害活性が改善されていた。
【０１５４】
本開示の目的では、「ＡｂＡ−ＭＭＡＥ」又は（「ＡｂＡ−ｖｃＭＭＡＥ」）とは、切断可能バリン−シトルリン（ＶＣ）リンカーを介してオーリスタチン弾頭モノメチルオーリスタチンＥにコンジュゲートされているＡｂＡを含む、オーリスタチンベースのＡＤＣのことである。別段記載されなければ、本開示の実施例において使用されるＡｂＡ−ＭＭＡＥ  ＡＤＣは約３のＤＡＲを有することに留意すべきである。本開示の目的では、「Ａｂ１−ＭＭＡＦ」とは、切断不可能マレイミドカプロイルリンカーを介してオーリスタチン弾頭モノメチルオーリスタチンＦにコンジュゲートされているヒト化ＩｇＧ１抗体Ａｂ１を有する抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）のことである。別段記載されなければ、本開示の実施例において使用されるＡｂ１−ＭＭＡＦ  ＡＤＣは約３．８のＤＡＲを有することに留意すべきである。
【０１５５】
この分析において使用される細胞上のＥＧＦＲ数は、図６にいくつかの他のＥＧＦＲ過剰発現細胞株と比べて示されている。Ａ４３１は、ＥＧＦＲが増幅されている（＞２×１０６受容体／細胞）類表皮癌細胞株である。ＳＷ−４８は、ＥＧＦＲを発現する（細胞あたり＞２００，０００受容体；ＩＨＣ  Ｈスコア２２８）結腸直腸腺癌細胞株であり；ＮＣＩ−Ｈ４４１は、ＥＧＦＲ発現が中程度から低いまで（細胞あたり約１００，０００受容体；ＩＨＣ  Ｈスコア１５０）の肺腺腫異種移植片モデルであり、ＬｏＶｏは、ＥＧＦＲ発現がもっと低い（細胞あたり＜１００，０００受容体；ＩＨＣ  Ｈスコア１４０）ＫＲＡＳ突然変異結腸直腸腺癌である（図６）。
【０１５６】
ＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤ及びＡｂ１（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤも、異なるレベルのＥＧＦＲを発現している２２の結腸直腸がん細胞株のパネルの成長を阻害するその能力について評価した（表１）。細胞増殖アッセイにおける、ＡＤＣの感受性は、オーリスタチンＡＤＣ  Ａｂ１−ＭＭＡＦ及びＡｂＡ−ＭＭＡＥと共に、ＩＣ５０値により示される。この研究で使用されるＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤ及びＡｂ１（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤコンジュゲートは＞８５％のＤＡＲ２薬物負荷を含有する。
【０１５７】
【表１】
2020532523.tif 000029
【０１５８】
マイクロチューブリン阻害剤は、ＥＧＦＲ陽性結腸直腸腫瘍を含む一部の疾患状況において有意な有効性を示していない。Ｐｅｒｅｚ  ＥＡ．Ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ  ｔｕｂｕｌｉｎ−ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ、ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ、ａｎｄ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  ２００９年；８（８）：２０８６〜９５頁を参照されたい。ＩＨＣ分析は、＞２５％のＣＲＣがＥＧＦＲを発現することを示しており、ＣＲＣはいくつかのＥＧＦＲベースの治療についての承認された徴候である。Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ  Ｊ、Ｂａｓｅｌｇａ  Ｊ．Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００６年；３３（４）：３６９〜８５頁；Ｈｅｒｂｓｔ  ＲＳ、Ｋｉｍ  ＥＳ、Ｈａｒａｒｉ  ＰＭ．ＩＭＣ−Ｃ２２５、ａｎ  ａｎｔｉ−ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ、ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｃａｎｃｅｒ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２００１年；１（４）：７１９〜３２頁；Ｌｙｎｃｈ  ＤＨ、Ｙａｎｇ  ＸＤ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ＡＢＸ−ＥＧＦ：ａ  ｆｕｌｌｙ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉ−ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００２年；２９（１  Ｓｕｐｐｌ  ４）：４７〜５０頁を参照されたい。
【０１５９】
表１に示されているように、細胞株の大半は、一般に＞１００ｎｍのＩＣ５０値により証明されたように、オーリスタチンベースのＡＤＣ（ＡｂＡ−ＭＭＡＥ  ＡＤＣ及びＡｂ１−ＭＭＡＦ  ＡＤＣ）には大いに非感受性であったが、ＰＢＤコンジュゲートＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤ及びＡｂ１（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤは細胞成長を阻害するのにはるかに効果的であった。さらに、重要なことに、細胞成長の阻害はＥＧＦＲ発現レベルとは相関しておらず、本開示のＰＢＤ  ＡＤＣは低ＥＧＦＲ発現結腸直腸腫瘍細胞株に対して効果的である可能性があることが示唆される。ＥＧＦリガンド誘導自己分泌活性化及びＡｂＡエピトープの露出の対応する増加も、これら腫瘍細胞株の一部の感受性に寄与している可能性がある。非ターゲティングＰＢＤ  ＡＤＣ対照も選ばれた腫瘍細胞株に対してある程度の抑制活性を有していたが、全体ではその活性は、ＥＧＦＲターゲティングＰＢＤを用いて観察された活性と比べると有意に減少していた。要約すると、これらの結果は、ＥＧＦＲ−ＰＢＤ  ＡＤＣの活性が、オーリスタチンベースのＡＤＣには大いに非感受性である低レベル及び中程度レベルのＥＧＦＲ発現結腸直腸腫瘍まで及ぶ可能性があることを示している。
【０１６０】
ＥＧＦＲ−ＰＢＤ  ＡＤＣ  ＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤ及びＡｂ１（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤの活性は、ヒト神経膠芽腫（ＧＢＭ）腫瘍細胞株のパネルに対しても評価された。
【０１６１】
【表２】
2020532523.tif 000030
【０１６２】
表２に示されるように、ＡｂＡ−ＭＭＡＥ及びＡｂ１  ＭＭＡＦはこれらの腫瘍細胞株の増殖を阻害するのが大部分無効であった。なぜならば、このパネルに含まれる細胞株は増幅されたＥＧＦＲがないからである（Ｕ８７ＭＧｄｅ２−７を除いて）。これらの腫瘍細胞株上で発現されたＥＧＦＲのレベルはさらに低いにもかかわらず、ＰＢＤコンジュゲートＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤ及びＡｂ１（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤは効力が改善されており、ＥＧＦＲ−ＰＢＤコンジュゲートは、ＥＧＦＲ増幅又は過剰発現腫瘍以上にＧＢＭに活性がある可能性があるという所見と一致している。
【０１６３】
実施例５：ＥＧＦＲ  ＡＤＣのインビボ特徴付け
マウス対象においてＥＧＦＲ発現レベルが低から高まで変化する異種移植片モデルを使用するインビボ研究を、ＡｂＡコンジュゲートオーリスタチンペイロードとＰＢＤペイロードの両方を使用して実施した。
【０１６４】
ＮＣＩ−Ｈ４４１は、図６に示されるように、中程度から低ＥＧＦＲ発現（細胞あたり約１００，０００受容体、ＩＨＣ  Ｈスコア１５０）の肺腺腫異種移植片モデルである。ＮＣＩ−Ｈ４４１（肺腺癌）におけるＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤ及びＡｂ１（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤの有効性は図８Ａに示されている。図８Ａに示されているように、ＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤ及びＡｂ１（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤは、７日毎に１回０．３ｍｇ／ｋｇで合計６用量投与され（Ｑ７Ｄｘ６）、動物の１００％において完全及び永続的退縮を誘導し、１０倍の高用量（３ｍｇ／ｋｇ）Ｑ７Ｄｘ６で投与されたＡｂ１−ＭＭＡＦは動物の４０％でしか完全奏功を誘導しなかった。完全奏功（ＣＲ）は、少なくとも３回の連続測定について２５ｍｍ３未満の腫瘍量と定義される。Ａｂ１−ＭＭＡＦ処置に続いてすべての腫瘍が最終的に再発した。負の対照ＡＤＣであるＡｂ０９５−ＰＢＤも動物の１００％において永続的及び完全奏功を誘導した。この感受性は、他のＡＤＣの場合に観察されたが、腫瘍関連抗原の認識というよりもＮＣＩ−Ｈ４４１腫瘍におけるＰＢＤ感受性と抗体蓄積の組合せからの増強された透過性及び保持効果から生じる可能性がある。ＩＨＣによれば、ＮＣＩ−Ｈ４４１腫瘍細胞の細胞膜上のＥＧＦＲの発現は３＋であった。
【０１６５】
図８Ｂは、結腸直腸腺癌ＬｏＶｏ異種移植片におけるＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤ及びＡｂ１（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤの有効性を示している。ＬｏＶｏは、ＥＧＦＲ発現がＮＣＩ−Ｈ４４１よりも低い（細胞あたり＜１００，０００受容体；ＩＨＣ  Ｈスコア１４０）ＫＲＡＳ突然変異結腸直腸腺癌である。標的発現がＮＣＩ−Ｈ４４１よりも低いＬｏＶｏである結腸直腸腺癌モデルでは、ＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤは完全及び永続的奏功を誘導したが、Ａｂ１（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤを用いた投与の休止に続いて腫瘍が再発した（図８Ｂ）。両方のコンジュゲートはｑ７ｄｘ６レジメン（マウスは６週の間７日毎に投与された）において０．５ｍｇ／ｋｇで投与された。このモデルでは、抗ＥＧＦＲコンジュゲートの特異性は、負の対照コンジュゲートＡｂ０９５ＰＢＤと比べて奏功の持続性の増加により実証された。ＡｂＡ−ＭＭＡＥもこのモデルでは活性であり、活性はＡｂ１（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤで観察された活性に類似していたが、ＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤほど活性ではなかった。さらに、これらの結果を達成するため、ＡｂＡ−ＭＭＡＥは、ＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤよりもはるかに高用量で（具体的には、１０倍の用量で）投与しなければならなかった。図８Ａ及び図８Ｂでは、丸カッコ内の数はｍｇ／ｋｇでの用量を表す。矢印は投与日を表す。ＨＣによれば、ＬｏＶｏ腫瘍細胞の細胞膜上のＥＧＦＲの発現は３＋である。
【０１６６】
ＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤ及びＡｂ１（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤの有効性を、結腸直腸腺癌の第２のモデルである、ＳＷ４８（細胞あたり＞２００，０００受容体；ＥＧＦＲ  Ｈスコア：２２８）において対応するオーリスタチンＡＤＣと比べて評価した。図９Ａに示されるように、０．１ｍｇ／ｋｇの単回投与に続いて、ＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤはＡｂ１（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤよりも永続性のある奏功を誘導した。図９Ｂに示されるように、０．２ｍｇ／ｋｇでの投与に従ったＡｂ１（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤに続く奏功の永続性は、０．１ｍｇ／ｋｇでのＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤで観察された奏功の永続性と類似しており、このモデルでは、ＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤの効力はＡｂ１（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤの少なくとも２倍であることが示唆される。図９Ａ及び図９Ｂでは、丸カッコ内の数はｍｇ／ｋｇでの用量を表す。矢印は投与日を表す。ＩＨＣにより決定されるＳＷ４８異種移植片におけるＥＧＦＲの発現は３＋である。
【０１６７】
ＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤ及びＡｂ１（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤの有効性を、ＣＴＧ−０１６２非小細胞肺がんモデルでもＡｂ１及びＡｂＡ−ＭＭＡＥと比べて評価した。図１０Ａに示されるように、ＣＴＧ−０１６２ＮＳＣＬＣモデルでは、ｑ７ｘ６で投与されたＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤ及びＡｂ１（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤは腫瘍成長を阻害するのに非常に効果的であり、ＡｂＡ−ＭＭＡＥは、ＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤ又はＡｂ１（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤの１０倍投与されたにもかかわらず、効果はもっと低かった。Ａｂ１もこのモデルでは効果的ではなかった。
【０１６８】
ＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤ及びＡｂ１（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤの有効性を、ＣＴＧ−９７８６頭頚部がんモデルでもＡｂ１及びＡｂＡ−ＭＭＡＥと比べて評価した。図１０Ｂに示されるように、ＣＴＧ−９７８６頭頚部がんモデルでは、ｑ７ｘ６で投与されたＡｂ１（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤ及びＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤは腫瘍成長を阻害するのに非常に効果的であった。ＡｂＡ−ＭＭＡＥも効果的であったが、はるかに高用量を必要とした。
【０１６９】
要約すると、これらのインビボ結果は、ＰＢＤコンジュゲートが、もっと低いＥＧＦＲ発現結腸直腸腫瘍を含む、様々な異なる腫瘍型にわたってオーリスタチンベースのコンジュゲートよりも強力であり、より持続する抗腫瘍応答を生み出すことを示している。ＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤを用いたＮＳＣＬＣ、ＣＲＣ及びＨ＆Ｎ異種移植片の処置により腫瘍成長は著しく低減された。ＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤによる異種移植片阻害の広さ及び永続性は、通常、同じレジメンでオーリスタチンコンジュゲートの用量の１０分の１で試験した場合、オーリスタチンコンジュゲートと比べて増加した。
【０１７０】
実施例６：インビトロ血漿安定性
蛍光標識されたＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）抗体及びＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）−ＰＢＤ  ＤＡＲ２の安定性を、マウス、ラット、イヌ及びヒト由来の血漿中、並びにバッファー中、３７℃、６日間インビトロで評価した。タンパク質凝集及び断片化はサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により測定した。コンジュゲートされていないＰＢＤは液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）により判定した。
【０１７１】
ＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）モノクローナル抗体のインビトロ血漿安定性は図に示されている。図１１Ａ．ＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）モノクローナル抗体は、バッファー及び血漿中ｔ０で２．３〜３．１％の初期凝集体を示し、バッファー及び血漿中では凝集体の低増加／日（≦０．７％）であった。ＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）抗体はバッファー及び血漿中ｔ０で初期断片は０％であり、バッファー及び血漿中断片の１日あたり低増加（≦１．５％）であった。
【０１７２】
ＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）ＰＢＤ  ＤＡＲ２  ＡＤＣのインビトロ血漿安定性は図に示されている。図１１Ｂ．ＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）ＰＢＤ  ＤＡＲ２  ＡＤＣは、バッファー及び血漿中で高い初期凝集体（１１〜１３％）を示し、％凝集体増加／日はバッファー及び血漿中で低い（≦０．３％）又は減少した。ＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）ＰＢＤ  ＤＡＲ２  ＡＤＣはバッファー及び血漿中で初期断片は０％であり、バッファー及び血漿中で最少％増加／日（≦０．３％）であった。
【０１７３】
ＰＢＤ弾頭それ自体が試験され、すべての血漿マトリックス中３７℃で６日間血漿中で安定であることが見出された。ＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）ＰＢＤ  ＤＡＲ２  ＡＤＣから放出されたコンジュゲートしていない弾頭はあらゆる時点で及びすべてのマトリックス中で定量レベルよりも下であった。これは、投与された弾頭等価物の＜０．５％に相当する。
【０１７４】
蛍光標識されたＡｂＡ−ＭＭＡＥの安定性も、血漿（ヒト、イヌ、マウス、ラット）及びバッファー中、３７℃、６日間インビトロで評価された。タンパク質凝集及び断片化はサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により測定した。ＡｂＡ  ＭＭＡＥ  ＡＤＣはバッファー及び血漿中で１．８〜４．１％の初期凝集体を示し、１日あたりの％凝集体増加は血漿中で３．１〜６．２％であった。ＡｂＡ  ＭＭＡＥ  ＡＤＣはバッファー及び血漿中、ｔ０でバッファー及び血漿中０〜１．２％の初期断片を有し、バッファー及び血漿中、≦１．４％の断片の１日あたり増加を示した。
【０１７５】
全体では、高い初期凝集体を有するにもかかわらず、ＡｂＡ（Ｓ２３９Ｃ）ＰＢＤ  ＤＡＲ２  ＡＤＣのインビトロ血漿安定性はＡｂＡ  ＭＭＡＥ  ＡＤＣ（よりもよくはないにしても）に類似していた。
【０１７６】
【表３】
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【０１７７】
本出願に引用されるすべての出版物、特許、特許出願及び他の文書は、参照によりその全体をあらゆる目的のために、まるでそれぞれ個々の出版物、特許、特許出願又は他の文書が、参照によりあらゆる目的のために組み込まれることを個々に指示されている場合と同じ程度に本明細書に組み込む。
【０１７８】
種々の特定の実施形態が図示され説明されたてきが、本開示の精神及び範囲から逸脱することなく、種々の変化を加えることが可能であることは認識されるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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