(57)【要約】  本発明は、多価不飽和脂肪酸において濃縮されているオイル組成物；そのオイル組成物を含有する組成物；並びにそのオイル組成物を製造及び使用する方法に関する。このオイルは、好ましくは、微生物又は海産オイルである。【選択図】なし
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
長鎖多価不飽和脂肪酸（ＬＣ−ＰＵＦＡ）を含むオイルを分離及び濃縮するプロセスであって、
ａ）出発オイルをそのエチルエステル形態にエステル交換反応させる工程；
ｂ）前記エチルエステルオイルを蒸留する工程；
ｃ）前記蒸留エチルエステルオイルを尿素複合体形成させる工程；
ｄ）工程ｃ）から得られた前記オイルをさらなる濃縮工程にかける工程；
ｅ）工程ｄ）から得られた前記オイルを尿素複合体形成させる工程；及び
ｆ）工程ｅ）から得られた前記オイルを濾過して、結果的なオイルを得る工程
を含み、前記結果的なオイルは、少なくとも１つのＬＣ−ＰＵＦＡにおいて濃縮されている、プロセス。
【請求項２】
工程ｄ）における前記濃縮工程は、クロマトグラフィー、蒸留、尿素複合体形成及びその組み合わせを含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
前記少なくとも１つのＬＣ−ＰＵＦＡの重量％は、前記出発オイル中の重量％と比較して、前記結果的なオイルにおいて少なくとも約２０重量％だけ増加される、請求項１又は２に記載のプロセス。
【請求項４】
前記少なくとも１つのＬＣ−ＰＵＦＡの重量％は、前記出発オイル中の重量％と比較して、前記結果的なオイルにおいて少なくとも約３０重量％だけ増加される、請求項１〜３のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項５】
前記結果的なオイルは、少なくとも約７０％の前記少なくとも１つのＬＣ−ＰＵＦＡを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項６】
前記結果的なオイルは、少なくとも約８０％の前記少なくとも１つのＬＣ−ＰＵＦＡを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項７】
前記結果的なオイルは、少なくとも約９０％の前記少なくとも１つのＬＣ−ＰＵＦＡを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項８】
前記少なくとも１つのＬＣ−ＰＵＦＡは、アラキドン酸（ＡＲＡ）である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項９】
前記蒸留工程は、分留、ショートパス蒸留、流下薄膜型蒸発、ワイプフィルム蒸発器又はその組み合わせを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１０】
前記蒸留工程は、ショートパス蒸留を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１１】
前記蒸留工程は、分留を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１２】
前記出発オイルは、微生物オイル又は海産オイルである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１３】
前記出発オイルは、微生物オイルである、請求項１２に記載のプロセス。
【請求項１４】
前記出発オイルは、微生物によって産生され、前記微生物は、微細藻類、細菌、真菌及び原生生物を含む群から選択される、請求項１３に記載のプロセス。
【請求項１５】
前記微生物は、真菌である、請求項１４に記載のプロセス。
【請求項１６】
前記微生物は、モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属のものである、請求項１５に記載のプロセス。
【請求項１７】
前記微生物は、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）種のものである、請求項１６に記載のプロセス。
【請求項１８】
前記結果的なオイルは、前記オイル中のエステル画分の少なくとも一部をトリグリセリド画分に変換するために再度エステル交換反応される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１９】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載のプロセスによって生成されるオイル。
【請求項２０】
少なくとも約７０重量％のＡＲＡを含む、請求項１９に記載の微生物オイル。
【請求項２１】
少なくとも約８０重量％のＡＲＡを含む、請求項１９に記載の微生物オイル。
【請求項２２】
少なくとも約９０重量％のＡＲＡを含む、請求項１９に記載の微生物オイル。
【請求項２３】
前記ＡＲＡは、エチルエステルである、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の微生物オイル。
【請求項２４】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載のプロセスによって生成されるオイル。
【請求項２５】
少なくとも約７０重量％のＡＲＡを含む、請求項２４に記載の微生物オイル。
【請求項２６】
少なくとも約８０重量％のＡＲＡを含む、請求項２４に記載の微生物オイル。
【請求項２７】
少なくとも約９０重量％のＡＲＡを含む、請求項２４に記載の微生物オイル。
【請求項２８】
前記ＡＲＡは、トリグリセリドである、請求項２４〜２７のいずれか一項に記載の微生物オイル。
【請求項２９】
少なくとも約７０重量％のＡＲＡを含む微生物オイル。
【請求項３０】
少なくとも約８０重量％のＡＲＡを含む、請求項２９に記載の微生物オイル。
【請求項３１】
少なくとも約９０重量％のＡＲＡを含む、請求項２９に記載の微生物オイル。
【請求項３２】
前記ＡＲＡは、エチルエステルである、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の微生物オイル。
【請求項３３】
前記ＡＲＡは、トリグリセリドである、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の微生物オイル。
【請求項３４】
微生物に由来し、前記微生物は、微細藻類、細菌、真菌及び原生生物を含む群から選択される、請求項２９〜３３のいずれか一項に記載の微生物オイル。
【請求項３５】
前記微生物は、真菌である、請求項３４に記載の微生物オイル。
【請求項３６】
前記微生物は、モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属のものである、請求項３５に記載の微生物オイル。
【請求項３７】
前記微生物は、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）種のものである、請求項３６に記載の微生物オイル。
【請求項３８】
請求項１９〜３７のいずれか一項に記載のオイルを含む、非ヒト又はヒトのための食品、化粧品組成物又は医薬組成物。
【請求項３９】
ミルク、飲料、治療用飲料、栄養飲料又はその組み合わせである、請求項３８に記載の食品。
【請求項４０】
幼児製剤である、請求項３８又は３９に記載の食品。
【請求項４１】
栄養補助食品である、請求項３８又は３９に記載の食品。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
[0001]本出願は、その開示が参照により本明細書に組み込まれる２０１７年８月７日出願の米国仮特許出願第６２／５４２，０５３号明細書の出願日の利益を主張する。
【０００２】
［発明の分野］
[0002]本開示は、多価不飽和脂肪酸、特にアラキドン酸において濃縮されているオイル組成物；そのオイル組成物を含有する組成物；並びにそのオイル組成物を製造及び使用する方法に関する。
【０００３】
［発明の背景］
[0003]脂肪酸は、炭素鎖の長さ及び飽和特性に基づいて分類される。脂肪酸は、鎖に存在する炭素数に基づいて短鎖、中鎖又は長鎖脂肪酸と呼ばれ、炭素原子間に二重結合又は三重結合が存在しない場合、飽和脂肪酸と呼ばれ、二重結合又は三重結合が存在する場合、不飽和脂肪酸と呼ばれる。不飽和長鎖脂肪酸は、二重結合又は三重結合が１つのみ存在する場合には一価不飽和であり、二重結合又は三重結合が２つ以上存在する場合には多価不飽和である。
【０００４】
[0004]多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）は、脂肪酸のメチル末端から第１の二重結合の位置に基づいて分類され；ω−３（ｎ−３）脂肪酸は、メチル末端から数えて３番目の炭素において第１の二重結合を含有するのに対して、ω−６（ｎ−６）脂肪酸は、６番目の炭素において第１の二重結合を含有する。例えば、ドコサヘキサエン酸（「ＤＨＡ」）は、炭素数２２個の鎖長及び二重結合６個を有するω−３長鎖多価不飽和脂肪酸（ＬＣ−ＰＵＦＡ）であり、「２２：６  ｎ−３」と示される場合が多い。他のω−３  ＬＣ−ＰＵＦＡは、「２０：５  ｎ−３」と示されるエイコサペンタエン酸（「ＥＰＡ」）及び「２２：５  ｎ−３」と示されるω−３ドコサぺンタエン酸（「ＤＰＡ  ｎ−３」）を含む。ω−６  ＬＣ−ＰＵＦＡは、「２０：４  ｎ−６」と示されるアラキドン酸（「ＡＲＡ」）及び「２２：５  ｎ−６」と示されるω−６ドコサぺンタエン酸（「ＤＰＡ  ｎ−６」）を含む。
【０００５】
[0005]アラキドン酸（ＡＲＡ、２０：４  ｎ−６）は、ω−６カテゴリーに属するＬＣ−ＰＵＦＡである。この分子は、シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ４５０）ファミリーにおいて酵素によって一酸素添加又はエポキシ化のいずれかを受け得、且つ代謝産物は、多くの器官、肺、尿細管及び角膜上皮、肝臓などの血管内皮の産生部位に基づいて異なる生物学的機能を有する。可能性のある標的は、酵素（Ｎａ＋−Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ）又はイオンチャネル（カルシウム活性化カリウムチャネル）のいずれかである。骨格筋は、アラキドン酸保持の特に活性な部位である。ＰＬＣ−γ、ＰＬＣ−δ並びにＰＫＣ−α、−β及び−γアイソフォームなどのシグナル伝達酵素の調節に関与する脂質第２メッセンジャーとして、細胞シグナル伝達に関与することに加えて、アラキドン酸は、重要な炎症性中間体であり、且つ血管拡張剤として作用する。
【０００６】
[0006]ＡＲＡ濃縮オイルは、特殊な医薬品有効成分（ＡＰＩ）分子の構築単位として単独で使用することができ、例えば疼痛、炎症、神経性及び脳疾患の管理並びに認知障害向けのものである。それは、疼痛、炎症、神経性及び脳疾患の管理並びに認知障害の予防又は管理のために、栄養補助食品として単独で、ω−３、ω−７及び他の適切な物質と組み合わせて使用することもできる。このＡＲＡ濃縮物へのアクセスは、例えば、他の非常に強力なＡＲＡ形態の製造などのさらなる可能性を開く。
【０００７】
[0007]出発オイルからＥＰＡ及びＤＨＡなどのω−３脂肪酸を濃縮する方法は、公知であり、且つ比較的簡単明瞭であり、９５％を超える効力が得られる。しかしながら、ＡＲＡの濃縮は、一般に、モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属の真菌の発酵から通常得られる出発オイルの組成のために非常に大きい課題をもたらす。
【０００８】
[0008]したがって、出発オイルからＡＲＡを濃縮して、ある程度の収率で高効力のＡＲＡオイルを得る方法が必要とされ続けている。
【０００９】
[0009]この技術的問題の解決策は、特許請求の範囲で特徴付けられる実施形態によって提供される。
【００１０】
［発明の概要］
[0010]本出願は、出発オイル、例えばモルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）の発酵から得られるオイルから、ＡＲＡが豊富なオイルを製造するプロセスに関する。一般に、このプロセスは、例えば、無水エタノールをナトリウムエトキシドの存在下で使用し、続いて例えばワイプフィルム蒸発、分留又はショートパス蒸留で蒸留することにより、対応するエチルエステル形態に出発オイルをエステル交換反応させることを含む。次いで、留出物は、例えば、９５％エタノール中の尿素を使用して、第１の尿素複合体形成工程にかけられる。中間体を単離した後、アイソクラティック条件下において、メタノール／水中で逆相クロマトグラフィーによって中間体をさらに分画する。適切な画分を収集し、濃縮し、第２の尿素複合体形成工程にかけて、生成物を単離し且つ安定化する。
【００１１】
[0011]本出願は、本明細書に記載のプロセスによって製造されるオイルも開示する。
【００１２】
[0012]本出願は、少なくとも約７０重量％のＡＲＡを含む微生物オイルをさらに開示する。特に、微生物オイルは、１つ又は複数の微生物、例えば微細藻類、細菌、真菌及び原生生物などから得られる。一部の実施形態において、微生物は、真菌である。好ましい実施形態において、真菌は、モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属である。さらに好ましい実施形態では、微生物は、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）種である。
【００１３】
[0013]本明細書に記載のオイルを含む、非ヒト又はヒトのための食品、化粧品又は医薬組成物も提供される。一部の実施形態では、食品は、ミルク、飲料、治療用飲料、栄養ドリンク又はその組み合わせである。好ましい実施形態において、食品は、幼児製剤又は栄養補助食品である。
【００１４】
[0014]本開示の性質、目的及び利点をさらに理解するために、以下の詳細な説明が参照され、同様の参照番号が同様の要素を示す以下の図面と共に読まれるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の例示的なプロセスを示す。
【図２】比較のプロセスを示す。
【００１６】
［本発明の詳細な説明］
[0017]主題の開示をさらに説明する前に、本開示は、以下に記載される本開示の特定の実施形態に限定されず、特定の実施形態に対する変更形態がなされ得、且つ依然として添付の特許請求の範囲内にあることが理解されるべきである。使用される専門用語は、特定の実施形態を説明するためのものであり、限定することを意図するものではないことも理解されるべきである。代わりに、本開示の範囲は、添付の特許請求の範囲によって確立されるであろう。
【００１７】
[0018]本明細書及び添付の特許請求の範囲において、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈に明確に特別な指示がない限り、複数の言及を包含する。特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的及び科学的用語は、本開示が属する技術分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。
【００１８】
[0019]一態様において、主題の開示は、長鎖多価不飽和脂肪酸（ＬＣ−ＰＵＦＡ）が豊富なオイルを製造するプロセスを特徴とする。好ましい実施形態において、ＬＣ−ＰＵＦＡは、ω−６脂肪酸である。さらに好ましい実施形態において、ＬＣ−ＰＵＦＡは、アラキドン酸（ＡＲＡ）である。
【００１９】
[0020]［出発オイル組成物］
[0021]一部の実施形態において、出発オイルは、微生物又は海産オイルである。
【００２０】
[0022]微生物によって産生されるか又は微生物細胞から得られるオイルは、「微生物オイル」と呼ばれる。藻類及び／又は真菌によって産生されるオイルは、それぞれ藻類及び／又は真菌オイルと呼ばれる。
【００２１】
[0023]本明細書で使用される「微生物」とは、藻類、細菌、真菌、原生生物、酵母及びその組み合わせ、例えば単細胞生物などの生物を意味する。微生物としては、限定されないが、黄金藻類（例えば、ストラメノパイル界（ｋｉｎｇｄｏｍ  Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ）の微生物）；緑色藻類；ケイ藻綱；渦鞭毛藻類（例えば、クリプテコジニウム・コーニイ（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ又はＣ．ｃｏｈｎｉｉ）などのクリプテコジニウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）属のメンバーを含む渦鞭藻綱（Ｄｉｎｏｐｈｙｃｅａｅ）目の微生物）；ヤブレツボカビ（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）目の微細藻類；酵母（子嚢菌綱又は担子菌類）；及びケカビ（Ｍｕｃｏｒ）属、限定されないが、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）及びモルティエレラ・セクト（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｓｅｃｔ）などのモルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属、シュムッケリ（ｓｃｈｍｕｃｋｅｒｉ）及び限定されないが、ピシウム・インシディオサム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｉｎｓｉｄｉｏｓｕｍ）などのクサレカビ属（Ｐｙｔｈｉｕｍ）の真菌が挙げられる。
【００２２】
[0024]一実施形態において、微生物は、モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属、クリプテコジニウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）属、トラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属及びその混合物に由来する。さらなる実施形態において、微生物は、クリプテコジニウム・コーニイ（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  Ｃｏｈｎｉｉ）に由来する。さらなる実施形態において、微生物は、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）に由来する。またさらなる実施形態において、微生物は、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種に由来する。またさらなる実施形態において、微生物は、クリプテコジニウム・コーニイ（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ）、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種及びその混合物から選択される。
【００２３】
[0025]さらなる実施形態において、微生物としては、限定されないが、モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属、コニディオボルス（Ｃｏｎｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）属、クサレカビ（Ｐｙｔｈｉｕｍ）属、エキビョウキン（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、クラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、ケカビ（Ｍｕｃｏｒ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ロードトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、エントモフソーラ（Ｅｎｔｏｍｏｐｈｔｈｏｒａ）属、エキノスポランギウム（Ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ）属及びミズカビ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ）属に属する微生物が挙げられる。
【００２４】
[0026]またさらなる実施形態において、微生物は、限定されないが、トラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属（アルジメンタレ（ａｒｕｄｉｍｅｎｔａｌｅ）、アウレウム（ａｕｒｅｕｍ）、ベンチコラ（ｂｅｎｔｈｉｃｏｌａ）、グロボスム（ｇｌｏｂｏｓｕｍ）、キンネイ（ｋｉｎｎｅｉ）、モチバム（ｍｏｔｉｖｕｍ）、マルチルジメンタレ（ｍｕｌｔｉｒｕｄｉｍｅｎｔａｌｅ）、パキデルマム（ｐａｃｈｙｄｅｒｍｕｍ）、プロリフェルム（ｐｒｏｌｉｆｅｒｕｍ）、ロゼウム（ｒｏｓｅｕｍ）、ストリアツム（ｓｔｒｉａｔｕｍ）を包含する種）；シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属（アグレガツム（ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ）、リムナセウム（ｌｉｍｎａｃｅｕｍ）、マングロベイ（ｍａｎｇｒｏｖｅｉ）、ミヌツム（ｍｉｎｕｔｕｍ）、オクトスポルム（ｏｃｔｏｓｐｏｒｕｍ）を包含する種）；ウルケニア（Ｕｌｋｅｎｉａ）属（アメボイデア（ａｍｏｅｂｏｉｄｅａ）、ケルゲレンシス（ｋｅｒｇｕｅｌｅｎｓｉｓ）、ミヌタ（ｍｉｎｕｔａ）、プロフンダ（ｐｒｏｆｕｎｄａ）、ラジアテ（ｒａｄｉａｔｅ）、サイレンス（ｓａｉｌｅｎｓ）、サルカリアナ（ｓａｒｋａｒｉａｎａ）、シゾキトロプス（ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｏｐｓ）、ビスルゲンシス（ｖｉｓｕｒｇｅｎｓｉｓ）、ヨルケンシス（ｙｏｒｋｅｎｓｉｓ）を包含する種）；オーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉａｃｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属；オーランチオキトリウム（Ｏｂｌｏｎｇｉｃｈｙｔｒｉｕｍ）属；サイコイドキトリウム（Ｓｉｃｙｏｉｄｏｃｈｙｔｉｕｍ）属；パリエンティチトリウム（Ｐａｒｉｅｎｔｉｃｈｙｔｒｉｕｍ）属；ボツリオキトリウム（Ｂｏｔｒｙｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属；及びその組み合わせなどのヤブレツボカビ目（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）の微細藻類に由来する。ウルケニア（Ｕｌｋｅｎｉａ）属に記載の種は、シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）のメンバーであるとみなされるであろう。他の実施形態において、微生物は、ヤブレツボカビ目（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）に由来する。さらに他の実施形態において、微生物は、トラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）に由来する。またさらなる実施形態において、微生物は、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種に由来する。
【００２５】
[0027]特定の実施形態において、オイルは、海産オイルを含み得る。適切な海産オイルの例としては、限定されないが、大西洋魚オイル、太平洋魚オイル若しくは地中海魚オイル又はそのいずれかの混合物若しくは組み合わせが挙げられる。より具体的な実施例において、適切な魚オイルは、限定されないが、そのいずれかの混合物又は組み合わせを含め、タラオイル、カツオオイル、イワシオイル、テラピアオイル、マグロオイル、スズキオイル、ハリバットオイル、フウライカジキオイル、バラクーダオイル、タラオイル、ニシンオイル、サーディンオイル、カタクチイワシオイル、カラフトシシャモオイル、ニシンオイル、サバオイル、サケ科の魚のオイル、マグロオイル及びサメオイルであり得る。本明細書で使用するのに適切な他の海産オイルとしては、限定されないが、ジンドウイカ類のオイル、イカオイル、タコのオイル、クリールのオイル、アザラシオイル、クジラのオイル及びそのいずれかの混合物若しくは組み合わせなどが挙げられる。
【００２６】
[0028]［エステル化］
[0029]一部の実施形態において、本明細書に記載の脂肪酸は、脂肪酸エステル又はエステルであり得る。一部の実施形態において、脂肪酸エステルとしては、ω−３脂肪酸、ω−６脂肪酸のエステル及びその組み合わせが挙げられる。一部の実施形態において、脂肪酸エステルは、ＡＲＡエステルである。一部の実施形態において、本明細書に記載のそのオイル又は画分をエステル化して、脂肪酸エステルを含むそのオイル又は画分を生成する。「エステル」という用語は、脂肪酸分子のカルボン酸基における水素を他の置換基で置換することを意味する。エステルの例としては、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ｔ−ブチル、ベンジル、ニトロベンジル、メトキシベンジル、ベンズヒドリル及びトリクロロエチルが挙げられる。一部の実施形態において、エステルは、カルボン酸保護性エステル基、アラルキル（例えば、ベンジル、フェネチル）を有するエステル、低級アルケニルを有するエステル（例えば、アリル、２−ブテニル）、低級アルコキシ−低級アルキル（例えば、メトキシメチル、２−メトキシエチル、２−エトキシエチル）を有するエステル、低級アルカノイルオキシ−低級アルキル（例えば、アセトキシメチル、ピバロイルオキシメチル、１−ピバロイルオキシエチル）を有するエステル、低級アルコキシカルボニル−低級アルキル（例えば、メトキシカルボニルメチル、イソプロポキシカルボニルメチル）を有するエステル、カルボキシ−低級アルキル（例えば、カルボキシメチル）を有するエステル、低級アルコキシカルボニルオキシ−低級アルキル（例えば、１−（エトキシカルボニルオキシ）エチル、１−（シクロヘキシルオキシカルボニルオキシ）エチル）を有するエステル、カルバモイルオキシ−低級アルキル（例えば、カルバモイルオキシメチル）を有するエステル等である。一部の実施形態において、付加される置換基は、直鎖状又は環状炭化水素基、例えばＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６シクロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル又はＣ１〜Ｃ６アリールエステルである。一部の実施形態において、エステルは、アルキルエステル、例えばメチルエステル、エチルエステル又はプロピルエステルである。一部の実施形態において、脂肪酸が精製状態又は半精製状態である場合、エステル置換基が遊離脂肪酸分子に付加される。
【００２７】
[0030]脂肪酸エステル、特に多価不飽和脂肪酸エステルを当業者に公知の方法で製造することができる。
【００２８】
[0031]例えば、脂肪酸、特に多価不飽和脂肪酸を含有するトリアシルグリセリド、ジアシルグリセリド及び／又はモノアシルグリセリドを酸又は塩基の存在下でアルコールと反応させて、エステルを生成することができる。米国特許出願公開第２００９／００２３８０８号明細書の開示全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００２９】
[0032]塩基は、例えば、金属アルキル酸化物であり得る。金属アルキル酸化物としては、ナトリウムエトキシド、ナトリウムメトキシド、ナトリウムｎ−プロポキシド、ナトリウムイソプロポキシド、ナトリウムｎ−ブトキシド、ナトリウムイソブトキシド、ナトリウムｓｅｃ−ブトキシド、ナトリウムｔｅｒｔ−ブトキシド、ナトリウムｎ−ペントキシド、ナトリウムｎ−ヘキソキシド、リチウムエトキシド、リチウムメトキシド、リチウムｎ−プロポキシド、リチウムイソプロポキシド、リチウムｎ−ブトキシド、リチウムイソ−ブトキシド、リチウムｓｅｃ−ブトキシド、リチウムｔｅｒｔ−ブトキシド、リチウムｎ−ペントキシド、リチウムｎ−ヘキソキシド、カリウムエトキシド、カリウムメトキシド、カリウムｎ−プロポキシド、カリウムイソ−プロポキシド、カリウムｎ−ブトキシド、カリウムイソ−ブトキシド、カリウムｓｅｃ−ブトキシド、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド、カリウムｎ−ペントキシド及び／又はカリウムｎ−ヘキソキシドが挙げられる。
【００３０】
[0033]一部の状況において、塩基は、ナトリウム金属、カリウム金属又はリチウム金属をアルコール溶液に添加することによって製造され得る。
【００３１】
[0034]一部の状況において、塩基は、水素化リチウム、水素化ナトリウム又は水素化カリウムなどの金属水素化物をアルコール溶液に添加することによって製造され得る。
【００３２】
[0035]重量対重量ベースの塩基とオイルとの比は、明確に記載されているかのように、すべての値及びその間の部分範囲を含めて、例えば１：１〜１０００：１の範囲であり得る。例えば、重量対重量ベースの塩基とオイルとの比は、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、１００：１、２００：１、３００：１、４００：１、５００；１、６００：１、７００：１、８００：１又は９００：１であり得る。
【００３３】
[0036]エステル化反応は、明確に記載されているかのように、すべての値及びその間の部分範囲を含めて、１０〜１００℃の範囲の温度で実施され得る。例えば、エステル化反応は、２０℃、３０℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃又は９０℃で行われ得る。
【００３４】
[0037]エステル化反応は、大気中において又は窒素若しくはアルゴンなどの不活性雰囲気下において行われ得る。
【００３５】
[0038]脂肪酸エステルのワークアップ及び単離は、例えば、有機溶媒、水又は超臨界流体で抽出することにより、当業者に公知の方法で行うことができる。有機溶媒は、例えば、ペンタン、ヘキサン、ジ−エチルエーテル、酢酸エチル又はこれらの組み合わせであり得る。水は、任意選択的に、重炭酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、塩化アンモニウム及び／又は希鉱酸などの他の物質を含み得る。超臨界流体は、例えば、二酸化炭素であり得る。
【００３６】
[0039]一部の実施形態において、オイルは、ときに、オイル中のエステル画分の少なくとも一部をトリグリセリド画分に変換するために再度エステル交換反応される。エステル交換反応、特にポリ不飽和脂肪酸エステルのエステル交換反応は、当業者に知られている方法で行うことができる。
【００３７】
[0040]［蒸留］
[0041]一部の実施形態において、このプロセスは、エステル化オイルを少なくとも１つの装置に供給することを含む少なくとも１つの蒸留工程にオイルをかけることと、留出物中の低沸点化合物を除去するための条件にエステル化オイルをかけることとを含む。
【００３８】
[0042]蒸留工程は、分留、ショートパス蒸留、流下薄膜型蒸発、ワイプフィルム蒸発器又はその組み合わせであり得る。好ましい実施形態において、蒸留工程は、分留である。他の好ましい実施形態において、蒸留工程は、ショートパス蒸留である。
【００３９】
[0043]当業者に公知のいずれかの手段によって蒸留を実施することができる。
【００４０】
[0044]［尿素複合体形成］
[0045]一部の実施形態において、このプロセスは、少なくとも１つの尿素複合体形成工程にオイルをかけることを含む。好ましい実施形態において、このプロセスは、少なくとも２つの尿素複合体形成工程を含む。尿素複合体形成は、当業者に公知のいずれかの方法を用いて実施され得る。
【００４１】
[0046]「尿素／オイル複合体」という用語は、「尿素付加物」又は「クラスレート」と同義で本明細書において使用される。尿素／オイル複合体は、種々の供給源のいずれかからのオイルを尿素と接触させる、工業的又は実験的なオイル処理工程において製造され得る。尿素は、オイル中の飽和及び一価不飽和脂肪酸／エステルとの複合体を優先的に形成し、尿素／オイル複合体又は尿素付加物と呼ばれる。したがって、尿素／オイル複合体は、尿素と、飽和及び／又は一価不飽和脂肪酸／エステルとを含有する組成物である。オイルの残りの画分は、ＰＵＦＡを豊富に含む一方、一部のＰＵＦＡは、尿素と複合体化することができ、尿素／オイル複合体の一部となることができる。溶媒は、このプロセスにも使用され、そのため、残留溶媒は、尿素／オイル複合体の一部である場合が多い。したがって、開示される方法は、尿素、飽和及び一価不飽和脂肪酸／エステルを含む尿素／オイル複合体で開始し、尿素、残留量の溶媒及び任意選択的に望ましくない残留量のＰＵＦＡを伴う。
【００４２】
[0047]尿素／オイル複合体を形成するために使用することができる尿素は、様々な商業的な供給元から得られる。尿素の適切な供給元の例としては、Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ（ニュージャージー州モリスプレインズ（Ｍｏｒｒｉｓ  Ｐｌａｉｎｓ，Ｎ．Ｊ．））、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ペンシルバニア州ピッツバーグ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，Ｐａ．））又はシグマ・アルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）（ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．））が挙げられる。
【００４３】
[0048]尿素及びオイルは、溶媒の存在下で組み合わされて、尿素／オイル複合体を形成し得る。したがって、尿素／オイル複合体の製造において溶媒を使用した結果として、複合体は、最も多くの場合、残留量の溶媒を含み得る。一部の実施形態において、溶媒は、アルコール（例えば、エタノール）である。好ましくは、溶媒は、１９０プルーフのエタノール（すなわち９５％エタノール）である。
【００４４】
[0049]一部の実施形態において、尿素／オイル複合体は、エタノールに尿素を溶解して尿素／エタノール溶液を形成することによって調製される。反応混合物中の尿素とエタノールとの比は、約１：０．１〜約１：１０、より一般的には約１：１．５であり得る。エタノール中の尿素の溶解を促進するために混合物を加熱し得る。エタノールと尿素とを混合することができる適切な温度としては、限定されないが、約６０℃〜約１００℃、約６５℃〜約９５℃、約７０℃〜約９０℃又は約７５℃〜約８５℃が挙げられる。例えば、混合物を約８５℃〜約９０℃に加熱することができる。
【００４５】
[0050]高温の尿素／エタノール溶液（すなわち熱い尿素／エタノール溶液）とオイルとを組み合わせて、複合体を形成することができる。熱い尿素／エタノール溶液とオイルとを組み合わせる前に、任意選択的にオイルを脱気及び／又は加熱する。一部の実施例では、熱い尿素／エタノール溶液の約１５℃以内の温度にオイルが加熱される。例えば、尿素／エタノール溶液が約８５℃〜約９０℃の温度である場合、尿素／エタノール溶液とオイルとを組み合わせる前に、オイルを約８０℃の温度に加熱することができる。オイルを尿素／エタノール溶液と混合し、組み合わせた混合物を冷却させて、固体尿素／オイル複合体を形成する。同じ手順を他の溶媒で用い得る。
【００４６】
[0051]反応混合物中の尿素とオイルとの比は、約０．１：１〜約２：１、より一般的には約０．５：１．５、約０．８５：１又は約１．２：１であり得る。次いで、尿素／オイル複合体は、通常、残りのオイルから例えば濾過によって分離される。
【００４７】
開示される方法は、尿素／オイル複合体（尿素付加物）を形成する工程と、残留する溶媒（例えば、エタノール）を除去して、乾燥尿素／オイル複合体（尿素「ケーク」とも呼ばれる）を形成する工程とを含む。乾燥尿素／オイル複合体は、溶媒を実質的に含有しない。「溶媒を実質的に含有しない」とは、乾燥尿素／オイル複合体が約１重量％未満、約０．５重量％未満又は約０．１重量％未満の溶媒を含有することを意味する。溶媒は、真空下で除去することができる。溶媒除去を実施するのに適した温度としては、限定されないが、約４℃〜約６０℃、好ましくは約１０℃〜約２２℃が挙げられる。他の実施例において、溶媒は、指定の値のいずれかが一定範囲の上限及び／又は下限の終点を形成し得る、約５℃、約１０℃、約１５℃、約２０℃、約２５℃、約３０℃、約３５℃、約４０℃、約４５℃、約５０℃、約５５℃又は約６０℃で除去することができる。
【００４８】
[0053]尿素／オイル複合体から溶媒を除去した後、乾燥尿素／オイル複合体又はケークを水と組み合わせる。乾燥尿素／オイル複合体の尿素成分は、水に溶解する。一部には高温での水への尿素の溶解性が高いため、尿素の溶解は、高温でさらに促進することができる。周囲温度の水への尿素の溶解性は、水１００ｍＬ当たり尿素約１０８ｇである。しかしながら、約６０℃〜約８０℃では、水への尿素の溶解性は、水１００ｍＬ当たり尿素約２５０〜４００グラムに増加する。したがって、好ましい実施形態において、水を組み合わせる工程は、限定されないが、約５０℃〜約８０℃、約５５℃〜約７５℃又は約６０℃〜約７０℃を含む温度で実施される。一部の実施例において、乾燥尿素／オイル複合体は、約５０℃、約５５℃、約６０℃、約６５℃、約７０℃、約７５℃又は約８０℃で水と組み合わせることができ、指定の値のいずれかが一定範囲の上限及び／又は下限の終点を形成し得る。一部の特定の実施例において、乾燥尿素／オイル複合体は、約６０℃〜約８０℃、又はさらに具体的には約６５℃〜約７５℃、又はまたさらに具体的には約７２℃で水と組み合わせることができる。任意選択的に、水が高温に加熱され、高温で乾燥尿素／オイル複合体に提供される。
【００４９】
[0054]高温の水への尿素の溶解性が高いため、最低限の量の水をこの工程で用いて、濃縮尿素水溶液を形成することができる。当然のことながら、添加される水の総量は、ケークにどの程度の尿素が存在するかに応じて異なる。一部の実施形態において、組み合わせる工程における水は、乾燥尿素／オイル複合体に対して約３０重量％〜約５０重量％で提供される。例えば、乾燥尿素／オイル複合体に対して約３０重量％、約３１重量％、約３２重量％、約３３重量％、約３４重量％、約３５重量％、約３６重量％、約３７重量％、約３８重量％、約３９重量％、約４０重量％、約４１重量％、約４２重量％、約４３重量％、約４４重量％、約４５重量％、約４６重量％、約４７重量％、約４８重量％、約４９重量％又は約５０重量％で水が提供され得、指定の値のいずれかが一定範囲の上限及び／又は下限の終点を形成し得る。一部の実施例において、組み合わせる工程における水は、乾燥尿素／オイル複合体に対して約４０重量％で提供される。
【００５０】
[0055]この工程を繰り返し行うこと、すなわち乾燥尿素／オイル複合体を水と組み合わせ、水層を分離し、次いで乾燥尿素／オイル複合体を水と再び組み合わせることも可能である。さらに、この工程は、攪拌しながら窒素雰囲気下で行うこともできる。
【００５１】
[0056]注目されるように、乾燥尿素／オイル複合体を水と組み合わせると、２つの相：溶解尿素を含有する濃縮尿素水溶液及びオイル（飽和及び／又は一価飽和脂肪酸、任意選択的にＰＵＦＡ）を含有する有機相が形成する。次いで、２つの相を水層及び有機層にさらに分離させることができる。相分離は、約５０℃〜約８０℃の温度で行われ得る。例えば、分離工程は、約５５℃〜約７５℃又は約６０℃〜約７０℃の温度で実施され得る。一部の実施例において、２つの相を約５０℃、約５５℃、約６０℃、約６５℃、約７０℃、約７５℃又は約８０℃で分離させることができ、指定の値のいずれかが一定範囲の上限及び／又は下限の終点を形成し得る。
【００５２】
[0057]水で洗浄し、層を乾燥させることにより、ときにかなりの量で有機相からオイルを回収することができる。
【００５３】
[0058]［濃縮法］
[0059]一部の実施形態において、このプロセスは、オイルを少なくとも１つの濃縮工程にかけることを含む。一部の実施形態において、濃縮工程は、クロマトグラフィー、蒸留、尿素複合体形成及びその組み合わせを含む。
【００５４】
[0060]一実施形態において、濃縮工程は、クロマトグラフィーを含む。好ましい一実施形態において、クロマトグラフィーは、銀イオンクロマトグラフィーである。さらに好ましい実施形態において、クロマトグラフィーは、疑似移動床クロマトグラフィーである。さらなる好ましい実施形態において、クロマトグラフィーは、逆相クロマトグラフィーである。
【００５５】
[0061]一実施形態において、濃縮工程は、蒸留を含む。好ましい一実施形態において、蒸留は、分留である。他の好ましい実施形態において、蒸留は、ショートパス蒸留である。
【００５６】
[0062]一実施形態において、濃縮工程は、尿素複合体形成を含む。
【００５７】
[0063]［逆相クロマトグラフィー］
[0064]一部の実施形態において、このプロセスは、オイルを少なくとも１つの逆相クロマトグラフィー工程にかけることを含む。逆相クロマトグラフィーは、当業者に公知のいずれかの方法を用いて実施され得る。
【００５８】
[0065]一部の実施形態において、クロマトグラフィーカラムは、内径約３．８ｃｍ、有効長約２７ｃｍ及び／又は容積約３１３ｍＬを有し得る。
【００５９】
[0066]一部の実施形態において、クロマトグラフィーカラムは、シリカマトリックスで充填される。好ましい実施形態において、シリカマトリックスは、Ｃ１８結合シリカゲルである。好ましい実施形態において、マトリックスの粒径は、約４０μｍ〜約６３μｍである。
【００６０】
[0067]一部の実施形態において、溶離剤は、メタノールを含む。好ましい実施形態において、溶離剤は、メタノールと水との混合物である。
【００６１】
[0068]一部の実施形態において、溶離剤は、少なくとも約８０重量％のメタノール、少なくとも約８５重量％のメタノール、少なくとも約９０重量％のメタノール又は少なくとも約９５重量％のメタノールを含む。一部の実施形態において、溶離剤は、少なくとも約８０重量％のメタノール、少なくとも約８５重量％のメタノール、少なくとも約９０重量％のメタノール又は少なくとも約９５重量％のメタノールを含む。
【００６２】
[0069]一部の実施形態において、溶離剤は、約２０重量％未満の水、約１５重量％未満の水、約１０重量％未満の水又は約５重量％未満の水を含む。一部の実施形態において、溶離剤は、約２０重量％未満の水、約１５重量％未満の水、約１０重量％未満の水又は約５重量％未満の水を含む。
【００６３】
[0070]一部の実施形態において、溶離剤は、約８０〜約９５重量％のメタノールを含む。好ましい実施形態において、溶離剤は、約９０〜約９５重量％のメタノールを含む。さらに好ましい実施形態において、溶離剤は、約９２重量％のメタノールを含む。
【００６４】
[0071]一部の実施形態において、溶離剤は、約５〜約２０重量％の水を含む。好ましい実施形態において、溶離剤は、約５〜約１０重量％の水を含む。さらに好ましい実施形態において、溶離剤は、約８重量％の水を含む。
【００６５】
[0072]一部の実施形態において、オイルは、アイソクラティック方式のクロマトグラフィーカラムから溶離される。
【００６６】
[0073]［カラムクロマトグラフィー］
[0074]一部の実施形態において、このプロセスは、カラムクロマトグラフィーを含む。硝酸銀で含侵されたシリカゲル、アルミナ及び／又はシリカゲルなどの固定相でカラムを充填し、溶媒又は溶媒の混合物で湿潤させる。所望の生成物を含有するオイルをカラム上にローディングし、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、酢酸エチル、ヘキサン、メタノール、アセトン、エタノール、プロパノール、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、ペンタン、ジクロロメタン、クロロホルム及びテトラヒドロピランなどの１つ又は複数の移動相溶媒で溶離する。
【００６７】
所望の生成物を画分で回収し（例えば、試験管中）、次いで減圧下での溶媒除去により又は代わりに回収画分に不活性雰囲気を送風することにより濃縮して、所望の生成物において濃縮されたオイルが得られる。
【００６８】
[0076]［分留］
[0077]一部の実施形態において、このプロセスは、分留を含む。オイルを加熱フラスコに入れ、フラスコを任意選択的に減圧下で加熱する。一実施例において、所望の生成物は、その沸点に達すると気相に変換し、分留塔を通過し、凝縮器で凝縮され、受器フラスコ中に回収される。代替の実施例において、所望の生成物は、加熱フラスコに留まり、所望の生成物から不純物が蒸留除去される。
【００６９】
分留は、明確に記載されているかのように、すべての値及びその間の部分範囲を含めて、例えば４０℃〜５００℃の範囲の温度で実施され得る。例えば、分留は、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃、９０℃、１００℃、１１０℃又は１２０℃、１３０℃、１４０℃、１５０℃、１６０℃、１７０℃、１８０℃、１９０℃、２００℃、２１０℃、２２０℃、２３０℃又は２４０℃、２５０℃、２６０℃、２７０℃、２８０℃、２９０℃、３００℃、３１０℃、３２０℃、３３０℃、３４０℃、３５０℃又は３６０℃、３７０℃、３８０℃、３９０℃、４００℃、４１０℃、４２０℃、４３０℃、４４０℃、４５０℃、４６０℃、４７０℃、４８０℃又は４９０℃で実施され得る。
【００７０】
[0079]分留は、好ましくは、減圧下で行われる。その減圧は、明確に記載されているかのように、すべての値及びその間の部分範囲を含めて、０．０００１気圧〜０．９気圧の範囲であり得る。気圧は、「ａｔｍ」と略記され、１０１，３２５Ｐａに等しい。減圧は、例えば、０．００１ａｔｍ、０．０１ａｔｍ、０．１ａｔｍ、０．２ａｔｍ、０．３ａｔｍ、０．４ａｔｍ、０．５ａｔｍ、０．６ａｔｍ、０．７ａｔｍ又は０．８ａｔｍであり得る。
【００７１】
[0080]［固相抽出］
[0081]一部の実施形態において、このプロセスは、オイルを少なくとも１つの固相抽出工程にかけることを含む。固相抽出（ＳＰＥ）は、当業者に公知のいずれかの方法を用いて実施され得る。
【００７２】
[0082]一部の実施形態において、ＳＰＥ工程は、シリカＳＰＥカートリッジを用いて実施される。
【００７３】
[0083]本発明において、いずれかの濃縮、反応及び／又は精製技術を他のいずれかの濃縮、反応及び／又は精製技術と組み合わせて、多価不飽和脂肪酸、そのエステル、その塩、そのアルデヒド及び／又はそのアルコールにおいて濃縮された微生物オイルを生成することができる。濃縮技術は、あらゆる順序及び組み合わせで用いられ得る。
【００７４】
[0084]［結果的なオイル組成物］
[0085]一部の実施形態において、そのオイルは、１つ又は複数のＬＣ−ＰＵＦＡを含む。一部の実施形態において、オイルは、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％又は少なくとも約９９％のＬＣ−ＰＵＦＡを含む。好ましい実施形態において、ＬＣ−ＰＵＦＡは、エステル形態をとる。さらに好ましい実施形態において、エステルは、エチルエステルである。好ましい実施形態において、ＬＣ−ＰＵＦＡの重量％は、オイルに対する重量％である。さらに好ましい実施形態において、ＬＣ−ＰＵＦＡの重量％は、エステル画分中の脂肪酸の重量％である。一部の実施形態において、ＬＣ−ＰＵＦＡは、トリグリセリド形態をとる。
【００７５】
[0086]一実施形態において、オイルは、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％又は少なくとも約９９重量％のＡＲＡを含む。好ましい実施形態において、ＡＲＡは、エステル形態をとる。さらに好ましい実施形態において、エステルは、エチルエステルである。好ましい実施形態において、ＡＲＡの重量％は、オイルに対する重量％である。さらに好ましい実施形態において、ＡＲＡの重量％は、エステル画分中の脂肪酸に対する重量％である。
【００７６】
[0087]一部の実施形態において、オイルは、約３〜約１３％、約４〜約１２％、約５〜約１１％、約６〜約１０％又は約７〜約９％のリノール酸（ＬＡ）を含む。好ましい実施形態において、ＬＡは、エステル形態をとる。さらに好ましい実施形態において、エステルは、エチルエステルである。好ましい実施形態において、ＬＡの重量％は、オイルに対する重量％である。さらに好ましい実施形態において、ＬＡの重量％は、エステル画分中の脂肪酸に対する重量％である。
【００７７】
[0088]一部の実施形態において、オイルは、約０．５〜約５％、約１〜約５％又は約３〜約４％のＬＡを含む。好ましい実施形態において、ＬＡは、エステル形態をとる。さらに好ましい実施形態において、エステルは、エチルエステルである。好ましい実施形態において、ＬＡの重量％は、オイルに対する重量％である。さらに好ましい実施形態において、ＬＡの重量％は、エステル画分中の脂肪酸に対する重量％である。
【００７８】
[0089]一部の実施形態において、オイルは、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２．５％未満、約２％未満、約２％未満、約１．５％未満、約１％未満又は約０．５％未満のＥＰＡを含む。好ましい実施形態において、ＥＰＡは、エステル形態をとる。さらに好ましい実施形態において、エステルは、エチルエステルである。好ましい実施形態において、ＥＰＡの重量％は、オイルに対する重量％である。さらに好ましい実施形態において、ＥＰＡの重量％は、エステル画分中の脂肪酸に対する重量％である。
【００７９】
[0090]一部の実施形態において、オイルは、約０．１〜約５％、約０．５〜約３％又は約１〜約２％のＥＰＡを含む。好ましい実施形態において、ＥＰＡは、エステル形態をとる。さらに好ましい実施形態において、エステルは、エチルエステルである。好ましい実施形態において、ＥＰＡの重量％は、オイルに対する重量％である。さらに好ましい実施形態において、ＥＰＡの重量％は、エステル画分中の脂肪酸に対する重量％である。
【００８０】
[0091]一部の実施形態において、オイルは、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２．５％未満、約２％未満、約２％未満、約１．５％未満、約１％未満又は約０．５％未満のＤＨＡを含む。好ましい実施形態において、ＤＨＡは、エステル形態をとる。さらに好ましい実施形態において、エステルは、エチルエステルである。好ましい実施形態において、ＤＨＡの重量％は、オイルに対する重量％である。さらに好ましい実施形態において、ＤＨＡの重量％は、エステル画分中の脂肪酸に対する重量％である。
【００８１】
[0092]一部の実施形態において、オイルは、約０．１〜約５％、約０．５〜約３％又は約１〜約２％のＤＨＡを含む。好ましい実施形態において、ＤＨＡは、エステル形態をとる。さらに好ましい実施形態において、エステルは、エチルエステルである。好ましい実施形態において、ＤＨＡの重量％は、オイルに対する重量％である。さらに好ましい実施形態において、ＤＨＡの重量％は、エステル画分中の脂肪酸に対する重量％である。
【００８２】
[0093]一部の実施形態において、オイルは、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２．５％未満、約２％未満、約２％未満、約１．５％未満、約１％未満又は約０．５％未満のγ−リノレン酸（「ＧＬＡ」）を含む。好ましい実施形態において、ＧＬＡは、エステル形態をとる。さらに好ましい実施形態において、エステルは、エチルエステルである。好ましい実施形態において、ＧＬＡの重量％は、オイルに対する重量％である。さらに好ましい実施形態において、ＧＬＡの重量％は、エステル画分中の脂肪酸に対する重量％である。
【００８３】
[0094]一部の実施形態において、オイルは、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２．５％未満、約２％未満、約２％未満、約１．５％未満、約１％未満又は約０．５％未満のジホモ−γ−リノレン酸（「ＤＧＬＡ」）を含む。好ましい実施形態において、ＤＧＬＡは、エステル形態をとる。さらに好ましい実施形態において、エステルは、エチルエステルである。好ましい実施形態において、ＤＧＬＡの重量％は、オイルに対する重量％である。さらに好ましい実施形態において、ＤＧＬＡの重量％は、エステル画分中の脂肪酸に対する重量％である。
【００８４】
[0095]一部の実施形態において、オイルは、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２．５％未満、約２％未満、約２％未満、約１．５％未満、約１％未満又は約０．５％未満のステアリドン酸（「ＳＤＡ」）を含む。好ましい実施形態において、ＳＤＡは、エステル形態をとる。さらに好ましい実施形態において、エステルは、エチルエステルである。好ましい実施形態において、ＳＤＡの重量％は、オイルに対する重量％である。好ましい実施形態において、ＳＤＡの重量％は、エステル画分中の脂肪酸に対する重量％である。
【００８５】
[0096]一部の実施形態において、それは、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２．５％未満、約２％未満、約２％未満、約１．５％未満、約１％未満又は約０．５％未満の、２３個以上の炭素を有する多価不飽和脂肪酸（極長鎖ＰＵＦＡ）を含む。一部の実施形態において、極長鎖ＰＵＦＡは、７，１０，１３，１６，１９，２２，２５オクタコサオクタエン酸（Ｃ２８：８）である。好ましい実施形態において、オイルは、０％の７，１０，１３，１６，１９，２２，２５オクタコサオクタエン酸（Ｃ２８：８）を含む。好ましい実施形態において、極長鎖ＰＵＦＡは、エステル形態をとる。さらに好ましい実施形態において、エステルは、エチルエステルである。好ましい実施形態において、極長鎖ＰＵＦＡの重量％は、オイルに対する重量％である。好ましい実施形態において、極長鎖ＰＵＦＡの重量％は、エステル画分中の脂肪酸に対する重量％である。
【００８６】
[0097]一部の実施形態において、オイルは、エステル画分を含み、そのエステル画分中の脂肪酸の少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％又は少なくとも約９９重量％は、アラキドン酸（ＡＲＡ）であり、且つエステル画分中のＡＲＡの量は、エステル画分中の総ω−６脂肪酸の少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０重量％である。一部の実施形態において、エステル画分中の脂肪酸の少なくとも約８％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０重量％は、ＬＡである。一部の実施形態において、エステル画分中のＬＡの量は、エステル画分中の総ω−６脂肪酸の少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５重量％である。
【００８７】
[0098]一部の実施形態において、オイルは、オイルに対して少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％又は少なくとも約９９重量％のエステル画分を含む。一部の実施形態において、エステル画分中の脂肪酸の少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％又は少なくとも約９９重量％は、ＡＲＡである。一部の実施形態において、エステル画分中の脂肪酸の約０．５〜約５％、約１〜約５％又は約３〜約４重量％は、ＬＡである。
【００８８】
[0099]一部の実施形態において、エステル画分中の脂肪酸の少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％又は少なくとも約９９重量％は、ＡＲＡ及びＬＡである。
【００８９】
[00100]一部の実施形態において、エステル画分中の脂肪酸のＡＲＡ含有量は、エステル画分中の脂肪酸のＡＲＡ及びＬＡ含有量の少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％又は少なくとも約９９重量％である。
【００９０】
[00101]一部の実施形態において、エステル画分中の脂肪酸のＬＡ含有量は、エステル画分中の脂肪酸のＡＲＡ及びＬＡ含有量の約０．５〜約５％、約１〜約５％又は約３〜約４％である。
【００９１】
[00102]好ましい実施形態において、エステル画分は、エチルエステルである。
【００９２】
[00103]一部の実施形態において、オイルの総異性体値は、５％未満、４．５％未満、４％未満、３．５％未満、３％未満、２．５％未満、２％未満、１．５％未満、１％未満、０．５％未満、０．１％未満又は０％である。
【００９３】
[00104]一部の実施形態において、オイルのＡＲＡ異性体値は、５％未満、４．５％未満、４％未満、３．５％未満、３％未満、２．５％未満、２％未満、１．５％未満、１％未満、０．５％未満、０．１％未満又は０％である。
【００９４】
[00105]一部の実施形態において、オイル１ｇ当たりのオイル中のＡＲＡの量は、約１００〜約３００ｍｇ、約１００〜約６００ｍｇ、約１００〜約８００ｍｇ、約１００〜約９００ｍｇ、約１００〜約９５０ｍｇ、約８００〜約９５０ｍｇ又は０〜約１００ｍｇである。
【００９５】
[00106]［食品、サプリメント及び／又は医薬組成物］
[00107]一部の実施形態において、本発明は、本発明のオイルを含む食品、サプリメント又は医薬組成物である。医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体を含有し得る。
【００９６】
[00108]一部の実施形態において、組成物は、食品である。食品は、非ヒト動物又はヒトが消費するための任意の食品であり、固体及び液体組成物の両方を含む。食品は、動物又はヒトの食品への添加剤であることができる。限定されないが、食品としては、一般的な食品；ミルク、飲料、治療用飲料及び栄養飲料などの液体製品；機能性食品、サプリメント、栄養補助食品；及び未熟児用調合乳を含む幼児製剤；妊婦用食品及び母乳で育てている母親のための食品；成人用食品；老人用食品；並びに動物用食品が挙げられる。
【００９７】
[00109]一部の実施形態において、組成物は、動物飼料である。「動物」は、動物界に属する非ヒト生物を含み、限定されないが、水生動物及び陸生動物を含む。「動物飼料」又は「動物用食品」という用語は、非ヒト動物のための食品、魚、市場向けの魚、観賞のための魚、幼魚、二枚貝類、軟体動物、甲殻類、貝、エビ、幼生エビ、アルテミア属（ａｒｔｅｍｉａ）、輪形動物、ブラインシュリンプ、濾過摂食者、両生類、爬虫類；哺乳動物；家畜；農場動物；動物園の動物；スポーツ用動物；繁殖ストック；レース用動物；見せ物のための動物、在来種動物、希少動物又は絶滅危惧種動物、コンパニオンアニマル；イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス若しくはウマなどのペット動物；サル（例えば、オマキザル、アカゲザル、アフリカングリーン、パタス、カニクイザル及びオナガザル）、類人猿、オランウータン、ヒヒ、テナガザル及びチンパンジーなどの霊長類；イヌ及びオオカミなどのイヌ科；ネコ、ライオン及びトラなどのネコ科；ウマ、ロバ及びシマウマなどのウマ科；ウシ、畜牛、ブタ及びヒツジなどの食用動物；シカ及びキリンなどの有蹄動物；又はマウス、ラット、ハムスター及びモルモットなどのげっ歯類等のための食品を意味する。動物飼料としては、限定されないが、水産養殖飼料、ペット飼料、動物園の動物飼料、研究用動物飼料、家畜（ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ）飼料及びその組み合わせを含む家畜（ｄｏｍｅｓｔｉｃ  ａｎｉｍａｌ）飼料が挙げられる。
【００９８】
[00110]一部の実施形態において、組成物は、その肉又は生産物がヒトによって消費されるいずれかの動物用、例えばその肉、卵又はミルクがヒトの消費のために誘導されるいずれかの動物のための飼料又は飼料サプリメントである。かかる動物に餌を与える場合、ＬＣ−ＰＵＦＡなどの栄養素をかかる動物の肉、ミルク、卵又は他の産物に組み込んで、これらの栄養素の含有量を高めることができる。
［実施例］
【００９９】
[00111]以下の実施例は、開示される主題による方法及び結果を例示するために以下に記載される。これらの実施例は、本明細書に開示される主題のすべての態様を包含することを意図するものではなく、代表的な方法及び結果を示す。これらの実施例は、当業者に明らかな均等物及び変形形態を排除することを意図するものではない
【０１００】
[00112]分析方法：ヨーロッパ薬局方法２．０４．２９による水素炎イオン化検出器（ＧＤ／ＦＩＤ）を有するガスクロマトグラフを用いて脂肪酸組成の決定を行った。
【０１０１】
[00113]［実施例１］
[00114]［ＡＲＡエチルエステル濃縮物の製造］
[00115]［工程１．エステル交換反応］
[00116]段階１．ＡＲＡ含有オイル５００ｇを含む２Ｌ丸底フラスコにナトリウムエトキシド（シグマ社）の２１％（重量ベース）エタノール溶液２４ｇ及び無水エタノール１３１ｇを添加した。還流冷却器を使用して、混合物をＮ２雰囲気下で攪拌しながら、７５℃に１時間加熱し、反応混合物からエタノールが出ないようにした。反応混合物から熱を除去し、約４０℃に冷却させ、次いで２Ｌ分液漏斗にそれを移し、底のグリセロール層が排出された。
【０１０２】
[00117]段階２．上部オイル層を清潔な２Ｌ丸底フラスコに移し、さらに２．４ｇのナトリウムエトキシドのエタノール溶液及び１３．１ｇの無水エタノールを装入した。再び、混合物をＮ２雰囲気下において且つ還流冷却器を用いて、７５℃に１時間加熱した。
【０１０３】
[00118]約４０℃に冷却した後、反応混合物を真空下で蒸発させて、残りのエタノールを除去した。残留物を２Ｌ分液漏斗に移し、水性洗浄部分のｐＨがもはや塩基性でなくなるまでクエン酸溶液（１％ｗ／ｗ）で洗浄した。蒸留水１．５Ｌ（３つの等しい５００ｍＬ部分において）で中性オイルを洗浄し、次いでそれを真空下において７０℃で２時間乾燥させて、ＡＲＡ５３．８８％（面積）を含有するオイルを収率９５％で得た。
【０１０４】
[00119]［工程２．ショートパス蒸留］
[00120]工程１で調製されたＡＲＡエチルエステルをショートパス蒸留によって精製した。標準プロトコルに従ってショートパス蒸留ユニットを組み立てた。加熱オイルにおける作業温度を１３０℃に設定し、内部凝縮器をコントロールする加熱ユニットにおける温度を５０℃に設定した。システムの圧力を１００ミリトルに平衡化したとき、オイル約４７５ｇを流量５００ｇ／時でショートパスユニットにおいて蒸留した。さらに精製するために、ＡＲＡ４４．５６％（面積）を含有する透明な淡黄色留出物約４４５ｇを収率９３％で得た。未蒸留部分（残留物）は廃棄した。
【０１０５】
[00121]［工程３．尿素複合体形成］
[00122]工程２で調製された蒸留ＡＲＡエチルエステルを尿素複合体形成によって濃縮した。５００ｍＬ丸底フラスコに尿素５０ｇ及び９５％（ｖ／ｖ）水性エタノール７５ｇを添加した。混合物をマントルヒーターに置き、還流冷却器の存在下で攪拌しながら還流した。溶液が透明に変化したら、尿素／水性エタノール混合物にオイルを添加した。フラスコを熱から除去し、混合物を攪拌しながら一晩空気冷却した。翌日、混合物を真空濾過し、濾液を真空下で蒸発させて、残留エタノールを除去した。乾燥残留物を５００ｍＬ分液ロートに移し、次いで６０℃に予備加熱された蒸留水（３×１００ｍＬ）で３回洗浄した。最後の水洗浄から得られた上部オイル層を真空下において７０℃で２時間乾燥させて、ＡＲＡ７５．２％（面積）を含有するオイルを収率５２．４％で得た。
【０１０６】
[00123]［工程４．逆相クロマトグラフィー］
[00124]工程３で調製されたオイルを逆相クロマトグラフィーによってさらに濃縮した。以下のパラメーターを用いた。
【０１０７】
[00125]カラム：内径３．８ｃｍ
有効長：２７ｃｍ
容積：３１３ｍＬ
【０１０８】
[00126]シリカマトリックス：Ｓｉｌｉｃｙｃｌｅ  ６０Ａ．Ｃ−１８シリカゲル、炭素ローディング１７％、粒径４０〜６３ｕｍ。
【０１０９】
[00127]重量基準でメタノール９２％及び水８％からなる溶離液５００ｍＬ中のシリカゲル２０６ｇのスラリーを調製し、カラムを充填するために使用した。カラムを充填したとき、溶離剤約１Ｌをカラムに通し、それを平衡化した。工程３で調製されたＡＲＡ濃縮物約８．０ｇをシリカゲル上にそのままの状態でローディングした。次いで、メタノール／水（９２／８）混合物を用いてアイソクラティック形式でカラムを溶離した。カラムを通した最初の溶離剤１．５Ｌ（約４．８カラム容積）は、全くオイルを含有しなかったために廃棄した。残りの溶離液を１５ｍＬ画分に集めた。追加の１２９０ｍＬ（４．１カラム容積）に対して合計８６の画分を収集した。これらの画分からのアリコートをＧＣによって脂肪酸プロファイル分析にかけた。８９％（面積）以上でＡＲＡを含有する画分を組み合わせ、真空下で乾燥させて、ＡＲＡ８９．３４％（面積）を含有するオイルを収率５５％で得た。
【０１１０】
[00128]［工程５．尿素複合体形成］
[00129]第２尿素複合体形成工程により、工程４で調製されたオイルをさらに濃縮した。２５０ｍＬ丸底フラスコに尿素９．８ｇ及び９５％（ｖ／ｖ）水性エタノール２４．５ｇを添加した。混合物をマントルヒーターに置き、還流冷却器の存在下で攪拌しながら加熱した。尿素の大部分が溶解したら、室温のオイルを尿素／水性エタノール混合物に添加した。フラスコを熱から除去し、混合物を攪拌しながら一晩空気冷却した。翌日、混合物を真空濾過し、濾液を真空下で蒸発させて、残留エタノールを除去した。乾燥残留物を１２５ｍＬ分液漏斗に移し、６０℃に予備加熱された蒸留水（３×５０ｍＬ）で３回洗浄した。最後の水洗浄から得られた上部オイル層を真空下において７０℃で２時間乾燥させて、ＡＲＡ９７．３５％（面積）を含有するオイルを収率５１．１％で得た。
【０１１１】
[00130]［工程６．固相抽出］
[00131]シリカＳＰＥカートリッジを使用して、固相抽出により、工程５で調製されたオイルをさらに濃縮した。オイル物質約４．５ｇをヘキサン／酢酸エチル（９０／１０（ｖ／ｖ））混合物１０ｍＬに溶解した。ヘキサン／酢酸エチル（９０／１０）溶媒混合物で予め平衡化されたＨｙｐｅｒ  Ｓｅｐ  ＳＩシリカカートリッジに溶液をローディングした。溶媒混合物２００ｍＬを使用してシリカカートリッジからオイルを溶離した。溶媒を真空下で蒸発させ、ＡＲＡ９０．１重量％（ＡＲＡ９７．３％（面積））を含有するオイルを収率８２．２％で得た。
【０１１２】
[00132]このプロセスの図を図１に示す。
【０１１３】
[00133]［実施例２］
[00134]［比較例］
[00135]この実施例において、蒸留工程（工程２）及び固相抽出工程（工程６）が省略されたことを除いて、実施されたプロセスは、実施例１に記載のプロセスと同一であった。
【０１１４】
[00136]このプロセスから得られた最終オイルは、収率５２．０％でＡＲＡ７４．０重量％（ＡＲＡ９６．９％（面積））を含有した。
【０１１５】
[00137]比較プロセスの図を図２に示す。
【０１１６】
[00138]それぞれの参考文献は、具体的且つ個々に参照により本明細書に組み込まれると示されているが、本明細書に記載のすべての参考文献は、参照により本明細書に組み込まれる。いずれかの参考文献の引用は、出願日に先行するその開示のためのものであり、本開示が、先行発明により、かかる参考文献に先行しているという権利が与えられないことの承認として解釈されるべきではない。
【０１１７】
[00139]上記の要素のそれぞれ又は２つ以上の組み合わせは、上記のタイプと異なる他のタイプの方法でも有用な用途を見出し得ることが理解されるであろう。さらに分析することなく、前述のことは、本開示の要点を詳細に明らかにしているため、他者は、現在の知識を適用することにより、従来技術の観点から、添付の特許請求の範囲に記載の本開示の一般的又は特定の態様の本質的な特徴をかなり構成する特徴を省略することなく、それを様々な用途に容易に適合させることができる。上記の実施形態は、単なる一例として提示されており、本開示の範囲は、以下の特許請求の範囲によってのみ限定されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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