(57)【要約】本開示は、オリゴ糖転移酵素ポリペプチド及び細菌細胞での複合糖質の合成におけるそれらの使用、当該複合糖質を含むワクチン及び免疫原性組成物ならびに細菌感染症の予防及び／または治療における当該ワクチン及び免疫原性組成物の使用に関する。当該オリゴ糖転移酵素ポリペプチドを含む細菌発現系も開示される。【選択図】図１Ａ
2020513803.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）配列番号１もしくは配列番号２に示される、オリゴ糖転移酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、または
ｉｉ）配列番号１もしくは配列番号２に示されるヌクレオチド配列に対して縮重し、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、または
ｉｉｉ）オリゴ糖転移酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記ヌクレオチド配列が、配列番号１に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９７％の同一性を有する、前記核酸分子、または
ｉｖ）オリゴ糖転移酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記ヌクレオチド配列が、配列番号２に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７７％の同一性を有する、前記核酸分子
を含む転写カセットであって、
前記核酸分子が、細菌宿主細胞における発現に適したプロモーターに動作可能なように連結される、前記転写カセット。
【請求項２】
前記核酸分子が、配列番号１に示されるヌクレオチド配列に対して９８％または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の転写カセット。
【請求項３】
前記核酸分子が、配列番号２に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の転写カセット。
【請求項４】
前記転写カセットが、担体ポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含み、前記担体ポリペプチドが、前記オリゴ糖転移酵素のための１つまたは複数の糖鎖付加モチーフを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の転写カセット。
【請求項５】
前記転写カセットが、異種グリカン抗原の合成に必要な１つまたは複数のポリペプチドを含む生合成遺伝子座をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子をさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の転写カセット。
【請求項６】
前記オリゴ糖転移酵素及び／または前記担体ポリペプチド及び／または生合成遺伝子座が、制御可能なプロモーターに動作可能なように連結されることで、前記ポリペプチドをコードするそれぞれまたはすべての核酸分子の発現が制御される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の転写カセット。
【請求項７】
前記プロモーターが、リボソーム結合部位に動作可能なようにさらに連結され、前記リボソーム結合部位の３’プライム末端と、前記オリゴ糖転移酵素をコードする前記核酸分子の５’開始コドンと、の間にヌクレオチドスペーサー配列が設けられ、前記オリゴ糖転移酵素をコードする前記核酸分子からの翻訳が、前記ヌクレオチドスペーサー配列を含まない、前記組換えポリペプチドをコードする対照核酸分子と比較すると低減される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の転写カセット。
【請求項８】
前記プロモーターが、リボソーム結合部位に動作可能なようにさらに連結され、前記リボソーム結合部位の３’プライム末端と、前記担体ポリペプチドをコードする前記核酸分子の５’開始コドンと、の間にヌクレオチドスペーサー配列が設けられ、前記担体ポリペプチドをコードする前記核酸分子からの翻訳が、前記ヌクレオチドスペーサー配列を含まない、前記組換えポリペプチドをコードする対照核酸分子と比較すると低減される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の転写カセット。
【請求項９】
前記プロモーターが、リボソーム結合部位に動作可能なようにさらに連結され、前記リボソーム結合部位の３’プライム末端と、異種グリカン抗原の合成に必要な前記１つまたは複数のポリペプチドをコードする前記核酸分子の５’開始コドンと、の間にヌクレオチドスペーサー配列が設けられ、前記生合成遺伝子座をコードする前記核酸分子からの翻訳が、前記ヌクレオチドスペーサー配列を含まない、前記組換えポリペプチドをコードする対照核酸分子と比較すると低減される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の転写カセット。
【請求項１０】
前記担体ポリペプチドが、Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒであって、ここでＸはプロリンを除く任意のアミノ酸である、アミノ酸モチーフを含む、請求項４〜９のいずれか１項に記載の転写カセット。
【請求項１１】
前記担体ポリペプチドが、Ｄ／Ｅ−Ｘ−Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔであって、ここでＸはプロリンを除く任意のアミノ酸である、アミノ酸モチーフを含む、請求項１０に記載の転写カセット。
【請求項１２】
前記異種グリカン抗原が、七糖である、請求項５〜１１のいずれか１項に記載の転写カセット。
【請求項１３】
前記生合成遺伝子座が、Ｐｇｌ遺伝子座である、請求項５〜１２のいずれか１項に記載の転写カセット。
【請求項１４】
前記Ｐｇｌ遺伝子座が、ＰｇｌＧと、ＰｇｌＦと、ＰｇｌＥと、任意選択のＣｊ１１２２ｃと、ＰｇｌＤと、ＰｇｌＣと、ＰｇｌＡと、ＰｇｌＪと、ＰｇｌＩと、ＰｇｌＨと、ＰｇｌＫと、からなる群から選択される前記１つまたは複数のポリペプチドをコードする遺伝子を含む、請求項１３に記載の転写カセット。
【請求項１５】
異種グリカン抗原の合成に必要な１つまたは複数のポリペプチドをコードする前記核酸分子が、配列番号１０に示されるヌクレオチド配列を含み、前記配列番号１０が、配列番号１８に示されるＰｇｌＢの機能性バージョンを含まない、請求項１３または請求項１４に記載の転写カセット。
【請求項１６】
前記ヌクレオチドスペーサー配列が、少なくとも１３ヌクレオチドの長さを有する、請求項７〜１５のいずれか１項に記載の転写カセット。
【請求項１７】
前記ヌクレオチドスペーサー配列が、１３〜４０ヌクレオチドの長さを有する、請求項１６に記載の転写カセット。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の転写カセットを含む、ベクター。
【請求項１９】
前記ベクターが、プラスミドである、請求項１８に記載のベクター。
【請求項２０】
前記ベクターが、トランスポゾンである、請求項１８に記載のベクター。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載の転写カセットまたはベクターで遺伝子改変された、細菌細胞。
【請求項２２】
前記オリゴ糖転移酵素をコードする前記核酸分子が、前記細菌細胞のゲノムに安定的に組み込まれる、請求項２１に記載の細菌細胞。
【請求項２３】
前記担体ポリペプチドをコードする前記核酸分子が、前記細菌細胞のゲノムに安定的に組み込まれる、請求項２１または請求項２２に記載の細菌細胞。
【請求項２４】
前記生合成遺伝子座をコードする前記核酸分子が、前記細菌細胞のゲノムに安定的に組み込まれる、請求項２１〜請求項２３のいずれか１項に記載の細菌細胞。
【請求項２５】
前記細菌細胞が、非ヒト病原体である、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の細菌細胞。
【請求項２６】
前記細菌細胞が、人畜共通感染性細菌種である、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の細菌細胞。
【請求項２７】
請求項２１〜２６のいずれか１項に記載の遺伝子改変細菌細胞を含む、細菌細胞培養物。
【請求項２８】
ｉ）配列番号１もしくは配列番号２に示される、オリゴ糖転移酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、または
ｉｉ）配列番号１もしくは配列番号２に示されるヌクレオチド配列に対して縮重し、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、または
ｉｉｉ）オリゴ糖転移酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記ヌクレオチド配列が、配列番号１に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９７％の同一性を有する、前記核酸分子、
ｉｖ）オリゴ糖転移酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記ヌクレオチド配列が、配列番号２に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７７％の同一性を有する、前記核酸分子
からなる群から選択されるオリゴ糖転移酵素ポリペプチドであって、
前記オリゴ糖転移酵素が、少なくとも１つの担体ポリペプチドへの１つまたは複数の異種グリカンの転移において使用するためものものである、前記オリゴ糖転移酵素ポリペプチド。
【請求項２９】
前記使用が、微生物宿主細胞におけるものであり、前記オリゴ糖転移酵素ポリペプチドが、前記微生物宿主細胞に形質転換される、請求項２８に記載の使用。
【請求項３０】
１つまたは複数の複合糖質の生成において使用するための、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の転写カセットまたはベクター。
【請求項３１】
１つまたは複数の複合糖質を生成させるためのプロセスであって、前記プロセスが、
ｉ）請求項２７に記載の細菌細胞培養物を得ること、
ｉｉ）細胞培養条件を得ること、及び任意選択で、
ｉｉｉ）前記細菌細胞または細胞培地から１つまたは複数の複合糖質を単離すること、
を含む、前記プロセス。
【請求項３２】
請求項２７に記載の細菌細胞培養物を含む、細胞培養容器。
【請求項３３】
配列番号３に示されるアミノ酸配列またはその多型配列変異体を含むオリゴ糖転移酵素ポリペプチドであって、前記アミノ酸配列が、少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失または置換によって改変され、前記改変ポリペプチドが、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む未改変のオリゴ糖転移酵素ポリペプチドと比較すると、基質特異性が変化しており、及び／またはオリゴ糖転移酵素活性が増加している、前記オリゴ糖転移酵素ポリペプチド。
【請求項３４】
前記改変が、配列番号３に示されるアミノ酸残基８６及び／またはアミノ酸残基２９３及び／またはアミノ酸残基３１６からなる群から選択されるアミノ酸残基のうちの１つまたは複数の欠失または置換である、請求項３３に記載のオリゴ糖転移酵素ポリペプチド。
【請求項３５】
前記改変が、アミノ酸置換であり、前記置換が、配列番号３に示されるアミノ酸残基８６に対するものであり、アミノ酸残基セリンがアミノ酸残基アルギニンで置換される、請求項３３または請求項３４に記載のオリゴ糖転移酵素ポリペプチド。
【請求項３６】
前記改変が、アミノ酸置換であり、前記置換が、配列番号３に示されるアミノ酸残基２９３に対するものであり、アミノ酸残基アスパラギンがアミノ酸残基プロリンで置換される、請求項３３〜３５のいずれか１項に記載のオリゴ糖転移酵素ポリペプチド。
【請求項３７】
前記改変が、アミノ酸置換であり、前記置換が、配列番号３に示されるアミノ酸残基３１６に対するものであり、アミノ酸残基アスパラギンがアミノ酸残基バリンで置換される、請求項３３〜３６のいずれか１項に記載のオリゴ糖転移酵素ポリペプチド。
【請求項３８】
前記改変ポリペプチドまたは多型配列変異体が、配列番号４３に示されるアミノ酸配列を含む、請求項３３に記載のオリゴ糖転移酵素ポリペプチド。
【請求項３９】
請求項３３〜３８のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする、核酸分子。
【請求項４０】
前記核酸分子が、配列番号４３に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項３９に記載の核酸分子。
【請求項４１】
前記単離核酸分子が、
ｉ）配列番号４２に示されるヌクレオチド配列を含むか、または前記ヌクレオチド配列からなる核酸分子と、
ｉｉ）配列番号４２に示されるヌクレオチド配列に対して縮重するヌクレオチド配列を含むか、または前記ヌクレオチド配列からなり、請求項３３〜３８のいずれか１項に記載の改変アミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子と、
からなる群から選択される、請求項４０に記載の核酸分子。
【請求項４２】
前記核酸分子が、配列番号４２に示されるヌクレオチド配列を含むか、または前記ヌクレオチド配列からなる、請求項４１に記載の核酸分子。
【請求項４３】
前記核酸分子が、転写カセットの一部である、請求項４１〜４３のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項４４】
請求項３９〜４３のいずれか１項に記載の核酸分子または転写カセットを含む、ベクター。
【請求項４５】
前記ベクターが、発現ベクターである、請求項４４に記載のベクター。
【請求項４６】
前記ベクターが、トランスポゾンである、請求項４４または請求項４５に記載のベクター。
【請求項４７】
請求項３９〜４６のいずれか１項に記載の核酸分子または発現ベクターで形質転換または遺伝子導入された、細胞。
【請求項４８】
前記細胞が、微生物細胞である、請求項４７に記載の細胞。
【請求項４９】
前記細胞が、細菌細胞である、請求項４８に記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、オリゴ糖転移酵素ポリペプチド及び細菌細胞における複合糖質の合成におけるその使用と、当該複合糖質を含むワクチン及び免疫原性組成物ならびに細菌感染症の予防及び／または治療におけるそれらの使用とに関する。当該オリゴ糖転移酵素を含む細菌発現系も開示される。未改変のオリゴ糖転移酵素ポリペプチドと比較して、グリカン特異性が変化しており、及び／または酵素活性が増強している改変オリゴ糖転移酵素ポリペプチドも開示する。
【背景技術】
【０００２】
グリカン抗原を含むワクチンまたは免疫原性組成物は、さまざまな病原性細菌に対する防御をもたらすための特異的抗体の産生を誘導することができる。サブユニットワクチンは、典型的には、不活化または弱毒化された病原体よりも好まれ、この理由は、サブユニットワクチンの示す副作用が、多くの場合でより弱いことによるものであるが、サブユニットワクチンの免疫原性は低いことが多く、典型的には、メモリーＢ細胞応答を十分に生成することができない。多糖抗原をタンパク質担体に結合させて複合糖質を生成すると、免疫原性が著しく増加することが知られている。現在認可されているヒト複合糖質ワクチンには、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａに対するものが含まれる。
【０００３】
複合糖質ワクチンの開発及び化学合成は、手間と費用がかかり、天然の病原体からの多糖グリカンの精製及び適切なタンパク質担体への当該糖の化学的結合を含めて、いくつかのステップを必要とするものである。多くの場合、有機系を使用することは、複合糖質のより迅速かつ経済的な製造方法である。Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉは、リポオリゴ糖及びＮ結合型糖タンパク質の合成に関与する遺伝子クラスターを有しており、この遺伝子クラスターは、３０を超えるタンパク質の糖鎖付加に関与する。Ｃ．ｊｅｊｕｎｉにおいて同定されたオリゴ糖転移酵素であるＰｇｌＢは、グリカンのタンパク質アクセプタータンパク質及び遺伝子クラスターの一部への転移に関与する酵素であり、種とは無関係なさまざまな異なるタンパク質アクセプターへのグリカンの転移を触媒することも明らかとなっている。
【０００４】
ＰｇｌＢ、担体ポリペプチド、及び抗原性の糖を利用するＥ．ｃｏｌｉなどの細菌系における複合糖質ワクチンの生産は、ＷＯ２００９／１０４０７４において開示されている。ＷＯ２０１４／１１１７２４では、グリカン転移能を有する関連種であるＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｕｔｏｒｕｍから単離されたさらなるオリゴ糖転移酵素が開示されている。
【０００５】
細菌発現系において複合糖質を生産するには、アクセプタータンパク質、多糖生合成遺伝子座、及びオリゴ糖転移酵素という３つの遺伝子［「トリプラスミド」］を同時発現させることが必要である。ＷＯ２０１４／１１１７２４では、複合糖質を適正なレベルで生成させるための転移因子を使用して、アクセプタータンパク質をコードする遺伝子、グリカン生合成遺伝子座をコードする遺伝子、及びオリゴ糖転移酵素をコードする遺伝子を細菌ゲノムに安定的に組み込む方法が開示されている。
【０００６】
本開示は、密接な相同性を有するオリゴ糖転移酵素と比較した場合にグリカン転移活性が増強された、ＷＯ２０１４／１１１７２４に開示されるオリゴ糖転移酵素と配列が密接に関連する代替のＣ．ｓｐｕｔｏｒｕｍオリゴ糖転移酵素の同定に関する。さらに、オリゴ糖転移酵素、毒性担体タンパク質、またはグリカン生合成に必要なタンパク質をコードする遺伝子を含む翻訳効率が低下した組換え発現系も開示される。リボソーム結合部位［ＲＢＳ］と翻訳開始コドンとの間の距離を長くしたベクターを提供することによって翻訳効率が低下し、それによって、細菌の高密度増殖が可能となり、発現する組換えタンパク質が細菌細胞に毒性を示す濃度で組換えタンパク質を発現させる有害な作用が回避される。さらに、本開示は、未改変のオリゴ糖転移酵素ポリペプチドと比較した場合に、グリカン特異性及び／または酵素活性が変化した改変オリゴ糖転移酵素ポリペプチドの特徴付けに関する。
【発明の概要】
【０００７】
本発明の態様によれば、転写カセットが提供され、当該転写カセットは、
ｉ）配列番号１もしくは配列番号２に示される、オリゴ糖転移酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、または
ｉｉ）配列番号１もしくは配列番号２に示されるヌクレオチド配列に縮重し、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、または
ｉｉｉ）オリゴ糖転移酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、当該ヌクレオチド配列が、配列番号１に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９７％の同一性を有する、当該核酸分子、または
ｉｖ）オリゴ糖転移酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、当該ヌクレオチド配列が、配列番号２に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７７％の同一性を有する、当該核酸分子
を含み、
当該核酸分子は、細菌宿主細胞における発現に適したプロモーターに動作可能なように連結される。
【０００８】
本発明の好ましい実施形態では、当該核酸分子は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列に対して９８％または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【０００９】
本発明の代替の実施形態では、当該核酸分子は、配列番号２に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００１０】
本発明の好ましい実施形態では、オリゴ糖転移酵素をコードする核酸分子を含む転写カセットが提供され、当該オリゴ糖転移酵素は、配列番号３に示されるアミノ酸配列に対して９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００１１】
好ましくは、当該オリゴ糖転移酵素は、配列番号３に示されるアミノ酸配列に対して９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００１２】
本発明の好ましい実施形態では、当該転写カセットは、担体ポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含み、当該担体ポリペプチドは、当該オリゴ糖転移酵素のための１つまたは複数の糖鎖付加モチーフを含む。
【００１３】
本発明の別の好ましい実施形態では、当該転写カセットは、異種グリカン抗原の合成に必要な１つまたは複数のポリペプチドを含む生合成遺伝子座をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を、追加で含むか、または代替的に含む。
【００１４】
本発明の好ましい実施形態では、当該オリゴ糖転移酵素及び／または当該担体ポリペプチド及び／または生合成遺伝子座は、制御可能なプロモーターに動作可能なように連結されることで、当該ポリペプチドをコードするそれぞれまたはすべての核酸分子の発現が制御される。
【００１５】
本発明の好ましい実施形態では、異種グリカン抗原の合成に必要な当該１つまたは複数のポリペプチドは、１つまたは複数の制御可能なプロモーターに動作可能なように連結されることで、当該ポリペプチドをコードするそれぞれまたはすべての核酸分子の発現が制御される。
【００１６】
本発明の好ましい実施形態では、当該プロモーターは、誘導物質に応じて発現を制御する誘導性ヌクレオチド要素を含む。
【００１７】
本発明の代替の実施形態では、当該プロモーターは、リプレッサーに応じて発現を制御する抑制性ヌクレオチド要素を含む。
【００１８】
本発明の好ましい実施形態では、当該プロモーターは、リボソーム結合部位に動作可能なようにさらに連結され、当該リボソーム結合部位の３’プライム末端と、当該オリゴ糖転移酵素をコードする核酸分子の５’開始コドンと、の間にヌクレオチドスペーサー配列が設けられ、当該オリゴ糖転移酵素をコードする核酸分子からの翻訳は、当該ヌクレオチドスペーサー配列を含まない、当該組換えポリペプチドをコードする対照核酸分子と比較すると低減される。
【００１９】
別の好ましい実施形態では、当該オリゴ糖転移酵素は、配列番号１、配列番号２、または配列番号１８に示される配列を含む。
【００２０】
本発明の好ましい実施形態では、当該プロモーターは、リボソーム結合部位に動作可能なようにさらに連結され、当該リボソーム結合部位の３’プライム末端と、当該担体ポリペプチドをコードする核酸分子の５’開始コドンと、の間にヌクレオチドスペーサー配列が設けられ、当該担体ポリペプチドをコードする核酸分子からの翻訳は、当該ヌクレオチドスペーサー配列を含まない、当該組換えポリペプチドをコードする対照核酸分子と比較すると低減される。
【００２１】
本発明の好ましい実施形態では、当該担体ポリペプチドは、Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒであって、ここでＸは、プロリンを除く任意のアミノ酸である、アミノ酸モチーフを含む。
【００２２】
本発明の代替の実施形態では、当該担体ポリペプチドは、Ｄ／Ｅ−Ｘ−Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔであって、ここでＸは、プロリンを除く任意のアミノ酸である、アミノ酸モチーフを含む。
【００２３】
本発明の代替の好ましい実施形態では、当該担体ポリペプチドは、Ｄ／Ｅ−Ｘ−Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔであって、ここでＸは、プロリンを除く任意のアミノ酸である、アミノ酸モチーフを含み、このアミノ酸モチーフは、ＤＶＮＶＴ（配列番号１９）、ＥＶＮＡＴ（配列番号２０）、ＤＱＮＡＴ（配列番号２１）、ＤＮＮＮＴ（配列番号２２）、ＤＮＮＮＳ（配列番号２３）、ＤＱＮＲＴ（配列番号２４）、ＥＮＮＦＴ（配列番号２５）、ＤＳＮＳＴ（配列番号２６）、ＤＱＮＩＳ（配列番号２７）、ＤＱＮＶＳ（配列番号２８）、ＤＮＮＶＳ（配列番号２９）、ＤＹＮＶＳ（配列番号３０）、ＤＦＮＶＳ（配列番号３１）、ＤＦＮＡＳ（配列番号３２）、ＤＦＮＳＳ（配列番号３３）、ＤＶＮＡＴ（配列番号３４）、ＤＦＮＶＴ（配列番号３５）、またはＤＶＮＡＳ（配列番号３６）からなる群から選択される。
【００２４】
別の好ましい実施形態では、当該担体ポリペプチドは、配列番号４または配列番号６または配列番号８に示されるヌクレオチド配列を含む、当該ポリペプチドをコードする核酸を含む。
【００２５】
本発明の好ましい実施形態では、当該プロモーターは、リボソーム結合部位に動作可能なようにさらに連結され、当該リボソーム結合部位の３’プライム末端と、異種グリカン抗原の合成に必要な当該１つまたは複数のポリペプチドをコードする核酸分子の５’開始コドンと、の間にヌクレオチドスペーサー配列が設けられ、当該生合成遺伝子座をコードする核酸分子からの翻訳は、当該ヌクレオチドスペーサー配列を含まない、当該組換えポリペプチドをコードする対照核酸分子と比較すると低減される。
【００２６】
本発明の好ましい実施形態では、当該異種グリカン抗原は、七糖である。
【００２７】
本発明の好ましい実施形態では、当該生合成遺伝子座は、Ｐｇｌ遺伝子座である。
【００２８】
好ましくは、当該Ｐｇｌ遺伝子座は、ＰｇｌＧと、ＰｇｌＦと、ＰｇｌＥと、任意選択のＣｊ１１２２ｃと、ＰｇｌＤと、ＰｇｌＣと、ＰｇｌＡと、ＰｇｌＪと、ＰｇｌＩと、ＰｇｌＨと、ＰｇｌＫと、Ｇｎｅと、からなる群から選択される当該１つまたは複数のポリペプチドをコードする遺伝子を含む。
【００２９】
本発明の別の好ましい実施形態では、異種グリカン抗原の合成に必要な１つまたは複数のポリペプチドをコードする当該核酸分子は、配列番号１０に示されるヌクレオチド配列を含み、当該配列番号１０は、ＰｇｌＢ（配列番号１８）の機能性バージョンを含まない。
【００３０】
原核生物の核酸分子におけるリボソーム結合部位［ＲＢＳ］は、シャイン・ダルガーノ［ＳＤ］配列と称され、典型的には、核酸分子の開始コドンの５〜１３ヌクレオチド上流に位置するコンセンサス配列である。コンセンサスＲＢＳ配列は、Ａ及びＴの含量が高い翻訳スペーサー領域が後に続くプリン高含量領域からなるものであり、例えば、コンセンサスＡＧＧＡＧＧまたはコンセンサスＡＧＧＡＧＧＵである。開始コドンは、ＡＵＧであることが一般的であるが、ＧＵＧ、ＵＵＧ、ＡＵＵ、またはＣＵＧなどのコドンにおいても翻訳が開始され得る。
【００３１】
本発明の好ましい実施形態では、当該ヌクレオチドスペーサー配列は、少なくとも１３ヌクレオチドの長さを有する。
【００３２】
本発明の好ましい実施形態では、当該ヌクレオチドスペーサー配列は、１３〜４０ヌクレオチドの長さを有し、好ましくは、ヌクレオチドスペーサー配列は、１３〜２０ヌクレオチドの長さを有する。
【００３３】
本発明の好ましい実施形態では、当該ヌクレオチドスペーサー配列は、１６ヌクレオチドの長さを有する。
【００３４】
本発明の好ましい実施形態では、当該ヌクレオチドスペーサー配列は、１３ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、１９ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２１ヌクレオチド、２２ヌクレオチド、２３ヌクレオチド、２４ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、２６ヌクレオチド、２７ヌクレオチド、２８ヌクレオチド、２９ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、３１ヌクレオチド、３２ヌクレオチド、３３ヌクレオチド、３４ヌクレオチド、３５ヌクレオチド、３６ヌクレオチド、３７ヌクレオチド、３８ヌクレオチド、３９ヌクレオチド、または４０ヌクレオチドの長さを有する。
【００３５】
本発明の好ましい実施形態では、当該ヌクレオチドスペーサー配列は、少なくとも４０ヌクレオチドの長さを有する。
【００３６】
本発明の好ましい実施形態では、当該ヌクレオチドスペーサー配列は、４０〜７５ヌクレオチドの長さを有する。
【００３７】
本発明の好ましい実施形態では、当該ヌクレオチドスペーサー配列は、４０ヌクレオチド、４５ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、５５ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、６５ヌクレオチド、７０ヌクレオチド、または７５ヌクレオチドの長さを有する。
【００３８】
本発明の代替の実施形態では、当該オリゴ糖転移酵素及び／または当該担体ポリペプチド及び／または生合成遺伝子座の核酸分子の翻訳の減少は、当該オリゴ糖転移酵素及び／または当該担体ポリペプチド及び／または生合成遺伝子座をコードするが、当該スペーサーヌクレオチド配列は含まない対照核酸分子と比較すると、少なくとも１０％の減少である。
【００３９】
本発明の好ましい実施形態では、核酸の翻訳の減少は、当該組換えポリペプチドをコードするが、当該スペーサーヌクレオチド配列は含まない対照核酸と比較すると、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％または９０％の減少である。
【００４０】
遺伝子発現の誘導物質及びリプレッサーを利用する細菌発現系は、当該技術分野においてよく知られており、遺伝子発現の誘導または抑制を増進するよく確立された改変を含む。例えば、ｌａｃＩｑは、細胞内でＬａｃリプレッサーの転写を増加させ、そのレベルを上昇させる変異をｌａｃＩ遺伝子のプロモーター領域に有する。さらに、Ｐｔａｃは、ｔｒｐプロモーターの−３５領域と、ｌａｃＵＶ５プロモーター／オペレーターの−１０領域とから構成される強力なハイブリッドプロモーターであり、強力な誘導性を有する。
【００４１】
代替の異種グリカン抗原は、Ｏ抗原を含む。反復性のグリカンポリマーを含むＯ抗原は、グラム陰性細菌の外膜と結合して見られるリポ多糖（ＬＰＳ）の多糖成分である。Ｏ抗原は、典型的には、動物において強力な免疫応答を誘発する。Ｏ鎖の組成は、細菌株によって異なる。例えば、異なるＥ．ｃｏｌｉ株によって生成される異なる既知Ｏ抗原構造の数は１６０を超える。Ｏ抗原は、細菌細胞の外表面に露出しており、宿主抗体による認識のための標的として働く。多糖合成遺伝子座の例は、当該技術分野においてよく知られており、“Ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃａｐｓｕｌａｒ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｌｏｃｕｓ  ｆｒｏｍ  ａｌｌ  ９０  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ”，Ｂｅｎｔｌｅｙ  ＳＤ，Ａａｎｅｎｓｅｎ  ＤＭ，Ｍａｖｒｏｉｄｉ  Ａ，Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｄ，Ｒａｂｂｉｎｏｗｉｔｓｃｈ  Ｅ，Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｍ，Ｄｏｎｏｈｏｅ  Ｋ，Ｈａｒｒｉｓ  Ｄ，Ｍｕｒｐｈｙ  Ｌ，Ｑｕａｉｌ  ＭＡ，Ｓａｍｕｅｌ  Ｇ，Ｓｋｏｖｓｔｅｄ  ＩＣ，Ｋａｌｔｏｆｔ  ＭＳ，Ｂａｒｒｅｌｌ  Ｂ，Ｒｅｅｖｅｓ  ＰＲ，Ｐａｒｋｈｉｌｌ  Ｊ，Ｓｐｒａｔｔ  ＢＧ．ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ．２００６  Ｍａｒ：２（３）：ｅ３１、“Ｇｅｎｅ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｏｃｉ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｃａｐｓｕｌａｒ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  １５  ｓｅｒｏｖａｒ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｏｆ  Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｓｕｉｓ．”Ｈｏｗｅｌｌ  ＫＪ，Ｗｅｉｎｅｒｔ  ＬＡ，Ｌｕａｎ  ＳＬ，Ｐｅｔｅｒｓ  ＳＥ，Ｃｈａｕｄｈｕｒｉ  ＲＲ，Ｈａｒｒｉｓ  Ｄ，Ａｎｇｅｎ  Ｏ，Ａｒａｇｏｎ  Ｖ，Ｐａｒｋｈｉｌｌ  Ｊ，Ｌａｎｇｆｏｒｄ  ＰＲ，Ｒｙｃｒｏｆｔ  ＡＮ，Ｗｒｅｎ  ＢＷ，Ｔｕｃｋｅｒ  ＡＷ，Ｍａｓｋｅｌｌ  ＤＪ；ＢＲａＤＰ１Ｔ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２０１３  Ｓｅｐ：１９５（１８）：４２６４−７３．ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＢ．００４７１−１３．Ｅｐｕｂ  ２０１３  Ｊｕｌ  １９、“Ｅｘｐｌｏｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｄｅｖｅｌｏｐ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ”．Ｃｕｃｃｕｉ  Ｊ，Ｔｈｏｍａｓ  ＲＭ，Ｍｏｕｌｅ  ＭＧ，Ｄ’Ｅｌｉａ  ＲＶ，Ｌａｗｓ  ＴＲ，Ｍｉｌｌｓ  ＤＣ，Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ  Ｄ，Ａｔｋｉｎｓ  ＴＰ，Ｐｒｉｏｒ  ＪＬ，Ｗｒｅｎ  ＢＷ．Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｌ．２０１３  Ｍａｙ  ２２；３（５）：１３０００２、及び“Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ  ｄｉｖｅｒｓｅ  Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ  ｇｌｙｃａｎｓ  ｏｆ  Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｅｃｉｅｓ”．Ｊｅｒｖｉｓ  ＡＪ，Ｂｕｔｌｅｒ  ＪＡ，Ｌａｗｓｏｎ  ＡＪ，Ｌａｎｇｄｏｎ  Ｒ，Ｗｒｅｎ  ＢＷ，Ｌｉｎｔｏｎ  Ｄ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２０１２  Ｍａｙ：１９４（９）：２３５５−６２において見つけることができる。
【００４２】
本発明の別の態様によれば、オリゴ糖転移酵素ポリペプチドが提供され、当該オリゴ糖転移酵素ポリペプチドは、
ｉ）配列番号１もしくは配列番号２に示される、オリゴ糖転移酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、または
ｉｉ）配列番号１もしくは配列番号２に示されるヌクレオチド配列に対して縮重し、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、または
ｉｉｉ）オリゴ糖転移酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、当該ヌクレオチド配列が、配列番号１に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９７％の同一性を有する、当該核酸分子、または
ｉｖ）オリゴ糖転移酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、当該ヌクレオチド配列が、配列番号２に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７７％の同一性を有する、当該核酸分子
からなる群から選択され、
当該オリゴ糖転移酵素は、少なくとも１つの担体ポリペプチドへの１つまたは複数の異種グリカンの転移において使用するためものものである。
【００４３】
本発明の好ましい実施形態では、当該核酸分子は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列に対して９８％または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００４４】
本発明の代替の実施形態では、当該核酸分子は、配列番号２に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００４５】
本発明の好ましい実施形態では、オリゴ糖転移酵素をコードする核酸分子を含む転写カセットが提供され、当該オリゴ糖転移酵素は、配列番号３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００４６】
好ましくは、当該オリゴ糖転移酵素は、配列番号３に示されるアミノ酸配列に対して９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００４７】
本発明の好ましい実施形態では、当該使用は、微生物宿主細胞におけるものであり、当該オリゴ糖転移酵素ポリペプチドは、当該微生物宿主細胞に形質転換される。
【００４８】
本発明の別の態様によれば、本発明による転写カセットを含むベクターが提供される。
【００４９】
本発明の好ましい実施形態では、当該ベクターは、プラスミドである。
【００５０】
本発明の代替の好ましい実施形態では、当該ベクターは、トランスポゾンである。
【００５１】
本発明の好ましい実施形態では、当該トランスポゾンは、Ｔｎ５、Ｔｎ１０、Ｈｉｍａｒ１及び他のマリナー因子、Ｔｎ７、Ｔｎ９１７、ならびにＴｎ９１６からなる群から選択される。
【００５２】
本発明の好ましい実施形態では、当該トランスポゾンは、Ｔｎ５である。
【００５３】
本発明の別の態様によれば、本発明による転写カセットまたはベクターで遺伝子改変された細菌細胞が提供される。
【００５４】
本発明の好ましい実施形態では、当該オリゴ糖転移酵素をコードする当該核酸分子は、当該細菌細胞のゲノムに安定的に組み込まれる。
【００５５】
本発明の別の好ましい実施形態では、当該担体ポリペプチドをコードする当該核酸分子は、当該細菌細胞のゲノムに安定的に組み込まれる。
【００５６】
本発明のさらに別の好ましい実施形態では、当該生合成遺伝子座をコードする当該核酸分子は、当該細菌細胞のゲノムに安定的に組み込まれる。
【００５７】
本明細書に開示の転写カセットを使用する本発明による弱毒化病原性細菌細胞の遺伝子形質転換は、弱毒化病原性細菌細胞のゲノムとは別に複製されて遺伝子（複数可）のコピーを複数生成するエピソームベクターを使用する形質転換を介するものであり得る。あるいは、弱毒化病原性細菌細胞のゲノムとの組換えを起こし、当該弱毒化病原性細菌細胞のゲノムと共に複製される組み込みベクターである。
【００５８】
本発明の好ましい実施形態では、オリゴ糖転移酵素ポリペプチド、担体ポリペプチド、及び異種グリカン抗原の合成に必要な１つまたは複数のポリペプチドを含む生合成遺伝子座をコードする当該核酸分子は、当該細菌細胞のゲノムにそれぞれ組み込まれる。
【００５９】
本発明の好ましい実施形態では、当該細菌細胞は、病原性グラム陽性細菌細胞である。
【００６０】
本発明の好ましい実施形態では、当該細菌細胞は、病原性グラム陰性細菌細胞である。
【００６１】
本発明の好ましい実施形態では、当該細菌細胞は、ヒト病原体である。
【００６２】
本発明の好ましい実施形態では、当該ヒト病原体は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ、及びＳｅｒｒａｔｉａからなる群から選択される。
【００６３】
本発明の好ましい実施形態では、当該細菌細胞は、非ヒト病原体である。
【００６４】
本発明の好ましい実施形態では、当該非ヒト病原体は、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ属の種、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の種（例えば、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ属の種、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属の種、またはＥｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ属の種からなる群から選択される。
【００６５】
本発明の好ましい実施形態では、当該細菌細胞は、人畜共通感染性細菌種である。
【００６６】
本発明の好ましい実施形態では、当該人畜共通感染性細菌種は、Ｂｒｕｃｅｌｌａ属の種、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ属の種、Ｖｉｂｒｉｏ属の種、Ｙｅｒｓｉｎｉａ属の種、及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａ属の種からなる群から選択される。
【００６７】
本発明の別の態様によれば、本発明による遺伝子改変細菌細胞を含む細菌細胞培養物が提供される。
【００６８】
本発明の態様によれば、１つまたは複数の複合糖質の生成において使用するための、本発明による転写カセットまたはベクターが提供される。
【００６９】
本発明の別の態様によれば、１つまたは複数の複合糖質を生成させるためのプロセスが提供され、当該プロセスは、
ｉ）本発明による細菌細胞培養物を得ること、
ｉｉ）細胞培養条件を得ること、ならびに
ｉｉｉ）細菌細胞または細胞培地から１つまたは複数の複合糖質を単離すること、
を含む。
【００７０】
本発明の別の態様によれば、本発明による細菌細胞培養物を含む細胞培養容器が提供される。
【００７１】
本発明の好ましい実施形態では、当該細胞培養容器は、発酵槽である。
【００７２】
本発明によるプロセスで使用される細菌培養物は、宿主生物に応じて、当業者に知られる方法で増殖または培養される。原則として、通常は、糖の形態の炭素源、通常は、酵母抽出物などの有機窒素源の形態の窒素源、または硫酸アンモニウムなどの塩、鉄塩、マンガン塩、マグネシウム塩など微量元素、及び、適切な場合はビタミンを含む液体培地において、酸素含有ガスを導入しながら０℃〜１００℃、好ましくは１０℃〜６０℃の温度で細菌の増殖培養が行われる。
【００７３】
液体培地のｐＨは、一定に保つこと、すなわち、培養期間中に制御することもできるし、また、保たないようにすることもできる。培養物の増殖培養は、バッチ式、半バッチ式、または連続式のものであり得る。栄養素は、発酵の開始時点で供給するか、または半連続的もしくは連続的に供給することができる。生成した生成物は、当業者に知られるプロセスによって上記のように細菌から単離することができ、例えば、抽出、蒸留、結晶化、適切な場合は、塩を用いる沈降、及び／またはクロマトグラフィーによって単離することができる。このプロセスでは、ｐＨ値は、ｐＨ４〜１２、好ましくはｐＨ６〜９、特に好ましくはｐＨ７〜８に保つことが有利である。
【００７４】
既知の培養方法の概要は、Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １．Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ］（Ｇｕｓｔａｖ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，１９９１））という教科書、またはＳｔｏｒｈａｓによる教科書（Ｂｉｏｒｅａｋｔｏｒｅｎ  ｕｎｄ  ｐｅｒｉｐｈｅｒｅ  Ｅｉｎｒｉｃｈｔｕｎｇｅｎ［Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ］（Ｖｉｅｗｅｇ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ／Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ，１９９４））にあります。
【００７５】
使用する培地は、問題の細菌株の要件を適切に満たさなくてはならない。さまざまな細菌のための培地の説明は、“Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ”ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡ，１９８１）という教科書にあります。
【００７６】
上記のように、本発明に従って利用することができるこれらの培地は、通常、１つまたは複数の炭素源、窒素源、無機塩、ビタミン、及び／または微量元素を含む。
【００７７】
好ましい炭素源は、単糖類、二糖類または多糖類などの糖である。炭素源の例は、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、リボース、ソルボース、リブロース、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース、デンプン、またはセルロースである。糖蜜などの複雑な化合物または糖精製に由来するその他の副産物を介して糖を培地に添加することもできる。さまざまな炭素源の混合物を添加することも有利であり得る。他の可能な炭素源は、例えば、大豆油、ヒマワリ油、ピーナッツ油、及び／またはココナッツ油脂などの油及び脂肪、例えば、パルミチン酸、ステアリン酸、及び／またはリノール酸などの脂肪酸、例えば、グリセロール、メタノール、及び／またはエタノールなどのアルコール及び／または多価アルコール、ならびに／もしくは、例えば、酢酸及び／または乳酸などの有機酸である。
【００７８】
窒素源は、通常、有機窒素化合物または無機窒素化合物であるか、もしくはこれらの化合物を含む材料である。窒素源の例には、液体状または気体状のアンモニア、もしくは硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、または硝酸アンモニウムなどのアンモニウム塩、硝酸塩、尿素、アミノ酸、またはコーンスティープリカー、大豆ミール、大豆タンパク質、酵母エキス、肉エキス、及び他のものなどの複合窒素源が含まれる。窒素源は、個別に使用するか、または混合物として使用することができる。
【００７９】
培地に存在し得る無機塩化合物には、カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、コバルト、モリブデン、カリウム、マンガン、亜鉛、銅、及び鉄の塩化物、リン含有塩、及び硫酸塩が含まれる。
【００８０】
例えば、硫酸塩、亜硫酸塩、亜ジチオン酸塩、テトラチオン酸塩、チオ硫酸塩、硫化物などの無機硫黄含有化合物、またはメルカプタンやチオールなどの有機硫黄化合物が、含硫ファインケミカル、とりわけ、メチオニンを生成させるための硫黄源として使用され得る。
【００８１】
リン酸、リン酸二水素カリウム、もしくはリン酸水素二カリウム、または対応するナトリウム含有塩が、リン源として使用され得る。
【００８２】
金属イオンを溶液中に留めるためにキレート剤が培地に添加され得る。特に適したキレート剤は、カテコールまたはプロトカテク酸などのジヒドロキシフェノール及びクエン酸などの有機酸を含む。
【００８３】
細菌を培養するために本発明に従って使用される発酵培地は、通常、ビタミンなどの他の増殖因子または増殖促進物質も含み、こうした増殖因子または増殖促進物質には、例えば、ビオチン、リボフラビン、チアミン、葉酸、ニコチン酸、パントテン酸、及びピリドキシンが含まれる。増殖因子及び塩は、酵母エキス、糖蜜、コーンスティープリカー等のような複合培地成分から得られることが多い。さらに、適当な前駆物質を培地に添加することも可能である。培地化合物の正確な組成は、特定の実験に大きく依存するものであり、それぞれの特定の事例ごとに個別に決定される。培地の最適化に関する情報は、“Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ”（Ｅｄｉｔｏｒｓ  Ｐ．Ｍ．Ｒｈｏｄｅｓ，Ｐ．Ｆ．Ｓｔａｎｂｕｒｙ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９７）ｐｐ．５３−７３，ＩＳＢＮ ０ １９ ９６３５７７ ３）という教科書にあります。商業的なサプライヤーから増殖培地を入手することもでき、こうした増殖培地は、例えば、Ｓｔａｎｄａｒｄ １（Ｍｅｒｃｋ）またはＢＨＩ（ｂｒａｉｎ ｈｅａｒｔ ｉｎｆｕｓｏｎ、ＤＩＦＣＯ）及び同様のものである。
【００８４】
培地成分はすべて、熱（２０分、１．５バール、及び１２１℃）またはろ過滅菌によって滅菌処理される。こうした成分は、一緒に滅菌処理されるか、または必要に応じて別々に滅菌処理され得る。培地成分はすべて、培養の開始時点で存在するか、または必要に応じて連続式もしくはバッチ式で添加され得る。
【００８５】
培養温度は、通常、１５℃〜４５℃、好ましくは２５℃〜４０℃であり、一定に保たれ得るか、または実験中に変更され得る。培地のｐＨは、５〜８．５の範囲、好ましくは７．０付近にするべきである。培養中のｐＨは、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア、アンモニア水などの塩基性化合物、またはリン酸や硫酸などの酸性化合物を添加することによって制御することができる。起泡は、例えば、脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を利用することによって制御できる。プラスミドの安定性を維持するために、選択的な作用を有する適切な物質、例えば、抗生物質を培地に添加することが可能である。好気条件は、酸素または酸素含有ガス混合物、例えば、周囲の空気などを培養物に導入することによって維持される。培養温度は、通常、２０℃〜４５℃であり、好ましくは２５℃〜４０℃である。培養は、所望の生成物の形成が最大となるまで継続される。この目標は、通常、１０〜１６０時間以内に達成される。
【００８６】
次に、発酵ブロスをさらに処理することができる。バイオマスは、必要に応じて、例えば、遠心分離、ろ過、デカント、もしくはこれらの方法の組み合わせなどの分離方法によって発酵ブロスから完全または部分的に取り出されるか、もしくは当該ブロスに完全に残してもよい。バイオマスは、それを分離した後に処理することが有利である。
【００８７】
しかしながら、例えば、ロータリーエバポレーター、薄膜式エバポレーター、流下膜式エバポレーター、逆浸透、またはナノろ過などの既知の方法を利用して、細胞を分離せずに発酵ブロスを増粘させるか、または濃縮することもできる。最終的に、この濃縮発酵ブロスを処理することで、そこに存在する脂肪酸を得ることができる。
【００８８】
本発明の別の態様によれば、新規の複合糖質を同定するためのプロセスが提供され、当該プロセスは、
ｉ）本発明による細菌細胞及びトランスポゾンを含む細胞培養調製物を形成させること、
ｉｉ）調製物をインキュベートしてトランスポゾンが安定的に組み込まれるようにすること、
ｉｉｉ）安定的に組み込まれているトランスポゾンを有する細菌細胞を、安定な組み込み体である細菌細胞を選択する培養条件を使用して選択すること、
ｉｖ）トランスポゾンが安定的に組み込まれている細菌細胞をクローニングすること、
ｖ）クローニングした細菌細胞または細胞培地から複合糖質を単離すること、ならびに
ｖｉ）当該単離複合糖質の単糖含量または多糖含量を分析すること、
を含む。
【００８９】
本発明の別の態様によれば、本発明によるプロセスによって形成された複合糖質が提供される。
【００９０】
本発明の態様によれば、配列番号３に示されるアミノ酸配列またはその多型配列変異体を含む単離されたオリゴ糖転移酵素ポリペプチドが提供され、アミノ酸配列は、少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失または置換によって改変され、当該改変ポリペプチドは、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む未改変のオリゴ糖転移酵素ポリペプチドと比較すると、基質特異性が改変されており、及び／またはオリゴ糖転移酵素活性が増加している。
【００９１】
本発明の好ましい実施形態では、当該改変は、配列番号３に示されるアミノ酸残基８６及び／またはアミノ酸残基２９３及び／またはアミノ酸残基３１６からなる群から選択されるアミノ酸残基のうちの１つまたは複数の欠失または置換である。
【００９２】
本発明の好ましい実施形態では、当該改変は、アミノ酸置換であり、置換は、配列番号３に示されるアミノ酸残基８６に対するものであり、アミノ酸残基セリンがアミノ酸残基アルギニンで置換される。
【００９３】
本発明の代替の実施形態では、当該改変は、アミノ酸置換であり、置換は、配列番号３に示されるアミノ酸残基２９３に対するものであり、アミノ酸残基アスパラギンがアミノ酸残基プロリンで置換される。
【００９４】
本発明の別の代替の実施形態では、当該改変は、アミノ酸置換であり、置換は、配列番号３に示されるアミノ酸残基３１６に対するものであり、アミノ酸残基アスパラギンがアミノ酸残基バリンで置換される。
【００９５】
本発明の好ましい実施形態では、当該改変ポリペプチドまたは多型配列変異体は、配列番号４３に示されるアミノ酸配列を含む。
【００９６】
本発明の別の好ましい実施形態では、当該改変核酸配列は、配列番号４３に示される配列を含むポリペプチドをコードする。
【００９７】
本発明の態様によれば、本発明によるポリペプチドをコードする単離核酸分子が提供される。
【００９８】
本発明の好ましい実施形態では、当該単離核酸分子は、
ｉ）配列番号４２に示されるヌクレオチド配列を含むか、または当該ヌクレオチド配列からなる核酸分子と、
ｉｉ）配列番号４２に示されるヌクレオチド配列に対して縮重するヌクレオチド配列を含むか、または当該ヌクレオチド配列からなり、本発明による改変アミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子と、
からなる群から選択される。
【００９９】
本発明の好ましい実施形態では、当該単離核酸分子は、配列番号４２に示されるヌクレオチド配列を含むか、または当該ヌクレオチド配列からなる。
【０１００】
本発明の好ましい実施形態では、当該核酸分子は、転写カセットの一部である。
【０１０１】
本発明の態様によれば、本発明による核酸分子を含むベクターが提供される。
【０１０２】
本発明の好ましい実施形態では、当該ベクターは、発現ベクターである。
【０１０３】
本発明の好ましい実施形態では、当該ベクターは、トランスポゾンである。
【０１０４】
本発明の別の態様によれば、本発明による核酸分子または発現ベクターで形質転換または遺伝子導入された細胞が提供される。
【０１０５】
本発明の好ましい実施形態では、当該細胞は、微生物細胞であり、例えば、細菌細胞である。
【０１０６】
本明細書の説明及び特許請求の範囲を通じて、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」という言葉ならびにこれらの言葉の異形（例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、「含むが、限定はされない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」を意味し、他の部分、添加物、成分、整数値、またはステップを除外することは意図されない（それらを除外しない）。「本質的になる」は、本質的な整数値を有するが、本質的な整数値の機能に実質的に影響を与えない整数値を含むことを意味する。
【０１０７】
本明細書の説明及び特許請求の範囲を通じて、文脈上異なる解釈を要する場合を除き、単数形は、複数形を包含する。具体的には、不定冠詞が使用される場合、文脈上異なる解釈を要する場合を除き、本明細書は、単数の存在だけでなく複数の存在も企図するものであることが理解されよう。
【０１０８】
本発明の特定の態様、実施形態、または実施例と関連付けて説明される特性、整数値、特徴、化合物、化学部分、または群は、適用対象と不適合でない限り、本明細書に記載の任意の他の態様、実施形態、または実施例に適用可能であることが理解されよう。
【０１０９】
ここでは、下記の図面を参照して本発明の実施形態が説明されることになるが、説明される実施形態は例示にすぎない。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ  ｐｇｌＢ及びＣｓｐｇｌＢ２の発現誘導後のＥ．ｃｏｌｉ  ＣＬＭ２４の増殖を比較したものを示す。増殖曲線を描くことで、ＣｊｐｇｌＢまたはＣｓｐｇｌＢ２の誘導後のＥ．ｃｏｌｉ細胞の光学密度を監視した（図１Ａ）。我々は、ＣｓｐｇｌＢ２とＣ．ｊｅｊｕｎｉ  ｐｇｌＢとが非常に類似した毒性レベルを有すると思われることを見出した。
【図２】単一の糖鎖付加部位（ＤＱＮＲＴのみ）を有する外毒素Ａが糖鎖付加を受ける糖鎖付加効率をＥ．ｃｏｌｉ  ＣＬＭ２４において試験したものを示す。
【図３】生存弱毒化株ＰｏｕｌＶａｃ  Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＣ．ｓｐｕｔｏｒｕｍ  ＰｇｌＢが糖タンパク質をどのように生成できるかを示す。この図は、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉの七糖による糖鎖付加がＡｃｒＡタンパク質の移動度にどのような影響を及ぼすかを示す。
【図４】構築されたコンストラクトに対応するＤＮＡ配列を示す。ｐＥＸＴ２１配列（ａｔｔｔｃａｃａｃａｇｇａａａｃａ）、ＥｃｏＲＩ制限酵素認識部位（ＧＡＡＴＴＣ）、１０ヌクレオチドの挿入（ＧＡＴＴＡＴＣＧＣＣ）、Ｃ．ｓｐｕｔｏｒｕｍ  ｐｇｌＢの配列（ＡＴＧＧＣＧＴＣＡＡＡＴＴＴＴＡＡＴＴＴＣＧＣＴＡＡＡ）。コンティグは、構築されたコンストラクトを示し、予測は、Ｃ．ｓｐｕｔｏｒｕｍ  ｐｇｌＢの予測配列である。
【０１１１】
材料及び方法
Ｃ．ｓｐｕｔｏｒｕｍ  ｐｇｌＢ２発現プラスミドｐＥＬＬＡ１の構築
ＤＮＡ合成によってＣ．ｓｐｕｔｏｒｕｍ  ｐｇｌＢ２のコドン最適化バージョンを生成し、クローニングベクターｐＵＣ５７ｋｍに導入した。このコドン最適化バージョンは、当該コンストラクトの５’末端及び３’末端にＥｃｏＲＩ（ＧＡＡＴＴＣ）制限酵素認識部位を有するように設計した。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α細胞においてプラスミドｐＥＸＴ２１を増殖させ、プラスミド抽出（ＱＩＡＧＥＮ Ｌｔｄ ＵＫ）によって精製した。ＣｓＰｇｌＢ２を含む１μｇのｐＵＣ５７Ｋｍ及び１μｇのｐＥＸＴ２１をＥｃｏＲＩＨＦ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｕ．Ｋ．）で消化し、ベクターｐＥＬＬＡ１を生成するためにＩＰＴＧ誘導性発現ベクターｐＥＸＴ２１のＥｃｏＲＩ部位へクローニングした。
【０１１２】
ｐＥＬＬＡ２の構築
Ｃ．ｓｐｕｔｏｒｕｍ  ＰｇｌＢ２をコードする遺伝子を、テンプレートとしてプラスミドｐＥＸＴ２１由来のｐＴａｃプロモーター及びＬａｃＩリプレッサーを用いたＰＣＲにより、フォワードプライマーとしての（配列番号１１：５’−ＴＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＣＴＡＣＧＴＧＴＴＣＣＧＣＴＴＣＣ−３’）とリバースプライマーとしての（配列番号１２：５’−ＴＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＴＧＣＧＴＴＧＣＧＣＴＣＡＣＴＧＣ−３’）と共にＡｃｃｕｐｒｉｍｅ  Ｔａｑ  Ｈｉｆｉを使用し、以下のサイクリング条件、９４℃、２分間に続いて、９４℃で３０秒間、５６℃で３０秒間、及び６８℃で４分間の３５サイクルで実施し、ＰＣＲ増幅し、Ｚｅｏｃｉｎ（登録商標）耐性トランスポゾンであるｐＪＣＵＳＡ１に固有のＮｏｔＩ部位に連結した。このＺｅｏｃｉｎ（登録商標）耐性トランスポゾンでは、抗生物質マーカーにｌｏｘＰ部位が隣接しており、これによって、ＣＲＥ酵素を導入することで最終標的株から抗生物質マーカーを後に除去することが可能である。このトランスポゾンは、ｐＭＢ１複製起点を有していることから、任意のＥ．ｃｏｌｉ株において維持することができ、その後に、ＳｆｉＩによる制限酵素消化を使用してＺｅｏｃｉｎ（登録商標）耐性カセットと共に切り出し、移動させ、ｐＵＴ送達ベクターに導入することで、機能性トランスポゾンを得ることができる。このトランスポゾンの配列は、以下に示される（配列番号１３）：
2020513803.tif 000003
【０１１３】
このトランスポゾンへのＣｓｐｇｌＢ２の挿入及びｐＵＴ送達ベクターへの導入は、プラスミドｐＥＬＬＡ２を生成し、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｘ Ｅ．ｃｏｌｉ株ＥＣ１００Ｄ ｐｉｒ＋（Ｃａｍｂｉｏ Ｕ．Ｋ．）において維持した。
【０１１４】
細菌接合
レシピエントであるＥ．ｃｏｌｉ株または任意の他の細菌の染色体へとＣｓｐｇｌＢ２トランスポゾンカーゴを導入することを可能にするために、プラスミドｐＥＬＬＡ２をＥ．ｃｏｌｉ  ＭＦＤ（ジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）要求株）に導入した。Ｚｅｏｃｉｎ（登録商標）（１００μｇ／ｍｌ）及びアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を増殖培地に添加した。ドナー細菌とレシピエント細菌との両方を、対数増殖後期に到達するまで増殖させた。遠心分離によって細菌細胞をペレットにし、ＰＢＳで３回洗浄してから、レシピエントとドナーとの比を１：３として一緒に混合した後、抗生物質を含まない乾燥ＬＢ寒天プレートにスポットし、４〜８時間保持した。細胞を剥離させてからＰＢＳに浮遊させ、希釈液を、適当な選択抗生物質を含むＬＢ寒天培地に播種することでトランスコンジュゲートを選択した。個々のコロニーをピッキングし、ｐＵＴ骨格の消失及びトランスポゾンの存在についてスクリーニングを実施した。
【０１１５】
マーカーが除去されたｐｇｌＢ挿入物の生成
ＣｓｐｇｌＢ２と、Ｚｅｏｃｉｎ（登録商標）耐性カセット周囲のｌｏｘＰ組換え部位と、を含むトランスポゾンをＰｏｕｌＶＡｃ  Ｅ．ｃｏｌｉに導入した。Ｚｅｏｃｉｎ（登録商標）耐性コロニーを選択した後、電気穿孔を介して温度感受性ベクターｐＣＲＥ５を導入することによって当該抗生物質選択マーカーを除去した（参考文献：Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００８  Ｆｅｂｒｕａｒｙ；７４（４）：１０６４−１０７５．Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｓｅｌｅｃｔ−Ａｇｅｎｔ−Ｃｏｍｐｌｉａｎｔ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ．Ｋｙｏｕｎｇ−Ｈｅｅ  Ｃｈｏｉ，Ｔａｋｅｈｉｋｏ  Ｍｉｍａ，Ｙｖｅｔｈ  Ｃａｓａｒｔ，Ｄｒｅｗ  Ｒｈｏｌｌ，Ａｙｕｓｈ  Ｋｕｍａｒ，Ｉｆｏｒ  Ｒ．Ｂｅａｃｈａｍ  ａｎｄ  Ｈｅｒｂｅｒｔ  Ｐ．Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ）。
【０１１６】
５０μｇ／ｍｌのカナマイシンの存在下でＰｏｕｌＶＡｃ  Ｅ．ｃｏｌｉを２８℃で培養し、ラムノースを最終濃度が０．２％となるよう添加して発現誘導を行い、当該生物を数回継代培養することで、Ｚｅｏｃｉｎ（登録商標）耐性は消失しているが、ブレオマイシン耐性遺伝子が染色体から反転されたことを示すカナマイシンへの耐性を維持しているコロニーを選択した。
【０１１７】
次いで、このＥ．ｃｏｌｉ変異体を４２℃で継代培養して、ｐＣＲＥ５プラスミドを除去した。再びカナマイシン感受性となったコロニーをスクリーニングすることにより、ｐＣＲＥ５の消失が確認され、Ｅ．ｃｏｌｉの染色体上にマーカーが除去されたｐｇｌＢの誘導性コピーの生成が完了した。
【０１１８】
担体ポリペプチド
改変された担体ポリペプチド［ＧＴ−ＥｘｏＡ］をコードするプラスミドｐＧＶＸＮ１５０：ＧＴ−ＥｘｏＡで弱毒化細菌株を形質転換した。当該ＧＴ−ＥｘｏＡコンストラクトは、ベクターｐＧＨにおいてＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの外毒素Ａの改変バージョンを発現するように操作し、制限酵素ＮｈｅＩと制限酵素ＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ）とを使用して、ｐＥＣ４１５に由来するベクターにクローニングした。合成されたタンパク質には、Ｎ末端にＮ結合型糖鎖付加シークオンを４つ含み、かつＣ末端に４つの糖鎖タグ（ｇｌｙｃｏｔａｇ）をさらに含むことに加えて、Ｐｇｌによる当該タンパク質への糖鎖付加を可能にする内部改変を２つ含む。さらに、当該タンパク質のＣ末端にヘキサヒスチジンタグを付加することで、精製を容易にすると共に、Ｎ末端配列にＥ．ｃｏｌｉ ＤｓｂＡシグナルペプチドを付加することで、ペリプラズムへのＳｅｃ依存性の分泌を可能にした。ｐＧＶＸＮ１５０：ＧＴ−ＥｘｏＡは、アンピシリン耐性を有し、Ｌ−（＋）−アラビノース誘導性である。次いで、プライマーＧＴＥｘｏＡ ＮＦ（配列番号１４；ＧＣＧＣＴＧＧＣＴＧＧＴＴＴＡＧＴＴＴ）、プライマーＧＴＥｘｏＡ ＮＲ（配列番号１５；ＣＧＣＡＴＴＣＧＴＴＣＣＡＧＡＧＧＴ）、プライマーＧＴＥｘｏＡ ＣＦ（配列番号１６；ＧＡＣＡＡＧＧＡＡＣＡＧＧＣＧＡＴＣＡＧ）、及びプライマーＧＴＥｘｏＡ ＣＲ（配列番号１７；ＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＣ）を用いたサンガーシークエンス法を使用して当該コンストラクトの配列を確認した。
【０１１９】
ＰｇｌＢの毒性の低減
タンパク質糖鎖カップリング技術では、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ  ＰｇｌＢの使用が必要である。この酵素は、１３回膜貫通型ドメインを有しており、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて過剰発現すると毒性を示す。ｐｇｌＢ遺伝子はもともと、オリゴヌクレオチドＰｇｌＢＥｃｏＲＩ（ＥｃｏＲＩ作用部位は太字で示す）（配列番号３７：
2020513803.tif 000004
）及びオリゴヌクレオチドＰｇｌＢＮｃｏＩ−ＨＡ（配列番号３８：ＡＡＣＣＡＴＧＧＴＴＡＡＧＣＧＴＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＡＴＣＧＴＡＴＧＧＧＴＡＡＡＴＴＴＴＡＡＧＴＴＴＡＡＡＡＡＣＣＴＴＡＧＣ）をプライマーとして使用し、ＰＣＲによって増幅された。この増幅では、テンプレートとしてのｐＡＣＹＣ（ｐｇｌ）と一緒にＰｆｕポリメラーゼを使用した。オリゴヌクレオチドＰｇｌＢＮｃｏＩ−ＨＡは、ウエスタンブロットによってＰｇｌＢの発現を追跡するためにＨＡタグをコードする。当該ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩとＮｃｏＩとで消化し、ベクターｐＭＬＢＡＤの同一部位にクローニングした。得られたプラスミドをｐＭＡＦ１０と命名した。ＰｇｌＢがアラビノース依存性に発現することをウエスタンブロットによって確認した（Ｆｅｌｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．２００５）。このコンストラクトを、ベクターｐＥＸＴ２１のＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングすることで、ＣｊｐｇｌＢのＩＰＴＧ依存性誘導性発現が可能になる。このプラスミドとオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）との組み合わせは、いくつかの複合糖質ワクチンを生成するために数年間使用されているものである。Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｕｔｏｒｕｍに由来するＰｇｌＢを使用した最近の改変では、我々は試験を実施し、リボソーム結合部位がｐＥＸＴ２１ベクター自体にコードされていることを発見した。このことは、翻訳効率がＲＢＳとｐｇｌＢのＡＴＧ開始コドンとの間の距離によって部分的に制御されることを意味する。ＰｇｌＢをコードする遺伝子を、ＤＮＡ配列を１０塩基対延長したベクターｐＥＸＴ２１に挿入することで、当該酵素の毒性が減少し、それに伴い、光学密度によって測定したときの担体Ｅ．ｃｏｌｉ株の増殖が増加することが明らかとなった。したがって、ＡＴＧ開始コドンの前に追加のヌクレオチドを挿入するという単純な改変、または発現プラスミド中に含まれるＲＢＳから遺伝子をさらに遠ざけてクローニングすることによって、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＰｇｌＢの毒性を低減することが可能であり得る。
【０１２０】
ｐＥＬＬＡ３の構築
Ａｃｃｕｐｒｉｍｅ  Ｔａｑ  Ｈｉｆｉを使用し、プライマーとしてＣｓＰｇｌＢ１ｆｗｄ：ＴＴＴＴＧＡＡＴＴＣＧＡＴＴＡＴＣＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴＣＡＡＡＴＴＴＴＡＡＴＴＴＣＧＣＴＡＡＡ（配列番号３９）及びリバースプライマーＣｓＰｇｌＢ１ｒｅｖ：ＴＴＴＴ  ＧＡＡＴＴＣ  ＴＴＡＴＴＴＴＴＴＧＡＧＴＴＴＡＴＡＡＡＴＴＴＴＡＧＴＴＧＡＴ（配列番号４０）を使用して、Ｃ．ｓｐｕｔｏｒｕｍに由来するｐｇｌＢ遺伝子を増幅した。この増幅では、９４℃、３０秒間に続いて、９４℃で３０秒間、５３℃で３０秒間、６８℃で２分間を２４サイクル実施するサイクル条件を使用した。ＰＣＲ産物を制限酵素ＥｃｏＲＩ ＨＦを用いて３７℃で１６時間切断処理した。ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ  ＵＫ）を用いて、プラスミドとＰＣＲ産物との両方を精製し、アンタークティックホスファターゼ（Ａｎｔａｒｃｔｉｃ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）（ＮＥＢ  ＵＫ  Ｌｔｄ）を用いて３７℃、１時間処理することによってプラスミドｐＥＸＴ２１の脱リン酸化処理を実施した。８０℃で２分間加熱することによって当該酵素を熱失活させた後、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ  ＵＫ）を使用して上記プラスミドと上記挿入断片とを共に連結し、この反応液を４℃で一晩インキュベートした。このライゲーション反応物をＥ．ｃｏｌｉ  Ｄｈ１０β細胞（ＮＥＢ  ＵＫ  Ｌｔｄ）に形質転換し、ＬＢスペクチノマイシンプレート（８０μｇ／ｍｌ）で回収した。次いで、コンストラクトを配列決定し、クローニングされたＣ．ｓｐｕｔｏｒｕｍ  ＰｇｌＢがクローニングプロセス中にいずれの変異も生じなかったことを確認した。この新たなコンストラクトをｐＥＬＬＡ３と命名した。
【０１２１】
ｐＡＣＹＣ１８４にクローニングされたＣ．ｊｅｊｕｎｉ  ８１１１６  ｐｇｌ遺伝子座へのインビトロ変異導入
ｐＡＣＹＣ１８４（ｐＡＣＹＣｐｇｌ）にクローニングされたＣ．ｊｅｊｕｎｉ  ８１１１６糖鎖付加遺伝子座の１１遺伝子への変異導入を、カスタマイズされたＥＺ：：ＴＮトランスポゾンシステム（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を使用してインビトロで実施した。簡潔に記載すると、転写ターミネーターを欠いているため、下流への極性効果を発揮できないカナマイシン耐性カセット（Ｔｒｉｅｕ−Ｃｕｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５）をＰＣＲによって増幅し、ベクターｐＭＯＤ（商標）＜ＭＣＳ＞（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）のマルチクローニング部位にクローニングした。このコンストラクトを、ＳｃａＩ消化によって直鎖化し、カナマイシン耐性カセットを、隣接するモザイク末端と共に、プライマーＦＰ−１及びプライマーＲＰ−１（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を使用したＰＣＲによって増幅した。当該ＰＣＲ産物を、インビトロでの転移反応を実施することでプラスミドｐＡＣＹＣｐｇｌ（Ｗａｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）と結合させた。この転移反応は、製造者の指示（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）に従って実施した。得られた変異導入ｐＡＣＹＣｐｇｌプラスミドプールを電気穿孔法によってＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に導入し、ＰＣＲによって推定変異体をスクリーニングすることで、カナマイシンカセットの位置及び方向を同定した。糖鎖付加遺伝子座の遺伝子と同じ転写方向で挿入されたカナマイシン耐性カセットを有する変異体のみを使用し、これらの変異体は、配列解析によっても確認した。
【０１２２】
実施例１
単一の内部糖鎖付加部位を有するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの外毒素ＡをコードするｐＥＣ４１５ベクターと、ｍｉｎｉＴｎ５ｋｍ２要素を挿入することによってｐｇｌＢ遺伝子を破壊した、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉの七糖全体をコードするプラスミドｐＡＣＹＣｐｇｌＢ：：ｋｍとともに、コンストラクトｐＥＬＬＡ１をＥ．ｃｏｌｉ  ＣＬＭ２４細胞に形質転換した。比較として、外毒素ＡをコードするコンストラクトとＣ．ｊｅｊｕｎｉの七糖をコードするコンストラクトとを、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ由来のｐＥＸＴ２１ｐｇｌＢを保持するＥ．ｃｏｌｉ  ＣＬＭ２４細胞に形質転換した。３０μｇ／ｍｌ−１のｃｍ、１００μｇ／ｍｌ−１のａｍｐ、８０μｇ／ｍｌ−１のスペクチノマイシンを含む５００ｍｌのＬＢに、ＣＬＭ２４コンストラクトの組み合わせの一晩培養した培養物のいずれか１０ｍｌを接種し、振とうしながら３７℃でインキュベートした。６００ｎｍでの光学密度の読み取りを１時間に１回の間隔で実施し、ＯＤ６００ｎｍが０．４に達した時点でＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭ、Ｌ−アラビノースを最終濃度０．２％となるように添加することによってタンパク質発現を誘導した。最初の誘導から５時間後、０．２％ Ｌ−アラビノースを添加し、ＯＤ６００ｎｍを引き続き測定した（図１Ａ）。
【０１２３】
タンパク質発現の誘導を全く伴わないＥ．ｃｏｌｉ ＣＬＭ２４細胞の増殖も測定した。この測定は、ＩＰＴＧまたはＬ−アラビノースを添加しなかったことを除き、ｐＥＬＬＡ１を保持するＥ．ｃｏｌｉ ＣＬＭ２４細胞について上記と同じ方法で実施した（図１Ｂ）。
【０１２４】
実施例２
単一の糖鎖の付加が可能な外毒素Ａをコードするプラスミド、Ｃ．ｓｐｕｔｏｒｕｍ  ＰｇｌＢ２またはＣ．ｊｅｊｕｎｉ  ＰｇｌＢをコードするプラスミドを有するＥ．ｃｏｌｉ  ＣＬＭ２４培養物を使用して、５００ｍｌのＬＢブロスに接種した。タンパク質発現は、２回目の０．２％ Ｌ−アラビノースを添加した後に、培養物をさらに１６時間インキュベートするという変更を加えて実施例１に記載したように誘導した。この時点で、４０００×ｇで３０分間遠心分離することによって細胞をペレット形成させ、高圧細胞ホモジナイザー（Ｓｔａｎｓｔｅｄ  Ｆｌｕｉｄ  ｐｏｗｅｒ）を使用して溶解し、ＮｉＮＴＡに結合させることでＣＬＭ２４細胞からＨＩＳタグ付き外毒素Ａを精製した。１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でタンパク質を分離した後、ニトロセルロース膜に転写した。ウサギｈｒ６抗ｃａｍｐｙグリカン一次抗体及びマウス抗ＨＩＳを用いてこれをプローブした。ヤギ抗ウサギ赤外色素標識二次抗体及びヤギ抗マウス赤外色素標識二次抗体を使用することで、Ｏｄｙｓｓｅｙ  ＬＩ−ＣＯＲスキャナー（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＫ  Ｌｔｄ）を使用した糖タンパク質の可視化を可能にした（図２）。
【０１２５】
実施例３
ＨＩＳタグの付いた、ジグリコシル化可能なＣｍｅＡをコードするプラスミドｐＷＡ２、及びｐＥＬＬＡ１とともに、ｐＡＣＹＣｐｇｌＢ：：ｋａｎを電気穿孔によってＰｏｕｌＶＡＣ  Ｅ．ｃｏｌｉに導入した。１ｍＭのＩＰＴＧで誘導を行った後、３７℃で振とうしながら合計２４時間インキュベートした。培養物を２００ｍｌ取得し、１０，０００×ｇで１０分間遠心分離した。細胞を高圧で溶解し、ＮｉＮＴＡを使用して精製を実施した。次いで、製造者の指示（ＱＩＡＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｓｔ，Ｑｉａｇｅｎ  ＵＫ）に従ってタンパク質を精製し、０．５ｍｌによる溶出を４回実施した後、試料を５０μｌに濃縮した。等量の２×ＳＤＳ  ＰＡＧＥローディング色素を２０μｌ添加し、１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓゲルにロードし、クマシーで染色した（図３）。
【０１２６】
実施例４
ｐＵＡ３１（アクセプタータンパク質ＣｊａＡをコードする）、ｐＡＣＹＣｐｇｌＢ：：ｋｍ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉの七糖をコードする遺伝子座をコードするが、ｐｇｌＢはノックアウトされている）、及びｐＥＬＬＡ１（ＩＰＴＧ誘導性Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ  ｐｇｌＢをコードする）でＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ株ＳＬ３７４９を形質転換した。一晩３７℃で振とう培養した培養物１０ｍｌを調製し、２００ｍｌのＬＢブロスへの接種に使用した。ＯＤ６００ｎｍが０．４に達するまで、これを３７℃で継続的に振とうした。この時点で、１ｍＭのＩＰＴＧを添加することで、ＣｓＰｇｌＢ２の発現を誘導した。培養物を３７℃で振とうしながらさらに１６時間インキュベートした。６０００×ｇで３０分間遠心分離することによって細菌培養物をペレット形成させ、３０ｍｌの２５ｍＭ トリス、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５（ＴＢＳ）に再懸濁した。高圧細胞ホモジナイザーを使用して細胞を溶解させた。２％ＳＤＳと１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００とを添加し、溶解材料を４℃で混合しながら３時間インキュベートした。次いで、この材料を４０００×ｇで２０分間遠心分離した。３００μｌのｃ−Ｍｙｃ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＵＳＡ）を添加する前に、ペレットを廃棄した。これを混合しながら４℃で一晩インキュベートした。次いで、当該材料を４０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清を除去した。１ｍｌのＴＢＳを０．０５％のＴｗｅｅｎと共に添加した。これを、１０，０００×ｇの遠心分離を瞬間的に行うことによって５回洗浄した。３μｌのＤＴＴを含む２×ＳＤＳローディング緩衝液３００μｌを添加することによってタンパク質を溶出させ、１０分間煮沸した。ウエスタンブロットを実施することで結果を可視化した。
【０１２７】
実施例５
これまでに、ＣｓｐｇｌＢのＩＰＴＧ誘導性コピーを担持したトランスポゾンｐＥＬＬＡ２を使用して、この遺伝子を、糖鎖工学Ｅ．ｃｏｌｉ株であるＷ３１１０、ＣＬＭ２４、ＣＬＭ３７、Ｓθ８７４、ＳＣＭ７、ＳＣＭ６、ＳＣＭ３、ならびにＰｏｕｌＶＡｃ  Ｅ．ｃｏｌｉ、及びＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの染色体に組み込んだ。
【図１Ａ】
2020513803.tif 000005
【図１Ｂ】
2020513803.tif 000006
【図２】
2020513803.tif 000007
【図３】
2020513803.tif 000008
【図４】
2020513803.tif 000009
【配列表】
2020513803000001.app
【国際調査報告】
2020513803.tif 000010
2020513803.tif 000011
2020513803.tif 000012
2020513803.tif 000013