(57)【要約】本開示は、凍結保護剤および／または凍結保存剤組成物、その方法および使用に関する。この組成物は、細胞、生物および／または組織の保存および／または保護に使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
水素結合供与体化合物と水素結合受容体化合物とを含む凍結保護剤および／または凍結保存剤組成物であって、
ポリオールとしてのグリセロールおよび糖としてのトレハロース、ならびに任意の尿素および／もしくはアミノ酸；または
尿素およびアミノ酸を含有する水溶液、
を含む、凍結保護剤および／または凍結保存剤組成物。
【請求項２】
グリセロールおよびトレハロース、ならびに任意の尿素および／もしくはアミノ酸；または
尿素およびアミノ酸を含む水溶液、
からなる、請求項１に記載の凍結保護剤および／または凍結保存剤組成物。
【請求項３】
尿素、グルコース、プロリン、および水を含む、請求項１または２のいずれか１項に記載の凍結保護剤および／または凍結保存剤組成物。
【請求項４】
糖：ポリオールのモル比が１：０．５〜１：４０の間であり、好ましくは１：７〜１：３０の間であり、より好ましくは１：１０〜１：２０の間である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の凍結保護剤および／または凍結保存剤組成物。
【請求項５】
尿素：ポリオールのモル比が１：０．２５〜１：１０の間であり、好ましくは１：１〜１：５の間であり、より好ましくは１：３〜１：４の間である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の凍結保護剤および／または凍結保存剤組成物。
【請求項６】
尿素：糖のモル比が１：１〜１０：１の間であり、好ましくは２：１〜６：１の間であり、より好ましくは３：１〜４：１の間である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の凍結保護剤および／または凍結保存剤組成物。
【請求項７】
前記アミノ酸が、プロリン、ヒスチジン、グリシン、リシン、トリプトファン、アスパラギン酸、アラニン、グルタミン酸、ロイシン、イソロイシン、バリン、アスパラギン、セリン、グルタミン、またはそれらの混合物からなるリストから選択され、好ましくはプロリンである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の凍結保護剤および／または凍結保存剤組成物。
【請求項８】
尿素：ポリオール：アミノ酸のモル比が１：１：０．２５〜３：３：１の間である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の凍結保護剤および／または凍結保存剤組成物。
【請求項９】
尿素：糖：アミノ酸のモル比が１：１：１〜３：２：１の間であり、好ましくは尿素：糖：アミノ酸のモル比が１：１：１、２：１：１、３：１：１、２：２：１、３：２：１である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の凍結保護剤および／または凍結保存剤組成物。
【請求項１０】
さらに水を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の凍結保護剤および／または凍結保存剤組成物。
【請求項１１】
尿素：糖：アミノ酸：水のモル比が１：１：１：１〜２：１：１：４の間であり、好ましくは、１：１：１：２、１：１：１：３、１：１：１：４、２：１：１：１、２：１：１：３である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の凍結保護剤および／または凍結保存剤組成物。
【請求項１２】
細胞生存率または組織の増強剤としての、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の凍結保護剤および／または凍結保存剤組成物の使用。
【請求項１３】
前記細胞または組織が８℃以下で保存される、請求項１２に記載の凍結保護剤および／または凍結保存剤組成物の使用。
【請求項１４】
前記細胞または組織が−４℃以下で保存される、請求項１３に記載の凍結保護剤および／または凍結保存剤組成物の使用。
【請求項１５】
前記細胞または組織が−２０℃以下で保存される、請求項１４に記載の凍結保護剤および／または凍結保存剤組成物の使用。
【請求項１６】
前記細胞または組織が−８０℃以下、好ましくは−１９６℃以下で保存される、請求項１５に記載の凍結保護剤および／または凍結保存剤組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、凍結保護剤および／または凍結保存剤組成物、その方法およびその使用に関する。この組成物は、細胞、生物および／または組織の保存および／または保護に使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
細胞の凍結プロセス中に、２つの主要な事象が発生する。大気圧下で、高速冷却速度で０℃未満に冷却すると、水は六方晶または立方晶の形で氷を形成する。氷晶の形成は、細胞膜と細胞小器官を損傷し、細胞死を引き起こし得る。ゆっくりと冷却すると、結晶の形成が減少するが、細胞外培地への水の浸透によって生じる細胞の脱水や収縮の影響が増加し、細胞膜や細胞小器官にも物理的なストレスを引き起こし、細胞死を引き起こし得る。どちらの場合においても、溶質の細胞内濃度の増加もまた、細胞死に寄与する。最適な冷却速度は、冷却速度が十分に遅く、それによって細胞内の氷晶形成を防ぎ、しかし深刻な脱水効果を克服するのに十分なほど速くなるように見つけられ得る。しかし、温血（恒温）動物の臓器細胞の場合、この冷却速度域を見つけるのは非常に難しく、完全な細胞生存率を達成することはできない。制御冷却速度による凍結保存は、原核生物などの特定の場合にのみ実行可能な、コストのかかる方法である（非特許文献３〜５）。
【０００３】
水溶液を急速に冷却すると、結晶化が回避され、結果として、ガラス転移温度未満の温度でガラス質固体へとガラス化する前に、水が準安定非晶質固体になる。動物細胞の場合、水のガラス化を達成するために必要な冷却速度は実用的ではなく、凍結保護剤の使用が必要である。この条件では、細胞に氷晶がないと考えられる。細胞内の氷晶を回避することが細胞の生存の鍵となる（非特許文献６）。さまざまな細胞と組織は、冷却速度と凍結保護剤に対してさまざまな反応を示す。最適な冷却条件を決定するには、依然として実験が最も効率的な方法である（非特許文献７）。凍結保護剤は、分子量（高分子量か低分子量か）および細胞への浸透速度（エタノール、エチレングリコールまたはメチルアセトアミドは急速に浸透し、グリセロールはよりゆっくり浸透する）のいずれかで分類できる。細胞壁および／または細胞膜に浸透せず、１０から４０％の濃度で細胞外の凍結保護を提供する、単糖、オリゴ糖、多糖、タンパク質、生体高分子などの凍結保護剤の分類もある（非特許文献１、４）。
【０００４】
最も広く使用されている凍結保存剤であるＤＭＳＯに加えて、グリセロールや１，２ジオールプロパンなどの多価アルコールが、皮膚や神経組織などの複雑な細胞構造に対してある程度の成功を収めていることが報告されている。デキストランまたはトレハロースなどの非浸透性凍結保護剤も、単独または浸透性凍結保護剤と組み合わせて、複雑な組織の凍結保護に使用された。トレハロースの場合、浸透性凍結保護剤との組み合わせが有利であることが明らかとなった（非特許文献３、７）。
【０００５】
非浸透性凍結保護剤と浸透性凍結保護剤の作用におけるもう１つの重要な違いは、塩濃度である。塩のみを含む溶液では、温度が低下すると塩濃度が急速に増加する。一方、凍結保護剤を添加した溶液では、溶質濃度は同じように増加するが、塩濃度は低くなる。非浸透性凍結保護剤の場合、細胞外塩濃度のみが影響を受け、高い溶質濃度が細胞膜に浸透圧ストレスを引き起こす。これは、浸透性凍結保護剤の場合には当てはまらない。この場合、水が細胞外に拡散すると凍結保護剤が細胞内に拡散し、これにより元の細胞体積を維持し、浸透圧ストレスを低減する。浸透圧ストレスに加えて、ガラス化プロセスに必要な高濃度の凍結保護剤は、水の化学ポテンシャルの低さまたは化学毒性のために損傷を引き起こす可能性がある（非特許文献４）。
【０００６】
生物の極端な温度振幅に耐える戦略は、さまざまな生物代謝産物の組織化された生産に依存する。
【０００７】
広く知られているさまざまな糖、ポリオール、およびアミノ酸は、動物界の極端な温度差に対抗するための多成分系の一部であることが証明されている。この知識は、前世紀の凍結保護剤ソリューション開発の基礎であったが、この知識は最近まで深共晶系に関連していなかった。
【０００８】
天然深共晶溶媒（ＮＡＤＥＳ）は、糖、アミノ酸、有機酸、コリン誘導体などの、２つ以上の固体または液体成分の混合物として定義され、個々の成分と比較して特定の組成で高い融点低下を示し、室温または室温付近で液体となる（非特許文献２５）。
【０００９】
凍結保存の研究は深共晶溶媒のより近年の理解を進展させ、細胞内の自然発生深共晶溶媒（ＮＡＤＥＳ）のより具体的な役割は、自然に基づいた凍結保存剤のより効率的な開発のための研究の窓を開いた。ＮＡＤＥＳは、本質的に水素結合供与体と水素結合受容体化合物で構成されている。ＮＡＤＥＳを構成する可能性のあるさまざまな分子の配列は、最大１０から６の組み合わせまで生じると推定される。
【００１０】
天然深共晶系に基づいた新しい凍結保護系を設計し、細胞の凍結保存の挙動を評価した。
【００１１】
これらの事実は、本開示により取り組まれる技術的問題を説明するために開示される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｈｕｂ，  Ｚ．  Ｐｒｏｔｅｃｔａｎｔｓ  ｕｓｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｑ．  ２００３，  ４６，  ２０５−２２９．
【非特許文献２】Ｋａｒｌｓｓｏｎ，  Ｊ．  Ｏ．  Ｍ．；  Ｔｏｎｅｒ，  Ｍ．  Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ｂｙ  ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ：  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｉｓｓｕｅｓ．  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  １９９６，  １７  （３），  ２４３−２５６．
【非特許文献３】Ｌｉｕ，  Ｄ．；  Ｐａｎ，  Ｆ．  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｓ  ＊．  ２０１６，  ３６  （２），  １５３−１６１．
【非特許文献４】ＦＡＯ．  Ｂａｓｉｃ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ．  Ｃｒｙｏｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ  Ａｎｉｍ．  Ｇｅｎｅｔ．  Ｒｅｓｏｕｒ．  ２０１２，  ８５−９４．
【非特許文献５】Ｓｅｇａｌｌ，  Ｐ．  Ｅ．  Ｌｏｗ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｍ．  Ｊ．  Ａｓｈｗｏｏｄ−Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｊ．  Ｆａｒｒａｎｔ．  Ｍｅｄ．  Ｐｈｙｓ．  １９８２，  ９  （３），  １９−４４．
【非特許文献６】Ｈｕｅｂｉｎｇｅｒ，  Ｊ．；  Ｈａｎ，  Ｈ．  Ｍ．；  Ｈｏｆｎａｇｅｌ，  Ｏ．；  Ｖｅｔｔｅｒ，  Ｉ．  Ｒ．；  Ｂａｓｔｉａｅｎｓ，  Ｐ．  Ｉ．  Ｈ．；  Ｇｒａｂｅｎｂａｕｅｒ，  Ｍ．  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｗａｔｅｒ  Ｓｔａｔｅｓ  ｉｎ  Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ｒｅｖｅａｌｓ  Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｔｏｗａｒｄ  Ｉｃｅ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｊ．  ２０１６，  １１０  （４），  ８４０−８４９．
【非特許文献７】Ｂａｋｈａｃｈ，  Ｊ．  Ｔｈｅ  ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  ｔｉｓｓｕｅｓ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｃｅｎｔ  ａｄｖａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｎ  ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｔｙｐｅ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅｓ．  Ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２００９，  ５  （３），  １１９−１２６．
【非特許文献８】Ｊｏｈｎ  Ｍ．  Ｋｉｍｂｌｅ．  Ｇｌｏｂａｌ  Ｃｌｉｍａｔｅ  Ｃｈａｎｇｅ  ａｎｄ  Ｃｏｌｄ  Ｒｅｇｉｏｎｓ  Ｅｃｏｓｙｓｔｅｍｓ；  Ｒ  Ｌａｌ，  Ｒ  Ｍ  Ｋｉｍｂｌｅ，  Ｂ．  Ａ．  Ｓ．，  Ｅｄ．；  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  ２０００．
【非特許文献９】Ｗａｌｔｅｒｓ，  Ｋ．  Ｒ．；  Ｓｆｏｒｍｏ，  Ｔ．；  Ｂａｒｎｅｓ，  Ｂ．  Ｍ．；  Ｄｕｍａｎ，  Ｊ．  Ｇ．  Ｆｒｅｅｚｅ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｉｎ  ａｎ  ａｒｃｔｉｃ  Ａｌａｓｋａ  ｓｔｏｎｅｆｌｙ．  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｂｉｏｌ．  ２００９，  ２１２  （Ｐｔ  ２），  ３０５−３１２．
【非特許文献１０】Ｓｏｍｍｅ，  Ｌ．；  Ｍｅｉｅｒ，  Ｔ．  Ｃｏｌｄ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｉｎ  Ｔａｒｄｉｇｒａｄａ  ｆｒｏｍ  Ｄｒｏｎｎｉｎｇ  Ｍａｕｄ  Ｌａｎｄ，  Ａｎｔａｒｃｔｉｃａ．  Ｐｏｌａｒ  Ｂｉｏｌ．  １９９５，  １５  （３），  ２２１−２２４．
【非特許文献１１】Ｒｉｇｈｔ，  Ｊ．  Ｃ．  Ｗ．  Ｃｒｙｐｔｏｂｉｏｓｉｓ  ３００  Ｙｅａｒｓ  ｏｎ  ｆｒｏｍ  ｖａｎ  Ｌｅｕｗｅｎｈｏｅｋ：  Ｗｈａｔ  Ｈａｖｅ  Ｗｅ  Ｌｅａｒｎｅｄ  ａｂｏｕｔ  Ｔａｒｄｉｇｒａｄｅｓ？  ＊．  ２００１，  ２４０  （Ａｕｇｕｓｔ  ２０００），  ５６３−５８２．
【非特許文献１２】Ｗｅｓｔｈ，  Ｐ．；  Ｒａｍｌｏｖ，  Ｈ．  Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔａｒｄｉｇｒａｄｅ  Ａｄｏｒｙｂｉｏｔｕｓ  ｃｏｒｏｎｉｆｅｒ  ｄｕｒｉｎｇ  ａｎｈｙｄｒｏｂｉｏｓｉｓ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｚｏｏｌｏｇｙ．  １９９１，  ｐｐ  ３０３−３１１．
【非特許文献１３】Ｈｅｎｇｈｅｒｒ，  Ｓ．；  Ｈｅｙｅｒ，  Ａ．  Ｇ．；  Ｋｏｈｌｅｒ，  Ｈ．  Ｒ．；  Ｓｃｈｉｌｌ，  Ｒ．  Ｏ．  Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ  ａｎｄ  ａｎｈｙｄｒｏｂｉｏｓｉｓ  ｉｎ  ｔａｒｄｉｇｒａｄｅｓ  −  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｃｅ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ．  ＦＥＢＳ  Ｊ．  ２００８，  ２７５  （２），  ２８１−２８８．
【非特許文献１４】Ｋｏｓｔａｌ，  Ｖ．；  Ｄｏｌｅｚａｌ，  Ｐ．；  Ｒｏｚｓｙｐａｌ，  Ｊ．；  Ｍｏｒａｖｃｏｖａ，  Ｍ．；  Ｚａｈｒａｄｎｉｃｋｏｖａ，  Ｈ．；  Ｓｉｍｅｋ，  Ｐ．  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｏｖｅｒｗｉｎｔｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｏｌｄ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｉｎ  ｔｗｏ  Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｐｒｕｃｅ  ｂａｒｋ  ｂｅｅｔｌｅ，  Ｉｐｓ  ｔｙｐｏｇｒａｐｈｕｓ．  Ｊ．  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２０１１，  ５７  （８），  １１３６−１１４６．
【非特許文献１５】Ｋｏｓｔａｌ，  Ｖ．；  Ｓｉｍｅｋ，  Ｐ．  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  ｃｏｌｄ  ｈａｒｄｉｎｅｓｓ，  ｓｕｐｅｒｃｏｏｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔｓ  ｉｎ  ｄｉａｐａｕｓｉｎｇ  ａｎｄ  ｎｏｎ−ｄｉａｐａｕｓｉｎｇ  ｐｕｐａｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃａｂｂａｇｅ  ｒｏｏｔ  ｆｌｙ，  Ｄｅｌｉａ  ｒａｄｉｃｕｍ  Ｌ．  Ｊ．  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １９９５，  ４１  （７），  ６２７−６３４．
【非特許文献１６】Ｏｖｅｒｇａａｒｄ，  Ｊ．；  Ｍａｌｍｅｎｄａｌ，  Ａ．；  Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，  Ｊ．  Ｇ．；  Ｂｕｎｄｙ，  Ｊ．  Ｇ．；  Ｌｏｅｓｃｈｃｋｅ，  Ｖ．；  Ｎｉｅｌｓｅｎ，  Ｎ．  Ｃ．；  Ｈｏｌｍｓｔｒｕｐ，  Ｍ．  Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｒａｐｉｄ  ｃｏｌｄ  ｈａｒｄｅｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｏｌｄ  ｓｈｏｃｋ  ｉｎ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ．  Ｊ．  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２００７，  ５３  （１２），  １２１８−１２３２．
【非特許文献１７】Ｌｅｅ，  Ｒ．；  Ｄｏｍｍｅｌ，  Ｒ．；  Ｊｏｐｌｉｎ，  Ｋ．；  Ｄｅｎｌｉｎｇｅｒ，  Ｄ．  Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｒｅｅｚｅ−ｔｏｌｅｒａｎｔ  ｇａｌｌ  ｆｌｙ  Ｅｕｒｏｓｔａ  ｓｏｌｉｄａｇｉｎｉｓ：  ｏｖｅｒｗｉｎｔｅｒｉｎｇ  ｅｎｅｒｇｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ｃｌｉｍ．  Ｒｅｓ．  １９９５，  ５，  ６１−６７．
【非特許文献１８】Ｒｏｚｓｙｐａｌ，  Ｊ．；  Ｋｏｓｔａｌ，  Ｖ．；  Ｚａｈｒａｄｎｉｃｋｏｖａ，  Ｈ．；  Ｓｉｍｅｋ，  Ｐ．  Ｏｖｅｒｗｉｎｔｅｒｉｎｇ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｃｏｌｄ  Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｃｏｄｌｉｎｇ  Ｍｏｔｈ  （Ｃｙｄｉａ  ｐｏｍｏｎｅｌｌａ）．  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２０１３，  ８  （４）．
【非特許文献１９】Ｌａｌｏｕｅｔｔｅ，  Ｌ．；  Ｋｏｓｔａｌ，  Ｖ．；  Ｃｏｌｉｎｅｔ，  Ｈ．；  Ｇａｇｎｅｕｌ，  Ｄ．；  Ｒｅｎａｕｌｔ，  Ｄ．  Ｃｏｌｄ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ａｎｄ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ａｄｕｌｔ  ｔｒｏｐｉｃａｌ  ｂｅｅｔｌｅｓ  ｅｘｐｏｓｅｄ  ｔｏ  ｆｌｕｃｔｕａｔｉｎｇ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｒｅｇｉｍｅｓ．  ＦＥＢＳ  Ｊ．  ２００７，  ２７４  （７），  １７５９−１７６７．
【非特許文献２０】Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ，  Ｒ．  Ｅ．；  Ｂａｕｓｔ，  Ｊ．  Ｇ．  Ｔｈｅ  ｏｎｔｏｇｅｎｙ  ｏｆ  ｃｏｌｄ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇａｌｌ  ｆｌｙ，  Ｅｕｒｏｓｔａ  ｓｏｌｉｄａｇｅｎｓｉｓ．  Ｊ．  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １９７６，  ２２  （３），  ４３１−４３７．
【非特許文献２１】Ｌｅｅ，  Ｋ．  Ｙ．；  Ｃｈａｎｇ，  Ｙ．  Ｄ．；  Ｋｉｍ，  Ｙ．  Ｇ．  Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ，  ａ  Ｍａｊｏｒ  Ｓｕｇａｒ  Ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｏｖｅｒｗｉｎｔｅｒｉｎｇ  Ｒｉｃｅ  Ｗａｔｅｒ  Ｗｅｅｖｉｌ，  Ｌｉｓｓｏｒｈｏｐｔｒｕｓ  ｏｒｙｚｏｐｈｉｌｕｓ  （Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ：  Ｃｕｒｃｕｌｉｏｎｉｄａｅ）．  Ｊ．  Ａｓｉａ．  Ｐａｃ．  Ｅｎｔｏｍｏｌ．  ２００２，  ５  （１），  ３５−４１．
【非特許文献２２】Ｋｏｓｔａｌ，  Ｖ．；  Ｚａｈｒａｄｎｉｃｋｏｖａ，  Ｈ．；  Ｓｉｍｅｋ，  Ｐ．；  Ｚｅｌｅｎｙ，  Ｊ．  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｓｙｓｔｅｍ  ｏｆ  ｓｕｇａｒｓ  ａｎｄ  ｐｏｌｙｏｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｏｖｅｒｗｉｎｔｅｒｉｎｇ  ｓｐｒｕｃｅ  ｂａｒｋ  ｂｅｅｔｌｅ，  Ｉｐｓ  ｔｙｐｏｇｒａｐｈｕｓ．  Ｊ．  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２００７，  ５３  （６），  ５８０−５８６．
【非特許文献２３】Ｓｆｏｒｍｏ，  Ｔ．；  Ｗａｌｔｅｒｓ，  Ｋ．；  Ｊｅａｎｎｅｔ，  Ｋ．；  Ｗｏｗｋ，  Ｂ．；  Ｆａｈｙ，  Ｇ．  Ｍ．；  Ｂａｒｎｅｓ，  Ｂ．  Ｍ．；  Ｄｕｍａｎ，  Ｊ．  Ｇ．  Ｄｅｅｐ  ｓｕｐｅｒｃｏｏｌｉｎｇ，  ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｔｏ  −１００°Ｃ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ａｌａｓｋａｎ  ｂｅｅｔｌｅ  Ｃｕｃｕｊｕｓ  ｃｌａｖｉｐｅｓ  ｐｕｎｉｃｅｕｓ  （Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ：  Ｃｕｃｕｊｉｄａｅ）．  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｂｉｏｌ．  ２０１０，  ２１３，  ５０２−５０９．
【非特許文献２４】Ｃｈｏｉ，  Ｙ．  Ｈ．；  ｖａｎ  Ｓｐｒｏｎｓｅｎ，  Ｊ．；  Ｄａｉ，  Ｙ．；  Ｖｅｒｂｅｒｎｅ，  Ｍ．；  Ｈｏｌｌｍａｎｎ，  Ｆ．；  Ａｒｅｎｄｓ，  Ｉ．  Ｗ．  Ｃ．  Ｅ．；  Ｗｉｔｋａｍｐ，  Ｇ．−Ｊ．；  Ｖｅｒｐｏｏｒｔｅ，  Ｒ．  Ａｒｅ  ｎａｔｕｒａｌ  ｄｅｅｐ  ｅｕｔｅｃｔｉｃ  ｓｏｌｖｅｎｔｓ  ｔｈｅ  ｍｉｓｓｉｎｇ  ｌｉｎｋ  ｉｎ  ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ？  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２０１１，  １５６  （４），  １７０１−１７０５．
【非特許文献２５】Ｐａｉｖａ，  Ａ．；  Ｃｒａｖｅｉｒｏ，  Ｒ．；  Ａｒｏｓｏ，  Ｉ．；  Ｍａｒｔｉｎｓ，  Ｍ．；  Ｒｅｉｓ，  Ｒ．  Ｌ．；  Ｄｕａｒｔｅ，  Ａ．  Ｒ．  Ｃ．；  Ｐａｉｖａ，  Ａｌｅｘａｎｄｒｅ；  Ｃｒａｖｅｉｒｏ，  Ｒｉｔａ；  Ａｒｏｓｏ，  Ｉｖｏ；  Ｍａｒｔｉｎｓ，  Ｍａｒｔａ；  Ｒｅｉｓ，  Ｒｕｉ；  Ｄｕａｒｔｅ，  Ａ．  Ｒ．  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｄｅｅｐ  Ｅｕｔｅｃｔｉｃ  Ｓｏｌｖｅｎｔｓ  −  Ｓｏｌｖｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ２１ｓｔ  ｃｅｎｔｕｒｙ．  Ｓｕｓｔａｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｅｎｇ．  ２０１４，  ＡＳＡＰ．
【非特許文献２６】Ｄａｉ，  Ｙ．；  ｖａｎ  Ｓｐｒｏｎｓｅｎ，  Ｊ．；  Ｗｉｔｋａｍｐ，  Ｇ．−Ｊ．；  Ｖｅｒｐｏｏｒｔｅ，  Ｒ．；  Ｃｈｏｉ，  Ｙ．  Ｈ．  Ｉｏｎｉｃ  ｌｉｑｕｉｄｓ  ａｎｄ  ｄｅｅｐ  ｅｕｔｅｃｔｉｃ  ｓｏｌｖｅｎｔｓ  ｉｎ  ｎａｔｕｒａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ：  ｍｉｘｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｓｏｌｉｄｓ  ａｓ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｓｏｌｖｅｎｔｓ．  Ｊ．  Ｎａｔ．  Ｐｒｏｄ．  ２０１３，  ７６  （１１），  ２１６２−２１７３．
【非特許文献２７】Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，  Ｍ．；  ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｒｕｉｎｈｏｒｓｔ，  Ａ．；  Ｋｒｏｏｎ，  Ｍ．  Ｃ．  Ｌｏｗ−ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ−ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ  （ＬＴＴＭｓ）：  ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｓｉｇｎｅｒ  ｓｏｌｖｅｎｔｓ．  Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌ．  ２０１３，  ５２  （１１），  ３０７４−３０８５．
【非特許文献２８】Ｄｕｒａｎｄ，  Ｅ．；  Ｌｅｃｏｍｔｅ，  Ｊ．；  Ｖｉｌｌｅｎｅｕｖｅ，  Ｐ．  Ｆｒｏｍ  ｇｒｅｅｎ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｔｏ  ｎａｔｕｒｅ：  Ｔｈｅ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｌｏｗ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ．  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ２０１６，  １２０，  １１９−１２３．
【発明の概要】
【００１３】
凍結は、食物、臓器、さらには生物さえも長期保存するための最良の技術とみなされている。温度が下がると、反応が遅くなり、微生物の活動が最小限に抑えられる。保存に関しては、これが選択手法となるが、凍結保存にはいくつかの課題がある。水は生物の細胞の最も一般的な成分であり、温度が低下して水が氷に変わると、生きるために不可欠な同じ成分が有害となる。凍結時の水の結晶化は、多くの場合、生物または器官中の死んだ細胞を起源とする、解凍時に回復できない方法で細胞を破壊する。これらの影響を最小限に抑えるいくつかの解決方法としては、特定の凍結時間勾配を使用して細胞内氷晶の数とサイズを制御する、または凍結保護剤を使用するなどがあり、水の非晶質化を促進し、これによって結晶化プロセスを部分的または完全に回避する。より複雑なシステムの解決策は凍結保存剤を使用することだが、高濃度の凍結保存剤が必要になることがあり、毒性の問題が生じる場合がある（非特許文献１）。凍結保存は価値の高い市場であるが、効率的な解決策はない。産業におけるこの技術の実装例は、主に胚、精子、および幹細胞の貯蔵であり、解凍時に大量の細胞死が許容されるものである（非特許文献２）。
【００１４】
これらの化合物は、天然深共晶溶媒（ＮＡＤＥＳ）の成分として定義されており、ＤＭＳＯや他の毒性凍結保護剤の使用を回避する凍結保護剤の開発に大きな可能性を示している。
【００１５】
凍結保護剤／凍結保存剤は、生体組織、細胞、または生物を凍結損傷から保護するために使用される物質である。
【００１６】
本開示は、凍結保存剤として天然および生体適合性分子を使用し、ＤＭＳＯなどの有毒な凍結保護剤の使用を回避し、（−１９６℃から８℃に）保存温度を上げ、好ましくは−５０℃から−２０℃とし、細胞、組織および／または臓器を貯蔵でき、保管時間を増やすことができる、という利点を有する。
【００１７】
一実施形態では、本開示の組成物は、ＤＭＳＯを含まない凍結保護剤を使用する。
【００１８】
本開示は、水素結合供与体化合物と水素結合受容体化合物とを含む凍結保護剤および／または凍結保存剤組成物であって、ポリオールとしてのグリセロールおよび糖としてのトレハロース、ならびに任意の尿素および／もしくはアミノ酸；または尿素およびアミノ酸を含有する水溶液、を含む、凍結保護剤および／または凍結保存剤組成物に関する。
【００１９】
一実施形態では、凍結保護剤および／または凍結保存剤組成物は、グリセロールおよびトレハロース、ならびに任意の尿素および／もしくはアミノ酸；または尿素およびアミノ酸を含む水溶液、からなる。
【００２０】
一実施形態では、前記組成物は第２の糖をさらに含み得、前記第２の糖は単糖、二糖、または多糖であってよく、特に前記糖はグルコース、フルクトース、またはそれらの混合物からなるリストから選択され得る。
【００２１】
一実施形態では、前記組成物は第２のポリオールをさらに含み得、前記第２のポリオールはグリセロール、ソルビトール、マンニトール、またはそれらの混合物からなるリストから選択され得る。
【００２２】
一実施形態では、糖：ポリオールのモル比が１：０．５〜１：４０の間であり、好ましくは１：７〜１：３０の間であり、より好ましくは１：１０〜１：２０の間である。好ましくは、前記糖はトレハロースであり、前記ポリオールはグリセロールである。
【００２３】
一実施形態では、尿素：ポリオールのモル比が１：０．２５〜１：１０の間であり、好ましくは１：１〜１：５の間であり、より好ましくは１：３〜１：４の間である。好ましくは、前記ポリオールはグリセロールである。
【００２４】
一実施形態では、尿素：糖のモル比が１：１〜１０：１の間であり、好ましくは２：１〜６：１の間であり、より好ましくは３：１〜４：１の間である。好ましくは、前記糖はトレハロースである。
【００２５】
一実施形態では、前記凍結保護剤および／または凍結保存剤組成物は、アミノ酸をさらに含んでもよく、特に、前記アミノ酸は、プロリン、ヒスチジン、グリシン、リシン、トリプトファン、アスパラギン酸、アラニン、グルタミン酸、ロイシン、イソロイシン、バリン、アスパラギン、セリン、グルタミン、またはそれらの混合物からなるリストから選択され、より好ましくは、プロリンである。
【００２６】
一実施形態では、尿素：ポリオール：アミノ酸のモル比が１：１：０．２５〜３：３：１の間であり得る。好ましくは、アミノ酸はプロリンである。
【００２７】
一実施形態では、尿素：ポリオール：アミノ酸のモル比が１：１：０．２５、１：１：０．５、１：１：０．７５、１：１：１、２：１：０．２５、２：１：０．５、２：１：０．７５、２：１：１、３：１：０．２５、３：１：０．５、３：１：０．７５、３：１：１、１：２：０．２５、１：２：０．５、１：２：０．７５、１：２：１、１：３：０．２５、１：３：０．５、１：３：０．７５、１：３：１、２：２：０．２５、２：２：０．５、２：２：０．７５、２：２：１、３：３：０．２５、３：３：０．５、３：３：０．７５、３：３：１であり得る。
【００２８】
一実施形態では、尿素：糖：アミノ酸のモル比が１：１：１〜３：２：１の間であり得る。好ましくは、アミノ酸はプロリンであり、かつ／または糖はトレハロース／グルコースである。
【００２９】
一実施形態では、尿素：糖：アミノ酸のモル比が１：１：１、２：１：１、３：１：１、２：２：１、３：２：１であり得る。好ましくは、アミノ酸はプロリンであり、かつ／または糖はトレハロース／グルコースである。
【００３０】
一実施形態では、凍結保護剤および／または凍結保存剤組成物はさらに水を含んでもよい。
【００３１】
一実施形態では、尿素：糖：アミノ酸：水のモル比が１：１：１：１〜２：１：１：４の間であり、好ましくは尿素：糖：アミノ酸：水のモル比が１：１：１：２、１：１：１：３、１：１：１：４、２：１：１：１、２：１：１：３である。好ましくは、アミノ酸はプロリンであり、かつ／または糖はトレハロース／グルコースである。
【００３２】
一実施形態では、尿素：グルコース：プロリン：水のモル比は、１：１：１：１〜１：１：１：４の間であり得る。
【００３３】
一実施形態では、前記凍結保護剤および／または凍結保存剤組成物は、細胞または組織の保存用であってよく、前記細胞または組織は、８℃以下、好ましくは−４℃以下、好ましくは−２０℃以下、好ましくは−８０℃以下、好ましくは−１９６℃以下で保存される。
【００３４】
本開示はまた、細胞生存率の増強剤としての凍結保護剤および／または凍結保存剤組成物の使用に関する。
【００３５】
以下の図は、説明を説明するための好ましい実施形態を提供するものであり、本発明の範囲を限定するものと見なされるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】純水、ならびに水およびＤＥＳ（トレハロース：グリセロール（モル比）＝１：３０）のさまざまな混合物について、−９０℃〜４０℃の温度範囲で、１０℃／分で得られたサーモグラムである。
【図２】さまざまな濃度の天然深共晶系と接触した細胞の生存率を示すグラフである。
【図３】トレハロース：グリセロール１：３０系およびＤＭＳＯ系のさまざまな濃度と接触した場合の細胞生存率を示すグラフである。（注：％は基本溶液の重量体積パーセントであり、Ｘ：Ｙは化合物のモル比である）
【図４】さまざまな系で凍結保存した後の、保存された細胞の形態学的観察図である。右側は、ＭＴＳの生存率テストの結果である。（注：％は基本溶液の重量体積パーセントであり、Ｘ：Ｙは化合物のモル比である）
【図５】さまざまな継代後の細胞の生存率、生死アッセイ、ＭＴＳ生存率、ＤＮＡ分析を示す図である。（注：％は基本溶液の重量体積パーセントであり、Ｘ：Ｙは化合物のモル比である）
【図６】凍結保護剤としてさまざまな系と、さまざまな保存温度とを用いた、解凍（Ｐ０）後および最初の継代（Ｐ１）後のＭＴＳアッセイによって決定された細胞生存率を示すグラフである。
【図７】グリセロール（Ａ）およびトレハロース（Ｂ）系の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルであり、全共鳴が帰属されている。
【図８】トレハロース：グリセロール（１：３０）系の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルであり、全共鳴が帰属されている。
【図９】トレハロース：グリセロール（１：３０）系の２Ｄ  ＮＭＲ（ＨＭＢＣ）スペクトルであり、全共鳴が帰属されている。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
一実施形態では、トレハロース−グリセロール（モル比１：３０；Ｄ（＋）トレハロース二水和物、９９％、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、グリセロール、９９．９％、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を含む天然深共晶溶媒（ＮＡＤＥＳ）を、透明な液体が形成されるまで、攪拌しながら７０℃で加熱し、調製した。
【００３８】
一実施形態では、ＮＡＤＥＳサンプルの光学特性評価は、ライカデジタルカメラと結合されたオリンパス透過顕微鏡を使用して、偏光顕微鏡法（ＰＯＭ）により室温で行った。カバーは１〜２滴のＮＡＤＥＳで調製され、顕微鏡で観察された。
【００３９】
一実施形態では、示差走査熱量測定分析（ＤＳＣ）実験は次のように実行された。熱量測定実験は、ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社の示差走査熱量計ＤＳＣ  Ｑ２０００（Ｔｚｅｒｏ  ＤＳＣテクノロジー）にて、熱流量Ｔ４Ｐオプションで行われた。測定は、５０ｍＬ／分の流量の無水高純度窒素下において実施した。ＤＳＣ  Ｔｚｅｒｏキャリブレーションは−９０℃〜２００℃の温度範囲で行った。純粋な化合物である水、トレハロース、グリセロール、および純粋なＤＥＳ（水を追加しない）に、−９０℃から１００℃（純水の場合は１２０℃）の間で、１０℃／分の速度でいくつかの冷却および加熱を施した。これらのサンプルは、水の蒸発を可能にするピンホールを備えたＴｚｅｒｏ密閉蓋付きのＴｚｅｒｏ（アルミニウム）密閉皿に封入された。ＤＥＳと水の混合物をＤＳＣで分析した場合に、−９０℃〜４０℃の冷却を、同じく１０℃／分の速度で数回行ったが、この場合、密閉皿にはピンホールがなく、水の損失が避けられた。一部のサンプルでは、その結果として生じる水とＤＥＳの混合物の熱挙動への影響を確認するために、走査速度を変化させた。これらの場合、加熱走査速度は５℃／分および２０℃／分であった。
【００４０】
一実施形態において、Ｌ９２９細胞株は、１０％の熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｂｉｏｃｈｒｏｎ  ＡＧ社、ドイツ）および１％の抗生物質−抗真菌薬（Ｇｉｂｃｏ製、米国）を補充したＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ社、米国）で増殖させた。細胞は、３７℃、５％ＣＯ２の加湿雰囲気で培養した。
【００４１】
一実施形態では、調製された系の生存率は、細胞との直接接触方法（ＮＡＤＥＳと細胞培養物との直接接触）を使用して測定された。細胞を９６ウェルプレートに２４時間、合計１ウェル当たり１ｘ１０４細胞で播種した。２４時間後、培地を除去し、さまざまな割合のＮＡＤＥＳ、特に培地中の１％、５％、１０％および２０％のＮＡＤＥＳを含む抽出物を加えた。これらの抽出物とともに培養された細胞の生存率は、２４時間後および７２時間後にＭＴＳアッセイによって決定された。
【００４２】
一実施形態では、細胞を凍結および解凍し、特に、細胞を遠心分離（３００ｒｐｍで５分間）により収集し、ＦＢＳおよび凍結保存剤の冷却混合物（ＤＭＳＯまたはトレハロース‐グリセロール；ＦＢＳ中に５％および１０％の凍結保存剤）中に懸濁する。細胞と凍結培地をクライオチューブ（Ｎｕｎｃ製）（１ｘ１０６細胞／１ｍＬ）に分注し、すぐに−２０℃の凍結ボックス（製品名Ｍｒ．Ｆｒｏｓｔｙ）に２時間置いた。その後、それらを−８０℃で２４時間置いた後、クライオチューブを液体窒素中に置いた。細胞を１ヶ月、２ヶ月および３ヶ月間凍結させた。コントロールとして、トレハロースおよびグリセロールのみを同じ濃度で使用した。
【００４３】
一実施形態では、解凍のために、クライオチューブを３７℃の水浴で約１分間急速に温めた。遠心分離チューブに５ｍＬの培地を加え、細胞懸濁液を移した。この懸濁液を遠心分離し（３００ｒｐｍ、５分間、２１°Ｃ）、上澄み液を除去した。細胞を新鮮な培地に再懸濁し、９６ウェルプレートに播種した。
【００４４】
一実施形態では、ＭＴＳ細胞生存率アッセイは以下のように実施された。凍結保存剤の影響は、培養の２４時間および７２時間後にＭＴＳアッセイ（比色定量分析用試薬  製品名Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  ９６Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｆｒａｉｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ社、米国）により決定された。その時点で、細胞をＰＢＳで洗浄し、無血清細胞培地とＭＴＳ試薬の混合物を５：１の比率で加え、５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気において、３７℃で４時間インキュベートした。４時間後、各ウェルにつき１００μＬを９６ウェルプレートに移した。マイクロプレート分光光度計（製品名Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴ、Ｂｉｏ−ＴＥＫ社、米国）を使用して、４９０ｎｍの波長で吸光度を測定した。結果として得られた吸光度から、ブランク（ＭＴＳ試薬を含む培地ＭＴＳ）によって得られた吸光度を減算した。
【００４５】
一実施形態では、細胞生存率を評価するために、生／死細胞生存率アッセイ（カルセインＡＭ／ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色）を使用した（ｎ＝５サンプル／ウェル）。細胞は、ＤＭＥＭ培地中で２μＬのカルセインＡＭ（１ｍｇ・ｍＬ−１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ製、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、米国）および３μＬのＰＩ（１ｍｇ・ｍＬ−１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ製、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、米国）で２０分間インキュベートし、遮光した。細胞をＰＢＳで洗浄して残留蛍光を除去し、倒立顕微鏡（製品名Ａｘｉｏ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ、ＺＥＩＳＳ社、ドイツ）で可視化した。
【００４６】
一実施形態では、ＤＡＰＩ−ファロイジンアッセイによる形態学的特性決定を行った。細胞を４５分間、１０％ホルマリン溶液で固定した。ホルマリンを除去し、ＰＢＳに置き換えた。ＤＡＰＩ−ファロイジンアッセイには、４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール、ジラクテート（ＤＡＰＩ、２０ｍｇ・ｍＬ−１、ＢＩＯＴＯＩＵＭ社、米国）およびファロイジン−テトラメチルローダミンＢイソチオシアネート（ファロイジン、１０ｍｇ・ｍＬ−１、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国）が用いられた（１ウェルあたりｎ＝５サンプル、３回）。ＰＢＳ１ｍＬに対して５μＬのファロイジンと２μＬのＤＡＰＩとでファロイジンの溶液を調製し、細胞に添加し、室温で４５分間インキュベートし、遮光した。次に、サンプルをＰＢＳで３回洗浄し、倒立顕微鏡（製品名Ａｘｉｏ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ、ＺＥＩＳＳ社、ドイツ）により暗所で可視化した。画像は、Ｚスタックモードにおいて、スライド間で４．５μｍ（１０ｘ）および２μｍ（２０ｘ）の解像度で取得された。
【００４７】
一実施形態では、ＤＮＡ定量化のために、Ｑｕａｎｔ−ＩＴ  ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡアッセイキットが製造業者の指示に従って使用された。最初に、９６ウェルプレートで、細胞を浸透圧および熱ショックによって溶解し、分析のために上澄みを収集した。各サンプルまたは標準アッセイについて、３度行った。マイクロプレート分光光度計（Ｂｉｏ−ＴＥＫ社、米国）での吸光度は赤色で、色素の分光特性に応じて、それぞれ４８５ｎｍおよび５２８ｎｍを励起波長および発光波長として使用した。ＤＮＡ量を計算するために、吸光度値を検量線で調整した。
【００４８】
一実施形態では、表１に挙げられた代謝産物の組み合わせに基づいて、しかしそれらに限定されることなく、より具体的にはトレハロース、グルコース、グリセロール、ならびに他のアミノ酸、多価アルコールおよび糖に基づいて、新しいＮＡＤＥＳが開発された。
【００４９】
【表１】
2020520253.tif 000002
【００５０】
一実施形態では、異なるモル比を有するさまざまな組み合わせが生成された（表２）。
【００５１】
【表２】
2020520253.tif 000003
【００５２】
一実施形態では、新しいＮＡＤＥＳの暫定的な生存率を決定するために、室温より低いまたは室温に近い融解温度を示すものについて、水がＮＡＤＥＳとさまざまな組成で混合される。ＮＡＤＥＳ／水の系の熱特性評価は、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって実行される。
【００５３】
一実施形態では、ガラス化および／または融解温度を大幅な低下させるための調合に必要なＮＡＤＥＳの最小濃度が研究された。冷却−加熱サイクルで発生する相転移を理解することは、凍結保存剤として系を評価するために重要である。結晶化は動力学的現象であるため、融解温度の大幅な低下が発生するか、または結晶化現象が完全に回避されてガラス転移温度のみが観察されるか（水の完全なガラス化が達成されたことを意味する）を判断するために、−１２０℃から４０℃の間でさまざまな冷却速度および加熱速度がテストされた。さらに、アモルファス材料を一定時間低温に維持することにより（アニーリング）、結晶の形成が促進され得る。
【００５４】
一実施形態では、水中のＤＥＳトレハロース：グリセロール（１：３０）の影響を評価するために、さまざまな割合（１０重量％間隔）の水およびＤＥＳでいくつかの混合物を調製した。このＤＥＳが水の結晶化を防ぐ可能性を確認するために、これらの混合物のそれぞれの熱挙動をＤＳＣで分析した。図１に、純水および調製されたＤＥＳのサーモグラムを示す。ＤＥＳサーモグラムにおいて、少なくともＤＳＣの検出限界まで、熱的事象は発生しない。特定の量のトレハロース：グリセロールが水に加えられると、その熱挙動に影響があり、変化は混合物中に存在するトレハロース：グリセロールの量に依存する。６０重量％を超えるトレハロース：グリセロールを含むサンプルの場合、サーモグラムで熱的事象は観察されず、すなわち混合物はアモルファス材料としてふるまい、水の結晶が存在する証拠はない。Ｈ２Ｏとトレハロース：グリセロールとを４０：６０の重量％で混合すると、ＤＳＣで冷却結晶化ピークと融解ピークが観察される（図１）が、結晶化ピークは依然として観察されない。より多量の水（５０から９０重量％）では、融解ピークが常に観察される。このピークから、融解温度Ｔｍを計算でき、これはピークの開始によって定義される。融解エンタルピーの変化（ΔＨｍ）は、ピークの下の面積から決定することができる。
【００５５】
一実施形態では、水の融解温度の有意な低下を示すか、または完全にガラス化されたＮＡＤＥＳ／水混合物について、毒性試験を行った。ＮＡＤＥＳ成分は人体に自然に存在し、毒性の問題は発生しないであろうが、ＮＡＤＥＳを形成する２つの成分間の相互作用により、未知の毒性が発生する可能性がある。選択されたＮＡＤＥＳが実際に凍結保存剤として使用できることを保証するためには、それらが組織に重大な毒性を示さないことが最重要である。ＮＡＤＥＳの毒性を判定するため、ＩＳＯガイドラインに従ってＮＡＤＥＳ／水混合物の細胞毒性を評価した。細胞の生存率を決定するさまざまな濃度について、フラクションの細胞毒性を吸光度を使用して評価した。図２は、試験されたさまざまな系で実行された生存率試験の結果を示している。
【００５６】
一実施形態では、凍結保護剤として使用されるゴールドスタンダードであるＤＭＳＯと比較して、薬剤の毒性プロファイルの違いが顕著である（図３）。トレハロース：グリセロール（１：３０）系は、濃度が１０重量％になるまで、３７℃での細胞との接触で良好な生存率を示す。ＤＭＳＯと接触している細胞は、１％または５％などの低濃度であっても、非常に低い生存率を示し、培地中のＤＭＳＯの濃度を１０％や２０％に上げると細胞死に至る。
【００５７】
一実施形態において、凍結保存剤としてのＮＡＤＥＳ性能のインビトロ生物学的評価は、Ｌ９２９細胞株を使用して評価された。前述のように、凍結保存は浸透圧ストレスに関連する低温障害を引き起こす可能性があるため、開発されたＮＡＤＥＳ製剤との接触時の細胞の浸透圧耐性および膜の完全性を研究しなければならない。
【００５８】
一実施形態では、凍結保存された細胞は、コントロールとして使用されるＤＭＳＯと常に比較して、−２０℃、−８０℃、および−１９６℃でさまざまな期間（１、２、および３か月）およびさまざまな系のさまざまな濃度で、保存状態に維持された。解凍プロセス後、細胞を顕微鏡で評価した。これらは、さまざまな細胞タイプおよび保存条件についての凍結保存剤としてのＮＡＤＥＳの影響に関する証拠を提供する。
【００５９】
一実施形態においておよび他の実施形態に加えて、細胞生存率を評価し、解凍後の細胞膜の完全性をチェックするために、生死判定およびＤＡＰＩファロイジン試験が実施された。図４は、細胞の生存率に関する形態学的分析と最初のテストを示している。画像から観察できるように、１０％ＤＭＳＯを使用した細胞の凍結保存と、トレハロース：グリセロール（１：３０）を使用した細胞の凍結保存は同様の反応を有する。一方、トレハロース単独またはグリセロール単独を使用すると、細胞の生存率が多少低下する。
【００６０】
一実施形態では、ＭＴＳ生存率試験によりこれらの結果が確認される。したがって、実際には、成分単独の場合と比較すると、トレハロース：グリセロール系の存在が相乗効果をもたらす。
【００６１】
一実施形態では、細胞の形態は２つの系の間で類似しており、継代間においても違いはない。ＤＡＰＩ−ファロイジンは、細胞膜の完全性と培養後の細胞の伸長形状を示す。
【００６２】
一実施形態では、さまざまな保存温度、特に−１９６℃、−８０℃、および−２０℃で、さまざまな系の試験を行った。図６に見られるように、−８０℃で細胞を保存し生存率を維持することが可能である。さまざまな系がテストされ、ＤＭＳＯに匹敵する結果が得られた。
【００６３】
一実施形態では、驚くべきことに、尿素：グルコース：プロリン：Ｈ２Ｏ（１：１：１：２）系が凍結保護剤として使用される場合、細胞は細胞生存率を損なうことなく、少なくとも１ヶ月間、−２０℃で保存することができ、さらに、研究されている他の系で起こることとは反対に、再播種され、成長することができる（Ｐ１）。
【００６４】
核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法を使用して、ＮＡＤＥＳの水素結合の存在を証明した。この研究では、１Ｈ  ＮＭＲをトレハロース：グリセロール（１：３０）（図８）、トレハロース（図７Ｂ）、グリセロール（図７Ａ）に適用し、２Ｄ  ＮＭＲ（ＨＭＢＣ）をトレハロース：グリセロール（１：３０）（図９）に適用した。トレハロース：グリセロール（１：３０）中のトレハロースとグリセロールの間の水素結合の存在を観察でき（図８および図９）、これは共晶混合物であることを示している。
【００６５】
本開示は、記載された実施形態に限定されるものと決して見なされるべきではなく、当業者は、その変更に対する多くの可能性を予見するであろう。
【００６６】
上述の実施形態は組み合わせ可能である。
【００６７】
添付の請求項は、本開示の特定の実施形態をさらに説明する。
【図１】
2020520253.tif 000004
【図２】
2020520253.tif 000005
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７（Ａ）】
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【図７（Ｂ）】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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