(57)【要約】  リボスイッチ及び小リボザイム由来の足場のライブラリならびにそれらの使用方法が本明細書に提供される。本発明の足場は、構造的足場により容易に特定及び特徴付けされるアプタマーをもたらす。足場の性質は、読み取りドメインに結合するためのこれらのＲＮＡが、インビトロ及びインビボで機能するバイオセンサーを操作しやすくなることである。バイオセンサー、合成ＲＮＡ剤、及び合成ＤＮＡ剤、ならびにそれらの使用方法も提供される。
2020504096.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の同一でないオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドのライブラリであって、個々のオリゴヌクレオチドが、
ａ）ヘリックスドメインを含む第１の配列と、
ｂ）第１のヘアピンドメインを含む第２の配列と、
ｃ）第２のヘアピンドメインを含む第３の配列と、を含み、
前記ヘリックスドメイン、第１のヘアピンドメイン、及び第２のヘアピンドメインが、リガンド結合ドメインを含むオリゴヌクレオチド接合部を形成し、
前記ライブラリが、複数の同一でないリガンド結合ドメインを含む、前記オリゴヌクレオチドのライブラリ。
【請求項２】
各ヘリックスドメインが独立して、不適正塩基対、Ｇ・Ｕゆらぎ塩基対、及びバルジからなる群から選択される１つ以上の不安定化ヌクレオチドを任意選択で含む、完全に相補的なヘリックスである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドのライブラリ。
【請求項３】
各ヘリックスドメインが、完全に相補的なヘリックスである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドのライブラリ。
【請求項４】
各第１のヘアピンドメインが独立して、不適正塩基対、Ｇ・Ｕゆらぎ塩基対、及びバルジからなる群から選択される１つ以上の不安定化ヌクレオチドを含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドのライブラリ。
【請求項５】
各第２のヘアピンドメインが独立して、不適正塩基対、Ｇ・Ｕゆらぎ塩基対、及びバルジからなる群から選択される１つ以上の不安定化ヌクレオチドを含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドのライブラリ。
【請求項６】
前記ヘリックスドメインが、少なくとも４〜１０塩基対の長さである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドのライブラリ。
【請求項７】
前記ヘリックスドメインが、少なくとも１０塩基対の長さである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドのライブラリ。
【請求項８】
前記オリゴヌクレオチドが、オリゴリボヌクレオチドである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドのライブラリ。
【請求項９】
前記オリゴヌクレオチドが個々に、式Ｉに従う一連の連結配列を有する配列を含み、
Ｐ１−Ｊ１／２−Ｐ２−Ｌ２−Ｐ２’−Ｊ２／３−Ｐ３−Ｌ３−Ｐ３’−Ｊ３／１−Ｐ１’
（Ｉ）
式中、
−が、結合を表し、
Ｐ１及びＰ１’が、前記ヘリックスを形成し、
Ｐ２、Ｌ２、及びＰ２’が、前記第１のヘアピンを形成し、
Ｐ３、Ｌ３、及びＰ３’が、前記第２のヘアピンを形成し、
Ｊ１／２、Ｊ２／３、及びＪ３／１が一緒に、前記オリゴヌクレオチド接合部を形成する、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドのライブラリ。
【請求項１０】
Ｊ２／３が、Ｔループモチーフを含む、請求項９に記載のオリゴヌクレオチドのライブラリ。
【請求項１１】
前記Ｔループモチーフが、配列ＵＵＧＡＡを含む、請求項１０に記載のオリゴヌクレオチドのライブラリ。
【請求項１２】
前記Ｔループのグアノシンが、Ｊ３／１においてシチジンとワトソン・クリック塩基対を形成する、請求項１１に記載のオリゴヌクレオチドのライブラリ。
【請求項１３】
前記ヘリックスドメインが、第１の端部及び第２の端部を有し、前記第１の端部が、前記オリゴヌクレオチド接合部の近位にあり、前記第２の端部が、オリゴヌクレオチドに基づく読み取りモジュールに連結されている、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドのライブラリ。
【請求項１４】
前記オリゴヌクレオチドに基づく読み取りモジュールが、蛍光発生またはスイッチに基づく読み取りモジュールである、請求項１３に記載のオリゴヌクレオチドのライブラリ。
【請求項１５】
前記蛍光発生モジュールが、ブロッコリーフルオロフォア結合アプタマーである、請求項１４に記載のオリゴヌクレオチドのライブラリ。
【請求項１６】
前記スイッチに基づくモジュールが、ｐｂｕＥスイッチである、請求項１４に記載のオリゴヌクレオチドのライブラリ。
【請求項１７】
前記オリゴヌクレオチドに基づく読み取りモジュールが、オリゴリボヌクレオチドに基づく読み取りモジュールである、請求項１３に記載のオリゴヌクレオチドのライブラリ。
【請求項１８】
個々のオリゴヌクレオチドが、前記オリゴヌクレオチド接合部内に約２３の可変ヌクレオチド残基を含む、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｘｐｔ−ｐｂｕＸグアニンリボスイッチ配列に対する配列対応を有する、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドのライブラリ。
【請求項１９】
個々のオリゴヌクレオチドが、前記オリゴヌクレオチド接合部内に約２１の可変ヌクレオチド残基を含む、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａ  Ｖｃ２環状ジ−ＧＭＰリボスイッチ配列に対する配列対応を有する、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドのライブラリ。
【請求項２０】
個々のオリゴヌクレオチドが、前記オリゴヌクレオチド接合部内に約２１の可変ヌクレオチド残基を含む、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉハンマーヘッド型リボザイム配列に対する配列対応を有する、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドのライブラリ。
【請求項２１】
前記オリゴヌクレオチド接合部が、Ｎ方向接合部であり、Ｎが、２、３、４、または５である、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドのライブラリ。
【請求項２２】
前記オリゴヌクレオチド接合部が、Ｎ方向接合部であり、Ｎが２である、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドのライブラリ。
【請求項２３】
前記オリゴヌクレオチド接合部が、Ｎ方向接合部であり、Ｎが３である、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドのライブラリ。
【請求項２４】
前記オリゴヌクレオチド接合部が、Ｎ方向接合部であり、Ｎが４である、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドのライブラリ。
【請求項２５】
前記オリゴヌクレオチド接合部が、Ｎ方向接合部であり、Ｎが５である、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドのライブラリ。
【請求項２６】
前記ライブラリが、約４２１〜約４２３の同一でないメンバーを含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドのライブラリ。
【請求項２７】
複数の同一でないオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドのライブラリであって、個々のオリゴヌクレオチドが、
ａ）ヘリックスドメインを含む第１の配列と、
ｂ）第１のヘアピンドメインを含む第２の配列と、
ｃ）第２のヘアピンドメインを含む第３の配列と、を含み、
前記ヘリックスドメイン、前記第１のヘアピンドメイン、及び前記第２のヘアピンドメインが、事前選択されたリガンド結合ドメインを含むオリゴヌクレオチド接合部を形成し、
前記ライブラリが、複数の同一でないリガンド結合ドメインを含む、前記オリゴヌクレオチドのライブラリ。
【請求項２８】
各ヘリックスドメインが独立して、不適正塩基対、Ｇ・Ｕゆらぎ塩基対、及びバルジからなる群から選択される１つ以上の不安定化ヌクレオチドを任意選択で含む、完全に相補的なヘリックスである、請求項２７に記載のオリゴヌクレオチドのライブラリ。
【請求項２９】
各ヘリックスドメインが、完全に相補的なヘリックスである、請求項２７に記載のオリゴヌクレオチドのライブラリ。
【請求項３０】
各第１のヘアピンドメインが独立して、不適正塩基対、Ｇ・Ｕゆらぎ塩基対、及びバルジからなる群から選択される１つ以上の不安定化ヌクレオチドを含む、請求項２７に記載のオリゴヌクレオチドのライブラリ。
【請求項３１】
各第２のヘアピンドメインが独立して、不適正塩基対、Ｇ・Ｕゆらぎ塩基対、及びバルジからなる群から選択される１つ以上の不安定化ヌクレオチドを含む、請求項２７に記載のオリゴヌクレオチドのライブラリ。
【請求項３２】
前記ヘリックスドメインが、少なくとも４〜１０塩基対の長さである、請求項２７に記載のオリゴヌクレオチドのライブラリ。
【請求項３３】
前記ヘリックスドメインが、少なくとも１０塩基対の長さである、請求項２７に記載のオリゴヌクレオチドのライブラリ。
【請求項３４】
前記オリゴヌクレオチドが、オリゴリボヌクレオチドである、請求項２７に記載のオリゴヌクレオチドのライブラリ。
【請求項３５】
個々のオリゴヌクレオチドが、式Ｉに従う一連の連結配列を有する配列を含み、
Ｐ１−Ｊ１／２−Ｐ２−Ｌ２−Ｐ２’−Ｊ２／３−Ｐ３−Ｌ３−Ｐ３’−Ｊ３／１−Ｐ１’
（Ｉ）
式中、
−が、結合を表し、
Ｐ１及びＰ１’が、前記ヘリックスを形成し、
Ｐ２、Ｌ２、及びＰ２’が、前記第１のヘアピンを形成し、
Ｐ３、Ｌ３、及びＰ３’が、前記第２のヘアピンを形成し、
Ｊ１／２、Ｊ２／３、及びＪ３／１が一緒に、前記オリゴヌクレオチド接合部を形成する、請求項２７に記載のオリゴヌクレオチドのライブラリ。
【請求項３６】
Ｊ２／３が、Ｔループモチーフを含む、請求項３５に記載のオリゴヌクレオチドのライブラリ。
【請求項３７】
前記Ｔループモチーフが、配列ＵＵＧＡＡを含む、請求項３６に記載のオリゴヌクレオチドのライブラリ。
【請求項３８】
前記Ｔループのグアノシンが、Ｊ３／１においてシチジンとワトソン・クリック塩基対を形成する、請求項３７に記載のオリゴヌクレオチドのライブラリ。
【請求項３９】
前記ヘリックスドメインが、第１の端部及び第２の端部を有し、前記第１の端部が、前記オリゴヌクレオチド接合部の近位にあり、前記第２の端部が、オリゴヌクレオチドに基づく読み取りモジュールに連結されている、請求項２７に記載のオリゴヌクレオチドのライブラリ。
【請求項４０】
前記オリゴヌクレオチドに基づく読み取りモジュールが、蛍光発生またはスイッチに基づく読み取りモジュールである、請求項３９に記載のオリゴヌクレオチドのライブラリ。
【請求項４１】
前記蛍光発生モジュールが、ブロッコリーフルオロフォア結合アプタマーである、請求項４０に記載のオリゴヌクレオチドのライブラリ。
【請求項４２】
前記スイッチに基づくモジュールが、ｐｂｕＥスイッチである、請求項４０に記載のオリゴヌクレオチドのライブラリ。
【請求項４３】
前記オリゴヌクレオチドに基づく読み取りモジュールが、オリゴリボヌクレオチドに基づく読み取りモジュールである、請求項３９に記載のオリゴヌクレオチドのライブラリ。
【請求項４４】
個々のオリゴヌクレオチドが、前記オリゴヌクレオチド接合部内に約２３の可変ヌクレオチド残基を含む、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｘｐｔ−ｐｂｕＸグアニンリボスイッチ配列に対する配列対応を有する配列を含む、請求項２７に記載のオリゴヌクレオチドのライブラリ。
【請求項４５】
個々のオリゴヌクレオチドが、前記オリゴヌクレオチド接合部内に約２１の可変ヌクレオチド残基を含む、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａ  Ｖｃ２環状ジ−ＧＭＰリボスイッチ配列に対する配列対応を有する配列を含む、請求項２７に記載のオリゴヌクレオチドのライブラリ。
【請求項４６】
個々のオリゴヌクレオチドが、前記オリゴヌクレオチド接合部内に約２１の可変ヌクレオチド残基を含む、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉハンマーヘッド型リボザイム配列に対する配列対応を有する配列を含む、請求項２７に記載のオリゴヌクレオチドのライブラリ。
【請求項４７】
前記オリゴヌクレオチド接合部が、Ｎ方向接合部であり、Ｎが、２、３、４、または５である、請求項２７に記載のオリゴヌクレオチドのライブラリ。
【請求項４８】
前記オリゴヌクレオチド接合部が、Ｎ方向接合部であり、Ｎが２である、請求項２７に記載のオリゴヌクレオチドのライブラリ。
【請求項４９】
前記オリゴヌクレオチド接合部が、Ｎ方向接合部であり、Ｎが３である、請求項２７に記載のオリゴヌクレオチドのライブラリ。
【請求項５０】
前記オリゴヌクレオチド接合部が、Ｎ方向接合部であり、Ｎが４である、請求項２７に記載のオリゴヌクレオチドのライブラリ。
【請求項５１】
前記オリゴヌクレオチド接合部が、Ｎ方向接合部であり、Ｎが５である、請求項２７に記載のオリゴヌクレオチドのライブラリ。
【請求項５２】
前記事前選択されたリガンド結合部位が、アミノ酸、ペプチド、核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、金属イオン、神経伝達物質、ホルモン、原薬、及びそれらの誘導体からなる群から選択される化合物の結合部位を含む、請求項２７に記載のオリゴヌクレオチドのライブラリ。
【請求項５３】
前記事前選択されたリガンド結合部位が、アミノ酸、核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、神経伝達物質、ホルモン、及びそれらの誘導体からなる群から選択されるリガンドの結合部位を含む、請求項５２に記載のオリゴヌクレオチドのライブラリ。
【請求項５４】
前記事前選択されたリガンド結合部位が、ヌクレオチド、神経伝達物質、ホルモン、及びそれらの誘導体からなる群から選択されるリガンドの結合部位を含む、請求項５３に記載のオリゴヌクレオチドのライブラリ。
【請求項５５】
前記事前選択されたリガンド結合部位が、５−ヒドロキシ−Ｌ−トリプトファン、Ｌ−トリプトファン、セロトニン、及び５−ヒドロキシ−Ｌ−トリプトファン−メチルアミドからなる群から選択される少なくとも１つのリガンドの結合部位を含む、請求項２７に記載のオリゴヌクレオチドのライブラリ。
【請求項５６】
前記リガンドが、５−ヒドロキシ−Ｌ−トリプトファンまたはセロトニンのうちの少なくとも１つである、請求項５５に記載のオリゴヌクレオチドのライブラリ。
【請求項５７】
複数の同一でないリガンド結合オリゴヌクレオチドの選択方法であって、
１）複数のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドのライブラリを、リガンド結合に適した条件下でリガンドと接触させるステップであって、個々のオリゴヌクレオチドが、
ａ）ヘリックスドメインを含む第１の配列と、
ｂ）第１のヘアピンドメインを含む第２の配列と、
ｃ）第２のヘアピンドメインを含む第３の配列と、を含み、
前記ヘリックスドメイン、第１のヘアピンドメイン、及び第２のヘアピンドメインが、オリゴヌクレオチド接合部を形成する、前記接触させるステップと、
２）前記複数の同一でないリガンド結合オリゴヌクレオチドが選択されるように空間的にアドレス可能に前記オリゴヌクレオチドのライブラリを分配するステップであって、前記オリゴヌクレオチド接合部を有する前記オリゴヌクレオチドが、リガンド結合ドメインを更に含み、前記オリゴヌクレオチドのライブラリの前記リガンド結合ドメインが、可変ヌクレオチド残基を含む、が選択される、前記分配するステップと、を含む、前記方法。
【請求項５８】
前記方法が、ステップ１）とステップ２）との間にステップ１ａ）を更に含み、ステップ１ａ）が、前記オリゴヌクレオチドのライブラリを遊離リガンドの溶液で競合的に分配することを含む、請求項５７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１６年１２月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／４３２，８７９号の優先権の利益を主張し、その内容は、全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦支援研究または開発に関する陳述
本発明は、国立科学財団により付与された助成金番号ＣＭＭＩ  ＣＨＥ１１５０８３４の下、政府の支援を受けて行われた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
アロステリックＲＮＡデバイスは、酵素進化を監視する、操作された代謝経路を最適化する、新規遺伝子及び核酸に基づく治療薬の調節因子の発見を容易にすることができる重要なツールとますますみなされている。しかしながら、これらのプラットホームの開発における１つの障害は、細胞環境において頑強に機能する小分子結合ＲＮＡアプタマーの利用可能性である。アプタマーはインビトロ選択によりほぼ全ての所望の標的に対して生じさせることができるが、これらのＲＮＡに基づくアプタマーの多くは、デバイスに容易に組み込むことができないか、または細胞状況において確実に機能しない。したがって、アプタマー及びアプタマーを開発する方法の必要性が依然として存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国仮特許出願第６２／４３２，８７９号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
リボスイッチ及び小リボザイム由来の足場を使用する新規アプローチが本明細書において記載される。例示的な態様において、ここで５−ヒドロキシトリプトファンに適用されたこのアプローチは、構造的足場により容易に特定及び特徴付けされるアプタマーをもたらす。足場の性質は、読み取りドメインに結合するためのこれらのＲＮＡが、インビトロ及び細胞状況で機能する核酸デバイスを操作しやすくなることである。
【０００６】
一態様では、複数の同一でないオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドのライブラリが提供される提供される。ライブラリの個々のオリゴヌクレオチドは、ヘリックスドメインを含む第１の配列、第１のヘアピンドメインを含む第２の配列、及び第２のヘアピンドメインを含む第３の配列を含み、ヘリックスドメイン、第１のヘアピンドメイン、及び第２のヘアピンドメインは、リガンド結合ドメインを含むオリゴヌクレオチド接合部を形成し、ライブラリは、複数の同一でないリガンド結合ドメインを含む。
【０００７】
一実施形態では、各ヘリックスドメインは独立して、不適正塩基対、Ｇ・Ｕゆらぎ塩基対、及びバルジからなる群から選択される１つ以上の不安定化ヌクレオチドを任意選択で含む、完全に相補的なヘリックスである。一実施形態では、各ヘリックスドメインは、完全に相補的なヘリックスである。
【０００８】
一実施形態では、各第１のヘアピンドメインは独立して、不適正塩基対、Ｇ・Ｕゆらぎ塩基対、及びバルジからなる群から選択される１つ以上の不安定化ヌクレオチドを含み、及び／または各第２のヘアピンドメインは独立して、不適正塩基対、Ｇ・Ｕゆらぎ塩基対、及びバルジからなる群から選択される１つ以上の不安定化ヌクレオチドを含む。
【０００９】
一実施形態では、ヘリックスドメインは、少なくとも４〜１０塩基対の長さ、または少なくとも１０塩基対の長さである。
【００１０】
一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、オリゴリボヌクレオチドである。
【００１１】
一実施形態では、オリゴヌクレオチドは個々に、式Ｉ：Ｐ１−Ｊ１／２−Ｐ２−Ｌ２−Ｐ２’−Ｊ２／３−Ｐ３−Ｌ３−Ｐ３’−Ｊ３／１−Ｐ１’（Ｉ）に従う一連の連結配列を有する配列を含み、式中、「−」は、結合を表し、Ｐ１及びＰ１’は、ヘリックスを形成し、Ｐ２、Ｌ２、及びＰ２’は、第１のヘアピンを形成し、Ｐ３、Ｌ３、及びＰ３’は、第２のヘアピンを形成し、Ｊ１／２、Ｊ２／３、及びＪ３／１は一緒に、オリゴヌクレオチド接合部を形成する。一実施形態では、Ｊ２／３は、Ｔループモチーフを含む。一実施形態では、Ｔループモチーフは、配列ＵＵＧＡＡを含み、任意選択で、Ｔループのグアノシンは、Ｊ３／１においてシチジンとワトソン・クリック塩基対を形成する。
【００１２】
一実施形態では、ヘリックスドメインは、第１の端部及び第２の端部を有し、第１の端部は、オリゴヌクレオチド接合部の近位にあり、第２の端部は、オリゴヌクレオチドに基づく読み取りモジュールに連結されている。一実施形態では、オリゴヌクレオチドに基づく読み取りモジュールは、蛍光発生の、例えば、ブロッコリーフルオロフォア結合アプタマー、またはスイッチに基づく読み取りモジュール、例えば、ｐｂｕＥスイッチである。一実施形態では、オリゴヌクレオチドに基づく読み取りモジュールは、オリゴリボヌクレオチドに基づく読み取りモジュールである。
【００１３】
一実施形態では、個々のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド接合部内に約２３の可変ヌクレオチド残基を含む、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｘｐｔ−ｐｂｕＸグアニンリボスイッチ配列に対応する配列を有するか、または個々のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド接合部内に約２１の可変ヌクレオチド残基を含む、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａ  Ｖｃ２環状ジ−ＧＭＰリボスイッチ配列に対応する配列を有するか、または個々のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド接合部内に約２１の可変ヌクレオチド残基を含む、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉハンマーヘッド型リボザイム配列に対応する配列を有する。
【００１４】
一実施形態では、オリゴヌクレオチド接合部は、Ｎ方向接合部であり、Ｎは、２、３、４、または５であるか、またはＮは２であるか、またはＮは３であるか、またはＮは４であるか、またはＮは５である。
【００１５】
一実施形態では、ライブラリは、約４２１〜約４２３の同一でないメンバーを含む。
【００１６】
別の態様では、複数の同一でないオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドのライブラリが提供される。ライブラリの個々のオリゴヌクレオチドは、ヘリックスドメインを含む第１の配列、第１のヘアピンドメインを含む第２の配列、及び第２のヘアピンドメインを含む第３の配列を含み、ヘリックスドメイン、第１のヘアピンドメイン、及び第２のヘアピンドメインは、事前選択されたリガンド結合ドメインを含むオリゴヌクレオチド接合部を形成し、ライブラリは、複数の同一でないリガンド結合ドメインを含む。
【００１７】
一実施形態では、各ヘリックスドメインは独立して、不適正塩基対、Ｇ・Ｕゆらぎ塩基対、及びバルジからなる群から選択される１つ以上の不安定化ヌクレオチドを任意選択で含む、完全に相補的なヘリックスである。一実施形態では、各ヘリックスドメインは、完全に相補的なヘリックスである。
【００１８】
一実施形態では、各第１のヘアピンドメインは独立して、不適正塩基対、Ｇ・Ｕゆらぎ塩基対、及びバルジからなる群から選択される１つ以上の不安定化ヌクレオチドを含み、及び／または各第２のヘアピンドメインは独立して、不適正塩基対、Ｇ・Ｕゆらぎ塩基対、及びバルジからなる群から選択される１つ以上の不安定化ヌクレオチドを含む。
【００１９】
一実施形態では、ヘリックスドメインは、少なくとも４〜１０塩基対の長さ、または少なくとも１０塩基対の長さである。
【００２０】
一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、オリゴリボヌクレオチドである。
【００２１】
一実施形態では、個々のオリゴヌクレオチドは、式Ｉ：Ｐ１−Ｊ１／２−Ｐ２−Ｌ２−Ｐ２’−Ｊ２／３−Ｐ３−Ｌ３−Ｐ３’−Ｊ３／１−Ｐ１’（Ｉ）に従う一連の連結配列を有する配列を含み、式中、「−」は、結合を表し、Ｐ１及びＰ１’は、ヘリックスを形成し、Ｐ２、Ｌ２、及びＰ２’は、第１のヘアピンを形成し、Ｐ３、Ｌ３、及びＰ３’は、第２のヘアピンを形成し、Ｊ１／２、Ｊ２／３、及びＪ３／１は一緒に、オリゴヌクレオチド接合部を形成する。一実施形態では、Ｊ２／３は、Ｔループモチーフを含む。一実施形態では、Ｔループモチーフは、配列ＵＵＧＡＡを含み、任意選択で、Ｔループのグアノシンは、Ｊ３／１においてシチジンとワトソン・クリック塩基対を形成する。
【００２２】
一実施形態では、ヘリックスドメインは、第１の端部及び第２の端部を有し、第１の端部は、オリゴヌクレオチド接合部の近位にあり、第２の端部は、オリゴヌクレオチドに基づく読み取りモジュールに連結されている。一実施形態では、オリゴヌクレオチドに基づく読み取りモジュールは、蛍光発生であり、例えば、ブロッコリーフルオロフォア結合アプタマー、またはスイッチに基づく読み取りモジュール、例えば、ｐｂｕＥスイッチである。一実施形態では、オリゴヌクレオチドに基づく読み取りモジュールは、オリゴリボヌクレオチドに基づく読み取りモジュールである。
【００２３】
一実施形態では、個々のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド接合部内に約２３の可変ヌクレオチド残基を含む、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｘｐｔ−ｐｂｕＸグアニンリボスイッチ配列に対する配列対応を有する配列を含むか、または個々のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド接合部内に約２１の可変ヌクレオチド残基を含む、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａ  Ｖｃ２環状ジ−ＧＭＰリボスイッチ配列に対する配列対応を有する配列を含むか、または個々のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド接合部内に約２１の可変ヌクレオチド残基を含む、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉハンマーヘッド型リボザイム配列に対応する配列を有する配列を含む。
【００２４】
一実施形態では、オリゴヌクレオチド接合部は、Ｎ方向接合部であり、Ｎは、２、３、４、もしくは５であるか、またはＮは２であるか、またはＮは３であるか、またはＮは４であるか、またはＮは５である。
【００２５】
一実施形態では、事前選択されたリガンド結合部位は、アミノ酸、ペプチド、核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、金属イオン、神経伝達物質、ホルモン、原薬、及びそれらの誘導体からなる群から選択される化合物の結合部位を含む。一実施形態では、事前選択されたリガンド結合部位は、アミノ酸、核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、神経伝達物質、ホルモン、及びそれらの誘導体からなる群から選択されるリガンドの結合部位を含む。一実施形態では、事前選択されたリガンド結合部位は、５−ヒドロキシ−Ｌ−トリプトファン、Ｌ−トリプトファン、セロトニン、及び５−ヒドロキシ−Ｌ−トリプトファン−メチルアミドからなる群から選択される少なくとも１つのリガンドの結合部位を含む。一実施形態では、リガンドは、５−ヒドロキシ−Ｌ−トリプトファンまたはセロトニンのうちの少なくとも１つである。
【００２６】
また別の態様では、複数の同一でないリガンド結合オリゴヌクレオチドの選択方法が提供される。本方法は、複数のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドのライブラリを、リガンド結合に適した条件下でリガンドと接触させるステップであって、個々のオリゴヌクレオチドが、ヘリックスドメインを含む第１の配列、第１のヘアピンドメインを含む第２の配列、及び第２のヘアピンドメインを含む第３の配列を含み、ヘリックスドメイン、第１のヘアピンドメイン、及び第２のヘアピンドメインがオリゴヌクレオチド接合部を形成する、接触させるステップと、複数の同一でないリガンド結合オリゴヌクレオチドが選択されるように空間的にアドレス可能にオリゴヌクレオチドのライブラリを分配するステップであって、オリゴヌクレオチド接合部を有するオリゴヌクレオチドが、リガンド結合ドメインを更に含み、オリゴヌクレオチドのライブラリのリガンド結合ドメインが、可変ヌクレオチド残基を含む、が選択される、分配するステップと、を含む。
【００２７】
一実施形態では、本方法は、接触ステップと分配ステップとの間に、オリゴヌクレオチドのライブラリを遊離リガンドの溶液で競合的に分配することを含むステップを更に含む。
【００２８】
本発明の前述の及び他の特長ならびに利点は、添付の図面と併せて、以下の例示的な実施形態の詳細な説明からより完全に理解されるであろう。本特許または出願書類は、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラーの図面（複数可）を含むこの特許または特許出願公開のコピーは、要求及び必要な料金の支払いにより、官庁により提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１Ａ】ＧＲ足場を示す。ＧＲ足場は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｘｐｔ−ｐｂｕＸグアニンリボスイッチのアプタマードメインに由来する。アプタマーは、グアニン（Ｇｕａ、赤紫色）結合部位を含む３方向接合部の接合（Ｊ）領域によって接続された３対（Ｐ）の領域からなる（破線は、直接的なＲＮＡ−リガンド相互作用を表す）。囲まれた青緑色のヌクレオチドは、選択のためにランダム化されたものである。Ｐ２及びＰ３の末端ループ（Ｌ２及びＬ３、緑色のボックス）は、ドメインを編成する三次相互作用に関与する。下はＲＮＡ（ＰＤＢ  ＩＤ  ４ＦＥ５）の三次元構造であり、同じ色のスキームは、リガンド結合部位とランダム化ヌクレオチドとの間の空間的関係を強調する。
【図１Ｂ】ＣＤＧ足場を示す。アプタマードメインＶ．ｃｈｏｌｅｒａ  Ｖｃ２環状ジ−ＧＭＰリボスイッチ（ＰＤＢ  ＩＤ  ３ＩＷＮ）由来のＣＤＧ足場の二次（上）及び三次（下）構造。標識及び色付けスキームは、図１Ａに記載される通りである。
【図１Ｃ】ＨＨ足場を示す。Ｓ．ｍａｎｓｏｎｉハンマーヘッド型リボザイム（ＰＤＢ  ＩＤ  ３ＺＰ８）由来のＨＨ足場の二次（上）及び三次（下）構造。標識及び色付けスキームは、図１Ａに記載される通りである。
【図２−１】図２。図２Ａは、５−ヒドロキシ−Ｌ−トリプトファンの化学構造を示す。図２Ｂは、７回目のＧＲ−ＳＳＩＩＩ選択から導かれた配列の距離行列の無根系統樹表示を示す。配列は、独自に色付けされる３つの主なクラスターに群分けされる。距離は、樹の２つのノード間の部位ごとにいくつの置換が生じたかの最尤推定値（ＭＬＥ）として表される（棒は尺度のために示される）。図２Ｃは、７回目のＧＲ−ＧｓＩ選択から導かれた配列の距離行列の無根系統樹表示を示す。代表的な配列が分析された４つのクラスターは、独自の色で示される（説明文は右側に示される）；黒色の領域は、樹の分析されないクラスター及び領域を表す。図２Ｄは、ＧＲ選択から導かれた６つの観察されたクラスターの共変動モデルを示す；色は図２Ｂ及び２Ｃと一致する。破線は、ランダム化された足場の領域と対応し、Ｌ２及びＬ３を結ぶ線は、三次相互作用を支持するであろう配列が維持されたクラスターを示す。
【図２−２】図２の続き。
【図３−１】図３。図３Ａは、天然ｘｐｔグアニンリボスイッチと比較した、３つの配列（５ＨＴＰ−Ｉ、−ＩＩ、及び−ＩＩＩ）のＳｅｌｅｃｔｉｖｅ  ２’−Ｈｙｄｒｏｘｙｌ  Ａｃｙｌａｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｚｅｄ  ｂｙ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ（「ＳＨＡＰＥ」）の化学プロービングの結果を示す。明確にするために、Ｊ２／３鎖及びＬ３に対応するゲルの領域が示される（ゲル全体は補足図４ａに示される）。３つ全てのＲＮＡは、Ｊ２／３内またはそれに隣接するＲＮＡ骨格の化学反応性におけるリガンド依存的な減少を明らかにしたが、５ＨＴＰ−ＩＩのみが、ｘｐｔグアニンリボスイッチにおいてＬ２とのその相互作用の形成を示すＬ３における反応性の特徴的なホットスポットを保持する。図３Ｂは、５ＨＴＰの存在下及び不在下での５ＨＴＰ−ＩＩのＳＨＡＰＥプロービングのリガンド依存的な差次的強度の定量化であり、大部分の反応性の変化は接合部に局在することを明らかにする。Ｌ３シグナルの増強は、接合部のリガンド結合と三次構造形成との間の結合を示唆する。図３Ｃは、５’−及び３’−増幅カセットを有する（左）または有しない（右）５ＨＴＰ−ＩＩへの５ＨＴＰの結合の等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）分析を示し、これらの領域がリガンド結合に影響を及ぼさないことを示す。図３Ｄは、５−ヒドロキシトリプトファン（赤紫色）と複合した５ＨＴＰ−ＩＩアプタマーの結晶構造を示す。緑色は、親足場（図１Ａ）のＬ２−Ｌ３相互作用を強調し、青緑色は、開始ＲＮＡライブラリにおいてランダム化されたヌクレオチドを示す。図３Ｅは、パネル（Ｂ）の定量化されたＳＨＡＰＥ反応性データの、ＲＮＡ骨格及び構造の動力学におけるリガンド依存的変化間の関係を強調する結晶構造上へのオーバーレイを示す。
【図３−２】図３の続き。
【図３−３】図３の続き。
【図４】図４Ａは、５ＨＴＰ−ＩＩアプタマーにおける５ＨＴＰの結合ポケットを示す。３方向接合部内の５ＨＴＰ結合ポケットは、化合物を固定化するためにアミドとなるカルボキシレート基の１個の酸素原子を除き、５−ヒドロキシトリプトファンの全ての極性官能基を係合する一組の水素結合相互作用を形成する。加えて、複合体は、５ＨＴＰのヒドロキシインドール環とＪ２／３のアデニン塩基（Ａ４８及びＡ４９）との間の相互作用を積み重ねることによって安定化される。図４Ｂは、５ＨＴＰ−ＩＩアプタマーにおける５ＨＴＰの結合ポケットを示す。５ＨＴＰ−ＩＩアプタマーにおける結合ポケットのコア（緑色）は、ｔＲＮＡＰｈｅ（橙色）及びチアミンピロリン酸（ＴＰＰ）リボスイッチ（青緑色）からのＴループとほぼ完全に重なるＴループである。３つの例の各々において、Ｔ４位及びＴ５位（Ｔ１〜５の番号付けはＴループモチーフ内のヌクレオチド位置を示す）の２つのプリン間の空間は、芳香族環の相互作用を可能にする。
【図５−１】図５。図５Ａは、５ＨＴＰアプタマーに基づくバイオセンサーがＥ．ｃｏｌｉにおいて機能することを示す。野生型５ＨＴＰ−ＩＩアプタマーは、５ＨＴＰの存在下でブロッコリーレポーターの蛍光を特異的に活性化する。ｔ＝０分で、２ｍＭの５ＨＴＰが培地に添加された。図５Ｂは、野生型５ＨＴＰ−ＩＩアプタマーがＬ−トリプトファンの存在下でブロッコリーレポーターの蛍光を特異的に活性化しないことを示す。ｔ＝０分で、５ｍＭのＬ−トリプトファンが培地に添加された。図５Ｃは、５ＨＴＰ−ＩＩアプタマー（Ａ４８Ｕ）の５ＨＴＰ結合ポケットにおける単一点変異もフルオロフォアの存在下で蛍光を消失させることを示す。ｔ＝０分で、２ｍＭの５ＨＴＰが培地に添加された。図５Ｄは、５ＨＴＰの存在下での野生型５ＨＴＰ−ＩＩ−ブロッコリーセンサーの蛍光誘導の単一細胞の痕跡を示す。ｔ＝０分で、２ｍＭの５ＨＴＰが培地に添加された。図５Ｅは、Ｌ−トリプトファンの存在下での野生型５ＨＴＰ−ＩＩ−ブロッコリーセンサーの蛍光誘導の単一細胞の痕跡を示す。ｔ＝０分で、５ｍＭのＬ−トリプトファンが培地に添加された。図５Ｆは、５ＨＴＰの存在下での結合不能５ＨＴＰ−ＩＩ  Ａ４８Ｕ構築物の蛍光誘導の単一細胞の痕跡を示す。ｔ＝０分で、２ｍＭの５ＨＴＰが培地に添加された。
【図５−２】図５の続き。
【図６Ａ】５ＨＴＰ−ＩＶアプタマーに基づく人工５ＨＴＰ／セロトニン「ＯＮ」リボスイッチの二次構造を示す。５ＨＴＰ−ＩＶアプタマーは破線で囲まれており、実線で囲まれたヌクレオチドは、代替えの構造形成に直接関与するヌクレオチドに対応する。
【図６Ｂ】５ＨＴＰ、セロトニン、または５ＨＴＰ−ＮＨｍｅの添加時に頑強な抗転写終結を示すリボスイッチの定量化された単一ターンオーバー転写反応を示す。転写反応のゲル画像は右側に示され、終結（Ｔ）からリードスルー（ＲＴ）産物のリガンド依存的な移行を表す。Ｌ−トリプトファンでの同様の滴定は、リードスルー転写をもたらすことができなかった。
【図７−１】図７。図７Ａは、ＧｓＩ逆転写酵素を使用して７回目のＣＤＧ選択から導かれた配列の距離行列の無根系統樹表示を示す。５ＨＴＰアプタマーの由来元のクラスターは、赤色で強調される。距離は、樹の２つのノード間の部位ごとにいくつの置換が生じたかの最尤推定値（ＭＬＥ）として表される（棒は尺度のために示される）。図７Ｂは、５ＨＴＰ−ＶＩＩアプタマーの共変動モデルを示す；赤色の実線は、ランダム化された生体足場（ｂｉｏｓｃａｆｆｏｌｄ）の領域に対応し、Ｌ２及びＰ３を結ぶ線は三次相互作用を示す。図７Ｃは、ＧｓＩ逆転写酵素を使用して７回目のＨＨ選択から導かれた配列の距離行列の無根系統樹表示を示す。５ＨＴＰ−ＶＩＩＩアプタマーの由来元のクラスターは、紫色で強調される；黒色の領域は、樹の分析されないクラスター及び領域を表す。図７Ｄは、５ＨＴＰ−ＶＩＩＩアプタマーの共変動モデルを示す；紫色の実線は、ランダム化された生体足場の領域に対応し、Ｐ２及びＬ３を結ぶ線は三次相互作用を示す。
【図７−２】図７の続き。
【図８】図８Ａは、７回目の選択による生体足場における変異の顕著な蓄積を示し、３’端のいくつかの位置ではＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した初期選択において９０％を超える変異頻度を達成する。二次及び三次構造（Ｐ２及びＰ３）に重要な配列要素において変異が蓄積する傾向も強い。図８Ｂは、開発されたグループＩＩイントロンＲＴ（ＧｓＩ−ＩＩＣ）を使用した修正された選択プロトコルを示し、ＧＲ生体足場、特にＰ２及びＰ３領域における変異の蓄積量を緩和することを示す。これは、配列内に設計された構造要素の保持を可能にする。図８Ｃは、７回目のＣＤＧ／ＧｓＩ選択におけるヌクレオチド位置の関数としての観察された誤差頻度を示す。図８Ｄは、７回目のＨＨ／ＧｓＩ選択におけるヌクレオチド位置の関数としての観察された誤差頻度を示す。
【図９−１】図９。図９Ａは、５ＨＴＰの不在下及び存在下での５ＨＴＰ−ＩＶ、−Ｖ、及び−ＶＩアプタマーのＳＨＡＰＥ分析を示す。横の棒は、３方向接合部における様々なリガンド依存的保護及びＬ２−Ｌ３相互作用のＬ３診断における特徴的な反応性ホットスポットの存在を示すＪ２／３及びＬ３領域を強調する。図９Ｂは、ＣＤＧ足場付き５ＨＴＰ結合アプタマーのＳＨＡＰＥ分析を示す。未加工のゲルは、Ｊ１／２及びＪ２／３において明らかなリガンド依存的修飾を示す。親Ｖｃ２  ＲＮＡは、テトラループドッキング部位のＰ３においてリガンド依存的保護を示す一方で、５ＨＴＰ−ＶＩＩアプタマーは、ヘリックスの反対側にリガンド依存的修飾を示す。加えて、いずれのＲＮＡも無関係なリガンドの存在下でいずれの修飾も示さない。図９Ｃは、ＨＨ足場付き５ＨＴＰ結合アプタマーのＳＨＡＰＥ分析を示す。未加工のゲルは、Ｊ１／２及びＪ２／３において明らかなリガンド依存的修飾を示す。Ｊ２／３における変化は、予測されたＴループモチーフの３位及び４位に主に局在する。加えて、構造が維持される場合、親ＲＮＡのＰ２にドッキングするＰ３の末端ループ（Ｌ３）はリガンド依存的保護を示す。ゲルからの距離の関数としてのバンドの統合は左側に示される。
【図９−２】図９の続き。
【図１０】図１０Ａは、２σで成形されたモデルの周りの５ＨＴＰ−ＩＩ／５ＨＴＰ複合体の２Ｆｏ−Ｆｃ電子密度図を示す。ＲＮＡの全ての領域は、電子密度によって良好に画定され、残基及び骨格の配置を明白にする。青緑色のヌクレオチドは元のＲＮＡライブラリにおいてランダム化され、５ＨＴＰは橙色で示される。図１０Ｂは、リガンド（５ＨＴＰ）及び隣接するイリジウムヘキサアンミン（ＩｒＨｅｘ）の配置を支持する明らかな密度を示す、１σで成形された５ＨＴＰ−ＩＩ／５ＨＴＰ複合体のリガンド結合ポケットを省いた複合物を示す。図１０Ｃは、１σで成形された５ＨＴＰ−ＩＩ／５ＨＴＰ複合体の５ＨＴＰ結合ポケットの最終２Ｆｏ−Ｆｃ電位密度図を示す。
【図１１】図１１Ａは、ＨＨ／ＧｓＩ選択の最も密度が高いクラスターの５ＨＴＰ−ＶＩＩＩアプタマーのＪ２／３の差異分析から導かれたＲ２Ｒダイアグラムを示す。図１１Ｂは、生物学的ＲＮＡｓ１にみられるＴループ（上）及び５ＨＴＰ−ＶＩＩＩアプタマーを含むクラスターの変動パターンを比較する５ＨＴＰ−ＶＩＩＩアプタマーのＪ２／３の差異分析を示す。
【図１２】５ＨＴＰ−ブロッコリーバイオセンサーの構築スキームを示す。ブロッコリー二次構造の赤色のヌクレオチドは、ＤＦＨＢＩのプラットホームを形成するＧ四重鎖を示し、緑色のヌクレオチドは、ホウレン草とブロッコリーとの間の相違を示す。
【図１３】本発明の新規足場アプタマーの設計を示す図解した抄録（ｇｒａｐｈｉｃａｌ  ａｂｓｔｒａｃｔ）である。
【図１４−１】図１４。図１４Ａは、ＧＲ−足場付きアプタマー（青緑色）が通信モジュール（橙色、ＣＭ；配列は下）を介して蛍光発生アプタマー（ブロッコリー、緑色）に結合され、ｔＲＮＡ足場（黄色）によりインビボで安定化される、５ＨＴＰ及びＬ−ＤＯＰＡの遺伝学的にコード化可能なバイオセンサーの二次構造の概略図である。図１４Ｂ及び図１４Ｃは、２〜５塩基対のＣＭでブロッコリーに結合された一連のＧＲ−足場付きアプタマーの、観察されたリガンド誘導蛍光（上）のヒートマップ及びｔＲＮＡ／ブロッコリー対照（下）に対するリガンド結合センサーの輝度を示す。図１４Ｄ及び図１４Ｅは、Ｅ．ｃｏｌｉにおける同じセンサーの性能のヒートマップを示す。
【図１４−２】図１４の続き。
【図１５−１】図１５。図１５Ａ及び図１５Ｂは、野生型５ＧＲ−ＩＩアプタマーは５ＨＴＰの存在下でブロッコリーレポーターの蛍光を特異的に活性化するが、Ｌ−トリプトファンの存在下では活性化しないことを示す。図１５Ｃは、５ＧＲ−ＩＩアプタマー（Ａ４８Ｕ）の５ＨＴＰ結合ポケットにおける単一点変異もフルオロフォアの存在下で蛍光を消失させることを示す。図１５Ｄ、図１５Ｅ及び図１５Ｆは、５ＨＴＰ、Ｌ−トリプトファンの存在下での野生型５ＧＲ−ＩＩ−ブロッコリーセンサー、及び５ＨＴＰの存在下での結合不能５ＧＲ−ＩＩ  Ａ４８Ｕ構築物の蛍光誘導の単一細胞の痕跡を示す。ｔ＝０分で、２ｍＭの５ＨＴＰまたは５ｍＭのＬ−トリプトファンのいずれかが培地に添加された。
【図１５−２】図１５の続き。
【図１６】図１６Ａは、全ての骨格原子への親Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ  ｘｐｔグアニンリボスイッチ及び５ＧＲ−１１  ＲＮＡの重ね合わせを示す。グアニンリボスイッチ（ＰＤＢ  ４ＦＥ５）は赤色で示され、そのリガンドのヒポキサンチンは赤紫色で示される。５ＧＲ−ＩＩアプタマーは青色で示され、そのリガンドの５ＨＴＰは緑色で示される。図１６Ｂは、Ｐ２及びＰ３のみの骨格原子を使用した２つのＲＮＡの重ね合わせを示す。図１６Ｃは、この三次相互作用を確立する個々の塩基相互作用の完全な保持を示す、Ｌ２−Ｌ３相互作用のコアを含む２つの塩基四重鎖の重ね合わせの図を示す。
【図１７−１】図１７。図１７Ａ〜図１７Ｄは、初期のＲＮＡライブラリの配列及び二次構造を示す。緑色のボックスはプライミングに使用される定常領域を強調し、黄色のボックスは各足場に特異的なバーコードを強調する。開始ライブラリにおいてランダム化されたヌクレオチドの位置は、青緑色で強調される。図１７Ａは、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＲＴを使用した、選択のためのグアニンリボスイッチアプタマー（ＧＲ）ＲＮＡライブラリの配列を示す。図１７Ｂは、ＧｓＩ−ＩＩＣ  ＲＴを使用した、選択のために使用されたＧＲ  ＲＮＡライブラリの配列を示す。図１７Ｃは、二環状ＧＭＰリボスイッチアプタマー（ＣＧ）ライブラリの配列を示す。図１７Ｄは、ハンマーヘッド型リボザイム（ＨＲ）ライブラリの配列を示す。
【図１７−２】図１７の続き。
【図１８−１】図１８。図１８Ａ〜図１８Ｃは、３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｌ−ＤＯＰＡ）に選択的に結合する足場付きアプタマーの配列を示す。図１８Ａは、ドーパミン（１）及びＬ−ＤＯＰＡ（２）の化学構造を示す。図１８Ｂは、Ｌ−ＤＯＰＡに対する７回目のＧＲ−ＧｓＩ−ＩＩＣ選択から導かれた配列の距離行列の無根系統樹表示を示す。代表的な配列が蛍光発生バイオセンサーに組み込まれた４つのクラスターは、独自の色で示される。黒色の領域は、樹の分析されないクラスター及び領域を表す。図１８Ｃは、色はパネル（Ｂ）のものと一致する、４つのクラスターの共変動モデルを示す。ＤＧＲ−ＩＩＩ  ＭＦＥ構造は、正しい場合、三次ループ−ループ相互作用を切断する、代替的な二次構造を有することに留意する。
【図１８−２】図１８の続き。
【図１９】ＧＲ足場付き５ＨＴＰ結合アプタマーのＳＨＡＰＥ分析を示す。この図は、図４Ａを生成するために使用されたゲルの完全な配列決定領域を示す。
【図２０】ＧＲ−足場付き５ＨＴＰ結合アプタマーのＳＨＡＰＥ分析を示す。図４Ａに示される配列決定ゲルの完全かつ未変更の画像（Ｊ２／３に対応する領域及びＬ３は図４Ａを作成するために切り取られた）。５ＧＲ−ＩＶ、−Ｖ、及び−ＶＩアプタマーのＳＨＡＰＥ分析は、５ＨＴＰの不在及び存在下で示される。横の棒は、３ＷＪにおける様々なリガンド依存的保護及びＬ２−Ｌ３相互作用のＬ３診断における特徴的な反応性ホットスポットの存在を示すＪ２／３及びＬ３領域を強調する。
【図２１】ＣＧ−足場付き５ＨＴＰ結合アプタマーのＳＨＡＰＥ分析を示す。未加工のゲル（挿入物）は、Ｊ１／２及びＪ２／３において明らかなリガンド依存的修飾を示す。親Ｖｃ２  ＲＮＡは、テトラループドッキング部位のＰ３においてリガンド依存的保護を示すが、５ＣＧ−Ｉアプタマーは、ヘリックスの反対側にリガンド依存的修飾を示す。加えて、いずれのＲＮＡも無関係なリガンドの存在下での修飾を示さない。ゲルからの距離の関数としてのバンドの統合は下に示される。正規化及び割り当て後、リガンド依存的な変化は、特にＪ１／２において、依然として明らかである（色付きの星印）。
【図２２】ＨＲ−足場付き５ＨＴＰ結合アプタマーのＳＨＡＰＥ分析を示す。未加工のゲル（右）は、Ｊ１／２及びＪ２／３において明らかなリガンド依存的修飾を示す。Ｊ２／３における変化は、予測されたＴループモチーフの３位及び４位に主に局在する。加えて、構造が維持される場合、親ＲＮＡのＰ２にドッキングするＰ３の末端ループ（Ｌ３）はリガンド依存的保護を示す。ゲルからの距離の関数としてのバンドの統合は左側に示される。正規化及び割り当て後、リガンド依存的な変化は、依然として明らかである（色付きの星印）。親ハンマーヘッド型ＲＮＡ（上の緑色の星印）における相当部位での背景切断はないことに留意する。
【図２３−１】図２３。Ｇ−ブロックとして合成された本発明の操作されたセンサーを示す。「Ｎ」は、Ａ、Ｃ、Ｇ、及びＴの組成が各々およそ２５％である位置を表す。ＲＮＡアプタマー及びセンサー配列は、それらの同等のＤＮＡ配列として示される。ブロッコリーセンサーの別個のドメインは、ｔＲＮＡ足場（灰色）、ＤＦＨＢＩ−１Ｔ結合ブロッコリーアプタマー（黄色）、通信モジュール（青緑色）、及びＧＲ足場付きアプタマー（赤色）を示すために色分けされている。
【図２３−２】図２３の続き。
【図２３−３】図２３の続き。
【図２３−４】図２３の続き。
【図２３−５】図２３の続き。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
新規の調節及び感知能力を有する合成ＲＮＡ及び／またはＤＮＡ要素を生成する手段は、インビトロ選択によって大いに可能となり、利用可能な合成アプタマーのプールは現在大きい。しかしながら、いくつかの小分子結合ＲＮＡアプタマーしか、それらの同族リガンドまたは他のＲＮＡデバイスの有効かつ広く使用される細胞内バイオセンサーに移行されない。インビトロ結合と細胞内活性との間のこの不一致は問題であり、現在の選択戦略が細胞環境において頑強に機能することができる小分子結合ＲＮＡアプタマーに容易にアクセスできないことを示唆する。小分子結合ＲＮＡのインビボ選択戦略は、細胞可能アプタマーの生成により多く成功しているかもしれないが、これらのアプローチは現在広く実用的ではない。したがって、現在の戦略は、機能強化のためのタンデムの用途特異的選択を用いた従来のインビトロ選択を組み込む長期ワークフローに依存し続ける。
【００３１】
合成アプタマーと違い、天然のリボスイッチの小分子結合ドメインは、細胞との関連で進化し、高忠実度の折り畳み及び下流調節スイッチとの通信能力を含むリガンド結合部位を超えて拡張する追加の特長を組み込んで、検出可能な出力をもたらす。これらのアプタマーは高度にモジュール式であり、頑強であり、細菌種の広域スペクトルにおいて観察され、転写、翻訳、選択的スプライシング、及びｍＲＮＡ安定性に作用する多様な調節ドメインと結合する。したがって、それらは、出力を誘発する（例えば、遺伝子調節）隣接するドメインまたは配列との通信機構に関して高度に可動性である。これらのアプタマーは、合成用途において良好であり、合成ＲＮＡツールを検証するために使用されている。天然のアプタマーを特定し特徴付けするための相当な努力がなされてきたが、調節するのが困難なエフェクターリガンドの内因性プールにより、それらの多様性及び用途において本質的に制限される。
【００３２】
これらの問題に応えて、親の頑強な折り畳み及び高度に安定したアーキテクチャ特性を保持しながら、天然のＲＮＡアプタマーにみられる反復性のアーキテクチャ折り畳み体及び小分子結合部位の広域スペクトルを提供するインビトロ選択を使用して再プログラム化され得る小さい核酸分解リボザイム、ならびにそれらの使用方法を本明細書に提供する。小分子結合アプタマーの選択における、部分的に構造化されたＲＮＡライブラリの使用は、以前に用いられたが、これらの単純なヘアピン及びヘリックスは、天然のアプタマーに似た高次構造を形成する能力がない。ＴｅｔｒａｈｙｍｅｎａリボザイムＰ４５６ドメインの末端ループをランダム化することによる非常に適度な活性のＲＮＡリガーゼリボザイムの選択は、足場付きライブラリのリボザイムを得ることが可能であることを示した。しかしながら、Ｐ４５６アーキテクチャは、大きく（１６０ヌクレオチド）、グループＩの自己スプライシングイントロンのＩＣ１及びＩＣ２サブクラスに制限される。したがって、細胞環境の広域スペクトルにおいて活性である多様な小分子結合アプタマーを生じさせるための一般的なプラットホームとしてはあまり適していない。
【００３３】
２つの異なるリボスイッチアプタマードメイン及びリボザイム由来の足場を使用して、５−ヒドロキシトリプトファン（５ＨＴＰ）及び／またはセロトニン（５ＨＴ）に選択的に結合する一組の多様なアプタマーが得られた。足場の各々は認識のための独自の解決策を提供するが、それらは全て、同様の結合親和性に集まり、化学的に関連するＬ−トリプトファンを区別する。これらのアプタマーは、構造的足場により蛍光発生及びスイッチに基づく読み取りモジュールに結合しやすくなる。スクリーニング戦略では、様々な程度の成功が得られるが、このアプローチを使用して簡単に達成されるアプタマーの多様性は、実践的なＲＮＡデバイスを実装するために必要とされるインビトロ特徴付けがより少ない、より可動性の戦略を可能にする。
【００３４】
ＲＮＡに基づくデバイスは、合成生物学において潜在的にますます頑強かつ予測可能なツールとみなされている。ＲＮＡは、シスで調節する能力、予測可能な二次構造、及び小さな遺伝的足跡を含む、タンパク質に基づく代替物と比較した場合、独自の特長集合を有する。中でもより求められているＲＮＡデバイスの能力は、追加のタンパク質因子の不在下で外部刺激を感知し、遺伝的または表現型応答を調節する能力である。合成リボスイッチ、アプタザイム、及び蛍光発生ＲＮＡセンサーの創出に努力が注がれてきたが、それらの能力は、一部ＲＮＡ感知ドメインの限られた利用可能性により、まだ完全には理解されていない。本明細書に提供される組成物及び方法は、驚くべきことに、選択のための足場として自然に進化したリボスイッチまたはリボザイムを使用することにより、現時点で最良の人工及び天然のアプタマーと同等に、インビトロ及び細胞状況の両方で機能することができる頑強な感知ドメインを産生することができることを示す。
【００３５】
本明細書に記載の組成物及び方法の主な長所は、一連のアプタマーを得るために、平行選択で複数の足場を使用することである。異なる足場由来のアプタマーは、同様の５ＨＴＰに対する親和性及びＬ−トリプトファンに対する選択性を有するが、それらは、足場の全てに共通の特長であるＰ１ヘリックスを介した読み取りドメインと通信するそれらの能力に関して明確に異なる特徴を有する。理論に拘束されることなく、これは、選択において完全に制御することができない特長であるリガンドとドメイン間（Ｐ１）ヘリックスとの間の空間的関係における差異によるものであると仮定される。生物学的リボスイッチにおいて、リガンドは、直接接触しているか、またはアプタマーを下流調節スイッチに連結するＰ１ヘリックスを伴うＲＮＡにおける立体構造変化を誘導するかのいずれかである。
【００３６】
一連のアプタマーでは、コンビナトリアルアプローチを用いて、広範なアプタマーの特徴付けまたはデバイスの最適化を行うことなく、所望の特性を有するセンサーを迅速にスクリーニングすることができる。典型的には、従来のインビトロ選択では単一の小分子結合アプタマーしか得られず、ＲＮＡデバイスの開発には、感覚アプタマーを固定ノードとして残しながら、多くの通信モジュール及びアダプター配列をスクリーニングすることが必要である。足場付き選択アプローチでは、一組の異なるアプタマーが組み合わせにより一組の通信モジュールに結合され、所望の活性を有する変異型を迅速にスクリーニングし得る。この方法により、このアプローチは、ＲＮＡデバイス及びセンサーの開発における主な障害を排除するはずである。特に、この研究では、特徴付け及びセンサー設計のための各選択において、最も密度が高いクラスターのみに焦点を置くが、各選択内で、下流用途を開発するためのアプタマーの初期プールを更に濃縮することができた代替配列を含む多くのクラスターが存在した。
【００３７】
この選択戦略の第２の強力な利点は、オリゴヌクレオチド接合部アーキテクチャの三次相互作用（例えば、３方向接合部）により提供される細胞状況における頑強な折り畳みである。これらのアプタマーの各々は、広範な生物進化を受けた折り畳み体を有し、特に３方向接合部のコアを編成する遠位三次相互作用は高度に安定である。プリンリボスイッチのＬ２−Ｌ３相互作用及び環状ジ−ＧＭＰリボスイッチ足場のテトラループ−テトラループ受容体の両方は、他のＲＮＡ構造の状況の外側で安定して形成することができる。これは、大部分の集団が規定の二次及び三次構造を含むように、これらの要素が初期ライブラリの全てのメンバーの折り畳みを潜在的に先導することを可能にする。誤った折り畳みは、しばしば、従来の合成アプタマーにとって重大な問題であり、これは、ＲＮＡ要素が別のＲＮＡ要素に結合されるか、またはより大きなＲＮＡの状況に配置される場合、非常に悪化し得る。典型的な選択プロトコルにおいて高忠実度の折り畳みに対する顕著な選択圧がないため、開始ライブラリにおいてこの情報を提供することは、頑強な折り畳みＲＮＡへの道筋であり得る。
【００３８】
３方向接合部の足場が本明細書において例示されるが、天然のリボスイッチ及びリボザイムの多様性は、このアプローチに更なる供給材料を提供し得る。３方向接合部ファミリー内で、特定のリガンドまたはセンサーに優れた足場を提供し得る３つのヘリックスの配向、接合部領域のサイズ、及び遠位三次相互作用の性質を変える広範囲にわたる配列が存在する。更に、他の折り畳み体は、同族リガンドの性質に基づいて標的小分子に結合しやすくなり得る。例えば、５ＨＴＰに結合する足場の別の選択は、リガンド結合部位を収容し、それをＰ１ヘリックスに隣接して位置付ける５方向接合部を含むリジンリボスイッチアプタマードメインである。より大きなリガンドは、フラビンモノヌクレオチドまたはコバラミンリボスイッチ由来の足場によってより容易に対処され得る一方で、ＮＡＤＨなどのジヌクレオチドは、他の二環状ヌクレオチドアプタマーのうちの１つにより簡単に対処され得る。したがって、本明細書に記載の足場付き選択アプローチは、ＲＮＡデバイスを使用して広範囲な用途にわたる細胞環境において小分子を監視し、それに応答するための強力な新しいツールの開発を容易にする可能性がある。
【００３９】
一般に、本明細書に記載の細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質及び核酸化学、ならびにハイブリダイゼーションに関連して使用される名称は、周知であり、当該技術分野において一般に使用されるものである。本明細書に提供される方法及び技法は、別途指示されない限り、当該技術分野において周知の従来の方法に従って、また本明細書の全体を通して引用され、論じられる様々な一般的な及びより具体的な参考文献に記載されるように、一般的に行われる。
【００４０】
酵素反応及び精製技法は、当該技術分野において一般的に達成されるように、または本明細書に記載されるように、製造業者の仕様書に従って行われる。本明細書に記載の分析化学、合成有機化学、ならびに医薬品及び製薬化学に関連して使用される名称、ならびにそれらの検査手順及び技法は、周知であり、当技術分野で一般に使用されるものである。標準的な技法が、化学合成、化学分析、薬学的調製物、製剤、及び送達、ならびに患者の治療に使用される。
【００４１】
本明細書において別途定義されない限り、本明細書で使用される科学及び技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。いずれの潜在的な曖昧性がある場合には、本明細書に提供される定義がいずれの辞書または付帯的な定義に優先するものとする。別段文脈によって要求されない限り、単数形の用語は複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。「または」の使用は、別途記述されない限り、「及び／または」を意味する。「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（〜を含む）」という用語、ならびに「ｉｎｃｌｕｄｅｓ（〜を含む）」及び「ｉｎｃｌｕｄｅｄ（含まれる）」などの他の形態の使用は、限定的なものではない。
【００４２】
本発明がより容易に理解されるために、ある特定の用語を最初に定義する。
【００４３】
「アプタマー」及び「アプタマードメイン」という用語は、高い特異性及び親和性で小分子、タンパク質、核酸、細胞、組織などの様々な分子標的に特異的に結合する短い一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはペプチド配列を指す。アプタマーは、一般的に、高度に特異的であり、比較的サイズが小さく、非免疫原性である。抗体と同様に、アプタマーは、特異的な３次元構造を認識することによってそれらの標的と相互作用し、したがって、「化学抗体」としても知られる。タンパク質抗体とは対照的に、ＤＮＡまたはＲＮＡアプタマーは、それらのオリゴヌクレオチド特性に基づいて独自の化学的及び生物学的特徴を提示する。
【００４４】
「リボスイッチ」という用語は、小分子リガンドに直接結合することによりシス様式の転写物に対してその調節制御を及ぼすｍＲＮＡの５’−非翻訳領域に通常みられる要素を指す。典型的なリボスイッチは、２つの異なる機能性ドメイン：リガンド結合ポケットに足場を設けるために、コンパクトな３次元折り畳み体を採用するアプタマードメインと、転写または翻訳機構と結合する二次構造スイッチを含む発現プラットホームとを含む。調節は、その対合が、ｍＲＮＡのオン及びオフ状態を表す発現プラットホームにおける２つの相互に排他的な構造のうちの１つへのＲＮＡの折り畳みを指向する、スイッチ配列として知られるこれらの２つのドメイン間の重複領域によって達成される。ある特定の例示的な実施形態では、好ましいリボスイッチは、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｘｐｔ−ｐｂｕＸグアニンリボスイッチ（本明細書において「ＧＲ」と称される）またはＶｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ  Ｖｃ２環状ジ−ＧＭＰリボスイッチ（本明細書において「ＣＤＧ」と称される）である。
【００４５】
「リボザイム」という用語は、酵素として作用するＲＮＡ分子を指し、タンパク質酵素の作用と同様の特異的な生化学反応を触媒することができる。リボザイムのクラスには、ＧＩＲ１分枝リボザイム、ｇｌｍＳリボザイム、グループＩ自己スプライシングイントロン、グループＩＩ自己スプライシングイントロン、ヘアピンリボザイム、ハンマーヘッド型リボザイム、及びＨＤＶリボザイムが含まれる。ある特定の例示的な実施形態では、好ましいリボザイムは、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉハンマーヘッド型リボザイム（本明細書において「ＨＨ」と称される）である。
【００４６】
「合成ＲＮＡ剤」、「合成ＤＮＡ剤」、「バイオセンサー」、及び「足場」という用語は、天然に存在するアプタマー、例えば、リボスイッチ及びリボザイム由来の二次及び三次構造的足場を含む、本明細書に記載の核酸感覚デバイスを指す。本発明の「合成ＲＮＡ剤」、「合成ＤＮＡ剤」、「バイオセンサー」、または「構造的足場」には、ヘリックスドメイン、第１及び第２のヘアピンドメイン、ならびにリガンド結合ドメインを含むオリゴヌクレオチド接合部が含まれる。本発明のバイオセンサーは、Ｎ方向接合部を含み得、Ｎは、２、３、４、または５である。
【００４７】
ある特定の実施形態では、本発明のバイオセンサーは、式Ｉ：（Ｉ）Ｐ１−Ｊ１／２−Ｐ２−Ｌ２−Ｐ２’−Ｊ２／３−Ｐ３−Ｌ３−Ｐ３’−Ｊ３／１−に従う一連の連結された構成要素を有する配列を含み、式中、「−」は、結合を表し、「Ｐ１」及び「Ｐ１’」は、ヘリックスを形成し、「Ｐ２」、「Ｌ２」、及び「Ｐ２’」は、第１のヘアピンを形成し、「Ｐ３」、「Ｌ３」、及び「Ｐ３’」は、第２のヘアピンを形成し、「Ｊ１／２」、「Ｊ２／３」、及び「Ｊ３／１」は一緒に、オリゴヌクレオチド接合部を形成する。（例えば、図１を参照されたい。）
【００４８】
ある特定の実施形態では、本発明のバイオセンサーは、リガンドのモジュールの特異性及び／または親和性が決定され得る「読み取り」モジュールを含む。「読み取り」は、視覚的に検出可能な、例えば、蛍光発生の読み取り、例えば、ブロッコリーであり得るか、または本明細書において更に記載されるリボスイッチに基づく読み取り、もしくはオリゴヌクレオチドに基づく読み取りであり得る。
【００４９】
「ヘリックスドメイン」という用語は、例えば、水素、フーグスティーン、または逆フーグスティーン結合により一緒に保持され、そのため二重ヘリックスまたは三重ヘリックス構造を形成する２つ以上のポリヌクレオチドを指す。
【００５０】
「ヘアピンドメイン」という用語は、ポリヌクレオチドの５’端及び３’端が互いに近接し、ループ構造を形成するポリヌクレオチドの非ハイブリダイズ部分によって連結されるように、ポリヌクレオチドが自身と塩基対合する能力を指す。
【００５１】
「オリゴヌクレオチド接合部」という用語は、リガンド結合部位、例えば、Ｇｕａ結合部位を形成する足場の２、３、４、または５つの領域を指す。（例えば、図１を参照されたい。）
【００５２】
「オリゴヌクレオチドライブラリ」という用語は、合成オリゴヌクレオチド配列の集合を指し、各配列は、本発明の構造的足場を含み、各構造的足場は、少なくともヘリックスドメイン、第１及び第２のヘアピンドメイン、ならびにリガンド結合ドメインを含むオリゴヌクレオチド接合部を含む。
【００５３】
ある特定の例示的な実施形態では、本発明のバイオセンサーに結合するリガンドまたは試験化合物をスクリーニングするためのアッセイが提供される。本発明の試験化合物は、生物学的ライブラリ、空間的にアドレス可能な平行固相もしくは液相ライブラリ、デコンボリューションを必要とする合成ライブラリ方法、「１つのビーズに１つの化合物（ｏｎｅ−ｂｅａｄ  ｏｎｅ−ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」ライブラリ方法、及び親和性クロマトグラフィー選択を使用した合成ライブラリ方法を含む、当該技術分野において既知のコンビナトリアルライブラリ方法における多くのアプローチのうちのいずれかを使用して得ることができる。生物学的ライブラリアプローチはペプチドライブラリに限定される一方で、他の４つのアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマー、または化合物の小分子ライブラリに適用可能である（Ｌａｍ，Ｋ．Ｓ．（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．１２：１４５）。
【００５４】
「ヌクレオシド」という用語は、リボーズまたはデオキシリボーズ糖に共有結合により連結されたプリンまたはピリミジン塩基を有する分子を指す。例示的なヌクレオシドとしては、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、及びチミジンが挙げられる。追加の例示的なヌクレオシドとしては、イノシン、１−メチルイノシン、プソイドウリジン、５，６−ジヒドロウリジン、リボチミジン、２Ｎ−メチルグアノシン、及び２，２Ｎ，Ｎ−ジメチルグアノシン（「稀」なヌクレオシドとも称される）が挙げられる。「ヌクレオチド」という用語は、エステル連結において糖部分に接合された１つ以上のリン酸基を有するヌクレオシドを指す。例示的なヌクレオチドとしては、ヌクレオシド一リン酸、二リン酸、及び三リン酸が挙げられる。「ポリヌクレオチド」及び「核酸分子」という用語は、本明細書において互換的に使用され、５’と３’の炭素原子との間のホスホジエステル連結により一緒に接合されたヌクレオチドのポリマーを指す。
【００５５】
「ＲＮＡ」、または「ＲＮＡ分子」、または「リボ核酸分子」という用語は、リボヌクレオチド（例えば、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０以上のリボヌクレオチド）のポリマーを指す。「ＤＮＡ」、または「ＤＮＡ分子」、または「デオキシリボ核酸分子」という用語は、デオキシリボヌクレオチドのポリマーを指す。ＤＮＡ及びＲＮＡは、（例えば、それぞれ、ＤＮＡ複製またはＤＮＡの転写により）天然に合成され得る。ＲＮＡは、転写後に修飾され得る。ＤＮＡ及びＲＮＡはまた、化学合成され得る。ＤＮＡ及びＲＮＡは、一本鎖（すなわち、それぞれ、ｓｓＲＮＡ及びｓｓＤＮＡ）または多鎖（例えば、二本鎖、すなわち、それぞれ、ｄｓＲＮＡ及びｄｓＤＮＡ）であり得る。「ｍＲＮＡ」または「メッセンジャーＲＮＡ」は、１つ以上のポリペプチド鎖のアミノ酸配列を特定する一本鎖ＲＮＡである。この情報は、リボソームがｍＲＮＡに結合するタンパク質合成中に翻訳される。
【００５６】
「ヌクレオチド類似体」、または「変更されたヌクレオチド」、または「修飾されたヌクレオチド」は、天然発生ではないリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを含む、非標準のヌクレオチドを指す。例示的なヌクレオチド類似体は、ヌクレオチドのある特定の化学特性を変更するために任意の位置で修飾されるが、ヌクレオチド類似体がその意図される機能を行う能力を保持する。誘導体化され得るヌクレオチドの位置の例としては、５位、例えば、５−（２−アミノ）プロピルウリジン、５−ブロモウリジン、５−プロピンウリジン、５−プロペニルウリジンなど、６位、例えば、６−（２−アミノ）プロピルウリジン、アデノシン及び／またはグアノシンの８位、例えば、８−ブロモグアノシン、８−クロログアノシン、８−フルオログアノシンなどが挙げられる。ヌクレオチド類似体には、デアザヌクレオチド、例えば、７−デアザ−アデノシン、Ｏ−及びＮ修飾された（例えば、アルキル化、例えば、Ｎ６−メチルアデノシン、または当該技術分野で別様に知られる）ヌクレオチド、及びＨｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．，２０００  Ａｕｇ．１０（４）：２９７−３１０に記載されるものなどの他の複素環的に修飾されたヌクレオチド類似体も含まれる。
【００５７】
ヌクレオチド類似体は、ヌクレオチドの糖部分にも修飾を含み得る。例えば、２’ＯＨ−基は、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、ＣＯＯＲ、またはＯＲから選択される基によって置き換えられ得、ここで、Ｒは、置換または非置換Ｃ１−Ｃ６アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールなどである。他の可能な修飾には、米国特許第５，８５８，９８８号及び同第６，２９１，４３８号に記載されるものが含まれる。
【００５８】
ヌクレオチドのリン酸基は、例えば、リン酸基の酸素のうちの１つ以上を硫黄（例えば、ホスホロチオエート）で置換することによって、または例えば、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．２０００  Ａｐｒ．１０（２）：１１７−２１、Ｒｕｓｃｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．２０００  Ｏｃｔ．１０（５）：３３３−４５、Ｓｔｅｉｎ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．２００１  Ｏｃｔ．１１（５）：３１７−２５、Ｖｏｒｏｂｊｅｖ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．２００１  Ａｐｒ．１１（２）：７７−８５、及び米国特許第５，６８４，１４３号などに記載される、ヌクレオチドがその意図される機能を行うことを可能にする他の置換を行うことによっても修飾され得る。上記に参照される修飾のいくつか（例えば、リン酸基修飾）は、好ましくは、例えば、インビボまたはインビトロでの該類似体を含むポリヌクレオチドの加水分解率を減少させる。
【００５９】
ある特定の例示的な実施形態では、検出可能な標識が本明細書に記載の１つ以上のオリゴヌクレオチド及び／またはポリヌクレオチドを検出するために使用され得る。検出可能なマーカーの例としては、様々な放射性活性部分、酵素、補欠分子族、蛍光マーカー、発光マーカー、生物発光マーカー、金属粒子、タンパク質−タンパク質結合対、タンパク質−抗体結合対などが挙げられる。蛍光タンパク質の例としては、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青緑色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、フィコエリトリンなどが挙げられるが、これらに限定されない。生物発光マーカーの例としては、ルシフェラーゼ（例えば、細菌、ホタル、コメツキムシなど）、ルシフェリン、エクオリンなどが挙げられるが、これらに限定されない。視覚的に検出可能なシグナルを有する酵素系の例としては、ガラクトシダーゼ、グルコリニダーゼ、ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、コリンエステラーゼなどが挙げられるが、これらに限定されない。特定可能なマーカーは、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３Ｈなどの放射活性化合物も含む。特定可能なマーカーは、様々な供給源から市販されている。
【００６０】
［００４５］蛍光標識ならびにそれらのヌクレオチド及び／またはオリゴヌクレオチドへの結合は、Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｎｉｎｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，２００２）、Ｋｅｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍａｎａｋ，ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅｓ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３）、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，ｅｄｉｔｏｒ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９９１）、及びＷｅｔｍｕｒ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２６：２２７−２５９（１９９１）を含む、多くの概説に記載されている。本発明に適用可能な特定の方法論は、以下の参考文献の実例に開示されている：米国特許第４，７５７，１４１号、同第５，１５１，５０７号、及び同第５，０９１，５１９号。一態様では、例えば、米国特許第５，１８８，９３４号（４，７−ジクロロフルオレセイン色素）、米国特許第５，３６６，８６０号（スペクトル的に分解可能なローダミン色素）、米国特許第５，８４７，１６２号（４，７−ジクロロローダミン色素）、米国特許第４，３１８，８４６号（エーテル置換フルオレセイン色素）、米国特許第５，８００，９９６号（エネルギー移動色素）、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．；米国特許第５，０６６，５８０号（キサンチン色素）、米国特許第５，６８８，６４８号（エネルギー移動色素）などによって開示される、１つ以上の蛍光色素が標識化された標的配列の標識として使用される。標識化は、以下の特許及び特許公開に開示される、量子ドットを用いて行うこともできる：米国特許第６，３２２，９０１号、同第６，５７６，２９１号、同第６，４２３，５５１号、同第６，２５１，３０３号、同第６，３１９，４２６号、同第６，４２６，５１３号、同第６，４４４，１４３号、同第５，９９０，４７９号、同第６，２０７，３９２号、第２００２／００４５０４５号、及び第２００３／００１７２６４号。本明細書で使用される場合、「蛍光標識」という用語は、１つ以上の分子の蛍光吸光及び／または発光特性を通して情報を伝達するシグナル伝達部分を含む。そのような蛍光特性は、蛍光強度、蛍光寿命、発光スペクトル特徴、エネルギー移動などを含む。
【００６１】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチド及び／またはヌクレオチド類似体の短いポリマーを指す。「ＲＮＡ類似体」または「ＤＮＡ類似体」という用語は、対応する未変更または未修飾のＤＮＡまたはＲＮＡと比較して、少なくとも１つの変更または修飾されたヌクレオチドを有するが、対応する未変更または未修飾のＤＮＡまたはＲＮＡと同じまたは類似の性質または機能を保持するポリヌクレオチド（例えば、化学合成されたポリヌクレオチド）を指す。上記で論じられるように、オリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル連結を有するＲＮＡまたはＤＮＡ分子と比較して、ＲＮＡまたはＤＮＡ類似体の加水分解率が低くなる連結で連結され得る。例えば、類似体のヌクレオチドは、メチレンジオール、エチレンジオール、オキシメチルチオ、オキシエチルチオ、オキシカルボニルオキシ、ホスホロジアミデート、ホスホロアミデート、及び／またはホスホロチオエート連結を含み得る。好ましいＲＮＡまたはＤＮＡ類似体は、糖及び／または骨格修飾されたリボヌクレオチド及び／またはデオキシリボヌクレオチドを含む。そのような変更または修飾は、ＲＮＡもしくはＤＮＡの端部（複数可）などへの、または内部的に（ＲＮＡまたはＤＮＡの１つ以上のヌクレオチドにおいて）非ヌクレオチド材料の付加を更に含み得る。
【００６２】
本明細書で使用される場合、「単離されたＲＮＡ」または「単離されたＤＮＡ」という用語は、組換え技法により産生された場合、他の細胞材料もしくは培養培地を実質的に含まないか、または化学合成された場合、化学的な前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まないＲＮＡまたはＤＮＡ分子を指す。
【００６３】
「インビトロ」という用語は、その当該技術分野で認識される意味を有し、例えば、精製された試薬または抽出物、例えば細胞抽出物を伴う。「インビボ」という用語も、その当該技術分野で認識される意味を有し、例えば、生細胞、例えば、不死化された細胞、一次細胞、細胞株、及び／または生物の細胞を伴う。
【００６４】
本明細書で使用される場合、「導入遺伝子」という用語は、技術により細胞内に挿入され、細胞から発達する生物のゲノムの一部となる任意の核酸分子を指す。そのような導入遺伝子は、トランスジェニック生物に対して部分的にもしくは完全に異種（すなわち、外来）である遺伝子を含み得るか、または生物の内因性遺伝子に対して相同の遺伝子を表し得る。「導入遺伝子」という用語は、トランスジェニック生物（例えば、動物）において発現される１つ以上の操作されたＲＮＡ前駆体をコードする１つ以上の選択された核酸配列（例えば、ＤＮＡ）を含む核酸分子も意味し、これは、トランスジェニック動物に部分的にもしくは完全に異種（すなわち、外来）であるか、またはトランスジェニック動物の内因性遺伝子に相同であるが、天然の遺伝子とは異なる位置で動物のゲノム内に挿入されるように設計されている。導入遺伝子は、選択された核酸配列の発現に必要な１つ以上のプロモーター及びイントロンなどの任意の他のＤＮＡ（全て、選択された配列に作動可能に連結されている）を含み、エンハンサー配列を含み得る。
【００６５】
疾患または障害に「関与する」遺伝子は、その正常または異常な発現または機能が疾患もしくは障害、または該疾患もしくは障害の少なくとも１つの症状をもたらすか、または引き起こす遺伝子を含む。
【００６６】
本明細書で使用される場合、「試料集団」という用語は、統計学的に有意な数の個体を含む、個体集団を指す。例えば、試料集団は、５０、７５、１００、２００、５００、１０００以上の個体を含み得る。特定の実施形態では、試料集団は、少なくとも共通の疾患表現型（例えば、機能獲得障害）または変異（例えば、機能獲得変異）で共有する個体を含み得る。
【００６７】
本明細書で使用される場合、「ヘテロ接合性」という用語は、特定の遺伝子座で（例えば、ＳＮＰで）ヘテロ接合である（例えば、２つ以上の異なる対立遺伝子を含む）集団内の個体率を指す。ヘテロ接合性は、当業者に周知である方法を使用して試料集団について計算され得る。
【００６８】
「細胞または生物における遺伝子の機能を検査する」という語句は、それから生じる発現、活性、機能、または表現型を検査または研究することを指す。
【００６９】
本明細書で使用される場合、「稀なヌクレオチド」という用語は、稀に生じる天然発生のヌクレオチドを指し、稀に生じる天然発生のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、例えば、グアノシン、アデノシン、シトシン、もしくはウリジンではない天然発生のリボヌクレオチドを含む。稀なヌクレオチドの例としては、イノシン、１−メチルイノシン、プソイドウリジン、５，６−ジヒドロウリジン、リボチミジン、２Ｎ−メチルグアノシン、及び２，２Ｎ，Ｎ−ジメチルグアノシンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７０】
操作されたＲＮＡ前駆体または操作された核酸分子にあるような「操作された」という用語は、前駆体または分子の核酸配列の全てまたは一部がヒトによって創出または選択されるという点で、前駆体または分子が自然界において見出されないことを示す。創出または選択されたら、配列は、細胞内の機構によって複製、翻訳、転写、またはさもなければ処理され得る。したがって、操作された核酸分子を含む導入遺伝子からの細胞内で産生されたＲＮＡ前駆体は、操作されたＲＮＡ前駆体である。
【００７１】
本明細書で使用される場合、「結合強度」または「塩基対強度」という用語は、オリゴヌクレオチド二本鎖の対向する鎖上のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）対間の、主に該ヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）間のＨ結合、ファンデルワールス相互作用などによる相互作用の強度を指す。
【００７２】
本明細書で使用される場合、「不安定化ヌクレオチド」という用語は、塩基対が従来の塩基対（すなわち、ワトソン・クリック塩基対）よりも弱い結合強度のものであるように、第２のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体と塩基対を形成することができる第１のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を指す。ある特定の実施形態では、不安定化ヌクレオチドは、第２のヌクレオチドと不適正塩基対を形成することができる。別の実施形態では、不安定化ヌクレオチドは、第２のヌクレオチドとゆらぎ塩基対を形成することができる。また別の実施形態では、不安定化ヌクレオチドは、第２のヌクレオチドと曖昧な塩基対を形成することができる。また別の実施形態では、不安定化ヌクレオチドはバルジを形成することができ、不安定化ヌクレオチドは第２のヌクレオチドと対合しない。
【００７３】
本明細書で使用される場合、「塩基対」という用語は、オリゴヌクレオチド二本鎖の対向する鎖上のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）対間の、主に該ヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）間のＨ結合、ファンデルワールス相互作用などによる相互作用を指す。本明細書で使用される場合、「結合強度」または「塩基対強度」という用語は、塩基対の強度を指す。
【００７４】
本明細書で使用される場合、「不適正塩基対」という用語は、非相補性または非ワトソン・クリック塩基対からなる塩基対、例えば、通常ではない相補性のＧ：Ｃ、Ａ：Ｔ、またはＡ：Ｕ塩基対を指す。本明細書で使用される場合、「曖昧な塩基対」（非差別的な塩基対としても知られる）は、普遍的ヌクレオチドにより形成される塩基対を指す。
【００７５】
本明細書で使用される場合、「普遍的ヌクレオチド」（「中性ヌクレオチド」としても知られる）は、塩基対を形成するとき、相補性ポリヌクレオチド上の塩基を顕著に区別をしない塩基（「普遍的ヌクレオチド」または「中性塩基」）を有するこれらのヌクレオチド（例えば、ある特定の不安定化ヌクレオチド）を含む。普遍的ヌクレオチドは、大部分は、スタッキング相互作用により、逆平行二本鎖核酸（例えば、二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ）に効率的に詰め込むことができる疎水性分子である。普遍的ヌクレオチドの塩基部分は、典型的には、窒素含有芳香族複素環部分を含む。
【００７６】
本明細書で使用される場合、「十分な相補性」または「十分な相補性の程度」という用語は、オリゴヌクレオチド配列が所望の標的オリゴヌクレオチドを結合するのに十分に相補性であることを意味する。
【００７７】
本発明の様々な方法論は、値、レベル、特長、特徴、特性などを「好適な対照」（本明細書において、互換的に「適切な対照」とも称される）と比較することを伴うステップを含む。「好適な対照」または「適切な対照」は、比較目的に有用な、当業者によく知られる任意の対照または標準である。一実施形態では、「好適な対照」または「適切な対照」は、本明細書に記載の方法論を行う前に決定された値、レベル、特長、特徴、特性などである。例えば、転写速度、ｍＲＮＡレベル、翻訳速度、タンパク質レベル、生物学的活性、細胞特徴または特性、遺伝子型、表現型などは、本発明の合成ＲＮＡまたはＤＮＡ剤を細胞または生物に導入する前に決定され得る。別の実施形態では、「好適な対照」または「適切な対照」は、例えば、正常な形質を示す細胞または生物（例えば、対照または正常な細胞もしくは生物）において決定された値、レベル、特長、特徴、特性などである。また別の実施形態では、「好適な対照」または「適切な対照」は、所定の値、レベル、特長、特徴、特性などである。
【００７８】
本発明の合成ＲＮＡまたはＤＮＡ剤は、細胞に直接導入される（すなわち、細胞内に）か、または空洞内、間質腔、生物の循環内の細胞外に導入されるか、経口導入され得るか、または細胞もしくは生物を、核酸を含む溶液に浸すことによって導入され得る。血管または血管外循環、血液またはリンパ系、及び脳脊髄液は、合成ＲＮＡまたはＤＮＡ剤が導入され得る部位である。
【００７９】
本発明の合成ＲＮＡまたはＤＮＡ剤は、核酸を含む溶液の注入、ＲＮＡ剤で被覆された粒子による衝撃、細胞もしくは生物のＲＮＡ剤溶液への浸漬、またはＲＮＡ剤の存在下での細胞膜の電気穿孔を含む、当該技術分野で既知の核酸送達方法を使用して導入され得る。液体媒介担体輸送、化学媒介輸送、及びリン酸カルシウムなどのカチオン性リポソームトランスフェクションなどの、核酸を細胞に導入するための当該技術分野で既知の他の方法が使用されてもよい。合成ＲＮＡまたはＤＮＡ剤は、細胞による核酸取り込みを強化するか、またはさもなければ標的遺伝子の阻害を増加させる活性のうちの１つ以上を果たす他の構成要素とともに導入され得る。
【００８０】
核酸を導入する物理的方法は、バイオセンサーを含む溶液の注入、バイオセンサーで被覆された粒子による衝撃、細胞もしくは生物のバイオセンサー溶液への浸漬、またはバイオセンサーの存在下での細胞膜の電気穿孔を含む。ウイルス粒子にパッケージされたウイルス構築物は、発現構築物の細胞への効率的な導入、及び発現構築物によってコードされるＲＮＡの転写の両方を達成するであろう。液体媒介担体輸送、化学媒介輸送、例えば、リン酸カルシウムなどの、核酸を細胞に導入するための当該技術分野で既知の他の方法が使用されてもよい。したがって、ＲＮＡは、細胞によるＲＮＡ取り込みを強化する、一本鎖のアニーリングを阻害する、一本鎖を安定化させる、またはさもなければ標的遺伝子の阻害を増加させる活性のうちの１つ以上を果たす構成要素とともに導入され得る。
【００８１】
合成ＲＮＡまたはＤＮＡ剤は、細胞に直接導入される（すなわち、細胞内に）か、または空洞内、間質腔、生物の循環内の細胞外に導入されるか、経口導入され得るか、または細胞もしくは生物を、ＲＮＡもしくはＤＮＡを含む溶液に浸すことによって導入され得る。血管または血管外循環、血液またはリンパ系、及び脳脊髄液は、ＲＮＡまたはＤＮＡが導入され得る部位である。
【００８２】
標的細胞は、生殖系列もしくは体細胞、全能性もしくは多能性、分裂もしくは非分裂、実質もしくは上皮、不死化もしくは形質転換、または同等のものからであってよい。細胞は、幹細胞または分化細胞であり得る。分化される細胞型は、脂肪細胞、線維芽細胞、筋細胞、心筋細胞、内皮、神経細胞、膠細胞、血液細胞、巨核球、リンパ球、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞、白血球、顆粒球、角化細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、肝細胞、及び内分泌または外分泌腺の細胞を含む。
【００８３】
合成ＲＮＡまたはＤＮＡ剤は、細胞当たり少なくとも１つのコピーの送達を可能にする量で導入され得る。材料のより高い用量（例えば、細胞当たり少なくとも５、１０、１００、５００、または１０００のコピー）は、より効果的な阻害をもたらす可能性があり、より低い用量も特定の用途に有用であり得る。
【００８４】
例示的な態様では、本発明のバイオセンサーの有効性は、細胞において標的の転写、翻訳、選択的スプライシング、及び／またはｍＲＮＡ安定性を特異的に調節するその能力について試験される。細胞は、本明細書に記載の１つ以上のバイオセンサーでトランスフェクトすることができる。標的ＤＮＡ、標的ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）、及び／または標的タンパク質における選択的低減が測定される。標的ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質の低減は、バイオセンサーの不在下、またはＤＮＡ、ＲＮＡ、もしくはタンパク質を標的としないバイオセンサーの存在下の標的ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質のレベルと比較され得る。外因的に導入されるＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質は、比較目的のためにアッセイされ得る。標準のトランスフェクション技法にいくぶん耐性であることが知られる神経細胞を利用する場合、受動的取り込みによりバイオセンサーを導入することが望ましい場合がある。
【００８５】
本明細書で使用される場合、「治療」または「治療すること」は、疾患もしくは障害、疾患もしくは障害の症状、または疾患に対する素因を治癒する、癒す、緩和する、軽減する、変更する、治す、寛解させる、改善する、またはそれに影響を及ぼす目的で、患者に治療薬（例えば、合成ＲＮＡまたはＤＮＡ剤）を適用または投与する、あるいは疾患もしくは障害、疾患もしくは障害の症状、または疾患もしくは障害に対する素因を有する患者からの単離された組織または細胞株に治療薬を適用または投与することとして定義される。
【００８６】
一態様では、本発明は、対象に治療薬（例えば、合成ＲＮＡもしくはＤＮＡ剤、またはそれらをコードするベクターもしくは導入遺伝子）を投与することにより、対象において、疾患または障害を予防するための方法を提供する。疾患のリスクにある対象は、例えば、任意の診断もしくは予後またはそれらの組み合わせにより特定することができる。予防薬の投与は、疾患もしくは障害が予防されるか、または代替的にその進行を遅延するように、疾患または障害の特徴である症状の兆候前に生じ得る。
【００８７】
本発明の別の態様は、治療的に対象を処置する、すなわち、疾患または障害の症状の発症を変更する方法に関連する。例示的な実施形態では、本発明の調節方法は、標的配列との配列特異的相互作用が達成されるように、障害を発現する細胞を、１つ以上の標的配列に特異的である治療薬（例えば、合成ＲＮＡもしくはＤＮＡ剤、またはそれらをコードするベクターもしくは導入遺伝子）と接触させることを伴う。これらの方法は、インビトロ（例えば、細胞を薬剤とともに培養することにより）、または代替的にインビボ（例えば、対象に薬剤を投与することにより）で行うことができる。
【００８８】
治療の予防及び治療方法の両方に関して、そのような治療は、薬理ゲノミクスの分野から得られた知識に基づいて具体的に調整または修正され得る。本明細書で使用される場合、「薬理ゲノミクス」は、遺伝子配列決定、統計遺伝学、及び遺伝子発現分析などのゲノム技術を臨床開発中及び市場の薬物に適用することを指す。より具体的には、本用語は、患者の遺伝子が薬物に対する患者の応答（例えば、患者の「薬物応答表現型」または「薬物応答遺伝子型」）をどのように決定するかの研究を指す。したがって、本発明の別の態様は、個体の予防または治療上の処置を、その個体の薬物応答遺伝子型により本発明の標的遺伝子分子または標的遺伝子調節剤のいずれかで調整するための方法を提供する。薬理ゲノミクスは、臨床医または医師が、処置から最も利益を受けるであろう患者への予防または治療上の処置を目的とし、毒性の薬物関連副作用を受けるであろう患者の治療を回避することを可能にする。
【００８９】
治療薬は、適切な動物モデルにおいて試験され得る。例えば、本明細書に記載の合成ＲＮＡまたはＤＮＡ剤（またはそれらをコードする発現ベクターもしくは導入遺伝子）は、該薬剤を用いた治療の有効性、毒性、または副作用を決定するために、動物モデルにおいて使用され得る。代替的に、治療薬は、そのような薬剤の作用機序を決定するために動物モデルにおいて使用され得る。例えば、薬剤は、そのような薬剤を用いた治療の有効性、毒性、または副作用を決定するために動物モデルにおいて使用され得る。代替的に、薬剤は、そのような薬剤の作用機序を決定するために動物モデルにおいて使用され得る。
【００９０】
本発明の合成ＲＮＡまたはＤＮＡ剤を含む医薬組成物は、障害を有する、またはそれを発症させるリスクにあると診断された任意の患者に投与され得る。一実施形態では、患者は障害を有すると診断され、患者はさもなければ良好な一般健康状態にある。例えば、患者は末期病状ではなく、患者は診断後少なくとも２、３、５年以上生存する可能性がある。患者は診断後すぐに治療され得るか、または治療は、患者がより衰弱症状を経験するまで遅延され得る。別の実施形態では、患者は疾患の進行期に達していない。
【００９１】
合成ＲＮＡまたはＤＮＡ剤は、約１．４ｍｇ／体重ｋｇ未満、または１０、５、２、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００１、０．００００５、もしくは０．００００１ｍｇ／体重ｋｇ未満、及び２００ｎｍｏｌｅ未満のＲＮＡ剤（例えば、約４．４ｘ１０１６コピー）／体重ｋｇ、または１５００、７５０、３００、１５０、７５、１５、７．５、１．５、０．７５、０．１５、０．０７５、０．０１５、０．００７５、０．００１５、０．０００７５、０．０００１５ｎｍｏｌｅ未満の合成ＲＮＡもしくはＤＮＡ剤／体重ｋｇの単位用量で投与され得る。単位用量は、例えば、注射（例えば、静脈内もしくは筋肉内、髄腔内、または脳内に直接）、吸引用量、または局部適用により投与され得る。特定の好ましい投薬量は、２、１、または０．１ｍｇ／体重ｋｇ未満である。
【００９２】
合成ＲＮＡまたはＤＮＡ剤の直接臓器への送達は、約０．００００１ｍｇ〜約３ｍｇ／臓器、または好ましくは約０．０００１〜０．００１ｍｇ／臓器、約０．０３〜３．０ｍｇ／臓器、約０．１〜３．０ｍｇ／眼、または約０．３〜３．０ｍｇ／臓器の投薬量であり得る。投薬量は、障害を治療または予防するのに十分な量であり得る。一実施形態では、単位用量は、１日１回よりも少ない頻度、例えば、２、４、８、または３０日未満ごとに投与される。別の実施形態では、単位用量は、頻度で投与されない（例えば、規則的な頻度ではない）。例えば、単位用量は、１回投与され得る。一実施形態では、有効量は、他の従来の治療様式で投与される。
【００９３】
一実施形態では、対象は、初期用量、及び１回以上の維持用量の合成ＲＮＡまたはＤＮＡ剤を投与される。維持用量（複数可）は、一般的に、初期用量よりも低く、例えば、初期用量の半分である。維持レジメンは、０．０１μｇ〜１．４ｍｇ／体重ｋｇ／日の範囲、例えば、１０、１、０．１、０．０１、０．００１、または０．００００１ｍｇ／体重ｋｇ／日の用量（複数可）で対象を治療することを含み得る。維持用量は、好ましくは、５、１０、または３０日に１回以下で投与される。更に、特定の疾患の性質、その重症度、及び患者の全体的な状態により変動する治療レジメンはある一定期間続く場合がある。好ましい実施形態では、投薬量は、１日１回以下、例えば、２４、３６、４８時間以上に１回以下、例えば、５または８日に１回以下送達され得る。治療後、患者は、患者の状態の変化、及び疾患状態の症状の緩和について監視され得る。化合物の投薬量は、患者が現在の投薬量レベルに有意に応答しない事象において増加され得るか、または疾患状態の症状の緩和が観察される場合、疾患状態が取り除かれた場合、もしくは望ましくない副作用が観察される場合に用量が減少されるかのいずれかであり得る。
【００９４】
有効量は、特定の状況下で、所望される、または適切と考えられるとき、単回用量で、または２回以上の用量で投与され得る。反復または頻繁な注入を容易にすることが所望される場合、送達デバイス、例えば、ポンプ、半永久的ステント（例えば、静脈内、腹腔内、大槽内、または関節内）、またはリザーバの埋め込みが望ましい場合がある。一実施形態では、薬学的組成物は、複数の合成ＲＮＡまたはＤＮＡ剤種を含む。別の実施形態では、合成ＲＮＡまたはＤＮＡ剤種は、天然発生の標的配列に関して、別の種と重複せず、隣接しない配列を有する。別の実施形態では、複数の合成ＲＮＡまたはＤＮＡ剤種は、異なる天然発生の標的に特異的である。別の実施形態では、複数の合成ＲＮＡまたはＤＮＡ剤種は、２つ以上の標的配列（例えば、２、３、４、５、６以上の標的配列）を標的とする。
【００９５】
治療成功後、疾患状態の再発を防止するために、患者に維持療法を受けさせることが望ましい場合があり、この場合、本発明の化合物は、０．０１μｇ〜１００ｇ／体重ｋｇの範囲の維持用量で投与される（米国特許第６，１０７，０９４号を参照されたい）。
【００９６】
合成ＲＮＡまたはＤＮＡ剤組成物の濃度は、障害を治療もしくは予防するのに有効であるか、またはヒトの生理学的条件を調節するのに十分な量である。投与される合成ＲＮＡまたはＤＮＡ剤の濃度または量は、薬剤について決定されるパラメータ、及び投与方法、例えば、鼻、口腔、または肺に依存する。例えば、鼻用製剤は、鼻腔の刺激または灼熱感を回避するために、いくつかの成分の濃度を非常に低くすることを必要とする傾向がある。好適な鼻用製剤を提供するために、経口用製剤を最大１０〜１００倍希釈することが望ましい場合がある。
【００９７】
疾患もしくは障害の重症度、以前の治療、対象の一般的な健康及び／または年齢、ならびに存在する他の疾患を含むがこれらに限定されないある特定の因子は、対象を効果的に治療するために必要とされる投薬量に影響を及ぼし得る。更に、治療有効量の合成ＲＮＡまたはＤＮＡ剤での対象の治療は、単回治療を含み得るか、または好ましくは一連の治療を含み得る。治療のための合成ＲＮＡまたはＤＮＡ剤の有効投薬量は、特定の治療過程にわたって増加または減少され得ることも理解する。投薬量の変更は、本明細書に記載の診断アッセイの結果に起因し、それから明らかとなってもよい。例えば、対象は、合成ＲＮＡまたはＤＮＡ剤組成物を投与された後、監視され得る。監視からの情報に基づいて、追加量の合成ＲＮＡまたはＤＮＡ剤組成物が投与され得る。
【００９８】
投薬は、治療される疾患状態の重症度及び応答性に依存し、治療過程は数日〜数ヵ月間、または治癒が達成されるまで、もしくは疾患状態の減少が達成されるまで続く。最適な投薬スケジュールは、患者の体内に蓄積した薬物の測定から計算され得る。当業者は、最適な投薬量、投薬方法論、及び反復速度を容易に決定することができる。最適な投薬量は、個々の化合物の相対効力により変動してもよく、一般的に、インビトロ及びインビボ動物モデルにおいて有効であると見出されたＥＣ５０に基づいて推定され得る。
【００９９】
本発明は、以下に記載の予防及び／または治療上の処置のための上述の薬剤の使用に関連する。したがって、本発明の調節剤（例えば、合成ＲＮＡまたはＤＮＡ剤）は、投与に好適な薬学的組成物に組み込むことができる。そのような組成物は、典型的には、核酸分子、タンパク質、抗体、または調節化合物、及び薬学的に許容される担体を含む。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、医薬品の投与と適合する、任意及び全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などを含むことが意図される。薬理学的活性物質のためのそのような媒体及び薬剤の使用は、当該技術分野で周知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物と相溶性でない場合を除き、組成物におけるその使用は企図される。補足的活性化合物も組成物に組み込むことができる。
【０１００】
本発明の薬学的組成物は、その意図される投与経路と適合するように製剤化される。投与経路の例としては、非経口、例えば、静脈内（ＩＶ）、皮内、皮下（ＳＣまたはＳＱ）、腹腔内、筋肉内、経口（例えば、吸入）、経皮（局部）、及び経粘膜投与が挙げられる。非経口、皮内、または皮下適用に使用される溶液または懸濁液は、以下の構成成分を含み得る：注射用蒸留水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒などの滅菌希釈剤、ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤、アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤、エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤、酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩などの緩衝液、ならびに塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの等張性調節のための薬剤。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調整され得る。非経口調製物は、アンプル、使い捨てシリンジ、またはガラスもしくはプラスチックから作製された複数用量バイアルに封入され得る。
【０１０１】
注射用途に好適な薬学的組成物には、滅菌注射用溶液または分散液を即時調製するための滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液及び滅菌粉末が含まれる。静脈内投与に関して、好適な担体としては、生理学的生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、組成物は、滅菌でなければならず、容易に注射できる程度の流動性を有する必要がある。これは、製造及び貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保持されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）を含む溶媒または分散媒、及びそれらの好適な混合物であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散の場合には必要とされる粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって、維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成され得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖、ポリアルコール（マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムなど）を組成物中に含むことが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、組成物中に、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを含むことによって、もたらすことができる。
【０１０２】
滅菌注射用溶液は、上に列挙される成分のうちの１つまたはその組み合わせとともに、活性化合物を必要な量で適切な溶媒に組み込み、必要に応じて、その後濾過滅菌することにより調製することができる。一般的に、分散液は、活性化合物を、基本的な分散媒及び上で列挙されたものからの必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことによって、調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、その予め滅菌濾過した溶液から活性成分と任意の所望の追加成分とを合わせた粉末が得られる、真空乾燥及び凍結乾燥である。
【０１０３】
経口用組成物は、一般的に、不活性希釈剤または食用担体を含む。それらは、ゼラチンカプセルに封入されるか、または錠剤に圧縮され得る。経口治療投与の目的に関して、活性化合物は、賦形剤とともに組み込まれ、錠剤、トローチ、またはカプセルの形態で使用され得る。経口用組成物は、洗口剤として使用するための液体担体を使用して調製することもでき、液体担体中の化合物は、経口適用され、口に含んで喀出されるか、嚥下される。薬学的に相溶性の結合剤及び／またはアジュバント材料は、組成物の一部として含まれ得る。錠剤、ピル、カプセル、トローチなどは、以下の成分または同様の性質の化合物のいずれかを含み得る：微結晶セルロース、トラガカントガム、もしくはゼラチンなどの結合剤、デンプンもしくはラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、プリモゲル、もしくはトウモロコシデンプンなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムもしくはステロートなどの滑沢剤、コロイド状二酸化ケイ素などのグリダント、スクロースもしくはサッカリンなどの甘味剤、またはペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジ香料などの香味剤。
【０１０４】
吸入による投与に関して、化合物は、好適な推進剤、例えば、二酸化炭素などのガスを含む加圧容器もしくは分注装置、または噴霧器からのエアロゾルスプレーの形態で送達される。
【０１０５】
全身投与も、経粘膜または経皮手段によるものであってよい。経粘膜または経皮投与に関して、浸透すべき障壁に適切な浸透剤が製剤に使用される。そのような浸透剤は、当該技術分野において一般的に知られており、例えば、経粘膜投与に関しては、洗剤、胆汁酸塩、及びフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、鼻用スプレーまたは坐剤の使用を通して達成され得る。経皮投与に関して、活性化合物は、当技術分野において一般的に知られているように、軟膏、膏薬、ゲル、またはクリームに製剤化される。
【０１０６】
化合物は、坐剤（例えば、ココアバター及び他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を用いて）または直腸送達のための停留浣腸の形態にも調製され得る。
【０１０７】
合成ＲＮＡまたはＤＮＡ剤はまた、ＭｃＣａｆｆｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｎａｔｕｒｅ，４１８（６８９３），３８−９（流体力学トランスフェクション）、Ｘｉａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０（１０），１００６−１０（ウイルス媒介送達）、またはＰｕｔｎａｍ（１９９６），Ａｍ．Ｊ．Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｙｓｔ．Ｐｈａｒｍ．５３（２），１５１−１６０，ｅｒｒａｔｕｍ  ａｔ  Ａｍ．Ｊ．Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｙｓｔ．Ｐｈａｒｍ．５３（３），３２５（１９９６）に記載される方法を含むが、これらに限定されない当該技術分野で既知の方法を使用して、トランスフェクションまたは感染によって投与されてもよい。
【０１０８】
合成ＲＮＡまたはＤＮＡ剤は、ＤＮＡワクチンなどの核酸剤の投与に好適な任意の方法によっても投与され得る。これらの方法には、遺伝子銃、バイオ注射器、及び皮膚パッチ、ならびに米国特許第６，１９４，３８９号に開示されるマイクロ粒子ＤＮＡワクチン技術、及び米国特許第６，１６８，５８７号に開示される粉末形態ワクチンを用いた哺乳類経皮無針ワクチン接種などの無針方法が含まれる。加えて、とりわけ、Ｈａｍａｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８），Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．，８８（２），２０５−１０に記載される鼻腔内送達が可能である。リポソーム（例えば、米国特許第６，４７２，３７５号に記載される）及びマイクロカプセル封入も使用され得る。生分解性標的性微粒子送達系も使用され得る（例えば、米国特許第６，４７１，９９６号に記載される）。
【０１０９】
一実施形態では、活性化合物は、化合物を、埋め込み物及びマイクロカプセル封入送達系を含む放出制御製剤などの、身体からの急速な排出から保護する担体とともに調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーを使用することができる。そのような製剤の調製方法は、当業者には明らかであろう。材料は、Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ及びＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から商業的に得ることもできる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を用いた感染細胞を標的とするリポソームを含む）も薬学的に許容される担体として使用され得る。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載される、当業者に既知の方法に従い調製することができる。
【０１１０】
投与の容易性及び投薬量の均一性のために、投薬量単位形態の経口または非経口組成物を配合することが特に有益である。本明細書で使用される投薬量単位形態は、治療される対象の単位投薬量として適した、物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要とされる薬学的担体に関連して所望の治療効果をもたらすように計算された、既定量の活性化合物を含む。本発明の投薬量単位形態の仕様は、活性化合物の独自の特徴及び達成される特定の治療効果、ならびに個体の治療のためのそのような活性化合物を調合する技術分野の本質的な制限によって決定付けられ、またそれに直接依存する。
【０１１１】
そのような化合物の毒性及び治療有効性は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）及びＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効な用量）を決定するために、細胞培養物または実験動物において標準の薬学的手順により決定され得る。毒性と治療効果との間の用量比は、治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比率として表され得る。より大きな治療指数を示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物が使用され得るが、非感染細胞への潜在的損傷を最小限に抑え、それにより、副作用を低減するために、そのような化合物を罹患組織の部位に標的化する送達系を設計する際には注意を払う必要がある。
【０１１２】
細胞培養アッセイ及び動物研究から得られたデータは、ヒトにおいて使用するための投薬量の範囲を公式化する際に使用され得る。そのような化合物の投薬量は、好ましくは、毒性がほとんどまたは全くないＥＤ５０を含む、循環濃度の範囲内にある。投薬量は、用いられる剤形及び利用される投与経路により、この範囲内で変動する。本発明の方法に使用される任意の化合物に関して、治療有効量は、初めに細胞培養アッセイから推定することができる。細胞培養において決定される、ＥＣ５０（すなわち、最大応答の半分を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するために、用量は動物モデルにおいて公式化され得る。そのような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用され得る。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定され得る。
【０１１３】
薬学的組成物は、投与のための任意の説明書とともに、容器、パック、またはディスペンサーに含まれ得る。
【０１１４】
本明細書で定義されるように、合成ＲＮＡまたはＤＮＡ剤の治療有効量（すなわち、有効投薬量）は、選択される合成ＲＮＡまたはＤＮＡ剤に依存する。例えば、およそ１μｇ〜１０００ｍｇの範囲の単回投与量が投与され得、いくつかの実施形態では、１０、３０、１００、または１０００μｇが投与され得る。いくつかの実施形態では、１〜５ｇの組成物が投与され得る。組成物は、２日に１回を含む、１〜１回以上／日〜１回以上／週で投与され得る。当業者は、疾患もしくは障害の重症度、以前の治療、対象の一般的な健康及び／または年齢、ならびに存在する他の疾患を含むがこれらに限定されないある特定の因子が、対象を効果的に治療するために必要とされる投薬量及びタイミングに影響を及ぼし得ることを理解するだろう。更に、治療有効量の合成ＲＮＡまたはＤＮＡ剤での対象の治療は、単回治療を含み得るか、または好ましくは一連の治療を含み得る。
【０１１５】
本発明の核酸分子は、例えば、Ｘｉａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）（上掲）に記載されるものを含むがこれらに限定されない、当該技術分野で既知の方法を使用して、発現構築物、例えば、ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、発現カセット、またはプラスミドウイルスベクターに挿入され得る。発現構築物は、例えば、吸入、経口、静脈内注射、局部投与（米国特許第５，３２８，４７０号を参照されたい）により、または定位注射（例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，３０５４−３０５７を参照されたい）により対象に送達され得る。送達ベクターの薬学的調製物は、許容される希釈剤にベクターを含み得るか、または送達ビヒクルが埋め込まれる徐放マトリックスを含み得る。代替的に、完全な送達ベクターが組換え細胞、例えば、レトロウイルスベクターから未変化で産生され得る場合、薬学的調製物は、遺伝子送達系を産生する１つ以上の細胞を含み得る。
【０１１６】
送達経路は、患者の障害に依存し得る。ある特定の例示的な実施形態では、対象は、ＩＶまたはＳＣ投与により本発明の合成ＲＮＡまたはＤＮＡ剤を投与され得る。本発明の合成ＲＮＡまたはＤＮＡ剤に加えて、患者は、第２の療法、例えば、対症療法及び／または疾患特異的療法を施され得る。二次療法は、例えば、症候性（例えば、症状を緩和するため）、保護性（例えば、疾患の進行を緩徐または停止させるため）、または回復性（例えば、疾患の進行を反転させるため）であり得る。
【０１１７】
一般に、本発明の合成ＲＮＡまたはＤＮＡ剤は、任意の好適な方法により投与することができる。本明細書で使用される場合、局部送達は、眼、粘膜、体腔の表面、または任意の内表面を含む、身体の任意の表面への合成ＲＮＡまたはＤＮＡ剤の直接適用を指し得る。局部投与用の製剤は、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、液滴、スプレー、及び液体を含み得る。従来の薬学的担体、水性、粉末、または油性基剤、増粘剤などは、必須であるか、または望ましい場合がある。局部投与は、合成ＲＮＡまたはＤＮＡ剤を対象の表皮もしくは真皮、またはその特定の層、または下層組織に選択的に送達する手段としても使用され得る。
【０１１８】
髄腔内または脳室内投与用の組成物は、緩衝剤、希釈剤、及び他の好適な添加剤も含み得る滅菌水溶液を含み得る。髄腔内または脳室内投与用の組成物は、好ましくは、トランスフェクション試薬または更に追加の親油性部分、例えば、合成ＲＮＡまたはＤＮＡ剤に結合された親油性部分を含まない。
【０１１９】
非経口投与用の組成物は、緩衝剤、希釈剤、及び他の好適な添加剤も含み得る滅菌水溶液を含み得る。脳室内注射は、例えば、リザーバに結合された脳室内カテーテルによって容易にすることができる。静脈内使用に関して、溶質の総濃度は、調製物を等張性を付与するために制御されるべきである。
【０１２０】
本発明の合成ＲＮＡまたはＤＮＡ剤は、肺送達によって対象に投与することができる。肺送達用組成物は、分散液内の組成物が肺胞領域を通して直接血液循環中に容易に吸収され得る肺に達することができるように、分散液の吸入により送達され得る。肺送達は、肺の疾患を治療するための全身送達及び局在送達の両方に有効であり得る。
【０１２１】
肺送達は、噴霧状、エアロゾル化、ミセル、及び乾燥粉末系製剤の使用を含む異なるアプローチによって達成することができる。液体噴霧器、エアロゾル系吸入器、及び乾燥粉末分散デバイスを用いて送達を達成することができる。定量デバイスが好ましい。霧化器または吸入器を使用する利益の１つは、デバイスが内蔵型であるため、汚染の可能性が最小限に抑えられることである。例えば、乾燥粉末分散デバイスは、乾燥粉末として容易に製剤化することができる薬物を送達する。合成ＲＮＡまたはＤＮＡ剤組成物は、それ自体凍結乾燥もしくはスプレー乾燥粉末として、または好適な粉末担体と組み合わせて、安定して貯蔵することができる。吸入用組成物の送達は、デバイスに組み込まれる場合、エアロゾル医薬品の投与中の用量追跡、コンプライアンス監視、及び／または患者に対する用量トリガーを可能にするタイマー、用量計、時間測定デバイス、または時間表示部を含み得る、投薬のタイミング素子によって媒介され得る。
【０１２２】
担体として有用な薬学的賦形剤の種類としては、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などの安定化剤、炭水化物、アミノ酸、及びポリペプチドなどの増量剤、ｐＨ調整剤または緩衝剤、塩化ナトリウムなどの塩などが挙げられる。これらの担体は、結晶もしくは非晶質形態であり得るか、またはこの２つの混合物であり得る。
【０１２３】
特に有用な増量剤としては、相溶性炭水化物、ポリペプチド、アミノ酸、またはそれらの組み合わせが挙げられる。好適な炭水化物としては、ガラクトース、Ｄ−マンノース、ソルボーズなどの単糖、ラクトース、トレハロースなどの二糖、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンなどのシクロデキストリン、及びラフィノース、マルトデキストリン、デキストランなどの多糖、マンニトール、キシリトールなどのアルジトールが挙げられる。好ましい炭水化物群としては、ラクトース、トレハロース、ラフィノースマルトデキストリン、及びマンニトールが挙げられる。好適なポリペプチドとしてはアスパルテームが挙げられる。アミノ酸としてはアラニン及びグリシンが挙げられるが、グリシンが好ましい。
【０１２４】
好適なｐＨ調整剤または緩衝剤としては、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウムなどの有機酸及び塩基から調製された有機塩が挙げられるが、クエン酸ナトリウムが好ましい。
【０１２５】
本発明の合成ＲＮＡまたはＤＮＡ剤は、経口及び鼻送達により投与され得る。例えば、これらの膜を通して投与された薬物は、作用の開始が迅速であり、血漿レベルの治療を提供し、肝代謝の初回通過効果を回避し、過酷な消化管（ＧＩ）環境に薬物を曝すのを回避する。更なる利点としては、薬物が容易に適用、局在、及び除去され得るような、膜部位への容易なアクセスが挙げられる。一実施形態では、経口または鼻送達により投与された合成ＲＮＡまたはＤＮＡ剤は、血液脳関門を横断することができるように修飾されている。
【０１２６】
一実施形態では、合成ＲＮＡまたはＤＮＡ剤を含む組成物の単位用量または測定用量は、埋め込まれたデバイスによって分配される。デバイスは、対象内のパラメータを監視するセンサーを含み得る。例えば、デバイスは、浸透圧ポンプなどのポンプ、及び任意選択で関連電子機器を含む。
【０１２７】
合成ＲＮＡまたはＤＮＡ剤は、天然のウイルスカプシドに、あるいは化学的もしくは酵素的に産生された人工カプシド、またはそれらに由来する構造にパッケージングされ得る。
【０１２８】
ある特定の他の態様では、本発明は、合成ＲＮＡまたはＤＮＡ剤の医薬製剤を含む好適な容器を含むキットを提供する。ある特定の実施形態では、医薬製剤の個々の構成成分は、１つの容器で提供され得る。代替的に、医薬製剤の構成成分を、２つ以上の容器、例えば、合成ＲＮＡまたはＤＮＡ剤調製物用に１つの容器、そして担体化合物用に少なくとも別の容器で別個に提供することが望ましい場合がある。キットは、単一ボックスに１つ以上の容器などのいくつかの異なる構成でパッケージングすることができる。例えば、キットとともに提供される説明書に従って、異なる構成成分を組み合わせることができる。例えば、薬学的組成物を調製及び投与するために、本明細書に記載の方法により構成成分を組み合わせることができる。キットは送達デバイスも含み得る。
【０１２９】
本明細書に開示される実施形態の範囲から逸脱することなく、好適な等価物を使用して、本明細書に記載の方法の他の好適な修正及び変形がなされることは、当業者には容易に明らかであろう。今まである特定の実施形態を詳細に記載してきたが、これらは、単に例示の目的のために含まれるものであり、限定的であることを意図するものではない、以下の実施例を参照することによって更に明確に理解されるだろう。
【０１３０】
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、本発明が属する当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または同等の方法及び材料が本発明の実施または試験で使用され得るが、好適な方法及び材料が以下に記載される。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、参照によってそれらの全体が組み込まれる。矛盾する場合には、定義を含めて本明細書が優先する。加えて、材料、方法、及び実施例は単に例示であり、限定的であることを意図するものではない。
【実施例】
【０１３１】
実施例１：生物学的ＲＮＡからの情報を用いた足場選択ライブラリ
多ヘリックス詰め込み（すなわち、三次折り畳み）を有する小さな生物学的ＲＮＡの検査により、有利な足場と考えられ得る２つの反復アーキテクチャが示された。１つ目は、Ｈ型シュードノットであり、これは、ウイルスｍＲＮＡに小さなリボザイムのリボソームフレームシフト要素を含む生物学的ＲＮＡ、ならびに天然及び合成のアプタマーに広くみられる。しかしながら、設計の観点から、この折り畳み体は操作するのが困難であり得る。もう１つは、接合部の周りにヘリックス配列を編成する遠隔三次相互作用によって支持される３方向接合部（３ＷＪ）である。この折り畳み体は、典型的には接合部に収容されるリガンド結合部位の近位に明示できるヘリックス要素（Ｐ１ヘリックスと呼ばれる）を位置付けるため、アプタマーを組み込むＲＮＡデバイスの設計により適している。
【０１３２】
３方向接合部折り畳み群内に、インビトロ選択のための配列の初期ライブラリに足場を設けるために使用することができる潜在的候補の選択が多数存在する。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｘｐｔ−ｐｂｕＸグアニンリボスイッチ（本明細書において「ＧＲ」と称される）のアプタマードメイン、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ  Ｖｃ２環状ジ−ＧＭＰリボスイッチ（本明細書において「ＣＤＧ」と称される）のアプタマードメイン、及びＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉハンマーヘッド型リボザイム（本明細書において「ＨＨ」と称される）の３つが本明細書において例示される（図１）。これらの親ＲＮＡ足場の各々において、接合部は、読み取りドメインへの二次構造架橋として機能することができるＰ１ヘリックスの近位に主な生物学的活性を提供する。
【０１３３】
開始ライブラリは、獲得物が出現するような適切なプール多様性を確実にするために、接合部の十分な数のヌクレオチドをランダム化しながら、足場の全体的な二次及び三次構造を保持するように設計された。接合部の接合鎖の全てのヌクレオチド（各位置の４つのヌクレオチドの等しい集団）ならびに接合部の近位にある各ヘリックスの少なくとも１つの塩基対をランダム化した（図１）。ＧＲ足場に関して、これにより、約７ｘ１０１３配列（４２３配列）のライブラリサイズに等しい２３のランダム化されたヌクレオチド位置の初期ライブラリを得た。ＣＤＧ及びＨＨは、同等のレベルの多様性を含んだ（約４ｘ１０１２配列のライブラリサイズに等しい２１のランダム化されたヌクレオチド位置；４２１配列）。この配列数は、理論的上、少なくとも５倍の冗長性を有するＲＮＡの初期プールにおいて完全に表される。これは、典型的な選択に推奨されるものよりも実質的に低い多様性であるが、新規アプタマーは、更により限られた配列空間のサンプリングで開始プールから得られた。
【０１３４】
３つの足場が、特定の設計特長を有するライブラリカセットに組み込まれた。足場配列の初期及び末端塩基を含む各足場のＰ１ヘリックスは、ＲＮＡ構造のＳｅｌｅｃｔｉｖｅ  ２’−Ｈｙｄｒｏｘｙｌ  Ａｃｙｌａｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｚｅｄ  ｂｙ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ（「ＳＨＡＰＥ」）化学プロービングのために開発されたものに基づいて、全てのライブラリにおいて、設計されたヘリックス含有構造化増幅カセットに置き換えられた（図１７）。これは、複製に必要な定常領域が構造化され、選択されたアプタマーに組み込まれる可能性が低いことを確実にする。リガンド結合部位の形成に定常領域が関与する可能性を更に最小限に抑えるために、Ｐ１ヘリックスを少なくとも１０塩基対に伸長した。初期開始ライブラリをコードするＤＮＡテンプレートの完全な配列を表１及び図２３に示す。
【０１３５】
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
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【０１３６】
足場選択の更なる複雑な問題は、ウイルス逆転写酵素（ＲＴ）の忠実度が低いことであった。熱安定性及び処理能力を改善して、この酵素の最も一般的に使用されるバージョンを創出するためのＭＭＬＶ  ＲＴの操作では、その既に低い忠実度を減少させた。足場の保存配列におけるヌクレオチドの誤取り込みまたは欠失は、全体的な折り畳み体を安定化させる三次相互作用を容易に破壊する。構造を欠くＲＮＡは、一部、選択において観察される「小さなモチーフの専制」をもたらす可能性がある各選択回の複製ステップ中に顕著な偏りを導入し得るＲＴによってより効率的に増幅される。これに取り組むために、近年、最大７０℃（ＳＳＩＩＩの５５℃に対して）で活性を保持し、ＭＭＬＶ由来ＲＴよりも本質的に高い忠実度を有する、好熱性Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（ＧｓＩ−ＩＩＣ−ＭＲＦまたは「ＧｓＩ」）からの可動性グループＩＩイントロン由来の特徴付けされたＲＴが採用された。比較のために、ＧＲ足場選択がＧｓＩとともにＭＭＬＶ（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩまたは「ＳＳＩＩＩ」）由来のＲＴで行われた。
【０１３７】
実施例２：５ＨＴＰに対する足場付き選択は多くの潜在的なアプタマーをもたらす
選択の標的は、セロトニンの直接の生合成前駆体である５−ヒドロキシ−Ｌ−トリプトファン（５ＨＴＰ；図２Ａ）であり、これは、そのカルボキシレート基を介して固体マトリックス上に固定化された。各ライブラリでの７回の選択が行われ、Ｌ−トリプトファンに対する対抗選択及びますます厳密な洗浄手順が後の回で行われた。ＳＳＩＩＩ選択において、親和性カラムが未結合ＲＮＡを除去するための競合溶出前に初期の回で大規模に洗浄された、従来のＳＥＬＥＸプロトコルが採用された。競合溶出は最初に４回目で観察され、６回目の全入力ＲＮＡの＞５０％でピークであった。ＧｓＩ選択には、洗浄厳密性を増大する前に、プールの配列多様性を保持するために、競合溶出下のカラム上に残存する全ＲＮＡのおよそ最後の１０％が最初の４回において増幅のために収集された、一般的に推奨されるよりもあまり厳密でないプロトコルを使用した。選択の詳細は、実施例６〜８及び表２に示される。
【０１３８】
【表２】
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【０１３９】
配列多様性の保持及び初期の確率事象を最小限に抑える際に、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）及び下流バイオインフォマティクス分析の組み合わせに依存して、潜在的なアプタマーを明らかにし、選択の主な特長を解明した。各選択に関して、＞２００，０００の読み取りを最終回からのＲＮＡについて得、得られた配列をクラスター化し、最尤系統樹を生成した。ＧＲ足場を使用したＳＳＩＩＩとＧｓＩ選択との比較は、いくつかの重要な特長を明らかにした。
【０１４０】
ＧＲ／ＳＳＩＩＩ選択の距離行列は、いくつかの単離されたクラスターのみを明確に示し、各クラスター内で、配列は高い内部関連の程度を有する（図２Ｂ）。配列の大部分（＞８０％）が、５ＨＴＰ−Ｉ、−ＩＩ、及び−ＩＩＩと称される３つの異なる配列関連ファミリーにクラスター化され（図２Ｄ）、残りは解釈が困難な小さい集団にクラスター化された。これは、単一の単離体が特定されることが多く、共変動情報を得るために更なる変異誘発及び選択が必要である従来のＳＥＬＥＸに特有である。対照的に、ＧＲ／ＧｓＩ選択は、主要なクラスター間の領域に密集した配列のサンプリングがより高い、より多様なクラスターをもたらした（図２Ｃ及び２Ｄ）。ＧｓＩでのＣＤＧ及びＨＨ選択は、多くの潜在的なアプタマーを有するそれらの配列空間において同様に多様である（図７）。従来の選択アプローチは、限られた配列情報でアプタマーを見出すのを容易にするために過剰選択に依存することが多いが、獲得物の多様性の保持及びＮＧＳによる配列分析は、保存及び共変動パターンのより徹底的な分析を可能にし、コンセンサスアプタマー配列の決定に役立つ。同様の結果がＧＲ−足場付きＬ−ＤＯＰＡ選択において観察された（図１８）。有効な５ＨＴＰアプタマーをもたらしたクラスターの各々からの２５０の配列のサブセットは、本明細書において更に記載される。
【０１４１】
予想外に、ＳＳＩＩＩ選択の限られた配列多様性に加えて、足場の定常領域の完全な同一性を保持する配列が最終回で回収されないような欠失及び点変異の大量の蓄積が観察された。クラスターのうちの２つである５ＨＴＰ−Ｉ及び５ＨＴＰ−ＩＩＩ（図２Ｄ）は、プリンリボスイッチのループ−ループ相互作用の形成に必須である足場のＬ２またはＬ３に欠失を有する。加えて、５ＨＴＰ−ＩＩＩメンバーは、極端に別の二次構造の可能性をもたらす選択中に獲得したいくつかの点欠失を含む。この配列の最小自由エネルギー（ＭＦＥ）及び共変動分析は、Ｌ−トリプトファンアプタマー（２方向接合部を含むアプタマー；Ｍａｊｅｒｆｅｌｄ  ＆  Ｙａｒｕｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００５，３３，５４８２−５４９３）のコンセンサス配列と一致する二次構造を示唆し、足場が５ＨＴＰ−ＩＩＩファミリーにおいて維持されなかったことを更に示唆する。５ＨＴＰ−ＩＩは、ライブラリに設計された三次構造に必要な配列要件を維持する唯一の主なクラスターであり、またＳＳＩＩＩとＧｓＩ選択との間で共有される唯一豊富な配列である。ＳＳＩＩＩを使用した選択とは対照的に、ＧｓＩ選択は、足場の定常領域に生じる変異の量が低いことを示し、足場の頑強な維持を示す（図８）。
【０１４２】
高いアプタマーの可能性を有する配列を特定するために、各プールから１０の最も密度が高いクラスターを個々に整列させ、ＭＦＥ構造を予測し、共変動モデルを生成した。これは、選択によって提示された主なコンセンサス配列の情報豊富な表示を可能にする。ＧＲ／ＳＳＩＩＩ実験は、非常に過剰選択されたため、３つの主なクラスターの各々からの最も豊富な配列を更なる検証のために選んだ。ＧｓＩ選択に関して、コンセンサスＭＦＥ構造が親足場と一致した１つ以上のクラスターからの優性配列が選択された。
【０１４３】
実施例３：最も密集したクラスターは足場アーキテクチャを保持し、高い選択性で５ＨＴＰに結合する
構造的足場は、得られたアプタマーの構造的及び相互作用特長の検証を非常に容易にする。「ＳＨＡＰＥ」と称される技法のＮ−メチルサト酸無水物（「ＮＭＩＡ」）を使用したＲＮＡ構造の化学プロービングは、親足場の二次及び三次アーキテクチャが保持されたか、ならびにリガンド依存的構造がアプタマーにおいて変化したかを明らかにする。ＧＲ／ＳＳＩＩＩ選択において、５ＨＴＰ−Ｉ及び５ＨＴＰ−ＩＩアプタマーは、リガンドの存在下で、３方向接合要素内のＮＭＩＡ反応性パターンの変化を局在し、リガンド結合部位であるこれと一致する（図３Ａ、図１９）。しかしながら、５ＨＴＰ−ＩＩＩは、定常領域のＪ２／３の外側で変化を示し、予測された構造及び前に記載されたトリプトファンアプタマーのＬ−Ｔｒｐ結合部位と一致する（Ｍａｊｅｒｆｅｌｄ  ＆  Ｙａｒｕｓ）。ＧＲ足場の保持は、Ｌ２と相互作用するときにのみ存在するＬ３の独自のリガンド非依存的ＮＭＩＡ反応性の特徴を使用して評価された（Ｓｔｏｄｄａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ，２００８，１４，６７５−６８４）。５ＨＴＰ−ＩＩは、この特長を示すＳＳＩＩＩ選択の３つのクラスターからの唯一の配列である。逆に、ＧＲ／ＧｓＩ選択からの全ての試験した配列は、この三次構造の特徴を有する（図９Ａ及び２０）。これらのデータは、ＧＲ／ＳＳＩＩＩ選択が３つの異なるアプタマーをもたらし、５ＨＴＰ−ＩＩのみが構造的足場を保持する一方で、ＧＲ／ＧｓＩ選択が足場を維持する複数の解決策をもたらしたことを強く示す。ＧＲ／ＧｓＩ単離体の５ＨＴＰ依存的な特徴は、５ＨＴＰ−ＩＩ及び親アプタマーのものよりも弱いが、定量化は、それらが類似する様式で接合部に局在することを明らかにする（図３Ｂ）。ＣＤＧ／ＧｓＩ及びＨＨ／ＧｓＩ選択のＳＨＡＰＥ特徴付けは、アプタマーの新しいクラスのリガンド依存的変化を示し、全体的な反応性パターンは、親足場に類似する（図９Ｂ、９Ｃ、２１、及び２２）。
【０１４４】
５ＨＴＰのこれらのアプタマーの親和性及び選択性、ならびに一組の化学的に同様の化合物を、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）により評価した。重要なことには、試験したアプタマーの全てに関して、５’−及び３’−カセット配列は５ＨＴＰ結合に必要ではなく、中性配列の良好な設計を示す（図３Ｃ）。いくつかの傾向がこの分析から浮かび上がった。まず、親足場を保持しない両アプタマー（５ＨＴＰ−Ｉ、−ＩＩＩ）は、細胞に基づく用途に重要な要件である５ＨＴＰとＬ−トリプトファンとを区別しない（表３）。第２に、３方向接合足場を保持する大部分のアプタマーは、破壊された足場を有するアプタマーよりも５ＨＴＰに高い親和性を有し、全てがＬ−トリプトファンを強く区別する。これは、足場のアーキテクチャが、アミノ酸に結合する他の合成及び天然アプタマーと比較可能な親和性を維持しながら、選択的結合ポケットを創出するのに重要であることを示す。５ＨＴＰ−Ｉ及び５ＨＴＰ−ＩＩＩは、５ＨＴＰ及びセロトニン間の強い区別を示し、主な鎖原子が直接認識されることを暗示する。対照的に、足場を保持するアプタマーの多くは、５ＨＴＰよりも２〜４倍高い親和性でＮ−メチル−５−ヒドロキシ−Ｌ−トリプトファノミドに結合する。また、それらは、５ＨＴＰの脱炭酸産物であるセロトニンに結合し、結合における主な鎖原子の要件が低いことを示唆する（図３）。したがって、これらのアプタマーのいくつかが優れたセロトニンセンサーであり得る。ＧｓＩ選択から最も際立ったことは、各選択からの優性アプタマーが、異なる足場アーキテクチャを有するにもかかわらず、非常に類似する結合親和性及び選択性プロファイルに集まり、３方向接合部が５ＨＴＰ結合ポケットを提供するための頑強な折り畳み体であることを明らかにしたことである。まとめると、これらのデータは、３方向接合部アーキテクチャ変異型などの異なるオリゴヌクレオチド接合部が５ＨＴＰ認識のための頑強な解決策を見出すことができることを示す。
【０１４５】
【表３】
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【０１４６】
実施例４：５ＧＲ−ＩＩアプタマーの構造分析は反復ＲＮＡモチーフが５ＨＴＰ結合に使用されることを明らかにする
本明細書に記載の足場付き選択戦略が親ＲＮＡの折り畳み体を保持したことを更に示し、ＲＮＡが５ＨＴＰをどのように認識することができるかを解明するために、５ＨＴＰと複合体形成した５ＨＴＰ−ＩＩの構造を２．０Å分解能で決定した（図３Ｄ、代表的な電子密度図が図１０に示され、結晶学統計値が表４に示される）。この構造は、残基１９〜７７の全ての骨格原子に対して６．５Åのｒ．ｍ．ｓ．ｄ．の親ｘｐｔグアニンリボスイッチアプタマーと全体的に重なり、偏差の主な供給源は、結合ポケット及び有効な接合領域に関してＰ１の異なる角度によりもたらされた（図１６Ａ〜Ｃ）。Ｌ２−Ｌ３三次相互作用内で、塩基−塩基相互作用のパターン及び骨格配置は２つのＲＮＡ間でほぼ同一である（残基３１〜３９、６１〜６７の全ての原子に対してｒ．ｍ．ｓ．ｄ．０．９６Å）。したがって、ＧＲ足場は、選択プロセス中、全体的及び局所的の両方で未変化のままであった。
【０１４７】
【表４】
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【０１４８】
５ＨＴＰ−ＩＩのリガンド結合ポケットは、親ＲＮＡとは根本的に異なる局所構造を有する３方向接合部内に存在する。直接的なリガンド接触は、主に、通常のＲＮＡ構造モジュールのＴループを使用して、Ｊ２／３のヌクレオチドにより媒介される（図４Ａ）。Ｊ２／３の最初の５つのヌクレオチドは、ｔＲＮＡＰｈｅＴループとほぼ完全に重なる正準Ｔループ構造を形成する（骨格残基についてｒ．ｍ．ｓ．ｄ．０．４９Å）。Ｄループと対合する長距離のワトソン・クリックによるｔＲＮＡ  Ｔループの３位の安定化は活性に重要である。５ＨＴＰ−ＩＩは、ＴループのＧ４７とＪ３／１のＣ７５との間に同様の相互作用を有する。５ＨＴＰ−ＩＩＴループは、ｔＲＮＡ  ＴループがどのようにＤループからの挿入プリンを提供し、そのリボスイッチによるチアミンピロリン酸（ＴＰＰ）認識とも類似するオルソロガスな様式で４位と５位との間に積み重ねられる５ＨＴＰを提供する（図４Ｂ）。Ｔループはリガンドの認識に直接関与するが、３つ全てのランダム化された領域からのヌクレオチドは、Ｔループを安定化するコンパクトな接合部の形成に役立つ局所構造に関与する。そのように複雑な一組の相互作用がＴループを支持することを考えると、単離されたＴループが５ＨＴＰに結合する可能性は低い。
【０１４９】
５ＨＴＰ−ＩＩの結晶構造により、他の足場付きアプタマーによる５ＨＴＰ認識の更なる見識が得られる。ＧＲ／ＧｓＩ選択において最も豊富なクラスターである５ＨＴＰ−ＩＶもＴループのＵＵＧＡＡ特徴を含む。しかしながら、モチーフは、単一のヌクレオチドによって３’シフトされ、５ＨＴＰ−ＩＩと５ＨＴＰ−ＩＶとの間のＪ１／２及びＪ３／１における顕著な配列相違により示唆されるように、３方向接合部内に別の配向をもたらす可能性がある。ＨＨ選択において、最も密度が高いクラスター（５ＨＴＰ−ＶＩＩＩ）の最も豊富な配列もＪ２／３のＴループの保存されたＵＵＧＡＡ配列を含む。５ＨＴＰ−ＶＩＩＩアプタマーのこの領域の配列差異分析は、わずかな偏差のみで生物学的Ｔループのものと一致する保存パターンを明らかにする（図１１）。これは、ＴループモチーフがＲＮＡによる小さな平面化合物の認識のための頑強なモジュールであり得ることを示唆する。ＣＤＧ選択からのＲＮＡにおける明らかに識別可能なＴループは存在しないが、結合パラメータは、他の２つの選択のものとほぼ完全に一致し、同様の認識モードを示唆する。
【０１５０】
実施例５：足場付きアプタマーは、頑強な小分子感覚デバイスに容易に組み込むことができる
足場付き選択技法が十分に折り畳まれ、高度に構造化された特異的なＲＮＡアプタマーの創出を可能にすると立証するため、機能的合成ＲＮＡバイオセンサーを産生するその能力を試験した。これらのデバイスを創出するために、短いヘリックス要素を介して小分子結合アプタマーをフルオロフォア結合モジュールに連結する戦略を使用した。各ライブラリからの主な候補アプタマーをブロッコリーフルオロフォア結合アプタマーに結合し、２つのヘリックス変異型（通信モジュールは「Ａ」及び「Ｕ」と称される、図１２）は２つのアプタマーを連結する。これにより、様々な出力蛍光ダイナミックレンジで、インビトロで数桁にわたって５ＨＴＰ及び／またはセロトニンを感知することができる一組のＲＮＡが得られる（表５及び表６）。これらのセンサーの多くは、リガンドが存在する場合、同一の条件下で未コンジュゲートのブロッコリーアプタマー単独以上の蛍光レベルをもたらすことができる。この系に特有なのは、ブロッコリー蛍光によって監視されるとき、単離されたアプタマーのＫＤに対する明らかに低減したＦ５０（最大蛍光応答の半分を誘発するのに必要なリガンド濃度として定義される）である。しかしながら、いくつかの足場付きアプタマーは、それらのＫＤとＦ５０との間に約１０倍の差異しか示さない。全体的に、これは、感度またはリガンド毒性がリボスイッチ用途における制限因子である場合に考慮する重要な特色であるＫＤとＦ５０との差異が１０００倍に近づき得る、文献の天然のリボスイッチアプタマードメインの例に比べて優る。
【０１５１】
【表５】
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【表６−１】
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【表６−２】
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【０１５２】
上記デバイスのうち、５ＨＴＰ−ＩＩ（Ａ）は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて５ＨＴＰを特異的に感知することができる。この遺伝学的にコードされたセンサーは、栄養豊富な既知組成培地中で成長する（１０分間）Ｅ．ｃｏｌｉに２ｍＭの５ＨＴＰを添加したときに蛍光の迅速な誘導をもたらした（およそ８０％の細菌が２０分以内に観察可能な応答を示した）（図５）。蛍光シグナルは、５ＨＴＰに結合するＲＮＡデバイスに完全に依存した。Ｌ−トリプトファンが培地に含まれた場合、またはセンサーが単離されたアプタマーに結合するリガンドを切断したＴループモジュールに点変異（Ａ４８Ｕ）を含んだ場合、シグナル増加は観察されなかった（データ示さず）。更に、５ＨＴＰの存在下での相対的な蛍光の増加は、生細胞の天然のリボスイッチアプタマードメインに基づく頑強な環状ジヌクレオチドセンサーと比較可能であった。重要なことには、これらの観察は、天然ではないアプタマーが蛍光センサーとの関連で天然のアプタマーと比較して低減した細胞内性能を有するという主張と対照的である（Ｙｏｕ，ＰＮＡＳ（２０１５）１１２：２１，Ｅ２７５６−２７６５）。
【０１５３】
選択した足場付き５ＨＴＰアプタマーも、遺伝子調節要素を生成するために天然のリボスイッチ発現プラットホーム由来の操作されたモジュール式二次スイッチに結合された。アプタマーのＰ１ヘリックス及び発現プラットホームが直接結合される結合戦略を使用して、５ＨＴＰ−ＩＶセンサー及びｐｂｕＥ「ＯＮ」スイッチプラットホームを融合することにより、転写の優れたリガンド依存的調節因子が操作された（図６Ａ）。得られたＲＮＡ要素は、単独で、インビトロでアプタマードメインと同一の特異性プロファイルを有する転写リードスルーを活性化することができ、天然のリボスイッチと一致するダイナミックレンジを有する（図６Ｂ）；驚くべきことに、Ｌ−Ｔｒｐは、リードスルー転写を可能にすることが完全に不可能である。同様に、ＫＤとＴ５０との間の不一致はわずかであるが（セロトニンに関しては６倍、５ＨＴＰに関しては２２倍）、アプタマーの熱力学的特性がアダプター配列と通信するその能力に必ずしも影響しない天然のリボスイッチの観察された傾向を反映した。
【０１５４】
実施例６：例示的な実施形態による足場付きアプタマー
ブロッコリーアプタマーをｔＲＮＡ足場に結合して、細胞に基づく用途のバイオセンサーを安定化した。４つの異なるＧＲ−足場付き５ＨＴＰアプタマーを異なる長さ（２〜５のＡ−Ｕ及びＵ−Ａ塩基対；図１４Ａ）の４つの通信モジュールに結合し、各得られたバイオセンサーをリガンド依存的様式で蛍光を発する能力について試験した。各センサーを、インビトロ（図１４Ｂ；表７及び８）及びＥ．ｃｏｌｉ（図１４Ｄ；表９及び１０）の両方において、蛍光におけるそれらのリガンド依存的変化倍率、及び単離されたブロッコリーアプタマーに対する最大輝度について評価した。インビトロでの候補の迅速なスクリーニングを可能にするために、バイオセンサーを転写し、更に精製することなく蛍光アッセイに直接使用した。これらのデータは、３つのアプタマー（５ＧＲ−ＩＩ、−ＩＶ、及び−Ｖ）がインビトロ及び細胞状況の両方において５ＨＴＰ及び／またはセロトニンを検出することができるセンサーをもたらしたことを明らかにし、５ＧＲ−ＩＩは蛍光の増加倍率及び最大輝度の組み合わせに関して最良の性能を示す。
【０１５５】
足場付きアプタマーの能力を更に示すために、生細胞の撮像を使用して、５ＧＲ−ＩＩ／ＣＭ−４バイオセンサーを使用するＥ．ｃｏｌｉによる５ＨＴＰの取り込みを可視化した。単一細胞の蛍光撮像は、栄養豊富な既知組成培地中で成長するＥ．ｃｏｌｉに２ｍＭの５ＨＴＰを添加したときに蛍光の迅速な誘導を明らかにした（およそ８０％の細菌が２０分以内に観察可能な応答を示した）（図１５Ａ、Ｄ）。蛍光シグナルは５ＨＴＰに結合するＲＮＡデバイスに完全に依存した；Ｌ−トリプトファンが培地に含まれた場合（図１５Ｂ、Ｅ）、またはセンサーが単離されたアプタマーに結合するリガンドを切断したＴループモジュールに点変異（Ａ４８Ｕ）を含んだ場合（図１５Ｃ、Ｆ）、検出可能なシグナル増加は観察されなかった。５ＨＴＰの存在下での相対的な蛍光の観察された増加は、生細胞の天然のリボスイッチアプタマードメインに基づく頑強な環状ジヌクレオチドセンサーと比較可能であった。これらの結果は、合成アプタマーが天然のアプタマーと比較して低減した細胞内性能を有するという以前の主張と対照的であり、ここでは複数の合成アプタマーがアロステリック蛍光発生ＲＮＡとの関連でＥ．ｃｏｌｉ内で機能することができることを示す。
【０１５６】
上記の５ＨＴＰバイオセンサーは、選択したアプタマーの生化学及び生物理学的分析からの知識を用いて設計された。しかしながら、バイオセンサーの迅速な開発のための最適なワークフローは、候補ＲＮＡを設計するために、選択の計算分析からのみ導かれた情報を使用することができるだろう。足場付きアプタマーが実験上の特徴付けなくバイオセンサーの操作を可能にする設計原理を組み込むことを示すために、Ｌ−ＤＯＰＡ選択から導かれた４つのアプタマーに上記バイオセンサー戦略を用いた。これらのアプタマーのいずれも、アロステリック蛍光発生センサーへのそれらの組み込み前にいかなる様式において検証されなかった。インビトロ（図１４Ｃ；表７及び８）及びＥ．ｃｏｌｉ（図１４Ｅ；表９及び１０）での、Ｌ−ＤＯＰＡ及びドーパミンを用いた、得られたバイオセンサーのスクリーニングは、両方の状況で機能する２つのアプタマー（ＤＧ−Ｉ及びＤＧ−ＩＩ）を明らかにした。
【０１５７】
【表７】
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【０１５８】
【表８】
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【０１５９】
【表９】
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【０１６０】
【表１０】
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【０１６１】
実施例７：考察
ＲＮＡに基づくデバイスは、シスで調節する能力、予測可能な二次構造、及び小さな遺伝的足跡を含む、タンパク質に基づく代替物と比較した場合、独自の特長組によって導かれる合成生物学における頑強なツールとなる方向に進歩している。合成リボスイッチ、アプタザイム、及び蛍光発生ＲＮＡセンサーの創出に努力が注がれてきたが、それらの能力は、かなりの部分で、そのようなデバイスとの関連で機能する小分子受容体の限られた利用可能性により、まだ完全には理解されていない。本明細書に提示される作業において、インビトロ選択を通して生じた小分子結合ポケットに足場を設けるために、自然に進化したリボスイッチ及びリボザイムの二次及び三次構造アーキテクチャを利用する戦略が設計された。重要なことには、選択の最終回のハイスループット配列決定から得られた情報以外を使用することなく、このアプローチを使用してＬ−ＤＯＰＡに選択されたアプタマーを、蛍光発生アプタマーモジュールに結合して、細胞状況において機能する遺伝学的にコード可能なバイオセンサーを産生する。
【０１６２】
本明細書に記載の方法及び組成物の１つの主な長所は、一連のアプタマーを得るために、平行選択で複数の足場を使用することである。これは、同じサブセットの溶液がセンサーの多様性及び開発を大幅に制約する単純なランダム化されたプールから再現的に生成される当該技術分野で既知の従来の方法とは大幅に異なる。異なる足場由来のアプタマーは、同様の５ＨＴＰに対する親和性及びＬ−トリプトファンに対する選択性を有するが、それらは、足場の全てに共通の特長であるＰ１ヘリックスを介した読み取りドメインと通信するそれらの能力に関して明確に異なる特徴を有する。生物学的リボスイッチにおいて、リガンドは、直接接触しているか、またはアプタマーを下流調節スイッチに連結するＰ１ヘリックスを伴うＲＮＡにおける立体構造変化を誘導するかのいずれかである。科学的理論に拘束されることを意図することなく、これは、異なるアプタマーにわたるセンサーの性能の相違が、一部、選択において完全に制御することができない特長であるリガンドとドメイン間（Ｐ１）ヘリックスとの間の空間的関係における変動によるものであると仮定される。しかしながら、大規模な選択とは異なり、本明細書に提示される足場付き選択アプローチは、可能なリガンド位置を制約することによって好都合なリガンド／Ｐ１配向へと選択を強く偏らせる。
【０１６３】
一連のアプタマーでは、本明細書におけるドーパミンセンサー開発に代表されるように、コンビナトリアルアプローチを用いて、広範なアプタマーの特徴付けまたはデバイスの最適化を行うことなく、センサーを迅速にスクリーニングすることができる（図１９）。大規模な選択から導かれたアプタマーからのＲＮＡデバイスの開発は、多様性の欠如により感覚アプタマーを固定された不変ノードとして残しながら、通信モジュールの広範なスクリーニングとともに徹底的な特徴付けを必要とする。本明細書に記載の足場付き選択方法及び組成物では、Ｌ−ＤＯＰＡ選択で示されるように、一組の異なるアプタマーが組み合わせにより一組の通信モジュールに結合され、所望の活性を有する変異型を迅速にスクリーニングし得る。この様式により、本明細書に提供される方法及び組成物は、それらの開発における主な障害を軽減することによって、便宜的なＲＮＡデバイス及びセンサーの開発を容易にするはずである。特に、この研究では、特徴付け及び／またはセンサー設計のための各選択において、最も密度が高いクラスターのみに焦点を置くが、各選択内で、下流用途を開発するためのアプタマーの初期プールを更に濃縮し得る代替配列を含む多くのクラスターが存在する。
【０１６４】
本明細書に記載の選択方法及び組成物の第２の強力な利点は、３方向接合部アーキテクチャの三次相互作用により提供される細胞状況における頑強な折り畳みの可能性である。これらのアプタマーの各々は、広範な生物進化を受けた折り畳み体を有する。更に、３方向接合部のコアを編成する遠位三次相互作用は高度に安定であり得る。プリンリボスイッチのＬ２−Ｌ３相互作用及び環状ジ−ＧＭＰリボスイッチ足場のテトラループ−テトラループ受容体の両方は、他のＲＮＡ構造の状況の外側で安定して形成することができる。対照的に、選択された足場に関して多様性の別の態様である、Ｓ．ｍａｎｓｏｎｉハンマーヘッド型リボザイムを編成する長距離相互作用は動的である。足場における頑強な二次及び三次構造の存在は、これらの要素が初期ライブラリの全てのメンバーの折り畳みを潜在的に先導することを可能にする。対照的に、選択中のＲＮＡの誤った折り畳み及びまたは最終アプタマーにおける複数のＭＦＥ構造の存在は、従来の大規模な選択には非常に問題であることが多い。典型的な選択プロトコルにおいて高忠実度の折り畳みに対する顕著な選択圧がないため、開始ライブラリにおいてこの情報を提供することは、頑強な折り畳みＲＮＡへの道筋であり得る。
【０１６５】
３方向接合足場が本研究の焦点として選択されたが、天然のリボスイッチ及びリボザイムの多様性は、このアプローチに更なる供給材料を提供し得る。３方向接合部ファミリー内で、特定のリガンドまたはセンサーに優れた足場を提供し得る３つのヘリックスの配向、接合部領域のサイズ、及び遠位三次相互作用の性質を変える広範囲にわたる配列が存在する。更に、他の折り畳み体は、同族リガンドの性質に基づいて標的小分子に結合しやすくなり得る。例えば、５ＨＴＰに結合する足場の別の理論的な選択は、リジンリボスイッチアプタマードメインである。より大きなリガンドは、フラビンモノヌクレオチドまたはコバラミンリボスイッチ由来足場によってより容易に認識され得る一方で、ＮＡＤＨなどのジヌクレオチドは、二環状ヌクレオチドアプタマーのうちの１つにより簡単に対処され得る。天然のＲＮＡアプタマーは、化学的に多様な小分子を認識することが分かったため、新規アプタマーの選択に向けたそれらのアーキテクチャの利用が、広範囲な用途にわたる細胞環境において小分子を監視し、それに応答するための強力な新しいツールの開発を容易にする可能性がある。
【０１６６】
実施例８：ライブラリ構築
各足場に関して、親ＲＮＡのリガンド結合部位または活性部位を囲む８Åシェル内のヌクレオチドはそれらの結晶構造から特定された（ＧＲ、ＰＤＢ  ＩＤ  ４ＦＥ５；ＣＤＧ、ＰＤＢ  ＩＤ  ３ＩＷＮ；ＨＨ，ＰＤＢ  ＩＤ  ３ＺＤ５）。対応する位置は、逆転写及び増幅のための保存隣接配列（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；この研究に使用された全ての核酸の配列は表１に提供される）を有するアプタマードメイン全体に及ぶＤＮＡ  ｕｌｔｒａｍｅｒにおいてランダム化された。ｓｓＤＮＡは、約２ｘ１０−１２ｍｏｌ  ＤＮＡ（約１０１２の個々の配列に相当する）が各１００μＬのＰＣＲ反応に使用され、Ｔ７部位付加及びＲＴ−ＰＣＲプライマーを用いて１５サイクルの間増幅された標準のＴａｑ  ＰＣＲ条件を使用して、転写のためのｄｓＤＮＡテンプレートに変換された。およそ１ｘ１０１４配列を、４０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２５ｍＭのＤＴＴ、２ｍＭのスペルミジン、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、各４ｍＭのｒＮＴＰ  ｐＨ８．０、０．０８単位無機ホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、凍結乾燥粉）、及び０．２５ｍｇ／ｍＬのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを含む１２．５ｍＬの転写反応物において転写し、３７℃で４時間インキュベートした。次いで、転写試料を、−２０℃の７５％エタノール中で沈殿させ、ペレット化し、３００μＬのホルムアミド、３ｍＬの８Ｍ尿素、及び３００μＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０の溶液に再懸濁した。完全長ＲＮＡを変性８％の２９：１のアクリルアミド：ビスアクリルアミドゲルで精製した。産物ＲＮＡをＵＶシャドウイングにより可視化した後にゲルから切り出し、０．３ＭのＮａＯＡｃ  ｐＨ５．０において溶出した後に、０．５ｘＴＥに交換し、貯蔵した。
【０１６７】
実施例９：５ＨＴＰ親和性カラムマトリックスの合成
誘導体化カラムに関して、３ｍＬの床容積のＥＡＨセファロース  ４Ｂ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で脱水した。１０μモルのＦｍｏｃ−５−ヒドロキシ−Ｌ−トリプトファン及び１０μモルのベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）を１ｍＬのＤＭＦに溶解し、２０μモルのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を有する脱水したカラムに添加し、室温で２時間、攪拌しながらインキュベートした。次いで、カラムマトリックスを流し、ＤＭＦで十分に洗浄した。未反応セファロースアミンは、およそ１ｍＬ  ＤＭＦ中の１ｍｍｏｌｅの酢酸無水物及び１ｍｍｏｌｅのＤＩＰＥＡを添加することによりアセチル化され、室温で１時間混合された。アセチル化混合物をカラムから流し、２０％ｖ／ｖピペリジン／ＤＭＦを使用して、Ｆｍｏｃ脱保護の前にＤＭＦで洗浄した。カラムのアミノ酸濃度は、脱保護画分におけるＦｍｏｃの濃度を測定することにより決定された（Ａ３０１ｎｍ＝８０００Ｍ−１ｃｍ−１）。この方法は、およそ０．５〜１ｍＭの脱保護されたアミノ酸／１ｍＬ樹脂を生成した。対抗選択に関して、ＥＡＨセファロースは、アセチル化セファロースをもたらすリガンド結合ステップを省くことを除き、まったく同じに調製された。
【０１６８】
実施例１０：インビトロ選択
ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ逆転写酵素（ＧＲ／ＳＳＩＩＩ）を使用するＧＲ足場選択に関して、３５０μＬのアセチル化セファロースを選択緩衝液（１０ｍＭのＮａ−ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、２５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１ｍｇ／ｍＬのｔＲＮＡ）において平衡化し、３５０μＬの選択緩衝液中の１ｎｍｏｌのライブラリＲＮＡを、攪拌しながら室温で３０分間インキュベートした。適用した溶液を除去し、３５０μＬの選択緩衝液で１回カラムマトリックスを洗浄した。プールしたフロースルー及び洗浄液（合計７５０μＬ）を予め平衡化した５ＨＴＰ誘導体化セファロース４Ｂカラムに添加し、４５分間インキュベートした。次いで、カラムを空にし、選択緩衝液で３回洗浄した後、選択緩衝液中１０ｍＭの５ＨＴＰで溶出した（３５０μＬ中で、１時間のインキュベーションを２回；合計７００μＬの溶出容積）。次いで、溶出した画分を０．５ｍＬのＵｌｔｒａｃｅｌ  １０ｋＤ  ＭＷＣＯフィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）において５０μＬに濃縮し、０．３Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）、５μｇのグリコーゲン中にエタノール沈殿させ、７５％エタノールの最終濃度にした後に−７０℃で３０分間貯蔵した。各サイクルの条件の詳細は表２に提供される。
【０１６９】
競合的に溶出されたＲＮＡを新しいＲＮＡ集団に変換するために、溶出画分をエタノール沈殿させ、４℃で、１３０００ｘｇでペレット化し、デカントし、真空下で乾燥させた。乾燥させたペレットを各０．７ｍＭのｄＮＴＰ、７μＭのＲＴ−ＰＣＲプライマーで再構成し、１４μＬの総容積にした後、５分間６５℃に加熱し、氷上で１０分間インキュベートした。次いで、溶液を、２０μＬの総容積中５ｍＭのＤＴＴ及び２００単位のＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて１ｘ  ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ一本鎖緩衝液（５ｘ：２５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、３７５ｍＭのＫＣＬ、１５ｍＭのＭｇＣｌ２）に提示した後、５４℃で１５分間伸長した。２０μＬ全ての逆転写溶液を、標準のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ条件を使用して、総容積５００μＬ中でＰＣＲ増幅した。次いで、増幅したプールを、４０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２５ｍＭのＤＴＴ、２ｍＭのスペルミジン、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、各４ｍＭのｒＮＴＰ  ｐＨ８．０、０．０８単位無機ホスファターゼ、及び０．２５ｍｇ／ｍＬのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを含む１ｍＬの転写反応物に１００μＬのＰＣＲ反応物を添加することによって転写し、３７℃で２時間インキュベートした。３２Ｐ標識ＲＮＡのための１００μＬの転写反応を、ｒＮＴＰがＵＴＰ、ＣＴＰ、及びＧＴＰについて２ｍＭに低下し、同時にＡＴＰが２００μＭ及び約１００μＣｉ  ３２Ｐ−ＡＴＰに還元された伸長を用いた同様の条件下で行った。適切にスケーリングしたゲル充填条件を用いて、上述のように転写試料をゲル精製した。
【０１７０】
ＧｓＩ逆転写酵素を使用した選択は、以下の変更とともに上述のように行われた。選択のための緩衝液は、減少させたマグネシウム濃度及びより生理学的に適切な一価のカチオン：２５ｍＭのＮａ−ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、１５０ｍＭのＫＣｌ、５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ２）を含んだ。ＧｓＩ−ＩＩＣ−ＭＲＦ逆転写酵素がＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩの代わりに使用された。ＧｓＩ−ＩＩＣ  ＭＲＦ逆転写酵素をＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、記載のように精製した（Ｍｏｈｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ，２０１３，１９，９５８−９７０）。沈殿させたＲＮＡペレットを１．２５ｍＭのｄＮＴＰ及び２０μＭのＲＴ−ＰＣＲプライマーに提示した後、６５℃で変性し、４℃でアニーリングし、６０℃で平衡化した。次いで、溶液を、２０μＬの総容積中で１ｘＧｓＩ−ＩＩＣ−ＭＲＦ緩衝液条件（１０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｍＭのＴｒｉｓＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭのＤＴＴ）に提示し、伸長のために６０℃で十分な酵素を添加した。ＰＣＲは上述のように行った。
【０１７１】
実施例１１：ハイスループット配列決定及びバイオインフォマティクス分析
フローセルにアニーリングするために必要なＩｌｌｕｍｉｎａハイブリダイゼーション配列を付加するために標準のＰＣＲを実施した。各ライブラリを、順方向配列決定プライマー及び特徴のある１２のヌクレオチドバーコードを含む独自の逆方向プライマーを用いて増幅した（配列は表１に示される）。カスタムリード及びインデックスプライマーを用いたＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）での１５０サイクル用のｖ３試薬キットを使用して、試料を配列決定した。
【０１７２】
得られた配列を、ＱＩＩＭＥ（Ｃａｐｏｒａｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１０，７，３３５−３３６）からのスクリプトを使用して逆多重化し、トリミングし、品質選別した。Ｐ１ステムの外側の全ての配列情報をトリミングし、各ヌクレオチドに対してＰｈｒｅｄスコア≧２０を有する配列のみを分析に使用した。次いで、各ライブラリの得られたｆａｓｔａ形式のファイルを、９０％同一性でクラスター化されたシード配列を生成するＵＳＥＡＲＣＨ（Ｅｄｇａｒ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２６，２４６０−２４６１）によるクラスター化に供した。単一配列を含む全てのクラスターを廃棄した。次いで、密度が高い上位１０のクラスターをそれらの元の配列ファイルにマッピングし戻し、２５０の個々の配列を、更なる分析のための各クラスターの代表的な試料としてランダムに選んだ。各クラスターの配列を、ＭＵＳＣＬＥ（Ｅｄｇａｒ，ＮＡＲ，２００４，３２，１７９２−１７９７）を使用して整列し、得られたアラインメントをＣＭｆｉｎｄｅｒ（Ｙａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２００６，２２，４４５−４５２）を使用して分析した。Ｒ２Ｒ（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  ＆  Ｂｒｅａｋｅｒ，ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２０１１，１２，３）をそのデフォルト設定で実行して、最小自由エネルギー（ＭＦＥ）二次構造上にマッピングされた配列保存図を生成した。
【０１７３】
実施例１２：ＮＭＩＡ化学プロービング
前に記載されるように（Ｅｄｗａｒｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２００９，５３５，１３５−１６３）、ＲＮＡを調製した。ＲＮＡの５’及び３’端に隣接する構造カセットを付加して逆転写を容易にし、確立されたプロトコル（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．，２００６，１，１６１０−１６１６）を使用して、２５℃でＮＭＩＡ修飾を行った。１００ｍＭのＮａ−ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０、１００ｍＭのＮａＣｌ、及び６ｍＭのＭｇＣｌ２中１００ｎＭでＲＮＡをプローブした。リガンドの濃度は、示される場合、５００μＭであった。ゲル画像はＳＡＦＡ（Ｄａｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ，２００５，１１，３４４−３５４）及びＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）により分析された。
【０１７４】
実施例１３：等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）
試験した全てのＲＮＡは、ＳＳＩＩＩ選択緩衝液（１０ｍＭのＮａ−ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、２５０ｍＭのＮａＣｌ；５０ｍＭ  ＫＣｌ；１０ｍＭのＭｇＣｌ２）に交換され、１０ｋＤ  ＭＷＣＯフィルタ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）において３回洗浄された。リガンドは乾燥個体から直接結合緩衝液に提示され、濃度は、５−ヒドロキシインドール部分に関して、２７５ｎｍで８０００ｍｏｌ−１ｃｍ−１の吸光係数を使用して、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で確立された。ＲＮＡを５０〜１００μＭに希釈し、リガンドを、ＲＮＡのおよそ１０倍の濃度で滴定した。滴定は、確立されたプロトコル（Ｇｉｌｂｅｒｔ  ａｎｄ  Ｂａｔｅｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２００９，５４０，９７−１１４）を使用して、ＭｉｃｒｏＣａｌ  ｉＴＣ２００マイクロカロリメーター（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して２５℃で行った。データを分析し、Ｏｒｉｇｉｎ  ５．０ソフトウェアスイート（Ｏｒｉｇｉｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いてフィッティングを行った。
【０１７５】
実施例１４：５ＨＴＰ−ＩＩ／５ＨＴＰ複合体の構造決定
前に記載されるように（Ｅｄｗａｒｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２００９，５３５，１３５−１６３）、結晶化のためのＲＮＡを調製した。Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  １５  １０ｋ  ＭＷＣＯフィルタ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｉｎｃ．）においてＲＮＡを濃縮し、０．５ｘＴ．Ｅ．緩衝液に交換した。２μＬのＲＮＡ：リガンド複合体（１：１）及び３．５μＬの母液（８〜１４％  ２−メチル−２，４−ペンタンジオール、４０ｍＭのカコジル酸ナトリウム、ｐＨ５．５、４ｍＭのＭｇＣｌ２、１２ｍＭのＮａＣｌ、８０ｍＭのＫＣｌ、及び４〜９ｍＭのヘキサアンミンコバルト）を混合し、マイクロシーディングし、２２℃で１〜３日間インキュベートすることにより、回折品質の結晶を得た。結晶は更なる低温保護を必要とせず、データ収集前に液体窒素で急速冷凍された。１００ＫでＣｕＫα放射線（１．５４１８Å）を使用して、Ｒｉｇａｋｕ  Ｒ−Ａｘｉｓ  ＩＶ画像プレートシステムを用いてデータを収集し、Ｄ＊ＴＲＥＫ（Ｐｆｌｕｇｒａｔｈ，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ  Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，１９９９，５５，１７１８−１７２５）を使用してインデックスを付け、スケーリングした。ヘキサアンミンコバルトを１〜１１ｍＭのヘキサミンイリジウムに置き換えることによって作製された重原子誘導体のデータも社内（ｈｏｍｅ）ｘ線源で収集された。異常散乱（ＳＩＲＡＳ）方法を用いた単一同形置換を使用して相を決定した。ＡｕｔｏＳｏｌ（Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ  Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，２０１０，６６，２１３−２２１）を使用して１２のイリジウム原子を見つけ、次いで、これを、相を計算するために使用した。得られた実験密度図はＲＮＡ骨格の明白な特長を表し、ヘリックスは、モデルを構築するために使用した。
【０１７６】
初期のモデルは、Ｃｏｏｔ（Ｅｍｓｌｅｙ  ＆  Ｃｏｗｔａｎ，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ  Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，２００４，６０，２１２６−２１３２）においてリガンドなしで、ＰＨＥＮＩＸ（Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ  Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，２０１０，６６，２１３−２２１）における精密化回間で繰り返し構築された。数回の精密化及び疑似アニーリングを通してＲＮＡモデルを得た後、５ＨＴＰをモデルに構築した。この構築時点で、リガンドの確信的な配置及び配向を可能にする結合ポケットにおいて明らかなリガンド密度が存在した。リガンド及び塩基の配置はコンポジットオミットマップにより検証された（図１０Ｂ）。Ｆｏ−Ｆｃ差異マップにおけるピークサイズに基づいたリガンド配置の後、水の配置は最終精密化回で自動化された。得られたモデルは、ＭｏｌＰｒｏｂｉｔｙ（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ  Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，２０１０，６６，２１３−２２１）及び最終モデル統計値（Ｒｗｏｒｋ及びＲｆｒｅｅは、それぞれ、２１．９％及び２６．２％であった）を使用して判断されるように、良好な配置を有した。全ての結晶学データ及びモデル統計値を表４に示す。
【０１７７】
実施例１５：インビトロブロッコリーセンサーアッセイ
上述のようにＲＮＡを調製するが、金属イオンの持ち越しを最小限に抑えるために、１０ｋ  ＭＷＣＯ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）において、追加の０．５ｘＴ．Ｅ．緩衝液洗浄を伴った。全てのＲＮＡセンサーを、８０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＫＣｌ、及び５０ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液中０．５μＭのＲＮＡ及び１０μＭの（Ｚ）−４−（３，５−ジフルオロ−４−ヒドロキシベンジリデン）−１，２−ジメチル−１Ｈ−イミダゾール−５（４Ｈ）−オン（ＤＦＨＢＩ）の濃度でアッセイした。緩衝液、リガンド、マグネシウム（濃度は表６に示される）、及びＤＦＨＢＩを混合した後、ＲＮＡを添加し、全ての反応物を室温で３０分間インキュベートした。ＤＦＨＢＩ蛍光を、Ｇｒｅｉｎｅｒ  ９６ウェルの平底黒色蛍光プレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に２００μＬの反応容積を入れ、Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００  ＰＲＯプレートリーダーで読み取ることにより測定した。試料を４６０ｎｍで励起し、蛍光発光を５０６〜５１０ｎｍの平均シグナルとして測定した。最大蛍光応答の半分を誘発するリガンドの濃度を、リガンド濃度の関数として観察された蛍光を二状態モデルにフィッティングすることにより決定した。
【０１７８】
操作されたセンサーをＧ−ブロック（図２３に示されるセンサーの配列；Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）として合成し、標準の分子クローニング技法を使用して、ｐＥＴ３０ｂのＸｂａＩとＢｌｐＩ部位との間にクローニングした。全ての得られたプラスミドを配列検証した。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ転写反応に関して、標準のＰＣＲ反応を使用して、ＤＮＡテンプレートを、１μＭのアウタープライマー（５’：ＧＧＣＣＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＡＧＣＣＣＧＧＡＴＡＧＣＴＣＡＧＴＣＧＧＴＡＧＡＧＣＡＧ、３’：ＴＧＧＣＧＣＣＣＧＡＡＣＡＧＧＧＡＣＴＴＧＡＡＣＣＣＴＧＧＡ）を使用してＰＣＲにより生成した。テンプレートをインビトロ転写反応（上記を参照されたい）に直接添加し、ＲＮＡ合成を３７℃で２時間進行させた。上記の転写反応からのＲＮＡを更に精製することなくアッセイに直接使用した。
【０１７９】
各センサーの活性は、５０μＬのインビトロ転写反応物、１０μＬの１０ｘＳｕｒｖｅｙ  Ｂｕｆｆｅｒ（１ｘ：５０ｍＭ  Ｋ−ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１５０ｍＭのＫＣｌ、５０ｍＭのＮａＣｌ）、３０μＭのＤＦＨＢＩ−１Ｔ、及び２ｍＭのリガンド（＋リガンド反応に関して）を含む１００μＬの反応物において監視された。反応物を室温で３０分間インキュベートし、ＤＦＨＢＩ蛍光を、Ｇｒｅｉｎｅｒ  ９６ウェルの平底黒色蛍光プレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に９０μＬの反応容積を入れ、Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００  ＰＲＯプレートリーダーで読み取ることにより測定した。試料を４６０ｎｍで励起し、蛍光発光を５０６〜５１０ｎｍの平均シグナルとして測定した。全ての実験に関して、ｔＲＮＡ−足場付きブロッコリーアプタマーの陽性対照は、リガンドの存在下及び不在下で行われ、これは相対輝度の参照としても使用された。誘導倍率は、ＤＦＨＢＩ−１Ｔ＋リガンド反応の蛍光値をＤＦＨＢＩ−１Ｔ条件単独の蛍光値で除すことにより計算された。全ての実験は、三つ組で行われ、定量化されたデータは平均値の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）で報告された。
【０１８０】
実施例１６：インビトロブロッコリーセンサーアッセイ
Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ＢＬ２１  Ｓｔａｒ（ＤＥ３）細胞（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を、誘導制御下で、センサーを含有するｐＥＴ３０ｂ由来プラスミドで形質転換し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンで補足されたＬＢ寒天上で平板培養し、３７℃でおよそ１６時間インキュベートした。個々のコロニーを選び、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンで補足された５ｍＬのＬＢ中で一晩（およそ１６時間）成長させて、培養物を飽和に達するようにした。スクリーニング実験に関して、５μＬの飽和させた一晩培養物を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンで補足された５ｍＬのＬＢに添加し、３７℃で対数中期（ＯＤ６００はおよそ０．４〜０．６）に成長させた。ブロッコリーアプタマー単独またはブロッコリー／リボスイッチアプタマー融合構築物の発現を誘導するために、ＩＰＴＧを、各培養物の１ｍＭの最終濃度まで添加し、次いで、これを３７℃で更に２時間成長させた。次いで、細胞を、遠心分離によりペレット化し、最終濃度５ｍＭのＭｇＳＯ４及び最終濃度５０μｇ／ｍＬのカナマイシンで補足された５ｍＬの１Ｘ  Ｍ９塩で１回洗浄した。洗浄後、細胞を遠心分離によりペレット化し、２５０μＬの上記のＭ９培地に再懸濁し、２つの１００μｌアリコートに分けた。アリコートの半分に、ＤＦＨＢＩ−１Ｔを、１１０μＬの最終容積で５０μＭの最終濃度まで添加した。アリコートのもう一方の半分に、ＤＦＨＢＩ−１Ｔを５０μＭの最終濃度まで添加し、リガンド（５ＨＴＰ、５ＨＰ、またはドーパミン）を、１１０μＬの最終容積で１ｍＭの最終濃度まで添加した。次いで、細胞を３７℃で３０分間インキュベートし、各化合物を取り込ませた。３０分間のインキュベーション後、１００μＬの各アリコートを、Ｇｒｅｉｎｅｒ  ９６ウェルの黒色マイクロプレートにピペットで滴下し、氷上で３０分間冷却した。蛍光測定に関して、ＤＦＨＢＩ−１Ｔを４７２ｎｍ及び５２０ｎｍの発光波長の励起波長で監視した。定量化したデータは、ｐＥＴ３０ｂ空ベクター対照を使用して背景補正された３つの生物学的複写物からの平均蛍光値±平均値の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）を表す。誘導倍率は、リガンドに曝露された細胞の平均蛍光値をリガンドなしの細胞の平均蛍光で除すことにより計算された。
【０１８１】
実施例１７：５ＨＴＰの細胞内蛍光撮像
ＤＮＡ及び培養物を記載のように（Ｐａｉｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１２，３３５，１１９４）調製した。簡潔に、ｔＲＮＡ／ブロッコリー融合配列を、誘導性Ｔ７プロモーターの下流のＸｂａＩとＢｌｐＩ部位との間のｐＥＴ３０ｂにクローニングした。配列検証されたプラスミドをＢＬ２１（ＤＥ３）ＳＴＡＲ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換し、単一のコロニーを５０μｇ／ｍＬのカナマイシンで補足されたルリアブロス（ＬＢ）中で一晩成長させた。一晩培養物を使用して、１：１０００希釈で新しいＬＢ／カナマイシン培地に播種し、培養物を３７℃でＯＤ６００＝０．４〜０．６に成長させた後、１ｍＭのＩＰＴＧで誘導し、３７℃で２〜４時間成長させた。２００μＬの得られた培養物を遠心分離し、デカントし、５０μｇ／ｍＬのカナマイシン、５ｍＭのＭｇＳＯ４、及び１ｍＭのＩＰＴＧで補足された２ｍＬのＭ９最小塩培地に再懸濁した。２００μＬの再懸濁した培養物を９６ウェルのポリ−Ｄ−リジンコーティングしたガラス底プレート（ＭａｔＴｅｋ）に移し、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、培地を除去し、Ｍ９／カナマイシン／１ｍＭのＩＰＴＧ培地でウェルを洗浄した後、２００μＬのＭ９培地、１ｍＭのＩＰＴＧ、及び４００μＭのＤＦＨＢＩ−１Ｔ（Ｌｕｃｅｒｎａ）を添加した。Ｎｉｋｏｎ  Ｔｉ−Ｅ顕微鏡で、６０ｘ油対物レンズ、励起フィルタ４７２／３０、ダイクロイックミラー４９０（ロングパス型）、及び発光フィルタ５２０／４０を使用するＡｎｄｏｒ  ｉＸｏｎ３  ８９７  ＥＭＣＣＤを用いて、ライブ蛍光画像を取り、ＦＩＪＩ（Ｓｃｈｉｎｄｅｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１２，９，６７６−６８２）で分析した。
【０１８２】
実施例１８：単一ターンオーバーインビトロ転写アッセイ
前に記載されるように（Ｔｒａｕｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，２０１１，１９，１４１３−１４２３）、ｄｓＤＮＡテンプレートを転写した。簡潔に、５０ｎｇのＤＮＡテンプレートを、１２．５μＬの２ｘ転写緩衝液（１４０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１４０ｍＭのＮａＣｌ、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、２８ｍＭのβ−メルカプトエタノール、及び７０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ）中で、３７℃で１０分間インキュベートし、２．５μＬの５０ｍＭのＭｇＣｌ２、１００〜２００μＣｉの３２Ｐ−ＡＴＰ、及び０．２５単位のＥ．ｃｏｌｉ  ＲＮＡポリメラーゼσ７０ホロ酵素（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）／反応を２３μＬにした。次いで、７．５μＬの反応緩衝液（各１６５μＭのｒＮＴＰ、０．２ｍｇ／ｍＬのヘパリン、及び所望のリガンド濃度）の添加により平衡化反応を開始させ、３７℃で１５分間インキュベートした後、８Ｍの尿素でクエンチした。次いで、反応物を８％変性ＰＡＧＥで分離し、乾燥させ、リン光体イメージスクリーン（ｐｈｏｓｐｈｏｒ  ｉｍａｇｅｒ  ｓｃｒｅｅｎ）に曝露した。次いで、ゲルの定量をＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）で実行し、データを二状態モデルにフィッティングさせた。
【０１８３】
受入コード
配位及び構造因子は、受入コード４ＺＡＱのもとＲＳＣＢ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋに寄託されている。
【０１８４】
参照による組み込み
本出願全体を通して引用される全ての参考文献の内容（参考文献、発行済特許、公開特許出願、及び同時係属特許出願を含む）は、本明細書において、参照によりそれらの全体が本明細書に明示的に組み込まれる。別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、当業者に一般的に知られる意味に従う。
【０１８５】
等価物
当業者は、慣用の実験に過ぎないものを使用して、本明細書に提供される特定の実施形態の多くの等価物を認識する、または確認することができるであろう。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
【図１Ａ】
2020504096.tif 000019
【図１Ｂ】
2020504096.tif 000020
【図１Ｃ】
2020504096.tif 000021
【図２−１】
2020504096.tif 000022
【図２−２】
2020504096.tif 000023
【図３−１】
2020504096.tif 000024
【図３−２】
2020504096.tif 000025
【図３−３】
2020504096.tif 000026
【図４】
2020504096.tif 000027
【図５−１】
2020504096.tif 000028
【図５−２】
2020504096.tif 000029
【図６Ａ】
2020504096.tif 000030
【図６Ｂ】
2020504096.tif 000031
【図７−１】
2020504096.tif 000032
【図７−２】
2020504096.tif 000033
【図８】
2020504096.tif 000034
【図９−１】
2020504096.tif 000035
【図９−２】
2020504096.tif 000036
【図１０Ａ】
2020504096.tif 000037
【図１０Ｂ】
2020504096.tif 000038
【図１０Ｃ】
2020504096.tif 000039
【図１１】
2020504096.tif 000040
【図１２】
2020504096.tif 000041
【図１３】
2020504096.tif 000042
【図１４−１】
2020504096.tif 000043
【図１４−２】
2020504096.tif 000044
【図１５−１】
2020504096.tif 000045
【図１５−２】
2020504096.tif 000046
【図１６Ａ】
2020504096.tif 000047
【図１６Ｂ】
2020504096.tif 000048
【図１６Ｃ】
2020504096.tif 000049
【図１７Ａ】
2020504096.tif 000050
【図１７Ｂ】
2020504096.tif 000051
【図１７Ｃ】
2020504096.tif 000052
【図１７Ｄ】
2020504096.tif 000053
【図１８Ａ】
2020504096.tif 000054
【図１８Ｂ】
2020504096.tif 000055
【図１８Ｃ】
2020504096.tif 000056
【図１９】
2020504096.tif 000057
【図２０】
2020504096.tif 000058
【図２１】
2020504096.tif 000059
【図２２】
2020504096.tif 000060
【図２３−１】
2020504096.tif 000061
【図２３−２】
2020504096.tif 000062
【図２３−３】
2020504096.tif 000063
【図２３−４】
2020504096.tif 000064
【図２３−５】
2020504096.tif 000065
【国際調査報告】
2020504096.tif 000066
2020504096.tif 000067