(57)【要約】  細胞集団の単クローン性の確率の値を評価するための方法が開示される。
2020505059.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単クローン性の確率についての値を評価する方法であって：
ａ）細胞集団を含む溶液を提供するステップと；
ｂ）該溶液の複数のアリコートを形成するステップと；
ｃ）１個の細胞を有するアリコートを特定するステップと；
ｄ）１個の細胞を有すると特定したアリコートについて、後続の増殖が単クローンであった確率についての値を提供するステップと
を含み、それによって、単クローン性の確率についての値を評価する方法。
【請求項２】
ｂ）が：
ｂ）プリンティングデバイスにより、ピペッティングすることによって、毛細管デバイス（例えばＣＡＣＣにおけるような）を使用して、又は蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）若しくはフローサイトメトリーを使用して、前記溶液の複数のアリコートを形成するステップ
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｂ）が：
ｂ）毛細管デバイス（例えばＣＡＣＣによる）を使用して、前記溶液の複数のアリコートを形成するステップ
を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ｂ）が：
ｂ）蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）又はフローサイトメトリーを使用して、前記溶液の複数のアリコートを形成するステップ
を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
ｃ）が、アリコートが１個の細胞を有し、後続の増殖を示すと特定する、複数のオブザーバーを含む、請求項１から４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ｃ）が、アリコートが１個の細胞を有し、後続の増殖を示すと特定する、２つのオブザーバーを含む、請求項１から５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ｃ）が、アリコートが０個、１個又はそれよりも多い細胞を有するかどうかを特定する、２つのオブザーバーを含む、請求項１から６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ｃ）が、アリコートが０個、１個又はそれよりも多い細胞を有するかどうかを特定し、アリコートが後続の増殖を示すかどうかを特定する、２つのオブザーバーを含む、請求項１から７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ｄ）が：
ｉ）アリコートを、０個、１個又はそれよりも多い細胞を有すると特定し、該アリコートが後続の増殖を示したか又は示さなかったかを特定した頻度についてのデータ値を計算することと；
ｉｉ）確率式及び該データ値を使用して、１個の細胞を有すると特定したアリコートの該後続の増殖が単クローンである確率を評価することと
を含む、請求項１から８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ｄ）ｉ）が：
ｉ）アリコートを、０個、１個又はそれよりも多い細胞を有すると特定し、該アリコートが後続の増殖を示したか又は示さなかったかを特定した頻度についてのデータ値を計算することを含み、該データ値は、表６に列挙するデータ値を含む、請求項１から９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ｄ）ｉ）が：
ｉ）アリコートを、０個、１個又はそれよりも多い細胞を有すると特定し、該アリコートが後続の増殖を示したか又は示さなかったかを特定した頻度についてのデータ値を計算することを含み、該データ値は：
２つのオブザーバーが、後続の増殖を示さない０個の細胞を含有すると特定した、アリコートの数である、ｎ０１；
１つのオブザーバーが、後続の増殖を示さない０個の細胞を含有すると特定し、１つのオブザーバーが、後続の増殖を示さない１個の細胞を含有すると特定した、アリコートの数である、ｎ０２；
２つのオブザーバーが、後続の増殖を示さない１個の細胞を含有すると特定した、アリコートの数である、ｎ０３；
１つのオブザーバーが、後続の増殖を示さない０個の細胞を含有すると特定し、１つのオブザーバーが、後続の増殖を示さない１個よりも多い細胞を含有すると特定した、アリコートの数である、ｎ０４；
１つのオブザーバーが、後続の増殖を示さない１個の細胞を含有すると特定し、１つのオブザーバーが、後続の増殖を示さない１個よりも多い細胞を含有すると特定した、アリコートの数である、ｎ０５；
２つのオブザーバーが、後続の増殖を示さない１個よりも多い細胞を含有すると特定した、アリコートの数である、ｎ０６；
２つのオブザーバーが、後続の増殖を示す０個の細胞を含有すると特定した、アリコートの数である、ｎ１１；
１つのオブザーバーが、後続の増殖を示す０個の細胞を含有すると特定し、１つのオブザーバーが、後続の増殖を示す１個の細胞を含有すると特定した、アリコートの数である、ｎ１２；
２つのオブザーバーが、後続の増殖を示す１個の細胞を含有すると特定した、アリコートの数である、ｎ１３；
１つのオブザーバーが、後続の増殖を示す０個の細胞を含有すると特定し、１つのオブザーバーが、後続の増殖を示す１個よりも多い細胞を含有すると特定した、アリコートの数である、ｎ１４；
１つのオブザーバーが、後続の増殖を示す１個の細胞を含有すると特定し、１つのオブザーバーが、後続の増殖を示す１個よりも多い細胞を含有すると特定した、アリコートの数である、ｎ１５；及び
２つのオブザーバーが、後続の増殖を示す１個よりも多い細胞を含有すると特定した、アリコートの数である、ｎ１６
を含む、請求項１から１０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ｄ）ｉｉ）が：
ｉｉ）前記データ値を、表６に列挙するパラメータからなる未知数を含む確率式にフィッティング／適用して、１個の細胞を有すると特定したアリコートの前記後続の増殖が単クローンである確率を評価すること
を含む、請求項１から１１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ｄ）ｉｉ）が：
ｉｉ）前記データ値を：
アリコートが実際に０個の細胞を含有する場合、オブザーバーが、該アリコートが０個の細胞を含有すると特定する確率である、ｑ００；
アリコートが実際に１個の細胞を含有する場合、オブザーバーが、該アリコートが０個の細胞を含有すると特定する確率である、ｑ１０；
アリコートが実際に０個の細胞を含有する場合、オブザーバーが、該アリコートが１個の細胞を含有すると特定する確率である、ｑ０１；
アリコートが実際に１個の細胞を含有する場合、オブザーバーが、該アリコートが１個の細胞を含有すると特定する確率である、ｑ１１；
アリコートが実際に１個よりも多い細胞を含有する場合、オブザーバーが、該アリコートが１個の細胞を含有すると特定する確率である、ｑ２１；
アリコート中の平均細胞数である、μ；及び
細胞が観察可能な増殖まで増殖する確率である、ｐ
からなる未知数を含む確率式にフィッティング／適用して、１個の細胞を有すると特定したアリコートの前記後続の増殖が単クローンである確率を評価すること
を含む、請求項１から１２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ｄ）ｉｉ）が：
ｉｉ）前記データ値を、
【数１】
2020505059.tif 000043
からなる確率式にフィッティング／適用して、１個の細胞を有すると特定したアリコートの前記後続の増殖が単クローンである確率を評価すること
を含む、請求項１から１３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ｄ）ｉｉ）が：
ｉｉ）前記データ値を、表７に列挙するパラメータからなる未知数を含む確率式にフィッティング／適用して、１個の細胞を有すると特定したアリコートの前記後続の増殖が単クローンである確率を評価することであって、該未知数についての開始値の１つより多い（例えば２、３、４、５、６つ又はそれよりも多い）組が、前記データ値を該確率式に適用するために使用される、評価すること
を含む、請求項１から１４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
ｄ）が：
ｉｉｉ）１つ又は複数の統計分析、例えば最大尤度、最小二乗和、最小カイ二乗又は対数尤度比を使用して前記確率の評価を査定することであって、より高い最大尤度、より低い最小二乗和、より低い最小カイ二乗及びより低い対数尤度比が、より信頼性のある前記確率の評価を示す、査定すること
を更に含む、請求項１から１５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ｃ）のアリコート内の細胞の特定が、蛍光顕微鏡を使用して達成される、請求項１から１６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
単一細胞クローニング技術の信頼性を評価する方法であって：
ａ）細胞集団を含む溶液を提供するステップと；
ｂ）該単一細胞クローニング技術の単クローン性の確率の値の第１の推定を行うステップであって：
ｉ）該溶液の複数のアリコートを形成すること；
ｉｉ）１個の細胞を有するアリコートを特定すること；及び
ｉｉｉ）１個の細胞を有すると特定したアリコートについて、後続の増殖が単クローンであった確率の値を提供すること
を含む第１の推定を行うステップと；
ｃ）所定のインターバルで、該単一細胞クローニング技術を実施するステップと；
ｄ）該単一細胞クローニング技術の単クローン性の確率の値の第２の推定を行うステップであって：
ｉ）該溶液の複数のアリコートを形成すること；
ｉｉ）１個の細胞を有するアリコートを特定すること；及び
ｉｉｉ）１個の細胞を有すると特定したアリコートについて、後続の増殖が単クローンであった確率の値を提供すること
を含む第２の推定を行うステップと；
ｅ）該単一細胞クローニング技術の単クローン性の確率の値の前記第２の推定を単クローン性の確率の前記第１の推定と、又は閾値と比較するステップと
を含み、それによって、単一細胞クローニング技術の信頼性を評価する方法。
【請求項１９】
前記単一細胞クローニング技術を調節して、単クローン性の確率の値を改善するステップを更に含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ｂ）ｉｉ）及びｄ）ｉｉ）が、０個、１個又はそれよりも多い細胞を有するアリコートを特定することを含む、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
ｂ）ｉｉ）及びｄ）ｉｉ）が、蛍光顕微鏡を使用して０個、１個又はそれよりも多い細胞を有するアリコートを特定することを含む、請求項１８から２０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
ｂ）ｉｉ）及びｄ）ｉｉ）が、蛍光顕微鏡を使用して０個、１個又はそれよりも多い細胞を有するアリコートを特定する複数のオブザーバーを含む、請求項１８から２１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
ｂ）ｉｉ）及びｄ）ｉｉ）が、蛍光顕微鏡を使用して０個、１個又はそれよりも多い細胞を有するアリコートを特定する２つのオブザーバーを含む、請求項１８から２２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記オブザーバーが、アリコートの同じ蛍光顕微鏡写真を調査することに基づいて０個、１個又はそれよりも多い細胞を有する該アリコートを特定する、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記オブザーバーが、アリコートの異なる蛍光顕微鏡写真、例えば各オブザーバーについての別個の蛍光顕微鏡写真を調査することに基づいて０個、１個又はそれよりも多い細胞を有する該アリコートを特定する、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記オブザーバーが、アリコートが後続の増殖を示すかどうかを更に特定する、請求項２２から２５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
ｂ）ｉｉｉ）及びｄ）ｉｉｉ）が：
ａ）アリコートを、０個、１個又はそれよりも多い細胞を有すると特定し、該アリコートが後続の増殖を示したか又は示さなかったかを特定した頻度についてのデータ値を計算すること；並びに
ｂ）確率式及び該データ値を使用して、１個の細胞を有すると特定したアリコートの該後続の増殖が単クローンである確率を評価すること
を含む、請求項１８から２６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
ｂ）ｉｉｉ）ａ）及びｄ）ｉｉｉ）ａ）が：
ａ）アリコートを、０個、１個又はそれよりも多い細胞を有すると特定し、該アリコートが後続の増殖を示したか又は示さなかったかを特定した頻度についてのデータ値を計算することであって、該データ値が、表６に列挙するデータ値を含む、計算すること
を含む、請求項１８から２７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
ｂ）ｉｉｉ）ａ）及びｄ）ｉｉｉ）ａ）が：
ａ）アリコートを、０個、１個又はそれよりも多い細胞を有すると特定し、該アリコートが後続の増殖を示したか又は示さなかったかを特定した頻度についてのデータ値を計算することであって、該データ値が：
２つのオブザーバーが、後続の増殖を示さない０個の細胞を含有すると特定した、アリコートの数である、ｎ０１；
１つのオブザーバーが、後続の増殖を示さない０個の細胞を含有すると特定し、１つのオブザーバーが、後続の増殖を示さない１個の細胞を含有すると特定した、アリコートの数である、ｎ０２；
２つのオブザーバーが、後続の増殖を示さない１個の細胞を含有すると特定した、アリコートの数である、ｎ０３；
１つのオブザーバーが、後続の増殖を示さない０個の細胞を含有すると特定し、１つのオブザーバーが、後続の増殖を示さない１個よりも多い細胞を含有すると特定した、アリコートの数である、ｎ０４；
１つのオブザーバーが、後続の増殖を示さない１個の細胞を含有すると特定し、１つのオブザーバーが、後続の増殖を示さない１個よりも多い細胞を含有すると特定した、アリコートの数である、ｎ０５；
２つのオブザーバーが、後続の増殖を示さない１個よりも多い細胞を含有すると特定した、アリコートの数である、ｎ０６；
２つのオブザーバーが、後続の増殖を示す０個の細胞を含有すると特定した、アリコートの数である、ｎ１１；
１つのオブザーバーが、後続の増殖を示す０個の細胞を含有すると特定し、１つのオブザーバーが、後続の増殖を示す１個の細胞を含有すると特定した、アリコートの数である、ｎ１２；
２つのオブザーバーが、後続の増殖を示す１個の細胞を含有すると特定した、アリコートの数である、ｎ１３；
１つのオブザーバーが、後続の増殖を示す０個の細胞を含有すると特定し、１つのオブザーバーが、後続の増殖を示す１個よりも多い細胞を含有すると特定した、アリコートの数である、ｎ１４；
１つのオブザーバーが、後続の増殖を示す１個の細胞を含有すると特定し、１つのオブザーバーが、後続の増殖を示す１個よりも多い細胞を含有すると特定した、アリコートの数である、ｎ１５；及び
２つのオブザーバーが、後続の増殖を示す１個よりも多い細胞を含有すると特定した、アリコートの数である、ｎ１６
を含む、計算すること
を含む、請求項１８から２８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
ｂ）ｉｉｉ）ｂ）及びｄ）ｉｉｉ）ｂ）が：
ｂ）前記データ値を、表６に列挙するパラメータからなる未知数を含む確率式にフィッティング／適用して、１個の細胞を有すると特定したアリコートの前記後続の増殖が単クローンである確率を評価すること
を含む、請求項１８から２９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
ｂ）ｉｉｉ）ｂ）及びｄ）ｉｉｉ）ｂ）が：
ｂ）前記データ値を：
アリコートが実際に０個の細胞を含有する場合、オブザーバーが、該アリコートが０個の細胞を含有すると特定する確率である、ｑ００；
アリコートが実際に１個の細胞を含有する場合、オブザーバーが、該アリコートが０個の細胞を含有すると特定する確率である、ｑ１０；
アリコートが実際に０個の細胞を含有する場合、オブザーバーが、該アリコートが１個の細胞を含有すると特定する確率である、ｑ０１；
アリコートが実際に１個の細胞を含有する場合、オブザーバーが、該アリコートが１個の細胞を含有すると特定する確率である、ｑ１１；
アリコートが実際に１個よりも多い細胞を含有する場合、オブザーバーが、該アリコートが１個の細胞を含有すると特定する確率である、ｑ２１；
アリコート中の平均細胞数である、μ；及び
細胞が観察可能な増殖まで増殖する確率である、ｐ
からなる未知数を含む確率式にフィッティング／適用して、１個の細胞を有すると特定したアリコートの前記後続の増殖が単クローンである確率を評価すること
を含む、請求項１８から３０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
ｂ）ｉｉｉ）ｂ）及びｄ）ｉｉｉ）ｂ）が：
ｂ）前記データ値を、
【数２】
2020505059.tif 000044
からなる確率式にフィッティング／適用して、１個の細胞を有すると特定したアリコートの前記後続の増殖が単クローンである確率を評価すること
を含む、請求項１８から３１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
ｂ）ｉｉｉ）ｂ）及びｄ）ｉｉｉ）ｂ）が：
ｂ）前記データ値を、表７に列挙するパラメータからなる未知数を含む確率式にフィッティング／適用して、１個の細胞を有すると特定したアリコートの前記後続の増殖が単クローンである確率を評価することであって、該未知数についての開始値の１つより多い（例えば２、３、４、５、６つ又はそれよりも多い）組が、前記データ値を該確率式に適用するために使用される、評価すること
を含む、請求項１８から３２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
ｂ）ｉｉｉ）及びｄ）ｉｉｉ）が：
ｃ）１つ又は複数の統計分析、例えば最大尤度、最小二乗和、最小カイ二乗又は対数尤度比を使用して前記確率の評価を査定することであって、より高い最大尤度、より低い最小二乗和、より低い最小カイ二乗及びより低い対数尤度比が、より信頼性のある前記確率の評価を示す、査定すること
を更に含む、請求項１８から３３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記単一細胞クローニング技術が、ＣＡＣＣ、ＦＡＣＳ又はスポッティングから選択される、請求項１８から３４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記単一細胞クローニング技術が、ＣＡＣＣである、請求項１８から３５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記単一細胞クローニング技術が、ＦＡＣＳである、請求項１８から３５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記単一細胞クローニング技術が、スポッティングである、請求項１８から３５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記インターバルが、いくつかのアリコートを、単クローン性の前記確率の値を評価することなく形成することを含む、請求項１８から３８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
アリコートの数が、少なくとも１、１０、５０、１００、２００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００又はそれよりも多い、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記インターバルが、いくつかのマルチウェルプレート、例えば９６ウェルプレートを、単クローン性の前記確率の値を評価することなくアリコートで満たすことを含む、請求項１８から３８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
マルチウェルプレート、例えば９６ウェルプレートの数が、少なくとも１、５、１０、１５、２０、２５、３０又はそれよりも多い、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記方法の前記ステップが：
ａ）、ｂ）、［ｃ）、ｄ）、ｅ）］ｎ
の形態をとり、［ｃ）、ｄ）、ｅ）］が、ｎ回繰り返され、ｎが、１よりも大きいか、又は１に等しい、請求項１８から４２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
ｎが、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０よりも大きいか、又はこれに等しい、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
ｅ）が：
ｅ）前記単一細胞クローニング技術の単クローン性の前記確率の前記値の前記第２の推定を、前記第１の推定と比較するステップ
を含む、請求項１８から４４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
ｅ）が：
ｅ）前記単一細胞クローニング技術の単クローン性の前記確率の前記値の前記第２の推定を、単クローン性の前記確率の閾値と比較するステップ
を含む、請求項１８から４４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
オブザーバー又は複数のオブザーバーが、ヒトオブザーバー（単数又は複数）である、請求項１から４６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
オブザーバー又は複数のオブザーバーが、機械オブザーバー（単数又は複数）である、請求項１から４６までのいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１７年１月１８日出願の米国特許出願第６２／４４７，７２４号及び２０１７年５月１２日出願の米国特許出願第６２／５０５，２９３号の優先権を主張し、当該出願の全内容は、それらを全体として参照により本明細書に組み込む。
【０００２】
本開示は、単一細胞を含有すると特定したアリコートの増殖における単クローン性の確率を評価する方法に関する。本開示はまた、治療用ポリペプチドを生成するための単クローン細胞系を生成する方法の信頼性の評価に関する。
【背景技術】
【０００３】
細胞系のクローン性を保証することは、定性的及び定量的細胞培養科学並びに製造経済にとって必須である。クローンではない細胞系は、製造使用について一貫性がなく、信頼性がない場合がある。また、クローニング手技が、生成細胞系の調製又は誘導において使用されてきたことは、規制的期待値である。最近、単クローン性を達成するために使用される方法は、益々精査されており、とられたある特定のアプローチに対して関心が示されている。
【０００４】
限界希釈は、統計分布に頼る、通常使用される細胞クローニング法である（Ｐｕｃｋ及びＭａｒｃｕｓ、１９５５年）。この技術の限界は、細胞の播種がポアソン分布に従う一方で、観察されたコロニー数は、ポアソン分布に従わないことである（Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄ及びＢｅａｎ、１９８８年；Ｃｏｌｌｅｒ及びＣｏｌｌｅｒ、１９８６年）。それゆえ、単クローン性の確率の許容可能なレベルを達成するために、多ラウンドの限界希釈クローニングが典型的に必要である。クローン細胞系の創出は多くの場合、治療用製品開発中の重要な進路活動であるので、単一ラウンドのクローニングを使用してクローン細胞系のより速い誘導を可能にする代替の方法が開発されている。これらの方法として、「スポッティング」技術、蛍光標識細胞分取及びクローニングリングが挙げられる。毛細管支援細胞クローニング（ｃａｐｉｌｌａｒｙ−ａｉｄｅｄ  ｃｅｌｌ  ｃｌｏｎｉｎｇ）技術は、Ｃｌａｒｋｅ及びＳｐｉｅｒ、１９８０年によって説明される「スポッティング」技術の変形として開発された。
【０００５】
蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ：ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）は、単一細胞を迅速に単離するために使用されており、限界希釈法で必要とされる多ラウンドの代わりに、単回のクローニングラウンドにおいて高確率の単クローン性が達成される。典型的に、単一細胞分取のためのＦＡＣＳ設定を支持する供給業者のデータ及び推奨に対する信頼がある。
【０００６】
毛細管支援細胞クローニング（ＣＡＣＣ）技術は、希釈細胞懸濁液の液滴をマルチウェルプレートに分配するための毛細管の使用を含む。典型的に、２人の科学者が独立して、中に含有される細胞数について液滴を目視検査する。両方の科学者が独立して、クローニング中に単一細胞の観察を報告したウェル中で増殖していることが分かったコロニーは、単クローンと考えられる。
【０００７】
毛細管支援細胞クローニング技術の使用は、いくつかの利点を提供するが、細胞クローニング法にかかわらず、クローン細胞系の生成の信頼性を査定する；換言すれば、単クローンであると特定した細胞系が実際に単クローンである確率を評価する必要性が存在している。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本開示は、一部には、細胞系生成プロセスにおいて提供された細胞集団から分配された複数のアリコートの中で、単一細胞を含有すると特定したアリコートの増殖の単クローン性の確率の値を評価することが可能であるという発見に基づく。本明細書において開示する方法は、治療用ポリペプチドを生成するための単クローン細胞系を生成する方法の信頼性の評価を提供し、単クローン細胞系を生成する多種多様な方法の単クローン性の確信を増大させる。理論に束縛されるものではないが、アリコートを、０個、１個又はそれよりも多い細胞を有すると特定し、アリコートが後続の増殖を示したか又は示さなかったかを特定した頻度についてのデータ値の計算を、確率式に適用し、１個の細胞を含有すると特定したアリコートからの増殖が単クローン増殖である確率についての値を生成することができると考えられる。したがって、単クローン性の確率についての値を評価するための方法を本明細書において開示する。これらの方法は、細胞集団を含む溶液を提供するステップと、溶液の複数のアリコートを形成するステップと、０個、１個又はそれよりも多い細胞を有するアリコートを特定するステップと、１個の細胞を有すると特定したアリコートについて、後続の増殖が単クローンであった確率についての値を提供するステップとを含む。したがって、また、細胞系の例、複数のアリコートを形成する方法、アリコート中の細胞数を特定する方法及び単クローン性の確率についての値を提供するための方法を、本明細書において提供する。本明細書において開示する方法は、本明細書において説明する方法の使用を伴わない場合でさえも、許容される、それどころか非常に良い結果を与えるＣＡＣＣなどの方法を含む、単クローン性を達成するための様々な方法のいずれかを改善するために適用することができる。本明細書において説明する方法は、細胞の存在若しくは非存在についての直接的なヒトによる検査、又は細胞の存在若しくは非存在の検出のための機械ベース、例えばコンピュータベースの画像分析に頼る単クローン性を達成するための方法で使用することができる。本明細書において説明する方法は、機械ベースのスコア付けの性能の信頼性を改善することができる。
【０００９】
したがって、一態様において、本発明は、単クローン性の確率についての値を評価する方法であって、細胞集団を含む溶液を提供するステップと、溶液の複数のアリコートを形成するステップと、１個の細胞を有するアリコートを特定するステップと、１個の細胞を有すると特定したアリコートについて、後続の増殖が単クローンであった確率についての値を提供するステップとを含み、それによって、単クローン性の確率についての値を評価する方法を特徴とする。
【００１０】
一実施形態において、溶液の複数のアリコートを形成するステップは、プリンティングデバイスを使用して、ピペッティングすることによって、毛細管デバイス（例えばＣＡＣＣにおけるような）を使用して、又は蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）若しくはフローサイトメトリーを使用して達成される。
【００１１】
一実施形態において、溶液の複数のアリコートを形成するステップは、毛細管デバイス（例えばＣＡＣＣにおけるような）を使用して達成される。
【００１２】
一実施形態において、溶液の複数のアリコートを形成するステップは、ＦＡＣＳ又はフローサイトメトリーを使用して達成される。
【００１３】
一実施形態において、１個の細胞を有するアリコートを特定するステップは、ＦＡＣＳ又はフローサイトメトリーを使用して達成される。
【００１４】
一実施形態において、溶液の複数のアリコートを形成するステップ、及び１個の細胞を有するアリコートを特定するステップは、ＦＡＣＳ又はフローサイトメトリーを使用して達成される。
【００１５】
一実施形態において、オブザーバー、例えばヒトオブザーバー又は機械オブザーバーは：
ａ）例えば０個、１個又は１個よりも多い細胞を有するいくつかのアリコートを含む、複数のアリコート中の細胞数を特定し；
ｂ）１個の細胞を有するアリコートを特定し、アリコートが後続の増殖を示すかどうかを特定し；
ｃ）ｂ）又はｃ）についての値を記憶する。
【００１６】
一実施形態において、オブザーバー、例えばヒトオブザーバー又は機械オブザーバーは、ａ）を行う。
【００１７】
一実施形態において、オブザーバー、例えばヒトオブザーバー又は機械オブザーバーは、ａ）及びｂ）を行う。
【００１８】
一実施形態において、オブザーバー、例えばヒトオブザーバー又は機械オブザーバーは、ａ）、ｂ）及びｃ）を行う。
【００１９】
一実施形態において、第２のオブザーバー、例えば第２のヒトオブザーバー又は第２の機械オブザーバー（又は機械オブザーバーの第２の使用）は、ａ）、ｂ）及びｃ）のうちの１つ又は複数、例えばａ）、ａ）及びｂ）、又はａ）、ｂ）及びｃ）を行う。
【００２０】
一実施形態において、オブザーバー及び第２のオブザーバー、例えば第２のヒトオブザーバー又は第２の機械オブザーバー（又は機械オブザーバーの第２の使用）は両方とも、ａ）、ｂ）及びｃ）のうちの１つ又は複数、例えばａ）、ａ）及びｂ）、又はａ）、ｂ）及びｃ）を行う。
【００２１】
一実施形態において、複数の、例えば２つのオブザーバー、例えば複数の、例えば２人のヒトオブザーバー、複数の、例えば２つの機械オブザーバー（又は機械オブザーバーの第２の使用）、又はヒトオブザーバー及び機械オブザーバーは、１個の細胞を有するアリコートを特定し、アリコートが後続の増殖を示すかどうかを特定する。
【００２２】
一実施形態において、２つのオブザーバーは、１個の細胞を有するアリコートを特定し、アリコートが後続の増殖を示すかどうかを特定する。
【００２３】
一実施形態において、２つのオブザーバーは、アリコートが０個、１個又はそれよりも多い細胞を有するかどうかを特定し、アリコートが後続の増殖を示すかどうかを特定する。
【００２４】
一実施形態において、オブザーバーによってアリコートに割り当てられた値は、記憶される。
【００２５】
一実施形態において、第２のオブザーバーによってアリコートに割り当てられた値は、記憶される。
【００２６】
一実施形態において、オブザーバー及び第２のオブザーバーによってアリコートに割り当てられた値は、それが事前選択基準に見合う場合、記憶される。一実施形態において、基準は、第１のオブザーバーによって割り当てられた値と、第２のオブザーバーによって割り当てられた値とが同一であること、例えばオブザーバーの両方が、アリコートが単一細胞を有するとスコア付けすることである。一実施形態において、基準は、第１のオブザーバーによって割り当てられた値と、第２のオブザーバーによって割り当てられた値とが、同一ではないこと、例えば一方が、アリコートが１個の細胞を有するとスコア付けした場合に、他方が、アリコートが１個の細胞以外の値を有するとスコア付けすることである。
【００２７】
一実施形態において、１個の細胞を有すると特定したアリコートについて、後続の増殖が単クローンであった確率についての値を提供するステップは、アリコートを、０個、１個又はそれよりも多い細胞を有すると特定し、アリコートが後続の増殖を示したか又は示さなかったかを特定した頻度についてのデータ値を計算することと；確率式及びデータ値を使用して、１個の細胞を有すると特定したアリコートの後続の増殖が単クローンである確率を評価することとを含む。
【００２８】
一実施形態において、１個の細胞を有すると特定したアリコートについて、後続の増殖が単クローンであった確率についての値を提供するステップは、アリコートを、０個、１個又はそれよりも多い細胞を有すると特定し、アリコートが後続の増殖を示したか又は示さなかったかを特定した頻度についてのデータ値を計算することを含み、データ値は、表６に列挙するデータ値を含む。
【００２９】
一実施形態においては、１個の細胞を有すると特定したアリコートについて、後続の増殖が単クローンであった確率についての値を提供するステップは、アリコートを、０個、１個又はそれよりも多い細胞を有すると特定し、アリコートが後続の増殖を示したか又は示さなかったかを特定した頻度についてのデータ値を計算することであって、データ値が：２つのオブザーバーが、後続の増殖を示さない０個の細胞を含有すると特定した、アリコートの数である、ｎ０１；１つのオブザーバーが、後続の増殖を示さない０個の細胞を含有すると特定し、１つのオブザーバーが、後続の増殖を示さない１個の細胞を含有すると特定した、アリコートの数である、ｎ０２；２つのオブザーバーが、後続の増殖を示さない１個の細胞を含有すると特定した、アリコートの数である、ｎ０３；１つのオブザーバーが、後続の増殖を示さない０個の細胞を含有すると特定し、１つのオブザーバーが、後続の増殖を示さない１個よりも多い細胞を含有すると特定した、アリコートの数である、ｎ０４；１つのオブザーバーが、後続の増殖を示さない１個の細胞を含有すると特定し、１つのオブザーバーが、後続の増殖を示さない１個よりも多い細胞を含有すると特定した、アリコートの数である、ｎ０５；２つのオブザーバーが、後続の増殖を示さない１個よりも多い細胞を含有すると特定した、アリコートの数である、ｎ０６；２つのオブザーバーが、後続の増殖を示す０個の細胞を含有すると特定した、アリコートの数である、ｎ１１；１つのオブザーバーが、後続の増殖を示す０個の細胞を含有すると特定し、１つのオブザーバーが、後続の増殖を示す１個の細胞を含有すると特定した、アリコートの数である、ｎ１２；２つのオブザーバーが、後続の増殖を示す１個の細胞を含有すると特定した、アリコートの数である、ｎ１３；１つのオブザーバーが、後続の増殖を示す０個の細胞を含有すると特定し、１つのオブザーバーが、後続の増殖を示す１個よりも多い細胞を含有すると特定した、アリコートの数である、ｎ１４；１つのオブザーバーが後続の増殖を示す１個の細胞を含有すると特定し、１つのオブザーバーが後続の増殖を示す１個よりも多い細胞を含有すると特定した、アリコートの数である、ｎ１５；及び２つのオブザーバーが後続の増殖を示す１個よりも多い細胞を含有すると特定した、アリコートの数である、ｎ１６を含む、計算することを含む。
【００３０】
一実施形態において、１個の細胞を有すると特定したアリコートについて、後続の増殖が単クローンであった確率についての値を提供するステップは、データ値を、表７に列挙するパラメータからなる未知数を含む確率式にフィッティング／適用して、１個の細胞を有すると特定したアリコートの後続の増殖が単クローンである確率を評価することを含む。
【００３１】
一実施形態において、１個の細胞を有すると特定したアリコートについて、後続の増殖が単クローンであった確率についての値を提供するステップは、データ値を：アリコートが実際に０個の細胞を含有する場合、オブザーバーが、アリコートが０個の細胞を含有すると特定する確率である、ｑ００；アリコートが実際に１個の細胞を含有する場合、オブザーバーが、アリコートが０個の細胞を含有すると特定する確率である、ｑ１０；アリコートが実際に０個の細胞を含有する場合、オブザーバーが、アリコートが１個の細胞を含有すると特定する確率である、ｑ０１；アリコートが実際に１個の細胞を含有する場合、オブザーバーが、アリコートが１個の細胞を含有すると特定する確率である、ｑ１１；アリコートが実際に１個よりも多い細胞を含有する場合、オブザーバーが、アリコートが１個の細胞を含有すると特定する確率である、ｑ２１；アリコート中の平均細胞数である、μ；及び細胞が観察可能な増殖まで増殖する確率である、ｐからなる未知数を含む確率式にフィッティング／適用して、１個の細胞を有すると特定したアリコートの後続の増殖が単クローンである確率を評価することを含む。
【００３２】
一実施形態において、１個の細胞を有すると特定したアリコートについて、後続の増殖が単クローンであった確率についての値を提供するステップは、データ値を、
【数１】
2020505059.tif 000003
からなる確率式にフィッティング／適用して、１個の細胞を有すると特定したアリコートの後続の増殖が単クローンである確率を評価することを含む。
【００３３】
一実施形態において、１個の細胞を有すると特定したアリコートについて、後続の増殖が単クローンであった確率についての値を提供するステップは、データ値を、表７に列挙するパラメータからなる未知数を含む確率式にフィッティング／適用して、１個の細胞を有すると特定したアリコートの後続の増殖が単クローンである確率を評価することを含み、未知数についての開始値の２以上（例えば２、３、４、５、６つ又はそれよりも多い）のセットが、データ値を確率式に適用するために使用される。
【００３４】
一実施形態において、１個の細胞を有すると特定したアリコートについて、後続の増殖が単クローンであった確率についての値を提供するステップは、１つ又は複数の統計分析、例えば最大尤度、最小二乗和、最小カイ二乗又は対数尤度比を使用して確率の評価を査定することを更に含み、より高い最大尤度、より低い最小二乗和、より低い最小カイ二乗及びより低い対数尤度比が、より信頼性のある確率の評価を示す。
【００３５】
一実施形態において、本発明は、単一細胞クローニング技術の信頼性を評価する方法であって：ａ）細胞集団を含む溶液を提供するステップと；ｂ）単一細胞クローニング技術の単クローン性の確率の値の第１の推定を行うステップであって：ｉ）溶液の複数のアリコートを形成すること；ｉｉ）１個の細胞を有するアリコートを特定すること；及びｉｉｉ）１個の細胞を有すると特定したアリコートについて、後続の増殖が単クローンであった確率の値を提供することを含む第１の推定を行うステップと；ｃ）所定のインターバルで、単一細胞クローニング技術を実施するステップと；ｄ）単一細胞クローニング技術の単クローン性の確率の値の第２の推定を行うステップであって：ｉ）溶液の複数のアリコートを形成すること；ｉｉ）１個の細胞を有するアリコートを特定すること；及びｉｉｉ）１個の細胞を有すると特定したアリコートについて、後続の増殖が単クローンであった確率の値を提供することを含む第２の推定を行うステップと；ｅ）単一細胞クローニング技術の単クローン性の確率の値の第１及び第２の推定を比較するステップとを含み、それによって、単一細胞クローニング技術の信頼性を評価する方法を特徴とする。別の実施形態において、本方法は、単一細胞クローニング技術を調節して、単クローン性の確率の値を改善するステップを更に含む。
【００３６】
一実施形態において、ｂ）ｉｉ）及びｄ）ｉｉ）は、０個、１個又はそれよりも多い細胞を有するアリコートを特定することを含む。
【００３７】
一実施形態において、ｂ）ｉｉ）及びｄ）ｉｉ）は、蛍光顕微鏡を使用して０個、１個又はそれよりも多い細胞を有するアリコートを特定することを含む。
【００３８】
一実施形態において、ｂ）ｉｉ）及びｄ）ｉｉ）は、蛍光顕微鏡を使用して０個、１個又はそれよりも多い細胞を有するアリコートを特定する複数のオブザーバーを含む。
【００３９】
一実施形態において、ｂ）ｉｉ）及びｄ）ｉｉ）は、蛍光顕微鏡を使用して０個、１個又はそれよりも多い細胞を有するアリコートを特定する２つのオブザーバーを含む。
【００４０】
一実施形態において、オブザーバーは、アリコートの同じ蛍光顕微鏡写真を調査することに基づいて０個、１個又はそれよりも多い細胞を有するアリコートを特定する。
【００４１】
一実施形態において、オブザーバーは、アリコートの異なる蛍光顕微鏡写真、例えば各オブザーバーについての別個の蛍光顕微鏡写真を調査することに基づいて０個、１個又はそれよりも多い細胞を有するアリコートを特定する。
【００４２】
一実施形態において、オブザーバーは、アリコートが後続の増殖を示すかどうかを更に特定する。
【００４３】
一実施形態において、ｂ）ｉｉｉ）及びｄ）ｉｉｉ）は：
ａ）アリコートを、０個、１個又はそれよりも多い細胞を有すると特定し、アリコートが後続の増殖を示したか又は示さなかったかを特定した頻度についてのデータ値を計算すること；並びに
ｂ）確率式及びデータ値を使用して、１個の細胞を有すると特定したアリコートの後続の増殖が単クローンである確率を評価すること
を含む。
【００４４】
一実施形態において、単一細胞クローニング技術は、ＣＡＣＣ、ＦＡＣＳ又はスポッティングから選択される。一実施形態において、単一細胞クローニング技術は、ＣＡＣＣである。一実施形態において、単一細胞クローニング技術は、ＦＡＣＳである。一実施形態において、単一細胞クローニング技術は、スポッティングである。
【００４５】
一実施形態において、インターバルは、いくつかのアリコートを、単クローン性の確率の値を評価することなく形成することを含む。一実施形態において、アリコートの数は、少なくとも１、１０、５０、１００、２００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００又はそれよりも多い。
【００４６】
一実施形態において、インターバルは、いくつかのマルチウェルプレート、例えば９６ウェルプレートを、単クローン性の確率の値を評価することなくアリコートで満たすことを含む。一実施形態において、マルチウェルプレート、例えば９６ウェルプレートの数は、少なくとも１、５、１０、１５、２０、２５、３０又はそれよりも多い。
【００４７】
一実施形態において、本方法のステップは：ａ）、ｂ）、［ｃ）、ｄ）、ｅ）］ｎの形態をとり、［ｃ）、ｄ）、ｅ）］は、ｎ回繰り返され、ｎは、１よりも大きいか、又は１に等しい。一実施形態において、ｎは、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０よりも大きいか、又はそれに等しい。
【００４８】
別の態様において、本発明は、単一細胞クローニング技術の信頼性を評価する方法であって：
ａ）細胞集団を含む溶液を提供するステップと；
ｂ）第１の方法、例えばＣＡＣＣ又はＦＡＣＳを使用して、溶液の複数のアリコートを形成するステップであって、複数のアリコートが、
ｉ）第１（又は１型）の特徴を有する１型アリコート（又は複数以下(a sub-plurality of)の１型アリコート）；
ｉｉ）第２（又は２型）の特徴を有する２型アリコート（又は複数以下(a sub-plurality of)の２型アリコート）；
を含む、形成するステップと；
ｃ）第１のオブザーバー、例えば機械オブザーバーを使用して、１型アリコート中（又は複数以下の１型アリコートのアリコート中）の細胞数、及び２型アリコート中（又は複数以下の２型アリコートのアリコート中）の細胞数を評価するステップと；
ｄ）ｃ）において１個の細胞を有すると特定したアリコートについて、後続の増殖が単クローンであった確率の値を提供するステップと；
ｅ）第２のオブザーバー、例えばヒトオブザーバーを使用して、１型アリコート中（又は複数以下の１型アリコートのアリコート中）の細胞数、及び２型アリコート中（又は複数以下の２型アリコートのアリコート中）の細胞数を評価するステップと；
ｆ）ｅ）において１個の細胞を有すると特定したアリコートについて、後続の増殖が単クローンであった確率の値を提供するステップと；
ｇ）ｄ）、ｆ）又は両方における値を評価するステップと
を含み、それによって、単一細胞クローニング技術の信頼性を評価する方法を特徴とする。
【００４９】
一実施形態において、ｇ）は、ｄ）、ｆ）又は両方からの値を、参照値又は閾値、例えば単クローン性の確率の閾値と比較することを含む。
【００５０】
一実施形態において、ｇ）は、ｄ）からの値をｆ）からの値と比較することを含む。
【００５１】
一実施形態において、比較することは、ｄ）、ｆ）又は両方からの値が、参照値又は閾値と所定の関係を有するかどうかを決定すること、例えば、値が、参照値又は閾値未満であるか、それと同じであるか、又はそれを超えるかを決定することを含む。
【００５２】
一実施形態において、第１のオブザーバーは、機械オブザーバーを含む。
【００５３】
一実施形態において、第２のオブザーバーは、ヒトオブザーバーを含む。
【００５４】
一実施形態において、第１のオブザーバーは、機械オブザーバーを含み、第２のオブザーバーは、ヒトオブザーバーを含む。
【００５５】
一実施形態において、本方法は、第１のオブザーバーによって評価した複数のアリコートの画像を提供し、第２のオブザーバーが当該画像を読んで、複数のアリコートを評価するステップを含む。
【００５６】
一実施形態において、第１又は１型の特徴は、第１の期間に形成したアリコートを含み、第２又は２型の特徴は、第２の期間に形成したアリコートを含む。
【００５７】
一実施形態において、１型アリコート（又は複数以下の１型アリコート）は、２型アリコート（又は複数以下の２型アリコート）の前に形成された。
【００５８】
一実施形態において、１型アリコート（又は複数以下の１型アリコート）は、２型アリコート（又は複数以下の２型アリコート）の前にクローン性について評価された。
【００５９】
一実施形態において、第１又は１型の特徴は、基板の第１の領域において形成したアリコートを含み、第２又は２型の特徴は、基板の第２の領域において形成したアリコートを含む。
【００６０】
一実施形態において、基板の第１の領域は、基板の境界に隣接したアリコートを含み、第２又は２型の特徴は、基板の境界に隣接していないアリコートを含む。
【００６１】
一実施形態において、ｂ）は、ｉｉｉ）第３（又は３型）の特徴を有する３型アリコート（又は複数以下の３型アリコート）を形成することを含む。
【００６２】
一実施形態において、３型アリコートは、１型アリコートの形成後であるが、２型アリコートの前に形成された。
【００６３】
一実施形態において、本方法は、複数の評価にわたる、第１のオブザーバー評価の一貫性の評価を可能にする。
【００６４】
一実施形態において、ｃ）及び／又はｅ）は、０個、１個又はそれよりも多い細胞を有するアリコートを特定することを含む。
【００６５】
一実施形態において、ｃ）及び／又はｅ）は、蛍光顕微鏡を使用して、０個、１個又はそれよりも多い細胞を有するアリコートを特定することを含む。
【００６６】
一実施形態において、ｃ）及び／又はｅ）は、蛍光顕微鏡を使用して、０個、１個又はそれよりも多い細胞を有するアリコートを特定する複数のオブザーバーを含む。
【００６７】
一実施形態において、ｃ）及び／又はｅ）は、蛍光顕微鏡を使用して、０個、１個又はそれよりも多い細胞を有するアリコートを特定する２つのオブザーバーを含む。
【００６８】
一実施形態において、ｃ）及び／又はｅ）は、アリコートの同じ蛍光顕微鏡写真を調査することに基づいて、０個、１個又はそれよりも多い細胞を有するアリコートを特定するオブザーバーを含む。
【００６９】
一実施形態において、ｃ）及び／又はｅ）は、アリコートの異なる蛍光顕微鏡写真、例えば各オブザーバーについての別個の蛍光顕微鏡写真を調査することに基づいて、０個、１個又はそれよりも多い細胞を有するアリコートを特定することを含む。
【００７０】
一実施形態において、ｃ）及び／又はｅ）は、アリコートが後続の増殖を示すかどうかを更に特定するオブザーバーを含む。
【００７１】
一実施形態において、ｃ）及び／又はｅ）は：
ａ）アリコートを、０個、１個又はそれよりも多い細胞を有すると特定し、アリコートが後続の増殖を示したか又は示さなかったかを特定した頻度についてのデータ値を計算することと；
ｂ）確率式及びデータ値を使用して、１個の細胞を有すると特定したアリコートの後続の増殖が単クローンである確率を評価することと
を含む。
【００７２】
一実施形態において、第１の方法は、単一細胞クローニング技術が、ＣＡＣＣ、ＦＡＣＳ又はスポッティングから選択されることを含む。一実施形態において、単一細胞クローニング技術は、ＣＡＣＣである。一実施形態において、単一細胞クローニング技術は、ＦＡＣＳである。一実施形態において、単一細胞クローニング技術は、スポッティングである。
【００７３】
一実施形態において、３型アリコートは、単クローン性の確率の値を評価することなく形成される。一実施形態において、アリコートの数は、少なくとも１、１０、５０、１００、２００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００又はそれよりも多い。
【００７４】
一実施形態において、いくつかのマルチウェルプレート、例えば９６ウェルプレートは、単クローン性の確率の値を評価することなくアリコートで満たされる。一実施形態において、マルチウェルプレート、例えば９６ウェルプレートの数は、少なくとも１、５、１０、１５、２０、２５、３０又はそれよりも多い。
【００７５】
別に定義しない限り、本明細書で使用するすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書において説明する方法及び材料と同様又は同等の方法及び材料は、本発明の実施又は試験において使用することができるが、好適な方法及び材料は、以下に説明する。本明細書において挙げるすべての出版物、特許出願、特許及び他の参考文献は、それらを全体として参照により組み込む。加えて、材料、方法及び例は、単に例示であり、限定であるとは意図されない。見出し、小見出し、又は番号若しくは文字を付けた要素、例えば（ａ）、（ｂ）、（ｉ）等は、読みやすさのために単に示され、限定ではない。本文書における見出し、又は番号若しくは文字を付けた要素の使用は、ステップ若しくは要素がアルファベット順に行われること、又はステップ若しくは要素が必ずしも互いに別個であることを必要としない。本発明の他の特徴、目的及び利点は、説明及び図面から、並びに特許請求の範囲から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】図１は、毛細管支援細胞クローニング技術を使用した２つのＧＳ−ＮＳ０細胞系の混合培養物のクローニング後に、細胞増殖を示すウェルについて、統計モデルによって予測したデータと比較した、実験的に観察したデータのグラフを示す。横軸は、２人の科学者が報告した細胞数の一組の観察を表す。
【図２】図２は、毛細管支援細胞クローニング技術を使用した２つのＧＳ−ＮＳ０細胞系の混合培養物のクローニング後に、細胞増殖を示さないウェルについて、統計モデルによって予測したデータと比較した、実験的に観察したデータのグラフを示す。横軸は、２人の科学者が報告した細胞数の一組の観察を示す。
【図３】図３は、非生存細胞、細片並びに細胞の二倍及びより高次の凝集体を除外するゲーティング法の例を示す、ＦＡＣＳデータを示す。
【図４】図４は、ＦＡＣＳ器具によって液滴に分取されるか、又は分取されない溶液のフロー内の細胞の位置付けの概略図を示す。
【図５】図５は、蛍光顕微鏡を使用して、０、１又は２＋細胞の存在についてウェルをチェックすることを示す図を示す。
【図６】図６は、試料データの単クローン性の確率を予測するために使用した過去のＦＡＣＳ器具性能の例のグラフを示す。
【図７】図７は、Ｐ（Ｘ＝０）の事前事後データのベータ分布のグラフを示す。
【図８】図８は、Ｐ（Ｘ＝１）の事前事後データのベータ分布のグラフを示す。
【図９】図９は、事後分布モードとして見積もったＦＡＣＳ器具についてのセッション当たりの単クローン性の確率のグラフを示す。
【図１０】図１０は、ピペット先端からの毛細管作用によって置いた、ウェル中の細胞懸濁液の約１μｌの液滴の画像を示す。
【図１１Ａ】図１１Ａは、１液滴当たり０個の細胞を有する液滴の画像を示す。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、１液滴当たり１個の細胞を有する液滴の画像を示す。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、１液滴当たり２個の細胞を有する液滴の画像を示す。
【図１２Ａ】図１２Ａは、分析から除外されうる液滴の画像を示す。図１２Ａ中の液滴は、気泡を含有する。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、分析から除外されうる液滴の画像を示す。図１２Ｂ中の液滴は、単一の視野内で完全に可視化することができない。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、分析から除外されうる液滴の画像を示す。図１２Ｃ中の液滴は、ウェルの端に接触している（例えば、液滴の境界がクリアでない）。
【図１２Ｄ】図１２Ｄは、分析から除外されうる液滴の画像を示す。図１２Ｄ中の液滴は、細片を含有する。
【発明を実施するための形態】
【００７７】
定義
冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、冠詞の文法的目的語のうちの１つ又は１つよりも多く（すなわち、少なくとも１つ）を指すために、本明細書において使用される。例として、「細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」は、１個の細胞又は１個よりも多い細胞を意味し得る。
【００７８】
本明細書において使用するとき、「単クローン性」という用語は、細胞群の質を指し、その質は、細胞群が厳密に１個の親細胞に由来することである。例えば、単クローン細胞系は、厳密に１個の細胞に由来する細胞系である。
【００７９】
本明細書において使用するとき、「単クローン性の確率についての値」という用語は、単クローンと特定した細胞群が実際に単クローンである可能性の推定を指す。
【００８０】
本明細書において使用するとき、「アリコート」という用語は、ある体積の溶液を指す。一実施形態において、複数のアリコートを形成、調査又は分析し、複数のうちの各アリコートは、体積についての条件を満たす、例えば複数のうちの各アリコートは：最小体積、例えば事前設定最小値を有し；最小値と最大値との間の範囲内、例えば事前設定最小値及び／若しくは最大値；およそ等しい値、例えば事前設定値；又は同じ体積、例えば事前設定値に入る。一実施形態において、アリコートの体積は、機能的限界に見合う体積に制約される。例として、複数のアリコートのうちの各アリコートは、ヒト又は機械オブザーバーにとっての所定の視野を満たさなければならない、例えば各々は、全視野、例えば顕微鏡を使用して形成される視野を満たさなければならない。より大量の液体が複数のアリコートに分割される場合、複数は、より大量全体に等しいか、又はより大量全体未満に等しい場合がある。
【００８１】
本明細書において使用するとき、「複数のアリコート」という用語は、１つより多い（例えば２つ又はそれよりも多い）アリコートを指す。
【００８２】
本明細書において使用するとき、「オブザーバー」という用語は、アリコート中の細胞の存在又は非存在について観察を行うことができる実体を指す。実体は、十分な技能を有するヒトであり得る。典型的に、ヒトオブザーバーは、アリコートの直接的な目視検査に基づいて、例えば拡大デバイスを通して、細胞数又は増殖を結論付ける。実体は、機械、例えば画像を形成及び分析するためのコンピュータ化デバイス、又は他の好適な自動化デバイス、例えばコンピュータ化顕微鏡カメラ若しくはフローサイトメーターの検出器であってもよい。ヒト又は機械オブザーバーは、様々な拡大検出デバイス、例えば蛍光顕微鏡を使用し得る。オブザーバーは、任意選択で、アリコートが後に増殖を示したかどうかについての観察を行うことができる場合がある。一実施形態において、機械オブザーバーは、データを収集し、データに応答して画像、例えばデジタル画像を形成し、デジタル画像に値、例えば観察された細胞数又は増殖が観察されたかどうかを示す値を割り当てる。
【００８３】
本明細書において使用するとき、「単一細胞クローニング技術の信頼性」という用語は、単一細胞クローニング技術が、どのくらい一貫して、高確率の単クローン性を有する細胞増殖をもたらすかを指す。
【００８４】
本明細書において使用するとき、「インターバル」という用語は、単一細胞クローニング技術が実施され、単クローン性の確率の値の評価が行われていない期間を指す。この期間は、形成したアリコート中で、満たしたアリコートの組を含む容器、例えばマルチウェルプレート、例えば９６ウェルプレート中で、時間内に、又は本分野で公知の他のユニット中で、測定することができる。
【００８５】
本明細書において使用するとき、「単クローン性の確率の閾値」という用語は、単クローン性の確率の計算した値を比較することができる確率基準である。一部の実施形態において、単クローン性の確率の閾値に見合うか、又はそれを超える単クローン性の確率の値を有すると評価された複数のアリコートは、単一細胞クローニング技術を通して続行し得る。一部の実施形態において、単クローン性の確率の閾値未満である単クローン性の確率の値を有すると評価された複数のアリコートは、単一細胞クローニング技術を通して続行し得ない。一部の実施形態において、単クローン性の確率の閾値は、０．９５、０．９５２、０．９５４、０．９５６、０．９５８、０．９６、０．９６２、０．９６４、０．９６８、０．９７、０．９７２、０．９７４、０．９７６、０．９７８、０．９８、０．９８２、０．９８４、０．９８６、０．９８８、０．９９、０．９９２、０．９９４、０．９９６、０．９９８又は１である。一部の実施形態において、単クローン性の確率の閾値は、０．９８である。一部の実施形態において、単クローン性の確率の閾値は、０．９９である。
【００８６】
本明細書において使用するとき、「内因性」という用語は、生物、細胞、組織又は系からの、又はそれの内側で天然に生成した任意の材料を指す。
【００８７】
本明細書において使用するとき、「外因性」という用語は、生物、細胞、組織又は系に導入した、又はそれの外側で生成した任意の材料を指す。したがって、「外因性核酸」は、生物、細胞、組織又は系に導入した、又はそれの外側で生成した核酸を指す。一実施形態において、外因性核酸の配列は、外因性核酸が導入された生物、細胞、組織又は系の内側で、天然に生成しないか、又は天然に見ることができない。同様に、「外因性ポリペプチド」は、例えば外因性核酸配列からの発現によって外因性ポリペプチドが導入された生物、細胞、組織又は系の内側で、天然に生成しないか、又は天然に見ることができないポリペプチドを指す。
【００８８】
本明細書において使用するとき、「異種の」という用語は、異なる種からの生物、細胞、組織又は系に導入された場合の、１つの種からの任意の材料を指す。
【００８９】
本明細書において使用するとき、「核酸」、「ポリヌクレオチド」又は「核酸分子」という用語は、互換的に使用され、一本鎖又は二本鎖の形態いずれかのデオキシリボ核酸（ＤＮＡ：ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）若しくはリボ核酸（ＲＮＡ：ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、又はＤＮＡ若しくはそのＲＮＡの組合せ、及びそのポリマーを指す。「核酸」という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ又はｍＲＮＡを含むが、これらに限定されない。一実施形態において、核酸分子は、合成（例えば化学合成又は人工）又は組換えである。具体的に限定しない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、天然又は非天然ヌクレオチドと同様の様式で代謝される、天然ヌクレオチドのアナログ又は誘導体を含有する分子を包含する。別に示さない限り、特定の核酸配列はまた、明示的に示される配列はもちろん、その保存的に改変されたバリアント（例えば、縮重コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、ＳＮＰ及び相補配列を暗黙のうちに包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つ又は複数の選択した（又はすべての）コドンの第３位が、混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換された配列を産生することによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  １９巻：５０８１頁（１９９１年）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０巻：２６０５〜２６０８頁（１９８５年）；及びＲｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８巻：９１〜９８頁（１９９４年））。
【００９０】
本明細書において使用するとき、「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、互換的に使用され、ペプチド結合によって、又はペプチド結合以外の手段によって共有結合されたアミノ酸残基を含む化合物を指す。タンパク質又はペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含有しなければならず、タンパク質の配列又はペプチドの配列を含み得るアミノ酸の最大数について制限はない。一実施形態において、タンパク質は、１つより多い、例えば２、３、４、５つ又はそれよりも多いポリペプチドを含んでいてもよく、各ポリペプチドは、共有又は非共有結合／相互作用のいずれかによって別のポリペプチドに会合する。ポリペプチドは、ペプチド結合によって、又はペプチド結合以外の手段によって互いに連結された２つ又はそれよりも多いアミノ酸を含む任意のペプチド又はタンパク質を含む。本明細書において使用するとき、この用語は、例えばペプチド、オリゴペプチド及びオリゴマーとも本分野で通常呼ばれる短鎖、並びに多くの種類がある一般的にタンパク質と本分野で呼ばれる長鎖の両方を指す。「ポリペプチド」として、中でも、例えば生物学的に活性な断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモダイマー、ヘテロダイマー、ポリペプチドのバリアント、修飾ポリペプチド、誘導体、アナログ、融合タンパク質が挙げられる。
【００９１】
単一細胞クローニング技術
治療用タンパク質の製造において考慮すべき問題の１つは、一貫した製造プロセスを確実にするための安定なクローン細胞系の必要条件である。非クローン細胞系の使用は、非経済的プロセス、又は更に悪い場合は、製品の質及び生物学的活性の変動をもたらし得る。限界希釈単一細胞クローニング（ＬＤＳＣＣ：ｌｉｍｉｔｅｄ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌ  ｃｌｏｎｉｎｇ）、スポッティング（Ｃｌａｒｋｅ及びＳｐｉｅｒ、１９８０年）、毛細管支援細胞クローニング（Ｏｎａｄｉｐｅら、２００１年）及びフローサイトメトリー（例えば蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ））を含む数種の単一細胞クローニング技術が存在し、各々は、本明細書において開示する方法と共に使用することができる。
【００９２】
限界希釈単一細胞クローニングは、１つのアリコート当たり１個未満の細胞の細胞濃度で、培養物をアリコートに希釈し、その後アリコートを培養して、増殖を観察することを含む。単クローン性を達成するために、多ラウンドの時間及び労力集約的希釈及び培養が必要とされる。ＬＤＳＣＣでは、数ラウンド後でさえも、観察された増殖が単クローンであることが確実にならないので、多ラウンドが必要とされる。
【００９３】
スポッティングは、滅菌パスツールピペットを使用して細胞の希釈液を１μｌのアリコート（例えば液滴）に分離し、液滴をマイクロウェルプレートに、ウェルの側面に接触しないように入れ、存在する細胞数を決定するためにオブザーバーによって容易に目視検査できる独立型アリコートを創出することを含む技術である。しかしながら、標準のスポッティングプロトコールは、オブザーバーの、アリコート中の細胞の特定における誤りの確率を考慮しない。一部の実施形態において、本開示の方法は、スポッティング技術の適用において生成した細胞集団及びアリコートに適用することができる。一部の実施形態において、本開示の方法は、スポッティングで達成した単クローン性の信頼性を評価して、任意の得られた細胞系が単クローンである高確率を有することを確実にする。
【００９４】
毛細管支援細胞クローニング（ＣＡＣＣ）は、スポッティングに類似した技術であり、細胞溶液の約１μｌアリコート（例えば液滴）への分離は、毛細管ピペットを使用することによって達成され、各液滴の調査は、２人の科学者によって独立して行われる。一部の実施形態において、本開示の方法は、毛細管支援細胞クローニング（ＣＡＣＣ）技術の適用において生成した細胞集団及びアリコートに適用することができる。一部の実施形態において、本開示の方法は、ＣＡＣＣで達成した単クローン性の信頼性を評価して、任意の得られた細胞系が単クローンである高確率を有することを確実にする。
【００９５】
フローサイトメトリーは、細胞溶液を、狭いフローセルを通して一列で、細胞の特徴を観察及び処理することができる変換器及びコンピュータに連結した検出器（例えばレーザー）を通過させて流動させるデバイスを用いる技術である。フローサイトメーターは、次に、細胞ストリームを破壊して、平均で１個未満の細胞を含有する液滴（すなわち、アリコート）にし、このアリコートを別個の行き先に入れることができる。蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）は、細胞表面上の蛍光染料又は蛍光ポリペプチドを用いて、細胞を特定し、別個の集団に分離するフローサイトメトリーの特別な適用である。しかしながら、フローサイトメトリーを用いる単一細胞クローニングの標準のプロトコールは、オブザーバー（すなわち、検出器）の、アリコート中の細胞の特定における誤りの確率を考慮しない。一部の実施形態において、本開示の方法は、フローサイトメトリー技術の適用において生成した細胞集団及びアリコートに適用することができる。一部の実施形態において、本開示の方法、例えば例、例えば例１１において説明するステップ又はアルゴリズムは、特定の分析方法、例えばフローサイトメトリー、例えばＦＡＣＳ、又は機械又は技術を収容するために適合され得る。一部の実施形態において、本開示の方法は、任意の得られた細胞系が単クローンである高確率を有することを確実にする対照を導入する。
【００９６】
一態様において、本発明は、単クローン性の確率についての値を評価する方法であって：細胞集団を含む溶液を提供するステップと；溶液の複数のアリコートを形成するステップと；１個の細胞を有するアリコートを特定するステップと；１個の細胞を有すると特定したアリコートについて、後続の増殖が単クローンであった確率についての値を提供するステップとを含み、それによって、単クローン性の確率についての値を評価する方法を特徴とする。本明細書において開示する方法の、単一細胞クローニング技術への適用を通して、アリコートから続行する増殖が単クローンである可能性の査定を行い、したがって、オブザーバー（単数又は複数）による誤りの可能性を考慮に入れることができる。
【００９７】
別の態様において、本発明は、単一細胞クローニング技術の信頼性を評価する方法であって：ａ）細胞集団を含む溶液を提供するステップと；ｂ）単一細胞クローニング技術の単クローン性の確率の値の第１の推定を行うステップであって：ｉ）溶液の複数のアリコートを形成すること；ｉｉ）１個の細胞を有するアリコートを特定すること；及びｉｉｉ）１個の細胞を有すると特定したアリコートについて、後続の増殖が単クローンであった確率の値を提供することを含む第１の推定を行うステップと；ｃ）所定のインターバルで、単一細胞クローニング技術を実施するステップと；ｄ）単一細胞クローニング技術の単クローン性の確率の値の第２の推定を行うステップであって：ｉ）溶液の複数のアリコートを形成すること；ｉｉ）１個の細胞を有するアリコートを特定すること；及びｉｉｉ）１個の細胞を有すると特定したアリコートについて、後続の増殖が単クローンであった確率の値を提供することを含む第２の推定を行うステップと；ｅ）単一細胞クローニング技術の単クローン性の確率の値の第１及び第２の推定を比較するステップとを含み、それによって、単一細胞クローニング技術の信頼性を評価する方法を特徴とする。単一細胞クローニング技術を実施する前後の単クローン性の確率の値を比較することによって、得られた細胞増殖の単クローン性の信頼性を評価することができる。一実施形態において、第１の推定と第２の推定との間の単クローン性の確率における変動又は差は、例えば単クローン性の確率を改善するための、単一細胞クローニング技術のパラメータの調節を示唆し得る。一実施形態において、ｃ）、ｄ）及びｅ）を、単一細胞クローニング技術の各インターバルにつき繰り返し、それによって、複数のインターバルにわたる単一細胞クローニング技術の信頼性の評価を提供することができる。
【００９８】
別の態様において、本発明の方法は、撮像システム若しくは技術からのデータ、又は画像処理ソフトウェアのデータを評価するために使用してもよい。一部の実施形態において、本方法は：体撮像、体スキャナー、全身撮像、全身スキャナー、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ：ｐｏｓｉｔｒｏｎ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）スキャニング、ＰＥＴ／コンピュータ断層撮影（ＣＴ：ｃｏｍｐｕｔｅｄ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）スキャニング、磁気共鳴画像法、光学顕微鏡、共焦点顕微鏡、蛍光顕微鏡、電子顕微鏡、低温電子顕微鏡、低温電子顕微鏡断層撮影、デジタル式Ｘ線撮影システム、デジタル式蛍光透視撮影システム、マシンビジョンシステム、生細胞分析器、固定細胞分析器、高解像度撮像システム、高解像度細胞撮像システム、レーザースキャナーシステム及び放射性、蛍光又は化学発光撮像システムに適用してもよい。
【００９９】
生成のための適用
本明細書において開示する、単クローン性の確率についての値を評価する方法及び単一細胞クローニング技術の信頼性を評価する方法は、バイオリアクター若しくは処理容器若しくはタンクにおける、又はより一般的には任意の供給源での使用のための、様々な細胞系を評価するため、又は様々な細胞系の生成を評価するために使用することができる。本明細書において説明するデバイス、設備及び方法は、原核細胞系及び／又は真核細胞系を含む任意の所望の細胞系を培養するために好適である。更に、実施形態において、デバイス、設備及び方法は、懸濁細胞又は足場依存性（接着性）細胞を培養するために好適であり、医薬製品及び生物製剤製品（例えばポリペプチド製品、核酸製品（例えばＤＮＡ又はＲＮＡ）又は細胞及び／若しくはウイルス、例えば細胞及び／若しくはウイルス療法において使用される細胞及び／若しくはウイルス）の生成のために構成した生成操作に好適である。
【０１００】
実施形態において、細胞は、製品、例えば組換え治療製品又は診断製品を発現又は生成する。以下により詳細に説明する通り、細胞によって生成された製品の例として、抗体分子（例えばモノクローナル抗体、二重特異性抗体）、抗体ミメティック（例えばＤＡＲＰｉｎ、アフィボディ、アドネクチン又はＩｇＮＡＲ等の抗原に特異的に結合するが、抗体に構造的に関連しないポリペプチド分子）、融合タンパク質（例えばＦｃ融合タンパク質、キメラサイトカイン）、他の組換えタンパク質（例えばグリコシル化タンパク質、酵素、ホルモン）、ウイルス療法薬（例えば抗がん腫瘍溶解性ウイルス、遺伝子療法及びウイルス免疫療法のためのウイルスベクター）、細胞療法薬（例えば多能性幹細胞、間葉系幹細胞及び成体幹細胞）、ワクチン若しくは脂質被包粒子（例えばエキソソーム、ウイルス様粒子）、ＲＮＡ（例えばｓｉＲＮＡ等）若しくはＤＮＡ（例えばプラスミドＤＮＡ等）、抗生物質又はアミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。実施形態において、デバイス、設備及び方法は、バイオシミラーを生成するために使用することができる。
【０１０１】
言及する通り、実施形態において、デバイス、設備及び方法は、真核細胞、例えば哺乳動物細胞、若しくは例えば酵母細胞若しくは糸状菌細胞等のより下等な真核細胞、若しくは原核細胞、例えばグラム陽性若しくはグラム陰性細胞、及び／又は真核細胞若しくは原核細胞の生成物、例えばラージスケール様式で真核細胞によって合成されるタンパク質、ペプチド、抗生物質、アミノ酸、核酸（例えばＤＮＡ又はＲＮＡ）の生成を可能にする。本明細書において別に示さない限り、デバイス、設備及び方法は、非限定的に、ベンチスケール、パイロットスケール及び全生成スケール能を含む、任意の所望の容積又は生成能を含み得る。
【０１０２】
更に、本明細書において別に示さない限り、デバイス、設備及び方法は、非限定的に、攪拌タンク、空気圧リフト、繊維、マイクロファイバー、中空繊維、セラミックマトリックス、流動床、固定床及び／又は噴流床バイオリアクターを含む、任意の好適なリアクター（単数又は複数）を含み得る。本明細書において使用するとき、「リアクター」は、発酵器若しくは発酵ユニット、又は任意の他の反応容器を含む場合があり、「リアクター」という用語は、「発酵器」と互換的に使用される。例えば、一部の態様において、バイオリアクターユニットは、以下のもの：栄養素及び／若しくは炭素源の供給、好適な気体（例えば酸素）の注入、発酵若しくは細胞培養培地の入出流、気相及び液相の分離、温度維持、酸素及びＣＯ２レベルの維持、ｐＨレベルの維持、アジテーション（例えば攪拌）並びに／又はクリーニング／滅菌のうちの１つ若しくは複数、又はすべてを行い得る。リアクターユニット、例えば発酵ユニットの例は、ユニット内に多数のリアクターを含有する場合があり、例えば、ユニットは、各ユニット中に１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０若しくは１００個若しくはそれよりも多いバイオリアクターを有する場合があり、且つ／又は設備は、設備内に単一若しくは多数のリアクターを有する多数のユニットを含有する場合がある。様々な実施形態において、バイオリアクターは、バッチ、半供給バッチ、供給バッチ、灌流及び／又は連続発酵プロセスに好適であり得る。任意の好適なリアクター直径を使用することができる。実施形態において、バイオリアクターは、約１００ｍＬ〜約５０，０００Ｌの容積を有し得る。非限定的な例として、１００ｍＬ、２５０ｍＬ、５００ｍＬ、７５０ｍＬ、１リットル、２リットル、３リットル、４リットル、５リットル、６リットル、７リットル、８リットル、９リットル、１０リットル、１５リットル、２０リットル、２５リットル、３０リットル、４０リットル、５０リットル、６０リットル、７０リットル、８０リットル、９０リットル、１００リットル、１５０リットル、２００リットル、２５０リットル、３００リットル、３５０リットル、４００リットル、４５０リットル、５００リットル、５５０リットル、６００リットル、６５０リットル、７００リットル、７５０リットル、８００リットル、８５０リットル、９００リットル、９５０リットル、１０００リットル、１５００リットル、２０００リットル、２５００リットル、３０００リットル、３５００リットル、４０００リットル、４５００リットル、５０００リットル、６０００リットル、７０００リットル、８０００リットル、９０００リットル、１０，０００リットル、１５，０００リットル、２０，０００リットル及び／又は５０，０００リットルが挙げられる。加えて、好適なリアクターは、多使用、単独使用、使い捨て又は非使い捨てであってもよく、金属合金、例えばステンレススチール（例えば３１６Ｌ又は任意の他の好適なステンレススチール）及びインコネル、プラスチック並びに／又はガラスを含む任意の好適な材料から形成され得る。一部の実施形態において、好適なリアクターは、円形、例えば円筒形であり得る。一部の実施形態において、好適なリアクターは、四角形、例えば長方形であり得る。四角形のリアクターは、一部の場合、使用の容易さ（例えば当業者によるローディング及び設定）、リアクター内容物のより優れた混合及び均一性、並びにより小さい占有床面積等の円形リアクターに優る利点を提供し得る。
【０１０３】
実施形態において、本明細書において別に示さない限り、単クローン性の確率についての値を評価する方法での使用のための本明細書において説明するデバイス、設備及び方法はまた、別に挙げていない任意の好適なユニット操作及び／又は機器、例えばそのような生成物の分離、精製及び単離のための操作及び／又は機器を含み得る。任意の好適な設備及び環境、例えば伝統的な現場組立設備、モジュール式、移動式及び一時的設備、又は任意の他の好適な建築物、設備及び／若しくは間取りを使用することができる。例えば、一部の実施形態において、モジュール式クリーンルームを使用することができる。加えて、別に示さない限り、本明細書において説明するデバイス、システム及び方法は、単一の場所若しくは設備において収容され、且つ／若しくは行われる場合があり、又は或いは、別々の、若しくは多数の場所及び／若しくは設備で収容され、且つ／若しくは行われる場合がある。
【０１０４】
非限定的な例として、限定ではなく、米国特許公開公報第２０１３／０２８０７９７号；同第２０１２／００７７４２９号；同第２０１１／０２８０７９７号；同第２００９／０３０５６２６号；並びに米国特許第８，２９８，０５４号；同第７，６２９，１６７号；及び同第５，６５６，４９１号は、それらを全体として参照により本明細書に組み込み、好適であり得る設備、機器及び／又はシステムの例を説明する。
【０１０５】
本明細書において説明する方法は、広いスペクトルの細胞の単クローン調製物を評価及び生成するために使用することができる。実施形態において、細胞は、真核細胞、例えば哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞は、例えばヒト又はげっ歯類又はウシ細胞系又は細胞株であり得る。そのような細胞、細胞系又は細胞株の例は、例えばマウス黒色腫（ＮＳＯ）細胞系、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系、ＨＴ１０８０、Ｈ９、ＨｅｐＧ２、ＭＣＦ７、ＭＤＢＫ  Ｊｕｒｋａｔ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ１２、ＢＨＫ（仔ハムスター腎細胞）、ＶＥＲＯ、ＳＰ２／０、ＹＢ２／０、Ｙ０、Ｃ１２７、Ｌ細胞、ＣＯＳ、例えばＣＯＳ１及びＣＯＳ７、ＱＣ１〜３、ＨＥＫ−２９３、ＶＥＲＯ、ＰＥＲ．Ｃ６、ＨｅＬＡ、ＥＢ１、ＥＢ２、ＥＢ３、腫瘍溶解性又はハイブリドーマ細胞系である。好ましくは、哺乳動物細胞は、ＣＨＯ細胞系である。一実施形態において、細胞は、ＣＨＯ細胞である。一実施形態において、細胞は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＣＨＯ−Ｋ１  ＳＶ細胞、ＤＧ４４  ＣＨＯ細胞、ＤＵＸＢ１１  ＣＨＯ細胞、ＣＨＯＳ、ＣＨＯ  ＧＳノックアウト細胞、ＣＨＯ  ＦＵＴ８  ＧＳノックアウト細胞、ＣＨＯＺＮ又はＣＨＯ由来細胞である。ＣＨＯ  ＧＳノックアウト細胞（例えばＧＳＫＯ細胞）は、例えばＣＨＯ  Ｋ１  ＳＶ  ＧＳノックアウト細胞である。ＣＨＯ  ＦＵＴ８ノックアウト細胞は、例えばＰｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ（登録商標）ＣＨＯＫ１  ＳＶ（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，  Ｉｎｃ．社）である。真核細胞はまた、例えばＥＢｘ（登録商標）細胞、ＥＢ１４、ＥＢ２４、ＥＢ２６、ＥＢ６６又はＥＢｖ１３等の鳥類細胞、細胞系又は細胞株であり得る。
【０１０６】
一実施形態において、真核細胞は、幹細胞である。幹細胞は、例えば、胚性幹細胞（ＥＳＣ：ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）、成体幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ：ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）、組織特異的幹細胞（例えば造血幹細胞）及び間葉系幹細胞（ＭＳＣ：ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）を含む多能性幹細胞であり得る。
【０１０７】
一実施形態において、細胞は、本明細書において説明する細胞のいずれかの分化形態である。一実施形態において、細胞は、培養物中の任意の初代細胞に由来する細胞である。
【０１０８】
実施形態において、細胞は、肝細胞、例えばヒト肝細胞、動物肝細胞又は非実質細胞である。例えば、細胞は、接着型代謝試験用ヒト肝細胞、接着型酵素誘導試験用ヒト肝細胞、接着型Ｑｕａｌｙｓｔ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ（商標）ヒト肝細胞、浮遊型ヒト肝細胞（１０人のドナー及び２０人のドナーからプールした肝細胞を含む）、ヒト肝クッパー細胞、ヒト肝星細胞、イヌ肝細胞（単一及びプールしたビーグル肝細胞を含む）、マウス肝細胞（ＣＤ−１及びＣ５７ＢＩ／６肝細胞を含む）、ラット肝細胞（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ、Ｗｉｓｔａｒ  Ｈａｎ及びＷｉｓｔａｒ肝細胞を含む）、サル肝細胞（カニクイザル又はアカゲザル肝細胞を含む）、ネコ肝細胞（飼いネコショートヘア肝細胞を含む）及びウサギ肝細胞（ニュージーランド白色肝細胞を含む）であり得る。肝細胞の例は、Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ社、ＬＬＣ、６  Ｄａｖｉｓ  Ｄｒｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ、Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ、ＵＳＡ  ２７７０９から市販されている。
【０１０９】
一実施形態において、真核細胞は、例えば酵母細胞（例えばピチア（Ｐｉｃｈｉａ）属（例えばピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピチア・クルイベリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）及びピチア・アングスタ（Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ））、コマガタエラ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ）属（例えばコマガタエラ・パストリス（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、コマガタエラ・シュードパストリス（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐｓｅｕｄｏｐａｓｔｏｒｉｓ）又はコマガタエラ・ファッフィ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐｈａｆｆｉｉ））、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属（例えばサッカロマイセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）、セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロマイセス・ウバルム（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｕｖａｒｕｍ））、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属（例えばクルイベロマイセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、クルイベロマイセス  マルキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ））、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属（例えばトルラ酵母（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）、カンジダ・カカオイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｃａｃａｏｉ）、カンジダ・ボイディニ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ））、ゲオトリクム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）属（例えばゲオトリクム・ファーメンタンス（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ））、メタノール資化酵母（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）又は分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ））等の下等真核細胞である。ピチア・パストリス種は、好ましい。ピチア・パストリス株の例は、Ｘ３３、ＧＳ１１５、ＫＭ７１、ＫＭ７１Ｈ及びＣＢＳ７４３５である。
【０１１０】
一実施形態において、真核細胞は、真菌細胞（例えばコウジカビ属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）（例えばクロコウジカビ（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、コウジカビ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）、偽巣性コウジ菌（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ））、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）（例えばアクレモニウム・サーモフィルム（Ａ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ））、ケトミウム属（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ）（例えばケトミウム・サーモフィルム（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ））、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）（例えばクリソスポリウム・サーモフィレ（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ））、冬虫夏草属（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ）（例えば冬虫夏草（Ｃ．ｍｉｌｉｔａｒｉｓ））、コリナスクス属（Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ）、クテノマイセス属（Ｃｔｅｎｏｍｙｃｅｓ）、フサリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）（例えばフサリウム・オキシスポルム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ））、グロメレラ属（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ）（例えばイネ科炭疽病菌（Ｇ．ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ））、ボタンタケ属（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）（例えばヒポクレア・ジェコリナ（Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ））、マグナポルテ属（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）（例えばイネいもち病菌（Ｍ．ｏｒｙｚａｅ））、マイセリオフトーラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）（例えばマイセリオフトーラ・サーモフィレ（Ｍ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ））、アカツブタケ属（Ｎｅｃｔｒｉａ）（例えばネクトリア・ヘマトコッカ（Ｎ．ｈｅａｍａｔｏｃｏｃｃａ））、アカパンカビ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）（例えばアカパンカビ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ））、アオカビ属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、スポロトリクム属（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ）（例えばスポロトリクム・サーモフィレ（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ））、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）（例えばチエラビア・テレストリス（Ｔ．ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、チエラビア・ヘテロタリカ（Ｔ．ｈｅｔｅｒｏｔｈａｌｌｉｃａ））、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）（例えばトリコデルマ・リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ））又はバーティシリウム属（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）（例えばバーティシリウム・ダリア（Ｖ．ｄａｈｌｉａ）））である。
【０１１１】
一実施形態において、真核細胞は、昆虫細胞（例えばＳｆ９、Ｍｉｍｉｃ（商標）Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ（商標）（ＢＴ１−ＴＮ−５Ｂ１−４）又はＢＴ１−Ｅａ８８細胞）、藻類細胞（例えばアンフォラ属（Ａｍｐｈｏｒａ）、珪藻類（Ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｃｅａｅ）、ドナリエラ属（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）、クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、クラミドモナス属（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）、藍藻類（Ｃｙａｎｏｐｈｙｔａ）（シアノバクテリア）、ナンノクロロプシス属（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）、スピルリナ属（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）又はオクロモナス属（Ｏｃｈｒｏｍｏｎａｓ）の藻類細胞）又は植物細胞（例えば単子葉植物（例えばトウモロコシ、米、小麦又はセタリア属（Ｓｅｔａｒｉａ））から、又は双子葉植物（例えばキャッサバ、ジャガイモ、大豆、トマト、タバコ、アルファルファ、ニセツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）又はシロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ））からの細胞）である。
【０１１２】
一実施形態において、細胞は、細菌細胞又は原核細胞である。
【０１１３】
実施形態において、原核細胞は、グラム陽性細胞、例えば桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）又は乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）である。使用することができる桿菌は、例えば、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、納豆菌（Ｂ．ｎａｔｔｏ）又は巨大菌（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）である。実施形態において、細胞は、枯草菌、例えば枯草菌３ＮＡ及び枯草菌１６８である。桿菌は、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ５５６、４８４  Ｗｅｓｔ  １２ｔｈ  Ａｖｅｎｕｅ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ  ＯＨ  ４３２１０〜１２１４から得ることができる。
【０１１４】
一実施形態において、原核細胞は、グラム陰性細胞、例えばサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．）又は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、例えばＴＧ１、ＴＧ２、Ｗ３１１０、ＤＨ１、ＤＨＢ４、ＤＨ５ａ、ＨＭＳ１７４、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、ＮＭ５３３、Ｃ６００、ＨＢ１０１、ＪＭ１０９、ＭＣ４１００、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ及びＯｒｉｇａｍｉ並びに大腸菌Ｂ株に由来するもの、例えばＢＬ−２１又はＢＬ２１（ＤＥ３）であり、これらのすべては、市販されている。
【０１１５】
好適なホスト細胞は、例えばＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ａｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）又はＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）等の微生物株保存機関から市販されている。
【０１１６】
実施形態において、培養細胞は、治療的使用のための、タンパク質、例えば抗体、例えばモノクローナル抗体、及び／又は組換えタンパク質を生成するために使用される。実施形態において、培養細胞は、ペプチド、アミノ酸、脂肪酸又は他の有用な生化学中間体若しくは代謝物を生成する。例えば、実施形態において、約４０００ダルトン〜約１４０，０００ダルトンを超える分子量を有する分子を生成することができる。実施形態において、これらの分子は、ある範囲の複雑さを有する場合があり、糖鎖付加を含む翻訳後修飾を含み得る。
【０１１７】
実施形態において、タンパク質は、例えばＢＯＴＯＸ、Ｍｙｏｂｌｏｃ、Ｎｅｕｒｏｂｌｏｃ、Ｄｙｓｐｏｒｔ（又はボツリヌス菌神経毒の他の血清型）、アルグルコシダーゼアルファ、ダプトマイシン、ＹＨ−１６、絨毛性ゴナドトロピンアルファ、フィルグラスチム、セトロレリクス、インターロイキン−２、アルデスロイキン、テセロイキン（ｔｅｃｅｌｅｕｌｉｎ）、デニロイキンジフチトクス、インターフェロンアルファ−ｎ３（注射用）、インターフェロンアルファ−ｎ１、ＤＬ−８２３４、インターフェロン、サントリー（ガンマ−１ａ）、インターフェロンガンマ、チモシンアルファ１、タソネルミン、ＤｉｇｉＦａｂ、ＶｉｐｅｒａＴＡｂ、ＥｃｈｉＴＡｂ、ＣｒｏＦａｂ、ネシリチド、アバタセプト、アレファセプト、レビフ、エプトテルミンアルファ、テリパラチド（骨粗鬆症）、注射用カルシトニン（骨疾患）、カルシトニン（鼻、骨粗鬆症）、エタネルセプト、ヘモグロビングルタメール２５０（ウシ）、ドロトレコギンアルファ、コラゲナーゼ、カルペリチド、組換えヒト上皮増殖因子（局所ゲル、創傷治癒）、ＤＷＰ４０１、ダルベポエチンアルファ、エポエチンオメガ、エポエチンベータ、エポエチンアルファ、デシルジン、レピルジン、ビバリルジン、ノナコグアルファ、Ｍｏｎｏｎｉｎｅ、エプタコグアルファ（活性化）、組換え第ＶＩＩＩ因子＋ＶＷＦ、リコネイト、組換え第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子（組換え）、Ａｌｐｈｎｍａｔｅ、オクトコグアルファ、第ＶＩＩＩ因子、パリフェルミン、Ｉｎｄｉｋｉｎａｓｅ、テネクテプラーゼ、アルテプラーゼ、パミテプラーゼ、レテプラーゼ、ナテプラーゼ、モンテプラーゼ、フォリトロピンアルファ、ｒＦＳＨ、ｈｐＦＳＨ、ミカファンギン、ペグフィルグラスチム、レノグラスチム、ナルトグラスチム、セルモレリン、グルカゴン、エキセナチド、プラムリンチド、イミグルセラーゼ（ｉｎｉｇｌｕｃｅｒａｓｅ）、ガルスルファーゼ、Ｌｅｕｃｏｔｒｏｐｉｎ、モルグラモスチム（ｍｏｌｇｒａｍｏｓｔｉｒｎ）、酢酸トリプトレリン、ヒストレリン（皮下インプラント、Ｈｙｄｒｏｎ）、デスロレリン、ヒストレリン、ナファレリン、ロイプロリド維持放出デポー（ＡＴＲＩＧＥＬ）、ロイプロリドインプラント（ＤＵＲＯＳ）、ゴセレリン、Ｅｕｔｒｏｐｉｎ、ＫＰ−１０２プログラム、ソマトロピン、メカセルミン（増殖障害）、エンフビルチド（ｅｎｌｆａｖｉｒｔｉｄｅ）、Ｏｒｇ−３３４０８、インスリングラルギン、インスリングルリジン、インスリン（吸入用）、インスリンリスプロ、インスリンデテミル（ｉｎｓｕｌｉｎ  ｄｅｔｅｒｎｉｒ）、インスリン（口腔、ＲａｐｉｄＭｉｓｔ）、メカセルミンリンファバート、アナキンラ、セルモロイキン、注射用アプシチドテクネチウム（９９ｍＴｃ）、ｍｙｅｌｏｐｉｄ、Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ、酢酸グラチラマー、Ｇｅｐｏｎ、サルグラモスチム、オプレルベキン、ヒト白血球由来アルファインターフェロン、Ｂｉｌｉｖｅ、インスリン（組換え）、組換えヒトインスリン、インスリンアスパルト、メカセルミン（ｍｅｃａｓｅｎｉｎ）、Ｒｏｆｅｒｏｎ−Ａ、インターフェロン−アルファ２、Ａｌｆａｆｅｒｏｎｅ、インターフェロンアルファコン−１、インタ���フェロンアルファ、Ａｖｏｎｅｘ組換えヒト黄体形成ホルモン、ドルナーゼアルファ、トラフェルミン、ジコノチド、タルチレリン、ジボテルミンアルファ、アトシバン、ベカプレルミン、エプチフィバチド、Ｚｅｍａｉｒａ、ＣＴＣ−１１１、Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂ、ＨＰＶワクチン（四価）、オクトレオチド、ランレオチド、アンセスチム（ａｎｃｅｓｔｉｒｎ）、アガルシダーゼベータ、アガルシダーゼアルファ、ラロニダーゼ、酢酸プレザチド銅（局所ゲル）、ラスブリカーゼ、ラニビズマブ、Ａｃｔｉｍｍｕｎｅ、ＰＥＧ−Ｉｎｔｒｏｎ、Ｔｒｉｃｏｍｉｎ、組換えチリダニアレルギー脱感作注射、組換えヒト副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ：ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ）１〜８４（ｓｃ、骨粗鬆症）、エポエチンデルタ、トランスジェニック抗トロンビンＩＩＩ、Ｇｒａｎｄｉｔｒｏｐｉｎ、Ｖｉｔｒａｓｅ、組換えインスリン、インターフェロン−アルファ（経口トローチ）、ＧＥＭ−２１Ｓ、バプレオチド、イデュルスルファーゼ、オマパトリラト（ｏｍｎａｐａｔｒｉｌａｔ）、組換え血清アルブミン、セルトリズマブペゴル、グルカルピダーゼ、ヒト組換えＣ１エステラーゼ阻害剤（血管浮腫）、ラノテプラーゼ、組換えヒト成長ホルモン、エンフビルチド（無針注射、Ｂｉｏｊｅｃｔｏｒ  ２０００）、ＶＧＶ−１、インターフェロン（アルファ）、ルシナクタント、アビプタジル（吸入用、肺疾患）、イカチバント、エカランチド、ｏｍｉｇａｎａｎ、Ａｕｒｏｇｒａｂ、ペキシガナン酢酸、ＡＤＩ−ＰＥＧ−２０、ＬＤＩ−２００、デガレリクス、ｃｉｎｔｒｅｄｅｌｉｎｂｅｓｕｄｏｔｏｘ、Ｆａｖｌｄ、ＭＤＸ−１３７９、ＩＳＡｔｘ−２４７、リラグルチド、テリパラチド（骨粗鬆症）、チファコギン、ＡＡ４５００、Ｔ４Ｎ５リポソームローション、カツマキソマブ、ＤＷＰ４１３、ＡＲＴ−１２３、Ｃｈｒｙｓａｌｉｎ、デスモテプラーゼ、アメジプラーゼ、コリフォリトロピンアルファ、ＴＨ−９５０７、テデュグルチド、Ｄｉａｍｙｄ、ＤＷＰ−４１２、成長ホルモン（維持放出注射）、組換えＧ−ＣＳＦ、インスリン（吸入用、ＡＩＲ）、インスリン（吸入用、Ｔｅｃｈｎｏｓｐｈｅｒｅ）、インスリン（吸入用、ＡＥＲｘ）、ＲＧＮ−３０３、ＤｉａＰｅｐ２７７、インターフェロンベータ（Ｃ型肝炎ウイルス感染（ＨＣＶ：ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ））、インターフェロンアルファ−ｎ３（経口）、ベラタセプト、経皮インスリンパッチ、ＡＭＧ−５３１、ＭＢＰ−８２９８、Ｘｅｒｅｃｅｐｔ、オペバカン、ＡＩＤＳＶＡＸ、ＧＶ−１００１、ＬｙｍｐｈｏＳｃａｎ、ランピルナーゼ、Ｌｉｐｏｘｙｓａｎ、ルスプルチド、ＭＰ５２（ベータ−リン酸三カルシウム担体、骨再生）、黒色腫ワクチン、シプロイセル−Ｔ、ＣＴＰ−３７、Ｉｎｓｅｇｉａ、ビテスペン、ヒトトロンビン（凍結、外科的出血）、トロンビン、ＴｒａｎｓＭＩＤ、アルフィメプラーゼ、Ｐｕｒｉｃａｓｅ、テルリプレシン（静脈内、肝腎症候群）、ＥＵＲ−１００８Ｍ、組換えＦＧＦ−Ｉ（注射用、血管疾患）、ＢＤＭ−Ｅ、ロチガプチド、ＥＴＣ−２１６、Ｐ−１１３、ＭＢＩ−５９４ＡＮ、デュラマイシン（吸入用、嚢胞性線維症）、ＳＣＶ−０７、ＯＰＩ−４５、エンドスタチン、アンギオスタチン、ＡＢＴ−５１０、Ｂｏｗｍａｎ  Ｂｉｒｋ阻害剤濃縮物、ＸＭＰ−６２９、９９ｍＴｃ標識−Ｈｙｎｉｃ−アネキシンＶ、カハラリドＦ、ＣＴＣＥ−９９０８、ｔｅｖｅｒｅｌｉｘ（延長放出）、オザレリクス、ロミデプシン（ｒｏｒｎｉｄｅｐｓｉｎ）、ＢＡＹ−５０４７９８、インターロイキン４、ＰＲＸ−３２１、Ｐｅｐｓｃａｎ、ｉｂｏｃｔａｄｅｋｉｎ、ｒｈラクトフェリン、ＴＲＵ−０１５、ＩＬ−２１、ＡＴＮ−１６１、シレンジタイド、アルブフェロン、Ｂｉｐｈａｓｉｘ、ＩＲＸ−２、オメガインターフェロン、ＰＣＫ−３１４５、ＣＡＰ−２３２、パシレオチド、ｈｕＮ９０１−ＤＭＩ、卵巣がん免疫療法ワクチン、ＳＢ−２４９５５３、Ｏｎｃｏｖａｘ−ＣＬ、ＯｎｃｏＶａｘ−Ｐ、ＢＬＰ−２５、ＣｅｒＶａｘ−１６、多エピトープペプチド黒色腫ワクチン（ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００、チロシナーゼ）、ｎｅｍｉｆｉｔｉｄｅ、ｒＡＡＴ（吸入用）、ｒＡＡＴ（皮膚科用）、ＣＧＲＰ（吸入用、喘息）、ペグスネルセプト、チモシンベータ４、ｐｌｉｔｉｄｅｐｓｉｎ、ＧＴＰ−２００、ラモプラニン、ＧＲＡＳＰＡ、ＯＢＩ−１、ＡＣ−１００、サケカルシトニン（経口、ｅｌｉｇｅｎ）、カルシトニン（経口、骨粗鬆症）、エキサモレリン、カプロモレリン、Ｃａｒｄｅｖａ、ベラフェルミン、１３１Ｉ−ＴＭ−６０１、ＫＫ−２２０、Ｔ−１０、ウラリチド、ｄｅｐｅｌｅｓｔａｔ、ヘマタイド、Ｃｈｒｙｓａｌｉｎ（局所）、ｒＮＡＰｃ２、組換え第ＶＩＩＩ因子、（ペグ化リポソーム）、ｂＦＧＦ、ペグ化組換えスタフィロキナーゼバリアント、Ｖ−１０１５３、ＳｏｎｏＬｙｓｉｓ  Ｐｒｏｌｙｓｅ、ＮｅｕｒｏＶａｘ、ＣＺＥＮ−００２、膵島細胞新生療法、ｒＧＬＰ−１、ＢＩＭ−５１０７７、ＬＹ−５４８８０６、エキセナチド（制御放出、Ｍｅｄｉｓｏｒｂ）、ＡＶＥ−００１０、ＧＡ−ＧＣＢ、ａｖｏｒｅｌｉｎ、ＡＣＭ−９６０４、リナクロチドアセタート（ｅａｃｅｔａｔｅ）、ＣＥＴｉ−１、Ｈｅｍｏｓｐａｎ、ＶＡＬ（注射用）、即時作用インスリン（注射用、Ｖｉａｄｅｌ）、鼻内インスリン、インスリン（吸入用）、インスリン（経口、ｅｌｉｇｅｎ）、組換えメチオニルヒトレプチン、ピトラキンラ（皮下注射、湿疹）、ピトラキンラ（吸入用乾燥粉末、喘息）、Ｍｕｌｔｉｋｉｎｅ、ＲＧ−１０６８、ＭＭ−０９３、ＮＢＩ−６０２４、ＡＴ−００１、ＰＩ−０８２４、Ｏｒｇ−３９１４１、Ｃｐｎ１０（自己免疫疾患／炎症）、タラクトフェリン（局所）、ｒＥＶ−１３１（眼科用）、ｒＥＶ−１３１（呼吸器疾患）、経口組換えヒトインスリン（糖尿病）、ＲＰＩ−７８Ｍ、オプレルベキン（経口）、ＣＹＴ−９９００７  ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、ＤＴＹ−００１、バラテグラスト、インターフェロンアルファ−ｎ３（局所）、ＩＲＸ−３、ＲＤＰ−５８、Ｔａｕｆｅｒｏｎ、胆汁酸塩刺激リパーゼ、Ｍｅｒｉｓｐａｓｅ、アルカリホスファターゼ（ａｌａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、ＥＰ−２１０４Ｒ、Ｍｅｌａｎｏｔａｎ−ＩＩ、ブレメラノチド、ＡＴＬ−１０４、組換えヒトマイクロプラスミン、ＡＸ−２００、ＳＥＭＡＸ、ＡＣＶ−１、Ｘｅｎ−２１７４、ＣＪＣ−１００８、ダイノルフィンＡ、ＳＩ���６６０３、ＬＡＢ  ＧＨＲＨ、ＡＥＲ−００２、ＢＧＣ−７２８、マラリアワクチン（ビロソーム、ＰｅｖｉＰＲＯ）、ＡＬＴＵ−１３５、パルボウイルスＢ１９ワクチン、インフルエンザワクチン（組換えノイラミニダーゼ）、マラリア／ＨＢＶワクチン、炭疽病ワクチン、Ｖａｃｃ−５ｑ、Ｖａｃｃ−４ｘ、ＨＩＶワクチン（経口）、ＨＰＶワクチン、Ｔａｔ類毒素、ＹＳＰＳＬ、ＣＨＳ−１３３４０、ＰＴＨ（１〜３４）リポソームクリーム（Ｎｏｖａｓｏｍｅ）、Ｏｓｔａｂｏｌｉｎ−Ｃ、ＰＴＨアナログ（局所、乾癬）、ＭＢＲＩ−９３．０２、ＭＴＢ７２Ｆワクチン（結核）、ＭＶＡ−Ａｇ８５Ａワクチン（結核）、ＦＡＲＡ０４、ＢＡ−２１０、組換え伝染病ＦＩＶワクチン、ＡＧ−７０２、ＯｘＳＯＤｒｏｌ、ｒＢｅｔＶ１、Ｄｅｒ−ｐ１／Ｄｅｒ−ｐ２／Ｄｅｒ−ｐ７アレルゲンターゲティングワクチン（チリダニアレルギー）、ＰＲ１ペプチド抗原（白血病）、突然変異ｒａｓワクチン、ＨＰＶ−１６  Ｅ７リポペプチドワクチン、ラビリンチンワクチン（腺癌）、ＣＭＬワクチン、ＷＴ１−ペプチドワクチン（がん）、ＩＤＤ−５、ＣＤＸ−１１０、Ｐｅｎｔｒｙｓ、Ｎｏｒｅｌｉｎ、ＣｙｔｏＦａｂ、Ｐ−９８０８、ＶＴ−１１１、ｉｃｒｏｃａｐｔｉｄｅ、テルベルミン（皮膚科用、糖尿病性足部潰瘍）、ルピントリビル、ｒｅｔｉｃｕｌｏｓｅ、ｒＧＲＦ、ＨＡ、アルファ−ガラクトシダーゼＡ、ＡＣＥ−０１１、ＡＬＴＵ−１４０、ＣＧＸ−１１６０、アンギオテンシン治療ワクチン、Ｄ−４Ｆ、ＥＴＣ−６４２、ＡＰＰ−０１８、ｒｈＭＢＬ、ＳＣＶ−０７（経口、結核）、ＤＲＦ−７２９５、ＡＢＴ−８２８、ＥｒｂＢ２特異的免疫毒素（抗がん）、ＤＴ３ＳＳＩＬ−３、ＴＳＴ−１００８８、ＰＲＯ−１７６２、Ｃｏｍｂｏｔｏｘ、コレシストキニン−Ｂ／ガストリン受容体結合ペプチド、１１１Ｉｎ−ｈＥＧＦ、ＡＥ−３７、トラスツズマブ（ｔｒａｓｎｉｚｕｍａｂ）−ＤＭ１、アンタゴニストＧ、ＩＬ−１２（組換え）、ＰＭ−０２７３４、ＩＭＰ−３２１、ｒｈＩＧＦ−ＢＰ３、ＢＬＸ−８８３、ＣＵＶ−１６４７（局所）、Ｌ−１９ベースの放射免疫療法薬（がん）、Ｒｅ−１８８−Ｐ−２０４５、ＡＭＧ−３８６、ＤＣ／１５４０／ＫＬＨワクチン（がん）、ＶＸ−００１、ＡＶＥ−９６３３、ＡＣ−９３０１、ＮＹ−ＥＳＯ−１ワクチン（ペプチド）、ＮＡ１７．Ａ２ペプチド、黒色腫ワクチン（パルス抗原療法薬
）、前立腺がんワクチン、ＣＢＰ−５０１、組換えヒトラクトフェリン（ドライアイ）、ＦＸ−０６、ＡＰ−２１４、ＷＡＰ−８２９４Ａ（注射用）、ＡＣＰ−ＨＩＰ、ＳＵＮ−１１０３１、ペプチドＹＹ［３〜３６］（肥満、鼻内）、ＦＧＬＬ、アタシセプト、ＢＲ３−Ｆｃ、ＢＮ−００３、ＢＡ−０５８、ヒト副甲状腺ホルモン１〜３４（鼻、骨粗鬆症）、Ｆ−１８−ＣＣＲ１、ＡＴ−１１００（セリアック病／糖尿病）、ＪＰＤ−００３、ＰＴＨ（７〜３４）リポソームクリーム（Ｎｏｖａｓｏｍｅ）、デュラマイシン（眼科用、ドライアイ）、ＣＡＢ−２、ＣＴＣＥ−０２１４、糖ペグ化エリスロポエチン、ＥＰＯ−Ｆｃ、ＣＮＴＯ−５２８、ＡＭＧ−１１４、ＪＲ−０１３、第ＸＩＩＩ因子、ａｍｉｎｏｃａｎｄｉｎ、ＰＮ−９５１、７１６１５５、ＳＵＮ−Ｅ７００１、ＴＨ−０３１８、ＢＡＹ−７３−７９７７、テベレリクス（即時放出）、ＥＰ−５１２１６、ｈＧＨ（制御放出、Ｂｉｏｓｐｈｅｒｅ）、ＯＧＰ−Ｉ、ｓｉｆｕｖｉｒｔｉｄｅ、ＴＶ４７１０、ＡＬＧ−８８９、Ｏｒｇ−４１２５９、ｒｈＣＣ１０、Ｆ−９９１、チモペンチン（肺疾患）、ｒ（ｍ）ＣＲＰ、肝選択インスリン、ｓｕｂａｌｉｎ、Ｌ１９−ＩＬ−２融合タンパク質、エラフィン、ＮＭＫ−１５０、ＡＬＴＵ−１３９、ＥＮ−１２２００４、ｒｈＴＰＯ、トロンボポエチン受容体アゴニスト（血小板減少症）、ＡＬ−１０８、ＡＬ−２０８、神経成長因子アンタゴニスト（疼痛）、ＳＬＶ−３１７、ＣＧＸ−１００７、ＩＮＮＯ−１０５、経口テリパラチド（ｅｌｉｇｅｎ）、ＧＥＭ−ＯＳ１、ＡＣ−１６２３５２、ＰＲＸ−３０２、ＬＦｎ−ｐ２４融合ワクチン（Ｔｈｅｒａｐｏｒｅ）、ＥＰ−１０４３、肺炎球菌（Ｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）小児ワクチン、マラリアワクチン、髄膜炎菌Ｂ群ワクチン、新生児Ｂ群連鎖球菌ワクチン、炭疽病ワクチン、ＨＣＶワクチン（ｇｐＥ１＋ｇｐＥ２＋ＭＦ−５９）、中耳炎治療、ＨＣＶワクチン（コア抗原＋ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ）、ｈＰＴＨ（１〜３４）（経皮、ＶｉａＤｅｒｍ）、７６８９７４、ＳＹＮ−１０１、ＰＧＮ−００５２、ａｖｉｓｃｕｍｎｉｎｅ、ＢＩＭ−２３１９０、結核ワクチン、多エピトープチロシナーゼペプチド、がんワクチン、ｅｎｋａｓｔｉｍ、ＡＰＣ−８０２４、ＧＩ−５００５、ＡＣＣ−００１、ＴＴＳ−ＣＤ３、血管ターゲティングＴＮＦ（固形腫瘍）、デスモプレシン（口腔制御放出）、ｏｎｅｒｃｅｐｔ及びＴＰ−９２０１である。
【０１１８】
一部の実施形態において、ポリペプチドは、アダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ）、インフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（商標））、リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（商標）／ＭＡＢ  ＴＨＥＲＡ（商標））、エタネルセプト（ＥＮＢＲＥＬ（商標））、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（商標））、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（商標））、ペグフィルグラスチム（ｐｅｇｒｉｌｇｒａｓｔｉｍ）（ＮＥＵＬＡＳＴＡ（商標））、又はバイオシミラー及びバイオベターを含む任意の他の好適なポリペプチドである。
【０１１９】
他の好適なポリペプチドは、以下及び（ＵＳ２０１６／００９７０７４から適合した）表１に列挙するポリペプチドである：
【表１−１】
2020505059.tif 000004
【表１−２】
2020505059.tif 000005
【表１−３】
2020505059.tif 000006
【表１−４】
2020505059.tif 000007
【表１−５】
2020505059.tif 000008
【表１−６】
2020505059.tif 000009
【０１２０】
実施形態において、ポリペプチドは、以下の表２に示すホルモン、凝血／凝固因子、サイトカイン／増殖因子、抗体分子、融合タンパク質、タンパク質ワクチン又はペプチドである。
【表２−１】
2020505059.tif 000010
【表２−２】
2020505059.tif 000011
【表２−３】
2020505059.tif 000012
【０１２１】
実施形態において、タンパク質は、表３に示す多特異性タンパク質、例えば二重特異性抗体である。
【表３−１】
2020505059.tif 000013
【表３−２】
2020505059.tif 000014
【表３−３】
2020505059.tif 000015
【表３−４】
2020505059.tif 000016
【表３−５】
2020505059.tif 000017
【表３−６】
2020505059.tif 000018
【表３−７】
2020505059.tif 000019
【表３−８】
2020505059.tif 000020
【実施例】
【０１２２】
（例１）
毛細管支援細胞クローニング
最初に、クローニングに使用する培養物の細胞カウントを行った。その後、この培養物を１ｍｌ当たり細胞約１０００個に希釈した。希釈した細胞懸濁液の約１μＬの液滴を、４８ウェルプレートに分配した（図１０）。２人の科学者は独立して、顕微鏡により液滴を調査し、含有される細胞数を記録した（図１１Ａ〜１１Ｃ）。初期に液滴全体を４０倍の倍率で、その後１００倍又は２００倍の倍率で細胞の存在について走査して、単一細胞のみの存在を確認することによって、観察を行った。気泡を含有する液滴、単一の視野内で完全に可視化することができない液滴、境界が明確に見えない液滴又は細片を含有する液滴は、更なる分析から除外した（図１２Ａ〜１２Ｄ）。観察後、すべてのウェルに増殖培地を添加した。その後、プレートを、１０％ＣＯ２及び９０％空気を含有する雰囲気中で３７℃にて最長１２週間インキュベートして、遅延増殖コロニーの増殖を可能にした。コロニーを生成したすべてのウェルを記録した。両方の科学者によって同意される、１個の細胞を含有するウェルからのコロニーのみを進めた。
【０１２３】
（例２）
データ分析の材料及び方法
科学者の各々の観察を、３つのカテゴリー：細胞なし、１個の細胞又は１個よりも多い細胞に要約した。各ウェルについての観察結果は、それが増殖を示したか、又は増殖を示さなかったかであった。このデータを、最大尤度を使用してコロニーの単クローン性の確率を見積もるために使用した統計モデルに入力した。ソフトウェアパッケージ、Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａ４．１版（Ｗｏｌｆｒａｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．社）を使用して、単クローン性の確率の計算を行った。
【０１２４】
（例３）
毛細管支援細胞クローニング技術の確証
２人の科学者によって行われた目視観察における誤りの可能性を考察した。第１の誤りの可能性は、２人の科学者がウェル中の細胞を見逃し得ること、及び実際には２個の細胞がある場合に１個の細胞の存在を見逃し得ることであった。第２の懸念は、１個の細胞が別の細胞の上部上にあり、したがって、２個の細胞が１個に見え得ることであった。
【０１２５】
これらの懸念に取り組むため、技術を確証するための実験を行った。この実験において、２つの非常に類似したＧＳ−ＮＳ０細胞系を、同じ割合で混合した。細胞系は、同じＮＳ０ホスト細胞バンクに由来し、グルタミン合成酵素（ＧＳ：ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）発現系を使用して、可変領域における軽微な変化においてのみ互いに異なる類似した抗体を発現した。１１回の別々のセッションにおいて、４人の科学者が、２つの細胞系の混合物からの細胞を２，３００ウェルに播種した。４人の科学者は、２人１組で作業し、播種した２３００ウェルのうちの３２１ウェルが、各々１個の細胞を含有することを確認した。最長４週間のインキュベーション後、これらの３２１ウェルのうちの１５６ウェルにおいて、増殖コロニーを発見した。各抗体について特異的な、確証済みＥＬＩＳＡによって、１５６ウェルのうちの各々が、１つの抗体のみを含有することが示された。両方の抗体について陽性又は陰性であるウェルはなかった（表１）。これらの結果は、毛細管支援細胞クローニング技術が、２つの細胞系の混合培養物を単クローン性コロニーに分解することを示した。この実験において、２人の科学者の観察における誤りは、細胞を含有しないと報告したウェルにおける細胞増殖に基づいて、０．４％と非常に低いことが分かった（表２）。このことは、２人の科学者がウェル中の細胞の存在を見逃す機会は非常に低かったことを示す。
【表４】
2020505059.tif 000021
【表５】
2020505059.tif 000022
【０１２６】
（例４）
数学的モデルの開発
例３において説明する実験において、細胞のランダム分布を含有する液体を、多数のＮ個のウェルに入れる。その後、各々３人の選択肢を有する２人の科学者が独立して、各ウェルを検査する。彼らは、ウェルが、細胞を含有しない、１個の細胞を含有する、又は１個よりも多い細胞を含有することを報告し得る。
【０１２７】
各ウェルについての観察結果は、ウェルが、１個若しくは複数の細胞からの増殖を示すか、又は増殖を示さないかである。後者は、ウェル中に増殖が開始し得る細胞がなかったため、又は１個若しくは複数の細胞があったが、それらが増殖しなかったためにもたらされ得る。そのような実験の結果は、１２の頻度ｎｉｊ（ｉは、増殖（ｉ＝１）又は増殖なし（ｉ＝０）を示し、ｊは、２人の科学者からの報告の６つの組合せを示し、ｎｉｊは、カテゴリー（ｉ，ｊ）に入るウェル数を示す）によって要約することができる。２人の科学者は特定されないことが暗黙のうちに仮定される。実験で、どの科学者がどの報告を作成するかが記録され、２人又は数人の科学者のみを使用する場合、以下に特定するモデルとは異なるモデルを使用するべきである。以下の表は、すべての重要な概念を例示する。
【表６】
2020505059.tif 000023
【０１２８】
ウェルが増殖を示す場合、これは、ただ１個の細胞から生じ、そのため単クローンであり得るか、或いはそれは、２個又はそれよりも多い細胞からの増殖混合物であり得る。科学者が熟練している場合、単クローン増殖を発見する最も良い機会は、両方の科学者が、初期にただ１個の細胞が存在し、後に増殖を示したと報告するｎ１３ウェル中にある。それゆえ、これらのウェルの、実際に単クローン増殖を有する割合Ｐを見積もることが必要とされる。
【０１２９】
この量は、直接観察可能ではなく、その推定は、実験データから推測しなければならないことに留意しなければならない。
【０１３０】
観察不能な量を見積もらなければならないすべての実験において、推定は、１組の仮定に基づかなければならず、推定の妥当性は、仮定の合理性によって成立又は崩壊する。ここで、以下の組の仮定を立てた：
１．ウェル中の初期の実際の細胞数は、未知の平均値μを有するポアソン分布に従う。異なるウェル中の数を、独立して、ランダムにこの分布から引き出し、ウェル中の予測数又は平均数は、すべてのウェルについて同じである。
２．各細胞は、すべての他の細胞とは独立して、いくつの細胞が同じウェル中にあるかとは独立して、同じ未知の増殖確率ｐを有する。
３．ウェルは、そのウェル中の１個又は複数の細胞が増殖する場合且つその場合に限り、増殖を示す。
４．ウェル中に実際にｋ個の細胞がある場合、科学者が組合せｊを報告する確率は、未知の量πｋｊである。ｋの各値について、ｊ＝１〜６にわたる、これらの合計は、１でなければならない。
【０１３１】
仮定１から、ウェルがｋ個の細胞を含有する確率は、ｅ−μμｋ／ｋ！（ｋ＝０、１、２、３、・・・）である。
【０１３２】
仮定２及び３から、ｋ個の細胞を含有するウェルが増殖を示さない確率は、（１−ｐ）ｋである。
【０１３３】
ｐｉｊが、任意のウェルが様々な結果の可能性を示す表３における組合せ（ｉ，ｊ）に入る確率を示す場合、これらのすべての１２個についての式は、ここで、仮定４を使用して導くことができる。例えば：
【数２】
2020505059.tif 000024
【０１３４】
更に５つの同様の式の対があり、ｐ及びπの２番目の下付き文字は、１〜６に変化する。
【０１３５】
モデルは、ここまでは、無限数の未知の量を導入した。これらは、μ、ｐ及びすべてのπｋｊであり、ｊ＝１〜６、ｋ＝０、１、２、３、４、・・・である。そのようなモデルは、どんなデータの組にも正確なフィッティングを提供し損なう場合はなく、使用可能なモデルを得ることができる前に、未知数の数を限定するために直感的な条件を課さなければならない。もちろん、これを行う多くの方法があるが、第１のステップとして、上記仮定４は、
５．ウェル中に実際にｋ個の細胞がある場合、各科学者は独立して、細胞なし（ｍ＝０）、１個の細胞（ｍ＝１）又は１個よりも多い細胞（ｍ＝２）と報告する確率ｑｋｍを有し、ｑｋ０＋ｑｋ１＋ｑｋ２＝１である。
によって置換することができる。
【０１３６】
これは、５つの未知数π（６は、それらが最大１を付加しなければならないという制約を受けやすい）の各組を２つの未知数ｑの組により置換する効果を有する。それらの間の関係は、簡単に式：
πｋ１＝ｑｋ０２
πｋ２＝２ｑｋ０ｑｋ１
πｋ３＝ｑｋ１２
πｋ４＝２ｑｋ０ｑｋ２
πｋ５＝２ｑｋ１ｑｋ２
πｋ６＝ｑｋ２２
によって与えられる。
【０１３７】
しかしながら、無限数のそのような組がまだあり、そのため、更なる限定が必要とされる。以下の仮定は、初期に提案される。それらは、両方の科学者がかなり適格であり、大きな間違いをしないという概念を記号に入れる。
６．ウェル中に３個又はそれよりも多い細胞が存在する場合、各科学者は、必ず「１個よりも多い細胞」と報告する。
７．ウェル中に２個又はそれよりも多い細胞が存在する場合、各科学者は、必ず「細胞なし」と報告しない。
【０１３８】
残りの未知数ｑは、模式的に表に入れることができ、アスタリスクは、０ではない可能性を示すが、各カラムを合計１にするように制約される：
【表７】
2020505059.tif 000025
【０１３９】
それゆえ、ここで、５つの未知数ｑのみが存在し、すべてにおいて７つの未知数になる。これは、モデルが合理的な事実の表示であるなら、１２の観察頻度ｎｉｊへの優れたフィッティングを可能にするはずである。
【０１４０】
更なる１つの制約がある、すなわち、ｑ２１は、少なくともｑ１０と同じくらい大きいはずである。これは、実際に２個の細胞が存在する場合、１個がほとんど完全に他方を覆い隠し、１個の細胞のみが存在するかのように見える場合があることが起こり得るからである。この誤りは、実際に１個の細胞が存在する場合に１個の細胞を認識しないという、他の種類の誤りより起こりやすいと思われる。
【０１４１】
（例５）
モデルの、データへのフィッティングの良さについての基準
最大尤度
尤度は、単に、本発明者らが、モデルが真であったかどうかを本発明者らが観察したことを観察した確率である。それは、観察データのみでなく、モデルにおける未知のパラメータの関数である。これらは、原始的な意味において、本発明者らがなぜ本発明者らが観察したものを観察したのかを最も良く「説明する」ので、本発明者らは自然に、尤度を最大限にする未知のパラメータのそれらの値を選択することを望む。本発明者らの場合において、それゆえ、本発明者らは、７次元の一面としての尤度について考え、この面の「頂点」を見つけることを求める。
【０１４２】
尤度についての式は、単に、Ｎ個のウェルの各１個についての結果の確率のすべての積である。これは、
【数３】
2020505059.tif 000026
として表すことができる。
【０１４３】
最小二乗和
各観察頻度ｎｉｊについて、本発明者らは、モデルによって予測される予測頻度ｅｉｊを計算することができる。本発明者らは、観察頻度と予測頻度との間の相違の二乗和を最小限にする、モデルにおける未知のパラメータの値を見つけようとし得る。これは、
【数４】
2020505059.tif 000027
によって与えられる。
【０１４４】
最小カイ二乗
上記二乗和についての変形として、本発明者らは、予測頻度によって逆に、観察頻度と予測頻度との間の各二乗した相違に重みを付けることを望む場合があり、この考えは、１００２の観察頻度と１０００の予測頻度との間の差が、１０２と１００との間の差、又は１２と１０との間の差より「重大」ではないことである。よく知られているカイ二乗統計は、多くの意味において、最適な方法であるものにおいて、これを達成する。それは、
【数５】
2020505059.tif 000028
によって与えられる。
【０１４５】
対数尤度比統計
多くの場合使用される全体的な相違の代替の測定値は、
【数６】
2020505059.tif 000029
によって与えられる。
【０１４６】
すべての４つの量、Ｌ、Ｓ、Ｃ及びＧは、７つの未知のパラメータの複雑な関数である。本発明者らは、Ｌの、又は同等にログＬ（これは典型的に、大きな負の数である）の最大値、しかしＳ、Ｃ及びＧの最小値を求める。これが微分によって代数的に実行可能な方法でなされ得ることはなく、そのため多くの関数最大化アルゴリズムのうちの１つを使用しなければならない。これらはすべて、大きな欠点を有する、すなわち、それらは、それらの逐次探索ルーチンのための開始点として使用するために未知数の値で一部の初期の推量を必要とする。より悪いことに、それらが最終的に生成する解は、それらが与えられた開始値に大きく依存し得る。７つの未知数の関数としての、例えばＬの７次元面が平滑であり、単一の頂点を有する場合、通常問題はなく、ルーチンは、開始値にかかわらず頂点を発見するが、面が様々な場所に様々な高さの頂点を有する山脈にむしろ近い場合、ルーチンは容易に脇道に逸れ、小頂点を発見したり、どこか別のところに更に高い頂点があることに気付かず停止したりし得る。これに対する防御方法は、ただ２つである：
・事前知識によって可能な限り良い開始値を慎重に選択すること。特にμ及びｐの値について、事前にかなりの情報が存在するべきであり、これを使用するべきである。
・解を慎重に検査して、それらが生物学的に常識的であるかどうか確かめること。
【０１４７】
すべてが明確であり正確であるように見える場合でさえも、初期の組にかなり近いいくつかの他の組の開始値で行い、それらが生成する解が本質的に同じであることをチェックすることによって、確認するべきである。
【０１４８】
ある他の複雑さに言及する必要がある。量Ｌ、Ｓ、Ｃ及びＧは、７つの未知数の値の限定された範囲にわたってのみ定義される。制約
０≦ｐ≦１
は、十分に明らかであるが、その他、例えば
０≦ｑ００≦１
０≦ｑ０１≦１−ｑ００
が存在し、これは数ルーチンに慎重にプログラムされる必要がある。頂点は、許容される領域の境界の一部の非常に近くで十分に起こる場合があり、このことは再び、計算の、最終的な解への収束での問題を引き起こし得る。
【０１４９】
要約すると、このモデルは、１組の実験データを不注意に導入し、保証された正確な解を得る手段では決してない。それは常に、注意を伴って使用しなければならず、解は、確認が得られるまで懐疑的に見なければならない。
【０１５０】
（例６）
単クローン性の確率の推定
このモデリング、及び当該モデルのデータへのフィッティングのすべては、１つの主要な目的を有する。これは、両方の科学者によってウェルがただ１個の細胞を含有すると報告し、且つウェルが後に増殖を示す場合、当該増殖が実際に単クローンである確率を見積もることである。これは：
【数７】
2020505059.tif 000030
によって与えられる。分子は、
【数８】
2020505059.tif 000031
として、分母は、
【数９】
2020505059.tif 000032
として表すことができ、そのため、平易化後、比は、
【数１０】
2020505059.tif 000033
になる。前の節における数値処理によって見積もった未知数の値を、それゆえ、この式に挿入して、Ｐ値の推定を得なければならない。
【０１５１】
（例７）
科学者の技能についての仮定
モデルの主要な限界は、２人の科学者が、彼らが３種類の可能性のある報告を作成する同じ機会を有すると仮定される点において、同等に熟練していると仮定されることである。科学者が特定可能でない場合、これについて改善する方法はないように見える。しかしながら、実験全体を、例えば１及び２と標識した特定の科学者を使用して行った場合、それはもっと多くの情報を伝達し得る。例えば「１人の科学者が細胞なしと報告し、他方が１個の細胞と報告する」結果は、「科学者１が細胞なしと報告し、科学者２が１個の細胞と報告する」及び「科学者２が細胞なしと報告し、科学者１が１個の細胞と報告する」という２つに分けることができる。本発明者らは、各科学者について異なる組のｑを導入して、彼らの熟練が異なることを可能にし得る。
【０１５２】
（例８）
数値例
約１９９６年からの実験からの結果を、以下に示す。
【表８】
2020505059.tif 000034
【０１５３】
未知数についての値での初期の推量は、μ＝０．４、ｐ＝０．２５であり、
【表９】
2020505059.tif 000035
アスタリスクを付した値は、デフォルトにより供給されて、各列に最大１を付加させる。
【０１５４】
最大尤度基準からのμ及びｐの推定は、
μ＝１．０９０９、ｐ＝０．５０８３
であり、ｑの推定は、
【表１０】
2020505059.tif 000036
であった。
【０１５５】
これらの解が正しい場合、科学者は、本発明者らが本発明者らの初期の推定において彼らを信頼したよりも更により熟練していた。
【０１５６】
単クローン性の確率の推定Ｐは、０．９９９１であった。
【０１５７】
モデリング処理の内的妥当性をチェックするために、１２個のカテゴリーのうちの各々においてどんな頻度になると予測するべきであったかを解明してもよい。各対応する観察頻度に伴って、最大尤度基準に由来する頻度を括弧内に挿入する。
【表１１】
2020505059.tif 000037
【０１５８】
開始値の不適切な選択の効果を示すために、前とは異なる組の開始値を使用して、μ＝０．４及びｐ＝０．２５により、再び分析を行ったが、
【表１２】
2020505059.tif 000038
【０１５９】
結果は、
μ＝１．０９１５、ｐ＝０．５０８１、Ｐ＝０．９９９１
であり、ｑの推定は、
【表１３】
2020505059.tif 000039
であった。
【０１６０】
これらは、少数第４位のわずかな差を伴って、以前と同じである。他の６つの組の開始値を試し、それらのうちの５つは、上記と同じ解答に収束した。１つの例外は、明らかに間違った解答に収束した。それが発見した尤度面の頂点は、他の解答が発見した頂点よりかなり低く、ｑは不適切であった。しかし、この間違った解を生成した開始値は、
μ＝１．１５５３、ｐ＝０．５５１４
であり、ｑについては上記と同じ組の０．４の値であったことは教示的である。μ及びｐについての開始値は、生データからの粗い推定を使用することによって生成された値であり、実際に、他の解答が発見した「正しい」値に非常に近かった。それゆえ、一部の未知数について「良い」初期値で開始することは、最も良い解を得ることを保証しない。
【０１６１】
また、ｑ２１の推定は常に、ｑ１０の推定と全く同じになったことに留意すべきである。それは、ｑ２１≧ｑ１０の制約がなければ、より低く、これは、単クローン性の確率Ｐを１に更により近いものにする効果を有したであろう。
【０１６２】
この例は、結果は常に批判的に調査しなければならないことを示す。ほとんどの場合、任意の１組の解を満足して受け入れることができるまでに、かなり多くの開始値の組が、おそらく必要である。
【０１６３】
（例９）
Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａへのモデルの適合
μ及びｐについての開始値を見積もるための手技を改変して、Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａにクローニング実験から供給したデータからこれらの値を計算させることを可能にした。μ１の開始値は、播種した合計ウェル数から大まかに見積もることができ、１ウェル当たりに播種した平均細胞数の計算は、２人の科学者が報告した観察に基づいた。ｐ２の開始値は、２人の科学者が１個の細胞の存在を報告したカテゴリー内の合計ウェル数に対する、増殖を示すウェル数の比から大まかに見積もることができる。μ及びｐについての開始値のより良い推定は、このようにして得ることができると考えられた。初期値がμ及びｐについて与えられても、与えられなくても、結果は同様であったが、実際には、初期値は、μ及びｐについて与えられない。
１  −ｌｎ［（ｎ０１＋ｎ１１）／Ｎ］
２  ｎ１３／（ｎ０３＋ｎ１３）。
【０１６４】
クローン性の確率は、１に非常に近かったので、単クローン性の確率（Ｐ）の、より９５％低い境界の推定は、確率がどのくらい良い推定であったかを決定するための最も実用的な方法であると考えられた。これは、Ｐの推定と１−Ｐの推定との比の自然対数をとり、その分布がおよそ正規であるという共通の仮定を起動することによって行った。
【０１６５】
（例１０）
細胞系の毛細管支援細胞クローニングへのモデルの適用
毛細管支援細胞クローニング技術を使用して行ったいくつかの細胞系のクローニングから得たデータに、数学モデルを適用した。現在までに２４回のクローニングから得た単クローン性の確率は、０．９８２７〜０．９９９９であった。このことは、毛細管支援細胞クローニング技術は、高確率の単クローン性を達成するクローニングのための信頼性のある１ステップ法であることを示す。
【表１４−１】
2020505059.tif 000040
【表１４−２】
2020505059.tif 000041
【０１６６】
１ラウンドの毛細管支援細胞クローニングは、単クローン細胞系を得るための２ラウンドの限界希釈クローニングに取って代わることができる。この技術は、単クローン性を示すためにルーチンに使用することができる。
【０１６７】
開発したモデルは、強固であり、実験データと優れた一致を示す結果を予測する。このモデル及び示されるデータの使用は、本方法を支持する十分なデータを提供する。このモデルは、単クローン性の確率を見積もることを可能にし、また、この確率についてのより９５％低い境界の推定を計算することができる。
【０１６８】
（例１１）
ＦＡＣＳに基づく単一細胞クローニングの改善
現在のＦＡＣＳ設定における不備は特定されており、任意の得られる細胞系が単クローンである高確率を有することを確実にする対照が導入された。ＦＡＣＳを使用してどのくらい再生可能な高確率の単クローン性（≧０．９９）が達成されたかを示すために、実験を考案した。慎重な器具設定後、代表的な細胞試料を蛍光染色し、細胞細片、非生存細胞及び細胞凝集体を除外する一連のゲートを使用して、第１の９６ウェルプレート蓋上に単一細胞を分取する。これらの９６ウェルプレート蓋を、蛍光顕微鏡を使用して目視検査する。少なくとも１人の科学者が、画像におけるウェル中のアリコートを検査し、０個の細胞、１個の細胞又は２個以上の細胞の観察を行い、観察を記録する。各カテゴリーについての観察数を、確率式、例えば例６で開発した式、又は事前事後確率ベイズ分析を使用する同様の式を使用して、単クローン性の確率を見積もるために使用する。ＦＡＣＳの使用は、各液滴が細胞を含有すると仮定するので、液滴中の細胞のランダム分布に基づく統計法は適切ではない。第１の９６ウェルプレート蓋の単クローン性の信頼性の初期査定を行った後、更なる１、５、１０、１５、２０、２５個又はそれよりも多いプレートを、ＦＡＣＳを使用するクローニングのために選択した非染色細胞集団のアリコートで満たす。このインターバル後、第２の９６ウェルプレート蓋を、蛍光顕微鏡を使用して検査する。ここでもまた、少なくとも１人の科学者が、画像におけるウェル中のアリコートを検査し、０個の細胞、１個の細胞又は２個以上の細胞の観察を行い、観察を記録し、そしてここでもまた、各カテゴリーについての観察数を、単クローン性の確率を見積もるために使用する。単クローン性の確率の第２の推定が第１の推定から変えられるか、又は単クローン性の確率閾値に見合わないか、若しくはそれを超える場合、先行するインターバルのプレートを、更に進めない。器具の性能が変動する場合、ＦＡＣＳをその所望の性能エンベロープに戻すために、適切な対照計画を使用する。そのような対照計画の使用は、ウェルが単一細胞を含有するという確信を増大させる。この、方法に対して増大した対照により、バイオプロセシング使用のための細胞系を産生するためのＦＡＣＳの利用性及び信頼性は、大いに増大する。ＦＡＣＳに基づく単一細胞クローニングを使用するためのより特定の詳細を、以下に説明する。使用されるステップ及び／又はアルゴリズムは、特定のフローサイトメーター、例えばＦＡＣＳ、機械又は技術の機械特異的特徴に適合され得る。
【０１６９】
器具設定
・無菌分取のための調製
・製造業者のガイドラインに沿った、すべての使い捨て流路管の置換及び器具の消毒
・シース液及びストリームの無菌状態の確認
・ストリームの安定化
・ストリームの一貫した挙動を確実にするためにチェックを行う
・ストリーム頻度、液滴ブレークオフ及びギャップフィールドについて固定パラメータを確立する
・安定な側面ストリーム形成の確認
・サイトメーター性能チェック
・ＰＭＴ取得を設定するためにビーズを使用する
・対照チャートを使用して器具性能をチェックする
・レーザー整列及び領域スケーリング因子チェック
・サイトメーターチャネルの性能確証
・領域スケーリング因子の確証
・設置及び液滴遅延設定
・分取ストリームからの設置位置が、ウェルの中心にあるように確認／調節する
・液滴遅延を最適化して、分取ストリームにおける最大産出を達成する
・ビーズを使用する設定の確認
・単一細胞精密マスクを使用して蛍光ビーズを分取する
・１ウェル当たり１個のビーズの設置を目視確認する；１個よりも多いビーズが任意のウェル中に存在する場合、設定を繰り返す
・代表的な細胞を使用する設定の確認
・細片及び細胞凝集体を除外するゲート内で細胞集団を確立する
・単一細胞精密マスクを使用して蛍光染色した代表的な細胞を分取する
・１ウェル当たり１個の細胞の設置を目視確認する；計算した単クローン性の確率は０．９９以上でなければならず、そうでなければ設定を繰り返す
・分取準備済みのシステム
・すべてのパラメータ電圧及びゲートを固定する
・システム設定に対する任意の変化は、細胞を使用する設定の再確認を要する
【０１７０】
ゲーティング計画及び単一細胞分取
細胞を、細胞フィルターを通して通過させて任意の細胞凝集体を破壊することを含む、各分取セッションについて、新鮮な細胞集団を調製した。その後、細胞を、図３に示す通り、非生存細胞、細片及び残りの二重体又はより高次の細胞凝集体を除外するゲーティング計画に供した。分取のための細胞の特定及び選択において補助するために蛍光は使用しない。
【０１７１】
選択した集団からの細胞を、単一細胞精密マスク(a single precision mask)を使用して、単一細胞分取して、マルチウェルプレート（典型的に分取セッション当たり２０個×９６ウェルプレート）に入れた。１個の細胞を含有する液滴のみを、液滴が汚染粒子を含有せず、液滴内の中央にある場合に分取した（図４）。先頭及び末尾の液滴は分取しなかった。大きな割合の細胞が捨てられて浪費されたが、これにより分取された液滴の高純度が可能になった。
【０１７２】
器具性能の一貫性の測定
細胞集団をＥＲ−Ｔｒａｃｋｅｒ（商標）Ｇｒｅｅｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で染色して、細胞集団の目視特定において補助し、続いて標的として９６ウェルプレートの蓋上に分取することによって、器具性能を規則的なインターバルで測定した。蓋上の印は、９６ウェルプレート中のウェルの位置に対応した。その後、プレート蓋上の液滴を、蛍光顕微鏡を使用して手動でチェックし、各標的中の細胞数を、０、１又は２＋細胞のいずれかとして記録した（図５）。各分取セッションの開始及び終了時に、このプロセスを繰り返し、得られたデータ組を使用して、分取セッションについての単クローン性の確率を計算した。クローニングセッションの開始及び／又は終了時に、単クローン性の確率が０．９９０未満であると計算された場合、器具は、単一細胞設置に好適ではないと考えられ、適切な調整行為を実行した。その周囲のセッション中に分取したプレートを捨て、細胞を使用する器具設定確認を繰り返した。このように、器具の挙動が分取セッションの過程にわたり一貫していないと考えられる（例えば、プレート内の細胞設置位置が変動する）場合、また、これにより上記の調整行為及び器具設定の再確認を要し得る。
【０１７３】
単クローン性の確率を計算するための統計モデル
事前事後確率ベイズ分析を使用して、標的が０（Ｘ＝０）又は単一細胞（Ｘ＝１）を有する確率（Ｐ）を見積もった。単クローン性の確率を：
【数１１】
2020505059.tif 000042
として見積もった。これは、限界希釈クローニングにおいて頻繁に使用される、表現Ｓ／Ｒと同等であり、Ｓ＝単一コロニーを含有するウェル数であり、Ｒ＝応答中の（すなわち、増殖中の）ウェル数である（Ｃｏｌｌｅｒ  ＆  Ｃｏｌｌｅｒ、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、２巻（１号）：９１〜９６頁、１９８３年）。
【０１７４】
単一細胞分取モードで操作するＦＡＣＳについて、ほとんどすべての液滴は、細胞を含有し、したがって、ポアソン分布を支持するランダム性の仮定に背く。それゆえ、Ｐ（Ｘ＝０）及びＰ（Ｘ＝１）を見積もるために、ベイズアプローチは、分布を支持する仮定が必要とされないので、使用する。ベイズモデルは、採取したデータの結果を予測するために、器具の以前の性能を使用する（図６）。ベータ分布を、事前事後複合物として使用する（図７及び８）。事後分布のモードとしてＰ（Ｘ＝０）及びＰ（Ｘ＝１）についての値を見積もった（図９）。
【０１７５】
結論
ＦＡＣＳは、強固な器具設定の使用及び器具性能の規則的なモニタリングを通して、高確率の単クローン性（０．９９０以上）で単一細胞を単離するために使用することができる。ベイズモデルを適用して、ＦＡＣＳ器具の以前の性能に基づいて各単一細胞分取セッションについて単クローン性の確率を見積もることができる。そのようなＦＡＣＳ補助単一クローニングラウンドは、生物製剤を製造するために好適な細胞系を開発する時間及びコストを低減することができる。単クローン性の更なる保証は、単一細胞画像法及び／又はコロニー増殖のモニタリングを通して提供することができる。
【図１】
2020505059.tif 000045
【図２】
2020505059.tif 000046
【図３】
2020505059.tif 000047
【図４】
2020505059.tif 000048
【図５】
2020505059.tif 000049
【図６】
2020505059.tif 000050
【図７】
2020505059.tif 000051
【図８】
2020505059.tif 000052
【図９】
2020505059.tif 000053
【図１０】
2020505059.tif 000054
【図１１Ａ】
2020505059.tif 000055
【図１１Ｂ】
2020505059.tif 000056
【図１１Ｃ】
2020505059.tif 000057
【図１２Ａ】
2020505059.tif 000058
【図１２Ｂ】
2020505059.tif 000059
【図１２Ｃ】
2020505059.tif 000060
【図１２Ｄ】
2020505059.tif 000061
【国際調査報告】
2020505059.tif 000062
2020505059.tif 000063
2020505059.tif 000064
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2020505059.tif 000066