(57)【要約】  本発明は、がん細胞を死滅させるための化学療法などのシナリオにおいて正常細胞を保護するための化合物、ならびにRas/Raf/MEK/ERKシグナル伝達経路およびPI3K/Akt/mTORシグナル伝達経路の制御におけるその使用に関する。より詳しくは、該化合物は、ホスファチジルイノシトール５−リン酸４−キナーゼ（PI5P4K）および／またはホスホイノシチド３−キナーゼ相互作用タンパク質１（PIK3IP1）を抑制する。また、前記化合物を同定する方法、該化合物を用いた治療法およびその他の使用も提供する。
2020501544.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロまたはインビボにおいて細胞の生存を制御する方法であって、
少なくとも１種のホスファチジルイノシトール５−リン酸４−キナーゼファミリー（PI5P4K）制御因子および／または少なくとも１種のホスホイノシチド３−キナーゼ相互作用タンパク質１（PIK3IP1）制御因子に少なくとも１種の細胞を接触させることを含む方法。
【請求項２】
前記少なくとも１種の制御因子が、PI5P4Kα、PI5P4Kβおよび／またはPI5P4Kγの活性を抑制し、かつ／またはPIK3IP1を活性化することによって、正常細胞の細胞周期をG1/S期で停止させるが、形質転換細胞または過剰増殖細胞の細胞周期を停止させない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１種の制御因子が、PI5P4Kα、PI5P4KβおよびPI5P4Kγの活性を抑制する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１種の制御因子がPI5P4Kの活性を抑制し、正常細胞の細胞周期をG1/S期で停止させる場合、該制御因子が該正常細胞の化学保護薬として作用する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１種の制御因子が、PI5P4Kの活性を抑制し、正常細胞の細胞周期をG1/S期で停止させるが、形質転換細胞または過剰増殖細胞の細胞周期を停止させない場合、該制御因子が該正常細胞の化学保護薬として作用する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記形質転換細胞または過剰増殖細胞が、がん細胞である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記制御因子が、
（ａ）表３に記載のグループ１および／もしくはグループ２から選択される少なくとも１種の化合物もしくはそのバリアント；
（ｂ）PI5P4Kα、PI5P4Kβおよび／もしくはPI5P4Kγの活性を抑制する少なくとも１種のsiRNA；または
（ｃ）PIK3IP1を活性化する少なくとも１種のMEK阻害剤もしくはERK阻害剤
である、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも１種のsiRNAが、配列番号１９、２１、２３、２５、２７、２９および３１を含む群から選択される核酸配列を有するPI5P4Kα、PI5P4Kβおよび／またはPI5P4Kγに指向性を有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
正常細胞の化学保護および／または形質転換細胞もしくは過剰増殖細胞に対する化学療法に使用するための組成物であって、
PI5P4Kα、PI5P4Kβおよび／またはPI5P4Kγの活性を抑制し、かつ／またはPIK3IP1を活性化することによって、正常細胞の細胞周期をG1/S期で停止させるが、形質転換細胞または過剰増殖細胞の細胞周期を停止させない少なくとも１種の制御因子を含む組成物。
【請求項１０】
前記少なくとも１種の制御因子が、グループ１もしくはグループ２の化合物もしくはそのバリアント、PI5P4Kα、PI5P4Kβおよび／もしくはPI5P4Kγの活性を抑制する少なくとも１種のsiRNA、ならびに／またはPIK3IP1を活性化するMEK阻害剤もしくはERK阻害剤である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記少なくとも１種のsiRNAが、配列番号１９、２１、２３、２５、２７、２９および３１を含む群から選択される核酸配列を有するPI5P4Kα、PI5P4Kβおよび／またはPI5P4Kγに指向性を有する、請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
PI5P4Kの活性を制御し、過剰増殖性障害または過剰増殖性疾患の治療における使用に適した化合物を同定する方法であって、
（ａ）PI5P4Kを有する少なくとも１種の細胞を提供すること；
（ｂ）前記少なくとも１種の細胞を少なくとも１種の試験化合物に接触させること；ならびに
（ｃ）PI5P4Kα、PI5P4Kβおよび／またはPI5P4Kγの活性が抑制されているか否か、および前記少なくとも１種の細胞の細胞周期がG1/S期で停止されているか否かを調べて、未処理の細胞と比較すること
を含む方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１種の試験化合物が、PI5P4Kα、PI5P4Kβおよび／またはPI5P4Kγの活性を抑制し、正常細胞の細胞周期をG1/S期で停止させる場合、該少なくとも１種の試験化合物が、化学療法の際に正常細胞の化学保護薬として作用する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記正常細胞において、PI5P4Kα、PI5P4Kβおよび／またはPI5P4Kγの活性が抑制されることによって、PIK3IP1がアップレギュレートされ、かつPI3K/Akt/mTOR経路が阻害される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
形質転換細胞または過剰増殖細胞におけるRasの活性化により、PIK3IP1の発現とPI5P4KによるPIK3IP1のアップレギュレーションとが抑制され、その結果、該形質転換細胞または過剰増殖細胞においてPI5P4KによるPI3K/Akt/mTOR経路の抑制が無効化される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記形質転換細胞または過剰増殖細胞が、Rasが活性化されたがん細胞である、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記少なくとも１種の試験化合物が、低分子、アプタマーまたはsiRNAである、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記PI5P4Kの活性の抑制が、未処理の細胞と比較してPIK3IP1のmRNA量およびタンパク質量がアップレギュレートされていることによって示される、請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
過剰増殖性疾患または過剰増殖性障害を治療する方法であって、
PI5P4Kα、PI5P4Kβおよび／またはPI5P4Kγの活性を抑制し、かつ正常細胞の細胞周期をG1/S期で停止させるが、形質転換細胞または過剰増殖細胞の細胞周期を停止させない少なくとも１種の化合物の有効量と、任意で抗過剰増殖剤の有効量とを投与することを含む方法。
【請求項２０】
前記形質転換細胞または過剰増殖細胞が、Rasが活性化されたがん細胞である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗過剰増殖剤が化学療法剤である、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記少なくとも１種の化合物が、低分子、アプタマーまたはsiRNAである、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記少なくとも１種の化合物が、表３に記載のグループ２の化合物から選択される化合物またはそのバリアントである、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記少なくとも１種の化合物が、さらに形質転換細胞または過剰増殖細胞の分裂期細胞死を誘導し、表３に記載のグループ１の化合物から選択される化合物またはそのバリアントである、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
G1/S期における細胞周期の停止が、一時的および／または可逆的である、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
過剰増殖性疾患または過剰増殖性障害の治療用医薬を製造するための、任意で抗増殖剤と併用される少なくとも１種の制御因子の使用であって、
前記少なくとも１種の制御因子が、PI5P4Kα、PI5P4Kβおよび／またはPI5P4Kγの活性を抑制し、かつ正常細胞の細胞周期をG1/S期で停止させるが、形質転換細胞または過剰増殖細胞の細胞周期を停止させない、使用。
【請求項２７】
前記少なくとも１種の制御因子が、PIK3IP1の発現を増加させる、請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
前記少なくとも１種の制御因子が、低分子、アプタマーまたはsiRNAである、請求項２６または２７に記載の使用。
【請求項２９】
前記過剰増殖性疾患または過剰増殖性障害が、Rasが活性化されたがん細胞が関与するものである、請求項２６〜２８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３０】
前記少なくとも１種の制御因子が、さらに形質転換細胞または過剰増殖細胞の分裂期細胞死を誘導する少なくとも第２の活性を有する、請求項２６〜２９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３１】
前記少なくとも１種の制御因子が、グループ１もしくはグループ２の化合物もしくはそのバリアント、またはPI5P4Kα、PI5P4Kβおよび／もしくはPI5P4Kγの活性を抑制する少なくとも１種のsiRNAである、請求項２６〜３０のいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がん細胞を死滅させるための化学療法などのシナリオにおいて正常細胞を保護するための化合物、ならびにRas/Raf/MEK/ERKシグナル伝達経路およびPI3K/Akt/mTORシグナル伝達経路の制御におけるその使用に関する。より詳しくは、該化合物は、ホスファチジルイノシトール５−リン酸４−キナーゼ（PI5P4K）および／またはホスホイノシチド３−キナーゼ相互作用タンパク質１（PIK3IP1）を制御する。また、前記化合物を同定する方法、該化合物を用いた治療法およびその他の使用も提供する。
【背景技術】
【０００２】
強力ながん特異的腫瘍細胞致死性を得ることは臨床の究極の目的である。Ras/Raf/MEK/ERKシグナル伝達経路およびPI3K/Akt/mTORシグナル伝達経路は、外的要因に対応して細胞が生存および増殖する上で重要である。これらの経路内のタンパク質の変異は、ヒトのがんにおいて最もよく知られている発がんターゲットの１つであり（McCormick，F．Clin．Cancer Res．21：1797-1801（2015）；Mayer，I．A．& Arteaga，C．L．Annu．Rev．Med．67：11-28（2016））、がんの治療を目的とした、これらの経路の選択的阻害剤を開発するための取り組みが長年にわたり続けられている。しかし、これらの経路間でシグナル伝達事象のクロストークまたは交差増幅（cross-amplification）が起こることは多くの証拠により明らかになっており、そのクロストークまたは交差増幅によって、下流で起こる細胞増殖事象は正にも負にも制御される。さらに、これらのシグナル伝達経路を遮断することを目的とした単剤標的療法の抗腫瘍活性は、意図しない経路の活性化によって薬物耐性が生じる可能性があり、一般に期待通りの結果は得られていない。そのため、多重発癌依存性を抑制するために多剤併用標的療法の試験が進められている。しかしながら、Ras/Raf/MEK/ERKシグナル伝達経路およびPI3K/Akt/mTORシグナル伝達経路を標的とする薬物を用いた併用治療で良好な臨床成績が得られているのはほんのわずかにすぎない（Jokinen, E. & Koivunen, J. P. Ther. Adv. Med. Oncol. 7: 170-180 (2015)）。したがって、耐性およびこれらの２つの中心的経路間のクロストークを媒介する標的を同定するという究極の目的はいまだ達成できていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
第１の態様において、本発明の好ましい一実施形態により、インビトロまたはインビボにおいて細胞の生存を制御する方法であって、少なくとも１種のホスファチジルイノシトール５−リン酸４−キナーゼファミリー（PI5P4K）制御因子および／または少なくとも１種のホスホイノシチド３−キナーゼ相互作用タンパク質１（PIK3IP1）制御因子に少なくとも１種の細胞を接触させることを含む方法が提供される。
【０００４】
別の態様において、本発明により、PI5P4Kの活性を制御し、過剰増殖性障害または過剰増殖性疾患の治療における使用に適した化合物を同定する方法であって、
（ａ）PI5P4Kを有する少なくとも１種の細胞を提供すること；
（ｂ）前記少なくとも１種の細胞を少なくとも１種の試験化合物に接触させること；ならびに
（ｃ）PI5P4Kα、PI5P4Kβおよび／またはPI5P4Kγの活性が抑制されているか否か、および前記少なくとも１種の細胞の細胞周期がＧ１／Ｓ期で停止されているか否かを調べて、未処理の細胞と比較すること
を含む方法が提供される。
【０００５】
別の態様において、本発明の好ましい一実施形態により、過剰増殖性疾患または過剰増殖性障害を治療する方法であって、PI5P4Kの活性を抑制し、かつ正常細胞の細胞周期をＧ１／Ｓ期で停止させるが、形質転換細胞または過剰増殖細胞に対してはその効果を有しない少なくとも１種の化合物の有効量と、抗過剰増殖剤の有効量とを投与することを含む方法が提供される。
【０００６】
好ましい一実施形態において、前記少なくとも１種の化合物は、PI5P4Kα、PI5P4Kβおよび／またはPI5P4Kγの活性を抑制し、正常細胞の細胞周期をＧ１／Ｓ期で停止させるが形質転換細胞または過剰増殖細胞に対してはその効果を有しない。
【０００７】
別の態様において、本発明の好ましい一実施形態により、過剰増殖性疾患または過剰増殖性障害を治療する方法であって、PI5P4Kα、PI5P4Kβおよび／またはPI5P4Kγの活性を抑制する化合物の有効量を投与して、正常細胞の細胞周期をＧ１／Ｓ期で停止させることを含み、前記化合物が、さらに前記過剰増殖性疾患の細胞の分裂期細胞死を誘導することを特徴とする方法が提供される。
【０００８】
別の態様において、本発明の好ましい一実施形態により、過剰増殖性疾患または過剰増殖性障害の治療用医薬を製造するための、抗増殖剤と併用される少なくとも１種の制御因子の使用であって、該少なくとも１種の制御因子が、PI5P4Kα、PI5P4Kβおよび／またはPI5P4Kγの活性を抑制し、かつ正常細胞の細胞周期をＧ１／Ｓ期で停止させるが形質転換細胞または過剰増殖細胞に対してはその効果を有しないことを特徴とする使用が提供される。
【０００９】
別の態様において、本発明の好ましい一実施形態により、過剰増殖性疾患または過剰増殖性障害の治療用医薬を製造するための、少なくとも１種の制御因子の使用であって、該少なくとも１種の制御因子が、PI5P4Kα、PI5P4Kβおよび／またはPI5P4Kγの活性を抑制し、かつ正常細胞の細胞周期をＧ１／Ｓ期で停止させ、さらに形質転換細胞または過剰増殖細胞の分裂期細胞死を誘導することを特徴とする使用が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１Ａ−１Ｋは、がん細胞に対する化合物ａ１３１の選択的死滅効果を示す。図１Ａ：ａ１３１の構造。図１Ｂ：ａ１３１で７２時間処理した同質遺伝子系の正常ＢＪ細胞および形質転換ＢＪ細胞のクリスタルバイオレットアッセイ。図１Ｃ−１Ｄ：正常ＢＪ細胞および形質転換ＢＪ細胞を２．５μＭのａ１３１で４８時間処理した。各細胞のＢｒｄＵとＰＩの二重染色を用いたＦＡＣＳ解析。ＢｒｄＵ陽性（Ｓ）集団およびｓｕｂＧ１（＜２Ｎ）集団の割合を示す（図１Ｃ）。切断型ＰＡＲＰおよび切断型カスパーゼ−３（Ｃａｓ−３）のイムノブロット解析（図１Ｄ）。図１Ｅ：ａ１３１で７２時間処理したヒトの正常細胞株およびがん細胞株のＭＴＴアッセイ（ｎ＝３）。各細胞株において５０％増殖抑制が達成されるａ１３１の平均濃度値（ＧＩ５０）を±Ｓ．Ｄ．とともにプロットしたもの。図１Ｆ：５μＭのａ１３１で４８時間処理した一連の遺伝子改変ＢＪ由来線維芽細胞のＦＡＣＳ解析。ｓｕｂＧ１（＜２Ｎ）集団の平均値±Ｓ．Ｄ．を示す（ｎ＞３）。図１Ｇ−１Ｈ：ＧＦＰ−ヒストンＨ２Ｂを安定的に発現している正常ＢＪ細胞および形質転換ＢＪ細胞を２．５μＭのａ１３１で３２時間処理した後、固定した。免疫蛍光解析と代表的な画像（図１Ｇ）。各中心体数を有する細胞（ｎ＞１００／条件）の定量。平均値±Ｓ．Ｄ．を示す（ｎ＝３）（図１Ｈ）。図１Ｉ：作成した腫瘍異種移植片を担持しているマウスに各用量のａ１３１またはその誘導体ｂ５を１日２回経口（ＰＯ）投与または腹腔内（ＩＰ）投与する処置を行った。腫瘍体積を記載の通り定期的に計算した。パクリタキセル（ＰＴＸ）を４日間毎に２回、静脈内投与した。６匹のマウスの平均腫瘍体積±Ｓ．Ｄ．を示す。二元配置ＡＮＯＶＡを行い、ビヒクル対照に対する統計学的有意性を調べた。図１Ｊ−１Ｋ：１２日目のＨＣＴ−１５腫瘍切片のＴＵＮＥＬ染色（図１Ｊ）または免疫組織化学的解析（図１Ｋ）と代表的な画像（上段）。図１Ｊ：腫瘍切片のＴＵＮＥＬ陽性細胞の割合を計算した（下段，各群の６を超える切片の５箇所のクロップ画像）。図１Ｋ：多極分裂した紡錘体を有する細胞集団（ｎ＞１００／条件）の平均値±Ｓ．Ｄ．を示す（下段）。白色バー、５μｍ。特に記載のない限り、対応のない両側ｔ検定を行い、統計学的有意性を判断した。
【００１１】
【図２】図２Ａ−２Ｅは、遺伝毒性ストレスの誘導なしの形質転換ＢＪ細胞に対する化合物ａ１３１の選択的死滅効果を示す。図２Ａ：正常ＢＪ細胞および形質転換ＢＪ細胞を、種々の濃度（０．１μＭ−４０μＭ）のａ１３１で７２時間、それぞれｎ＝３で処理し、ＭＴＴアッセイにより細胞生存率を測定し、各種抗増殖剤と比較した。平均値とともに±標準偏差（Ｓ．Ｄ．）を示す（ｎ＝３）。図２Ｂ：正常ＢＪ細胞および形質転換ＢＪ細胞を、各濃度のａ１３１で４８時間処理した。ａ１３１処理による形質転換ＢＪ細胞におけるカスパーゼ−３／７の総活性の選択的な増大が示されている。平均値を±Ｓ．Ｄ．とともに示す（ｎ＝３）。対応のない両側ｔ検定を行い、統計学的有意性を判断した。図２Ｃ：対照と比較した、ａ１３１で２４時間処理したＢＪ細胞におけるKEGG「細胞周期」経路遺伝子のＧＳＥＡエンリッチメントプロットおよびヒートマップ。エンリッチメントグラフに各遺伝子のエンリッチメントスコアをプロットし（バーで示す）、ＤＭＳＯ対照とａ１３１処理試料との間でその信号対ノイズ基準によって順位付けしている。経路のコアエンリッチメントに寄与している遺伝子を星印で強調表示している。これらの遺伝子の試料ごとの発現プロファイルを、強度に基づいて行正規化した青から赤へのカラースケールを用いてヒートマップに示した。青は低発現を示す。発現は概して、ａ１３１処理細胞（暗い色の四角）の方がＤＭＳＯ処理細胞（より明るい色の四角）より低かった。図２Ｄ：正常ＢＪ細胞を、２日間の血清（０．１％ＦＢＳ）飢餓によってＧ１期に同期化させた。続いて、細胞を、血清飢餓状態から１０％ＦＢＳを有する新鮮培地中に同調的に解放し、次いで５μＭのａ１３１で２日間、４日間または１１日間処理した。２日後または４日後にａ１３１を除去し、新鮮培地中で最大１１日間、細胞増殖を継続させた。各時点における細胞の総数を、自動セルカウンター（SCEPTOR，Merck）を用いて計算し、平均値を±Ｓ．Ｄ．とともに示す（ｎ＞６）。図２Ｅ：正常ＢＪ細胞を２．５μＭおよび５μＭのａ１３１、１００μＭのエトポシドまたはＤＭＳＯビヒクル対照で４８時間処理し、抗γ−ヒストンＨ２ＡＸ（γ−Ｈ２ＡＸ）抗体およびＤＡＰＩを用いて免疫蛍光解析に供した。エトポシド処理によってＤＮＡ損傷（γ−Ｈ２ＡＸに対する染色によって可視化される）が顕著に誘導されたが、ａ１３１処理では、ＤＭＳＯ処理の場合と同様に誘導されなかったことに注意されたい。スケールバー：５μｍ。
【００１２】
【図３】図３Ａ−３Ｇは、中心体のデクラスタリング（ｄｅ−ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ）を誘導することによる形質転換ＢＪ細胞および種々のがん細胞株に対する化合物ａ１３１の選択的死滅効果を示す。図３Ａ：ヒトの正常細胞株およびがん細胞株を、種々の濃度（０．１μＭ−４０μＭ）のａ１３１で７２時間、それぞれｎ＝３で処理し、ＭＴＴアッセイにより細胞生存率を調べた。正常細胞株および由来組織が異なるがん細胞株の各群において５０％増殖抑制が達成されるａ１３１の平均濃度値（ＧＩ５０）をプロットしたもの。平均値を±Ｓ．Ｄ．とともに示す。対応のない両側ｔ検定を行い、統計学的有意性を判断した。図３Ｂ：各種がん細胞株を、２．５μＭまたは５μＭのａ１３１で４８時間処理した。細胞を回収してＰＩで染色した後、ＦＡＣＳ解析に供し、細胞死の指標となるｓｕｂＧ１（＜２Ｎ）集団の有無を調べた。平均値を±Ｓ．Ｄ．とともに示す（ｎ＞３）。図３Ｃ−３Ｄ：ＧＦＰ−ヒストンＨ２Ｂを安定的に発現している正常ＢＪ細胞および形質転換ＢＪ細胞を、２．５μＭのａ１３１またはＤＭＳＯビヒクル対照で８時間処理し、５分間隔で２４時間のタイムラプス生細胞イメージングに供した。それぞれ無作為に選択した個々の細胞における核膜崩壊後から細胞分裂終了までの分裂過程に要する時間を図３Ｃに示す（ｎ＞５０／条件）。また、ｎ＝３の実験の平均値も±Ｓ．Ｄ．とともに示す。対応のない両側ｔ検定を行い、統計学的有意性を判断した。続いて、細胞をＰＦＡで固定し、β−チューブリンおよびγ−チューブリンに対する抗体を用いて免疫蛍光解析に供した。染色体のミスアラインメントが生じている細胞（ｎ＞５０／条件）の定量を図３Ｄに示す。ｎ＝３の実験の平均値を±Ｓ．Ｄ．とともに示す。図３Ｅ：各種がん細胞株を、２．５μＭのａ１３１またはＤＭＳＯビヒクル対照で１２時間処理し、図３Ｄと同様にして免疫蛍光解析に供し、細胞をＤＡＰＩで対比染色した。３Ｄ−ＳＩＭ超解像顕微鏡を用いて画像を取得した。スケールバー：５μｍ。図３Ｆ−３Ｇ：ＧＦＰ−ヒストンＨ２Ｂを安定的に発現している正常ＢＪ細胞および形質転換ＢＪ細胞を、２．５μＭのａ１３１で２４時間処理した。続いて、細胞をＰＦＡで固定し、β−チューブリンに対する抗体を用いて免疫蛍光解析に供した。３Ｄ−ＳＩＭ超解像顕微鏡を用いて画像を取得した。ａ１３１処理により、形質転換ＢＪ細胞では多極紡錘体の形成とともに染色体のミスアラインメントが大量に生じた（図３Ｆの下パネル）が、正常ＢＪ細胞では生じなかった（図３Ｆの上パネル）。スケールバー：５μｍ。正常ＢＪ細胞における中期紡錘体の長さ（二極間の距離）（ｎ＞２０細胞）の定量を図３Ｇに示す。ｎ＝３の実験の平均値を±Ｓ．Ｄ．とともに示す。対応のない両側ｔ検定を行い、統計学的有意性を判断した。
【００１３】
【図４】図４Ａ−４Ｃは、化合物ａ１３１がRas誘導性グリオーマ幹細胞（ＧＩＣ）の増殖を抑制することを示す。図４Ａ：マウスＧＩＣスフィアの増殖に対するａ１３１の効果。ＤＭＳＯ、テモゾロミド（１００μＭ）またはａ１３１（５μＭ）を含む神経幹細胞培地で７日間インキュベートしたDsRed発現ＧＩＣの代表的な画像（上段パネル）とともに、下段パネルに定量結果を示す。図４Ｂ：マウス脳外植片における腫瘍生存率に対するａ１３１の効果。ＤＭＳＯまたはａ１３１（２０μＭ）で４日間処理した脳冠状スライスにおける切断型カスパーゼ−３の免疫染色（矢印は陽性染色）。スケールバー：２０μｍ。図４Ｃ：マウス脳外植片における腫瘍の増殖に対するａ１３１の効果。実験を模式的に説明したもの（上段）。ＳＶＺ：脳室下帯。ＤＭＳＯまたはａ１３１（２０μＭ）での処理前（０日目）および処理後（４日目）の腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脳から作成した冠状スライス。Ｒｅｄ：DsRed発現ＧＩＣ，スケールバー：３００μｍ（中段）。腫瘍の増殖比（４日目／０日目）を定量し、ｎ＝３の実験の平均値を±Ｓ．Ｄ．とともに示す（下段）。両側対応のないｔ−検定を行い、統計学的有意性を判断した。
【００１４】
【図５】図５Ａ−５Ｆは、正常細胞および形質転換細胞に対する種々の化合物の阻害特性ならびに４つのグループのうちの１つへの指定を示す。図５Ａ−５Ｃ：正常ＢＪ細胞および形質転換ＢＪ細胞を、５μＭのａ１３１およびその誘導体で４８時間処理した。図５Ａ：１３１およびその誘導体の形質転換ＢＪ細胞の分裂停止を誘導する能力を調べるための、リン酸化ヒストンＨ３（Ｓｅｒ１０）［ｐＨ３（Ｓｅｒ１０）］抗体およびβ−アクチン（ローディングコントロール）抗体を用いたイムノブロット解析。ＤＭＳＯと比較したときのバンド強度の誘導倍率［ｐＨ３（Ｓｅｒ１０）／β−アクチン］を平均値および±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）としてプロットしたもの。図５Ｂ：図１Ｃと同様にして実施した正常ＢＪ細胞を用いたＢｒｄＵ取込みアッセイ。ＤＭＳＯ対照との比較におけるＢｒｄＵ陽性細胞集団の割合を平均値および±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）として示す。図５Ｃ：ｓｕｂＧ１（＜２Ｎ）の細胞の割合を調べるためのＦＡＣＳ解析。平均値および±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）を示す。各細胞を、５μＭ（左）または各濃度（右）のａ１３１およびその誘導体で処理した。グループ１の化合物のみが形質転換ＢＪ細胞を選択的に死滅させる能力を保持しており、グループ３の化合物はグループ１の化合物より選択性が顕著に低く、正常細胞株と形質転換細胞株の両方を死滅させることに注意されたい。図５Ｄ−５Ｆ：正常ＢＪ細胞および形質転換ＢＪ細胞を５μＭのａ１６６で処理した。処理の４８時間後に、細胞をａ１５９（図５Ｄ）、パクリタキセル（ＰＴＸ）（図５Ｅ）またはエトポシド（図５Ｆ）で、４８−７２時間さらに処理した。ＰＩと一緒にアネキシンＶで染色した細胞のＦＡＣＳ解析。アネキシンＶとＰＩの二重陽性細胞の割合を平均値および±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）として示す（図５Ｄ−５Ｅ）。図５Ｆ：細胞生存率を調べるためのＭＴＴアッセイ。結果は、ＤＭＳＯ対照との比較における平均値および±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝４）としてプロットしている。特に記載のない限り、対応のない両側ｔ検定を行い、統計学的有意性を判断した。
【００１５】
【図６】図６Ａ−６Ｂは、正常ＢＪ細胞溶解液中の化合物ａ１３１およびａ１６６での顕著なヒットのＣＥＴＳＡ融解曲線を示す。図６Ａ：正常ＢＪ細胞溶解液をビヒクル対照（ＤＭＳＯ）またはａ１３１化合物で処理し、次いでＣＥＴＳＡ処理に供した。選択基準を満たした１６個のヒットタンパク質のＣＥＴＳＡ融解曲線を示す。矢印で示した曲線はＤＭＳＯ対照処理試料を表し、楔形で示した曲線はａ１３１処理細胞溶解液を示す。図６Ｂ：正常ＢＪ細胞溶解液をビヒクル対照（ＤＭＳＯ）またはａ１６６化合物で処理し、次いでＣＥＴＳＡ処理に供した。選択基準を満たした１１個のヒットタンパク質のＣＥＴＳＡ融解曲線を示す。矢印で示した曲線はＤＭＳＯ対照処理試料を表し、楔形で示した曲線はａ１６６処理細胞溶解液を示す。データは、代表的な１つの実験から各条件２つずつ示している。化合物は表４に列記している。
【００１６】
【図７】図７Ａ−７Ｆは、正常細胞に対して選択的増殖停止を誘導するａ１３１の標的としてPI5P4Kを同定した結果を示す。図７Ａ−７Ｂ：ＣＥＴＳＡを用いた標的の同定。実験はすべて、完全に独立して２回ずつ実施した。ａ１３１およびａ１６６の陽性ヒットのベン図を示すとともに共通の標的ヒットを列記した（図７Ａ）。各ヒットを距離によってランク付けした（材料および方法を参照されたい）。図７Ｂ：ａ１３１処理（楔形）対ＤＭＳＯ処理（矢印）（上段）またはａ１６６処理（楔形）対ＤＭＳＯ処理（矢印）（下段）の２回ずつ実施した実験のPI5P4Kアイソフォームの融解曲線。図７Ｃ−７Ｄ：ＰＩ５Ｐを基質として用いたPI5P4K酵素活性アッセイ（材料および方法を参照されたい）。各化合物の阻害曲線±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝４）を示す。各化合物とともにプレインキュベートしたPI5P4Kαのインビトロ酵素活性（図７Ｃ）。図７Ｄ：ａ１３１または各誘導体による阻害が細胞の種類に依存せずに起こることを検証するためのＨｅＬａ細胞を用いたインビボPI5P4K活性。図７Ｅ：図１Ｃと同様にして実施したＢｒｄＵ取込みアッセイ。正常ＢＪ細胞および形質転換ＢＪ細胞を、対照または異なる３組のPI5P4K  ｓｉＲＮＡ（PI5P4Kα、PI5P4Kβ、PI5P4Kγの混合物）で４８時間トランスフェクトした。ＢｒｄＵ陽性細胞集団の割合を平均値±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）として示す。対応のない両側ｔ検定を行い、統計学的有意性を判断した。図７Ｆ：KEGG細胞周期経路遺伝子のＧＳＥＡエンリッチメントプロットおよびヒートマップ。正常ＢＪ細胞を５μＭのａ１３１およびａ１６６で２４時間処理するか、または各ｓｉＲＮＡで４８時間トランスフェクトした。これらの遺伝子の試料ごとの発現プロファイルを、強度に基づいて行正規化した青（−１）から赤（＋１）へのカラースケールを用いてヒートマップに示した。青は低発現を示す。ＤＭＳＯと対照ｓｉＲＮＡはゼロより上であり；試験化合物とｓｉＲＮＡはゼロより下であった。
【００１７】
【図８】図８Ａ−８Ｆは、ａ１３１処理とａ１６６処理との間の遺伝子発現の類似性およびａ１６６の化学保護効果の表現型模写を伴うPI5P4Kノックダウンを示す。図８Ａ−８Ｂ：ａ１３１およびａ１６６で２４時間処理するか、または異なる２組のPI5P4Kで４８時間トランスフェクトした正常ＢＪ細胞の遺伝子発現データを使用し、エンリッチされた（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）KEGG経路を同定した。アップレギュレートされた経路のリストとダウンレギュレートされた経路のリストのそれぞれで４つの輪の（４−ｗａｙ）ベン図（上段）およびヒートマップ（下段）を作成し、それぞれ固有の経路と重複する経路を同定した。この４つの試験の各々からＦＤＲ＜１％の有意な経路を選択し、Vennyソフトウェアパッケージ（bioinforgp.cnb.csic.es/tools/venny）によって比較した。図８Ｃ：４つの実験すべてでＦＤＲ＜０．０１を示した経路は、全部で、ダウンレギュレートされたKEGG経路が４つ、アップレギュレートされたKEGG経路が１２つであった。図７Ｆと同様の細胞周期経路に加えて、選択した２つの経路（ＤＮＡ複製、Ｔｏｌｌ様受容体シグナル伝達）のコアエンリッチメントに寄与している遺伝子を、ダウンレギュレートされた経路およびアップレギュレートされた経路に対する効果の一例として示す。これらの遺伝子の試料ごとの発現プロファイルを、強度に基づいて行正規化した青（−２）から赤（＋２）へのカラースケールを用いてヒートマップに示した。青は低発現を示す。ＤＮＡ複製では、ＤＭＳＯと対照ｓｉＲＮＡはゼロより上であり；試験化合物とｓｉＲＮＡはゼロより下であった。ＴＬＲシグナル伝達では、ＤＭＳＯと対照ｓｉＲＮＡはゼロより下であり；試験化合物とｓｉＲＮＡはゼロより上であった。図８Ｄ：個々のPI5P4KファミリーメンバーのｍＲＮＡ量を測定するためにｎ＝３で実施した定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）解析。正常ＢＪ細胞および形質転換ＢＪ細胞を、材料および方法に記載のPI5P4Kアイソフォームを標的とする異なる３組のｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。図８Ｅ−８Ｆ：正常ＢＪ細胞および形質転換ＢＪ細胞を対照の非サイレンシングｓｉＲＮＡまたはPI5P4K  ｓｉＲＮＡで４８時間トランスフェクトし、続いて、パクリタキセル（ＰＴＸ）（図８Ｅ）またはエトポシド（図８Ｆ）でさらに４８−７２時間処理した。図８Ｅ：ＰＩ染色によるＦＡＣＳ解析。ｓｕｂ−Ｇ１（＜２Ｎ）の細胞の割合を平均値および±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）として示す。図８Ｆ：アポトーシスの有無を調べるためのカスパーゼ−３／７活性アッセイ。ＤＭＳＯ対照との比較における誘導倍率を平均値および±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝４）としてプロットしたもの。特に記載のない限り、対応のない両側ｔ検定を行い、統計学的有意性を判断した。
【００１８】
【図９】図９Ａ−９Ｄは、化合物ａ１３１とRasがPI3K/Akt/mTOR経路をアンタゴニスト的に制御することを示す。図９Ａ−９Ｃ：ａ１３１もしくはａ１６６で２４時間処理した（図９Ａ、９Ｃ）、または各ｓｉＲＮＡで４８時間トランスフェクトした（図９Ｂ、９Ｃ）正常ＢＪ細胞および形質転換ＢＪ細胞のイムノブロット解析。Ａｋｔおよびp70S6Kのリン酸化量／総量の相対比をＤＭＳＯとの比較において示す。４ＨＴ（＋）は、H-RasV12-ERを活性化するために４−ＯＨＴで２４時間処理した正常ＢＪ細胞を示す。図９Ｄ：図１Ｃと同様にして実施したＢｒｄＵ取込みアッセイ。４−ＯＨＴ［４ＨＴ（＋）］を正常ＢＪ細胞に添加して２４時間処理した。続いて、細胞を５μＭのａ１３１またはａ１６６で４８時間処理した（上段）。正常ＢＪ細胞を、各ｓｉＲＮＡで４８時間トランスフェクトし、４−ＯＨＴで２４時間処理した（下段）。ＢｒｄＵ陽性細胞集団の割合をＤＭＳＯとの比較における平均値および±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）として示す。
【００１９】
【図１０】図１０Ａ−１０Ｋは、Ras┤PIK3IP1┤PI3Kシグナル伝達ネットワークによるRas/Raf/MEK/ERK経路とPI3K/Akt/mTOR経路との間の正のクロストークを確認した結果を示す。図１０Ａ：５μＭのａ１３１で２４時間処理した正常細胞（上段）および形質転換ＢＪ細胞（下段）におけるPI3K制御因子の遺伝子発現を用いたPI3Kネットワーク解析。実験的な裏付けおよびSTRINGによる信頼度の高さから、PI3Kと相互作用するPI3K制御因子、例えばPIK3IP1を同定した。PIK3IP1の試料ごとの発現プロファイルをヒートマップ（左）に示す。色：マイナスのｌｏｇ  ＦＤＲ（偽発見率），０．１５−５．３７のスケールで白色から濃いグレーでコード。サイズ：ｌｏｇ比；アップレギュレーション（星印）またはダウンレギュレーション（星印なし）；形状：上流（四角）、並列（ひし形）または下流（円形）。図１０Ｂ，１０Ｅ，１０Ｇ：５μＭのａ１３１またはａ１６６で２４時間処理したＢＪ細胞株におけるPIK3IP1発現のｑＲＴ−ＰＣＲ解析。平均値±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）。図１０Ｃ：H-RasV12-ERを活性化させるために４−ＯＨＴ［４ＨＴ（＋）］で２４時間処理し、続いてａ１３１で処理した正常ＢＪ細胞（左）、または各ｓｉＲＮＡで４８時間トランスフェクトした正常ＢＪ細胞（右）のイムノブロット解析。図１０Ｄ：PIK3IP1遺伝子プロモーターのＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ  ＩＩ）に対する抗体を用いた、ａ１３１で処理した正常ＢＪ細胞のＣｈＩＰ解析（ｎ＝３）。図１０Ｅ：ａ１３１で処理した正常ＢＪ細胞を、続いてＭＥＫ阻害剤Ｕ０１２６（１０μＭ）でさらに２時間処理した。次いで、H-RasV12-ERを活性化させるために４−ＯＨＴを各時点で添加した。図１０Ｆ：各ｓｉＲＮＡを４８時間トランスフェクトし、ａ１３１でさらに２４時間処理した正常ＢＪ細胞のＢｒｄＵ取込み（左、ｎ＝３）およびイムノブロット解析（右）。図１０Ｇ：種々の正常細胞株およびRas変異型がん細胞株を０μＭ、２．５μＭおよび５μＭのａ１６６で２４時間処理した。図１０Ｈ：ＭＥＫ阻害剤Ｕ０１２６（１０μＭ）およびＥＲＫ阻害剤SCH722984（１．２μＭ）で２４時間処理したRas形質転換細胞およびRas変異型細胞のPIK3IP1発現のｑＲＴ−ＰＣＲ解析（上段）およびイムノブロット解析（下段）。図１０Ｉ：各ｓｉＲＮＡを４８時間トランスフェクトし、Ｕ０１２６（１０μＭ）およびSCH722984（１．２μＭ）でさらに２４時間処理したＨＣＴ１１６細胞のイムノブロット解析（上段）およびカスパーゼ−３／７活性化（下段，ｎ＝３）。図１０Ｊ：PIKfyve阻害剤YM-201636（１００ｎＭ）で２時間、続いてａ１３１で２４時間処理した正常ＢＪ細胞のイムノブロット解析。PIK3IP1／β−アクチンの相対比をＤＭＳＯと比較して示す。図１０Ｋ：がん細胞増殖のためのRas┤PIK3IP1┤PI3Kシグナル伝達ネットワークによるRas/Raf/MEK/ERK経路とPI3K/Akt/mTOR経路との間のクロストークのモデル案。特に記載のない限り、Ａｋｔおよびp70S6Kのリン酸化量／総量の相対比をＤＭＳＯと比較して示す。対応のない両側ｔ検定を行い、統計学的有意性を判断した。
【００２０】
【図１１】図１１Ａ−１１Ｅは、種々の正常細胞株およびRas−またはRaf−変異型がん細胞株におけるPIK3IP1のｍＲＮＡ発現、ならびにＴＣＧＡデータセットを用いた図中に記載のがん−正常およびがん−がんにおけるPIK3IP1のｍＲＮＡ発現を示す。図１１Ａ，１１Ｂ，１１Ｅ：種々の正常細胞株およびRas−またはRaf−変異型がん細胞株におけるPIK3IP1のｍＲＮＡ発現のｑＲＴ−ＰＣＲ解析。図１１Ａ：内因性PIK3IP1のｍＲＮＡ発現量。図１１Ｂ：各細胞を、ＤＭＳＯ対照または２．５μＭおよび５μＭのａ１３１で２４時間処理した。図１１Ｃ−１１Ｄ：ＰＩＫ３ＩＰ遺伝子発現のOncomine解析。図１１Ｃ：PIK3IP1のｍＲＮＡ発現は、Ras変異およびRasシグナル伝達経路の活性化がよくみられるヒト結腸直腸腺癌およびヒト肺腺癌では、対応する正常組織またはRas変異が稀である肺扁平上皮癌と比べて抑制されている。ＴＣＧＡコンソーシアムデータセットの発現マイクロアレイの結果を解析し、統計学的有意性を、Oncomineウェブサイト（oncomine.org）を用いて計算した。図１１Ｄ：ヒト結腸直腸腺癌およびヒト肺腺癌におけるPIK3IP1のｍＲＮＡ発現とRas変異状態との間の負の相関。箱ひげ図は、図中に記載のがん−正常およびがん−がんにおけるｍＲＮＡ発現の違いを示す。データを箱ひげ図の分布として示す（線＝中央値）。番号は解析した試料数を表す。図１１Ｅ：ＭＥＫ／ＥＲＫの薬理学的阻害はPIK3IP1のRasによる抑制およびRafによる抑制を減弱させる。種々のRas−またはRaf−変異型がん細胞株をＭＥＫ阻害剤（ＭＥＫｉ）Ｕ０１２６および／またはＥＲＫ阻害剤（ＥＲＫｉ）SCH772984で２４時間処理し、PIK3IP1のｍＲＮＡ発現をｑＲＴ−ＰＣＲによって測定した。注目すべきことに、PIK3IP1のｍＲＮＡ発現の増大はRaf−変異型がん細胞の方がはるかに顕著であり、高ＭＡＰＫ活性がPIK3IP1の抑制に関与していることが示唆される。
【００２１】
【図１２】図１２Ａ−１２Ｄは、正常細胞およびがん細胞の細胞周期過程に対するａ１３１またはａ１６６の効果のモデル案を示す。ａ１３１またはａ１６６によりPI5P4Kが阻害されることにより、PIK3IP1の転写がアップレギュレートされ、それによりPI3K/Akt/mTORシグナル伝達経路が抑制されることによって正常細胞の細胞周期がＧ１／Ｓ期で停止する（図１２Ａ、上段）。この細胞周期の停止は、薬物除去後に回復する（図１２Ａ、下段）。一方、がん細胞におけるRas/Raf/MEK/ERK経路の変異または活性化は、PIK3IP1の負の転写調節によってPI3K/Akt/mTOR経路との正のクロストークを促進させ、これにより、がん細胞は、ａ１３１による細胞周期のＧ１／Ｓ期での増殖停止を回避することが可能になるが、その後、がん細胞はａ１３１による分裂期細胞死および細胞死に至る（図１２Ｂ）。正常細胞は、ａ１６６での前処理により細胞周期がＧ１／Ｓ期で停止することによって、化学療法毒性から保護される（図１２Ｃ）。一方、がん細胞におけるRas/Raf/MEK/ERK経路の変異または活性化により増殖停止は回避されるが、化学療法薬（Ｅｔｏ，エトポシド；ＰＴＸ，パクリタキセル）による細胞死に至る（図１２Ｄ）。注目すべきことに、この試験で同定されたこのRas┤PIK3IP1┤PI3Kシグナル伝達ネットワークは、がんの細胞増殖および増殖のためのRas経路およびPI3K経路の「がん遺伝子コラボレーション（ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｏｎ）」に寄与し得る。
【００２２】
【図１３】図１３Ａ−１３Ｂは、種々のがん細胞株に対してアポトーシスを誘導するａ１３１の選択的死滅効果が、正常細胞株においては働かないことを示す。各種がん細胞株および正常細胞株を、２．５μＭまたは５μＭのａ１３１で４８時間処理した。細胞を回収し、ＰＩ（図１３Ａ）またはアネキシンＶ（図１３Ｂ）でメーカーの使用説明書（eBioscience）に従って染色し、アポトーシスによる細胞死の指標となるｓｕｂＧ１（＜２Ｎ）集団（図１３Ａ）およびアネキシンＶ陽性集団（図１３Ｂ）を調べるＦＡＣＳ解析に供した。平均値を±Ｓ．Ｄ．とともに示す（ｎ＞３）。ｓｕｂＧ１集団およびアネキシンＶ発現はいずれも、処理したがん細胞において、ＤＭＳＯで処理した対照グループと比べて有意に高い（ｐ＜０．０００１）。対応のない両側ｔ検定を行い、統計学的有意性を判断した。ｎ．ｓ．：有意でない
【発明を実施するための形態】
【００２３】
簡便に参照できるように、本明細書に記載の参考文献を一覧にして実施例の後に記載している。参考文献の一覧に記載された文献はいずれも、引用によってその内容全体が本明細書に組み込まれる。
【００２４】
用語の定義
便宜上、本明細書、実施例および添付の特許請求の範囲（statements）で使用している用語について、ここにまとめて示す。
【００２５】
本明細書において「含む（comprising）」または「含む（including）」という用語は、これらの用語によって示される本明細書に記載の特徴、整数、工程または成分の存在を特定するものであると解釈されるが、１つ以上の特徴、整数、工程もしくは成分またはこれらの群の存在または付加を除外するものではない。しかしながら、本開示の文脈において、「含む（comprising）」または「含む（including）」という用語は、「実質的に〜からなる（consisting essentially of）」および「からなる（consisting of）」といったさらに限定的な用語を包含する。したがって、「comprise」や「comprises」などの「含む（comprising）」という用語の変化形、および「include」や「includes」などの「含む（including）」という用語の変化形も同様に広い意味を有する。
【００２６】
本明細書において、「分裂期細胞死」は、中心体のデクラスタリングおよび紡錘体の多極分裂を伴う分裂停止により細胞死に至る現象のことをいう。本発明のグループ１の化合物の処理により細胞の分裂期細胞死が誘導または誘発される機構は不明であり、前記化合物の直接的活性または間接的活性によるものであると考えられる。
【００２７】
本明細書において、用語「ホスファチジルイノシトール５−リン酸４−キナーゼファミリー」および／または用語「（PI5P4K）」は、３つのアイソフォームPI5P4Kα、PI5P4KβおよびPI5P4Kγを含むPI5P4K酵素ファミリーを表すことを意図している。PI5P4Kはまた、PIP4K2としても知られている。この３つの主要アイソフォームPI5P4Kα、PI5P4KβおよびPI5P4Kγには選択的スプライシングによる配列バリアントが存在することが知られており、当業者であれば、本発明がPI5P4Kの配列バリアントの制御を包含することを意図するものであることは理解できるであろう。PI5P4Kα（PIP4K2A，UniGene 138363）、PI5P4Kβ（PIP4K2B，UniGene 171988）およびPI5P4Kγ（PIP4K2C，UniGene 6280511）のｍＲＮＡ配列およびコード領域を表１および配列表に示す。
【００２８】
【表１】
2020501544.tif 000003
【００２９】
本明細書において、用語「低分子干渉（small interfering）ＲＮＡ」または“ｓｉＲＮＡ”は、“short interfering（低分子干渉）”ＲＮＡまたはサイレンシングＲＮＡとしても知られており、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路内で機能する２０〜２５塩基対の長さの二本鎖ＲＮＡ分子種を表すことを意図している。ｓｉＲＮＡは、相補的なヌクレオチド配列を有する特定の遺伝子の発現を、転写後のｍＲＮＡを分解することによって干渉し（Agrawal N, et al., Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67(4): 657-685 (2003)）、翻訳を妨げる。さらに、PI5P4K配列と少なくとも７０％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性、好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を有するｓｉＲＮＡを用いてPI5P4K発現を阻害することにより、正常細胞の細胞周期をＧ１／Ｓで停止させてもよい。オフターゲット効果を最小限にするためのｓｉＲＮＡ設計を補助する利用可能なソフトウェアシステムがあることは理解できるであろう。
【００３０】
本明細書において「対象」は脊椎動物として定義され、特に哺乳動物、さらに特にはヒトを指す。特に研究を目的とする場合、対象は、少なくとも１種の動物モデル（たとえばマウス、ラットなど）であってもよい。しかし、過剰増殖性障害の治療を行う対象は、がん細胞を有するヒトであってもよい。
【００３１】
用語「治療」は、本発明との関連において用いる場合、予防的、緩和的、治療的または治癒的な処置をいう。
【００３２】
用語「形質転換細胞」は本明細書において、初期化合物のスクリーニングのための試験で使用した、本明細書に記載のものなどの遺伝子改変された細胞を示していることを意図している。本明細書の実施例で使用した細胞は、Ras、hTer、p53_koおよびRB_koで形質転換し、接着非依存的様式で培養した。
【００３３】
用語「過剰増殖細胞」は本明細書において、一般的に、天然に存在するがん細胞株を包含することを意図している。形質転換細胞は必ずしも過剰増殖細胞と同じではない。
【００３４】
本明細書において、用語「バリアント」は、ある化合物における、少なくとも１種のホスファチジルイノシトール５−リン酸４−キナーゼ（PI5P4K）ファミリーメンバーおよび／または少なくとも１種のホスホイノシチド３−キナーゼ相互作用タンパク質１（PIK3IP1）の活性を制御する能力に対してほとんどまたはまったく悪影響を及ぼさない１以上の構造変化をいう。例えば、有効なPI5P4K阻害活性を保持した［５−（（Ｅ）−２−（１Ｈ−インドール−３−イル）ビニル）イソキノリン］の構造バリアントを作製することは当業者の技量の範囲内である。
【００３５】
好ましい一態様において、本発明により、細胞の生存を制御する方法であって、少なくとも１種のホスファチジルイノシトール５−リン酸４−キナーゼファミリー（PI5P4K）制御因子および／または少なくとも１種のホスホイノシチド３−キナーゼ相互作用タンパク質１（PIK3IP1）制御因子に少なくとも１種の細胞を接触させることを含む方法が提供される。
【００３６】
好ましい一実施形態において、前記少なくとも１種の制御因子は、PI5P4Kα、PI5P4Kβおよび／またはPI5P4Kγの活性を抑制し、かつ／またはPIK3IP1を活性化することによって、正常細胞の細胞周期をＧ１／Ｓで停止させるが、形質転換細胞または過剰増殖細胞の細胞周期を停止させない。
【００３７】
別の好ましい実施形態において、前記少なくとも１種の制御因子は、PI5P4Kα、PI5P4KβおよびPI5P4Kγの活性を抑制する。好ましくは、PI5P4Kα、PI5P4Kβおよび／またはPI5P4Kγはヒト由来のものである。
【００３８】
PIK3IP1発現の活性化はＭＥＫおよび／またはＥＲＫの薬理学的阻害によって行われ得る。本明細書において、ＭＥＫおよびＥＲＫの阻害によってPIK3IP1発現が有意に高まり、正常細胞において可逆的な増殖停止が誘導されることが示されている。
【００３９】
別の好ましい実施形態において、前記少なくとも１種の制御因子がPI5P4K活性を抑制し、正常細胞の細胞周期をＧ１／Ｓで停止させる場合、該少なくとも１種の制御因子は前記正常細胞の化学保護薬として作用する。本出願において、グループ１および／またはグループ２に属すると称される化合物は、かかる制御因子の一例である。非限定的な例の構造式を表３に示す。
【００４０】
本出願において、グループ１の化合物は形質転換細胞または過剰増殖細胞の分裂期細胞死を誘導し、化学療法活性を有する。
【００４１】
別の好ましい実施形態において、前記少なくとも１種の制御因子がPI5P4K活性を抑制し、正常細胞の細胞周期をＧ１／Ｓで停止させるが、形質転換細胞または過剰増殖細胞の細胞周期を停止させない場合、該制御因子は前記正常細胞の化学保護薬として作用する。本出願において、グループ２の化合物はかかる制御因子の一例である。
【００４２】
別の好ましい実施形態において、前記形質転換細胞または過剰増殖細胞は、がん細胞である。
【００４３】
本発明の別の態様において、正常細胞の化学保護および／または形質転換細胞もしくは過剰増殖細胞の化学療法に使用するための組成物であって、本発明のいずれかの態様で規定される少なくとも１種の化合物を含む組成物を提供する。
【００４４】
好ましい一実施形態において、前記少なくとも１種の化合物は、グループ１もしくはグループ２の化合物もしくはそのバリアント、またはPI5P4Kα、PI5P4Kβおよび／もしくはPI5P4Kγを阻害する少なくとも１種のｓｉＲＮＡである。
【００４５】
本発明のいずれかの態様において、PI5P4Kαバリアントのアミノ酸配列は配列番号２０および２２によって表され；PI5P4Kβのアミノ酸配列は配列番号２４によって表され；PI5P4Kγバリアントのアミノ酸配列は配列番号２６、２８、３０および３２によって表される。
【００４６】
本発明のいずれかの態様において、PI5P4Kαバリアントの核酸配列は配列番号１９および２１によって表され；PI5P4Kβの核酸配列は配列番号２３によって表され；PI5P4Kγバリアントの核酸配列は配列番号２５、２７、２９および３１によって表される。抑制性ｓｉＲＮＡは、PI5P4Kα、PI5P4Kβおよび／またはPI5P4Kγの核酸配列の任意の適当な領域に対する指向性を有していてもよいことは理解できるであろう。
【００４７】
ｓｉＲＮＡを介した効率的な遺伝子サイレンシングには、対象とする標的に相補的な配列であって、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路のタンパク質との好都合な機能的相互作用を促す配列的特徴および構造的特徴を有する配列の選択が必要とされる。最適な配列を選択する上で考慮すべき事項は当業者には公知である（例えば、Angart P.A. et al., Nucleic Acid Therapeutics. 26(5), 309-317 (2016); Agrawal N, et al., Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67(4): 657-685 (2003)。）
【００４８】
別の好ましい実施形態において、前記少なくとも１種のｓｉＲＮＡが、配列番号１−８を含む群から選択される。
【００４９】
本発明の別の態様において、PI5P4Kの活性を制御し、過剰増殖性障害または過剰増殖性疾患の治療における使用に適した化合物を同定する方法であって、
（ａ）PI5P4Kを有する少なくとも１種の細胞を提供すること；
（ｂ）前記少なくとも１種の細胞を少なくとも１種の試験化合物に接触させること；ならびに
（ｃ）PI5P4Kα、PI5P4Kβおよび／またはPI5P4Kγの活性が抑制されているか否か、および前記少なくとも１種の細胞の細胞周期がＧ１／Ｓ期で停止されているか否かを調べて、未処理の細胞と比較すること
を含む方法が提供される。
【００５０】
前記少なくとも１種の試験化合物がPI5P4Kα、PI5P4Kβおよび／またはPI5P4Kγの活性を抑制し、正常細胞の細胞周期をＧ１／Ｓ期で停止させる場合、前記少なくとも１種の試験化合物は、化学療法の際に正常細胞の化学保護薬として作用する。
【００５１】
好ましい一実施形態において、前記正常細胞において、PI5P4Kα、PI5P4Kβおよび／またはPI5P4Kγの活性が抑制されることによって、PIK3IP1がアップレギュレートされ、かつPI3K/Akt/mTOR経路が阻害される。
【００５２】
本発明において、形質転換細胞または過剰増殖細胞におけるRasの活性化により、PIK3IP1の発現とPI5P4K抑制によるPIK3IP1のアップレギュレーションとが抑制され、その結果、前記形質転換細胞または過剰増殖細胞においてPI5P4K抑制によるPI3K/Akt/mTOR経路の抑制が無効化されることがわかった。
【００５３】
本発明の方法の好ましい一実施形態において、前記形質転換細胞または過剰増殖細胞はRasが活性化されたがん細胞である。
【００５４】
本発明の方法の別の好ましい実施形態において、前記少なくとも１種の試験化合物は低分子、アプタマーまたはｓｉＲＮＡである。好ましくは、前記ｓｉＲＮＡは少なくとも１種のPI5P4KアイソフォームのDNA配列の一部分に対する指向性を有する。より好ましくは、前記少なくとも１種のPI5P4Kアイソフォームは、PI5P4Kα、PI5P4KβおよびPI5P4Kγの群から選択される。かかる標的ＤＮＡ配列の例を配列番号１９、２１、２３、２５、２７、２９および３１に示す。より具体的な標的配列を実施例１において配列番号１−８として示す。
【００５５】
本発明の方法の別の好ましい実施形態において、PI5P4Kの活性の抑制は、未処理の細胞と比較してPIK3IP1のｍＲＮＡ量およびタンパク質量がアップレギュレートされていることによって示される。PIK3IP1はまた、ＭＥＫ阻害剤および／またはＥＲＫ阻害剤、例えば、実施例８に記載され、図１０Ｈ−１０Ｉに示されるようなU0126およびSCH722984の投与によってもアップレギュレートされ得る。
【００５６】
本発明の別の態様において、過剰増殖性疾患または過剰増殖性障害を治療する方法であって、PI5P4Kα、PI5P4Kβおよび／またはPI5P4Kγの活性を抑制し、かつ正常細胞の細胞周期をＧ１／Ｓで停止させるが、形質転換細胞または過剰増殖細胞の細胞周期を停止させない少なくとも１種の化合物の有効量と、抗過剰増殖剤の有効量とを投与することを含む方法が提供される。
【００５７】
好ましい一実施形態において、前記形質転換細胞または過剰増殖細胞はRasが活性化されたがん細胞である。
【００５８】
別の好ましい実施形態において、前記抗過剰増殖剤は化学療法剤である。
【００５９】
本発明のいずれかの態様において、前記少なくとも１種の化合物は低分子、アプタマーまたはｓｉＲＮＡである。
【００６０】
別の好ましい実施形態において、前記少なくとも１種の化合物は、例えば、［５−（（Ｅ）−２−（１Ｈ−インドール−３−イル）ビニル）イソキノリン］、またはそのバリアントである。
【００６１】
別の好ましい実施形態において、前記少なくとも１種の化合物は、例えば、配列番号１−配列番号８を含む群から選択されるＤＮＡ標的配列に指向性を有する少なくとも１種のｓｉＲＮＡである。より好ましくは、前記少なくとも１種のｓｉＲＮＡ標的配列は、配列番号１−３；配列番号３−５および配列番号６−８を含む群から選択される。
【００６２】
別の好ましい実施形態において、前記少なくとも１種の化合物は、さらに形質転換細胞または過剰増殖細胞の分裂期細胞死を誘導する少なくとも第２の活性を有し、例えば、（Ｚ）−２−（１Ｈ−インドール−３−イル）−３−（５−イソキノリル）プロパ−２−エンニトリルまたは（Ｚ）−３−（イソキノリン−５−イル）−２−（１−（２−（４−メチルピペラジン−１−イル）アセチル）−１Ｈ−インドール−３−イル）アクリロニトリル、またはそのバリアントである。本出願において、グループ１の化合物はかかる制御因子の一例であり、前記正常細胞に対しては化学保護薬として作用すると考えられるが、形質転換細胞または過剰増殖細胞を選択的に死滅させる。
【００６３】
本発明のいずれかの態様の別の好ましい実施形態において、前記Ｇ１／Ｓ期における細胞周期の停止は、一時的および／または可逆的である。
【００６４】
本発明の別の態様において、過剰増殖性疾患または過剰増殖性障害の治療用医薬を製造するための、少なくとも１種の制御因子の使用であって、該少なくとも１種の制御因子が、PI5P4Kα、PI5P4Kβおよび／またはPI5P4Kγの活性を抑制し、かつ正常細胞の周期をＧ１／Ｓ期で停止させ、さらに形質転換細胞または過剰増殖細胞の分裂期細胞死を誘導することを特徴とする使用が提供される。
【００６５】
本発明の別の態様において、過剰増殖性疾患または過剰増殖性障害の治療用医薬を製造するための、抗増殖剤と併用される少なくとも１種の制御因子の使用であって、該少なくとも１種の制御因子が、PI5P4Kα、PI5P4Kβおよび／またはPI5P4Kγの活性を抑制し、かつ正常細胞の細胞周期をＧ１／Ｓ期で停止させることを特徴とする使用が提供される。好ましくは、前記少なくとも１種の制御因子は、本明細書に記載のグループ１および／またはグループ２の化合物から選択される。前記少なくとも１種の制御因子は、代替的にまたは付加的に、任意の適当なｓｉＲＮＡまたはアプタマーであり得る。
【００６６】
好ましい一実施形態において、PI5P4Kα、PI5P4Kβおよび／またはPI5P4Kγの活性を抑制する少なくとも１種のｓｉＲＮＡは、配列番号１９、２１、２３、２５、２７、２９および３１を含む群から選択されるＤＮＡ標的配列に指向性を有し、そのより具体的な例は配列番号１−配列番号８の群によって表される。
【００６７】
好ましい一実施形態において、前記少なくとも１種の制御因子の使用により、正常細胞においてPIK3IP1の発現の増大がもたらされる。
【００６８】
別の好ましい実施形態において、過剰増殖性疾患または過剰増殖性障害は、Rasが活性化されたがん細胞が関与するものである。
【００６９】
本発明の化合物は一般的に、意図される投与経路および標準的な製薬実務に充分に配慮して選択され得る薬学的に許容され得る補助剤、希釈剤または担体との混合物である医薬製剤として投与される。かかる薬学的に許容され得る担体としては、活性化合物に対して化学的に不活性であるものが挙げられ、また、使用条件下で有害な副作用または毒性を有しないものが挙げられる。好適な医薬製剤については、例えば、Remington The Science and Practice of Pharmacy, 19th ed., Mack Printing Company, Easton, Pennsylvania (1995)を参照されたい。非経口投与では、パイロジェンフリーであり、かつ必要なｐＨ、等張性および安定性を有する非経口的に許容され得る水溶液が使用され得る。好適な溶液は当業者によく知られており、数多くの方法が文献に報告されている。また、薬物送達の方法の簡潔なレビューとしては、例えば、Langer R., Science 249: 1527-33 (1990)を参照されたい。
【００７０】
また、好適な製剤の調製は、当業者により、常法により慣例に従って、かつ／または標準的な製薬実務および／または認められている製薬実務に従って行われる。
【００７１】
本発明に従って使用される任意の医薬製剤中の化合物の量は、種々の要因、例えば、治療対象となる病態の重症度、治療対象となる個々の患者、ならびに使用される化合物（１種または複数種）に依存する。いずれの場合も、製剤中の化合物の量は当業者によって慣例的に決定することができる。
【００７２】
例えば、固形経口組成物、例えば、錠剤またはカプセル剤は、１−９９％（ｗ／ｗ）の活性成分；０−９９％（ｗ／ｗ）の希釈剤または増量剤；０−２０％（ｗ／ｗ）の崩壊剤；０−５％（ｗ／ｗ）の滑沢剤；０−５％（ｗ／ｗ）の流動助剤；０−５０％（ｗ／ｗ）の造粒剤または結合剤；０−５％（ｗ／ｗ）の酸化防止剤；および０−５％（ｗ／ｗ）の顔料を含むものであり得る。制御放出錠剤には加えて０−９０％（ｗ／ｗ）の放出制御ポリマーが含有され得る。
【００７３】
非経口製剤（例えば、注射用の液剤もしくは懸濁剤または輸注用の液剤）は、１−５０％（ｗ／ｗ）の活性成分；および５０％（ｗ／ｗ）−９９％（ｗ／ｗ）の液状または半固形の担体またはビヒクル（例えば、溶媒、例えば水）；ならびに０−２０％（ｗ／ｗ）の１種類以上の他の賦形剤、例えば、緩衝剤、酸化防止剤、懸濁安定剤、調度調整剤および保存料を含むものであり得る。
【００７４】
化合物は、治療対象の障害および患者、ならびに投与経路に応じて、それぞれ異なる治療有効用量で、それを必要とする患者に投与され得る。
【００７５】
しかしながら、本発明との関連において、哺乳動物、特にヒトに投与される用量は、該哺乳動物において適当な期間にわたって治療応答がもたらされるのに充分なものであるのがよい。当業者であれば、正確な用量および組成ならびに最も適切な送達レジメンの選択が、とりわけ、製剤の薬理学的特性、治療対象である病態の性質および重症度、レシピエントの体調および知的鋭敏さ、ならびに具体的な化合物の効力、治療対象となる患者の年齢、状態、体重、性別および応答、疾患の病期／重症度によっても影響されることは理解できるであろう。
【００７６】
本発明の概要を説明してきたが、例証を目的として記載された以下の実施例を参照することによって、本発明をさらに容易に理解することができるであろう。なお、以下の実施例は本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００７７】
実施例１：方法
本明細書において具体的に述べていない当技術分野で公知の標準的な分子生物学的技術は、Sambrook and Russel, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York (2001)の記載に概ね準じた。
【００７８】
細胞株、培養および試薬
非形質転換（正常）ＢＪ細胞および形質転換ＢＪ細胞を含む同質遺伝子系のＢＪヒト包皮線維芽細胞の細胞株ならびにすべての胃がん細胞株は、それぞれ、Mathijs Voorhoeve博士およびPatrick Tan博士（Duke-NUS）のご厚意により提供を受けたものであり、いずれもマイコプラズマ感染の確認試験を行った。以下の試験で使用した細胞株用の培養培地を表２にまとめた。試験で使用したヒトがん細胞株は、上記以外はすべて、ＡＴＣＣから購入し、ＡＴＣＣの使用説明書に従って培養した。H-RasV12-ERは、ＢＪ由来線維芽細胞を４−ＯＨＴ（１００ｎＭ，Sigma-Aldrich）に曝露することによって活性化させた。以下の試験において、PI5P4KアイソフォームＤＮＡ配列を標的とする異なる３組のｓｉＲＮＡを使用した。その３組のｓｉＲＮＡを以下に示す。
プール＃１、
PI5P4Kα（5’-CTGCCCGATGGTCTTCCGTAA-3’；配列番号１）、
PI5P4Kβ（5’-CACGATCAATGAGCTGAGCAA-5’；配列番号２）、および
PI5P4Kγ（5’-CCGGAGCAGTATGCTAAGCGA-3’；配列番号３）；
プール＃２、
PI5P4Kα（5’-CGGCTTAATGTTGATGGAGTT-3’；配列番号４）、
PI5P4Kβ（5’-CCCTCGATCTATTTCCTTCTT-3’；配列番号５）、および
PI5P4Kγ（5’- CCGGAGCAGTATGCTAAGCGA-3’；配列番号３）；
プール＃３、
PI5P4Kα（5’-CCTCGGACAGACATGAACATT-3’；配列番号６）、
PI5P4Kβ（5’- CAAACGCTTCAACGAGTTTAT-3’；配列番号７）、および
PI5P4Kγ（5’- CCGAGTCAGTGTGGACAACGA-3’；配列番号８）
【００７９】
PIK3IP1をノックダウンするため、ｓｉＲＮＡ＃１（5’-AGAGGCTAACCTGGAAACTAA-3’；配列番号9）と＃２（5’- TACACTGTTATTCATGGTTAA-3’；配列番号10）を使用した。非サイレンシング対照ｓｉＲＮＡはDharmaconから購入した。ｓｉＲＮＡのトランスフェクションには、Lipofectamine 2000（Invitrogen）またはDharmafect（Dharmacon）をメーカーの使用説明書に従って使用した。
【００８０】
細胞毒性試験
細胞を９６ウェルマイクロプレートに０日目に播種し、１日目に種々の濃度（０．１μＭ−４０μＭ）のａ１３１を３ウェルずつ添加した。３日間培養した後、ＭＴＴ細胞増殖アッセイを用いて、チアゾリルブルーテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ試薬，Invitrogen）を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度で各ウェルに添加し、３７℃で４時間インキュベートすることにより生細胞数を測定した。培地を除去し、ＤＭＳＯを加えて、各ウェル内に残存している青色色素をマイクロプレートミキサーを用いて混合することにより溶解させた。各ウェルの５４０ｎｍおよび６６０ｎｍの吸光度を、マイクロプレートリーダー（Benchmark plus，Bio-Rad）を用いて測定した。光学密度（ＯＤ）値を、５４０ｎｍの吸光度から６６０ｎｍの吸光度を差し引くことにより計算した。対照細胞（ＤＭＳＯのみで処理したウェル）の平均ＯＤ値を生細胞数１００％とした。細胞生存率を５０％低下させる薬物濃度（ＧＩ５０）を、非線形回帰フィッティングによりGraphPad Prismを用いて計算した。
【００８１】
クリスタルバイオレット染色
細胞を１×ＰＢＳで２回洗浄し、０．５％クリスタルバイオレット色素（１：５のメタノール：脱イオン水に溶解）で１０分間染色した。過剰のクリスタルバイオレット色素を、振盪機上にて脱イオン水で５回（１０分／洗浄）洗浄することにより除去し、培養プレートを一晩乾燥させた。
【００８２】
細胞死および細胞増殖停止の解析
細胞死は、アネキシンＶおよび／またはＰＩ（ヨウ化プロピジウム）染色により、メーカーの使用説明書（eBioscience）に従って評価した。細胞増殖停止は、ヌクレオシドアナログであるブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を取り込ませてＤＮＡ合成を直接測定することにより評価した。以下、方法について簡単に述べる。ＢｒｄＵ（３０μＭ，Sigma-Aldrich）を添加し、２時間後に細胞を回収した。続いて、細胞をPacific Blue標識ＢｒｄＵ抗体（Invitrogen）で１時間染色した後、ＰＩ染色を行った。染色した細胞をMACSQuant（MACS）によって解析した。実験はｎ＝３で、独立して３回行った。アネキシンＶ／ＰＩ陽性細胞またはＢｒｄＵ陽性細胞の割合を、Flow Joソフトウェア（Becton Dickinson）を用いて定量した。特に記載のない限り、カスパーゼ−３／７の総活性は、カスパーゼ-Glo 3/7 Assay Kit（Promega）を用いて測定し、ＭＴＴアッセイで求めた生細胞数で補正した。
【００８３】
インビボ試験
ＢＡＬＢ／ｃ胸腺欠損雌ヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ，５−７週齢）（InVivos）を特定病原体不在（ＳＰＦ）条件下で飼育した。マウスの飼育および使用は、Duke-NUS IACUCに承認されたものであり、プロトコル2015/SHS/1030に従うものであった。ＨＣＴ１５ヒト結腸がん細胞（５×１０６）またはＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳がん細胞（４×１０６，Matrigelを伴う）をマウスの側腹部に皮下注射した。平均腫瘍体積が１００−３００ｍｍ３に達したところで（１日目）、動物を動き回らせるアルゴリズムによって６匹ずつのマウスの実験群に無作為に分け、各処置群が同様の平均腫瘍量および標準偏差を有する最適なケース分布が得られるようにした。事前のサンプルサイズの決定に統計学的方法は使用しなかった。動物にａ１３１（２０ｍｇ／ｋｇ）、ｂ５（４０−８０ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクル対照を１日２回、１２日間（ＨＣＴ１１５）または１５日間（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）、腹腔内（ＩＰ）注射または経口（ＰＯ）投与した。化合物ａ１３１およびｂ５は、ＤＭＳＯに溶解した後、ＰＥＧ４００および脱イオン水（ｐＨ５．０）（終濃度，１０％ＤＭＳＯ，５０％ＰＥＧ４００）を添加した。パクリタキセル（Cayman Chemical）をエタノール：Ｔｗｅｅｎ  ８０＝１：３（ｖ／ｖ）溶液に溶解した後、５％グルコース溶液を添加し（最終比，エタノール：Ｔｗｅｅｎ  ８０：５％グルコース＝５：１５：８０）、尾静脈に注射した（ＩＶ）。腫瘍の寸法をノギスを用いて測定し、腫瘍体積（ｍｍ３）を、幅２×長さ／２の式を用いて盲検的に計算を行った。１２日目（ＨＣＴ１５）または１６日目（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）に、マウスを屠殺した。腫瘍を採取し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で一晩固定し、７０％エタノールに保存した。免疫染色を行うために、ホルムアルデヒドで固定したパラフィン包埋腫瘍組織切片をクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０）中で３０分間、マイクロウェーブ固定包埋装置（Milestone）を用いて煮沸することにより、抗原を賦活化させた。組織切片を室温で２０分間、３％過酸化水素（Ｈ２Ｏ２は１×ＴＢＳ中）で処理することにより、組織切片の内因性ペルオキシダーゼ活性を枯渇させた。腫瘍組織切片を抗β−チューブリン（Abcam；３％ＢＳＡ／ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ２０で１：１００希釈）とともに４℃で一晩インキュベートした後、ヤギ抗ウサギＦＩＴＣ標識二次抗体（Invitrogen；３％ＢＳＡ／ＴＢＳで１：２００希釈）とともに２５℃で１時間インキュベーションした。脱水処理後、ＤＡＰＩ封入剤（Vector）を滴下してカバーガラスで封入した。超解像顕微鏡（Nikon）を用いて３Ｄ−ＳＩＭモードで画像を取得し、２つまたは３つ以上の分裂紡錘体を有する細胞数を定量した（ｎ＞５０細胞／切片，６−７切片／処理）。ＴＵＮＥＬ法を用いたアポトーシスの検出を行うために、ｂ５（８０ｍｇ／ｋｇ，ＩＰ）または対照ビヒクルを１２日間投与したマウスのホルムアルデヒドで固定したパラフィン包埋腫瘍組織切片に対して、ApopTag Plus Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit（Millipore）を使用した。Zeiss AxioImager Z.2正立顕微鏡に付属のMetaSystems Metaferを用いて、スライドのスキャン画像を取得した。このシステムは、CoolCube1カメラおよびZeiss Plan-Neofluar 20x/0.5 Ph2対物レンズを備えている。画���取得はMetafer4ソフトウェアを用いて制御し、スティッチングはVSlideソフトウェアを用いて行い、オープンソースソフトウェアFIJIを用いてさらに処理した。カスタムマクロを用いて画像を以下の順序でバッチ処理した。ガウシアンフィルター、ヘマトキシリンおよびＤＡＢのカラーデコンボリューション、ヘマトキシリン画像の閾値処理、ｗａｔｅｒｓｈｅｄ法による隣接した核の分割、次いで、ヘマトキシリン染色核の数のカウント。ＤＡＢ画像では、固定閾値を使用し、ｗａｔｅｒｓｈｅｄ法を適用し、ＤＡＢ染色核の数をカウントした。いずれの場合も、データの除外、動物の除外は行わなかった。結果を平均および平均の標準偏差として示す。
【００８４】
スフィア形成アッセイ
マウスグリオーマ幹細胞（ＧＩＣ）を、既報と同様の方法で樹立し、培養した（Saga,I.et al.,Neuro.Oncol.16:1048-1056(2014)）。以下、方法について簡単に述べる。Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ欠損神経幹細胞／前駆細胞にヒトH-RasV12およびDsRedを形質導入し、２０ｎｇ／ｍｌの組換え上皮成長因子（ＥＧＦ；PeproTech）および塩基性線維芽細胞増殖因子（PeproTech）、２００ｎｇ／ｍｌのヘパラン硫酸（Sigma-Aldrich）、およびビタミンＡ非含有Ｂ２７ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Invitrogen，Carlsbad，CA）を含む無血清ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）／F12（Sigma-Aldrich）で増殖させた。ＧＩＣを解離させ、９６ウェルプレートに１００個／ウェルの密度で播種した。ビヒクル（ＤＭＳＯ）、１００μＭのテモゾロミド（Sigma-Aldrich）または５μＭのａ１３１を添加し、播種の７日後にスフィアの形成およびサイズを評価した。各処理群について３つのプレートを用意し、１プレートあたり３０個のウェルを定量した。画像をBZ-X700倒立蛍光顕微鏡（Keyence）下にて取得した。定量は、Nikon NIS-elementソフトウェアによって行った（ｎ＝９０）。
【００８５】
脳外植片スライスおよび薬物処理
５万個のＧＩＣを野生型マウスの前脳内に同所性移植し、移植後７日目、脳外植片スライスを既報と同様の方法で作成した（Sampetrean,O.et al.,Neoplasia 13:784-791(2011)）。冠状スライス（２００μｍ）をMillicell-CM培養用インサートプレート（Millipore）上で培養し、ビヒクルまたはａ１３１で４日間処理した。画像をFV10i Olympus共焦点顕微鏡（Olympus）下にて取得し、腫瘍面積をNikon NIS-elementソフトウェアによって定量した。実験はｎ＝３で行った。実験終了時（４日目）、スライスを４％パラホルムアルデヒドで一晩固定し、パラフィンに包埋し、次いで４μｍの厚さの切片を作製した。脱パラフィン処理した切片を切断型カスパーゼ３に対するウサギポリクローナル抗体（Cell Signaling）で染色した。免疫複合体を、Histofine（Nichirei Biosciences）およびImmPACTDAB（Vector Laboratories）を用いて検出した。動物実験はすべて、慶應義塾大学（Keio University）の動物飼育ガイドラインに従って実施した。
【００８６】
ｑＲＴ−ＰＣＲ
RNeasy mini kit（Qiagen）を用いて培養細胞から全ＲＮＡを単離した。１μｇの全ＲＮＡからiScript cDNA合成キット（Bio-Rad）を用いてｃＤＮＡを合成した。ｑＲＴ−ＰＣＲ解析は、iQ SYBR Green Super mix（Bio-Rad）を使用し、以下の遺伝子特異的プライマー：
ヒトPI5P4Kα（5’-AAGAAGAAGCACTTCGTAGCG-3’; 配列番号11, 5’-ATGGCTCAGTTCATTGATCGAG-3’；配列番号12）、
ヒトPI5P4Kβ（5’-CCACACGATCAATGAGCTGAG-3’; 配列番号13, 5’-TCCTTAAACTTAAAGCGGCTGG-3’；配列番号14）、
ヒトPI5P4Kγ（5’-CCGGGAAGCCAGCGATAAG-3’; 配列番号15, 5’-AGCTGCACTAGAAACTCCACA-3’；配列番号１６）および
ヒトPIK3IP1（5’-GCTAGGAGGAACTACCACTTTG-3’; 配列番号17, 5’-GATGGACAAGGAGCACTGTTA-3’；配列番号１８）
を用いて行った。ＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）遺伝子を補正に使用した。ＰＣＲ反応はすべてｎ＝３で行った。
【００８７】
マイクロアレイデータ解析
２５０−５００ｎｇの全ＲＮＡからIllumina TotalPrep RNA Amplification Kit（Ambion Inc.）を用いてビオチン標識ｃＲＮＡを調製した。ｃＲＮＡ収量をAgilent Bioanalyzerで定量し、７５０ｎｇのビオチン標識ｃＲＮＡとIllumina HT-12 v4.0 Expression Beadchipとを、メーカーの使用説明書（Illumina,Inc.）に従ってハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、ビーズチップを洗浄し、Ｃｙ３標識ストレプトアビジンでメーカーのプロトコルに従って染色した。乾燥させたビーズチップをIllumina BeadArray Reader共焦点スキャナ（Illumina,Inc.）でスキャンした。チップスキャニング後に得られた遺伝子発現シグナルをPartek Genomics Suite v6.6（Partek Inc.）でｑｕａｎｔｉｌｅ法により正規化した。すべての群において、正規化後の最大平均シグナルが＜１００の遺伝子はバックグラウンドと同様とみなし、さらなる解析には使用しなかった。サンプルの外れ値の検出は、Partekの主成分解析により行った。差次的発現遺伝子を、一元配置ＡＮＯＶＡと、所望のペアワイズ比較を指定する事後検定とを用いて同定した。２群間の差次遺伝子発現の大きさを変化倍率の対数（基数２）として示し、遺伝子発現の差の統計学的有意性を偽発見率（ＦＤＲ）によって確認した。ほとんどの解析において、ｌｏｇ変化倍率の絶対値＞０．５８およびＦＤＲ＜５％の遺伝子を有意な差次的発現遺伝子とみなした。比較群の遺伝子発現プロファイルを、gplotsおよびRColorbBrewerパッケージを用いてR 3.2.3のgplotsライブラリーによって作成したヒートマップにより可視化した。ヒートマップは、各行が遺伝子名、各列が処理の種類からなる行列として示される。各遺伝子についてエンリッチメントグラフをプロットし（バーで示す）、これを、対照と処理化合物またはPI5P4Kノックダウン試料との間の信号対ノイズ基準によって順位付けする。遺伝子発現値を行正規化し、発現シグナルの漸増スケールを表すカラースケールでマッピングした。一部の解析では、遺伝子発現マトリックスをウォードのアルゴリズム（Ward, J. H. Journal of the American Statistical Association 58: 236-244 (1963)）による階層的クラスタリングに供した後、ヒートマップを作成した。生物学的機構に対する差次的遺伝子発現の効果を評価するため、本発明者らは遺伝子セットエンリッチメント解析（ＧＳＥＡ）（Subramanian, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102: 15545-15550 (2005)）を、Molecular Signatures Database, MSigDB（Kanehisa, M. & Goto, S. KEGG: Nucl. Acids Res. 28: 27-30 (2000)）から入手したKEGG経路レポジトリーのカスタマイズバージョンを用いて行った。解析では、１０−２００個の遺伝子を含む生物学的経路を検討し、ＦＤＲ＜１０％の経路を統計学的に有意とみなした。
【００８８】
イムノブロット解析
全細胞溶解液を、１％ｔｒｉｔｏｎ溶解バッファー［２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１％ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００，１ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ），プロテアーゼ阻害剤ミックス（Complete Mini，Roche）およびホスファターゼ阻害剤（PhosphoStop，Roche）］を用いて調製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。以下の抗体をイムノブロッティングに使用した：抗β−アクチン（Sigma-Aldrich）、抗切断型ＰＡＲＰ（Abcam，＃ａｂ３２０６４）、抗PI5P4Kα（＃５５２７）、抗PI5P4Kβ（＃９６９４）、抗切断型カスパーゼ−３（＃９６６４）、抗リン酸化ヒストンＨ３（Ｓｅｒ１０）（＃３３７７）、抗ｐＡｋｔ（Ｓ４７３）（＃９２７１）、抗ｐＡｋｔ（Ｔ３０８）（＃１３０３８）、抗全Ａｋｔ（＃９２７２）、抗p70S6K（Ｔ３８９）（＃９２３４）、抗全p70S6K（＃９２０２）、抗ｐＥｒｋ（＃４３７０）、抗γ−ヒストンＨ２ＡＸ（＃９７１８）（細胞シグナル伝達）および抗PIK3IP1（Proteintech，＃１６８２６−１−ＡＰ）。二次抗体はヒツジ抗マウスＩｇＧ  ＨＲＰおよびロバ抗ウサギＩｇＧ  ＨＲＰ（Amersham；１：２０００に希釈）を使用した。免疫反応性タンパク質を、ＥＣＬ試薬（Amersham）を用いて可視化した。特に記載のない限り、タンパク質のバンドの強度は、デンシトメトリー（Odyssey V3.0）によって定量し、そのローディングコントロールに対して補正し、次いで、ＤＭＳＯ対照に対する発現の変化倍率として計算した。
【００８９】
免疫蛍光およびタイムラプス生細胞イメージング
免疫蛍光解析を行うために、カバーガラス底面チャンバースライド（Lab-Tek）上で培養した細胞を４％ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）で２５℃にて１５分間固定した。固定した細胞を０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いて透過処理し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と２％ＢＳＡを含むＴＢＳ（AbDil）に曝露した。以下の一次抗体を、１％ＢＳＡと０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むＰＢＳで希釈した：抗γ−チューブリン（Sigma-Aldrich，＃Ｔ６５５７；１：１０００）および抗β−チューブリン（Abcam，＃ａｂ１８２０７；１：２０００）。Alexa Fluor 488、594またはＣｙ５と結合したアイソタイプ特異的二次抗体（Molecular Probes）（１：５００に希釈）を使用した。また、細胞をＤＡＰＩ（Thermo Scientific）で対比染色した。CFI Apo TIRF（100x/1.40 oil）対物レンズを備えたNikon Eclipse Ti-E倒立顕微鏡に搭載されたiXon EM+ 885 EMCCDカメラ（Andor）を備えた超解像顕微鏡（Nikon）を用いて３Ｄ−ＳＩＭモードで、室温にて画像を取得し、NIS-Elements ARソフトウェアを用いて処理した。タイムラプス生細胞解析では、デジタルＣＯ２ミキサーを有するステージトップインキュベーター（Tokai）を使用し、３７℃で画像を取得した。
【００９０】
細胞サーマルシフトアッセイ（ＣＥＴＳＡ）
定量質量分析と組み合わせた細胞サーマルシフトアッセイ（ＣＥＴＳＡ）により標的の同定を行った。以下、方法について簡単に述べる。正常ＢＪ細胞を、凍結／解凍と針を用いた機械的剪断の組合せにより、バッファー［５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５），５ｍＭ  β−グリセロホスフェート、０．１ｍＭバナジン酸ナトリウム、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＴＣＥＰおよび１×プロテアーゼ阻害剤カクテル］中で溶解させた。２０，０００ｇで４℃にて２０分間遠心分離を行い、細胞残渣を除去した。細胞溶解液を１００μＭのａ１３１、ａ１６６またはＤＭＳＯとともに室温で３分間インキュベートした。各溶解液を１０等分し、９６ウェルサーモサイクラーにて各温度で３分間熱処理し、続いて４℃で３分間静置した。溶解液を２０，０００ｇで４℃にて２０分間遠心分離し、上清みをマイクロチューブに移し、ＭＳ用試料の調製に用いた。
【００９１】
ＭＳ用試料の調製
溶解後、少なくとも１００μｇのタンパク質（ＢＣＡアッセイで測定）を還元、変性およびアルキル化に供した。続いて試料をシーケンシンググレードのＬｙｓＣ（Wako）およびトリプシン（Promega）とともに３７℃で一晩インキュベートして消化した。消化した試料を、遠心真空エバポレータを用いて乾燥させ、１００ｍＭ  ＴＥＡＢで可溶化させた。各測定に際して、２５μｇの消化後のタンパク質を１時間、10plexTMT（Pierce）で標識した。次いで試料を、１Ｍ  Ｔｒｉｓバッファー、ｐＨ７．４を用いてクエンチした。次いで、標識した試料をまとめてプールし、C18 Sep-Pak（Waters）カートリッジを用いて脱塩処理し、高ｐＨ逆相Zorbax 300 Extend C-18 4.6mm×250mm（Agilent）カラムおよび液体クロマトグラフィーAKTA Micro（GE）システムを用いて８０個の画分に予備分画した。
【００９２】
ＬＣ−ＭＳ解析
この予備分画の画分を２０個の画分にプールし、各実験のプール画分を、Q Exactive質量分析計（Thermo Scientific）と連結した逆相液体クロマトグラフィーDionex 3000 UHPLCシステムを用いた質量分析解析に供した。取得パラメータは以下の通り設定した：サーベイスキャンによるデータ依存的取得（Ｄａｔａ  Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ）  分解能７０，０００およびＡＧＣターゲット値３ｅ６；Top12 MS/MS  分解能３５，０００（ｍ／ｚ  ２００）およびＡＧＣターゲット値１ｅ５；単離幅１．６  ｍ／ｚ。その後の検索のためのピークリストを、Mascot 2.5.1（Matrix Science）およびProteome Discoverer 2.0ソフトウェア（Thermo Scientific）のSequest HT（Thermo Scientific）を用いて作成した。参照タンパク質データベースとして、連結フォワード／デコイ（ｃｏｎｃａｔｅｎａｔｅｄ  ｆｏｒｗａｒｄ／ｄｅｃｏｙ）Human-HHV4 Uniprotデータベースを使用した。
【００９３】
ヒットの選択およびランク付け
最高温度点で高値の平坦域を有するタンパク質を、対照（ＤＳＭＯ処理）条件における最後３つの温度点の平均読み値に対して＞０．３でのカットオフを用いて消去した。（Savitski, M. M. et al., Science 346 (6205): 55 (2014）。低温平坦域が存在しないタンパク質を、最初の３つの温度点の平均読み値に対してカットオフ＞０．８５を用いて消去した（本発明者らの実験では、約３７℃で既に融解するタンパク質はシフト解析において、より偽陽性を示す傾向にある）。次いで、全反復実験のすべてのタンパク質のサーマルシフトのユークリッド距離（ＥＤ）スコアを計算し、ａ１３１およびａ１６６について、中央値＋２．７５＊ＭＡＤ（中央値絶対偏差）でのカットオフを用いてＥＤヒットリストを作成した。サーマルシフトのΔＴｍ値を、対照試料と０．５倍変化した処理試料との間の平均偏差として計算し、中央値＋２．７５＊ＭＡＤの有意な正のΔＴｍ値を有するタンパク質を選択した。有意なＥＤスコアと有意なΔＴｍ値の両方を有するタンパク質を、それぞれａ１３１およびａ１６６に対する１６種類および１１種類のタンパク質に相当する最終ヒットリストとして選択した。平坦であり、端の高温で高値の平坦域を有する融解曲線は、直接結合に相当する可能性が低く（Mayer, I. A. & Arteaga, C. L. Annu. Rev. Med. 67: 11-28 (2016)）、光学検査により、例えば、亜ヒ酸（ａｒｓｅｎａｔｅ）メチルトランスフェラーゼは、最も大きいΔＴｍのうちの１つを示すにもかかわらず、直接標的結合に相当する有意なヒットである可能性が低いことが示唆される。タンパク質融解曲線のプロット、ヒット選択およびランク付けを含む解析工程は、Ｒプログラミング言語を用いて所内開発したスクリプトを用いて自動で行った（Core_Team, R. R: (2014)）。
【００９４】
PI5P4K酵素アッセイ
ＨｅＬａ細胞をＤＭＳＯまたは化合物で２４時間処理した。ＲＩＰＡバッファー（Sigma-Aldrich）で細胞を溶解し、総タンパク質濃度を、ビシンコニン酸タンパク質アッセイキット（Thermo Scientific）を用いて測定した。次に、１０μｇの細胞溶解液を１μＭのＰＩ（５）Ｐ  および５００ｎＭのＡＴＰとともに３７℃で１時間インキュベートした。PI5P4K活性は、PIP4KII Activity Assay Kit（Echelon）を用いてメーカーの使用説明書に従って発光シグナルを記録すること（Tecan）により測定した。無細胞のPI5P4Kα活性アッセイでは、段階希釈した化合物を１ｎｇのPI5P4Kα（第一三共株式会社および第一三共ＲＤノバーレ株式会社のご厚意により提供を受けたもの）ともに、反応バッファー［５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０），１３ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．００５％ＣＨＡＰＳ，０．０１％ＢＳＡ，２．５ｍＭ  ＤＴＴ］で２５℃にて１時間プレインキュベートした。ＤＯＰＳ（８０μＭ，Avanti polar lipids）、ＰＩ（５）Ｐ（２０μＭ，Echelon）およびＡＴＰ（１０μＭ，Sigma-Aldrich）を添加し、室温で９０分間さらにインキュベートした。PI5P4Kα活性は、ADP-Glo Kinase Assay（Promega）を用いてメーカーのプロトコルに従って発光シグナルを記録すること（Tecan）により測定した。
【００９５】
ＣｈＩＰ
クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）アッセイは、Magna ChIP A/G Kit（Millipore）を用いてメーカーの使用説明書に従って行った。PIK3IP1に対するＰｏｌＩＩ結合のエンリッチメントは、免疫沈降クロマチンの１／１０を鋳型とし、iQ SYBR Green Super mix（Bio-Rad）を用いてｑＰＣＲにより評価した。プライマー配列は請求に応じて入手可能である。
【００９６】
実施例２：がん選択的化合物の同定
形質転換細胞の増殖および生存に必要とされる具体的なシグナル伝達ネットワークを調べるため、２種類の同質遺伝子系のヒトＢＪ包皮線維芽細胞、すなわちｈＴｅｒｔのみの導入により不死化されたヒトＢＪ包皮線維芽細胞（以下、本明細書において正常ＢＪと命名する）、ならびにｈＴｅｒｔ，ｓｍａｌｌ  ｔ、ｐ５３およびｐ１６に対するｓｈＲＮＡ、ならびにH-RasV12-ER（活性化型Ｇ１２Ｖ変異を有するエストロゲン受容体融合H-Ras）で完全に形質転換されたヒトＢＪ包皮線維芽細胞（以下、本明細書において形質転換ＢＪと命名する）を用いて低分子スクリーニングを実施した。スクリーニングした化合物のうちの１つ（抗がん化合物131；以下、本明細書においてａ１３１と称する）（図１Ａ）は形質転換ＢＪ細胞を効率的に死滅させたが、正常ＢＪ細胞は死滅させなかった（図１Ｂ；図２Ａ）。一方、パクリタキセル（微小管安定化剤）およびノコダゾール（微小管不安定化剤）のでの処理では、ごくわずかながん選択性しか見られなかった（図２Ａ）。細胞周期のＦＡＣＳ解析により、ａ１３１は、形質転換ＢＪ細胞に対してはアポトーシスによって細胞死（＜２Ｎ）を顕著に誘導する（図１Ｄ；図２Ｂ）が、正常ＢＪ細胞においては誘導しない（図１Ｃ）ことが示された。さらに、ａ１３１処理により、形質転換ＢＪ細胞でのみ異数性（＞４Ｎ）が有意に誘導された（図１Ｃ，パネルｄ’）。一方で、ａ１３１は正常ＢＪ細胞の細胞周期をＧ１／Ｓ期で停止させ、ＢｒｄＵ取込みはほとんど見られなかった（図１Ｃ，パネルｂ’）。このことは、細胞周期を促進させる遺伝子の遺伝子セットエンリッチメント解析（ＧＳＥＡ）でも確認された（図２Ｃ）。重要なことに、正常ＢＪ細胞におけるこのａ１３１による増殖停止は一過性であり、ａ１３１の除去後に回復した（図２Ｄ）。さらに、ＤＮＡ損傷性のＴｏｐｏ  ＩＩ阻害剤であるエトポシドとは異なり、ａ１３１による増殖停止は遺伝毒性ストレスと伴わずに起こっている（図２Ｅ）。ａ１３１のこのがん選択的致死性は、ヒトの正常細胞株およびがん細胞株のパネル［ＧＩ５０＝６．５対１．７μＭ（正常対がん）］を用いてさらに確認され（図１Ｅ；図３Ａおよび３Ｂ；表２）、ａ１３１ががん細胞死滅に対して明確な選択性を有する強力な抗増殖剤であることが示唆された。
【００９７】
【表２】
2020501544.tif 000004
【００９８】
一連のヒトＢＪ遺伝子改変細胞株（Voorhoeve, P. M. & Agami, R. Cancer Cell 4: 311-319 (2003)）を用いてａ１３１による腫瘍細胞選択性の分子基盤を明らかにする試みを行ったところ（図１Ｆ）、種々の組合せのｐ１６−ｐＲｂ、ｐ５３およびＰＰ２Ａの腫瘍抑制経路の阻害は、ａ１３１による細胞死に有意に寄与しないことがわかった。一方、４−ＯＨＴによるH-RasV12-ER単独の急性活性化は、正常ＢＪ細胞をａ１３１による細胞死に感作させるのに充分であり、この効果は、形質転換ＢＪ細胞ではさらに増強された（図１Ｆ）。以上をまとめると、これらのデータから、ａ１３１が、Ras活性化細胞またはRas形質転換細胞に対して強い選択的致死性を示すことが示唆される。
【００９９】
実施例３：正常細胞における可逆的な細胞周期停止の誘導
形質転換細胞におけるａ１３１による異数性（図１Ｃ，パネルｄ’）の誘導と一致して、タイムラプス解析により、ａ１３１処理によって形質転換ＢＪ細胞における分裂停止が即座に誘導されるとともに（図３Ｃ）、染色体のミスアラインメントが大量に生じ（図１Ｇ；図３Ｄ）、その後、異常凝縮（ｍｉｓａｇｇｒｅｇａｔｅ）して娘細胞に分配され、多くの場合、崩壊的多極分裂を伴い、細胞死に至ることが判明した（データ示さず）。一方、ａ１３１で処理した正常ＢＪ細胞ではかかる崩壊的細胞分裂が起こるのは稀であり（データ示さず）、分裂欠陥が形質転換細胞より有意に少ないことが示された（図３Ｃおよび３Ｅ）。高解像免疫蛍光顕微鏡検査を用いた詳細な解析により、ａ１３１は形質転換ＢＪ（図１Ｇおよび１Ｈ）ならびに他のがん細胞（図３Ｅ）において中心体のデクラスタリングおよび紡錘体の多極分裂を誘導することが示され、これは、ほとんどのがん細胞が、分裂前に二極様式でクラスター化する規定数以上の中心体を含んでいるためである８。一方、ａ１３１で処理した正常ＢＪ細胞の多くは、中期紡錘体の長さがわずかに短い（図３Ｇ）にもかかわらず、機能的な二極紡錘体が形成された（図１Ｈ；図３Ｆ）。以上をまとめると、これらのデータから、強力な抗分裂剤としてのａ１３１は、インビトロで即座のがん選択的な分裂期細胞死を誘導することによってがん細胞および形質転換細胞を優先的に死滅させるとともに、正常細胞を可逆的な様式で細胞周期のＧ１／Ｓ期で停止させることが示唆される。ａ１３１の広範な抗がん効果はこのような理由によるものと説明できる（図３Ａおよび３Ｂ）。
【０１００】
実施例４：がん選択的化合物のインビボ有効性
ａ１３１および水溶性を改善するために設計されたａ１３１の誘導体であるｂ５の抗腫瘍活性を、変異型K-RasG13Dを有するＨＣＴ−１５ヒト結腸腺癌細胞およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳房腫瘍細胞を用いて作成したマウス異種移植モデルにおいてさらに調べた。予想された通り、パクリタキセルはＨＣＴ−１５に対する有意な抗腫瘍活性を示さなかった（図１Ｉ）が、ａ１３１およびｂ５の経口注射および腹腔内注射ではともに、体重減少を伴わずに顕著な抗腫瘍有効性（図１Ｉ）およびＴＵＮＥＬ染色により測定されるがん細胞死（図１Ｊ）が確認された。インビトロ組織培養でも観察されたように、ａ１３１により、腫瘍切片において多極紡錘体の形成とともに染色体のミスアラインメントが大量に確認された（図１Ｋ）。さらに、腫瘍のスフェロイド培養または同所性移植エクスビボモデルでは、ａ１３１処理によってRas誘導性グリオーマ幹細胞（ＧＩＣ）の増殖が有意に抑制された（図４Ａおよび４Ｃ）。また、ａ１３１はエクスビボモデルにおいて腫瘍のみにアポトーシスを誘導したが、周辺の正常組織に対しては誘導しなかった（図４Ｂ）。以上をまとめると、ａ１３１は、インビトロ、エクスビボおよびインビボでがん選択的分裂期細胞死を誘導する強力で広範な抗がん有効性を有する唯一無二の化合物である。
【０１０１】
実施例５：化学療法用化合物および化学保護化合物の同定
ａ１３１の種々の誘導体を用いることにより、ａ１３１の特性は２種類の相違するファーマコフォアに薬理学的に分けられることがわかった（実験の詳細および結果の要約は図５Ａ−５Ｃおよび表３に示している）。ａ１３１の構造活性相関（ＳＡＲ）の解析により、このような化合物を４つのグループ：グループ１の化合物、これは正常ＢＪ細胞のＧ１／Ｓ期での停止と形質転換ＢＪ細胞における分裂停止／崩壊との両方を引き起こす二重抑制特性を有する（例えば、ａ１３１、ｂ５）；グループ２の化合物、これは正常ＢＪ細胞のＧ１／Ｓ期での停止のみを引き起こす（例えば、ａ１６６）；グループ３の化合物、これは形質転換ＢＪ細胞における分裂停止／崩壊を引き起こすが、正常ＢＪ細胞をＧ１／Ｓ期での停止を引き起こさない（例えば、ａ１５９）；およびグループ４の化合物、これは不活性であるか、または活性が弱い（例えば、ａ１３２）に分類した。重要なことに、グループ１の化合物のみが形質転換ＢＪ細胞を選択的に死滅させる能力を保持していた（図５Ｃ）。一方、グループ２およびグループ４の化合物は、正常細胞株または形質転換細胞株のいずれかを死滅させることができず、グループ３の化合物は正常細胞株と形質転換細胞株の両方を死滅させるが、その選択性は、グループ１の化合物より顕著に低かった（図５Ｃ）。注目すべきことに、ａ１３１様がん選択的致死性は、グループ２と３の化合物を併用することによって再現された（図５Ｄ）。さらに、パクリタキセル単独またはエトポシド単独で処理した場合は、形質転換ＢＪ細胞に対する選択性は極めて低かったが、グループ２のａ１６６で前処理すると、正常ＢＪ細胞が化学療法毒性から保護されることによってかかる選択性が顕著に増大した（図５Ｅおよび５Ｆ）。以上をまとめると、これらのデータから、がん選択的致死性を得るためにはグループ１の化合物（例えば、ａ１３１）の二重抑制特性が必須であることが示唆される。さらに、グループ２の化合物（例えば、ａ１６６）およびグループ３の化合物（例えば、ａ１５９）は、それぞれ化学保護剤および化学療法剤として分類することができる。
【０１０２】
【表３】
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【０１０３】
実施例６：増殖停止を誘導するための標的として同定されたPI5P4K
正常ＢＪ細胞に対してのみ細胞周期のＧ１／Ｓ期での停止を誘導するａ１３１の細胞内標的およびシグナル伝達経路を同定するため、プロテオームレベルでの標的同定を目的とした細胞サーマルシフトアッセイ（ＭＳ−ＣＥＴＳＡ）と質量分析の組合せ実施を検討した。標的同定の信頼度を高めるため、ａ１３１およびａ１６６の両方をＣＥＴＳＡ解析に供し、共通の標的タンパク質を見出した。正常ＢＪ細胞の溶解液中に含まれる＞８，０００種類のタンパク質を含むデータを取得し、最終解析では各化合物に対して＞４，０００種類のタンパク質を使用した。ユークリッド距離およびサーマルシフトサイズに基づいたランク付けを使用し、１６種類および１１種類のタンパク質を、それぞれａ１３１およびａ１６６の有意な潜在的ヒットとして選択した（図６Ａ−６Ｂ；表４）。ａ１３１ではフェロケラターゼおよびａ１６６ではコプロポルフィリノーゲンＩＩＩオキシダーゼ（ＣＰＯＸ）が顕著なヒットとして同定された。しかしながら、ヘム合成経路のこれらの２種類のタンパク質は、多くの薬物に対して非特異的に結合する物質として以前に同定されており（Savitski, M. M. et al., Science 346: 55 (2014); Klaeger, S. et al., ACS Chem. Biol. 11: 1245-1254 (2016)）、その阻害によってａ１３１およびａ１６６で観察された表現型がもたらされる可能性は低いことが示される。一方で、PI5P4K（ホスファチジルイノシトール５−リン酸４−キナーゼ）のメンバー（Bulley, S. J., Clarke, J. H., Droubi, A., Giudici, M.-L. & Irvine, R. Adv. Biol. Regul. 57: 193-202 (2015); Clarke, J. H. & Irvine, R. F. Adv. Biol. Regul. 52: 40-45 (2012)）が最も顕著な共通ヒットとして傑出しており、薬理学的標的の候補である可能性があった；ａ１３１では３つのファミリーメンバーのうちの２つ（PI5P4KαおよびPI5P4Kγ）ならびにａ１６６では３つのファミリーメンバーすべて（PI5P4Kα、PI5P4KβおよびPI5P4Kγ）がＣＥＴＳＡヒットとして同定された（図７Ａおよび７Ｂ；表４）。実際、ａ１３１は、インビトロでの精製PI5P4Kαのキナーゼ活性ならびに細胞内PI5P4Kの総キナーゼ活性を、それぞれ１．９μＭおよび０．６μＭのＩＣ５０で阻害した（図７Ｃおよび７Ｄ）。同様に、ａ１６６およびPI5P4Kα阻害を示すことが以前に報告されているＩ−ＯＭｅ−ＡＧ−５３８（Davis, M. I. et al., PloS one 8: e54127 (2013)）もまた、PI5P4Kα活性を、それぞれ１．８μＭおよび２．１μＭのＩＣ５０で阻害した（図７Ｃ）。異なる３組のｓｉＲＮＡを用いてすべてのPI5P4Kアイソフォームをノックダウンしたところ（図８Ｄ）、正常ＢＪ細胞でのみ増殖停止（図７Ｅ）が誘導され、ａ１３１処理およびａ１６６処理の表現型模写が生じた（図１Ｃ；図５Ａおよび５Ｂ）。さらに、ＧＳＥＡおよびKEGG経路解析により、正常ＢＪ細胞におけるPI5P4Kノックダウンでは、細胞周期を促進させる遺伝子セットがダウンレギュレートされ（図７ｆ）、ａ１３１およびａ１６６で処理した場合と同様に、共通の多数の細胞内経路が同等にアップレギュレートまたはダウンレギュレートされている（図８Ａ−８Ｃ）ことが示された。ａ１６６での処理（図５Ｄ−５Ｆ）と同様、PI5P4Kノックダウンでもまた、正常ＢＪ細胞でのみパクリタキセル処理およびエトポシド処理からの有意な化学保護効果が示された（図８Ｅおよび８Ｆ）。以上をまとめると、これらのデ���タから、PI5P4Kはａ１３１およびａ１６６の細胞内標的であることが示唆される。これは、本発明者らが知る限り、表現型スクリーニングからヒットの医薬標的を明らかにするためにＭＳ−ＣＥＴＳＡが使用された最初の試験である。
【０１０４】
【表４】
2020501544.tif 000006
ａ１３１データセットおよびａ１６６データセットからヒットとしてスコア化されたタンパク質の詳細を示す。ヒットのＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ、タンパク質名、ユークリッド距離（ＥＤ）スコアおよび平均ΔＴｍを示す。タンパク質のサーマルシフトのＥＤスコアを計算し、中央値＋２．７５＊ＭＡＤ（平均絶対偏差）でのカットオフを用いてヒットリストを作成した。サーマルシフトのΔＴｍ値を、対照試料と０．５倍変化した処理試料と間の平均偏差として計算し、中央値＋２．７５＊ＭＡＤの有意な正のΔＴｍ値を有するタンパク質を選択した。有意なＥＤスコアと有意なΔＴｍ値の両方を有するタンパク質を、それぞれａ１３１およびａ１６６に対する１６種類および１１種類のタンパク質に相当する最終ヒットリストとして選択した。次いでヒットリストを、ＥＤスコアおよびΔＴｍ値の降順にランク付けした。
【０１０５】
実施例７：PI3K相互作用タンパク質１の制御により作用を発揮する化学保護化合物
PI5P4Kのアイソフォームを１つだけ有するショウジョウバエのPI5P4K機能喪失変異型は、PI3K/Akt/mTOR経路が阻害されている（Gupta, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110: 5963-5968 (2013)）。重要なことに、ａ１３１処理または異なる３組のｓｉＲＮＡを用いたPI5P4Kノックダウンでもまた、一貫して、正常ＢＪ細胞でのみPI3K/Akt/mTOR経路の阻害が誘導されたが、形質転換細胞では誘導されなかった（図９Ａおよび９Ｂ）。同様に、４−ＯＨＴによるH-RasV12-ERの活性化によって、ａ１３１およびａ１６６での処理またはPI5P4Kノックダウンを施した正常ＢＪ細胞のPI3K/Akt/mTOR経路を再活性化させることが可能であり（図９Ｃ）、このことは、活性型Rasが、正常ＢＪ細胞におけるａ１３１、ａ１６６またはPI5P4Kノックダウンによる増殖停止を無効にすることと相関している（図９Ｄ）。以上をまとめると、これらのデータから、PI3K/Akt/mTORシグナル伝達経路のRas依存的な促進におけるPI5P4Kの役割が示唆される。
【０１０６】
Ras/Raf/MEK/ERK経路とPI3K/Akt/mTOR経路との間の相互作用を制御する分子成分については充分に理解されていない。ａ１３１およびａ１６６での処理でもPI5P4Kノックダウンでも、正常ＢＪ細胞においてRas/Raf/MEK/ERK経路は阻害されないことが、ＥＲＫリン酸化による測定で示された（図９Ａ−９Ｃ）。そこで、どのようにしてａ１３１がPI3K/Akt/mTOR経路をRas依存的に制御しているのかを調べるため、本発明者らは、ａ１３１で処理した際の正常ＢＪ細胞および形質転換ＢＪ細胞におけるPI3Kに関連する既知の制御因子およびエフェクターの遺伝子発現量の差を調べた。特筆すべきことに、これらの遺伝子の中で、PI3K相互作用タンパク質１遺伝子（PIK3IP1）はａ１３１で処理した正常ＢＪ細胞でのみ有意にアップレギュレートされた（図１０Ａ）。実際、ｑＲＴ−ＰＣＲおよびイムノブロット解析により、ｍＲＮＡ量とタンパク質量の両方においてPIK3IP1がアップレギュレートされていることが、ａ１３１処理、ａ１６６処理、PI5P4Kノックダウンのいずれかの正常ＢＪ細胞で確認された（図１０Ｂおよび１０Ｃ）。逆に、形質転換ＢＪ細胞におけるPIK3IP1のｍＲＮＡ発現は有意に低かっただけでなく、ａ１３１およびａ１６６で処理しても反応を示さなかった（図１０Ｂ）。さらに、４−ＯＨＴによるH-RasV12-ERの活性化により、ａ１３１で処理した正常ＢＪ細胞においてPIK3IP1のｍＲＮＡ量およびタンパク質量をダウンレギュレートし（図１０Ｃ）、かつＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ  ＩＩ）をPIK3IP1プロモーターから解離させることが可能であった（図１０Ｄ）。一方、ＭＥＫの薬理学的阻害により、H-RasV12-ERによるPIK3IP1抑制が減弱され（図１０Ｅ）、Ras/Raf/MEK/ERK経路とPI3K/Akt/mTOR経路との間の正のクロストークの分子基盤はPIK3IP1の負の転写調節を介することが示唆された。
【０１０７】
PIK3IP1はPI3Kヘテロ二量体のｐ１１０触媒サブユニットに結合してPI3Kの触媒活性を抑制し、これによりPI3K/Akt/mTOR経路が阻害され、PIK3IP1の調節不全は発癌の原因となる（Bitler, B. G. et al., Nat. Med. 21: 231-238 (2015); He, X. et al., Cancer Res. 68: 5591-5598 (2008); Zhu, Z. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 358: 66-72 (2007); Wong, C. C. et al., Nat. Genet. 46: 33-38 (2014)）。そこで、PIK3IP1のａ１３１によるアップレギュレーションが実際に、観察されたPI3K/Akt/mTOR経路の阻害および正常ＢＪ細胞におけるＧ１／Ｓ期移行の阻害に関与しているのかどうかを調べた。実際、正常ＢＪ細胞におけるPIK3IP1のノックダウンによってPI3K/Akt/mTOR経路の活性化が有意に回復し、ＢｒｄＵ陽性増殖細胞集団がレスキューされたが、いずれもａ１３１での処理によって抑制された（図１０Ｆ）。以上をまとめると、これらのデータから、Ras┤PIK3IP1┤PI3Kシグナル伝達ネットワークによるRas経路とPI3K経路との間の正のクロストークが確認された。
【０１０８】
ａ１３１およびａ１６６によるPI5P4K阻害により、PI3K/Akt/mTOR経路のサプレッサーであるPIK3IP1の転写のアップレギュレーションによって正常細胞において可逆的な増殖停止が引き起こされたという観察結果は治療上重要である（Bitler, B. G. et al., Nat. Med. 21: 231-238 (2015); He, X. et al., Cancer Res. 68: 5591-5598 (2008); Zhu, Z. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 358: 66-72 (2007); Wong, C. C. et al., Nat. Genet. 46: 33-38 (2014)）。
【０１０９】
実施例８：種々のヒトがん細胞にみられるが正常細胞にはみられないａ１３１の選択的死滅効果
PIK3IP1  ｍＲＮＡ量がRas変異型がん細胞およびRaf変異型がん細胞では正常細胞と比べてかなり低かっただけでなく（図１１Ａ）、このようながん細胞では、正常細胞とは異なり、PIK3IP1のａ１３１による誘導およびａ１６６による誘導も有意に抑えられていた（図１０Ｇ；図１１Ｂ）。同様に、患者試料に由来するOncomineデータセットの解析により、PIK3IP1発現が、Ras変異およびRasシグナル伝達経路の活性化がよくみられるヒト結腸直腸腺癌およびヒト肺腺癌では、対応する正常組織またはRas変異が稀である肺扁平上皮癌と比べて有意に低いことが示された（図１１Ｃ）。実際、ヒト結腸直腸腺癌およびヒト肺腺癌ではPIK3IP1発現とRas変異状態との間に負の相関が観察された（図１１Ｄ）。逆に、ＭＥＫおよびＥＲＫの薬理学的阻害により、多くのRas変異型がん細胞およびRaf変異型がん細胞においてPIK3IP1発現が有意に増大した（図１０Ｈ；図１１Ｅ）が、観察されたこのPIK3IP1の抑制解除は、ほとんどのRaf変異型がん細胞でより顕著に見られ（図１１Ｅ）、高ＭＡＰＫ活性がPIK3IP1の抑制に関与していることが示される。さらに、PIK3IP1のこの抑制解除は、ＨＣＴ１１６細胞、Ａ５４９細胞および形質転換ＢＪ細胞においては、同時に起こるPI3K/Akt/mTOR経路の阻害と相関していたが、PIK3IP1を抑制解除できない細胞では相関していなかった（図１０Ｈ）。逆に、PIK3IP1のノックダウンによってPI3K/Akt/mTOR経路の活性化が有意に回復し、ＭＥＫおよびＥＲＫの阻害によって誘導される細胞死が抑制される（図１０Ｉ）ことから、がん細胞の増殖および生存のためのRas┤PIK3IP1┤PI3Kシグナル伝達ネットワークによるRas経路とPI3K経路との間の正のクロストークがさらに示唆された。
【０１１０】
図１３は、ａ１３１ががん細胞に対して選択的であり、ａ１３１で処理したがん細胞はアポトーシスによる細胞死を受けるが他の形態の細胞死は受けないことを示すためのさらなる裏付けを示すものである。ｓｕｂＧ１集団およびアネキシンＶを発現する細胞の割合は、ａ１３１で処理したがん細胞では（２．５μＭおよび５μＭのいずれの用量でも）、ＤＭＳＯで処理したがん細胞と比べて有意に高い（ｐ＜０．０００１）。
【０１１１】
引用文献
本明細書で引用された過去に出版された一連の文献およびこれらに記載の考察は、当技術分野の技術水準や技術常識の一部を構成するものであると認識する必要は必ずしもない。
Agrawal N, Dasaradhi PVN, Mohmmed A, Malhotra P, Bhatnagar RK, Mukherjee SK. RNA Interference: Biology, Mechanism, and Applications. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67(4): 657-685 (2003).
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【図１Ａ−Ｅ】
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【図１Ｆ−Ｈ】
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【図１Ｉ−Ｋ】
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【図２Ａ−Ｂ】
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【図２Ｃ−Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３Ａ−Ｄ】
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【図３Ｅ−Ｇ】
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【図４Ａ−Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ−Ｆ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ−Ｆ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ−Ｆ】
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【図９Ａ−Ｄ】
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【図１０Ａ−Ｃ】
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【図１０Ｄ−Ｈ】
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【図１０Ｉ−Ｋ】
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【図１１Ａ−Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ−Ｅ】
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【図１２Ａ−Ｄ】
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【図１３Ａ−Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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