(57)【要約】  共に共有結合される複数の化合物を含み、それらの化合物は独立して式（Ｉ）:  【化１】2020504080.tif 000063である多量体を、本明細書に記載する。【選択図】図１０
2020504080.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
共に共有結合される複数の化合物を含む多量体であって、前記化合物が独立して式（Ｉ）：
【化１】
2020504080.tif 000062
［式中、
Ｒ１は、Ｈ；低級アルキル；アリール；ヘテロアリール；アルケニル；または複素環であり；これらのすべては任意選択で、１または複数の置換可能な位置で１または複数の適切な置換基と置換され；
Ｒ２およびＲ３は各々が独立して、タンパク質原性もしくは非タンパク質原性のα−アミノ酸のアミノ酸鎖であり、
ただしＲ２およびＲ３が互いに共有結合されて環を形成してよいことを条件とし；
Ｒ４およびＲ５は各々が独立して、Ｈ；低級アルキル；アリール；ヘテロアリール；アルケニル；複合環；式−Ｃ（Ｏ）ＯＨの酸；式−Ｃ（Ｏ）ＯＲ＊のエステル（式中、Ｒ＊は、アルキルおよびアリールから選択される）；式−Ｃ（Ｏ）ＮＲ＊＊Ｒ＊＊＊のアミド（式中、Ｒ＊＊およびＲ＊＊＊は独立して、Ｈ、アルキルおよびアリールから選択される）；−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｒ（式中、Ｒは、−ＯＨ、低級アルキル、アリール、−低級アルキル−アリール、もしくは−ＮＲａＲｂから選択され、ＲａおよびＲｂは独立して、Ｈ、低級アルキル、アリールもしくは−低級アルキル−アリールから選択される）；または−Ｃ（Ｏ）Ｒｃ（式中、Ｒｃは、低級アルキル、アリールもしくは−低級アルキル−アリールから選択される）；または−低級アルキル−ＯＲｄ（式中、Ｒｄは、適切な保護基もしくはＯＨ基である）であり；これらのすべては任意選択で、１または複数の置換可能な位置で１または複数の適切な置換基と置換され；
ただしＲ２またはＲ３がＲ１に共有結合されて環状二級アミンを形成でき、および／またはＲ４もしくはＲ５に共有結合して環を形成でき、Ｒ４およびＲ５もまた互いに共有結合されて環を形成してよいことを条件とし；
Ｒ６は、Ｈ；低級アルキル；ベンジル；アルケニル；低級アルキルオキシ；アリール；ヘテロアリール；複素環；−Ｃ（Ｏ）Ｒ＊＊＊＊（式中、Ｒ＊＊＊＊は独立して、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アミノ、アミノアルキル、アミノアリール、アミノヘテロアリール、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシから選択される）；−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｒ；または−Ｃ（Ｏ）Ｒｃであり；これらのすべては任意選択で、１または複数の置換可能な位置で１または複数の適切な置換基と置換され、
またはＲ７もしくはＲ８と共に、そのＮ末端がＮ−Ｒ６であるＮ末端を有するタンパク質原性もしくは非タンパク質原性のアミノ酸の環側鎖であり、前記タンパク質原性もしくは非タンパク質原性のアミノ酸は、適切な置換基と置換されてよく、
Ｒ７およびＲ８は独立して、そのＮ末端がＮ−Ｒ６であるＮ末端を有するタンパク質原性もしくは非タンパク質原性のα−アミノ酸のアミノ酸側鎖から選択され、またはＲ６と環側鎖を形成でき；
立体中心１＊、２＊および３＊は各々独立して、ＲおよびＳから選択され；
ｎは、１、２、３、または４でありかつｎが２〜４である場合、各Ｒ７および各Ｒ８は、互いに独立しており；および
Ｚは、アミノ酸のアミノ末端であり；Ｌに隣接する−Ｃ＝Ｏ−は、アミノ酸のカルボキシ末端であり；かつＺおよび−Ｃ＝Ｏ−と共にＬは、以下の式：
Ｘｙ−Ｘｚ−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
を有するペプチドであり、
式中、ＸｙおよびＸｚは各々独立して、タンパク質原性もしくは非タンパク質原性のアミノ酸であり；
Ｘ１は、ロイシンまたはｔｅｒｔ−ブチル−Ａｌａであり；
Ｘ２は、Ａｓｐであり；および
Ｘ３は、表１ＢのＸ３列下に列挙される任意のアミノ酸である］
である、多量体。
【請求項２】
Ｒ１がＨである、請求項１に記載の多量体。
【請求項３】
Ｒ２またはＲ３がＲ１に共有結合されてＮ末端としてＮＲ１を有するプロリンを形成する、請求項１に記載の多量体。
【請求項４】
Ｒ２およびＲ３が両方ともＨでない、請求項１〜３のいずれか１項に記載の多量体。
【請求項５】
Ｒ２およびＲ３が各々独立してタンパク質原性もしくは非タンパク質原性のα−アミノ酸のアミノ酸鎖からなる群から選択される、請求項１または２に記載の多量体。
【請求項６】
Ｒ２およびＲ３がそれぞれＨおよびＣＨ３であるまたはその逆である、請求項１または２に記載の多量体。
【請求項７】
Ｒ２またはＲ３が−ＣＨ２−Ｓ−Ｒ３であり、Ｒ５が低級アルキル；低級アミノアルキル；アリール；ヘテロアリール；アルケニル；またはヘテロ環から選択され；これらのすべては任意選択で１または複数の置換可能な位置で１または複数の適切な置換基と置換され；好ましくはＲ５はフェニルまたは低級アルキル、ハロゲン、もしくは低級アミノアルキルで置換されたフェニルである、請求項１または２に記載の多量体。
【請求項８】
Ｒ４およびＲ５が両方ともＨでない、請求項１〜４のいずれか１項に記載の多量体。
【請求項９】
Ｒ＊＊およびＲ＊＊＊が両方ともＨでない、請求項１〜４のいずれか１項に記載の多量体。
【請求項１０】
Ｒ４およびＲ５が各々独立してＨ、またはＣ（Ｏ）−ＮＨＲｔであり、ＲｔがＨまたは低級アルキルである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の多量体。
【請求項１１】
Ｒｔがｔｅｒｔ−ブチルである、請求項１０に記載の多量体。
【請求項１２】
ＲｔがＨである、請求項１０に記載の多量体。
【請求項１３】
Ｒ６がＨである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の多量体。
【請求項１４】
Ｒ６およびＲ８またはＲ９のいずれかがそのＮ−末端としてＮ−Ｒ６を有するプロリン残基をもたらす環を形成する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の多量体。
【請求項１５】
ｎが１である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の多量体。
【請求項１６】
Ｌおよび−Ｃ＝Ｏと共にＺが配列番号１〜３８０のいずれか１つである、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の多量体。
【請求項１７】
Ｘ１がＬｅｕである、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の多量体。
【請求項１８】
Ｘ２がＡｓｐである、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の多量体。
【請求項１９】
Ｘ３がＴｈｒである、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の多量体。
【請求項２０】
Ｘ３がＶａｌである、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の多量体。
【請求項２１】
Ｘ３がＩｌｅである、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の多量体。
【請求項２２】
ＸｙおよびＸｚが各々独立してタンパク質原性もしくは非タンパク質原性のα−アミノ酸である、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の多量体。
【請求項２３】
Ｘｚがタンパク質原性もしくは非タンパク質原性のβ−アミノ酸である、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の多量体。
【請求項２４】
Ｘｚがβ−ＨｏｍｏＬｙｓまたはメチル−β−ＨｏｍｏＬｙｓである、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の多量体。
【請求項２５】
ＸｙおよびＸｚが各々一次アミノ酸である、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の多量体。
【請求項２６】
ＸｙおよびＸｚが各々表１ＢのＸｙ列およびＸｚ列下にそれぞれ列挙される任意のアミノ酸である、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の多量体。
【請求項２７】
前記化合物が化合物１〜３８９および４５６の任意の１つであるまたは前記多量体が化合物３９０〜３９７および４５７〜５３８の任意の１つである、請求項１に記載の多量体。
【請求項２８】
二量体である、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の多量体。
【請求項２９】
三量体である、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の多量体。
【請求項３０】
四量体である、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の多量体。
【請求項３１】
五量体である、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の多量体。
【請求項３２】
前記化合物がリンカーにより共に結合される、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の多量体。
【請求項３３】
前記化合物がＲ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７／Ｒ８、Ｘｚ、またはＸｙに関連した炭素、窒素、酸素、硫酸または他の原子において共に結合される、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の多量体。
【請求項３４】
前記リンカーがエステル、アミド、アミンもしくは混合アミド／アミン、エーテル、チオエーテル、チオエステル、ジスルフィド、スルホキシド、スルホン、スルホンアミド、スルファメート、スルファミド、カルバメート、尿素、カルボナート、ホスホジエステル、ホスホンアミド、ホスホロアミダート、複素環、アジド−アルキン環化付加（「クリック」ケミストリー）からのトリアゾールなど、炭素−炭素単結合連結、炭素−炭素二重結合連結または炭素−炭素三重結合連結を含む群から選択される、請求項３２または３３に記載の多量体。
【請求項３５】
ホモ多量体である、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の多量体。
【請求項３６】
ヘテロ多量体である、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の多量体。
【請求項３７】
薬学的に許容される担体と共に請求項１〜３６のいずれか１項に記載の多量体を含む医薬組成物。
【請求項３８】
経口送達のために調製される、請求項３７に記載の医薬組成物。
【請求項３９】
局所送達のために調製される、請求項３７に記載の医薬組成物。
【請求項４０】
非経口送達のために調製される、請求項３７に記載の医薬組成物。
【請求項４１】
患者において炎症または自己免疫疾患を処置する方法であって、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の多量体の治療有効量を前記患者に投与することを含む、方法。
【請求項４２】
前記炎症または自己免疫疾患が胃腸管系である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
α４β７インテグリンの生物学的機能に関連した患者において状態を処置するための方法であって、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の前記多量体の治療有効量を前記患者に投与することを含む、方法。
【請求項４４】
前記状態または疾患が炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎、クローン病、セリアック疾患（非熱帯性スプルー）、血清反応陰性関節症に関連する腸疾患、顕微鏡的大腸炎、膠原線維性大腸炎、好酸球性胃腸炎、放射線療法、化学療法、直腸結腸切除と回腸肛門吻合の後に生じる回腸嚢炎、胃腸癌、膵臓炎、インスリン依存生糖尿病、乳腺炎、胆嚢炎、胆管炎、胆管周囲炎、慢性気管支炎、慢性副鼻腔炎、喘息、原発性硬化性胆管炎、胃腸管におけるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症、好酸性喘息、好酸性食道炎、胃炎、大腸炎、顕微鏡的大腸炎、移植片対宿主病、放射線療法もしくは化学療法に伴う大腸炎、白血球粘着不全症１型でのような自然免疫障害に伴う大腸炎、慢性肉芽腫症、糖尿病１ｂ型、ヘルマンスキー・パドラック症候群、チェディアック・東症候群、およびウィスコット・アルドリッチ症候群、または直腸結腸切除と回腸肛門吻合の後に生じる回腸嚢炎および胃腸癌の種々の形態、骨粗鬆症、関節炎、多発性硬化症、慢性疼痛、体重増加、およびうつ病であり、別の実施形態において、状態が膵臓炎、インスリン依存生糖尿病、乳腺炎、胆嚢炎、胆管炎、胆管周囲炎、慢性気管支炎、慢性副鼻腔炎、喘息または移植片対宿主病である、請求項４１および４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記状態が炎症性腸疾患である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記炎症性腸疾患が潰瘍性大腸炎である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記炎症性腸疾患がクローン病である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
患者において疾患または状態を処置するための方法であって、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の前記多量体の治療有効量を前記患者に投与することを含み、前記疾患または状態がウイルスまたはレトロウイルスの局所感染症もしくは全身感染症である、方法。
【請求項４９】
前記ウイルスまたはレトロウイルスがエコーウイルス１型および８型、エコーウイルス９型／Ｂａｒｔｙ株、ヒトパピローマウイルス、ハンタウイルス、ロタウイルス、アデノウイルス、口蹄疫ウイルス、コクサッキーウイルスＡ９型、ヒトパレコウイルス１型またはヒト免疫不全ウイルス１型である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
患者において疾患または状態を処置するための方法であって、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の前記多量体の治療有効量を前記患者に投与することを含み、前記疾患または状態がＡ型肝炎、Ｂ型肝炎もしくはＣ型肝炎、肝性脳症、非アルコール性脂肪性肝炎、硬変症、静脈瘤出血、ヘモクロマトーシス、ウィルソン病、チロシン血症、α１アンチトリプシン欠損症、糖原病、肝細胞癌、肝癌、原発性胆汁性胆管炎、原発性硬化性胆管炎、原発性胆管硬化症、胆道疾患、自己免疫性肝炎、または移植片対宿主病である、方法。
【請求項５１】
前記化合物がＭＡｄＣＡＭへのα４β７インテグリンの結合を阻害する、請求項４０〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記化合物がＭＡｄＣＡＭへのα４β７インテグリンの結合を選択的に阻害する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記患者がヒトである、請求項４０〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１６年１１月１１日に出願され、その全体が本明細書に組み込まれる米国仮出願番号第６２／４２１，１１７号に対する優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、α４β７インテグリンのアンタゴニストに関し、より具体的には環状ペプチドアンタゴニストに関する。
【背景技術】
【０００３】
インテグリンは、細胞間相互作用および細胞−細胞外マトリックス（ＥＣＭ）相互作用のための架橋である膜貫通受容体である。誘発されると、インテグリンは、ＥＣＭの化学組成および機械的状態などの内部への化学経路（シグナル伝達）を誘発する。
【０００４】
インテグリンは、偏性ヘテロ二量体であり、2本の異なる鎖：α（アルファ）およびβ（ベータ）サブユニットを有する。
【０００５】
α４β７インテグリンは、リンパ球上で発現し、粘膜リンパ器官の高内皮細静脈に存在する粘膜アドレシン細胞接着分子（ＭＡｄＣＡＭ）へのその結合を介して腸管関連リンパ組織へのＴ細胞ホーミングに関与する。特異的インテグリン−リガンド相互作用の阻害剤は、種々の自己免疫疾患の処置のための抗炎症剤として有効であることが示されてきた。例えば、α４β７に対して高い結合親和性を示すモノクロナール抗体は、クローン病および潰瘍性大腸炎などの胃腸の自己炎症疾患／自己免疫疾患に対する治療効果を示してきた。
【０００６】
炎症症状および／または自己免疫疾患を予防する、または処置するための改善されたα４β７アンタゴニストを開発する必要がある。
【０００７】
環状ペプチド（ナセリン）を製造するいくつかの方法が本出願人の国際公開第２０１０／１０５３６３号に記載されている。
【発明の概要】
【０００８】
一態様では、共に共有結合される複数の化合物を含む多量体が提供され、化合物は独立して式（Ｉ）：
【化１】
2020504080.tif 000003
［式中、
Ｒ１は、Ｈ；低級アルキル；アリール；ヘテロアリール；アルケニル；または複素環であり、これらのすべては任意選択で、１または複数の置換可能な位置で１または複数の適切な置換基と置換され、
Ｒ２およびＲ３は各々独立して、タンパク質原性もしくは非タンパク質原性のα−アミノ酸のアミノ酸鎖であるが、
ただし、Ｒ２およびＲ３が互いに共有結合されて環を形成できることを条件とし、
Ｒ４およびＲ５は各々独立してＨ；低級アルキル；アリール；ヘテロアリール；アルケニル；複合環；式−Ｃ（Ｏ）ＯＨの酸；式−Ｃ（Ｏ）ＯＲ＊のエステル（式中、Ｒ＊は、アルキルおよびアリールから選択される）；式−Ｃ（Ｏ）ＮＲ＊＊Ｒ＊＊＊のアミド（式中、Ｒ＊＊およびＲ＊＊＊は独立して、Ｈ、アルキルおよびアリールから選択される）；−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｒ（式中、Ｒは、−ＯＨ、低級アルキル、アリール、−低級アルキル−アリール、もしくは−ＮＲａＲｂから選択され、ＲａおよびＲｂは独立して、Ｈ、低級アルキル、アリールもしくは−低級アルキル−アリールから選択される）；または−Ｃ（Ｏ）Ｒｃ（式中、Ｒｃは、低級アルキル、アリールもしくは−低級アルキル−アリールから選択される）；または−低級アルキル−ＯＲｄ（式中、Ｒｄは、適切な保護基もしくはＯＨ基である）であり；これらのすべては任意選択で１または複数の置換可能な位置で１または複数の適切な置換基と置換されるが、
ただし、Ｒ２またはＲ３がＲ１に共有結合されて環状二級アミンを形成でき、および／またはＲ４もしくはＲ５に共有結合されて環を形成でき、Ｒ４およびＲ５も互いに共有結合されて環を形成できることを条件とし、
Ｒ６は、Ｈ；低級アルキル；ベンジル；アルケニル；低級アルキルオキシ；アリール；ヘテロアリール；複素環；−Ｃ（Ｏ）Ｒ＊＊＊＊（式中、Ｒ＊＊＊＊は独立して、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アミノ、アミノアルキル、アミノアリール、アミノヘテロアリール、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシから選択される）；−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｒ；または−Ｃ（Ｏ）Ｒｃであり；これらのすべては任意選択で１または複数の置換可能な位置で１または複数の適切な置換基と置換され、
またはＲ７もしくはＲ８と共に、そのＮ末端がＮ−Ｒ６であるＮ末端を有するタンパク質原性もしくは非タンパク質原性のアミノ酸の環側鎖であり、タンパク質原性もしくは非タンパク質原性のアミノ酸が適切な置換基と置換されてよく、
Ｒ７およびＲ８は独立して、そのＮ末端がＮ−Ｒ６であるＮ末端を有するタンパク質原性もしくは非タンパク質原性のα−アミノ酸のアミノ酸側鎖から選択され、またはＲ６と環側鎖を形成でき、
立体中心１＊、２＊、および３＊は各々独立して、ＲおよびＳから選択され、
ｎは、１、２、３、または４であり、ｎが２〜４の場合、各Ｒ７および各Ｒ８は互いに独立しており、および
Ｚは、アミノ酸のアミノ末端であり；Ｌに隣接する−Ｃ＝Ｏ−は、アミノ酸のカルボキシ末端であり；およびＺおよび−Ｃ＝Ｏ−と共にＬは、以下の式：
Ｘｙ−Ｘｚ−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
を有するペプチドであり、
式中、ＸｙおよびＸｚは各々独立して、タンパク質原性もしくは非タンパク質原性のアミノ酸であり、
Ｘ１は、ロイシンまたはｔｅｒｔ−ブチル−Ａｌａであり、
Ｘ２は、Ａｓｐであり、および
Ｘ３は、表１ＢのＸ３列下に列挙されている任意のアミノ酸である］
である。
【０００９】
一態様では、薬学的に許容される担体と共に本明細書に記載の多量体を含む医薬組成物が提供される。医薬組成物は、経口送達、局所送達および非経口送達のいずれか１つのために調製されてよい。
【００１０】
一態様では、患者において炎症または自己免疫疾患を処置する方法であって、本明細書に記載の多量体の治療有効量を患者に投与することを含む、方法が提供される。好ましくは、炎症または自己免疫疾患は、胃腸管系である。
【００１１】
一態様では、α４β７インテグリンの生物学的機能に関連する患者において状態を処置するための方法であって、本明細書に記載の多量体の治療有効量を患者に投与することを含む、方法が提供される。
【００１２】
一態様では、患者において疾患または状態を処置するための方法であって、本明細書に記載の多量体の治療有効量を患者に投与することを含み、疾患または状態がウイルスまたはレトロウイルスの局所感染症もしくは全身感染症である、方法が提供される。
【００１３】
一態様では、患者において疾患または状態を処置するための方法であって、本明細書に記載の多量体の治療有効量を患者に投与することを含み、疾患がＡ型肝炎、Ｂ型肝炎もしくはＣ型肝炎、肝性脳症、非アルコール性脂肪性肝炎、硬変症、静脈瘤出血、ヘモクロマトーシス、ウィルソン病、チロシン血症、α１アンチトリプシン欠損症、糖原病、肝細胞癌、肝癌、原発性胆汁性胆管炎、原発性硬化性胆管炎、原発性胆管硬化症、胆道疾患、自己免疫性肝炎、または移植片対宿主病である、方法が提供される。
【００１４】
本発明の好ましい実施形態のこれらおよび他の特徴は、添付の図面および表が参照される以下の詳細な説明においてより明らかにされよう。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本出願の代表的な化合物、すなわち以下のクラス、１８員環、２１員環、（非標準的、すなわちδ−アミノ酸を有する）２１員環、２２員環、および２４員環からの化合物を示す。
【図２】代表的な１８員環の化合物を、ある特定の位置でなされた変異と、これらの変異に関連する対応するα４β７インテグリンＥＬＩＳＡ  ＩＣ５０結合値と共に示す。
【図３】代表的な２１員環の化合物を、ある特定の位置でなされた変異と、これらの変異に関連する対応するα４β７インテグリンＥＬＩＳＡ  ＩＣ５０結合値と共に示す。
【図４】代表的な２１員環（非標準的、すなわちδ−アミノ酸を有する）の化合物を、ある特定の位置でなされた変異と、これらの変異に関連する対応するα４β７インテグリンＥＬＩＳＡ  ＩＣ５０結合値と共に示す。
【図５】代表的な２２員環の化合物を、ある特定の位置でなされた変異と、これらの変異に関連する対応するα４β７インテグリンＥＬＩＳＡ  ＩＣ５０結合値と共に示す。
【図６Ａ】２５℃で記録された１Ｈ−１ＨＴＯＣＳＹ  ＮＭＲスペクトルでの、多量体分子、化合物番号３９０についての代表的なＮＭＲデータを示す。
【図６Ｂ】２５℃で記録された１Ｈ−および１Ｈ−１Ｈ  ＴＯＣＳＹ  ＮＭＲスペクトルでの、多量体分子、化合物番号３９０についての代表的なＮＭＲデータを示す。
【図７】以下についてヒト全血でのＭＡＤＣＡＭ−１競合アッセイとして測定されたα４β７インテグリンへの結合を示す：ａ）代表的な単量体化合物４５６（ＥＴ４０６２）、および化合物４５６に由来する多量体化合物番号５３４（ＥＴ４１１３）と５３５（ＥＴ４１１０）、ならびにｂ）代表的な単量体化合物３４０（ＥＴ２４５１）、および化合物３４０に由来する多量体化合物番号３９０（ＥＴ３７５５）と５１７（ＥＴ３７６４）。
【図８】ＤＳＳ誘発大腸炎を患い化合物番号５１７（ＥＴ３７６４）またはビヒクルで４日間処置されたマウスでの、腸間膜リンパ節におけるα４β７＋Ｔｈメモリー細胞輸送の検出を示す。
【図９】ＤＳＳ刺激剤に曝され種々の濃度の化合物番号５１７（ＥＴ３７６４）または対照（ＳＭＥＤＤＳビヒクル）で４日間処置されたマウスから採取された腸間膜リンパ節におけるα４β７＋Ｔｈメモリーリンパ球含有量を示す。
【図１０】ヒト全血でのＭＡＤＣＡＭ−１競合アッセイにおいて測定されたα４β７−陽性Ｔヘルパーメモリー細胞上での代表的な多量体化合物の受容体占有率を示す。
【図１１】ヒト全血でのＶＣＡＭ−１競合アッセイにおいて測定されたα４β７−陰性Ｔｈメモリー細胞上での代表的なナセリン二量体の受容体占有率を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
表１は、α４β７インテグリンの親和性、選択性および／または活性を呈する多量体化合物を示し、特にこれらの化合物に関して、（Ａ）リンカー部分の構造；（Ｂ）ペプチド部分の構造；および（Ｃ）ならびに（Ｃ’）親和性、選択性および活性の値を示す。
【００１７】
表の解釈を補助するために、以下に留意されたい：
表１Ａ：
Ｒ２がＨであり、Ｒ３がＣＨ３である場合、Ｒ２およびＲ３を有する炭素原子はＳ立体配置を有する。
Ｒ２がＣＨ３であり、Ｒ３がＨである場合、Ｒ２およびＲ３を有する炭素原子はＲ立体配置を有する。
Ｒ２がＨであり、Ｒ３がＣＨ２−Ｓ−Ｐｈである場合、Ｒ２およびＲ３を有する炭素原子はＳ立体配置を有する。
Ｒ４がＨであり、Ｒ５がＣ（Ｏ）−ＮＨ−ｔｅｒｔ−ブチルである場合、Ｒ４およびＲ５を有する炭素原子はＳ立体配置を有する。
Ｒ４がＣ（Ｏ）−ＮＨ−ｔｅｒｔ−ブチルであり、Ｒ５がＨである場合、Ｒ４およびＲ５を有する炭素原子はＲ立体配置を有する。
Ｒ１およびＲ２が両方ともＰｒｏ−である場合、Ｒ１およびＲ２の置換基は共有結合され、Ｐｒｏのピロリジン環を形成する。
【００１８】
表１Ｂ
Ｒ６およびＲ７が両方ともＰｒｏである場合、Ｒ６およびＲ７の置換基は共有結合され、Ｐｒｏのピロリジン環を形成する。
Ｒ６およびＲ８が両方ともｄＰｒｏである場合、Ｒ６およびＲ８の置換基は共有結合され、ｄＰｒｏのピロリジン環を形成する。
Ｒ６およびＲ７が両方とも［（４Ｓ）−フルオロ−Ｐｒｏ］である場合、Ｒ６およびＲ７の置換基は共有結合され、［（４Ｓ）−フルオロ−Ｐｒｏ］のピロリジン環を形成する。
Ｒ７がＮｖａであり、Ｒ８がＨである場合、Ｒ７およびＲ８を有する炭素原子はＳ立体配置を有する。
Ｒ６およびＲ７が両方ともＨｙｐである場合、Ｒ６およびＲ７の置換基は共有結合され、Ｈｙｐのピロリジン環を形成する。
Ｘｚ列下に記入事項が存在しない場合、残基は存在しない。
【００１９】
表１Ｃおよび１Ｃ’
いずれの列にも記入事項が存在しない場合、データは収集されなかった。
【００２０】
表１Ｘは、本明細書に記載の方法および材料に概説される合成プロトコルと化合物を関連づける対応表である。
【００２１】
表２は、α４β７インテグリンの親和性、選択性および／または活性を呈する多量体化合物を示し、特にこれらの化合物に関して、（Ａ）リンカー部分の構造；（Ｂ）ペプチド部分の構造；および（Ｃ）親和性、選択性および活性の値を示す。
【００２２】
表の解釈を補助するために、以下に留意されたい：
表２Ａ
Ｒ２がＨであり、Ｒ３がＣＨ３である場合、Ｒ２およびＲ３を有する炭素原子はＳ立体配置を有する。
【００２３】
表２Ｂ
Ｒ６およびＲ７が両方ともＰｒｏである場合、Ｒ６およびＲ７の置換基は共有結合され、Ｐｒｏのピロリジン環を形成する。
Ｒ６およびＲ７が両方ともＨｙｐである場合、Ｒ６およびＲ７の置換基は共有結合され、Ｈｙｐのピロリジン環を形成する。
Ｘｚ列下に記入事項が存在しない場合、残基は存在しない。
【００２４】
表２Ｘは、本明細書に記載の方法および材料に概説される合成プロトコルと多量体を関連づける対応表であり、ｍ／ｚは（Ｍ＋２Ｈ／２）であり、追加情報はリンカーに関する。
【００２５】
詳細な説明
本発明の完全な理解のために、以下の説明において、多数の具体的な詳細を記載する。しかし、本発明がこれらの具体的な詳細なしで実行されてよいことを理解されたい。
【００２６】
一態様では、共に共有結合された複数の化合物を含む多量体が提供され、化合物は独立して式（Ｉ）：
【化２】
2020504080.tif 000004
［式中、
Ｒ１は、Ｈ；低級アルキル；アリール；ヘテロアリール；アルケニル；または複素環であり；これらのすべては任意選択で、１または複数の置換可能な位置で１または複数の適切な置換基と置換され、
Ｒ２およびＲ３は各々独立して、タンパク質原性もしくは非タンパク質原性のα−アミノ酸のアミノ酸鎖であるが、
ただし、Ｒ２およびＲ３が互いに共有結合して環を形成できることを条件とし、
Ｒ４およびＲ５は各々独立して、Ｈ；低級アルキル；アリール；ヘテロアリール；アルケニル；複合環；式−Ｃ（Ｏ）ＯＨの酸；式−Ｃ（Ｏ）ＯＲ＊のエステル（式中、Ｒ＊は、アルキルおよびアリールから選択される）；式−Ｃ（Ｏ）ＮＲ＊＊Ｒ＊＊＊のアミド（式中、Ｒ＊＊およびＲ＊＊＊は独立して、Ｈ、アルキルおよびアリールから選択される）；−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｒ（式中、Ｒは、−ＯＨ、低級アルキル、アリール、−低級アルキル−アリール、もしくは−ＮＲａＲｂから選択され、ＲａおよびＲｂは独立して、Ｈ、低級アルキル、アリール、または−低級アルキル−アリールから選択さる）；または−Ｃ（Ｏ）Ｒｃ（式中、Ｒｃは、低級アルキル、アリールもしくは−低級アルキル−アリール；または−低級アルキル−ＯＲｄ（式中、Ｒｄは、適切な保護基もしくはＯＨ基である）であり；これらのすべては任意選択で、１または複数の置換可能な位置で１または複数の適切な置換基と置換されるが、
ただし、Ｒ２またはＲ３がＲ１に共有結合されて環状二級アミンを形成でき、および／またはＲ４もしくはＲ５に共有結合されて環を形成でき、Ｒ４およびＲ５も互いに共有結合されて環を形成できることを条件とし、
Ｒ６は、Ｈ；低級アルキル；ベンジル；アルケニル；低級アルキルオキシ；アリール；ヘテロアリール；複素環；−Ｃ（Ｏ）Ｒ＊＊＊＊（式中、Ｒ＊＊＊＊は独立して、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アミノ、アミノアルキル、アミノアリール、アミノヘテロアリール、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシから選択される）；−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｒ；または−Ｃ（Ｏ）Ｒｃであり；これらのすべては任意選択で、１または複数の置換可能な位置で１または複数の適切な置換基と置換され、
またはＲ７もしくはＲ８と共に、そのＮ末端がＮ−Ｒ６であるＮ末端を有するタンパク質原性もしくは非タンパク質原性アミノ酸の環側鎖であり、タンパク質原性もしくは非タンパク質原性のアミノ酸が適切な置換基と置換されてよく、
Ｒ７およびＲ８は独立して、そのＮ末端がＮ−Ｒ６であるＮ末端を有するタンパク質原性もしくは非タンパク質原性のα−アミノ酸のアミノ酸側鎖から選択され、またはＲ６と環側鎖を形成でき、
立体中心１＊、２＊、および３＊は各々独立して、ＲおよびＳから選択され、
ｎは、１、２、３、または４であり、ｎが２〜４の場合、各Ｒ７および各Ｒ８は互いに独立しており、および
Ｚは、アミノ酸のアミノ末端であり；Ｌに隣接する−Ｃ＝Ｏ−は、アミノ酸のカルボキシ末端であり、およびＺおよび−Ｃ＝Ｏ−と共にＬは、以下の式：
Ｘｙ−Ｘｚ−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
を有するペプチドであり、
式中、ＸｙおよびＸｚは各々独立して、タンパク質原性もしくは非タンパク質原性のアミノ酸であり、
Ｘ１は、ロイシンまたはｔｅｒｔ−ブチル−Ａｌａであり、
Ｘ２は、Ａｓｐであり、および
Ｘ３は、表１ＢのＸ３列下に列挙されている任意のアミノ酸である］
である。
【００２７】
表１Ａ、１Ｂ、および１Ｃ（ならびに１Ｃ’）に示す化合物は、α４β７インテグリンに対して拮抗活性を示し、α４β１インテグリンへの選択性を有する。異なる化合物に関して表１Ａおよび１Ｂで概説される置換基Ｒ１〜Ｒ８、ならびにアミノ酸Ｘｙ、Ｘｚ、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３は、任意の方法で組み合わされてよく、α４β７インテグリンの活性および選択性を示し得る化合物を生じる可能性があることを、当業者は予想するであろう。これらの化合物はさらに、国際公開第２０１７／０７９８２０号に記載され、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【００２８】
本明細書に記載のいくつかの化合物の多量体化、特に二量体化のバージョンは、親和性、選択性および活性を示し、表２Ａ、２Ｂ、および２Ｃに要約される。
【００２９】
本明細書で用いる場合、用語「アミノ酸」は、アミン基、カルボン酸基、および異なる側鎖を含む分子を指す。アミノ酸は、一般にタンパク質中に見いだされる２０個のアミノ酸だけでなく、当業者には既知の非標準アミノ酸と非天然アミノ酸誘導体とを含むことを意味し、したがって、α−アミノ酸、β−アミノ酸、およびγ−アミノ酸を含むが、これらに限定されない。ペプチドは少なくとも２つのアミノ酸のポリマーであり、標準アミノ酸、非標準アミノ酸、および非天然アミノ酸を含んでよい。ペプチドは、２つ以上のアミノ酸のポリマーである。
【００３０】
以下の略称を本明細書で用いる。
【００３１】
【表１】
2020504080.tif 000005
2020504080.tif 000006
2020504080.tif 000007
【００３２】
本発明と関連して用いる用語「適切な置換基」は、独立してＨ；ヒドロキシル；シアン；低級アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ヘキシルなど）などのアルキル；低級アルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシなど）などのアルコキシ：アリールオキシ（例えばフェノキシなど）；ビニル；アルケニル（例えばヘキセニルなど）；アルキニル；ホルミル；ハロアルキル（例えば、ＣＦ３、ＣＣｌ３などを含む低級ハロアルキル）；ハライド；アリール（例えばフェニルおよびナフチル）；ヘテロアリール（例えばチエニルおよびフラニルなど）；Ｃ（Ｏ）ＮＲａＲｂなどのアミド（式中、ＲａおよびＲｂは独立して、低級アルキル、アリール、またはベンジルなどから選択される）；アシル（例えばＣ（Ｏ）−Ｃ６Ｈ５など）；エステル（例えば−Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ３など）；エーテルおよびチオエーテル（例えばＯ−Ｂｎなど）；チオアルコキシ；ホスフィノ；ならびに−ＮＲａＲｂ（式中、ＲａおよびＲｂは独立して、低級アルキル、アリール、またはベンジルなどから選択される）を含むことを意味する。本発明と関連して用いる適切な置換基は、本発明のプロセスによる所望の生成物の形成を妨害しない置換基を示すことを意味すると理解すべきである。
【００３３】
本発明と関連して用いる場合、単独でまたは別の置換基との組み合わせで、本明細書で用いる「低級アルキル」という用語は、１〜６個の炭素を含有する非環状鎖、直鎖、または分枝鎖のアルキル置換基を意味し、例えば、メチル、エチル、１−メチルエチル、１−メチルプロピル、２−メチルプロピルなどが挙げられる。用語の同様の使用は、炭素原子の数に関し「低級アルコキシ」、「低級チオアルキル」、「低級アルケニル」などについて理解されるべきである。例えば、本明細書で用いる場合、「低級アルコキシ」は、メトキシ、エトキシ、ｔ−ブトキシを含む。
【００３４】
「アルキル」という用語は、低級アルキルを包含し、例えば、７〜１０個の炭素原子を有する非環状鎖、直鎖、または分枝鎖のアルキル置換基など、６個以上の炭素原子を有するアルキル基も含む。
【００３５】
単独でまたは別の置換基との組み合わせで、本明細書で用いる「アリール」という用語は、芳香族単環系または芳香族多環系を意味する。
例えば、「アリール」という用語は、フェニルまたはナフチル環を含み、より大きな芳香族多環系、例えば蛍光標識（例えばアントラセン）または放射性標識およびそれらの誘導体も含んでよい。
【００３６】
単独でまたは別の置換基との組み合わせで、本明細書で用いる場合、「ヘテロアリール」という用語は、窒素、酸素、および硫黄から選択された１〜４個のヘテロ原子を含有しかつ、芳香族系を形成する５員環、６員環、または７員環の不飽和複素環を意味する。「ヘテロアリール」という用語はまた、窒素、酸素、および硫黄から選択される１〜４個のヘテロ原子を含有する５員環、６員環、または７員環の不飽和複素環を含む多環芳香族系も含む。
【００３７】
単独でまたは別の置換基との組み合わせで、本明細書で用いる場合、「シクロアルキル」という用語は、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、およびシクロヘプチルを含むがこれらに限定されないシクロアルキル置換基を意味する。
【００３８】
本明細書で用いる場合、「シクロアルキル−アルキル−」という用語は、それにシクロアルキルラジカルが直接結合されるアルキルラジカルを意味し、シクロプロピルメチル、シクロブチルメチル、シクロペンチルメチル、１−シクロペンチルエチル、２−シクロペンチルエチル、シクロヘキシルメチル、１−シクロヘキシルエチル、および２−シクロヘキシルエチルを含むがこれらに限定されない。「アルキル」または「低級アルキル」という用語の同様の使用は、本明細書で用いる場合アリール−アルキル−、アリール−低級アルキル−（例えばベンジル）、−低級アルキル−アルケニル（例えばアリル）、ヘテロアリール−アルキル−などについて理解されるべきである。例えば、「アリール−アルキル−」という用語は、アルキルラジカルを意味し、それにアリールが結合される。アリール−アルキル−例としては、ベンジル（フェニルメチル）、１−フェニルエチル、２−フェニルエチル、およびフェニルプロピルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３９】
単独でまたは別のラジカルとの組み合わせで、本明細書で用いる場合、「複素環」という用語は、窒素、酸素、および硫黄から選択される１〜４個のヘテロ原子を含有する３員環〜７員環の飽和または不飽和（芳香族を含む）環状化合物からの水素の除去により誘導される一価のラジカルを意味する。そのような複素環の例としては、アジリジン、エポキシド、アゼチジン、ピロリジン、テトラヒドロフラン、チアゾリジン、ピロール、チオフェン、ヒダントイン、ジアゼピン、イミダゾール、イソオキサゾール、チアゾール、テトラゾール、ピペリジン、ピペラジン、ホモピペリジン、ホモピペラジン、１，４−ジオキサン、４−モルホリン、４−チオモルホリン、ピリジン、ピリジン−Ｎ−オキシド、またはピリミジンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４０】
単独でまたは別のラジカルとの組み合わせで、本明細書で用いる場合、「アルケニル」という用語は、２個以上の炭素原子を含有する不飽和非環状直鎖ラジカルを意味することを意図し、それらの炭素原子の少なくとも２個は二重結合によって互いに結合される。そのようなラジカルの例としては、エチニル、１−プロピニル、２−プロピニル、および１−ブチニルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４１】
本明細書で用いる場合、「アルキニル」という用語は、２個以上の炭素原子を含有する不飽和非環状直鎖ラジカルを意味することを意図し、それらの炭素原子の少なくとも２個は三重結合によって互いに結合される。そのようなラジカルの例としては、エチニル、１−プロピニル、２−プロピニル、および１−ブチニルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４２】
単独でまたは別のラジカルとの組み合わせで、本明細書で用いる場合、「アルコキシ」という用語は、上記で定義されるようにアルキルが１または複数個の炭素原子を含有するラジカル−Ｏ−（Ｃｌ−ｎ）アルキルを意味し、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、１−メチルエトキシ、ブトキシ、および１，１−ジメチルエトキシを含む。式中、ｎは１〜６であり、上記のように、用語「低級アルコキシ」にあてはまるが、用語「アルコキシ」は、「低級アルコキシ」と同様に、ｎが６より大きい（例えば、ｎ＝７〜１０）アルコキシ基を包含する。単独でまたは別のラジカルとの組み合わせで、本明細書で用いる場合、「アリールオキシ」という用語は、−Ｏ−アーリルを意味し、アーリルは上記のように定義される。
【００４３】
保護基または保護的な基は、以降の化学反応で化学選択性を求めるために分子に導入される置換基である。多くの保護基が当技術分野で既知であり、当業者は、本明細書に記載の方法と関連して組み込み、用いることができる保護基の種類を理解できる。「保護基に基づくペプチド合成」、一般的に固相ペプチド合成において、所望のペプチドは、構築中のペプチド鎖にアミノ酸部分を段階的に加えることによって調製される。固相合成において、２種の最も広く使われるプロトコルは、アミノ保護基としてｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）または９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）を使用する。アミノ保護基は一般的に、合成手順時に好ましくない反応からアミノ基を保護し、後でアミンを暴露するために除去できる。一般的に用いられるアミノ保護基は、Ｇｒｅｅｎｅ，  Ｔ．Ｗ．ら，  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，第３版，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９９）に開示されている。アミノ保護基としては、アシル基（例えば、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ピバロイル、ｔ−ブチルアセチル、２−クロロアセチル、２−ブロモアセチル、トリフルオロアセチル、トリクロロアセチル、ｏ−ニトロフェノキシアセチル、α−クロロブチリル、ベンゾイル、４−クロロベンゾイル、４−ブロモベンゾイル、４−ニトロベンゾイルなど）；スルホニル基（例えば、ベンゼンスルホニル、ｐ−トルエンスルホニルなど）；（保護されたアミンと共にウレタンを形成する）アルコキシカルボニル基またはアリールオキシ−カルボニル基（例えば、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）、ｐ−クロロベンジルオキシカルボニル、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル、２−ニトロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ブロモベンジルオキシカルボニル、３，４−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、３，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、２，４−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、２−ニトロ−４，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、３，４，５−トリメトキシベンジルオキシカルボニル、１−（ｐ−ビフェニルイル）−１−メチルエトキシカルボニル、α−α−ジメチル−３，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、ベンズヒドリルオキシカルボニル、ｔ−ブチロキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ジイソプロピルメトキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、エトキシカルボニル、メトキシカルボニル、アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル、２−トリメチルシリルエチルオキシカルボニル（Ｔｅｏｃ）、フェノキシカルボニル、４−ニトロフェノキシカルボニル、フルオレニル−９−メトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、シクロペンチルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、シクロヘキシルオキシカルボニル、フェニルチオカルボニルなど）；アラルキル基（例えば、ベンジル、トリフェニルメチル、ベンジルオキシメチルなど）；ならびにシリル基（例えば、トリメチルシリルなど）が挙げられる。アミン保護基は、アミノ態窒素を複素環に組み込むフタロイルおよびジチオスクシンイミジルなどの環状アミノ保護基も含む。一般的に、アミノ保護基としては、ホルミル、アセチル、ベンゾイル、ピバロイル、ｔ−ブチルアセチル、フェニルスルホニル、Ａｌｌｏｃ、Ｔｅｏｃ、ベンジル、Ｆｍｏｃ、Ｂｏｃ、およびＣｂｚが挙げられる。手元の合成作業課題のために適切なアミノ保護基を選択し使用することは、十分に当業者の技術範囲内である。
【００４４】
いくつかの実施形態において、Ｒ１はＨである。
【００４５】
いくつかの実施形態において、Ｒ２またはＲ３は、Ｒ１に共有結合されて、Ｎ末端としてＮＲ１を有するプロリンを形成する。
【００４６】
いくつかの実施形態において、Ｒ２およびＲ３は、両方ともＨでない。
【００４７】
いくつかの実施形態において、Ｒ２およびＲ３は各々独立して、タンパク質原性もしくは非タンパク質原性のα−アミノ酸の諸アミノ酸鎖からなる群から選択される。
【００４８】
いくつかの実施形態において、Ｒ２およびＲ３は、それぞれＨおよびＣＨ３であるか、またはその逆である。
【００４９】
いくつかの実施形態において、Ｒ２またはＲ３は、−ＣＨ２−Ｓ−Ｒｓ（式中、Ｒｓは低級アルキル、低級アミノアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルケニル、または複素環から選択される）であり、これらのすべては任意選択で１または複数の置換可能な位置で１または複数の適切な置換基と置換され、好ましくはＲｓは、フェニル、もしくは低級アルキルで置換されたフェニル、ハロゲン、または低級アミノアルキルである。
【００５０】
いくつかの実施形態において、Ｒ４およびＲ５は、両方ともＨでない。
【００５１】
いくつかの実施形態において、Ｒ＊＊およびＲ＊＊＊は、両方ともＨでない。
【００５２】
いくつかの実施形態において、Ｒ４およびＲ５は各々独立して、ＨまたはＣ（Ｏ）−ＮＨＲｔであり、ＲｔはＨまたは低級アルキルである。好ましくは、Ｒｔはｔｅｒｔ−ブチルまたはＨである。
【００５３】
いくつかの実施形態において、Ｒ６はＨである。
【００５４】
いくつかの実施形態において、Ｒ６および、Ｒ８またはＲ９のいずれかは、そのＮ末端としてＮ−Ｒ６を有するプロリン残基をもたらす環を形成する。
【００５５】
いくつかの実施形態において、ｎは１である。
【００５６】
いくつかの実施形態において、Ｌおよび−Ｃ＝Ｏと共にＺは、配列番号１〜３８０のいずれか１つである。
【００５７】
いくつかの実施形態において、Ｘ１はＬｅｕである。
【００５８】
いくつかの実施形態において、Ｘ２はＡｓｐである。
【００５９】
いくつかの実施形態において、Ｘ３はＴｈｒである。
【００６０】
いくつかの実施形態において、Ｘ３はＶａｌである。
【００６１】
いくつかの実施形態において、Ｘ３はＩｌｅである。
【００６２】
いくつかの実施形態において、ＸｙおよびＸｚは各々独立して、タンパク質原性または非タンパク質原性のα−アミノ酸である。
【００６３】
いくつかの実施形態において、Ｘｚは、タンパク質原性もしくは非タンパク質原性のβ−アミノ酸である。
【００６４】
いくつかの実施形態において、Ｘｚは、β−ＨｏｍｏＬｙｓまたはメチル−β−ＨｏｍｏＬｙｓである。
【００６５】
いくつかの実施形態において、ＸｙおよびＸｚは各々、一次アミノ酸である。
【００６６】
いくつかの実施形態において、ＸｙおよびＸｚは各々、表１ＢのＸｙ列およびＸｚ列下にそれぞれ列挙されている任意のアミノ酸である。
【００６７】
種々の実施形態において、化合物は、化合物１〜３８９および４５６のいずれか１つであり、または多量体は、化合物３９０〜３９７および４５７〜５３８のいずれか１つである。
【００６８】
種々の実施形態において、多量体は、二量体、三量体、四量体、または５量体である。
【００６９】
いくつかの実施形態において、単量体化合物は、リンカーによって結合される。
【００７０】
いくつかの実施形態において、化合物は、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７／Ｒ８、Ｘｚ、またはＸｙに関連した炭素、窒素、酸素、硫黄、または他の原子において共に結合される。
【００７１】
本明細書に記載の大環状分子を多量体化するために、エステル、アミド、アミン、または混合アミド／アミンを含む、種々のリンカーを用いることができることを当業者は理解する。さらなる結合としては、エーテル、チオエーテル、チオエステル、ジスルフィド、スルホキシド、スルホン、スルホンアミド、スルファメート、スルファミド、カルバメート、尿素、カルボナート、ホスホジエステル、ホスホンアミド、ホスホロアミダート、複素環（例えばアジド−アルキン環化付加（「クリック」ケミストリー）からのトリアゾール）が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、単量体大環状分子は、炭素−炭素単結合連結、炭素−炭素二重結合連結、または炭素−炭素三重結合連結を介してリンカーに共有結合できる。あるいは、単量体大環状分子は、上記結合のいずれかを介して第２、第３、または第４の単量体大環状分子に直接結合できる。この場合、正式なリンカー部分は存在しない。
【００７２】
いくつかの実施形態において、多量体はホモ多量体である。
【００７３】
いくつかの実施形態において、多量体はヘテロ多量体である。
【００７４】
特定の実施形態において、本明細書に記載の化合物の薬学的に許容される塩が提供される。本明細書で用いる場合、「薬学的に許容される塩」という用語は、過度の毒性、刺激、およびアレルギー反応を伴わずに疾患の処置に適する、水溶性もしくは油溶性もしくは油分散性であり、適切なベネフィット／リスク比に相応し、かつそれらの意図される用途のために効果的である、本発明の化合物の塩または双性イオン形態を表す。塩は、アミノ基の適切な酸での処理によって、化合物の最終的分離および精製時に、または別々に調製できる。代表的な酸付加塩としては、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、クエン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、ジグルコン酸塩、グリセロリン酸、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ギ酸塩、フマル酸、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩（イセチオン酸塩）、乳酸塩、マレイン酸、メシチレンスルホン酸塩、メタンスルホン酸塩、ナフチレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、トリクロロ酢酸塩、トリフルオロ酢酸、リン酸塩、グルタミン酸塩、重炭酸塩、ｐ‐トルエンスルホン酸、およびウンデカン酸塩が挙げられる。また、本発明の化合物中のアミノ基は、メチル、エチル、プロピルとブチルクロリド、臭化物、およびヨウ化物；ジメチル、ジエチル、ジブチル、およびジアミルスフフェート；デシル、ラウリル、ミリスチル、およびステリルクロリド、臭化物、およびヨウ化物；ならびにベンジルおよび臭化フェネチルで四級化できる。治療的に許容される付加塩を形成するために用いられる酸の例としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、およびリン酸などの無機酸と、シュウ酸、マレイン酸、コハク酸、およびクエン酸などの有機酸が挙げられる。特定の実施形態において、本明細書に記載のペプチド化合物のいずれかは、塩の形態、例えば酢酸塩である。
【００７５】
一態様では、薬学的に許容される担体と共に本明細書に記載の多量体を含む医薬組成物が提供される。医薬組成物は、経口送達、局所送達、および非経口送達のいずれか一つのために調製されてよい。
【００７６】
本明細書で用いる場合、「薬学的に許容される担体」は、生理学的に適合するありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤と抗真菌剤、等張剤、および吸収遅延剤などを意味する。薬学的に許容される担体の例としては、水、生理食塩水、リン酸塩緩衝生理的食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどのうちの１または複数種、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。多くの場合、医薬組成物に等張剤、例えば、糖、ポリアルコール（マンニトール、ソルビトールなど）、または塩化ナトリウムを組み入れることが好ましい。薬学的に許容される担体は、薬剤の有効期間または有効性を向上させる少量の補助剤、例えば、湿潤剤もしくは乳化剤、保存剤、または緩衝剤をさらに含んでよい。
【００７７】
一態様では、患者において炎症または自己免疫疾患を処置する方法であって、本明細書に記載の多量体の治療有効量を患者に投与することを含む、方法が提供される。好ましくは、炎症または自己免疫疾患は胃腸系である。
【００７８】
一態様では、α４β７インテグリンの生物学的機能に関連する患者において状態を処置するための方法であって、本明細書に記載の多量体の治療有効量を患者に投与することを含む、方法が提供される。
【００７９】
いくつかの実施形態において、状態または疾患は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎、クローン病、セリアック疾患（非熱帯性スプルー）、血清反応陰性関節症に関連する腸疾患、顕微鏡的大腸炎、膠原線維性大腸炎、好酸球性胃腸炎、放射線療法、化学療法、直腸結腸切除と回腸肛門吻合の後に生じる回腸嚢炎、胃腸癌、膵臓炎、インスリン依存生糖尿病、乳腺炎、胆嚢炎、胆管炎、胆管周囲炎、慢性気管支炎、慢性副鼻腔炎、喘息、原発性硬化性胆管炎、胃腸管におけるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症、好酸性喘息、好酸性食道炎、胃炎、大腸炎、顕微鏡的大腸炎、移植片対宿主病、放射線療法もしくは化学療法に伴う大腸炎、白血球粘着不全症１型でのような自然免疫障害に伴う大腸炎、慢性肉芽腫症、糖尿病１ｂ型、ヘルマンスキー・パドラック症候群、チェディアック・東症候群、およびウィスコット・アルドリッチ症候群、または直腸結腸切除と回腸肛門吻合の後に生じる回腸嚢炎および胃腸癌の種々の形態、骨粗鬆症、関節炎、多発性硬化症、慢性疼痛、体重増加、およびうつ病である。別の実施形態において、状態は膵臓炎、インスリン依存生糖尿病、乳腺炎、胆嚢炎、胆管炎、胆管周囲炎、慢性気管支炎、慢性副鼻腔炎、喘息、または移植片対宿主病である。
【００８０】
好ましい実施形態において、炎症性腸疾患は、例えば、潰瘍性大腸炎またはクローン病である。
【００８１】
一態様では、患者において疾患または状態を処置するための方法であって、本明細書に記載の多量体の治療有効量を患者に投与することを含み、疾患または状態がウイルスまたはレトロウイルスの局所感染症もしくは全身感染症である、方法が提供される。
【００８２】
いくつかの実施形態において、ウイルスまたはレトロウイルスは、エコーウイルス１型と８型、エコーウイルス９型／Ｂａｒｔｙ株、ヒトパピローマウイルス、ハンタウイルス、ロタウイルス、アデノウイルス、口蹄疫ウイルス、コクサッキーウイルスＡ９型、ヒトパレコウイルス１型、またはヒト免疫不全ウイルス１型である。
【００８３】
一態様では、患者において疾患または状態を処置するための方法であって、本明細書に記載の多量体の治療有効量を患者に投与することを含み、疾患がＡ型肝炎、Ｂ型肝炎もしくはＣ型肝炎、肝性脳症、非アルコール性脂肪性肝炎、硬変症、静脈瘤出血、ヘモクロマトーシス、ウィルソン病、チロシン血症、α１アンチトリプシン欠損症、糖原病、肝細胞癌、肝癌、原発性胆汁性胆管炎、原発性硬化性胆管炎、原発性胆管硬化症、胆道疾患、自己免疫性肝炎、または移植片対宿主病である、方法が提供される。
【００８４】
いくつかの実施形態において、多量体はα４β７インテグリンのＭＡｄＣＡＭへの結合を阻害する。好ましくは、化合物はα４β７インテグリンのＭＡｄＣＡＭへの結合を選択的に阻害する。
【００８５】
いずれの実施形態において、患者は、好ましくはヒトである。
【００８６】
本明細書で用いる場合、「疾患」、「障害」、および「状態」という用語は、同じ意味で用いられてよい。
【００８７】
本明細書で用いる場合、「阻害」、「処置」、「処置する」、および「寛解させる」は、同じ意味で用いられ、対象、例えば哺乳動物における、例えば、症状の停止、生存率の延長、症状の部分的もしくは完全な寛解、ならびに状態、疾患、または障害の部分的もしくは完全な根絶を指す。
【００８８】
本明細書で用いる場合、「予防する」または「予防」は、（ｉ）対象、例えば哺乳動物において、特に、そのような対象が状態になりやすい素因を有するがそれを患っているとまだ診断されていない場合、疾患、損傷、もしくは状態が起こることを予防する、もしくは阻止すること；または（ｉｉ）対象において、疾患、損傷、または状態が起こる可能性を減少させることを含む。
【００８９】
本明細書で用いる場合、「治療有効量」は、所望の治療結果を達成するのに必要な、投与量でかつ特定の期間にわたって、有効な量を指す。薬剤の治療有効量は、諸要因、例えば、個体の病状、年齢、性別、および体重に応じて、ならびに個体において所望の反応を誘発するための薬剤の性能によって変化し得る。治療有効量はまた、薬剤のあらゆる毒作用または有害効果が治療的に有益な効果によって凌駕される量でもある。
【００９０】
いくつかの実施形態において、化合物は、経口投与、静脈内投与、腹腔内投与、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、くも膜下腔内投与、吸入投与、気化投与、噴霧化投与、舌下投与、頬側投与、非経口投与、経直腸投与、経腟投与、および局所投与からなる群から選択される投与形態で投与される。
【００９１】
いくつかの実施形態において、化合物は、初回投与に続いて１また複数回の後続投与として投与され、任意の２回の投与間の最小間隔は１日未満の期間であり、および各投与は化合物の有効量を含む。
【００９２】
いくつかの実施形態において、化合物の有効量は、以下からなる群から選択される少なくとも１つを達成するのに十分な量である：ａ）α４β７インテグリン分子上のＭＡｄＣＡＭ結合部位の約５０％以上の飽和；ｂ）細胞表面でのα４β７インテグリン発現の約５０％以上の阻害；ならびにｃ）α４β７インテグリン分子上のＭＡｄＣＡＭ結合部位の約５０％以上の飽和および細胞表面でのα４β７インテグリン発現の約５０％以上の阻害、ただし、ｉ）飽和は、１日２回を超えない投与頻度に矛盾しない期間中維持される、ｉｉ）阻害は、１日２回を超えない投与頻度に矛盾しない期間中維持される、またはｉｉｉ）飽和および阻害は各々、１日２回を超えない投与頻度に矛盾しない期間中、維持される。
【００９３】
いくつかの実施形態において、化合物は、２４時間中、１時間ごと、４時間ごと、１日１回、１日２回、１日３回、１日４回、隔日、週１回、隔週、および毎月からなる群から選択される間隔で投与される。
【００９４】
本明細書に記載の化合物は、当業者には既知の方法、例えば、国際公開第２０１６／０５４４１１号に記載の方法およびリンカーを用いて多量体化されることができる。
【００９５】
本発明の利点を以下の実施例によってさらに説明する。本明細書に記載の実施例およびそれらの特定の詳細は、説明のためのみ示されており、本発明の特許請求の範囲の限定として解釈されるべきではない。
【００９６】
実施例
方法および材料
合成
本明細書に記載の環状ペプチドを作製するための適用可能な方法は全体的に、本出願人のＰＣＴ国際公開第ＷＯ２０１０／１０５３６３号と、本出願同日に提出された「環状ペプチドのフラグメント合成」（代理人整理番号５５８１３８３２−６ＰＣＴ）と題され、２０１５年１１月１１日出願の米国仮出願第６２／２５４００３号に対して一般優先権を主張する出願に見出すことができる。
【００９７】
より具体的には、表１Ｘに示される化合物の各々を合成するために、以下のプロトコルを用いた。化合物の多量体も、表２Ｘに示されているように合成した。
【００９８】
プロトコルＡ：一般的なナセリン合成
１．樹脂の調製：Ｆｍｏｃアミノ酸（樹脂に対して１．１当量）をＣＨ２ＣＩ２（１０ｍＬ／ｇ樹脂）に溶解した。アミノ酸が完全に溶解しなかった場合は、均一混合物が撹拌／超音波処理時に持続するまで、ＤＭＦをゆっくりと滴下した。２−クロロトリチル樹脂をＣＨ２ＣＩ２（５ｍＬ／ｇ樹脂）中で１５分間膨潤させた。ＣＨ２ＣＩ２を次いで排出し、２−Ｃｌ  Ｆｍｏｃアミノ酸溶液を、Ｔｒｔ樹脂が入っている容器に加えた。ＤＩＰＥＡを加え（アミノ酸に対して２当量）、容器を５分間撹拌した。新たにＤＩＰＥＡを次いで２当量加え、容器をさらに６０分間撹拌させておいた。樹脂を次いで、何らかの残存する反応性２−Ｃｌ  Ｔｒｔ基をエンドキャップするためにメタノール（１ｍＬ／ｇ樹脂）で処理した。溶液を１５分間混合し、排出し、ＣＨ２ＣＩ２（３回）、ＤＭＦ（３回）、ＣＨ２ＣＩ２（２回）、およびＭｅＯＨ（３回）ですすいだ。樹脂を次いで真空下で乾燥し秤量して、Ｆｍｏｃアミノ酸の推定負荷を決定した。
２．手動合成または自動合成による直鎖ペプチド配列の調製：完全に保護された樹脂結合ペプチドを、標準Ｆｍｏｃ固相ペプチド化学によって手動で、または自動ペプチド合成機を用いて合成した。すべてＮ−Ｆｍｏｃアミノ酸を使用した。
ａ．Ｆｍｏｃ脱保護：樹脂をＮＭＰまたはＤＭＦ中２０％ピペリジンで２回、それぞれ５分間と１０分間、処理し、各添加後にＤＭＦおよびＮＭＰを連続して洗浄した。
ｂ．Ｆｍｏｃアミノ酸カップリング：樹脂をＮＭＰ中３当量のＦｍｏｃアミノ酸、３当量のＨＡＴＵ、および６当量のＤＩＰＥＡで６０分間、処理した。カップリングが困難な場合、ＮＭＰ中３当量のＦｍｏｃアミノ酸、３当量のＨＡＴＵおよび６当量のＤＩＰＥＡでの２回目の処理を、４０分間行った。
３．保護基の保持による一般的な切断：所望の直鎖配列を合成したら、樹脂を１．）１：３のＨＦＩＰ：ＣＨ２Ｃｌ２または２．）ＣＨ２Ｃｌ２に溶解した５％ＴＦＡのいずれかで２回、それぞれ３０分間処理して、固体支持体から切断した。溶媒を次いで取り除き、冷却したｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（またはジエチルエーテル／ヘキサン）で２回トリチュレートして、所望の生成物を得た。純度を次いで、逆相ＬＣＭＳによって分析した。
【００９９】
プロトコルＢ：Ｎ−アルキル化Ｆｍｏｃアミノ酸ビルディングブロックの調製
１．樹脂調製：プロトコルＡ、ステップ１を参照されたい
２．Ｆｍｏｃ脱保護：プロトコルＡ、ステップ２ａを参照されたい
３．ノシル保護：脱保護した樹脂をＣＨ２ＣＩ２（５ｍＬ／ｍｍｏｌ樹脂）およびＤＩＰＥＡ（６．５当量）中で撹拌した。塩化ノシル溶液（４．０当量）を、急速な発熱反応をふせぐために、ゆっくりと３０分間かけて滴下した。添加が完了した後、撹拌を室温で３時間続けた。得られたノシル保護樹脂を濾過し、ＣＨ２ＣＩ２、ＭｅＯＨ、ＣＨ２ＣＩ２、およびＴＨＦで洗浄した。
４．Ｎ−メチル化：ＴＨＦ（１０ｍＬ／ｍｍｏｌ樹脂）中樹脂の懸濁液に、ＴＨＦ（２Ｍ）とＭｅＯＨ（１０当量）中のトリフェニルホスフィン（５当量）の溶液を加えた。懸濁液を撹拌しながら氷浴中で冷却した。ＴＨＦ（１Ｍ）中のＤＩＡＤ（５当量）の溶液を添加漏斗で滴下した。添加が完了した後、氷浴を取り除き、反応物を室温でさらに９０分間撹拌した。樹脂を濾過し、ＴＨＦ（４回）、ＣＨ２Ｃｌ２（３回）、次いでＴＨＦ（２回）で洗浄した。
５．ノシル脱保護：ＮＭＰ（１０ｍＬ／ｍｍｏｌ樹脂）中の樹脂の懸濁液に、２−メルカプトエタノール（１０．１当量）およびＤＢＵ（５．０当量）を加えた。溶液の色が濃緑色になった。５分後、樹脂を濾過し、洗浄液が無色になるまで、ＤＭＦで洗浄した。この方法を再度繰り返し、樹脂を次いで最後にＣＨ２Ｃｌ２で洗浄した。
６．Ｆｍｏｃ保護：ＣＨ２ＣＩ２（７ｍＬ／ｍｍｏｌ樹脂）中の樹脂の懸濁液に、ＣＨ２Ｃｌ２（７ｍＬ）およびＤＩＰＥＡ（６．１当量）中のＦｍｏｃ−Ｃｌ（４当量）の溶液を加えた。懸濁液を室温で４時間撹拌し、次いで濾過し、ＣＨ２ＣＩ２（２回）、ＭｅＯＨ（２回）、ＣＨ２ＣＩ２（２回）、次いでＥｔ２Ｏ（２回）で洗浄した。
７．樹脂からの切断：プロトコルＡ、ステップ３を参照されたい。
【０１００】
プロトコルＣ：還元的アミノ化
１．Ｆｍｏｃワインレブアミド形成：ＣＨ２Ｃｌ２（６．５ｍＬ）中のＦｍｏｃアミノ酸（１ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｏ−ジメチルヒドロキシルアミン−ＨＣｌ（１．２当量）、およびＨＣＴＵ（１．２当量）の混合物を０℃に冷却した。ＤＩＰＥＡ（３当量）を次いで、この混合物に撹拌しながらゆっくりと滴下した。冷却浴を取り除き、反応物を室温で１６時間撹拌した。ＨＣｌ（４ｍＬ）の１０％溶液を加えると、沈殿物が形成され、これを濾過して取り除いた。濾液を１０％ＨＣｌ（４ｍＬで３回）で、次いで塩水（４ｍＬで２回）で洗浄した。有機相を次いで、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥した。溶媒を減圧下で除去して、粗Ｆｍｏｃワインレブアミドを得、これを精製せずに次の反応で使用した。
２．ａ）Ｆｍｏｃアミノアルデヒド形成：水素化アルミニウムリチウム粉末（１．５当量）を乾燥したフラスコに入れた。ＴＨＦ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＢＨＴ２５０ｐｐｍ、ＡＣＳ試薬＞９９．０％、６．５ｍＬ）を加え、生じたスラリーを撹拌しながら−７８℃に冷却した。このスラリーに、ＴＨＦ中のＦｍｏｃワインレブアミド溶液（１０ｍＬ）を加えた。反応器を氷／水浴へ移し、０℃で１時間維持した。０℃で反応物に、アセトン（１．５ｍＬ）、続いてＨ２Ｏ（０．２５ｍＬ）を滴下し、次いで反応物を室温でさらに１時間撹拌させておいた。混合物を、セライトを通して濾過し、ＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）およびＭｅＯＨ（１０ｍＬ）で洗浄し、濾液を濃縮した。粗材料をＣＨＣＩ３（６．５ｍＬ）に溶解し、塩水（３ｍＬで２回）で洗浄し、有機相を次いでＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮して、Ｆｍｏｃアミノアルデヒドを得た。
あるいは、ｂ）アルゴン雰囲気下で、ＴＨＦ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、１５７．８１ｍＬ、１５７．８２ｍｍｍｏｌ、１当量）中の水素化アルミニウムリチウム１．０Ｍ溶液を０℃で、ＴＨＦ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＢＨＴ２５０ｐｐｍ、ＡＣＳ試薬、＞９９．０％、１Ｌ）中のワインレブアミド（１５７．８２ｍｍｏｌ）溶液に徐々に加え、次いで１時間撹拌した。０℃で反応物をＥｔ２Ｏ（５００ｍＬ）で希釈し、得られた溶液を１０％ＮａＨＳＯ４（３００ｍＬで１０回）、１０％ＫＨＳＯ４（３００ｍＬで１０回）およびＨＣｌ（３００ｍＬで１０回）で洗浄した。有機相を次いでＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮して、粗Ｆｍｏｃアミノアルデヒドを得た。
３．樹脂上での還元的アミノ化：樹脂上の直鎖ペプチドを固相ペプチド合成反応器に入れ、ＤＭＦ（２２ｍＬ／ｇ樹脂）で希釈した。Ｆｍｏｃアルデヒド（４．０当量）を加え、反応物を終夜振盪させておいた。溶液を次いで排出し、樹脂をＣＨ２Ｃｌ２（３回）およびＤＭＦ（３回）で洗浄した。樹脂を次いでＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２（２２ｍＬ／ｇ樹脂、１：３比）の混合液で希釈し、続いてＮａＢＨ４（７当量）を加えた。混合物を、４時間振盪させておき、次いで溶液を排出し、樹脂をＣＨ２Ｃｌ２（３回）およびＤＭＦ（３回）で洗浄した。
【０１０１】
プロトコルＤ：フラグメントベースの大環状化
ａ）２ドラムバイアル中で、直鎖ペプチド０．１ｍｍｏｌとＤＥＰＢＴ（１．５当量）を蒸留直後のＴＨＦ（０．０２Ｍ）５ｍＬに溶解した。ＤＩＰＥＡ（３当量）を次いで加え、反応混合物を室温で終夜撹拌させた（１６時間）。テトラアルキルアンモニウム炭酸樹脂（Ｂｉｏｔａｇｅ（登録商標）、６当量）を次いで反応混合物に加え、さらに２４時間、撹拌し続けた。反応物を次いで、固相抽出容器を介して濾過し、ＣＨ２ＣＩ２（２ｍＬ）ですすいだ。濾液と洗浄液を合わせ、溶媒を減圧下で除去した。
あるいは、ｂ）２ドラムバイアル中で、直鎖ペプチド０．１ｍｍｏｌとＨＡＴＵ（２当量）をＣＨ２Ｃｌ２（１．２５ｍＭ）８０ｍＬに溶解した。ＤＩＰＥＡ（６当量）を次いで加え、反応混合物を室温で終夜撹拌させた（１６時間）。溶媒を減圧下で除去した。
【０１０２】
プロトコルＥ：アジリジンアルデヒドベースの大環状化
直鎖ペプチドをＴＦＥに溶解した（溶解性の問題が発生した場合、ＴＦＥ：ＣＨ２Ｃｌ２の５０：６０混合物を環化のために使用した）。次いで、ＴＦＥ保存液（０．２Ｍ）として０．６当量の（Ｓ）−アジリジン−２−カルボキシアルデヒド−二量体（文献のプロトコル：Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ２００６，  １２８（４６），  １４７７２−１４７７３およびＮａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．  ２０１０，  ５（１１），  １８１３−１８２２に従って調製した）を加え、０．１Ｍの最終反応混合物濃度を得た。ｔｅｒｔ−ブチルイソシアニド（１．２当量）を次いで加え、反応混合物を４時間撹拌した。進行を、ＬＣ−ＭＳにより途中で分析した。
【０１０３】
プロトコルＦ：大環状化後、アシルアジリジンの求核的開環
ａ）チオ酢酸／チオ安息香酸：対応するチオ酸（４当量）を粗反応混合物に加えた。反応の進行は、ＬＣ−ＭＳでモニターし、１〜２時間後に大体完了した。
あるいは、ｂ）チオフェノール：チオフェノール（４当量）およびＤＩＰＥＡ（４当量）を粗環化混合物に加えた。
反応の進行は、ＬＣ−ＭＳでモニターし、１〜２時間後に大体完了した。溶媒を減圧下で除去し、真空下で乾燥した。粗材料をＥｔ２Ｏ／ヘキサンまたはＴＢＭＥのいずれかでトリチュレートし、またはあるいは、Ｈ２Ｏで希釈し、凍結乾燥した。
【０１０４】
プロトコルＧ：大環状化後、スズキカップリング
ａ）一般的な一例として、大環状分子を含有するヨード−ｐｈｅ（０．１ｍｍｏｌ）、Ｎａ２ＣＯ３（２当量）、置換ボロン酸（１．１当量）、および水：アセトニトリル（１：１比）４ｍＬをマイクロ波バイアル中で合わせた。混合物をＮ２ガス流で１０分間処理した。Ｎ２下の間、ケイ素系Ｐｄ触媒（Ｓｉｌｉａｃａｔ−ＤＰＰ  Ｐｄ不均一系触媒、０．０５当量）を加えた。反応バイアルを密封し、電子レンジ中に１２０℃で１０分間（基質に応じて、反応時間および温度を３０分間、および１５０℃に上げた）置くか、または９０℃で１時間熱により加熱した。反応の進行をＬＣＭＳでモニターした。完了すると、反応物をセライトプラグにより濾過し、溶媒を減圧下で除去した。
あるいは、ｂ）具体例として、３−（（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）メチル）−４−ブロモ安息香酸を用いて調製した大環状分子と共にスズキカップリングを以下の通りに行った：Ａｓｐ残基のβーｔｅｒｔ−ブチルエステルおよびＴｈｒ残基のｔｅｒｔ−ブチルエテル（２００ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）として直交保護された粗大環状化合物３４０と、４−（４−Ｂｏｃ−ピペラジノ）フェニルボロン酸ピナコールエステル（１７１ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）との混合物を室温で１，２−ジメトキシエタン（５．４ｍＬ）およびエタノール（１．２ｍＬ）に溶解した。この溶液に、水（１．２ｍＬ）に続いてＮａ２ＣＯ３（３５ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）を加えた。反応フラスコを窒素ガス下で少なくとも５〜１０分間フラッシュし、次いで触媒ＳｉｌｉａＣａｔ−ＤＰＰ  Ｐｄ（８８ｍｇ、１０ｍｏｌ％、０．２５ｍｍｏｌ／ｇｍ）を加えた。反応混合物を窒素下で撹拌しながら９０℃で１時間加熱した。１時間後ＬＣＭＳは基質および約５％の脱臭素化化合物の完全消化を示し、所望のスズキクロスカップリング生成物は、ＵＶによる過剰ボロン酸エステルを考慮すると、約８４％収率を示した。反応混合物を室温に冷却し、セライトパッド上で濾過して、触媒ＳｉｌｉａＣａｔ−ＤＰＰ  Ｐｄを除去した。セライトパッドを少量のＤＣＭで洗浄し、真空下で溶媒を除去して、スズキカップリング生成物として淡黄色の粗固体を得た。試薬３−（（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）メチル）−４−ブロモ安息香酸をそれ自体、次の通り、メチルエステルのけん化およびＦｍｏｃカルバメートとしてアミンの保護によってメチル３−（アミノメチル）−４−ブロモベンゾエート（米国特許出願公開第２０１１２５１２４７号）から調製した：ジオキサン（３３ｍＬ）および水（９ｍＬ）中のメチル３−（アミノメチル）−４−ブロモベンゾエート（１．３６ｇ、５．５７ｍｍｏｌ）の溶液に水酸化リチウム（６．１３ｍＬ、６．１３ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を室温で３時間撹拌した。ＴＬＣは、加水分解反応が完了したことを示した。ジオキサン（１６ｍＬ）を加えた。混合物を、１Ｎ  ＨＣＩ（水溶液）（６．１７ｍＬ）の添加により中和した。炭酸水素ナトリウム（０．４６８ｇ、５．５７ｍｍｏｌ）を加え、続いて（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチルカルボノクロリダート（２．１６２ｇ、８．３６ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で２時間撹拌し、１Ｎ  ＨＣＩ（水溶液）（６．２ｍＬ）を加えることによってｐＨ３に酸性化した。水（４０ｍＬ）を加え、ＡｃＯＥｔ（４回、１５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、溶媒を約５０ｍＬに留去した。沈殿が起こり始め、それを室温で終夜ゆっくりと続けさせた。白色固体を次いで濾過により収集し、ヘキサンで洗浄し、真空下で乾燥して、３−（（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）メチル）−４−ブロモ安息香酸（２．０ｇ、４．４２ｍｍｏｌ、７９％収率）を得た。
【０１０５】
プロトコルＨ：一般的なウルマンカップリング、大環状化後
不活性雰囲気下でペプチド大環状分子（０．０１８ｍｍｏｌ）を、乾燥ＣＨ２Ｃｌ２２ｍＬを含有する２ドラムバイアルに入れ、Ｃｕ（ＯＡｃ）２（１当量）、ベンゼンボロン酸（２当量）、および４Å（オーブン乾燥）モレキュラーシーブを次いでバイアルに加え、続いてＤＩＰＥＡ（４当量）を加えた。バイアルの内容物を室温で終夜撹拌した。反応の進行をＬＣＭＳで評価した。反応が完了したと判断されたら、混合物をセライトプラグにより濾過し、溶媒を減圧下で除去した。
【０１０６】
プロトコルＩ：一般的な全体的脱保護および切断
側鎖保護基の脱保護を、ＴＦＡ：Ｈ２Ｏ：ＴＩＳ（９５：２．５：２．５）からなる切断混合物２ｍＬにペプチドを２時間溶解することによって達成した（高感度ペプチドの場合、ＴＦＡ：Ｈ２Ｏ：ＴＩＳ（９５：２．５：２．５）混合物をＴＦＡ：ＣＨ２Ｃｌ２（５０：５０）の混合物に代えてもよい）。続いて、切断混合物を減圧下で留去し、ペプチドを冷却ジエチルエーテル／ヘキサン（またはｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル）から２回沈殿させた。
【０１０７】
プロトコルＪ：還元的に不安定な保護基の一般的切断
ａ）Ｐｄ／Ｃおよびギ酸による脱ベンジル化：ベンジル保護大環状分子（０．３５ｍｍｏｌ）を、１０％ギ酸、１０重量％Ｐｄ／Ｃ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、３７ｍｇ、０．１当量）を含むＭｅＯＨ（８ｍＬ）に溶解し、５５℃に１〜４時間加熱した。反応が完了したと判断されたら、混合物をセライトプラグにより濾過し、ＭｅＯＨで洗浄し、溶媒を減圧下で除去した。
またはあるいは、ｂ）ラネーニッケル脱硫／脱ベンジル化：ラネーニッケル・スラリー（１〜２ｍＬ）を環化反応混合物に直接加え、終夜勢いよく撹拌した。バイアルを次いで遠心分離し、液体を、風袋計量したバイアルにピペットを使用して移した。ＭｅＯＨを、ラネーニッケルを含有するバイアルに加えた。バイアルを次いで超音波処理し、ボルテックスし、遠心分離した。再び、液体を、風袋計量したバイアルに移した。このプロセスをＥｔＯＡｃで繰り返し、次いで最後にＭｅＯＨで繰り返した。合わせた洗浄液を次いで減圧下で除去し、残留物を真空下で乾燥した。
【０１０８】
プロトコルＫ：大環状化後、側鎖のアミド化
大環状分子（０．０２１ｍｍｏｌ）をＣＨ３ＣＮ１ｍＬに溶解した。Ｋ２ＣＯ３（５当量）および対応する酸塩化物（２当量）を次いで加え、反応混合物を室温で終夜撹拌させておいた。午前中に反応の進行をＬＣ−ＭＳで確認した。完了すると、溶媒を減圧によって除去した。
【０１０９】
プロトコルＬ：蛍光色素の付着
大環状分子（４μｍｏｌ）をＤＭＳＯ（２００μＬ）に溶解した。ＤＩＰＥＡ（５当量）を次いで加えた。別のバイアル中で、ＮＨＳエステルとして５ｍｇの蛍光色素を２００μＬのＤＭＳＯに溶解した。大環状分子溶液を次いで蛍光標識溶液に加えた。反応混合物を終夜撹拌した。午前中に反応の進行をＬＣ−ＭＳで確認し、次いで溶媒を凍結乾燥によって除去した。
【０１１０】
プロトコルＭ：精製方法
すべての大環状分子を３０ｇのＲｅｄｉＳｅｐ  Ｃ１８  Ｇｏｌｄカラムを用いる逆相フラッシュカラムクロマトグラフィーを使用して精製した。勾配は、３５ｍＬ／分の流速で、溶離液Ａ（再蒸留水中の０．１％ギ酸）と溶離液Ｂ（ＨＰＬＣグレードのアセトニトリル中の０．１％ギ酸）からなった。
【０１１１】
多量体化プロトコル
プロトコルＮ：多量体化のためのリンカー合成
ａ）塩化アシルリンカーの調製：
ジカルボン酸、トリカルボン酸、またはテトラカルボン酸（１当量）と、ＣＨ２Ｃｌ２（０．１１４Ｍ濃度）とを２−ドラムバイアルに加えた。ＳＯＣｌ２（カルボン酸に対して１５当量）を次いで加え、反応混合物を室温で４時間、撹拌させておいた（いくつかの基質は完全溶液および／または変換のために７０℃で終夜加熱する必要があった）。溶媒をＮ２流で除去した。残留物を３ｍＬの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、これを次いでＮ２流下で除去した。試料からいずれの遊離ＨＣｌを除去するためにこのプロセスをさらに２回行った。得られた残留物を次いで、精製せずに二量体化で使用した。
ｂ）ベンゾトリアゾールリンカーの調製、方法Ａ：ジクロロメタン（開始リンカー１ｍｍｏｌあたり２０ｍＬ）中のベンゾトリアゾール溶液（カルボン酸に対して１０当量）に塩化チオニル（カルボン酸に対して２当量）を加え、この溶液を室温で２０分間撹拌した。ジカルボン酸、トリカルボン酸、またはテトラカルボン酸（１当量）を各混合物に加え、次いで室温で２４時間撹拌した（追加順の変更は結果を物質的に変えなかった）。反応をＮａＨＣＯ３（１０％、１００ｍＬ）でクエンチし、層を分離した。有機層をＨＣｌ（１０％、１００ｍＬで２回）およびＮａＨＣＯ３（１０％、１００ｍＬで２回）で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、真空下で留去して、所望のベンゾトリアゾール活性化カルボン酸を得た。
ｃ）ベンゾトリアゾールリンカーの調製、方法Ｂ：ジクロロメタン（開始リンカー１ｍｍｏｌあたり２０ｍＬ）中のＨＡＴＵ（カルボン酸に対して１．５当量）、ベンゾトリアゾール（カルボン酸に対して２当量）およびジカルボン酸、トリカルボン酸、またはテトラカルボン酸（１当量）の懸濁液にＤＩＰＥＡ（カルボン酸に対して３当量）を加え、得られた黄色溶液を室温で１６時間撹拌した。反応をＮａＨＣＯ３（１０％、１００ｍＬ）でクエンチし、層を分離した。有機層をＨＣｌ（１０％、１００ｍＬで２回）およびＮａＨＣＯ３（１０％、１００ｍＬで２回）で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、真空下で留去して、所望のベンゾトリアゾール活性化カルボン酸を得た。
ｄ）Ｌｙｓ（ＣＢｚ）−ピメリン酸−Ｌｙｓ（ＣＢｚ）リンカーの調製：ピメリン酸を、プロトコルＮｂを用いてビス−ベンゾトリアゾール活性化部分に変換した。市販のＮα−Ｚ−Ｌ−リジンメチルエステル塩酸塩（２当量；Ｃｈｅｍｌｍｐｅｘ）を、ＤＩＰＥＡ（１０当量）を含有するＣＨ３ＣＮ（０．０１１Ｍ）中のビス−ベンゾトリアゾール活性化ピメリン酸（１当量）で処理した。反応混合物を１６時間撹拌した（ＬＣ−ＭＳでモニターした）。溶媒をロートエバポレーションによって除去し、粗材料を逆相シリカクロマトグラフィー（Ｂｉｏｔａｇｅ）にかけて、中間体としてＬｙｓ（ＣＢＺ）−ピメリン酸−Ｌｙｓ（ＣＢＺ）の精製ビス−メチルエステルを得た。ＴＨＦ（１０ｍＬ）中のビス−メチルエステル溶液（１．５ｍｍｏｌ、１．０当量）にＬｉＣｌ（３．０ｍｍｏｌ、２．０当量）およびＬｉＯＨ−Ｈ２Ｏ（３．０ｍｍｏｌ、２．０当量）を加え、続いてＨ２Ｏ（２５０μＬ）を加えて、塩の可溶化を促進した。反応物を室温で終夜撹拌した。ＬＣ−ＭＳモニタリングで評価し、加水分解が完了すると、ギ酸を滴下して、塩基性溶液を中和した。溶媒をロートエバポレーションによって除去し、粗材料を逆相クロマトグラフィー（Ｂｉｏｔａｇｅ）にかけて、精製二酸リンカーを得た。
ｅ）ＰＥＧ２−ジグリコール酸−ＰＥＧ２リンカーの調製：無水ＣＨ２ＣＩ２（５ｍＬ）中の塩化ジグリコール酸（０．３５ｍｍｏｌ；１当量；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号３７８１５１）を、ＮＨ２−ＰＥＧ２−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯｔＢｕ（２当量；Ｂｉｏｃｈｅｍｐｅｇカタログ番号ＭＤ００５０６７−２）で処理し、続いてＤＩＰＥＡ（３．５ｍｍｏｌ、１０．０当量）を滴下した。特に留意されたい−この追加順番は極めて重要であることが判明した。反応をＬＣ−ＭＳでモニターした。３０分後に、反応が完了し、より長い撹拌時間は生成物比に影響を及ぼさなかった。溶媒を真空下で除去し、粗材料を逆相クロマトグラフィー（Ｂｉｏｔａｇｅ）にかけて、精製ジ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル中間体を得た。ｔｅｒｔ−ブチルエステル基の除去を、プロトコルＩによって行った。二酸リンカーを粗材料として単離し、さらに処理をせずに多量体化反応などで使用した。
ｆ）ＰＥＧ２−ジフェン酸−ＰＥＧ２リンカーの調製：ジフェン酸を、プロトコルＮｂを用いてビス−ベンゾトリアゾール活性化部分に変換した。市販のＮＨ２−ＰＥＧ２−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯｔＢｕ（２当量；Ｂｉｏｃｈｅｍｐｅｇカタログ番号ＭＤ００５０６７−２）を、ＤＩＰＥＡ（１０当量）を含有するＣＨ３ＣＮ（０．０１１Ｍ）中のビス−ベンゾトリアゾール活性化ジフェン酸（１当量）で処理した。反応混合物を１６時間撹拌した（ＬＣ−ＭＳでモニターした）。溶媒をロートエバポレーションで除去し、粗材料を逆相シリカクロマトグラフィー（Ｂｉｏｔａｇｅ）にかけて、精製ジ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル中間体を得た。ｔｅｒｔ−ブチルエステル基の除去を、プロトコルＩによって行った。二酸リンカーを粗材料として単離し、さらに処理をせずに多量体化反応などで使用した。
ｇ）ＰＥＧ２−ピメリン酸−ＰＥＧ２リンカーの調製：ピメリン酸を、プロトコルＮｂを用いてビス−ベンゾトリアゾール活性化部分に変換した。市販のＮＨ２−ＰＥＧ２−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯｔＢｕ（２当量；Ｂｉｏｃｈｅｍｐｅｇカタログ番号ＭＤ００５０６７−２）を、ＤＩＰＥＡ（１０当量）を含有するＣＨ３ＣＮ（０．０１１Ｍ）中のビス−ベンゾトリアゾール活性化ピメリン酸（１当量）で処理した。反応混合物を１６時間撹拌した（ＬＣ−ＭＳでモニターした）。溶媒をロートエバポレーションで除去し、粗材料を逆相シリカクロマトグラフィー（Ｂｉｏｔａｇｅ）にかけて、精製ジ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル中間体を得た。ｔｅｒｔ−ブチルエステル基の除去を、プロトコルＩによって行った。二酸リンカーを粗材料として単離し、さらに処理をせずにこれを多量体化反応などで使用した。
【０１１２】
プロトコルＯ：ナセリン多量体化
ａ）ビスアシルクロリド活性化リンカーまたはトリアシルクロリド活性化リンカーを使用することによるアミン含有単量体大環状分子の多量体化：アルゴン雰囲気下で新たに調製した、対応する塩化アシル（０．３５ｍｍｏｌ、１．０当量）を無水ＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ；規模の大きい反応では高収率の二量体化をもたらすためにより高い濃度の溶液が必要であることを留意されたい）に溶解した。反応性アミン中心の遊離塩基／非加塩形態として最適に補充された、単量体大環状分子（ビスアシルクロリド、トリスアシルクロリド、またはテトラアシルクロリドの場合、２当量、３当量、または４当量）をフラスコに入れ、続いてＤＩＰＥＡを滴下した（３．５ｍｍｏｌ、１０．０当量）；特に留意されたい−この追加順番は極めて重要であることが判明した。反応をＬＣ−ＭＳでモニターした。３０分後に、反応が完了し、より長い撹拌時間は生成物比に影響を及ぼさなかった。溶媒を真空下で除去し、粗材料を逆相クロマトグラフィー（Ｂｉｏｔａｇｅ）にかけて、精製生成物を得た。
ｂ）ベンゾトリアゾール活性化リンカーを使用することによるアミン含有単量体大環状分子の多量体化：ＣＨ３ＣＮ（１ｍＬ）中の、反応性アミン中心の遊離塩基／非加塩形態として最適に補充された、単量体大環状分子（２、３または４当量）と、多量体化前の１週間以内に、前もって調製された、対応するベンゾトリアゾール活性化リンカー（０．０１１ｍｍｏｌ、１当量）の溶液にＤＩＰＥＡ（０．０２ｍＬ、０．１１４ｍｍｏｌ、１０当量）の存在下で。反応混合物を１６時間撹拌した（ＬＣ−ＭＳでモニターした）。溶媒をロートエバポレーションで除去し、粗材料を逆相シリカクロマトグラフィー（Ｂｉｏｔａｇｅ）にかけて、精製生成物を得た。
ｃ）２−クロロアセチルクロリドを使用することによるアミン含有単量体大環状分子の二量体化：蒸留ＴＨＦ（１．０ｍＬ）中の、反応性アミン中心の遊離塩基／非加塩形態として最適に補充された単量体大環状分子（０．０５７１ｍｍｏｌ、２当量）の溶液に、２−クロロアセチルクロリド（３．１９ｍｇ、０．０２９ｍｍｏｌ、１当量）に続いてＤＩＰＥＡ（２５ｕＬ、０．１７ｍｍｏｌ、６．０当量）を加えた。反応混合物を１６時間撹拌した（ＬＣ−ＭＳでモニターした）。Ｎａｌ（８．５ｍｇ、０．０５７０８ｍｍｏｌ、２当量）を次いで加え、反応混合物を５０℃で２時間加熱した。溶媒を真空下で除去し、粗材料を逆相シリカクロマトグラフィー（Ｂｉｏｔａｇｅ）にかけて、精製生成物を得た。
ｄ）アクリロイルクロリドを使用することによるアミン含有単量体大環状分子の二量体化：蒸留ＴＨＦ（１．０ｍＬ）中の、反応性アミン中心の遊離塩基／非加塩形態として最適に補充された単量体大環状分子（０．０５７１ｍｍｏｌ、２当量）の溶液に、アクリロイルクロリド（２．６ｍｇ、０．０２９ｍｍｏｌ、１当量）に続いてＤＩＰＥＡ（２５ｕＬ、０．１７ｍｍｏｌ、６．０当量）を加えた。反応混合物を１６時間撹拌した（ＬＣ−ＭＳでモニターした）。ＤＢＵ（８．５ｕＬ、０．０５７ｍｍｏｌ、２当量）を次いで加え、反応物を５０℃で５時間加熱した。溶媒を真空下で除去し、粗材料を逆相シリカクロマトグラフィー（Ｂｉｏｔａｇｅ）にかけて、精製生成物を得た。
ｅ）ヒドロキシル含有単量体大環状分子の多量体化：ジカルボン酸リンカー、トリカルボン酸リンカー、またはテトラカルボン酸リンカー（４．３μｍｏｌ）、単量体大環状分子（２、３、または４当量）、ＤＭＡＰ（２、３、または４当量）、およびＥＤＣ−ＨＣｌ（４、８、または１２当量）をＤＣＭ（５００〜１０００μＬ）に溶解した。反応混合物を室温で終夜撹拌させておいた。反応の進行をＬＣ−ＭＳで評価した。完了すると、溶媒を減圧下で除去し、粗材料を逆相シリカクロマトグラフィー（Ｂｉｏｔａｇｅ）にかけて、精製生成物を得た。
ｆ）２，４−ジクロロ−５−ニトロピリミジンを使用することによるアミン含有単量体大環状分子の二量体化：１−ドラムバイアル中で、クロロホルム（１ｍＬ）中の２，４−ジクロロ−５−ニトロピリミジン（２．０ｍｇ、０．０１０ｍｍｏｌ、１．０当量）および、反応性アミン中心の遊離塩基／非加塩形態として最適に補充された単量体大環状分子（０．０２１ｍｍｏｌ、２．１当量）の溶液に、ＤＩＰＥＡ（０．０２ｍＬ、０．１１ｍｍｏｌ、１１．０当量）を加え、反応混合物は直ちに黄色に変わった。撹拌を室温で終夜し続け、その時点でＬＣ−ＭＳ分析は所望の二量体へのほぼ完全な変換を示した。追加の２４時間の反応時間は、それ以上の変換をもたらさなかった。溶媒をロートエバポレートして乾燥させ、粗残留物を逆相クロマトグラフィーにかけて、７６％の単離収率で精製物を得た。
ｇ）ＨＡＴＵ活性化リンカーを使用することによるアミン含有単量体大環状分子の多量体化：１ｍＬの無水ＤＣＭ中の、反応性アミン中心の遊離塩基／非加塩形態として最適に補充された、単量体大環状分子（２、３、または４当量）の溶液に、室温にて不活性雰囲気下でジ置換カルボン酸、トリ置換カルボン酸、またはテトラ置換カルボン酸（１当量）を加えた。ＨＡＴＵ（３、６、または９当量）を溶液に加え、続いてＤＩＰＥＡ（３、６、または９当量）を加えた。反応混合物を終夜撹拌させておいた。１４時間後のＬＣ−ＭＳによる反応の進行評価は完了を示した。反応混合物をロートエバポレートしてほぼ乾燥し、次いで高真空下に置いた。直交保護基が除去を必要としない場合（例えば、ＣＢｚカルバメートとして保護されているアミン）、粗材料を逆相シリカクロマトグラフィーにかけて、精製物を得た。
ｈ）ハライド活性化リンカーを使用することによるアミン含有単量体大環状分子の多量体化：ＣＨ３ＣＮ（２ｍＬ）中の単量体大環状分子（ジハライドと共に使用した場合は３．０当量、トリハライドと共に使用した場合は４．５当量）および対応するジハライドリンカー（１．０当量）の溶液にＤＩＰＥＡ（約３０当量）を加えた。反応混合物を１６時間撹拌した（ＬＣ−ＭＳでモニターした）。溶媒を除去し、粗材料を逆相クロマトグラフィーにかけて、精製物を得た。
【０１１３】
インテグリンα４β７−ＭＡｄＣＡＭ−１  ＥＬＩＳＡ競合アッセイ
９６ウェルＭｉｃｒｏｌｏｎプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、６５５００１）の各ウェルを、炭酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ９．６）中の１μｇ／ｍＬ組換えインテグリンα４β７（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、５３９７−Ａ３−０５０）の溶液１００μＬでコーティングした。プレートを４℃で終夜インキュベートした。溶液を除去し、２５０μＬのブロッキング緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣＩ、１ｍＭのＭｎＣｌ２、１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ）を各ウェルに加えた。プレートを次いで室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭのＮａＣＩ、１ｍＭのＭｎＣＩ２、０．０５％Ｔｗｅｅｎ）で、３回洗浄した。各ウェルに、アッセイ緩衝液で希釈した５０μＬの化合物を化合物段階希釈プレートから移して加えた。アッセイ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｎＣｌ２、０．１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ）中０．１μｇ／ｍＬの濃度の組換えＭＡｄＣＡＭ−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、６０５６−ＭＣ−０５０）５０μＬを各ウェルに加えた。結合平衡に達するように、プレートを振盪（３００ｒｐｍ）させながら、室温で２時間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄し、アッセイ緩衝液で１：２０００に希釈した抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ特異的ＨＲＰ（Ａｂｃａｍ、Ａｂ９７２２５）１００μＬを各ウェルに加えた。プレートを室温で撹拌しながら１時間、インキュベートした。プレートを次いで３回洗浄し、続いて１，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ、ＫＰＬ５１２０−００８３）１００μＬを各ウェルに加えた。反応を、２分間のインキュベーションの後、５０μＬの１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を加えることにより停止させ、光学吸光度を４５０ｎＭで読み取った。
【０１１４】
インテグリンα４β１−ＶＣＡＭ−１競合ＥＬＩＳＡ
９６ウェルＭｉｃｒｏｌｏｎプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、６５５００１）の各ウェルを、炭酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ９．６）中の０．５μｇ／ｍＬ組換えインテグリンα４β１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、５３９７−Ａ３−０５０）の溶液１００μＬでコーティングした。プレートを４℃で終夜インキュベートした。溶液を除去し、２５０μＬのブロッキング緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣＩ、１ｍＭのＭｎＣｌ２、１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ）を各ウェルに加えた。プレートを次いで室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭのＮａＣＩ、１ｍＭのＭｎＣＩ２、０．０５％Ｔｗｅｅｎ）で、３回洗浄した。各ウェルに、アッセイ緩衝液で希釈した５０μＬの化合物を化合物段階希釈プレートから移して加えた。アッセイ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｎＣｌ２、０．１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ）中０．１μｇ／ｍＬの濃度の組換えＶＣＡ−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、８６２−ＶＣ−１００）５０μＬを各ウェルに加えた。結合平衡に達するように、プレートを振盪（３００ｒｐｍ）させながら、室温で２時間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄し、アッセイ緩衝液で１：２０００に希釈した抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ特異的ＨＲＰ（Ａｂｃａｍ、Ａｂ９７２２５）１００μＬを各ウェルに加えた。プレートを撹拌しながら室温で１時間インキュベートした。プレートを次いで３回洗浄し、続いて１，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ，（ＴＭＢ、ＫＰＬ５１２０−００８３）１００μＬを各ウェルに加えた。反応を、２分間のインキュベーションの後、５０μＬの１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を加えることにより停止させ、光学吸光度を４５０ｎＭで読み取った。
【０１１５】
インテグリンα４β７−ＭＡｄＣＡＭ細胞接着アッセイ
ＲＰＭＩ８８６６ヒト細胞（Ｓｉｇｍａ＃９５０４１３１６）を、１０％ＦＢＳ（Ｓｅｒａｄｉｇｍ）と１％ペニシリン−ストレプトマイシンとを補充したＲＰＭＩ１６４０培地（ＨｙＣｌｏｎｅ  ＳＨ３００２７．１）中で培養した。９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、３６０３）の各ウェルを、コーティング緩衝液（５０ｍＭの炭酸ナトリウム、ｐＨ９．６）中の０．２５μｇ／ｍＬのヒト組換えＭＡｄＣＡＭ−１Ｆｃ  Ｃｈｉｍｅｒａ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，６０５６−ＭＣ−０５０）の溶液１００ｍＬでコーティングした。プレートを４℃で終夜インキュベートし、１ウェルあたり１５０μＬの洗浄緩衝液（ＰＢＳ中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で２回洗浄し、１ウェルあたり２５０μＬのブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中の１％脱脂粉乳）でブロックし、室温で２時間インキュベートした。ＲＰＭＩ８８６６細胞を、５ｍＭカルセイン含有ＰＢＳに１０百万細胞／ｍＬで再懸濁し、５０ｍＬチューブ中で３７℃にて３０分間インキュベートした。ＰＢＳをチューブに満たし、細胞を沈降させＲＰＭＩ１６４０培地中で２百万／ｍＬに再懸濁した。化合物を、結合緩衝液（１．５ｍＭのＣａＣｌ２、０．５ｍＭのＭｎＣＩ２、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）での段階希釈によって２×濃度で１ウェルあたり５０μＬの最終量に希釈した。プレートを３００μＬのＰＢＳで１回洗浄し、５０μＬの化合物と５０μＬの細胞（１００，０００細胞）とを各ウェルに移し、プレートを３７℃にて、５％ＣＯ２の暗所で４５分間インキュベートして、細胞接着させた。プレートを、紙タオルの上で反転させ拭き取ることにより空にし、ＰＢＳを用いて２回手動で洗浄した。１００μＬのＰＢＳを次いで各ウェルに加えた。蛍光を、プレートリーダー（Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  １０００）を使用して読み取った（Ｅｘ４９５／Ｅｍ５１５）。用量反応を算出するために、細胞を含まない対照ウェルの蛍光値を各テストウェルから引いた。
【０１１６】
インテグリンα４β１−ＶＣＡＭ細胞接着アッセイ
ＲＡＭＯＳヒト細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５９６）を、１０％ＦＢＳ（Ｓｅｒａｄｉｇｍ）と１％ペニシリン−ストレプトマイシンとを補充したＲＰＭＩ１６４０培地（ＨｙＣｌｏｎｅ  ＳＨ３００２７．１）中で培養した。９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、３６０３）の各ウェルを、コーティング緩衝液（５０ｍＭの炭酸ナトリウム、ｐＨ９．６）中の０．２５μｇ／ｍＬの組換えヒトＶＣＡＭ−１Ｆｃ  Ｃｈｉｍｅｒａ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、８６２−ＶＣ−１００）の溶液１００ｍＬでコーティングした。プレートを４℃で終夜インキュベートし、１ウェルあたり１５０μＬの洗浄緩衝液（ＰＢＳ中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で２回洗浄し、１ウェルあたり２５０μＬのブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中の１％脱脂粉乳）でブロックし、室温で１時間インキュベートした。ブロッキングステップの間、ＲＡＭＯＳ細胞を、５ｍＭカルセイン含有ＰＢＳに１０百万細胞／ｍＬで再懸濁し、５０ｍＬチューブ中で３７℃にて３０分間インキュベートした。チューブにＰＢＳを満たし、細胞を沈降させ、次いでＲＰＭＩ１６４０培地中で２百万／ｍＬに再懸濁した。化合物を、結合緩衝液（１．５ｍＭのＣａＣｌ２、０．５ｍＭのＭｎＣＩ２、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）での段階希釈によって２×濃度で１ウェルあたり５０μＬの最終量に希釈した。プレートを３００μＬのＰＢＳで１回洗浄し、５０μＬの化合物と５０μＬの細胞（１００，０００細胞）とを各ウェルに移し、プレートを３７℃にて、５％ＣＯ２の暗所で４５分間インキュベートして、細胞接着させた。プレートを、紙タオルの上で反転させ拭き取ることにより空にし、ＰＢＳを用いて２回手動で洗浄した。最終洗浄の後、１００μＬのＰＢＳをウェルに加え、蛍光を、プレートリーダー（Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  １０００）を使用して読み取った（Ｅｘ４９５／Ｅｍ５１５）。用量反応を算出するために、細胞を含まない対照ウェルの蛍光値を各テストウェルから引いた。
【０１１７】
ＣＤ４＋インテグリンα４＋β７−ｌｏメモリーＴ細胞における分析物競合アッセイ
一次細胞における受容体占有率を、フローサイトメトリーを用いて選択した細胞集団に結合したビオチン化ヒト組換えＭＡｄＣＡＭ−１−ＦＣまたはヒト組換えＶＣＡＭ−１−Ｆｃの量を測定することによって決定した。ヒト組換えＭＡｄＣＡＭ−１−ＦＣまたはヒト組換えＶＣＡＭ−１−ＦＣ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を、市販の試薬およびプロトコル（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用してビオチン化した。
【０１１８】
全血を、ヒトドナーからナトリウムヘパリンチューブに採取した。１００μＬ量の血液を化合物および４ｍＭのＭｎＣｌ２と室温で１時間インキュベートした。細胞を、１ｍＬのカルシウム・マグネシウムを含まない（ＣＭＦ）ＤＰＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で２回洗浄し、１００μＬのＤＰＢＳ  ＣＭＦに再懸濁した。
【０１１９】
ビオチン化ヒト組換えＭＡｄＣＡＭ−１−ＦｃまたはＶＣＡＭ−１−Ｆｃを飽和濃度で加え、室温で１時間インキュベートした。２ｍＬ量の１ＸＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｌｙｓｅ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を次いで加え、混合物を暗所で室温にて８〜１２分間インキュベートして、赤血球を溶解した。細胞を１ｍＬの染色緩衝液ＦＢＳ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で洗浄し、４ｍＭのＭｎＣｌ２を含有する１００μＬの染色緩衝液−ＦＢＳ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に再懸濁した。ビオチン化−ｒｈＭＡｄＣＡＭ−１を、試験物と結合を競合するために１２００の飽和濃度で適用し、室温で１時間インキュベートした。細胞を次いで１ｍＬの染色緩衝液−ＦＢＳで洗浄し、１００μＬの染色緩衝液−ＦＢＳに再懸濁した。細胞を、１ｕＬのストレプトアビジンＡＰＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  ０．２ｍｇ／ｍＬ）およびメモリーＴヘルパーα４β７−陽性細胞サブセットの検出用抗体のパネルと暗所で室温にて３０分間インキュベートした。および以下の抗体を各５．０μＬの量で用いた；ＣＤ４５  ＦＩＴＣ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  ２００μｇ／ｍＬ）、ＣＤ２９  ＡＰＣ  Ｃｙ７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  １００μｇ／ｍＬ）、Ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｂｅｔａ７  ＰＥ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  濃度５０μｇ／ｍＬ）、ＣＤ４９ｄ  Ｖ４２１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  ５０μｇ／ｍＬ）、ＣＤ３  Ｖ５１０（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  ３０μｇ／ｍＬ）、ＣＤ４  ＰＥＣｙ７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  １００μｇ／ｍＬ）、ＣＤ４５ＲＯ  ＰｅｒＣＰ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  ２００μｇ／ｍＬ）。細胞を次いで、フローサイトメーター（ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）フローサイトメーターおよびＢＤＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）ソフトウェア）でのデータ取得のために染色緩衝液−ＦＢＳで洗浄し、１５０μＬの染色緩衝液−ＦＢＳに再懸濁した。ＦＡＣＳデータを、前方散乱対側方散乱に基づく電子ゲーティングによって取得した。サイトメーターを、各チューブ内で２０，０００イベントを収集するように設定した。細胞集団を、次のマーカー（ＣＤ４５＋、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ４９ｄ＋、インテグリンｂ７、ビオチン化リガンド）を用いて、決定した。
【０１２０】
化合物受容体占有率を、ビオチン化ｒｈＭＡｄＣＡＭ−１またはｒｈＶＣＡＭ−１にそれぞれ結合するインテグリンβ７＋細胞またはインテグリンβ７−ｌｏ細胞の数の減少として定義した。
【０１２１】
受容体占有率を、以下の式で算出した：１００−（（％リガンド−化合物を含む陽性細胞／％リガンド−陽性細胞ＤＭＳＯ）×１００）。
【０１２２】
大腸炎のマウスモデルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏのＴリンパ球輸送の分析
動物の飼育：使用した動物飼育施設は、Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｏｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ（ＣＣＡＣ）によって認定されている。本研究は、認定されたＡｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって認可され、研究のための動物の使用を管理するＣＡＣＣ基準および規則を遵守した。動物を、標準化された環境条件下で飼育した。標準認定された市販の齧歯動物用飼料を自由摂取させた。水道水を常に自由摂取させた。
【０１２３】
デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）を、飲料水に３％を添加することによって５日間、Ｃ５７Ｂ１／６雌マウスに投与した。投与前にＤＳＳ−処置動物を均一の群に割り当てるために、５日目に体重および疾患活動指数（「ＤＡＩ」）を測定した。ＤＡＩを、大腸炎に関連する次の３つの特定症状の重症度に基づいてスコア化した：１−血便（ヘモカルト陰性、ヘモカルト陽性、便中に目に見える血痕、直腸出血）；２−便粘度（正常、柔らかいが依然として形成される、非常に柔らかい、下痢）；３−体重減少。
【０１２４】
６日目〜９日目に、化合物番号５１７（ＥＴ０３７６４）またはビヒクルを５ｍＬ／ｋｇで毎日経口投与した。９日目に、投与の４時間後、動物を全身麻酔下で心臓穿刺によって安楽死させた。腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）を採取し、すりつぶし、ＨＢＳＳ−ＦＣＳで洗浄した。細胞をＢＤマウスＦｃＢｌｏｃｋ中で１５分間インキュベートし、続いて特異抗体と３０分間インキュベートした。洗浄後、細胞を、ＢＤ固定溶液を用いて固定したか、細胞表面マーカー染色のために即時処理した。使用した抗体は、以下の通りであった：ＣＤ４  ＰＥ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ４４  ＦＩＴＣ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ４５ＲＢ  ＰｅｒＣｙ  ５．５（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ａ４ｂ７  ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。細胞集団を次いで、ＦＡＣＳＣａｎｔｏサイトメーターを使用しＣＤ４＋、ＣＤ４４ｈｉ、ＣＤ４５ＲＢｌｏｗ、α４β７＋のゲーティングによって分析した。
【０１２５】
統計分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して行った。群間の差を、９５％信頼区間で二元配置分散分析によって評価した。
【０１２６】
結果および考察
化合物を上述の方法に従って合成した。選択した化合物を、ＮＭＲを使用して特徴づけた（すべてのデータが示されているわけではない）。ＮＭＲデータのサブセットを、化合物番号３９０に関して図６に示す。
【０１２７】
インテグリンα４β７およびα４β１に対する化合物の結合親和性と選択性
単量体化合物および二量体化合物のα４β７への結合効力を、一連の生化学的アッセイ、細胞ベースアッセイおよびｅｘ−ｖｉｖｏアッセイを用いて測定した。多量体化合物は、細胞アッセイにおいて全般的に効力が高かった。
【０１２８】
インテグリンα４β７を発現するＲＰＭＩ８８６６細胞のＭＡｄＣＡＭ−１でコーティングされたプレートへの接着を阻止する、試験物の能力を測定した。多量体化合物は、細胞接着を阻害するその能力において、それらの構成単量体よりも全般的に効力が高かった。例えば、化合物番号３４０（ＥＴ２４５１）および化合物番号４５６（ＥＴ４０６２）は、ＲＰＭＩ８８６６細胞接着アッセイにおいてそれぞれ１７５ｎＭおよび１９９ｎＭのＩＣ５０を有した（表１Ｃおよび１Ｃ’）。その構成単量体化合物よりも１０倍を超える高い効力を有する多量体化合物が生成された。例えば、化合物番号３４０（ＥＴ２４５１）のホモ二量体である化合物番号５１７（ＥＴ３７６４）は、ＲＰＭＩ８８６６細胞接着アッセイにおいて９．９ｎＭのＩＣ５０を有した。単量体化合物４５６（ＥＴ４０６２）から生成された化合物多量体も、より高い結合親和性を示した（表２Ｃ）。
【０１２９】
同様の結果が、ヒト全血におけるインテグリンα４β７への結合についてのリガンド競合アッセイにおいて得られた。ナセリンの受容体占有率を、フローサイトメトリーを使用して、ビオチン化ｒｈＭＡｄＣＡＭ−１を結合できるα４β７＋メモリーＴヘルパー細胞の比率を測定することにより決定した（図７）。多量体化合物は、単量体化合物よりも高い効力で、α４β７−陽性一次細胞上でＭａｄＣＡＭ−１と競合できた。２つの一般的な単量体化学型は、種々のリンカーを用いて多量体化されると、インテグリンα４β７への結合の増大した効力を有し、より効果的に競合することを示した。例えば、二量体化合物番号５３４（ＥＴ４１１３）および５３５（ＥＴ４１１０）はそれぞれ３８ｎＭと７６ｎＭのＩＣ５０を示したが、対応する親単量体化合物番号４５６（ＥＴ４０６２）は１０００ｎＭの最大濃度で１５％の受容体占有率に達しただけであった。同様に、二量体化合物番号５１７（ＥＴ３７６４）および３９０（ＥＴ３７５５）は、飽和量のＭＡｄＣＡＭと競合し、同じ試験内でそれぞれ３８ｎＭと９０ｎＭのＥＣ５０を有した。対応する単量体化合物３４０（ＥＴ２４５１）は低濃度で５０％の受容体占有率に達したが、濃度−反応曲線を得られなかった。これは、細胞への単量体化合物の非特異的結合の結果であり得る。
【０１３０】
興味深いことに、単量体化合物と多量体化合物の間の結合親和性の相違は、ＥＬＩＳＡ結合アッセイにおいて顕著でなかった。結合活性が細胞において多量体化合物の結合効力を高める可能性がある。
【０１３１】
多量体化合物は、インテグリンα４β１よりもインテグリンα４β７に対し向上された選択性を示した。細胞アッセイにおいて化合物の選択性を決定するために、インテグリンα４β１を発現するＲａｍｏｓ細胞のＶＣＡＭコーティングプレートへの接着を測定した。多量体化合物は全般的に、その単量体構成物よりも、インテグリンα４β１よりインテグリンα４β７に対しより高い選択性を有した。例えば、単量体化合物番号３４０（ＥＴ２４５１）および４５６（ＥＴ４０６２）は、α４β７対α４β１で細胞接着アッセイを比較すると、それぞれ１６倍と４５倍の選択性を示した。対照的に、単量体化合物番号３４０（ＥＴ２４５１）に基づく多量体化合物は、α４β７を優先する２０倍〜１００倍の選択性を示し、単量体化合物番号４５６（ＥＴ４０６２）に基づく多量体化合物は、Ｒａｍｏｓ細胞を発現するα４β１のＶＣＡＭへの接着に対して測定可能な効果を示さなかった（表２Ｃ）。
【０１３２】
ｉｎ  ｖｉｖｏのＴリンパ球輸送の分析
Ｔリンパ球を発現するインテグリンα４β７の輸送を軽減するいくつかのインテグリンα４β７阻害化合物の能力を、ＤＳＳ処置マウスでのｉｎ  ｖｉｖｏ薬力学試験において示した。デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）は、実験動物において、飲料水中で５日間、経口投与し、続いてＤＳＳを含まない飲料水を摂取させると、慢性大腸炎を誘発する。慢性炎症は、血液から腸組織への白血球の浸潤を伴う。腸の内皮上でのインテグリンα４β７とＭＡｄＣＡＭ−１の間の相互作用は、接着と腸へのＴ細胞の輸送を可能にする。Ｔリンパ球を発現するインテグリンα４β７の輸送を軽減するいくつかのインテグリンα４β７阻害ナセリンの能力を、ＤＳＳ処置マウスでのｉｎ  ｖｉｖｏ薬力学試験において示した。
【０１３３】
試験は、飲料水中の硫酸デキストランにマウスを５日間曝すことで行った。６日目〜９日目に、化合物またはビヒクルを毎日経口投与した。腸間膜リンパ節を最後の投与の４時間後に採取し、評価した。図８に示すように、化合物番号５１７（ＥＴ３７６４）は、腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）におけるインテグリンα４β７＋Ｔヘルパーメモリーリンパ球の検出を減少させた。８０ｍｇ／ｋｇの用量で投与された化合物番号５１７は、α４β７＋陽性リンパ球の数を６０％減少させた。
【０１３４】
ＤＳＳ処置マウスの腸間膜リンパ節で検出されたα４β７＋Ｔヘルパーメモリーリンパ球の減少レベルは、投与された化合物番号５１７の用量に依存したことを決定した。図９は、腸間膜リンパ節に存在するα４β７＋Ｔ細胞の用量依存的減少を示す。
【０１３５】
標識ヒト組換えＭＡＤＣＡＭ−１またはＶＣＡＭのそれぞれα４β７−陽性またはα４β７−陰性Ｔｈメモリー細胞への結合を阻害する化合物の能力を比較した。単一ドナー由来の全血を、化合物および飽和量の組換えリガンドとインキュベートした。ＭＡｄＣＡＭまたはＶＣＡＭ結合の阻害を、ＦＡＣＳ分析を使用してＴ細胞サブセット上で測定した。図１０に示すように、代表的な多量体化合物番号５１７、４８２、５３０および５３４は、一次細胞へのＭＡｄＣＡＭ−１の結合を８７ｎＭ〜１４１ｎＭの範囲のＩＣ５０値で阻害した。同じ代表的な化合物は、６００ｎＭ〜４０００ｎＭでの検出不可能な結合の範囲のＩＣ５０値で、低親和性にてＶＣＡＭに結合した（図１１）。
【０１３６】
本発明の好ましい実施形態が本明細書に記述されているが、本発明の趣旨または添付の特許請求の範囲から逸脱することなく変更がなされ得ることを当業者には理解されよう。以下の参照リストに記載のものを含み、本明細書に開示されるすべての文書は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３７】
【表２】
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【０１３８】
【表３】
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【０１３９】
【表４】
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【０１４０】
【表５】
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【０１４１】
【表６】
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【０１４２】
【表７】
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【０１４３】
【表８】
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【０１４４】
【表９】
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【０１４５】
【表１０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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