(57)【要約】変異型３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼをコードする遺伝子が宿主細胞に導入される。所定の変異型は、野生型（変異していない）酵素よりも細胞によるより短い鎖の脂肪酸及び誘導体の生成を促進する。他の場合では、鎖長はあまり影響を受けないが、生産性が促進される。特定の場合では、より短い鎖長及びより高い生産性へのシフトが見られる。変異型３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼを生成する細胞は、Ｃ６−Ｃ１０脂肪酸及び誘導体を生成するのに特に好適である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１１９を有するか、または配列番号１１９と少なくとも８０％同一であるケトアシル−ＣｏＡシンターゼであって、配列番号１１９のアミノ酸残基１８４に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、イソロイシン、ロイシン、メチオニンまたはバリンである、前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【請求項２】
以下の特徴ｉ）〜ｘｌｉｉｉ）：
ｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基１８に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、アラニンであり；
ｉｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基２２に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、メチオニンであり；
ｉｉｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基３０に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、アラニンであり；
ｉｖ）配列番号１１９のアミノ酸残基３８に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、バリンであり；
ｖ）配列番号１１９のアミノ酸残基３９に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、バリンであり；
ｖｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基５１に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、アラニン、システイン、アスパラギン酸、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファンまたはチロシンであり；
ｖｉｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基５４に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、バリンであり；
ｖｉｉｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基６９に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、バリンであり；
ｉｘ）配列番号１１９のアミノ酸残基８３に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、アスパラギンであり；
ｘ）配列番号１１９のアミノ酸残基９４に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、トレオニン、ロイシン、グルタミン酸、またはアラニンであり；
ｘｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基１１１に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、システインであり；
ｘｉｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基１１６に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、グリシンであり；
ｘｉｉｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基１２７に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、トレオニンであり；
ｘｉｖ）配列番号１１９のアミノ酸残基１３０に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、グリシンであり；
ｘｖ）配列番号１１９のアミノ酸残基１５２に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、システイン、ロイシン、メチオニンまたはトレオニンであり；
ｘｖｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基１５４に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、グリシンであり；
ｘｖｉｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基１７８に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、ロイシンまたはトレオニンであり；
ｘｖｉｉｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基１９０に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、フェニルアラニンまたはチロシンであり；
ｘｉｘ）配列番号１１９のアミノ酸残基２１０に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、バリンであり；
ｘｘ）配列番号１１９のアミノ酸残基２２３に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、ヒスチジンであり；
ｘｘｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基２３１に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、イソロイシンであり；
ｘｘｉｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基２３２に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、バリンであり；
ｘｘｉｉｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基２３６に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、ロイシンまたはメチオニンであり；
ｘｘｉｖ）配列番号１１９のアミノ酸残基２４１に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、プロリンであり；
ｘｘｖ）配列番号１１９のアミノ酸残基２６８に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、アラニンであり；
ｘｘｖｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基２７１に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、イソロイシンであり；
ｘｘｖｉｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基２７４に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、グルタミン酸であり；
ｘｘｖｉｉｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基２７８に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、アルギニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミンであり；
ｘｘｉｘ）配列番号１１９のアミノ酸残基２８０に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、イソロイシンであり；
ｘｘｘ）配列番号１１９のアミノ酸残基２８２に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、グリシンであり；
ｘｘｘｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基２９６に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、アラニンであり；
ｘｘｘｉｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基３０２に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、トレオニンであり；
ｘｘｘｉｉｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基３１２に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、アスパラギン酸であり；
ｘｘｘｉｖ）配列番号１１９のアミノ酸残基３１３に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、グルタミン酸またはメチオニンであり；
ｘｘｘｖ）配列番号１１９のアミノ酸残基３１５に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、リシンであり；
ｘｘｘｖｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基３１７に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、アラニンであり；
ｘｘｘｖｉｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基３２２に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、グリシンであり；
ｘｘｘｖｉｉｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基３２８に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、グリシンであり；
ｘｘｘｉｘ）配列番号１１９のアミノ酸残基３２９に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、グリシンであり；
ｘｌ）配列番号１１９のアミノ酸残基３４４に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアスパラギンであり；
ｘｌｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基３５６に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、グリシンまたはセリンであり；
ｘｌｉｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基３６８に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、アルギニンであり；
ｘｌｉｉｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基３７０に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、トレオニンである、
のうちの少なくとも１つを含む、請求項１に記載のケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【請求項３】
配列番号１１９のアミノ酸残基１８４に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼの前記アミノ酸残基は、イソロイシンである、請求項１または２に記載のケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【請求項４】
以下の特徴：
配列番号１１９のアミノ酸残基２６８に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼの前記アミノ酸残基は、アラニンであり；
配列番号１１９のアミノ酸残基２９６に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼの前記アミノ酸残基は、アラニンであり；
配列番号１１９のアミノ酸残基３２８に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼの前記アミノ酸残基は、グリシンである、
のうちの少なくとも１つを更に含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【請求項５】
配列番号１１９のアミノ酸残基３１７に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼの前記アミノ酸残基は、アラニンである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【請求項６】
配列番号１１９のアミノ酸残基３０に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼの前記アミノ酸残基は、アラニンである、請求項２〜５のいずれか１項に記載のケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【請求項７】
配列番号１１９のアミノ酸残基３６８に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼの前記アミノ酸残基は、アルギニンである、請求項２〜６のいずれか１項に記載のケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【請求項８】
配列番号１１９のアミノ酸残基５１に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼの前記アミノ酸残基は、アラニン、システイン、アスパラギン酸、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファンまたはチロシンである、先行請求項のいずれか１項に記載のケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【請求項９】
配列番号１１９のアミノ酸残基５１に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼの前記アミノ酸残基は、アラニンである、先行請求項のいずれか１項に記載のケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【請求項１０】
前記アミノ酸配列は、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号９２、配列番号９３、配列番号１２１〜１５７のいずれか及び配列番号１７２〜２０４のいずれか１つからなる群から選択される、先行請求項のいずれか１項に記載の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【請求項１１】
配列番号１１０を有するか、または配列番号１１０と少なくとも８０％同一であるケトアシル−ＣｏＡシンターゼであって、特徴ｉ）〜ｘｉｉｉ）：
ｉ）配列番号１１０のアミノ酸残基３０に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、アラニンであり；
ｉｉ）配列番号１１０のアミノ酸残基３９に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、バリンであり；
ｉｉｉ）配列番号１１０のアミノ酸残基６９に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、バリンであり；
ｉｖ）配列番号１１０のアミノ酸残基１１１に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、システインであり；
ｖ）配列番号１１０のアミノ酸残基１５２に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、システイン、ロイシン、メチオニンまたはトレオニンであり；
ｖｉ）配列番号１１０のアミノ酸残基１７８に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、ロイシンまたはトレオニンであり；
ｖｉｉ）配列番号１１０のアミノ酸残基１８４に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、イソロイシン、ロイシン、メチオニンまたはバリンであり；
ｖｉｉｉ）配列番号１１０のアミノ酸残基２６８に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、アラニンであり；
ｉｘ）配列番号１１０のアミノ酸残基２７１に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、イソロイシンであり；
ｘ）配列番号１１０のアミノ酸残基２７８に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、アルギニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、またはグルタミンであり；
ｘｉ）配列番号１１０のアミノ酸残基２９６に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、アラニンであり；
ｘｉｉ）配列番号１１０のアミノ酸残基３１７に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、アラニンであり；
ｘｉｉｉ）配列番号１１０のアミノ酸残基３２８に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、グリシンである、
のうちの少なくとも１つを含む、前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【請求項１２】
配列番号１２０のアミノ酸残基１８４に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼの前記アミノ酸残基は、イソロイシン、ロイシン、メチオニンまたはバリンである、請求項１１のケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【請求項１３】
配列番号１２０のアミノ酸残基１８４に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼの前記アミノ酸残基は、イソロイシンである、請求項１１のケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【請求項１４】
配列番号１２０のアミノ酸残基２６８に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼの前記アミノ酸残基は、アラニンであり；
配列番号１２０のアミノ酸残基２９６に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼの前記アミノ酸残基は、アラニンであり；
配列番号１２０のアミノ酸残基３２８に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼの前記アミノ酸残基は、グリシンである、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載のケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【請求項１５】
配列番号１２０のアミノ酸残基３１７に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼの前記アミノ酸残基は、アラニンである、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載のケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【請求項１６】
配列番号１２０のアミノ酸残基３０に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼの前記アミノ酸残基は、アラニンである、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載のケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【請求項１７】
配列番号１２０のアミノ酸残基３６８に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼの前記アミノ酸残基は、アルギニンである、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載のケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【請求項１８】
配列番号１１０を有するか、または配列番号１１０と少なくとも８０％同一であるケトアシル−ＣｏＡシンターゼであって、各場合において、特徴ｉ）〜ｘｉｉｉ）：
ｉ）配列番号１１０のアミノ酸残基３０に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、アラニンであり；
ｉｉ）配列番号１１０のアミノ酸残基３９に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、バリンであり；
ｉｉｉ）配列番号１１０のアミノ酸残基６９に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、バリンであり；
ｉｖ）配列番号１１０のアミノ酸残基１１１に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、システインであり；
ｖ）配列番号１１０のアミノ酸残基１５２に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、システイン、ロイシン、メチオニンまたはトレオニンであり；
ｖｉ）配列番号１１０のアミノ酸残基１７８に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、ロイシンであり；
ｖｉｉ）配列番号１１０のアミノ酸残基１８４に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、イソロイシン、ロイシン、メチオニンまたはバリンであり；
ｖｉｉｉ）配列番号１１０のアミノ酸残基２６８に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、アラニンであり；
ｉｘ）配列番号１１０のアミノ酸残基２７１に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、イソロイシンであり；
ｘ）配列番号１１０のアミノ酸残基２７８に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、アルギニンであり；
ｘｉ）配列番号１１０のアミノ酸残基２９６に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、アラニンであり；
ｘｉｉ）配列番号１１０のアミノ酸残基３１７に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、アラニンであり；
ｘｉｉｉ）配列番号１１０のアミノ酸残基３２８に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、グリシンである、
のうちの少なくとも１つを含む、前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【請求項１９】
配列番号１１０のアミノ酸残基１８４に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼの前記アミノ酸残基は、イソロイシン、ロイシン、メチオニンまたはバリンである、請求項１８のケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【請求項２０】
配列番号１１０のアミノ酸残基１８４に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼの前記アミノ酸残基は、イソロイシンである、請求項１８のケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【請求項２１】
配列番号１１０のアミノ酸残基２６８に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼの前記アミノ酸残基は、アラニンであり；
配列番号１１０のアミノ酸残基２９６に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼの前記アミノ酸残基は、アラニンであり；
配列番号１１０のアミノ酸残基３２８に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼの前記アミノ酸残基は、グリシンである、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載のケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【請求項２２】
配列番号１１０のアミノ酸残基３１７に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼの前記アミノ酸残基は、アラニンである、請求項１８〜２１のいずれか１項に記載のケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【請求項２３】
配列番号１１０のアミノ酸残基３０に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼの前記アミノ酸残基は、アラニンである、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載のケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【請求項２４】
配列番号１１０のアミノ酸残基３６８に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼの前記アミノ酸残基は、アルギニンである、請求項１９〜２３のいずれか１項に記載のケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【請求項２５】
配列番号１１９を有するか、または配列番号１１９と少なくとも８０％同一であるケトアシル−ＣｏＡシンターゼであって、以下の特徴ｉ）〜ｘｘｘｖｉ）：
ｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基１８に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、アラニンであり；
ｉｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基２２に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、メチオニンであり；
ｉｉｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基３０に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、アラニンであり；
ｉｖ）配列番号１１９のアミノ酸残基３８に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、バリンであり；
ｖ）配列番号１１９のアミノ酸残基３９に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、バリンであり；
ｖｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基５１に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、アラニン、システイン、アスパラギン酸、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファンまたはチロシンであり；
ｖｉｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基６９に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、バリンであり；
ｖｉｉｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基９４に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、トレオニン、ロイシン、グルタミン酸、またはアラニンであり；
ｉｘ）配列番号１１９のアミノ酸残基１１１に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、システインであり；
ｘ）配列番号１１９のアミノ酸残基１１６に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、グリシンであり；
ｘｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基１５２に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、システイン、ロイシン、メチオニンまたはトレオニンであり；
ｘｉｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基１５４に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、グリシンであり；
ｘｉｉｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基１７８に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、ロイシンまたはトレオニンであり；
ｘｉｖ）配列番号１１９のアミノ酸残基１８４に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、イソロイシン、ロイシン、メチオニンまたはバリンであり；
ｘｖ）配列番号１１９のアミノ酸残基２１０に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、バリンであり；
ｘｖｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基２３１に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、イソロイシンであり；
ｘｖｉｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基２３２に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、バリンであり；
ｘｖｉｉｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基２３６に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、ロイシンまたはメチオニンであり；
ｘｉｘ）配列番号１１９のアミノ酸残基２４１に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、プロリンであり；
ｘｘ）配列番号１１９のアミノ酸残基２６８に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、アラニンであり；
ｘｘｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基２７１に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、イソロイシンであり；
ｘｘｉｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基２７４に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、グルタミン酸であり；
ｘｘｉｉｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基２７８に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、アルギニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミンであり；
ｘｘｉｖ）配列番号１１９のアミノ酸残基２８２に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、グリシンであり；
ｘｘｖ）配列番号１１９のアミノ酸残基２９６に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、アラニンであり；
ｘｘｖｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基３０２に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、トレオニンであり；
ｘｘｖｉｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基３１２に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、アスパラギン酸であり；
ｘｘｖｉｉｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基３１３に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、グルタミン酸またはメチオニンであり；
ｘｘｉｘ）配列番号１１９のアミノ酸残基３１５に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、リシンであり；
ｘｘｘ）配列番号１１９のアミノ酸残基３１７に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、アラニンであり；
ｘｘｘｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基３２２に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、グリシンであり；
ｘｘｘｉｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基３２８に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、グリシンであり；
ｘｘｘｉｉｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基３２９に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、グリシンであり；
ｘｘｘｉｖ）配列番号１１９のアミノ酸残基３４４に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、アスパラギン酸またはアスパラギンであり；
ｘｘｘｖ）配列番号１１９のアミノ酸残基３５６に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、グリシンまたはセリンであり；
ｘｘｘｖｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基３７０に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、トレオニンである、
のうちの少なくとも１つを含む、前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【請求項２６】
請求項１〜２５のいずれか１項に記載のケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【請求項２７】
請求項１〜２６のいずれか１項に記載の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼをコードする３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ遺伝子。
【請求項２８】
請求項２７に記載の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ遺伝子を含む遺伝子組み換え細胞。
【請求項２９】
請求項１〜２６のいずれか１項に記載の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼをコードする異種核酸配列を含む遺伝子組み換え細胞。
【請求項３０】
請求項１〜２６のいずれか１項に記載の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼを生成する細胞。
【請求項３１】
直鎖アルキル基を有する１つ以上の化合物を製造するためのプロセスであって、請求項２８〜３０のいずれか１項に記載の遺伝子組み換え細胞を発酵培地中で培養すること、及び前記発酵培地から直鎖アルキル基を有する前記化合物（複数可）を回収することを含む、前記プロセス。
【請求項３２】
直鎖アルキル基を有する１つ以上の化合物を生成するための請求項２８〜３０のいずれか１項に記載の遺伝子組み換え細胞の使用であって、前記１つ以上の化合物の少なくとも６０重量％は、前記直鎖アルキル基中に６〜１０個の炭素原子を有する、前記使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この研究は、契約番号ＤＥ−ＥＥ００７０００７下で米国エネルギー省によって支援された。米国政府は、本発明に所定の権利を有する。
【０００２】
本発明は、Ｃ６−Ｃ１０脂肪酸ならびにＣ６−Ｃ１０脂肪酸エステル及びＣ６−Ｃ１０脂肪酸アルコールなどの脂肪酸誘導体を生成する遺伝子組換え細胞に関する。
【０００３】
脂肪酸及び脂肪酸誘導体は、ラッカー、塗料、ワニス及び他の組成物用の溶媒として；有機樹脂用の可塑剤として、香料及び香味料として、ジェットエンジン及び他の内燃機関用の燃料として、ならびに様々な下流の製品用の原料として有用である。したがって、脂肪酸及び誘導体は、現在、炭素源として再生不可能な化石燃料を使用して、またはヤシもしくはココナッツなどの植物に由来する油から工業的に生成されている。特定の鎖長に対する選択性は、これらのプロセスにおける重要な欠点である−生成物は、様々な炭素原子数を有する化合物の混合物となる傾向がある。化合物を別々の鎖長に分離することは困難であり、しばしば、供給原料の多くは、必要な炭素原子数を有しない低価値の生成物に転化される。
【０００４】
生体細胞は自然に脂肪酸誘導体を生成する。例えば、ほとんど全ての生細胞は、脂肪酸のトリグリセリドならびに他の脂肪酸エステルを生成する。トリグリセリド及び他のエステルは、代謝、細胞構造、及び細胞の他の生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たし、エネルギー貯蔵などの他の有用な機能を果たすことができる。生物学的プロセスは、工業的に脂肪酸誘導体を生成する方法を潜在的に提供する。他の潜在的な利点の中でも、生物学的に生成される脂肪酸及び脂肪酸誘導体の生成は、いくつかの場合、化石燃料ではなく、砂糖などの毎年再生可能な炭素源に依存することができる。
【０００５】
生体系で生成される脂肪酸群は、１２個以上の炭素原子の鎖長を有する傾向がある。それ故、天然に存在する細胞は、Ｃ１２以上の脂肪酸及び誘導体の良好な供給源である。例えば、これらの細胞によって天然に生成されるトリグリセリドは、加水分解されてＣ１２以上の脂肪酸を生成し得、これは今度はエステルまたはアルコールなどの他の誘導体に転化され得る。一方、Ｃ６−Ｃ１０鎖長の脂肪酸を大量に生成する細胞は天然にはほとんどない。
【０００６】
より短い鎖の脂肪酸は、生物学的に生成された油脂（及び／またはそれらの構成脂肪酸）から生成され得るが、それを行うには、より短い鎖長への転化を達成するための必要な処理機器のための更なる資本コスト及び運転コストが必要となる。また、原料のコストは、作物生産に対する気象の影響により、年毎にまたは地理的場所毎にかなり変動し得る。
【０００７】
生体細胞は、アセチル−ＣｏＡ及びマロニル−ＡＣＰから始まる天然代謝経路を介して脂肪酸誘導体を生成する。アセチル−ＣｏＡはマロニル−ＡＣＰと縮合して二酸化炭素及びＣｏＡを失い、３−ケトブチリル−ＡＣＰを生成する。その後の酵素反応は、３−ケトブチリル−ＡＣＰを連続的に３−ヒドロキシブチリル−ＡＣＰに、次いでトランス−２−ブテノイル−ＡＣＰに（水を失う）、最後にブチリル−ＡＣＰに転化する。アセチル−ＣｏＡの代わりにブチリル−ＡＣＰがこの反応サイクルに再び入ってヘキサノイル−ＡＣＰを生成し得る。このサイクルはそれ自体を繰り返し、いくつかの他の細胞プロセスによって終結されるまで、各反復において２個の炭素原子を一度に付加することによってより長い炭素原子鎖を生成する。しかしながら、この天然のＡＣＰ依存性経路は、Ｃ６−Ｃ１０鎖長の停止速度が低く、Ｃ６−Ｃ１０脂肪酸及び脂肪酸誘導体の低い生成をもたらす。
【０００８】
Ｏｋａｍｕｒａらは、ＰＮＡＳ  ｖｏｌ．１０７，ｎｏ．２５，ｐｐ．１１２６５−１１２７０（２０１０）において、土壌から単離したＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ菌株のｎｐｈＴ７遺伝子によって生成される酵素がアセチル−ＣｏＡとマロニル−ＣｏＡの単縮合を触媒してアセトアセチル−ＣｏＡを生成することを報告した。
【０００９】
ＵＳ２０１４／００５１１３６に更に記載されているように、Ｃ４脂肪酸誘導体は、ｎｐｈＴ７遺伝子及び更に３−ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラーゼ及びトランス−２−エノール−ＣｏＡレダクターゼをコードする非天然遺伝子を含むように組み換えられた細胞によって、天然ＡＣＰ依存性経路の代わりにＣｏＡ依存性経路を介して生成され得る。しかしながら、ｎｐｈＴ７遺伝子は、Ｃ４脂肪酸及び誘導体を生成するためにアセチル−ＣｏＡとマロニル−ＣｏＡの反応に非常に選択的である。天然のＡＣＰ依存性経路とは異なり、ｎｐｈＴ７遺伝子に基づくＣｏＡ依存性経路は、Ｃ６以上の鎖長を有する脂肪酸誘導体をほとんど生成しない。それ故、ＵＳ２０１４／００５１１３６に示されているように、この手法で組み換えられた細胞は、少ない割合のＣ６以上の脂肪酸誘導体しか生成しない。
【００１０】
ＷＯ２０１５／１０１０３は、長鎖アシル−ＣｏＡ化合物とマロニル−ＣｏＡとの縮合をより効率的に触媒することを可能にするＮｐｈＴ７酵素に対する組み換えを記載している。所定の菌株は、野生型ｎｐｈＴ７遺伝子及びその遺伝子の変種の両方を含むように組み換えられた。これらの細胞は、より多い相対量のより長い脂肪酸を生成するが、選択性は低い。Ｃ６−Ｃ１０脂肪酸誘導体は特に少量しか作られない。
【００１１】
そのため、良好な収率でかつＣ６−Ｃ１０脂肪酸または誘導体に対する良好な選択性で脂肪酸を生成するプロセスに対する要望が残っている。
【００１２】
出願人は、細胞内で所定の変異型３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ酵素を生成する変異型３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ遺伝子で細胞を組み換えすることによってＣ６−Ｃ１０脂肪酸または誘導体が生成され得ることを発見した。
【００１３】
サブ配列の配列番号８７、配列番号１０５もしくは配列番号１０６、またはこれらのいずれかと密接に相同するサブ配列のうちの少なくとも１つを含む天然に存在する３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ酵素は、細胞内に異種発現した場合、主にＣ１０以上の脂肪酸または誘導体を、しばしば相当な割合のＣ１２以上の化合物を伴って生成する傾向がある。出願人は、これらのサブ配列内に特定の変異を作ることによって、脂肪酸または誘導体の鎖長が下方にシフトし、Ｃ６−Ｃ１０鎖長が優勢になり、Ｃ１２以上の化合物の生成が無視できるほどのものになることを見出した。特定の場合、Ｃ６及び／またはＣ８鎖長に対して高い選択性が見られる。
【００１４】
そのため、本発明は、一態様では、ａ）配列番号１と少なくとも８０％同一のサブ配列（但し、アミノ酸残基８はロイシン、バリン、イソロイシンまたはメチオニンであり、アミノ酸残基２はロイシンまたはメチオニンである）または配列番号１６０と少なくとも８０％同一のサブ配列（但し、アミノ酸残基８はシステイン、ロイシン、バリン、イソロイシンまたはメチオニンであり、アミノ酸残基２はロイシン、トレオニンまたはメチオニンである）；ｂ）配列番号２と少なくとも８０％同一のサブ配列（但し、アミノ酸残基６はイソロイシンまたはメチオニンである）及びｃ）配列番号３と少なくとも８０％同一のサブ配列（但し、アミノ酸残基６はイソロイシン、メチオニン、トレオニン、システイン、バリン、グルタミン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、アスパラギンまたはチロシンである）のうちの少なくとも１つを含むことを特徴とするアミノ酸配列を有する３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼである。本発明は、更なる態様では、そのような３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼをコードする異種核酸配列を含む遺伝子組み換え細胞である。
【００１５】
出願人は、所定の異種発現する３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼにおいて特定の変異を作ることが、Ｃ６−Ｃ１０鎖長の脂肪酸（及び脂肪酸誘導体）の生成を増加（例えば、力価の上昇）させることができることを更に発見した。それ故、他の態様では、本発明は、配列番号５０、配列番号５６、配列番号６０、配列番号６５、配列番号６９及び配列番号１７０のうちの１つ以上を含むことを特徴とするアミノ酸配列を有する３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ、及びそのような３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼをコードする異種核酸配列を含む遺伝子組み換え細胞である。
【００１６】
本発明は、特定の態様では、配列番号１１９を有する変異型３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ、及びそのような変異型３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼをコードする異種核酸配列を含む遺伝子組み換え細胞である。これらの変異型３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、直鎖アルキル基を有する化合物の生成及びそのような化合物におけるＣ６−Ｃ１０鎖長に対する特異性を改善することが見出された。特定の実施形態では、変異型３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号９２、配列番号９３、配列番号１２１〜１５７のいずれか１つまたは配列番号１７２〜２０４のいずれか１つのいずれかを有し得る。
【００１７】
本発明は、他の態様では、直鎖アルキル基を有する化合物を製造するために前述の態様のいずれかの微生物を使用する方法を含む。特定の態様では、本発明は、直鎖アルキル基を有する１つ以上の化合物を製造するための方法であって、本発明の遺伝子組み換え細胞を発酵培地中で培養すること、及び発酵培地から直鎖アルキル基を有する化合物（複数可）を回収することを含む、方法である。
【００１８】
以下の表１は、本明細書で参照される３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼの配列及びサブ配列の概要を含む。表１では、「Ａｓｃｈ」はＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｃｈｉｎｄｌｅｒｉ  ＣＩＰ  １０７２８７を指し；「Ａｓｃｈ−２」はＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｃｈｉｎｄｌｅｒｉ  ＮＩＰＨ  ９００を指し；「Ａｊｏｈ−２」はＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｊｏｈｎｓｉｉ  ＳＨ０４６を指し；「Ａｌｗｏ」はＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｌｗｏｆｆｉｉ  ＳＨ１４５を指し；「ＡＮＩＰＨ７１」はＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ  ＮＩＰＨ  ７１３を指し；「Ａｓｃｈ相同体」はＡｓｃｈ、Ａｓｃｈ−２、Ａｊｏｈ−２、Ａｌｗｏ及びＡＮＩＰＨ７１を指し；「Ｐｓｔｕ」はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｕｔｚｅｒｉ  ＡＴＣＣ  １７５８８を指し、「Ａａｇｒ」はＡｌｉｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ａｇｒｉ  ＢＬ０６を指す。
【００１９】
【表１−１】
2020506702.tif 000002
【００２０】
【表１−２】
2020506702.tif 000003
【００２１】
【表１−３】
2020506702.tif 000004
【００２２】
本明細書に記載の全てのアミノ酸配列におけるアミノ酸残基は、Ｎ末端からＣ末端方向で順序付けされている。「上流」はＮ末端に向かう方向を意味し、「下流」はＣ末端方向に向かうことを意味する。アミノ酸配列の「開始」は、Ｎ末端方向の最初のアミノ酸残基である。本明細書に記載のいずれかの配列またはサブ配列についての最初のアミノ酸残基（アミノ酸残基１）は、そのＮ末端におけるアミノ酸残基である。
【００２３】
「サブ配列」は、より大きなアミノ酸配列内に含有されるアミノ酸残基の配列である。
【００２４】
「同一性」は、本明細書では、２つの（ヌクレオチドまたはアミノ酸）配列がアライメント中の同じ位置に同じ残基を有する程度を示すために使用される。同一性は、本明細書では、本段落で別段示されていない限り、デフォルトパラメータを使用して、ＢＬＡＳＴ（国立生物情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）の基礎的局所整列探索ツール（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ））バージョン２．２．３１ソフトウェアを使用して決定される％の同一性として表される。アミノ酸配列間の同一性は、次のパラメータでタンパク質ＢＬＡＳＴを使用して決定される：最大標的配列：１００；短いクエリー：短いインプット配列のための自動調節パラメータ；予期閾値１０；ワードサイズ：６；クエリー範囲内の最大マッチ：０；マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ６２；Ｇａｐコスト：（存在：１１、伸長：１）；組成調節：条件的組成スコアマトリックス調節；フィルター；未選択；マスク：未選択核酸配列間の核酸％配列同一性は、以下のデフォルトパラメータで標準ヌクレオチドＢＬＡＳＴを使用して決定される：最大標的配列：１００；短いクエリー：短いインプット配列のための自動調節パラメータ；予期閾値１０；ワードサイズ：２８；クエリー範囲内の最大マッチ：０；マッチ／ミスマッチスコア：１，−２；Ｇａｐコスト：線状；フィルター：低複雑性領域；マスク：参照テーブルのみのためのマスク。この手法で決定された参照配列に対するＸＸ％（例えば、８０％）の％同一性スコアを有する配列は、本発明の目的のためには、参照配列とＸＸ％同一であるか、またはＸＸ％の配列同一性を同等に有すると考えられる。
【００２５】
本発明の目的のため、調査中の配列またはサブ配列のアミノ酸残基は、次の場合には、参照配列またはサブ配列のアミノ酸残基に「整列する」：
ｉ）全体の配列の場合、配列はＢＬＡＳＴバージョン２．２．３１ソフトウェアを使用して上述の手法で整列され、調査中の配列のアミノ酸残基は、参照配列のアミノ酸残基と同じアラインメント中の位置を占める；
ｉｉ）サブ配列の場合、調査中のサブ配列を含有する配列は参照配列と整列され、調査中のサブ配列のアミノ酸残基は参照サブ配列のアミノ酸残基と同じアラインメント中の位置を占める。
【００２６】
例えば、野生型Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｃｈｉｎｄｌｅｒｉ  ＣＩＰ  １０７２８７（配列番号８）の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ酵素は、以下の９つのアミノ酸残基サブ配列を含む。
【００２７】
【表２】
2020506702.tif 000005
【００２８】
野生型Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ  ＮＩＰＨ  ７１３の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ酵素（配列番号８９）は、記載したようにＢＬＡＳＴソフトウェアを使用して配列番号８と整列された場合、次のアミノ酸残基は整列中の同じ位置を占める。
【００２９】
【表３】
2020506702.tif 000006
【００３０】
Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．ＮＩＰＨサブ配列のロイシン（Ｌ）は、Ａ．ｓｃｈｉｎｄｌｅｒｉサブ配列のアミノ酸残基位置１でロイシンに整列し、また、Ａ．ｓｃｈｌｉｎｄｌｅｒｉ３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ配列の位置２３９でロイシンに整列する。Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．ＮＩＰＨサブ配列の欠失アミノ酸残基は、Ａ．ｓｃｈｉｎｄｌｅｒｉサブ配列のアミノ酸残基位置６でバリン（Ｖ）に整列し、また、Ａ．ｓｃｈｌｉｎｄｌｅｒｉ３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ配列のアミン位置２４４でバリンに整列する。Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．ＮＩＰＨサブ配列の２番目のアスパラギン（Ｎ）残基は、Ａ．ｓｃｈｉｎｄｌｅｒｉサブ配列の位置７でアスパラギン酸残基に整列し、また、Ａ．ｓｃｈｌｉｎｄｌｅｒｉ３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ配列の位置２４５でアスパラギン酸残基に整列する。
【００３１】
本出願の目的のため、遺伝子、プロモーター及びターミネーターなどの遺伝物質は、それが（ｉ）宿主細胞に対して非天然である場合、及び／または（ｉｉ）細胞に対して天然であるが、その遺伝物質が野生型宿主細胞中に存在する場所とは異なる場所に存在している場合、及び／または（ｉｉｉ）非天然プロモーター及び／または非天然ターミネーターの調節制御下にある場合、「異種」である。天然の遺伝物質の余分なコピーは、たとえそのような余分なコピーが、その遺伝物質が野生型宿主菌株中に存在するのと同じ遺伝子座に存在するとしても、本発明の目的のためには「異種」であるとみなされる。
【００３２】
酵素（３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼなど）は、それが野生型宿主細胞によって生成されない場合、「異種」である。
【００３３】
「３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ」は、アシル−ＣｏＡとマロニル−ＣｏＡとの縮合反応を触媒して３−ケトアシル−ＣｏＡを形成する酵素である。この反応を触媒する酵素の能力は、酵素の存在下で、５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）試薬、ドナー基質としてのマロニル−ＣｏＡ、及びプライマー基質としてのＣ４−Ｃ８アシル−ＣｏＡを使用して遊離ＣｏＡ−ＳＨの放出を測定することによって評価され得る。これらのプライマー基質のいずれかからの対応する３−ケトアシル−ＣｏＡの形成は、酵素が３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼであることを示す。
【００３４】
この反応を触媒する酵素の能力はまた、５ｍＭのＭｇ＋＋塩の存在下でプライマー基質としてのブチリル−ＣｏＡ及びドナー基質としてのマロニル−ＣｏＡを使用して、３−ケトヘキサノイル−ＣｏＡ生成物とのＭｇ＋＋−錯体の形成の増加の関数として３０３ｎｍでの吸光度の増加を測定することによって評価され得る。３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、ブチリル−ＣｏＡプライマーから３−ケトヘキサノイル−ＣｏＡ、ハキサノイル−ＣｏＡプライマーから３−ケトオクタノイル−ＣｏＡ、及びオクタノイル−ＣｏＡプライマーから３−ケトデカノイル−ＣｏＡを生成する。
【００３５】
ＥＣ番号は、ｔｈｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＮＣ−ＩＵＢＭＢ）によって設定される（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  １９９２［Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＩＳＢＮ  ０−１２−２２７１６４−５（ｈａｒｄｂａｃｋ），０−１２−２２７１６５−３（ｐａｐｅｒｂａｃｋ）］Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １  （１９９３），Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ２  （１９９４），Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ３  （１９９５），Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ４  （１９９７）及びＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ５付属（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９４，２２３，１−５；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９５，２３２，１−６；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９６，２３７，１−５；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９７，２５０；１−６，及びＥｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９９，２６４，６１０−６５０）。本明細書で参照されるＥＣ番号は、東京大学が一部スポンサーとなっている、京都遺伝子ゲノム百科事典によって維持されているＫＥＧＧリガンドデータベースに由来する。別段示されない限り、ＥＣ番号は、２００９年４月時点のデータベースに提供されているとおりである。
【００３６】
本発明の目的のための「脂肪酸」は、少なくとも４つの炭素原子を有する直鎖のモノアルカン酸である。
【００３７】
脂肪酸の「誘導体」は、脂肪酸（または対応する−ＣｏＡ化合物）の末端カルボキシル基の部位において、末端カルボキシル基を（カルボキシル炭素を失うことなく）異なる末端基、例えば、エステル、アルコール基、アミノ基、アルデヒド基、ケトン、メチル基、またはアルケニル基などに転化する一連の１つ以上の反応で形成される直鎖アルキル基を有する化合物である。脂肪酸の直鎖アルキル基の長さは、任意のそのような誘導体で保存され、いくつかの場合では延長され得る。
【００３８】
脂肪酸エステルは、脂肪酸または脂肪アシル−ＣｏＡとアルコールとの反応生成物（水を失う）に相当するエステル化合物である。
【００３９】
脂肪酸及び誘導体の鎖長は、時に本明細書において省略形「ＣＸ」（Ｘは炭素原子の数を指定する数である）で示され得る。各場合において指定される炭素原子の数は、以下の反応サイクルの１回以上の反復を介して本発明の細胞によって形成される（ＣｏＡまたはＡＣＰ補酵素の除去後の）直鎖化合物の炭素長を表す：
アシル−ＣｏＡ（またはアシル−ＡＣＰ）＋マロニル−ＣｏＡから３−ケトアシル化合物を形成する；
３−ケトアシル化合物を還元して３−ヒドロキシアシル化合物を形成する；
３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡを脱水して３−エノイルアシル化合物を形成する；及び
３−エノイルアシル化合物の対応するアシル化合物への還元。
【００４０】
この反応サイクルの各々の繰り返しは、出発アシル−ＣｏＡまたはアシル−ＡＣＰに２個の炭素原子を付加する。炭素原子の数は、例えば、エステル基に含まれる炭素などの脂肪酸の任意の誘導体の形成中に付加され得る追加的な炭素原子を含まない。それ故、ヘキサン酸メチルエステルは、本発明の目的のための「Ｃ６」脂肪酸エステル化合物とみなされ、メチルエステル基の炭素はカウントされない。
【００４１】
いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え細胞は原核細胞である。いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え細胞は真核細胞である。
【００４２】
いくつかの実施形態では、遺伝子組み換え細胞は微生物であり、単細胞微生物であり得る。
【００４３】
宿主細胞は、Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ、Ｃｈａｒｏｐｈｙｔａ、Ｍａｒｃｈａｎｔｉｏｐｈｙｔａ、Ａｎｔｈｏｃｅｒｏｔｏｐｈｙｔａ、Ｂｒｙｏｐｈｙｔａ、Ｌｙｃｏｐｏｄｉｏｐｈｙｔａ、Ｐｔｅｒｉｄｏｐｈｙｔａ、Ｃｙｃａｄｏｐｈｙｔａ、Ｇｉｎｋｇｏｐｈｙｔａ、Ｐｉｎｏｐｈｙｔａ、ＧｎｅｔｏｐｈｙｔａまたはＭａｇｎｏｌｉｏｐｈｙｔａ植物のいずれかの範囲内の植物由来の細胞を含む植物細胞であり得る。そのような植物細胞は、例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、Ｂｅｔａ、Ｇｌｙｃｉｎｅ、Ｊａｔｒｏｐｈａ、Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ、Ｐａｎｉｃｕｍ、Ｐｈａｌａｒｉｓ、Ｐｏｐｕｌｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ、Ｓａｌｉｘ、Ｓｉｍｍｏｎｄｓｉａ、及びＺｅａの属のいずれかの範囲内の植物由来の細胞であり得る。
【００４４】
宿主細胞は、菌類、微細藻類、藻類または紅藻類（不等毛）細胞であり得る。宿主細胞は酵母細胞であり得る。酵母または真菌細胞は、油性酵母または真菌であり得、及び／またはクラブトリー陰性酵母または真菌であり得る。
【００４５】
用語「油性菌類」は、それらのバイオマスの少なくとも１０％、１２．５％、１５％、１７．５％、好ましくは少なくとも２０％または更に少なくとも２５％（ｗ／ｗ）を脂質として蓄積する酵母または糸状菌類を指す。それらは、脂質としてそれらのバイオマスの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％（ｗ／ｗ）またはそれ以上を更に蓄積し得る。バイオマスは通常、細胞乾燥重量（ＣＤＷ）として測定される。
【００４６】
「クラブトリー陽性」生物は、酸素の存在下でエタノールを生成することが可能なものである一方で、「クラブトリー陰性」生物はそうではない。クラブトリー陰性の表現型を有する酵母細胞は、クラブトリー効果を示さない任意の酵母細胞である。用語「クラブトリー陰性」は、天然に存在する生物及び遺伝子組み換え生物の両方を指す。簡潔には、クラブトリー効果は、高濃度のグルコース（例えば、１０ｇ−グルコースＬ−１）の存在に起因して好気的条件下で培養された場合の微生物による酸素消費の阻害と定義される。言い換えると、クラブトリー陽性の表現型を有する酵母細胞は、グルコースの存在に起因する酸素の利用可能性に関係なく発酵を継続するが、クラブトリー陰性の表現型を有する酵母細胞は、グルコースを介した酸素消費の阻害を示さない。クラブトリー陽性酵母は、バイオマス生成よりむしろ過剰のアルコールを生成する。
【００４７】
好適な酵母細胞の例には、Ｐｉｃｈｉａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ、Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ、Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ、Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ、Ｙａｍａｄａｚｙｍａ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｏｃｏｃｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ及びＹａｒｒｏｗｉａが含まれる。特定の宿主酵母細胞の例には、Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ、Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｃ．ｍｅｔｈａｎｅｓｏｒｂｏｓａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂｕｌｄｅｒｉ（Ｓ．ｂｕｌｄｅｒｉ）、Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ、Ｃ．ｌａｍｂｉｃａ、Ｃ．ｓｏｒｂｏｘｙｌｏｓａ、Ｃ．ｚｅｍｐｌｉｎｉｎａ、Ｃ．ｇｅｏｃｈａｒｅｓ、Ｐ．ｍｅｍｂｒａｎｉｆａｃｉｅｎｓ、Ｚ．ｋｏｍｂｕｃｈａｅｎｓｉｓ、Ｃ．ｓｏｒｂｏｓｉｖｏｒａｎｓ、Ｃ．ｖａｎｄｅｒｗａｌｔｉｉ、Ｃ．ｓｏｒｂｏｐｈｉｌａ、Ｚ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ、Ｚ．ｌｅｎｔｕｓ，Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｙａｎｕｓ（Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ）、Ｄ．ｃａｓｔｅｌｌｉｉ、Ｃ、ｂｏｉｄｉｎｉｉ、Ｃ．ｅｔｃｈｅｌｌｓｉｉ、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｐ．ｊａｄｉｎｉｉ、Ｐ．ａｎｏｍａｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｐｉｃｈｉａ  ｇａｌｅｉｆｏｒｍｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．ＹＢ−４１４９（ＮＲＲＬの称号）、Ｃａｎｄｉｄａ  ｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐ．ｄｅｓｅｒｔｉｃｏｌａ、Ｐ．ｍｅｍｂｒａｎｉｆａｃｉｅｎｓ、Ｐ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｓｔａｒｋｅｙｉｉ、Ｌ．ｌｉｐｏｆｅｒｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｅｖｋａｕｆｉ、Ｃ．ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｐｕｌｌａｓ、Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｏｕｓ、Ｒ．ｇａｒｍｉｎｉｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ  ｃｒａｔａｅｇｅｎｓｉｓ（Ｓ．ｃｒａｔａｅｇｅｎｓｉｓ）が挙げられる。Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ及びＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓの好適な菌株には、ＷＯ００／７１７３８Ａ１、ＷＯ０２／４２４７１Ａ２、ＷＯ０３／０４９５２５Ａ２、ＷＯ０３／１０２１５２Ａ２及びＷＯ０３／１０２２０１Ａ２に記載されているものが含まれる。Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓの好適な菌株は、ＡＴＣＣ菌株３２１９６及びＡＴＣＣ菌株ＰＴＡ−６６４８である。
【００４８】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、細菌細胞である。細菌は、グラム陽性細菌またはグラム陰性細菌であり得る。それは、クラミジア、緑色非硫黄、アクチノバクテリア、プランクトミケス、スピロヘータ、フソバクテリア、シアノバクテリア、好熱性硫酸還元菌、アシドバクテリアまたはプロテオバクテリアの細菌分類のいずれかの範囲内の細胞であり得る（Ｃｉｃｃａｒｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１１（５７６５）：１２８３−７（２００６）。
【００４９】
好適な細菌細胞の例には、例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｃａｎｔｈｏｃｅｒａｓ、Ａｃａｎｔｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ａｃａｒｖｏｃｈｌｏｒｉｓ、Ａｃｈｎａｎｔｈｅｓ、Ａｃｈｎａｎｔｈｉｄｉｕｎ、Ａｃｔｉｎａｓｔｒｕｍ、Ａｃｔｉｎｏｃｈｌｏｒｉｓ、Ａｃｔｉｎｏｃｙｃｌｕｓ、Ａｃｔｉｎｏｔａｅｎｉｕｍ、Ａｍｐｈｉｃｈｒｓｉｓ、Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｎｍ、Ａｍｐｈｉｋｒｉｋｏｓ、Ａｍｐｌｈｉｐｌｅｕｒａ、Ａｍｐｈｉｐｒｏｒａ、Ａｍｐｈｉｔｈｒｉｘ、Ａｍｐｈｏｒａ、Ａｎａｂａｅｎａ、Ａｎａｂａｅｎｏｐｓｉｓ、Ａｎｅｕｍｎａｓｔｕｓ、Ａｎｋｉｓｔｒｏｄｅｓｍｉｕｓ、Ａｎｋｙｒａ、Ａｎｏｍｏｅｏｎｅｉｓ、Ａｐａｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ａｐｈａｎｉｚｏｍｅｎｏｎ、Ａｐｈａｎｏｃａｐｓａ、Ａｐｈａｎｏｃｈａｅｔｅ、Ａｐｈａｎｏｔｈｅｃｅ、Ａｐｉｏｃｙｓｔｉｓ、Ａｐｉｓｔｏｎｅｍａ、Ａｒｔｈｒｏｄｅｓｍｕｓ、Ａｒｔｈｅｒｏｓｐｉｒａ、Ａｓｃｏｃｈｌｏｒｉｓ、Ａｓｔｅｒｉｏｎｅｌｌａ、Ａｓｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ａｕｄｏｕｉｎｅｌｌａ、Ａｕｌａｒｏｓｅｉｒａ、Ｂａｃｉｌｌａｒｉａ、Ｂａｌｂｉａｎｉａ、Ｂａｍｂｉｕｓｉｎａ、Ｂａｎｇｉａ、Ｂａｓｉｃｈｌａｍｙｓ、Ｂａｔｒａｒｈｏｓｐｅｒｍｕｍ、Ｂｉｎｕｒｌｅａｒｉａ、Ｂｉｔｒｉｃｈｉａ、Ｂｌｉｄｉｎｇｉａ、Ｂｏｔｒｄｉｏｐｓｉｓ、Ｂｏｔｒｙｄｉｕｍ、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ、Ｂｏｔｒｙｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ、Ｂｒａｃｈｉｏｍｏｎａｓ、Ｂｒａｃｈｙｓｉｒａ、Ｂｒａｃｈｙｔｒｉｃｈｉａ、Ｂｒｅｂｉｓｓｏｎｉａ、Ｂｕｌｂｏｃｈａｅｔｅ、Ｂｕｍｎｉｌｌｅｒｉａ、Ｂｕｉｎｉｌｌｅｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃａｌｏｎｅｉｓ、Ｃａｌｏｔｈｒｉｘ、Ｃａｍｐｙｌｏｄｉｓｃｕｓ、Ｃａｐｓｏｓｉｐｈｏｎ、Ｃａｒｔｅｒｉａ、Ｃａｔｅｎａ、Ｃａｖｉｎｕｌａ、Ｃｅｎｒｉｔｒａｃｔｕｓ、Ｃｅｎｔｒｏｎｉｅｌｌａ、Ｃｅｒａｔｉｕｎｔ、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ、Ｃｈａｅｔｏｃｈｌｏｒｉｓ、Ｃｈａｅｔｏｍｏｒｐｈａ、Ｃｈａｅｔｏｎｅｌｌａ、Ｃｈａｅｔｏｎｅｍｎａ、Ｃｈａｅｔｏｐｅｌｔｉｓ、Ｃｈａｅｔｏｐｈｏｒａ、Ｃｈａｅｔｏｓｐｈａｅｒｉｄｉｕｍ、Ｃｈａｍａｅｓｉｐｈｉｏｎ、Ｃｈａｒａ、Ｃｈａｒａｃｉｏｃｈｌｏｒｉｓ、Ｃｈａｒａｃｉｏｐｓｉｓ、Ｃｈａｒａｃｉｕｍ、Ｃｈａｒａｌｅｓ、Ｃｈｉｌｏｍｏｎａｓ、Ｃｈｌａｉｎｏｍｏｎａｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｂｌｅｐｈａｒｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｃａｐｓａ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎｏｐｓｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｎｙｘａ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｎｅｐｈｒｉｓ、Ｃｈｌｏｒａｎｇｉｅｌｌａ、Ｃｈｌｏｒａｎｇｉｏｐｓｉｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ、Ｃｈｌｏｒｏｂｏｔｒｙｓ、Ｃｈｌｏｒｏｂｒａｃｈｉｓ、Ｃｈｌｏｒｏｃｈｙｔｒｉｕｍ、Ｃｈｌｏｒｏｃｃｕｎ、Ｃｈｌｏｒｏｇｌｏｅａ、Ｃｈｌｏｒｏｇｌｏｅｏｐｓｉｓ、Ｃｈｌｏｒｏｇｏｎｉｕｍ、Ｃｈｌｏｒｏｌｏｂｉｏｎ、Ｃｈｌｏｒｏｍｏｎａｓ、Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｓｅｍａ、Ｃｈｏｌｏｒｐｈｙｔａ、Ｃｈｏｌｏｒｏｓａｃｃｕｓ、Ｃｈｏｌｏｒｏｓａｒｃｉｎａ、Ｃｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ、Ｃｈｒｏｍｏｐｈｙｔｏｎ、Ｃｈｒｏｍｕｌｉｎａ、Ｃｈｒｏｏｃｏｃｃｉｄｉｏｐｓｉｓ、Ｃｈｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｈｒｏｏｄａｃｔｙｌｏｎ、Ｃｈｒｏｏｍｏｎａｓ、Ｃｈｒｏｏｔｈｅｃｅ、Ｃｈｒｙｓａｍｏｅｂａ、Ｃｈｙｓａｐｓｉｓ、Ｃｈｒｙｓｉｄｉａｓｔｒｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｃａｐｓａ、Ｃｈｒｙｓｏｃａｐｓｅｌｌａ、Ｃｈｒｙｓｏｃｈａｅｔｅ、Ｃｈｒｙｓｏｈｒｏｍｕｌｉｎａ、Ｃｈｒｙｓｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｈｒｙｓｏｃｒｉｎｕｓ、Ｃｈｒｙｎｓｏｌｅｐｉｄｏｍｏｎａｓ、Ｃｈｒｙｓｏｌｙｋｏｓ、Ｃｈｒｙｓｏｎｅｂｕｌａ、Ｃｈｒｙｓｏｐｈｙｔａ、Ｃｈｒｙｓｏｐｙｘｉｓ、Ｃｈｒｙｓｏｓａｃｃｕｓ、Ｃｈｒｙｓｏｐｈａｅｒｅｌｌａ、Ｃｈｒｙｓｏｔｅｐｈａｎｏｓｐｈａｅｒａ、Ｃｌｏｄｏｐｈｏｒａ、Ｃｌａｓｔｉｄｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｅｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｌｏｓｔｅｒｉｕｍ、Ｃｏｃｃｏｍｙｘａ、Ｃｏｃｃｏｎｅｉｓ、Ｃｏｅｌａｓｔｒｅｌｌａ、Ｃｏｅｌａｓｔｒｕｍ、Ｃｏｅｌｏｓｐｈａｅｒｉｕｍ、Ｃｏｅｎｏｃｈｌｏｒｉｓ、Ｃｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｅｎｏｃｙｓｔｉｓ、Ｃｏｌａｃｉｕｍ、Ｃｏｌｅｏｃｈａｅｔｅ、Ｃｏｌｌｏｄｉｃｔｙｏｎ、Ｃｏｍｐｓｏｇｏｎｏｐｓｉｓ、Ｃｏｍｐｓｏｐｏｇｏｎ、Ｃｏｎｊｕｇａｔｏｐｈｙｔａ、Ｃｏｎｏｅｈａｅｔｅ、Ｃｏｒｏｎａｓｔｒｕｍ、Ｃｏｓｍａｒｉｕｍ、Ｃｏｓｍｎｉｏｎｅｉｓ、Ｃｏｓｍｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｃｒａｔｅｒｉｐｏｒｔｕｌａ、Ｃｒａｔｉｃｕｌａ、Ｃｒｉｎａｌｉｕｍ、Ｃｒｕｃｉｇｅｎｉａ、Ｃｒｕｃｉｇｅｎｉｅｌｌａ、Ｃｒｙｐｔｏａｕｌａｘ、Ｃｒｙｐｔｏｍｏｎａｓ、Ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｔａ、Ｃｔｅｎｏｐｈｏｒａ、Ｃｙａｎｏｄｉｃｔｙｏｎ、Ｃｙａｎｏｎｅｐｈｒｏｎ、Ｃｙａｎｏｐｈｏｒａ、Ｃｙａｎｏｐｈｙｔａ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ、Ｃｙａｎｏｔｈｏｍｏｎａｓ、Ｃｙｃｌｏｎｅｘｉｓ、Ｃｙｃｌｏｓｔｅｐｈａｎｏｓ、Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃａｐｓａ、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃｙｓｔｉｓ、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｅｒｍｕｍ、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ、Ｃｙｍａｔｏｐｌｅｕｒａ、Ｃｙｍｂｅｌｌａ、Ｃｙｍｂｅｉｌｏｎｉｔｚｓｃｈｉａ、Ｃｙｓｔｏｄｉｎｉｕｍ  Ｄａｃｔｙｌｏｃｏｃｃｏｐｓｉｓ、Ｄｅｂａｒｙａ、Ｄｅｎｔｉｃｕｌａ、Ｄｅｒｍａｔｏｃｈｒｙｓｉｓ、Ｄｅｒｍｏｒａｒｐａ、Ｄｅｒｍｏｃａｒｐｅｌｌａ、Ｄｅｓｍａｔｒａｃｔｕｍ、Ｄｅｓｍｉｄｉｕｍ、Ｄｅｓｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｄｅｓｍｏｎｅｍａ、Ｄｅｓｍｏｓｉｐｈｏｎ、Ｄｉａｃａｎｔｈｏｓ、Ｄｉａｃｒｏｎｅｍａ、Ｄｉａｄｅｓｍｉｓ、Ｄｉａｔｏｍａ、Ｄｉａｔｏｍｅｌｌａ、Ｄｉｃｅｌｌｕｌａ、Ｄｉｃｈｏｔｈｒｉｘ、Ｄｉｃｈｔｏｔｏｍｏｃｏｃｃｒｕｓ、Ｄｉｃｒａｎｏｃｈａｅｔｅ、Ｄｉｃｔｙｏｃｈｌｏｒｉｓ、Ｄｉｃｔｙｏｃｏｃｃｕｓ、Ｄｉｃ���ｙｏｓｐｈａｅｒｉｕｍ、Ｄｉｄｙｍｏｃｙｓｔｉｓ、Ｄｉｄｙｍｏｇｅｎｅｓ、Ｄｉｄｙｍｏｓｐｈｅｎｉａ、Ｄｉｌａｂｉｆｉｌｕｍ、Ｄｉｍｏｒｐｈｏｃｃｕｓ、Ｄｉｎｏｂｒｙｏｎ、Ｄｉｎｏｃｕｃｃｕｓ、Ｄｉｐｌｏｃｈｌｏｒｉｓ、Ｄｉｐｌｏｎｅｉｓ、Ｄｉｐｌｏｓｔａｕｒｏｎ、Ｄｉｓｔｒｉｏｎｅｌｌａ、Ｄｏｃｉｄｉｕｍ、Ｄｒａｐａｒｎａｌｄｉａ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ、Ｄｙｓｍｏｒｐｈａｏｃｕｃｃｕｓ、Ｅｃｂａｌｌｏｃｙｓｔｉｓ、Ｅｌａｋａｔｏｔｈｒｉｘ、Ｅｌｌｅｒｂｅｃｋｉａ、Ｅｎｃｙｏｎｅｍａ、Ｅｎｔｅｒｏｍｏｒｐｈａ、Ｅｎｔｏｃｌａｄｉａ、Ｅｎｔｏｍｏｅｉｓ、Ｅｎｔｏｐｈｙｓａｌｉｓ、Ｅｐｈｉｃｈｒｙｓｉｓ、Ｅｐｉｐｙｘｉｓ、Ｅｐｉｔｈｅｍｉａ、Ｅｒｅｍｏｓｐｈａｕｒａ、Ｅｕａｓｔｒｏｐｓｉｓ、Ｅｕａｔｓｔｒｕｍ、Ｅｕｃａｐｓｉｓ、Ｅｕｃｏｃｃｏｎｅｉｓ、Ｅｕｄｏｒｉｎａ、Ｅｕｇｌｅｎａ、Ｅｕｇｌｅｎｏｐｈｙｔａ、Ｅｕｎｏｔｉａ、Ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｐｈｙｔａ、Ｅｕｔｒｅｐｔｉａ、Ｆａｌｌｃｉａ、Ｆｉｃｈｅｒｅｌｌａ、Ｆｒａｇｉｌａｒｉａ、Ｆｒａｇｉｌａｒｉｆｏｒｍａ、Ｆｒａｎｃｅｉａ、Ｆｒｕｓｔｕｌｉａ、Ｃｕｒｃｉｌｌａ、Ｇｅｍｉｎｅｌｌａ、Ｇｅｎｉｃｕｌａｒｉａ、Ｇｌａｕｃｏｃｙｓｔｉｓ、Ｇｌａｕｃｏｐｈｙｔａ、Ｇｌｅｎｏｄｉｎｉｏｐｓｉｓ、Ｇｌｅｎｏｄｉｎｉｕｍ、Ｇｌｏｅｏｍｏｎａｓ、Ｇｌｏｅｏｐｌａｘ、Ｇｌｏｅｏｔｈｅｃｅ、Ｇｅｌｏｅｏｔｉｌａ、Ｇｌｏｅｏｔｒｉｃｈｉａ、Ｇｌｏｉｏｄｉｃｔｙｏｎ、Ｇｏｌｅｎｋｉｎｉａ、Ｇｏｌｅｎｋｉｎｉｏｐｓｉｓ、Ｇｏｍｏｎｔｉａ、Ｇｏｍｐｈｏｃｙｍｂｅｌｌａ、Ｇｏｍｐｈｏｎｅｍａ、Ｇｏｍｐｈｏｓｐｈａｅｒｉａ、Ｇｏｎａｔｏｚｙｇｏｎ、Ｇｏｎｇｒｏｓｉａ、Ｇｏｎｇｒｏｓｉｒａ、Ｇｏｎｉｏｃｈｌｏｒｉｓ、Ｇｏｎｉｕｍ、Ｇｏｎｙｏｓｔｏｍｕｍ、Ｇｒａｎｕｌｏｃｈｌｏｒｉｓ、Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｓｔｏｐｓｉｓ、Ｇｒｏｅｎｂｌａｄｉａ、Ｇｙｍｎｏｄｉｕｎｉｕｍ、Ｇｙｍｎｏｚｙｇａ、Ｇｙｒｏｓｉｇｎｍａ、Ｈａｅｍａｔｏｃｕｃｃｕｓ、Ｈａｆｎｉｏｍｏｎａｓ、Ｈａｌｌａｓｓｉａ、Ｈａｍｍａｔｏｉｄｅａ、Ｈａｎｎａｅａ、Ｈａｎｔｚｃｈｉａ、Ｈａｐａｌｏｓｉｐｈｏｎ、Ｈａｐｌｏｔａｅｎｉｕｍ、Ｈａｐｔｏｐｈｙｔａ、Ｈａｓｌｅａ、Ｈｅｍｉｄｉｎｕｉｍ、Ｈｅｍｉｔｏｎｉａ、Ｈｅｒｉｂａｕｄｉｅｌｌａ、Ｈｅｔｅｒｏｍａｓｔｉｘ、Ｈｅｔｅｒｏｔｈｒｉｘ、Ｈｉｂｂｅｒｄｉａ、Ｈｉｌｄｅｎｂｒａｎｄｉａ、Ｈｉｌｌｅａ、Ｈｏｌｏｐｅｄｉｕｍ、Ｈｏｍｏｅｏｔｈｒｉｘ、Ｈｏｒｍａｎｔｈｏｎｅｍａ、Ｈｏｒｍｏｔｉｌａ、Ｈｙａｌｏｂｒａｃｈｉｏｎ、Ｈｙａｌｏｃａｒｄｉｕｍ、Ｈｙａｌｏｄｉｓｃｕｓ、Ｈｙａｌｏｇｏｎｉｕｍ、Ｈｙａｌｏｔｈｅｃａ、Ｈｙｄｒｉａｎｕｍ、Ｈｙｄｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｈｙｄｒｏｃｏｌｅｕｍ、Ｈｙｄｒｏｃｏｒｙｎｅ、Ｈｙｄｒｏｄｉｃｔｙｏｎ、Ｈｙｄｒｏｓｅｒａ、Ｈｙｄｒｕｒｕｓ、Ｈｙｅｌｌａ、Ｈｙｍｅｎｏｍｏｎａｓ、Ｉｓｔｈｍｏｃｈｌｏｒｏｎ、Ｊｏｈａｎｎｅｓｂａｐｔｉｓｔｉａ、Ｊｕｒａｎｙｉｅｌｌａ、Ｋａｒａｙｅｖｉａ、Ｋａｔｈａｂｌｅｐｈａｒｉｓ、Ｋａｔｏｄｉｎｉｕｍ���Ｋａｐｈｙｒｉｏｎ、Ｋｅｒａｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｋｉｒｃｈｎｅｒｉｅｌｌａ、Ｋｌｅｂｓｏｒｍｉｄｉｕｍ、Ｋｏｌｂｅｓｉａ、Ｋｏｌｉｅｌｌａ、Ｋｏｍａｒｅｋｉａ、Ｋｏｒｓｈｉｋｏｖｉｅｌｌａ、Ｋｒａｓｋｅｌｌａ、Ｌａｇｅｒｈｅｉｍｉａ、Ｌａｇｙｎｉｏｎ、Ｌａｍｐｒｏｔｈａｍｎｉｕｍ、Ｌｅｍａｎｅａ、Ｌｅｐｏｃｉｎｃｌｉｓ、Ｌｅｐｔｏｓｉｒａ、Ｌｏｂｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌｏｂｏｃｙｓｔｉｓ、Ｌｏｂｏｍｏｎａｓ、Ｌｕｔｉｃｏｌａ、Ｌｙｎｂｙａ、Ｍａｌｌｅｏｃｈｌｏｒｉｓ、Ｍａｌｌｏｍｏｎａｓ、Ｍａｎｔｏｎｉｅｌｌａ、Ｍａｒｓｓｏｎｉｅｌｌａ、Ｍａｒｔｙａｎａ、Ｍａｓｔｉｇｏｃｌｏｌｅｕｓ、Ｇａｓｔｏｇｌｏｉａ、Ｍｅｌｏｓｉｒａ、Ｍｅｒｉｓｍｏｐｅｄｉａ、Ｍｅｓｏｓｔｉｇｍａ、Ｍｅｓｏｔａｅｎｉｕｍ、Ｍｉｃｒａｃｔｉｎｉｕｍ、Ｍｉｃｒａｓｔｅｒｉａｓ、Ｍｉｃｒｏｃｈａｅｔｅ、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ、Ｍｉｃｒｏｇｌｅｎａ、Ｍｉｃｒｏｍｏｎａｓ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ、Ｍｉｃｒｏｔｈａｍｎｉｏｎ、Ｍｉｓｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｏｎｏｃｒｙｓｉｓ、Ｍｏｎｏｄｕｓ、Ｍｏｎｏｍａｓｔｉｘ、Ｍｏｎｏｒａｐｈｉｄｉｕｍ、Ｍｏｎｏｓｔｒｏｍａ、Ｍｏｕｇｅｏｔｉａ、Ｍｏｕｇｅｏｔｉｏｐｓｉｓ、Ｍｙｏｃｈｌｏｒｉｓ、Ｍｙｒｏｍｅｃｉａ、Ｍｙｘｏｃａｒｃｉｎａ、Ｎａｅｇｅｌｉｅｌｌａ、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ、Ｎａｕｔｏｃｃｕｓ、Ｎａｖｉｃｕｌａ、Ｎｅｇｌｅｃｔｅｌｌａ、Ｎｅｉｄｉｕｍ、Ｎｅｐｈｒｏｃｌａｍｙｓ、Ｎｅｐｈｒｏｃｙｔｉｕｍ、Ｎｅｐｈｒｏｄｉｅｌｌａ、Ｎｅｐｈｒｏｓｅｌｍｉｓ、Ｎｅｔｒｉｕｍ、Ｎｉｔｅｌｌａ、Ｎｉｔｅｌｌｏｐｓｉｓ、Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ、Ｎｏｓｔｏｃ、Ｏｃｈｒｏｍｏｎａｓ、Ｏｅｄｏｇｏｎｉｕｍ、Ｏｌｉｇｏｃｈａｅｔｏｐｈｏｒａ、Ｏｎｙｃｈｏｎｅｍａ、Ｏｏｃａｄｒｉｕｍ、Ｏｏｃｒｙｓｔｉｓ、Ｏｐｅｐｈｏｒａ、Ｏｐｈｉｏｃｙｔｉｕｍ、Ｏｒｔｈｏｓｅｉｒａ、Ｏｓｃｉｌｌａｒｔｏｒｉａ、Ｏｘｙｎｅｉｓ、Ｐａｃｈｙｃｌａｄｅｌｌａ、Ｐａｌｍｅｌｌａ、Ｐａｌｍｏｄｉｃｔｙｏｎ、Ｐｎａｄｏｒｉｎａ、Ｐａｎｎｕｓ、Ｐａｒａｌｉａ、Ｐａｓｃｈｅｒｉｎａ、Ｐａｕｌｓｈｕｌｚｉａ、Ｐｅｄｉａｓｔｒｕｍ、Ｐｅｄｉｎｅｌｌａ、Ｐｅｄｉｎｏｍｏｎａｓ、Ｐｅｄｉｎｏｐｅｒａ、Ｐｅｌａｇｏｄｉｃｔｙｏｎ、Ｐｅｎｉｕ
ｍ、Ｐｅｒａｎｅｍａ、Ｐｅｒｉｄｉｎｉｏｐｓｉｓ、Ｐｅｒｉｄｉｎｉｕｍ、Ｐｅｒｏｎｉａ、Ｐｅｔｒｏｎｅｉｓ、Ｐｈａｃｏｔｕｓ、Ｐｈａｃｕｓ、Ｐｈａｅａｓｔｅｒ、Ｐｈａｅｏｄｅｒｍａｔｉｕｍ、Ｐｈａｅｏｐｈｙｔａ、Ｐｈａｅｏｓｈａｅｒａ、Ｐｈａｅｏｔｈａｍｎｉｏｎ、Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ、Ｐｈｙｃｏｐｅｌｔｉｓ、Ｐｈｙｌｌａｒｉｏｃｈｌｏｒｉｓ、Ｐｈｙｌｌｏｃａｄｉｕｍ、Ｐｈｙｌｌｏｍｉｔａｓ、Ｐｉｎｎｉｌａｒｉａ、Ｐｉｔｏｐｈｏｒａ、Ｐｌａｃｏｎｅｉｓ、Ｐｌａｎｃｔｏｎｅｍａ、Ｐｌａｎｋｔｏｐｈａｅｒｉａ、Ｐｌａｎｏｔｈｉｄｉｕｍ、Ｐｌｅｃｔｏｎｅｍａ、Ｐｌｅｏｄｏｒｉｎａ、Ｐｌｅｕｒａｓｔｒｕｍ、Ｐｌｅｕｒｏｃａｐｓａ、Ｐｌｅｕｒｏｃｌａｄｉａ、Ｐｌｅｕｒｏｄｉｓｃｕｓ、Ｐｌｅｕｒｏｓｉｇｍａ、Ｐｌｅｕｒｏｓｉｒａ、Ｐｌｅｕｒｏｔａｅｎｉｕｍ、Ｐｏｃｉｌｌｏｍａｎａｓ、Ｐｏｄｏｈｅｄｅａ、Ｐｏｌｙｂｌｅｐｈａｒｉｄｅｓ、Ｐｏｌｙｃｈａｅｔｏｐｈｏｒａ、Ｐｏｌｙｅｄｒｉｅｌｌａ、Ｐｏｌｙｅｄｒｉｏｐｓｉｓ、Ｐｏｌｙｇｏｎｉｏｃｈｌｏｒｉｓ、Ｐｏｌｙｅｐｉｄｏｍａｎａｓ、Ｐｏｌｙｔａｅｎｉａ、Ｐｏｌｙｔｏｍａ、Ｐｏｌｙｔｏｍｅｌｌａ、Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ、Ｐｏｓｔｅｒｉｏｃｈｒｏｍｏｎａｓ、Ｐｒａｓｉｎｏｃｈｌｏｒｉｓ、Ｐｒａｓｉｎｏｃｌａｄｕｓ、Ｐｒａｓｉｎｏｐｈｙｔａ、Ｐｒａｉｓｏｌａ、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｐｈｙｔａ、Ｐｓａｍｍｏｄｉｃｔｙｏｎ、Ｐｓａｍｍｏｔｈｉｄｉｕｍ、Ｐｓｅｕｄａｎａｂａｅｎａ、Ｐｓｅｕｄｅｎｏｃｌｏｎｉｕｍ、Ｐｓｕｅｄｏｃａｒｔｅｒｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｃｈａｔｅ、Ｐｓｅａｕｄｏｃｈａｒａｃｉｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｃｏｃｃｏｍｙｘａ、Ｐｓｅｕｄｏｄｉｃｔｙｏｓｐｈａｅｒｉｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｋｅｐｈｙｒｉｏｎ、Ｐｓｅｕｄｏｎｃｏｂｒｙｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｑｕａｄｒｉｇｕｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｐｈａｅｒｏｃｙｓｔｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｓｔａｕｒａｓｔｒｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｓｔｒａｕｒｏｓｉｒａ、Ｐｙｒｒｏｐｈｙｔａ、Ｑｕａｄｒｉｃｈｌｏｒｉｓ、Ｑｕａｄｒｉｃｏｃｃｕｓ、Ｑｕａｄｒｉｇｕｌａ、Ｒａｄｉｏｃｕｃｃｕｓ、Ｒａｄｉｏｂｅｔａｌｕｍ、Ｒａｐｈｉｄｉｏｐｓｉｓ、Ｒａｐｈｉｄｏｃｅｌｉｓ、Ｒａｐｈｉｄｏｎｅｍａ、Ｒａｐｈｉｄｏｐｈｙｔａ、Ｐｅｉｍｅｒｉａ、Ｒｈａｄｏｒｄｅｒｍａ、Ｒｈａｂｏｍｏｎａｓ、Ｒｈｉｚｏｃｌｏｎｉｕｍ、Ｒｈｏｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｈｏｄｉｐｈｙｔａ、Ｒｈｏｉｃｏｓｅｎｉａ、Ｒｈｏｐａｌｏｄｉａ、Ｒｉｖｕｌａｒｉａ、Ｒｏｓｅｎｖｉｎｇｉｅｌｌａ、Ｒｏｓｓｉｔｈｉｄｉｕｍ、Ｒｏｙａ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ、Ｓｃｈｅｒｆｆｅｌｉａ、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｌａｍｙｄｅｌｌａ、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｌａｍｙｓ、Ｓｃｈｉｚｏｍｅｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｔｈｒｉｘ、Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒｉａ、Ｓｃｏｌｉｏｎｅｉｓ、Ｓｃｏｔｉｅｌｌａ、Ｓｃｏｔｉｅｌｌｏｐｓｉｓ、Ｓｃｏｕｒｆｉｅｌｄｉａ、Ｓｃｙｔｏｎｅｍａ、Ｓｌｅｎａｓｔｒｕｍ、Ｓｅｌｅｎｏｃｈｌｏｒｉｓ、Ｓｅｌｌａｐｈｏｒａ、Ｓｅｍｉｏｒｂｉｓ、Ｓｉｄｅｒｏｃｅｌｉｓ、Ｄｉｄｅｒｏｃｙｓｔｏｐｓｉｓ、Ｄｉｍｏｎｓｅｎｉａ、Ｓｉｐｈｏｎｏｎｅｍａ、Ｓｉｒｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｓｉｒｏｇｏｎｉｕｍ、Ｓｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ、Ｓｏｒａｓｔｒｕｍ、Ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏｐｉｓ、Ｓｐｈａｅｒｅｌｌｏｃｙｓｔｉｓ、Ｓｐｈａｅｒｅｌｌｏｐｓｉｓ、Ｓｐｈａｅｒｏｄｉｎｉｕｍ、Ｓｐｈａｅｒｏｐｌｅａ、Ｓｐｈａｅｒｏｚｏｓｍａ、Ｓｐｉｎｉｆｅｒｏｍｏｎａｓ、Ｓｐｉｒｏｇｙｒａ、Ｓｐｉｒｏｔａｅｎｉａ、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ、Ｓｐｏｎｄｙｌｏｍｏｒｕｍ、Ｓｐｏｎｄｙｌｏｓｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｅｔｒａｓ、Ｓｐｕｍｅｌｌａ、Ｓｔａｕｒａｓｔｒｕｍ、Ｓｔａｕｅｒｏｄｅｓｍｕｓ、Ｓｔａｕｒｏｎｅｉｓ、Ｓｔａｕｒｏｓｉｒａ、Ｓｔａｕｒｒｏｓｉｅｌｌａ、Ｓｔｅｎｏｐｔｅｒｏｂｉａ、Ｓｔｅｐｈａｎｏｃｏｓｔｉｓ、Ｓｔｅｐｈａｎｏｄｉｓｃｕｓ、Ｓｔｅｐｈａｎｏｐｏｒｏｓ、Ｓｔｅｐｈａｎｏｓｈａｅｒａ、Ｓｔｉｃｈｏｃｃｕｓ、Ｓｔｉｃｈｏｇｌｏｅａ、Ｓｉｇｅｏｃｌｏｎｉｕｍ、Ｓｔｉｇｏｎｅｍａ、Ｓｔｉｐｉｔｏｃｕｃｃｕｓ、Ｓｔｏｋｅｓｉｅｌｌａ、Ｓｔｏｍｂｏｍｏｎａｓ、Ｓｔｙｌｏｃｈｒｙｓａｌｉｓ、Ｓｔｙｌｏｄｉｎｉｕｍ、Ｓｔｙｌｏｙｘｉｓ、Ｓｔｙｌｏｓｐｈａｅｒｉｄｉｕｍ、Ｓｕｒｉｒｅｌｌａ、Ｓｙｋｉｄｉｏｎ、Ｓｙｍｐｌｏｃａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ、Ｓｙｎｅｄｒａ、Ｓｙｎｏｃｈｒｏｍｏｎａｓ、Ｓｙｎｕｒａ、Ｔａｂｅｌｌａｒｉａ、Ｔａｂｕｌａｒｉａ、Ｔｅｉｌｉｎｇｉａ、Ｔｅｍｎｏｇａｍｅｔｕｍ、Ｔｅｔｍｅｍｏｒｕｓ、Ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ、Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｕｓ、Ｔｅｔｒａｄｅｍｕｓ、Ｔｅｔｒａｅｄｒｉｅｌｌａ、ｔｅｔｒａｅｄｒｏｎ、Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ、Ｔｅｔｒａｓｐｏｒａ、Ｔｅｔｒａｓｔｒｕｍ、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ、Ｔｈａｎｍｉｏｃｈａｅｔｅ、Ｔｈｏａｋｏｃｈｌｏｒｉｓ、Ｔｈｏｒｅａ、Ｔｏｌｙｐｅｌｌａ、Ｔｏｌｙｐｏｔｈｒｉｘ、Ｔｒａｃｈｅｌｏｍｏｎａｓ、Ｔｒａｃｈｙｄｉｓｃｕｓ、Ｔｒｅｂｏｕｘｉａ、Ｔｒｅｎｔｅｐｈｏｌｉａ、Ｔｒｅｕｂａｒｉａ、Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ、Ｔｒｉｃｏｄｉｓｃｕｓ、Ｔｒｏｃｈｉｓｃｉａ、Ｔｒｙｂｌｉｏｎｅｌｌａ、Ｕｌｏｔｈｒｉｘ、Ｕｒｏｇｌｅｎａ、Ｕｒｏｎｅｍａ、Ｕｒｏｓｏｌｅｎｉａ、Ｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｕｖａ、Ｖａｃｕｏｌａｒｉａ、Ｖａｕｃｈｅｒｉａ、Ｖｏｌｖｏｘ、Ｖｏｌｖｕｌｉｎａ、Ｗｅｓｔｅｌｌａ、Ｗｏｌｏｓｚｙｎｓｋｉａ、Ｘａｎｔｈｉｄｉｕｍ、Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｔａ、Ｅｘｅｎｃｏｃｃｕｓ、Ｚｙｇｅｎｅｍａ、Ｚｙｇｎｅｍｏｐｓｉｓ、及びＺｙｇｏｎｉｕｍ属のいずれかの範囲内のものが含まれる。
【００５０】
細菌宿主細胞の特定の例には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ；Ｏｌｉｇｏｔｒｏｐｈａ  ｃａｒｂｏｘｉｄｏｖｏｒａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎｏｎａｓ  ｓｐ．Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｂａｓｉｌｅｎｓｉｓ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｃａｍｐｉｎｅｎｓｉｓ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｇｉｌａｒｄｉ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｌａｈａｒｓｉｓ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｏｘａｌａｔｉｃｕｓ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｐａｕｃｕｌｕｓ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｐｉｎａｔｕｂｏｎｅｎｓｉｓ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｒｅｓｐｉｒａｃｕｌｉ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｔａｉｗａｎｅｎｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｂｓｃｅｓｓｕｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍａｒｉｎｕｍ、及びＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｕｌｃｅｒａｎｓが含まれる。他の実施形態では、細菌は、Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｓｐ．ＮＲＲＬ  ５６４６、Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｆａｒｃｉｎｉｃａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ  ａｒｅｎｉｃｏｌａ、またはＣｌａｖｉｂａｃｔｅｒ  ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｅｓｉｓである。
【００５１】
宿主細胞は、米国特許公開２００７／０２６４６８８、または２００７／０２６９８６２に記載されているように、合成細胞または合成ゲノムによって生成される細胞であり得る。宿主細胞は、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃｖ１細胞、ＭＤＣＫ細胞、２９３細胞、３Ｔ３細胞、またはＰＣ１２細胞であり得る。
【００５２】
所定の実施形態では、３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、サブ配列の配列番号１または配列番号１６０、または配列番号１または配列番号１６０と少なくとも８０％同一のサブ配列を含み、但し、各場合においてアミノ酸残基８に整列するアミノ酸残基は、ロイシン、バリン、イソロイシンまたはメチオニンのいずれか１つであり、アミノ酸残基８に整列するアミノ酸残基は、配列番号１の場合はロイシンまたはメチオニンであり、配列番号１６０の場合はロイシン、メチオニンまたはトレオニンである。配列番号１は、配列番号８７と、配列番号８７のアミノ酸残基位置８におけるトレオニンが配列番号１ではロイシン、バリン、イソロイシンまたはメチオニンのいずれか１つに置き換えられている点で異なる。配列番号１６０は、配列番号８７と、配列番号８７のアミノ酸残基位置８におけるトレオニンが配列番号１６０ではロイシン、バリン、イソロイシンまたはメチオニンのいずれか１つに置き換えられており、位置２におけるアミノ酸残基がまたトレオニンであり得る点で異なる。配列番号８７は、様々な天然に存在する３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼに見られるサブ配列を表す。配列番号８７は、例えば、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｃｈｉｎｄｌｅｒｉ  ＣＩＰ  １０７２８７（配列番号８のアミノ酸残基１７７〜１８５として、アミノ酸残基１７８はメチオニンである）；Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｃｈｉｎｄｌｅｒｉ  ＮＩＰＨ  ９００（配列番号８６のアミノ酸残基１７７〜１８５として、アミノ酸残基１７８はメチオニンである）；Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｊｏｈｎｓｉｉ  ＳＨ０４６（配列番号３５のアミノ酸残基１７７〜１８５として、アミノ酸残基１７８はロイシンである）；Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｌｗｏｆｆｉｉ  ＳＨ１４５（配列番号８８のアミノ酸残基１７７〜１８５として、アミノ酸残基１７８はロイシンである）；Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ  ＮＩＰＨ  ７１３（配列番号８９のアミノ酸残基１７７〜１８５として、アミノ酸残基１７８はロイシンである）の天然に存在する３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼに現れる。サブ配列の配列番号１または配列番号１６０のアミノ酸残基８で示されるトレオニンのこの置換は、脂肪酸生成（及び脂肪酸誘導体の生成）をＣ６、Ｃ８及び／またはＣ１０脂肪酸及び誘導体へシフトさせることが見出されている。
【００５３】
３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、いくつかの実施形態では、ａ）配列番号４または配列番号１６１、ｂ）配列番号５及びｃ）配列番号６または配列番号１６２から選択される少なくとも１つのサブ配列を含む。３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは好ましくはａ）、ｂ）及びｃ）の各々を含む。
【００５４】
３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ中に配列番号４または配列番号１６１が存在するいくつかの実施形態では、場合によって、サブ配列の配列番号４は、サブ配列の配列番号１または配列番号１６０の上流に存在する。サブ配列の配列番号４または配列番号１６１の開始は、場合によって、例えば、そのような３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ酵素中のサブ配列の配列番号１または配列番号１６０（場合による）の開始の２５〜３０アミノ酸残基、特に正確には２７アミノ酸残基上流に位置し得る。
【００５５】
３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、いくつかの実施形態では、サブ配列の配列番号４４及び／または配列番号４５、またはそれらのいずれかと少なくとも８５％同一のサブ配列を含む。配列を比較することによって分かるように、配列番号４４及び４５の各々は、配列番号４（配列番号４４及び４５のアミノ酸残基１〜７として現れる）及び配列番号１（配列番号４４及び４５のアミノ酸残基２８〜３６として現れる）を含む。サブ配列の配列番号４４及び４５では、サブ配列の配列番号４の開始は、サブ配列の配列番号１の開始の２７アミノ酸残基上流に位置する。
【００５６】
３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、いくつかの実施形態では、サブ配列の配列番号１６４及び／または配列番号１６５、またはそれらの各々と少なくとも８５％同一のサブ配列を含む。配列を比較することによって分かるように、配列番号１６４及び１６５の各々は、配列番号１６１（配列番号１６４及び１６５のアミノ酸残基１〜７として現れる）及び配列番号１６０（配列番号１６４及び１６５のアミノ酸残基２８〜３６として現れる）を含む。サブ配列の配列番号１６４及び１６５では、サブ配列の配列番号１６１の開始は、サブ配列の配列番号１６０の開始の２７アミノ酸残基上流に位置する。
【００５７】
３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ中に配列番号５が存在するいくつかの実施形態では、場合によって、サブ配列の配列番号５は好ましくは、サブ配列の配列番号１または配列番号１６０の下流に存在する。サブ配列の配列番号５の開始は、例えば、そのような３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ酵素中のサブ配列の配列番号１または配列番号１６０（場合による）の開始の１００〜１２０アミノ酸残基、１０８〜１１６アミノ酸残基、または正確には１１２または１１３アミノ酸下流に位置し得る。
【００５８】
３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ中に配列番号６または配列番号１６２が存在するいくつかの実施形態では、場合によって、サブ配列の配列番号６または配列番号１６２は、場合によって、好ましくは、サブ配列の配列番号１または配列番号１６０の下流に存在する。サブ配列の配列番号６または配列番号１６２の開始は、例えば、そのような３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ酵素中のサブ配列の配列番号１または配列番号１６０（場合による）の開始の１４０〜１６０アミノ酸残基、１４５〜１５５アミノ、特に正確には１４７または１４８アミノ酸残基下流に位置し得る。
【００５９】
サブ配列の配列番号５及び６の両方が存在するいくつかの実施形態では、３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、サブ配列の配列番号４６を含む。配列番号４６では、サブ配列の配列番号５はアミノ酸残基１〜７として現れ、サブ配列の配列番号６はアミノ酸残基３６〜４２として現れる。
【００６０】
サブ配列の配列番号５及び１６２の両方が存在するいくつかの実施形態では、３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、サブ配列の配列番号１６６を含む。配列番号１６６では、サブ配列の配列番号５はアミノ酸残基１〜７として現れ、サブ配列の配列番号１６２はアミノ酸残基３６〜４２として現れる。
【００６１】
サブ配列の配列番号４、５及び６の各々が存在するいくつかの実施形態では、３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、サブ配列の配列番号４７を含む。配列番号４７では、サブ配列の配列番号４はアミノ酸残基１〜７として現れ：サブ配列の配列番号１はアミノ酸残基２８〜３６として現れ；サブ配列の配列番号５はアミノ酸残基１４１〜１４７として現れ、サブ配列の配列番号６はアミノ酸残基１７６〜１８２として現れる。
【００６２】
サブ配列の配列番号１６１、５及び１６２の各々が存在するいくつかの実施形態では、３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、サブ配列の配列番号１６７を含む。配列番号１６７では、サブ配列の配列番号１６１はアミノ酸残基１〜７として現れ：サブ配列の配列番号１６０はアミノ酸残基２８〜３６として現れ；サブ配列の配列番号５はアミノ酸残基１４１〜１４７として現れ、サブ配列の配列番号１６２はアミノ酸残基１７６〜１８２として現れる。
【００６３】
前述の実施形態のいずれかにおいて、３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、サブ配列の配列番号４８または配列番号１６８を含み得る。配列番号４８または配列番号１６８は好ましくは、場合によって、サブ配列の配列番号１または配列番号１６０の上流であり、存在する場合、サブ配列の配列番号４または１６１、５及び６または１６２の各々の上流である。
【００６４】
いくつかの実施形態では、３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、配列番号４９または配列番号４９と少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一である配列を含み、但し、配列番号４９の位置１８４に整列するアミノ酸残基は、ロイシン、バリン、イソロイシンまたはメチオニンのうちの１つである。
【００６５】
いくつかの実施形態では、３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、配列番号１６９または配列番号１６９と少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一である配列を含み、但し、配列番号１６９の位置１８４に整列するアミノ酸残基は、システイン、ロイシン、バリン、イソロイシンまたはメチオニンのうちの１つである。
【００６６】
いくつかの実施形態では、３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、配列番号１１０を有するか、または配列番号１１０と少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一であり、但し、配列番号１１０のアミノ酸残基１８４に整列する３−ケトアシル−ＣｏＡのアミノ酸残基は、ロイシン、バリン、イソロイシンまたはメチオニンのうちの１つである。
【００６７】
いくつかの実施形態では、３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、配列番号１１９を有するか、または配列番号１１９と少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一であり、但し、配列番号１１９の位置１８４に整列するアミノ酸残基は、システイン、ロイシン、バリン、イソロイシンまたはメチオニンのうちの１つである。
【００６８】
他の実施形態では、３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、配列番号８、３５、８６、８８または８９のいずれかと少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一であり、但し、各場合において、配列番号８、３５、８６、８８または８９のいずれかのアミノ酸残基１８４に整列する３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、ロイシン、バリン、イソロイシンまたはメチオニンである。
【００６９】
特定の実施形態では、３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、配列番号９〜３４、３６〜３９、９２〜９３、１２１〜１５７または１７２〜２０４のいずれかを有するか、または配列番号９〜３４、３６〜３９、９２〜９３、１２１〜１５７または１７２〜２０４のいずれかと少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一であり、但し、各場合において、配列番号９〜３４、３６〜３９、９２〜９３、１２１〜１５７または１７２〜２０４のいずれかのアミノ酸残基１８４に整列する３−ケトアシル−ＣｏＡのアミノ酸残基は、ロイシン、バリン、イソロイシンまたはメチオニンのうちの１つである。
【００７０】
所定の実施形態では、３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、サブ配列の配列番号２、または配列番号２と少なくとも８０％同一の配列を含み、但し、配列番号２のアミノ酸残基６に整列する３−ケトアシル−ＣｏＡのアミノ酸残基は、イソロイシンまたはメチオニンである。配列番号２のアミノ酸残基６に整列するアミノ酸残基がシステインであること以外は配列番号２と同一であるサブ配列は、天然に存在する３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ、例えばＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｕｔｚｅｒｉ  ＡＴＣＣ  １７５８８のもの（配列番号９０、そのような配列はアミノ酸残基１８１〜１９０として現れ、システインはアミノ酸残基１８６として現れる）において現れる。このシステインの置換は、脂肪酸生成（及び脂肪酸誘導体の生成）をＣ６、Ｃ８及び／またはＣ１０脂肪酸及び誘導体へ、かつ長鎖化合物から遠ざかるようにシフトさせることが見出された。
【００７１】
前述のとおり、サブ配列の配列番号２を含む３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、ａ）配列番号４または配列番号１６１、ｂ）配列番号５及びｃ）配列番号６または配列番号１６２から選択される少なくとも１つのサブ配列を含み得る。３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは好ましくはこれらのサブ配列の各々を含む。サブ配列の配列番号４または配列番号１６１が存在する場合、サブ配列の配列番号４または配列番号１６１は、サブ配列の配列番号２の上流に存在し、その開始は、例えば、サブ配列の配列番号２の開始の２５〜３５アミノ酸残基、２８〜３２アミノ酸残基、または特に正確には３０アミノ酸残基上流に位置し得る。サブ配列の配列番号５が存在する場合、サブ配列の配列番号５は好ましくは、サブ配列の配列番号２の下流に存在し、サブ配列の配列番号５の開始は、例えば、サブ配列の配列番号２の開始の１００〜１２０アミノ酸残基、１１０〜１１８、特に正確には１１５または１１６アミノ酸残基下流に位置し得る。サブ配列の配列番号６または配列番号１６２が存在する場合、サブ配列の配列番号６または配列番号１６２は好ましくは、サブ配列の配列番号２の下流に存在し、サブ配列の配列番号６または配列番号１６２の開始は、例えば、そのような３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ酵素においてサブ配列の配列番号２の開始の１４０〜１６０アミノ酸残基、１４５〜１５５アミノ酸残基、特に正確には１４８、１４９または１５０アミノ酸残基下流に位置し得る。
【００７２】
サブ配列の配列番号２が存在するいくつかの実施形態では、３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、配列番号４０と少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一であり、但し、配列番号４０のアミノ酸残基１８６に整列する３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、イソロイシンまたはメチオニンである。
【００７３】
所定の実施形態では、３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、サブ配列の配列番号３、または配列番号３と少なくとも８０％同一の配列を含み、但し、配列番号３のアミノ酸残基６に整列する３−ケトアシル−ＣｏＡのアミノ酸残基は、イソロイシン、メチオニン、ロイシン、トレオニン、システイン、バリン、グルタミン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、アスパラギン及びチロシンのいずれか１つである。配列番号３のアミノ酸残基６に整列するアミノ酸残基がアラニンであること以外は配列番号３と同一のサブ配列は、天然に存在する３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ、例えばＡｌｉｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ａｇｒｉ  ＢＬ０６のもの（配列番号９１、そのような配列はアミノ酸残基１８１〜１９０として現れ、アラニンはアミノ酸残基１８６として現れる）において現れる。このアラニンの置換は、Ｃ６、Ｃ８及び／またはＣ１０脂肪酸及び誘導体を優先し、Ｃ１２脂肪酸及び誘導体の生成を著しく減少させることが見出された。
【００７４】
前述のとおり、サブ配列の配列番号３を含む３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、ａ）配列番号４または配列番号１６１、ｂ）配列番号５及びｃ）配列番号６または配列番号１６２から選択される少なくとも１つのサブ配列を含み得る。３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは好ましくはこれらのサブ配列の各々を含む。サブ配列の配列番号４または配列番号１６１が存在する場合、サブ配列の配列番号４または配列番号１６１は、サブ配列の配列番号３の上流に存在し、その開始は、例えば、サブ配列の配列番号３の開始の２５〜３５アミノ酸残基、２８〜３２アミノ酸残基、または特に正確には３０アミノ酸残基上流に位置し得る。サブ配列の配列番号５が存在する場合、サブ配列の配列番号５は好ましくは、サブ配列の配列番号３の下流に存在し、サブ配列の配列番号５の開始は、例えば、サブ配列の配列番号３の開始の１００〜１２０アミノ酸残基、１１０〜１１８、特に正確には１１５または１１６アミノ酸残基下流に位置し得る。サブ配列の配列番号６または配列番号１６２が存在する場合、サブ配列の配列番号６または配列番号１６２は好ましくは、サブ配列の配列番号３の下流に存在し、サブ配列の配列番号６または配列番号１６２の開始は、例えば、そのような３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ酵素においてサブ配列の配列番号３の開始の１４０〜１６０アミノ酸残基、１４５〜１５５アミノ酸残基、特に正確には１４８、１４９または１５０アミノ酸残基下流に位置し得る。
【００７５】
サブ配列の配列番号３が存在するいくつかの実施形態では、３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、配列番号４２のいずれかと少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一であり、但し、配列番号４２のアミノ酸残基１８６に整列する３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、イソロイシン、メチオニン、ロイシン、トレオニン、システイン、バリン、グルタミン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、アスパラギン及びチロシンのいずれか１つである。
【００７６】
サブ配列の配列番号３が存在するいくつかの実施形態では、３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、配列番号４３のいずれかと少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一であり、但し、配列番号４３のアミノ酸残基１８６に整列する３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、イソロイシンである。
【００７７】
サブ配列の配列番号３が存在するいくつかの実施形態では、３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、配列番号４２または配列番号４３を有する。
【００７８】
サブ配列の配列番号３が存在するいくつかの実施形態では、３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、配列番号４２を有し、
ａ）アミノ酸残基１８６は、イソロイシン、トレオニン、システイン、バリン、グルタミン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、アスパラギンまたはチロシンのいずれか１つであり；
ｂ）アミノ酸残基１８６は、イソロイシン、トレオニン、システイン、バリン、グルタミン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、アスパラギンまたはチロシンのいずれか１つであり、アミノ酸残基２４１は、メチオニン、フェニルアラニン、グルタミン酸、ロイシン、チロシンまたはアスパラギン酸のいずれか１つであり；
ｃ）アミノ酸残基１８６は、イソロイシン、トレオニン、システイン、バリン、グルタミン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、アスパラギンまたはチロシンのいずれか１つであり、アミノ酸残基２３９は、グルタミン、アスパラギン酸またはアスパラギンのいずれか１つであり；
ｄ）アミノ酸残基１８６は、イソロイシン、トレオニン、システイン、バリン、グルタミン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、アスパラギンまたはチロシンのいずれか１つであり、アミノ酸残基２４６は、リシンまたはアルギニンのいずれか１つであり；
ｅ）アミノ酸残基１８６は、イソロイシン、トレオニン、システイン、バリン、グルタミン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、アスパラギンまたはチロシンのいずれか１つであり、アミノ酸残基２３９は、グルタミン、アスパラギン酸またはアスパラギンのいずれか１つであり、アミノ酸残基２４１は、メチオニン、フェニルアラニン、グルタミン酸、ロイシン、チロシンまたはアスパラギン酸のいずれか１つであり；
ｆ）アミノ酸残基１８６は、イソロイシン、トレオニン、システイン、バリン、グルタミン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、アスパラギンまたはチロシンのいずれか１つであり、アミノ酸残基２３９は、グルタミン、アスパラギン酸、チロシンまたはアスパラギンのいずれか１つであり、アミノ酸残基２４６は、リシン及びアルギニンのいずれか１つであり；
ｇ）アミノ酸残基１８６は、イソロイシン、トレオニン、システイン、バリン、グルタミン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、アスパラギンまたはチロシンのいずれか１つであり、アミノ酸残基２４１は、メチオニン、フェニルアラニン、グルタミン酸またはアスパラギン酸のいずれか１つであり、アミノ酸残基２４６は、リシン及びアルギニンのいずれか１つであり；または
ｈ）アミノ酸残基１８６は、イソロイシン、トレオニン、システイン、バリン、グルタミン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、アスパラギンまたはチロシンのいずれか１つであり、アミノ酸残基２４３は、グルタミン酸であり、アミノ酸残基２４６は、ヒスチジン、リシン及びアルギニンのいずれか１つである。
【００７９】
いくつかの実施形態では、３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、サブ配列の配列番号１７０、または配列番号１７０と少なくとも８０％同一のサブ配列を含み、但し、（１）配列番号１７０のアミノ酸残基１に整列する３−ケトアシル−ＣｏＡのアミノ酸残基は、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、セリン、トレオニン、トリプトファンまたはチロシンのいずれか１つであり、（２）配列番号１７０のアミノ酸残基４に整列する３−ケトアシル−ＣｏＡのアミノ酸残基は、バリンまたはアラニンである。配列番号１７０は、配列番号１７１と、配列番号１７１のアミノ酸位置１におけるグリシンが配列番号１７０ではアラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、セリン、トレオニン、トリプトファンまたはチロシンのいずれか１つに置き換えられている点、及び更に位置４におけるアミノ酸がバリンであり得る点で異なる。配列番号１７１は、様々な天然に存在する３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼで見られるサブ配列を表す。配列番号１７１は、例えば、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｃｈｉｎｄｌｅｒｉ  ＣＩＰ  １０７２８７（配列番号８のアミノ酸残基５１〜６０として、アミノ酸残基５５はグルタミン酸である）；Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｃｈｉｎｄｌｅｒｉ  ＮＩＰＨ  ９００（配列番号８６のアミノ酸残基５１〜６０として、アミノ酸残基５５はグルタミン酸である）；Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｊｏｈｎｓｉｉ  ＳＨ０４６（配列番号３５のアミノ酸残基５１〜６０として、アミノ酸残基５５はグルタミン酸である）；Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｌｗｏｆｆｉｉ  ＳＨ１４５（配列番号８８のアミノ酸残基５１〜６０として、アミノ酸残基５はアスパラギン酸である）；Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ  ＮＩＰＨ  ７１３（配列番号８９のアミノ酸残基５１〜６０として、アミノ酸残基５５はグルタミン酸である）の天然に存在する３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼに現れる。
【００８０】
いくつかの実施形態では、３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、サブ配列の配列番号５０、または配列番号５０と少なくとも８０％同一のサブ配列を含み、但し、配列番号５０のアミノ酸残基４に整列する３−ケトアシル−ＣｏＡのアミノ酸残基は、アルギニンである。配列番号５０は、配列番号１０８と、配列番号１０８のリシンが配列番号５０ではアルギニンに置き換えられている点で異なる。配列番号１０８は、様々な天然に存在する３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼに見られるサブ配列を表す。配列番号１０８は、例えば、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｃｈｉｎｄｌｅｒｉ  ＣＩＰ  １０７２８７（配列番号８のアミノ酸残基２７５〜２８１として、アミノ酸残基２８０はグルタミンである）；Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｃｈｉｎｄｌｅｒｉ  ＮＩＰＨ  ９００（配列番号８６のアミノ酸残基２７５〜２８１として、アミノ酸残基２７９はグルタミンである）；Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｊｏｈｎｓｉｉ  ＳＨ０４６（配列番号３５のアミノ酸残基２７５〜２８１として、アミノ酸残基２８０はアスパラギンである）；Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｌｗｏｆｆｉｉ  ＳＨ１４５（配列番号８８のアミノ酸残基２７４〜２８０として、アミノ酸残基２７９はグルタミンである）；Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ  ＮＩＰＨ  ７１３（配列番号８９のアミノ酸残基２７４〜２８０として、アミノ酸残基２７９はグルタミンである）の天然に存在する３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼに現れる。このリシンの置換は、脂肪酸生成速度（及び脂肪酸誘導体の生成速度）を上昇させることが見出されている。
【００８１】
サブ配列の配列番号５０を含む３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、いくつかの実施形態では、配列番号５１、配列番号４、配列番号５及び配列番号６、またはそれらの任意の２つ以上の任意の組み合わせから選択される少なくとも１つのサブ配列を含む。３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは好ましくはサブ配列の配列番号５１、４、５及び６の各々を含む。サブ配列の配列番号４が存在する場合、それは好ましくはサブ配列の配列番号５０から上流である。サブ配列の配列番号４の開始は、例えば、サブ配列の配列番号５０の開始の１２０〜１３０、１２２〜１２８、または１２４〜１２５アミノ酸残基上流であり得る。サブ配列の配列番号５１が存在する場合、それは好ましくはサブ配列の配列番号５０から上流である。サブ配列の配列番号５１の開始は、例えば、サブ配列の配列番号５０の開始の９３〜１０３、９５〜１００、または９７〜９８アミノ酸残基上流であり得る。サブ配列の配列番号５が存在する場合、それは好ましくはサブ配列の配列番号５０から下流である。サブ配列の配列番号５の開始は、例えば、サブ配列の配列番号５０の開始の１０〜２０、１２〜１８、または正確には１５アミノ酸残基下流であり得る。サブ配列の配列番号６が存在する場合、それは好ましくはサブ配列の配列番号５０から下流である。サブ配列の配列番号５の開始は、例えば、サブ配列の配列番号５０の開始の４５〜５６、４９〜５３、または正確には５１アミノ酸残基下流であり得る。
【００８２】
サブ配列の配列番号５０を含む３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼはまた、サブ配列の配列番号５２、サブ配列の配列番号５３、サブ配列の配列番号４６、サブ配列の配列番号４８（但し、アミノ酸残基２７８はアルギニンである）またはサブ配列の配列番号１１０は（この場合も但し、アミノ酸残基２７８はアルギニンである）のいずれか１つ以上を含み得る。前記サブ配列の配列番号５２または５３の開始は、サブ配列の配列番号５０の開始の１２０〜１３０、１２２〜１２８または１２４〜１２６アミノ酸残基上流であり得る。サブ配列の配列番号５２の開始は、サブ配列の配列番号５０の開始の１２０〜１３０、１２２〜１２８または１２４〜１２６アミノ酸残基上流であり得る。サブ配列の配列番号４６の開始は、例えば、サブ配列の配列番号５０の開始の１０〜２０、１２〜１８、または正確には１５アミノ酸残基下流であり得る。サブ配列の配列番号５０を含む３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、サブ配列の配列番号５４を含み得、但し、配列番号５４のアミノ酸残基１２９は、アルギニンである。
【００８３】
配列番号５０を含む３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのサブ配列は、配列番号５５を含み得るか、または配列番号５５と少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一の配列を含み得、但し、配列番号５５におけるアミノ酸残基２７８に整列する３−ケトアシル−ＣｏＡのアミノ酸残基は、アルギニンである。配列番号５０を含む３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのサブ配列は、配列番号１１１を有し得るか、または配列番号１１１と少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一であり得、但し、配列番号１１１におけるアミノ酸残基２７８に整列する３−ケトアシル−ＣｏＡのアミノ酸残基は、アルギニンである。
【００８４】
いくつかの実施形態では、３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、サブ配列の配列番号５６、または配列番号５６と少なくとも８０％同一のサブ配列を含み、但し、配列番号５６のアミノ酸残基６に整列する３−ケトアシル−ＣｏＡのアミノ酸残基は、アラニンである。配列を比較することによって分かるように、配列番号５６は、配列番号１０９と、配列番号１０９のアミノ酸残基位置６におけるバリンが配列番号５６ではアラニンに置き換えられている点で異なる。配列番号１０９は、様々な天然に存在する３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼに見られるサブ配列を表す。配列番号１０９は、例えば、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｃｈｉｎｄｌｅｒｉ  ＣＩＰ  １０７２８７（配列番号８のアミノ酸残基２９１〜３００として）及びＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｃｈｉｎｄｌｅｒｉ  ＮＩＰＨ  ９００（配列番号８６のアミノ酸残基２９１〜３００として）の天然に存在する３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼに現れる。このバリンのアラニンによる置換は、脂肪酸生成速度（及び脂肪酸誘導体の生成速度）を上昇させることが見出されている。
【００８５】
サブ配列の配列番号５６を含む３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、いくつかの実施形態では、配列番号５１、配列番号４、及び配列番号６、またはそれらの任意の２つ以上の任意の組み合わせから選択される少なくとも１つのサブ配列を含む。３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは好ましくはサブ配列の配列番号５１、４、及び６の各々を含む。サブ配列の配列番号５１の開始は、サブ配列の配列番号５６の開始から１０９〜１２０、１１２〜１１６または１１４アミノ酸残基上流であり得る。サブ配列の配列番号４の開始は、サブ配列の配列番号５６の開始から１３５〜１４８、１３９〜１４３または１４１アミノ酸残基上流であり得る。サブ配列の配列番号６の開始は、サブ配列の配列番号５６の開始から３０〜４０、３３〜３７または３５アミノ酸残基下流であり得る。
【００８６】
サブ配列の配列番号５６を含む３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼはまた、サブ配列の配列番号５２、サブ配列の配列番号５３、またはサブ配列の配列番号４８のいずれか１つ以上を含み得る。サブ配列の配列番号５２または５３の開始は、サブ配列の配列番号５６の開始から１３５〜１４８、１３９〜１４３または１４１アミノ酸残基上流であり得る。サブ配列の配列番号４８の開始は、サブ配列の配列番号５６の開始から２８５〜２９５、２８８〜２９２または２９０アミノ酸残基上流であり得る。サブ配列の配列番号５６を含む３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、サブ配列の配列番号５８を含み得る。
【００８７】
配列番号５６を含む３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのサブ配列は、配列番号５９を有し得るか、または配列番号５９と少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一であり得、但し、配列番号５９におけるアミノ酸残基２９６に整列する３−ケトアシル−ＣｏＡのアミノ酸残基は、アラニンである。配列番号５６を含む３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのサブ配列は、配列番号１１２を有し得るか、または配列番号１１２と少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一であり得、但し、配列番号１１２におけるアミノ酸残基２９６に整列する３−ケトアシル−ＣｏＡのアミノ酸残基は、アラニンである。
【００８８】
いくつかの実施形態では、３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、サブ配列の配列番号６０、または配列番号６０と少なくとも８０％同一のサブ配列を含み、但し、配列番号６０のアミノ酸残基２に整列する３−ケトアシル−ＣｏＡのアミノ酸残基は、ロイシンであり、配列番号６０のアミノ酸残基１０に整列する３−ケトアシル−ＣｏＡのアミノ酸残基は、グルタミンである。配列を比較することによって分かるように、配列番号６０は、配列番号１１６と、配列番号１１６のアミノ酸残基位置２におけるメチオニンが配列番号６０ではロイシンに置き換えられている点で異なる。配列番号１１６は、様々な天然に存在する３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼに見られるサブ配列を表す。配列番号１１６は、例えば、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｃｈｉｎｄｌｅｒｉ  ＣＩＰ  １０７２８７（配列番号８のアミノ酸残基１７７〜１９０として）及びＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｃｈｉｎｄｌｅｒｉ  ＮＩＰＨ  ９００（配列番号８６のアミノ酸残基１７７〜１９０として）の天然に存在する３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼに現れる。このメチオニンのロイシンによる置換は、脂肪酸生成速度（及び脂肪酸誘導体の生成速度）を上昇させることが見出されている。
【００８９】
サブ配列の配列番号６０を含む３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、サブ配列の配列番号４を更に含み得る。サブ配列の配列番号４の開始は、サブ配列の配列番号６０の開始から２２〜３２、２５〜２９または２７アミノ酸残基上流であり得る。そのような３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、サブ配列の配列番号６１またはサブ配列の配列番号６２を有し得る。
【００９０】
サブ配列の配列番号６０を含む３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、いくつかの実施形態では、配列番号５及び配列番号６から選択される少なくとも１つのサブ配列を含む。サブ配列の配列番号５の開始は、サブ配列の配列番号６０の開始の１０９〜１２０、１１〜１１５または１１２〜１１３アミノ酸残基下流であり得る。サブ配列の配列番号６の開始は、サブ配列の配列番号６０の開始の１４３〜１５３、１４６〜１５１または１４８〜１４９アミノ酸残基上流であり得る。３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは好ましくはサブ配列の配列番号４、５及び６の各々を含む。
【００９１】
サブ配列の配列番号６０、配列番号４、配列番号５及び配列番号６を含む３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、サブ配列の配列番号６３を含み得る。
【００９２】
サブ配列の配列番号６０を含む３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼはまた、サブ配列の配列番号４８を含み得る。サブ配列の配列番号４８の開始は、サブ配列の配列番号６０の開始から１７３〜１８３、１７５〜１７９または１７７アミノ酸残基上流であり得る。配列番号６０を含む３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのサブ配列は、配列番号６４を含み得るか、または配列番号６４と少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一である配列を含み得、但し、位置１７８におけるアミノ酸残基はロイシンであり、位置１８６におけるアミノ酸残基はグルタミンである。配列番号６０を含む３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのサブ配列は、配列番号１１３を有し得るか、または配列番号１１３と少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一であり得、但し、位置１７８におけるアミノ酸残基はロイシンであり、位置１８６におけるアミノ酸残基はグルタミンである。
【００９３】
いくつかの実施形態では、３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、サブ配列の配列番号６５、または配列番号６５と少なくとも８０％同一のサブ配列を含み、但し、配列番号６５の位置２におけるアミノ酸残基に整列する３−ケトアシル−ＣｏＡのアミノ酸残基は、アラニンである。配列を比較することによって分かるように、配列番号６５は、配列番号９７と、配列番号９７のアミノ酸残基位置２におけるバリンが配列番号６５ではアラニンに置き換えられている点で異なる。配列番号９７は、様々な天然に存在する３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼに見られるサブ配列を表す。配列番号９７は、例えば、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｃｈｉｎｄｌｅｒｉ  ＣＩＰ  １０７２８７（配列番号８のアミノ酸残基３１６〜３３１として、アミノ酸残基３１９はロイシンであり、アミノ酸残基３２２はアスパラギン酸である）；Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｃｈｉｎｄｌｅｒｉ  ＮＩＰＨ  ９００（配列番号８６のアミノ酸残基３１６〜３３１として、アミノ酸残基３１９はロイシンであり、アミノ酸残基３２２はアスパラギン酸である）；Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｊｏｈｎｓｉｉ  ＳＨ０４６（配列番号３５のアミノ酸残基３１６〜３３１として、アミノ酸残基３１９はイソロイシンであり、アミノ酸残基３２２はアスパラギン酸である）；Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｌｗｏｆｆｉｉ  ＳＨ１４５（配列番号８８のアミノ酸残基３１５〜３３０として、アミノ酸残基３１８はイソロイシンであり、アミノ酸残基３２１はアスパラギンである）；Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ  ＮＩＰＨ  ７１３（配列番号８９のアミノ酸残基３１５〜３３０として、アミノ酸残基３１８はメチオニンであり、アミノ酸残基３２１はアスパラギンである）；の天然に存在する３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼに現れる。このバリンのアラニンでの置換は、脂肪酸生成速度（及び脂肪酸誘導体の生成速度）を上昇させることが見出されている。
【００９４】
サブ配列の配列番号６５を含む３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、サブ配列の配列番号５を更に含み得る。サブ配列の配列番号６５の開始は、サブ配列の配列番号６５の開始から２０〜３１、２４〜２８または２６アミノ酸残基上流であり得る。サブ配列の配列番号６５及びサブ配列の配列番号５を含む３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、サブ配列の配列番号６６を含み得る。
【００９５】
サブ配列の配列番号６５を含む３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、サブ配列の配列番号５１を更に含み得る。サブ配列の配列番号５１の開始は、サブ配列の配列番号６５の開始の１３４〜１４４、１３６〜１４０または１３８〜１３９アミノ酸残基上流であり得る。
【００９６】
サブ配列の配列番号６５を含む３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、サブ配列の配列番号４を含み得る。サブ配列の配列番号６５及びサブ配列の配列番号４を含む３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、サブ配列の配列番号５３またはサブ配列の配列番号６７を含み得る。サブ配列の配列番号４、５３または６７の開始は、サブ配列の配列番号６５の開始から１６０〜１７０、１６３〜１６８または１６５〜１６６アミノ酸残基上流であり得る。
【００９７】
サブ配列の配列番号６５を含む３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、サブ配列の配列番号４８のいずれかを更に含み得る。サブ配列の配列番号４８の開始は、サブ配列の配列番号６５の開始から３１０〜３２０、３１３〜３１６、または３１４〜３１５アミノ酸残基上流であり得る。サブ配列の配列番号６５を含む３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、サブ配列の配列番号６８、または配列番号６８と少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一のサブ配列を含み得、但し、配列番号６８のアミノ酸残基３１７に整列する３−ケトアシル−ＣｏＡのアミノ酸残基は、アラニンである。サブ配列の配列番号６５を含む３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、配列番号１１４を有し得るか、または配列番号１１４と少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一であり得、但し、配列番号１１４のアミノ酸残基３１７に整列する３−ケトアシル−ＣｏＡのアミノ酸残基は、アラニンである。
【００９８】
いくつかの実施形態では、３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、サブ配列の配列番号６９、または配列番号６９と少なくとも８０％同一のサブ配列を含み、但し、配列番号６９の位置６におけるアミノ酸残基に整列する３−ケトアシル−ＣｏＡのアミノ酸残基は、イソロイシンである。配列を比較することによって分かるように、配列番号６９は、配列番号１０７と、配列番号１０７のアミノ酸残基位置６におけるメチオニンが配列番号６９ではイソロイシンに置き換えられている点で異なる。配列番号１０７は、様々な天然に存在する３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼに見られるサブ配列を表す。配列番号１０７は、例えば、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｃｈｉｎｄｌｅｒｉ  ＣＩＰ  １０７２８７（配列番号８のアミノ酸残基２６６〜２７４として、アミノ酸残基２６８はバリンであり、アミノ酸残基２７４はリシンである）；Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｃｈｉｎｄｌｅｒｉ  ＮＩＰＨ  ９００（配列番号８６のアミノ酸残基２６６〜２７４として、アミノ酸残基２６８はバリンであり、アミノ酸残基２７４はリシンである）；Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｊｏｈｎｓｉｉ  ＳＨ０４６（配列番号３５のアミノ酸残基２６６〜２７４として、アミノ酸残基２６８はバリンであり、アミノ酸残基２７４はアラニンである）；Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｌｗｏｆｆｉｉ  ＳＨ１４５（配列番号８８のアミノ酸残基２６５〜２７３として、アミノ酸残基２６７はバリンであり、アミノ酸残基２７３はアラニンである）；Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ  ＮＩＰＨ  ７１３（配列番号８９のアミノ酸残基２６５〜２７３として、アミノ酸残基２６７はバリンであり、アミノ酸残基２７３はアラニンである）の天然に存在する３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼに現れる。このメチオニンのイソロイシンでの置換は、脂肪酸生成速度（及び脂肪酸誘導体の生成速度）を上昇させることが見出されている。
【００９９】
サブ配列の配列番号６９を含む３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、サブ配列の配列番号５１を更に含み得る。サブ配列の配列番号５１の開始は、サブ配列の配列番号６９の開始から８５〜９５、８７〜９１または８８〜８９アミノ酸残基上流であり得る。
【０１００】
サブ配列の配列番号６９を含む３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、サブ配列の配列番号４、５及び６のいずれかまたは全てを更に含み得る。サブ配列の配列番号６９及びサブ配列の配列番号４を含む３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、サブ配列の配列番号５２またはサブ配列の配列番号５３を含み得る。サブ配列の配列番号６９、サブ配列の配列番号５及びサブ配列の配列番号６を含む３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、サブ配列の配列番号４６を含み得る。サブ配列の配列番号６９、４、５及び６を含む３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、サブ配列の配列番号７０を含み得る。
【０１０１】
サブ配列の配列番号６９を含む３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、サブ配列の配列番号４８を含み得る。サブ配列の配列番号６９を含む３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、サブ配列の配列番号７１を含み得るか、またはサブ配列の配列番号７１と少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一のサブ配列を含み得、但し、配列番号７１のアミノ酸残基２７１に整列する３−ケトアシル−ＣｏＡのアミノ酸残基は、イソロイシンである。そのような３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、配列番号１１５を有し得るか、またはサブ配列の配列番号１１５と少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一であり得、但し、配列番号１１５のアミノ酸残基２７１に整列する３−ケトアシル−ＣｏＡのアミノ酸残基は、イソロイシンである。
【０１０２】
非天然脂肪酸合成経路における更なる反応工程
アシル−ＣｏＡとマロニル−ＣｏＡとの反応は、３−ケトアシル−ＣｏＡ化合物を生成し、これは対応するアシル化合物に還元されなければならず、その後にそれはマロニル−ＣｏＡの別の分子と縮合して鎖を延長することができる。還元は３工程で起こり、最初は３−ケトアシル基の対応する３−ヒドロキシアシル基への還元である。第２の反応は、対応する３−エノイル化合物への脱水であり、これは第３工程で対応するアシル−ＣｏＡに還元される。第１の反応工程は、ケト−ＣｏＡレダクターゼ（ＫＣＲ）酵素（ＥＣ１．１．１．３５）によって酵素的に触媒される。第２の工程は、３−ヒドロキシ−アシル−ＣｏＡデヒドラターゼ（３ＨＤｈ）酵素（ＥＣ４．２．１．１７）によって酵素的に触媒される。いくつかの２機能性酵素は、第１及び第２の工程の反応の両方を触媒する（ＥＣ１．１．１．３５及びＥＣ４．２．１．５５）。第３の反応工程は、エノイル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣＲ）酵素（ＥＣ１．１．１．３２）によって酵素的に触媒される。
【０１０３】
したがって、遺伝子組換え細胞は、好ましくは、（１）ＫＣＲ酵素をコードする異種ＫＣＲ遺伝子；（２）３ＨＤｈ酵素をコードする異種３ＨＤｈ遺伝子；（３）第１及び第２の反応工程の両方を触媒する２機能性酵素（ＥＣ１．１．１．３５及び４．１．２．５５）をコードする異種遺伝子及び（４）ＥＣＲ酵素をコードする異種ＥＣＲ遺伝子のうちの少なくとも１つを更に含む。好ましくは、遺伝子組み換え細胞は、少なくとも（１）、（２）及び（４）または少なくとも（３）及び（４）を含有する。各場合において、遺伝子は好ましくは、宿主細胞において活性なプロモーター及び／またはターミネーター配列活性の制御下にある。
【０１０４】
ＫＣＲ酵素は、例えば、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ｐａｆａｄＢ遺伝子によってコードされる及び／または配列番号１０３と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％同一のアミノ酸配列を有するもの、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ｆａｄＧ遺伝子によってコードされる及び／または配列番号１０２と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％同一のアミノ酸配列を有するもの、Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ  ｈｂｄ遺伝子によってコードされる及び／または配列番号１０１と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％同一のアミノ酸配列を有するもの、及びＷＯ２０１５／０１０１０３に記載されている他のものであり得る。
【０１０５】
３ＨＤｈ酵素は、例えば、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  ｃｒｔ（短鎖−エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ）遺伝子によってコードされる及び／または配列番号９９と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％同一のアミノ酸配列を有するもの、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ  ｅｃｈ（エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ／アルドラーゼ）遺伝子によってコードされる及び／または配列番号１００と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％同一のアミノ酸配列を有するもの、及びＷＯ２０１５／０１０１０３に記載されている他のものであり得る。
【０１０６】
第１及び第２の反応工程の両方を触媒する好適な２機能性酵素には、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｆａｄＢ遺伝子によってコードされる及び／または配列番号９８と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％同一のアミノ酸配列を有するもの；Ｒ．ｎｏｖｅｇｉｃｕｓ  ｅｃｈ２遺伝子によってコードされるもの、及びＷＯ２０１５／０１０１０３に記載されている他のものが含まれる。
【０１０７】
好適なＥＣＲ酵素には、例えば、Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ  ｔｅｒ遺伝子によってコードされる及び／または配列番号８４と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％同一のアミノ酸配列を有するものが含まれる。
【０１０８】
本発明の遺伝子組換え細胞は、いくつかの実施形態では、３−ケトブチリル−ＣｏＡシンターゼをコードする、上述した組換え３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼとは異なる少なくとも１つの異種３−ケトブチリル−ＣｏＡシンターゼ遺伝子を更に含む。異種３−ケトブチリル−ＣｏＡシンターゼ遺伝子は、ＷＯ２０１５／１０１０３の配列番号１〜１２０として特定されたもののいずれかと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％同一である３−ケトブチリル−ＣｏＡシンターゼ酵素をコードし得る。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、異種３−ケトブチリル−ＣｏＡシンターゼ遺伝子は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  Ｓｐ  ＣＬ１９０遺伝子及び／または配列番号８３と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％同一であるＮｐｈＴ７酵素をコードする遺伝子である。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子組換え細胞は、ＷＯ２０１５／１０１０３に記載されている組換えＮｐｈＴ７酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子を含む。組換えＮｐｈＴ７酵素は、配列番号８３に対して少なくとも７０％であるが１００％未満を有するアミノ酸配列を含む。組み換えＮｐｈＴ７酵素は、例えば、Ｈ１００Ｌ、Ｉ１４７Ｔ、Ｆ２１７Ｖ、Ｙ１４４Ｌ、Ｖ１５７Ｆ、Ｇ３０９Ｓ、Ｇ２８８Ｓ、アミノ酸残基８６〜８９についてのＰＤＲＰからＨＦＬＱへの置換、Ｉ１４７Ｆ、Ｉ１４７Ｍ、Ｉ１４７Ｑ、Ｉ１４７Ｓ、Ｉ１４７Ｃ、１１４７Ｅ、Ｉ１４７Ｎ、Ｉ１４７Ｗ、Ｉ１４７Ｄ、Ｉ１４７Ｒ、Ｉ１４７Ｐ、Ｉ１４７Ｌ、Ｖ１９６Ｇ、Ｉ１４７Ｇ、Ｉ１４７Ｈ、Ｉ１４７Ｋ、Ｉ１４７Ｖ、Ｉ１４７Ａ、Ｉ１４７Ｙ、Ｆ２１７Ｇ、Ｆ２１７Ａ、Ｆ２１７Ｌ、Ｆ２１７Ｉ、Ｆ２１７Ｍ、Ｆ２１７Ｔ、Ｆ２１７Ｐ、Ｆ２１７Ｓ、Ｆ２１７Ｅ、Ｆ２１７Ｌ、Ｆ２１７Ｖ、Ｆ２１７Ｗ、Ｓ３２３Ａ及びＳ３２３Ｖ、ならびにこれらの２つ以上の任意の組み合わせからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を有し得る。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、組換えＮｐｈＴ７酵素は、Ｉ１４７Ｖ、Ｉ１４７Ｓ、Ｉ１４７Ｔからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換、及びＨ１００Ｌ、Ｆ２１７Ｖ、Ｓ３２３Ａ及びＳ３２３Ｖから選択される少なくとも１つの追加的なアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、組換えＮｐｈＴ７酵素は配列番号８２に相当する。いくつかの実施形態では、組み換えられたＮｐｈＴ７酵素は、Ｉ１４７Ｖ、Ｉ１４７ＳまたはＩ１４７Ｔアミノ酸置換及びＳ３２３Ａアミノ酸置換を含む（アミノ酸１００がＨであり、アミノ酸１４７がＶ、ＳまたはＴであり、アミノ酸２１７がＦであり、アミノ酸３２３がＡである配列番号８２に相当する）。いくつかの実施形態では、組み換えられたＮｐｈＴ７酵素は、Ｈ１００Ｌ置換、Ｉ１４７Ｖ、Ｉ１４７ＳまたはＩ１４７Ｔアミノ酸置換、Ｆ２１７Ｖ置換及びＳ３２３Ａアミノ酸置換を含む（アミノ酸残基１００がＬであり、アミノ酸残基１４７がＶ、ＳまたはＴであり、アミノ酸残基２１７がＶであり、アミノ酸残基３２３がＡである配列番号８２に相当する）。
【０１１２】
所定の実施形態では、本発明の遺伝子組み換え細胞は、（１）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  Ｓｐ  ＣＬ１９０  ｎｐｈＴ７遺伝子または配列番号８３と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％同一であるＮｐｈＴ７酵素をコードする遺伝子（２）Ｈ１００Ｌ、Ｉ１４７Ｔ、Ｆ２１７Ｖ、Ｙ１４４Ｌ、Ｖ１５７Ｆ、Ｇ３０９Ｓ、Ｇ２８８Ｓ、アミノ酸残基８６〜８９についてのＰＤＲＰからＨＦＬＱへの置換、Ｉ１４７Ｆ、Ｉ１４７Ｍ、Ｉ１４７Ｑ、Ｉ１４７Ｓ、Ｉ１４７Ｃ、１１４７Ｅ、Ｉ１４７Ｎ、Ｉ１４７Ｗ、Ｉ１４７Ｄ、Ｉ１４７Ｒ、Ｉ１４７Ｐ、Ｉ１４７Ｌ、Ｖ１９６Ｇ、Ｉ１４７Ｇ、Ｉ１４７Ｈ、Ｉ１４７Ｋ、Ｉ１４７Ｖ、Ｉ１４７Ａ、Ｉ１４７Ｙ、Ｆ２１７Ｇ、Ｆ２１７Ａ、Ｆ２１７Ｌ、Ｆ２１７Ｉ、Ｆ２１７Ｍ、Ｆ２１７Ｔ、Ｆ２１７Ｐ、Ｆ２１７Ｓ、Ｆ２１７Ｅ、Ｆ２１７Ｌ、Ｆ２１７Ｖ、Ｆ２１７Ｗ、Ｓ３２３Ａ及びＳ３２３Ｖ、ならびにこれらの２つ以上の任意の組み合わせからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を有する組み換えＮｐｈＴ７酵素の両方を含む。好ましい実施形態では、遺伝子組み換え細胞は、配列番号８３を有する酵素をコードする遺伝子及び配列番号８２を有する酵素をコードする別の遺伝子を含む。特に好ましい実施形態では、遺伝子組み換え細胞は、配列番号８３を有する酵素をコードする遺伝子及び配列番号８２を有する酵素をコードする別の遺伝子（アミノ酸残基１００がＨまたはＬであり、アミノ酸残基１４７がＳ、ＴまたはＶであり、アミノ酸残基２７１がＦまたはＶであり、アミノ酸残基３２３がＡである）を含む。
【０１１３】
本発明の遺伝子組み換え細胞は、アシル伸長サイクルを終結させ、かつ所望の鎖長を有する生成物を生成する１つ以上の酵素を生成する。そのような終結酵素は異種であってもなくてもよい。終結酵素の選択は、所望の生成物が脂肪酸またはその誘導体、例えば脂肪アルコール、脂肪アルデヒド、脂肪アルケン、脂肪アミド、脂肪エステルまたは脂肪アルカンであるかどうかに依存し得る。
【０１１４】
本発明の細胞は、いくつかの実施形態では、アシル−ＣｏＡエステラーゼなどのチオエステラーゼをコードする異種チオエステラーゼ遺伝子を含み、その場合、生成物は脂肪酸である。好適なチオエステラーゼには、ＷＯ２０１５／１０１０１３の表１１に記載されているものが含まれる。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、本発明の細胞は、エステルシンターゼをコードする遺伝子を含み、その場合、生成物は典型的には脂肪酸エステルである。好適なエステルシンターゼは、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ａｑｕａｃｏｌｅｉ  Ｍａｑ１酵素（ＷＯ２０１５／１０１０３の配列番号２８９）、Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｙｏｈａｌｏｅｎｔｉｓ  Ｐｃｒｙ１酵素（ＷＯ２０１５／１０１０３の配列番号２９０）、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊｏｓｔｉｉ  Ｒｊｏｓ１酵素（ＷＯ２０１５／１０１０３の配列番号２９１）、Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｘ  ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓ菌株ＳＫ２  Ａｂｏｒｋ１酵素（ＷＯ２０１５／１０１０３の配列番号２９２）及びＨａｈｅｌｌａ  ｃｈｅｊｕｅｎｓｉｓ  ｈｃｈｅ遺伝子（配列番号１０４）のいずれかと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または少なくとも１００％同一のアミノ酸配列を有する。エステルシンターゼは、Ｈａｈｅｌｌａ  ｃｈｅｊｕｅｎｓｉｓ  Ｈｃｈｅエステルシンターゼ（配列番号１０４）と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または少なくとも１００％同一のアミノ酸配列を有し得る。
【０１１６】
本発明の遺伝子組換え細胞はまた、脂肪アシル−ＣｏＡレダクターゼ（アルコールまたはアルデヒド形成）、脂肪アルデヒドレダクターゼ、アシル−ＡＣＰレダクターゼ、アシル−ＣｏＡ：ＡＣＰアシルトランスフェラーゼ、アシル−ＣｏＡヒドロラーゼ、カルボン酸レダクターゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ及び／またはアシル−ＡＣＰレダクターゼのうちの１つ以上をコードする１つ以上の遺伝子を含み得る。
【０１１７】
本発明の遺伝子組み換え細胞はまた、（Ａ）カルボキシルトランスフェラーゼサブユニットα酵素（ＥＣ６．３．１．２）、例えばＥ．Ｃｏｌｉ  ａｃｃＡ酵素またはそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％同一である酵素をコードする１つ以上の遺伝子；（Ｂ）ビオチンカルボキシル担体タンパク質（ＥＣ６．４．１．２）、例えばＥ．ｃｏｌｉ  ａｃｃＢまたはそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％同一である酵素をコードする１つ以上の遺伝子；（Ｃ）ビオチンカルボキシラーゼサブユニット酵素（ＥＣ６．３．４．１４）、例えばＥ．ｃｏｌｉ  ａｃｃＣ酵素またはそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％同一である酵素をコードする１つ以上の遺伝子；（Ｄ）カルボキシルトランスフェラーゼサブユニットβ（ＥＣ６．４．１．２）、例えばＥ．ｃｏｌｉ  ａｃｃＤ酵素またはそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％同一である酵素、またはこれらの任意の２つ以上の組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態では、（Ａ）〜（Ｄ）の全てが存在する。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子組み換え細胞は、以下の酵素のうちの１つ以上の生成を完全にまたは部分的に阻害する１つ以上の追加的な遺伝子組み換えを更に含む：
例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｇｓＡ遺伝子によってコードされるメチルグリオキサールシンターゼ（ＥＣ４．２．３．３）。
例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｌｄｈＡ遺伝子によってコードされるラクテートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．２７）。
例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｐｔａ遺伝子によってコードされるホスホトランスアセチラーゼ（ＥＣ２．３．１．８）。
例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ａｃｋＡ遺伝子によってコードされるアセテートキナーゼ（ＥＣ２．７．２．１）。
例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｆａｄＤ遺伝子によってコードされるアシル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ６．２．１．３）。
例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｐｆｌＢ遺伝子によってコードされるピルベートホルメートリアーゼ（ＥＣ２．３．１．５４）。
例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｐｏｘＢ遺伝子によってコードされるピルベートオキシダーゼ（ＥＣ１．２．２．２）。
縮合アセトアルデヒド−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．１０）。
例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｔｉｇ遺伝子によってコードされるトリガーファクター（ＥＣ５．２．１．８）。
例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｈｓｄｒ５１４遺伝子によってコードされる制限エンドヌクレアーゼ（ＥＣ３．１．２１．３）。
ａｔｏＤＡＥＢオペロン。
例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｔｅｓＢまたはｙｃｉＡ遺伝子によってコードされるアシル−ＣｏＡチオエステラーゼ（ＥＣ３．１．２．−）。
例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｆａｄＥ遺伝子によってコードされるアシル−補酵素Ａデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．３．８．７）。
例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｆａｄＡ遺伝子によってコードされる３−ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ（ＥＣ２．３．１．１６）。
例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ａｒａＢ遺伝子によってコードされるＬ−リブロキナーゼ（ＥＣ２．７．１．１６）。
例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ａｒａＤ遺伝子によってコードされるＬ−リブロース−５−ホスフェート−４−エピメラーゼ（ＥＣ５．１．３．４）。
例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｌａｃＺ遺伝子によってコードされるベータ−Ｄ−ガラクトシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２３）。
ラムダ相溶原菌。
例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｒｈａＤ遺伝子によってコードされるラムヌロース−１−ホスフェートアルドラーゼ（ＥＣ４．１．２．１９）。
例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｒｈａＢ遺伝子によってコードされるラムロキナーゼ（ＥＣ２．７．１．５）。
Ｆ接合因子。
Ｒｐｈ−１遺伝子。
【０１１９】
ＷＯ２０１５／１０１０３に記載されているもののいずれかを含む、他の遺伝子組み換えが細胞中に存在し得る。
【０１２０】
任意の異種遺伝子は、宿主菌株において機能的であるプロモーター及び／またはターミネーター配列に機能的に連結され得る。プロモーターは、所定の条件下でのみ機能する誘導性プロモーターであり得る。例えば、野生型Ｅ．ｃｏｌｉ  ｐｈｏＥ遺伝子のプロモーター（ＰｐｈｏＥ）プロモーターなどの低ホスフェート誘導性プロモーターは、３−ケトアシルシンターゼ遺伝子のための有用なプロモーターである。そのようなプロモーターは低いホスフェート環境下で活性である。したがって、本発明の３−ケトアシルシンターゼ遺伝子がＥ．ｃｏｌｉ  ｐｈｏＥプロモーターまたは別の低ホスフェート誘導性プロモーターの制御下にある微生物は、２５ｍＭ以下のホスフェート、特に２０ｍＭ以下、２ｍＭ以下、１ｍＭ以下、０．５ｍＭ以下、または０．２５ｍＭ以下のホスフェートを含有する発酵培地中で培養され得る。
【０１２１】
任意の異種遺伝子は、宿主菌株のゲノム中に組み込まれ得、及び／または１つ以上のプラスミド中に存在し得る。ゲノムに組み込まれる場合、異種遺伝子は、標的のまたはランダムな位置に挿入され得る。エレクトロポレーション及び当該技術分野で知られている化学的方法（塩化カルシウム法及び／または酢酸リチウム法を含む）などの形質転換方法が好適である。好適な形質転換方法の例は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ  Ｅｄ．Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ  ２０１２に記載されている。一般に、本発明の遺伝子組み換え細胞を生成するのに特別な形質転換方法は必要ではない。
【０１２２】
天然遺伝子の欠失及び／または破壊は、形質転換法によって、突然変異生成によって及び／または強制進化法によって実施され得る。変異誘発法では、細胞の高い死滅速度（６０〜９９．９％、好ましくは９０〜９９．９％）を達成するのに十分な条件下で細胞を紫外線または変異誘発物質に暴露する。次いで生存細胞をプレーティングし、欠失または破壊された代謝活性を有する細胞について選択またはスクリーニングする。所望の天然遺伝子（複数可）の破壊または欠失は、ＰＣＲまたはサザン分析法により確認され得る。
【０１２３】
本明細書に記載の遺伝子組換え細胞は、直鎖アルキル基を有する化合物を生成するために使用される。そのような化合物を生成するような条件下で細胞を増殖させ、化合物を回収する。
【０１２４】
宿主細胞が植物細胞である場合、植物を成長させることができ、植物の成長中に化合物が蓄積する植物またはその任意の部分、例えば根、茎、葉、花、種子、種子鞘などから直鎖アルキル基を有する化合物を回収することができる。
【０１２５】
本発明の単細胞及び他のミクロ細胞は、そのような化合物を生成するための培養プロセスで使用され得る。
【０１２６】
培養は、一般に、細胞によって代謝されて、特定の細胞によって必要とされ得るような生成物化合物及び栄養素を生成することが可能な少なくとも１つの炭素源を含む培地を形成することによって実施される。栄養素は、例えば、酵母エキス、ペプトン、トリプトン、大豆粉、コーン浸出液、またはカゼインなどの少なくとも１つの窒素源、少なくとも１つのリン源、ビオチン、ビタミンＢ１２及びビタミンＢ１２の誘導体、チアミン、パントテン酸塩などの１つ以上のビタミン、１つ以上の微量金属などを含み得る。発酵媒体はまた、発泡防止剤、殺生物剤、緩衝剤などの追加の材料を含有し得る。
【０１２７】
脂肪酸エステルの生成などのいくつかの場合では、培地はまた、所望の生成物を生成するために直鎖化合物と反応する試薬を含み得る。脂肪酸エステルの特定の場合では、例えば、培地は好ましくは、メタノール、エタノールまたはＣ３−Ｃ８アルカノールなどのアルカノールを含有する。アルカノールは反応して対応するエステルを生成する。天然または異種エステルシンターゼ、または他の適切な酵素は、そのような反応を触媒するために細胞によって発現され得る。
【０１２８】
一般に、培地に本発明の細胞を接種し、生成に好適な細胞密度まで細胞密度を増加させるように接種物を培地中で培養する。次いで培地を細胞が所望の生成物を生成するのに十分な条件で維持する。
【０１２９】
好適な培養条件は、当然ながら、特定の宿主菌株の必要性に依存する。培地の温度は、例えば、２０〜７０℃であり得、２５〜４０℃の温度がほとんどの細胞にとって好ましい。
【０１３０】
培地のｐＨは、例えば、２．０〜１０．０、３．０〜９．０または６．０〜ｐＨ８．５であり得る。
【０１３１】
本発明の実施形態は、バッチ式、フェッドバッチ式または連続式プロセスを使用して実行され得、生物学的生成の任意の既知のモードが好適であろうことが企図される。
【０１３２】
培養は、特定の細胞に必要とされるかまたは許容され得るように、好気的、微好気的、または嫌気的条件下で実施され得る。
【０１３３】
一般に、発酵を実施するために特別な培養機器は必要ない。機器は、例えば、細胞及び培地を保持するのに好適なタンク；内容物を培養タンクから抽出及び／または分離容器に排出するためのライン；及び細胞培養廃棄物から化学生成物を除去するのに好適な抽出及び／または分離容器を含み得る。
【０１３４】
炭素源は、炭素源として本発明の細胞によって代謝され得る１つ以上の炭素含有化合物である。好適な炭素源の例には、糖、例えばグルコース、スクロース、フルクトース、ラクトース、Ｃ−５糖、例えばキシロース及びアラビノース、グリセロール及び多糖、例えばデンプン及びセルロースが含まれる。他の好適な炭素源には、例えば、米国特許公開第２００７／００３１９１８Ａ１に記載されているように、前処理及び糖化のプロセスを介してセルロース及びリグノセルロース系バイオマスから得られ得るような発酵性糖、ヘミセルロース、リグニン、デンプン、オリゴ糖及び／または単糖が含まれる。他の好適な炭素源には、高フルクトースのコーンシロップ、チーズホエイパーミエイト、コーン浸出液、テンサイ糖蜜、及びオオムギ麦芽が含まれる。更に他の好適な炭素源には、二酸化炭素、一酸化炭素、メタノール、メチルアミン及びグルコサミンが含まれる。
【０１３５】
培養プロセスは、所望の生成物の力価が培地のリットル当たり少なくとも０．０１、少なくとも０．０５、少なくとも０．１、少なくとも０．２５、少なくとも０．５または少なくとも１ｇ（ｇ／Ｌ）に達するまで継続され得る。発酵プロセスは、力価が、例えば、最大４０、最大４５、最大５０、最大８０、最大１００、または最大１２０ｇ／Ｌに達するまで継続され得る。比生産性は、例えば、１時間当たりの乾燥重量基準で細胞１グラム当たり０．０１から０．６０グラムの所望の生成物（ｇ化学生成物／ｇＤＣＷ−時）であり得る。達成される体積生産性は、１時間当たり１リットル当たり少なくとも０．００５ｇ（ｇ／Ｌ−ｈｒ）、少なくとも０．０１ｇ／Ｌ−ｈｒ、少なくとも０．１ｇ／Ｌ−ｈｒまたは少なくとも０．５ｇ／Ｌ−ｈｒの所望の生成物であり得、最大で、例えば、１０ｇ／Ｌ−ｈｒ、最大で５ｇ／Ｌ−ｈｒまたは最大で１ｇ／Ｌ−ｈｒであり得る。［０２１２］いくつかの実施形態では、２４時間の発酵（培養）期間にわたって測定される比生産性は、細胞のＤＣＭ（２４時間の期間終了時の最終ＤＣＷに基づく）１グラム当たり約０．０１、０．０５、０．１０、０．２０、０．５、１．０、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０．０、１１．０または１２．０グラムを超える化学生成物であり得る。
【０１３６】
以下の実施例は、本発明を例示するために提供されるが、その範囲を限定することは意図されていない。別段示されない限り、全ての部及び百分率は重量％による。
【実施例】
【０１３７】
以下の宿主Ｅ．ｃｏｌｉ菌株を以下の実施例において示されるように使用する。
【０１３８】
宿主菌株１は、ＢＷ２５１１３と指定されたＥ．ｃｏｌｉ菌株の変異型であり、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｒａｉｎ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＣＧＳＣ＃７６３６；Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ，ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ）から入手可能であり、以下の追加的な遺伝子組み換えを有する：
【０１３９】
【表４】
2020506702.tif 000007
【０１４０】
宿主菌株２は、以下の追加的な遺伝子組み換えを有するＢＷ２５１１３Ｅ．ｃｏｌｉ菌株の変異型である：
【０１４１】
【表５】
2020506702.tif 000008
【０１４２】
宿主菌株３は、以下の遺伝子組み換えを有するＢＷ２５１１３Ｅ．ｃｏｌｉ菌株の変異型である：
【０１４３】
【表６】
2020506702.tif 000009
【０１４４】
３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ遺伝子及び変異型の生成
様々な野生型３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ遺伝子の公表された配列情報に基づいて３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ遺伝子を合成する。合成した３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ遺伝子の部位特異的変異型をオリゴヌクレオチド特異的変異誘発によって発生させる。野生型遺伝子の供給源及びそれらの各々について本明細書で使用される略式名称及び野生型遺伝子によって生成される天然酵素のアミノ酸配列は以下の通りである：
【０１４５】
【表７】
2020506702.tif 000010
【０１４６】
各場合において、３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ遺伝子を、６個のヒスチジン残基及びプロテアーゼ認識部位を含有するタンパク質断片をコードするＤＮＡ配列に融合し、ＣｏｌＥ１複製起点及びカナマイシン耐性マーカーを有するｐＥＴプラスミドに組み込む。
【０１４７】
野生型遺伝子によってコードされるアミノ酸残基に対する変異は、本明細書では、野生型菌株の省略形名称と、それに続く括弧内の、天然酵素中のアミノ酸残基を指定する最初の文字、天然酵素中のそのアミノ酸残基の位置を示す１、２または３桁の数字、及び変異した酵素中のその位置におけるアミノ酸残基を指定する最後の文字からなる３、４または５文字のコードによって指定される。一文字の記号表示は、例えば、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８：９−３７（１９８４）で報告されているようなＩＵＰＡＣアミノ酸略号である。例えば、名称「Ａｓｃｈ（Ｔ１８４Ｉ）」は、野生型Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｃｈｉｎｄｌｅｒｉ  ＣＩＰ  １０７２８７酵素においてアミノ酸残基位置１８４におけるトレオニン（Ｔ）がイソロイシン（Ｉ）に置き換えられていることを示す。
【０１４８】
多重に変異した３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ遺伝子の生成。多重に変異した遺伝子を、変異誘発法としてエラープローンＰＣＲを使用して野生型または変異（親）３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ遺伝子から調製する。３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ遺伝子のエラープローンＰＣＲは、配列番号９４及び配列番号９５を有するプライマー及びＥｃｏｎｏＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｕｃｉｇｅｎ）を使用して熱サイクルプログラム：９４℃で２分、３０×［９４℃で２０秒、５５℃で２０秒、７２℃で７２秒］、７２℃で１０分、４℃で維持で行う。また、エラープローンＰＣＲ反応は、５０、１００、１５０または２００μＭのＭｎＣｌ２を含有する。ＰＣＲ断片をＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で精製し、３７℃で１時間ＤｐｎＩで消化し、再度精製する。プラスミド及びインサートは、プラスミドに対して２倍モル過剰のインサートである２×ＨｉＦｉ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ及び５０℃で１時間のインキュベートを使用して構築される。
【０１４９】
多重に変異した遺伝子によって生成される遺伝子のアミノ酸配列は、上述したように省略形によって指定され、変異は順次列挙される。例えば、「Ａｓｃｈ（Ｔ１８４Ｉ、Ｓ３２８Ｖ）」は、野生型Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｃｈｉｎｄｌｅｒｉ  ＣＩＰ  １０７２８７酵素においてアミノ酸残基位置１８４におけるトレオニン（Ｔ）がイソロイシン（Ｉ）に置き換えられており、位置３２８におけるセリンがバリンに置き換えられていることを示す。
【０１５０】
変異型Ｅ．ｃｏｌｉ菌株の生成
変異型Ｅ．ｃｏｌｉ菌株を、標準エレクトロポレーション法を使用して調製する。各場合において、宿主菌株は、以下に記載するように「１型」プラスミド及び「２型」プラスミドで形質転換される。
【０１５１】
１型プラスミドは、ｐ１５ａ複製起点及びクロラムフェニコール耐性マーカーを含有するｐＡＣＹＣプラスミドである。以下の実施例で使用される１型プラスミドは：
１Ａ型：このプラスミドは、Ｈ１００Ｌ、Ｉ１４７Ｓ、Ｆ２１７Ｖ及びＳ３２３Ａ変異を有する３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ（「ＬＳＶＡ」ＮｐｈＴ７変異型、配列番号８２）をコードする変異したＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ｎｐｈＴ７遺伝子、Ｅ．ｃｏｌｉ２機能性３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ／デヒドラターゼ（ｆａｄＢ）遺伝子及びＴ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａエノイル−ＣｏＡ（ｔｅｒ）遺伝子カセットを全て天然のＥ．ｃｏｌｉ  ｐｓｔｓＩＨプロモーター及び天然のＥ．ｃｏｌｉターミネーター下で含む。このプラスミドはまた、６個のヒスチジン残基及びプロテアーゼ認識部位をＥ．ｃｏｌｉ  ｐｈｏＥプロモーター下で含有するタンパク質断片をコードするＤＮＡ配列に融合したＨａｈｅｌｌａ  ｃｈｅｊｕｅｎｓｉｓエステルシンターゼ遺伝子、ならびにＥ．ｃｏｌｉ  ｔｐｉＡプロモーターと融合したＥ．ｃｏｌｉ  ａｃｃＡ及びａｃｃＤ遺伝子を含むＡＣＣ（アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ）カセット及びＥ．ｃｏｌｉ  ｒｐｉＡプロモーター下でＥ．ｃｏｌｉ  ａｃｃＢ及びＥ．ｃｏｌｉ  ａｃｃＣ遺伝子を含むカセットを含有する。
１Ｂ型：このプラスミドは、Ｉ１４７Ｓ及びＦ２１７Ｖ変異を有するｎｐｈＴ７酵素（「ＳＶ」ＮｐｈＴ７変異型、配列番号９６）をコードする変異したＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．遺伝子及びＴ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａエノイル−ＣｏＡ（ｔｅｒ）遺伝子カセットを天然のＥ．ｃｏｌｉ  ｐｓｔｓＩＨプロモーター及び天然のＥ．ｃｏｌｉターミネーター下で含む。そのプラスミドは更に、天然のＥ．ｃｏｌｉ  ｐｓｔｓＩＨプロモーター下でＥ．ｃｏｌｉ２機能性３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ／デヒドラターゼ（ｆａｄＢ）遺伝子；及びＥ．ｃｏｌｉ  ｐｈｏＥプロモーター下で６個のヒスチジン残基及びプロテアーゼ認識部位を含有するタンパク質断片をコードするＤＮＡ配列に融合したＨａｈｅｌｌａ  ｃｈｅｊｕｅｎｓｉｓエステルシンターゼ遺伝子を含有する。
【０１５２】
プラスミド２Ａ型は、Ｅ．ｃｏｌｉプロモーター及びＥ．ｃｏｌｉターミネーター下でＣｏｌＥ１複製起点、カナマイシン耐性マーカー及び評価される３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ遺伝子（別段示されない限り、６個のヒスチジン残基及びプロテアーゼ認識部位を含有するＮ末端タンパク質断片をコードするＤＮＡ配列に融合されている）を含む。Ｅ．ｃｏｌｉプロモーターは、天然のｐｓｔＳ遺伝子のためのプロモーター（ＰｐｓｔｓＩＨプロモーター）または天然のｐｈｏＥ遺伝子のためのもの（ＰｐｈｏＥプロモーター）のいずれかであり、後者は低ホスフェート誘導型である。３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ及び３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ遺伝子のためのプロモーターは、以下の具体例に示されるとおりである。
【０１５３】
プラスミド２Ｂは、ＰｐｓｔｓＩＨ（配列番号１１８）またはＰｐｈｏＥプロモーター（配列番号１１７）及びＥ．ｃｏｌｉターミネーター下でＣｏｌＥ１複製起点、カナマイシン耐性マーカー及び評価される３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ遺伝子（いくつかの場合にはＨｉｓタグを有しない）を含む。３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ及びその遺伝子のためのプロモーターは、以下の具体例に示されるとおりである。
【０１５４】
小規模発酵法
塩、グルコース、ＮＨ４Ｃｌを含有し、かつビタミン、酵母エキス、３５μｇ／ｍｌのカナマイシン及び２０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールが補充された合成培地の培養物に試験される菌株を接種し、３０℃で一晩増殖させる。この培養物の１：１０希釈物のＯＤ６００を決定し、８ＯＤ単位に相当する元の培養物の容量を遠心分離し、上清を廃棄する。ペレット化した細胞を、３０ｇ／Ｌのグルコース、０．１５８ｍＭのホスフェート（低ホスフェート培地）、１％（Ｖ／Ｖ）のメタノール（脂肪酸メチルエステルを生成するため）またはエタノール（脂肪酸エチルエステルを生成するため）、クロラムフェニコール、及びカナマイシンを上記のように含有する４ｍＬの新鮮な培地に徹底的に再懸濁し、１ｍｌのアリコートを６４μＬのヘプタデカンまたはメチルテトラデカノエートを含有する三重１６ｍｍガラス管内に分配する。これは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＰｐｈｏＥプロモーター（配列番号１１７）などの低ホスフェート誘導性プロモーターの活性を促進する制限されたホスフェート培地を表す。チューブを３０℃、２５０ｒｐｍで４時間インキュベートする。次いでインキュベート温度を３７℃に上昇させ、インキュベートを更に２０時間継続する。培養物全体をメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルで抽出し、抽出物をガスクロマトグラフィによって脂肪酸エステルについて分析する。
【０１５５】
実施例８０〜１１６に使用される小規模発酵法
塩、グルコース、ＮＨ４Ｃｌを含有し、かつビタミン、酵母エキス、３５μｇ／ｍｌのカナマイシン及び２０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールが補充された合成培地の培養物に試験される菌株を接種し、３２℃で一晩増殖させる。シード２フラスコを０．３の最終ＯＤ６００まで接種するためにこの培養物の１：１０希釈物のＯＤ６００を決定する。シード２フラスコは、塩、グルコース、ＮＨ４Ｃｌを含有し、かつビタミン、酵母エキス、３５μｇ／ｍｌのカナマイシン及び２０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール、０〜２％のメタノールが補充された２５〜３０ｍｌの合成培地を含有する。シード２フラスコを３２℃で６〜７時間インキュベートする。
【０１５６】
生成フラスコを０．０１〜０．０２５の最終ＯＤ６００まで接種するために、この培養物の１：１０希釈のＯＤ６００を決定する。生成フラスコは、塩、グルコース、ＮＨ４Ｃｌを含有し、かつビタミン、酵母エキス、３５μｇ／ｍｌのカナマイシン及び２０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール、１．２５〜２．５ｍＭのホスフェート、０〜２％のメタノール、３〜６ｇ／ｌのグルコース、１５〜４０ｇ／ｌのグリセロールが補充された２５ｍｌの合成培地を含有する。これは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＰｐｈｏＥプロモーター（配列番号１１７）などの低ホスフェート誘導性プロモーターの活性を促進する制限されたホスフェート培地を表す。生成フラスコを３２℃でインキュベートする。ホスフェートが枯渇したときに以下の添加を行う：２ｍｌのミリスチン酸メチル、１ｍｌの１２．５％のＴｗｅｅｎ８０、１〜１．２５ｍｌの５０％のグリセロール。メタノール（０〜０．５ｍｌ）は、生成アッセイの開始時またはホスフェート枯渇直後に添加する。ホスフェート枯渇後に追加のメタノールを添加してメタノールの蒸発を補うことができる。フラスコを３５℃で更に２４時間インキュベートする。２４時間の時点で試料を採取し、ＭＴＢＥ（メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル）中の０．１％ＨＣＬで抽出し、抽出物をガスクロマトグラフィによって脂肪酸エステルについて分析する。
【０１５７】
実施例１１７〜１４８に使用される小規模発酵法
塩、グルコース、ＮＨ４Ｃｌを含有し、かつビタミン、酵母エキス、３５μｇ／ｍｌのカナマイシン及び２０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールが補充された合成培地の浅い９６ウェルプレートに試験される菌株を接種し、３０℃で一晩増殖させる。浅い９６ウェルプレートからの培養物を使用して深いウェルの生成プレートにウェル当たり２〜３μｌを接種する。生成プレートの各ウェルは、塩、グルコース、ＮＨ４Ｃｌを含有し、かつビタミン、３５μｇ／ｍｌのカナマイシン及び２０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール、１．２５ｍＭのホスフェート、２％のメタノール、３ｇ／ｌのグルコース、３０ｇ／ｌのグリセロールが補充された４００μｌの合成培地を含有する。これは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＰｐｈｏＥプロモーター（配列番号１１７）などの低ホスフェート誘導性プロモーターの活性を促進する制限されたホスフェート培地を表す。生成プレートを３２℃でインキュベートする。ホスフェートが枯渇したときに、２６μｌのミリスチン酸メチルを各ウェルに添加する。プレートを３５℃で更に２０時間インキュベートする。２０時間の時点で試料を採取し、アセトニトリルで希釈し、ガスクロマトグラフィによって脂肪酸エステルについて分析する。
【０１５８】
実施例１〜１５及び比較試料Ａ〜Ｃ−Ａｓｃｈ（Ｔ１８４Ｉ）変種
変異型Ｅ．ｃｏｌｉ菌株の実施例１及び２は、３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼＡｓｃｈ（Ｔ１８４Ｉ）（配列番号９）をコードする組み換えＡｓｃｈ遺伝子を含有する。比較試料Ａ及びＢは、野生型遺伝子（配列番号８をコードする）を含有する。菌株構造の詳細は以下のとおりである：
【０１５９】
【表８】
2020506702.tif 000011
【０１６０】
実施例１及び２ならびに比較試料の各々は、上述の小規模法を使用して脂肪酸メチルエステルを生成するために培養される。総脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）及び生成されたＣ６、Ｃ８及びＣ１０脂肪酸エステルの量は以下の表に示されるとおりである。Ｃ８及びＣ１０脂肪酸エステルに対する選択性は、それぞれの「％」欄に示されている；これらは総脂肪酸エステル生成に対するＣ８またはＣ１０脂肪酸エステルの力価として計算される。高及び低炭素数脂肪酸エステルの量は別々に示されていないが、示された総ＦＡＭＥ生成値で示されている。
【０１６１】
【表９】
2020506702.tif 000012
【０１６２】
野生型Ａｓｃｈ酵素は、最少量のＣ８エステルで約８２％のＣ１０脂肪酸メチルエステルを生成する。位置１８４におけるトレオニンをイソロイシンに変えることによって、生成は、ほぼ独占的にＣ１０脂肪酸エステルから主にＣ８脂肪酸エステルにシフトし、Ｃ６脂肪酸エステルに対する選択性のいくらかの増加も見られる。変異型菌株の実施例１及び２は、Ｃ８エステルに富む脂肪酸エステルの混合物を生成するのに有用である。
【０１６３】
変異型Ｅ．ｃｏｌｉ菌株の実施例３〜５は、同様に、変異した３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ（Ａｓｃｈ（Ｔ１８４Ｌ）、Ａｓｃｈ（Ｔ１８４Ｍ）またはＡｓｃｈ（Ｔ１８４Ｖ））をコードする組み換えＡｓｃｈ遺伝子を含有する。比較試料Ｃもまた野生型遺伝子を含有する。菌株構造の詳細は以下のとおりである：
【０１６４】
【表１０】
2020506702.tif 000013
【０１６５】
実施例３〜５及び比較試料Ｃの各々は、上述の小規模法を使用して脂肪酸エチルエステルを生成するために培養される。総脂肪酸エチルエステル（ＦＡＥＥ）ならびに生成されたＣ６、Ｃ８及びＣ１０脂肪酸エステルの量は、以下の表に示されているとおりであり、Ｃ８及びＣ１０脂肪酸エステルに対する選択性である。高及び低炭素数脂肪酸エステルの量は別々に示されていないが、示された総ＦＡＥＥ生成値で示されている。
【０１６６】
【表１１】
2020506702.tif 000014
【０１６７】
比較試料Ａ及びＢで上記で分かるように、野生型Ａｓｃｈ酵素は主にＣ１０脂肪酸エステル生成をもたらす。Ｔ１８４Ｌ、Ｔ１８４Ｍ及びＴ１８４Ｖ変異は全てＣ１０脂肪酸エステルから主にＣ６及びＣ８脂肪酸エステルに生成をシフトさせる。実施例４におけるＴ１８４Ｍ変異は、Ｃ１０脂肪酸エステル生成を２％未満に減少させる。Ｃ８脂肪酸エステルに対する選択性は、Ｔ１８４Ｖ変異についてはほぼ５０％である。
【０１６８】
変異型Ｅ．ｃｏｌｉ菌株の実施例６〜１５は、同様に、以下の表に示される複数の変異を有する変異した３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼをコードする変異したＡｓｃｈ遺伝子を含有する。菌株構造の詳細は以下のとおりである：
【０１６９】
【表１２】
2020506702.tif 000015
【０１７０】
実施例６〜１５の各々は、上述の小規模法を使用して脂肪酸メチルエステルを生成するために培養される。総脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）ならびに生成されたＣ６、Ｃ８及びＣ１０脂肪酸エステルの量は、以下の表に示されているとおりであり、Ｃ８及びＣ１０脂肪酸エステルに対する選択性である。高及び低炭素数脂肪酸エステルの量は別々に示されていないが、示された総ＦＡＭＥ生成値で示されている。
【０１７１】
【表１３】
2020506702.tif 000016
【０１７２】
このデータが示すように、Ｔ１８４変異を含有する多重に変異した酵素は全て、生成をＣ１０脂肪酸エステルから主にＣ８脂肪酸エステルにシフトさせる。Ｓ３２８Ｇ変異を有する変異した酵素は、この評価においてＣ８脂肪酸エステルに対して特に選択的であり、選択性は８０％に近い。
【０１７３】
実施例１６〜１８及び比較試料Ｄ−Ａｓｃｈ−２変種
変異型Ｅ．ｃｏｌｉ菌株の実施例１６〜１８は、３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ（Ａｓｃｈ−２（Ｔ１８４Ｍ）、Ａｓｃｈ−２（Ｔ１８４Ｖ）及びＡｓｃｈ−２（Ｔ１８４Ｉ）、それぞれ配列番号２２〜２４）をコードする組み換えＡｓｃｈ−２遺伝子を含有する。比較試料Ｄは、野生型遺伝子（配列番号８６をコードする）を含有する。菌株構造の詳細は以下のとおりである：
【０１７４】
【表１４】
2020506702.tif 000017
【０１７５】
実施例１６〜１８及び比較試料Ｄの各々は、上述の小規模法を使用して脂肪酸メチルエステルを生成するために培養される。総脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）ならびに生成されたＣ６、Ｃ８及びＣ１０脂肪酸エステルの量は、以下の表に示されているとおりであり、Ｃ８及びＣ１０脂肪酸エステルに対する選択性である。高及び低炭素数脂肪酸エステルの量は別々に示されていないが、示された総ＦＡＥＥ生成値で示されている。
【０１７６】
【表１５】
2020506702.tif 000018
【０１７７】
野生型Ａｓｈ−２遺伝子は、ほぼ独占的にＣ１０脂肪酸エステルを生成する。Ｔ１８４Ｖ変異は全てＣ１０脂肪酸エステルからＣ６及びＣ８脂肪酸エステルへ生成をシフトさせる。Ｃ８脂肪酸エステルに対する選択性は、Ａｓｈ−２遺伝子に対するこれらの組み換えで０から約３０〜４５％まで増加する。
【０１７８】
実施例１９〜２２及び比較試料Ｅ−Ａｌｗｏ変種
変異型Ｅ．ｃｏｌｉ菌株の実施例１９〜２２は、変異した３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ（Ａｌｗｏ（Ｔ１８４Ｌ）、Ａｌｗｏ（Ｔ１８４Ｍ）、Ａｌｗｏ（Ｔ１８４Ｖ）及びＡｌｗｏ（Ｔ１８４Ｉ）、それぞれ配列番号２６〜２９）をコードする組み換えＡｌｗｏ遺伝子を含有する。比較試料Ｅは、野生型遺伝子（配列番号８８をコードする）を含有する。菌株構造の詳細は以下のとおりである：
【０１７９】
【表１６】
2020506702.tif 000019
【０１８０】
実施例１９〜２２及び比較試料Ｅの各々は、上述の小規模法を使用して脂肪酸エチルエステルを生成するために培養される。総脂肪酸エチルエステル（ＦＡＥＥ）ならびに生成されたＣ６、Ｃ８及びＣ１０脂肪酸エステルの量は、以下の表に示されているとおりであり、Ｃ８及びＣ１０脂肪酸エステルに対する選択性である。高及び低炭素数脂肪酸エステルの量は別々に示されていないが、示された総ＦＡＥＥ生成値で示されている。
【０１８１】
【表１７】
2020506702.tif 000020
【０１８２】
Ａｌｗｏ酵素におけるＴ１８４変異の影響は、Ａｓｃｈ及びＡｓｃｈ−２変異で見られるものと同様である。野生型Ａｌｗｏ酵素は９０％を超えるＣ１０脂肪酸エステルを生成し、Ｃ８脂肪酸エステルを生成しないが、Ｔ１８４Ｌ、Ｍ、Ｖ及びＩ変異は全てＣ６及びＣ８脂肪酸エステルに生成をシフトさせる。Ｔ１８４Ｍ及びＴ１８４Ｉ変異は、この点に関して特に有効であり、Ｃ１０脂肪酸エステル選択性は、それらの場合の各々において２０％未満に低下し、Ｃ８脂肪酸エステル選択性は、Ｔ１８４Ｉの場合では６０％を超える。
【０１８３】
実施例２３〜２６及び比較試料Ｆ−Ａｊｏｈ−２変種
変異型Ｅ．ｃｏｌｉ菌株の実施例２３〜２６は、３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ（Ａｊｏｈ−２（Ｔ１８４Ｌ）、Ａｊｏｈ−２（Ｔ１８４Ｍ）、Ａｊｏｈ−２（Ｔ１８４Ｖ）及びＡｊｏｈ−２（Ｔ１８４Ｉ）、それぞれ配列番号３６〜３９）をコードする組み換えＡｊｏｈ−２遺伝子を含有する。比較試料Ｆは、野生型遺伝子（配列番号３５をコードする）を含有する。菌株構造の詳細は以下のとおりである：
【０１８４】
【表１８】
2020506702.tif 000021
【０１８５】
実施例２３〜２６及び比較試料Ｆの各々は、上述の小規模法を使用して脂肪酸メチルエステルを生成するために培養される。総脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）ならびに生成されたＣ６、Ｃ８及びＣ１０脂肪酸エステルの量は、以下の表に示されているとおりであり、Ｃ８及びＣ１０脂肪酸エステルに対する選択性である。高及び低炭素数脂肪酸エステルの量は別々に示されていないが、示された総ＦＡＥＥ生成値で示されている。
【０１８６】
【表１９】
2020506702.tif 000022
【０１８７】
同じ一般的パターンがＡｊｏｈ−２遺伝子組み換えで見られる。Ｃ１０脂肪酸エステル生成に対する野生型遺伝子の高い選択性は、Ｃ６及びＣ８脂肪酸エステル生成にシフトする。Ｔ１８４Ｍ及びＴ１８４Ｉ変異は、この点に関して特に有効である。Ｔ１８４Ｖ変異は、Ｔ１８４Ｌ、Ｍ及びＩ変異と比較して全体の生産性の大きな増加をもたらす。
【０１８８】
実施例２７〜２９及び比較試料Ｇ−ＡＮＩＰ７１変種
変異型Ｅ．ｃｏｌｉ菌株の実施例２７〜２９は、３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ（ＡＮＩＰ７１（Ｔ１８４Ｍ）、ＡＮＩＰ７１（Ｔ１８４Ｖ）及びＡＮＩＰ７１（Ｔ１８４Ｉ）、それぞれ配列番号３２、３４及び３１）をコードする組み換えＡＮＩＰ７１遺伝子を含有する。比較試料Ｇは、野生型遺伝子（配列番号８９をコードする）を含有する。菌株構造の詳細は以下のとおりである：
【０１８９】
【表２０】
2020506702.tif 000023
【０１９０】
実施例２７〜２９及び比較試料Ｇの各々は、上述の小規模法を使用して脂肪酸メチルエステルを生成するために培養される。総脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）ならびに生成されたＣ６、Ｃ８及びＣ１０脂肪酸エステルの量は、以下の表に示されているとおりであり、Ｃ８及びＣ１０脂肪酸エステルに対する選択性である。高及び低炭素数脂肪酸エステルの量は別々に示されていないが、示された総ＦＡＭＥ生成値で示されている。
【０１９１】
【表２１】
2020506702.tif 000024
【０１９２】
前述のとおり、Ｔ１８４変異は全てＣ１０脂肪酸エステルからＣ８脂肪酸エステルへ生成をシフトさせ、Ｔ１８４Ｍ及びＴ１８４Ｉ変異は特に有効である。Ｔ１８４Ｖ変異は、Ｔ１８４Ｍ及びＴ１８４Ｉ変異と比較して全体の生産性の大きな増加をもたらす。Ｔ１８４Ｉ変異はＣ８脂肪酸エステルに対して最も高い選択性を示す。
【０１９３】
実施例３０〜３１及び比較試料Ｈ−Ｐｓｔｕ変種
変異型Ｅ．ｃｏｌｉ菌株の実施例３０〜３１は、３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ（Ｐｓｔｕ（Ｃ１８６Ｍ）及びＰｓｔｕ（Ｃ１８６Ｉ）、それぞれ配列番号４０、位置１８６はそれぞれＭ及びＩである）をコードする組み換えＰｓｔｕ遺伝子を含有する。比較試料Ｈは、野生型遺伝子（配列番号９０をコードする）を含有する。菌株構造の詳細は以下のとおりである：
【０１９４】
【表２２】
2020506702.tif 000025
【０１９５】
実施例３０〜３１及び比較試料Ｈの各々は、上述の小規模法を使用して脂肪酸メチルエステルを生成するために培養される。総脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）ならびに生成されたＣ６、Ｃ８及びＣ１０脂肪酸エステルの量は、以下の表に示されているとおりであり、Ｃ８及びＣ１０脂肪酸エステルに対する選択性である。高及び低炭素数脂肪酸エステルの量は別々に示されていないが、示された総ＦＡＭＥ生成値で示されている。
【０１９６】
【表２３】
2020506702.tif 000026
【０１９７】
野生型Ｐｓｔｕ酵素は、ほぼ独占的にＣ１０脂肪酸エステルを生成する。Ｃ１８６Ｍ及びＩ変異は両方とも、Ｃ６及びＣ８脂肪酸エステルへ生成をシフトさせ、Ｃ８脂肪酸エステルへの選択性は約４０〜６０％である。
【０１９８】
実施例３２〜６１及び比較試料Ｉ−Ａａｇｒ変種
変異型Ｅ．ｃｏｌｉ菌株の実施例３２〜６１は、以下の表に示される３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼをコードする組み換えＡａｇｒ遺伝子を含有する。比較試料Ｉは、野生型遺伝子（配列番号９１をコードする）を含有する。菌株構造の詳細は以下のとおりである：
【０１９９】
【表２４】
2020506702.tif 000027
【０２００】
実施例３２、３５〜４２、４４及び５０〜６１ならびに比較試料Ｉの各々は、上述の小規模法で脂肪酸エチルエステルを生成するために培養される。総脂肪酸エチルエステル（ＦＡＥＥ）ならびに生成されたＣ８及びＣ１０脂肪酸エステルの量は、以下の表に以下に示されているとおりであり、Ｃ８、Ｃ１０及びＣ１２脂肪酸エステルに対する選択性である。高及び低炭素数脂肪酸エステルの量は別々に示されていないが、示された総ＦＡＥＥ生成値で示されている。「Ｃ１２生成」の欄下の「小」とは、表に特に説明されていないほとんどのＦＡＥＥ生成がＣ６エチルエステルであり、５％未満のＣ１２脂肪酸エステルが生成されることを意味する。
【０２０１】
【表２５】
2020506702.tif 000028
【０２０２】
野生型Ａａｇｒ酵素は、この評価では１８％のＣ１２脂肪酸エステルを生成する。野生型Ａａｇｒの置換は、Ｃ１２脂肪酸エステル生成を低下させ、ほとんどの場合、Ｃ８及び／またはＣ１０脂肪酸エステルに対するより高い選択性を支持する。
【０２０３】
実施例３２〜３４及び４３〜４９の各々は、上述の小規模法を使用して脂肪酸メチルエステルを生成するために培養される。総脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）ならびに生成されたＣ８及びＣ１０脂肪酸エステルの量は、以下の表に示されているとおりであり、Ｃ８、Ｃ１０及びＣ１２脂肪酸エステルに対する選択性である。高及び低炭素数脂肪酸エステルの量は別々に示されていないが、示された総ＦＡＭＥ生成値で示されている。「Ｃ１２生成」の欄下の「小」とは、表に説明されていないほとんどのＦＡＭＥ生成がＣ６メチルエステルであり、５％未満のＣ１２脂肪酸エステルが生成されることを意味する。
【０２０４】
【表２６】
2020506702.tif 000029
【０２０５】
前述の２つの表のデータが示すように、野生型Ａａｇｒ酵素は相当な割合（１８％）のＣ１２脂肪酸エステルを生成する。Ａ１８６Ｉ組み換えは、それ自体でまたは追加の組み換えを伴って、Ｃ８及び／またはＣ１０脂肪酸エステルを優先し、またいくつかの場合では、ＦＡＥＥおよびＦＡＭＥ生成の両方においてＣ６脂肪酸エステルを優先し、Ｃ１２脂肪酸エステル生成を低下させる。
【０２０６】
実施例６２〜７１及び比較試料Ｊ及びＫ−Ａｓｃｈ変種
変異型Ｅ．ｃｏｌｉ菌株の実施例６２〜７１は、以下の表に示される３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼをコードする組み換えＡｓｃｈ遺伝子を含有する。比較試料Ｊ及びＫは、野生型遺伝子（配列番号８をコードする）を含有する。実施例６２〜６４及び比較試料Ｋのみでは、変異型Ａｓｃｈ遺伝子は、６個のヒスチジン残基及びプロテアーゼ認識部位を含有するタンパク質断片をコードするＤＮＡ配列に融合される。菌株構造の詳細は以下のとおりである：
【０２０７】
【表２７】
2020506702.tif 000030
【０２０８】
実施例６２〜７１及び比較試料Ｊ及びＫの各々は、上述の小規模法を使用して脂肪酸メチルエステルを生成するために培養される。総脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）ならびに生成されたＣ６、Ｃ８及びＣ１０脂肪酸エステルの量は、以下の表に示されているとおりである。高及び低炭素数脂肪酸エステルの量は別々に示されていないが、示された総ＦＡＭＥ生成値で示されている。
【０２０９】
【表２８】
2020506702.tif 000031
【０２１０】
このデータが示すように、Ｋ２７８Ｒ、Ｖ２９６Ａ、Ｖ３１７Ａ、Ｍ２７１Ｉ及びＭ１７８Ｌ変異は全て、野生型Ａｓｃｈ酵素と比較して細胞の総生産性の増加をもたらす。これらの例では生産性が３６％も改善する。比較Ｊ及び実施例６２〜６４と比較した比較Ｋ及び実施例６５〜７１の概してより高い生産性は、低ホスフェート誘導性プロモーターの制御下で３−ケトアシルシンターゼを有することと、低ホスフェート培地の選択との組み合わせに起因すると考えられる。
【０２１１】
実施例７２〜７４−Ａｓｃｈ（Ｔ１８４Ｉ）変種
変異型Ｅ．ｃｏｌｉ菌株の実施例７２〜７４は、同様に、以下の表に示される複数の変異を有する変異した３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼをコードする変異したＡｓｃｈ遺伝子を含有する。菌株構造の詳細は以下のとおりである：
【０２１２】
【表２９】
2020506702.tif 000032
【０２１３】
実施例７２〜７４の各々は、上述の小規模法を使用して脂肪酸メチルエステルを生成するために培養される。総脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）ならびに生成されたＣ６、Ｃ８及びＣ１０脂肪酸エステルの量は、以下の表に示されているとおりであり、Ｃ８及びＣ１０脂肪酸エステルに対する選択性である。高及び低炭素数脂肪酸エステルの量は別々に示されていないが、示された総ＦＡＭＥ生成値で示されている。
【０２１４】
【表３０】
2020506702.tif 000033
【０２１５】
実施例７５〜７７
Ｅ．ｃｏｌｉ変異型は、前述したエレクトロポレーション法を使用して、「１型」プラスミド及び「２型」プラスミドでＥ．ｃｏｌｉ菌株ＢＷ２５１１３を形質転換することによって調製される。菌株構造の詳細は以下のとおりである：
【０２１６】
【表３１】
2020506702.tif 000034
【０２１７】
実施例７５〜７７の全ては、小規模発酵法を使用して評価した場合、Ｃ６−Ｃ１０脂肪酸エステルに対して良好な選択性を示す。
【０２１８】
実施例７８
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ菌株ＩＭＸ５８１（Ｍａｎｓ，Ｒ．，Ｈ．Ｍ．ｖａｎ  Ｒｏｓｓｕｍ，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ  １５（２）における複数の遺伝子組み換えの同時導入のための分子ツール）は、ＣＲＩＳＰＲ技術（ＵＳ２０１４００６８７９７Ａ１）を使用してゲノムを操作するための宿主菌株として使用され得るように、その染色体に組み込まれたＣａｓ９ヌクレアーゼを有する。ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、プラスミドのｐＭＥＬまたはｐＲＯＳシリーズのいずれかから発現される。この技術を使用してＩＭＸ５８１の染色体に非天然脂肪酸及び脂肪酸エステル経路の遺伝子が組み込まれる。ｇＲＮＡ配列は、Ｙｅａｓｔｒｉｃｔｉｏｎオンラインツール（Ｒｏｂｅｒｔ  Ｍａｎｓ，Ｈａｒｍｅｎ  Ｍ．ｖａｎ  Ｒｏｓｓｕｍ，Ｍｅｌａｎｉｅ  Ｗｉｊｓｍａｎ，Ａｎｔｏｏｎ  Ｂａｃｋｘ，Ｎｉｅｌｓ  Ｇ．Ａ．Ｋｕｉｊｐｅｒｓ，Ｍａｒｃｅｌ  ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｒｏｅｋ，Ｐａｓｃａｌｅ  Ｄａｒａｎ−Ｌａｐｕｊａｄｅ，Ｊａｃｋ  Ｔ．Ｐｒｏｎｋ，Ａｎｔｏｎｉｕｓ  Ｊ．Ａ．ｖａｎ  Ｍａｒｉｓ，Ｊｅａｎ−Ｍａｒｃ  Ｇ．Ｄａｒａｎ（２０１５）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける複数の遺伝子組み換えの同時導入のための分子スイスアーミーナイフ．ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １６）を使用して設計される。ｇＲＮＡ配列は、５０ｂｐの相同性を有し、ＰＡＧＥ精製される相補的プライマーを使用してｐＭＥＬプラスミドに導入される。プライマーを蒸留水に溶解して１００μＭの最終濃度とし、プライマーを１：１のモル比で混合し、混合物を９５℃まで５分間加熱し、室温に冷却することによってアニールする。プライマーを鋳型としてのｐＭＥＬ１０と混合し、混合物をＱ５  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ２Ｘ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓ．）を使用して増幅する。ＰＣＲ生成物をＤｐｎＩで３０分間消化し、ＰＣＲ産物をアガロースゲルで精製する。同時組み込み及び欠失のためのプロトコルは、Ｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ（上記参照）に記載されている。そのプロトコルを使用して、以下の表に列挙されるタンパク質をコードする遺伝子を、以下に列挙されるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ染色体中の遺伝子座に組み込む。遺伝子を発現するために使用されるターミネーター及びプロモーターも表に列挙されている。
【０２１９】
【表３２】
2020506702.tif 000035
【０２２０】
改変された酵母を、炭素源としての１０ｇ／Ｌのグルコースを補充した２５ｍＬの合成規定培地中で３０℃で２５０ｍＬの振盪フラスコ内で増殖させる。フラスコを２００ｒｐｍで２４時間振盪する。上清中の脂肪酸または脂肪酸メチルエステル酸を測定する。
【０２２１】
実施例７９
油性酵母Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ菌株ＬＧＡＭ  Ｓ（７）１（Ｐａｐａｎｉｋｏｌａｏｕ  Ｓ．，及びＡｇｇｅｌｉｓ  Ｇ．，Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．８２（１）：４３−９（２００２））．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９：Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおける複数の遺伝子組み換えの同時導入のための分子ツール。宿主は、ＣＲＩＳＰＲ技術（ＵＳ２０１４００６８７９７Ａ１）を使用してゲノムを操作するための宿主菌株として使用され得るように、その染色体に組み込まれたＣａｓ９ヌクレアーゼで改変される。ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、プラスミドのｐＭＥＬまたはｐＲＯＳシリーズのいずれかから発現される。この技術を使用してＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの染色体に非天然脂肪酸及び脂肪酸エステル経路の遺伝子が組み込まれる。ｇＲＮＡ配列は、Ｙｅａｓｔｒｉｃｔｉｏｎオンラインツール（Ｒｏｂｅｒｔ  Ｍａｎｓ，Ｈａｒｍｅｎ  Ｍ．ｖａｎ  Ｒｏｓｓｕｍ，Ｍｅｌａｎｉｅ  Ｗｉｊｓｍａｎ，Ａｎｔｏｏｎ  Ｂａｃｋｘ，Ｎｉｅｌｓ  Ｇ．Ａ．Ｋｕｉｊｐｅｒｓ，Ｍａｒｃｅｌ  ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｒｏｅｋ，Ｐａｓｃａｌｅ  Ｄａｒａｎ−Ｌａｐｕｊａｄｅ，Ｊａｃｋ  Ｔ．Ｐｒｏｎｋ，Ａｎｔｏｎｉｕｓ  Ｊ．Ａ．ｖａｎ  Ｍａｒｉｓ，Ｊｅａｎ−Ｍａｒｃ  Ｇ．Ｄａｒａｎ（２０１５）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける複数の遺伝子組み換えの同時導入のための分子スイスアーミーナイフ．ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １６）を使用して設計される。ｇＲＮＡ配列は、５０ｂｐの相同性を有し、ＰＡＧＥ精製される相補的プライマーを使用してｐＭＥＬプラスミドに導入される。プライマーを蒸留水に溶解して１００μＭの最終濃度とし、プライマーを１：１のモル比で混合し、混合物を９５℃まで５分間加熱し、室温に冷却することによってアニールする。プライマーを鋳型としてのｐＭＥＬ１０と混合し、混合物をＱ５  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ２Ｘ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓ．）を使用して増幅する。ＰＣＲ生成物をＤｐｎＩで３０分間消化し、ＰＣＲ産物をアガロースゲルで精製する。同時組み込み及び欠失のためのプロトコルは、Ｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ（上記参照）に記載されている。そのプロトコルを使用して、以下の表に列挙されるタンパク質をコードする遺伝子を、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ染色体中の遺伝子座に組み込む。遺伝子を発現するために使用されるターミネーター及びプロモーターの例も表に列挙されている。
【０２２２】
【表３３】
2020506702.tif 000036
【０２２３】
改変された酵母を、炭素源としての１０ｇ／Ｌのグルコースを補充した２５ｍＬの合成規定培地中で３０℃で２５０ｍＬの振盪フラスコ内で増殖させる。フラスコを２００ｒｐｍで２４時間振盪する。上清中の脂肪酸または脂肪酸メチルエステル酸を測定する。
【０２２４】
実施例８０〜９６−Ａｓｃｈ（Ｔ１８４Ｉ）変種
配列番号２０を有する変異型３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、追加の変異を介する更なる改善のための有望な候補として選択される。発明対照Ａは、配列番号２０を有する変異型３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼをＥ．ｃｏｌｉ宿主菌株３に導入することによって生成される。この発明実施例は、追加の変異型の実施例８０〜９６の比較用の基礎として機能する。変異型Ｅ．ｃｏｌｉ菌株の実施例８０〜９６は、１つ以上の追加の変異と共に配列番号２０と同じ変異を有する変異した３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼをコードする変異したＡｓｃｈ遺伝子を含有する。野生型３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ（配列番号８）とは異なる全ての変異は以下の表に示されている。菌株構造の詳細は以下のとおりである：
【０２２５】
【表３４】
2020506702.tif 000037
【０２２６】
実施例８０〜９６の各々は、上述の振盪フラスコ法を使用して脂肪酸メチルエステルを生成するために培養される。Ｃ８及びＣ１０脂肪酸エステルの量が測定される。Ｃ８及び／またはＣ１０脂肪エステルの生成を増加させる各例の能力は、示されているように記録されている。Ｃ８及び／またはＣ１０に対する特異性を増加させる各例の能力は、示されているように記録されている。
【０２２７】
【表３５】
2020506702.tif 000038
【０２２８】
実施例９７〜９９−Ａｓｃｈ（Ｔ１８４Ｉ）変種
アミノ酸３０及び３１７で現れるバリンがそれぞれアラニンに置き換えられていることを除き、配列番号２０を有する変異型３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、追加の変異を介する更なる改善のための候補として選択される。発明対照Ｂは、この変異型３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼをＥ．ｃｏｌｉ宿主菌株２に導入することによって生成される。この発明実施例は、追加の変異型の実施例９７〜９９の比較用の基礎として機能する。変異型Ｅ．ｃｏｌｉ菌株の実施例９７〜９９は、１つ以上の追加の変異と共に発明対照Ｂのものと同じ変異を有する変異した３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼをコードする変異したＡｓｃｈ遺伝子を含有する。野生型３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ（配列番号８）とは異なる全ての変異は以下の表に示されている。菌株構造の詳細は以下のとおりである：
【０２２９】
【表３６】
2020506702.tif 000039
【０２３０】
実施例９７〜９９の各々は、上述の振盪フラスコ法を使用して脂肪酸メチルエステルを生成するために培養される。Ｃ８及びＣ１０脂肪酸エステルの量が測定される。Ｃ８及び／またはＣ１０脂肪エステルの生成を増加させる各例の能力は、示されているように記録されている。Ｃ８及び／またはＣ１０に対する特異性を増加させる各例の能力は、示されているように記録されている。
【０２３１】
【表３７】
2020506702.tif 000040
【０２３２】
実施例１００〜１１６−Ａｓｃｈ（Ｔ１８４Ｉ）変種
以下の表に示されるように６個の特定の変異を有する配列番号８に相当する変異型３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、追加の変異を介する更なる改善のための候補として選択される。発明対照Ｃは、この変異型３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼをＥ．ｃｏｌｉ宿主菌株３に導入することによって生成される。この発明実施例は、追加の変異型の実施例１００〜１１６の比較用の基礎として機能する。変異型Ｅ．ｃｏｌｉ菌株の実施例１００〜１１６は、１つ以上の追加の変異と共に発明対照Ｃのものと同じ変異を有する変異した３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼをコードする変異したＡｓｃｈ遺伝子を含有する。野生型３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ（配列番号８）とは異なる全ての変異は以下の表に示されている。菌株構造の詳細は以下のとおりである：
【０２３３】
【表３８】
2020506702.tif 000041
【０２３４】
実施例１００〜１１６の各々は、上述の振盪フラスコ法を使用して脂肪酸メチルエステルを生成するために培養される。Ｃ８及びＣ１０脂肪酸エステルの量が測定される。Ｃ８及び／またはＣ１０脂肪エステルの生成を増加させる各例の能力は、示されているように記録されている。
【０２３５】
【表３９】
2020506702.tif 000042
【０２３６】
実施例１１７〜１３３−Ａｓｃｈ（Ｇ５１）変種
変異型Ｅ．ｃｏｌｉ菌株の実施例１１７〜１３３は、同様に、以下の表に示される複数の変異を有する変異した３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼをコードする変異したＡｓｃｈ遺伝子を含有する。菌株構造の詳細は以下のとおりである：
【０２３７】
【表４０】
2020506702.tif 000043
【０２３８】
実施例１１７〜１３３の各々は、上述の振盪フラスコ法を使用して脂肪酸メチルエステルを生成するために培養される。総脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）ならびに生成されたＣ８及びＣ１０脂肪酸エステルの量は、以下の表に示されているとおりであり、Ｃ８及びＣ１０脂肪酸の相対百分率である。高及び低炭素数脂肪酸エステルの量は別々に示されていないが、示された総ＦＡＭＥ生成値で示されている。
【０２３９】
【表４１】
2020506702.tif 000044
【０２４０】
実施例１３４〜１４８−Ａｓｃｈ（Ｇ５１）変種
以下の表に示されるように７個の特定の変異を有する配列番号８に相当する変異型３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、追加の変異を介する更なる改善のための候補として選択される。発明対照Ｄは、この変異型３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼをＥ．ｃｏｌｉ宿主菌株３に導入することによって生成される。この発明実施例は、追加の変異型の実施例１３４〜１４８の比較用の基礎として機能する。変異型Ｅ．ｃｏｌｉ菌株の実施例１３４〜１４８は、１つ以上の追加の変異と共に発明対照Ｄのものと同じ変異を有する変異した３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼをコードする変異したＡｓｃｈ遺伝子を含有する。野生型３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ（配列番号８）とは異なる全ての変異は以下の表に示されている。菌株構造の詳細は以下のとおりである：
【０２４１】
【表４２】
2020506702.tif 000045
【０２４２】
実施例１３４〜１４８の各々は、上述の振盪フラスコ法を使用して脂肪酸メチルエステルを生成するために培養される。総脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）ならびに生成されたＣ８及びＣ１０脂肪酸エステルの量は、以下の表に示されているとおりであり、Ｃ８及びＣ１０脂肪酸の相対百分率である。高及び低炭素数脂肪酸エステルの量は別々に示されていないが、示された総ＦＡＭＥ生成値で示されている。
【０２４３】
【表４３】
2020506702.tif 000046
【０２４４】
実施形態
１．ａ）配列番号１と少なくとも８０％同一のサブ配列（但し、配列番号１のアミノ酸残基８に整列するアミノ酸残基はロイシン、バリン、イソロイシンまたはメチオニンであり、アミノ酸残基２はロイシンまたはメチオニンである）；ｂ）配列番号２と少なくとも８０％同一のサブ配列（但し、配列番号２のアミノ酸残基６に整列するアミノ酸残基はイソロイシンまたはメチオニンである）及びｃ）配列番号３と少なくとも８０％同一のサブ配列（但し、配列番号３のアミノ酸残基６に整列するアミノ酸残基はイソロイシン、メチオニン、トレオニン、システイン、バリン、グルタミン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、アスパラギンまたはチロシンである）のうちの少なくとも１つを含むことを特徴とするアミノ酸配列を有する３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０２４５】
２．ａ）配列番号１、ｂ）配列番号２及びｃ）配列番号３のうちの少なくとも１つを含むことを特徴とするアミノ酸配列を有する３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０２４６】
３．前記アミノ酸配列は、配列番号１を含む、実施形態２の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０２４７】
４．前記アミノ酸配列は、ａ）配列番号４または配列番号１６１、ｂ）配列番号５及びｃ）配列番号６または配列番号１６２のうちの少なくとも１つを更に含む、実施形態１〜３のいずれかの３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０２４８】
５．前記アミノ酸配列は、配列番号４４を含む、実施形態４の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０２４９】
６．前記アミノ酸配列は、配列番号４５と少なくとも８５％同一のサブ配列を含み、但し、配列番号５のアミノ酸残基３５に整列する前記３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、ロイシン、バリン、イソロイシンまたはメチオニンである、実施形態５の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０２５０】
７．前記アミノ酸配列は、配列番号４５を含む、実施形態５の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０２５１】
８．前記アミノ酸配列は、配列番号４または配列番号１６１、配列番号５及び配列番号６または配列番号１６２を含む、実施形態４〜７のいずれかの３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０２５２】
９．前記アミノ酸配列は、配列番号４６を更に含む、実施形態７の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０２５３】
１０．前記アミノ酸配列は、配列番号４７を含む、実施形態８の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０２５４】
１１．前記アミノ酸配列は、配列番号４８を含む、実施形態１〜１０のいずれかの３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０２５５】
１２．前記アミノ酸配列は、配列番号４９と少なくとも８０％同一である、実施形態３の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０２５６】
１３．前記アミノ酸配列は、配列番号４９を有する、実施形態３の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０２５７】
１４．前記アミノ酸配列は、配列番号８と少なくとも５０％同一である、実施形態１〜１３のいずれかの３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０２５８】
１５．前記アミノ酸配列は、配列番号８と少なくとも８０％同一である、実施形態１４の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０２５９】
１６．配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号９２、配列番号９３、配列番号１２１〜１５７のいずれか１つまたは配列番号１７２〜２０４のいずれか１つからなる群から選択される、アミノ酸配列を有する３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０２６０】
１７．前記アミノ酸配列は、配列番号２を含む、実施形態２の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０２６１】
１８．前記アミノ酸配列は、ａ）配列番号４または配列番号１６１、ｂ）配列番号５及びｃ）配列番号６または配列番号１６２のうちの少なくとも１つを更に含む、実施形態１７の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０２６２】
１９．前記アミノ酸配列は、配列番号４０と少なくとも５０％同一である、実施形態１８の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０２６３】
２０．前記アミノ酸配列は、配列番号４０と少なくとも８０％同一である、実施形態１９の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０２６４】
２１．配列番号４０を有する、実施形態１８の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０２６５】
２２．前記アミノ酸配列は、配列番号３を含む、実施形態２の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０２６６】
２３．前記アミノ酸配列は、ａ）配列番号４または配列番号１６１、ｂ）配列番号５及びｃ）配列番号６または配列番号１６２を更に含む、実施形態２２の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０２６７】
２４．前記アミノ酸配列は、配列番号４１を含む、実施形態２２の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０２６８】
２５．前記アミノ酸配列は、配列番号４２または４３と少なくとも５０％同一である、実施形態２２の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０２６９】
２６．前記アミノ酸配列は、配列番号４２または４３と少なくとも８０％同一である、実施形態２２の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０２７０】
２７．前記アミノ酸配列は、配列番号４２または４３である、実施形態２２の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０２７１】
２８．配列番号５０を含むことを特徴とするアミノ酸配列を有する３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０２７２】
２９．前記アミノ酸配列は、配列番号５１を含む、実施形態２８の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０２７３】
３０．前記アミノ酸配列は、配列番号５２を含む、実施形態２８の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０２７４】
３１．前記アミノ酸配列は、配列番号５３を含む、実施形態２８の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０２７５】
３２．前記アミノ酸配列は、配列番号４６を更に含む、実施形態２３〜３１のいずれかの３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０２７６】
３３．前記アミノ酸配列は、配列番号５４を含む、実施形態２８の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０２７７】
３４．前記アミノ酸配列は、配列番号４８を更に含む、実施形態２８〜３３のいずれかの３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０２７８】
３５．前記アミノ酸配列は、配列番号５５を含む、実施形態２８の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０２７９】
３６．配列番号５６を含むことを特徴とするアミノ酸配列を有する３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０２８０】
３７．前記アミノ酸配列は、配列番号５７を含む、実施形態３６の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０２８１】
３８．前記アミノ酸配列は、配列番号５１を更に含む、実施形態３６または３７の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０２８２】
３９．前記アミノ酸配列は、配列番号５２を更に含む、実施形態３６または３７の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０２８３】
４０．前記アミノ酸配列は、配列番号５３を更に含む、実施形態３６または３７の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０２８４】
４１．前記アミノ酸配列は、配列番号５８を含む、実施形態３６の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０２８５】
４２．前記アミノ酸配列は、配列番号４８を更に含む、実施形態３６〜４１のいずれかの３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０２８６】
４３．前記アミノ酸配列は、配列番号５９を含む、実施形態３６の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０２８７】
４４．配列番号６０を含むことを特徴とするアミノ酸配列を有する３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０２８８】
４５．前記アミノ酸配列は、配列番号６１を含む、実施形態４４の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０２８９】
４６．前記アミノ酸配列は、配列番号６２を含む、実施形態４４の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０２９０】
４７．前記アミノ酸配列は、配列番号６３を含む、実施形態４４の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０２９１】
４８．前記アミノ酸配列は、配列番号４６を含む、実施形態４４〜４６のいずれかの３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０２９２】
４９．前記アミノ酸配列は、配列番号４８を含む、実施形態４４〜４８のいずれかの３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０２９３】
５０．前記アミノ酸配列は、配列番号６４を含む、実施形態４４の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０２９４】
５１．配列番号６５を含むことを特徴とする酸配列を有する３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０２９５】
５２．前記アミノ酸配列は、配列番号５１を含む、実施形態５１の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０２９６】
５３．前記アミノ酸配列は、配列番号６６を含む、実施形態５１または５２のいずれかの３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０２９７】
５４．前記アミノ酸配列は、配列番号４８を含む、実施形態５１〜５３のいずれかの３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０２９８】
５５．前記アミノ酸配列は、ａ）配列番号４または配列番号１６１及びｂ）配列番号５のうちの少なくとも１つを含む、実施形態５１〜５４のいずれかの３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０２９９】
５６．前記アミノ酸配列は、配列番号５３を含む、実施形態５１〜５５のいずれかの３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０３００】
５７．前記アミノ酸配列は、配列番号６７を含む、実施形態５１の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０３０１】
５８．前記アミノ酸配列は、配列番号６８を含む、実施形態５１の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０３０２】
５９．配列番号６９を含むことを特徴とするアミノ配列を有する３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼをコードする異種核酸配列を含む３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０３０３】
６０．前記アミノ酸配列は、配列番号５１を更に含む、実施形態５９の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０３０４】
６１．前記アミノ酸配列は、配列番号５２を含む、実施形態５９または６０の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０３０５】
６２．前記アミノ酸配列は、配列番号５３を含む、実施形態５９または６９の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０３０６】
６３．前記アミノ酸配列は、ａ）配列番号５及びｂ）配列番号６または配列番号１６２のうちの少なくとも１つを含む、実施形態５６〜６２のいずれかの３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０３０７】
６４．前記アミノ酸配列は、配列番号４６を含む、実施形態５９〜６３のいずれかの３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０３０８】
６５．前記アミノ酸配列は、配列番号７０を含む、実施形態５９または６０の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０３０９】
６６．前記アミノ酸配列は、配列番号４８を含む、実施形態５９〜６５のいずれかの３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０３１０】
６７．前記アミノ酸配列は、配列番号７１を含む、実施形態５９の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０３１１】
６８．配列番号１１０を有するか、または配列番号１１０と少なくとも８０％同一であるケトアシル−ＣｏＡシンターゼであって、各場合において、特徴ｉ）〜ｘｉｉｉ）：
ｉ）配列番号１１０のアミノ酸残基３０に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、アラニンであり；
ｉｉ）配列番号１１０のアミノ酸残基３９に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、バリンであり；
ｉｉｉ）配列番号１１０のアミノ酸残基６９に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、バリンであり；
ｉｖ）配列番号１１０のアミノ酸残基１１１に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、システインであり；
ｖ）配列番号１１０のアミノ酸残基１５２に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、システイン、ロイシン、メチオニンまたはトレオニンであり；
ｖｉ）配列番号１１０のアミノ酸残基１７８に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、ロイシンであり；
ｖｉｉ）配列番号１１０のアミノ酸残基１８４に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、イソロイシン、ロイシン、メチオニンまたはバリンであり；
ｖｉｉｉ）配列番号１１０のアミノ酸残基２６８に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、アラニンであり；
ｉｘ）配列番号１１０のアミノ酸残基２７１に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、イソロイシンであり；
ｘ）配列番号１１０のアミノ酸残基２７８に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、アルギニンであり；
ｘｉ）配列番号１１０のアミノ酸残基２９６に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、アラニンであり；
ｘｉｉ）配列番号１１０のアミノ酸残基３１７に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、アラニンであり；
ｘｉｉｉ）配列番号１１０のアミノ酸残基３２８に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、グリシンである、
のうち少なくとも１つを含む、前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０３１２】
６９．配列番号１１９を有するか、または配列番号１１９と少なくとも８０％同一であるケトアシル−ＣｏＡシンターゼであって、各場合において、特徴ｉ）〜ｘｌｉｉｉ）：
ｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基１８に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、アラニンであり；
ｉｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基２２に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、メチオニンであり；
ｉｉｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基３０に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、アラニンであり；
ｉｖ）配列番号１１９のアミノ酸残基３８に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、バリンであり；
ｖ）配列番号１１９のアミノ酸残基３９に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、バリンであり；
ｖｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基５１に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、アラニン、システイン、アスパラギン酸、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファンまたはチロシンであり；
ｖｉｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基５４に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、バリンであり；
ｖｉｉｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基６９に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、バリンであり；
ｉｘ）配列番号１１９のアミノ酸残基８３に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、アスパラギンであり；
ｘ）配列番号１１９のアミノ酸残基９４に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、トレオニン、ロイシン、グルタミン酸、またはアラニンであり；
ｘｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基１１１に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、システインであり；
ｘｉｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基１１６に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、グリシンであり；
ｘｉｉｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基１２７に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、トレオニンであり；
ｘｉｖ）配列番号１１９のアミノ酸残基１３０に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、グリシンであり；
ｘｖ）配列番号１１９のアミノ酸残基１５２に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、システイン、ロイシン、メチオニンまたはトレオニンであり；
ｘｖｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基１５４に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、グリシンであり；
ｘｖｉｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基１７８に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、ロイシンまたはトレオニンであり；
ｘｖｉｉｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基１９０に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、フェニルアラニンまたはチロシンであり；
ｘｉｘ）配列番号１１９のアミノ酸残基２１０に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、バリンであり；
ｘｘ）配列番号１１９のアミノ酸残基２２３に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、ヒスチジンであり；
ｘｘｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基２３１に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、イソロイシンであり；
ｘｘｉｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基２３２に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、バリンであり；
ｘｘｉｉｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基２３６に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、ロイシンまたはメチオニンであり；
ｘｘｉｖ）配列番号１１９のアミノ酸残基２４１に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、プロリンであり；
ｘｘｖ）配列番号１１９のアミノ酸残基２６８に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、アラニンであり；
ｘｘｖｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基２７１に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、イソロイシンであり；
ｘｘｖｉｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基２７４に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、グルタミン酸であり；
ｘｘｖｉｉｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基２７８に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、アルギニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミンであり；
ｘｘｉｘ）配列番号１１９のアミノ酸残基２８０に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、イソロイシンであり；
ｘｘｘ）配列番号１１９のアミノ酸残基２８２に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、グリシンであり；
ｘｘｘｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基２９６に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、アラニンであり；
ｘｘｘｉｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基３０２に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、トレオニンであり；
ｘｘｘｉｉｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基３１２に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、アスパラギン酸であり；
ｘｘｘｉｖ）配列番号１１９のアミノ酸残基３１３に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、グルタミン酸またはメチオニンであり；
ｘｘｘｖ）配列番号１１９のアミノ酸残基３１５に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、リシンであり；
ｘｘｘｖｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基３１７に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、アラニンであり；
ｘｘｘｖｉｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基３２２に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、グリシンであり；
ｘｘｘｖｉｉｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基３２８に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、グリシンであり；
ｘｘｘｉｘ）配列番号１１９のアミノ酸残基３２９に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、グリシンであり；
ｘｌ）配列番号１１９のアミノ酸残基３４４に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアスパラギンであり；
ｘｌｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基３５６に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、グリシンまたはセリンであり；
ｘｌｉｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基３６８に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、アルギニンであり；
ｘｌｉｉｉ）配列番号１１９のアミノ酸残基３７０に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、トレオニンである、
という特徴のうち少なくとも１つを含む、前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０３１３】
７０．配列番号１１９のアミノ酸残基１８４に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼの前記アミノ酸残基は、イソロイシン、ロイシン、メチオニンまたはバリンである、実施形態６９のケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０３１４】
７１．配列番号１１９のアミノ酸残基１８４に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼの前記アミノ酸残基は、イソロイシンである、実施形態６９のケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０３１５】
７２．  配列番号１１９のアミノ酸残基２６８に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼの前記アミノ酸残基は、アラニンであり；
配列番号１１９のアミノ酸残基２９６に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼの前記アミノ酸残基は、アラニンであり；
配列番号１１９のアミノ酸残基３２８に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼの前記アミノ酸残基は、グリシンである、実施形態６９〜７１のいずれかのケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０３１６】
７３．配列番号１１９のアミノ酸残基３１７に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼの前記アミノ酸残基は、アラニンである、実施形態６９〜７２のいずれかのケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０３１７】
７４．配列番号１１９のアミノ酸残基３０に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼの前記アミノ酸残基は、アラニンである、実施形態７０〜７３のいずれかのケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０３１８】
７５．配列番号１１９のアミノ酸残基３６８に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼの前記アミノ酸残基は、アルギニンである、実施形態７０〜７４のいずれかのケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０３１９】
７６．配列番号１１９のアミノ酸残基５１に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼの前記アミノ酸残基は、アラニン、システイン、アスパラギン酸、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファンまたはチロシンである、実施形態６９〜７５のいずれかのケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０３２０】
７７．配列番号１１９のアミノ酸残基５１に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼの前記アミノ酸残基は、アラニンである、実施形態６９〜７６のいずれかのケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０３２１】
７８．配列番号１２１〜１５７のいずれかからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０３２２】
７９．配列番号１１０を有するか、または配列番号１１０と少なくとも８０％同一であるケトアシル−ＣｏＡシンターゼであって、各場合において、特徴ｉ）〜ｘｉｉｉ）：
ｉ）配列番号１１０のアミノ酸残基３０に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、アラニンであり；
ｉｉ）配列番号１１０のアミノ酸残基３９に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、バリンであり；
ｉｉｉ）配列番号１１０のアミノ酸残基６９に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、バリンであり；
ｉｖ）配列番号１１０のアミノ酸残基１１１に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、システインであり；
ｖ）配列番号１１０のアミノ酸残基１５２に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、システイン、ロイシン、メチオニンまたはトレオニンであり；
ｖｉ）配列番号１１０のアミノ酸残基１７８に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、ロイシンであり；
ｖｉｉ）配列番号１１０のアミノ酸残基１８４に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、イソロイシン、ロイシン、メチオニンまたはバリンであり；
ｖｉｉｉ）配列番号１１０のアミノ酸残基２６８に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、アラニンであり；
ｉｘ）配列番号１１０のアミノ酸残基２７１に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、イソロイシンであり；
ｘ）配列番号１１０のアミノ酸残基２７８に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、アルギニンであり；
ｘｉ）配列番号１１０のアミノ酸残基２９６に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、アラニンであり；
ｘｉｉ）配列番号１１０のアミノ酸残基３１７に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、アラニンであり；
ｘｉｉｉ）配列番号１１０のアミノ酸残基３２８に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、グリシンである、
のうち少なくとも１つを含む、前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０３２３】
８０．配列番号１２０のアミノ酸残基１８４に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼの前記アミノ酸残基は、イソロイシン、ロイシン、メチオニンまたはバリンである、実施形態７９のケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０３２４】
８１．配列番号１２０のアミノ酸残基１８４に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼの前記アミノ酸残基は、イソロイシンである、実施形態７９のケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０３２５】
８２．配列番号１２０のアミノ酸残基２６８に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼの前記アミノ酸残基は、アラニンであり；
配列番号１２０のアミノ酸残基２９６に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼの前記アミノ酸残基は、アラニンであり；
配列番号１２０のアミノ酸残基３２８に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼの前記アミノ酸残基は、グリシンである、実施形態７９〜８１のいずれかのケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０３２６】
８３．配列番号１２０のアミノ酸残基３１７に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼの前記アミノ酸残基は、アラニンである、実施形態７９〜８２のいずれかのケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０３２７】
８４．配列番号１２０のアミノ酸残基３０に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼの前記アミノ酸残基は、アラニンである、実施形態８０〜８３のいずれかのケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０３２８】
８５．配列番号１２０のアミノ酸残基３６８に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼの前記アミノ酸残基は、アルギニンである、実施形態８０〜８４のいずれかのケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０３２９】
８６．配列番号１１０を有するか、または配列番号１１０と少なくとも８０％同一であるケトアシル−ＣｏＡシンターゼであって、各場合において、特徴ｉ）〜ｘｉｉｉ）：
ｉ）配列番号１１０のアミノ酸残基３０に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、アラニンであり；
ｉｉ）配列番号１１０のアミノ酸残基３９に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、バリンであり；
ｉｉｉ）配列番号１１０のアミノ酸残基６９に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、バリンであり；
ｉｖ）配列番号１１０のアミノ酸残基１１１に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、システインであり；
ｖ）配列番号１１０のアミノ酸残基１５２に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、システイン、ロイシン、メチオニンまたはトレオニンであり；
ｖｉ）配列番号１１０のアミノ酸残基１７８に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、ロイシンであり；
ｖｉｉ）配列番号１１０のアミノ酸残基１８４に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、イソロイシン、ロイシン、メチオニンまたはバリンであり；
ｖｉｉｉ）配列番号１１０のアミノ酸残基２６８に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、アラニンであり；
ｉｘ）配列番号１１０のアミノ酸残基２７１に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、イソロイシンであり；
ｘ）配列番号１１０のアミノ酸残基２７８に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、アルギニンであり；
ｘｉ）配列番号１１０のアミノ酸残基２９６に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、アラニンであり；
ｘｉｉ）配列番号１１０のアミノ酸残基３１７に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、アラニンであり；
ｘｉｉｉ）配列番号１１０のアミノ酸残基３２８に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸残基は、グリシンである、
のうち少なくとも１つを含む、前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０３３０】
８７．配列番号１１０のアミノ酸残基１８４に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼの前記アミノ酸残基は、イソロイシン、ロイシン、メチオニンまたはバリンである、実施形態８６のケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０３３１】
８８．配列番号１１０のアミノ酸残基１８４に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼの前記アミノ酸残基は、イソロイシンである、実施形態８６のケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０３３２】
８９．配列番号１１０のアミノ酸残基２６８に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼの前記アミノ酸残基は、アラニンであり；
配列番号１１０のアミノ酸残基２９６に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼの前記アミノ酸残基は、アラニンであり；
配列番号１１０のアミノ酸残基３２８に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼの前記アミノ酸残基は、グリシンである、実施形態８６〜８８のいずれかのケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０３３３】
９０．配列番号１１０のアミノ酸残基３１７に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼの前記アミノ酸残基は、アラニンである、実施形態８６〜８９のいずれかのケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０３３４】
９１．配列番号１１０のアミノ酸残基３０に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼの前記アミノ酸残基は、アラニンである、実施形態８７〜９０のいずれかのケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０３３５】
９２．配列番号１１０のアミノ酸残基３６８に整列する前記ケトアシル−ＣｏＡシンターゼの前記アミノ酸残基は、アルギニンである、実施形態８７〜９１のいずれかのケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０３３６】
９３．配列番号１７０を含むことを特徴とする酸配列を有する３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ。
【０３３７】
９４．実施形態１〜９３のいずれかの３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼをコードする３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ遺伝子。
【０３３８】
９５．実施形態１〜９３のいずれかの３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼをコードする異種核酸配列を含む遺伝子組み換え細胞。
【０３３９】
９６．実施形態９４の３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ遺伝子を含む遺伝子組み換え細胞。
【０３４０】
９７．前記３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼは、マロニル−ＣｏＡ依存性である、実施形態９５または９６の遺伝子組み換え細胞。
【０３４１】
９８．マロニル−ＣｏＡ依存性３−ケトヘキサノイル−ＣｏＡシンターゼをコードする異種核酸配列を更に含む、実施形態９５〜９７のいずれかの遺伝子組み換え細胞。
【０３４２】
９９．マロニル−ＣｏＡ依存性３−ケトヘキサノイル−ＣｏＡシンターゼをコードする前記異種核酸配列は、配列番号８２を含む、実施形態９８の遺伝子組み換え細胞。
【０３４３】
１００．マロニル−ＣｏＡ依存性３−ケトヘキサノイル−ＣｏＡシンターゼをコードする前記異種核酸配列は、アミノ酸残基１００がロイシンであり、アミノ酸残基１４７がセリン、トレオニンまたはフェニルアラニンであり、アミノ酸残基２１７がバリンであり、アミノ酸残基３２３がバリンである配列番号８２を含む、実施形態９８の遺伝子組み換え細胞。
【０３４４】
１０１．マロニル−ＣｏＡ依存性３−ケトブチリル−ＣｏＡシンターゼをコードする異種核酸配列を更に含む、実施形態９５〜１００のいずれかの遺伝子組み換え細胞。
【０３４５】
１０２．マロニル−ＣｏＡ依存性３−ケトブチリル−ＣｏＡシンターゼをコードする前記異種核酸配列は、配列番号８３を含む、実施形態１０１の遺伝子組み換え細胞。
【０３４６】
１０３．３−ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼをコードする異種核酸配列を更に含む、実施形態９５〜１０２のいずれかの遺伝子組み換え細胞。
【０３４７】
１０４．前記３−ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼは、配列番号１０３、配列番号１０２、配列番号１０１のいずれか１つを有するか、またはそれと少なくとも８０％同一である、実施形態１０３の遺伝子組み換え細胞。
【０３４８】
１０５．３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼをコードする異種核酸配列を更に含む、実施形態９５〜１０４のいずれかの遺伝子組み換え細胞。
【０３４９】
１０６．３−ケトアシル−ＣｏＡを還元して対応する３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡを形成し、前記３−ケトアシル−ＣｏＡを脱水して対応する２−トランス−エノイル−ＣｏＡを形成する酵素をコードする異種核酸配列を更に含む、実施形態９５〜１０５のいずれかの遺伝子組み換え細胞。
【０３５０】
１０７．３−ケトアシル−ＣｏＡを還元して対応する３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡを形成し、前記３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡを脱水して対応する２−トランス−エノイル−ＣｏＡを形成する酵素をコードする前記異種核酸配列は、配列番号９８を有するか、またはそれと少なくとも８０％同一である、実施形態１０６の遺伝子組み換え細胞。
【０３５１】
１０８．エノイル−ＣｏＡレダクターゼをコードする異種核酸配列を更に含む、実施形態９５〜１０７のいずれかの遺伝子組み換え細胞。
【０３５２】
１０９．エステルシンターゼをコードする異種核酸配列を更に含む、実施形態９５〜１０８のいずれかの遺伝子組み換え細胞。
【０３５３】
１１０．天然ＬＤＨ遺伝子の欠失を更に含む、実施形態９５〜１０９のいずれかの遺伝子組み換え細胞。
【０３５４】
１１１．天然ピルビン酸ギ酸リアーゼ遺伝子の欠失を更に含む、実施形態９５〜１１０のいずれかの遺伝子組み換え細胞。
【０３５５】
１１２．天然メチルグリオキサールシンターゼ遺伝子の欠失を更に含む、実施形態９５〜１１１のいずれかの遺伝子組み換え細胞。
【０３５６】
１１３．天然ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子の欠失を更に含む、実施形態９５〜１１２のいずれかの遺伝子組み換え細胞。
【０３５７】
１１４．天然チオエステラーゼ遺伝子の欠失を更に含む、実施形態９５〜１１３のいずれかの遺伝子組み換え細胞。
【０３５８】
１１５．天然ａｄｈＥ遺伝子の欠失を更に含む、実施形態９５〜１１４のいずれかの遺伝子組み換え細胞。
【０３５９】
１１６．天然ａｔｏＤＡＥＢオペロンの欠失を更に含む、実施形態９５〜１１５のいずれかの遺伝子組み換え細胞。
【０３６０】
１１７．天然ｆａｄＤ遺伝子の欠失を更に含む、実施形態９５〜１１６のいずれかの遺伝子組み換え細胞。
【０３６１】
１１８．天然ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子の欠失を更に含む、実施形態９５〜１１１のいずれかの遺伝子組み換え細胞。
【０３６２】
１１９．脂肪アシル−ＣｏＡレダクターゼ、脂肪アルデヒドレダクターゼ、アシル−ＡＣＰレダクターゼ、アシル−ＣｏＡ：ＡＣＰアシルトランスフェラーゼ、チオエステラーゼ、アシル−ＣｏＡヒドロラーゼ、カルボン酸レダクターゼ、ＣｏＡヒドロラーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、カルボン酸レダクターゼ及びアシル−ＡＣＰレダクターゼのいずれかをコードする異種核酸配列を更に含む、実施形態９５〜１１８のいずれかの遺伝子組み換え細胞。
【０３６３】
１２０．細菌である、実施形態９５〜１１９のいずれかの遺伝子組み換え細胞。
【０３６４】
１２１．前記細菌は、Ｅ．ｃｏｌｉである、実施形態１２０の遺伝子組み換え細胞。
【０３６５】
１２２．直鎖アルキル基を有する１つ以上の化合物を製造するためのプロセスであって、実施形態９５〜１２１のいずれかの遺伝子組み換え細胞を発酵培地中で培養すること、及び前記発酵培地から直鎖アルキル基を有する前記化合物（複数可）を回収することを含む、前記プロセス。
【０３６６】
１２３．直鎖アルキル基を有する前記化合物（複数可）の少なくとも４０重量％は、前記直鎖アルキル基中に６〜１０個の炭素原子を有する、実施形態１２２のプロセス。
【０３６７】
１２４．直鎖アルキル基を有する前記化合物（複数可）の少なくとも６０重量％は、前記直鎖アルキル基中に６〜１０個の炭素原子を有する、実施形態１２２のプロセス。
【０３６８】
１２５．直鎖アルキル基を有する前記化合物（複数可）は、脂肪アルコールである、実施形態１２２〜１２４のいずれかのプロセス。
【０３６９】
１２６．直鎖アルキル基を有する前記化合物（複数可）は、脂肪アミドである、実施形態１２２〜１２４のいずれかのプロセス。
【０３７０】
１２７．直鎖アルキル基を有する前記化合物（複数可）は、脂肪二酸または脂肪二酸エステルである、実施形態１２２〜１２４のいずれかのプロセス。
【０３７１】
１２８．直鎖アルキル基を有する前記化合物（複数可）は、脂肪酸である、実施形態１２２〜１２４のいずれかのプロセス。
【０３７２】
１２９．直鎖アルキル基を有する前記化合物（複数可）は、脂肪酸エステルである、実施形態１２２〜１２４のいずれかのプロセス。
【０３７３】
１３０．前記脂肪酸エステルは、メチル及び／またはエチルエステルである、実施形態１２９のプロセス。
【０３７４】
１３１．前記発酵培地は、メタノール及び／またはエタノールを含む、実施形態１３０のプロセス。
【０３７５】
１３２．直鎖アルキル基を有する前記化合物（複数可）の少なくとも６０重量％は、前記直鎖アルキル基中に８個の炭素原子を有する、実施形態１２２〜１３１のいずれかのプロセス。
【０３７６】
１３３．直鎖アルキル基を有する前記化合物（複数可）の少なくとも８０重量％は、前記直鎖アルキル基中に８個の炭素原子を有する、実施形態１２２〜１３１のいずれかのプロセス。
【０３７７】
１３４．直鎖アルキル基を有する前記化合物（複数可）の少なくとも９０重量％は、前記直鎖アルキル基中に８個の炭素原子を有する、実施形態１２２〜１３１のいずれかのプロセス。
【０３７８】
１３５．直鎖アルキル基を有する前記化合物（複数可）の少なくとも６０重量％は、前記直鎖アルキル基中に１０個の炭素原子を有する、実施形態１２２〜１３１のいずれかのプロセス。
【０３７９】
１３６．直鎖アルキル基を有する前記化合物（複数可）の少なくとも８０重量％は、前記直鎖アルキル基中に１０個の炭素原子を有する、実施形態１２２〜１３１のいずれかのプロセス。
【０３８０】
１３７．直鎖アルキル基を有する前記化合物（複数可）の少なくとも９０重量％は、前記直鎖アルキル基中に８個の炭素原子を有する、実施形態１２２〜１３１のいずれかのプロセス。
【０３８１】
１３８．直鎖アルキル基を有する前記化合物（複数可）の少なくとも９５重量％は、前記直鎖アルキル基中に８個の炭素原子を有する、実施形態１２２〜１３１のいずれかのプロセス。
【０３８２】
１３９．直鎖アルキル基を有する前記１つ以上の化合物（複数可）の少なくとも０．０５グラムは、１時間当たり発酵ブロス１リットル当たりで生成される、実施形態１２２〜１３８のいずれかのプロセス。
【０３８３】
１４０．直鎖アルキル基を有する前記１つ以上の化合物（複数可）の少なくとも０．１グラムは、１時間当たり発酵ブロス１リットル当たりで生成される、実施形態１２２〜１３８のいずれかのプロセス。
【０３８４】
１４１．直鎖アルキル基を有する前記１つ以上の化合物（複数可）の少なくとも０．２５グラムは、１時間当たり発酵ブロス１リットル当たりで生成される、実施形態１２２〜１３８のいずれかのプロセス。
【０３８５】
１４２．直鎖アルキル基を有する１つ以上の化合物を生成するための実施形態９５〜１２１のいずれかの遺伝子組み換え細胞の使用であって、前記１つ以上の化合物の少なくとも６０重量％は、前記直鎖アルキル基中に６〜１０個の炭素原子を有する、前記使用。
【０３８６】
１４５．直鎖アルキル基を有する１つ以上の化合物を生成するための実施形態９５〜１２１のいずれかの遺伝子組み換え細胞の使用であって、前記１つ以上の化合物の少なくとも８０％は、前記直鎖アルキル基中に８〜１０個の炭素原子を有する、前記使用。
【０３８７】
１４６．実施形態１〜９３のいずれかの３−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼを生成する細胞。
【配列表】
2020506702000001.app
【国際調査報告】
2020506702.tif 000047
2020506702.tif 000048
2020506702.tif 000049