(57)【要約】  本発明は、石油及びガス産業、環境浄化や、様々な他の用途において用いられる微生物ベースの組成物を製造するためのシステム及び装置を提供する。詳述すると、本発明は微生物ベースの組成物を発酵するためのバイオリアクター、機器、材料を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物ベースの組成物を製造するシステムであって、
第１のタンクと第２のタンクとを含むリアクターと、
第１のチューブを介して前記第１のタンクに接続される入力部と、第２のチューブを介して前記第２のタンクに接続される出力部と、を備えるポンプと、
前記第２のタンクと前記第１のタンクとを接続する第３のチューブと、を具備し、
前記第３のチューブは、静水圧によって液体を前記第２のタンクから前記第１のタンクに流すのに適している
システム。
【請求項２】
請求項１に記載のシステムであって、
１以上の送風機又は空気圧縮機をさらに具備し、
前記１以上の送風機又は空気圧縮機は、１以上のガス注入器と、１以上のバブラーと、１以上のスパージャと、のうちの少なくとも１つに接続される
システム。
【請求項３】
請求項１に記載のシステムであって、
前記リアクターの作業容量は１０ガロンから４００００ガロンである
システム。
【請求項４】
請求項１に記載のシステムであって、
システムコンポーネントを支えるためのフレームをさらに具備する
システム。
【請求項５】
請求項１に記載のシステムであって、
前記システムを操作するための車輪及びハンドルをさらに具備する
システム。
【請求項６】
請求項１に記載のシステムであって、
前記システムはトラックトレーラー及び／又はセミトレーラーの後部に設置するように構成され、及び／又は
前記システムは運搬可能である
システム。
【請求項７】
請求項１に記載のシステムであって、
１以上の前記ポンプの循環比は３０から０．１の間である
システム。
【請求項８】
無汚染で微生物を培養する方法であって、
ペリスタルティックポンプを用いて請求項１に記載のシステムに、水と栄養成分を含む培養培地を投入し、
前記システムに生存微生物をイノキュレーションすることを含み、
任意で、前記システムに抗菌剤を投入することを含む
方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって、
前記微生物は酵母である
方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、
前記微生物はスタルメレラ・ボンビコラ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ  ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）である
方法。
【請求項１１】
請求項９に記載の方法であって、
前記微生物はシュードザイマ・アフィディス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ  ａｐｈｉｄｉｓ）である
方法。
【請求項１２】
請求項８に記載の方法であって、
前記微生物を培養する前に、請求項１に記載の前記システムを殺菌する
方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、殺菌は
前記リアクターの内面を消毒剤で洗浄することと、
３％の過酸化水素水を前記リアクターの内側に噴霧することと、
前記リアクターの内側を１０５℃から１１０℃の水蒸気に晒すことと、のうちの少なくとも１つを含む
方法。
【請求項１４】
請求項８に記載の方法であって、
前記培養培地は、前記システムに投入される前に汚染除去される
方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、汚染除去は
前記培養培地成分を加圧滅菌し、
０．１ミクロンのウォーターフィルターを用いて前記水の濾過を行い、
前記水のＵＶ殺菌を行う
方法。
【請求項１６】
請求項８に記載の方法であって、
前記抗菌剤はバイオサーファクタントである
方法。
【請求項１７】
微生物と、
前記微生物の増殖によって得られる１以上の生成物と、のうちの少なくとも１つを含む
請求項１に記載のシステムにより製造された組成物。
【請求項１８】
請求項１７に記載の組成物であって、
前記微生物はスタルメレラ・ボンビコラ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ  ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）である
組成物。
【請求項１９】
請求項１７に記載の組成物であって、
前記微生物はシュードザイマ・アフィディス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ  ａｐｈｉｄｉｓ）である
組成物。
【請求項２０】
請求項１７に記載の組成物であって、
前記増殖副産物はバイオサーファクタントである
組成物。
【請求項２１】
請求項２０に記載の組成物であって、
前記バイオサーファクタントはソホロ脂質である
組成物。
【請求項２２】
請求項２０に記載の組成物であって、
前記バイオサーファクタントはマンノシルエリスリトールリピッドである
組成物。
【請求項２３】
含油層から採掘可能な石油の量を増加させる方法であって、
請求項１７に記載の組成物を前記含油層に対して使用することを含む
方法。
【請求項２４】
油井ロッドと、チューブと、ケーシングと、のうちの少なくとも１つを洗浄する方法であって、
請求項１７に記載の組成物を、前記油井ロッド、前記チューブ、及び前記ケーシングの構造に対して使用することを含む
方法。
【請求項２５】
植物の成長と、収穫量と、生育状態と、のうちの少なくとも１つを改善する方法であって、
請求項１７に記載の組成物を前記植物又はその環境に対して使用することを含む
方法。
【請求項２６】
動物の害虫を抑制する方法であって、
請求項１７に記載の組成物に前記害虫を接触させることを含む
方法。
【請求項２７】
動物に給餌する方法であって、
請求項１７に記載の組成物を、前記動物の餌と、前記動物の飲水源と、のうちの少なくとも１つに投入することを含む
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願を相互参照
本出願は、２０１７年１月６日に出願された米国特許仮出願第６２／４４３，３５６号の利益を主張するものであり、該仮出願は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、例えば、石油産業、農業、鉱業、廃棄物処理、バイオレメディエーションにおいて用いられる微生物ベースの組成物を製造する方法及びシステムに関する。
【背景技術】
【０００３】
バクテリア、酵母、菌類等の微生物の培養は、多種の有用な生物学的製剤の製造において重要である。微生物は、例えば食品産業、製薬、農業、鉱業、環境修復、及び廃棄物処理において重要な役割を果たしている。
【０００４】
微生物は広い産業分野において用いられる可能性が高い。微生物ベースの製品の商用化の制限要因としては、散布体密度あたりのコストがある。利益をあげるための、十分なイノキュラムを用いた微生物製品の大規模な運用には莫大な費用がかかり、実現不可能である。
【０００５】
微生物の培養に関しては、液内培養と表面培養の２つの原理がある。バクテリア、酵母、菌類は全て液内培養でも表面培養でもどちらでも増殖可能である。液内培養でも表面培養でも、微生物の増殖のためには栄養培地が必要となる。栄養培地は液体でも固体でもよく、通常は炭素源、窒素源、塩、及び他の適切な追加栄養素と微量要素を含む。ｐＨ値と酸素濃度は、所定の微生物に適した値に維持される。
【０００６】
もし微生物の入手が容易になり、好ましくはより活性な形態での入手が可能になりさえすれば、微生物は、例えば、石油産業や農産業においてとても有益な役割を果たす可能性がある。
【０００７】
石油や天然ガスは、一般的に掘削リグと呼ばれる装置を用いて地表を掘削することにより入手される。坑井や掘削孔を掘るには、まずはドリルビットを用いて地面に大口径（例えば、直径２４から３６インチ）の穴をあける。このドリルビットはドリルパイプに取り付けられており、掘削リグによって回転させられる。通常、ドリルビットが地下水面に到達するまで、掘削リグは穴の掘削を続ける。次に、金属ライナー（又はケーシング）が大口径の穴の中に設置され、ライナーの中を通ってセメントがポンプで注入される。セメントがライナーの底に到達すると、セメントはライナーとその周りの構造の間の空間を埋め、地下水面を隔離し、続くステップにおいて穴の中にポンプによって注入される掘削流体から地下水面を保護するように、上に向かって堆積する。
【０００８】
第１のケーシングのセメンチングが終わると、地下層をより深く掘削するための中型ビットの使用が可能になる。通常、１以上の中継点が存在する。この中継点では、ドリルビットが取り外され、その後、より小型のケーシングライナーとセメントを用いた作業が続く。上記のプロセスは坑井が完成するまで繰り返される。
【０００９】
この掘削プロセスにおいて、掘削流体はドリルパイプを通してポンプによって注入され、ドリルビットから排出される。その後、この流体はドリルパイプと地層又はケーシングの間の空間に逆流する。この掘削流体により、掘りくずを取り除き、坑内圧力のバランスをとり、掘削孔の潤滑化を行い、掘削孔から摩擦を引き起こす物質を取り除く。
【００１０】
一般的に、抗井が堀りおわったら、生産ライナー（又はケーシング）が設置され、その後、抗井を穿孔する（例えば、含油層の特定のポイントにおいて生産ライナーに穴をあけるため、爆薬が使用される）。その後、抗井から石油が流れ出す。これは、地層の自然圧力によって行われてもよいし、機械設備によって引き起こされた圧力によって行われてもよいし、水攻法や、他の方法によって行われてもよい。抗井を原油が流れるにつれて、原油中の物質が生産ライナーの表面に溜まることがしばしば発生する。これにより原油の流れのスピードが遅くなり、時には生産工程の全てがストップする場合もある。
【００１１】
この問題を解決又は軽減するために、様々な異なる化学物質や機器が用いられたが、未だに生産物や方法の改良の必要がある。特に、より環境に優しく、毒性が低く、より効率の高い生産物や方法が求められている。
【００１２】
農産業においては、農業従事者らは収穫量を上げ、農作物を病原体や害虫、病気から守るために、化学物質や化学肥料に大きく依存している。しかし、これらを使いすぎたり、不適切に使用した場合、これらの物質が流出、浸出、蒸発することによって大気汚染や水質汚染を引き起こす可能性がある。たとえ適切に使用した場合でも、特定の化学肥料や殺虫剤に過度に依存したり、長期で使用したりすると、土壌生態系を有害に変化させ、ストレス耐性を減らしてしまい、害虫抵抗性を高め、植物や動物の成長や活力を阻害する。
【００１３】
増加する規制は、化学物質の入手や使用を管理することを命じている。また、残留物が無く、環境への害を最小限におさえた持続可能な食糧生産を消費者は要求している。これらは農産業へ大きな影響を与えており、様々な課題にどのように取り組むべきかという考え方に進化を引き起こしている。より安全な殺虫剤や、害虫を抑制するための他の手法への要求が高まってきている。現時点での化学物質の大規模撤廃は現実的ではないが、総合的栄養管理（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ）プログラム及び総合的害虫管理（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｐｅｓｔ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ）プログラムの実現可能な要素として、生物学的な手法の使用を試みる農業従事者らが増加している。
【００１４】
例えば、近年において、生物学的線虫防除が大きな注目を集めている。この方法は、例えば、生きた微生物や、これらの微生物に由来するバイオ製品、これらを組み合わせたもの等の生物剤を殺虫剤として使用する。これらの生物農薬は従来の殺虫剤に比べ重要な利点を持つ。例えば、これらの生物農薬は従来の化学農薬に比べ害が少ない。生物農薬はより効率的で、その効果は限定的である。多くの生物農薬は迅速に生分解され、このため環境汚染を減らすことができる。
【００１５】
生物農薬やその他の生物剤の使用は、その生産、輸送、管理、価格設定、効果発揮の難しさのためかなり限定されている。例えば、多くの微生物は、使用効果を得るのに十分な量での培養が難しく、また培養後の農業システム及び林業生産システムへの適用も難しい。この問題は、流通前の処理、配合、保存、安定化による生存率及び活性の減少によってさらに悪化してしまう。さらに、バイオ製品を使用しても、多くの理由によりバイオ製品は生育しない可能性がある。これは、例えば、初期の細胞密度の不足や、特定の場所における既存のマイクロフローラと効果的に競合することができないということ、及び、微生物が繁栄又は生存すらできない土壌や環境条件に導入されることがある、などといった理由のためである。
【００１６】
微生物ベースの組成物を用いれば、農産業、石油及びガス産業等が直面している上記のような問題のうちいくつかを解決に導く手助けをすることが可能である。つまり、微生物及び微生物代謝産物の大量生産のためのより効率的な培養方法が求められている。
【発明の概要】
【００１７】
本発明は、石油及びガス産業、農業、ヘルスケア、及び環境浄化分野や、様々な他の利用分野において用いられる微生物ベースの組成物を製造するための材料、方法、及びシステムを提供する。具体的には、本発明は効率的な微生物の培養及び微生物増殖副産物の製造のための材料、方法、システムを提供する。
【００１８】
本発明の実施形態は、低コストで新規な発酵方法及びシステムを提供する。詳述すると、本発明は発酵のためのバイオリアクターを提供する。具体的な実施形態として、酵母及び／又は他の微生物ベースの組成物の培養に用いられるシステムがある。ある具体的な実施形態として、スタルメレラ・ボンビコラ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ  ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）酵母組成物の製造のために用いられるシステムがある。
【００１９】
このシステムは酵母、菌類、及びバクテリアを培養するために用いることができる。ある実施形態において、酵母ベースの組成物の製造のために用いられるシステムがある。この酵母ベースの組成物は、例えば、スタルメレラ・ボンビコラ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ  ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）、ウィッカーハモマイセス・アノマルス（Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｏｍｙｃｅｓ  ａｎｏｍａｌｕｓ）、及び／又はシュードザイマ・アフィディス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ  ａｐｈｉｄｉｓ）酵母を含む組成物を含む。いくつかの実施形態において、このシステムはバクテリア・ベースの組成物を製造するために用いることができる。このバクテリア・ベースの組成物は、例えば、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及び／又はバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）を含む組成物を含む。
【００２０】
具体的な実施形態として、本発明のシステムはチューブによって互いに接続された少なくとも２つのタンクを含む。この多槽式リアクターでは、ポンプによって微生物の培養物が一方のタンクと他方のタンクを繋ぐチューブに通される。好適な実施形態においては、このチューブは各タンクの上部、又はその近くに設置される。培養物がチューブの中を移動する間に、例えば、空気圧縮機によって流体の流れの中に送り込まれた空気によって培養物に酸素を供給することができる。これにより、培養物は混合され、酸素化される。各タンクの下部付近では、各タンクの培養レベルのバランスをとるために、他のチューブが２つのタンクを接続する。このチューブは、空気の補充するための他の入り口を備えていてもよい。従って、このチューブによって、更なる混合と空気の導入が可能になる。加えて、両タンクはそれぞれ独立したスパージングシステムを有していてもよい。
【００２１】
イノキュレーションは片方又は両方のタンクにおいて行うことができ、イノキュラムは上記のチューブシステムによって両方のタンクにおいて混合される。多槽式システムの好適な実施形態においては、発酵プロセスの間中連続して１又は複数のポンプが動作する。例えば、流量は毎分１０から２０又は２００ガロンである。具体的な実施形態として、各タンク間での培養物の全交換が行われるのは５から１０分に１度である。
【００２２】
本発明のシステムの利点としては、そのサイズを使用目的によって変更することができる点が挙げられる。例えば、タンクのサイズは数ガロンから数万ガロンの容量の間で変更可能である。
【００２３】
一実施形態において、本発明によれば上記のシステムを用いて、無汚染で微生物の培養を行う方法を提供することができる。ある実施形態における培養方法では、例えば、ペリスタルティックポンプを用いて本システムに水と栄養成分を含む培養培地を投入し、このシステムに生存微生物をイノキュレーションすることを含み、任意で、この培養培地に抗菌剤を投入してもよい。この抗菌剤は、例えば、抗生物質やソホロ脂質であってもよい。
【００２４】
一実施形態において、本発明はさらに、少なくとも１種の微生物及び／又は本発明の発酵システムを用いて増殖した微生物によって製造された少なくとも１の微生物代謝産物を含む組成物を提供する。この組成物中の微生物は活性形態でも不活性形態でもよい。また、この組成物は乾燥形態でも液状でもよい。
【００２５】
本発明の方法及び機器の利点としては、微生物及びその代謝産物を大規模に製造する際の資本と労働コストを減少することができる点が挙げられる。また、本発明の培養プロセスによれば、培養完了後の微生物の濃縮の必要性を低下又は排除することができる。本発明が提供する培養方法は、栄養培地単位の微生物製品の生産量を実質的に増加するだけでなく、製造工程を簡易化し、また装置の可搬性を促進する。
【００２６】
この可搬性によりコストを大幅に削減することができる。例えば、微生物ベースの組成物は、その使用場所やその近くで製造することができる。つまり、もし要望があれば、現場で採取される材料を用いて、現場で最終的な組成物の製造を行うことが可能になり、これにより輸送コストを削減することができる。また、この組成物はその使用の時点で生存している微生物を含んでおり、これにより製品の有効性を向上することができる。
【００２７】
つまり、ある実施形態において、本発明のシステムは天然に存在する現場の微生物とその代謝副産物の力を利用する。現場の微生物群の使用は遠隔地を含む、環境修復（例えば、石油流出の場合）、畜産、水産養殖、林業、草地管理、芝生管理、園芸・観賞植物産業、廃棄物処理、鉱業、石油回収、ヒューマンヘルス等の背景において有益である。しかし、本発明はこれらに限定されない。
【００２８】
本発明によって製造される組成物は、例えば、微生物的石油増進回収等、様々な石油産業において用いることができる。このような用法として、原油回収の促進、油井及びガス井への刺激（裸孔への原油の流入の改善）、パラフィン、アスファルテン、及びロッド、チューブ、ライナー、タンク、ポンプ等の機器からのスケール等の汚染物質や障害物の除去、石油及びガス生産機器及び輸送機器の腐食の防止、原油及び天然ガス中のＨ２Ｓ濃度の減少、原油の粘度の減少、重質原油及びアスファルテンの軽質な炭化水素留分へのアップグレード、タンク、流路、パイプラインの洗浄、選択的又は非選択的閉塞による水攻法における石油の移動性の向上、及び破砕流体等を含む。しかし、本発明はこれらに限定されない。
【００２９】
石油やガスに関して使用される場合、本発明のシステムは微生物ベースの油田組成物のコストを低下させるために用いられ、例えば、高分子化合物、溶媒、水圧破砕砂及びビーズ、乳化剤、界面活性剤、その他当分野において既知の物質等の他の化学促進剤と一緒に用いられても良い。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本発明の一実施形態に係る２槽式システムを示す図である。
【図２】本開示の一実施形態に係る２槽式システムの側面図であって、タンクの寸法の例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明は、石油及びガス産業、水産養殖、農業、環境浄化、ヒューマンヘルス分野や、様々な他の分野において用いられる微生物ベースの組成物を製造するための材料、方法、及びシステムを提供する。詳述すると、本発明の好適な実施形態によれば、酵母ベース及び／又は微生物ベースの組成物を発酵させるためのバイオリアクターが提供される。
さらに、本発明の実施形態によれば、低コストで新規な発酵方法やシステムが提供される。このシステムは酵母、菌類、及びバクテリア、及び／又はその増殖副産物の培養のために使用することができる。ある実施形態として、酵母ベースの組成物の製造のために用いられるシステムがある。この酵母ベースの組成物は、例えば、スタルメレラ・ボンビコラ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ  ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）、ウィッカーハモマイセス・アノマルス（Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｏｍｙｃｅｓ  ａｎｏｍａｌｕｓ）、及び／又はシュードザイマ・アフィディス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ  ａｐｈｉｄｉｓ）酵母を含む組成物を含む。いくつかの実施形態において、このシステムはバクテリア・ベースの組成物を製造するために用いることができる。このバクテリア・ベースの組成物は、例えば、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及び／又はバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）を含む組成物を含む。
【００３２】
酵母が培養される好適な実施形態において最終的に生じる組成物は、酵母の細胞壁の一部として高濃度のマンノプロテインやベータグルカンを備えたり、培養物がバイオサーファクタントや他の微生物代謝産物（例えば、乳酸、エタノール等）を含むなどの１以上の有益な特性を持つ。
【００３３】
選択定義
本明細書において、「微生物ベースの組成物」は、微生物や他の細胞培養物の増殖によって製造された成分を含む組成物を意味する。つまり、微生物ベースの組成物は、微生物自体及び／又は微生物の増殖による副産物を含みうる。微生物は、植物状態、胞子状態、菌糸状態、その他の散布体状態、又はそれらの混合状態であってよい。微生物はプランクトン状態、バイオフィルム状態、又は両者の混合状態であってもよい。増殖の副産物は、例えば、代謝産物、細胞膜成分、発現タンパク質、及び／又はその他の細胞成分である。この微生物とは無傷のものであってもよいし、溶解されたものであってもよい。好適な実施形態において、微生物はそれらが増殖される培養液とともに、微生物ベースの組成物中に存在する。例えば、細胞は１ミリリットルの組成物に対して濃度が１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、又はそれ以上の散布体中に存在する。本明細書において、散布体は、新規な及び／又は成熟した有機体が発現する微生物の一部である。これらは細胞、胞子、菌糸、芽、及び種子を含むが、本発明はこれに限定されない。
【００３４】
本発明はさらに「微生物ベースの製品」も提供する。これは、所望の結果を達成するために実際に使用する製品である。微生物ベースの製品とは単に、微生物培養プロセスを通じて採取された微生物ベースの組成物でありうる。また、微生物ベースの製品は追加の成分を含んでいてもよい。追加の成分は、例えば、安定剤、緩衝剤、水や食塩水等の適切なキャリア、その他の適切なキャリア、微生物のさらなる増殖をサポートするための追加の栄養素、植物ホルモン等の非栄養型の増殖エンハンサー、及び／又は微生物や組成物が使用された環境においてその微生物や組成物の追跡を補助する物質が含まれうる。微生物ベースの製品は、微生物ベースの組成物の混合物を含みうる。微生物ベースの製品は、濾過、遠心分離、溶解、乾燥、精製等の方法によって処理された微生物ベースの組成物の１以上の成分を含みうる。しかし、本発明はこれに限定されない。
【００３５】
本明細書における「採取」は、増殖容器から一部又は全ての微生物ベースの組成物を分離することを指す。
【００３６】
本明細における「バイオフィルム」は、バクテリア等の微生物の複合体のことであり、各細胞はお互いに接着している。このバイオフィルムにおける接着細胞とは、同じ微生物における浮遊細胞とは生理学的に異なるものである。浮遊細胞は、液体培地中を浮遊している単細胞のことである。
【００３７】
本明細書において、「抑制」は、対象の微生物によって生じる活動のことであり、これは害虫の駆除、無力化、機能停止等の活動や、害虫が実質的に害を及ぼさない状態にすることを含む。
【００３８】
本明細書において「単離」又は「精製」核酸分子、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、タンパク質、又は小分子（例は後述する）等の有機化合物は、通常自然界においては結合している細胞物質等の他の化合物が実質的に含まれていない。本明細書において、微生物菌株の文脈において用いられている「単離」は、菌株が通常自然界において存在している環境からは切り離されていることを意味する。つまり、単離菌株は、例えば、生物学的に純粋培養で、又はキャリアと結合した胞子として（又はその他の菌株形態で）存在しうる。
【００３９】
ある実施形態においては、精製化合物は対象の化合物の少なくとも６０重量％（乾燥重量）である。好ましくは、対象の化合物の少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９９％の重量で生成される。例えば、精製化合物は所望の化合物の重量の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９８％、９９％、又は１００％（ｗ／ｗ）の化合物である。純度は、適切な標準方式を用いて計測される。例えば、カラムクロマトグラフィーや、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による分析がある。ポリヌクレオチド（リボ核酸（ＲＮＡ）又はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ））は自然状態では遺伝子や遺伝子配列とともに存在するが、精製又は単離ポリヌクレオチド（リボ核酸（ＲＮＡ）又はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ））はそれらから分離されている。ポリペプチドは自然状態ではアミノ酸やアミノ酸配列とともに存在するが、精製又は単離ポリペプチドはそれらから分離されている。
【００４０】
「代謝産物」は、代謝によって生じた物質や、特定の代謝プロセスに必要な物質を指す。代謝産物は代謝の出発物質（例えば、グルコース）や、中間体（例えばアセチルＣｏＡ）、最終生成物（例えば、ｎ−ブタノール）といった有機化合物でありうる。代謝産物の例としては、酵素、毒素、酸、溶媒、アルコール、タンパク質、ビタミン、ミネラル、微量要素、アミノ酸、バイオサーファクタントを含むが、本発明はこれに限定されない。
【００４１】
本明細書における「界面活性剤」は、２種の液体間又は液体と固体間の表面張力（又は界面張力）を下げる化合物のことである。界面活性剤は洗剤、湿潤剤、乳化剤、発泡剤、分散剤として作用する。「バイオサーファクタント」は、生体に由来する界面活性剤である。
【００４２】
発酵システムの構成と動作
具体的な実施形態として、本発明のシステムはチューブによって互いに接続された少なくとも２つのタンクを含む。ポンプによって微生物の培養物が一方のタンクと他方のタンクを繋ぐチューブに通される。好適な実施形態においては、このチューブは各タンクの上部、又はその付近に設置される。ポンプは、第１のチューブ（又はホースやパイプ）を介して第１のタンクに接続される入力部と、第２のチューブを介して第２のタンクに接続される出力部を備える。
【００４３】
１以上の空気圧縮機がエアレーションのために備えられる。各空気圧縮機は任意で、汚染を防止するためのエアフィルターを有していてもよい。空気圧縮機は１以上のガス注入器、バブラー、及び／又はスパージャに接続することができる。例えば、ガス注入器は、リアクターのいずれか、及び／又は全てのチューブ及び／又はタンクに設置することができる。バブラー及び／又はスパージャはいずれか、及び／又は全てのタンクに設置することができる。培養物がチューブを移動する間に、例えば、空気圧縮機によって流体の流れの中に送り込まれた空気によって培養物を酸素化することができる。これにより、培養物が混合され、酸素化される。
【００４４】
各タンクの下部付近では、第３のチューブ（又はホースやパイプ）が第２のタンクと第１のタンクとを接続することができる。第３のチューブは、静水圧によって液体を第２のタンクから第１のタンクに流す。各タンクの培養レベルのバランスをとるために、これらのチューブが２つのタンクを接続する。これらのチューブには、空気の補充を促進するための他の入り口があってもよい。従って、これらのチューブによって、更なる混合と空気の導入が可能になる。このシステムは、第１のポンプの出力部に、第１のポンプの流量を制御するのに適している流量制御弁を備えることができる。第１のポンプは可変周波数モーターを用いて制御することができる。これにより、電気周波数の変化を利用して適切に流量を制御することができる。
【００４５】
２つのタンクの上部付近のチューブは、好ましくは各タンクの上部５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、２％、１％の位置に接続される。２つのタンクの下部付近のチューブは、好ましくは各タンクの下部５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、２％、１％の位置に接続される。
【００４６】
システムのポンプは、例えば、３０から０．１０の範囲の循環比（１時間ごとにポンプによって注入される体積／リアクターの液体の総体積）になるようにサイズ調整することができる。ポンプは遠心ポンプであってもよい。このシステムは、第１のタンクと第２のタンクの注入口と排出口に１以上のブロック弁（流れをせき止めるために用いる一般的な弁）を含むことができる。リアクターを空にし、組成物を目的の場所にポンプで注入するために、ホースは第１のポンプ（又はリアクターに接続される第２のポンプ）に接続することができる。ホースの端には、組成物を散布するのに適したノズルを設置することができる。
【００４７】
システムの好適な実施形態においては、発酵プロセスの間中連続して１又は複数のポンプが動作する。例えば、流量は毎分１０ガロンから２０ガロン又は２００ガロンである。具体的な実施形態として、各タンク間での培養物の全交換が達成されるのは５分から１０分に１度である。
【００４８】
発酵プロセスを目視でモニタリングするために、システムにおいて１以上ののぞき窓を、例えば、いずれかの、及び／又は全てのチューブ及び／又はタンクに設置することができる。さらに、逆流を防ぐための逆止弁を、いずれかの、及び／又は全てのチューブに設置してもよい。
【００４９】
１以上のベント（又は圧力逃がし弁（ＰＳＶ））がいずれか、及び／又は全てのタンクに設置されてもよい。ベントやＰＳＶはガスを排出することができるが、空気を流入させることはない（例えば、リアクター内部のガス圧が１．２ａｔｍを超えたら弁が開き、内部のガス圧が１．１ａｔｍを下回ったら弁が閉じる）。
【００５０】
本発明において使用されるタンクは、工業用の発酵槽や培養リアクターであってもよい。例えば、タンクはガラス、ポリマー、金属、金属合金、又はこれらを組み合わせたもので作られてもよい。タンクの容量は、例えば、５リットルから２０００リットル以上であってもよい。通常、容器の大きさは１０リットルから１５００リットルである。好ましくは、１００リットルから１０００リットル、より好ましくは２５０リットルから７５０リットル、３００リットルから６００リットル、又は４００リットルから５５０リットルであってもよい。
【００５１】
微生物の増殖前に、タンクは消毒又は殺菌されてもよい。一実施形態においては、この方法及び培養プロセスで用いる発酵培地、空気、及び機器が殺菌される。リアクターや容器等の培養機器は、例えば、加圧滅菌器等の殺菌ユニットとは別のものであるが、これらは互いに接続されている。培養機器は殺菌ユニットを含んでいてもよい。この殺菌ユニットは、イノキュレーションを開始する前に、例えば、スチーマーを用いて原位置で殺菌を行う。空気は、既知の方法を用いて殺菌される。例えば、外気が弁を通して供給される前に少なくとも１つのフィルターを通過するようにしてもよい。他の実施形態において、培地は低温殺菌されてもよい。任意で、熱を全く使わずに低温殺菌が行われてもよい。この場合、低水分活性と低いｐＨを利用してバクテリアの増殖を制御してもよい。
【００５２】
このシステムは（連続式リアクターとは反対の）回分式リアクターとして用いることができる。このシステムの利点としては、そのサイズを使用目的によって変更することができる点が挙げられる。このシステムを小規模で利用する場合、例えば、バイオレメディエーションの際には、このシステムは５０ガロンと同じくらい、又はこれより小さくてもよい。例えば、微生物的石油増進回収のような大量の組成物が必要になるような状況でシステムを利用する場合、システムは２００００ガロン以上の製品を製造できるような大きさにすることができる。
【００５３】
システムは温度制御装置を含んでいてもよい。低温環境において適切な温度で発酵プロセスが維持されるように、このシステムの断熱を行うこともできる。既存のいずれの断熱素材を用いてもよい。例えば、グラスファイバー、シリカエアロゲル、セラミックファイバー断熱材等を用いることができる。断熱材は、システムのいずれか、及び／又は全てのチューブ及び／又はタンクを取り囲むことができる。
【００５４】
このシステムは、適切な発酵温度を保つために用いることもできる。例えば、日中のシステムの温度の上昇を避けるため、システムの外側が反射性を持っていてもよい。さらに、例えば、１以上の冷却ジャケットや冷却系熱交換器を含む冷却システムが備えられていてもよい。冷却水によって外気と熱が交換され、この冷却水は冷却システムを再循環する。これらの熱交換器及び／又は冷却ジャケットは、システムのいずれか、及び／又は全てのチューブ及び／又はタンクやその周りに設置することができる。極限環境においては、システムはリアクターや、リアクターの周囲のジャケット、又はチューブが接続される熱交換器中に冷凍又は冷却コイルを含むことができる。
【００５５】
システムは電気ヒーターを使用してもよい。しかし、熱が必要となるような大規模な状態でシステムを利用する場合、蒸気や炭化水素燃料を使用してもよい。蒸気発生器及び／又は蒸気源は１以上の蒸気注入器、蒸気ジャケット、及び蒸気熱交換器に接続することができる。蒸気ジャケットは、システムのいずれか、及び／又は全てのタンクを取り囲むことができる。さらに、蒸気はシステムのいずれか、及び／又は全てのチューブ及び／又はタンクに直接注入することができる。蒸気熱交換器はリアクター内に設置することができ、蒸気は熱交換器のチューブ内で凝縮され、その後、排出される。リアクター内に水や蒸気を混入させないように、この蒸気熱交換器は密閉されていてもよい。
【００５６】
一実施形態において、培養プロセスにおいて重要な要素を計測するための機能制御部やセンサがタンクに含まれていてもよい。又は、これらの機能制御部やセンサがタンクに接続されていてもよい。重要な要素とは、例えば、ｐＨ値、酸素、圧力、温度、撹拌シャフトのパワー、湿度、粘度、及び／又は微生物密度、及び／又は代謝産物の濃度等である。
【００５７】
温度計が備えられていてもよく、この温度計は自動であってもよいし、手動であってもよい。この温度計は、リアクターのいずれか、及び／又は全てのタンクに設置されるのが好ましい。自動温度計は、熱源と冷却源を適切に管理することができ、発酵プロセスにおける温度を制御する。所望の温度は現場でプログラムされてもよいし、又はシステムが発酵場所に運ばれる前に事前にプログラムされてもよい。温度測定の結果は、上記の暖房システム及び冷却システムを自動で制御するのに使用されてもよい。
【００５８】
ｐＨ値の調節は自動で行われてもよいし、手動で行われてもよい。自動ｐＨ値調整器はｐＨプローブと電子機器を含み、ｐＨ値測定結果に応じて適切にｐＨ値調整物質を投与することができる。ｐＨプローブは、リアクターのいずれか、及び／又は全てのタンクに設置されるのが好ましい。ｐＨ値はユーザによって具体的な数値に設定されてもよい。又は、発酵プロセス中にｐＨ値が適宜変更されるように事前にプログラムされてもよい。ｐＨ値が手動で調整される場合、システムには手動テストのための周知のｐＨ値測定器が含まれていてもよい。
【００５９】
リアクターの各タンクの発酵パラメータをモニタリングし、制御するために、ｐＨ値及び温度を計測し調整するコンピュータシステムが用いられてもよい。例えば、コンピュータは温度計とｐＨプローブに接続されてもよい。温度とｐＨ値をモニタリングして制御することに加え、各容器は、例えば、溶存酸素、撹拌、発泡、微生物培養物の純度、所望の微生物の製造等のモニタリングと制御を行うことも可能である。さらにこのシステムはこれらのパラメータを遠隔でモニタリングするのに適していてもよい。これには、例えば、タブレット、スマートフォン、又は無線でデータの送受信が可能な他のモバイルコンピューティングデバイスが用いられる。
【００６０】
他の実施形態おいて、タンクが容器内の微生物の増殖をモニタリング可能であってもよい（例えば、細胞数及び増殖期の測定）。また、エミュレーションのために毎日容器からサンプルを採取してもよい。これは、例えば、希釈平板法等の周知の方法が用いられる。希釈平板法とは、サンプル中のバクテリアの数を推測するために用いられる単純な技術である。この技術は、異なる環境や処理を比較するための指標も提供することができる。
【００６１】
一実施形態において、発酵システムは、移動可能又は運搬可能なバイオリアクターである。これにより、適量の所望の微生物株を含む微生物製品を現場で製造することができる。微生物製品の、その使用場所での生成が可能となることによって、従来の製造工程におけるバクテリアの安定化、保存、貯蔵、及び輸送プロセスに頼ることなく、より高い密度の生きた微生物を生成することができ、これにより、現場で使用する微生物組成物の体積を減らすことができる。これにより、バイオリアクターのサイズを小さくすることができ（例えば、発酵タンクの小規模化や、スターター材料、栄養素、ｐＨ値制御剤、消泡剤等の提供量の削減等）、これにより、システムの移動性と可搬性を高める。
【００６２】
このシステムは、装置の構成要素（例えば、タンク、フローループ、ポンプ等）を支えるフレームを有していてもよい。システムは、装置を移動するための車輪を備えていてもよい。また、装置を操作するときにステアリングしたり、押したり引いたりするハンドルを備えていてもよい。
【００６３】
システムは１以上のトラックトレーラー及び／又はセミトレーラーの後部に設置するように構成されてもよい。つまり、このシステムは運搬可能に構成されている（つまり、このシステムはピックアップトラックや平台トレーラー、セミトレーラーでの輸送に適している）。
【００６４】
微生物
本発明のシステム及び方法によって増殖する微生物は、例えば、バクテリア、酵母、及び／又は菌類である。この微生物は、天然の微生物であってもよいし、遺伝子組み換えされた微生物であってもよい。例えば、特定の特性を発揮するために、特定の遺伝子が転換されている微生物でもよい。また、微生物は所望の株の突然変異体であってもよい。突然変異体を作る手法としては、微生物分野において周知の方法が用いられる。例えば、突然変異体を作るために、紫外線やニトロソグアニジンが広く用いられる。
【００６５】
本発明による微生物やそれらの増殖製品は、幅広い有用な製品を製造するのに用いることができる。これらは、例えば、生物農薬、バイオサーファクタント、エタノール、栄養化合物や、インシュリン等の治療用タンパク質、ワクチンとして使用可能な化合物、及びその他の生体高分子を含む。上記のような微生物工場において用いられる微生物は、天然の微生物であってもよいし、突然変異微生物であってもよいし、組み換え微生物であってもよい。
【００６６】
一実施形態において、微生物は、酵母や菌類である。本発明による使用に適した種の酵母や菌類は、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｂｏｕｌａｒｄｉｉ  ｓｅｑｕｅｌａ、Ｓ．ｔｏｒｕｌａ）、Ｉｓｓａｌｃｈｅｎｋｉａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｏｍｙｃｅｓ（例えば、Ｗ．ａｎｏｍａｌｕｓ）、Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ（例えば、Ｓ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）、Ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａ、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ、Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ、Ｂｌａｋｅｓｌｅａ、Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ、Ｐｈｙｔｈｉｕｍ、Ｅｎｔｏｍｏｐｈｔｈｏｒａ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ  ａｐｈｉｄｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｌｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ（例えば、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ、Ｔ．ｈａｒｚｉａｎｕｍ、Ｔ．ｈａｍａｔｕｍ、Ｔ．ｖｉｒｉｄｅ）、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属、Ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａ（例えば、Ｇｌｏｍｕｓ属、Ａｃａｕｌｏｓｐｏｒａ属、ｖｅｓｉｃｕｌａｒ−ａｒｂｕｓｃｕｌａｒ  ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａｅ（ＶＡＭ）、ａｒｂｕｓｃｕｌａｒ  ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａｅ（ＡＭ））、内生真菌（例えば、Ｐｉｒｉｆｏｒｍｉｓ  ｉｎｄｉｃａ）、キラー酵母株、及びこれらの混合物を含む。
【００６７】
一実施形態において、酵母は、キラー酵母である。本明細書において、「キラー酵母」は、株自体が免疫がある毒性タンパク質や糖タンパク質を分泌する性質がある酵母株を意味する。キラー酵母から分泌される外毒素は、他の酵母、菌類、又はバクテリアの株を死滅させることができる。例えば、微生物はフサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）を含むキラー酵母や他の糸状菌によって制御されうる。本発明に係るキラー酵母の例としては、食品産業や発酵産業において安全に使用することができる酵母がある。例えば、ビール酵母、ワイン酵母、パン酵母などがある。これらは製造プロセスにおいて汚染の可能性がある他の微生物を制御するために用いられたり、食品の保存のための生物的防除に用いられたり、人間と植物両方に対する真菌感染症の治療に用いられたり、遺伝子組み換え技術に用いられたりすることができる。このような酵母としては、Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ  （例えば、Ｐ．ａｎｏｍａｌａ、Ｐ．ｇｕｉｅｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ、Ｐ．ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ）、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ、（例えば、Ｈ．ｕｖａｒｕｍ）、Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｈａｎｓｅｎｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ、Ｕｓｔｉｌａｇｏ、Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（例えば、Ｚ．ｂａｉｌｉｉ）等を含むことができる。しかし、本発明はこれに限定されない。
【００６８】
一実施形態において、微生物は、キラー酵母であり、例えば、Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｏｍａｌａ（Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｏｍｙｃｅｓ  ａｎｏｍａｌｕｓ）、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｅｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ、及びＰｉｃｈｉａ  ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉから選択されるピキア属酵母である。特に、ピキア・アノマラ（Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｏｍａｌａ）は、様々な溶媒、酵素、キラートキシン、ソホロ脂質バイオサーファクタントを製造するのに効果的である。
【００６９】
一実施形態において、微生物株は、スタルメレラ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ）系統群から選択される。本発明において有用なスタルメレラ微生物の培養物であるスタルメレラ・ボンビコラ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ  ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）は、アメリカの、ジップコード２０１１０−２２０９のバージニア州、マナッサスのユニバーシティ・ブールバード１０８０１番地にあるアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＡＴＣＣ）から入手することができる。これは、ＡＴＣＣ受入番号２２２１４として寄託されている。
【００７０】
本システムは、原油増進回収やパラフィン分解が可能な酵母株を用いることもできる。これは、例えば、Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ（Ｃａｎｄｉｄａ）ｂｏｍｂｉｃｏｌａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｐｉｃｏｌａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｂａｔｉｓｔａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｆｌｏｒｉｃｏｌａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｉｏｄｏｃｅｎｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｔｅｌｌａｔｅ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｕｏｉ、Ｃａｎｄｉｄａ属ＮＲＲＬ  Ｙ−２７２０８、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｂｏｇｏｒｉｅｎｓｉｓ属、Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｅｌｌａ  ｄｏｍｅｒｉｃｑｉａｅや、Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ系統群の他のソホロ脂質生産株である。具体的な実施形態において、酵母株はＡＴＣＣ２２２１４及びその変異体である。
【００７１】
一実施形態において、微生物はシュードザイマ・アフィディス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ  ａｐｈｉｄｉｓ）株である。この微生物は、マンノシルエリスリトールリピッド・バイオサーファクタントを生産するのに効果的である。
【００７２】
一実施形態において、微生物は、グラム陽性菌及びグラム陰性菌を含むバクテリアである。これらのバクテリアの例として、Ｂａｃｉｌｌｕｓ（例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｆｉｒｍｕｓ、Ｂ．ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｉｆａｃｉｅｎｓ）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ（Ｃ．ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｃ．ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ＮＩＰＥＲ７、Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）、Ａｚｏｂａｃｔｅｒ（Ａ．ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ、Ａ．ｃｈｒｏｏｃｏｃｃｕｍ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（Ｐ．ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ  （Ｋｌｕｙｖｅｒ）、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｒａｌｓｌｏｎｉａ  ｅｕｌｒｏｐｈａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｒｕｂｒｕｍ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ（例えば、Ｓ．ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ（例えば、Ｓ．ｇｒｉｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ｑｒｉｓｅｕｓ、Ｓ．ｃａｃａｏｉ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ｋａｓｕｇａｅｎｉｓ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ（例えば、Ｓ．ｒｉｍｏｆａｃｉｅｎｓ）、Ｒａｌｓｌｏｎｉａ（例えば、Ｒ．ｅｕｌｒｏｐｈａ）、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ（例えば、Ｒ．ｒｕｂｒｕｍ）、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ（例えば、Ｘ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）、Ｅｒｗｉｎｉａ（例えば、Ｅ．ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ（例えば、Ｒ．ｊａｐｏｎｉｃｕｍ、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｆｒｅｄｉｉ、Ｒ．ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ  ｂｉｏｖａｒ  ｔｒｉｆｏｌｉｉ、Ｒ．ｅｔｌｉ）、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ（例えば、Ｂ．ｊａｐａｎｉｃｕｍ、Ｂ．ｐａｒａｓｐｏｎｉａ）、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ（例えば、Ａ．ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、Ａｚｏｍｏｎａｓ、Ｄｅｒｘｉａ、Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉａ、Ｎｏｃａｒｄｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ（例えば、Ｃ．ｘｙｌｉ  ｓｕｂｓｐ．ｘｙｌｉ、Ｃ．ｘｙｌｉ  ｓｕｂｓｐ．ｃｙｎｏｄｏｎｔｉｓ）、Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｐａｎｔｏｅａ（例えば、Ｐ．ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、及びこれらの混合物がある。しかし、本発明はこれに限定されない。
【００７３】
一実施形態において、微生物は、例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｖａｒ．ｌｏｃｕｓｅｓ  Ｂ１又はＢ２等の枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株である。これは、例えば、サーファクチンや、生体高分子等の他のバイオサーファクタントを製造するのに効果的である。本明細書で開示されている教示と対応する範囲において、本明細書には参照により国際公開公報ＷＯ２０１７／０４４９５３Ａ１が組み込まれる。他の実施形態では、微生物はバシラスリケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）株である。これはバイオサーファクタントや、レバン等の生体高分子を製造するのに効果的である。
【００７４】
一実施形態において、微生物はシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属の非病原菌株である。好ましくは、この株によると、ラムノリピド・バイオサーファクタントを製造することができる。
【００７５】
本発明で使用することができる他の微生物株としては、例えば、大量の糖脂質バイオサーファクタント等を蓄積することができる株を含む。本発明において有用な他の微生物副産物としては、マンノプロテイン、ベータグルカンや、バイオ乳化特性や表面／界面張力低減特性を持つ他の代謝産物を含む。
【００７６】
一実施形態において、容器内では１種の微生物が増殖する。他の実施形態おいて、１つの容器内で複数種の微生物を増殖してもよい。この複数種の微生物は、増殖やその生成物に悪影響を及ぼすことなく、一緒に増殖することができる。これらは、例えば、１つの容器内で同時に増殖する、２種、３種又はそれ以上の異なる微生物であってもよい。
【００７７】
本発酵システムを用いた培養方法
本発明は、新規のバイオリアクターを用いて効率的に微生物を製造することができる方法とシステムを提供する。このシステムは発酵（又は培養）プロセスに必要な全ての要素を含むことができる。これは、例えば、機器、殺菌装置、及び培養培地成分を含む。なお、現場の水源から提供される淡水が本発明の方法によって殺菌されることを想定する。
【００７８】
一実施形態において、このシステムは生存微生物のイノキュラムを備える。好ましくは、微生物は、生化学的に製造された微生物である。これは、例えば、バイオサーファクタント、酵素、溶媒、生体高分子、酸、及び／又は他の有用な代謝産物を蓄積することができる。特に好適な実施形態においては、微生物は生化学的に製造された酵母（キラー酵母を含む）、菌類、及び／又はバクテリアである。しかし、本発明はこれらに限定されない。
【００７９】
一実施形態において、このシステムは培養培地を備える。この培地は、例えば、炭素源、脂質源、窒素源、及び／又は微量栄養素源等の栄養源を含んでいてもよい。炭素源、脂質源、窒素源、及び／又は微量栄養素源は、それぞれ、発酵プロセス中の適切なタイミングでリアクターに投入することが可能なように、独立してパッケージすることができる。各パッケージは、発酵プロセス中の所定の時点（例えば、酵母、ｐＨ、及び／又は栄養レベルが所定の濃度以上又は以下になったとき）又は所定の時間（例えば、１０時間後、２０時間後、３０時間後、４０時間後、等）に投入されるサブパッケージを含みうる。
【００８０】
発酵の前に、汚染防止のため、タンクは過酸化水素水によって洗浄することができる（例えば、２．０％から４．０％の過酸化水素である。これは、例えば、８０℃から９０℃の湯洗の前後に行われてもよい）。また、タンクは市販の消毒剤、漂白溶液、及び／又はお湯、又は蒸気によって洗浄されてもよい。システムは、濃縮漂白剤及び濃縮過酸化水素を備えていてもよい。これは、後に、使用前に発酵場所にて希釈することができる。例えば、濃縮過酸化水素が備えられており、これは事前濯ぎによる汚染除去のため（重量又は体積で）２．０％から４．０％の過酸化水素を生成するために希釈されてもよい。
【００８１】
具体的な実施形態として、培養方法は発酵前に対象の発酵リアクターを殺菌することを含む。まず、リアクター（例えば、タンク、ポート、スパージャ、ミキサーシステムを含む）の内面を市販の消毒剤で洗浄する。その後、２％から４％の過酸化水素、好ましくは３％の過酸化水素を噴霧する（又は高拡散スプレーシステムによって噴射する）。最後に、約１０５℃から約１１０℃又はそれ以上の温度のポータブルスチーマーによって蒸気にさらされる。
【００８２】
培養培地成分（例えば、炭素源、水、脂質源、微量栄養素等）もまた殺菌されてもよい。これは、温度を利用した汚染除去や、過酸化水素を用いた汚染除去によって行うことができる（この後、例えば、ＨＣｌ、Ｈ２ＳＯ４等の酸を用いて過酸化水素を中和する場合もある）。
【００８３】
具体的な実施形態として、培養培地に使用される水はインラインＵＶ水殺菌装置を用いてＵＶ殺菌され、例えば、０．１ミクロンのウォーターフィルターを用いて濾過される。他の実施形態においては、全ての栄養成分及び他の培地成分が発酵前に加圧滅菌される。
【００８４】
さらに汚染を防ぐために、システムの培養培地は、培養プロセスの前及び／又はその最中に投入される追加の酸、抗菌剤、及び／又は抗生物質を含んでいてもよい。１以上の抗菌物質は、例えば、ストレプトマイシン、オキシテトラサイクリン、ソホロ脂質、ラムノリピドを含んでもよい。
【００８５】
イノキュレーションは、いずれか及び／又は全てのリアクタータンクで行うことができ、このリアクタータンクにてチューブシステムを用いてイノキュラムを混合する。総発酵時間は１０時間から２００時間の範囲内であり、好ましくは２０時間から１８０時間の範囲内である。
【００８６】
本システム及び方法で用いられる発酵温度は、例えば、約２５℃から４０℃であるが、この温度範囲外でプロセスが行われてもよい。一実施形態において、微生物培養方法は約５℃から約１００℃で行われる。好ましくは１５℃から６０℃、より好ましくは２５℃から５０℃の範囲で行われる。他の実施形態において、培養は一定の温度にて継続的に行われる。他の実施形態においては、培養の間に温度が変わってもよい。
【００８７】
培地のｐＨ値は、対象の微生物に適したｐＨ値でなければならない。ｐＨ値を最適な値付近で安定化するために、炭酸塩やリン酸塩等の緩衝塩やｐＨ値調節剤が用いられうる。金属イオンが高濃度で存在する場合、液体培地においてキレート剤の使用が必須でありうる。
【００８８】
ある実施形態において、微生物は約２．０から約１０．０のｐＨ値範囲で発酵することができる。これは具体的には約３．０から７．０のｐＨ値範囲である（ｐＨ値は塩基、酸、緩衝剤を用いて手動又は自動で調整される。例えば、ＨＣｌ、ＫＯＨ、ＮａＯＨ、Ｈ２ＳＯ４、及び／又はＨ３ＰＯ４）。本発明は上記のｐＨ値範囲外で実行されてもよい。
【００８９】
発酵は、第１のｐＨ値（例えば、ｐＨ４．０からｐＨ４．５）で開始され、その後のプロセスでは第２のｐＨ値（例えば、ｐＨ３．２からｐＨ３．５）に変更される。これにより、汚染防止を促進し、その他の望ましい結果を得ることができる（第１のｐＨ値は第２のｐＨ値より高くても低くてもよい）。いくつかの実施形態において、所望のバイオマスが蓄積されたあとに、ｐＨ値は第１のｐＨ値から第２のｐＨ値に調整される。これは、例えば、発酵開始から０時間から２００時間の間に行われる。より詳細には、１２時間から１２０時間、又は２４時間から７２時間の間に行われる。
【００９０】
一実施形態において、培養培地の湿度レベルは、対象の微生物に適した湿度レベルでなければならない。他の実施形態において、湿度レベルは２０％から９０％の範囲である。好ましくは３０％から８０％、より好ましくは４０％から６０％である。
【００９１】
本発明の培養プロセスは、嫌気性であってもよいし、好気性であってもよいし、その両方が組み合わされたものであってもよい。好ましくはこのプロセスは好気性プロセスである。この場合、発酵の間、溶存酸素濃度は飽和状態の１０％から１５％の濃度より高い状態で保たれる。しかし、いくつかの実施形態においては２０％以内でもよいし、３０％以内でもよい。
【００９２】
このシステムの利点としては、例えば、含有酸素の少ない空気を取り除くため、低空気運動を用いて培養中の培地の酸素化を簡単に行うことができたり、酸素化された空気の導入が簡単に行うことができる点が挙げられる。酸素化された空気は、周期的に（例えば、毎日）供給される外気でありうる。
【００９３】
さらに、培養や発酵の間にガスが発生した場合、発泡及び／又はその泡の蓄積を防ぐために、システムに消泡剤が投入される。
【００９４】
一実施形態において、発酵後は微生物ベースの組成物に対してさらなる処理を行う必要は無い（例えば、酵母、代謝産物、残留炭素源をソホロ脂質から分離する必要は無い）。最終生成物の物理的特性（例えば、粘度や密度等）は、周知の様々な物質や化学物質を用いて調整することができる。
【００９５】
一実施形態において、本システムで用いる培養培地は微生物のために補助栄養素を含んでいてもよい。通常、これらは炭素源、タンパク質、脂肪、脂質、窒素源、微量元素、及び／又は増殖因子（例えば、ビタミンやｐＨ値調節剤）が含まれる。特定の微生物の増殖を最適化するために、栄養素濃度、含水量、ｐＨ値等を調節しうることは、当業者にとって明らかである。
【００９６】
脂質源は、植物油、植物性脂肪、又は動物油、動物性脂肪を含みうる。これらはトリアシルグリセロールを含む、遊離脂肪酸、又はその塩やエステルを含む。脂肪酸の例としては、１６から１８個の炭素原子を含む遊離脂肪酸やエステル化脂肪酸、疎水性炭素源、パーム油、動物性脂肪、ココナッツ油、オレイン酸、大豆油、ひまわり油、菜種油、ステアリン酸、パルミチン酸を含む。しかし、本発明はこれに限定されない。
【００９７】
本システムの培養培地は、さらに炭素源を含むこともできる。通常、炭素源は、グルコース、キシロース、スクロース、ラクトース、フルクトース、トレハロース、ガラクトース、マンノース、マンニトール、ソルボース、リボース、マルトース等の炭水化物；酢酸、フマル酸、クエン酸、プロピオン酸、リンゴ酸、マロン酸、ピルビン酸等の有機酸；エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、エリトリトール、イソブタノール、キシリトール、グリセロール等のアルコール；菜種油、大豆油、ぬか油、オリーブ油、コーン油、ごま油、アマニ油等の脂肪や油；等である。他の炭素源としては、アルブチン、ラフィノース、グルコン酸塩、クエン酸塩、糖蜜、加水分解でんぷん、ポテトエキス、コーンシロップ、加水分解セルロース物質を含むことができる。上述の炭素源は、それぞれ独立して使用することもできるし、２種以上の炭素源を組み合わせて用いることもできる。
【００９８】
一実施形態において、微生物のための微量栄養素と成長因子がシステムの培地に含まれる。これは、必要とする全てのビタミンを生成することができない微生物を培養する場合に特に適している。本システムの培養培地は、鉄、亜鉛、カリウム、カルシウム、銅、マンガン、モリブデン、コバルト等の微量元素を含む無機栄養素；例えば、リン酸塩由来のリン；他の成長刺激成分を含むことができる。さらに、ビタミン源、必須アミノ酸、微量元素を含むことができる。例えば、トウモロコシ粉のように粉末や粗びき粉の形、又は酵母エキス、ポテトエキス、牛肉エキス、大豆エキス、バナナの皮エキス等のエキスの形、又は精製された形で含まれていてもよい。例えば、タンパク質の生合成の際に有用である、Ｌ−アラニン等のアミノ酸が含まれていてもよい。
【００９９】
一実施形態において、例えば、無機塩類が含まれていてもよい。無機塩は、例えば、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸水素二ナトリウム（無水）、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、硫酸第一鉄、塩化鉄、硫酸マンガン、塩化マンガン、硫酸亜鉛、塩化鉛、硫酸銅、塩化カルシウム、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムである。上述の無機塩は、それぞれ独立して使用することもできるし、２以上の無機塩を組み合わせて用いることもできる。
【０１００】
本システムの培養培地は、さらに窒素源を含むこともできる。窒素源は、例えば、硝酸カリウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、アンモニア、尿素及び塩化アンモニウムのような無機形態であってもよく、又はタンパク質、アミノ酸、酵母エキス、酵母自己分解物、コーンペプトン、カゼイン加水分解物及び大豆タンパク質のような有機形態であってもよい。上述の窒素源は、それぞれ独立して使用することもできるし、２以上の窒素源を組み合わせて用いることもできる。
【０１０１】
微生物はプランクトン状態で、又はバイオフィルムとして増殖可能である。バイオフィルムの場合、容器は、基質を含みうる。この基質上で、微生物がバイオフィルム状態で増殖することができる。このシステムは例えば、刺激（剪断応力等）を与えることが可能であってもよい。これにより、バイオフィルム成長特性が促進及び／又は向上される。
【０１０２】
微生物ベースの製品の生成
本発明の微生物ベースの製品は、微生物及び／又は微生物増殖副産物を含む製品を含む。また任意で、増殖培地や、例えば、水、キャリア、補助剤、栄養素、粘度調整剤、及びその他の活性剤等の追加の材料を含んでいてもよい。
【０１０３】
本発明の微生物ベースの製品のうちの１つは、微生物及び／又は微生物増殖副産物を含む単なる発酵培地である。この微生物増殖副産物は、微生物及び／又は残留栄養素によって生成される。発酵製品は、抽出や精製を行うこと無く直接使用することができる。必要に応じて、当業者に周知の標準的な抽出方法や技術を用いて、抽出及び精製は簡単に行うことができる。
【０１０４】
この微生物ベースの製品の微生物は活性形態でも不活性形態でもよい。また、栄養細胞、胞子、菌糸、分生子の形態、及び／又は微生物の珠芽の形態であってもよい。微生物ベースの製品は、さらなる安定化や、保存、貯蔵をすることなく用いることができる。利点としては、これらの微生物ベースの製品を直接使用できることによって、微生物を高い生存率で保存できる点、外部の物質や望ましくない微生物による汚染の可能性を下げる点、微生物増殖の副産物の活性を保てる点、が挙げられる。
【０１０５】
微生物及び／又は微生物の増殖によってもたらされた培地は、増殖容器から取り出され、例えば、パイプを通して運ばれることによって、直接使用することができる。
【０１０６】
他の実施形態において、組成物（微生物、培地、又は微生物と培地）は、例えば、使用目的、予定している使用方法、発酵タンクのサイズ、及び微生物増殖施設から使用場所への輸送方法等を考慮した、適切な大きさのコンテナに入れることができる。つまり、微生物ベースの組成物が入れられるコンテナは、例えば、１ガロンから１０００ガロン以上の大きさでありうる。他の実施形態においては、コンテナの大きさは、２ガロン、５ガロン、２５ガロン、又はそれ以上である。
【０１０７】
増殖容器から微生物ベースの組成物を採取後、さらなる成分が採取製品としてコンテナ及び／又はパイプに入れられることもできる（又は使用するために輸送される）。添加物は、例えば、緩衝剤、キャリア、同じ又は異なる施設で製造された他の微生物ベースの組成物、粘度調整剤、保存料、微生物増殖のための栄養素、植物成長のための栄養素、トラッキング剤、殺虫剤、除草剤、動物飼料、食品、及び所定の使用目的のための成分であってもよい。
【０１０８】
本発明の利点としては、微生物ベースの製品が微生物が増殖した培養液を含みうる点が挙げられる。この製品は、例えば、少なくとも重量１％、５％、１０％、２５％、５０％、７５％又は１００％の培養液であってもよい。製品中のバイオマスの量は、例えば、０％から１００％の間のいずれの重量％であってもよい。
【０１０９】
任意で、この製品を使用前に貯蔵することもできる。この貯蔵期間は短い方が好ましい。つまり、貯蔵期間は６０日間、４５日間、３０日間、２０日間、１５日間、１０日間、７日間、５日間、３日間、２日間、１日間、又は１２時間より少なくてもよい。好適な実施形態において、製品に生細胞が含まれる場合は、製品は冷温で貯蔵される。これは、例えば、２０℃、１５℃、１０℃、又は５℃より低い温度である。一方、バイオサーファクタント組成物は通常、常温にて貯蔵される。
【０１１０】
本発明の微生物ベースの製品は、例えば、微生物イノキュラントや、生物農薬、栄養源、治療薬、健康製品、及び／又はバイオサーファクタントであってもよい。
【０１１１】
一実施形態において、培養プロセス後に得られる発酵製品（例えば、微生物及び／又は代謝産物）は通常高い商業的価値がある。微生物を含むこれらの製品は、微生物を含まない製品に比べて高い栄養分を有する。微生物は、培養システム、培養液、及び／又は培養バイオマス中に存在しうる。培養液及び／又は培養バイオマスは乾燥（吹付乾燥）することができ、これにより対象の製品を生成する。
【０１１２】
一実施形態において、培養製品は、吹付乾燥バイオマス製品として製造される。バイオマスは周知の方法を用いて取り出すことができる。これは、例えば、遠心分離、濾過、分離、デカンテーション、分離とデカンテーションの組み合わせ、限外濾過、又は精密濾過等である。バイオマス培養製品は、ルーメンバイパスを促進するためにさらに処理することができる。バイオマス製品は培養培地から分離され、吹付乾燥される。その後、ルーメンバイパスを調節するために任意で処理が行われ、栄養源として給餌するために投入されてもよい。
【０１１３】
一実施形態において、培養製品は動物用の飼料や、人間用の食品サプリメントとして用いられてもよい。培養製品は、脂肪、脂肪酸、リン脂質などの脂質、ビタミン、必須アミノ酸、ペプチド、タンパク質、炭水化物、ステロール、酵素、及び微量ミネラルのうちの少なくとも１種又は複数種に富んでいてもよい。微量ミネラルは、例えば、鉄、銅、亜鉛、マンガン、コバルト、ヨウ素、セレン、モリブデン、ニッケル、フッ素、バナジウム、スズ及びケイ素等である。ペプチドは少なくとも１種の必須アミノ酸を含みうる。
【０１１４】
他の実施形態においては、必須アミノ酸は、培養反応において使用される対象の組み換え微生物内に封入される。必須アミノ酸は、微生物によって発現される異種ポリペプチドに含まれる。必要に応じて、異種ペプチドを発現させ、適した微生物（例えば、菌類）中の封入体に貯蔵する。
【０１１５】
一実施形態において、培養製品は栄養素含有量が高い。その結果、完成した動物飼料には培養製品が高い割合で使用される。一実施形態では、飼料組成物は、飼料の１５％から飼料の１００％までの範囲で組み換え培養製品を含む。
【０１１６】
本発明はさらに、バイオマス（例えば、生存細胞物質）、細胞外代謝物（例えば、小分子と巨大分子の両方）、及び／又は細胞間成分（例えば、酵素や他のタンパク質）を製造するための材料や方法を提供する。本発明の微生物や微生物増殖副産物は、鉱石等の基質の変質のために用いることもできる。この場合、変質された基質が製品となる。
【０１１７】
本発明はさらに、微生物ベースの製品を提供するとともに、この製品を用いて様々な状況で有益な結果を得ることができるような用法も提供する。これは、例えば、１以上の微生物ベースの製品を使用することによる、改良されたバイオレメディエーション、採鉱、石油及びガス生産、廃棄物処理、家畜や他の動物の健康増進、植物の生育状態や生産性の向上を含む。
【０１１８】
具体的な実施形態として、本発明のシステムは農業生産性を高める科学的な解決策を提供する。これは、例えば、農作物の生命力を促進したり、農作物の生産量を高めたり、植物の免疫反応を高めたり、昆虫抵抗性、害虫抵抗性、病害抵抗性を高めたり、昆虫、線虫、病気、雑草を抑制したり、植物養分を増加させたり、農業土壌、林業土壌、草地土壌の栄養素含有量を改善したり、水利用の改善と効率化を促進したりすることによって達成される。
【０１１９】
一実施形態において、本発明はさらに、本明細書で開示した組成物を土壌、種子、又は植物部位に適用することによって、植物の生育状態を改善したり、及び／又は農作物の収穫量を増加させる方法を提供する。他の実施形態において、本発明によれば、農作物や植物の収穫量を増加させる方法を提供する。この方法は、本明細書で開示された組成物を複数回使用することを含む。
【０１２０】
この方法の利点としては、副作用や追加のコストを避けつつ、収穫量を増加し、線虫や害虫によって引き起こされる病気を効果的に抑制することができる点が挙げられる。
【０１２１】
他の実施形態において、微生物増殖副産物の製造方法は、対象の副産物を濃縮及び精製するステップをさらに含むこともできる。
【０１２２】
一実施形態において、本発明はさらに、少なくとも１種の微生物及び／又はこの微生物によって生成された少なくとも１種の微生物増殖副産物を含む組成物を提供する。この組成物の微生物は活性形態でも不活性形態でもよい。また、栄養細胞、胞子、菌糸、分生子、及び／又は微生物の珠芽の形態であってもよい。この組成物は、微生物が増殖した増殖マトリクスを含んでいてもいなくてもよい。また、この組成物は乾燥形態でも液状でもよい。
【０１２３】
一実施形態において、この組成物は農業に適している。例えば、組成物は土壌、植物、種子を処理するのに用いることができる。また、組成物は殺虫剤として用いられてもよい。
【０１２４】
一実施形態において、本発明はさらに、現場での要求に応じて材料や方法をカスタマイズする。例えば、微生物の培養方法は、現場の土壌、所定の油井、又は汚染箇所に存在している微生物を培養するために用いることができる。具体的な実施形態における、自然増殖環境を提供するための培養方法において、現場の土壌は固体基質として用いることができる。この利点として、微生物が現場の要求により適して有益に作用する点が挙げられる。
【０１２５】
本発明による培養方法は、栄養培地単位の微生物製品の収穫量を実質的に増加させるだけでなく、製造作業の単純化にも寄与する。さらに、この培養プロセスは、発酵終了後の微生物の濃縮の必要性を除外したり、削減したりすることができる。
【０１２６】
この方法の利点として、複雑な機器や高いエネルギー消費を要求しない点が挙げられる。これにより、微生物及びその代謝産物を大規模に製造する際の資本と労働コストを削減することができる。
【０１２７】
微生物増殖副産物
本発明の方法やシステムは、有用な微生物増殖副産物の製造に用いることができる。微生物増殖副産物は、例えば、バイオサーファクタント、酵素、酸、生体高分子、溶媒、及び／又はその他の微生物代謝産物である。具体的な実施形態において、増殖副産物は、バイオサーファクタントである。より詳しくは、増殖副産物は、サーファクチン、ソホロ脂質（ＳＬＰ）、ラムノリピド（ＲＬＰ）、及びマンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）から選択されるバイオサーファクタントでありうる。
【０１２８】
バイオサーファクタントは、微生物によって生成された、構造的に異なる界面活性物質群のことである。バイオサーファクタントは生分解可能であり、再生可能な基質上の、選択された有機体を用いて容易かつ安価に製造することができる。多くのバイオサーファクタント産生有機体は、成長培地に炭化水素源（例えば、油、糖類、グリセロール等）がある場合にバイオサーファクタントを生成する。例えば、鉄濃度等の他の培地要素も、バイオサーファクタントの生成に大きな影響を与えうる。例えば、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のバクテリアを用いたＲＬＰの生成量は、窒素源としてアンモニウムを使用する場合より、硝酸エステルを使用した場合の方が増加する。鉄、マグネシウム、ナトリウム、カリウムの濃度や、炭素とリンの比率、及び撹拌もまた、ラムノリピドの生成に大きな影響を与えうる。
【０１２９】
全てのバイオサーファクタントは両親媒性物質である。これらは極性部（親水基）と非極性部（疎水基）の２つの部分から構成される。これらの両親媒性構造により、バイオサーファクタントは疎水性の非水溶性物質の表面積を拡大し、これらの物質における水のバイオアベイラビリティを高め、バクテリアの細胞表面の性質を変化させる。
【０１３０】
バイオサーファクタントは、低分子量糖脂質（例えば、ラムノリピド、ソホロ脂質、マンノシルエリスリトールリピッド）、リポペプチド（例えば、サーファクチン）、フラボリピド、リン脂質、及びリポタンパク質、リポ多糖類−タンパク質複合体、多糖タンパク質脂肪酸複合体等の高分子量ポリマーを含む。一般的なバイオサーファクタント分子の親油性部分は脂肪酸の炭化水素鎖である。この場合、親水性部分は中性脂肪のアルコール基又はエステル基によって形成されたり、脂肪酸やアミノ酸（又はペプチド）のカルボキシレート基で形成されたり、フラボリピド又は糖脂質の場合は有機酸で形成されたり、炭水化物で形成されたりする。
【０１３１】
微生物バイオサーファクタントは、例えば、バクテリア、菌類、酵母等の様々な微生物によって生成される。バイオサーファクタント産生微生物の例としては、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ、Ｐ．ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐ．ｆｒａｇｉ、Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅ）；Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属；Ｂａｃｉｌｌｕｓ属（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｐｕｍｉｌｌｕｓ、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）；Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｏｍｙｃｅｓ属、Ｃａｎｄｉｄａ属（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｒｕｇｏｓａ、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｃ．ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）；Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属．；Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属；ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ属．；ｃｏｒｎｙｂａｃｔｅｒｉｕｍ属；Ｐｉｃｈｉａ属；Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ属；等が含まれる。バイオサーファクタントは既知の発酵プロセスによって生成されてもよい。
【０１３２】
他の微生物株としては、例えば、大量の糖脂質バイオサーファクタントを蓄積することができる他の真菌株及び／又は、例えば、大量のサーファクチンを蓄積することができるバクテリア株を含み、これらの他の微生物株は本発明において使用することができる。本発明において有用な他の代謝産物としては、マンノプロテイン、ベータグルカンや、バイオ乳化特性や表面／界面張力低減特性を持つ他のバクテリアを含む。
【０１３３】
本発明の一実施形態において、本システムによって生成されたバイオサーファクタントは、ラムノリピド（ＲＬＰ）、ソホロ脂質（ＳＬＰ）、トレハロース脂質、マンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）等の糖脂質とサーファクチンを含む。特定の実施形態として、本システムは大規模にＳＬＰ及び／又はＭＥＬを製造するために用いられる。
【０１３４】
ソホロ脂質は、例えば、スタルメレラ系統群の様々な酵母によって生成される糖脂質バイオサーファクタントである。研究されたスタルメレラ系統群の酵母の中で、ソホロ脂質の生産量が一番多かったのはカンジダ・アピコラ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｐｉｃｏｌａ）とスタルメレラ・ボンビコラ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ  ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）であった。ＳＬＰは長鎖ヒドロキシ脂肪酸と結合している二糖ソホロースからなる。これらのＳＬＰは、１７−Ｌ−ヒドロキシオクタデカン酸又は１７−Ｌ−ヒドロキシ−Δ９−オクタデカン酸にβ−グリコシド結合された部分アセチル化２−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−グルコピラノース単位である。ヒドロキシ脂肪酸は通常１６から１８の炭素原子であり、１以上の不飽和結合を含みうる。脂肪酸カルボキシル基は遊離していてもよいし（遊離酸又は開状態）又は４″位に内部でエステル化されていてもよい（ラクトン型）。
【０１３５】
マンノシルエリスリトールリピッドは様々な酵母株や真菌株によって生成される糖脂質クラスのバイオサーファクタントである。効果的にＭＥＬを生成するには、主にシュードザイマ属に限定される。これは各属によって生成されるＭＥＬ構造の中でも、大きな多様性を発揮する。ＭＥＬはその糖成分又は親水性ユニットとして、４−Ｏ−ｂ−Ｄ−マンノピラノシル−エリトリトールを含む。マンノピラノシルのＣ−４'及びＣ−６'位でのアセチル化度によって、ＭＥＬはＭＥＬ−Ａ、ＭＥＬ−Ｂ、ＭＥＬ−Ｃ、及びＭＥＬ−Ｄに分類される。ＭＥＬ−Ａはジアセチル化化合物を表し、ＭＥＬ−ＢとＭＥＬ−ＣはそれぞれＣ−６'又はＣ−４'位でモノアセチル化されている。完全にジアセチル化された構造はＭＥＬ−Ｄに起因する。シュードザイマの他には、最近発見された株であるＵｓｔｉｌａｇｏ  ｓｃｉｔａｍｉｎｅａがサトウキビジュースから生成された大量のＭＥＬ−Ｂを示す。ＭＥＬは効果的な局所保湿剤として作用し、傷んだ髪を補修することができる。また、これらの化合物は保護効果と治癒効果の両方を示す。これらは線維芽細胞及び乳頭細胞を活性化させ、天然酸化防止剤として作用する。
【０１３６】
ＳＬＰとＭＥＬの構成と組成物のおかげで、これらのバイオサーファクタントは優れた表面／界面張力低減特性を持ち、他の有用な生化学的性質を示すことができる。これは、大規模な工業利用や農業利用等を行う際に有用であり、また、化粧品分野、家庭用品分野、健康分野、医療分野、製薬分野等を含む他の分野においても有用である。しかし、本発明はこれに限定されない。
【０１３７】
バイオサーファクタントは界面に蓄積されるため、界面張力を減少させることができ、溶液中の凝集ミセル構造の形成を導くことができる。安全で効果的な微生物バイオサーファクタントは液体、固体、気体の分子間の表面／界面張力を減少させる。バイオサーファクタントが気孔を形成し、生体膜を不安定化させることによって、その抗菌剤、抗真菌剤、溶血剤としての使用が可能になる。低毒性特性と生物分解性特性と組み合わせられると、バイオサーファクタントは、例えば、微生物的石油増進回収等、様々な石油、ガス産業において広く有用に用いることができる。これらは、含油層からの原油回収の向上、油井及びガス井刺激（裸孔への原油の流入の改善）、パラフィン、アスファルテン、及びロッド、チューブ、ライナー、タンク、ポンプ等の機器からのスケール等の汚染物質及び／又は障害物の除去、石油及びガス生産及び輸送機器の腐食の防止、原油及び天然ガス中のＨ２Ｓ濃度の減少、原油の粘度の減少、重質原油及びアスファルテンの軽質な炭化水素留分へのアップグレード、タンク、流路、パイプラインの洗浄、選択的又は非選択的閉塞による水攻法における石油の移動性の向上、及び破砕流体を含む。しかし、本発明はこれらに限定されない。
【０１３８】
石油やガスの用途で使用される場合、本発明のシステムは微生物ベースの油田組成物のコストを低下させるために用いられ、例えば、ポリマー、溶媒、水圧破砕砂及びビーズ、乳化剤、界面活性剤、その他当分野において既知の物質等の他の化学促進剤と一緒に用いられてもよい。
【０１３９】
本発明によって生成されたバイオサーファクタントは他の、原油以外の回収目的で使用されてもよい。これは、例えば、パイプ、リアクター及び他の機械や表面の洗浄や、例えば、植物及び／又はその周辺環境にバイオサーファクタントを用いた害虫抑制を含む。本発明により生成されるいくつかのバイオサーファクタントは、害虫を抑制するために用いることができる。これは、バイオサーファクタントが害虫の組織に浸透することが可能で、補助剤を用いずとも少量で効果が得られるためである。臨界ミセル濃度を超えると、バイオサーファクタントはより効率的に対象の物体に浸透可能になることが分かっている。
【０１４０】
害虫の抑制は、生物防除剤としてのバイオサーファクタント産生有機体を用いて行われてもよいし、それに由来するバイオサーファクタントを用いて行われてもよい。さらに、害虫の抑制はバイオサーファクタント産生有機体の成長を補助し、バイオサーファクタント殺虫剤を生成する特定の基質を用いて行われてもよい。本開示の利点として、天然のバイオサーファクタントが競合する有機体の成長を抑制し、特定のバイオサーファクタント産生有機体の成長を促進する点が挙げられる。
【０１４１】
さらに、これらのバイオサーファクタントは動物や人間の病気の治療において重要な役割を果たす。例えば、動物の治療においては、生物細胞集団の有無にかかわらず単体のバイオサーファクタント溶液に浸される、及び／又は銅や亜鉛等の他の化合物の存在下でバイオサーファクタント溶液に浸される。
【０１４２】
本発明によって製造される組成物は、バイオサーファクタントが単体で使用されるときに効果的である。これは、細胞培養物全体を使用するためである。この細胞培養物は、酵母細胞壁の外面の一部として高濃度マンノプロテインを含み（マンノプロテインは８０％の乳化指標まで到達可能な、とても効果的な生物乳化剤である）、酵母細胞壁に生体高分子ベータグルカン（乳化剤）を含み、培地にソホロ脂質を含み、培地に代謝産物（例えば、乳酸、エタノール等）を含む。このソホロ脂質は、表面／界面張力を減少させることができる強力なバイオサーファクタントである。様々な他の用法がある中で、これらの組成物はバイオサーファクタントとして作用し、表面／界面張力低減特性を持つことができる。
【０１４３】
従来の微生物バイオサーファクタントの培養は複雑で、時間がかかり、資源の消費もあり、プロセスは複数の段階が必要だった。本発明は、シンプルで、プロセスにかかるコストを抑えることができる機器、装置、方法、及びシステムを提供する。さらに、本発明は新規の組成物と、この組成物の使用方法を提供する。
【実施例】
【０１４４】
本発明及びその多くの利点は、例示として与えられる以下の実施例から深く理解することができる。下記の実施例は、本発明のいつくかの方法、用法、実施例、及び変形例を示す。これらは本発明を限定するものではない。本発明は、様々な変更や改良が可能である。
【０１４５】
実施例１：多槽式発酵システム
図１、２に示すように、移動可能で流通可能なプラスチック製のリアクターを構築した。このリアクターは、２つのプラスチック製の四角いタンクと、２つのループを備える。これにより、２つのタンク間で質量交換が行われる。
【０１４６】
このシステムの上部には、ポンピング機構が備えられており、これにより、第１のタンク内のものを取り出し、それを第２のタンク内に注入する。この際、ループのうち一方のループが用いられる。他方のループはタンクの下部に設置されており、静水圧によって各タンクの体積を均等にする。
【０１４７】
タンクへの濾過した空気の注入は、バブラーによって動作されるスパージング機構によって制御した。散布予定の、濾過された空気は大容量の水ポンピングシステムを通して生成した。１つのタンクにつきそれぞれ２つの７２インチのバブラーを設置した。つまり、システム全体では４つのバブラーが設置された。空気圧縮機は、さらなる空気の混入のために、上部と下部のループに濾過された空気を注入するために用いた。
【０１４８】
上部のループにはのぞき窓が設置され、これにより培養物の濁度や、色、厚さや他の特性を観察することができる。細胞及び代謝産物を生成するためのスタルメレラ酵母を培養するため、リアクターは７５０リットルから８５０リットルの作業容量を有する（しかし、リアクターのサイズや寸法は必要な用法に応じて変更可能である）。このリアクターは小規模でも大規模でも、スタルメレラ系統群の酵母を大量生産するのに特に適している。
【０１４９】
培養物の生成にかかるコストをさらに削減し、技術のスケーラビリティを高めるため、このシステムには従来の方法を用いた殺菌は行われない。その代わりに、空の容器の衛生管理方法が用いられる。これは、２％から３％の過酸化水素を用いた処理を内面に施したり、漂白剤や高圧の熱湯を用いて濯ぎを行うことを含む。さらに、汚染の可能性を減らすために、培養物を生成するために用いる水は０．１ミクロンのフィルターで濾過された。
【０１５０】
培養培地成分は８５℃から９０℃の温度で汚染除去されるか、油以外に関して３％の過酸化水素（乾燥成分とＨ２Ｏの比率はｖ／ｖで１：３）に溶解された。油に関しては、温度による汚染除去のみが行われた。
【０１５１】
通常、発酵温度は約２３℃から３７℃にする必要があり、好ましくは約２５℃から３０℃にする必要がある。
【０１５２】
ｐＨ値は約３から５にする必要があり、好ましくは約３．５から約４．５にする必要がある。さらに、汚染の可能性をさらに減らすために、培養プロセスは４．０から４．５のｐＨ値で開始され、その後、３．２から３．５の平均ｐＨ値で実行された。
【０１５３】
上述のような培養条件下において、約６０時間から約１２０時間の発酵によって、工業的に有用なバイオマス、ソホロ脂質、及び他の代謝産物が製造された。この発酵が完了すると、培養物は様々な工業用途に適用することができる。
【０１５４】
実施例２：培養培地と、その培地による多槽式リアクターにおけるスタルメレラ培養物の利用
２０ｇＬ?１から１００ｇＬ?１のグルコース、０ｇＬ?１から５０ｇＬ?１（これは、製造するバイオサーファクタントの所望の量等に応じて変更することができる）の菜種油、５ｇＬ?１の酵母エキス、４ｇＬ?１のＮＨ４Ｃｌ、１ｇＬ?１のＫＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、０．１ｇＬ?１のＮａＣｌ、及び０．５ｇＬ?１のＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏからなる培地が濾過された水の中で調製された。
【０１５５】
最初のｐＨ値は、６Ｎ  ＫＯＨを用いて約４．５に調整された。培養物は約２５℃の温度で増殖した。培養時間は最大で１２０時間であり、リアクターの培養物のｐＨ値は１日に２回１．０Ｍ  ＮａＯＨを投入することによって約３．５に調整された。
【０１５６】
このような培養条件において、スタルメレラ湿潤バイオマスの量は、培養物１リットルにつき最大で１００グラムとなった。
【０１５７】
実施例３：抗生物質を用いた種培養物の生成
下記に示すのは、本発明によるスケールアップした微生物ベースの製品の製造方法の一例である。種培養物は、本システムにおいて用いるために生成され、その後、スケールアップすることができる。このスケールアップは、独立した容器において行うことができる。例えば、ドラムミキサーに試薬を投入し、２日又はそれ以上の日数をかけて培養物を培養する。ミキサー内で少なくとも２日間かけて種培養物が培養された後、この培養物は任意の個数の本リアクターシステムにイノキュレーションを行うために、適切な個数に分けられる。
【０１５８】
【表１】
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【０１５９】
振とうフラスコ
抗生物質を用いずに、２リットルの培地組成物が４リットルのフラスコを用いて生成された。その後、加圧滅菌のためフラスコの準備を行った。１枚のチーズクロスと、１枚の青色のオートクレーブ紙を、ゴムバンドを用いてフラスコの縁に固定した。（チーズクロスと青色の紙は、ゴムバンドが縁の一部を固定する場所をクロスと紙で覆うのに十分な大きさが必要である。）オートクレーブ（加圧滅菌）は１２１℃で２０分間行われ、その後、フラスコは３０℃以下の温度まで冷まされた。
【０１６０】
次に、抗生物質の量を測り、ビーカー又は５０ｍＬのコニカルチューブ内で抗生物質は脱イオン水（ＤＩウォーター）に溶解した。各寒天プレートはＣ．ボンビコラ又はＳ．ボンビコラで標識した。単一コロニーはループ（１、２個のループで十分である）を用いてプレートから選択され、無菌法を実行し、研究室のドラフトチャンバー内でフラスコにイノキュレーションを行った。溶解した抗生物質もフラスコに投入された。ドラフトチャンバー内でチーズクロスと青色のオートクレーブ紙を取り外し、交換を行う際は、フラスコ内部に触れていたチーズクロスの底には接触しないように注意が必要である。
【０１６１】
４リットルのフラスコに対しイノキュレーションを行うと、これらは発酵室内のシェーカーに移される。シェーカーの温度は３０℃に設定された。このフラスコは、種培養物を使用する前に少なくとも２日間発酵を行った。種培養イノキュラムを純粋なまま、汚染されないように保つために、種培養イノキュラムのサンプルは使用前に、ドラフトチャンバー内で採取した。単純なグラム染色を用いて、サンプルのスライドを作成した。
【０１６２】
ドラムミキサーを用いたスケールアップ
種培養物を２日間培養した後、この種培養物をリアクターにイノキュレーションするため、黒色のドラムミキサー内でスケールアップを行った。４０リットルのバッチ分の粉状の上述の試薬が計量された。抗生物質の計量も行われ、別のコンテナに保存された。
【０１６３】
培地成分を４０リットルのカーボイ中で溶解した。このとき、体積は４０リットルレベルを超えることはなかった。４０リットル分の培地がミキサーに投入され、その後、２リットル分のイノキュラムがシェーカーから投入され、適切な量の溶解抗生物質が投入された。その後、その一部をリアクターに移動する前に、培養物はミキサー内で少なくとも２日間培養した。各キュービクルに分配された培養物の量は、何リットルの培養物が生成されたか、及びキュービクルの数によって決まる。各リアクターには、少なくとも１０リットルの培養物が投入された。
【０１６４】
スケールアップ後の培養物は、２０リットル又は４０リットルのカーボイ内のドラムポンプを用いて採取され、これはリアクター毎に必要な培養物の体積に応じて決定される。その後、培養物は同じドラムポンプを用いてカーボイから移され、リアクターにイノキュレーションされた。
【０１６５】
ドラムミキサーの洗浄
全ての培養物をドラムミキサーから採取した後、ミキサーを排水設備まで移し、温水で濯ぎ、バイオフィルムを除去した。完全に濯いだ後で、７０％のＩＰＡを用いてリアクターを殺菌した。ミキサーを乾燥し、全てのＩＰＡ残留物を取り除いた後、他の種培養物のバッチを開始した。
【０１６６】
実施例３：抗生物質を含む培養培地を用いた多槽式リアクターの動作
【０１６７】
【表２】
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【０１６８】
多槽式リアクターの用意
多槽式リアクターの総体積は７５０リットルであった。これにより、上述の試薬の適切な量が判定され、計量された。バレル内で、粉末が濾過された水を用いて溶解された。この溶解ステップにおいては、菜種油は投入されなかった。抗生物質は独立して保存され、より大きなビーカー内で脱イオン水に溶解された。
【０１６９】
次に、溶解培地がリアクターに投入された。このリアクターは最大で１８５ガロンの総量の濾過された水で満たされ、続いて菜種油で満たされた。各タンクは最終的に１００ガロンの体積となり、これにより、合わせて２００ガロンとなった。
【０１７０】
開始温度は少なくとも２３℃であり３０℃より高くなることはなかった。温度が２３℃から３０℃の範囲で設定された後、イノキュラムがミキサーから投入され、溶解抗生物質が投入された。ｐＨ値及び溶存酸素飽和度（ＤＯ％）を計測するために、サンプルが採取された。培養物は最低でも３日間は培養を行い、少なくとも１日に１度はｐＨ値、温度、及びＤＯ％のモニタリングを行った。キューブの採取の準備が整うと、ｐＨ値計測のためにサンプルが採取された。
【０１７１】
スライドが作成され、連続希釈プレートが作成され、品質管理／品質保証のためにＯＤ測定が行われた。ＤＯ測定と温度測定も行った。培養物の品質が保証されたら、下部のループに設置されているカムロック継手と、２組のホースを備える移送ポンプを用いて培養物の採取を行った。
【０１７２】
培養物バッチの品質が使用に適さない場合は、ボトルの半分の量の漂白剤をリアクターの２つのタンクに注ぎ、２０分待ってから排出を行った。
【０１７３】
リアクターの洗浄
まず、リアクタータンクの濯ぎを行った。壁からリアクターのプラグを抜き、下部の両方のボール弁を閉じ、カムロック継手を外して下部のループ部品を取り外した。この際、下部のループを外すときに大量の培地がこぼれてしまわないように気を付ける。ループを取り外した後、リアクターを倉庫内の排水設備に向かって移動するのにパレットトラックを使用した。
【０１７４】
その後、上部のループが取り外され、下部のループの部品を熱湯で濯いだ。もし、ループやその部品がひどく汚い場合は、それらを全て完全に綺麗にするために消毒剤を用いる。次に、排水設備付近で、熱湯と、倉庫内のホースのスプレーノズルを用いてタンクを濯いだ。この際、タンク内の全てのフィルムを取り除くように気を付ける。
【０１７５】
次に、タンク内部に、３％の過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を少なくとも３分から５分間噴霧した。このステップにおいては、個人用保護具（ＰＰＥ）を着用することが重要である。
【０１７６】
なお、汚染の心配がある場合には、リアクターはその稼働位置まで運び戻され、タンクを０．５％の過酸化水素水で満たす。リアクターの総体積は約１１００リットルであるので、つまり約５５リットル分の１０％の過酸化水素が必要となる。下部のループは取り付け直され、ユニットの電源を入れる。リアクターは少なくとも４時間、０．５％の過酸化水素を用いた洗浄を行う。少なくとも２時間が経過したら、ユニットの電源はオフにする。下部のループのボール弁が閉鎖され、下部のループが取り外される。排水を行うため、リアクターを排水設備に向かって移動するのにパレットトラックを使用する。
【０１７７】
その後、濾過された水（好ましくは熱湯）でリアクターを完全に濯ぎ、これで他のバッチを開始する準備が整った。
【０１７８】
実施例４：パラフィンの液状化
パラフィンの液状化に対するスタルメレラ培養物の効果を示すために実験は行われた。図２は実験の結果を示しており、培養物の結果を「星３」として示す。
【０１７９】
パラフィン分解効果を調査するために、２１の微生物／化学乳化生成物（市販のものを含む）について研究を行った。この実験において、５０ｍＬのファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）チューブを使用した。このファルコンチューブは、２５ｍＬの作業容量を有する。油田からは、固形パラフィンが採取された。４グラムの固形パラフィンが計量され、その後、各ファルコンチューブに注入され、表１の各液体が２０ｍＬ分、ファルコンチューブに注入された。全てのファルコンチューブは、３０℃から４０℃の温度のＥＮＶＩＲＯ  ＧＥＮＥインキュベーター内に並列に配置され、ゆっくり混ぜ合わせされた。それぞれ異なるインキュベーション時間（１、２、又は４日間）経過後に各チューブは回収され、分析された。
【０１８０】
異なるインキュベーション時間と異なる温度において、この実験は３回行われた。１回目の実験は３０℃にて行われた。１回目の実験では、「星３」が示す結果は約４ｇ／Ｌ（ほぼ飽和状態）のソホロ脂質と共にＳ．ボンビコラを含んでいた。「星３」が示す処理はチューブ内で完全な拡散が行われていることを示しており、「星３」が示す処理はパラフィンを完全な液体に変化させるための唯一の追加的な処理であった。一方、（市販のＮａｘａｎを含む）他の全てのテストにおいて、パラフィンは固体のままだった。この概念実証実験により、スタルメレラ培養物がパラフィンの液状化にとても有効であり、入手可能な他の市販の化学物質や生物製剤よりも優れていることがわかった。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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