(57)【要約】【課題】高い活性を示す２−ＯＳＴ変異体などを提供すること。【解決手段】下記：（ａ）配列番号２のアミノ酸配列；（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列；または（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列；あるいは（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列における６９番目から３５６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；（ｅ）配列番号２のアミノ酸配列における６９番目から３５６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列；または（ｆ）配列番号２のアミノ酸配列における６９番目から３５６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列；のいずれかのアミノ酸配列において、３２１番目のロイシン残基が塩基性アミノ酸残基に置換されており、かつ、２−Ｏ−硫酸転移活性を有する２−Ｏ−硫酸化酵素変異体；など。【選択図】なし
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列；または
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列；あるいは
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列における６９番目から３５６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号２のアミノ酸配列における６９番目から３５６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列；または
（ｆ）配列番号２のアミノ酸配列における６９番目から３５６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列；
のいずれかのアミノ酸配列において、３２１番目のロイシン残基が塩基性アミノ酸残基に置換されており、かつ、２−Ｏ−硫酸転移活性を有する２−Ｏ−硫酸化酵素変異体。
【請求項２】
塩基性アミノ酸残基が、アルギニン残基またはリジン残基である、請求項１記載の２−Ｏ−硫酸化酵素変異体。
【請求項３】
ヘキスロン酸残基の２位の水酸基が硫酸化された修飾ヘパロサン化合物の製造方法であって、
２−Ｏ−硫酸化酵素変異体の存在下において、ヘパロサン化合物を、ヘキスロン酸残基の２位の水酸基が硫酸化された修飾ヘパロサン化合物に変換することを含み、
２−Ｏ−硫酸化酵素変異体が、下記：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列；または
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列；あるいは
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列における６９番目から３５６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号２のアミノ酸配列における６９番目から３５６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列；または
（ｆ）配列番号２のアミノ酸配列における６９番目から３５６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列；
のいずれかのアミノ酸配列において、３２１番目のロイシン残基が塩基性アミノ酸残基に置換されており、かつ、２−Ｏ−硫酸転移活性を有する２−Ｏ−硫酸化酵素変異体である、方法。
【請求項４】
前記ヘパロサン化合物が、Ｎ−硫酸化ヘパロサン、Ｎ−硫酸化エピメリ化ヘパロサン、Ｎ−硫酸化低分子化ヘパロサン、またはＮ−硫酸化エピメリ化低分子化ヘパロサンである、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記２−Ｏ−硫酸化酵素変異体を産生する形質転換微生物、またはその抽出物の存在下において、ヘキスロン酸残基の２位の水酸基が硫酸化されたヘパロサン化合物が製造される、請求項３または４記載の方法。
【請求項６】
前記形質転換微生物がエシェリヒア属細菌である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
エシェリヒア属細菌がエシェリヒア・コリである、請求項６記載の方法。
【請求項８】
下記：
（ａ’）配列番号８のアミノ酸配列；
（ｂ’）配列番号８のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列；または
（ｃ’）配列番号８のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列；あるいは
（ｄ’）配列番号８のアミノ酸配列における４８番目から３１１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
（ｅ’）配列番号８のアミノ酸配列における４８番目から３１１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列；または
（ｆ’）配列番号８のアミノ酸配列における４８番目から３１１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列；
のいずれかのアミノ酸配列において、
（ｉ）７７番目のメチオニン残基がリジン残基に置換されているか、
（ｉｉ）９６番目のトリプトファン残基がフェニルアラニン残基に置換されているか、
（ｉｉｉ）１２５番目のプロリン残基がアラニン残基に置換されているか、
（ｉｖ）１６４番目のバリン残基がイソロイシン残基に置換されているか、
（ｖ）１６７番目のアスパラギン残基がヒスチジン残基に置換されているか、
（ｖｉ）１７１番目のリジン残基がグルタミン残基に置換されているか、または
（ｖｉｉ）２５９番目のチロシン残基がフェニルアラニン残基に置換されており、かつ
３−Ｏ−硫酸転移活性を有する３−Ｏ−硫酸化酵素変異体。
【請求項９】
α−Ｄ−グルコサミン残基の３位の水酸基が硫酸化された修飾ヘパロサン化合物の製造方法であって、
３−Ｏ−硫酸化酵素変異体の存在下において、ヘパロサン化合物を、α−Ｄ−グルコサミン残基の３位の水酸基が硫酸化された修飾ヘパロサン化合物に変換することを含み、
３−Ｏ−硫酸化酵素変異体が、下記：
（ａ’）配列番号８のアミノ酸配列；
（ｂ’）配列番号８のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列；または
（ｃ’）配列番号８のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列；あるいは
（ｄ’）配列番号８のアミノ酸配列における４８番目から３１１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
（ｅ’）配列番号８のアミノ酸配列における４８番目から３１１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列；または
（ｆ’）配列番号８のアミノ酸配列における４８番目から３１１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列；
のいずれかのアミノ酸配列において、
（ｉ）７７番目のメチオニン残基がリジン残基に置換されているか、
（ｉｉ）９６番目のトリプトファン残基がフェニルアラニン残基に置換されているか、
（ｉｉｉ）１２５番目のプロリン残基がアラニン残基に置換されているか、
（ｉｖ）１６４番目のバリン残基がイソロイシン残基に置換されているか、
（ｖ）１６７番目のアスパラギン残基がヒスチジン残基に置換されているか、
（ｖｉ）１７１番目のリジン残基がグルタミン残基に置換されているか、または
（ｖｉｉ）２５９番目のチロシン残基がフェニルアラニン残基に置換されており、かつ
３−Ｏ−硫酸転移活性を有する３−Ｏ−硫酸化酵素変異体である、方法。
【請求項１０】
前記ヘパロサン化合物が、Ｎ−硫酸化６−Ｏ−硫酸化ヘパロサン、Ｎ−硫酸化６−Ｏ−硫酸化エピメリ化ヘパロサン、Ｎ−硫酸化２−Ｏ−硫酸化６−Ｏ−硫酸化ヘパロサン、Ｎ−硫酸化２−Ｏ−硫酸化６−Ｏ−硫酸化エピメリ化低分子化ヘパロサン、Ｎ−硫酸化６−Ｏ−硫酸化低分子化ヘパロサン、Ｎ−硫酸化６−Ｏ−硫酸化エピメリ化低分子化ヘパロサン、Ｎ−硫酸化２−Ｏ−硫酸化６−Ｏ−硫酸化低分子化ヘパロサン、またはＮ−硫酸化２−Ｏ−硫酸化６−Ｏ−硫酸化エピメリ化低分子化ヘパロサンである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記３−Ｏ−硫酸化酵素変異体を産生する形質転換微生物、またはその抽出物の存在下において、α−Ｄ−グルコサミン残基の３位の水酸基が硫酸化された修飾ヘパロサン化合物が製造される、請求項９または１０記載の方法。
【請求項１２】
前記形質転換微生物がエシェリヒア属細菌である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
エシェリヒア属細菌がエシェリヒア・コリである、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
ヘパラン硫酸の製造方法であって、
ヘパロサンを、（１）α−Ｄ−グルコサミン残基のＮ−脱アセチル化、（２）低分子化、（３）α−Ｄ−グルコサミン残基のＮ−硫酸化、（４）ヘキスロン酸残基のＣ５−エピメリ化、（５）ヘキスロン酸残基の２−Ｏ−硫酸化、（６）α−Ｄ−グルコサミン残基の６−Ｏ−硫酸化、および（７）α−Ｄ−グルコサミン残基の３−Ｏ−硫酸化を含む処理に供して、ヘパラン硫酸を生成することを含み、
（Ｉ）ヘキスロン酸残基の２−Ｏ−硫酸化が、下記：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列；または
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列；あるいは
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列における６９番目から３５６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号２のアミノ酸配列における６９番目から３５６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列；または
（ｆ）配列番号２のアミノ酸配列における６９番目から３５６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列；
のいずれかのアミノ酸配列において、３２１番目のロイシン残基が塩基性アミノ酸残基に置換されており、かつ、２−Ｏ−硫酸転移活性を有する２−Ｏ−硫酸化酵素変異体の存在下で行われるか、あるいは
（ＩＩ）α−Ｄ−グルコサミン残基の３−Ｏ−硫酸化が、下記：
（ａ’）配列番号８のアミノ酸配列；
（ｂ’）配列番号８のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列；または
（ｃ’）配列番号８のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列；あるいは
（ｄ’）配列番号８のアミノ酸配列における４８番目から３１１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
（ｅ’）配列番号８のアミノ酸配列における４８番目から３１１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列；または
（ｆ’）配列番号８のアミノ酸配列における４８番目から３１１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列；
のいずれかのアミノ酸配列において、
（ｉ）７７番目のメチオニン残基がリジン残基に置換されているか、
（ｉｉ）９６番目のトリプトファン残基がフェニルアラニン残基に置換されているか、
（ｉｉｉ）１２５番目のプロリン残基がアラニン残基に置換されているか、
（ｉｖ）１６４番目のバリン残基がイソロイシン残基に置換されているか、
（ｖ）１６７番目のアスパラギン残基がヒスチジン残基に置換されているか、
（ｖｉ）１７１番目のリジン残基がグルタミン残基に置換されているか、または
（ｖｉｉ）２５９番目のチロシン残基がフェニルアラニン残基に置換されており、かつ
３−Ｏ−硫酸転移活性を有する３−Ｏ−硫酸化酵素変異体の存在下で行われる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２−Ｏ−硫酸化酵素変異体、および３−Ｏ−硫酸化酵素変異体、ならびにそれらを用いる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘパリンは、ヘパラン硫酸の一種であり、抗凝固活性を有する化合物である。動物由来ヘパリンは、品質管理の面で問題があり、品質管理された非動物由来ヘパリンの製造開発が検討されてきた。非動物由来ヘパリンを製造する方法には、例えば、微生物を用いて生産されたヘパロサンを、硫酸化および異性化等の反応に供してヘパリンを製造する方法がある（特許文献１、２、非特許文献１〜３）。
【０００３】
ヘパリンを製造するための好ましい原料として、ヘパロサンが知られている。ヘパロサンは、β−Ｄ−グルクロン酸（ＧｌｃＡ）残基とＮ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基からなる二糖の繰り返し構造［→４）−β−Ｄ−ＧｌｃＡ−（１→４）−α−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→］より構成される多糖である。
【０００４】
ヘパロサンからヘパリンを製造する方法では、（１）α−Ｄ−グルコサミン残基のＮ−脱アセチル化、（２）低分子化（ｄｅｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）、（３）α−Ｄ−グルコサミン残基のＮ−硫酸化、（４）ヘキスロン酸残基のＣ５−エピメリ化（すなわち、β−Ｄ−グルクロン酸残基のα−Ｌ−イズロン酸残基への異性化）、（５）ヘキスロン酸残基（好ましくはα−Ｌ−イズロン酸残基）の２−Ｏ−硫酸化、（６）α−Ｄ−グルコサミン残基の６−Ｏ−硫酸化、（７）α−Ｄ−グルコサミン残基の３−Ｏ−硫酸化という、相互に入れ替え可能である一連の反応を必要とする方法が知られている（特許文献１、３〜５）。
【０００５】
これらの反応のうち、２−Ｏ−硫酸化の反応を触媒する酵素（２−ＯＳＴ）について、幾つかの知見が報告されている。例えば、ニワトリ由来２−ＯＳＴを用いた解析では、３量体が活性型であること、精製酵素中に凝集した多量体（非３量体）が存在すること、および３３２位のバリンの変異が３量体率（活性体率）を低下させることが報告されている（非特許文献４）。しかし、２−ＯＳＴについて、３量体率の向上や、それによって活性が向上した変異体は報告されていない。
【０００６】
また、３−Ｏ−硫酸化の反応を触媒する酵素（３−ＯＳＴ）についても、幾つかの知見が報告されている。例えば、マウス由来３−ＯＳＴのアイソフォームである３−ＯＳＴ−１について、結晶構造（非特許文献５）、Ｅ９０Ｑ変異体およびＲ２７６Ａ変異体（非特許文献６）、ならびにＥ７６Ａ変異体、Ｅ７６Ｑ変異体、Ｋ１２３Ａ変異体、Ｑ１６３Ａ変異体、Ｈ２７１Ａ変異体等の種々の変異体（非特許文献７）が報告されている。しかし、３−ＯＳＴについて、活性が向上した変異体は殆ど報告されていない。例えば、非特許文献７には、Ｈ２７１Ａ変異体のみが野生型酵素に比し１０９％という僅かに高い比活性を有することしか記載されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第８，２２７，４４９号
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１２／３２２１１４号明細書
【特許文献３】国際公開第２０１７／１１５６７４号
【特許文献４】国際公開第２０１７／１１５６７５号
【特許文献５】米国特許出願公開第２０１２／０３２２１１４号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｌｉｎｄａｈｌ  Ｕ．  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ４８（２）：３４９−３５２
【非特許文献２】Ｚｈａｎｇ  Ｚ．  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １３０（３９）：１２９９８−１３００７
【非特許文献３】Ｃｈｅｎ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２８０（５２）：４２８１７−２５
【非特許文献４】Ｂｅｔｈｅａ  ＨＮ  ｅｔ  ａｌ．，（２００８）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．  １０５（４８）：１８７２４−９
【非特許文献５】Ｍｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．  １０９（１４）：５２６５−７０
【非特許文献６】Ｍｕｎｏｚ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４５：５１２２−２８
【非特許文献７】Ｅｄａｖｅｔｔａｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ  ＢＩＯＬ  ＣＨＥＭ．  ２７９（２４）：２５７８９−９７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の第１の目的は、高い活性を示す２−ＯＳＴ変異体、および当該２−ＯＳＴ変異体を用いた２−Ｏ−硫酸化方法を提供することである。
【００１０】
本発明の第２の目的は、高い活性を示す３−ＯＳＴ変異体、および当該３−ＯＳＴ変異体を用いた３−Ｏ−硫酸化方法を提供することである。
【００１１】
本発明の第３の目的は、上記硫酸化方法を利用した、ヘパリン等のヘパラン硫酸の製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、鋭意検討した結果、３２１位のロイシン残基を塩基性アミノ酸残基に置換した２−ＯＳＴ変異体が３量体率の向上により高い活性を示すことを見出した。本発明者らはまた、７７位、１２５位または１６４位のアミノ酸残基を特定のアミノ酸残基に置換した３−ＯＳＴ−１変異体が高い活性を示すことを見出した。したがって、本発明者らは、効率的な２−Ｏ−および３−Ｏ−硫酸化方法、ならびにこれらの硫酸化方法を利用したヘパラン硫酸の製造方法を提供することに成功し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕下記：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列；または
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列；あるいは
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列における６９番目から３５６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号２のアミノ酸配列における６９番目から３５６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列；または
（ｆ）配列番号２のアミノ酸配列における６９番目から３５６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
のいずれかのアミノ酸配列において、３２１番目のロイシン残基が塩基性アミノ酸残基に置換されており、かつ、２−Ｏ−硫酸転移活性を有する２−Ｏ−硫酸化酵素変異体。
〔２〕塩基性アミノ酸残基が、アルギニン残基またはリジン残基である、〔１〕の２−Ｏ−硫酸化酵素変異体。
〔３〕ヘキスロン酸残基の２位の水酸基が硫酸化された修飾ヘパロサン化合物の製造方法であって、
２−Ｏ−硫酸化酵素変異体の存在下において、ヘパロサン化合物を、ヘキスロン酸残基の２位の水酸基が硫酸化された修飾ヘパロサン化合物に変換することを含み、
２−Ｏ−硫酸化酵素変異体が、下記：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列；または
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列；あるいは
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列における６９番目から３５６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号２のアミノ酸配列における６９番目から３５６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列；または
（ｆ）配列番号２のアミノ酸配列における６９番目から３５６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
のいずれかのアミノ酸配列において、３２１番目のロイシン残基が塩基性アミノ酸残基に置換されており、かつ、２−Ｏ−硫酸転移活性を有する２−Ｏ−硫酸化酵素変異体である、方法。
〔４〕前記ヘパロサン化合物が、Ｎ−硫酸化ヘパロサン、Ｎ−硫酸化エピメリ化ヘパロサン、Ｎ−硫酸化低分子化ヘパロサン、またはＮ−硫酸化エピメリ化低分子化ヘパロサンである、〔３〕の方法。
〔５〕前記２−Ｏ−硫酸化酵素変異体を産生する形質転換微生物、またはその抽出物の存在下において、ヘキスロン酸残基の２位の水酸基が硫酸化されたヘパロサン化合物が製造される、〔３〕または〔４〕の方法。
〔６〕前記形質転換微生物がエシェリヒア属細菌である、〔５〕の方法。
〔７〕エシェリヒア属細菌がエシェリヒア・コリである、〔６〕の方法。
〔８〕下記：
（ａ’）配列番号８のアミノ酸配列；
（ｂ’）配列番号８のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列；または
（ｃ’）配列番号８のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列；あるいは
（ｄ’）配列番号８のアミノ酸配列における４８番目から３１１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
（ｅ’）配列番号８のアミノ酸配列における４８番目から３１１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列；または
（ｆ’）配列番号８のアミノ酸配列における４８番目から３１１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
のいずれかのアミノ酸配列において、
（ｉ）７７番目のメチオニン残基がリジン残基に置換されているか、
（ｉｉ）９６番目のトリプトファン残基がフェニルアラニン残基に置換されているか、
（ｉｉｉ）１２５番目のプロリン残基がアラニン残基に置換されているか、
（ｉｖ）１６４番目のバリン残基がイソロイシン残基に置換されているか、
（ｖ）１６７番目のアスパラギン残基がヒスチジン残基に置換されているか、
（ｖｉ）１７１番目のリジン残基がグルタミン残基に置換されているか、または
（ｖｉｉ）２５９番目のチロシン残基がフェニルアラニン残基に置換されており、かつ
３−Ｏ−硫酸転移活性を有する３−Ｏ−硫酸化酵素変異体。
〔９〕α−Ｄ−グルコサミン残基の３位の水酸基が硫酸化された修飾ヘパロサン化合物の製造方法であって、
３−Ｏ−硫酸化酵素変異体の存在下において、ヘパロサン化合物を、α−Ｄ−グルコサミン残基の３位の水酸基が硫酸化された修飾ヘパロサン化合物に変換することを含み、
３−Ｏ−硫酸化酵素変異体が、下記：
（ａ’）配列番号８のアミノ酸配列；
（ｂ’）配列番号８のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列；または
（ｃ’）配列番号８のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列；あるいは
（ｄ’）配列番号８のアミノ酸配列における４８番目から３１１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
（ｅ’）配列番号８のアミノ酸配列における４８番目から３１１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列；または
（ｆ’）配列番号８のアミノ酸配列における４８番目から３１１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
のいずれかのアミノ酸配列において、
（ｉ）７７番目のメチオニン残基がリジン残基に置換されているか、
（ｉｉ）９６番目のトリプトファン残基がフェニルアラニン残基に置換されているか、
（ｉｉｉ）１２５番目のプロリン残基がアラニン残基に置換されているか、
（ｉｖ）１６４番目のバリン残基がイソロイシン残基に置換されているか、
（ｖ）１６７番目のアスパラギン残基がヒスチジン残基に置換されているか、
（ｖｉ）１７１番目のリジン残基がグルタミン残基に置換されているか、または
（ｖｉｉ）２５９番目のチロシン残基がフェニルアラニン残基に置換されており、かつ
３−Ｏ−硫酸転移活性を有する３−Ｏ−硫酸化酵素変異体である、方法。
〔１０〕前記ヘパロサン化合物が、Ｎ−硫酸化６−Ｏ−硫酸化ヘパロサン、Ｎ−硫酸化６−Ｏ−硫酸化エピメリ化ヘパロサン、Ｎ−硫酸化２−Ｏ−硫酸化６−Ｏ−硫酸化ヘパロサン、Ｎ−硫酸化２−Ｏ−硫酸化６−Ｏ−硫酸化エピメリ化低分子化ヘパロサン、Ｎ−硫酸化６−Ｏ−硫酸化低分子化ヘパロサン、Ｎ−硫酸化６−Ｏ−硫酸化エピメリ化低分子化ヘパロサン、Ｎ−硫酸化２−Ｏ−硫酸化６−Ｏ−硫酸化低分子化ヘパロサン、またはＮ−硫酸化２−Ｏ−硫酸化６−Ｏ−硫酸化エピメリ化低分子化ヘパロサンである、〔９〕の方法。
〔１１〕前記３−Ｏ−硫酸化酵素変異体を産生する形質転換微生物、またはその抽出物の存在下において、α−Ｄ−グルコサミン残基の３位の水酸基が硫酸化された修飾ヘパロサン化合物が製造される、〔９〕または〔１０〕の方法。
〔１２〕前記形質転換微生物がエシェリヒア属細菌である、〔１１〕の方法。
〔１３〕エシェリヒア属細菌がエシェリヒア・コリである、〔１２〕の方法。
〔１４〕ヘパラン硫酸の製造方法であって、
ヘパロサンを、（１）α−Ｄ−グルコサミン残基のＮ−脱アセチル化、（２）低分子化、（３）α−Ｄ−グルコサミン残基のＮ−硫酸化、（４）ヘキスロン酸残基のＣ５−エピメリ化、（５）ヘキスロン酸残基の２−Ｏ−硫酸化、（６）α−Ｄ−グルコサミン残基の６−Ｏ−硫酸化、および（７）α−Ｄ−グルコサミン残基の３−Ｏ−硫酸化を含む処理に供して、ヘパラン硫酸を生成することを含み、
（Ｉ）ヘキスロン酸残基の２−Ｏ−硫酸化が、下記：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列；または
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列；あるいは
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列における６９番目から３５６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号２のアミノ酸配列における６９番目から３５６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列；または
（ｆ）配列番号２のアミノ酸配列における６９番目から３５６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
のいずれかのアミノ酸配列において、３２１番目のロイシン残基が塩基性アミノ酸残基に置換されており、かつ、２−Ｏ−硫酸転移活性を有する２−Ｏ−硫酸化酵素変異体の存在下で行われるか、あるいは
（ＩＩ）α−Ｄ−グルコサミン残基の３−Ｏ−硫酸化が、下記：
（ａ’）配列番号８のアミノ酸配列；
（ｂ’）配列番号８のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列；または
（ｃ’）配列番号８のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列；あるいは
（ｄ’）配列番号８のアミノ酸配列における４８番目から３１１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
（ｅ’）配列番号８のアミノ酸配列における４８番目から３１１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列；または
（ｆ’）配列番号８のアミノ酸配列における４８番目から３１１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
のいずれかのアミノ酸配列において、
（ｉ）７７番目のメチオニン残基がリジン残基に置換されているか、
（ｉｉ）９６番目のトリプトファン残基がフェニルアラニン残基に置換されているか、
（ｉｉｉ）１２５番目のプロリン残基がアラニン残基に置換されているか、
（ｉｖ）１６４番目のバリン残基がイソロイシン残基に置換されているか、
（ｖ）１６７番目のアスパラギン残基がヒスチジン残基に置換されているか、
（ｖｉ）１７１番目のリジン残基がグルタミン残基に置換されているか、または
（ｖｉｉ）２５９番目のチロシン残基がフェニルアラニン残基に置換されており、かつ
３−Ｏ−硫酸転移活性を有する３−Ｏ−硫酸化酵素変異体の存在下で行われる、方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の２−Ｏ−硫酸化酵素変異体および３−Ｏ−硫酸化酵素変異体は、高い活性を示すことから、目的物質の製造プロセスにおいて好適に用いることができる。
本発明の変異体を用いる本発明の方法によれば、目的物質を効率的に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、ヘパロサンからヘパリンを製造する方法の好ましい例を示す図である（例、国際公開第２０１７／１１５６７４号、国際公開第２０１７／１１５６７５号）。ヘパロサンは、Ｄ−グルクロン酸（ＧｌｃＡ）残基とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基からなる二糖の繰り返し構造［→４）−β−Ｄ−ＧｌｃＡ−（１→４）−α−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→］より構成される多糖である。（１）α−Ｄ−グルコサミン残基のＮ−脱アセチル化は、ヘパロサン中のα−Ｄ−グルコサミン残基のＮ−アセチル基をＮ−脱アセチル化（例、部分的Ｎ−脱アセチル化）してアミノ基を生成する反応である。（２）低分子化（ｄｅｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）は、ヘパロサンを分解して、より低分子量のヘパロサンを生成する反応である。（３）α−Ｄ−グルコサミン残基のＮ−硫酸化は、ヘパロサン中のα−Ｄ−グルコサミン残基のアミノ基を硫酸化する反応である。（４）ヘキスロン酸残基のＣ５−エピメリ化は、ヘパロサン中のβ−Ｄ−グルクロン酸残基を、エピマーであるα−Ｌ−イズロン酸（ＩｄｏＡ）残基に異性化する反応である。（５）ヘキスロン酸残基の２−Ｏ−硫酸化は、ヘパロサン中のヘキスロン酸残基（好ましくはα−Ｌ−イズロン酸残基）中の２位の水酸基を硫酸化する反応である。（６）α−Ｄ−グルコサミン残基の６−Ｏ−硫酸化は、ヘパロサン中のα−Ｄ−グルコサミン残基の６位の水酸基を硫酸化する反応である。（７）α−Ｄ−グルコサミン残基の３−Ｏ−硫酸化は、ヘパロサン中のα−Ｄ−グルコサミン残基の３位の水酸基を硫酸化する反応である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
１．変異体
（１−１）２−Ｏ−硫酸化酵素変異体
本発明は、下記（ａ）〜（ｆ）のいずれかのアミノ酸配列において、３２１番目のロイシン残基が塩基性アミノ酸残基に置換されており、かつ、２−Ｏ−硫酸転移活性を有する２−Ｏ−硫酸化酵素変異体を提供する。
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列；または
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列；あるいは
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列における６９番目から３５６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号２のアミノ酸配列における６９番目から３５６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列；または
（ｆ）配列番号２のアミノ酸配列における６９番目から３５６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列。
【００１７】
（ａ）〜（ｃ）は、チャイニーズハムスター由来２−Ｏ硫酸化酵素（２−ＯＳＴ）の全長アミノ酸配列に対応する配列番号２で特定される。（ｄ）〜（ｆ）は、チャイニーズハムスター由来２−ＯＳＴの触媒部位（配列番号２におけるＡｓｐ６９−Ａｓｎ３５６）で特定される。
【００１８】
３２１番目のロイシン残基が置換されるべき塩基性アミノ酸残基は、アルギニン残基、リジン残基、またはヒスチジン残基であるが、アルギニン残基、またはリジン残基が好ましく、アルギニン残基がより好ましい。
【００１９】
（ｂ）、（ｃ）、（ｅ）および（ｆ）は、所定の部位に所望の変異をさらに有していてもよい。例えば、２−ＯＳＴについて、配列番号２のアミノ酸配列における９４番目のチロシン残基が、アラニン残基、イソロイシン残基、グリシン残基、フェニルアラニン残基、またはグルタミン酸残基に置換されている場合、β−Ｄ−グルクロン酸残基（ヘキスロン酸残基）よりもα−Ｌ−イズロン酸残基（ヘキスロン酸残基）の２位の水酸基を優先的に硫酸化できること（すなわち、基質特異性の変化）が報告されている（Ｌｉ  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８５（１５）：１１１０６−１１１１３）。３２１番目のロイシン残基の塩基性アミノ酸残基への置換は、３量体率の向上により活性を改善するものであり、基質特異性には影響し得ない変異である。したがって、本発明の２−Ｏ−硫酸化酵素変異体は、３２１番目のロイシン残基の塩基性アミノ酸残基への置換に加えて、このような変異をさらに有することもまた好ましい。
【００２０】
用語「２−Ｏ−硫酸転移活性」とは、ヘキスロン酸残基の２位の水酸基に対して、硫酸基供与体（例、３’−ホスホアデノシン−５’−ホスホサルフェート（ＰＡＰＳ））からの硫酸基を転移して、ヘキスロン酸残基の２位において「−Ｏ−硫酸基」の構造を生成する活性をいう。ヘキスロン酸残基としては、例えば、α−Ｌ−イズロン酸残基、β−Ｄ−グルクロン酸残基が挙げられるが、α−Ｌ−イズロン酸残基が好ましい。
【００２１】
２−Ｏ−硫酸転移活性の評価は、適宜行うことができる。例えば、２−Ｏ−硫酸転移活性の評価は、実施例に記載されるように、２−Ｏ−硫酸転移活性を測定し、次いで、二糖組成分析により２−Ｏ−硫酸化率を決定することにより行われてもよい。より具体的には、２−Ｏ−硫酸転移活性の測定は、反応液（２ｍｇ／ｍＬ  ヘパロサン化合物（基質）、０．６ｍＭ  ＰＡＰＳ（硫酸基供与体）、５０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ７．０））に変異体含有液を１．９％添加し、３７℃で３０分間反応を行い、２倍量の２．０Ｍ  クエン酸水溶液と混合し、９５℃、１５分間の熱処理により反応を停止することにより行うことができる。変異体含有液としては、例えば、精製酵素液、無細胞抽出液を利用することができる。ヘパロサン化合物（基質）としては、後述するものを用いることができるが、Ｎ−硫酸化ヘパロサン、もしくはエピメリ化ヘパロサン、またはＮ−硫酸化エピメリ化ヘパロサンが好ましい。これらのヘパロサンは、低分子化されていてもよい。ヘパロサン化合物（基質）は、Ｎ−硫酸化エピメリ化低分子化ヘパロサンであってもよい。
【００２２】
（１−２）３−Ｏ−硫酸化酵素変異体
本発明はまた、下記（ａ’）〜（ｆ’）のいずれかのアミノ酸配列において、
（ｉ）７７番目のメチオニン残基がリジン残基に置換されているか、
（ｉｉ）９６番目のトリプトファン残基がフェニルアラニン残基に置換されているか、
（ｉｉｉ）１２５番目のプロリン残基がアラニン残基に置換されているか、
（ｉｖ）１６４番目のバリン残基がイソロイシン残基に置換されているか、
（ｖ）１６７番目のアスパラギン残基がヒスチジン残基に置換されているか、
（ｖｉ）１７１番目のリジン残基がグルタミン残基に置換されているか、または
（ｖｉｉ）２５９番目のチロシン残基がフェニルアラニン残基に置換されており、かつ
３−Ｏ−硫酸転移活性を有する３−Ｏ−硫酸化酵素変異体を提供する。
（ａ’）配列番号８のアミノ酸配列；
（ｂ’）配列番号８のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列；または
（ｃ’）配列番号８のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列；あるいは
（ｄ’）配列番号８のアミノ酸配列における４８番目から３１１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
（ｅ’）配列番号８のアミノ酸配列における４８番目から３１１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列；または
（ｆ’）配列番号８のアミノ酸配列における４８番目から３１１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列。
【００２３】
（ａ’）〜（ｃ’）は、マウス由来３−ＯＳＴのアイソフォーム（３−ＯＳＴ−１）の全長アミノ酸配列に対応する配列番号８で特定される。（ｄ’）〜（ｆ’）は、マウス由来３−ＯＳＴ−１の触媒部位（配列番号８におけるＧｌｙ４８−Ｈｉｓ３１１）で特定される。
【００２４】
用語「３−Ｏ−硫酸転移活性」とは、α−Ｄ−グルコサミン残基の３位の水酸基に対して、硫酸基供与体（例、ＰＡＰＳ）からの硫酸基を転移して、α−Ｄ−グルコサミン残基の３位において「−Ｏ−硫酸基」の構造を生成する活性をいう。
【００２５】
３−Ｏ−硫酸転移活性の評価は、適宜行うことができる。例えば、３−Ｏ−硫酸転移活性の評価は、実施例に記載されるように、３−Ｏ−硫酸転移活性を測定し、次いで、二糖組成分析により３−Ｏ−硫酸化率を決定することにより行われてもよい。より具体的には、３−Ｏ−硫酸転移活性の測定は、１g／Ｌ  ヘパロサン化合物（基質）、１．２５ｍＭ  ＰＡＰＳ（硫酸基供与体）、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）の混合液８０μＬ（水浴中で予め３７℃に保温）に、変異体含有液２０μＬを添加することにより、３７℃で酵素反応を開始させ、１時間経過後に１００℃３分加熱し酵素を失活させることにより、行われてもよい。変異体含有液としては、例えば、精製酵素液、無細胞抽出液を利用することができる。ヘパロサン化合物（基質）としては、後述するものを用いることができるが、Ｎ−硫酸化ヘパロサン、もしくは６−Ｏ硫酸化ヘパロサン、またはＮ−硫酸化６−Ｏ硫酸化ヘパロサンが好ましい。これらのヘパロサンは、低分子化されていてもよい。ヘパロサン化合物（基質）は、Ｎ−硫酸化６−Ｏ硫酸化低分子化ヘパロサンがであってもよい。
【００２６】
（１−３）変異体に関する一般的な説明
（ｂ）、（ｅ）、（ｂ’）または（ｅ’）のアミノ酸配列では、アミノ酸残基の欠失、置換、付加および挿入からなる群より選ばれる１、２、３または４種の変異により、１個または数個のアミノ酸残基が改変され得る。アミノ酸残基の変異は、アミノ酸配列中の１つの領域に導入されてもよいが、複数の異なる領域に導入されてもよい。用語「１個または数個」は、タンパク質の活性を大きく損なわない個数を示す。用語「１個または数個」が示す数は、例えば、１〜１００個、好ましくは１〜８０個、より好ましくは１〜５０個、さらにより好ましくは１〜４０個、特に好ましくは１〜３０個、１〜２０個、１〜１０個または１〜５個（例、１個、２個、３個、４個、または５個）である。
【００２７】
（ｃ）、（ｆ）、（ｃ’）または（ｆ’）のアミノ酸配列に対する同一性％は、９０％以上である。好ましくは、同一性は、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上であってもよい。より具体的には、ポリペプチド（タンパク質）の同一性％の算出は、アルゴリズムｂｌａｓｔｐにより行うことができる。ポリペプチドの同一性％の算定は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）において提供されているアルゴリズムｂｌａｓｔｐにおいて、デフォルト設定のＳｃｏｒｉｎｇ  Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ（Ｍａｔｒｉｘ：ＢＬＯＳＵＭ６２；Ｇａｐ  Ｃｏｓｔｓ：Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ＝１１  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ＝１；Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  Ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔｓ：Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ｓｃｏｒｅ  ｍａｔｒｉｘ  ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ）を用いて行うことができる。ポリヌクレオチド（遺伝子）の同一性％の算定は、アルゴリズムｂｌａｓｔｎにより行うことができる。より具体的には、ポリヌクレオチドの同一性％の算定は、ＮＣＢＩにおいて提供されているアルゴリズムｂｌａｓｔｎにおいて、デフォルト設定のＳｃｏｒｉｎｇ  Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ（Ｍａｔｃｈ／Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｓｃｏｒｅｓ＝１，−２；Ｇａｐ  Ｃｏｓｔｓ＝Ｌｉｎｅａｒ）を用いて行うことができる。
【００２８】
（ｂ）、（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｂ’）、（ｃ’）、（ｅ’）または（ｆ’）に対応する変異体は、目的物質の生成に優れ得るという特性を有する。例えば、（ｂ）および（ｃ）に対応する変異体は、特定の測定条件で活性を測定した場合、（ａ）に対応する変異体の活性を基準として、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９４％以上、９６％以上、９８％以上、または同等以上の活性を有することが好ましい。（ｅ）および（ｆ）に対応する変異体は、特定の測定条件で活性を測定した場合、（ｄ）に対応する変異体の活性を基準として、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９４％以上、９６％以上、９８％以上、または同等以上の活性を有することが好ましい。（ｂ’）および（ｃ’）に対応する変異体は、特定の測定条件で活性を測定した場合、（ａ’）に対応する変異体の活性を基準として、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９４％以上、９６％以上、９８％以上、または同等以上の活性を有することが好ましい。（ｅ’）および（ｆ’）に対応する変異体はそれぞれ、特定の測定条件で活性を測定した場合、（ｄ’）に対応する変異体の活性を基準として、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９４％以上、９６％以上、９８％以上、または同等以上の活性を有することが好ましい。このような特定の測定条件として、上述した条件を利用することができる。
【００２９】
（ｂ）、（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｂ’）、（ｃ’）、（ｅ’）または（ｆ’）のアミノ酸配列には、目的特性を保持し得る限り、触媒ドメイン中の部位、および触媒ドメイン以外の部位に、変異が導入されていてもよい。目的特性を保持し得る、変異が導入されてもよいアミノ酸残基の位置は、当業者に明らかである。具体的には、当業者は、１）同種の特性を有する複数のタンパク質のアミノ酸配列を比較し、２）相対的に保存されている領域、および相対的に保存されていない領域を明らかにし、次いで、３）相対的に保存されている領域および相対的に保存されていない領域から、それぞれ、機能に重要な役割を果たし得る領域および機能に重要な役割を果たし得ない領域を予測できるので、構造・機能の相関性を認識できる。したがって、当業者は、アミノ酸配列において変異が導入されてもよいアミノ酸残基の位置を特定できる。
【００３０】
アミノ酸残基が置換により変異される場合、アミノ酸残基の置換は、保存的置換であってもよい。用語「保存的置換」とは、所定のアミノ酸残基を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換することをいう。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で周知である。例えば、このようなファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β位分岐側鎖を有するアミノ酸（例、スレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖を有するアミノ酸（例、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）、ヒドロキシル基（例、アルコール性、フェノール性）含有側鎖を有するアミノ酸（例、セリン、スレオニン、チロシン）、および硫黄含有側鎖を有するアミノ酸（例、システイン、メチオニン）が挙げられる。好ましくは、アミノ酸の保存的置換は、アスパラギン酸とグルタミン酸との間での置換、アルギニンとリジンとヒスチジンとの間での置換、トリプトファンとフェニルアラニンとの間での置換、フェニルアラニンとバリンとの間での置換、ロイシンとイソロイシンとアラニンとの間での置換、およびグリシンとアラニンとの間での置換であってもよい。
【００３１】
本発明で用いられる変異体はまた、異種部分とペプチド結合を介して連結された融合タンパク質であってもよい。このような異種部分としては、例えば、目的タンパク質（変異体）の精製を容易にするペプチド成分（例、ヒスチジンタグ、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ  ＩＩ等のタグ部分；グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質、およびこれらの変異型等の目的タンパク質の精製に利用されるタンパク質）、目的タンパク質の可溶性を向上させるペプチド成分（例、Ｎｕｓ−ｔａｇ）、シャペロンとして働くペプチド成分（例、トリガーファクター）、他の機能を有するペプチド成分（例、全長タンパク質またはその一部）、ならびにリンカーが挙げられる。
【００３２】
（ａ）〜（ｆ）、および（ａ’）〜（ｆ’）のアミノ酸配列としては、例えば、天然タンパク質、天然に生じるそのホモログ、または人為的に作出された変異タンパク質のアミノ酸配列が挙げられる。変異タンパク質は、例えば、目的タンパク質をコードするＤＮＡに変異を導入し、得られた変異ＤＮＡを用いて変異タンパク質を産生させることにより、得ることができる。変異導入法としては、例えば、部位特異的変異導入、ならびに無作為変異導入処理（例、変異剤による処理、および紫外線照射）が挙げられる。
【００３３】
２．変異体を用いた目的物質の製造方法
（２−１）ヘパロサン化合物
本発明の製造方法では、ヘパロサン化合物を出発物質として用いることにより所定の目的物質を製造することができる。
【００３４】
本発明において、用語「ヘパロサン化合物」とは、ヘパロサン、またはヘパロサン誘導体を意味する。
【００３５】
ヘパロサンは、β−Ｄ−グルクロン酸（ＧｌｃＡ）残基とＮ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基からなる二糖の繰り返し構造［→４）−β−Ｄ−ＧｌｃＡ−（１→４）−α−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→］より構成される多糖である。ヘパロサンは、例えば、ヘパロサン生産能を有する微生物を利用した発酵法により調製することができる（例、国際公開第２０１５／０５０１８４号）。
【００３６】
本発明において、用語「ヘパロサン誘導体」とは、以下（１）〜（７）からなる群より選ばれる１以上（例、１、２、３、４、５、６または７）の修飾を有するヘパロサンをいう：
（１）α−Ｄ−グルコサミン残基のＮ−脱アセチル化；
（２）低分子化（ｄｅｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）；
（３）α−Ｄ−グルコサミン残基のＮ−硫酸化；
（４）ヘキスロン酸残基のＣ５−エピメリ化；
（５）ヘキスロン酸残基の２−Ｏ−硫酸化；
（６）α−Ｄ−グルコサミン残基の６−Ｏ−硫酸化；または
（７）α−Ｄ−グルコサミン残基の３−Ｏ−硫酸化。
これらの修飾様式の詳細は、図面の簡単な説明に記載したとおりである。このようなヘパロサン誘導体は、後述する処理により調製することができる。
【００３７】
本発明において、用語「ヘキスロン酸」（ＨｅｘＡ）は、β−Ｄ−グルクロン酸（ＧｌｃＡ）またはα−Ｌ−イズロン酸（ＩｄｏＡ）を意味する。（４）の「ヘキスロン酸残基のＣ５−エピメリ化」における「ヘキスロン酸残基」としては、β−Ｄ−グルクロン酸が好ましい。したがって、（４）のＣ５−エピメリ化では、β−Ｄ−グルクロン酸の異性化によりα−Ｌ−イズロン酸が生成することが好ましい。また、（５）の「ヘキスロン酸残基の２−Ｏ−硫酸化」における「ヘキスロン酸残基」としては、α−Ｌ−イズロン酸が好ましい。したがって、（５）の２−Ｏ−硫酸化では、ヘキスロン酸残基としてα−Ｌ−イズロン酸の２位の水酸基が硫酸化されることが好ましい。
【００３８】
（２−２）ヘキスロン酸残基の２位の水酸基が硫酸化された修飾ヘパロサン化合物の製造方法
本発明は、ヘキスロン酸残基の２位の水酸基が硫酸化された修飾ヘパロサン化合物の製造方法を提供する。本方法は、上述したような２−Ｏ−硫酸化酵素変異体の存在下において、ヘパロサン化合物を、ヘキスロン酸残基の２位の水酸基が硫酸化された修飾ヘパロサン化合物に変換することを含む。
【００３９】
一実施形態では、出発物質であるヘパロサン化合物は、Ｎ−硫酸化ヘパロサン化合物であってもよい。用語「Ｎ−硫酸化」とは、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基のアミノ基が硫酸化されていることを意味する。Ｎ−硫酸化ヘパロサン化合物は、上記（１）および（３）の双方の処理にヘパロサンを供することにより得ることができる。Ｎ−硫酸化ヘパロサン化合物は、上記（２）、（４）、（６）、（７）からなる群より選ばれる１以上（例、１、２、３、または４）の修飾をさらに有していてもよい。
【００４０】
別の実施形態では、出発物質であるヘパロサン化合物は、エピメリ化ヘパロサン化合物であってもよい。用語「エピメリ化」とは、ヘキスロン酸残基についてβ−Ｄ−グルクロン酸残基がα−Ｌ−イズロン酸残基に変換されていることを意味する。エピメリ化ヘパロサン化合物は、上記（４）の処理にヘパロサンを供することにより得ることができる。エピメリ化ヘパロサン化合物は、上記（１）〜（３）、（６）、（７）からなる群より選ばれる１以上（例、１、２、３、４、または５）の修飾をさらに有していてもよい。
【００４１】
さらに別の実施形態では、出発物質であるヘパロサン化合物は、低分子化ヘパロサン化合物であってもよい。用語「低分子化」とは、分子量が小さくなるように処理されることを意味する。例えば、「低分子化」ヘパロサン化合物は、プルランを標準としてＧＰＣにより測定される値として、１０００〜１５００００、好ましくは、８０００〜６００００の数平均分子量（Ｍｎ）、および２０００〜３０００００、好ましくは、１００００〜１０００００の重量平均分子量（Ｍｗ）を有する。低分子化ヘパロサン化合物は、上記（２）の処理にヘパロサンを供することにより得ることができる。低分子化ヘパロサン化合物は、上記（１）、（３）、（４）、（６）、（７）からなる群より選ばれる１以上（例、１、２、３、４、または５）の修飾をさらに有していてもよい。
【００４２】
特定の実施形態では、出発物質であるヘパロサン化合物は、Ｎ−硫酸化エピメリ化低分子化ヘパロサン化合物であってもよい。Ｎ−硫酸化エピメリ化低分子化ヘパロサン化合物における「Ｎ−硫酸化」、「エピメリ化」、および「低分子化」は、上述したとおりである。Ｎ−硫酸化エピメリ化低分子化ヘパロサン化合物は、上記（１）〜（４）の処理にヘパロサンを供することにより得ることができる。Ｎ−硫酸化エピメリ化低分子化ヘパロサン化合物は、上記（６）、（７）からなる群より選ばれる１以上（例、１、２）の修飾をさらに有していてもよい。
【００４３】
好ましい実施形態では、出発物質であるヘパロサン化合物は、Ｎ−硫酸化エピメリ化低分子化ヘパロサンであってもよい（実施例５（１）を参照）。Ｎ−硫酸化エピメリ化低分子化ヘパロサンにおける「Ｎ−硫酸化」、「エピメリ化」、および「低分子化」は、上述したとおりである。Ｎ−硫酸化エピメリ化低分子化ヘパロサンは、上記（１）〜（４）の処理にヘパロサンを供することにより得ることができる。Ｎ−硫酸化エピメリ化低分子化ヘパロサンは、上記（６）、（７）からなる群より選ばれる１以上（例、１、２）の修飾を有しない。
【００４４】
（２−３）α−Ｄ−グルコサミン残基の３位の水酸基が硫酸化された修飾ヘパロサン化合物の製造方法
本発明は、α−Ｄ−グルコサミン残基の３位の水酸基が硫酸化された修飾ヘパロサン化合物の製造方法を提供する。本方法は、上述したような３−Ｏ−硫酸化酵素変異体の存在下において、ヘパロサン化合物を、α−Ｄ−グルコサミン残基の３位の水酸基が硫酸化された修飾ヘパロサン化合物に変換することを含む。
【００４５】
一実施形態では、出発物質であるヘパロサン化合物は、上述したようなＮ−硫酸化ヘパロサン化合物であってもよい。Ｎ−硫酸化ヘパロサン化合物は、上記（２）、（４）〜（６）からなる群より選ばれる１以上（例、１、２、３、または４）の修飾をさらに有していてもよい。
【００４６】
別の実施形態では、出発物質であるヘパロサン化合物は、上述したようなエピメリ化ヘパロサン化合物であってもよい。エピメリ化ヘパロサン化合物は、上記（１）〜（３）、（５）、（６）からなる群より選ばれる１以上（例、１、２、３、４、または５）の修飾をさらに有していてもよい。
【００４７】
さらに別の実施形態では、出発物質であるヘパロサン化合物は、上述したような低分子化ヘパロサン化合物であってもよい。低分子化ヘパロサン化合物は、上記（１）、（３）、（４）〜（６）からなる群より選ばれる１以上（例、１、２、３、４、または５）の修飾をさらに有していてもよい。
【００４８】
さらに別の実施形態では、出発物質であるヘパロサン化合物は、２−Ｏ−硫酸化ヘパロサン化合物であってもよい。用語「２−Ｏ−硫酸化」とは、ヘキスロン酸残基（好ましくはα−Ｌ−イズロン酸残基）の２位の水酸基が硫酸化されていることを意味する。２−Ｏ−硫酸化ヘパロサン化合物は、上記（５）の処理にヘパロサンを供することにより得ることができる。２−Ｏ−硫酸化ヘパロサン化合物は、上記（１）〜（４）、（６）からなる群より選ばれる１以上（例、１、２、３、４、または５）の修飾をさらに有していてもよい。
【００４９】
さらに別の実施形態では、出発物質であるヘパロサン化合物は、６−Ｏ−硫酸化ヘパロサン化合物であってもよい。用語「６−Ｏ−硫酸化」とは、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基の６位の水酸基が硫酸化されていることを意味する。６−Ｏ−硫酸化ヘパロサン化合物は、上記（６）の処理にヘパロサンを供することにより得ることができる。６−Ｏ−硫酸化ヘパロサン化合物は、上記（１）〜（５）からなる群より選ばれる１以上（例、１、２、３、４、または５）の修飾をさらに有していてもよい。
【００５０】
特定の実施形態では、出発物質であるヘパロサン化合物は、Ｎ−硫酸化６−Ｏ−硫酸化低分子化ヘパロサン化合物であってもよい。Ｎ−硫酸化６−Ｏ−硫酸化低分子化ヘパロサン化合物における「Ｎ−硫酸化」、「６−Ｏ−硫酸化」、および「低分子化」は、上述したとおりである。Ｎ−硫酸化６−Ｏ−硫酸化低分子化ヘパロサン化合物は、上記（１）〜（３）、（６）の処理にヘパロサンを供することにより得ることができる。Ｎ−硫酸化６−Ｏ−硫酸化低分子化ヘパロサン化合物は、上記（４）、（５）からなる群より選ばれる１以上（例、１、２）の修飾をさらに有していてもよい。
【００５１】
好ましい実施形態では、出発物質であるヘパロサン化合物は、Ｎ−硫酸化６−Ｏ−硫酸化低分子化ヘパロサンであってもよい（実施例９（１）を参照）。Ｎ−硫酸化６−Ｏ−硫酸化低分子化ヘパロサンにおける「Ｎ−硫酸化」、「６−Ｏ−硫酸化」、および「低分子化」は、上述したとおりである。Ｎ−硫酸化６−Ｏ−硫酸化低分子化ヘパロサンは、上記（１）〜（３）、（６）の処理にヘパロサンを供することにより得ることができる。Ｎ−硫酸化６−Ｏ−硫酸化低分子化ヘパロサンは、上記（４）、（５）からなる群より選ばれる１以上（例、１、２）の修飾を有しない。
【００５２】
別の好ましい実施形態では、出発物質であるヘパロサン化合物は、Ｎ−硫酸化２−Ｏ−硫酸化６−Ｏ硫酸化エピメリ化低分子化ヘパロサンであってもよい。Ｎ−硫酸化２−Ｏ−硫酸化６−Ｏ硫酸化エピメリ化低分子化ヘパロサンにおける「Ｎ−硫酸化」、「２−Ｏ硫酸化」、「６−Ｏ−硫酸化」、「エピメリ化」、および「低分子化」は、上述したとおりである。Ｎ−硫酸化２−Ｏ−硫酸化６−Ｏ−硫酸化エピメリ化低分子化ヘパロサンは、上記（１）〜（６）の処理にヘパロサンを供することにより得ることができる。３−Ｏ−硫酸化酵素は、Ｎ−硫酸化２−Ｏ−硫酸化６−Ｏ−硫酸化エピメリ化低分子化ヘパロサンを基質として利用することができることが周知である（例、国際公開第２０１７／１１５６７４号、国際公開第２０１７／１１５６７５号）。したがって、本発明の３−Ｏ−硫酸化酵素変異体は、Ｎ−硫酸化２−Ｏ−硫酸化６−Ｏ−硫酸化エピメリ化低分子化ヘパロサンを基質として利用することができる。
【００５３】
（２−４）ヘパラン硫酸の製造方法
本発明は、ヘパラン硫酸（好ましくはヘパリン）の製造方法を提供する。本方法は、ヘパロサンを、（１）α−Ｄ−グルコサミン残基のＮ−脱アセチル化、（２）低分子化、（３）α−Ｄ−グルコサミン残基のＮ−硫酸化、（４）ヘキスロン酸残基のＣ５−エピメリ化、（５）ヘキスロン酸残基の２−Ｏ−硫酸化、（６）α−Ｄ−グルコサミン残基の６−Ｏ−硫酸化、および（７）α−Ｄ−グルコサミン残基の３−Ｏ−硫酸化を含む処理に供して、ヘパラン硫酸を生成することを含み、
（Ｉ）ヘキスロン酸残基の２−Ｏ−硫酸化が、上述したような２−Ｏ−硫酸化酵素変異体の存在下で行われるか、あるいは
（ＩＩ）α−Ｄ−グルコサミン残基の３−Ｏ−硫酸化が、上述したような３−Ｏ−硫酸化酵素変異体の存在下で行われることを特徴とする。
【００５４】
ヘパラン硫酸の製造方法において、上記（１）〜（７）によるヘパロサンの処理は、後述するような当該分野において周知の方法により行うことができる（例、国際公開第２０１７／１１５６７４号；国際公開第２０１７／１１５６７５号；米国特許第８，２２７，４４９号；米国特許出願公開第２０１２／３２２１１４号；Ｌｉｎｄａｈｌ  Ｕ．  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ４８（２）：３４９−３５２；Ｚｈａｎｇ  Ｚ．  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １３０（３９）：１２９９８−１３００７；Ｃｈｅｎ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００５  Ｄｅｃ  ３０；２８０（５２）：４２８１７−２５．）。
【００５５】
（１）α−Ｄ−グルコサミン残基のＮ−脱アセチル化は、例えば、脱アセチル化剤を利用して化学的に実施できる。脱アセチル化剤としては、例えば、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩およびヒドラジン等の塩基性物質が挙げられる。アルカリ金属塩としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化ルビジウムおよび水酸化セシウムが挙げられる。アルカリ土類金属塩としては、例えば、水酸化ベリリウム、水酸化マグネシウム、水酸化カルシウム、水酸化ストロンチウムおよび水酸化バリウムが挙げられる。
【００５６】
Ｎ−脱アセチル化としては、部分的Ｎ−脱アセチル化が好ましい。Ｎ−脱アセチル化は、例えば、Ｎ−アセチル基の残存率が下記のような値となるように実施することができる。すなわち、Ｎ−アセチル基の残存率は、例えば、１％以上、１．５％以上、３％以上、５％以上、７％以上、９％以上、または１１％以上であってもよく、５０％以下、４５％以下、４０％以下、３５％以下、３３％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、または１７％以下であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。Ｎ−アセチル基の残存率は、具体的には、例えば、１％〜３３％、７％〜３３％、７％〜３０％、または１１％〜１７％であってもよい。例えば、Ｎ−アセチル基の残存率７％〜３０％は、概ね、Ｎ−アセチル基が６〜２８糖残基に１つ（二糖単位として３〜１４単位に１つ）の比率で存在していることに相当する。また、例えば、Ｎ−アセチル基の残存率１１％〜１７％は、概ね、Ｎ−アセチル基が１２〜１８糖残基に１つ（二糖単位として６〜９単位に１つ）の比率で存在していることに相当する。Ｎ−脱アセチル化の程度（すなわちＮ−アセチル基の残存率）は、例えば、二糖分析により確認することができる。すなわち、Ｎ−アセチル基の残存率は、多糖を二糖分析に供した際の、二糖単位の総量に対する、Ｎ−アセチル基を有する二糖単位の量の比率（モル比）として算出することができる。
【００５７】
水酸化ナトリウムを利用した部分的Ｎ−脱アセチル化の条件としては、例えば、既報（Ｋｕｂｅｒａｎ  Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，２７８（５２）：５２６１３−５２６２１；ＵＳ２０１１２８１８２０Ａ１）の条件を参照することができる。ヒドラジンを利用した部分的Ｎ−脱アセチル化の条件としては、例えば、既報（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，１０（２０００）１５９−１７１；Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２９０（１９９６）８７−９６；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２１７（１９８４）１８７−１９７）の条件を参照することができる。
【００５８】
（２）低分子化は、ヘパリナーゼを利用して酵素的に実施することができる。ヘパリナーゼとしては、例えば、ヘパリナーゼＩ、ヘパリナーゼＩＩ、およびヘパリナーゼＩＩＩが挙げられるが、ヘパリナーゼＩＩＩが好ましい。低分子化は、低分子化後のヘパロサンが低分子化前のヘパロサンよりも分子量が小さくなるように処理される限り特に限定されないが、プルランを標準としてＧＰＣにより測定される値として、１０００〜１５００００、好ましくは、８０００〜６００００の数平均分子量（Ｍｎ）および２０００〜３０００００、好ましくは、１００００〜１０００００の重量平均分子量（Ｍｗ）となるように実施することができる。
【００５９】
好ましくは、低分子化は、ヘパリナーゼＩＩＩを用いて行われる。「ヘパリナーゼＩＩＩ」とは、ヘパロサン等のグリコサミノグリカンにおけるＮ−硫酸化またはＮ−アセチル化されたグルコサミン残基の部位を切断する酵素（典型的には、ＥＣ４．２．２．８）をいう。本発明において用いられるヘパリナーゼＩＩＩは、Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンの、Ｎ−アセチル基を有するグルコサミン残基の部位を優先的に切断できるものであれば、特に制限されない。
【００６０】
（３）α−Ｄ−グルコサミン残基のＮ−硫酸化は、ヘパロサン中のα−Ｄ−グルコサミン残基のアミノ基を硫酸化する工程である。Ｎ−硫酸化は、例えば、硫酸化試薬を利用して化学的に実施することができる。硫酸化試薬としては、例えば、三酸化硫黄ピリジン錯体（ＰｙＳＯ３）や三酸化硫黄トリメチルアミン錯体（ＴＭＡＳＯ３）等の三酸化硫黄錯体が挙げられる。
【００６１】
（４）ヘキスロン酸残基のＣ５−エピメリ化は、ヘパロサン中のβ−Ｄ−グルクロン酸残基の異性化によりα−Ｌ−イズロン酸残基を生成する工程である。Ｃ５−エピメリ化は、Ｃ５−エピメラーゼを用いて行うことができる。Ｃ５−エピメラーゼとしては、種々の哺乳類および細菌に由来するＣ５−エピメラーゼを用いることができる（米国特許第８，２２７，４４９号；米国特許出願公開第２０１２／３２２１１４号；国際公開第０２／４６３７９号；Ｌｉｎｄａｈｌ  Ｕ．  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ４８（２）：３４９−３５２；Ｚｈａｎｇ  Ｚ．  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １３０（３９）：１２９９８−１３００７；Ｃｈｅｎ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００５  Ｄｅｃ  ３０；２８０（５２）：４２８１７−２５；Ｊｏｈｎ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２０１３  Ａｕｇ  ２３；２８８（３４）：２４３３２−９）。
【００６２】
（５）ヘキスロン酸残基の２−Ｏ−硫酸化は、ヘパロサン中のヘキスロン酸残基（好ましくはα−Ｌ−イズロン酸残基）の２位の水酸基を硫酸化する工程である。２−Ｏ−硫酸化は、例えば、種々の２−Ｏ−硫酸化酵素（２−ＯＳＴ）を利用して酵素的に実施することができる（例、背景技術に挙げた文献を参照）。
【００６３】
（６）α−Ｄ−グルコサミン残基の６−Ｏ−硫酸化は、ヘパロサン中のα−Ｄ−グルコサミン残基の６位の水酸基を硫酸化する工程である。６−Ｏ−硫酸化は、例えば、６−Ｏ−硫酸化酵素（６−ＯＳＴ）を利用して酵素的に実施することができる。６−ＯＳＴとしては、例えば、６−ＯＳＴ−１、６−ＯＳＴ−２、６−ＯＳＴ−３が挙げられる。６−Ｏ−硫酸化はまた、例えば、硫酸化試薬を利用して化学的に実施することもできる。硫酸化試薬としては、例えば、三酸化硫黄ピリジン錯体（ＰｙＳＯ３）や三酸化硫黄トリメチルアミン錯体（ＴＭＡＳＯ３）等の三酸化硫黄錯体が挙げられる。
【００６４】
（７）α−Ｄ−グルコサミン残基の３−Ｏ−硫酸化は、ヘパロサン中のα−Ｄ−グルコサミン残基の３位の水酸基を硫酸化する工程である。３−Ｏ−硫酸化は、例えば、３−Ｏ−硫酸化酵素（３−ＯＳＴ）を利用して酵素的に実施することができる。３−ＯＳＴとしては、例えば、３−ＯＳＴ−１、３−ＯＳＴ−２、３−ＯＳＴ−３、３−ＯＳＴ−４、３−ＯＳＴ−５が挙げられる（例、背景技術に挙げた文献を参照）。
【００６５】
上記処理は、任意の順番で行うことができる。例えば、（２）低分子化は、上記（１）、（３）〜（７）による処理前後または途中に行うことができるが、上記（１）の後であって上記（３）の前に行われてもよい。また、上記（５）〜（７）の処理は、いずれの順序により行われてもよいが、代表的には、２−Ｏ−硫酸化、３−Ｏ−硫酸化、および６−Ｏ−硫酸化の順序、ならびに、２−Ｏ−硫酸化、６−Ｏ−硫酸化、および３−Ｏ−硫酸化の順序で行うことができる。上記処理はまた、番号順に行われてもよい（図１）。上記処理の２以上は、同時または別個に実施してもよい。
【００６６】
各工程による生成物は、各工程の反応液に含まれたまま次の工程に供してもよく、反応液から回収して次の工程に供してもよい。反応液から各生成物を回収する手段は、特に制限されない。各生成物を回収する手段としては、膜処理法や沈殿法等の、化合物の分離精製に用いられる公知の手法が挙げられる。各工程による生成物は、適宜、精製、希釈、濃縮、乾燥、溶解、酵素の失活等の処理に供してから、次の工程に供してもよい。精製は所望の程度に実施してよい。これらの処理は、単独で、あるいは適宜組み合わせて実施してよい。
【００６７】
（２−５）上記（２−２）〜（２−４）の方法の実施様式
上記（２−２）〜（２−４）の方法における各反応は、適切な系（例、緩衝液系、発酵系）において適宜行うことができる。これらの反応の条件としては、既報（例、上述した文献を参照）、または実施例に記載される条件を採用することができる。例えば、（２−２）および（２−３）の方法は、０．１〜５０ｇ／Ｌ  へパロサン化合物、０．０５〜１０ｍＭ  ＰＡＰＳを含む適切なｐＨ（例、５．０〜９．０）の緩衝液（例、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ）中において、適切な温度（例、２５〜４２℃）で所望の時間（例、１０分〜４８時間）反応させることにより、行うことができる。
【００６８】
一実施形態では、本発明の方法は、本発明の変異体（以下、必要に応じて「タンパク質」等と称する）自体を用いて行うことができる。例えば、本発明の変異体として組換えタンパク質を用いる場合、組換えタンパク質は、無細胞系ベクターを用いて、または本発明の変異体を産生する形質転換微生物から得ることができる。本発明の変異体は、未精製、粗精製または精製タンパク質として利用することができる。これらのタンパク質としては、反応において、固相に固定された固相化タンパク質として利用されてもよい。
【００６９】
形質転換微生物を培養するための培地は公知であり、例えば、ＬＢ培地などの栄養培地や、Ｍ９培地などの最小培地に炭素源、窒素源、ビタミン源等を添加して用いることができる。形質転換微生物は宿主に応じて、通常、１６〜４２℃、好ましくは２５〜３７℃で５〜１６８時間、好ましくは８〜７２時間培養される。宿主に依存して、振盪培養と静置培養のいずれも可能であるが、必要に応じて攪拌を行ってもよく、通気を行ってもよい。放線菌を発現宿主として選択する場合は、タンパク質を生産させるために使用し得る条件を適宜用いることが出来る。また、タンパク質の発現のために誘導型プロモーターを用いた場合は、培地にプロモーター誘導剤を添加して培養を行うこともできる。
【００７０】
産生されたタンパク質は、形質転換微生物の抽出物から公知の塩析、等電点沈殿法もしくは溶媒沈殿法等の沈殿法、透析、限外濾過もしくはゲル濾過等の分子量差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィー等の特異的親和性を利用する方法、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等の疎水度の差を利用する方法やその他アフィニティークロマトグラフィー、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法、等電点電気泳動法等、またはこれらの組み合わせにより、精製および単離することが可能である。目的タンパク質を分泌発現させた場合には、形質転換微生物を培養して得られた培養液から、菌体を遠心分離等で除くことでタンパク質を含む培養上清が得られる。この培養上清からもタンパク質を精製および単離することが可能である。
【００７１】
別の実施形態では、本発明の方法は、本発明の変異体を産生する形質転換微生物、またはその抽出物の存在下で行うことができる。
【００７２】
本発明の変異体を産生する微生物の抽出物としては、任意の方法により処理された、目的タンパク質を含有する処理液を使用することができる。このような処理としては、例えば、上述した単離および精製で言及した方法、ならびに微生物の死滅を可能にする殺微生物処理方法が挙げられる。殺微生物処理方法としては、微生物の死滅を可能にする任意の方法を用いることができるが、例えば、熱処理、酸性処理、アルカリ性処理、界面活性剤処理、および有機溶媒処理が挙げられる。
【００７３】
好ましい実施形態では、形質転換微生物は、本発明の変異体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドおよびそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現単位を含む宿主細胞である。
【００７４】
用語「発現単位」とは、タンパク質として発現されるべき所定のポリヌクレオチドおよびそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む、当該ポリヌクレオチドの転写、ひいては当該ポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の産生を可能にする最小単位をいう。発現単位は、ターミネーター、リボゾーム結合部位、および薬剤耐性遺伝子等のエレメントをさらに含んでいてもよい。発現単位は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいが、ＤＮＡであることが好ましい。
【００７５】
発現単位は、宿主細胞に対して同種（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）（すなわち、固有（ｉｎｈｅｒｅｎｔ））であっても、異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）（すなわち、非固有）であってもよいが、好ましくは異種発現単位である。用語「異種発現単位」とは、発現単位が宿主細胞に対して異種であることを意味する。したがって、本発明では、発現単位を構成する少なくとも１つのエレメントが宿主細胞に対して異種である。宿主細胞に対して異種である、発現単位を構成するエレメントとしては、例えば、上述したエレメントが挙げられる。好ましくは、異種発現単位を構成する、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチド、もしくはプロモーターの一方、または双方が、宿主細胞に対して異種である。したがって、本発明では、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチド、もしくはプロモーターの一方、または双方が、宿主細胞以外の生物（例、原核生物および真核生物、または微生物、昆虫、植物、および哺乳動物等の動物）もしくはウイルスに由来するか、または人工的に合成されたものである。あるいは、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドが、宿主細胞に対して異種であってもよい。好ましくは、目的タンパク質が、宿主細胞に対して異種である。
【００７６】
異種発現単位を構成するプロモーターは、その下流に連結されたポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質を宿主細胞で発現させることができるものであれば特に限定されない。例えば、プロモーターは、宿主細胞に対して同種であっても異種であってもよい。例えば、組換えタンパク質の産生に汎用される構成または誘導プロモーターを用いることができる。このようなプロモーターとしては、例えば、ＰｈｏＡプロモーター、ＰｈｏＣプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーター、Ｔ３プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター、ＳＰ６プロモーター、アラビノース誘導プロモーター、コールドショックプロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーターが挙げられる。好ましくは、宿主細胞で強力な転写活性を有するプロモーターを用いることができる。宿主細胞で強力な転写活性を有するプロモーターとしては、例えば、宿主細胞で高発現している遺伝子のプロモーター、およびウイルス由来のプロモーターが挙げられる。
【００７７】
本発明において、形質転換微生物として使用される宿主細胞としては、例えば、エシェリヒア属細菌（例、エシェリヒア・コリ）、放線菌およびコリネ型細菌を含む種々の微生物が挙げられる。本発明において宿主細胞として用いられるエシェリヒア・コリには一般にクローニングや異種タンパク質の発現によく利用される菌株、例えば、ＨＢ１０１、ＭＣ１０６１、ＪＭ１０９、ＣＪ２３６、ＭＶ１１８４が含まれる。本発明において宿主細胞として用いられる放線菌には一般に異種タンパク質の発現によく利用される菌株、例えば、Ｓ．リビダンス  ＴＫ２４やＳ．セリカラーＡ３（２）が含まれる。本発明において宿主細胞として用いられるコリネ型細菌とは好気性のグラム陽性桿菌であり、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが現在コリネバクテリウム属に統合された細菌を含み（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，４１，２５５（１９８１））、またコリネバクテリウム属と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌を含む。コリネ型細菌を使用することの利点には、これまでにタンパク質の分泌に好適とされてきたカビ、酵母やＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌と比べて本来的に菌体外に分泌されるタンパク質が極めて少なく、目的タンパク質を分泌生産した場合にその精製過程が簡略化、省略化できること、分泌生産した酵素を用いて酵素反応を行う場合には、培養上清を酵素源として用いることができるため、菌体成分、夾雑酵素等による不純物、副反応を低減させることができること、糖、アンモニアや無機塩等を含む単純な培地で容易に生育するため、培地代や培養方法、培養生産性の点で優れていることが含まれる。また、Ｔａｔ系分泌経路を利用することにより、これまでに知られていたＳｅｃ系分泌経路では分泌生産が困難なタンパク質であったイソマルトデキストラナーゼやプロテイングルタミナーゼ等産業上有用なタンパク質も効率良く分泌させることが可能である（国際公開第２００５／１０３２７８号）。その他、国際公開第０１／２３４９１号、国際公開第０２／０８１６９４号、国際公開第０１／２３４９１号等に開示されるコリネバクテリウム・グルタミカムを用いることもできる。
【００７８】
好ましくは、形質転換微生物は、エシェリヒア属細菌である。エシェリヒア属細菌としては、エシェリヒア・コリが好ましい。
【００７９】
本発明で用いられる形質転換微生物は、当該分野において公知の任意の方法により作製することができる。例えば、このような発現単位は、宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれた形態、または宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれていない形態（例、発現ベクターの状態）において、宿主細胞に含まれる。発現単位を含む宿主細胞は、当該分野において公知の任意の方法（例、コンピテント細胞法、エレクトロポレーション法）により、発現ベクターで宿主細胞を形質転換することにより得ることができる。発現ベクターが宿主細胞のゲノムＤＮＡと相同組換えを生じる組込み型（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ベクターである場合、発現単位は、形質転換により、宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれることができる。一方、発現ベクターが宿主細胞のゲノムＤＮＡと相同組換えを生じない非組込み型ベクターである場合、発現単位は、形質転換により、宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれず、宿主細胞内において、発現ベクターの状態のまま、ゲノムＤＮＡから独立して存在できる。あるいは、ゲノム編集技術（例、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ−Ｌｉｋｅ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ（ＴＡＬＥＮ））により発現単位を宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込むことが可能である。
【００８０】
本発明で用いられる発現ベクターは、発現単位として上述した最小単位に加えて、宿主細胞で機能するターミネーター、リボゾーム結合部位、および薬剤耐性遺伝子等のエレメントをさらに含んでいてもよい。薬剤耐性遺伝子としては、例えば、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬剤に対する耐性遺伝子が挙げられる。
【００８１】
発現ベクターはまた、宿主細胞のゲノムＤＮＡとの相同組換えのために、宿主細胞のゲノムとの相同組換えを可能にする領域をさらに含んでいてもよい。例えば、発現ベクターは、それに含まれる発現単位が一対の相同領域（例、宿主細胞のゲノム中の特定配列に対して相同なホモロジーアーム、ｌｏｘＰ、ＦＲＴ）間に位置するように設計されてもよい。発現単位が導入されるべき宿主細胞のゲノム領域（相同領域の標的）としては、特に限定されないが、宿主細胞において発現量が多い遺伝子のローカスであってもよい。
【００８２】
発現ベクターは、プラスミド、ウイルスベクター、ファージ、または人工染色体であってもよい。発現ベクターはまた、組込み型（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ベクターであっても非組込み型ベクターであってもよい。組込み型ベクターは、その全体が宿主細胞のゲノムに組み込まれるタイプのベクターであってもよい。あるいは、組込み型ベクターは、その一部（例、発現単位）のみが宿主細胞のゲノムに組み込まれるタイプのベクターであってもよい。発現ベクターはさらに、ＤＮＡベクター、またはＲＮＡベクター（例、レトロウイルス）であってもよい。発現ベクターはまた、汎用される発現ベクターを用いてもよい。このような発現ベクターとしては、例えば、ｐＵＣ（例、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８）、ｐＳＴＶ、ｐＢＲ（例、ｐＢＲ３２２）、ｐＨＳＧ（例、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８）、ＲＳＦ（例、ＲＳＦ１０１０）、ｐＡＣＹＣ（例、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４）、ｐＭＷ（例、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ２１９、ｐＭＷ２１８）、ｐＱＥ（例、ｐＱＥ３０）、およびその誘導体が挙げられる。また、コリネバクテリウム・グルタミカムのようなコリネ型細菌を宿主細胞として選択する場合、高コピーベクターであるｐＰＫ４などを好適に利用することができる。
【実施例】
【００８３】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００８４】
実施例１：Ｎ−硫酸化エピメリ化低分子化ヘパロサンの調製
（１）ヘパロサン発酵
ＷＯ２０１５／０５０１８４の実施例１に記載のヘパロサン生産菌（エシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＶＫ９−ｋｆｉＡＢＣＤ株）および培養条件にてヘパロサンを含有する培養液を得た。
【００８５】
（２）ヘパロサンの精製
培養液から遠心分離により培養上清を回収した。培地成分を除去するために１ｍＬの培養上清をＵＦ膜を用いてｍｉｌｌｉＱ水で洗浄し、２５０μＬまで濃縮した。ＵＦ膜濃縮液２５０μＬに５００μＬの１００％エタノールを加え、遠心分離によってヘパロサンを沈降させた。得られた沈殿を風乾させ、ヘパロサンを得た。残りの培養上清から同様の手順でヘパロサンを精製し、ヘパロサン計１０ｇを得た。
【００８６】
（３）ヘパロサンのＮ−脱アセチル化
先ず、ヘパロサン１．２２ｇにＨｙｄｒａｚｉｎｅ・Ｈ２Ｏ  ６１ｍＬおよび１Ｎ硫酸４．７ｍＬを添加し、気相を窒素置換後、１００℃に加温し、４．７５時間反応させた。
【００８７】
次に、氷冷により反応を停止させた後、１６％ＮａＣｌ水溶液６１ｍＬおよびＭｅＯＨ  ６１０ｍＬを添加して遠心し、上清を除去した。得られた沈殿をＨ２Ｏ  ５０ｍＬに溶解させた後、ＡｍｉｃｏｎＵＦ膜（３ｋＤａ）を用いて脱塩濃縮した。
【００８８】
次に、得られた濃縮液に２倍量のＨ２Ｏおよび等量の１Ｍ  ＮａＨＣＯ３を添加後、０．２Ｍ  Ｉ２／０．４Ｍ  ＫＩ溶液を黄色に呈色するまで滴下した。その後Ｈｙｄｒａｚｉｎｅ・Ｈ２Ｏを滴下し、余剰のヨウ素をヨウ素イオンに還元後、再度ＡｍｉｃｏｎＵＦ膜（３ｋＤａ）を用いて脱塩濃縮し、濃縮液を減圧乾固してＮ−脱アセチル化ヘパロサンを得た。得られたＮ−脱アセチル化ヘパロサンにおけるアセチル基の残存率は１４．９％であった（後述）。
【００８９】
（４）Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンの低分子化
（４−１）ヘパリナーゼＩＩＩの調製
＜Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来ｈｅｐＣ遺伝子の発現プラスミドの構築＞
Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈｅｐａｒｉｎｕｍ（ＡＴＣＣ１３１２５）よりヘパリナーゼＩＩＩをコードするｈｅｐＣ遺伝子をｐＭＩＶ−Ｐｎｌｐ０ベクター（米国特許出願公開２００５０１９６８４６号）にクローニングし、ｈｅｐＣ遺伝子の発現プラスミドｐＭＩＶ−Ｐｎｌｐ０−ｈｅｐＣを構築した。ｐＭＩＶ−Ｐｎｌｐ０−ｔｅｒには強力なｎｌｐ０プロモーター（Ｐｎｌｐ０）とｒｒｎＢターミネーターが組み込まれており、プロモーターとターミネーターの間に目的の遺伝子を挿入することで発現ユニットとして機能させることができる。「Ｐｎｌｐ０」はエシェリヒア・コリＫ−１２株由来の野生型ｎｌｐＤ遺伝子のプロモーターを示す。
【００９０】
発現プラスミドの構築の詳細を以下に示す。エシェリヒア・コリＭＧ１６５５の染色体ＤＮＡをテンプレートとして、プライマーＰ１（配列番号１１）及びプライマーＰ２（配列番号１２）を用いたＰＣＲによって、ｎｌｐＤ遺伝子のプロモーター領域（Ｐｎｌｐ０）約３００ｂｐを含むＤＮＡ断片を取得した。これらプライマーの５’末端には制限酵素ＳａｌＩ及びＰａｅＩのサイトがそれぞれデザインされている。ＰＣＲサイクルは次の通りであった。９５℃３分の後、９５℃６０秒、５０℃３０秒、７２℃４０秒を２サイクル、９４℃２０秒、５５℃２０秒、７２℃１５秒を２５サイクル、最後に７２℃５分。得られた断片をＳａｌＩ及びＰａｅＩで処理し、ｐＭＩＶ−５ＪＳ（特開２００８−０９９６６８号）のＳａｌＩ−ＰａｅＩサイトに挿入し、プラスミドｐＭＩＶ−Ｐｎｌｐ０を取得した。このｐＭＩＶ−Ｐｎｌｐ０プラスミドに挿入されたＰｎｌｐ０プロモーターのＰａｅＩ−ＳａｌＩ断片のヌクレオチド配列は配列番号１３に示したとおりである。
【００９１】
次に、ＭＧ１６５５の染色体ＤＮＡをテンプレートとして、プライマーＰ３（配列番号１４）及びプライマーＰ４（配列番号１５）を用いたＰＣＲによって、ｒｒｎＢ遺伝子のターミネーター領域約３００ｂｐを含むＤＮＡ断片（配列番号１６）を取得した。これらプライマーの５’末端には制限酵素ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩのサイトがそれぞれデザインされている。ＰＣＲサイクルは次の通りであった。９５℃３分の後、９５℃６０秒、５０℃３０秒、７２℃４０秒を２サイクル、９４℃２０秒、５９℃２０秒、７２℃１５秒を２５サイクル、最後に７２℃５分。得られた断片をＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで処理し、ｐＭＩＶ−Ｐｎｌｐ０のＸｂａＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入し、プラスミドｐＭＩＶ−Ｐｎｌｐ０−ｔｅｒを取得した。
【００９２】
次に、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈｅｐａｒｉｎｕｍ（ＡＴＣＣ１３１２５）のｈｅｐＣ遺伝子のＯＲＦ（Ｓｕ  Ｈ．ｅｔ．ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９６，６２：２７２３−２７３４）を含むＤＮＡ鎖を人工合成した。そのＤＮＡ鎖をテンプレートとして、プライマーＰ５（配列番号１７）及びプライマーＰ６（配列番号１８）をプライマーとして用いたＰＣＲによって、ｈｅｐＣ遺伝子のＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲにはＰｒｉｍｅＳｔａｒポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ社）を用い、プロトコールに記載の反応組成で行った。ＰＣＲサイクルは次の通りであった。９４℃５分の後、９８℃５秒、５５℃１０秒、７２℃８分を３０サイクル、最後に４℃保温。また、ｐＭＩＶ−Ｐｎｌｐ０をテンプレートＤＮＡとし、プライマーＰ７（配列番号１９）及びプライマーＰ８（配列番号２０）のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲによって、ｐＭＩＶ−Ｐｎｌｐ０のＤＮＡ断片を得た。ＰＣＲにはＰｒｉｍｅＳｔａｒポリメラーゼを用い、プロトコールに記載の反応組成で行った。ＰＣＲサイクルは次の通りであった。９４℃５分の後、９８℃５秒、５５℃１０秒、７２℃６分を３０サイクル、最後に４℃保温。得られた両ＤＮＡ断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤクローニングキット（クロンテック社製）を用いて連結し、ｈｅｐＣ遺伝子の発現プラスミドｐＭＩＶ−Ｐｎｌｐ０−ｈｅｐＣを構築した。クローニングされたｈｅｐＣ遺伝子のヌクレオチド配列を配列番号２１に、それがコードするヘパリナーゼＩＩＩ（ＨｅｐＣ）のアミノ酸配列を配列番号２２に示す。
【００９３】
＜エシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）株のｈｅｐＣ遺伝子発現株の構築及びヘパリナーゼＩＩＩ酵素液の調製＞
ｈｅｐＣ遺伝子の発現プラスミドｐＭＩＶ−Ｐｎｌｐ０−ｈｅｐＣをエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）株（ライフテクノロジーズ社）へエレクトロポレーション（Ｃｅｌｌ：８０μＬ，２００Ω，２５μＦ，１．８ｋＶ，キュベット：０．１ｍＬ）により導入し、ヘパリナーゼＩＩＩ生産株としてエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＭＩＶ−Ｐｎｌｐ０−ｈｅｐＣ株を得た。この株を２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコール添加ＬＢ培地にて３７℃で一晩前培養を行った。その後、培養液を、坂口フラスコに３００ｍＬ張りこんだＬＢ培地中に終濃度２％ｖ／ｖとなるよう植菌した。３７℃にて４時間振とう培養を行い、培養を終了した。遠心分離後、菌体を０．８５％ＮａＣｌにて２回洗浄し、３０ｍＬの５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．０）にて懸濁した。懸濁液を超音波破砕に供して菌体を破砕した。細胞破砕液を遠心分離し、上清（無細胞抽出液）としてヘパリナーゼＩＩＩ酵素液を調製した。
【００９４】
（４−２）ヘパリナーゼＩＩＩ反応による低分子化
上記（３）で得られたＮ−アセチル基残存率１４．９％のＮ−脱アセチル化ヘパロサン１ｇおよび３１．３ｍＩＵ／μＬのヘパリナーゼＩＩＩ溶液２ｍＬを１００ｍＭ  ＮａＣｌおよび１．５ｍＭ  ＣａＣｌ２を含むＴｒｉｓ緩衝溶液（ｐＨ８．０）１００ｍＬに溶解し、３７℃にて５．３時間反応させた。反応液に１６％ＮａＣｌ水溶液１００ｍＬおよびＥｔＯＨ  ９００ｍＬを添加して混合し、遠心分離して上清を除去し、低分子化Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンを得た。ヘパリナーゼＩＩＩによる低分子化後の分子量について、プルランを標準としてＧＰＣにより測定した。その結果、数平均分子量（Ｍｎ）は、９８６０、重量平均分子量（Ｍｗ）は、１５４３０であった。
【００９５】
（５）低分子化Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンのＮ−硫酸化
先ず、上記（４）で得られた低分子化Ｎ−脱アセチル化ヘパロサン１ｇをｍｉｌｌｉＱ水５０ｍＬに溶解させ、２０ｍｇ／ｍＬ  ＮａＨＣＯ３／２０ｍｇ／ｍＬ  Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ・ＳＯ３水溶液を５０ｍＬ添加して５５℃で一晩反応させた。
【００９６】
次に、ＥｔＯＨ  １Ｌを添加して混合し、遠心分離して上清を除去し、Ｎ−硫酸化低分子化ヘパロサンを得た。
【００９７】
次に、得られたＮ−硫酸化低分子化ヘパロサンをｍｉｌｌｉＱ水に溶解して５００μＬとし、二糖分析を行ってＮ−脱アセチル化ヘパロサンに対する収率を求めた。手順を以下に示す。
【００９８】
＜二糖分析＞
Ｎ−硫酸化低分子化ヘパロサンの二糖分析は、既報（Ｔ．Ｉｍａｎａｒｉ，ｅｔ．ａｌ．，“Ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ．”Ｊ．Ｏ．Ｃｈｒｏｍａｔｏ．Ａ，７２０，２７５−２９３（１９９６））の条件に従い実施した。すなわち、Ｎ−硫酸化低分子化ヘパロサンをヘパリナーゼＩＩおよびＩＩＩを用いて不飽和二糖に分解し、分解物をＨＰＬＣで分析することにより、各構成二糖の量を定量した。
【００９９】
同様に、Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンの二糖分析を実施した。なお、Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンの二糖分析は、Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンをＮ−硫酸化してから実施した。すなわち、Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンをＮ−硫酸化した後、ヘパリナーゼＩＩおよびＩＩＩを用いて不飽和二糖に分解し、分解物をＨＰＬＣで分析することにより、各構成二糖の量を定量した。Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンのＮ−硫酸化は、低分子化Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンのＮ−硫酸化と同様に実施した。
【０１００】
二糖分析は、具体的には、以下の手順で実施した。
（ａ）ヘパリナーゼＩＩ  ０．２Ｕ（Ｓｉｇｍａ）、ヘパリナーゼＩＩＩ  ０．０２〜０．０３ｍＩＵ、多糖サンプル５μｇ、および酵素消化用ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ  ＣＨ３ＣＯＯＮａ，１０ｍＭ（ＣＨ３ＣＯＯ）２Ｃａ，ｐＨ７．０）１０μＬを混合し、ｍｉｌｌｉＱ水で１００μＬにメスアップし、反応溶液とした。
（ｂ）反応溶液を３７℃で１６時間以上反応させた後、１００℃にて２分間煮沸し、反応を停止させた。
（ｃ）０．４５μｍのフィルターで不溶物を除去した溶液を二糖分析用サンプルとした。
（ｄ）分析は、カラムにはＩｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３  １５０ｍｍ×２．１ｍｍ、粒子径５μｍを用い、温度は５０℃、流速は０．２５ｍＬ／ｍｉｎ、検出波長は２３０ｎｍ、溶離液はＡ液として４％Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ、１．２ｍＭ  Ｔｒｉｂｕｔｙｌａｍｉｎｅを用い、Ｂ液として４％Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ、０．１Ｍ  ＣｓＣｌを用い、Ｂ液１−９０％のグラジエント条件で行った。
【０１０１】
各多糖サンプルから生成した構成二糖の量の合計から、収率を算出した。すなわち、収率は、Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンから生成した二糖の全量に対する、Ｎ−硫酸化低分子化ヘパロサンから生成した二糖の全量の比率（モル比）として算出した。また、この時、得られたＮ−硫酸化低分子化ヘパロサンにおいて、Ｎ−脱アセチル化により生じたアミノ基の９９％以上がＮ−硫酸化されていることを確認した。
【０１０２】
また、Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンから生成した各構成二糖の量に基づき、Ｎ−脱アセチル化ヘパロサンにおけるＮ−アセチル基の残存率を算出した。すなわち、アセチル基の残存率は、二糖の総量に対する、Ｎ−アセチル基を有する二糖の量の比率（モル比）として算出した。アセチル基の残存率は、１４．９％であった。
【０１０３】
（６）Ｎ−硫酸化エピメリ化低分子化ヘパロサンの調製
（６−１）精製Ｄ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ（Ｄｌｃｅ）の調製
＜ゼブラフィッシュ由来Ｄｌｃｅ発現菌株の構築＞
ｐＭＡＬ−ｃ２ｘ（配列番号２３、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ社）をテンプレートＤＮＡとし、配列番号２４および２５をプライマーとして用いたＰＣＲ反応によって、変異型Ｍａｌｔｏｓｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＢＰ＊）のＣ末端領域ＤＮＡ断片を得た。上記ＰＣＲ反応においては、５’末端に制限酵素ＢｇｌＩＩ、３’末端に制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＳａｃＩ、ＸｈｏＩ、およびＮｏｔＩの認識サイトを付加した。ｐＭＡＬ−ｃ２ｘプラスミドＤＮＡおよびＭＢＰ＊のＣ末端領域ＤＮＡ断片をＢｇｌＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩにより切断し、ライゲーション反応を行うことによりｐＭＡＬ−ＭＢＰ＊プラスミドを得た。ｐＭＡＬ−ＭＢＰ＊プラスミドのヌクレオチド配列を配列番号２６に示す。
【０１０４】
ｐＭＡＬ−ＭＢＰ＊をテンプレートＤＮＡとして、ポリメラーゼとしてＰｒｉｍｅＳｔａｒポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ社）を使用して、製造元のプロトコールに従ってＰＣＲを行い、ｐＭＡＬ−ＭＢＰ＊のＤＮＡ断片を得た。プライマーとしては配列番号２７および２８の組み合わせを使用した。
【０１０５】
ゼブラフィッシュ由来ＤｌｃｅのｃＤＮＡを人工遺伝子合成（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）により調製した。そのｃＤＮＡをテンプレートとして、配列番号２９および３０をプライマーとして用いたＰＣＲ反応によって、ゼブラフィッシュ由来Ｄｌｃｅの触媒部位（Ｇ７０−Ａｓｎ５８５）をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片を取得した。得られたＤＮＡ断片とｐＭＡＬ−ＭＢＰ＊のＤＮＡ断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤクローニングキット（クロンテック社製）を用いて連結した。該反応液でエシェリヒア・コリＪＭ１０９株を形質転換し、ｐＭＡＬ−ＭＢＰ＊−ｄｒｅＤｌｃｅ（Ｇ７０）を得た。得られたプラスミドでエシェリヒア・コリＯｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）を形質転換し、エシェリヒア・コリＯｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）／ｐＭＡＬ−ＭＢＰ＊−ｄｒｅＤｌｃｅ（Ｇ７０）と命名した。挿入断片のヌクレオチド配列、および、それによりコードされるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号３１および３２に示す。
【０１０６】
＜Ｄ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼ（Ｄｌｃｅ）の調製＞
エシェリヒア・コリＯｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）／ｐＭＡＬ−ＭＢＰ＊−ｄｒｅＤｌｃｅ（Ｇ７０）を１００μｇ／ｍＬアンピシリンを添加したＬＢ培地に植菌し、３７℃にて一晩前培養を行った。その後、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを添加したＬＢ＋Ｇｌｙｃｅｒｏｌ培地（９５％（ｖ／ｖ）ＬＢ培地、１．０％（ｖ／ｖ）グリセロール、５ｍＭ  ＭＯＰＳ−ＫＯＨ  （ｐＨ  ７．０））を１００ｍＬ張り込んだ５００ｍＬ容坂口フラスコに、終濃度１％となるように植菌し、３７℃にてＯＤ６６０が０．５−０．７となるまで振とう培養後、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）（ナカライテスク社）を終濃度０．５ｍＭとなるよう添加し、さらに一晩２２℃にて培養を行った。
【０１０７】
培養液を遠心分離後、菌体を回収し、緩衝液−１（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２００ｍＭ  ＮａＣｌ）により１回洗浄し、懸濁した。懸濁液を超音波破砕機２０１Ｍ（久保田商事株式会社）により超音波破砕し１４，０００ｒｐｍ、２０分間の遠心分離後の上清を無細胞抽出液として得た。次いで、無細胞抽出液を２０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ７．５）、２００  ｍＭ  ＮａＣｌにより平衡化したＭＢＰＴｒａｐ  ＨＰ  ５  ｍｌ  （ＧＥヘルスケア）に供し、非吸着タンパク質を緩衝液−１で洗浄後、１０  ｍＭのマルトースを添加した緩衝液−１にて溶出し、精製ＭＢＰ＊−ｄｒｅＤｌｃｅ（Ｇ７０）を取得した。
【０１０８】
（６−２）ＤｌｃｅによるＣ５−エピメリ化
上記（４）で取得したＮ−硫酸化低分子化ヘパロサンのＣ５−エピメリ化反応を実施した。４ｇ／Ｌ  Ｎ−硫酸化低分子化ヘパロサン、５０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ７．０）、１ｍＭ塩化カルシウムに８ｍＵ／ｍＬの精製ＭＢＰ＊−ｄｒｅＤｌｃｅ（Ｇ７０）を添加し、３７℃にて一晩反応した。９５℃、１５分間の熱処理による反応停止後、反応停止液をアミコンウルトラ−１５  ３Ｋ（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて超純水に液置換した。
【０１０９】
（６−３）Ｃ５−エピメリ化率の定量
Ｃ５−エピメリ化率の定量は、亜硝酸分解による二糖組成分析により実施した。その結果、Ｃ５−エピメリ化率は２６．７％であった。
【０１１０】
＜試薬＞
ＮａＮＯ２（ＣＡＳ  Ｎｏ．：７６３２−００−０，ＭＷ：６９．０１）
クエン酸（ＣＡＳ  Ｎｏ．：７７−９２−９，ＭＷ：１９２．１）
２，４−ジニトロフェニルヒドラジン（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１１９−２６−６，ＭＷ：１９８．１）５０％含水品（略：ＤＮＰＨ）
【０１１１】
＜試験液＞
ＮａＮＯ２水溶液：試薬４９．５ｍｇをＨ２Ｏ  １ｍＬに溶解
クエン酸水溶液：試薬３８４．２ｍｇをＨ２Ｏ  １ｍＬに溶解
ＤＮＰＨ溶液：試薬２０．４ｍｇ（５０％含水）をアセトニトリル１ｍＬに溶解
【０１１２】
＜分析手順＞
１．５ｍＬマイクロチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）に反応液１０μＬ、クエン酸緩衝液２０μＬ、ＮａＮＯ２水溶液１０μＬを順に添加し、混合溶液を６５℃で２ｈｒ撹拌（１０００ｒｐｍ）し、亜硝酸分解液を得た。得られた亜硝酸分解液４０μＬにＤＮＰＨ溶液２０μＬを添加し、４５℃で２ｈｒ撹拌（１０００ｒｐｍ）し、誘導化液を得た。得られた誘導化液の組成を下記に示す条件によりＨＰＬＣで分析した。
【０１１３】
＜ＨＰＬＣ分析条件＞
カラム：住化分析センター製ＯＤＳ  Ｚ−ＣＬＵＥ３μｍ  ２．０ｍｍ×２５０ｍｍ
カラム槽温度：５０℃
溶離液流量：０．３ｍＬ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ３６５ｎｍ
注入量：５μＬ
溶離液組成：Ａ液  ５０ｍＭ−ＨＣＯＯＮＨ４（ｐＨ４．５）
Ｂ液  ＭｅＣＮ
【０１１４】
【表１】
2020532278.tif 000003
【０１１５】
【表２】
2020532278.tif 000004
【０１１６】
実施例２：２−Ｏ硫酸化酵素（２−ＯＳＴ）発現菌株の構築
（１）ｐＣ２−１の構築
２−Ｏ硫酸化酵素（２−ＯＳＴ）としては、チャイニーズハムスター由来の２−ＯＳＴの９４番目のチロシン残基をアラニンに変換した変異体の触媒部位（Ａｓｐ６９−Ａｓｎ３５６）と、マルトース結合タンパク質ＭＢＰとの融合タンパク質（ＭＢＰ＊＊−２−ＯＳＴ）を利用した。
【０１１７】
発現プラスミドの構築の詳細を以下に示す。ｐＭＡＬ−ｃ２ｘプラスミドをテンプレートＤＮＡとして、ポリメラーゼとしてＰｒｉｍｅＳｔａｒポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ社）を使用して、製造元のプロトコールに従ってＰＣＲを行い、ｐＭＡＬ−ＭＢＰ＊＊のＤＮＡ断片を得た。プライマーとしては、配列番号３３および３４の組み合わせを使用した。
【０１１８】
小林らの報告（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ｍ．  ｅｔ．  ａｌ．，  Ｊｏｕｒ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  １９９７，  ２７２：１３９８０−１３９８５）を参照して、チャイニーズハムスター由来の２−ＯＳＴの９４番目のチロシン残基をイソロイシンに変換した変異体のｃＤＮＡ（エシェリヒア・コリのｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅに合わせて最適化）を人工遺伝子合成（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）により調製した（ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列については、配列番号５および６を参照）。そのｃＤＮＡをテンプレートとして、配列番号３５および３６のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲ反応によって、チャイニーズハムスター由来の２−ＯＳＴの触媒部位（Ａｓｐ６９−Ａｓｎ３５６）をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片２−ＯＳＴ（Ｙ９４Ａ）を取得した。得られたＤＮＡ断片とｐＭＡＬ−ＭＢＰ＊＊のＤＮＡ断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤクローニングキット（クロンテック社製）を用いて連結した。該反応液でエシェリヒア・コリＪＭ１０９株を形質転換し、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３７℃で終夜培養した。生育してきた形質転換微生物のコロニーから公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、３１００ジェネティックアナライザー（アプライドバイオシステムズ社製）を用いてヌクレオチド配列の確認を行い、目的の構造を持つプラスミドをｐＣ２−１と名付けた。
【０１１９】
（２）変異型２−ＯＳＴ発現プラスミドの構築
変異型２−ＯＳＴ発現プラスミドを構築するため、各種変異型に対応するプライマー（配列番号３７〜６４）を用いて、ｐＭＡＬ−ＭＢＰ＊＊−２−ＯＳＴ（Ｙ９４Ａ）を鋳型として、ＰＣＲを実施した。各変異とプライマーの関係を表３に示す。得られたＰＣＲ産物をＤｐｎＩで消化した後、該反応液でエシェリヒア・コリＪＭ１０９株を形質転換し、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３７℃で終夜培養した。生育してきた形質転換微生物のコロニーから公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、３１００ジェネティックアナライザー（アプライドバイオシステムズ社製）を用いてヌクレオチド配列の確認を行い、目的の構造を持つプラスミドｐＣ２−２、３、４、５、６、７、８、１０、１１、１２を取得した。同様の方法で、ｐＣ２−３を鋳型として、ＰＣＲを実施し、ｐＣ２−２２、２５、２６、２７、２８を構築した。各変異とプライマーおよびプラスミドの関係を表３に示す。
【０１２０】
【表３】
2020532278.tif 000005
【０１２１】
（３）発現菌株の構築
シャペロニン発現プラスミドｐＧｒｏ７（ＴａＫａＲａ社）でエシェリヒア・コリＯｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）株（ノバジェン社）を形質転換し、エシェリヒア・コリＯｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）／ｐＧｒｏ７を構築した。これを上記（１）および（２）で構築したプラスミドｐＣ２−１、２、３、４、５、６、７、８、１０、１１、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８によりそれぞれ形質転換し、菌株Ｃ２−１、２、３、４、５、６、７、８、１０、１１、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８を取得した。
【０１２２】
実施例３：２−ＯＳＴの発現および無細胞抽出液の調製
実施例２で取得した菌株を１００μｇ／ｍＬアンピシリンおよび２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを添加したＬＢ培地に植菌し、３７℃にて一晩前培養を行った。その後、１００μｇ／ｍＬアンピシリンおよび２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを添加したＬＢ＋Ｇｌｙｃｅｒｏｌ培地を１００ｍＬ張り込んだ５００ｍＬ容坂口フラスコに、終濃度１％となるように植菌し、３７℃にてＯＤ６６０が０．５−０．７となるまで振とう培養後、ＩＰＴＧ（ナカライテスク社）を終濃度０．５ｍＭ、Ｌ−アラビノース（和光純薬工業社）を終濃度０．２％となるよう添加し、さらに一晩２２℃にて培養を行った。
【０１２３】
培養液を遠心分離後、菌体を回収し、緩衝液−２（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１５％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）により１回洗浄し、培養液の１／１０量の緩衝液−２にて懸濁した。次いで、菌体をＢｉｏｒａｐｔｏｒ（ソニック・バイオ株式会社）により超音波破砕し１４，０００ｒｐｍ、２０分間の遠心分離後の上清液を無細胞抽出液として得た。
【０１２４】
実施例４：分子量分画による高次構造解析と活性体（３量体）率の測定
実施例３で取得した無細胞抽出液０．５ｍＬを、緩衝液−２で予め平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ  ６  ｉｎｃｒｅａｓｅ  １０／３００カラム（ＧＥヘルスケア社）に注入し、流速０．２５ｍＬ／分にて分子量分画した。０．２倍のカラムボリューム量以降の透過液を０．４ｍＬずつ９８穴プレートに回収した。分子量スタンダードとしては、ゲルろ過スタンダード（バイオ・ラッド社、＃１５１−１９０１）および分子量マーカー（ＨＰＬＣ）（オリエンタル酵母工業株式会社、＃４６８０４０００）を使用した。
【０１２５】
各フラクション１０μＬに試料緩衝液（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用，  ６倍濃縮，  還元剤含有）（ナカライテスク）を２μＬ添加し、９５℃にて５分間熱変性した。全量を４−２０％  Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ（登録商標）  ＴＧＸ（登録商標）  プレキャストゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ゲルをバレットＣＢＢステイン  ワン（Ｒｅａｄｙ  Ｔｏ  Ｕｓｅ）（ナカライテスク）を用いて染色した。本来、２−ＯＳＴは活性体として３量体を形成しており、３量体はフラクションの２９番目（Ｃ３フラクション）付近に溶出されるが、推定分画分子量が３量体のものより大きな画分にも多くの２−ＯＳＴが溶出され、多量体を形成していることが推定された。そこで、ゲルの染色像をＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｉｍａｇｅｒ  ６００（ＧＥヘルスケア）により取り込み、多量体の分子量を示す２−ＯＳＴが分画されたフラクションの９番目（Ａ９）、および、３量体の分子量を示す２−ＯＳＴが分画された２９番目（Ｃ３）中の２−ＯＳＴのバンド強度をＩｍａｇｅ  ＱｕａｎｔＴＬ（ＧＥヘルスケア）を用いて解析した。各バンド強度の解析結果から、Ｃ３フラクションのバンド強度／Ａ９フラクションのバンド強度×１００を算出し、活性体の含まれる割合を示す指標とした。
【０１２６】
各種変異体発現株から調製した無細胞抽出液の活性体率を算出した結果を表４に示す。Ｌ３２１Ｒの変異導入により活性体率指標が向上することが明らかとなった。
【０１２７】
【表４】
2020532278.tif 000006
【０１２８】
実施例５：無細胞抽出液による２−Ｏ硫酸化反応
（１）２−Ｏ硫酸化反応
実施例１で調製したＮ−硫酸化エピメリ化低分子化ヘパロサンを基質として反応を実施した。反応液（２ｍｇ／ｍＬ  Ｎ−硫酸化エピメリ化低分子化ヘパロサン、０．６ｍＭ  ３’−Ｐｈｏｓｐｈｏａｄｅｎｏｓｉｎｅ−５’−ｐｈｏｓｐｈｏｓｕｌｆａｔｅ、５０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ７．０））に各無細胞抽出液を１．９％添加し、３７℃で３０分間反応を行い、２倍量の２．０Ｍ  クエン酸水溶液と混合し、９５℃、１５分間の熱処理により反応を停止した。陰性対照として、反応液に無細胞抽出液の代わりに緩衝液−２を添加した条件で酵素反応を実施した。
【０１２９】
２−Ｏ硫酸化率は二糖組成分析により定量した。ＨＰＬＣ分析により求めたＩｄｏＡ−ＧｌｃＮ（ＮＳ）とＩｄｏＡ２Ｓ−ＧｌｃＮ（ＮＳ）の比率から２−Ｏ硫酸化率を算出し、各２−Ｏ硫酸化率から陰性対象の２−Ｏ硫酸化率を差し引いた値を２−Ｏ硫酸化反応において変換された割合として求めた。２糖単位であるＧＩｄｏＡ−ＧｌｃＮＳの分子量４１５．８から、変換した物質量を算出した。酵素単位（Ｕ）は、上記の条件下で、１分間に１μｍｏｌのＩｄｏＡ（２Ｓ）−Ｇｌｃ（ＮＳ）を生成させる酵素量と定義した。実施例４ではＬ３２１Ｒ変異導入により、無細胞抽出液中の活性体（３量体）の比率が約２倍に向上し、活性向上が期待されたが、活性体率から予想された通り、Ｌ３２１Ｒの変異導入によって２−Ｏ硫酸化活性は１３５  Ｕ／ｍｌから３３０  Ｕ／ｍｌと大きく向上した（表５）。
【０１３０】
【表５】
2020532278.tif 000007
【０１３１】
（２）変換率の定量（二糖組成分析）
変換率（２−Ｏ−硫酸化率および３−Ｏ−硫酸化率）の定量は、亜硝酸分解による二糖組成分析により実施した。
【０１３２】
＜試薬＞
ＮａＮＯ２（ＣＡＳ  Ｎｏ．：７６３２−００−０，ＭＷ：６９．０１）
クエン酸（ＣＡＳ  Ｎｏ．：７７−９２−９，ＭＷ：１９２．１）
２，４−ジニトロフェニルヒドラジン（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１１９−２６−６，ＭＷ：１９８．１）５０％含水品（略：ＤＮＰＨ）
Ｈｅｐａｒｉｎ（Ａｌｄｒｉｃｈ製）
【０１３３】
＜試験液＞
Ｈｅｐａｒｉｎ標準溶液：１ｍｇ／ｍＬ
ＮａＮＯ２水溶液：試薬４９．５ｍｇをＨ２Ｏ１ｍＬに溶解
クエン酸水溶液：試薬３８４．２ｍｇをＨ２Ｏ１ｍＬに溶解
ＤＮＰＨ溶液：試薬２０．４ｍｇ（５０％含水）をアセトニトリル１ｍＬに溶解
【０１３４】
＜ＬＣ−ＭＳ分析条件＞
＜ＬＣ条件＞
カラム：住化分析センター製ＯＤＳ  Ｚ−ＣＬＵＥ３μｍ  ２．０ｍｍ×２５０ｍｍ
カラム槽温度：５０℃
溶離液流量：０．３ｍＬ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ３６５ｎｍ
注入量：５μＬ
溶離液組成：Ａ液  ５０ｍＭ−ＨＣＯＯＮＨ４（ｐＨ４．５）
Ｂ液  ＭｅＣＮ
【０１３５】
【表６】
2020532278.tif 000008
【０１３６】
＜ＭＳ条件＞
イオン化法      ；エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ（＋／−））
ＤＬ温度        ：２５０℃
ヒートブロック  ：２５０℃
ネブライザーガス流速：１．５Ｌ／ｍｉｎ
ドライガス流速  ：１５Ｌ／ｍｉｎ
【０１３７】
【表７】
2020532278.tif 000009
【０１３８】
＜分析手順および結果＞
１．５ｍＬマイクロチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）にＨｅｐａｒｉｎ標準液又は被験液１０μＬ、クエン酸ｂｕｆｆｅｒ水溶液２０μＬ、ＮａＮＯ２水溶液１０μＬを順に添加し、混合溶液を６５℃で２ｈｒ撹拌（１０００ｒｐｍ）し、亜硝酸分解液を得た。得られた亜硝酸分解液４０μＬにＤＮＰＨ溶液２０μＬを添加し、４５℃で２ｈｒ撹拌（１０００ｒｐｍ）し、誘導化液を得た。得られた誘導化液の組成をＬＣ−ＭＳで分析した。Ｈｅｐａｒｉｎ標準液を分析して得られるＩｄｏＡ（２Ｓ）−ＧｌｃＮ（ＮＳ６Ｓ）のピークから換算係数（１ｍｇ×ＩｄｏＡ（２Ｓ）−ＧｌｃＮ（ＮＳ６Ｓ）のａｒｅａ純度／ＩｄｏＡ（２Ｓ）−ＧｌｃＮ（ＮＳ６Ｓ）のａｒｅａ値）を算出し、被験液中の各二糖誘導体のａｒｅａ値からその濃度を求めた。算出された二糖構造とその割合を表３に示す。表中、Ｎ−アセチル基を有する二糖誘導体等を含むと考えられる未同定ピークのデータは割愛し、ＧｌｃＡ（２Ｓ）−ＧｌｃＮ（ＮＳ）、ＩｄｏＡ（２Ｓ）−ＧｌｃＮ（ＮＳ）、ＧｌｃＡ−ＧｌｃＮ（ＮＳ）、およびＩｄｏＡ−ＧｌｃＮ（ＮＳ）の総量を１００％とした。
【０１３９】
実施例６：Ｎ−硫酸化６−Ｏ硫酸化低分子化ヘパロサンの調製
（１）Ｎ−硫酸化低分子化ヘパロサンの６−Ｏ硫酸化
＜反応前の精製＞
実施例１（５）で得られたＮ−硫酸化低分子化ヘパロサン３０ｍＬを遠心分離し（７０００Ｇ、３０分）、その上清を０．４５μｍのフィルターで濾過した。濾過液２７．３ｇをファルマシア製カラム（型番：ＸＫ２６）に充填した弱アニオン交換樹脂１５ｇ（ＤＩＡＩＯＮ、ＷＡ−３０三菱化学製  事前に２５．６ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４でｐＨ５．５に調整）に投入して多糖成分を吸着し、洗浄液（０．５Ｍ  ＮａＣｌ＋２５．６ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ５．５））４８０ｍＬを通液した（流速：６．４ｍＬ／ｍｉｎ）。次に、溶離液（２Ｍ  ＮａＣｌ＋２５．６ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ５．５））２３０ｍＬを通液し（流速６．４ｍＬ／ｍｉｎ）、多糖成分を含む溶離液を得た。得られた溶離液をＡｍｉｃｏｎ−３Ｋ（メルクミリポア製）にチャージして遠心分離（４０００Ｇ）を行った。得られた濃縮液に更に水１００ｍＬを添加して再度遠心分離を行った。この洗浄操作を３回実施して洗浄濃縮液１１ｇを取得した。
【０１４０】
＜イオン交換＞
強カチオン交換樹脂（ＤＩＡＩＯＮ、ＵＢＫ５５０三菱化学製  予め１Ｍ塩酸でＨ型に変換）３ｍＬに洗浄濃縮液１１ｇを通液した後（ｐＨ２．２５）、トリブチルアミン２．３６ｍｇ／エタノール１０μＬの混合液１．８ｍＬを添加して中和した（ｐＨ８．３６）。得られた中和液を凍結乾燥した。
【０１４１】
＜６−Ｏ硫酸化反応＞
アルゴン気流下で凍結乾燥物全量にＤＭＦ１．９２ｍＬ及び三酸化硫黄ピリジン付加物７６．４ｍｇ（０．４８ｍｍｏｌ）を添加し、−１０℃で４８時間撹拌した。反応液に５Ｍ酢酸Ｎａ水溶液２．８ｍＬ及び水３１ｍＬを添加して室温で１時間撹拌することで反応を停止した。反応停止液を０．２μｍのフィルターで濾過し、その濾過液をＡｍｉｃｏｎ−３Ｋ（メルクミリポア製）にチャージして遠心分離（４０００Ｇ）を行った。得られた濃縮液に更に水２０ｍＬを添加して再度遠心分離を行った。この洗浄操作を２回実施して洗浄濃縮液３．９２ｇを取得した。得られた洗浄濃縮液をサンプリングし、実施例１と同様の手順で亜硝酸分解により二糖組成分析を行った。その結果、洗浄濃縮液３．９２ｇ中に二糖単位の量に換算して７６．５ｍｇの反応生成物Ｎ−硫酸化６−Ｏ硫酸化低分子化ヘパロサンが含まれていることを確認した。
【０１４２】
実施例７：３−Ｏ硫酸化酵素（３−ＯＳＴ−１）発現菌株の構築
（１）ｐＥＴＤｕｅｔ−３−ＯＳＴ−１の構築
マウス由来３−ＯＳＴ−１のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＩＤ：ＮＰ＿０３４６０４；配列番号８）をＫＥＧＧ（Ｋｙｏｔｏ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅｓ）データベースより取得した。既報（Ｅｄａｖｅｔｔａｌ  Ｓ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００４；２７９（２４）２５７８９−９７）を参考に、エシェリヒア・コリのｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅに合わせて最適化した、同３−ＯＳＴ−１の触媒部位（Ｇｌｙ４８−Ｈｉｓ３１１；配列番号１０）をコードする塩基配列（配列番号９）を含むＤＮＡ断片を合成した。得られたＤＮＡ断片をｐＥＴＤｕｅｔ−１ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩサイトに挿入して、３−ＯＳＴ−１発現プラスミドｐＥＴＤｕｅｔ−３−ＯＳＴ−１を構築した。この発現プラスミドによれば、Ｎ末端側にＨｉｓ−Ｔａｇが付加された３−ＯＳＴ−１が発現するため、Ｈｉｓタグによる３−ＯＳＴ−１の精製が可能となる。
【０１４３】
（２）変異型３−ＯＳＴ−１発現プラスミドの構築
変異型３−ＯＳＴ−１発現プラスミドを構築するため、各種変異型に対応するプライマー（配列番号６５〜１３８）を用いて、ｐＥＴＤｕｅｔ−３−ＯＳＴ−１を鋳型として、ＰＣＲを実施した。各変異とプライマーの関係を表６に示す。得られたＰＣＲ産物をＤｐｎＩで消化した後、該反応液でエシェリヒア・コリＪＭ１０９株を形質転換し、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３７℃で終夜培養した。生育してきた形質転換微生物のコロニーから公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、３１００ジェネティックアナライザー（アプライドバイオシステムズ社製）を用いてヌクレオチド配列の確認を行い、目的の構造を持つプラスミドｐＥＴ３ＯＳＴ＃１、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０を取得した。各変異とプライマーおよびプラスミドの関係を表８−１および８−２に示す。
【０１４４】
【表８−１】
2020532278.tif 000010
【０１４５】
【表８−２】
2020532278.tif 000011
【０１４６】
（３）３−ＯＳＴ−１発現菌株の構築
野生型３−ＯＳＴ−１を搭載した発現プラスミドｐＥＴＤｕｅｔ−３−ＯＳＴ−１、および変異型３−ＯＳＴ−１を搭載した３７種の発現プラスミドｐＥＴ３ＯＳＴをエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）株へ実施例１（５）と同様の手法で導入し、野生型３−ＯＳＴ−１発現株ｐＥＴＤｕｅｔ−３−ＯＳＴ−１／ＢＬ２１（ＤＥ３）株（３ＯＳ−ＷＴ）および３７種の変異型３−ＯＳＴ−１発現株を得た。
【０１４７】
実施例８：３−ＯＳＴの発現および無細胞抽出液の調製
実施例７で取得した菌株を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地３ｍＬ（１．０％（ｗ／ｖ）ペプトン、０．５％（ｗ／ｖ）酵母エキス、１．０％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、１．５％（ｗ／ｖ）寒天）に接種し、試験管にて３７℃での一晩前培養を行なった。トリプトントリプトン（ＢＤ社製）１．２％（ｗ／ｖ）、酵母エキス（ＢＤ社製）２．４％（ｗ／ｖ）、グリセリン（純正化学社製）０．５％（ｗ／ｖ）)及び水からなる溶液Ａを１２０℃、２０分オートクレーブ処理して調製し、リン酸二水素カリウム（純正化学社製）２．３％（ｗ／ｖ）、リン酸水素二カリウム（純正化学社製）１２．５％（ｗ／ｖ）及び水からなる溶液Ｂを０．４５μmフィルター（メルク社製）を用いてろ過調製した。上記の溶液Ａと溶液ＢをＡ：Ｂ＝９：１となるように無菌環境下混合し、ＴＢ培地を調製した。ＴＢ培地３ｍＬ（１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有）を張り込んだ試験管に、前培養した培養液を終濃度１％となるよう添加し、３７℃にて、１２０往復／分でＯＤ６６０が０．５−０．７に到達するまで振とう培養した。そこでＩＰＴＧ(ナカライテスク社)を終濃度０．２ｍＭとなるよう添加し、さらに２４〜２６時間振とう培養を行なった。培養液１ｍＬを遠心分離（４℃、１５，０００ｒｐｍ、５分）によって集菌した。沈殿として得られた菌体を１ｍＬの平衡化バッファー（５０ｍＭ  リン酸ナトリウム、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）に懸濁し、再度遠心分離（４℃、８，０００ｒｐｍ、５分）することによって菌体を洗浄した。洗浄操作を２回繰り返した後、沈殿として得られた菌体を４００μＬの平衡化バッファーに再度懸濁し、４℃冷却水で冷やしながら超音波破砕装置Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ(ソニック・バイオ社製)を用いて、菌体破砕を行った。破砕液を遠心分離（４℃、１５，０００ｒｐｍ、２０分）し、得られた上清を無細胞抽出液とした。
【０１４８】
実施例９：無細胞抽出液による３−Ｏ硫酸化反応
（１）ＧｌｃＮ残基の３−Ｏ硫酸化反応
実施例６で得られたＮ−硫酸化６−Ｏ硫酸化低分子化ヘパロサンを基質として反応を実施した。反応液として、１g／Ｌ  Ｎ−硫酸化６−Ｏ硫酸化低分子化ヘパロサン、１．２５ｍＭ  ＰＡＰＳ、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５））の混合液８０μＬを調製した。水浴中で予め３７℃に保温した同混合液に実施例８で調製した無細胞抽出液  ２０μＬを添加し酵素反応を開始した。３７℃で反応を進行させ、１時間経過後に１００℃３分加熱し酵素を失活させた。
【０１４９】
（２）ＧｌｃＮ残基の３−Ｏ−硫酸化率の定量
実施例５（２）と同様の手順で亜硝酸分解により反応生成物の二糖組成分析を行った。反応停止液を亜硝酸分解による二糖組成分析に供することより３−Ｏ硫酸化率を算出した。３−Ｏ硫酸化率の計算方法は、式（Ｉ）の通りである。
【０１５０】
【数１】
2020532278.tif 000012
【０１５１】
（３）変異型３−ＯＳＴ−１の活性評価
実施例９（２）で求めた３−Ｏ硫酸化率をもとに３−ＯＳＴ活性を算出した。１分間に1μｍｏｌの３−Ｏ硫酸化二糖単位ＧｌｃＡ−ＧｌｃＮＳ３Ｓ６Ｓ（分子量  ５９３）を生成させる酵素量を1Ｕと定義した。野生型３−ＯＳＴ−１の酵素活性を１とする変異型３−ＯＳＴ相対活性を表９に示す。活性評価の結果、Ｍ７７Ｋ、Ｐ１２５Ａ、およびＶ１６４Ｉの変異導入により、３−ＯＳＴ活性が向上することが明らかとなった。
【０１５２】
【表９】
2020532278.tif 000013
【配列表フリーテキスト】
【０１５３】
配列番号１は、チャイニーズハムスター由来２−Ｏ硫酸化酵素（２−ＯＳＴ）をコードする全長ヌクレオチド配列を示す。
配列番号２は、チャイニーズハムスター由来２−Ｏ硫酸化酵素（２−ＯＳＴ）の全長アミノ酸配列を示す。
配列番号３は、チャイニーズハムスター由来２−Ｏ硫酸化酵素（２−ＯＳＴ）の触媒部位（Ａｓｐ６９−Ａｓｎ３５６）のアミノ酸配列を示す。
配列番号４は、Ｙ９４Ａ変異を有する、チャイニーズハムスター由来２−Ｏ硫酸化酵素（２−ＯＳＴ）の全長アミノ酸配列を示す。
配列番号５は、エシェリヒア・コリにおけるｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅに最適化された、Ｙ９４Ａ変異を有するチャイニーズハムスター由来２−Ｏ硫酸化酵素（２−ＯＳＴ）の触媒部位（Ａｓｐ６９−Ａｓｎ３５６）をコードするヌクレオチド配列を示す。
配列番号６は、Ｙ９４Ａ変異を有するチャイニーズハムスター由来２−Ｏ硫酸化酵素（２−ＯＳＴ）の触媒部位（Ａｓｐ６９−Ａｓｎ３５６）のアミノ酸配列を示す。
配列番号７は、マウス由来３−Ｏ硫酸化酵素（３−ＯＳＴ−１）をコードする全長ヌクレオチド配列を示す。
配列番号８は、マウス由来３−Ｏ硫酸化酵素（３−ＯＳＴ−１）の全長アミノ酸配列を示す。
配列番号９は、エシェリヒア・コリにおけるｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅに最適化された、マウス由来３−Ｏ硫酸化酵素（３−ＯＳＴ−１）の触媒部位（Ｇｌｙ４８−Ｈｉｓ３１１）をコードするヌクレオチド配列を示す。
配列番号１０は、マウス由来３−Ｏ硫酸化酵素（３−ＯＳＴ−１）の触媒部位（Ｇｌｙ４８−Ｈｉｓ３１１）のアミノ酸配列を示す。
配列番号１１は、プライマーＰ１のヌクレオチド配列を示す。
配列番号１２は、プライマーＰ２のヌクレオチド配列を示す。
配列番号１３は、Ｐｎｌｐ０プロモーターのＰａｅＩ−ＳａｌＩ断片のヌクレオチド配列のヌクレオチド配列を示す。
配列番号１４は、プライマーＰ３のヌクレオチド配列を示す。
配列番号１５は、プライマーＰ４のヌクレオチド配列を示す。
配列番号１６は、ｒｒｎＢ遺伝子のターミネーター領域約３００ｂｐを含むＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を示す。
配列番号１７は、プライマーＰ５のヌクレオチド配列を示す。
配列番号１８は、プライマーＰ６のヌクレオチド配列を示す。
配列番号１９は、プライマーＰ７のヌクレオチド配列を示す。
配列番号２０は、プライマーＰ８のヌクレオチド配列を示す。
配列番号２１は、実施例１でクローニングされたｈｅｐＣ遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
配列番号２２は、配列番号２１のヌクレオチド配列がコードするヘパリナーゼＩＩＩ（ＨｅｐＣ）のアミノ酸配列を示す。
配列番号２３は、ｐＭＡＬ−ｃ２ｘプラスミドのヌクレオチド配列を示す。
配列番号２４および２５は、実施例１でＭＢＰ＊を作成するために使用したプライマーのヌクレオチド配列を示す。
配列番号２６は、ｐＭＡＬ−ＭＢＰ＊プラスミドのヌクレオチド配列を示す。
配列番号２７および２８は、実施例１でｐＭＡＬ−ＭＢＰ＊のＤＮＡ断片を取得するために使用したプライマーのヌクレオチド配列を示す。
配列番号２９および３０は、実施例１でゼブラフィッシュ由来Ｄ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼの断片を取得するために使用したプライマーのヌクレオチド配列を示す。
配列番号３１は、ゼブラフィッシュ由来Ｄ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼの部分アミノ酸配列（Ｇｌｙ７０−Ａｓｎ５８５）をコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を示す。
配列番号３２は、ゼブラフィッシュ由来Ｄ−グルクロニル  Ｃ５−エピメラーゼの部分アミノ酸配列（Ｇｌｙ７０−Ａｓｎ５８５）を示す。
配列番号３３〜１３８は、プライマーのヌクレオチド配列を示す。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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