(57)【要約】  本発明は、生物医学の分野、特に、治療用核酸の分野に関する。本発明は、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする人工核酸、特にＲＮＡを提供する。（医薬）組成物およびそれを含むキットオブパーツも提供される。更に、本発明は、医学において使用するための、特に、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質による治療が有効な疾患の治療および／または予防において使用するための人工核酸、（医薬）組成物、またはキットオブパーツに関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする少なくとも１つのコード領域と；
ｂ．ＳＬＣ７Ａ３、ＡＴＰ５Ａ１、ＲＰＬ３２、ＨＳＤ１７Ｂ４、ＮＯＳＩＰ、ＡＳＡＨ１、ＲＰＬ３１、ＴＵＢＢ４Ｂ、ＵＢＱＬＮ２、ＭＰ６８、及びＮＤＵＦＡ４からなる群から選択される遺伝子の５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメントと；
ｃ．ＧＮＡＳ、ＣＡＳＰ１、ＰＳＭＢ３、ＡＬＢ、ＣＯＸ６Ｂ１、ＮＤＵＦＡ１、及びＲＰＳ９からなる群から選択される遺伝子の３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）に由来する少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントとを含むことを特徴とする人工核酸分子。
【請求項２】
前記遺伝子のそれぞれが、天然に存在するＤＮＡ配列、並びにそのホモログ、変異体、断片、及び対応するＲＮＡ配列を含む請求項１に記載の人工核酸分子。
【請求項３】
ａ．ＳＬＣ７Ａ３遺伝子の５’ＵＴＲ、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＧＮＡＳ遺伝子の３’ＵＴＲ、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメント；又は
ｂ．ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子の５’ＵＴＲ、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＧＮＡＳ遺伝子の３’ＵＴＲ、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメント；又は
ｃ．ＡＴＰ５Ａ１遺伝子の５’ＵＴＲ、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＣＡＳＰ１遺伝子の３’ＵＴＲ、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメント；又は
ｄ．ＮＤＵＦＡ４遺伝子の５’ＵＴＲ、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＰＳＭＢ３遺伝子の３’ＵＴＲ、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメント；又は
ｅ．ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子の５’ＵＴＲ、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＰＳＭＢ３遺伝子の３’ＵＴＲ、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメント；又は
ｆ．ＲＰＬ３２遺伝子の５’ＵＴＲ、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＡＬＢ遺伝子の３’ＵＴＲ、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメント；又は
ｇ．ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子の５’ＵＴＲ、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＣＡＳＰ１遺伝子の３’ＵＴＲ、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメント；又は
ｈ．ＳＬＣ７Ａ３遺伝子の５’ＵＴＲ、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＣＡＳＰ１遺伝子の３’ＵＴＲ、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメント；又は
ｉ．ＳＬＣ７Ａ３遺伝子の５’ＵＴＲ、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＰＳＭＢ３遺伝子の３’ＵＴＲ、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメント；又は
ｊ．ＮＯＳＩＰ遺伝子の５’ＵＴＲ、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＰＳＭＢ３遺伝子の３’ＵＴＲ、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメント；又は
ｋ．ＮＤＵＦＡ４遺伝子の５’ＵＴＲ、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＲＰＳ９遺伝子の３’ＵＴＲ、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメント；又は
ｌ．ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子の５’ＵＴＲ、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＲＰＳ９遺伝子の３’ＵＴＲ、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメント；又は
ｍ．ＡＴＰ５Ａ１遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＧＮＡＳ遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメント；又は
ｎ．ＮＤＵＦＡ４遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＣＯＸ６Ｂ１遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメント；又は
ｎ．ＮＤＵＦＡ４遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＧＮＡＳ遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメント；又は
ｏ．ＮＤＵＦＡ４遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＮＤＵＦＡ１遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメント；又は
ｐ．ＮＯＳＩＰ遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＮＤＵＦＡ１遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメント；又は
ｑ．ＲＰＬ３１遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＧＮＡＳ遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメント；又は
ｒ．ＴＵＢＢ４Ｂ遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＲＰＳ９遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメント；又は
ｓ．ＵＢＱＬＮ２遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＲＰＳ９遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメント；又は
ｔ．ＭＰ６８遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＧＮＡＳ遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメント；又は
ｕ．ＭＰ６８遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＮＤＵＦＡ１遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントを含む請求項１から２のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項４】
ｄ、ｅ、ｇ、又はｌに係るＵＴＲエレメントを含む請求項３に記載の人工核酸分子。
【請求項５】
−ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子に由来する前記５’ＵＴＲエレメントが、配列番号１に係るＤＮＡ配列、又は配列番号１に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列、又はその断片若しくは変異体；又は配列番号２に係るＲＮＡ配列、又は配列番号２に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＲＮＡ配列、又はその断片若しくは変異体を含む又はからなり；
−ＲＰＬ３２遺伝子に由来する前記５’ＵＴＲエレメントが、配列番号２１に係るＤＮＡ配列、又は配列番号２１に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列、又はその断片若しくは変異体；又は配列番号２２に係るＲＮＡ配列、又は配列番号２２に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＲＮＡ配列、又はその断片若しくは変異体を含む又はからなり；
−ＮＤＵＦＡ４遺伝子に由来する前記５’ＵＴＲエレメントが、配列番号９に係るＤＮＡ配列、又は配列番号９に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列、又はその断片若しくは変異体；又は配列番号１０に係るＲＮＡ配列、又は配列番号１０に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＲＮＡ配列、又はその断片若しくは変異体を含む又はからなり；
−ＳＬＣ７Ａ３遺伝子に由来する前記５’ＵＴＲエレメントが、配列番号１５に係るＤＮＡ配列、又は配列番号１５に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列、又はその断片若しくは変異体；又は配列番号１６に係るＲＮＡ配列、又は配列番号１６に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＲＮＡ配列、又はその断片若しくは変異体を含む又はからなり；
−ＮＯＳＩＰ遺伝子に由来する前記５’ＵＴＲエレメントが、配列番号１１に係るＤＮＡ配列、又は配列番号１１に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列、又はその断片若しくは変異体；又は配列番号１２に係るＲＮＡ配列、又は配列番号１２に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＲＮＡ配列、又はその断片若しくは変異体を含む又はからなり；
−ＡＴＰ５Ａ１遺伝子に由来する前記５’ＵＴＲエレメントが、配列番号５に係るＤＮＡ配列、又は配列番号５に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列、又はその断片若しくは変異体；又は配列番号６に係るＲＮＡ配列、又は配列番号６に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＲＮＡ配列、又はその断片若しくは変異体を含む又はからなり；
−ＡＳＡＨ１遺伝子に由来する前記５’ＵＴＲエレメントが、配列番号３に係るＤＮＡ配列、又は配列番号３に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列、又はその断片若しくは変異体；又は配列番号４に係るＲＮＡ配列、又は配列番号４に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＲＮＡ配列、又はその断片若しくは変異体を含む又はからなり；
−Ｍｐ６８遺伝子に由来する前記５’ＵＴＲエレメントが、配列番号７に係るＤＮＡ配列、又は配列番号７に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列、又はその断片若しくは変異体；又は配列番号８に係るＲＮＡ配列、又は配列番号８に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＲＮＡ配列、又はその断片若しくは変異体を含む又はからなり；
−Ｒｐｌ３１遺伝子に由来する前記５’ＵＴＲエレメントが、配列番号１３に係るＤＮＡ配列、又は配列番号１３に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列、又はその断片若しくは変異体；又は配列番号１４に係るＲＮＡ配列、又は配列番号１４に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＲＮＡ配列、又はその断片若しくは変異体を含む又はからなり；
−ＴＵＢＢ４Ｂ遺伝子に由来する前記５’ＵＴＲエレメントが、配列番号１７に係るＤＮＡ配列、又は配列番号１７に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列、又はその断片若しくは変異体；又は配列番号１８に係るＲＮＡ配列、又は配列番号１８に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＲＮＡ配列、又はその断片若しくは変異体を含む又はからなり；
−Ｕｂｑｌｎ２遺伝子に由来する前記５’ＵＴＲエレメントが、配列番号１９に係るＤＮＡ配列、又は配列番号１９に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列、又はその断片若しくは変異体；又は配列番号２０に係るＲＮＡ配列、又は配列番号２０に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＲＮＡ配列、又はその断片若しくは変異体を含む又はからなり；
−ＧＮＡＳ遺伝子に由来する前記３’ＵＴＲエレメントが、配列番号２９に係るＤＮＡ配列、又は配列番号２９に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列、又はその断片若しくは変異体；又は配列番号３０に係るＲＮＡ配列、又は配列番号３０に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＲＮＡ配列、又はその断片若しくは変異体を含む又はからなり；
−ＣＡＳＰ１遺伝子に由来する前記３’ＵＴＲエレメントが、配列番号２５に係るＤＮＡ配列、又は配列番号２５に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列、又はその断片若しくは変異体；又は配列番号２６に係るＲＮＡ配列、又は配列番号２６に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＲＮＡ配列、又はその断片若しくは変異体を含む又はからなり；
−ＰＳＭＢ３遺伝子に由来する前記３’ＵＴＲエレメントが、配列番号２３に係るＤＮＡ配列、又は配列番号２３に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列、又はその断片若しくは変異体；又は配列番号２４に係るＲＮＡ配列、又は配列番号２４に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＲＮＡ配列、又はその断片若しくは変異体を含む又はからなり；
−ＡＬＢ遺伝子に由来する前記３’ＵＴＲエレメントが、配列番号３５に係るＤＮＡ配列、又は配列番号３５に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列、又はその断片若しくは変異体；又は配列番号３６に係るＲＮＡ配列、又は配列番号３６に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＲＮＡ配列、又はその断片若しくは変異体を含む又はからなり；
−ＲＰＳ９遺伝子に由来する前記３’ＵＴＲエレメントが、配列番号３３に係るＤＮＡ配列、又は配列番号３３に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列、又はその断片若しくは変異体；又は配列番号３４に係るＲＮＡ配列、又は配列番号３４に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＲＮＡ配列、又はその断片若しくは変異体を含む又はからなり；
−ＣＯＸ６Ｂ１遺伝子に由来する前記３’ＵＴＲエレメントが、配列番号２７に係るＤＮＡ配列、又は配列番号２７に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列、又はその断片若しくは変異体；又は配列番号２８に係るＲＮＡ配列、又は配列番号２８に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＲＮＡ配列、又はその断片若しくは変異体を含む又はからなり；又は
−Ｎｄｕｆａ１遺伝子に由来する前記３’ＵＴＲエレメントが、配列番号３１に係るＤＮＡ配列、又は配列番号３１に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列、又はその断片若しくは変異体；又は配列番号３２に係るＲＮＡ配列、又は配列番号３２に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＲＮＡ配列、又はその断片若しくは変異体を含む又はからなる請求項１から４のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項６】
前記ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質が、ＣＲＩＳＰＲ関連野生型タンパク質、そのホモログ、変異体、断片、及び誘導体を含む請求項１から５のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項７】
前記ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質が、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２）、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１３、ＣａｓＸ、又はＣａｓＹから選択される請求項１から６のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項８】
配列番号４２８〜４４１；１０９９９〜１１００１；４４２〜１３４５のいずれかに係るアミノ酸配列、又は配列番号４２８〜４４１；１０９９９〜１１００１；４４２〜１３４５のいずれかに係るアミノ酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又はこれらの配列のいずれかの変異体又は断片を含む又はからなるＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする核酸配列を含む請求項１から７のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項９】
前記ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質誘導体が、少なくとも１つの更なるエフェクタードメインを含み、前記少なくとも１つの更なるエフェクタードメインが、任意に、ＫＲＡＢ、ＣＳＤ、ＷＲＰＷ、ＶＰ６４、ｐ６５ＡＤ、及びＭｘｉから選択される請求項８に記載の人工核酸分子。
【請求項１０】
核局在化シグナル（ＮＬＳ）をコードする少なくとも１つの核酸配列を更に含み、前記核局在化シグナルが、任意に、配列番号４２６；４２７；１０５７５；３８１；３８２；３８４；１１９５７；１１９５８〜１１９６４に係るアミノ酸配列、又は配列番号４２６；４２７；１０５７５；３８１；３８２；３８４；１１９５７；１１９５８〜１１９６４に係るアミノ酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む又はからなるＮＬＳ、及び配列番号４２６；４２７；１０５７５；３８１；３８２；３８４；１１９５７；１１９５８〜１１９６４に係るアミノ酸配列、又は配列番号４２６；４２７；１０５７５；３８１；３８２；３８４；１１９５７；１１９５８〜１１９６４に係るアミノ酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む又はからなるＮＬＳ、又は配列番号１２０２１〜１４２７４に係るアミノ酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＮＬＳから選択される請求項１から９のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項１１】
タンパク質又はペプチドタグをコードする少なくとも１つの核酸配列を更に含む請求項１から１０のいずれかに記載の人工核酸分子。
【請求項１２】
前記人工核酸分子の少なくとも１つのコード領域が、配列番号４１１；２５４０〜２５５３；１１１１７〜１１１１９；１１３５５〜１１３５７；２５５４〜３４５７；１３８０〜１３９３；３７００〜３７１３；４８６０〜４８７３；６０２０〜６０３３；７１８０〜７１９３；８３４０〜８３５３；１１２３７〜１１２３９；１１４７３〜１１４７５；１１５９１〜１１５９３；１１７０９〜１１７１１；１１８２７〜１１８２９；１１９４５〜１１９４７；１３９４〜２２９７；３７１４〜４６１７；４８７４〜５７７７；６０３４〜６９３７；７１９４〜８０９７；８３５４〜９２５７；４１２；３４７４〜３８８７  ２３１４〜２３２７；４６３４〜４６４７；５７９４〜５８０７；６９５４〜６９６７；８１１４〜８１２７；４１３〜４２５；３４９０〜３５０３；３５０６〜３５１９；３５２２〜３５３５；３５３８〜３５５１；３５５４〜３５６７；３５７０〜３５８３；３５８６〜３５９９；３６０２〜３６１５；３６１８〜３６３１；３６３４〜３６４７；３６５０〜３６６３；３６６６〜３６７９；３６８２〜３６９５；９５１４〜９５２７；９６２６〜９６３９；９７３８〜９７５１；９８５０〜９８６３；９９６２〜９９７５，１００７４〜１００８７；１０１８６〜１０１９９；１０２９８〜１０３１１；２３３０〜２３４３；２３４６〜２３５９；２３６２〜２３７５；２３７８〜２３９１；２３９４〜２４０７；２４１０〜２４２３；２４２６〜２４３９；２４４２〜２４５５；２４５８〜２４７１；２４７４〜２４８７；２４９０〜２５０３；２５０６〜２５１９；２５２２〜２５３５；９４９８〜９５１１；９６１０〜９６２３；９７２２〜９７３５；９８３４〜９８４７；９９４６〜９９５９；１００５８〜１００７１；１０１７０〜１０１８３〜１０２８２〜１０２９５；４６５０〜４６６３；４６６６〜４６７９；４６８２〜４６９５；４６９８〜４７１１；４７１４〜４７２７；４７３０〜４７４３；４７４６〜４７５９；４７６２〜４７７５；４７７８〜４７９１；４７９４〜４８０７；４８１０〜４８２３；４８２６〜４８３９；４８４２〜４８５５；９５３０〜９５４３；９６４２〜９６５５；９７５４〜９７６７；９８６６〜９８７９；９９７８〜９９９１；１００９０〜１０１０３；１０２０２〜１０２１５；１０３１４〜１０３２７；５８１０〜５８２３；５８２６〜５８３９；５８４２〜５８５５；５８５８〜５８７１；５８７４〜５８８７；５８９０〜５９０３；５９０６〜５９１９；５９２２〜５９３５；５９３８〜５９５１；５９５４〜５９６７；５９７０〜５９８３，５９８６〜５９９９；６００２〜６０１５；９５４６〜９５５９；９６５８〜９６７１；９７７０〜９７８３；９８８２〜９８９５；９９９４〜１０００７；１０１０６〜１０１１９；１０２１８〜１０２３１；１０３３０〜１０３４３；６９７０〜６９８３；６９８６〜６９９９；７００２〜７０１５；７０１８〜７０３１；７０３４〜７０４７；７０５０〜７０６３；７０６６〜７０７９；７０８２〜７０９５；７０９８〜７１１１；７１１４〜７１２７；７１３０〜７１４３；７１４６〜７１５９；７１６２〜７１７５；９５６２〜９５７５；９６７４〜９６８７；９７８６〜９７９９；���８９８〜９９１１；１００１０〜１００２３；１０１２２〜１０１３５；１０２３４〜１０２４７；１０３４６〜１０３５９；８１３０〜８１４３；８１４６〜８１５９；８１６２〜８１７５；８１７８〜８１９１；８１９４〜８２０７；８２１０〜８２２３；８２２６〜８２３９；８２４２〜８２５５；８２５８〜８２７１；８２７４〜８２８７；８２９０〜８３０２；８３０６〜８３１９；８３２２〜８３３５；９５７８〜９５９１；９６９０〜９７０３；９８０２〜９８１５；９９１４〜９９２７；１００２６〜１００３９；１０１３８〜１０１５１；１０２５０〜１０２６３；１０３６２〜１０３７５；９２９０〜９３０３；９３０６〜９３１９；９３２２〜９３３５；９３３８〜９３５１；９３５４〜９３６７；９３７０〜９３８３；９３８６〜９３９９；９４０２〜９４１５；９４１８〜９４３１；９４３４〜９４４７；９４５０〜９４６３；９４６６〜９４７９；９４８２〜９４９５；９５９４〜９６０７；９７０６〜９７１９；９８１８〜９８３１；９９３０〜９９４３；１００４２〜１００５５；１０１５４〜１０１６７；１０２６６〜１０２７９；１０３７８〜１０３９１のいずれかに係る核酸配列；又は前記核酸配列のいずれかに対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む又はからなる請求項１から１１のいずれか記載の人工核酸分子。
【請求項１３】
配列番号１０５５２；３４５８〜３４５９；３４６０〜３４７３；２２９８〜２２９９；４６１８〜４６１９；５７７８〜５７７９；６９３８〜６９３９；８０９８〜８０９９；９２５８〜９２５９；２３００〜２３１３；４６２０〜４６３３；５７８０〜５７９３；６９４０〜６９５３；８１００〜８１１３；９２６０〜９２７３；３４８８〜３４８９；１０３９６；２３２８〜２３２９；１０３９５；４６４８〜４６４９；１０３９７；５８０８〜５８０９；１０３９８；６９６８〜６９６９；１０３９９；８１２８〜８１２９；１０４００；９２７４〜９２８７；３５０４〜３５０５；３５２０〜３５２１；３５３６〜３５３７；３５５２〜３５５３；３５６８〜３６６９；３５８４〜３５８５；３６００〜３６０１；３６１６〜３６１７；３６３２〜３６３３；３６４８〜３６４９；３６６４〜３６６５；３６８０〜３６８１；３６９６〜３６９７；９５２８〜９５２９；９６４０〜９６４１；９７５２〜９７５３；９８６４〜９８６５；９９７６〜９９７７；１００８８〜１００８９；１０２００〜１０２０１；１０３１２〜１０３１３；１０４０３；１０４１０；１０４１７；１０４２４；１０４３１；１０４３８；１０４４５；１０４５２；１０４５９；１０４６６；１０４７３；１０４８０；１０４８７；１０４９４；１０５０１；１０５０８；１０５１５；１０５２２；１０５２９；１０５３６；１０５４３；２３４４〜２３４５；２３６０〜２３６１；２３７６〜２３７７；２３９２〜２３９３；２４０８〜２４０９；２４２４〜２４２５；２４４０〜２４４１；２４５６〜２４５７；２４７２〜２４７３；２４８９〜２４９０；２５０４〜２５０５；２５２０〜２５２１；２５３６〜２５３７；９５１２〜９５１３；９６２４〜９６２５；９７３６〜９７３７；９８４８〜９８４９；９９６０〜９９６１；１００７２〜１００７３；１０１８４〜１０１８５；１０２９６〜１０２９７；１０４０２；１０４０９；１０４１６；１０４２３；１０４３０；１０４３７；１０４４４；１０４５１；１０４５８；１０４６５；１０４７２；１０４７９；１０４８６；１０４９３；１０５００；１０５０７；１０５１４；１０５２１；１０５２８；１０５３５；１０５４２；４６６４〜４６６５；４６８０〜４６８１；４６９６〜４６９７；４７１２〜４７１３；４７２８〜４７２９；４７４４〜４７４５；４７６０〜４７６１；４７７６〜４７７７；４７９２〜４７９３；４８０８〜４８０９；４８２４〜４８２５；４８４０〜４８４１；４８５６〜４８５７；９５４４〜９５４５；９６５６〜９６５７；９７６８〜９７６９；９８８０〜９８８１；９９９２〜９９９３；１０１０４〜１０１０５；１０２１６〜１０２１７；１０３２８〜１０３２９；１０４０４；１０４１１；１０４１８；１０４２５；１０４３２；１０４３９；１０４４６；１０４５３；１０４６０；１０４６７；１０４７４；１０４８１；１０４８８；１０４９５；１０５０２；１０５０９；１０５１６；１０５２３；１０５３０；１０５３７；１０５４４；５８２４〜５８２５；５８４０〜５８４１；５８５６〜５８５７；５８７２〜５８７３；５８８８〜５８８９；５９０４〜５９０５；５９２０〜５９２１；５９３６〜５９３７；５９５２〜５９５３；５９６８〜５９６９；５９８４〜５９８５；６０００〜６００１；６０１６〜６０１７；９５６０〜９５６１；９６７２〜９６７３；９７８４〜９７８５；９８９６〜９８９７；１０００８〜１０００９；１０１２０〜１０１２１；１０２３２〜１０２３３；１０３４４〜１０３４５；１０４０５；１０４１２；１０４１９；１０４２６；１０４３３；１０４４０；１０４４７；１０４５４；１０４６１；１０４６８；１０４７５；１０４８２；１０４８９；１０４９６；１０５０３；１０５１０；１０５１７；１０５２４；１０５３１；１０５３８；１０５４５；７０３３；７０４８〜７０４９；７０６４〜７０６５；７０８０〜７０８１；７０９６〜７０９７；７１１２〜７１１３；７１２８〜７１２９；７１４４〜７１４５；７１６０〜７１６１；７１７６〜７１７７；９５７６〜９５７７；９６８８〜９６８９；９８００〜９８０１；９９１２〜９９１３；１００２４〜１００２５；１０１３６〜１０１３７；１０２４８〜１０２４９；１０３６０〜１０３６１；１０４０６；１０４１３；１０４２０；１０４２７；１０４３４；１０４４１；１０４４８；１０４５５；１０４６２；１０４６９；１０４７６；１０４８３；１０４９０；１０４９７；１０５０４；１０５１１；１０５１８；１０５２５；１０５３２；１０５３９；１０５４６；８１４４〜８１４５；８１６０〜８１６０；８１７６〜８１７７；８１９２〜８１９３；８２０８〜８２０９；８２２４〜８２２５；８２４０〜８２４１；８２５６〜８２５７；８２７２〜８２７３；８２８８〜８２８９；８３０４〜８３０５；８３２０〜８３２１；８３３６〜８３３７；９５９２〜９５９３；９７０４〜９７０５；９８１６〜９８１７；９９２８〜９９２９；１００４０〜１００４１；１０１５２〜１０１５３；１０２６４〜１０２６５；１０３７６〜１０３７７；１０４０７；１０４１４；１０４２１；１０４２８；１０４３５；１０４４２；１０４４９；１０４５６；１０４６３；１０４７０；１０４７７；１０４８４；１０４９１；１０４９８；１０５０５；１０５１２；１０５１９；１０５２６；１０５３３；１０５４０；１０５４７；９２８８〜９２８９；１０４０１；１０５５３；１０５８２〜１０５８３；１０５７９〜１０５８０；１０５８５〜１０５８６；１０５８８〜１０５８９；１０５９１〜１０５９２；１０５９４〜１０５９５；１０５９７〜１０５９８；１０５５４〜１０５７４；１０６０１；１０６０２；１０６１５；１０６１６；１０６２９；１０６３０；１０６４３；１０６４４；１０６５７；１０６５８；１０６７１；１０６７２；１０６８５；１０６８６；１０６９９；１０７００；１０７１３；１０７１４；１０７２７；１０７２８；１０７４１；１０７４２；１０７５５；１０７５６；１０７６９；１０７７０；１０７８３；１０７８４；１０７９７；１０７９８；１０８１１；１０８１２；１０８２５；１０８２６；１０８３９；１０８４０；１０８５３；１０８５４；１０８６７；１０８６８；１０８８１；１０８８２；１０６０３；１０６０４；１０６１７；１０６１８；１０６３１；１０６３２；１０６４５；１０６４６；１０６５９；１０６６０；１０６７３；１０６７４；１０６８７；１０６８８；１０７０１；１０７０２；１０７１５；１０７１６；１０７２９；１０７３０；１０７４３；１０７４４；１０７５７；１０７５８；１０７７１；１０７７２；１０７８５；１０７８６；１０７９９；１０８００；１０８１３；１０８１４；１０８２７；１０８２８；１０８４１；１０８４２；１０８５５；１０８５６；１０８６９；１０８７０；１０８８３；１０８８４；１０６０５；１０６０６；１０６１９；１０６２０；１０６３３；１０６３４；１０６４７；１０６４８；１０６６１；１０６６２；１０６７５；１０６７６；１０６８９；１０６９０；１０７０３；１０７０４；１０７１７；１０７１８；１０７３１；１０７３２；１０７４５；１０７４６；１０７５９；１０７６０；１０７７３；１０７７４；１０７８７；１０７８８；１０８０１；１０８０２；１０８１５；１０８１６；１０８２９；１０８３０；１０８４３；１０８４４；１０８５７；１０８５８；１０８７１；１０８７２；１０８８５；１０８８６；１０６０７；１０６０８；１０６２１；１０６２２；１０６３５；１０６３６；１０６４９；１０６５０；１０６６３；１０６６４；１０６７７；１０６７８；１０６９１；１０６９２；１０７０５；１０７０６；１０７１９；１０７２０；１０７３３；１０７３４；１０７４７；１０７４８；１０７６１；１０７６２；１０７７５；１０７７６；１０７８９；１０７９０；１０８０３；１０８０４；１０８１７；１０８１８；１０８３１；１０８３２；１０８４５；１０８４６；１０８５９；１０８６０；１０８７３；１０８７４；１０８８７；１０８８８；１０６０９；１０６１０；１０６２３；１０６２４；１０６３７；１０６３８；１０６５１；１０６５２；１０６６５；１０６６６；１０６７９；１０６８０；１０６９３；１０６９４；１０７０７；１０７０８；１０７２１；１０７２２；１０７３５；１０７３６；１０７４９；１０７５０；１０７６３；１０７６４；１０７７７；１０７７８；１０７９１；１０７９２；１０８０５；１０８０６；１０８１９；１０８２０；１０８３３；１０８３４；１０８４７；１０８４８；１０８６１；１０８６２；１０８７５；１０８７６；１０８８９；１０８９０；１０６１１；１０６１２；１０６２５；１０６２６；１０６３９；１０６４０；１０６５３；１０６５４；１０６６７；１０６６８；１０６８１；１０６８２；１０６９５；１０６９６；１０７０９；１０７１０；１０７２３；１０７２４；１０７３７；１０７３８；１０７５１；１０７５２；１０７６５；１０７６６；１０７７９；１０７８０；１０７９３；１０７９４；１０８０７；１０８０８；１０８２１；１０８２２；１０８３５；１０８３６；１０８４９；１０８５０；１０８６３；１０８６４；１０８７７；１０８７８；１０８９１；１０８９２；９３０４〜９３０５；９３２０〜９３２１；９３３６〜９３３７；９３５２〜９３５３；９３６８〜９３６９；９３８４〜９３８５；９４００〜９４０１；９４１６〜９４１７；９４３２〜９４３３；９４４８〜９４４９；９４６４〜９４６５；９４８０〜９４８１；９４９６〜９４９７；９６０８〜９６０９；９７２０〜９７２１；９８３２〜９８３３；９９４４〜９９４５；１００５６〜１００５７；１０１６８〜１０１６９；１０２８０〜１０２８１；１０３９２〜１０３９３；１０４０８；１０４１５；１０４２２；１０４２９；１０４３６；１０４４３；１０４５０；１０４５７；１０４６４；１０４７１；１０４７８；１０４８５；１０４９２；１０４９９；１０５０６；１０５１３；１０５２０；１０５２７；１０５３４；１０５４１；１０５４８のいずれかに係る核酸配列、又は前記核酸配列のいずれかに対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む請求項１から１２のいずれか記載の人工核酸分子。
【請求項１４】
配列番号１１０１１〜１１０４２；１１２４９〜１１２８０１１１３１〜１１１６２；１１３６７〜１１３９８；１１４８５〜１１５１６；１１６０３〜１１６３４；１１７２１〜１１７５２；１１８３９〜１１８７０；１１０４４〜１１１１６；１１２８２〜１１３５４；１１１６４〜１１２３６；１１４００〜１１４７２；１１５１８〜１１５９０；１１６３６〜１１７０８；１１７５４〜１１８２６；１１８７２〜１１９４４；１１０１１〜１１０４２；１１２４９〜１１２８０；１１０４４〜１１１１６；１１２８２〜１１３５４；１１１３１〜１１１６２；１１３６７〜１１３９８；１１４８５〜１１５１６；１１６０３〜１１６３４；１１７２１〜１１７５２；１１８３９〜１１８７０；１１１６４〜１１２３６；１１４００〜１１４７２；１１５１８〜１１５９０；１１６３６〜１１７０８；１１７５４〜１１８２６；１１８７２〜１１９４４；１１１２０〜１１１２２；１１２４０；１１２４１；１１３５８；１１３５９；１１４７６；１１４７７；１１５９４；１１５９５；１１７１２；１１７１３；１１８３０；１１８３１；１１９４８；１１９４９；１１１２３〜１１１３０；１１３６０〜１１３６６  １１２４２〜１１２４８；１１４７８〜１１４８４；１１５９６〜１１６０２；１１７１４〜１１７２０；１１８３２〜１１８３８；１１９５０〜１１９５６のいずれかに係る核酸配列、又は前記核酸配列のいずれかに対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む請求項１から１３のいずれか記載の人工核酸分子。
【請求項１５】
ＲＮＡである請求項１から１４のいずれか記載の人工核酸分子。
【請求項１６】
モノ−、ビ−、又はマルチシストロン性である請求項１５に記載のＲＮＡ。
【請求項１７】
ｍＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、又はレプリコンＲＮＡである請求項１４から１５のいずれかに記載のＲＮＡ。
【請求項１８】
修飾された核酸、好ましくは安定化された核酸である請求項１から１７のいずれかに記載の人工核酸、好ましくはＲＮＡ。
【請求項１９】
−前記人工核酸の少なくとも１つのコード領域のＧ／Ｃ含量が、対応する野生型核酸の対応するコード配列のＧ／Ｃ含量と比較して増加している、及び／又は
−前記人工核酸の少なくとも１つのコード領域のＣ含量が、対応する野生型核酸の対応するコード配列のＣ含量と比較して増加している、及び／又は
−前記人工核酸の少なくとも１つのコード領域中のコドンが、ヒトのコドン使用に適合されており、コドン適合度指数（ＣＡＩ）が、好ましくは、前記人工核酸の少なくとも１つのコード配列において増加又は最大化されている、
−前記人工核酸によってコードされるアミノ酸配列が、好ましくは、対応する野生型人工核酸によってコードされるアミノ酸配列と比較して変化しない、
請求項１から１８のいずれかに記載の人工核酸、好ましくはＲＮＡ。
【請求項２０】
５’−キャップ構造、好ましくはｍ７ＧｐｐｐＮ又はＣａｐ１を含む請求項１から１９のいずれかに記載の人工核酸、好ましくはＲＮＡ。
【請求項２１】
少なくとも１つのヒストンステムループを含む請求項１から２０のいずれかに記載の人工核酸、好ましくはＲＮＡ。
【請求項２２】
前記少なくとも１つのヒストンステムループが、以下の式（Ｉ）又は（ＩＩ）に係る核酸配列を含む請求項２１に記載の人工核酸、好ましくはＲＮＡ：
式（Ｉ）（ステム境界エレメントを含まないステムループ配列）：
【化１】
2020513824.tif 000043
式（ＩＩ）（ステム境界エレメントを含むステムループ配列）：
【化２】
2020513824.tif 000044
式中、
ステム１又はステム２の境界エレメントＮ１−６は、１〜６個、好ましくは２〜６個、より好ましくは２〜５個、更により好ましくは３〜５個、最も好ましくは４〜５個、又は５個のＮの連続配列であり、各Ｎは、互いに独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、及びＣから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチド類似体から選択され、
ステム１［Ｎ０−２ＧＮ３−５］は、エレメントステム２に対して逆相補的であるか又は部分的に逆相補的であり、且つ５〜７個のヌクレオチドの連続配列であり、
Ｎ０−２は、０〜２個、好ましくは０〜１個、より好ましくは１個のＮの連続配列であり、各Ｎは、互いに独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、及びＣから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチド類似体から選択され、
Ｎ３−５は、３〜５個、好ましくは４〜５個、より好ましくは４個のＮの連続配列であり、各Ｎは、互いに独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、及びＣから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチド類似体から選択され、
Ｇは、グアノシン又はその類似体であり、任意に、シチジン又はその類似体によって置換されてもよいが、但し、その場合、ステム２におけるその相補的ヌクレオチドであるシチジンも、グアノシンによって置換され、
ループ配列［Ｎ０−４（Ｕ／Ｔ）Ｎ０−４］は、エレメントステム１とステム２との間に位置し、且つ３〜５個のヌクレオチド、より好ましくは４個のヌクレオチドの連続配列であり、
各Ｎ０−４は、互いに独立して、０〜４個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個のＮの連続配列であり、各Ｎは、互いに独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、及びＣから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチド類似体から選択され、
Ｕ／Ｔは、ウリジン又は任意にチミジンを表し、
ステム２［Ｎ３−５ＣＮ０−２］は、エレメントステム１に対して逆相補的であるか又は部分的に逆相補的であり、且つ５〜７個のヌクレオチドの連続配列であり、
Ｎ３−５は、３〜５個、好ましくは４〜５個、より好ましくは４個のＮの連続配列であり、各Ｎは、互いに独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、及びＣから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチド類似体から選択され、
Ｎ０−２は、０〜２個、好ましくは０〜１個、より好ましくは１個のＮの連続配列であり、各Ｎは、互いに独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、若しくはＣから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチド類似体から選択され、
Ｃは、シチジン又はその類似体であり、任意に、グアノシン又はその類似体によって置換されてもよいが、但し、その場合、ステム１におけるその相補的ヌクレオチドであるグアノシンも、シチジンによって置換され、
ステム１及びステム２が、互いに塩基対合でき、
逆相補的配列を形成して、塩基対合がステム１とステム２との間で生じ得る、又は
部分的に逆相補的な配列を形成して、不完全な塩基対合がステム１とステム２との間で生じ得る。
【請求項２３】
前記少なくとも１つのヒストンステムループが、以下の式（Ｉａ）又は（ＩＩａ）に係る核酸配列を含む請求項２１から２２のいずれかに記載の人工核酸、好ましくはＲＮＡ：
式（Ｉａ）（ステム境界エレメントを含まないステムループ配列）：
【化３】
2020513824.tif 000045
式（ＩＩａ）（ステム境界エレメントを含むステムループ配列）：
【化４】
2020513824.tif 000046
【請求項２４】
任意に、ポリ（Ａ）配列を含み、前記ポリ（Ａ）配列が、好ましくは１０〜２００、１０〜１００、４０〜８０、又は５０〜７０個のアデノシンヌクレオチドを含む請求項１から２３のいずれかに記載の人工核酸、好ましくはＲＮＡ。
【請求項２５】
任意に、ポリ（Ｃ）配列を含み、前記ポリ（Ｃ）配列が、好ましくは１０〜２００、１０〜１００、２０〜７０、２０〜６０、又は１０〜４０個のシトシンヌクレオチドを含む請求項１から２４のいずれかに記載の人工核酸、好ましくはＲＮＡ。
【請求項２６】
以下のエレメントを、好ましくは５’から３’方向に含む請求項１から２５のいずれかに記載の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ：
ａ）５’−キャップ構造、好ましくはｍ７ＧｐｐｐＮ又はＣａｐ１；
ｂ）請求項１から５のいずれかに定義される５’−ＵＴＲに由来する核酸配列を含む又はからなる、好ましくは配列番号１；３；５；７；９；１１；１３；１５；１７；１９；又は２１に係る核酸配列、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に対応する核酸配列を含む５’−ＵＴＲエレメント；
ｃ）請求項７から１３のいずれかに定義される少なくとも１つのコード配列；
ｄ）請求項１から５のいずれかに定義される３’−ＵＴＲに由来する核酸配列を含む又はからなる、好ましくは配列番号１５；１７；１９；２１；２９；３１；３３又は３５に係る核酸配列、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に対応する核酸配列を含む５’−ＵＴＲエレメント；
ｅ）任意に、ポリ（Ａ）テール、好ましくは１０〜１０００、１０〜５００、１０〜３００、１０〜２００、１０〜１００、４０〜８０、又は５０〜７０個のアデノシンヌクレオチドからなる；
ｆ）任意に、ポリ（Ｃ）テール、好ましくは１０〜２００、１０〜１００、２０〜７０、２０〜６０、又は１０〜４０個のシトシンヌクレオチドからなる；及び
ｇ）任意に、ヒストンステムループ（ＨＳＬ）。
【請求項２７】
請求項１から２６のいずれかに記載の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡと、薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤とを含むことを特徴とする組成物。
【請求項２８】
前記人工核酸分子、好ましくはＲＮＡが、１以上のカチオン性又はポリカチオン性化合物、好ましくはカチオン性又はポリカチオンポリマー、カチオン性又はポリカチオン性ペプチド又はタンパク質、例えば、プロタミン、カチオン性又はポリカチオン性多糖類、及び／又はカチオン性又はポリカチオン性脂質と複合体化される請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記人工核酸分子、好ましくはＲＮＡの、前記１以上カチオン性又はポリカチオン性ペプチド又はタンパク質に対するＮ／Ｐ比が、約０．３〜４、約０．５〜２、約０．７〜２、及び約０．７〜１．５の範囲を含む約０．１〜１０の範囲である請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
前記人工核酸分子、好ましくはＲＮＡが、１以上の脂質と複合体を形成し、それによってリポソーム、脂質ナノ粒子、及び／又はリポプレックスを形成する請求項２７から２９のいずれかに記載の組成物。
【請求項３１】
少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）又はそれをコードする核酸を更に含み、前記ｇＲＮＡが、対象の標的ＤＮＡ配列又はそれに機能可能に連結された調節エレメントにＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を標的化することができる請求項２７から３０のいずれかに記載の組成物。
【請求項３２】
請求項１から２６のいずれかに記載の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ、又は請求項２７から３１のいずれかに記載の組成物、及び任意に液体ビヒクル及び／又は任意に前記人工核酸分子又は前記組成物の投与及び用量に関する情報を含む技術的指示を含むことを特徴とするキット、好ましくはキットオブパーツ。
【請求項３３】
リンゲルラクタート溶液を一部として含む請求項３２に記載のキット。
【請求項３４】
ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）又はそれをコードする核酸を更に含み、前記ｇＲＮＡが、対象の標的ＤＮＡ配列又はそれに機能可能に連結された調節エレメントにＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を標的化することができる請求項３２から３３のいずれかに記載のキット。
【請求項３５】
医薬として使用するための、請求項１から２６のいずれかに記載の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ、請求項２７から３１のいずれかに記載の組成物、又は請求項３２から３４に記載のキット。
【請求項３６】
遺伝子治療において使用するための、請求項１から２６のいずれかに記載の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ、請求項２７から３１のいずれかに記載の組成物、又は請求項３２から３４に記載のキット。
【請求項３７】
（ａ）前記人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ、前記組成物、又は前記キット、及び（ｂ）ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）又はそれをコードする核酸を、それを必要とする患者に投与することを含み、前記ｓｇＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を目的遺伝子、又はそれに機能可能に連結された調節エレメントに標的化することができる、目的遺伝子の発現を調節する方法における使用のための請求項１から２６のいずれかに記載の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ、請求項２７から３１のいずれかに記載の組成物、又は請求項３２から３４に記載のキット。
【請求項３８】
医薬として使用するための、又は前記少なくとも１つのコード配列によってコードされるＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質の発現による治療が有効な疾患、障害、又は状態における遺伝子治療における使用のための、請求項１から２６のいずれかに記載の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ、請求項２７から３１のいずれかに記載の組成物、又は請求項３２から３４に記載のキット。
【請求項３９】
医薬として使用するための、又は目的遺伝子をノックイン、ノックアウト、又は操作する又は目的遺伝子の発現を調節することが有効である疾患、障害、又は状態の遺伝子治療において使用するための、請求項１から２６のいずれかに記載の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ、請求項２７から３１のいずれかに記載の組成物、又は請求項３２から３４に記載のキット。
【請求項４０】
前記疾患、障害、又は状態が、遺伝病、癌、自己免疫疾患、炎症性疾患、及び感染症から選択される請求項３９に記載の使用のための人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ、組成物、又はキット。
【請求項４１】
前記コードされたＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質の発現を、任意に遺伝子治療において、上昇させるための、請求項１から２６のいずれかに記載の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ、請求項２７から３１のいずれかに記載の組成物、又は請求項３２から３４に記載のキットの使用。
【請求項４２】
前記コードされたＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質によって標的化される目的遺伝子の発現を調節するための、請求項１から２６のいずれかに記載の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ、請求項２７から３１のいずれかに記載の組成物、又は請求項３２から３４に記載のキットの使用。
【請求項４３】
ａ）請求項１から２６のいずれかに記載の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡを提供する工程と；
ｂ）ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を目的の標的ＤＮＡ配列、又はそれに機能可能に連結された調節エレメントを標的にすることができるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）又はそれをコードする核酸を提供する工程と；
ｃ）目的遺伝子の発現効率を調節するのに適した条件下で、細胞、組織、又は生物を、前記人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ、及び、前記ｇＲＮＡ又はそれをコードする核酸に接触させる工程とを含む目的遺伝子の発現を調節することを特徴とする方法。
【請求項４４】
障害を治療又は予防する方法であって、それを必要とする被験体に、請求項１から２６のいずれかに記載の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ、請求項２７から３１のいずれかに記載の組成物、又は請求項３２から３４に記載のキットの有効量と、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を目的の標的ＤＮＡ配列又はそれに機能可能に連結された調節エレメントに標的化することができるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）又はそれをコードする核酸とを投与することを含むことを特徴とする方法。
【請求項４５】
前記障害が、前記コードされたＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質の発現による治療が有効な、好ましくは前記ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質が標的とする目的遺伝子の発現の調節による治療が有効な疾患、障害、又は状態である請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記障害が、目的遺伝子をノックイン、ノックアウト、若しくは操作する、又は目的遺伝子の発現を変化させることが有効である疾患、障害、又は状態である請求項４４から４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードするコード領域を含む人工核酸分子、好ましくはＲＮＡの発現効率を上昇させるための方法であって、
（ａ）前記コード領域を、ＡＴＰ５Ａ１、ＲＰＬ３２、ＨＳＤ１７Ｂ４、ＳＬＣ７Ａ３、ＮＯＳＩＰ、又はＮＤＵＦＡ４からなる群から選択される遺伝子の５’ＵＴＲ、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、又は変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメントと会合させることと；
（ｂ）前記コード領域を、ＧＮＡＳ、ＣＡＳＰ１、ＰＳＭＢ３、ＡＬＢ、又はＲＰＳ９からなる群から選択される遺伝子の３’ＵＴＲ、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、又は変異体に由来する少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントと会合させることと；
（ｃ）請求項１から４６のいずれかに記載の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡを得ることとを含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする人工核酸、特にＲＮＡ、並びにそれを含む（医薬）組成物及びキットオブパーツに関する。前記人工核酸、特にＲＮＡ、（医薬）組成物及びキットは、医学（例えば、遺伝子治療）における使用、及び、特にＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質による治療（例えば、遺伝子編集、ノックイン、ノックアウト、又は目的の標的遺伝子の発現調節による治療）が有効な疾患の治療及び／又は予防における使用が特に想定される。
【０００２】
ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化した規則的に散在した短い回文）−Ｃａｓシステムは、アンチセンスＲＮＡを使用して配列特異的に外来ＤＮＡを認識し切断することにより、侵入ＤＮＡエレメント（例えば、ウイルス、プラスミド）に対する適応免疫防御を細菌及び古細菌に付与する。最新の分類では、多様なＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、そのエフェクターの構成にしたがい、以下の２つのクラスに分類される。即ち、クラス１のＣＲＩＳＰＲシステムは、幾つかのＣａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）タンパク質と、ガイドＲＮＡとしてＣＲＩＳＰＲ−ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とを利用し、エフェクター複合体を形成する。一方、クラス２のＣＲＩＳＰＲシステムは、ｃｒＲＮＡと組み合わせて大型の単一成分Ｃａｓタンパク質を利用し、外来ＤＮＡエレメントとの干渉を媒介する。タイプＩ及びタイプＩＩＩシステムを含む複数のクラス１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムが同定され、詳細に機能的に特徴付けられている。これまでに同定され、実験的に特徴付けられている大部分のクラス２  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、エフェクターとしてＣａｓ９ファミリーの相同ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼを使用し、これは、ｃｒＲＮＡ及びトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）或いは合成シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と共にマルチドメインエンドヌクレアーゼとして機能し、侵入する標的ＤＮＡの両方の鎖を切断する（非特許文献１及び２）。
【０００３】
ネイティブのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９タイプＩＩシステムは、本質的に３段階で機能する。外来ＤＮＡに曝露すると、短い外来ＤＮＡ配列（プロトスペーサー）がＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の短い回文の間の細菌ゲノムに組み込まれる。プロトスペーサーに近接する短い一続きの保存ヌクレオチド（プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ））が、プロトスペーサーの獲得（獲得又は適応段階）に使用される。続いて、宿主原核生物は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を転写及び処理して、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と共に、ＣＲＩＳＰＲ反復エレメント及び以前の非自己ＤＮＡエレメントに対応する外来ＤＮＡの組み込まれたスペーサー遺伝子セグメントの両方を含む成熟ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を生成する（発現又は成熟工程）。最後に、ｃｒＲＮＡ及びＣａｓ９はｔｒａｃｒＲＮＡと会合して、ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ：Ｃａｓ９複合体を生じ、これが、侵入ＤＮＡ中の相補的配列と会合する。次いで、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を標的ＤＮＡに導入する（干渉段階）（非特許文献１）。
【０００４】
哺乳動物細胞は、非相同末端結合法（ＮＨＥＪ）又は相同性指向修復（ＨＤＲ）のいずれかによりＤＳＢに応答する。ＮＨＥＪは、短い一続きのヌクレオチド塩基の無作為な挿入又は欠失を導入し、遺伝子突然変異及び機能喪失効果をもたらし得る。ＨＤＲにおいて、ＤＮＡ二本鎖切断の両側に隣接する配列と相同性を有する領域を有するＤＮＡセグメントの導入は、宿主細胞の機構による修復をもたらす（非特許文献１）。
【０００５】
暫定的にタイプＶに割り当てられる、第２の推定クラス２ＣＲＩＳＰＲシステムは、近年幾つかの細菌ゲノムで同定されている。推定タイプＶ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、Ｃｐｆ１又はＣａｓ１２（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  １のＣＲＩＳＰＲ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ  ＢＶ３Ｌ６（ＡｓＣｐｆ１）、及びＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＮＤ２００６（ＬｂＣｐｆ１））と呼ばれる大きな〜１，３００個のアミノ酸タンパク質を含む。Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９用の〜１００ｎｔのガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡ）に代えて、その標的ＤＮＡ配列を認識して結合する短いｃｒＲＮＡを１つだけ必要とする。即ち、Ｃｐｆ１は通常、その３’末端に、標的ＤＮＡ配列のプロトスペーサーと相補的である２３ｎｔを有する単一の４２ｎｔと、プロトスペーサーの５’にＴＴＴＮ  ＰＡＭを示し、ｓｐＣａｓ９の平滑末端に対してＤＳＢ５’オーバーハングとして生成する。Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９システムの標的ＤＮＡに続くＧリッチＰＡＭではなく、短いＴリッチプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）が先行する標的ＤＮＡを効率的に切断する。第三に、Ｃｐｆ１は、４又は５ｎｔの５’オーバーハングを有するスタガーＤＮＡ二本鎖切断を導入する（非特許文献３）。ヒト細胞におけるＣｐｆ１のオンターゲット効率はｓｐＣａｓ９に匹敵し、Ｃｐｆ１はオフターゲット切断を全く示さないか又は低下させる。
【０００６】
哺乳動物ゲノムにおけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの適用以来、この技術は急速に進化している：エンドヌクレアーゼ活性を示さない触媒的に不活性又は「死んだ」Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）は、目的のＤＮＡ配列を標的とする適切なｇＲＮＡによって特異的に動員され得る。そのようなＣａｓタンパク質並びにそれらの変異体及び誘導体は、用途が広く、配列特異的且つ非変異原性の遺伝子調節ツールとして特に興味深い。例えば、適切なｇＲＮＡを使用して、転写抑制又は活性化ドメインを有するｄＣａｓ９誘導体を標的遺伝子に標的とし、転写抑制（ＣＲＩＳＰＲ干渉、ＣＲＩＳＰＲｉと呼ばれる）又は活性化（ＣＲＩＳＰＲ活性化、ＣＲＩＳＰＲａと呼ばれる）をもたらすことができる。
【０００７】
これらの連続的な革新により、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、ゲノム工学に広く適応するようになっている。目的の標的遺伝子に特異的なｇＲＮＡは容易に調製できるので、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは多用途で容易にカスタマイズできる一方で、Ｃａｓタンパク質は修飾を必要としない。複数の遺伝子座は、幾つかのｇＲＮＡを導入することによって容易に標的化され得る（「多重化」）。
【０００８】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、細菌及び真核生物におけるゲノム編集及び転写活性化／抑制のための頑健で多用途且つ正確なツールとして首尾よく採用されており、研究及び治療目的のための有望な新しいアプローチの開発を刺激している。しかしながら、その多数の利点にもかかわらず、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの適用は、しばしば、Ｃａｓタンパク質の不十分な発現によって妨げられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｓａｎｄｅｒ  ａｎｄ  Ｊｏｕｎｇ，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４  Ａｐｒ；３２（４）：３４７−３５５
【非特許文献２】Ｂｏｅｔｔｃｈｅｒ  ａｎｄ  ＭｃＭａｎｕｓ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．２０１５  Ｍａｙ  ２１；５８（４）：５７５−５８５
【非特許文献３】Ｚｅｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｅｌｌ．  ２０１５  Ｏｃｔ  ２２；１６３（３）：７５９−７７１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、これらの必要性を満たし、癌、感染症、並びに本明細書中に定義された他の疾患及び状態を治療するための改善された治療アプローチを提供することである。本発明の根底にある課題は、特許請求された主題によって解決される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、実施例１（インセルウェスタン）で詳述されるように、ＨｅＬａ細胞のＣａｓ９の発現レベルに対する様々なＵＴＲの組合せの効果を示す。ｙ軸は、ＵＴＲの組合せＲＰＬ３２／ＡＬＢ７．１の場合に１００％の発現レベルを示すように正規化されている。
【図２】図２は、実施例２（インセルウェスタン）で詳述されるように、Ｈｅｋ２９３Ｔ細胞のＣａｓ９の発現レベルに対する様々なＵＴＲの組合せの効果を示す。ｙ軸は、ＵＴＲの組合せＲＰＬ３２／ＡＬＢ７．１の場合に１００％の発現レベルを示すように正規化されている。
【図３】図３は、実施例１（ウェスタンブロット）で詳述されるように、ＨｅｐＧ２細胞のＣａｓ９の発現レベルに対する様々なＵＴＲの組合せの効果を示す。ｙ軸は、ＵＴＲの組合せＲＰＬ３２／ＡＬＢ７．１の場合に１００％の発現レベルを示すように正規化されている。
【図４】図４は、実施例２（ウェスタンブロット）で詳述されるように、ＨｅＬａ細胞における最適化されたｓｐＣａｓ９  ｍＲＮＡ構築物の発現レベルを示す。ｙ軸は、ＵＴＲの組合せＲＰＬ３２／ＡＬＢ７．１の場合に１００％の発現レベルを示すように正規化されている。
【図５】図５は、実施例２（インセルウェスタン）で詳述されるように、ＨｅＬａ細胞における最適化されたｓｐＣａｓ９  ｍＲＮＡ構築物の発現レベルを示す。ｙ軸は、ＵＴＲの組合せＲＰＬ３２／ＡＬＢ７．１の場合に１００％の発現レベルを示すように正規化されている。
【図６】図６は、実施例１（インセルウェスタン）で詳述されるように、ＨｅＬａ細胞における最適化されたｓｐＣａｓ９  ｍＲＮＡ構築物の発現レベルを、市販のＣａｓ９  ｍＲＮＡと比較して示す。ｙ軸は、市販のＣａｓ９  ｍＲＮＡの場合に１００％の発現レベルを示すように正規化されている。
【図７】図７は、実施例１（インセルウェスタン）で詳述されるように、ＨｅＬａ細胞における最適化されたｓｐＣａｓ９  ｍＲＮＡ構築物の発現レベルを示す。ｙ軸は、ＵＴＲの組合せＲＰＬ３２／ＡＬＢ７．１の場合に１００％の発現レベルを示すように正規化されている。
【図８】図８は、実施例２（インセルウェスタン）で詳述されるように、Ｈｅｋ２９３Ｔ細胞における最適化されたｓｐＣａｓ９  ｍＲＮＡ構築物の発現レベルを、市販のＣａｓ９  ｍＲＮＡと比較して示す。
【図９】図９は、実施例２（ウェスタンブロット）で詳述されるように、ＨｅｐＧ２細胞における最適化されたｓｐＣａｓ９  ｍＲＮＡ構築物の発現レベルを、市販のＣａｓ９  ｍＲＮＡと比較して示す。ｙ軸は、市販のＣａｓ９  ｍＲＮＡの場合に１００％の発現レベルを示すように正規化されている。
【図１０】図１０は、ミスマッチヌクレアーゼアッセイ／ミスマッチ検出アッセイにより実施例３に詳述されるように、ｍＲＮＡ構築物から発現されたｓｐＣａｓ９のＤＮＡ編集活性を示す。Ａ：ＰＣＲ増幅、Ｂ：ミスマッチ検出アッセイ。
【図１１】図１１は、％でのＲＰＬ３２／ＡＬＢ７に対する、ＨｅｐＧ２における最適化されたＣｐｆ１  ｍＲＮＡ構築物の発現レベルを示す。ｙ軸は、ＲＰＬ３２／ＡＬＢ７  ＵＴＲの組合せＣｐｆ１  ｍＲＮＡの場合に１００％の発現レベルを示すように正規化されている。
【図１２】図１２は、％でのＲＰＬ３２／ＡＬＢ７に対する、ＨｅＬａにおける最適化されたＣｐｆ１  ｍＲＮＡ構築物の発現レベルを示す。ｙ軸は、ＲＰＬ３２／ＡＬＢ７  ＵＴＲの組合せＣｐｆ１  ｍＲＮＡの場合に１００％の発現レベルを示すように正規化されている。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明について以下に詳細に説明するが、この発明は本明細書に記載する特定の方法、プロトコル、及び試薬に限定されるものではない（これらは変更し得る）ことを理解すべきである。また、本明細書で使用される用語は、本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解すべきである。特に規定しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者が一般的に理解する意味と同じ意味を有する。
【００１３】
以下に、本発明の構成要素について説明する。これら構成要素は、特定の実施形態と共に列挙されるが、これらを任意の方式で任意の数組み合わせて更なる実施形態を生み出すことができると理解すべきである。様々に記載される実施例及び好ましい実施形態は、本発明を明示的に記載される実施形態のみに限定すると解釈すべきではない。この説明は、明示的に記載される実施形態を、任意の数の開示する及び／又は好ましい構成要素と組み合わせた実施形態をサポート及び包含すると理解すべきである。更に、特に文脈上示されていない限り、本願に記載する全ての構成要素の任意の順序及び組合せが、本願の記載によって開示されているとみなすべきである。
【００１４】
特に文脈上必要としない限り、以下の本明細書及び特許請求の範囲全体を通して、用語「含む」並びに「含み」及び「含んでいる」などの変形は、指定の部材、整数、又は工程を含むことを意味するが、任意の他の指定されていない部材、整数、又は工程を除外するものではないと理解される。用語「からなる」は、任意の他の指定されていない部材、整数、又は工程が除外される、用語「含む」の特定の実施形態である。本発明の状況では、用語「含む」は、用語「からなる」を包含する。したがって、用語「を含む」は、「を含める」及び「からなる」を包含し、例えば、Ｘ「を含む」組成物は、Ｘのみからなっていてもよく、追加の要素を含んでいてもよい（例えば、Ｘ＋Ｙ）。
【００１５】
用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」、並びに（特に、特許請求の範囲において）本発明を説明する際に用いる類似の参照物は、本明細書において特に指定しない限り又は文脈上明らかに矛盾していない限り、単数及び複数の両方を網羅すると解釈すべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、単に、範囲内の各個別の値に個々に参照する簡略な方法として機能することを意図する。本明細書において特に指定しない限り、各個別の値は、それが個々に本明細書に列挙されているかのように明細書に組み込まれる。明細書中の如何なる言語も、本発明の実施に必須である任意の請求されていない構成要素を示すと解釈すべきではない。
【００１６】
用語「実質的に」は、「完全に」を除外するものではなく、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含んでいなくてもよい。必要な場合、用語「実質的に」を本発明の定義から省略する場合がある。
【００１７】
数値ｘに関する用語「約」は、ｘ±１０％を意味する。
【００１８】
本発明においては、特に断りのない限り、代替及び実施形態の異なる特徴を互いに組み合わせてもよい。
【００１９】
明確に且つ読みやすくするために、以下の定義を提供する。これら定義について言及される任意の技術的特徴は、本発明の各実施形態及び全実施形態において読み取ることができる。これら実施形態に関連して更なる定義及び説明を具体的に提供する場合がある。
【００２０】
定義
人工核酸分子：人工核酸分子は、典型的に、自然界には存在しない核酸分子（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）であると理解してよい。言い換えれば、人工核酸分子は、非天然核酸分子として理解してよい。かかる核酸分子は、その個々の配列（自然界には存在しない）及び／又は他の修飾（例えば、自然界には存在しないヌクレオチドの構造的修飾）から非天然であり得る。人工核酸分子は、ＤＮＡ分子であってもよく、ＲＮＡ分子であってもよく、ＤＮＡ部分とＲＮＡ部分とを含むハイブリッド分子であってもよい。典型的に、人工核酸分子は、所望の人工ヌクレオチド配列（異種配列）に相当するように遺伝子修飾方法によって設計及び／又は作製することができる。これに関連して、人工配列は、通常、自然界には存在し得ない配列である、即ち、少なくとも１つのヌクレオチドが野生型配列とは異なる。用語「野生型」とは、自然界に存在する配列であると理解してよい。更に、用語「人工核酸分子」の意味は、「１つの単一分子」には限定されず、典型的に、同一分子の集合体を含むと理解される。したがって、人工核酸分子とは、アリコートに含有されている複数の同一分子に関する場合もある。
【００２１】
ＤＮＡ：ＤＮＡは、デオキシリボ核酸の一般的な略称である。ＤＮＡは、核酸分子、即ち、ヌクレオチドからなるポリマーである。これらヌクレオチドは、通常、デオキシアデノシン一リン酸、デオキシチミジン一リン酸、デオキシグアノシン一リン酸、及びデオキシシチジン一リン酸のモノマーであり、これらは、単独で、糖部分（デオキシリボース）、塩基部分、及びリン酸部分で構成され、特徴的な骨格構造によって重合する。前記骨格構造は、典型的に、第１のヌクレオチドの糖部分（即ち、デオキシリボース）と、隣接する第２のモノマーのリン酸部分との間のホスホジエステル結合によって形成される。モノマーの特定の順序、即ち、糖／リン酸骨格に結合している塩基の順序が、ＤＮＡ配列と呼ばれる。ＤＮＡは、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。二本鎖形態では、第１の鎖のヌクレオチドは、典型的に、例えばＡ／Ｔ塩基対合及びＧ／Ｃ塩基対合によって第２の鎖のヌクレオチドとハイブリダイズする。
【００２２】
異種配列：２つの配列は、典型的に、同一の遺伝子に由来していない場合、「異種」であると理解される。即ち、異種配列は、同一の生物に由来し得たとしても、天然で（自然界で）同一の核酸分子（例えば、同一のｍＲＮＡ）中に存在することはない。
【００２３】
クローニングサイト：クローニングサイトは、典型的に、核酸配列、例えば、オープンリーディングフレームを含む核酸配列の挿入に好適である核酸分子のセグメントであると理解される。挿入は、例えば、制限酵素処理及びライゲーションによって当業者に公知の任意の分子生物学的方法によって実施してよい。クローニングサイトは、典型的に、１以上の制限酵素認識部位（制限酵素部位）を含む。これら１以上の制限酵素部位は、これら部位においてＤＮＡを切断する制限酵素によって認識され得る。１超の制限酵素部位を含むクローニングサイトは、マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）又はポリリンカーと呼ばれる場合もある。
【００２４】
核酸分子：核酸分子は、核酸成分を含む、好ましくは核酸成分からなる分子である。核酸分子という用語は、好ましくは、ＤＮＡ又はＲＮＡの分子を指す。好ましくは、用語「ポリヌクレオチド」と同義的に用いられる。好ましくは、核酸分子は、糖／リン酸骨格のホスホジエステル結合によって互いに共有結合しているヌクレオチドモノマーを含むか又はからなるポリマーである。また、用語「核酸分子」は、例えば、塩基が修飾されている、糖が修飾されている、又は骨格が修飾されているＤＮＡ又はＲＮＡの分子などの修飾核酸分子も含む。
【００２５】
オープンリーディングフレーム：本発明におけるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、典型的に、ペプチド又はタンパク質に翻訳され得る幾つかのヌクレオチドトリプレットの配列であってよい。オープンリーディングフレームは、好ましくは、その５’末端における開始コドン、即ち、通常アミノ酸メチオニンをコードしている３つの連続するヌクレオチドの組合せ（ＡＴＧ）と、その後に、通常３の倍数である長さのヌクレオチドを有する領域とを含む。ＯＲＦは、好ましくは、終止コドン（例えば、ＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡ）によって終結する。典型的に、これは、オープンリーディングフレームの唯一の終止コドンである。したがって、本発明におけるオープンリーディングフレームは、好ましくは、開始コドン（例えば、ＡＴＧ）で始まり、好ましくは、終止コドン（例えば、ＴＡＡ、ＴＧＡ、又はＴＡＧ）で終結する、３で割り切れる多数のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列である。オープンリーディングフレームは、単離することができたり、例えば、ベクター又はｍＲＮＡにおけるより長い核酸配列に組み込むことができたりする。また、オープンリーディングフレームは、「（タンパク質）コード配列」、又は好ましくは「コード配列」と呼ばれる場合もある。
【００２６】
ペプチド：ペプチド又はポリペプチドは、典型的に、ペプチド結合によって連結されているアミノ酸モノマーのポリマーである。典型的に、５０個未満のモノマーユニットを含む。しかし、ペプチドという用語は、５０個超のモノマーユニットを有する分子を除外するものではない。また、典型的に５０〜６００個のモノマーユニットを有する長いペプチドは、ポリペプチドとも呼ばれる。
【００２７】
タンパク質：タンパク質は、典型的に、１以上のペプチド又はタンパク質を含む。タンパク質は、典型的に、３次元形態に折り畳まれており、このことは、タンパク質がその生物学的機能を発揮するのに必要である場合がある。
【００２８】
制限酵素部位：「制限酵素認識部位」とも呼ばれる制限酵素部位は、制限酵素によって認識されるヌクレオチド配列である。制限酵素部位は、典型的に短く、好ましくは、回文構造のヌクレオチド配列、例えば、４〜８個のヌクレオチドを含む配列である。制限酵素部位は、好ましくは、制限酵素によって特異的に認識される。制限酵素は、典型的に、この部位において制限酵素部位を含むヌクレオチド配列を切断する。二本鎖ＤＮＡ配列などの二本鎖ヌクレオチド配列では、制限酵素は、典型的に、ヌクレオチド配列の両方の鎖を切断する。
【００２９】
ＲＮＡ、ｍＲＮＡ：ＲＮＡは、リボ核酸の一般的な略称である。ＲＮＡは、核酸分子、即ち、ヌクレオチドからなるポリマーである。これらヌクレオチドは、通常、所謂骨格に沿って互いに結合しているアデノシン一リン酸、ウリジン一リン酸、グアノシン一リン酸、及びシチジン一リン酸のモノマーである。骨格は、第１のモノマーの糖（即ち、リボース）と第２の隣接するモノマーのリン酸部分との間のホスホジエステル結合によって形成される。特定の連続するモノマーをＲＮＡ配列と呼ぶ。通常、ＲＮＡは、例えば、細胞内部のＤＮＡ配列の転写によって得ることができる。真核細胞では、転写は、通常、核又はミトコンドリア内部で実施される。インビボでは、ＤＮＡの転写により、通常、所謂未成熟ＲＮＡが得られ、これは、所謂メッセンジャーＲＮＡ（通常、ｍＲＮＡと略される）にプロセシングされなければならない。例えば、真核生物における未成熟ＲＮＡのプロセシングは、スプライシング、５’−キャッピング、ポリアデニル化、核又はミトコンドリアからのエクスポートなどの様々な異なる転写後修飾を含む。これらプロセス全体をＲＮＡの成熟とも呼ぶ。成熟メッセンジャーＲＮＡは、通常、特定のペプチド又はタンパク質のアミノ酸配列に翻訳され得るヌクレオチド配列を提供する。典型的に、成熟ｍＲＮＡは、５’−キャップ、５’−ＵＴＲ、オープンリーディングフレーム、３’−ＵＴＲ、及びポリ（Ａ）配列を含む。メッセンジャーＲＮＡは別として、転写及び／又は翻訳の制御に関与し得る幾つかの非コード型のＲＮＡが存在する。
【００３０】
核酸分子の配列：核酸分子の配列は、典型的に、そのヌクレオチドの特定の及び個々の順序、即ち、連続物であると理解される。タンパク質又はペプチドの配列は、典型的に、そのアミノ酸の順序、即ち、連続物であると理解される。
【００３１】
配列同一性：同じ長さ及び順序のヌクレオチド又はアミノ酸を有する場合、２以上の配列は同一である。同一性の割合は、典型的に、２つの配列が同一である程度について説明する。即ち、典型的に、その配列位置においてレファレンス配列の同一ヌクレオチドと一致するヌクレオチドの割合について説明するものである。同一性の程度（「同一性％」）を決定する場合、典型的には、比較する配列は、同じ長さ、即ち、比較する配列のうちの最長の配列の長さを有するとみなされる。これは、８ヌクレオチドからなる第１の配列が、前記第１の配列を含む１０ヌクレオチドからなる第２の配列と８０％同一であることを意味する。言い換えれば、本発明において、配列同一性は、好ましくは、同じ長さを有する２以上の配列において配列のうちの同一位置を有するヌクレオチド又はアミノ酸の割合に関する。具体的には、２つのアミノ酸配列又は２つの核酸配列の「同一性％」は、最適な比較目的のために配列を整列させ（例えば、他方の配列との最良のアラインメントを得るために、いずれかの配列にギャップを導入することができる）、対応する位置のアミノ酸又はヌクレオチドを比較することによって決定できる。ギャップは、アラインメントにおけるその実際の位置にかかわらず、通常、非同一位置であるとみなされる。「最良のアラインメント」は、典型的には最高の同一性パーセントをもたらす２つの配列のアラインメントである。同一性パーセントは、比較される配列中の同一ヌクレオチドの数によって決定される（即ち、同一性％＝同一位置の＃／位置の合計＃×１００）。２つの配列間の同一性パーセントの決定は、当業者に知られている数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。
【００３２】
安定化核酸分子：安定化核酸分子は、例えば、環境因子又はエキソヌクレアーゼ若しくはエンドヌクレアーゼによる分解などの酵素分解によって、修飾されていない核酸分子よりも崩壊又は分解に対して安定であるように修飾されている核酸分子、好ましくはＤＮＡ又はＲＮＡの分子である。好ましくは、本発明における安定化核酸分子は、細胞（例えば、原核細胞又は真核細胞）、好ましくは哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞）において安定化される。また、安定化効果は、例えば、安定化核酸分子を含む医薬組成物の製造過程において、細胞外、例えば、バッファ溶液中などでも発揮され得る。
【００３３】
トランスフェクション：用語「トランスフェクション」は、ＤＮＡ又はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の分子などの核酸分子を細胞、好ましくは真核細胞に導入することを指す。本発明において、用語「トランスフェクション」は、核酸分子を細胞、好ましくは真核細胞、例えば哺乳類細胞に導入するための当業者に公知の任意の方法を含む。かかる方法は、例えば、エレクトロポレーション、（例えば、カチオン性脂質及び／又はリポソームに基づく）リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ナノ粒子に基づくトランスフェクション、ウイルスに基づくトランスフェクション、又はカチオン性ポリマー（例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン又はポリエチレンイミンなど）に基づくトランスフェクションを含む。好ましくは、非ウイルス的に導入される。
【００３４】
ベクター：用語「ベクター」は、核酸分子、好ましくは人工核酸分子を指す。本発明におけるベクターは、オープンリーディングフレームを含む核酸配列などの所望の核酸配列を組み込むか又は有するのに好適である。かかるベクターは、ストレージベクター、発現ベクター、クローニングベクター、トランスファーベクターなどであってよい。ストレージベクターは、核酸分子、例えば、ｍＲＮＡ分子を便利に保管することができるベクターである。したがって、このベクターは、例えば、所望のｍＲＮＡ配列又はその一部に相当する配列（例えば、ｍＲＮＡの３’−ＵＴＲ及びコード配列に相当する配列）を含んでいてよい。発現ベクターは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）、又はペプチド、ポリペプチド、若しくはタンパク質などの発現産物を産生するために用いることができる。例えば、発現ベクターは、プロモータ配列（例えば、ＲＮＡポリメラーゼプロモータ配列）などのベクターの一続きの配列の転写に必要な配列を含んでいてよい。クローニングベクターは、典型的に、核酸配列をベクターに組み込むために用いることができるクローニングサイトを含むベクターである。クローニングベクターは、例えば、プラスミドベクター又はバクテリオファージベクターであってよい。トランスファーベクターは、細胞又は生物に核酸分子を移入するのに好適なベクター、例えば、ウイルスベクターであってよい。本発明におけるベクターは、例えば、ＲＮＡベクターであってもＤＮＡベクターであってもよい。好ましくは、ベクターは、ＤＮＡ分子である。好ましくは、本願の意味におけるベクターは、クローニングサイト、選択マーカー（例えば、抗生物質耐性因子）、及びベクターの増殖に好適な配列（例えば、複製起点）を含む。
【００３５】
ビヒクル：ビヒクルは、典型的に、化合物（例えば、薬学的に活性のある化合物）を保管、輸送、及び／又は投与するのに好適な材料であると理解される。例えば、薬学的に活性のある化合物を保管、輸送、及び／又は投与するのに好適な生理学的に許容できる液体であってよい。
【００３６】
本発明は、特定の３’及び／又は５’ＵＴＲエレメントが、コード配列、具体的には、Ｃａｓ９又はＣｐｆ１などのＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質をコードするものの発現増加を媒介し得るという驚くべき発見に部分的に基づく。本発明者らは、具体的には、３’及び５’ＵＴＲエレメントの特定の組合せが、所望の発現プロファイル及び発現タンパク質の量を提供するのに有利であることを特に発見した。特に、ゲノムＤＮＡの曝露を最小限としオフターゲット効果（即ち、任意の１以上の標的、遺伝子、又は細胞転写物に対する意図しない効果）を低減するために、短期間（約２４時間、「パルス発現」）の高いＣａｓタンパク質発現が多くの用途に望ましい場合がある。ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする人工核酸におけるそのような３’及び５’ＵＴＲエレメントの相乗作用は、大量のこのようなタンパク質の一過性発現がインビトロ又はインビボで望まれる場合に特に有益である。したがって、そのような人工核酸は、特に、突然変異、遺伝子ノックアウト又はノックインを導入すること、又は目的の遺伝子の発現を調節することによって治療に適し得る様々な治療用途に役立つ。
【００３７】
したがって、第１の態様において、本発明は、ａ．少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする少なくとも１つのコード領域と；ｂ．ＡＴＰ５Ａ１、ＲＰＬ３２、ＨＳＤ１７Ｂ４、ＳＬＣ７Ａ３、ＮＯＳＩＰ、及びＮＤＵＦＡ４からなる群から選択される遺伝子の５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメントと；ｃ．ＧＮＡＳ、ＣＡＳＰ１、ＰＳＭＢ３、ＡＬＢ、及びＲＰＳ９からなる群から選択される遺伝子の３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）に由来する少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントとを含む人工核酸分子に関する。
【００３８】
「ＵＴＲ」という用語は、本明細書に定義される人工核酸のコード配列に隣接する「非翻訳領域」を意味する。この文脈において、「ＵＴＲエレメント」は、好ましくは本明細書に例示されるように、特定遺伝子の（天然に存在する野生型の）ＵＴＲに由来する核酸配列を含む又はからなる。
【００３９】
特定のＵＴＲに「由来する」ＵＴＲエレメントに言及するとき、前記ＵＴＲの配列（「親ＵＴＲ」）又は前記ＵＴＲのホモログ、変異体、若しくは断片に対応する核酸配列が言及される。この用語は、前記ＵＴＲ又はそのホモログ、変異体、若しくは断片の完全（完全長）野生型配列に対応する配列を含み、完全長ホモログ及び変異体、前記完全長野生型配列、ホモログ、及び変異体の断片、前記断片の変異体を含む。「対応する」という用語は、「親ＵＴＲ」に由来する核酸配列がＲＮＡ配列（例えば、前記親ＵＴＲ配列を規定するために使用されるＲＮＡ配列に等しい）、又は、そのようなＲＮＡ配列に対応するＤＮＡ配列（センス鎖及びアンチセンス鎖の両方並びに成熟及び未成熟の両方）であり得ることを意味する。
【００４０】
遺伝子のＵＴＲ「又はそのホモログ、断片、若しくは変異体」に由来するＵＴＲエレメントに言及するとき、表現「又はそのホモログ、断片、若しくは変異体」は、遺伝子、又はＵＴＲ、或いはその両方を意味することがある。
【００４１】
遺伝子（又はそれに由来する、又はＵＴＲのような前記遺伝子に含まれる核酸配列）の文脈における「ホモログ」という用語は、共通の祖先ＤＮＡ配列に由来する第２の遺伝子（又はそのような核酸配列）に関連する遺伝子（又はそれに由来する、又は前記遺伝子に含まれる核酸配列）を意味する。用語「ホモログ」は、種分化の事象によって分離した遺伝子（「オルソログ」）及び遺伝的重複の事象によって分離した遺伝子（「パラログ」）を含む。
【００４２】
遺伝子の核酸配列の文脈における「変異体」という用語は、核酸配列変異体、即ち、参照（又は「親」）核酸又は遺伝子の参照（又は「親」）核酸配列と、少なくとも１つの核酸が異なる核酸配列を含む核酸配列又は遺伝子を意味する。したがって、変異体核酸又は遺伝子は、それらのそれぞれの参照配列と比較して、好ましくは、それらの核酸配列中に少なくとも１つの突然変異、置換、挿入、又は欠失を含み得る。好ましくは、本明細書に使用される「変異体」という用語は、天然に存在する変異体、及び核酸配列又は遺伝子の操作された変異体を含む。したがって、本明細書に定義される「変異体」は、参照核酸配列に由来する、それから単離される、それに基づく、又はそれと相同であり得る。「変異体」は、それぞれの天然に存在する（野生型）核酸配列若しくは遺伝子、又はそのホモログ、断片、若しくは誘導体の核酸配列に対して、好ましくは少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有することができ、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有することができる。
【００４３】
核酸配列又は遺伝子の文脈における「断片」という用語は、完全長参照（又は「親」）核酸配列又は遺伝子の連続部分配列を意味する。換言すれば、「断片」は、典型的には、完全長核酸配列又は遺伝子のより短い部分であり得る。したがって、断片は、典型的には、完全長核酸配列又は遺伝子内の対応する一続きと同一の配列からなる。この用語は、天然に存在する断片及び操作された断片を含む。本発明の文脈における配列の好ましい断片は、その断片が由来する核酸又は遺伝子中の連続する一続きの実体に対応する連続する一続きの核酸からなり、これは、その断片が由来する合計（即ち、完全長）核酸配列又は遺伝子の少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、更により好ましくは少なくとも６０％、更により好ましくは少なくとも７０％、最も好ましくは少なくとも８０％を表す。そのような断片に関して示された配列同一性は、好ましくは全核酸配列又は遺伝子を意味する。好ましくは、「断片」は、それが由来する参照核酸配列又は遺伝子に対して、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むことができ、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有する核酸配列を含むことができる。
【００４４】
本発明の文脈において使用されるＵＴＲエレメントは、好ましくは機能的である、即ちそれらが由来する天然の（野生型）ＵＴＲと同じ所望の生物学的効果を引き出すことができる、即ち特に、機能可能に連結されたコード配列の発現を制御する（即ち調節する、好ましくは増強する）ことができる。本明細書に使用される「機能可能に連結された」という用語は、「コード配列と機能的関係に置かれている」ことを意味する。本明細書に定義されるＵＴＲエレメントは、好ましくはそれらが前記コード配列の発現を制御する（即ち調節する、好ましくは増強する）ことが可能な様式で、本発明の人工核酸のコード配列に機能可能に連結、即ち機能的関係に置かれる。本明細書に使用される「発現」という用語は、一般に、タンパク質生合成、特に転写、ｍＲＮＡプロセシング及び翻訳の全工程を含む。本明細書に特定されたＵＴＲエレメント、特に記載される組合せにおけるものは、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードするコード配列の転写を増強することが特に想定される。
【００４５】
したがって、本発明の人工核酸は、それぞれが本明細書に示されるものから選択される遺伝子に由来する５’ＵＴＲエレメント及び３’ＵＴＲエレメントを含むのが有利である。好適な５’ＵＴＲエレメントは、好ましくは本明細書に定義されるように、ＡＴＰ５Ａ１、ＲＰＬ３２、ＨＳＤ１７Ｂ４、ＳＬＣ７Ａ３、ＮＯＳＩＰ、及びＮＤＵＦＡ４からなる群から選択される遺伝子の５’ＵＴＲに由来する５’−ＵＴＲエレメントから選択される。好適な３’ＵＴＲエレメントは、好ましくは本明細書に定義されるように、ＧＮＡＳ、ＣＡＳＰ１、ＰＳＭＢ３、ＡＬＢ、及びＲＰＳ９からなる群から選択される遺伝子の３’ＵＴＲに由来する３’ＵＴＲエレメントから選択される。
【００４６】
典型的には、本発明の人工核酸分子の５’−又は３’−ＵＴＲエレメントは、前記少なくとも１つのコード配列に対して異種である。
【００４７】
好ましくは、本明細書に示されるＵＴＲ（本発明の人工核酸のＵＴＲエレメントに対する「親ＵＴＲ」としての役割を果たす）は、天然に存在する（野生型）ＵＴＲ、並びにそのホモログ、断片、変異体、及び対応するＲＮＡ配列を包含する。
【００４８】
換言すれば、人工核酸は、好ましくは、ａ．少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする少なくとも１つのコード領域と；ｂ．ＡＴＰ５Ａ１、ＲＰＬ３２、ＨＳＤ１７Ｂ４、ＳＬＣ７Ａ３、ＮＯＳＩＰ、及びＮＤＵＦＡ４からなる群から選択される遺伝子の５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、又は前記５’ＵＴＲのいずれかのホモログ、断片、変異体、若しくは対応するＲＮＡ配列と；ｃ．ＧＮＡＳ、ＣＡＳＰ１、ＰＳＭＢ３、ＡＬＢ、及びＲＰＳ９からなる群から選択される遺伝子の３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）に由来する少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメント、又は前記３’ＵＴＲのいずれかのホモログ、断片、変異体、若しくは対応するＲＮＡ配列とを含むことができる。
【００４９】
５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲは、好ましくは、本発明の人工核酸のコード配列に機能可能に連結される。
【００５０】
ＵＴＲ
５’ＵＴＲ
本明細書に記載の人工核酸は、本明細書に記載の遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメントを含む。
【００５１】
「５’−ＵＴＲ」という用語は、オープンリーディングフレームの５’（即ち「上流」）に位置し、タンパク質に翻訳されない核酸分子の一部を意味する。本発明の文脈において、５’−ＵＴＲは転写開始部位で開始し、オープンリーディングフレームの開始コドンの前の１ヌクレオチドで終結する。５’−ＵＴＲは、調節エレメントとも呼ばれる遺伝子発現を制御するためのエレメントを含んでもよい。そのような調節エレメントは、例えば、リボソーム結合部位であり得る。５’−ＵＴＲは、例えば５’−キャップの付加によって、転写後に修飾することができる。したがって、５’−ＵＴＲは、５’−キャップと開始コドンとの間に位置する核酸、特に成熟ｍＲＮＡの配列に対応し、より具体的には、３’から５’−キャップまでに位置するヌクレオチドから、好ましくは３’直近から５’−キャップまでに位置するヌクレオチドから、タンパク質コード配列の開始コドンの５’側に位置するヌクレオチド（転写開始部位）まで、好ましくはタンパク質コード配列の開始コドンの５’直近に位置するヌクレオチド（転写開始部位）まで延びる配列に対応する。成熟ｍＲＮＡの３’直近から５’−キャップに位置するヌクレオチドは、典型的には、転写開始部位に対応する。５’ＵＴＲの長さは、典型的には、５００、４００、３００、２５０個未満、又は２００個未満のヌクレオチドである。幾つかの実施形態では、その長さは、少なくとも１０、２０、３０、又は４０個、好ましくは最大１００又は１５０個のヌクレオチドの範囲であり得る。
【００５２】
好ましくは、少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメントは、脊索動物遺伝子、好ましくは脊椎動物遺伝子、より好ましくは哺乳動物遺伝子、最も好ましくはヒト遺伝子の５’ＵＴＲ、又は脊索動物遺伝子、好ましくは脊椎動物遺伝子、より好ましくは哺乳動物遺伝子、最も好ましくはヒト遺伝子の３’ＵＴＲ変異体に由来する核酸配列を含む又はからなる。
【００５３】
延長部分「．１」又は「ｖａｒ」を含むＵＴＲ名は、前記延長部分のないＵＴＲと同じである。
【００５４】
ＴＯＰ遺伝子由来の５’ＵＴＲエレメント
本明細書に特定される５’ＵＴＲエレメントの幾つかは、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片に由来し得る。
【００５５】
ＴＯＰ遺伝子は、典型的には、５’末端オリゴピリミジントラクト（ＴＯＰ）の存在によって特徴付けられ、更に、典型的には、成長に関連した翻訳調節によって特徴付けられる。しかしながら、組織特異的翻訳調節を有するＴＯＰ遺伝子も知られている。５’ＴＯＰを含むｍＲＮＡは、しばしばＴＯＰｍＲＮＡと呼ばれる。したがって、そのようなメッセンジャーＲＮＡを提供する遺伝子は、ＴＯＰ遺伝子と呼ばれる。ＴＯＰ配列は、例えば、ペプチド伸長因子及びリボソームタンパク質をコードする遺伝子及びｍＲＮＡ中に見出されている。
【００５６】
５’末端オリゴピリミジントラクト（「５’ＴＯＰ」又は「ＴＯＰ」）は、典型的には、特定のｍＲＮＡ分子の５’末端領域又は特定の遺伝子の機能的実体（例えば、転写領域）の５’末端領域など、核酸分子の５’末端領域に位置する一続きのピリミジンヌクレオチドである。
【００５７】
ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲは、ＴＯＰ遺伝子に由来する成熟ｍＲＮＡの５’ＵＴＲの配列に対応し、これは、好ましくは、３’から５’−キャップまで位置するヌクレオチドから、５’から開始コドンまで位置するヌクレオチドまで延びる。ＴＯＰ配列は、典型的にはシチジンで開始し、これは通常転写開始部位に対応し、その後に、通常約３〜３０個の一続きのピリミジンヌクレオチドが続く。一続きのピリミジン、したがって５’ＴＯＰは、ＴＯＰの下流に位置する最初のプリンヌクレオチドに対して５’側の１ヌクレオチドで終結する。
【００５８】
ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲは、典型的には開始コドンを含まず、好ましくは上流のＡＵＧ（ｕＡＵＧ）又は上流のオープンリーディングフレーム（ｕＯＲＦ）を含まない。その中で、上流のＡＵＧ及び上流のオープンリーディングフレームは、典型的には、翻訳されるべきオープンリーディングフレームの開始コドン（ＡＵＧ）の５’に存在するＡＵＧ及びオープンリーディングフレームであると理解される。ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲは、通常、幾分短い。ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲの長さは、２０ヌクレオチドから５００ヌクレオチドの間であることができ、典型的には、約２００ヌクレオチド未満、好ましくは約１５０ヌクレオチド未満、より好ましくは約１００ヌクレオチド未満である。例えば、ＴＯＰは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個、又はそれ以上のヌクレオチドを含み得る。
【００５９】
本発明の文脈において、「ＴＯＰモチーフ」は、上で定義されるように５’ＴＯＰに対応する核酸配列である。したがって、本発明の文脈におけるＴＯＰモチーフは、好ましくは、３〜３０ヌクレオチドの長さを有する一続きのピリミジンヌクレオチドである。好ましくは、ＴＯＰモチーフは、少なくとも３個のピリミジンヌクレオチド、好ましくは少なくとも４個のピリミジンヌクレオチド、より好ましくは少なくとも６個のピリミジンヌクレオチド、更に好ましくは少なくとも７個のピリミジンヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも８個のピリミジンヌクレオチドからなり、一続きのピリミジンヌクレオチドは、その５’末端において、シトシンヌクレオチドで始まるのが好ましい。ＴＯＰ遺伝子及びＴＯＰｍＲＮＡにおいて、ＴＯＰモチーフは、好ましくは、その５’末端において、転写開始部位で開始し、前記遺伝子又はｍＲＮＡの最初のプリン残基に対して５’側の１ヌクレオチドで終結する。本発明の意味における「ＴＯＰモチーフ」は、好ましくは、５’ＵＴＲを表す配列の５’末端、又は５’ＵＴＲをコードする配列の５’末端に位置する。したがって、好ましくは、３個以上の一続きのピリミジンヌクレオチドは、この一続きがそれぞれの配列（例えば、人工核酸分子、人工核酸分子の５’ＵＴＲエレメント、又は本明細書に記載されるＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲに由来する核酸配列）の５’末端に位置する場合、本発明の意味において「ＴＯＰモチーフ」と呼ばれる。換言すれば、５’ＵＴＲ又は５’ＵＴＲエレメントの５’末端ではなく、５’ＵＴＲ又は５’ＵＴＲエレメント内の任意の場所に位置する３個以上の一続きのピリミジンヌクレオチドは、「ＴＯＰモチーフ」と呼ばないことが好ましい。
【００６０】
特に好ましい実施形態では、本明細書に例示されたＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲに由来する５’ＵＴＲエレメントは、上で定義されたように、ＴＯＰモチーフ又は５’ＴＯＰを含まない。したがって、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲに由来する５’ＵＴＲエレメントの核酸配列は、その３’末端で、それが由来する遺伝子又はｍＲＮＡの開始コドン（例えば、Ａ（Ｕ／Ｔ）Ｇ）の上流の位置１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０に位置するヌクレオチドで終結し得る。したがって、５’ＵＴＲエレメントは、タンパク質コード配列のいかなる部分も含まない。したがって、好ましくは、人工核酸の唯一のアミノ酸コード部分は、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（及び任意に、本明細書に記載の更なるアミノ酸配列）をコードするコード配列によって提供される。
【００６１】
本発明にしたがって想定される具体的な５’ＵＴＲエレメントについて、以下に詳細に説明する。
【００６２】
ＨＳＤ１７Ｂ４由来の５’ＵＴＲエレメント
本発明に係る人工核酸は、１７−ベータ−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ４をコードする遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片（好ましくは５’ＴＯＰモチーフを欠く）に由来する核酸配列を含む又はからなる５’ＵＴＲエレメントを含み得る。
【００６３】
そのような５’ＵＴＲエレメントは、好ましくは１７−ベータ−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ４（「ＨＳＤ１７Ｂ４」、ペルオキシソーム多機能酵素タイプ２とも呼ばれる）遺伝子の５’ＵＴＲに由来する核酸配列、好ましくは脊椎動物の１７−ベータ−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ４（ＨＳＤ１７Ｂ４）遺伝子、より好ましくは哺乳動物の１７−ベータ−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ４（ＨＳＤ１７Ｂ４）遺伝子、最も好ましくはヒト１７−ベータ−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ４（ＨＳＤ１７Ｂ４）遺伝子に由来する核酸配列、又は前記５’ＵＴＲのいずれかのホモログ、変異体、又は断片に由来する核酸配列を含む又はからなり、好ましくは５’ＵＴＲエレメントが前記遺伝子の５’ＴＯＰを含まない。
【００６４】
したがって、本発明に係る人工核酸は、ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子に由来する５’ＵＴＲエレメントを含むことができ、ここで、前記５’ＵＴＲエレメントは、配列番号１に係るＤＮＡ配列又はそのホモログ、変異体、若しくは断片、特に、配列番号１に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有するＤＮＡ配列を含む又はからなる、又は前記５’ＵＴＲエレメントは、配列番号２に係るＲＮＡ配列、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片、特に、配列番号２に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有するＲＮＡ配列を含む又はからなる。
【００６５】
ＰＬ３２由来の５’−ＵＴＲエレメント
本発明に係る人工核酸は、リボソームラージタンパク質（ＲＰＬ）をコードする遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片に由来する核酸配列を含む又はからなる５’ＵＴＲエレメントを含むことができ、前記５’ＵＴＲエレメントは、好ましくは５’ＴＯＰ（末端オリゴピリミジントラクト）モチーフを欠く。
【００６６】
そのような５’ＵＴＲエレメントは、好ましくは、リボソームタンパク質ラージ３２（「ＲＰＬ３２」）遺伝子の５’ＵＴＲ、好ましくは脊椎動物のリボソームタンパク質ラージ３２（Ｌ３２）遺伝子、より好ましくは哺乳動物のリボソームタンパク質ラージ３２（Ｌ３２）遺伝子、最も好ましくはヒトのリボソームタンパク質ラージ３２（Ｌ３２）遺伝子、又は前記５’ＵＴＲのいずれかのホモログ、変異体、若しくは断片に由来する核酸配列を含む又はからなり、前記５’ＵＴＲエレメントは、好ましくは前記遺伝子の５’ＴＯＰを含まない。用語「ＲＰＬ３２」はまた、本明細書で「ＲＰＬ３２ｖａｒ」又は「３２Ｌ４」とも呼ばれる、その変異体及び断片も含む。
【００６７】
したがって、本発明に係る人工核酸は、ＲＰＬ３２遺伝子に由来する５’ＵＴＲエレメントを含むことができ、ここで、前記５’ＵＴＲエレメントは、配列番号２１に係るＤＮＡ配列又はそのホモログ、変異体、若しくは断片、特に、配列番号２１に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有するＤＮＡ配列を含む又はからなる、又は前記５’ＵＴＲエレメントは、配列番号２２に係るＲＮＡ配列、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片、特に、配列番号２２に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有するＲＮＡ配列を含む又はからなる。
【００６８】
ＮＤＵＦＡ４由来の５’−ＵＴＲエレメント
本発明に係る人工核酸は、シトクロムｃオキシダーゼサブユニット（ＮＤＵＦＡ４）をコードする遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する核酸配列を含む又はからなる５’ＵＴＲエレメントを含み得る。
【００６９】
そのような５’ＵＴＲエレメントは、好ましくはシトクロムｃオキシダーゼサブユニット（「ＮＤＵＦＡ４」又は「Ｎｄｕｆａ４．１」）遺伝子の５’ＵＴＲ、好ましくは脊椎動物のシトクロムｃオキシダーゼサブユニット（ＮＤＵＦＡ４）遺伝子、より好ましくは哺乳動物のシトクロムｃオキシダーゼサブユニット（ＮＤＵＦＡ４）遺伝子、最も好ましくはヒトのシトクロムｃオキシダーゼサブユニット（ＮＤＵＦＡ４）遺伝子、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片に由来する核酸配列を含む又はからなる。
【００７０】
したがって、本発明に係る人工核酸は、ＮＤＵＦＡ４遺伝子に由来する５’ＵＴＲエレメントを含むことができ、ここで、前記５’ＵＴＲエレメントは、配列番号９に係るＤＮＡ配列又はそのホモログ、変異体、若しくは断片、特に、配列番号９に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有するＤＮＡ配列を含む又はからなる、又は前記５’ＵＴＲエレメントは、配列番号１０に係るＲＮＡ配列、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片、特に、配列番号１０に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有するＲＮＡ配列を含む又はからなる。
【００７１】
ＳＬＣ７Ａ３由来の５’−ＵＴＲエレメント
本発明に係る人工核酸は、溶質輸送体ファミリー７メンバー３（ＳＬＣ７Ａ３）をコードする遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する核酸配列を含む又はからなる５’ＵＴＲエレメントを含み得る。
【００７２】
そのような５’ＵＴＲエレメントは、好ましくは溶質輸送体ファミリー７メンバー３（「ＳＬＣ７Ａ３」又は「Ｓｌｃ７ａ３．１」）遺伝子の５’ＵＴＲ、好ましくは脊椎動物の溶質輸送体ファミリー７メンバー３（ＳＬＣ７Ａ３）遺伝子、より好ましくは哺乳動物の溶質輸送体ファミリー７メンバー３（ＳＬＣ７Ａ３）遺伝子、最も好ましくはヒトの溶質輸送体ファミリー７メンバー３（ＳＬＣ７Ａ３）遺伝子、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片に由来する核酸配列を含む又はからなる。
【００７３】
したがって、本発明に係る人工核酸は、ＳＬＣ７Ａ３遺伝子に由来する５’ＵＴＲエレメントを含むことができ、ここで、前記５’ＵＴＲエレメントは、配列番号１５に係るＤＮＡ配列又はそのホモログ、変異体、若しくは断片、特に、配列番号１５に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有するＤＮＡ配列を含む又はからなる、又は前記５’ＵＴＲエレメントは、配列番号１６に係るＲＮＡ配列、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片、特に、配列番号１６に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有するＲＮＡ配列を含む又はからなる。
【００７４】
ＮＯＳＩＰ由来の５’ＵＴＲエレメント
本発明に係る人工核酸は、一酸化窒素シンターゼ相互作用タンパク質をコードする遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片に由来する核酸配列を含む又はからなる５’ＵＴＲエレメントを含み得る。
【００７５】
そのような５’ＵＴＲエレメントは、好ましくは一酸化窒素シンターゼ相互作用タンパク質（「ＮＯＳＩＰ」又は「Ｎｏｓｉｐ．１」）遺伝子の５’ＵＴＲ、好ましくは脊椎動物の一酸化窒素シンターゼ相互作用タンパク質（ＮＯＳＩＰ）遺伝子、より好ましくは哺乳動物の一酸化窒素シンターゼ相互作用タンパク質（ＮＯＳＩＰ）遺伝子、最も好ましくはヒトの一酸化窒素シンターゼ相互作用タンパク質（ＮＯＳＩＰ）遺伝子、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片に由来する核酸配列を含む又はからなる。
【００７６】
したがって、本発明に係る人工核酸は、ＮＯＳＩＰ遺伝子に由来する５’ＵＴＲエレメントを含むことができ、ここで、前記５’ＵＴＲエレメントは、配列番号１１に係るＤＮＡ配列又はそのホモログ、変異体、若しくは断片、特に、配列番号１１に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有するＤＮＡ配列を含む又はからなる、又は前記５’ＵＴＲエレメントは、配列番号１２に係るＲＮＡ配列、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片、特に、配列番号１２に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有するＲＮＡ配列を含む又はからなる。
【００７７】
ＡＴＰ５Ａ１由来の５’−ＵＴＲエレメント
本発明に係る人工核酸は、ミトコンドリアＡＴＰシンターゼサブユニットアルファ（ＡＴＰ５Ａ１）をコードする遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片に由来する核酸配列を含む又はからなる５’ＵＴＲエレメントを含むことができ、前記５’ＵＴＲエレメントは、好ましくは５’ＴＯＰモチーフを欠く。
【００７８】
そのような５’ＵＴＲエレメントは、ミトコンドリアＡＴＰシンターゼサブユニットアルファ（「ＡＴＰ５Ａ１」）遺伝子の５’ＵＴＲ、好ましくは脊椎動物のミトコンドリアＡＴＰシンターゼサブユニットアルファ（ＡＴＰ５Ａ１）遺伝子、より好ましくは哺乳動物のミトコンドリアＡＴＰシンターゼサブユニットアルファ（ＡＴＰ５Ａ１）遺伝子、最も好ましくはヒトのミトコンドリアＡＴＰシンターゼサブユニットアルファ（ＡＴＰ５Ａ１）遺伝子、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片に由来する５’ＵＴＲに由来する核酸配列を含む又はからなることが好ましく、前記５’ＵＴＲエレメントは、好ましくは前記遺伝子の５’ＴＯＰを含まない。
【００７９】
したがって、本発明に係る人工核酸は、ＡＴＰ５Ａ１遺伝子に由来する５’ＵＴＲエレメントを含むことができ、ここで、前記５’ＵＴＲエレメントは、配列番号５に係るＤＮＡ配列又はそのホモログ、変異体、若しくは断片、特に、配列番号５に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有するＤＮＡ配列を含む又はからなる、又は前記５’ＵＴＲエレメントは、配列番号６に係るＲＮＡ配列、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片、特に、配列番号６に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有するＲＮＡ配列を含む又はからなる。
【００８０】
ＡＳＡＨ１由来の５’−ＵＴＲエレメント
本発明に係る人工核酸は、ミトコンドリアＡＴＰシンターゼサブユニットアルファ（ＡＳＡＨ１）をコードする遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、変異体、又は断片に由来する核酸配列を含む又はからなる５’ＵＴＲエレメントを含むことができ、前記５’ＵＴＲエレメントは、好ましくは５’ＴＯＰモチーフを欠く。
【００８１】
そのような５’ＵＴＲエレメントは、ミトコンドリアＡＴＰシンターゼサブユニットアルファ（「ＡＳＡＨ１」）遺伝子の５’ＵＴＲ、好ましくは脊椎動物のミトコンドリアＡＴＰシンターゼサブユニットアルファ（ＡＳＡＨ１）遺伝子、より好ましくは哺乳動物のミトコンドリアＡＴＰシンターゼサブユニットアルファ（ＡＳＡＨ１）遺伝子、最も好ましくはヒトのミトコンドリアＡＴＰシンターゼサブユニットアルファ（ＡＳＡＨ１）遺伝子、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片に由来する５’ＵＴＲに由来する核酸配列を含む又はからなることが好ましく、前記５’ＵＴＲエレメントは、好ましくは前記遺伝子の５’ＴＯＰを含まない。
【００８２】
したがって、本発明に係る人工核酸は、ＡＳＡＨ１遺伝子に由来する５’ＵＴＲエレメントを含むことができ、ここで、前記５’ＵＴＲエレメントは、配列番号３に係るＤＮＡ配列又はそのホモログ、変異体、若しくは断片、特に、配列番号３に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有するＤＮＡ配列を含む又はからなる、又は前記５’ＵＴＲエレメントは、配列番号４に係るＲＮＡ配列、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片、特に、配列番号４に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有するＲＮＡ配列を含む又はからなる。
【００８３】
ＭＰ６８由来の５’−ＵＴＲエレメント
本発明に係る人工核酸は、ミトコンドリアＡＴＰシンターゼサブユニットアルファ（ＭＰ６８）をコードする遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片に由来する核酸配列を含む又はからなる５’ＵＴＲエレメントを含むことができ、前記５’ＵＴＲエレメントは、好ましくは５’ＴＯＰモチーフを欠く。
【００８４】
そのような５’ＵＴＲエレメントは、ミトコンドリアＡＴＰシンターゼサブユニットアルファ（「ＭＰ６８」又は「Ｍｐ６８」）遺伝子の５’ＵＴＲ、好ましくは脊椎動物のミトコンドリアＡＴＰシンターゼサブユニットアルファ（ＭＰ６８）遺伝子、より好ましくは哺乳動物のミトコンドリアＡＴＰシンターゼサブユニットアルファ（ＭＰ６８）遺伝子、最も好ましくはヒトのミトコンドリアＡＴＰシンターゼサブユニットアルファ（ＭＰ６８）遺伝子、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片に由来する５’ＵＴＲに由来する核酸配列を含む又はからなることが好ましく、前記５’ＵＴＲエレメントは、好ましくは前記遺伝子の５’ＴＯＰを含まない。
【００８５】
したがって、本発明に係る人工核酸は、Ｍｐ６８遺伝子に由来する５’ＵＴＲエレメントを含むことができ、ここで、前記５’ＵＴＲエレメントは、配列番号７に係るＤＮＡ配列又はそのホモログ、変異体、若しくは断片、特に、配列番号７に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有するＤＮＡ配列を含む又はからなる、又は前記５’ＵＴＲエレメントは、配列番号８に係るＲＮＡ配列、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片、特に、配列番号８に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有するＲＮＡ配列を含む又はからなる。
【００８６】
ＲＰＬ３１由来の５’−ＵＴＲエレメント
本発明に係る人工核酸は、ミトコンドリアＡＴＰシンターゼサブユニットアルファ（ＲＰＬ３１）をコードする遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片に由来する核酸配列を含む又はからなる５’ＵＴＲエレメントを含むことができ、前記５’ＵＴＲエレメントは、好ましくは５’ＴＯＰモチーフを欠く。
【００８７】
そのような５’ＵＴＲエレメントは、ミトコンドリアＡＴＰシンターゼサブユニットアルファ（「ＲＰＬ３１」又は「Ｒｐｌ３１．１」）遺伝子の５’ＵＴＲ、好ましくは脊椎動物のミトコンドリアＡＴＰシンターゼサブユニットアルファ（ＲＰＬ３１）遺伝子、より好ましくは哺乳動物のミトコンドリアＡＴＰシンターゼサブユニットアルファ（ＲＰＬ３１）遺伝子、最も好ましくはヒトのミトコンドリアＡＴＰシンターゼサブユニットアルファ（ＲＰＬ３１）遺伝子、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片に由来する５’ＵＴＲに由来する核酸配列を含む又はからなることが好ましく、前記５’ＵＴＲエレメントは、好ましくは前記遺伝子の５’ＴＯＰを含まない。
【００８８】
したがって、本発明に係る人工核酸は、ＲＰＬ３１遺伝子に由来する５’ＵＴＲエレメントを含むことができ、ここで、前記５’ＵＴＲエレメントは、配列番号１３に係るＤＮＡ配列又はそのホモログ、変異体、若しくは断片、特に、配列番号１３に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有するＤＮＡ配列を含む又はからなる、又は前記５’ＵＴＲエレメントは、配列番号１４に係るＲＮＡ配列、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片、特に、配列番号１４に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有するＲＮＡ配列を含む又はからなる。
【００８９】
ＴＵＢＢ４Ｂ由来の５’−ＵＴＲエレメント
本発明に係る人工核酸は、ミトコンドリアＡＴＰシンターゼサブユニットアルファ（ＴＵＢＢ４Ｂ）をコードする遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片に由来する核酸配列を含む又はからなる５’ＵＴＲエレメントを含むことができ、前記５’ＵＴＲエレメントは、好ましくは５’ＴＯＰモチーフを欠く。
【００９０】
そのような５’ＵＴＲエレメントは、ミトコンドリアＡＴＰシンターゼサブユニットアルファ（「ＴＵＢＢ４Ｂ」又は「ＴＵＢＢ４Ｂ．１」）遺伝子の５’ＵＴＲ、好ましくは脊椎動物のミトコンドリアＡＴＰシンターゼサブユニットアルファ（ＴＵＢＢ４Ｂ）遺伝子、より好ましくは哺乳動物のミトコンドリアＡＴＰシンターゼサブユニットアルファ（ＴＵＢＢ４Ｂ）遺伝子、最も好ましくはヒトのミトコンドリアＡＴＰシンターゼサブユニットアルファ（ＴＵＢＢ４Ｂ）遺伝子、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片に由来する５’ＵＴＲに由来する核酸配列を含む又はからなることが好ましく、前記５’ＵＴＲエレメントは、好ましくは前記遺伝子の５’ＴＯＰを含まない。
【００９１】
したがって、本発明に係る人工核酸は、ＴＵＢＢ４Ｂ遺伝子に由来する５’ＵＴＲエレメントを含むことができ、ここで、前記５’ＵＴＲエレメントは、配列番号１７に係るＤＮＡ配列又はそのホモログ、変異体、若しくは断片、特に、配列番号１７に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有するＤＮＡ配列を含む又はからなる、又は前記５’ＵＴＲエレメントは、配列番号１８に係るＲＮＡ配列、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片、特に、配列番号１８に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有するＲＮＡ配列を含む又はからなる。
【００９２】
ＵＢＱＬＮ２由来の５’−ＵＴＲエレメント
本発明に係る人工核酸は、ミトコンドリアＡＴＰシンターゼサブユニットアルファ（ＵＢＱＬＮ２）をコードする遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片に由来する核酸配列を含む又はからなる５’ＵＴＲエレメントを含むことができ、前記５’ＵＴＲエレメントは、好ましくは５’ＴＯＰモチーフを欠く。
【００９３】
そのような５’ＵＴＲエレメントは、ミトコンドリアＡＴＰシンターゼサブユニットアルファ（「ＵＢＱＬＮ２」又は「Ｕｂｑｌｎ２．１」）遺伝子の５’ＵＴＲ、好ましくは脊椎動物のミトコンドリアＡＴＰシンターゼサブユニットアルファ（ＵＢＱＬＮ２）遺伝子、より好ましくは哺乳動物のミトコンドリアＡＴＰシンターゼサブユニットアルファ（ＵＢＱＬＮ２）遺伝子、最も好ましくはヒトのミトコンドリアＡＴＰシンターゼサブユニットアルファ（ＵＢＱＬＮ２）遺伝子、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片に由来する５’ＵＴＲに由来する核酸配列を含む又はからなることが好ましく、前記５’ＵＴＲエレメントは、好ましくは前記遺伝子の５’ＴＯＰを含まない。
【００９４】
したがって、本発明に係る人工核酸は、ＵＢＱＬＮ２遺伝子に由来する５’ＵＴＲエレメントを含むことができ、ここで、前記５’ＵＴＲエレメントは、配列番号１９に係るＤＮＡ配列又はそのホモログ、変異体、若しくは断片、特に、配列番号１９に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有するＤＮＡ配列を含む又はからなる、又は前記５’ＵＴＲエレメントは、配列番号２０に係るＲＮＡ配列、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片、特に、配列番号２０に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有するＲＮＡ配列を含む又はからなる。
【００９５】
３’ＵＴＲ
本明細書に記載の人工核酸は、本明細書に記載の遺伝子、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片の３’ＵＴＲに由来する少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントを更に含む。「３’−ＵＴＲ」という用語は、オープンリーディングフレームの３’（即ち「下流」）に位置し、タンパク質に翻訳されない核酸分子の一部を意味する。本発明の文脈において、３’−ＵＴＲは、タンパク質コード配列の終止コドン、好ましくはタンパク質コード配列の終止コドンの３’の直近と、人工核酸分子のポリ（Ａ）配列との間に位置する配列に対応する（好ましくはＲＮＡである）。
【００９６】
好ましくは、少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントは、脊索動物遺伝子、好ましくは脊椎動物遺伝子、より好ましくは哺乳動物遺伝子、最も好ましくはヒト遺伝子の３’ＵＴＲ、又は脊索動物遺伝子、好ましくは脊椎動物遺伝子、より好ましくは哺乳動物遺伝子、最も好ましくはヒト遺伝子の３’ＵＴＲ変異体に由来する核酸配列を含む又はからなる。
【００９７】
ＧＮＡＳ由来の３’−ＵＴＲエレメント
本発明に係る人工核酸は、グアニンヌクレオチド結合タンパク質Ｇ（ｓ）サブユニットアルファアイソフォームショート（ＧＮＡＳ）をコードする遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片に由来する核酸配列を含む又はからなる３’ＵＴＲエレメントを含み得る。
【００９８】
そのような３’ＵＴＲエレメントは、グアニンヌクレオチド結合タンパク質Ｇ（ｓ）サブユニットアルファアイソフォームショート（「ＧＮＡＳ」又は「Ｇｎａｓ．１」）遺伝子の３’ＵＴＲ、好ましくは脊椎動物のグアニンヌクレオチド結合タンパク質Ｇ（ｓ）サブユニットアルファアイソフォームショート（ＧＮＡＳ）遺伝子、より好ましくは哺乳動物のグアニンヌクレオチド結合タンパク質Ｇ（ｓ）サブユニットアルファアイソフォームショート（ＧＮＡＳ）遺伝子、最も好ましくはヒトのグアニンヌクレオチド結合タンパク質Ｇ（ｓ）サブユニットアルファアイソフォームショート（ＧＮＡＳ）遺伝子、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片に由来する核酸配列を含む又はからなることが好ましい。
【００９９】
したがって、本発明に係る人工核酸は、ＧＮＡＳ遺伝子に由来する３’ＵＴＲエレメントを含むことができ、ここで、前記３’ＵＴＲエレメントは、配列番号２９に係るＤＮＡ配列、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片、特に、配列番号２９に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有するＤＮＡ配列を含む又はからなる、又は前記３’ＵＴＲエレメントは、配列番号３０に係るＲＮＡ配列、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片、特に、配列番号３０に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有するＲＮＡ配列を含む又はからなる。
【０１００】
ＣＡＳＰ１由来の３’−ＵＴＲエレメント
本発明に係る人工核酸は、カスパーゼ−１（ＣＡＳＰ１）をコードする遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片に由来する核酸配列を含む又はからなる３’ＵＴＲエレメントを含み得る。
【０１０１】
そのような３’ＵＴＲエレメントは、カスパーゼ−１（「ＣＡＳＰ１」又は「ＣＡＳＰ１．１」）遺伝子の３’ＵＴＲ、好ましくは脊椎動物のカスパーゼ−１（ＣＡＳＰ１）遺伝子、より好ましくは哺乳動物のカスパーゼ−１（ＣＡＳＰ１）遺伝子、最も好ましくはヒトのカスパーゼ−１（ＣＡＳＰ１）遺伝子、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片に由来する核酸配列を含む又はからなることが好ましい。
【０１０２】
したがって、本発明に係る人工核酸は、ＣＡＳＰ１遺伝子に由来する３’ＵＴＲエレメントを含むことができ、ここで、前記３’ＵＴＲエレメントは、配列番号２５に係るＤＮＡ配列、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片、特に、配列番号２５に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有するＤＮＡ配列を含む又はからなる、又は前記３’ＵＴＲエレメントは、配列番号２６に係るＲＮＡ配列、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片、特に、配列番号２６に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有するＲＮＡ配列を含む又はからなる。
【０１０３】
ＰＳＭＢ３由来の３’−ＵＴＲエレメント
本発明に係る人工核酸は、プロテアソームサブユニットベータ３型（ＰＳＭＢ３）をコードする遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片に由来する核酸配列を含む又はからなる３’ＵＴＲエレメントを含み得る。
【０１０４】
そのような３’ＵＴＲエレメントは、プロテアソームサブユニットベータ３型（「ＰＳＭＢ３」又は「ＰＳＭＢ３．１」）遺伝子の３’ＵＴＲ、好ましくは脊椎動物のプロテアソームサブユニットベータ３型（ＰＳＭＢ３）遺伝子、より好ましくは哺乳動物のプロテアソームサブユニットベータ３型（ＰＳＭＢ３）遺伝子、最も好ましくはヒトのプロテアソームサブユニットベータ３型（ＰＳＭＢ３）遺伝子、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片に由来する核酸配列を含む又はからなることが好ましい。
【０１０５】
したがって、本発明に係る人工核酸は、ＰＳＭＢ３遺伝子に由来する３’ＵＴＲエレメントを含むことができ、ここで、前記３’ＵＴＲエレメントは、配列番号２３に係るＤＮＡ配列、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片、特に、配列番号２３に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有するＤＮＡ配列を含む又はからなる、又は前記３’ＵＴＲエレメントは、配列番号２４に係るＲＮＡ配列、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片、特に、配列番号２４に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有するＲＮＡ配列を含む又はからなる。
【０１０６】
ＡＬＢ由来の３’ＵＴＲエレメント
本発明に係る人工核酸は、血清アルブミン（ＡＬＢ）をコードする遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片に由来する核酸配列を含む又はからなる３’ＵＴＲエレメントを含み得る。
【０１０７】
そのような３’ＵＴＲエレメントは、血清アルブミン（「ＡＬＢ」又は「アルブミン７」）遺伝子の３’ＵＴＲ、好ましくは脊椎動物の血清アルブミン（ＡＬＢ）遺伝子、より好ましくは哺乳動物の血清アルブミン（ＡＬＢ）遺伝子、最も好ましくはヒトの血清アルブミン（ＡＬＢ）遺伝子、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片に由来する核酸配列を含む又はからなることが好ましい。
【０１０８】
したがって、本発明に係る人工核酸は、ＡＬＢ遺伝子に由来する３’ＵＴＲエレメントを含むことができ、ここで、前記３’ＵＴＲエレメントは、配列番号３５に係るＤＮＡ配列、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片、特に、配列番号３５に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有するＤＮＡ配列を含む又はからなる、又は前記３’ＵＴＲエレメントは、配列番号３６に係るＲＮＡ配列、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片、特に、配列番号３６に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有するＲＮＡ配列を含む又はからなる。
【０１０９】
ＲＰＳ９由来の３’−ＵＴＲエレメント
本発明に係る人工核酸は、４０Ｓリボソームタンパク質Ｓ９（ＲＰＳ９）をコードする遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片に由来する核酸配列を含む又はからなる３’ＵＴＲエレメントを含み得る。
【０１１０】
そのような３’ＵＴＲエレメントは、４０Ｓリボソームタンパク質Ｓ９（「ＲＰＳ９」又は「ＲＰＳ９．１」）遺伝子の３’ＵＴＲ、好ましくは脊椎動物の４０Ｓリボソームタンパク質Ｓ９（ＲＰＳ９）遺伝子、より好ましくは哺乳動物の４０Ｓリボソームタンパク質Ｓ９（ＲＰＳ９）遺伝子、最も好ましくはヒトの４０Ｓリボソームタンパク質Ｓ９（ＲＰＳ９）遺伝子、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片に由来する核酸配列を含む又はからなることが好ましい。
【０１１１】
したがって、本発明に係る人工核酸は、ＲＰＳ９遺伝子に由来する３’ＵＴＲエレメントを含むことができ、ここで、前記３’ＵＴＲエレメントは、配列番号３３に係るＤＮＡ配列、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片、特に、配列番号３３に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有するＤＮＡ配列を含む又はからなる、又は前記３’ＵＴＲエレメントは、配列番号３４に係るＲＮＡ配列、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片、特に、配列番号３４に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有するＲＮＡ配列を含む又はからなる。
【０１１２】
ＣＯＸ６Ｂ１由来の３’−ＵＴＲエレメント
本発明に係る人工核酸は、ＣＯＸ６Ｂ１遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片に由来する核酸配列を含む又はからなる３’ＵＴＲエレメントを含み得る。
【０１１３】
そのような３’ＵＴＲエレメントは、ＣＯＸ６Ｂ１（又は「ＣＯＸ６Ｂ１．１」）遺伝子の３’ＵＴＲ、好ましくは脊椎動物のＣＯＸ６Ｂ１遺伝子、より好ましくは哺乳動物のＣＯＸ６Ｂ１遺伝子、最も好ましくはヒトのＣＯＸ６Ｂ１遺伝子、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片に由来する核酸配列を含む又はからなることが好ましい。
【０１１４】
したがって、本発明に係る人工核酸は、ＣＯＸ６Ｂ１遺伝子に由来する３’ＵＴＲエレメントを含むことができ、ここで、前記３’ＵＴＲエレメントは、配列番号２７に係るＤＮＡ配列、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片、特に、配列番号２７に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有するＤＮＡ配列を含む又はからなる、又は前記３’ＵＴＲエレメントは、配列番号２８に係るＲＮＡ配列、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片、特に、配列番号２８に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有するＲＮＡ配列を含む又はからなる。
【０１１５】
ＮＤＵＦＡ１由来の３’−ＵＴＲエレメント
本発明に係る人工核酸は、ＮＤＵＦＡ１遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片に由来する核酸配列を含む又はからなる３’ＵＴＲエレメントを含み得る。
【０１１６】
そのような３’ＵＴＲエレメントは、ＮＤＵＦＡ１（又は「Ｎｄｕｆａ１．１」）遺伝子の３’ＵＴＲ、好ましくは脊椎動物のＮＤＵＦＡ１遺伝子、より好ましくは哺乳動物のＮＤＵＦＡ１遺伝子、最も好ましくはヒトのＮＤＵＦＡ１遺伝子、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片に由来する核酸配列を含む又はからなることが好ましい。
【０１１７】
したがって、本発明に係る人工核酸は、ＮＤＵＦＡ１遺伝子に由来する３’ＵＴＲエレメントを含むことができ、ここで、前記３’ＵＴＲエレメントは、配列番号３１に係るＤＮＡ配列、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片、特に、配列番号３１に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有するＤＮＡ配列を含む又はからなる、又は前記３’ＵＴＲエレメントは、配列番号３２に係るＲＮＡ配列、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片、特に、配列番号３２に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有するＲＮＡ配列を含む又はからなる。
【０１１８】
ＵＴＲの組合せ
好ましくは、少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント及び少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントは相乗的に作用して、前記ＵＴＲに機能可能に連結された少なくとも１つのコード配列の発現を上昇させる。本明細書では、列挙された５’−ＵＴＲ及び３’−ＵＴＲを任意の有用な組合せで利用することが想定される。特に有用な５’及び３’ＵＴＲを以下の表１Ａに示す。５’ＵＴＲと３’−ＵＴＲの特に有用な組合せを以下の表１Ｂに示す。本発明の特に好ましい実施形態は、最適なＣＤＳ、即ちＣａｓ９、Ｃｐｆ１、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、又はＣａｓ１３と、ＨＳＤ１７Ｂ４／Ｇｎａｓ．１；Ｓｌｃ７ａ３．１／Ｇｎａｓ．１；ＡＴＰ５Ａ１／ＣＡＳＰ．１；Ｎｄｕｆａ４．１／ＰＳＭＢ３．１；ＨＳＤ１７Ｂ４／ＰＳＭＢ３．１；ＲＰＬ３２ｖａｒ／アルブミン７；３２Ｌ４／アルブミン７；ＨＳＤ１７Ｂ４／ＣＡＳＰ１．１；Ｓｌｃ７ａ３．１／ＣＡＳＰ１．１；Ｓｌｃ７ａ３．１／ＰＳＭＢ３．１；Ｎｏｓｉｐ．１／ＰＳＭＢ３．１；Ｎｄｕｆａ４．１／ＲＰＳ９．１；ＨＳＤ１７Ｂ４／ＲＰＳ９．１；ＡＴＰ５Ａ１／Ｇｎａｓ．１；Ｎｄｕｆａ４．１／ＣＯＸ６Ｂ１．１；Ｎｄｕｆａ４．１／Ｇｎａｓ．１；Ｎｄｕｆａ４．１／Ｎｄｕｆａ１．１；Ｎｏｓｉｐ．１／Ｎｄｕｆａ１．１；Ｒｐｌ３１．１／Ｇｎａｓ．１；ＴＵＢＢ４Ｂ．１／ＲＰＳ９．１；及びＵｂｑｌｎ２．１／ＲＰＳ９．１の群から選択されるＵＴＲ組合せとの組合せを含む。
【表１Ａ】
2020513824.tif 000002
【表１Ｂ】
2020513824.tif 000003
【０１１９】
幾つかの実施形態では、本発明のＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする人工核酸は、ＨＳＤ１７Ｂ４／Ｇｎａｓ．１；Ｓｌｃ７ａ３．１／Ｇｎａｓ．１；ＡＴＰ５Ａ１／ＣＡＳＰ．１；Ｎｄｕｆａ４．１／ＰＳＭＢ３．１；ＨＳＤ１７Ｂ４／ＰＳＭＢ３．１；ＲＰＬ３２ｖａｒ／アルブミン７；３２Ｌ４／アルブミン７；ＨＳＤ１７Ｂ４／ＣＡＳＰ１．１；Ｓｌｃ７ａ３．１／ＣＡＳＰ１．１；Ｓｌｃ７ａ３．１／ＰＳＭＢ３．１；Ｎｏｓｉｐ．１／ＰＳＭＢ３．１；Ｎｄｕｆａ４．１／ＲＰＳ９．１；ＨＳＤ１７Ｂ４／ＲＰＳ９．１；ＡＴＰ５Ａ１／Ｇｎａｓ．１；Ｎｄｕｆａ４．１／ＣＯＸ６Ｂ１．１；Ｎｄｕｆａ４．１／Ｇｎａｓ．１；Ｎｄｕｆａ４．１／Ｎｄｕｆａ１．１；Ｎｏｓｉｐ．１／Ｎｄｕｆａ１．１；Ｒｐｌ３１．１／Ｇｎａｓ．１；ＴＵＢＢ４Ｂ．１／ＲＰＳ９．１；Ｕｂｑｌｎ２．１／ＲＰＳ９．１；ＭＰ６８／Ｇｎａｓ１．１、及びＭＰ６８／Ｎｄｕｆａ１．１からなる群から選択される少なくとも１つのＵＴＲの組合せを含む。
【０１２０】
幾つかの実施形態において、本発明に係る人工核酸は、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする人工核酸に関連してＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０７６７７５（その全体を参照により本明細書に援用する）に開示されるＵＴＲの組合せから選択される少なくとも１つのＵＴＲの組合せを含む。したがって、幾つかの実施形態では、本発明に係る人工核酸は、ＳＬＣ７Ａ３／ＧＮＡＳ；ＡＴＰ５Ａ１／ＣＡＳＰ１；ＨＳＤ１７Ｂ４／ＧＮＡＳ；ＮＤＵＦＡ４／ＣＯＸ６Ｂ１；ＮＯＳＩＰ／ＮＤＵＦＡ１；ＮＤＵＦＡ４／ＮＤＵＦＡ１；ＡＴＰ５Ａ１／ＧＮＡＳ；ＭＰ６８／ＮＤＵＦＡ１；ＮＤＵＦＡ４／ＲＰＳ９；ＮＤＵＦＡ４／ＧＮＡＳ；ＮＤＵＦＡ４／ＰＳＭＢ３；ＴＵＢＢ４Ｂ／ＲＰＳ９．１；ＵＱＢＬＮ２／ＲＰＳ９；ＲＰＬ３１／ＧＮＡＳ）、又はＨＳＤ１７Ｂ４／ＰＳＭＢ３からなる群から選択される少なくとも１つのＵＴＲの組合せを含み得る。
【０１２１】
したがって、幾つかの実施形態では、本発明に係る人工核酸は、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする人工核酸に関連してＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０７６７７５に開示される核酸配列を含む又はからなることができる。
【０１２２】
特定の配列番号を参照して表１に定義されるＵＴＲエレメントはそれぞれ、その特定の配列番号を参照することにより定義されるそれぞれの核酸配列に対して、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を示すそれらの変異体又は断片を含み得る。表１の最後の欄は、配列番号を含む欄「５’ＵＴＲ」と配列番号を含む欄「３’ＵＴＲ」に示される特定の有利なＵＴＲの組合せと組み合わせることができる全ての可能なＣａｓ９及びＣｐｆ１のｃｄを明確に開示する（即ち、開示される組合せは、当業者にとって本発明の好ましい実施形態である）。特に好ましい実施形態は、本発明のＣａｓ９又はＣｐｆ１配列と、５’ＵＴＲ  ＳＬＣ７Ａ３（配列番号１５／１６）若しくはそれに由来する配列、又は３’ＵＴＲ  ＧＮＡＳ（配列番号２９／３０）若しくはそれに由来する配列に類似する。
【０１２３】
参照を容易にするために、表Ａ１は、特に好ましく且つ有利なＣＤＳとＵＴＲの組合せを記載する。
【０１２４】
表１においてそれらの特定の配列番号を参照することによって同定される配列はそれぞれ、本明細書に示されるように、その対応するＤＮＡ配列によっても定義され得る。
【０１２５】
それらの特定の配列番号を参照することにより表１に同定された配列はそれぞれ、以下に記載されるように（任意に互いに独立して）修飾され得る。
【０１２６】
本発明に係る好ましい人工核酸は、
ａ．ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＧＮＡＳ遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメント；又は
ｂ．ＳＬＣ７Ａ３遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＧＮＡＳ遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメント；又は
ｃ．ＡＴＰ５Ａ１遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＣＡＳＰ１遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメント；又は
ｄ．ＮＤＵＦＡ４遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＰＳＭＢ３遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメント；又は
ｅ．ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＰＳＳＬＣ７Ａ３ＭＢ３遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメント；又は
ｆ．ＲＰＬ３２遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＡＬＢ遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメント；又は
ｇ．ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＣＡＳＰ１遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメント；又は
ｈ．ＳＬＣ７Ａ３遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＣＡＳＰ１遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメント；又は
ｉ．ＳＬＣ７Ａ３遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＰＳＭＢ３遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメント；又は
ｊ．ＮＯＳＩＰ遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＰＳＭＢ３遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメント；又は
ｋ．ＮＤＵＦＡ４遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＲＰＳ９遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメント；又は
ｌ．ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＲＰＳ９遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメント；又は
ｍ．ＡＴＰ５Ａ１遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＧＮＡＳ遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメント；又は
ｎ．ＮＤＵＦＡ４遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＣＯＸ６Ｂ１遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメント；又は
ｎ．ＮＤＵＦＡ４遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＧＮＡＳ遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメント；又は
ｏ．ＮＤＵＦＡ４遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＮＤＵＦＡ１遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメント；又は
ｐ．ＮＯＳＩＰ遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＮＤＵＦＡ１遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメント；又は
ｑ．ＲＰＬ３１遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＧＮＡＳ遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメント；又は
ｒ．ＴＵＢＢ４Ｂ遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＲＰＳ９遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメント；又は
ｓ．ＵＢＱＬＮ２遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＲＰＳ９遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメント；又は
ｔ．ＭＰ６８遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＧＮＡＳ遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメント；又は
ｕ．ＭＰ６８遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＮＤＵＦＡ１遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントを含み得る。
【０１２７】
特に好ましい人工核酸は、ｄ、ｅ、ｇ，又はｌに係るＵＴＲの組合せを含み得る。
【０１２８】
幾つかの実施形態では、本発明に係る人工核酸は、ＡＬＢ遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する３’ＵＴＲエレメントを含まなくてもよい。
【０１２９】
コード配列
ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質
本発明に係る人工核酸は、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする少なくとも１つのコード配列を含む。
【０１３０】
「ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質」という用語は、外来ＤＮＡエレメントに対する適応免疫を付与するために原核生物によって使用されるＣＲＩＳＰＲ（クラスター化した規則的に散在した短い回文）システム（及びそれらのホモログ、変異体、断片、又は誘導体）の一部であるＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼを意味する。ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、限定するものではないが、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２）、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ３、Ｃ２ｃ２、Ｃａｓ１３、ＣａｓＸ、及びＣａｓＹを含む。本明細書に使用されるとき、用語「ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質」は、野生型タンパク質、及びそれらのホモログ、変異体、断片、又は誘導体を含む。したがって、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２）、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ３、及びＣ２ｃ２、Ｃａｓ１３、ＣａｓＸ、及びＣａｓＹをコードする人工核酸分子に言及するとき、前記人工核酸分子は、それぞれの野生型タンパク質、又はそのホモログ、変異体、断片、及び誘導体をコードし得る。
【０１３１】
ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、任意の遺伝子、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片によってコードされていてもよい。遺伝子に言及するとき、用語「ホモログ」又は「ホモロガス遺伝子」は、「オルソロガス遺伝子」及び「パラロガス遺伝子」を含む。
【０１３２】
ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（及びそれらのホモログ、変異体、断片、又は誘導体）は、好ましくは機能的である、即ち所望の生物学的特性を示す、及び／又は所望の生物学的機能を発揮する。前記生物学的特性又は生物学的機能は、対応する参照（又は「親」）タンパク質と比較してそれに匹敵するか又は更に向上していてもよい。機能的ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、並びにそのホモログ、変異体、断片、又は誘導体は、好ましくは、ガイドＲＮＡによって目的ＤＮＡ配列を配列特異的な様式で標的とする能力を保持する。しかし、野生型ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質によって典型的に発揮されるエンドヌクレアーゼ活性（即ち、目的のＤＮＡ配列にＤＳＢを導入する能力）は、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質の「機能的」ホモログ、変異体、断片、及び誘導体において保持され得るが、それらの全てが保持する訳ではない。
【０１３３】
具体的には、機能的ホモログ、変異体、断片、又は誘導体は、好ましくは、（１）標的ＤＮＡ配列と特異的に相互作用することができる、（２）適切なガイドＲＮＡと会合することができる、及び任意に（３）標的ＤＮＡ配列に対して並置されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識することができる。この文脈において、「相互作用する」は、好ましくは、結合し、任意に（更に）切断し（エンドヌクレアーゼ又はニッカーゼ活性によって）、発現を活性化又は抑制し、及び／又はエフェクターを動員することを意味する。「特異的」は、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質が他の非標的ＤＮＡ配列と相互作用するよりも容易に標的ＤＮＡ配列と相互作用することを意味する。
【０１３４】
本明細書において特定のＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１など）に言及するとき、それぞれのタンパク質はその翻訳後修飾形態の全てを包含すると理解されるべきである。翻訳後修飾（ＰＴＭ）は、所与のタンパク質の共有結合的又は非共有結合的修飾をもたらし得る。一般的な翻訳後修飾としては、グリコシル化、リン酸化、ユビキチン化、Ｓ−ニトロシル化、メチル化、Ｎ−アセチル化、脂質化、ジスルフィド結合形成、硫酸化、アシル化、脱アミノ化などが挙げられる。異なるＰＴＭは、例えば、異なる化学的性質、活性、局在化、相互作用、又は立体配座をもたらし得る。しかし、本発明の文脈で想定される全ての翻訳後修飾ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、上に定義されるように機能的なままであることが好ましい。
【０１３５】
ホモログ
本明細書に例示される各ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１など）はまた、好ましくはそのホモログも包含する。タンパク質に言及するとき、用語「ホモログ」は、「オルソログ」（又は「オルソロガスタンパク質」）及びパラログ（又は「パラロガスタンパク質」）を包含する。この文脈において、「オルソログ」は、種分化によって共通の祖先遺伝子から進化した異なる種の遺伝子によってコードされるタンパク質である。オルソログは、しばしば進化の過程で同じ機能を保持する。したがって、一対のオルソログを比較すると、機能を喪失している場合もあれば、獲得している場合もある。しかし、本発明の文脈において、オルソロガスＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、好ましくは、目的のＤＮＡ配列と特異的に相互作用する（即ち、「機能的」である）適切なガイドＲＮＡと会合する能力を保持する。「パラログ」は、ゲノム中の遺伝子重複を介して産生される遺伝子である。パラログは通常、新しい機能を進化させるか、又は最終的にシュード遺伝子になることがある。本発明の文脈において、パラロガスＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、上で定義されるように、好ましくは機能的である。
【０１３６】
変異体
本明細書に例示される各ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１など）はまた、好ましくはその変異体も包含する。
【０１３７】
タンパク質に関して本明細書に使用される「変異体」という用語は、好ましくは「配列変異体」、即ち、参照（又は「親」）タンパク質の参照（又は「親」）アミノ酸配列と、少なくとも１つのアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を含むタンパク質を意味する。
【０１３８】
したがって、変異体タンパク質は、それらのそれぞれの参照配列と比較して、それらのアミノ酸配列中に少なくとも１つのアミノ酸の突然変異、置換、挿入、又は欠失を含むことが好ましい。置換は、保存的又は非保存的置換から選択され得る。幾つかの実施形態では、本発明の人工核酸の少なくとも１つのコード配列によってコードされるタンパク質「変異体」は、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含み、同一クラスに由来するアミノ酸が、互いに交換される。特に、これらは脂肪族側鎖、正又は負に荷電した側鎖、側鎖中の芳香族基、又はアミノ酸を有するアミノ酸であり、それらの側鎖は水素架橋（例えば、ヒドロキシル官能性を有する側鎖など）を形成することができる。保存的な構成によって、例えば。極性側鎖を有するアミノ酸は、対応する極性側鎖を有する別のアミノ酸によって置換されてもよく、又は例えば、疎水性側鎖を特徴とするアミノ酸は、対応する疎水性側鎖を有する別のアミノ酸によって置換されてもよい（例えば、セリン（スレオニン）がスレオニン（セリン）で置換される、又はロイシン（イソロイシン）がイソロイシン（ロイシン）で置換される）。
【０１３９】
好ましくは、本明細書に使用される「変異体」という用語は、天然に存在する変異体、例えば、翻訳後タンパク質分解処理（これは、Ｎ末端メチオニン、シグナルペプチドの除去、及び／又は不活性タンパク質若しくは非機能性タンパク質の活性タンパク質若しくは機能性タンパク質への変換を伴うことがある）に付されたプレプロタンパク質、プロタンパク質、及びＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、及び天然に存在する変異タンパク質を含む。「変異体」という用語は更に、特定の生物学的特性及び／又は機能性を導入又は排除するように（配列）修飾されていてもよいＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質の操作された変異体も包含する。操作されたＣａｓ９変異体について以下に詳細に記載する。タンパク質の文脈における「転写物変異体」又は「スプライス変異体」という用語は、最初は同じ遺伝子から転写されるが、その後オルタナティブ（又はディファレンシャル）スプライシング（ここで、遺伝子の特定のエクソンが、最終加工メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）内に含有される又は除去されることがある）に付されるメッセンジャーＲＮＡから産生される変異体を意味する。しかし、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質の「転写物変異体」は、好ましくは、上で定義されるそれらの所望の生物学的機能性を保持する。「変異体」という用語は、参照タンパク質との比較における、最低限の程度の配列同一性によって（及び好ましくは、所望の生物学的機能／特性によっても）本質的に定義され得ることに留意されたい。したがって、ホモログ、断片、又は特定の誘導体（それらのアミノ酸配列が参照タンパク質と異なる）も同様に「変異体」として分類することができる。したがって、本明細書に定義される「変異体」は、本明細書に定義されるＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１など）、又はそのホモログ、断片変異体、又は誘導体であり得る参照タンパク質に由来する、それから単離される、それに関連する、それに基づく、又はそれとホモロガスであり得る。
【０１４０】
本発明に係るＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（例えばＣａｓ９、Ｃｐｆ１）変異体は、好ましくは、それぞれの天然に存在する（野生型）ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１など）、又はそのホモログ、断片、若しくは誘導体のアミノ酸配列に対して、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有する。
【０１４１】
断片
本明細書に例示される各ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１）はまた、好ましくはそれらの断片も包含する。
【０１４２】
「断片」という用語は、参照（又は「親」）タンパク質又は（ポリ）ペプチドの全長アミノ酸配列の連続する部分配列からなるタンパク質又はポリペプチドを意味し、前記部分配列は、そのアミノ酸配列に関して、前記参照タンパク質のアミノ酸配列と比較して、Ｎ末端、Ｃ末端、及び／又は配列内でトランケートされたアミノ酸配列である。このようなトランケーションは、それぞれアミノ酸レベル又は核酸レベルのいずれでも起こり得る。換言すれば、「断片」は、典型的には、アミノ酸配列の全長配列のより短い部分であり得る。したがって、断片は、典型的には、全長アミノ酸配列内の対応する一続きと同一の配列からなる。この用語は、天然に存在する断片（天然に存在するインビボプロテアーゼ活性から生じる断片など）及び操作された断片を含む。
【０１４３】
本明細書に使用される「断片」という用語は、本明細書に定義されるＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質のアミノ酸配列、又はそのホモログ、変異体、又は誘導体の少なくとも５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも２０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも２５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも４０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも５０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも６０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも７０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも８０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも９０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１００個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１２５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１５０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１７５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも２００個の連続するアミノ酸残基、少なくとも２５０個の連続するアミノ酸残基を含むペプチド又はポリペプチドを意味する。
【０１４４】
本発明の文脈における配列の好ましい断片は、その断片が由来するタンパク質における実体の連続する一続きに対応するアミノ酸の連続する一続きからなり、その断片が由来する合計（即ち、完全長）タンパク質又は（ポリ−）ペプチドの少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、更により好ましくは少なくとも６０％、更により好ましくは少なくとも７０％、最も好ましくは少なくとも８０％を表す。
【０１４５】
そのような断片に関して示される配列同一性は、好ましくは、前記参照タンパク質の全アミノ酸配列又は前記参照タンパク質をコードする全核酸配列を意味する。好ましくは、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（例えば、Ｃａｓ９又はＣｐｆ１）の「断片」、又はそのホモログ、変異体、若しくは誘導体は、典型的には、前記ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１）のアミノ酸配列、又は前記ホモログ、変異体、若しくは誘導体と少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【０１４６】
誘導体
本明細書に例示される各ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１）はまた、好ましくはそれらの誘導体も包含する。
【０１４７】
タンパク質を意味するときの「誘導体」という用語は、新たな又は追加の特性又は機能性を含むように参照（又は「親」）タンパク質に対して修飾されたタンパク質として理解されるべきである。誘導体は、所望の生物学的機能性（例えば、標的結合親和性又は特異性又は酵素活性を付与、増強、低減、又は無効化する部分又はドメインを導入又は除去することによって）、製造特性（例えば、溶解度の増加若しくは排泄の促進、又は精製を可能にする部分を導入することによって）、又は医学用途のため薬物動態／薬力学特性（例えば、安定性、バイオアベイラビリティー、吸収性の向上；分布及び／又は減少したクリアランスをもたらす部分を導入することによって）を含むように修飾することができる。誘導体は、目的の生物学的特性又は機能性を付与する部分又はドメインを導入又は除去することによって調製することができる。そのような部分又はドメインは、翻訳後又はアミノ酸配列レベルで、標準的な遺伝子工学技術を用いてアミノ酸配列に（例えば、アミノ及び／又はカルボキシル末端残基に）導入することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２  （４ｔｈ  ｅｄ．），  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。「誘導体」は、天然に存在する（野生型）ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質配列、又はその変異体若しくは断片に由来し得る（任意に、これを含み得る）。
【０１４８】
ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質誘導体は、それらが由来する参照タンパク質とそれらのアミノ酸配列において（例えば、（ポリ）ペプチド部分及び／又はタンパク質ドメインの導入又は除去によって）異なることができ、そうであることにより「変異体」となり得ることが理解される。しかし、配列変異体は、主に、参照アミノ酸配列に対するそれらの配列同一性で定義されるが、誘導体は、好ましくは、参照タンパク質と比較したときに特定の生物学的特性又は機能性の存在又は非存在によって特徴付けられる。
【０１４９】
多くのＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質誘導体は、それぞれ天然に存在する（野生型）ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質の変異体、断片、断片の変異体、又は変異体の断片に基づく。例えば、本発明に係るＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質誘導体は、エンドヌクレアーゼ及び／又はニッカーゼ活性を無効化する変異を含む、新たな又は追加の生物学的特性又は機能性を付与するエフェクター又はアダプタードメインを含むように更に操作された操作済タンパク質変異体に基づく誘導体を含み得る。
【０１５０】
好ましい実施形態では、本発明の人工核酸分子は、したがって、本明細書に定義されるＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１）誘導体をコードし、ここで前記誘導体は、少なくとも１つの更なるエフェクタードメインを含む。
【０１５１】
「エフェクタードメイン」は、追加の及び／又は新たな生物学的特性又は機能性を付与するタンパク質部分として理解されるべきである。本発明の文脈において、エフェクタードメインは、（新たな又は追加の）生物学的機能をＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質に付与するそれらの能力に基づいて、好ましくは、標的ＤＮＡ配列と特異的に相互作用する適切なガイドＲＮＡと会合する能力を妨害することなしに選択され得る。新たな又は追加の生物学的機能は、例えば、転写抑制（ＣＲＩＳＰＲ干渉、ＣＲＩＳＰＲｉを誘導する）又は活性化（ＣＲＩＳＰＲ活性化、ＣＲＩＳＰＲａを誘導する）であり得る。したがって、本発明の文脈における目的のエフェクタードメインは、クリュペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメイン、ＭＡＸ相互作用タンパク質１（ＭＸＩ１）ドメイン、４つの連結ｍＳｉｎ３（ＳＩＤ４Ｘ）ドメイン、又は、例えば、単純ヘルペスＶＰ１６活性化ドメイン（ＶＰ６４又はＶＰ１６０）、核因子κＢ（ＮＦ−κＢ）トランス活性化サブユニット活性化ドメイン（ｐ６５ＡＤ）を含む転写抑制ドメインから選択され得る。そのようなエフェクタードメインは、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質のアミノ（Ｎ）若しくはカルボキシル（Ｃ）末端、又はその両方に融合することができる。適切なエフェクタードメインを用いることで、転写はエピジェネティックレベルでも調節することができる。ヒストンデメチラーゼＬＳＤ１は、標的遠位エンハンサーからヒストン３  Ｌｙｓ４ジメチル化（Ｈ３Ｋ４ｍｅ２）マークを除去し、転写抑制をもたらす。ヒストンアセチルトランスフェラーゼｐ３００（ｐ３００Ｃｏｒｅ）の触媒コアは、標的化された近位エンハンサー及び遠位エンハンサーにおいてＨ３Ｋ２７（Ｈ３Ｋ２７ａｃ）をアセチル化することができ、これは転写活性化をもたらす。新たな又は追加の生物学的機能性は、追加的又は代替的に、目的のエフェクタードメインの動員であり得る。その目的のために、エフェクタードメインは、「リクルーティングドメイン」、好ましくはＷＲＰＷ（Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ）モチーフなどのタンパク質−タンパク質相互作用ドメイン又はモチーフであり得る（Ｆｉｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １９９６  Ｊｕｎ；１６（６）：２６７０−７）。新たな又は追加の生物学的機能は、追加的又は代替的に、ＲＮＡなどの他の目的の実体の動員であり得る。その目的のために、エフェクタードメインは、コールドショックドメイン（ＣＳＤ）などのタンパク質−ＲＮＡ相互作用ドメインから選択され得る。
【０１５２】
エフェクタードメインを含むＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質誘導体は、したがって、（ａ）標的ＤＮＡ配列（又はそれに機能可能に連結された調節エレメント）と相互作用することができるエフェクタードメインに直接（任意に、適切なリンカーを介して）融合されているＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（又はそのホモログ、変異体、断片）、及び（ｂ）更なる目的のエフェクター（ドメイン、タンパク質、若しくは核酸）を動員するエフェクタードメインに直接（任意に、適切なリンカーを介して）融合されており、後に、標的ＤＮＡ配列（又はそれに機能可能に連結された調節エレメント）と相互作用することができるＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（又はそのホモログ、変異体、断片）を含む。
【０１５３】
エフェクタードメインは、遺伝子工学の標準的な技術を用いて、任意に、適切な（ペプチド）リンカーを介して、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（又はその変異体若しくは断片）に融合することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２  （４ｔｈ  ｅｄ．），  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照）。
【０１５４】
対象となるペプチドリンカーは、当技術分野において一般に知られており、以下の３つのタイプに分類することができる：フレキシブルリンカー、リジッドリンカー、及び切断可能リンカー。フレキシブルリンカーは、通常、結合されたドメインがある程度の運動又は相互作用を必要とする場合に適用され、したがって本発明のＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質誘導体の文脈において特に興味深い。それらは通常、小さい非極性（例えば、Ｇｌｙ）又は極性（例えば、Ｓｅｒ又はＴｈｒ）のアミノ酸がリッチであり、良好な柔軟性及び溶解性を提供し、連結したタンパク質ドメインの運動性を可能にする。Ｓｅｒ又はＴｈｒを含有させることで、水分子と水素結合を形成することによって水溶液中でのリンカーの安定性を維持することができ、したがって、リンカーとタンパク質部分との間の好ましくない相互作用を低減する。
【０１５５】
最も一般的に使用されるフレキシブルリンカーは、主に、一連のＧｌｙ及びＳｅｒ残基の一続きからなる配列を有する（「ＧＳ」リンカー）。最も広く使用されるフレキシブルリンカーの例は、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎの配列を有する。コピー数「ｎ」を調整することによって、このＧＳリンカーの長さを最適化して、タンパク質ドメインの適切な分離を達成する、又は必要なドメイン間相互作用を維持することができる。ＧＳリンカー以外に、多くの他のフレキシブルリンカーが、組換え融合タンパク質用に設計されている。これらのフレキシブルリンカーは、Ｇｌｙ及びＳｅｒなどの小さい又は極性アミノ酸もリッチであるが、柔軟性を維持するためにＴｈｒ及びＡｌａなどの追加のアミノ酸、並びに溶解性を改善するためにＬｙｓ及びＧｌｕなどの極性アミノ酸を含んでもよい。
【０１５６】
ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ、ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴ、及びＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦを含む、フレキシブルリンカーの幾つかの他の種類が構築融合タンパク質に適用されている。他のフレキシブルリンカーは、グリシンのみのリンカー（Ｇｌｙ）６又は（Ｇｌｙ）８を含む。
【０１５７】
タンパク質ドメインの分離及びそれらの干渉の低減を確実にすべきである場合、リジッドリンカーを使用することができる。一方、切断可能リンカーは、インビボで遊離の機能性ドメインを放出するために導入することができる。Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．  ２０１３  Ｏｃｔ  １５；  ６５（１０）：  １３５７−１３６９は、最も一般的に使用されるペプチドリンカー及びそれらの用途を概説しており、その全体を参照により本明細書に援用する。
【０１５８】
所望のエフェクタードメインをＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質に融合させることに加えて、目的の標的配列に対する所望の生物学的効果を媒介するための幾つかの代替アプローチがある。これらのアプローチは、本質的に、目的のエフェクタードメインを標的ＤＮＡ配列に動員することができるＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（又はガイドＲＮＡ）を利用する。これらのアプローチは、目的の特定の標的ＤＮＡ配列（プロモーター又はエンハンサーなど）へのエフェクタードメインの多重動員（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ）のための更なる選択肢及び柔軟性を提供し得る。
【０１５９】
ＳｕｎＴａｇ活性化法は、小型ペプチドエピトープタグが融合したＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（例えば、ｄＣａｓ９）のアレイを使用して、エフェクタードメイン（例えば、ＶＰ６４）に融合した、スーパーフォルダーＧＦＰ（ｓｆＧＦＰ；タンパク質の折り畳みを改善するため）に融合した単鎖可変断片（ｓｃＦＶ）の多数のコピーを動員する。相乗的三者活性化法（ＶＰＲ）は、所望の生物学的機能性を付与するために、３つのエフェクタードメイン（例えば、転写活性剤、ＶＰ６４、ｐ６５、及びエプスタイン−バーウイルスＲトランス活性化剤（Ｒｔａ））のタンデム融合を使用する。アプタマーに基づく動員システム（相乗的活性化メディエーター（ＳＡＭ））は、２つの結合部位（例えば、テトラループ及び第２のステムループにあるＲＮＡアプタマー）を有するガイドＲＮＡを有するＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（例えば、ｄＣａｓ９）を利用して、エフェクタードメインに融合しているファージＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ）（例えば、ｐ６５などの転写活性化因子及びヒートショック因子１（ＨＳＦ１））を動員する。更に、更なるエフェクタードメイン（例えば、ＶＰ６４）をＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質に融合させて、本発明に係る誘導体を得ることができる。
【０１６０】
上に活性化方法は、転写抑制機能又は他の所望の生物学的機能性を、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質又はそれらのホモログ、変異体、断片、若しくは誘導体に付与するように容易に適合され得る。ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質誘導体、及びＣＲＩＳＰＲａ及びＣＲＩＳＰＲｉを媒介するための様々なアプローチは、Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２０１６  Ｊａｎ；１７（１）：５−１５に概説されており、その全体を参照により本明細書に援用する。
【０１６１】
シグナルペプチド
幾つかの実施形態では、本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡは、シグナルペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列を含む。前記核酸配列は、好ましくは本発明の人工核酸分子のコード領域（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする）内に位置する。したがって、本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡは、少なくとも１つのシグナルペプチドを含む、本明細書に定義されるＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質又はそのホモログ、変異体、断片、若しくは誘導体をコードするコード領域を好ましくは含むことができる。
【０１６２】
シグナルペプチド（シグナル配列、標的シグナル、局在化シグナル、局在化配列、輸送ペプチド、リーダー配列、又はリーダーペプチドと呼ばれることもある）は、典型的には、好ましくは、コードされたＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（又はそのホモログ、変異体、断片、若しくは誘導体）のＮ末端に位置する短い（５〜３０アミノ酸長）ペプチドである。
【０１６３】
シグナルペプチドは、好ましくは、コードされたＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（又はそのホモログ、変異体、断片、若しくは誘導体）の、画定された細胞区画（例えば、細胞表面、小胞体（ＥＲ）、又はエンドソーム−リソソーム区画）への輸送を媒介する。したがって、シグナルペプチドは、生産細胞系から発現されたタンパク質の排出を促進するために特に有用である。
【０１６４】
本発明の文脈において想定される例示的なシグナルペプチドとしては、限定されるものではないが、古典的又は非古典的ＭＨＣ分子のシグナル配列（例えば、ＭＨＣＩ及びＩＩ分子のシグナル配列、例えば、ＭＨＣクラスＩ分子ＨＬＡ−Ａ＊０２０１のシグナル配列）、サイトカイン又は免疫グロブリンのシグナル配列、免疫グロブリン又は抗体の不変鎖のシグナル配列、Ｌａｍｐ１、タパシン、Ｅｒｐ５７、カルレチクリン、カルネキシン、ＰＬＡＴ、ＥＰＯ又はアルブミンのシグナル配列、及び更なる膜関連タンパク質、又は小胞体（ＥＲ）又はエンドソーム−リソソーム区画に関連するタンパク質のシグナル配列が挙げられる。最も好ましくは、シグナル配列は、（ヒト）ＨＬＡ−Ａ２、（ヒト）ＰＬＡＴ、（ヒト）ｓＥＰＯ、（ヒト）ＡＬＢ、（ヒト）ＩｇＥ−リーダー、（ヒト）ＣＤ５、（ヒト）ＩＬ２、（ヒト）ＣＴＲＢ２、（ヒト）ＩｇＧ−ＨＣ、（ヒト）Ｉｇ−ＨＣ、（ヒト）Ｉｇ−ＬＣ、ＧｐＬｕｃ、（ヒト）Ｉｇカッパ、又は前述のタンパク質のいずれかの断片若しくは変異体、特にＨＬＡ−Ａ２、ＨｓＰＬＡＴ、ｓＨｓＥＰＯ、ＨｓＡＬＢ、ＨｓＰＬＡＴ（ａａ１−２２）、ＨｓＰＬＡＴ（ａａ１−２２）、ＩｇＥ−リーダー、ＨｓＣＤ５（ａａ１−２４）、ＨｓＩＬ２（ａａ１−２０）、ＨｓＣＴＲＢ２（ａａ１−１８）、ＩｇＧ−ＨＣ（ａａ１−１９）、Ｉｇ−ＨＣ（ａａ１−１９）、Ｉｇ−ＬＣ（ａａ１−１９）、ＧｐＬｕｃ（１−１７）、又はＭｍＩｇカッパに由来する。本発明は、変異体又は断片が機能的である限り、即ち目的の（細胞内又は細胞外）細胞位置にＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を標的とすることができる限り、前述のシグナル配列又はその変異体若しくは断片の使用を想定する。
【０１６５】
前記シグナルペプチドをコードする核酸配列は、好ましくは、標準的な遺伝子工学技術によって、本発明の人工核酸のコード領域中のＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（又はそのホモログ、変異体、断片、若しくは誘導体）をコードする核酸配列に融合される（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２  （４ｔｈ  ｅｄ．），  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。前記コード領域の発現により、好ましくは、（好ましくはそのＮ末端、Ｃ末端、又はその両方に）コードされたシグナルペプチドを含むＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質が生じる。
【０１６６】
核局在化配列（ＮＬＳ）
本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡは、好ましくは少なくとも１つの核局在化配列（ＮＬＳ）をコードする核酸配列を更に含み得る。前記核酸配列は、好ましくは本発明の人工核酸分子の（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする）コード領域内に位置する。したがって、本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡは、少なくとも１つの核局在化配列（ＮＬＳ）を含む、本明細書に定義されるＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、又はそのホモログ、変異体、断片、若しくは誘導体をコードするコード領域を好ましくは含むことができる。
【０１６７】
核局在化シグナル又は配列（ＮＬＳ）は、核タンパク質の核内への輸送を媒介するアミノ酸の短い一続きである。本発明の人工核酸によってコードされるＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、哺乳動物細胞における治療及び研究用途が特に想定されるので、それらがそれらの効果をゲノムＤＮＡに対して発揮し得る核内への移入を可能にするために、少なくとも１つのＮＬＳを設けることができる。ＮＬＳは、核エンベロープ内の核孔複合体（ＮＰＣ）と相互作用し、それによってＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質の核内への輸送を促進することが好ましい。
【０１６８】
様々なＮＬＳ配列が当技術分野で知られており、本発明に係るそれらの使用（又は使用のための適合）は、当業者の平均的な技術及び知識の範囲内である。最もよく特徴付けられている輸送シグナルは、核タンパク質移入のための古典的ＮＬＳ（ｃＮＬＳ）であり、それは塩基性アミノ酸の１つ（単節型（ｍｏｎｏｐａｒｔｉｔｅ））又は２つ（双節型（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ））の一続きからなる。典型的には、単節型モチーフは、ヘリックス切断残基によって先行される塩基性残基のクラスターによって特徴付けられる。同様に、双節型モチーフは、９〜１２残基離れた塩基性残基の２つのクラスターからなる。単節型ｃＮＬＳは、ＳＶ４０ラージＴ抗原ＮＬＳ（１２６ＰＫＫＫＲＲＶ１３２；配列番号３８１）により例示され、双節型ｃＮＬＳは、ヌクレオプラスミンＮＬＳ（１５５ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ１７０；配列番号３８２）により例示される。単節型ＮＬＳのＮ末端リジンからの連続残基は、Ｐ１、Ｐ２などと呼ばれる。単節型ｃＮＬＳは、典型的には、Ｐ１位置にリジンを必要とし、続いて位置Ｐ２及びＰ４に塩基性残基が続き、Ｋ（Ｋ／Ｒ）Ｘ（Ｋ／Ｒ）のゆるいコンセンサス配列を生じる（配列番号３８４；Ｌａｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２００７  Ｆｅｂ  ２３；  ２８２（８）：  ５１０１−５１０５）。
【０１６９】
したがって、好ましい実施形態によれば、人工核酸分子は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）をコードする少なくとも１つの核酸配列を更に含むことが想定される。したがって、本発明に係る人工核酸分子は、１、２、３、４、５、又はそれ以上のＮＬＳをコードしていてもよく、それらは本明細書に例示されたＮＬＳから任意に選択される。前記ＮＬＳコード核酸配列は、好ましくは本発明の人工核酸のコード領域に位置し、好ましくはＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする核酸配列に融合され、その結果、前記コード領域の発現により、前記少なくとも１つＮＬＳを、好ましくはそのＮ末端、Ｃ末端、又はその両方に含むＣＲＩＳＰＲ会合タンパク質を生じる。換言すれば、本発明に係る人工核酸分子は、少なくとも１つのＮＬＳを、好ましくはそのＮ末端、Ｃ末端、又はその両方に含むＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を好ましくはコードし得る。
【０１７０】
本発明に係る好適なＮＬＳは、本明細書でＮＬＳ２とも呼ばれる、配列番号４２６に係るアミノ酸配列（ＭＡＰＫＫＫＲＫＶＧＩＨＧＶＰＡＡ）を含む又はからなることができ、これは、配列番号４０９；２５３８、１３７８；３６９８；４８５８；６０１８；７１７８；又は８３３８のいずれかに係る核酸配列、又はこれらの配列のいずれかの（機能的）変異体又は断片、特に、これらの配列のいずれかに対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ得る。本発明は更に、変異体及び断片が機能的である、即ち、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質の核内への移入を媒介することができる限り、ＮＬＳ２の変異体又は断片の使用も想定される。そのような機能的変異体又は断片は、配列番号４２６に係るアミノ酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む又はからなり得る。
【０１７１】
本発明に係る別の好適なＮＬＳは、本明細書でＮＬＳ４とも呼ばれる、配列番号４２７に係るアミノ酸配列（ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ）を含む又はからなることができ、これは、配列番号４１０；２５３９；１３７９；３６９９；４８５９；６０１９；７１７９；８３３９のいずれかに係る核酸配列、又はこれらの配列のいずれかの（機能的）変異体又は断片、特に、これらの配列のいずれかに対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ得る。本発明は更に、変異体及び断片が機能的である、即ち、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質の核内への移入を媒介することができる限り、ＮＬＳ４の変異体又は断片の使用も想定される。そのような機能的変異体又は断片は、配列番号４２７に係るアミノ酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む又はからなり得る。
【０１７２】
本発明に係る別の好適なＮＬＳは、本明細書でＮＬＳ４とも呼ばれる、配列番号４２７に係るアミノ酸配列（ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ）を含む又はからなることができ、これは、配列番号４１０；２５３９；１３７９；３６９９；４８５９；６０１９；７１７９；８３３９のいずれかに係る核酸配列、又はこれらの配列のいずれかの（機能的）変異体又は断片、特に、これらの配列のいずれかに対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ得る。本発明は更に、変異体及び断片が機能的である、即ち、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質の核内への移入を媒介することができる限り、ＮＬＳ４の変異体又は断片の使用も想定される。そのような機能的変異体又は断片は、配列番号４２７に係るアミノ酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む又はからなり得る。
【０１７３】
ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質に２つ以上のＮＬＳを設けることが本明細書では更に想定され、これらのＮＬＳは、例えば、ＮＬＳ２（配列番号４２６によって特徴付けられる）及びＮＬＳ４（配列番号４２７によって特徴付けられる）又はこれらの核局在化シグナルのいずれか又は両方の機能的変異体又は断片から選択され得る。
【０１７４】
本発明に係る別の好適なＮＬＳは、本明細書でＮＬＳ３とも呼ばれる、配列番号１０５７５に係るアミノ酸配列（ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ）を含む又はからなることができ、これは、配列番号４１０；２５３９  １３７９；３６９９；４８５９；６０１９；７１７９；８３３９、１０５５１；１０５８１、１０５９３；１０５８４；１０５８７；１０５９０；１０５９３；１０５９６のいずれかに係る核酸配列、又はこれらの配列のいずれかの（機能的）変異体又は断片、特に、これらの配列のいずれかに対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ得る。本発明は更に、変異体及び断片が機能的である、即ち、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質の核内への移入を媒介することができる限り、ＮＬＳ３の変異体又は断片の使用も想定される。そのような機能的変異体又は断片は、配列番号４２７に係るアミノ酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む又はからなり得る。
【０１７５】
したがって、更なる好ましいＮＬＳ配列は、配列番号４２６；４２７；１０５７５；３８１；３８２；３８４；１１９５７；１１９５８〜１１９６４に係るアミノ酸配列を含み又はからなることができ、４０９；２５３８；４１０；２５３９；１０５５１；１０５８１；１１９７３；１１９７４〜１１９８；１３７８；３６９８；４８５８；６０１８；７１７８；８３３８；１３７９；３６９９；４８５９；６０１９；７１７９；８３３９；１０５９３；１０５８４；１０５８７；１０５９０；１０５９３；１０５９６；１１９６５；１１９８１；１１９８９；１１９９７；１２００５；１２０１３；１１９６６〜１１９７２；１１９８２〜１１９８８；１１９９０〜１１９９６；１１９９８〜１２００４；１２００６〜１２０１２；又は１２０１４〜１２０２０に係る核酸配列によってコードし得る。
【０１７６】
更なる好ましいＮＬＳは、配列番号１２０２１〜１４２７４に係るアミノ酸配列を含む又はからなり得る。
【０１７７】
前記したＮＬＳ配列は、一般に使用され認められているＮＬＳの非限定的一覧である。本明細書中で言及された遺伝子編集酵素のいずれか、即ち、Ｃａｓ９又はＣｐｆ１は、当技術分野で知られた任意の他のＮＬＳと、及び配列中の任意の数のＮＬＳ配列と組み合わせることができる。また、異なるＮＬＳ配列の組合せも本発明の前記開示によって網羅されている。
【０１７８】
本明細書に開示される遺伝子編集タンパク質をコードする配列、又は本明細書に開示されるＮＬＳの任意の数及び／又は組合せ（即ち、５’／３’ＮＬＳ）で任意のＮＬＳを含む配列表中の遺伝子編集タンパク質をコードする配列も本発明の教示の範囲に含まれる。
【０１７９】
タンパク質及びペプチドのタグ
幾つかの実施形態において、本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡは、タンパク質又はペプチドのタグをコードする少なくとも１つの核酸配列を更に含む。前記核酸配列は、好ましくは本発明の人工核酸分子のコード領域（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする）内に位置する。したがって、本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡは、少なくとも１つのタンパク質又はペプチドのタグを含む、本明細書に定義されるＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、又はそのホモログ、変異体、断片、若しくは誘導体をコードするコード領域を含むことが好ましい。
【０１８０】
タンパク質及びペプチドのタグは、精製、検出、局在化を可能にするために、又は他の目的のために目的タンパク質に導入することができるアミノ酸配列である。タンパク質及びペプチドのタグは、それらの機能に基づいて分類することができ、限定するものではないが、親和性タグ（例えば、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリ（Ｈｉｓ）タグ、Ｆｃタグ、Ｓｔｒｅｐタグ）、可溶化タグ（例えば、チオレドキシン（ＴＲＸ）及びポリ（ＮＡＮＰ））、クロマトグラフィータグ（例えば、ＦＬＡＧタグ）、エピトープタグ（例えば、Ｖ５タグ、Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、及びＮＥタグ）、蛍光タグ（例えば、ＧＦＰタグ）、又はその他（ビオチン化及びその後の単離を可能にするＡｖタグ）が挙げられる。
【０１８１】
したがって、本発明に係る人工核酸分子は、１、２、３、４、５、又はそれ以上のタンパク質又はペプチドタグをコードすることができ、これらは本明細書に例示されるタンパク質タグから任意に選択される。前記タンパク質又はペプチドタグをコードする核酸配列は、好ましくは本発明の人工核酸分子のコード領域に位置し、好ましくはＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする核酸配列に融合され、その結果、前記コード領域の発現により、前記少なくとも１つのタンパク質又はペプチドタグを含むＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質が生じる。換言すれば、本発明に係る人工核酸分子は、少なくとも１つのタンパク質又はペプチドタグを含むＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を好ましくはコードすることができる。そのようなタンパク質又はペプチドタグをコードする核酸を導入するための手段及び方法は、当業者の技術及び常識の範囲内である。
【０１８２】
本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡは、適切である場合又は必要に応じて、組み合わせられた特徴又は特性が互いに干渉し合うことがない限り、互いに組み合わせて、前記した特徴又は特性のいずれかを示すＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１など）をコードしてもよい。したがって、人工核酸分子、特にＲＮＡは、コードされたＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（及びＮＬＳ、シグナル配列、タンパク質／ペプチドタグ）が、好ましくは上で定義されたその所望の生物学的機能又は特性を保持する限り、本明細書に例示される任意のＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、又は本明細書に定義されるそのホモログ、変異体、断片、若しくは誘導体をコードすることができ、これは１以上のＮＬＳ、及び任意に１以上のシグナル配列及び／又はタンパク質若しくはペプチドタグを含み得る。
【０１８３】
精製、検出、局在化のため又は他の目的のために導入された前記タグ配列を含まないタンパク質又はペプチドタグを有する配列も全て、本発明の教示の範囲内に含まれる。換言すれば、ペプチド又はタンパク質タグとともに配列表に開示されている配列も、タグ配列が除かれた場合でも、本発明の教示の範囲内に明確に含まれる。当業者であれば、タグ付きタンパク質配列から任意のタグ配列を容易に除去することができる、即ち、本発明の配列をタグなしの形態でも使用することができる。必要に応じて、タンパク質から容易に除去することができる、又はタンパク質に付加することもできるポリＣ及びヒストンステムループ配列についても同様である。
【０１８４】
Ｃａｓ９
「Ｃａｓ９」は、ストレプトコッカスピオゲネス血清型Ｍ１  ｃａｓ９遺伝子（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＣ＿００２７３７．２、「ＳＰｙ１０４６」；Ｓ．ピオゲネス）、即ち、ｓｐＣａｓ９又はそのホモログ、変異体、若しくは断片によってコードされ得るＲＮＡガイドＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓＤＮＡエンドヌクレアーゼを意味する。Ｃａｓ９は、好ましくはガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）によって動員されて、部位特異的に、ＤＮＡの二重らせんの各鎖に１つずつである２つの異なるエンドヌクレアーゼドメイン（ＨＮＨ及びＲｕｖＣ／ＲＮａｓｅ  Ｈ様ドメイン）を用いて標的ＤＮＡ配列を切断する。ＲｕｖＣ及びＨＮＨは協働して、二本鎖切断（ＤＳＢ）を生じ、別々に一本鎖切断を生じさせることができる（米国特許出願公開第２０１４−００６８７９７号明細書及びＪｉｎｅｋ  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２０１２  Ａｕｇ  １７；３３７（６０９６）：８１６−２１）。Ｃａｓ９は、好ましくは、標的ＤＮＡ配列に並置されたプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を特異的に認識（好ましくはそれに結合）することができる。ＰＡＭは、典型的には、標的ＤＮＡの３’に位置し、いずれも３ヌクレオチド配列ＮＧＧを含み得る又はからなり得る。典型的には、Ｃａｓ９のＣ末端近傍に位置するＰＡＭ相互作用ドメイン（ＰＩドメイン）によって認識される。
【０１８５】
多数のＣａｓ９タンパク質が、当技術分野において知られており、本発明の文脈においてＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質として想定される。好適なＣａｓ９タンパク質は、以下の表２に列挙されている。そこでは、各行は、対応するタンパク質のデータベースアクセッション番号によって同定されるＣａｓ９タンパク質に対応する（第１列、「Ａ」、「Ａｃｃ．Ｎｏ．」）。表２の第２列（「Ｂ」）は、本明細書に提供されるそれぞれのアミノ酸配列に対応する配列番号を示す。好ましいＣａｓ９タンパク質は、配列番号４２８〜４４１；配列番号１０９９９〜１１００１；及び配列番号４４２〜１３４５として配列表に示される。本発明の好ましい実施形態である対応する最適化されたｍＲＮＡ配列は、配列番号４１１；２５４０〜２５５３；１１１１７〜１１１１９；１１３５５〜１１３５７；２５５４〜３４５７；１３８０〜１３９３；３７００〜３７１３；４８６０〜４８７３；６０２０〜６０３３；７１８０〜７１９３；８３４０〜８３５３；１１２３７〜１１２３９；１１４７３〜１１４７５；１１５９１〜１１５９３；１１７０９〜１１７１１；１１８２７〜１１８２９；１１９４５〜１１９４７；１３９４〜２２９７；３７１４〜４６１７；４８７４〜５７７７；６０３４〜６９３７；７１９４〜８０９７；及び８３５４〜９２５７として配列表に示される。
【０１８６】
アミノ酸配列
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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【表２−５】
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【表２−６】
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【表２−７】
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【表２−８】
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【表２−９】
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【表２−１０】
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【表２−１１】
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【表２−１２】
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【表２−１３】
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【表２−１４】
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【表２−１５】
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【表２−１６】
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【表２−１７】
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【表２−１８】
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【表２−１９】
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【表２−２０】
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【表２−２１】
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【表２−２２】
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【表２−２３】
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【表２−２４】
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【０１８７】
好ましい実施形態では、本発明の人工核酸分子は、表２の各列に与えられるデータベースアクセッション番号によって定義されるＣａｓ９タンパク質をコードする核酸配列、又はそのホモログ、変異体、断片、若しくは誘導体を含む又はからなるコード配列を含む。特に、コードされたＣａｓ９タンパク質は、表２の各列に示されるアミノ酸配列、又はそのホモログ、変異体、断片、若しくは誘導体を好ましくは含む又はからなることができる。
【０１８８】
具体的には、好ましい実施形態では、本発明の人工核酸分子は、したがって、配列番号４２８〜１３７５のいずれかによって定義されるアミノ酸配列、又はその（機能的）ホモログ、変異体、断片、若しくは誘導体、特に、これらの配列のいずれかに対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む又はからなるＣａｓ９タンパク質をコードする核酸配列を含む又はからなるコード配列を含み得る。
【０１８９】
特に、コードされたＣａｓ９タンパク質は、好ましくは少なくとも１つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）、より好ましくは上で定義されたＮＬＳ２及びＮＬＳ４から選択される２つのＮＬＳを含み得る。好ましい態様において、本発明の人工核酸分子は、配列番号４２６；４２７；１０５７５；３８１；３８２；３８４；１１９５７；１１９５８〜１１９６４、又は配列番号１２０２１〜１４２７４のいずれかで定義されるアミノ酸配列、又はその（機能的）ホモログ、変異体、断片、若しくは誘導体、特に、これらの配列のいずれかに対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む又はからなる核局在化シグナルを有するＣａｓ９タンパク質をコードする核酸配列を含む又はからなるコード配列を含み得る。
【０１９０】
本明細書で想定される好ましい機能的Ｃａｓ９変異体としては、特に「ｄｅａｄＣａｓ９（ｄＣａｓ９）」及び「Ｃａｓ９ニッカーゼ」が挙げられる。
【０１９１】
「ｄＣａｓ９」という用語は、「触媒的に不活性」、「触媒的に死んだＣａｓ９」、又は「死んだＣａｓ９」とも呼ばれるヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９を意味する。このようなヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼ活性の全て又は一部を欠くので、ＲＮＡにガイドされる方法で遺伝子を調節するために使用できる（Ｊｉｎｅｋ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２０１２  Ａｕｇ  １７；３３７（６０９６）：８１６−２１）。ｄＣａｓ９ヌクレアーゼは、典型的には２つの触媒残基（Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９（即ち、ｓｐＣａｓ９）に対して番号付けされたＲｕｖＣ−１ドメインのＤ１０Ａ、及びＨＮＨドメインのＨ８４０Ａ）の両方に、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ活性を不活性化する変異を含む。しかし、ヌクレアーゼドメインのいずれか又は両方の活性を低下させるために、他の触媒残基も変異させることができる。ｄＣａｓ９は、ｄｓＤＮＡを切断できないことが好ましいが、適切なｇＲＮＡと会合し、標的ＤＮＡに特異的に結合する能力を保持する。アミノ酸位置Ｄ１０Ａ及びＨ８４０Ａに変化をもつＣａｓ９二重変異体は、ヌクレアーゼ及びニッカーゼ活性の両方を完全に不活性化する。「ｄＣａｓ９」に基づくＣａｓ９誘導体を使用して、追加のエフェクタードメインを標的ＤＮＡ配列に送り込み、それにより、例えばＣＲＩＳＰＲａ又はＣＲＩＳＰＲｉを誘導することができる（本明細書の他の箇所で説明）。
【０１９２】
「Ｃａｓ９ニッカーゼ」という用語は、標的核酸配列に二本鎖切断を導入する能力を保持しないが、標的部位に結合して一本鎖切断を導入する能力を維持するＣａｓ９変異体を意味する。そのような変異体は、典型的には、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼドメイン（ＨＮＨ及びＲｕｖＣ）の両方ではなく、一方に変異を含む。したがって、Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９（即ち、ｓｐＣａｓ９）に対して番号付けされたＣａｓ９の位置Ｄ１０Ａ又はＨ８４０Ａのアミノ酸変異は、ヌクレアーゼ触媒活性の不活性化を引き起こし、Ｃａｓ９をニッカーゼに変換し得る。
【０１９３】
更なるＣａｓ９変異体は当技術分野で知られており、本発明に係る変異体として想定される。米国特許出願公開第２０１４０２７３２２６号明細書は、Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９遺伝子、Ｃａｓ９タンパク質、並びに宿主特異的コドン最適化Ｃａｓ９コード配列及びＣａｓ９融合タンパク質を含むＣａｓ９タンパク質の変異体について記載している。米国特許出願公開第２０１４０３１５９８５号明細書は、Ｓ．ピオゲネス由来のＣａｓ９の配列（米国特許出願公開第２０１４０２７３２２６号明細書の配列番号８）を含む多数の例示的な野生型Ｃａｓ９ポリペプチド（例えば、米国特許出願公開第２０１４０２７３２２６号明細書の配列番号１〜２５６、配列番号７９５〜１３４６）を教示している。Ｃａｓ９タンパク質の修飾及び変異体についても記載されている。これらの文献の開示は、その全体を本明細書に援用する。
【０１９４】
更なる実施形態において、本発明に係る人工核酸は、参照によりその全体を本明細書に援用するＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０７６７７５の表２に示されるように、Ｃａｓ９タンパク質、又はそのアイソフォーム、ホモログ、変異体、断片、若しくは誘導体をコードする。したがって、例えば、本発明の人工核酸は、ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０７６７７５の配列番号４２８〜１３４５又は１３６２〜１３７５のいずれかにより定義されるアミノ酸配列を含む又はからなるＣａｓ９タンパク質、又はその（機能的）アイソフォーム、ホモログ、変異体、断片、又は誘導体をコードする少なくとも１つのコード配列を含み得る。
【０１９５】
核酸配列
好ましい実施形態では、本発明の人工核酸分子は、本明細書に定義されるＣａｓ９タンパク質をコードする核酸配列を含む又はからなるコード配列を含むことができ、前記核酸配列は、配列番号４１２；３４７４〜３８８７；２３１４〜２３２７；４６３４〜４６４７；５７９４〜５８０７；６９５４〜６９６７；８１１４〜８１２７；４１３〜４２５；３４９０〜３５０３；３５０６〜３５１９；３５２２〜３５３５；３５３８〜３５５１；３５５４〜３５６７；３５７０〜３５８３；３５８６〜３５９９；３６０２〜３６１５；３６１８〜３６３１；３６３４〜３６４７；３６５０〜３６６３；３６６６〜３６７９；３６８２〜３６９５；９５１４〜９５２７；９６２６〜９６３９；９７３８〜９７５１；９８５０〜９８６３；９９６２〜９９７５；１００７４〜１００８７；１０１８６〜１０１９９；１０２９８〜１０３１１；２３３０〜２３４３；２３４６〜２３５９；２３６２〜２３７５；２３７８〜２３９１；２３９４〜２４０７；２４１０〜２４２３；２４２６〜２４３９；２４４２〜２４５５；２４５８〜２４７１；２４７４〜２４８７；２４９０〜２５０３；２５０６〜２５１９；２５２２〜２５３５；９４９８〜９５１１；９６１０〜９６２３；９７２２〜９７３５；９８３４〜９８４７；９９４６〜９９５９；１００５８〜１００７１；１０１７０〜１０１８３〜１０２８２〜１０２９５；４６５０〜４６６３；４６６６〜４６７９；４６８２〜４６９５；４６９８〜４７１１；４７１４〜４７２７；４７３０〜４７４３；４７４６〜４７５９；４７６２〜４７７５；４７７８〜４７９１；４７９４〜４８０７；４８１０〜４８２３；４８２６〜４８３９；４８４２〜４８５５；９５３０〜９５４３；９６４２〜９６５５；９７５４〜９７６７；９８６６  〜９８７９；９９７８〜９９９１；１００９０〜１０１０３；１０２０２〜１０２１５；１０３１４〜１０３２７；５８１０〜５８２３；５８２６〜５８３９；５８４２〜５８５５；５８５８〜５８７１；５８７４〜５８８７；５８９０〜５９０３；５９０６〜５９１９；５９２２〜５９３５；５９３８〜５９５１；５９５４〜５９６７；５９７０〜５９８３；５９８６〜５９９９；６００２〜６０１５；９５４６〜９５５９；９６５８〜９６７１；９７７０〜９７８３；９８８２〜９８９５；９９９４〜１０００７；１０１０６〜１０１１９；１０２１８〜１０２３１；１０３３０〜１０３４３；６９７０〜６９８３；６９８６〜６９９９；７００２〜７０１５；７０１８〜７０３１；７０３４〜７０４７；７０５０〜７０６３；７０６６〜７０７９；７０８２〜７０９５；７０９８〜７１１１；７１１４〜７１２７；７１３０〜７１４３；７１４６〜７１５９；７１６２〜７１７５；９５６２〜９５７５；９６７４〜９６８７；９７８６〜９７９９；９８９８〜９９１１；１００１０〜１００２３；１０１２２〜１０１３５；１０２３４〜１０２４７；１０３４６〜１０３５９；８１３０〜８１４３；８１４６〜８１５９；８１６２〜８１７５；８１７８〜８１９１；８１９４〜８２０７；８２１０〜８２２３；８２２６〜８２３９；８２４２〜８２５５；８２５８〜８２７１；８２７４〜８２８７；８２９０〜８３０２；８３０６〜８３１９；８３���２〜８３３５；９５７８〜９５９１；９６９０〜９７０３；９８０２〜９８１５；９９１４〜９９２７；１００２６〜１００３９；１０１３８〜１０１５１；１０２５０〜１０２６３；１０３６２〜１０３７５；９２９０〜９３０３；９３０６〜９３１９；９３２２〜９３３５；９３３８〜９３５１；９３５４〜９３６７；９３７０〜９３８３；９３８６〜９３９９；９４０２〜９４１５；９４１８〜９４３１；９４３４〜９４４７；９４５０〜９４６３；９４６６〜９４７９；９４８２〜９４９５；９５９４〜９６０７；９７０６〜９７１９；９８１８〜９８３１；９９３０〜９９４３；１００４２〜１００５５；１０１５４〜１０１６７；１０２６６〜１０２７９；１０３７８〜１０３９１；２７；９９６〜１００９；２１５６〜２１６９；３３１６〜３３２９；４４７６〜４４８９；５６３６〜５６４９；６７９６〜６８０９；７９５６〜７９６９；１０１０〜１９１３；２１７０〜３０７３；３３３０〜４２３３；４４９０〜５３９３；５６５０〜６５５３；６８１０〜７７１３；７９７０〜８８７３のいずれか、又はその（機能的）ホモログ、変異体、断片、若しくは誘導体、特に、これらの配列のいずれかに対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有する核酸配列で定義される。
【０１９６】
好ましい実施形態では、本発明の人工核酸は、それらのコード領域において、少なくとも１つの核局在化シグナルを更にコードする。核局在化シグナルをコードする核酸配列は、好ましくは、本明細書で定義されるＣａｓ９タンパク質、又はそのホモログ、変異体、断片、若しくは誘導体をコードする核酸に融合され、前記Ｃａｓ９タンパク質、又はそのホモログ、変異体、断片、又は誘導体の核への輸送を促進する。したがって、好ましい実施形態では、人工核酸は、少なくとも１つの核局在化シグナルと融合されたＣａｓ９タンパク質、又はそのホモログ、変異体、断片、若しくは誘導体をコードする核酸配列を含む又はからなり、前記核酸配列は、好ましくは、配列番号４０９；２５３８；４１０；２５３９；１０５５１；１０５８１；１１９７３；１１９７４〜１１９８０；１３７８；３６９８；４８５８；６０１８；７１７８；８３３８；１３７９；３６９９；４８５９；６０１９；７１７９；８３３９；１０５９３；１０５８４；１０５８７；１０５９０；１０５９３；１０５９６；１１９６５；１１９８１；１１９８９；１１９９７；１２００５；１２０１３；１１９６６〜１１９７２；１１９８２〜１１９８８；１１９９０〜１１９９６；１１９９８〜１２００４；１２００６〜１２０１２；１２０１４〜１２０２０のいずれか、又はタンパク質配列番号１２０２１〜１４２７４をコードする核酸配列、又はその（機能的）ホモログ、変異体、断片、若しくは誘導体、特に、これらの配列のいずれかに対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有する核酸配列で定義される。
【０１９７】
本発明は、前記コードされたタンパク質の発現を好ましくは上昇させるために、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質コード領域と本明細書で定義されるＵＴＲとの有利な組合せを想定している。好ましい実施形態では、したがって、人工核酸は、少なくとも１つの核局在化シグナルに融合されたＣａｓ９タンパク質又はそのホモログ、変異体、断片、若しくは誘導体をコードする核酸配列を含む又はからなり、前記核酸配列は、配列番号４１２；３４７４〜３８８７；２３１４〜２３２７；４６３４〜４６４７；５７９４〜５８０７；６９５４〜６９６７；８１１４〜８１２７；４１３〜４２５；３４９０〜３５０３；３５０６〜３５１９；３５２２〜３５３５；３５３８〜３５５１；３５５４〜３５６７；３５７０〜３５８３；３５８６〜３５９９；３６０２〜３６１５；３６１８〜３６３１；３６３４〜３６４７；３６５０〜３６６３；３６６６〜３６７９；３６８２〜３６９５；９５１４〜９５２７；９６２６〜９６３９；９７３８〜９７５１；９８５０〜９８６３；９９６２〜９９７５；１００７４〜１００８７；１０１８６〜１０１９９；１０２９８〜１０３１１；２３３０〜２３４３；２３４６〜２３５９；２３６２〜２３７５；２３７８〜２３９１；２３９４〜２４０７；２４１０〜２４２３；２４２６〜２４３９；２４４２〜２４５５；２４５８〜２４７１；２４７４〜２４８７；２４９０〜２５０３；２５０６〜２５１９；２５２２〜２５３５；９４９８〜９５１１；９６１０〜９６２３；９７２２〜９７３５；９８３４〜９８４７；９９４６〜９９５９；１００５８〜１００７１；１０１７０〜１０１８３〜１０２８２〜１０２９５；４６５０〜４６６３；４６６６〜４６７９；４６８２〜４６９５；４６９８〜４７１１；４７１４〜４７２７；４７３０〜４７４３；４７４６〜４７５９；４７６２〜４７７５；４７７８〜４７９１；４７９４〜４８０７；４８１０〜４８２３；４８２６〜４８３９；４８４２〜４８５５；９５３０〜９５４３；９６４２〜９６５５；９７５４〜９７６７；９８６６〜９８７９；９９７８〜９９９１；１００９０〜１０１０３；１０２０２〜１０２１５；１０３１４〜１０３２７；５８１０〜５８２３；５８２６〜５８３９；５８４２〜５８５５；５８５８〜５８７１；５８７４〜５８８７；５８９０〜５９０３；５９０６〜５９１９；５９２２〜５９３５；５９３８〜５９５１；５９５４〜５９６７；５９７０〜５９８３；５９８６〜５９９９；６００２〜６０１５；９５４６〜９５５９；９６５８〜９６７１；９７７０〜９７８３；９８８２〜９８９５；９９９４〜１０００７；１０１０６〜１０１１９；１０２１８〜１０２３１；１０３３０〜１０３４３；６９７０〜６９８３；６９８６〜６９９９；７００２〜７０１５；７０１８〜７０３１；７０３４〜７０４７；７０５０〜７０６３；７０６６〜７０７９；７０８２〜７０９５；７０９８〜７１１１；７１１４〜７１２７；７１３０〜７１４３；７１４６〜７１５９；７１６２〜７１７５；９５６２〜９５７５；９６７４〜９６８７；９７８６〜９７９９；９８９８〜９９１１；１００１０〜１００２３；１０１２２〜１０１３５；１０２３４〜１０２４７；１０３４６〜１０３５９；８１３０〜８１４３；８１４６〜８１５９；８１６２〜８１７５；８１７８〜８１９１；８１９４〜８２０７；８２１０〜８２２３；８２２６〜８２３９；８２４２〜８２５５；８２５８〜８２７１；８２７４〜８２８７；８２９０〜８３０２；８３０６〜８３１９；８３２２〜８３３５；９５７８〜９５９１；９６９０〜９７０３；９８０２〜９８１５；９９１４〜９９２７；１００２６〜１００３９；１０１３８〜１０１５１；１０２５０〜１０２６３；１０３６２〜１０３７５；９２９０〜９３０３；９３０６〜９３１９；９３２２〜９３３５；９３３８〜９３５１；９３５４〜９３６７；９３７０〜９３８３；９３８６〜９３９９；９４０２〜９４１５；９４１８〜９４３１；９４３４〜９４４７；９４５０〜９４６３；９４６６〜９４７９；９４８２〜９４９５；９５９４〜９６０７；９７０６〜９７１９；９８１８〜９８３１；９９３０〜９９４３；１００４２〜１００５５；１０１５４〜１０１６７；１０２６６〜１０２７９；１０３７８〜１０３９１、又はその（機能的）ホモログ、変異体、断片、若しくは誘導体、特に、これらの配列のいずれかに対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有する核酸配列で定義される。
【０１９８】
本発明は、前記コードされたタンパク質の発現を好ましくは上昇させるために、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質コード領域と本明細書で定義されるＵＴＲとの有利益な組合せを想定している。したがって、好ましい実施形態では、人工核酸は、少なくとも１つの核局在化シグナルに融合されたＣａｓ９タンパク質又はそのホモログ、変異体、断片、若しくは誘導体をコードする核酸配列を含む又はからなり、前記核酸配列は、配列番号１４２７４、配列番号１４２７５、配列番号１４２７６、配列番号１４２７７、配列番号１４２７８、配列番号１４２７９、配列番号１４２８０、配列番号１４２８１、及び配列番号１４２８２、より好ましくは配列番号１４２８１、配列番号４１７（ＨＳＤ１７Ｂ４／ＰＳＭＢ３．１、即ち、構築物ＨＳＤ１７Ｂ４＿ＮＬＳ２＿ＳＴＲＰ１（ＳＦ３７０）−ｃａｓ９＿ＨｓＯｐｔ＿ＮＬＳ４＿ＰＳＭＢ３．１；Ｈｓｏｐｔ＝ホモサピエンス最適化）又は配列番号４１４（Ｓｌｃ７ａ３．１／Ｇｎａｓ１、即ち、構築物Ｓｃｌ７ａ３．１＿ＮＬＳ２＿ＳＴＲＰ１（ＳＦ３７０）−ｃａｓ９＿ＨｓＯｐｔ＿ＮＬＳ４＿Ｇｎａｓ．１）からなる群から選択される。
【０１９９】
有利には、開示される任意のＣａｓ９配列、即ち本明細書及び／又は配列表に開示される前記した任意の配列、即ちＣａｓ９タンパク質配列及びそれぞれのＣａｓ９タンパク質配列の異なるバージョンをコードするｍＲＮＡ、即ちＷＴ又は最適化された配列を、本発明の使用のために選択することができる。
【０２００】
更に、Ｃａｓ９ニッカーゼによるハンチンチン遺伝子からのＣＡＧトラクトの正確な切除は、参照により本明細書に援用されるＰＭＩＤ  ２９５３５５９４を参照することにより、本発明の教示の範囲内に含まれる。また、髄膜炎菌由来の天然ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムによるプログラム可能なＲＮＡ切断及び認識は、参照により本明細書に援用されるＰＭＩＤ  ２９４５６１８９を参照することにより、本発明の教示の範囲内に含まれる。更に、カンピロバクタージェジュニＣａｓ９による内因性ＲＮＡのＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ依存性結合及び切断は、参照により本明細書に援用されるＰＭＩＤ  ２９４９９１３９を参照することにより、本発明の教示の範囲内に含まれる。また、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介トランスエピジェネティック調節を介したインビボ標的遺伝子活性化は、参照により本明細書に援用されるＰＭＩＤ  ２９２２４７８３を参照することにより、本発明の教示の範囲内に含まれる。
【０２０１】
更なる実施形態では、本発明はまた、表２Ａに示される核酸配列も想定する。
【表２Ａ】
2020513824.tif 000028
【０２０２】
更なる実施形態において、ＮＬＳ２＿ＳＴＲＰ１（ＳＦ３７０）−ｃａｓ９＿ＨｓＯｐｔ＿ＮＬＳ４（配列番号４１２）は、表２Ａに示されるようにＵＴＲの組合せ、即ちＳｌｃ７ａ３．１（配列番号１５／１６）／Ｇｎａｓ．１（配列番号２９／３０）と組み合わされる。
【表２Ｂ】
2020513824.tif 000029
【０２０３】
更なる実施形態では、本発明に係る人工核酸配列は、ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０７６７７５の配列番号１３８０〜１３９３；１３９４〜２２９７；２３１４〜２３２７；２３３０〜２３４３；２３４６〜２３５９；２３６２〜２３７５；２３７８〜２３９１；２３９４〜２４０７；２４１０〜２４２３；２４２６〜２４３９；２４４２〜２４５５；２４５８〜２４７１；２４７４〜２４８７；２４９０〜２５０３；２５０６〜２５１９；２５２２〜２５３５；９４９８〜９５１１；９６１０〜９６２３；９７２２〜９７３５；９８３４〜９８４７；９９４６〜９９５９；１００５８〜１００７１；１０１７０〜１０１８３〜１０２８２〜１０２９５；２５４０〜２５５３；２５５４〜３４５７；３４７４〜３８８７；３４９０〜３５０３；３５０６〜３５１９；３５２２〜３５３５；３５３８〜３５５１；３５５４〜３５６７；３５７０〜３５８３；３５８６〜３５９９；３６０２〜３６１５；３６１８〜３６３１；３６３４〜３６４７；３６５０〜３６６３；３６６６〜３６７９；３６８２〜３６９５；９５１４〜９５２７；９６２６〜９６３９；９７３８〜９７５１；９８５０〜９８６３；９９６２〜９９７５；１００７４〜１００８７；１０１８６〜１０１９９；１０２９８〜１０３１１；３７００〜３７１３；３７１４〜４６１７；４６３４〜４６４７；４６５０〜４６６３；４６６６〜４６７９；４６８２〜４６９５；４６９８〜４７１１；４７１４〜４７２７；４７３０〜４７４３；４７４６〜４７５９；４７６２〜４７７５；４７７８〜４７９１；４７９４〜４８０７；４８１０〜４８２３；４８２６〜４８３９；４８４２〜４８５５；９５３０〜９５４３；９６４２〜９６５５；９７５４〜９７６７；９８６６〜９８７９；９９７８〜９９９１；１００９０〜１０１０３；１０２０２〜１０２１５；１０３１４〜１０３２７；４８６０〜４８７３；４８７４〜５７７７；５７９４〜５８０７；５８１０〜５８２３；５８２６〜５８３９；５８４２〜５８５５；５８５８〜５８７１；５８７４〜５８８７；５８９０〜５９０３；５９０６〜５９１９；５９２２〜５９３５；５９３８〜５９５１；５９５４〜５９６７；５９７０〜５９８３；５９８６〜５９９９；６００２〜６０１５；９５４６〜９５５９；９６５８〜９６７１；９７７０〜９７８３；９８８２〜９８９５；９９９４〜１０００７；１０１０６〜１０１１９；１０２１８〜１０２３１；１０３３０〜１０３４３；６０２０〜６０３３；６０３４〜６９３７；６９５４〜６９６７；６９７０〜６９８３；６９８６〜６９９９；７００２〜７０１５；７０１８〜７０３１；７０３４〜７０４７；７０５０〜７０６３；７０６６〜７０７９；７０８２〜７０９５；７０９８〜７１１１；７１１４〜７１２７；７１３０〜７１４３；７１４６〜７１５９；７１６２〜７１７５；９５６２〜９５７５；９６７４〜９６８７；９７８６〜９７９９；９８９８〜９９１１；１００１０〜１００２３；１０１２２〜１０１３５；１０２３４〜１０２４７；１０３４６〜１０３５９；７１８０〜７１９３；７１９４〜８０９７；８１１４〜８１２７；８１３０〜８１４３；８１４６〜８１５９；８１６２〜８１７５；８１７８〜８１９１；８１９４〜８２０７；８２１０〜８２２３；８２２６〜８２３９；８２４２〜８２５５；８２５８〜８２７１；８２７４〜８２８７；８２９０〜８３０２；８３０６〜８３１９；８３２２〜８３３５；９５７８〜９５９１；９６９０〜９７０３；９８０２〜９８１５；９９１４〜９９２７；１００２６〜１００３９；１０１３８〜１０１５１；１０２５０〜１０２６３；１０３６２〜１０３７５；８３４０〜８３５３；８３５４〜９２５７；９２７４〜９２８７；９２９０〜９３０３；９３０６〜９３１９；９３２２〜９３３５；９３３８〜９３５１；９３５４〜９３６７；９３７０〜９３８３；９３８６〜９３９９；９４０２〜９４１５；９４１８〜９４３１；９４３４〜９４４７；９４５０〜９４６３；９４６６〜９４７９；９４８２〜９４９５；９５９４〜９６０７；９７０６〜９７１９；９８１８〜９８３１；９９３０〜９９４３；１００４２〜１００５５；１０１５４〜１０１６７；１０２６６〜１０２７９；１０３７８〜１０３９１；４１１；１３８０〜１３９３；２５４０〜２５５３；３７００〜３７１３；４８６０〜４８７３；６０２０〜６０３３；７１８０〜７１９３；８３４０〜８３５３；１３９４〜２２９７；２５５４〜３４５７；３７１４〜４６１７；４８７４〜５７７７；６０３４〜６９３７；７１９４〜８０９７；８３５４〜９２５７；２３１４〜２３２７；３４７４〜３８８７；４６３４〜４６４７；５７９４〜５８０７；６９５４〜６９６７；８１１４〜８１２７；９２７４〜９２８７；４１３〜４２５；２３３０〜２３４３；２３４６〜２３５９；２３６２〜２３７５；２３７８〜２３９１；２３９４〜２４０７；２４１０〜２４２３；２４２６〜２４３９；２４４２〜２４５５；２４５８〜２４７１；２４７４〜２４８７；２４９０〜２５０３；２５０６〜２５１９；２５２２〜２５３５；９４９８〜９５１１；９６１０〜９６２３；９７２２〜９７３５；９８３４〜９８４７；９９４６〜９９５９；１００５８〜１００７１；１０１７０〜１０１８３〜１０２８２〜１０２９５；３４９０〜３５０３；３５０６〜３５１９；３５２２〜３５３５；３５３８〜３５５１；３５５４〜３５６７；３５７０〜３５８３；３５８６〜３５９９；３６０２〜３６１５；３６１８〜３６３１；３６３４〜３６４７；３６５０〜３６６３；３６６６〜３６７９；３６８２〜３６９５；９５１４〜９５２７；９６２６〜９６３９；９７３８〜９７５１；９８５０〜９８６３；９９６２〜９９７５；１００７４〜１００８７；１０１８６〜１０１９９；１０２９８〜１０３１１；４６５０〜４６６３；４６６６〜４６７９；４６８２〜４６９５；４６９８〜４７１１；４７１４〜４７２７；４７３０〜４７４３；４７４６〜４７５９；４７６２〜４７７５；４７７８〜４７９１；４７９４〜４８０７；４８１０〜４８２３；４８２６〜４８３９；４８４２〜４８５５；９５３０〜９５４３；９６４２〜９６５５；９７５４〜９７６７；９８６６〜９８７９；９９７８〜９９９１；１００９０〜１０１０３；１０２０２〜１０２１５；１０３１４〜１０３２７；５８１０〜５８２３；５８２６〜５８３９；５８４２〜５８５５；５８５８〜５８７１；５８７４〜５８８７；５８９０〜５９０３；５９０６〜５９１９；５９２２〜５９３５；５９３８〜５９５１；５９５４〜５９６７；５９７０〜５９８３；５９８６〜５９９９；６００２〜６０１５；９５４６〜９５５９；９６５８〜９６７１；９７７０〜９７８３；９８８２〜９８９５；９９９４〜１０００７；１０１０６〜１０１１９；１０２１８〜１０２３１；１０３３０〜１０３４３；６９７０〜６９８３；６９８６〜６９９９；７００２〜７０１５；７０１８〜７０３１；７０３４〜７０４７；７０５０〜７０６３；７０６６〜７０７９；７０８２〜７０９５；７０９８〜７１１１；７１１４〜７１２７；７１３０〜７１４３；７１４６〜７１５９；７１６２〜７１７５；９５６２〜９５７５；９６７４〜９６８７；９７８６〜９７９９；９８９８〜９９１１；１００１０〜１００２３；１０１２２〜１０１３５；１０２３４〜１０２４７；１０３４６〜１０３５９；８１３０〜８１４３；８１４６〜８１５９；８１６２〜８１７５；８１７８〜８１９１；８１９４〜８２０７；８２１０〜８２２３；８２２６〜８２３９；８２４２〜８２５５；８２５８〜８２７１；８２７４〜８２８７；８２９０〜８３０２；８３０６〜８３１９；８３２２〜８３３５；９５７８〜９５９１；９６９０〜９７０３；９８０２〜９８１５；９９１４〜９９２７；１００２６〜１００３９；１０１３８〜１０１５１；１０２５０〜１０２６３；１０３６２〜１０３７５；９２９０〜９３０３；９３０６〜９３１９；９３２２〜９３３５；９３３８〜９３５１；９３５４〜９３６７；９３７０〜９３８３；９３８６〜９３９９；９４０２〜９４１５；９４１８〜９４３１；９４３４〜９４４７；９４５０〜９４６３；９４６６〜９４７９；９４８２〜９４９５；９５９４〜９６０７；９７０６〜９７１９；９８１８〜９８３１；９９３０〜９９４３；１００４２〜１００５５；１０１５４〜１０１６７；１０２６６〜１０２７９；１０３７８〜１０３９１に係る核酸配列、又はその（機能的）ホモログ、断片、変異体、若しくは誘導体を含む又はからなり得る。
【０２０４】
Ｃｐｆ１
「Ｃｐｆ１」（「Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ及びＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  １由来のＣＲＩＳＰＲ」）又は「Ｃａｓ１２」は、推定クラス２タイプＶ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム（Ｚｅｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ．  ２０１５  Ｏｃｔ  ２２；  １６３（３）：  ７５９−７７１）に属するＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼ、及びそのホモログ、変異体、断片、及び誘導体を意味する。Ｃｐｆ１をコードする遺伝子は、フランシセラ  ツラレンシス亜種ノビシダ（Ｕ１１２株）ｃｐｆ１遺伝子（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＺ＿ＣＰ００９６３３．１、「ＡＷ２５＿ＲＳ０３０３５」）又はそのホモログ、変異体、又は断片を含む。配列分析に基づき、Ｃｐｆ１は、１つだけの検出可能なＲｕｖＣエンドヌクレアーゼドメインと、第２の推定新規ヌクレアーゼ（ＮＵＣ）ドメインを含む（Ｚｅｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ．  ２０１５  Ｏｃｔ  ２２；  １６３（３）：  ７５９−７７１，  Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．  ２０１６  Ａｕｇ；２６（８）：９０１−１３）。
【０２０５】
Ｃｐｆ１タンパク質は、ｃｒＲＮＡと会合して、好ましくは標的ＤＮＡ配列と特異的に相互作用することができるＣｐｆ１：ｃｒＲＮＡ複合体を形成することが好ましい。Ｃｐｆ１：ｃｒＲＮＡ複合体は、ターゲットＤＮＡの５’に位置する短いＴリッチプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）によって先行されるターゲットＤＮＡを効率的に切断でき、４又は５−ｎｔの５’オーバーハングを有する互い違いのＤＮＡ二本鎖切断を導入できることが好ましい。
【０２０６】
アミノ酸配列
幾つかのＣｐｆ１タンパク質が、当技術分野において知られており、本発明の文脈においてＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質として想定される。好適なＣｐｆ１タンパク質は、以下の表３に列挙されている。そこでは、各行は、データベースアクセッション番号によって同定されるＣｐｆ１タンパク質に対応する（第１列、「Ａ」、「Ａｃｃ．Ｎｏ．」）。表２の第２列（「Ｂ」）は、本明細書に提供されるそれぞれのアミノ酸配列に対応する配列番号を示す。好ましいＣｐｆ１タンパク質は、配列番号１３４６〜１３４７；１０５７６〜１０５７７；及び１３４８〜１３６１として配列表に示される。本発明の好ましい実施形態である対応する最適化されたｍＲＮＡ配列は、配列番号１０５５２；３４５８〜３４５９；３４６０〜３４７３  ２２９８〜２２９９；４６１８〜４６１９；５７７８〜５７７９；６９３８〜６９３９；８０９８〜８０９９；９２５８〜９２５９；２３００〜２３１３；４６２０〜４６３３；５７８０〜５７９３；６９４０〜６９５３；８１００〜８１１３；及び９２６０〜９２７３として配列表に示される。
【表３】
2020513824.tif 000030
【０２０７】
好ましい実施形態では、本発明の人工核酸分子は、表３の各列に提供されるデータベースアクセッション番号によって定義されるＣｐｆ１タンパク質、又はそのホモログ、変異体、断片、若しくは誘導体をコードする核酸配列を含む又はからなるコード配列を含む。特に、コードされたＣｐｆ１タンパク質は、好ましくは、表３の各列に示されるアミノ酸配列、又はそのホモログ、変異体、断片、若しくは誘導体を含む又はらからなり得る。
【０２０８】
具体的には、好ましい実施形態では、本発明の人工核酸分子は、配列番号１３４６〜１３４７；１０５７６〜１０５７７；又は１３４８〜１３６１によって定義されるアミノ酸配列、又はその（機能的）ホモログ、変異体、断片、若しくは誘導体、特に、これらの配列のいずれかに対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有する核酸配列を含む又はからなるコード配列を含み得る。
【０２０９】
特に、コードされたＣｐｆ１タンパク質は、好ましくは少なくとも１つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）、より好ましくは上で定義したＮＬＳ２及びＮＬＳ４から選択される２つのＮＬＳを含み得る。好ましい実施形態では、本発明の人工核酸分子は、配列番号９９２〜９９３によって定義されるアミノ酸配列、又はその（機能的）ホモログ、変異体、断片、若しくは誘導体、特に、これらの配列のいずれかに対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有する核酸配列を含む又はからなる核局在化シグナルを有するＣｐｆ１タンパク質をコードする核酸配列を含む又はからなるコード配列を含み得る。
【０２１０】
更なる態様において、本発明に係る人工核酸は、参照によりその全体が本明細書に援用されるＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０７６７７５の表３に示される、Ｃｐｆ１タンパク質、又はそのアイソフォーム、ホモログ、変異体、断片、若しくは誘導体をコードする。具体的には、本発明の人工核酸（ＲＮＡ）分子は、ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０７６７７５の配列番号１３４６〜１３６１、１３７６〜１３７７、又は１０５７６〜１０５７７のいずれかによって定義されるアミノ酸配列を含む又はからなるＣｐｆ１タンパク質、又はその（機能的）アイソフォーム、ホモログ、変異体、断片、又は誘導体をコードするコード配列を含み得る。
【０２１１】
核酸配列
好ましい実施形態では、本発明の人工核酸分子は、本明細書に定義されるＣｐｆ１タンパク質をコードする核酸配列（ここで、前記核酸配列は、配列番号３４８８〜３４８９；１０３９６；２３２８〜２３２９；１０３９５；４６４８〜４６４９；１０３９７；５８０８〜５８０９；１０３９８；６９６８〜６９６９；１０３９９；８１２８〜８１２９；１０４００；９２７４〜９２８７；３５０４〜３５０５；３５２０〜３５２１；３５３６〜３５３７；３５５２〜３５５３；３５６８〜３６６９；３５８４〜３５８５；３６００〜３６０１；３６１６〜３６１７；３６３２〜３６３３；３６４８〜３６４９；３６６４〜３６６５；３６８０〜３６８１；３６９６〜３６９７；９５２８〜９５２９；９６４０〜９６４１；９７５２〜９７５３；９８６４〜９８６５；９９７６〜９９７７；１００８８〜１００８９；１０２００〜１０２０１；１０３１２〜１０３１３；１０４０３；１０４１０；１０４１７；１０４２４；１０４３１；１０４３８；１０４４５；１０４５２；１０４５９；１０４６６；１０４７３；１０４８０；１０４８７；１０４９４；１０５０１；１０５０８；１０５１５；１０５２２；１０５２９；１０５３６；１０５４３；２３４４〜２３４５；２３６０〜２３６１；２３７６〜２３７７；２３９２〜２３９３；２４０８〜２４０９；２４２４〜２４２５；２４４０〜２４４１；２４５６〜２４５７；２４７２〜２４７３；２４８９〜２４９０；２５０４〜２５０５；２５２０〜２５２１；２５３６〜２５３７；９５１２〜９５１３；９６２４〜９６２５；９７３６〜９７３７；９８４８〜９８４９；９９６０〜９９６１；１００７２〜１００７３；１０１８４〜１０１８５；１０２９６〜１０２９７；１０４０２；１０４０９；１０４１６；１０４２３；１０４３０；１０４３７；１０４４４；１０４５１；１０４５８；１０４６５；１０４７２；１０４７９；１０４８６；１０４９３；１０５００；１０５０７；１０５１４；１０５２１；１０５２８；１０５３５；１０５４２；４６６４〜４６６５；４６８０〜４６８１；４６９６〜４６９７；４７１２〜４７１３；４７２８〜４７２９；４７４４〜４７４５；４７６０〜４７６１；４７７６〜４７７７；４７９２〜４７９３；４８０８〜４８０９；４８２４〜４８２５；４８４０〜４８４１；４８５６〜４８５７；９５４４〜９５４５；９６５６〜９６５７；９７６８〜９７６９；９８８０〜９８８１；９９９２〜９９９３；１０１０４〜１０１０５；１０２１６〜１０２１７；１０３２８〜１０３２９；１０４０４；１０４１１；１０４１８；１０４２５；１０４３２；１０４３９；１０４４６；１０４５３；１０４６０；１０４６７；１０４７４；１０４８１；１０４８８；１０４９５；１０５０２；１０５０９；１０５１６；１０５２３；１０５３０；１０５３７；１０５４４；５８２４〜５８２５；５８４０〜５８４１；５８５６〜５８５７；５８７２〜５８７３；５８８８〜５８８９；５９０４〜５９０５；５９２０〜５９２１；５９３６〜５９３７；５９５２〜５９５３；５９６８〜５９６９；５９８４〜５９８５；６０００〜６００１；６０１６〜６０１７；９５６０〜９５６１；９６７２〜９６７３；９７８４〜９７８５；９８９６〜９８９７；１０００８〜１０００９；１０１２０〜１０１２１；１０２３２〜１０２３３；１０３４４〜１０３４５；１０４０５；１０４１２；１０４１９；１０４２６；１０４３３；１０４４０；１０４４７；１０４５４；１０４６１；１０４６８；１０４７５；１０４８２；１０４８９；１０４９６；１０５０３；１０５１０；１０５１７；１０５２４；１０５３１；１０５３８；１０５４５；７０３３；７０４８〜７０４９；７０６４〜７０６５；７０８０〜７０８１；７０９６〜７０９７；７１１２〜７１１３；７１２８〜７１２９；７１４４〜７１４５；７１６０〜７１６１；７１７６〜７１７７；９５７６〜９５７７；９６８８〜９６８９；９８００〜９８０１；９９１２〜９９１３；１００２４〜１００２５；１０１３６〜１０１３７；１０２４８〜１０２４９；１０３６０〜１０３６１；１０４０６；１０４１３；１０４２０；１０４２７；１０４３４；１０４４１；１０４４８；１０４５５；１０４６２；１０４６９；１０４７６；１０４８３；１０４９０；１０４９７；１０５０４；１０５１１；１０５１８；１０５２５；１０５３２；１０５３９；１０５４６；８１４４〜８１４５；８１６０〜８１６０；８１７６〜８１７７；８１９２〜８１９３；８２０８〜８２０９；８２２４〜８２２５；８２４０〜８２４１；８２５６〜８２５７；８２７２〜８２７３；８２８８〜８２８９；８３０４〜８３０５；８３２０〜８３２１；８３３６〜８３３７；９５９２〜９５９３；９７０４〜９７０５；９８１６〜９８１７；９９２８〜９９２９；１００４０〜１００４１；１０１５２〜１０１５３；１０２６４〜１０２６５；１０３７６〜１０３７７；１０４０７；１０４１４；１０４２１；１０４２８；１０４３５；１０４４２；１０４４９；１０４５６；１０４６３；１０４７０；１０４７７；１０４８４；１０４９１；１０４９８；１０５０５；１０５１２；１０５１９；１０５２６；１０５３３；１０５４０；１０５４７；９２８８〜９２８９；１０４０１；１０５５３；１０５８２〜１０５８３；１０５７９〜１０５８０；１０５８５〜１０５８６；１０５８８〜１０５８９；１０５９１〜１０５９２；１０５９４〜１０５９５；１０５９７〜１０５９８；１０５５４〜１０５７４；１０６０１；１０６０２；１０６１５；１０６１６；１０６２９；１０６３０；１０６４３；１０６４４；１０６５７；１０６５８；１０６７１；１０６７２；１０６８５；１０６８６；１０６９９；１０７００；１０７１３；１０７１４；１０７２７；１０７２８；１０７４１；１０７４２；１０７５５；１０７５６；１０７６９；１０７７０；１０７８３；１０７８４；１０７９７；１０７９８；１０８１１；１０８１２；１０８２５；１０８２６；１０８３９；１０８４０；１０８５３；１０８５４；１０８６７；１０８６８；１０８８１；１０８８２；１０６０３；１０６０４；１０６１７；１０６１８；１０６３１；１０６３２；１０６４５；１０６４６；１０６５９；１０６６０；１０６７３；１０６７４；１０６８７；１０６８８；１０７０１；１０７０２；１０７１５；１０７１６；１０７２９；１０７３０；１０７４３；１０７４４；１０７５７；１０７５８；１０７７１；１０７７２；１０７８５；１０７８６；１０７９９；１０８００；１０８１３；１０８１４；１０８２７；１０８２８；１０８４１；１０８４２；１０８５５；１０８５６；１０８６９；１０８７０；１０８８３；１０８８４；１０６０５；１０６０６；１０６１９；１０６２０；１０６３３；１０６３４；１０６４７；１０６４８；１０６６１；１０６６２；１０６７５；１０６７６；１０６８９；１０６９０；１０７０３；１０７０４；１０７１７；１０７１８；１０７３１；１０７３２；１０７４５；１０７４６；１０７５９；１０７６０；１０７７３；１０７７４；１０７８７；１０７８８；１０８０１；１０８０２；１０８１５；１０８１６；１０８２９；１０８３０；１０８４３；１０８４４；１０８５７；１０８５８；１０８７１；１０８７２；１０８８５；１０８８６；１０６０７；１０６０８；１０６２１；１０６２２；１０６３５；１０６３６；１０６４９；１０６５０；１０６６３；１０６６４；１０６７７；１０６７８；１０６９１；１０６９２；１０７０５；１０７０６；１０７１９；１０７２０；１０７３３；１０７３４；１０７４７；１０７４８；１０７６１；１０７６２；１０７７５；１０７７６；１０７８９；１０７９０；１０８０３；１０８０４；１０８１７；１０８１８；１０８３１；１０８３２；１０８４５；１０８４６；１０８５９；１０８６０；１０８７３；１０８７４；１０８８７；１０８８８；１０６０９；１０６１０；１０６２３；１０６２４；１０６３７；１０６３８；１０６５１；１０６５２；１０６６５；１０６６６；１０６７９；１０６８０；１０６９３；１０６９４；１０７０７；１０７０８；１０７２１；１０７２２；１０７３５；１０７３６；１０７４９；１０７５０；１０７６３；１０７６４；１０７７７；１０７７８；１０７９１；１０７９２；１０８０５；１０８０６；１０８１９；１０８２０；１０８３３；１０８３４；１０８４７；１０８４８；１０８６１；１０８６２；１０８７５；１０８７６；１０８８９；１０８９０；１０６１１；１０６１２；１０６２５；１０６２６；１０６３９；１０６４０；１０６５３；１０６５４；１０６６７；１０６６８；１０６８１；１０６８２；１０６９５；１０６９６；１０７０９；１０７１０；１０７２３；１０７２４；１０７３７；１０７３８；１０７５１；１０７５２；１０７６５；１０７６６；１０７７９；１０７８０；１０７９３；１０７９４；１０８０７；１０８０８；１０８２１；１０８２２；１０８３５；１０８３６；１０８４９；１０８５０；１０８６３；１０８６４；１０８７７；１０８７８；１０８９１；１０８９２；９３０４〜９３０５；９３２０〜９３２１；９３３６〜９３３７；９３５２〜９３５３；９３６８〜９３６９；９３８４〜９３８５；９４００〜９４０１；９４１６〜９４１７；９４３２〜９４３３；９４４８〜９４４９；９４６４〜９４６５；９４８０〜９４８１；９４９６〜９４９７；９６０８〜９６０９；９７２０〜９７２１；９８３２〜９８３３；９９４４〜９９４５；１００５６〜１００５７；１０１６８〜１０１６９；１０２８０〜１０２８１；１０３９２〜１０３９３；１０４０８；１０４１５；１０４２２；１０４２９；１０４３６；１０４４３；１０４５０；１０４５７；１０４６４；１０４７１；１０４７８；１０４８５；１０４９２；１０４９９；１０５０６；１０５１３；１０５２０；１０５２７；１０５３４；１０５４１；１０５４８のいずれかで定義される）；又はその（機能的）ホモログ、変異体、断片、若しくは誘導体、特に、これらの配列のいずれかに対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有する核酸配列を含む又はからなるコード配列を含み得る。
【０２１２】
別の好ましい実施形態では、本発明の人工核酸分子は、本明細書に定義されるＣｐｆ１タンパク質をコードする核酸配列を含む又はからなるコード配列を含むことができ、前記核酸配列は、配列番号１０５４９（即ち、ＡｓＣｐｆ１＝３２Ｌ４＿ＡｓＣｐｆ１（Ｈｓｏｐｔ）−ＮＬＳ３−３ｘＨＡ−ｔａｇ＿ａｌｂｕｍｉｎ７）又は配列番号１０５５０（即ち、ＬｂＣｐｆ１＝３２Ｌ４＿ＬｂＣｐｆ１（Ｈｓｏｐｔ）−ＮＬＳ３−３ｘＨＡ−ｔａｇ＿ａｌｂｕｍｉｎ７）；又はその（機能的）ホモログ、変異体、断片、若しくは誘導体、特に、これらの配列のいずれかに対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有する核酸配列のいずれかによって定義される。
【０２１３】
好ましい実施形態では、本発明の人工核酸は、それらのコード領域において、少なくとも１つの核局在化シグナルを更にコードする。核局在化シグナルをコードする核酸配列は、好ましくは、Ｃｐｆ１タンパク質、又はそのホモログ、変異体、断片、又は誘導体の核内への輸送を促進するために、本明細書に定義される前記Ｃｐｆ１タンパク質、又はそのホモログ、変異体、断片、若しくは誘導体をコードする核酸に融合される。好ましい実施形態では、人工核酸は、少なくとも１つの核局在化シグナルに融合されたＣｐｆ１タンパク質、又はそのホモログ、断片、変異体、若しくは誘導体をコードする核酸配列を含む又はからなり、前記核酸配列は、配列番号１０５５１；１０５８１；１０５９３；１０５８４；１０５８７；１０５９０；１０５９３；１０５９６；４０９；２５３８；４１０；２５３９；１０５５１；１０５８１；１１９７３；１１９７４〜１１９８０；１３７８；３６９８；４８５８；６０１８；７１７８；８３３８；１３７９；３６９９；４８５９；６０１９；７１７９；８３３９；１０５９３；１０５８４；１０５８７；１０５９０；１０５９３；１０５９６；１１９６５；１１９８１；１１９８９；１１９９７；１２００５；１２０１３；１１９６６〜１１９７２；１１９８２〜１１９８８；１１９９０〜１１９９６；１１９９８〜１２００４；１２００６〜１２０１２；１２０１４〜１２０２０のいすれか、又は配列番号１２０２１〜１４２７４のいずれか又は組合せ、又はその（機能的）ホモログ、変異体、断片、若しくは誘導体、特に、これらの配列のいずれかに対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有する核酸配列のいずれかによって定義される。
【０２１４】
有利には、前記コードタンパク質の発現を好ましくは上昇させるために、Ｃｐｆ１などのＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする核酸配列、又はそれらのホモログ、変異体、断片、若しくは誘導体は、本発明に係る人工核酸のコード領域内で本明細書に定義されるＵＴＲと組み合わされる。好ましい実施形態では、人工核酸は、少なくとも１つの核局在化シグナルに更に融合されたＣｐｆ１タンパク質、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片をコードする核酸配列（ここで、前記核酸配列は、好ましくは、配列番号３４８８〜３４８９；１０３９６；２３２８〜２３２９；１０３９５；４６４８〜４６４９；１０３９７；５８０８〜５８０９；１０３９８；６９６８〜６９６９；１０３９９；８１２８〜８１２９；１０４００；９２７４〜９２８７；３５０４〜３５０５；３５２０〜３５２１；３５３６〜３５３７；３５５２〜３５５３；３５６８〜３６６９；３５８４〜３５８５；３６００〜３６０１；３６１６〜３６１７；３６３２〜３６３３；３６４８〜３６４９；３６６４〜３６６５；３６８０〜３６８１；３６９６〜３６９７；９５２８〜９５２９；９６４０〜９６４１；９７５２〜９７５３；９８６４〜９８６５；９９７６〜９９７７；１００８８〜１００８９；１０２００〜１０２０１；１０３１２〜１０３１３；１０４０３；１０４１０；１０４１７；１０４２４；１０４３１；１０４３８；１０４４５；１０４５２；１０４５９；１０４６６；１０４７３；１０４８０；１０４８７；１０４９４；１０５０１；１０５０８；１０５１５；１０５２２；１０５２９；１０５３６；１０５４３；２３４４〜２３４５；２３６０〜２３６１；２３７６〜２３７７；２３９２〜２３９３；２４０８〜２４０９；２４２４〜２４２５；２４４０〜２４４１；２４５６〜２４５７；２４７２〜２４７３；２４８９〜２４９０；２５０４〜２５０５；２５２０〜２５２１；２５３６〜２５３７；９５１２〜９５１３；９６２４〜９６２５；９７３６〜９７３７；９８４８〜９８４９；９９６０〜９９６１；１００７２〜１００７３；１０１８４〜１０１８５；１０２９６〜１０２９７；１０４０２；１０４０９；１０４１６；１０４２３；１０４３０；１０４３７；１０４４４；１０４５１；１０４５８；１０４６５；１０４７２；１０４７９；１０４８６；１０４９３；１０５００；１０５０７；１０５１４；１０５２１；１０５２８；１０５３５；１０５４２；４６６４〜４６６５；４６８０〜４６８１；４６９６〜４６９７；４７１２〜４７１３；４７２８〜４７２９；４７４４〜４７４５；４７６０〜４７６１；４７７６〜４７７７；４７９２〜４７９３；４８０８〜４８０９；４８２４〜４８２５；４８４０〜４８４１；４８５６〜４８５７；９５４４〜９５４５；９６５６〜９６５７；９７６８〜９７６９；９８８０〜９８８１；９９９２〜９９９３；１０１０４〜１０１０５；１０２１６〜１０２１７；１０３２８〜１０３２９；１０４０４；１０４１１；１０４１８；１０４２５；１０４３２；１０４３９；１０４４６；１０４５３；１０４６０；１０４６７；１０４７４；１０４８１；１０４８８；１０４９５；１０５０２；１０５０９；１０５１６；１０５２３；１０５３０；１０５３７；１０５４４；５８２４〜５８２５；５８４０〜５８４１；５８５６〜５８５７；５８７２〜５８７３；５８８８〜５８８９；５９０４〜５９０５；５９２０〜５９２１；５９３６〜５９３７；５９５２〜５９５３；５９６８〜５９６９；５９８４〜５９８５；６０００〜６００１；６０１６〜６０１７；９５６０〜９５６１；９６７２〜９６７３；９７８４〜９７８５；９８９６〜９８９７；１０００８〜１０００９；１０１２０〜１０１２１；１０２３２〜１０２３３；１０３４４〜１０３４５；１０４０５；１０４１２；１０４１９；１０４２６；１０４３３；１０４４０；１０４４７；１０４５４；１０４６１；１０４６８；１０４７５；１０４８２；１０４８９；１０４９６；１０５０３；１０５１０；１０５１７；１０５２４；１０５３１；１０５３８；１０５４５；７０３３；７０４８〜７０４９；７０６４〜７０６５；７０８０〜７０８１；７０９６〜７０９７；７１１２〜７１１３；７１２８〜７１２９；７１４４〜７１４５；７１６０〜７１６１；７１７６〜７１７７；９５７６〜９５７７；９６８８〜９６８９；９８００〜９８０１；９９１２〜９９１３；１００２４〜１００２５；１０１３６〜１０１３７；１０２４８〜１０２４９；１０３６０〜１０３６１；１０４０６；１０４１３；１０４２０；１０４２７；１０４３４；１０４４１；１０４４８；１０４５５；１０４６２；１０４６９；１０４７６；１０４８３；１０４９０；１０４９７；１０５０４；１０５１１；１０５１８；１０５２５；１０５３２；１０５３９；１０５４６；８１４４〜８１４５；８１６０〜８１６０；８１７６〜８１７７；８１９２〜８１９３；８２０８〜８２０９；８２２４〜８２２５；８２４０〜８２４１；８２５６〜８２５７；８２７２〜８２７３；８２８８〜８２８９；８３０４〜８３０５；８３２０〜８３２１；８３３６〜８３３７；９５９２〜９５９３；９７０４〜９７０５；９８１６〜９８１７；９９２８〜９９２９；１００４０〜１００４１；１０１５２〜１０１５３；１０２６４〜１０２６５；１０３７６〜１０３７７；１０４０７；１０４１４；１０４２１；１０４２８；１０４３５；１０４４２；１０４４９；１０４５６；１０４６３；１０４７０；１０４７７；１０４８４；１０４９１；１０４９８；１０５０５；１０５１２；１０５１９；１０５２６；１０５３３；１０５４０；１０５４７；９２８８〜９２８９；１０４０１；１０５５３；１０５８２〜１０５８３  １０５７９〜１０５８０；１０５８５〜１０５８６；１０５８８〜１０５８９；１０５９１〜１０５９２；１０５９４〜１０５９５；１０５９７〜１０５９８；１０５５４〜１０５７４；１０６０１；１０６０２；１０６１５；１０６１６；１０６２９；１０６３０；１０６４３；１０６４４；１０６５７；１０６５８；１０６７１；１０６７２；１０６８５；１０６８６；１０６９９；１０７００；１０７１３；１０７１４；１０７２７；１０７２８；１０７４１；１０７４２；１０７５５；１０７５６；１０７６９；１０７７０；１０７８３；１０７８４；１０７９７；１０７９８；１０８１１；１０８１２；１０８２５；１０８２６；１０８３９；１０８４０；１０８５３；１０８５４；１０８６７；１０８６８；１０８８１；１０８���２；１０６０３；１０６０４；１０６１７；１０６１８；１０６３１；１０６３２；１０６４５；１０６４６；１０６５９；１０６６０；１０６７３；１０６７４；１０６８７；１０６８８；１０７０１；１０７０２；１０７１５；１０７１６；１０７２９；１０７３０；１０７４３；１０７４４；１０７５７；１０７５８；１０７７１；１０７７２；１０７８５；１０７８６；１０７９９；１０８００；１０８１３；１０８１４；１０８２７；１０８２８；１０８４１；１０８４２；１０８５５；１０８５６；１０８６９；１０８７０；１０８８３；１０８８４；１０６０５；１０６０６；１０６１９；１０６２０；１０６３３；１０６３４；１０６４７；１０６４８；１０６６１；１０６６２；１０６７５；１０６７６；１０６８９；１０６９０；１０７０３；１０７０４；１０７１７；１０７１８；１０７３１；１０７３２；１０７４５；１０７４６；１０７５９；１０７６０；１０７７３；１０７７４；１０７８７；１０７８８；１０８０１；１０８０２；１０８１５；１０８１６；１０８２９；１０８３０；１０８４３；１０８４４；１０８５７；１０８５８；１０８７１；１０８７２；１０８８５；１０８８６；１０６０７；１０６０８；１０６２１；１０６２２；１０６３５；１０６３６；１０６４９；１０６５０；１０６６３；１０６６４；１０６７７；１０６７８；１０６９１；１０６９２；１０７０５；１０７０６；１０７１９；１０７２０；１０７３３；１０７３４；１０７４７；１０７４８；１０７６１；１０７６２；１０７７５；１０７７６；１０７８９；１０７９０；１０８０３；１０８０４；１０８１７；１０８１８；１０８３１；１０８３２；１０８４５；１０８４６；１０８５９；１０８６０；１０８７３；１０８７４；１０８８７；１０８８８；１０６０９；１０６１０；１０６２３；１０６２４；１０６３７；１０６３８；１０６５１；１０６５２；１０６６５；１０６６６；１０６７９；１０６８０；１０６９３；１０６９４；１０７０７；１０７０８；１０７２１；１０７２２；１０７３５；１０７３６；１０７４９；１０７５０；１０７６３；１０７６４；１０７７７；１０７７８；１０７９１；１０７９２；１０８０５；１０８０６；１０８１９；１０８２０；１０８３３；１０８３４；１０８４７；１０８４８；１０８６１；１０８６２；１０８７５；１０８７６；１０８８９；１０８９０；１０６１１；１０６１２；１０６２５；１０６２６；１０６３９；１０６４０；１０６５３；１０６５４；１０６６７；１０６６８；１０６８１；１０６８２；１０６９５；１０６９６；１０７０９；１０７１０；１０７２３；１０７２４；１０７３７；１０７３８；１０７５１；１０７５２；１０７６５；１０７６６；１０７７９；１０７８０；１０７９３；１０７９４；１０８０７；１０８０８；１０８２１；１０８２２；１０８３５；１０８３６；１０８４９；１０８５０；１０８６３；１０８６４；１０８７７；１０８７８；１０８９１；１０８９２；９３０４〜９３０５；９３２０〜９３２１；９３３６〜９３３７；９３５２〜９３５３；９３６８〜９３６９；９３８４〜９３８５；９４００〜９４０１；９４１６〜９４１７；９４３２〜９４３３；９４４８〜９４４９；９４���４〜９４６５；９４８０〜９４８１；９４９６〜９４９７；９６０８〜９６０９；９７２０〜９７２１；９８３２〜９８３３；９９４４〜９９４５；１００５６〜１００５７；１０１６８〜１０１６９；１０２８０〜１０２８１；１０３９２〜１０３９３；１０４０８；１０４１５；１０４２２；１０４２９；１０４３６；１０４４３；１０４５０；１０４５７；１０４６４；１０４７１；１０４７８；１０４８５；１０４９２；１０４９９；１０５０６；１０５１３；１０５２０；１０５２７；１０５３４；１０５４１；１０５４８のいずれかで定義される）；又はその（機能的）ホモログ、変異体、断片、若しくは誘導体、特に、これらの配列のいずれかに対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有する核酸配列を含む又はからなる。
【０２１５】
有利には、開示される任意のＣｐｆ１配列、即ち、上述した配列、即ち、本明細書及び／又は配列表に記載される任意の配列（即ち、Ｃｐｆ１タンパク質配列）及びそれぞれのＣｐｆ１タンパク質配列の各種バージョン（即ち、ＷＴ又は最適化された配列）をコードするｍＲＮＡを、本発明の使用のために選択することができる。
【０２１６】
更なる実施形態では、本発明に係る人工核酸配列は、ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０７６７７５の配列番号２２９８〜２２９９；３４５８〜３４５９；４６１８〜４６１９；５７７８〜５７７９；６９３８〜６９３９；８０９８〜８０９９；９２５８〜９２５９；２３００〜２３１３；３４６０〜３４７３；４６２０〜４６３３；５７８０〜５７９３；６９４０〜６９５３；８１００〜８１１３；９２６０〜９２７３；２３２８〜２３２９；１０３９５；３４８８〜３４８９；１０３９６；４６４８〜４６４９；１０３９７；５８０８〜５８０９；１０３９８；６９６８〜６９６９；１０３９９；８１２８〜８１２９；１０４００；９２８８〜９２８９；１０４０１；２３４４〜２３４５；２３６０〜２３６１；２３７６〜２３７７；２３９２〜２３９３；２４０８〜２４０９；２４２４〜２４２５；２４４０〜２４４１；２４５６〜２４５７；２４７２〜２４７３；２４８９〜２４９０；２５０４〜２５０５；２５２０〜２５２１；２５３６〜２５３７；９５１２〜９５１３；９６２４〜９６２５；９７３６〜９７３７；９８４８〜９８４９；９９６０〜９９６１；１００７２〜１００７３；１０１８４〜１０１８５；１０２９６〜１０２９７；１０４０２；１０４０９；１０４１６；１０４２３；１０４３０；１０４３７；１０４４４；１０４５１；１０４５８；１０４６５；１０４７２；１０４７９；１０４８６；１０４９３；１０５００；１０５０７；１０５１４；１０５２１；１０５２８；１０５３５；１０５４２；３５０４〜３５０５；３５２０〜３５２１；３５３６〜３５３７；３５５２〜３５５３；３５６８〜３６６９；３５８４〜３５８５；３６００〜３６０１；３６１６〜３６１７；３６３２〜３６３３；３６４８〜３６４９；３６６４〜３６６５；３６８０〜３６８１；３６９６〜３６９７；９５２８〜９５２９；９６４０〜９６４１；９７５２〜９７５３；９８６４〜９８６５；９９７６〜９９７７；１００８８〜１００８９；１０２００〜１０２０１；１０３１２〜１０３１３；１０４０３；１０４１０；１０４１７；１０４２４；１０４３１；１０４３８；１０４４５；１０４５２；１０４５９；１０４６６；１０４７３；１０４８０；１０４８７；１０４９４；１０５０１；１０５０８；１０５１５；１０５２２；１０５２９；１０５３６；１０５４３；４６６４〜４６６５；４６８０〜４６８１；４６９６〜４６９７；４７１２〜４７１３；４７２８〜４７２９；４７４４〜４７４５；４７６０〜４７６１；４７７６〜４７７７；４７９２〜４７９３；４８０８〜４８０９；４８２４〜４８２５；４８４０〜４８４１；４８５６〜４８５７；９５４４〜９５４５；９６５６〜９６５７；９７６８〜９７６９；９８８０〜９８８１；９９９２〜９９９３；１０１０４〜１０１０５；１０２１６〜１０２１７；１０３２８〜１０３２９；１０４０４；１０４１１；１０４１８；１０４２５；１０４３２；１０４３９；１０４４６；１０４５３；１０４６０；１０４６７；１０４７４；１０４８１；１０４８８；１０４９５；１０５０２；１０５０９；１０５１６；１０５２３；１０５３０；１０５３７；１０５４４；５８２４〜５８２５；５８４０〜５８４１；５８５６〜５８５７；５８７２〜５８７３；５８８８〜５８８９；５９０４〜５９０５；５９２０〜５９２１；５９３６〜５９３７；５９５２〜５９５３；５９６８〜５９６９；５９８４〜５９８５；６０００〜６００１；６０１６〜６０１７；９５６０〜９５６１；９６７２〜９６７３；９７８４〜９７８５；９８９６〜９８９７；１０００８〜１０００９；１０１２０〜１０１２１；１０２３２〜１０２３３；１０３４４〜１０３４５；１０４０５；１０４１２；１０４１９；１０４２６；１０４３３；１０４４０；１０４４７；１０４５４；１０４６１；１０４６８；１０４７５；１０４８２；１０４８９；１０４９６；１０５０３；１０５１０；１０５１７；１０５２４；１０５３１；１０５３８；１０５４５；６９８４〜６９８５；７０００〜７００１；１０１６〜７０１７；７０３２〜７０３３；７０４８〜７０４９；７０６４〜７０６５；７０８０〜７０８１；７０９６〜７０９７；７１１２〜７１１３；７１２８〜７１２９；７１４４〜７１４５；７１６０〜７１６１；７１７６〜７１７７；９５７６〜９５７７；９６８８〜９６８９；９８００〜９８０１；９９１２〜９９１３；１００２４〜１００２５；１０１３６〜１０１３７；１０２４８〜１０２４９；１０３６０〜１０３６１；１０４０６；１０４１３；１０４２０；１０４２７；１０４３４；１０４４１；１０４４８；１０４５５；１０４６２；１０４６９；１０４７６；１０４８３；１０４９０；１０４９７；１０５０４；１０５１１；１０５１８；１０５２５；１０５３２；１０５３９；１０５４６；８１４４〜８１４５；８１６０〜８１６０；８１７６〜８１７７；８１９２〜８１９３；８２０８〜８２０９；８２２４〜８２２５；８２４０〜８２４１；８２５６〜８２５７；８２７２〜８２７３；８２８８〜８２８９；８３０４〜８３０５；８３２０〜８３２１；８３３６〜８３３７；９５９２〜９５９３；９７０４〜９７０５；９８１６〜９８１７；９９２８〜９９２９；１００４０〜１００４１；１０１５２〜１０１５３；１０２６４〜１０２６５；１０３７６〜１０３７７；１０４０７；１０４１４；１０４２１；１０４２８；１０４３５；１０４４２；１０４４９；１０４５６；１０４６３；１０４７０；１０４７７；１０４８４；１０４９１；１０４９８；１０５０５；１０５１２；１０５１９；１０５２６；１０５３３；１０５４０；１０５４７；９３０４〜９３０５；９３２０〜９３２１；９３３６〜９３３７；９３５２〜９３５３；９３６８〜９３６９；９３８４〜９３８５；９４００〜９４０１；９４１６〜９４１７；９４３２〜９４３３；９４４８〜９４４９；９４６４〜９４６５；９４８０〜９４８１；９４９６〜９４９７；９６０８〜９６０９；９７２０〜９７２１；９８３２〜９８３３；９９４４〜９９４５；１００５６〜１００５７；１０１６８〜１０１６９；１０２８０〜１０２８１；１０３９２〜１０３９３；１０４０８；１０４１５；１０４２２；１０４２９；１０４３６；１０４４３；１０４５０；１０４５７；１０４６４；１０４７１；１０４７８；１０４８５；１０４９２；１０４９９；１０５０６；１０５１３；１０５２０；１０５２７；１０５３４；１０５４１；１０５４８；１０５５２；１０５９４〜１０５９５；１０５８２〜１０５８３；１０５８５〜１０５８６；１０５８８〜１０５８９；１０５９１〜１０５９２；１０５９４〜１０５９５；１０５９７〜１０５９８；１０５５３；１０５９９；１０６００；１０６１３；１０６１４；１０６２７；１０６２８；１０６４１；１０６４２；１０６５５；１０６５６；１０６６９；１０６７０；１０６８３；１０６８４；１０６９７；１０６９８；１０７１１；１０７１２；１０７２５；１０７２６；１０７３９；１０７４０；１０７５３；１０７５４；１０７６７；１０７６８；１０７８１；１０７８２；１０７９５；１０７９６；１０８０９；１０８１０；１０８２３；１０８２４；１０８３７；１０８３８；１０８５１；１０８５２；１０８６５；１０８６６；１０８７９；１０８８０；；１０６０１；１０６０２；１０６１５；１０６１６；１０６２９；１０６３０；１０６４３；１０６４４；１０６５７；１０６５８；１０６７１；１０６７２；１０６８５；１０６８６；１０６９９；１０７００；１０７１３；１０７１４；１０７２７；１０７２８；１０７４１；１０７４２；１０７５５；１０７５６；１０７６９；１０７７０；１０７８３；１０７８４；１０７９７；１０７９８；１０８１１；１０８１２；１０８２５；１０８２６；１０８３９；１０８４０；１０８５３；１０８５４；１０８６７；１０８６８；１０８８１；１０８８２；１０６０３；１０６０４；１０６１７；１０６１８；１０６３１；１０６３２；１０６４５；１０６４６；１０６５９；１０６６０；１０６７３；１０６７４；１０６８７；１０６８８；１０７０１；１０７０２；１０７１５；１０７１６；１０７２９；１０７３０；１０７４３；１０７４４；１０７５７；１０７５８；１０７７１；１０７７２；１０７８５；１０７８６；１０７９９；１０８００；１０８１３；１０８１４；１０８２７；１０８２８；１０８４１；１０８４２；１０８５５；１０８５６；１０８６９；１０８７０；１０８８３；１０８８４；１０６０５；１０６０６；１０６１９；１０６２０；１０６３３；１０６３４；１０６４７；１０６４８；１０６６１；１０６６２；１０６７５；１０６７６；１０６８９；１０６９０；１０７０３；１０７０４；１０７１７；１０７１８；１０７３１；１０７３２；１０７４５；１０７４６；１０７５９；１０７６０；１０７７３；１０７７４；１０７８７；１０７８８；１０８０１；１０８０２；１０８１５；１０８１６；１０８２９；１０８３０；１０８４３；１０８４４；１０８５７；１０８５８；１０８７１；１０８７２；１０８８５；１０８８６；１０６０７；１０６０８；１０６２１；１０６２２；１０６３５；１０６３６；１０６４９；１０６５０；１０６６３；１０６６４；１０６７７；１０６７８；１０６９１；１０６９２；１０７０５；１０７０６；１０７１９；１０７２０；１０７３３；１０７３４；１０７４７；１０７４８；１０７６１；１０７６２；１０７７５；１０７７６；１０７８９；１０７９０；１０８０３；１０８０４；１０８１７；１０８１８；１０
８３１；１０８３２；１０８４５；１０８４６；１０８５９；１０８６０；１０８７３；１０８７４；１０８８７；１０８８８；１０６０９；１０６１０；１０６２３；１０６２４；１０６３７；１０６３８；１０６５１；１０６５２；１０６６５；１０６６６；１０６７９；１０６８０；１０６９３；１０６９４；１０７０７；１０７０８；１０７２１；１０７２２；１０７３５；１０７３６；１０７４９；１０７５０；１０７６３；１０７６４；１０７７７；１０７７８；１０７９１；１０７９２；１０８０５；１０８０６；１０８１９；１０８２０；１０８３３；１０８３４；１０８４７；１０８４８；１０８６１；１０８６２；１０８７５；１０８７６；１０８８９；１０８９０；１０６１１；１０６１２；１０６２５；１０６２６；１０６３９；１０６４０；１０６５３；１０６５４；１０６６７；１０６６８；１０６８１；１０６８２；１０６９５；１０６９６；１０７０９；１０７１０；１０７２３；１０７２４；１０７３７；１０７３８；１０７５１；１０７５２；１０７６５；１０７６６；１０７７９；１０７８０；１０７９３；１０７９４；１０８０７；１０８０８；１０８２１；１０８２２；１０８３５；１０８３６；１０８４９；１０８５０；１０８６３；１０８６４；１０８７７；１０８７８；１０８９１；１０８９２；２２９８〜２２９９；３４５８〜３４５９；４６１８〜４６１９；５７７８〜５７７９；６９３８〜６９３９；８０９８〜８０９９；９２５８〜９２５９；１０５５２；２３００〜２３１３；３４６０〜３４７３；４６２０〜４６３３；５７８０〜５７９３；６９４０〜６９５３；８１００〜８１１３；９２６０〜９２７３；２３１４〜２３２７；３４７４〜３８８７；４６３４〜４６４７；５７９４〜５８０７；６９５４〜６９６７；８１１４〜８１２７；９２７４〜９２８７；２３２８〜２３２９；１０３９５；３４８８〜３４８９；１０３９６；４６４８〜４６４９；１０３９７；５８０８〜５８０９；１０３９８；６９６８〜６９６９；１０３９９；８１２８〜８１２９；１０４００；９２８８〜９２８９；１０４０１；１０５５３；２３４４〜２３４５；２３６０〜２３６１；２３７６〜２３７７；２３９２〜２３９３；２４０８〜２４０９；２４２４〜２４２５；２４４０〜２４４１；２４５６〜２４５７；２４７２〜２４７３；２４８９〜２４９０；２５０４〜２５０５；２５２０〜２５２１；２５３６〜２５３７；９５１２〜９５１３；９６２４〜９６２５；９７３６〜９７３７；９８４８〜９８４９；９９６０〜９９６１；１００７２〜１００７３；１０１８４〜１０１８５；１０２９６〜１０２９７；１０４０２；１０４０９；１０４１６；１０４２３；１０４３０；１０４３７；１０４４４；１０４５１；１０４５８；１０４６５；１０４７２；１０４７９；１０４８６；１０４９３；１０５００；１０５０７；１０５１４；１０５２１；１０５２８；１０５３５；１０５４２；３５０４〜３５０５；３５２０〜３５２１；３５３６〜３５３７；３５５２〜３５５３；３５６８〜３６６９；３５８４〜３５８５；３６００〜３６０１；３６１６〜３６１７；３６３２〜３６３３；３６４８〜３６４９；３６６４〜３６６５；３６８０〜３６８１；３６９６〜３６９７；９５２８〜９５２９；９６４０〜９６４１；９７５２〜９７５３；９８６４〜９８６５；９９７６〜９９７７；１００８８〜１００８９；１０２００〜１０２０１；１０３１２〜１０３１３；１０４０３；１０４１０；１０４１７；１０４２４；１０４３１；１０４３８；１０４４５；１０４５２；１０４５９；１０４６６；１０４７３；１０４８０；１０４８７；１０４９４；１０５０１；１０５０８；１０５１５；１０５２２；１０５２９；１０５３６；１０５４３；４６６４〜４６６５；４６８０〜４６８１；４６９６〜４６９７；４７１２〜４７１３；４７２８〜４７２９；４７４４〜４７４５；４７６０〜４７６１；４７７６〜４７７７；４７９２〜４７９３；４８０８〜４８０９；４８２４〜４８２５；４８４０〜４８４１；４８５６〜４８５７；９５４４〜９５４５；９６５６〜９６５７；９７６８〜９７６９；９８８０〜９８８１；９９９２〜９９９３；１０１０４〜１０１０５；１０２１６〜１０２１７；１０３２８〜１０３２９；１０４０４；１０４１１；１０４１８；１０４２５；１０４３２；１０４３９；１０４４６；１０４５３；１０４６０；１０４６７；１０４７４；１０４８１；１０４８８；１０４９５；１０５０２；１０５０９；１０５１６；１０５２３；１０５３０；１０５３７；１０５４４；５８２４〜５８２５；５８４０〜５８４１；５８５６〜５８５７；５８７２〜５８７３；５８８８〜５８８９；５９０４〜５９０５；５９２０〜５９２１；５９３６〜５９３７；５９５２〜５９５３；５９６８〜５９６９；５９８４〜５９８５；６０００〜６００１；６０１６〜６０１７；９５６０〜９５６１；９６７２〜９６７３；９７８４〜９７８５；９８９６〜９８９７；１０００８〜１０００９；１０１２０〜１０１２１；１０２３２〜１０２３３；１０３４４〜１０３４５；１０４０５；１０４１２；１０４１９；１０４２６；１０４３３；１０４４０；１０４４７；１０４５４；１０４６１；１０４６８；１０４７５；１０４８２；１０４８９；１０４９６；１０５０３；１０５１０；１０５１７；１０５２４；１０５３１；１０５３８；１０５４５；６９８４〜６９８５；７０００〜７００１；１０１６〜７０１７；７０３２〜７０３３；７０４８〜７０４９；７０６４〜７０６５；７０８０〜７０８１；７０９６〜７０９７；７１１２〜７１１３；７１２８〜７１２９；７１４４〜７１４５；７１６０〜７１６１；７１７６〜７１７７；９５７６〜９５７７；９６８８〜９６８９；９８００〜９８０１；９９１２〜９９１３；１００２４〜１００２５；１０１３６〜１０１３７；１０２４８〜１０２４９；１０３６０〜１０３６１；１０４０６；１０４１３；１０４２０；１０４２７；１０４３４；１０４４１；１０４４８；１０４５５；１０４６２；１０４６９；１０４７６；１０４８３；１０４９０；１０４９７；１０５０４；１０５１１；１０５１８；１０５２５；１０５３２；１０５３９；１０５４６；８１４４〜８１４５；８１６０〜８１６０；８１７６〜８１７７；８１９２〜８１９３；８２０８〜８２０９；８２２４〜８２２５；８２４０〜８２４１；８２５６〜８２５７；８２７２〜８２７３；８２８８〜８２８９；８３０４〜８３０５；８３２０〜８３２１；８３３６〜８３３７；９５９２〜９５９３；９７０４〜９７０５；９８１６〜９８１７；９９２８〜９９２９；１００４０〜１００４１；１０１５２〜１０１５３；１０２６４〜１０２６５；１０３７６〜１０３７７；１０４０７；１０４１４；１０４２１；１０４２８；１０４３５；１０４４２；１０４４９；１０４５６；１０４６３；１０４７０；１０４７７；１０４８４；１０４９１；１０４９８；１０５０５；１０５１２；１０５１９；１０５２６；１０５３３；１０５４０；１０５４７；９３０４〜９３０５；９３２０〜９３２１；９３３６〜９３３７；９３５２〜９３５３；９３６８〜９３６９；９３８４〜９３８５；９４００〜９４０１；９４１６〜９４１７；９４３２〜９４３３；９４４８〜９４４９；９４６４〜９４６５；９４８０〜９４８１；９４９６〜９４９７；９６０８〜９６０９；９７２０〜９７２１；９８３２〜９８３３；９９４４〜９９４５；１００５６〜１００５７；１０１６８〜１０１６９；１０２８０〜１０２８１；１０３９２〜１０３９３；１０４０８；１０４１５；１０４２２；１０４２９；１０４３６；１０４４３；１０４５０；１０４５７；１０４６４；１０４７１；１０４７８；１０４８５；１０４９２；１０４９９；１０５０６；１０５１３；１０５２０；１０５２７；１０５３４；１０５４１；１０５４８；１０５５４〜１０５７４；１０５９４〜１０５９５；１０５８２〜１０５８３；１０５８５〜１０５８６；１０５８８〜１０５８９；１０５９１〜１０５９２；１０５９４〜１０５９５；１０５９７〜１０５９８；１０５９９；１０６００；１０６１３；１０６１４；１０６２７；１０６２８；１０６４１；１０６４２；１０６５５；１０６５６；１０６６９；１０６７０；１０６８３；１０６８４；１０６９７；１０６９８；１０７１１；１０７１２；１０７２５；１０７２６；１０７３９；１０７４０；１０７５３；１０７５４；１０７６７；１０７６８；１０７８１；１０７８２；１０７９５；１０７９６；１０８０９；１０８１０；１０８２３；１０８２４；１０８３７；１０８３８；１０８５１；１０８５２；１０８６５；１０８６６；１０８７９；１０８８０；１０６０１；１０６０２；１０６１５；１０６１６；１０６２９；１０６３０；１０６４３；１０６４４；１０６５７；１０６５８；１０６７１；１０６７２；１０６８５；１０６８６；１０６９９；１０７００；１０７１３；１０７１４；１０７２７；１０７２８；１０７４１；１０７４２；１０７５５；１０７５６；１０７６９；１０７７０；１０７８３；１０７８４；１０７９７；１０７９８；１０８１１；１０８１２；１０８２５；１０８２６；１０８３９；１０８４０；１０８５３；１０８５４；１０８６７；１０８６８；１０８８１；１０８８２；１０６０３；１０６０４；１０６１７；１０６１８；１０６３１；１０６３２；１０６４５；１０６４６；１０６５９；１０６６０；１０６７３；１０６７４；１０６８７；１０６８８；１０７０１；１０７０２；１０７１５；
１０７１６；１０７２９；１０７３０；１０７４３；１０７４４；１０７５７；１０７５８；１０７７１；１０７７２；１０７８５；１０７８６；１０７９９；１０８００；１０８１３；１０８１４；１０８２７；１０８２８；１０８４１；１０８４２；１０８５５；１０８５６；１０８６９；１０８７０；１０８８３；１０８８４；１０６０５；１０６０６；１０６１９；１０６２０；１０６３３；１０６３４；１０６４７；１０６４８；１０６６１；１０６６２；１０６７５；１０６７６；１０６８９；１０６９０；１０７０３；１０７０４；１０７１７；１０７１８；１０７３１；１０７３２；１０７４５；１０７４６；１０７５９；１０７６０；１０７７３；１０７７４；１０７８７；１０７８８；１０８０１；１０８０２；１０８１５；１０８１６；１０８２９；１０８３０；１０８４３；１０８４４；１０８５７；１０８５８；１０８７１；１０８７２；１０８８５；１０８８６；１０６０７；１０６０８；１０６２１；１０６２２；１０６３５；１０６３６；１０６４９；１０６５０；１０６６３；１０６６４；１０６７７；１０６７８；１０６９１；１０６９２；１０７０５；１０７０６；１０７１９；１０７２０；１０７３３；１０７３４；１０７４７；１０７４８；１０７６１；１０７６２；１０７７５；１０７７６；１０７８９；１０７９０；１０８０３；１０８０４；１０８１７；１０８１８；１０８３１；１０８３２；１０８４５；１０８４６；１０８５９；１０８６０；１０８７３；１０８７４；１０８８７；１０８８８；１０６０９；１０６１０；１０６２３；１０６２４；１０６３７；１０６３８；１０６５１；１０６５２；１０６６５；１０６６６；１０６７９；１０６８０；１０６９３；１０６９４；１０７０７；１０７０８；１０７２１；１０７２２；１０７３５；１０７３６；１０７４９；１０７５０；１０７６３；１０７６４；１０７７７；１０７７８；１０７９１；１０７９２；１０８０５；１０８０６；１０８１９；１０８２０；１０８３３；１０８３４；１０８４７；１０８４８；１０８６１；１０８６２；１０８７５；１０８７６；１０８８９；１０８９０；１０６１１；１０６１２；１０６２５；１０６２６；１０６３９；１０６４０；１０６５３；１０６５４；１０６６７；１０６６８；１０６８１；１０６８２；１０６９５；１０６９６；１０７０９；１０７１０；１０７２３；１０７２４；１０７３７；１０７３８；１０７５１；１０７５２；１０７６５；１０７６６；１０７７９；１０７８０；１０７９３；１０７９４；１０８０７；１０８０８；１０８２１；１０８２２；１０８３５；１０８３６；１０８４９；１０８５０；１０８６３；１０８６４；１０８７７；１０８７８；１０８９１；１０８９２に係る核酸配列、又はその（機能的）ホモログ、断片、変異体、若しくは誘導体を含む又はからなり得る。
【０２１７】
Ｃａｓ１３、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、及びその他の（エンド）ヌクレアーゼ
アミノ酸配列
幾つかのＣａｓ１３、ＣａｓＸ、及びＣａｓＹタンパク質は、当技術分野で知られており、本発明の文脈におけるＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質として想定される。好適なＣａｓ１３、ＣａｓＸ、及びＣａｓＹタンパク質は、配列番号１０８９３〜１０９２５；１０９２６〜１０９９８（Ｃａｓ１３、即ち、ＷＰ１５７７０００４、ＷＰ１８４５１５９５、ＷＰ２１７４４０６３、ＷＰ２１７４６７７４、ＥＲＫ５３４４０、ＷＰ３１４７３３４６、ＣＶＲＱ０１０００００８、ＣＲＺ３５５５４、ＷＰ２２７８５４４３、ＷＰ３６０９１００２、ＷＰ１２９８５４７７、ＷＰ１３４４３７１０、ＥＴＤ７６９３４、ＷＰ３８６１７２４２、ＷＰ２６６４４９２、ＷＰ４３４３９７３、ＷＰ４４０６５２９４、ＡＤＡＲ２ＤＤ、ＷＰ４７４４７９０１、ＥＲＩ８１７００、ＷＰ３４５４２２８１、ＷＰ１３９９７２７１、ＷＰ４１９８９５８１、ＷＰ４７４３１７９６、ＷＰ１４０８４６６６、ＷＰ６０３８１８５５、ＷＰ１４１６５５４１、ＷＰ６３７４４０７０、ＷＰ６５２１３４２４、ＷＰ４５９６８３７７、ＥＨＯ０６５６２、ＷＰ６２６１４１４、ＥＫＢ０６０１４、ＷＰ５８７０００６０、ＷＰ１３４４６１０７、ＷＰ４４２１８２３９、ＷＰ１２４５８１５１、ＥＲＪ８１９８７、ＥＲＪ６５６３７、ＷＰ２１６６５４７５、ＷＰ６１１５６６３７、ＷＰ２３８４６７６７、ＥＲＪ８７３３５、ＷＰ５８７３５１１、ＷＰ３９４４５０５５、ＷＰ５２９１２３１２、ＷＰ５３４４４４１７、ＷＰ１２４５８４１４、ＷＰ３９４１７３９０、ＥＯＡ１０５３５、ＷＰ６１１５６４７０、ＷＰ１３８１６１５５、ＷＰ５８７４１９５、ＷＰ３９４３７１９９、ＷＰ３９４１９７９２、ＷＰ３９４３１７７８、ＷＰ４６２０１０１８、ＷＰ３９４４２１７１、ＷＰ３９４２６１７６、ＷＰ３９４１８９１２、ＷＰ３９４３４８０３、ＷＰ３９４２８９６８、ＷＰ２５０００９２６、ＥＦＵ３１９８１、ＷＰ４３４３５８１、ＷＰ３６８８４９２９、ＢＡＵ１８６２３、ＡＦＪ０７５２３、ＷＰ１４７０８４４１、ＷＰ３６８６０８９９、ＷＰ６１８６８５５３、ＫＪＪ８６７５６、ＥＧＱ１８４４４、ＥＫＹ０００８９、ＷＰ３６９２９１７５、ＷＰ７４１２１６３、ＷＰ４４０７２１４７、ＷＰ４２５１８１６９、ＷＰ４４０７４７８０、ＷＰ１５０２４７６５、ＷＰ４９３５４２６３、ＷＰ４９１９７５５、ＷＰ６４９７０８８７、ＷＰ６１７１０１３８）；１１００２；１１００３（ＣａｓＸ、即ち、ＯＧＰ０７４３８、ＯＨＢ９９６１８）；及び１１００４〜１１０１０（ＣａｓＹ、即ち、ＯＪＩ０８７６９、ＯＧＹ８２２２１、ＯＪＩ０６４５４、ＡＰＧ８０６５６、ＯＪＩ０７４５５、ＯＪＩ０９４３６、ＰＩＰ５８３０９）で示される。
【０２１８】
有利には、前記コードされたタンパク質の発現を好ましくは上昇させるために、Ｃａｓ１３などのＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、又はそれらのホモログ、変異体、断片、若しくは誘導体をコードする核酸配列、本発明に係る人工核酸のコード領域内で、本明細書に定義されるＵＴＲと組み合わされる。好ましい実施形態では、人工核酸は、少なくとも１つの核局在化シグナルに更に融合されるＣａｓ１３タンパク質、又はそのホモログ、変異体、又は断片をコードする核酸配列を含む又はからなり、前記核酸配列は、好ましくは、配列番号１１０１１〜１１０４２；１１２４９〜１１２８０；１１０４４〜１１１１６；１１２８２〜１１３５４；１１１３１〜１１１６２；１１３６７〜１１３９８；１１４８５〜１１５１６；１１６０３〜１１６３４；１１７２１〜１１７５２；１１８３９〜１１８７０；１１１６４〜１１２３６；１１４００〜１１４７２；１１５１８〜１１５９０；１１６３６〜１１７０８；１１７５４〜１１８２６；１１８７２〜１１９４４の少なくとも１つ、又はその（機能的）ホモログ、変異体、断片、若しくは誘導体、特に、これらの配列のいずれかに対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有する核酸配列によって定義される。また、他のＣａｓ１３タンパク質、即ち、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、及びＣａｓ１３ｄも本発明の開示の範囲内に含まれる（参照により本明細書に援用されるＰＭＩＤ  ２９５５１５１４及び２９５５５１２７２から明らかである）。また、Ｃａｓ１３関連の刊行物ＰＭＩＤ  ２６５９３７１９、２８９７６９５９、及び２９０７０７０３も、参照により本明細書に援用される。
【０２１９】
多数のＣａｓ１３タンパク質が当技術分野で知られており、本発明の文脈におけるＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質として想定される。本発明の好ましいＣａｓ１３ｄ配列は、Ｃａｓ１３ｄタンパク質（配列番号１４２９４〜１４３２１）及び配列番号１４３２２〜１４３４９、配列番号１４３５０〜１４３７７、配列番号１４３７８〜１４４０５、配列番号１４４０６〜１４４３３、配列番号１４４３４〜１４４６１、配列番号１４４６２〜１４４８９、及び配列番号１４４９０〜１４５１７を有するそれらの最適化されたｍＲＮＡ配列である。
【０２２０】
有利には、前記コードされたタンパク質の発現を好ましくは上昇させるために、ＣａｓＸなどのＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、又はそれらのホモログ、変異体、断片、若しくは誘導体をコードする核酸配列は、本発明に係る人工核酸のコード領域内で、本明細書に定義されるＵＴＲと組み合わされる。好ましい実施形態では、人工核酸は、少なくとも１つの核局在化シグナルに更に融合されるＣａｓＸタンパク質、又はその（機能的）ホモログ、変異体、若しくは断片をコードする核酸配列を含む又はからなり、前記核酸配列は、配列番号１１１２０〜１１１２２；１１２４０；１１２４１；１１３５８；１１３５９；１１４７６；１１４７７；１１５９４；１１５９５；１１７１２；１１７１３；１１８３０；１１８３１；１１９４８；１１９４９のいずれか、又はそのホモログ、変異体、断片、若しくは誘導体、特に、これらの配列のいずれかに対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有する核酸配列によって定義される。
【０２２１】
有利には、本明細書又は配列表に開示される任意のＣａｓ１３、ＣａｓＸ、又はＣａｓＹ配列、即ち、前記した任意の配列、即ち、本明細書及び／又は配列表の配列、即ち、Ｃａｓ１３、ＣａｓＸ、又はＣａｓＹタンパク質配列、及びそれぞれのＣａｓ１３、ＣａｓＸ、又はＣａｓＹタンパク質配列の異なるバージョン、即ち、ＷＴ又は最適化された配列をコードするｍＲＮＡは、本発明の文脈におけるＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質として本発明の使用のために選択することができる。
【０２２２】
更に、ＰＭＩＤ  ２９１６０３０８に記載されるゲノムＤＮＡのＡ・ＴからＧ・Ｃへの変換を媒介するアデニン塩基エディター（ＡＢＥ）は、刊行物ＰＭＩＤ  ２９１６０３０８自体と共に参照により本明細書に援用される。著者によれば、ＡＢＥは、現在のＣａｓ９ヌクレアーゼに基づく方法よりも効率的且つ簡潔に、より少ないオフターゲットゲノムの変更で点変異を導入し、ヒト細胞に疾患修正又は疾患抑制変異を導入することができる。
【０２２３】
ＡＲＭＡＮエンドヌクレアーゼ
また、未培養微生物由来の新しいＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム、即ち、ＡＲＭＡＮ  Ｃａｓ９、即ち、ナノ古細菌ＡＲＭＡＮ−１（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｍｉｃｒａｒｃｈａｅｕｍ  ａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｍ  ＡＲＭＡＮ−１）及びＡＲＭＡＮ−４（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｐａｒｖａｒｃｈａｅｕｍ  ａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｍ  ＡＲＭＡＮ−４）の使用も、参照により本明細書に援用されるＰＭＩＤ  ２８００５０５６、２０４２１４８４、及び１７１８５６０２を参照することにより、本発明の教示の範囲内に含まれる。
【０２２４】
有利には、前記コードされたタンパク質の発現を好ましくは上昇させるために、ＣａｓＹなどのＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、又はそれらのホモログ、変異体、断片、若しくは誘導体をコードする核酸配列は、本発明に係る人工核酸のコード領域内で、本明細書に定義されるＵＴＲと組み合わされる。好ましい実施形態では、人工核酸は、少なくとも１つの核局在化シグナルに更に融合されるＣａｓＹタンパク質、又はその（機能的）ホモログ、変異体、又は断片をコードする核酸配列を含む又はからなり、前記核酸配列は、配列番号１１１２３〜１１１３０；１１３６０〜１１３６６；１１２４２〜１１２４８；１１４７８〜１１４８４；１１５９６〜１１６０２；１１７１４〜１１７２０；１１８３２〜１１８３８；１１９５０〜１１９５６のいずれか、又はそのホモログ、変異体、断片、若しくは誘導体、特に、これらの配列のいずれかに対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有する核酸配列によって定義される。
【０２２５】
ｇＲＮＡ
本明細書で述べるように、機能的ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、典型的には、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質と会合し、これを相補的標的ＤＮＡ配列に動員するガイドＲＮＡ（「ｇＲＮＡ」）の存在を必要とする。ガイドＲＮＡの構造と特性は通常、特定のＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質の選択に依存する。
【０２２６】
したがって、本明細書に使用される「ガイドＲＮＡ」という用語は、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を目的の標的ＤＮＡ配列に標的化することができる任意のＲＮＡ分子に関する。ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、好ましくは、ｉ）標的ＤＮＡ配列に特異的にハイブリダイズすることができる相補性の第１の領域、及びｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質と相互作用する第２の領域を含む。
【０２２７】
典型的には、ｇＲＮＡの５’末端に位置する前記領域は、標的ＤＮＡ配列に相補的な短いヌクレオチド配列を含み、本明細書では「標的領域」とも呼ばれる。「領域」という用語は、分子のセクション／セグメント、例えば、ＲＮＡ内のヌクレオチド連続した一続きを意味する。標的領域は、長さが約１７〜２０個、例えば、約２１〜２３個のヌクレオチドであることができ、又はそれより長くても短くてもよい（「トランケートされたｇＲＮＡ」）。好ましくは、相補的塩基対（即ち、対になった塩基）間の水素結合を介して標的ＤＮＡ配列と相互作用し得る。
【０２２８】
「ｇＲＮＡ」は、「標的領域」を含み、好ましくは、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を配列特異的に標的ＤＮＡ配列に動員することができる限り、任意の長さであり得る。したがって、「ｇＲＮＡ」は、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、より好ましくは少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、最も好ましくは少なくとも１６、又は少なくとも１７ヌクレオチド、又は少なくとも１８ヌクレオチド、又は少なくとも１９ヌクレオチド、又は少なくとも２０ヌクレオチドの長さであり得る。幾つかの実施形態では、「ｇＲＮＡ」は、好ましくは少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５ヌクレオチド以上の長さの標的領域、及びｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質と相互作用する第２の領域を含む。
【０２２９】
本明細書で使用されるとき、「ｇＲＮＡ」という用語は、２分子ｇＲＮＡ及び１分子ＲＮＡを含む。ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質と相互作用するための二次構造特徴を含んでも含まなくてもよい。
【０２３０】
タイプＩＩ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムは、天然には、２分子ｇＲＮＡを使用する。このような２分子ｇＲＮＡ（「ｔｒａｃｒＲＮＡ／ｃｒＲＮＡ」）は通常、ｃｒＲＮＡ（「ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ」又は「ターゲター−ＲＮＡ」又は「ｃｒＲＮＡ」又は「ｃｒＲＮＡ  リピート」）及び対応するｔｒａｃｒＲＮＡ（「トランス−アクティングＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ」又は「アクティベーターＲＮＡ」又は「ｔｒａｃｒＲＮＡ」）分子を含む。ｃｒＲＮＡは、ｇＲＮＡのＣａｓ９結合領域のｄｓＲＮＡ二重鎖の半分を形成するヌクレオチドの標的領域（一本鎖）及び一続き（「二重鎖形成領域」）の両方を含む。対応するｔｒａｃｒＲＮＡは、ｇＲＮＡのＣａｓ９結合領域のｄｓＲＮＡ二重鎖の他の半分を形成するヌクレオチドの一続き（二重鎖形成領域）を含む。換言すれば、ｃｒＲＮＡのヌクレオチドの一続きは、ｔｒａｃｒＲＮＡのヌクレオチドの一続きに相補的であり、それとハイブリダイズして、ｇＲＮＡのＣａｓ９結合領域のｄｓＲＮＡ二重鎖を形成する。このように、各ｃｒＲＮＡには対応するｔｒａｃｒＲＮＡがあると言える。ｃｒＲＮＡは更に、一本鎖の標的領域を提供する。したがって、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡ（対応するペアとして）は、ハイブリダイズしてｇＲＮＡを形成する。
【０２３１】
ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡを結合させて、（人工の）単一分子ガイドＲＮＡ（「シングルガイドＲＮＡ」、「ｓｇＲＮＡ」）を提供することもできる。「ｓｇＲＮＡ」は、通常、「ループ」配列を介してｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端にその３’末端で接続されたｃｒＲＮＡを含む（例えば、米国特許出願公開第２０１４００６８７９７号明細書参照）。ｃｒＲＮＡと同様に、ｓｇＲＮＡは、典型的には、二次構造（典型的には、ステム構造）を形成する塩基対水素結合を形成する第２の領域に隣接する、標的ポリヌクレオチド配列に相補的な標的領域を含む。「ｓｇＲＮＡ」は通常、長さが〜１００ヌクレオチドであるが、この用語は、約１７〜１８ｎｔのトランケートされたシングルガイドＲＮＡ（ｔｒｕ−ｓｇＲＮＡ）も含む（Ｆｕ，  Ｙ．  ｅｔ．  ａｌ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０１４  Ｍａｒ；３２（３）：２７９−８４を参照）。この用語は、喪失してもより特徴部分が除去された機能的ミニチュアｓｇＲＮＡであって、ｔｒａｃｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡではない）に対応するｓｇＲＮＡの部分に位置する「ネクサス」と呼ばれる必須且つ保存されたモジュールを保持するｓｇＲＮＡも含む（米国特許出願公開第２０１４０３１５９８５号明細書及びＢｒｉｎｅｒ  ＡＥ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．  ２０１４  Ｏｃｔ  ２３；５６（２）：３３３−９を参照）。ネクサスは、タイプＩＩ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムの下部ステムのすぐ下流に位置する（即ち、下部ステムから３’方向に位置する）。「ｓｇＲＮＡ」という用語は、１１〜１５ヌクレオチドの短い標的領域を含む「ｄｅａｄＲＮＡ」（「ｄＲＮＡ」）も包含する。このようなｄＲＮＡを使用して、ＤＳＢを誘導せずに遺伝子発現を変化させるために、触媒活性のあるＣａｓ９エンドヌクレアーゼを動員してＤＮＡ配列を標的にすることができる（Ｄａｈｌｍａｎ  ＪＥ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０１５  Ｎｏｖ；３３（１１）：１１５９−６１を参照）。ｓｇＲＮＡ誘導体もこの用語に含まれる。そのような誘導体は、典型的には、新たな又は追加の機能を付与する更なる部分又は実体を含む。特に、ｓｇＲＮＡテトラループ及び／又はステムループ構造に付加されたＭＳ２アプタマーは、ＭＳ２ドメインを含むエフェクタータンパク質を標的ＤＮＡに選択的に動員することがでる（「ｓｇＲＮＡ−ＭＳ２」）（Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ．  ２０１５  Ｊａｎ  ２９；  ５１７（７５３６）：  ５８３−５８８を参照）。本明細書では、更なる変更も考えられ、想定される。
【０２３２】
ｇＲＮＡとしてのｔｒａｃｒＲＮＡ／ｃｒＲＮＡ又はｓｇＲＮＡの使用は、Ｃａｓ９タンパク質に限定されない。任意の他のＣＲＩＳＰＲ関連システム（好ましくはＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム）をそのようなｇＲＮＡに関連して使用することができる。しかし、他のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質の機能性を確保するには、他のｇＲＮＡが必要になる場合があり、そのようなｇＲＮＡもそれぞれの定義に含まれる。例えば、Ｃｐｆ１などのＶ型ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、通常、直接反復配列に単一ステムループを含むｇＲＮＡとしての単一の短い（４２〜４４ｎｔ）ｃｒＲＮＡによってガイドされる。
【０２３３】
ｔｒａｃｒＲＮＡ／ｃｒＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、又はｃｒＲＮＡなどのｇＲＮＡは、任意の適切な手段、例えば、人工核酸分子の文脈で本明細書に記載されるネイキッド又は複合体形態で、例えば、脂質又は（ポリ）カチオン性担体を使用して提供され得るが、通常はベクターによって送達される。適切なベクター（「定義」と題されたセクションにおいて定義されるように）は、機能的ｇＲＮＡを好ましくは遍在的に発現できる（即ち、それぞれのＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を標的ＤＮＡ配列に動員できる）核酸を含む。したがって、ベクターは、プラスミド及びウイルスベクター、特に、レンチウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）を含む。
【０２３４】
ＲＮＡ
本発明の人工核酸分子は、好ましくはＲＮＡであり得る。「ＲＮＡ」という用語は、前記分子を形成するために結合されたヌクレオチドの特定の連続（即ち、それらのＲＮＡ配列）によって特徴付けられるリボ核酸分子を意味すると理解される。したがって、用語「ＲＮＡ」は、それぞれの文脈において当業者によって容易に理解されるように、ＲＮＡ分子又はＲＮＡ配列を意味するために使用され得る。例えば、本発明の文脈で使用される「ＲＮＡ」という用語は、好ましくはＲＮＡ分子を意味する（前記分子は、特に、その特定のＲＮＡ配列によって特徴付けられる）。配列修飾の文脈における「ＲＮＡ」という用語は、修飾されたＲＮＡ配列に関連すると理解されるが、典型的には結果として生じるＲＮＡ分子（ＲＮＡ配列に関して修飾されている）も含む。好ましい実施形態において、ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、又はレプリコンＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡであり得る。
【０２３５】
モノ−、ビ−、又はマルチシストロン性ＲＮＡ
本発明の幾つかの実施形態によれば、人工核酸分子、好ましくはＲＮＡは、好ましくは本明細書に定義される、モノ−、ビ−、又はマルチシストロン性であり得る。ビ−又はマルチシストロン性ＲＮＡは、典型的には、２つ（ビシストロン性）又はそれ以上（マルチシストロン性）のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。この文脈におけるオープンリーディングフレームは、ペプチド又はタンパク質に翻訳可能なコドンの配列である。ビシストロン性又はマルチシストロン性人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ中のコード配列は、好ましくは、本明細書に定義される、異なるタンパク質をコードする。ビ−又はマルチシストロン性人工核酸分子、好ましくはＲＮＡは、例えば、本明細書に定義される少なくとも２、３、４、５、６個以上の（好ましくは異なる）タンパク質（又はそのホモログ、変異体、断片、若しくは誘導体）をコードすることができる。「２つ以上のタンパク質をコードする」という用語は、ビシストロン性又はマルチシストロン性人工核酸分子、好ましくはＲＮＡが、例えば、少なくとも２、３、４、５、６個以上の（好ましくは異なる）タンパク質（又はそのホモログ、変異体、断片、若しくは誘導体）をコードすることができることを意味し得るが、これに限定されない。
【０２３６】
幾つかの実施形態においては、本明細書に定義される２つ以上のＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、又はそのホモログ、変異体、断片、若しくは誘導体をコードするコード配列は、少なくとも１つのＩＲＥＳ（内部リボソーム侵入部位）配列によってビ−又はマルチシストロンＲＮＡ中で分離され得る。用語「ＩＲＥＳ」（内部リボソーム侵入部位）は、翻訳開始を可能にするＲＮＡ配列を意味する。ＩＲＥＳは、唯一のリボソーム結合部位として機能することができるが、互いに独立してリボソームによって翻訳される幾つかのタンパク質、又はそのホモログ、変異体、断片、若しくは誘導体をコードする、上に定義されるビシストロン又はマルチシストロン性人工核酸分子、好ましくはＲＮＡを提供するように機能することもできる。本発明にしたがって使用することができるＩＲＥＳ配列の例としては、ピコルナウイルス（例えばＦＭＤＶ）、ペスチウイルス（ＣＦＦＶ）、ポリオウイルス（ＰＶ）、脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭＶ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、古典的ブタ熱ウイルス（ＣＳＦＶ）、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、又はクリケット麻痺ウイルス（ＣｒＰＶ）に由来するものである。
【０２３７】
更なる実施形態によれば、本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡの少なくとも１つのコード配列は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８個以上の、本明細書に定義されるＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（又はそのホモログ、変異体、断片、若しくは誘導体）をコードしてもよい。これらのエピトープは、アミノ酸リンカー配列によって又はアミノ酸リンカー配列なしで結合されている。前記リンカー配列は、リジッドリンカー、フレキシブルリンカー、切断可能リンカー（例えば、自己切断ペプチド）、又はそれらの組合せを含むことができる。例示的なリンカーは、「誘導体」と題されたセクションに記載されている。それぞれの開示は、必要な変更を加えて、複数のＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質の連結に適用可能である。その中で、本明細書に定義されるＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、同一でも異なっていてもよく、又はそれらの組合せでもよい。
【０２３８】
好ましくは、人工核酸分子、好ましくはＲＮＡは、約５０〜約２００００、又は１００〜約２００００個のヌクレオチド、好ましくは約２５０〜約２００００個のヌクレオチド、より好ましくは約５００〜約１００００個、更により好ましくは約５００〜約５０００個の長さを有する。
【０２３９】
本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡは更に、一本鎖又は二本鎖であることができる。二本鎖ＲＮＡとして提供される場合、本発明の人工核酸分子は、好ましくはセンス鎖及び対応するアンチセンス鎖を含む。
【０２４０】
核酸修飾
本明細書に定義される人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ又は任意の他の核酸（例えば、ベクター）は、修飾核酸の形態で提供されてもよい。本発明の文脈において想定される好適な核酸修飾を以下に記載する。「本明細書に定義される任意の他の核酸」という表現は、通常はそうではないが、ｇＲＮＡを意味することがある。
【０２４１】
好ましい実施形態によれば、本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（配列）（又は本明細書に定義される任意の他の核酸、特にＲＮＡ）は、本明細書に定義されるように修飾される。本明細書に定義される修飾は、好ましくは前記人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ又は本明細書に定義の他の核酸の安定化をもたらす。したがって、より好ましくは、本発明は、「安定化された」人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は本明細書に定義される任意の他の核酸、特にＲＮＡ）を提供する。
【０２４２】
好ましい実施形態によれば、本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は本明細書に定義される任意の他の核酸、特にＲＮＡ）は、したがって、「安定化された」人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ、特にｍＲＮＡとして提供することができる。即ち、インビボ分解（例えば、エキソ−又はエンド−ヌクレアーゼによる）に対して本質的に耐性である。
【０２４３】
そのような安定化は、例えば、人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は本明細書に定義される任意の他の核酸、特にＲＮＡ）の修飾されたリン酸骨格によって達成することができる。本発明に関連する骨格修飾は、前記ＲＮＡ（又は本明細書に定義される任意の他の核酸、特にＲＮＡ）に含まれるヌクレオチドの骨格のリン酸が化学的に修飾される修飾である。これに関連して好ましく使用され得るヌクレオチドは、例えば、ホスホロチオアート修飾リン酸骨格、好ましくはリン酸骨格に含まれるリン酸酸素の少なくとも１つが硫黄原子で置換されている。安定化された人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は本明細書に定義される他の核酸、特にＲＮＡ）は、例えば、帯電ホスホナート酸素が、アルキル又はアリール基に置き換わっているアルキル及びアリールホスホナート、又は帯電酸素残基がアルキル化形態で存在するホスホジエステル及びアルキルホスホトリエステルなどの非イオンホスファート類似体を更に含み得る。そのような骨格修飾は、限定することを意図するものではないが、典型的には、メチルホスホナート、ホスホルアミダート、及びホスホロチオアート（例えば、シチジン−５’−Ｏ−（１−チオホスファート）からなる群からの修飾を含む。
【０２４４】
以下に、本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は本明細書に定義される任意の他の核酸、特にＲＮＡ）を好ましくは「安定化」させることができる具体的な修飾を記載する。
【０２４５】
化学修飾
本明細書で使用される「修飾」という用語は、骨格修飾並びに糖修飾又は塩基修飾を含む化学修飾を意味し得る。
【０２４６】
この文脈において、「修飾された」人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は本明細書に定義される任意の他の核酸、特にＲＮＡ）はヌクレオチド類似体／修飾（修飾ヌクレオチド又はヌクレオシド）、例えば、骨格修飾、糖修飾、又は塩基修飾を含み得る。
【０２４７】
本発明に関連する骨格修飾は、前記人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は本明細書に定義される任意の他の核酸、特にＲＮＡ）に含まれるヌクレオチドの骨格のリン酸が化学的に修飾される修飾である。本発明に関連する糖修飾は、エ人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は本明細書に定義される任意の他の核酸、特にＲＮＡ）のヌクレオチドの糖の化学修飾である。更に、本発明に関連する塩基修飾は、人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は本明細書に定義される任意の他の核酸、特にＲＮＡ）のヌクレオチドの塩基部分の化学修飾である。この文脈において、ヌクレオチド類似体又は修飾は、転写及び／又は翻訳に適用可能なヌクレオチド類似体から選択されることが好ましい。
【０２４８】
糖修飾：
（化学的に）修飾された核酸、特に本発明に係る人工核酸分子は、糖修飾、即ちそれらの糖部分で修飾されたヌクレオシド／ヌクレオチドを含み得る。
【０２４９】
例えば、２’ヒドロキシル基（ＯＨ）を、多数の異なる「オキシ」又は「デオキシ」置換基で修飾又は置換することができる。「オキシ」−２’ヒドロキシル基修飾の例としては、アルコキシ又はアリールオキシ（−ＯＲ、例えば、Ｒ＝Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、又は糖）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲ；２’ヒドロキシルが、例えば、メチレン架橋などによって、同じリボース糖の４’炭素に結合された「ロックされた」核酸（ＬＮＡ）；及びアミノ基（−Ｏ−アミノ、ここでアミノ基（例えば、ＮＲＲ）は、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、又はジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノであり得る）又はアミノアルコキシを含むがこれらに限定されない。
【０２５０】
「デオキシ」修飾は、水素、アミノ（例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、又はアミノ酸）を含み、アミノ基はリンカーを介して糖に結合することができ、リンカーは原子Ｃ、Ｎ、及びＯの１つ以上を含む。
【０２５１】
糖基はまた、リボース中の対応する炭素とは反対の立体化学配置を有する１つ以上の炭素を含み得る。したがって、修飾された人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は本明細書に定義される任意の他の核酸、特にＲＮＡ）は、糖として例えばアラビノースを含有するヌクレオチドを含み得る。
【０２５２】
骨格修飾：
（化学的に）修飾された核酸、特に本発明に係る人工核酸分子は、骨格修飾、即ちそれらの骨格部分で修飾されたヌクレオシド／ヌクレオチドを含み得る。
【０２５３】
骨格のリン酸基は、酸素原子１つ以上を異なる置換基で置き換えることによって修飾することができる。更に、修飾されたヌクレオシド及びヌクレオチドは、本明細書に記載されるように、修飾されたリン酸による未修飾リン酸部分の完全置換を含むことができる。
【０２５４】
修飾されたリン酸基の例としては、ホスホロチオアート、ホスホロセレナート、ボラノホスファート、ボラノホスファートエステル、ホスホン酸水素、ホスホロアミダート、アルキル又はアリールホスホナート、及びホスホトリエステルが挙げられるが、これらに限定されない。ホスホロジチオアートは、非結合酸素の両方が硫黄によって置き換わっている。リン酸リンカーは、結合酸素を窒素（架橋されたホスホロアミダート）、硫黄（架橋されたホスホロチオアート）、及び炭素（架橋されたメチレン−ホスホナート）で置き換えることによっても修飾することができる。
【０２５５】
塩基修飾：
（化学的に）修飾された核酸、特に本発明に係る人工核酸分子は、塩基修飾、即ちそれらの核酸塩基部分で修飾されたヌクレオシド／ヌクレオチドを含み得る。
【０２５６】
ＲＮＡ中に存在する核酸塩基の例としては、アデニン、グアニン、シトシン、及びウラシルが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、本明細書に記載されるヌクレオシド及びヌクレオチドを、主溝面上で化学的に修飾することができる。幾つかの実施形態においては、主溝化学修飾は、アミノ基、チオール基、アルキル基、又はハロ基を含むことができる。
【０２５７】
幾つかの実施形態では、ヌクレオチド類似体／修飾は、塩基修飾から選択され、好ましくは、２−アミノ−６−クロロプリンリボシド−５’−トリホスファート、２−アミノプリン−リボシド−５’−トリホスファート；２−アミノアデノシン−５’−トリホスファート、２’−アミノ−２’−デオキシシチジン−トリホスファート、２−チオシチジン−５’−トリホスファート、２−チオウリジン−５’−トリホスファート、２’−フルオロチミジン−５’−トリホスファート、２’−Ｏ−メチル−イノシン−５’−トリホスファート  ４−チオウリジン−５’−トリホスファート、５−アミノアリルシチジン−５’−トリホスファート、５−アミノアリルウリジン−５’−トリホスファート、５−ブロモシチジン−５’−トリホスファート、５−ブロモウリジン−５’−トリホスファート、５−ブロモ−２’−デオキシシチジン−５’−トリホスファート、５−ブロモ−２’−デオキシウリジン−５’−トリホスファート、５−ヨードシチジン−５’−トリホスファート、５−ヨード−２’−デオキシシチジン−５’−トリホスファート、５−ヨードウリジン−５’−トリホスファート、５−ヨード−２’−デオキシウリジン−５’−トリホスファート、５−メチルシチジン−５’−トリホスファート、５−メチルウリジン−５’−トリホスファート、５−プロピニル−２’−デオキシシチジン−５’−トリホスファート、５−プロピニル−２’−デオキシウリジン−５’−トリホスファート、６−アザシチジン−５’−トリホスファート、６−アザウリジン−５’−トリホスファート、６−クロロプリンリボシド−５’−トリホスファート、７−デアザアデノシン−５’−トリホスファート、７−デアザグアノシン−５’−トリホスファート、８−アザアデノシン−５’−トリホスファート、８−アジドアデノシン−５’−トリホスファート、ベンズイミダゾール−リボシド−５’−トリホスファート、Ｎ１−メチルアデノシン−５’−トリホスファート、Ｎ１−メチルグアノシン−５’−トリホスファート、Ｎ６−メチルアデノシン−５’−トリホスファート、Ｏ６−メチルグアノシン−５’−トリホスファート、シュードウリジン−５’−トリホスファート、又はピューロマイシン−５’−トリホスファート、キサントシン−５’−トリホスファートから選択される。５−メチルシチジン−５’−トリホスファート、７−デアザグアノシン−５’−トリホスファート、５−ブロモシチジン−５’−トリホスファート、及びシュードウリジン−５’−トリホスファートからなる塩基修飾されたヌクレオチドの群から選択される、塩基修飾のためのヌクレオチドが特に好ましい。
【０２５８】
幾つかの実施形態においては、修飾されたヌクレオシドは、ピリジン−４−オンリボヌクレオシド、５−アザ−ウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオウリジン、４−チオ−シュードウリジン、２−チオ−シュードウリジン、５−ヒドロキシウリジン、３−メチルウリジン、５−カルボキシメチル−ウリジン、１−カルボキシメチル−シュードウリジン、５−プロピニル−ウリジン、１−プロピニル−シュードウリジン、５−タウリノメチルウリジン、１−タウリノメチル−シュードウリジン、５−タウリノメチル−２−チオ−ウリジン、１−タウリノメチル−４−チオ−ウリジン、５−メチル−ウリジン、１−メチル−シュードウリジン、４−チオ−１−メチル−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−シュードウリジン、１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロシュードウリジン、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−ジヒドロシュードウリジン、２−メトキシウリジン、２−メトキシ−４−チオ−ウリジン、４−メトキシ−シュードウリジン、及び４−メトキシ−２−チオ−シュードウリジンを含む。
【０２５９】
幾つかの実施形態においては、修飾されたヌクレオシドは、５−アザ−シチジン、シュードイソシチジン、３−メチル−シチジン、Ｎ４−アセチルシチジン、５−ホルミルシチジン、Ｎ４−メチルシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、１−メチル−シュードイソシチジン、ピロロ−シチジン、ピロロ−シュードイソシチジン、２−チオ−シチジン、２−チオ−５−メチル−シチジン、４−チオ−シュードイソシチジン、４−チオ−１−メチル−シュードイソシチジン、４−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードイソシチジン、１−メチル−１−デアザ−シュードイソシチジン、ゼブラリン、５−アザ−ゼブラリン、５−メチル−ゼブラリン、５−アザ−２−チオ−ゼブラリン、２−チオ−ゼブラリン、２−メトキシ−シチジン、２−メトキシ−５−メチル−シチジン、４−メトキシ−シュードイソシチジン、及び４−メトキシ−１−メチル−シュードイソシチジンを含む。
【０２６０】
他の実施形態においては、修飾されたヌクレオシドは、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−アデニン、７−デアザ−８−アザ−アデニン、７−デアザ−２−アミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２−アミノプリン、７−デアザ−２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノプリン、１−メチルアデノシン、Ｎ６−メチルアデノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２−メチルチオ−Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６−グリシニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン、２−メチルチオ−Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデノシン、７−メチルアデニン、２−メチルチオ−アデニン、及び２−メトキシ−アデニンを含む。
【０２６１】
他の実施形態においては、修飾されたヌクレオシドは、イノシン、１−メチル−イノシン、ウィオシン（ｗｙｏｓｉｎｅ）、ウィブトシン（ｗｙｂｕｔｏｓｉｎｅ）、７−デアザ−グアノシン、７−デアザ−８−アザ−グアノシン、６−チオ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−８−アザ−グアノシン、７−メチル−グアノシン、６−チオ−７−メチル−グアノシン、７−メチルイノシン、６−メトキシ−グアノシン、１−メチルグアノシン、Ｎ２−メチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２−ジメチルグアノシン、８−オキソ−グアノシン、７−メチル−８−オキソ−グアノシン、１−メチル−６−チオ−グアノシン、Ｎ２−メチル−６−チオ−グアノシン、及びＮ２，Ｎ２−ジメチル−６−チオグアノシンを含む。
【０２６２】
幾つかの実施形態においては、ヌクレオチドは、主溝面上で修飾することができ、ウラシルのＣ−５上の水素をメチル基又はハロ基で置き換えることを含むことができる。特定の実施形態においては、修飾されたヌクレオシドは、５’−Ｏ−（１−チオホスファート）−アデノシン、５’−Ｏ−（１−チオホスファート）−シチジン、５’−Ｏ−（１−チオホスファート）−グアノシン、５’−Ｏ−（１−チオホスファート）−ウリジン、又は５’−Ｏ−（１−チオホスファート）−シュードウリジンである。
【０２６３】
幾つかの実施形態においては、本発明の修飾されたＲＮＡ（又は本明細書に定義される任意の他の核酸、特にＲＮＡ）は、６−アザ−シチジン、２−チオ−シチジン、α−チオ−シチジン、シュード−イソ−シチジン、５−アミノアリル−ウリジン、５−ヨード−ウリジン、Ｎ１−メチル−シュードウリジン、５，６−ジヒドロウリジン、α−チオ−ウリジン、４−チオ−ウリジン、６−アザ−ウリジン、５−ヒドロキシ−ウリジン、デオキシ−チミジン、５−メチル−ウリジン、ピロロ−シチジン、イノシン、α−チオ−グアノシン、６−メチル−グアノシン、５−メチル−シチジン、８−オキソ−グアノシン、７−デアザ−グアノシン、Ｎ１−メチル−アデノシン、２−アミノ−６−クロロ−プリン、Ｎ６−メチル−２−アミノ−プリン、シュード−イソ−シチジン、６−クロロ−プリン、Ｎ６−メチル−アデノシン、α−チオ−アデノシン、８−アジド−アデノシン、７−デアザ−アデノシンから選択されるヌクレオシド修飾を含み得る。
【０２６４】
幾つかの実施形態では、修飾された人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は本明細書に定義される任意の他の核酸、特にＲＮＡ）は、本明細書に記載される化学修飾のいずれをも含まない。前記修飾された人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は本明細書に定義される任意の他の核酸、特にＲＮＡ）は、以下に記載されるように脂質修飾又は配列修飾を含み得る。
【０２６５】
脂質修飾
更なる実施形態によれば、本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は本明細書に定義される任意の他の核酸、特にＲＮＡ）は、少なくとも１つの脂質修飾を含む。
【０２６６】
そのような脂質修飾された本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は本明細書に記載される他の核酸、特にＲＮＡ）は、典型的には、（ｉ）本明細書に定義される人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は前記核酸、特にＲＮＡ）と、（ｉｉ）前記人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は前記他の核酸、特にＲＮＡ）と共有結合した少なくとも１つのリンカーと、（ｉｉｉ）各リンカーと共有結合している少なくとも１つの脂質とを含む。
【０２６７】
或いは、脂質修飾された人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は本明細書に定義される他の核酸）は、少なくとも１つの人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は前記他の核酸、特にＲＮＡ）と、前記人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は前記他の核酸、特にＲＮＡ）と（リンカーなしで）共有結合した少なくとも１つの（二官能性）脂質とを含む。
【０２６８】
或いは、脂質修飾された人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は本明細書に定義される任意の他の核酸、特にＲＮＡ）は、（ｉ）人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は前記他の核酸、特にＲＮＡ）と、（ｉｉ）前記人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は前記他の核酸、特にＲＮＡ）と共有結合した少なくとも１つのリンカーと、（ｉｉｉ）各リンカーと共有結合している少なくとも１つの脂質と、また（ｉｖ）前記人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は前記他の核酸、特にＲＮＡ）と（リンカーなしで）共有結合した少なくとも１つの（二官能性）脂質とを含む。
【０２６９】
この文脈においては、脂質修飾は、線状の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は本明細書に定義される任意の他の核酸）の末端に存在することが特に好ましい。
【０２７０】
配列修飾
好ましい実施形態によれば、本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡ、又は本明細書に定義される任意の他の核酸は、「配列修飾」される、即ち、下記のような少なくとも１つの配列修飾を含む。特定の理論に拘束されることを望むものではないが、そのような配列修飾は、本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡの安定性を増加させる及び／又は発現を増強させることができる。
【０２７１】
Ｇ／Ｃ含量の修飾
好ましい実施形態によれば、本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ、より好ましくはｍＲＮＡ（又は本明細書に定義される任意の他の核酸、特にＲＮＡ）は、そのグアノシン／シトシン（Ｇ／Ｃ）含量を変更する、好ましくは少なくとも１つのコード配列のＧ／Ｃ含量を変更することによって、修飾され、したがって安定化されることができる。換言すれば、本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は本明細書に定義される任意の他の核酸、特にＲＮＡ）及び好ましくはその配列をＧ／Ｃ修飾することができる。
【０２７２】
「Ｇ／Ｃ修飾された」核酸（好ましくはＲＮＡ）配列は、典型的には、修飾された野生型ＲＮＡ配列に基づく核酸（好ましくはＲＮＡ）配列を含む核酸（好ましくはＲＮＡ）を意味し、前記野生型核酸（好ましくはＲＮＡ）配列と比較して個数が変更されたグアノシン及び／又はシトシンヌクレオチドを含む。そのような変更された個数のＧ／Ｃヌクレオチドは、アデノシン又はチミジンヌクレオチドを含むコドンをグアノシン又はシトシンヌクレオチドを含む「同義」コドンで置換することによって生成され得る。したがって、コドン置換は、コードされたアミノ酸残基を変更せずに、核酸（好ましくはＲＮＡ）のＧ／Ｃ含量のみを変更することが好ましい。
【０２７３】
本発明の特に好ましい実施形態においては、本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は本明細書に定義される任意の他の核酸、特にＲＮＡ）のコード配列のＧ／Ｃ含量が、それぞれの野生型、即ち、未修飾核酸のコード配列のＧ／Ｃ含量に比較して変更される、特に増大される。本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は本明細書で定義される他の核酸、特にＲＮＡ）によってコードされるアミノ酸配列は、それぞれの野生型核酸、好ましくはＲＮＡによってコードされるアミノ酸配列に比較して変更されないことが好ましい。
【０２７４】
本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は本明細書に定義される他の核酸、特にＲＮＡ）のそのような修飾は、翻訳される任意のＲＮＡ（又は他の核酸）領域の配列が、前記ＲＮＡ（又は前記他の核酸）の効率的な翻訳にとって重要であるという事実に基づく。したがって、ＲＮＡ（又は前記他の核酸）の組成及び各種ヌクレオチドの配列が重要である。特に、増大したＧ（グアノシン）／Ｃ（シトシン）含量を有する配列は、増大したＡ（アデノシン）／Ｕ（ウラシル）含量を有する配列よりも安定である。
【０２７５】
したがって、本発明によれば、本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は本明細書に定義される任意の他の核酸、特にＲＮＡ）のコドンは、翻訳されるアミノ酸配列を維持しつつ、それらが増大した量のＧ／Ｃヌクレオチドを含むように、それぞれの野生型核酸、好ましくはＲＮＡ（又は前記他の核酸）に比較して変化させる。
【０２７６】
幾つかのコドンが同一のアミノ酸をコードするという事実（いわゆる遺伝コードの縮重）に関しては、安定性にとって最も好ましいコドンを決定することができる（いわゆる代替コドンの使用）。本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は本明細書に定義される任意の他の核酸、特にＲＮＡ）によってコードされるアミノ酸に応じて、その核酸配列の、その野生型配列に対する修飾について様々な可能性がある。Ｇ又はＣヌクレオチドのみを含むコドンによってコードされるアミノ酸の場合、コドンの変更は必要ではない。
したがって、Ｐｒｏ（ＣＣＣ又はＣＣＧ）、Ａｒｇ（ＣＧＣ又はＣＧＧ）、Ａｌａ（ＧＣＣ又はＧＣＧ）、及びＧｌｙ（ＧＧＣ又はＧＧＧ）のコドンは、Ａ又はＵが存在しないので変更を必要としない。対照的に、Ａ及び／又はＵヌクレオチドを含むコドンは、同じアミノ酸をコードするがＡ及び／又はＵを含まない他のコドンの置換によって変更することができる。これらの例として、Ｐｒｏのコドンは、ＣＣＵ又はＣＣＡからＣＣＣ又はＣＣＧに変更でき；Ａｒｇのコドンは、ＣＧＵ又はＣＧＡ又はＡＧＡ又はＡＧＧからＣＧＣ又はＣＧＧに変更でき；Ａｌａのコドンは、ＧＣＵ又はＧＣＡからＧＣＣ又はＧＣＧに変更でき；Ｇｌｙのコドンは、ＧＧＵ又はＧＧＡからＧＧＣ又はＧＧＧに変更できる。他の場合では、Ａ又はＵヌクレオチドをコドンから排除することはできないが、Ａ及び／又はＵヌクレオチドの含量がより少ないコドンを使用することによってＡ及びＵの含量を減少させることが可能である。これらの例として、Ｐｈｅのコドンは、ＵＵＵからＵＵＣに変更でき、Ｌｅｕのコドンは、ＵＵＡ、ＵＵＧ、ＣＵＵ又はＣＵＡからＣＵＣ又はＣＵＧに変更でき、Ｓｅｒのコドンは、ＵＣＵ又はＵＣＡ又はＡＧＵからＵＣＣ、ＵＣＧ又はＡＧＣに変更でき、Ｔｙｒのコドンは、ＵＡＵからＵＡＣに変更でき、Ｃｙｓのコドンは、ＵＧＵからＵＧＣに変更でき、Ｈｉｓのコドンは、ＣＡＵからＣＡＣに変更でき、Ｇｌｎのコドンは、ＣＡＡからＣＡＧに変更でき、Ｉｌｅのコドンは、ＡＵＵ又はＡＵＡからＡＵＣに変更でき、Ｔｈｒのコドンは、ＡＣＵ又はＡＣＡからＡＣＣ又はＡＣＧに変更でき、Ａｓｎのコドンは、ＡＡＵからＡＡＣに変更でき、Ｌｙｓのコドンは、ＡＡＡからＡＡＧに変更でき、Ｖａｌのコドンは、ＧＵＵ又はＧＵＡからＧＵＣ又はＧＵＧに変更でき、Ａｓｐのコドンは、ＧＡＵからＧＡＣに変更でき、Ｇｌｕのコドンは、ＧＡＡからＧＡＧに変更でき、終止コドンＵＡＡは、ＵＡＧ又はＵＧＡに変更できる。一方、Ｍｅｔ（ＡＵＧ）及びＴｒｐ（ＵＧＧ）のコドンの場合には、配列修飾の可能性はない。本発明の人工核酸配列、好ましくはＲＮＡ配列（又は本明細書に定義される任意の他の核酸、特にＲＮＡ）のＧ／Ｃ含量を、その特定の野生型核酸配列（即ち、元の配列）に比較して増大させるために、上に挙げた置換を個別に又は全ての可能な組合せで使用することができる。したがって、例えば、野生型配列中に存在するＴｈｒの全てのコドンを、ＡＣＣ（又はＡＣＧ）に変更することができる。しかしながら、例えば、前記置換可能性の以下のような組合せを使用することが好ましい。
元の配列（野生型ＲＮＡ）中のＴｈｒをコードする全てのコドンのＡＣＣ（又はＡＣＧ）への置換、及び
Ｓｅｒを元来コードする全てコドンのＵＣＣ（又はＵＣＧ又はＡＧＣ）への置換；元の配列中のＩｌｅをコードする全てのコドンのＡＵＣへの置換、及び
Ｌｙｓを元来コードする全てのコドンのＡＡＧへの置換、及び
Ｔｙｒを元来コードする全てコドンのＵＡＣへの置換；元の配列中のＶａｌをコードする全てのコドンのＧＵＣ（又はＧＵＧ）への置換、及び
Ｇｌｕを元来コードする全てのコドンのＧＡＧへの置換、及び
Ａｌａを元来コードする全てのコドンのＧＣＣ（又はＧＣＧ）への置換、及び
Ａｒｇを元来コードする全てのコドンのＣＧＣ（又はＣＧＧ）への置換；元の配列中のＶａｌをコードする全てコドンのＧＵＣ（又はＧＵＧ）への置換、及び
Ｇｌｕを元来コードする全てのコドンのＧＡＧへの置換、及び
Ａｌａを元来コードする全てのコドンのＧＣＣ（又はＧＣＧ）への置換、及び
Ｇｌｙを元来コードする全てのコドンのＧＧＣ（又はＧＧＧ）への置換、及び
Ａｓｎを元来コードする全てのコドンのＡＡＣへの置換；元の配列中のＶａｌをコードする全てのコドンのＧＵＣ（又はＧＵＧ）への置換、及び
Ｐｈｅを元来コードする全てのコドンのＵＵＣへの置換、及び
Ｃｙｓを元来コードする全てのコドンのＵＧＣへの置換、及び
Ｌｅｕを元来コードする全てのコドンのＣＵＧ（又はＣＵＣ）への置換、及び
Ｇｌｎを元来コードする全てのコドンのＣＡＧへの置換、及び
Ｐｒｏを元来コードする全てのコドンのＣＣＣ（又はＣＣＧ）への置換、などである。
【０２７７】
好ましくは、本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は本明細書に定義される任意の他の核酸、特にＲＮＡ）のコード配列のＧ／Ｃ含量は、本明細書に定義される少なくとも１つのタンパク質をコードする野生型核酸、好ましくはＲＮＡ（又は前記他の核酸、特にＲＮＡ）のコード配列のＧ／Ｃ含量に比べて、少なくとも７％、より好ましくは少なくとも１５％、特に好ましくは少なくとも２０％増大する。
【０２７８】
好ましい実施形態によれば、本明細書に定義されるＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、又はそのホモログ、変異体、断片、若しくは誘導体をコードする領域、又は野生型ＲＮＡ配列の全配列における置換可能なコドンの少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、より好ましくは少なくとも７０％、更により好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％、９５％、更には１００％が置換され、それによって前記配列のＧ／Ｃ含量が増大する。
【０２７９】
この文脈においては、本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は本明細書に定義される他の核酸、特にＲＮＡ）、好ましくはその少なくとも１つのコード配列のＧ／Ｃ含量を、野生型配列に比較して最大限（即ち、置換可能なコドンの１００％）増大させることが特に好ましい。
【０２８０】
本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は本明細書に定義される任意の他の核酸、特にＲＮＡ）の更に好ましい修飾は、翻訳効率が、細胞内のｔＲＮＡの出現頻度によっても決定されるという知見に基づく。したがって、いわゆる「レアコドン」が本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は前記他の核酸、特にＲＮＡ）中に高程度で存在する場合、対応する修飾されたＲＮＡ（又は前記他の核酸、特にＲＮＡ）配列は、比較的「高頻度の」ｔＲＮＡをコードするコドンが存在する場合よりも著しく低い程度で翻訳される。
【０２８１】
幾つかの好ましい実施形態では、本明細書に定義される修飾された人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は任意の他の核酸）では、タンパク質をコードする領域が、細胞内において比較的稀であるｔＲＮＡをコードする野生型配列の少なくとも１つのコドンが、細胞内において比較的高頻度で存在し、且つ比較的稀なｔＲＮＡと同じアミノ酸を運搬するｔＲＮＡをコードするコドンと交換されるように、野生型核酸、好ましくはＲＮＡの対応する領域と比較して修飾される。
【０２８２】
それによって、本発明人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は本明細書に定義される任意の他の核酸、特にＲＮＡ）の配列は、高頻度で存在するｔＲＮＡが利用可能であるコドンが挿入されるように修飾される。換言すれば、本発明によれば、この修飾により、細胞内において比較的稀であるｔＲＮＡをコードする野生型配列の全てのコドンをそれぞれ、細胞内において比較的高頻度で存在し、且つそれぞれが比較的稀なｔＲＮＡと同じアミノ酸を運搬するｔＲＮＡをコードするコドンと交換することができる。どのｔＲＮＡが細胞内において比較的高頻度で存在し、逆に、比較的稀であるかについては、当業者に知られている（例えば、Ａｋａｓｈｉ，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  Ｄｅｖ．  ２００１，  １１（６）：  ６６０−６６６参照）。特定のアミノ酸に対して最も高頻度で存在するｔＲＮＡを用いるコドン（例えば、（ヒト）細胞に最も高頻度で存在するｔＲＮＡを使用するＧｌｙコドン）が特に好ましい。
【０２８３】
本発明によれば、本発明の修飾された人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は本明細書に定義される任意の他の核酸、特にＲＮＡ）において増大する、特に最大となる配列Ｇ／Ｃ含量（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  Ｇ／Ｃ  ｃｏｎｔｅｎｔ）を、前記人工核酸分子、好ましくはＲＮＡのコード配列によりコードされたコードアミノ酸配列を変更することなく、「高頻度」コドンと結び付けることが特に好ましい。そのような好ましい実施形態は、特に効率的に翻訳され安定化された（修飾された）人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は本明細書に定義される任意の他の核酸）の提供を可能にする。
【０２８４】
前記のような（Ｇ／Ｃ含量が増大した；ｔＲＮＡが交換された）修飾人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は本明細書に定義される任意の他の核酸）の決定は、その開示内容が本発明の全範囲に含まれるＷＯ０２／０９８４４３に説明されるコンピュータープログラムを使用して行うことができる。このコンピュータープログラムを使用して、任意の所望の核酸、特にＲＮＡのヌクレオチド配列を、遺伝子コード又はその縮重的性質を用いて修飾することができる。この修飾は、最大のＧ／Ｃ含量が、細胞内で可能な限り高頻度で存在するｔＲＮＡをコードするコドンの使用との組み合わせで、修飾核酸（特にＲＮＡ）によってコードされるアミノ酸配列、好ましくは非修飾配列と比較して変化しないものを生じるように行われる。
【０２８５】
或いは、元の配列と比較してＧ／Ｃ含量のみ又はコドンの使用のみを改変することも可能である。Ｖｉｓｕａｌ  Ｂａｓｉｃ  ６．０（使用される展開環境：Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｔｕｄｉｏ  Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ  ６．０、Ｓｅｒｖｉｃｅｐａｃｋ  ３）のソースコードも、ＷＯ０２／０９８４４３に記載されている。
【０２８６】
Ａ／Ｕ含量修飾
本発明の更なる好ましい実施形態では、本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は本明細書に定義される任意の他の核酸、特にＲＮＡ）のリボソーム結合部位の環境におけるＡ／Ｕ含量は、そのそれぞれの野生型核酸、好ましくはＲＮＡ（又は前記他の核酸、特にＲＮＡ）のリボソーム結合部位の環境におけるＡ／Ｕ含量に比較して増加する。
【０２８７】
この改変（リボソーム結合部位周辺の増加したＡ／Ｕ含量）は、前記人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は本明細書に定義される任意の他の核酸、特にＲＮＡ）へのリボソームの結合効率を高める。リボソーム結合部位（コザック配列）へのリボソームの効果的な結合は、次に、人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は本明細書に定義される任意の他の核酸、特にＲＮＡ）の効率的な翻訳の効果を奏する。
【０２８８】
ＤＳＥ修飾
本発明の更なる実施形態によれば、本発明人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は本明細書に定義される任意の他の核酸、特にＲＮＡ）は、潜在的な不安定化配列エレメントに関して改変され得る。特に、前記人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は前記他の核酸、特にＲＮＡ）のコード配列及び／又は５’及び／又は３’非翻訳領域は、それぞれの野生型核酸、好ましくはＲＮＡ（又は前記他の野生型核酸）と比較して、不安定化配列エレメントを含まないように改変することができ、改変人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は前記他の核酸、特にＲＮＡ）のコードされたアミノ酸配列は、そのそれぞれの野生型核酸、好ましくはＲＮＡ（又は前記他の野生型核酸）と比較して改変されていないことが好ましい。
【０２８９】
例えば、真核生物のＲＮＡの配列において、不安定化配列エレメント（ＤＳＥ）が生じ、それにシグナルタンパク質が結合してインビボでＲＮＡの酵素的分解を調節することが知られている。修飾人工核酸分子、好ましくはＲＮＡの更なる安定化のために、任意に、本明細書に定義されるＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質又は本明細書に定義される任意の他の核酸をコードする領域をコードする領域において、不安定化配列エレメントが含まれない又は実質的に含まれないように、野生型核酸、好ましくはＲＮＡの対応する領域と比較して１つ以上のそのような改変を行うことができる。
【０２９０】
本発明によれば、非翻訳領域（３’−及び／又は５’−ＵＴＲ）に存在するＤＳＥも、そのような改変によって、人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は本明細書に定義される任意の他の核酸、特にＲＮＡ）から排除することができる。そのような不安定化配列は、例えば、多数の不安定なＲＮＡの３’−ＵＴＲ部分に存在するＡＵ−リッチ配列（ＡＵＲＥＳ）である（Ｃａｐｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １９８６，  ８３：  １６７０〜１６７４）。したがって、本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は本明細書に定義される任意の他の核酸、特にＲＮＡ）は、前記人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は前記他の核酸、特にＲＮＡ）がそのような不安定化配列を含まないように、それぞれの野生型核酸、好ましくはＲＮＡ（又は前記それぞれの他の野生型核酸）と比較して改変されることが好ましい。このことは、可能なエンドヌクレアーゼによって認識される配列モチーフ（例えば、トランスフェリン受容体をコードする遺伝子の３’−ＵＴＲセグメントに含まれる配列ＧＡＡＣＡＡＧ）にも当てはまる（Ｂｉｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １９９４，  １３：  １９６９〜１９８０）。これらの配列モチーフはまた、前記人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は本明細書に定義される任意の他の核酸、特にＲＮＡ）から除去されることが好ましい。
【０２９１】
ヒトのコドン使用に適合させた配列：
本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は本明細書に定義される任意の他の核酸、特にＲＮＡ）の更なる好ましい修飾は、同じアミノ酸をコードするコドンが典型的には異なる頻度で存在するという知見に基づく。更に好ましい実施形態によれば、修飾された人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は他の核酸、特にＲＮＡ）において、コード配列を、それぞれの野生型核酸、好ましくはＲＮＡ（又は他の野生型核酸）の対応する領域に比較して、同じアミノ酸をコードするコドンの頻度が、例えば、表４に示されるように、ヒトのコドンの使用にしたがう当該コドンの天然に存在する頻度に対応するように修飾される。
【０２９２】
例えば、本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（本明細書に定義される任意の他の核酸、特にＲＮＡ）の少なくとも１つのコード配列によってコードされるアミノ酸配列中に存在するアミノ酸アラニン（Ａｌａ）の場合、野生型コード配列は、コドン「ＧＣＣ」が０．４０の頻度で使用され、コドン「ＧＣＴ」が０．２８の頻度で使用され、コドン「ＧＣＡ」が０．２２の頻度で使用され、コドン「ＧＣＧ」が０．１０の頻度で使用されるなどのように適合させることが好ましい（表４参照）。
【表４】
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【０２９３】
コドン最適化配列：
前述したように、本発明によれば、細胞内において比較的稀なｔＲＮＡをコードする野生型配列の全てのコドンを、細胞内において比較的高頻度であり、且ついずれも前記比較的稀なｔＲＮＡと同一のアミノ酸を運搬するｔＲＮＡをコードするコドンと交換されることが好ましい。
したがって、最も高頻度のコドンが各コードアミノ酸に対して使用されることが特に好ましい（表４を参照のこと、最も高頻度のコドンはアスタリスクで示されている）。そのような最適化手順は、コドン適合度指数（ＣＡＩ）を上昇させ、最終的にＣＡＩを最大にする。本発明の文脈において、上昇又は最大化されたＣＡＩを有する配列は、典型的には「コドン最適化」配列及び／又はＣＡＩ上昇及び／又は最大化配列と称される。好ましい実施形態によれば、本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は本明細書に定義される任意の他の核酸、特にＲＮＡ）は、少なくとも１つのコード配列を含み、前記コード配列は、本明細書に記載されるようにコドン最適化される。より好ましくは、少なくとも１つのコード配列のコドン適合度指数（ＣＡＩ）は、少なくとも０．５、少なくとも０．８、少なくとも０．９、又は少なくとも０．９５である。最も好ましくは、少なくとも１つのコード配列のコドン適合度指数（ＣＡＩ）は１である。
【０２９４】
例えば、本発明の組合せ（又は他の任意の核酸、特にＲＮＡ）の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡの少なくとも１つのコード配列によってコードされるアミノ酸配列中に存在するアミノ酸アラニン（Ａｌａ）の場合、野生型コード配列が、最も高頻度のヒトコドン「ＧＣＣ」が常に前記アミノ酸のために使用されるように適合される、又はアミノ酸システイン（Ｃｙｓ）の場合には、野生型配列が、最も高頻度のヒトコドン「ＴＧＣ」が常に前記アミノ酸のために使用されるように適合される。
【０２９５】
Ｃ最適化配列：
好ましい実施形態によれば、本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は本明細書に定義される任意の他の核酸、特にＲＮＡ）は、前記人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は他の核酸、特にＲＮＡ）、特にその少なくとも１つのコード配列におけるシトシン（Ｃ）含量を変更する、好ましくは増加させることによって改変される。
【０２９６】
好ましい実施形態においては、本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は本明細書に定義される任意の他の核酸、特にＲＮＡ）のコード配列のＣ含量を、それぞれの野生型（未修飾）核酸の配列のコード配列のＣ含量と比較して改変、好ましくは増加させる。本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡの少なくとも１つのコード配列によってコードされるアミノ酸配列は、それぞれの野生型核酸、好ましくはＲＮＡ（又はそれぞれの他の野生型核酸）によってコードされるアミノ酸配列と比較して変更がないことが好ましい。
【０２９７】
好ましい実施形態においては、前記修飾人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は本明細書に定義される任意の他の核酸、特にＲＮＡ）は、理論的に可能な最大シトシン含量の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、又は８０％、又は少なくとも９０％、更には最大シトシン含量が達成されるように改変される。
【０２９８】
更に好ましい実施形態においては、野生型ＲＮＡ配列のコドンの、「シトシン含量最適化可能な」少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、更には１００％が、野生型核酸、好ましくはＲＮＡ配列に存在するものよりも高いシトシン含量を有するコドンによって置き換えられる。
【０２９９】
更なる好ましい実施形態においては、野生型コード配列の幾つかのコドンは、細胞内において比較的稀なｔＲＮＡのコドンが、細胞内において比較的高頻度のｔＲＮＡのコドンに置き換わるように改変される。ただし、比較的高頻度のｔＲＮＡの置換コドンは、元の野生型コドンの比較的稀なｔＲＮＡと同じアミノ酸を運搬する。好ましくは、シトシンを含まないコドンによってのみコードされるアミノ酸をコードするコドンを除き、又はそれぞれ同じ数のシトシンを含む２つのコドンによってコードされるグルタミン（Ｇｌｎ）を除き、比較的稀なｔＲＮＡのコドンの全てが、細胞内において比較的高頻度のｔＲＮＡのコドンによって置き換えられる。
【０３００】
本発明の更なる好ましい実施形態において、改変人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は本明細書に定義される任意の他の核酸、特にＲＮＡ）は、理論的に可能な最大シトシン含量、又は最大シトシン含量の少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、更には最大シトシン含量が、細胞内において比較的高い頻度のｔＲＮＡをコードするコドンによって、アミノ酸配列は変化しないように改変される。
【０３０１】
遺伝暗号の天然に生じる縮重のために、１超のコドンが特定のアミノ酸をコードし得る。したがって、２０個の天然アミノ酸のうち１８個は、１つより多いコドンによってコードされる（ただし、ＴｒｙｐとＭｅｔは例外である）例えば、２種類のコドン（例えば、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）、３種類のコドン（例えば、Ｉｌｅ）、４種類のコドン（例えば、Ａｌ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ）、又は６種類のコドン（例えば、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ）。しかしながら、同じアミノ酸をコードする全てのコドンがインビボ条件下で同じ頻度で利用される訳ではない。それぞれの単一生物によって、典型的なコドン使用プロファイルが確立されている。
【０３０２】
本発明の文脈において使用される「シトシン含量最適化可能コドン」という用語は、同じアミノ酸をコードする他のコドンよりも低いシトシン含量を示すコドンを意味する。したがって、同じアミノ酸をコードし、そのコドン内でより多くのシトシンを示す別のコドンによって置き換えられ得る任意の野生型コドンは、シトシン最適化可能（Ｃ最適化可能）であるとみなされる。野生型コード配列内の特定のＣ最適化コドンによるＣ最適化可能野生型コドンのそのような置換は、その全体のＣ含量を増加させ、Ｃがリッチな改変ＲＮＡ配列を反映する。
【０３０３】
幾つかの好ましい実施形態によれば、本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は本明細書に定義される任意の他の核酸、特にＲＮＡ）、特にその少なくとも１つのコード配列は、全ての潜在的なＣ最適化可能コドンのためのＣ最適化コドンを含むＣ最大化配列を含む又はからなる。したがって、理論的に置換可能なＣ最適化可能コドンの１００％、即ち全てが、コード配列の全長に亘ってＣ最適化コドンによって置換されることが好ましい。
【０３０４】
この文脈において、シトシン含量最適化可能コドンは、同じアミノ酸をコードする他のコドンよりも少ない数のシトシンを含むコドンである。コドンＧＣＧ、ＧＣＡ、ＧＣＵのいずれもアミノ酸Ａｌａをコードするが、これらは同じアミノ酸をコードするコドンＧＣＣで交換することができる、及び／又は
ＣｙｓをコードするコドンＵＧＵは、同じアミノ酸をコードするコドンＵＧＣで交換することができる、及び／又は
ＡｓｐをコードするコドンＧＡＵは、同じアミノ酸をコードするコドンＧＡＣで交換することができる、及び／又は
ＰｈｅをコードするＵＵＵは、同じアミノ酸をコードするコドンＵＵＣで交換することができる、及び／又は
ＧｌｙをコードするコドンＧＧＧ、ＧＧＡ、ＧＧＵのいずれも、同じアミノ酸をコードするコドンＧＧＣで交換することができる、及び／又は
ＨｉｓをコードするコドンＣＡＵは、同じアミノ酸をコードするコドンＣＡＣで交換することができる、及び／又は
ＩｌｅをコードするコドンＡＵＡ、ＡＵＵのいずれも、コドンＡＵＣで交換することができる、及び／又は
ＬｅｕをコードするコドンＵＵＧ、ＵＵＡ、ＣＵＧ、ＣＵＡ、ＣＵＵのいずれも、同じアミノ酸をコードするコドンＣＵＣで交換することができる、及び／又は
ＡｓｎをコードするコドンＡＡＵは、同じアミノ酸をコードするコドンＡＡＣで交換することができる、及び／又は
ＰｒｏをコードするコドンＣＣＧ、ＣＣＡ、ＣＣＵのいずれも、同じアミノ酸をコードするコドンＣＣＣで交換することができる、及び／又は
ＡｒｇをコードするコドンＡＧＧ、ＡＧＡ、ＣＧＧ、ＣＧＡ、ＣＧＵのいずれも、同じアミノ酸をコードするコドンＣＧＣで交換することができる、及び／又は
ＳｅｒをコードするコドンＡＧＵ、ＡＧＣ、ＵＣＧ、ＵＣＡ、ＵＣＵのいずれかも、同じアミノ酸をコードするコドンＵＣＣで交換することができる、及び／又は
ＴｈｒをコードするコドンＡＣＧ、ＡＣＡ、ＡＣＵのいずれも、同じアミノ酸をコードするコドンＡＣＣで交換することができる、及び／又は
ＶａｌをコードするコドンＧＵＧ、ＧＵＡ、ＧＵＵのいずれも、同じアミノ酸をコードするコドンＧＵＣで交換することができる、及び／又は
ＴｙｒをコードするコドンＵＡＵは、同じアミノ酸をコードするコドンＵＡＣで交換することができる。
【０３０５】
前記の例のいずれにおいても、シトシンの数は交換されたコドン当たり１つ増加する。コード配列の全ての非Ｃ最適化コドン（Ｃ最適化可能コドンに対応する）の交換により、Ｃ最大化コード配列がもたらされる。本発明の文脈において、本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は本明細書に定義される任意の他の核酸、特にＲＮＡ）の少なくとも１つのコード配列内の非Ｃ最適化コドンの少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％が、Ｃ最適化コドンによって置き換えられる。
【０３０６】
幾つかのアミノ酸については、Ｃ最適化コドンによって置換されたＣ最適化可能コドンの割合が７０％未満であり、一方、他のアミノ酸については、置換されたコドンの割合が７０％より高いことにより、コード配列の全てのＣ最適化可能野生型コドンの少なくとも７０％の全体的なＣ最適化割合を満たすことが好ましい場合がある。
【０３０７】
好ましくは、Ｃ最適化人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は本明細書に定義される任意の他の核酸、特にＲＮＡ）では、任意の所与のアミノ酸についてのＣ最適化可能野生型コドンの少なくとも５０％がＣ最適化コドンによって置き換えられる。例えば、任意の改変ＣリッチＲＮＡ（又は他の核酸、特にＲＮＡ）は、好ましくは、前記アミノ酸Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、及びＴｙｒのいずれか１つをコードするＣ最適化可能野生型コドン位置に少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％のＣ最適化コドンを含む。
【０３０８】
この文脈において、シトシン含量を最適化可能ではないが、少なくとも２種類のコドンによってコードされるアミノ酸をコードするコドンは、更なる選択プロセスなしに使用され得る。しかしながら、細胞内、例えば、ヒト細胞において比較的稀なｔＲＮＡをコードする野生型配列のコドンは、細胞内において比較的高頻度のｔＲＮＡをコードするコドンと交換することができ、ここで両者とも同じアミノ酸をコードする。したがって、Ｇｌｕをコードする比較的稀なコドンＧＡＡは、同じアミノ酸をコードする比較的高頻度のコドンＧＡＧで交換することができ、及び／又は
Ｌｙｓをコードする比較的稀なコドンＡＡＡは、同じアミノ酸をコードする比較的高頻度のコドンＡＡＧで交換することができ、及び／又は
Ｇｌｎをコードする比較的稀なコドンＣＡＡは、同じアミノ酸をコードする比較的高頻度のコドンＣＡＧで交換することができる。
【０３０９】
この文脈において、それぞれ１つのコドンのみによってコードされるアミノ酸Ｍｅｔ（ＡＵＧ）及びＴｒｐ（ＵＧＧ）は変化しないままである。終止コドンは、シトシン含量について最適化されないが、比較的稀な終止コドンであるアンバー、オーカー（ＵＡＡ、ＵＡＧ）は、比較的高頻度の終止コドンであるオパール（ＵＧＡ）で交換することができる。
【０３１０】
上に列挙した各置換は、改変された人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は本明細書に記載される任意の他の核酸、特にＲＮＡ）のシトシン含量を野生型配列と比較して最適化するために、別々に且つ可能な全ての組合せで使用することができる。
【０３１１】
したがって、本明細書に定義される少なくとも１つのコード配列は、少なくとも２つ以上のコドン（そのうちの１つは、１つの追加のシトシンを含む）によってコードされるアミノ酸について、それぞれの野生型ＲＮＡ（又は他の野生型核酸）のコード配列と比較して変更することができ、そのようなコドンは、１つの追加のシトシンを含むＣ最適化されたコドンで交換することができ、前記アミノ酸は野生型配列と比較して変化しないことが好ましい。
【０３１２】
特に好ましい実施形態によれば、本発明の組合せは、（本明細書に特定される５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲに加えて）本明細書に定義される少なくとも１つのコード配列を含む人工核酸分子、好ましくはＲＮＡを含み、（ａ）前記人工核酸分子、好ましくはＲＮＡの少なくとも１つのコード配列のＧ／Ｃ含量が、対応する野生型核酸（好ましくはＲＮＡ）の対応するコード配列のＧ／Ｃ含量と比較して増加し、及び／又は（ｂ）前記人工核酸分子、好ましくはＲＮＡの少なくとも１つのコード配列のＣ含量が、対応する野生型核酸（好ましくはＲＮＡ）の対応するコード配列のＣ含量と比較して増加し、及び／又は（ｃ）前記人工核酸分子、好ましくはＲＮＡの少なくとも１つのコード配列中のコドンが、ヒトのコドン使用に適合されており、コドン適合度指数（ＣＡＩ）が、好ましくは、前記人工核酸分子、好ましくはＲＮＡの少なくとも１つのコード配列において増加又は最大化されており、前記人工核酸分子、好ましくはＲＮＡによってコードされるアミノ酸配列が、好ましくは、対応する野生型核酸（好ましくはＲＮＡ）によってコードされるアミノ酸配列と比較して変化しない。
【０３１３】
修飾核酸配列
前記配列修飾は、一般に、本明細書に記載される任意の核酸配列に適用することができ、本明細書に定義されるＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする核酸配列、及び任意にＮＬＳ又は他のペプチド若しくはタンパク質部分、ドメイン、又はタグを含む又はからなるコード配列に適用することが特に想定される。修飾（化学修飾、脂質修飾、及び配列修飾を含む）は、適切である又は必要である場合には、組み合わせられた修飾が互いに干渉しない限り、好ましくはコードされたＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（及びＮＬＳ、シグナル配列、タンパク質／ペプチドタグ）が、好ましくは上で定義される、その所望の生物学的機能性又は特性を保持する限り、任意の組合せで組み合わせることができる。
【０３１４】
好ましい実施形態では、本発明に係る人工核酸は、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードするコード配列を含み、前記コード配列は前記したように修飾されている。
【０３１５】
幾つかの好ましい実施形態において、本発明に係る人工核酸は、Ｃａｓ９タンパク質、又はそのホモログ、変異体、断片、若しくは誘導体をコードするコード配列を含み、前記コード配列は、配列番号４１２；３４７４〜３８８７  ２３１４〜２３２７；４６３４〜４６４７；５７９４〜５８０７；６９５４〜６９６７；８１１４〜８１２７；４１３〜４２５；３４９０〜３５０３；３５０６〜３５１９；３５２２〜３５３５；３５３８〜３５５１；３５５４〜３５６７；３５７０〜３５８３；３５８６〜３５９９；３６０２〜３６１５；３６１８〜３６３１；３６３４〜３６４７；３６５０〜３６６３；３６６６〜３６７９；３６８２〜３６９５；９５１４〜９５２７；９６２６〜９６３９；９７３８〜９７５１；９８５０〜９８６３；９９６２〜９９７５；１００７４〜１００８７；１０１８６〜１０１９９；１０２９８〜１０３１１；２３３０〜２３４３；２３４６〜２３５９；２３６２〜２３７５；２３７８〜２３９１；２３９４〜２４０７；２４１０〜２４２３；２４２６〜２４３９；２４４２〜２４５５；２４５８〜２４７１；２４７４〜２４８７；２４９０〜２５０３；２５０６〜２５１９；２５２２〜２５３５；９４９８〜９５１１；９６１０〜９６２３；９７２２〜９７３５；９８３４〜９８４７；９９４６〜９９５９；１００５８〜１００７１；１０１７０〜１０１８３〜１０２８２〜１０２９５；４６５０〜４６６３；４６６６〜４６７９；４６８２〜４６９５；４６９８〜４７１１；４７１４〜４７２７；４７３０〜４７４３；４７４６〜４７５９；４７６２〜４７７５；４７７８〜４７９１；４７９４〜４８０７；４８１０〜４８２３；４８２６〜４８３９；４８４２〜４８５５；９５３０〜９５４３；９６４２〜９６５５；９７５４〜９７６７；９８６６〜９８７９；９９７８〜９９９１；１００９０〜１０１０３；１０２０２〜１０２１５；１０３１４〜１０３２７；５８１０〜５８２３；５８２６〜５８３９；５８４２〜５８５５；５８５８〜５８７１；５８７４〜５８８７；５８９０〜５９０３；５９０６〜５９１９；５９２２〜５９３５；５９３８〜５９５１；５９５４〜５９６７；５９７０〜５９８３；５９８６〜５９９９；６００２〜６０１５；９５４６〜９５５９；９６５８〜９６７１；９７７０〜９７８３；９８８２〜９８９５；９９９４〜１０００７；１０１０６〜１０１１９；１０２１８〜１０２３１；１０３３０〜１０３４３；６９７０〜６９８３；６９８６〜６９９９；７００２〜７０１５；７０１８〜７０３１；７０３４〜７０４７；７０５０〜７０６３；７０６６〜７０７９；７０８２〜７０９５；７０９８〜７１１１；７１１４〜７１２７；７１３０〜７１４３；７１４６〜７１５９；７１６２〜７１７５；９５６２〜９５７５；９６７４〜９６８７；９７８６〜９７９９；９８９８〜９９１１；１００１０〜１００２３；１０１２２〜１０１３５；１０２３４〜１０２４７；１０３４６〜１０３５９；８１３０〜８１４３；８１４６〜８１５９；８１６２〜８１７５；８１７８〜８１９１；８１９４〜８２０７；８２１０〜８２２３；８２２６〜８２３９；８２４２〜８２５５；８２５８〜８２７１；８２７４〜８２８７；８２９０〜８３０２；８３０６〜８３１９；���３２２〜８３３５；９５７８〜９５９１；９６９０〜９７０３；９８０２〜９８１５；９９１４〜９９２７；１００２６〜１００３９；１０１３８〜１０１５１；１０２５０〜１０２６３；１０３６２〜１０３７５；９２９０〜９３０３；９３０６〜９３１９；９３２２〜９３３５；９３３８〜９３５１；９３５４〜９３６７；９３７０〜９３８３；９３８６〜９３９９；９４０２〜９４１５；９４１８〜９４３１；９４３４〜９４４７；９４５０〜９４６３；９４６６〜９４７９；９４８２〜９４９５；９５９４〜９６０７；９７０６〜９７１９；９８１８〜９８３１；９９３０〜９９４３；１００４２〜１００５５；１０１５４〜１０１６７；１０２６６〜１０２７９；１０３７８〜１０３９１に係る核酸配列、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片、特に、これらの配列のいずれかに対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有する核酸配列を含む又はからなる。
【０３１６】
幾つかの好ましい実施形態において、本発明に係る人工核酸は、Ｃｐｆ１タンパク質、又はそのホモログ、変異体、断片、若しくは誘導体をコードするコード配列を含み、前記コード配列は、配列番号１０５５２；３４５８〜３４５９；３４６０〜３４７３；２２９８〜２２９９；４６１８〜４６１９；５７７８〜５７７９；６９３８〜６９３９；８０９８〜８０９９；９２５８〜９２５９；２３００〜２３１３；４６２０〜４６３３；５７８０〜５７９３；６９４０〜６９５３；８１００〜８１１３；９２６０〜９２７３；３４８８〜３４８９；１０３９６；２３２８〜２３２９；１０３９５；４６４８〜４６４９；１０３９７；５８０８〜５８０９；１０３９８；６９６８〜６９６９；１０３９９；８１２８〜８１２９；１０４００；９２７４〜９２８７；３５０４〜３５０５；３５２０〜３５２１；３５３６〜３５３７；３５５２〜３５５３；３５６８〜３６６９；３５８４〜３５８５；３６００〜３６０１；３６１６〜３６１７；３６３２〜３６３３；３６４８〜３６４９；３６６４〜３６６５；３６８０〜３６８１；３６９６〜３６９７；９５２８〜９５２９；９６４０〜９６４１；９７５２〜９７５３；９８６４〜９８６５；９９７６〜９９７７；１００８８〜１００８９；１０２００〜１０２０１；１０３１２〜１０３１３；１０４０３；１０４１０；１０４１７；１０４２４；１０４３１；１０４３８；１０４４５；１０４５２；１０４５９；１０４６６；１０４７３；１０４８０；１０４８７；１０４９４；１０５０１；１０５０８；１０５１５；１０５２２；１０５２９；１０５３６；１０５４３  ２３４４〜２３４５；２３６０〜２３６１；２３７６〜２３７７；２３９２〜２３９３；２４０８〜２４０９；２４２４〜２４２５；２４４０〜２４４１；２４５６〜２４５７；２４７２〜２４７３；２４８９〜２４９０；２５０４〜２５０５；２５２０〜２５２１；２５３６〜２５３７；９５１２〜９５１３；９６２４〜９６２５；９７３６〜９７３７；９８４８〜９８４９；９９６０〜９９６１；１００７２〜１００７３；１０１８４〜１０１８５；１０２９６〜１０２９７；１０４０２；１０４０９；１０４１６；１０４２３；１０４３０；１０４３７；１０４４４；１０４５１；１０４５８；１０４６５；１０４７２；１０４７９；１０４８６；１０４９３；１０５００；１０５０７；１０５１４；１０５２１；１０５２８；１０５３５；１０５４２；４６６４〜４６６５；４６８０〜４６８１；４６９６〜４６９７；４７１２〜４７１３；４７２８〜４７２９；４７４４〜４７４５；４７６０〜４７６１；４７７６〜４７７７；４７９２〜４７９３；４８０８〜４８０９；４８２４〜４８２５；４８４０〜４８４１；４８５６〜４８５７；９５４４〜９５４５；９６５６〜９６５７；９７６８〜９７６９；９８８０〜９８８１；９９９２〜９９９３；１０１０４〜１０１０５；１０２１６〜１０２１７；１０３２８〜１０３２９；１０４０４；１０４１１；１０４１８；１０４２５；１０４３２；１０４３９；１０４４６；１０４５３；１０４６０；１０４６７；１０４７４；１０４８１；１０４８８；１０４９５；１０５０２；１０５０９；１０５１６；１０５２３；１０５３０；１０５３７；１０５���４；５８２４〜５８２５；５８４０〜５８４１；５８５６〜５８５７；５８７２〜５８７３；５８８８〜５８８９；５９０４〜５９０５；５９２０〜５９２１；５９３６〜５９３７；５９５２〜５９５３；５９６８〜５９６９；５９８４〜５９８５；６０００〜６００１；６０１６〜６０１７；９５６０〜９５６１；９６７２〜９６７３；９７８４〜９７８５；９８９６〜９８９７；１０００８〜１０００９；１０１２０〜１０１２１；１０２３２〜１０２３３；１０３４４〜１０３４５；１０４０５；１０４１２；１０４１９；１０４２６；１０４３３；１０４４０；１０４４７；１０４５４；１０４６１；１０４６８；１０４７５；１０４８２；１０４８９；１０４９６；１０５０３；１０５１０；１０５１７；１０５２４；１０５３１；１０５３８；１０５４５；７０３３；７０４８〜７０４９；７０６４〜７０６５；７０８０〜７０８１；７０９６〜７０９７；７１１２〜７１１３；７１２８〜７１２９；７１４４〜７１４５；７１６０〜７１６１；７１７６〜７１７７；９５７６〜９５７７；９６８８〜９６８９；９８００〜９８０１；９９１２〜９９１３；１００２４〜１００２５；１０１３６〜１０１３７；１０２４８〜１０２４９；１０３６０〜１０３６１；１０４０６；１０４１３；１０４２０；１０４２７；１０４３４；１０４４１；１０４４８；１０４５５；１０４６２；１０４６９；１０４７６；１０４８３；１０４９０；１０４９７；１０５０４；１０５１１；１０５１８；１０５２５；１０５３２；１０５３９；１０５４６；８１４４〜８１４５；８１６０〜８１６０；８１７６〜８１７７；８１９２〜８１９３；８２０８〜８２０９；８２２４〜８２２５；８２４０〜８２４１；８２５６〜８２５７；８２７２〜８２７３；８２８８〜８２８９；８３０４〜８３０５；８３２０〜８３２１；８３３６〜８３３７；９５９２〜９５９３；９７０４〜９７０５；９８１６〜９８１７；９９２８〜９９２９；１００４０〜１００４１；１０１５２〜１０１５３；１０２６４〜１０２６５；１０３７６〜１０３７７；１０４０７；１０４１４；１０４２１；１０４２８；１０４３５；１０４４２；１０４４９；１０４５６；１０４６３；１０４７０；１０４７７；１０４８４；１０４９１；１０４９８；１０５０５；１０５１２；１０５１９；１０５２６；１０５３３；１０５４０；１０５４７；９２８８〜９２８９；１０４０１；１０５５３；１０５８２〜１０５８３  １０５７９〜１０５８０；１０５８５〜１０５８６；１０５８８〜１０５８９；１０５９１〜１０５９２；１０５９４〜１０５９５；１０５９７〜１０５９８；１０５５４〜１０５７４；１０６０１；１０６０２；１０６１５；１０６１６；１０６２９；１０６３０；１０６４３；１０６４４；１０６５７；１０６５８；１０６７１；１０６７２；１０６８５；１０６８６；１０６９９；１０７００；１０７１３；１０７１４；１０７２７；１０７２８；１０７４１；１０７４２；１０７５５；１０７５６；１０７６９；１０７７０；１０７８３；１０７８４；１０７９７；１０７９８；１０８１１；１０８１２；１０８２５；１０８２６；１０８３９；１０８４０；１０８５３；１０８５４；１０８６７；１０８６８；１０８８１；１��８８２；１０６０３；１０６０４；１０６１７；１０６１８；１０６３１；１０６３２；１０６４５；１０６４６；１０６５９；１０６６０；１０６７３；１０６７４；１０６８７；１０６８８；１０７０１；１０７０２；１０７１５；１０７１６；１０７２９；１０７３０；１０７４３；１０７４４；１０７５７；１０７５８；１０７７１；１０７７２；１０７８５；１０７８６；１０７９９；１０８００；１０８１３；１０８１４；１０８２７；１０８２８；１０８４１；１０８４２；１０８５５；１０８５６；１０８６９；１０８７０；１０８８３；１０８８４；１０６０５；１０６０６；１０６１９；１０６２０；１０６３３；１０６３４；１０６４７；１０６４８；１０６６１；１０６６２；１０６７５；１０６７６；１０６８９；１０６９０；１０７０３；１０７０４；１０７１７；１０７１８；１０７３１；１０７３２；１０７４５；１０７４６；１０７５９；１０７６０；１０７７３；１０７７４；１０７８７；１０７８８；１０８０１；１０８０２；１０８１５；１０８１６；１０８２９；１０８３０；１０８４３；１０８４４；１０８５７；１０８５８；１０８７１；１０８７２；１０８８５；１０８８６；１０６０７；１０６０８；１０６２１；１０６２２；１０６３５；１０６３６；１０６４９；１０６５０；１０６６３；１０６６４；１０６７７；１０６７８；１０６９１；１０６９２；１０７０５；１０７０６；１０７１９；１０７２０；１０７３３；１０７３４；１０７４７；１０７４８；１０７６１；１０７６２；１０７７５；１０７７６；１０７８９；１０７９０；１０８０３；１０８０４；１０８１７；１０８１８；１０８３１；１０８３２；１０８４５；１０８４６；１０８５９；１０８６０；１０８７３；１０８７４；１０８８７；１０８８８；１０６０９；１０６１０；１０６２３；１０６２４；１０６３７；１０６３８；１０６５１；１０６５２；１０６６５；１０６６６；１０６７９；１０６８０；１０６９３；１０６９４；１０７０７；１０７０８；１０７２１；１０７２２；１０７３５；１０７３６；１０７４９；１０７５０；１０７６３；１０７６４；１０７７７；１０７７８；１０７９１；１０７９２；１０８０５；１０８０６；１０８１９；１０８２０；１０８３３；１０８３４；１０８４７；１０８４８；１０８６１；１０８６２；１０８７５；１０８７６；１０８８９；１０８９０；１０６１１；１０６１２；１０６２５；１０６２６；１０６３９；１０６４０；１０６５３；１０６５４；１０６６７；１０６６８；１０６８１；１０６８２；１０６９５；１０６９６；１０７０９；１０７１０；１０７２３；１０７２４；１０７３７；１０７３８；１０７５１；１０７５２；１０７６５；１０７６６；１０７７９；１０７８０；１０７９３；１０７９４；１０８０７；１０８０８；１０８２１；１０８２２；１０８３５；１０８３６；１０８４９；１０８５０；１０８６３；１０８６４；１０８７７；１０８７８；１０８９１；１０８９２；９３０４〜９３０５；９３２０〜９３２１；９３３６〜９３３７；９３５２〜９３５３；９３６８〜９３６９；９３８４〜９３８５；９４００〜９４０１；９４１６〜９４１７；９４３２〜９４３３；９４４８〜９４４９；��４６４〜９４６５；９４８０〜９４８１；９４９６〜９４９７；９６０８〜９６０９；９７２０〜９７２１；９８３２〜９８３３；９９４４〜９９４５；１００５６〜１００５７；１０１６８〜１０１６９；１０２８０〜１０２８１；１０３９２〜１０３９３；１０４０８；１０４１５；１０４２２；１０４２９；１０４３６；１０４４３；１０４５０；１０４５７；１０４６４；１０４７１；１０４７８；１０４８５；１０４９２；１０４９９；１０５０６；１０５１３；１０５２０；１０５２７；１０５３４；１０５４１；１０５４８に係る核酸配列、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片、特に、これらの配列のいずれかに対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有する核酸配列を含む又はからなる。
【０３１７】
本発明に係る人工核酸は、同じ（モノシストロン性核酸）又は異なる（マルチシストロン性核酸）コード領域において、更なるタンパク質又はペプチドをコードしてもよい。それぞれのコード核酸配列は、前記と同じ配列修飾に付すことができる。特に、本発明の人工核酸のコード配列は、好ましくはＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする核酸配列に融合される１以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）をコードする１以上の配列を含み得る。これらの配列も前記のように修飾ことができる。
【０３１８】
修飾された（又は「最適化された」）コード配列は、本明細書に開示される任意のＵＴＲと組み合わせることができる。
【０３１９】
したがって、幾つかの好ましい実施形態では、本発明に係る人工核酸は、本明細書に定義される少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、本明細書に定義される少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメント、及びＣａｓ９又はＣｐｆ１タンパク質をコードするコード配列、又はその（機能的）ホモログ、変異体、断片、若しくは誘導体を含み、前記人工核酸分子が、配列番号４１３；２３３０〜２３４５；３４９０〜３５０５；４６５０〜４６６５；５８１０〜５８２５；６９７０〜６９８５；８１３０〜８１４５；９２９０〜９３０５；１０４０２〜１０４０８；１０５５４；１０５９９〜１０６１２（ＨＳＤ１７Ｂ４／Ｇｎａｓ．１）；配列番号４１４；２３４６〜２３６１；３５０６〜３５２１；４６６６〜４６８１；５８２６〜５８４１；６９８６〜７００１；８１４６〜８１６１；９３０６〜９３２１；１０４０９〜１０４１５；１０５５５；１０６１３〜１０６２６（Ｓｌｃ７ａ３．１／Ｇｎａｓ．１）；配列番号４１５；２３６２〜２３７７；３５２２〜３５３７；４６８２〜４６９７；５８４２〜５８５７；７００２〜７０１７；８１６２〜８１７７；９３２２〜９３３７；１０４１６〜１０４２２；１０５５６；１０６２７〜１０６４０（ＡＴＰ５Ａ１／ＣＡＳＰ．１）；配列番号４１６；２３７８〜２３９３；３５３８〜３５５３；４６９８〜４７１３；５８５８〜５８７３；７０１８〜７０３３；８１７８〜８１９３；９３３８〜９３５３；１０４２３〜１０４２９；１０５５７；１０６４１〜１０６５４（Ｎｄｕｆａ４．１／ＰＳＭＢ３．１）；配列番号４１７；２３９４〜２４０９；３５５４〜３５６９；４７１４〜４７２９；５８７４〜５８８９；７０３４〜７０４９；８１９４〜８２０９；９３５４〜９３６９；１０４３０〜１０４３６；１０５５８；１０６５５〜１０６６８（ＨＳＤ１７Ｂ４／ＰＳＭＢ３．１）；配列番号４１８；２４１０〜２４２５；３５７０〜３５８５；４７３０〜４７４５；５８９０〜５９０５；７０５０〜７０６５；８２１０〜８２２５；９３７０〜９３８５；１０４３７〜１０４４３；１０５５９；１０６６９〜１０６８２（ＲＰＬ３２ｖａｒ／アルブミン７）；配列番号４１９；２４２６〜２４４１；３５８６〜３６０１；４７４６〜４７６１；５９０６〜５９２１；７０６６〜７０８１；８２２６〜８２４１；９３８６〜９４０１；１０４４４〜１０４５０；１０５６０；１０６８３〜１０６９６（３２Ｌ４／アルブミン７）；配列番号４２０；２４４２〜２４５７；３６０２〜３６１７；４７６２〜４７７７；５９２２〜５９３７；７０８２〜７０９７；８２４２〜８２５７；９４０２〜９４１７；１０４５１〜１０４５７；１０５６１；１０６９７〜１０７１０（ＨＳＤ１７Ｂ４／ＣＡＳＰ１．１）；配列番号４２１；２４５８〜２４７３；３６１８〜３６３３；４７７８〜４７９３；５９３８〜５９５３；７０９８〜７１１３；８２５８〜８２７３；９４１８〜９４３３；１０４５８〜１０４６４；１０５６２；１０７１１〜１０７２４（Ｓｌｃ７ａ３．１／ＣＡＳＰ１．１）；配列番号４２２；２４７４〜２４８９；３６３４〜３６４９；４７９４〜４８０９；５９５４〜５９６９；７１１４〜７１２９；８２７４〜８２８９；９４３４〜９４４９；１０４６５〜１０４７１；１０５６３；１０７２５〜１０７３８（Ｓｌｃ７ａ３．１／ＰＳＭＢ３．１）；配列番号４２３；２４９０〜２５０５；３６５０〜３６６５；４８１０〜４８２５；５９７０〜５９８５；７１３０〜７１４５；８２９０〜８３０５；９４５９〜９４５０；１０４７２〜１０４７８；１０５６４；１０７３９〜１０７５２（Ｎｏｓｉｐ．１／ＰＳＭＢ３．１）；配列番号４２４；２５０６〜２５２１；３６６６〜３６８１；４８２６〜４８４１；５９８６〜６００１；７１４６〜７１６１；８３０６〜８３２１；９４６６〜９４８１；１０４７９〜１０４８５；１０５６５；１０７５３〜１０７６６（Ｎｄｕｆａ４．１／ＲＰＳ９．１）；配列番号４２５；２５２２〜２５３７；３６８２〜３６９７；４８４２〜４８５７；６００２〜６０１７；７１６２〜７１７７；８３２２〜８３３７；９４８２〜９４９７；１０４８６〜１０４９２；１０５６６；１０７６７〜１０７８０（ＨＳＤ１７Ｂ４／ＲＰＳ９．１）；配列番号９４９８〜９６０９；１０４９３〜１０４９９；１０５６７；１０７８１〜１０７９４（ＡＴＰ５Ａ１／Ｇｎａｓ．１）；配列番号９６１０〜９７２１；１０５００〜１０５０６；１０５６８；１０７９５〜１０８０８（Ｎｄｕｆａ４．１／ＣＯＸ６Ｂ１．１）；配列番号９７２２〜９８３３；１０５０７〜１０５１３；１０５６９；１０８０９〜１０８２２（Ｎｄｕｆａ４．１／Ｇｎａｓ．１）；配列番号９８３４〜９９４５；１０５１４〜１０５２０；１０５７０；１０８２３〜１０８３６（Ｎｄｕｆａ４．１／Ｎｄｕｆａ１．１）；配列番号９９４６〜１００５７；１０５２１〜１０５２７；１０５７１；１０８３７〜１０８５０（Ｎｏｓｉｐ．１／Ｎｄｕｆａ１．１）；配列番号１００５８〜１０１６９；１０５２８〜１０５３４；１０５７２；１０８５１〜１０８６４（Ｒｐｌ３１．１／Ｇｎａｓ．１）；配列番号１０１７０〜１０２８１；１０５３５〜１０５４１；１０５７３；１０８６５〜１０８７８（ＴＵＢＢ４Ｂ．１／ＲＰＳ９．１）；配列番号１０２８２〜１０３９３；１０５４２〜１０５４８；１０５７４；１０８７９〜１０８９２（Ｕｂｑｌｎ２．１／ＲＰＳ９．１）に係る核酸配列、又は前記配列のいずれかのホモログ、変異体、若しくは断片、特に、これらの配列のいずれかに対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有する核酸配列を含む又はからなる。どの配列番号がどのタンパク質（Ｃａｓ９又はＣｐｆ１）に属するかは、配列表の＜２２３＞の下の「その他の情報」の欄に示されているガイダンスによって当業者には明らかである。ここには、各配列番号が、Ｃｐｆ１変異体ｍＲＮＡ産物又はＣａｓ９変異体ｍＲＮＡ産物のいずれに類似するかが開示されている。
【０３２０】
５’キャップ
本発明の更なる好ましい実施形態によれば、本明細書に定義される改変人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は任意の他の核酸、特にＲＮＡ）は、いわゆる「５’キャップ」構造の付加によって修飾することができ、これにより、本明細書に記載されるように、前記人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は前記他の核酸、特にＲＮＡ）が安定化する。
【０３２１】
５’−キャップは、一般に成熟ｍＲＮＡの５’末端を「キャップ」する実体、典型的には修飾されたヌクレオチド実体である。５’−キャップは、典型的には修飾ヌクレオチド、特にグアニンヌクレオチドの誘導体によって形成され得る。好ましくは、５’−キャップは、５’−５’−トリホスファート結合を介して５’末端に結合する。５’−キャップは、メチル化されていてもよく、例えば、ｍ７ＧｐｐｐＮがある（ここでＮは、５’−キャップを有する核酸の末端５’ヌクレオチド、典型的にはｍＲＮＡの５’末端である）。ｍ７ＧｐｐｐＮは、ポリメラーゼＩＩによって転写されたｍＲＮＡ中に天然に存在するので、この文脈では、修飾ｍＲＮＡ中に含まれる修飾と考えないことが好ましい５’−キャップ構造である。したがって、「修飾された」人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は本明細書に定義される任意の他の核酸、特にＲＮＡ）は、５’−キャップとしてｍ７ＧｐｐｐＮを含むことができるが、これに加えて、前記修飾人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は他の核酸）は、本明細書に定義される少なくとも１つの更なる修飾を含む。
【０３２２】
５’キャップ構造の更なる例としては、グリセリル、反転デオキシ脱塩基残基（部分）、４’，５’メチレンヌクレオチド、１−（ベータ−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド、１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド、Ｌ−ヌクレオチド、アルファ−ヌクレオチド、修飾塩基ヌクレオチド、トレオ−ペントフラノシルヌクレオチド、非環式３’，４’−セコヌクレオチド、非環式３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド、非環式３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、３’−３’−反転ヌクレオチド部分、３’−３’−反転脱塩基部分、３’−２’−反転脱塩基部分、３’−２’−反転脱塩基部分、１，４−ブタンジオールホスファート、３’−ホスホルアミダート、ヘキシルホスファート、アミノヘキシルホスファート、３’−ホスファート、３’−ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、又は架橋若しくは非架橋メチルホスホナート部分が挙げられる。これらの改変５’−キャップ構造は、この文脈において、少なくとも１つの改変とみなされる。
【０３２３】
特に好ましい改変５’−キャップ構造は、ｃａｐ１（ｍ７Ｇの隣接ヌクレオチドのリボースのメチル化）、ｃａｐ２（ｍ７Ｇの下流の２番目のヌクレオチドのリボースの更なるメチル化）、ｃａｐ３（ｍ７Ｇの下流の３番目のリボースの更なるメチル化）、ｃａｐ４（ｍ７Ｇの下流の４番目のヌクレオチドのリボースのメチル化）、ＡＲＣＡ（アンチリバースキャップ類似体、改変ＡＲＣＡ（例えば、ホスホチオアート修飾ＡＲＣＡ）、ＣｌｅａｎＣａｐ（ＴｒｉＬｉｎｋ）、及び／又はＷＯ２０１７０５３２９７Ａ１（参照により本明細書に援用される）に開示されるキャップ構造、イノシン、Ｎ１−メチル−グアノシン、２’−フルオロ−グアノシン、７−デアザ−グアノシン、８−オキソ−グアノシン、２−アミノ−グアノシン、ＬＮＡ−グアノシン、及び２−アジド−グアノシンである。
【０３２４】
好ましい実施形態によれば、人工核酸は、ＲＮＡの５’末端のキャップ構造（ｃａｐ−１）に隣接する第１のヌクレオチドのリボース−２’−Ｏ位置の２’−Ｏ位置にメチル基を含む。典型的には、メチル化は、キャップ２’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼの作用によって達成することができ、ｍ７ＧｐｐｐＮキャップ化人工核酸（好ましくはＲＮＡ）を基質として、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）をメチルドナーとして用い、キャップ化ＲＮＡ（ｃａｐ−０）メチル化してｃａｐ−１構造をもたらす。ｃａｐ−１構造は、ｍＲＮＡ翻訳効率を高めることが報告されており、したがって、本明細書に記載される本発明の人工核酸、好ましくはＲＮＡの発現効率を改善するのに役立ち得る。
【０３２５】
ポリ（Ａ）
更なる好ましい実施形態によれば、本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は本明細書に定義される任意の他の核酸、特にＲＮＡ）は、ポリ（Ａ）配列を含む。
【０３２６】
ポリ（Ａ）テール又は３’−ポリ（Ａ）テールとも呼ばれるポリ（Ａ）配列は、典型的にはアデノシンヌクレオチドの配列、例えば最大約４００個のアデノシンヌクレオチドの配列、例えば約２０〜約４００個、好ましくは約５０〜約４００個、より好ましくは約５０〜約３００個、更により好ましくは約５０〜約２５０個、最も好ましくは約６０〜約２５０個のアデノシンヌクレオチドの配列であると理解される。本明細書中で使用される場合、ポリ（Ａ）配列はまた、約１０〜２００個のアデノシンヌクレオチド、好ましくは約１０〜１００個のアデノシンヌクレオチド、より好ましくは約４０〜８０個のアデノシンヌクレオチド、又は更により好ましくは約５０〜７０個のアデノシンヌクレオチドを含み得る。ポリ（Ａ）配列は、典型的には、ＲＮＡ、特にｍＲＮＡの３’末端に位置する。
【０３２７】
したがって、更なる好ましい実施形態においては、本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は本明細書に定義される任意の他の核酸、特にＲＮＡ）は、その３’末端に、典型的には約１０〜２００個のアデノシンヌクレオチド、好ましくは約１０〜１００個のアデノシンヌクレオチド、より好ましくは約４０〜８０個のアデノシンヌクレオチド、又は更により好ましくは約５０〜７０個のアデノシンヌクレオチドのポリ（Ａ）テールを含む。
【０３２８】
好ましくは、本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は前記他の核酸、特にＲＮＡ）中のポリ（Ａ）配列は、ＲＮＡインビトロ転写によってＤＮＡ鋳型から誘導される。或いは、ポリ（Ａ）配列はまた、必ずしもＤＮＡ前駆体から転写されることなく、一般的な化学合成法によってインビトロで得ることができる。
【０３２９】
更に、ポリ（Ａ）配列、又はポリ（Ａ）テールは、市販のポリアデニル化キット及び当技術分野において公知の対応するプロトコルを使用して、本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は前記他の核酸、特にＲＮＡ）の酵素的ポリアデニル化によって生成され得る。ポリアデニル化は、典型的には、ＲＮＡ分子（例えば未成熟ｍＲＮＡ）などの核酸分子へのポリ（Ａ）配列の付加であると理解される。ポリアデニル化は、いわゆるポリアデニル化シグナルによって誘発され得る。このシグナルは、ポリアデニル化されるｍＲＮＡの３’末端の幾つかのヌクレオチド内に位置することが好ましい。ポリアデニル化シグナルは、典型的には、アデニン及びウラシル／チミンヌクレオチドからなるヘキサマー、好ましくはヘキサマー配列ＡＡＵＡＡＡを含む。他の配列、好ましくはヘキサマー配列も考えられる。ポリアデニル化は、典型的にはプレｍＲＮＡ（未成熟ｍＲＮＡとも呼ばれる）のプロセシング中に生じる。典型的には、（プレｍＲＮＡから成熟ｍＲＮＡへの）ＲＮＡ成熟は、ポリアデニル化の工程を含む。
【０３３０】
したがって、本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は本明細書に定義される任意の他の核酸、特にＲＮＡ）は、特定のタンパク質因子（例えば、切断及びポリアデニル化特異性因子（ＣＰＳＦ）、切断刺激因子（ＣｓｔＦ）、切断因子Ｉ及びＩＩ（ＣＦ  Ｉ及びＣＦ  ＩＩ）、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ（ＰＡＰ））によってポリアデニル化を（転写）ＲＮＡに伝達するポリアデニル化シグナルを含み得る。
【０３３１】
この文脈において、ＮＮ（Ｕ／Ｔ）ＡＮＡコンセンサス配列を含むコンセンサスポリアデニル化シグナルが好ましい。特に好ましい態様においては、ポリアデニル化シグナルは以下の配列のうちの１つを含む：ＡＡ（Ｕ／Ｔ）ＡＡＡ又はＡ（Ｕ／Ｔ）（Ｕ／Ｔ）ＡＡＡ（ここで、ウリジンは通常、ＲＮＡ中に存在し、チミジンは通常、ＤＮＡ中に存在する）。
【０３３２】
ポリ（Ｃ）
更なる好ましい実施形態によれば、本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は本明細書に定義される任意の他の核酸、特にＲＮＡ）は、３’末端に、典型的には約１０〜２００個のシトシンヌクレオチド、好ましくは約１０〜１００個のシトシンヌクレオチド、より好ましくは約２０〜７０個のシトシンヌクレオチド、更により好ましくは約２０〜６０個、更には１０〜４０個のシトシンヌクレオチドのポリ（Ｃ）テールを含む。
【０３３３】
ヒストンステムループ（ＨＳＬ）
幾つかの好ましい実施形態においては、本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は本明細書に定義される任意の他の核酸、特にＲＮＡ）は、ヒストンステムループ（ＨＳＬ）配列／構造を含む。そのようなヒストンステムループ配列は、その開示が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１２／０１９７８０に開示されるヒストンステムループ配列から選択されることが好ましい。
【０３３４】
本発明において用いるのに好適なヒストンステムループ配列は、以下の式（Ｉ）又は（ＩＩ）のうちの少なくとも１つから選択することが好ましい：
式（Ｉ）（ステム境界エレメントを含まないステムループ配列）：
【化１】
2020513824.tif 000032
式（ＩＩ）（ステム境界エレメントを含むステムループ配列）：
【化２】
2020513824.tif 000033
（式中、
ステム１又はステム２の境界エレメントＮ１−６は、１〜６個、好ましくは２〜６個、より好ましくは２〜５個、更により好ましくは３〜５個、最も好ましくは４〜５個、又は５個のＮの連続配列であり、各Ｎは、互いに独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、及びＣから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチド類似体から選択され、
ステム１［Ｎ０−２ＧＮ３−５］は、エレメントステム２に対して逆相補的であるか又は部分的に逆相補的であり、且つ５〜７個のヌクレオチドの連続配列であり、
Ｎ０−２は、０〜２個、好ましくは０〜１個、より好ましくは１個のＮの連続配列であり、各Ｎは、互いに独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、及びＣから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチド類似体から選択され、
Ｎ３−５は、３〜５個、好ましくは４〜５個、より好ましくは４個のＮの連続配列であり、各Ｎは、互いに独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、及びＣから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチド類似体から選択され、
Ｇは、グアノシン又はその類似体であり、任意に、シチジン又はその類似体によって置換されてもよいが、但し、その場合、ステム２におけるその相補的ヌクレオチドであるシチジンも、グアノシンによって置換され、
ループ配列［Ｎ０−４（Ｕ／Ｔ）Ｎ０−４］は、エレメントステム１とステム２との間に位置し、且つ３〜５個のヌクレオチド、より好ましくは４個のヌクレオチドの連続配列であり、
各Ｎ０−４は、互いに独立して、０〜４個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個のＮの連続配列であり、各Ｎは、互いに独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、及びＣから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチド類似体から選択され、
Ｕ／Ｔは、ウリジン又は任意にチミジンを表し、
ステム２［Ｎ３−５ＣＮ０−２］は、エレメントステム１に対して逆相補的であるか又は部分的に逆相補的であり、且つ５〜７個のヌクレオチドの連続配列であり、
Ｎ３−５は、３〜５個、好ましくは４〜５個、より好ましくは４個のＮの連続配列であり、各Ｎは、互いに独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、及びＣから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチド類似体から選択され、
Ｎ０−２は、０〜２個、好ましくは０〜１個、より好ましくは１個のＮの連続配列であり、各Ｎは、互いに独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、若しくはＣから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチド類似体から選択され、
Ｃは、シチジン又はその類似体であり、任意に、グアノシン又はその類似体によって置換されてもよいが、但し、その場合、ステム１におけるその相補的ヌクレオチドであるグアノシンも、シチジンによって置換され、
ステム１及びステム２は、互いに塩基対合して逆相補的配列を形成することができる（前記塩基対合は、例えば、ヌクレオチドＡとＵ／Ｔ若しくはＧとＣとのワトソン−クリック塩基対合、又は非ワトソン−クリック塩基対合（例えば、ゆらぎ塩基対合、逆ワトソン−クリック塩基対合、フーグスティーン塩基対合、逆フーグスティーン塩基対合）によってステム１とステム２との間で生じ得る）か、或いは、互いに塩基対合して部分的に逆相補的な配列を形成することができる（一方のステムにおける１以上の塩基が、他方のステムの逆相補的な配列において相補的塩基を有しないことに基づいて、ステム１とステム２との間で不完全な塩基対合が生じ得る）。
【０３３５】
更なる好ましい実施形態によれば、本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は本明細書に定義される任意の他の核酸、特にＲＮＡ）は、以下の特定の式（Ｉａ）又は（ＩＩａ）の少なくとも１つに係る少なくとも１つのヒストンステムループ（ＨＳＬ）配列を含み得る。
式（Ｉａ）（ステム境界エレメントを含まないステムループ配列）：
【化３】
2020513824.tif 000034
式（ＩＩａ）（ステム境界エレメントを含むステムループ配列）：
【化４】
2020513824.tif 000035
（式中、Ｎ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、及びＵは、上に定義した通りである）。
【０３３６】
更により好ましい実施形態によれば、本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は本明細書に定義される任意の他の核酸、特にＲＮＡ）は、以下の特定の式（Ｉｂ）又は（ＩＩｂ）の少なくとも１つに係る少なくとも１つのヒストンステムループ配列を含み得る。
【化５】
2020513824.tif 000036
式（ＩＩｂ）（ステム境界エレメントを含むステムループ配列）：
【化６】
2020513824.tif 000037
（式中、Ｎ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、及びＵは、上に定義した通りである）。
【０３３７】
特に好ましいヒストンステムループ配列は、配列ＣＡＡＡＧＧＣＴＣＴＴＴＴＣＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡ又はより好ましくは対応するＲＮＡ配列ＣＡＡＡＧＧＣＵＣＵＵＵＵＣＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡである。
【０３３８】
ｍｉＲＮＡ部分
更なる実施形態では、非コード部分、即ち、ｍｉＲＮＡ部分は、本発明の配列と組み合わされる。非コード部分は、以下のリストに開示される１以上からの核酸配列から選択できる：
５’−ＵＴＲ；
３’−ＵＴＲ；
ｍｉＲＮＡ部分；
キャップ；
ポリ（Ｃ）配列；
ヒストンステムループ配列；
ポリ（Ａ）配列又はポリアデニル化シグナル；
ＩＲＥＳ部分；
ヘアピン部分；
ＲＮＡ結合タンパク質のための部分；
３’−５’分解を防ぐ部分；
ＲＮＡ崩壊速度を調節する部分。
【０３３９】
前記したものは、一般的な用語である。これらの一般的な用語に該当する特定の部分も本発明により提供される。特定の実施形態に関する配列を含む、前記リストからの部分の詳細について以下に示す。
【０３４０】
前記リストは、単数形で各項目を示すが、１超のそれぞれの部分を選択されることも同様に可能である。前記リストに含まれない核酸部分も同様に選択できる。好ましくは、少なくとも１つのモジュール又は部分は、前記リストからのものである。
【０３４１】
典型的な実施形態では、少なくとも１つの５’−ＵＴＲ部分及び／又は少なくとも１つの３’−ＵＴＲ部分が選択される。好ましくは、少なくとも１つの５’−ＵＴＲ及び少なくとも１つの３’−ＵＴＲが選択される。
【０３４２】
ｍｉＲＮＡも本発明の部分として選択され得る。当技術分野で知られた任意のｍｉＲＮＡ部分が選択され得る。そのような部分は、マイクロＲＮＡ標的配列、マイクロＲＮＡ配列、又はマイクロＲＮＡシードから選択することができる。例えば、ｍｉＲＮＡ配列（マイクロＲＮＡ標的配列、マイクロＲＮＡ配列、又はマイクロＲＮＡシード）は、ＷＯ２０１５０８５３１８Ａ２、ＵＳ２００５／０２６１２１８、ＵＳ２０１７０２１１０６６、ＷＯ２０１７２０１３３２、ＷＯ２０１７２０１３２８、ＷＯ２０１７２０１３４９、ＷＯ２０１７２０１３４７、ＷＯ２０１７２０１３４８、ＷＯ２０１７２０１３４２、ＷＯ２０１７２０１３４６、ＵＳ２０１６０１７７２９５、ＷＯ２０１４１１３０８９、ＥＰ２９４６０１４、ＷＯ２０１６１００８１２、ＷＯ２０１３１２６８０３、及びＵＳ２００５／００５９００５（前記した全ての文献を参照により本明細書に援用する）に記載される。マイクロＲＮＡ、マイクロＲＮＡ標的領域、及びそれらの発現パターンと生物学における役割の同定が報告されている（Ｂｏｎａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ２０１０  １１  ：９４３−９４９；  Ａｎａｎｄ  ａｎｄ  Ｃｈｅｒｅｓｈ，  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ２０１１，  １８：  １７１−１７６；  Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ  ａｎｄ  Ｒａｏ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ，  ２０１２  ２６：４０４−４１３；  Ｂａｒｒｅｌ，  Ｃｅｌｌ，  ２００９  １３６：２１５−２３３；  Ｌａｎｄｇｒａｆ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ，  ２００７  １２９：  １４０１−１４１４）（前記した全ての文献を参照により本明細書に援用する）。
【０３４３】
一般的に、マイクロＲＮＡ（又はｍｉＲＮＡ）は１９〜２５ヌクレオチド長の非コードＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは、核酸分子の３’−ＵＴＲに結合する。これは、核酸分子の安定性を低下させる、又は翻訳を阻害することにより、遺伝子発現のダウンレギュレーションを引き起こす。本発明のモジュールとして、本発明のポリヌクレオチドは、１以上のマイクロＲＮＡ標的配列、マイクロＲＮＡ配列、又はマイクロＲＮＡシードを含み得る。
【０３４４】
本明細書に使用される「マイクロＲＮＡ部位」という用語は、マイクロＲＮＡが結合する、そうでなければ会合することができるポリヌクレオチド配列を意味する。「結合」は通常、ワトソン−クリックハイブリダイゼーションによって生じる。しかし、マイクロＲＮＡとマイクロＲＮＡ部位又はその近傍の標的配列とのその他の安定した会合も、本発明に係る「マイクロＲＮＡ部位」の概念に含まれる。
【０３４５】
一般に、マイクロＲＮＡ配列は、「シード」領域、即ち典型的には成熟マイクロＲＮＡの位置２〜８の領域にある配列を含む。シード領域配列は、ｍｉＲＮＡの標的配列に対して完全なワトソン−クリック相補性を有する。そのようなマイクロＲＮＡシードは、成熟マイクロＲＮＡの位置２〜８、又は２〜７を含んでもよい。したがって、一実施形態では、マイクロＲＮＡシードは、７ヌクレオチド（例えば、成熟マイクロＲＮＡのヌクレオチド２〜８）を含み、対応するｍｉＲＮＡ標的のシード相補部位は、マイクロＲＮＡ位置１と反対のアデニン（Ａ）に隣接している。別の実施形態では、マイクロＲＮＡシードは６ヌクレオチド（例えば、成熟マイクロＲＮＡのヌクレオチド２〜７）を含み、対応するｍｉＲＮＡ標的のシード相補部位は、マイクロＲＮＡ位置１と反対のアデニン（Ａ）に隣接している。それぞれの核酸モジュールは、Ｇｒｉｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．；  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．  ２００７  Ｊｕｌ  ６；２７（１）：９１−１０５に開示されている。
【０３４６】
本発明において、マイクロＲＮＡ標的配列は、典型的には、３’−ＵＴＲ又はそうでなければオープンリーディングフレームの３’（上流）に含まれるように設計される。このような場合、ｍｉＲＮＡの標的配列は、対象の対応するマイクロＲＮＡが利用可能である限り、分解又は翻訳の低減のために分子を標的とすると考えられる。これにより、本発明の核酸分子の送達時の望ましくないオフターゲット効果を制御することが可能になる。
【０３４７】
肝臓でｍＲＮＡを翻訳することが望ましくないが、ｍＲＮＡが肝臓に輸送されるか、そうでなければそこで終わる場合、本発明のポリヌクレオチドの３’−ＵＴＲ領域にｍｉＲ−１２２の１つ又は複数の標的部位が存在する（例えば、設計される）ならば、肝臓に豊富なマイクロＲＮＡであるｍｉＲ−１２２は、本発明の核酸の発現を阻害できる。異なるマイクロＲＮＡに対する１つ又は複数の結合部位の導入は、ポリヌクレオチドの寿命、安定性、及びタンパク質翻訳に更に影響する（例えば、減少させる）ように設計することができる。対照的に、ｍＲＮＡを翻訳することが実際に望まれる場合、例えば、特定の組織でのタンパク質発現を上昇させるために、マイクロＲＮＡ結合部位をそれらが生じる配列から操作（即ち、除去）することができる。例えば、１以上のｍｉＲ−１２２結合部位を除去して、肝臓でのタンパク質発現を改善することができる。
【０３４８】
それにより、特定の組織での発現の調節は、導入又は除去、又は１つ又は複数のマイクロＲＮＡ結合部位によって達成することができる。例えば、マイクロＲＮＡは、ｍＲＮＡを調節し、それによって、限定するものではないが、肝臓（ｍｉＲ−１２２）、心臓（ｍｉＲ−ｌｄ、ｍｉＲ−１４９）、内皮細胞（ｍｉＲ−１７−９２、ｍｉＲ−１２６）、脂肪組織（ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−３０ｃ）、腎臓（ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−２０４）、骨髄細胞（ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２７）、筋肉（ｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２０８）、及び肺上皮細胞（ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−１２６）でのタンパク質発現を調節することが知られている。マイクロＲＮＡは、血管新生（ｍｉＲ−１３２）などの複雑な生物学的プロセスも制御できる（例えば、Ａｎａｎｄ  ａｎｄ  Ｃｈｅｒｅｓｈ，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｈｅｍａｔｏｌ．  ２０１１，  １８：  １７１−１７６）。
【０３４９】
したがって、一般に、本発明のモジュール設計原理によれば、ポリヌクレオチドの発現を所望の細胞型又は組織、又は関連する生物学的プロセスの状況において調整するために、マイクロＲＮＡの結合部位を除去又は導入することができる。ｍｉＲＮＡ配列と結合部位のリストが公開されている。本明細書で論じられる文献に開示される任意の配列は、本発明の文脈において使用され得る：組織特異的又は疾患特異的遺伝子発現を駆動するマイクロＲＮＡの例は、Ｇｅｔｎｅｒ  ａｎｄ  Ｎａｌｄｉｎｉ，  Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ．  ２０１２，  ８０：３９３−４０３に列挙される。マイクロＲＮＡシード部位の組み込みの例は、ｍｉＲ−１４２部位のＵＧＴ１Ａ１発現レンチウイルスベクターへの組み込みであり、これは、Ｓｃｈｍｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ２０１０；  １３９：９９９−１００７；  Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ａｓｅｑｕｉｎｏｌａｚａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ２０１０，  １３９：７２６−７２９に開示されているように、ウイルス発現ＵＧＴ１Ａ１に対する免疫応答の欠如につながる抗原提示細胞での発現低下を引き起こす。したがって、１以上のｍｉＲ−１４２シード部位をｍＲＮＡに組み込むことは、完全なタンパク質欠乏症の患者（ＵＧＴ１Ａ１  Ｉ型、ＬＤＬＲ欠損患者、ＣＲＩＭ陰性ポンペ患者、など）の治療の場合に重要であると考えられる。それにより、本発明の核酸分子は、そのような目的に適合するように設計することができる。そのようなｍｉＲＮＡ配列のいずれかに対して少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％の同一性を特徴とする任意のポリヌクレオチドを選択することができる。
【０３５０】
異なる細胞型におけるマイクロＲＮＡの異なる発現パターンにより、本発明は、特定の細胞型又は特定の生物学的条件下での標的化発現のためのポリヌクレオチド分子を特異的に設計することを可能にする。組織特異的マイクロＲＮＡ結合部位の導入により、組織内又は生物学的状態の状況でのタンパク質発現のためのポリヌクレオチドを設計できる。
【０３５１】
本発明の一実施形態では、本発明のＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１）をコードする本発明の人工核酸分子は、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９９ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０−５ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−５ｐからなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡ配列を含む。
【０３５２】
構築物
本明細書に定義される少なくとも１つのコード配列を含む本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡは、本明細書に記載される少なくとも１つの５’ＵＴＲ及び少なくとも１つの３’ＵＴＲ、並びに任意に、少なくとも１つのヒストンステムループを含む。
【０３５３】
本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡの３’ＵＴＲ（又は本明細書に定義される任意の他の核酸、特にＲＮＡ）は、本明細書に定義されるポリ（Ａ）及び／又はポリ（Ｃ）配列を更に含み得る。３’ＵＴＲの単一エレメントは、本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡの配列に沿って５’から３’に向かって任意の順で存在し得る。
【０３５４】
更に、本明細書に定義される安定化配列（例えば、グロビン遺伝子のＵＴＲに由来）、ＩＲＥＳ配列などの、本明細書に記載される更なるエレメントも含まれ得る。エレメントのそれぞれは、本発明の人工核酸分子中、好ましくはＲＮＡ中で、少なくとも１回（特にジ−又はマルチシストロン性構築物において）、例えば、２回以上繰り返されてもよい。一例として、単一エレメントは、本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ中に以下の順で存在し得る：
５’−コード配列−ヒストンステムループ−ポリ（Ａ）／（Ｃ）配列−３’；又は
５’−コード配列−ポリ（Ａ）／（Ｃ）配列−ヒストンステムループ−３’；又は
５’−コード配列−ヒストンステムループ−ポリアデニル化シグナル−３’；又は
５’−コード配列−ポリアデニル化シグナル−ヒストンステムループ−３’；又は
５’−コード配列−ヒストンステムループ−ヒストンステムループ−ポリ（Ａ）／（Ｃ）配列−３’；又は
５’−コード配列−ヒストンステムループ−ヒストンステムループ−ポリアデニル化シグナル−３’；又は
５’−コード配列−安定化配列−ポリ（Ａ）／（Ｃ）配列−ヒストンステムループ−３’；又は
５’−コード配列−安定化配列−ポリ（Ａ）／（Ｃ）配列−ポリ（Ａ）／（Ｃ）配列−ヒストンステムループ−３’；など。
【０３５５】
更なる実施形態によれば、人工核酸分子、好ましくはＲＮＡは、好ましくは以下の構造エレメントの少なくとも１つを更に含む：ヒストンステムループ構造（好ましくはその３’非翻訳領域におけるヒストンステムループ）；５’キャップ構造；ポリＡテール；又はポリ（Ｃ）配列。
【０３５６】
幾つかの実施形態によれば、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質に加えて、更なるペプチド又はタンパク質が本明細書に定義される少なくとも１つのコード配列によってコードされる場合、コードされるペプチド又はタンパク質は好ましくはヒストンタンパク質ではなく、レポータータンパク質（例えば、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ、及びその変異体（例えば、ｅＧＦＰ、ＲＦＰ、又はＢＦＰ）ではなく、及び／又はマーカー又は選択タンパク質（例えば、アルファグロビン、ガラクトキナーゼ、及びキサンチン：グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＧＰＴ）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）、ベータ−ガラクトシダーゼ、ガラクトキナーゼ、アルカリホスファターゼ、分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）、又は耐性遺伝子（例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、及びゼオシンに対する耐性遺伝子）ではないことが特に好ましい。好ましい実施形態では、人工核酸分子、好ましくはＲＮＡは、レポーター遺伝子又はマーカー遺伝子をコードしない。好ましい実施形態では、人工核酸分子、好ましくはＲＮＡは、ルシフェラーゼをコードしない。他の実施形態では、人工核酸分子、好ましくはＲＮＡは、ＧＦＰ又はその変異体をコードしない。
【０３５７】
具体的には、本発明に係る人工核酸分子、特にＲＮＡは、好ましくは５’から３’方向に以下のエレメントを含むことができる：
ａ）５’−キャップ構造、好ましくはｍ７ＧｐｐｐＮ又はＣａｐ１；
ｂ）本明細書に定義される５’−ＵＴＲに由来する核酸配列を含む又はからなる、好ましくは配列番号１；３；５；７；９；１１；１３；１５；１７；１９；又は２１に係る核酸配列、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に対応する核酸配列を含む５’−ＵＴＲエレメント；
ｃ）本明細書に定義される少なくとも１つのコード配列；
ｄ）本明細書に定義される３’−ＵＴＲに由来する核酸配列を含む又はからなる、好ましくは配列番号２３；２５；２７；２９；３１；３３又は３５に係る核酸配列、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に対応する核酸配列を含む５’−ＵＴＲエレメント；
ｅ）任意に、ポリ（Ａ）テール、好ましくは１０〜１０００、１０〜５００、１０〜３００、１０〜２００、１０〜１００、４０〜８０、又は５０〜７０個のアデノシンヌクレオチドからなる；
ｆ）任意に、ポリ（Ｃ）テール、好ましくは１０〜２００、１０〜１００、２０〜７０、２０〜６０、又は１０〜４０個のシトシンヌクレオチドからなる；及び
ｇ）任意に、ヒストンステムループ。
【０３５８】
好ましい人工核酸構築物について以下に詳細に記載する。
【０３５９】
ＨＳＤ１７Ｂ４由来５’ＵＴＲエレメント及びＧＮＡＳ由来３’ＵＴＲエレメント：
幾つかの好ましい実施形態では、本発明に係る人工核酸は、ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＧＮＡＳ遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する３’ＵＴＲエレメントを含む又はからなり、前記人工核酸は、配列番号４１３；２３３０〜２３４５；３４９０〜３５０５；４６５０〜４６６５；５８１０〜５８２５；６９７０〜６９８５；８１３０〜８１４５；９２９０〜９３０５；１０４０２〜１０４０８；１０５５４；１０５９９〜１０６１２に係る核酸配列、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片、特に、これらの配列のいずれかに対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有する核酸配列を含む又はからなる。
【０３６０】
ＳＬＣ７Ａ３由来５’ＵＴＲエレメント及びＧＮＡＳ由来３’ＵＴＲエレメント：
幾つかの好ましい実施形態では、本発明に係る人工核酸は、ＳＬＣ７Ａ３遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＧＮＡＳ遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する３’ＵＴＲエレメントを含む又はからなり、前記人工核酸は、配列番号４１４；２３４６〜２３６１；３５０６〜３５２１；４６６６〜４６８１；５８２６〜５８４１；６９８６〜７００１；８１４６〜８１６１；９３０６〜９３２１；１０４０９〜１０４１５；１０５５５；１０６１３〜１０６２６に係る核酸配列、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片、特に、これらの配列のいずれかに対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有する核酸配列を含む又はからなる。
【０３６１】
ＡＴＰ５Ａ１由来５’ＵＴＲエレメント及びＣＡＳＰ１由来３’ＵＴＲエレメント：
幾つかの好ましい実施形態では、本発明に係る人工核酸は、ＡＴＰ５Ａ１遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＣＡＳＰ１遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する３’ＵＴＲエレメントを含む又はからなり、前記人工核酸は、配列番号４１５；２３６２〜２３７７；３５２２〜３５３７；４６８２〜４６９７；５８４２〜５８５７；７００２〜７０１７；８１６２〜８１７７；９３２２〜９３３７；１０４１６〜１０４２２；１０５５６；１０６２７〜１０６４０に係る核酸配列、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片、特に、これらの配列のいずれかに対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有する核酸配列を含む又はからなる。
【０３６２】
ＮＤＵＦＡ４由来５’ＵＴＲエレメント及びＰＳＭＢ３由来３’ＵＴＲエレメント：
幾つかの好ましい実施形態では、本発明に係る人工核酸は、ＮＤＵＦＡ４遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＰＳＭＢ３遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する３’ＵＴＲエレメントを含む又はからなり、前記人工核酸は、配列番号４１６；２３７８〜２３９３；３５３８〜３５５３；４６９８〜４７１３；５８５８〜５８７３；７０１８〜７０３３；８１７８〜８１９３；９３３８〜９３５３；１０４２３〜１０４２９；１０５５７；１０６４１〜１０６５４に係る核酸配列、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片、特に、これらの配列のいずれかに対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有する核酸配列を含む又はからなる。
【０３６３】
ＨＳＤ１７Ｂ４由来５’ＵＴＲエレメント及びＰＳＭＢ３由来３’ＵＴＲエレメント：
幾つかの好ましい実施形態では、本発明に係る人工核酸は、ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＰＳＭＢ３遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する３’ＵＴＲエレメントを含む又はからなり、前記人工核酸は、配列番号４１７；２３９４〜２４０９；３５５４〜３５６９；４７１４〜４７２９；５８７４〜５８８９；７０３４〜７０４９；８１９４〜８２０９；９３５４〜９３６９；１０４３０〜１０４３６；１０５５８；１０６５５〜１０６６８に係る核酸配列、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片、特に、これらの配列のいずれかに対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有する核酸配列を含む又はからなる。
【０３６４】
ＲＰＬ３２由来５’ＵＴＲエレメント及びＡＬＢ由来３’ＵＴＲエレメント：
幾つかの好ましい実施形態では、本発明に係る人工核酸は、ＲＰＬ３２遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＡＬＢ遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する３’ＵＴＲエレメントを含む又はからなり、前記人工核酸は、配列番号４１８；２４１０〜２４２５；３５７０〜３５８５；４７３０〜４７４５；５８９０〜５９０５；７０５０〜７０６５；８２１０〜８２２５；９３７０〜９３８５；１０４３７〜１０４４３；１０５５９；１０６６９〜１０６８２に係る核酸配列、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片、特に、これらの配列のいずれかに対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有する核酸配列を含む又はからなる。
【０３６５】
ＨＳＤ１７Ｂ４由来５’ＵＴＲエレメント及びＣＡＳＰ１由来３’ＵＴＲエレメント：
幾つかの好ましい実施形態では、本発明に係る人工核酸は、ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＣＡＳＰ１遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する３’ＵＴＲエレメントを含む又はからなり、前記人工核酸は、配列番号４２０；２４４２〜２４５７；３６０２〜３６１７；４７６２〜４７７７；５９２２〜５９３７；７０８２〜７０９７；８２４２〜８２５７；９４０２〜９４１７；１０４５１〜１０４５７；１０５６１；１０６９７〜１０７１０に係る核酸配列、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片、特に、これらの配列のいずれかに対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有する核酸配列を含む又はからなる。
【０３６６】
ＳＬＣ７Ａ３由来５’ＵＴＲエレメント及びＣＡＳＰ１由来３’ＵＴＲエレメント：
幾つかの好ましい実施形態では、本発明に係る人工核酸は、ＳＬＣ７Ａ３遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＣＡＳＰ１遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する３’ＵＴＲエレメントを含む又はからなり、前記人工核酸は、配列番号４２１；２４５８〜２４７３；３６１８〜３６３３；４７７８〜４７９３；５９３８〜５９５３；７０９８〜７１１３；８２５８〜８２７３；９４１８〜９４３３；１０４５８〜１０４６４；１０５６２；１０７１１〜１０７２４に係る核酸配列、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片、特に、これらの配列のいずれかに対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有する核酸配列を含む又はからなる。
【０３６７】
ＳＬＣ７Ａ３由来５’ＵＴＲエレメント及びＰＳＭＢ３由来３’ＵＴＲエレメント：
幾つかの好ましい実施形態では、本発明に係る人工核酸は、ＳＬＣ７Ａ３遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＰＳＭＢ３遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する３’ＵＴＲエレメントを含む又はからなり、前記人工核酸は、配列番号４２２；２４７４〜２４８９；３６３４〜３６４９；４７９４〜４８０９；５９５４〜５９６９；７１１４〜７１２９；８２７４〜８２８９；９４３４〜９４４９；１０４６５〜１０４７１；１０５６３；１０７２５〜１０７３８に係る核酸配列、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片、特に、これらの配列のいずれかに対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有する核酸配列を含む又はからなる。
【０３６８】
ＮＯＳＩＰ由来５’ＵＴＲエレメント及びＰＳＭＢ３由来３’ＵＴＲエレメント：
幾つかの好ましい実施形態では、本発明に係る人工核酸は、ＮＯＳＩＰ遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＰＳＭＢ３遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する３’ＵＴＲエレメントを含む又はからなり、前記人工核酸は、配列番号４２３；２４９０〜２５０５；３６５０〜３６６５；４８１０〜４８２５；５９７０〜５９８５；７１３０〜７１４５；８２９０〜８３０５；９４５９〜９４５０；１０４７２〜１０４７８；１０５６４；１０７３９〜１０７５２に係る核酸配列、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片、特に、これらの配列のいずれかに対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有する核酸配列を含む又はからなる。
【０３６９】
ＮＤＵＦＡ４由来５’ＵＴＲエレメント及びＲＰＳ９由来３’ＵＴＲエレメント：
幾つかの好ましい実施形態では、本発明に係る人工核酸は、ＮＤＵＦＡ４遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＲＰＳ９遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する３’ＵＴＲエレメントを含む又はからなり、前記人工核酸は、配列番号４２４；２５０６〜２５２１；３６６６〜３６８１；４８２６〜４８４１；５９８６〜６００１；７１４６〜７１６１；８３０６〜８３２１；９４６６〜９４８１；１０４７９〜１０４８５；１０５６５；１０７５３〜１０７６６に係る核酸配列、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片、特に、これらの配列のいずれかに対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有する核酸配列を含む又はからなる。
【０３７０】
ＨＳＤ１７Ｂ４由来５’ＵＴＲエレメント及びＲＰＳ９由来３’ＵＴＲエレメント：
幾つかの好ましい実施形態では、本発明に係る人工核酸は、ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＲＰＳ９遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する３’ＵＴＲエレメントを含む又はからなり、前記人工核酸は、配列番号４２５；２５２２〜２５３７；３６８２〜３６９７；４８４２〜４８５７；６００２〜６０１７；７１６２〜７１７７；８３２２〜８３３７；９４８２〜９４９７；１０４８６〜１０４９２；１０５６６；１０７６７〜１０７８０に係る核酸配列、又はそのホモログ、変異体、若しくは断片、特に、これらの配列のいずれかに対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、更には９７％の配列同一性を有する核酸配列を含む又はからなる。
【０３７１】
他の好ましい実施形態では、本発明に係る人工核酸は、本明細書に以下に記載される少なくとも１つの５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲエレメント（又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来するもの）を含む又はからなり、前記人工核酸は、特定のＵＴＲの組合せに続く括弧内の配列番号に係る核酸配列を含む又はからなる：
ＡＴＰ５Ａ１／Ｇｎａｓ．１（配列番号９４９８〜９６０９；１０４９３〜１０４９９；１０５６７；１０７８１〜１０７９４）；
Ｎｄｕｆａ４．１／ＣＯＸ６Ｂ１．１（配列番号９６１０〜９７２１；１０５００〜１０５０６；１０５６８；１０７９５〜１０８０８）；
Ｎｄｕｆａ４．１／Ｇｎａｓ．１（配列番号９７２２〜９８３３；１０５０７〜１０５１３；１０５６９；１０８０９〜１０８２２）；
Ｎｄｕｆａ４．１／Ｎｄｕｆａ１．１（配列番号９８３４〜９９４５；１０５１４〜１０５２０；１０５７０；１０８２３〜１０８３６）；
Ｎｏｓｉｐ．１／Ｎｄｕｆａ１．１（配列番号９９４６〜１００５７；１０５２１〜１０５２７；１０５７１；１０８３７〜１０８５０）；
Ｒｐｌ３１．１／Ｇｎａｓ．１（配列番号１００５８〜１０１６９；１０５２８〜１０５３４；１０５７２；１０８５１〜１０８６４）；
ＴＵＢＢ４Ｂ．１／ＲＰＳ９．１（配列番号１０１７０〜１０２８１；１０５３５〜１０５４１；１０５７３；１０８６５〜１０８７８）；
Ｕｂｑｌｎ２．１／ＲＰＳ９．１（配列番号１０２８２〜１０３９３；１０５４２〜１０５４８；１０５７４；１０８７９〜１０８９２）。
他の好ましい実施形態では、本発明の構築物の３’末端は、Ａ６４−Ｃ３０−ＨＳＬ−Ｎ５；Ａ６４−ＨＳＬ−Ｎ５；Ａ６４−Ｎ５；Ａ６４−Ｎ５；Ａ６４−Ｃ５−Ｎ５；Ａ６４−Ｃ５−Ｎ５；Ａ６４−Ｃ１０−Ｎ５；Ａ６４−Ｃ１０−Ｎ５；Ａ６４−Ｃ１５−Ｎ５；Ａ４０−ＨＳＬ−Ａ５０−Ｎ５；ＨＳＬ−Ｎ５；Ａ６４−ＨＳＬ−ＮＲ；Ａ６４−Ｎ５；及びＡ６４−Ｃ１５−Ｎ５からなる群から選択される。
【０３７２】
複合体化
好ましい実施形態では、本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は本明細書に記載される任意の他の核酸）は、複合体化形態、即ち、１以上の（ポリ）カチオン性化合物、好ましくは（ポリ）カチオンポリマー、（ポリ）カチオン性ペプチド又はタンパク質、例えば、プロタミン、（ポリ）カチオン性多糖類及び／又は（ポリ）カチオン性脂質などと複合体化又は会合されて提供される。この文脈においては、用語「複合体化された」又は「会合された」は、少なくとも１つの人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は前記他の核酸）と前記化合物の１以上との、共有結合を介さない、より大きな複合体又はアセンブリへの本質的に安定な組合せを意味する。
【０３７３】
脂質
好ましい実施形態によれば、本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡは、脂質（特に、カチオン性及び／又は中性脂質）と複合体化又は会合し、１以上のリポソーム、リポプレックス、脂質ナノ粒子、又はナノリポソームを形成する。
【０３７４】
したがって、幾つかの実施形態においては、本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ、（医薬）組成物、又はワクチン（又は本明細書に定義される任意の他の核酸、特にＲＮＡ）は、脂質ベース製剤の形態、特に、前記人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は前記他の核酸、特にＲＮＡ）を含むリポソーム、リポプレックス、及び／又は脂質ナノ粒子の形態で提供される。
【０３７５】
脂質ナノ粒子
幾つかの好ましい実施形態によれば、本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は本明細書に定義される他の核酸、特にＲＮＡ）は、脂質（特にカチオン性及び／又は中性脂質）と複合体化又は会合し、１以上の脂質ナノ粒子を形成する。幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子は、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする少なくとも１つの人工核酸分子、及び更に本明細書に記載の少なくとも１つのｇＲＮＡを含む。
【０３７６】
好ましくは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、（ａ）本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は本明細書に定義される他の核酸）、（ｂ）カチオン性脂質、（ｃ）凝集低減剤（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質又はＰＥＧ改変脂質）、（ｄ）任意に、非カチオン性脂質（例えば、中性脂質）、及び（ｅ）任意に、ステロールを含む。
【０３７７】
幾つかの実施形態では、ＬＮＰは、本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は本明細書に定義される任意の他の核酸）に加えて、（ｉ）少なくとも１つのカチオン性脂質；（ｉｉ）中性脂質；（ｉｉｉ）ステロール、例えば、コレステロール；及び（ｉｖ）約２０〜６０％のカチオン性脂質：５〜２５％の中性脂質：２５〜５５％のステロール；０．５〜１５％ＰＥＧ−脂質のモル比のＰＥＧ脂質を含む。
【０３７８】
幾つかの実施形態では、本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は本明細書に定義されて任意の他の核酸）は、アミノアルコールリピドイドに製剤化することができる。本発明にで使用できるアミノアルコールリピドイドは、その全体を参照により本明細書に援用する米国特許第８，４５０，２９８号明細書に記載される方法によって調製することができる。
【０３７９】
（ｉ）カチオン性脂質
ＬＮＰは、脂質ナノ粒子を形成するのに適した任意のカチオン性脂質を含み得る。好ましくは、カチオン性脂質は、ほぼ生理学的ｐＨで正味の正電荷を帯びている。
【０３８０】
カチオン性脂質は、アミノ脂質であり得る。本明細書で使用される場合、用語「アミノ脂質」は、１つ又は２つの脂肪酸又は脂肪アルキル鎖及び生理学的ｐＨでプロトン化してカチオン性脂質を形成し得るアミノヘッド基（アルキルアミノ又はジアルキルアミノ基を含む）を有する脂質を含むことを意味する。
【０３８１】
カチオン性脂質は、例えば、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、１，２−ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパンクロリド（ＤＯＴＡＰ）（Ｎ−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド及び１，２−ジオレイルオキシ−３−トリメチルアミノプロパンクロリド塩としても知られる）、Ｎ−（１−（２，３−）ジオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２−ジ−ｙ−リノレニルオキシ−Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノプロパン（γ−ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルカルバモイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｃ−ＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＡＣ）、１，２−ジリノレイオキシ−３−モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ−ＭＡ）、１，２−ジリノレオイル−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルチオ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｓ−ＤＭＡ）、１−リノレオイル−２−リノレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−２−ＤＭＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ−ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２−ジリノレオイル−３−トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ−ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−（Ｎ−メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ−ＭＰＺ）又は３−（Ｎ，Ｎ−ジリノレイルアミノ）−１，２−プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３−（Ｎ，Ｎ−ジオレイルアミノ）−１，２−プロパンジオ（ＤＯＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキソ−３−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＥＧ−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）又はその類似体、（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニル）テトラヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−アミン、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノアート（ＭＣ３）、１，１’−（２−（４−（２−（（２−（ビス（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２−ヒドロキシ−ドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン−１−イル）エチル−アザンジイル）ジドデカン−２−オール（Ｃ１２−２００）、２，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）、（６Ｚ，９���，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノアート（ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｃ３−ＤＭＡ）、３−（（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３−１−テトラエン−１９−イルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−１−アミン（ＭＣ３エーテル）、４−（（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルブタン−１−アミン（ＭＣ４エーテル）、又はこれらの任意の組合せであることができる。
【０３８２】
他のカチオン性脂質としては、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ、Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、３Ｐ−（Ｎ−（Ｎ’、Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル）コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｉ）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ−２−（スペルミンカルボキサミド）エチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムトリフルオロアセタート（ＤＯＳＰＡ）、ジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン（ＤＯＧＳ）、１，２−ジレオイル−ｓｎ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、Ｎ−（１，２−ジミリスチルオキシプロパン−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、及び２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＸＴＣ）が挙げられるが、これらに限定されない。更に、例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（ＤＯＴＭＡ及びＤＯＰＥなど、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬから入手可能）及びＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（ＤＯＳＰＡ及びＤＯＰＥなど、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬから入手可能）などのカチオン性脂質の市販調製物を使用することができる。
【０３８３】
他の適切なカチオン性脂質は、国際公開第０９／０８６５５８号、国際公開第０９／１２７０６０号、国際公開第１０／０４５４３６号、国際公開第１０／０５４４０６号、国際公開第１０／０８８５３７号、国際公開第１０／１２９７０９号、及び国際公開第２０１１／１５３４９３号；米国特許出願公開第２０１１／０２５６１７５号明細書、米国特許出願公開第２０１２／０１２８７６０号明細書、及び米国特許出願公開第２０１２／００２７８０３号明細書；米国特許第８，１５８，６０１号明細書；Ｌｏｖｅ  ｅｔ  ａｌ，ＰＮＡＳ，１０７（５），１８６４−６９，２０１０に開示されている。
【０３８４】
他の適切なアミノ脂質としては、アルキル置換基が異なるもの（例えば、Ｎ−エチル−Ｎ−メチルアミノ−、及びＮ−プロピル−Ｎ−エチルアミノ−）を含む、代替の脂肪酸基及び他のジアルキルアミノ基を有するものが挙げられる。一般に、飽和度の低いアシル鎖を有するアミノ脂質は、特に、フィルター滅菌の目的で複合体を約０．３ミクロン未満のサイズにしなければならない場合に、より容易にサイズ調整される。Ｃ１４〜Ｃ２２の範囲の炭素鎖長を有する不飽和脂肪酸を含有するアミノ脂質が使用され得る。アミノ基とアミノ脂質の脂肪酸又は脂肪アルキル部分とを分離するために他の足場を使用することもできる。
【０３８５】
幾つか実施形態において、アミノ又はカチオン性脂質は、脂質が生理学的ｐＨ（例えばｐＨ７．４）以下のｐＨで正に帯電し、第２のｐＨ、好ましくは生理学的ｐＨ以上で中性になるように少なくとも１つのプロトン化可能又は脱プロトン化可能基を有する。当然のことながら、ｐＨの関数としてのプロトンの付加又は脱離は平衡プロセスであり、帯電脂質又は中性脂質への言及は、主となる種の性質を意味し、全ての脂質が、帯電又は中性の形で存在することを必要としないと理解される。１超のプロトン化可能基又は脱プロトン化可能基を有する、又は双性イオン性である脂質は、本発明での使用から除外されない。
【０３８６】
幾つか実施形態において、プロトン化可能脂質は、プロトン化可能基のｐＫａが、約４〜約１１、例えば、約５〜約７の範囲である。
【０３８７】
ＬＮＰは、２以上のカチオン性脂質を含み得る。カチオン性脂質は、種々の有利な特性に寄与するように選択することができる。例えば、アミンｐＫａ、化学的安定性、循環中の半減期、組織中の半減期、組織中の正味の蓄積、又は毒性などの性質が異なるカチオン性脂質をＬＮＰに使用することができる。特に、カチオン性脂質は、混合ＬＮＰの特性が個々の脂質の単一ＬＮＰの特性よりも望ましくなるように選択することができる。
【０３８８】
幾つか実施形態において、カチオン性脂質は、ＬＮＰ中に存在する総脂質の約２０モル％〜約７０若しくは７５モル％、又は約４５〜約６５モル％、又は約２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、又は約７０モル％の割合で存在する。更なる実施形態では、ＬＮＰは、カチオン性脂質を、モル基準で約２５％〜約７５％含み、例えば、（脂質ナノ粒子中の脂質の総モル（１００％）に基づく）モル基準で、約２０〜約７０％、約３５〜約６５％、約４５〜約６５％、６０％、約５０％、又は約４０％含む。幾つか実施形態では、核酸に対するカチオン性脂質の比は、約３〜約１５、例えば、約５〜約１３又は約７〜約１１である。
【０３８９】
幾つかの実施形態では、リポソームは、国際公開第２０１３／００６８２５号（参照によりその全体を本明細書に援用する）に記載されているように、カチオン性脂質中の窒素原子の、ＲＮＡ中のリン酸に対するモル比（Ｎ：Ｐ比）が１：１〜２０：１であり得る。他の実施形態では、リポソームは、２０：１超又は１：１未満のＮ：Ｐ比を有し得る。
【０３９０】
幾つかの態様では、脂質は、９８Ｎ１２−５、Ｃ１２−２００、及びｃＫＫ−Ｅ１２からなる群から選択される。一実施形態では、核酸は、アミノアルコールリピドイドに製剤化することができる。本発明において使用され得るアミノアルコールリピドイドは、米国特許第８，４５０，２９８号明細書（参照によりその全体を本明細書に援用する）に記載される方法によって調製することができる。
【０３９１】
別の実施形態では、イオン化可能脂質はまた、国際公開第２０１５／０７４０８５号、米国特許出願第６１／９０５，７２４号明細書及び第１５／６１４，４９９号明細書、国際公開第２０１５０７４０８５号、又は米国特許又は出願第９，５９３，０７７号明細書、第６１／９０５，７２４号明細書、第９，５９３，０７７号明細書、第９，５６７，２９６号明細書、第１５／６１４，４９９号明細書、及び第９，５６７，２９６号明細書（参照によりその全体を本明細書に援用する）に開示される化合物であり得る。
【０３９２】
イオン化可能脂質はまた、国際公開第２０１７／０７５５３１号（参照によりその全体を本明細書に援用する）の表１、２、及び３、並びに請求項１〜２４に開示される化合物であり得る。別の実施形態では、イオン化可能脂質はまた、国際公開第２０１５／０７４０８５号（即ち、ＡＴＸ−００１〜ＡＴＸ−０３２又は請求項１〜２６に記載の化合物）、米国特許出願第６１／９０５，７２４号明細書及び第１５／６１４，４９９号明細書、又は米国特許第９，５９３，０７７号明細書及び第９，５６７，２９６号明細書（参照によりその全体を本明細書に援用する）に開示される化合物であり得る。
【０３９３】
（ｉｉ）中性及び非カチオン性脂質
非カチオン性脂質は、中性脂質、アニオン性脂質、又は両親媒性脂質であり得る。存在する場合、中性脂質は、生理学的ｐＨで非帯電又は中性双性イオン形態のいずれかで存在する任意の数の脂質種であり得る。そのような脂質には、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、セファリン、及びセレブロシドが含まれる。本明細書に記載の粒子における使用のための中性脂質の選択は、一般に、例えば、ＬＮＰサイズ及び血流中でのＬＮＰの安定性を考慮することによって導かれる。好ましくは、中性脂質は、２つのアシル基を有する脂質（例えば、ジアシルホスファチジルコリン及びジアシルホスファチジルエタノールアミン）である。
【０３９４】
幾つか実施形態では、中性脂質は、Ｃ１０〜Ｃ２０の範囲の炭素鎖長を有する飽和脂肪酸を含有する。他の実施形態では、Ｃ１０〜Ｃ２０の範囲の炭素鎖長を有するモノ又はジ不飽和脂肪酸を有する中性脂質が使用される。更に、飽和及び不飽和脂肪酸鎖の混合物を有する中性脂質を使用することができる。
【０３９５】
好適な中性脂質としては、限定されるものではないが、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシラート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジステアロイル−ホスファチジル−エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ＳＭ、１６−０−モノメチルＰＥ、１６−Ｏ−ジメチルＰＥ、１８−１−トランスＰＥ、ｌ−ステアロイル−２−オレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、コレステロール、又はそれらの混合物が挙げられる。ＬＮＰでの使用に適したアニオン性脂質としては、限定されるものではないが、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジル酸、Ｎ−ドデカノイルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−スクシニルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−グルタリルホスファチジルエタノールアミン、リシルホスファチジルグリセロール、及び他のアニオン性修飾基が結合した中性脂質が挙げられる。
【０３９６】
両親媒性脂質は、脂質材料の疎水性部分が疎水性相に向き、親水性部分が水相に向く任意の適切な材料を意味する。そのような化合物としては、限定されるものではないが、リン脂質、アミノ脂質、及びスフィンゴ脂質が挙げられる。代表的なリン脂質としては、スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、又はジリノレオイルホスファチジルコリンが挙げられる。スフィンゴ脂質、グリコスフィンゴ脂質ファミリー、ジアシルグリセロール、及びベータ−アシルオキシ酸などの他のリン欠乏化合物も使用することができる。
【０３９７】
幾つか実施形態では、非カチオン性脂質は、ＬＮＰ中に存在する総脂質の約５モル％〜約９０モル％、約５モル％〜約１０モル％、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、又は約９０モル％の割合で存在する。
【０３９８】
幾つか実施形態では、ＬＮＰは、中性脂質をモル基準で、約０％〜約１５又は４５％、例えば、約３〜約１２％又は約５〜約１０％含む。例えば、ＬＮＰは、（ＬＮＰ中の脂質の総モル（１００％）に基づく）モル基準で、約１５％、約１０％、約７．５％、又は約７．１％の中性脂質を含み得る。
【０３９９】
（ｉｉｉ）ステロール
ステロールは、好ましくはコレステロールである。
ステロールは、ＬＮＰの約１０モル％〜約６０モル％又は約２５モル％〜約４０モル％の割合で存在することができる。幾つか実施形態では、ステロールは、ＬＮＰ中に存在する全脂質の約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、又は約６０モル％の割合で存在する。他の実施形態においては、ＬＮＰは、ステロールをモル基準で、約５％〜約５０％、例えば、（ＬＮＰ中の脂質の総モル（１００％）に基づく）モル基準で、約１５％〜約４５％、約２０％〜約４０％、約４８％、約４０％、約３８．５％、約３５％、約３４．４％、約３１．５％、又は約３１％を含む。
【０４００】
（ｉｖ）凝集低減剤
凝集低減剤は、凝集を低減することができる脂質であることができる。
そのような脂質の例としては、限定されるものではないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾脂質、モノシアロガングリオシドＧｍｌ、及びポリアミドオリゴマー（ＰＡＯ）、例えば、その全体を参照により本明細書に援用する米国特許第６，３２０，０１７号明細書に記載されているものなどが挙げられる。ＰＥＧ、Ｇｍｌ、又はＡＴＴＡのような、処方中の凝集を防ぐ、帯電していない親水性の立体障壁部分を有する他の化合物も脂質に結合することができる。ＡＴＴＡ−脂質は、例えば、米国特許第６，３２０，０１７号明細書に記載されており、ＰＥＧ−脂質コンジュゲートは、例えば、米国特許第５，８２０，８７３号明細書、第５，５３４，４９９号明細書、及び第５，８８５，６１３号明細書に記載されている（これらのそれぞれの全体を参照により本明細書に援用する）。
【０４０１】
凝集低減剤は、例えば、限定するものではないが、ＰＥＧ−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＰＥＧ−ジアルキルグリセロール、ＰＥＧ−ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ−リン脂質、ＰＥＧ−セラミド（Ｃｅｒ）、又はそれらの混合物（ＰＥＧ−Ｃｅｒ１４又はＰＥＧ−Ｃｅｒ２０など）を含むポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−脂質から選択することができる。ＰＥＧ−ＤＡＡコンジュゲートは、例えば、ＰＥＧ−ジラウリルオキシプロピル（Ｃ１２）、ＰＥＧ−ジミリスチルオキシプロピル（Ｃ１４）、ＰＥＧ−ジパルミチルオキシプロピル（Ｃ１６）、又はＰＥＧ−ジステアリルオキシプロピル（Ｃ１８）であり得る。他のペグ化脂質としては、限定するものではないが、ポリエチレングリコール−ジミリストイルグリセロール（Ｃ１４−ＰＥＧ又はＰＥＧ−Ｃ１４、ここで、ＰＥＧは２０００Ｄａの平均分子量を有する）（ＰＥＧ−ＤＭＧ）；（Ｒ）−２，３−ビス（オクタデシルオキシ）プロピル−１−（メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）プロピルカルバマート）（ＰＥＧ−ＤＳＧ）；ＰＥＧ−カルバモイル−１，２−ジミリスチルオキシプロピルアミン、ここで、ＰＥＧは２０００Ｄａの平均分子量を有する（ＰＥＧ−ｃＤＭＡ）；Ｎ−アセチルガラクトサミン−（（Ｒ）−２，３−ビス（オクタデシルオキシ）プロピル−１−（メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）プロピルカルバマート））（ＧａｌＮＡｃ−ＰＥＧ−ＤＳＧ）；ｍＰＥＧ（ｍｗ２０００）−ジアステアロイルホスファチジル−エタノールアミン（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）；及びポリエチレングリコール−ジパルミトイルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＰＧ）が挙げられる。
【０４０２】
幾つか実施形態では、凝集低減剤は、ＰＥＧ−ＤＭＧである。他の実施形態では、凝集低減剤は、ＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡである。
【０４０３】
別の実施形態において、ＰＥＧ脂質はまた、米国特許出願公開第２０１５０３７６１１５号明細書又は国際公開第２０１５１９９９５２号に開示される化合物であってもよく、これらのそれぞれの全体を参照により援用する。
【０４０４】
ＬＮＰ組成
ＬＮＰの組成は、特に、カチオン性脂質成分の選択、カチオン性脂質飽和度、ＰＥＧ化の性質、全成分の比率、及びそのサイズなどの生物物理学的パラメータによって影響され得る。Ｓｅｍｐｌｅらによる１例では（Ｓｅｍｐｌｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ２０１０  ２８：  １７２−１７６；その全体を参照により本明細書に援用する）、ＬＮＰ組成物は、５７．１％のカチオン性脂質、７．１％のジパルミトイルホスファチジルコリン、３４．３％のコレステロール、及び１．４％のＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡから構成された（Ｂａｓｈａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．  ２０１１  １９：２１８６−２２００；その全体を参照により本明細書に援用する）。
【０４０５】
幾つか実施形態では、ＬＮＰは、約３５〜約４５％のカチオン性脂質、約４０％〜約５０％のカチオン性脂質、約５０％〜約６０％のカチオン性脂質、及び／又は約５５％〜約６５％のカチオン性脂質を含み得る。幾つか実施形態では、脂質の核酸に対する比は、約５：１〜約２０：１、約１０：１〜約２５：１、約１５：１〜約３０：１、及び／又は少なくとも３０：１であることができる。
【０４０６】
ＰＥＧ修飾脂質中のＰＥＧ部分の平均分子量は、約５００〜約８，０００ダルトン（例えば、約１，０００〜約４，０００ダルトン）の範囲であり得る。好ましい一実施形態では、ＰＥＧ部分の平均分子量は、約２，０００ダルトンである。
【０４０７】
凝集低減剤の濃度は、ＬＮＰ中の脂質の総モル１００％当たり、約０．１〜約１５モル％の範囲であり得る。幾つか実施形態においては、ＬＮＰは、ＬＮＰ中の脂質の総モルに基づいて、約３、２、又は１モルパーセント未満のＰＥＧ又はＰＥＧ修飾脂質を含む。更なる実施形態では、ＬＮＰは、ＰＥＧ修飾脂質をモル基準で、約０．１％〜約２０％、例えば、（ＬＮＰ中の脂質の総モル（１００％）に基づく）モル基準で、約０．５〜約１０％、約０．５〜約５％、約１０％、約５％、約３．５％、約１．５％、約０．５％、又は約０．３％含む。
【０４０８】
（脂質ナノ粒子中の脂質の総モルに基づく）モル基準で、カチオン性脂質、非カチオン性（又は中性）脂質、ステロール（例えば、コレステロール）、及び凝集低減剤（例えば、ＰＥＧ修飾脂質）を各種モル比で有する各種ＬＮＰを以下の表５に示す。好ましい実施形態では、本発明の脂質ナノ粒子製剤は、モル比で、約２０〜７０％のカチオン性脂質：５〜４５％の中性脂質：２０〜５５％のコレステロール、０．５〜１５％のＰＥＧ修飾脂質、より好ましくは、モル比で、約２０〜６０％のカチオン性脂質：５〜２５％の中性脂質：２５〜５５％のコレステロール：０．５〜１５％のＰＥＧ修飾脂質の脂質混合物から本質的になる。
【０４０９】
【表５】
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【０４１０】
幾つか実施形態において、ＬＮＰは、以下に更に詳細に記載されるように、リポソーム又はリポプレックスとして生じる。
【０４１１】
ＬＮＰサイズ
幾つか実施形態では、ＬＮＰは、約５０ｎｍ〜約３００ｎｍのメジアン径サイズを有し、例えば、約５０ｎｍ〜約２５０ｎｍ、例えば、約５０ｎｍ〜約２００ｎｍのメジアン径サイズを有する。
【０４１２】
幾つか実施形態では、より小さなＬＮＰを使用することができる。そのような粒子は、０．１ｕｍ未満で１００ｎｍまでの直径を有することができ、例えば、限定するものではないが、未満０．１ｕｍ、１．０ｕｍ未満、未満、５ｕｍ未満、１０ｕｍ未満、１５ｕｍ未満、２０ｕｍ未満、２５ｕｍ未満、３０ｕｍ未満、３５ｕｍ未満、４０ｕｍ未満、５０ｕｍ未満、５５ｕｍ未満、未満、６０ｕｍ未満、６５ｕｍ未満、７０ｕｍ未満、７５ｕｍ未満、８０ｕｍ未満、８５ｕｍ未満、９０ｕｍ未満、９５ｕｍ未満、１００ｕｍ未満、１２５ｕｍ未満、１５０ｕｍ未満、１７５ｕｍ未満、２００ｕｍ未満、２２５ｕｍ未満、２５０ｕｍ未満、２７５ｕｍ未満、３００ｕｍ未満、３２５ｕｍ未満、３５０ｕｍ未満、３７５ｕｍ未満、４００ｕｍ未満、４２５ｕｍ未満、４５０ｕｍ未満、４７５ｕｍ未満、５００ｕｍ未満、５２５ｕｍ未満、５５０ｕｍ未満、５７５ｕｍ未満、６００ｕｍ未満、６２５ｕｍ未満、６５０ｕｍ未満、６７５ｕｍ未満、７００ｕｍ未満、７２５ｕｍ未満、７５０ｕｍ未満、７７５ｕｍ未満、８００ｕｍ未満、８２５ｕｍ未満、８５０ｕｍ未満、８７５ｕｍ未満、９００ｕｍ未満、９２５ｕｍ未満、９５０ｕｍ未満、９７５ｕｍ未満である。別の実施形態においては、より小さいＬＮＰを用いて核酸を送達することができ、このＬＮＰは、約１ｎｍ〜約１００ｎｍ、約１ｎｍ〜約１０ｎｍ、約１ｎｍ〜約２０ｎｍ、約１ｎｍ〜約３０ｎｍ、約１ｎｍ〜約４０ｎｍ、約１ｎｍ〜約５０ｎｍ、約１ｎｍ〜約６０ｎｍ、約１ｎｍ〜約７０ｎｍ、約１ｎｍ〜約８０ｎｍ、約１ｎｍ〜約９０ｎｍ、約５ｎｍ〜約１００ｎｍ、約５ｎｍ〜約１０ｎｍ、約５ｎｍ〜約２０ｎｍ、約５ｎｍ〜約３０ｎｍ、約５ｎｍ〜約４０ｎｍ、約５ｎｍ〜約５０ｎｍ、約５ｎｍ〜約６０ｎｍ、約５ｎｍ〜約７０ｎｍ、約５ｎｍ〜約８０ｎｍ、約５ｎｍ〜約９０ｎｍ、約１０〜約５０ｎＭ、約２０〜約５０ｎｍ、約３０〜約５０ｎｍ、約４０〜約５０ｎｍ、約２０〜約６０ｎｍ、約３０〜約６０ｎｍ、約４０〜約６０ｎｍ、約２０〜約７０ｎｍ、約３０〜約７０ｎｍ、約４０〜約７０ｎｍ、約５０〜約７０ｎｍ、約６０〜約７０ｎｍ、約２０〜約８０ｎｍ、約３０〜約８０ｎｍ、約４０〜約８０ｎｍ、約５０〜約８０ｎｍ、約６０〜約８０ｎｍ、約２０〜約９０ｎｍ、約３０〜約９０ｎｍ、約４０〜約９０ｎｍ、約５０〜約９０ｎｍ、約６０〜約９０ｎｍ、及び／又は約７０〜約９０ｎｍの直径を有することができる。
【０４１３】
幾つか実施形態では、ＬＮＰは、１００ｎｍ超、１５０ｎｍ超、２００ｎｍ超、２５０ｎｍ超、３００ｎｍ超、３５０ｎｍ超、４００ｎｍ超、４５０ｎｍ超、５００ｎｍ超、５５０ｎｍ超、６００ｎｍ超、６５０ｎｍ超、７００ｎｍ超、７５０ｎｍ超、８００ｎｍ超、８５０ｎｍ超、９００ｎｍ超、９５０ｎｍ超、又は１０００ｎｍ超の直径を有することができる。
【０４１４】
他の実施形態では、ＬＮＰは、シングルモード粒度分布を有する（即ち、それらは二峰性又は多峰性ではない）。
【０４１５】
他の成分
ＬＮＰは、上記のものに加えて、１以上の脂質及び／又は他の成分を更に含み得る。
【０４１６】
脂質の酸化を防止するため、又はリガンドをリポソーム表面に付着させるためなどの様々な目的のために、他の脂質をリポソーム組成物に含有させることができる。両親媒性、中性、カチオン性、及びアニオン性脂質を含む、任意の多数の脂質がＬＮＰ中に存在し得る。そのような脂質は、単独で又は組み合わせて使用することができる。
【０４１７】
ＬＮＰ中に存在し得る更なる成分としては、ポリアミドオリゴマー（例えば、その全体を参照により本明細書に援用する米国特許第６，３２０，０１７号明細書を参照）、ペプチド、タンパク質、及び洗剤などの二層安定化成分が挙げられる。
【０４１８】
リポソーム
幾つか実施形態では、本発明の組合せの人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は本明細書に定義される任意の他の核酸）は、リポソームとして製剤化される。
【０４１９】
カチオン性脂質ベースのリポソームは、静電的相互作用を介して負に帯電した核酸（例えば、ＲＮＡ）と複合化を形成することができ、生体適合性、低毒性、及びインビボ臨床用途に必要な大規模生産の可能性を提供する複合体をもたらす。リポソームは取り込みのために原形質膜と融合することができる。一旦細胞内に入ると、リポソームはエンドサイトーシス経路を介してプロセシングされ、次いで核酸は、エンドソーム／担体から細胞質内に放出される。リポソームは基本的に生体膜の類似体であり、天然及び合成リン脂質の両方から調製できることから、リポソームはその優れた生体適合性のために薬物送達媒体として長年認識されている（Ｉｎｔ  Ｊ  Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ．  ２０１４；９：  １８３３−１８４３）。
【０４２０】
リポソームは、典型的には、カチオン性、アニオン性、又は中性（ホスホ）脂質と、水性コアを取り囲むコレステロールとから構成することができる脂質二重層からなる。脂質二重層及び水性空間の両方は、それぞれ疎水性又は親水性化合物を組み込むことができる。リポソームは１つ以上の脂質膜を有し得る。リポソームは、ユニラメラと呼ばれる単層、又はマルチラメラと呼ばれる多層であることができる。
【０４２１】
インビボでのリポソームの特徴及び挙動は、親水性ポリマーコーティング（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））をリポソーム表面に加えて、立体安定化を付与することによって改変することができる。更に、リポソームは、リガンド（例えば、抗体、ペプチド、及び炭水化物）をその表面又は結合したＰＥＧ鎖の末端に結合させることによって、特異的標的化に使用することができる（Ｆｒｏｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ２０１５  Ｄｅｃ  １；６：２８６）。
【０４２２】
リポソームは、典型的には、球状小胞として存在し、２０ｎｍから数ミクロンのサイズの範囲であり得る。
【０４２３】
リポソームは、直径が数百ナノメートルであることがあり、狭い水性区画によって分離された一連の同心二重層を含むことがあるマルチラメラ小胞（ＭＬＶ）、直径が５０ｎｍよりも小さいことがある小さい単細胞小胞（ＳＵＶ）、及び直径が５０〜５００ｎｍであることがある大きいユニラメラ小胞（ＬＵＶ）などの異なるサイズのものであり得るが、これらに限定されない。リポソーム設計は、リポソームの不健康な組織への結合を改善するため、又は限定されるものではないが、エンドサイトーシスなどの事象を活性化するために、オプソニン又はリガンドを含み得るが、これらに限定されない。リポソームは、医薬製剤の送達を改善するために低い又は高いｐＨを有し得る。
【０４２４】
非限定的な例として、合成膜小胞などのリポソームは、米国特許出願公開第２０１３０１７７６３８号明細書、第２０１３０１７７６３７号明細書、第２０１３０１７７６３６号明細書、第２０１３０１７７６３５号明細書、第２０１３０１７７６３４号明細書、第２０１３０１７７６３３号明細書、第２０１３０１８３３７５号明細書、第２０１３０１８３３７３号明細書、及び第２０１３０１８３３７２号明細書（これらのそれぞれの内容の全体を参照により本明細書に援用する）に記載された方法、装置、及びデバイスによって製造することができる。本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ、（医薬）組成物、又はキット（又は本明細書に定義される他の核酸、特にＲＮＡ）は、リポソームによってカプセル化されてもよく、及び／又は水性コアに含有された後、リポソームによってカプセル化されてもよい（国際公開第２０１２０３１０４６号、第２０１２０３１０４３号、第２０１２０３０９０１号、及び第２０１２００６３７８号、及び米国特許出願公開第２０１３０１８９３５１号明細書、第２０１３０１９５９６９号明細書、及び第２０１３０２０２６８４号明細書（これらのそれぞれの内容の全体を参照により本明細書に援用する）を参照）。
【０４２５】
幾つか実施形態では、本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は本明細書に定義される任意の他の核酸）は、限定するものではないが、ＤｉＬａ２リポソーム（Ｍａｒｉｎａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ボセル、ＷＡ）、ＳＭＡＲＴＩＣＬＥＳ（登録商標）（Ｍａｒｉｎａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ボセル、ＷＡ）、中性ＤＯＰＣ（ｌ，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）ベースのリポソーム（例えば、卵巣癌に対するｓｉＲＮＡ送達（Ｌａｎｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＆  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２００６  ５（１２）１７０８−１７１３）；全体を参照により本明細書に援用する）ヒアルロナン被覆リポソーム（Ｑｕｉｅｔ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、イスラエル）などのリポソームに製剤化することができる。
【０４２６】
リポプレックス
幾つか実施形態では、本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は本明細書に定義される任意の他の核酸）は、リポプレックス、即ち、核酸の層の間に挟まれたカチオン性脂質二重層として製剤化される。
【０４２７】
ＤＯＴＡＰ、（１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン）及びＤＯＴＭＡ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−アンモニウムメチルサルファート）などのカチオン性脂質は、負に帯電した核酸と複合体又はリポプレックスを形成し、静電気的相互作用によってナノ粒子を形成し、高いインビトロトランスフェクション効率を提供することができる。
【０４２８】
ナノリポソーム
幾つか実施形態では、人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は本明細書に定義される任意の他の核酸）は、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）ベースのナノリポソームなどの中性脂質ベースのナノリポソームとして製剤化される（Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．  ２０１４  Ｆｅｂ；６６：  １１０−１１６．）。
【０４２９】
エマルジョン
幾つか実施形態では、人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は本明細書に定義される任意の他の核酸）は、エマルジョンとして製剤化される。別の実施形態では、前記人工核酸分子、好ましくはＲＮＡは、カチオン性水中油型エマルジョンに製剤化され、エマルジョン粒子は、オイルコアとカチオン性脂質を含み、カチオン性脂質は、核酸と相互作用し、該分子をエマルジョン粒子に固定することができる（国際公開第２０１２００６３８０号を参照；その全体を参照により本明細書に援用する）。幾つか実施形態では、前記人工核酸分子、好ましくはＲＮＡは、親水性相が分散している連続疎水性相を含む油中水型エマルジョンに製剤化される。非限定的な例として、エマルジョンは、国際公開第２０１０８７７９１号に記載される方法によって製造することができ、その内容の全体を参照により本明細書に援用する。
【０４３０】
（ポリ）カチオン化合物及び担体
好ましい実施形態では、本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は本明細書に定義される任意の他の核酸）は、カチオン性又はポリカチオン性化合物（「（ポリ）カチオン性化合物」）及び／又はポリマー担体と複合体化又は会合する。
【０４３１】
「（ポリ）カチオン性化合物」という用語は、典型的には、１〜９のｐＨ値、好ましくは９以下（例えば、５〜９）、８以下（例えば、５〜８）、７以下（例えば、５〜７）のｐＨ値、最も好ましくは生理学的ｐＨ（例えば、７．３〜７．４）で正に帯電する（カチオン）帯電分子を通常意味する。
【０４３２】
したがって、「（ポリ）カチオン性化合物」は、生理学的条件下、特にインビボでの生理学的条件下で正に帯電する任意の正電荷を帯びた化合物又はポリマー、好ましくはカチオン性ペプチド又はタンパク質であり得る。「（ポリ）カチオン性ペプチド又はタンパク質」は、少なくとも１つの正電荷を帯びたアミノ酸、又は１超の正電荷を帯びたアミノ酸（例えば、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、又はＯｒｎから選択される）を含有することができる。
【０４３３】
（ポリ）カチオン性アミノ酸、ペプチド、及びタンパク質
本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は本明細書に定義される任意の他の核酸）のエピトープコードＲＮＡの複合体化又は会合のための特に好ましい剤である（ポリ）カチオン性化合物としては、プロタミン、ヌクレオリン、スペルミン、又はスペルミジン、又は他のカチオン性ペプチド又はタンパク質、例えば、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）、ポリアルギニン、塩基性ポリペプチド、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）（ＨＩＶ結合ペプチドを含む）、ＨＩＶ−１  Ｔａｔ（ＨＩＶ）、Ｔａｔ由来ペプチド、ペネトラチン、ＶＰ２２由来又は類似体ペプチド、ＨＳＶ  ＶＰ２２（単純ヘルペス）、ＭＡＰ、ＫＡＬＡ、又はタンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）、ＰｐＴ６２０、プロリンリッチペプチド、アルギニンリッチペプチド、リジンリッチペプチド、ＭＰＧ−ペプチド、Ｐｅｐ−１、Ｌ−オリゴマー、カルシトニンペプチド、アンテナペディア由来ペプチド（特に、ショウジョウバエアンテナペディア）、ｐＡｎｔｐ、ｐＩｓｌ、ＦＧＦ、ラクトフェリン、トランスポータン、ブフォリン−２、Ｂａｃ７１５−２４、ＳｙｎＢ、ＳｙｎＢ（１）、ｐＶＥＣ、ｈＣＴ由来ペプチド、ＳＡＰ、又はヒストンが挙げられる。
【０４３４】
より好ましくは、本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は本明細書に定義される任意の他の核酸）は、１以上のポリカチオン、好ましくはプロタミン又はオリゴフェクタミン（後述）、最も好ましくはプロタミンと共に複合体化される。この文脈においては、プロタミンが特に好ましい。
【０４３５】
更に、好ましい（ポリ）カチオン性タンパク質又はペプチドは、以下の合計式（ＩＩＩ）を有する以下のタンパク質又はペプチドから選択することができる。
（Ａｒｇ）ｌ；（Ｌｙｓ）ｍ；（Ｈｉｓ）ｎ；（Ｏｒｎ）ｏ；（Ｘａａ）ｘ
（式（ＩＩＩ））
式中、ｌ＋ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｘ＝８〜１５であり、ｌ、ｍ、ｎ又はｏは、互いに独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５から選択される任意の数であるが、但し、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ及びＯｒｎの全体含量がオリゴペプチドの全アミノ酸の少なくとも５０％を表し；Ｘａａは、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ又はＯｒｎを除くネイティブの（＝天然）又は非ネイティブのアミノ酸から選択される任意のアミノ酸であってよく；ｘは、０、１、２、３又は４から選択される任意の数であってよいが、但し、Ｘａａの全体含量がオリゴペプチドの全アミノ酸の５０％を超えない）を有する以下のタンパク質又はペプチドから選択してよい。この状況において特に好ましいカチオン性ペプチドは、例えば、Ａｒｇ７、Ａｒｇ８、Ａｒｇ９、Ｈ３Ｒ９、Ｒ９Ｈ３、Ｈ３Ｒ９Ｈ３、ＹＳＳＲ９ＳＳＹ、（ＲＫＨ）４、及びＹ（ＲＫＨ）２Ｒなどである。この文脈において、国際公開第２００９／０３０４８１号の開示を参照により本明細書に援用する。
【０４３６】
（ポリ）カチオン性多糖類
本発明の組合せ、（医薬）組成物、又はワクチンのエピトープコードＲＮＡ（又は本明細書に定義される任意の他の核酸、特にＲＮＡ）の複合体化又は会合のための更なる好ましい（ポリ）カチオン性化合物としては、カチオン性多糖類、例えば、キトサン、ポリブレン、カチオン性ポリマー、例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などが挙げられる。
【０４３７】
（ポリ）カチオン性脂質
本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は本明細書に定義される任意の他の核酸）の複合体化又は会合のための更なる好ましい（ポリ）カチオン性化合物としては、例えば、ＤＯＴＭＡ：［１−（２，３−シオレイルオキシ）プロピル）］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド、ＤＭＲＩＥ、ジ−Ｃ１４−アミジン、ＤＯＴＩＭ、ＳＡＩＮＴ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＢＧＴＣ、ＣＴＡＰ、ＤＯＰＣ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＰＥ：ジオレイルホスファチジルエタノール−アミン、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＤＡＢ、ＤＯＩＣ、ＤＭＥＰＣ、ＤＯＧＳ：ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン、ＤＩＭＲＩ：ジミリスト−オキシプロピルジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド、ＤＯＴＡＰ：ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン、ＤＣ−６−１４：Ｏ，Ｏ−ジテトラデカノイル−Ｎ−（アルファ−トリメチルアンモニオアセチル）ジエタノールアミンクロリド、ＣＬＩＰ１：ｒａｃ−［（２，３）−ジオクタデシルオキシプロピル）（２−ヒドロキシエチル）］−ジメチルアンモニウムクロリド、ＣＬＩＰ６：ｒａｃ−［２（２，３−ジヘキサデシルオキシプロピル−オキシメチルオキシ）エチル］トリメチルアンモニウム、ＣＬＩＰ９：ｒａｃ−［２（２，３−ジヘキサデシルオキシプロピル−オキシスクシニルオキシ）エチル］−トリメチルアンモニウム、又はオリゴフェクタミンなどのカチオン性脂質が挙げられる。
【０４３８】
（ポリ）カチオン性ポリマー
本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は本明細書に定義される任意の他の核酸）のエピトープコードＲＮＡの複合体化又は会合のための更なる好ましい（ポリ）カチオン性化合物としては、（ポリ）カチオン性ポリマー、例えば、変性ポリアミノ酸（例えば、ベータ−アミノ酸−ポリマー又は逆ポリアミドなど）、変性ポリエチレン（例えば、ＰＶＰ（ポリ（Ｎ−エチル−４−ビニルピリジニウムブロミド））など、変性アクリラート（例えば、ｐＤＭＡＥＭＡ（ポリ（ジメチルアミノエチルメチルアクリラート））など、変性アミドアミン（例えば、ｐＡＭＡＭ（ポリ（アミドアミン））など、変性ポリベータアミノエステル（ＰＢＡＥ）（例えば、ジアミン末端変性１，４−ブタンジオールジアクリラート−ｃｏ−５−アミノ−１−ペンタノールポリマーなど、デンドリマー（例えば、ポリプロピレンアミンデンドリマー又はｐＡＭＡＭベースデンドリマーなど）、ポリイミン（例えば、ＰＥＩ：ポリ（エチレンイミン）、ポリ（プロピレンイミン））など、ポリアリルアミン、糖骨格ベースポリマー（例えば、シクロデキストリン系ポリマー、デキストラン系ポリマー、キトサンなど）、シラン骨格系ポリマー（例えば、ＰＭＯＸＡ−ＰＤＭＳコポリマー）など、又は１以上のカチオン性ブロック（例えば、前記したカチオン性ポリマーから選択される）と１以上の親水性又は疎水性ブロック（例えば、ポリエチレングリコール）との組合せからなるブロックポリマーが挙げられる。
【０４３９】
ポリマー担体
好ましい実施形態によれば、本発明の組合せ、（医薬）組成物、又はワクチンのエピトープコードＲＮＡ（又は本明細書に定義される任意の他の核酸、特にＲＮＡ）は、ポリマー担体と複合体化又は会合する。
【０４４０】
本発明にしたがって使用される「ポリマー担体」は、ジスルフィド架橋カチオン性成分によって形成されるポリマー担体であり得る。ジスルフィド架橋カチオン性成分は、互いに同一でも異なっていてもよい。ポリマー担体はまた、更なる成分を含み得る。
【０４４１】
本発明にしたがって使用されるポリマー担体は、カチオン性ペプチド、タンパク質又はポリマーと、任意に、本明細書に記載されるジスルフィド結合によって架橋される本明細書に定義される更なる成分との混合物を含むことも特に好ましい。この文脈においては、国際公開第２０１２／０１３３２６号の開示を参照により本明細書に援用する。
【０４４２】
この文脈においては、ジスルフィド架橋によってポリマー担体の基礎を形成するカチオン性成分は、通常、この目的に適した任意の適切な（ポリ）カチオン性ペプチド、タンパク質、又はポリマー、特に、本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は本明細書に定義される任意の他の核酸）と複合体化でき、それによって好ましくは縮合できる任意の（ポリ）カチオン性ペプチド、タンパク質、又はポリマーから選択される。（ポリ）カチオン性ペプチド、タンパク質、又はポリマーは、好ましくは線状分子であるが、分枝状（ポリ）カチオン性ペプチド、タンパク質、又はポリマーもまた使用され得る。
【０４４３】
人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は任意の他の核酸）を複合体化するために使用され得るポリマー担体のジスルフィド架橋（ポリ）カチオン性タンパク質、ペプチド、又はポリマーはいずれも、少なくとも１つの−ＳＨ部分、最も好ましくは少なくとも１つのシステイン残基、又は、本明細書に記載されるポリマー担体のカチオン成分として少なくとも１つの更なる（ポリ）カチオン性タンパク質、ペプチド、又はポリマーとの縮合時にジスルフィド結合を形成することができる−ＳＨ部分を示す任意の更なる化学基を含む。
【０４４４】
上に定義したように、本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は本明細書に定義される任意の他の核酸）のエピトープコードＲＮＡを複合体化するために使用できるポリマー担体は、ジスルフィド架橋カチオン性（又はポリカチオン性）成分によって形成され得る。好ましくは、少なくとも１つの−ＳＨ部分を含む又は含むように更に修飾されている、ポリマー担体のそのような（ポリ）カチオン性ペプチド又はタンパク質又はポリマーは、本明細書に定義されるタンパク質、ペプチド、及びポリマーから選択される。
【０４４５】
幾つか実施形態では、ポリマー担体は、一般式（ＩＶ）に係るポリマー担体分子から選択することができる。
Ｌ−Ｐ１−Ｓ−［Ｓ−Ｐ２−Ｓ］ｎ−Ｓ−Ｐ３−Ｌ          式（ＩＶ）
式中
Ｐ１及びＰ３は、互いに異なるか又は同一であり、直鎖状又は分枝状の親水性ポリマー鎖を表し、各々のＰ１及びＰ３は、成分Ｐ２との縮合により、或いは、（ＡＡ）、（ＡＡ）ｘ又は［（ＡＡ）ｘ］ｚ（そのような成分がＰ１及びＰ２又はＰ３及びＰ２の間のリンカーとして使用される場合）、及び／又は更なる成分（例えば、（ＡＡ）、（ＡＡ）ｘ、［（ＡＡ）ｘ］ｚ又はＬ）との縮合によりジスルフィド結合を形成可能な、少なくとも１つの−ＳＨ部分を提示し、前記直鎖状又は分枝状の親水性ポリマー鎖は、互いに独立して、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ−Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド、ポリ−２−（メタクリロイルオキシ）エチルホスホリルコリン、ポリ（ヒドロキシアルキルＬ−アスパラギン）、ポリ（２−（メタクリロイルオキシ）エチルホスホリルコリン）、ヒドロキシエチルデンプン、又はポリ（ヒドロキシアルキルＬ−グルタミン）から選択され、ここで、前記親水性ポリマー鎖は、約１ｋＤａ〜約１００ｋＤａ、好ましくは約２ｋＤａ〜約２５ｋＤａ、より好ましくは約２ｋＤａ〜約１０ｋＤａ、例えば約５ｋＤａ〜約２５ｋＤａ又は５ｋＤａ〜約１０ｋＤａの分子量を示し、
Ｐ２は、例えば、ジスルフィド架橋カチオン性成分によって形成されるポリマー担体について上で定義される、好ましくは約３〜１００アミノ酸長を有し、より好ましくは約３〜約５０アミノ酸長を有し、更により好ましくは約３〜約２５アミノ酸長、例えば約３〜１０アミノ酸長、５〜１５アミノ酸長、１０〜２０アミノ酸長又は１５〜２５アミノ酸長、より好ましくは約５〜２０アミノ酸長、及び更により好ましくは約１０〜約２０アミノ酸長を有する（ポリ）カチオン性のペプチド又はタンパク質である、又は、
Ｐ２は、例えば、ジスルフィド架橋カチオン性成分によって形成されるポリマー担体について上で定義される、典型的には、約１ｋＤａ〜約２０ｋＤａ、更に好ましくは約１．５ｋＤａ〜約１０ｋＤａの分子量を含む約０．５ｋＤａ〜約３０ｋＤａの分子量を有する、又は、約１０ｋＤａ〜約５０ｋＤａ、更に好ましくは約１０ｋＤａ〜約３０ｋＤａの分子量を含む約０．５ｋＤａ〜約１００ｋＤａの分子量を有する（ポリ）カチオン性のペプチド又はタンパク質であり、
各Ｐ２は、更なる成分Ｐ２、又は成分Ｐ１及び／又は成分Ｐ３と、或いは代替的に更なる成分（例えば、（ＡＡ）、（ＡＡ）ｘ、又は［（ＡＡ）ｘ］ｚ）との縮合によりジスルフィド結合を形成可能な少なくとも２つの−ＳＨ部分を提示し、
−Ｓ−Ｓ−は、（可逆の）ジスルフィド結合（読み易くするために括弧は省略されている）であり、ここで、Ｓは、好ましくは、硫黄、又は（可逆の）ジスルフィド結合を形成した−ＳＨ担持部分を表す。前記（可逆の）ジスルフィド結合は、好ましくは、成分Ｐ１及びＰ２、Ｐ２及びＰ２、又はＰ２及びＰ３、或いは任意に本明細書で定義する更なる成分（例えば、Ｌ、（ＡＡ）、（ＡＡ）ｘ、［（ＡＡ）ｘ］ｚなど）のいずれかの−ＳＨ部分の縮合により形成され、前記−ＳＨ部分は、これらの成分の構造の一部であるか、又は以下で定義する修飾によって付加されてもよく、
Ｌは、存在してもしなくてもよい任意のリガンドであり、互いに独立して、ＲＧＤ、トランスフェリン、葉酸、シグナルペプチド又はシグナル配列、局在化シグナル又は局在化配列、核酸局在化シグナル又は核酸局在化配列（ＮＬＳ）、抗体、細胞透過性ペプチド（例えば、ＴＡＴ、又はＫＡＬＡ）、受容体のリガンド（例えば、サイトカイン、ホルモン、成長因子など）、低分子（例えば、マンノース、ガラクトース、又は合成リガンドなどの炭水化物）、低分子アゴニスト、受容体の阻害剤又はアンタゴニスト（例えば、ＲＧＤペプチド模倣薬類似体）、又は本明細書に定義する任意の更なるタンパク質から選択することができ、
ｎは、典型的には、例えば、約４〜９、４〜１０、３〜２０、４〜２０、５〜２０又は１０〜２０の範囲、約３〜１５、４〜１５、５〜１５又は１０〜１５の範囲、或いは約６〜１１又は７〜１０の範囲を含む、約１〜５０の範囲、好ましくは約１、２又は３〜３０の範囲、より好ましくは約１、２、３、４又は５〜２５の範囲、約１、２、３、４又は５〜２０の範囲、約１、２、３、４又は５〜１５の範囲、又は約１、２、３、４又は５〜１０の範囲から選択される整数である。最も好ましくは、ｎは、約１、２、３、４又は５〜１０の範囲、より好ましくは約１、２、３又は４〜９の範囲、約１、２、３又は４〜８の範囲、又は約１、２又は３〜７の範囲である。
【０４４６】
この文脈において、国際公開第２０１１／０２６６４１号の開示を、参照により本明細書に援用する。親水性ポリマーＰ１及びＰ３のそれぞれは、典型的には、少なくとも１つの−ＳＨ−部分を示し、ここで少なくとも１つの−ＳＨ−部分は、成分Ｐ２又は成分（ＡＡ）若しくは（ＡＡ）ｘ（以下に定義されるように、Ｐ１及びＰ２又はＰ３及びＰ２の間のリンカーとして使用される場合）及び任意に更なる成分（例えば、Ｌ及び／又は（ＡＡ）若しくは（ＡＡ）ｘ）（例えば、２つ以上の−ＳＨ−部分が含まれる場合）との反応でジスルフィド結合を形成することができる。前記一般式（ＩＶ）に包含される次の下位式「Ｐ１−Ｓ−Ｓ−Ｐ２」及び「Ｐ２−Ｓ−Ｓ−Ｐ３」（読み易くするために括弧は省略されている）（式中、Ｓ、Ｐ１、及びＰ３はいずれも本明細書で定義した通りであり、典型的には、状況（ｓｉｔｕａｔｉｏｎ）を表し、親水性ポリマーＰ１及びＰ３の一方の−ＳＨ−部分が前記一般式（ＩＶ）の成分Ｐ２の一方の−ＳＨ−部分と縮合しており、これらの−ＳＨ−部分の両方の硫黄が、本明細書において式（ＩＶ）に定義されている通りジスルフィド結合−Ｓ−Ｓ−を形成する。これらの−ＳＨ−部分は、典型的には、親水性ポリマーＰ１及びＰ３のそれぞれによって、例えば、内部システイン、又は他の（修飾された）アミノ酸、或いは−ＳＨ部分を有する化合物を介して提供される。したがって、下位式「Ｐ１−Ｓ−Ｓ−Ｐ２」及び「Ｐ２−Ｓ−Ｓ−Ｐ３」は、−ＳＨ−部分がシステインによって提供される場合、「Ｐ１−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐ２」及び「Ｐ２−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐ３」と表記することもでき、ここで、Ｃｙｓ−Ｃｙｓという用語は、ペプチド結合ではなくジスルフィド結合を介して結合した２つのシステインを表す。この場合、これらの式中の用語「−Ｓ−Ｓ−」もまた、「−Ｓ−Ｃｙｓ」、「−Ｃｙｓ−Ｓ」、又は「−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−」と表記することがある。これに関連して、用語「−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−」は、ペプチド結合ではなく、ジスルフィド結合を形成するためのそれらの−ＳＨ−部分を介した２つのシステインの結合を表す。したがって、用語「−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−」はまた、通常「−（Ｃｙｓ−Ｓ）−（Ｓ−Ｃｙｓ）−」として理解することもでき、この特定の場合においては、Ｓは、システインの−ＳＨ−部分の硫黄を示す。同様に、用語「−Ｓ−Ｃｙｓ」及び「−Ｃｙｓ−Ｓ」は、−ＳＨ含有部分とシステインとの間のジスルフィド結合を示し、これはまた、「−Ｓ−（Ｓ−Ｃｙｓ）」及び「−（Ｃｙｓ−Ｓ）−Ｓ」と表記するもできる。或いは、親水性ポリマーＰ１及びＰ３は、親水性ポリマーＰ１及びＰ３のそれぞれが少なくとも１つのそのような−ＳＨ部分を有するように、好ましくは−ＳＨ部分を有する化合物との化学反応を介して−ＳＨ部分で修飾され得る。−ＳＨ部分を有するそのような化合物は、例えば、−ＳＨ部分を有する（追加の）システイン又は任意の更なる（修飾された）アミノ酸であり得る。そのような化合物はまた、本明細書で定義されるように親水性ポリマーＰ１及びＰ３に−ＳＨ部分を含有させる又は導入することを可能にする任意の非アミノ化合物又は部分であり得る。そのような非アミノ化合物は、化学反応又は化合物の結合を介して本発明に係るポリマー担体の式（ＩＶ）の親水性ポリマーＰ１及びＰ３に結合することができ、例えば、３−チオプロピオン酸又はチオモランの結合、アミド形成（例えば、カルボン酸、スルホン酸、アミンなど）、マイケル付加（例えば、マレインイミド部分、α、β−不飽和カルボニル、など）、クリック化学（例えば、アジド又はアルキン）、アルケン／アルキンメタセシス（例えば、アルケン又はアルキン）、イミン又はヒドラゾン形成（アルデヒド又はケトン、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、アミン）、複合体形成反応（アビジン、ビオチン、プロテインＧ）、又はＳｎ型置換反応を許容する化合物（例えば、ハロゲン化アルカン、チオール、アルコール、アミン、ヒドラジン、ヒドラジド、スルホン酸エステル、オキシホスホニウム塩）又は更なる成分の連結に利用できる他の化学的部分によって結合することができる。この文脈において特に好ましいＰＥＧ誘導体は、アルファ−メトキシ−オメガ−メルカプトポリ（エチレングリコール）である。それぞれの場合において、例えばシステイン又は任意の更なる（修飾）アミノ酸又は化合物のＳＨ部分は、親水性ポリマーＰ１及びＰ３の任意の位置の末端又は内部に存在していてもよい。本明細書で定義するように、各々の親水性ポリマーＰ１及びＰ３は、典型的には、好ましくは１つの末端における少なくとも１つの−ＳＨ部分を提示するが、２つ又はそれ以上の−ＳＨ部分を含んでいてもよく、これらは、本明細書で定義する更なる成分、好ましくは、更なる機能性ペプチド又はタンパク質、例えばリガンド、アミノ酸成分（ＡＡ）又は（ＡＡ）ｘ、抗体、細胞透過性ペプチド又はエンハンサーペプチド（例えば、ＴＡＴ、ＫＡＬＡ）などを追加で付加するために使用されてもよい。
【０４４７】
重量比とＮ／Ｐ比
本発明の幾つかの実施形態では、人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は前記他の核酸）は、（ポリ）カチオン性化合物又はポリマー担体と、任意に、核酸の（ポリ）カチオン性化合物及び／又はポリマー担体に対する重量比として約６：１（ｗ／ｗ）〜約０．２５：１（ｗ／ｗ）、より好ましくは約５：１（ｗ／ｗ）〜約０．５：１（ｗ／ｗ）、更により好ましくは約４：１（ｗ／ｗ）〜約１：１（ｗ／ｗ）又は約３：１（ｗ／ｗ）〜約１：１（ｗ／ｗ）、最も好ましくは約３：１（ｗ／ｗ）〜約２：１（ｗ／ｗ）の範囲から選択される重量比で、又は任意に、核酸の（ポリ）カチオン性化合物及び／又はポリマー担体に対する窒素／ホスファート（Ｎ／Ｐ）比として約０．１〜１０の範囲、好ましくは約０．３〜４又は０．３〜１、最も好ましくは約０．５〜１又は０．７〜１の範囲、更に最も好ましくは約０．３〜０．９又は０．５〜０．９の範囲で会合又は複合体化される。より好ましくは、少なくとも１つの人工核酸分子、好ましくはＲＮＡの１以上のポリカチオンに対するＮ／Ｐ比は、約０．１〜１０の範囲であり、約０．３〜４、約０．５〜２、約０．７〜２、及び約０．７〜１．５の範囲を含む。
【０４４８】
本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ（又は本明細書に定義される任意の他の核酸）はまた、人工核酸分子、好ましくはＲＮＡのトランスフェクション効率を高めるためのビヒクル、トランスフェクション、又は複合体化剤と会合し得る。
【０４４９】
この文脈において、本発明の（医薬）組成物は、（ポリ）カチオン性化合物及び／又はポリマー担体、好ましくはカチオン性タンパク質又はペプチドと少なくとも部分的に複合体を形成する人工核酸分子、好ましくはＲＮＡを含むことが特に好ましい。この文脈において、国際公開第２０１０／０３７５３９号及び第２０１２／１１３５１３号の開示を、参照により本明細書に援用する。「部分的に」とは、前記人工核酸分子、好ましくはＲＮＡの一部のみが（ポリ）カチオン性化合物及び／又はポリマー担体と複合体を形成し、前記人工核酸分子、好ましくはＲＮＡの残りの部分は、複合体を形成しない形態で存在する（「遊離」）ことを意味する。
【０４５０】
好ましくは、複合体化された人工核酸分子、好ましくはＲＮＡの、遊離の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡに対するモル比は、約１：１の比を含む約０．００１：１〜約１：０．００１のモル比から選択される。より好ましくは、複合体化された人工核酸分子、好ましくはＲＮＡの、遊離の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡに対するモル比は、約５：１（ｗ／ｗ）〜約１：１０（ｗ／ｗ）の範囲、より好ましくは約４：１（ｗ／ｗ）〜約１：８（ｗ／ｗ）、更により好ましくは約３：１（ｗ／ｗ）〜約１：５（ｗ／ｗ）又は１：３（ｗ／ｗ）の範囲から選択され、最も好ましくは、複合体化された人工核酸分子、好ましくはＲＮＡの、遊離の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡに対するモル比は、約１：１（ｗ／ｗ）の比から選択される。
【０４５１】
本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡは、好ましくは第１の工程にしたがって、人工核酸分子、好ましくはＲＮＡを、好ましくは本明細書に定義される（ポリ）カチオン性化合物及び／又はポリマー担体と、安定な複合体を形成するための特定の比率で複合体化させることにより調製する。これに関連して、前記人工核酸分子、好ましくはＲＮＡを複合体化した後の複合体化された人工核酸分子、好ましくはＲＮＡの画分中に、遊離の（ポリ）カチオン性化合物若しくはポリマー担体が存在しない、又は無視できる程度に僅かな量しか残らないことが非常に好ましい。したがって、複合体化された人工核酸分子、好ましくはＲＮＡの画分中の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ及び（ポリ）カチオン性化合物及び／又はポリマー担体の比率は、典型的には、人工核酸分子、好ましくはＲＮＡが完全に複合体化され、前記画分中に遊離の（ポリ）カチオン性化合物若しくはポリマー担体が存在しない、又は無視できる程度に僅かな量しか残らないような範囲で選択される。
【０４５２】
好ましくは、本明細書に定義される人工核酸分子、好ましくはＲＮＡの、好ましくは本明細書に定義される（ポリ）カチオン性化合物及び／又はポリマー担体に対する比は、約６：１（ｗ／ｗ）〜０．２５：１（ｗ／ｗ）、より好ましくは約５：１（ｗ／ｗ）〜約０．５：１（ｗ／ｗ）、更により好ましくは約４：１（ｗ／ｗ）〜約１：１（ｗ／ｗ）又は約３：１（ｗ／ｗ）〜約１：１（ｗ／ｗ）の範囲から選択され、最も好ましくは約３：１（ｗ／ｗ）〜約２：１の比である。
【０４５３】
或いは、本明細書に定義される人工核酸分子、好ましくはＲＮＡの、（ポリ）カチオン性化合物及び／又はポリマー担体に対する比はまた、複合体全体の窒素／ホスファート比（Ｎ／Ｐ比）に基づき計算することがもできる。本発明の文脈において、Ｎ／Ｐ比は、複合体中の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡの（ポリ）カチオン性化合物及び／又はポリマー担体（好ましくは本明細書に定義されるもの）に対する比に関して、好ましくは約０．１〜１０の範囲、好ましくは約０．３〜４の範囲、最も好ましくは約０．５〜２又は０．７〜２の範囲であり、最も好ましくは約０．７〜１．５、０．５〜１、又は０．７〜１の範囲、更に最も好ましくは約０．３〜０．９又は０．５〜０．９の範囲であり、ただし、複合体中の（ポリ）カチオン性化合物は、（ポリ）カチオン性タンパク質又はペプチド、及び／又は上で定義したポリマー担体であることが好ましい。
【０４５４】
他の実施形態では、本明細書に定義される本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡは、更なるビヒクル、トランスフェクション、又は複合体化剤と会合されることなく、遊離又はネイキッドの形態で提供され、使用され得る。
【０４５５】
標的化送達
幾つかの実施形態では、（ポリ）カチオン性化合物、担体、リポソーム、又はＬＮＰは、異なる臓器及び／又は細胞型に到達するための標的化送達用に製剤化することができる。非限定的な例として、（ポリ）カチオン性化合物、担体、リポソーム、又はＬＮＰは、肝臓への標的化送達のために処方され得る。標的化送達に使用される（ポリ）カチオン化合物、担体、リポソーム、又はＬＮＰは、本明細書に記載される（ポリ）カチオン性化合物、担体、リポソーム、又はＬＮＰを含み得るが、これらに限定されない。本発明のＲＮＡは、担体又は標的化基に共有結合されるコンジュゲート（例えば、治療用タンパク質又はその断片若しくは変異体）をコードしてもよい。
【０４５６】
標的化基は、タンパク質、例えば糖タンパク質、又はペプチド、例えば共リガンドに対して特異的親和性を有する分子、又は抗体、例えば上皮細胞、ケラチノサイトなどの特定の細胞型に結合する抗体であり得る。標的化基はまた、ホルモン及びホルモン受容体を含み得る。それらはまた、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、多価マンノース、多価フコース、又はアプタマーなどの非ペプチド種を含むことができる。標的化基は、特定の受容体を標的化することができる任意のリガンドであり得る。
【０４５７】
幾つかの実施形態では、人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ、及び任意に、それを含む（医薬）組成物又はキットは、肝臓への標的化に適合されている。そのような人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ、及び任意に、それを含む（医薬）組成物又はキットは、代謝疾患、例えば先天的な遺伝的エラーによって引き起こされる代謝疾患、例えばオルニチントランスカルバミラーゼ欠損症関連疾患の治療、予防、又は軽減に特に適していることがある。
【０４５８】
（医薬）組成物
更なる態様では、本発明は、本発明に係る人工核酸分子、好ましくはＲＮＡと、少なくとも１つの薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む組成物を提供する。本発明に係る組成物は、好ましくは医薬組成物として提供される。
【０４５９】
人工核酸分子、好ましくはＲＮＡは、本明細書の他の箇所に記載される「複合体化」又は「遊離」形態、又はそれらの混合物で（医薬）組成物の一部として提供されてもよい。
【０４６０】
本発明に係る（医薬）組成物は、本明細書の他の箇所に定義される少なくとも１つのｇＲＮＡ又はそれを提供するベクターを更に含み得る。
【０４６１】
本発明に係る（医薬）組成物は、人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ、又はそれを含む（医薬）組成物による治療を受ける疾患又は状態の治療に有用な少なくとも１つの更なる活性剤を更に含み得る。
【０４６２】
薬学的に許容される賦形剤及び担体
好ましくは、本発明に係る（医薬）組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤を含む。「薬学的に許容される」という用語は、１以上の活性剤（ここでは、人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ）と適合性があり、それらの医薬活性に干渉しない及び／又は実質的に低下させない化合物又は剤を意味する。薬学的に許容される担体は、治療される被験体への投与のためにそれらを適切なものとするために十分に高い純度及び十分に低い毒性を有することが好ましい。
【０４６３】
賦形剤
薬学的に許容される賦形剤は、種々の機能的役割を示すことができ、限定するものではないが、希釈剤、フィラー、増量剤、担体、崩壊剤、結合剤、潤滑剤、滑剤、コーティング剤、溶媒及び共溶媒、緩衝剤、保存剤、補助剤、酸化防止剤、湿潤剤、消泡剤、増粘剤、甘味剤、香味剤、及び保湿剤が挙げられる。
【０４６４】
液体形態の（医薬）組成物の場合、一般に、有用な薬学的に許容される賦形剤としては、溶媒、（パイロジェンフリー）水などの希釈剤又は担体、リン酸又はクエン酸緩衝食塩水などの（等張）食塩水、固定油、植物油（例えば、落花生油、綿実油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）；レシチン；界面活性剤；ベンジルアルコール、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどの保存剤；糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、又は塩化ナトリウムなどの等張剤；モノステアリン酸アルミニウム又はゼラチン；アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムなどの酸化防止剤；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩、又はリン酸塩などの緩衝剤、及び塩化ナトリウム又はデキストロースなどの張度調整剤が挙げられる。ｐＨは、塩酸又は水酸化ナトリウムなどの酸又は塩基で調整することができる。緩衝剤は、特定の参照媒体に関して高張性、等張性、又は低張性であり得る、即ち、緩衝剤は、特定の参照媒体に関してより高い、同一、又はより低い塩含量を有することができ、前記塩を、浸透又は他の濃度の影響による細胞の損傷をもたらさないそのような濃度で使用することができることが好ましい。参照媒体は、例えば、血液、リンパ液、サイトゾル液、又は他の体液などの「インビボ」法で生じる液体、又は一般的な緩衝液又は液体などの「インビトロ」法で参照媒体として使用され得る液体である。そのような一般的な緩衝液又は液体は当業者に知られている。リンゲルラクタート溶液は、液体ベースとして特に好ましい。
【０４６５】
（半）固体形態の（医薬）組成物の場合、有用な薬学的に許容される賦形剤としては、微結晶セルロース、トラガカントガム、又はゼラチンなどの結合剤；デンプン又はラクトース；例えば、ラクトース、グルコース、及びスクロースなどの糖；例えば、コーンスターチ又はポテトスターチなどのデンプン；セルロース及びその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、酢酸セルロースなど；アルギン酸などの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤；ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウムなどの滑剤；硫酸カルシウム、コロイド状二酸化ケイ素など；スクロース又はサッカリンなどの甘味剤；ペパーミント、サリチル酸メチル、又はオレンジ香味料などの香味剤などが挙げられる。
【０４６６】
担体
適切な薬学的に許容される担体は、典型的には、（医薬）組成物の処方に基づいて選択される。
【０４６７】
注射（特に、ｉ．ｖ．注射）により投与される液体（医薬）組成物は、製造及び保存の条件下で無菌且つ安定であるべきである。そのような組成物は、典型的には、パイロジェンフリーであり、適切なｐＨを有し、等張性であり、活性成分の安定性を維持する、非経口的に許容される水溶液として処方される。
【０４６８】
本発明に係る液体（医薬）組成物のための特に有用な薬学的に許容される担体としては、水、典型的にはパイロジェンフリー水；等張食塩水又は緩衝（水）溶液、例えば、リン酸塩、クエン酸塩などの緩衝溶液が挙げられる。特に、本発明の（医薬）組成物の注射のためには、水又は好ましくは緩衝液、より好ましくは水性緩衝液を使用することができ、これは、ナトリウム塩、好ましくは少なくとも５０ｍＭのナトリウム塩、カルシウム塩、好ましくは少なくとも０．０１ｍＭのカルシウム塩、及び任意にカリウム塩、好ましくは少なくとも３ｍＭのカリウム塩を含有する。
【０４６９】
好ましい実施形態によれば、ナトリウム塩、カルシウム塩、及び任意にカリウム塩は、それらのハロゲン化物の形態（例えば、塩化物、ヨウ化物、又は臭化物）、それらの水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩、又は硫酸塩などで存在してもよい。限定するものではないが、ナトリウム塩の例としては、例えば、ＮａＣｌ、ＮａＩ、ＮａＢｒ、Ｎａ２ＣＯ３、ＮａＨＣＯ３、Ｎａ２ＳＯ４が挙げられ、任意のカリウム塩の例としては、例えば、ＫＣｌ、ＫＩ、ＫＢｒ、Ｋ２ＣＯ３、ＫＨＣＯ３、Ｋ２ＳＯ４が挙げられ、カルシム塩の例としては、例えば、ＣａＣｌ２、ＣａＩ２、ＣａＢｒ２、ＣａＣＯ３、ＣａＳＯ４、Ｃａ（ＯＨ）２が挙げられる。更に、前記カチオンの有機アニオンも緩衝剤中に含有されてもよい。
【０４７０】
より好ましい実施形態によれば、上に定義される注射目的に適した緩衝剤は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、及び任意に塩化カリウム（ＫＣｌ）から選択される塩を含むことができ、前記塩化物に加えて更なるアニオンが存在してもよい。ＣａＣｌ２はまた、ＫＣｌのような他の塩で置き換えることができる。典型的には、注射緩衝液中の塩は、少なくとも５０ｍＭの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、少なくとも３ｍＭの塩化カリウム（ＫＣｌ）、及び少なくとも０．０１ｍＭの塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）の濃度で存在する。注射緩衝液は、特定の参照媒体に関して高張性、等張性、又は低張性であり得る、即ち、緩衝剤は、特定の参照媒体に関してより高い、同一、又はより低い塩含量を有し得る。前記塩を、浸透又は他の濃度の影響による細胞の損傷をもたらさないそのような濃度で使用することができることが好ましい。参照媒体は、例えば、血液、リンパ液、サイトゾル液、又は他の体液などの「インビボ」法で生じる液体、又は一般的な緩衝液又は液体などの「インビトロ」法で参照媒体として使用され得る液体である。そのような一般的な緩衝液又は液体は当業者に知られている。リンゲルラクタート溶液は、液体ベースとして特に好ましい。
【０４７１】
処方
一般に、局所投与用の（医薬）組成物は、クリーム、軟膏、ゲル、ペースト、又は散剤として処方することができる。経口投与用の（医薬）組成物は、錠剤、カプセル剤、液剤、散剤として、又は持続放出形式で処方することができる。しかし、好ましい実施形態によれば、本発明の（医薬）組成物は、特に皮内又は筋肉内注射を介して非経口的に投与され、したがって、本明細書の他の箇所で記載されるように非経口投与用に液体形態又は凍結乾燥形態で処方される。非経口製剤は、典型的にはバイアル、ＩＶバッグ、アンプル、カートリッジ、又はプレフィルドシリンジに保管され、注射剤、吸入剤、又はエアロゾルとして投与することができるが、注射剤が好ましい。
【０４７２】
凍結乾燥製剤
更なる好ましい実施形態では、（医薬）組成物は、凍結乾燥形態で提供される。好ましくは、凍結乾燥（医薬）組成物は、投与前に、有利には水性担体に基づく、適切な緩衝液中で再構成される。これは、例えば、リンゲルラクタート溶液（これが好ましい）、リンゲル溶液、リン酸緩衝溶液である。幾つかの実施形態では、本発明に係る（医薬）組成物は、少なくとも２、３、４、５、６、又はそれ以上の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡを含み、これらは、前記人工核酸分子、好ましくはＲＮＡの各々の個々の投与が可能となるように、（任意に、少なくとも１つの更なる添加剤と共に）凍結乾燥形態で別々に提供され、それらの使用前に適切な緩衝液（例えば、リンゲルラクタート溶液）中で別々に再構成されることが好ましい。
【０４７３】
液体製剤
更に好ましい実施形態では、（医薬）組成物は、食塩水又は脂質ベース製剤の形態で提供される。脂質ベース製剤は、「複合体化」と題されたセクションに記載されるリポソーム、リポプレックス、ナノリポソーム、及び脂質ナノ粒子を含み得る。
【０４７４】
キット
更なる態様では、本発明は、人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ、及び／又は（医薬）組成物を含むキット又はキットオブパーツに関する。キットは、少なくとも１つのｇＲＮＡ（又はそれを提供するベクター）を更に含み得る。
【０４７５】
前述の成分はそれぞれ、キットオブパーツ中に医薬組成物の形態で提供されてもよい。その限りにおいて、（医薬）組成物について上に与えた定義及び説明は、必要な変更を加えて、キットオブパーツの個々の成分に等しく適用可能である。
【０４７６】
例えば、少なくとも１つの人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ、及び任意に、それをコードする少なくとも１つのｇＲＮＡ又は核酸は、互いに独立して、凍結乾燥形態又は液体形態で、任意に、医薬組成物の文脈において前記した１以上の薬学的に許容される担体、賦形剤、又は更なる剤と共に提供され得る。
【０４７７】
任意に、キットオブパーツは、医薬組成物、抗菌剤、ＲＮＡｓｅ阻害剤、可溶化剤などの文脈において本明細書に定義される少なくとも１つの更なる剤を含み得る。
【０４７８】
キットオブパーツは、２つ以上のパーツのキットであることができ、典型的には適切な容器中に各成分を含む。例えば、容器が成分の適時前の混合を防止するように構成されている限り、各容器は、バイアル、ボトル、スクイーズボトル、ジャー、密封スリーブ、エンベロープ若しくはポーチ、チューブ若しくはブリスターパッケージ、又は他の好適な形態であり得る。異なる成分はそれぞれ、別々に提供されてもよく、又は異なる構成要素の幾つかは、一緒に（即ち同じ容器内に）提供されてもよい。薬剤師又は医師による意図的な混合の前に、１つの区画の内容物が別の区画の内容物と物理的に関連することができないという限り、容器は、バイアル、チューブ、ジャー、又はエンベロープ、又はスリーブ、又はブリスターパッケージ、又はボトル内の区画又はチャンバーでもあり得る。
【０４７９】
キットオブパーツは、その成分のいずれかの投与及び投与量に関する情報を含む技術的な説明書を更に含み得る。
【０４８０】
医療用途と治療
本明細書に定義される人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ、又は（医薬）組成物、若しくはキットオブパーツは、ヒト及び獣医学の医学的目的のために、好ましくはヒトの医学的目的のために使用され得る。
【０４８１】
更なる態様によれば、本発明は、したがって、医薬として使用するための本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ、又は（医薬）組成物、若しくはキットオブパーツに関する。
【０４８２】
人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ、又は（医薬）組成物、若しくはキットオブキットは、特に、コードされたＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質の発現による治療が有効な、好ましくは目的遺伝子の発現をノックイン、ノックアウト、操作、又は調節することによる治療が有効な疾患の治療及び／又は予防に有用である。
【０４８３】
更なる態様によれば、本発明は、したがって、遺伝子治療の方法において使用するための、及び／又は、コードされたＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質の発現による治療が有効な、好ましくは目的遺伝子の発現をノックイン、ノックアウト、操作、又は調節することによる治療が有効な疾患の治療のための人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ、又は（医薬）組成物、若しくはキットオブパーツに関する。そのような疾患は、遺伝的疾患、癌、自己免疫疾患、炎症性疾患、感染症、代謝性疾患、神経疾患、心血管疾患、又は他の疾患若しくは状態から選択され得る。
【０４８４】
「遺伝子治療」は、治療効果を達成するために、好ましくは、被験体における遺伝子発現を調節する（即ち、回復する、増強する、減少させる、又は阻害する）ことを含む。この目的のために、遺伝子治療は典型的には細胞への核酸の導入を包含する。この用語は、一般に、治療目的のためのゲノムの操作を意味し、疾患を引き起こす突然変異の修正、ゲノムへの治療用遺伝子の付加、有害な遺伝子又はゲノム配列の除去、及び遺伝子発現の調節のためのゲノム編集技術の使用を含む。遺伝子治療は、宿主細胞のインビボ又はエキソビボ形質転換を含み得る。
【０４８５】
疾患の「治療」又は「治療すること」という用語は、その疾患を予防又はそれに対し防御すること（即ち、臨床症状が発症しないようにすること）；疾患を阻害すること（即ち、臨床症状の発症を阻止又は抑制すること、及び／又は疾患を軽減すること（即ち、臨床症状の後退を引き起こすこと）を含む。理解されるように、最終的な１つ又は複数の誘発事象は未知又は潜在的であり得るので、疾患又は障害を「予防する」ことと「抑制すること」とを区別することは常に可能という訳ではない。したがって、用語「予防」は、「予防すること」及び「抑制すること」の両方を包含する一種の「治療」を構成すると理解される。したがって、用語「治療」は「予防」を含む。
【０４８６】
本明細書で使用される「被験体」、「患者」、又は「個体」という用語は、一般に、ヒト及び非ヒト動物、好ましくは哺乳動物（例えば、マーモセット、タマリン、クモザル、フクロウザル、ベルベットサル、リスザル、ヒヒ、マカク、チンパンジー、オランウータン、ゴリラ；ウシ；ウマ；ヒツジ；ブタ；トリ；ネコ；イヌ；マウス；ラット；ウサギ；モルモットなどの非ヒト霊長類）、例えば、キメラ及びトランスジェニック動物並びに疾患モデルを含む。本発明の文脈において、「被験体」という用語は、好ましくは非ヒト霊長類又はヒト、最も好ましくはヒトを意味する。
【０４８７】
したがって、本発明は更に、それを必要とする被験体に薬学的に有効な量の本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ、又は（医薬）組成物、若しくはキットオブパーツを投与することによって、コードされたＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質の発現による治療が有効な、好ましくは目的遺伝子の発現をノックイン、ノックアウト、操作、又は調節することによる治療が有効な疾患を治療する方法を提供する。そのような方法は、本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ、（医薬）組成物、又はキットオブパーツを調製する任意の第１の工程、及び（薬学的及び／又は治療的に有効な量の）前記人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ、（医薬）組成物、又はキットオブパーツを、それを必要とする患者／被験体に投与することを含む第２の工程を含み得る。
【０４８８】
投与は、好ましくは非経口的に、例えば皮下、筋肉内、又は皮内注射により、好ましくは筋肉内又は皮内注射により、より好ましくは皮内注射により達成される。好ましくは、注射は、従来の針注射又は（無針）ジェット注射を用いて、好ましくは（無針）ジェット注射を用いて行われる。
【０４８９】
本発明はまた、好ましくは、目的遺伝子の発現をノックイン、ノックアウト、操作、又は調節するための、好ましくは誘導又は増強するための、本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ、又は（医薬）組成物、若しくはキットオブパーツの使用に関する。
【０４９０】
投与経路
本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ、又は（医薬）組成物、若しくは、キットオブパーツは、例えば、全身的又は局所的に投与することができる。
【０４９１】
全身投与のための経路としては、一般に、例えば、経皮、経口、非経口経路が挙げられ、皮下、静脈内、筋肉内、動脈内、皮内、及び腹腔内注射、及び／又は鼻腔内投与経路を含む。
【０４９２】
局所投与のための経路としては、一般に、例えば、局所投与経路だけでなく、皮内、経皮、皮下、若しくは筋肉内注射又は病巣内、腫瘍内、頭蓋内、肺内、心臓内、及び舌下注射も含む。
【０４９３】
例えば、前記（医薬）組成物又はキットオブパーツが幾つかの異なる核酸（例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸及び少なくとも１つのｇＲＮＡ又はそれを提供するベクター）を含む場合、本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ、又は（医薬）組成物、若しくはキットオブパーツの異なる成分に対して異なる投与経路を使用することが更に考えられる。
【０４９４】
好ましい実施形態によれば、人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ、又は（医薬）組成物、若しくはキットオブパーツは、非経口経路によって、好ましくは皮内経路、皮下経路、又は筋肉内経路によって投与される。好ましくは、前記人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ、又は（医薬）組成物、若しくはキットオブパーツは注射、例えば、皮下、筋肉内、又は皮内注射（これは無針注射及び／又は針注射であり得る）によって投与される。したがって、好ましい実施形態において、本発明に係る医学的使用及び／又は治療方法は、皮下、筋肉内又は皮内注射、好ましくは筋肉内又は皮内注射、より好ましくは皮内注射による前記人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ、又は（医薬）組成物、若しくはキットオブパーツの投与を含む。このような注射は、従来の針注射又は（無針）ジェット注射、好ましくは（無針）ジェット注射を用いて行うことができる。
【０４９５】
投与計画
本発明の（医薬）組成物又はキットオブパーツの各成分、即ち少なくとも１つの人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ、及び任意に、少なくとも１つの他の核酸（例えば、ｇＲＮＡ又はそれを提供するベクター）を、それを必要としする対象に、１日間に数回、１日間に１回、１日間おきに、１週間に１回、又は１ヶ月間に１回投与することができ、順次又は同時に投与することができる。前記成分は、それを必要とする被験体に、上に定義される異なる投与経路を介して投与することができる。
【０４９６】
幾つかの好ましい実施形態によれば、本発明の（医薬）組成物の各成分は同時に（即ち、同一又は異なる投与経路を介して同時に）投与される
【０４９７】
他の好ましい実施形態によれば、本発明の（医薬）組成物又はキットオブパーツの各成分は別々に（即ち、異なる時点で及び／又は異なる投与経路を介して順次）投与される。そのような順次投与スキームは、「時間差」投与とも呼ばれる。時間差投与は、人工核酸分子、好ましくはＲＮＡが、ｇＲＮＡ又はそれを提供するベクターの、例えば、前に、同時に、又は後に投与される、、又はその逆も同様であることを意味し得る。
【０４９８】
用量
本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ、（医薬）組成物、又はキットは、好ましくは安全且つ治療的に有効な量で投与される。
【０４９９】
本明細書に使用されるとき、「安全且つ治療的に有効な量」とは、対象とされる組織、系、動物、又はヒトにおいて所望の生物学的又は医学的応答を引き起こすのに十分な活性剤の量を意味する。安全且つ治療的に有効な量は、治療されべき疾患の積極的な修正を誘導するために、即ち治療される疾患の症状の軽減、疾患進行の減少、又は予防される疾患の症状の予防に十分であることが好ましい。しかし、同時に、「安全且つ治療的に有効な量」は、重篤な副作用を回避するのに十分なほど、即ち利点とリスクとの間の良好な関係を可能にするのに十分なほど少ない。
【０５００】
「安全且つ治療的に有効な量」は更に、治療されるべき特定の状態に関連して、また治療されるべき患者の年齢、体調、体重、性別、及び食事、状態の重篤度、治療期間、付随する治療の性質、使用される特定の薬学的に許容される担体又は賦形剤、治療計画及び類似の要因にも関連して変化する。人工核酸分子、好ましくはＲＮＡの「安全且つ（治療的に）有効な有効量」は、人工核酸分子、好ましくはＲＮＡの種類、例えば、モノシストロン性、ビ−、又はマルチシストロン性ＲＮＡに応じて更に選択され得る。これは、ビ−又はマルチシストロン性ＲＮＡは、等量のモノシストロン性ＲＮＡの使用よりも有意に高いコード化ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質の発現をもたらし得るためである。
【０５０１】
本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ、（医薬）組成物、又はキットオブパーツの治療効果及び毒性は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％致死量）及びＥＤ５０（集団の５０％に治療的に有効な用量）を決定するための、細胞培養又は実験動物における標準的な医薬手続によって決定できる。毒性効果と治療効果との間の用量比が治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。大きな治療指数を示す人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ、（医薬）組成物、又はキットオブパーツが一般に好ましい。細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデータは、ヒトに使用するための投与量の範囲を処方するのに使用することができる。そのような化合物の投与量は、好ましくは、毒性が殆どない又は全くないＥＤ５０を含む血中濃度の範囲内にある。
【０５０２】
例えば、本明細書に記載の本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ、（医薬）組成物、又はキットオブパーツの治療有効用量は、投与単位当たり約０．００１ｍｇ〜１０ｍｇ、好ましくは約０．０１ｍｇ〜５ｍｇ、より好ましくは約０．１ｍｇ〜２ｍｇ、又は投与単位当たり約０．０１ｎｍｏｌ〜１ｍｍｏｌ、特に、投与単位当たり１ｎｍｏｌ〜１ｍｍｏｌ、好ましくは投与単位当たり１μｍｏｌ〜１ｍｍｏｌである。本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ、（医薬）組成物、又はキットオブパーツの治療有効用量は、（体重１ｋｇ当たり）約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｇ／ｋｇ、好ましくは約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜５ｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇ〜２．５ｇ／ｋｇの範囲であり得ることもまた想定される。
【０５０３】
投与される本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ、（医薬）組成物、又はキットオブパーツの安全且つ治療的に有効な量は、通常の実験、例えば、動物モデルを使用して決定することができる。そのようなモデルとしては、限定するものではないが、ウサギ、ヒツジ、マウス、ラット、イヌ、及び非ヒト霊長類モデルが挙げられる。
【０５０４】
疾患
ＣＲＩＳＰＲ技術は、遺伝子の機能的ノックアウト又はノックイン、遺伝子編集、又は転写活性化又は阻害を含む様々な目的に使用することができる。したがって、本発明に係る人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ、（医薬）組成物、又はキットは、様々な疾患を治療するために使用することができる。人工核酸分子の少なくとも１つのコード配列によってコードされるＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質の発現による治療が有効な疾患、障害、又は状態における遺伝子治療における使用が特に想定される。
【０５０５】
好ましくは、治療されべき疾患は、目的遺伝子のノックイン、ノックアウト、又は操作（例えば、突然変異の導入又は除去）、又はその発現の調節（即ち、改変、誘導、増加、減少、予防、又は破壊）による治療に適している。
【０５０６】
本発明に係る人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ、又はそれを含む（医薬）組成物若しくはキットを用いて、遺伝子ノックアウトを誘導する（即ち、遺伝子を機能しないようにする又はゲノムから遺伝子を除去する）ことができる。したがって、エンドヌクレアーゼ活性を示すＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする人工核酸分子、好ましくはＲＮＡを利用することができ、これらはＤＳＢをゲノムＤＮＡに導入することができる。前記ＤＳＢは、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を誘導でき、コドン読み枠の破壊（フレームシフト）をもたらす短いヌクレオチ長のランダム挿入又は欠失をもたらし、誤った転写物及び遺伝子発現の除去をもたらす（機能喪失）。この戦略は、例えば、腫瘍細胞の増殖と生存を媒介する遺伝子をノックアウトするために、或いは宿主細胞のゲノムから組み込まれたウイルスを除去するために有用であり得る。
【０５０７】
本発明に係る人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ、又はそれを含む（医薬）組成物若しくはキットを用いて、遺伝子ノックインを誘導する（即ち、新しい又は修飾された遺伝子をゲノムに導入する）ことができる。それゆえ、ニッカーゼ活性を示すＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする人工核酸分子、好ましくはＲＮＡを利用することができ、それによりニック（即ち、二本鎖ゲノムＤＮＡの一方の鎖のホスホジエステル結合の加水分解）をゲノムＤＮＡに導入することができる。そのようなニックは、好ましくは相同性修復（ＨＤＲ）を誘導し、その結果、ＤＮＡ二本鎖切断の両側に隣接する配列に対して相同性を有する領域を有するＤＮＡセグメントの組み込みをもたらす。ＨＤＲを用いて、任意の所望のＤＮＡ配列をゲノムＤＮＡに挿入して、例えば、機能喪失、機能獲得、又は改変（新形態）機能を誘導する、又は未知の機能的状態の変異体を調べることができる。ＨＤＲを利用してゲノムを編集するために、所望の配列を有するＤＮＡ修復テンプレートが、典型的には本発明の人工核酸（及びｇＲＮＡ）と共に提供される。この戦略は、例えば、治療用遺伝子をノックインするのに有用であり得る。
【０５０８】
本発明に係る人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ、又はそれを含む（医薬）組成物若しくはキットを用いて、遺伝子発現、特に遺伝子転写を調節することができる。したがって、好適なエフェクタードメインを含むＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質誘導体をコードする人工核酸分子、好ましくはＲＮＡを利用することができる。エフェクタードメインは、その発現を調節するために標的遺伝子（又はそれに機能可能に連結された調節配列）と相互作用し得る。このアプローチは、目的の標的遺伝子の望ましくない（存在する又は存在しない、増加又は減少する）発現に関連する任意の疾患に有用であり得る。
【０５０９】
癌
好ましい実施形態では、人工核酸、好ましくはＲＮＡ、（医薬）組成物、又はキットは、癌の治療又は予防に使用される。
【０５１０】
本明細書中で使用される場合、用語「癌」は、周囲の組織に侵入し、離れた身体部位に転移する傾向を示す細胞の制御されない、通常急速な増殖によって特徴付けられる新生物を意味する。この用語は、良性及び悪性の新生物を包含する。癌における悪性腫瘍は、通常、無形成症、浸潤性、及び転移によって特徴付けられ、一方、良性悪性腫瘍は、通常、これらの特性は有しない。この用語は、腫瘍の増殖、並びに血液及びリンパ系の癌を特徴とする新生物を含む。
【０５１１】
幾つかの実施形態では、本発明に係る人工核酸、好ましくはＲＮＡ、（医薬）組成物、又はキットは、特に腫瘍又は癌の疾患の治療のための医薬として使用することができる。この文脈において、治療は、特に腫瘍内注射による腫瘍内適用を含むことが好ましい。したがって、本発明に係る人工核酸、好ましくはＲＮＡ、（医薬）組成物、又はキットは、腫瘍又は癌の疾患の治療のための医薬の調製に使用することができ、前記医薬は、腫瘍又は癌の疾患の治療のための腫瘍内適用（投与）に特に適している。
【０５１２】
好ましくは、本明細書に記載の腫瘍及び癌の疾患は、好ましくは以下を含む腫瘍又は癌の疾患から選択される：例えば、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、エイズ関連癌、エイズ関連リンパ腫、肛門癌、虫垂癌、星状細胞腫、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、骨肉腫／悪性線維性組織球腫、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、小脳星細胞腫、脳星細胞腫／悪性神経膠腫、上衣腫、髄芽腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、視覚経路及び視床下部神経膠腫、乳癌、気管支腺腫／カルチノイド、バーキットリンパ腫、小児期カルチノイド腫瘍、消化管カルチノイド腫瘍、原発不明の癌、原発性中枢神経系リンパ腫、小児期小脳星細胞腫、小児期脳星細胞腫／悪性神経膠腫、子宮頸癌、小児癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性障害、大腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、腫瘍のユーイングファミリーのユーイング肉腫、小児期頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管癌、眼内黒色腫、網膜芽腫、胆嚢癌、胃癌（胃臓）癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、頭蓋外、性腺外、又は卵巣の胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛腫瘍、脳幹の神経膠腫、小児期脳星細胞腫、小児期視覚経路及び視床下部神経膠腫、胃カルチノイド、毛様細胞白血病、頭頸部癌、心臓癌、肝細胞（肝臓）癌、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、小児期視床下部及び視覚経路神経膠腫、眼内黒色腫、膵島細胞癌（内分泌膵臓）、カポジ肉腫、腎臓癌（腎細胞癌）、喉頭癌、白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、有毛細胞白血病、口唇及び口腔癌、脂肪肉腫、肝癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、リンパ腫、エイズ関連リンパ腫、バーキットリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、ワルデンストロームマクログロブリン血症、骨／骨肉腫の悪性線維性組織球腫、小児期髄芽腫、メラノーマ、眼内（眼）メラノーマ、メルケル細胞癌、成体悪性中皮腫、小児期中皮腫、原発不明転移性扁平上皮癌、口腔癌、小児期多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫／プラズマ細胞新生物、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性疾患、慢性骨髄性白血病、成体急性骨髄性白血病、小児期急性骨髄性白血病骨髄腫、多発性骨髄腫（骨髄の癌）、慢性骨髄増殖性障害、鼻腔及び副鼻腔癌、上咽頭癌、神経芽細胞腫、口腔癌、中咽頭癌、骨の骨肉腫／悪性線維性組織球腫、卵巣癌、卵巣上皮癌（表面上皮間質腫瘍）、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性腫瘍、膵臓癌、膵島細胞膵臓癌、副鼻腔癌及び鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、松果体星細胞腫、松果体胚細胞腫、小児期松果体芽腫及びテント上原始神経外胚葉性腫瘍、下垂体腺腫、形質細胞腫瘍／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌（腎臓癌）、腎盂及び尿管の癌、網膜芽細胞腫、小児期横紋筋肉腫、唾液腺癌、腫瘍のユーイングファミリーの肉腫、カポジ肉腫、軟部肉腫、子宮肉腫、セザリー症候群、皮膚癌（非黒色腫）、皮膚癌（黒色腫）、メルケル細胞皮膚癌、小腸癌、扁平上皮癌、原発不明の転移性扁平上皮性頸部癌、小児期のテント上原始神経外胚葉性腫瘍、精巣癌、咽頭癌、小児期胸腺腫、胸腺腫及び胸腺癌、甲状腺癌、小児期甲状腺癌、腎盂及び尿管の移行上皮がん、妊娠性絨毛腫瘍、尿道癌、子宮内膜癌、子宮肉腫、膣癌、小児期視覚経路及び視床下部神経膠腫、外陰癌、ワルデンストロームマクログロブリン血症、及び小児期ウィルムス腫瘍（腎臓癌）。
【０５１３】
腫瘍内投与に適した腫瘍又は癌の特に好ましい例としては、前立腺癌、肺癌、乳癌、脳癌、頭頸部癌、甲状腺癌、結腸癌、胃癌、肝臓癌、膵臓癌、卵巣癌、皮膚癌、膀胱癌、子宮癌、及び子宮頸部癌が挙げられる。
【０５１４】
感染症
本発明の組合せ、医薬組成物、又はキットは、感染症を治療するために使用され得る。「感染」又は「感染症」という用語は、通常は体内に存在しない細菌、ウイルス、寄生虫などの微生物の侵入及び増殖に関する。感染は、症状を引き起こさず無症状である場合もあれば、症状を引き起こして臨床的に明らかとなる場合もある。感染は、局所に留まる場合もあれば、血液又はリンパ系を介して広がり、全身性になる場合もある。この文脈における感染症は、好ましくは、ウイルス性、細菌性、真菌性、又は原虫性の感染症を含む。
【０５１５】
本発明の人工核酸、好ましくはＲＮＡは、宿主細胞のゲノムに組み込まれたウイルスゲノムを除去するのに特に有用であると考えられる。本発明の人工核酸、好ましくはＲＮＡによってコードされるＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質による宿主細胞からのウイルスの根絶は、その生活環にＤＮＡ中間体を有する任意のＤＮＡウイルス又はＲＮＡウイルスに好ましく適用可能である。したがって、本発明に係る人工核酸、好ましくはＲＮＡ、（医薬）組成物、及びキットは、ヒトパピローマウイルスＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８感染、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、ＨＩＶ−１感染、ヘルペスウイルス感染（カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ、ＨＨＶ８）感染を含む）、ポリオーマウイルス感染（メルケル細胞癌ウイルス（ＭＣＶ）、ポリオーマウイルスＪＣ（ＪＣＶ）、及びポリオーマウイルスＢＫ（ＢＫＶ）感染）、及び関連する感染症の治療が特に想定される。
【０５１６】
組合せ療法
本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ、（医薬）組成物、ワクチン、又はキットオブパーツはまた、組合せ療法において使用され得る。本明細書に定義される疾患及び障害を治療又は予防するために有用な任意の他の療法は、本明細書に開示される使用及び方法と組み合わせることができる。
【０５１７】
例えば、人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ、（医薬）組成物、又はキットオブパーツを受ける被験体は、化学療法（例えば、第１選択又は第２選択療法）、放射線療法、化学放射線療法（化学療法と放射線療法の組合せ）、チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤）、抗体療法及び／又は阻害性及び／又は刺激性チェックポイント分子（例えば、ＣＴＬＡ４阻害剤）を受けている、好ましくは本明細書に定義される癌又は関連する状態を有する患者、又は、又は上で特定した治療のうちの１つ以上を受けた後、部分奏効を達成した又は疾患が安定した患者であり得る。或いは、人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ、（医薬）組成物、又はキットオブパーツが投与される被験体は、抗生物療法、抗真菌療法、又は抗ウイルス療法を受けている、好ましくは本明細書に定義される感染症を有する患者であり得る。
更なる態様において、本発明は、したがって、前記人工核酸分子、（医薬）組成物、又はキットでの治療が有効な癌、感染症、又は他の任意の疾患の別の治療を支援するための本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ、（医薬）組成物、又はキットオブパーツの使用にも関する。
【０５１８】
癌の治療又は予防の「支援」は、例えば、外科手術、放射線療法、化学療法（例えば、第１選択又は第２選択化学療法）、化学放射線療法、チロシンキナーゼ阻害剤による治療、阻害性及び／又は刺激性チェックポイント分子による治療、好ましくはＣＴＬＡ４阻害剤、抗体療法、又はこれらの任意の組合せ、並びに本明細書に定義される本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ、（医薬）組成物、又はキットオブパーツを用いる療法などの従来の癌治療法の任意の組合せであり得る。
【０５１９】
本発明に係る本発明の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ、（医薬）組成物、又はキットオブパーツの投与は、別の治療薬の投与すること、又は治療対象の特定の疾患又は状態の治療に有用な別の治療を患者に施すことの前、それと同時、及び／又はその後に達成できる。
【０５２０】
項目
前記に鑑みて、本発明は、以下の項目によって特徴付けられ得る。
１．ａ．少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする少なくとも１つのコード領域と；
ｂ．ＡＴＰ５Ａ１、ＲＰＬ３２、ＨＳＤ１７Ｂ４、ＳＬＣ７Ａ３、ＮＯＳＩＰ、ＡＳＡＨ１、ＲＰＬ３１、ＴＵＢＢ４Ｂ、ＵＢＱＬＮ２、ＭＰ６８、及びＮＤＵＦＡ４からなる群から選択される遺伝子の５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメントと；
ｃ．ＧＮＡＳ、ＣＡＳＰ１、ＰＳＭＢ３、ＡＬＢ、ＣＯＸ６Ｂ１、ＮＤＵＦＡ１、及びＲＰＳ９からなる群から選択される遺伝子の３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）に由来する少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメント
とを含むことを特徴とする人工核酸分子。
２．前記遺伝子のそれぞれが、天然に存在するＤＮＡ配列、並びにそのホモログ、変異体、断片、及び対応するＲＮＡ配列を含む項目１に記載の人工核酸分子。
３．ａ．ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＧＮＡＳ遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメント；又は
ｂ．ＳＬＣ７Ａ３遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＧＮＡＳ遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメント；又は
ｃ．ＡＴＰ５Ａ１遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＣＡＳＰ１遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメント；又は
ｄ．ＮＤＵＦＡ４遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＰＳＭＢ３遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメント；又は
ｅ．ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＰＳＭＢ３遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメント；又は
ｆ．ＲＰＬ３２遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＡＬＢ遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメント；又は
ｇ．ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＣＡＳＰ１遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメント；又は
ｈ．ＳＬＣ７Ａ３遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＣＡＳＰ１遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメント；又は
ｉ．ＳＬＣ７Ａ３遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＰＳＭＢ３遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメント；又は
ｊ．ＮＯＳＩＰ遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＰＳＭＢ３遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメント；又は
ｋ．ＮＤＵＦＡ４遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＲＰＳ９遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメント；又は
ｌ．ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＲＰＳ９遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメント；又は
ｍ．ＡＴＰ５Ａ１遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＧＮＡＳ遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメント；又は
ｎ．ＮＤＵＦＡ４遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＣＯＸ６Ｂ１遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメント；又は
ｎ．ＮＤＵＦＡ４遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＧＮＡＳ遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメント；又は
ｏ．ＮＤＵＦＡ４遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＮＤＵＦＡ１遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメント；又は
ｐ．ＮＯＳＩＰ遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＮＤＵＦＡ１遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメント；又は
ｑ．ＲＰＬ３１遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＧＮＡＳ遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメント；又は
ｒ．ＴＵＢＢ４Ｂ遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＲＰＳ９遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメント；又は
ｓ．ＵＢＱＬＮ２遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＲＰＳ９遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメント；又は
ｔ．ＭＰ６８遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＧＮＡＳ遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメント；又は
ｕ．ＭＰ６８遺伝子の５’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメント、及びＮＤＵＦＡ１遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントを含む項目１から２のいずれかに記載の人工核酸分子。
４．ｄ、ｅ、ｇ、又はｌに係るＵＴＲエレメントを含む項目３に記載の人工核酸分子。
５．−ＨＳＤ１７Ｂ４遺伝子に由来する前記５’ＵＴＲエレメントは、配列番号１に係るＤＮＡ配列、又は配列番号１に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列、又はその断片若しくは変異体；又は配列番号２に係るＲＮＡ配列、又は配列番号２に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＲＮＡ配列、又はその断片若しくは変異体を含む又はからなり；
−ＲＰＬ３２遺伝子に由来する前記５’ＵＴＲエレメントは、配列番号２１に係るＤＮＡ配列、又は配列番号２１に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列、又はその断片若しくは変異体；又は配列番号２２に係るＲＮＡ配列、又は配列番号２２に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＲＮＡ配列、又はその断片若しくは変異体を含む又はからなり；
−ＮＤＵＦＡ４遺伝子に由来する前記５’ＵＴＲエレメントは、配列番号９に係るＤＮＡ配列、又は配列番号９に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列、又はその断片若しくは変異体；又は配列番号１０に係るＲＮＡ配列、又は配列番号１０に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＲＮＡ配列、又はその断片若しくは変異体を含む又はからなり；
−ＳＬＣ７Ａ３遺伝子に由来する前記５’ＵＴＲエレメントは、配列番号１５に係るＤＮＡ配列、又は配列番号１５に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列、又はその断片若しくは変異体；又は配列番号１６に係るＲＮＡ配列、又は配列番号１６に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＲＮＡ配列、又はその断片若しくは変異体を含む又はからなり；
−ＮＯＳＩＰ遺伝子に由来する前記５’ＵＴＲエレメントは、配列番号１１に係るＤＮＡ配列、又は配列番号１１に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列、又はその断片若しくは変異体；又は配列番号１２に係るＲＮＡ配列、又は配列番号１２に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＲＮＡ配列、又はその断片若しくは変異体を含む又はからなり；
−ＡＴＰ５Ａ１遺伝子に由来する前記５’ＵＴＲエレメントは、配列番号５に係るＤＮＡ配列、又は配列番号５に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列、又はその断片若しくは変異体；又は配列番号６に係るＲＮＡ配列、又は配列番号６に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＲＮＡ配列、又はその断片若しくは変異体を含む又はからなり；
−ＡＳＡＨ１遺伝子に由来する前記５’ＵＴＲエレメントは、配列番号３に係るＤＮＡ配列、又は配列番号３に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列、又はその断片若しくは変異体；又は配列番号４に係るＲＮＡ配列、又は配列番号４に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＲＮＡ配列、又はその断片若しくは変異体を含む又はからなり；
−Ｍｐ６８遺伝子に由来する前記５’ＵＴＲエレメントは、配列番号７に係るＤＮＡ配列、又は配列番号７に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列、又はその断片若しくは変異体；又は配列番号８に係るＲＮＡ配列、又は配列番号８に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＲＮＡ配列、又はその断片若しくは変異体を含む又はからなり；
−Ｒｐｌ３１遺伝子に由来する前記５’ＵＴＲエレメントは、配列番号１３に係るＤＮＡ配列、又は配列番号１３に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列、又はその断片若しくは変異体；又は配列番号１４に係るＲＮＡ配列、又は配列番号１４に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＲＮＡ配列、又はその断片若しくは変異体を含む又はからなり；
−ＴＵＢＢ４Ｂ遺伝子に由来する前記５’ＵＴＲエレメントは、配列番号１７に係るＤＮＡ配列、又は配列番号１７に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列、又はその断片若しくは変異体；又は配列番号１８に係るＲＮＡ配列、又は配列番号１８に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＲＮＡ配列、又はその断片若しくは変異体を含む又はからなり；
−Ｕｂｑｌｎ２遺伝子に由来する前記５’ＵＴＲエレメントは、配列番号１９に係るＤＮＡ配列、又は配列番号１９に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列、又はその断片若しくは変異体；又は配列番号２０に係るＲＮＡ配列、又は配列番号２０に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＲＮＡ配列、又はその断片若しくは変異体を含む又はからなり；
−ＧＮＡＳ遺伝子に由来する前記５’ＵＴＲエレメントは、配列番号２９に係るＤＮＡ配列、又は配列番号２９に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列、又はその断片若しくは変異体；又は配列番号３０に係るＲＮＡ配列、又は配列番号３０に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＲＮＡ配列、又はその断片若しくは変異体を含む又はからなり；
−ＣＡＳＰ１遺伝子に由来する前記５’ＵＴＲエレメントは、配列番号２５に係るＤＮＡ配列、又は配列番号２５に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列、又はその断片若しくは変異体；又は配列番号２６に係るＲＮＡ配列、又は配列番号２６に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＲＮＡ配列、又はその断片若しくは変異体を含む又はからなり；
−ＰＳＭＢ３遺伝子に由来する前記５’ＵＴＲエレメントは、配列番号２３に係るＤＮＡ配列、又は配列番号２３に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列、又はその断片若しくは変異体；又は配列番号２４に係るＲＮＡ配列、又は配列番号２４に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＲＮＡ配列、又はその断片若しくは変異体を含む又はからなり；
−ＡＬＢ遺伝子に由来する前記５’ＵＴＲエレメントは、配列番号３５に係るＤＮＡ配列、又は配列番号３５に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列、又はその断片若しくは変異体；又は配列番号３６に係るＲＮＡ配列、又は配列番号３６に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＲＮＡ配列、又はその断片若しくは変異体を含む又はからなり；
−ＲＰＳ９遺伝子に由来する前記５’ＵＴＲエレメントは、配列番号３３に係るＤＮＡ配列、又は配列番号３３に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列、又はその断片若しくは変異体；又は配列番号３４に係るＲＮＡ配列、又は配列番号３４に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＲＮＡ配列、又はその断片若しくは変異体を含む又はからなり；
−ＣＯＸ６Ｂ１遺伝子に由来する前記５’ＵＴＲエレメントは、配列番号２７に係るＤＮＡ配列、又は配列番号２７に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列、又はその断片若しくは変異体；又は配列番号２８に係るＲＮＡ配列、又は配列番号２８に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＲＮＡ配列、又はその断片若しくは変異体を含む又はからなり；又は
−Ｎｄｕｆａ１遺伝子に由来する前記５’ＵＴＲエレメントは、配列番号３１に係るＤＮＡ配列、又は配列番号３１に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列、又はその断片若しくは変異体；又は配列番号３２に係るＲＮＡ配列、又は配列番号３２に係る核酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＲＮＡ配列、又はその断片若しくは変異体を含む又はからなる項目１から４のいずれかに記載の人工核酸分子。
６．ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質が、ＣＲＩＳＰＲ関連野生型タンパク質、そのホモログ、変異体、断片、及び誘導体を含む項目１から５のいずれかに記載の人工核酸分子。
７．前記ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質が、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２）、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１３、ＣａｓＸ、又はＣａｓＹから選択される項目１から６のいずれかに記載の人工核酸分子。
８．配列番号４２８〜４４１；１０９９９〜１１００１；４４２〜１３４５のいずれかに係るアミノ酸配列、又は配列番号４２８〜４４１；１０９９９〜１１００１；４４２〜１３４５のいずれかに係るアミノ酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又はこれらの配列のいずれかの変異体又は断片を含む又はからなるＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする核酸配列を含む項目１から７のいずれかに記載の人工核酸分子。
９．前記ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質誘導体が、ＫＲＡＢ、ＣＳＤ、ＷＲＰＷ、ＶＰ６４、ｐ６５ＡＤ、及びＭｘｉから任意に選択される少なくとも１つの更なるエフェクタードメインを含む項目８に記載の人工核酸分子。
１０．核局在化シグナル（ＮＬＳ）をコードする少なくとも１つの核酸配列を更に含み、前記核局在化シグナルが、任意に、配列番号４２６；４２７；１０５７５；３８１；３８２；３８４；１１９５７；１１９５８〜１１９６４に係るアミノ酸配列、又は配列番号４２６；４２７；１０５７５；３８１；３８２；３８４；１１９５７；１１９５８〜１１９６４に係るアミノ酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む又はからなるＮＬＳ、及び配列番号４２６；４２７；１０５７５；３８１；３８２；３８４；１１９５７；１１９５８〜１１９６４に係るアミノ酸配列、又は配列番号４２６；４２７；１０５７５；３８１；３８２；３８４；１１９５７；１１９５８〜１１９６４に係るアミノ酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む又はからなるＮＬＳ、又は配列番号１２０２１〜１４２７４に係るアミノ酸配列に対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＮＬＳから選択される項目１から９のいずれかに記載の人工核酸分子。
１１．タンパク質又はペプチドタグをコードする少なくとも１つの核酸配列を更に含む項目１から１０のいずれかに記載の人工核酸分子。
１２．前記人工核酸分子の少なくとも１つのコード領域が、配列番号４１１；２５４０〜２５５３；１１１１７〜１１１１９；１１３５５〜１１３５７；２５５４〜３４５７；１３８０〜１３９３；３７００〜３７１３；４８６０〜４８７３；６０２０〜６０３３；７１８０〜７１９３；８３４０〜８３５３；１１２３７〜１１２３９；１１４７３〜１１４７５；１１５９１〜１１５９３；１１７０９〜１１７１１；１１８２７〜１１８２９；１１９４５〜１１９４７；１３９４〜２２９７；３７１４〜４６１７；４８７４〜５７７７；６０３４〜６９３７；７１９４〜８０９７；８３５４〜９２５７；４１２；３４７４〜３８８７  ２３１４〜２３２７；４６３４〜４６４７；５７９４〜５８０７；６９５４〜６９６７；８１１４〜８１２７；４１３〜４２５；３４９０〜３５０３；３５０６〜３５１９；３５２２〜３５３５；３５３８〜３５５１；３５５４〜３５６７；３５７０〜３５８３；３５８６〜３５９９；３６０２〜３６１５；３６１８〜３６３１；３６３４〜３６４７；３６５０〜３６６３；３６６６〜３６７９；３６８２〜３６９５；９５１４〜９５２７；９６２６〜９６３９；９７３８〜９７５１；９８５０〜９８６３；９９６２〜９９７５，１００７４〜１００８７；１０１８６〜１０１９９；１０２９８〜１０３１１；２３３０〜２３４３；２３４６〜２３５９；２３６２〜２３７５；２３７８〜２３９１；２３９４〜２４０７；２４１０〜２４２３；２４２６〜２４３９；２４４２〜２４５５；２４５８〜２４７１；２４７４〜２４８７；２４９０〜２５０３；２５０６〜２５１９；２５２２〜２５３５；９４９８〜９５１１；９６１０〜９６２３；９７２２〜９７３５；９８３４〜９８４７；９９４６〜９９５９；１００５８〜１００７１；１０１７０〜１０１８３〜１０２８２〜１０２９５；４６５０〜４６６３；４６６６〜４６７９；４６８２〜４６９５；４６９８〜４７１１；４７１４〜４７２７；４７３０〜４７４３；４７４６〜４７５９；４７６２〜４７７５；４７７８〜４７９１；４７９４〜４８０７；４８１０〜４８２３；４８２６〜４８３９；４８４２〜４８５５；９５３０〜９５４３；９６４２〜９６５５；９７５４〜９７６７；９８６６〜９８７９；９９７８〜９９９１；１００９０〜１０１０３；１０２０２〜１０２１５；１０３１４〜１０３２７；５８１０〜５８２３；５８２６〜５８３９；５８４２〜５８５５；５８５８〜５８７１；５８７４〜５８８７；５８９０〜５９０３；５９０６〜５９１９；５９２２〜５９３５；５９３８〜５９５１；５９５４〜５９６７；５９７０〜５９８３，５９８６〜５９９９；６００２〜６０１５；９５４６〜９５５９；９６５８〜９６７１；９７７０〜９７８３；９８８２〜９８９５；９９９４〜１０００７；１０１０６〜１０１１９；１０２１８〜１０２３１；１０３３０〜１０３４３；６９７０〜６９８３；６９８６〜６９９９；７００２〜７０１５；７０１８〜７０３１；７０３４〜７０４７；７０５０〜７０６３；７０６６〜７０７９；７０８２〜７０９５；７０９８〜７１１１；７１１４〜７１２７；７１３０〜７１４３；７１４６〜７１５９；７１６２〜７１７５；９５６２〜９５７５；９６７４〜９６８７；９７８６〜９７���９；９８９８〜９９１１；１００１０〜１００２３；１０１２２〜１０１３５；１０２３４〜１０２４７；１０３４６〜１０３５９；８１３０〜８１４３；８１４６〜８１５９；８１６２〜８１７５；８１７８〜８１９１；８１９４〜８２０７；８２１０〜８２２３；８２２６〜８２３９；８２４２〜８２５５；８２５８〜８２７１；８２７４〜８２８７；８２９０〜８３０２；８３０６〜８３１９；８３２２〜８３３５；９５７８〜９５９１；９６９０〜９７０３；９８０２〜９８１５；９９１４〜９９２７；１００２６〜１００３９；１０１３８〜１０１５１；１０２５０〜１０２６３；１０３６２〜１０３７５；９２９０〜９３０３；９３０６〜９３１９；９３２２〜９３３５；９３３８〜９３５１；９３５４〜９３６７；９３７０〜９３８３；９３８６〜９３９９；９４０２〜９４１５；９４１８〜９４３１；９４３４〜９４４７；９４５０〜９４６３；９４６６〜９４７９；９４８２〜９４９５；９５９４〜９６０７；９７０６〜９７１９；９８１８〜９８３１；９９３０〜９９４３；１００４２〜１００５５；１０１５４〜１０１６７；１０２６６〜１０２７９；１０３７８〜１０３９１のいずれかに係る核酸配列；又は前記核酸配列のいずれかに対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む又はからなる項目１から１１のいずれか記載の人工核酸分子。
１３．配列番号１０５５２；３４５８〜３４５９；３４６０〜３４７３；２２９８〜２２９９；４６１８〜４６１９；５７７８〜５７７９；６９３８〜６９３９；８０９８〜８０９９；９２５８〜９２５９；２３００〜２３１３；４６２０〜４６３３；５７８０〜５７９３；６９４０〜６９５３；８１００〜８１１３；９２６０〜９２７３；３４８８〜３４８９；１０３９６；２３２８〜２３２９；１０３９５；４６４８〜４６４９；１０３９７；５８０８〜５８０９；１０３９８；６９６８〜６９６９；１０３９９；８１２８〜８１２９；１０４００；９２７４〜９２８７；３５０４〜３５０５；３５２０〜３５２１；３５３６〜３５３７；３５５２〜３５５３；３５６８〜３６６９；３５８４〜３５８５；３６００〜３６０１；３６１６〜３６１７；３６３２〜３６３３；３６４８〜３６４９；３６６４〜３６６５；３６８０〜３６８１；３６９６〜３６９７；９５２８〜９５２９；９６４０〜９６４１；９７５２〜９７５３；９８６４〜９８６５；９９７６〜９９７７；１００８８〜１００８９；１０２００〜１０２０１；１０３１２〜１０３１３；１０４０３；１０４１０；１０４１７；１０４２４；１０４３１；１０４３８；１０４４５；１０４５２；１０４５９；１０４６６；１０４７３；１０４８０；１０４８７；１０４９４；１０５０１；１０５０８；１０５１５；１０５２２；１０５２９；１０５３６；１０５４３；２３４４〜２３４５；２３６０〜２３６１；２３７６〜２３７７；２３９２〜２３９３；２４０８〜２４０９；２４２４〜２４２５；２４４０〜２４４１；２４５６〜２４５７；２４７２〜２４７３；２４８９〜２４９０；２５０４〜２５０５；２５２０〜２５２１；２５３６〜２５３７；９５１２〜９５１３；９６２４〜９６２５；９７３６〜９７３７；９８４８〜９８４９；９９６０〜９９６１；１００７２〜１００７３；１０１８４〜１０１８５；１０２９６〜１０２９７；１０４０２；１０４０９；１０４１６；１０４２３；１０４３０；１０４３７；１０４４４；１０４５１；１０４５８；１０４６５；１０４７２；１０４７９；１０４８６；１０４９３；１０５００；１０５０７；１０５１４；１０５２１；１０５２８；１０５３５；１０５４２；４６６４〜４６６５；４６８０〜４６８１；４６９６〜４６９７；４７１２〜４７１３；４７２８〜４７２９；４７４４〜４７４５；４７６０〜４７６１；４７７６〜４７７７；４７９２〜４７９３；４８０８〜４８０９；４８２４〜４８２５；４８４０〜４８４１；４８５６〜４８５７；９５４４〜９５４５；９６５６〜９６５７；９７６８〜９７６９；９８８０〜９８８１；９９９２〜９９９３；１０１０４〜１０１０５；１０２１６〜１０２１７；１０３２８〜１０３２９；１０４０４；１０４１１；１０４１８；１０４２５；１０４３２；１０４３９；１０４４６；１０４５３；１０４６０；１０４６７；１０４７４；１０４８１；１０４８８；１０４９５；１０５０２；１０５０９；１０５１６；１０５２３；１０５３０；１０５３７；１０５４４；５８２４〜５８２５；５８４０〜５８４１；５８５６〜５８５７；５８７２〜５８７３；５８８８〜５８８９；５９０４〜５９０５；５９２０〜５９２１；５９３６〜５９３７；５９５２〜５９５３；５９６８〜５９６９；５９８４〜５９８５；６０００〜６００１；６０１６〜６０１７；９５６０〜９５６１；９６７２〜９６７３；９７８４〜９７８５；９８９６〜９８９７；１０００８〜１０００９；１０１２０〜１０１２１；１０２３２〜１０２３３；１０３４４〜１０３４５；１０４０５；１０４１２；１０４１９；１０４２６；１０４３３；１０４４０；１０４４７；１０４５４；１０４６１；１０４６８；１０４７５；１０４８２；１０４８９；１０４９６；１０５０３；１０５１０；１０５１７；１０５２４；１０５３１；１０５３８；１０５４５；７０３３；７０４８〜７０４９；７０６４〜７０６５；７０８０〜７０８１；７０９６〜７０９７；７１１２〜７１１３；７１２８〜７１２９；７１４４〜７１４５；７１６０〜７１６１；７１７６〜７１７７；９５７６〜９５７７；９６８８〜９６８９；９８００〜９８０１；９９１２〜９９１３；１００２４〜１００２５；１０１３６〜１０１３７；１０２４８〜１０２４９；１０３６０〜１０３６１；１０４０６；１０４１３；１０４２０；１０４２７；１０４３４；１０４４１；１０４４８；１０４５５；１０４６２；１０４６９；１０４７６；１０４８３；１０４９０；１０４９７；１０５０４；１０５１１；１０５１８；１０５２５；１０５３２；１０５３９；１０５４６；８１４４〜８１４５；８１６０〜８１６０；８１７６〜８１７７；８１９２〜８１９３；８２０８〜８２０９；８２２４〜８２２５；８２４０〜８２４１；８２５６〜８２５７；８２７２〜８２７３；８２８８〜８２８９；８３０４〜８３０５；８３２０〜８３２１；８３３６〜８３３７；９５９２〜９５９３；９７０４〜９７０５；９８１６〜９８１７；９９２８〜９９２９；１００４０〜１００４１；１０１５２〜１０１５３；１０２６４〜１０２６５；１０３７６〜１０３７７；１０４０７；１０４１４；１０４２１；１０４２８；１０４３５；１０４４２；１０４４９；１０４５６；１０４６３；１０４７０；１０４７７；１０４８４；１０４９１；１０４９８；１０５０５；１０５１２；１０５１９；１０５２６；１０５３３；１０５４０；１０５４７；９２８８〜９２８９；１０４０１；１０５５３；１０５８２〜１０５８３；１０５７９〜１０５８０；１０５８５〜１０５８６；１０５８８〜１０５８９；１０５９１〜１０５９２；１０５９４〜１０５９５；１０５９７〜１０５９８；１０５５４〜１０５７４；１０６０１；１０６０２；１０６１５；１０６１６；１０６２９；１０６３０；１０６４３；１０６４４；１０６５７；１０６５８；１０６７１；１０６７２；１０６８５；１０６８６；１０６９９；１０７００；１０７１３；１０７１４；１０７２７；１０７２８；１０７４１；１０７４２；１０７５５；１０７５６；１０７６９；１０７７０；１０７８３；１０７８４；１０７９７；１０７９８；１０８１１；１０８１２；１０８２５；１０８２６；１０８３９；１０８４０；１０８５３；１０８５４；１０８６７；１０８６８；１０８８１；１０８８２；１０６０３；１０６０４；１０６１７；１０６１８；１０６３１；１０６３２；１０６４５；１０６４６；１０６５９；１０６６０；１０６７３；１０６７４；１０６８７；１０６８８；１０７０１；１０７０２；１０７１５；１０７１６；１０７２９；１０７３０；１０７４３；１０７４４；１０７５７；１０７５８；１０７７１；１０７７２；１０７８５；１０７８６；１０７９９；１０８００；１０８１３；１０８１４；１０８２７；１０８２８；１０８４１；１０８４２；１０８５５；１０８５６；１０８６９；１０８７０；１０８８３；１０８８４；１０６０５；１０６０６；１０６１９；１０６２０；１０６３３；１０６３４；１０６４７；１０６４８；１０６６１；１０６６２；１０６７５；１０６７６；１０６８９；１０６９０；１０７０３；１０７０４；１０７１７；１０７１８；１０７３１；１０７３２；１０７４５；１０７４６；１０７５９；１０７６０；１０７７３；１０７７４；１０７８７；１０７８８；１０８０１；１０８０２；１０８１５；１０８１６；１０８２９；１０８３０；１０８４３；１０８４４；１０８５７；１０８５８；１０８７１；１０８７２；１０８８５；１０８８６；１０６０７；１０６０８；１０６２１；１０６２２；１０６３５；１０６３６；１０６４９；１０６５０；１０６６３；１０６６４；１０６７７；１０６７８；１０６９１；１０６９２；１０７０５；１０７０６；１０７１９；１０７２０；１０７３３；１０７３４；１０７４７；１０７４８；１０７６１；１０７６２；１０７７５；１０７７６；１０７８９；１０７９０；１０８０３；１０８０４；１０８１７；１０８１８；１０８３１；１０８３２；１０８４５；１０８４６；１０８５９；１０８６０；１０８７３；１０８７４；１０８８７；１０８８８；１０６０９；１０６１０；１０６２３；１０６２４；１０６３７；１０６３８；１０６５１；１０６５２；１０６６５；１０６６６；１０６７９；１０６８０；１０６９３；１０６９４；１０７０７；１０７０８；１０７２１；１０７２２；１０７３５；１０７３６；１０７４９；１０７５０；１０７６３；１０７６４；１０７７７；１０７７８；１０７９１；１０７９２；１０８０５；１０８０６；１０８１９；１０８２０；１０８３３；１０８３４；１０８４７；１０８４８；１０８６１；１０８６２；１０８７５；１０８７６；１０８８９；１０８９０；１０６１１；１０６１２；１０６２５；１０６２６；１０６３９；１０６４０；１０６５３；１０６５４；１０６６７；１０６６８；１０６８１；１０６８２；１０６９５；１０６９６；１０７０９；１０７１０；１０７２３；１０７２４；１０７３７；１０７３８；１０７５１；１０７５２；１０７６５；１０７６６；１０７７９；１０７８０；１０７９３；１０７９４；１０８０７；１０８０８；１０８２１；１０８２２；１０８３５；１０８３６；１０８４９；１０８５０；１０８６３；１０８６４；１０８７７；１０８７８；１０８９１；１０８９２；９３０４〜９３０５；９３２０〜９３２１；９３３６〜９３３７；９３５２〜９３５３；９３６８〜９３６９；９３８４〜９３８５；９４００〜９４０１；９４１６〜９４１７；９４３２〜９４３３；９４４８〜９４４９；９４６４〜９４６５；９４８０〜９４８１；９４９６〜９４９７；９６０８〜９６０９；９７２０〜９７２１；９８３２〜９８３３；９９４４〜９９４５；１００５６〜１００５７；１０１６８〜１０１６９；１０２８０〜１０２８１；１０３９２〜１０３９３；１０４０８；１０４１５；１０４２２；１０４２９；１０４３６；１０４４３；１０４５０；１０４５７；１０４６４；１０４７１；１０４７８；１０４８５；１０４９２；１０４９９；１０５０６；１０５１３；１０５２０；１０５２７；１０５３４；１０５４１；１０５４８のいずれかに係る核酸配列、又は前記核酸配列のいずれかに対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む項目１から１２のいずれか記載の人工核酸分子。
１４．配列番号１１０１１〜１１０４２；１１２４９〜１１２８０１１１３１〜１１１６２；１１３６７〜１１３９８；１１４８５〜１１５１６；１１６０３〜１１６３４；１１７２１〜１１７５２；１１８３９〜１１８７０；１１０４４〜１１１１６；１１２８２〜１１３５４；１１１６４〜１１２３６；１１４００〜１１４７２；１１５１８〜１１５９０；１１６３６〜１１７０８；１１７５４〜１１８２６；１１８７２〜１１９４４；１１０１１〜１１０４２；１１２４９〜１１２８０；１１０４４〜１１１１６；１１２８２〜１１３５４；１１１３１〜１１１６２；１１３６７〜１１３９８；１１４８５〜１１５１６；１１６０３〜１１６３４；１１７２１〜１１７５２；１１８３９〜１１８７０；１１１６４〜１１２３６；１１４００〜１１４７２；１１５１８〜１１５９０；１１６３６〜１１７０８；１１７５４〜１１８２６；１１８７２〜１１９４４；１１１２０〜１１１２２；１１２４０；１１２４１；１１３５８；１１３５９；１１４７６；１１４７７；１１５９４；１１５９５；１１７１２；１１７１３；１１８３０；１１８３１；１１９４８；１１９４９；１１１２３〜１１１３０；１１３６０〜１１３６６；１１２４２〜１１２４８；１１４７８〜１１４８４；１１５９６〜１１６０２；１１７１４〜１１７２０；１１８３２〜１１８３８；１１９５０〜１１９５６のいずれかに係る核酸配列、又は前記核酸配列のいずれかに対して、好ましさが高くなる順で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む項目１から１３のいずれか記載の人工核酸分子。
１５．ＲＮＡである項目１から１４のいずれか記載の人工核酸分子。
１６．モノ−、ビ−、又はマルチシストロン性である項目１５に記載のＲＮＡ。
１７．ｍＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、又はレプリコンＲＮＡである項目１４から１５のいずれかに記載のＲＮＡ。
１８．修飾された核酸、好ましくは安定化された核酸である項目１から１７のいずれかに記載の人工核酸。
１９．−前記人工核酸の少なくとも１つのコード領域のＧ／Ｃ含量が、対応する野生型核酸の対応するコード配列のＧ／Ｃ含量と比較して増加している、及び／又は
−前記人工核酸の少なくとも１つのコード領域のＣ含量が、対応する野生型核酸の対応するコード配列のＣ含量と比較して増加している、及び／又は
−前記人工核酸の少なくとも１つのコード領域中のコドンが、ヒトのコドン使用に適合されており、コドン適合度指数（ＣＡＩ）が、好ましくは、前記人工核酸の少なくとも１つのコード配列において増加又は最大化されている、
−前記人工核酸によってコードされるアミノ酸配列が、好ましくは、対応する野生型人工核酸によってコードされるアミノ酸配列と比較して変化しない、
項目１から１８のいずれかに記載の人工核酸、好ましくはＲＮＡ。
２０．５’−キャップ構造、好ましくはｍ７ＧｐｐｐＮ又はＣａｐ１を含む項目１から１９のいずれかに記載の人工核酸、好ましくはＲＮＡ。
２１．少なくとも１つのヒストンステムループを含む項目１から２０のいずれかに記載の人工核酸、好ましくはＲＮＡ。
２２．前記少なくとも１つのヒストンステムループが、以下の式（Ｉ）又は（ＩＩ）に係る核酸配列を含む項目２１に記載の人工核酸、好ましくはＲＮＡ：
式（Ｉ）（ステム境界エレメントを含まないステムループ配列）：
【化７】
2020513824.tif 000039
式（ＩＩ）（ステム境界エレメントを含むステムループ配列）：
【化８】
2020513824.tif 000040
式中、
ステム１又はステム２の境界エレメントＮ１−６は、１〜６個、好ましくは２〜６個、より好ましくは２〜５個、更により好ましくは３〜５個、最も好ましくは４〜５個、又は５個のＮの連続配列であり、各Ｎは、互いに独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、及びＣから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチド類似体から選択され、
ステム１［Ｎ０−２ＧＮ３−５］は、エレメントステム２に対して逆相補的であるか又は部分的に逆相補的であり、且つ５〜７個のヌクレオチドの連続配列であり、
Ｎ０−２は、０〜２個、好ましくは０〜１個、より好ましくは１個のＮの連続配列であり、各Ｎは、互いに独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、及びＣから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチド類似体から選択され、
Ｎ３−５は、３〜５個、好ましくは４〜５個、より好ましくは４個のＮの連続配列であり、各Ｎは、互いに独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、及びＣから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチド類似体から選択され、
Ｇは、グアノシン又はその類似体であり、任意に、シチジン又はその類似体によって置換されてもよいが、但し、その場合、ステム２におけるその相補的ヌクレオチドであるシチジンも、グアノシンによって置換され、
ループ配列［Ｎ０−４（Ｕ／Ｔ）Ｎ０−４］は、エレメントステム１とステム２との間に位置し、且つ３〜５個のヌクレオチド、より好ましくは４個のヌクレオチドの連続配列であり、
各Ｎ０−４は、互いに独立して、０〜４個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個のＮの連続配列であり、各Ｎは、互いに独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、及びＣから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチド類似体から選択され、
Ｕ／Ｔは、ウリジン又は任意にチミジンを表し、
ステム２［Ｎ３−５ＣＮ０−２］は、エレメントステム１に対して逆相補的であるか又は部分的に逆相補的であり、且つ５〜７個のヌクレオチドの連続配列であり、
Ｎ３−５は、３〜５個、好ましくは４〜５個、より好ましくは４個のＮの連続配列であり、各Ｎは、互いに独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、及びＣから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチド類似体から選択され、
Ｎ０−２は、０〜２個、好ましくは０〜１個、より好ましくは１個のＮの連続配列であり、各Ｎは、互いに独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、Ｇ、若しくはＣから選択されるヌクレオチド、又はこれらのヌクレオチド類似体から選択され、
Ｃは、シチジン又はその類似体であり、任意に、グアノシン又はその類似体によって置換されてもよいが、但し、その場合、ステム１におけるその相補的ヌクレオチドであるグアノシンも、シチジンによって置換され、
ステム１及びステム２が、互いに塩基対合でき、
逆相補的配列を形成して、塩基対合がステム１とステム２との間で生じ得る、又は
部分的に逆相補的な配列を形成して、不完全な塩基対合がステム１とステム２との間で生じ得る。
２４．前記少なくとも１つのヒストンステムループが、以下の式（Ｉａ）又は（ＩＩａ）に係る核酸配列を含む項目１９から２０のいずれかに記載の人工核酸、好ましくはＲＮＡ：
式（Ｉａ）（ステム境界エレメントを含まないステムループ配列）：
【化９】
2020513824.tif 000041
式（ＩＩａ）（ステム境界エレメントを含むステムループ配列）：
【化１０】
2020513824.tif 000042
２５．任意に、ポリ（Ａ）配列を含み、前記ポリ（Ａ）配列が、好ましくは１０〜２００、１０〜１００、４０〜８０、又は５０〜７０個のアデノシンヌクレオチドを含む項目１から２４のいずれかに記載の人工核酸、好ましくはＲＮＡ。
２６．任意に、ポリ（Ｃ）配列を含み、前記ポリ（Ｃ）配列が、好ましくは１０〜２００、１０〜１００、２０〜７０、２０〜６０、又は１０〜４０個のシトシンヌクレオチドを含む項目１から２５のいずれかに記載の人工核酸、好ましくはＲＮＡ。
２７．以下のエレメントを、好ましくは５’から３’方向に含む項目１から２６のいずれかに記載の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ：
ａ）５’−キャップ構造、好ましくはｍ７ＧｐｐｐＮ又はＣａｐ１；
ｂ）本明細書に定義される５’−ＵＴＲに由来する核酸配列を含む又はからなる、好ましくは配列番号１；３；５；７；９；１１；１３；１５；１７；１９；又は２１に係る核酸配列、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に対応する核酸配列を含む５’−ＵＴＲエレメント；
ｃ）本明細書に定義される少なくとも１つのコード配列；
ｄ）本明細書に定義される３’−ＵＴＲに由来する核酸配列を含む又はからなる、好ましくは配列番号１５；１７；１９；２１；２９；３１；３３又は３５に係る核酸配列、又はそのホモログ、断片、若しくは変異体に対応する核酸配列を含む５’−ＵＴＲエレメント；
ｅ）任意に、ポリ（Ａ）テール、好ましくは１０〜１０００、１０〜５００、１０〜３００、１０〜２００、１０〜１００、４０〜８０、又は５０〜７０個のアデノシンヌクレオチドからなる；
ｆ）任意に、ポリ（Ｃ）テール、好ましくは１０〜２００、１０〜１００、２０〜７０、２０〜６０、又は１０〜４０個のシトシンヌクレオチドからなる；及び
ｇ）任意に、ヒストンステムループ（ＨＳＬ）。
２８．項目１から２６のいずれかに記載の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡと、薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤とを含むことを特徴とする組成物。
２９．前記人工核酸分子、好ましくはＲＮＡが、１以上のカチオン性又はポリカチオン性化合物、好ましくはカチオン性又はポリカチオンポリマー、カチオン性又はポリカチオン性ペプチド又はタンパク質、例えば、プロタミン、カチオン性又はポリカチオン性多糖類、及び／又はカチオン性又はポリカチオン性脂質と複合体化される項目２８に記載の組成物。
３０．前記人工核酸分子、好ましくはＲＮＡの、前記１以上カチオン性又はポリカチオン性ペプチド又はタンパク質に対するＮ／Ｐ比が、約０．３〜４、約０．５〜２、約０．７〜２、及び約０．７〜１．５の範囲を含む約０．１〜１０の範囲である項目２９に記載の組成物。
３１．前記人工核酸分子、好ましくはＲＮＡが、１以上の脂質と複合体を形成し、それによってリポソーム、脂質ナノ粒子、及び／又はリポプレックスを形成する項目２８から３０のいずれかに記載の組成物。
３２．少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）又はそれをコードする核酸を更に含み、前記ｇＲＮＡが、対象の標的ＤＮＡ配列又はそれに機能可能に連結された調節エレメントにＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を標的化することができる項目２８から３１のいずれかに記載の組成物。
３３．項目１から２７のいずれかに記載の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ、又は項目２８から３２のいずれかに記載の組成物、及び任意に液体ビヒクル及び／又は任意に前記人工核酸分子又は前記組成物の投与及び用量に関する情報を含む技術的指示を含むことを特徴とするキット、好ましくはキットオブパーツ。
３４．リンゲルラクタート溶液を一部として含む項目３３に記載のキット。
３５．ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）又はそれをコードする核酸を更に含み、前記ｇＲＮＡが、対象の標的ＤＮＡ配列又はそれに機能可能に連結された調節エレメントにＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を標的化することができる項目３３から３４のいずれかに記載のキット。
３６．医薬として使用するための、項目１から２７のいずれかに記載の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ、項目２８から３２のいずれかに記載の組成物、又は項目３３から３５に記載のキット。
３７．遺伝子治療において使用するための、項目１から２７のいずれかに記載の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ、項目２８から３２のいずれかに記載の組成物、又は項目３３から３５に記載のキット。
３８．（ａ）前記人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ、前記組成物、又は前記キット、及び（ｂ）ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）又はそれをコードする核酸を、それを必要とする患者に投与することを含み、前記ｓｇＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を目的遺伝子、又はそれに機能可能に連結された調節エレメントに標的化することができる、目的遺伝子の発現を調節する方法における使用のための項目１から２７のいずれかに記載の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ、項目２８から３２のいずれかに記載の組成物、又は項目３３から３５に記載のキット。
３９．医薬として使用するための、又は前記少なくとも１つのコード配列によってコードされるＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質の発現による治療が有効な疾患、障害、又は状態における遺伝子治療における使用のための、項目１から２７のいずれかに記載の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ、項目２８から３２のいずれかに記載の組成物、又は項目３３から３５に記載のキット。
４０．医薬として使用するための、又は目的遺伝子をノックイン、ノックアウト、又は操作する又は目的遺伝子の発現を調節することが有効である疾患、障害、又は状態の遺伝子治療において使用するための、項目１から２７のいずれかに記載の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ、項目２８から３２のいずれかに記載の組成物、又は項目３３から３５に記載のキット。
４１．前記疾患、障害、又は状態が、遺伝病、癌、自己免疫疾患、炎症性疾患、及び感染症から選択される項目４０に記載の使用のための人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ、組成物、又はキット。
４２．前記コードされたＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質の発現を、任意に遺伝子治療において、上昇させるための、項目１から２７のいずれかに記載の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ、項目２８から３２のいずれかに記載の組成物、又は項目３３から３５に記載のキットの使用。
４３．前記コードされたＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質によって標的化される目的遺伝子の発現を調節するための、項目１から２７のいずれかに記載の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ、項目２８から３２のいずれかに記載の組成物、又は項目３３から３５のいずれかに記載のキットの使用。
４４．ａ）項目１から２７のいずれかに記載の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡを提供する工程と；
ｂ）ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を目的の標的ＤＮＡ配列、又はそれに機能可能に連結された調節エレメントを標的にすることができるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）又はそれをコードする核酸を提供する工程と；
ｃ）目的遺伝子の発現効率を調節するのに適した条件下で、細胞、組織、又は生物を、前記人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ、及び、前記ｇＲＮＡ又はそれをコードする核酸に接触させる工程とを含む目的遺伝子の発現を調節することを特徴とする方法。
４５．障害を治療又は予防する方法であって、それを必要とする被験体に、項目１から２７のいずれかに記載の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡ、項目２８から３２のいずれかに記載の組成物、又は項目３３から３５のいずれかに記載のキットの有効量と、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を目的の標的ＤＮＡ配列又はそれに機能可能に連結された調節エレメントに標的化することができるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）又はそれをコードする核酸とを投与することを含むことを特徴とする方法。
４６．前記障害が、前記コードされたＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質の発現による治療が有効な、好ましくは前記ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質が標的とする目的遺伝子の発現の調節による治療が有効な疾患、障害、又は状態である項目４５に記載の方法。
４７．前記障害が、目的遺伝子をノックイン、ノックアウト、若しくは操作する、又は目的遺伝子の発現を変化させることが有効である疾患、障害、又は状態である項目４５から４６のいずれかに記載の方法。
４８．ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードするコード領域を含む人工核酸分子、好ましくはＲＮＡの発現効率を上昇させるための方法であって、
（ａ）前記コード領域を、ＡＴＰ５Ａ１、ＲＰＬ３２、ＨＳＤ１７Ｂ４、ＳＬＣ７Ａ３、ＮＯＳＩＰ、又はＮＤＵＦＡ４からなる群から選択される遺伝子の５’ＵＴＲ、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、又は変異体に由来する少なくとも１つの５’ＵＴＲエレメントと会合させることと；
（ｂ）前記コード領域を、ＧＮＡＳ、ＣＡＳＰ１、ＰＳＭＢ３、ＡＬＢ、又はＲＰＳ９からなる群から選択される遺伝子の３’ＵＴＲ、又はその対応するＲＮＡ配列、ホモログ、断片、又は変異体に由来する少なくとも１つの３’ＵＴＲエレメントと会合させることと；
（ｃ）項目１から４７のいずれかに記載の人工核酸分子、好ましくはＲＮＡを得ることとを含むことを特徴とする方法。
【０５２１】
実施例
以下に、本発明の様々な実施形態及び態様を説明する具体例を提示する。しかし、本発明は、本明細書に記載する特定の実施形態によって範囲が限定されるものではない。以下の調製及び実施例は、当業者が本発明をより明確に理解し、実施することができるように与えられるものである。しかし、本発明は、例示される実施形態によって範囲が限定されるものではなく、前記実施形態は、本発明の１つの態様を説明することのみを意図し、機能的に等価な方法は、本発明の範囲内である。実際、本明細書に記載するものに加えて本発明の様々な変形例は、前述の記載、添付図面、及び以下の実施例から当業者に容易に明らかになる。全てのかかる変形例は、添付の特許請求の範囲の範囲内である。
【０５２２】
実施例１：インセルウェスタン及びウェスタンブロット分析を用いた、ＨｅＬａ、Ｈｅｋ２９３Ｔ、及びＨｅｐＧ２細胞でのＣａｓ９発現の検出
細胞を、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｂｌａｃｋ  ｗ  ／  Ｃｌｅａｒ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｂｏｔｔｏｍ；  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）中、Ｈｅｌａは、１０，０００細胞／ウェルの密度で、Ｈｅｋ２９３ＴとＨＥＰＧ２は、２０，０００細胞／ウェルで、互換性のある完全細胞培地（２００μｌ）に播種した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で２４時間維持した。トランスフェクション当日、完全培地を５０μｌの無血清Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）で交換した。各ｍＲＮＡ、即ち、配列番号１４２７４（ＲＰＬ３２／ＡＬＢ７．１）、配列番号１４２７５（ＨＳＤ１７Ｂ４／ＣＡＳＰ１．１）、配列番号１４２７６（ＳＬＣ７Ａ３．１／ＰＳＭＢ３．１）、配列番号１４２７７（ＳＬＣ７Ａ３．１／ＣＡＳＰ１．１）、配列番号１４２７８（ＮＯＳＩＰ．１／ＰＳＭＢ３．１）、配列番号１４２７９（ＮＤＵＦＡ４．１／ＲＰＳ９．１）、配列番号１４２８０（ＮＤＵＦＡ４．１／ＰＳＭＢ３．１）、配列番号１４２８１（ＨＳＤ１７Ｂ４／ＰＳＭＢ３．１）、及び配列番号１４２８２（ＨＳＤ１７Ｂ４／ＲＰＳ９．１）の１００ｎｇを、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭの５０μｌ中、リポフェクタミン３０００をｍＲＮＡ：リポフェクタミン３０００の比が１：１．５で用いて、リポ複合体化した。次いで、リポ複合体化ｍＲＮＡを対応する９６ウェルプレートに添加した。トランスフェクションの３時間後、前記完全培地を１００μｌの完全細胞培地で交換した。インセルウェスタンを行う前に、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で２４時間更に維持した。
【０５２３】
インセルウェスタン分析（ＨｅＬａ及びＨｅｋ２９３Ｔ）では、細胞をＰＢＳ１Ｘで２回洗浄し、メタノール／アセトン（１：１）の溶液で１０分間固定した。固定後、続いて細胞をＰＢＳ１Ｘで３回、それぞれ５分間洗浄した。非特異的結合を避けるため、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００を添加したＯｄｙｓｓｅｙブロッキングバッファ（ＰＢＳ、ＬＩ−ＣＯＲ）で室温にて１時間細胞をブロッキングし、次いで、一次抗体、即ち、ｓｐＣａｓ９（１／１０００；＃６３２６０６；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ／Ｔａｋａｒａ）に対するポリクローナルウサギ抗体と共に１時間半インキュベートした。続いて、細胞をＰＢＳ１Ｘ中の０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で５分間、穏やかな振とう（８０ｒｐｍ）下にて４回洗浄した。
【０５２４】
その後、二次抗体、即ち、ｉｎｆｒａｒｅｄ  ｄｙｅ（登録商標）８００ＣＷヤギ抗ウサギポリクローナル抗体（１／２５０；ＬＩ−ＣＯＲ）を、ＯｄｙｓｓｅｙブロッキングバッファでＣｅｌｌ−Ｔａｇ  ７００  Ｓｔａｉｎ（１／５０００；ＬＩ−ＣＯＲ）と混合し、遮光下で室温にて１時間インキュベートした。Ｏｄｙｓｓｅｙ（登録商標）ＣＬｘ  Ｉｍａｇｉｎｇシステム（ＬＩ−ＣＯＲ）を使用してスキャンする前に、前記したように洗浄工程を行った。Ｉｍａｇｅ  ＳｔｕｄｉｏＴＭ  Ｌｉｔｅソフトウェアを使用して、相対的な定量化（８００／７００）を得た。ｍＲＮＡなしでリポフェクションされたウェルから得られたバックグラウンド蛍光を測定値から差し引き、結果を、市販のＣａｓ９コードＲＮＡ（ＴｒｉＬｉｎｋ  ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＬＬＣ、カタログ番号Ｌ−６１２５）からの発現と比較した。
【０５２５】
ＨｅｐＧ２細胞では、ウェスタンブロットを使用して分析を行った。プレートをＰＢＳ１Ｘで２回洗浄し、室温で２０分間、ベンゾナーゼエンドヌクレアーゼ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を含む５０μｌのサンプルローディングバッファ１Ｘ（Ｂｉｏｒａｄ）と直接インキュベートした。次いで、プレートを９５℃で５分間インキュベートし、遠心分離した。
【０５２６】
１５μｌのライセートを１０％Ｍｉｎｉ−Ｐｒｏｔｅａｎ  ＴＧＸゲル（Ｂｉｏｒａｄ）で泳動し、ニトロセルロース膜に移した（１００Ｖ；９０分間）。膜をＰＢＳ中の０．１  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００でそれぞれ１０分間３回洗浄し、ＰＢＳ１Ｘ中の１０％ミルクにて４℃で一晩飽和させた。
【０５２７】
ＰＢＳ１Ｘ中の５％ミルク中のｓｐＣａｓ９（１／１０００；＃６３２６０６；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ／Ｔａｋａｒａ）に対するポリクローナルウサギ抗体及びコントロールマウスモノクローナル抗ベータアクチン抗体（１／１００００；ａｂ６２７６；Ａｂｃａｍ）を室温で１時間インキュベートした。続いて、膜をＴＢＳ１Ｘ中の０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄した。ｉｎｆｒａｒｅｄ  ｄｙｅ（登録商標）８００ＣＷヤギ抗ウサギポリクローナル抗体及びｉｎｆｒａｒｅｄ  ｄｙｅ（登録商標）ヤギ抗マウス抗体（１／７５００及び１／１００００をそれぞれ検出に使用した）。Ｏｄｙｓｓｅｙ（登録商標）ＣＬｘ  Ｉｍａｇｉｎｇシステム（ＬＩ−ＣＯＲ）を使用してスキャンする前に、以下に説明する洗浄工程を３回繰り返した。ＳｔｕｄｉｏＴＭ  Ｌｉｔｅソフトウェア（ＬＩ−ＣＯＲ）を使用して、バンド強度と相対定量を行った。
【０５２８】
本発明に係るＵＴＲの組合せを含むＣａｓ９コードｍＲＮＡは、市販のＣａｓ９ｍＲＮＡ（図６）と比較して非常に優れた発現上昇（図１、図３、図７）を示す。
【０５２９】
実施例２：ウェスタンブロット分析を使用したＨｅＬａ細胞におけるＣａｓ９発現の検出
Ｈｅｌａ細胞を１２ウェルプレート（Ｎｕｎｃ；  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）に、完全細胞培地（ＲＰＭＩ；１０％ウシ胎児血清；１％ペニシリン／ストレプトマイシン及び１％Ｌ−グルタミン；Ｌｏｎｚａ）中のＨｅｌａが最終密度２００，０００細胞／ウェルで播種した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で２４時間維持した。トランスフェクション当日、完全培地を７５０μｌの無血清Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）で交換した。本発明のＵＴＲの組合せ（図の凡例を参照）を含むＣａｓ９コードｍＲＮＡ、即ち、配列番号１４２７４（ＲＰＬ３２／ＡＬＢ７．１）、配列番号１４２７５（ＨＳＤ１７Ｂ４／ＣＡＳＰ１．１）、配列番号１４２７６（ＳＬＣ７Ａ３．１／ＰＳＭＢ３．１）、配列番号１４２７７（ＳＬＣ７Ａ３．１／ＣＡＳＰ１．１）、配列番号１４２７８（ＮＯＳＩＰ．１／ＰＳＭＢ３．１）、配列番号１４２７９（ＮＤＵＦＡ４．１／ＲＰＳ９．１）、配列番号１４２８０（ＮＤＵＦＡ４．１／ＰＳＭＢ３．１）、配列番号１４２８１（ＨＳＤ１７Ｂ４／ＰＳＭＢ３．１）、及び配列番号１４２８２（ＨＳＤ１７Ｂ４／ＲＰＳ９．１）の１μｇを、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  ２５０μｌ中リポフェクタミン３０００をｍＲＮＡ：リポフェクタミン３０００の比が１：１．５で用いてリポ複合体化した。次に、リポ複合体化ｍＲＮＡを各ウェルに添加した。トランスフェクションの３時間後、完全培地を１ｍｌの完全細胞培地で交換した。タンパク質抽出を行う前に、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で２４時間更に維持した。
【０５３０】
ウェルをＰＢＳ１Ｘで２回洗浄し、室温で２０分間、ベンゾナーゼエンドヌクレアーゼ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を含む１００μｌのサンプルローディングバッファ１Ｘ（Ｂｉｏｒａｄ）と直接インキュベートした。細胞を掻き取り、溶解物をエッペンドルフチューブに移した。次に、サンプルを９５℃で５分間変性させ、氷中で５分間冷却し、最大速度で２分間遠心分離してからロードした。
【０５３１】
１５μｌのライセートを１０％Ｍｉｎｉ−Ｐｒｏｔｅａｎ  ＴＧＸゲル（Ｂｉｏｒａｄ）で泳動し、ニトロセルロース膜に移した（１００Ｖ；９０分間）。膜をＰＢＳ中の０．１  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００でそれぞれ１０分間３回洗浄し、ＰＢＳ１Ｘ中の１０％ミルクにて４℃で一晩飽和させた。
【０５３２】
ＰＢＳ１Ｘ中の５％ミルク中のｓｐＣａｓ９（１／１０００；＃６３２６０６；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ／Ｔａｋａｒａ）に対するポリクローナルウサギ抗体及びマウスモノクローナル抗ベータアクチン抗体（１／１００００；ａｂ６２７６；Ａｂｃａｍ）を室温で１時間インキュベートした。続いて、膜をＴＢＳ１Ｘ中の０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄した。ｉｎｆｒａｒｅｄ  ｄｙｅ（登録商標）８００ＣＷヤギ抗ウサギポリクローナル抗体及びｉｎｆｒａｒｅｄ  ｄｙｅ（登録商標）ヤギ抗マウス抗体（１／７５００及び１／１００００をそれぞれ検出に使用した）。Ｏｄｙｓｓｅｙ（登録商標）ＣＬｘ  Ｉｍａｇｉｎｇシステム（ＬＩ−ＣＯＲ）を使用してスキャンする前に、以下に説明する洗浄工程を３回繰り返した。ＳｔｕｄｉｏＴＭ  Ｌｉｔｅソフトウェア（ＬＩ−ＣＯＲ）を使用して、バンド強度と相対定量を行った。
【０５３３】
本発明のｍＲＮＡからのＣａｓ９発現を、市販のＣａｓ９コードＲＮＡ（ＴｒｉＬｉｎｋ  ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＬＬＣ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｌ−６１２５）からの発現と比較した。本発明に係るＵＴＲの組合せを含むＣａｓ９コードｍＲＮＡは、市販のＣａｓ９ｍＲＮＡ（図８、図９）と比較して非常に優れた発現上昇を示す（図２、図４、図５）。
【０５３４】
実施例３：ミスマッチ検出アッセイを使用したインビトロｓｐＣａｓ９活性の決定
細胞を、完全細胞培地（ＲＰＭＩ２００μｌ、１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１％Ｌ−グルタミン、Ｌｏｎｚａ）で、Ｈｅｌａの密度５０，０００細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種した。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間維持した。トランスフェクション当日、ｓｐＣａｓ９ｍＲＮＡ（配列番号１４２７４＝ＲＰＬ３２／ＡＬＢ７．１、配列番号１４２８１＝ＨＳＤ１７Ｂ４／ＰＳＭＢ３．１の１００ｎｇ（各ｍＲＮＡは、１回、追加の酵素的ポリアデニル化なしで、１回、追加の酵素的ポリアデニル化ありで；参照として市販のＣａｓ９コードＲＮＡ  ＴｒｉＬｉｎｋ  ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＬＬＣ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｌ−６１２５を使用）を、ＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）ｍＲＮＡトランスフェクション（Ｍｉｒｕｓ  Ｂｉｏ）を使用して、ヒトペプチジルプロリルイソメラーゼＢ（ＰＰＩＢ、即ち、シクロフィリンＢ；Ｄｈａｒｍａｃｏｎ；ＳＯ−２５４４６４６Ｇ）に対するｃｒＲＮＡ（２５ｎＭ）と、ｔｒａｃｒＲＮＡ（２５ｎＭ；Ｄｈａｒｍａｃｏｎ；Ｕ−００２０００−２０）の混合物でリポ複合体化した。ネガティブコントロールとして、トランスフェクション混合物ではｓｐＣａｓ９ｍＲＮＡ又はガイドＲＮＡ、或いはその両方を除いた。最終体積１０μｌを９６ウェルプレートの培地に添加した。トランスフェクションの３時間後、完全培地を１００μｌの完全細胞培地で交換した。細胞抽出を行う前に、細胞を更に３７℃、５％ＣＯ２で２４時間維持した。
【０５３５】
ウェルをＰＢＳ１Ｘで１回洗浄し、１ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ及び０．５ｍｇ／ｍｌ  ＲＮＡｓｅ  Ａ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を含むＰｈｕｓｉｏｎ  ＨＦバッファ１Ｘを１００μｌ使用して、細胞を５６℃で３０分間溶解した。溶解の最後に９５℃で５分間の変性工程を追加した。
【０５３６】
細胞溶解物５μｌを、ヒトＰＰＩＢ（Ｅｄｉｔ−Ｒ  ＰＰＩＢ  ｃｒＲＮＡ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｋｉｔ；ＵＫ−００７０６０；Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）及びＰｈｕｓｉｏｎ  ｈｏｔ−ｓｔａｒｔ  ＩＩ  ｈｉｇｈ  ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）に対する特異的プライマーを使用したｈＰＰＩＢ断片のＰＣＲ増幅に使用した。増幅のためのＰＣＲ条件は、以下の通りである：
１）変性工程：９８℃で３分間；
２）タッチダウンＰＣＲサイクル反応１０×（変性９８℃で１０秒間；タッチダウンアニーリング７２℃〜１℃／サイクルで１５秒間、伸長７２℃で３０秒間）；
３）通常のＰＣＲサイクル反応２５ｘ（変性９８℃で１０秒間；アニーリング６２℃で１５秒間；伸長７２℃で３０秒間）；
４）７２℃で１０分間最終延長。
次いで、ＰＣＲサンプルを９５℃で１０分間加熱し、室温で１５分間超ゆっくりと冷却した。
【０５３７】
ミスマッチ検出アッセイは、３７℃で２５分間のインキュベーション期間中に、１０μｌのＰＣＲ反応物、ＮＥＢバッファ２及びＴ７エンドヌクレアーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を使用して行った。全反応量を直ちに２％アガロースゲルで泳動した。予想されるバンドは、５０５ｂｐ（編集なし）又はそれぞれ３３０ｂｐと１７４ｂｐ（編集あり）であった。
【０５３８】
本発明のＵＴＲの組合せを含むｍＲＮＡから発現したｓｐＣａｓ９は、標的ＤＮＡを編集することができ、機能的であった（図１０Ａ、Ｂ）。
【０５３９】
実施例４：インセルウェスタンを使用したＨｅＬａ、Ｈｅｋ２９３Ｔ、及びＨｅｐＧ２細胞におけるＣｐｆ１発現の検出
細胞を、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｂｌａｃｋ  ｗ  ／  Ｃｌｅａｒ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｂｏｔｔｏｍ；  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）中、Ｈｅｌａは、１０，０００細胞／ウェルの密度で、ＨｅｐＧ２とＨｅｋ２９３Ｔは、２０，０００細胞／ウェルで、前に使用した互換性のある完全細胞培地（２００μｌ）に播種した。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間維持した。トランスフェクション当日、ｍＲＮＡ、即ち、配列番号１０５４９（ＲＰＬ３２／ＡＬＢ７）、配列番号１４２８９（Ｍｐ６８／Ｇｎａｓ．１）、配列番号１４２９０（Ｎｄｕｆａ４．１／ＰＳＭＢ３．１）、配列番号１４２９１（ＨＳＤ１７Ｂ４／Ｇｎａｓ．１）、配列番号１４２９２（ＨＳＤ１７Ｂ４／ＰＳＭＢ３．１）、及び配列番号１４２９３（Ｎｄｕｆａ４．１／Ａｌｂ７）（ＨｅＬａ及びＨｅｋ２９３Ｔ細胞のトランスフェクション用）の１００ｎｇ、及びｍＲＮＡ、即ち、同一配列番号（ＨｅｐＧ２）の５００ｎｇを、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ５０μｌ中のリポフェクタミンメッセンジャーマックスをｍＲＮＡ：リポフェクタミンメッセンジャーマックスの比が１：１．５で使用して、リポ複合体化した。次いで、リポ複合体化ｍＲＮＡを対応する９６ウェルプレートに添加した。インセルウェスタンを行う前に、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で２４時間更に維持した。
【０５４０】
インセルウェスタン分析（ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、及びＨｅｋ２９３Ｔ）では、細胞をＰＢＳ１Ｘで３回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで１０分間固定した。固定後、続いて細胞をＰＢＳ１Ｘで３回、それぞれ５分間洗浄し、ＰＢＳ中の２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００で１５分間透過処理した。非特異的結合を避けるために、細胞を、Ｏｄｙｓｓｅｙブロッキングバッファ（ＰＢＳ、ＬＩ−ＣＯＲ）で室温にて１時間ブロッキングし、次いで、一次抗体、即ち、ＨＡに対するポリクローナルウサギ抗体（１／１０００；Ｈ６９０８；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）と共に１時間半インキュベートした。続いて、細胞をＰＢＳ１Ｘ中の０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で５分間、穏やかな振とう（８０ｒｐｍ）下で４回洗浄した。
【０５４１】
その後、二次抗体、即ち、ｉｎｆｒａｒｅｄ  ｄｙｅ（登録商標）８００ＣＷヤギ抗ウサギポリクローナル抗体（１／５００；ＬＩ−ＣＯＲ）を、Ｏｄｙｓｓｅｙブロッキングバッファ中でＣｅｌｌ−Ｔａｇ  ７００  Ｓｔａｉｎ（１／５０００；ＬＩ−ＣＯＲ）と混合し、遮光下で室温にて１時間インキュベートした。Ｏｄｙｓｓｅｙ（登録商標）ＣＬｘ  Ｉｍａｇｉｎｇシステム（ＬＩ−ＣＯＲ）を使用してスキャンする前に、前記したように洗浄工程を行った。Ｉｍａｇｅ  ＳｔｕｄｉｏＴＭ  Ｌｉｔｅソフトウェアを使用して、相対的な定量化（８００／７００）を得た。ｍＲＮＡなしでリポフェクションしたウェルから得られたバックグラウンド蛍光を測定値から差し引き、結果を、標準ｍＲＮＡからの発現と比較した。
【０５４２】
本発明に係るＵＴＲの組合せを含むＣｐｆ１コードｍＲＮＡは、参照Ｃｐｆ１ｍＲＮＡ  ＲＰＬ３２／Ａｌｂ７と比較して非常に優れた強力な発現上昇を示す。図１１及び図１２（ＨｅｐＧ２及びＨｅＬａ細胞）から明らかなように、発現は、％としてＲＰＬ３２／ＡＬＢ７に対して示される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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