(57)【要約】  非神経学的及び／又は神経学的状態のＩＧＦ−１分析、調節及び疾患管理に関する改善が本明細書に記載される。より詳細には、ＩＧＦ−１機能障害を伴う非神経学的及び／又は神経学的状態のリスク及び回復を予測するための環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）バイオマーカーの臨床適用に関する方法、並びにそれらを治療するためのブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）の濃縮抽出物などのｃＧＰを含有する有機又は植物ベースの材料の使用に関する。本方法では、ｃＧＰ及びｃＧＰ／ＩＧＦ−１比（ひいては活性ＩＧＦ−１濃度）を調節するための手段、及びベースラインデータの標準セットと比べてのｃＧＰレベルの低下又は低減を有する個体に対する具体的治療方法とともに、ｃＧＰ及びｃＧＰ／ＩＧＦ−１比を間接的に用いて、インビボでＩＧＦ−１機能がより正確に測定される。
2020532587.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物におけるＩＧＦ−１機能障害に関連した非神経学的及び／又は神経学的状態を治療する方法であって、
ａ）前記動物から生物学的検体を得るステップと；
ｂ）前記生物学的検体中での活性濃度依存性のインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）のバイオアベイラビリティに対するバイオマーカーとしての環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）の濃度を測定するステップと；
ｃ）前記生物学的検体中の前記測定されたｃＧＰ濃度及び／又はｃＧＰ濃度のＩＧＦ−１総測定量に対する比のいずれかを標準と比較することで、結果の連続体の中で、前記測定されたｃＧＰ濃度及び／又はｃＧＰ濃度のＩＧＦ−１総測定量に対する比が、前記個体のＩＧＦ−１機能を評価するための相対標準に一致するか否かを確認するステップと；
ｄ）ブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）の濃縮抽出物を治療有効量で前記動物に投与し、
動物におけるｃＧＰの濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対する比における減少を阻止し；及び／又は
動物における既存のｃＧＰの濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対する比を維持し；及び／又は
動物におけるｃＧＰの前記濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対する比を増加させるステップと、
を含む、方法。
【請求項２】
改変されたＩＧＦ−１機能を有するバイオマーカーとして環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）を利用して、動物における加齢に伴う非神経学的及び／又は神経学的状態のリスクを予測する方法であって、
ａ）前記動物から生物学的検体を得るステップと；
ｂ）前記動物の第１設定年齢時、又は前記非神経学的及び／又は神経学的状態の初期段階、又はブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）の濃縮抽出物の治療有効量での前記動物に対する処置前に、前記生物学的検体中での活性濃度依存性のインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）のバイオアベイラビリティに対するバイオマーカーとしての環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）の濃度を測定するステップと；
ｃ）前記動物のさらなる設定年齢間隔又は前記非神経学的及び／又は神経学的状態のさらなる段階、又はブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）の前記濃縮抽出物の前記治療有効量での前記動物に対する処置後に、前記生物学的検体中での活性濃度依存性のインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）のバイオアベイラビリティに対する環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）バイオマーカーの濃度を再測定するステップと；
ｄ）前記第１の設定年齢に対する前記設定年齢間隔、又はＩＧＦ−１機能障害を伴う前記非神経学的及び／又は神経学的状態の前記初期段階、又はブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）の濃縮抽出物の前記治療有効量での前記動物に対する前記処置前に、前記生物学的検体中での前記測定されたｃＧＰ濃度及び／又はｃＧＰ濃度のＩＧＦ−１総測定量に対する比のいずれかを比較することで、結果の連続体の中で、前記測定されたｃＧＰ濃度及び／又はｃＧＰ濃度のＩＧＦ−１総測定量に対する比において変化があるか否かを確認し、それにより前記動物における認知減退からの非神経学的及び／又は神経学的状態の発生リスクがベースラインデータの標準セットと比べて増加しているか否かを判定するステップと、
を含み、ここで前記測定された比が、ＢＣＡ処置についての個別患者及びそこでの前記ＢＣＡ処置に適した用量を選択するために用いられる、方法。
【請求項３】
ＩＧＦ−１機能に対するバイオマーカーとしての環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）を利用して、ＩＧＦ−１機能障害を伴う非神経学的及び／又は神経学的状態を有する動物の自発的回復を予測する方法であって、
ａ）前記動物から生物学的検体を得るステップと；
ｂ）前記動物の前記非神経学的及び／又は神経学的状態の発症からの前記動物のベースライン時（＜７２時間）に前記生物学的検体中での活性濃度依存性のインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）のバイオアベイラビリティに対する環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）バイオマーカーの濃度を測定するステップと；
ｃ）前記動物の回復中のさらなる規則的間隔で、前記生物学的検体中での活性濃度依存性のインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）のバイオアベイラビリティに対する環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）バイオマーカーの濃度を再測定するステップと、
ｄ）前記ベースラインからの前記動物の機能的回復をさらなる設定間隔で評価するステップと、
を含み、ここで、前記動物におけるより高いベースラインｃＧＰ濃度、前記より陽性の予後が機能的回復の前記評価に基づくように、データの連続体からのＣＧＰの前記ベースライン濃度から、前記動物の非神経学的及び／又は神経学的状態の回復の短期転帰が予測される、方法。
【請求項４】
動物におけるｃＧＰの濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対する比における減少を阻止し；及び／又は
動物における既存のｃＧＰの濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対する比を維持し；及び／又は
動物におけるｃＧＰの前記濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対する比を増加させるための、製剤化される薬剤の製造におけるブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）の濃縮抽出物の使用。
【請求項５】
それを必要とする患者における非神経学的及び／又は神経学的状態の影響を改善し、及び／又はそれらを治療するための、経口投与用に製剤化される薬剤の製造におけるブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）の濃縮抽出物の使用。
【請求項６】
動物におけるｃＧＰの濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対する比における減少を阻止し；及び／又は
動物における既存のｃＧＰの（正常／生理学的）濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対する比を維持し；及び／又は
動物におけるｃＧＰの前記濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対する比を増加させる又は正常化するための、動物への投与用に製剤化される濃縮されたブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）を治療有効量で含む抽出物。
【請求項７】
それを必要とする患者における高血圧症及び／又は脳卒中の影響を改善し；及び／又は高血圧症及び／又は脳卒中を治療し；及び／又は高血圧症及び／又は脳卒中に関連する症状を低減するための方法であって、ブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）の濃縮抽出物を治療有効量で投与することを含む、方法。
【請求項８】
それを必要とする患者におけるパーキンソン病若しくはパーキンソン病に関連する症状、若しくは認識機能障害に伴う合併症の影響を改善し、及び／又はそれらを治療するための方法であって、ブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）の濃縮抽出物を治療有効量で投与することを含む、方法。
【請求項９】
前記非神経学的及び／又は神経学的状態又は疾患が、脳血管発作若しくは脳卒中、軽度認知障害（ＭＣＩ）、アルツハイマー病、血管性認知症、レット症候群、脳振盪、高血圧症及びそれに伴う脳合併症、パーキンソン病及び／又は任意の他の加齢関連状態若しくはＩＧＦ−１欠損関連状態である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
投与により、疾患又は状態の結果としてのｃＧＰ濃度における減少が停止する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
投与により、ｃＧＰ濃度が投与のない前記患者において測定される場合よりも少なくとも１％高く増加する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＢＣＡの添加により、前記ＣＳＦ中のＩＧＦ−１及びＩＧＦ結合タンパク質でなく、ｃＧＰの濃度が増加する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ＢＣＡの添加後、ｃＧＰ、ＩＧＦ−１及びＩＧＦＢＰの血漿濃度における測定可能な変化がない、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ｃＧＰの前記ＣＳＦ濃度が、ｃＧＰの血漿濃度及びｃＧＰ／ＩＧＦ−１比と相関する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記動物がヒトである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記動物が健常である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記動物が、既存の状態又は病態を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記標準又はベースラインが、患者について収集されたデータセットに基づく、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記標準又はベースラインが、集団について収集されたデータセットに基づく、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記生物学的検体が、脳脊髄（ＣＳＦ）、血漿、尿、及び／又は任意の他の生物学的検体（涙及び任意の他の身体機能）、並びにそれらの組み合わせから選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
ｃＧＰが、ＥＬＩＳＡ、ＨＰＬＣ、質量分析、及びそれらの組み合わせから選択される技術によって測定される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記薬剤が、経口投与用に製剤化される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記薬剤が、非経口投与用に製剤化される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記薬剤が、丸剤、錠剤、カプセル剤、液体、粉末、微粒子化された粉末又はゲルとして製剤化される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
１日あたり１２０ｍｇ〜６００ｍｇの用量のアントシアニンを前記動物に提供するため、薬剤が投与される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
１日あたり５０ｍｇ〜１０００ｍｇの用量のアントシアニンを前記動物に提供するため、前記薬剤が投与される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
ＢＣＡの添加後、脳脊髄液（ＣＳＦ）中でｃＧＰが少なくとも２５％増加する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）の範囲内に存在する前記環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）濃度が、１００ｍｇ中２７ｎｇ〜１００ｍｇ中１００ｎｇの間である、請求項４〜６のいずれか一項に記載の抽出物。
【請求項２９】
前記抽出物が、最大で４０％のアントシアニンを含む、請求項４〜６のいずれか一項に記載の抽出物。
【請求項３０】
前記抽出物カプセル剤又は他の送達手段が、少なくとも５０ｍｇ〜１０００ｍｇのアントシアニンを含む、請求項４〜６のいずれか一項に記載の抽出物。
【請求項３１】
前記ブラックカラントが、限定はされないが、アメリカ、アジア、オーストラリア、ヨーロッパ、及びニュージーランド内を含む、国際的に育成された任意のブラックカラント品種に由来する、請求項４〜６のいずれか一項に記載の抽出物。
【請求項３２】
前記ブラックカラントが、４０°を上回る緯度の北半球及び／又は赤道から５０°北の南半球において育成された果実に由来する、請求項３１に記載の抽出物。
【請求項３３】
前記アントシアニン：デルフィニジン−３−グルコシド、デルフィニジン−３−ルチノシド、シアニジン−３−グルコシド、シアニジン−３−ルチノシド、ペツニジン−３−ルトニオシド（rutonioside）、及びそれらの組み合わせを含めることによって特徴づけられる、請求項４〜６のいずれか一項に記載の抽出物。
【請求項３４】
デルフィニジン−３−グルコシド、デルフィニジン−３−ルチノシドシアニジン−３−グルコシド及びシアニジン−３−ルチノシドが、前記抽出物中のアントシアニンの総量の少なくとも８０％を含む、請求項３３に記載の抽出物。
【請求項３５】
前記抽出物が、ブラックカラントに由来し、標準のニュージーランドでのアントシアニン分析において、前記ブラックカラントからの非濃縮ジュース中で測定されるとき、
少なくとも６０ｍｇ／１００ｍｌのデルフィニジン−３−グルコシド；及び／又は
少なくとも２００ｍｇ／１００ｍｌのデルフィニジン−３−ルチノシド；及び／又は
少なくとも４０ｍｇ／１００ｍｌのシアニジン−３−グルコシド；及び／又は
少なくとも２４０ｍｇ／１００ｍｌのシアニジン−３−ルチノシド；及び／又は
少なくとも１４ｍｇ／１００ｍｌのペツニジン−３−ルトニオシド
を含む、請求項４〜６のいずれか一項に記載の抽出物。
【請求項３６】
動物におけるＩＧＦ−１機能障害を伴う非神経学的及び／又は神経学的状態を治療する方法であって、
ａ）前記動物から生物学的検体を得るステップと；
ｂ）前記生物学的検体中での活性濃度依存性のインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）のバイオアベイラビリティに対するバイオマーカーとしての環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）の濃度を測定するステップと；
ｃ）前記生物学的検体中での前記測定されたｃＧＰ濃度及び／又はｃＧＰ濃度のＩＧＦ−１総測定量に対する比のいずれかを標準と比較し、結果の連続体の中で、前記測定されたｃＧＰ濃度及び／又はｃＧＰ濃度のＩＧＦ−１総測定量に対する比が、前記個体のＩＧＦ−１機能を評価するための前記相対標準に一致するか否かを確認するステップと；
ｄ）ｃＧＰを含有する有機又は植物ベースの材料の濃縮抽出物を治療有効量で前記動物に投与し、
動物におけるｃＧＰの濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対する比における減少を阻止し；及び／又は
動物における既存のｃＧＰの濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対する比を維持し；及び／又は
動物におけるｃＧＰの濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対する比を増加させるステップと、
を含む、方法。
【請求項３７】
改変されたＩＧＦ−１機能を有するバイオマーカーとして環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）を利用して、動物における加齢に伴う非神経学的及び／又は神経学的状態のリスクを予測する方法であって、
ａ）前記動物から生物学的検体を得るステップと；
ｂ）前記動物の第１設定年齢時、又は前記非神経学的及び／又は神経学的状態の初期段階、又はｃＧＰを含有する有機又は植物ベースの材料の濃縮抽出物の治療有効量での前記動物に対する処置前に、前記生物学的検体中での活性濃度依存性のインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）のバイオアベイラビリティに対するバイオマーカーとしての環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）の濃度を測定するステップと；
ｃ）前記動物のさらなる設定年齢間隔又は前記非神経学的及び／又は神経学的状態のさらなる段階、又はｃＧＰを含有する有機又は植物ベースの材料の前記濃縮抽出物の前記治療有効量での処置後に、前記生物学的検体中での活性濃度依存性のインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）のバイオアベイラビリティに対する環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）バイオマーカーの濃度を再測定するステップと；
ｄ）前記第１の設定年齢に対する前記設定年齢間隔、又はＩＧＦ−１機能障害を伴う前記非神経学的及び／又は神経学的状態の前記初期段階、又はｃＧＰを含有する有機又は植物ベースの材料の濃縮抽出物の前記治療有効量での前記動物に対する前記処置前に、前記生物学的検体中での前記測定されたｃＧＰ濃度及び／又はｃＧＰ濃度のＩＧＦ−１総測定量に対する比のいずれかを比較することで、結果の連続体の中で、前記測定されたｃＧＰ濃度及び／又はｃＧＰ濃度のＩＧＦ−１総測定量に対する比において変化があるか否かを確認し、それにより前記動物における認知減退からの非神経学的及び／又は神経学的状態の発生リスクがベースラインデータの標準セットと比べて増加しているか否かを判定するステップと、
を含み、ここで前記測定された比が、ｃＧＰを含有する有機又は植物ベースの材料での処置についての個別患者及びそこでの前記ｃＧＰを含有する有機又は植物ベースの材料での処置に適した用量を選択するために用いられる、方法。
【請求項３８】
動物におけるｃＧＰの濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対する比における減少を阻止し；及び／又は
動物における既存のｃＧＰの濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対する比を維持し；及び／又は
動物におけるｃＧＰの前記濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対する比を増加させるための、製剤化される薬剤の製造におけるｃＧＰを含有する有機又は植物ベースの材料の濃縮抽出物の使用。
【請求項３９】
それを必要とする患者における非神経学的及び／又は神経学的状態の影響を改善し、及び／又はそれらを治療するための、経口投与用に製剤化される薬剤の製造におけるｃＧＰを含有する有機又は植物ベースの材料の濃縮抽出物の使用。
【請求項４０】
動物におけるｃＧＰの濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対する比における減少を阻止し；及び／又は
動物における既存のｃＧＰの（正常／生理学的）濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対する比を維持し；及び／又は
動物におけるｃＧＰの前記濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対する比を増加させる又は正常化するための、動物への投与用に製剤化されるｃＧＰを含有する有機又は植物ベースの材料の濃縮抽出物を治療有効量で含む抽出物。
【請求項４１】
それを必要とする患者における高血圧症及び／又は脳卒中の影響を改善し；及び／又は高血圧症及び／又は脳卒中を治療し；及び／又は高血圧症及び／又は脳卒中に関連する症状を低減するための方法であって、ｃＧＰを含有する有機又は植物ベースの材料の濃縮抽出物を治療有効量で投与することを含む、方法。
【請求項４２】
それを必要とする患者におけるパーキンソン病若しくはパーキンソン病に関連する症状、若しくは認識機能障害に伴う合併症の影響を改善し、及び／又はそれらを治療するための方法であって、ｃＧＰを含有する有機又は植物ベースの材料の濃縮抽出物を治療有効量で投与することを含む、方法
【請求項４３】
前記非神経学的及び／又は神経学的状態又は疾患が、脳血管発作若しくは脳卒中、軽度認知障害（ＭＣＩ）、アルツハイマー病、血管性認知症、レット症候群、脳振盪、高血圧症及びそれに伴う脳合併症、パーキンソン病及び／又は任意の他の加齢関連状態若しくはＩＧＦ−１欠損関連状態である、請求項３６又は請求項３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
投与により、疾患又は状態の結果としてのｃＧＰ濃度における減少が停止する、請求項３６又は請求項３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
投与により、ｃＧＰ濃度が投与のない前記患者において測定される場合よりも少なくとも１％高く増加する、請求項３６又は請求項３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記ｃＧＰを含有する有機又は植物ベースの材料の添加により、前記ＣＳＦ中のＩＧＦ−１及びＩＧＦ結合タンパク質ではなく、ｃＧＰの濃度が増加する、請求項３６又は請求項３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記ｃＧＰを含有する有機又は植物ベースの材料の添加後、ｃＧＰ、ＩＧＦ−１及びＩＧＦＢＰの血漿濃度における測定可能な変化がない、請求項３６又は請求項３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
ｃＧＰの前記ＣＳＦ濃度が、ｃＧＰの血漿濃度及びｃＧＰ／ＩＧＦ−１比と相関する、請求項３６又は請求項３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記動物がヒトである、請求項３６又は請求項３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記動物が健常である、請求項３６又は請求項３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記動物が、既存の状態又は病態を有する、請求項３６又は請求項３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記標準又はベースラインが、患者について収集されたデータセットに基づく、請求項３６又は請求項３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記標準又はベースラインが、集団について収集されたデータセットに基づく、請求項３６又は請求項３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記生物学的検体が、脳脊髄（ＣＳＦ）、血漿、尿、及び／又は任意の他の生物学的検体（涙及び任意の他の身体機能）、並びにそれらの組み合わせから選択される、請求項３６又は請求項３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
ｃＧＰが、ＥＬＩＳＡ、ＨＰＬＣ、質量分析、及びそれらの組み合わせから選択される技術によって測定される、請求項３６又は請求項３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記薬剤が、経口投与用に製剤化される、請求項３６又は請求項３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記薬剤が、非経口投与用に製剤化される、請求項３６又は請求項３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記薬剤が、丸剤、錠剤、カプセル剤、液体、粉末、微粒子化された粉末又はゲルとして製剤化される、請求項３６又は請求項３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
ｃＧＰを含有する有機又は植物ベースの材料の添加後、脳脊髄液（ＣＳＦ）中でｃＧＰが少なくとも２５％増加する、請求項３６又は請求項３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記ＢＣＡ抽出物及び／又はｃＧＰを含有する有機又は植物ベースの材料中に含まれる前記ｃＧＰ濃縮物を測定する前に、前記抽出物及び／又は材料が、Diaion HP20でコーティングされた樹脂ビーズを利用するクロマトグラフィーカラムを通じて処理される、請求項２１又は請求項５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
それを必要とする患者におけるレット症候群の影響を改善し、及び／又はそれを治療するための、経口投与用に製剤化された薬剤の製造における、ブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）の濃縮抽出物とＩＧＦ−１との組み合わせの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本明細書に記載されるのは、非神経学的及び／又は神経学的状態のＩＧＦ−１分析、調節及び疾患管理に関する改善である。より詳細には、ＩＧＦ−１機能障害を伴う非神経学的及び／又は神経学的状態のリスク及び回復を予測するための環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）バイオマーカーの臨床適用、並びにそれらを治療するための有機又は植物ベースの材料、例えばブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）の濃縮抽出物を含有するｃＧＰの使用についての方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）は、内分泌ホルモンとして生成されるタンパク質である。それは、成長ホルモンの効果の一次メディエーターであり、身体内のほぼすべての細胞における体成長を刺激する。成長効果に加えて、ＩＧＦ−１はまた、神経細胞及び細胞ＤＮＡ合成を調節しうる。
【０００３】
それはまた、向神経性因子であり、認知機能などの種々の神経機能において決定的役割を担う。ＩＧＦ−１は、一生を通じて生成されるが、幼仔期（特に新生仔）に最も低く、成体期の間に増加し、年齢とともに低下する。ＩＧＦ−１機能の測定は、加齢に伴う認知減退のバイオマーカーであってもよく、さらに薬剤治療などの介入が有用なことがあるか否かについての、及びかかる治療をいつ開始すべきかについての理解を支援するために用いられてもよい。
【０００４】
しかし、血漿ＩＧＦ−１濃度は、ＩＧＦ−１の直接的測定が、ある程度の信頼度で使用できないような矛盾した結果をもたらすことから、歴史的にはＩＧＦ−１機能に対して不十分なバイオマーカーであった。歴史的使用は、例えば成長ホルモン欠乏及び異常な成長パターンについてのスクリーニング試験として血液中のＩＧＦ−１について検査するためであってもよいが、その結果は、主に総ＩＧＦ−１の指針であり、活性ＩＧＦ−１に特異的な尺度ではない。
【０００５】
直接的なＩＧＦ−１測定から得られる矛盾した結果が、不活性であるインビボでのＩＧＦ−１の大部分に起因することがあると理解される。それは主要な活性部分である。血漿中では、ＩＧＦ−１の９５％超が、ＩＧＦ結合タンパク質−３（ＩＧＦＢＰ−３）に結合し、ＩＧＦ結合タンパク質−３は、一旦結合されると、ＩＧＦ−１機能的受容体の活性化を阻止する。したがって、ＩＧＦ−１が直接的に測定されると、活性型と不活性型との間に差がなく、それ故、活性部分が目的のバイオマーカーであるとして、インビボでのＩＧＦ−１の真の活性量についての知見は得られない。
【０００６】
ＩＧＦ−１／ＩＧＦＢＰ−３の比は、非結合の生理活性ＩＧＦ−１を示すための代替物として用いられてもよいが、実際、ＩＧＦＢＰ−３の大部分がＩＧＦ−１に結合しないことから、この比はいずれにしても明確な指標を提供しない。
【０００７】
理解されているかもしれないが、ＩＧＦ−１の代替的尺度は、ＩＧＦ−１機能を追跡し、ひいてはこの尺度を患者の健康のバイオマーカーとして用いるための手段として有利であってもよい。例えば、ＩＧＦ−１の代謝産物である環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）は、血漿中のＩＧＦ−１のバイオアベイラビリティを改善／正常化することを通じて神経保護的である。
【０００８】
ＩＧＦ−１レベルを理解することに対応し、そこで患者の自然免疫及び修復系をそれらのＩＧＦ−１活性部分を増加させることによって調節又は支持することが所望されてもよい。
【０００９】
さらに、ＩＧＦ−１が種々の動物機能（多くの中の１つが神経変性機能）に密接に関連することから、それに関連した変化を測定するための方法と、様々な関連状態を治療する、改善する又はそれにおける治癒を促進するための方法の双方が有用なことがある。
【００１０】
ヒト身体は、それ自身を損傷及び疾病から保護する能力を有し、例えば、我々のホルモン系がより活性化する。しかし、我々の回復を支援する能力は、特に高齢者においては加齢に伴うホルモンの減少に起因し、十分な回復を達成するのに常に有効とは限らない。脳卒中は、若年者及び高齢者集団に生じる。若年脳卒中患者がより迅速且つより良好な回復を来すことができる一方で、年配患者からの回復は緩徐且つ不良でありうる。ＩＧＦ−１機能はまた、脳卒中の回復にとって重要である。したがって、脳卒中におけるＩＧＦ−１機能に対する信頼できるバイオマーカーが脳卒中又は他の神経学的状態の予後に用いられてもよく、さらに脳卒中の回復能力を予測する方法を個別患者に対する臨床管理を設計することに役立ててもよい。しかし、上記の通り、血漿ＩＧＦ−１又はＩＧＦ−１／ＩＧＦ結合タンパク質−３（ＩＧＦＢＰ−３）比は、信頼できるバイオマーカーでない。したがって、脳卒中患者の自発的回復及びそれらの治療方法を支援するため、ＩＧＦ−１機能に対する有望なバイオマーカーを見出すことが有用となろう。
【００１１】
年齢関連状態として、パーキンソン病（ＰＤ）は、２番目に一般的な神経変性状態である。インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）は、神経栄養因子であり、神経生存及び脳機能の維持における本質的役割を担う。循環ＩＧＦ−１の増加及びＩＧＦ−１機能の障害によって特徴づけられるＩＧＦ−１抵抗性は、ＰＤ患者における神経障害及び認知減退に関連することが報告されている。上記の通り、血清中のＩＧＦ−１濃度における変化が、ＰＤにおける予後及び治療応答を監視するのに用いられる、ＩＧＦ−１機能障害に対するバイオマーカーとして用いられているが、これはさらに議論の余地がある。ベリーフルーツの高消費が、ＰＤのリスク低下に関連することが報告されているが、この推定上の利益の根底にある機構は未知のままである。
【００１２】
ＩＧＦ−１機能障害に起因する非神経学的及び／又は神経学的状態のＩＧＦ−１機能の分析、調節及び疾患管理に関する改善のさらなる態様及び利点は、あくまで例示される後述の説明から明白となろう。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
概要
ＩＧＦ−１機能障害を伴う非神経学的及び／又は神経学的状態のリスク及び回復を予測するための環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）バイオマーカーの臨床適用、並びにそれらを治療するためのブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）の濃縮抽出物などのｃＧＰを含有する有機又は植物ベースの材料の使用に関する方法が本明細書に記載される。この方法では、より正確には、ｃＧＰ及びｃＧＰ／ＩＧＦ−１比（ひいては活性ＩＧＦ−１濃度）を調節するための手段、及びベースラインデータの標準セットと比べてのｃＧＰレベルの低下又は低減を有する個体に対する具体的治療方法とともに、ｃＧＰ及びｃＧＰ／ＩＧＦ−１比を用いて間接的にインビボでＩＧＦ−１機能を測定する。
【００１４】
第１の態様では、動物におけるＩＧＦ−１機能障害に関連した非神経学的及び／又は神経学的状態を治療する方法であって、
ａ）動物から生物学的検体を得るステップと；
ｂ）生物学的検体中での活性濃度依存性のインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）のバイオアベイラビリティに対するバイオマーカーとしての環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）の濃度を測定するステップと；
ｃ）生物学的検体中の測定されたｃＧＰ濃度及び／又はｃＧＰ濃度のＩＧＦ−１総測定量に対する比のいずれかを標準と比較することで、結果の連続体の中で、測定されたｃＧＰ濃度及び／又はｃＧＰ濃度のＩＧＦ−１総測定量に対する比が個体のＩＧＦ−１機能を評価するための相対標準に一致するか否かを確認するステップと；
ｄ）ブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）の濃縮抽出物を治療有効量で動物に投与し、
動物におけるｃＧＰの濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対する比における減少を阻止し；及び／又は
動物における既存のｃＧＰの濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対する比を維持し；及び／又は
動物におけるｃＧＰの濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対する比を増加させるステップと、
を含む、方法が提供される。
【００１５】
第２の態様では、改変されたＩＧＦ−１機能を有するバイオマーカーとして環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）を利用して、動物における加齢に伴う非神経学的及び／又は神経学的状態のリスクを予測する方法であって、
ａ）動物から生物学的検体を得るステップと；
ｂ）動物の第１設定年齢時、又は神経学的状態の初期段階、又はブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）の濃縮抽出物の治療有効量での動物に対する処置前に、生物学的検体中での活性濃度依存性のインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）のバイオアベイラビリティに対するバイオマーカーとしての環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）の濃度を測定するステップと；
ｃ）動物のさらなる設定年齢間隔又は非神経学的及び／又は神経学的状態のさらなる段階、又はブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）の濃縮抽出物の治療有効量での動物に対する処置後に、生物学的検体中での活性濃度依存性のインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）のバイオアベイラビリティに対する環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）バイオマーカーの濃度を再測定するステップと；
ｄ）第１の設定年齢に対する設定年齢間隔、又はＩＧＦ−１機能障害を伴う非神経学的及び／又は神経学的状態の初期段階、又はブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）の濃縮抽出物の治療有効量での動物に対する処置前、生物学的検体中での測定されたｃＧＰ濃度及び／又はｃＧＰ濃度のＩＧＦ−１総測定量に対する比のいずれかを比較することで、結果の連続体の中で、測定されたｃＧＰ濃度及び／又はｃＧＰ濃度のＩＧＦ−１総測定量に対する比において変化があるか否かを確認し、それにより動物における認知減退からの非神経学的及び／又は神経学的状態の発生リスクがベースラインデータの標準セットと比べて増加しているか否かを判定するステップと、
を含み、ここで前記測定された比が、ＢＣＡ処置についての個別患者及びそこでのＢＣＡ処置に適した用量を選択するために用いられる、方法が提供される。
【００１６】
第３の態様では、ＩＧＦ−１機能に対するバイオマーカーとしての環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）を利用して、ＩＧＦ−１機能障害を伴う非神経学的及び／又は神経学的状態を有する動物の自発的回復を予測する方法であって、
ａ）動物から生物学的検体を得るステップと；
ｂ）非神経学的及び／又は神経学的状態の発症からの動物のベースライン時（＜７２時間）に生物学的検体中での活性濃度依存性のインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）のバイオアベイラビリティに対する環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）バイオマーカーの濃度を測定するステップと、
ｃ）動物の回復中のさらなる規則的間隔で、生物学的検体中での活性濃度依存性のインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）のバイオアベイラビリティに対する環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）バイオマーカーの濃度を再測定するステップと、
ｄ）さらなる設定間隔でのベースラインからの動物の機能的回復を評価するステップと、
を含み、ここで、動物におけるより高いベースラインｃＧＰ濃度、より陽性の予後が機能的回復の評価に基づくように、データの連続体からのＣＧＰのベースライン濃度から、動物の非神経学的及び／又は神経学的状態の回復の短期転帰が予測される、方法が提供される。
【００１７】
第４の態様では、動物におけるｃＧＰの濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対する比における減少を阻止し；及び／又は
動物における既存のｃＧＰの濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対する比を維持し；及び／又は
動物におけるｃＧＰの濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対する比を増加させるための、製剤化される薬剤の製造におけるブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）の濃縮抽出物の使用が提供される。
【００１８】
第５の態様では、それを必要とする患者における非神経学的及び／又は神経学的状態の影響を改善し、及び／又はそれらを治療するための、経口投与用に製剤化される薬剤の製造におけるブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）の濃縮抽出物の使用が提供される。
【００１９】
第６の態様では、動物におけるｃＧＰの濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対する比における減少を阻止し；及び／又は
動物における既存のｃＧＰの（正常／生理学的）濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対する比を維持し；及び／又は
動物におけるｃＧＰの濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対する比を増加させる又は正常化するための、動物への投与用に製剤化される濃縮されたブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）を治療有効量で含む抽出物が提供される。
【００２０】
第７の態様では、それを必要とする患者における高血圧症及び／又は脳卒中の影響を改善し；及び／又は高血圧症及び／又は脳卒中を治療し；及び／又は高血圧症及び／又は脳卒中に関連する症状を低減するための方法であって、ブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）の濃縮抽出物を治療有効量で投与することを含む、方法が提供される。
【００２１】
第８の態様では、それを必要とする患者におけるパーキンソン病若しくはパーキンソン病に関連する症状、若しくは認識機能障害に伴う合併症の影響を改善し、及び／又はそれらを治療するための方法であって、ブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）の濃縮抽出物を治療有効量で投与することを含む、方法が提供される。
【００２２】
第９の態様では、動物におけるＩＧＦ−１機能障害に関連した非神経学的及び／又は神経学的状態を治療する方法であって、
ａ）動物から生物学的検体を得るステップと；
ｂ）生物学的検体中での活性濃度依存性のインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）のバイオアベイラビリティに対する環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）バイオマーカーの濃度を測定するステップと；
ｃ）生物学的検体中での測定されたｃＧＰ濃度及び／又はｃＧＰ濃度のＩＧＦ−１総測定量に対する比のいずれかを標準と比較することで、結果の連続体の中で、測定されたｃＧＰ濃度及び／又はｃＧＰ濃度のＩＧＦ−１総測定量に対する比が個体のＩＧＦ−１機能を評価するための相対標準に一致するか否かを確認するステップと
ｄ）ｃＧＰを含有する有機又は植物ベースの材料の濃縮抽出物を治療有効量で動物に投与し、
動物におけるｃＧＰの濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対する比における減少を阻止し；及び／又は
動物における既存のｃＧＰの濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対する比を維持し；及び／又は
動物におけるｃＧＰの濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対する比を増加させるステップと、
を含む、方法が提供される。
【００２３】
第１０の態様では、改変されたＩＧＦ−１機能を有するバイオマーカーとして環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）を利用して、動物における加齢に伴う非神経学的及び／又は神経学的状態のリスクを予測する方法であって、
ａ）動物から生物学的検体を得るステップと；
ｂ）動物の第１設定年齢時、又は非神経学的及び／又は神経学的状態の初期段階、又はｃＧＰを含有する有機又は植物ベースの材料の濃縮抽出物の治療有効量での動物に対する処置前に、生物学的検体中での活性濃度依存性のインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）のバイオアベイラビリティに対する環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）バイオマーカーの濃度を測定するステップと；
ｃ）動物のさらなる設定年齢間隔又は非神経学的及び／又は神経学的状態のさらなる段階、又はｃＧＰを含有する有機又は植物ベースの材料の濃縮抽出物の治療有効量での動物に対する処置後に、生物学的検体中での活性濃度依存性のインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）のバイオアベイラビリティに対する環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）バイオマーカーの濃度を再測定するステップと；
ｄ）第１の設定年齢に対する設定年齢間隔、又は非神経学的及び／又は神経学的状態の初期段階、又はｃＧＰを含有する有機又は植物ベースの材料の濃縮抽出物の治療有効量での動物に対する処置前、生物学的検体中での測定されたｃＧＰ濃度及び／又はｃＧＰ濃度のＩＧＦ−１総測定量に対する比のいずれかを比較することで、結果の連続体の中で、測定されたｃＧＰ濃度及び／又はｃＧＰ濃度のＩＧＦ−１総測定量に対する比において変化があるか否かを確認し、それにより動物における認知減退からの非神経学的及び／又は神経学的状態の発生リスクがベースラインデータの標準セットと比べて増加しているか否かを判定するステップと、
を含み、ここで前記測定された比が、ｃＧＰを含有する有機又は植物ベースの材料での処置についての個別患者及びそこでのｃＧＰを含有する有機又は植物ベースの材料での処置に適した用量を選択するために用いられる、方法が提供される。
【００２４】
第１１の態様では、動物におけるｃＧＰの濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対する比における減少を阻止し；及び／又は
動物における既存のｃＧＰの濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対する比を維持し；及び／又は
動物におけるｃＧＰの濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対する比を増加させるための、製剤化される薬剤の製造におけるｃＧＰを含有する有機又は植物ベースの材料の濃縮抽出物の使用が提供される。
【００２５】
第１２の態様では、それを必要とする患者における非神経学的及び／又は神経学的状態の影響を改善し、及び／又はそれらを治療するための、経口投与用に製剤化される薬剤の製造におけるｃＧＰを含有する有機又は植物ベースの材料の濃縮抽出物の使用が提供される。
【００２６】
第１３の態様では、動物におけるｃＧＰの濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対する比における減少を阻止し；及び／又は
動物における既存のｃＧＰの（正常／生理学的）濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対する比を維持し；及び／又は
動物におけるｃＧＰの濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対する比を増加させる又は正常化するための、動物への投与用に製剤化されるｃＧＰを含有する有機又は植物ベースの材料の濃縮抽出物を治療有効量で含む抽出物が提供される。
【００２７】
第１４の態様では、それを必要とする患者における高血圧症及び／又は脳卒中の影響を改善し；及び／又は高血圧症及び／又は脳卒中を治療し；及び／又は高血圧症及び／又は脳卒中に関連する症状を低減するための方法であって、ｃＧＰを含有する有機又は植物ベースの材料の濃縮抽出物を治療有効量で投与することを含む、方法が提供される。
【００２８】
第１５の態様では、それを必要とする患者におけるパーキンソン病若しくはパーキンソン病に関連する症状、若しくは認識機能障害に伴う合併症の影響を改善し、及び／又はそれらを治療するための方法であって、ｃＧＰを含有する有機又は植物ベースの材料の濃縮抽出物を治療有効量で投与することを含む、方法が提供される。
【００２９】
上記の利点は、変化することがある。バイオマーカーについては、上記のようなｃＧＰは、ＩＧＦ−１の安定な代謝産物であり、発明者の研究に基づくと、動物から採取される生物学的検体中で容易に測定される。ｃＧＰは、活性型と不活性型とを識別するという観点からＩＧＦ−１と同様の可変性を有しないことから、総ＩＧＦ−１を測定するよりも信頼できる。ｃＧＰにおける変化を測定し、及び／又は神経学的状態に対処する上記の方法については、信頼できるバイオマーカーとしての環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）の臨床適用の利点により、治療に適した患者及び個別の投与計画の選択が可能になる。ｃＧＰの増加は、神経学的状態のリスクを示し、ｃＧＰの減少は、神経学的状態の段階を示す。有利には、治療に適した患者は、それらのｃＧＰレベルに基づいて選択されてもよく、ｃＧＰレベルの変化は、適合又は個別化された治療投与計画について容易に監視されうる。ＢＣＡの投与計画及び／又はｃＧＰを含有する有機又は植物ベースの材料の抽出を調節することにより、非神経学的及び／又は神経学的状態の効果的治療が可能になり、ひいては長期回復（３か月超）及び非神経学的及び／又は神経学的状態に伴う長期合併症（認識機能障害）の予防が改善される。さらなる利点は、ｃＧＰレベルが分析を容易にするために尿サンプルを測定することにより容易に監視されうることであり、将来的にＢＣＡ／有機植物抽出物を含有するｃＧＰの大規模臨床試験にとって重大な意義を持つ。
【００３０】
かかる測定可能な公知の方法でのブラックカラントの使用は、当該技術分野で公知でないか又は完成されていない。ブラックカラントジュース又はブラックカラントの他の形態（上記の抽出物でない）は、現在実現可能であり且つ本明細書に記載されるような公知の測定可能な方法で用いられていない。脳卒中及びパーキンソン病の知見は、有意且つ測定可能な利益を患者に提供するだけでなく、潜在的に既存の技術による治療に干渉しないか又は望まれない副作用を引き起こさないことがあり得る、ブラックカラントについての新規の又は少なくとも代替的な使用を特に示している。さらに、一般に天然生成物及びそれに関連する生理活性化合物については、本明細書に記載の方法及び使用は、治療に介入することが適切であるときを認識するための独自の方法を提供し、さらに治療の奏功又はそれ以外を評価するための方法を提供する。タイミング及び有効性へのこの洞察は、多数の薬剤に望まれるようなことであり、生理活性化合物を含有する天然生成物中に共通に観察されることではない。
【００３１】
図面の簡単な説明
ＩＧＦ−１機能障害を伴う非神経学的及び神経学的状態のリスク及び回復を予測するための環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）バイオマーカーの臨床適用、並びにそれらを治療するためのブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）の濃縮抽出物などのｃＧＰを含有する有機又は植物ベースの材料の使用に関する方法のさらなる態様は、以下の添付の図面に対する参照とともに、あくまで例として示される以下の説明から明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】ＢＣＡにおけるｃＧＰの用量依存的増加を示す。データは、平均±ＳＥＭ、ｐ＜０．０００１として提示される。
【図２Ａ】ブラックカラント抽出物の添加前及び添加後における患者のＣＳＦサンプル中でのｃＧＰの変化を図示するグラフを示す。データは、平均±ＳＥＭ、ｐ＜０．０１として提示される。
【図２Ｂ】ブラックカラント抽出物の添加前及び添加後における患者のＣＳＦサンプル中でのＩＧＦ−１の変化を図示するグラフを示す。ＩＧＦ−１濃度において統計学的差異が認められた。データは、平均±ＳＥＭ、ｐ＜０．０１として提示される。
【図２Ｃ】ブラックカラント抽出物の添加前及び添加後における患者のＣＳＦサンプル中でのｃＧＰ／ＩＧＦ−１の比の変化を図示するグラフを示す。ｃＧＰ／ＩＧＦ−１比において統計学的差異が認められた。データは、平均±ＳＥＭ、ｐ＜０．０１として提示される。
【図３Ａ】ＢＣＡの添加後における血漿中でのｃＧＰの変化を図示するグラフを示す。ｃＧＰ濃度において統計学的変化が認められなかった。データは、平均±ＳＥＭとして提示される。
【図３Ｂ】ＢＣＡの添加後における血漿中でのＩＧＦ−１の変化を図示するグラフを示す。ＩＧＦ−１濃度において統計学的変化が認められなかった。データは、平均±ＳＥＭとして提示される。
【図３Ｃ】ＢＣＡの添加後における血漿中でのｃＧＰ／ＩＧＦ−１の比の変化を図示するグラフを示す。ｃＧＰ／ＩＧＦ−１比において統計学的変化が認められなかった。データは、平均±ＳＥＭとして提示される。
【図４Ａ】ＣＳＦ  ｃＧＰと血漿ｃＧＰ濃度との間の相関を図示するグラフを示す。ＣＳＦ  ｃＧＰの濃度は、血漿ｃＧＰと有意に相関する（Ａ、ｒ＝０．６８、ｐ＝０．０１４）。
【図４Ｂ】ＣＳＦ  ＩＧＦ−１と血漿ＩＧＦ−１濃度との間の相関を図示するグラフを示す。ＩＧＦ−１濃度は、ＣＳＦと血漿との間で相関しなかった。
【図４Ｃ】ＣＳＦ  ｃＧＰとＣＳＦ  ＩＧＦ−１濃度との間の相関を図示するグラフを示す。ＣＳＦ中のｃＧＰとＩＧＦ−１濃度との間で相関が認められなかった。
【図４Ｄ】血漿ｃＧＰと血漿ＩＧＦ−１濃度との間の相関を図示するグラフを示す。血漿中のｃＧＰとＩＧＦ−１濃度との間で相関が認められなかった。
【図４Ｅ】ＣＳＦ  ｃＧＰと血漿ｃＧＰ／ＩＧＦ−１モル比との間の相関を図示するグラフを示す。ＣＳＦ  ｃＧＰの濃度は、血漿ｃＧＰ／ＩＧＦ−１比と有意に相関する（Ｅ、ｒ＝０．６６、ｐ＝０．０１６）。ｃＧＰ／ＩＧＦ−１比はまた、血漿ｃＧＰ濃度と相関する（Ｆ、ｒ＝０．９、ｐ＜０．００１）。
【図５Ａ】７０歳未満の群（＜７０、黒色バー）と比べて、年配群（＞＝７０、灰色バー）におけるＩＧＦ−１は減少した。データは、平均±ＳＥＭ及びｐ＜０．０５として提示される。
【図５Ｂ】年齢に伴うｃＧＰの測定された変化を示すグラフを図示する。７０歳未満の群（＜７０、黒色バー）と比べて、年配群（＞＝７０）におけるｃＧＰ濃度は増加した。データは、平均±ＳＥＭ及びｐ＜０．０５として提示される。
【図５Ｃ】年齢に伴うｃＧＰ／ＩＧＦ−１の測定された変化を示すグラフを図示する。７０歳未満の群（＜７０、黒色バー）と比べて、年配群（＞＝７０）におけるｃＧＰ／ＩＧＦ−１比は増加した。データは、平均±ＳＥＭ及びｐ＜０．０５として提示される。
【図６Ａ】正常対照（脳卒中なし）と（図１５で提示される最新データと相関する）脳卒中患者のベースラインレベルとの間でのＩＧＦ−１の測定された変化を示すグラフを図示する。
【図６Ｂ】正常対照（脳卒中なし）と（図１５で提示される最新データと相関する）脳卒中患者のベースラインレベルとの間でのＩＧＦＢＰ−３の測定された変化を示すグラフを図示する。
【図６Ｃ】正常対照（脳卒中なし）と（図１５で提示される最新データと相関する）脳卒中患者のベースラインレベルとの間でのｃＧＰの測定された変化を示すグラフを図示する。
【図６Ｄ】正常対照（脳卒中なし）と（図１５で提示される最新データと相関する）脳卒中患者のベースラインレベルとの間でのｃ−ＧＰ／ＩＧＦ−１比の測定された変化を示すグラフを図示する。
【図７Ａ】試験の脳卒中患者が、神経学的スコアにおける有意な減少を示すことにより、３か月にわたる回復を来したことを示すグラフを図示する。
【図７Ｂ】血漿ｃＧＰにおける増加への傾向が認められた。
【図７Ｃ】（図１６で提示される最新データと相関する）脳卒中回復の期間にわたるＩＧＦ−１における変化は認められなかった。
【図７Ｄ】（図１６で提示される最新データと相関する）脳卒中回復の期間にわたるＩＧＦＢＰ−３における変化は認められなかった。
【図７Ｅ】ｃＧＰ／ＩＧＦ−１比における増加への傾向が認められた。
【図７Ｆ】ベースラインｃＧＰ濃度は、脳卒中の回復と相関する。
【図８Ａ】尿分析から収集されたデータを示す。年齢適合対照と脳卒中との間での尿中のｃＧＰの差異は、血漿サンプルにおいて認められた場合と類似する。
【図８Ｂ】尿分析から収集されたデータを示す。予想通り、ベースラインと比べて、後の時点における尿ｃＧＰの増加への傾向が認められ、時点測定値における尿と血漿の間での差異もまた有意でなかった。
【図８Ｃ】尿分析から収集されたデータを示す。尿中のｃＧＰ濃度は、血漿ｃＧＰ濃度と有意な相関を有した（ｒ＝０．５９、ｐ＜０．０１）。
【図８Ｄ】尿分析から収集されたデータを示す。尿中のｃＧＰ濃度は、ｃＧＰ／ＩＧＦ−１比と有意な相関を有した（ｒ＝０．６３、ｐ＜０．００１）。
【図９】高齢者における尿ｃＧＰで認められた変化を示す。尿中のｃＧＰ濃度は、高齢者の順に有意に増加する。
【図１０Ａ】尿中（図１０Ｂ）でなく血漿中（図１０Ａ）のベースラインｃＧＰの変化が回復に関連したことを示す（ΔｍＲＳ：ｍＲＳベース−３か月）（ｒ＝−０．６３０、ｐ＝０．００３、図１０）。
【図１０Ｂ】尿中（図１０Ｂ）でなく血漿中（図１０Ａ）のベースラインｃＧＰの変化が回復に関連したことを示す（ΔｍＲＳ：ｍＲＳベース−３か月）（ｒ＝−０．６３０、ｐ＝０．００３、図１０）。
【図１１】４つの異なる濃度（１、５、２５及び１００ｍｇ／水）における、ブラックカラント、クランベリー、ビートルート、ブラックエルダーベリー及びＢＨＣ複合体（ビルベリー及びセイヨウトチノキ）から選択されたベリーフルーツ中のｃ−ＧＰ濃度（含量）の結果を示す。
【図１２】陽性対照としてのＢＣＡの用量範囲内でのｃＧＰ濃度の追加的分析としてのベリーフルーツサンプルからのデータを示す。ｃＧＰ濃度は、１００ｍｇのＢＣＡ（対照）中で２７ｎｇ、１００ｍｇのビルベリー中で４６．７、１００ｍｇ（１０ｎｇ／ｍｇ）の新規に配合されたＢＣＡ中で１００ｎｇである。
【図１３】Vitalityによって提供された製品サンプルの、それらのｃＧＰ濃度を測定するためのさらなる分析からの結果を示す。Vitalityによって提供された製品サンプル（ＢＣ抽出物China-47、NZBCジュース濃縮物（Ｔ１８０２１２及びＴ１８０１１５）、アレパ抽出物、Enzogenol、タルトチェリー、紫小麦、紫人参及びビートルートというラベル）の４つの異なる濃度（１、５、２５及び１００ｍｇ／水）における分析からの結果。上で３０ｎｇ／ｍｇを用いて試験された最初のVitalityのＢＣＡサンプルが陽性対照として用いられた。
【図１４Ａ】神経学的スコア（ＮＩＨＳＳ）における有意な減少を示すことにより、試験の脳卒中患者が３、７及び９０日から各々回復を来したことを示すグラフを図示する。
【図１４Ｂ】神経学的スコア（ｍＲＳ）における有意な減少を示すことにより、試験の脳卒中患者が３、７及び９０日から各々回復を来したことを示すグラフを図示する。
【図１４Ｃ】ＦＭスコアにおける改善を示すことにより、試験の脳卒中患者が３、７及び９０日から各々回復を来したことを示すグラフを図示する。
【図１５Ａ】正常対照（脳卒中なし）と３日未満の脳卒中患者のベースラインレベルとの間でのＩＧＦ−１の測定された変化を示すグラフを図示する。
【図１５Ｂ】正常対照（脳卒中なし）と３日未満の脳卒中患者のベースラインレベルとの間でのＩＧＦＢＰ−３の測定された変化を示すグラフを図示する。
【図１５Ｃ】正常対照（脳卒中なし）と３日未満の脳卒中患者のベースラインレベルとの間でのｃＧＰの測定された変化を示すグラフを図示する。
【図１５Ｄ】正常対照（脳卒中なし）と３日未満の脳卒中患者のベースラインレベルとの間でのｃ−ＧＰ／ＩＧＦ−１比の測定された変化を示すグラフを図示する。
【図１６Ａ】３日未満、７日及び９０日各々の脳卒中患者のＩＧＦ−１の測定された変化を示すグラフを図示する。
【図１６Ｂ】３日未満、７日及び９０日各々の脳卒中患者のＩＧＦＢＰ−３の測定された変化を示すグラフを図示する。
【図１６Ｃ】３日未満、７日及び９０日各々の脳卒中患者のｃＧＰの測定された変化を示すグラフを図示する。
【図１６Ｄ】３日未満、７日及び９０日各々の脳卒中患者のｃ−ＧＰ／ＩＧＦ−１比の測定された変化を示すグラフを図示する。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
詳細な説明
上記の通り、非神経学的及び神経学的状態のリスク及び回復を予測するための環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）バイオマーカーの臨床適用に関する方法、並びにそれらを治療するためのブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）の濃縮抽出物などのｃＧＰを含有する有機又は植物ベースの材料の使用が本明細書に記載される。この方法では、ｃＧＰ及びｃＧＰ／ＩＧＦ−１比（ひいては活性ＩＧＦ−１濃度）を調節するための手段、及びｃＧＰレベルの、ベースラインデータの標準セットと比べての低下又は低減を有する個体に対する特定の治療方法とともに、ｃＧＰ及びｃＧＰ／ＩＧＦ−１ＢＰ３比を間接的に用いて、インビボでＩＧＦ−１がより正確に測定される。
【００３４】
本明細書を対象として、用語「約（about）」又は「約（approximately）」及びその文法的変形は、参照としての量（quantity）、レベル、程度、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量（amount）、重量又は長さに対して、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１％だけ変化する量（quantity）、レベル、程度、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量（amount）、重量又は長さを意味する。
【００３５】
用語「実質的に」又はその文法的変形は、少なくとも約５０％、例えば、７５％、８５％、９５％又は９８％を指す。
【００３６】
用語「含む（comprise）」及びその文法的変形は、包括的意味を有するものとする、即ち、それはそれが直接的に参照する列挙成分だけでなく、他の非特定の成分又は要素を包含することを意味するように解釈されることになる。
【００３７】
ブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）という用語は、本明細書及び特許請求の範囲の全体を通じてブラックカラントの抽出物であると理解されるべきであり、ＢＣＡは、ブラックカラント濃縮物及び／又は還元果汁と互換的に置き換えられてもよい。さらに、ＢＣＡ抽出物及び／又は濃縮物は、アントシアニンが存在するか否かと無関係に、ｃＧＰの供給源又は担体であってもよい。
【００３８】
第１の態様では、動物における非神経学的及び／又は神経学的状態を治療する方法であって、
ａ）動物から生物学的検体を得るステップと；
ｂ）生物学的検体中での活性濃度依存性のインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）のバイオアベイラビリティに対する環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）バイオマーカーの濃度を測定するステップと；
ｃ）生物学的検体中の測定されたｃＧＰ濃度及び／又はｃＧＰ濃度のＩＧＦ−１総測定量に対する比のいずれかを標準と比較することで、結果の連続体の中で、測定されたｃＧＰ濃度及び／又はｃＧＰ濃度のＩＧＦ−１総測定量に対する比が個体のＩＧＦ−１機能を評価するための相対標準に一致するか否かを確認するステップと；
ｄ）ブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）の濃縮抽出物を治療有効量で動物に投与し、
動物におけるｃＧＰの濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対する比における減少を阻止し；及び／又は
動物における既存のｃＧＰの濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対する比を維持し；及び／又は
動物におけるｃＧＰの濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対する比を増加させるステップと、
を含む、方法が提供される。
【００３９】
第２の態様では、改変されたＩＧＦ−１機能を有するバイオマーカーとしての環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）を利用して、動物における加齢に伴う非神経学的及び／又は神経学的状態のリスクを予測する方法であって、
ａ）動物から生物学的検体を得るステップと；
ｂ）動物の第１設定年齢時、又は神経学的状態の初期段階、又はブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）の濃縮抽出物の治療有効量での動物に対する処置前に、生物学的検体中での活性濃度依存性のインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）のバイオアベイラビリティに対する環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）バイオマーカーの濃度を測定するステップと；
ｃ）動物のさらなる設定年齢間隔又は非神経学的及び／又は神経学的状態のさらなる段階、又はブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）の濃縮抽出物の治療有効量での動物に対する処置後に、生物学的検体中での活性濃度依存性のインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）のバイオアベイラビリティに対する環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）バイオマーカーの濃度を再測定するステップと；
ｄ）第１の設定年齢に対する設定年齢間隔、又は神経学的状態の初期段階、又はブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）の濃縮抽出物の治療有効量での動物に対する処置前、生物学的検体中での測定されたｃＧＰ濃度及び／又はｃＧＰ濃度のＩＧＦ−１総測定量に対する比のいずれかを比較することで、結果の連続体の中で、測定されたｃＧＰ濃度及び／又はｃＧＰ濃度のＩＧＦ−１総測定量に対する比において変化があるか否かを確認し、それにより動物における認知減退からの非神経学的及び／又は神経学的状態の発生リスクがベースラインデータの標準セットと比べて増加しているか否かを判定するステップと、
を含み、ここで前記測定された比が、ＢＣＡ処置についての個別患者及びそこでのＢＣＡ処置に適した用量を選択するために用いられる、方法が提供される。
【００４０】
第３の態様では、ＩＧＦ−１機能に対するバイオマーカーとしての環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）を利用して、非神経学的及び／又は神経学的状態を有する動物の自発的回復を予測する方法であって、
ａ）動物から生物学的検体を得るステップと；
ｂ）非神経学的及び／又は神経学的状態の発症からの動物のベースライン時（＜４８時間）の生物学的検体中での活性濃度依存性のインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）のバイオアベイラビリティに対する環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）バイオマーカーの濃度を測定するステップと、
ｃ）動物の回復中のさらなる規則的間隔で、生物学的検体中での活性濃度依存性のインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）のバイオアベイラビリティに対する環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）バイオマーカーの濃度を再測定するステップと、
ｄ）ベースラインからさらなる設定間隔での動物の機能的回復を評価するステップと、
を含み、ここで、動物におけるより高いベースラインｃＧＰ濃度、より陽性の予後が機能的回復の評価に基づくように、データの連続体からのＣＧＰのベースライン濃度から動物の神経学的状態の回復の短期転帰が予測される、方法が提供される。
【００４１】
環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）は、非結合及び生理活性ＩＧＦ−１により天然に形成される安定な断片である。ｃＧＰは、ＩＧＦＢＰ−３の結合形態に対するＩＧＦ−１の不活性化と濃度依存的様式で競合する。発明者は、ｃＧＰが、上記の濃度依存的様式での不活性化の結果として、活性ＩＧＦ−１の量と強力に相関するような測定可能で信頼できるバイオマーカーであることを見出している。即ち、ｃＧＰ濃度を測定することによる活性ＩＧＦ−１機能の存在又はそれ以外が、可変の直接的なＩＧＦ−１の測定結果に対する信頼性に代わるものとして測定されうる。
【００４２】
発明者の研究は、ｃＧＰの濃度が高まると、上記の濃度依存的様式を通じてＩＧＦ−１がＩＧＦＢＰ−３から一層遊離することになり、ひいては生体利用可能なＩＧＦ−１の増加をもたらすことを示している。
【００４３】
直接的なｃＧＰ測定に加えて、発明者はまた、ＩＧＦ−１に対するｃＧＰの相対濃度（即ち、ｃＧＰ／ＩＧＦ−１比）もまた、患者における生体利用可能なＩＧＦ−１の量を表すことがあることから、さらに、潜在的にはＩＧＦ−１関連認知機能に適したバイオマーカーとしての役割を満たすことがあることを確認している。ｃＧＰの増加が神経学的状態のリスクを示し、及びｃＧＰの減少が神経学的状態の段階と相関することも見出されている。それ故、ＢＣＡによる処置が認知減退の発生を阻止する又は遅延させることがあると予想される。
【００４４】
用語「バイオマーカー」は、本明細書で用いられるとき、動物の健康及び機能といった機能を検討するための手段として、動物において追跡可能なｃＧＰ又はｃＧＰの総ＩＧＦ−１に対する比を指す。健康及び機能は、限定はされないが、動物又は集団におけるヒストリカルな標準測定値のいずれかと比べての、動物における「正常」又は「健常」状態の検出を含んでもよい。健康及び機能はまた、おそらくは状態、疾患又は異常状態に関連した動物の非正常又は非健康な状態の検出を含んでもよい。理解されるかもしれないが、「正常な」及び「健常な」などの用語は主観的な用語であるが、本明細書の文脈においては、これらの用語は、動物についてのヒストリカルな詳細及び／又は標準と称される集団に対する変動のいずれかと比べた、上記のバイオマーカー化合物又は比の相対的尺度である。
【００４５】
上記の通り、標準は、個別動物について収集されたデータセットに基づいてもよい。例えば、一時期、例えば１週〜６か月〜２年にわたり、ｃＧＰ及びｃＧＰの総ＩＧＦ−１に対する比を平均したデータが、動物に対して収集されてもよい。バイオマーカー濃度又は比における変動は、動物における「典型的な」数字、並びに典型的変動に対する正常又は標準な数字を理解するために用いられるそのデータ及び任意の偏差の範囲を見出し、ひいては非正常又は非定型な変化が生じるときを確認するため、観察及び分析されてもよい。
【００４６】
標準は、代替的に、又は個別の動物データと併せて、集団に対して収集されたデータセットに基づいてもよい。集団は、例えば、性別群、年齢によって規定された群、症状、状態又は病態によって規定された群などであってもよい。
【００４７】
ｃＧＰ及び／又はＩＧＦ−１は、動物から採取された生物学的検体中で測定されてもよい。本明細書の対象として、用語「生物学的検体」、「身体サンプル」、又は「サンプル」は、互換可能に用いられもよく、また患者から採取又は抽出され、貯蔵され、後に分析される検体を集合的に指してもよい。検体を抽出するための技術は、例えば、スワブ、静脈穿刺、スティック、生検、分画、排尿、便サンプルなどを介してもよい。選択された実施形態では、生物学的検体は、脳脊髄液（ＣＳＦ）、血漿、尿、任意の他の生物学的検体（涙及び任意の他の身体機能）、及びそれらの組み合わせであってもよい。
【００４８】
生物学的検体中のｃＧＰ及び／又は総ＩＧＦ−１は、ＥＬＩＳＡ、ＨＰＬＣ、質量分析、及びそれらの組み合わせから選択される技術により測定されてもよい。他の技術分野の分析技術であっても用いてよく、これらの技術に対する参照は、限定的に理解されるべきではない。
【００４９】
第４の態様では、動物におけるｃＧＰの濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対する比における減少を阻止し；及び／又は
動物における既存のｃＧＰの濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対する比を維持し；及び／又は
動物におけるｃＧＰの濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対する比を増加させるための、製剤化される薬剤の製造におけるブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）の濃縮抽出物の使用が提供される。
【００５０】
第５の態様では、それを必要とする患者における非神経学的及び／又は神経学的状態の影響を改善し、及び／又はそれらを治療するための、経口投与用に製剤化される薬剤の製造におけるブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）の濃縮抽出物の使用が提供される。
【００５１】
第６の態様では、動物におけるｃＧＰの濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対する比における減少を阻止し；及び／又は
動物における既存のｃＧＰの（正常／生理学的）濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対する比を維持し；及び／又は
動物におけるｃＧＰの濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対する比を増加させる又は正常化するための、動物への投与用に製剤化される濃縮されたブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）を治療有効量で含む抽出物が提供される。
【００５２】
第７の態様では、それを必要とする患者における高血圧症及び／又は脳卒中の影響を改善し；及び／又は高血圧症及び／又は脳卒中を治療し；及び／又は高血圧症及び／又は脳卒中に関連する症状を低減するための方法であって、ブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）の濃縮抽出物を治療有効量で投与することを含む、方法が提供される。
【００５３】
発明者は、高血圧症（高血圧）を有する患者にＢＣＡを適用するとき、彼らの血圧が許容できる基礎レベルまで低下することを見出している。
【００５４】
治療対象であり、且つ回復を予測するための非神経学的状態又は疾患は、限定はされないが、高血圧症、急性脳損傷（例えば、脳振盪）、肥満女性における体重変化、及び生後発達から選択されてもよい。
【００５５】
第８の態様では、それを必要とする患者におけるパーキンソン病若しくはパーキンソン病に関連する症状、若しくは認識機能障害に伴う合併症の影響を改善し、及び／又はそれらを治療する方法であって、ブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）の濃縮抽出物を治療有効量で投与することを含む、方法が提供される。
【００５６】
治療対象の神経学的状態又は疾患は、限定はされないが、脳血管発作（ＣＶＡ）若しくは脳卒中、軽度認知障害（ＭＣＩ）、アルツハイマー病、血管性認知症、高血圧症及びそれに伴う脳合併症、パーキンソン病、及び／又は任意の他の加齢関連状態若しくはＩＧＦ−１欠損関連状態から選択されてもよい。
【００５７】
脳卒中は、脳への血流不良が細胞死をもたらし、典型的には適切に機能しない脳の部分をもたらすような典型的な神経学的状態である。発明者は、上記のバイオマーカーを介して、脳卒中患者においてｃＧＰ濃度及びｃＧＰの総ＩＧＦ−１に対する比が変化し、且つｃＧＰ又は比が減少する範囲が患者の回復及び予後の強力な指標であることを確認している。減少がより低いことは、回復がより迅速であること、潜在的には進行中の課題がより少ないことに関連する。しかし、これに対する正確な機構は、判明していない。というのは、ＩＧＦ−１が、ｃＧＰレベル又はｃＧＰの総ＩＧＦ−１に対する比の減少がＩＧＦ−１の活性低下、ひいては神経経路のより緩やかな成長、ひいてはより緩やかな回復に対応することによる増殖に関連するからである。この知見に基づき、発明者は、ブラックカラント抽出物の投与により、ｃＧＰレベル及び／又はｃＧＰの総ＩＧＦ−１に対する比が増加し、ひいては脳卒中の影響が改善する、脳卒中が治療される、又は脳卒中及び／又は他の神経学的状態に関連する症状が少なくとも低減されることがあることを示している。
【００５８】
発明者によって評価される神経学的状態のさらなる例が、２番目に一般的な神経変性状態であるパーキンソン病（ＰＤ）である。上記の通り、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）は、神経栄養因子であり、神経生存及び脳機能における本質的役割を担う。障害されたＩＧＦ−１機能に伴う循環ＩＧＦ−１の増加として特徴づけられるＩＧＦ−１の抵抗性は、特発性ＰＤの疾患進行、認識機能障害及びＰＤの病理における役割を担う。したがって、ＩＧＦ−１の血漿濃度の変化が、ＰＤにおける予後及び治療応答を予測するため、ＩＧＦ−１機能を監視するためのバイオマーカーとしても発明者により評価されている。
【００５９】
本明細書の対象として、用語「改善」、「治療する」又は「〜の症状を低減する」は、神経学的状態に関連する少なくとも１つの徴候又は症状の測定される影響を、ブラックカラント抽出物投与のない患者にて測定される場合と比べて、少なくとも１、又は２％、又は３％、又は４％、又は５％、又は６％、又は７％、又は８％、又は９％、又は１０％低減することを指す。
【００６０】
投与により、ｃＧＰ濃度の減少又はｃＧＰの総ＩＧＦ−１に対する比の減少が、疾患若しくは状態により、又は疾患若しくは状態に関連する症状から引き起こされるような非正常状態の結果として、停止することがある。用語「減少を停止する」は、用いられるとき、ｃＧＰ濃度及び／又はｃＧＰの総ＩＧＦ−１に対する比を、投与前に測定された濃度又は比の少なくとも１、又は２％、又は３％、又は４％、又は５％、又は６％、又は７％、又は８％、又は９％、又は１０％以内に維持することを指す。
【００６１】
投与により、ｃＧＰ濃度及び／又はｃＧＰの総ＩＧＦ−１に対する比が、ブラックカラント抽出物投与（ＢＣＡ）のない患者において測定されることになる場合よりも、少なくとも１、又は２％、又は３％、又は４％、又は５％、又は６％、又は７％、又は８％、又は９％、又は１０％高く増加することがある。発明者は、意外にも、ＢＣＡの添加後、脳脊髄液（ＣＳＦ）中のｃＧＰが２５％増加することがあることを見出している。理論に拘束されない限り、これは、経口投与後の脳による有効な取り込みを示唆し、また任意の脳疾患の治療における有意な知見である。さらに、ＢＣＡは、ヒト血漿中でのｃＧＰの形成を増強することがある。発明者が認識している限り、ＣＳＦ中での少なくとも２５％のｃＧＰの有効な脳の取り込みを示している試験は他に実施されていない。ＢＣＡの添加の有効性及び取り込みを確認するため、さらなる臨床試験が進行中である。また、該機構の解明により、ＩＧＦ−１機能を正常化するための介入としてＢＣＡをさらに支持するための本質的な科学的証拠が得られることがある。
【００６２】
上記態様中で示される動物は、ヒトであってもよい。動物は、代替的に非ヒト動物であってもよい。動物に対する参照は、本明細書中で用語「対象」又は「患者」と互換可能に用いられてもよく、一方又は他方に対する参照は、限定的に理解されるべきではない。
【００６３】
一実施形態では、ブラックカラント抽出物が投与される動物は、非正常なｃＧＰ及び／又はｃＧＰの総ＩＧＦ−１に対する比を全く示していない健常動物であってもよい。本実施形態では、該抽出物は、後に生じる疾患、状態又は疾患若しくは状態の症状に関連することがある、ｃＧＰ又はｃＧＰの総ＩＧＦ−１に対する比における変化を阻止又は回避するための手段として、予防的に投与されてもよい。或いは、動物は、既存の状態、病態、及び／又は状態若しくは病態に関連する症状を有してもよい。
【００６４】
上記の通り、「正常な」及び「健常な」などの用語は主観的な用語であるが、本明細書との関連において、該用語は、動物についてのヒストリカルな詳細のいずれかと比べたバイオマーカー化合物若しくは比、及び／又はベースライン若しくは標準と称される集団に対する変動の相対的尺度である。個体のベースラインは、年齢、性別、及びＩＧＦ−１機能に関連することがある任意の他の医学的状態の間で変動してもよい。個体のベースラインからのｃＧＰ及び／又はｃＧＰの総ＩＧＦ−１に対する比の変化が、治療及びＢＣＡ投与計画を導くためのより決定的な情報であることが見出されている。発明者によって実施された例示的試験では、血漿中のｃＧＰレベルが、健常女性においては３．５ｎｇ／ｍｇであり、５０〜７０歳においては８〜１０ｎｇ／ｍｌであり、またＰＤ患者においてはＩＧＦ−１抵抗性に起因して１２ｎｇ〜１５ｎｇ／ｍｌであることが示された。
【００６５】
上記の薬剤は、一実施形態では経口投与用に製剤化されてもよい。経口投与は、生理活性化合物を投与するための非浸潤性の単純な手段であり、且つブラックカラントの観点で十分に検討された方法である。さらに、規制当局の承認を得ることを目的に、それは上記方法の市場化を意図して作製するための有用な手法であってもよい。経口投与への言及にもかかわらず、該薬剤はまた、非経口投与用に製剤化することができ、例えば非限定例として、注射、舌下ウエハ又は坐剤が挙げられる。血液脳関門（ＢＢＢ）を克服することは、多数の生理活性化合物について当該技術分野で幅広く記載がなされていることから、経口的若しくは非経口的方法のいずれが好ましいか、又はさらにＢＢＢが通過を可能にするか否かといったことは余談ともいえる。発明者は、経口投与されるブラックカラント抽出物が、血液脳関門を必ず通過することから、投与における有用な手段であってもよいことを見出している。
【００６６】
一実施形態では、抽出物自体は、乾燥粉末であってもよい。抽出物粉末は、ミクロン範囲内の直径まで微粒子化されてもよい。抽出物は、１０００未満、又は１００、又は１０、又は１ミクロンの粒径を有してもよい。抽出物を含む薬剤は、丸剤、錠剤、カプセル剤、液体、粉末、微粒子化粉末、ゲル、液体で満たされた軟質ゲル、及びこれら形態の組み合わせとして製剤化されてもよい。技巧的なブラックカラント抽出物は、１０００ミクロンを超える粒径を有する粗粉末であってもよい。かかる抽出物は水性環境下で可溶化することが困難であり得、それ故、上記抽出物の微粒子化形態は、可溶化がより容易であり、ひいてはより迅速且つより完全に摂取され、動物血流に移動することから、有用なことがある。
【００６７】
上記の通り、用量は、治療有効量である。一実施形態では、治療有効量のブラックカラント抽出物は、１日あたりの用量が少なくとも５０、１００、又は１５０、又は２００、又は２５０、又は３００、又は３５０、又は４００、又は４５０、又は５００、又は５５０、又は６００、又は６５０、又は７００、又は７５０、又は８００、又は８５０、又は９００、又は９５０、又は１０００ｍｇのアントシアニンを動物に提供してもよい。用量は、動物に対して、１日あたり、５０〜１０００ｍｇ、又は１２０〜７００ｍｇ、又は２００〜７００ｍｇ、又は３００〜６００ｍｇのアントシアニンであってもよい。理解されるべきこととして、用いられる用量は、個別の動物代謝、動物種、動物体重、動物年齢及び他の要素などの要素に応じて変動してもよく、それ故、これらの用量は限定的に理解されるべきではない。
【００６８】
ブラックカラント抽出物は、限定はされないが、アメリカ、アジア、オーストラリア、ヨーロッパ、及びニュージーランド内を含む、国際的に育成された任意のブラックカラント品種に由来してもよい。
【００６９】
ブラックカラント抽出物は、４０°を上回る緯度の北半球及び／又は赤道から５０°北の南半球において育成された果実に由来してもよい。
【００７０】
一実施形態では、ブラックカラント植物は、クロスグリ（Ribes nigrum）種に由来してもよい。
【００７１】
上記のブラックカラント抽出物は、果実、又は皮、ジュース、種子、茎、及びそれらの組み合わせから選択される果実部分を用いて作製されてもよい。一実施形態では、抽出物は、皮、ジュース、種子及び潜在的にはブラックカラント植物からの葉又は茎質を含む果実の解離及び酵素消化、その後の濃縮粉末（次に微粒子化されてもよい）を形成するための乾燥により、生成されてもよい。微粒子化粉末は、カプセル形態が所望される場合、任意選択的にはカプセル封入されるか、又はその他として最終形態まで加工されてもよい。別の実施形態では、ブラックカラント濃縮物及び／又は還元果汁は、ｃＧＰの供給源であってもよい。好ましくは、ブラックカラント濃縮物は、最大で６５ブリックスの濃縮物であってもよい。本出願人は、６５ブリックスより高い濃縮物の粘稠性が高すぎることを見出している。
【００７２】
上記のブラックカラント抽出物は、ニュージーランドで育成された少なくとも１つのブラックカラント品種から収穫された果実から作製されてもよい。ニュージーランドで育成されたブラックカラントは、世界の他の地域で育成されたブラックカラントと比べて非定型な組成物を有し、通常よりも高いアントシアニンレベルを有することがあるという点でやや独特である。これは、暖かいが暖かすぎない夏（１０〜３０℃の日内温度）と涼しいが涼しすぎない冬（−５〜１５℃の日内温度）といったニュージーランドの温帯気候；特にオゾン層がニュージーランドを低く覆う時期のブラックカラント果実熟成中での太陽／ＵＶ照射強度の増加；及びブラックカラントが育成される地方の「テロワール」に起因してもよい。ブラックカラントは、ニュージーランドの南島において育成されてもよい。
【００７３】
しかし、これは本発明に対して想定される実施形態に対して限定的に理解されるべきではない。ｃＧＰの濃縮物を含有する、ベリーフルーツ、ナッツ、植物、低木などの有機又は植物ベースの材料の他のタイプ及び／又はそれらの組み合わせであれば、おそらくは本発明で用いることができる。さらに、これらの有機又は植物ベースの材料は、任意量又は最小量のアントシアニンを含有してもよい。非限定例として、クランベリー、ビートルート、ブラックエルダーベリー及びＢＨＣ複合体（ビルベリー及びセイヨウトチノキ）、紫人参、マツ樹皮、ビートルート、及び紫小麦を挙げてもよい。
【００７４】
一実施形態では、ブラックカラント抽出物は、少なくとも１つの「Ben」ブラックカラント品種から収穫された果実に由来してもよい。しかし、抽出物を形成するには、他のあらゆるブラックカラント品種が用いられてもよい。理解されているかもしれないが、品種の収量を混合することにより、アントシアニン量及びアントシアニン型が抽出物において変更及び／又は調整されてもよい。一実施形態では、ブラックカラント抽出物は、「Ben Ard」品種、「Ben Rua」品種、及びこれら品種の組み合わせ、又は他のブラックカラント品種に由来するブラックカラント植物から収穫された果実から作製されてもよい。
【００７５】
上記のブラックカラント抽出物は、少なくとも１０又は１１又は１２又は１３又は１４又は１５又は１６又は１７又は１８又は１９、２０、又は２１、又は２２、又は２３、又は２４、又は２５、又は２６、又は２７、又は２８、又は２９、又は３０、又は３１、又は３２、又は３３、又は３４、又は３５％、最大では５０重量％のアントシアニンを含んでもよい。
【００７６】
ブラックカラント抽出物は、健康上の利益をもたらすため、少なくとも０．１６ｎｇ／ｍｇの濃度の環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）及び／又は少なくとも所要量のｃＧＰを含んでもよい。
【００７７】
ブラックカラント抽出物は、アントシアニン：デルフィニジン−３−グルコシド、デルフィニジン−３−ルチノシド、シアニジン−３−グルコシド、シアニジン−３−ルチノシド、ペツニジン−３−ルトニオシド（rutonioside）、及びそれらの組み合わせを含めることにより、さらに特徴づけられてもよい。これらの同じ化合物が、当該技術分野の文献中で、デルフィニジン−３−Ｏ−グルコシド、デルフィニジン−３−Ｏ−ルチノシド、シアニジン−３−Ｏ−グルコシド、シアニジン−３−Ｏ−ルチノシド、ペツニジン−３−Ｏ−ルトニオシド（「Ｏ」は、酸素原子によって連結されている配糖体を指す）と称されてもよいことに注目されたい。同じ化合物に対する別称として、化合物が偏光下で回転する方向を特定するための「Ｄ」命名法が用いられてもよく、例えばデルフィニジン３−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドが挙げられる。「３」の形式のみを参照し、「Ｏ」又は「Ｄ」命名法を参照しないことは、本明細書の目的として限定的に理解されるべきではない。
【００７８】
デルフィニジン−３−グルコシド、デルフィニジン−３−ルチノシド、シアニジン−３−グルコシド及びシアニジン−３−ルチノシドであるとして記されるアントシアニンの組み合わせは、抽出物中のアントシアニンの総量の重量を基準として、少なくとも８０〜９０、又は９１、又は９２、又は９３、又は９４、又は９５、又は９６、又は９７、又は９８、又は９９％を含んでもよい。すなわち、さらなるアントシアニンが存在してもよいが、主に用いられる抽出物は、上記のアントシアニンを含む。理論に拘束されない限り、これらのアントシアニンが、組み合わせで又は別々に、ＩＧＦ−１の結合に対してインビボで観察される効果、ひいてはｃＧＰ濃度及び／又はｃＧＰの総ＩＧＦ−１に対する比において観察される増加に起因してもよいことが理解される。とはいえ、抽出物は、アントシアニン以外の他の化合物を含み、植物に由来していることから、これらの化合物に純粋に起因しない抽出物からの他の生理活性化合物又は相乗物質が存在してもよい。結果として、これらの化合物を具体的に参照する場合、抽出物中に存在する可能性がある他の化合物の生理活性を排除することが意図されていない。
【００７９】
１つの特定の実施形態では、抽出物は、以下のアントシアニン化合物を、すべてが測定されたとき、含んでもよく、標準のニュージーランドでのアントシアニン分析において、ブラックカラントからの非濃縮ジュース中で測定されるとき、
少なくとも６０ｍｇ／１００ｍｌのデルフィニジン−３−グルコシド；及び／又は
少なくとも２００ｍｇ／１００ｍｌのデルフィニジン−３−ルチノシド；及び／又は
少なくとも４０ｍｇ／１００ｍｌのシアニジン−３−グルコシド；及び／又は
少なくとも２４０ｍｇ／１００ｍｌのシアニジン−３−ルチノシド；及び／又は
を含む。
【００８０】
抽出物は、ブラックカラント果実から得られる非濃縮ジュース中で測定されるとき、少なくとも１４ｍｇ／１００ｍｌのペツニジン−３−ルトニオシドをさらに含んでもよい。
【００８１】
上記の利点は変動してもよい。バイオマーカーについては、上記のようなｃＧＰは、ＩＧＦ−１の安定な代謝産物であり、発明者の研究に基づき、動物から採取される生物学的検体中で容易に測定される。ｃＧＰは、ＩＧＦ−１の非結合活性型から形成され、それ故、総ＩＧＦ−１を測定するよりも信頼できる。ｃＧＰを増加させ、及び／又は神経学的状態に対処する上記の方法については、例えば測定可能で且つ公知の様式などでのブラックカラントの使用は、当該技術分野で公知でないか又は完成されていない。ブラックカラントジュース又はブラックカラントの他の形態（上記の抽出物でない）は、現時点で考えられる公知で且つ測定可能な様式で、また本明細書に記載のように用いられていない。脳卒中及びＰＤの知見は特に、潜在的には既存技術による治療に干渉することも又は望ましくない副作用を引き起こすこともなく患者に有意且つ測定可能な利益をもたらすことがある、ブラックカラントに対する新規な又は少なくとも代替的な使用を示す。しかし、発明者が、ｃＧＰのレベルを増加させるためにＢＣＡを適用するとき、ビタミンＣがアスコルビン酸としてＢＣＡに添加される場合には有効性に対して負の効果を有することを見出していることは注目すべきである。
【００８２】
ｃＧＰにおける変化を測定し、及び／又は神経学的状態に対処する上記方法については、環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）の信頼できるバイオマーカーとしての臨床適用の利点は、治療及び個別の投与計画に適した患者の選択を可能にする。ｃＧＰの増加は、神経学的状態のリスクを示し、ｃＧＰの減少は、神経学的状態の段階を示す。有利なことに、治療に適した患者はそのｃＧＰレベルに基づいて選択されてもよく、ｃＧＰレベルの変化は、調整及び個別化された治療投与計画において容易に監視されうる。ＢＣＡの投与計画を調節することにより、神経学的状態の効果的治療が可能になり、それ故、長期的回復（３か月超）及び神経学的状態に伴う長期合併症（認識機能障害）の予防が改善される。さらなる利点は、ｃＧＰレベルが分析を容易にするために尿サンプルを測定することにより容易に監視されうることであり、将来的なＢＣＡの大規模臨床試験にとって重大な意義を持つ。
【００８３】
さらに、一般に天然生成物及びそれに関連する生理活性化合物については、本明細書に記載の方法及び使用は、治療に介入することが適切であるときを認識するための特有の方法を提供し、治療の成功又はそれ以外を評価するための方法をさらに提供する。タイミング及び有効性に関するこの洞察は、時として多数の医薬品に望まれることであり、生理活性化合物を含有する天然生成物中に共通に認められるものではない。
【００８４】
上記の実施形態はまた、広義では、個別に又は集合的に、本願の明細書中で参照又は指定される部分、要素及び特徴に、また任意の２以上の前記部分、要素又は特徴のいずれか又はすべての組み合わせにあると述べられてもよい。
【００８５】
さらに、具体的整数が、実施形態が関連する当該技術分野で公知の均等物を有するように本明細書で述べられる場合、かかる公知の均等物は、個別に示される時点から本明細書中に援用されるものとする。
【実施例】
【００８６】
研究実施例
非神経学的及び神経学的状態のリスク及び回復を予測するための環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）バイオマーカーの臨床適用に関する上記方法、並びにそれらを治療するためのブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）の濃縮抽出物などのｃＧＰを含有する有機又は植物ベースの材料の使用が、ここで具体的実施例の参照により説明される。
【００８７】
実施例１
ブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）の添加により、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）の機能を改善するための栄養応答として、パーキンソン患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）中で環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）が増加するか否かを知るため、発明者により試験を完了した。
【００８８】
生物学的検体サンプルを患者から採取し、ｃＧＰ及びｃＧＰの総ＩＧＦ−１に対する比について検体を分析し、ｃＧＰ及びｃＧＰの総ＩＧＦ−１に対する比を活性ＩＧＦ−１の存在及び機能の予測変数として用いてもよいか否かを確認した。次に、患者におけるｃＧＰに対するブラックカラント抽出物添加の効果を分析するため、試験を続行した。
【００８９】
すべての患者は、Van der Veer Movement Disorderクリニック及びニュージーランド脳研究所（New Zealand Brain Research Institute）の患者データベースからリクルートした。患者は、疾患のステージ及び診断からの期間と無関係に、試験への登録に適格であった。患者は、４０歳以上であり、運動障害の神経学者によって確認された特発性ＰＤにおける英国ブレインバンク診断基準を満たした。試験は、Upper South A Regional Ethics Committeeによって認可された（参照：ＵＲＡ／１０／０３／０２２）。試験集団のフローチャートは患者のリクルーティングを示す。患者は、Unified PD Rating Scale（ＵＰＤＲＳ）パートＩＩＩを用いて評価し、さらに初回来診時にサンプルを得る前、一連の精神認知試験を実施した。これらは、ＨＡＤＳ、ミニメンタルステート検査（Mini Mental State Examination）（ＭＭＳＥ）、モントリオール認知評価（Montreal Cognitive Assessment）（ＭｏＣＡ）及びPD Questionnaire（PDQ-39）を含んだ。任意の学習効果を回避するため、２回目の来診については、利用可能であれば異なるバージョンの試験を用いた。表１は、試験前の患者の臨床情報及び評価を示す。患者の大部分が、明白な認識機能障害を伴わない特発性ＰＤと診断された。
【００９０】
【表１】
2020532587.tif 000003
【００９１】
試験方法は、ブラックカラント抽出物の添加前と２８日後の双方で男性ボランティア７名から７対の脳脊髄液（ＣＳＦ）サンプルを採取することを含んだ。
【００９２】
各来診の間に、血漿及び脳脊髄液（ＣＳＦ）サンプルを収集した。患者は、各来診の１２時間前、「低アントシアニン食」（即ち、白米、白パン、ツナ、チキン、コーヒー及び非ハーブティー）を消費するように指示された。
【００９３】
初回来診後、次の２８日間にわたり、患者にブラックカラントカプセルを添加した。ＢＣＡ濃縮カプセル（２０％アントシアニン、Super Currantex（登録商標）20、Just the Berries Ltd. New Zealandによる資金提供（NZ Pharmaceuticals Limited製））の用量は、２８日間にわたり１日２回服用された。各患者が服用する抽出物用量は、１日あたり約６００ｍｇのアントシアニンに相当した。抽出物は、ニュージーランドで育成されたBen品種の果実から作製した。抽出物は、解離及び酵素消化により作製してから、乾燥して濃縮粉末を形成し、次に微粒子化し、カプセル封入する。
【００９４】
上記の通り、ボランティアはパーキンソン病（ＰＤ）を有する人々であったが、ＩＧＦ−１が神経栄養因子であり、神経生存及び（振戦などの症状が認められるようになるＰＤ患者において障害された可能性がある）脳機能を維持することにおいて本質的な役割を担うことから、彼らは既にいくつかのＩＧＦ−１機能上の課題を有していたことになる。ＩＧＦ−１の抵抗性は、循環ＩＧＦ−１における増加によって特徴づけられてもよく、ＩＧＦ−１機能の障害が、ＰＤ患者において認知減退を伴うことが報告されている。循環中のＩＧＦ−１は、貯蔵状態にあり、機能的でない。しかし、各ＩＧＦ−１分子は、小さいｃＧＰ分子と、ＩＧＦ−１が十分に機能的であることを可能にする、ＩＧＦ−１の代謝産物とを含有する。ｃＧＰは、貯蔵状態のままで、且つ１対１の様式でのワーカーになることができる、ＩＧＦ−１の数を決定するための門番のように作用する。したがって、ｃＧＰは、ＩＧＦ−１の機能若しくは働きが十分でないとき、又は身体がより十分に働くＩＧＦ−１を求めるとき、患者の循環中で増加する。したがって、ｃＧＰは、ＩＧＦ−１が全力で機能できるために重要であり、ひいてはＩＧＦ−１機能を改善することを通じて神経保護的である
【００９５】
各サンプルを入手及び分析し、添加前及び添加後に採取した各サンプル中での総ＩＧＦ−１、ｃＧＰ及びＩＧＦ結合タンパク質１〜３の濃度を測定した。サンプルは、ＥＬＩＳＡ及び高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）質量分析を用いて分析した。
【００９６】
特記：
ＣＳＦサンプル
ＣＳＦサンプルを腰椎穿刺により得た。各来診中に約８ｍＬのＣＳＦを得た。平滑管内に収集したＣＳＦサンプルは、収集から１５分以内に、濡れた氷上でEndolab, Christchurch, New Zealandに輸送した。次に、サンプル受け取りから３０分以内に、サンプルを室温、３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を２つの平滑管の間で等しくアリコートし、−８０℃未満で凍結させた。
【００９７】
血漿サンプル
血液サンプルを肘前窩の静脈穿刺を介して得て；２０ｍＬをヘパリン及びＥＤＴＡ管の間で等しく分割した。サンプルは、収集から４５分以内に、濡れた氷上でEndolabに直ちに輸送した。次に、サンプル受け取りから３０分以内に、サンプルを１５分間遠心分離し（３０００ｒｐｍ）、血漿を平滑管内に吸引し、−８０℃未満で凍結させた。
【００９８】
インビトロサンプル
ＢＣＡ中のｃＧＰの存在可能性を分析するため、ＢＣＡを水に溶かし、５、５０及び１００ｍｇ／ｍｌの３つの異なる濃度を得た。各濃度は５通りに分析している。
【００９９】
下記は、ｃＧＰアッセイ及びＨＰＬＣ−ｍｓにおける、ＢＣＡ及び他の有機又は植物ベースの材料中でのｃＧＰのレベルを測定する方法である。
【０１００】
ｃＧＰアッセイ
ｃＧＰアッセイにおける内部標準として提供されるｃＧＰ−ｄ２。ｃＧＰ−ｄ２（５００ｎｇ／ｍＬの５０μＬ）を血漿１００μＬに添加し、ボルテックス混合した。溶液を、４．５ｍＬの管内に含まれる１ｍＬのPhreeリン脂質除去カートリッジ（Phenomenex, Auckland, New Zealand）に移し；アセトニトリル（ＭｅＣＮ）中の１％ギ酸５００μＬをカートリッジに添加し、４℃、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、濾液を収集することができた。真空濃縮器を用いて濾液を乾燥させた（１．５ｍＴｏｒで１時間、次に０．７ｍＴｏｒで４５分間、室温）。乾燥したサンプルを１００μＬの１０％メタノール／水で再構成し、定量のために超高圧液体クロマトグラフィーバイアルに移し、次に４℃、５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、任意の残存する微粒子を沈降させた。ｃＧＰを木炭除去ヒト血漿に添加することによって調製した標準である品質管理サンプルを、２つの異なる濃度のｃＧＰとともに利用し、次にサンプルと同じ抽出手順を施した。
【０１０１】
高性能液体クロマトグラフィー質量分析アッセイ（ＨＰＬＣ−ｍｓ）
手短に言うと、クロマトグラフィー条件は、３５℃のカラム温度で１０％メタノール／９０％水の初期移動相組成物が２００μＬ／分で流れる、Synergy Hydroの２．５μｍカラム（Phenomenex）（１００×２ｍｍ）から構成した。質量分析条件は、４０００Ｖの電圧、３０ｐｓｉのシースガスフロー、２ｐｓｉの補助ガスフロー、及び２５０℃のキャピラリー温度で正モードのエレクトロスプレーイオン化から構成した。断片化は、衝突ガスとしての１．２ｍＴｏｒｒのアルゴン及び３５Ｖの解離電圧を用いて行った。質量分析計は、ｃＧＰ及びｃＧＰ−ｄ２各々に対して１５５．１→７０．２ｍ／ｚ及び１５７．１→７０．２ｍ／ｚといった２つのトランジションを利用して、選択的反応モニタリング（ＳＲＭ）モードで稼動させた。両ピークに対する保持時間は３．６分であった。未知のサンプルは、既知濃度の検量線と比べてのｃＧＰ／ｃＧＰ−ｄ２のピーク面積比を用いて定量化した。
【０１０２】
ＥＬＩＳＡ
総ＩＧＦ−１、ＩＧＦＢＰ−１、−２及び−３の血漿及びＣＳＦ濃度は、市販のＥＬＩＳＡキット（Crystal Chem, Chicago, IL, USA）を用い、製造業者の使用説明書に従って測定した。アッセイは、血漿サンプル中で４回繰り返したが、利用可能なＣＳＦ量が限られたため、ＣＳＦサンプル中では繰り返さなかった。
【０１０３】
統計分析
ブラックカラント添加後、ｃＧＰ、ＩＧＦ−１、ＩＧＦＢＰ−１、ＩＧＦＢＰ−２及びＩＧＦＢＰ−３における変化を分析するため、対応ｔ検定を用いた。生物学的変化間の相関は、ピアソン検定を用いて計算した。０．０５未満のＰ値を有意であるとみなす。
【０１０４】
結果
ＢＣＡ中のｃＧＰ濃度のインビトロ分析
一元配置分散分析によると、ｃＧＰの濃度がＢＣＡの異なる用量間で有意に異なることが示唆された（ｐ＜０．０００１、ｎ＝５、図１）。ｃＧＰの濃度は、５０ｍｇ／ｍｌのＢＣＡを用いる群において、低いＢＣＡ（５ｍｇ／ｍｌ）を用いる群と比べて有意に増加し（ｐ＝０．０００１、ｎ＝５）、ＢＣＡ用量が１００ｍｇ／ｍｌまで増加したとき、さらに増加した（ｐ＜０．０００１、ｎ＝５）。
【０１０５】
ＣＳＦ
ＣＳＦのｃＧＰ濃度は、ＢＣＡの添加後、有意に増加した（７．２７±０．６７から１２．１２±０．９４へ、ｐ＜０．００１、ｎ＝６、図２Ａ）。ｃＧＰ濃度における平均百分率変化は、添加後、７４．３６％増加した（ｐ＜０．０５、ｔ（５）＝３．９８９。全部で７対のサンプルの中で、添加後、それらの６つが増加を示した。患者１名が、ＣＳＦ中で１６．９倍のｃＧＰの増加を示し（１１．３０ｎｇ／ｍｌから１９１．８０ｎｇ／ｍｌへ）、それは異常値（平均の１５．７倍）として統計分析から排除している。患者１名が添加に応答せず、添加後のｃＧＰ濃度は一定を維持した（８．８〜８．７ｎｇ／ｍｌ、図２Ｄ）。ＩＧＦ−１、ｃＧＰ／ＩＧＦ−１比（図２Ｂ及びＣ）、ＩＧＦＢＰ−２及びＩＧＦＢＰ−３の濃度における変化はなかった（表２）。
【０１０６】
血漿
ＢＣＡの添加後、ｃＧＰ、ＩＧＦ−１、ｃＧＰ／ＩＧＦ−１比（図３Ａ〜Ｃ）、ＩＧＦＢＰ−１、２及び−３の濃度における統計学的変化はなかった（表２）。
【０１０７】
ＣＳＦ対血漿濃度
表２は、添加前及び添加後のＣＳＦ及び血漿中でのｃＧＰ、ＩＧＦ−１及びＩＧＦＢＰにおける値を示す。ＩＧＦＢＰ−１の濃度は、血漿中で低かった。ＩＧＦＢＰ−３（３０３８〜３０２９ｎｇ／ｍＬ）は、血漿中の主要なＩＧＦＢＰであり、ＩＧＦＢＰ−２（８３．７〜８５．５ｎｇ／ｍＬ）は、ＣＳＦ中の主要なＩＧＦＢＰであった。ＣＳＦ／血漿比は、ＩＧＦ−１及びＩＧＦＢＰ−３双方において＜１％であり；ＩＧＦＢＰ−２において１．３〜２％であり、またｃＧＰにおいて５２〜７１％であった（表２）。
【０１０８】
相関分析
ピアソン検定によると、ＣＳＦ中のｃＧＰ濃度と血漿中のｃＧＰ濃度との間に有意な相関（Ｒ＝０．６８、ｐ＝０．０１、図４Ａ、ｎ＝１２）、並びに血漿中のｃＧＰ／ＩＧＦ−１の比とＣＳＦ中のｃＧＰ濃度との間に有意な相関（Ｒ＝０．６６、ｐ＝０．０１、図４Ｅ、ｎ＝１２）が示された。ＩＧＦ−１濃度においてＣＳＦと血漿との間に相関がなく（Ｒ＝０．０９、ｐ＝０．７５、図４Ｂ）、且つＣＳＦと血漿の双方におけるｃＧＰ濃度とＩＧＦ−１濃度との間に相関がなかった（Ｒ＝０．０４、ｐ＝０．８５、図４Ｄ、Ｒ＝−０．１２、ｐ＝０．６９、図４Ｃ）。
【０１０９】
下の表２にまとめた結果は、添加前及び添加後の測定データを示す。
【０１１０】
【表２】
2020532587.tif 000004
【０１１１】
考察
先に見出されているように、ＢＣＡは、天然栄養素であるｃＧＰを含む。ＢＣＡの添加により、ＰＤ患者のＣＳＦ中でＩＧＦ−１ではなくｃＧＰの増加がもたらされた。ＣＳＦ中のｃＧＰ濃度は、血漿中のｃＧＰ濃度及びｃＧＰ／ＩＧＦ−１の比と、血漿中での変化が有意でなかったとしても相関した。血漿からの中枢取り込みは、おそらくは血液脳関門（ＢＢＢ）の機能に起因して、ｃＧＰにおいて高く、ＩＧＦ−１及びＩＧＦＢＰにおいて低かった。ＣＳＦ中でのｃＧＰの増加は、ＢＣＡの添加に対する栄養応答であってもよい。血漿ｃＧＰの非統計学的変化がその原因である可能性が高かった。その機構の解明により、ＢＣＡがＩＧＦ−１機能を正常化するための介入であってもよいことのさらなる科学的証拠が得られることになる。
【０１１２】
ｃＧＰは、ＢＢを通過する能力を有する小さい親油性分子（１９２ｄ）である。血漿ｃＧＰの約５２％は、添加前、ＣＳＦ中で見出され、添加後、７１％に増加し（表２）、ｃＧＰのＣＳＦ濃度と血漿濃度との間に有意な相関が得られた（図３Ａ）。したがって、たとえ添加による血漿中のｃＧＰ濃度の増加が有意でなかったとしても、血漿ｃＧＰは、ＣＳＦ  ｃＧＰの増加のための供給源であった可能性が高い。ＣＳＦ中のｃＧＰとＩＧＦ−１との間に相関はなく（図３Ｃ）、ここでは、ＣＳＦ  ｃＧＰの小部分が中枢神経系（ＣＮＳ）におけるＩＧＦ−１から形成し、それがＣＮＳにおいてＩＧＦ−１を切断する酵素も生じるためであるという可能性を除外しなくてもよい。
【０１１３】
ｃＧＰと対照的に、ＣＳＦ中のＩＧＦ−１の濃度は、血漿ＩＧＦ−１の約１％であり（表２）、それらの間に相関はなかった（図３Ｂ）。これらの観察結果は、ＣＳＦ  ＩＧＦ−１が主に循環ＩＧＦ−１と独立していたことを示唆する。ＩＧＦ−１は、ＢＢＢを通過する能力が限られた、ｃＧＰよりも大きい分子（７６００ｄ）である。データは、ｃＧＰの中枢取り込みが高く、ＩＧＦ−１が低く、それはサンプリングされたＰＤ患者におけるＢＢＢの維持された機能に起因することを示した。理論に拘束されない限り、変性する脳からの栄養的支持への要求により、ｃＧＰの血漿からＣＳＦへの移行が促進されたという可能性がある。したがって、アントシアニンの添加後のＣＳＦ  ｃＧＰのさらなる増加は、ＩＧＦ−１機能を改善するためのＢＣＡ処置に対する栄養応答であってもよい。ｃＧＰがＢＣＡの天然栄養素であるならば、ＢＣＡの有益な効果は、生体利用可能なＩＧＦ−１、ひいてはその機能を改善することを通じて媒介されてもよい。ＣＳＦ  ｃＧＰの変化は有意であったが、より多数の症例を用いたさらなる臨床試験により、ＢＣＡの添加の有効性、特に血漿中でのｃＧＰの変化が確認されることになる。
【０１１４】
結論
結論として、ｃＧＰはＢＣＡの栄養素であり、ＢＣＡの添加により、ＰＤ患者のＣＳＦ中でのｃＧＰの上昇がもたらされ、ＰＤの脳におけるＩＧＦ−１機能が改善される。例えば、ＢＣＡの添加により、図２Ａに示す通り、添加後のｃＧＰのＣＳＦ濃度が有意に増加した（ｐ＜０．００１，ｎ＝７）。ｃＧＰ／ＩＧＦ−１の比もまた、図２Ｃに示す通り、有意に変化した。
【０１１５】
ＣＳＦ中でのｃＧＰの増加は、血漿ｃＧＰの高い中枢取り込みの結果である可能性が高かった。ＩＧＦ−１の中枢取り込みは、ＰＤ患者における保持されたＢＢＢ機能に起因して制限された。血漿中のｃＧＰ及びｃＧＰ／ＩＧＦ−１比の変化は、変性脳におけるＩＧＦ−１機能についてのさらなる指標を提供し得、大規模臨床試験においてさらに評価されることになる。
【０１１６】
対照的に、添加により、ＣＳＦ（図２Ｂ）サンプル中のＩＧＦ−１の濃度が有意に変化せず、ＩＧＦ−１又は結合ＩＧＦ−１の測定が、ＩＧＦ−１機能の区別（活性型又は結合型）ができず、故にＩＧＦ−１活性の尺度として確実には利用できないことから、不良なバイオマーカーであるという事実が再現された。
【０１１７】
実施例２
本実施例において、バイオマーカーとしてｃＧＰを用いる能力についてさらに評価した。試験のため、全部で２９名をリクルートし、患者は７０歳超又は７０歳未満のいずれかであり、全員が正常な認知機能を有した。生物学的検体を血漿の形態で患者から採取した。血漿中のＩＧＦ−１及びＩＧＦＢＰ−３の濃度をＥＬＩＳＡにより測定し、血漿ｃＧＰを高性能液体クロマトグラフィー質量分析アッセイにより測定した。
【０１１８】
結果は、図５Ａ、５Ｂ及び５Ｃに示す通りであった。
【０１１９】
図５Ａは、総血漿ＩＧＦ−１の測定濃度が年齢とともにいかに減少する傾向があるかを図示するが、測定された総ＩＧＦ−１における差異は比較的小さかった。
【０１２０】
対照的に、図５Ｂは、ｃＧＰ血漿濃度が年齢とともにいかに変化するかを示し、その変化は明白であり、測定が容易である。図５Ｃは、測定されたｃＧＰの総ＩＧＦ−１に対する比もまた、年齢とともにいかに有意に変化するかをさらに示す。
【０１２１】
理論に拘束されない限り、ｃＧＰ及びｃＧＰ／ＩＧＦ−１比における観察された増加が、年配者において正常な認知を維持するための、血漿ＩＧＦ−１の減少に対する代償性応答であることが推測される。
【０１２２】
実施例３
本実施例において、個別の治療レジームとしての脳卒中のリスク及び回復を予測するためのｃＧＰバイオマーカーの臨床適用を試験するため、初期試験を完了した。
【０１２３】
（完了した最新試験は、本明細書で実施例８にて最新のデータ及び図面とともに説明され、ここで試験中に脳卒中後に入院して４８時間未満の患者が十分でなかったことから、ベースライン測定値は７２時間に修正したことに注目されたし。また、このデータとしてもはや利用されないｍＲＳのベースラインデータは、脳卒中後３日未満の信頼できるものでなかったことから、ＮＩＨＳＳと交換している）
【０１２４】
ＩＧＦ−１機能が脳卒中の回復にとって重要であることが理解されている。結果として、脳卒中におけるＩＧＦ−１機能にとって信頼できるバイオマーカーが、脳卒中の予後にとって有用なことがある。しかし、本明細書の他の箇所に記される通り、血漿ＩＧＦ−１又はＩＧＦ−１／ＩＧＦ結合タンパク質−３（ＩＧＦＢＰ−３）比は、信頼できるバイオマーカーでない。ｃＧＰは、脳卒中患者の自発的回復中でのＩＧＦ−１機能にとっての有望なバイオマーカーとして試験した。
【０１２５】
脳卒中患者１４名から、脳卒中発症からのベースライン時（＜４８時間）、１週後及び３か月後、血漿サンプルを収集した。さらに、試験における陰性対照として作用するように、年齢適合健常者から２９の血漿サンプルを収集した。
【０１２６】
ベースラインと３か月との間での修正ランキンスケール（modified Rankin Scale）（ｍＲＳ）における差異（ΔｍＲＳ）を用いて、脳卒中後の機能的回復を評価した。血漿サンプル中のＩＧＦ−１及びＩＧＦＢＰ−３の濃度をＥＬＩＳＡにより測定し、血漿ｃＧＰを高性能液体クロマトグラフィー質量分析アッセイにより測定した。
【０１２７】
結果によると、血漿ＩＧＦ−１における無変化が示され、この結果は、バイオマーカーとしてのＩＧＦ−１の不良な性質をさらに再現している（図６Ａ）。対照的に、脳卒中患者は、健常患者対照と比べて、有意により低いｃＧＰレベル（ｐ＝０．００６、図６Ｃ）及びｃ−ＧＰ／ＩＧＦ−１比（ｐ＝０．００１．図６Ｄ）を有した。
【０１２８】
脳卒中患者におけるＩＧＦＢＰ−３は、やや低下した（ｐ＝０．０４９、図６Ｂ）。ＩＧＦＢＰ−３の低下の場合、遊離ＩＧＦ−１を増加させるような陽性応答でありうる。
【０１２９】
したがって、ｃＧＰ及びＩＧＦ−１に対するその比における変化は、脳卒中回復中のＩＧＦ−１機能に対する感受性がＩＧＦ−１測定単独に対する信頼性よりも高いようなバイオマーカーである。
【０１３０】
興味深いことに、脳卒中発症から４８時間以内にｃＧＰ濃度が有意に減少した。この急激な減少が脳卒中の直接的な結果又は原因であるか否かは不確かであるが、これは観察可能な特徴であり、おそらくは異常な機能の指標であると思われる。
【０１３１】
図７Ａ〜７Ｅに図示されるような（更新された図１４も参照）経時的に取得した結果によると、脳卒中患者が、３か月にわたり、ｍＲＳ（ここでは表７に示すような最新のＮＩＨＳＳに相当）の減少を示すことにより徐々に回復する（図７Ａ）ことが示された。脳卒中患者において、３か月後、ベースラインレベル（＜脳卒中後４８時間）と比べて、ｃＧＰの増加（ｐ＝０．０５７、ｎ＝１４）及びｃ−ＧＰ／ＩＧＦ−１の増加（ｐ＝０．０８、ｎ＝１４、図７Ｂ及び図７Ｅ）への傾向が認められた。
【０１３２】
ベースラインｃＧＰは、ベースラインと３か月との間での神経学的スコアにおける差異により評価される回復に負に関連した（ΔｍＲＳ、ｒ＝−０．６５１、ｐ＝０．０２２、図７Ｆ）。
【０１３３】
発明者の結果は、ベースラインｃＧＰが脳卒中回復の短期転帰を予測することを示唆する。ベースラインｃＧＰが高まると、患者における予後がより陽性になる。その結果はまた、脳卒中回復の期間にわたってＩＧＦ−１及びＩＧＦＢＰ−３における変化がなかったことから、ｃＧＰ及びｃＧＰ／ＩＧＦ−１比の変化が、ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−１／ＩＧＦＢＰ−３比よりも信頼できるバイオマーカーであってもよいという初期の知見をさらに支持する。
【０１３４】
ｃＧＰにおける増加は、脳卒中回復を促進するための栄養応答であると理解される。ｃＧＰ及びｃＧＰ／ＩＧＦ−１比の増加と同様、脳卒中回復中のｃＧＰの増加もまた、脳卒中回復を促進するための栄養応答であると理解される。これらの知見は、回復がｃＧＰと相関してもよく、ｃＧＰの添加が回復を補助することがあることを示す。さらに、脳卒中から４８時間後のｃＧＰ濃度が、脳卒中患者における神経学的機能の回復と有意に相関することから（図７Ｆ）、これは、入院時のｃＧＰ濃度が回復の能力、ひいては治療向けの決定的情報を予測することを示唆する。これはまた、ｃＧＰレベルを増加させるための添加が、脳卒中からの短期回復をも補助することを示唆するであろう。
【０１３５】
実施例４
上記試験では、尿であっても有用な生物学的検体となるか否かを試験するため、試験に登録した患者から尿サンプルも採取した。試験中、全部で７１の尿サンプルを採取し（対照３０名、脳卒中患者３３名）、これらのサンプルを上記方法と同様の様式で分析した。相関が存在することを確認するため、より早期の試験から脳卒中患者及び高齢対照におけるさらなる３７の血漿サンプルも比較した。
【０１３６】
図８Ａ及び図８Ｂは、尿分析から収集したデータを示す。血漿ｃＧＰは、脳卒中患者において、ベースライン（＜脳卒中後４８時間、ｐ＜０．０１、ｎ＝９、図８Ａ）時、正常対照（ｎ＝３０）よりも有意に低下する。年齢適合対照と脳卒中との間での尿中のｃＧＰの差異は、血漿サンプルにおいて認められた場合と類似する（図８Ａ）。想定の通り、ベースラインと比べての、後の時点における尿ｃＧＰの増加への傾向が認められ、時点測定値における尿と血漿の間での差異もまた有意でなかった（図５Ｂ）。
【０１３７】
尿中ｃＧＰ濃度は、血漿ｃＧＰ濃度（ｒ＝０．５９、ｐ＜０．０１、図５Ｃ）及びｃＧＰ／ＩＧＦ−１比（ｒ＝０．６３、ｐ＜０．００１、図８Ｄ）と有意な相関を有した。高齢者と若年者との間での尿サンプル中で、同様の結果が認められた（図９）。結果は、尿及び血漿を生物学的検体として用いてもよいことを示す。
【０１３８】
図１０Ａ及び図１０Ｂは、尿中（図１０Ｂ）でなく血漿中（図１０Ａ）のベースラインｃＧＰの変化が回復に関連したことを示す（ΔｍＲＳ：ｍＲＳベース−３か月）（ｒ＝−０．６３０、ｐ＝０．００３、図１０Ａ、１０Ｂ）。
【０１３９】
それ故、尿中でのｃＧＰの変化は、血漿中でのｃＧＰの変化を表しうる。
【０１４０】
実施例５
当該技術では、ブラックカラントの様々な遺伝子型から、アントシアニン含量がブラックカラントジュース１００ｍｌあたり８０〜７００ｍｇであることが示唆される。ニュージーランドで育成されたブラックカラントがより高レベルのアントシアニンを有し、且つBen品種が選択された潜在的に生理活性のあるアントシアニンを潜在的により高濃度で有することが理解される。任意の抽出及び濃縮に先立ち、ブラックカラントジュース中の選択されたアントシアニンの量の存在を確認するため、さらなるニュージーランドで育成された品種Blackadderに対するブラックカラントの２つのBen品種を比較する試験が終了した。
【０１４１】
下の表３はその結果を示す。
【０１４２】
【表３】
2020532587.tif 000005
【０１４３】
上から理解できるように、Ben品種は、高い総アントシアニン含量と、Blackadderのような他のニュージーランドで育成された品種にとっても変化するアントシアニン特性とを有する。３つ全部のニュージーランド品種に対して上で測定された総レベルは、当該技術分野で記録された場合よりも十分高く、ニュージーランドで育成されたブラックカラントが他の場所で育成されたものと異なるという見解が支持される。さらに、例えば上記のBen品種を混合することにより、上記のBlackadderのようなニュージーランドで育成された非Ben品種とであっても特性が大きく異なるようなアントシアニンの混合が可能な場合があることは注目されるべきである。
【０１４４】
実施例６
ｃＧＰの濃度を含む４つの異なる濃度（１、５、２５及び１００ｍｇ／水）でのベリーフルーツ（ブラックカラント、クランベリー、ビートルート、ブラックエルダーベリー及びＢＨＣ複合体（ビルベリー＋セイヨウトチノキ））の選択についての分析からの結果を図１１に示す。
【０１４５】
結果は、３０ｎｇ／ｍｇのブラックカラント中のｃＧＰの濃度が、Vitalityから供給された先のブラックカラントサンプルよりも高いことを示す。これは、加工方法における可変性に起因することがあり、さらなる検討を要する。Diaion HP20でコーティングされた樹脂ビーズを利用するクロマトグラフィーカラムを通じて処理されたこのＢＣＡサンプルが、溶媒抽出プロセスを用いて抽出した先のＢＣＡサンプルよりも３倍高いｃＧＰ濃度を有することは発明者によって注目されている。
【０１４６】
ＢＨＣ複合体のｃＧＰ濃度は８０ｎｇ／ｍｇであり、ブラックエルダーベリー及びクランベリー中にｃＧＰの画分が存在するが、より高濃度でのさらなる試験が必要であり得る。
【０１４７】
ブラックカラント及びビートルート以外では、他の３つのサンプルが１００ｍｇの濃度にて完全には溶解されなかったことも注目されている。
【０１４８】
図１２は、陽性対照としてのＢＣＡの用量範囲内で、追加的分析として供給したサンプルからのデータを示す。ｃＧＰ濃度は、１００ｍｇのＢＣＡ（対照）中で２７ｎｇ、１００ｍｇのビルベリー中で４６．７ｎｇ、また１００ｍｇ（１０ｎｇ／ｍｇ）の新規に配合されたＢＣＡ中で１００ｎｇである。
【０１４９】
これらの結果は、クロマトグラフィーカラムを通じて処理されたＢＣＡが、エタノール溶媒抽出プロセスのみを用いて抽出されたＢＣＡと比べて、より高いｃＧＰ濃度を有することをさらに示唆する。さらに、ビルベリー単独は、ビルベリーとセイヨウトチノキとの複合体よりも低いｃＣＰ濃度を有する。
【０１５０】
図１３は、Vitalityによって提供された製品サンプルの、それらのｃＧＰ濃度を測定するためのさらなる分析からの結果を示す。Vitalityによって提供された製品サンプル（ＢＣ抽出物China-47、NZBCジュース濃縮物（Ｔ１８０２１２及びＴ１８０１１５）、アレパ抽出物、Enzogenol、タルトチェリー、紫小麦、紫人参及びビートルートというラベル）の４つの異なる濃度（１、５、２５及び１００ｍｇ／水）における分析からの結果。上で３０ｎｇ／ｍｇを用いて試験された最初のVitalityのＢＣＡサンプルを陽性対照として用いた。
【０１５１】
結果は、次のことを示す。
・ブラックカラントをアッセイ用の陽性対照として使用。ｃＧＰの濃度は２９ｎｇ／ｍｇであり、３０ｎｇ／ｍｇであった上記分析からの濃度に一致する。
・製品のｃＧＰ濃度は、次の通りである。
・タルトチェリーは、ｃＧＰの最高濃度（１３５ｎｇ／ｍｇ）を有し、陽性対照として用いたVitalityのＢＣＡ抽出物よりも４倍高い；
・NZBCジュース濃度（２１２）は５３ｎｇ／ｍｇである；
・NZBCジュース濃度（１１５）は６１ｎｇ／ｍｇである；
・紫人参は５７ｎｇ／ｍｇを含有する；
・Enzogenolは、VitalityのＢＣＡに類似したｃＧＰ濃度（３６ｎｇ／ｍｇ）を有する；
・ＢＣ抽出物China-47は２２ｎｇ／ｍｇである；
・ビートルートは、VitalityのＢＣＡと比べてｃＧＰの半量（１４ｎｇ／ｍｇ）を有する；
・アレパ抽出物は非常に低いｃＧＰ（４ｎｇ／ｍｇ）を有する；及び
・紫小麦は、この分析におけるｃＧＰを有するように思われない
【０１５２】
上の製品サンプルが上で示す結果から増加したｃＧＰ濃度を有してもよく、さらに（これらの結果において示さないが）紫小麦がｃＧＰを含有してもよいことは注目されるべきである。上記の通り、有機物質から抽出したｃＧＰ濃縮物（又はその存在）は、加工方法における可変性に起因することがあり、さらなる検討を要する。例えば、Diaion HP20樹脂ビーズを利用するクロマトグラフィーカラムを通じて最初に処理された有機物質が、エタノール溶媒抽出プロセス単独を用いて抽出した先のＢＣＡサンプルよりも３倍高いｃＧＰ濃度を有することは発明者によって注目されている。しかし、類似のｃＧＰ抽出能力を有する他の樹脂ビーズを利用してもよいことは理解されるべきである。さらに、ｃＧＰ濃縮抽出プロセスは、アッセイ中、有機物質が水に溶解されうるか否か、及びｃＧＰを含有する画分がクロマトグラフィーカラム内で正確に捕捉され、同定されているか否か、などの他の要素に依存してもよい。
【０１５３】
実施例７
本実施例において、試験は、レット症候群（ＲＴＴ）と遺伝子診断された６歳少女の、ＩＧＦ−１、メラトニン（ＭＴ）、ブラックカラント抽出物（ＢＣＡ）、及びリハビリテーションで６か月間処置されてからの良好な進化を説明する。患者は、１歳時から正常な発達を停止した。
【０１５４】
患者は、低い体重及び身長を示し、典型的なＲＴＴとしての主な診断基準を満たした。奇妙なことに、ゴナドトロピンが低いにもかかわらず、陰毛（タナーＩＩ）での非常に高い血漿テストステロンが認められた。副腎酵素欠損が不在であり、腹部超音波検査は正常であった。
【０１５５】
治療の中身は、３か月間のＩＧＦ−１（０．０４ｍｇ／ｋｇ／日、５／週、皮下）、次いで１５日間の安静、ＭＴ（５０ｍｇ／日、経口的、継続的）及び神経リハビリテーションであった。
【０１５６】
新鮮血液検査は絶対的に正常であり、陰毛が消失した。次いで、ＩＧＦ−１、ＭＴ、及びＢＣＡを用いた新しい治療がさらに３か月間開始した。その後、パブリックなタナー段階が、原因不明な条件下でＩＩＩに上昇した。
【０１５７】
後続治療により、表４及び５に示す通り、初期機能障害の大部分における明確な改善がもたらされた。
【０１５８】
【表４】
2020532587.tif 000006
【０１５９】
【表５】
2020532587.tif 000007
【０１６０】
上記の結果は、ＩＧＦ−１による治療の効果、ＭＴ及びＢＣの抗酸化剤効果、並びにＢＣＡ投与後の環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）における増加が、レット症候群を有する少女に内在する神経障害を改善するために有用であることを支持する。例えば、有意な所見が、治療の結果として歯ぎしりが消失したことである。ブラックカラントの抽出物がｃＧＰのレベルを上昇させることから、ＩＧＦ−１の分裂促進能が相殺されうることで、このホルモンによる治療がより長期に延長されうる。
【０１６１】
ＩＧＦ−１、ＭＴ及びＢＣによる継続治療により、進行中の試験に伴い、ＲＴＴにおいて生じる神経障害の大部分が回復し得る。
【０１６２】
結果はまた、（ＩＧＦ−１及びＭＴに加えて）ｃＧＰとの組み合わせ治療後、レット症候群が改善し、他の疾患／症候群の治療を意図した物質／ホルモンの他の組み合わせとともに、ｃＧＰを用いてもよいことを示す。
【０１６３】
実施例８
本実施例において、脳卒中後３日以内の環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）の血漿濃度と、いかに血漿ｃＧＰが短期的な脳卒中回復を予測することがあるかを評価するため、実施例３に対するさらなる更新試験を完了した。
【０１６４】
脳卒中患者は機能が回復する。この自己回復過程は、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）の機能を促進することに関連する。ＩＧＦ−１機能を表すバイオマーカーは、脳卒中患者における回復を予測し、臨床管理を導くことを補助することがある。血漿ＩＧＦ−１は、すべてが生体利用可能ではない。ＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）−３及び環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）は、ＩＧＦ−１のバイオアベイラビリティを集合的に調節する。血漿ＩＧＦ−１、ＩＧＦＢＰ−３及びｃＧＰ濃度を、ＩＧＦ−１機能に対するバイオマーカーとして、並びに脳卒中患者における臨床成績及び回復とのそれらの関連として評価した。
【０１６５】
方法
年齢適合対照対象５０名（女性／男性が３５名／１５名）及び脳卒中を有する者３４名（女性／男性が１５名／１９名）を脳卒中の３日以内にリクルートした。臨床的評価は、ベースライン（＜３日）時、次いで７日目及び９０日目のＮＩＨ脳卒中スケール（National Institutes of Health Stroke Scale）（ＮＩＨＳＳ）、並びに７日目及び９０日目の修正ランキンスケール（modified Rankin Scale）（ｍＲＳ）及びFugl-Meyer Upper Limb Assessmentスケール（ＦＭ）を含んだ。
【０１６６】
ベースライン時に脳卒中患者３４名から、７日目に患者２１名から、及び９０日目に患者２６名から、血漿サンプルを収集した。
【０１６７】
患者２８名がフォローアップを完了していた。彼らの中で、患者２１名が７日目に血漿サンプルを提供し、患者２６名が９０日目に血漿サンプルを提供した。したがって、全部で患者２１名が臨床スコアを完了しており、すべての時間間隔で血漿サンプルを提供した。患者２８名がベースライン時に血漿サンプルを提供し、９０日目に臨床的評価を受けた。脳卒中の病歴を有しない年齢適合対照参加者５０名（女性が３５名）もリクルートし、全員が血漿サンプルを提供した（表６及び７）。
【０１６８】
【表６】
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【０１６９】
【表７】
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【０１７０】
ＩＧＦ−１、ＩＧＦＢＰ−３又はｃＧＰの濃度は、前述の通り、ＥＬＩＳＡ又は高性能液体クロマトグラフィー質量分析を用いて測定した。
【０１７１】
結果
対照参加者は、有意な神経障害（ＮＩＨＳＳ中央値（範囲）：０（０−２））も全身体障害（global disability）（ｍＲＳ中央値（範囲）０（０−１））も有しておらず、正常な上肢機能（ＦＭ中央値（範囲）：６６（６５−６６））を有した。脳卒中患者では、経時的に脳卒中重症度（ＮＩＨＳＳ）及び身体障害（ｍＲＳ）が低下し、上肢機能（ＦＭ）が改善した。例えば、ＮＩＨＳＳスコアは経時的に改善した（Ｆ（２，２０）＝２７．４８、ｐ＜．００１、ｎ＝２１、図１４Ａ）。ベースラインと比べて、ＮＩＨＳＳスコアは、７日（中央値：２対４、ｐ＝０．０１）及び９０日（中央値：１対４、ｐ＜０．００１）までに低下した。ＦＭスコアが改善したように（中央値：６４対６５、ｐ＝０．００１、ｎ＝２１、図１４Ｃ）、ｍＲＳスコアも改善した（中央値：３対２、ｐ＝０．００３、ｎ＝２１、図１４）。
【０１７２】
ＩＧＦＢＰ−３、ｃＧＰ及びｃＧＰ／ＩＧＦ−１モル比のベースライン濃度は、脳卒中患者において、対照対象よりも低かった。特に、対照群と比べて、ＩＧＦＢＰ−３濃度（ｐ＝０．００２、図１５Ｂ）、ｃＧＰ濃度（ｐ＝０．０４７、図１５Ｃ）及びｃＧＰ／ＩＧＦ−１モル比（ｐ＝０．０４３、図１５Ｄ）は、ベースライン時、脳卒中群においてより低かった。ＩＧＦ−１濃度（図１５Ａ）においては、対照群と脳卒中群との間での差異は認められなかった。ベースライン時のＩＧＦ−１／ＩＧＦＢＰ−３比は、脳卒中群において、対照群の場合よりも高かった。
【０１７３】
血漿ｃＧＰ及びｃＧＰ／ＩＧＦ−１モル比は、ＩＧＦ−１及びＩＧＦＢＰ−３と異なり、経時的に増加した。ベースラインｃＧＰ／ＩＧＦ−１モル比は、ベースラインから９０日目にかけて、ＮＩＨＳＳスコアにおける変化と相関した。特に、分散分析反復分析によると、脳卒中後、経時的に、ｃＧＰ濃度（Ｆ（２，２０）＝５．３４５、ｐ＝０．０１、ｎ＝２１、図１６Ｃ）及びｃＧＰ／ＩＧＦ−１モル比（Ｆ（２，２０）＝３．９４６、ｐ＝０．０２９、ｎ＝２１、図１６４Ｄ）における有意な増加が示された。ベースラインと比べて、ｃＧＰの濃度（ｐ＝０．０１４）及びｃＧＰ／ＩＧＦ−１比（ｐ＝０．０３１）が、９０日目までに有意に増加した。ＩＧＦ−１、ＩＧＦＢＰ−３の濃度及びＩＧＦ−１／ＩＧＦＢＰ−３モル比は、経時的に安定なままであった（図１６Ａ、Ｂ）。
【０１７４】
考察
この試験は、脳卒中発症後、短期的に（＜３日）、ｃＧＰ、ＩＧＦＢＰ−３の血漿濃度及びｃＧＰ／ＩＧＦ−１比が減少することを示しており、ＩＧＦ−１の自己分泌調節の障害を示唆している。次の９０日にわたり、脳卒中患者は、神経学的機能及び全身体障害における改善を示した。これは血漿ｃＧＰ及びｃＧＰ／ＩＧＦ−１比の漸増と並行している。ベースライン時により高いｃＧＰ／ＩＧＦ−１比を有する患者は、脳卒中後９０日目、神経学的機能におけるより良好な回復を来した。これらの結果は、脳卒中回復におけるＩＧＦ−１の自己分泌調節の役割を示唆してもよい。ｃＧＰ／ＩＧＦ−１比における急激な変化は、脳卒中回復を予測するための有望なバイオマーカーであってもよい。
【０１７５】
血漿中の生体利用可能なＩＧＦ−１の量は、ＩＧＦＢＰ−３及びｃＧＰにより集合的に調節される。ＩＧＦＢＰ−３の減少及びｃＧＰの増加により、生体利用可能なＩＧＦが増加しうる。年齢適合対照と比べて、ＩＧＦＢＰ−３及びｃＧＰの濃度は、ベースライン時、脳卒中患者において低下した。高血圧女性もまた、正常血圧女性と比べて、血漿ＩＧＦＢＰ−３及びｃＧＰの減少を示しており、心血管機能への関与を示唆している。脳卒中及び高血圧患者における血漿ＩＧＦＢＰ−３の減少は、生体利用可能なＩＧＦ−１を改善するための自己分泌応答である。血漿ｃＧＰの減少は、自己分泌調節の障害を示唆する。その結論はまた、ｃＧＰの投与により、ラットにおける虚血性脳障害が予防され、高血圧ラットにおける全身血圧が正常化するという観察結果によって支持される。血管保護におけるｃＧＰの機能は、インビボ及びインビトロ試験の双方により説明されている。有意でないが、上記試験における脳卒中患者のほぼ半数及び対照参加者のわずか１／４が高血圧であった。高血圧症は、脳卒中の主要なリスク因子であり、ＩＧＦ−１の自己分泌調節の障害は、高血圧症及び脳卒中によって共有される病態生理であってもよい。
【０１７６】
ｃＧＰは、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する能力を有する安定な小さい親油性環状ペプチドである。脳脊髄液（ＣＳＦ）中のｃＧＰの内因性濃度は、パーキンソン病患者の血漿中の場合の約５０％である。ｃＧＰ類似体の中枢取り込みは、ラットにおいて低酸素性−虚血性脳損傷後の最初の２時間で、＞１００％まで増強される。したがって、我々は、脳損傷が血漿からのｃＧＰの中枢取り込みを促進し、それ故、脳卒中の急性期の間、血漿ｃＧＰレベルを低下させたという可能性を排除することができなかった。
【０１７７】
この試験における大部分の患者が、９０日の追跡期間中、神経学的機能及び脳卒中の転帰における改善によって示される通り、経時的に部分的回復を来した。これらの臨床的改善は、経時的にｃＧＰ濃度及びｃＧＰ／ＩＧＦ−１比の増加と並行していた。血漿ＩＧＦ−１のバイオアベイラビリティの改善は、機能的回復に寄与することがある。ベースラインＮＩＨＳＳ及び年齢は、脳卒中回復に影響を及ぼす決定的要因である。それは、生物学的変化とこれらの交絡要因の可能性を伴う臨床成績との間の真の関係性を分析するために不可欠である。年齢及びベースラインＮＩＨＳＳスコアの調節との相関分析により、ベースライン時にｃＧＰ／ＩＧＦ−１モル比の増加を伴う患者が、脳卒中の９０日目に神経障害の低減を有し、脳卒中から９０日後に神経学的機能におけるより良好な回復を来すことが示された。
【０１７８】
対照群と比べて、脳卒中から３日後の患者において、血漿ＩＧＦ−１濃度の減少又は増加のいずれかが報告されている。血漿ＩＧＦ−１濃度における変化は、死亡率のみを予測するが、脳卒中患者の機能的回復は予測しない。この試験からの発明者の観察では、９０日の追跡期間中、ＩＧＦ−１濃度における変化は全く不明であった。この証拠は、血漿濃度ＩＧＦ−１における変化がＩＧＦ−１機能における信頼できる尺度でないという示唆を支持する。
【０１７９】
これらの有望な結果は、血漿中のｃＧＰに関連する変化がＩＧＦ−１機能に対する感受性バイオマーカーであることを示唆する。
【０１８０】
結論
低いｃＧＰ濃度及びｃＧＰ／ＩＧＦ−１比は、脳卒中におけるＩＧＦ−１の自己分泌調節の障害を示唆する。ｃＧＰ濃度及びｃＧＰ／ＩＧＦ−１比の増加は、３か月後の臨床的回復に関連してもよい。入院時のｃＧＰ／ＩＧＦ−１比は、より大規模な試験においてさらに確認される場合、脳卒中患者における回復を予測するためのバイオマーカーであってもよい。さらに、高血圧患者におけるｃＧＰ濃度の漸減もまた、脳卒中リスクに対するバイオマーカーであってもよい。
【０１８１】
非神経学的及び／又は神経学的状態のリスク及び回復を予測するための環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）バイオマーカーの臨床適用、並びにそれらを治療するためのブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）／ｃＧＰを含有する有機又は植物ベースの材料の濃縮抽出物の使用に関する方法の態様は、あくまで例として説明されており、本明細書中の特許請求の範囲の範囲から逸脱することなく、それらに対して修飾及び添加が実施されてもよいと理解されるべきではない。
【図１】
2020532587.tif 000010
【図２】
2020532587.tif 000011
【図３】
2020532587.tif 000012
【図４】
2020532587.tif 000013
【図５Ａ】
2020532587.tif 000014
【図５Ｂ】
2020532587.tif 000015
【図５Ｃ】
2020532587.tif 000016
【図６Ａ】
2020532587.tif 000017
【図６Ｂ】
2020532587.tif 000018
【図６Ｃ】
2020532587.tif 000019
【図６Ｄ】
2020532587.tif 000020
【図７Ａ】
2020532587.tif 000021
【図７Ｂ】
2020532587.tif 000022
【図７Ｃ】
2020532587.tif 000023
【図７Ｄ】
2020532587.tif 000024
【図７Ｅ】
2020532587.tif 000025
【図７Ｆ】
2020532587.tif 000026
【図８】
2020532587.tif 000027
【図９】
2020532587.tif 000028
【図１０】
2020532587.tif 000029
【図１１】
2020532587.tif 000030
【図１２】
2020532587.tif 000031
【図１３】
2020532587.tif 000032
【図１４】
2020532587.tif 000033
【図１５】
2020532587.tif 000034
【図１６】
2020532587.tif 000035
【手続補正書】
【提出日】令和1年6月28日(2019.6.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本明細書に記載されるのは、非神経学的及び／又は神経学的状態の疾患管理におけるＩＧＦ−１の機能分析、調節及びその適用に関する改善である。より詳細には、ＩＧＦ−１機能障害を伴う非神経学的及び／又は神経学的状態のリスク及び回復を予測するための環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）バイオマーカーの臨床適用、並びにそれらを治療するための有機又は植物ベースの材料、例えばブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）の濃縮抽出物を含有するｃＧＰの使用についての方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）は、内分泌ホルモンとして生成されるタンパク質である。それは、成長ホルモンの効果の一次メディエーターであり、身体内のほぼすべての細胞における体成長を刺激する。成長効果に加えて、ＩＧＦ−１はまた、神経細胞及び細胞ＤＮＡ合成を調節しうる。
【０００３】
それはまた、向神経性因子であり、認知機能などの種々の神経機能において決定的役割を担う。ＩＧＦ−１は、一生を通じて生成されるが、幼仔期（特に新生仔）に最も低く、成体期の間に増加し、年齢とともに低下する。ＩＧＦ−１機能の測定は、加齢に伴う認知減退のバイオマーカーであってもよく、さらに薬剤治療などの介入が有用なことがあるか否かについての、及びかかる治療をいつ開始すべきかについての理解を支援するために用いられてもよい。
【０００４】
しかし、血漿ＩＧＦ−１濃度は、ＩＧＦ−１の直接的測定が、ある程度の信頼度で使用できないような矛盾した結果をもたらすことから、歴史的にはＩＧＦ−１機能に対して不十分なバイオマーカーであった。歴史的使用は、例えば成長ホルモン欠乏及び異常な成長パターンについてのスクリーニング試験として血液中のＩＧＦ−１について検査するためであってもよいが、その結果は、主に総ＩＧＦ−１の指針であり、活性ＩＧＦ−１に特異的な尺度ではない。
【０００５】
直接的なＩＧＦ−１測定から得られる矛盾した結果が、不活性であるインビボでのＩＧＦ−１の大部分に起因することがあると理解される。それは主要な活性部分である。血漿中では、ＩＧＦ−１の９５％超が、ＩＧＦ結合タンパク質−３（ＩＧＦＢＰ−３）に結合し、ＩＧＦ結合タンパク質−３は、一旦結合されると、ＩＧＦ−１機能的受容体の活性化を阻止する。したがって、ＩＧＦ−１が直接的に測定されると、活性型と不活性型との間に差がなく、それ故、活性部分が目的のバイオマーカーであるとして、インビボでのＩＧＦ−１の真の活性量についての知見は得られない。
【０００６】
ＩＧＦ−１／ＩＧＦＢＰ−３の比は、非結合の生理活性ＩＧＦ−１を示すための代替物として用いられてもよいが、実際、ＩＧＦＢＰ−３の大部分がＩＧＦ−１に結合しないことから、この比はいずれにしても明確な指標を提供しない。
【０００７】
理解されているかもしれないが、ＩＧＦ−１の代替的尺度は、ＩＧＦ−１機能を追跡し、ひいてはこの尺度を患者の健康のバイオマーカーとして用いるための手段として有利であってもよい。例えば、ＩＧＦ−１の代謝産物である環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）は、血漿中のＩＧＦ−１のバイオアベイラビリティを改善／正常化することを通じて神経保護的である。
【０００８】
ＩＧＦ−１レベルを理解することに対応し、そこで患者の自然免疫及び修復系をそれらのＩＧＦ−１活性部分を増加させることによって調節又は支持することが所望されてもよい。
【０００９】
さらに、ＩＧＦ−１が種々の動物機能（多くの中の１つが神経変性機能）に密接に関連することから、それに関連した変化を測定するための方法と、様々な関連状態を治療する、改善する又はそれにおける治癒を促進するための方法の双方が有用なことがある。
【００１０】
ヒト身体は、それ自身を損傷及び疾病から保護する能力を有し、例えば、我々のホルモン系がより活性化する。しかし、我々の回復を支援する能力は、特に高齢者においては加齢に伴うホルモンの減少に起因し、十分な回復を達成するのに常に有効とは限らない。脳卒中は、若年者及び高齢者集団に生じる。若年脳卒中患者がより迅速且つより良好な回復を来すことができる一方で、年配患者からの回復は緩徐且つ不良でありうる。ＩＧＦ−１機能はまた、脳卒中の回復にとって重要である。したがって、脳卒中におけるＩＧＦ−１機能に対する信頼できるバイオマーカーが脳卒中又は他の神経学的状態の予後に用いられてもよく、さらに脳卒中の回復能力を予測する方法を個別患者に対する臨床管理を設計することに役立ててもよい。しかし、上記の通り、血漿ＩＧＦ−１又はＩＧＦ−１／ＩＧＦ結合タンパク質−３（ＩＧＦＢＰ−３）比は、信頼できるバイオマーカーでない。したがって、脳卒中患者の自発的回復及びそれらの治療方法を支援するため、ＩＧＦ−１機能に対する有望なバイオマーカーを見出すことが有用となろう。
【００１１】
年齢関連状態として、パーキンソン病（ＰＤ）は、２番目に一般的な神経変性状態である。インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）は、神経栄養因子であり、神経生存及び脳機能の維持における本質的役割を担う。循環ＩＧＦ−１の増加及びＩＧＦ−１機能の障害によって特徴づけられるＩＧＦ−１抵抗性は、ＰＤ患者における神経障害及び認知減退に関連することが報告されている。上記の通り、血清中のＩＧＦ−１濃度における変化が、ＰＤにおける予後及び治療応答を監視するのに用いられる、ＩＧＦ−１機能障害に対するバイオマーカーとして用いられているが、これはさらに議論の余地がある。ベリーフルーツの高消費が、ＰＤのリスク低下に関連することが報告されているが、この推定上の利益の根底にある機構は未知のままである。
【００１２】
ＩＧＦ−１機能障害に起因する非神経学的及び／又は神経学的状態のＩＧＦ−１機能の分析、調節及び疾患管理に関する改善のさらなる態様及び利点は、あくまで例示される後述の説明から明白となろう。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
概要
ＩＧＦ−１機能障害を伴う非神経学的及び／又は神経学的状態のリスク及び回復を予測するための環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）プラズマバイオマーカーの臨床適用、並びにそれらを治療するためのブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）の濃縮抽出物などのｃＧＰを含有する有機又は植物ベースの材料の使用に関する方法が本明細書に記載される。この方法では、より正確には、ｃＧＰ及びｃＧＰ／ＩＧＦ−１比（ひいては活性ＩＧＦ−１濃度）を調節するための手段、及びベースラインデータの標準セットと比べてのｃＧＰレベルの低下又は低減を有する個体に対する具体的治療方法とともに、ｃＧＰ及びｃＧＰ／ＩＧＦ−１比を用いて間接的にインビボでＩＧＦ−１機能を測定する。
【００１４】
第１の態様では、動物におけるＩＧＦ−１機能障害に関連した非神経学的及び／又は神経学的状態を治療する方法であって、
ａ）動物から生物学的検体を得るステップと；
ｂ）生物学的検体中での活性濃度依存性のインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）のバイオアベイラビリティに対するプラズマバイオマーカーとしての環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）の濃度を測定するステップと；
ｃ）生物学的検体中の測定されたｃＧＰ濃度及び／又はｃＧＰ濃度のＩＧＦ−１総測定量に対する比のいずれかを標準と比較することで、結果の連続体の中で、測定されたｃＧＰ濃度及び／又はｃＧＰ濃度のＩＧＦ−１総測定量に対する比が個体のＩＧＦ−１機能を評価するための相対標準に一致するか否かを確認するステップと；
ｄ）ブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）の濃縮抽出物を治療有効量で動物に投与し、
動物におけるｃＧＰの濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対する比における減少を阻止し；及び／又は
動物における既存のｃＧＰの濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対する比を維持し；及び／又は
動物におけるｃＧＰの濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対する比を増加させるステップと、
を含む、方法が提供される。
【００１５】
第２の態様では、改変されたＩＧＦ−１機能を有するプラズマバイオマーカーとして環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）を利用して、動物における加齢に伴う非神経学的及び／又は神経学的状態のリスクを予測する方法であって、
ａ）動物から生物学的検体を得るステップと；
ｂ）動物の第１設定年齢時、又は神経学的状態の初期段階、又はブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）の濃縮抽出物の治療有効量での動物に対する処置前に、生物学的検体中での活性濃度依存性のインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）のバイオアベイラビリティに対するプラズマバイオマーカーとしての環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）の濃度を測定するステップと；
ｃ）動物のさらなる設定年齢間隔又は非神経学的及び／又は神経学的状態のさらなる段階、又はブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）の濃縮抽出物の治療有効量での動物に対する処置後に、生物学的検体中での活性濃度依存性のインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）のバイオアベイラビリティに対する環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）プラズマバイオマーカーの濃度を再測定するステップと；
ｄ）第１の設定年齢に対する設定年齢間隔、又はＩＧＦ−１機能障害を伴う非神経学的及び／又は神経学的状態の初期段階、又はブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）の濃縮抽出物の治療有効量での動物に対する処置前、生物学的検体中での測定されたｃＧＰ濃度及び／又はｃＧＰ濃度のＩＧＦ−１総測定量に対する比のいずれかを比較することで、結果の連続体の中で、測定されたｃＧＰ濃度及び／又はｃＧＰ濃度のＩＧＦ−１総測定量に対する比において変化があるか否かを確認し、それにより動物における認知減退からの非神経学的及び／又は神経学的状態の発生リスクがベースラインデータの標準セットと比べて増加しているか否かを判定するステップと、
を含み、ここで前記測定された比が、ＢＣＡ処置についての個別患者及びそこでのＢＣＡ処置に適した用量を選択するために用いられる、方法が提供される。
【００１６】
第３の態様では、ＩＧＦ−１機能に対するプラズマバイオマーカーとしての環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）を利用して、ＩＧＦ−１機能障害を伴う非神経学的及び／又は神経学的状態を有する動物の自発的回復を予測する方法であって、
ａ）動物から生物学的検体を得るステップと；
ｂ）非神経学的及び／又は神経学的状態の発症からの動物のベースライン時（＜７２時間）に生物学的検体中での活性濃度依存性のインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）のバイオアベイラビリティに対する環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）プラズマバイオマーカーの濃度を測定するステップと、
ｃ）動物の回復中のさらなる規則的間隔で、生物学的検体中での活性濃度依存性のインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）のバイオアベイラビリティに対する環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）プラズマバイオマーカーの濃度を再測定するステップと、
ｄ）さらなる設定間隔でのベースラインからの動物の機能的回復を評価するステップと、
を含み、ここで、動物におけるより高いベースラインｃＧＰ濃度、より陽性の予後が機能的回復の評価に基づくように、データの連続体からのＣＧＰのベースライン濃度から、動物の非神経学的及び／又は神経学的状態の回復の短期転帰が予測される、方法が提供される。
【００１７】
第４の態様では、動物におけるｃＧＰの濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対する比における減少を阻止し；及び／又は
動物における既存のｃＧＰの濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対する比を維持し；及び／又は
動物におけるｃＧＰの濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対する比を増加させるための、製剤化される薬剤の製造におけるブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）の濃縮抽出物の使用が提供される。
【００１８】
第５の態様では、それを必要とする患者における非神経学的及び／又は神経学的状態の影響を改善し、及び／又はそれらを治療するための、経口投与用に製剤化される薬剤の製造におけるブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）の濃縮抽出物の使用が提供される。
【００１９】
第６の態様では、動物におけるｃＧＰの濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対する比における減少を阻止し；及び／又は
動物における既存のｃＧＰの（正常／生理学的）濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対する比を維持し；及び／又は
動物におけるｃＧＰの濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対する比を増加させる又は正常化するための、動物への投与用に製剤化される濃縮されたブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）を治療有効量で含む抽出物が提供される。
【００２０】
第７の態様では、それを必要とする患者における高血圧症及び／又は脳卒中の影響を改善し；及び／又は高血圧症及び／又は脳卒中を治療し；及び／又は高血圧症及び／又は脳卒中に関連する症状を低減するための方法であって、ブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）の濃縮抽出物を治療有効量で投与することを含む、方法が提供される。
【００２１】
第８の態様では、それを必要とする患者におけるパーキンソン病若しくはパーキンソン病に関連する症状、若しくは認識機能障害に伴う合併症の影響を改善し、及び／又はそれらを治療するための方法であって、ブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）の濃縮抽出物を治療有効量で投与することを含む、方法が提供される。
【００２２】
第９の態様では、動物におけるＩＧＦ−１機能障害に関連した非神経学的及び／又は神経学的状態を治療する方法であって、
ａ）動物から生物学的検体を得るステップと；
ｂ）生物学的検体中での活性濃度依存性のインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）のバイオアベイラビリティに対する環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）プラズマバイオマーカーの濃度を測定するステップと；
ｃ）生物学的検体中での測定されたｃＧＰ濃度及び／又はｃＧＰ濃度のＩＧＦ−１総測定量に対する比のいずれかを標準と比較することで、結果の連続体の中で、測定されたｃＧＰ濃度及び／又はｃＧＰ濃度のＩＧＦ−１総測定量に対する比が個体のＩＧＦ−１機能を評価するための相対標準に一致するか否かを確認するステップと
ｄ）ｃＧＰを含有する有機又は植物ベースの材料の濃縮抽出物を治療有効量で動物に投与し、
動物におけるｃＧＰの濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対する比における減少を阻止し；及び／又は
動物における既存のｃＧＰの濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対する比を維持し；及び／又は
動物におけるｃＧＰの濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対する比を増加させるステップと、
を含む、方法が提供される。
【００２３】
第１０の態様では、改変されたＩＧＦ−１機能を有するプラズマバイオマーカーとして環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）を利用して、動物における加齢に伴う非神経学的及び／又は神経学的状態のリスクを予測する方法であって、
ａ）動物から生物学的検体を得るステップと；
ｂ）動物の第１設定年齢時、又は非神経学的及び／又は神経学的状態の初期段階、又はｃＧＰを含有する有機又は植物ベースの材料の濃縮抽出物の治療有効量での動物に対する処置前に、生物学的検体中での活性濃度依存性のインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）のバイオアベイラビリティに対する環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）プラズマバイオマーカーの濃度を測定するステップと；
ｃ）動物のさらなる設定年齢間隔又は非神経学的及び／又は神経学的状態のさらなる段階、又はｃＧＰを含有する有機又は植物ベースの材料の濃縮抽出物の治療有効量での動物に対する処置後に、生物学的検体中での活性濃度依存性のインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）のバイオアベイラビリティに対する環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）プラズマバイオマーカーの濃度を再測定するステップと；
ｄ）第１の設定年齢に対する設定年齢間隔、又は非神経学的及び／又は神経学的状態の初期段階、又はｃＧＰを含有する有機又は植物ベースの材料の濃縮抽出物の治療有効量での動物に対する処置前、生物学的検体中での測定されたｃＧＰ濃度及び／又はｃＧＰ濃度のＩＧＦ−１総測定量に対する比のいずれかを比較することで、結果の連続体の中で、測定されたｃＧＰ濃度及び／又はｃＧＰ濃度のＩＧＦ−１総測定量に対する比において変化があるか否かを確認し、それにより動物における認知減退からの非神経学的及び／又は神経学的状態の発生リスクがベースラインデータの標準セットと比べて増加しているか否かを判定するステップと、
を含み、ここで前記測定された比が、ｃＧＰを含有する有機又は植物ベースの材料での処置についての個別患者及びそこでのｃＧＰを含有する有機又は植物ベースの材料での処置に適した用量を選択するために用いられる、方法が提供される。
【００２４】
第１１の態様では、動物におけるｃＧＰの濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対する比における減少を阻止し；及び／又は
動物における既存のｃＧＰの濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対する比を維持し；及び／又は
動物におけるｃＧＰの濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対する比を増加させるための、製剤化される薬剤の製造におけるｃＧＰを含有する有機又は植物ベースの材料の濃縮抽出物の使用が提供される。
【００２５】
第１２の態様では、それを必要とする患者における非神経学的及び／又は神経学的状態の影響を改善し、及び／又はそれらを治療するための、経口投与用に製剤化される薬剤の製造におけるｃＧＰを含有する有機又は植物ベースの材料の濃縮抽出物の使用が提供される。
【００２６】
第１３の態様では、動物におけるｃＧＰの濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対する比における減少を阻止し；及び／又は
動物における既存のｃＧＰの（正常／生理学的）濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対する比を維持し；及び／又は
動物におけるｃＧＰの濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対する比を増加させる又は正常化するための、動物への投与用に製剤化されるｃＧＰを含有する有機又は植物ベースの材料の濃縮抽出物を治療有効量で含む抽出物が提供される。
【００２７】
第１４の態様では、それを必要とする患者における高血圧症及び／又は脳卒中の影響を改善し；及び／又は高血圧症及び／又は脳卒中を治療し；及び／又は高血圧症及び／又は脳卒中に関連する症状を低減するための方法であって、ｃＧＰを含有する有機又は植物ベースの材料の濃縮抽出物を治療有効量で投与することを含む、方法が提供される。
【００２８】
第１５の態様では、それを必要とする患者におけるパーキンソン病若しくはパーキンソン病に関連する症状、若しくは認識機能障害に伴う合併症の影響を改善し、及び／又はそれらを治療するための方法であって、ｃＧＰを含有する有機又は植物ベースの材料の濃縮抽出物を治療有効量で投与することを含む、方法が提供される。
【００２９】
上記の利点は、変化することがある。バイオマーカーについては、上記のようなｃＧＰは、ＩＧＦ−１の安定な代謝産物であり、発明者の研究に基づくと、動物から採取される生物学的検体中で容易に測定される。ｃＧＰは、活性型と不活性型とを識別するという観点からＩＧＦ−１と同様の可変性を有しないことから、総ＩＧＦ−１を測定するよりも信頼できる。ｃＧＰにおける変化を測定し、及び／又は神経学的状態に対処する上記の方法については、信頼できるバイオマーカーとしての環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）の臨床適用の利点により、治療に適した患者及び個別の投与計画の選択が可能になる。ｃＧＰの増加は、神経学的状態のリスクを示し、ｃＧＰの減少は、神経学的状態の段階を示す。有利には、治療に適した患者は、それらのｃＧＰレベルに基づいて選択されてもよく、ｃＧＰレベルの変化は、適合又は個別化された治療投与計画について容易に監視されうる。ＢＣＡの投与計画及び／又はｃＧＰを含有する有機又は植物ベースの材料の抽出を調節することにより、非神経学的及び／又は神経学的状態の効果的治療が可能になり、ひいては長期回復（３か月超）及び非神経学的及び／又は神経学的状態に伴う長期合併症（認識機能障害）の予防が改善される。さらなる利点は、ｃＧＰレベルが分析を容易にするために尿サンプルを測定することにより容易に監視されうることであり、将来的にＢＣＡ／有機植物抽出物を含有するｃＧＰの大規模臨床試験にとって重大な意義を持つ。
【００３０】
かかる測定可能な公知の方法でのブラックカラントの使用は、当該技術分野で公知でないか又は完成されていない。ブラックカラントジュース又はブラックカラントの他の形態（上記の抽出物でない）は、現在実現可能であり且つ本明細書に記載されるような公知の測定可能な方法で用いられていない。脳卒中及びパーキンソン病の知見は、有意且つ測定可能な利益を患者に提供するだけでなく、潜在的に既存の技術による治療に干渉しないか又は望まれない副作用を引き起こさないことがあり得る、ブラックカラントについての新規の又は少なくとも代替的な使用を特に示している。さらに、一般に天然生成物及びそれに関連する生理活性化合物については、本明細書に記載の方法及び使用は、治療に介入することが適切であるときを認識するための独自の方法を提供し、さらに治療の奏功又はそれ以外を評価するための方法を提供する。タイミング及び有効性へのこの洞察は、多数の薬剤に望まれるようなことであり、生理活性化合物を含有する天然生成物中に共通に観察されることではない。
【００３１】
図面の簡単な説明
ＩＧＦ−１機能障害を伴う非神経学的及び神経学的状態のリスク及び回復を予測するための環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）プラズマバイオマーカーの臨床適用、並びにそれらを治療するためのブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）の濃縮抽出物などのｃＧＰを含有する有機又は植物ベースの材料の使用に関する方法のさらなる態様は、以下の添付の図面に対する参照とともに、あくまで例として示される以下の説明から明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】ＢＣＡにおけるｃＧＰの用量依存的増加を示す。データは、平均±ＳＥＭ、ｐ＜０．０００１として提示される。
【図２Ａ】ブラックカラント抽出物の添加前及び添加後における患者のＣＳＦサンプル中でのｃＧＰの変化を図示するグラフを示す。データは、平均±ＳＥＭ、ｐ＜０．０１として提示される。
【図２Ｂ】ブラックカラント抽出物の添加前及び添加後における患者のＣＳＦサンプル中でのＩＧＦ−１の変化を図示するグラフを示す。ＩＧＦ−１濃度において統計学的差異が認められた。データは、平均±ＳＥＭ、ｐ＜０．０１として提示される。
【図２Ｃ】ブラックカラント抽出物の添加前及び添加後における患者のＣＳＦサンプル中でのｃＧＰ／ＩＧＦ−１の比の変化を図示するグラフを示す。ｃＧＰ／ＩＧＦ−１比において統計学的差異が認められた。データは、平均±ＳＥＭ、ｐ＜０．０１として提示される。
【図３Ａ】ＢＣＡの添加後における血漿中でのｃＧＰの変化を図示するグラフを示す。ｃＧＰ濃度において統計学的変化が認められなかった。データは、平均±ＳＥＭとして提示される。
【図３Ｂ】ＢＣＡの添加後における血漿中でのＩＧＦ−１の変化を図示するグラフを示す。ＩＧＦ−１濃度において統計学的変化が認められなかった。データは、平均±ＳＥＭとして提示される。
【図３Ｃ】ＢＣＡの添加後における血漿中でのｃＧＰ／ＩＧＦ−１の比の変化を図示するグラフを示す。ｃＧＰ／ＩＧＦ−１比において統計学的変化が認められなかった。データは、平均±ＳＥＭとして提示される。
【図４Ａ】ＣＳＦ  ｃＧＰと血漿ｃＧＰ濃度との間の相関を図示するグラフを示す。ＣＳＦ  ｃＧＰの濃度は、血漿ｃＧＰと有意に相関する（Ａ、ｒ＝０．６８、ｐ＝０．０１４）。
【図４Ｂ】ＣＳＦ  ＩＧＦ−１と血漿ＩＧＦ−１濃度との間の相関を図示するグラフを示す。ＩＧＦ−１濃度は、ＣＳＦと血漿との間で相関しなかった。
【図４Ｃ】ＣＳＦ  ｃＧＰとＣＳＦ  ＩＧＦ−１濃度との間の相関を図示するグラフを示す。ＣＳＦ中のｃＧＰとＩＧＦ−１濃度との間で相関が認められなかった。
【図４Ｄ】血漿ｃＧＰと血漿ＩＧＦ−１濃度との間の相関を図示するグラフを示す。血漿中のｃＧＰとＩＧＦ−１濃度との間で相関が認められなかった。
【図４Ｅ】ＣＳＦ  ｃＧＰと血漿ｃＧＰ／ＩＧＦ−１モル比との間の相関を図示するグラフを示す。ＣＳＦ  ｃＧＰの濃度は、血漿ｃＧＰ／ＩＧＦ−１比と有意に相関する（Ｅ、ｒ＝０．６６、ｐ＝０．０１６）。ｃＧＰ／ＩＧＦ−１比はまた、血漿ｃＧＰ濃度と相関する（Ｆ、ｒ＝０．９、ｐ＜０．００１）。
【図５Ａ】７０歳未満の群（＜７０、黒色バー）と比べて、年配群（＞＝７０、灰色バー）におけるＩＧＦ−１は減少した。データは、平均±ＳＥＭ及びｐ＜０．０５として提示される。
【図５Ｂ】年齢に伴うｃＧＰの測定された変化を示すグラフを図示する。７０歳未満の群（＜７０、黒色バー）と比べて、年配群（＞＝７０）におけるｃＧＰ濃度は増加した。データは、平均±ＳＥＭ及びｐ＜０．０５として提示される。
【図５Ｃ】年齢に伴うｃＧＰ／ＩＧＦ−１の測定された変化を示すグラフを図示する。７０歳未満の群（＜７０、黒色バー）と比べて、年配群（＞＝７０）におけるｃＧＰ／ＩＧＦ−１比は増加した。データは、平均±ＳＥＭ及びｐ＜０．０５として提示される。
【図６Ａ】正常対照（脳卒中なし）と（図１５で提示される最新データと相関する）脳卒中患者のベースラインレベルとの間でのＩＧＦ−１の測定された変化を示すグラフを図示する。
【図６Ｂ】正常対照（脳卒中なし）と（図１５で提示される最新データと相関する）脳卒中患者のベースラインレベルとの間でのＩＧＦＢＰ−３の測定された変化を示すグラフを図示する。
【図６Ｃ】正常対照（脳卒中なし）と（図１５で提示される最新データと相関する）脳卒中患者のベースラインレベルとの間でのｃＧＰの測定された変化を示すグラフを図示する。
【図６Ｄ】正常対照（脳卒中なし）と（図１５で提示される最新データと相関する）脳卒中患者のベースラインレベルとの間でのｃ−ＧＰ／ＩＧＦ−１比の測定された変化を示すグラフを図示する。
【図７Ａ】試験の脳卒中患者が、神経学的スコアにおける有意な減少を示すことにより、３か月にわたる回復を来したことを示すグラフを図示する。
【図７Ｂ】血漿ｃＧＰにおける増加への傾向が認められた。
【図７Ｃ】（図１６で提示される最新データと相関する）脳卒中回復の期間にわたるＩＧＦ−１における変化は認められなかった。
【図７Ｄ】（図１６で提示される最新データと相関する）脳卒中回復の期間にわたるＩＧＦＢＰ−３における変化は認められなかった。
【図７Ｅ】ｃＧＰ／ＩＧＦ−１比における増加への傾向が認められた。
【図７Ｆ】ベースラインｃＧＰ濃度は、脳卒中の回復と相関する。
【図８Ａ】尿分析から収集されたデータを示す。年齢適合対照と脳卒中との間での尿中のｃＧＰの差異は、血漿サンプルにおいて認められた場合と類似する。
【図８Ｂ】尿分析から収集されたデータを示す。予想通り、ベースラインと比べて、後の時点における尿ｃＧＰの増加への傾向が認められ、時点測定値における尿と血漿の間での差異もまた有意でなかった。
【図８Ｃ】尿分析から収集されたデータを示す。尿中のｃＧＰ濃度は、血漿ｃＧＰ濃度と有意な相関を有した（ｒ＝０．５９、ｐ＜０．０１）。
【図８Ｄ】尿分析から収集されたデータを示す。尿中のｃＧＰ濃度は、ｃＧＰ／ＩＧＦ−１比と有意な相関を有した（ｒ＝０．６３、ｐ＜０．００１）。
【図９】高齢者における尿ｃＧＰで認められた変化を示す。尿中のｃＧＰ濃度は、高齢者の順に有意に増加する。
【図１０Ａ】尿中（図１０Ｂ）でなく血漿中（図１０Ａ）のベースラインｃＧＰの変化が回復に関連したことを示す（ΔｍＲＳ：ｍＲＳベース−３か月）（ｒ＝−０．６３０、ｐ＝０．００３、図１０）。
【図１０Ｂ】尿中（図１０Ｂ）でなく血漿中（図１０Ａ）のベースラインｃＧＰの変化が回復に関連したことを示す（ΔｍＲＳ：ｍＲＳベース−３か月）（ｒ＝−０．６３０、ｐ＝０．００３、図１０）。
【図１１】４つの異なる濃度（１、５、２５及び１００ｍｇ／水）における、ブラックカラント、クランベリー、ビートルート、ブラックエルダーベリー及びＢＨＣ複合体（ビルベリー及びセイヨウトチノキ）から選択されたベリーフルーツ中のｃ−ＧＰ濃度（含量）の結果を示す。
【図１２】陽性対照としてのＢＣＡの用量範囲内でのｃＧＰ濃度の追加的分析としてのベリーフルーツサンプルからのデータを示す。ｃＧＰ濃度は、１００ｍｇのＢＣＡ（対照）中で２７ｎｇ、１００ｍｇのビルベリー中で４６．７、１００ｍｇ（１０ｎｇ／ｍｇ）の新規に配合されたＢＣＡ中で１００ｎｇである。
【図１３】Vitalityによって提供された製品サンプルの、それらのｃＧＰ濃度を測定するためのさらなる分析からの結果を示す。Vitalityによって提供された製品サンプル（ＢＣ抽出物China-47、NZBCジュース濃縮物（Ｔ１８０２１２及びＴ１８０１１５）、アレパ抽出物、Enzogenol、タルトチェリー、紫小麦、紫人参及びビートルートというラベル）の４つの異なる濃度（１、５、２５及び１００ｍｇ／水）における分析からの結果。上で３０ｎｇ／ｍｇを用いて試験された最初のVitalityのＢＣＡサンプルが陽性対照として用いられた。
【図１４Ａ】神経学的スコア（ＮＩＨＳＳ）における有意な減少を示すことにより、試験の脳卒中患者が３、７及び９０日から各々回復を来したことを示すグラフを図示する。
【図１４Ｂ】神経学的スコア（ｍＲＳ）における有意な減少を示すことにより、試験の脳卒中患者が３、７及び９０日から各々回復を来したことを示すグラフを図示する。
【図１４Ｃ】ＦＭスコアにおける改善を示すことにより、試験の脳卒中患者が３、７及び９０日から各々回復を来したことを示すグラフを図示する。
【図１５Ａ】正常対照（脳卒中なし）と３日未満の脳卒中患者のベースラインレベルとの間でのＩＧＦ−１の測定された変化を示すグラフを図示する。
【図１５Ｂ】正常対照（脳卒中なし）と３日未満の脳卒中患者のベースラインレベルとの間でのＩＧＦＢＰ−３の測定された変化を示すグラフを図示する。
【図１５Ｃ】正常対照（脳卒中なし）と３日未満の脳卒中患者のベースラインレベルとの間でのｃＧＰの測定された変化を示すグラフを図示する。
【図１５Ｄ】正常対照（脳卒中なし）と３日未満の脳卒中患者のベースラインレベルとの間でのｃ−ＧＰ／ＩＧＦ−１比の測定された変化を示すグラフを図示する。
【図１６Ａ】３日未満、７日及び９０日各々の脳卒中患者のＩＧＦ−１の測定された変化を示すグラフを図示する。
【図１６Ｂ】３日未満、７日及び９０日各々の脳卒中患者のＩＧＦＢＰ−３の測定された変化を示すグラフを図示する。
【図１６Ｃ】３日未満、７日及び９０日各々の脳卒中患者のｃＧＰの測定された変化を示すグラフを図示する。
【図１６Ｄ】３日未満、７日及び９０日各々の脳卒中患者のｃ−ＧＰ／ＩＧＦ−１比の測定された変化を示すグラフを図示する。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
詳細な説明
上記の通り、非神経学的及び神経学的状態のリスク及び回復を予測するための環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）プラズマバイオマーカーの臨床適用に関する方法、並びにそれらを治療するためのブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）の濃縮抽出物などのｃＧＰを含有する有機又は植物ベースの材料の使用が本明細書に記載される。この方法では、ｃＧＰ及びｃＧＰ／ＩＧＦ−１比（ひいては活性ＩＧＦ−１濃度）を調節するための手段、及びｃＧＰレベルの、ベースラインデータの標準セットと比べての低下又は低減を有する個体に対する特定の治療方法とともに、ｃＧＰ及びｃＧＰ／ＩＧＦ−１ＢＰ３比を間接的に用いて、インビボでＩＧＦ−１がより正確に測定される。
【００３４】
本明細書を対象として、用語「約（about）」又は「約（approximately）」及びその文法的変形は、参照としての量（quantity）、レベル、程度、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量（amount）、重量又は長さに対して、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１％だけ変化する量（quantity）、レベル、程度、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量（amount）、重量又は長さを意味する。
【００３５】
用語「実質的に」又はその文法的変形は、少なくとも約５０％、例えば、７５％、８５％、９５％又は９８％を指す。
【００３６】
用語「含む（comprise）」及びその文法的変形は、包括的意味を有するものとする、即ち、それはそれが直接的に参照する列挙成分だけでなく、他の非特定の成分又は要素を包含することを意味するように解釈されることになる。
【００３７】
ブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）という用語は、本明細書及び特許請求の範囲の全体を通じてブラックカラントの抽出物であると理解されるべきであり、ＢＣＡは、ブラックカラント濃縮物及び／又は還元果汁と互換的に置き換えられてもよい。さらに、ＢＣＡ抽出物及び／又は濃縮物は、アントシアニンが存在するか否かと無関係に、ｃＧＰの供給源又は担体であってもよい。
【００３８】
第１の態様では、動物における非神経学的及び／又は神経学的状態を治療する方法であって、
ａ）動物から生物学的検体を得るステップと；
ｂ）生物学的検体中での活性濃度依存性のインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）のバイオアベイラビリティに対する環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）プラズマバイオマーカーの濃度を測定するステップと；
ｃ）生物学的検体中の測定されたｃＧＰ濃度及び／又はｃＧＰ濃度のＩＧＦ−１総測定量に対する比のいずれかを標準と比較することで、結果の連続体の中で、測定されたｃＧＰ濃度及び／又はｃＧＰ濃度のＩＧＦ−１総測定量に対する比が個体のＩＧＦ−１機能を評価するための相対標準に一致するか否かを確認するステップと；
ｄ）ブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）の濃縮抽出物を治療有効量で動物に投与し、
動物におけるｃＧＰの濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対する比における減少を阻止し；及び／又は
動物における既存のｃＧＰの濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対する比を維持し；及び／又は
動物におけるｃＧＰの濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対する比を増加させるステップと、
を含む、方法が提供される。
【００３９】
第２の態様では、改変されたＩＧＦ−１機能を有するプラズマバイオマーカーとしての環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）を利用して、動物における加齢に伴う非神経学的及び／又は神経学的状態のリスクを予測する方法であって、
ａ）動物から生物学的検体を得るステップと；
ｂ）動物の第１設定年齢時、又は神経学的状態の初期段階、又はブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）の濃縮抽出物の治療有効量での動物に対する処置前に、生物学的検体中での活性濃度依存性のインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）のバイオアベイラビリティに対する環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）プラズマバイオマーカーの濃度を測定するステップと；
ｃ）動物のさらなる設定年齢間隔又は非神経学的及び／又は神経学的状態のさらなる段階、又はブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）の濃縮抽出物の治療有効量での動物に対する処置後に、生物学的検体中での活性濃度依存性のインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）のバイオアベイラビリティに対する環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）プラズマバイオマーカーの濃度を再測定するステップと；
ｄ）第１の設定年齢に対する設定年齢間隔、又は神経学的状態の初期段階、又はブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）の濃縮抽出物の治療有効量での動物に対する処置前、生物学的検体中での測定されたｃＧＰ濃度及び／又はｃＧＰ濃度のＩＧＦ−１総測定量に対する比のいずれかを比較することで、結果の連続体の中で、測定されたｃＧＰ濃度及び／又はｃＧＰ濃度のＩＧＦ−１総測定量に対する比において変化があるか否かを確認し、それにより動物における認知減退からの非神経学的及び／又は神経学的状態の発生リスクがベースラインデータの標準セットと比べて増加しているか否かを判定するステップと、
を含み、ここで前記測定された比が、ＢＣＡ処置についての個別患者及びそこでのＢＣＡ処置に適した用量を選択するために用いられる、方法が提供される。
【００４０】
第３の態様では、ＩＧＦ−１機能に対するプラズマバイオマーカーとしての環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）を利用して、非神経学的及び／又は神経学的状態を有する動物の自発的回復を予測する方法であって、
ａ）動物から生物学的検体を得るステップと；
ｂ）非神経学的及び／又は神経学的状態の発症からの動物のベースライン時（＜４８時間）の生物学的検体中での活性濃度依存性のインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）のバイオアベイラビリティに対する環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）プラズマバイオマーカーの濃度を測定するステップと、
ｃ）動物の回復中のさらなる規則的間隔で、生物学的検体中での活性濃度依存性のインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）のバイオアベイラビリティに対する環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）プラズマバイオマーカーの濃度を再測定するステップと、
ｄ）ベースラインからさらなる設定間隔での動物の機能的回復を評価するステップと、
を含み、ここで、動物におけるより高いベースラインｃＧＰ濃度、より陽性の予後が機能的回復の評価に基づくように、データの連続体からのＣＧＰのベースライン濃度から動物の神経学的状態の回復の短期転帰が予測される、方法が提供される。
【００４１】
環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）は、非結合及び生理活性ＩＧＦ−１により天然に形成される安定な断片である。ｃＧＰは、ＩＧＦＢＰ−３の結合形態に対するＩＧＦ−１の不活性化と濃度依存的様式で競合する。発明者は、ｃＧＰが、上記の濃度依存的様式での不活性化の結果として、活性ＩＧＦ−１の量と強力に相関するような測定可能で信頼できるプラズマバイオマーカーであることを見出している。即ち、ｃＧＰ濃度を測定することによる活性ＩＧＦ−１機能の存在又はそれ以外が、可変の直接的なＩＧＦ−１の測定結果に対する信頼性に代わるものとして測定されうる。
【００４２】
発明者の研究は、ｃＧＰの濃度が高まると、上記の濃度依存的様式を通じてＩＧＦ−１がＩＧＦＢＰ−３から一層遊離することになり、ひいては生体利用可能なＩＧＦ−１の増加をもたらすことを示している。
【００４３】
直接的なｃＧＰ測定に加えて、発明者はまた、ＩＧＦ−１に対するｃＧＰの相対濃度（即ち、ｃＧＰ／ＩＧＦ−１モル比）もまた、患者における生体利用可能なＩＧＦ−１の量を表すことがあることから、さらに、潜在的にはＩＧＦ−１関連認知機能に適したバイオマーカーとしての役割を満たすことがあることを確認している。ｃＧＰの増加が神経学的状態のリスクを示し、及びｃＧＰの減少が神経学的状態の段階と相関することも見出されている。それ故、ＢＣＡによる処置が認知減退の発生を阻止する又は遅延させることがあると予想される。
【００４４】
用語「バイオマーカー」は、本明細書で用いられるとき、動物の健康及び機能といった機能を検討するための手段として、動物において追跡可能なｃＧＰ又はｃＧＰの総ＩＧＦ−１に対するモル比を指す。健康及び機能は、限定はされないが、動物又は集団におけるヒストリカルな標準測定値のいずれかと比べての、動物における「正常」又は「健常」状態の検出を含んでもよい。健康及び機能はまた、おそらくは状態、疾患又は異常状態に関連した動物の非正常又は非健康な状態の検出を含んでもよい。理解されるかもしれないが、「正常な」及び「健常な」などの用語は主観的な用語であるが、本明細書の文脈においては、これらの用語は、動物についてのヒストリカルな詳細及び／又は標準と称される集団に対する変動のいずれかと比べた、上記のバイオマーカー化合物又は比の相対的尺度である。
【００４５】
上記の通り、標準は、個別動物について収集されたデータセットに基づいてもよい。例えば、一時期、例えば１週〜６か月〜２年にわたり、ｃＧＰ及びｃＧＰの総ＩＧＦ−１に対する比を平均したデータが、動物に対して収集されてもよい。バイオマーカー濃度又は比における変動は、動物における「典型的な」数字、並びに典型的変動に対する正常又は標準な数字を理解するために用いられるそのデータ及び任意の偏差の範囲を見出し、ひいては非正常又は非定型な変化が生じるときを確認するため、観察及び分析されてもよい。
【００４６】
標準は、代替的に、又は個別の動物データと併せて、集団に対して収集されたデータセットに基づいてもよい。集団は、例えば、性別群、年齢によって規定された群、症状、状態又は病態によって規定された群などであってもよい。
【００４７】
ｃＧＰ及び／又はＩＧＦ−１は、動物から採取された生物学的検体中で測定されてもよい。本明細書の対象として、用語「生物学的検体」、「身体サンプル」、又は「サンプル」は、互換可能に用いられもよく、また患者から採取又は抽出され、貯蔵され、後に分析される検体を集合的に指してもよい。検体を抽出するための技術は、例えば、スワブ、静脈穿刺、スティック、生検、分画、排尿、便サンプルなどを介してもよい。選択された実施形態では、生物学的検体は、脳脊髄液（ＣＳＦ）、血漿、尿、任意の他の生物学的検体（涙及び任意の他の身体機能）、及びそれらの組み合わせであってもよい。
【００４８】
生物学的検体中のｃＧＰ及び／又は総ＩＧＦ−１は、ＥＬＩＳＡ、ＨＰＬＣ、質量分析、及びそれらの組み合わせから選択される技術により測定されてもよい。他の技術分野の分析技術であっても用いてよく、これらの技術に対する参照は、限定的に理解されるべきではない。
【００４９】
第４の態様では、動物におけるｃＧＰの濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対するモル比における減少を阻止し；及び／又は
動物における既存のｃＧＰの濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対するモル比を維持し；及び／又は
動物におけるｃＧＰの濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対するモル比を増加させるための、製剤化される薬剤の製造におけるブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）の濃縮抽出物の使用が提供される。
【００５０】
第５の態様では、それを必要とする患者における非神経学的及び／又は神経学的状態の影響を改善し、及び／又はそれらを治療するための、経口投与用に製剤化される薬剤の製造におけるブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）の濃縮抽出物の使用が提供される。
【００５１】
第６の態様では、動物におけるｃＧＰの濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対するモル比における減少を阻止し；及び／又は
動物における既存のｃＧＰの（正常／生理学的）濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対するモル比を維持し；及び／又は
動物におけるｃＧＰの濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対するモル比を増加させる又は正常化するための、動物への投与用に製剤化される濃縮されたブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）を治療有効量で含む抽出物が提供される。
【００５２】
第７の態様では、それを必要とする患者における高血圧症及び／又は脳卒中の影響を改善し；及び／又は高血圧症及び／又は脳卒中を治療し；及び／又は高血圧症及び／又は脳卒中に関連する症状を低減するための方法であって、ブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）の濃縮抽出物を治療有効量で投与することを含む、方法が提供される。
【００５３】
発明者は、高血圧症（高血圧）を有する患者にＢＣＡを適用するとき、彼らの血圧が許容できる基礎レベルまで低下することを見出している。
【００５４】
治療対象であり、且つ回復を予測するための非神経学的状態又は疾患は、限定はされないが、高血圧症、急性脳損傷（例えば、脳振盪）、肥満女性における体重変化、及び生後発達から選択されてもよい。
【００５５】
第８の態様では、それを必要とする患者におけるパーキンソン病若しくはパーキンソン病に関連する症状、若しくは認識機能障害に伴う合併症の影響を改善し、及び／又はそれらを治療する方法であって、ブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）の濃縮抽出物を治療有効量で投与することを含む、方法が提供される。
【００５６】
治療対象の神経学的状態又は疾患は、限定はされないが、脳血管発作（ＣＶＡ）若しくは脳卒中、軽度認知障害（ＭＣＩ）、アルツハイマー病、血管性認知症、高血圧症及びそれに伴う脳合併症、パーキンソン病、及び／又は任意の他の加齢関連状態若しくはＩＧＦ−１欠損関連状態から選択されてもよい。
【００５７】
脳卒中は、脳への血流不良が細胞死をもたらし、典型的には適切に機能しない脳の部分をもたらすような典型的な神経学的状態である。発明者は、上記のバイオマーカーを介して、脳卒中患者においてｃＧＰ濃度及びｃＧＰの総ＩＧＦ−１に対する比が変化し、且つｃＧＰ又は比が減少する範囲が患者の回復及び予後の強力な指標であることを確認している。減少がより低いことは、回復がより迅速であること、潜在的には進行中の課題がより少ないことに関連する。しかし、これに対する正確な機構は、判明していない。というのは、ＩＧＦ−１が、ｃＧＰレベル又はｃＧＰの総ＩＧＦ−１に対する比の減少がＩＧＦ−１の活性低下、ひいては神経経路のより緩やかな成長、ひいてはより緩やかな回復に対応することによる増殖に関連するからである。この知見に基づき、発明者は、ブラックカラント抽出物の投与により、ｃＧＰレベル及び／又はｃＧＰの総ＩＧＦ−１に対する比が増加し、ひいては脳卒中の影響が改善する、脳卒中が治療される、又は脳卒中及び／又は他の神経学的状態に関連する症状が少なくとも低減されることがあることを示している。
【００５８】
発明者によって評価される神経学的状態のさらなる例が、２番目に一般的な神経変性状態であるパーキンソン病（ＰＤ）である。上記の通り、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）は、神経栄養因子であり、神経生存及び脳機能における本質的役割を担う。障害されたＩＧＦ−１機能に伴う循環ＩＧＦ−１の増加として特徴づけられるＩＧＦ−１の抵抗性は、特発性ＰＤの疾患進行、認識機能障害及びＰＤの病理における役割を担う。したがって、ＩＧＦ−１の血漿濃度の変化が、ＰＤにおける予後及び治療応答を予測するため、ＩＧＦ−１機能を監視するためのバイオマーカーとしても発明者により評価されている。
【００５９】
本明細書の対象として、用語「改善」、「治療する」又は「〜の症状を低減する」は、神経学的状態に関連する少なくとも１つの徴候又は症状の測定される影響を、ブラックカラント抽出物投与のない患者にて測定される場合と比べて、少なくとも１、又は２％、又は３％、又は４％、又は５％、又は６％、又は７％、又は８％、又は９％、又は１０％低減することを指す。
【００６０】
投与により、ｃＧＰ濃度の減少又はｃＧＰの総ＩＧＦ−１に対する比の減少が、疾患若しくは状態により、又は疾患若しくは状態に関連する症状から引き起こされるような非正常状態の結果として、停止することがある。用語「減少を停止する」は、用いられるとき、ｃＧＰ濃度及び／又はｃＧＰの総ＩＧＦ−１に対する比を、投与前に測定された濃度又は比の少なくとも１、又は２％、又は３％、又は４％、又は５％、又は６％、又は７％、又は８％、又は９％、又は１０％以内に維持することを指す。
【００６１】
投与により、ｃＧＰ濃度及び／又はｃＧＰの総ＩＧＦ−１に対する比が、ブラックカラント抽出物投与（ＢＣＡ）のない患者において測定されることになる場合よりも、少なくとも１、又は２％、又は３％、又は４％、又は５％、又は６％、又は７％、又は８％、又は９％、又は１０％高く増加することがある。発明者は、意外にも、ＢＣＡの添加後、脳脊髄液（ＣＳＦ）中のｃＧＰが２５％増加することがあることを見出している。理論に拘束されない限り、これは、経口投与後の脳による有効な取り込みを示唆し、また任意の脳疾患の治療における有意な知見である。さらに、ＢＣＡは、ヒト血漿中でのｃＧＰの形成を増強することがある。発明者が認識している限り、ＣＳＦ中での少なくとも２５％のｃＧＰの有効な脳の取り込みを示している試験は他に実施されていない。ＢＣＡの添加の有効性及び取り込みを確認するため、さらなる臨床試験が進行中である。また、該機構の解明により、ＩＧＦ−１機能を正常化するための介入としてＢＣＡをさらに支持するための本質的な科学的証拠が得られることがある。
【００６２】
上記態様中で示される動物は、ヒトであってもよい。動物は、代替的に非ヒト動物であってもよい。動物に対する参照は、本明細書中で用語「対象」又は「患者」と互換可能に用いられてもよく、一方又は他方に対する参照は、限定的に理解されるべきではない。
【００６３】
一実施形態では、ブラックカラント抽出物が投与される動物は、非正常なｃＧＰ及び／又はｃＧＰの総ＩＧＦ−１に対する比を全く示していない健常動物であってもよい。本実施形態では、該抽出物は、後に生じる疾患、状態又は疾患若しくは状態の症状に関連することがある、ｃＧＰ又はｃＧＰの総ＩＧＦ−１に対する比における変化を阻止又は回避するための手段として、予防的に投与されてもよい。或いは、動物は、既存の状態、病態、及び／又は状態若しくは病態に関連する症状を有してもよい。
【００６４】
上記の通り、「正常な」及び「健常な」などの用語は主観的な用語であるが、本明細書との関連において、該用語は、動物についてのヒストリカルな詳細のいずれかと比べたバイオマーカー化合物若しくは比、及び／又はベースライン若しくは標準と称される集団に対する変動の相対的尺度である。個体のベースラインは、年齢、性別、及びＩＧＦ−１機能に関連することがある任意の他の医学的状態の間で変動してもよい。個体のベースラインからのｃＧＰ及び／又はｃＧＰの総ＩＧＦ−１に対する比の変化が、治療及びＢＣＡ投与計画を導くためのより決定的な情報であることが見出されている。発明者によって実施された例示的試験では、血漿中のｃＧＰレベルが、健常女性においては３．５ｎｇ／ｍｇであり、５０〜７０歳においては８〜１０ｎｇ／ｍｌであり、またＰＤ患者においてはＩＧＦ−１抵抗性に起因して１２ｎｇ〜１５ｎｇ／ｍｌであることが示された。
【００６５】
上記の薬剤は、一実施形態では経口投与用に製剤化されてもよい。経口投与は、生理活性化合物を投与するための非浸潤性の単純な手段であり、且つブラックカラントの観点で十分に検討された方法である。さらに、規制当局の承認を得ることを目的に、それは上記方法の市場化を意図して作製するための有用な手法であってもよい。経口投与への言及にもかかわらず、該薬剤はまた、非経口投与用に製剤化することができ、例えば非限定例として、注射、舌下ウエハ又は坐剤が挙げられる。血液脳関門（ＢＢＢ）を克服することは、多数の生理活性化合物について当該技術分野で幅広く記載がなされていることから、経口的若しくは非経口的方法のいずれが好ましいか、又はさらにＢＢＢが通過を可能にするか否かといったことは余談ともいえる。発明者は、経口投与されるブラックカラント抽出物が、血液脳関門を必ず通過することから、投与における有用な手段であってもよいことを見出している。
【００６６】
一実施形態では、抽出物自体は、乾燥粉末であってもよい。抽出物粉末は、ミクロン範囲内の直径まで微粒子化されてもよい。抽出物は、１０００未満、又は１００、又は１０、又は１ミクロンの粒径を有してもよい。抽出物を含む薬剤は、丸剤、錠剤、カプセル剤、液体、粉末、微粒子化粉末、ゲル、液体で満たされた軟質ゲル、及びこれら形態の組み合わせとして製剤化されてもよい。技巧的なブラックカラント抽出物は、１０００ミクロンを超える粒径を有する粗粉末であってもよい。かかる抽出物は水性環境下で可溶化することが困難であり得、それ故、上記抽出物の微粒子化形態は、可溶化がより容易であり、ひいてはより迅速且つより完全に摂取され、動物血流に移動することから、有用なことがある。
【００６７】
上記の通り、用量は、治療有効量である。一実施形態では、治療有効量のブラックカラント抽出物は、１日あたりの用量が少なくとも５０、１００、又は１５０、又は２００、又は２５０、又は３００、又は３５０、又は４００、又は４５０、又は５００、又は５５０、又は６００、又は６５０、又は７００、又は７５０、又は８００、又は８５０、又は９００、又は９５０、又は１０００ｍｇのアントシアニンを動物に提供してもよい。用量は、動物に対して、１日あたり、５０〜１０００ｍｇ、又は１２０〜７００ｍｇ、又は２００〜７００ｍｇ、又は３００〜６００ｍｇのアントシアニンであってもよい。理解されるべきこととして、用いられる用量は、個別の動物代謝、動物種、動物体重、動物年齢及び他の要素などの要素に応じて変動してもよく、それ故、これらの用量は限定的に理解されるべきではない。
【００６８】
ブラックカラント抽出物は、限定はされないが、アメリカ、アジア、オーストラリア、ヨーロッパ、及びニュージーランド内を含む、国際的に育成された任意のブラックカラント品種に由来してもよい。
【００６９】
ブラックカラント抽出物は、４０°を上回る緯度の北半球及び／又は赤道から５０°北の南半球において育成された果実に由来してもよい。
【００７０】
一実施形態では、ブラックカラント植物は、クロスグリ（Ribes nigrum）種に由来してもよい。
【００７１】
上記のブラックカラント抽出物は、果実、又は皮、ジュース、種子、茎、及びそれらの組み合わせから選択される果実部分を用いて作製されてもよい。一実施形態では、抽出物は、皮、ジュース、種子及び潜在的にはブラックカラント植物からの葉又は茎質を含む果実の解離及び酵素消化、その後の濃縮粉末（次に微粒子化されてもよい）を形成するための乾燥により、生成されてもよい。微粒子化粉末は、カプセル形態が所望される場合、任意選択的にはカプセル封入されるか、又はその他として最終形態まで加工されてもよい。別の実施形態では、ブラックカラント濃縮物及び／又は還元果汁は、ｃＧＰの供給源であってもよい。好ましくは、ブラックカラント濃縮物は、最大で６５ブリックスの濃縮物であってもよい。本出願人は、６５ブリックスより高い濃縮物の粘稠性が高すぎることを見出している。
【００７２】
上記のブラックカラント抽出物は、ニュージーランドで育成された少なくとも１つのブラックカラント品種から収穫された果実から作製されてもよい。ニュージーランドで育成されたブラックカラントは、世界の他の地域で育成されたブラックカラントと比べて非定型な組成物を有し、通常よりも高いアントシアニンレベルを有することがあるという点でやや独特である。これは、暖かいが暖かすぎない夏（１０〜３０℃の日内温度）と涼しいが涼しすぎない冬（−５〜１５℃の日内温度）といったニュージーランドの温帯気候；特にオゾン層がニュージーランドを低く覆う時期のブラックカラント果実熟成中での太陽／ＵＶ照射強度の増加；及びブラックカラントが育成される地方の「テロワール」に起因してもよい。ブラックカラントは、ニュージーランドの南島において育成されてもよい。
【００７３】
しかし、これは本発明に対して想定される実施形態に対して限定的に理解されるべきではない。ｃＧＰの濃縮物を含有する、ベリーフルーツ、ナッツ、植物、低木などの有機又は植物ベースの材料の他のタイプ及び／又はそれらの組み合わせであれば、おそらくは本発明で用いることができる。さらに、これらの有機又は植物ベースの材料は、任意量又は最小量のアントシアニンを含有してもよい。非限定例として、クランベリー、ビートルート、ブラックエルダーベリー及びＢＨＣ複合体（ビルベリー及びセイヨウトチノキ）、紫人参、マツ樹皮、ビートルート、及び紫小麦を挙げてもよい。
【００７４】
一実施形態では、ブラックカラント抽出物は、少なくとも１つの「Ben」ブラックカラント品種から収穫された果実に由来してもよい。しかし、抽出物を形成するには、他のあらゆるブラックカラント品種が用いられてもよい。理解されているかもしれないが、品種の収量を混合することにより、アントシアニン量及びアントシアニン型が抽出物において変更及び／又は調整されてもよい。一実施形態では、ブラックカラント抽出物は、「Ben Ard」品種、「Ben Rua」品種、及びこれら品種の組み合わせ、又は他のブラックカラント品種に由来するブラックカラント植物から収穫された果実から作製されてもよい。
【００７５】
上記のブラックカラント抽出物は、少なくとも１０又は１１又は１２又は１３又は１４又は１５又は１６又は１７又は１８又は１９、２０、又は２１、又は２２、又は２３、又は２４、又は２５、又は２６、又は２７、又は２８、又は２９、又は３０、又は３１、又は３２、又は３３、又は３４、又は３５％、最大では５０重量％のアントシアニンを含んでもよい。
【００７６】
ブラックカラント抽出物は、健康上の利益をもたらすため、少なくとも０．１６ｎｇ／ｍｇの濃度の環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）及び／又は少なくとも所要量のｃＧＰを含んでもよい。
【００７７】
ブラックカラント抽出物は、アントシアニン：デルフィニジン−３−グルコシド、デルフィニジン−３−ルチノシド、シアニジン−３−グルコシド、シアニジン−３−ルチノシド、ペツニジン−３−ルトニオシド（rutonioside）、及びそれらの組み合わせを含めることにより、さらに特徴づけられてもよい。これらの同じ化合物が、当該技術分野の文献中で、デルフィニジン−３−Ｏ−グルコシド、デルフィニジン−３−Ｏ−ルチノシド、シアニジン−３−Ｏ−グルコシド、シアニジン−３−Ｏ−ルチノシド、ペツニジン−３−Ｏ−ルトニオシド（「Ｏ」は、酸素原子によって連結されている配糖体を指す）と称されてもよいことに注目されたい。同じ化合物に対する別称として、化合物が偏光下で回転する方向を特定するための「Ｄ」命名法が用いられてもよく、例えばデルフィニジン３−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドが挙げられる。「３」の形式のみを参照し、「Ｏ」又は「Ｄ」命名法を参照しないことは、本明細書の目的として限定的に理解されるべきではない。
【００７８】
デルフィニジン−３−グルコシド、デルフィニジン−３−ルチノシド、シアニジン−３−グルコシド及びシアニジン−３−ルチノシドであるとして記されるアントシアニンの組み合わせは、抽出物中のアントシアニンの総量の重量を基準として、少なくとも８０〜９０、又は９１、又は９２、又は９３、又は９４、又は９５、又は９６、又は９７、又は９８、又は９９％を含んでもよい。すなわち、さらなるアントシアニンが存在してもよいが、主に用いられる抽出物は、上記のアントシアニンを含む。理論に拘束されない限り、これらのアントシアニンが、組み合わせで又は別々に、ＩＧＦ−１の結合に対してインビボで観察される効果、ひいてはｃＧＰ濃度及び／又はｃＧＰの総ＩＧＦ−１に対する比において観察される増加に起因してもよいことが理解される。とはいえ、抽出物は、アントシアニン以外の他の化合物を含み、植物に由来していることから、これらの化合物に純粋に起因しない抽出物からの他の生理活性化合物又は相乗物質が存在してもよい。結果として、これらの化合物を具体的に参照する場合、抽出物中に存在する可能性がある他の化合物の生理活性を排除することが意図されていない。
【００７９】
１つの特定の実施形態では、抽出物は、以下のアントシアニン化合物を、すべてが測定されたとき、含んでもよく、標準のニュージーランドでのアントシアニン分析において、ブラックカラントからの非濃縮ジュース中で測定されるとき、
少なくとも６０ｍｇ／１００ｍｌのデルフィニジン−３−グルコシド；及び／又は
少なくとも２００ｍｇ／１００ｍｌのデルフィニジン−３−ルチノシド；及び／又は
少なくとも４０ｍｇ／１００ｍｌのシアニジン−３−グルコシド；及び／又は
少なくとも２４０ｍｇ／１００ｍｌのシアニジン−３−ルチノシド；及び／又は
を含む。
【００８０】
抽出物は、ブラックカラント果実から得られる非濃縮ジュース中で測定されるとき、少なくとも１４ｍｇ／１００ｍｌのペツニジン−３−ルトニオシドをさらに含んでもよい。
【００８１】
上記の利点は変動してもよい。バイオマーカーについては、上記のようなｃＧＰは、ＩＧＦ−１の安定な代謝産物であり、発明者の研究に基づき、動物から採取される生物学的検体中で容易に測定される。ｃＧＰは、ＩＧＦ−１の非結合活性型から形成され、それ故、総ＩＧＦ−１を測定するよりも信頼できる。ｃＧＰを増加させ、及び／又は神経学的状態に対処する上記の方法については、例えば測定可能で且つ公知の様式などでのブラックカラントの使用は、当該技術分野で公知でないか又は完成されていない。ブラックカラントジュース又はブラックカラントの他の形態（上記の抽出物でない）は、現時点で考えられる公知で且つ測定可能な様式で、また本明細書に記載のように用いられていない。脳卒中及びＰＤの知見は特に、潜在的には既存技術による治療に干渉することも又は望ましくない副作用を引き起こすこともなく患者に有意且つ測定可能な利益をもたらすことがある、ブラックカラントに対する新規な又は少なくとも代替的な使用を示す。しかし、発明者が、ｃＧＰのレベルを増加させるためにＢＣＡを適用するとき、ビタミンＣがアスコルビン酸としてＢＣＡに添加される場合には有効性に対して負の効果を有することを見出していることは注目すべきである。
【００８２】
ｃＧＰにおける変化を測定し、及び／又は神経学的状態に対処する上記方法については、環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）の信頼できるプラズマバイオマーカーとしての臨床適用の利点は、治療及び個別の投与計画に適した患者の選択を可能にする。ｃＧＰの増加は、神経学的状態のリスクを示し、ｃＧＰの減少は、神経学的状態の段階を示す。有利なことに、治療に適した患者はそのｃＧＰレベルに基づいて選択されてもよく、ｃＧＰレベルの変化は、調整及び個別化された治療投与計画において容易に監視されうる。ＢＣＡの投与計画を調節することにより、神経学的状態の効果的治療が可能になり、それ故、長期的回復（３か月超）及び神経学的状態に伴う長期合併症（認識機能障害）の予防が改善される。さらなる利点は、ｃＧＰレベルが分析を容易にするために尿サンプルを測定することにより容易に監視されうることであり、将来的なＢＣＡの大規模臨床試験にとって重大な意義を持つ。
【００８３】
さらに、一般に天然生成物及びそれに関連する生理活性化合物については、本明細書に記載の方法及び使用は、治療に介入することが適切であるときを認識するための特有の方法を提供し、治療の成功又はそれ以外を評価するための方法をさらに提供する。タイミング及び有効性に関するこの洞察は、時として多数の医薬品に望まれることであり、生理活性化合物を含有する天然生成物中に共通に認められるものではない。
【００８４】
上記の実施形態はまた、広義では、個別に又は集合的に、本願の明細書中で参照又は指定される部分、要素及び特徴に、また任意の２以上の前記部分、要素又は特徴のいずれか又はすべての組み合わせにあると述べられてもよい。
【００８５】
さらに、具体的整数が、実施形態が関連する当該技術分野で公知の均等物を有するように本明細書で述べられる場合、かかる公知の均等物は、個別に示される時点から本明細書中に援用されるものとする。
【実施例】
【００８６】
研究実施例
非神経学的及び神経学的状態のリスク及び回復を予測するための環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）バイオマーカーの臨床適用に関する上記方法、並びにそれらを治療するためのブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）の濃縮抽出物などのｃＧＰを含有する有機又は植物ベースの材料の使用が、ここで具体的実施例の参照により説明される。
【００８７】
実施例１
ブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）の添加により、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）の機能を改善するための栄養応答として、パーキンソン患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）中で環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）が増加するか否かを知るため、発明者により試験を完了した。
【００８８】
生物学的検体サンプルを患者から採取し、ｃＧＰ及びｃＧＰの総ＩＧＦ−１に対する比について検体を分析し、ｃＧＰ及びｃＧＰの総ＩＧＦ−１に対する比を活性ＩＧＦ−１の存在及び機能の予測変数として用いてもよいか否かを確認した。次に、患者におけるｃＧＰに対するブラックカラント抽出物添加の効果を分析するため、試験を続行した。
【００８９】
すべての患者は、Van der Veer Movement Disorderクリニック及びニュージーランド脳研究所（New Zealand Brain Research Institute）の患者データベースからリクルートした。患者は、疾患のステージ及び診断からの期間と無関係に、試験への登録に適格であった。患者は、４０歳以上であり、運動障害の神経学者によって確認された特発性ＰＤにおける英国ブレインバンク診断基準を満たした。試験は、Upper South A Regional Ethics Committeeによって認可された（参照：ＵＲＡ／１０／０３／０２２）。試験集団のフローチャートは患者のリクルーティングを示す。患者は、Unified PD Rating Scale（ＵＰＤＲＳ）パートＩＩＩを用いて評価し、さらに初回来診時にサンプルを得る前、一連の精神認知試験を実施した。これらは、ＨＡＤＳ、ミニメンタルステート検査（Mini Mental State Examination）（ＭＭＳＥ）、モントリオール認知評価（Montreal Cognitive Assessment）（ＭｏＣＡ）及びPD Questionnaire（PDQ-39）を含んだ。任意の学習効果を回避するため、２回目の来診については、利用可能であれば異なるバージョンの試験を用いた。表１は、試験前の患者の臨床情報及び評価を示す。患者の大部分が、明白な認識機能障害を伴わない特発性ＰＤと診断された。
【００９０】
【表１】
2020532587.tif 000036
【００９１】
試験方法は、ブラックカラント抽出物の添加前と２８日後の双方で男性ボランティア７名から７対の脳脊髄液（ＣＳＦ）サンプルを採取することを含んだ。
【００９２】
各来診の間に、血漿及び脳脊髄液（ＣＳＦ）サンプルを収集した。患者は、各来診の１２時間前、「低アントシアニン食」（即ち、白米、白パン、ツナ、チキン、コーヒー及び非ハーブティー）を消費するように指示された。
【００９３】
初回来診後、次の２８日間にわたり、患者にブラックカラントカプセルを添加した。ＢＣＡ濃縮カプセル（２０％アントシアニン、Super Currantex（登録商標）20、Just the Berries Ltd. New Zealandによる資金提供（NZ Pharmaceuticals Limited製））の用量は、２８日間にわたり１日２回服用された。各患者が服用する抽出物用量は、１日あたり約６００ｍｇのアントシアニンに相当した。抽出物は、ニュージーランドで育成されたBen品種の果実から作製した。抽出物は、解離及び酵素消化により作製してから、乾燥して濃縮粉末を形成し、次に微粒子化し、カプセル封入する。
【００９４】
上記の通り、ボランティアはパーキンソン病（ＰＤ）を有する人々であったが、ＩＧＦ−１が神経栄養因子であり、神経生存及び（振戦などの症状が認められるようになるＰＤ患者において障害された可能性がある）脳機能を維持することにおいて本質的な役割を担うことから、彼らは既にいくつかのＩＧＦ−１機能上の課題を有していたことになる。ＩＧＦ−１の抵抗性は、循環ＩＧＦ−１における増加によって特徴づけられてもよく、ＩＧＦ−１機能の障害が、ＰＤ患者において認知減退を伴うことが報告されている。循環中のＩＧＦ−１は、貯蔵状態にあり、機能的でない。しかし、各ＩＧＦ−１分子は、小さいｃＧＰ分子と、ＩＧＦ−１が十分に機能的であることを可能にする、ＩＧＦ−１の代謝産物とを含有する。ｃＧＰは、貯蔵状態のままで、且つ１対１の様式でのワーカーになることができる、ＩＧＦ−１の数を決定するための門番のように作用する。したがって、ｃＧＰは、ＩＧＦ−１の機能若しくは働きが十分でないとき、又は身体がより十分に働くＩＧＦ−１を求めるとき、患者の循環中で増加する。したがって、ｃＧＰは、ＩＧＦ−１が全力で機能できるために重要であり、ひいてはＩＧＦ−１機能を改善することを通じて神経保護的である
【００９５】
各サンプルを入手及び分析し、添加前及び添加後に採取した各サンプル中での総ＩＧＦ−１、ｃＧＰ及びＩＧＦ結合タンパク質１〜３の濃度を測定した。サンプルは、ＥＬＩＳＡ及び高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）質量分析を用いて分析した。
【００９６】
特記：
ＣＳＦサンプル
ＣＳＦサンプルを腰椎穿刺により得た。各来診中に約８ｍＬのＣＳＦを得た。平滑管内に収集したＣＳＦサンプルは、収集から１５分以内に、濡れた氷上でEndolab, Christchurch, New Zealandに輸送した。次に、サンプル受け取りから３０分以内に、サンプルを室温、３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を２つの平滑管の間で等しくアリコートし、−８０℃未満で凍結させた。
【００９７】
血漿サンプル
血液サンプルを肘前窩の静脈穿刺を介して得て；２０ｍＬをヘパリン及びＥＤＴＡ管の間で等しく分割した。サンプルは、収集から４５分以内に、濡れた氷上でEndolabに直ちに輸送した。次に、サンプル受け取りから３０分以内に、サンプルを１５分間遠心分離し（３０００ｒｐｍ）、血漿を平滑管内に吸引し、−８０℃未満で凍結させた。
【００９８】
インビトロサンプル
ＢＣＡ中のｃＧＰの存在可能性を分析するため、ＢＣＡを水に溶かし、５、５０及び１００ｍｇ／ｍｌの３つの異なる濃度を得た。各濃度は５通りに分析している。
【００９９】
下記は、ｃＧＰアッセイ及びＨＰＬＣ−ｍｓにおける、ＢＣＡ及び他の有機又は植物ベースの材料中でのｃＧＰのレベルを測定する方法である。
【０１００】
ｃＧＰアッセイ
ｃＧＰアッセイにおける内部標準として提供されるｃＧＰ−ｄ２。ｃＧＰ−ｄ２（５００ｎｇ／ｍＬの５０μＬ）を血漿１００μＬに添加し、ボルテックス混合した。溶液を、４．５ｍＬの管内に含まれる１ｍＬのPhreeリン脂質除去カートリッジ（Phenomenex, Auckland, New Zealand）に移し；アセトニトリル（ＭｅＣＮ）中の１％ギ酸５００μＬをカートリッジに添加し、４℃、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、濾液を収集することができた。真空濃縮器を用いて濾液を乾燥させた（１．５ｍＴｏｒで１時間、次に０．７ｍＴｏｒで４５分間、室温）。乾燥したサンプルを１００μＬの１０％メタノール／水で再構成し、定量のために超高圧液体クロマトグラフィーバイアルに移し、次に４℃、５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、任意の残存する微粒子を沈降させた。ｃＧＰを木炭除去ヒト血漿に添加することによって調製した標準である品質管理サンプルを、２つの異なる濃度のｃＧＰとともに利用し、次にサンプルと同じ抽出手順を施した。
【０１０１】
高性能液体クロマトグラフィー質量分析アッセイ（ＨＰＬＣ−ｍｓ）
手短に言うと、クロマトグラフィー条件は、３５℃のカラム温度で１０％メタノール／９０％水の初期移動相組成物が２００μＬ／分で流れる、Synergy Hydroの２．５μｍカラム（Phenomenex）（１００×２ｍｍ）から構成した。質量分析条件は、４０００Ｖの電圧、３０ｐｓｉのシースガスフロー、２ｐｓｉの補助ガスフロー、及び２５０℃のキャピラリー温度で正モードのエレクトロスプレーイオン化から構成した。断片化は、衝突ガスとしての１．２ｍＴｏｒｒのアルゴン及び３５Ｖの解離電圧を用いて行った。質量分析計は、ｃＧＰ及びｃＧＰ−ｄ２各々に対して１５５．１→７０．２ｍ／ｚ及び１５７．１→７０．２ｍ／ｚといった２つのトランジションを利用して、選択的反応モニタリング（ＳＲＭ）モードで稼動させた。両ピークに対する保持時間は３．６分であった。未知のサンプルは、既知濃度の検量線と比べてのｃＧＰ／ｃＧＰ−ｄ２のピーク面積比を用いて定量化した。
【０１０２】
ＥＬＩＳＡ
総ＩＧＦ−１、ＩＧＦＢＰ−１、−２及び−３の血漿及びＣＳＦ濃度は、市販のＥＬＩＳＡキット（Crystal Chem, Chicago, IL, USA）を用い、製造業者の使用説明書に従って測定した。アッセイは、血漿サンプル中で４回繰り返したが、利用可能なＣＳＦ量が限られたため、ＣＳＦサンプル中では繰り返さなかった。
【０１０３】
統計分析
ブラックカラント添加後、ｃＧＰ、ＩＧＦ−１、ＩＧＦＢＰ−１、ＩＧＦＢＰ−２及びＩＧＦＢＰ−３における変化を分析するため、対応ｔ検定を用いた。生物学的変化間の相関は、ピアソン検定を用いて計算した。０．０５未満のＰ値を有意であるとみなす。
【０１０４】
結果
ＢＣＡ中のｃＧＰ濃度のインビトロ分析
一元配置分散分析によると、ｃＧＰの濃度がＢＣＡの異なる用量間で有意に異なることが示唆された（ｐ＜０．０００１、ｎ＝５、図１）。ｃＧＰの濃度は、５０ｍｇ／ｍｌのＢＣＡを用いる群において、低いＢＣＡ（５ｍｇ／ｍｌ）を用いる群と比べて有意に増加し（ｐ＝０．０００１、ｎ＝５）、ＢＣＡ用量が１００ｍｇ／ｍｌまで増加したとき、さらに増加した（ｐ＜０．０００１、ｎ＝５）。
【０１０５】
ＣＳＦ
ＣＳＦのｃＧＰ濃度は、ＢＣＡの添加後、有意に増加した（７．２７±０．６７から１２．１２±０．９４へ、ｐ＜０．００１、ｎ＝６、図２Ａ）。ｃＧＰ濃度における平均百分率変化は、添加後、７４．３６％増加した（ｐ＜０．０５、ｔ（５）＝３．９８９。全部で７対のサンプルの中で、添加後、それらの６つが増加を示した。患者１名が、ＣＳＦ中で１６．９倍のｃＧＰの増加を示し（１１．３０ｎｇ／ｍｌから１９１．８０ｎｇ／ｍｌへ）、それは異常値（平均の１５．７倍）として統計分析から排除している。患者１名が添加に応答せず、添加後のｃＧＰ濃度は一定を維持した（８．８〜８．７ｎｇ／ｍｌ、図２Ｄ）。ＩＧＦ−１、ｃＧＰ／ＩＧＦ−１比（図２Ｂ及びＣ）、ＩＧＦＢＰ−２及びＩＧＦＢＰ−３の濃度における変化はなかった（表２）。
【０１０６】
血漿
ＢＣＡの添加後、ｃＧＰ、ＩＧＦ−１、ｃＧＰ／ＩＧＦ−１比（図３Ａ〜Ｃ）、ＩＧＦＢＰ−１、２及び−３の濃度における統計学的変化はなかった（表２）。
【０１０７】
ＣＳＦ対血漿濃度
表２は、添加前及び添加後のＣＳＦ及び血漿中でのｃＧＰ、ＩＧＦ−１及びＩＧＦＢＰにおける値を示す。ＩＧＦＢＰ−１の濃度は、血漿中で低かった。ＩＧＦＢＰ−３（３０３８〜３０２９ｎｇ／ｍＬ）は、血漿中の主要なＩＧＦＢＰであり、ＩＧＦＢＰ−２（８３．７〜８５．５ｎｇ／ｍＬ）は、ＣＳＦ中の主要なＩＧＦＢＰであった。ＣＳＦ／血漿比は、ＩＧＦ−１及びＩＧＦＢＰ−３双方において＜１％であり；ＩＧＦＢＰ−２において１．３〜２％であり、またｃＧＰにおいて５２〜７１％であった（表２）。
【０１０８】
相関分析
ピアソン検定によると、ＣＳＦ中のｃＧＰ濃度と血漿中のｃＧＰ濃度との間に有意な相関（Ｒ＝０．６８、ｐ＝０．０１、図４Ａ、ｎ＝１２）、並びに血漿中のｃＧＰ／ＩＧＦ−１の比とＣＳＦ中のｃＧＰ濃度との間に有意な相関（Ｒ＝０．６６、ｐ＝０．０１、図４Ｅ、ｎ＝１２）が示された。ＩＧＦ−１濃度においてＣＳＦと血漿との間に相関がなく（Ｒ＝０．０９、ｐ＝０．７５、図４Ｂ）、且つＣＳＦと血漿の双方におけるｃＧＰ濃度とＩＧＦ−１濃度との間に相関がなかった（Ｒ＝０．０４、ｐ＝０．８５、図４Ｄ、Ｒ＝−０．１２、ｐ＝０．６９、図４Ｃ）。
【０１０９】
下の表２にまとめた結果は、添加前及び添加後の測定データを示す。
【０１１０】
【表２】
2020532587.tif 000037
【０１１１】
考察
先に見出されているように、ＢＣＡは、天然栄養素であるｃＧＰを含む。ＢＣＡの添加により、ＰＤ患者のＣＳＦ中でＩＧＦ−１ではなくｃＧＰの増加がもたらされた。ＣＳＦ中のｃＧＰ濃度は、血漿中のｃＧＰ濃度及びｃＧＰ／ＩＧＦ−１のモル比と、血漿中での変化が有意でなかったとしても相関した。血漿からの中枢取り込みは、おそらくは血液脳関門（ＢＢＢ）の機能に起因して、ｃＧＰにおいて高く、ＩＧＦ−１及びＩＧＦＢＰにおいて低かった。ＣＳＦ中でのｃＧＰの増加は、ＢＣＡの添加に対する栄養応答であってもよい。血漿ｃＧＰの非統計学的変化がその原因である可能性が高かった。その機構の解明により、ＢＣＡがＩＧＦ−１機能を正常化するための介入であってもよいことのさらなる科学的証拠が得られることになる。
【０１１２】
ｃＧＰは、ＢＢを通過する能力を有する小さい親油性分子（１９２ｄ）である。血漿ｃＧＰの約５２％は、添加前、ＣＳＦ中で見出され、添加後、７１％に増加し（表２）、ｃＧＰのＣＳＦ濃度と血漿濃度との間に有意な相関が得られた（図３Ａ）。したがって、たとえ添加による血漿中のｃＧＰ濃度の増加が有意でなかったとしても、血漿ｃＧＰは、ＣＳＦ  ｃＧＰの増加のための供給源であった可能性が高い。ＣＳＦ中のｃＧＰとＩＧＦ−１との間に相関はなく（図３Ｃ）、ここでは、ＣＳＦ  ｃＧＰの小部分が中枢神経系（ＣＮＳ）におけるＩＧＦ−１から形成し、それがＣＮＳにおいてＩＧＦ−１を切断する酵素も生じるためであるという可能性を除外しなくてもよい。
【０１１３】
ｃＧＰと対照的に、ＣＳＦ中のＩＧＦ−１の濃度は、血漿ＩＧＦ−１の約１％であり（表２）、それらの間に相関はなかった（図３Ｂ）。これらの観察結果は、ＣＳＦ  ＩＧＦ−１が主に循環ＩＧＦ−１と独立していたことを示唆する。ＩＧＦ−１は、ＢＢＢを通過する能力が限られた、ｃＧＰよりも大きい分子（７６００ｄ）である。データは、ｃＧＰの中枢取り込みが高く、ＩＧＦ−１が低く、それはサンプリングされたＰＤ患者におけるＢＢＢの維持された機能に起因することを示した。理論に拘束されない限り、変性する脳からの栄養的支持への要求により、ｃＧＰの血漿からＣＳＦへの移行が促進されたという可能性がある。したがって、アントシアニンの添加後のＣＳＦ  ｃＧＰのさらなる増加は、ＩＧＦ−１機能を改善するためのＢＣＡ処置に対する栄養応答であってもよい。ｃＧＰがＢＣＡの天然栄養素であるならば、ＢＣＡの有益な効果は、生体利用可能なＩＧＦ−１、ひいてはその機能を改善することを通じて媒介されてもよい。ＣＳＦ  ｃＧＰの変化は有意であったが、より多数の症例を用いたさらなる臨床試験により、ＢＣＡの添加の有効性、特に血漿中でのｃＧＰの変化が確認されることになる。
【０１１４】
結論
結論として、ｃＧＰはＢＣＡの栄養素であり、ＢＣＡの添加により、ＰＤ患者のＣＳＦ中でのｃＧＰの上昇がもたらされ、ＰＤの脳におけるＩＧＦ−１機能が改善される。例えば、ＢＣＡの添加により、図２Ａに示す通り、添加後のｃＧＰのＣＳＦ濃度が有意に増加した（ｐ＜０．００１，ｎ＝７）。ｃＧＰ／ＩＧＦ−１のモル比もまた、図２Ｃに示す通り、有意に変化した。
【０１１５】
ＣＳＦ中でのｃＧＰの増加は、血漿ｃＧＰの高い中枢取り込みの結果である可能性が高かった。ＩＧＦ−１の中枢取り込みは、ＰＤ患者における保持されたＢＢＢ機能に起因して制限された。血漿中のｃＧＰ及びｃＧＰ／ＩＧＦ−１比の変化は、変性脳におけるＩＧＦ−１機能についてのさらなる指標を提供し得、大規模臨床試験においてさらに評価されることになる。
【０１１６】
対照的に、添加により、ＣＳＦ（図２Ｂ）サンプル中のＩＧＦ−１の濃度が有意に変化せず、ＩＧＦ−１又は結合ＩＧＦ−１の測定が、ＩＧＦ−１機能の区別（活性型又は結合型）ができず、故にＩＧＦ−１活性の尺度として確実には利用できないことから、不良なバイオマーカーであるという事実が再現された。
【０１１７】
実施例２
本実施例において、バイオマーカーとしてｃＧＰを用いる能力についてさらに評価した。試験のため、全部で２９名をリクルートし、参加者は７０歳超又は７０歳未満のいずれかであり、全員が正常な認知機能を有した。生物学的検体を血漿の形態で参加者から採取した。血漿中のＩＧＦ−１及びＩＧＦＢＰ−３の濃度をＥＬＩＳＡにより測定し、血漿ｃＧＰを高性能液体クロマトグラフィー質量分析アッセイにより測定した。
【０１１８】
結果は、図５Ａ、５Ｂ及び５Ｃに示す通りであった。
【０１１９】
図５Ａは、総血漿ＩＧＦ−１の測定濃度が年齢とともにいかに減少する傾向があるかを図示するが、測定された総ＩＧＦ−１における差異は比較的小さかった。
【０１２０】
対照的に、図５Ｂは、ｃＧＰ血漿濃度が年齢とともにいかに変化するかを示し、その変化は明白であり、測定が容易である。図５Ｃは、測定されたｃＧＰの総ＩＧＦ−１に対する比もまた、年齢とともにいかに有意に変化するかをさらに示す。
【０１２１】
理論に拘束されない限り、ｃＧＰ及びｃＧＰ／ＩＧＦ−１モル比における観察された増加が、年配者において正常な認知を維持するための、血漿ＩＧＦ−１の減少に対する代償性応答であることが推測される。
【０１２２】
実施例３
本実施例において、潜在的な個別の治療レジームとしての脳卒中のリスク及び回復を予測するためのｃＧＰバイオマーカーの臨床適用を試験するため、初期試験を完了した。
【０１２３】
（完了した最新試験は、本明細書で実施例８にて最新のデータ及び図面とともに説明され、ここで試験中に脳卒中後に入院して４８時間未満の患者が十分でなかったことから、ベースライン測定値は７２時間に修正したことに注目されたし。また、このデータとしてもはや利用されないｍＲＳのベースラインデータは、脳卒中後３日未満の信頼できるものでなかったことから、ＮＩＨＳＳと交換している）
【０１２４】
ＩＧＦ−１機能が脳卒中の回復にとって重要であることが理解されている。結果として、脳卒中におけるＩＧＦ−１機能にとって信頼できるバイオマーカーが、脳卒中の予後にとって有用なことがある。しかし、本明細書の他の箇所に記される通り、血漿ＩＧＦ−１又はＩＧＦ−１／ＩＧＦ結合タンパク質−３（ＩＧＦＢＰ−３）モル比は、信頼できるバイオマーカーでない。ｃＧＰは、脳卒中患者の自発的回復中でのＩＧＦ−１機能にとっての有望なバイオマーカーとして試験した。
【０１２５】
脳卒中患者１４名から、脳卒中発症からのベースライン時（＜４８時間）、１週後及び３か月後、血漿サンプルを収集した。さらに、試験における陰性対照として作用するように、年齢適合健常者から２９の血漿サンプルを収集した。
【０１２６】
ベースラインと３か月との間での修正ランキンスケール（modified Rankin Scale）（ｍＲＳ）における差異（ΔｍＲＳ）を用いて、脳卒中後の機能的回復を評価した。血漿サンプル中のＩＧＦ−１及びＩＧＦＢＰ−３の濃度をＥＬＩＳＡにより測定し、血漿ｃＧＰを高性能液体クロマトグラフィー質量分析アッセイにより測定した。
【０１２７】
結果によると、血漿ＩＧＦ−１における無変化が示され、この結果は、バイオマーカーとしてのＩＧＦ−１の不良な性質をさらに再現している（図６Ａ）。対照的に、脳卒中患者は、健常患者対照と比べて、有意により低いｃＧＰレベル（ｐ＝０．００６、図６Ｃ）及びｃ−ＧＰ／ＩＧＦ−１モル比（ｐ＝０．００１．図６Ｄ）を有した。
【０１２８】
脳卒中患者におけるＩＧＦＢＰ−３は、やや低下した（ｐ＝０．０４９、図６Ｂ）。ＩＧＦＢＰ−３の低下の場合、遊離ＩＧＦ−１を増加させるような陽性応答でありうる。
【０１２９】
したがって、ｃＧＰ及びＩＧＦ−１に対するそのモル比における変化は、脳卒中回復中のＩＧＦ−１機能に対する感受性がＩＧＦ−１測定単独に対する信頼性よりも高いようなバイオマーカーである。
【０１３０】
興味深いことに、脳卒中発症から４８時間以内にｃＧＰ濃度が有意に減少した。この急激な減少が脳卒中の直接的な結果又は原因であるか否かは不確かであるが、これは観察可能な特徴であり、おそらくは異常な機能の指標であると思われる。
【０１３１】
図７Ａ〜７Ｅに図示されるような（更新された図１４も参照）経時的に取得した結果によると、脳卒中患者が、３か月にわたり、ｍＲＳ（ここでは表７に示すような最新のＮＩＨＳＳに相当）の減少を示すことにより徐々に回復する（図７Ａ）ことが示された。脳卒中患者において、３か月後、ベースラインレベル（＜脳卒中後４８時間）と比べて、ｃＧＰの増加（ｐ＝０．０５７、ｎ＝１４）及びｃ−ＧＰ／ＩＧＦ−１の増加（ｐ＝０．０８、ｎ＝１４、図７Ｂ及び図７Ｅ）への傾向が認められた。
【０１３２】
ベースラインｃＧＰは、ベースラインと３か月との間での神経学的スコアにおける差異により評価される回復に負に関連した（ΔｍＲＳ、ｒ＝−０．６５１、ｐ＝０．０２２、図７Ｆ）。
【０１３３】
発明者の結果は、ベースラインｃＧＰが脳卒中回復の短期転帰を予測することを示唆する。ベースラインｃＧＰが高まると、患者における予後がより陽性になる。その結果はまた、脳卒中回復の期間にわたってＩＧＦ−１及びＩＧＦＢＰ−３における変化がなかったことから、ｃＧＰ及びｃＧＰ／ＩＧＦ−１モル比の変化が、ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−１／ＩＧＦＢＰ−３モル比よりも信頼できるバイオマーカーであってもよいという初期の知見をさらに支持する。
【０１３４】
ｃＧＰにおける増加は、脳卒中回復を促進するための栄養応答であると理解される。ｃＧＰ及びｃＧＰ／ＩＧＦ−１モル比の増加と同様、脳卒中回復中のｃＧＰの増加もまた、脳卒中回復を促進するための栄養応答であると理解される。これらの知見は、回復がｃＧＰと相関してもよく、ｃＧＰの添加が回復を補助することがあることを示す。さらに、脳卒中から４８時間後のｃＧＰ濃度が、脳卒中患者における神経学的機能の回復と有意に相関することから（図７Ｆ）、これは、入院時のｃＧＰ濃度が回復の能力、ひいては治療向けの決定的情報を予測することを示唆する。これはまた、ｃＧＰレベルを増加させるための添加が、脳卒中からの短期回復をも補助することを示唆するであろう。
【０１３５】
実施例４
上記試験では、尿であっても有用な生物学的検体となるか否かを試験するため、試験に登録した患者から尿サンプルも採取した。試験中、全部で７１の尿サンプルを採取し（対照３０名、脳卒中患者３３名）、これらのサンプルを上記方法と同様の様式で分析した。相関が存在することを確認するため、より早期の試験から脳卒中患者及び高齢対照におけるさらなる３７の血漿サンプルも比較した。
【０１３６】
図８Ａ及び図８Ｂは、尿分析から収集したデータを示す。血漿ｃＧＰは、脳卒中患者において、ベースライン（＜脳卒中後４８時間、ｐ＜０．０１、ｎ＝９、図８Ａ）時、正常対照（ｎ＝３０）よりも有意に低下する。年齢適合対照と脳卒中との間での尿中のｃＧＰの差異は、血漿サンプルにおいて認められた場合と類似する（図８Ａ）。想定の通り、ベースラインと比べての、後の時点における尿ｃＧＰの増加への傾向が認められ、時点測定値における尿と血漿の間での差異もまた有意でなかった（図５Ｂ）。
【０１３７】
尿中ｃＧＰ濃度は、血漿ｃＧＰ濃度（ｒ＝０．５９、ｐ＜０．０１、図５Ｃ）及びｃＧＰ／ＩＧＦ−１モル比（ｒ＝０．６３、ｐ＜０．００１、図８Ｄ）と有意な相関を有した。高齢者と若年者との間での尿サンプル中で、同様の結果が認められた（図９）。結果は、尿及び血漿を生物学的検体として用いてもよいことを示す。
【０１３８】
図１０Ａ及び図１０Ｂは、尿中（図１０Ｂ）でなく血漿中（図１０Ａ）のベースラインｃＧＰの変化が回復に関連したことを示す（ΔｍＲＳ：ｍＲＳベース−３か月）（ｒ＝−０．６３０、ｐ＝０．００３、図１０Ａ、１０Ｂ）。
【０１３９】
それ故、尿中でのｃＧＰの変化は、血漿中でのｃＧＰの変化を表しうる。
【０１４０】
実施例５
当該技術では、ブラックカラントの様々な遺伝子型から、アントシアニン含量がブラックカラントジュース１００ｍｌあたり８０〜７００ｍｇであることが示唆される。ニュージーランドで育成されたブラックカラントがより高レベルのアントシアニンを有し、且つBen品種が選択された潜在的に生理活性のあるアントシアニンを潜在的により高濃度で有することが理解される。任意の抽出及び濃縮に先立ち、ブラックカラントジュース中の選択されたアントシアニンの量の存在を確認するため、さらなるニュージーランドで育成された品種Blackadderに対するブラックカラントの２つのBen品種を比較する試験が終了した。
【０１４１】
下の表３はその結果を示す。
【０１４２】
【表３】
2020532587.tif 000038
【０１４３】
上から理解できるように、Ben品種は、高い総アントシアニン含量と、Blackadderのような他のニュージーランドで育成された品種にとっても変化するアントシアニン特性とを有する。３つ全部のニュージーランド品種に対して上で測定された総レベルは、当該技術分野で記録された場合よりも十分高く、ニュージーランドで育成されたブラックカラントが他の場所で育成されたものと異なるという見解が支持される。さらに、例えば上記のBen品種を混合することにより、上記のBlackadderのようなニュージーランドで育成された非Ben品種とであっても特性が大きく異なるようなアントシアニンの混合が可能な場合があることは注目されるべきである。
【０１４４】
実施例６
ｃＧＰの濃度を含む４つの異なる濃度（１、５、２５及び１００ｍｇ／水）でのベリーフルーツ（ブラックカラント、クランベリー、ビートルート、ブラックエルダーベリー及びＢＨＣ複合体（ビルベリー＋セイヨウトチノキ））の選択についての分析からの結果を図１１に示す。
【０１４５】
結果は、３０ｎｇ／ｍｇのブラックカラント中のｃＧＰの濃度が、Vitalityから供給された先のブラックカラントサンプルよりも高いことを示す。これは、加工方法における可変性に起因することがあり、さらなる検討を要する。Diaion HP20でコーティングされた樹脂ビーズを利用するクロマトグラフィーカラムを通じて処理されたこのＢＣＡサンプルが、溶媒抽出プロセスを用いて抽出した先のＢＣＡサンプルよりも３倍高いｃＧＰ濃度を有することは発明者によって注目されている。
【０１４６】
ＢＨＣ複合体のｃＧＰ濃度は８０ｎｇ／ｍｇであり、ブラックエルダーベリー及びクランベリー中にｃＧＰの画分が存在するが、より高濃度でのさらなる試験が必要であり得る。
【０１４７】
ブラックカラント及びビートルート以外では、他の３つのサンプルが１００ｍｇの濃度にて完全には溶解されなかったことも注目されている。
【０１４８】
図１２は、陽性対照としてのＢＣＡの用量範囲内で、追加的分析として供給したサンプルからのデータを示す。ｃＧＰ濃度は、１００ｍｇのＢＣＡ（対照）中で２７ｎｇ、１００ｍｇのビルベリー中で４６．７ｎｇ、また１００ｍｇ（１０ｎｇ／ｍｇ）の新規に配合されたＢＣＡ中で１００ｎｇである。
【０１４９】
これらの結果は、クロマトグラフィーカラムを通じて処理されたＢＣＡが、エタノール溶媒抽出プロセスのみを用いて抽出されたＢＣＡと比べて、より高いｃＧＰ濃度を有することをさらに示唆する。さらに、ビルベリー単独は、ビルベリーとセイヨウトチノキとの複合体よりも低いｃＣＰ濃度を有する。
【０１５０】
図１３は、Vitalityによって提供された製品サンプルの、それらのｃＧＰ濃度を測定するためのさらなる分析からの結果を示す。Vitalityによって提供された製品サンプル（ＢＣ抽出物China-47、NZBCジュース濃縮物（Ｔ１８０２１２及びＴ１８０１１５）、アレパ抽出物、Enzogenol、タルトチェリー、紫小麦、紫人参及びビートルートというラベル）の４つの異なる濃度（１、５、２５及び１００ｍｇ／水）における分析からの結果。上で３０ｎｇ／ｍｇを用いて試験された最初のVitalityのＢＣＡサンプルを陽性対照として用いた。
【０１５１】
結果は、次のことを示す。
・ブラックカラントをアッセイ用の陽性対照として使用。ｃＧＰの濃度は２９ｎｇ／ｍｇであり、３０ｎｇ／ｍｇであった上記分析からの濃度に一致する。
・製品のｃＧＰ濃度は、次の通りである。
・タルトチェリーは、ｃＧＰの最高濃度（１３５ｎｇ／ｍｇ）を有し、陽性対照として用いたVitalityのＢＣＡ抽出物よりも４倍高い；
・NZBCジュース濃度（２１２）は５３ｎｇ／ｍｇである；
・NZBCジュース濃度（１１５）は６１ｎｇ／ｍｇである；
・紫人参は５７ｎｇ／ｍｇを含有する；
・Enzogenolは、VitalityのＢＣＡに類似したｃＧＰ濃度（３６ｎｇ／ｍｇ）を有する；
・ＢＣ抽出物China-47は２２ｎｇ／ｍｇである；
・ビートルートは、VitalityのＢＣＡと比べてｃＧＰの半量（１４ｎｇ／ｍｇ）を有する；
・アレパ抽出物は非常に低いｃＧＰ（４ｎｇ／ｍｇ）を有する；及び
・紫小麦は、この分析におけるｃＧＰを有するように思われない
【０１５２】
上の製品サンプルが上で示す結果から増加したｃＧＰ濃度を有してもよく、さらに（これらの結果において示さないが）紫小麦がｃＧＰを含有してもよいことは注目されるべきである。上記の通り、有機物質から抽出したｃＧＰ濃縮物（又はその存在）は、加工方法における可変性に起因することがあり、さらなる検討を要する。例えば、Diaion HP20樹脂ビーズを利用するクロマトグラフィーカラムを通じて最初に処理された有機物質が、エタノール溶媒抽出プロセス単独を用いて抽出した先のＢＣＡサンプルよりも３倍高いｃＧＰ濃度を有することは発明者によって注目されている。しかし、類似のｃＧＰ抽出能力を有する他の樹脂ビーズを利用してもよいことは理解されるべきである。さらに、ｃＧＰ濃縮抽出プロセスは、アッセイ中、有機物質が水に溶解されうるか否か、及びｃＧＰを含有する画分がクロマトグラフィーカラム内で正確に捕捉され、同定されているか否か、などの他の要素に依存してもよい。
【０１５３】
実施例７
本実施例において、試験は、レット症候群（ＲＴＴ）と遺伝子診断された６歳少女の、ＩＧＦ−１、メラトニン（ＭＴ）、ブラックカラント抽出物（ＢＣＡ）、及びリハビリテーションで６か月間処置されてからの良好な進化を説明する。患者は、１歳時から正常な発達を停止した。
【０１５４】
患者は、低い体重及び身長を示し、典型的なＲＴＴとしての主な診断基準を満たした。奇妙なことに、ゴナドトロピンが低いにもかかわらず、陰毛（タナーＩＩ）での非常に高い血漿テストステロンが認められた。副腎酵素欠損が不在であり、腹部超音波検査は正常であった。
【０１５５】
治療の中身は、３か月間のＩＧＦ−１（０．０４ｍｇ／ｋｇ／日、５／週、皮下）、次いで１５日間の安静、ＭＴ（５０ｍｇ／日、経口的、継続的）及び神経リハビリテーションであった。
【０１５６】
新鮮血液検査は絶対的に正常であり、陰毛が消失した。次いで、ＩＧＦ−１、ＭＴ、及びＢＣＡを用いた新しい治療がさらに３か月間開始した。その後、パブリックなタナー段階が、原因不明な条件下でＩＩＩに上昇した。
【０１５７】
後続治療により、表４及び５に示す通り、初期機能障害の大部分における明確な改善がもたらされた。
【０１５８】
【表４】
2020532587.tif 000039
【０１５９】
【表５】
2020532587.tif 000040
【０１６０】
上記の結果は、ＩＧＦ−１による治療の効果、ＭＴ及びＢＣの抗酸化剤効果、並びにＢＣＡ投与後の環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）における増加が、レット症候群を有する少女に内在する神経障害を改善するために有用であることを支持する。例えば、有意な所見が、治療の結果として歯ぎしりが消失したことである。ブラックカラントの抽出物がｃＧＰのレベルを上昇させることから、ＩＧＦ−１の分裂促進能が相殺されうることで、このホルモンによる治療がより長期に延長されうる。
【０１６１】
ＩＧＦ−１、ＭＴ及びＢＣによる継続治療により、進行中の試験に伴い、ＲＴＴにおいて生じる神経障害の大部分が回復し得る。
【０１６２】
結果はまた、（ＩＧＦ−１及びＭＴに加えて）ｃＧＰとの組み合わせ治療後、レット症候群が改善し、他の疾患／症候群の治療を意図した物質／ホルモンの他の組み合わせとともに、ｃＧＰを用いてもよいことを示す。
【０１６３】
実施例８
本実施例において、脳卒中後３日以内の環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）の血漿濃度と、いかに血漿ｃＧＰが短期的な脳卒中回復を予測することがあるかを評価するため、実施例３に対するさらなる更新試験を完了した。
【０１６４】
脳卒中患者は機能が回復する。この自己回復過程は、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）の機能を促進することに関連する。ＩＧＦ−１機能を表すバイオマーカーは、脳卒中患者における回復を予測し、臨床管理を導くことを補助することがある。血漿ＩＧＦ−１は、すべてが生体利用可能ではない。ＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）−３及び環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）は、ＩＧＦ−１のバイオアベイラビリティを集合的に調節する。血漿ＩＧＦ−１、ＩＧＦＢＰ−３及びｃＧＰ濃度を、ＩＧＦ−１機能に対するバイオマーカーとして、並びに脳卒中患者における臨床成績及び回復とのそれらの関連として評価した。
【０１６５】
方法
年齢適合対照対象５０名（女性／男性が３５名／１５名）及び脳卒中を有する者３４名（女性／男性が１５名／１９名）を脳卒中の３日以内にリクルートした。臨床的評価は、ベースライン（＜３日）時、次いで７日目及び９０日目のＮＩＨ脳卒中スケール（National Institutes of Health Stroke Scale）（ＮＩＨＳＳ）、並びに７日目及び９０日目の修正ランキンスケール（modified Rankin Scale）（ｍＲＳ）及びFugl-Meyer Upper Limb Assessmentスケール（ＦＭ）を含んだ。
【０１６６】
ベースライン時に脳卒中患者３４名から、７日目に患者２１名から、及び９０日目に患者２６名から、血漿サンプルを収集した。
【０１６７】
患者２８名がフォローアップを完了していた。彼らの中で、患者２１名が７日目に血漿サンプルを提供し、患者２６名が９０日目に血漿サンプルを提供した。したがって、全部で患者２１名が臨床スコアを完了しており、すべての時間間隔で血漿サンプルを提供した。患者２８名がベースライン時に血漿サンプルを提供し、９０日目に臨床的評価を受けた。脳卒中の病歴を有しない年齢適合対照参加者５０名（女性が３５名）もリクルートし、全員が血漿サンプルを提供した（表６及び７）。
【０１６８】
【表６】
2020532587.tif 000041
【０１６９】
【表７】
2020532587.tif 000042
【０１７０】
ＩＧＦ−１、ＩＧＦＢＰ−３又はｃＧＰの濃度は、前述の通り、ＥＬＩＳＡ又は高性能液体クロマトグラフィー質量分析を用いて測定した。
【０１７１】
結果
対照参加者は、有意な神経障害（ＮＩＨＳＳ中央値（範囲）：０（０−２））も全身体障害（global disability）（ｍＲＳ中央値（範囲）０（０−１））も有しておらず、正常な上肢機能（ＦＭ中央値（範囲）：６６（６５−６６））を有した。脳卒中患者では、経時的に脳卒中重症度（ＮＩＨＳＳ）及び身体障害（ｍＲＳ）が低下し、上肢機能（ＦＭ）が改善した。例えば、ＮＩＨＳＳスコアは経時的に改善した（Ｆ（２，２０）＝２７．４８、ｐ＜．００１、ｎ＝２１、図１４Ａ）。ベースラインと比べて、ＮＩＨＳＳスコアは、７日（中央値：２対４、ｐ＝０．０１）及び９０日（中央値：１対４、ｐ＜０．００１）までに低下した。ＦＭスコアが改善したように（中央値：６４対６５、ｐ＝０．００１、ｎ＝２１、図１４Ｃ）、ｍＲＳスコアも改善した（中央値：３対２、ｐ＝０．００３、ｎ＝２１、図１４）。
【０１７２】
ＩＧＦＢＰ−３、ｃＧＰ及びｃＧＰ／ＩＧＦ−１モル比のベースライン濃度は、脳卒中患者において、対照対象よりも低かった。特に、対照群と比べて、ＩＧＦＢＰ−３濃度（ｐ＝０．００２、図１５Ｂ）、ｃＧＰ濃度（ｐ＝０．０４７、図１５Ｃ）及びｃＧＰ／ＩＧＦ−１モル比（ｐ＝０．０４３、図１５Ｄ）は、ベースライン時、脳卒中群においてより低かった。ＩＧＦ−１濃度（図１５Ａ）においては、対照群と脳卒中群との間での差異は認められなかった。ベースライン時のＩＧＦ−１／ＩＧＦＢＰ−３モル比は、脳卒中群において、対照群の場合よりも高かった。
【０１７３】
血漿ｃＧＰ及びｃＧＰ／ＩＧＦ−１モル比は、ＩＧＦ−１及びＩＧＦＢＰ−３と異なり、経時的に増加した。ベースラインｃＧＰ／ＩＧＦ−１モル比は、ベースラインから９０日目にかけて、ＮＩＨＳＳスコアにおける変化と相関した。特に、分散分析反復分析によると、脳卒中後、経時的に、ｃＧＰ濃度（Ｆ（２，２０）＝５．３４５、ｐ＝０．０１、ｎ＝２１、図１６Ｃ）及びｃＧＰ／ＩＧＦ−１モル比（Ｆ（２，２０）＝３．９４６、ｐ＝０．０２９、ｎ＝２１、図１６４Ｄ）における有意な増加が示された。ベースラインと比べて、ｃＧＰの濃度（ｐ＝０．０１４）及びｃＧＰ／ＩＧＦ−１モル比（ｐ＝０．０３１）が、９０日目までに有意に増加した。ＩＧＦ−１、ＩＧＦＢＰ−３の濃度及びＩＧＦ−１／ＩＧＦＢＰ−３モル比は、経時的に安定なままであった（図１６Ａ、Ｂ）。
【０１７４】
考察
この試験は、脳卒中発症後、短期的に（＜３日）、ｃＧＰ、ＩＧＦＢＰ−３の血漿濃度及びｃＧＰ／ＩＧＦ−１モル比が減少することを示しており、ＩＧＦ−１の自己分泌調節の障害を示唆している。次の９０日にわたり、脳卒中患者は、神経学的機能及び全身体障害における改善を示した。これは血漿ｃＧＰ及びｃＧＰ／ＩＧＦ−１モル比の漸増と並行している。ベースライン時により高いｃＧＰ／ＩＧＦ−１モル比を有する患者は、脳卒中後９０日目、神経学的機能におけるより良好な回復を来した。これらの結果は、脳卒中回復におけるＩＧＦ−１の自己分泌調節の役割を示唆してもよい。ｃＧＰ／ＩＧＦ−１モル比における急激な変化は、脳卒中回復を予測するための有望なバイオマーカーであってもよい。
【０１７５】
血漿中の生体利用可能なＩＧＦ−１の量は、ＩＧＦＢＰ−３及びｃＧＰにより集合的に調節される。ＩＧＦＢＰ−３の減少及びｃＧＰの増加により、生体利用可能なＩＧＦが増加しうる。年齢適合対照と比べて、ＩＧＦＢＰ−３及びｃＧＰの濃度は、ベースライン時、脳卒中患者において低下した。高血圧女性もまた、正常血圧女性と比べて、血漿ＩＧＦＢＰ−３及びｃＧＰの減少を示しており、心血管機能への関与を示唆している。脳卒中及び高血圧患者における血漿ＩＧＦＢＰ−３の減少は、生体利用可能なＩＧＦ−１を改善するための自己分泌応答である。血漿ｃＧＰの減少は、自己分泌調節の障害を示唆する。その結論はまた、ｃＧＰの投与により、ラットにおける虚血性脳障害が予防され、高血圧ラットにおける全身血圧が正常化するという観察結果によって支持される。血管保護におけるｃＧＰの機能は、インビボ及びインビトロ試験の双方により説明されている。有意でないが、上記試験における脳卒中患者のほぼ半数及び対照参加者のわずか１／４が高血圧であった。高血圧症は、脳卒中の主要なリスク因子であり、ＩＧＦ−１の自己分泌調節の障害は、高血圧症及び脳卒中によって共有される病態生理であってもよい。
【０１７６】
ｃＧＰは、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する能力を有する安定な小さい親油性環状ペプチドである。脳脊髄液（ＣＳＦ）中のｃＧＰの内因性濃度は、パーキンソン病患者の血漿中の場合の約５０％である。ｃＧＰ類似体の中枢取り込みは、ラットにおいて低酸素性−虚血性脳損傷後の最初の２時間で、＞１００％まで増強される。したがって、我々は、脳損傷が血漿からのｃＧＰの中枢取り込みを促進し、それ故、脳卒中の急性期の間、血漿ｃＧＰレベルを低下させたという可能性を排除することができなかった。
【０１７７】
この試験における大部分の患者が、９０日の追跡期間中、神経学的機能及び脳卒中の転帰における改善によって示される通り、経時的に部分的回復を来した。これらの臨床的改善は、経時的にｃＧＰ濃度及びｃＧＰ／ＩＧＦ−１モル比の増加と並行していた。血漿ＩＧＦ−１のバイオアベイラビリティの改善は、機能的回復に寄与することがある。ベースラインＮＩＨＳＳ及び年齢は、脳卒中回復に影響を及ぼす決定的要因である。それは、生物学的変化とこれらの交絡要因の可能性を伴う臨床成績との間の真の関係性を分析するために不可欠である。年齢及びベースラインＮＩＨＳＳスコアの調節との相関分析により、ベースライン時にｃＧＰ／ＩＧＦ−１モル比の増加を伴う患者が、脳卒中の９０日目に神経障害の低減を有し、脳卒中から９０日後に神経学的機能におけるより良好な回復を来すことが示された。
【０１７８】
対照群と比べて、脳卒中から３日後の患者において、血漿ＩＧＦ−１濃度の減少又は増加のいずれかが報告されている。血漿ＩＧＦ−１濃度における変化は、死亡率のみを予測するが、脳卒中患者の機能的回復は予測しない。この試験からの発明者の観察では、９０日の追跡期間中、ＩＧＦ−１濃度における変化は全く不明であった。この証拠は、血漿濃度ＩＧＦ−１における変化がＩＧＦ−１機能における信頼できる尺度でないという示唆を支持する。
【０１７９】
これらの有望な結果は、血漿中のｃＧＰに関連する変化がＩＧＦ−１機能に対する感受性バイオマーカーであることを示唆する。
【０１８０】
結論
低いｃＧＰ濃度及びモルｃＧＰ／ＩＧＦ−１比は、脳卒中におけるＩＧＦ−１の自己分泌調節の障害を示唆する。ｃＧＰ濃度及びモルｃＧＰ／ＩＧＦ−１比の増加は、３か月後の臨床的回復に関連してもよい。入院時のｃＧＰ／ＩＧＦ−１モル比は、より大規模な試験においてさらに確認される場合、脳卒中患者における回復を予測するためのバイオマーカーであってもよい。さらに、高血圧患者におけるｃＧＰ濃度の漸減もまた、脳卒中リスクに対するバイオマーカーであってもよい。
【０１８１】
非神経学的及び／又は神経学的状態のリスク及び回復を予測するための環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）バイオマーカーの臨床適用、並びにそれらを治療するためのブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）／ｃＧＰを含有する有機又は植物ベースの材料の濃縮抽出物の使用に関する方法の態様は、あくまで例として説明されており、本明細書中の特許請求の範囲の範囲から逸脱することなく、それらに対して修飾及び添加が実施されてもよいと理解されるべきではない。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物におけるＩＧＦ−１機能障害に関連した非神経学的及び／又は神経学的状態を治療する方法であって、
ａ）前記動物から生物学的検体を得るステップと；
ｂ）前記生物学的検体中での活性濃度依存性のインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）のバイオアベイラビリティに対するプラズマバイオマーカーとしての環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）の濃度を測定するステップと；
ｃ）前記生物学的検体中の前記測定されたｃＧＰ濃度及び／又はｃＧＰ濃度のＩＧＦ−１総測定量に対するモル比のいずれかを標準と比較することで、結果の連続体の中で、前記測定されたｃＧＰ濃度及び／又はｃＧＰ濃度のＩＧＦ−１総測定量に対する比が、前記個体のＩＧＦ−１機能を評価するための相対標準に一致するか否かを確認するステップと；
ｄ）ブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）の濃縮抽出物を治療有効量で前記動物に投与し、
動物におけるｃＧＰの濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対するモル比における減少を阻止し；及び／又は
動物における既存のｃＧＰの濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対するモル比を維持し；及び／又は
動物におけるｃＧＰの前記濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対するモル比を増加させるステップと、
を含む、方法。
【請求項２】
改変されたＩＧＦ−１機能を有するプラズマバイオマーカーとして環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）を利用して、動物における加齢に伴う非神経学的及び／又は神経学的状態のリスクを予測する方法であって、
ａ）前記動物から生物学的検体を得るステップと；
ｂ）前記動物の第１設定年齢時、又は前記非神経学的及び／又は神経学的状態の初期段階、又はブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）の濃縮抽出物の治療有効量での前記動物に対する処置前に、前記生物学的検体中での活性濃度依存性のインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）のバイオアベイラビリティに対するプラズマバイオマーカーとしての環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）の濃度を測定するステップと；
ｃ）前記動物のさらなる設定年齢間隔又は前記非神経学的及び／又は神経学的状態のさらなる段階、又はブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）の前記濃縮抽出物の前記治療有効量での前記動物に対する処置後に、前記生物学的検体中での活性濃度依存性のインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）のバイオアベイラビリティに対する環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）プラズマバイオマーカーの濃度を再測定するステップと；
ｄ）前記第１の設定年齢に対する前記設定年齢間隔、又はＩＧＦ−１機能障害を伴う前記非神経学的及び／又は神経学的状態の前記初期段階、又はブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）の濃縮抽出物の前記治療有効量での前記動物に対する前記処置前に、前記生物学的検体中での前記測定されたｃＧＰ濃度及び／又はｃＧＰ濃度のＩＧＦ−１総測定量に対するモル比のいずれかを比較することで、結果の連続体の中で、前記測定されたｃＧＰ濃度及び／又はｃＧＰ濃度のＩＧＦ−１総測定量に対するモル比において変化があるか否かを確認し、それにより前記動物における認知減退からの非神経学的及び／又は神経学的状態の発生リスクがベースラインデータの標準セットと比べて増加しているか否かを判定するステップと、
を含み、ここで前記測定された比が、ＢＣＡ処置についての個別患者及びそこでの前記ＢＣＡ処置に適した用量を選択するために用いられる、方法。
【請求項３】
ＩＧＦ−１機能に対するプラズマバイオマーカーとしての環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）及びｃＧＰ／ＩＧＦ−１モル比を利用して、ＩＧＦ−１機能障害を伴う非神経学的及び／又は神経学的状態を有する動物の自発的回復を予測する方法であって、
ａ）前記動物から生物学的検体を得るステップと；
ｂ）前記動物の前記非神経学的及び／又は神経学的状態の発症からの前記動物のベースライン時（＜７２時間）に前記生物学的検体中での活性濃度依存性のインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）のバイオアベイラビリティに対する環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）プラズマバイオマーカーの濃度を測定するステップと；
ｃ）前記動物の回復中のさらなる規則的間隔で、前記生物学的検体中での活性濃度依存性のインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）のバイオアベイラビリティに対する環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）プラズマバイオマーカーの濃度を再測定するステップと、
ｄ）前記ベースラインからの前記動物の機能的回復をさらなる設定間隔で評価するステップと、
を含み、ここで、前記動物におけるより高いベースラインｃＧＰ濃度、前記より陽性の予後が機能的回復の前記評価に基づくように、データの連続体からのＣＧＰの前記ベースライン濃度から、前記動物の非神経学的及び／又は神経学的状態の回復の短期転帰が予測される、方法。
【請求項４】
動物におけるｃＧＰの濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対するモル比における減少を阻止し；及び／又は
動物における既存のｃＧＰの濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対するモル比を維持し；及び／又は
動物におけるｃＧＰの前記濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対する比を増加させるための、製剤化される薬剤の製造におけるブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）の濃縮抽出物の使用。
【請求項５】
それを必要とする患者における非神経学的及び／又は神経学的状態の影響を改善し、及び／又はそれらを治療するための、経口投与用に製剤化される薬剤の製造におけるブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）の濃縮抽出物の使用。
【請求項６】
動物におけるｃＧＰの濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対するモル比における減少を阻止し；及び／又は
動物における既存のｃＧＰの（正常／生理学的）濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対するモル比を維持し；及び／又は
動物におけるｃＧＰの前記濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対するモル比を増加させる又は正常化するための、動物への投与用に製剤化される濃縮されたブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）を治療有効量で含む抽出物。
【請求項７】
それを必要とする患者における高血圧症及び／又は脳卒中の影響を改善し；及び／又は高血圧症及び／又は脳卒中を治療し；及び／又は高血圧症及び／又は脳卒中に関連する症状を低減するための方法であって、ブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）の濃縮抽出物を治療有効量で投与することを含む、方法。
【請求項８】
それを必要とする患者におけるパーキンソン病若しくはパーキンソン病に関連する症状、若しくは認識機能障害に伴う合併症の影響を改善し、及び／又はそれらを治療するための方法であって、ブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）の濃縮抽出物を治療有効量で投与することを含む、方法。
【請求項９】
前記非神経学的及び／又は神経学的状態又は疾患が、脳血管発作若しくは脳卒中、軽度認知障害（ＭＣＩ）、アルツハイマー病、血管性認知症、レット症候群、脳振盪、高血圧症及びそれに伴う脳合併症、パーキンソン病及び／又は任意の他の加齢関連状態若しくはＩＧＦ−１欠損関連状態である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
投与により、疾患又は状態の結果としてのｃＧＰ濃度における減少が停止する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
投与により、ｃＧＰ濃度が投与のない前記患者において測定される場合よりも少なくとも１％高く増加する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＢＣＡの添加により、前記ＣＳＦ中のＩＧＦ−１及びＩＧＦ結合タンパク質でなく、ｃＧＰの濃度が増加する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ＢＣＡの添加後、ｃＧＰ、ＩＧＦ−１及びＩＧＦＢＰの血漿濃度における測定可能な変化がない、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ｃＧＰの前記ＣＳＦ濃度が、ｃＧＰの血漿濃度及びｃＧＰ／ＩＧＦ−１比と相関する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記動物がヒトである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記動物が健常である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記動物が、既存の状態又は病態を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記標準又はベースラインが、患者について収集されたデータセットに基づく、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記標準又はベースラインが、集団について収集されたデータセットに基づく、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記生物学的検体が、脳脊髄（ＣＳＦ）、血漿、尿、及び／又は任意の他の生物学的検体（涙及び任意の他の身体機能）、並びにそれらの組み合わせから選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
ｃＧＰが、ＥＬＩＳＡ、ＨＰＬＣ、質量分析、及びそれらの組み合わせから選択される技術によって測定される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記薬剤が、経口投与用に製剤化される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記薬剤が、非経口投与用に製剤化される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記薬剤が、丸剤、錠剤、カプセル剤、液体、粉末、微粒子化された粉末又はゲルとして製剤化される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
１日あたり１２０ｍｇ〜６００ｍｇの用量のアントシアニンを前記動物に提供するため、薬剤が投与される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
１日あたり５０ｍｇ〜１０００ｍｇの用量のアントシアニンを前記動物に提供するため、前記薬剤が投与される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
ＢＣＡの添加後、脳脊髄液（ＣＳＦ）中でｃＧＰが少なくとも２５％増加する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）の範囲内に存在する前記環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）濃度が、１００ｍｇ中２７ｎｇ〜１００ｍｇ中１００ｎｇの間である、請求項４〜６のいずれか一項に記載の抽出物。
【請求項２９】
前記抽出物が、最大で４０％のアントシアニンを含む、請求項４〜６のいずれか一項に記載の抽出物。
【請求項３０】
前記抽出物カプセル剤又は他の送達手段が、少なくとも５０ｍｇ〜１０００ｍｇのアントシアニンを含む、請求項４〜６のいずれか一項に記載の抽出物。
【請求項３１】
前記ブラックカラントが、限定はされないが、アメリカ、アジア、オーストラリア、ヨーロッパ、及びニュージーランド内を含む、国際的に育成された任意のブラックカラント品種に由来する、請求項４〜６のいずれか一項に記載の抽出物。
【請求項３２】
前記ブラックカラントが、４０°を上回る緯度の北半球及び／又は赤道から５０°北の南半球において育成された果実に由来する、請求項３１に記載の抽出物。
【請求項３３】
前記アントシアニン：デルフィニジン−３−グルコシド、デルフィニジン−３−ルチノシド、シアニジン−３−グルコシド、シアニジン−３−ルチノシド、ペツニジン−３−ルトニオシド（rutonioside）、及びそれらの組み合わせを含めることによって特徴づけられる、請求項４〜６のいずれか一項に記載の抽出物。
【請求項３４】
デルフィニジン−３−グルコシド、デルフィニジン−３−ルチノシドシアニジン−３−グルコシド及びシアニジン−３−ルチノシドが、前記抽出物中のアントシアニンの総量の少なくとも８０％を含む、請求項３３に記載の抽出物。
【請求項３５】
前記抽出物が、ブラックカラントに由来し、標準のニュージーランドでのアントシアニン分析において、前記ブラックカラントからの非濃縮ジュース中で測定されるとき、
少なくとも６０ｍｇ／１００ｍｌのデルフィニジン−３−グルコシド；及び／又は
少なくとも２００ｍｇ／１００ｍｌのデルフィニジン−３−ルチノシド；及び／又は
少なくとも４０ｍｇ／１００ｍｌのシアニジン−３−グルコシド；及び／又は
少なくとも２４０ｍｇ／１００ｍｌのシアニジン−３−ルチノシド；及び／又は
少なくとも１４ｍｇ／１００ｍｌのペツニジン−３−ルトニオシド
を含む、請求項４〜６のいずれか一項に記載の抽出物。
【請求項３６】
動物におけるＩＧＦ−１機能障害を伴う非神経学的及び／又は神経学的状態を治療する方法であって、
ａ）前記動物から生物学的検体を得るステップと；
ｂ）前記生物学的検体中での活性濃度依存性のインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）のバイオアベイラビリティに対するプラズマバイオマーカーとしての環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）の濃度を測定するステップと；
ｃ）前記生物学的検体中での前記測定されたｃＧＰ濃度及び／又はｃＧＰ濃度のＩＧＦ−１総測定量に対する比のいずれかを標準と比較し、結果の連続体の中で、前記測定されたｃＧＰ濃度及び／又はｃＧＰ濃度のＩＧＦ−１総測定量に対する比が、前記個体のＩＧＦ−１機能を評価するための前記相対標準に一致するか否かを確認するステップと；
ｄ）ｃＧＰを含有する有機又は植物ベースの材料の濃縮抽出物を治療有効量で前記動物に投与し、
動物におけるｃＧＰの濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対するモル比における減少を阻止し；及び／又は
動物における既存のｃＧＰの濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対するモル比を維持し；及び／又は
動物におけるｃＧＰの濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対するモル比を増加させるステップと、
を含む、方法。
【請求項３７】
改変されたＩＧＦ−１機能を有するプラズマバイオマーカーとして環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）及びｃＧＰ／ＩＧＦ−１モル比を利用して、動物における加齢に伴う非神経学的及び／又は神経学的状態のリスクを予測する方法であって、
ａ）前記動物から生物学的検体を得るステップと；
ｂ）前記動物の第１設定年齢時、又は前記非神経学的及び／又は神経学的状態の初期段階、又はｃＧＰを含有する有機又は植物ベースの材料の濃縮抽出物の治療有効量での前記動物に対する処置前に、前記生物学的検体中での活性濃度依存性のインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）のバイオアベイラビリティに対するプラズマバイオマーカーとしての環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）の濃度及びｃＧＰ／ＩＧＦ−１モル比を測定するステップと；
ｃ）前記動物のさらなる設定年齢間隔又は前記非神経学的及び／又は神経学的状態のさらなる段階、又はｃＧＰを含有する有機又は植物ベースの材料の前記濃縮抽出物の前記治療有効量での処置後に、前記生物学的検体中での活性濃度依存性のインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）のバイオアベイラビリティに対する環状グリシン−プロリン（ｃＧＰ）バイオマーカーの濃度及びｃＧＰ／ＩＧＦ−１モル比を再測定するステップと；
ｄ）前記第１の設定年齢に対する前記設定年齢間隔、又はＩＧＦ−１機能障害を伴う前記非神経学的及び／又は神経学的状態の前記初期段階、又はｃＧＰを含有する有機又は植物ベースの材料の濃縮抽出物の前記治療有効量での前記動物に対する前記処置前に、前記生物学的検体中での前記測定されたｃＧＰ濃度及び／又はｃＧＰ濃度のＩＧＦ−１総測定量に対するモル比のいずれかを比較することで、結果の連続体の中で、前記測定されたｃＧＰ濃度及び／又はｃＧＰ濃度のＩＧＦ−１総測定量に対するモル比において変化があるか否かを確認し、それにより前記動物における認知減退からの非神経学的及び／又は神経学的状態の発生リスクがベースラインデータの標準セットと比べて増加しているか否かを判定するステップと、
を含み、ここで前記測定された比が、ｃＧＰを含有する有機又は植物ベースの材料での処置についての個別患者及びそこでの前記ｃＧＰを含有する有機又は植物ベースの材料での処置に適した用量を選択するために用いられる、方法。
【請求項３８】
動物におけるｃＧＰの濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対するモル比における減少を阻止し；及び／又は
動物における既存のｃＧＰの濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対するモル比を維持し；及び／又は
動物におけるｃＧＰの前記濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対するモル比を増加させるための、製剤化される薬剤の製造におけるｃＧＰを含有する有機又は植物ベースの材料の濃縮抽出物の使用。
【請求項３９】
それを必要とする患者における非神経学的及び／又は神経学的状態の影響を改善し、及び／又はそれらを治療するための、経口投与用に製剤化される薬剤の製造におけるｃＧＰを含有する有機又は植物ベースの材料の濃縮抽出物の使用。
【請求項４０】
動物におけるｃＧＰの濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対するモル比における減少を阻止し；及び／又は
動物における既存のｃＧＰの（正常／生理学的）濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対するモル比を維持し；及び／又は
動物におけるｃＧＰの前記濃度及び／又はｃＧＰのＩＧＦ−１総測定量に対するモル比を増加させる又は正常化するための、動物への投与用に製剤化されるｃＧＰを含有する有機又は植物ベースの材料の濃縮抽出物を治療有効量で含む抽出物。
【請求項４１】
それを必要とする患者における高血圧症及び／又は脳卒中の影響を改善し；及び／又は高血圧症及び／又は脳卒中を治療し；及び／又は高血圧症及び／又は脳卒中に関連する症状を低減するための方法であって、ｃＧＰを含有する有機又は植物ベースの材料の濃縮抽出物を治療有効量で投与することを含む、方法。
【請求項４２】
それを必要とする患者におけるパーキンソン病若しくはパーキンソン病に関連する症状、若しくは認識機能障害に伴う合併症の影響を改善し、及び／又はそれらを治療するための方法であって、ｃＧＰを含有する有機又は植物ベースの材料の濃縮抽出物を治療有効量で投与することを含む、方法
【請求項４３】
前記非神経学的及び／又は神経学的状態又は疾患が、脳血管発作若しくは脳卒中、軽度認知障害（ＭＣＩ）、アルツハイマー病、血管性認知症、レット症候群、脳振盪、高血圧症及びそれに伴う脳合併症、パーキンソン病及び／又は任意の他の加齢関連状態若しくはＩＧＦ−１欠損関連状態である、請求項３６又は請求項３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
投与により、疾患又は状態の結果としてのｃＧＰ濃度における減少が停止する、請求項３６又は請求項３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
投与により、ｃＧＰ濃度が投与のない前記患者において測定される場合よりも少なくとも１％高く増加する、請求項３６又は請求項３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記ｃＧＰを含有する有機又は植物ベースの材料の添加により、前記ＣＳＦ中のＩＧＦ−１及びＩＧＦ結合タンパク質ではなく、ｃＧＰの濃度が増加する、請求項３６又は請求項３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記ｃＧＰを含有する有機又は植物ベースの材料の添加後、ｃＧＰ、ＩＧＦ−１及びＩＧＦＢＰの血漿濃度における測定可能な変化がない、請求項３６又は請求項３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
ｃＧＰの前記ＣＳＦ濃度が、ｃＧＰの血漿濃度及びｃＧＰ／ＩＧＦ−１比と相関する、請求項３６又は請求項３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記動物がヒトである、請求項３６又は請求項３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記動物が健常である、請求項３６又は請求項３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記動物が、既存の状態又は病態を有する、請求項３６又は請求項３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記標準又はベースラインが、患者について収集されたデータセットに基づく、請求項３６又は請求項３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記標準又はベースラインが、集団について収集されたデータセットに基づく、請求項３６又は請求項３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記生物学的検体が、脳脊髄（ＣＳＦ）、血漿、尿、及び／又は任意の他の生物学的検体（涙及び任意の他の身体機能）、並びにそれらの組み合わせから選択される、請求項３６又は請求項３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
ｃＧＰが、ＥＬＩＳＡ、ＨＰＬＣ、質量分析、及びそれらの組み合わせから選択される技術によって測定される、請求項３６又は請求項３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記薬剤が、経口投与用に製剤化される、請求項３６又は請求項３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記薬剤が、非経口投与用に製剤化される、請求項３６又は請求項３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記薬剤が、丸剤、錠剤、カプセル剤、液体、粉末、微粒子化された粉末又はゲルとして製剤化される、請求項３６又は請求項３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
ｃＧＰを含有する有機又は植物ベースの材料の添加後、脳脊髄液（ＣＳＦ）中でｃＧＰが少なくとも２５％増加する、請求項３６又は請求項３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記ＢＣＡ抽出物及び／又はｃＧＰを含有する有機又は植物ベースの材料中に含まれる前記ｃＧＰ濃縮物を測定する前に、前記抽出物及び／又は材料が、Diaion HP20でコーティングされた樹脂ビーズを利用するクロマトグラフィーカラムを通じて処理される、請求項２１又は請求項５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
それを必要とする患者におけるレット症候群の影響を改善し、及び／又はそれを治療するための、経口投与用に製剤化された薬剤の製造における、ブラックカラントアントシアニン（ＢＣＡ）の濃縮抽出物とＩＧＦ−１との組み合わせの使用。
【国際調査報告】
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2020532587.tif 000044
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