(57)【要約】  検討される治療組成物及び方法は、感作遺伝子修飾ＮＫ細胞及び組換えＩＬ−１２の同時投与を対象とし、遺伝子修飾ＮＫ細胞は、好ましくはＩＬ−２への構成的曝露によって感作されており、ＩＬ−１２は組換えウイルスから発現され、又はＩＬ−１２−抗体コンジュゲートとして投与される。このような治療は、感作ＮＫ細胞によるＩＦＮγ分泌を増加させ、有利にはＮＫＧ２Ｄの発現もまた増加させる。【選択図】図３Ｂ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子修飾ＮＫ細胞を刺激する方法であって、
遺伝子修飾ＮＫ細胞をＩＬ−２に構成的に曝露させ、それによって前記遺伝子修飾ＮＫ細胞をＩＬ−１２に感作させるステップと；
前記感作細胞をＩＬ−１２に曝露させ、前記感作細胞によるインターフェロンγ（ＩＦＮγ）分泌を刺激するステップと
を含んでなる、方法。
【請求項２】
前記感作細胞をＩＬ−１２に曝露させる前記ステップが、ＮＫＧ２Ｄの発現を増加させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記遺伝子修飾ＮＫ細胞がａＮＫ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記遺伝子修飾ＮＫ細胞が、少なくとも１００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２に構成的に曝露される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＩＬ−２がＰＥＧ化ＩＬ−２である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記遺伝子修飾ＮＫ細胞が、ＩＬ−２の細胞内発現によってＩＬ−２に構成的に曝露される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記遺伝子修飾ＮＫ細胞がｈａＮＫ細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＩＬ−１２が組換えウイルスに感染した細胞から発現され、前記組換えウイルスが前記ＩＬ−１２をコードする配列セグメントを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記組換えウイルスが、腫瘍及び患者特異的抗原、腫瘍関連抗原、及び腫瘍特異的抗原の少なくとも１つをコードする第２の配列セグメントを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＩＬ−１２が抗体に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗体ががん細胞に結合する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記遺伝子修飾ＮＫ細胞が生体外で前記ＩＬ−２に曝露され、前記感作細胞が患者に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記感作細胞が生体外で前記ＩＬ−１２に曝露され、前記感作細胞が患者に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
がんを治療する方法であって、
感作遺伝子修飾ＮＫ細胞をがんと診断された個人に投与するステップであって、前記遺伝子修飾ＮＫ細胞がＩＬ−２への構成的曝露によって感作されるステップと、
ＩＬ−１２抗体コンジュゲート又は組換えウイルスをＩＬ−１２をコードする前記個人に投与して、前記感作遺伝子修飾ＮＫ細胞によるインターフェロンγ（ＩＦＮγ）分泌を刺激するステップと
を含んでなる、方法。
【請求項１５】
前記組換えウイルスから発現された前記ＩＬ−１２抗体又は前記ＩＬ−１２が、ＮＫＧ２Ｄの発現を増加させる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記遺伝子修飾ＮＫ細胞がａＮＫ細胞である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記遺伝子修飾ＮＫ細胞が、少なくとも１００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２に構成的に曝露される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＩＬ−２がＰＥＧ化ＩＬ−２である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記遺伝子修飾ＮＫ細胞が、ＩＬ−２の細胞内発現によってＩＬ−２に構成的に曝露される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記遺伝子修飾ＮＫ細胞がｈａＮＫ細胞である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ＩＬ−１２抗体コンジュゲートが投与される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
前記抗体ががん細胞に結合する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記組換えウイルスが、腫瘍及び患者特異的抗原、腫瘍関連抗原、及び腫瘍特異的抗原の少なくとも１つをコードする配列セグメントを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２４】
前記遺伝子修飾ＮＫ細胞が生体外で前記ＩＬ−２に曝露され、前記感作細胞が患者に投与される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２５】
前記感作細胞が生体外で前記ＩＬ−１２に曝露され、前記感作細胞が患者に投与される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２６】
がんの免疫療法で使用するための感作遺伝子修飾ＮＫ細胞であって、前記遺伝子修飾ＮＫ細胞がＩＬ−２への構成的曝露によって感作され、前記構成的曝露が（ａ）ＩＬ−２の培地への連続的又は半連続的な添加によって生物活性ＩＬ−２の濃度を実質的に一定に維持すること、又は（ｂ）ＩＬ−２の細胞内発現によって実施され、前記免疫療法がＩＬ−１２又はＩＬ−１２抗体コンジュゲートを発現する組換えウイルスを使用する、感作遺伝子修飾ＮＫ細胞。
【請求項２７】
前記遺伝子修飾ＮＫ細胞がａＮＫ細胞である、請求項２６に記載の感作細胞。
【請求項２８】
前記遺伝子修飾ＮＫ細胞が、少なくとも１００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２（２００／５００／１，０００）への構成的曝露によって感作される、請求項２６に記載の感作細胞。
【請求項２９】
前記遺伝子修飾ＮＫ細胞がＰＥＧ化ＩＬ−２によって感作される、請求項２６に記載の感作細胞。
【請求項３０】
前記遺伝子修飾ＮＫ細胞がＩＬ−２の細胞内発現によって感作される、請求項２６に記載の感作細胞。
【請求項３１】
前記遺伝子修飾ＮＫ細胞がｈａＮＫ細胞である、請求項３０に記載の感作細胞。
【請求項３２】
前記組換えウイルスが、腫瘍及び患者特異的抗原、腫瘍関連抗原、及び腫瘍特異的抗原の少なくとも１つをコードする配列セグメントをさらに含む、請求項２６に記載の感作細胞。
【請求項３３】
前記免疫療法が前記ＩＬ−１２抗体コンジュゲートを使用する、請求項２６に記載の感作細胞。
【請求項３４】
前記抗体ががん細胞に結合する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
哺乳類におけるＮＫ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞の活性を増加させる方法であって、前記哺乳類の細胞に複数の組換えウイルス粒子を感染させるステップであって、各ウイルス粒子が、前記組換えウイルス粒子に感染した細胞内でＩＬ−１２の発現を駆動するプロモーター配列に作動可能に結合するＩＬ−１２をコードする、組換え核酸セグメントを含んでなるステップを含んでなり；
前記ＮＫ細胞が、ａＮＫ細胞、ｈａＮＫ細胞、及びｔａＮＫ細胞からなる群から選択される、同種異系ＮＫ９２誘導細胞であり；
前記複数の組換えウイルス粒子が、前記ウイルスに感染した前記哺乳類の前記ＮＫ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞上のＮＫＧ２Ｄの発現を増加させる、前記感染細胞内の一定量のＩＬ−１２の発現を引き起こすのに十分である、方法。
【請求項３６】
前記組換えウイルス粒子が遺伝子修飾アデノウイルスＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］粒子である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞を感染させる前記ステップが生体外で実施され、前記感染細胞が患者に投与される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＮＫ細胞が、ｈａＮＫ細胞である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
ＮＫ細胞及びＴ細胞の、ＮＫＧ２Ｄベースの細胞傷害性を増加させる医薬品を前記患者に投与するステップをさらに含んでなる、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
前記医薬品が、ＩＬ−１５、ＩＬ−２、ドキソルビシン、又はグルテンペプチド断片である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記細胞が少なくとも１０１１個のウイルス粒子で感染される、請求項３５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１７年３月２７日に出願された、本発明者らの同時係属米国仮特許出願第６２／４７７，２３２号明細書の優先権を主張する。
【０００２】
本発明の分野は、ナチュラルキラー細胞及び免疫刺激性サイトカイン、特に活性化ＮＫ細胞及びＩＬ−１２を使用したがん治療及び方法である。
【背景技術】
【０００３】
背景説明は、本発明を理解するのに有用であってもよい情報を含む。これは、本明細書で提供される情報のいずれかが先行技術であること、又は現在請求されている発明に関連があること、又は具体的に若しくは暗黙的に参照される出版物が先行技術であることを認めるものではない。
【０００４】
本明細書の全ての刊行物及び特許出願は、あたかも個々の刊行物又は特許出願が参照により援用されることが具体的且つ個別に示されているかのように、参照により援用される。援用される参考文献の用語の定義又は使用が一貫していないか、又はここで提供されているその用語の定義に反している場合、ここで提供されているその用語の定義が適用され、参考文献におけるその用語の定義は適用されない。
【０００５】
より最近では、遺伝子修飾ＮＫ細胞による細胞ベースのがん治療法は、特に、活性化ＮＫ細胞（ａＮＫ細胞）、高親和性ＣＤ１６受容体を有する遺伝子修飾ＮＫ細胞（ｈａＮＫ細胞）、又はキメラ抗原受容体（ｔａＮＫ細胞）などのＮＫ９２誘導体が使用された場合の肯定的な治療転帰のために注目を集めている。このような細胞ベースの治療法は、概念的に魅力的であるものの、腫瘍微小環境及びその他の患者特異的要素は、細胞傷害性活性をしばしば低下させ、ＮＫ９２細胞の細胞傷害性を調節するための様々な試みがなされている。
【０００６】
インターロイキン−２（ＩＬ−２）及びインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）は、Ｔ細胞やナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などの非修飾免疫細胞を刺激することによって、強力な抗腫瘍効果を生じさせることが知られているサイトカインである。どちらのサイトカインもＴ細胞の増殖を刺激するが、ＮＫ細胞によるインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）の産生、そして最終的にＩＬ−２とＩＬ−１２による、細胞溶解活性、刺激効果の大きさ、及びスペクトルは異なる（例えば、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．５８：２２５−２３３；１９９５を参照されたい）。ＩＬ−２は増殖及び細胞溶解活性のより強力な刺激因子であるが、ＩＬ−１２は非修飾ＮＫ細胞及び活性化Ｔ細胞からのＩＦＮ−γのより強力な誘導因子である。ＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡは、ＩＬ−２及びＩＬ−１２で共刺激されたＮＫ細胞における安定性を向上させることが示された（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍａｒ．２００２，ｐ．１７４２−１７５３を参照されたい）。しかし、生体外で使用されるＩＬ−２及びＩＬ−１２の濃度は、生体内で達成可能なレベル又は望ましいレベルでさえも必ずしも反映しない可能性がある。実際に、ＩＬ−２の全身投与は、比較的高い毒性及び毛細血管漏出症候群に関連付けられ、いくつかの死亡例がＩＬ−１２の投与に帰するとされている。さらに、様々なサイトカインに対する初代ＮＫ細胞の応答は、ＮＫ細胞腫瘍細胞であるＮＫ９２細胞の応答と必ずしも同じでない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、細胞ベースの治療薬、特にＮＫ細胞ベースの治療薬を使用して、臨床的に安全な様式でＮＫ細胞が刺激される、がんを治療する組成物及び方法の必要性が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の主題は、ＮＫ細胞活性化の様々な組成物及び方法に関し、特にＩＬ−２への構成的曝露、好ましくは生体内で発現された又は抗体にコンジュゲートされたＩＬ−１２へのさらなる曝露による、ａＮＫ細胞及びその他の遺伝子修飾ＮＫ９２誘導体の活性化に関する。したがって、予備調整細胞は、実質的なＩＦＮ−γ分泌を示し、さもなければａＮＫ細胞を投与される患者へのＩＬ−２及びＩＬ−１２の生体内投与によって遭遇する、全身毒性を回避した。さらに、このように活性化されたＮＫ細胞は、ＮＫＧ２Ｄ発現を増加させ、それは内在的細胞傷害性をさらに増強した。
【０００９】
本発明の主題の一態様では、本発明者らは、遺伝子修飾ＮＫ細胞をＩＬ−２に構成的に曝露させ、それによって遺伝子修飾ＮＫ細胞をＩＬ−１２に感作させる１つのステップと、感作細胞をＩＬ−１２に曝露させ、感作細胞によるインターフェロンγ（ＩＦＮγ）分泌を刺激する別のステップを含む、遺伝子修飾ＮＫ細胞を刺激する方法を検討する。最も典型的には、感作細胞をＩＬ−１２に曝露させるステップは、ＮＫＧ２Ｄの発現もまた増加させる。
【００１０】
いくつかの実施形態では、遺伝子修飾ＮＫ細胞はａＮＫ細胞であり、遺伝子修飾ＮＫ細胞は、少なくとも１００、又は少なくとも２００、又は少なくとも５００、又は少なくとも１，０００ＩＵ／ｍｌの濃度でＩＬ−２に構成的に曝露される。さらに、ＩＬ−２はＰＥＧ化ＩＬ−２であってもよいことが検討される。代案としては、遺伝子修飾ＮＫ細胞はまた、ＩＬ−２の細胞内発現によって、ＩＬ−２に構成的に曝露されてもよい。したがって、検討される遺伝子修飾ＮＫ細胞は、ｈａＮＫ細胞もまた含む。
【００１１】
ＩＬ−１２は、組換えウイルスに感染している細胞から発現させてもよく、組換えウイルスはＩＬ−１２をコードする配列セグメントを含む。このような場合、組換えウイルスが、腫瘍及び患者特異的抗原、腫瘍関連抗原、及び腫瘍特異的抗原の少なくとも１つをコードする、第２の配列セグメントを含むことも検討される。代案としては、又はそれに加えて、ＩＬ−１２は、好ましくはがん細胞に結合する抗体に結合してもよい。遺伝子修飾ＮＫ細胞が生体外でＩＬ−２に曝露されること、及び感作細胞が患者に投与されること、及び／又は感作細胞が生体外でＩＬ−１２に曝露されること、そして感作細胞が患者に投与されることもさらに検討される。
【００１２】
したがって、本発明の主題の別の態様では、発明者らは、遺伝子修飾ＮＫ細胞がＩＬ−２への構成的曝露によって感作された、感作遺伝子修飾ＮＫ細胞をがんと診断された個人に投与するステップと、ＩＬ−１２抗体コンジュゲート又は組換えウイルスをＩＬ−１２をコードする個人に投与して、感作遺伝子修飾ＮＫ細胞によるインターフェロンγ（ＩＦＮγ）分泌を刺激する別のステップとを含む、がんを治療する方法もまた検討する。典型的には、組換えウイルスから発現されるＩＬ−１２抗体又はＩＬ−１２も、ＮＫＧ２Ｄの発現を増加させるであろう。ＮＫ細胞、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、及び投与方法に関しては、上記と同じ考察事項が当てはまる。
【００１３】
したがって、別の観点から見ると、本発明者らは、遺伝子修飾ＮＫ細胞がＩＬ−２への構成的曝露によって感作され、免疫療法がＩＬ−１２又はＩＬ−１２抗体コンジュゲートを発現する組換えウイルスを使用する、がんの免疫療法で使用するための感作遺伝子修飾ＮＫ細胞もまた検討する。最も典型的には、このような細胞は、少なくとも１００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２への構成的曝露によって、ＰＥＧ化ＩＬ−２によって、又はＩＬ−２の細胞内発現によって、感作されてもよい、ａＮＫ細胞である。したがって、適切な遺伝子修飾ＮＫ細胞としてはまた、ｈａＮＫ細胞も挙げられる。適切な組換えウイルスは、腫瘍及び患者特異的抗原の少なくとも１つをコードする配列セグメント、腫瘍関連抗原、及び腫瘍特異的抗原をさらに含んでもよく、及び／又は免疫療法はＩＬ−１２抗体コンジュゲートを使用してもよく、抗体は好ましくはがん細胞に結合する。
【００１４】
本発明の主題のさらに別の態様では、本発明者らは、哺乳類におけるＮＫ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞の活性を増加させる方法もまた検討する。好ましい方法は、哺乳類の細胞を複数の組換えウイルス粒子に感染させるステップを含み、各ウイルス粒子は、組換えウイルス粒子に感染した細胞内でＩＬ−１２の発現を駆動するプロモーター配列に作動可能に結合したＩＬ−１２をコードする、組換え核酸セグメントを含んでなる。最も典型的には、複数の組換えウイルス粒子は、ウイルスに感染した哺乳類のＮＫ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞上のＮＫＧ２Ｄの発現を増加させる、感染細胞内の一定量のＩＬ−１２の発現を引き起こすのに十分である（典型的には、少なくとも１０１０個又は１０１１個のウイルス粒子。本発明の主題に限定するものではないが、典型的には、組換えウイルス粒子は、遺伝子修飾アデノウイルスＡｄ５［Ｅ１−，Ｅ２ｂ−］粒子であることが好ましい。所望であれば、細胞を感染させるステップは生体外で実施され、次に感染細胞が患者に投与されてもよい。適切なＮＫ細胞としては、同種異系ＮＫ９２誘導体細胞（例えば、ａＮＫ細胞、ｈａＮＫ細胞、ｔａＮＫ細胞）が挙げられることが検討される。さらに、このような方法は、ＮＫ細胞及びＴ細胞の、ＮＫＧ２Ｄベースの細胞傷害性を増加させる医薬品（例えば、ＩＬ−１５、ＩＬ−２、ドキソルビシン、又はグルテンペプチド断片）を患者に投与するステップをさらに含むことが検討される。
【００１５】
本発明の主題の様々な目的、特徴、態様、及び利点は、同様の数字が同様の構成要素に相当する添付の図面と共に、以下の好ましい実施形態の詳細な説明からより明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ−１Ｂ】ＩＬ−２への事前の構成的曝露なしでＩＬ−１２刺激に応答した、ａＮＫ細胞のＩＦＮγ分泌の欠如を示す例示的なグラフである。
【図２Ａ−２Ｂ】ＩＬ−２への事前の構成的曝露ありでＩＬ−１２刺激に応答した、ｈａＮＫ細胞の高いＩＦＮγ分泌を示す例示的なグラフである。
【図３Ａ−３Ｂ】ＩＬ−２への事前の構成的曝露なし（３Ａ）、及びＩＬ−２への事前の構成的曝露あり（３Ｂ）でＩＬ−１２刺激に応答した、ａＮＫ／ｈａＮＫ細胞の高いＩＦＮγ分泌を示す例示的なグラフである。
【図４】様々なサンプルにおけるＩＬ−１２発現を示す、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの例示的な写真である。
【図５Ａ−５Ｂ】Ａｄ５［Ｅ１−，Ｅ２ｂ−］−ＩＬ−１２に感染させた非ヒト霊長類（ＮＨＰ）の体重（５Ａ）及び体温（５Ｂ）を描写するグラフである。
【図６】Ａｄ５［Ｅ１−，Ｅ２ｂ−］−ＩＬ−１２に感染させた非ヒト霊長類の血清ＩＬ−１２レベルを描写するグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明者らは、今や、ＮＫ細胞、特に遺伝子修飾ＮＫ９２細胞が、ＩＬ−１２曝露に応答して効果的に刺激され、ＩＦＮγを分泌し得て、細胞障害性及びＮＫ細胞の活性を促進し得て、ＭＨＣ−Ｉ／ＩＩ発現の増加を通じて抗原提示細胞の抗原提示を増加させ得て、免疫応答をＴｈ１応答に偏らせ得ることを発見した。注目すべきことに、以下でより詳細に考察されるように、様々なＮＫ９２細胞は、定期的に、通常２〜３日毎に（細胞密度に応じて）更新される、ＩＬ−２を含む培地中で既に増殖されている。しかし、これらの細胞はＩＬ−１２に応答性でない。意外にも、ＩＬ−２が構成的又は連続的様式で同一細胞に供給されると、細胞はＩＬ−１２シグナル伝達に対して感受性で、顕著な量のＩＦＮγを産生し、細胞傷害性が増加する。
【００１８】
ＩＬ−２との関連で「構成的曝露」又は「構成的に曝露」という用語は、本明細書の用法では、細胞における又は細胞内の生物活性ＩＬ−２濃度の変動（又はＩＬ−２刺激）が、４８時間にわたり２０％以下であるように、生物活性ＩＬ−２が、連続的（又は半連続的）様式で供給又は産生されることを意味する。したがって、いくつかの実施形態では、細胞における又は細胞内の生物活性ＩＬ−２濃度（又はＩＬ−２刺激）の変動は、４８時間にわたり１５％以下、又は４８時間にわたり１０％以下、又は４８時間にわたり７％以下、又は４８時間にわたり５％以下、又は４８時間にわたり１％以下である。
【００１９】
ＩＬ−２への構成的曝露は、ＩＬ−２への自然曝露により近く似ていると考えられ、ＩＬ−１２への曝露によって引き起こされる、ＩＬ−１２及びＩＦＮγ分泌に対する持続性の感受性をもたらす。対照的に、２〜３日毎に培地が更新される通例のＮＫ−９２細胞培養の状況のように、断続的様式でのＮＫ−９２細胞のＩＬ−２への曝露は、おそらくは、血清タンパク質による結合、又は培地の血清成分（典型的に、ウマ血清及びウシ胎仔血清）に存在する血清プロテアーゼによるタンパク質分解のために、生物活性ＩＬ−２の不活性化及び／又は分解をもたらすこともある。その結果、いかなる理論又は仮説による制限も望まないが、本発明者らは、通例のＮＫ−９２細胞培養条件は、ＮＫ−９２細胞の増殖をサポートする断続的又は「パルス」ＩＬ−２シグナル伝達を促進するが、シグナル伝達してＮＫ−９２細胞をＩＬ−１２及びＩＬ−１２依存性ＩＦＮγ分泌に感作させ、並びにＮＫＧ２Ｄの発現を（非ＩＬ−１２刺激細胞と比較して）増加させる細胞は、サポートしないと考える。
【００２０】
以下でより詳細に示される知見に基づいて、本発明者らは、細胞をＩＬ−２に構成的に曝露させることによって、ＮＫ−９２細胞及びその誘導体をＩＬ−１２及びＩＬ−１２依存性ＩＦＮγ分泌に感作させ、ＮＫＧ２Ｄの発現を増加させ得ることを検討する。例えば、一実施形態では、構成的曝露は、培地へのＩＬ−２の連続的又は半連続的添加によって実施され、それによって生物活性ＩＬ−２の濃度が実質的に一定に維持され得る。したがって、培地中の生物活性ＩＬ−２の濃度は、４８時間にわたり１５％以下、又は１０％以下、又は７％以下、又は５％以下、又は３％以下変化することが検討される。容易に理解されるように、ＩＬ−２の生物活性は、例えばＣＴＬＬ−２細胞増殖アッセイなどの既知の手順を用いて定量化され得る（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００９  Ａｕｇ  ３１；３４８（１−２）：８３−９４）。
【００２１】
ＩＬ−２の連続的又は半連続的な添加は、蠕動ポンプ又は定量注入装置の使用などの多数の様式で実施され得る。代案としては、及び好ましさに劣る態様では、ＩＬ−２の連続的又は半連続的な添加は、頻繁に（例えば、２時間毎、４時間毎、８時間毎など）培地を更新することによって実施され得る。複数回の添加又は連続的な添加が好ましくない場合、本発明者らは、ＩＬ−２を比較的緩慢に放出する配合物を使用して、構成的曝露を達成させ得ることも検討する。例えば、ＮＫＴＲ−２１４（Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ；４５５  Ｍｉｓｓｉｏｎ  Ｂａｙ  Ｂｌｖｄ  Ｓｏｕｔｈ；Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ  ９４１５８）から知られているように、ＩＬ−２の遅延放出（又はタンパク質結合及び／又はプロテアーゼ消化に対する安定性の増加）は、ＩＬ−２のＰＥＧ化によって実施され得る。ここで、ＰＥＧ化ＩＬ−２は、生物活性ＩＬ−２のプロドラッグ形態であると考えられ、それは経時的にＰＥＧ鎖を放出して生物活性ＩＬ−２を生じる（ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１７  Ｊｕｌ  ５；１２（７）：ｅ０１７９４３１）。有利なことに、このようなＰＥＧ化ＩＬ−２は全身投与され得て、ＮＫ／ＮＫ９２細胞及びその誘導体の生体内ＩＬ−２への構成的曝露を可能にする一方で、同時にＩＬ−２の全身性副作用が低減され、又は完全に回避されることすらある。
【００２２】
代案としては、又はそれに加えて、抗体コンジュゲートＩＬ−２は、おそらく血清タンパク質への結合の減少及び血清プロテアーゼによるタンパク質分解の減少のために、安定性を増加させることが示されているので、構成的曝露はまた、このようなコンジュゲートを使用して得られ得ることに留意すべきである。ここでもまた、このような抗体薬物コンジュゲートは、生体内で患者に有利に投与可能である。しかし、この実施形態では（ＮＫＴＲ−２１４とは対照的に）、ＩＬ−２の送達及びそのＮＫ細胞の活性化は、部位に関する限り高い特異性及び選択性で可能である。例えば、このような抗体薬物コンジュゲートは、患者及び腫瘍特異的（すなわち、腫瘍ネオエピトープ）、がん関連、がん特異的、又は腫瘍微小環境で一般的に見られる壊死組織に特異的な、腫瘍マーカーを標的としてもよい。もちろん、このような抗体薬物コンジュゲート中の抗体部分は、完全ＩｇＧ抗体、又はその任意の適切な断片（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２など）であってもよいことを理解すべきである。
【００２３】
容易に理解されるように、このような抗体薬物コンジュゲートは、（例えば、ジスルフィド結合又はヒドラゾン（ｈｙｄｒｏｚｏｎｅ｝、又はタンパク質分解性部位などを介する）切断可能リンカー、又は（例えば、マレイミド修飾ＰＥＧを介する）切断不能リンカーを使用した、化学的コンジュゲーションによって調製されてもよい。代案としては、コンジュゲーションは、重鎖又は軽鎖（若しくはその断片）のＮ又はＣ末端がリンカー部分及びＩＬ−２もインフレームでコードするように修飾される、組換えクローニングを使用して実施されてもよい。したがって、好ましくは腫瘍細胞の構成要素、リンカー、及びＩＬ−２部分に結合する抗体部分を有する、キメラ組換えタンパク質が調製され得る。注目すべきことに、ＩＬ−２との例示的な抗体−薬物コンジュゲートは、以下でより詳細に示されるように、顕著な活性を維持した。
【００２４】
ＩＬ−２の特定形態にかかわりなく、ＮＫ／ＮＫ９２細胞及びそれらの誘導体のＩＬ−２（及びＩＬ−２の修飾形態）への構成的曝露は、（ＣＴＬＬ−２増殖アッセイによる判定で）約１０〜５０ＩＵ／ｍｌ、又は約５０〜１５０ＩＵ／ｍｌ、又は約１５０〜３００ＩＵ／ｍｌ、又は約３００〜５００ＩＵ／ｍｌ、又は約５００〜１，０００ＩＵ／ｍｌ、又はさらにより高い濃度であることが、一般に検討される。さらに、一般に、ＩＬ−２濃度は少なくとも限られた期間にわたり、実質的に一定のままであることが検討される。例えば、生物活性ＩＬ−２の濃度は、７２時間にわたり、又は６０時間にわたり、又は４８時間にわたり、又は３６時間にわたり、又は２４時間にわたり、又は１８時間にわたり、ＩＵ／ｍｌの％変化の測定で、２５％未満、又は２０％未満、又は１５％未満、又は１０％未満、又は７％未満、又は５％未満、又は３％未満変動することが典型的に好ましい。したがって、別の視点から見た場合、生物活性ＩＬ−２の適切な濃度は、細胞培養全体にわたり、５０〜７０ＩＵ／ｍｌ、又は７０〜１００ＩＵ／ｍｌ、又は１００〜１２０ＩＵ／ｍｌ、又は１２０〜１５０ＩＵ／ｍｌ、又は１５０〜２００ＩＵ／ｍｌ、又は２００〜２３０ＩＵ／ｍｌ、又は２３０〜２５０ＩＵ／ｍｌ、又は２５０〜２８０ＩＵ／ｍｌ、又はより高く維持されるであろう。
【００２５】
なおもさらに検討される態様では、ＮＫ／ＮＫ９２細胞及びそれらの誘導体のＩＬ−２への構成的曝露はまた、それぞれの細胞における組換えＩＬ−２の細胞内発現によっても達成され得る。最も好ましくは、細胞内発現は、構成的に活性なプロモーターから駆動され、恒常的発現レベルが達成され、分泌されない形態（すなわち、搬出シグナル配列を欠き、小胞体又は細胞質保持配列を含んでもよい）で発現される。このような細胞内発現は、外部から提供されたＩＬ−２への構成的曝露と同じ機能的影響を細胞に提供すると考えられる。実際に、以下でより詳細に示されるように、発明者らは、ＮＫ９２細胞又は誘導体が、ＩＬ−２を発現し細胞内に保持するように遺伝子操作された場合、ＩＦＮγ分泌及び／又はＮＫＧ２Ｄの発現増加によって測定されるように、細胞がＩＬ１２刺激に対して予想外に感作されたことを発見した。容易に理解されるように、ＩＬ−２の組換え発現及び細胞内保持は多数の様式で実施され得て、このような方法は全て本明細書での使用に適すると見なされる（例えば、Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ  ２０１６  Ｄｅｃ  ２７；７（５２）：８６３５９−８６３７３を参照されたい）。その他の利点の中でも特に、このような組換え細胞が、患者にＩＬ−２を投与する必要なしに、生体内で患者に投与され得ることに留意すべきである。このような修飾細胞はＩＬ−１２に感作され、ＩＬ−１２刺激時にＩＦＮγを分泌するであろう。実際に、ＩＬ−２への構成的曝露（外部又は内部）による感作は、併用免疫療法の状況で治療効果を提供すると考えられるＩＦＮγのかなりの量を提供したが、これは特にそのような刺激された細胞におけるＮＫＧ２Ｄ発現も著しく増加したためである。
【００２６】
ＮＫ細胞に関しては、全てのＮＫ細胞が本明細書での使用に適すると考えられ、したがって患者由来の自己ＮＫ細胞（例えば、全血から単離され、又は当該技術分野で公知の方法を使用して前駆細胞若しくは幹細胞から培養される）と、様々な同種異系ＮＫ細胞とを含むと考えられる。しかし、本発明の主題の好ましい態様では、ＮＫ細胞は、１つ又は複数の望ましい形質を達成するように遺伝子操作され、特にＮＫ−９２細胞及びその誘導体を含む。例えば、適切な遺伝子操作されたＮＫ細胞は、少なくとも１つのキラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）の発現を低減又は消失させるように修飾されたＮＫ−９２誘導体を含み、このような細胞は（阻害の欠如又は低下を介して）構成的に活性化される。
【００２７】
ＮＫ−９２細胞は異例の受容体発現プロファイルを示し、比較的多数の活性化（例えば、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、２Ｂ４、ＮＫＧＤ、ＣＤ２８）受容体を発現する。逆に、ＮＫ−９２細胞はまた、わずかな阻害性受容体（例えば、ＮＫＧＡ／Ｂ、低レベルのＫＩＲ２ＤＬ４、ＩＬＴ−２）のみ発現し、正常なＮＫ細胞上でクローン的に発現されるキラー抑制性受容体（ＫＩＲ）の大部分を欠いている。さらに、ＮＫ−９２は、パーフォリン・グランザイム細胞溶解経路に関与する比較的高レベルの分子、並びに腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーメンバーＦａｓＬ、ＴＲＡＩＬ、ＴＷＥＡＫ、ＴＮＦ−αをはじめとする追加の細胞傷害性エフェクター分子を発現し、代替機序を通じて殺滅する能力が示唆される。さらに、ＮＫ−９２細胞はまた、免疫エフェクター細胞調節に関与するとされるその他の分子（ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０Ｌ、ＴＲＡＮＣＥ）も発現するが、ＮＫ殺滅とそれらの関連性は不明確である。
【００２８】
さらに、適切なＮＫ細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子との相互作用を低減又は消失させるように変異した、１つ又は複数の修飾ＫＩＲを有してもよい。もちろん、１つ又は複数のＫＩＲもまた消去されても、又は発現が抑制されてもよいことに留意すべきである（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡなどを通じて）。最も典型的には、２つ以上のＫＩＲが変異、消去、又は発現停止され、特に検討されるＫＩＲとしては、短い又は長い細胞質尾部がある２つ又は３つのドメインを有するものが挙げられる。別の視点から見た場合、修飾、発現停止、又は消去されるＫＩＲとしては、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＳ３、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＫＩＲ２ＤＳ５、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３、及び／又はＫＩＲ３ＤＳ１が挙げられる。このような修飾細胞は、当該技術分野で周知のプロトコルを用いて調製されてもよい。代案としては、このような細胞は、ａＮＫ細胞（「活性化ナチュラルキラー細胞」）としてＮａｎｔＫｗｅｓｔ（ＵＲＬ  ｗｗｗ．ｎａｎｔｋｗｅｓｔ．ｃｏｍを参照されたい）から商業的に入手されてもよい。
【００２９】
本発明の主題の別の好ましい態様では、遺伝子操作ＮＫ細胞は、高親和性Ｆｃγ受容体（ＣＤ１６）を発現するように修飾されたＮＫ−９２誘導体であってもよい。Ｆｃγ受容体の高親和性変異型の配列は、当該技術分野で周知であり（例えば、Ｂｌｏｏｄ  ２００９  １１３：３７１６−３７２５を参照されたい）、全ての生成及び発現様式は、本明細書での使用に適すると見なされる。このような受容体の発現は、患者の腫瘍細胞（例えば、ネオエピトープ）、特定の腫瘍型（例えば、ｈｅｒ２ｎｅｕ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡなど）に特異的な抗体、又はがんに関連するもの（例えば、ＣＥＡ−ＣＡＭ）を使用して、腫瘍細胞の特異的標的化を可能にすると考えられる。有利なことに、このような抗体は市販されており、（例えば、Ｆｃγ受容体に結合する）細胞と併用され得る。代案としては、このような細胞は、ｈａＮＫ細胞（「高親和性ナチュラルキラー細胞」）としてＮａｎｔＫｗｅｓｔから商業的に入手され得る。
【００３０】
本発明の主題のなおもさらなる態様では、遺伝子操作ＮＫ細胞はまた、遺伝子操作されてキメラＴ細胞受容体を発現してもよい。特に好ましい態様では、キメラＴ細胞受容体は、腫瘍関連抗原、腫瘍特異的抗原、及びがんネオエピトープに対する結合特異性を有する、ｓｃＦｖ部分又は他の外部ドメインを有するであろう。言及されるように、ＮＫ細胞を遺伝子操作して、このようなキメラＴ細胞受容体を発現させる多数の様式があり、全ての方法が本明細書での使用に適すると見なされる。代案としては、このような細胞は、ＮａｎｔＫｗｅｓｔからｔａＮＫ細胞（「標的活性化ナチュラルキラー細胞」）として商業的に入手されてもよい。
【００３１】
細胞が、（例えば、ＣＡＲの発現を通じて）がん関連抗原に対し、又はがん関連抗原に対する特異性を有する抗体に対し、親和性を有するように操作されている場合、全ての既知のがん関連抗原が使用に適すると見なされることが検討される。例えば、がん関連抗原としては、ＣＥＡ、ＭＵＣ−１、ＣＹＰＢ１などが挙げられる。同様に、細胞が、がん特異的抗原に対し、又はがん特異的抗原に対する特異性を有する抗体に対し、親和性を有するように操作されている場合、全ての既知のがん特異的抗原が使用に適すると見なされることが検討される。例えば、がん特異的抗原としては、ＰＳＡ、Ｈｅｒ−２、ＰＳＡ、ブラキウリなどが挙げられる。細胞が、がんネオエピトープに対し、又はがんネオエピトープに対する特異性を有する抗体に対し、親和性を有するように操作されている場合、ネオエピトープを同定する全ての既知の様式が、適切な標的をもたらすことが検討される。例えば、ネオエピトープは、最初のステップで、得られたオミクス情報の同期比較を通じて、腫瘍生検（又はリンパ生検若しくは転移部位生検）及び一致する正常組織（すなわち、同一患者からの非患部組織）の全ゲノム解析によって、患者の腫瘍から同定されてもよい。このように同定されたネオエピトープは、次に患者のＨＬＡ型の一致についてさらにフィルター処理され、ネオエピトープの抗原提示の可能性を高め得る。最も好ましくは、このような一致は、コンピュータを用いて成し得る。さらに、本明細書で検討される全てのＮＫ細胞はまた、（例えば、ＥＲ区画に保持される）非分泌ＩＬ−２を発現するように遺伝子修飾されてもよい。
【００３２】
ＩＬ−１２については、一般に、当該技術分野で周知のプロトコルを用いて、ＩＬ−１２が非経口的及び全身的に投与され得ることが検討される。さらに、ＩＬ−１２はまた、上記のＩＬ−２抗体コンジュゲートについて既述されるように、抗体薬物コンジュゲートとして体内の特定部位に特異的に投与され得る。有利なことに、特定部位へのこのような投与は、免疫刺激が望まれる部位（例えば、がん又は壊死性組織、腫瘍微小環境など）に、刺激されたＮＫ細胞のＩＦＮγ分泌を集中させる。しかし、下でさらに詳述されるように、さらに検討される態様では、自己由来患者細胞又は同種異系免疫コンピテント細胞（例えば、ＮＫ細胞、ＮＫ９２誘導体、ＣＤ８＋及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞、樹状細胞、マクロファージなど）に形質移入され得る組換え発現系から、ＩＬ−１２が発現されることもまた検討される。このような組換え系は、ＩＬ−１２以外のタンパク質をコードする１つ又は複数の配列部分、特に、１つ又は複数の腫瘍又はがん特異的抗原、及び／又は共刺激分子、及び／又はチェックポイント阻害剤もまた含んでもよい。有利なことに、免疫コンピテント細胞が組換えＩＬ−１２を産生する場合、免疫コンピテント細胞と相互作用する刺激されたＮＫ細胞は、ＩＦＮγ分泌を通じて、免疫コンピテント細胞にさらなる活性化を提供してもよいことに留意すべきである。
【００３３】
例えば、本明細書での使用のために特に検討される発現システムとしては、様々なウイルス性形質移入系、最も好ましくはアデノウイルス発現系、又はアデノ随伴、レンチウイルス、及びレトロウイルス発現系などのその他の薬学的に許容可能な発現系が挙げられる。なおもさらに、適切な代替発現系としては、酵母及び人工染色体発現系が挙げられ、さらにはゲノム編集技術を用いて宿主細胞のゲノムに組み込まれる、組換え発現カセットさえ挙げられることが検討される。しかし、本発明の主題の特に好ましい態様では、発現系はアデノウイルス系であり、特に免疫原性が低下したアデノウイルス系である。例えば、適切なアデノウイルス系としては、Ｅ１及びＥ２ｂ遺伝子が欠失しているＡｄ５が挙げられる。ほとんどのウイルスは追加のカーゴも許容するため、ＩＬ−１２の隣に発現され得るタンパク質としては、がん関連抗原、腫瘍及び患者特異的ネオエピトープが挙げられる（それらは全て、好ましくは、患者に関してＨＬＡ適合され、及び／又は患者のＭＨＣ−Ｉ及び／又はＭＨＣ−ＩＩ提示経路に向けられる）。さらに、適切な発現系から発現されてもよい、さらなる検討される追加のタンパク質としては、１つ又は複数の共刺激分子（例えば、Ｂ７．１（ＣＤ８０）、Ｂ７．２（ＣＤ８６）、ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）、ＩＣＯＳ−Ｌ、ＬＦＡ−３（ＣＤ５８）、４−１ＢＢＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４８、ＣＤ７０、ＣＤ１１２、ＣＤ１５５、ＧＩＴＲＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＬ１Ａなど）及び／又は１つ又は複数のチェックポイント阻害剤（例えば、ＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２）又はＰＤ−１（ＣＤ２７９）に結合する、タンパク質又はペプチド）が挙げられる。発現のための追加のタンパク質としては、様々な免疫刺激性サイトカイン、特にＩＬ−２（特に上で既述したように形質移入された細胞内にＩＬ−２が保持される場合）、ＩＬ−１５、及びＩＬ−１５スーパーアゴニスト（ＡＬＴ−８０３など）も挙げられる。
【００３４】
本明細書で検討される発現系における配列要素の特定の配置に関して、ＩＬ−１２は構成的強力プロモーター（例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＵＢＣ、ＥＦ１Ａ、ＰＧＫ、ＣＡＧＧプロモーター）から発現されることが一般に好ましいが、誘導性プロモーターもまた、特に誘導条件が腫瘍微小環境に典型的である場合、本明細書での使用に適すると見なされる。例えば、誘導性プロモーターとしては、低酸素に感受性のプロモーター、及び（例えば、ＴＲＡＦ、ＪＮＫ、Ｅｒｋ、又はその他の応答性要素プロモーターを通じて）ＴＧＦ−β又はＩＬ−８に感受性のプロモーターが挙げられる。その他の例では、適切な誘導性プロモーターとしては、テトラサイクリン誘導性プロモーター、ミクソウイルス耐性１（Ｍｘ１）プロモーターなどが挙げられる。発現のための追加の要素が存在する場合、それらは同一プロモーターから同時発現されてもよく、例えば、内部リボソーム侵入（ＩＲＥＳ）部位がある単一転写物を生成し、又は単一遺伝子転写物、タンデムミニ遺伝子、又は発現に適した任意のその他の配置として、１つ又は複数の別個のプロモーターから転写されてもよい。
【００３５】
なおもさらに検討される態様では、特にウイルス発現系が検討される場合は、一般に、ウイルス系が複製欠損であり、宿主細胞が侵入に適した受容体を有することが好ましい。例えば、ウイルスがアデノウイルス又はコクサッキーウイルスである場合、受容体は典型的には、天然に存在してもよい又は宿主細胞内で組換え核酸から発現されてもよい、ＣＡＲ受容体である。他方、ＩＬ−１２の発現のための組換え核酸が、線状又は環状の「裸の」核酸（例えば、ＤＮＡプラスミド又はＲＮＡ）である場合、従来の形質移入（例えば、リポフェクション、電気穿孔、ソノポレーション、弾道輸送など）が、典型的には好ましい。
【００３６】
患者、同種異系細胞、又は患者細胞への組換えウイルスの投与は、典型的には血清中に検出可能なＩＬ−１２をもたらす量であり、好ましい量は典型的には１０〜１０００ｐｇ／ｍｌの範囲である。例えば、適切な検出可能な血清濃度は、少なくとも１０ｐｇ／ｍｌ、少なくとも２５ｐｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｐｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｐｇ／ｍｌ、又は少なくとも２５０ｐｇ／ｍｌである。しかし、正確な量は一般に、ＭＯＩ、感染細胞の数、プロモーターの強度などに依存する。したがって、特定の血清濃度は、ウイルス粒子の適切な選択及び／又は量、感染細胞の数、プロモーターの選択などによって達成され得ることを認識すべきである。例えば、ウイルスがＡｄ５でありプロモーターがＣＭＶプロモーターである場合、典型的には少なくとも１０８、より典型的には少なくとも１０９、なおもより典型的には１０１０、最も典型的には１０１１個のウイルス粒子が、少なくとも１回、より典型的には２回、又は治療効果に必要な頻度で投与される。しかし、投与は、ＩＬ−２刺激ＮＫ細胞が、発現された、さもなければ投与されたＩＬ−１２と同時に存在するような同時投与であることが、一般に検討される。例えば、ＩＬ−２刺激ＮＫ−９２誘導体（例えば、ａＮＫ細胞、ｈａＮＫ細胞、ｔａＮＫ細胞など）は、ＩＬ−１２、ＩＬ−１２をコードするウイルス、又はＩＬ−１２抗体コンジュゲートと同時投与され得て、それによって、刺激された細胞からのＩＦＮγ分泌も増加させ、並びにこのような細胞におけるＮＫＤ２Ｄ発現を増加させる。さらに、本明細書で検討される治療法としては、腫瘍組織上のＮＫＧ２Ｄリガンドの発現をさらに誘導するための（メトロノミック）低用量化学療法／放射線もまた挙げられる。
【００３７】
したがって、本発明の主題のさらに別の態様では、こうして刺激されたＮＫ細胞は、投与単位あたり、典型的には１０４〜１０１１個、より典型的には１０５〜１０９個の細胞を有する無菌注射用組成物として調合されて、医薬組成物中で使用されてもよい。望ましい場合、これらの細胞は、投与後のさらなる増殖を防ぐために、適切な放射線量で照射されてもよい。しかし、代替製剤もまた、本明細書での使用に適すると見なされ、全ての既知の投与経路及び投与様式が本明細書で検討される。本明細書の用法では、医薬組成物又は薬物を「投与する」という用語は、医薬組成物又は薬物の直接及び間接投与の双方を指し、医薬組成物又は薬物の直接投与は、典型的には、医療従事者（例えば、医師、看護師など）によって行われ、間接投与は、（例えば、腫瘍への注射、輸液、経口送達、局所送達などを通じた）直接投与のために、医療従事者に医薬組成物又は薬物を提供する又は利用可能にするステップを含む。
【００３８】
したがって、本発明者らは、構成的に刺激されたナチュラルキラー細胞とＩＬ−１２とを同時投与する、がんを治療する方法を特に検討し、ＩＬ−１２はＮＫ細胞上のＮＫＧ２Ｄ発現を増加させる用量で投与される。最も典型的には、上記のように、ＩＬ−１２は、以下で例示されるようにＩＬ−１２をコードする組換え核酸で形質移入された（宿主又は同種異系）細胞の発現を通じて、同時投与されることが一般に好ましい。同様に、さらに特に好ましい方法としては、哺乳類におけるＮＫ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞の活性を増加させる方法が挙げられる。このような方法では、哺乳類は、組換えウイルス粒子に感染した細胞内でＩＬ−１２の発現を駆動するプロモーター配列に作動可能に結合するＩＬ−１２をコードする、組換え核酸セグメントをそれぞれ含んでなる、複数の組換えウイルス粒子に感染される。最も典型的には、組換えウイルス粒子の数は、ウイルスに感染した哺乳類のＮＫ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞上のＮＫＧ２Ｄの発現を増加させる、感染細胞内の一定量のＩＬ−１２の発現を引き起こすのに十分である。
【００３９】
検討される方法は、ＩＦＮγ分泌に加えて、様々な細胞、特にＮＫ細胞、ＣＤ８＋、及びＣＤ４＋Ｔ細胞などの免疫コンピテント細胞上でＮＫＤ２Ｄ表面発現を増加させると考えられ、治療は、ＮＫＧ２Ｄリガンドの発現と提示を増加させる１つ又は複数のステップを含んでもよいこともさらに検討される。例えば、好ましい治療は、典型的には、最大耐量の５０％以下、３０％以下、２０％以下、又は１０％以下の用量で実施される、低用量化学療法及び／又は低用量放射線療法を含む。さらに、このような低用量治療は、好ましくは、例えば、隔日、３日毎、又は数週間にわたり週１回などのメトロノミック様式で実施されるであろう。
【実施例】
【００４０】
ＩＬ−１２刺激に応答したＩＦＮ−γ産生：構成的ＩＬ−２曝露のないａＮＫ細胞は、ヒト組換えＩＬ−１２及び選択されたマウス組換えＩＬ−１２−Ａｂコンジュゲート（図１Ａ）、又はヒト組換えＩＬ−１２及び選択されたヒト組換えＩＬ−１２−Ａｂコンジュゲート（図１Ｂ）と共に一晩培養した。２．５×１０５個の細胞を５％ヒト血清を含むＸ−Ｖｉｖｏ  １０の２４ウェルプレートに播種して、細胞を培養した。次に細胞培養上清を収集し、ＥＬＩＳＡによってヒトＩＦＮ−γを測定した。図１Ａ及び１Ｂのグラフから容易に理解できるように、様々な形態のＩＬ−１２への曝露は、有意なＩＦＮγ分泌をもたらさなかった。
【００４１】
さらなる実験セットでは、ｈａＮＫ細胞（すなわち、高親和性ＣＤ１６及び細胞内に保持されるＩＬ−２を発現するａＮＫ細胞誘導体）を、ヒト組換えＩＬ−１２及び選択されたマウス組換えＩＬ−１２−Ａｂコンジュゲート（図２Ａ）、又はヒト組換えＩＬ−１２及び選択されたヒト組換えＩＬ−１２−Ａｂコンジュゲート（図２Ｂ）と共に一晩培養した。２．５×１０５個の細胞を５％ヒト血清を含むＸ−Ｖｉｖｏ  １０の２４ウェルプレートに播種して、細胞を培養した。次に細胞培養上清を収集し、ＥＬＩＳＡによってヒトＩＦＮ−γを測定した。驚くべきことに、図２Ａ及び２Ｂのグラフから容易に理解できるように、ＩＬ−２の細胞内発現を通じた構成的ＩＬ−２曝露は、ａＮＫ細胞をＩＬ−１２シグナル伝達に対して感受性にした。実際に、様々な形態のＩＬ−１２への曝露は、マウスＩＬ−１２及びヒトＩＬ−１２の双方に対して有意なＩＦＮγ分泌をもたらした。予期されたように、ヒトＩＬ−１２は、ｈａＮＫ細胞内でマウスＩＬ−１２よりもやや強いＩＦＮγ分泌を生じた。
【００４２】
図３Ａは、構成的ＩＬ−２曝露のないａＮＫ細胞と構成的ＩＬ−２曝露のあるｈａＮＫ細胞とのデータを比較して示す。さらに別の実験において、本発明者らは、ＩＬ−２発現カセットの安定した組み込みによってａＮＫ細胞を修飾した（高親和性ＣＤ１６変異型を発現しないＮＫ−９２ＭＩ細胞を形成するため）。図３Ｂの結果から分かるように、このような修飾ＮＫ細胞は、ＩＬ−１２シグナル伝達に応答してＩＦＮγを分泌するだけでなく、予想外の大量のＩＦＮγ（２００ｎｇ／ｍｌに近いピーク）も分泌した。ＮＫ９２−ＭＩ産生：粒子媒介遺伝子移入によって、レトロウイルスＭＦＧ−ｈＩＬ−２ベクター中のヒトＩＬ−２  ｃＤＮＡで、ＮＫ−９２細胞を形質移入した。形質移入は安定していた。ＮＫ−９２及びこの誘導体細胞株ＮＫ−９２ＭＩは、次の特性を有した：ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２８、ＣＤ４５、ＣＤ５４、及びＣＤ５６  ｂｒｉｇｈｔについて陽性の表面マーカー；ＣＤ１、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ３４、及びＨＬＡ−ＤＲについて陰性の表面マーカー。
【００４３】
Ａｄ５［Ｅ１−，Ｅ２ｂ−］ベクターにおけるＩＬ−１２の発現：ヒトＩＬ−１２の遺伝子をＡｄ５［Ｅ１−，Ｅ２ｂ−］ウイルスベクター骨格に挿入した（例えば、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．１９９８  Ｆｅｂ；７２（２）：９２６−３３）。Ａｄ５［Ｅ１−，Ｅ２ｂ−］−ＩＬ−１２で感染されたヒト細胞におけるＩＬ−１２の発現が示される図４に見られるように、ヒト細胞（Ａ５４９）をＡｄ５［Ｅ１−，Ｅ２ｂ−］−ＩＬ−１２組換えウイルスで感染させることによってＩＬ−１２の発現を確認し、ウエスタンブロット分析によってＩＬ−１２産生を確認した。より具体的には、Ａ５４９細胞に１０００のＭＯＩでＡｄ５［Ｅ１−，Ｅ２ｂ−］−ＩＬ−１２を感染させ、ウエスタンブロット分析によってＩＬ−１２の発現を確認した。組換えＩＬ−１２を陽性対照として使用し、非感染Ａ５４９細胞が陰性対照の役割を果たした。サンプルは、次の順序で図４に視覚化される：Ａ．１００ｎｇのＩＬ−１２標準物質、Ｂ．５０ｎｇのＩＬ−１２標準物質、Ｃ．２５ｎｇのＩＬ−１２標準物質、Ｄ．陰性、Ｅ．Ａｄ５［Ｅ１−，Ｅ２ｂ−］−ＩＬ−１２溶解産物（１０ｕＬ）、Ｆ．Ａｄ５［Ｅ１−，Ｅ２ｂ−］−ＩＬ−１２溶解産物（１７ｕＬ）、Ｇ．Ａｄ５［Ｅ１−，Ｅ２ｂ−］−ＩＬ−１２溶解産物（２５ｕＬ）。
【００４４】
Ａｄ５［Ｅ１−，Ｅ２ｂ−］−ＩＬ−１２の生体内投与：４匹の非ヒト霊長類（ＮＨＰ）を２週間間隔で２回の１×１０１１ＶＰのＡｄ５［Ｅ１−，Ｅ２ｂ−］−ＩＬ−１２及び４×１０１１ＶＰのＡｄ５［Ｅ１−，Ｅ２ｂ−］−ｇａｇ／ｐｏｌ／ｎｅｆ／ｅｎｖ（５×１０１１ＶＰ）によって、後肢で免疫化した。６０ｋｇのヒト体重及び３．９ｋｇのＮＨＰの平均体重を仮定して、これらのＮＨＰにおける５×１０１１ＶＰ／投与は、ヒトにおける７．７×１０１２ＶＰ／投与のＮＨＰ−対−ヒト対当量である。処置による有害作用をモニターするために、動物の体重及び体温をはじめとする臨床的観察を記録した。動物は、図５Ａに示されるように体重減少を経験せず、又は図５Ｂに見られるようにＡｄ５［Ｅ１−，Ｅ２ｂ−］−ＩＬ−１２及びＡｄ５［Ｅ１−，Ｅ２ｂ−］−ｇａｇ／ｐｏｌ／ｎｅｆ／ｅｎｖの投与後に発熱しなかった。ここで、各線は個々の動物を表す。矢印は、動物にＡｄ５［Ｅ１−，Ｅ２ｂ−］処置を投与した日を示す。また、鼠径部及び腋窩のリンパ節を検査したところ、研究の過程で正常なままであった。これらのデータは、Ａｄ５［Ｅ１−，Ｅ２ｂ−］−ＩＬ−１２が、その他のベクタード導入遺伝子と同時に、非常に高用量でも副作用なしで投与され得ることを示す。ＩＬ−１２の血清レベルは、Ａｄ５［Ｅ１−，Ｅ２ｂ−］−ＩＬ−１２で処置されたＮＨＰにおいて、定量ＥＬＩＳＡによって判定され、例示的結果が図６に示される。より具体的には、４匹のアカゲザルに、２週間間隔で２回の１×１０１１ＶＰのＡｄ５［Ｅ１−，Ｅ２ｂ−］−ＩＬ−１２及び４×１０１１ＶＰのＡｄ５［Ｅ１−，Ｅ２ｂ−］−ｇａｇ／ｐｏｌ／ｎｅｆ／ｅｎｖ（５×１０１１ＶＰ）を後肢に投与した。血清中のＩＬ−１２のレベルは、定量ＥＬＩＳＡによって判定した。日付は、サンプルを試験した日時を指す。
【００４５】
いくつかの実施形態では、本発明の特定の実施形態を説明し請求するために使用される、成分の量、濃度及び反応条件などの特性を表す数字は、場合によっては、「約」という用語によって修飾されるものと理解される。したがって、いくつかの実施形態では、記載された説明及び添付の特許請求の範囲に記載される数値パラメータは、特定の実施形態によって得られることが求められる所望の特性に応じて変化し得る近似値である。いくつかの実施形態では、数値パラメータは、報告された有効桁数に照らして、通常の丸め技術を適用することによって解釈されるべきである。本発明のいくつかの実施形態の広い範囲を示す数値範囲及びパラメータは近似値であるにもかかわらず、具体例に記載される数値は、実行可能な限り正確に報告されている。本発明のいくつかの実施形態で提示される数値は、それぞれの試験測定で見られる標準偏差から必然的に生じる特定の誤差を含むこともある。文脈が逆を示さない限り、本明細書に記載される全ての範囲は、それらの終点を包含すると解釈されるべきであり、開放型の範囲は、商業的に実用的な値を含むと解釈されるべきである。同様に、文脈が逆を示さない限り、値の全てのリストは、中間値を包含すると見なされるべきである。
【００４６】
本明細書の説明及びそれに続く特許請求の範囲を通して使用される「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」の意味は、文脈上例外が明記されていない限り、複数形への言及を含む。また、本明細書の説明で使用される「ｉｎ」の意味は、文脈上例外が明記されていない限り、「ｉｎ」及び「ｏｎ」を含む。さらに、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「に結合する（ｃｏｕｐｌｅｄ  ｔｏ）」という用語は、直接結合（互いに結合される２つの要素が互いに接触する）及び間接結合（少なくとも１つの追加要素が２つの要素の間に配置される）の双方を含むことが意図される。したがって、「に結合する（ｃｏｕｐｌｅｄ  ｔｏ）」及び「と結合する（ｃｏｕｐｌｅｄ  ｗｉｔｈ）」という用語は、同義的に使用される。
【００４７】
本明細書における本発明の概念から逸脱することなく、既述のものに加えてさらに多数の修正が可能であることは、当業者には明らかであるはずである。したがって、本発明の主題は、添付の特許請求の範囲を除いて制限されるべきではない。さらに、本明細書及び特許請求の範囲の双方を解釈する際に、全ての用語は、文脈と一致する可能な限り最も広い様式で解釈されるべきである。特に、「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、要素、構成要素、又はステップを非排他的様式で参照するものとして解釈されるべきであり、参照されている要素、構成要素、若しくはステップが存在しても若しくは利用されてもよく、又は明示的に参照されていないその他の要素、構成要素、又はステップと組み合わされてもよいことを示す。仕様クレームがＡ、Ｂ、Ｃ．．．．及びＮからなる群から選択される少なくとも１つのものを参照する場合、テキストはＡプラスＮ、又はＢプラスＮなどではなく、群からの１つの要素のみが必要であるものと解釈されるべきである。
【図１Ａ−１Ｂ】
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【図２Ａ−２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【国際調査報告】
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