(57)【要約】  本開示は、ヒト補体成分Ｃ５および／または血清アルブミンに特異的に結合する改変ポリペプチドを提供する。また、本開示は、そのような改変ポリペプチドを含む融合タンパク質であって、多価の多重特異性融合タンパク質であってもよい融合タンパク質を提供する。さらに、本開示は、そのような改変ポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする核酸分子ならびに、そのような改変ポリペプチドまたは融合タンパク質を作製する方法も提供する。さらに、本開示は、そのような改変ポリペプチドまたは融合タンパク質を含む医薬組成物ならびに、そのような改変ポリペプチドまたは融合タンパク質を使用する治療方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト補体成分Ｃ５に特異的に結合する改変ポリペプチドと、ヒト血清アルブミンに特異的に結合する改変ポリペプチドとを含む融合タンパク質であって、
ヒト補体成分Ｃ５に特異的に結合する前記改変ポリペプチドが、ヒト血清アルブミンに特異的に結合する前記ポリペプチドに、直接またはペプチドリンカーを介して融合されている、融合タンパク質。
【請求項２】
ヒト血清アルブミンに特異的に結合する前記ポリペプチドのＣ末端残基は、ヒト補体成分Ｃ５に特異的に結合する前記ポリペプチドのＮ末端残基に直接またはリンカーを介して融合される、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
ヒト補体成分Ｃ５に特異的に結合する前記ポリペプチドのＣ末端残基は、ヒト血清アルブミンに特異的に結合する前記ポリペプチドのＮ末端残基に、直接またはリンカーを介して融合される、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
ヒト補体成分Ｃ５に特異的に結合する前記ポリペプチドは、配列番号１〜１２およびそれらのフラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ヒト血清アルブミンに特異的に結合する前記ポリペプチドは、配列番号２２〜３４およびそれらのフラグメントからなる群から選択されるアミノ酸を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
ヒト補体成分Ｃ５に特異的に結合する前記ポリペプチドは配列番号１１のアミノ酸配列を含み、ヒト血清アルブミンに特異的に結合する前記ポリペプチドは配列番号２６のアミノ酸配列を有する、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
配列番号１０２または１０３のアミノ酸配列を有するペプチドリンカーをさらに含む、請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記ペプチドリンカーは、配列番号１０２のアミノ酸配列を有する、請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
配列番号９６〜１０１からなる群から選択される配列と少なくとも９５％同一の配列を有する、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
配列番号９６〜１０１からなる群から選択される配列からなる、請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
配列番号９６のポリペプチド配列からなる、請求項９に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
ヒト補体成分Ｃ５に特異的に結合する前記ポリペプチドは、３つの相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ＣＤＲ１は配列番号１３〜１７のアミノ酸配列のうちのいずれか１つを含み、ＣＤＲ２は配列番号１８または１９のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３は配列番号２０または２１のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
ヒト血清アルブミンに特異的に結合する前記ポリペプチドは、３つの相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ＣＤＲ１は配列番号３５〜４３のアミノ酸配列のうちのいずれか１つを含み、ＣＤＲ２は配列番号４４〜５１のアミノ酸配列のうちのいずれか１つを含み、ＣＤＲ３は配列番号５２〜６３のアミノ酸配列のうちのいずれか１つを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
ヒト補体成分Ｃ５またはアルブミンに結合する前記ポリペプチドのうちの一方または両方は、ｐＨ依存的な形で結合する、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
治療有効量の、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の融合タンパク質と、薬学的に許容される担体と、を含む医薬組成物。
【請求項１５】
ヒアルロニダーゼをさらに含む、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子。
【請求項１７】
請求項１６に記載の前記核酸分子を含む、発現ベクター。
【請求項１８】
請求項１６に記載の前記核酸分子を含む、単離された宿主細胞。
【請求項１９】
請求項１７に記載の前記発現ベクターを含む、単離された宿主細胞。
【請求項２０】
哺乳動物細胞または酵母細胞である、請求項１９に記載の単離された宿主細胞。
【請求項２１】
配列番号１〜１２からなる群から選択される配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する、ヒト補体成分Ｃ５に結合する改変ポリペプチド。
【請求項２２】
配列番号１〜１２およびそれらのフラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項２１に記載の改変ポリペプチド。
【請求項２３】
配列番号２２〜３４のアミノ酸配列のうちのいずれか１つと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する、ヒト血清アルブミンに特異的に結合する改変ポリペプチド。
【請求項２４】
前記改変ポリペプチドは、配列番号２２〜３４およびそれらのフラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項２３に記載の改変ポリペプチド。
【請求項２５】
前記ポリペプチドは、３つの相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ＣＤＲ１は配列番号３５〜４３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２は配列番号４４〜５１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３は配列番号５２〜６３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項２４に記載の改変ポリペプチド
【請求項２６】
前記ポリペプチドは、ヒト血清アルブミン上のＡｌｂ１と同じエピトープに特異的に結合する、請求項２２に記載の改変ポリペプチド
【請求項２７】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する少なくとも１つの核酸分子を宿主細胞で発現させることを含む、前記融合タンパク質を作製するための方法。
【請求項２８】
（ａ）ラベルを含む容器と、
（ｂ）請求項１〜１３のいずれか１項に記載の前記融合タンパク質を含む組成物と、を含み、
前記ラベルは、前記組成物が補体による障害のある患者またはそのような障害が疑われる患者に投与される組成物であることを示す、治療用キット。
【請求項２９】
ヒアルロニダーゼをさらに含む、請求項２８に記載のキット。
【請求項３０】
補体による障害を有する患者を治療するための方法であって、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の融合タンパク質を治療有効量で前記患者に投与することを含む、方法。
【請求項３１】
前記補体による障害は、関節リウマチ、ループス腎炎、喘息、虚血再灌流障害、非定型溶血性尿毒症症候群、膜性増殖性糸球体腎炎ＩＩ型、発作性夜間血色素尿症、黄斑変性、ＨＥＬＬＰ症候群、ギランバレー症候群、ＣＨＡＰＬＥ症候群、重症筋無力症、視神経脊髄炎、造血幹細胞移植後の血栓性微小血管障害症（ＨＳＣＴ後ＴＭＡ）、骨髄移植後ＴＭＡ（ＢＭＴ後ＴＭＡ）、デゴス病、ゴーシェ病、糸球体腎炎、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、自然流産、寡免疫性の血管炎、表皮水疱症、習慣性流産、多発性硬化症（ＭＳ）、外傷性脳損傷および心筋梗塞、心肺バイパス、血液透析に起因する損傷からなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１７年７月１１日に出願された米国仮出願第６２／５３１，２１５号の優先日の利益を主張するものであり、その内容全体を本明細書に援用する。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体を本明細書に援用する。前述のＡＳＣＩＩコピーは２０１８年７月２４日に作成され、ファイル名がＡＸＪ−２５１ＰＣ＿ＳＬ．ｔｘｔであり、大きさは３７６，５７５バイトである。
【背景技術】
【０００３】
補体成分５（Ｃ５）は補体の５番目の成分であり、炎症および細胞殺傷過程で重要な役割を果たす。活性化ペプチドＣ５ａは、強力な痙攣誘発性活性および走化性活性を有するアナフィラトキシンであり、Ｃ５転換酵素での切断によってαポリペプチドから形成される。Ｃ５ｂ高分子切断産物は、Ｃ６補体成分との間で複合体を形成することができ、この複合体は、別の補体成分を含む膜侵襲複合体（ＭＡＣ）の形成の基礎となる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
Ｃ５の調節が不適切であると、過剰な細胞分解を特徴とする、免疫が低下した患者または障害（例えば、Ｃ５による溶血が原因の溶血性障害など）につながる可能性がある。
【０００５】
Ｃ５の誤調節は重度で破壊的な表現型につながる可能性があるため、好ましい医薬特性（例えば、半減期など）を持つＣ５活性のモジュレーターが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示は、ｓｄＡｂまたはＩｇ可変ドメインであってもよい、補体成分Ｃ５または血清アルブミンに特異的に結合する改変ポリペプチドを提供する。いくつかの実施態様では、改変ポリペプチドは、ＦｃＲｎへの血清アルブミンの結合を大幅に低減または阻害することがないか、血清アルブミンの半減期を大幅に低減することがない。また、本開示は、そのような改変ポリペプチドを含む、多価の多重特異性融合タンパク質であってもよい融合タンパク質を提供する。さらに、本開示は、そのような改変ポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする核酸分子およびそのような改変ポリペプチドまたは融合タンパク質を作製する方法を提供する。さらに、本開示は、そのような改変ポリペプチドまたは融合タンパク質を含む医薬組成物およびそのような改変ポリペプチドまたは融合タンパク質を使用する治療方法を提供する。
【０００７】
一実施態様では、本開示は、ヒト補体成分Ｃ５に特異的に結合する改変ポリペプチドと、ヒト血清アルブミンに特異的に結合する改変ポリペプチドとを含む融合タンパク質であって、ヒト補体成分Ｃ５に特異的に結合する改変ポリペプチドが、ヒト血清アルブミンに特異的に結合するポリペプチドに、直接またはペプチドリンカーを介して融合されている、融合タンパク質に関する。特定の実施態様では、ヒト血清アルブミンに特異的に結合するポリペプチドのＣ末端残基は、ヒト補体成分Ｃ５に特異的に結合するポリペプチドのＮ末端残基に直接またはリンカーを介して融合される。特定の実施態様では、ヒト補体成分Ｃ５に特異的に結合するポリペプチドのＣ末端残基は、ヒト血清アルブミンに特異的に結合するポリペプチドのＮ末端残基に、直接またはリンカーを介して融合される。特定の実施態様では、ヒト補体成分Ｃ５に特異的に結合するポリペプチドは、配列番号１〜１２およびそれらのフラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ヒト血清アルブミンに特異的に結合するポリペプチドは、配列番号２２〜３４およびそれらのフラグメントからなる群から選択されるアミノ酸を含む。特定の実施態様では、ヒト補体成分Ｃ５に特異的に結合するポリペプチドは配列番号１１のアミノ酸配列を含み、ヒト血清アルブミンに特異的に結合するポリペプチドは配列番号２６のアミノ酸配列を有する。特定の実施態様では、本明細書に記載の融合タンパク質は、配列番号１０２または１０３のアミノ酸配列を有するペプチドリンカーをさらに含む。特定の実施態様では、融合タンパク質は、配列番号９６〜１０１からなる群から選択される配列と少なくとも９５％同一の配列を有する。特定の実施態様では、融合タンパク質は、配列番号９６〜１０１からなる群から選択される配列からなる。特定の実施態様では、融合タンパク質は、配列番号９６のポリペプチド配列からなる。特定の実施態様では、ヒト補体成分Ｃ５に特異的に結合するポリペプチドは、３つの相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ＣＤＲ１は配列番号１３〜１７のアミノ酸配列のうちのいずれか１つを含み、ＣＤＲ２は配列番号１８または１９のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３は配列番号２０または２１のアミノ酸配列を有する。特定の実施態様では、ヒト血清アルブミンに特異的に結合するポリペプチドは、３つの相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ＣＤＲ１は配列番号３５〜４３のアミノ酸配列のうちのいずれか１つを含み、ＣＤＲ２は配列番号４４〜５１のアミノ酸配列のうちのいずれか１つを含み、ＣＤＲ３は配列番号５２〜６３のアミノ酸配列のうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施態様では、本明細書に記載の抗原結合ドメインは、例えば、高いｐＨでの、抗原に対する高い親和性、低めのｐＨでの抗原結合に対する低めの親和性、またはその逆など、ｐＨ依存的な形で抗原に結合するように改変またはさらに改変することができる。
【０００８】
一実施態様では、本開示は、治療有効量の本明細書に記載の融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物に関する。特定の実施態様では、医薬組成物は、ヒアルロナンを分解または不活性化する薬剤、例えばヒアルロニダーゼまたは組換えヒアルロニダーゼを含むことができる。
【０００９】
一実施態様では、本開示は、本明細書に記載の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子に関する。核酸分子は、例えば、発現ベクターであってもよい。本開示は、宿主細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Pichia pastoris細胞、哺乳動物細胞、酵母細胞、植物細胞など）および本明細書に記載の融合タンパク質をコードする核酸を含むまたは利用する発現系に関する。
【００１０】
一実施態様では、本開示は、配列番号１〜１２およびそれらのフラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、ヒト補体成分Ｃ５に結合する改変ポリペプチドに関する。特定の実施態様では、改変ポリペプチドは、配列番号１〜１２からなる群から選択される配列と少なくとも９０％同一の（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一の）アミノ酸配列を有する。例えば、一実施態様では、改変ポリペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列または配列番号１に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を有する。もうひとつの実施態様では、改変ポリペプチドは、配列番号２に記載のアミノ酸配列または配列番号２に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を有する。もうひとつの実施態様では、改変ポリペプチドは、配列番号３に記載のアミノ酸配列または配列番号３に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を有する。もうひとつの実施態様では、改変ポリペプチドは、配列番号４に記載のアミノ酸配列または配列番号４に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を有する。もうひとつの実施態様では、改変ポリペプチドは、配列番号５に記載のアミノ酸配列または配列番号５に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を有する。もうひとつの実施態様では、改変ポリペプチドは、配列番号６に記載のアミノ酸配列または配列番号６に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を有する。もうひとつの実施態様では、改変ポリペプチドは、配列番号７に記載のアミノ酸配列または配列番号７に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を有する。もうひとつの実施態様では、改変ポリペプチドは、配列番号８に記載のアミノ酸配列または配列番号８に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を有する。もうひとつの実施態様では、改変ポリペプチドは、配列番号９に記載のアミノ酸配列または配列番号９に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を有する。もうひとつの実施態様では、改変ポリペプチドは、配列番号１０に記載のアミノ酸配列または配列番号１０に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を有する。もうひとつの実施態様では、改変ポリペプチドは、配列番号１１に記載のアミノ酸配列または配列番号１１に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を有する。もうひとつの実施態様では、改変ポリペプチドは、配列番号１２に記載のアミノ酸配列または配列番号１２に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を有する。
【００１１】
もうひとつの実施態様では、配列番号１〜１２およびそれらのフラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、ヒト補体成分Ｃ５に結合する改変ポリペプチドが提供される。例えば、一実施態様では、改変ポリペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる。もうひとつの実施態様では、改変ポリペプチドは、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる。もうひとつの実施態様では、改変ポリペプチドは、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる。もうひとつの実施態様では、改変ポリペプチドは、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなる。もうひとつの実施態様では、改変ポリペプチドは、配列番号５に記載のアミノ酸配列からなる。もうひとつの実施態様では、改変ポリペプチドは、配列番号６に記載のアミノ酸配列からなる。もうひとつの実施態様では、改変ポリペプチドは、配列番号７に記載のアミノ酸配列からなる。もうひとつの実施態様では、改変ポリペプチドは、配列番号８に記載のアミノ酸配列からなる。もうひとつの実施態様では、改変ポリペプチドは、配列番号９に記載のアミノ酸配列からなる。もうひとつの実施態様では、改変ポリペプチドは、配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなる。もうひとつの実施態様では、改変ポリペプチドは、配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなる。もうひとつの実施態様では、改変ポリペプチドは、配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなる。
【００１２】
一実施態様では、本開示は、配列番号２２〜３４およびそれらのフラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、ヒト血清アルブミンに特異的に結合する改変ポリペプチドに関する。特定の実施態様では、改変ポリペプチドは、配列番号２２〜３４のアミノ酸配列のうちのいずれか１つと少なくとも９０％同一の（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一の）アミノ酸配列を有する。例えば、一実施態様では、改変ポリペプチドは、配列番号２２に記載のアミノ酸配列または配列番号２２に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を有する。もうひとつの実施態様では、改変ポリペプチドは、配列番号２３に記載のアミノ酸配列または配列番号２３に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を有する。もうひとつの実施態様では、改変ポリペプチドは、配列番号２４に記載のアミノ酸配列または配列番号２４に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を有する。もうひとつの実施態様では、改変ポリペプチドは、配列番号２５に記載のアミノ酸配列または配列番号２５に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を有する。もうひとつの実施態様では、改変ポリペプチドは、配列番号２６に記載のアミノ酸配列または配列番号２６に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を有する。もうひとつの実施態様では、改変ポリペプチドは、配列番号２７に記載のアミノ酸配列または配列番号２７に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を有する。もうひとつの実施態様では、改変ポリペプチドは、配列番号２８に記載のアミノ酸配列または配列番号２８に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を有する。もうひとつの実施態様では、改変ポリペプチドは、配列番号２９に記載のアミノ酸配列または配列番号２９に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を有する。もうひとつの実施態様では、改変ポリペプチドは、配列番号３０に記載のアミノ酸配列または配列番号３０に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を有する。もうひとつの実施態様では、改変ポリペプチドは、配列番号３１に記載のアミノ酸配列または配列番号３１に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を有する。もうひとつの実施態様では、改変ポリペプチドは、配列番号３２に記載のアミノ酸配列または配列番号３２に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を有する。もうひとつの実施態様では、改変ポリペプチドは、配列番号３３に記載のアミノ酸配列または配列番号３３に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を有する。もうひとつの実施態様では、改変ポリペプチドは、配列番号３４に記載のアミノ酸配列または配列番号３４に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を有する。
【００１３】
もうひとつの実施態様では、ヒト血清アルブミンに特異的に結合する改変ポリペプチドは、配列番号２２〜３４およびそれらのフラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。例えば、一実施態様では、改変ポリペプチドは、配列番号２２に記載のアミノ酸配列からなる。もうひとつの実施態様では、改変ポリペプチドは、配列番号２３に記載のアミノ酸配列からなる。もうひとつの実施態様では、改変ポリペプチドは、配列番号２４に記載のアミノ酸配列からなる。もうひとつの実施態様では、改変ポリペプチドは、配列番号２５に記載のアミノ酸配列からなる。もうひとつの実施態様では、改変ポリペプチドは、配列番号２６に記載のアミノ酸配列からなる。もうひとつの実施態様では、改変ポリペプチドは、配列番号２７に記載のアミノ酸配列からなる。もうひとつの実施態様では、改変ポリペプチドは、配列番号２８に記載のアミノ酸配列からなる。もうひとつの実施態様では、改変ポリペプチドは、配列番号２９に記載のアミノ酸配列からなる。もうひとつの実施態様では、改変ポリペプチドは、配列番号３０に記載のアミノ酸配列からなる。もうひとつの実施態様では、改変ポリペプチドは、配列番号３１に記載のアミノ酸配列からなる。もうひとつの実施態様では、改変ポリペプチドは、配列番号３２に記載のアミノ酸配列からなる。もうひとつの実施態様では、改変ポリペプチドは、配列番号３３に記載のアミノ酸配列からなる。もうひとつの実施態様では、改変ポリペプチドは、配列番号３４に記載のアミノ酸配列からなる。
【００１４】
特定の実施態様では、ヒト血清アルブミンに特異的に結合するポリペプチドは、３つの相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ＣＤＲ１は配列番号３５〜４３からなる群から選択されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つを含み、ＣＤＲ２は配列番号４４〜５１からなる群から選択されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つを含み、ＣＤＲ３は配列番号５２〜６３からなる群から選択されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つを含む。特定の実施態様では、ポリペプチドは、ヒト血清アルブミン上のＡｌｂ１と同じエピトープに特異的に結合する。
【００１５】
一実施態様では、本開示は、本明細書に記載の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する少なくとも１つの核酸分子を宿主細胞で発現させることを含む、本明細書に記載の融合タンパク質を作製するための方法に関する。
【００１６】
一実施態様では、本開示は、（ａ）ラベルを含む容器と、（ｂ）本明細書に記載の融合タンパク質を含む組成物とを含み、ラベルは、組成物が補体が介在した障害のある患者またはそのような障害が疑われる患者に投与される組成物であることを示す、治療用キットに関する。このキットには、ヒアルロナンを分解または不活性化する薬剤、例えばヒアルロニダーゼまたは組換えヒアルロニダーゼを任意に含むことができる。
【００１７】
一実施態様では、本開示は、補体による障害を有する患者を治療するための方法であって、本明細書に記載の融合タンパク質を治療有効量で患者に投与することを含む、方法に関する。特定の実施態様では、補体による障害は、関節リウマチ、ループス腎炎、喘息、虚血再灌流障害、非定型溶血性尿毒症症候群、膜性増殖性糸球体腎炎ＩＩ型、発作性夜間血色素尿症、黄斑変性、ＨＥＬＬＰ症候群、ギランバレー症候群、ＣＨＡＰＬＥ症候群、重症筋無力症、視神経脊髄炎、造血幹細胞移植後の血栓性微小血管障害症（ＨＳＣＴ後ＴＭＡ）、骨髄移植後ＴＭＡ（ＢＭＴ後ＴＭＡ）、デゴス病、ゴーシェ病、糸球体腎炎、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、自然流産、寡免疫性の血管炎、表皮水疱症、習慣性流産、多発性硬化症（ＭＳ）、外傷性脳損傷および心筋梗塞、心肺バイパス、血液透析に起因する損傷からなる群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ】図１Ａは、抗Ｃ５ＶＨＨドメインの補体古典経路（ＣＣＰ）溶血アッセイの結果を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、抗Ｃ５ＶＨＨドメインの補体古典経路（ＣＣＰ）溶血アッセイの結果を示す。
【図２】図２は、抗Ｃ５ＶＨＨドメインのＣ５ａ遊離アッセイの結果を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、二重特異性融合タンパク質のＣＣＰ溶血アッセイの結果を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、二重特異性融合タンパク質のＣＣＰ溶血アッセイの結果を示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、二重特異性融合タンパク質のＣＣＰ溶血アッセイの結果を示す。
【図３Ｄ】図３Ｄは、二重特異性融合タンパク質のＣＣＰ溶血アッセイの結果を示す。
【図４】図４は、二重特異性融合タンパク質のＷｉｅｓｌａｂ  ＣＣＰアッセイの結果を示す。
【図５】図５は、二重特異性融合タンパク質のＣ５ａ遊離アッセイの結果を示す。
【図６Ａ】図６Ａは、二重特異性融合タンパク質の薬物動態を示す、ＬＣ−ＭＳに基づく定量アッセイの結果を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、二重特異性融合タンパク質の薬物動態を示す、ＬＣ−ＭＳに基づく定量アッセイの結果を示す。
【図７】図７Ａは、ＶＨＨドメインをもたないＨＳＡ（対照）に対するＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中におけるｐＨ６．０でのＦｃＲｎの結合を示す、Ｂｉａｃｏｒｅのセンサーグラムを示す。図７Ｂは、ＭＳＡ２１に対するＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中におけるｐＨ６．０でのＦｃＲｎの結合を示す、Ｂｉａｃｏｒｅのセンサーグラムを示す。図７Ｃは、ＨＡＳ０４０に対するＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中におけるｐＨ６．０でのＦｃＲｎの結合を示す、Ｂｉａｃｏｒｅのセンサーグラムを示す。図７Ｄは、ＨＡＳ０４１に対するＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中におけるｐＨ６．０でのＦｃＲｎの結合を示す、Ｂｉａｃｏｒｅのセンサーグラムを示す。
【図８】図８Ａは、Ａｌｂ１  ＶＨＨと競合するＶＨＨドメインＨＡＳ０４０によるアルブミンの結合を示す、Ｂｉａｃｏｒｅのセンサーグラムを示す。図８Ｂは、Ａｌｂ１  ＶＨＨと競合するＶＨＨドメインＨＡＳ０４１によるアルブミンの結合を示す、Ｂｉａｃｏｒｅのセンサーグラムを示す。図８Ｃは、Ａｌｂ１  ＶＨＨと競合するＶＨＨドメインＨＡＳ０２０によるアルブミンの結合を示す、Ｂｉａｃｏｒｅのセンサーグラムを示す。図８Ｄは、Ａｌｂ１  ＶＨＨと競合するＶＨＨドメインＨＡＳ０４４によるアルブミンの結合を示す、Ｂｉａｃｏｒｅのセンサーグラムを示す。
【図９Ａ】図９Ａは、様々な二重特異性融合タンパク質の溶血を阻害する能力を示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、様々な二重特異性融合タンパク質の溶血を阻害する能力を示す。
【図１０】図１０は、ＣＲＬ０９５２（配列番号９６）が溶血防止においてＣＲＬ０５００と機能的に極めて類似していることを示す。ＣＲＬ０５００は、（Ｇ４Ｓ）３（配列番号１０６）リンカーで結合した二重特異性Ｃ５・アルブミン結合性融合タンパク質である。
【図１１Ａ】図１１Ａは、ヒスチジン置換融合タンパク質のｐＨ依存性結合を示す。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、ヒスチジン置換融合タンパク質のｐＨ依存性結合を示す。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、ヒスチジン置換融合タンパク質のｐＨ依存性結合を示す。
【図１１Ｄ】図１１Ｄは、ヒスチジン置換融合タンパク質のｐＨ依存性結合を示す。
【図１２Ａ】図１２Ａは、ヒスチジン置換融合タンパク質のｐＨ依存性結合を示す。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、ヒスチジン置換融合タンパク質のｐＨ依存性結合を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本開示は、血清アルブミンまたは補体成分Ｃ５に特異的に結合する改変ポリペプチドであって、例えば、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）または免疫グロブリン（ＩｇＧ）可変ドメインであってもよい改変ポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、改変ポリペプチドは、ＦｃＲｎへの血清アルブミンの結合を大幅に低減または阻害することがないか、血清アルブミンの半減期を大幅に短縮することがない。また、本開示は、改変ポリペプチドを含む融合タンパク質であって、例えば、多価の多重特異性融合タンパク質であってもよい融合タンパク質を提供する。さらに、本開示は、改変ポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする核酸分子およびそのような改変ポリペプチドまたは融合タンパク質を作製する方法を提供する。さらに、本開示は、改変ポリペプチドまたは融合タンパク質を含む医薬組成物およびそのような改変ポリペプチドまたは融合タンパク質を使用する治療方法も提供する。
【００２０】
標準的な組換えＤＮＡ方法論を使用して、本開示の改変ポリペプチドまたは融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを構築し、そのようなポリヌクレオチドを組換え発現ベクターに組み込み、そのようなベクターを宿主細胞に導入して本開示の改変ポリペプチドまたは融合タンパク質を生成する。例えば、Sambrook et al., 2001, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd ed.)を参照のこと。具体的な定義がなされない限り、本明細書に記載の分析化学、合成有機化学、医薬化学に関連して用いられる命名法、実験室手順、技術は、従来技術において知られており、一般的に使用されるものである。同様に、化学合成、化学分析、医薬品の調製、製剤化、デリバリー、患者の治療に、従来の技術を用いることが可能である。
【００２１】
定義
本開示に従って用いる場合、以下の用語は、特に明記しない限り以下の意味を有すると理解されるものとする。文脈で特に必要とされない限り、単数形の用語には複数形が含まれ、複数形の用語には単数形が含まれる。
【００２２】
本明細書で使用する場合、「結合ドメイン」という用語は、抗原と相互作用するアミノ酸残基を含むタンパク質または抗体の一部をいう。結合ドメインには、抗体（例えば、全長抗体）およびその抗原結合部分が含まれるが、これらに限定されるものではない。結合ドメインは、抗原に対する自己の特異性と親和性を結合因子に与える。また、この用語には、免疫グロブリン結合ドメインと相同であるか大部分が相同である結合ドメインを有するタンパク質も包含される。
【００２３】
本明細書で言及される「抗体」という用語は、抗体全体および任意の抗原結合フラグメント（すなわち、「抗原結合部分」）またはその一本鎖ヴァージョンを含む。「抗体」は、好ましい一実施形態では、ジスルフィド結合によって互いに結合された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質またはその抗原結合部をいう。重鎖は各々、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略す）と重鎖定常領域で構成されている。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３の３つのドメインで構成されている。軽鎖は各々、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略す）と軽鎖定常領域で構成されている。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬで構成されている。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域にさらに区分することができる。これらのＣＤＲは、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域で分離されている。ＶＨおよびＶＬは各々、３つのＣＤＲと４つのＦＲで構成され、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順で配置されている。重鎖と軽鎖の可変領域には、抗原と相互作用する結合ドメインが含まれる。抗体の定常領域は、古典的な補体系の最初の成分（Ｃｌｑ）や免疫系のさまざまな細胞（例えば、エフェクター細胞など）を含む宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介することができる。
【００２４】
本明細書で使用する場合、抗体の「抗原結合フラグメント」（または単に「抗体フラグメント」）という用語は、抗原に特異的に結合する能力を持つ、抗体の１つ以上のフラグメントまたは部分をいう。そのような「フラグメント」は、例えば、約８から約１５００アミノ酸長、適切には約８から約７４５アミノ酸長、適切には約８から約３００、例えば約８から約２００アミノ酸または約１０から約５０または１００アミノ酸長である。抗体の抗原結合機能は、全長抗体のフラグメントによって発揮できることが明らかになっている。抗体の「抗原結合フラグメント」という用語に包含される結合フラグメントの例として、（ｉ）Ｆａｂフラグメントすなわち、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメントすなわち、ヒンジ領域でジスルフィド結合により連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ward et al., (1989) Nature 341:544-546）、（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）または（ｖｉｉ）任意に合成リンカーによって結合されてもよい２つ以上の単離されたＣＤＲの組み合わせがあげられる。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメインであるＶＬおよびＶＨは別々の遺伝子によってコードされるが、組換え法を使用して、ＶＬとＶＨを単一のタンパク質鎖にできる合成リンカーによって接合することが可能である。この単一のタンパク質鎖では、ＶＬ領域とＶＨ領域が対になって一価の分子（一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）として知られている；例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423-426; and Huston et al.(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883を参照のこと）が形成されている。また、そのような単鎖抗体も、抗体の「抗原結合フラグメント」という用語に含むことが意図されている。これらの抗体フラグメントは、当業者に知られている従来の技術を使用して得られ、無傷の抗体と同じ方法で有用性についてスクリーニングされる。抗原結合部は、組換えＤＮＡ技術によって、あるいは、無傷の免疫グロブリンの酵素による切断または化学的切断によって作製することができる。
【００２５】
本明細書で使用する場合、「組換えヒト抗体」という用語は、（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子のトランスジェニックまたはトランス染色体である動物（例えば、マウス）またはそれから調製されたハイブリドーマから単離された抗体（ｂ）トランスフェクトーマなどの、抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から単離された抗体、（ｃ）組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体、（ｄ）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列を他のＤＮＡ配列にスプライシングすることを含む他の手段により調製、発現、作製または単離された抗体など、組換え手段によって調製、発現、作製または単離されるすべてのヒト抗体を含む。そのような組換えヒト抗体は、生殖細胞系列の遺伝子によりコードされる特定のヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列を利用する可変領域および定常領域を含むが、例えば抗体成熟時に生じる以後の再配列および突然変異を含む。従来技術において知られているように（例えば、Lonberg (2005) Nature Biotech. 23(9):1117-1125を参照のこと）、可変領域は抗原結合ドメインを含み、これは再構成して外来抗原に特異的な抗体を形成する様々な遺伝子によってコードされる。再配列だけでなく、可変領域が複数の単一アミノ酸の変化（体細胞変異または超変異と呼ばれる）によってさらに修飾され、外来抗原に対する抗体の親和性が増す場合がある。定常領域は、抗原に対してさらに応答して変化することになる（すなわち、アイソタイプスイッチ）。したがって、抗原に応答して軽鎖および重鎖免疫グロブリンポリペプチドをコードする再配列および体細胞変異した核酸分子は、元の核酸分子と配列同一性を持たない場合があるが、実質的に同一または類似になる（すなわち、少なくとも８０％の同一性を持つ）。
【００２６】
本明細書で使用する場合、「ヒト抗体」という用語は、例えば、病原体に結合して中和するために免疫系によって使用される免疫グロブリン（Ｉｇ）をいう。この用語は、ヒト生殖細胞Ｉｇ配列に実質的に対応する可変領域および定常領域を有する抗体を含む。いくつかの実施形態では、ヒト抗体は、マウスならびにラットなどのげっ歯類およびウサギなどのウサギ類を含むがこれらに限定されるものではない非ヒト哺乳動物で産生される。他の実施形態では、ヒト抗体はハイブリドーマ細胞で産生される。さらに他の実施形態では、ヒト抗体は組換えにより産生される。本明細書で使用する場合、ヒト抗体には、例えば重鎖および軽鎖、可変領域、定常領域、タンパク質分解フラグメント、相補性決定領域（ＣＤＲ）および他の機能的フラグメントを含む抗体のすべてまたは一部が含まれる。
【００２７】
本明細書で使用する場合、「生物学的に活性なフラグメント」とは、所望の長さまたは生物学的機能を有する分子、例えば遺伝子、コーディング配列、ｍＲＮＡ、ポリペプチドまたはタンパク質の一部をいう。タンパク質の生物学的に活性なフラグメントは、例えば、タンパク質の１以上の生物学的活性を保持する全長タンパク質のフラグメントであってもよい。ｍＲＮＡの生物学的に活性なフラグメントは、例えば、翻訳されたときに生物学的に活性なタンパク質フラグメントを発現するフラグメントであってもよい。さらに、生物学的に活性なｍＲＮＡフラグメントは、非コーディング配列、例えば調節配列、ＵＴＲなどの短縮バージョンを含むことができる。一般に、酵素またはシグナル伝達分子のフラグメントは、例えば、そのシグナル伝達または酵素活性を保持する分子のその部分であり得る。遺伝子またはコーディング配列のフラグメントは、例えば、発現産物フラグメントを産生する遺伝子またはコーディング配列のその部分であり得る。フラグメントは、分子全体ではないが分子の一部をいう場合もあるため、必ずしも機能的に定義される必要はないが、何らかの望ましい特性または長さを有する（例えば、制限フラグメント、タンパク質のタンパク質分解フラグメント、増幅フラグメントなど）。
【００２８】
通常の哺乳動物抗体または従来の哺乳動物抗体は、一般に同じ二対のポリペプチド鎖で構成される四量体であり、それぞれの対は、完全長の「軽」鎖（一般に分子量約２５ｋＤａである）１つと完全長の「重」鎖（一般に分子量約５０〜７０ｋＤａである）１つを持つ。本明細書で使用する場合、「重鎖」および「軽鎖」という用語は、標的抗原に対する特異性を付与するのに十分な可変ドメイン配列を有するＩｇポリペプチドをいう。各軽鎖および重鎖のＮ末端部分は一般に、抗原認識に一般に関与する約１００〜１１０アミノ酸長またはそれ以上の可変ドメインを含む。各鎖のＣ末端部分は一般に、エフェクター機能を担う定常ドメインを定義する。したがって、天然に存在する抗体では、全長重鎖Ｉｇポリペプチドは可変ドメイン（ＶＨまたはＶＨ）および３つの定常ドメイン（ＣＨ１またはＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ２、ＣＨ３またはＣＨ３）を含み、ＶＨドメインはポリペプチドのＮ末端、ＣＨ３ドメインはＣ末端にあり、全長軽鎖Ｉｇポリペプチドは可変ドメイン（ＶＬまたはＶＬ）および定常ドメイン（ＣＬまたはＣＬ）を含み、ＶＬドメインはポリペプチドのＮ末端、ＣＬドメインはＣ末端にある。
【００２９】
完全長の軽鎖および重鎖内で、可変ドメインおよび定常ドメインは一般に、約１２個以上のアミノ酸からなる「Ｊ」領域によって接合され、重鎖は約１０個以上のアミノ酸からなる「Ｄ」領域も含む。各軽／重鎖対の可変領域は一般に、抗原結合部位を形成する。天然に存在する抗体の可変ドメインは一般に、ＣＤＲと呼ばれる３つの超可変領域によって接合された、比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同一の一般構造を示す。各対の２つの鎖からのＣＤＲは一般に、フレームワーク領域によって整列され、特定のエピトープへの結合を可能にする。Ｎ末端からＣ末端まで、軽鎖および重鎖の両方の可変ドメインは一般に、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含む。
【００３０】
本明細書で使用する場合、「実質的に純粋」または「実質的に精製された」という表現は、組成物中に存在する主たる種である化合物または種をいう（すなわち、モル基準で、組成物中の他のどの種よりも豊富である）。例えば、実質的に精製された画分は、存在するすべての高分子種の（モル基準で）少なくとも約５０％が主たる種に含まれる組成物であり得る。例えば、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在するすべての高分子種の約８０％、８５％、９０％、９５％または９９％よりも多くを表す主たる種を含むことができる。他の実施形態では、組成物が本質的に単一の高分子種からなる場合、主たる種を実質的に均一に精製することができる（従来の検出方法では組成物中の汚染種を検出できない）。
【００３１】
本明細書で使用する場合、「抗原」または「抗原標的」という用語は、抗体によって、例えば本明細書に開示される改変ポリペプチドまたは融合タンパク質を含む１つ以上のＩｇ結合ドメインまたは他の免疫学的結合部分に結合できる分子または分子の一部をいう。抗原は、その抗原のエピトープに結合できる抗体を産生するために動物で使用することができる。抗原は、１つ以上のエピトープを有していてもよい。
【００３２】
「エピトープ」または「抗原決定基」という用語は、免疫グロブリンまたは抗体が特異的に結合する抗原上の部位をいう。エピトープは、タンパク質の三次フォールディングによって隣り合うものであれば、連続したアミノ酸配列でも連続しないアミノ酸配列でも、どちらからでも形成される。連続したアミノ酸から形成されたエピトープは一般に、変性溶媒への曝露時にも保持されるのに対し、三次フォールディングによって形成されたエピトープは一般に、変性溶媒での処理時に失われる。エピトープは一般に、特有の空間コンフォメーションで少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のアミノ酸を含む。所与の抗体がどのエピトープに結合するかを決定する方法（すなわち、エピトープマッピング）が従来技術において周知であり、例えば、抗原からの重なったペプチドまたは連続したペプチドが所与の抗体との反応性について試験される免疫ブロットおよび免疫沈降アッセイが含まれる。エピトープの空間コンフォメーションを決定する方法として、従来技術における技術および本明細書に記載の技術、例えば、Ｘ線結晶構造解析および二次元核磁気共鳴があげられる（例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)を参照のこと）。
【００３３】
本開示の改変ポリペプチドまたは融合タンパク質に関して使用される「活性」「生物学的活性」または「生物学的特性」という用語には、エピトープ親和性および特異性、抗原標的の活性に拮抗する能力、本開示の改変ポリペプチドまたは融合タンパク質のin vivo安定性および本開示の改変ポリペプチドまたは融合タンパク質の免疫原性の特性が含まれるが、これらに限定されるものではない。他の識別可能な生物学的特性には、例えば、（例えば、抗原標的の非ヒトホモログ、または一般に他の抗原標的または組織との）交差反応性および哺乳動物細胞におけるタンパク質の高発現レベルを保持する能力が含まれる。
【００３４】
抗体、免疫グロブリンまたは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントもしくは本明細書で開示される改変ポリペプチドまたは融合タンパク質は、分子がタンパク質および／または高分子の複雑な混合物中でその抗原標的を優先的に認識するときに、抗原に「特異的に」結合すると言われる。本明細書で使用する場合、「特異的に結合する」という表現は、抗体、免疫グロブリンまたは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントもしくは本開示の改変ポリペプチドまたは融合タンパク質が、ＫＤが少なくとも約１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍまたはそれを上回るエピトープを含む抗原に結合する能力および／または非特異的抗原に対する親和性よりも親和性が少なくとも２倍大きいエピトープに結合する能力をいう。
【００３５】
本明細書で使用する場合、「ＫＤ」という用語は、抗体、免疫グロブリンまたは免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントもしくは本明細書で開示される改変ポリペプチドまたは融合タンパク質と抗原標的との間の相互作用の解離定数をいう。本開示の改変ポリペプチドまたは融合タンパク質が一価のＩｇ配列を有する場合、この一価のＩｇ配列は、好ましくは、例えば１０−５〜１０−１２Ｍまたはそれ未満もしくは１０−７〜１０−１２Ｍまたはそれ未満もしくは１０−３〜１０−１２ＭのＫＤおよび／または少なくとも１０７Ｍ−１、少なくとも１０８Ｍ−１、少なくとも１０９Ｍ−１または少なくとも１０１２Ｍ−１の結合親和性で、所望の抗原に結合する。１０−４Ｍより大きいＫＤ値は一般に、非特異的結合を示すと考えられている。いくつかの実施形態では、本開示の改変ポリペプチドまたは融合タンパク質の一価のＩｇ配列は、５００ｍＭ未満、２００ｎＭ未満、１０ｎＭ未満または５００ｐＭ未満の親和性で所望の抗原に結合する。
【００３６】
ＫＤは、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を含む、従来技術において知られた方法によって決定することができる。一般に、ＳＰＲ分析では、例えばＢＩＡｃｏｒｅシステム（Pharmacia Biosensor; Piscataway, NJ）を使用して、リガンド（バイオセンサーマトリックス上の標的抗原）と検体とのリアルタイムの結合相互作用を測定する。また、検体を固定し、リガンドを提示することによってＳＰＲ分析を行うこともできる。本開示の改変ポリペプチドまたは融合タンパク質の抗原または抗原決定基への特異的結合は、例えば、スキャッチャード分析および／または競合結合アッセイ、例えば放射免疫測定、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）およびサンドイッチ競合分析などを含む、従来技術において知られている任意の適切な方法で決定することもできる。
【００３７】
「二重特異性」という用語は、２つの抗原に結合することができる本開示の融合タンパク質をいう。「多価の融合タンパク質」という用語は、２つ以上の抗原結合部位を含む融合タンパク質を意味する。
【００３８】
「多重特異性融合タンパク質」という用語は、２つ以上の関連するまたは関連しない標的を結合することができる本開示の融合タンパク質をいう。
【００３９】
本明細書で使用する場合、「〜に融合された」という用語は、２つ（または３つ以上）のコーディング配列が単一の連続したポリペプチドに転写されて翻訳されるように、典型的には、コーディング配列などの１つの配列を、１つまたは複数の第２のコーディング配列とインフレームで発現ベクターにクローニングすることによって、２つ以上の配列を結合して作製されるポリペプチドをいう。組換え技術によって作製されることに加えて、ポリペプチドの一部を、化学反応あるいは、カスタムポリペプチドを作製するための従来技術において知られている他の手段によって、互いに「融合」することができる。
【００４０】
本明細書で使用する場合、「ベクター」という用語は、コード情報を発現系（例えば、宿主細胞またはin vitro発現系）に伝達するのに使用される分子（例えば、核酸、プラスミドまたはウイルス）をいう。ベクターの１つのタイプは「プラスミド」であり、これは追加のＤＮＡセグメントを挿入できる環状の二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）分子をいう。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、追加のＤＮＡセグメントをウイルスゲノムに挿入することができる。ベクターによっては、導入先の宿主細胞での自己複製が可能である（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクターなど）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムへの組み込みが可能であり、それによって、宿主ゲノムとともに複製される。また、ベクターによっては、転写制御できるように結合されたコーディング配列を発現させることができる。そのようなベクターを、本明細書では「発現ベクター」という。
【００４１】
本明細書で使用する場合、「発現調節できるように結合された」という表現は、フランキング配列が所望の機能を果たすように構成または構築された、フランキング配列の配置をいう。したがって、コーディング配列に発現調節できるように結合されたフランキング配列は、コーディング配列の複製、転写および／または翻訳に影響を与えることができてもよい。コーディング配列は、例えば、そのコーディング配列を転写させることができるようなプロモーターに、発現調節できるように結合される。フランキング配列は、正しく機能する限り、発現調節できるように結合されているとみなされるためにコーディング配列と連続している必要はない。
【００４２】
本明細書で使用する場合、「宿主細胞」という用語は、発現ベクターが導入された細胞をいう。宿主細胞とは、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫も指すことを意図している。突然変異または環境の影響により何らかの修飾が後代で発生する可能性があるため、そのような子孫が実際には親細胞と同一ではない場合もあるが、そのような細胞も依然として本明細書で使用する「宿主細胞」という用語の範囲に含まれる。細菌、酵母、バキュロウイルスおよび哺乳動物発現系（ならびにファージディスプレイ発現系）を含む、多種多様な宿主細胞発現系を使用して、本開示の改変ポリペプチドまたは融合タンパク質を発現させることができる。
【００４３】
本明細書で使用され、特定の分子に適用される「天然に存在する」という用語は、自然界に見られ、人間によって操作されていない分子をいう。同様に、本明細書で使用する場合、「天然に存在しない」という用語は、自然界には見られないか、修飾または人工的に合成された分子をいう。
【００４４】
本明細書で使用され、突然変異、トランケーション、欠失、置換、付加、コンジュゲーションによって、そうでなければ、分子の一次配列、化学構造または三次元構造、化学的特徴、折り畳み挙動、グリコシル化状態または他の属性を変化させることなどによって、分子が、これに対応する天然に存在する分子とは異なるように、修飾または操作された特定の分子、例えばポリペプチドに適用される「改変」という用語。
【００４５】
本明細書で使用する場合、「患者」という用語は、ヒトおよび動物の対象を含む。
【００４６】
「障害」は、本開示の改変ポリペプチドまたは融合タンパク質を使用する治療から利益を得るあらゆる状態である。「障害」および「病状」は、本明細書では同義に用いられる。
【００４７】
本明細書で使用する場合、「補体による障害」は、補体経路の誤った調節、例えば補体経路の活性化または抑制によって直接的または間接的に引き起こされる障害もしくは補体経路の１つ以上の成分または補体経路によって産生される産物によって直接的または間接的に媒介される障害をいう。この用語は、補体経路の１つ以上の成分によって悪化する障害または補体経路によって産生される産物もいう。
【００４８】
本明細書で使用する場合、「治療」または「治療する」という用語は、治療のための処置と予防策または防止策の両方をいう。治療を必要とする人には、障害のある人ならびに障害を持つ危険がある人、あるいは、障害の予防対象となる人が含まれる。
【００４９】
本明細書で使用する場合、例えば本明細書に記載の融合タンパク質または改変ポリペプチドの「治療有効」量は、投与されると、疾患症状の重症度の低下（例えば、補体による障害に関連した障害の症状の軽減、疾患症状のない期間の延長および頻度の増加、あるいは、疾患の苦痛による機能低下または能力低下の予防につながる量である。実施形態によっては、本明細書に記載の治療薬の治療有効量は、溶血を軽減するか、補体による障害の症状を改善する量（または複数回投与の場合はさまざまな量）を含み得る。
【００５０】
本明細書で使用する場合、「医薬組成物」または「治療用組成物」という用語は、患者に投与したときに所望の治療効果を誘発することができる化合物または組成物をいう。
【００５１】
本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される担体」または「生理学的に許容される担体」という用語は、本開示の改変ポリペプチドまたは融合タンパク質のデリバリーを達成または増強するのに適した１種類以上の製剤材料をいう。
【００５２】
本開示の改変ポリペプチドまたは融合タンパク質を１種類以上含む医薬組成物に関して使用される「治療有効量」という用語は、所望の治療結果を生むのに十分な量または投与量をいう。具体的には、治療有効量は、補体による障害など、治療対象となっている病状に関連する臨床的に定義された病理学的過程の１つ以上を一定期間阻害するのに十分な本開示の改変ポリペプチドまたは融合タンパク質１種類以上の量である。治療有効量は、使用される特定の改変ポリペプチドまたは融合タンパク質に応じて異なる場合があり、治療中の患者および障害の重症度に関連するさまざまな要因および病状に依存する。
【００５３】
補体系
補体系は、体の他の免疫系と連動して、細胞性およびウイルス性病原体の侵入を防ぐ。補体タンパク質は少なくとも２５種類存在し、これらは血漿タンパク質と膜補因子の複雑な集合である。血漿タンパク質は、脊椎動物の血清に含まれるグロブリンの約１０％を占めている。補体成分は、複雑ではあるが正確な一連の酵素的切断および膜結合イベントで相互作用することにより、免疫防御機能を発揮する。こうして生じる補体カスケードは、オプソニック、免疫調節および溶解機能を備えた産物の産生につながる。
【００５４】
補体カスケードは、古典経路（ＣＰ）、レクチン経路または第二経路（ＡＰ）を介して進行することができる。レクチン経路は一般に、高マンノース基質へのマンノース結合レクチン（ＭＢＬ）の結合で開始される。ＡＰは、抗体に依存せずに病原体表面の特定の分子によって開始することができる。ＣＰは一般に、標的細胞上の抗原部位の抗体認識および結合により開始される。これらの経路はＣ３転換酵素で収束するが、ここで補体成分Ｃ３が活性プロテアーゼによって切断されてＣ３ａとＣ３ｂが生成する。
【００５５】
血液の血漿画分に豊富に存在する補体成分Ｃ３の自発的な加水分解も、ＡＰ  Ｃ３転換酵素の開始を引き起こし得る。「自己活性化」として知られるこの過程は、Ｃ３のチオエステル結合が自発的に切断されてＣ３ｉまたはＣ３（Ｈ２０）が形成されて生じる。自己活性化は、活性化されたＣ３の結合を支持する表面および／または中性または正電荷の特性を持つ表面（例えば、細菌細胞の表面など）の存在によって促進される。Ｃ３（Ｈ２０）の形成により、血漿タンパク質因子Ｂの結合が可能になり、これによって、因子Ｄが因子Ｂを切断してＢａとＢｂにすることができるようになる。ＢｂフラグメントはＣ３に結合したまま、Ｃ３（Ｈ２０）Ｂｂを含む複合体すなわち「流体相」または「開始」Ｃ３転換酵素を形成する。少量しか産生されないが、流体相のＣ３転換酵素は複数のＣ３タンパク質を切断してＣ３ａとＣ３ｂにすることができ、Ｃ３ｂの生成と、その後の表面（例えば、細菌表面など）への共有結合を生じる。表面結合Ｃ３ｂに結合した因子Ｂは、因子Ｄによって切断され、Ｃ３ｂ，Ｂｂを含む表面結合ＡＰ  Ｃ３転換酵素複合体を形成する。
【００５６】
ＡＰ  Ｃ５転換酵素（（Ｃ３ｂ）２，Ｂｂ）は、ＡＰ  Ｃ３転換酵素に第２のＣ３ｂモノマーを加えると形成される。第２のＣ３ｂ分子の役割は、Ｃ５に結合し、Ｂｂによる切断用にＣ５を提示することである。ＡＰ  Ｃ３およびＣ５転換酵素は、三量体タンパク質であるプロペルジンの添加によって安定化する。しかしながら、機能する第二経路Ｃ３またはＣ５転換酵素を形成するのにプロペルジン結合は必要ない。
【００５７】
ＣＰ  Ｃ３転換酵素は、Ｃ１ｑ、Ｃ１ｒ、Ｃ１ｓの複合体である補体成分Ｃ１と、標的抗原（例えば、微生物抗原）に結合した抗体との相互作用時に形成される。Ｃ１のＣ１ｑ部分が抗体抗原複合体と結合することで、Ｃ１ｒを活性化するＣ１の構造変化が引き起こされる。そうすると、活性Ｃ１ｒがＣ１に関連するＣ１ｓを切断し、活性セリンプロテアーゼが生成する。活性Ｃ１ｓは補体成分Ｃ４を切断してＣ４ｂとＣ４ａにする。Ｃ３ｂと同様に、新たに生じたＣ４ｂフラグメントには、標的表面（例えば、微生物細胞表面など）の適切な分子と容易にアミドまたはエステル結合を形成する反応性の高いチオールが含まれている。Ｃ１ｓも補体成分Ｃ２を切断してＣ２ｂとＣ２ａにする。Ｃ４ｂとＣ２ａによって形成される複合体はＣＰ  Ｃ３転換酵素であり、Ｃ３を処理してＣ３ａとＣ３ｂにすることができる。ＣＰ  Ｃ５転換酵素（Ｃ４ｂ、Ｃ２ａ、Ｃ３ｂ）は、ＣＰ  Ｃ３転換酵素にＣ３ｂモノマーが加わると形成される。
【００５８】
Ｃ３およびＣ５転換酵素における役割に加えて、Ｃ３ｂはマクロファージや樹状細胞などの抗原提示細胞の表面に存在する補体受容体との相互作用を通じてオプソニンとしても機能する。Ｃ３ｂのオプソニック機能は通常、補体系の最も重要な抗感染機能の１つであると考えられている。Ｃ３ｂの機能を阻害する遺伝的障害を持つ患者は、多種多様な病原生物による感染を起こしやすいが、補体カスケードシーケンスの後半に障害を持つ患者、すなわちＣ５機能を阻害する障害を持つ患者は、Neisseriaだけに感染しやすく、しかもほんの少し感染しやすいだけであることが明らかになっている。
【００５９】
ＡＰおよびＣＰ  Ｃ５転換酵素は、Ｃ５を切断してＣ５ａとＣ５ｂにする。Ｃ５が切断されることで、強力なアナフィラトキシンであるＣ５ａと、走化性因子であるＣ５ｂが放出され、これによって溶解性末端補体複合体Ｃ５ｂ−９の形成を可能になる。Ｃ５ｂは、Ｃ６、Ｃ７およびＣ８と結合し、標的細胞の表面でＣ５ｂ−８複合体を形成する。いくつかのＣ９分子が結合すると、膜侵襲複合体（ＭＡＣ、Ｃ５ｂ−９、末端補体複合体（「ＴＣＣ」））が形成される。十分な数のＭＡＣが標的細胞膜に挿入されると、ＭＡＣによって生じる開口（ＭＡＣポア）がゆえに、標的細胞の急速な浸透圧溶解が引き起こされる。
【００６０】
適切に機能する補体系は感染微生物をしっかり防御するが、補体経路の不適切な調節または活性化は、例えば、関節リウマチ（ＲＡ）、ループス腎炎、喘息、虚血再灌流障害、非定型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）、膜性増殖性糸球体腎炎ＩＩ型（ＤＤＤ）、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）、黄斑変性（例えば、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）など）、ＨＥＬＬＰ症候群、ギランバレー症候群（ＧＢＳ）、タンパク質喪失性腸疾患（例えば、ＣＨＡＰＬＥ症候群など）、重症筋無力症（ＭＧ）、視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、造血幹細胞移植後の血栓性微小血管障害症（ＨＳＣＴ後ＴＭＡ）、骨髄移植後ＴＭＡ（ＢＭＴ後ＴＭＡ）、デゴス病、ゴーシェ病、糸球体腎炎、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、自然流産、寡免疫性の血管炎、表皮水疱症、習慣性流産、多発性硬化症（ＭＳ）、外傷性脳損傷および心筋梗塞、心肺バイパス、血液透析に起因する損傷を含むさまざまな障害の病因に関係している（Holers, V., Immunol. Rev., 223:300-16, 2008）。補体活性化の下方制御が、さまざまな動物モデルで、いくつかの疾患適応症の治療に有効であることが示されている（Rother, R. et al., Nat. Biotechnol., 25:1256-64, 2007; Wang, Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:8563-8, 1996; Wang, Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:8955-9, 1995; Rinder, C. et al., J. Clin. Invest., 96:1564-72, 1995; Kroshus, T. et al., Transplantation, 60:1194-202, 1995; Homeister, J. et al., J. Immunol., 150:1055-64, 1993; Weisman, H. et al., Science, 249:146-51, 1990; Amsterdam, E. et al., Am. J. Physiol., 268:H448-57, 1995; and Rabinovici, R. et al., J. Immunol., 149:1744-50, 1992）。
【００６１】
ヒト血清アルブミンおよび新生児Ｆｃ受容体
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合して治療関連タンパク質の半減期を延長できるポリペプチドが説明されている（国際公開第ＷＯ９１／０１７４３号、同第ＷＯ０１／４５７４６号、同第ＷＯ０２／０７６４８９号）。しかしながら、記載のあるペプチド部分は細菌または合成起源のものであり、ヒトの治療薬に使用するには好ましくない。国際公開第ＷＯ０４／０４１８６５号には、他のタンパク質（所望の標的に対する１つ以上の他の単一ドメイン抗体など）に結合して半減期を延長できる、血清アルブミン（特にＨＳＡ）に対する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂまたはNanobodies（登録商標））について記載されている。
【００６２】
「Ｂｒａｍｂｅｌｌ受容体」とも呼ばれる新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）は、体内循環でのアルブミンの寿命の延長に関与している（Chaudhury, C. et al., J. Exp. Med., 3:315-22, 2003）。ＦｃＲｎは、３つの細胞外ドメイン、膜貫通領域、約５０アミノ酸長の細胞質尾部を持つ４３ｋＤａのα鎖に非共有結合した２−ミクログロブリン（β２ｍ）からなる可溶性軽鎖で構成される膜内在性糖タンパク質である。細胞質尾部には、受容体の内在化に関与するジヌクレオチドモチーフのエンドサイトーシスシグナルが含まれている。α鎖は、非古典的なＭＨＣ  Ｉファミリーのタンパク質のメンバーである。ＦｃＲｎの正しい折り畳みと、小胞体を出て、エンドソームおよび細胞表面へ行くために、α鎖とβ２ｍとの会合が重要である。
【００６３】
ＦｃＲｎの全体構造は、クラスＩ分子の構造と類似している。α−１およびα−２の領域は、ＭＨＣ  Ｉ分子のペプチドのクレフトに非常によく似た２つの逆平行αヘリックスで覆われた単一のβシートを形成する８つの逆平行鎖で構成されるプラットフォームに似ている。Ｐｒｏ１６２の存在によって導入されたヘリックスの切断によるα２ヘリックスのＣ末端部分の屈曲とα−１の全体的な再配置がゆえ、ＦｃＲｎヘリックスは近接し、ペプチド結合を遮断している。ＦｃＲｎのＡｒｇ１６４の側鎖も、ペプチドＮ末端とＭＨＣポケットとの潜在的な相互作用を遮断する。さらに、α−１ヘリックスとα−２ヘリックスとの間の疎水性相互作用および塩橋も、溝の閉鎖に寄与する場合がある。したがって、ＦｃＲｎは抗原提示に関与せず、ペプチドのクレフトは空である。
【００６４】
ＦｃＲｎはＩｇＧと結合し、母体の体内循環から胎盤の合胞体芽細胞を通して胎児の循環にＩｇＧを輸送し、成人ではＩｇＧが分解されないように保護する。ホメオスタシスに加えて、ＦｃＲｎは組織内でのＩｇＧのトランスサイトーシスを制御する。ＦｃＲｎは、上皮細胞、内皮細胞、肝細胞に局在している。
【００６５】
ＨＳＡはＦｃＲｎに結合し、ＩｇＧとの三分子複合体を形成する。アルブミンおよびＩｇＧは、いずれもＦｃＲｎ上の異なる部位に非協調的に結合する。ヒトＦｃＲｎのセファロースＨＳＡおよびセファロースｈＩｇＧへの結合はｐＨ依存的であって、ｐＨ５で最大であり、ｐＨ７からｐＨ８で検出不能である。ＦｃＲｎがＩｇＧに結合するのと同じようにｐＨ依存的にアルブミンに結合するという観察結果は、アルブミンがＦｃＲｎと相互作用することで分解から保護される作用機序がＩｇＧの場合の作用機序と同一であり、同じようにＦｃＲｎとのｐＨ感受性の相互作用によるものであることを示唆している。表面プラズモン共鳴を使用して、固定化された可溶性ｈＦｃＲｎ、ＦｃＲｎおよびアルブミンを結合する個々のＨＳＡドメインの能力を測定したところ、ＩｇＧ結合部位とは異なる部位で、ｐＨ依存的にアルブミンのＤ  ＩＩＩドメインを介して相互作用することが明らかになっている（Chaudhury, C. et al., Biochemistry, 45:4983-90, 2006）。
【００６６】
改変ポリペプチドは補体Ｃ５または血清アルブミンに特異的に結合する
本明細書に記載されるのは、補体成分Ｃ５または血清アルブミンに結合するか、そうでなければ会合することができるＩｇ配列、例えばＩｇ可変ドメイン配列を有する改変ポリペプチドである。本明細書に記載の改変ポリペプチドは、改変ポリペプチドが血清アルブミン分子に結合またはそうでなければ会合する場合、ＦｃＲｎへの血清アルブミン分子の結合が、ポリペプチドが結合していない場合の血清アルブミン分子のＦｃＲｎへの結合と比較して大幅に低減または阻害されることがないような状態で、血清アルブミンに特異的に結合することができる。本実施形態では、「大幅に低減または阻害することがない」とは、（例えば、ＳＰＲなどの適切なアッセイを使用して測定される）ＦｃＲｎに対する血清アルブミンの結合親和性が、５０％を超えて、あるいは３０％を超えて、あるいは１０％を超えて、あるいは５％を超えて減ることがないか、まったく減らないことを意味する。本実施形態において、「大幅に低減または阻害することがない」とは、血清アルブミン分子の半減期が大幅に短縮されないことも意味する。特に、改変ポリペプチドは、血清アルブミンのＦｃＲｎへの結合に関与しない血清アルブミン上のアミノ酸残基にすることができる。具体的には、改変ポリペプチド、例えば、ドメインＩおよび／またはドメインＩＩの一部を形成する血清アルブミンのアミノ酸残基または配列に結合できる改変ポリペプチドは、血清アルブミンのドメインＩＩＩの一部を形成しない血清アルブミンのアミノ酸残基または配列に結合できる。
【００６７】
いくつかの実施形態では、改変ポリペプチドは、ｓｄＡｂであるか、ｓｄＡｂとしての使用に適しており、それ自体が重鎖可変ドメイン配列または軽鎖可変ドメイン配列の場合もあり、実施形態によっては、重鎖抗体の重鎖可変ドメイン配列である。改変ポリペプチドが、単一ドメインであるか、重鎖抗体からの重鎖可変ドメイン配列である場合、そのような配列を、ＶＨＨ抗体またはＶＨＨ抗体、ＶＨＨ抗体フラグメントまたはＶＨＨ抗体フラグメントもしくはＶＨＨドメインまたはＶＨＨドメインと呼ぶ場合もある。
【００６８】
「重鎖抗体」とは、２つの重鎖からなり、従来の抗体に見られる２つの軽鎖を欠く抗体をいう。ラクダ科動物（生物学でいうラクダ科（Camelidae）のメンバーであり、ラクダ亜目（Tylopoda）のうち生存している唯一の科；現存のラクダ科動物には、ヒトコブラクダ、フタコブラクダ、野生または野生に返ったラクダ、ラマ、アルパカ、ビクーナ、グアナコスが含まれる）は、単鎖ＶＨＨ抗体を持つ唯一の哺乳動物である。ラクダ科動物の抗体の約５０％は重鎖抗体であり、残りの５０％は通常または従来の哺乳類の重鎖／軽鎖抗体タイプである。
【００６９】
「ＶＨＨドメイン」とは、天然に存在する重鎖抗体にある可変ドメインをいい、従来の４本鎖抗体に存在する重鎖可変ドメイン（本明細書では「ＶＨドメイン」と呼ぶ）および従来の４本鎖抗体に存在する軽鎖可変ドメイン（本明細書では「ＶＬドメイン」と呼ばれる）とは区別される。
【００７０】
ＶＨＨドメインは、単離されたＶＨＨドメイン（のみならず、ＶＨＨドメインを基本とし、、天然に存在するＶＨＨドメインと同じ構造的な特徴および機能特性を持つｓｄＡｂ）およびＶＨＨドメインを含むタンパク質を、機能性抗原結合ドメインまたはタンパク質として使用するのに非常に都合のよいものにする特有の構造的な特徴と機能特性を多く兼ね備えている。例えば、ＶＬなしで抗原に結合するＶＨＨドメインやｓｄＡｂは、単一の比較的小さい機能性抗原結合構造単位、ドメインまたはタンパク質として機能することができる。これらの分子は小さいため、ＶＨＨドメインは従来の４本鎖抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインとは区別される。ＶＨＨドメインおよびｓｄＡｂを単一の抗原結合タンパク質として、あるいは抗原結合ドメインとして（例えば、より大きなタンパク質またはポリペプチドの一部として）使用すると、従来のＶＨドメインならびにＶＬドメインおよびｓｃＦｖまたは従来の抗体フラグメント（ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントなど）にはない大きな利点が多数もたらされる。例えば、高い親和性と高い選択性で抗原を結合するのに必要なのは単一のドメインだけであるため、２つの別個のドメインが存在する必要はなく、これらの２つのドメインを（例えばｓｃＦｖを用いる場合のように特定のリンカーを使用して）特定の空間的コンフォメーションおよび構成で確実に存在させる必要もない。ＶＨＨドメインおよびｓｄＡｂは単一の遺伝子からも発現させることが可能であり、翻訳後の折りたたみや修飾を必要としない。ＶＨＨドメインおよびｓｄＡｂは、容易に多価形式や多重特異性の形式に設計できる。ＶＨＨドメインおよびｓｄＡｂは非常に溶解性が高くもあり、凝集する傾向がなく（Ward, E. et al., Nature, 341:544-6, 1989）、熱、ｐＨ、プロテアーゼ、その他の変性剤または変成条件に対して非常に安定している（Ewert, S. et al., Biochemistry, 41:3628-36, 2002）。ＶＨＨドメインおよびｓｄＡｂは、生産に必要な規模であっても、比較的簡単かつ安価に調製できる。例えば、ＶＨＨドメイン、ｓｄＡｂ、ＶＨＨドメインまたはｓｄＡｂを含むポリペプチドは、従来技術で知られている方法による微生物発酵を使用して産生でき、たとえば従来の抗体フラグメントのように哺乳類発現系の使用を必要としない。ＶＨＨドメインおよびｓｄＡｂは、従来の４本鎖抗体およびその抗原結合フラグメントと比較して比較的小さく（約１５ｋＤａすなわち従来のＩｇＧの１０分の１）、したがって、（固形腫瘍および他の密度の高い組織を含むがこれらに限定されるものではない）組織への進入性が高い。ＶＨＨドメインおよびｓｄＡｂは、（例えばＣＤＲ３ループが拡張されているため）いわゆる「キャビティ結合」特性を示すことができ、従来の４本鎖抗体およびその抗原結合フラグメントにはアクセスできない標的およびエピトープにアクセスすることができる。ＶＨＨドメインおよびｓｄＡｂは、例えば、酵素を阻害できることが示されている（国際公開第ＷＯ９７／４９８０５号、Transue, T. et al., Proteins, 32:515-22, 1998; Lauwereys, M. et al., EMBO J., 17:3512-20, 1998）。
【００７１】
本明細書で使用する場合、「単一ドメイン抗体」または「ｓｄＡｂ」という用語は、単一の単量体可変抗体ドメインからなる抗体またはそのフラグメントである。特定の生物源または特定の調製方法に限定されるものではない。ｓｄＡｂは、例えば、（１）天然に存在する重鎖抗体のＶＨＨドメインを分離する、（２）天然に存在するＶＨＨドメインをコードするヌクレオチド配列を発現させる、（３）天然に存在するＶＨＨドメインの「ヒト化」またはそのようなヒト化ＶＨＨドメインをコードする核酸の発現、（４）任意の動物種、特にヒトなどの哺乳動物種に由来する、天然に存在するＶＨドメインの「ラクダ化」またはそのようなラクダ化ＶＨドメインをコードする核酸の発現、（５）「ドメイン抗体」（「Ｄａｂ」）の「ラクダ化」またはそのようなラクダ化ＶＨドメインをコードする核酸の発現、（６）改変ポリペプチドまたは融合タンパク質を調製するための合成または半合成技術の使用、（７）核酸合成のための技術を使用してｓｄＡｂをコードする核酸を調製後、得られた核酸の発現および／または（８）上記の任意の組み合わせによって得ることができる。
【００７２】
本明細書に記載の改変ポリペプチドまたは融合タンパク質は、例えば、天然に存在するＶＨＨ配列のアミノ酸配列の１つ以上のアミノ酸残基を、ヒト由来のＶＨドメインの対応する位置に生じる１つまたは複数のアミノ酸残基で置換することなどによって「ヒト化」された天然に存在するＶＨＨドメインのアミノ酸配列を有することができる。
【００７３】
本明細書に記載の改変ポリペプチドまたは融合タンパク質は、例えば、天然に存在するＶＨ配列のアミノ酸配列の１つ以上のアミノ酸残基を、例えばラクダ化抗体のＶＨＨドメインの対応する位置に生じる１つまたは複数のアミノ酸残基で置換することなどによって「ラクダ化」された天然に存在するＶＨドメインのアミノ酸配列を有することができる。これは、従来技術において知られている方法で実行することができる。そのようなラクダ化は、ＶＨ−ＶＬ界面およびいわゆる「ラクダ科ホールマーク残基」（国際公開第ＷＯ９４／０４６７８号）に存在するアミノ酸位置で優先的に起こり得る。ラクダ化配列を作製または設計するための親配列または出発材料として使用されるＶＨドメインまたは配列は、例えば、哺乳動物由来のＶＨ配列、実施形態によってはヒトのＶＨ配列であってもよい。しかしながら、そのようなラクダ化配列は、従来技術において知られている任意の適切な方法で得ることができるため、天然に存在する親ＶＨドメインを含むポリペプチドを使用して得られたポリペプチドに厳密に限定されるものではない。
【００７４】
「ヒト化」および「ラクダ化」はどちらも、それぞれ天然に存在するＶＨＨドメインまたはＶＨドメインをコードするヌクレオチド配列を準備した後、当業者に知られた方法で、新たなヌクレオチド配列がそれぞれヒト化またはラクダ化配列をコードするように、ヌクレオチド配列の１つ以上のコドンを当業者に既知の方法で変更することによって実行することができる。また、天然に存在するＶＨＨドメインまたはＶＨドメインのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列に基づいて、所望のヒト化またはラクダ化配列をコードするヌクレオチド配列を、従来技術において知られている核酸合成の技術を使用して、de novoで設計および合成することができ、その後、このようにして得られたヌクレオチド配列を、従来技術において知られている方法で発現させることができる。
【００７５】
いくつかの実施形態では、本開示は、エクリズマブと同一のヒトＣ５上のエピトープに特異的に結合する改変ポリペプチドまたはＣ５からＣ５ａおよびＣ５ｂへの切断を妨げるＣ５上のエピトープに結合する改変ポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号１〜１２のアミノ酸配列またはそれらのフラグメントのうちのいずれか１つを含む、ヒト補体成分Ｃ５に特異的に結合する改変ポリペプチドを提供する。他の実施形態では、本開示は、配列番号１〜１２のアミノ酸配列のうちのいずれか１つと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する、ヒト補体成分Ｃ５に特異的に結合する改変ポリペプチドを提供する。他の実施形態では、本開示は、配列番号１〜１２のアミノ酸配列のうちのいずれか１つと少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有する、ヒト補体成分Ｃ５に特異的に結合する改変ポリペプチドを提供する。例えば、一実施態様では、改変ポリペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列または配列番号１に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を有する。もうひとつの実施形態では、改変ポリペプチドは、配列番号２に記載のアミノ酸配列または配列番号２に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を有する。もうひとつの実施形態では、改変ポリペプチドは、配列番号３に記載のアミノ酸配列または配列番号３に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を有する。もうひとつの実施形態では、改変ポリペプチドは、配列番号４に記載のアミノ酸配列または配列番号４に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を有する。もうひとつの実施形態では、改変ポリペプチドは、配列番号５に記載のアミノ酸配列または配列番号５に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を有する。もうひとつの実施形態では、改変ポリペプチドは、配列番号６に記載のアミノ酸配列または配列番号６に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を有する。もうひとつの実施形態では、改変ポリペプチドは、配列番号７に記載のアミノ酸配列または配列番号７に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を有する。もうひとつの実施形態では、改変ポリペプチドは、配列番号８に記載のアミノ酸配列または配列番号８に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を有する。もうひとつの実施形態では、改変ポリペプチドは、配列番号９に記載のアミノ酸配列または配列番号９に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を有する。もうひとつの実施形態では、改変ポリペプチドは、配列番号１０に記載のアミノ酸配列または配列番号１０に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を有する。もうひとつの実施形態では、改変ポリペプチドは、配列番号１１に記載のアミノ酸配列または配列番号１１に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を有する。もうひとつの実施形態では、改変ポリペプチドは、配列番号１２に記載のアミノ酸配列または当該配列と少なくとも９０％同一の配列を有する。
【００７６】
もうひとつの実施形態では、配列番号１〜１２およびそれらのフラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、ヒト補体成分Ｃ５に結合する改変ポリペプチドが提供される。例えば、一実施態様では、改変ポリペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる。もうひとつの実施形態では、改変ポリペプチドは、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる。もうひとつの実施形態では、改変ポリペプチドは、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる。もうひとつの実施形態では、改変ポリペプチドは、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなる。もうひとつの実施形態では、改変ポリペプチドは、配列番号５に記載のアミノ酸配列からなる。もうひとつの実施形態では、改変ポリペプチドは、配列番号６に記載のアミノ酸配列からなる。もうひとつの実施形態では、改変ポリペプチドは、配列番号７に記載のアミノ酸配列からなる。もうひとつの実施形態では、改変ポリペプチドは、配列番号８に記載のアミノ酸配列からなる。もうひとつの実施形態では、改変ポリペプチドは、配列番号９に記載のアミノ酸配列からなる。もうひとつの実施形態では、改変ポリペプチドは、配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなる。もうひとつの実施形態では、改変ポリペプチドは、配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなる。もうひとつの実施形態では、改変ポリペプチドは、配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなる。
【００７７】
もうひとつの実施形態では、本開示は、ヒト補体成分Ｃ５に特異的に結合する改変ポリペプチドであって、３つの相補性決定領域すなわちＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ＣＤＲ１は配列番号１３〜１７のアミノ酸配列のうちのいずれか１つを含むか、配列番号１３〜１７と少なくとも９０％同一の配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号１８または１９のアミノ酸配列を有するか、配列番号１８または１９と少なくとも９０％同一の配列を含み、ＣＤＲ３は、配列番号２０または２１のアミノ酸配列を有するか、配列番号２０または２１と少なくとも９０％同一の配列を有する改変ポリペプチドを提供する。
【００７８】
他の実施形態では、本開示は、配列番号２２〜３４のアミノ酸配列またはそれらのフラグメントのうちのいずれか１つを含む、ヒト血清アルブミンに特異的に結合する改変ポリペプチドを提供する。他の実施形態では、本開示は、配列番号２２〜３４のアミノ酸配列のうちのいずれか１つと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する、ヒト血清アルブミンに特異的に結合する改変ポリペプチドを提供する。他の実施形態では、配列番号２２〜３４のアミノ酸配列のうちのいずれか１つと少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有する、ヒト血清アルブミンに特異的に結合する改変ポリペプチドを提供する。例えば、一実施態様では、改変ポリペプチドは、配列番号２２に記載のアミノ酸配列または配列番号２２に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を有する。もうひとつの実施形態では、改変ポリペプチドは、配列番号２３に記載のアミノ酸配列または配列番号２３に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を有する。もうひとつの実施形態では、改変ポリペプチドは、配列番号２４に記載のアミノ酸配列または配列番号２４に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を有する。もうひとつの実施形態では、改変ポリペプチドは、配列番号２５に記載のアミノ酸配列または配列番号２５に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を有する。もうひとつの実施形態では、改変ポリペプチドは、配列番号２６に記載のアミノ酸配列または配列番号２６に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を有する。もうひとつの実施形態では、改変ポリペプチドは、配列番号２７に記載のアミノ酸配列または配列番号２７に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を有する。もうひとつの実施形態では、改変ポリペプチドは、配列番号２８に記載のアミノ酸配列または配列番号２８に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を有する。もうひとつの実施形態では、改変ポリペプチドは、配列番号２９に記載のアミノ酸配列または配列番号２９に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を有する。もうひとつの実施形態では、改変ポリペプチドは、配列番号３０に記載のアミノ酸配列または配列番号３０に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を有する。もうひとつの実施形態では、改変ポリペプチドは、配列番号３１に記載のアミノ酸配列または配列番号３１に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を有する。もうひとつの実施形態では、改変ポリペプチドは、配列番号３２に記載のアミノ酸配列または配列番号３２に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を有する。もうひとつの実施形態では、改変ポリペプチドは、配列番号３３に記載のアミノ酸配列または配列番号３３に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を有する。もうひとつの実施形態では、改変ポリペプチドは、配列番号３４に記載のアミノ酸配列または配列番号３４に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を有する。
【００７９】
もうひとつの実施形態では、ヒト血清アルブミンに特異的に結合する改変ポリペプチドは、配列番号２２〜３４およびそれらのフラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。例えば、一実施態様では、改変ポリペプチドは、配列番号２２に記載のアミノ酸配列からなる。もうひとつの実施形態では、改変ポリペプチドは、配列番号２３に記載のアミノ酸配列からなる。もうひとつの実施形態では、改変ポリペプチドは、配列番号２４に記載のアミノ酸配列からなる。もうひとつの実施形態では、改変ポリペプチドは、配列番号２５に記載のアミノ酸配列からなる。もうひとつの実施形態では、改変ポリペプチドは、配列番号２６に記載のアミノ酸配列からなる。もうひとつの実施形態では、改変ポリペプチドは、配列番号２７に記載のアミノ酸配列からなる。もうひとつの実施形態では、改変ポリペプチドは、配列番号２８に記載のアミノ酸配列からなる。もうひとつの実施形態では、改変ポリペプチドは、配列番号２９に記載のアミノ酸配列からなる。もうひとつの実施形態では、改変ポリペプチドは、配列番号３０に記載のアミノ酸配列からなる。もうひとつの実施形態では、改変ポリペプチドは、配列番号３１に記載のアミノ酸配列からなる。もうひとつの実施形態では、改変ポリペプチドは、配列番号３２に記載のアミノ酸配列からなる。もうひとつの実施形態では、改変ポリペプチドは、配列番号３３に記載のアミノ酸配列からなる。もうひとつの実施形態では、改変ポリペプチドは、配列番号３４に記載のアミノ酸配列からなる。
【００８０】
もうひとつの実施形態では、本開示は、ヒト血清アルブミンに特異的に結合する改変ポリペプチドであって、３つの相補性決定領域すなわちＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ＣＤＲ１は配列番号３５〜４３のアミノ酸配列のうちのいずれか１つを含むか、配列番号３５〜４３と少なくとも９０％同一の配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号４４〜５１のアミノ酸配列のうちのいずれか１つを含むか、配列番号４４〜５１と少なくとも９０％同一の配列を含み、ＣＤＲ３は、配列番号５２〜６３のアミノ酸配列のうちのいずれか１つを含むか、配列番号５２から６３と少なくとも９０％同一の配列を有する改変ポリペプチドを提供する。
【００８１】
本明細書で開示する改変ポリペプチドは、例えば、Ａｌｂ１（AVQLVESGGG LVQPGNSLRL SCAASGFTFR SFGMSWVRQA PGKEPEWVSS ISGSGSDTLY ADSVKGRFTI SRDNAKTTLY LQMNSLKPED TAVYYCTIGG SLSRSSQGTQ VTVSS；配列番号１４９）と同じ、ヒト血清アルブミン上のエピトープに特異的に結合することができる。他の実施形態では、改変ポリペプチドは、Ａｌｂ１のヒト血清アルブミンへの結合を競合的に阻害する。
【００８２】
改変ポリペプチドがＩｇを含む場合、Ｉｇ可変ドメインなどのＩｇの適切なフラグメントも、完全なＩｇの代わりに使用することができる。
【００８３】
所与の免疫グロブリン可変ドメイン内からＣＤＲを同定する方法は、従来技術において知られている（Wu, T. & Kabat, E., J. Exp. Med., 132:211-50, 1970; Clothia, C. et al., Nature, 342:877-83, 1989; Al-Lazikani, B. et al., J. Mol. Biol., 273:927-48, 1997; and Ofran, Y. et al., J. Immunol., 181:6230-35, 2008）。
【００８４】
補体成分Ｃ５および血清アルブミンに特異的に結合する融合タンパク質
本明細書に記載されるのは、アルブミンおよび補体成分Ｃ５に特異的に結合する改変ポリペプチドを含む融合タンパク質であって、ここでの改変ポリペプチドは直接融合されるか、１つ以上の適切なリンカーまたはスペーサーを介して結合される。本明細書で使用する場合、「ペプチドリンカー」という用語は、融合タンパク質の改変ポリペプチド間に挿入または含まれる１つ以上のアミノ酸残基をいう。ペプチドリンカーは、例えば、融合タンパク質の改変ポリペプチド間の分節部分に、配列レベルで挿入または含めることができる。リンカーにおけるアミノ酸残基の同一性と配列は、望ましい二次構造によって異なる。例えば、グリシン、セリン、アラニンは、最大限の柔軟性を持つリンカーに有用である。どのアミノ酸残基も、所望の特性によって必要に応じてより大きなペプチドリンカーを構築するために他のアミノ酸残基と同一であっても異なっていてもよい１つ以上の他のアミノ酸残基と組み合わせたリンカーと見なすことができる。他の実施形態では、リンカーは、GGGGAGGGGAGGGGS（配列番号１０２）である。他の実施形態では、リンカーは、GGGGSGGGGSGGGGS（配列番号１０３）である。本明細書に記載の融合タンパク質の作製に適した別のペプチドリンカーとして、例えば、G4S（配列番号１０４）、(G4S)2（配列番号１０５）、(G4S)3（配列番号１０６）、(G4S)4（配列番号１０７）、(G4S)5（配列番号１０８）、(G4S)6（配列番号１０９）、(EAAAK)3（配列番号１１０）、PAPAP（配列番号１１１）、G4SPAPAP（配列番号１１２）、PAPAPG4S（配列番号１１３）、GSTSGKSSEGKG（配列番号１１４）、(GGGDS)2（配列番号１１５）、(GGGES)2（配列番号１１６）、GGGDSGGGGS（配列番号１１７）、GGGASGGGGS（配列番号１１８）、GGGESGGGGS（配列番号１１９）、ASTKGP（配列番号１２０）、ASTKGPSVFPLAP（配列番号１２１）、G3P（配列番号１２２）、G7P（配列番号１２３）、PAPNLLGGP（配列番号１２４）、G6（配列番号１２５）、G12（配列番号１２６）、APELPGGP（配列番号１２７）、SEPQPQPG（配列番号１２８）、(G3S2)3（配列番号１２９）、GGGGGGGGGSGGGS（配列番号１３０）、GGGGSGGGGGGGGGS（配列番号１３１）、(GGSSS)3（配列番号１３２）、(GS4)3（配列番号１３３）、G4A(G4S)2（配列番号１３４）、G4SG4AG4S（配列番号１３５）、G3AS(G4S)2（配列番号１３６）、G4SG3ASG4S（配列番号１３７）、G4SAG3SG4S（配列番号１３８）、(G4S)2AG3S（配列番号１３９）、G4SAG3SAG3S（配列番号１４０）、G4D(G4S)2（配列番号１４１）、G4SG4DG4S（配列番号１４２）、(G4D)2G4S（配列番号１４３）、G4E(G4S)2（配列番号１４４）、G4SG4EG4S（配列番号１４５）および(G4E)2G4S（配列番号１４６）があげられる。当業者は、例えば、翻訳後修飾、例えばグリコシル化、例えばキシロシル化を低減または排除するために、リンカーを選択することができる。実施形態によっては、融合タンパク質は、少なくとも２つのｓｄＡｂ、Ｄａｂ、ＶＨＨ抗体、ＶＨＨ抗体フラグメントまたはそれらの組み合わせを含み、ｓｄＡｂ、Ｄａｂ、ＶＨＨ抗体またはＶＨＨ抗体フラグメントの少なくとも１つはアルブミンに対するものであり、ｓｄＡｂ、Ｄａｂ、ＶＨＨ抗体またはＶＨＨ抗体フラグメントのうちの１つは補体成分Ｃ５に対するものであるため、得られる融合タンパク質は多価または多重特異性になる。結合ドメインまたは部分は、例えば、ＨＳＡ、カニクイザル血清アルブミン、ヒトＣ５および／またはカニクイザルＣ５に対するものにすることができる。
【００８５】
いくつかの実施形態では、融合タンパク質のアルブミン結合ドメインのＣ末端残基は、補体成分Ｃ５結合ドメインのＮ末端残基に直接またはペプチドを介して融合することができる。他の実施形態では、融合タンパク質の補体成分Ｃ５結合ドメインのＣ末端残基は、アルブミン結合ドメインのＮ末端残基に直接またはペプチドを介して融合することができる。
【００８６】
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１〜１２のアミノ酸配列またはそれらのフラグメントを含む補体成分Ｃ５結合を含み、ヒト血清アルブミンに特異的に結合するポリペプチドは、配列番号２２〜３４のアミノ酸配列またはそれらのフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、配列番号１〜１２のいずれかに記載のアミノ酸配列に由来し、第２のポリペプチドは、配列番号２２〜３４のいずれかに記載のアミノ酸配列に由来する。ヒト補体成分Ｃ５結合ドメインは、例えば、配列番号５または１１のアミノ酸配列を有することができ、アルブミン結合ドメインは、例えば、配列番号２６のアミノ酸配列を有することができる。もうひとつの実施形態では、本開示は、配列番号６４〜９５のアミノ酸配列のうちのいずれか１つを有する融合タンパク質を提供する。もうひとつの実施形態では、本開示は、配列番号９３のアミノ酸配列を有する融合タンパク質を提供する。もうひとつの実施形態では、本開示は、配列番号７７のアミノ酸配列を有する融合タンパク質を提供する。もうひとつの実施形態では、本開示は、配列番号９６〜１０１のアミノ酸配列のうちのいずれか１つを有する融合タンパク質を提供する。
【００８７】
本明細書で開示する融合タンパク質は、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する少なくとも１つの核酸分子を宿主細胞で発現させることにより作製することができる。宿主細胞は、哺乳類由来であってもよいし、植物または微生物由来であってもよい。既知の哺乳動物宿主細胞に加えて、酵母宿主細胞、例えば、Pichia pastoris、Saccharomyces cerevisiaeおよび／または植物宿主細胞を使用することができる。
【００８８】
補体Ｃ５または血清アルブミンもしくはその融合タンパク質に特異的に結合するポリペプチドを含む治療用組成物およびその投与
もうひとつの実施形態では、本開示は、本明細書に開示されるアミノ酸配列を有するか、そのようなアミノ酸配列からなる改変ポリペプチドを提供する。もうひとつの実施形態では、本開示は、任意に１つ以上の適切なリンカーまたはスペーサーを介して、少なくとも１つの治療部分または標的部分に結合される本開示の少なくとも１つの改変ポリペプチドを含むか、少なくとも１つのそのような改変ポリペプチドからなる融合タンパク質、多価の多重特異性融合タンパク質を提供する。
【００８９】
また、本開示は、本開示の改変ポリペプチド、またはそのような改変ポリペプチドを含むかそのような改変ポリペプチドをからなる融合タンパク質および多価の多重特異性融合タンパク質の治療的使用、あるいは、そのような改変ポリペプチド、融合タンパク質、または多価の多重特異性融合タンパク質を含む医薬組成物に関する。
【００９０】
いくつかの実施形態では、治療部分または標的部分は、例えば、少なくとも１つのｓｄＡｂ、Ｄａｂ、ＶＨＨまたはそれらのフラグメントを含むことができる。実施形態によっては、本開示の改変ポリペプチドは、少なくとも２つのｓｄＡｂ、Ｄａｂ、ＶＨＨ抗体、ＶＨＨ抗体断片またはそれらの組み合わせを含む多価および／または多重特異性融合タンパク質である。
【００９１】
いくつかの実施形態では、改変ポリペプチド、融合タンパク質、または多価の多重特異性融合タンパク質は、マウス血清アルブミンに対する親和性よりも高い、ＨＳＡに対する親和性を示す。実施形態によっては、改変ポリペプチド、融合タンパク質または多価の多重特異性融合タンパク質は、マウス血清アルブミンに対する親和性よりも高い、カニクイザル血清アルブミンに対する親和性を示す。他の実施形態では、改変ポリペプチド、融合タンパク質、または多価の多重特異性融合タンパク質は、カニクイザル血清アルブミンに対する親和性よりも高い、ＨＳＡに対する親和性を示す。
【００９２】
いくつかの実施形態では、改変ポリペプチド、融合タンパク質、または多価の多重特異性融合タンパク質は、マウスＣ５に対する親和性よりも高い、ヒトＣ５に対する親和性を示す。実施形態によっては、改変ポリペプチド、融合タンパク質、または多価の多重特異性融合タンパク質は、マウスＣ５に対する親和性よりも高い、カニクイザルＣ５に対する親和性を示す。他の実施形態では、改変ポリペプチド、融合タンパク質、または多価の多重特異性融合タンパク質は、カニクイザルＣ５に対する親和性よりも高い、ヒトＣ５に対する親和性を示す。
【００９３】
本明細書に記載の改変ポリペプチド、融合タンパク質、または多価の多重特異性融合タンパク質は、例えば、抗体治療薬または他の治療薬と比較した場合に、有効性、バイオアベイラビリティ、半減期または他の治療上望ましい特性の向上などの改善された治療特性を示すことができる。一実施形態では、本開示の融合タンパク質は、本明細書に開示される少なくとも１種の改変ポリペプチドおよび少なくとも１種の治療部分または標的部分を含む。そのような融合タンパク質において、融合タンパク質は、例えば、治療結合ドメインだけの場合と比較して、半減期が長くなり得る。一般に、そのような融合タンパク質は、対応する治療部分または標的部分だけの場合よりも半減期が少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、または少なくとも５倍、または少なくとも１０倍、または２０倍を超える。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、対応する治療部分または標的部分と比較して、半減期が、１時間を超えて、２時間を超えて、６時間を超えてまたは１２時間を超えて長くなる。他の実施形態では、融合タンパク質の半減期は、１時間を上回る、２時間を上回る、６時間を上回る、１２時間を上回る、約１日、約２日、約１週間、約２週間、約３週間または２か月以内である。
【００９４】
本明細書で使用する場合、「半減期」という用語は、例えば、生理学的な作用機序による分子の分解および／または分子のクリアランスまたは分離の結果として、改変ポリペプチド、融合タンパク質または多価の多重特異性融合タンパク質の血清濃度がin vivoで５０％低下するのにかかる時間をいう。薬物動態分析および半減期を決定するための方法は、当業者に知られている。
【００９５】
１種類以上のＶＨＨ抗体を含む多価の多重特異性融合タンパク質およびそれらの調製物の一般的な説明は知られている（Els Conrath, K. et al., J. Biol. Chem., 276:7346-50, 2001; Muyldermans, S., J. Biotechnol., 74:277-302 2001、国際公開第ＷＯ９６／３４１０３号、同第ＷＯ９９／２３２２１号、同第ＷＯ０４／０４１８６５号）。
【００９６】
本明細書に開示される改変ポリペプチド、融合タンパク質、多価の多重特異性融合タンパク質は、例えば、発現ベクターなどの１つ以上の要素を含むコンストラクトから発現または会合させることができる（国際出願公開第ＷＯ０４／０４１８６２号）。
【００９７】
本明細書に開示される改変ポリペプチド、融合タンパク質、多価の多重特異性融合タンパク質は、例えば、本明細書に開示される改変ポリペプチド、融合タンパク質、多価の多重特異性融合タンパク質をコードする核酸分子を含む単離された宿主細胞で発現させることができる。適切な宿主細胞には、哺乳動物および酵母細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００９８】
本明細書に開示される治療用組成物または医薬組成物は、本明細書に開示される１種類以上の改変ポリペプチド、融合タンパク質または多価の多重特異性融合タンパク質を、治療有効量で、投与様式に合うように選択される薬学的または生理学的に許容される製剤材との混合物で含むことができる。許容可能な製剤材料は、使用される投与量および濃度でレシピエントに無毒であると好ましい。
【００９９】
許容可能な製剤材料を使用して、例えば、組成物のｐＨ、浸透圧、粘度、透明度、色、等張性、臭気、無菌性、安定性、溶解または放出の速度、吸着または進入を変更、維持または保持することができる。許容可能な製剤材料としては、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジンなど）、抗菌剤、酸化防止剤（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素ナトリウムなど）、緩衝剤（ホウ酸塩、重炭酸塩、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩または他の有機酸など）、バルク剤（マンニトールまたはグリシンなど）、キレート剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など）、錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、βシクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル−βシクロデキストリンなど）、充填剤、単糖類、二糖類および他の炭水化物（グルコース、マンノースまたはデキストリンなど）、タンパク質（血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなど）、着色剤、香料、希釈薬剤、乳化剤、親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン（ナトリウムなど）、防腐剤（塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸または過酸化水素など）、溶媒（グリセリン、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなど）、糖アルコール（マンニトールまたはソルビトールなど）、懸濁化剤、界面活性剤または湿潤剤（プルロニクス、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０などのポリソルベート、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロールまたはチロキサパルなど）、安定性向上剤（スクロースまたはソルビトールなど）、等張性向上剤（アルカリ金属ハロゲン化物など、好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウムまたはマンニトールソルビトールなど）、デリバリービヒクル、希釈剤、賦形剤および／または薬学的アジュバント（例えば、内容を本明細書に援用するREMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (18th Ed., A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company 1990および同書の以後の版を参照のこと）があげられるが、これらに限定されるものではない。
【０１００】
当業者であれば、例えば、意図される投与経路、デリバリー形式および所望の投与量に応じて、本明細書に開示される改変ポリペプチド、融合タンパク質または多価の多重特異性融合タンパク質を含む医薬組成物を開発することができる。
【０１０１】
本明細書に開示される改変ポリペプチド、融合タンパク質、多価の多重特異性融合タンパク質は、例えば、半減期が長くなり得るため、いくつかの実施形態では、循環するように投与してもよい。それ自体、改変ポリペプチド、融合タンパク質または多価の多重特異性融合タンパク質が体内循環に入ることができるようにする、静脈内、皮下、注射または注入あるいは他の任意の適切な方法で、投与することができる。そのような医薬組成物の調製は、当業者の知識の範囲内である。
【０１０２】
本明細書に開示される改変ポリペプチド、融合タンパク質、多価の多重特異性融合タンパク質のいずれも、追加の療法と組み合わせて、すなわち他の薬剤と組み合わせて投与することができる。本明細書で使用する場合、「共投与」という用語は、投与計画の一部としての投与を含めて、本明細書に記載の改変ポリペプチド、融合タンパク質、多価の多重特異性融合タンパク質とアジュバントおよび他の薬剤との同時投与、個別投与または逐次投与のいずれかまたはすべてを含む。
【０１０３】
本明細書に記載の医薬組成物は、例えば治療薬のデリバリーを改善するための１種類以上の薬剤を含むことができる。追加の薬剤は、例えば、同時注射可能なものとして共投与が可能である。例えば、ヒアルロン酸を分解する薬剤を本明細書に記載の医薬組成物に含めることができ、またはそのような薬剤を本明細書に記載の医薬組成物と共投与して、例えば投与時に本明細書に記載の治療剤の分散および吸収を促進することができる。そのような薬剤の一例に、組換えヒアルロニダーゼがある。
【０１０４】
医薬組成物は、非経口デリバリー用にも選択することができる。あるいは、組成物は、吸入用または経口などの消化管を介したデリバリー用に選択することができる。そのような医薬組成物の調製は、当業者の知識の範囲内である。
【０１０５】
持続デリバリーまたは制御デリバリー用の製剤を含む製剤をはじめとして、追加の医薬組成物が当業者には明らかであろう。例えば、リポソーム担体、生体侵食性微粒子または多孔性ビーズ、デポー注射を使用して、持続デリバリーまたは制御デリバリー用の製剤を調製する技術は、当業者に知られている。
【０１０６】
また、本開示は、本明細書に開示される改変ポリペプチド、融合タンパク質、多価の多重特異性融合タンパク質を含む治療用キットも包含する。いくつかの実施形態では、キットは、乾燥タンパク質の入った第１の容器と水性製剤の入った第２の容器の両方を含む。他の実施形態では、キットは、シングルおよびマルチチャンバーのプレフィルドシリンジ（例えば、液体シリンジおよびリオシリンジ）を含む。
【０１０７】
また、本開示は、ラベルを含む容器と、本明細書に開示される改変ポリペプチド、融合タンパク質、多価の多重特異性融合タンパク質を含む組成物とを含む製品であって、ラベルが、補体による障害のある患者またはそのような障害が疑われる患者に投与される組成物であることを示す製品を包含する。
【０１０８】
一実施形態では、本開示は、本明細書に開示される改変ポリペプチド、融合タンパク質または多価の多重特異性融合タンパク質を使用して予防または治療できる少なくとも１種の疾患、病状または障害を予防および／または治療するための方法であって、本明細書に開示される改変ポリペプチド、融合タンパク質または多価の多重特異性融合タンパク質を、それを必要とする患者に、治療的有効量または薬学的有効量で投与することを含む方法を提供する。特定の実施形態では、障害は、例えば、関節リウマチ（ＲＡ）、ループス腎炎、喘息、虚血再灌流障害、非定型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）、膜性増殖性糸球体腎炎ＩＩ型（ＤＤＤ）、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）、黄斑変性（例えば、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）など）、ＨＥＬＬＰ症候群、ギランバレー症候群（ＧＢＳ）、ＣＨＡＰＬＥ症候群、重症筋無力症（ＭＧ）、視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、造血幹細胞移植後の血栓性微小血管障害症（ＨＳＣＴ後ＴＭＡ）、骨髄移植後ＴＭＡ（ＢＭＴ後ＴＭＡ）、デゴス病、ゴーシェ病、糸球体腎炎、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、自然流産、寡免疫性の血管炎、表皮水疱症、習慣性流産、多発性硬化症（ＭＳ）、外傷性脳損傷および心筋梗塞、心肺バイパス、血液透析に起因する損傷などの補体による障害である。
【０１０９】
治療的に使用される、本明細書に開示される医薬組成物の有効量は、例えば、治療の内容および目的に依存することになる。当業者であれば、治療のための適切な投与量レベルが、ある程度は、デリバリーされる分子、組成物が使用される適応症、投与経路、患者の大きさ（体重、体表面または臓器の大きさ）および病状（年齢と全身の健康）に依存して変わることを理解できるであろう。
【実施例】
【０１１０】
以下の実施例は、本開示の具体的な実施形態およびその様々な用途の例示である。いずれも説明のみを目的として記載されており、どのような形であろうと本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【０１１１】
実施例１  ラマの免疫化と抗Ｃ５  ＶＨＨファージライブラリの構築
注射による一次注射から開始し、続いて二次のブーストを起こしてラマを免疫した。簡単に説明すると、ヒト補体タンパク質Ｃ５を５００μｇ用いて一次免疫を開始し、その後、２週目（追加免疫１）、４週目（追加免疫２）、８週目（追加免疫３）、１２週目（追加免疫４）に、ヒト補体タンパク質Ｃ５抗原５００μｇでの追加免疫を施した。血清力価をＥＬＩＳＡで測定したところ、力価は追加免疫３の後が最大で、１：１，０００，０００希釈で採血前シグナルよりも１０倍大きいことが明らかになった。追加免疫３の後の血液試料から、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。トリパンブルー染色により、細胞生存率が９８％であることが明らかになった。ＰＢＭＣの単離直後に、ＲＮＡ溶解バッファーで細胞を溶解した。全ＲＮＡをＰＢＭＣから単離し、ラマ重鎖特異的プライマーを使用してｃＤＮＡを合成した。ゲル電気泳動でＶＨ（従来の重鎖）フラグメントからＶＨＨ（重鎖のみ）フラグメントを分離した。これらのＶＨＨフラグメントをｐＡＤＬ−１０ｂ（Antibody Design Labs，カリフォルニア州サンディエゴ）にクローニングし、ＤＮＡライブラリーでＴＧ１細胞を形質転換した。１１４のコロニーを無作為に配列決定したところ、１０１（８９％）の正しい配列が得られた。このライブラリーを掻爬し、２５％グリセロールに懸濁後、−８０℃で保存した。
【０１１２】
実施例２  抗Ｃ５  ＶＨＨドメインのファージディスプレイパニングおよびスクリーニング
抗ヒト補体タンパク質Ｃ５  ＶＨＨドメインライブラリーを含むＴＧ１細胞を、カルベニシリン１００μｇ／ｍＬおよび２％グルコースを含む２×ＹＴ培地で、３７℃で対数期（ＯＤ６００＝０．４〜０．８）まで増殖させた。これらの細胞に、振盪ありまたは振盪なしで、３７℃で３０分間、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージを感染させた。感染細胞を４０００×ｇで１０分間処理してペレット化し、カルベニシリン１００μｇ／ｍＬ、カナマイシン５０μｇ／ｍＬおよび１ｍＭ  ＩＰＴＧを含む２×ＹＴ培地に再懸濁し、３０℃および２５０ｒｐｍでの一晩培養によってバクテリオファージを増殖させた。この一晩培養物を４℃で１０分間、９０００×ｇで遠心し、氷上で１時間インキュベーションすることにより、ファージを１／５容量のＰＥＧ  ＮａＣｌ溶液［２０％ポリエチレングリコール６０００、１．５Ｍ  ＮａＣｌ］で沈降させた。ファージ粒子を４℃で１５分間、９０００×ｇで遠心してペレット化し、上清を廃棄した。ファージ粒子をスーパーブロックブロッキングバッファーに再懸濁し、マイクロ遠心チューブにて７５００×ｇで１０分間の遠心によって細胞片をペレット化した。ファージ粒子を含む上清を新しいチューブに移し、上述したようにしてファージを再沈殿させた。濃縮されたファージ粒子を７０℃で１時間加熱を試みた。加熱前後のファージの力価を、対数期のＴＧ１細胞による感染と、カルベニシリン１００μｇ／ｍＬ、カナマイシン５０μｇ／ｍＬおよび２％グルコースを含有する２×ＹＴ寒天培地への播種によって決定した。
【０１１３】
ヒトとカニクイザルの両方の種に対する反応性を持つ、親和性が揃った抗Ｃ５  ＶＨＨドメインを得るために、ライブラリーの選択基準には、ビオチン化カニクイザル（cyno）補体タンパク質Ｃ５による選択と、等モル量の非ビオチン化ヒト補体タンパク質Ｃ５との競合を含めた。ファージディスプレイＶＨＨライブラリーを、室温で１時間、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２８０ストレプトアビジンで選択解除した。選択解除後のファージ粒子を、ビオチン化カニクイザルＣ５と非ビオチン化ヒトＣ５の等モル溶液でＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２８０ストレプトアビジンを用いて室温で３０分間インキュベーションすることにより、ヒトおよびカニクイザルのＣ５と親和性が一致するように選択した。ＰＢＳＴおよびＰＢＳで５回洗浄後、ＢＳＡを１ｍｇ／ｍＬ含有した０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．２）を使用して、ファージをビーズから溶出した。溶出後の上清をｐＨ８．０の１Ｍ  Ｔｒｉｓで中和した。対数期のＴＧ１細胞に中和後のファージを感染させ、２ＹＴＣＧ培地に播種して、アウトプット力価を測定した。アウトプットとインプットの力価を比較して、濃縮比を計算した。比が大きいほど、Ｃ５特異的クローンをうまく分離できたことを示唆していた。
【０１１４】
個々のクローンを採取し、カルベニシリン１００μｇ／ｍＬおよび２％グルコースを含有する２×ＹＴ培地の９６ウェル深ウェルプレートに接種し、対数期まで増殖させた。細胞にＭ１３Ｋ０７を感染させ、培養上清で個々のＶＨＨドメインをディスプレイするファージ粒子を作るために３０℃で一晩培養した。ストレプトアビジン被覆プレートに捕捉したヒトＣ５を含む４つの９６ウェルプレートでのファージＥＬＩＳＡスクリーニングでは、約６０％の陽性クローンが示唆された。ＣＤＲ  Ｈ３の配列分析に基づいて、７６のクローンのうち７２のユニークなクローンを代表として選択した。これらの代表的なＶＨＨクローンの配列を表１に示す。クローニングの目的で、Ｎ末端とＣ末端のアミノ酸を修飾し、ヒトＶＨ−３生殖細胞のＮ末端とＣ末端のアミノ酸と一致させた。
【０１１５】
本開示の改変ポリペプチドで使用するのに適したアミノ酸配列には、表１に開示するアミノ酸配列またはそれらのフラグメントが含まれる。
【０１１６】
［表１］
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【０１１７】
実施例３  抗Ｃ５  ＶＨＨドメインのクローニングと発現
代表的な抗Ｃ５  ＶＨＨドメインを哺乳動物の発現ベクターにサブクローニングし、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞においてＶＨＨ−Ｈｉｓタグ融合体として発現させた。細胞生存率が５０〜６０％に低下したら、培養上清を回収した。この上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥで還元条件下にて分析した後、クーマシーブリリアントブルーで染色した。Ｏｃｔｅｔ（ForteBio Inc.）装置でバイオレイヤー干渉法を使用して、発現レベルを計算した。ＡＫＴＡ（GE Healthcare）での固定化金属アフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によって、Ｈｉｓ−タグを付加したＶＨＨドメインを培養上清から精製した。
【０１１８】
実施例４  抗Ｃ５  ＶＨＨドメインの結合と機能分析
補体成分Ｃ５に対する結合分析  Ｏｃｔｅｔ（ForteBio Inc.）装置でバイオレイヤー干渉法を使用して、代表的な抗Ｃ５  ＶＨＨドメインの配列を決定し、特徴を解析し、ヒト、カニクイザル（cyno）およびマウスのＣ５タンパク質への結合について評価した。発現させたＶＨＨ−Ｈｉｓドメインの細胞培養上清を２×カイネティクス緩衝液で濃度２０μｇ／ｍＬに標準化し、抗ペンタＨＩＳ（ＨＩＳ１Ｋ）バイオセンサーチップ（ForteBio Inc.）に３００秒間かけて捕捉して、センサーチップを完全に飽和させた。次に、飽和したチップを、別々の実験でそれぞれ６００秒間、２×カイネティクス緩衝液に５０ｎＭの可溶性Ｃ５（ヒト、カニクイザルまたはマウス）を加えた溶液に曝露した後、６００秒間かけて２×カイネティクス緩衝液に解離させた。ヒトのＣ５（ｈＣ５）またはカニクイザルのＣ５（ｃＣ５）に対する結合が認められたＶＨＨドメインには、表１に「＋」の印を示してある。
【０１１９】
Ｃ５拮抗作用の溶血アッセイ  補体古典経路（ＣＣＰ）により活性化した血清への曝露時に溶解した感作ニワトリ赤血球からのヘモグロビンの放出を、溶血アッセイで測定する。Ｈｉｓ−タグを付加したＶＨＨドメインをＥｘｐｉ２９３細胞で発現させた。予備アッセイを使用して機能的抗Ｃ５  ＶＨＨドメインを選択し、これをＩＭＡＣで精製した。１０の精製ＶＨＨドメインを、さまざまな濃度で、感作ニワトリ赤血球のＣＣＰによる溶血を阻害する能力について分析した。
【０１２０】
このアッセイでは、完全溶血には抗体を使用せず、溶血なしの対照には２０ｍＭ  ＥＤＴＡを使用しなかった。濃度の異なる（３２μｇ／ｍＬ〜０．５μｇ／ｍＬ）１０のＶＨＨドメインと抗Ｃ５  ＩｇＧ対照（ｈ５Ｇ１．１、ＢＮＪ４４１およびＥｃ−ＣＨＯと表示）を、０．１ｍＬゼラチンベロナール緩衝生理食塩水（ＧＶＢ＋＋、カタログ番号Ｂ１００、Comptech）（２０％正常ヒト血清（ＮＨＳ）含有）とともに、室温にて３０分間プレインキュベーションした。ニワトリ赤血球（Lampire Biologicals、カタログ番号７２０１４０３）４００μＬを、１ｍＬのＧＶＢ＋＋で４回洗浄し、５×１０７個／ｍＬの細胞を１：５００（ｖ／ｖ）に希釈したウサギ抗ニワトリＩｇＧ（カタログ番号２０３−４１３９、Rockland）とともにインキュベーションして感作ｃＲＢＣを調製し、４℃で１５分間インキュベーションした。細胞をＧＶＢ＋＋で２回洗浄し、最終容積がＧＶＢ＋＋  ３．６ｍＬになるように再懸濁した。感作ｃＲＢＣ（細胞２．５×１０６個）３０μＬを、プレインキュベーションしたヒト血清および抗体に加え、３７℃で３０分間インキュベーションした。細胞を４℃で３分間、１７００×ｇで遠心することによりペレット化し、上清（８５μＬ）を新しい平底９６ウェルプレートに移した。４１５ｎｍで吸光度を測定した。ＶＨＨドメインと対照抗体の各々について、以下のようにして溶血率を計算した。
【０１２１】
［数１］
((A415試料−A415溶血なし)/(A415完全溶血−A415溶血なし))×100
式中、Ａ４１５試料は試料抗体の４１５ｎｍでの吸光度であり、Ａ４１５溶血なしは溶血なしの対照（２０ｍＭ  ＥＤＴＡ）の４１５ｎｍでの吸光度であり、Ａ４１５完全溶血は完全溶血対照の４１５ｎｍでの吸光度である。結果を図１に示す。
【０１２２】
Ｃ５ａの遊離を阻害するＶＨＨドメインの特定  Meso Scale Discovery (MSD)によるイムノアッセイを使用して、ヒトＣ５タンパク質の切断（例えば、ＣＡＰアクチベーターであるザイモサンに結合させた補体の第二経路Ｃ５転換酵素によるＣ５ａの遊離）を測定した。抗Ｃ５−ＶＨＨドメインを前項のようにして発現させて精製し、ｈＣ５ａの放出量を測定することにより、ヒトＣ５タンパク質の切断を遮断する能力について分析した。試料のＶＨＨドメインの最適濃度については、パイロット実験で決定した。試料のＶＨＨドメインと対照抗体（ｈ５Ｇ１．１、Ｎ１９／８、ＢＮＪ４４１およびＥｃ−ＣＨＯ）を、ＧＶＢ＋＋緩衝液（ヒトＣ５タンパク質（最終濃度２５ｎＭ）（CompTech Inc.）、１％ゼラチンおよび２．５ｍＭ  ＮｉＣｌ含有）でに３７℃で３０分間かけて加え、その後使用するまで４℃で保存した。ＭＳＤ高結合９６ウェルプレートに、抗Ｃ５ａ抗体（２μｇ／ｍＬでＢｕｐＨリン酸緩衝生理食塩水（ThermoFisher）に溶解）をコーティングし、１時間インキュベーションした。次に、補体の第二経路を活性化するために、ザイモサンを等割合でＮＨＳに加えた。このザイモサンとＮＨＳの混合物を、プレインキュベーションしておいたＶＨＨ−ｈＣ５溶液に添加し、３７℃でインキュベーションした。フサンＥＤＴＡを加えることで、異なる時点（０分、３０分、６０分および９０分）で反応を停止した。プレートを３６００ｒｐｍで２分間遠心し、上清を新しいポリプロピレンプレートに移した。ブロッカーＡを室温で１時間かけて添加し、コーティングされたＭＳＤプレートへの非特異的結合を遮断した。ＭＳＤプレートを洗浄し、上記の試料の上清を加えた。このプレートを室温で１５分間インキュベーションした。検出抗体ビオチンＡｂ２９４２（Abcam）１μｇ／ｍＬとストレプトアビジン結合スルホタグ０．５μｇ／ｍＬの混合物を調製して各ウェルに加え、室温で３０分間インキュベーションした。ＭＳＤ  ２ｘ読み取り緩衝液を各ウェルに加え、電気化学発光シグナルを測定した。ＭＳＤワークベンチソフトウェアを使用して、生データを分析した。この実験の結果を図２に示す。
【０１２３】
ＬＣＰ０１１５、ＬＣＰ０１４６、ＬＣＰ０２９５、ＬＣＰ０２９６、ＬＣＰ０２９７およびＬＣＰ０３０２がＣ５ａの放出を阻害したことから、その後の特徴の解析に使用した。
【０１２４】
実施例５  Ｂｉａｃｏｒｅによる抗Ｃ５  ＶＨＨドメインのアフィニティ分析
カニクイザルＣ５との交差反応性に基づいて抗Ｃ５  ＶＨＨドメインに優先順位を付け、８例の精製抗Ｃ５  ＶＨＨドメインをＢｉａｃｏｒｅによるアフィニティ分析の対象とした。最初の候補８例のヒトＣ５とカニクイザルＣ５への結合の動力学的パラメーターを表２に示す。８例のアフィニティ分析候補から、５つの抗Ｃ５ドメイン（ＬＣＰ０１１５、ＬＣＰ０１４３、ＬＣＰ０１４６、ＬＣＰ０２９６およびＬＣＰ０３０２）を選択し、ヒトＣ５およびカニクイザルＣ５に対する適合した親和性に基づく以後の分析用に優先順位を付けた。
【０１２５】
［表２］
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【０１２６】
実施例６  抗Ｃ５  ＶＨＨドメインのヒト化
優先順位を付けた５つの抗Ｃ５  ＶＨＨドメイン（ＬＣＰ０１１５、ＬＣＰ０１４３、ＬＣＰ０１４６、ＬＣＰ０２９６およびＬＣＰ０３０２）を、ラマ配列との配列類似性を持つヒト生殖細胞へのＣＤＲ移植によってヒト化した。ＣＤＲは、ＩＭＧＴとＫａｂａｔでの定義の中で、より高いアミノ酸位置の一致率に基づく。ＶＨＨドメインの安定性を維持するために、ラマＦＲ２ホールマーク残基には復帰突然変異を起こさせた。ヒト化バリアントをＥｘｐｉ２９３細胞で発現させ、バイオレイヤー干渉法を用いてヒトＣ５への結合を試験した。
【０１２７】
いくつかのバリアントの選択されたフレームワークに、親ラマ残基への復帰突然変異をさらに導入し、ヒトＣ５に対する親和性を改善した。コンストラクトをＨＥＫ２９３Ｆ細胞で発現させ、バイオレイヤー干渉法により結合について評価した。親和性をさらに最適化するために、いくつかのバリアントでさらに変異を起こし、Ｎ末端をEVQLV（必要な場合、配列番号１４７）にヒト化し、Ｃ末端はWGQGTLVTVSS（必要な場合、配列番号１４８）にヒト化した。優先順位を付けた抗Ｃ５  ＶＨＨの得られた候補を以下の表３に示す。これらの候補のＣＤＲを表４に示す。
【０１２８】
［表３］
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【０１２９】
［表４］
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【０１３０】
ヒト化の評価で選択されたフレームワークに、親ラマ残基への復帰突然変異を導入し、選択されたバリアントの親和力を改善した。復帰突然変異後のバリアントの配列を表５に示す。コンストラクトをＨＥＫ２９３Ｆ細胞で発現させ、バイオレイヤー干渉法により結合について評価した。
【０１３１】
［表５］
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【０１３２】
実施例７  ヒト血清アルブミンに結合するＶＨＨドメインの単離
アルブミンは、血清に豊富に含まれるタンパク質であり、糸球体濾過バリアによる濾過によって除去されないだけの十分な分子量を持つ。細胞内分解による血清からのアルブミン除去は、低ｐＨで生じるＦｃＲｎとアルブミンとの相互作用によって阻害される。この相互作用により、アルブミンＦｃＲｎ複合体が形質膜に戻され、形質膜で血液の中性寄りのｐＨに曝露されると、アルブミンが放出されて血中に戻る。
【０１３３】
抗ＨＳＡ  ＶＨＨを作製するための過程の概要
抗Ｃ５  ＶＨＨドメインおよび抗ＨＳＡ  ＶＨＨドメインについて、免疫したラマのＢ細胞から免疫バイアスＶＨＨ抗ＨＳＡファージディスプレイライブラリを作製した。ＨＳＡに対するエンドポイント力価が１，０００，０００を超えたら、ＰＢＭＣを回収し、ＲＮＡを単離し、ＶＨＨ領域を遺伝的に単離した。実施例２〜４の抗Ｃ５  ＶＨＨドメインで詳細に説明したように、これらの抗ＨＳＡ  ＶＨＨ配列をｐＩＩＩ融合ファージミドにクローニングし、６×１０８個の独立したクローンのライブラリーを得た。標準的なファージディスプレイパニング技術を使用して、ＨＳＡおよびＣＳＡ（カニクイザル血清アルブミン）に対して反応性のＶＨＨドメインを選択した。３ラウンドのパニングの出力を、ＥＬＩＳＡおよびサンガーシーケンスで分析した。並行して、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を使用して、元のライブラリー内の配列の集団、またはパニングによって富化された配列の集団を調べた。合計約１０００個のクローンを分離し、これらの方法を使用して分析した。
【０１３４】
ラマの免疫化とＶＨＨファージライブラリの構築  ラマをＨＳＡで免疫した。一次免疫は、完全フロイントアジュバントと混合した５００μｇの抗原で構成した。２週目、４週目、８週目、１２週目に、不完全フロイントアジュバントで５００μｇの抗原の追加免疫を施した。各追加免疫の約２週間後に、血液サンプルで血清力価をモニターした。血液サンプルをＥＬＩＳＡにより分析し、免疫応答の力価を決定した。抗ＨＳＡ血清力価は、１：１００，０００希釈の事前採血より２０倍高いシグナルで検出されたため、５００ｍＬの作製血を処理して、ＲＮＡの単離およびライブラリー作製用の約７×１０８個のＰＢＭＣを得た。ＰＢＭＣの全ＲＮＡをフェノール／クロロホルム抽出で精製した後、シリカスピンカラムで精製し、ＲＮａｓｅフリー水で全ＲＮＡを溶出した。ＯＤ２６０／２８０比を決定し、アガロースゲル電気泳動により、ＲＮＡの品質を評価した。ラマ重鎖特異的リバースプライマーを使用してｃＤＮＡを合成した。ゲル電気泳動により、ＶＨ（従来の重鎖）フラグメントからＶＨＨ（重鎖のみ）フラグメントを分離した。
【０１３５】
ＶＨＨフラグメントをＳｆｉＩ部位で修飾し、ｐＡＤＬ−１０ｂにクローニングし、ＤＮＡライブラリーをＴＧ１細胞に形質転換した。ライブラリー用に合計６×１０８個の独立したクローンを得た。すべてのクローンを回収し、使用するまで２５％グリセロール中−８０℃で保存した。正しいリーディングフレームを持つインサートの存在、一意性、プライマー配列の存在についての１０５個のクローンの分析によって、ライブラリーの品質を検証した。
【０１３６】
ファージディスプレイのパンおよびスクリーニング  ３．７５×１０１０個の細胞を含む抗ＨＳＡ  ＶＨＨライブラリーのグリセロールストックのアリコートを、２％グルコースおよびカルベニシリン１００μｇ／ｍＬを含有する２×ＹＴ培地で培養した。ＯＤ６００が約０．６になるまで、細胞を約２５０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で増殖させた。ヘルパーファージを感染多重度（ＭＯＩ）２０で加え、培養を振盪せずに３０分間インキュベーションし、続いて３７℃で振盪しながら３０分間インキュベーションした。細胞を回収し、カルベニシリン２５μｇ／ｍＬ、カナマイシン５０μｇ／ｍＬおよび２００μＭ  ＩＰＴＧを追加した２×ＹＴ培地に再懸濁した。培養を３０℃および２５０ｒｐｍで一晩振盪した。培地を遠心分離により清澄化し、１／４量の１０％ＰＥＧ−８０００／２．５Ｍ  ＮａＣｌの添加および氷上での３０分間のインキュベーションによりファージを沈降させた。ＳＬＡ３０００ローターにおいて４５００℃で１５分間、７５００ｒｐｍで遠心することによりファージをペレット化した。ペレットをスーパーブロック（Thermo Scientific、３７５１５）に再懸濁した。
【０１３７】
ファージのアリコートを室温で３０分間Ｍ２８０ストレプトアビジンビーズ（Life Technologies、１１２０５Ｄ）で選択解除し、磁石を使用してビーズを除去し、ファージ含有上清を新しいエッペンドルフチューブに移した。ファージにビオチン化ＨＳＡ１０μｇを加え、室温で３０分間回転させながらインキュベーションした後、Ｍ２８０ストレプトアビジンビーズを加えてビオチン化ＨＳＡを固定した。ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ洗浄緩衝液でビーズを１１回洗浄し、ｐＨ２．７の０．１Ｍグリシンで溶出した後、溶出緩衝液をｐＨ９．０の１Ｍ  Ｔｒｉｓで中和した。溶出したファージを対数ファージＴＧ１細胞にレスキューし、２５０ｃｍ×２５０ｃｍのＬＢカルベニシリン、２％グルコーストレイで増殖物を回収した。ファージレスキューのアリコートの連続希釈により力価を決定した。第２ラウンドのパニングは、選択のために第１ラウンドの増殖物のアリコートおよび５μｇのビオチン化ＨＳＡを使用して、基本的には上記のように実施した。
【０１３８】
ＨＳＡに対する反応性についてクローンをスクリーニングするために、個々のクローンを９６ウェルのプレートに採取し、カルベニシリン１００μｇ／ｍＬおよび２％グルコースを含有する容量２５０μＬの２×ＹＴにて３７℃で一晩培養した。５μＬの高密度一晩培養物を２５０μＬの新鮮な培地に移すことにより、各ウェルを継代培養した。ローリングサークル増幅シーケンス解析のためにアリコートを用い、コードされたインサートを決定した。細胞をＯＤ６００が約０．６になるまで増殖させた後、ＭＯＩ２０で１時間Ｍ１３ヘルパーファージを加えた。遠心分離により細胞を回収し、カルベニシリン１００μｇ／ｍＬおよびカナマイシン５０μｇ／ｍＬを加えた、１ウェルあたり２５０μＬの２×ＹＴで培地を置き換えた。次に、プレートを２５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で一晩インキュベーションした。培地を遠心分離により清澄化し、ＥＬＩＳＡアッセイで使用するためのファージ上清を調製した。
【０１３９】
ＥＬＩＳＡ分析のために、ストレプトアビジンでコートし、予めブロックした９６ウェルプレート（Pierce、１５５００）を、振盪しながら室温で３０分間、ビオチン２μｇ／ｍＬとともにインキュベーションした。プレートを洗浄した後、室温で１時間ブロッキングを繰り返した。プレートを再度洗浄し、清澄化上清５０μＬを室温で３０分間加えた。プレートを３回洗浄した後、ブロッキングバッファー中の抗Ｍ１３  ＨＲＰ抗体（GE Healthcare、カタログ番号２７−９４２１−０１）とともに室温で３０分間インキュベーションした。プレートを４回洗浄した後、１ステップＵｌｔｒａ  ＴＭＢ  ＥＬＩＳＡ試薬（Thermo Scientific、カタログ番号３４０２９）を加え、発色させ、２Ｍ硫酸停止溶液を使用して反応を止めた。ＢｉｏＲａｄ  ｉＭａｒｋプレートリーダーを使用して、ＯＤ４５０の読み値を測定した。
【０１４０】
ＮＧＳを使用して、元のライブラリー内の配列の集団、またはパニングによって富化された配列の集団を調べた。ＮＧＳの場合、最初のライブラリー、１回目のパニング、２回目のパニングの増殖物からファージミドＤＮＡを分離した。ファージミドから制限消化によってＶＨＨカセットを切り出し、アガロースゲル電気泳動によりＶＨＨをコードするバンドを分離し、ＤＮＡアフィニティーカラムを使用してＤＮＡを精製した。このＤＮＡを、ＭｉＳｅｑ  ２×３００プラットフォームでのライブラリーの作製と分析に供した。
【０１４１】
実施例８  ＨＳＡに結合するＶＨＨドメインの発現および精製
上記の方法論を使用して選択されたＶＨＨ配列を、Ｎ末端シグナルペプチドおよびＣ末端６×Ｈｉｓタグ（配列番号３２４）で合成し、哺乳動物の発現コンストラクトにクローニングした。ＧｅｎｅＢｌｏｃｋｓ（Integrated DNA Technologies）の合成および標準的な哺乳動物発現ベクターへの挿入クローニングによって、公開されたＭＳＡ２１  ＶＨＨドメイン（国際公開第ＷＯ２００４／０６２５５１号Ａ２）および個々のクローンの遺伝子修飾バージョン（脱グリコシル化またはヒト化）を調製した。これらのコンストラクトを２９３ｅｘｐｉ細胞にトランスフェクトし、トランスフェクションの９６時間後に上清を回収した。上清をＰＢＳで透析し、標準的なクロマトグラフィー法を使用してＶＨＨ−Ｈｉｓタンパク質を精製した。精製タンパク質をＰＢＳに緩衝液交換し、ＯＤおよび吸光係数を使用して定量化した。
【０１４２】
実施例９  可溶性ＨＳＡ、ＣＳＡおよびマウス血清アルブミンに結合する固定化ＶＨＨドメインの特徴解析
２９３  ｅｘｐｉ発現系で産生されたタンパク質および１１２のＶＨＨ配列について、哺乳動物の発現ベクターを作製した。まず、ＶＨＨ配列をＳＤＳ  ＰＡＧＥおよびクーマシー染色によって分析し、既知の標準に対するおおよその濃度を決定した。次に、上清濃度を標準化し、Ｏｃｔｅｔ  ＨＴＸ（Pall/ForteBio）でバイオレイヤー干渉測定を行った。ペンタＨｉｓセンサーをカイネティクス緩衝液に６０秒間曝露し、ベースライン測定値を確立した。次に、センサーにＶＨＨ−Ｈｉｓ含有上清を３００秒間ロードした後、カイネティクス緩衝液中１２０秒間で２番目のベースラインを確立した。次に、チップをカイネティクス緩衝液中１００ｎＭ  ＨＳＡまたはＣＳＡとともに６００秒間インキュベーションし、さらに６００秒間で解離を測定した。
【０１４３】
分析した１１２個のＶＨＨドメインのうち、１２個のドメインがビオチン化ＨＳＡへの結合を示し、３つのクローン（ＨＡＳ０４０、ＨＡＳ０４１およびＨＡＳ０４２）がビオチン化ＣＳＡとビオチン化ＨＳＡの両方と相互作用した。これらの１２個の抗ＨＳＡ  ＶＨＨドメインの配列を、その１つ以上のヒト化バージョンを含めて表６に示し、これらの抗ＨＳＡ  ＶＨＨドメインのＣＤＲを表７に示す。
【０１４４】
［表６］
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【０１４５】
［表７］
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【０１４６】
実施例１０  Ｂｉａｃｏｒｅによるアルブミン結合動態の特徴解析
Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００装置でＳＰＲを使用して、ＨＳＡまたはＣＳＡに対するＶＨＨドメインＨＡＳ０４０およびＨＡＳ０４１の結合動態を決定した。デオキシリボオリゴヌクレオチドを含むビオチンＣＡＰｔｕｒｅ試薬で飽和したＣＡＰチップ（GE Healthcareから入手）にビオチン化アルブミンを捕捉した。精製ＶＨＨドメインの濃縮物を、流量５０μＬ／分で５分間注入した。ＶＨＨドメイン１つあたり３つの濃縮物を評価した。結合した検体を６００秒間で解離させた。濃縮のつど、６Ｍ塩酸グアニジン／０．２５Ｍ  ＮａＯＨを１０μＬ／分で２分間注入することにより、チップ表面を再生した。１：１のラングミュアモデル（ローカルＲｍａｘおよび定数ＲＩ）および二重参照減算（試料濃縮サイクルからの緩衝液濃縮サイクルの減算および並行参照フロー細胞の減算）を使用して、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中ｐＨ７．４およびｐＨ６．０で反応動態を決定した）。ＭＳＡ２１  ＶＨＨドメイン（国際公開第ＷＯ２００４／０６２５５１号Ａ２）（配列：
LEQVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCEASGFTFSRFGMTWVRQAPGKGVEWVSGISSLGDSTLYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCTIGGSLNPGGQGTQVTVSS（配列番号３２２）
を調製し、これらのアッセイにおけるコンパレーターとして使用した。
【０１４７】
このアッセイの結果を表８に示す。結合親和性は０．３〜５ｎＭの範囲で観察され、ＨＡＳ０４０およびＨＡＳ０４１ドメインがｐＨ６とｐＨ７．４の両方で半減期の延長を促進するのに十分な親和性を有することが示された。さらに、これらのＶＨＨドメインは非常に類似した親和性でＣＳＡとＨＳＡへの結合を示し、霊長類で行われる半減期延長試験の予測的性質を高めた。
【０１４８】
［表８］
2020532285.tif 000020
【０１４９】
実施例１１  ＶＨＨおよびＦｃＲｎによる非競合的アルブミン結合の実証
エンドサイトーシス小胞からのアルブミンのリサイクルは、ＦｃＲｎとの相互作用によってなされる。したがって、ＶＨＨがＨＳＡとＦｃＲｎの相互作用を妨げるか否かを判断することが重要であった。ＨＡＳ０４０およびＨＡＳ０４１  ＶＨＨドメインがＦｃＲｎと同一のエピトープに結合するか否かを判断するために、抗ＨＳＡ  ＶＨＨドメインで飽和したＨＳＡへのＦｃＲｎの結合を、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中ｐＨ６．０でＢｉａｃｏｒｅ  ３０００装置にて分析した。ＨＳＡをＣＭ５チップに直接固定して、アミンカップリングを使用して２５０ＲＵ（共鳴ユニット）の目標密度に達した。ＶＨＨドメインを約１〜１０μｇ／ｍＬに希釈し、注入して飽和状態にした（５０μＬ／分で３分間）。ある濃度のＦｃＲｎをＨＳＡ：ＶＨＨ表面に注入し、５０μＬ／分で５分間の反応動態を得た。再生前に１８０秒間、解離させた。１００μＬ／分で２５ｍＭ  ＮａＯＨを２０μＬ注入することで、チップ表面を再生した。１：１のラングミュアモデル（ローカルＲｍａｘおよび定数ＲＩ）および二重参照減算（試料濃縮サイクルからの緩衝液濃縮サイクルの減算および並行参照フロー細胞の減算）を使用して、反応動態を決定した。
【０１５０】
結果を図７に示す。図７Ａでは、ＦｃＲｎとＨＳＡ飽和表面との直接相互作用により、３０ＲＵの応答差が生じた。ＨＳＡとＭＳＡ２１（ＡＤＬ０２１）（図７Ｂ）、ＨＡＳ０４０（図７Ｃ）またはＨＡＳ０４１（図７Ｄ）との複合体で飽和した表面に４００ｎＭ  ＦｃＲｎを注入すると、同様のＲＵが得られた。これらのデータに基づいて、ＨＡＳ０４０およびＨＡＳ０４１はＦｃＲｎ結合を妨害せず、アルブミンとＦｃＲｎとの相互作用を介してエンドソームからリサイクルされると予想される。
【０１５１】
実施例１２  抗Ｃ５および抗アルブミン二重特異性融合タンパク質の作製
抗Ｃ５  ＶＨＨドメインを抗アルブミンドメインに融合し、二重特異性分子を作製した。４通りのリンカー長(G4S)3（配列番号１０６）、(G4S)4（配列番号１０７）、(G4S)5（配列番号１０８）および(G4S)6（配列番号１０９）および抗アルブミンドメインの２つの異なる向き（Ｎ末端またはＣ末端）を評価した。コンストラクトをＨＥＫ２９３Ｆ細胞で発現させ、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製した。精製後の融合分子を、Ｂｉａｃｏｒｅ実験で評価した。ヒトＣ５をビオチン化してｂｉａｃｏｒｅチップに固定し、精製後の二重特異性分子を注入してチップを飽和させた後、３通りの濃度のヒト血清アルブミンを注入して反応動態を求めた。ヒト血清アルブミンに対する実測親和性を、異なるリンカー長を比較するためのプロキシとして使用した。(G4S)3（配列番号１０６）を、二重特異性融合を生成する最適なリンカー長として選択した。Ｎ末端またはＣ末端の抗アルブミン融合体も同じ実験で評価した。異なる向きが、異なる抗Ｃ５  ＶＨＨドメインに最適であることが明らかになった。表９では、コンストラクトのＮ対Ｃ末端の向きをコンストラクト名の下に記載し、（Ｃ５／ＨＳＡ）は抗Ｃ５ドメインが抗ＨＳＡドメインのＮ末端に位置することを示す。同様に、（ＨＳＡ／Ｃ５）は、抗ＨＳＡドメインが抗Ｃ５ドメインのＮ末端に位置することを示す。
【０１５２】
最適なリンカー長を選択した後、２つの異なる抗アルブミンドメインに融合したヒト化抗Ｃ５  ＶＨＨドメインを使用して、一連の異なる二重特異性融合分子を作製した（表８に示す）。これらのコンストラクトをＥｘｐｉ２９３細胞で発現させ、プロテインＡクロマトグラフィーを使用して精製した。精製後の二重特異性融合タンパク質を溶血アッセイで試験した。結果を図３Ａおよび図３Ｂに示す。
【０１５３】
［表９］
2020532285.tif 000021
2020532285.tif 000022
2020532285.tif 000023
2020532285.tif 000024
【０１５４】
結合および機能アッセイに基づいて、４つの二重特異性分子ＣＲＬ０４８３、ＣＲＬ０４８４、ＣＲＬ０４９９およびＣＲＬ０５００に優先順位を付けた。ＣＲＬ０４８３、ＣＲＬ０４８４、ＣＲＬ０４９９およびＣＲＬ０５００のヒトＣ５への結合についてのＢｉａｃｏｒｅ親和性測定値を表１０に示し、機能的評価を図３、図４、図５に示す。これらの４つの二重特異性分子を、カニクイザルのin vivo薬物動態試験で評価した。
【０１５５】
［表１０］
2020532285.tif 000025
【０１５６】
実施例１３  二重特異性融合タンパク質の薬物動態分析
カニクイザルに精製タンパク質を１０ｍｇ／ｋｇで静脈内投与または皮下投与した。被験物質ごとに各用量群３匹のサルを使用した。各コンストラクトに対するシグネチャペプチドを使用したＬＣ  ＭＳベースの定量によって、二重特異性分子の薬物動態特性を測定した。ＰＫプロファイルを図６に示し、パラメーターを表１１に記載しておく。
【０１５７】
［表１１］
2020532285.tif 000026
【０１５８】
二重特異性融合タンパク質のバリアントリンカー配列も作製した。これらのバリアントリンカー配列を有する配列を表１２に示す。
【０１５９】
［表１２］
2020532285.tif 000027
【０１６０】
実施例１４  様々なペプチドリンカー配列
ＨＡＳ０４２（配列番号２６）アルブミン結合ドメインおよびＣＲＬ０３０５（配列番号１１）ヒト化抗Ｃ５  ＶＨＨを使用して、コンストラクトを作製した。評価したコンストラクトを表１３にあげておく。
【０１６１】
［表１３］
2020532285.tif 000028
【０１６２】
表１３に列挙した２６のコンストラクトを発現させ、ヒトＣ５およびアルブミンへの結合（表１３−オクテット結合）、凝集体の生成、疎水性（ＨＩＣ  ＨＰＬＣ）およびグリコシル化（エレクトロスプレー質量分析）について融合タンパク質を評価した。オクテット分析では、ビオチン化したヒトＣ５をＣＡＰチップで捕捉した後、被験二重特異性分子を注入した。その後、さまざまな濃度のアルブミンを注入した。ｐＨ７．４で反応動態を決定した（Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００）。すべての二重特異性分子がＣ５とアルブミンの両方に結合し、それぞれがアルブミンに対して類似の親和性（５〜６ｎＭ）を有していた。
【０１６３】
in vitro溶血アッセイにおいて、二重特異性融合タンパク質が溶血を阻害する能力について試験した。データを図９Ａおよび図９Ｂに示す。
【０１６４】
表１４に、ヒトＣ５（ｈＣ５）およびカニクイザルＣ５（ｃＣ５）に結合するＣＲＬ０５００およびＣＲＬ０９５２の結合動態を示す。
【０１６５】
［表１４］
2020532285.tif 000029
【０１６６】
表１５は、Plasbumin（登録商標）およびカニクイザルアルブミンへのＣＲＬ０５００およびＣＲＬ０９５２の結合の結合動態を示す。
【０１６７】
［表１５］
2020532285.tif 000030
【０１６８】
実施例１５  抗Ｃ５  ＶＨＨドメインのｐＨ依存性結合
抗Ｃ５  ＶＨＨドメインＬＣＰ０１１５、ＬＣＰ０１４３、ＬＣＰ０１４６、ＬＣＰ０３０２のすべてのＣＤＲでヒスチジンスキャンを実施した。ＣＤＲの各位置で、単一のヒスチジン置換を行った（太字の下線付きテキストで表示）。バリアントをＥｘｐｉ２９３細胞培養でトランスフェクトし、ｐＨ７．４、６．０および５．５でのｐＨ依存性結合を評価した。抗体ごとにいくつかのバリアントがｐＨ依存性の結合を示した。これらのバリアントを表１６に列挙し、それらのｐＨ依存性結合応答を図１１Ａ〜図１１Ｄに示す。
【０１６９】
［表１６］
2020532285.tif 000031
【０１７０】
ｐＨ依存性結合について特定された単一のヒスチジン変異を組み合わせ、ｐＨ感受性を高めた。これらのバリアントの配列を表１７に示す。これらのバリアントをｐＨ依存性結合のバイオレイヤー干渉法で評価し、結果を図１２Ａおよび図１２Ｂに示す。
【０１７１】
［表１７］
2020532285.tif 000032
【０１７２】
実施例１６  抗Ｃ５および抗アルブミン二重特異性融合体の作製
抗Ｃ５  ＶＨＨドメインを抗アルブミンドメインに融合し、二重特異性分子を作製した。４通りのリンカー長(G4S)3（配列番号１０６）、(G4S)4（配列番号１０７）、(G4S)5（配列番号１０８）および(G4S)6（配列番号１０９）および抗アルブミンドメインのおよび抗アルブミンドメインの２つの異なる向き（Ｎ末端またはＣ末端）を評価した。作製した分子の配列を表１８に示す。コンストラクトをＨＥＫ２９３Ｆ細胞で発現させ、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製した。精製後の融合分子を、Ｂｉａｃｏｒｅ実験で評価した。ヒトＣ５をビオチン化してｂｉａｃｏｒｅチップに固定し、精製後の二重特異性分子を注入してチップを飽和させた後、３通りの濃度のヒト血清アルブミンを注入して反応動態を求めた。ヒト血清アルブミンに対する実測親和性を、異なるリンカー長を比較するためのプロキシとして使用した。(G4S)3（配列番号１０６）を、二重特異性融合を生成する最適なリンカー長として選択した。Ｎ末端またはＣ末端の抗アルブミン融合体も同じ実験で評価した。異なる向きは、異なる抗Ｃ５  ＶＨＨドメインに最適であることが明らかになった。
【０１７３】
［表８］
2020532285.tif 000033
2020532285.tif 000034
【０１７４】
ｐＨ依存性結合ありまたはなしの状態で、ヒト化抗Ｃ５  ＶＨＨドメインを用いて一連の異なる二重特異性融合分子を作製した。抗Ｃ５  ＶＨＨドメインを２つの異なる抗アルブミンドメインに融合させ、二重特異性分子を作製した（表９に示す）。これらのコンストラクトをＨＥＫ２９３Ｆ細胞で発現させ、プロテインＡクロマトグラフィーを使用して精製した。精製後の二重特異性融合体を溶血アッセイで試験した。結果を図３Ａ〜図３Ｄに示す。
【０１７５】
結合および機能アッセイに基づいて、４つの二重特異性分子ＣＲＬ０４８３、ＣＲＬ０４８４、ＣＲＬ０４９９およびＣＲＬ０５００に優先順位を付けた。ＣＲＬ０４８３、ＣＲＬ０４８４、ＣＲＬ０４９９およびＣＲＬ０５００のヒトＣ５への結合についてのＢｉａｃｏｒｅ親和性測定値を表１０に示し、機能的評価を図５、図６、図７に示す。これらの４つの二重特異性分子を、カニクイザルのin vivo薬物動態試験で評価した。
【０１７６】
実施例１７  二重特異性融合分子の薬物動態分析
カニクイザルに精製タンパク質を１０ｍｇ／ｋｇで静脈内投与または皮下投与した。被験物質ごとに各用量群３匹のサルを使用した。各コンストラクトに特異的なシグネチャペプチドを使用したＬＣ  ＭＳベースの定量アッセイによって、二重特異性分子の薬物動態を測定した。ＰＫプロファイルを図６Ａおよび図６Ｂに示し、パラメーターを表２０に記載しておく。
【０１７７】
［表２０］
2020532285.tif 000035
【０１７８】
本開示では様々な実施形態を説明したが、当業者には変形例および改変例が思い浮かぶことが理解される。したがって、添付の特許請求の範囲は、そのような等価の変形例をすべて網羅するものとする。加えて、本明細書で使用した各項の見出しは編成目的だけのものであり、説明した主題を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０１７９】
本明細書で説明した実施形態は、逆である旨が別途明示されない限り、他の実施形態と組み合わせてもよい。特に、好ましいまたは有利であると示された特徴または実施形態は、逆である旨が別途明示されない限り、好ましいまたは有利であると示された他の特徴または実施形態と組み合わせることができる。  
本出願で引用した参考文献を、いずれも明示的に本明細書に援用する。
【図１Ａ】
2020532285.tif 000036
【図１Ｂ】
2020532285.tif 000037
【図２】
2020532285.tif 000038
【図３Ａ】
2020532285.tif 000039
【図３Ｂ】
2020532285.tif 000040
【図３Ｃ】
2020532285.tif 000041
【図３Ｄ】
2020532285.tif 000042
【図４】
2020532285.tif 000043
【図５】
2020532285.tif 000044
【図６Ａ】
2020532285.tif 000045
【図６Ｂ】
2020532285.tif 000046
【図７】
2020532285.tif 000047
【図８】
2020532285.tif 000048
【図９Ａ】
2020532285.tif 000049
【図９Ｂ】
2020532285.tif 000050
【図１０】
2020532285.tif 000051
【図１１Ａ】
2020532285.tif 000052
【図１１Ｂ】
2020532285.tif 000053
【図１１Ｃ】
2020532285.tif 000054
【図１１Ｄ】
2020532285.tif 000055
【図１２Ａ】
2020532285.tif 000056
【図１２Ｂ】
2020532285.tif 000057
【配列表】
2020532285000001.app
【国際調査報告】
2020532285.tif 000058
2020532285.tif 000059
2020532285.tif 000060