(57)【要約】  本発明は、修飾ヌクレオシドポリリン酸を含む、ＰＣＲ及びＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素−ＰＣＲ）による核酸増幅に使用される安定なヌクレオチド試薬を提供する。本発明はさらに、増幅反応において試料中で標的核酸配列の存在下又は非存在下で検出するために修飾ヌクレオシドポリリン酸を使用する方法も提供する。
2020506666.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料における標的核酸配列の存在又は非存在を検出する方法であって：
ａ）前記試料を増幅試薬と接触させて、前記標的核酸配列が前記試料中に存在する場合は増幅産物を産生することを含む増幅ステップを実施し、
ｂ）前記増幅産物を検出することを含み、
前記増幅試薬は：
【化１】
2020506666.tif 000007
の構造を有する修飾ヌクレオシドポリリン酸を含み、式中、Ｂ＝プリン若しくはピリミジン塩基又は類似体、Ｌ＝リンカー又は存在しない、Ｚ＝標識又は存在しない、Ｒ＝ＯＨ又はＯ−、Ｒ１及びＲ２＝Ｈ又はＯＨ、ｎ＝１〜７、Ｘ＝Ｏ、Ｓ、又はＮＨ、Ｙ＝化学的又は酵素的に除去できる有機部分である、方法。
【請求項２】
Ｘ＝Ｏであり、Ｙ＝還元剤によって化学的に除去できる有機部分である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記還元剤が、ホスフィン誘導体、亜硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ３）、β−メルカプトエタノール及びジチオトレイトールからなる群より選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ホスフィン誘導体がトリス−（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＹがＨＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
Ｘ＝Ｏであり、Ｙ＝エステラーゼにより酵素的に除去できる有機部分である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記エステラーゼがカルボキシルエステラーゼである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
Ｙが、ＣＨ３Ｃ（Ｏ）−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−及びＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ２−からなる群から選択される、請求項６〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
増幅試薬を使用して標的核酸配列を増幅する方法であって、前記増幅試薬が：
【化２】
2020506666.tif 000008
の構造を有する修飾ヌクレオシドポリリン酸を含み、式中、Ｂ＝プリン若しくはピリミジン塩基又は類似体、Ｌ＝リンカー又は存在しない、Ｚ＝標識又は存在しない、Ｒ＝ＯＨ又はＯ−、Ｒ１及びＲ２＝Ｈ又はＯＨ、ｎ＝１〜７、Ｘ＝Ｏ、Ｓ、又はＮＨ、Ｙ＝化学的又は酵素的に除去できる有機部分である、方法。
【請求項１０】
Ｘ＝Ｏであり、Ｙ＝還元剤によって化学的に除去できる有機部分である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記還元剤が、ホスフィン誘導体、亜硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ３）、β−メルカプトエタノール及びジチオトレイトールからなる群より選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ホスフィン誘導体がトリス−（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＹがＨＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−である、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
Ｘ＝Ｏであり、Ｙ＝エステラーゼにより酵素的に除去で得きる有機部分である、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記エステラーゼがカルボキシルエステラーゼである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
Ｙが、ＣＨ３Ｃ（Ｏ）−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−及びＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ２−からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
【化３】
2020506666.tif 000009
の構造を有し、式中、Ｂ＝プリン若しくはピリミジン塩基又は類似体、Ｌ＝リンカー又は存在しない、Ｚ＝標識又は存在しない、Ｒ＝ＯＨ又はＯ−、Ｒ１及びＲ２＝Ｈ又はＯＨ、ｎ＝１〜７、Ｘ＝Ｏ、Ｓ、又はＮＨ、そしてＹが、ＨＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−、ＣＨ３Ｃ（Ｏ）−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−、及びＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ２−からなる群から選択される、修飾ヌクレオシドポリリン酸。
【請求項１８】
ＹがＨＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−である、請求項１７に記載の修飾ヌクレオシドポリリン酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、安定なヌクレオチド試薬、それらの調製法、それらの使用法、及びそれらを含むキットを提供する。ヌクレオチド試薬は、多くの組換えＤＮＡ技術、特にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による核酸増幅で有用である。
【背景技術】
【０００２】
核酸増幅試薬は、典型的には温度感受性成分から構成され、したがって、周囲温度より充分低い温度で保管し輸送しなければならないことが多い。これは、デオキシヌクレオシド三リン酸又はそのリボヌクレオシド三リン酸類似体に特に当てはまる。これらの試薬は、末端から連続してリン酸基が失われることにより分解しやすく、その結果、ヌクレオシド二リン酸及び一リン酸が形成され、どちらも核酸ポリメラーゼの基質として活性ではない。ヌクレオシドポリリン酸の安定性は、末端ホスフェートをエステル化することによってきわめて大幅に改善することができる。例えば、ｇ−メチル−ｄＮＴＰ類似体は、正常なｄＮＴＰを完全に分解するのに充分な熱ストレス条件下で完全に安定であった。しかしながら、末端ホスフェートのエステル形成は、これらのヌクレオチドがある特定のポリメラーゼ酵素の有効な基質として機能する能力に対してマイナスの影響を及ぼす可能性がある。熱的に安定かつ基質として不活性であるか又はもともと低い活性を有しているが、簡単な化学的又は酵素的ステップによって容易に活性化されるヌクレオチド三リン酸を有することが必要とされる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、修飾ヌクレオシドポリリン酸を含むＰＣＲ及びＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素−ＰＣＲ）による核酸増幅に使用される安定なヌクレオチド試薬を提供する。本発明はさらに、増幅反応において試料中の標的核酸配列の存在又は非存在を検出するために修飾ヌクレオシドポリリン酸を使用する方法も提供する。
【０００４】
したがって、一態様において、本発明は、試料を増幅試薬と接触させて、試料中に標的核酸配列が存在する場合は増幅産物を生成し、増幅産物を検出することを含む増幅ステップを実施することを含む、試料における標的核酸配列の存在又は非存在を検出する方法を含み、ここで、増幅試薬は：
【０００５】
【化１】
2020506666.tif 000003
【０００６】
の構造を有する修飾ヌクレオシドポリリン酸を含み、式中、Ｂ＝プリン若しくはピリミジン塩基又は類似体、Ｌ＝リンカー又は存在しない、Ｚ＝標識又は存在しない、Ｒ＝ＯＨ又はＯ−、Ｒ１及びＲ２＝Ｈ又はＯＨ、ｎ＝１〜７、Ｘ＝Ｏ、Ｓ、又はＮＨ、Ｙ＝化学的又は酵素的に除去できる有機部分である。一実施形態において、Ｘ＝Ｏであり、Ｙ＝還元剤によって化学的に除去できる有機部分である。別の実施形態において、還元剤は、ホスフィン誘導体、亜硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ３）、β−メルカプトエタノール及びジチオトレイトールからなるメルカプトエタノールから選択される。別の実施形態において、ホスフィン誘導体はトリス−（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）である。別の実施形態において、ＹはＨＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−である。一実施形態において、Ｘ＝Ｏであり、Ｙ＝エステラーゼによって酵素的に除去できる有機部分である。別の実施形態において、エステラーゼはカルボキシルエステラーゼである。さらに別の実施形態において、Ｙは、ＣＨ３Ｃ（Ｏ）−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−及びＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ２−からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、増幅ステップを少なくとも１回繰り返す。いくつかの実施形態では、増幅ステップを少なくとも約２０回繰り返すが、少なくとも４０回、少なくとも６０、又は少なくとも１００回繰り返してもよい。いくつかの実施形態において、増幅産物は、増幅が起こった後に１度検出される。いくつかの実施形態において、増幅産物は、増幅ステップ中及び／又は後に検出される。いくつかの実施形態において、増幅産物は、３、５、１０、２０、３０、４０、又は５０の増幅ステップ中及び／若しくは後又は各増幅ステップ中及び／若しくは後の所定の時点で検出される。
【０００７】
別の態様において、本発明は、増幅試薬を使用して標的核酸配列を増幅する方法を含み、ここで、増幅試薬は：
【０００８】
【化２】
2020506666.tif 000004
【０００９】
の構造を有する修飾ヌクレオシドポリリン酸を含み、式中、Ｂ＝プリン若しくはピリミジン塩基又は類似体、Ｌ＝リンカー又は存在しない、Ｚ＝標識又は存在しない、Ｒ＝ＯＨ又はＯ−、Ｒ１及びＲ２＝Ｈ又はＯＨ、ｎ＝１〜７、Ｘ＝Ｏ、Ｓ、又はＮＨ、Ｙ＝化学的又は酵素的に除去できる有機部分。一実施形態において、Ｘ＝Ｏであり、Ｙ＝還元剤によって化学的に除去できる有機部分である。別の実施形態において、還元剤は、ホスフィン誘導体、亜硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ３）、β−メルカプトエタノール及びジチオトレイトールからなる群より選択される。別の実施形態において、ホスフィン誘導体はトリス−（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）である。別の実施形態において、ＹはＨＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−である。一実施形態において、Ｘ＝Ｏであり、Ｙ＝エステラーゼにより酵素的に除去で得きる有機部分である。別の実施形態において、エステラーゼはカルボキシルエステラーゼである。さらに別の実施形態において、Ｙは、ＣＨ３Ｃ（Ｏ）−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−及びＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ２−からなる群から選択される。
別の態様において、本発明は：
【００１０】
【化３】
2020506666.tif 000005
【００１１】
の構造を有する修飾ヌクレオシドポリリン酸を含む組成物を含み、式中、Ｂ＝プリン若しくはピリミジン塩基又は類似体、Ｌ＝リンカー又は存在しない、Ｚ＝標識又は存在しない、Ｒ＝ＯＨ又はＯ−、Ｒ１及びＲ２＝Ｈ又はＯＨ、ｎ＝１〜７、Ｘ＝Ｏ、Ｓ、又はＮＨ、そしてＹが、ＨＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−、ＣＨ３Ｃ（Ｏ）−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−、及びＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ２−からなる群から選択される。一実施形態において、ＹはＨＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−である。
【００１２】
本発明の実施形態及び利点を本発明の詳細な説明及び図面でさらに詳細に記載する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】修飾ヌクレオシドポリリン酸、ヒドロキシエチルジスルフィド−ｄＮＴＰ（ＨＥＤＳ−ｄＮＴＰ）を使用する化学的活性化反応の一例を示す。
【図２】修飾ヌクレオシドポリリン酸、アセチル−チオエチル−ｄＮＴＰ（ＡＴＥ−ｄＮＴＰ）を使用する酵素的活性化反応の一例を示す。
【図３】ｄＡＴＰ−２−ヒドロキシエチルジスルフィドエステル（ＨＥＤＳ−ｄＡＴＰ）の調製の概略図である。
【図４】６０℃での５分、１０分、２０分、３０分及び６０分処理後のＴＣＥＰによるＨＥＤＳ−ｄＡＴＰの変換を示すＨＰＬＣクロマトグラムである。ピーク１は中間生成物を表し；ピーク２は出発物質を表し；ピーク３はＴＣＥＰによる活性化後の生成物を表す。
【図５】６０℃にて３０分間１ｍＭ  ＴＣＥＰで処理することによってｄＮＴＰに変換されたＨＥＤＳ−ｄＮＴＰを使用した２００コピー／反応でのＨＩＶ−１Ｍ鋳型からのＰＣＲ増幅反応の成長曲線を示す。
【図６】５ｍＭ亜硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ３）での処理によってｄＮＴＰに変換されたＨＥＤＳ−ｄＮＴＰを使用した２００コピー／反応でのＨＩＶ−１Ｍ鋳型からのＰＣＲ増幅反応の成長曲線を示す。
【図７】鋳型としてＨＩＶ−１Ｍ、ＨＩＶ−２及びＩＣを有し、３７℃にて２２日間保存した正常ｄＮＴＰ又はＨＥＤＳ−ｄＮＴＰのいずれかを使用するＰＣＲ反応のＣｔ値を示す。
【図８】鋳型としてＨＩＶ−１Ｍ、ＨＩＶ−２及びＩＣを有し、４５℃で２２日間保存した正常ｄＮＴＰ又はＨＥＤＳ−ｄＮＴＰを使用するＰＣＲ反応のＣｔ値を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、修飾ヌクレオシドポリリン酸を含むＰＣＲ及びＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素−ＰＣＲ）による核酸増幅に使用される安定なヌクレオチド試薬を提供する。本発明はまた、増幅反応において試料中の標的核酸配列の存在又は非存在を検出するため、そして試料中の標的核酸配列を増幅するための、修飾ヌクレオシドポリリン酸を使用するための方法も提供する。
【００１５】
定義
別段の定めがない限り、本明細書中で用いられるすべての技術的及び科学的用語は本発明が属する分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載されるものと類似した本質的にあらゆる方法及び材料を本発明の実施又は試験において使用することができるが、単なる例示的方法及び材料を記載する。本発明に関して、以下の用語を定義する。
【００１６】
「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」という用語は、文脈が明らかに反対を示す場合を除き、複数の対象物を包含する。
【００１７】
「周囲温度」という用語は周囲の温度を指し、温度調節された建物の屋内の温度について言及する場合は「室温」と同義である。典型的には、周囲温度は１５℃〜２５℃の温度範囲を指すが、若干低い温度又は若干高い温度も周囲温度の範囲内にあると考えることができる。
【００１８】
「アプタマー」という用語は、米国特許第５，６９３，５０２号明細書に記載されるように、ＤＮＡポリメラーゼを認識して結合し、そしてポリメラーゼ活性を効率的に阻害する一本鎖ＤＮＡを指す。ＲＴ−ＰＣＲにおけるアプタマー及びｄＵＴＰ／ＵＮＧの使用はまた、例えば、Ｓｍｉｔｈ，Ｅ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ：Ｈｉｇｈ−ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，ｉｎ  ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ，Ｃ．Ｗ．ａｎｄ  Ｄｖｅｋｓｌｅｒ，Ｇ．Ｓ．，Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１１−２１９，（２００３））で記載されている。
【００１９】
「組換え体」は、本明細書中で用いられる場合、組換え法によって意図的に修飾されたアミノ酸配列又はヌクレオチド配列を指す。「組換え核酸」という用語は本明細書中では、自然界で通常見いだされない形態の、概して制限エンドヌクレアーゼによる核酸の操作によって、本来はインビトロで形成される核酸を意味する。したがって、線状形態の単離された変異ＤＮＡポリメラーゼ核酸、又は通常結合しないＤＮＡ分子をライゲートすることによってインビトロで形成された発現ベクターはどちらも本発明の目的で想定される組換え的である。組換え核酸は一旦作製され宿主細胞に再導入されたら、非組換え的に、すなわち、インビトロ操作ではなく宿主細胞のインビボ細胞機構を使用して複製されると理解される；しかしながら、そのような核酸は、一旦組換え的に産生されると、その後、非組み換え的に複製されるが、それでもなお本発明の目的に関して想定される組換え的である。「組換えタンパク質」は、組換え技術を使用して、すなわち、前述の組換え核酸の発現によって作製されるタンパク質である。
【００２０】
核酸は、他の核酸配列と機能的に関連づけられている場合に「機能的に連結」されている。例えば、プロモータ又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合、コーディング配列に機能的に連結されている；又はリボソーム結合部位が、翻訳を促進するような位置にある場合、コーディング配列に機能的に連結している。
【００２１】
「宿主細胞」という用語は、単細胞原核及び真核生物（例えば、細菌、酵母、及び放線菌）ならびに細胞培養で成長させる場合のより高次の植物又は動物由来の単細胞の両方を指す。
【００２２】
「ベクター」という用語は、典型的には二本鎖であって、外来ＤＮＡ片が挿入されていてもよいＤＮＡ片を指す。ベクターは、例えば、プラスミド起源であってよい。ベクターは、宿主細胞におけるベクターの自己複製を促進する「レプリコン」ポリヌクレオチド配列を含む。外来ＤＮＡは、例えばベクター分子を複製するか、選択可能若しくはスクリーン可能なマーカーをコードするか、又はトランス遺伝子をコードする、宿主細胞で天然に見いだされないＤＮＡである、ヘテロローガスなＤＮＡとして定義される。ベクターを使用して、外来又はヘテロローガスなＤＮＡを好適な宿主細胞に輸送する。一旦宿主細胞中にはいると、ベクターは宿主染色体ＤＮＡとは関係なく、又は宿主染色体ＤＮＡと一致して複製することができ、複数コピーのベクター及びその挿入されたＤＮＡを生成することができる。加えて、ベクターは、挿入されたＤＮＡをｍＲＮＡ分子中に転写させるか、又は挿入されたＤＮＡを複数コピーのＲＮＡに複製させるのに必要な要素も含み得る。いくつかの発現ベクターは、発現されたｍＲＮＡの半減期を増大させる、及び／又はｍＲＮＡのタンパク質分子への翻訳を可能にする、挿入されたＤＮＡに隣接する配列要素をさらに含む。挿入されたＤＮＡによってコードされるｍＲＮＡ及びポリペプチドの多くの分子はしたがって迅速に合成することができる。
【００２３】
「増幅試薬」は、核酸の増幅を可能にする化学的又は生化学的成分である。そのような試薬は、限定されるものではないが、核酸ポリメラーゼ、緩衝液、モノヌクレオチド、例えばヌクレオシド三リン酸、オリゴヌクレオチドを、例えばオリゴヌクレオチドプライマー、塩及びそれぞれの溶液、検出プローブ、色素などとして含む。
【００２４】
当該技術分野で公知のように、「ヌクレオシド」は塩基−糖の組み合わせである。ヌクレオシドの塩基部分は、通常、複素環式塩基である。そのような複素環式塩基の２つの最も一般的なクラスはプリン及びピリミジンである。
【００２５】
「ヌクレオチド」は、ヌクレオシドの糖部分と共有結合したリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドについて、リン酸基は、糖の２’−、３’−又は５’−ヒドロキシル部分のいずれかと結合できる。ヌクレオチドは、「オリゴヌクレオチド」のモノマー単位であり、これはさらに一般的には「オリゴマー化合物」、又は「ポリヌクレオチド」として表示することができ、さらに一般的には「ポリマー化合物」として表示することができる。前記の別の一般的な発現はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）である。
【００２６】
「オリゴマー化合物」は、ヌクレオチド単独又は非天然化合物（下記参照）、さらに具体的には修飾ヌクレオチド（若しくはヌクレオチド類似体）又は非ヌクレオチド化合物単独又はそれらの組み合わせであり得る「モノマー単位」から構成される化合物である。
【００２７】
「オリゴヌクレオチド」及び「修飾オリゴヌクレオチド」（又は「オリゴヌクレオチド類似体」）はオリゴマー化合物の亜群である。「オリゴヌクレオチド」という用語は、それらのモノマー単位として複数のヌクレオチドから形成されている成分を指す。リン酸基は通常、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間骨格を形成するといわれる。ＲＮＡ及びＤＮＡの通常の結合又は骨格は３‘から５’のホスホジエステル結合である。本発明に有用なオリゴヌクレオチド及び修飾オリゴヌクレオチド（下記参照）は、当該技術分野で主に記載されているようにして、また当業者に公知のように合成することができる。特異的配列のオリゴマー化合物を調製するための方法は当該技術分野で公知であり、例えば、適切な配列のクローニング及び制限ならびに直接的化学合成が挙げられる。化学合成法としては、例えば、Ｎａｒａｎｇ  Ｓ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ６８（１９７９）９０−９８に記載されているホスホトリエステル法、Ｂｒｏｗｎ  Ｅ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ６８（１９７９）１０９−１５１で開示されているホスホジエステル法、Ｂｅａｕｃａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２２（１９８１）１８５９で開示されているホスホルアミダイト法、Ｇａｒｅｇｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｓｃｒ．２５（１９８５）２８０−２８２で開示されているＨ−ホスホネート法及び米国特許第４，４５８，０６６号明細書で開示されている固体支持体法を挙げることができる。
【００２８】
前述のプロセスにおいて、オリゴヌクレオチドは化学的に修飾されていてもよく、すなわち、プライマー及び／又はプローブは修飾ヌクレオチド又は非ヌクレオチド化合物を含む。プローブ又はプライマーは次いで修飾オリゴヌクレオチドである。
【００２９】
「修飾ヌクレオチド」（又は「ヌクレオチド類似体」）はある修飾によって天然のヌクレオチドとは異なるが、それでもなお、塩基、ペントフラノシル糖、リン酸部分、塩基様、ペントフラノシル糖様及びリン酸様部分又はそれらの組み合わせから構成される。例えば、標識は、ヌクレオチドの塩基部分に結合していてもよく、それによって修飾ヌクレオチドが得られる。ヌクレオチド中の天然の塩基はまた、例えば７−デアザプリンで置換されていてもよく、それによって修飾ヌクレオチドも同様に得られる。
【００３０】
オリゴマー化合物の別の具体的な亜群に属する「修飾オリゴヌクレオチド」（又は「オリゴヌクレオチド類似体」）は、１以上のヌクレオチド及び１以上の修飾ヌクレオチドをモノマー単位として有する。したがって、「修飾オリゴヌクレオチド」（又は「オリゴヌクレオチド類似体」）という用語は、オリゴヌクレオチドと実質的に類似した方法で機能する構造を指し、本発明の文脈で交換可能に使用することができる。合成の観点から、修飾オリゴヌクレオチド（又はオリゴヌクレオチド類似体）は、例えば、リン酸骨格、リボース単位又はヌクレオチド塩基の適切な修飾によってオリゴヌクレオチドの化学的修飾によって作製できる（Ｕｈｌｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｐｅｙｍａｎ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ９０（１９９０）５４３；Ｖｅｒｍａ  Ｓ．，ａｎｄ  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ  Ｆ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７（１９９８）９９−１３４）。代表的な修飾としては、ホスホジエステルヌクレオシド間結合の代わりにホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホン酸メチル、ホスホトリエステル又はホスホルアミデートヌクレオシド間結合；天然のプリン及びピリミジン塩基、５又は６位に置換基を有するピリミジン塩基の代わりにデアザプリン又はアザプリン及びデアザピリミジン又はアザピリミジン；７−デアザプリンとして２、６若しくは８位又は７位に変更された置換基を有するプリン塩基；アルキル部分、アルケニル部分、アルキニル部分又はアリール部分、例えば低級アルキル基、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、又はフェニル、ベンジル、ナフチルのようなアリール基を有する塩基；例えば、それらの２’位で置換基を有する糖；又は炭素環式若しくは非環式糖類似体が挙げられる。他の修飾は当業者に公知である。そのような修飾オリゴヌクレオチド（又はオリゴヌクレオチド類似体）は天然のオリゴヌクレオチドと機能的に交換可能であるが、構造的には異なるとして最もよく記載されている。さらに詳細には、例示的な修飾は、Ｖｅｒｍａ  Ｓ．，ａｎｄ  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ  Ｆ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７（１９９８）９９−１３４又は国際公開第０２／１２２６３号パンフレットで開示されている。加えて、ヌクレオシド単位がヌクレオシド間ホスフェート又は糖ホスフェート結合と置換する基を介して結合している修飾を作製できる。そのような結合には、Ｖｅｒｍａ  Ｓ．，ａｎｄ  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ  Ｆ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７（１９９８）９９−１３４で開示されているものが含まれる。ホスフェート結合以外を利用してヌクレオシド単位を結合する場合、そのような構造は「オリゴヌクレオシド」としても記載されている。
【００３１】
「標的核酸」と同様に「核酸」は、当業者に公知のようにヌクレオチドのポリマー化合物である。「標的核酸」は、本明細書中で用いられる場合、分析されるべき、すなわち、試料中のその存在、非存在及び／又は量が測定されるべき試料中の核酸を意味する。
【００３２】
「プライマー」という用語は、本明細書では、当業者に知られているように使用し、オリゴマー化合物、主にオリゴヌクレオチドを指すが、鋳型依存型ＤＮＡポリメラーゼ、すなわち、例えばプライマーの３’末端が遊離３’−ＯＨ基を提供し、そこにさらなるヌクレオチドが鋳型依存型ＤＮＡポリメラーゼによって結合して、３’から５’のホスホジエステル結合を形成し、これによってデオキシヌクレオシド三リン酸が使用され、ホスフェートが放出されることによってＤＮＡ合成をプライムすることができる修飾オリゴヌクレオチドも指す。
【００３３】
「プローブ」はまた、天然又は修飾オリゴヌクレオチドを意味する。当該技術分野で公知のように、プローブは分析物又は増幅物を検出する目的で機能する。前述のプロセスの場合、プローブを使用して、標的核酸の増幅物を検出することができる。この目的のために、プローブは典型的には標識を有する。
【００３４】
「標識」は、多くの場合、「レポーター基」と称され、概して、核酸、特にオリゴヌクレオチド又は修飾オリゴヌクレオチド、ならびにそれに結合する任意の核酸を試料の残りから識別可能にする基である（標識に結合した核酸は、標識核酸結合化合物、標識プローブ又は単にプローブとも称され得る）。例示的標識は蛍光標識であり、これは例えばフルオレセイン色素、ローダミン色素、シアニン色素、及びクマリン色素などの蛍光色素である。例示的蛍光色素は、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＪＡ２７０、ＣＡＬ６３５、Ｃｏｕｍａｒｉｎ３４３、Ｑｕａｓａｒ７０５、Ｃｙａｎ５００、ＣＹ５．５、ＬＣ−Ｒｅｄ  ６４０、ＬＣ−Ｒｅｄ  ７０５である。
【００３５】
いくつかの実施形態において、標識は、「リンカー」又は「リンカーアーム」を介してプリン若しくはピリミジン塩基又は類似体に結合させることができる。リンカーアームの長さは、ヌクレオチド塩基から蛍光部分までのオングストローム（Å）で表した距離である。概して、リンカーアームは約１０Å〜約２５Åである。リンカーアームは、国際公開第８４／０３２８５号パンフレットで記載されている種類のものであってよい。国際公開第８４／０３２８５号パンフレットはまた、リンカーアームを特定のヌクレオチド塩基に結合させるための方法、また蛍光部分をリンカーアームに結合させるための方法も開示している。例示的に、ＬＣ  Ｒｅｄ  ６４０−ＮＨＳ−エステルなどのアクセプター蛍光部分をＣ６−ホスホルアミダイト（ＡＢＩ（カリフォルニア州フォスターシティ）又はＧｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（バージニア州スターリング）から入手可能）と組み合わせて、ＬＣ  Ｒｅｄ  ６４０−ホスホルアミダイトを生成することができる。フルオレセインなどのドナー蛍光部分をオリゴヌクレオチドとカップリングさせるためにしばしば使用されるリンカーとしては、チオ尿素リンカー（ＦＩＴＣ由来、例えば、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ又はＣｈｅｍＧｅｎｅ（マサチューセッツ州アシュランド）製のフルオレセイン−ＣＰＧ）、アミド−リンカー（フルオレセイン−ＮＨＳ−エステル由来、例えばＢｉｏＧｅｎｅｘ（カリフォルニア州サンラモン）製のフルオレセイン−ＣＰＧ）、又はオリゴヌクレオチド合成後にフルオレセイン−ＮＨＳ−エステルのカップリングを必要とする３’−アミノ−ＣＰＧが挙げられる。さらに、他の非ヌクレオシドリンカーは、例えば、脂肪族、芳香族、アリール、環状、キラル、アキラル、ペプチド、炭水化物、脂質、脂肪酸、トリ−ポリエチレングリコール、テトラ−ポリエチレングリコール、ペンタ−ポリエチレングリコール、ヘキサ−ポリエチレングリコール（ＨＥＧ）若しくはポリ−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、又は複素環式部分であり得る。他の通常の非ヌクレオシドリンカーは、同種二官能性及び異種二官能性架橋試薬を用いる。同種二官能性試薬は２つの同じ官能基を有し、一方、異種二官能性試薬は２つの異なる官能基を含み、生物製剤を生体接着剤に結合させる。大多数の異種二官能性架橋剤は第一アミン反応性基及びチオール反応性基を含む。共有的架橋剤は、ジスルフィド（Ｓ−−Ｓ）、グリコール（−−ＣＨ（ＯＨ）−−ＣＨ（ＯＨ）−−）、アゾ（−−Ｎ＝Ｎ−−）、スルホン（−−Ｓ（＝Ｏ２−−）、エステル（−−Ｃ（＝Ｏ）−−Ｏ−−）、又はアミド（−−Ｃ（＝Ｏ）−−Ｎ−−）架橋を形成できる試薬から選択される。
【００３６】
いずれのプライマー及び／又はプローブも化学的に修飾することができる、すなわち、プライマー及び／又はプローブは修飾ヌクレオチド又は非ヌクレオチド化合物を含む。プローブ又はプライマーは、その結果、修飾オリゴヌクレオチドとなる。
【００３７】
核酸増幅の方法はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）であり、これは他の文献の中でも、米国特許第４，６８３，２０２号明細書、同第４，６８３，１９５号明細書、同第４，８００，１５９号明細書、及び同第４，９６５，１８８号明細書で開示されている。ＰＣＲは、典型的には、選択された核酸鋳型（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）を結合する２以上のオリゴヌクレオチドプライマーを用いる。核酸分析に有用なプライマーには、標的核酸の核酸配列内で核酸合成の開始点として作用できるオリゴヌクレオチドが含まれる。プライマーは、従来法により制限消化物から精製することができるか、又は合成により産生することができる。プライマーは、増幅における最大効率のために一本鎖であってもよいが、プライマーは二本鎖であってもよい。二本鎖プライマーをまず変性させ、すなわち、鎖を分離させる処理をする。二本鎖核酸を変性させる一方法は加熱による。「熱安定性ポリメラーゼ」は熱安定性であるポリメラーゼ酵素である、すなわち、鋳型に対して相補的なプライマー伸長産物の形成を触媒し、二本鎖鋳型核酸の変性を行うために必要な時間、高温にさらされた場合に不可逆的に変性しない酵素である。概して、合成は、各プライマーの３’末端で開始され、鋳型鎖に沿って５’から３’への方向に進行する。熱安定性ポリメラーゼは、例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓ、Ｔ．ｒｕｂｅｒ、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｔ．ｌａｃｔｅｕｓ、Ｔ．ｒｕｂｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、及びＭｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｅｒｖｉｄｕｓから単離された。それでもなお、熱安定性でないポリメラーゼも酵素が補充されるならば、ＰＣＲアッセイで用いることができる。
【００３８】
鋳型核酸が二本鎖である場合、ＰＣＲにおいて鋳型として使用し得る前に二本の鎖を分離する必要がある。鎖分離は、物理的、化学的又は酵素的手段を含む任意の好適な変性方法によって達成することができる。核酸鎖を分離する一方法は、主に変性されるまで（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％超の変性）、核酸を加熱することを含む。鋳型核酸を変性させるために必要な加熱条件は、例えば緩衝液塩濃度ならびに変性される核酸の長さ及びヌクレオチド組成に依存するが、典型的には、約９０℃〜約１０５℃の範囲で、温度及び核酸の長さなどの反応の特徴に応じた時間である。変性は、典型的には、約５秒〜９分間実施する。例えばＺ０５ＤＮＡポリメラーゼのような各ポリメラーゼをそのような高温に過度に長い時間曝露し、そのため機能的酵素が失われるリスクにさらすことのないようにするため、短い変性ステップを使用することが好ましい可能性がある。
【００３９】
二本鎖鋳型核酸が熱によって変性される場合、標的核酸上のその標的配列への各プライマーのアニーリングを促進する温度まで反応混合物を冷却させる。
【００４０】
アニーリングの温度は約３５℃〜約７０℃、又は約４５℃〜約６５℃；又は約５０℃〜約６０℃、又は約５５℃〜約５８℃であり得る。アニーリング時間は約１０秒〜約１分（例えば、約２０秒〜約５０秒；約３０秒〜約４０秒）であり得る。この関連で、各アッセイの包括性を増大させるために、異なるアニーリング温度を使用することが有利であり得る。簡単に説明すると、これは、比較的低いアニーリング温度で、プライマーは単一のミスマッチを有する標的と結合することもでき、したがって、ある特定の配列の変異体も増幅することができることを意味する。これは、例えばある特定の生物が、これもまた検出されるべき既知又は未知の遺伝的変異体を有する場合に望ましい可能性がある。一方、温度が高くなるにつれ、プライマーが正確にマッチしない標的配列と結合する可能性は連続して減少するので、比較的高いアニーリング温度は、より高い特異性を提供するという利点を有する。両方の現象から恩恵を受けるために、本発明のいくつかの実施形態において、前述のプロセスは異なる温度でのアニーリング、例えば最初に低い温度で、その後より高い温度でのアニーリングを含む。例えば、最初のインキュベーションが５５℃で約５サイクル行われる場合、正確にマッチングしない標的配列が（プレ）増幅され得る。これに続いて、例えば５８℃で約４５サイクル行って、実験の大部分にわたってより高い特異性を提供することができる。Ｔｈｉｓ  ｗａｙこのようにして、特異性は比較的高いままで、潜在的に重要な遺伝的変異体は失われない。
【００４１】
反応混合物を次いでポリメラーゼの活性が促進又は最適化される温度、すなわち、アニーリングされたプライマーから伸長が起こって分析される核酸に相補的な産物が生成するために充分な温度に調節する。温度は、核酸鋳型にアニーリングされる各プライマーから伸長産物を合成するために充分でなければならないが、その相補的鋳型からの伸長産物を変性させるほど高くてはならない（例えば、伸長のための温度は概して約４０℃〜８０℃の範囲である（例えば、約５０℃〜約７０℃；約６５℃）。伸長時間は約１０秒〜約５分、又は約１５秒〜２分、又は約２０秒〜約１分、又は約２５秒〜約３５秒であり得る。新たに合成された鎖は二本鎖分子を形成し、これを反応の続くステップで使用することができる。鎖分離、アニーリング、及び伸長のステップは、標的核酸に対応する所望の量の増幅産物を産生するために必要な回数繰り返すことができる。反応における限定因子は、反応において存在するプライマー、熱安定性酵素、及びヌクレオシド三リン酸の量である。環化ステップ（すなわち、変性、アニーリング、及び伸長）は少なくとも１回繰り返すことができる。検出で使用するために、環化ステップの数は、例えば、試料の性質に依存する。試料が核酸の複雑な混合物である場合、検出に充分な標的配列を増幅するためにはさらに多くの環化ステップ必要であろう。概して、環化ステップは少なくとも約２０回繰り返されるが、４０、６０、又はさらには１００回も繰り返すことができる。
【００４２】
アニーリング及び伸長ステップを同じステップで実施するＰＣＲ（１ステップＰＣＲ）又は、前述のように、別のステップで実施するＰＣＲ（２ステップＰＣＲ）を実施できる。アニーリング及び伸長をあわせて、したがって同じ物理的及び化学的条件下で、例えば、Ｚ０５  ＤＮＡポリメラーゼなどの好適な酵素を用いて実施することは、各サイクルでの追加のステップのための時間を節約し、またアニーリングと伸長との間の追加の温度調節の必要性をなくすという利点を有する。したがって、１ステップＰＣＲは各アッセイの全体的な複雑さを軽減する。
【００４３】
概して、結果までの時間が短縮され、より早期の診断が可能になるため、増幅全体の時間が短いほど好ましい可能性がある。
【００４４】
使用される他の核酸増幅法はリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ；Ｗｕ  Ｄ．Ｙ．  ａｎｄ  Ｗａｌｌａｃｅ  Ｒ．Ｂ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４（１９８９）５６０−６９；及びＢａｒａｎｙ  Ｆ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８（１９９１）１８９−１９３）；ポリメラーゼリガーゼ連鎖反応（Ｂａｒａｎｙ  Ｆ．，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃ．１（１９９１）５−１６）；Ｇａｐ−ＬＣＲ（国際公開第９０／０１０６９号パンフレット）；修復連鎖反応（欧州特許第０４３９１８２（Ａ２）号明細書）、３ＳＲ（Ｋｗｏｈ  Ｄ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６（１９８９）１１７３−１１７７；Ｇｕａｔｅｌｌｉ  Ｊ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７（１９９０）１８７４−１８７８；国際公開第９２／０８８０８号パンフレット）、及びＮＡＳＢＡ（米国特許第５，１３０，２３８号明細書）を含む。さらに、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、及びＱｂ増幅（概説に関しては、例えば、Ｗｈｅｌｅｎ  Ａ．Ｃ．ａｎｄ  Ｐｅｒｓｉｎｇ  Ｄ．Ｈ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５０（１９９６）３４９−３７３；Ａｂｒａｍｓｏｎ  Ｒ．Ｄ．ａｎｄ  Ｍｙｅｒｓ  Ｔ．Ｗ．，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ４（１９９３）４１−４７を参照）を含む。
【００４５】
「Ｃｐ値」又は「交差点」値という用語は、入力標的核酸の定量化を可能にする値を指す。Ｃｐ値は、二次導関数最大方法（Ｖａｎ  Ｌｕｕ−Ｔｈｅ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ｓｅｃｏｎｄ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｏｕｂｌｅ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ，”  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｖｏｌ．３８，Ｎｏ．２，Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２００５，ｐｐ．２８７-２９３）に従って決定することができる。二次導関数法において、Ｃｐは二次導関数曲線の第一ピークに相当する。このピークはｌｏｇ−線形位相の開始に相当する。二次導関数法はリアルタイム蛍光強度曲線の二次導関数値を算出し、１つの値だけが得られる。元のＣｐ法は、例えば多項式関数による強度値の局所的に規定された、微分可能な近似に基づく。次に、三次導関数を計算する。Ｃｐ値は三次導関数の最小累乗根である。Ｃｐはフィットポイント法を使用して決定することもでき、Ｃｐはｌｏｇ−線形領域で閾値線に対する平行線の交点によって決定される（Ｖａｎ  Ｌｕｕ−Ｔｈｅ，ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｖｏｌ．３８，Ｎｏ．２，Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２００５，ｐｐ．２８７-２９３）。二次導関数最大法による計算によりＲｏｃｈｅによって提供されるＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ装置によって提供されるＣｐ値。
【００４６】
「ＰＣＲ効率」という用語はサイクル間の増幅効率の指標を指す。ＰＣＲ効率は、式：％ＰＣＲ効率＝（１０（−勾配）−１）×１００を使用して各条件について算出され、式中、勾配は、ｙ軸上にプロットされたｌｏｇコピー数及びｘ軸上にプロットされたＣｐを使用した線形回帰によって算出した。ＰＣＲ効率は、完全マッチ又はミスマッチプライマー鋳型を使用して測定することができる。
【００４７】
「ＦＲＥＴ」又は「蛍光共鳴エネルギー移動」又は「フォスター共鳴エネルギー移動」という用語は、少なくとも２つのクロモフォア、つまりドナークロモフォア及びアクセプタークロモフォア（クエンチャーと称する）間のエネルギーの移動を指す。ドナーは典型的には好適な波長を有する光放射によってドナーが励起されると、アクセプターへエネルギーを移動させる。アクセプターは典型的には異なる波長を有する光放射の形態で移動されたエネルギーを再放射する。アクセプターが「ダーク」クエンチャーである場合、これは光以外の形態で移動されたエネルギーを消散させる。特定のフルオロフォアがドナーとして作用するか、又はアクセプターとして作用するかは、ＦＲＥＴ対の他のメンバーの性質に依存する。通常使用されるドナー−アクセプター対にはＦＡＭ−ＴＡＭＲＡ対が含まれる。通常使用されるクエンチャーはＤＡＢＣＹＬ及びＴＡＭＲＡである。通常使用されるダーククエンチャーとしては、ＢｌａｃｋＨｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒｓ（商標）（ＢＨＱ）、（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州ナヴァト）、Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ（商標）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈ．，Ｉｎｃ．，、アイオワ州コーラルビル）、及びＢｌａｃｋＢｅｒｒｙ（商標）Ｑｕｅｎｃｈｅｒ  ６５０（ＢＢＱ−６５０）（Ｂｅｒｒｙ＆Ａｓｓｏｃ．、ミシガン州デクスター）が挙げられる。
【００４８】
前述の方法は、ドナー蛍光部分とアクセプター蛍光部分との間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に基づくものであり得る。代表的なドナー蛍光部分はフルオレセインであり、代表的な対応するアクセプター蛍光部分は、ＬＣ−Ｒｅｄ６４０、ＬＣ−Ｒｅｄ７０５、Ｃｙ５、及びＣｙ５．５を含む。典型的には、検出は、ドナー蛍光部分によって吸収される波長で試料を励起し、そして対応するアクセプター蛍光部分によって放射される波長を可視化及び／又は測定することを含む。本発明によるプロセスでは、検出に続いて、ＦＲＥＴを定量化することができる。例えば、各環化ステップの後に検出を実施する。例えば、検出はリアルタイムで実施する。市販のリアルタイムＰＣＲ器具（例えば、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商標）又はＴａｑＭａｎ（登録商標））を使用することにより、増幅産物のＰＣＲ増幅及び検出を単一の閉鎖キュベット中で組み合わせて、サイクリング時間を劇的に短縮することができる。検出は増幅と同時に起こるので、リアルタイムＰＣＲ法は増幅産物の操作の必要性をなくし、増幅産物間の交差汚染のリスクを減らす。リアルタイムＰＣＲは好転時間を大幅に短縮し、臨床研究所における従来のＰＣＲ技術に対する魅力的な代替策である。
【００４９】
以下の特許出願はＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）技術で使用するリアルタイムＰＣＲを記載している：国際公開第９７／４６７０７号パンフレット、国際公開第９７／４６７１４号パンフレット及び国際公開第９７／４６７１２号パンフレット。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）装置は、高品質の光学素子を利用する微小体積蛍光計と組み合わせたラピッドサーマルサイクラーである。このラピッドサーモサイクリング技術は反応容器として薄いガラス製キュベットを使用する。反応チャンバーの加熱及び冷却は、加熱空気及び周囲空気を交互にすることによって制御される。少量の空気と、キュベットの容積に対する表面積の割合が高いために、非常に迅速な温度交換速度をサーマルチャンバー内で達成できる。
【００５０】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）技術は２つの蛍光部分で標識された一本鎖ハイブリダイゼーションプローブを利用する。第一蛍光部分が好適な波長の光で励起される場合、吸収されたエネルギーがＦＲＥＴの原理に従って第二蛍光部分に移される。第二蛍光部分は概してクエンチャー分子である。このフォーマットで使用される典型的な蛍光色素は、例えば、中でも、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＣＹ５、ＪＡ２７０、Ｃｙａｎ及びＣＹ５．５である。ＰＣＲ反応のアニーリングステップの間に、標識されたハイブリダイゼーションプローブは標的核酸（すなわち、増幅産物）と結合し、Ｔａｑ又は当業者に公知の別の好適な別の好適なポリメラーゼ、例えばその後の伸長期中に変異Ｚ０５ポリメラーゼの５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性によって分解される。その結果、励起された蛍光部分及びクエンチャー部分は互いに空間的に分離されるようになる。その結果、クエンチャーの非存在下で第一蛍光部分が励起されると、第一蛍光部分からの蛍光発光を検出することができる。
【００５１】
前記の両検出フォーマットにおいて、発光されたシグナルの強度を、もとの標的核酸分子の数と相関させることができる。
【００５２】
ＦＲＥＴの代替策として、蛍光ＤＮＡ結合色素（例えば、ＳＹＢＲＧＲＥＥＮ  Ｉ（登録商標）又はＳＹＢＲＧＯＬＤ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ））などの二本鎖ＤＮＡ結合色素を使用して増幅産物を検出することができる。二本鎖核酸との相互作用により、そのような蛍光ＤＮＡ結合色素は好適な波長の光での励起後に蛍光シグナルを放射する。核酸挿入色素などの二本鎖ＤＮＡ結合色素も使用することができる。二本鎖ＤＮＡ結合色素を使用する場合、融解曲線分析は、通常、増幅産物の存在の確認のために実施される。
【００５３】
ＦＲＥＴと併せて分子指標も使用して、本発明のリアルタイムＰＣＲ法を使用する増幅産物の存在を検出することもできる。分子指標技術は、第一蛍光部分及び第二蛍光部分で標識されたハイブリダイゼーションプローブを使用する。第二蛍光部分は概してクエンチャーであり、蛍光標識は典型的にはプローブの各末端に位置する。分子指標技術は、二次構造形成（例えば、ヘアピン）を可能にする配列を有するプローブオリゴヌクレオチドを使用する。プローブ内での二次構造形成の結果として、プローブが溶液中にある場合には両蛍光部分が空間的に近接している。増幅産物に対するハイブリダイゼーション後に、プローブの二次構造は破壊され、蛍光部分は互いに分離され、したがって、好適な波長の光での励起後に第一蛍光部分の発光を検出できる。
【００５４】
したがって、前述のように本発明の方法はＦＲＥＴの使用であり得、前記プローブは二次構造形成を許容する核酸配列を含み、前記二次構造形成の結果、前記第一及び第二蛍光部分間が空間的に近接する。効率的ＦＲＥＴは、蛍光部分が直接的局所的に近接している場合及びドナー蛍光部分の発光スペクトルがアクセプター蛍光部分の吸収スペクトルと重なり合う場合にのみ起こり得る。したがって、実施形態において、前記ドナー及びアクセプター蛍光部分は前記プローブ上で互いに５ヌクレオチド以内である。さらなる実施形態において、前記アクセプター蛍光部分はクエンチャーである。
【００５５】
前述のように、ＴａｑＭａｎ（登録商標）フォーマットにおいて、ＰＣＲ反応のアニーリングステップの間に、標識されたハイブリダイゼーションプローブは標的核酸（すなわち、増幅産物）に結合し、その後の伸長期の間にＴａｑ又は変異Ｚ０５ポリメラーゼなどの当業者に公知の別の好適なポリメラーゼの５’→３’−エキソヌクレアーゼ活性によって分解する。したがって、一実施形態では、前述のプロセスにおいて、増幅は５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素を用いる。
【００５６】
前記プロセスの結果として生じるアンプリコンの長さを慎重に選択することはさらに有利である。概して、比較的短いアンプリコンは増幅反応の効率を増大させる。したがって、本発明の一態様は前記プロセスであって、増幅されたフラグメントが４５０塩基まで、３００塩基まで、２００塩基まで、又は１５０塩基までを含むプロセスである。
【００５７】
「配列」は、核酸の一次構造、すなわち、各々の核酸からなる単一の核酸塩基の特異的配置である「配列」という用語は、ＲＮＡ又はＤＮＡなどの核酸の特定の種類を示すのではなく、両方、ならびに例えば、ＰＮＡなどの他の種類の核酸にも適用されると理解されるべきである。核酸塩基が互いに対応する場合、特に、ウラシル（ＲＮＡ中に存在）及びチミン（ＤＮＡ中に存在）の場合、これらの塩基は、当該技術分野で周知のように、ＲＮＡ配列とＤＮＡ配列との間で等価とみなすことができる。
【００５８】
臨床的に関連する核酸は、多くの場合、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）などのようなＤＮＡウイルス、又は例えばＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ（ＣＴ）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＮＧ）などのような細菌から誘導することができるＤＮＡである。そのような場合、標的核酸特性を反映するために、ＤＮＡからなる内部制御核酸を使用することが有利であり得る。
【００５９】
「細胞」、「細胞株」、及び「細胞培養」という用語は交換可能に使用することができ、そのような表示はすべて子孫を含む。したがって、「形質転換体」又は「形質転換細胞」という語は、初代形質転換細胞及び転移回数を問わず、その細胞から誘導される培養物を含む。全ての子孫は、計画的又は偶発的な変異のためにＤＮＡ含有量において正確に同一でなくてもよい。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングされたのと同じ機能性を有する変異子孫は形質転換体の定義に含まれる。細胞は原核又は真核であり得る。
【００６０】
「制御配列」という用語は、特定の宿主生物における機能的に連結されたコーディング配列の発現に必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物に適した制御配列には、例えば、プロモータ、場合によってオペレーター配列、リボソーム結合部位、正のレトロ調節エレメント（米国特許第４，６６６，８４８号明細書参照）、及びおそらくは他の配列が含まれる。真核細胞は、プロモータ、ポリアデニル化シグナル、及びエンハンサーを利用することが知られている。
【００６１】
「機能的に連結された」という用語は、制御配列がコーディング配列によってコードされるタンパク質の発現を駆動するように機能するようにコーディング配列を配置することを指す。したがって、制御配列に「機能的に連結された」コーディング配列とは、コーディング配列を制御配列の指揮下で発現することができる構造を指す。
【００６２】
「制限エンドヌクレアーゼ」及び「制限酵素」という用語は、典型的には、細菌起源の、二本鎖ＤＮＡを特異的ヌクレオチド配列又はその付近で切断する酵素を指す。
【００６３】
類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーを本明細書中で定義する。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、システイン、グリシン）、β分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。
【００６４】
「試薬溶液」という用語は、ＰＣＲの目的のために必要とされるか又は使用される、少なくとも１つの試薬を含むあらゆる溶液である。最も典型的な成分はポリメラーゼ、ヌクレオチド、プライマー、イオン、マグネシウム、塩、ｐＨ緩衝剤、ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）又はデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、プローブ、蛍光色素（プローブに結合させることができる）、核酸結合剤、核酸鋳型である。試薬はまた他のポリメラーゼ反応添加剤であってもよく、これはポリメラーゼ反応又はそのモニタリングに影響を及ぼす。
【００６５】
「マスターミックス」という用語は、ＰＣＲが起こるために必要な成分又は因子の全部若しくはほとんどの混合物、そして場合によっては、試料及びアンプリコン特異的である鋳型及びプライマーを除くすべてを指す。市販のマスターミックスは通常、濃縮溶液である。マスターミックスは、複数の試料に共通の試薬すべてを含んでもよいが、１つの試料のみのために構成することもできる。マスターミックスの使用は、ピペッティング誤差及びピペッティングされた体積間の差に起因する試料間の変動を減少させるのに役立つ。
【００６６】
「熱安定性ポリメラーゼ」という用語は、熱に対して安定であり、耐熱性であり、二本鎖核酸を変性させるために必要な時間、高温に供した後に、その後のプライマー伸長反応を実施するために充分な活性を保持する酵素を指す。核酸変性に必要な加熱条件は当該技術分野で周知であり、米国特許第４，９６５，１８８号明細書及び同第４，８８９，８１８号明細書で例示されている。本明細書中で使用される場合、熱安定性ポリメラーゼはＰＣＲなどの温度循環反応での使用に好適である。熱安定性核酸ポリメラーゼの例としては、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｐ．Ｚ０５ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａポリメラーゼ、例えばＴＭＡ−２５及びＴＭＡ−３０ポリメラーゼ、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ及び同種のものが挙げられる。
【００６７】
「逆転写酵素活性を有するポリメラーゼ」は、ＲＮＡ鋳型に基づいてＤＮＡを合成できる核酸ポリメラーゼである。これはまた、ＲＮＡが一旦一本鎖ｃＤＮＡに逆転写されると、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡを複製できる。本発明の一実施形態において、逆転写酵素活性を有するポリメラーゼは熱安定性である。
【００６８】
ＤＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ分子の増幅において、第一の伸長反応はＲＮＡ鋳型を使用する逆転写であり、ＤＮＡ鎖が産生される。第二の伸長反応は、ＤＮＡ鋳型を使用して、二本鎖ＤＮＡ分子を産生する。したがって、ＤＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ鋳型からの相補ＤＮＡ鎖の合成によって、増幅用の出発物質が得られる。
【００６９】
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、カップリングさせた一酵素逆転写／増幅反応で使用することができる。「均質」という用語は、この文脈で、ＲＮＡ標的の逆転写及び増幅のための２ステップの単一付加反応を指す。均質とは、逆転写（ＲＴ）ステップの後で、増幅ステップの前に、反応容器を開けるか、又は反応成分を調節する必要がないことを意味する。不均質ＲＴ／ＰＣＲ反応において、逆転写後で増幅の前に、増幅試薬などの反応成分の１以上を、例えば、調節、添加、又は希釈し、そのために反応容器を開けておくか、又は少なくともその内容物を操作しなければならない。均質及び不均質実施形態のどちらも本発明の範囲に含まれる。
【００７０】
逆転写はＲＴ／ＰＣＲにおいて重要なステップである。例えば、ＲＮＡ鋳型が、各逆転写酵素によるｃＤＮＡ鎖のプライマー結合及び／又は伸長を妨害し得る二次構造を形成する傾向を示すことが当該技術分野で公知である。したがって、ＲＴ反応の比較的高い温度は、転写の効率に関して有利である。一方、インキュベーション温度を上昇させることはまた、より高い特異性、すなわち、ＲＴプライマーが、予想される１つ又は複数の配列に対してミスマッチを示す配列とアニーリングされないことも意味する。特に、複数の異なる標的ＲＮＡの場合、単一のミスマッチを有する配列を転写し、その後増幅し検出することが、例えば、流体試料中に生物の未知又は稀な亜株又は亜種が存在する可能性がある場合にも望ましい可能性がある。
【００７１】
前述の利点、すなわち二次構造の減少及びミスマッチを有する鋳型の逆転写の両方から恩恵を受けるために、ＲＴインキュベーションを複数の異なる温度で実施することができる。
【００７２】
したがって、本発明の一態様は、逆転写酵素活性を有するポリメラーゼの前記インキュベーションを３０℃〜７５℃、又は４５℃〜７０℃、又は５５℃〜６５℃の異なる範囲で実施する前記プロセスである。
【００７３】
逆転写のさらなる重要な態様として、長いＲＴステップは流体試料中に存在し得るＤＮＡ鋳型に損傷を与え得る。流体試料がＲＮＡ種とＤＮＡ種の両方を含む場合、ＲＴステップの期間を可能な限り短く維持するが、同時にその後の増幅と増幅物の任意の検出のために充分なｃＤＮＡ量の合成を確実にすることが好ましい。
【００７４】
したがって、本発明の一態様は、逆転写酵素活性を有するポリメラーゼのインキュベーション時間が最高３０分、２０分、１５分、１２．５分、１０分、５分、又は１分である前記プロセスである。
本発明のさらなる態様は、逆転写酵素活性を有し、変異を含むポリメラーゼが以下のものからなる群から選択される前述のプロセスである：
ａ）ＣＳ５  ＤＮＡポリメラーゼ
ｂ）ＣＳ６  ＤＮＡポリメラーゼ
ｃ）Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ
ｄ）Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ
ｅ）Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ
ｆ）Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ
ｇ）Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼ
ｈ）Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｐ．ｓｐｓ１７  ＤＮＡポリメラーゼ
ｉ）Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｐ．Ｚ０５  ＤＮＡポリメラーゼ
ｊ）Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ  ＤＮＡポリメラーゼ
ｋ）Ｔｅｒｍｏｓｉｐｈｏ  ａｆｒｉｃａｎｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ
ｌ）Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ
【００７５】
これらの要件に特に適しているのは、より速い伸長速度の観点からそれらの逆転写効率を増強するポリメラーゼドメインにおいて変異を有する酵素である。
【００７６】
したがって、前述のプロセスにおいて、逆転写酵素活性を有するポリメラーゼは、各野生型ポリメラーゼに対して改善された核酸伸長速度及び／又は改善された逆転写酵素活性を付与する変異を含むポリメラーゼである。
【００７７】
一実施形態では、前述のプロセスにおいて、逆転写酵素活性を有するポリメラーゼは、各野生型ポリメラーゼに対して改善された逆転写酵素活性を付与する変異を含むポリメラーゼである。ポリメラーゼを特に有用にする点変異を有するポリメラーゼは、国際公開第２００８／０４６６１２号パンフレットで開示されている。特に、使用されるポリメラーゼは、ポリメラーゼドメイン中に少なくとも以下のモチーフを含む変異ＤＮＡポリメラーゼであり得る：Ｔ−Ｇ−Ｒ−Ｌ−Ｓ−Ｓ−Ｘｂ７−Ｘｂ８−Ｐ−Ｎ−Ｌ−Ｑ−Ｎ；式中、Ｘｂ７はＳ又はＴから選択されるアミノ酸であり、Ｘｂ８は、Ｇ、Ｔ、Ｒ、Ｋ、又はＬから選択されるアミノ酸であり、ポリメラーゼは、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を含み、野生型ＤＮＡポリメラーゼに対して改善された核酸伸長速度及び／又は改善された逆転写効率を有し、前記野生型ＤＮＡポリメラーゼにおいて、Ｘｂ８は、Ｄ、Ｅ又はＮから選択されるアミノ酸である。一例は、Ｔｈｅｒｍｕｓ種Ｚ０５由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの変異体（例えば、米国特許第５，４５５，１７０号明細書に記載）であり、前記変形例は各野生型酵素Ｚ０５と比較してポリメラーゼドメインに変異を含む。本発明による方法の一実施形態は、５８０位のアミノ酸がＧ、Ｔ、Ｒ、Ｋ及びＬからなる群から選択される変異Ｚ０５  ＤＮＡポリメラーゼである。
【００７８】
熱安定性ポリメラーゼを使用する逆転写のために、Ｍｎ２＋は二価カチオンであり得、典型的には塩、例えば、塩化マンガン（ＭｎＣｌ２）、酢酸マンガン（Ｍｎ（ＯＡｃ）２）、又は硫酸マンガン（ＭｎＳＯ４）として含まれる。ＭｎＣｌ２が、５０ｍＭのトリシン緩衝液を含有する反応に含まれる場合、例えば、ＭｎＣｌ２は、概して、０．５〜７．０ｍＭの濃度で存在し；２００μＭのｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ、及び、ｄＣＴＰの各々を利用する場合、２．５〜３．５ｍＭが概して存在する。
【００７９】
「修飾」熱安定性ポリメラーゼとは、少なくとも１つのモノマーが、ポリメラーゼの天然若しくは野生型形態又はポリメラーゼの別の修飾形態などの、基準配列とは異なるポリメラーゼを指す。例示的修飾には、モノマー挿入、欠失、及び置換が含まれる。修飾ポリメラーゼはまた、２以上の親由来の同定可能な成分配列（例えば、構造的又は機能的ドメインなど）を有するキメラポリメラーゼを含む。また、修飾ポリメラーゼの定義内には、基準配列の化学的修飾を含むものも含まれる。修飾熱安定性ポリメラーゼの例としては、Ｇ４６Ｅ  Ｅ６７８Ｇ  ＣＳ５  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｇ４６Ｅ  Ｌ３２９Ａ  Ｅ６７８Ｇ  ＣＳ５  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｇ４６Ｅ  Ｌ３２９Ａ  Ｄ６４０Ｇ  Ｓ６７１Ｆ  ＣＳ５  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｇ４６Ｅ  Ｌ３２９Ａ  Ｄ６４０Ｇ  Ｓ６７１Ｆ  Ｅ６７８Ｇ  ＣＳ５  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｇ４６Ｅ  Ｅ６７８Ｇ  ＣＳ６  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｚ０５  ＤＮＡポリメラーゼ、ΔＺ０５ポリメラーゼ、ΔＺ０５−Ｇｏｌｄ  ポリメラーゼ、ΔＺ０５Ｒポリメラーゼ、Ｅ６１５Ｇ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ６７８Ｇ  ＴＭＡ−２５ポリメラーゼ、Ｅ６７８Ｇ  ＴＭＡ−３０ポリメラーゼ及び同種のもの挙げられる。
【００８０】
「熱活性ポリメラーゼ」という用語は、特異的プライミング及びプライマー伸長を確実にするために必要な高温（例えば、５５〜８０℃）で活性な酵素を指す。
【００８１】
「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」という用語は交換可能に用いられる。「核酸」及び「ポリヌクレオチド」という用語は交換可能に用いられる。アミノ酸配列は、別段の表示がない限り、アミノ末端からカルボキシ末端へと記載される。一本鎖核酸配列は、別段の表示がない限り、５’から３’へと記載される。別段の表示がない限り、二本鎖核酸配列の上側の鎖は５’から３’へと記載され、下側の鎖は３’から５’へと記載される。
【００８２】
核酸増幅試薬は、典型的には温度感受性成分を含み、したがって周囲環境よりも充分低い温度で保存し輸送しなければならないことが多い。これは特にデオキシヌクレオシド三リン酸又はそれらのリボヌクレオシド類似体に当てはまる。これらの試薬は末端から連続したリン酸基の喪失により分解されやすく、その結果、ヌクレオシド二リン酸及び一リン酸が形成され、どちらもポリメラーゼ基質として活性ではない。
【００８３】
ヌクレオシドポリリン酸の安定性は、末端ホスフェートをエステル化することによって極めて大幅に改善することができる。例えば、γ−メチル−ｄＮＴＰ類似体は、正常なｄＮＴＰを完全に分解させるために充分な熱応力条件下で完全に安定であった。しかしながら、末端ホスフェートのエステル形成は、ヌクレオチドがある特定のポリメラーゼ酵素に有効な基質として作用する能力にマイナスの影響を及ぼし得る。
【００８４】
本発明は、この問題に対処するための簡単かつ優れた溶液を提供する。本発明で記載するヌクレオチドは、熱安定性であり、かつ、基質として不活性であるか又は活性が低減されているかのいずれかであるが、望ましい場合、簡単な化学的又は酵素的ステップによって容易に不活性化される。この概念を例示する一般的構造を以下に示す：
【００８５】
【化４】
2020506666.tif 000006
【００８６】
式中、
Ｂ＝プリン又はピリミジン塩基又は類似体、
Ｌ＝リンカー又は存在しない
Ｚ＝標識又は存在しない
Ｒ＝ＯＨ又はＯ−
Ｒ１、Ｒ２＝Ｈ又はＯＨ
ｎ＝１〜７
Ｘ＝Ｏ、Ｓ又はＮＨ
Ｙ＝化学的又は酵素的に除去できる有機基
好ましい実施形態
Ｙ＝ＨＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−，ＣＨ３Ｃ（Ｏ）−Ｓ−ＣＨ２ＣＨ２又はＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ２。
【００８７】
化学的活性化
保護基は、初期反応、例えば還元剤との反応によってさらに分解して所望の活性なヌクレオチドをもたらす反応性中間体を生成するように選択される。還元剤は、ジスルフィドを還元することができる任意の試薬であり得る。そのような還元剤の数例は、β−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール及びＴＣＥＰ（トリス−（２−カルボキシエチル）ホスフィン）である。
【００８８】
本発明の方法において、反応成分は、反応混合物が調製され試料が添加されるまで、ｄＮＴＰ類似体が還元剤から分離して保持されるように構成されている。修飾ヌクレオシドポリリン酸、ヒドロキシエチルジスルフィド−ｄＮＴＰ（ＨＥＤＳ−ｄＮＴＰ）を使用する化学的活性化反応の一例を図１に示す。
【００８９】
酵素的活性化
保護基は、初期酵素反応、例えばエステラーゼとの反応によって、さらに分解して所望の活性ヌクレオチドをもたらす反応性中間体を生じるように選択される。本発明の方法において、反応成分は、反応混合物が調製され試料が添加されるまでｄＮＴＰ類似体が活性化酵素から離れて保持されるように構成されている。修飾ヌクレオシドポリリン酸、アセチル−チオエチル−ｄＮＴＰ（ＡＴＥ−ｄＮＴＰ）を使用する酵素的活性化反応の一例を図２に示す。
【００９０】
前記発明を、明確にして理解する目的である程度詳細に記載してきたが、本開示を読むと、形態及び詳細において様々な変更をなし得ることは当業者には明らかであろう。例えば、前記組成物及び方法のすべては、様々な組み合わせで使用することができる。以下の実施例は、実施するのに現在好ましいように、本発明の実施形態を説明するために提示する。実施例は説明であり、本発明は添付の特許請求の範囲で示す以外に限定されるべきでないとみなされると理解される。
【実施例】
【００９１】
実施例１：ｄＡＴＰ−２−ヒドロキシエチルジスルフィドエステルの調製
ｄＡＴＰ−２−ヒドロキシエチルジスルフィドエステル（ＨＥＤＳ−ｄＡＴＰ）の調製を図３に示す。簡単に言うと、５００μＭのｄＡＴＰを２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液ｐＨ４．５中に懸濁させ、０．８２ｍＭの２，２’−ジスルファンジイル−ビス（エタン−１−オール）とインキュベートし、続いて１５分間氷中でインキュベーションをおこなった。次いで、増加量のＥＤＣ（Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩）を混合物に徐々に添加し、２．６１ｍＭの最終濃度に達した。反応混合物を室温で７日間インキュベートし、生成物を超高性能液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）によって分析した。約９０％の収率の生成物ＨＥＤＳ−ｄＡＴＰが、このプロトコルを用いて産生された。
【００９２】
実施例２：トリス−（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）によるＨＥＤＳ−ｄＡＴＰの活性化
還元剤トリス−（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を使用して、６０℃での熱処理によってＨＥＤＳ−ｄＡＴＰをｄＡＴＰに還元した。図４は、６０℃での１ｍＭ  ＴＣＥＰの処理の０分、１０分、２０分、３０分及び６０分後にＨＥＤＳ−ｄＡＴＰの変換を示すＨＰＬＣクロマトグラムを示す。ピーク１は中間生成物を表す。ピーク２は出発物質であるＨＥＤＳ−ｄＡＴＰを表す。ピーク３は生成物であるｄＡＴＰを表す。
【００９３】
実施例３：ＨＥＤＳ−ｄＮＴＰを使用する増幅反応
ＰＣＲ反応混合物を９６ウェルプレート上で、以下の最終濃度で調製した：６０ｍＭ  トリシン（ｐＨ８．３）、１２０ｍＭ酢酸カリウム、３％グリセロール、５．４％ＤＭＳＯ、０．０１５％Ｔｗｅｅｎ２０、標的ＨＩＶ−１Ｍ鋳型（２００コピー／反応）、各々６００ｎＭの順及び逆プライマー、１００ｎＭのＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ、９００単位／ｍＬのＺＯ５Ｄ  ＤＮＡポリメラーゼ（５’ヌクレアーゼ活性を有する）、２００単位／ｍＬのＵＮＧ、４４μＭ  ＥＤＴＡ、及び３．３ｍＭ酢酸マンガン。１つの反応セットでは、各々４００μＭのデオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、及び８００μＭのデオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）を添加し、別の反応セットでは、各々４００μＭのＨＥＤＳ−ｄＡＴＰ、ＨＥＤＳ−ｄＧＴＰ（ｄＧＴＰ−２−ヒドロキシエチルジスルフィドエステル）、ＨＥＤＳ−ｄＣＴＰ（ｄＣＴＰ−２−ヒドロキシエチルジスルフィドエステル）、及び８００μＭのＨＥＤＳ−ｄＵＴＰ（ｄＵＴＰ−２−ヒドロキシエチルジスルフィドエステル）を添加した。
【００９４】
図５及び６は、１ｍＭ  ＴＣＥＰ（図５）及び５ｍＭ亜硫酸ナトリウムＮａ２ＳＯ３（図６）を使用してｄＮＴＰに換算した、ＨＥＤＳ−ｄＮＴＰを使用したＰＣＲ増幅反応の成長曲線を示す。ＴＣＥＰを使用して活性化したＨＥＤＳ−ｄＮＴＰは、標準ｄＮＴＰに対して約１Ｃｔの遅延を伴う成長曲線を示したが、亜硫酸ナトリウムを用いて活性化したＨＥＤＳ−ｄＮＴＰからの成長曲線は、標準ｄＮＴＰを使用したものと実質的に同一であった。
【００９５】
実施例４：ＨＥＤＳ−ｄＮＴＰを使用した安定性試験
標準ｄＮＴＰ又はＨＥＤＳ−ｄＮＴＰのいずれかの形態のヌクレオシド三リン酸を３７℃又は４５℃のいずれかで２２日間保存した。これらの保存したヌクレオシドトリスホスフェートをその後、ＨＥＤＳ−ｄＮＴＰの活性化のための還元剤として１ｍＭ  ＴＣＥＰを用い、ＨＩＶ−１Ｍ（反応あたり２００コピー）、ＨＩＶ−２（反応あたり１００コピー）又は内部制御配列（ＩＣ、反応あたり１０００コピー）を鋳型として使用して、実施例３で記載するようなアッセイ条件でＰＣＲ反応において利用した。これらの保存した試薬を使用するＰＣＲ増幅の効率は、平均Ｃｔ値（閾値サイクル数）として表され、図７（３７℃でインキュベートした試薬について）及び図８（４５℃でインキュベートした試薬について）中の棒グラフとして表す。結果は、３７℃での保存において、標準ｄＮＴＰは、ＨＥＤＳ−ｄＮＴＰよりも高いＣｔ値（１．９〜３．９）を示し、おそらくは標準ｄＮＴＰのある程度の分解のために、あまり効率的でない増幅を示した。４５℃での保存について、標準ｄＮＴＰを使用する３つの反応のうち２つは、ＨＥＤＳ−ｄＮＴＰを使用する３つの反応はすべて、３７℃で保存されたＨＥＤＳ−ｄＮＴＰとは有意に異ならないＣｔ値を示した一方で、ほぼ完全な分解のために、成長曲線を生じなかった（図７と図８との間で暗灰色のバーを比較）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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