(57)【要約】  本開示の主題は、嗜好性の高いペットフード製品を製造するために原材料及びペットフード製品をスクリーニングする方法に関する。本開示の主題はまた、嗅覚受容体の活性及び／又は発現を調節する化合物を特定する方法にも関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
嗅覚受容体の活性を調節することができる組成物であって、
（ａ）前記嗅覚受容体の第１の活性を測定するステップ、
（ｂ）試験薬剤を前記嗅覚受容体と接触させるステップ、
（ｃ）前記試験薬剤との接触後に、前記嗅覚受容体の第２の活性を測定するステップ、及び
（ｄ）前記嗅覚受容体の前記第２の活性が、前記嗅覚受容体の前記第１の活性と比較して増加又は低下している場合に、前記試験薬剤が前記嗅覚受容体の活性を調節することができる化合物であることを決定するステップ
を含む方法に従って特定される、組成物。
【請求項２】
前記嗅覚受容体が、配列番号：６１〜３８０８に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、イヌ又はネコ嗅覚受容体であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記嗅覚受容体が、配列番号：４１〜６０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むイヌ又はネコ嗅覚受容体であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
嗅覚受容体の活性を調節することができる組成物であって、
（ａ）試験薬剤を嗅覚受容体と接触させるステップ、
（ｂ）前記試験薬剤と、前記嗅覚受容体の１つ以上のアミノ酸との相互作用を検出するステップ、及び
（ｃ）前記試験薬剤が前記１つ以上のアミノ酸と相互作用する場合に、前記試験薬剤が前記嗅覚受容体の活性を調節することができる化合物であることを決定するステップ
を含む方法に従って特定される、組成物。
【請求項５】
前記方法が、前記試験薬剤と、前記嗅覚受容体の７回膜貫通（７ＴＭ）ドメインの１つ以上のアミノ酸との間の相互作用を検出するステップを含むことを特徴とする、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記方法が、前記試験薬剤との接触前に、前記嗅覚受容体の第１の活性を測定するステップ、及び前記試験薬剤との接触後に、前記嗅覚受容体の第２の活性を測定するステップをさらに含むことを特徴とする、請求項４又は５に記載の組成物。
【請求項７】
前記方法が、嗅覚受容体リガンドを前記嗅覚受容体に接触させるステップをさらに含むことを特徴とする、請求項４〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記方法が、前記嗅覚受容体の前記第２の活性が前記嗅覚受容体の前記第１の活性と比較して低下する場合に、前記試験薬剤が前記嗅覚受容体の活性を低下させることができる化合物であることを決定するステップをさらに含むことを特徴とする、請求項４〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記方法が、前記嗅覚受容体の前記第２の活性が前記嗅覚受容体の前記第１の活性と比較して増加する場合に、前記試験薬剤が前記嗅覚受容体の活性を増加させることができる化合物であることを決定するステップをさらに含むことを特徴とする、請求項４〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記嗅覚受容体が、配列番号：６１〜３８０８に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、イヌ又はネコ嗅覚受容体であることを特徴とする、請求項４〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記嗅覚受容体が、配列番号：４１〜６０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むイヌ又はネコ嗅覚受容体であることを特徴とする、請求項４〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記嗅覚受容体が、配列番号：４１に記載されるアミノ酸配列を含むイヌＣａｆａＯＲ９．２．９嗅覚受容体であり、前記嗅覚受容体の１つ以上のアミノ酸が、Ｇｌｎ１０３、Ｌｅｕ１０４、Ｌｙｓ２７５、Ａｒｇ８７、Ｖａｌ８１、Ｍｅｔ８４、Ｖａｌ２７９、Ｔｙｒ２６２、Ｍｅｔ２０９、Ｇｌｙ２５８、Ｖａｌ１１１、Ｔｙｒ２５５、Ｔｈｒ２８２、Ｐｈｅ１０７及びＴｈｒ８０からなる群より選択されることを特徴とする、請求項４〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記嗅覚受容体が、配列番号：４２に記載されるアミノ酸配列を含むイヌＣａｆａＯＲ３８．１．２１嗅覚受容体であり、前記嗅覚受容体の１つ以上のアミノ酸が、Ｌｙｓ２７３、Ｔｈｒ７８、Ｌｅｕ８２、Ｔｙｒ２６０、Ｔｈｒ２５６、Ｔｙｒ２５３及びＰｈｅ１０５からなる群より選択されることを特徴とする、請求項４〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記嗅覚受容体が、配列番号：４３に記載されるアミノ酸配列を含むイヌＣａｆａＯＲ２１．２．１５  嗅覚受容体であり、前記嗅覚受容体の１つ以上のアミノ酸が、Ｍｅｔ１０３、Ｍｅｔ８３、Ｈｉｓ１０７、Ｉｌｅ１０６、Ｌｅｕ１８２、Ａｓｎ１９７、Ｇｌｙ２０１、Ｖａｌ２０４、Ｓｅｒ２６０、Ｐｈｅ２５６及びＬｅｕ２７３からなる群より選択されることを特徴とする、請求項４〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記嗅覚受容体が、配列番号：４４に記載されるアミノ酸配列を含むイヌＣａｆａＯＲ２１．２．４３  嗅覚受容体であり、前記嗅覚受容体の１つ以上のアミノ酸が、Ａｓｐ２８５、Ｍｅｔ８０、Ｍｅｔ８８、Ｌｅｕ１０８、Ｉｌｅ１１１、Ｈｉｓ１１２、Ｔｈｒ１１５、Ｖａｌ２０９、Ｖａｌ２１０、Ｔｈｒ２１３、Ｌｅｕ２１４、Ｖａｌ２６２、Ｉｌｅ２６３、Ｓｅｒ２６６、Ｉｌｅ２８１、Ａｌａ２８４、及びＬｅｕ２８８からなる群より選択されることを特徴とする、請求項４〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記嗅覚受容体が、配列番号：５５に記載されるアミノ酸配列を含むネコｃａｔＧｒ５（Ｂ３：７２９０８２９５−７２９０９２８７）嗅覚受容体であり、前記嗅覚受容体の１つ以上のアミノ酸が、Ｔｙｒ２７７、Ｌｙｓ２９０、Ｐｈｅ１１９、Ｐｒｏ１７７、Ｌｅｕ１８０、Ｉｌｅ１８１、Ｐｒｏ１９９、Ｃｙｓ２１７、及びＰｈｅ２２０からなる群より選択されることを特徴とする、請求項４〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記嗅覚受容体が、配列番号：５６に記載されるアミノ酸配列を含むネコｃａｔＧｒ６（Ｄ１：１０５４８６５２８−１０５４８７４９３）嗅覚受容体であり、前記嗅覚受容体の１つ以上のアミノ酸が、Ｈｉｓ１１２、Ａｓｎ２０９、Ｔｙｒ２６５、Ｐｈｅ８８、Ｐｈｅ１１１、Ｍｅｔ１７０、Ｍｅｔ２０６、Ｃｙｓ２６１、Ｉｌｅ２６４、Ｓｅｒ２７９、Ｉｌｅ２８０、及びＴｈｒ２８３からなる群より選択されることを特徴とする、請求項４〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記嗅覚受容体が、配列番号：５７に記載されるアミノ酸配列を含むネコｃａｔＧ７（Ｂ３：７４１１６９５５−７４１１７８９３）嗅覚受容体であり、前記嗅覚受容体の１つ以上のアミノ酸が、Ｍｅｔ８１、Ｔｙｒ２５８、Ｇｌｎ１００、Ｔｈｒ７７、Ｌｙｓ２６９、Ｌｅｕ１０４、Ｔｈｒ２７６、Ｖａｌ２７７、Ｈｉｓ７３、Ｖａｌ２７３及びＶａｌ７８からなる群より選択されることを特徴とする、請求項４〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記嗅覚受容体が、配列番号：５８に記載されるアミノ酸配列を含むネコｃａｔＧ８（Ｅ３：４０２３７９０４−４０２３８８４２）嗅覚受容体であり、前記嗅覚受容体の１つ以上のアミノ酸が、Ｍｅｔ８１、Ｌｅｕ１０１、Ｐｈｅ１０４、Ｌｅｕ１０５、Ｇｌｙ１０８、Ｇｌｕ１８０、Ｖａｌ２０２、Ｐｈｅ２０６、Ｔｙｒ２５９、及びＬｙｓ２７２からなる群より選択されることを特徴とする、請求項４〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記嗅覚受容体が、配列番号：５９に記載されるアミノ酸配列を含むネコｃａｔＧ９（Ｄ１：１０５４６２５５４−１０５４６３５１２）嗅覚受容体であり、前記嗅覚受容体の１つ以上のアミノ酸が、Ｔｙｒ７９、Ｌｙｓ２７８、Ｐｈｅ１１０、Ｖａｌ１１１、Ｇｌｙ１１４、Ｖａｌ２０８、Ｉｌｅ２１２、Ｐｈｅ２５８、Ａｌａ２６１、Ｌｅｕ２６２、Ｔｙｒ２６５、Ｖａｌ２８２、及びＳｅｒ２８５からなる群より選択されることを特徴とする、請求項４〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記嗅覚受容体が、配列番号：５０に記載されるアミノ酸配列を含むイヌＣａｆａＯＲ５．２．５嗅覚受容体であり、前記嗅覚受容体の１つ以上のアミノ酸が、Ｔｙｒ２６３、Ｔｙｒ７７、Ｐｈｅ１０８、Ｖａｌ１１２、Ｓｅｒ１１６、Ｖａｌ２０６、Ａｓｐ２１０、Ｐｈｅ２５６、及びＴｈｒ２８３からなる群より選択されることを特徴とする、請求項４〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記相互作用が、部位特異的突然変異誘発、Ｘ線結晶学、Ｘ線分光、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、架橋性評価、質量分析、電気泳動、置換アッセイ、及びそれらの組合せによって決定されることを特徴とする、請求項４〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
嗅覚受容体の活性を調節することができる組成物であって、
（ａ）嗅覚受容体アゴニストを嗅覚受容体と接触させるステップ、
（ｂ）前記嗅覚受容体の第１の活性を測定するステップ、
（ｃ）試験薬剤を前記嗅覚受容体と接触させるステップ、
（ｄ）前記嗅覚受容体の第２の活性を測定するステップ、及び
（ｅ）前記第１の活性が、前記第２の活性よりも大きい又は小さい場合に、前記試験薬剤が前記嗅覚受容体の活性を調節することができる化合物であることを決定するステップ
を含む方法に従って特定される、組成物。
【請求項２４】
前記嗅覚受容体が、配列番号：６１〜３８０８に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、イヌ又はネコ嗅覚受容体であることを特徴とする、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記嗅覚受容体が、配列番号：４１〜６０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むイヌ又はネコ嗅覚受容体であることを特徴とする、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２６】
前記嗅覚受容体アゴニストが、トリフェルナール、イソ吉草酸、３−メチル−２−ヘキサン酸、α−イオノン、酢酸ヘキシル、アミルメルカプタン、ヘリオナール、ｐ−アニスアルデヒド、４−エトキシベンズアルデヒド、メントール、メチル−オイゲノール、サリチル酸メチル、フェニルアセトアルデヒド、β−イオノン、酢酸アミル、ノナンチオール、アセトフェノン、クマリン、リリアール、ｍ−アニスアルデヒド、４−メチル吉草酸、ペンタノール、フェニル酢酸アリル、ヘキサン酸、α−イオノン、シトラール、酢酸イソアミル、オクタンチオール、プロピオフェノン、７−メトキシクマリン及びそれらの組合せからなる群より選択されることを特徴とする、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２７】
前記試験薬剤が約２００μＭ以下のＥＣ５０値を有することを特徴とする、請求項１〜３及び２３〜２６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８】
前記試験薬剤が約２．０以下のＥｍａｘ値を有することを特徴とする、請求項１〜３及び２３〜２６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２９】
ステップ（ｃ）が、前記嗅覚受容体の活性が前記試験薬剤との接触後に低下する場合に、前記試験薬剤が前記嗅覚受容体の活性を調節することができる化合物であることを決定するステップを含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３０】
ステップ（ｃ）が、前記嗅覚受容体の活性が前記試験薬剤との接触後に増加する場合に、前記試験薬剤が前記嗅覚受容体の活性を調節することができる化合物であることを決定するステップを含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３１】
請求項１〜３０のいずれか一項に記載の組成物を含む、食品。
【請求項３２】
前記組成物が、前記食品の約０．０００１質量％〜約１０質量％の濃度で存在することを特徴とする、請求項３１に記載の食品。
【請求項３３】
前記組成物が、前記食品の約０．００１ｐｐｍ〜約１，０００ｐｐｍの濃度で存在することを特徴とする、請求項３１に記載の食品。
【請求項３４】
前記組成物が、前記食品の約１μＭ〜約１Ｍの濃度で存在することを特徴とする、請求項３１に記載の食品。
【請求項３５】
前記組成物が、味覚テスターのパネルによって決定して、前記食品の嗜好性の向上に有効な量で存在することを特徴とする、請求項３１〜３４のいずれか一項に記載の食品。
【請求項３６】
前記食品がペットフード製品を含むことを特徴とする、請求項３１〜３５のいずれか一項に記載の食品。
【請求項３７】
前記ペットフード製品が、ネコ用ペットフード製品又はイヌ用ペットフード製品であることを特徴とする、請求項３６に記載の食品。
【請求項３８】
前記ネコ用ペットフード製品が、ウェットペットフード製品又はドライペットフード製品であることを特徴とする、請求項３７に記載の食品。
【請求項３９】
食品を請求項１〜３０のいずれか一項に記載の組成物と混和するステップを含む、食品中の匂い強度を増加させる方法であって、前記組成物が、前記混和物の約０．０００１質量％〜約１０質量％の濃度で存在する、方法。
【請求項４０】
食品を請求項１〜３０のいずれか一項に記載の組成物と混和するステップを含む、食品中の匂い強度を増加させる方法であって、前記組成物が、前記混和物の約０．００１ｐｐｍ〜約１，０００ｐｐｍの濃度で存在する、方法。
【請求項４１】
食品を請求項１〜３０のいずれか一項に記載の組成物と混和するステップを含む、食品中の匂い強度を増加させる方法であって、前記組成物が、前記混和物の約１μＭ〜約１Ｍの濃度で存在する、方法。
【請求項４２】
前記方法が、食品前駆体の熱処理を含み、前記組成物が前記熱処理の間に生成することを特徴とする、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の組成物を含む食品を調製する方法。
【請求項４３】
前記熱処理が、滅菌、レトルト処理、押出成形、射出成形、又はそれらの組合せを含むことを特徴とする、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
嗅覚受容体の活性を調節することができる化合物を特定する方法であって、
（ａ）前記嗅覚受容体の第１の活性を測定するステップ、
（ｂ）試験薬剤を前記嗅覚受容体と接触させるステップ、
（ｃ）前記試験薬剤との接触後に、前記嗅覚受容体の第２の活性を測定するステップ、及び
（ｄ）前記嗅覚受容体の前記第２の活性が、前記嗅覚受容体の前記第１の活性と比較して増加又は低下している場合に、前記試験薬剤が前記嗅覚受容体の活性を調節することができる化合物であることを決定するステップ
を含む、方法。
【請求項４５】
前記嗅覚受容体が、配列番号：６１〜３８０８に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、イヌ又はネコ嗅覚受容体であることを特徴とする、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記嗅覚受容体が、配列番号：４１〜６０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むイヌ又はネコ嗅覚受容体であることを特徴とする、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
嗅覚受容体の活性を調節することができる化合物を特定する方法であって、
（ａ）試験薬剤を嗅覚受容体と接触させるステップ、
（ｂ）前記試験薬剤と、前記嗅覚受容体の１つ以上のアミノ酸との相互作用を検出するステップ、及び
（ｃ）前記試験薬剤が前記１つ以上のアミノ酸と相互作用する場合に、前記試験薬剤が前記嗅覚受容体の活性を調節することができる化合物であることを決定するステップ
を含む、方法。
【請求項４８】
前記方法が、前記試験薬剤と、前記嗅覚受容体の７回膜貫通（７ＴＭ）ドメインの１つ以上のアミノ酸との間の相互作用を検出するステップを含むことを特徴とする、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記試験薬剤との接触前に、前記嗅覚受容体の第１の活性を測定するステップ、及び前記試験薬剤との接触後に、前記嗅覚受容体の第２の活性を測定するステップをさらに含むことを特徴とする、請求項４７又は４８に記載の方法。
【請求項５０】
嗅覚受容体リガンドを前記嗅覚受容体に接触させるステップをさらに含むことを特徴とする、請求項４７〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記嗅覚受容体の前記第２の活性が前記嗅覚受容体の前記第１の活性と比較して低下する場合に、前記試験薬剤が、前記嗅覚受容体の活性を低下させることができる化合物であることを決定するステップをさらに含むことを特徴とする、請求項４７〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記嗅覚受容体の前記第２の活性が前記嗅覚受容体の前記第１の活性と比較して増加する場合に、前記試験薬剤が前記嗅覚受容体の活性を増加させることができる化合物であることを決定するステップをさらに含むことを特徴とする、請求項４７〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記嗅覚受容体が、配列番号：６１〜３８０８に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、イヌ又はネコ嗅覚受容体であることを特徴とする、請求項４７〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記嗅覚受容体が、配列番号：４１〜６０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、イヌ又はネコ嗅覚受容体であることを特徴とする、請求項４７〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記嗅覚受容体が、配列番号：４１に記載されるアミノ酸配列を含むイヌＣａｆａＯＲ９．２．９嗅覚受容体であり、前記嗅覚受容体の１つ以上のアミノ酸が、Ｇｌｎ１０３、Ｌｅｕ１０４、Ｌｙｓ２７５、Ａｒｇ８７、Ｖａｌ８１、Ｍｅｔ８４、Ｖａｌ２７９、Ｔｙｒ２６２、Ｍｅｔ２０９、Ｇｌｙ２５８、Ｖａｌ１１１、Ｔｙｒ２５５、Ｔｈｒ２８２、Ｐｈｅ１０７及びＴｈｒ８０からなる群より選択されることを特徴とする、請求項４７〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記嗅覚受容体が、配列番号：４２に記載されるアミノ酸配列を含むイヌＣａｆａＯＲ３８．１．２１嗅覚受容体であり、前記嗅覚受容体の１つ以上のアミノ酸が、Ｌｙｓ２７３、Ｔｈｒ７８、Ｌｅｕ８２、Ｔｙｒ２６０、Ｔｈｒ２５６、Ｔｙｒ２５３及びＰｈｅ１０５からなる群より選択されることを特徴とする、請求項４７〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記嗅覚受容体が、配列番号：４３に記載されるアミノ酸配列を含むイヌＣａｆａＯＲ２１．２．１５  嗅覚受容体であり、前記嗅覚受容体の１つ以上のアミノ酸が、Ｍｅｔ１０３、Ｍｅｔ８３、Ｈｉｓ１０７、Ｉｌｅ１０６、Ｌｅｕ１８２、Ａｓｎ１９７、Ｇｌｙ２０１、Ｖａｌ２０４、Ｓｅｒ２６０、Ｐｈｅ２５６及びＬｅｕ２７３からなる群より選択されることを特徴とする、請求項４７〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記嗅覚受容体が、配列番号：４４に記載されるアミノ酸配列を含むイヌＣａｆａＯＲ２１．２．４３  嗅覚受容体であり、前記嗅覚受容体の１つ以上のアミノ酸が、Ａｓｐ２８５、Ｍｅｔ８０、Ｍｅｔ８８、Ｌｅｕ１０８、Ｉｌｅ１１１、Ｈｉｓ１１２、Ｔｈｒ１１５、Ｖａｌ２０９、Ｖａｌ２１０、Ｔｈｒ２１３、Ｌｅｕ２１４、Ｖａｌ２６２、Ｉｌｅ２６３、Ｓｅｒ２６６、Ｉｌｅ２８１、Ａｌａ２８４、及びＬｅｕ２８８からなる群より選択されることを特徴とする、請求項４７〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記嗅覚受容体が、配列番号：５５に記載されるアミノ酸配列を含むネコｃａｔＧｒ５（Ｂ３：７２９０８２９５−７２９０９２８７）嗅覚受容体であり、前記嗅覚受容体の１つ以上のアミノ酸が、Ｔｙｒ２７７、Ｌｙｓ２９０、Ｐｈｅ１１９、Ｐｒｏ１７７、Ｌｅｕ１８０、Ｉｌｅ１８１、Ｐｒｏ１９９、Ｃｙｓ２１７、及びＰｈｅ２２０からなる群より選択されることを特徴とする、請求項４７〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記嗅覚受容体が、配列番号：５６に記載されるアミノ酸配列を含むネコｃａｔＧｒ６（Ｄ１：１０５４８６５２８−１０５４８７４９３）嗅覚受容体であり、前記嗅覚受容体の１つ以上のアミノ酸が、Ｈｉｓ１１２、Ａｓｎ２０９、Ｔｙｒ２６５、Ｐｈｅ８８、Ｐｈｅ１１１、Ｍｅｔ１７０、Ｍｅｔ２０６、Ｃｙｓ２６１、Ｉｌｅ２６４、Ｓｅｒ２７９、Ｉｌｅ２８０、及びＴｈｒ２８３からなる群より選択されることを特徴とする、請求項４７〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記嗅覚受容体が、配列番号：５７に記載されるアミノ酸配列を含むネコｃａｔＧ７（Ｂ３：７４１１６９５５−７４１１７８９３）嗅覚受容体であり、前記嗅覚受容体の１つ以上のアミノ酸が、Ｍｅｔ８１、Ｔｙｒ２５８、Ｇｌｎ１００、Ｔｈｒ７７、Ｌｙｓ２６９、Ｌｅｕ１０４、Ｔｈｒ２７６、Ｖａｌ２７７、Ｈｉｓ７３、Ｖａｌ２７３及びＶａｌ７８からなる群より選択されることを特徴とする、請求項４７〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記嗅覚受容体が、配列番号：５８に記載されるアミノ酸配列を含むネコｃａｔＧ８（Ｅ３：４０２３７９０４−４０２３８８４２）嗅覚受容体であり、前記嗅覚受容体の１つ以上のアミノ酸が、Ｍｅｔ８１、Ｌｅｕ１０１、Ｐｈｅ１０４、Ｌｅｕ１０５、Ｇｌｙ１０８、Ｇｌｕ１８０、Ｖａｌ２０２、Ｐｈｅ２０６、Ｔｙｒ２５９、及びＬｙｓ２７２からなる群より選択されることを特徴とする、請求項４７〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記嗅覚受容体が、配列番号：５９に記載されるアミノ酸配列を含むネコｃａｔＧ９（Ｄ１：１０５４６２５５４−１０５４６３５１２）嗅覚受容体であり、前記嗅覚受容体の１つ以上のアミノ酸が、Ｔｙｒ７９、Ｌｙｓ２７８、Ｐｈｅ１１０、Ｖａｌ１１１、Ｇｌｙ１１４、Ｖａｌ２０８、Ｉｌｅ２１２、Ｐｈｅ２５８、Ａｌａ２６１、Ｌｅｕ２６２、Ｔｙｒ２６５、Ｖａｌ２８２、及びＳｅｒ２８５からなる群より選択されることを特徴とする、請求項４７〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記嗅覚受容体が、配列番号：５０に記載されるアミノ酸配列を含むイヌＣａｆａＯＲ５．２．５嗅覚受容体であり、前記嗅覚受容体の１つ以上のアミノ酸が、Ｔｙｒ２６３、Ｔｙｒ７７、Ｐｈｅ１０８、Ｖａｌ１１２、Ｓｅｒ１１６、Ｖａｌ２０６、Ａｓｐ２１０、Ｐｈｅ２５６、及びＴｈｒ２８３からなる群より選択されることを特徴とする、請求項４７〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記相互作用が、部位特異的突然変異誘発、Ｘ線結晶学、Ｘ線分光、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、架橋性評価、質量分析、電気泳動、置換アッセイ、及びそれらの組合せによって決定されることを特徴とする、請求項４７〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
嗅覚受容体の活性を調節することができる化合物を特定する方法であって、
（ａ）嗅覚受容体アゴニストを嗅覚受容体と接触させるステップ、
（ｂ）前記嗅覚受容体の第１の活性を測定するステップ、
（ｃ）試験薬剤を前記嗅覚受容体と接触させるステップ、
（ｄ）前記嗅覚受容体の第２の活性を測定するステップ、及び
（ｅ）前記第１の活性が、前記第２の活性よりも大きい又は小さい場合に、前記試験薬剤が前記嗅覚受容体の活性を調節することができる化合物であることを決定するステップ
を含む、方法。
【請求項６７】
ペットフード製品又はそれらの成分を選択する方法であって、
（ａ）前記嗅覚受容体の第１の活性を測定するステップ、
（ｂ）試験薬剤を前記嗅覚受容体と接触させるステップ、
（ｃ）前記試験薬剤との接触後に、前記嗅覚受容体の第２の活性を測定するステップ、及び
（ｄ）前記嗅覚受容体の前記第２の活性が、前記嗅覚受容体の前記第１の活性と比較して増加又は低下している場合に、前記試験薬剤をペットフード製品又はそれらの成分として選択するステップ、
を含む、方法。
【請求項６８】
前記嗅覚受容体が、配列番号：６１〜３８０８に記載されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、イヌ又はネコ嗅覚受容体であることを特徴とする、請求項６６又は６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記嗅覚受容体が、配列番号：４１〜６０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むイヌ又はネコ嗅覚受容体であることを特徴とする、請求項６６又は６７に記載の方法。
【請求項７０】
前記嗅覚受容体アゴニストが、トリフェルナール、イソ吉草酸、３−メチル−２−ヘキサン酸、α−イオノン、酢酸ヘキシル、アミルメルカプタン、ヘリオナール、ｐ−アニスアルデヒド、４−エトキシベンズアルデヒド、メントール、メチル−オイゲノール、サリチル酸メチル、フェニルアセトアルデヒド、β−イオノン、酢酸アミル、ノナンチオール、アセトフェノン、クマリン、リリアール、ｍ−アニスアルデヒド、４−メチル吉草酸、ペンタノール、フェニル酢酸アリル、ヘキサン酸、α−イオノン、シトラール、酢酸イソアミル、オクタンチオール、プロピオフェノン、７−メトキシクマリン及びそれらの組合せからなる群より選択されることを特徴とする、請求項６６に記載の方法。
【請求項７１】
前記試験薬剤が約２００μＭ以下のＥＣ５０値を有することを特徴とする、請求項４４〜４７及び６６〜６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記試験薬剤が約２．０以下のＥｍａｘ値を有することを特徴とする、請求項４４〜４７及び６６〜６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
ステップ（ｃ）が、前記嗅覚受容体の活性が前記試験薬剤との接触後に低下する場合に、前記試験薬剤が前記嗅覚受容体の活性を調節することができる化合物であることを決定するステップを含むことを特徴とする、請求項４４〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
ステップ（ｃ）が、前記嗅覚受容体の活性が前記試験薬剤との接触後に増加する場合に、前記試験薬剤が前記嗅覚受容体の活性を調節することができる化合物であることを決定するステップを含むことを特徴とする、請求項４４〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、その内容全体がここに参照することによって本願に援用され、その優先権が主張される、２０１６年９月３０日出願の米国仮特許出願第６２／４０２，８２３号の優先権を主張する。
【技術分野】
【０００２】
本開示の主題は、嗅覚モジュレータの特定のための嗅覚受容体（ＯＲ）の使用に関する。本開示の主題は、さらに、ペットフード製品を製造するための原材料をスクリーニングするための嗅覚受容体の使用、並びに、嗅覚調節化合物の存在についての、完成したペットフード製品のスクリーニングに関する。
【背景技術】
【０００３】
食用組成物のための嗅覚プロファイルは、例えば、フルーツ、花、ハチミツ、脂肪、ミント、金属の香りのうちの１つ以上など、一組の精神物理学的な記述子によって特徴づけることができる。ある特定の実施形態では、異なる匂い物質の組合せを、新しい臭気物質として知覚することができる。これらの匂い感覚を生じさせる化合物は、しばしば、匂い物質と称される。理論に束縛されるものではないが、匂いは、匂い物質及びその結果生じる嗅覚プロファイルが登録されている脳へと信号を送信する、鼻腔及びのどの嗅覚受容体によって感知されると仮定される。嗅覚受容体は、匂い知覚に関連する化合物を検出する大分類のＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）を含む。
【０００４】
ペットフード製造業者は、長年、栄養価の高いペットフード製品を提供したいと望んでいる。加えて、特にキャットフード及びドッグフードに関しては、ペットフード製造業者は、ペットが食物から完全な栄養上の利益を受けることができるように、高度の嗜好性（palatability）を所望している。家畜は、その食物の好みで悪名高いほど気難く、多くの場合、長期間にわたって受け入れられていたペットフード製品を食べることを拒否するか、あるいは、最小限の量を超えるペットフード製品を食べることを拒否する。この現象は、部分的には、味覚系及び嗅覚系の理由から家畜が知覚することができる、原材料の官能特性の微妙な違いに起因する可能性がある。その結果、ペットの飼い主は、ペットを健康かつ満足のいく状態に維持するために、ペットフードの種類及び銘柄を頻繁に変更することとなる。
【０００５】
最近は匂い及びフレーバーの技術が進歩しているが、最も嗜好性の高い（palatable）製品及び該ペットフード製品を製造する方法が用いられることを確実にするために、ペットフード製品の製造に用いられる原材料をスクリーニングする方法、並びに完成したペットフード製品のスクリーニングが、依然として必要とされている。ペットフード製品の匂い、食感、及び／又はフレーバーのプロファイルを増強又は改質することによってペットフード製品の嗜好性を増強又は改質することができる化合物もまた、依然として必要とされている。望ましい属性の強度を増加させるため、ペットフード製品に存在しないか又は何らかの理由で失われた望ましい属性を置換するため、あるいは望んでいない属性の強度を低下させるために、強化又は改質を使用することができる。特に、ペットフード製品における望ましくない不快感を与える匂いの存在又は強度を低下させることが望ましい。同様に、医薬品の嗜好性を増強又は改質することによって、ペット用の医薬品の受け入れを高めることが必要とされている。
【０００６】
ペットケア産業はまた、ペットが動物の健康に害を及ぼす物や飼い主の財産を引っ掻いたり、噛んだり、舐めたり、又は摂取したりすることを効果的に止めさせることができる臭気抑制剤の開発にも関心を寄せている。ある特定の臭気物質がペットを抑止するのに効果的でありうることが知られているが、これらの臭気抑制物質に対するペットの反応には著しいばらつきがある。よって、有害な又は有毒な物体に望ましくない匂いを効果的に付与する化合物が必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、香りがよく、嗜好性及び栄養価の高いペットフードを提供するために、ペットフードの原材料（例えば新しいタンパク質供給源）をスクリーニングするための方法、並びに最終的なペットフード製品が、依然として当技術分野において必要とされている。また、ペットフード製品又は物体の嗜好性及び／又は抑止力を高める、低下させる、若しくは他の方法で調節する化合物を特定すること、並びにこれらの化合物を含む匂い組成物も、依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本開示の主題は、嗅覚受容体の活性及び／又は発現を増強、上昇、低下、及び／又は調節する化合物を特定する方法を提供する。ある特定の実施形態では、本方法は、ペットフード製品又は医薬品における、若しくは、該ペットフード製品又は医薬品の製造に用いられる原材料における嗅覚受容体の活性及び／又は発現を調節する化合物についてスクリーニングするステップを必然的に伴う。本開示の主題はまた、該方法によって特定される、嗅覚受容体の活性及び／又は発現を増強、上昇、低下、及び／又は調節する化合物も提供する。ある特定の実施形態では、嗅覚受容体はイヌ又はネコ受容体である。
【０００９】
ある特定の実施形態では、嗅覚受容体の活性及び／又は発現を増強、上昇、低下、及び／又は調節する化合物を特定する方法は、配列番号：１１〜３０のいずれか１つ以上に記載されるヌクレオチド配列、又は配列番号：６１〜３８０８に記載されるヌクレオチド配列のいずれか１つ以上、若しくはそれらの断片又は変異体を有する嗅覚受容体を、細胞に発現させるステップを含む。本方法は、さらに、嗅覚受容体を発現する細胞を試料（例えば、ペットフード原材料、完成したペットフード、又は試験化合物）と接触させるステップ、及び試料の不存在下での受容体の活性及び／又は発現と比較して、試料の存在下での嗅覚受容体の活性及び／又は発現を決定するステップを含みうる。ある特定の実施形態では、嗅覚受容体の活性及び／又は発現は、試料及び嗅覚受容体アゴニストの存在下で決定される。
【００１０】
ある特定の実施形態では、嗅覚受容体の活性及び／又は発現を増強、上昇、低下、及び／又は調節する化合物を特定する方法は、配列番号：４１〜６０の１つ以上に記載されるアミノ酸配列、又は配列番号：６１〜３８０８に記載されるアミノ酸配列のいずれか１つ以上、若しくはそれらの断片又は変異体を有する嗅覚受容体を、細胞に発現させるステップを含む。本方法は、さらに、嗅覚受容体を発現する細胞を試料（例えば、ペットフード原材料、完成したペットフード、又は試験化合物）と接触させるステップ、及び試料の不存在下での受容体の活性及び／又は発現と比較して、試料の存在下での嗅覚受容体の活性及び／又は発現を決定するステップを含みうる。ある特定の実施形態では、嗅覚受容体の活性及び／又は発現は、試料及び嗅覚受容体アゴニストの存在下で決定される。
【００１１】
ある特定の実施形態では、本開示は、（ａ）嗅覚受容体アゴニストを嗅覚受容体と接触させるステップ、（ｂ）嗅覚受容体の活性を決定するステップ、（ｃ）試験薬剤を嗅覚受容体と接触させるステップ、（ｄ）嗅覚受容体の活性を決定するステップ、及び（ｅ）（ｄ）の活性が（ｂ）の活性より大きい又は小さい場合に、試験薬剤を組成物として選択するステップを含む、嗅覚受容体の活性を調節する組成物を特定する方法を提供する。
【００１２】
ある特定の実施形態では、嗅覚受容体アゴニストは、トリフェルナール（trifernal）、イソ吉草酸、３−メチル−２−ヘキサン酸、α−イオノン、酢酸ヘキシル、アミルメルカプタン、ヘリオナール、ｐ−アニスアルデヒド、４−エトキシベンズアルデヒド、メントール、メチル−オイゲノール、サリチル酸メチル、フェニルアセトアルデヒド、β−イオノン、酢酸アミル、ノナンチオール、アセトフェノン、クマリン、リリアール、ｍ−アニスアルデヒド、４−メチル吉草酸、ペンタノール、フェニル酢酸アリル、ヘキサン酸、α−イオノン、シトラール、酢酸イソアミル、オクタンチオール、プロピオフェノン、７−メトキシクマリン及びそれらの組合せからなる群より選択される。
【００１３】
ある特定の非限定的な実施形態では、本明細書に記載される嗅覚受容体の活性を調節する化合物を特定する方法は、その細胞に固有の嗅覚受容体を発現する細胞を利用する。天然の嗅覚受容体を発現するこのような細胞の例としては、例えば、限定はしないが、ヒト、イヌ、及び／又はネコの嗅覚細胞（例えば、嗅覚受容体細胞）が挙げられる。ある特定の実施形態では、嗅覚受容体を発現するヒト、イヌ、及び／又はネコの嗅覚細胞は、ヒト、イヌ、及び／又はネコから単離され、かつ、インビトロで培養される。ある特定の実施形態では、嗅覚受容体細胞は、例えば、ヒト、イヌ、及び／又はネコから単離された細胞が培養液中で増殖することができるように、不死化させてもよい。
【００１４】
ある特定の実施形態では、細胞は、カルシウム結合発光タンパク質、環状ヌクレオチド感受性（ＣＮＧ）チャネル、ｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）含有ルシフェラーゼ受容体、ＧｌｏＳｅｎｓｏｒルシフェラーゼ、又はＰＫＡ−ＮａｎｏＢｉＴシステムを発現する。ある特定の実施形態では、カルシウム結合発光タンパク質は、クライティン、エクオリン、オベリン、それらの任意の組換え又は単離されたバージョン、及びそれらの任意の組合せからなる群より選択される。ある特定の実施形態では、細胞内カルシウムレベルは、発光検出又は蛍光検出によってモニタリングされる。ある特定の実施形態では、蛍光検出は、Ｆｕｒａ−２  ＡＭ、Ｆｕｒａ−２  ペンタカリウム、Ｆｕｒａ  Ｒｅｄ  ＡＭ、Ｉｎｄｏ−１  ＡＭ、Ｉｎｄｏ−１ペンタカリウム、Ｆｌｕｏ−３、Ｆｌｕｏ−４、Ｆｌｕｏ−８、カルシウムＧｒｅｅｎ−１、カルシウム３、カルシウム４、カルシウム５、Ｒｈｏｄ−２、それらの誘導体及びそれらの組合せからなる群より選択されるカルシウム感受性蛍光染料を含む。
【００１５】
ある特定の実施形態では、試験薬剤は、約２００μＭ以下のＥＣ５０値を有する。ある特定の実施形態では、試験薬剤は、約２．０以下のＥｍａｘ値を有する。
【００１６】
本開示はまた、嗅覚受容体の活性及び／又は発現を増強、上昇、低下、及び／又は調節する化合物を特定する方法も提供し、ここで、アッセイは、例えば、嗅覚受容体が基質に結合するか又は他の方法で付着する、無細胞アッセイを使用して行われる。
【００１７】
本開示はまた、嗅覚受容体の活性及び／又は発現を増強、上昇、低下、及び／又は調節する化合物を特定する方法も提供し、ここで、アッセイは、例えば、嗅覚受容体がコンピュータプログラムを用いてモデル化され、ドッキングアルゴリズムを通じて化合物の受容体への結合が予測される、嗅覚受容体のインシリコモデルを使用して行われる。
【００１８】
本開示の主題は、さらに、嗜好性の高いペットフード製品の製造方法を提供し、ここで、ペットフード製品の製造に使用される原材料は、嗅覚受容体の活性及び／又は発現を増強、上昇、低下、及び／又は調節する化合物がそれらに含まれているかどうかを決定するためにスクリーニングされる。ある特定の実施形態では、原材料は新規タンパク質源である。ある特定の実施形態では、原材料は、ヒトの食物連鎖では通常消費されないタンパク質源である。ある特定の実施形態では、嗅覚受容体の活性及び／又は発現を増加させる化合物を含む生のペットフード製品は（例えば、原材料と接触しない嗅覚受容体と比較して）、完成したペットフード製品の生成に使用するためには選択されない。ある特定の実施形態では、嗅覚受容体の活性及び／又は発現を増加させる化合物を含む生のペットフード製品が（例えば、原材料と接触しない嗅覚受容体と比較して）、完成したペットフード製品の生成に使用するために選択される。他の実施態様では、嗅覚受容体の活性及び／又は発現を増加させない（又は、例えば嗅覚受容体アゴニストの存在下で、嗅覚受容体の活性を低下させる）生のペットフード材料は、完成したペットフード製品の生成用に選択される。他の実施態様では、嗅覚受容体の活性及び／又は発現を増加させない（又は例えば嗅覚受容体アゴニストの存在下で、嗅覚受容体の活性を低下させる）生のペットフード材料は、完成したペットフード製品の生成用に選択されない。
【００１９】
本開示の主題は、さらに、嗜好性の高いペットフード製品の製造方法を提供し、ここで、完成したペットフード製品は、それが嗅覚受容体の活性及び／又は発現を増強、上昇、低下、及び／又は調節する化合物を含むかどうかを決定するためにスクリーニングされる。ある特定の実施形態では、該化合物は、製造プロセスの間に形成される。一実施形態では、嗅覚受容体の活性及び／又は発現を増加させる化合物を含む完成したペットフード製品には（例えば、完成したペットフード製品と接触しない嗅覚受容体と比較して）、嗅覚受容体の活性及び／又は発現を低下させる１つ以上の化合物（例えば、アンタゴニスト化合物）が補充される。一実施形態では、嗅覚受容体の活性及び／又は発現を低下させる化合物を含む完成したペットフード製品には（例えば、完成したペットフード製品と接触しない嗅覚受容体と比較して、又はアゴニストと接触する嗅覚受容体と比較して）、嗅覚受容体の活性及び／又は発現を増加させる１つ以上の化合物（例えば、アゴニスト化合物）が補充される。
【００２０】
本開示の主題は、さらに、嗜好性の高いペット用医薬品の製造方法を提供し、ここで、該完成したペット用医薬品は、それが嗅覚受容体の活性及び／又は発現を増強、上昇、低下、及び／又は調節する化合物を含むかどうかを決定するためにスクリーニングされる。ある特定の実施形態では、該化合物は、製造プロセスの間に形成される。一実施形態では、嗅覚受容体の活性及び／又は発現を増加させる化合物を含む完成したペット用医薬品には（例えば、完成したペット用医薬品と接触しない嗅覚受容体と比較して）、嗅覚受容体の活性及び／又は発現を低下させる１つ以上の化合物（例えば、アンタゴニスト化合物）が補充される。一実施形態では、嗅覚受容体の活性及び／又は発現を低下させる化合物を含む完成したペット用医薬品には（例えば、完成したペット用医薬品と接触しない嗅覚受容体と比較して、又はアゴニストと接触する嗅覚受容体と比較して）、嗅覚受容体の活性及び／又は発現を増加させる１つ以上の化合物（例えば、アゴニスト化合物）が補充される。
【００２１】
本開示の主題は、さらに、本明細書に記載される方法に従って特定される、例えば、アゴニスト及び／又はアンタゴニスト及び／又はアロステリックモジュレータ及び／又はインバースアゴニストなど、嗅覚受容体のモジュレータを含むフレーバー組成物を提供する。
【００２２】
ある特定の実施形態では、該化合物は、不快感を与える匂いを付与すること及び／又は物体又は表面の嗜好性を低下させることによって動物の健康を維持する方法に用いることができる。ある特定の実施形態では、本方法は、本明細書に記載される化合物を含む臭気抑制製品（odor deterrent product）を物体又は表面に印加するステップを含む。ある特定の実施形態では、該物体は、動物の健康にとって有害であるか、あるいは、動物に対して有毒である。
【００２３】
以下の詳細な説明をよりよく理解することができるように、前述の内容は、本出願の特徴及び技術的利点をやや広めに概説したものである。本出願の特許請求の範囲の主題を形成する、本出願のさらなる特徴及び利点を以下に説明する。開示された概念及び特定の実施形態が、本願の同じ目的を実行するために他の構造を修正又は設計するための基礎として容易に利用されうることを当業者は認識すべきである。このような同等の構成が、添付の特許請求の範囲に記載されている本出願の精神及び範囲から逸脱しないこともまた、当業者は認識すべきである。本出願の特徴であると考えられる新規特徴は、その構成及び操作方法の両方に関して、さらなる目的及び利点と共に、以下の説明から、よりよく理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１−１】ヒト、イヌ及びネコ嗅覚受容体（ＯＲ）ヌクレオチド配列（配列番号：１〜３０）並びにそれらの対応するアミノ酸配列（配列番号：３１〜６０）。該配列は、ヒト嗅覚受容体ＨｓＯＲ１７．１．１１（ｈＯＲ３Ａ１）、ＨｓＯＲ１．４．８（ｈＯＲ６Ｐ１）、ＨｓＯＲ１１．３．１４（ｈＯＲ５１Ｅ１）、ＨｓＯＲ１１．３．４０（ｈＯＲ５１Ｌ１）、ＨｓＯＲ１４．１．２７（ｈＯＲ１１Ｈ６）、ＨｓＯＲ１１．１３．７（ｈＯＲ４Ｄ６）、ＨｓＯＲ１４．２．５（ｈＯＲ４Ｅ２）、ＨｓＯＲ１６．１．３（ｈＯＲ２Ｃ１）、ＨｓＯＲ１１．１３．６（ｈＯＲ５Ａ１）、及びＨｓＯＲ１１．１８．３６（ｈＯＲ８Ｂ８）；イヌ嗅覚受容体ＣａｆａＯＲ９．２．９、ＣａｆａＯＲ３８．１．２１、ＣａｆａＯＲ２１．２．１５、ＣａｆａＯＲ２１．２．４３、ＣａｆａＯＲ１５．２．２０、ＣａｆａＯＲ１８．３．１１、ＣａｆａＯＲ１５．３．１、ＣａｆａＯＲ６．３．１、ＣａｆａＯＲ１８．３．１２、及びＣａｆａＯＲ５．２．５；並びに、ネコ嗅覚受容体Ｅ１：１３３４７０３０−１３３４７９７７、Ｆ１：６５１３４９０４−６５１３５８５８、Ｄ１：６２９５５８３９−６２９５６７９２、Ｄ１：６３３１２３２７−６３３１３２８９、Ｂ３：７２９０８２９５−７２９０９２８７、Ｄ１：１０５４８６５２８−１０５４８７４９３、Ｂ３：７４１１６９５５−７４１１７８９３、Ｅ３：４０２３７９０４−４０２３８８４２、Ｄ１：１０５４６２５５４−１０５４６３５１２、及びＤ１：２１２６６８２４−２１２６７７６８を含む。
【図１−２】図１−１と同じ
【図１−３】図１−１と同じ
【図１−４】図１−１と同じ
【図１−５】図１−１と同じ
【図１−６】図１−１と同じ
【図１−７】図１−１と同じ
【図１−８】図１−１と同じ
【図１−９】図１−１と同じ
【図１−１０】図１−１と同じ
【図１−１１】図１−１と同じ
【図１−１２】図１−１と同じ
【図１−１３】図１−１と同じ
【図１−１４】図１−１と同じ
【図１−１５】図１−１と同じ
【図１−１６】図１−１と同じ
【図１−１７】図１−１と同じ
【図１−１８】図１−１と同じ
【図１−１９】図１−１と同じ
【図１−２０】図１−１と同じ
【図１−２１】図１−１と同じ
【図１−２２】図１−１と同じ
【図１−２３】図１−１と同じ
【図１−２４】図１−１と同じ
【図１−２５】図１−１と同じ
【図１−２６】図１−１と同じ
【図１−２７】図１−１と同じ
【図１−２８】図１−１と同じ
【図１−２９】図１−１と同じ
【図１−３０】図１−１と同じ
【図２Ａ】標識されたイヌ、ネコ、及びヒト嗅覚受容体配列のアライメント（それぞれ出現順に、配列番号：４１、５１及び３１）。リガンド内のいずれかの重原子の９Å（１Å＝１０−１０ｍ）以内の残基として定義される活性部位は、配列アライメントの上に黒四角で強調表示されている。７回膜貫通ドメイン受容体に対するＮ末端残基は、タンパク質配列内で残基を番号によって識別し易くするために含まれている。７回膜貫通ドメイン受容体に対するＣ末端残基は、アライメントに含まれない。
【図２Ｂ】モデリングに使用したリガンド（リリアール）の化学構造
【図２Ｃ】イヌ受容体ＣａｆａＯＲ９．２．９に対するリガンド結合の近景。図は、選択された受容体の７ヘリカル膜貫通ドメイン（７ＴＭ）内の化合物が結合する場所を示している。
【図２Ｄ】結合リガンドの環境を規定する残基を示す受容体に対するリガンド結合の近景。より少数の残基が、見易さのために図２Ａで強調表示されたものに対して選択されている。
【図２Ｅ】結合リガンドの環境を定める残基を示す、受容体に結合したリガンドの相互作用地図。リガンドと接触可能な残基が円で示されている。暗色の円は、主としてファンデルワールス又は疎水性接触を通じて相互作用するものである。より明るい色の円は、水素結合、環スタッキング、塩橋などの他の相互作用型を介してリガンドと相互作用するものである。存在する場合、円の周りのハロは、リガンド結合におけるその残基についての水にアクセス可能な表面積の著しい損失があることを示している。存在する場合、水素結合は点線で示されている。リガンドと潜在的に水素結合することができる残基としては、Ｇｌｎ１０３が挙げられる。リガンドと潜在的に環スタッキング、塩橋、水素結合、π相互作用、荷電相互作用、ファンデルワールス相互作用、又は疎水性相互作用することができる追加の残基としては、Ｌｅｕ１０４、Ｌｙｓ２７５、Ａｒｇ８７、Ｖａｌ８１、Ｍｅｔ８４、Ｖａｌ２７９、Ｔｙｒ２６２、Ｍｅｔ２０９、Ｇｌｙ２５８、Ｖａｌ１１１、Ｔｙｒ２５５、Ｔｈｒ２８２、Ｐｈｅ１０７及びＴｈｒ８０が挙げられる。
【図３Ａ】標識されたイヌ、ネコ、及びヒト嗅覚受容体配列のアライメント（それぞれ、出現順に、配列番号：５２、３２及び４２）。リガンド内のいずれかの重原子の９Å（１Å＝１０−１０ｍ）の残基として定義される活性部位は、配列アライメントの上に黒四角で強調表示されている。７回膜貫通ドメイン受容体に対するＮ末端残基は、タンパク質配列内で残基を番号によって識別し易くするために含まれている。７回膜貫通ドメイン受容体に対する残基Ｃ末端は、アライメントに含まれない。
【図３Ｂ】モデリングに使用したリガンド（ｐ−アニスアルデヒド）の化学構造
【図３Ｃ】イヌ受容体ＣａｆａＯＲ３８．１．２１に対するリガンド結合の近景。図は、選択された受容体の７ヘリカル膜貫通ドメイン（７ＴＭ）内の化合物が結合する場所を示している。
【図３Ｄ】結合リガンドの環境を規定する残基を示す受容体に対するリガンド結合の近景。より少数の残基が、見易さのために図３Ａで強調表示されたものに対して選択されている。
【図３Ｅ】結合リガンドの環境を定める残基を示す、受容体に結合したリガンドの相互作用地図。リガンドと接触可能な残基が円で示されている。暗色の円は、主としてファンデルワールス又は疎水性接触を通じて相互作用するものである。より明るい色の円は、水素結合、環スタッキング、塩橋などの他の相互作用型を介してリガンドと相互作用するものである。存在する場合、円の周りのハロは、リガンド結合におけるその残基についての水にアクセス可能な表面積の著しい損失があることを示している。存在する場合には、水素結合は点線で示されている。リガンドと潜在的に水素結合することができる残基としては、Ｌｙｓ２７３が挙げられる。リガンドと潜在的に環スタッキング、塩橋、水素結合、π相互作用、荷電相互作用、ファンデルワールス、又は疎水性相互作用することができる追加の残基としては、Ｔｈｒ７８、Ｌｅｕ８２、Ｔｙｒ２６０、Ｔｈｒ２５６、Ｔｙｒ２５３及びＰｈｅ１０５が挙げられる。
【図４Ａ】標識されたイヌ、ネコ、及びヒト嗅覚受容体配列のアライメント（それぞれ、出現順に、配列番号：４３、５３及び３３）。リガンド内のいずれかの重原子の９Å（１Å＝１０−１０ｍ）以内の残基として定義される活性部位は、配列アライメントの上に黒四角で強調表示されている。７回膜貫通ドメイン受容体に対するＮ末端残基は、タンパク質配列内で残基を番号によって識別し易くするために含まれている。７回膜貫通ドメイン受容体に対する残基Ｃ末端は、アライメントに含まれない。
【図４Ｂ】モデリングに使用したリガンド（（＋）−メントール）の化学構造
【図４Ｃ】イヌ受容体ＣａｆａＯＲ２１．２．１５に対するリガンド結合の近景。図は、選択された受容体の７ヘリカル膜貫通ドメイン（７ＴＭ）内の化合物が結合する場所を示している。
【図４Ｄ】結合リガンドの環境を規定する残基を示す受容体に対するリガンド結合の近景。より少数の残基が、見易さのために図４Ａで強調表示されたものに対して選択されている。
【図４Ｅ】結合リガンドの環境を定める残基を示す、受容体に結合したリガンドの相互作用地図。リガンドと接触可能な残基が円で示されている。暗色の円は、主としてファンデルワールス又は疎水性接触を通じて相互作用するものである。より明るい色の円は、水素結合、環スタッキング、塩橋などの他の相互作用型を介してリガンドと相互作用するものである。存在する場合、円の周りのハロは、リガンド結合におけるその残基についての水にアクセス可能な表面積の著しい損失があることを示している。存在する場合、水素結合は点線で示されている。リガンドと潜在的に環スタッキング、塩橋、水素結合、π相互作用、荷電相互作用、ファンデルワールス、又は疎水性相互作用することができる残基としては、Ｍｅｔ８３、Ｈｉｓ１０７、Ｉｌｅ１０６、Ｌｅｕ１８２、Ａｓｎ１９７、Ｇｌｙ２０１、Ｖａｌ２０４、Ｓｅｒ２６０、Ｐｈｅ２５６及びＬｅｕ２７３が挙げられる。リガンドと潜在的にファンデルワールス又は疎水性相互作用することができる追加の残基としては、Ｍｅｔ１０３が挙げられる。
【図５Ａ】標識されたイヌ、ネコ、及びヒト嗅覚受容体配列のアライメント（それぞれ、出現順に、配列番号：３４、４４及び５４）。リガンド内のいずれかの重原子の９Å以内（１Å＝１０−１０ｍ）の残基として定義される活性部位が、配列アライメントの上に黒四角で強調表示されている。７回膜貫通ドメイン受容体に対するＮ末端残基は、タンパク質配列内で残基を番号によって識別し易くするために含まれている。７回膜貫通ドメイン受容体に対する残基Ｃ末端は、アライメントに含まれない。
【図５Ｂ】モデリングに使用したリガンド（アンドロスタジエノン）の化学構造
【図５Ｃ】イヌ受容体ＣａｆａＯＲ２１．２．４３に対するリガンド結合の近景。図は、選択された受容体の７ヘリカル膜貫通ドメイン（７ＴＭ）内の化合物が結合する場所を示している。
【図５Ｄ】結合リガンドの環境を規定する残基を示す受容体に対するリガンド結合の近景。より少数の残基が、見易さのために図５Ａで強調表示されたものに対して選択されている。
【図５Ｅ】結合リガンドの環境を定める残基を示す、受容体に結合したリガンドの相互作用地図。リガンドと接触可能な残基が円で示されている。暗色の円は、主としてファンデルワールス又は疎水性接触を通じて相互作用するものである。より明るい色の円は、水素結合、環スタッキング、塩橋などの他の相互作用型を介してリガンドと相互作用するものである。存在する場合、円の周りのハロは、リガンド結合におけるその残基についての水にアクセス可能な表面積の著しい損失があることを示している。存在する場合、水素結合は点線で示されている。リガンドと潜在的に環スタッキング、塩橋、水素結合、π相互作用、荷電相互作用、ファンデルワールス、又は疎水性相互作用することができる残基としては、Ｍｅｔ８０、Ｍｅｔ８８、Ｌｅｕ１０８、Ｉｌｅ１１１、Ｈｉｓ１１２、Ｔｈｒ１１５、Ｖａｌ２０９、Ｖａｌ２１０、Ｔｈｒ２１３、Ｌｅｕ２１４、Ｖａｌ２６２、Ｉｌｅ２６３、Ｓｅｒ２６６、Ｉｌｅ２８１、Ａｌａ２８４、及びＬｅｕ２８８が挙げられる。リガンドと潜在的にファンデルワールス又は疎水性相互作用することができる追加の残基としては、Ａｓｐ２８５が挙げられる。
【図６Ａ】標識されたイヌ、ネコ、及びヒト嗅覚受容体配列のアライメント（それぞれ、出現順に、配列番号：３５、４５及び５５）。リガンド内のいずれかの重原子の９Å以内（１Å＝１０−１０ｍ）の残基として定義される活性部位が、配列アライメントの上に黒四角で強調表示されている。７回膜貫通ドメイン受容体に対するＮ末端残基は、タンパク質配列内で残基を番号によって識別し易くするために含まれている。７回膜貫通ドメイン受容体に対する残基Ｃ末端は、アライメントに含まれない。
【図６Ｂ】モデリングに使用したリガンド（イソ酪酸）の化学構造
【図６Ｃ】ネコ受容体ｃａｔＧｒ５（Ｂ３：７２９０８２９５−７２９０９２８７）に対するリガンド結合の近景。図は、選択された受容体の７ヘリカル膜貫通ドメイン（７ＴＭ）内の化合物が結合する場所を示している。
【図６Ｄ】結合リガンドの環境を規定する残基を示す受容体に対するリガンド結合の近景。より少数の残基が、見易さのために図６Ａで強調表示されたものに対して選択されている。
【図６Ｅ】結合リガンドの環境を定める残基を示す、受容体に結合したリガンドの相互作用地図。リガンドと接触可能な残基が円で示されている。暗色の円は、主としてファンデルワールス又は疎水性接触を通じて相互作用するものである。より明るい色の円は、水素結合、環スタッキング、塩橋などの他の相互作用型を介してリガンドと相互作用するものである。存在する場合、円の周りのハロは、リガンド結合におけるその残基についての水にアクセス可能な表面積の著しい損失があることを示している。存在する場合、水素結合は点線で示されている。リガンドと潜在的に水素結合することができる残基としては、Ｔｙｒ２７７が挙げられる。リガンドと潜在的に環スタッキング、塩橋、水素結合、π相互作用、荷電相互作用、ファンデルワールス、又は疎水性相互作用することができる追加の残基としては、Ｐｈｅ１１９、Ｐｒｏ１７７、Ｌｅｕ１８０、Ｉｌｅ１８１、Ｐｒｏ１９９、Ｃｙｓ２１７、及びＰｈｅ２２０が挙げられる。リガンドと潜在的にファンデルワールス又は疎水性相互作用することができる追加の残基としては、Ｔｙｒ２７７及びＬｙｓ２９０が挙げられる。
【図７Ａ】標識されたイヌ、ネコ、及びヒト嗅覚受容体配列のアライメント（それぞれ、出現順に、配列番号：３６、５６及び４６）。リガンド内のいずれかの重原子の９Å以内（１Å＝１０−１０ｍ）の残基として定義される活性部位が、配列アライメントの上に黒四角で強調表示されている。７回膜貫通ドメイン受容体に対するＮ末端残基は、タンパク質配列内で残基を番号によって識別し易くするために含まれている。７回膜貫通ドメイン受容体に対する残基Ｃ末端は、アライメントに含まれない。
【図７Ｂ】モデリングに使用したリガンド（β−イオノン）の化学構造
【図７Ｃ】ネコ受容体ｃａｔＧｒ６（Ｄ１：１０５４８６５２８−１０５４８７４９３）に対するリガンド結合の近景。図は、選択された受容体の７ヘリカル膜貫通ドメイン（７ＴＭ）内の化合物が結合する場所を示している。
【図７Ｄ】結合リガンドの環境を規定する残基を示す受容体に対するリガンド結合の近景。より少数の残基が、見易さのために図７Ａで強調表示されたものに対して選択されている。
【図７Ｅ】結合リガンドの環境を定める残基を示す、受容体に結合したリガンドの相互作用地図。リガンドと接触可能な残基が円で示されている。暗色の円は、主としてファンデルワールス又は疎水性接触を通じて相互作用するものである。より明るい色の円は、水素結合、環スタッキング、塩橋などの他の相互作用型を介してリガンドと相互作用するものである。存在する場合、円の周りのハロは、リガンド結合におけるその残基についての水にアクセス可能な表面積の著しい損失があることを示している。存在する場合、水素結合は点線で示されている。リガンドと潜在的に水素結合することができる残基としては、Ｔｙｒ２６５が挙げられる。リガンドと潜在的に環スタッキング、塩橋、水素結合、π相互作用、荷電相互作用、ファンデルワールス、又は疎水性相互作用することができる追加の残基としては、Ｐｈｅ８８、Ｐｈｅ１１１、Ｍｅｔ１７０、Ｍｅｔ２０６、Ｃｙｓ２６１、Ｉｌｅ２６４、Ｓｅｒ２７９、Ｉｌｅ２８０、及びＴｈｒ２８３が挙げられる。リガンドと潜在的にファンデルワールス又は疎水性相互作用することができる追加の残基としては、Ｈｉｓ１１２、Ａｓｎ２０９及びＴｙｒ２６５が挙げられる。
【図８Ａ】標識されたイヌ、ネコ、及びヒト嗅覚受容体配列のアライメント（それぞれ、出現順に、配列番号：４７、３７及び５７）。リガンド内のいずれかの重原子の９Å以内（１Å＝１０−１０ｍ）の残基として定義される活性部位が、配列アライメントの上に黒四角で強調表示されている。７回膜貫通ドメイン受容体に対するＮ末端残基は、タンパク質配列内で残基を番号によって識別し易くするために含まれている。７回膜貫通ドメイン受容体に対する残基Ｃ末端は、アライメントに含まれない。
【図８Ｂ】モデリングに使用したリガンド（酢酸アミル）の化学構造
【図８Ｃ】ネコ受容体ｃａｔＧ７（Ｂ３：７４１１６９５５−７４１１７８９３）に対するリガンド結合の近景。図は、選択された受容体の７ヘリカル膜貫通ドメイン（７ＴＭ）内の化合物が結合する場所を示している。
【図８Ｄ】結合リガンドの環境を規定する残基を示す受容体に対するリガンド結合の近景。より少数の残基が、見易さのために図８Ａで強調表示されたものに対して選択されている。
【図８Ｅ】結合リガンドの環境を定める残基を示す、受容体に結合したリガンドの相互作用地図。リガンドと接触可能な残基が円で示されている。暗色の円は、主としてファンデルワールス又は疎水性接触を通じて相互作用するものである。より明るい色の円は、水素結合、環スタッキング、塩橋などの他の相互作用型を介してリガンドと相互作用するものである。存在する場合、円の周りのハロは、リガンド結合におけるその残基についての水にアクセス可能な表面積の著しい損失があることを示している。存在する場合、水素結合は点線で示されている。リガンドと潜在的に水素結合することができる残基としては、Ｍｅｔ８１、Ｔｙｒ２５８、及びＧｌｎ１００が挙げられる。リガンドと潜在的に環スタッキング、塩橋、水素結合、π相互作用、荷電相互作用、ファンデルワールス、又は疎水性相互作用することができる追加の残基としては、Ｔｈｒ７７、Ｌｙｓ２６９、Ｌｅｕ１０４、Ｔｈｒ２７６、Ｖａｌ２７７、Ｈｉｓ７３、Ｖａｌ２７３及びＶａｌ７８が挙げられる。
【図９Ａ】標識されたイヌ、ネコ、及びヒト嗅覚受容体配列のアライメント（それぞれ、出現順に、配列番号：３８、５８及び４８）。リガンド内のいずれかの重原子の９Å以内（１Å＝１０−１０ｍ）の残基として定義される活性部位が、配列アライメントの上に黒四角で強調表示されている。７回膜貫通ドメイン受容体に対するＮ末端残基は、タンパク質配列内で残基を番号によって識別し易くするために含まれている。７回膜貫通ドメイン受容体に対する残基Ｃ末端は、アライメントに含まれない。
【図９Ｂ】モデリングに使用したリガンド（１−ノナンチオール）の化学構造
【図９Ｃ】ネコ受容体ｃａｔＧ８（Ｅ３：４０２３７９０４−４０２３８８４２）に対するリガンド結合の近景。図は、選択された受容体の７ヘリカル膜貫通ドメイン（７ＴＭ）内の化合物が結合する場所を示している。
【図９Ｄ】結合リガンドの環境を規定する残基を示す受容体に対するリガンド結合の近景。より少数の残基が、見易さのために図９Ａで強調表示されたものに対して選択されている。
【図９Ｅ】結合リガンドの環境を定める残基を示す、受容体に結合したリガンドの相互作用地図。リガンドと接触可能な残基が円で示されている。暗色の円は、主としてファンデルワールス又は疎水性接触を通じて相互作用するものである。より明るい色の円は、水素結合、環スタッキング、塩橋などの他の相互作用型を介してリガンドと相互作用するものである。存在する場合、円の周りのハロは、リガンド結合におけるその残基についての水にアクセス可能な表面積の著しい損失があることを示している。存在する場合、水素結合は点線で示されている。リガンドと潜在的に環スタッキング、塩橋、水素結合、π相互作用、又は荷電相互作用することができる残基としては、Ｌｅｕ１０１、Ｐｈｅ１０４、Ｌｅｕ１０５、Ｇｌｙ１０８、Ｇｌｕ１８０、Ｖａｌ２０２、Ｐｈｅ２０６、Ｔｙｒ２５９、及びＬｙｓ２７２が挙げられる。リガンドと潜在的にファンデルワールス又は疎水性相互作用することができる追加の残基としては、Ｍｅｔ８１が挙げられる。
【図１０Ａ】標識されたイヌ、ネコ、及びヒト嗅覚受容体配列のアライメント（それぞれ、出現順に、配列番号：４９、５９及び３９）。リガンド内のいずれかの重原子の９Å以内（１Å＝１０−１０ｍ）の残基として定義される活性部位が、配列アライメントの上に黒四角で強調表示されている。７回膜貫通ドメイン受容体に対するＮ末端残基は、タンパク質配列内で残基を番号によって識別し易くするために含まれている。７回膜貫通ドメイン受容体に対する残基Ｃ末端は、アライメントに含まれない。
【図１０Ｂ】モデリングに使用したリガンド（β−イオノン）の化学構造
【図１０Ｃ】ネコ受容体ｃａｔＧ９（Ｄ１：１０５４６２５５４−１０５４６３５１２）に対するリガンド結合の近景。図は、選択された受容体の７ヘリカル膜貫通ドメイン（７ＴＭ）内の化合物が結合する場所を示している。
【図１０Ｄ】結合リガンドの環境を規定する残基を示す受容体に対するリガンド結合の近景。より少数の残基が、見易さのために図１０Ａで強調表示されたものに対して選択されている。
【図１０Ｅ】結合リガンドの環境を定める残基を示す、受容体に結合したリガンドの相互作用地図。リガンドと接触可能な残基が円で示されている。暗色の円は、主としてファンデルワールス又は疎水性接触を通じて相互作用するものである。より明るい色の円は、水素結合、環スタッキング、塩橋などの他の相互作用型を介してリガンドと相互作用するものである。存在する場合、円の周りのハロは、リガンド結合におけるその残基についての水にアクセス可能な表面積の著しい損失があることを示している。存在する場合、水素結合は点線で示されている。リガンドと潜在的に水素結合することができる残基としては、Ｌｙｓ２７８が挙げられる。追加のリガンドと潜在的に環スタッキング、塩橋、水素結合、π相互作用、又は荷電相互作用することができる残基としては、Ｐｈｅ１１０、Ｖａｌ１１１、Ｇｌｙ１１４、Ｖａｌ２０８、Ｉｌｅ２１２、Ｐｈｅ２５８、Ａｌａ２６１、Ｌｅｕ２６２、Ｔｙｒ２６５、Ｖａｌ２８２、及びＳｅｒ２８５が挙げられる。リガンドと潜在的にファンデルワールス又は疎水性相互作用することができる追加の残基としては、Ｔｙｒ７９及びＬｙｓ２７８が挙げられる。
【図１１Ａ】標識されたイヌ、ネズミ、ネコ、及びヒト嗅覚受容体配列のアライメント（それぞれ、出現順に、配列番号：６０、３，８０９、５０及び４０）。リガンド内のいずれかの重原子の９Å以内（１Å＝１０−１０ｍ）の残基として定義される活性部位が、配列アライメントの上に黒四角で強調表示されている。７回膜貫通ドメイン受容体に対するＮ末端残基は、タンパク質配列内で残基を番号によって識別し易くするために含まれている。７回膜貫通ドメイン受容体に対する残基Ｃ末端は、アライメントに含まれない。
【図１１Ｂ】モデリングに使用したリガンド（クマリン）の化学構造
【図１１Ｃ】イヌ受容体ＣａｆａＯＲ５．２．５に対するリガンド結合の近景。図は、選択された受容体の７ヘリカル膜貫通ドメイン（７ＴＭ）内の化合物が結合する場所を示している。
【図１１Ｄ】結合リガンドの環境を規定する残基を示す受容体に対するリガンド結合の近景。より少数の残基が、見易さのために図１１Ａで強調表示されたものに対して選択されている。
【図１１Ｅ】結合リガンドの環境を定める残基を示す、受容体に結合したリガンドの相互作用地図。リガンドと接触可能な残基が円で示されている。暗色の円は、主としてファンデルワールス又は疎水性接触を通じて相互作用するものである。より明るい色の円は、水素結合、環スタッキング、塩橋などの他の相互作用型を介してリガンドと相互作用するものである。存在する場合、円の周りのハロは、リガンド結合におけるその残基についての水にアクセス可能な表面積の著しい損失があることを示している。存在する場合、水素結合は点線で示されている。リガンドと潜在的に環スタッキング、塩橋、水素結合、π相互作用、又は荷電相互作用することができる残基としては、Ｔｙｒ７７、Ｐｈｅ１０８、Ｖａｌ１１２、Ｓｅｒ１１６、Ｖａｌ２０６、Ａｓｐ２１０、Ｐｈｅ２５６、及びＴｈｒ２８３が挙げられる。リガンドと潜在的にファンデルワールス又は疎水性相互作用することができる追加の残基としては、Ｔｙｒ２６３が挙げられる。
【図１２】天然の嗅覚受容体シグナル伝達経路及び可能な官能アッセイを示す図
【図１３】嗅覚遺伝空間をカバーする複数種（ヒト／イヌ／ネコ）の系統樹。該系統樹は、すべての嗅覚受容体を示しており、３０の選択された嗅覚受容体（１０のヒト受容体、１０のイヌ受容体、１０のネコ受容体）を強調表示している。
【図１４】実施例４のＯＲ＿１からＯＲ＿５のフェーズ２試験の結果のまとめ
【図１５】実施例４のＯＲ＿６からＯＲ＿１０のフェーズ２試験の結果のまとめ
【図１６】実施例４のイヌＯＲのフェーズ３試験の結果のまとめ
【図１７】実施例４のネコＯＲのフェーズ３試験の結果のまとめ
【図１８】ＯＲ＿１（ＯＲ３Ａ１）を使用するＣＲＥ−ＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼアッセイの結果を示す図
【図１９】ＯＲ＿１（ＯＲ３Ａ１）を使用するｃｈＡＭＰｉｏｎアッセイの結果を示す図
【図２０】ＯＲ＿２（ＯＲ６Ｐ１）を使用するＣＲＥ−ＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼアッセイの結果を示す図
【図２１】ＯＲ＿２（ＯＲ６Ｐ１）を使用するｃｈＡＭＰｉｏｎアッセイの結果を示す図
【図２２】ＯＲ＿３（ＯＲ５１Ｅ１）を使用するＣＲＥ−ＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼアッセイの結果を示す図
【図２３】ＯＲ＿３（ＯＲ５１Ｅ１）を使用するｃｈＡＭＰｉｏｎアッセイの結果を示す図
【図２４】ＯＲ＿４（ＯＲ５１Ｌ１）を使用するＣＲＥ−ＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼアッセイの結果を示す図
【図２５】ＯＲ＿４（ＯＲ５１Ｌ１）を使用するｃｈＡＭＰｉｏｎアッセイの結果を示す図
【図２６】ＯＲ＿５（ＯＲ１１Ｈ６）を使用するＣＲＥ−ＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼアッセイの結果を示す図
【図２７】ＯＲ＿５（ＯＲ１１Ｈ６）を使用するｃｈＡＭＰｉｏｎアッセイの結果を示す図
【図２８】ＯＲ＿６（ＯＲ４Ｄ６）を使用するＣＲＥ−ＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼアッセイの結果を示す図
【図２９】ＯＲ＿６（ＯＲ４Ｄ６）を使用するｃｈＡＭＰｉｏｎアッセイの結果を示す図
【図３０】ＯＲ＿７（ＯＲ４Ｅ２）を使用するＣＲＥ−ＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼアッセイの結果を示す図
【図３１】ＯＲ＿７（ＯＲ４Ｅ２）を使用するｃｈＡＭＰｉｏｎアッセイの結果を示す図
【図３２】ＯＲ＿８（ＯＲ２Ｃ１）を使用するＣＲＥ−ＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼアッセイの結果を示す図
【図３３】ＯＲ＿８（ＯＲ２Ｃ１）を使用するｃｈＡＭＰｉｏｎアッセイの結果を示す図
【図３４】ＯＲ＿９（ＯＲ５Ａ１）を使用するＣＲＥ−ＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼアッセイの結果を示す図
【図３５】ＯＲ＿９（ＯＲ５Ａ１）を使用するｃｈＡＭＰｉｏｎアッセイの結果を示す図
【図３６】ＯＲ＿１０（ＯＲ８Ｂ８）を使用するＣＲＥ−ＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼアッセイの結果を示す図
【図３７】ＯＲ＿１０（ＯＲ８Ｂ８）を使用するｃｈＡＭＰｉｏｎアッセイの結果を示す図
【図３８Ａ】ＯＲ＿２（ＯＲ６Ｐ１）の陽性リガンドの用量反応曲線。図３８Ａは、ｍｏｃｋ、ネコ及びイヌ受容体を使用するｐ−アニスアルデヒドの用量反応曲線である。
【図３８Ｂ】ＯＲ＿２（ＯＲ６Ｐ１）の陽性リガンドの用量反応曲線。図３８Ｂは、ｍｏｃｋ、ネコ及びイヌ受容体を使用する４−エトキシベンズアルデヒドの用量反応曲線である。
【図３９Ａ】ＯＲ＿３（ＯＲ５１Ｅ１）の陽性リガンドの用量反応曲線。図３９Ａは、ｍｏｃｋ、ネコ及びイヌ受容体を使用するイソ吉草酸の用量反応曲線である。
【図３９Ｂ】ＯＲ＿３（ＯＲ５１Ｅ１）の陽性リガンドの用量反応曲線。図３９Ｂは、ｍｏｃｋ、ネコ及びイヌ受容体を使用する４−メチル吉草酸の用量反応曲線である。
【図３９Ｃ】ＯＲ＿３（ＯＲ５１Ｅ１）の陽性リガンドの用量反応曲線。図３９Ｃは、ｍｏｃｋ、ネコ及びイヌ受容体を使用するヘキサン酸の用量反応曲線である。
【図３９Ｄ】ＯＲ＿３（ＯＲ５１Ｅ１）の陽性リガンドの用量反応曲線。図３９Ｄは、ｍｏｃｋ、ネコ及びイヌ受容体を使用する３−メチル−２−ヘキサン酸の用量反応曲線である。
【図４０Ａ】ＯＲ＿４（ＯＲ５１Ｌ１）の陽性リガンドの用量反応曲線。図４０Ａは、ｍｏｃｋ、ネコ及びイヌ受容体を使用するヘキサン酸の用量反応曲線である。
【図４０Ｂ】ＯＲ＿４（ＯＲ５１Ｌ１）の陽性リガンドの用量反応曲線。図４０Ｂは、ｍｏｃｋ、ネコ及びイヌ受容体を使用するフェニル酢酸アリルの用量反応曲線である。
【図４１Ａ】ＯＲ＿８（ＯＲ２Ｃ１）の陽性リガンドの用量反応曲線。図４１Ａは、ｍｏｃｋ、ネコ及びイヌ受容体を使用し、かつＣＲＥ−ＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼアッセイを使用したノナンチオールの用量反応曲線である。
【図４１Ｂ】ＯＲ＿８（ＯＲ２Ｃ１）の陽性リガンドの用量反応曲線。図４１Ｂは、ｍｏｃｋ、ネコ及びイヌ受容体を使用し、かつＣＮＧアッセイを使用したノナンチオールの用量反応曲線である。
【図４２Ａ】ＯＲ＿９（ＯＲ５Ａ１）の陽性リガンドの用量反応曲線。図４２Ａは、ｍｏｃｋ、ネコ及びイヌ受容体を使用し、かつＣＲＥ−ＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼアッセイを使用した、イソ吉草酸の用量反応曲線である。
【図４２Ｂ】ＯＲ＿９（ＯＲ５Ａ１）の陽性リガンドの用量反応曲線。図４２Ｂは、ｍｏｃｋ、ネコ及びイヌ受容体を使用し、かつＣＲＥ−ＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼアッセイを使用した、シトラールの用量反応曲線である。
【図４２Ｃ】ＯＲ＿９（ＯＲ５Ａ１）の陽性リガンドの用量反応曲線。図４２Ｃは、ｍｏｃｋ、ネコ及びイヌ受容体を使用し、かつＣＲＥ−ＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼアッセイを使用した、酢酸アミルの用量反応曲線である。
【図４２Ｄ】ＯＲ＿９（ＯＲ５Ａ１）の陽性リガンドの用量反応曲線。図４２Ｄは、ｍｏｃｋ、ネコ及びイヌ受容体を使用し、かつＣＲＥ−ＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼアッセイを使用した、β−イオノンの用量反応曲線である。
【図４２Ｅ】ＯＲ＿９（ＯＲ５Ａ１）の陽性リガンドの用量反応曲線。図４２Ｅは、ｍｏｃｋ、ネコ及びイヌ受容体を使用し、かつＣＮＧアッセイを使用した、イソ吉草酸の用量反応曲線である。
【図４２Ｆ】ＯＲ＿９（ＯＲ５Ａ１）の陽性リガンドの用量反応曲線。図４２Ｆは、ｍｏｃｋ、ネコ及びイヌ受容体を使用し、かつＣＮＧアッセイを使用した、シトラールの用量反応曲線である。
【図４２Ｇ】ＯＲ＿９（ＯＲ５Ａ１）の陽性リガンドの用量反応曲線。図４２Ｇは、ｍｏｃｋ、ネコ及びイヌ受容体を使用し、かつＣＮＧアッセイを使用した、酢酸アミルの用量反応曲線である。
【図４２Ｈ】ＯＲ＿９（ＯＲ５Ａ１）の陽性リガンドの用量反応曲線。図４２Ｈは、ｍｏｃｋ、ネコ及びイヌ受容体を使用し、かつＣＮＧアッセイを使用した、β−イオノンの用量反応曲線である。ヒトＯＲ５Ａ１は、β−イオノンにのみ反応するＣＲＥ−ＮａｎｏＬｕｃアッセイにおいてのみ、反応性である。イヌＯＲ５Ａ１は、両方のアッセイにおいて、わずかに異なる反応プロファイルを有する：ＣＲＥ−ＮａｎｏＬｕｃアッセイでは、受容体は、同様のＥＣ５０及びＥｍａｘで、４つの化合物すべてに対して反応する；ＣＮＧアッセイでは、受容体は、４つの化合物すべてに対して反応するが、β−イオノンに対する反応は、最低のＥＣ５０及び最高のＥｍａｘを有している。ネコＯＲ５Ａ１は、両方のアッセイで異なる反応プロファイルを有する：ＣＲＥ−ＮａｎｏＬｕｃアッセイでは、受容体は、同様のＥＣ５０及びＥｍａｘで、４つの化合物すべてに対して反応する；ＣＮＧアッセイでは、受容体は、β−イオノンに対してのみ、強い反応を有するが、イソ吉草酸及び酢酸アミルについては反応は弱く、シトラールに対しては反応を有しない。両方のアッセイにおける反応プロファイルの差異は、異なるアッセイプロトコル及びＣＲＥ−ＮａｎｏＬｕｃアッセイの方がインキュベーション時間がより長いことによるものである可能性がある。
【図４３Ａ】ＯＲ＿１０（ＯＲ８Ｂ８）の陽性リガンドの用量反応曲線。図４３Ａは、ｍｏｃｋ、ネコ及びイヌ受容体を使用した、アセトフェノンの用量反応曲線である。
【図４３Ｂ】ＯＲ＿１０（ＯＲ８Ｂ８）の陽性リガンドの用量反応曲線。図４３Ｂは、ｍｏｃｋ、ネコ及びイヌ受容体を使用した、プロピオフェノンの用量反応曲線である。
【図４３Ｃ】ＯＲ＿１０（ＯＲ８Ｂ８）の陽性リガンドの用量反応曲線。図４３Ｃは、ｍｏｃｋ、ネコ及びイヌ受容体を使用した、クマリンの用量反応曲線である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本開示の主題は、嗅覚受容体の活性及び／又は発現を調節する化合物をスクリーニング及び特定する方法に関する。本開示の主題は、さらに、香り豊かで嗜好性が高く、栄養的に完全なペットフード製品、医薬品、並びに、栄養的に完全ではないペットフード製品（例えば、スナック、ケア用及びおやつ）の製造に関し、ここで、ペットフード及び／又は最終的なペットフード製品又は医薬品の原材料は、それが嗅覚受容体を調節する化合物を含んでいるかどうかを決定するためにスクリーニングされる。さらには、このようなスクリーニング方法を使用して、忌避化合物を含まない原材料及び／又は最終的なペットフード製品を選択することができる。該方法を通じて特定された化合物を使用して、魅力的な匂い又は不快感を与える匂いを増加又は低減することによって、ペットフード製品及び医薬品の香り及び／又は嗜好性を調節することができる。該化合物を使用して、物体の不快感を与える匂いを増加させ、それによって、ネコ又はイヌによる接触、嗜好性、及び経口摂取を低減させてもよい。
【００２６】
１．定義
本明細書で用いられる用語は、本発明の文脈内において、及び各用語が使用される特定の文脈において、概して、その技術分野におけるそれらの通常の意味を有する。ある特定の用語は、実施者に、本発明の方法及び組成物、並びにそれらの製造及び使用方法を説明する、さらなる手引きを提供するために、以下又は本明細書の他の箇所で論じられる。
【００２７】
本明細書で用いられる場合、単語「ａ」又は「ａｎ」の使用は、特許請求の範囲及び／又は明細書内で用語「含む」と組み合わせて使用した場合には、「１つ」を意味しうるが、「１つ以上」、「少なくとも１つ」、及び「１つ又はそれ以上」の意味とも矛盾しない。さらには、用語「有する」、「含む」、「含有する」、及び「包含する」は交換可能であり、当業者は、これらの用語がオープンエンドの用語であることを認識している。 
【００２８】
用語「約」又は「およそ」とは、当業者によって決定される特定の値の許容誤差範囲内を意味し、これは、ある程度、値の測定方法又は決定方法に応じて、すなわち測定システムの限界に応じて決まる。例えば、「約」は、当技術分野における実施ごとに、３標準偏差以内、又は３を超える標準偏差を意味しうる。あるいは、「約」は、所与の値の最大２０％まで、好ましくは最大１０％まで、さらに好ましくは最大５％まで、さらになお好ましくは最大１％までの範囲を意味しうる。あるいは、特に生物学的システム又はプロセスに関しては、該用語は、ある値の１桁倍以内、好ましくは５倍以内、さらに好ましくは２倍以内を意味しうる。
【００２９】
本明細書において互換的に用いられる、「匂い」、「臭い」及び「香り」とは、対象の嗅覚系の受容体細胞の活性化によって引き起こされる感覚を指す。ある特定の実施形態では、匂いは、例えば、フルーツ、花、ハチミツ、脂肪、ミント、金属の香りのうちの１つ以上など、一組の精神物理学的な記述子によって特徴づけられる。例えば、その内容がここに参照することによって本明細書に取り込まれる、Dravnieks, Atlas of Odor Character Profiles, American Society for Testing and Materials, 1985; Castro et al., PLOS ONE, 0073289, 2014を参照。ある特定の実施形態では、嗅覚は、「匂い物質」によって対象に引き起こされる。ある特定の実施形態では、異なる匂い物質の組合せは、新しい臭気物質として知覚することができる。ある特定の実施形態では、匂い物質は、合成の匂い物質でありうる。ある特定の実施形態では、匂い物質は、天然資源から獲得又は調製される。
【００３０】
本明細書で用いられる場合、「嗅覚プロファイル」とは、その各々を、例えば、フルーツ、花、ハチミツ、脂肪、ミント、金属の香りのうちの１つ以上などの一組の精神物理学的な記述子によって特徴づけることができる嗅覚の組合せを指す。ある特定の実施形態では、異なる匂い物質の組合せは、新しい嗅覚経験として知覚されうる。ある特定の実施形態では、嗅覚プロファイルは、同一又は異なる濃度で組成物中に存在する１つ以上の匂い物質によって生成される。ある特定の実施形態では、嗅覚プロファイルとは、例えば、対象又は当技術分野で知られているアッセイによって検出される、フルーツ、花、ハチミツ、脂肪、ミント、金属の香りなどの匂い又は匂いの組合せの強度を指す。ある特定の実施形態では、嗅覚プロファイルにおける匂い物質の組合せの調節、変更、又は変動によって、対象の知覚経験を変化させることができる。
【００３１】
本明細書で用いられる場合、「フレーバー」とは、例えば、味（味覚）、臭い（嗅覚）、接触（触覚）及び温度（熱）刺激のうちの１つ以上など、１つ以上の感覚刺激を指す。ある特定の非限定的な実施形態では、フレーバーに曝露された対象の知覚経験は、特定のフレーバーについての特徴的な経験として分類することができる。例えば、フレーバーは、限定はしないが、フローラル、シトラス、ベリー、ナッツ、キャラメル、チョコレート、ペッパー、スモーク、チーズ、ミートなどのフレーバーとして、対象に識別されうる。本明細書で用いられる場合、フレーバー組成物は、液体、溶液、乾燥粉末、噴霧、ペースト、懸濁液及びそれらの任意の組合せから選択されうる。フレーバーは、天然組成物、人工組成物、ネイチャーアイデンティカル、又はそれらの任意の組合せでありうる。
【００３２】
本明細書で用いられる場合、「フレーバープロファイル」とは、例えば、味覚、嗅覚、触覚、及び／又はは熱刺激などの感覚刺激を指す。ある特定の実施形態では、フレーバープロファイルは、対象の知覚経験に寄与する１つ以上のフレーバーを含む。ある特定の実施形態では、フレーバープロファイルにおける刺激の組合せの調節、変更、又は変動によって、対象の知覚経験を変化させることができる。
【００３３】
例えば、「本出願にかかるフレーバー組成物又はそれらの組合せを食品と混和」させるなど、本明細書で用いられる「混和」とは、フレーバー組成物、又はフレーバー組成物の個々の構成成分を、完成品と混合する又はそれに添加するプロセス、あるいは、製品の形成中に製品の一部又は全ての成分と混合するプロセス、若しくはこれらのステップの幾つかの組合せを指す。混和の文脈で使用されるとき、用語「製品」とは、該製品又はその任意の構成成分を指す。この混和のステップは、フレーバー組成物を製品に添加するステップ、フレーバー組成物を製品に噴霧するステップ、フレーバー組成物を製品にコーティングするステップ、フレーバー組成物中に製品を懸濁させるステップ、フレーバー組成物を製品に塗布するステップ、フレーバー組成物を製品に貼り付けるステップ、製品をフレーバー組成物に封入するステップ、フレーバー組成物を製品と混合するステップ、並びにそれらの任意の組合せから選択されるプロセスを含みうる。フレーバー組成物は、溶液、液体、乾燥粉末、噴霧、ペースト、懸濁液、及びそれらの任意の組合せでありうる。
【００３４】
本明細書で用いられる場合、「嗜好性」とは、ヒト又は例えば愛玩動物などの非ヒト動物がある特定の食品を食する全体的な意欲を指しうる。食品の「嗜好性」の向上は、ヒト又は非ヒト動物による食べ物の享受及び許容の増加をもたらすことができ、ヒト又は非ヒト動物が「健康量」の食べ物を食することを確実にする。食品の「嗜好性」の低下は、ヒト又は非ヒト動物による食べ物の享受及び許容の低下をもたらしうる。本明細書で用いられる場合、用語「健康量」の食べ物とは、例えば、「Mars Petcare Essential Nutrient Standards」に定められているような微量栄養素、主要栄養素、カロリーの観点から、ヒト又は非ヒト動物が全体的な健康全般に寄与する摂取量を維持または達成することができる量を指す。ある特定の実施形態では、「嗜好性」とは、ヒト又は非ヒト動物におけるある食品の別の食品に対する相対的な好みを意味しうる。例えば、ヒト又は非ヒト動物が、２つ以上の食品のうちの１つを好む場合、好ましい食品は、より「嗜好性が高」く、「高められた嗜好性」を有している。ある特定の実施形態では、例として、並列比較、例えば食品の相対的消費による自由選択比較、あるいは嗜好性を示す他の適切な好みの尺度など、１つ以上の他の食品と比較して、１つの食品の相対的な嗜好性を決定することができる。嗜好性は、「ツーボウル試験」又は「対試験」と呼ばれる試験など、動物が両方の食品に平等にアクセスできる標準試験プロトコルによって決定することができる。このような好みは、動物のいずれの感覚からも生じうるが、とりわけ、味、後味、臭い、口あたり、及び／又は食感に関連しうる。
【００３５】
用語「ペットフード」又は「ペットフード製品」又は「最終的なペットフード製品」とは、ネコ、イヌ、モルモット、ウサギ、トリ、ウマなどの愛玩動物が消費することを意図した製品又は組成物を意味する。例えば、限定はしないが、愛玩動物は、例えば、イヌ（Canis lupus familiaris）などの「飼い」犬でありうる。ある特定の実施形態では、愛玩動物は、ネコ（Felis domesticus）などの「飼い」猫でありうる。「ペットフード」又は「ペットフード製品」は、食品、給食、スナック、栄養補助食品、液体、飲料、おやつ、玩具（噛むことができる及び／又は消耗性の玩具）、食事の置換品又は食事の代替品を含む。
【００３６】
用語「ヒトの食品」又は「ヒト用の食品」又は「最終的なヒト用の食品」とは、ヒトが消費することを意図した製品又は組成物を意味する。「ヒトの食品」又は「ヒト用の食品」は、任意の食品、給食、スナック、栄養補助食品、液体、飲料、おやつ、食事の置換品又は食事の代替品を含む。
【００３７】
ある特定の実施形態では、「食品」は、ヒト用及び／又はペット用の食品を含む。
【００３８】
本明細書で用いられる「栄養的に完全な」とは、ペットフード製品の対象となる受け手に必要な知られている栄養素のすべてを、例えば愛玩動物の栄養学の分野における公認又は管轄当局の勧告に基づく、適切な量及び割合で含むペットフード製品を指す。したがって、このような食品は、補足の栄養源を追加することなく、生命を維持するために食事摂取の唯一の源として役立てることができる。
【００３９】
用語「原材料」とは、最終的なペットフード製品へと加工又は製造される前の植物及び／又は動物材料を意味する。ある特定の実施形態では、「原材料」は、分析前に個別の要素へと分離するために（例えば、抽出、精製、分画、及び／又は濃縮によって）大幅に処理されていない。「原材料」は、ペットフード製品のためのタンパク質源を含む。ある特定の実施形態では、原材料は、ヒトの食品源と競合しない新規タンパク質源（すなわち、一般にはヒトが食さないタンパク質源）である。ある特定の実施形態では、原材料は、ヒトの食物連鎖の副産物である。ある特定の非限定的な実施形態では、「原材料」は、本明細書に記載される方法に従って分析される前に、例えば、分析の前にそれを個別の要素に分けるために加工されうる（例えば、抽出、精製、分画、及び／又は濃縮によって）。
【００４０】
本明細書で用いられる「フレーバー組成物」とは、天然又は合成の味物質、フレーバー剤の味、臭い、フレーバー及び／又は食感、動物又はヒトにおける味覚プロファイル、フレーバープロファイル及び／又は食感プロファイルを、強化、増倍、増強、減少、抑制、又は誘発することを含めて、調節する、少なくとも１つの化合物又はその生物学的に許容される塩を指す。ある特定の実施形態では、フレーバー組成物は、化合物又はそれらの生物学的に許容される塩の組合せを含む。ある特定の実施形態では、フレーバー組成物は、１つ以上の賦形剤を含む。
【００４１】
本明細書で用いられる場合、「臭気抑制剤」、「臭気抑制製品」、又は「臭気抑制組成物」とは、物体に不快感を与える匂いを提供する少なくとも１つの化合物又はその生物学的に許容される塩を含む製品又は組成物を指す。ある特定の実施形態では、臭気抑制剤は、動物が、例えば食べ物又は液体製品などの物体に触れたり、近づいたり、噛んだり、舐めたり、食べたりする気をそぐ。ある特定の実施形態では、物体は、例えば、限定はしないが、衣類、靴、カーペット、家具、家庭用品、農薬、除草剤、又は有毒化合物である。ある特定の実施形態では、物体は、別の動物又はその動物自体である。他の実施形態では、物体は、動物に対して有毒であるか、あるいは、接触又は摂取すると、動物の健康に悪影響を及ぼす可能性がある。
【００４２】
本明細書で用いられる場合、用語「調節」又は「改質」するとは、受容体の特定の活性の量、質、又は効果を増加又は低下させる、及び／又は、受容体の発現、活性、又は機能を増加又は低下させることを指す。「モジュレータ」とは、本明細書で用いられる場合には、例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、アロステリックモジュレータ、並びに、断片、変異体及び模倣物を含めたそれらの相同体について、インシリコ、インビトロ及び／又はインビボでのアッセイを使用して特定された化合物を阻害又は活性化することを指す。
【００４３】
「阻害剤」又は「アンタゴニスト」とは、本明細書で用いられる場合には、対象とする受容体又は経路の生物学的活性及び／又は発現を減少、低下、遮断、防止、活性化の遅延、不活性化、脱感作、又は下方制御する、調節化合物を指す。用語「アンタゴニスト」は、完全、部分的、及び天然のアンタゴニスト、並びにインバースアゴニストを含む。
【００４４】
「誘導物質」、「活性剤」、又は「アゴニスト」とは、本明細書で用いられる場合には、対象とする受容体又は経路を増加、誘導、刺激、開放、活性化、促進、活性化増進、感作、又は上方制御する調節化合物を指す。用語「アゴニスト」は、完全及び部分的アゴニストを含む。
【００４５】
「アロステリックモジュレータ」とは、本明細書で用いられる場合には、「陽性アロステリックモジュレータ」及び「陰性アロステリックモジュレータ」を指す。「陽性アロステリックモジュレータ」とは、受容体への異なる化合物の結合によって引き起こされる、対象とする受容体又は経路を増加、誘導、刺激、開放、活性化、促進、増強、活性化、感作、又は上方制御する調節化合物を指す。「陰性アロステリックモジュレータ」とは、受容体への異なる化合物の結合によって引き起こされる対象とする受容体又は経路の生物学的活性及び／又は発現を減少、低下、遮断、防止、活性化の遅延、不活性化、脱感作、又は下方制御する調節化合物を指す。
【００４６】
本明細書で用いられる場合、用語「ベクター」及び「発現ベクター」とは、適切な大きさの別のＤＮＡ配列断片を組み込むことができる、線状又は環状のいずれかのＤＮＡ分子を指す。このようなＤＮＡ断片は、ＤＮＡ配列断片によってコードされる遺伝子の転写をもたらす追加のセグメントを含みうる。該追加のセグメントとしては、プロモーター、転写ターミネーター、エンハンサー、内部リボソーム進入部位、非翻訳領域、ポリアデニル化シグナル、選択マーカー、複製起点などが挙げられるが、これらに限られない。発現ベクターは、しばしば、プラスミド、コスミド、ウイルスベクター及び酵母の人工染色体に由来する。ベクターは、しばしば、幾つかの供給源に由来するＤＮＡ配列を含む組換え分子である。
【００４７】
用語「動作可能に結合した」とは、例えば発現ベクター内など、ＤＮＡ配列に適用される場合には、配列それらの意図された目的を達成するために、それらが協調的に機能するように配置されること、すなわち、プロモーター配列が、結合したコード配列を介して終結シグナルまで進行する転写の開始を可能にすることを示唆する。
【００４８】
用語「核酸分子」及び「ヌクレオチド配列」とは、本明細書で用いられる場合には、各ヌクレオチドの３’及び５’末端がホスホジエステル結合によって結合している、ヌクレオチドの一本鎖又は二本鎖の共有結合した配列を指す。核酸分子は、デオキシリボヌクレオチド塩基又はリボヌクレオチド塩基を含んでよく、インビトロで合成によって、あるいは天然資源から単離することによって製造することができる。
【００４９】
本明細書において互換的に用いられる、用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、「アミノ酸配列」及び「タンパク質」とは、少なくとも２つのアミノ酸の結合から形成される分子を指す。１つのアミノ酸残基とその隣の残基との結合は、アミド結合であり、しばしば、ペプチド結合とも称される。ポリペプチドは、天然資源からの単離、組換え発現系での発現、化学合成又は酵素合成を含めた当技術分野で知られている適切な方法によって得ることができる。これらの用語は、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然のアミノ酸の人工的な化学的模倣物であるアミノ酸ポリマー、並びに、天然のアミノ酸ポリマー及び非天然のアミノ酸ポリマーにも適用することができる。
【００５０】
用語「アミノ酸」とは、本明細書で用いられる場合には、天然及び合成のアミノ酸、並びに、天然のアミノ酸と同様の方法で機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣物を指す。天然のアミノ酸は、遺伝コードにコードされているもの、並びに、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸及びＯ−ホスホセリンなどの後に改質されたアミノ酸である。アミノ酸類似体及び誘導体とは、天然のアミノ酸と同じ基本的な化学構造を有する化合物、すなわち、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド及びメチオニンメチルスルホニウムなど、水素、カルボキシル基、アミノ基、及びＲ基に結合する炭素を有する化合物を指しうる。このような類似体は、改質されたＲ基（例えばノルロイシン）又は改質されたペプチド骨格を有しうるが、天然のアミノ酸と同じ基本的な化学構造を保持している。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然のアミノ酸と同様の方式で機能する化合物を意味する。
【００５１】
本明細書において互換的に用いられる用語「単離」又は「精製」されるとは、それが天然に関連している成分から取り出された核酸、ポリペプチド、又は他の生物学的部分を指す。用語「単離」されたとは、分子が天然に存在するか、あるいは、同じ種類の他の生体高分子が実質的に存在しない状態で存在する、生物全体から分離及び個別化されたポリペプチドを指しうる。ポリヌクレオチドに関して、用語「単離」されたとは、自然界で通常それと関連している配列の全部又は一部を欠いている核酸分子；又は、自然界に存在するが、それに関連して異種配列を有する配列；又は、染色体から解離した分子を指しうる。
【００５２】
本明細書で用いられる場合、用語「組換え」は、核酸分子を説明するために用いることができ、また、その起源又は操作によって、それが自然界では関連しているポリヌクレオチドの全部又は一部と関連していない、ゲノム、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ウイルス、半合成又は合成を起源とするポリヌクレオチドを指す。
【００５３】
用語「融合」とは、本明細書で用いられる場合、遺伝的又は化学的方法によって異なるペプチド又はタンパク質セグメントを結合することを指し、該ペプチド又はタンパク質セグメントの結合末端は、互いに直接隣接していてもよく、あるいは、アミノ酸残基又は他の連結基などのリンカー又はスペーサー部分によって分離されていてもよい。
【００５４】
２．嗅覚受容体
本開示の主題は、本開示の方法に使用するための嗅覚受容体を提供する。本開示の嗅覚受容体は、ヒト、イヌ及びネコ嗅覚受容体などであるがそれらに限られない、哺乳動物の嗅覚受容体を含みうる。
【００５５】
ある特定の非限定的な実施形態では、嗅覚受容体は、例えば、ヒト嗅覚受容体ＨｓＯＲ１７．１．１１（ｈＯＲ３Ａ１）、ＨｓＯＲ１．４．８（ｈＯＲ６Ｐ１）、ＨｓＯＲ１１．３．１４（ｈＯＲ５１Ｅ１）、ＨｓＯＲ１１．３．４０（ｈＯＲ５１Ｌ１）、ＨｓＯＲ１４．１．２７（ｈＯＲ１１Ｈ６）、ＨｓＯＲ１１．１３．７（ｈＯＲ４Ｄ６）、ＨｓＯＲ１４．２．５（ｈＯＲ４Ｅ２）、ＨｓＯＲ１６．１．３（ｈＯＲ２Ｃ１）、ＨｓＯＲ１１．１３．６（ｈＯＲ５Ａ１）、ＨｓＯＲ１１．１８．３６（ｈＯＲ８Ｂ８）、又はそれらの組合せなどのヒト嗅覚受容体である。
【００５６】
ある特定の非限定的な実施形態では、嗅覚受容体は、例えば、イヌ嗅覚受容体ＣａｆａＯＲ９．２．９、ＣａｆａＯＲ３８．１．２１、ＣａｆａＯＲ２１．２．１５、ＣａｆａＯＲ２１．２．４３、ＣａｆａＯＲ１５．２．２０、ＣａｆａＯＲ１８．３．１１、ＣａｆａＯＲ１５．３．１、ＣａｆａＯＲ６．３．１、ＣａｆａＯＲ１８．３．１２、ＣａｆａＯＲ５．２．５、又はそれらの組合せなどのイヌ嗅覚受容体である。ある特定の非限定的な実施形態では、嗅覚受容体は、配列番号：６１〜２２６０に記載されるヌクレオチド配列又はアミノ酸配列を有するイヌ嗅覚受容体である。
【００５７】
ある特定の非限定的な実施形態では、嗅覚受容体は、例えば、ネコ嗅覚受容体Ｅ１：１３３４７０３０−１３３４７９７７、Ｆ１：６５１３４９０４−６５１３５８５８、Ｄ１：６２９５５８３９−６２９５６７９２、Ｄ１：６３３１２３２７−６３３１３２８９、Ｂ３：７２９０８２９５−７２９０９２８７、Ｄ１：１０５４８６５２８−１０５４８７４９３、Ｂ３：７４１１６９５５−７４１１７８９３、Ｅ３：４０２３７９０４−４０２３８８４２、Ｄ１：１０５４６２５５４−１０５４６３５１２、Ｄ１：２１２６６８２４−２１２６７７６８、又はそれらの組合せなどのネコ嗅覚受容体である。ある特定の非限定的な実施形態では、嗅覚受容体は、配列番号：２２６１〜３８０８に記載されるヌクレオチド配列又はアミノ酸配列を有するネコ嗅覚受容体である。
【００５８】
実施例で試験される嗅覚受容体が、それらの同義語及びグループの指定と共に、表１に列挙されている。
【００５９】
【表１】
2020501505.tif 000003
【００６０】
ある特定の実施形態では、本開示の方法に使用するための嗅覚受容体は、それらの断片（例えばそれらの機能的断片）及びそれらの変異体を含む、配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０に記載されるヌクレオチド配列、配列番号：４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０に記載されるアミノ酸配列、及び／又は配列番号：６１〜２２６０に記載されるヌクレオチド配列又はアミノ酸配列を含む、イヌ嗅覚受容体を包含する。
【００６１】
ある特定の実施形態では、本開示の方法に使用するための嗅覚受容体は、それらの断片（例えばそれらの機能的断片）及びそれらの変異体を含む、配列番号：２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０に記載されるヌクレオチド配列、配列番号：５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、又は６０に記載されるアミノ酸配列、及び／又は配列番号：２２６１〜３８０８に記載されるヌクレオチド配列又はアミノ酸配列を含む、ネコ嗅覚受容体を包含する。
【００６２】
ある特定の実施形態では、本開示の主題に使用するための嗅覚受容体は、それらの断片（例えばそれらの機能的断片）を含む、配列番号：１１〜３０のいずれか１つに対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％相同性であるヌクレオチド配列、及び／又は配列番号：６１〜３８０８に記載されるヌクレオチド配列にコードされた受容体を含みうる（相同性は、該用語が本明細書中で用いられる場合、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡなどの標準的なソフトウェアを使用して測定されうる）。
【００６３】
ある特定の実施形態では、本開示の方法に使用するための嗅覚受容体は、それらの断片（例えばそれらの機能的断片）を含む、配列番号：４１〜６０のいずれか１つに対して約３３〜９９％、約３４〜９９％、約３５〜９９％、約４０〜９９％、約４５〜９９％、約５０〜９９％、約５５〜９９％、約６０〜９９％、約６１〜９９％、約６５〜９９％、約７０〜９９％、約７２〜９９％、約７５〜９９％、約７９〜９９％、約８０〜９９％、約８４〜９９％、約８５〜９９％、約８７〜９９％、約８９〜９９％、約９０〜９９％、約９５〜９９％、又は約９７〜９９％相同性であるアミノ酸配列、及び／又は配列番号：６１〜３８０８に記載されるアミノ酸配列を含む受容体を含みうる（相同性は、該用語が本明細書中で用いられる場合、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡなどの標準的なソフトウェアを使用して測定されうる）。
【００６４】
ある特定の実施形態では、本開示の方法に使用するための嗅覚受容体は、それらの断片（例えばそれらの機能的断片）を含む、配列番号：４１〜６０のいずれか１つに対して少なくとも約３３％、３４％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６１％、６５％、７０％、７２％、７５％、７９％、８０％、８４％、８５％、８７％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％相同性であるアミノ酸配列、及び／又は配列番号：６１〜３８０８に記載されるアミノ酸配列を含む受容体を含みうる（相同性は、該用語が本明細書中で用いられる場合、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡなどの標準的なソフトウェアを使用して測定されうる）。
【００６５】
ある特定の実施形態では、嗅覚受容体は、配列番号：４１に記載されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９９、９８、９７、９６、９５、９０、８５、又は８０パーセント相同性の配列（相同性は、該用語が本明細書中で用いられる場合、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡなどの標準的なソフトウェアを使用して測定されうる）を含む、イヌＣａｆａＯＲ９．２．９であり、例えば、それらの断片（例えばそれらの機能的断片）を含む、配列番号：１１に記載される配列、又はそれに対して少なくとも９９、９８、９７、９６、９５、９０、８５、又は８０パーセント相同性の配列（相同性は、該用語が本明細書中で用いられる場合、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡなどの標準的なソフトウェアを使用して測定されうる）を含む核酸によってコードされている。
【００６６】
ある特定の実施形態では、嗅覚受容体は、配列番号：４２に記載されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９９、９８、９７、９６、９５、９０、８５、又は８０パーセント相同性の配列（相同性は、該用語が本明細書中で用いられる場合、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡなどの標準的なソフトウェアを使用して測定されうる）を含む、イヌＣａｆａＯＲ３８．１．２１であり、例えば、それらの断片（例えばそれらの機能的断片）を含む、配列番号：１２に記載される配列、又はそれに対して少なくとも９９、９８、９７、９６、９５、９０、８５、又は８０パーセント相同性の配列（相同性は、該用語が本明細書中で用いられる場合、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡなどの標準的なソフトウェアを使用して測定されうる）を含む核酸によってコードされている。
【００６７】
ある特定の実施形態では、嗅覚受容体は、配列番号：４３に記載されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９９、９８、９７、９６、９５、９０、８５、又は８０パーセント相同性の配列（相同性は、該用語が本明細書中で用いられる場合、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡなどの標準的なソフトウェアを使用して測定されうる）を含む、イヌＣａｆａＯＲ２１．２．１５であり、例えば、それらの断片（例えばそれらの機能的断片）を含む、配列番号：１３に記載される配列、又はそれに対して少なくとも９９、９８、９７、９６、９５、９０、８５、又は８０パーセント相同性の配列（相同性は、該用語が本明細書中で用いられる場合、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡなどの標準的なソフトウェアを使用して測定されうる）を含む核酸によってコードされている。
【００６８】
ある特定の実施形態では、嗅覚受容体は、配列番号：４４に記載されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９９、９８、９７、９６、９５、９０、８５、又は８０パーセント相同性の配列（相同性は、該用語が本明細書中で用いられる場合、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡなどの標準的なソフトウェアを使用して測定されうる）を含む、イヌＣａｆａＯＲ２１．２．４３であり、例えば、それらの断片（例えばそれらの機能的断片）を含む、配列番号：１４に記載される配列、又はそれに対して少なくとも９９、９８、９７、９６、９５、９０、８５、又は８０パーセント相同性の配列（相同性は、該用語が本明細書中で用いられる場合、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡなどの標準的なソフトウェアを使用して測定されうる）を含む核酸によってコードされている。
【００６９】
ある特定の実施形態では、嗅覚受容体は、配列番号：４５に記載されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９９、９８、９７、９６、９５、９０、８５、又は８０パーセント相同性の配列（相同性は、該用語が本明細書中で用いられる場合、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡなどの標準的なソフトウェアを使用して測定されうる）を含む、イヌＣａｆａＯＲ１５．２．２０であり、例えば、それらの断片（例えばそれらの機能的断片）を含む、配列番号：１５に記載される配列、又はそれに対して少なくとも９９、９８、９７、９６、９５、９０、８５、又は８０パーセント相同性の配列（相同性は、該用語が本明細書中で用いられる場合、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡなどの標準的なソフトウェアを使用して測定されうる）を含む核酸によってコードされている。
【００７０】
ある特定の実施形態では、嗅覚受容体は、配列番号：４６に記載されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９９、９８、９７、９６、９５、９０、８５、又は８０パーセント相同性の配列（相同性は、該用語が本明細書中で用いられる場合、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡなどの標準的なソフトウェアを使用して測定されうる）を含む、イヌＣａｆａＯＲ１８．３．１１であり、例えば、それらの断片（例えばそれらの機能的断片）を含む、配列番号：１６に記載される配列、又はそれに対して少なくとも９９、９８、９７、９６、９５、９０、８５、又は８０パーセント相同性の配列（相同性は、該用語が本明細書中で用いられる場合、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡなどの標準的なソフトウェアを使用して測定されうる）を含む核酸によってコードされている。
【００７１】
ある特定の実施形態では、嗅覚受容体は、配列番号：４７に記載されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９９、９８、９７、９６、９５、９０、８５、又は８０パーセント相同性の配列（相同性は、該用語が本明細書中で用いられる場合、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡなどの標準的なソフトウェアを使用して測定されうる）を含む、イヌＣａｆａＯＲ１５．３．１であり、例えば、それらの断片（例えばそれらの機能的断片）を含む、配列番号：１７に記載される配列、又はそれに対して少なくとも９９、９８、９７、９６、９５、９０、８５、又は８０パーセント相同性の配列（相同性は、該用語が本明細書中で用いられる場合、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡなどの標準的なソフトウェアを使用して測定されうる）を含む核酸によってコードされている。
【００７２】
ある特定の実施形態では、嗅覚受容体は、配列番号：４８に記載されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９９、９８、９７、９６、９５、９０、８５、又は８０パーセント相同性の配列（相同性は、該用語が本明細書中で用いられる場合、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡなどの標準的なソフトウェアを使用して測定されうる）を含む、イヌＣａｆａＯＲ６．３．１であり、例えば、それらの断片（例えばそれらの機能的断片）を含む、配列番号：１８に記載される配列、又はそれに対して少なくとも９９、９８、９７、９６、９５、９０、８５、又は８０パーセント相同性の配列（相同性は、該用語が本明細書中で用いられる場合、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡなどの標準的なソフトウェアを使用して測定されうる）を含む核酸によってコードされている。
【００７３】
ある特定の実施形態では、嗅覚受容体は、配列番号：４９に記載されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９９、９８、９７、９６、９５、９０、８５、又は８０パーセント相同性の配列（相同性は、該用語が本明細書中で用いられる場合、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡなどの標準的なソフトウェアを使用して測定されうる）を含む、イヌＣａｆａＯＲ１８．３．１２であり、例えば、それらの断片（例えばそれらの機能的断片）を含む、配列番号：１９に記載される配列、又はそれに対して少なくとも９９、９８、９７、９６、９５、９０、８５、又は８０パーセント相同性の配列（相同性は、該用語が本明細書中で用いられる場合、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡなどの標準的なソフトウェアを使用して測定されうる）を含む核酸によってコードされている。
【００７４】
ある特定の実施形態では、嗅覚受容体は、配列番号：５０に記載されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９９、９８、９７、９６、９５、９０、８５、又は８０パーセント相同性の配列（相同性は、該用語が本明細書中で用いられる場合、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡなどの標準的なソフトウェアを使用して測定されうる）を含む、イヌＣａｆａＯＲ５．２．５であり、例えば、それらの断片（例えばそれらの機能的断片）を含む、配列番号：２０に記載される配列、又はそれに対して少なくとも９９、９８、９７、９６、９５、９０、８５、又は８０パーセント相同性の配列（相同性は、該用語が本明細書中で用いられる場合、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡなどの標準的なソフトウェアを使用して測定されうる）を含む核酸によってコードされている。
【００７５】
ある特定の実施形態では、嗅覚受容体は、配列番号：５１に記載されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９９、９８、９７、９６、９５、９０、８５、又は８０パーセント相同性の配列（相同性は、該用語が本明細書中で用いられる場合、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡなどの標準的なソフトウェアを使用して測定されうる）を含む、ネコＥ１：１３３４７０３０−１３３４７９７７であり、例えば、それらの断片（例えばそれらの機能的断片）を含む、配列番号：２１に記載される配列、又はそれに対して少なくとも９９、９８、９７、９６、９５、９０、８５、又は８０パーセント相同性の配列（相同性は、該用語が本明細書中で用いられる場合、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡなどの標準的なソフトウェアを使用して測定されうる）を含む核酸によってコードされている。
【００７６】
ある特定の実施形態では、嗅覚受容体は、配列番号：５２に記載されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９９、９８、９７、９６、９５、９０、８５、又は８０パーセント相同性の配列（相同性は、該用語が本明細書中で用いられる場合、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡなどの標準的なソフトウェアを使用して測定されうる）を含む、ネコＦ１：６５１３４９０４−６５１３５８５８であり、例えば、それらの断片（例えばそれらの機能的断片）を含む、配列番号：２２に記載される配列、又はそれに対して少なくとも９９、９８、９７、９６、９５、９０、８５、又は８０パーセント相同性の配列（相同性は、該用語が本明細書中で用いられる場合、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡなどの標準的なソフトウェアを使用して測定されうる）を含む核酸によってコードされている。
【００７７】
ある特定の実施形態では、嗅覚受容体は、配列番号：５３に記載されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９９、９８、９７、９６、９５、９０、８５、又は８０パーセント相同性の配列（相同性は、該用語が本明細書中で用いられる場合、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡなどの標準的なソフトウェアを使用して測定されうる）を含む、ネコＤ１：６２９５５８３９−６２９５６７９２であり、例えば、それらの断片（例えばそれらの機能的断片）を含む、配列番号：２３に記載される配列、又はそれに対して少なくとも９９、９８、９７、９６、９５、９０、８５、又は８０パーセント相同性の配列（相同性は、該用語が本明細書中で用いられる場合、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡなどの標準的なソフトウェアを使用して測定されうる）を含む核酸によってコードされている。
【００７８】
ある特定の実施形態では、嗅覚受容体は、配列番号：５４に記載されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９９、９８、９７、９６、９５、９０、８５、又は８０パーセント相同性の配列（相同性は、該用語が本明細書中で用いられる場合、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡなどの標準的なソフトウェアを使用して測定されうる）を含む、ネコＤ１：６３３１２３２７−６３３１３２８９であり、例えば、それらの断片（例えばそれらの機能的断片）を含む、配列番号：２４に記載される配列、又はそれに対して少なくとも９９、９８、９７、９６、９５、９０、８５、又は８０パーセント相同性の配列（相同性は、該用語が本明細書中で用いられる場合、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡなどの標準的なソフトウェアを使用して測定されうる）を含む核酸によってコードされている。
【００７９】
ある特定の実施形態では、嗅覚受容体は、配列番号：５５に記載されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９９、９８、９７、９６、９５、９０、８５、又は８０パーセント相同性の配列（相同性は、該用語が本明細書中で用いられる場合、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡなどの標準的なソフトウェアを使用して測定されうる）を含む、ネコＢ３：７２９０８２９５−７２９０９２８７であり、例えば、それらの断片（例えばそれらの機能的断片）を含む、配列番号：２５に記載される配列、又はそれに対して少なくとも９９、９８、９７、９６、９５、９０、８５、又は８０パーセント相同性の配列（相同性は、該用語が本明細書中で用いられる場合、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡなどの標準的なソフトウェアを使用して測定されうる）を含む核酸によってコードされている。
【００８０】
ある特定の実施形態では、嗅覚受容体は、配列番号：５６に記載されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９９、９８、９７、９６、９５、９０、８５、又は８０パーセント相同性の配列（相同性は、該用語が本明細書中で用いられる場合、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡなどの標準的なソフトウェアを使用して測定されうる）を含む、ネコＤ１：１０５４８６５２８−１０５４８７４９３であり、例えば、それらの断片（例えばそれらの機能的断片）を含む、配列番号：２６に記載される配列、又はそれに対して少なくとも９９、９８、９７、９６、９５、９０、８５、又は８０パーセント相同性の配列（相同性は、該用語が本明細書中で用いられる場合、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡなどの標準的なソフトウェアを使用して測定されうる）を含む核酸によってコードされている。
【００８１】
ある特定の実施形態では、嗅覚受容体は、配列番号：５７に記載されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９９、９８、９７、９６、９５、９０、８５、又は８０パーセント相同性の配列（相同性は、該用語が本明細書中で用いられる場合、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡなどの標準的なソフトウェアを使用して測定されうる）を含む、ネコＢ３：７４１１６９５５−７４１１７８９３であり、例えば、それらの断片（例えばそれらの機能的断片）を含む、配列番号：２７に記載される配列、又はそれに対して少なくとも９９、９８、９７、９６、９５、９０、８５、又は８０パーセント相同性の配列（相同性は、該用語が本明細書中で用いられる場合、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡなどの標準的なソフトウェアを使用して測定されうる）を含む核酸によってコードされている。
【００８２】
ある特定の実施形態では、嗅覚受容体は、配列番号：５８に記載されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９９、９８、９７、９６、９５、９０、８５、又は８０パーセント相同性の配列（相同性は、該用語が本明細書中で用いられる場合、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡなどの標準的なソフトウェアを使用して測定されうる）を含む、ネコＥ３：４０２３７９０４−４０２３８８４２であり、例えば、それらの断片（例えばそれらの機能的断片）を含む、配列番号：２８に記載される配列、又はそれに対して少なくとも９９、９８、９７、９６、９５、９０、８５、又は８０パーセント相同性の配列（相同性は、該用語が本明細書中で用いられる場合、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡなどの標準的なソフトウェアを使用して測定されうる）を含む核酸によってコードされている。
【００８３】
ある特定の実施形態では、嗅覚受容体は、配列番号：５９に記載されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９９、９８、９７、９６、９５、９０、８５、又は８０パーセント相同性の配列（相同性は、該用語が本明細書中で用いられる場合、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡなどの標準的なソフトウェアを使用して測定されうる）を含む、ネコＤ１：１０５４６２５５４−１０５４６３５１２であり、例えば、それらの断片（例えばそれらの機能的断片）を含む、配列番号：２９に記載される配列、又はそれに対して少なくとも９９、９８、９７、９６、９５、９０、８５、又は８０パーセント相同性の配列（相同性は、該用語が本明細書中で用いられる場合、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡなどの標準的なソフトウェアを使用して測定されうる）を含む核酸によってコードされている。
【００８４】
ある特定の実施形態では、嗅覚受容体は、配列番号：６０に記載されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９９、９８、９７、９６、９５、９０、８５、又は８０パーセント相同性の配列（相同性は、該用語が本明細書中で用いられる場合、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡなどの標準的なソフトウェアを使用して測定されうる）を含む、ネコＤ１：２１２６６８２４−２１２６７７６８であり、例えば、それらの断片（例えばそれらの機能的断片）を含む、配列番号：３０に記載される配列、又はそれに対して少なくとも９９、９８、９７、９６、９５、９０、８５、又は８０パーセント相同性の配列（相同性は、該用語が本明細書中で用いられる場合、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡなどの標準的なソフトウェアを使用して測定されうる）を含む核酸によってコードされている。
【００８５】
ある特定の実施形態では、相同性は、２つの配列間のパーセント同一性として記載される。２つのアミノ酸配列又は２つのヌクレオチド配列のパーセント同一性は、最適に比較する目的で配列を位置合わせし（例えば、配列との最良の位置合わせのために第１の配列にギャップを導入してもよい）、対応する位置においてアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較することによって決定することができる。パーセント同一性は、比較される配列における同一のアミノ酸残基又はヌクレオチドの数によって決定することができる（例えば、％同一性＝（同一の位置の数／位置の総数）×１００）。
【００８６】
ある特定の実施形態では、嗅覚受容体の断片（例えば、それらの機能的断片）は、少なくとも約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１２５、約１５０、約１７５、約２００、約２５０、約３００又はそれより多いアミノ酸残基、若しくはそれらの中間の値又は範囲を含む。ある特定の実施形態では、断片は、約５〜約１０、約５〜約２０、約５〜約３０、約５〜約４０、約５〜約５０、約１０〜約５０、約１０〜約６０、約１０〜約７０、約１０〜約８０、約１０〜約９０、約１０〜約１００、約２０〜約１００、約５０〜約１００、約５０〜約１５０、約５０〜約２００、約５０〜約２５０、約１００〜約２５０、又は約１００〜約３００のアミノ酸残基、又はそれらの任意の中間値を含む。
【００８７】
２つの配列間のパーセント同一性の決定は、当業者に知られている数学的アルゴリズムを使用して決定することができる。２つの配列を比較する数学的アルゴリズムの非限定的な例は、それらの開示全体がここに参照することによって本明細書に組み込まれる、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877にあるように修正された、Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268のアルコ゛リス゛ムである。Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラムには、このようなアルゴリズムが組み込まれている。例えば、スコア＝１００、語長＝１２のＮＢＬＡＳＴプログラムを用いてＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を行うことにより、本発明にかかるヌクレオチド配列に対するヌクレオチド配列相同体を得ることができる。例えば、スコア＝５０、語長＝３のＸＢＬＡＳＴプログラムを用いてＢＬＡＳＴタンパク質検索を行うことにより、本発明にかかるアミノ酸配列に対するアミノ酸配列相同体を得ることができる。比較の目的でギャップ付きアライメントを取得するため、その開示の全体がここに参照することによって本明細書に組み込まれる、Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402に記載されるようにＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを利用することができる。あるいは、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔを使用して、分子間の距離関係を検出する反復検索を行うことができる。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ、及びＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用することができる。http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照。配列の比較に用いられる数学的アルゴリズムのさらなる非限定的な例は、その開示の全体がここに参照することによって本明細書に組み込まれる、Myers and Miller, CABIOS (1989)のアルゴリズムである。ＣＧＣ配列アライメントソフトウェアパッケー
ジの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）は、このようなアルゴリズムを組み込んでいる。当技術分野で知られている配列分析のためのアルゴリズムの他の非限定的な例としては、それらの開示全体がここに参照することによって本明細書に組み込まれる、Torellis and Robotti (1994) Comput. Appl. Biosci., 10:3-5に記載されるＡＤＶＡＮＣＥ及びＡＤＡＭ；及び、Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-8に記載されるＦＡＳＴＡが挙げられる。ＦＡＳＴＡ内では、ｋｔｕｐは、検索の感度及び速度を設定する制御オプションである。
【００８８】
ある特定の実施形態では、本開示の主題は、単離又は精製された嗅覚受容体及び／又は変異体、並びにそれらの断片の使用を提供する。本開示の主題はまた、配列変異体の使用も包含する。ある特定の実施形態では、変異は、嗅覚受容体のヌクレオチド配列のコード領域及び非コード領域のいずれかまたは両方において生じうる。変異体は、生物の同じ遺伝子座にコードされた実質的に相同のタンパク質、すなわち対立遺伝子変異体を含みうる。変異体はまた、例えば、ヒト、イヌ及びネコなど、生物の他の遺伝子座に由来するが、嗅覚受容体に対して実質的な相同性を有するタンパク質、すなわち、相同体も包含する。変異体はまた、嗅覚受容体に対して実質に相同であるが、別の生物に由来するタンパク質、すなわち、オーソログも含みうる。変異体はまた、化学合成によって生成された、嗅覚受容体に対して実質に相同であるタンパク質も含みうる。変異体はまた、組換え方法によって生成された、嗅覚受容体に対して実質に相同であるタンパク質も含みうる。
【００８９】
オーソログ、相同体、及び対立遺伝子変異体は、当技術分野でよく知られている方法を使用して特定することができる。これらの変異体は、配列番号：１１〜３０のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも約６０〜６５％、約６５〜７０％、約７０〜７５、約８０〜８５％、約９０〜９５％、約９５〜９９％、又はそれを超えて相同性である、受容体をコードするヌクレオチド配列、若しくは配列番号：６１〜３８０８のヌクレオチド配列のいずれか１つ、若しくはそれらの断片を含みうる。このような核酸分子は、ストリンジェントな条件下で、配列番号：１１〜３０のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又は配列番号：６１〜３８０８のヌクレオチド配列のいずれか１つ、若しくはそれらの断片にハイブリダイズ可能であると容易に特定することができる。ある特定の実施形態では、アミノ酸配列が、配列番号：４１〜６０のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも約６０〜６５％、約６５〜７０％、約７０〜７５、約８０〜８５％、約９０〜９５％、約９５〜９９％、又はそれを超えて相同性であるか、又は配列番号：６１〜３８０８のアミノ酸配列のいずれか１つ、若しくはそれらの断片である場合に、２つのポリペプチド（又はそれらの領域）は、実質的に相同性である。実質的に相同のアミノ酸配列は、本開示の主題によれば、ストリンジェントな条件下で、配列番号：４１〜６０のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又は配列番号：６１〜３８０８のアミノ酸配列のいずれか１つの核酸配列又はそれらの一部分にハイブリダイズする核酸配列によってコードされる。
【００９０】
本開示の主題の方法において使用するための嗅覚受容体は、受容体の生物学的活性を実質的に改変しないが、アミノ酸残基が追加、削除、又は置換された嗅覚受容体（変異体）を含む。生物学的活性に影響を与えずに改変することができる、嗅覚受容体の個々の部位又は領域は、例えば、嗅覚受容体細胞外ドメインの構造を調べることによって決定することができる。代替的に及び／又は追加的に、アラニンスキャンニング突然変異誘発によるアミノ酸置換を許容するであろう受容体のこれらの領域を経験的に決定してもよい（その開示全体が参照することによって本明細書に組み込まれる、Cunningham et al., Science 244, 1081-1085 (1989)）。アラニンスキャンニング突然変異誘発法では、選択されたアミノ酸残基が、その生物活性における効果を決定するために、中性アミノ酸（例えばアラニン）で個々に置換される。
【００９１】
保存アミノ酸の変化は、ポリペプチドの構造及び／又は機能を混乱させる可能性が最も低いと一般的に認識されている。したがって、本開示の主題は、嗅覚受容体内に１つ以上の保存アミノ酸の変化を包含する。保存アミノ酸の変化は、該して、１つのアミノ酸を、構造及び／又は機能が類似している別のもの（例えば、側鎖の大きさ、電荷、及び形状が似ているアミノ酸）で置換することを包含する。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリは、当技術分野で定義されている。これらのファミリには、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、無極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。ある特定の実施形態では、嗅覚受容体内の１つ以上のアミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリ由来の他のアミノ酸残基と置き換えることができ、本明細書に記載される機能的アッセイを使用して、保持機能について、改変されたタンパク質を試験することができる。部位特異的突然変異誘発及びＰＣＲ介在性突然変異誘発など、当技術分野で知られている標準的な技術によって、本開示の嗅覚受容体に改変を導入することができる。このような置換によって生物活性の保持がもたらされる場合、より実質的な変更を導入することができ、及び／又は、他の追加／削除を行って、結果的に得られる生成物をスクリーニングすることができる。ある特定の実施形態では、削除又は追加は、５〜１０の残基、代替的に、２〜５のアミノ酸残基、若しくは１〜２の残基、及びそれらの間の値でありうる。
【００９２】
本開示の主題はまた、それらの断片（例えばそれらの機能的断片）を含めて嗅覚受容体をコードする、単離された核酸も提供する。本開示の嗅覚受容体は、ヒト、イヌ及びネコ嗅覚受容体などであるがそれらに限られない、哺乳動物の嗅覚受容体を含みうる。その単離された核酸は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）でありうる。
【００９３】
ある特定の非限定的な実施形態では、嗅覚受容体は、イヌ嗅覚受容体、例えば、それらの断片（例えばそれらの機能的断片）又はそれらの組合せを含めて、イヌ嗅覚受容体ＣａｆａＯＲ９．２．９、ＣａｆａＯＲ３８．１．２１、ＣａｆａＯＲ２１．２．１５、ＣａｆａＯＲ２１．２．４３、ＣａｆａＯＲ１５．２．２０、ＣａｆａＯＲ１８．３．１１、ＣａｆａＯＲ１５．３．１、ＣａｆａＯＲ６．３．１、ＣａｆａＯＲ１８．３．１２、ＣａｆａＯＲ５．２．５である。ある特定の実施形態では、嗅覚受容体は、それらの断片（例えばそれらの機能的断片）を含めて、配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０に記載されるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、嗅覚受容体は、それらの断片（例えばそれらの機能的断片）を含めて、配列番号：６１〜２２６０に記載されるヌクレオチド配列を含む。
【００９４】
ある特定の非限定的な実施形態では、嗅覚受容体は、それらの断片（例えばそれらの機能的断片）又はそれらの組合せを含む、ネコ嗅覚受容体、例えば、ネコ嗅覚受容体Ｅ１：１３３４７０３０−１３３４７９７７、Ｆ１：６５１３４９０４−６５１３５８５８、Ｄ１：６２９５５８３９−６２９５６７９２、Ｄ１：６３３１２３２７−６３３１３２８９、Ｂ３：７２９０８２９５−７２９０９２８７、Ｄ１：１０５４８６５２８−１０５４８７４９３、Ｂ３：７４１１６９５５−７４１１７８９３、Ｅ３：４０２３７９０４−４０２３８８４２、Ｄ１：１０５４６２５５４−１０５４６３５１２、Ｄ１：２１２６６８２４−２１２６７７６８などである。ある特定の実施形態では、嗅覚受容体は、それらの断片（例えばそれらの機能的断片）を含めて、配列番号：２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０に記載されるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、嗅覚受容体は、それらの断片（例えばそれらの機能的断片）を含めて、配列番号：２２６１〜３８０８に記載されるヌクレオチド配列を含む。
【００９５】
本開示の主題はまた、嗅覚受容体又はそれらの断片を含む融合タンパク質も提供する。ある特定の実施形態では、本開示の主題は、嗅覚受容体の融合タンパク質、又はそれらの機能的断片、及び免疫グロブリン重鎖定常領域を提供する。ある特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質は、検出マーカー、担体などの官能基、標識、安定化配列、又は嗅覚受容体アゴニストの結合を検出可能な機構を含みうる。標識の非限定的な実施形態としては、当技術分野で知られているＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓタグ、ＭＹＣタグ、マルトース結合タンパク質及び他のものが挙げられる。本開示の主題はまた、このような融合タンパク質をコードする核酸、融合タンパク質をコードする核酸を含むベクター、及びこのような核酸又はベクターを含む宿主細胞も提供する。ある特定の実施形態では、嗅覚受容体のアミノ末端（Ｎ末端）又は嗅覚受容体のカルボキシ末端（Ｃ末端）において、融合がなされうる。
【００９６】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される嗅覚受容体は、例えば本開示の主題の方法に用いられる場合に、配列のＮ末端及び／又はＣ末端に追加のアミノ酸を含みうる。ある特定の実施形態では、追加のアミノ酸は、スクリーニングの目的でポリペプチドの固定化を補助してもよく、あるいは、生物学的活性の検出を容易にするために、ポリペプチドを、上記開示される融合タンパク質の一部とすることもできる。
【００９７】
３．嗅覚受容体調節化合物を特定する方法
本開示は、さらに、嗅覚受容体の活性及び／又は発現を調節する化合物を特定する方法を提供する。例えば、限定するわけではないが、モジュレータは、アゴニスト（例えば、完全な又は部分的なアゴニスト）、又はアンタゴニスト、又はインバースアゴニスト、又はアロステリックモジュレータでありうる。本開示の主題は、上記開示されるインシリコ及びインビトロで嗅覚受容体の活性及び／又は発現を調節する化合物を特定する方法を提供する。
【００９８】
３．１  インシリコでの方法
本開示の主題は、さらに、嗅覚受容体と潜在的に相互作用することができる、及び／又は、嗅覚受容体の活性及び／又は発現を調節することができる、インシリコで化合物を特定する方法を提供する。
【００９９】
ある特定の実施形態では、本方法は、嗅覚受容体の３次元構造（３Ｄ）を予測するステップ、及び該予測した３次元構造（３Ｄ）を、推定される嗅覚受容体調節化合物（すなわち試験化合物）を使用してスクリーニングするステップを含みうる。本方法は、さらに、推定される化合物と受容体のアミノ酸との潜在的な相互作用を解析することによって、該推定される化合物が受容体の結合部位と相互作用するかどうかを予測するステップを含みうる。本方法は、さらに、化合物の３Ｄ構造が受容体の３Ｄ構造の結合部位内にフィットするかどうかを決定することによって、嗅覚受容体に結合する、及び／又は、嗅覚受容体の生物学的活性を調節する試験化合物を特定するステップを含みうる。
【０１００】
ある特定の実施形態では、本開示の方法に使用するための嗅覚受容体は、イヌ受容体ＣａｆａＯＲ９．２．９、ＣａｆａＯＲ３８．１．２１、ＣａｆａＯＲ２１．２．１５、ＣａｆａＯＲ２１．２．４３、ＣａｆａＯＲ１５．２．２０、ＣａｆａＯＲ１８．３．１１、ＣａｆａＯＲ１５．３．１、ＣａｆａＯＲ６．３．１、ＣａｆａＯＲ１８．３．１２、ＣａｆａＯＲ５．２．５、又はそれらの組合せでありうる。ある特定の非限定的な実施形態では、嗅覚受容体は、配列番号：６１〜２２６０に記載されるイヌ嗅覚受容体である。
【０１０１】
ある特定の実施形態では、本開示の方法に使用するための嗅覚受容体は、ネコ受容体Ｅ１：１３３４７０３０−１３３４７９７７、Ｆ１：６５１３４９０４−６５１３５８５８、Ｄ１：６２９５５８３９−６２９５６７９２、Ｄ１：６３３１２３２７−６３３１３２８９、Ｂ３：７２９０８２９５−７２９０９２８７、Ｄ１：１０５４８６５２８−１０５４８７４９３、Ｂ３：７４１１６９５５−７４１１７８９３、Ｅ３：４０２３７９０４−４０２３８８４２、Ｄ１：１０５４６２５５４−１０５４６３５１２、及びＤ１：２１２６６８２４−２１２６７７６８、又はそれらの組合せでありうる。ある特定の非限定的な実施形態では、嗅覚受容体は、配列番号：２２６１〜３８０８に記載されるネコ嗅覚受容体である。
【０１０２】
他の実施態様では、本開示の方法に使用するための嗅覚受容体は、配列番号：４１〜６０のいずれか１つのアミノ酸配列、又は配列番号：６１〜３８０８のアミノ酸配列のいずれか１つ、若しくはそれらの断片又は変異体を有しうる。ある特定の実施形態では、本開示の主題に使用するための嗅覚受容体は、配列番号：４１〜６０のいずれか１つに対して少なくとも約３３％、３４％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６１％、６５％、７０％、７２％、７５％、７９％、８０％、８４％、８５％、８７％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号：６１〜３８０８のアミノ酸配列のいずれか１つ、若しくはそれらの断片又は変異体を含む受容体を含みうる。ある特定の実施形態では、本開示の方法に使用するための嗅覚受容体は、配列番号：１１〜３０のいずれか１つのヌクレオチド配列、又は配列番号：６１〜３８０８のヌクレオチド配列のいずれか１つ、若しくはそれらの断片又は変異体にコードされうる。ある特定の実施形態では、本開示の主題に使用するための嗅覚受容体は、配列番号：１１〜３０のいずれか１つに対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号：６１〜３８０８のヌクレオチド配列のいずれか１つ、若しくはそれらの断片又は変異体にコードされた受容体を含みうる。
【０１０３】
本開示の方法を使用して試験することができる化合物（例えば、潜在的な嗅覚受容体モジュレータ）の非限定的な例としては、当技術分野で知られているペプチド、塩、アミノ酸及び匂い化合物、例えばアンドロステノンなど、任意の小化合物、又は任意の生物学的実体が挙げられる。ある特定の実施形態では、試験化合物は、小化学分子でありうる。
【０１０４】
ある特定の実施形態では、嗅覚受容体の構造モデルは、他のＧＰＣＲの結晶構造を相同性モデリングのテンプレートとして使用して、構築することができる。例えば、限定しはないが、ＧＰＣＲの結晶構造を使用して、構造モデルを生成することができる。ある特定の実施形態では、嗅覚受容体の構造モデルは、ＧＰＣＲの知られている結晶構造又は知られている結晶構造の組合せに基づきうる。（例えば、ここに参照することによってその全体が取り込まれる、Lee et al., Eur J Pharmacol. 2015 May 14. pii: S0014-2999(15)30012-1参照）。ある特定の実施形態では、嗅覚受容体の構造モデルは、結晶質データバンク（ＰＤＢ）から得られるβ２アドレナリン受容体３ＳＮ６の結晶構造に基づいて生成することができる。（例えば、ここに参照することによってその全体が取り込まれる、Rasmussen et al., Nature. 2011 Jul 19;477(7366):549-55参照）。ある特定の実施形態では、嗅覚受容体の７回膜貫通ドメイン（７ＴＭ）の構造モデルは、ＰＤＢから得られる既存のＧＰＣＲ結晶構造３ＳＮ６の結晶構造に基づいて生成することができる。ある特定の実施形態では、嗅覚受容体の構造モデルは、Ａｃｃｅｌｒｙｓ社のＤｉｓｃｏｖｅｒｙＳｔｕｄｉｏ（ＤＳ）のプログラム一式の一部である、Ｉ−ＴＡＳＳＥＲのプログラム一式（ここに参照することによってその全体が取り込まれる、Yang et al., Nat Methods, 12: 7-8 (2015)）及びＭｏｄｅｌｌｅｒ（ここに参照することによってその全体が取り込まれる、Eswar et al., Curr Protoc Bioinformatics, 15: 5.6.1-5.6.30 (2006)）を使用して構築することができる（ＤｉｓｃｏｖｅｒｙＳｔｕｄｉｏ（ＤＳ）は、Ａｃｃｅｌｒｙｓ社の一連の対話型モデリング及びシミュレーションプログラムである）。
【０１０５】
当技術分野で知られている任意の適切なモデリング・ソフトウェアを使用することができる。ある特定の実施形態では、Ｍｏｄｅｌｌｅｒソフトウェアパッケージを使用して、３次元タンパク質構造を生成することができる。
【０１０６】
ある特定の実施形態では、嗅覚受容体に結合する化合物を特定するインシリコの方法は、試験化合物が、本明細書に記載されるように、嗅覚受容体結合ポケットの１つ以上のアミノ酸と相互作用するかどうかを決定するステップを含む。
【０１０７】
本明細書に開示されるインビトロ及びインビボの方法を使用して、本開示のインシリコの方法によって特定される化合物をさらに試験してもよい。
【０１０８】
３．２  嗅覚受容体膜貫通化合物結合部位
本出願は、例えば、イヌ又はネコ嗅覚受容体などの嗅覚受容体の活性を調節する化合物をスクリーニングする方法を提供し、該化合物は、嗅覚受容体の１つ以上のアミノ酸と相互作用する。ある特定の実施形態では、嗅覚受容体の結合部位は、受容体の７ＴＭドメイン内にアミノ酸を含んでおり、本明細書に記載されるように、インシリコ・モデリングを使用して、受容体の相互作用地図を生成することによって特定することができる。１つの非限定的な例では、７ＴＭ相互作用地図内のアミノ酸の存在とは、残基がリガンド結合環境の近くにあり、リガンドと相互作用することを意味する。
【０１０９】
ある特定の実施形態では、化合物と本明細書に記載される嗅覚受容体の１つ以上のアミノ酸との相互作用には、１つ以上の水素結合、共有結合、非共有結合、塩橋、物理的相互作用、及びそれらの組合せが含まれる。相互作用はまた、当技術分野で知られているリガンド受容体相互作用の任意の相互作用特徴であってもよい。このような相互作用は、例えば、部位特異的突然変異誘発、Ｘ線結晶学、ｘ−ｒａｙ又は他の分光法、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、架橋性評価、質量分析又は電気泳動、低温電子顕微鏡法、既知のアゴニストに基づく置換アッセイ、構造決定及びそれらの組合せなどによって決定することができる。ある特定の実施形態では、相互作用は、例えば、分子ドッキング、分子モデリング、分子シミュレーション、又は当業者に知られている他の手段を使用して、例えば、本明細書に記載されるネコ又はイヌの嗅覚受容体結合ポケットに化合物をドッキングするなどの理論的手段によって、インシリコで決定される。
【０１１０】
ある特定の実施形態では、７ＴＭ相互作用地図内のアミノ酸とリガンドとの相互作用は、ｐｉ−π相互作用である。
【０１１１】
ある特定の実施形態では、７ＴＭ相互作用地図内のアミノ酸とリガンドとの相互作用は、水素結合  相互作用である。
【０１１２】
ある特定の実施形態では、７ＴＭ相互作用地図内のアミノ酸とリガンドとの相互作用は、疎水性相互作用である。
【０１１３】
ある特定の実施形態では、７ＴＭ相互作用地図内のアミノ酸とリガンドとの相互作用は、ファンデルワールス相互作用である。
【０１１４】
ある特定の実施形態では、７ＴＭ相互作用地図内のアミノ酸は、アミノ酸が水素結合供与体及び／又は受容体としてリガンドと相互作用する、極性アミノ酸である。
【０１１５】
ある特定の実施形態では、化合物と本明細書に記載される嗅覚受容体の１つ以上のアミノ酸との相互作用は、１つ以上の水素結合、共有結合、非共有結合、塩橋、物理的相互作用、及びそれらの組合せを含みうる。相互作用はまた、当技術分野で知られているリガンド受容体相互作用の任意の相互作用特徴であってもよい。このような相互作用は、例えば、部位特異的突然変異誘発、Ｘ線結晶学、ｘ−ｒａｙ又は他の分光法、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、架橋性評価、質量分析又は電気泳動、低温電子顕微鏡法、既知のアゴニストに基づく置換アッセイ、構造決定、及びそれらの組合せによって決定することができる。ある特定の実施形態では、相互作用は、例えば、分子ドッキングを使用する嗅覚受容体結合ポケットへの化合物のドッキング、分子モデリング、分子シミュレーション、又は当業者に知られている他の手段など、理論的手段によって、インシリコで決定される。
【０１１６】
ある特定の実施形態では、嗅覚受容体は、イヌ嗅覚受容体であり、例えば、限定はしないが、ＣａｆａＯＲ９．２．９、ＣａｆａＯＲ３８．１．２１、ＣａｆａＯＲ２１．２．１５、ＣａｆａＯＲ２１．２．４３、ＣａｆａＯＲ１５．２．２０、ＣａｆａＯＲ１８．３．１１、ＣａｆａＯＲ１５．３．１、ＣａｆａＯＲ６．３．１、ＣａｆａＯＲ１８．３．１２、又はＣａｆａＯＲ５．２．５である。ある特定の非限定的な実施形態では、嗅覚受容体は、配列番号：６１〜２２６０に記載されるイヌ嗅覚受容体である。
【０１１７】
ある特定の実施形態では、嗅覚受容体は、ネコ嗅覚受容体であり、例えば、限定はしないが、、Ｅ１：１３３４７０３０−１３３４７９７７、Ｆ１：６５１３４９０４−６５１３５８５８、Ｄ１：６２９５５８３９−６２９５６７９２、Ｄ１：６３３１２３２７−６３３１３２８９、Ｂ３：７２９０８２９５−７２９０９２８７、Ｄ１：１０５４８６５２８−１０５４８７４９３、Ｂ３：７４１１６９５５−７４１１７８９３、Ｅ３：４０２３７９０４−４０２３８８４２、Ｄ１：１０５４６２５５４−１０５４６３５１２、又はＤ１：２１２６６８２４−２１２６７７６８である。ある特定の非限定的な実施形態では、嗅覚受容体は、配列番号：２２６１〜３８０８に記載されるネコ嗅覚受容体である。
【０１１８】
ある特定の実施形態では、化合物は、例えば、１つ、２つ、３つ、又はそれより多くの相互作用など、本明細書に記載される相互作用のいずれかの組合せに従って、本明細書に記載される１つ以上の嗅覚受容体と相互作用する。
【０１１９】
ある特定の実施形態では、化合物は、本明細書に記載される受容体の少なくとも１つと結合する。ある特定の実施形態では、化合物は、本明細書に記載される受容体のうちの１つのみと選択的に結合する。
【０１２０】
一実施形態では、嗅覚受容体は、イヌＣａｆａＯＲ９．２．９である。ある特定の実施形態では、ＣａｆａＯＲ９．２．９のリリアールのインシリコ・モデリングに例示されるように、例えば、水素結合又は塩橋の相互作用によって化合物と相互作用するアミノ酸残基は、ＣａｆａＯＲ９．２．９残基Ｇｌｎ１０３を含む（図２）。代替的に又は加えて、ある特定の実施形態では、ＣａｆａＯＲ９．２．９のリリアールのインシリコ・モデリングに例示されるように、例えば、極性、環スタッキング、塩橋、水素結合、π相互作用、荷電相互作用、ファンデルワールス相互作用、又は疎水性相互作用によって化合物と相互作用するアミノ酸残基は、単独で又は上記Ｇｌｎ１０３に対する相互作用と組み合わせて、ＣａｆａＯＲ９．２．９残基Ｌｅｕ１０４、Ｌｙｓ２７５、Ａｒｇ８７、Ｖａｌ８１、Ｍｅｔ８４、Ｖａｌ２７９、Ｔｙｒ２６２、Ｍｅｔ２０９、Ｇｌｙ２５８、Ｖａｌ１１１、Ｔｙｒ２５５、Ｔｈｒ２８２、Ｐｈｅ１０７及び／又はＴｈｒ８０を含む（図２）。代替的に又は加えて、ある特定の実施形態では、ＣａｆａＯＲ９．２．９のリリアールのインシリコ・モデリングに例示されるように、例えば、極性、環スタッキング、塩橋、水素結合、π相互作用、又は荷電相互作用、ファンデルワールス、疎水性相互作用、又は他の相互作用によって化合物と相互作用するアミノ酸残基は、ＣａｆａＯＲ９．２．９残基Ｇｌｎ１０３、Ｌｅｕ１０４、Ｌｙｓ２７５、Ａｒｇ８７、Ｖａｌ８１、Ｍｅｔ８４、Ｖａｌ２７９、Ｔｙｒ２６２、Ｍｅｔ２０９、Ｇｌｙ２５８、Ｖａｌ１１１、Ｔｙｒ２５５、Ｔｈｒ２８２、Ｐｈｅ１０７及びＴｈｒ８０のうちの１つ、２つ、又は３つ以上を含む（図２）。
【０１２１】
一実施形態では、嗅覚受容体は、イヌＣａｆａＯＲ３８．１．２１である。ある特定の実施形態では、ＣａｆａＯＲ３８．１．２１のｐ−アニスアルデヒドのインシリコ・モデリングに例示されるように、例えば、水素結合又は塩橋の相互作用によって化合物と相互作用するアミノ酸残基は、ＣａｆａＯＲ３８．１．２１残基Ｌｙｓ２７３を含む（図３）。代替的に又は加えて、ある特定の実施形態では、単独で又は上記Ｌｙｓ２７３に対する相互作用と組み合わせて、ＣａｆａＯＲ３８．１．２１のｐ−アニスアルデヒドのインシリコ・モデリングに例示されるように、例えば、極性、環スタッキング、塩橋、水素結合、π相互作用、荷電相互作用、ファンデルワールス相互作用、又は疎水性相互作用などによって化合物と相互作用するアミノ酸残基は、ＣａｆａＯＲ３８．１．２１残基Ｔｈｒ７８、Ｌｅｕ８２、Ｔｙｒ２６０、Ｔｈｒ２５６、Ｔｙｒ２５３及び／又はＰｈｅ１０５を含む（図３）。代替的に又は加えて、ある特定の実施形態では、ＣａｆａＯＲ３８．１．２１のｐ−アニスアルデヒドのインシリコ・モデリングに例示されるように、例えば、極性、環スタッキング、塩橋、水素結合、π相互作用、又は荷電相互作用、ファンデルワールス、疎水性相互作用、又は他の相互作用によって化合物と相互作用するアミノ酸残基は、ＣａｆａＯＲ３８．１．２１残基Ｌｙｓ２７３、Ｔｈｒ７８、Ｌｅｕ８２、Ｔｙｒ２６０、Ｔｈｒ２５６、Ｔｙｒ２５３及びＰｈｅ１０５のうちの１つ、２つ、又は３つ以上を含む（図３）。
【０１２２】
一実施形態では、嗅覚受容体は、イヌＣａｆａＯＲ２１．２．１５である。ある特定の実施形態では、ＣａｆａＯＲ２１．２．１５の（＋）−メントールのインシリコ・モデリングに例示されるように、例えば、極性、環スタッキング、塩橋、水素結合、π相互作用、荷電相互作用、ファンデルワールス相互作用、又は疎水性相互作用によって化合物と相互作用するアミノ酸残基は、ＣａｆａＯＲ２１．２．１５残基Ｍｅｔ８３、Ｈｉｓ１０７、Ｉｌｅ１０６、Ｌｅｕ１８２、Ａｓｎ１９７、Ｇｌｙ２０１、Ｖａｌ２０４、Ｓｅｒ２６０、Ｐｈｅ２５６及び／又はＬｅｕ２７３を含む（図４）。代替的に又は加えて、ある特定の実施形態では、ＣａｆａＯＲ２１．２．１５の（＋）−メントールのインシリコ・モデリングに例示されるように、例えば、極性、環スタッキング、塩橋、水素結合、π相互作用、又は荷電相互作用、ファンデルワールス、疎水性相互作用、又は他の相互作用によって化合物と相互作用するアミノ酸残基は、ＣａｆａＯＲ２１．２．１５残基Ｍｅｔ１０３、Ｍｅｔ８３、Ｈｉｓ１０７、Ｉｌｅ１０６、Ｌｅｕ１８２、Ａｓｎ１９７、Ｇｌｙ２０１、Ｖａｌ２０４、Ｓｅｒ２６０、Ｐｈｅ２５６及びＬｅｕ２７３のうちの１つ、２つ、又は３つ以上を含む（図４）。
【０１２３】
一実施形態では、嗅覚受容体は、イヌＣａｆａＯＲ２１．２．４３である。ある特定の実施形態では、ＣａｆａＯＲ２１．２．４３のアンドロスタジエノンのインシリコ・モデリングに例示されるように、例えば、極性、環スタッキング、塩橋、水素結合、π相互作用、荷電相互作用、ファンデルワールス相互作用、又は疎水性相互作用によって化合物と相互作用するアミノ酸残基は、ＣａｆａＯＲ２１．２．４３残基Ｍｅｔ８０、Ｍｅｔ８８、Ｌｅｕ１０８、Ｉｌｅ１１１、Ｈｉｓ１１２、Ｔｈｒ１１５、Ｖａｌ２０９、Ｖａｌ２１０、Ｔｈｒ２１３、Ｌｅｕ２１４、Ｖａｌ２６２、Ｉｌｅ２６３、Ｓｅｒ２６６、Ｉｌｅ２８１、Ａｌａ２８４、及び／又はＬｅｕ２８８を含む（図５）。代替的に又は加えて、ある特定の実施形態では、ＣａｆａＯＲ２１．２．４３のアンドロスタジエノンのインシリコ・モデリングに例示されるように、例えば、極性、環スタッキング、塩橋、水素結合、π相互作用、又は荷電相互作用、ファンデルワールス、疎水性相互作用、又は他の相互作用によって化合物と相互作用するアミノ酸残基は、ＣａｆａＯＲ２１．２．４３残基Ａｓｐ２８５、Ｍｅｔ８０、Ｍｅｔ８８、Ｌｅｕ１０８、Ｉｌｅ１１１、Ｈｉｓ１１２、Ｔｈｒ１１５、Ｖａｌ２０９、Ｖａｌ２１０、Ｔｈｒ２１３、Ｌｅｕ２１４、Ｖａｌ２６２、Ｉｌｅ２６３、Ｓｅｒ２６６、Ｉｌｅ２８１、Ａｌａ２８４、及びＬｅｕ２８８のうちの１つ、２つ、又は３つ以上を含む（図５）。
【０１２４】
一実施形態では、嗅覚受容体は、ネコｃａｔＧｒ５（Ｂ３：７２９０８２９５−７２９０９２８７）である。ある特定の実施形態では、ｃａｔＧｒ５（Ｂ３：７２９０８２９５−７２９０９２８７）のイソ酪酸のインシリコ・モデリングに例示されるように、例えば、水素結合又は塩橋の相互作用によって化合物と相互作用するアミノ酸残基は、ｃａｔＧｒ５（Ｂ３：７２９０８２９５−７２９０９２８７）残基Ｔｙｒ２７７を含む（図６）。代替的に又は加えて、ある特定の実施形態では、ｃａｔＧｒ５（Ｂ３：７２９０８２９５−７２９０９２８７）のイソ酪酸のインシリコ・モデリングに例示されるように、例えば、極性、環スタッキング、塩橋、水素結合、π相互作用、荷電相互作用、ファンデルワールス相互作用、又は疎水性相互作用によって、単独で又は上記列挙される相互作用と組み合わせてのいずれかで化合物と相互作用するアミノ酸残基は、ｃａｔＧｒ５（Ｂ３：７２９０８２９５−７２９０９２８７）残基Ｐｈｅ１１９、Ｐｒｏ１７７、Ｌｅｕ１８０、Ｉｌｅ１８１、Ｐｒｏ１９９、Ｃｙｓ２１７、及び／又はＰｈｅ２２０を含む（図６）。代替的に又は加えて、ある特定の実施形態では、ｃａｔＧｒ５（Ｂ３：７２９０８２９５−７２９０９２８７）のイソ酪酸のインシリコ・モデリングに例示されるように、例えば、極性、環スタッキング、塩橋、水素結合、π相互作用、又は荷電相互作用、ファンデルワールス、疎水性相互作用、又は他の相互作用によって化合物と相互作用するアミノ酸残基は、ＣａｆａＯＲ９．２．９残基Ｔｙｒ２７７、Ｌｙｓ２９０、Ｐｈｅ１１９、Ｐｒｏ１７７、Ｌｅｕ１８０、Ｉｌｅ１８１、Ｐｒｏ１９９、Ｃｙｓ２１７、及びＰｈｅ２２０のうちの１つ、２つ、又は３つ以上を含む（図６）。
【０１２５】
一実施形態では、嗅覚受容体は、ネコｃａｔＧｒ６（Ｄ１：１０５４８６５２８−１０５４８７４９３）である。ある特定の実施形態では、ｃａｔＧｒ６（Ｄ１：１０５４８６５２８−１０５４８７４９３）のβ−イオノンのインシリコ・モデリングに例示されるように、例えば、水素結合又は塩橋の相互作用によって、化合物と相互作用するアミノ酸残基は、ｃａｔＧｒ６（Ｄ１：１０５４８６５２８−１０５４８７４９３）残基Ｔｙｒ２６５を含む（図７）。代替的に又は加えて、ある特定の実施形態では、ｃａｔＧｒ６（Ｄ１：１０５４８６５２８−１０５４８７４９３）のβ−イオノンのインシリコ・モデリングに例示されるように、例えば、極性、環スタッキング、塩橋、水素結合、π相互作用、荷電相互作用、ファンデルワールス相互作用、又は疎水性相互作用によって、単独で又は上記列挙される相互作用と組み合わせてのいずれかで化合物と相互作用するアミノ酸残基は、ｃａｔＧｒ６（Ｄ１：１０５４８６５２８−１０５４８７４９３）残基Ｐｈｅ８８、Ｐｈｅ１１１、Ｍｅｔ１７０、Ｍｅｔ２０６、Ｃｙｓ２６１、Ｉｌｅ２６４、Ｓｅｒ２７９、Ｉｌｅ２８０、及び／又はＴｈｒ２８３を含む（図７）。代替的に又は加えて、ある特定の実施形態では、ｃａｔＧｒ６（Ｄ１：１０５４８６５２８−１０５４８７４９３）のβ−イオノンのインシリコ・モデリングに例示されるように、例えば、極性、環スタッキング、塩橋、水素結合、π相互作用、又は荷電相互作用、ファンデルワールス、疎水性相互作用、又は他の相互作用によって化合物と相互作用するアミノ酸残基は、ｃａｔＧｒ６（Ｄ１：１０５４８６５２８−１０５４８７４９３）残基Ｈｉｓ１１２、Ａｓｎ２０９、Ｔｙｒ２６５、Ｐｈｅ８８、Ｐｈｅ１１１、Ｍｅｔ１７０、Ｍｅｔ２０６、Ｃｙｓ２６１、Ｉｌｅ２６４、Ｓｅｒ２７９、Ｉｌｅ２８０、及びＴｈｒ２８３のうちの１つ、２つ、又は３つ以上を含む（図７）。
【０１２６】
一実施形態では、嗅覚受容体は、ネコｃａｔＧ７（Ｂ３：７４１１６９５５−７４１１７８９３）である。ある特定の実施形態では、ｃａｔＧ７（Ｂ３：７４１１６９５５−７４１１７８９３）の酢酸アミルのインシリコ・モデリングに例示されるように、例えば、水素結合又は塩橋の相互作用によって化合物と相互作用するアミノ酸残基は、ｃａｔＧ７（Ｂ３：７４１１６９５５−７４１１７８９３）残基Ｍｅｔ８１、Ｔｙｒ２５８、及びＧｌｎ１００を含む（図８）。代替的に又は加えて、ある特定の実施形態では、ｃａｔＧ７（Ｂ３：７４１１６９５５−７４１１７８９３）の酢酸アミルのインシリコ・モデリングに例示されるように、例えば、極性、環スタッキング、塩橋、水素結合、π相互作用、荷電相互作用、ファンデルワールス相互作用、又は疎水性相互作用によって、単独で又は上記列挙される相互作用と組み合わせてのいずれかで化合物と相互作用するアミノ酸残基は、ｃａｔＧ７（Ｂ３：７４１１６９５５−７４１１７８９３）残基Ｔｈｒ７７、Ｌｙｓ２６９、Ｌｅｕ１０４、Ｔｈｒ２７６、Ｖａｌ２７７、Ｈｉｓ７３、Ｖａｌ２７３及び／又はＶａｌ７８を含む（図８）。代替的に又は加えて、ある特定の実施形態では、ｃａｔＧ７（Ｂ３：７４１１６９５５−７４１１７８９３）の酢酸アミルのインシリコ・モデリングに例示されるように、例えば、極性、環スタッキング、塩橋、水素結合、π相互作用、又は荷電相互作用、ファンデルワールス、疎水性相互作用、又は他の相互作用によって化合物と相互作用するアミノ酸残基は、ｃａｔＧ７（Ｂ３：７４１１６９５５−７４１１７８９３）残基Ｍｅｔ８１、Ｔｙｒ２５８、Ｇｌｎ１００、Ｔｈｒ７７、Ｌｙｓ２６９、Ｌｅｕ１０４、Ｔｈｒ２７６、Ｖａｌ２７７、Ｈｉｓ７３、Ｖａｌ２７３及びＶａｌ７８のうちの１つ、２つ、又は３つ以上を含む（図８）。
【０１２７】
一実施形態では、嗅覚受容体は、ネコｃａｔＧ８（Ｅ３：４０２３７９０４−４０２３８８４２）である。ある特定の実施形態では、ｃａｔＧ８（Ｅ３：４０２３７９０４−４０２３８８４２）の１−ノナンチオールのインシリコ・モデリングに例示されるように、例えば、極性、環スタッキング、塩橋、水素結合、π相互作用、荷電相互作用、ファンデルワールス相互作用、又は疎水性相互作用によって、化合物と相互作用するアミノ酸残基は、ｃａｔＧ８（Ｅ３：４０２３７９０４−４０２３８８４２）残基Ｌｅｕ１０１、Ｐｈｅ１０４、Ｌｅｕ１０５、Ｇｌｙ１０８、Ｇｌｕ１８０、Ｖａｌ２０２、Ｐｈｅ２０６、Ｔｙｒ２５９、及び／又はＬｙｓ２７２を含む（図９）。代替的に又は加えて、ある特定の実施形態では、ｃａｔＧ８（Ｅ３：４０２３７９０４−４０２３８８４２）の１−ノナンチオールのインシリコ・モデリングに例示されるように、例えば、極性、環スタッキング、塩橋、水素結合、π相互作用、又は荷電相互作用、ファンデルワールス、疎水性相互作用、又は他の相互作用によって化合物と相互作用するアミノ酸残基は、ｃａｔＧ８（Ｅ３：４０２３７９０４−４０２３８８４２）残基Ｍｅｔ８１、Ｌｅｕ１０１、Ｐｈｅ１０４、Ｌｅｕ１０５、Ｇｌｙ１０８、Ｇｌｕ１８０、Ｖａｌ２０２、Ｐｈｅ２０６、Ｔｙｒ２５９、及びＬｙｓ２７２のうちの１つ、２つ、又は３つ以上を含む（図９）。
【０１２８】
一実施形態では、嗅覚受容体は、ネコｃａｔＧ９（Ｄ１：１０５４６２５５４−１０５４６３５１２）である。ある特定の実施形態では、ｃａｔＧ９（Ｄ１：１０５４６２５５４−１０５４６３５１２）のβ−イオノンのインシリコ・モデリングに例示されるように、例えば、水素結合又は塩橋の相互作用によって化合物と相互作用するアミノ酸残基は、ｃａｔＧ９（Ｄ１：１０５４６２５５４−１０５４６３５１２）残基Ｌｙｓ２７８を含む（図１０）。代替的に又は加えて、ある特定の実施形態では、ｃａｔＧ９（Ｄ１：１０５４６２５５４−１０５４６３５１２）のβ−イオノンのインシリコ・モデリングに例示されるように、例えば、極性、環スタッキング、塩橋、水素結合、π相互作用、荷電相互作用、ファンデルワールス相互作用、又は疎水性相互作用によって、単独で又は上記列挙される相互作用と組み合わせてのいずれかで化合物と相互作用するアミノ酸残基は、ｃａｔＧ９（Ｄ１：１０５４６２５５４−１０５４６３５１２）残基Ｐｈｅ１１０、Ｖａｌ１１１、Ｇｌｙ１１４、Ｖａｌ２０８、Ｉｌｅ２１２、Ｐｈｅ２５８、Ａｌａ２６１、Ｌｅｕ２６２、Ｔｙｒ２６５、Ｖａｌ２８２、及び／又はＳｅｒ２８５を含む（図１０）。代替的に又は加えて、ある特定の実施形態では、ｃａｔＧ９（Ｄ１：１０５４６２５５４−１０５４６３５１２）のβ−イオノンのインシリコ・モデリングに例示されるように、例えば、極性、環スタッキング、塩橋、水素結合、π相互作用、又は荷電相互作用、ファンデルワールス、疎水性相互作用、又は他の相互作用によって化合物と相互作用するアミノ酸残基は、ｃａｔＧ９（Ｄ１：１０５４６２５５４−１０５４６３５１２）残基Ｔｙｒ７９、Ｌｙｓ２７８、Ｐｈｅ１１０、Ｖａｌ１１１、Ｇｌｙ１１４、Ｖａｌ２０８、Ｉｌｅ２１２、Ｐｈｅ２５８、Ａｌａ２６１、Ｌｅｕ２６２、Ｔｙｒ２６５、Ｖａｌ２８２、及びＳｅｒ２８５のうちの１つ、２つ、又は３つ以上を含む（図１０）。
【０１２９】
一実施形態では、嗅覚受容体は、イヌＣａｆａＯＲ５．２．５である。ある特定の実施形態では、ＣａｆａＯＲ５．２．５におけるクマリンのインシリコ・モデリングに例示されるように、例えば、極性、環スタッキング、塩橋、水素結合、π相互作用、荷電相互作用、ファンデルワールス相互作用、又は疎水性相互作用によって化合物と相互作用するアミノ酸残基は、ＣａｆａＯＲ５．２．５残基Ｔｙｒ７７、Ｐｈｅ１０８、Ｖａｌ１１２、Ｓｅｒ１１６、Ｖａｌ２０６、Ａｓｐ２１０、Ｐｈｅ２５６、及び／又はＴｈｒ２８３を含む（図１１）。代替的に又は加えて、ある特定の実施形態では、ＣａｆａＯＲ５．２．５におけるクマリンのインシリコ・モデリングに例示されるように、例えば、極性、環スタッキング、塩橋、水素結合、π相互作用、又は荷電相互作用、ファンデルワールス、疎水性相互作用、又は他の相互作用によって化合物と相互作用するアミノ酸残基は、ＣａｆａＯＲ５．２．５残基Ｔｙｒ２６３、Ｔｙｒ７７、Ｐｈｅ１０８、Ｖａｌ１１２、Ｓｅｒ１１６、Ｖａｌ２０６、Ａｓｐ２１０、Ｐｈｅ２５６、及びＴｈｒ２８３のうちの１つ、２つ、又は３つ以上を含む（図１１）。
【０１３０】
ある特定の実施形態では、化合物は、本明細書に記載されるヒト、イヌ、又はネコの嗅覚受容体の１つ以上と相互作用し、該化合物は、該受容体の７ＴＭドメインに存在する１つ以上のアミノ酸残基と相互作用する。該受容体のＥＣ２ループは、受容体の活性部位ポケットへの入り口に存在する。ある特定の実施形態では、嗅覚受容体のＥＣ２ループに存在するアミノ酸残基は、本明細書に記載される化合物と相互作用する。
【０１３１】
３．３  インビトロの方法
本開示の主題は、さらに、嗅覚受容体の活性及び／又は発現を調節することができるペットフード、食品、又は化合物を生成するための原材料をインビトロで特定する方法を提供する。
【０１３２】
本開示の方法に使用するための嗅覚受容体は、本明細書に開示される嗅覚受容体を発現する、単離又は組換えされた嗅覚受容体又は細胞を含みうる。ある特定の実施形態では、本開示の方法に使用するための嗅覚受容体は、配列番号：４１〜６０のいずれか１つのアミノ酸配列、又は配列番号：６１〜３８０８のアミノ酸配列のいずれか１つ、又はそれらの断片又は変異体を含みうる。ある特定の実施形態では、本開示の方法に使用するための嗅覚受容体は、配列番号：４１〜６０のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも約３３％、３４％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６１％、６５％、７０％、７２％、７５％、７９％、８０％、８４％、８５％、８７％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性、又は配列番号：６１〜３８０８のいずれかのアミノ酸配列、若しくはそれらの断片又は変異体を有しうる。ある特定の実施形態では、本開示の方法に使用するための嗅覚受容体は、配列番号：１１〜３０のいずれか１つを含むヌクレオチド配列、又は配列番号：６１〜３８０８のヌクレオチド配列のいずれか１つ、若しくはそれらの断片又は変異体にコードされうる。ある特定の実施形態では、本開示の主題に使用するための嗅覚受容体は、配列番号：１１〜３０のいずれか１つに対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号：６１〜３８０８のヌクレオチド配列のいずれか１つ、若しくはそれらの断片又は変異体にコードされた受容体を含みうる。
【０１３３】
ある特定の実施形態では、嗅覚受容体の活性及び／又は発現を調節する化合物を特定する方法は、試験化合物の不存在下及び／又は存在下で嗅覚受容体の生物学的活性を測定するステップを含む。ある特定の実施形態では、本方法は、さまざまな濃度の試験化合物の存在下で嗅覚受容体の生物学的活性を測定するステップを含みうる。該方法は、さらに、試験化合物の不存在下での嗅覚受容体の活性及び／又は発現と比較して、嗅覚受容体の活性及び／又は発現の調節を生じる試験化合物を特定するステップを含みうる。
【０１３４】
ある特定の実施形態では、本方法は、さらに、２つ以上、３つ以上又は４つ以上の試験化合物を組み合わせて分析するステップを含みうる。ある特定の実施形態では、２つ以上、３つ以上又は４つ以上の試験化合物は、例えば、アミノ酸及び小化合物など、異なる分類の化合物に由来してもよい。例えば、限定はしないが、該方法は、１つ以上のアミノ酸試験化合物の存在下で、嗅覚受容体の生物学的活性及び／又は発現における１つ以上の小さい化学試験化合物の効果を分析するステップを含みうる。ある特定の実施形態では、嗅覚受容体の生物学的活性及び／又は発現における化合物の効果を特定する方法は、例えば、匂い物質又は嗅覚受容体アゴニスト／アンタゴニストなどの嗅覚受容体リガンドの存在下で、嗅覚受容体の生物学的活性及び／又は発現における試験化合物の効果を分析するステップを含む。
【０１３５】
ある特定の実施形態では、嗅覚受容体の活性及び／又は発現を調節することができる化合物を特定する方法は、細胞株において嗅覚受容体を発現させるステップ、及び試験化合物の存在下及び／又は不存在下で、受容体の生物学的活性を測定するステップを含む。本方法は、さらに、試験化合物の不存在下での受容体の活性と比較して、試験化合物の存在下での受容体の活性化に差異が存在するかどうかを決定することによって、受容体の活性を調節する試験化合物を特定するステップを含みうる。ある特定の実施形態では、該方法は、さまざまな濃度の試験化合物の存在下で、嗅覚受容体の生物学的活性を測定するステップを含みうる。ある特定の実施形態では、推定される嗅覚受容体モジュレータの選択性は、他のＧＰＣＲ又は嗅覚受容体におけるその効果を比較することによって評価することができる。
【０１３６】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って特定される化合物は、化合物が存在しない場合の嗅覚受容体の生物学的活性と比較して、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、又はそれより多く、嗅覚受容体の生物学的活性を増加又は低下させる。
【０１３７】
ある特定の実施形態では、嗅覚受容体の活性及び／又は発現を調節する化合物を特定する方法は、化合物が、例えばアゴニスト又はアンタゴニストとして、受容体を直接調節するかどうかを決定するステップを含む。ある特定の実施形態では、該方法は、例えば、受容体活性の活性化又は阻害における他の化合物の効果を増強又は低下させることによって、化合物が受容体の活性（例えば、アロステリックモジュレータとして）を間接的に調節するかどうかを決定するステップを含む。
【０１３８】
ある特定の実施形態では、嗅覚受容体の活性及び／又は発現を調節することができる試験薬剤は、約２００μＭ以下のＥＣ５０値を有する。ある特定の実施形態では、試験薬剤は、約１μＭ以下、２μＭ以下、３μＭ以下、４μＭ以下、５μＭ以下、６μＭ以下、７μＭ以下、８μＭ以下、９μＭ以下、１０μＭ以下、２０μＭ以下、３０μＭ以下、４０μＭ以下、５０μＭ以下、６０μＭ以下、７０μＭ以下、８０μＭ以下、９０μＭ以下、１００μＭ以下、１１０μＭ以下、１２０μＭ以下、１３０μＭ以下、１４０μＭ以下、１５０μＭ以下、１６０μＭ以下、１７０μＭ以下、１８０μＭ以下、１９０μＭ以下、又は２００μＭ以下のＥＣ５０値を有する。ある特定の実施形態では、試験薬剤は、約２５０μＭ以下、３００μＭ以下、４００μＭ以下、５００μＭ以下、６００μＭ以下、７００μＭ以下、８００μＭ以下、９００μＭ以下又は１Ｍ以下のＥＣ５０値を有する。ある特定の実施形態では、試験薬剤は、少なくとも１ｐＭ、１０ｐＭ、１００ｐＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、又は１００ｎＭであるが、約１μＭ以下、２μＭ以下、３μＭ以下、４μＭ以下、５μＭ以下、６μＭ以下、７μＭ以下、８μＭ以下、９μＭ以下、１０μＭ以下、２０μＭ以下、３０μＭ以下、４０μＭ以下、５０μＭ以下、６０μＭ以下、７０μＭ以下、８０μＭ以下、９０μＭ以下、１００μＭ以下、１１０μＭ以下、１２０μＭ以下、１３０μＭ以下、１４０μＭ以下、１５０μＭ以下、１６０μＭ以下、１７０μＭ以下、１８０μＭ以下、１９０μＭ以下又は２００μＭ以下のＥＣ５０値を有する。
【０１３９】
ある特定の実施形態では、嗅覚受容体の活性及び／又は発現を調節することができる試験薬剤は、約２．０以下のＥｍａｘ値を有する。ある特定の実施形態では、試験薬剤は、約１．５以上、１．６以上、１．７以上、１．８以上、１．９以上、２．０以上、２．５以上、３．０以上、３．５以上、４．０以上、４．５以上、５．０以上、５．５以上、６．０以上、６．５以上、７．０以上、７．５以上、８．０以上、８．５以上、９．０、９．５、１０、１５以上、２０以上、２５以上、３０以上、４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上、１００以上、１１０以上、１２０以上、１３０以上、１４０以上、１５０以上、又は２００以上のＥｍａｘ値を有する。ある特定の実施形態では、試験薬剤は、約２００超のＥｍａｘ値を有する。
【０１４０】
本開示の方法における受容体の活性化は、標識化合物及び／又は薬剤の使用を通じて検出されうる。ある特定の実施形態では、嗅覚受容体の活性は、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、ＩＰ３、ＤＡＧ又はカルシウムなどであるがそれらに限られない、セカンドメッセンジャーの検出によって決定することができる。ある特定の実施形態では、嗅覚受容体の活性は、細胞内カルシウムレベルの検出によって決定することができる。モニタリングは、限定はしないが、カルシウム感受性蛍光染料又は発光性の発光タンパク質などによる、発光又は蛍光検出によるものでありうる。ある特定の実施形態では、モニタリングは、発光によるものでありうる。ある特定の実施形態では、細胞内カルシウムレベルは、細胞用染料、例えば、カルシウム４などの蛍光カルシウム指示薬を使用して決定することができる。ある特定の実施形態では、細胞内カルシウムレベルは、例えばカルモジュリンなどのカルシウム結合タンパク質に対するカルシウムの結合レベルを測定することによって決定することができる。代替的に及び／又は追加的に、嗅覚受容体の活性は、嗅覚受容体の１つ以上の下流のタンパク質標的のリン酸化、転写レベル、及び／又はタンパク質レベルの検出によって決定することができる。ある特定の実施形態では、ＧｌｏＳｅｎｓｏｒ（商標）及び／又はタンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）−ＮａｎｏＢｉＴ（商標）技術を使用して、嗅覚受容体の活性を決定する。ある特定の実施形態では、環状ヌクレオチド感受性（ＣＮＧ）チャネルを通じたカルシウム流入によってｃＡＭＰレベルを間接的に測定する、ｃｈＡＭＰｉｏｎアッセイ系を使用して、嗅覚受容体の活性を決定する。ある特定の実施形態では、ＧｌｏＳｅｎｓｏｒアッセイは、ＯＲプラスミド及びＧｌｏＳｅｎｓｏｒプラスミドの一過性コトランスフェクション、及びＧｌｏＳｅｎｓｏｒによるｃＡＭＰの検出（順列置換ルシフェラーゼ、発光活性は、ｃＡＭＰの結合に依存する）；発光の読み出しを含む。ある特定の実施形態では、ＰＫＡ−ＮａｎｏＢｉＴアッセイは、ＰＫＡ−ＮａｎｏＢｉＴプラスミドを用いたＯＲプラスミドの一過性コトランスフェクション、並びに、分割型ルシフェラーゼの相補性を乱すＰＫＡサブユニットのｃＡＭＰ依存性解離から生じる、蛍光及び／又は発光読み出しの低下（オフ信号）の検出を含む。ある特定の実施形態では、ｃｈＡＭＰｉｏｎアッセイは、ＯＲプラスミドの一過性トランスフェクション、並びに、ＣＮＧチャネルの開放及びカルシウム流入をもたらすｃＡＭＰレベルの増加を生じる、発光タンパク質又は蛍光染料を介したカルシウムの検出を含む。
【０１４１】
本開示の方法に用いられる細胞株は、嗅覚受容体を発現（例えば、安定発現又は一過性発現）することができる任意の細胞型を含みうる。本開示の方法に用いることができる細胞の非限定的な例としては、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、アフリカミドリザル腎細胞（ＣＯＳ細胞）、アフリカツメガエル卵母細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、及びネズミ３Ｔ３線維芽細胞を挙げることができる。ある特定の実施形態では、本方法は、ＨＥＫ−２９３細胞において嗅覚受容体を発現させるステップを含みうる。ある特定の実施形態では、本方法は、ＣＯＳ細胞において嗅覚受容体を発現させるステップを含みうる。ある特定の実施形態では、細胞は、嗅覚受容体構成的に発現する。ある特定の実施形態では、細胞は、嗅覚受容体一過的に発現する。別の実施形態では、細胞による嗅覚受容体の発現は誘導性である。
【０１４２】
ある特定の実施形態では、細胞は、カルシウム結合発光タンパク質、環状ヌクレオチド感受性（ＣＮＧ）チャネル、ｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）含有ルシフェラーゼ受容体、ＧｌｏＳｅｎｓｏｒルシフェラーゼ、又はＰＫＡ−ＮａｎｏＢｉＴシステムを発現する。ある特定の実施形態では、細胞は、カルシウムと結合すると発光する、カルシウム結合発光タンパク質を発現する。ある特定の実施形態では、カルシウム結合発光タンパク質は、クライティン、エクオリン、オベリン、それらの任意の組換え又は単離されたバージョン、及びそれらの組合せからなる群より選択される化合物を含む。ある特定の実施形態では、カルシウム結合発光タンパク質は、タンパク質クライティンを含む。ある特定の実施形態では、クライティンは組換えクライティンである。ある特定の実施形態では、クライティンは、例えば、クリティア・グレガリア（Clytia gregarium）から単離されたクライティンなど、単離されたクライティンを含む。ある特定の実施形態では、カルシウム結合発光タンパク質は、タンパク質エクオリン、例えば、オワンクラゲ（Aequorea victoria）から単離されたエクオリンなどの組換えエクオリン又は単離されたエクオリンを含む。ある特定の実施形態では、カルシウム結合発光タンパク質は、タンパク質オベリン、例えば、オベリアクラゲ（Obelia longissima）から単離されたオベリンなどの組換えオベリン又は単離されたオベリンを含む。
【０１４３】
ある特定の実施形態では、細胞内カルシウムレベルは、発光検出又は蛍光検出によってモニタされる。ある特定の実施形態では、蛍光検出は、Ｆｕｒａ−２  ＡＭ、Ｆｕｒａ−２ペンタカリウム、Ｆｕｒａ  Ｒｅｄ  ＡＭ、Ｉｎｄｏ−１  ＡＭ、Ｉｎｄｏ−１ペンタカリウム、Ｆｌｕｏ−３、Ｆｌｕｏ−４、Ｆｌｕｏ−８、カルシウムＧｒｅｅｎ−１、カルシウム３、カルシウム４、カルシウム５、Ｒｈｏｄ−２、それらの誘導体、及びそれらの組合せからなる群より選択されるカルシウム感受性蛍光染料を含む。
【０１４４】
ある特定の実施形態では、細胞における嗅覚受容体の発現は、嗅覚受容体をコードする核酸を細胞に導入することによって行われうる。例えば、限定するわけではないが、配列番号：１１〜３０のいずれか１つに記載されるヌクレオチド配列、又は配列番号：６１〜３８０８のヌクレオチド配列のいずれか１つを有する核酸、若しくはそれらの断片を、細胞に導入することができる。ある特定の実施形態では、細胞への核酸の導入は、限定はしないが、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、核酸配列を含むウイルス又はバクテリオファージベクターによる感染、細胞融合、染色体を介した遺伝子導入、ミクロ細胞を介した遺伝子導入、スフェロプラスト融合等を含めた当技術分野で知られている方法によって行うことができる。細胞に外来遺伝子を導入するための多くの技法が、当技術分野で知られており（例えば、参照することによってその開示内容全体が本明細書に組み込まれる、Loeffler and Behr, Meth. Enzymol. 217:599-618 (1993); Cohen et al., Meth. Enzymol. 217:618-644 (1993); Cline, Pharmac. Ther. 29:69-92 (1985)を参照）、本開示の主題に従って使用することができる。ある特定の実施形態では、該手法は、核酸が細胞によって発現可能であり、その子孫に継承可能かつ発現可能になるように、細胞への核酸の安定した移入をもたらすことができる。ある特定の実施形態では、該手法は、核酸が細胞によって発現可能になるように、細胞への核酸の一時的移入をもたらすことができ、ここで、該核酸の濃度及び発現は、細胞の子孫のその後の世代において減少する。
【０１４５】
ある特定の実施形態では、本方法は、嗅覚受容体に結合する化合物を特定するステップを含みうる。本方法は、嗅覚受容体を試験化合物と接触させるステップ、及び化合物と嗅覚受容体との結合を測定するステップを含みうる。例えば、限定するわけではないが、本方法は、無細胞系に単離又は精製された嗅覚受容体を供給するステップ、及び該受容体を無細胞系で試験化合物と接触させて、試験化合物が嗅覚受容体に結合するかどうかを決定するステップを含みうる。ある特定の実施形態では、本方法は、細胞の表面に発現された嗅覚受容体を候補化合物と接触させるステップ、及び嗅覚受容体への候補化合物の結合を検出するステップを含みうる。結合は、例えば、標識された試験化合物を使用して直接的に測定することができ、あるいは、間接的に測定することもできる。ある特定の実施形態では、検出は、例えば、細胞内カルシウムレベルの増加など、嗅覚受容体への化合物の結合によって生じる細胞における生理学的事象を検出するステップを含む。例えば、限定するわけではないが、検出は、発光の検出、又は当技術分野で知られている任意の他の検出方法による、カルシウム感受性蛍光染料などの蛍光検出によって行うことができる。
【０１４６】
他の非限定的な実施形態では、インビトロアッセイは、その細胞に固有の嗅覚受容体を発現する細胞を含む。天然の嗅覚受容体を発現するこのような細胞の例としては、例えば、限定はしないが、ヒト、イヌ、及び／又はネコの嗅覚細胞（例えば、嗅覚受容体細胞）が挙げられる。ある特定の実施形態では、嗅覚を発現するヒト、イヌ、及び／又はネコの嗅覚細胞は、ヒト、イヌ、及び／又はネコから単離され、インビトロで培養される。ある特定の実施形態では、嗅覚受容体細胞は、例えば、ヒト、イヌ、及び／又はネコから単離された細胞が培養液中で伝播可能なように、不死化されうる。
【０１４７】
ある特定の実施形態では、例えば、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集システムの使用を通じてなど、遺伝子編集を通じて、細胞における嗅覚受容体の発現を誘発して、嗅覚受容体遺伝子を細胞のゲノムに組み込むこと、若しくは、細胞固有の嗅覚受容体遺伝子を編集又は改変することができる。
【０１４８】
ある特定の実施形態では、嗅覚受容体に結合する化合物を特定するインビトロの方法は、本明細書に記載されるように、試験化合物が嗅覚受容体結合ポケットの１つ以上のアミノ酸と相互作用するかどうかを決定するステップを含む。
【０１４９】
ある特定の実施形態では、嗅覚受容体のモジュレータとして特定される化合物を、限定はしないが、インビボでのアッセイを含めた他の分析方法でさらに試験して、それらの調節活性を確認又は定量化することができる。
【０１５０】
ある特定の実施形態では、嗅覚受容体モジュレータを特定する方法としては、嗅覚受容体アゴニスト又はアンタゴニストに対する試験化合物の効果を比較することが挙げられうる。例えば、嗅覚受容体アゴニストを単独で接触させた場合の受容体の活性と比較して、アゴニストの存在下で受容体の活性を上昇又は低下させる試験化合物を、嗅覚受容体調節化合物として選択することができる。
【０１５１】
該方法に従って使用することができる嗅覚受容体アゴニストとしては、表１に記載される１つ以上の化合物が挙げられうる。
【０１５２】
【表２】
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【０１５３】
ある特定の実施形態では、嗅覚受容体アゴニストは、トリフェルナール、イソ吉草酸、３−メチル−２−ヘキサン酸、α−イオノン、酢酸ヘキシル、アミルメルカプタン、ヘリオナール、ｐ−アニスアルデヒド、４−エトキシベンズアルデヒド、メントール、メチル−オイゲノール、サリチル酸メチル、フェニルアセトアルデヒド、β−イオノン、酢酸アミル、ノナンチオール、アセトフェノン、クマリン、リリアール、ｍ−アニスアルデヒド、４−メチル吉草酸、ペンタノール、フェニル酢酸アリル、ヘキサン酸、α−イオノン、シトラール、酢酸イソアミル、オクタンチオール、プロピオフェノン、７−メトキシクマリン及びそれらの組合せからなる群より選択される。
【０１５４】
ある特定の実施形態では、本開示の嗅覚受容体モジュレータは、例えば、限定はしないが、酢酸塩又はギ酸塩など、嗅覚受容体モジュレータの塩を含む。ある特定の実施形態では、嗅覚受容体モジュレータの塩は、イオン結合を介してカチオン（＋）（例えば、限定はしないが、Ａｌ３＋、Ｃａ２＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃｕ２＋、Ｈ＋、Ｆｅ３＋、Ｍｇ２＋、ＮＨ４＋及びＨ３Ｏ＋）と結合した、アニオン（−）（例えば、限定はしないが、Ｃｌ−、Ｏ２−、ＣＯ３２−、ＨＣＯ３−、ＯＨ−、ＮＯ３−、ＰＯ４３−、ＳＯ４２−、ＣＨ３ＣＯＯ−、ＨＣＯＯ−及びＣ２Ｏ４２−）を含む。他の実施態様では、嗅覚受容体アゴニストの塩は、イオン結合を介してアニオン（−）と結合したカチオン（＋）を含む。
【０１５５】
ある特定の実施形態では、本出願にかかる嗅覚受容体モジュレータは、例えばイヌ及び／又はネコ嗅覚受容体などの嗅覚受容体のインシリコ・モデリングを通じて特定され、本出願にかかる嗅覚受容体モジュレータは、嗅覚受容体の結合部位内にフィットする構造を含む。ある特定の実施形態では、インシリコの方法は、上述及び本出願の実施例のセクションに記載されるインシリコの方法を含む。
【０１５６】
ある特定の実施形態では、本出願にかかる嗅覚受容体モジュレータは、インビトロの方法を通じて特定され、該嗅覚受容体モジュレータ化合物は、インビトロで細胞によって発現される、本明細書に開示される嗅覚受容体を調節する。ある特定の実施形態では、インビトロの方法は、上述及び本出願の実施例のセクションに記載されるインビトロの方法を含む。
【０１５７】
４．ペットフード製品
本出願は、嗜好性及び栄養価が高いペットフード製品の製造に適した原材料の特定に使用することができるスクリーニング方法を提供する。本開示のスクリーニング方法は、完成したペットフード製品がペット（例えば、イヌ又はネコ）にとって嗜好性が高いかどうかを決定するためにも使用することができる。例えば、本明細書に記載されるインビトロの方法は、原材料及び完成したペットフード製品をスクリーニングして、該原材料又は完成したペットフード製品が、嗅覚受容体の活性及び／又は発現を増加、低下、又は調節する化合物を含むかどうかを特定するために、使用することができる。ある特定の実施形態では、嗅覚受容体の活性及び／又は発現を増加させない原材料及び完成したペットフード製品を、消費用のペットフード製品に使用するために、若しくは、消費用のペットフード製品として、選択することができる。ある特定の実施形態では、嗅覚受容体の活性及び／又は発現を増加させる原材料及び完成したペットフード製品を、消費用のペットフード製品に使用するために、若しくは、消費用のペットフード製品として、選択することができる。
【０１５８】
適切なペットフード製品の非限定的な例としては、ウェット食品、ドライ食品、湿り気のある食品、ペットフードサプリメント（例えば、ビタミン）、ペット飲料製品、スナック及びおやつ、並びに本明細書に記載されるペットフードのカテゴリが挙げられる。
【０１５９】
ペットケア産業の目標の一つは、ヒトの食物連鎖と競合しないペットのための持続可能なタンパク質源を特定することである。そのようなものとして、これらの基準に合う新規タンパク質源の探索が進行中である。本開示のスクリーニング方法を使用して、どの新規タンパク質源が、ペットにとって嗜好性が高いと考えられるか、若しくはペットフードの他の成分の嗜好性に何の影響も与えないかを特定することができる。ある特定の実施形態では、新規タンパク質源（すなわち、原材料）は、肉、魚、チーズ、豆、酵母、酵母エキス、細菌、藻類、菌類、ナッツ、種子又は他の植物材料、若しくはそれらの組合せである。ある特定の実施形態では、原材料は肉である。
【０１６０】
ある特定の実施形態では、タンパク質源は、さまざまな植物源に由来しうる。植物源の非限定的な例としては、トウモロコシ（corn、maize）、米、大豆、小麦等が挙げられる。例えば、限定するわけではないが、植物由来のタンパク質は、ルピナスタンパク質、小麦タンパク質、大豆タンパク質及びそれらの組合せを含みうる。代替的に又は追加的に、タンパク質源は、例えば、動物界由来の多細胞真核生物など、さまざまな動物源に由来しうる。動物タンパク質の非限定的な例としては、例えば、筋肉、肉副産物、肉粉、又は魚粉を含む、牛肉、豚肉、鶏肉、子羊肉、又は魚が挙げられる。動物源の他の非限定的な例としては、昆虫、又は節足動物門に由来する他の生物が挙げられる。
【０１６１】
ある特定の実施形態では、タンパク質源は、酵母、若しくは任意の他の単細胞真核生物、カビ、きのこ、又は菌類に由来しうる。
【０１６２】
ある特定の実施形態では、タンパク質源は、細菌、古細菌（archaea）、又は任意の他の古細菌（archaebacteria）、真正細菌、又は原核生物に由来しうる。
【０１６３】
ある特定の実施形態では、タンパク質源は、藻類、昆布、海藻、若しくは任意の他の単細胞又は多細胞光合成生物又は原生生物に由来しうる。
【０１６４】
ある特定の実施形態では、本開示の主題は、原材料が嗅覚受容体の活性及び／又は発現を、増強、増加、低下、及び／又は調節する能力に基づいて、ペットフードの製造のための原材料を許容又は拒否するステップを含む。
【０１６５】
ある特定の実施形態では、原材料は、該原材料が、少なくとも１つの嗅覚受容体の活性及び／又は発現に増強又は増加を生じる場合に、拒否される。ある特定の実施形態では、原材料は、該原材料が、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、及び／又は少なくとも１６の嗅覚受容体の活性及び／又は発現に増強又は増加を生じる場合に、拒否される。
【０１６６】
ある特定の実施形態では、原材料は、該原材料が、少なくとも１つの嗅覚受容体の活性及び／又は発現に増強又は増加を生じる場合に、許容される。ある特定の実施形態では、原材料は、原材料が、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、及び／又は少なくとも１６の嗅覚受容体の活性及び／又は発現に増強又は増加を生じる場合に、許容される。
【０１６７】
ある特定の実施形態では、原材料は、それが、少なくとも１つの嗅覚受容体の活性を調節しない場合に、許容される。ある特定の実施形態では、原材料は、それが、少なくとも１つの嗅覚受容体の活性及び／又は発現を阻害又は遮断する場合に、選択される。
【０１６８】
ある特定の実施形態では、原材料は、少なくとも１つの嗅覚受容体の活性を調節しない場合に、拒否される。ある特定の実施形態では、原材料は、それが、少なくとも１つの嗅覚受容体の活性及び／又は発現を阻害又は遮断する場合に、拒否される。
【０１６９】
ある特定の実施形態では、嗅覚受容体は、イヌ受容体ＣａｆａＯＲ９．２．９、ＣａｆａＯＲ３８．１．２１、ＣａｆａＯＲ２１．２．１５、ＣａｆａＯＲ２１．２．４３、ＣａｆａＯＲ１５．２．２０、ＣａｆａＯＲ１８．３．１１、ＣａｆａＯＲ１５．３．１、ＣａｆａＯＲ６．３．１、ＣａｆａＯＲ１８．３．１２、及び／又はＣａｆａＯＲ５．２．５の１つ以上から選択される。ある特定の非限定的な実施形態では、嗅覚受容体は、配列番号：６１〜２２６０に記載されるイヌ嗅覚受容体のうちの１つ以上から選択される。
【０１７０】
ある特定の実施形態では、嗅覚受容体は、ネコ受容体Ｅ１：１３３４７０３０−１３３４７９７７、Ｆ１：６５１３４９０４−６５１３５８５８、Ｄ１：６２９５５８３９−６２９５６７９２、Ｄ１：６３３１２３２７−６３３１３２８９、Ｂ３：７２９０８２９５−７２９０９２８７、Ｄ１：１０５４８６５２８−１０５４８７４９３、Ｂ３：７４１１６９５５−７４１１７８９３、Ｅ３：４０２３７９０４−４０２３８８４２、Ｄ１：１０５４６２５５４−１０５４６３５１２、及び／又はＤ１：２１２６６８２４−２１２６７７６８のいずれか１つ以上から選択される。ある特定の非限定的な実施形態では、嗅覚受容体は、配列番号：２２６１〜３８０８に記載される１つ以上のネコ嗅覚受容体から選択される。
【０１７１】
ある特定の非限定的な実施形態では、少なくとも１つの嗅覚受容体の活性及び／又は発現に増強又は増加を生じる原材料を、少なくとも１つの嗅覚受容体の活性及び／又は発現を阻害する又は低下させる化合物と混和することができ、その混和物は、ペットフードの製造に許容される。
【０１７２】
ペットフードの製造中に、幾つかの材料は、機械的な力、熱的な力、又は化学反応によって、形態が変化しうる。本開示のスクリーニング方法を使用して、例えば嗅覚受容体の活性及び／又は発現を増強する又は増加させる化合物など、例えばイヌ又はネコなどの動物にとって不快な化合物を形成するペットフード製品を特定することができる。
【０１７３】
ある特定の実施形態では、本開示の主題は、製品が嗅覚受容体の活性及び／又は発現を増強、増加、低下、及び／又は調節する能力に基づいて、ペットフード製品を許容又は拒否することを含む。
【０１７４】
ある特定の実施形態では、ペットフード製品は、該製品が、少なくとも１つの嗅覚受容体の活性及び／又は発現に増強又は増加を生じる場合に、拒否される。ある特定の実施形態では、ペットフード製品は、該製品が、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、及び／又は少なくとも１６の嗅覚受容体の活性及び／又は発現に増強又は増加を生じる場合に、拒否される。ある特定の実施形態では、ペットフード製品は、それが、少なくとも１つの嗅覚受容体の活性を調節しない場合に、許容される。ある特定の実施形態では、ペットフード製品は、それが、少なくとも１つの嗅覚受容体の活性及び／又は発現を阻害又は遮断する場合に、選択される。
【０１７５】
ある特定の実施形態では、ペットフード製品は、該製品が、少なくとも１つの嗅覚受容体の活性及び／又は発現に増強又は増加を生じる場合に、許容される。ある特定の実施形態では、ペットフード製品は、該製品が、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、及び／又は少なくとも１６の嗅覚受容体の活性及び／又は発現に増強又は増加を生じる場合に、許容される。ある特定の実施形態では、ペットフード製品は、少なくとも１つの嗅覚受容体の活性を調節しない場合に、拒否される。ある特定の実施形態では、ペットフード製品は、それが、少なくとも１つの嗅覚受容体の活性及び／又は発現を阻害又は遮断する場合に、拒否される。
【０１７６】
本開示の主題のフレーバー組成物はまた、さまざまなペットフード製品に使用することもできる。本開示の主題のフレーバー組成物と、ペットフード製品及び必要に応じて任意選択的な成分との組合せは、予期しない匂いを有するフレーバー剤を提供し、例えば、望ましい嗅覚経験を付与する。本明細書に開示されるフレーバー組成物は、ペットフード製品の配合プロセス及び包装の前、最中、又は後に加えることができ、フレーバー組成物の構成成分は、順次に又は同時に添加することができる。
【０１７７】
ある特定の実施形態では、ペットフード製品は、栄養的に完全なドライ、ウェット又はセミモイストの食品である。ドライ又は低水分含有の栄養的に完全なペットフード製品は、約１５％未満の水分を含みうる。ウェット又は高水分含有の栄養的に完全なペットフード製品は、約５０％超の水分を含みうる。このような食品は、パーセントのエネルギーに基づいて、約１０％〜約９０％の脂肪、約１０％〜約７０％のタンパク質及び約５％〜約８０％の炭水化物、例えば、食物繊維及び灰分を含みうる。
【０１７８】
ある特定の実施形態では、ペットフード製品は、栄養的に完全なドライ、ウェット又はセミモイストの食品である。ある特定の実施形態では、ペットフード製品は、パーセントのエネルギーに基づいて、約６０％の脂肪、約３０％のタンパク質及び約１０％の炭水化物、例えば、食物繊維及び灰分を含む。
【０１７９】
ある特定の実施形態では、ペットフード製品は、栄養的に完全なセミモイストの食品である。水分のある、例えば、セミモイスト又はセミドライ又はソフトドライ又はソフトモイスト又は中間又は中程度の水分を含有した栄養的に完全なペットフード製品は、約１５〜約５０％の水分を含む。
【０１８０】
ある特定の実施形態では、ペットフード製品は、栄養的に完全ではないペットフード製品（例えば、スナック、ケア用及びおや用）である。ある特定の実施形態では、ペットフード製品は、ペットフードスナック製品である。ペットフードスナック製品の非限定的な例としては、スナックバー、ペット用噛み物、カリカリしたおやつ、シリアルバー、スナック、ビスケット及び甘味製品が挙げられる。
【０１８１】
本開示のある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って調製されるペットフード製品又は医薬品の匂い及び／又は嗜好性の属性は、匂いテスターのパネリストを使用する、インビボでにおいを嗅ぐ方法によって測定することができる。例えば、限定するわけではないが、パネルは、イヌ及び／又はネコのパネリストを含みうる。ある特定の実施形態では、例えば、スクリーニングされた原材料又はスクリーニングされたペットフード製品を含むペットフード製品の嗜好性は、ペットフード製品単独での消費（例えば、ワン・ボウル・テスト、モナディックランク付け）によって決定することができる。ある特定の実施形態では、スクリーニングされた原材料又はスクリーニングされたペットフード製品の嗜好性は、動物にとって嗜好性が高いことが知られているペットフード製品に対する、ペットフード製品又は原材料の選択的消費によって決定することができる（例えば、好み、差異、及び／又は選択について試験するツー・ボウル・テスト）。
【０１８２】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って特定される化合物の嗜好性及び／又は不快感を与える忌避ブロッキング臭（ｒepellant blocking odor）は、化合物を含まない、若しくは、例えば、嗅覚受容体アゴニストなどの異なるフレーバー組成物を含む水溶液に対する該化合物を含む水溶液の選択的消費によって決定することができる（例えば、ツー・ボトル・テスト）。各ペットフード製品又は水溶液の摂取率は、一の配給の消費量を測定して総消費量で割ることによって決定することができる。次に、消費率（ＣＲ）を計算して、他の配給に関して一の配給の消費を比較し、他のものに対する一の食品又は水溶液の選択的消費を決定することができる。代替的に又は加えて、摂取量（ｇ）の差異を使用して、例えば５％の有意水準などの選択された有意水準での、ツー・ボトル・テストにおける２つの溶液間の摂取量の平均差異、若しくは、ツー・ボウル・テストにおける２つのペットフード製品間の平均差異を評価し、９５％の信頼区間での摂取量の平均差異を決定することができる。ある特定の実施形態では、信頼区間は約９０％でありうる。しかしながら、例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５又は５０％の有意水準など、あらゆる有意水準を用いることができる。
【０１８３】
ある特定の実施形態では、例えば、動物による１つの溶液又は食品の嗜好度のパーセンテージなど、その溶液又は食品が占める、試験中に摂取された液体又は食品全体のパーセンテージである、嗜好度スコアのパーセンテージもまた計算することができる。
【０１８４】
５．臭気抑制剤
本開示は、不快感を与える匂いを付与する及び／又は物体又は表面の嗜好性を低下させることによって動物の健康を維持する方法を提供する。ある特定の実施形態では、本方法は、本明細書に記載される方法に従って特定される化合物を含む臭気抑制製品を物体又は表面に施用、コーティング、又は接触させ、それによって、動物が該物体又は表面に接触する、及び／又は摂取するのを防ぐことを含む。したがって、該物体又は表面の接触及び／又は摂取によって起こりうる、動物の健康における悪影響が回避される。ある特定の実施形態では、物体又は表面は、動物の健康にとって有害である、若しくは、動物に対して有毒である。
【実施例】
【０１８５】
本開示の主題は、本発明の例示として提供される、限定ではない以下の実施例を参照することによって、よりよく理解されるであろう。
【０１８６】
実施例１  −  嗅覚受容体と、推定される結合化合物との相互作用のインシリコモデル
本実施例は、推定される嗅覚受容体モジュールを特定するためのイヌ／ネコ嗅覚受容体（ＯＲ）の計算モデリングについて記載する。
【０１８７】
イヌ／ネコ嗅覚受容体の相同モデルは、タンパク質データバンク（ＰＤＢ）から得た３ＳＮ６の結晶構造に基づいていた。３ＳＮ６は、結合したアゴニストを有するＡ群ＧＰＣＲに由来するβ２アドレナリン受容体の結晶構造である（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ社供給のＢＩ−１６７１０７）。（Rasmussen et al., Nature, 477: 549-555 (2011)）。モデルは、Ａｃｃｅｌｒｙｓ社のＤｉｓｃｏｖｅｒｙＳｔｕｄｉｏ（ＤＳ）のプログラム一式の一部である、Ｉ−ＴＡＳＳＥＲのプログラム一式（Yang et al., Nat Methods, 12: 7-8 (2015)）及びＭｏｄｅｌｌｅｒ（Eswar et al., Curr Protoc Bioinformatics, 15: 5.6.1-5.6.30 (2006)）を使用して構築した（ＤｉｓｃｏｖｅｒｙＳｔｕｄｉｏ（ＤＳ）は、Ａｃｃｅｌｒｙｓ社の一連の対話型モデリング及びシミュレーションプログラムである）。
【０１８８】
匂い化合物は、イヌ／ネコ嗅覚受容体の活性部位にドッキングした。ＢｉｏＰｒｅｄｉｃｔ，Ｉｎｃ．社のドッキングプログラムＢｉｏＤｏｃｋを使用したが、他の最先端のドッキングプログラムを本目的に使用することができる。
【０１８９】
インシリコ・モデリングの結果が図２〜１１に提示されている。図１３は、嗅覚遺伝空間をカバーする複数種（ヒト／イヌ／ネコ）についての系統樹を示している。該系統樹は、すべての嗅覚受容体を示しており、３０の選択された嗅覚受容体（１０のヒト受容体、１０のイヌ受容体、１０のネコ受容体、強調表示、配列番号：１〜６０）が、嗅覚遺伝空間の周囲に均等に分布している。図１３は、１０対のイヌ／ネコ嗅覚受容体（配列番号：１１〜３０及び配列番号：４１〜６０）が潜在的なＯＲ受容体の差異的な幅及び範囲をカバーすることから選択されたことをさらに示している。
【０１９０】
実施例２  −  イヌ及びネコ嗅覚受容体の特定
検出のためのイヌ嗅覚受容体配列及び方法は、１，１００のイヌ嗅覚受容体配列が得られた、Niimura & Nei(2007)に記載されている。以前のアノテーションと類似検索との組合せを使用して、７７４の推定されるネコ嗅覚受容体配列を特定した。ｅｎｓｅｍｂｌのネコゲノム（Ｆｅｌｉｓ＿ｃａｔｕｓ＿６．２（ＧＣＡ＿０００１８１３３５．２））から「嗅覚受容体」を含む遺伝子アノテーションのための配列を抽出した。加えて、イヌ、ヒト、マウス、ゾウ、ウシ、ウマ、ウサギ、及びモルモットのヌクレオチド配列（Niimura et al., 2015）を、ネコゲノムに対する検索に使用した。ネコ参照配列を、６５パーセント同一性及び＞＝６５０ｂｐ長を有するすべての一意的アラインメントについて抽出した。代表のみを保持している最長の最初の配列クラスタリングを使用して、冗長配列（＞＝９５％同一性）を取り除いた（Fu et al., 2012）。ｅｍｂｏｓｓ  ｐａｃｋａｇｅのｓｉｘｐａｃｋを使用して、これらの代表についてのアミノ酸翻訳を特定し（Rice et al., 2000）、オープンリーディングフレーム内の最長アミノ酸配列を選択した。
【０１９１】
１，１００のイヌ嗅覚受容体及び７７４の推定されるネコ嗅覚受容体の核酸及びアミノ酸配列が、配列番号：６１〜３８０８に記載されている。
【０１９２】
実施例３  −  インビトロアッセイを使用するイヌ及びネコ嗅覚受容体モジュレータの特定
本実施例は、異なるネコ及びイヌ嗅覚受容体（ＯＲ）の機能的発現について言及する。１０の配列はネコの起源を有し、残りの１０はイヌの起源を有する、２０のＯＲ配列を選択した。これらのＯＲを、該ＯＲの一次的な機能発現に適した改質された発現ベクターへとサブクローン化した。次に、ネコ及びイヌＯＲの脱オーファン化を目的として、一時的に発現した受容体をさまざまな濃度のさまざまな匂い物質で刺激した。図１２に示されるように、次の細胞株及びアッセイのいずれか一方又は両方で、ＯＲ反応性が検出された：１）ＨＥＫ２９３  ＰＥＡＫｒａｐｉｄ／ＲＴＰ１ｓ  ｅｎｄｏ（レポーター細胞株Ａ）及びＣＲＥ−ＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼ受容体アッセイ；並びに、２）ＨＥＫ２９３／Ｎａｔクライティン／ＣＮＧ／ＲＴＰ１ｓ（レポーター細胞株Ｂ）ｅｎｄｏ及びＣＮＧ  ｃｈＡＭＰｉｏｎアッセイ。さまざまなＯＲセットの機能的発現は、レポーター細胞株Ａ又はＢでは一時的であった。一時的にトランスフェクトされたＯＲを、３つの濃度（ｎ＝４）のさまざまな匂い物質（少なくとも３を）で刺激した。
【０１９３】
材料及び方法
細胞株。以下の細胞株を本プロジェクトに使用した：
・レポーター細胞株Ａ（ＣＲＥ−ルシフェラーゼ、ＧｌｏＳｅｎｓｏｒ、及びＰＫＡ−ＮａｎｏＢｉＴアッセイ用）：ＨＥＫ２９３  ＰＥＡＫｒａｐｉｄ／ＲＴＰ１ｓ  ｅｎｄｏ
・レポーター細胞株Ｂ（ｃｈＡＭＰｉｏｎアッセイ用）：ＨＥＫ２９３／ＣＮＧ／ｎａｔ−クライティン／ＲＴＰ１ｓ  ｅｎｄｏ。
【０１９４】
細胞培養培地。ウシ胎児血清（ＳｉｇｍａカタログＦ７５２４；最終的な濃度１０％）、ペニシリン−ストレプトマイシン（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒカタログＤＥ１７−６０２Ｅ；５ｍＬの１００倍溶液）、及び以下の選択抗生物質：
・ＨＥＫ２９３  ＰＥＡＫｒａｐｉｄ／ＲＴＰ１ｓ  ｅｎｄｏ：０．１ｍｇ／ｍＬのＧ４１８、０．２ｍｇ／ｍＬのハイグロマイシン、０．１ｍｇ／ｍＬのゼオシン
・ＨＥＫ２９３／ＣＮＧ／ｎａｔ−クライティン／ＲＴＰ１ｓ  ｅｎｄｏ：０．８ｍｇ／ｍＬのＧ４１８、５０μｇ／ｍＬ  ゼオシン、０．６μｇ／ｍＬのピューロマイシン
を補充したＤＭＥＭ高グルコース（Ｌｏｎｚａ  ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒカタログＢＥ１２−６０４Ｆ／Ｕ１；５００ｍＬ）中で、細胞を維持した。
【０１９５】
細胞培養条件。細胞株を、３７℃、５％のＣＯ２、及び９０％の湿度において、それらのそれぞれの完全培地中で維持した。細胞を週に２回分割した。標準的な伝播条件下で、約４ｘ１０６細胞をＴ２２５フラスコに播種し、約３０ｘ１０６細胞／フラスコを回収した。分割するために、細胞をＰＢＳで穏やかに洗浄し、次に、室温又は３７℃で５分間、トリプシンとともにインキュベートした。培地を加え、細胞を再懸濁した。
【０１９６】
緩衝液。０ｍＭのカルシウムを有するタイロード緩衝液：自社溶液（水中、１３０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＮａＨＣＯ３、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４；滅菌ろ過及びオートクレーブ処理済み）。タイロード緩衝液：自社溶液（水中、１３０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＮａＨＣＯ３、２ｍＭのＣａＣｌ２、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４；滅菌ろ過及びオートクレーブ処理済み）。１０ｍＭのカルシウムを有するタイロード緩衝液：０ｍＭのカルシウム＋１０ｍＭのＣａＣｌ２を有するタイロード緩衝液。塩化カルシウム（二水和物）：Ｓｉｇｍａ社、２２３５０６、１Ｍの原液、水中で調製し、室温で保管した。セレンテラジン：原液：ＤＭＳＯ（１１．８ｍＭ）中、５ｍｇ／ｍＬ、３０μＭのグルタチオンを含む；分注し、−２０℃で保管；実験用にタイロード緩衝液で１：１０００希釈した（最終濃度：１１．８μＭ）。
【０１９７】
ＯＲ配列。イヌＯＲ配列の配列番号：１１〜２０及びネコＯＲ配列の配列番号：２１〜３０を使用した。これらの配列を合成し、Ｎ末端ＳＳＴＲ３輸送タグを有するｐｃＤＮＡ５発現ベクターにクローニングした。
【０１９８】
ＯＲリガンド。フェーズ２におけるＯＲと匂い物質との組合せ試験が表３に提供されている。
【０１９９】
【表３−１】
2020501505.tif 000005
【０２００】
【表３−２】
2020501505.tif 000006
【０２０１】
ＯＲ＿３の４つの化合物（灰色で強調表示）は、受容体に対して個々には試験しなかったが、混合物に含まれていた。化合物はすべて、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入した。個々の化合物に加えて、混合物も、幾つかのＯＲにおいて、本プロジェクトのフェーズ２で試験した。フェーズ２において幾つかのＯＲに対して試験した混合物の組成が表４に提供されている。
【０２０２】
【表４】
2020501505.tif 000007
【０２０３】
フェーズ３では、ＯＲ（常に、ヒト、イヌ、及びネコＯＲを含む）と匂い物質とのすべての陽性の組合せを、全用量反応曲線において試験した。フェーズ３で試験したＯＲと匂い物質との組合せが、表５に提供されている。
【０２０４】
【表５】
2020501505.tif 000008
【０２０５】
アッセイキット。製造業者の指示書に従って以下のキットを使用した：
ＣＲＥ−ＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼアッセイ用のｎａｎｏ−Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ系（Ｐｒｏｍｅｇａ社）
アッセイプロトコル
ＣＲＥ−ＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼアッセイ。ＣＲＥ−ＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ社）とともに、それぞれＯＲをコードするプラスミドを、１：１の比で、ＨＥＫ２９３  ＰＥＡＫｒａｐｉｄ／ＲＴＰ１ｓ  ｅｎｄｏ細胞に一時的にトランスフェクトし、ポリ−Ｄ−リジンでコーティングしたブラックのクリアボトム３８４ＭＴＰにおいて、２５μＬ／ウェルの完全増殖培地に２０，０００細胞／ウェルで播種した。
【０２０６】
２４時間後、細胞培地を手動で除去し、細胞を２０μＬ／ウェルのタイロード緩衝液でインキュベートした。０ｍＭのカルシウムを有するタイロード緩衝液中で調製した化合物を細胞に加えた（１０μＬ／ウェルの３倍溶液）。次に、細胞を、３７℃で３〜４時間、インキュベートした。プレートを発光プレートリーダー（ＦＬＩＰＲＴＥＴＲＡ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社）で読み取った。発光（カメラ設定：露光時間：０．９９秒；最大ゲイン）を、２０μＬ／ウェルのＮａｎｏＧｌｏ試薬の添加後、９０秒間記録した。
【０２０７】
Ｓｃｒｅｅｎｗｏｒｋｓ（商標）ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社、バージョン４．０．０．３０）を用いて、データを分析した。発光値（ＲＬＵ単位）を、２０〜７５秒の平均値としてエクスポートした。生値の使用に加えて、データをバックグラウンド信号に対して正規化も行い（緩衝液のみを含むウェル）、「倍率変化」（平均値（ｎ＝２）／緩衝液ウェルの平均値（ｎ＝２））として表した。Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社）及びＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，  Ｉｎｃ．社）を使用して、データ解析及びグラフのプロットを行った。
【０２０８】
ｃｈＡＭＰｉｏｎ（ＣＮＧチャネル）アッセイ。ＨＥＫ２９３／ＣＮＧ／ｎａｔ−クライティン／ＲＴＰ１ｓ  ｅｎｄｏ細胞をそれぞれのＯＲをコードするプラスミドで一時的にトランスフェクトし、ポリ−Ｄ−リジンでコーティングしたブラックのクリアボトム３８４ＭＴＰにおいて、２５μＬ／ウェルの完全増殖培地に２０，０００細胞／ウェルで播種した。
【０２０９】
２４時間後、細胞培地を手動で除去し、細胞を手動で除去し、３７℃で３．５時間、０ｍＭのカルシウムで、タイロード緩衝液中、２０μＬ／ウェルのセレンテラジン（１１μＭ）でインキュベートした。次いで、プレートを次のカメラ設定で、発光プレートリーダー（ＦＬＩＰＲＴＥＴＲＡ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社）で読み取った：露光時間：０．５３３秒、最大ゲイン。１０μＬ／ウェルの化合物（０ｍＭのカルシウムを有するタイロード緩衝液中で調製した３倍溶液）を添加した後、１分間発光を記録し、続いて３７℃で３０分間、インキュベートした。１０ｍＭのＣａＣｌ２を含む２０μＬ／ウェルのタイロード緩衝液の添加後に、再び、発光を１分間記録した。化合物添加後の最初の読み取りは、受容体−Ｇαｑシグナル伝達経路をモニタリングする（予想通り、シグナルはここでは観察されなかった）。カルシウム添加後の２回目の読み取りは、ＯＲ−Ｇαｓシグナル伝達をモニタリングする；これらのデータを分析した。
【０２１０】
Ｓｃｒｅｅｎｗｏｒｋｓ（商標）ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社、バージョン４．０．０．３０）を用いて、データを分析した。発光値（ＲＬＵ単位）を、１０秒〜４０秒の間の最大ＲＬＵとしてエクスポートした。生値の使用に加えて、データをバックグラウンド信号に対する正規化も行い（緩衝液のみを含むウェル）、「倍率変化」（平均値（ｎ＝２）／緩衝液ウェルの平均値（ｎ＝２））として表した。Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社）及びＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，  Ｉｎｃ．社）を使用して、データ解析及びグラフのプロットを行った。 
【０２１１】
結果
プロジェクトのフェーズ１では、このプロジェクトで分析される２０のＯＲ配列、１０のイヌ配列、及び１０のネコ配列がＭａｒｓ  Ｐｅｔｃａｒｅ社によって提出された。ＯＲ配列を合成し、それらの発現及び原形質膜局在化を容易にするために、ＯＲタンパク質のＮ末端に輸送エピトープタグを付加する発現ベクターへとサブクローン化した。
【０２１２】
イヌ及びネコのＯＲの最初の機能試験をフェーズ２で行った。各々、ヒト、ネコ、及びイヌのオーソログ（並びに、ＯＲ＿１０、ＯＲ８Ｂ８の事例では、マウスのオーソログも）で構成されるＯＲのセットを、ヒトのオーソログ又は予測される潜在的な活性において公表されている活性に基づいて事前に選択された３つの濃度の最低３つの匂い物質で試験した。ほとんどのＯＲのセットはまた、各々１２の匂い物質からなる２つの混合物を用いてチャレンジした。全ＯＲセットを、２つの細胞系アッセイ、ＣＲＥ−ＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼアッセイ、及びＣＮＧ  ｃｈＡＭＰｉｏｎアッセイで並行して試験した。これら２つのアッセイは、以前の研究で試験した１０のヒトＯＲについての２つの最良のアッセイであることが判明した。
【０２１３】
フェーズ２で試験した１０のＯＲセットのうち、７セットは少なくとも１つの化合物に対して少なくとも１つの受容体オーソログの反応を示した（図１４及び１５）。幾つかのＯＲが複数の化合物に対して反応した。４つのＯＲセットでは、イヌとネコの両方のＯＲが活性を示した；これらには、ヒトオーソログがイヌ及びネコの受容体と同じリガンドのセットに対して反応しなかったＯＲ＿２（ＯＲ６Ｐ１）セットが含まれる。他の３つのＯＲセットについては、それぞれ、イヌのオーソログ又はネコのオーソログのみが反応した。
【０２１４】
該プロジェクトのフェーズ３では、すべての利用可能なオーソログを含む６つの陽性ＯＲセットを、８つの濃度におけるそれらの陽性リガンドを用いて再試験し、用量反応曲線を計算した。フェーズ３の結果を図１６及び１７にまとめる。簡潔に言えば、６つのイヌＯＲは、活性であることが示された（多数のリガンドを有する）：ＯＲ６Ｐ１（２）；ＯＲ５１Ｅ１（３−４）；ＯＲ５１Ｌ１（１）；ＯＲ２Ｃ１（１）；ＯＲ５Ａ１（４）；ＯＲ８Ｂ８（３）。加えて、６つのネコＯＲが活性を示した：ＯＲ６Ｐ１（２）；ＯＲ５１Ｅ１（３−４）；ＯＲ５１Ｌ１（２）；ＯＲ４Ｅ２（１）；ＯＲ２Ｃ１（１）；ＯＲ５Ａ１（４）；ＯＲ８Ｂ８（１）。
【０２１５】
データはすべて、図１８〜４３に詳細に示されている。図１８〜３７は、フェーズ２アッセイで得られた結果を表している。図３８〜４３は、フェーズ３アッセイにおける陽性リガンドの用量反応曲線を表している。次のデータをエクスポートした：ＣＲＥ−ルシフェラーゼ：平均１５ｓ〜６０ｓ；ｃｈＡＭＰｉｏｎアッセイ：最大１０ｓ〜３０ｓ。データを「倍率変化」として正規化した（緩衝値の平均と比較）。すべての対数の底は１０である。
【０２１６】
実施例４−インビトロアッセイを使用するイヌ及びネコ嗅覚受容体モジュレータの特定。
【０２１７】
本実施例は、嗅覚受容体リガンドによってイヌ又はネコ嗅覚受容体の活性化を調節する化合物を特定するためのインビトロアッセイについて記載する。
【０２１８】
推定される嗅覚受容体モジュレータとして、実施例１で詳述したように、嗅覚受容体を用いたインシリコ・モデリングによって特定された化合物を、インビトロでのさらなる試験のために選択する。選択されたモジュレータのインビトロでの機能的特徴付けを使用して、嗅覚受容体リガンドによる嗅覚受容体の活性化の調節における、推定されるモジュレータ化合物の有効性を評価する。
【０２１９】
イヌ又はネコ嗅覚受容体（例えば、イヌＣａｆａＯＲ９．２．９、ＣａｆａＯＲ３８．１．２１、ＣａｆａＯＲ２１．２．１５、ＣａｆａＯＲ２１．２．４３、ＣａｆａＯＲ１５．２．２０、ＣａｆａＯＲ１８．３．１１、ＣａｆａＯＲ１５．３．１、ＣａｆａＯＲ６．３．１、ＣａｆａＯＲ１８．３．１２、ＣａｆａＯＲ５．２．５、又はネコＥ１：１３３４７０３０−１３３４７９７７、Ｆ１：６５１３４９０４−６５１３５８５８、Ｄ１：６２９５５８３９−６２９５６７９２、Ｄ１：６３３１２３２７−６３３１３２８９、Ｂ３：７２９０８２９５−７２９０９２８７、Ｄ１：１０５４８６５２８−１０５４８７４９３、Ｂ３：７４１１６９５５−７４１１７８９３、Ｅ３：４０２３７９０４−４０２３８８４２、Ｄ１：１０５４６２５５４−１０５４６３５１２、Ｄ１：２１２６６８２４−２１２６７７６８、若しくは、配列番号：６１〜３８０８に記載されるヌクレオチド配列又はアミノ酸配列を有する受容体のいずれか１つ）を安定的に又は一過的に発現するＨＥＫ２９３細胞（又は他の適切な発現系）は、嗅覚受容体の活性及び／又は発現を調節するために、推定されるモジュレータ化合物及び嗅覚受容体リガンド（例えば、アゴニスト）に曝露される。
【０２２０】
インビトロアッセイの例示的な方法は次のとおりである。一過性トランスフェクションはすべて、製造業者のプロトコルに従って、例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて行われる。１０μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を５００μｌのＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）中に希釈し、室温で５分間、インキュベートする。３μｇのプラスミドＤＮＡ（１μｇ／μｌ）を５００μｌのＤＭＥＭ中に希釈し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００混合物に加えて、１０００μｌの最終的な容量を得る。室温でさらに３０分間インキュベートした後、ＤＮＡ−リポフェクタミン複合体を１，４００，０００細胞／ｍｌを含む、１０００μｌの細胞懸濁液に加える。その後、２５μｌの完全な混合物を、ブラックの３８４ウェル・ポリスチレンアッセイプレートの各ウェルに播種する。トランスフェクションの３時間後に、トランスフェクション混合物を細胞から取り出し、１０％のＦＢＳ及び１％のＰ／Ｓを含む新鮮なＤＭＥＭを加える。トランスフェクションの２７〜３０時間後に、培地を細胞から取り除き、カルシウム感受性蛍光染料又は発光基質（蛍光用のタイロード緩衝液＋２μＭのＦｌｕｏ４−ＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）＋２．５ｍＭのプロベネシド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含む２０μｌの負荷緩衝液、又は発光用のセレンテラジン（Ｂｉｏｓｙｎｔｈ社）＋タイロード緩衝液）を、３７℃で１時間（蛍光）又は３時間（発光）、加える。次に、細胞を、蛍光プロトコルについては自動プレート洗浄機（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  Ａｓｙｓプレートウォッシャー）を使用して、タイロード緩衝液で２０分ごとに２回洗浄する。発光プロトコルでは洗浄ステップは不要である。
【０２２１】
次に、例えば、カルシウム感受性の蛍光染料、カルシウム感受性かつ発光性の発光タンパク質を使用して細胞内カルシウムレベルの変化を検出することなどによって、あるいは、当技術分野で知られている任意の検出システムによって、嗅覚受容体の活性化を検出する。嗅覚受容体を発現しない細胞（ＭＯＣＫ対照）を対照として使用する。このようなデータ収集システムの例としては、ＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ又はＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ（登録商標）３システムが挙げられる。しかしながら、例えば、処理した細胞の顕微鏡イメージングなど、他のイメージング技術及びシステムを使用してもよい。
【０２２２】
各推定される嗅覚受容体モジュレータについては、用量反応曲線を、少なくとも８つの濃度で三重に生成し、推定される嗅覚受容体モジュレータのＥＣ５０値を決定する。例えば、ＳｉｇｍａＰｌｏｔ  Ｖ１２（Ｓｙｓｔａｔソフトウェア）で、標準誤差を表すエラーバーとともに、グラフをプロットする。
【０２２３】
参照文献
Niimura, Y., & Nei, M. (2007). Extensive Gains and Losses of Olfactory Receptor Genes in Mammalian Evolution. PLoS ONE, 2(8), e708. http://doi.org/10.1371/journal.pone.0000708
Niimura, Y., Matsui, A., & Touhara, K. (2015). Corrigendum: Extreme expansion of the olfactory receptor gene repertoire in African elephants and evolutionary dynamics of orthologous gene groups in 13 placental mammals. Genome Research, 25(6), 926
Fu L, Niu B, Zhu Z, Wu S, Li W. CD-HIT: accelerated for clustering the next-generation sequencing data. Bioinformatics. 2012 Dec 1;28(23):3150-2. doi:10.1093/bioinformatics/bts565. Epub 2012 Oct 11. PubMed PMID: 23060610; PubMedCentral PMCID: PMC3516142
Rice P, Longden I, Bleasby A. EMBOSS: the European Molecular Biology Open Software Suite. Trends Genet. 2000 Jun;16(6):276-7. PubMed PMID: 10827456。
【０２２４】
本明細書に開示された主題及びその利点について詳細に説明してきたが、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、さまざまな変更、置換、及び変更が本明細書においてなされうることが理解されるべきである。さらには、本出願の範囲は、明細書に記載されたプロセス、機械、製造、物質の組成、手段、方法、及びステップの特定の実施形態に限定されることを意図していない。当業者であれば、本明細書に記載された対応する実施形態と実質的に同じ機能を実行する、若しくは、実質的に同じ結果を達成する、既存の又は今後開発される、プロセス、機械、製造、物質の組成、手段、方法、又はステップを、本開示の主題に従って利用することができることを、本開示の主題の開示から容易に理解するであろう。したがって、添付の特許請求の範囲は、それらの範囲内にこのようなプロセス、機械、製造、物質の組成、手段、方法、又はステップを含むことが意図されている。
【０２２５】
特許、特許出願、刊行物、製品の説明書及びプロトコルは、本出願全体にわたって引用されており、すべての目的のために、それらの開示全体が、ここに参照することによって本明細書に組み込まれる。
【０２２６】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、その全体が参照することによって本明細書に組み込まれる、配列表を含む。２０１７年９月７日に作成された該ＡＳＣＩＩデータは、０６９２６９＿０２２５＿ＳＬ．ｔｘｔというファイル名であり、サイズは７，１２３，６１９バイトである。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図１−７】
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【図１−８】
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【図１−９】
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【図１−１０】
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【図１−１１】
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【図１−１２】
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【図１−１３】
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【図１−１４】
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【図１−１５】
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【図１−１６】
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【図１−１７】
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【図１−１８】
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【図１−１９】
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【図１−２０】
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【図１−２１】
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【図１−２２】
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【図１−２３】
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【図１−２４】
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【図１−２５】
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【図１−２６】
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【図１−２７】
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【図１−２８】
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【図１−２９】
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【図１−３０】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３９Ａ】
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【図３９Ｂ】
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【図３９Ｃ】
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【図３９Ｄ】
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【図４０Ａ】
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【図４０Ｂ】
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【図４１Ａ】
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【図４１Ｂ】
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【図４２Ａ】
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【図４２Ｂ】
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【図４２Ｃ】
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【図４２Ｄ】
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【図４２Ｅ】
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【図４２Ｆ】
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【図４２Ｇ】
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【図４２Ｈ】
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【図４３Ａ】
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【図４３Ｂ】
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【図４３Ｃ】
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【配列表】
2020501505000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年9月3日(2019.9.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１−１】
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【図１−２】
2020501505.tif 000137
【図１−３】
2020501505.tif 000138
【図１−４】
2020501505.tif 000139
【図１−５】
2020501505.tif 000140
【図１−６】
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【図１−７】
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【図１−８】
2020501505.tif 000143
【図１−９】
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【図１−１０】
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【図１−１１】
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【図１−１２】
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【図１−１３】
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【図１−１４】
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【図１−１５】
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【図１−１６】
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【図１−１７】
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【図１−１８】
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【図１−１９】
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【図１−２０】
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【図１−２１】
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【図１−２２】
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【図１−２３】
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【図１−２４】
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【図１−２５】
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【図１−２６】
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【図１−２７】
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【図１−２８】
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【図１−２９】
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【図１−３０】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
2020501505.tif 000167
【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
2020501505.tif 000169
【図２Ｅ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３９Ａ】
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【図３９Ｂ】
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【図３９Ｃ】
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【図３９Ｄ】
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【図４０Ａ】
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【図４０Ｂ】
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【図４１Ａ】
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【図４１Ｂ】
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【図４２Ａ】
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【図４２Ｂ】
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【図４２Ｃ】
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【図４２Ｄ】
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【図４２Ｅ】
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【図４２Ｆ】
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【図４２Ｇ】
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【図４２Ｈ】
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【図４３Ａ】
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【図４３Ｂ】
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【図４３Ｃ】
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【国際調査報告】
2020501505.tif 000263
2020501505.tif 000264
2020501505.tif 000265