(57)【要約】  本発明は、単離されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドに関係しており、このＣＡＲは、ヒトＣＸＣケモカイン受容体５型（ＣＸＣＲ５）タンパク質に結合する抗体または抗体フラグメントを含む細胞外抗原結合ドメインを含んでいる。本発明はさらに、本発明のＣＡＲをコードする核酸分子と、遺伝子が改変されていて本発明のＣＡＲを発現する免疫細胞（好ましくはＴ細胞）と、ＣＸＣＲ５を発現している病原性細胞（好ましくは、病原性の成熟Ｂ細胞および／または記憶Ｂ細胞、および／または病原性のＴ細胞および／またはＴ濾胞性ヘルパー細胞）の存在と関係する医学的障害（特に、成熟Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（Ｂ−ＮＨＬ）、Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫、自己抗体依存性自己免疫疾患（全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）と関節リウマチから選択されることが好ましい））の治療におけるその細胞の利用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）ＣＸＣケモカイン受容体５型（ＣＸＣＲ５）タンパク質に結合する抗体または抗体フラグメントを含む細胞外抗原結合ドメインと、
ｉｉ）膜貫通ドメインと、
ｉｉｉ）細胞内ドメイン
を含むキメラ抗原受容体ポリペプチド（ＣＡＲ）。
【請求項２】
前記細胞外抗原結合ドメインが、
−  配列番号１（ＧＦＴＦＳＴＳＧ）と配列が少なくとも８０％一致する重鎖相補性決定領域１（Ｈ−ＣＤＲ１）、
−  配列番号２（ＩＳＳＳＳＧＦＶ）と配列が少なくとも８０％一致する重鎖相補性決定領域２（Ｈ−ＣＤＲ２）、および
−  配列番号３（ＡＲＳＥＡＡＦ）と配列が少なくとも８０％一致する重鎖相補性決定領域３（Ｈ−ＣＤＲ３）
を含む可変重鎖（ＶＨ）と、
−  配列番号４（ＫＳＲＬＳＲＭＧＩＴＰ）と配列が少なくとも８０％一致する軽鎖相補性決定領域１（Ｌ−ＣＤＲ１）、
−  配列番号５（ＲＭＳ）と配列が少なくとも８０％一致する軽鎖相補性決定領域２（Ｌ−ＣＤＲ２）、および
−  配列番号６（ＡＱＦＬＥＹＰＰＴ）と配列が少なくとも８０％一致する軽鎖相補性決定領域３（Ｌ−ＣＤＲ３）
を含む可変軽鎖（ＶＬ）とを含む、請求項１に記載のキメラ抗原受容体ポリペプチド（ＣＡＲ）。
【請求項３】
配列番号１、配列番号２および配列番号３のＣＤＲ配列を含むＶＨドメインと、配列番号４、配列番号５および配列番号６のＣＤＲ配列を含むＶＬドメインとを含む、請求項１または２に記載のキメラ抗原受容体ポリペプチド（ＣＡＲ）。
【請求項４】
配列番号７：
【化１】
2020532969.tif 000015
（ただしＸ１はＧまたはＫであり；Ｘ２はＲまたはＫであり；Ｘ３はＡまたはＳであり；Ｘ４はＮまたはＨであり；Ｘ５はＥまたはＤであり；Ｘ６はＳまたはＡであり；Ｘ７はＳまたはＡであり；Ｘ８はＳまたはＴであり；Ｘ９はＭまたはＬであり；Ｘ１０はＲまたはＫであり；Ｘ１１はＡまたはＳであり；Ｘ１２はＶまたはＩである）
と配列が少なくとも８０％一致する、好ましくは少なくとも８５％、または９０％、または９５％、または１００％一致するＶＨドメインと、
配列番号８：
【化２】
2020532969.tif 000016
（ただしＸ１はＳまたはＡであり；Ｘ２はＬまたはＶであり；Ｘ３はＰまたはＳであり；Ｘ４はＳまたはＮであり；Ｘ５はＱまたはＫであり；Ｘ６はＲまたはＬであり；Ｘ７はＧまたはＥである）
と配列が少なくとも８０％一致する、好ましくは少なくとも８５％、または９０％、または９５％、または１００％一致するＶＬドメインとを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体ポリペプチド（ＣＡＲ）。
【請求項５】
配列番号９（ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＴＳＧＭＮＷＦＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＹＩＳＳＳＳＧＦＶＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＱＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＥＡＡＦＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ）、または
配列番号１０（ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＫＳＬＫＬＳＣＳＡＳＧＦＴＦＳＴＳＧＭＨＷＦＲＱＡＰＧＫＧＬＤＷＶＡＹＩＳＳＳＳＧＦＶＹＡＤＡＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＱＮＴＬＹＬＱＬＮＳＬＫＳＥＤＴＡＩＹＹＣＡＲＳＥＡＡＦＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ）に従うＶＨドメインと、
配列番号１１（ＤＩＶＬＴＱＳＰＲＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＫＳＲＬＳＲＭＧＩＴＰＬＮＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＲＭＳＮＲＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＫＶＥＴＥＤＶＧＶＹＹＣＡＱＦＬＥＹＰＰＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＫ）、または
配列番号１２（ＤＩＶＬＴＱＡＰＲＳＶＳＶＴＰＧＥＳＡＳＩＳＣＲＳＮＫＳＲＬＳＲＭＧＩＴＰＬＮＷＹＬＱＫＰＧＫＳＰＱＬＬＩＹＲＭＳＮＬＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＥＴＤＦＴＬＫＩＳＫＶＥＴＥＤＶＧＶＹＹＣＡＱＦＬＥＹＰＰＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＫ）に従うＶＬドメインとを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体ポリペプチド（ＣＡＲ）。
【請求項６】
前記ＣＡＲが、遺伝子を改変された免疫細胞の中、好ましくはＴリンパ球の中で発現するとき、前記免疫細胞が、ＣＸＣＲ５を発現している細胞の表面のＣＸＣＲ５に結合して活性化されることにより、前記ＣＸＣＲ５を発現している細胞に対する細胞傷害活性を誘導し、ここで前記ＣＸＣＲ５を発現している細胞が、好ましくはＤＯＨＨ−２細胞系、ＯＣＩ−Ｌｙ７細胞系、ＳＵ−ＤＨＬ４細胞系、ＪｅＫｏ−１細胞系、ＪＶＭ−３細胞系、ＭＥＣ−１細胞系、および／またはＳＣ−１細胞系である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体ポリペプチド（ＣＡＲ）。
【請求項７】
−  前記細胞外抗原結合ドメインが、前記ＶＨドメインと前記ＶＬドメインの間に位置するリンカーポリペプチドを含んでいて、前記リンカーが、好ましくはＷｈｉｔｌｏｗリンカー（配列番号１３：ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ）、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカー（配列番号１４：ＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）、あるいは配列番号１３または１４と配列が少なくとも８０％一致するリンカーから選択される；および／または
−  前記細胞外抗原結合ドメインと前記膜貫通ドメインの間に位置するスペーサポリペプチドを追加して含み、ここで前記スペーサが、
ａ．ＩｇＧ１スペーサ（配列番号１５；ＰＡＥＰＫＳＰＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＫＤＰＫ）
ｂ．ＩｇＧ１Δスペーサ（配列番号１６；ＰＡＥＰＫＳＰＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＳＬＳＰＧＫＫ）
ｃ．ＩｇＧ４（Ｈｉ−ＣＨ２−ＣＨ３）スペーサ（配列番号１７；ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＥＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ）；
ｄ．ＩｇＧ４（Ｈｉ−ＣＨ３）スペーサ（配列番号１８；ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ）；
ｅ．ＩｇＧ４（Ｈｉ）スペーサ（配列番号１９；ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ）；または
ｆ．配列番号１５〜１９のいずれか１つと配列が少なくとも８０％一致するスペーサ
から選択される、および／または
−  前記膜貫通ドメインが、ＣＤ８αドメイン（配列番号２０；ＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣ）、ＣＤ２８ドメイン（配列番号２１；ＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶ）、あるいは配列番号２０または２１と配列が少なくとも８０％一致する膜貫通ドメインから選択される；および／または
−  前記細胞内ドメインが、４−１ＢＢ共刺激ドメイン（配列番号２２；ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ）、ＣＤ２８共刺激ドメイン（配列番号２３；ＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳＬ）、４−１ＢＢ（配列番号２２）とＣＤ２８共刺激ドメイン（配列番号２３）の両方を隣接した配置で含む共刺激ドメイン、あるいは配列番号２２または２３と配列が少なくとも８０％一致する共刺激ドメインから選択される共刺激ドメインを含む；および／または
−  シグナル伝達ドメイン（活性化ドメイン）を追加して含み、前記シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ζ（４−１ＢＢまたはＣＤ２８）シグナル伝達ドメイン（配列番号２４；ＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ）、または配列番号２４と配列が少なくとも８０％一致するシグナル伝達ドメインである、
請求項１〜６のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体ポリペプチド（ＣＡＲ）。
【請求項８】
配列番号２５、２６、２７、２８、２９のいずれか１つに従う配列を含むか、その配列からなる、請求項１〜７のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体ポリペプチド（ＣＡＲ）。
【請求項９】
単離された核酸分子であって、好ましくはベクターの形態、例えばウイルスベクターまたはトランスポゾンベクター、好ましくはｓｌｅｅｐｉｎｇ  ｂｅａｕｔｙベクターの形態であり、
ａ）以下：
−  請求項１〜８のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドをコードする、
−  細胞外抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインをコードしていて、前記細胞外抗原結合ドメインが、配列番号３７、５３または３８の少なくとも１つの配列と、配列番号３９、５４または４０の少なくとも１つの配列によってコードされている、または
−  配列番号３１、３２、３３、３４、または３５に従う
ヌクレオチド配列を含む核酸分子；および／または
ｂ）ａ）に記載のヌクレオチド配列と相補的な核酸分子；  
ｃ）ａ）またはｂ）に記載のヌクレオチド配列と類似した／同等な機能を持つのに十分な程度に一致する配列を有するヌクレオチド配列、好ましくはａ）またはｂ）に記載のヌクレオチド配列と配列が少なくとも８０％一致しているヌクレオチド配列を含む核酸分子；  
ｄ）遺伝暗号の帰結として、縮重によりａ）〜ｃ）に記載のヌクレオチド配列になる核酸分子；および／または
ｅ）欠失、付加、置換、転位、逆転、および／または挿入によって改変されているが、ａ）〜ｄ）に記載のヌクレオチド配列と機能が類似した／同等な、ａ）〜ｄ）に記載のヌクレオチド配列に従う核酸分子
からなるグループから選択される、単離された核酸分子。
【請求項１０】
請求項９に記載の核酸分子を含む、および／または請求項１〜８のいずれか１項に記載のＣＡＲを発現する遺伝子改変免疫細胞。
【請求項１１】
前記免疫細胞がＴリンパ球とＮＫ細胞からなるグループから選択され、ここで前記Ｔリンパ球が細胞傷害性Ｔリンパ球であることが好ましい、請求項１０に記載の遺伝子改変免疫細胞。
【請求項１２】
ＣＸＣＲ５を発現する病原性細胞、好ましくは病原性の成熟Ｂ細胞および／または記憶Ｂ細胞、および／または病原性のＴ細胞および／またはＴ濾胞性ヘルパー細胞の存在に関係する医学的障害の治療に用いるための、請求項１０または１１に記載の遺伝子改変免疫細胞。
【請求項１３】
前記医学的障害が成熟Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（Ｂ−ＮＨＬ）である、薬として利用するための請求項１２に記載の免疫細胞。
【請求項１４】
前記医学的障害が、白血病腫瘍細胞播種を伴う、または伴わないＴ細胞非ホジキンリンパ腫である、薬として利用するための請求項１２に記載の免疫細胞。
【請求項１５】
前記医学的障害が、
−  急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）からなるグループから選択されるＢ細胞由来リンパ増殖性障害；または
−  血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、および白血病性播種を伴うＴ細胞リンパ腫からなるグループから選択されるＴ細胞由来リンパ増殖性障害
である、薬として利用するための請求項１２に記載の免疫細胞。
【請求項１６】
前記医学的障害が自己抗体依存性自己免疫疾患であり、好ましくは全身性ループスエリテマトーデス（ＳＬＥ）または関節リウマチから選択される、薬として利用するための請求項１２に記載の免疫細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単離されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドに関係しており、このＣＡＲは、ＣＸＣケモカイン受容体５型（ＣＸＣＲ５）タンパク質に結合する抗体または抗体フラグメントを含む細胞外抗原結合ドメインを含んでいる。本発明はさらに、本発明のＣＡＲをコードする核酸分子と、遺伝子が改変されていて本発明のＣＡＲを発現する免疫細胞（好ましくはＴ細胞）と、ＣＸＣＲ５を発現している病原性細胞（好ましくは、病原性の成熟Ｂ細胞および／または記憶Ｂ細胞、および／または病原性のＴ細胞および／またはＴ濾胞性ヘルパー細胞）の存在と関係する医学的障害（特に、成熟Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（Ｂ−ＮＨＬ）、Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫、自己抗体依存性自己免疫疾患（全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）と関節リウマチから選択されることが好ましい））の治療におけるその細胞の利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ−ＮＨＬは多彩であり、中悪性度と低悪性度によって識別することができる。標準治療は、典型的には抗体／化学療法の組み合わせであり、それが単独で、または自家幹細胞移植、免疫調節薬、放射線照射、プロテアソーム阻害剤、シグナル伝達経路阻害剤と組み合わされて適用され、ごく少数の患者には同種異系幹細胞移植が適用される。多くのＢ−ＮＨＬ患者で診断時の年齢の中央値が６６〜７２歳よりも高齢であるため、複数の病気を抱えていると、集中化学療法、長期化学療法ができなかったり、同種異系骨髄移植でさえできなかったりすることもある。
【０００３】
成熟Ｂ細胞リンパ腫におけるＢ細胞受容体（ＢＣＲ）シグナル伝達の阻害剤（特にイブルチニブなど）は、寛解率の大きな向上をもたらした。これらのクラスのキナーゼ阻害剤は初期には高感度であるにもかかわらず、腫瘍根絶を達成できるかどうかは確実でないことに加え、いくつかの研究では、クローン性のリンパ腫と白血病が進化するとブルトンチロシンキナーゼ（ＢＴＫ）抑制に対する耐性が発生することが明らかにされている。そのため、標的療法に対する二次的耐性が急速に出現することから、他のいくつかの化学療法を受けたことがあり、したがって臨床効果（ＩＰＩスコア）が低下している患者に適用可能な忍容できる救援療法という解決法を見いだすことが切に必要とされている。
【０００４】
白血病とリンパ腫のＢ細胞の表面に広く発現しているＣＤ１９抗原を標的とする養子キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）−Ｔ療法は大きな臨床効果をもたらしてきており、現時点で、Ｂ−ＮＨＬとＢ−ＡＬＬの治療を目的とした４０件を超えるＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞の研究がＦＤＡに登録されている（ｗｗｗ−ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ）。しかしＢ−ＮＨＬに対する抗ＣＤ１９抗体またはＣＡＲ−Ｔ細胞療法では、抗原の喪失が原因で耐性が生じる可能性がある。最近のある研究では、抗ＣＤ１９  ＣＡＲ−Ｔ細胞療法により、選択的スプライシングを受けたＣＤ１９アイソフォームが選択され、したがってコグネイトＣＤ１９  ＣＡＲエピトープが失われる結果として、エスケープバリアントが出現することが示された。
【０００５】
そこでＣＸＣＲ５が、Ｂ細胞リンパ腫の免疫療法にとっての代わりの標的として、既存の治療耀ｍＡｂやＣＡＲ−Ｔ細胞療法に加えて登場する。
【０００６】
リンパ節に存在していることが明確なＢ細胞由来リンパ増殖性障害（急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）など）は、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ５を恒常的に発現していることがしばしばある。ＣＸＣＲ５は、成熟した再循環しているＢ細胞の表面と、ＣＤ４+  Ｔ細胞の小さなサブセットである濾胞性Ｔヘルパー細胞（Ｔｆｈ）の表面に生理学的に発現し、それらが二次的リンパ器官内でＢ細胞濾胞に恒常的にトラフィキングとホーミングをするよう調節する。重要なことだが、ＣＸＣＲ５は骨髄（ＢＭ）内のＢ細胞前駆体の表面には発現せず、形質細胞もこの受容体を発現しない。
【０００７】
発明者が知る限り、代わりの抗ＣＸＣＲ５  ＣＡＲコンストラクトが以前に報告されたことはなく、本発明の医学的アプローチと関係する抗ＣＸＣＲ５抗体の研究も現在のところ知られていない。
【０００８】
Ｐａｎｊｉｄｅｈら（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ、第１３５巻、第１１号、２０１４年４月２９日）は、ＣＸＣＲ５二重特異性抗体を利用した非ホジキンリンパ腫の治療を記載している。Ｓａｄｅｌａｉｎら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、第３巻、第４号、２０１３年４月１日）は、さまざまなＣＡＲ技術の総説を提示しているが、ＣＸＣＲ５への言及はない。ＷＯ  ２０１６／０９００３４には、ＣＡＲコンストラクトのための可能な多数の標的が開示されている。ＣＤ１８５（ＣＸＣＲ５）に言及されているが、ＣＡＲの構成要素、医学的利用に関する詳細な説明はなく、この標的の重要性への言及もない。ＷＯ  ２０１６／１６４７３１には、さまざまなＢ細胞標的抗原に向かうＣＡＲ−Ｔ細胞の利用が記載されている。ＣＡＲ  Ｔの標的としてのＣＸＣＲ５については言及されていない。
【０００９】
上記のような病状のための代わりの療法が開発中であるか、最近確立された。それは例えば、抗ＣＤ１９  ＣＡＲコンストラクト、標準療法（細胞傷害性化学療法など）、コルチコステロイド、免疫調節剤（ＩＭＩＤなど）、プロテアソーム阻害剤、自家幹細胞移植、同種異系幹細胞移植、シグナル伝達阻害剤、ＣＤ２０に対する抗体（リツキシマブ）、抗ＣＤ１９（オレツズマブ）、ＣＤ１９を標的とするＦａｂフラグメントと抗ＣＤ３フラグメントからなる二重特異性抗体（ＢＩＴＥ）（ブリナツモマブ））である。
【００１０】
可能性のある代わりの多数の療法が病原性Ｂ細胞と病原性Ｔ細胞の疾患のために開発中であるが、そのような医学的障害に対処するための有効な手段を提供することが相変わらず大いに必要とされている。
【発明の概要】
【００１１】
先行技術を考慮すると、本発明の背後にある技術的問題は、病原性のＢ細胞および／またはＴ細胞に関係する疾患、特に非ホジキンリンパ腫または自己抗体依存性自己免疫疾患の治療に適した薬剤を用意することであった。
【００１２】
この問題は、独立請求項の特徴によって解決される。本発明の好ましい実施態様は、従属請求項によって提供される。
【００１３】
したがって本発明は、
ｉ．ＣＸＣケモカイン受容体５型（ＣＸＣＲ５）タンパク質に結合する抗体または抗体フラグメントを含む細胞外抗原結合ドメインと、
ｉｉ．膜貫通ドメインと、
ｉｉｉ．細胞内ドメイン
を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドに関する。
【００１４】
本発明はしたがって、抗ＣＸＣＲ５  ＣＡＲコンストラクトと、このコンストラクトを発現する対応する免疫細胞に関係しており、このコンストラクトは、正常な造血細胞（Ｔ細胞（本明細書に記載のＴｆｈリンパ腫や他のＴ細胞リンパ腫は除く）、形質Ｂ細胞、その骨髄前駆体など）には影響することなく、所定の成熟Ｂ−ＮＨＬに対する大きな細胞傷害活性をヒトＴ細胞に与えるＣＡＲ−Ｔ細胞産物であることが好ましい。好ましい実施態様では、すべての骨髄細胞とＮＫ細胞も同様に影響を受けない。というのも本発明のＣＡＲ−Ｔ細胞産物は、これらの細胞に対する活性を示さないからである。
【００１５】
本発明による免疫療法の好ましい実施態様では、患者由来のＴ細胞に好ましくはレトロウイルスを用いて形質導入し、本明細書に記載の人工免疫受容体を発現させる。この人工免疫受容体は、膜貫通ドメインに融合した細胞外の抗体由来抗原認識部分と、それに続く細胞内シグナル伝達ドメインからなる。したがって本明細書に記載のコンストラクトは、形質導入されたＴ細胞に抗腫瘍細胞溶解能力を与える。
【００１６】
Ｔ細胞のこの好ましい自家移植が理由で、本発明のＣＡＲ−Ｔを用いて治療すると移植片対宿主病は起こりえない。再発の予防にとって重要な記憶Ｔ細胞の形成を促進することができる。
【００１７】
このような成熟Ｂ−ＮＨＬの非限定的な例に含まれるのは、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病のいくつかの段階である。
【００１８】
初めて、抗ＣＸＣＲ５  ＣＡＲ細胞が、腫瘍微小環境の中の腫瘍細胞を標的とすることが可能になるであろう。なぜならリンパ腫の増殖を促進するＴｆｈ細胞が付随して根絶されることになるからである。所与の腫瘍内の腫瘍細胞は標的抗原ＣＸＣＲ５にとって一様に陽性であるため、低／非発現腫瘍細胞の望ましくない陽性選択が回避される。
【００１９】
本明細書に記載の抗ＣＸＣＲ５  ＣＡＲ細胞は、好ましい実施態様では、他の療法の適格とされない成熟Ｂ−ＮＨＬ患者の治療に適用することができる。より具体的には、本発明の実施態様は、以下の患者集団の治療に関する：
ｉ）多剤耐性の患者、および／または
ｉｉ）同種異系幹細胞移植の適格ではない患者、および／または
ｉｉｉ）複数の病気を抱えていて、さらなる化学療法ができない患者、および／または
ｉｖ）化学療法に耐えられない高齢の患者、および／または
ｖ）疾患が進行した後や、他のいくつかの標準療法が失敗した場合でさえ、救援療法のためにＣＡＲを適用できる、および／または
ｖｉ）標的腫瘍細胞上の抗原が低密度だと抗体はうまくいかない可能性があるが、それでもＣＡＲは適用できる、および／または
ｖｉｉ）抗体には当てはまらないが、ＣＡＲは単剤療法として適用できる。
【００２０】
本明細書に記載の抗ＣＸＣＲ５  ＣＡＲは、抗腫瘍効果に必要な大きなアビディティをＴ細胞に与える。本発明の抗ＣＸＣＲ５  ＣＡＲは、生理学的形質Ｂ細胞、Ｔ細胞（Ｔｆｈ細胞と、特別な病原性ＣＸＣＲ５発現Ｔ細胞は除く）、ＮＫ細胞、あらゆる骨髄細胞系譜とその前駆体に対するＴ細胞反応性を与えないことが実証された。したがって本発明は、他の造血組織に対する標的外反応性がこれまでになく小さい。
【００２１】
本発明の抗ＣＸＣＲ５  ＣＡＲは、抗ＣＤ１９  ＣＡＲ−Ｔ細胞とは異なり、未熟Ｂ−ＮＨＬ、前駆Ｂ細胞新生物、生理学的に良性のＢ細胞前駆体に対する望ましくない反応性を持ってない。
【００２２】
下記の実施例で実証されているように、インビトロ共培養系では、抗ＣＸＣＲ５  ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＸＣＲ５を発現しているヒトＢ−ＮＨＬ腫瘍細胞系に曝露されると活性化する。その後これらＴ細胞は、細胞傷害活性を予測する表現型である、ＩＦＮγの分泌レベルが高いエフェクタ表現型を発達させる。
【００２３】
それに加え、標的細胞系として選択されたＢ−ＮＨＬ細胞、Ｂ細胞白血病細胞、Ｔ細胞白血病細胞、ＣＸＣＲ５陰性細胞、ＣＸＣＲ５トランスフェクタントに対する細胞傷害アッセイ（51Ｃｒ放出）から、選択的な細胞傷害性が、ＣＸＣＲ５に関して陽性である細胞系でだけ得られることがわかる。
【００２４】
追加の前臨床試験には、ｉ）患者からの適切なＢ−ＮＨＬ細胞系に対するインビトロ細胞傷害性試験と、ｉｉ）異種移植Ｂ−ＮＨＬ細胞系に対する抗ＣＸＣＲ５  ＣＡＲ活性の生体内試験が含まれる。
【００２５】
そのため本発明のＣＡＲは、本明細書に記載の病状の治療に対する驚異的かつ有益なアプローチを提示する。抗ＣＸＣＲ５  ＣＡＲの使用がＮＨＬの治療に向けての有望なアプローチであるとして試みられることや報告されることはこれまでになかった。マーカーの選択性に起因する望ましくない副作用が（存在しないわけではないにしても）最少であることも、本発明の有益かつ驚くべき側面である。特に抗ＣＤ１９治療に対する耐性が生じた患者では、本発明は悪性腫瘍の根絶に向けての非常に有望なアプローチを提供する。
【００２６】
一実施態様では、本発明は、本明細書に記載のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドに関係しており、このＣＡＲが、遺伝子が改変された免疫細胞（好ましくはＴリンパ球）の中で発現するとき、この免疫細胞は、ＣＸＣＲ５を発現している細胞の表面のＣＸＣＲ５に結合して活性化されることにより、ＣＸＣＲ５を発現しているその細胞に対する細胞傷害活性を誘導する。
【００２７】
ＣＸＣＲ５を発現する細胞の例は当業者に知られており、がんやそれ以外の病原性細胞のさらなるスクリーニングによって同定することができる。ＣＸＣＲ５を発現する細胞系は、ＤＯＨＨ−２細胞系、および／またはＯＣＩ−Ｌｙ７細胞系、および／またはＳＵ−ＤＨＬ４細胞系、および／またはＪｅＫｏ−１細胞系、および／またはＪＶＭ−３細胞系、および／またはＭＥＣ−１細胞系、および／またはＳＣ−１細胞系であることが好ましい。
【００２８】
一実施態様では、本発明はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドに関係しており、このＣＡＲに含まれるのは、
−  ＣＸＣケモカイン受容体５型（ＣＸＣＲ５）タンパク質に結合する抗体または抗体フラグメントを含む細胞外抗原結合ドメイン（ただし抗体または抗体フラグメントは、一本鎖抗体フラグメントのＶＨドメインとＶＬドメインを含み、リンカーポリペプチドがＶＨドメインとＶＬドメインの間に位置していることが好ましく、このリンカーは、抗体フラグメントと  ＣＸＣＲ５抗原の相互作用に干渉しない配置であることが好ましい）と；
−  細胞外抗原結合ドメインと膜貫通ドメインの間に位置するスペーサポリペプチド（ヒンジとも呼ばれる）（ただしこのスペーサポリペプチドは、抗体フラグメントと  ＣＸＣＲ５抗原の相互作用に干渉しない配置、および／またはＣＡＲを発現するＴ細胞の中でそのＣＡＲが発現するときにＴ細胞の活性化に干渉しない配置であることが好ましい）と；
−  膜貫通ドメイン（ただしこの膜貫通ドメインは、抗体フラグメントと  ＣＸＣＲ５抗原の相互作用に干渉しない配置、および／またはＣＡＲを発現するＴ細胞の中でそのＣＡＲが発現するときにＴ細胞の活性化に干渉しない配置であることが好ましい）と；
−  細胞内ドメイン（この細胞内ドメインは、共刺激ドメインとシグナル伝達ドメインを含んでいて、例えばサイトカイン産生の増加および／またはＴ細胞複製の促進によってＣＸＣＲ５標的に結合したときにＴ細胞の活性化を刺激するシグナルを提供することで細胞傷害効果をもたらす配置であることが好ましい）である。
【００２９】
したがって本発明のＣＡＲはさまざまな形態を取ることができ、その中には、本明細書に記載のそれぞれの機能的ドメインが異なる可能性のあるタンパク質配列が含まれる。当業者は、例えば下記の実施例に示されている実験的アプローチに基づいてＣＡＲの望ましい機能を選択して試験することができる。そのため本明細書で議論されている機能的ドメインのどれについても、本発明のＣＡＲで使用するために選択されたあらゆる具体的なタンパク質配列を、当業者が定型的な方法を利用して機能上の効果について評価することができる。例えばＶＨドメインとＶＬドメインの間に位置するさまざまなリンカーポリペプチド配列、細胞外抗原結合ドメインと膜貫通ドメインの間に位置するさまざまなスペーサポリペプチド配列（ヒンジとも呼ばれる）、さまざまな膜貫通ドメイン、さまざまな細胞内ドメイン（共刺激ドメインとシグナル伝達ドメインを含んでいることが好ましい）を使用することができる。
【００３０】
本発明の実施態様では、ＣＡＲと、本明細書で言及されているエレメントまたはドメインのそれぞれは、抗体フラグメントとＣＸＣＲ５抗原の相互作用に有害な干渉をしない配置、ＣＡＲを発現するＴ細胞の中でそのＣＡＲが発現するときにＴ細胞の活性化に有害な干渉をしない配置、ＣＸＣＲ５標的に結合したときにＴ細胞の活性化を刺激するシグナルを提供するＣＡＲに有害な干渉をしない配置にされている。
【００３１】
本明細書には、ＣＸＣＲ５  ＣＡＲのこれらの特性を評価するための実験的方法が記載されていて、本発明は、機能するさまざまな配列バリアントと、本明細書に記載のタイプのドメインの組み合わせを包含すると考えられるが、含まれるのが以下に例として開示されている特定の配列に限定されることはない。例えばＣＸＣＲ５を発現している腫瘍細胞による本発明のＣＡＲ−Ｔ細胞の特異的活性化は、下に示されているように、ＩＦＮγ、ＩＬ−２、ＴＮＦ−αの放出によって実証することができる。
【００３２】
発明者が知る限り、本発明は、初めて記載されたＣＸＣＲ５  ＣＡＲと、医療現場でＣＸＣＲ５  ＣＡＲの望ましい治療効果が初めて機能した証拠に関する。本明細書に記載のさまざまな機能的ドメインで用いられる個々の配列とは独立に、ＣＸＣＲ５  ＣＡＲを提供するだけで、病原性の成熟Ｂ細胞および／または記憶Ｂ細胞、および／または病原性のＴ細胞および／またはＴ濾胞性ヘルパー細胞に関係する多くの疾患の治療に顕著かつ有益なブレイクスルーがもたらされる。
【００３３】
図面
【００３４】
本発明を、例としての以下の図面によって明らかにする。図面は、本発明の１つ以上の非限定的な実施態様の裏付けの補強となる潜在的に好ましい実施態様のより詳しい記述を提供するものと見なすべきである。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】好ましいＣＡＲの構造の模式図。
【００３６】
【図２】好ましいＣＡＲコンストラクトＨ２８、Ｒ２８、ＨＢＢ１、ＨＢＢ２、Ｈ２８ＢＢの模式図。
【００３７】
【図３】本明細書に記載の好ましいＣＡＲコンストラクトと、ＣＡＲのさまざまな構造エレメントの可能な組み合わせのリスト。
【００３８】
【図４】ｍＡｂ結合領域と本発明のＣＡＲで用いられる好ましいヒト化配列の間の配列比較。
【００３９】
【図５】ｍＡｂ結合領域ｈＨＣをコードするＤＮＡ配列の配列図。
【００４０】
【図６】ｍＡｂ結合領域ｈＬＣをコードするＤＮＡ配列の配列図。
【００４１】
【図７−１】ヒト化ＣＸＣＲ５−ＣＡＲ配列を有するＧｅｎｅＡｒｔ（商標）プラスミドと、ラットＣＸＣＲ５−ＣＡＲ配列を有するＧｅｎｅＡｒｔ（商標）プラスミド。
【図７−２】ヒト化ＣＸＣＲ５−ＣＡＲ配列を有するＧｅｎｅＡｒｔ（商標）プラスミドと、ラットＣＸＣＲ５−ＣＡＲ配列を有するＧｅｎｅＡｒｔ（商標）プラスミド。
【００４２】
【図８−１】制限後のコンストラクトとベクターのゲル電気泳動。
【図８−２】制限後のコンストラクトとベクターのゲル電気泳動。
【００４３】
【図９】レトロウイルスを用いて形質導入した後にヒトＴ細胞の表面にＣＸＣＲ５−ＣＡＲが発現していることのフローサイトメトリーによる確認。
【００４４】
【図１０−１】機能アッセイで評価したさまざまなタイプの細胞の表面におけるＣＸＣＲ５の発現。
【図１０−２】機能アッセイで評価したさまざまなタイプの細胞の表面におけるＣＸＣＲ５の発現。
【００４５】
【図１１】ＣＡＲを形質導入したヒトＴ細胞とさまざまな標的細胞系の共培養から、識別可能なＣＸＣＲ５+  Ｂ−ＮＨＬと対照細胞系による特異的なＴ細胞活性化がわかる。
【００４６】
【図１２−１】細胞傷害アッセイから、ＣＸＣＲ５陽性細胞系の選択的な殺傷が明らかになる。
【図１２−２】細胞傷害アッセイから、ＣＸＣＲ５陽性細胞系の選択的な殺傷が明らかになる。
【００４７】
【図１３−１】ＣＸＣＲ５リダイレクトＣＡＲ−Ｔ細胞は、異種移植されたＮＳＧマウスモデルのＢ細胞非ホジキンリンパ腫（Ｂ−ＮＨＬ）に対して有効である。
【図１３−２】ＣＸＣＲ５リダイレクトＣＡＲ−Ｔ細胞は、異種移植されたＮＳＧマウスモデルのＢ細胞非ホジキンリンパ腫（Ｂ−ＮＨＬ）に対して有効である。
【００４８】
【図１４−１】ＣＡＲを形質導入したヒトＴ細胞とさまざまな標的細胞系の共培養から、識別可能なＣＸＣＲ５+  Ｂ−ＮＨＬと対照細胞系による特異的なＴ細胞活性化がわかる。
【図１４−２】ＣＡＲを形質導入したヒトＴ細胞とさまざまな標的細胞系の共培養から、識別可能なＣＸＣＲ５+  Ｂ−ＮＨＬと対照細胞系による特異的なＴ細胞活性化がわかる。
【００４９】
【図１５】ＣＡＲを形質導入したヒトＴ細胞と、標的としてのさまざまなヒト組織のＣＸＣＲ５陰性一次細胞の共培養から、標的外Ｔ細胞活性化がないことがわかるのに対し、ＣＸＣＲ５を発現しているＢ−ＮＨＬ細胞系ＪｅＫｏ−１は特異的なＴ細胞活性化を媒介し、陽性対照として機能する。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
ＣＡＲの抗原結合ドメインに関する実施態様：
【００５１】
一実施態様では、本発明は、本明細書に記載のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドに関係しており、その中の抗原結合ドメインは、
−  配列番号１（ＧＦＴＦＳＴＳＧ）と配列が少なくとも８０％一致する重鎖相補性決定領域１（Ｈ−ＣＤＲ１）、
−  配列番号２（ＩＳＳＳＳＧＦＶ）と配列が少なくとも８０％一致する重鎖相補性決定領域２（Ｈ−ＣＤＲ２）、
−  配列番号３（ＡＲＳＥＡＡＦ）と配列が少なくとも８０％一致する重鎖相補性決定領域３（Ｈ−ＣＤＲ３）を含む可変重鎖（ＶＨ）と、
−  配列番号４（ＫＳＲＬＳＲＭＧＩＴＰ）と配列が少なくとも８０％一致する軽鎖相補性決定領域１（Ｌ−ＣＤＲ１）、
−  配列番号５（ＲＭＳ）と配列が少なくとも８０％一致する軽鎖相補性決定領域２（Ｌ−ＣＤＲ２）、
−  配列番号６（ＡＱＦＬＥＹＰＰＴ）と配列が少なくとも８０％一致する軽鎖相補性決定領域３（Ｌ−ＣＤＲ３）を含む可変軽鎖（ＶＬ）を含んでいる。
【００５２】
一実施態様では、本発明は、本明細書に記載のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドに関係しており、このＣＡＲは、配列番号１、配列番号２、配列番号３のＣＤＲ配列を含むＶＨドメインと、配列番号４、配列番号５、配列番号６のＣＤＲ配列を含むＶＬドメインを含んでいる。
【００５３】
好ましい実施態様では、配列番号１〜６の具体的なＣＤＲ配列と配列が８０％以上一致する配列バリアントは、配列番号１〜６という具体的なＣＤＲ配列を持つＶＨドメインおよびＶＬドメインと実質的に同じか類似した機能的特性を持った状態でＣＸＣＲ５への結合を維持する。すなわちＣＸＣＲ５への結合は、親和性、特異性、エピトープ結合様式に関して実質的に同じであるか、類似している。
【００５４】
ｓｃＦＶフラグメントのアミノ酸配列は、元々はラット抗ヒトＣＸＣＲ５抗体から得られたものであり、例えばＶＬ鎖とＶＨ鎖のヒト化による改変により多くの改善がなされることで、膜貫通受容体構造の文脈における折り畳みと発現が可能にされている。
【００５５】
さらに、軽鎖フラグメントと重鎖フラグメントの順番は、抗原結合フラグメントの望ましい配置を考慮して逆転させることができる。
【００５６】
それに加え、いくつかの実施態様では、重鎖と軽鎖の間のリンカー配列が例えば短縮による改変を受けることで、ＣＡＲ機能が増強されている。
【００５７】
それに加え、ＣＡＲをコードする核酸配列のコドンが最適化されることで、ＣＡＲの発現が改善されている。
【００５８】
これらの改変によってＴ細胞の表面における十分な発現が可能になり、抗原の適切な結合が相変わらず維持される。大きな親和性と大きなアビディティにより、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ｉ）ＣＸＣＲ５が表面に高発現、中発現、低発現している腫瘍標的細胞を認識し、ｉｉ）その腫瘍標的細胞に対して活性化され、ｉｉｉ）その腫瘍標的細胞を殺すことができる。
【００５９】
発明者が知る限り、抗ＣＸＣＲ５  ＣＡＲも、ヒト化抗ＣＸＣＲ５抗体も、これまで本分野で報告されたことがない。
【００６０】
本明細書に記載の抗ＣＸＣＲ５  ＣＡＲ細胞の抗原結合ドメインの大きな親和性とアビディティが理由で、ＣＸＣＲ５の発現が少ない成熟Ｂ−ＮＨＬさえも認識することができ、Ｔ細胞の活性化と腫瘍細胞の殺傷が可能になる。
【００６１】
本明細書に記載の抗ＣＸＣＲ５  ＣＡＲ細胞産物は、独自の特性を特徴とする。
【００６２】
本明細書に記載の抗ＣＸＣＲ５  ＣＡＲは大きな親和性を持っていて、Ｔ細胞に対する大きな特異性とアビディティを与える。これらの特性により、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ｉ）表面に発現しているＣＸＣＲ５が多い腫瘍標的細胞と少ない腫瘍標的細胞を認識し、ｉｉ）その腫瘍標的細胞に対して活性化され、ｉｉｉ）その腫瘍標的細胞を殺すことが可能になる。
【００６３】
腫瘍細胞の表面に発現しているＣＸＣＲ５抗原の数は、（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｓｉｎｓｏｎ社からの）Ｑｕａｎｔｉｂｒｉｔｅビーズと組み合わせた蛍光染料にカップルさせた抗ＣＸＣＲ５抗体によって定量することができる。腫瘍細胞の表面に発現しているＣＸＣＲ５抗原の定量に適用される好ましい方法は、「蛍光活性化セルソーティング／細胞分析」（ＦＡＣＳ）である。ビーズの蛍光強度は、細胞に結合した蛍光性抗体の数と正確に相関するため、これが、細胞の表面にあるＣＸＣＲ５分子の数の１つの指標である。
【００６４】
本明細書に記載のＶＨフラグメントとＶＬフラグメントは、ＣＡＲの中で複数の配置にすることができるが、それでも標的エピトープに対する大きな特異性と大きな親和性を維持している。いくつかの実施態様では、ＣＡＲは、ＶＨ−ＶＬ配置またはＶＬ−ＶＨ配置にすることができて、リンカー、および／またはヒンジ、および／または膜貫通ドメイン、および／または共刺激ドメイン、および／または活性化ドメインにはバリエーションがあるが、それでもその効果は維持されている。さらなる開発が必要であったり望まれたりするようなことがあれば、本発明のこの驚くべき特徴により、ＣＸＣＲ５に向かうＣＡＲの設計の柔軟性をより大きくすることができ、そのことによってＣＡＲの構造を本明細書に記載のＶＨドメインとＶＬドメインに基づいてさらに改変および／または最適化することが可能になる。
【００６５】
ラット配列とヒト化配列の配列アラインメントが図４に示されている。したがって下記の配列には、ラット形態とヒト化形態両方の抗原結合ドメインを表わす一般化された配列も含まれている。下記の配列中のそれぞれのＸは、アミノ酸が変化する可能性のあることを表わしている。好ましいアミノ酸置換は、変化する可能性のある各位置について記載されているアミノ酸置換である。
【００６６】
本明細書で提案されている変化する可能性のある所与のあらゆるバリアント残基（「一般化された配列」の中でＸによって特定されている）について、可能な改変の可能なあらゆる組み合わせが本発明に含まれる。これらのさまざまな置換の１つ以上を組み合わせることにより、本明細書で実証されるラット抗原結合ドメインの望ましい結合傷害性を示すヒト化バリアントを生成させることができる。本明細書に記載のＣＡＲまたはその一部には、明示的に、すなわち１つの配列の式で開示されているヒト化配列と配列が少なくとも７０％、８０％、好ましくは９０％一致する配列も含まれる。
【００６７】
一実施態様では、本発明は、本明細書に記載のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドに関係しており、このＣＡＲは、配列番号７：
【化１】
2020532969.tif 000002
（ただしＸ１はＧまたはＫであり；Ｘ２はＲまたはＫであり；Ｘ３はＡまたはＳであり；Ｘ４はＮまたはＨであり；Ｘ５はＥまたはＤであり；Ｘ６はＳまたはＡであり；Ｘ７はＳまたはＡであり；Ｘ８はＳまたはＴであり；Ｘ９はＭまたはＬであり；Ｘ１０はＲまたはＫであり；Ｘ１１はＡまたはＳであり；Ｘ１２はＶまたはＩである）
と配列が少なくとも７０％、または８０％一致する、好ましくは少なくとも８５％、または９０％、または９５％、または１００％一致するＶＨドメインと、
配列番号８：
【化２】
2020532969.tif 000003
（ただしＸ１はＳまたはＡであり；Ｘ２はＬまたはＶであり；Ｘ３はＰまたはＳであり；Ｘ４はＳまたはＮであり；Ｘ５はＱまたはＫであり；Ｘ６はＲまたはＬであり；Ｘ７はＧまたはＥである）
と配列が少なくとも８０％一致する、好ましくは少なくとも８５％、または９０％、または９５％、または１００％一致するＶＬドメインを含んでいる。
【００６８】
好ましい実施態様では、本明細書に掲載の具体的なＶＨ配列およびＶＬ配列と配列が８０％以上一致する配列バリアントは、本明細書に記載の具体的な配列を持つＶＨドメインおよびＶＬドメインと実質的に同じか類似した機能的特性を持ってＣＸＣＲ５への結合を維持する。すなわちＣＸＣＲ５への結合は、親和性、特異性、エピトープ結合様式に関して実質的に同じであるか、類似している。
【００６９】
一実施態様では、本発明は、本明細書に記載のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドに関係しており、このＣＡＲは、
配列番号９（ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＴＳＧＭＮＷＦＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＹＩＳＳＳＳＧＦＶＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＱＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＥＡＡＦＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ）、または
配列番号１０（ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＫＳＬＫＬＳＣＳＡＳＧＦＴＦＳＴＳＧＭＨＷＦＲＱＡＰＧＫＧＬＤＷＶＡＹＩＳＳＳＳＧＦＶＹＡＤＡＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＱＮＴＬＹＬＱＬＮＳＬＫＳＥＤＴＡＩＹＹＣＡＲＳＥＡＡＦＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ）に従うＶＨドメインと、
配列番号１１（ＤＩＶＬＴＱＳＰＲＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＫＳＲＬＳＲＭＧＩＴＰＬＮＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＲＭＳＮＲＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＫＶＥＴＥＤＶＧＶＹＹＣＡＱＦＬＥＹＰＰＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＫ）、または
配列番号１２（ＤＩＶＬＴＱＡＰＲＳＶＳＶＴＰＧＥＳＡＳＩＳＣＲＳＮＫＳＲＬＳＲＭＧＩＴＰＬＮＷＹＬＱＫＰＧＫＳＰＱＬＬＩＹＲＭＳＮＬＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＥＴＤＦＴＬＫＩＳＫＶＥＴＥＤＶＧＶＹＹＣＡＱＦＬＥＹＰＰＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＫ）に従うＶＬドメインを含んでいる。
【００７０】
さらに別の実施態様では、本発明は、１つ以上のリンカー、スペーサ、膜貫通ドメイン、シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドに関する。一実施態様では、ＣＡＲは、共刺激ドメインとシグナル伝達（活性化）ドメインを含む細胞内ドメインを含んでいる。
【００７１】
一実施態様では、本発明は、本明細書に記載のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドに関係しており、その中の細胞外抗原結合ドメインは、ＶＨドメインとＶＬドメインの間に位置するリンカーポリペプチドを含んでいて、このリンカーの選択は、
−  Ｗｈｉｔｌｏｗリンカー（配列番号１３：ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ）、
−  Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカー（配列番号１４：ＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）、
−  配列番号１３または１４と配列が少なくとも８０％一致するリンカー
からなされることが好ましい。
【００７２】
一実施態様では、本発明は、本明細書に記載のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドに関係しており、このＣＡＲは細胞外抗原結合ドメインと膜貫通ドメインの間にスペーサポリペプチドを追加して含んでいて、このスペーサの選択は、
−  ＩｇＧ１スペーサ（配列番号１５；ＰＡＥＰＫＳＰＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＫＤＰＫ）
−  ＩｇＧ１Δスペーサ（配列番号１６；ＰＡＥＰＫＳＰＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＡＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＳＬＳＰＧＫＫ）
−  ＩｇＧ４（Ｈｉ−ＣＨ２−ＣＨ３）スペーサ（配列番号１７；ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＥＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ）；
−  ＩｇＧ４（Ｈｉ−ＣＨ３）スペーサ（配列番号１８；ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ）；
−  ＩｇＧ４（Ｈｉ）スペーサ（配列番号１９；ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ）；
−  配列番号１５〜１９のいずれか１つと配列が少なくとも８０％一致するスペーサ
からなされる。
【００７３】
一実施態様では、本発明は、本明細書に記載のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドに関係しており、その中の膜貫通ドメインの選択は、
−  ＣＤ８αドメイン（配列番号２０；ＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣ）、
−  ＣＤ２８ドメイン（配列番号２１；ＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶ）、
−  配列番号２０または２１と配列が少なくとも８０％一致する膜貫通ドメイン
からなされる。
【００７４】
一実施態様では、本発明は、本明細書に記載のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドに関係しており、その中の細胞内ドメインに含まれるのは、
−  ４−１ＢＢ共刺激ドメイン（配列番号２２；ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ）、および／または
−  ＣＤ２８共刺激ドメイン（配列番号２３；ＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳＬ）、または
−  ４−１ＢＢ（配列番号２２）と  ＣＤ２８共刺激ドメイン（配列番号２３）の両方を隣接した配置で含む共刺激ドメイン、または
−  配列番号２２または２３と配列が少なくとも８０％一致する共刺激ドメイン
から選択された共刺激ドメインである。
【００７５】
一実施態様では、本発明は、本明細書に記載のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドに関係しており、このＣＡＲは、シグナル伝達ドメイン（活性化ドメインとしても知られる）を追加して含んでおり、このシグナル伝達ドメインは、
−  ＣＤ３ζ（４−１ＢＢまたはＣＤ２８）シグナル伝達ドメイン（配列番号２４；ＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ）、または
−  配列番号２４と配列が少なくとも８０％一致するシグナル伝達ドメインである。
【００７６】
一実施態様では、本発明は、本明細書に記載のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドに関係しており、このＣＡＲは、配列番号２５、２６、２７、２８、２９のいずれか１つに従う配列を含んでいる。
【００７７】
シグナル伝達ドメインの交換は、強力かつ迅速なエフェクタ相（ＣＤ２８共刺激ドメイン）、またはＴ細胞記憶集団（４−１ＢＢシグナル伝達ドメイン）によって保証される長く継続する再発制御という要求に合致する。本明細書で実証されているように、さまざまなシグナル伝達ドメインを交換して多数の配置にすることで、有利な結合特性を失うことなく、設計の柔軟性があるＣＡＲを提供することができる。
【００７８】
本発明のさらに別の実施態様では、ＣＡＲは、以下の配置：
−  Ｈ２８：ＭＰ７１−ｈＣＸＣＲ５−ＶＨ−Ｗｈｉｔｌｏｗ−ＶＬ−ＩｇＧ１−ＣＤ２８−ＣＤ２８−ＣＤ３ｚ
−  Ｒ２８：ＭＰ７１−ラットＣＸＣＲ５−ＶＨ−Ｗｈｉｔｌｏｗ−ＶＬ−ＩｇＧ１−ＣＤ２８−ＣＤ２８−ＣＤ３ｚ
−  ＨＢＢ１：ＭＰ７１−ｈＣＸＣＲ５−ＶＨ−Ｗｈｉｔｌｏｗ−ＶＬ−ＩｇＧ１Δ−ＣＤ８α−４−１ＢＢ−ＣＤ３ｚ
−  ＨＢＢ２：ＭＰ７１−ｈＣＸＣＲ５−ＶＨ−Ｗｈｉｔｌｏｗ−ＶＬ−ＩｇＧ１−ＣＤ２８−４−１ＢＢ−ＣＤ３ｚ
−  Ｈ２８ＢＢ：ＭＰ７１−ｈＣＸＣＲ５−ＶＨ−Ｗｈｉｔｌｏｗ−ＶＬ−ＩｇＧ１−ＣＤ２８−ＣＤ２８−４−１ＢＢ−ＣＤ３ｚ
を含むことができる。
【００７９】
これらの特別な配置が好ましいが、これらに限定されることはない。上記の配置が、本明細書に記載されている実施態様の具体的な配列によって制限されることもない。これらの配置の文脈の中で配列のバリエーションが可能であり、そのバリエーションは本発明の範囲に含まれる。
【００８０】
（代わりの構成要素を付加することによる）リンカー、スペーサ、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインとして使用されるバリアントにより、さまざまな構成要素を当業者が必要に応じて交換してＣＸＣＲ５への結合特性を維持することで、望む生物学的効果を維持できることは明らかである。
【００８１】
好ましい実施態様では、ＭＰ７１−ベクターおよびγ−レトロウイルス発現系と組み合わせることで、ヒトＴ細胞で異常に大きな形質導入率を実現することができる。形質導入系は、ＣＡＲコンストラクトがモジュール式の設計になっていることが理由でさまざまである。これは、本発明を実施するとき当業者の必要性と好みに応じてレンチウイルスとトランスポゾンを使用できることを意味する。ＣＸＣＲ５  ＣＡＲのための遺伝情報／核酸分子の導入には、Ｃｒｉｓｐ／ＣａｓとＴＡＬＥＮを媒介として標的細胞系（Ｔリンパ球、ナチュラルキラー細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）が好ましい）に挿入することも含まれる。ＣＸＣＲ５  ＣＡＲのための遺伝情報／核酸分子を、そのＣＡＲを発現している細胞の中に導入するのに適したあらゆる方法が本発明に包含され、適切な方法は、当業者が本発明を実施するときに選択できる。例えばＴ細胞を形質転換する多数の方法が本分野で知られており、その中には、ウイルスをベースとした遺伝子導入法（改変されたレトロウイルスに基づく方法など）、非ウイルス法（ＤＮＡに基づくトランスポゾン、電気穿孔によるｍＲＮＡの直接的な導入）が含まれる。
【００８２】
それに加え、ＣＡＲコンストラクトのシグナル伝達構成要素は、モジュール式組成と、熟練者が個別対応した臨床に適用可能な構成の抗ＣＸＣＲ５  ＣＡＲを可能にする３工程のクローニング手続きで交換されている。
【００８３】
本発明のさらに別の１つの側面では、本発明は、単離された核酸分子に関係しており、単離されたこの核酸分子は、ベクターの形態（例えばウイルスベクターまたはトランスポゾンベクターの形態）であることが好ましく、ｓｌｅｅｐｉｎｇ  ｂｅａｕｔｙベクターであることが好ましく、その選択は、
ａ）−  本明細書に記載のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または
−  細胞外抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインをコードしていて、細胞外抗原結合ドメインが、配列番号３７、３８のうちの少なくとも１つの配列と、配列番号３９、４０のうちの少なくとも１つの配列によってコードされているヌクレオチド配列、または
−  配列番号３１、３２、３３、３４、３５のいずれかに従うヌクレオチド配列
を含む核酸分子；  
ｂ）ａ）に記載のヌクレオチド配列と相補的な核酸分子；  
ｃ）ａ）またはｂ）に記載のヌクレオチド配列と類似した／同等な機能を持つのに十分な程度に配列が一致していて、好ましくはａ）またはｂ）に記載のヌクレオチド配列と配列が少なくとも８０％一致しているヌクレオチド配列を含む核酸分子；  
ｄ）遺伝暗号の帰結として、縮重によりａ）〜ｃ）に記載のヌクレオチド配列になる核酸分子；  
ｅ）欠失、および／または付加、および／または置換、および／または転位、および／または逆転、および／または挿入によって改変されているが、ａ）〜ｄ）に記載のヌクレオチド配列と機能が類似した／同等な、ａ）〜ｄ）に記載のヌクレオチド配列に従う核酸分子
からなるグループからなされる。
【００８４】
本発明の好ましい実施態様では、単離された核酸分子は、ベクターの形態（例えばウイルスベクターまたはトランスポゾンベクターの形態）であることが好ましく、ｓｌｅｅｐｉｎｇ  ｂｅａｕｔｙベクターであることが好ましく、その選択は、
ａ）−  本明細書に記載のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または
−  細胞外抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインをコードしていて、細胞外抗原結合ドメインが、配列番号３７、５３、３８のうちの少なくとも１つの配列と、配列番号３９、５４、４０のうちの少なくとも１つの配列によってコードされているヌクレオチド配列、または
−  配列番号３１、３２、３３、３４、３５のいずれかに従うヌクレオチド配列
を含む核酸分子；  
ｂ）ａ）に記載のヌクレオチド配列と相補的な核酸分子；  
ｃ）ＣＸＣＲ５標的抗原への結合に関してａ）またはｂ）に記載のヌクレオチド配列と類似した／同等な機能を持つのに十分な程度に配列が一致していて、好ましくはａ）またはｂ）に記載のヌクレオチド配列と配列が少なくとも８０％（好ましくは９０％または９５％）一致しているヌクレオチド配列を含み、対応するＴ細胞がコンストラクトを発現するとき、ＣＡＲ−Ｔ細胞産物は、成熟Ｂ−ＮＨＬに対する細胞傷害活性を与える一方で、正常な造血細胞（Ｔ細胞（本明細書に記載のＴｆｈや他のＴ細胞リンパ腫は除く）、形質Ｂ細胞、その骨髄前駆体など）には影響することがない核酸分子；
ｄ）遺伝暗号の帰結として、縮重によりａ）〜ｃ）に記載のヌクレオチド配列になる核酸分子
からなるグループからなされる。
【００８５】
縮重する（または縮重させる）という用語は、核酸分子のヌクレオチド配列に違いがあっても、遺伝暗号が理由で、翻訳後にそのヌクレオチド配列のタンパク質産物のアミノ酸の違いにつながらないことを意味する。一実施態様では、核酸分子は、ａ）とｂ）の上記分子、またはａ）とｂ）とｃ）の上記分子、またはａ）とｂ）とｄ）の上記分子に関係している。
【００８６】
本発明の好ましいアミノ酸とヌクレオチド配列：
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
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【表１−７】
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【表１−８】
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【表１−９】
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【００８７】
本発明のさらに別の1つの側面は、本明細書に記載の核酸分子を含むベクターに関係しており、このベクターはウイルスベクターであることが好ましく、γレトロウイルスベクターであることがさらに好ましい。本発明の別の1つの側面では、本発明は、本発明のCARをコードしていて好ましくはそのCARを発現することのできるトランスポゾンベクター（ｓｌｅｅｐｉｎｇ  ｂｅａｕｔｙベクターが好ましい）に関する。
【００８８】
本発明のさらに別の1つの側面は、本明細書に記載の核酸分子またはベクターを含む遺伝子改変免疫細胞、および／または本明細書に記載のCARを発現する遺伝子改変免疫細胞に関する。
【００８９】
好ましい一実施態様では、本明細書で言及されている疾患の治療に投与される免疫細胞は、「ｓｌｅｅｐｉｎｇ  ｂｅａｕｔｙ」トランスポゾン系（特にｓｌｅｅｐｉｎｇ  ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼ）を用い、本明細書に記載の抗ＣＸＣＲ５  ＣＡＲをコードしていて発現する本明細書に記載の核酸で遺伝子が改変される。ｓｌｅｅｐｉｎｇ  ｂｅａｕｔｙトランスポゾン系は、本発明の文脈において免疫細胞を改変して本明細書に記載のＣＡＲを発現させることを目的として正確に決められたＤＮＡ配列を脊椎動物の染色体の中に導入する設計にされた合成ＤＮＡトランスポゾンである。ｓｌｅｅｐｉｎｇ  ｂｅａｕｔｙトランスポゾンは、ウイルスの利点と裸のＤＮＡの利点を併せ持つ。ウイルスは、新たな宿主細胞に感染してその中で複製する能力に基づいて選択されて進化してきた。それと同時に細胞は、自らをウイルス感染から護るため、主要な分子防御機構を進化させてきた。社会的な理由と調節上の理由でウイルスの使用を避けることも重要である。したがってｓｌｅｅｐｉｎｇ  ｂｅａｕｔｙ系などの非ウイルスベクターを使用すると、細胞がベクターに対して用いる防御のすべてではないが多くが回避される。それが理由で、ｓｌｅｅｐｉｎｇ  ｂｅａｕｔｙ系により、患者に投与するための免疫細胞を特に効果的かつ安全に遺伝子改変することが可能になる。
【００９０】
本発明のさらに別の実施態様では、ＣｒｉｓｐＲ／ＣａｓとＴＡＬＥＮを媒介として、ＣＸＣＲ５  ＣＡＲをコードする核酸を挿入することができる。当業者に知られているＣｒｉｓｐＲ／Ｃａｓは、細菌における天然のプロセスから改変したものであり、それを利用してＤＮＡを正確かつ効果的に編集し、適切なコード配列を興味ある免疫細胞（好ましくはＴ細胞）の中に挿入することができる。Ｃａｓ９は分子レベルのハサミとして機能するタンパク質であり、関連するＲＮＡ分子（ガイドＲＮＡ）によって特定のＤＮＡ配列へと導かれる。Ｃａｓ９は、ＤＮＡ上の標的位置に到着すると、局所的な遺伝暗号を変化しやすくしてその遺伝子の機能に影響を与える。ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９はＣＡＲ遺伝子をＴ細胞のゲノム内のごく特定の部位に送達することができる。そのため正確でない位置または望ましくない位置に遺伝子が挿入されるリスクを減らすことができる。
【００９１】
一実施態様では、免疫細胞は、Ｔリンパ球とＮＫ細胞からなるグループから選択されることが好ましく、細胞傷害性Ｔリンパ球から選択されることがより好ましい。
【００９２】
好ましい一実施態様では、本明細書に記載の核酸分子またはベクターを含む免疫細胞、および／または本明細書に記載のＣＡＲを発現する免疫細胞は、ＣＤ４+  Ｔ細胞および／またはＣＤ８+  Ｔ細胞であること、好ましくは  ＣＤ４+  Ｔ細胞とＣＤ８+  Ｔ細胞の混合物であることを特徴とする。これらＴ細胞の集団、好ましくはＣＤ４+形質転換細胞とＣＤ８+形質転換細胞の両方を含む組成物は、さまざまな悪性Ｂ細胞（Ｂ−ＮＨＬなど）に対して、好ましくはこれらの細胞および／または本明細書に記載の関連する病状に対して特に有効な細胞溶解活性を示す。
【００９３】
好ましい一実施態様では、本明細書に記載の核酸分子またはベクターを含む遺伝子改変免疫細胞、および／または本明細書に記載のＣＡＲを発現する遺伝子改変免疫細胞は、ＣＤ４+  Ｔ細胞とＣＤ８+  Ｔ細胞であり、その比は１：１０〜１０：１であることが好ましく、５：１〜１：５、または２：１〜１：２、または１：１であることがより好ましい。本明細書に記載のＣＡＲを発現していてＣＸＣＲ５に向かう改変ＣＡＲ−Ｔ細胞を上記の比（好ましくはＣＤ４+：ＣＤ８+が１：１の比）で投与すると、本明細書で言及されている疾患を治療している間の有益な特徴につながる。例えばこれらの比にすると、治療に対する反応が改善され、毒性が低下する。
【００９４】
本発明の追加の驚くべき１つの側面は、本明細書に開示されているＣＡＲの安定性改善である。ＣＡＲポリペプチドは、適切な条件下では、結合親和性をまったく失うことなく長期にわたって保管することが容易にできる。
【００９５】
本発明のさらに別の１つの側面は、ＣＸＣＲ５を発現している病原性細胞の存在に関連する医学的障害の治療に用いるための、本明細書に記載の遺伝子改変免疫細胞に関する。
【００９６】
一実施態様では、治療すべき医学的障害は、病原性の成熟Ｂ細胞および／または記憶Ｂ細胞の存在に関係している。
【００９７】
一実施態様では、治療すべき医学的障害は、成熟Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（Ｂ−ＮＨＬ）である。
【００９８】
一実施態様では、治療すべき医学的障害はＢ細胞由来リンパ増殖性障害であり、急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）からなるグループから選択されることが好ましい。
【００９９】
一実施態様では、治療すべき医学的障害は、病原性のＴ細胞および／またはＴ濾胞性ヘルパー細胞に関係している。
【０１００】
一実施態様では、治療すべき医学的障害は、白血病腫瘍細胞播種を伴う、または伴わないＴ細胞非ホジキンリンパ腫である。
【０１０１】
一実施態様では、治療すべき医学的障害はＴ細胞由来リンパ増殖性傷害であり、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、白血病性播種を伴うＴ細胞リンパ腫からなるグループから選択されることが好ましい。
【０１０２】
本発明のさらに別の１つの側面は、自己抗体依存性自己免疫疾患の治療における薬として使用するための、本発明のＣＡＲを発現している本明細書に記載の遺伝子改変免疫細胞に関する。
【０１０３】
好ましい一実施態様では、自己免疫疾患は、全身性ループスエリテマトーデス（ＳＬＥ）と関節リウマチから選択される。
【０１０４】
ごく最近になり、ＣＡＲ−Ｔ細胞も、自己抗体を媒介とした疾患を治療するための標的となるアプローチとして議論されるようになってきた（Ｅｌｌｅｂｒｅｃｈｔ他（２０１６年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  第３５３巻：１７９〜１８４ページ）。ＣＸＣＲ５を標的とする能力は、共存する自己反応性のＢ細胞とＴｆｈ細胞を抑制すると考えられるため、自己免疫疾患の治療にとって大いに有益であると考えられる。
【０１０５】
穏やかな形態の自己免疫疾患は、通常は最初に非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）または疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）を用いて治療される。より重症の関節リウマチ（ＲＡ）と全身性ループスエリテマトーデス（ＳＬＥ）は、疾患の勢いが強いこと原因で臓器不全が関与するため、通常は、ステロイドに強い免疫抑制剤（循環している細胞を標的とする細胞傷害剤であるシクロホスファミドなど）を組み合わせて治療される。ごく最近になり、自己免疫疾患を有する患者の血清でレベルの上昇が見いだされているサイトカインＢＡＦＦを標的とする抗体であるベリムマブが、ＳＬＥでの使用について食品医薬品局（ＦＤＡ）によって認可された。
【０１０６】
しかしヒトにおける生存に関しては新たに形成されたＢ細胞だけがＢＡＦＦに依存している一方で、記憶Ｂ細胞と形質細胞は、選択的なＢＡＦＦ抑制に対する感度が劣っている（Ｊａｃｏｂｉ他（２０１０年）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ第６２巻：２０１〜２１０ページ）。関節リウマチ（ＲＡ）については、ＴＮＦ阻害剤が最初に認可された生物剤であり、その後アバタセプト、リツキシマブ、トシリズマブなどが続いた。これらは関節の炎症と破壊に関与する重要な炎症経路を抑制するが、免疫を比較的抑制することが原因で感染症のリスクが大きいという代償がある（Ｃｈａｎ他（２０１０年）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ第１０巻：３０１〜３１６ページ、Ｋｅｙｓｅｒ  （２０１１年）Ｃｕｒｒ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ  Ｒｅｖ  第７巻：７７〜８７ページ）。
【０１０７】
特にリツキシマブ（Ｂ細胞を循環から消失させるモノクローナル抗体）が、ＲＡの治療だけでなく、多発血管炎性肉芽腫症やそれ以外の抗好中球細胞質抗体関連血管炎の治療にますます多く処方されるようになっている。しかしリツキシマブにリスクがないわけではなく、シクロホスファミドと同様の有害事象発生率を示す（Ｓｈａｈ他（２０１５年）ＩｍｍｕｎｏＴａｒｇｅｔｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ第４巻：１７３〜１８３ページ）。そのため、自己反応性Ｂ細胞と自己抗体反応を標的としていて、より細かく調節できてより長く持続するアプローチが望まれている。
【０１０８】
本発明はさらに、本明細書に記載の病状を治療する方法に関係しており、この方法は、典型的には、ＣＡＲ、またはそのＣＡＲを発現している免疫細胞の治療に有効な量を、治療を必要とする患者に投与することを含んでいる。
【０１０９】
発明の詳細な説明
キメラ抗原受容体：
【０１１０】
本発明によれば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドは、ＣＸＣケモカイン受容体５型（ＣＸＣＲ５）タンパク質に結合する抗体または抗体フラグメントを含む細胞外抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインを含んでいる。ＣＡＲは、典型的には、抗体に由来する細胞外外部ドメイン（抗原結合ドメイン）と、Ｔ細胞シグナル伝達タンパク質に由来するシグナル伝達モジュールを含む内部ドメインを含むと記述される。
【０１１１】
好ましい一実施態様では、外部ドメインは、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）として構成された免疫グロブリンの重鎖と軽鎖からの可変領域を含むことが好ましい。ｓｃＦｖは、ヒンジ領域に結合していることが好ましい。このヒンジ領域は、可撓性を提供するとともに、細胞内シグナル伝達ドメインに固着している膜貫通部分を通じてシグナルを伝える。膜貫通ドメインは、ＣＤ８αまたはＣＤ２８に由来することが好ましい。第１世代のＣＡＲでは、シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲ複合体のζ鎖からなる。「世代」という用語は、細胞内シグナル伝達ドメインの構造を意味する。第２世代のＣＡＲは、ＣＤ２８または４−１ＢＢに由来する単一の共刺激ドメインを備えている。第３世代のＣＡＲは、すでに２つの共刺激ドメイン（例えばＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＩＣＯＳまたはＯＸ４０、ＣＤ３ζ）を含んでいる。本発明は、第２世代または第３世代のＣＡＲに関係することが好ましい。
【０１１２】
さまざまな実施態様では、免疫エフェクタ細胞の細胞傷害性をＢ細胞にリダイレクトする遺伝子操作された受容体が提供される。遺伝子操作されたこれら受容体を本明細書ではキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と呼ぶ。ＣＡＲは、特異的な抗ＣＸＣＲ５細胞免疫活性を示すキメラタンパク質を生成させるため、望む抗原（例えばＣＸＣＲ５）に対する特異性が抗体に基づくことと、Ｔ細胞受容体を活性化する細胞内ドメインを組み合わせた分子である。本明細書では、「キメラ」という用語は、起源が異なるさまざまなタンパク質またはＤＮＡの部分で構成されていることを記述する。
【０１１３】
本明細書で考慮するＣＡＲは、ＣＸＣＲ５に結合する細胞外ドメイン（結合ドメインまたは抗原結合ドメインとも呼ばれる）と、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインまたは細胞内シグナル伝達ドメインを含んでいる。ＣＡＲの抗ＣＸＣＲ５抗原結合ドメインが標的細胞の表面にあるＣＸＣＲ５と結合すると、ＣＡＲがクラスターになり、活性化刺激がＣＡＲ含有細胞に伝えられる。ＣＡＲの主要な特徴は、免疫エフェクタ細胞の特異性をリダイレクトすることであり、そうすることにより、増殖、またはサイトカイン産生、またはファゴサイトーシス、または標的抗原発現細胞の細胞死を媒介することのできる分子の産生を主要組織適合複合体（ＭＨＣ）とは独立したやり方で開始させ、モノクローナル抗体、または可溶性リガンド、または細胞特異的共受容体の細胞特異的なターゲティング能力を利用することである。
【０１１４】
さまざまな実施態様では、ＣＡＲは、ヒト化ＣＸＣＲ５特異的結合ドメインと、膜貫通ドメインと、１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含んでいる。特別な実施態様では、ＣＡＲは、ヒト化抗ＣＸＣＲ５抗原結合フラグメントを含む細胞外結合ドメインと、１つ以上のスペーサドメインと、膜貫通ドメインと、１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含んでいる。
【０１１５】
「細胞外抗原結合ドメイン」または「細胞外結合ドメイン」は交換可能に用いられ、興味ある標的抗原であるＣＸＣＲ５に特異的に結合する能力を持つＣＡＲを提供する。結合ドメインは、天然供給源、合成供給源、半合成供給源、組み換え供給源のいずれかが可能である。好ましいのはｓｃＦｖドメインである。
【０１１６】
「特異的な結合」は、当業者が理解しているのと同様の意味で理解され、当業者は、結合と結合特異性を調べるために利用できるさまざまな実験手続きを明確に認識している。平衡会合定数または平衡解離定数を求める方法は本分野で知られている。多くのタンパク質−タンパク質相互作用では、いくらかの交差反応またはバックグラウンドの結合が不可避である可能性があるが、そのことでＣＡＲとエピトープの間の結合の「特異性」が損なわれることはない。「特異的な結合」は、抗ＣＸＣＲ５抗体またはその抗原結合フラグメント（またはこれを含むＣＡＲ）が、バックグラウンドの結合よりも大きな結合親和性でＣＸＣＲ５に結合することを記述している。「に向かう」という表現も、抗体とエピトープの間の相互作用を理解するにあたって「特異性」という用語を考えるときに適用できる。
【０１１７】
「抗原（Ａｇ）」は、動物において抗体の産生またはＴ細胞の反応を刺激することのできる化合物、組成物、物質を意味する。特別な実施態様では、標的抗原は、ＣＸＣＲ５ポリペプチドのエピトープである。「エピトープ」は、抗原のうちで結合剤が結合する領域を意味する。エピトープは、タンパク質折り畳み三次構造によって隣接した配置になった連続アミノ酸と不連続アミノ酸の両方から形成することができる。
【０１１８】
「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨドメインとＶＬドメインを含んでおり、これらのドメインは、１本のポリペプチド鎖の中に、いずれかの向き（例えばＶＬ−ＶＨまたはＶＨ−ＶＬ）で存在する。一般に、ｓｃＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーをさらに含むことで、抗原が結合するための望む構造を形成することが可能になる。好ましい実施態様では、本明細書で考慮するＣＡＲは、抗原特異的結合ドメインを含んでいる。それはｓｃＦｖであり、マウスｓｃＦｖ、ヒトｓｃＦｖ、ヒト化ｓｃＦｖのいずれかが可能である。一本鎖抗体は、望む標的に対して特異的なハイブリドーマのＶ領域遺伝子からクローニングすることができる。特別な実施態様では、抗原特異的結合ドメインは、ヒトＣＸＣＲ５ポリペプチドに結合するヒト化ｓｃＦｖである。本明細書で考慮する抗ＣＸＣＲ５  ＣＡＲを構成するのに適した可変重鎖の１つの実例は、配列番号９に示されているアミノ酸配列だが、それに限定されない。本明細書で考慮する抗ＣＸＣＲ５  ＣＡＲを構成するのに適した可変軽鎖の１つの実例は、配列番号１１に示されているアミノ酸配列だが、それに限定されない。
【０１１９】
抗体と抗体フラグメント：
【０１２０】
ＣＡＲは、ＣＸＣＲ５ポリペプチドに結合する抗体または抗体フラグメントを含む細胞外抗原結合ドメインを含んでいる。したがって本発明の抗体または抗体フラグメントの非限定的な例に含まれるのは、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、一本鎖フラグメント（ｓｃＦｖ）、一本鎖可変フラグメント（ｓｓＦｖ）、単一ドメイン抗体（ナノボディからのＶＨＨフラグメントなど）、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリによって作製したフラグメント、抗イディオタイプ抗体、エピトープ結合フラグメントと、これらの任意のものの組み合わせだが、本明細書に記載のＣＡＲと同様の結合特性を保持していて、好ましくは対応するＣＤＲ、または本明細書に記載のＶＨ領域とＶＬ領域を含んでいることが条件である。ミニ抗体と多価抗体（２価抗体、３価抗体、４価抗体、５価抗体）も本発明の方法で使用することができる。本発明の免疫グロブリン分子として、任意のクラス（すなわちＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ）またはサブクラスの免疫グロブリン分子が可能である。したがって抗体という用語は、本明細書では、抗体全体の改変によって作製されたものであれ、組み換えＤＮＡ法を利用して新たに合成されたものであれ、本発明のＣＡＲに含まれる抗体と抗体フラグメントも包含する。
【０１２１】
本明細書では、一般に「抗体」は、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子の断片によって実質的にコードされている１つ以上のポリペプチドからなるタンパク質を意味する。「抗体」という用語が用いられている場合、「抗体フラグメント」という用語にも言及されていると見なすことができる。免疫グロブリン遺伝子に含まれると認識されているのは、κ、λ、γ、δ、ε、μという定常領域遺伝子のほか、多数の免疫グロブリン可変領域遺伝子である。軽鎖は、κまたはλとして分類される。重鎖は、γ、μ、α、δ、εとして分類され、それらが今度は免疫グロブリンのクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥをそれぞれ規定する。免疫グロブリン（抗体）の基本的な構造単位は、四量体または二量体を含むことが知られている。それぞれの四量体は、同じポリペプチド鎖のペア２つで構成されており、各ペアは、１本の「軽」鎖（約２５  ｋＤ）と１本の「重」鎖（約５０〜７０  ｋＤ）を有する。各鎖のＮ末端は約１００〜１１０個、またはそれよりも多数のアミノ酸からなる可変領域を規定していて、主に抗原の認識を担っている。「可変軽鎖」と「可変重鎖」という用語は、軽鎖と重鎖それぞれの可変領域を意味する。場合によっては、抗体、または抗体の免疫部分を、化学的に他のタンパク質との融合タンパク質と結合させること、または他のタンパク質との融合タンパク質として発現させることができる。
【０１２２】
本発明のＣＡＲは、哺乳動物（特にヒト）のタンパク質標的に結合することが想定されている。タンパク質名の使用は、あるタンパク質のマウス版またはヒト版に対応する可能性がある。
【０１２３】
本開示による結合ドメインポリペプチドとＣＡＲタンパク質の親和性は、従来の技術（例えば競合ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、結合会合、標識されたリガンドを用いた置換アッセイ、表面プラズモン共鳴装置（Ｂｉａｃｏｒｅなど））を利用して容易に求めることができる。
【０１２４】
本発明による抗体の１つ以上のＣＤＲを含むか、その抗体に由来する１つ以上のＣＤＲを含むヒト化抗体は、本分野で知られている任意の方法を利用して作製することができる。例えば４つの一般的な工程を利用してモノクローナル抗体をヒト化することができる。その工程とは、（１）元になる抗体の軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインのヌクレオチド配列と予想されるアミノ酸配列を求める工程、（２）ヒト化抗体を設計する工程、すなわちヒト化プロセスでどの抗体フレームワーク領域を用いるかを判断する工程、（３）実際にヒト化する方法／技術を用いる工程、（４）ヒト化抗体をトランスフェクトして発現させる工程である。例えばアメリカ合衆国特許第４，８１６，５６７号；第５，８０７，７１５号；第５，８６６，６９２号；第６，３３１，４１５号；第５，５３０，１０１号；第５，６９３，７６１号；第５，６９３，７６２号；第５，５８５，０８９号；第６，１８０，３７０号；第５，２２５，５３９号；第６，５４８，６４０号を参照されたい。
【０１２５】
ヒト化抗体という用語は、免疫グロブリンのフレームワーク領域の少なくとも一部と、場合によってはＣＤＲ領域または結合に関与するそれ以外の領域の一部が、ヒト免疫グロブリン配列に由来すること、またはヒト免疫グロブリン配列に適合するようにされていることを意味する。マウスモノクローナル抗体のヒト化版、キメラ版、部分的ヒト化版は、例えばＨ鎖とＬ鎖をコードするマウスおよび／またはヒトのゲノムＤＮＡ配列から出発するか、Ｈ鎖とＬ鎖をコードするｃＤＮＡクローンから出発して、組み換えＤＮＡ技術によって作製することができる（Ｑｕｅｅｎ他、１９８９年；ＷＯ  ９０／０７８６１）。あるいは本発明の方法で使用されるモノクローナル抗体として、ヒトモノクローナル抗体が可能である。ヒト抗体は、例えばファージ提示法を利用して取得することができる（ＷＯ  ９１／１７２７１；ＷＯ  ９２／０１０４７）。
【０１２６】
本明細書では、ヒト化抗体は、非ヒト（例えばマウス、ラクダ、ラマ、サメ）形態の抗体も意味し、それは、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有する特別なキメラ免疫グロブリン、または免疫グロブリン鎖、またはそのフラグメント（例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2や、抗体の他の抗原結合部分配列）である。
【０１２７】
本明細書では、ヒト抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体フラグメント、ヒト化抗体フラグメントは、ヒトが産生する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体、および／または本分野で知られているか本明細書に開示されているヒト抗体を作製する任意の技術を利用して作製された抗体を意味する。ヒト抗体またはそのフラグメントは、競合結合実験によって選択することや、そうでない場合には特定のマウス抗体と同じエピトープ特異性を持つものを選択することができる。本発明のヒト化抗体は、驚くべきことに、マウス抗体の有用な機能的特性を広い範囲で共有している。ヒトポリクローナル抗体を、免疫原で免疫化したヒトからの血清の形態で提供することもできる。場合によってはそのようなポリクローナル抗体を濃縮することが、アミロイド細繊維状および／または非繊維状ポリペプチドまたはそのフラグメントを親和性試薬として用いるアフィニティ精製によって可能である。モノクローナル抗体は、ＷＯ  ９９／６０８４６に記載されている技術に従って血清から取得することができる。
【０１２８】
可変領域とＣＤＲ
【０１２９】
抗体の可変領域は、単独であれ組み合わせであれ、抗体軽鎖の可変領域、または抗体重鎖の可変領域を意味する。重鎖と軽鎖の可変領域は、それぞれ、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）（超可変領域としても知られる）によって接続された４つのフレームワーク領域（ＦＲ）からなる。各鎖内のＣＤＲはＦＲによって互いに近接して保持され、他方の鎖からのＣＤＲと合わさって抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。
【０１３０】
ＣＤＲの決定に利用できる多数の技術が存在しており、例えば配列の種間変動性に基づくアプローチ（すなわちＫａｂａｔ他、『Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ』（第５版、１９９１年、国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランド州））；抗原−抗体複合体の結晶学的研究に基づくアプローチ（Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ他（１９９７年）Ｊ．  Ｍｏｌｅｃ．  Ｂｉｏｌ．  第２７３巻：９２７〜９４８ページ）がある。別のアプローチには、ＩＭＧＴ国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ情報システム（Ｍａｒｉｅ−Ｐａｕｌｅ  Ｌｅｆｒａｎｃ）が含まれる。Ｋａｂａｔの定義は配列の変動性に基づいており、最も一般的に利用されている方法である。Ｃｈｏｔｈｉａの定義は構造のループ領域の位置に基づいており、その中のＡｂＭの定義は、Ｏｘｆｏｒｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウエア（ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ：Ａｎｄｒｅｗ  Ｃ．Ｒ．  Ｍａｒｔｉｎ博士のグループ）で用いられているその２つのものの折衷である。本明細書では、ＣＤＲは、１つ以上のアプローチによって規定されるＣＤＲ、またはこれらのアプローチの組み合わせによって規定されるＣＤＲを意味する。
【０１３１】
いくつかの実施態様では、本発明により、ＣＡＲに組み込まれる抗体またはそのフラグメントが提供され、この抗体またはそのフラグメントは、本発明による抗体の少なくとも１つのＣＤＲ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、またはそれよりも多数のＣＤＲと実質的に同じ少なくとも１つのＣＤＲ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、またはそれよりも多数のＣＤＲを含んでいる。他の実施態様は、本発明の抗体の、または本発明の抗体に由来する少なくとも２つ、または３つ、または４つ、または５つ、または６つのＣＤＲと実質的に同じ少なくとも２つ、または３つ、または４つ、または５つ、または６つのＣＤＲを持つ抗体を含んでいる。いくつかの実施態様では、その少なくとも１つ、または２つ、または３つ、または４つ、または５つ、または６つのＣＤＲは、本発明の抗体の少なくとも１つ、または２つ、または３つのＣＤＲと少なくとも約７０％、または７５％、または８５％、または８６％、または８７％、または８８％、または８９％、または９０％、または９５％、または９６％、または９７％、または９８％、または９９％が一致する。本発明の目的では、結合特異性および／または全体的活性は一般に保持されるが、活性の程度は、抗体と比べて変化する可能性がある（より大きいか、より小さい可能性がある）ことが理解されよう。
【０１３２】
ＣＡＲの追加構成要素
【０１３３】
いくつかの実施態様では、本明細書で考慮するＣＡＲは、さまざまなドメインの間に、分子の間隔と配置を適切にするために付加されたリンカー残基を含むことができる。それは例えば、ＶＨドメインとＶＬドメインを接続するとともにその２つの部分的結合ドメインの相互作用に合致したスペーサ機能を提供するアミノ酸配列を含むリンカーである。そのため得られるポリペプチドは、同じ軽鎖可変領域と重鎖可変領域を含む抗体と同じ標的分子に対する特異的結合親和性を保持している。本明細書で考慮するＣＡＲは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれよりも多数のリンカーを含むことができる。特別な実施態様では、リンカーの長さは、約１〜約２５個のアミノ酸、または約５〜約２０個のアミノ酸、または約１０〜約２０個のアミノ酸、または任意の長さのアミノ酸である。
【０１３４】
リンカーの実例に含まれるのは、グリシンポリマー；グリシン−セリンポリマー；グリシン−アラニンポリマー；アラニン−セリンポリマー；本分野で知られている他の可撓性リンカー（Ｗｈｉｔｌｏｗリンカーなど）である。グリシンポリマーとグリシン−セリンポリマーは構造化が比較的なされていないため、本明細書に記載のＣＡＲなどの融合タンパク質のドメイン間の中性の繋ぎ紐（ｔｅｔｈｅｒ）として機能することができる。
【０１３５】
特別な実施態様では、ＣＡＲの結合ドメインの後に１つ以上の「スペーサ」または「スペーサポリペプチド」が続く。「スペーサ」または「スペーサポリペプチド」は、適切な細胞／細胞接触、抗原の結合、活性化が可能になるよう、抗原結合ドメインをエフェクタ細胞の表面から離している領域を意味する。いくつかの実施態様では、スペーサドメインは、免疫グロブリンのうちで１つ以上の重鎖定常領域（例えばＣＨ２とＣＨ３）を含む部分だが、含まれるのはそれに限定されない。スペーサドメインは、天然の免疫グロブリンヒンジ領域または改変された免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列を含むことができる。一実施態様では、スペーサドメインは、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４のＣＨ２とＣＨ３を含んでいる。一実施態様では、そのようなスペーサ／ヒンジ領域のＦｃ結合ドメインが変異することで、マクロファージやそれ以外の天然免疫細胞の表面に発現しているＦｃ受容体にＣＡＲが結合することが阻止される。
【０１３６】
いくつかの実施態様では、ＣＡＲの結合ドメインの後に１つ以上の「ヒンジドメイン」が続く。ヒンジドメインは、抗原結合ドメインをエフェクタ細胞の表面から離れた位置にすることで、適切な細胞／細胞接触、抗原の結合、活性化を可能にする役割を果たしている。ＣＡＲは、結合ドメインと膜貫通ドメイン（ＴＭ）の間に１つ以上のヒンジドメインを含むことができる。ヒンジドメインは、天然供給源、合成供給源、半合成供給源、組み換え供給源のいずれかに由来することが可能である。ヒンジドメインは、天然の免疫グロブリンヒンジ領域または改変された免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列を含むことができる。本明細書に記載のＣＡＲで用いるのに適したヒンジドメインの実例に含まれるのは、１型膜タンパク質（ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＰＤ１、ＣＤ１５２、ＣＤ７など）の細胞外領域に由来するものであり、このヒンジドメインは、これら分子からの野生型ヒンジ領域でもよいし、改変されていてもよい。別の一実施態様では、ヒンジドメインは、ＰＤ１、ＣＤ１５２、ＣＤ８αいずれかのヒンジドメインを含んでいる。
【０１３７】
「膜貫通ドメイン」は、ＣＡＲのうちで細胞外結合部分および細胞内シグナル伝達ドメインと融合する部分であり、ＣＡＲを免疫エフェクタ細胞の形質膜に固着させる。ＴＭドメインは、天然供給源、合成供給源、半合成供給源、組み換え供給源のいずれかに由来することが可能である。ＴＭドメインは、Ｔ細胞受容体ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、ＰＤ１のα鎖、β鎖、ζ鎖に由来することができる。一実施態様では、本明細書で考慮するＣＡＲは、ＣＤ８αまたはＣＤ２８に由来するＴＭドメインを含んでいる。
【０１３８】
特別な実施態様では、本明細書で考慮するＣＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメインを含んでいる。「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、ＣＡＲのうちで、抗ＣＸＣＲ５  ＣＡＲがヒトＣＸＣＲ５ポリペプチドにうまく結合したというメッセージを免疫エフェクタ細胞の内部に伝達することに関与する部分であり、そのメッセージにより、エフェクタ細胞の機能（例えば活性化、サイトカイン産生、増殖、細胞傷害活性（ＣＡＲが結合した標的細胞に細胞傷害因子を放出することが含まれる）や、抗原が細胞外ＣＡＲドメインに結合することで誘導されるそれ以外の細胞応答）が誘導される。「エフェクタ機能」という用語は、免疫エフェクタ細胞の特殊化された機能を意味する。例えばＴ細胞のエフェクタ機能として、細胞溶解の活性または援助、またはサイトカインの分泌を含む活性が可能である。したがって「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、タンパク質のうちで、エフェクタ機能シグナルを伝達して細胞に特殊化された機能を実行させる部分を意味する。本明細書で考慮するＣＡＲは、ＣＡＲ受容体を発現しているＴ細胞の効果および／または増殖および／または記憶形成を増強するための１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含んでいる。本明細書では、「共刺激シグナル伝達ドメイン」は、共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインを意味する。共刺激分子は、抗原に結合したときにＴリンパ球の効果的な活性化と機能に必要な第２のシグナルを提供する細胞表面分子で、抗原受容体やＦｃ受容体以外のものである。
【０１３９】
一実施態様では、ＣＡＲは、共刺激ドメインとシグナル伝達（活性化）ドメインを含む細胞内ドメインを含んでいる。したがってＣＡＲコンストラクトは、天然のＴ細胞受容体複合体の細胞内シグナル伝達ドメイン（ＣＤ３ζ）と、Ｔ細胞の全面活性化を刺激する第２のシグナルを提供する１つ以上の共刺激ドメインを含んでいる。共刺激ドメインは、ＣＡＲ  Ｔ細胞のサイトカイン産生を増加させ、Ｔ細胞の複製とＴ細胞の持続性を容易にすると考えられている。共刺激ドメインは、ＣＡＲ  Ｔ細胞の消耗を阻止する可能性があり、Ｔ細胞の抗腫瘍活性を増大させ、患者のＣＡＲ  Ｔ細胞の生存を増強することも示されている。非限定的な一例として、４−１ＢＢ共刺激ドメインを有するＣＡＲコンストラクトは、前臨床試験において、Ｔ細胞サブセット組成物の中で、漸進的な持続する増殖とエフェクタ機能、増大した持続性、豊富になった中央記憶細胞（ＴＣＭ）と関係していた。４−１ＢＢは腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーのメンバーであり、抗原によって活性化されたＣＤ４  Ｔ細胞とＣＤ８  Ｔ細胞の表面に主に発現する生体内の誘導性糖タンパク質受容体である。非限定的な一例として、ＣＤ２８は免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーのメンバーである。ＣＤ２８は休止中のＣＤ４  Ｔ細胞とＣＤ８  Ｔ細胞の表面と、活性化されたＣＤ４  Ｔ細胞とＣＤ８  Ｔ細胞の表面に構成的に発現し、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴシグナル伝達経路を刺激することによるＴ細胞活性化において極めて重要な役割を果たす。一実施態様では、細胞内ドメインは、４−１ＢＢとＣＤ２８両方の共刺激ドメインを含んでいる。別の共刺激ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達（活性化）ドメインと組み合わせることのできるＩＣＯＳとＯＸ４０を含んでいる。
【０１４０】
ポリペプチド
【０１４１】
「ペプチド」、「ポリペプチド」、「ポリペプチドフラグメント」、「タンパク質」は、特に断わらない限り交換可能に用いられ、通常の意味に従って、すなわちアミノ酸の配列の意味で用いられる。ポリペプチドが特定の長さに限定されることはない。ポリペプチドには、例えば完全長のタンパク質配列、または完全長のタンパク質の断片が含めることができ、そのポリペプチドの翻訳後修飾（例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化など）のほか、本分野で知られている他の修飾も含めることができる。修飾には、天然の修飾と非天然の修飾の両方が含まれる。
【０１４２】
さまざまな実施態様では、本明細書で考慮するＣＡＲポリペプチドは、このタンパク質のＮ末端に、翻訳と同時に、または翻訳後に、タンパク質の転移を指示するシグナル（またはリーダー）配列を含んでいる。ポリペプチドは、周知の多彩な組み換え技術および／または合成技術のうちの任意のものを利用して調製することができる。本明細書で考慮するポリペプチドに含まれるのは、具体的には、本開示のＣＡＲ、または本明細書に開示されているＣＡＲと比べて１つ以上のアミノ酸の欠失、および／または付加、および／または置換を有する配列である。
【０１４３】
「単離されたペプチド」または「単離されたポリペプチド」などは、本明細書では、細胞環境から、または細胞の他の構成要素との会合から、インビトロで単離および／または精製されたペプチド分子またはポリペプチド分子、すなわち生体内物質と有意に会合していないものを意味する。同様に、「単離された細胞」は、生体内の組織または臓器から得られた細胞を意味し、細胞外マトリックスから実質的に遊離している。
【０１４４】
核酸
【０１４５】
本明細書では、「ポリヌクレオチド」または「核酸分子」は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＲＮＡ、ゲノムＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、プラス鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（＋））、マイナス鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（−））、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、組み換えＤＮＡのいずれかを意味する。ポリヌクレオチドには一本鎖と二本鎖のポリヌクレオチドが含まれる。本発明のポリヌクレオチドには、本明細書に記載の任意の参照配列と配列が少なくとも約５０％、または５５％、または６０％、または６５％、または７０％、または７５％、または８０％、または８５％、または９０％、または９５％、または９６％、または９７％、または９８％、または９９％、または１００％一致するポリヌクレオチドまたはバリアントが含まれることが好ましく、典型的にはそのバリアントは、参照配列の少なくとも１つの生物活性を維持している。さまざまな実施態様の実例では、本発明において、部分的に、発現ベクター、ウイルスベクター、転移プラスミドを含むポリヌクレオチドと、組成物と、それを含む細胞を考慮する。
【０１４６】
ポリヌクレオチドは、本分野で知られていて利用できるよく確立された多彩な技術のうちの任意の技術を利用して調製すること、および／または操作すること、および／または発現させることができる。望むポリペプチドを発現させるため、ポリヌクレオチドをコードするヌクレオチド配列を適切なベクターの中に挿入することができる。ベクターの例は、プラスミド、自律的に複製する配列、転写可能なエレメントである。ベクターの非限定的な追加例に含まれるのは、プラスミド、ファージミド、コスミド、人工染色体（酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＰＩ由来人工染色体（ＰＡＣ）など）、バクテリオファージ（λファージ、ＭＩ  ３ファージなど）、動物ウイルスである。ベクターとして有用な動物ウイルスのカテゴリーに入る非限定的な例は、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば単純ヘルペスウイルス）、天然痘ウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス（例えばＳＶ４０）である。発現ベクターの例は、哺乳動物の細胞内で発現させるためのｐＣｌｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）；レンチウイルスを媒介として遺伝子を導入して哺乳動物の細胞内で発現させるためのｐＬｅｎｔｉ４／Ｖ５−ＤＥＳＴ（商標）、ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−ＤＥＳＴ（商標）、ｐＬｅｎｔｉ６．２／Ｖ５−ＧＷ／ｌａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）である。特別な実施態様では、本明細書に開示されているキメラタンパク質をコードする配列をそのような発現ベクターに連結してそのキメラタンパク質を哺乳動物の細胞内で発現させることができる。発現ベクターの中に存在する「制御エレメント」または「調節配列」は、そのベクターの非翻訳領域（複製起点、分泌カセット、プロモータ、エンハンサ、翻訳開始シグナル（シャイン・ダルガノ配列またはコザック配列）、イントロン、ポリアデニル化配列、５’と３’の非翻訳領域（宿主細胞のタンパク質と相互作用して転写と翻訳を実行する））である。このようなエレメントは、長さと特異性がさまざまである可能性がある。使用するベクター系と宿主に応じ、適切な任意の数の転写エレメントと翻訳エレメント（その中には普遍的プロモータと誘導プロモータが含まれる）を使用することができる。
【０１４７】
ベクター
【０１４８】
特別な実施態様では、細胞（例えばＴ細胞などの免疫エフェクタ細胞）にＣＡＲをコードするレトロウイルスベクター（例えばレンチウイルスベクター）でする。例えば免疫エフェクタ細胞に、ヒト化抗ＣＸＣＲ５抗体、またはＣＸＣＲ５ポリペプチドに結合する抗原結合フラグメントと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲをコードするベクターで形質導入することで、形質導入されたこれら細胞はＣＡＲを媒介とした細胞傷害反応を誘導することができる。
【０１４９】
レトロウイルスは、遺伝子を送達するための一般的なツールである。特別な実施態様では、レトロウイルスを用いてキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドを細胞に送達する。本明細書では、「レトロウイルス」という用語は、そのレトロウイルスのゲノムＲＮＡを逆転写して直線状の二本鎖ＤＮＡコピーにし、その後そのゲノムＤＮＡを宿主ゲノムに統合するＲＮＡウイルスを意味する。ウイルスは、宿主ゲノムに統合されると、「プロウイルス」と呼ばれる。プロウイルスはＲＮＡポリメラーゼＩＩの鋳型として機能し、新たなウイルス粒子の産生に必要な構造タンパク質と酵素をコードするＲＮＡ分子の発現を指示する。
【０１５０】
個々の実施態様で使用するのに適したレトロウイルスの非限定的な例に含まれるのは、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭｕＬＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭｏＭＳＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳がんウイルス（ＭｕＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）、スプーマウイルス、フレンドマウス白血病ウイルス、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、レンチウイルスである。
【０１５１】
本明細書では、「レンチウイルス」という用語は、複雑なレトロウイルスのグループ（属）を意味する。レンチウイルスの非限定的な例に含まれるのは、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス；ＨＩＶ１型、ＨＩＶ２型が含まれる）；ビスナ−マエディウイルス（ＶＭＶ）；ヤギ関節炎−脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）；ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）；ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）；ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）；サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）である。一実施態様では、ＨＩＶに基づくベクター骨格（すなわちＨＩＶシス作用性配列エレメント）が好ましい。特別な実施態様では、レンチウイルスを用いてＣＡＲを含むポリヌクレオチドを細胞に送達する。
【０１５２】
「ベクター」という用語は、本明細書では、核酸分子であって、別の核酸分子の転移または輸送が可能であるものを意味する。移された核酸は一般にベクターの核酸分子に連結される（例えば挿入される）。ベクターは、細胞内での自律的な複製を指示する配列、または宿主細胞のＤＮＡへの統合を可能にするのに十分な配列を含むことができる。有用なベクターに含まれるのは、例えば、プラスミド（例えばＤＮＡプラスミド、ＲＮＡプラスミド）、トランスポゾン、コスミド、細菌人工染色体、ウイルスベクターである。有用なウイルスベクターに含まれるのは、例えば複製に欠陥のあるレトリバーとレンチウイルスである。本発明のさらに別の実施態様では、ＣｒｉｓｐＲ／ＣａｓとＴＡＬＥＮを媒介としてＣＸＣＲ５  ＣＡＲをコードする核酸を挿入することができる。ＣｒｉｓｐＲ／ＣａｓとＴＡＬＥＮを媒介とした挿入のための適切なベクターは当業者に知られている。
【０１５３】
当業者には明らかなように、「ウイルスベクター」という用語は、典型的には細胞のゲノムへの核酸分子の導入または統合を容易にするウイルス由来の核酸エレメントを含む核酸分子（例えば転移プラスミド）、または核酸の導入を媒介するウイルス粒子を意味するのに広く用いられている。ウイルス粒子は典型的にはさまざまなウイルス構成要素を含んでいて、ときには核酸に加えて宿主細胞の構成要素も含んでいる。
【０１５４】
ウイルスベクターという用語は、核酸を細胞の中に移すことのできるウイルスまたはウイルス粒子か、移された核酸そのものを意味する。ウイルスベクターと転移プラスミドは、主にウイルスに由来する構造的および／または機能的な遺伝エレメントを含有している。「レトロウイルスベクター」という用語は、主にレトロウイルスに由来する構造的遺伝エレメントと機能的遺伝エレメント、またはその一部を含有するウイルスベクターまたはプラスミドを意味する。
【０１５５】
したがって好ましい一実施態様では、本発明は、ＣＡＲをコードする発現ベクターを細胞にトランスフェクトする方法に関する。例えばいくつかの実施態様では、ベクターは、追加配列（ＣＡＲの発現を容易にする配列であるプロモータ、エンハンサ、ポリ−Ａシグナルなど、および／または１つ以上のイントロン）を含んでいる。好ましい実施態様では、ＣＡＲをコードする配列はトランスポゾン配列に隣接しているため、トランスポザーゼが存在していると、トランスフェクトされた細胞のゲノムにコード配列を統合することができる。
【０１５６】
いくつかの実施態様では、遺伝子改変細胞にはさらに、トランスフェクトされた細胞のゲノムにＣＡＲをコードする配列を統合しやすくするトランスポザーゼがトランスフェクトされる。いくつかの実施態様では、トランスポザーゼはＤＮＡ発現ベクターとして提供される。しかし好ましい実施態様では、トランスポザーゼは、発現可能なＲＮＡまたはタンパク質として提供されるため、トランスポザーゼの長期発現がトランスジェニック細胞で起こることはない。例えばいくつかの実施態様では、トランスポザーゼは、ｍＲＮＡ（例えばキャップとポリ−Ａテイルを含むｍＲＮＡ）として提供される。任意のトランスポザーゼ系を本発明の実施態様に従って利用することができる。しかしいくつかの実施態様では、トランスポザーゼはサルモニド型Ｔｅｌ様トランスポザーゼ（ＳＢ）である。例えばトランスポザーゼとして、いわゆる「ｓｌｅｅｐｉｎｇ  ｂｅａｕｔｙ」トランスポザーゼが可能である。例えばアメリカ合衆国特許第６，４８９，４５８号を参照されたい（その内容は参照によって本明細書に組み込まれている）。いくつかの実施態様では、トランスポザーゼは、操作されて酵素活性が増大した酵素である。トランスポザーゼの非限定的ないくつかの具体例に含まれるのは、ＳＢ  １０、ＳＢ  １１、ＳＢ  １００Ｘトランスポザーゼである（例えばＭａｔｅｓ他、２００９年、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．  第４１巻（６）：７５３〜７６１ページ、またはアメリカ合衆国特許第９，２２８，１８０号を参照されたい（これらは参照によって本明細書に組み込まれている））。例えば１つの方法は、ＳＢ  １０、ＳＢ  １１、ＳＢ  １００ＸトランスポザーゼのいずれかをコードするｍＲＮＡを細胞に電気穿孔することを含むことができる。
【０１５７】
配列バリアント：
【０１５８】
本発明の結合特性と同様の結合特性を維持している核酸、タンパク質、抗体、抗体フラグメント、ＣＡＲの配列バリアント（例えば％配列一致によって規定されるもの）も、本発明の範囲に含まれる。提示されている具体的な配列と配列は異なるが実質的に同じ結合特性（標的特異性など）を維持しているそのようなバリアントは、機能的類似体として、または機能的に類似しているとして知られている。配列一致は、配列のアラインメントを実施するときにヌクレオチドまたはアミノ酸が一致する割合と関係している。
【０１５９】
本明細書では、「配列一致」への言及は、比較ウインドウ上で配列がヌクレオチドごとまたはアミノ酸ごとに同じである程度を意味する。したがって「配列一致の割合」は、比較ウインドウ上で最適なアラインメントにした２つの配列を比較し、両方の配列で同じ核酸塩基（例えばＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）または同じアミノ酸残基（例えばＡｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｈｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｉｎ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ）である位置の数を求めて一致した位置の数を出し、一致した位置の数を比較ウインドウ内の位置の総数（すなわちウインドウのサイズ）で割り、その結果に１００を掛ける計算によって配列一致の割合を得ることができる。含まれるのは、本明細書に記載の任意の参照配列と配列一致が少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のいずれかであるヌクレオチドとポリペプチドであり、その場合、典型的には、ポリペプチドバリアントは、参照ポリペプチドの少なくとも１つの生物活性を維持している。
【０１６０】
当業者であればわかるように、遺伝暗号が縮重している結果として、本明細書に記載のポリペプチドをコードする多数のヌクレオチド配列が存在する。これらポリヌクレオチドのいくつかは、任意の天然遺伝子のヌクレオチド配列と相同性または配列一致が最少である。それでもコドン利用法の違いが原因で異なるポリヌクレオチドを本発明では特に考慮する。配列内の欠失、置換や、それ以外の変化で記載されている配列一致に当てはまるものも、本発明に包含される。
【０１６１】
置換を通じて起こる可能性があるタンパク質配列の改変も本発明の範囲に含まれる。本明細書に定義されている置換は、タンパク質のアミノ酸配列に対してなされる改変であり、その置換によって１個以上のアミノ酸が同数の（異なる）アミノ酸で置き換えられ、元のタンパク質とは異なるアミノ酸配列を含有するタンパク質が生じる。タンパク質の機能を好ましくは顕著に変化させない置換を実施することができる。付加と同様、置換として天然の置換と人工的な置換が可能である。本分野では、タンパク質の機能を顕著に変化させることなくアミノ酸置換を実施できることがよく知られている。それは特に、改変が、１個のアミノ酸を特性が似た別のアミノ酸で置き換える「保存的な」アミノ酸置換に関係している場合に当てはまる。そのような「保存された」アミノ酸として、サイズ、電荷、極性、配座が理由でタンパク質の構造と機能に顕著な影響を与えることなく置換することのできる天然のアミノ酸または合成アミノ酸が可能である。タンパク質の機能に悪い影響を与えることなく、多くのアミノ酸を保存的アミノ酸で置き換えられることがしばしばある。
【０１６２】
一般に、非極性アミノ酸Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；非極性芳香族アミノ酸Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ；中性の極性アミノ酸Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ；正に帯電したアミノ酸Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；負に帯電したアミノ酸Ａｓｐ、Ｇｌｕが、代表的な保存されたアミノ酸のグループである。このリストは網羅的なものではない。例えばＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒと、ときにはＣｙｓは、異なるグループに属するが、互いに置き換えることができる。
【０１６３】
置換バリアントでは、抗体分子の中の少なくとも１個のアミノ酸残基が除去されて異なる残基がその場所に挿入されている。置換突然変異誘発に関する最も興味深い部位には超可変領域が含まれるが、ＦＲの変化も考慮される。そのような置換の結果として生物活性が変化する場合には、すぐ下に示す表の中に「代表的な置換」と表示してあるように、またはアミノ酸のクラスに関して下にさらに記述してあるように、より多くの変化を導入して産物をスクリーニングすることができる。
【０１６４】
【表２】
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【０１６５】
抗体の生物学的特性の実質的な改変は、（ａ）置換の領域におけるポリペプチド骨格の構造（例えばシートまたは螺旋構造）の維持、または（ｂ）標的部位における分子の電荷または疎水性の維持、または（ｃ）側鎖の大きさの維持に対する効果が有意に異なる置換を選択することによって実現される。
【０１６６】
保存的アミノ酸置換は天然のアミノ酸に限定されず、合成アミノ酸も含まれる。一般に用いられる合成アミノ酸は、中性の非極性類似体である、鎖の長さがさまざまなωアミノ酸類と、シクロヘキシルアラニン；中性の非極性類似体であるシトルリンとメチオニンスルホキシド、中性の芳香族類似体であるフェニルグリシン；負に帯電した類似体であるシステイン酸と、正帯電したアミノ酸類似体であるオルニチンである。天然のアミノ酸と同様、このリストは網羅的ではなく、本分野でよく知られている置換の例にすぎない。
【０１６７】
遺伝子改変細胞と免疫細胞
【０１６８】
本発明では、Ｂ細胞に関連した病気の治療に用いるため、特別な実施態様では、本明細書で考慮するＣＡＲを発現するように遺伝子改変された細胞を考慮する。本明細書では、「遺伝子操作された」または「遺伝子改変された」という表現は、ＤＮＡまたはＲＮＡの形態の追加遺伝材料を細胞内の全遺伝材料に付加することを意味する。「遺伝子改変細胞」、「改変細胞」、「リダイレクトされた細胞」という表現は交換可能に用いられる。本明細書では、「遺伝子療法」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡの形態の追加遺伝材料を細胞内の全遺伝材料に恒久的または一時的に導入して１つの遺伝子を修復、修正、改変したり、治療用ポリペプチド（例えばＣＡＲ）を発現させたりすることを意味する。特別な実施態様では、本明細書で考慮するＣＡＲが免疫エフェクタ細胞に導入されて発現し、その特異性を興味ある標的抗原（例えばＣＸＣＲ５ポリペプチド）にリダイレクトする。
【０１６９】
「免疫細胞」または「免疫エフェクタ細胞」は、１つ以上のエフェクタ機能（例えば細胞傷害細胞の殺傷活性、サイトカインの分泌、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣの誘導）を有する免疫系のあらゆる細胞である。免疫エフェクタ細胞は、ｉＰＳＣ（人工多能性幹細胞）から分化させることもできる。
【０１７０】
本発明の免疫エフェクタ細胞として、自家／自己生成（「自己」）細胞、または非自家（「非自己」、例えば同種異系、または同系、または異種）細胞が可能である。「自家」は、本明細書では、同じ対象に由来することを意味し、本発明の好ましい一実施態様である。「自己生成」は、本明細書では、同じ種に由来し、比較する細胞とは遺伝的に異なっていることを意味する。「同系」は、本明細書では、異なる対象に由来し、比較する細胞と遺伝的に同じであることを意味する。「異種」は、本明細書では、比較する細胞とは異なる種に由来することを意味する。好ましい実施態様では、本発明の細胞は自家細胞または自己生成細胞である。
【０１７１】
本発明で考慮するＣＡＲで使用される免疫エフェクタ細胞の実例にＴリンパ球が含まれる。「Ｔ細胞」または「Ｔリンパ球」という用語は本分野で認められており、その中に含まれるのは、胸腺細胞、未熟Ｔリンパ球、成熟Ｔリンパ球、静止Ｔリンパ球、サイトカイン誘導キラー細胞（ＣＩＫ細胞）、活性化Ｔリンパ球である。サイトカイン誘導キラー（ＣＩＫ）細胞は、典型的には、ＣＤ３陽性かつＣＤ５６陽性で、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）の制限がないナチュラルキラー（ＮＫ）様Ｔリンパ球である。Ｔ細胞として、Ｔヘルパー（Ｔｈ；ＣＤ４+  Ｔ細胞）細胞、例えばＴヘルパー１（Ｔｈ１）細胞、またはＴヘルパー２（Ｔｈ２）細胞が可能である。Ｔ細胞として、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ；ＣＤ８+  Ｔ細胞）、ＣＤ４+ＣＤ８+ Ｔ細胞、ＣＤ４ＣＤ８Ｔ細胞や、Ｔ細胞の他の任意のサブセットが可能である。特別な実施態様で用いるのに適したＴ細胞の他の集団の実例に含まれるのは、ナイーブＴ細胞、記憶Ｔ細胞、幹細胞様記憶細胞（ＴＳＣＭ）である。
【０１７２】
例えば本明細書に記載されているようにして本発明のＣＡＲで改変したＴ細胞は、自家細胞の移植後に患者に再導入されると、腫瘍細胞を認識して殺すことができる。ＣＩＫ細胞は、他のＴ細胞よりも大きな細胞傷害活性を持つことができるため、本発明の免疫細胞の好ましい一実施態様となる。
【０１７３】
当業者であればわかるように、他の細胞も、本明細書に記載のＣＡＲを有する免疫エフェクタ細胞として使用することができる。特に免疫エフェクタ細胞には、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、好中球、マクロファージも含まれる。免疫エフェクタ細胞にはエフェクタ細胞の前駆細胞も含まれ、生体内またはインビトロでそのような前駆細胞の分化を誘導して免疫エフェクタ細胞にすることができる。前駆細胞として、決められた培養条件下で免疫エフェクタ細胞になるｉＰＳＣが可能である。
【０１７４】
本発明により、本明細書で考慮するＣＡＲを発現する免疫エフェクタ細胞を作製する方法が提供される。一実施態様では、この方法は、個体から単離された免疫エフェクタ細胞にトランスフェクトまたは形質導入することにより、その免疫エフェクタ細胞に本明細書に記載の１つ以上のＣＡＲを発現させることを含んでいる。いくつかの実施態様では、免疫エフェクタ細胞は、個体から単離され、遺伝子が改変されるが、インビトロでそれ以上操作されることはない。次にそのような細胞を個体に直接再投与する。さらに別の実施態様では、免疫エフェクタ細胞を最初に活性化し、刺激してインビトロで増殖させた後、遺伝子を改変してＣＡＲを発現させる。この点に関し、免疫エフェクタ細胞は、遺伝子改変の前および／または後に培養することができる（すなわち形質導入またはトランスフェクションにより本明細書で考慮するＣＡＲを発現させる）。
【０１７５】
特別な実施態様では、本明細書に記載の免疫エフェクタ細胞をインビトロで操作または遺伝子改変する前に、細胞の供給源を対象から取得する。特別な実施態様では、ＣＡＲで改変した免疫エフェクタ細胞はＴ細胞を含んでいる。Ｔ細胞は、多数の供給源から取得することができる。供給源の非限定的な例に含まれるのは、末梢血単球細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、腫瘍である。いくつかの実施態様では、Ｔ細胞は、当業者に知られている多数の技術のうちの任意の技術（沈降（例えばフィコール（商標）分離）、抗体が結合したビーズに基づく方法（ＭＡＣＳ（商標）分離（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社））など）を利用して対象から回収した１単位の血液から取得することができる。一実施態様では、個体の循環している血液からの細胞がアフェレーシスによって得られる。アフェレーシス生成物は、典型的にはリンパ球（Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球細胞、赤血球細胞、血小板が含まれる）を含んでいる。一実施態様では、アフェレーシスによって回収された細胞を洗浄して血漿分画を除去し、細胞を適切なバッファーまたは培地に入れてその後処理することができる。細胞は、ＰＢＳで洗浄するか、カルシウムとマグネシウムを含まず、すべてではないが大半の２価カチオンも含まぬ他の適切な溶液で洗浄することができる。当業者であればわかるように、洗浄工程は当業者に知られている方法（例えば半自動化されたフロースルー遠心分離）によって実現することができる。例えばＣｏｂｅ  ２９９１細胞プロセッサ、Ｂａｘｔｅｒ  ＣｙｔｏＭａｔｅなど。細胞を洗浄した後、さまざまな生体適合性バッファーや、バッファーを含む、または含まない他の生理食塩溶液の中に再懸濁することができる。いくつかの実施態様では、アフェレーシスサンプルの望ましくない構成成分を、細胞を直接再懸濁させた培地の中で除去することができる。
【０１７６】
いくつかの実施態様では、末梢血単球細胞（ＰＢＭＣ）からのＴ細胞の単離を、赤血球細胞を溶解させ、例えばＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配を通じた遠心分離によって単球を欠乏させることによって実現する。陽性選択技術または陰性選択技術によってＴ細胞の特定の部分集団をさらに単離することができる。本明細書で利用する１つの方法は、陰性選択された細胞の表面に存在する細胞表面マーカーに向かうモノクローナル抗体のカクテルを用いる陰性磁性免疫吸着またはフローサイトメトリーを通じたセルソーティングおよび／または選択である。
【０１７７】
本明細書で考慮する方法を利用してＰＢＭＣを直接遺伝子改変してＣＡＲを発現させることができる。いくつかの実施態様では、ＰＢＭＣを単離した後、Ｔリンパ球をさらに単離し、いくつかの実施態様では、遺伝子改変および／または増殖の前または後に、細胞傷害性Ｔリンパ球とヘルパーＴリンパ球の両方を、ナイーブＴ細胞部分集団と、記憶Ｔ細胞部分集団と、エフェクタＴ細胞部分集団に分類することができる。ＣＤ８+細胞は、標準的な方法を利用して取得することができる。いくつかの実施態様では、ＣＤ８+細胞をさらにナイーブ中央記憶細胞とエフェクタ細胞に分類する操作を、これらのタイプのＣＤ８+細胞のそれぞれに関係する細胞表面抗原を同定することによって実施する。
【０１７８】
いくつかの実施態様では、本発明の免疫細胞（例えば本明細書に記載のＴ細胞）は、当業者に知られている方法を利用して人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から得ることができる。
【０１７９】
ＣＡＲ  Ｔ細胞を生成させるための受け入れられているアプローチは、循環している成熟Ｔ細胞の遺伝子改変と増殖に頼っている。このような方法は自家Ｔ細胞を利用しているため、内在性ＴＣＲの発現を通じた同種異系Ｔ細胞からの移植片対宿主（ＧｖＨＤ）病のリスクが低下するほか、ＭＨＣ不適合性を通じた拒絶が減少する。１つの代替手段として、多能性幹細胞（誘導可能な多能性幹細胞など）からの操作されたＴ細胞をインビトロで直接分化させることにより、遺伝子を改変して本発明のＣＡＲを発現させることのできる細胞の実質的に無制限の供給源が提供される。いくつかの実施態様では、均一な細胞生成物を着実かつ反復して作製するための更新可能な供給源であるいわゆるマスターｉＰＳＣ系を維持することができる。いくつかの実施態様では、増殖させて望む免疫細胞（好ましくはＴ細胞）へと分化させる前に、ＣＡＲをコードする核酸でマスターｉＰＳＣ細胞系を形質転換することを考慮する。Ｔリンパ球は例えばｉＰＳＣから生成させることができるため、ＣＡＲをコードする核酸でｉＰＳＣを改変した後、患者に投与するために増殖させ、Ｔ細胞へと分化させることができると考えられる。ｉＰＳＣを適切な免疫細胞（Ｔ細胞など）に分化させた後、ＣＡＲをコードする核酸を用いて形質転換し、増殖させて投与することもできよう。投与に適した数の細胞を提供するため、ｉＰＳＣの増殖、遺伝子改変、増殖の可能なあらゆる組み合わせを本発明では考慮する。
【０１８０】
公知の方法を利用して単離した後に免疫エフェクタ細胞（Ｔ細胞など）の遺伝子を改変すること、または免疫エフェクタ細胞をインビトロで活性化させて増殖させた（前駆細胞の場合には分化させた）後に遺伝子を改変することができる。特別な一実施態様では、本明細書で考慮するキメラ抗原受容体で免疫エフェクタ細胞（Ｔ細胞など）の遺伝子を改変した（例えばＣＡＲをコードする核酸を含むウイルスベクターで形質導入した）後、インビトロで活性化して増殖させる。さまざまな実施態様では、遺伝子改変の前または後にＴ細胞を活性化して増殖させてＣＡＲを発現させることができる。そのときに利用する方法が記載されているのは、例えばアメリカ合衆国特許第６，３５２，６９４号；第６，５３４，０５５号；第６，９０５，６８０号；第６，６９２，９６４号；第５，８５８，３５８号；第６，８８７，４６６号；第６，９０５，６８１号；第７，１４４，５７５号；第７，０６７，３１８号；第７，１７２，８６９号；第７，２３２，５６６号；第７，１７５，８４３号；第５，８８３，２２３号；第６，９０５，８７４号；第６，７９７，５１４号；第６，８６７，０４１号；アメリカ合衆国特許出願公開第２００６／０１２１００５号である。
【０１８１】
さらに別の一実施態様では、ドナー集団の免疫エフェクタ細胞の遺伝子を改変する際にベクター（例えば１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれよりも多数のベクター）の混合物を用いることができる。この場合に各ベクターは、本明細書で考慮する異なるキメラ抗原受容体タンパク質をコードしている。得られる改変された免疫エフェクタ細胞は、改変された細胞の混合集団を形成し、２つ以上の異なるＣＡＲタンパク質を発現している改変された細胞がある割合で含まれている。
【０１８２】
一実施態様では、本発明により、マウスの、またはヒトの、またはヒト化されたＣＡＲタンパク質を発現していてＣＸＣＲ５タンパク質を標的とする遺伝子改変免疫エフェクタ細胞を保管する方法として、解凍時に細胞が生きたままであるようにするためその免疫エフェクタ細胞を低温に維持することを含む方法が提供される。ＣＡＲタンパク質を発現する免疫エフェクタ細胞の一部を本分野で知られている方法によって低温に保持し、Ｂ細胞関連疾患を患っている患者を将来治療するためのそのような細胞の恒久的供給源を提供することができる。必要になったとき、低温に保持した形質転換された免疫エフェクタ細胞を解凍し、成長させ、増殖させることでそのような細胞をより多くする。
【０１８３】
組成物と製剤
【０１８４】
本明細書で考慮する組成物は、本明細書で考慮する１つ以上のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを含むベクター、遺伝子改変免疫エフェクタ細胞などを含むことができる。組成物の非限定的な例に医薬組成物が含まれる。「医薬組成物」は、単独で、または１つ以上の他の治療様式と組み合わせて細胞または動物に適用するため、医薬として許容可能な、または生理学的に許容可能な溶液の形態にされた組成物を意味する。望むのであれば、本発明の組成物を他の薬剤（例えばサイトカイン、増殖因子、ホルモン、小分子、化学療法剤、プロドラッグ、薬、抗体や、医薬として活性な他のさまざまな薬剤など）と組み合わせて投与できることも理解されよう。組成物に含めることのできる他の構成成分に実質的に制約はないが、追加の薬剤が、意図する治療を提供する組成物の効力に悪影響を及ぼさないことが条件である。
【０１８５】
「医薬として許容可能な」という表現は、本明細書では、健全な医学的判断の範囲において、過度な毒性、刺激、アレルギー反応がなく、他の問題や合併症もなく、合理的なベネフィット／リスク比で、ヒトと動物の組織に接触させて用いるのに適した化合物、および／または材料、および／または組成物、および／または剤形を意味する。
【０１８６】
本明細書では、「医薬として許容可能な基剤、または希釈剤、または賦形剤」の非限定的な例に含まれるのは、ヒトと家畜での使用を許容できるとしてアメリカ合衆国食品医薬品局によって認可されている任意のアジュバント、基剤、賦形剤、流動促進剤、甘味剤、希釈剤、保存剤、染料／着色剤、風味増進剤、界面活性剤、湿潤剤、分散剤、懸濁剤、安定剤、等張剤、溶媒、界面活性剤、乳化剤である。医薬として許容可能な基剤の非限定的な例に含まれるのは、糖（ラクトース、グルコース、スクロースなど）；デンプン（コーンスターチ、ジャガイモのデンプンなど）；セルロースとその誘導体（カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、酢酸セルロースなど）；トラガカントゴム；麦芽；ゼラチン；タルク；カカオバター、蝋、動物と植物の脂肪、パラフィン、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、酸化亜鉛；油（ピーナツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、ダイズ油など）；グリコール（プロピレングリコールなど）；ポリオール（グリセリン、ソルビトール、マンニトール、ポリエチレングリコールなど）；エステル（オレイン酸エチル、ラウリン酸エチルなど）；寒天；緩衝剤（水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウムなどなど）；アルギン酸；発熱性物質除去水；等張生理食塩水；リンゲル液；エチルアルコール；リン酸塩緩衝溶液；医薬製剤で用いられる適合性のある他の任意の物質である。
【０１８７】
特別な実施態様では、本発明の組成物は、本明細書で考慮するＣＡＲ発現免疫エフェクタ細胞をある量含んでいる。本明細書では、「量」という用語は、有効な、または望む予防結果や治療結果（臨床結果を含む）を実現するための、遺伝子改変治療用細胞（例えばＴ細胞）の「有効な量」または「有効量」を意味する。
【０１８８】
「予防に有効な量」は、望む予防結果を実現するのに有効な遺伝子改変治療用細胞の量を意味する。予防用量は、疾患の初期段階よりも前の対象、または疾患の初期段階の対象で用いられるため、予防に有効な量は典型的には治療に有効な量よりも少ないが、必ずしもそうとは限らない。予防のという用語は必ずしも特定の医学的障害の完全な抑制または阻止を意味しない。予防のという用語は、ある医学的障害が発生したり、その医学的障害の症状が悪化したりするリスクの低下も意味する。
【０１８９】
遺伝子改変治療用細胞の「治療に有効な量」は、さまざまな因子（個人の疾患状態、年齢、性別、体重や、幹細胞と前駆細胞が個人に望ましい反応を誘導する能力など）によって変化する可能性がある。治療に有効な量は、ウイルスまたは形質導入された治療用細胞のあらゆる毒性効果または有害な効果よりも治療の有益な効果が上回る量も意味する。「治療に有効な量」という表現には、対象（例えば患者）を「治療する」のに有効な量が含まれる。治療のための量が示されているとき、投与すべき本発明の組成物の正確な量は、医師が、年齢、体重、腫瘍のサイズ、感染または転移の程度、患者（対象）の状態に関する個々の違いを考慮して決定することができる。
【０１９０】
一般論として、本明細書に記載のＴ細胞を含む医薬組成物は、体重１  ｋｇ当たり１０2〜１０10個の細胞、好ましくは体重１  ｋｇ当たり１０5〜１０7個の細胞という用量で投与することができ、用量にはこの範囲内のあらゆる整数値が含まれる。細胞の数は、組成物の最終用途と、その中に含まれる細胞のタイプによって異なるであろう。本明細書に示されている利用に関しては、細胞は一般に１リットル以下の体積であり、５００  ｍｌ以下、それどころか２５０  ｍｌまたは１００  ｍｌ以下が可能である。したがって望ましい細胞の密度は、典型的には１０6細胞／ｍｌ超であり、一般に１０7細胞／ｍｌ超、または一般に１０8細胞／ｍｌ超、またはそれよりも大きな密度である。臨床的に重要な数の免疫細胞を複数の輸液に分割することができ、それを累積すると、１０5個の細胞以上、１０6個の細胞以上、１０7個の細胞以上、１０8個の細胞以上、１０9個の細胞以上、１０10個の細胞以上、１０11個の細胞以上、１０12個の細胞以上のいずれかになる。本発明のいくつかの側面では、特に輸液される全細胞が特定の標的抗原にリダイレクトされるため、投与する細胞をより少なくすることができる。ＣＡＲを発現する細胞組成物は、これらの範囲内の用量で複数回投与することができる。細胞として、治療を受ける患者にとって同系異種、同系、異種、自家のものが可能である。
【０１９１】
一般に、本明細書に記載されているようにして活性化させて増殖させた細胞を含む組成物は、免疫不全の個体に生じる疾患の治療と予防に用いることができる。特に本発明のＣＡＲ改変Ｔ細胞を含む組成物は、単独で投与すること、または基剤、および／または希釈剤、および／または賦形剤、および／または他の構成成分（ＩＬ−２やそれ以外のサイトカイン、細胞集団）と組み合わせた医薬組成物として投与することができる。特別な実施態様では、本明細書で考慮する医薬組成物は、ある量の遺伝子改変Ｔ細胞を、医薬としてまたは生理学的に許容可能な１つ以上の基剤、または希釈剤、または賦形剤と組み合わせて含んでいる。
【０１９２】
ＣＡＲを発現する免疫エフェクタ細胞集団（Ｔ細胞など）を含む本発明の医薬組成物は、バッファー（中性の緩衝化生理食塩水、リン酸塩緩衝化生理食塩水など）；炭水化物（グルコース、マンノース、スクロース、デキストラン、マンニトールなど）；タンパク質；ポリペプチドまたはアミノ酸（グリシンなど）；抗酸化剤；キレート剤（ＥＤＴＡ、グルタチオンなど）；アジュバント（例えば水酸化アルミニウム）；保存剤を含むことができる。本発明の医薬組成物は、非経口投与（例えば血管内投与（静脈内投与または動脈内投与）、腹腔内投与、筋肉内投与）のための製剤にされることが好ましい。
【０１９３】
液体医薬組成物は、溶液であれ、懸濁液であれ、他の形態であれ、含むことができるのは、減菌希釈剤（注射用の水、生理食塩溶液（好ましくは生理学的食塩水）、リンゲル溶液、等張塩化ナトリウムなど）、不揮発性油（合成されたモノグリセリドまたはジグリセリドなどであり、溶媒または懸濁媒体として機能することができる）、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、他の溶媒）；抗菌剤（ベンジルアルコール、メチルパラベンなど）；抗酸化剤（アスコルビン酸、亜硫酸水素ナトリウムなど）；キレート剤（エチレンジアミン四酢酸など）；バッファー（酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩など）；張性を調節するための薬剤（塩化ナトリウム、デキストロースなど）のうちの１つ以上である。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチックでできたアンプル、使い捨て注射器、多数回用量のバイアルの中に封入することができる。注射可能な医薬組成物は減菌されていることが好ましい。
【０１９４】
特別な一実施態様では、本明細書で考慮する組成物は、ＣＡＲを発現する免疫エフェクタ細胞の有効量を単独で、または１つ以上の治療剤と組み合わせて含んでいる。したがってＣＡＲを発現する免疫エフェクタ細胞組成物は、単独で、または他の既知のがん治療法（放射線療法、化学療法、移植、免疫療法、ホルモン療法、光線力学的療法など）と組み合わせて適用することができる。組成物は、抗生剤と組み合わせて投与することもできる。このような治療剤は、本明細書に記載の特定の疾患状態（特定のがんなど）の標準治療として本分野で受け入れることができる。考慮する代表的な治療剤に含まれるのは、サイトカイン、増殖因子、ステロイド、ＮＳＡＩＤ、ＤＭＡＲＤ、抗炎症剤、化学療法剤、放射線療法、治療用抗体や、他の活性剤と助剤である。
【０１９５】
治療法
【０１９６】
本明細書で考慮する遺伝子改変免疫エフェクタ細胞は、ＣＸＣＲ５を発現している病原性細胞の存在と関係する医学的障害（その非限定的な例に免疫調節疾患と血液悪性腫瘍が含まれる）の治療に用いるための改良された養子免疫療法を提供する。
【０１９７】
本明細書では、「ＣＸＣＲ５を発現している病原性細胞の存在に関係する医学的障害」は、がんや自己免疫疾患などの医学的疾患を意味し、疾患の病理生理学に関与する細胞はＣＸＣＲ５を発現している。ＣＸＣＲ５の発現は、当業者に知られているさまざまな方法によって明らかにすること、例えば患者から細胞を単離し、その細胞を、ＣＸＣＲ５転写産物に対するプライマーを用いてＰＣＲによって評価し、抗ＣＸＣＲ５抗体で免疫染色すること、またはフローサイトメトリーで分析することによって明らかにすることができる。そのような病原性細胞として、典型的には、病原性の成熟Ｂ細胞および／または記憶Ｂ細胞、および／または病原性のＴ細胞および／またはＴ濾胞性ヘルパー細胞が可能である。
【０１９８】
特別な実施態様では、本明細書で考慮するＣＡＲ改変Ｔ細胞を含む組成物を血液悪性腫瘍の治療に用いる。血液悪性腫瘍の非限定的な例には、Ｂ細胞悪性腫瘍である例えば非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）（Ｂ細胞ＮＨＬ、白血病腫瘍細胞播種を伴う、または伴わないＴ細胞非ホジキンリンパ腫など）が含まれる。
【０１９９】
非ホジキンリンパ腫には、リンパ球（白血球細胞）のがんの大きなグループが包含される。非ホジキンリンパ腫はどの年齢でも発症する可能性があり、正常状態よりも大きいリンパ節、発熱、体重減少を特徴とすることがしばしばある。非ホジキンリンパ腫は、節外部位（中枢神経系、粘膜組織（肺、小腸、大腸、消化管））にも存在する可能性がある。非ホジキンリンパ腫には異なる多くのタイプがある。例えば非ホジキンリンパ腫は、中悪性度（成長が速い）タイプと、低悪性度（成長が遅い）タイプに分けることができる。
【０２００】
非ホジキンリンパ腫は、Ｂ細胞とＴ細胞に由来する可能性がある。本明細書では、「非ホジキンリンパ腫」という用語に、「Ｂ細胞」非ホジキンリンパ腫と「Ｔ細胞」非ホジキンリンパ腫の両方が含まれる。Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）に含まれるのは、バーキットリンパ腫、慢性リンパ性白血病／小リンパ球性リンパ腫（ＣＬＬ／ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫である。骨髄または幹細胞を移植した後に発生するリンパ腫は、通常はＢ細胞非ホジキンリンパ腫である。
【０２０１】
Ｔ細胞リンパ腫は、アメリカ合衆国内の全ＮＨＬの約１５％を占める。Ｔ細胞リンパ腫には多くの異なる形態が存在しており、血液またはリンパ管免疫芽球の成熟Ｔ細胞リンパ腫である血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）などがある。Ｔ細胞リンパ腫のさらに別の形態は、皮膚Ｔ細胞リンパ腫と、白血病性播種を伴うＴ細胞リンパ腫に関係する。
【０２０２】
慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）も本発明のＣＡＲで治療することができる。ＣＬＬは、未熟な白血球細胞（Ｂリンパ球）のゆっくりとした増加を引き起こす低悪性度（成長が遅い）のがんである。がん細胞は血液と骨髄を通じて広がり、リンパ節や他の臓器（肝臓、脾臓など）にも影響を及ぼす可能性がある。ＣＬＬは最終的に骨髄が機能しなくする。この疾患の異なる呼称は小リンパ球性リンパ腫であり、たいてい二次リンパ器官（例えばリンパ節、脾臓）に局在する。
【０２０３】
本発明の一実施態様では、ＣＡＲ、またはＣＡＲを発現する免疫細胞は、自己免疫疾患の治療、好ましくは自己抗体依存性自己免疫疾患の治療、好ましくは炎症性成分を有する自己免疫疾患の治療に用いることが想定されている。
【０２０４】
ＣＸＣＲ５を発現している濾胞性Ｔヘルパー（Ｔｆｈ）細胞の調節異常が、自己免疫疾患における異常な液性免疫反応と自己抗体産生に寄与する重要な機構である。したがってＣＸＣＲ５を発現しているＴｆｈ細胞が、自己免疫の文脈における実際的な標的となる。
【０２０５】
治療する自己免疫疾患の選択は、高安動脈炎、巨細胞性動脈炎、家族性地中海熱、川崎病、結節性多発動脈炎、皮膚型結節性多発動脈炎、肝炎関連動脈炎、ベーチェット病、ウェゲナー肉芽腫症、ＡＮＣＡ血管炎、チャーグ−ストラウス症候群、顕微鏡的多発血管炎、結合組織疾患の血管炎、ヘノッホ−シェーンライン紫斑病、クリオグロブリン血管炎、皮膚白血球破壊性血管炎、熱帯大動脈炎、サルコイドーシス、コーガン症候群、ウィスコット−アルドリッチ症候群、らい腫型動脈炎、ＣＮＳ限局性血管炎、閉塞性血栓性血管炎、腫瘍随伴動脈炎、蕁麻疹、デゴス病、骨髄異形成症候群、持久性隆起性紅斑、高免疫グロブリンＤ、アレルギー性鼻炎、気管支喘息、慢性閉塞性肺疾患、歯周炎、関節リウマチ、アテローム性動脈硬化、アミロイドーシス、クローン病、潰瘍性大腸炎、自己免疫性筋炎、糖尿病、ギラン−バレー症候群、組織球症、変形性関節症、アトピー性皮膚炎、歯周炎、慢性副鼻腔炎、乾癬、乾癬性関節炎、顕微鏡的大腸炎、肺線維症、糸球体腎炎、ホイップル病、スティル病、結節性紅斑、中耳炎、クリオグロブリン血症、シェーグレン症候群、エリテマトーデス（好ましくは全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ））、再生不良性貧血、骨髄線維症、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、木村病、全身性強皮症、慢性大動脈周囲炎、慢性前立腺炎、特発性肺線維症、慢性肉芽腫症、特発性アカラシア、ブレオマイシン誘導肺炎症、シタラビン誘導肺炎症、自己免疫性血小板減少症、自己免疫性好中球減少症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性リンパ球減少症、シャーガス病、慢性自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性肝炎、橋本甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎、バセドウ病、多腺性自己免疫症候群、自己免疫性アジソン病、尋常性天疱瘡、落葉性天疱瘡、疱疹状皮膚炎、自己免疫性脱毛症、白班、抗リン脂質抗体症候群、  重症筋無力症、スティフ−マン症候群、グッドパスチャー症候群、交感性眼炎、毛包炎、シャープ症候群、エバンス症候群からなされること、特に花粉症、歯周炎、アテローム性動脈硬化、関節リウマチからなされることが好ましく、選択されることが最も好ましいのはＳＬＥである。
【０２０６】
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）（ループスとしても知られる）は自己免疫疾患であり、身体の免疫系が身体のさまざまな部分の健康な組織を攻撃する。症状は人によって異なり、軽症から重症までの可能性がある。一般的な症状に含まれるのは、痛みがあって膨潤した関節、発熱、胸部痛、脱毛、口の潰瘍、膨潤したリンパ節、疲労感、発疹（顔に現われることが最も多い）である。
【０２０７】
濾胞性Ｔヘルパー（Ｔｆｈ）細胞は最近、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の主要な細胞リザーバとなっているＣＤ４+ Ｔヘルパー細胞であることが発見された（Ｌｅｏｎｇ他、２０１７年、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第８巻：６２２ページ）ため、本発明のＣＡＲを発現しているＣＡＲ免疫細胞は、ＨＩＶ産生  Ｔヘルパー細胞の濾胞性リザーバを標的とできる可能性がある。そのためＨＩＶの治療で本発明のＣＡＲを用いてＨＩＶ産生  Ｔヘルパー細胞のリザーバを除去または抑制することができる。したがって一実施態様では、ＨＩＶ産生  Ｔヘルパー細胞のリザーバは、ＣＸＣＲ５を発現している一群の病原性細胞（特に病原性Ｔ細胞）と見なされる。
【０２０８】
本明細書では、「個体」と「対象」という用語はしばしば交換可能に用いられ、本明細書の別の箇所に開示されている遺伝子療法ベクター、細胞をベースとした治療剤、方法を利用して治療できる疾患、障害、病気の症状を示す任意の動物を意味する。好ましい実施態様では、対象に含まれるのは、造血系の疾患、傷害、病気（例えばＢ細胞悪性腫瘍）の症状を示す任意の動物であり、本明細書に開示されている細胞に基づく治療薬と方法で治療することができる。適切な対象に含まれるのは、実験室の動物（マウス、ラット、ウサギ、モルモットなど）、家畜、飼いならされた動物またはペット（ネコ、イヌなど）である。対象には、非ヒト霊長類とヒト患者、好ましくはヒト患者が含まれる。典型的な対象に含まれるのは、Ｂ細胞悪性腫瘍を有するヒト患者、Ｂ細胞悪性腫瘍であると診断されたヒト患者、又はＢ細胞悪性腫瘍のリスクがあるヒト患者である。
【０２０９】
本明細書では、「治療」または「治療している」に、疾患または病的状態の症状または病理に対するあらゆる有効な効果、または望ましい効果が含まれ、その中には、治療中の疾患または病的状態に関する１つ以上の測定可能なマーカーのごくわずかな低下を含めることができる。治療には、場合によっては疾患または病的状態の症状の軽減または改善や、疾患または病的状態の進行遅延を含めることができる。「治療」には、疾患または病的状態や、それに関連する症状の根絶や完全な治癒は必ずしも含まれない。
【０２１０】
本明細書では、「予防する」と、それと類似した「予防された」、「予防している」、「予防的」などの用語は、疾患または病的状態の発生または再発の可能性を予防、または抑制、または低下させるアプローチを指す。これらの用語は、疾患または病的状態の発生または再発を遅延させることや、疾患または病的状態の症状の発生または再発を遅延させることも意味する。本明細書では、「予防」およびそれと同様の用語に、疾患または病的状態が発生または再発する前のその疾患または病的状態の程度、および／または効果、および／または症状、および／または負荷の軽減も含まれる。
【０２１１】
一実施態様では、治療を必要とする対象におけるＢ細胞関連の病的状態を治療する方法は、本明細書で考慮する遺伝子改変免疫エフェクタ細胞を含む組成物を有効な量（例えば治療に有効な量）で投与することを含んでいる。投与の量と頻度は、患者の状態、患者の疾患のタイプと重症度などの因子によって決まるが、適切な用量は臨床試験によって決めることができる。
【０２１２】
本明細書で考慮する組成物の投与は、好都合な任意のやり方で実施することができ、その中に含まれるのは、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸液、埋め込み、移植によるやり方である。好ましい一実施態様では、組成物は非経口投与される。「非経口投与」と「非経口で投与される」という表現は、本明細書では、経腸投与と局所投与以外の投与形態を意味し、通常は注射による投与であり、その非限定的な例に含まれるのは、血管内、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、腫瘍内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、胸骨内への注射と輸液である。一実施態様では、本明細書で考慮する組成物は、腫瘍、リンパ節、感染部位への直接的な注射によって対象に投与される。
【０２１３】
図面
【０２１４】
図１：好ましいＣＡＲ構造の模式図。抗原結合ドメインのＶＬドメインとＶＨドメインが、それらＶＬドメインとＶＨドメインの間に位置するリンカーを含めて示されている。抗原結合ドメインと膜貫通ドメインの間に位置するスペーサ領域も示されている。細胞内ドメインのバリアントも示されており、その細胞内ドメインには、例えば共刺激ドメインと活性化ドメインが含まれている。
【０２１５】
図２：好ましいＣＡＲコンストラクトＨ２８、Ｒ２８、ＨＢＢ１、ＨＢＢ２、Ｈ２８ＢＢの模式図。本発明の好ましいコンストラクトは、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、活性化ドメインのバリアントを含んでいる。本質的に、本発明の好ましい実施態様により、これらのさまざまなドメイン（好ましくは本明細書に開示されている特別な実施態様のさまざまなドメイン）の交換が可能になるが、ドメインには、当業者に知られている類似した機能を持つ追加のドメインも含まれる。
【０２１６】
図３：本明細書に記載の好ましいＣＡＲコンストラクトと、ＣＡＲのさまざまな構造エレメントの可能な組み合わせのリスト。
【０２１７】
図４：ｍＡｂ結合領域と本発明のＣＡＲで用いられる好ましいヒト化配列の間の配列比較。ラットｈＨＣ配列とヒト化ｈＨＣ配列の間、ラットｈＬＣ配列とヒト化ｈＬＣ配列の間の配列一致を調べるアラインメントが表示されている。この表示からわかるように、ヒト化ｈＨＣ配列とラットｈＨＣ配列の間の配列一致は８９％であることが明らかであり、ヒト化ｈＬＣ配列とラットｈＬＣ配列の間の配列一致は９３％であることが明らかである。
【０２１８】
図５：ｍＡｂ結合領域ｈＨＣをコードするＤＮＡ配列の配列図であり、ヒト化ｈＨＣをコードする原初のＤＮＡ配列とコドンが最適化された（ＣＯ）ＤＮＡ配列の配列比較が特に示されている。
【０２１９】
図６：ｍＡｂ結合領域ｈＬＣをコードするＤＮＡ配列の配列図であり、ヒト化ｈＬＣをコードする原初のＤＮＡ配列とコドンが最適化された（ＣＯ）ＤＮＡ配列の配列比較が特に示されている。
【０２２０】
図７：ヒト化ＣＸＣＲ５−ＣＡＲ配列を有するＧｅｎｅＡｒｔ（商標）プラスミドと、ラットＣＸＣＲ５−ＣＡＲ配列を有するＧｅｎｅＡｒｔ（商標）プラスミド。切除されたｓｃＦｖがゲル電気泳動を利用して実証された。
【０２２１】
図８：制限後のコンストラクトとベクターのゲル電気泳動。ＣＡＲをコードするコンストラクトを含むプラスミドＭＰ７１も表示されている。
【０２２２】
図９：レトロウイルスを用いて形質導入した後にヒトＴ細胞の表面にＣＸＣＲ５−ＣＡＲが発現していることのフローサイトメトリーによる確認：ＣＡＲの発現、コンストラクトＨ２８と、コンストラクトＳＰ６と、形質導入なし。
【０２２３】
図１０：（Ａ）機能アッセイで評価したいくつかのタイプの細胞の表面におけるＣＸＣＲ５の発現。評価したのは、Ｂ−ＮＨＬ細胞系であるＤＯＨＨ−２、ＳＵ−ＤＨＬ４、ＯＣＩ−Ｌｙ７、ＪｅＫｏ−１と、初発次患者に由来するＭＣＬ異種移植片と、Ｂ−ＡＬＬ細胞系であるＮＡＬＭ６、ＲＥＨと、ＭＭ細胞系であるＮＣＩ−Ｈ９２９と、Ｔ−ＡＬＬ細胞系であるＪｕｒｋａｔであった。分析からわかるように、ＣＸＣＲ５は、Ｂ−ＮＨＬであるＤＯＨＨ−２細胞系、ＳＵ−ＤＨＬ４細胞系、ＯＣＩ−Ｌｙ７細胞系、ＪｅＫｏ−１細胞系の表面で発現した。（Ｂ）本発明のＣＸＣＲ５  ＣＡＲ−Ｔ細胞が健康なヒト組織と交差反応性を示すことを除外するため、健康なヒト組織に由来する一次細胞の集団でＣＸＣＲ５の発現を評価した。調べたどの一次ヒト細胞（ＨＵＶＥＣ、ヒト臍静脈内皮細胞；ＨＵＡＥＣ、ヒト臍動脈内皮細胞；ＨＡ、ヒトアストロサイト；ＨＮ、ヒトニューロン；ＨＰＮＣ、ヒト神経周膜細胞；ＨＣｏＥｐｉＣ、ヒト結腸上皮細胞）も、抗ＣＸＣＲ５免疫染色とフローサイトメトリー分析では表面でのＣＸＣＲ５の発現を示さなかった。（Ｃ）選択されたＢ−ＮＨＬ細胞系（ＳＵ−ＤＨＬ４、ＯＣＩ−Ｌｙ７、ＤＯＨＨ−２、ＳＣ−１、ＪｅＫｏ−１、ＭＥＣ−１、ＪＶＭ−３）、ＭＭ細胞系（ＮＣＩ−Ｈ９２９）、Ｂ−ＡＬＬ細胞系（ＲＥＨ、ＮＡＬＭ−６）、Ｔ−Ａｌｌ細胞系（Ｊｕｒｋａｔ）、大腸腺癌細胞系（ＳＷ−６２０）、トランスフェクションなしの胚性腎細胞系（ＨＥＫ２９３）、ＣＸＣＲ５がトランスフェクトされた胚性腎細胞系（ＨＥＫ−ＣＸＣＲ５）の表面での細胞１個当たりのＣＸＣＲ５密度の定量的測定を、ＱｕａｎｔｉＢＲＩＴＥ  ＰＥ較正ビーズとＣＸＣＲ５特異的抗体を用いて実施した。
【０２２４】
図１１：ＣＡＲを形質導入したヒトＴ細胞とさまざまな標的細胞系の共培養から、識別可能なＣＸＣＲ５+  Ｂ−ＮＨＬと対照細胞系による特異的なＴ細胞活性化がわかる。機能的インビトロ共培養とＩＦＮ−γＥＬＩＳＡを実施した。放出されるＩＦＮ−γのレベルがＴ細胞の活性化を示す。形質導入なし（ＵＴ；各シリーズの左側の棒）、ＣＸＣＲ５−ＣＡＲを発現しているＴ細胞（ＣＸＣＲ５（Ｈ２８）；各シリーズの中央の棒）、ＳＰ６  Ｔ細胞（ＳＰ６；各シリーズの右側の棒）を標的細胞系ＤＯＨＨ−２、ＳＵ−ＤＨＬ４、ＯＣＩ−Ｌｙ７、ＪｅＫｏ−１、ＮＡＬＭ６、ＲＥＨ、ＮＣＩ−Ｈ９２９、Ｊｕｒｋａｔと共培養した。標的細胞ＤＯＨＨ−２、ＳＵ−ＤＨＬ４、ＯＣＩ−Ｌｙ７、ＪｅＫｏ−１は、本発明のＣＸＣＲ５  ＣＡＲ−Ｔ細胞を用いた処理に反応してＩＦＮ−γの特異的放出を示す。ＪＶＭ−３も処理後にＩＦＮ−γの放出を示す。
【０２２５】
図１２：細胞傷害アッセイから、ＣＸＣＲ５陽性細胞系の選択的な殺傷が明らかになる。ＣＸＣＲ５陰性細胞系では実質的に殺傷が見られなかった。２つの独立な機能的インビトロ培養アッセイと51Ｃｒ放出アッセイを実施した。（Ａ、Ｂ）標的細胞系ＤＯＨＨ−２、ＳＵ−ＤＨＬ４、ＯＣＩ−Ｌｙ７、ＳＣ−１（（Ｂ）だけ）、ＪｅＫｏ−１は、本発明のＣＡＲ−Ｔを用いた処理の後に溶解を示すが、ＣＸＣＲ５を発現していない細胞（Ｎａｌｍ６とＮＣＩ−Ｈ９２９）は溶解を示さない。
【０２２６】
図１３：ＣＸＣＲ５リダイレクトＣＡＲ−Ｔ細胞は、異種移植されたＮＳＧマウスモデルのＢ細胞非ホジキンリンパ腫（Ｂ−ＮＨＬ）に対して有効である。ＣＸＣＲ５  ＣＡＲで改変したＴ細胞の強いインビトロ活性が生体内の効果的な抗腫瘍活性につながるという考え方を証明するため、ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃscid  Ｉｌ２ｒｇ  tm1 Wjl／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスのコホートで５×１０5個のマントル細胞リンパ腫細胞（ＭＣＬ）ＪｅＫｏ−１を静脈内に接種し（図１３Ａ〜Ｃ）、ＧＦＰと縦列にしたルシフェラーゼ遺伝子を形質導入した。ＮＳＧマウスはＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞を発達させることがないため、異種移植したヒト細胞のトレランスと増殖に適している。（Ａ）異種移植したＮＳＧマウスモデルでのＭＣＬ腫瘍の移植。マウスの静脈内にＭＣＬ細胞を移植することによるチャレンジを実施した。腫瘍を接種してから５日目に腫瘍細胞の増殖をＩＶＩＳイメージングによって可視化した。腫瘍負荷の発生を測定するため、イメージングを１２０秒まで延長した（０日目）。（Ｂ）処置効率を追跡し、生体発光強度を低下させてより見やすくするため、（Ａ）のようなマウスを０日目に再度１０秒間イメージングした。同日、マウスに３×１０6個の抗ＣＸＣＲ５形質導入Ｔ細胞（ｎ＝４）を与えるとともに、陰性対照としてＳＰ６−ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞（ｎ＝３）を使用した（０日目）。ＣＡＲ−Ｔ細胞を導入した後にＩＶＩＳ露出を１０秒間実施して０日目と１９日目をよりよく比較できるようにした。（Ｃ）各マウスの身体全体をカバーする興味ある領域から得られた生体発光信号の平均値を各時点で各群についてプロットする（図１３Ｃ）。ＳＰ６−ＣＡＲで処置した実質的にすべてのマウスでリンパ腫疾患が進行していて、後肢、胸郭臓器、腹部臓器の骨髄全体の強い発光信号を特徴としていたのに対し、ＣＸＣＲ５  ＣＡＲで処置した群では明らかにそうでなかった。これは、前臨床生体内試験でＣＸＣＲ５  ＣＡＲ−Ｔ細胞がＢ−ＮＨＬリンパ腫に対する抗腫瘍活性を持つことの初めての証拠を提供する。
【０２２７】
図１４：ＣＡＲを形質導入したヒトＴ細胞とさまざまな標的細胞系の共培養から、識別可能なＣＸＣＲ５+  Ｂ−ＮＨＬと対照細胞系による特異的なＴ細胞活性化がわかる。機能的インビトロ共培養と、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＡ（上側の図）、ＩＬ−２  ＥＬＩＳＡ（真ん中の図）、ＴＮＦ−αＥＬＩＳＡ（下側の図）を実施した。放出されるＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＴＮＦ−αのレベルが、Ｔ細胞の活性化とＴ細胞の機能性を示す。形質導入なしのＴ細胞（ＵＴ；白色の棒）、ＣＸＣＲ５−ＣＤ２８  ＣＡＲを発現しているＴ細胞（Ｈ２８、赤色の棒）、ＣＸＣＲ５−４−１ＢＢを発現しているＴ細胞（ＨＢＢ１；青色の棒）、ＣＸＣＲ５−ＣＤ２８／４−１ＢＢを発現しているＴ細胞（Ｈ２８ＢＢ；緑色の棒）、ＳＰ６  Ｔ細胞（ＳＰ６；灰色の棒）を、標的細胞系ＪｅＫｏ−１、ＤＯＨＨ−２、ＳＵ−ＤＨＬ４、ＯＣＩ−Ｌｙ７、ＲＥＨ、ＮＣＩ−Ｈ９２９と共培養した。標的細胞ＤＯＨＨ−２、ＳＵ−ＤＨＬ４、ＯＣＩ−Ｌｙ７、ＪｅＫｏ−１は、本発明のＣＸＣＲ５  ＣＡＲ−Ｔ細胞を用いた処理に反応して特異的なＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＴＮＦ−αの放出を示す。
【０２２８】
図１５：ＣＡＲを形質導入したヒトＴ細胞と、標的としてのさまざまなヒト組織のＣＸＣＲ５陰性一次細胞の共培養から、標的外Ｔ細胞活性化がないことがわかるのに対し、ＣＸＣＲ５を発現しているＢ−ＮＨＬ細胞系ＪｅＫｏ−１は特異的なＴ細胞活性化を媒介し、陽性対照として機能する。機能的インビトロ共培養とＩＦＮ−γＥＬＩＳＡを実施した。形質導入なしのＴ細胞（ＵＴ；白色の棒）、ＣＸＣＲ５−ＣＤ２８  ＣＡＲを発現しているＴ細胞（Ｈ２８、赤色の棒）、ＳＰ６  Ｔ細胞（ＳＰ６；灰色の棒）を、一次細胞であるＨＵＶＥＣ、ＨＵＡＥＣ、ＨＡ、ＨＮ、ＨＰＮＣ、ＨＣｏＥｐｉＣ、Ｔ−ＡＬＬ細胞系であるＪｕｒｋａｔ、Ｂ−ＮＨＬ細胞系であるＪｅＫｏ−１と共培養した。ＩＦＮ−γの放出がないというのは、ＣＸＣＲ５陰性一次細胞とＣＸＣＲ５陰性Ｔ−ＡＬＬ細胞系Ｊｕｒｋａｔの存在下では特異的なＴ細胞活性化がないことを示している。本発明のＣＸＣＲ５−ＣＤ２８  ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＸＣＲ５を発現しているＪｅＫｏ標的細胞との共培養に反応して特異的なＩＦＮ−γの放出を示す。
【実施例】
【０２２９】
本発明を下に開示されている実施例によって実証する。実施例は、好ましい可能性がある非限定的な実施態様の技術的な裏付けと、より詳細な記述を提供する。
【０２３０】
本明細書に記載のＣＡＲの機能的特性と利点を実証するため、以下の実施例を考慮する：
−  ＣＡＲ形質導入ヒトＴ細胞とさまざまな標的細胞系の共培養から、識別可能なＣＸＣＲ５+  細胞系による特異的Ｔ細胞活性化がわかる；読み取りは、Ｔ細胞からのエフェクタサイトカインとしてのＩＦＮ−γの放出であった；
−  細胞傷害アッセイから、ＣＸＣＲ５+  細胞系の選択的な殺傷が明らかになる；ＣＸＣＲ５陰性細胞系（例えばＮａｌｍ６とＮＣＩ−Ｈ９２９）では実質的に殺傷が見られなかった；
−  生体内実験は、異種移植ＮＳＧマウスモデルを用い、Ｂ−ＮＨＬ細胞系に対する養子移植されたＣＡＲ−Ｔ細胞のｉ）機能、ｉｉ）標的外反応性、ｉｉｉ）Ｔ細胞記憶、ｉｖ）バイオセイフティに関するデータを生成させることに関係している。Ｂ−ＮＨＬについて、抗ＣＸＣＲ５  ＣＡＲ−Ｔ細胞の細胞溶解能力を、確立されている抗ＣＤ１９  ＣＡＲ−Ｔ細胞産物と比較する。
【０２３１】
実施例１：クローニングとプラスミドの調製：
【０２３２】
ＧｅｎｅＡｒｔ（商標）（Ｇｅｎｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｅｒｖｉｃｅ社）を用いてＣＡＲ  ｓｃＦｖ配列を合成した。合成された配列の制限消化をＮｏｔＩとＣｓｉｌを用いて実施し、ＧｅｎｅＡｒｔプラスミドからｓｃＦｖインサートを放出させた。追加のＣＡＲ配列を含むレトロウイルスベクターＭＰ７１をＮｏｔＩとＣｓｉｌを用いて消化させ、単離されたｓｃＦｖインサートがベクター内のＣＡＲコンストラクトに連結できるようにした。消化されたベクターをその後脱リン酸化した。フラグメントをゲル電気泳動によって分離し（図８）、精製した。
【０２３３】
その後、上記のようにして生成させたＣＡＲ  ｓｃＦｖ配列を、追加ＣＡＲ配列を含む精製したベクター（５０ｎｇ）に３：１の比で連結させた。この連結混合物でＭＡＣＨ−１を形質転換した。対照の消化を実施し、得られたミニ調製物をシークエンシングした。その後、これらのコンストラクトでＭＡＣＨ−１を再度形質転換した。ＭＰ７１−ＣＸＣＲ５−ＣＡＲプラスミドのマキシ調製物を作製した。
【０２３４】
ＭＰ７１は一本（＋）鎖ＲＮＡウイルスである。逆転写酵素でレトロウイルスのＲＮＡゲノムをＤＮＡコピーに変換する。ＤＮＡはプロウイルスとして標的ゲノムのランダムな位置に統合される。ウイルスは、細胞分裂を通じ、プロウイルスとして安定に複製される。
【０２３５】
ＭＰ７１は以下の調節シスエレメントを含んでいる：
ＬＴＲ（＝長い末端反復）は、マウス骨髄増殖性肉腫ウイルス（ＭＰＳＶ）に由来し、プロモータを含有している。ベクターのリーダー配列は、マウス胚性幹細胞ウイルスに由来する。ＰＲＥ（＝転写後調節エレメント）は、元々はウッドチャック肝炎ウイルスに由来する。
【０２３６】
ＭＰ７１は脱活性化されている。なぜならＭＰ７１はレトロウイルス遺伝子が失われているため、もはや複製能力がないからである。構造遺伝子はパッケージング細胞系の中の２つのへルパープラスミドの中に以前に別々に導入された。トランスフェクションには、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖという遺伝子産物が必要とされる。感染性ウイルス粒子が放出されて細胞培養物の上清に入る。感染性ウイルス粒子をＰＢＬへの形質導入に用いることができる。ヒトＰＢＬで大きな発現率で大きな形質導入率を達成することができる。
【０２３７】
実施例２：トランスフェクションと形質導入：
【０２３８】
０日目：ウイルス産生のため、ＨＥＫ−Ｔ（２９３Ｔ）細胞またはＧａｌＶ細胞を６ウエルのプレートに播種する。
【０２３９】
１日目：レトロウイルス産生のため、一過性３−プラスミドのトランスフェクション（リン酸カルシウムトランスフェクション）。標準的なプロトコルに従い、ウエル１つにつき、２５０ｍＭのＣａＣｌ2を含む１５０μｌのＨ2Ｏの中で１０μｇのＤＮＡを使用した。細胞を３７℃で６時間インキュベートし、培地を交換し、３７℃でさらに４８時間インキュベートした。
【０２４０】
２４ウエルの非組織培養プレートを抗ｈｕＣＤ３抗体と抗ｈｕＣＤ２８抗体で覆う：
【０２４１】
抗ＣＤ３抗体／抗ＣＤ２８抗体をＰＢＳの中に含む溶液（５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３、１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８）をウエル１つにつき０．５ｍｌ調製する。０．５ｍｌの抗体溶液を含む各ウエルを３７℃で２時間インキュベートし、（水の中に）減菌２％ＢＳＡを含む溶液と置き換え、３０分間（３７℃）インキュベートする。ＢＳＡ溶液を除去し、ウエルを２ｍｌのＰＢＳで洗浄する。
【０２４２】
４０ｍｌの血液からＰＢＭＣを精製する（約２．５×１０7個のＰＢＭＣ）：
【０２４３】
１２．５ｍｌのフィコール勾配培地を２×５０ｍｌのファルコンチューブの中に調製し、血液をＲＰＭＩ（＋１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン、ストレプトマイシン）で希釈して４５ｍｌにし、混合し、２２．５ｍｌの血液−培地−混合物で被覆し、遠心分離する（２０分間、２０℃、１８００ｒｐｍ、ＲＺＢ＊６４８、Ｇ  １７．９）。上部の相を１５ｍｌ廃棄する。残った上部の相を白いミルク状のＰＢＭＣを含有する中間相とともに新しい５０ｍｌのファルコンチューブに移し、４５ｍｌになるまでＲＰＭＩ（＋１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン、ストレプトマイシン）を満たし、遠心分離する。ペレットを４５ｍｌのＲＰＭＩ（＋１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン、ストレプトマイシン）の中に再懸濁させ、遠心分離し、１０〜２０ｍｌのＴ細胞培地の中にペレットをまとめ、１つのサンプルをトリパンブルーで染色し、細胞をカウントし、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８で被覆したウエルに細胞を１〜１．５×１０6細胞／ｍｌの濃度で添加する。ＰＢＭＣの残りを遠心分離し、凍結培地の中に懸濁させ、クライオチューブの中で−８０℃にて保管する。
【０２４４】
３日目：ＰＢＬの形質導入
【０２４５】
ＨＥＫ−Ｔ細胞またはＧａｌＶ細胞からウイルス上清を取り出して濾過する（０．４５μｍのフィルタ）。刺激されたＰＢＭＣを１．０ｍｌのウイルス上清で処理する。刺激されたＰＢＬを１ｍｌのウイルス上清で処理し、ＣＤ３／ＣＤ２８で被覆したウエルの中で遠心分離する（９０分間、３２℃、８００×ｇ）。最終濃度は、１００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２、または１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７と１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５であり、それに加えて４μｇ／ｍｌ（８μｌ）の硫酸プロタミンである。
【０２４６】
４日目：ＰＢＬの形質導入
【０２４７】
残っているウイルス上清（４℃）と、ＨＥＫ−Ｔ細胞またはＧａｌＶ細胞からの第２の上清を濾過する（０．４５μｍ）。ＰＢＬから上清を１ｍｌ回収する。サイトカインの濃度を１００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２または１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７と１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５に調節するほか、４μｇ／ｍｌ（８μｌ）の硫酸プロタミンに調節する。３２℃にて８００×ｇで９０分間遠心分離する。形質導入の４時間後、ＰＢＬを２４ウエルのプレートから洗い流してＴ２５細胞培養フラスコに入れる。ＩＬ−２またはＩＬ−７／ＩＬ−１５を含む新鮮な培地を添加する。
【０２４８】
７日目〜１３日目：ＰＢＬを培養し、Ｔ細胞培地を新鮮なＩＬ２またはＩＬ７／ＩＬ１５で処理する
【０２４９】
１３日目：Ｔ細胞の刺激を終える。
【０２５０】
細胞培養フラスコからのＰＢＬ培養物をリンスし、遠心分離し、ペレットをＴ細胞培地（＋１０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２または１ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７／ＩＬ−１５）の中に再懸濁させる。
【０２５１】
１５日目の時点：機能アッセイ
【０２５２】
実施例３：抗ＣＸＣＲ５  ＣＡＲ  Ｔ細胞のインビトロでの機能試験
【０２５３】
レトロウイルスで形質導入した後のヒトＴ細胞の表面におけるＣＸＣＲ５  ＣＡＲの発現の確認：
【０２５４】
ヒトＴ細胞の文脈で、ＣＡＲ受容体の折り畳みと誘導に関する証拠が提供される。レトロウイルス形質導入プロトコルが機能することが実証される。
【０２５５】
１）ヒト末梢血白血球をフィコール勾配で精製した。上記のようにして細胞を培養し、刺激し、レトロウイルスで形質導入した。
【０２５６】
形質導入に続いて細胞をＩＬ−２またはＩＬ−７／ＩＬ−１５を含有する培地の中でさらに培養した後、ＣＸＣＲ５−ＣＡＲの発現を分析した。
【０２５７】
２）形質導入率と生存率をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）分析によって評価した。ＣＸＣＲ５−ＣＡＲの発現を検出するため、細胞の染色を、ＣＡＲコンストラクトのスペーサ領域の中のヒトＩｇＧ１区画またはヒトＩｇＧ４区画を選択的に認識する抗ヒトＩｇＧ抗体を用いて実施した。ＣＤ３／ＣＤ８  Ｔ細胞の共染色を実施した。
【０２５８】
結果を図９に示す。
【０２５９】
ＣＡＲを形質導入したヒトＴ細胞をさまざまな標的細胞系と共培養すると、識別可能なＣＸＣＲ５+  Ｂ−ＮＨＬ細胞系による特異的Ｔ細胞活性化がわかる
【０２６０】
ＣＡＲ−Ｔ細胞活性化のために用いた読み取りは、Ｔ細胞からのエフェクタサイトカインとしてのＩＦＮ−γの放出であった。
【０２６１】
１）上に詳述したようにして、レトロウイルスを用いて形質導入したヒトＴ細胞を生成させた。Ｔ細胞として使用したのは、ＣＸＣＲ５−ＣＤ２８  ＣＡＲ受容体バリアント（Ｈ２８）、ＣＸＣＲ５−４−１ＢＢ  ＣＡＲ受容体バリアント（ＨＢＢ１）、ＣＸＣＲ５−ＣＤ２８／４−１ＢＢ  ＣＡＲ受容体バリアント（Ｈ２８８ＢＢ）、ＳＰ６陰性対照ＣＡＲ、ＵＴ＝形質導入なしのＴ細胞であった。
【０２６２】
２）レトロウイルスを用いて形質導入したヒトＴ細胞を、掲載されている細胞系または一次細胞の存在下で、１：１の比にて１８〜２０時間にわたって共培養した。
【０２６３】
【表３】
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【０２６４】
３）共培養の後、無細胞培養上清をサンプリングし、ＩＦＮγの対照レベルを求めた。エフェクタＴ細胞をＰＭＡ／イオノマイシンで刺激することによって最大放出値を誘導し、Ｔ細胞だけを用いて最小放出値を誘導した。
【０２６５】
４）上清の中のＩＦＮ−γの放出をＥＬＩＳＡによって求めた。
【０２６６】
結果を図１１に示す。
【０２６７】
細胞傷害アッセイから、ＣＸＣＲ５陽性細胞系の選択的な殺傷が明らかになる：ＣＸＣＲ５陰性細胞系では殺傷が実質的に見られない
【０２６８】
細胞傷害性Ｔリンパ球の活性を定量するのに51Ｃｒ放出アッセイを利用した。このアッセイによって標的細胞の細胞溶解を測定することが可能になる。
【０２６９】
１）上に詳述したようにして、レトロウイルスを用いて形質導入したヒトＴ細胞を生成させた。ＳＰ６陰性対照ＣＡＲとＵＴ＝形質導入なしのＴ細胞に加え、ＣＸＣＲ５−ＣＤ２８  ＣＡＲ受容体バリアント（Ｈ２８）を使用した。
【０２７０】
２）標的細胞を51Ｃｒで標識した。
【０２７１】
３）次に、ＣＡＲ−Ｔ細胞と標識した標的細胞を４時間にわたって共培養し、標的細胞に対するエフェクタ細胞の比を滴定した：
【０２７２】
エフェクタと標的の比：
８０：１
０：１
２０：１
１０：１
５：１
２．５：１
【０２７３】
４）無細胞培養物上清を回収した。
【０２７４】
５）上清をＬＵＭＡ−シンチレーションプレートに移し、放出された51Ｃｒをγシンチレーションカウンタで測定した。ＬＵＭＡプレートに適用することで溶解した標的細胞によって最大放出値を求めた。最小放出値は、標的細胞だけを用いて求めた。
【０２７５】
結果を図１２に示す。
【０２７６】
実施例４：  Ｂ−ＮＨＬ細胞系に対する養子移植されたＣＡＲ−Ｔ細胞の評価を、異種移植ＮＧＳマウスモデルを用いて実施する生体内実験
【０２７７】
本明細書に記載のさまざまな抗ＣＸＣＲ５−ＣＡＲバリアントを含むＣＡＲ−Ｔ細胞がエフェクタ活性を持つことをインサイチュ条件でも実証するため、ＣＸＣＲ５+  Ｂ−ＮＨＬ細胞系をＮＳＧマウス（ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃscid  Ｉｌ２ｒｇ  tm1 Wjl／ＳｚＪ）に静脈内経路を通じて移植する。
【０２７８】
ＣＸＣＲ５+  Ｂ−ＮＨＬ細胞系は、ＳＵ−ＤＨＬ４（ＤＬＢＣＬ）、ＪＥＫＯ−１（マントル細胞リンパ腫）、ＪＶＭ３（ＣＬＬ）、ＤＯＨＨ−２（ＦＬ）、ＯＣＩ−Ｌｙ７、ＳＣ−１のいずれかである。
【０２７９】
陰性対照細胞系が含まれる。それはＲＥＨ（ＡＬＬ）であり、インビトロで抗ＣＸＣＲ５  ＣＡＲ  Ｔ細胞によって破壊されないが、抗ＣＤ１９  ＣＡＲにとっての標的である。
【０２８０】
これらのマウスは、異種移植に特に適している。なぜならヒト細胞の増殖をサイトカイン供給によって支援する一方で、移植を拒絶するＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞を持たないからである。Ｂ−ＮＨＬ細胞系には、ホタルのルシフェラーゼ遺伝子も安定に形質導入される。この遺伝子にルシフェリンを適用すると生体内腫瘍細胞の検出が可能になる。注入された腫瘍の増悪と分布は、ＩＶＩＳシステムを用いて生体発光イメージングによってモニタされる。
【０２８１】
次に、腫瘍細胞を接種してから約５〜８日後に腫瘍細胞の増殖をルシフェラーゼ発光信号の強度増加によって確認するとき、ヒトＣＡＲ  Ｔ細胞を、レシピエントごとに５×１０5個から開始して５×１０6個まで、滴定におけるようにして静脈内経路で投与する。抗ＣＸＣＲ５  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、抗ＣＤ１９  ＣＡＲおよび２つの適切な陰性対照（例えば無関係なＳＰ６対照と、形質導入なしのＴ細胞対照）と比較する。
【０２８２】
マウスで３〜５日間の間隔にて発光強度を測定し、増殖の遅延／進行と、腫瘍細胞に関連する信号の消失を明らかにする。２８日の観察期間を採用する。発光強度の低下と、腫瘍細胞に関連する信号の消失は、ＣＡＲ  Ｔ細胞の治療効果を示す。
【０２８３】
上記の実験は、ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃscid  Ｉｌ２ｒｇ  tm1 Wjl／ＳｚＪ  （ＮＳＧ）マウスを用いて実施し、この実験では、マウスの静脈内に、ＧＦＰと縦列にしたルシフェラーゼ遺伝子を形質導入した５×１０5個のマントル細胞リンパ腫細胞（ＭＣＬ）ＪｅＫｏ−１を接種した（図１３）。次に、マウスに３×１０6個の抗ＣＸＣＲ５  ＣＡＲを形質導入したＴ細胞（ｎ＝４）を与えるとともに、陰性対照として、ＳＰ６−ＣＡＲを形質導入したＴ細胞（ｎ＝３）を使用した（０日目）。生体発光信号の平均値は、各マウスの身体全体をカバーする興味ある領域から取得した。データを各群について各時点でプロットする（図１３Ｃ）。ＳＰ６  ＣＡＲで処置した実質的にすべてのマウスが進行性のリンパ腫疾患を持っていて、後肢、胸郭臓器、腹部臓器の骨髄全体の強い発光信号を特徴としていたのに対し、ＣＸＣＲ５  ＣＡＲで処置した群では明らかにそうでなかった。これは、前臨床生体内試験でＣＸＣＲ５  ＣＡＲ−Ｔ細胞がＢ−ＮＨＬリンパ腫に対する抗腫瘍活性を持つことの初めての証拠を提供する。
【０２８４】
図１４は、（１）共刺激構成要素として４−１ＢＢまたはＣＤ２８を有する代替ＣＡＲ構成要素と、（２）共刺激構成要素としてＣＤ２８と４−１ＢＢを有する第３世代ＣＡＲと、ＣＡＲ  Ｔ細胞と腫瘍細胞系を用いた共培養実験におけるこれらＣＡＲの効果を示している。ＣＸＣＲ５を有する腫瘍細胞によるＣＡＲ  Ｔ細胞の特異的活性化は、ＩＦＮγ、ＩＬ−２、ＴＨＦ−αの放出によって証明される。
【０２８５】
ＣＸＣＲ５−ＣＤ２８（Ｈ２８）ＣＡＲが最も有効であるように見えるが、２つの代替ＣＡＲ、すなわちＣＸＣＲ５−４−１ＢＢ（ＨＢＢ１）と  ＣＸＣＲ５−ＣＤ２８／４−１ＢＢ（Ｈ２８ＢＢ）も、明確な特異的活性を示す。図１５から、ＣＸＣＲ５を持たない健康なヒト組織からの一次細胞（図１０Ｂのデータも参照されたい）は、ＣＸＣＲ５−ＣＤ２８  ＣＡＲ−Ｔ細胞の特異的活性を誘導しないことがわかる。
【０２８６】
実施例５：特定の患者集団での臨床アプローチ
【０２８７】
ヒトの生体内という設定において、本発明は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、慢性リンパ細胞性白血病、マントル細胞リンパ腫を持つＢ−ＮＨＬ患者で効果を示すことが予想される。以下の特徴を持つ患者が、臨床第Ｉ相試験に登録される：ｉ）多剤耐性の患者、ｉｉ）同種異系幹細胞移植に適さない患者、ｉｉｉ）複数の病気を抱えていて、さらなる化学療法ができない患者、ｉｖ）化学療法に耐えられない高齢の患者、ｖ）進行性疾患が出現し、他のいくつかの標準療法が失敗した後で、救援療法の対象となる患者、ｖｉ）自家幹細胞移植の後に急速な進行性疾患を抱えている患者、ｖｉｉ）同種異系幹細胞移植の後に急速に進行した疾患を抱えている患者、ｖｉｉｉ）同種異系幹細胞移植の前のつなぎ療法として、および／またはｉｘ）腫瘍細胞の表面でＣＤ１９および／またはＣＤ２０のエスケープバリアントまたは変異体を示しているため、現在の抗体療法（抗ＣＤ２０、リツキシマブ；抗ＣＤ１９、オレツズマブ；ＢＩＴＥ  ＣＤ１９／ＣＤ３、ブリマツモマブ）または抗ＣＤ１９  ＣＡＲ療法が標的構造を失って／下方調製されていて有効でない患者。
【０２８８】
ヒトの生体内という設定において、本発明は、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫においてと、白血病性播種、皮膚局在、他の任意の臓器播種があるさまざまな形態のＴ細胞リンパ腫において効果を示すことが予想される。このような患者にとって、一般的な化学療法治療計画を除いて選択的な治療法は存在していない。したがって以下の特徴を持つ患者が、臨床第Ｉ相試験に登録される：ｉ）多剤耐性の患者、ｉｉ）同種異系幹細胞移植に適さない患者、ｉｉｉ）複数の病気を抱えていて、さらなる化学療法ができない患者、ｉｖ）化学療法に耐えられない高齢の患者、ｖ）進行性疾患が出現し、他のいくつかの標準療法が失敗した後で、救援療法の対象となる患者、ｖｉ）自家幹細胞移植の後に急速な進行性疾患を抱えている患者、ｖｉｉ）同種異系幹細胞移植の後に急速な進行性疾患を抱えている患者、ｖｉｉｉ）同種異系幹細胞移植の前のつなぎ療法として、ｉｘ）１つの標準的な化学療法を受けているときに進行性疾患を抱えている患者にとっての第２選択の治療法として。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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