(57)【要約】遺伝子治療ベクター調製物の質的及び／又は量的特性を測定する方法を本明細書に提供する。ある実施形態では、遺伝子治療ベクター調製物はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）調製物（例えば、ＡＡＶ８）である。ある実施形態では、その方法は、ＥＬＩＳＡを使用して、又はＣｒｙｏＴＥＭと組み合わせてＥＬＩＳＡを使用して、ＡＡＶ調製物の効力又は用量を決定することを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＡＶ調製物の用量を定量化する方法であって、ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡアッセイにより、ＡＡＶ調製物中のＡＡＶカプシドの総数を定量化するステップを含む、方法。
【請求項２】
ＡＡＶ調製物の用量を定量化する方法であって、ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡアッセイにより、ＡＡＶ調製物中のＡＡＶカプシドの総数を定量化するステップ、及び低温透過型電子顕微鏡法（ＣｒｙｏＴＥＭ）により、ＡＡＶ調製物中の完全対空（完全：空）ＡＡＶカプシドのパーセンテージ又は比を評価するステップを含む、方法。
【請求項３】
ＡＡＶ調製物中の完全ＡＡＶカプシドの濃度を測定する方法であって、ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡアッセイにより、ＡＡＶ調製物中のＡＡＶカプシドの総数を定量化するステップ、及び低温透過型電子顕微鏡法（ＣｒｙｏＴＥＭ）により、ＡＡＶ調製物中の完全対空ＡＡＶカプシドのパーセンテージを評価するステップを含む、方法。
【請求項４】
前記ＥＬＩＳＡアッセイが、ＡＡＶ抗原特異的な、サンドイッチＥＬＩＳＡ、直接ＥＬＩＳＡ、間接ＥＬＩＳＡ、又は競合ＥＬＩＳＡアッセイである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ＥＬＩＳＡアッセイが、ＡＡＶ抗原に特異的なサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ＡＡＶ調製物中の完全対空（完全：空）ＡＡＶカプシドのパーセンテージ又は比を評価するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記評価するステップが、ＥＬＩＳＡアッセイの前又は後に行われる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記評価するステップが、低温透過型電子顕微鏡法（ＣｒｙｏＴＥＭ）、ネガティブ染色ＴＥＭ、キャピラリー電気泳動、分析用超遠心法、ネイティブアガロースゲル、アルカリアガロースゲル、サザンブロット、ドットブロットハイブリダイゼーション、ＵＶ分光測光法、弱陰イオン交換クロマトグラフィ、又は質量分析により、完全：空ＡＡＶカプシドのパーセンテージ又は比を決定することを含む、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
前記評価するステップが、ＣｒｙｏＴＥＭを使用することを含む、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ＣｒｙｏＴＥＭステップが：
（ｉ）不活性支持体中の基材にＡＡＶ調製物を包埋する；
（ｉｉ）包埋ＡＡＶ調製物を瞬間凍結する；
（ｉｉｉ）低温透過型電子顕微鏡法を用いて包埋ＡＡＶ調製物を画像化する；及び
（ｉｖ）ＡＡＶ調製物中の完全ＡＡＶカプシド対空ＡＡＶカプシドのパーセンテージを定量化することを含む、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
前記基材が非結晶性の非晶質氷である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＡＡＶ調製物が細胞破片を含まない、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
定量ＰＣＲを含まない、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ＡＡＶ調製物をそれを必要とする対象に投与する方法であって、
（ｉ）精製ＡＡＶ調製物を得るステップ；
（ｉｉ）ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、精製ＡＡＶ調製物中のＡＡＶカプシドの濃度を測定するステップ；及び
（ｉｉｉ）治療有効量の精製ＡＡＶ調製物を対象に投与するステップ
を含む、方法。
【請求項１５】
前記ＥＬＩＳＡアッセイが、ＡＡＶ抗原特異的な、サンドイッチＥＬＩＳＡ、直接ＥＬＩＳＡ、間接ＥＬＩＳＡ、又は競合ＥＬＩＳＡアッセイである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＥＬＩＳＡアッセイが、ＡＡＶ抗原に特異的なサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイである、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＡＡＶ調製物中の完全対空（完全：空）ＡＡＶカプシドのパーセンテージ又は比を評価するステップをさらに含む、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記評価するステップが、ＥＬＩＳＡアッセイの前又は後に行われる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記評価するステップが、ＣｒｙｏＴＥＭ、分析用超遠心法、ネイティブアガロースゲル、アルカリアガロースゲル、サザンブロット、ドットブロットハイブリダイゼーション、ＵＶ分光測光法、弱陰イオン交換クロマトグラフィ、又は質量分析により、完全：空ＡＡＶカプシドのパーセンテージ又は比を決定することを含む、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記評価するステップが、ＣｒｙｏＴＥＭを使用することを含む、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
精製ＡＡＶ調製物の濃度が、約１ｘ１０１０ｃｐ／ｍｌ〜約１ｘ１０２０ｃｐ／ｍｌである、請求項１４〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
ＡＡＶ調製物の治療有効量が、約１ｘ１０１０ｃｐ／ｋｇ〜約１ｘ１０１６ｃｐ／ｋｇの間の用量である、請求項１４〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
定量ＰＣＲを含まない、請求項１４〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記対象がヒトである、請求項１４〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
ＡＡＶ調製物をそれを必要とする対象に特定用量で投与する方法であって、
（ｉ）精製ＡＡＶ調製物を得るステップ；
（ｉｉ）ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、精製ＡＡＶ調製物中のＡＡＶカプシドの濃度を測定するステップ；及び
（ｉｉｉ）特定用量の精製ＡＡＶ調製物を対象に投与するステップ
を含む、方法。
【請求項２６】
前記ＥＬＩＳＡアッセイが、ＡＡＶ抗原特異的な、サンドイッチＥＬＩＳＡ、直接ＥＬＩＳＡ、間接ＥＬＩＳＡ、又は競合ＥＬＩＳＡアッセイである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＥＬＩＳＡアッセイが、ＡＡＶ抗原に特異的なサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイである、請求項２５又は２６に記載の方法。
【請求項２８】
ＡＡＶ調製物中の完全対空（完全：空）ＡＡＶカプシドのパーセンテージ又は比を評価するステップをさらに含む、請求項２５又は２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記評価するステップが、ＥＬＩＳＡアッセイの前又は後に行われる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記評価するステップが、ＣｒｙｏＴＥＭ、分析用超遠心法、ネイティブアガロースゲル、アルカリアガロースゲル、サザンブロット、ドットブロットハイブリダイゼーション、ＵＶ分光測光法、弱陰イオン交換クロマトグラフィ、又は質量分析により、完全：空ＡＡＶカプシドのパーセンテージ又は比を決定することを含む、請求項２８又は２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記評価するステップが、ＣｒｙｏＴＥＭを使用することを含む、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
定量ＰＣＲを含まない、請求項２５〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
精製ＡＡＶ調製物の濃度が、約１ｘ１０１０ｃｐ／ｍｌ〜約１ｘ１０２０ｃｐ／ｍｌである、請求項２５〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
ＡＡＶ調製物の治療有効量が、約１ｘ１０１０ｃｐ／ｋｇ〜約１ｘ１０１６ｃｐ／ｋｇの間の用量である、請求項２５〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記対象がヒトである、請求項２５〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
ＡＡＶ調製物を生成する方法であって、
（ｉ）目的遺伝子を含む少なくとも１つのプラスミドで宿主細胞をトランスフェクトするステップ；
（ｉｉ）ＡＡＶカプシドを含む細胞培養物の上清又は細胞懸濁液を収集してＡＡＶ画分を作成するステップ；
（ｉｉｉ）ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、ＡＡＶ画分中のＡＡＶカプシドの総数を定量化するステップ；及び
（ｉｖ）前記ＡＡＶカプシドの総数に基づき、所望の濃度を有するＡＡＶ調製物を調製するステップ
を含む、方法。
【請求項３７】
ＡＡＶ画分を濃縮するステップをさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
ＡＡＶ画分から空カプシドの少なくとも一部を除去するステップをさらに含む、請求項３６又は３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＥＬＩＳＡアッセイが、ＡＡＶ抗原特異的な、サンドイッチＥＬＩＳＡ、直接ＥＬＩＳＡ、間接ＥＬＩＳＡ、又は競合ＥＬＩＳＡアッセイである、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＥＬＩＳＡアッセイが、ＡＡＶ抗原に特異的なサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイである、請求項３６〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
ＡＡＶ調製物中の完全対空（完全：空）ＡＡＶカプシドのパーセンテージ又は比を評価するステップをさらに含む、請求項３６〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記評価するステップが、ＥＬＩＳＡアッセイの前又は後に行われる、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記評価するステップが、ＣｒｙｏＴＥＭ、分析用超遠心法、ネイティブアガロースゲル、アルカリアガロースゲル、サザンブロット、ドットブロットハイブリダイゼーション、ＵＶ分光測光法、弱陰イオン交換クロマトグラフィ、又は質量分析により、完全：空ＡＡＶカプシドのパーセンテージ又は比を決定することを含む、請求項４１又は４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記評価するステップが、ＣｒｙｏＴＥＭを使用することを含む、請求項４１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
定量ＰＣＲを含まない、請求項３６〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
完全ＡＡＶカプシドのパーセンテージは約４０％〜約１００％である、請求項３６〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
少なくとも６０％のＡＡＶカプシドが完全ＡＡＶカプシドである、請求項３６〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記濃度は約１ｘ１０１０ｃｐ／ｍｌ〜約１ｘ１０２０ｃｐ／ｍｌの間である、請求項３６〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
ＡＡＶ調製物を凍結乾燥するステップをさらに含む。請求項３６〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、又はキメラＡＡＶベクターである、請求項１〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
ＡＡＶはＡＡＶ８である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
ＡＡＶはＡＡＶ９である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
ＡＡＶは、遺伝子操作ＡＡＶ、化学修飾ＡＡＶ、又はその両方である、請求項１〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
ＡＡＶ抗原は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、キメラＡＡＶ、遺伝子操作ＡＡＶ、又は化学修飾ＡＡＶに由来する、請求項４〜１３、１５〜２４、２６〜３５、及び３９〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
請求項３６〜５４のいずれか一項に記載の方法により生成されたＡＡＶ調製物。
【請求項５６】
特定の効力を有し、該効力が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏシステム、ｉｎ  ｖｉｖｏシステム、又はその両方の組合せを用いて確認される、請求項５５に記載のＡＡＶ調製物。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、参照することによってその全てが本願に援用される、２０１７年３月３日出願の米国仮特許出願第６２／４６７，０４５号に基づく優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、線状一本鎖ＤＮＡゲノムをパッケージングする小型の非エンベロープウイルスである。ＡＡＶによる増殖感染は、例えばアデノウイルス又はヘルペスウイルスなどのヘルパーウイルスの存在下でのみ生じるため、ＡＡＶはパルボウイルス科、ディペンドウイルス属に属する。ヘルパーウイルスの不在下ですら、ＡＡＶ（血清型２）は宿主ヒトゲノムの染色体１９ｑ１３．４中に組み込まれることにより潜伏を達成することができる。それは、部位特異的組込みができることが分かっている唯一の哺乳動物ＤＮＡウイルスである（非特許文献１）。
【０００３】
ＡＡＶを臨床で安全に使用するために、ＡＡＶはそのゲノム内のいくつかの位置で遺伝子改変されている。例えば、ウイルス複製に必要なＲｅｐ遺伝子、及び部位特異的組込みに必要な因子が、多くのウイルスベクターにおいてＡＡＶゲノムから除去されている。この組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、染色体外状態で存在し、ゲノムＤＮＡへの非常に低い組込み効率を有する。従って、ｒＡＡＶが宿主細胞においてランダム変異導入を生じさせる可能性は、全くなくなるとまではいかないとしても、低減される。これらの特性や病原性の欠如のため、ｒＡＡＶは前臨床及び臨床適用の多様な態様で遺伝子治療ベクターとして大きな見込みを示している。新たな血清型及び自己相補的ベクターが臨床で試験されている。これら進行中のベクター開発と並行して、高タイター量の高い純度及び効力（potency）を有するｒＡＡＶベクターを効率的に作成できるスケーラブルな製造プロセスに対する継続的な取組みに力が入れられている。
【０００４】
ヒト投与に適したＡＡＶ生成物を精製する効率的で大規模な方法を設計する取組みが進んではいるが、製品リリース及び正確な臨床投与を可能にするために、組換えｒＡＡＶに基づく遺伝子治療ベクター調製物の質的特性を測定する分析法に対する要求が依然としてある。例えば、細胞培養でＡＡＶを生成する現在の方法は、ベクターゲノムを欠きかつＴ細胞媒介免疫応答を引き起こすことが示されている「空」カプシドの形成をもたらす。さらには、空カプシドは、導入遺伝子産生に関連する治療的利益をもたらすことができず、またベクターに対する先天性又は適応性免疫応答（例えば、Ｔ細胞媒介性）を高める可能性があり、従って、空カプシドは遺伝子治療における懸念となる（非特許文献２）。
【０００５】
古典的に、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）の使用は、ベクターゲノムの測定（例えば、ベクターゲノム（ｖｇ）／ｋｇ対象）を提供するため、最も広く受け入れられており、またＡＡＶ調製物の用量を決定する好ましい方法である。非特許文献３〜６を参照。しかしながら、ｑＰＣＲの使用は、全ＤＮＡのみが測定されることによって制限され、それは重要な問題につながり得る。例えば、ｑＰＣＲの読み出しは、能率の悪いプライマーの使用、校正標準の問題、又はＤＮＡの三次構造（例えば、ヘアピン構造、環状、又はスーパーコイル）などの問題によって影響を受け得る。従って、ｑＰＣＲの使用は、用量計算において１コピーより多くのＤＮＡを含むカプシド及び／又は破損したカプシドを含めるため、最終ＡＡＶ調製物の用量及び最終的には効力の不正確な決定につながり得る。これは、ＡＡＶ調製物の効力が２つの部分：１）ＡＡＶカプシドが細胞を形質導入する能力；及び２）ＡＡＶ中のＤＮＡが所望の産物を産生する能力からなるためである。ｑＰＣＲで計上されない作動不能（inoperable）なカプシドは、細胞を有効に形質導入しない。さらには、ｑＰＣＲは、最終ＡＡＶ調製物の用量の不正確な決定につながり得るその固有の変動性（すなわち、０．５ｌｏｇステップまでの高い変動性）によっても制限される。固有の変動性は、カプシドタンパク質の消化、ＤＮＡ抽出、及びＤＮＡ精製を含めていくつかのステップを含む試料調製に起因してｑＰＣＲでみられるアッセイ間変動によっても増大し得る。用量及び／又は効力が正確に決定されなければ、患者は誤った用量及び／又は治療ごとに大きく変動する用量を受けることとなり得る。従って、ＡＡＶ調製物の用量及び最終的には効力を測定し、さらに遺伝子治療ベクターの質及び効力を監視する正確なツールが必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Daya and Berns, Clinical Microbiology Reviews, pages 583-593 (2008)
【非特許文献２】Wright, Molecular Therapy 22: 1-2 (2014)
【非特許文献３】Halbert CL et al., J Virol 1997;71:5932-5941
【非特許文献４】Samulski RJ et al., J Virol 1989;63:3822-3828
【非特許文献５】Clark KR et al., Hum Gene Ther 1999;10:1031-1039
【非特許文献６】Wright JF, Hum Gene Ther 2011;22:519-521
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
遺伝子治療ベクター調製物の量的特性を測定する方法をここに提供する。ある実施形態では、遺伝子治療ベクター調製物はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）調製物である。本明細書に開示の方法は、精製のあらゆる時点で用いることができる。ある実施形態では、使用のためにＡＡＶカプシドを調製又はパッケージングする前にその方法を使用してもよい。本明細書に開示の方法を用いて、ＡＡＶ調製物の濃度、用量及び／又は効力の決定を改善することができる。
【０００８】
細胞培養でのＡＡＶベクター生成の特徴は、ベクターゲノムを欠く過剰量の「空」カプシドの形成である。ある実施形態では、ＡＡＶ調製物の濃度、用量及び／又は効力を正確に決定するために空カプシドの量を評価する。空カプシドは、精製中に低減すべき生成物関連不純物ともみなされ得る。ある実施形態では、カプシド抗原に対する先天性及び／又は適応性免疫応答を低減するために、空カプシドの総量を決定することが重要である。
【０００９】
古典的に、ＡＡＶ調製物の濃度、用量及び／又は効力は、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）による定量に頼る。驚くことに、本発明者は、ＡＡＶ調製物の定量のためにＡＡＶ特異的酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）単独に依存し得ること、及びその使用が、ＡＡＶ調製物の濃度及び／又は用量、さらには最終的にその効力の測定を改善し得ることを見出した。ＥＬＩＳＡを用いた抗原決定は、驚くことにｑＰＣＲの結果よりも正確な、高い信頼度の結果を提供するため、本開示の方法は当業界で知られている方法よりも有利である。ある実施形態では、その方法は、ｑＰＣＲにより濃度、用量及び／又は効力を測定するステップを含まない。ある実施形態では、濃度、用量及び／又は効力は、ＡＡＶ調製物中のＡＡＶカプシドの濃度により決定することができる。ある実施形態では、ＥＬＩＳＡを含む本明細書に開示の方法は、ｑＰＣＲを用いる方法と比較して、濃度、用量及び／又は効力の変動が少なくとも約１０％少ないＡＡＶ調製物をもたらす。ある実施形態では、ＥＬＩＳＡを含む本明細書に開示の方法は、ｑＰＣＲを用いる方法と比較して、濃度、用量及び／又は効力の変動が少なくとも約２０％少ないＡＡＶ調製物をもたらす。ある実施形態では、ＥＬＩＳＡを含む本明細書に開示の方法は、ｑＰＣＲを用いる方法と比較して、濃度、用量及び／又は効力の変動が少なくとも約１０％〜約８０％少ないＡＡＶ調製物をもたらす。ある実施形態では、ＥＬＩＳＡを含む本明細書に開示の方法は、ｑＰＣＲを用いる方法と比較して、濃度、用量及び／又は効力の変動が少なくとも約１５％〜約５０％少ないＡＡＶ調製物をもたらす。ある実施形態では、ＥＬＩＳＡを含む本明細書に開示の方法は、ｑＰＣＲを用いる方法と比較して、濃度、用量及び／又は効力の変動が少なくとも約２０％〜約３３％少ないＡＡＶ調製物をもたらす。
【００１０】
ある態様では、本発明の方法は、ＡＡＶ調製物の用量及び／又は効力の定量化を伴う。ある実施形態では、その方法は、ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡアッセイによりＡＡＶ調製物を試験してＡＡＶ調製物中のＡＡＶカプシドの総数を定量化することを含む。その後、そのカプシドの数を用いて、対象に投与する用量を決定することができる。その用量を用いて効力（すなわち、ある効果をもたらすのに必要な用量又は濃度（例えば、ＥＣ５０））を決定することができる。ある実施形態では、その方法は、ｑＰＣＲにより用量及び／又は効力を測定するステップを含まない。
【００１１】
ある態様では、本発明の方法は、ＡＡＶ画分又は調製物中のＡＡＶカプシドの濃度を測定することを伴う。ある実施形態では、その方法は、ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡによりＡＡＶ画分又は調製物を試験して、ＡＡＶ画分又は調製物中のＡＡＶカプシドの総数を定量化することを含む。ある実施形態では、その方法は、ｑＰＣＲにより濃度を測定するステップを含まない。
【００１２】
ある態様では、本発明の方法は、ＡＡＶ画分又は調製物中の完全ＡＡＶカプシドの濃度を測定することを伴う。ある実施形態では、その方法は、ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡアッセイによりＡＡＶ画分又は調製物を試験して、ＡＡＶ画分又は調製物中のＡＡＶカプシドの総数を定量化し、さらにＡＡＶ調製物中の完全カプシド対空ＡＡＶカプシドのパーセンテージを評価する（例えば、低温透過型電子顕微鏡法（cryogenic transmission electron microscopy）（又はクライオ電子顕微鏡法）（ＣｒｙｏＴＥＭ）を使用する）ことを含む。ある実施形態では、その方法は、ｑＰＣＲにより濃度を測定するステップを含まない。
【００１３】
ある実施形態では、空カプシドをＡＡＶ画分又は調製物から除去し、特定濃度の完全カプシド及び／又は特定の完全：空カプシド比を有するＡＡＶ画分又は調製物をもたらす。ある実施形態では、ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡアッセイがＡＡＶ画分又は調製物の濃度、用量及び／又は効力を決定するのに十分であるように、その濃度又は比はバッチ間で一定である。ある実施形態では、その方法は、ｑＰＣＲにより濃度、用量及び／又は効力を測定するステップを含まない。
【００１４】
ある態様では、本発明の方法は、ＡＡＶ調製物の用量及び／又は効力を定量化することを伴う。ある実施形態では、その方法は、ＡＡＶ調製物中の完全対空（完全：空）ＡＡＶカプシドのパーセンテージ又は比を評価又は確認する方法と組み合わせて、ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡアッセイによりＡＡＶ調製物を試験することを含む。ある実施形態では、その方法は、ｑＰＣＲにより用量及び／又は効力を測定するステップを含まない
【００１５】
ある実施形態では、その方法は、ＡＡＶ画分又は調製物中の完全：空ＡＡＶカプシドのパーセンテージ又は比を評価又は確認する方法と組み合わせて、ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡアッセイによりＡＡＶ画分又は調製物中のＡＡＶカプシドの濃度を測定することを含む。ある実施形態では、その方法は、ｑＰＣＲにより濃度を測定するステップを含まない。
【００１６】
ある実施形態では、ＡＡＶ調製物の用量及び／又は効力を定量化する方法は、ＡＡＶ調製物の生物活性を確認することを含む。ある実施形態では、その方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法を用いてＡＡＶ調製物の生物活性を確認することを含む。ある実施形態では、その方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏ法を用いてＡＡＶ調製物の生物活性を確認することを含む。ある実施形態では、ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡアッセイを、生成物の質を確認する（例えば、完全：空の比を測定する）方法とペアにする場合は、本発明の方法は、生物学的アッセイを用いて確認することを必要としない。例えば、ある実施形態では、ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡアッセイをＣｒｙｏＴＥＭと組み合わせる場合は、本発明の方法は、生物学的アッセイを用いて確認することを必要としない。ある実施形態では、その方法は、ｑＰＣＲにより用量及び／又は効力を測定するステップを含まない。
【００１７】
ある態様では、本発明の方法はＡＡＶ調製物を生成することを伴い、（ｉ）目的遺伝子を含む少なくとも１つのプラスミドで宿主細胞をトランスフェクトするステップ；（ｉｉ）ＡＡＶカプシドを含む細胞培養物の上清又は細胞懸濁液を収集してＡＡＶ画分を作成するステップ；（ｉｉｉ）ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡアッセイを用いてＡＡＶ画分中のＡＡＶカプシドの総数を定量化するステップ；及び（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）で決定したＡＡＶカプシドの総数に基づき、所望の濃度のＡＡＶカプシドを含むＡＡＶ調製物を調製するステップを含む。ある実施形態では、その方法は、ＡＡＶ画分を濃縮することを含む。ある実施形態では、その方法は、ＡＡＶ画分から空カプシドの少なくとも一部を除去することを含む。ある実施形態では、空カプシドの少なくとも一部を除去して、特定濃度の完全カプシド及び／又は特定の完全：空カプシド比を有するＡＡＶ画分又は調製物を作成する。ある実施形態では、その方法は、ＡＡＶ画分又は調製物中の完全対空（完全：空）ＡＡＶカプシドのパーセンテージ又は比を評価又は確認することを含む。ある実施形態では、その方法は、ｑＰＣＲにより濃度、用量及び／又は効力を測定するステップを含まない。ある実施形態では、その方法は、ＡＡＶ画分又は調製物を凍結乾燥することをさらに含む。
【００１８】
ある態様では、本発明の方法は、ＡＡＶ調製物をそれを必要とする対象に投与することを伴い、（ｉ）精製ＡＡＶ調製物を得るステップ；（ｉｉ）ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡアッセイを用いて精製ＡＡＶ調製物中のＡＡＶカプシドの濃度を測定するステップ；（ｉｉｉ）治療有効量の精製ＡＡＶ調製物を対象に投与するステップを含む。ある実施形態では、ステップ（ｉ）及び（ｉｉ）におけるＡＡＶ調製物は、最終ＡＡＶ調製物を作成するのに使用され得るＡＡＶ画分であり、そのＡＡＶ画分を精製又は希釈して、ステップ（ｉ）、（ｉｉ）及び／又は（ｉｉｉ）のためのＡＡＶ調製物を形成する。ある実施形態では、ＡＡＶ画分又は調製物中のＡＡＶカプシドの総数を定量化することにより、精製ＡＡＶ画分又は調製物の用量及び／又は効力を測定する。ある実施形態では、その方法は、ＡＡＶ画分又は調製物中の完全：空ＡＡＶカプシドのパーセンテージ又は比を評価又は確認することを含む。ある実施形態では、その方法は、ｑＰＣＲにより濃度、用量及び／又は効力を測定するステップを含まない。
【００１９】
ある態様では、本発明の方法は、ＡＡＶ調製物をそれを必要とする対象に特定用量で投与することを伴い、（ｉ）精製ＡＡＶ調製物を得るステップ；（ｉｉ）ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、精製ＡＡＶ調製物中のＡＡＶカプシドの濃度を測定するステップ；（ｉｉｉ）特定用量のＡＡＶ調製物を対象に投与するステップを含む。ある実施形態では、ステップ（ｉ）及び（ｉｉ）におけるＡＡＶ調製物は、最終ＡＡＶ調製物を作成するのに使用され得るＡＡＶ画分であり、そのＡＡＶ画分を精製又は希釈して、ステップ（ｉ）、（ｉｉ）及び／又は（ｉｉｉ）のためのＡＡＶ調製物を形成する。ある実施形態では、ＡＡＶ画分又は調製物中のＡＡＶカプシドの総数を定量化することにより、精製ＡＡＶ画分又は調製物の用量を測定する。ある実施形態では、その方法は、ＡＡＶ画分又は調製物中の完全：空ＡＡＶカプシドのパーセンテージ又は比を評価又は確認することを含む。ある実施形態では、その方法は、ｑＰＣＲにより濃度、用量及び／又は効力を測定するステップを含まない。
【００２０】
ある実施形態では、ＥＬＩＳＡアッセイは、サンドイッチＥＬＩＳＡ、直接ＥＬＩＳＡ、間接ＥＬＩＳＡ、又は競合ＥＬＩＳＡアッセイであってよい。ある実施形態では、本明細書に開示の方法に関して、ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡアッセイは、ＡＡＶ抗原に特異的なサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイである。ある実施形態では、ＡＡＶ抗原は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、又はキメラＡＡＶ抗原である。ある実施形態では、ＡＡＶ抗原はＡＡＶ８抗原である。ある実施形態では、ＡＡＶ抗原は、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）に由来する。ある実施形態では、ＡＡＶ抗原は、遺伝子操作ＡＡＶ、又は化学修飾ＡＡＶ、又はその両方に由来する。
【００２１】
ある実施形態では、ＥＬＩＳＡは、抗原のＡＡＶエピトープに特異的な抗体を含む。ある実施形態では、ＡＡＶエピトープは、会合したＡＡＶカプシドに存在する立体構造エピトープである。ある実施形態では、ＡＡＶエピトープは、会合したＡＡＶカプシドに存在する線状エピトープである。そのようなエピトープの例として、限定はされないが、カプシドビリオンタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３が挙げられる。ある実施形態では、ＡＡＶはカプシドの表面上に追加のビリオンタンパク質を発現するように遺伝子操作され、そのような改変タンパク質をＥＬＩＳＡアッセイで使用／検出することができる。ある実施形態では、ＡＡＶはビリオンタンパク質のバリアントを発現するように化学修飾され、そのバリアントをＥＬＩＳＡアッセイにおいて使用／検出することができる（例えば、ＶＰ１’、ＶＰ２’、ＶＰ３’、など）。ある実施形態では、抗体は、血清型特異的カプシドビリオンタンパク質を同定する。
【００２２】
ある実施形態では、本明細書に開示の方法に関して、ＡＡＶ画分又は調製物中の完全：空ＡＡＶカプシドのパーセンテージ又は比を評価又は確認する方法は、ＣｒｙｏＴＥＭ、ネガティブ染色ＴＥＭ、キャピラリー電気泳動、分析用超遠心法、又はそれらの組合せであってよい。ある実施形態では、ＡＡＶ画分又は調製物中の完全対空（完全：空）ＡＡＶカプシドのパーセンテージ又は比を評価又は確認する方法はＣｒｙｏＴＥＭである。ある実施形態では、評価することは、完全：空ＡＡＶカプシドのパーセンテージ又は比を定量化することを含む。
【００２３】
ある実施形態では、ＣｒｙｏＴＥＭステップは、（ｉ）不活性支持体中の基材にＡＡＶ画分又は調製物を包埋する；（ｉｉ）包埋ＡＡＶ画分又は調製物を瞬間凍結する；（ｉｉｉ）低温透過型電子顕微鏡法を用いて包埋ＡＡＶ画分又は調製物を画像化する；及び（ｉｖ）ＡＡＶ画分又は調製物中の完全ＡＡＶカプシド対空ＡＡＶカプシドのパーセンテージを定量化することを含む。ある実施形態では、基材は、非結晶性の非晶質氷(amorphous, non-crystalline ice)である。ある実施形態では、ＡＡＶ画分又は調製物は細胞破片を含まない。例えば、ベクター試料は、＞２％の不確定粒子を含まず、＞２％の破損又はオリゴマー化粒子を含まない。
【００２４】
ＣｒｙｏＴＥＭは、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）とは異なり、完全：空カプシドの直接測定をもたらすため、ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡアッセイと組み合わせてＣｒｙｏＴＥＭを使用することは、当業界で知られている方法よりも有利である。
【００２５】
ある実施形態では、本明細書に開示の方法に関して、ＥＬＩＳＡアッセイを、完全：空ＡＡＶカプシドの定量化の前に実施する。ある実施形態では、ＥＬＩＳＡアッセイを、ＣｒｙｏＴＥＭの前に実施する。ある実施形態では、総ＡＡＶカプシド数を有効範囲（例えば、本明細書に開示されているｃｐ／ｍｌ範囲）に希釈するためにＥＬＩＳＡアッセイを実施する。ある実施形態では、ＥＬＩＳＡアッセイを、完全：空ＡＡＶカプシドの定量化の後に実施するある実施形態では、ＥＬＩＳＡアッセイをＣｒｙｏＴＥＭの後に実施する。ある実施形態では、完全ＡＡＶカプシド数の合計を有効範囲に希釈するためにＥＬＩＳＡアッセイを実施する。ある実施形態では、完全：空の定量化を１回のみ実施する。例えば、ＣｒｙｏＴＥＭステップを１回用いて、そのバッチが以前のバッチの空：完全比と一致する空：完全比を有することを試験することができる。
【００２６】
ある実施形態では、本明細書に開示の方法に関して、ＥＬＩＳＡ及びＣｒｙｏＴＥＭの両方の使用は、ベクターＤＮＡに関係なくすべてのＡＡＶ血清型に適用できる方法をもたらす。このことは、そのアッセイがすべてのプラットフォームを超えて実施されることを可能にするため有利である。
【００２７】
ある実施形態では、本明細書に開示の方法、画分又は調製物に関して、空カプシドと比較した、ＡＡＶ画分又は調製物中の完全ＡＡＶカプシドのパーセンテージは、約４０％〜約１００％である。ある実施形態では、完全ＡＡＶカプシドのパーセンテージは、約４０％〜約９５％、約４０％〜約９０％、約４０％〜約８５％、約４０％〜約８０％、約４５％〜約７５％、約５０％〜約７０％、又は約５５％〜約６５％である。ある実施形態では、少なくとも約６０％のＡＡＶカプシドが完全ＡＡＶカプシドである。ある実施形態では、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約１００％のＡＡＶカプシドが完全ＡＡＶカプシドである。ある実施形態では、本明細書に開示の方法を用いて、ＡＡＶ画分又は調製物のバッチ間で一貫した量の完全カプシドを有するＡＡＶ画分又は調製物を作成する。
【００２８】
ある実施形態では、本明細書に開示の方法及び調製物に関して、ＡＡＶ調製物の濃度は約１ｘ１０１０ｃｐ／ｍｌ〜約１ｘ１０２０ｃｐ／ｍｌの間である。ある実施形態では、本明細書に開示の方法及び調製物に関して、ＡＡＶ調製物の濃度は、約１ｘ１０１１ｃｐ／ｍｌ〜約１ｘ１０１９ｃｐ／ｍｌ、約１ｘ１０１２ｃｐ／ｍｌ〜約１ｘ１０１８ｃｐ／ｍｌ、約１ｘ１０１３ｃｐ／ｍｌ〜約１ｘ１０１７ｃｐ／ｍｌ、又は約１ｘ１０１４ｃｐ／ｍｌ〜約１ｘ１０１６ｃｐ／ｍｌの間である。ある実施形態では、本明細書に開示の方法及び調製物に関して、ＡＡＶ調製物の濃度は、約１ｘ１０１２ｃｐ／ｍｌ〜約１ｘ１０１５ｃｐ／ｍｌ、約１ｘ１０１３ｃｐ／ｍｌ〜約１ｘ１０１５ｃｐ／ｍｌ、又は約１ｘ１０１２ｃｐ／ｍｌ〜約１ｘ１０１３ｃｐ／ｍｌの間である。ある実施形態では、本明細書に開示の方法及び調製物に関して、ＡＡＶ調製物の濃度は、約１ｘ１０１４ｃｐ／ｍｌ〜約５ｘ１０１４ｃｐ／ｍｌ、約２ｘ１０１４ｃｐ／ｍｌ〜約３ｘ１０１４ｃｐ／ｍｌ、又は約３．５ｘ１０１４ｃｐ／ｍｌ〜約５ｘ１０１５ｃｐ／ｍｌの間である。ある実施形態では、ｃｐ／ｍｌは、全カプシド／ｍｌ、又は完全カプシド／ｍｌであり得る。ある実施形態では、ｃｐ／ｍｌは全カプシド／ｍｌである。
【００２９】
ある実施形態では、本明細書に開示の方法及び調製物に関して、ＡＡＶ調製物の用量は、約１ｘ１０５ｃｐ／ｋｇ〜約１ｘ１０２５ｃｐ／ｋｇの間である。ある実施形態では、本明細書に開示の方法、画分、又は調製物に関して、ＡＡＶ画分又は調製物の用量は、約１ｘ１０１０ｃｐ／ｋｇ〜約１ｘ１０２０ｃｐ／ｋｇの間である。ある実施形態では、本明細書に開示の方法、画分、又は調製物に関して、ＡＡＶ画分又は調製物の用量は、約１ｘ１０１０ｃｐ／ｋｇ〜約１ｘ１０１６ｃｐ／ｋｇの間である。ある実施形態では、ｃｐ／ｋｇは、全カプシド／ｋｇ対象、又は完全カプシド／ｋｇ対象であり得る。ある実施形態では、ｃｐ／ｋｇは、全カプシド／ｋｇ対象である。
【００３０】
ある実施形態では、本明細書に開示のすべての方法に関して、対象は、ヒト又は非ヒト動物（例えば、チンパンジー、並びに他の類人猿及びサル種；ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ及びウマなどの家畜；イヌ及びネコなどの飼育哺乳動物；マウス、ラット及びモルモットなどの齧歯動物を含む実験動物；ニワトリ、シチメンチョウ及び他のキジ科鳥類、カモ、又はガチョウなどの、飼育鳥、野鳥及び狩猟鳥を含む鳥類）である。ある実施形態では、対象はヒトである。
【００３１】
ある実施形態では、本明細書に開示のすべての方法に関して、ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、又はキメラＡＡＶベクターである。ある実施形態では、ＡＡＶはＡＡＶ８である。ある実施形態では、ＡＡＶはＡＡＶ９である。ある実施形態では、ＡＡＶは組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）である。ある実施形態では、ＡＡＶは、遺伝子操作されている、化学修飾されている、又はその両方である。
【００３２】
ある態様では、本発明は、画分又は調製物の濃度、用量及び／又は効力がＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡアッセイによって測定されたＡＡＶ画分又は調製物を含む。ある態様では、本発明は、画分又は調製物の濃度、用量及び／又は効力が、ＡＡＶ画分又は調製物中の完全対空ＡＡＶカプシドのパーセンテージ又は比を測定するアッセイと組み合わせてＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡアッセイによって測定されたＡＡＶ画分又は調製物を含む。ある態様では、本発明は、画分又は調製物の濃度、用量及び／又は効力が、ＣｒｙｏＴＥＭと組み合わせてＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡアッセイによって測定されたＡＡＶ画分又は調製物を含む。ある実施形態では、ＡＡＶ調製物の濃度、用量及び／又は効力はｑＰＣＲによって測定されない。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】それぞれ抗原ＥＬＩＳＡ又はｑＰＣＲを用いてＡＡＶベクター数及びベクターゲノム含量を測定した際のパーセント誤差を比較するグラフ。ＡＡＶ  ＥＬＩＳＡ（ＱＣ（「品質管理」）：ｎ＝６０；ＡＡＶ  ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ（「研究開発」））：ｎ＝８３；ＩＴＲ−ｑＰＣＲ（Ｒ＆Ｄ）：ｎ＝６４；ＦＩＸ−ｑＰＣＲ（ＱＣ）：ｎ＝４０；ＦＩＸ−ｑＰＣＲ（Ｒ＆Ｄ）：ｎ＝１３５。
【図２】抗原ＥＬＩＳＡ及びｑＰＣＲがアガロースゲルにロードされるＡＡＶカプシドの用量（２．０ｘ１０１０カプシド／レーン）を見積もる能力を調べるアガロースゲル電気泳動研究の結果。
【図３】抗原ＥＬＩＳＡ法を使用して、マウスモデル（ｎ＝７）を用いるｉｎ  ｖｉｖｏ生物効力（biopotency）アッセイで投与されるＡＡＶ調製物の用量を決定することを実証するグラフ。
【図４】ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡとＩＴＲ−ｑＰＣＲとを用いてＡＡＶ８  ＦＶＩＩＩ一本鎖ＤＮＡのバッチ間変動を比較するグラフＡＡＶ８：抗原−中央値：３．０３ｃｐ／ｍｌ±０．６６ｃｐ／ｍｌ。ＩＴＲ−ｑＰＣＲ−中央値：９．１１ｖｇ／ｍｌ±３．０１ｖｇ／ｍｌ。
【図５】図５Ａは、ＡＡＶベクターゲノム（ｖｇ）／ＡＡＶ８抗原ＥＬＩＳＡカプシド粒子（ｃｐ）の比を示すグラフ。図５Ｂは、ＡＡＶ調製物中の「完全」カプシドの高い一貫性を示すグラフ（例えば、すべての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０５９９６７号において検討されているプロセスを参照のこと）。
【図６】図６Ａは、１つの完全ＡＡＶ８カプシド及び１つの空ＡＡＶ８カプシドのＣｒｙｏＴＥＭ画像。図６Ｂは、１つのオリゴマー化ＡＡＶ８カプシド（すなわち、ＡＡＶカプシドは、空でも完全でもよい三量体構造を形成する）のＣｒｙｏＴＥＭ画像。図６Ｃは、１つの破損ＡＡＶ８カプシドのＣｒｙｏＴＥＭ画像。
【図７】ＣｒｙｏＴＥＭを用いたＡＡＶ８画分分析のグラフ。ＣｒｙｏＴＥＭ画像を３８ｋの倍率で取得し、内部密度分析にかけた。各ＡＡＶ粒子の半径方向密度プロファイルのクラスターを作成するための主成分分析は、パッケージングレベルのクラスターを明らかにした：完全（左）、青（右）、不確定（中央）（濃いマークは重なり合うデータ点を示す）；破線の輪：９９％信頼区間。５つの画像を分析、１５６８粒子。
【図８】ＣｒｙｏＴＥＭを使用して完全ＡＡＶ８ベクターカプシドのパーセンテージを測定することを実証するグラフ。
【図９】カプシド粒子当たりのベクターゲノムと完全カプシドの割合（％）との相関性を示すグラフ。
【図１０】第ＩＸ因子ノックアウトマウスモデルでのｉｎ  ｖｉｖｏ効力に対する、完全ＡＡＶ８カプシド粒子のパーセンテージの影響を示すグラフ。１４日後に血漿試料を採取し、ヒト血液凝固第ＩＸ因子の凝固活性を測定した。
【図１１】ｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物効力に対する完全ＡＡＶ８カプシド粒子のパーセンテージの影響を示すグラフ。生物効力を細胞ベースのアッセイで測定し、ｃｐに関連付け、さらに完全粒子％に対してプロットした。
【図１２】バッチ１７００４−１７０１３（表７を参照）に関して、ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡとＩＴＲ−ｑＰＣＲを用いてＡＡＶ８  ＦＶＩＩＩ一本鎖ＤＮＡのバッチ間変動を比較するグラフ。
【図１３】バッチ１７００４−１７０１３（表７を参照）に関して、ＡＡＶ調製物中の「完全」カプシドの高い一貫性を示すグラフ（例えば、すべての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０５９９６７号において検討されているプロセスを参照のこと）。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
添付の図面は単に本開示をさらに明確に説明することを意図したものであり、別途特許請求の範囲に記載されない限り、本開示の範囲に限定をもたらすことを意図していない。
【００３５】
遺伝子治療ベクター調製物の質的及び／又は量的特性を測定する方法を本明細書に提供する。ある実施形態では、遺伝子治療ベクター調製物はＡＡＶ調製物であり、例えば、ＡＡＶ８又はＡＡＶ９である。本明細書に開示のすべての方法は、ＡＡＶ調製物において、又はＡＡＶ調製物を作成するために使用することができる。
【００３６】
遺伝子治療ベクターの使用は、その能力に関する少なくとも２つの生物活性：１）ＤＮＡ配列を細胞に移送する能力；及び２）発現される遺伝子配列の生物学的効果；に依存する。これら活性を達成するために、適切な濃度又は用量のゲノム配列含有ＡＡＶカプシドが必要である。これは、「空」カプシドが導入遺伝子産物に関連する治療的利益をもたらすことができないためである。従って、ＡＡＶ調製物の濃度又は用量を正確に測定して、適切な及び／又は一貫した数の完全ＡＡＶベクター粒子が送達されることを確実にすることが重要である。これは、組換えタンパク質に関して、ロット／投与量間の適切な変動係数は≦１０％〜２０％であり、≦１０％がより理想的であるため、特にそうである。用量の適切な決定はＡＡＶ調製物の効力を確認するために重要である。これは、効力が段階的又は量子的な用量反応曲線によって決定されるためである。用量が不正確な場合、その不正確さは測定される効力に移行する。不正確な効力は、患者集団の治療不足又は過剰治療につながり得る。
【００３７】
本明細書で用いる場合、用語「カプシド」、「カプシド粒子」、及び「粒子」は互換的に用いられ、少なくとも１つの無傷のＡＡＶカプシドの殻で構成されるＡＡＶ粒子を意味する。
【００３８】
明細書で用いられる場合、ＡＡＶ又はＡＡＶカプシドに関して、用語「空」は、完全な（すなわち全ての）ベクターゲノムを欠くものを意味する。空ＡＡＶ又は空ＡＡＶカプシド又は空ＡＡＶ粒子は、治療的利益をもたらすことはできない。本明細書で用いられる場合、ＡＡＶ又はＡＡＶカプシド又はＡＡＶ粒子に関して、用語「完全(full)ＡＡＶカプシド」は、完全なベクターゲノムの大部分（過半）を含むものを意味する。完全ＡＡＶカプシドは、レシピエントの患者に治療的利益をもたらすことができる。ある実施形態では、「完全」は、「不完全なベクターＤＮＡ」又は「切断されたベクターＤＮＡ」を含んでいてもよい。ある実施形態では、完全なベクターＤＮＡと不完全な及び／又は切断されたベクターＤＮＡを、追加の分析法を用いて識別することができる。そのような方法として、限定はされないが、キャピラリー電気泳動によるＤＮＡサイジング、ＡＵＣ（分析用超遠心法）、％アガロースＤＮＡ（ネイティブ又はアルカリ）、ゲル、サザンブロット、ドットブロットハイブリダイゼーション、ＵＶ分光測光法、弱陰イオン交換クロマトグラフィ、及び質量分析が挙げられる（すべての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる、ResolvingAdeno-Associated Viral Particle Diversity with Charge Detection Mass Spectrometry Elizabeth E. Piersonet.al Anal. Chem., 2016, 88 (13), pp 6718-6725を参照）。
【００３９】
２０１１年１月に公開されたＦＤＡガイドライン（Ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ：  Ｐｏｔｅｎｃｙ  Ｔｅｓｔｓ  ｆｏｒ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）によると、１）ｉｎ  ｖｉｖｏ生物学的アッセイ；２）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ非生物学的アッセイ；及び３）複数の試験などの、効力を測定する３つの手法がある。しかしながら、生物学的アッセイは、投薬、アッセイ、及び読み出しの変動のせいで大きな変動（バラツキ）につながる。非生物学的アッセイも問題を有する。例えば、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）は、目的遺伝子を測定するのみである。従って、ｑＰＣＲの使用は、用量計算において、オリゴマー化された、破損した、及び／又は１コピーより多くのＤＮＡを含むものなど、作動不能なカプシドを含めるため、最終ＡＡＶ調製物の効力の不正確な決定につながり得る。作動不能なカプシドは、細胞を有効に形質導入しないであろう。さらには、ｑＰＣＲは、効力の不正確な決定につながり得るその固有の高いアッセイ内及びアッセイ間の変動性（すなわち、０．５ｌｏｇステップまでの高い変動性）のせいでも制限される。濃度、用量及び／又は効力が正確に決定されなければ、患者は、バッチ間及び／又は治療間で大きく変動する用量を受けることとなり得る。用量又は効力を過大に見積もると、疾病及び／又は疾患の不適切な治療につながり得る。用量又は効力を過小に見積もると、副作用（例えば、過量修正（例えば、血栓）、又は体内での大量のカプシド粒子により引き起こされる免疫応答）につながり得る。
【００４０】
ある実施形態では、本発明は、ＡＡＶ調製物中のＡＡＶカプシドの総数を定量化することを含む、ＡＡＶ調製物の濃度、用量及び／又は効力を定量化する方法を提供する。ある実施形態では、その方法は、ａ）ＡＡＶカプシドの総数を定量化するステップ、及び任意選択で、ｂ）ＡＡＶ調製物中の完全対空（完全：空）ＡＡＶカプシドのパーセンテージ又は比を評価及び／又は確認するステップを含む。
【００４１】
ある実施形態では、定量化ステップは、ＥＬＩＳＡ、ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）、示差走査蛍光光度法、免疫学的定量法、又はそれらの組合せによりＡＡＶカプシドの総数を決定することを含む。ある実施形態では、定量化ステップは、ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡによりＡＡＶカプシドの総数を決定することを含む。ある実施形態では、ＥＬＩＳＡアッセイは、サンドイッチＥＬＩＳＡ、直接ＥＬＩＳＡ、間接ＥＬＩＳＡ、又は競合ＥＬＩＳＡアッセイであってよい。ある実施形態では、本明細書に開示の方法に関して、ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡアッセイは、ＡＡＶ抗原に特異的なサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイである。
【００４２】
ある実施形態では、ＡＡＶ画分又は調製物中の完全対空（完全：空）ＡＡＶカプシドのパーセンテージ又は比を評価又は確認する方法は、低温透過型電子顕微鏡法（ＣｒｙｏＴＥＭ）、ネガティブ染色ＴＥＭ、完全及び空カプシドのクロマトグラフィによる分離（ＳＥＣ、ＩＥＸ、ＨＩＣ、など）、キャピラリー電気泳動、分析用超遠心法、又はそれらの組合せであってよい。ある実施形態では、ＡＡＶ画分又は調製物中の完全対空（完全：空）ＡＡＶカプシドのパーセンテージ又は比を評価又は確認する方法はＣｒｙｏＴＥＭであってよい。ある実施形態では、その方法は、ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡ及びＣｒｙｏＴＥＭの両方を含む。
【００４３】
本明細書に開示の方法は、この狭い変動の範囲内で効力を正確に測定する。ある実施形態では、開示の方法は、約３０％〜約１％、約２７％〜約２％、約２５％〜約５％、約２２％〜約７％、約２０％〜約１０％、又は約１７％〜約１２％の間の変動係数をもたらす。ある実施形態では、開示の方法は、≦約３０％、≦約２９％、≦約２８％、≦約２７％、≦約２６％、≦約２５％、≦約２４％、≦約２３％、≦約２２％、≦約２１％、≦約２０％、≦約１９％、≦約１８％、≦約１７％、≦約１６％、≦約１５％、≦約１４％、≦約１３％、≦約１２％、≦約１１％、≦約１０％、≦約９％、≦約８％、≦約７％、≦約６％、≦約５％、≦約４％、≦約３％、≦約２％、≦１％であるが、すべての場合において≧０である変動係数をもたらす。
【００４４】
ある実施形態では、ＥＬＩＳＡを含む本明細書に開示の方法は、ｑＰＣＲを用いる方法と比較して、濃度、用量及び／又は効力の変動が約１０％〜約８０％少ないＡＡＶ調製物をもたらす。ある実施形態では、ＥＬＩＳＡを含む本明細書に開示の方法は、ｑＰＣＲを用いる方法と比較して、濃度、用量及び／又は効力の変動が約１０％〜約７５％、約１０％〜約７０％、約１０％〜約６５％、約１５％〜約６０％、約１５％〜約５５％、約２０％〜約５０％、約２０％〜約４８％、約２０％〜約４６％、約２０％〜約４４％、約２０％〜約４２％、約２０％〜約４０％、約２０％〜約３８％、約２０％〜約３６％、約２０％〜約３４％、又は約２０％〜約３２％少ないＡＡＶ調製物をもたらす。ある実施形態では、ＥＬＩＳＡを含む本明細書に開示の方法は、ｑＰＣＲを用いる方法と比較して、濃度、用量及び／又は効力の変動が約２０％〜約３３％少ないＡＡＶ調製物をもたらす。ある実施形態では、ＥＬＩＳＡを含む本明細書に開示の方法は、ｑＰＣＲを用いる方法と比較して、濃度、用量及び／又は効力の変動が少なくとも約１０％、少なくとも約１１％、少なくとも約１２％、少なくとも約１３％、少なくとも約１４％、少なくとも約１５％、少なくとも約１６％、少なくとも約１７％、少なくとも約１８％、少なくとも約１９％、少なくとも約２０％、少なくとも約２１％、少なくとも約２２％、少なくとも約２３％、少なくとも約２４％、少なくとも約２５％、少なくとも約２６％、少なくとも約２７％、少なくとも約２８％、少なくとも約２９％、少なくとも約３０％、少なくとも約３１％、少なくとも約３２％、少なくとも約３３％、少なくとも約３４％、少なくとも約３５％、少なくとも約３６％、少なくとも約３７％、少なくとも約３８％、少なくとも約３９％、少なくとも約４０％、少なくとも約４１％、少なくとも約４２％、少なくとも約４３％、少なくとも約４４％、少なくとも約４５％、少なくとも約４６％、少なくとも約４７％、少なくとも約４８％、少なくとも約４９％、又は少なくとも約５０％少ないＡＡＶ調製物をもたらす。
【００４５】
ある実施形態では、その方法は、ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡによりＡＡＶ調製物を試験することを含む。ある実施形態では、ＡＡＶ調製物中のカプシドの大部分（過半）は完全カプシドであるため、ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡは、ＡＡＶ調製物の用量又は効力の代理の読み出しを提供するのに十分である。例えば、完全ＡＡＶカプシドのパーセンテージは過半数の約５０％〜約１００％である。ある実施形態では、完全ＡＡＶカプシドのパーセンテージは、約５０％〜約９５％、約５０％〜約９０％、約５０％〜約８５％、約５０％〜約８０％、約５５％〜約５０％、約６０％〜約８０％、又は約６５％〜約７５％である。ある実施形態では、ＡＡＶカプシドの少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約１００％が完全ＡＡＶカプシドである。ある実施形態では、ＡＡＶカプシドの少なくとも約６０％が完全ＡＡＶカプシドである。ある実施形態では、バッチ間でＡＡＶ調製物中の完全対空カプシドの比が一貫しているため、ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡは、ＡＡＶ調製物の効力の代理の読み出しを提供するのに十分である。ある実施形態では、一貫しているとは、約０％〜約１５％、約２％〜約１２％、約５％〜約１０％、約７％〜約９％の変動係数（ＣＶ）を意味する。ある実施形態では、一貫しているとは、約１５％以下、約１２％以下、約１０％以下、約９％以下、約８％以下、約７％以下、約６％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、又は約１％以下のＣＶを意味する。ある実施形態では、一貫しているとは、約１％以下のＣＶを意味する。ある実施形態では、ＣｒｙｏＴＥＭと組み合わせたＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡが、ＡＡＶ調製物の効力を試験するのに必要である。
【００４６】
ある実施形態では、方法は、ＣｒｙｏＴＥＭによりＡＡＶ画分又は調製物を試験することを含む。ある実施形態では、ＣｒｙｏＴＥＭは、ＡＡＶ調製物の効力の代理の読み出しを提供するのに十分である。ある実施形態では、ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡと組み合わせたＣｒｙｏＴＥＭがＡＡＶ調製物の効力を試験するのに必要である。
【００４７】
ある実施形態では、本開示の方法により生成及び／又は測定されたＡＡＶ調製物は、対象に投与するのに適している。適用可能なＡＡＶベクターを下記においてさらに詳細に説明する。ある実施形態では、本開示の方法により生成されるＡＡＶ調製物は、無菌及び／又は適正製造基準（ＧＭＰ）グレードである。ある実施形態では、本開示の方法により生成されるＡＡＶ生成物は、遺伝子治療用医薬品に関して米国薬局方Ｃｈａｐｔｅｒ  １０４６又は欧州薬局方に記載されている、或いはアメリカ食品医薬品局（ＵＳＦＤＡ）又は欧州医薬品庁（ＥＭＡ）により定められている要件に適合する。
【００４８】
本明細書で用いる場合、その方法はＡＡＶ画分及び／又はＡＡＶ調製物で用いることができる。用語「調製物」及び「画分」は本出願で互換的に用いてよい。ある実施形態では、用語「画分」は、対象に投与されるであろう最終ＡＡＶ「調製物」を作成するのに用いることができるＡＡＶ試料又はバッチを意味し得る。例えば、ＡＡＶ画分は、最終ＡＡＶ調製物を形成する前に、追加の処理、精製又は体積調節を受けてよい。
【００４９】
定量的及び／又は定性的方法
本開示の方法は、例えば、投与用の調製物を作成するための最終ステップを含めて精製プロセスの１又は２以上のステップの後（例えば、各ステップの後）に得られるＡＡＶ画分又は調製物の濃度、用量及び／又は効力を測定するステップなど、１又は２以上の品質管理ステップを含む。
【００５０】
本開示の方法は、ＡＡＶカプシドの数を定量化するために、ＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ抗原）に特異的なＥＬＩＳＡアッセイを含んでいてよい。ある実施形態では、ＥＬＩＳＡアッセイとして、限定はされないが、免疫吸着アッセイ、直接ＥＬＩＳＡ、間接ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ、及び／又は競合ＥＬＩＳＡが挙げられる。ある実施形態では、ＥＬＩＳＡはサンドイッチＥＬＩＳＡである。ＥＬＩＳＡアッセイの非限定的な例を実施例１に示す。
【００５１】
ある実施形態では、ＡＡＶ抗原は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、又はキメラＡＡＶ抗原である。ある実施形態では、ＡＡＶ抗原はＡＡＶ８抗原である。ある実施形態では、ＡＡＶ抗原は組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）に由来する。ある実施形態では、ＡＡＶ抗原は、遺伝子操作ＡＡＶ、又は化学修飾ＡＡＶ、又はその両方に由来する。
【００５２】
ある実施形態では、ＥＬＩＳＡは、ＡＡＶエピトープに特異的な抗体を含む。ある実施形態では、ＡＡＶエピトープは、会合したＡＡＶカプシドに存在する立体構造エピトープである。ある実施形態では、ＡＡＶエピトープは、会合したＡＡＶカプシドに存在する線状エピトープである。そのようなエピトープの例として、限定はされないが、カプシドビリオンタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３が挙げられる。ある実施形態では、ＡＡＶはカプシドの表面上に追加のビリオンタンパク質を発現するように遺伝子操作され、そのような改変タンパク質をＥＬＩＳＡアッセイで使用／検出することができる。ある実施形態では、ＡＡＶはビリオンタンパク質のバリアントを発現するように化学修飾され、そのようなバリアントをＥＬＩＳＡアッセイにおいて使用／検出することができる（例えば、ＶＰ１’、ＶＰ２’、ＶＰ３’、など）。ある実施形態では、抗体は、血清型特異的カプシドビリオンタンパク質を同定する。
【００５３】
ＥＬＩＳＡは、ＡＡＶ画分又は調製物の用量及び／又は効力を決定するための手法としてｑＰＣＲに取って代わることができる。図１に示すように、本発明のＥＬＩＳＡ技術は、ｑＰＣＲ法よりも有意に少ない変動を有する。ある実施形態では、本開示の方法は、ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡによりＡＡＶ画分又は調製物を評価することを含む。ある実施形態では、本明細書に開示の方法のすべてがｑＰＣＲステップを含まない。
【００５４】
ある実施形態では、本開示の方法は、超遠心分離の後に得られるＡＡＶ画分又は調製物をＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡにより試験して、ＡＡＶ画分又は調製物中のＡＡＶカプシドの数を決定することを含む。ある実施形態では、本開示の方法は、デプスろ過の後に得られるＡＡＶ画分又は調製物をＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡにより試験して、ＡＡＶ画分又は調製物中のＡＡＶカプシドの数を決定することを含む。ある実施形態では、本開示の方法は、限外ろ過／ダイアフィルトレーションシステムを用いてＡＡＶ画分又は調製物を濃縮した後に得られるＡＡＶ画分又は調製物をＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡにより試験して、ＡＡＶ画分又は調製物中のＡＡＶカプシドの数を決定することを含む。ある実施形態では、本開示の方法は、タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）ステップの後に得られるＡＡＶ画分又は調製物をＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡにより試験して、ＡＡＶ画分又は調製物中のＡＡＶカプシドの数を決定することを含む。ある実施形態では、本開示の方法は、ネガティブ陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィの後に得られるＡＡＶ画分又は調製物をＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡにより試験して、ＡＡＶ画分又は調製物中のＡＡＶカプシドの数を決定することを含む。ある実施形態では、本開示の方法は、ポリッシングステップの後に得られるＡＡＶ画分又は調製物をＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡにより試験して、ＡＡＶ画分又は調製物中のＡＡＶカプシドの数を決定することを含む。ある実施形態では、本開示の方法は、精製ＡＡＶ調製物をＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡにより試験して、ＡＡＶ調製物中のＡＡＶカプシドの数を決定することを含む。
【００５５】
ＡＡＶカプシドの数を定量化するための追加の方法として、限定はされないが、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ，ＯＣＴＥＴ）、示差走査蛍光光度法（例えば、Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ  ＮＴ４８，Ｎａｎｏｔｅｍｐｅｒ）、磁気的免疫検査法（ＭＩＡ）、及びクローン化酵素ドナーイムノアッセイ（cloned enzyme donor immunoassay）（ＣＥＤＩＡ）が挙げられる。これらの方法をＥＬＩＳＡ定量化アッセイに加えて又は代えて使用してよい。
【００５６】
ある実施形態では、本開示の方法は、完全対空ＡＡＶカプシド（例えば、完全対空ＡＡＶカプシドのパーセンテージ又は比）を測定することを含む。ＡＡＶ画分又は調製物中の完全：空ＡＡＶカプシドのパーセンテージ又は比を評価又は確認する方法として、限定はされないが、低温透過型電子顕微鏡法（ＣｒｙｏＴＥＭ）、ネガティブ染色ＴＥＭ、キャピラリー電気泳動、分析用超遠心法、又はそれらの組合せが挙げられる。
【００５７】
ある実施形態では、完全対空ＡＡＶカプシドを測定する方法はＣｒｙｏＴＥＭである（図６を参照）。ある実施形態では、その方法は、上記のようにＣｒｙｏＴＥＭ及びＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡの両方の使用を伴う。ある実施形態では、ＥＬＩＳＡはサンドイッチＥＬＩＳＡである。ある実施形態では、サンドイッチＥＬＩＳＡは、ＡＡＶエピトープに特異的な抗体を含む。ある実施形態では、ＡＡＶエピトープは、会合したＡＡＶカプシドに存在する立体構造エピトープである。ＣｒｙｏＴＥＭにより完全対空カプシドの量を測定する非限定的方法を実施例２として本明細書に記載する。
【００５８】
ＣｒｙｏＴＥＭを使用することの１つの利点は、ネガティブ染色の必要がないことである。ＣｒｙｏＴＥＭは、完全ＡＡＶカプシドの量を定量化する能力ももたらす。ある実施形態では、ＣｒｙｏＴＥＭの使用は、擬陽性シグナルのせいで完全ＡＡＶカプシドの量を過大評価しない。
【００５９】
本開示の方法は、完全対空ＡＡＶカプシドの数又はパーセンテージを評価する方法を含む。ある実施形態では、その方法はＣｒｙｏＴＥＭを含む。ある実施形態では、その方法は：（ｉ）不活性支持体中の基材にＡＡＶ画分又は調製物を包埋する；（ｉｉ）包埋ＡＡＶ画分又は調製物を瞬間凍結する；（ｉｉｉ）低温透過型電子顕微鏡法を用いて包埋ＡＡＶ画分又は調製物を画像化する；及び（ｉｖ）完全ＡＡＶカプシド対空ＡＡＶカプシドのパーセンテージを定量化することを含む。
【００６０】
ステップ（ｉ）に関して、その方法で使用するのに適した基材の例として、限定はされないが、非結晶性の非晶質氷が挙げられる。その方法で使用するのに適した不活性支持体の例として、限定はされないが、カーボン膜、熱可塑性樹脂、及びポリビニルホルマール（例えば、ポリ酢酸ビニルとのコポリマーとしてポリビニルアルコール及びホルムアルデヒドから形成されたポリマー、例えば、限定はされないが、フォルムバル（Ｆｏｒｍｖａｒ）又はビニレック（Ｖｉｎｙｌｅｃ）など、カーボンで安定化させたポリビニルホルマール、ポリビニルホルマール上の一酸化ケイ素、純粋なカーボン膜、カーボンタイプＡ：カーボン支持膜（例えば、グリッドの反対側の取り外し可能なポリビニルホルマール）、カーボンタイプＢ：ポリビニルホルマール膜（例えば、重いカーボン層でコーティングした）、及びカーボンタイプＡ上の一酸化ケイ素）が挙げられる。ある実施形態では、上記のステップ（ｉ）は、温度（例えば、（−１９６℃）又はそれより低い温度）及び湿度を制御した環境下で薄いカーボン支持膜上に試料を堆積することを含む。ある実施形態では、湿度レベルは相対湿度であってよい。ステップ（ｉｉ）に関して、試料は瞬間凍結され得る。ある実施形態では、瞬間凍結は、液体エタン、液体窒素、液体プロパン、又は液体窒素温度近くのヘリウムの使用を伴っていてよい。例えば、液体エタン、液体窒素、液体プロパン、又はヘリウムの容器は液体窒素により囲まれている。
【００６１】
ある実施形態では、ＡＡＶ画分又は調製物を、氷晶が形成できないように急速に（例えば、１０４〜１０６Ｋ／秒で）凍結させる。ある実施形態では、液体の水を急速に冷却する、或いは普通の氷を低温で圧縮することのいずれかにより、非晶質氷を製造する。ある実施形態では、過剰のＡＡＶ画分又は調製物を除去して一部の検体を付着したまま残した後、グリッドを液体エタン中にガラス化し、次いで液体窒素中で保管する。ＣｒｙｏＴＥＭを実施するための追加のステップの議論に関して、参照によりあらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれるCabra and Samso, J. Visualized Experiments, (2015) 95(e52311):1-11を参照のこと。
【００６２】
ＡＡＶ粒子のＣｒｙｏＴＥＭ分析を利用して、全体的な検体の形態、すなわち、様々なＡＡＶの形態の存在（一般的に、球状及び変形ＡＡＶ粒子、サブユニット構造、及び大きな構造的にあまり規定されない形態を含む）を評価することができる。図６Ａは、どのように「完全」対「空」ＡＡＶ粒子を可視的に識別することができるかの例を提供する。例えば、完全カプシドは、殻とコアとの間に明確な境界のない内部密度を示す。明確な外殻及び微小な内部密度を示すＡＡＶカプシドは空カプシドとして分類される。
【００６３】
ＣｒｙｏＴＥＭを用いて不確定なカプシドを評価することもできる。図６Ｂ及び６Ｃは、完全カプシドとして含まれない変形／不確定カプシドの例を提供する。例えば、ＣｒｙｏＴＥＭを用いて、「完全」、「空」、及び「不確定」カプシドを計測することができる。
【００６４】
また、ＣｒｙｏＴＥＭを用いて、手動で粒子を分類するか又は自動画像解析手法を用いるかのいずれかによって、粒子のパッケージングのレベルを決定することもできる。
【００６５】
ある実施形態では、本開示の方法は、超遠心分離の後に得られるＡＡＶ画分又は調製物をＣｒｙｏＴＥＭにより試験して、ＡＡＶ画分又は調製物中のＡＡＶカプシドの量及び／又は質を決定することを含む。ある実施形態では、本開示の方法は、デプスろ過の後に得られるＡＡＶ画分又は調製物をＣｒｙｏＴＥＭにより試験して、ＡＡＶ画分又は調製物中のＡＡＶカプシドの量及び／又は質を決定することを含む。ある実施形態では、本開示の方法は、限外ろ過／ダイアフィルトレーションシステムを用いてＡＡＶ画分又は調製物を濃縮した後に得られるＡＡＶ画分又は調製物をＣｒｙｏＴＥＭにより試験して、ＡＡＶ画分又は調製物中のＡＡＶカプシドの量及び／又は質を決定することを含む。ある実施形態では、本開示の方法は、タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）ステップの後に得られるＡＡＶ画分又は調製物をＣｒｙｏＴＥＭにより試験して、ＡＡＶ画分又は調製物中のＡＡＶカプシドの量及び／又は質を決定することを含む。ある実施形態では、本開示の方法は、ネガティブ陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィの後に得られるＡＡＶ画分又は調製物をＣｒｙｏＴＥＭにより試験して、ＡＡＶ画分又は調製物中のＡＡＶカプシドの量及び／又は質を決定することを含む。ある実施形態では、本開示の方法は、ポリッシングステップの後に得られるＡＡＶ画分又は調製物をＣｒｙｏＴＥＭにより試験して、ＡＡＶ画分又は調製物中のＡＡＶカプシドの量及び／又は質を決定することを含む。ある実施形態では、本開示の方法は、精製ＡＡＶ調製物をＣｒｙｏＴＥＭにより試験して、ＡＡＶ画分又は調製物中のＡＡＶカプシドの量及び／又は質を決定することを含む。
【００６６】
ある実施形態では、本開示の方法は、超遠心分離の後に得られるＡＡＶ画分又は調製物をＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡ及びＣｒｙｏＴＥＭにより試験して、ＡＡＶ画分又は調製物中のＡＡＶカプシドの量及び質を決定することを含む。ある実施形態では、本開示の方法は、デプスろ過の後に得られるＡＡＶ画分又は調製物をＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡ及びＣｒｙｏＴＥＭにより試験して、ＡＡＶ画分又は調製物中のＡＡＶカプシドの量及び質を決定することを含む。ある実施形態では、本開示の方法は、限外ろ過／ダイアフィルトレーションシステムを用いてＡＡＶ画分又は調製物を濃縮した後に得られるＡＡＶ画分又は調製物をＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡ及びＣｒｙｏＴＥＭにより試験して、ＡＡＶ画分又は調製物中のＡＡＶカプシドの量及び質を決定することを含む。ある実施形態では、本開示の方法は、タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）ステップの後に得られるＡＡＶ画分又は調製物をＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡ及びＣｒｙｏＴＥＭにより試験して、ＡＡＶ画分又は調製物中のＡＡＶカプシドの量及び質を決定することを含む。ある実施形態では、本開示の方法は、ネガティブ陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィの後に得られるＡＡＶ画分又は調製物をＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡ及びＣｒｙｏＴＥＭにより試験して、ＡＡＶ画分又は調製物中のＡＡＶカプシドの量及び質を決定することを含む。ある実施形態では、本開示の方法は、ポリッシングステップの後に得られるＡＡＶ画分又は調製物をＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡ及びＣｒｙｏＴＥＭにより試験して、ＡＡＶ画分又は調製物中のＡＡＶカプシドの量及び質を決定することを含む。ある実施形態では、本開示の方法は、精製ＡＡＶ調製物をＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡ及びＣｒｙｏＴＥＭにより試験して、ＡＡＶ画分又は調製物中のＡＡＶカプシドの量及び質を決定することを含む。
【００６７】
分析用超遠心法（ＡＵＣ）は、沈降係数によってタンパク質を分離することができる。同一のタンパク質に関して、沈降係数は凝集状態に相関し得る。簡単に説明すると、対応する試料バッファーで試料を希釈し、次いで、石英ウィンドウが中に組み込まれたセルアセンブリに移してロータにロードし、その後ロータを一定速度で回転させる。異なるサイズのタンパク質分子は、異なる沈降速度でセルの底に向かって移動し、それを２８０ｎｍでのＵＶ検出により遠心分離中に連続してモニターする。収集したデータセットはコンピューター解析を可能とし、それは沈降及び拡散プロセスをデコンボリューションし、差別的な沈降係数分布をもたらす。これは、試料の異なる種を分割し、それらのｓ値及び集団を提示する。沈降係数の分布が統合され、相対面積パーセンテージ並びにピーク最大値のＳ値を解析の結果として与える。
【００６８】
ＡＡＶ調製物
本開示の方法により生成されるＡＡＶ調製物を本明細書にさらに提供する。ある実施形態では、ＡＡＶ調製物を生成する方法は、（ｉ）目的遺伝子を含む少なくとも１つのプラスミドで宿主細胞をトランスフェクトするステップ；（ｉｉ）ＡＡＶカプシドを含む細胞培養物の上清又は細胞懸濁液を収集してＡＡＶ画分又は調製物を作成するステップ；（ｉｉｉ）ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡアッセイを用いてＡＡＶ画分又は調製物中のＡＡＶカプシドの総数を定量化するステップ；及び（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）において決定したＡＡＶカプシドの総数に基づき所望の濃度を有するＡＡＶ調製物を調製するステップを含む。ある実施形態では、その方法は、ＡＡＶ画分を濃縮することを含む。ある実施形態では、その方法は、ＡＡＶ画分から空カプシドの少なくとも一部を除去することを含む。ある実施形態では、特定濃度の完全カプシド及び／又は特定の完全カプシド：空カプシド比を有するＡＡＶ画分又は調製物をもたらすためにその量の空カプシドが除去される。ある実施形態では、ＡＡＶ画分又は調製物を適切なバッファーで所望の用量に希釈する。
【００６９】
ある実施形態では、その方法は、ＡＡＶ画分又は調製物中の完全対空（完全：空）ＡＡＶカプシドのパーセンテージ又は比を評価又は確認することを含む。ある実施形態では、その方法は、ＣｒｙｏＴＥＭにより完全対空（完全：空）ＡＡＶカプシドのパーセンテージ又は比を評価又は確認することを含む。ある実施形態では、ｑＰＣＲによって用量及び／又は効力を決定しない。ある実施形態では、完全ＡＡＶカプシドのパーセンテージは約４０％〜約１００％である。ある実施形態では、完全ＡＡＶカプシドのパーセンテージは、約４０％〜約９５％、約４０％〜約９０％、約４０％〜約８５％、約４０％〜約８０％、約４５％〜約７５％、約５０％〜約７０％、又は約５５％〜約６５％である。ある実施形態では、完全ＡＡＶカプシドのパーセンテージは、約６０％〜約８０％の間である。ある実施形態では、少なくとも約６０％のＡＡＶカプシドが完全ＡＡＶカプシドである。ある実施形態では、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約１００％のＡＡＶカプシドが完全ＡＡＶカプシドである。ある実施形態では、本明細書に開示の方法を用いて、ＡＡＶ画分又は調製物間で一貫した量の完全カプシドを有するＡＡＶ画分又は調製物を作成する。
【００７０】
本開示の方法により生成されるＡＡＶ調製物を投与する方法を本明細書にさらに提供する。ある実施形態では、ＡＡＶ調製物をそれを必要とする対象に投与する方法は、（ｉ）精製ＡＡＶ調製物を得るステップ；（ｉｉ）ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、精製ＡＡＶ調製物のＡＡＶカプシドの濃度を測定するステップ；（ｉｉｉ）治療有効量の精製ＡＡＶ調製物を対象に投与するステップを含む。ある実施形態では、ステップ（ｉ）及び（ｉｉ）における調製物は、最終ＡＡＶ調製物を作成するのに使用され得るＡＡＶ画分であり、そのＡＡＶ画分をさらに精製又は希釈してステップ（ｉ）、（ｉｉ）及び／又は（ｉｉｉ）のためのＡＡＶ調製物を形成する。ある実施形態では、精製ＡＡＶ画分又は調製物の濃度、用量及び／又は効力は、ＡＡＶ調製物中のＡＡＶカプシドの総数を定量化することにより測定する。ある実施形態では、その方法は、ＡＡＶ調製物中の完全：空（完全：空）ＡＡＶカプシドのパーセンテージ又は比を評価又は確認することを含む。ある実施形態では、その方法は、ＣｒｙｏＴＥＭにより完全対空（完全：空）ＡＡＶカプシドのパーセンテージ又は比を評価又は確認することを含む。ある実施形態では、ｑＰＣＲによって濃度、用量及び／又は効力を決定しない。ある実施形態では、完全ＡＡＶカプシドのパーセンテージは約４０％〜約１００％である。ある実施形態では、完全ＡＡＶカプシドのパーセンテージは、約４０％〜約９５％、約４０％〜約９０％、約４０％〜約８５％、約４０％〜約８０％、約４５％〜約７５％、約５０％〜約７０％、又は約５５％〜約６５％である。ある実施形態では、完全ＡＡＶカプシドのパーセンテージは、約６０％〜約８０％の間である。ある実施形態では、少なくとも約６０％のＡＡＶカプシドが完全ＡＡＶカプシドである。ある実施形態では、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約１００％のＡＡＶカプシドが完全ＡＡＶカプシドである。
【００７１】
本開示の方法により生成されるＡＡＶ調製物を投与する方法を本明細書にさらに提供する。ある態様では、本発明の方法は、特定用量のＡＡＶ調製物をそれを必要とする対象に投与することを伴い、（ｉ）精製ＡＡＶ調製物を得るステップ；（ｉｉ）ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、精製ＡＡＶ調製物中のＡＡＶカプシドの濃度を測定するステップ；（ｉｉｉ）特定用量のＡＡＶ調製物を対象に投与するステップを含む。ある実施形態では、ステップ（ｉ）及び（ｉｉ）における調製物は、最終ＡＡＶ調製物を作成するのに使用され得るＡＡＶ画分であり、そのＡＡＶ画分をさらに精製又は希釈してステップ（ｉ）、（ｉｉ）及び／又は（ｉｉｉ）のためのＡＡＶ調製物を形成する。ある実施形態では、その方法は、ＡＡＶ調製物中の完全：空（完全：空）ＡＡＶカプシドのパーセンテージ又は比を評価又は確認することを含む。ある実施形態では、その方法は、ＣｒｙｏＴＥＭにより完全対空（完全：空）ＡＡＶカプシドのパーセンテージ又は比を評価又は確認することを含む。ある実施形態では、ｑＰＣＲによって濃度、用量及び／又は効力を決定しない。ある実施形態では、完全ＡＡＶカプシドのパーセンテージは約４０％〜約１００％である。ある実施形態では、完全ＡＡＶカプシドのパーセンテージは、約４０％〜約９５％、約４０％〜約９０％、約４０％〜約８５％、約４０％〜約８０％、約４５％〜約７５％、約５０％〜約７０％、又は約５５％〜約６５％である。ある実施形態では、完全ＡＡＶカプシドのパーセンテージは、約６０％〜約８０％の間である。ある実施形態では、少なくとも約６０％のＡＡＶカプシドが完全ＡＡＶカプシドである。ある実施形態では、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約１００％のＡＡＶカプシドが完全ＡＡＶカプシドである。
【００７２】
ある実施形態では、ＡＡＶ調製物の効力を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏ生物効力アッセイによりさらに実証することができる。例えば、そのステップは、１）（例えばＥＬＩＳＡにより）調製物中のＡＡＶの含量を決定する；２）（例えばＣｒｙｏＴＥＭにより）完全カプシドのパーセンテージを決定する；及び３）（例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物効力アッセイにより）生物活性を確認することを伴っていてよい。
【００７３】
ある実施形態では、本明細書に開示の方法、画分、又は調製物に関して、ＡＡＶ調製物の濃度は、約１ｘ１０１０ｃｐ／ｍｌ〜約１ｘ１０２０ｃｐ／ｍｌの間である。ある実施形態では、本明細書に開示の方法、画分、又は調製物に関して、ＡＡＶ調製物の濃度は、約１ｘ１０１１ｃｐ／ｍｌ〜約１ｘ１０１９ｃｐ／ｍｌ、約１ｘ１０１２ｃｐ／ｍｌ〜約１ｘ１０１８ｃｐ／ｍｌ、約１ｘ１０１３ｃｐ／ｍｌ〜約１ｘ１０１７ｃｐ／ｍｌ、又は約１ｘ１０１４ｃｐ／ｍｌ〜約１ｘ１０１６ｃｐ／ｍｌの間である。ある実施形態では、本明細書に開示の方法及び調製物に関して、ＡＡＶ調製物の濃度は、約１ｘ１０１２ｃｐ／ｍｌ〜約１ｘ１０１５ｃｐ／ｍｌ、約１ｘ１０１３ｃｐ／ｍｌ〜約１ｘ１０１５ｃｐ／ｍｌ、又は約１ｘ１０１２ｃｐ／ｍｌ〜約１ｘ１０１３ｃｐ／ｍｌの間である。ある実施形態では、本明細書に開示の方法及び調製物に関して、ＡＡＶ調製物の濃度は、約１ｘ１０１４ｃｐ／ｍｌ〜約５ｘ１０１４ｃｐ／ｍｌ、約２ｘ１０１４ｃｐ／ｍｌ〜約３ｘ１０１４ｃｐ／ｍｌ、又は約３．５ｘ１０１４ｃｐ／ｍｌ〜約５ｘ１０１５ｃｐ／ｍｌの間である。ある実施形態では、ｃｐ／ｍｌは、全カプシド／ｍｌ、又は完全カプシド／ｍｌであり得る。ある実施形態では、ｃｐ／ｍｌは全カプシド／ｍｌである。
【００７４】
ある実施形態では、ＡＡＶ調製物は、約１０００Ｌの開始材料（例えば、細胞培養物）から生成された少なくとも約１０１２ウイルス粒子（ｖｐ）、又は約１０００Ｌの開始材料（例えば、細胞培養物）から生成された少なくとも約１０１３ウイルス粒子を含む。
【００７５】
ある実施形態では、本明細書に開示の方法及び調製物に関して、ＡＡＶ調製物の用量は、約１ｘ１０５ｃｐ／ｋｇ〜約１ｘ１０２５ｃｐ／ｋｇの間である。ある実施形態では、本明細書に開示の方法及び調製物に関して、ＡＡＶ調製物の用量は、約１ｘ１０６ｃｐ／ｋｇ〜約１ｘ１０２４ｃｐ／ｋｇ、約１ｘ１０７ｃｐ／ｋｇ〜約１ｘ１０２３ｃｐ／ｋｇ、約１ｘ１０８ｃｐ／ｋｇ〜約１ｘ１０２２ｃｐ／ｋｇ、約１ｘ１０９ｃｐ／ｋｇ〜約１ｘ１０２１ｃｐ／ｋｇ、約１ｘ１０１０ｃｐ／ｋｇ〜約１ｘ１０２０ｃｐ／ｋｇ、約１ｘ１０１１ｃｐ／ｋｇ〜約１ｘ１０１９ｃｐ／ｋｇ、約１ｘ１０１２ｃｐ／ｋｇ〜約１ｘ１０１８ｃｐ／ｋｇ、約１ｘ１０１３ｃｐ／ｋｇ〜約１ｘ１０１７ｃｐ／ｋｇ、又は約１ｘ１０１４ｃｐ／ｋｇ〜約１ｘ１０１６ｃｐ／ｋｇの間である。ある実施形態では、本明細書に開示の方法及び調製物に関して、ＡＡＶ調製物の用量は、約１ｘ１０１２ｃｐ／ｋｇ〜約１ｘ１０２０ｃｐ／ｋｇ、約１ｘ１０１３ｃｐ／ｋｇ〜約１ｘ１０１９ｃｐ／ｋｇ、約１ｘ１０１４ｃｐ／ｋｇ〜約１ｘ１０１８ｃｐ／ｋｇ、又は約１ｘ１０１５ｃｐ／ｋｇ〜約１ｘ１０１７ｃｐ／ｋｇの間である。ある実施形態では、本明細書に開示の方法及び調製物に関して、ＡＡＶ調製物の用量は、約１ｘ１０１０ｃｐ／ｋｇ〜約１ｘ１０１６ｃｐ／ｋｇの間である。ある実施形態では、本明細書に開示の方法及び調製物に関して、ＡＡＶ調製物の用量は、少なくとも約１ｘ１０６ｃｐ／ｋｇ、少なくとも約１ｘ１０７ｃｐ／ｋｇ、少なくとも約１ｘ１０８ｃｐ／ｋｇ、少なくとも約１ｘ１０９ｃｐ／ｋｇ、少なくとも約１ｘ１０１０ｃｐ／ｋｇ、少なくとも約１ｘ１０１１ｃｐ／ｋｇ、少なくとも約１ｘ１０１２ｃｐ／ｋｇ、少なくとも約１ｘ１０１３ｃｐ／ｋｇ、少なくとも約１ｘ１０１４ｃｐ／ｋｇ、少なくとも約１ｘ１０１５ｃｐ／ｋｇ、少なくとも約１ｘ１０１６ｃｐ／ｋｇ、少なくとも約１ｘ１０１７ｃｐ／ｋｇ、少なくとも約１ｘ１０１８ｃｐ／ｋｇ、少なくとも約１ｘ１０１９ｃｐ／ｋｇ、少なくとも約１ｘ１０２０ｃｐ／ｋｇ、少なくとも約１ｘ１０２１ｃｐ／ｋｇ、少なくとも約１ｘ１０２２ｃｐ／ｋｇ、少なくとも約１ｘ１０２３ｃｐ／ｋｇ、少なくとも約１ｘ１０２４ｃｐ／ｋｇ、又は少なくとも約１ｘ１０２５ｃｐ／ｋｇである。ある実施形態では、ｃｐ／ｋｇは、全カプシド／ｋｇ対象、又は完全カプシド／ｋｇ対象であり得る。ある実施形態では、ｃｐ／ｋｇは、全カプシド／ｋｇ対象である。
【００７６】
ある実施形態では、本開示のＡＡＶ調製物は、高純度で、高力価で、かつ対象での臨床用途に適している。ある実施形態では、ＡＡＶ調製物は、均質な集団でかつ高純度のＡＡＶカプシド粒子を含む。ある実施形態では、ＡＡＶ調製物は、完全長ベクターＤＮＡを含む。例示的実施形態では、ＡＡＶ調製物は、不要な汚染物質を実質的に含まず、そのような汚染物質として、限定はされないが、切断された又は不完全なベクターＤＮＡを含むＡＡＶカプシド粒子、不完全なタンパク質組成及びオリゴマー化構造を有するＡＡＶ粒子、又は例えば非ＡＡＶ、脂質エンベロープウイルスなどの汚染ウイルスが挙げられる。例示的実施形態では、ＡＡＶ調製物は、目的タンパク質をコードする大量のｃＤＮＡを含む。ある実施形態では、本開示のＡＡＶ調製物は対象に投与するのに適している。ある実施形態では、ＡＡＶ調製物は、滅菌及び／又は適正製造基準（ＧＭＰ）グレードである。ある実施形態では、ＡＡＶ調製物は、遺伝子治療用医薬品に関して米国薬局方Ｃｈａｐｔｅｒ  １０４６又は欧州薬局方に記載されている、或いはアメリカ食品医薬品局（ＵＳＦＤＡ）又は欧州医薬品庁（ＥＭＡ）により定められている要件に適合する。ある実施形態では、ＡＡＶ調製物は、ほとんど又は全く処理も操作も無しに対象に直接投与するためのすぐに使用可能な調製物である。
【００７７】
用語「患者」及び「対象」は互換的に用いられ、本開示の組成物の投与により予防又は治療されうる状態を患っている又は罹患しやすい生物を指すためにその通常の意味で用いられ、ヒト及び非ヒト動物の両方を含む。対象の例として、限定はされないが、ヒト、チンパンジー、並びに他の類人猿及びサル種；ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ及びウマなどの家畜；イヌ及びネコなどの飼育哺乳動物；マウス、ラット及びモルモットなどの齧歯動物を含む実験動物；ニワトリ、シチメンチョウ及び他のキジ科鳥類、カモ、ガチョウなどの、飼育鳥、野鳥及び狩猟鳥を含む鳥類が挙げられる。この用語は、特定の年齢を意味しない。従って、成人、若年者、及び新生児の個体も対象となる。
【００７８】
ＡＡＶの供給源
本開示の方法に関して、ＡＡＶはあらゆるＡＡＶ血清型であってよい。ある実施形態では、本明細書に記載のＡＡＶは、ＡＡＶ１血清型、ＡＡＶ２血清型、ＡＡＶ３血清型、ＡＡＶ４血清型、ＡＡＶ５血清型、ＡＡＶ６血清型、ＡＡＶ７血清型、ＡＡＶ８血清型、ＡＡＶ９血清型、ＡＡＶ１０血清型のもの、又はキメラＡＡＶベクターであってよい。ある実施形態では、ＡＡＶは野生型である。ある実施形態では、ＡＡＶは組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）である。ある実施形態では、ＡＡＶは、遺伝子操作により改変されている及び／又は化学修飾されている。ある実施形態では、ＡＡＶは、改変されたカプシド、例えば、遺伝子操作された又は化学修飾されたＡＡＶカプシドである。ある実施形態では、ＡＡＶは、ＡＡＶ８血清型のものである。ある実施形態では、ＡＡＶはＡＡＶ９血清型のものである。
【００７９】
本発明の方法に関して、ＡＡＶ画分は、例示的態様では、濃縮ＡＡＶ画分である。ある実施形態では、ＡＡＶ画分は、少なくとも約１ｘ１０１０、少なくとも約１ｘ１０１１、少なくとも約１ｘ１０１２、少なくとも約１ｘ１０１３、少なくとも約１ｘ１０１４、少なくとも約１ｘ１０１５、又は少なくとも約１ｘ１０１６のＡＡＶ全カプシド／ｍＬを含む。ある実施形態では、ＡＡＶ画分は、少なくとも約１ｘ１０１２のＡＡＶ全カプシド／ｍＬを含む。ＡＡＶカプシドは、空ＡＡＶカプシド及び完全ＡＡＶカプシドを含み得る。
【００８０】
ある実施形態では、ＡＡＶ画分は、トランスフェクトされた宿主細胞により生成されるＡＡＶ画分又は調製物を表す。ある実施形態では、ＡＡＶ画分又は調製物は、トリプルプラスミドシステムでトランスフェクトされた宿主細胞を含む細胞培養物から採取される上清又は細胞懸濁液を表し、そのシステムの１つのプラスミドは目的遺伝子又はｃＤＮＡを含み、１つのプラスミドはカプシドタンパク質ＶＰ１、カプシドタンパク質ＶＰ２及び／又はカプシドタンパク質ＶＰ３をコードする。ある実施形態では、ＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３は、ＡＡＶ８  ＶＰ１、ＡＡＶ８  ＶＰ２、及び／又はＡＡＶ８  ＶＰ３である。ｒＡＡＶの生成のためのトリプルプラスミドトランスフェクションは当業界で知られている。例えば、上記のQu et al., and Mizukami et al., “A Protocol for AAV vector production and purification.” PhD dissertation, Division of Genetic Therapeutics, Center for Molecular Medicine, 1998；及びKotin et al., Hum Mol Genet 20(R1): R2-R6 (2011)を参照のこと。ある実施形態では、トランスフェクションは、例えばリン酸カルシウムなどの無機化合物、又はポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などの有機化合物、又は例えばエレクトロポレーションなどの非化学的手段を用いて実施され得る。
【００８１】
ある実施形態では、宿主細胞は接着細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は懸濁細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、ＨＥＫ２９３細胞又はＳｆ９細胞（例えば、バキュロウイルス感染Ｓｆ９細胞）、或いはＨｅＬａ又はＢＨＫ（ヘルペスウイルスシステム）である。ある実施形態では、細胞培養物は、血清及びタンパク質を含まない培地を含む。ある実施形態では、培地は既知組成培地であり、動物由来成分、例えば加水分解物などを含まない。
【００８２】
ある実施形態では、ｒＡＡＶ粒子を含む画分は、トリプルプラスミドシステムでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を含む画分を表す。ある実施形態では、ｒＡＡＶ粒子を含む画分は、ＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクションの約２〜約７日後、或いは細胞培養物が約５ｘ１０６細胞／ｍＬ又はそれより高い細胞密度を有しかつ約５０％又はそれより高い細胞生存率を有するときの採取物の画分を表す。
【００８３】
ある実施形態では、ＡＡＶは、トリプルプラスミドトランスフェクション、次いで１〜７日後の採取により調製される。ある実施形態では、ＡＡＶは細胞破壊から調製される。
【００８４】
ある実施形態では、ＡＡＶは以下のように調製される：ＨＥＫ２９３細胞を、既知組成でよくかつ例えば血清及びタンパク質などの動物由来成分を含まなくてよい、市販の培地中で接着及び増殖させる。その細胞を約３ｘ１０６〜約１２ｘ１０６細胞／ｍｌ、例えば、約６ｘ１０６〜約１０ｘ１０６細胞／ｍｌの細胞密度まで培養する。その後、細胞密度が約３〜５ｘ１０６細胞／ｍｌになるように約１：２の比で細胞を分割する。分割の後、（１）ＡＡＶ生成に不可欠な１つ又は複数のヘルパーウイルス機能を提供することができるヘルパープラスミド；（２）ウイルスのカプシド生成、複製及びパッケージングに関連する１つ又は複数の遺伝子をコードするプラスミド；及び（３）結果として生じるｒＡＡＶ粒子内にパッケージングされるべき目的遺伝子（ＧＯＩ）を含むプラスミド；を含む、３つのプラスミドで細胞をトランスフェクトしてよい。例えば、ＧＯＩは、ベクターＤＮＡと共に一本鎖自己相補的な形態でヒト血液凝固第ＩＸ因子Ｐａｄｕａを含むベクターＤＮＡであってよい。別の例として、ＧＯＩは、二本鎖自己相補的な形態でヒト血液凝固第ＩＸ因子Ｐａｄｕａを含むベクターＤＮＡであってよく、そのベクターＤＮＡは４．８ｋＢの完全長を有する。別の例として、ＧＯＩは、一本鎖自己相補的な形態でＢドメイン欠失ヒト血液凝固第ＶＩＩＩ因子を含むベクターＤＮＡであってよく、そのベクターＤＮＡは４．８ｋＢの完全長を有する。他のＧＯＩを用いてもよい。トランスフェクションは、例えばカチオンポリマーを用いることにより、一過性に行ってよい。溶出の前に、ＨＥＫ２９３細胞株を、採取の前に少なくとも約１日間、例えば３〜５日間培養してよい。
【００８５】
ある実施形態では、ＡＡＶ粒子を含む画分は、その全体が本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第６２／４１７，７７５号、及び国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０５９９６７号に記載されている。
【００８６】
精製ステップ
本開示の方法は、本明細書に開示されるステップのあらゆる組合せを含み、任意選択で、１つ又は複数の追加ステップと組み合わせてもよい。
【００８７】
例示的実施形態では、本開示の方法は、超遠心分離ステップを含み、そのステップ中に密度勾配が形成される。理論に拘束されることを望むものではないが、超遠心分離ステップは、空ＡＡＶカプシドから完全ＡＡＶカプシドを分離させることを可能にすると考えられる。超遠心分離プロトコルの例は、例えば、あらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第２００８１３５２２９号及び国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１７／５９９６７号に見ることができる。
【００８８】
本開示の方法は、ＡＡＶの純度をさらに高め、かつ他の不要な成分を除去し得る、及び／又は画分を濃縮し得る、及び／又は後のステップのために画分を状態調節（condition）し得る、さらに他の追加ステップを含んでいてよい。
【００８９】
ある実施形態では、その方法はデプスろ過ステップを含む。ある実施形態では、その方法は、セルロース及びパーライトを含みかつ約５００Ｌ／ｍ２の最小透過性を有するフィルターを用いて、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞の培養物上清の画分をデプスろ過にかけることを含む。ある実施形態では、その方法は、約０．２μｍの最小孔径を有するフィルターの使用をさらに含む。ある実施形態では、デプスろ過の後、約０．２μｍの最小孔径を有するフィルターを通してろ過を行う。ある実施形態では、デプスフィルターと約０．２μｍの最小孔径を有するフィルターの一方又は両方を洗浄し、その洗浄液を回収する。ある実施形態では、洗浄液を一緒にプールし、デプスろ過及び約０．２μｍの最小孔径を有するフィルターを用いたろ過で得られるろ液と合わせる。ある実施形態では、デプスろ過ステップ及び他のろ過ステップは、本明細書に記載の超遠心分離ステップの前に行われる。
【００９０】
ある実施形態では、本開示の方法は、１つ又は複数のクロマトグラフィステップを含む。ある実施形態では、その方法は、ネガティブクロマトグラフィステップを含み、それによって不要な成分がクロマトグラフィ樹脂に結合し、所望のＡＡＶはクロマトグラフィ樹脂に結合しない。ある実施形態では、その方法は、ネガティブ陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィステップ、又は「非結合モード」でのＡＥＸクロマトグラフィステップを含む。「非結合モード」の利点として、その手順を実施するのが比較的容易であり、また続くアッセイを実施するのが容易であることが挙げられる。従って、ある実施形態では、ＡＡＶ粒子を精製する方法は、ＡＡＶがＡＥＸクロマトグラフィカラム又はメンブレンを素通りする条件下で、ＡＡＶ粒子を含む画分をＡＥＸクロマトグラフィカラム又はメンブレンに添加し、さらにＡＡＶ粒子を回収することにより、ＡＡＶ粒子を含む画分においてネガティブ陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィを実施することを含む。ある実施形態では、約１００ｍＭ〜約１５０ｍＭの塩（例えばＮａＣｌ）を含むローディングバッファーを用いて、画分をＡＥＸクロマトグラフィカラム又はメンブレンに添加し、任意選択で、ローディングバッファーのｐＨは約８〜約９である。ある実施形態では、ローディングバッファーは、約１１５ｍＭ〜約１３０ｍＭの塩（例えばＮａＣｌ）を含み、任意選択で、ローディングバッファーは約１２０ｍＭ〜約１２５ｍＭの塩（例えばＮａＣｌ）を含む。ある実施形態では、ネガティブＡＥＸステップは、本明細書に記載の超遠心分離ステップの前に行われる。
【００９１】
ある実施形態では、本開示の方法は、限外ろ過／ダイアフィルトレーションシステムを用いてＡＡＶ画分を濃縮することを含む。ある実施形態では、本開示の方法は、１つ又は複数のタンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）ステップを含む。ある実施形態では、ＡＡＶ画分は、限外ろ過／ダイアフィルトレーションを受ける。ある実施形態では、ＡＡＶ画分は、ネガティブＡＥＸクロマトグラフィを実施することを含むステップの前に、ネガティブＡＥＸクロマトグラフィを実施することを含むステップの後に、或いはネガティブＡＥＸクロマトグラフィを実施することを含むステップの前後に、限外ろ過／ダイアフィルトレーションシステムを用いて濃縮される。
【００９２】
ある実施形態では、本開示の方法は、ＡＡＶ粒子を含む画分を溶媒界面活性剤で処理して脂質エンベロープウイルスを不活化することを含む。
【００９３】
ある実施形態では、本開示の方法は、ｒＡＡＶ粒子を含む画分をろ過して、その画分中のｒＡＡＶ粒子より大きいサイズのウイルスを除去することを含む。ある実施形態では、本開示の方法は、ＡＡＶを含む画分をろ過して、約３５ｎｍ又はそれより大きいサイズのウイルスを除去することを含む。ある実施形態では、フィルターの孔径はナノメートル範囲であり、ある実施形態では、その方法はナノろ過を含む。ある実施形態では、本開示の方法は、水流法により決定して、３５ｎｍ±２ｎｍの範囲内の孔径のナノフィルターの使用を含む。フィルターのタイプの分類は、メンブレン構造、材料、及び供給メーカーによる。
【００９４】
ある実施形態では、ろ過ステップ中、フィルターを横切る圧力差を維持する。ある実施形態では、その圧力（例えば、フィルターを挟んだ圧力降下）は約０．０２ＭＰａ〜約０．１ＭＰａである。ある実施形態では、その圧力（例えば、フィルターを挟んだ圧力降下）は約０．０２ＭＰａ〜約０．０８ＭＰａである。フィルターをデッドエンドモードで使用する場合、圧力差は、添加する試料のフィード圧により（すなわち、フィード圧に影響する、特定の流量へのポンプの調整により）影響を受け得る。
【００９５】
ある実施形態では、ｒＡＡＶ粒子より大きいウイルスの除去のためのろ過ステップは、本開示のプロセス中に１回行われる。ある実施形態では、そのろ過ステップはプロセス中に２回行われる。ある実施形態では、ｒＡＡＶ粒子より大きいウイルスの除去のためのろ過ステップは、本明細書に記載の超遠心分離ステップの後に行われる。ある実施形態では、ｒＡＡＶ粒子より大きいウイルスの除去のためのろ過ステップは、ポリッシングステップの後に行われる。
【００９６】
ある実施形態では、本開示の方法は、任意選択でテンタクルゲルを含むカラムを用いて、ＡＥＸクロマトグラフィを実施することを含む、ポリッシングステップを含む。
【００９７】
本明細書で引用される、出版物、特許出願及び特許を含むあらゆる参考文献は、各参考文献が個別に及び具体的にその全体が参照により組み込まれることが指摘されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
【００９８】
本開示を説明する文脈（特に添付の特許請求の範囲の文脈）において使用される用語「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」及び同様の指示対象の用語は、本明細書に別段の指示がない限り、又は文脈において明らかに矛盾しない限り、単数形及び複数形の両方を含むと解釈される。用語「含む」、「有する」、「包含する」及び「含有する」は、特に断りのない限り、開放型用語（すなわち、「含むがそれに限定はされない」ことを意味する）として解釈される。
【００９９】
本明細書における数値範囲の列挙は、別段の指示がない限り、単にその範囲内に含まれる各個別の値及び各終点の値に対して個々に言及する省略方法としての役割を果たすことが意図され、各個別の値及び各終点の値は、それが本明細書に個々に列挙されているかのように本明細書内に組み込まれる。
【０１００】
本明細書に記載される全ての方法は、本明細書に別段の指示がない限り、又は文脈において明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施され得る。本明細書に提供される任意の及び全ての例、又は例示的な言語（例えば、「など」）の使用は、単に本開示をより明確に説明することを意図しており、別段に特許請求の範囲に記載されていない限り、本開示の範囲に限定を課すものではない。本明細書における言語は、特許請求の範囲に記載されていないいずれの要素も本開示の実施に必須であるとして指示すると解釈されるべきではない。
【０１０１】
本開示の実施形態を明細書中に記載する。それら実施形態の変形は、上記の説明を読むことにより当業者に明らかになるであろう。発明者は、当業者がそのような変形が適切であるとして利用することを予測し、また発明者は、具体的に明細書中に記載されているものとは別のやり方でその発明が実施されることを意図している。従って、本開示は、適用法に容認される、添付の特許請求の範囲に記載の主題の全ての変形及び等価物を包含する。さらには、本明細書に別段の指示がない限り、又は文脈において明らかに矛盾しない限り、上記の要素のあらゆる組合せもその全ての可能な変形において本開示に包含される。
【０１０２】
以下の実施例は、単に本発明を説明するためのものであり、決してその範囲を限定するためのものではない。
【実施例】
【０１０３】
実施例１
この実施例は、ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡを実証する。ＥＬＩＳＡは、試験画分又は調製物中に存在するＡＡＶ８粒子の量を決定する。
【０１０４】
ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡは、ＡＡＶ含有画分を同定するために実施される。会合したＡＡＶ８粒子上に繰り返し発現されるエピトープの検出のために立体構造特異的モノクローナル抗体を用いる。
【０１０５】
ＡＡＶ８  ＥＬＩＳＡは、ＴＥＣＡＮロボットシステムでＡＡＶ８滴定ＥＬＩＳＡキット（Ａｒｔ．Ｎｏ．ＰＲＡＡＶ８；Ｐｒｏｇｅｎ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて実施した。簡単に説明すると、会合したＡＡＶ８カプシド（ＡＤＫ８）上の立体構造エピトープに特異的なモノクローナル抗体をマイクロタイターストリップにコーティングし、ＡＡＶ画分からＡＡＶ８粒子を捕獲するのに用いた。捕獲ＡＡＶ粒子を２つのステップにより検出した。第１のステップでは、ＡＤＫ８抗体に特異的なビオチンコンジュゲートモノクローナル抗体を（ＡＤＫ８とＡＤＫ８抗体との）免疫複合体に結合させた。ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼコンジュゲートを、ビオチンコンジュゲートモノクローナル抗体に結合した免疫複合体に添加し、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼコンジュゲートをビオチンと反応させた。設定濃度で標識ＡＡＶ−８粒子を含有するＡＡＶ２／８粒子調製物、ＷＬ２１７Ｓを標準として用いた。ペルオキシダーゼの基質溶液を添加し、結合したＡＡＶカプシド粒子の量に比例する呈色反応をもたらした。呈色反応を４５０ｎｍで光度測定により測定した。
【０１０６】
予めコーティングしたプレートを１００μＬ／ウェルの希釈バッファーで満たした。その後、アッセイ標準、アッセイ対照及び試料用の希釈系列をプレート上で直接調製した。溶解したアッセイ標準は、１００μｌをウェル中にすでに存在する１００μＬの希釈バッファーと混合することによりプレート上で直接１＋１に６回、二重で希釈したが、アッセイ対照は、６回の連続希釈をプレート上で直接調製する前に、１／２００に希釈した。試料に関して、２つの連続希釈物を独立して二重で調製した。その後、マイクロプレートシェーカー上において＋３７℃（設定値）で６０±１０分間プレートをインキュベートし、その際に３０±５分後に１８０°プレートを回転させた。洗浄ステップ（洗浄バッファー：Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、０．８％ＮａＣｌ、０．０２％ＫＣｌ、０．０２％ＫＨ２ＰＯ４、０．１２６％Ｎａ２ＨＰＯ４ｘ２Ｈ２Ｏ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０、中性ｐＨ（ｐＨ試験紙でチェック））の後、１００μＬ／ウェルの検出抗体を添加し、添加後３０±５分間プレートをインキュベートした。このインキュベーションは洗浄ステップにより終了した。その後、１００μＬ／ウェルのテトラメチルベンジジン基質を添加した。停止溶液の添加により停止させる前に、着色反応を室温で２５±５分間進めた。リファレンス波長として４５０ｎｍ及び６２０ｎｍでＥＬＩＳＡリーダーを用いて３０分以内にプレートを測定した。ｌｏｇ−ｌｏｇフィッティングの後に校正曲線を得た。
【０１０７】
実施例２
この実施例は、低温透過型電子顕微鏡法（ＣｒｙｏＴＥＭ）を実証する。
【０１０８】
ＣｒｙｏＴＥＭは、ＡＡＶなどのナノサイズの粒子を可視化することができる。その技術は、温度及び湿度を制御した環境下で薄いカーボン支持膜上にＡＡＶ調製物を堆積することを含む。過剰のＡＡＶ調製物を除去して一部のＡＡＶ調製物を付着したまま残した後、グリッドを液体エタン中にガラス化し、その後、液体窒素中で保管した。ＡＡＶカプシド粒子のＣｒｙｏＴＥＭ分析を利用して、全体的な検体の形態、すなわち、様々なＡＡＶの形態の存在（一般的に、球状及び変形ＡＡＶ粒子、サブユニット構造、及び大きな構造的にあまり規定されない形態を含む）、並びに、自動画像解析手法によって粒子のパッケージングのレベルを評価した。
【０１０９】
極低温条件下で瞬間凍結することにより不活性支持体上において非結晶性の非晶質氷中に包埋することによって、ＡＡＶ画分又は調製物をそれらの本来の状態に近い状態で保存した。Ｖｉｒｏｎｏｖａ解析ソフト（ＶＡＳ）を利用する自動客観解析法を用いて画像解析を行った。
【０１１０】
殻とコアとの間に明確な境界のない内部密度を示すＡＡＶカプシド粒子は、充填（filled）又は完全粒子として分類した（図６Ａ）。明確な外殻及び微小な内部密度を示すＡＡＶカプシド粒子は、空粒子として分類した（図６Ａ）。不確定粒子には、空であっても完全であってもよい三量体構造の形態のＡＡＶカプシド（図６Ｂ）、及び破損ＡＡＶカプシドが含まれる（図６Ｃ）。
【０１１１】
ＣｒｙｏＴＥＭは、ＡＡＶ調製物中の空カプシドと対比した、全完全カプシドの量を決定する。
【０１１２】
実施例３
この実施例は、ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡを使用することにより、ｑＰＣＲ手法を使用するよりも少ない変動をもたらすことを実証する。
【０１１３】
ＡＡＶ８  ＥＬＩＳＡ：実施例１に記載のように、カプシド粒子（ｃｐ）濃度のためのＡＴＣＣ（登録商標）ＡＡＶ８参照標準物質に対して校正される市販のキット（Ｐｒｏｇｅｎ）を用いて全ＡＡＶ８カプシド粒子のタイター（力価）を測定した。
【０１１４】
ｑＰＣＲ：導入遺伝子ＤＮＡのベクターゲノムコピー濃度を測定するためにＴａｑｍａｎ（登録商標）ケミストリーに基づく定量ＰＣＲアッセイを開発した。ＦＶＩＩＩ用のＩＴＲ−ｑＰＣＲに関して、プライマー、並びにベクターゲノムのＩＴＲ配列内の配列を検出する蛍光標識プローブと共に、ＴａｑＭａｎベースのｑＰＣＲを用いてベクターゲノムのタイター（ｖｇ）／ミリリットル（ｍｌ）を決定した。ＡＡＶ粒子中のＩＴＲ特異的配列を検出するために、試料をＤＮＡｓｅ  Ｉで処理し、続くプロテイナーゼＫステップの後に、ｓｃＡＡＶゲノムをカプシドから放出させた。最後に、制限酵素消化を実施してＡＡＶ  ＩＴＲ  Ｔ形状構造を分割した。
【０１１５】
参照として用いるプラスミドを、シングルカッター制限酵素を用いて線状化し、さらにアガロースゲルから精製した。ゲルから抽出したＤＮＡのＵＶ  Ａ２６０吸光度をＵＶ吸光光度計で３回測定し、ＤＮＡ濃度の平均値をμｇ／ｍｌで計算した。
【０１１６】
線状化標準プラスミドに関してコピー数／ｍｌを決定するために、基本的な配列の各個別のヌクレオチドの正確な質量を考慮して、ｄｓ  ＤＮＡの分子量をｇ／モルで計算した。
【０１１７】
直線回帰を用いたプラスミド標準曲線フィッティングにより、試験物品中のベクターゲノムのタイター（ベクターゲノム／ｍＬ）を計算した。
【０１１８】
ＣｒｙｏＴＥＭ：実施例２に記載するように、極低温条件下で瞬間凍結することにより不活性支持体上において非結晶性の非晶質氷中に包埋することによって、試料をその本来の状態に近い状態で保存した。
【０１１９】
ゲル電気泳動：（Fagone et al., 2012）に記載のように電気泳動を実施した。簡単に説明すると、０．５％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の存在下で試料を７５℃で１０分間処理し、その後室温まで冷却した。次いで、試料（およそ１．５Ｅ１０ベクターゲノム（ｖｇ）／レーン）を１％  １ｘＴＡＥアガロースゲルにロードし、電場（７Ｖ／ｃｍゲル長さで６０分）で分離した。その後、ゲルを２ｘＧｅｌＲｅｄ（Ｂｉｏｔｉｕｍ）溶液中において染色し、ＣｈｅｍｉＤｏｃＴＭＭＰ（Ｂｉｏｒａｄ）により画像化した。
【０１２０】
Ｉｎ  ｖｉｖｏ生物効力：ＡＡＶ特異的ｉｎ  ｖｉｖｏ生物効力アッセイを、抗原ＥＬＩＳＡアッセイを使用して評価されたＡＡＶ調製物を用いて実施して、カプシド粒子／ｍｌ（ｃｐ／ｍｌ）を決定した。試料を試験施設に輸送し（冷凍、≦−６０℃）、解凍し、調合バッファーで４ｘ１０１１ｃｐ／ｍｌに希釈した。ｉｎ  ｖｉｖｏ生物効力試験は、各郡当たり８匹までの雄のＦＶＩＩＩノックアウトマウス（（Ｂ６；１２９Ｓ４−Ｆ８  ｔｍ２Ｋａｚ）；Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  ＧｍｂＨ，Ｓｕｌｚｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を含む。試料を解凍したすぐ後に、４ｘ１０１２ｃｐ／ｋｇの試験又は対照試料の単回静脈内ボーラス注射を動物に与えた。試験試料はＡＡＶ８−ＦＶＩＩＩ遺伝子治療ベクターであった。採集したマウスクエン酸血漿を用いて、ＦＶＩＩＩ活性アッセイを使用してＦＶＩＩＩ活性を評価する。ＦＶＩＩＩ活性アッセイをカルシウムイオン及びリン脂質の存在下で実施する。第Ｘ因子は第ＩＸａ因子により第Ｘａ因子に活性化される。この活性化は、この反応において補因子として作用する第ＶＩＩＩ因子により促進される。最適な量のＣａ２＋、リン脂質及び第ＩＸａ因子、並びに過剰量の第Ｘ因子を用いることにより、第Ｘ因子の活性化の速度は第ＶＩＩＩ因子の量に直線的に相関する。第Ｘａ因子は、発色基質を加水分解し、従って発色団を遊離させる。その後、色を４０５ｎｍで光度測定により読み取る。生成される第Ｘａ因子、及び従って色の強度は、試料中の第ＶＩＩＩ因子の活性に比例する。
【０１２１】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物効力：ＡＡＶ特異的ｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物効力アッセイを、抗原ＥＬＩＳＡアッセイを使用して評価されたＡＡＶ調製物を用いて実施して、カプシド粒子／ｍｌ（ｃｐ／ｍｌ）を決定した。目的遺伝子（ＧＯＩ）第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）を含むウイルスベクターＡＡＶを肝標的細胞株に感染させ、次いでそれは細胞培地中に機能的で測定可能なＦＶＩＩＩを分泌した。細胞培養上清の第ＶＩＩＩ因子活性をＦＶＩＩＩ発色アッセイにより直接測定した。ＡＡＶ８−ＦＶＩＩＩ試料の測定値は、参照物質に対するパーセンテージとして与えられる。その方法は、ＡＡＶ８−ＦＶＩＩＩ遺伝子治療ベクターの生物学的機能の定量的評価を可能にする。ｉｎ  ｖｉｖｏ生物効力に関して上述したのと同じアッセイを用いた。
【０１２２】
図１に示すように、ｑＰＣＲ法を用いると、ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡ法と比較してより大きな変動をもたらした。例えば、ＩＴＲベースのｑＰＣＲは、≦４３％の変動係数をもたらしたが、ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡの変動係数は≦１０％であった。ＥＬＩＳＡ法は、ｑＰＣＲ法よりも約２０％〜約３３％変動が少なかった。この驚くべき違いは、ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡアッセイ単独によりＡＡＶ画分の用量を決定することを可能にする。このアプローチは、ＡＡＶ画分を投薬するためのより正確な方法を提供するのみならず、より費用効果及び時間効率が高い。
【０１２３】
ＥＬＩＳＡ法又はｑＰＣＲ法がＡＡＶ調製物のカプシド含量を測定する正確な方法をもたらすかを試験するために、ＡＡＶ調製物を作成し、ＥＬＩＳＡ、及び別個にｑＰＣＲを用いて評価した。これら測定の結果を用いて各レーンにロードする試料（２．０ｘ１０１０カプシド／レーン）を調製した。図２に示すように、調製物は両方のタイプのアッセイを通して同じロットであったにもかかわらず、ＥＬＩＳＡ関連試料のシグナルはｑＰＸＲの結果に関連するものと比較してより一貫していたため、ＥＬＩＳＡで評価した試料は、ｑＰＣＲで評価したものよりも一貫して変動が少なかった。従って、ＥＬＩＳＡで補助した投薬はｑＰＣＲに関連する投薬よりも堅牢（robust）であった。
【０１２４】
ＡＡＶ８カプシドＥＬＩＳＡ及びＩＴＲ−ｑＰＣＲによる、前臨床及びＧＭＰ原薬（ＢＤＳ）、並びに最終製剤（ＦＤＰ）ロットの出荷試験のすべての結果を示し（表１〜４）、またベクターゲノム／全カプシド粒子の比を計算した（表５）。比較のため、ＡＡＶ８  ＥＬＩＳＡの値をＩＴＲ−ｑＰＣＲの値に対してプロットしたものも示す（図４）。図５は、ＡＡＶベクターゲノム（ｖｇ）／ＡＡＶ８抗原ＥＬＩＳＡカプシド粒子（ｃｐ）の比を評価する。図５Ａは、ベクターゲノム／ＡＡＶ抗原の比に基づきｑＰＣＲ法の変動性を示す。図５Ｂは、５０−５５−６０法を用いて国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０５９９６７号の超遠心分離に従う製造プロセスから得られた完全ＡＡＶのパーセンテージの高い一貫性を実証する。超遠心分離プロセスは、バッチ間で一貫した完全対空カプシドプロファイルをもたらす。従って、アッセイ間の変動は一貫性を有するものでなければならない（例えば、図５Ｂ）。しかしながら、ｑＰＣＲを用いて用量を計算した場合、バッチ間に高い変動がある（例えば、図５Ａ）。
【０１２５】
次に、ＥＬＩＳＡ法を用いるｉｎ  ｖｉｖｏ生物効力アッセイにおいてマウスに投薬して、ＡＡＶ調製物の効力を測定した。図３は、マウスモデルを用いるｉｎ  ｖｉｖｏ生物効力アッセイを用いることによりＡＡＶ調製物の効力を決定するために、抗原ＥＬＩＳＡ法を使用することを実証する。図３に示すように、生物学的アッセイは、すべてのロットに生物活性があり、そのロットの効力が類似し、一貫していることを確認した。上述したように、ｉｎ  ｖｉｖｏ生物効力アッセイは、ＡＡＶが細胞を形質導入する能力、及び目的タンパク質又は遺伝子を産生する能力の両方を評価する。
【０１２６】
【表１】
2020511630.tif 000002
【０１２７】
【表２】
2020511630.tif 000003
【０１２８】
【表３】
2020511630.tif 000004
【０１２９】
【表４】
2020511630.tif 000005
【０１３０】
【表５】
2020511630.tif 000006
【０１３１】
【表６】
2020511630.tif 000007
【０１３２】
図１２及び１３は、バッチ１７００４−１７０１４からのＥＬＩＳＡ、ｑＰＣＲ、及びＣｒｙｏＴＥＭの結果を検討する。バッチ１７００４−１７０１３（表６）は同じバッチサイズであり、それらは２回の５００Ｌバッチからのものである。これら１０のバッチは、最終製品中に類似の量のＡＡＶカプシドを含有する。バッチ１７００４−１７０１３の分析を表７に示す。
【０１３３】
【表７】
2020511630.tif 000008
【０１３４】
実施例４
この実施例は、ＡＡＶ調製物中の完全及び空カプシドの量を測定するツールとしてのＣｒｙｏＴＥＭのバリデーション（妥当性確認）を行う。
【０１３５】
製品リリース及び正確な臨床投与を可能にするために、組換えＡＡＶ８（ｒＡＡＶ８）に基づく遺伝子治療ベクター調製物の質的特性を測定するための信頼性の高い分析法の組合せが必要である。ＡＡＶ８遺伝子治療ベクター調製物中の完全ベクターゲノム含有ベクター粒子、及び空ベクター粒子を定量化するため、及びオルトゴナル法を用いて効力に関してこのパラメータの有用性を決定するために、ＣｒｙｏＴＥＭを確立した。
【０１３６】
ベクター調製物を混合することにより又は超遠心分離によってベクター画分を選択的に富化させることにより作製した４０〜８０％の完全粒子含量を有するヒト血液凝固第ＩＸ因子（ＦＩＸ）をコードするｒＡＡＶ８ベクター調製物を用いて、完全／空定量化に関してＣｒｙｏＴＥＭのバリデーションを行った。バリデーションは、１％未満の相対的標準偏差の、室内及びアッセイ間の再現精度をもたらした。６つの独立した実験の直線性が、０．９９６より高い各ｒ２をもって達成された。同じベクターバルク由来のベクター調製物は、完全対空の比と、細胞ベースのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ及びｉｎ  ｖｉｖｏモデルで測定した効力との相関性を示した。
【０１３７】
方法及び材料
ＣｒｙｏＴＥＭ：ベクター試料を、極低温条件下で瞬間凍結することにより不活性支持体上において非結晶性の非晶質氷中に包埋することによって、その本来の状態に近い状態で保存した。実施例２に記載するように、Ｖｉｒｏｎｏｖａ解析ソフト（ＶＡＳ）を利用する自動客観解析法を用いて画像解析を行った。
【０１３８】
ＡＡＶ８  ＥＬＩＳＡ：実施例１に記載のように、カプシド粒子（ｃｐ）濃度のためのＡＴＣＣ（登録商標）ＡＡＶ８参照標準物質に対して校正される市販のキット（Ｐｒｏｇｅｎ）を用いて全ＡＡＶ８カプシド粒子のタイター（力価）を測定した。
【０１３９】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物効力：ＦＩＸ−ＡＡＶ８を感染させたＨｅｐＧ２細胞の上清中のＦＩＸの発色活性を測定し、参照調製物に対する恣意的な生物効力単位として提供し、カプシド粒子に対して正規化した。ｉｎ−ｖｉｔｒｏ生物効力アッセイでは、ウイルスベクターＡＡＶを肝標的細胞株に感染させ、次いでそれは細胞培地中に機能的で測定可能なコードされたタンパク質を培地中に分泌する。第１のステップにおいて、ＨｅｐＧ２標的細胞にＡＡＶを感染させて形質導入する。インキュベーション中、コードされたタンパク質が上清中に放出される。第２のステップでは、上清中に分泌されたコードされたタンパク質の活性を、活性アッセイ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物効力アッセイ、酵素アッセイ−ＲＯＸ  ＦＩＸ（Ｒｏｓｓｉｘ）を用いた）により直接測定した。ＡＡＶ試料の測定値を参照物質に対するパーセンテージとして与える。その方法は、ＡＡＶ８遺伝子治療ベクターの生物学的機能の定量的評価を可能にする。参照は、ＷＨ標準、又はヒトＦＩＸに関するＷＨＯ標準に対して校正した標準調製物である。
【０１４０】
Ｉｎ  ｖｉｖｏ生物効力：ヒトＦＩＸをコードするＡＡＶ８粒子を８匹のヒトＦＩＸノックアウトマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｇｅｒｍａｎｙ（ＣＲ０  ｉｎ  Ｓｕｌｚｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に静脈内（ｉ．ｖ．）注入した。ＡＡＶ８調製物を抗原ＥＬＩＳＡにより評価して、カプシド粒子／ｍｌ（ｃｐ／ｍｌ）を決定した。試料を試験施設に輸送し（冷凍、≦−６０℃）、解凍し、調合バッファーで４．９５Ｅ＋ｌ０ｃｐ／ｍｌに希釈した。試料を解凍したすぐ後に、２．４７Ｅ＋１１ｃｐ／ｋｇの試験又は対照試料の単回静脈内ボーラス注射を動物に与えた。血漿中のＦＩＸ活性を、国際標準に対して校正したヒト血漿標準に対するＡＰＴＴを用いた凝固一段法により測定するＦＩＸ凝固活性によって定期的にモニターした。ＦＩＸ含有試料を、校正曲線内の範囲まで１％アルブミン添加イミダゾールバッファーで希釈した。５０μｌの希釈試料を５０μｌのＦＩＸ欠損血漿に添加し、５０μｌのリン脂質懸濁液（Ｐａｔｈｒｏｍｔｉｎ  ＳＬ，Ｓｉｅｍｅｎｓ）と接触させ、２４０秒インキュベーション後、５０μｌの２５ｍＭ  ＣａＣｌ２溶液を添加することにより、凝固を開始させ、凝固形成を生じさせるまでの時間をＢＣＳ  ＸＰ（Ｓｉｅｍｅｎｓ）又はＡＣＬ  ５００（Ｗｅｒｆｅｎ）スキッドで測定する。
【０１４１】
ｑＰＣＲ：導入遺伝子ＤＮＡのベクターゲノムコピー濃度を測定するためにＴａｑｍａｎ（登録商標）ケミストリーに基づく定量ＰＣＲアッセイを開発した。ＦＩＸベクターＤＮＡのために、２つのＦＩＸ特異的ｑＰＣＲ法を用いた：１つは二本鎖ＤＮＡ  ＡＡＶベクター用であり、もう一方は一本鎖ＤＮＡ  ＡＡＶベクター用である。
【０１４２】
プライマー、並びにＦＩＸ配列及びポリアデニル化シグナル内の配列を検出する蛍光標識プローブと共に、ＴａｑＭａｎベースのｑＰＣＲを用いてベクターゲノムのタイター（ｖｇ）／ミリリットル（ｍｌ）を決定した。ＦＩＸ特異的配列を検出するために、試料をＤＮＡｓｅ  Ｉで処理し、続くプロテイナーゼＫステップの後に、ｓｃＡＡＶゲノムをカプシドから放出させた。最後に、制限酵素消化を実施してＡＡＶ  ＩＴＲ  Ｔ形状構造を分割する。
【０１４３】
参照物質として用いるプラスミドを、シングルカッター制限酵素を用いて線状化し、さらにアガロースゲルから精製した。ゲルから抽出したＤＮＡのＵＶ  Ａ２６０吸光度をＵＶ吸光光度計で３回測定し、ＤＮＡ濃度の平均値をμｇ／ｍｌで計算した。
【０１４４】
線状化標準プラスミドに関してコピー数／ｍｌを決定するために、基本的な配列の各個別のヌクレオチドの正確な質量を考慮して、ｄｓ  ＤＮＡの分子量をｇ／モルで計算した。
【０１４５】
直線回帰を用いたプラスミド標準曲線フィッティングにより、試験物品中のベクターゲノムのタイター（ベクターゲノム／ｍＬ）を計算した。
【０１４６】
結果
図６は、ＣｒｙｏＴＥＭを用いて完全カプシド及び空カプシドを画像化できることを実証する。図７は、試料分析の例である。３８ｋの倍率で取得したＣｒｙｏＴＥＭ画像を、内部密度分析にかけた。各ＡＡＶ粒子の半径方向密度プロファイルの主成分分析は、パッケージングレベルのクラスターを表した：完全（赤；左）、青（空；右）、不確定（緑；中央）；破線の輪：９９％信頼区間。得られた結果の概要に関して表８を参照。
【０１４７】
【表８】
2020511630.tif 000009
【０１４８】
図８は、ＩＣＨ  Ｑ２（Ｒ１）（すなわち、医薬品規制調和国際会議（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｈａｒｍｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｕｓｅ））に従うＣｒｙｏＴＥＭのバリデーションであり、特異性、併行精度、室内再現精度、直線性、希釈精度、及び堅牢性を含んだ。一組の６つの独立した実験の直線性に関する結果を示す。図８は、完全ＡＡＶ８粒子の理論的含量と測定含量との間の違いを示す。ほぼ８０％の完全カプシドを含有するｒＡＡＶ８調製物と、ほとんどが空カプシドである別の調製物とを混合して、４０〜８０％の完全カプシドのパーセンテージを有する４つの試料を得た。これら調製物をそれぞれ２つのグリッド上で比較し、ｘ軸は「完全」カプシドの理論的パーセンテージを表し、ｙ軸はＣｒｙｏＴＥＭによる測定値を表す。１つのデータポイントは２つの繰り返しの平均を反映する。すべてが、０．９９６より高い相関係数をもって理論値と実験値との良好な相関性を実証した。
【０１４９】
図９は、超遠心分離画分（国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０５９９６７号の公開物を参照）から精製された完全カプシドの程度を高めて調製物を調べる。特に、図９は、「完全」カプシドのパーセンテージに依存してｑＰＣＲタイターが増加することを記載する。ｘ軸はＣｒｙｏＴＥＭにより測定した「完全」カプシドのパーセンテージであり、ｙ軸はｑＰＣＲの測定値である。「完全」カプシドのパーセンテージが高くなるにつれ、ｑＰＣＲのタイターが高くなる。図９におけるｑＰＣＲ／ＡＡＶ８抗原の比は、この比が「完全」粒子の量と共にどのように増加するかを実証する−「完全」カプシドのパーセンテージが高くなるにつれ、ｑＰＣＲ対ＡＡＶ８抗原の比は高くなる［Ｘ：完全カプシドのパーセンテージ（ＣｒｙｏＴＥＭ）に対する、Ｙ：比（ｖｇ／ｃｐ）］。完全カプシドの高いパーセンテージでは、ｑＰＣＲの変動性は高く、従って精度を低くする。対象に提供される製品が完全カプシドの高い範囲内となることを考えると、これは特に重要である。ｑＰＣＲ及びＡＡＶ８カプシド粒子ＥＬＩＳＡの結果からベクターゲノム／カプシド粒子のタイターを計算し、ＣｒｙｏＴＥＭのデータに相関させた。
【０１５０】
図１０及び１１は、ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物効力に対する完全ＦＩＸ−ＡＡＶ８カプシド粒子の％の影響を実証する。図１０において、図８で用いたのと同じＡＡＶベクター調製物を、第ＩＸ因子ノックアウトマウス（ｎ＝８）に静脈内（ｉ．ｖ．）投与した。１４日後に血漿試料を採取し、ｈｕＦＩＸ凝固活性を測定した。図１１に関して、超遠心分離画分の単離及び続く精製によって、様々な完全カプシドの程度を有する調製物（図９におけるものと同じ）を調製した。細胞ベースのアッセイにおいて生物効力を測定し、ｃｐに関連づけし、完全粒子％に対してプロットした。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物効力は、完全カプシドの程度が高くなるについて増大する。
【０１５１】
【表９】
2020511630.tif 000010
【０１５２】
ＣｒｙｏＴＥＭを用いて完全カプシド％を測定した。この場合、ＦＩＸ  Ｐａｄｕａをコードする二本鎖ＤＮＡを含むＡＡＶ８を用いた。この実験のｉｎ  ｖｉｖｏの結果に関して、図１０に示すように、完全カプシド含有ＢＤＳ製品を、空カプシドＢＤＳ製品と混合することにより、異なる含量の完全粒子及び空粒子を有する試料を調製した。０日目に単回静脈内ボーラス注射を動物に与え、７、１４及び２８日目に血液を採取した。ＦＩＸ段階凝固検査においてＦＩＸの活性を分析した（ＡＰＴＴベースの凝固因子検査は第ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩ及びＸＩ因子の測定に広く用いられる）。試料を第ＩＸ因子欠損血漿及びリン脂質と接触させ、インキュベートし、塩化カルシウム溶液を用いて凝固を開始させ、凝固時間を測定する。凝固時間は、凝固因子の濃度と明らかな数学的関係を有する。
【０１５３】
結論
ＣｒｙｏＴＥＭはＡＡＶ調製物の効力を定量化する有用なツールであり、治療用途用の遺伝子治療ベクター調製物のリリースを可能にする。ベクターの定量化のために完全及び空カプシド粒子の量、或いはベクターゲノムのタイターを測定することは、オルトゴナル法としての機能を果たすことができる。ＣｒｙｏＴＥＭは、遺伝子治療ベクターの質及び効力を監視することを可能にするという利点を有する。
【０１５４】
ＣｒｙｏＴＥＭは、その試料調製原理が試料の本来の状態を大いに保存するため、他の電子顕微鏡ベースの方法よりも優れている。さらには、染色に頼る必要がない。
【０１５５】
本明細書に記載されているものに加えて、本発明の様々な修飾が上記の記載から当業者に明らかとなるであろう。そのような修飾も添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されている。すべての特許、特許出願、及び非特許文献を含む、本出願において挙げられている各参考文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【図１】
2020511630.tif 000011
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2020511630.tif 000019
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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