(57)【要約】無血清条件下でＷｎｔポリペプチドを生成するための方法と組成物が本明細書に開示される。さらに、無血清条件からＷｎｔポリペプチドを精製する方法が本明細書に開示される。【選択図】図２５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
機能的に活性なＷｎｔポリペプチドを調製する方法であって、前記方法は：
ａ）複数のＷｎｔポリペプチド−シャペロン複合体を生成するために、調整培地中の細胞においてＷｎｔポリペプチドとシャペロンを共発現する工程；
ｂ）調整培地から複数のＷｎｔポリペプチド−シャペロン複合体を採取する工程；
ｃ）機能的に不活性なＷｎｔポリペプチドとシャペロン組成物を含む第１のＷｎｔ組成物を含む混合物を生成するために、糖界面活性剤を含む緩衝液を用いて、複数のＷｎｔポリペプチド−シャペロン複合体をインキュベートする工程；
ｄ）機能的に活性なＷｎｔポリペプチドと糖界面活性剤を含む第２のＷｎｔ組成物を生成するために、スルホン化された多環芳香族化合物で固定されたカラムを用いて前記混合物から第１のＷｎｔ組成物を分離する工程；および、
ｅ）機能的に活性なＷｎｔポリペプチドを含む最終的なＷｎｔ組成物を生成するために、第２のＷｎｔ組成物を、リポソームの水溶液に接触させる工程、を含む、方法。
【請求項２】
糖界面活性剤はグルコシド界面活性剤を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
グルコシド界面活性剤は、ｎ−ヘキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−オクチル−α−Ｄ−グルコピラノシド、オクチルβ−Ｄ−１−チオグルコピラノシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、ｎ−ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−デシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、あるいはメチル−６−Ｏ−（Ｎ−ヘプチルカルバモイル）−α−Ｄ−グルコピラノシドである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
グルコシド界面活性剤は、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドおよびオクチルβ−Ｄ−１−チオグルコピラノシドから選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
グルコシド界面活性剤はｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドである、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
グルコシド界面活性剤はオクチルβ−Ｄ−１−チオグルコピラノシドである、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
糖界面活性剤はマルトシド界面活性剤を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
マルトシド界面活性剤は、ｎ−デシル−β−Ｄ−マルトピラノシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド、あるいは６−シクロヘキシル−１−ヘキシル−β−Ｄ−マルトピラノシドである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
緩衝液中の糖界面活性剤の濃度は：約０．１％〜約５％ｗ／ｖ；あるいは、約０．１％、０．５％、１％、１．５％、あるいは約２％ｗ／ｖである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
第２のＷｎｔ組成物は、少なくとも一度、第３のＷｎｔ組成物を生成するために、抗体のＦｃ部分と相互作用するポリペプチドを含む親和性クロマトグラフィーカラム、混合モードカラム、サイズ排除クロマトグラフィーカラム、あるいはこれらの組み合わせを用いてさらに精製される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
複数のＷｎｔポリペプチド−シャペロン複合体はさらに、第１のＷｎｔ組成物を含む混合物を生成するために、緩衝液を用いてインキュベートする前に、抗体のＦｃ部分と相互作用するポリペプチドを含む親和性クロマトグラフィーカラムを用いて精製される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
親和性クロマトグラフィーカラムはプロテインＡカラムである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
複数のＷｎｔポリペプチド−シャペロン複合体は、５未満、４未満、あるいは３未満のｐＨを含む緩衝液を用いて、親和性クロマトグラフィーカラムから溶出される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記方法は：
ａ）Ｗｎｔポリペプチド−シャペロン複合体の溶出した混合物を生成するために、抗体のＦｃ部分と相互作用するポリペプチドを含む第１の親和性クロマトグラフィーカラムで複数のＷｎｔポリペプチド−シャペロン複合体を精製する工程；
ｂ）機能的に不活性なＷｎｔポリペプチドとシャペロン組成物を含む第１のＷｎｔ組成物を含む混合物を生成するために、糖界面活性剤を含む緩衝液を用いて、Ｗｎｔポリペプチド−シャペロン複合体の溶出した混合物をインキュベートする工程；
ｃ）機能的に活性なＷｎｔポリペプチドと糖界面活性剤を含む第２のＷｎｔ組成物を生成するために、スルホン化された多環芳香族化合物で固定されたカラムを用いて前記混合物から第１のＷｎｔ組成物を分離する工程；
ｄ）第３のＷｎｔ組成物を生成するために、抗体のＦｃ部分と相互作用するポリペプチドを含む第２の親和性クロマトグラフィーカラム、混合モードカラム、およびサイズ排除クロマトグラフィーカラムと並行して第２のＷｎｔ組成物を随意に精製する工程；および、
ｅ）機能的に活性なＷｎｔポリペプチドを含む最終的なＷｎｔ組成物を生成するために、第３のＷｎｔ組成物を、リポソームの水溶液に接触させる工程、を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
第１の親和性クロマトグラフィーカラムと第２の親和性クロマトグラフィーカラムはそれぞれ独立して、プロテインＡカラムである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
混合モードカラムの溶出緩衝液は、約０．１Ｍから約２Ｍ、約０．１Ｍから約１Ｍ、あるいは約０．１Ｍから約０．５Ｍのアルギニンを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
第２の親和性クロマトグラフィーカラム、混合モードカラム、およびサイズ排除クロマトグラフィーカラムの各々の溶出緩衝液は、糖界面活性剤を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
工程ｄ）の分離は、第１の塩濃度の第１の緩衝溶液と第２の塩濃度の第２の緩衝溶液を含む工程勾配で第１のＷｎｔ組成物を溶出することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
第１の緩衝溶液は、約１０ｍＭから約１００ｍＭ；あるいは、約１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、またはそれよりも高い濃度の塩を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
第２の緩衝溶液は、約１Ｍ、１．５Ｍ、２Ｍ、あるいはそれよりも高い濃度の塩を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
塩は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、リン酸カルシウム、リン酸カリウム、リン酸マグネシウム、リン酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、あるいはリン酸アンモニウムを含む、請求項１８−２０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２２】
シャペロンはＦｒｉｚｚｌｅｄタンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
シャペロンはＦｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質は、切断されたＦｒｉｚｚｌｅｄ−８タンパク質を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
切断されたＦｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８のシステインに富んだ領域（ＣＲＤ）を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
切断されたＦｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸残基２５からアミノ酸残基１７２まで及ぶ領域を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質はＩｇＧ  Ｆｃ部分を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質は：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、あるいは９９％の配列同一性；または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、あるいは９９％の配列同一性を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
Ｗｎｔポリペプチドは、異種のシグナル配列あるいは天然のシグナル配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
Ｗｎｔポリペプチドは、タグ、随意にＨＩＳ（６ｘ）−タグ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）、ＦＬＡＧタグ、あるいはＰＡタグを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
ＷｎｔポリペプチドはＷｎｔ３Ａポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対して、約９０％、９５％、９９％、あるいはそれよりも高い配列同一性を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、約１〜約３３のアミノ酸の切断、随意にＣ末端切断を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に対して、約９０％、９５％、９９％、あるいはそれよりも高い配列同一性を含むか、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２からなる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
Ｗｎｔポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に記載のアミノ酸残基２０９に対応するアミノ酸位置において脂質修飾を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
Ｗｎｔポリペプチドはパルミチン酸で修飾される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
第２の親和性クロマトグラフィーカラムは、第２のＷｎｔ組成物から残りのＦｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質を取り除く、請求項１４に記載の方法。
【請求項３８】
混合モードカラムは、第２のＷｎｔ組成物からＷｎｔポリペプチド断片を取り除く、請求項１０に記載の方法。
【請求項３９】
サイズ排除クロマトグラフィーカラムは、第３のＷｎｔ組成物を生成するために、第２のＷｎｔ組成物から残りのＷｎｔポリペプチド断片を取り除く、請求項１０に記載の方法。
【請求項４０】
第２のＷｎｔ組成物は、糖界面活性剤のない状態で精製される同等のＷｎｔ組成物に対して、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、あるいは９９％を超えて純粋である、請求項１に記載の方法。
【請求項４１】
第３のＷｎｔ組成物は、糖界面活性剤のない状態で精製される同等のＷｎｔ組成物に対して、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、あるいは９９％を超えて純粋である、請求項１０に記載の方法。
【請求項４２】
最終的なＷｎｔ組成物は、約１０ｎｍから約１μｍ、１０ｎｍから約５００ｎｍ、約５０ｎｍから約３００ｎｍ、約５０ｎｍから約２００ｎｍ、約５０ｎｍから約１５０ｎｍ、約１００ｎｍから約５００ｎｍ、約１００ｎｍから約３００ｎｍ、あるいは約１００ｎｍから約２００ｎｍまで；約１μｍ未満、約５００ｎｍ未満、約３００ｎｍ未満、約２００ｎｍ未満、あるいは約１５０ｎｍ未満；または、約５０ｎｍ、約１００ｎｍ、あるいは、約１５０ｎｍのリポソーム粒度分布を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４３】
請求項１の方法によって生成された機能的に活性なＷｎｔポリペプチド。
【請求項４４】
請求項１の方法によって生成された機能的に活性なＷｎｔポリペプチドを含むリポソームＷｎｔ組成物。
【請求項４５】
被験体において骨移植片中の細胞生存を増強する方法であって、前記方法は：
ａ）請求項１−４２の方法によって生成されたリポソームＷｎｔポリペプチドを含む組成物を用いて、エクスビボで細胞を含む単離された哺乳動物の骨移植片材料を含むサンプルをインキュベートする工程；および、
ｂ）標的部位へ増強された細胞を移植する工程、を含む、方法。
【請求項４６】
工程ａ）の細胞は、少なくとも１０分、１５分、２０分、３０分、１時間、２時間、あるいはそれ以上にわたってインキュベートされる、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
工程ａ）の細胞は、せいぜい３０分間、１時間、１．５時間、２時間以下にわたって、インキュベートされる、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
工程ａ）の細胞は、ほぼ室温あるいは約３７°Ｃでインキュベートされる、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
増強された細胞は、暴露されていない哺乳動物の骨移植片材料に対して増強された骨形成能力を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
被験体の骨欠損部位において細胞生存を増強する方法であって、前記方法は：
請求項１−４２の方法によって生成されたリポソームＷｎｔポリペプチドを含む組成物を、骨欠損部位へ投与する工程を含み、リポソームＷｎｔポリペプチドは骨欠損部位における細胞生存を増強する、方法。
【請求項５１】
骨欠損部位で歯科用あるいは整形外科用インプラントを投与する工程をさらに含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
歯科用あるいは整形外科用インプラントは、リポソームＷｎｔポリペプチドを含む組成物の投与前に、骨欠損部位に投与される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
歯科用あるいは整形外科用インプラントは、リポソームＷｎｔポリペプチドを含む組成物の投与後に、骨欠損部位に投与される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
歯科用あるいは整形外科用インプラントは、リポソームＷｎｔポリペプチドを含む組成物の投与の約１日、２日、５日、７日、２週間、３０日、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、あるいはそれ以上後に、骨欠損部位に投与される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
歯科用あるいは整形外科用インプラントと、リポソームＷｎｔポリペプチドを含む組成物は、骨欠損部位に同時に投与される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５６】
リポソームＷｎｔポリペプチドは、歯科用あるいは整形外科用インプラントの骨結合を増強する、請求項４５−５５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項５７】
被験体はヒトである、請求項４５−５６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項５８】
精製されたＷｎｔポリペプチド中間体と約０．１％〜約５％ｗ／ｖの濃度の糖界面活性剤を含む、Ｗｎｔ組成物。
【請求項５９】
糖界面活性剤はグルコシド界面活性剤を含む、請求項５８に記載のＷｎｔ組成物。
【請求項６０】
グルコシド界面活性剤は、ｎ−ヘキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−オクチル−α−Ｄ−グルコピラノシド、オクチルβ−Ｄ−１−チオグルコピラノシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、ｎ−ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−デシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、あるいはメチル−６−Ｏ−（Ｎ−ヘプチルカルバモイル）−α−Ｄ−グルコピラノシドである、請求項５９に記載のＷｎｔ組成物。
【請求項６１】
グルコシド界面活性剤は、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドおよびオクチルβ−Ｄ−１−チオグルコピラノシドから選択される、請求項５９に記載のＷｎｔ組成物。
【請求項６２】
グルコシド界面活性剤はｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドである、請求項５９に記載のＷｎｔ組成物。
【請求項６３】
グルコシド界面活性剤はオクチルβ−Ｄ−１−チオグルコピラノシドである、請求項５９に記載のＷｎｔ組成物。
【請求項６４】
糖界面活性剤はマルトシド界面活性剤を含む、請求項５９に記載のＷｎｔ組成物。
【請求項６５】
マルトシド界面活性剤は、ｎ−デシル−β−Ｄ−マルトピラノシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド、あるいは６−シクロヘキシル−１−ヘキシル−β−Ｄ−マルトピラノシドである、請求項６４に記載のＷｎｔ組成物。
【請求項６６】
糖界面活性剤の濃度は、約０．１％、０．５％、１％、１．５％、あるいは約２％ｗ／ｖである、請求項５８−６５のいずれか１つに記載のＷｎｔ組成物。
【請求項６７】
Ｗｎｔ組成物は約５、５．５、あるいは６のｐＨを有する、請求項５８−６６のいずれか１つに記載のＷｎｔ組成物。
【請求項６８】
Ｗｎｔ組成物は、約１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、あるいは５０ｍＭの濃度で酢酸塩を含む緩衝液を含んでいる、請求項５８−６７のいずれか１つに記載のＷｎｔ組成物。
【請求項６９】
精製されたＷｎｔポリペプチド中間体は：
ａ）複数のＷｎｔポリペプチド−シャペロン複合体を生成するために、調整培地中の細胞においてＷｎｔポリペプチドとシャペロンを共発現する工程；
ｂ）調整培地から複数のＷｎｔポリペプチド−シャペロン複合体を収穫する工程；
ｃ）機能的に不活性なＷｎｔポリペプチドとシャペロン組成物を含む第１のＷｎｔ組成物を含む混合物を生成するために、糖界面活性剤を含む緩衝液を用いて、複数のＷｎｔポリペプチド−シャペロン複合体をインキュベートする工程；および、
ｄ）精製されたＷｎｔポリペプチド中間体と糖界面活性剤を含むＷｎｔ組成物を生成するために、スルホン化された多環芳香族化合物を用いて固定されたカラム、抗体のＦｃ部分と相互作用するポリペプチドを含む親和性クロマトグラフィーカラム、混合モードカラム、サイズ排除クロマトグラフィーカラム、あるいはこれらの組み合わせを用いて、前記混合物から第１のＷｎｔ組成物を精製する工程、から得られる、請求項５８−６８のいずれか１つに記載のＷｎｔ組成物。
【請求項７０】
ＷｎｔポリペプチドはＷｎｔ３Ａポリペプチドである、請求項５８−６９のいずれか１つに記載のＷｎｔ組成物。
【請求項７１】
Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対して、約９０％、９５％、９９％、あるいはそれよりも高い配列同一性を含むポリペプチドである、請求項７０に記載のＷｎｔ組成物。
【請求項７２】
Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、約１〜約３３のアミノ酸の切断、随意にＣ末端切断を含む、請求項７０に記載のＷｎｔ組成物。
【請求項７３】
Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に対して、約９０％、９５％、９９％、あるいはそれよりも高い配列同一性を含むか、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２からなる、請求項７０に記載のＷｎｔ組成物。
【請求項７４】
Ｗｎｔポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に記載のアミノ酸残基２０９に対応するアミノ酸位置において脂質修飾を含む、請求項５８−７３のいずれか１つに記載のＷｎｔ組成物。
【請求項７５】
Ｗｎｔポリペプチドはパルミチン酸で修飾される、請求項５８−７４のいずれか１つに記載のＷｎｔ組成物。
【請求項７６】
精製されたＷｎｔポリペプチド中間体の濃度は：約２０μｇ／ｍＬ〜約５０μｇ／ｍＬ、約２５μｇ／ｍＬ〜約５０μｇ／ｍＬ、約３０μｇ／ｍＬ〜約５０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ〜約４０μｇ／ｍＬ、約２５μｇ／ｍＬ〜約４０μｇ／ｍＬ、約２５μｇ／ｍＬ〜約３０μｇ／ｍＬ、約３０μｇ／ｍＬ〜約５０μｇ／ｍＬ、あるいは、約３０μｇ／ｍＬ〜約４０μｇ／ｍＬ；または、約２０μｇ／ｍＬ、約２５μｇ／ｍＬ、約３０μｇ／ｍＬ、約３５μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ、約４５μｇ／ｍＬ、あるいは、約５０μｇ／ｍＬである、請求項５８−７５のいずれか１つに記載のＷｎｔ組成物。
【請求項７７】
Ｗｎｔ培養系であって、前記Ｗｎｔ培養系は：
ａ）最小血清培地；
ｂ）最小血清培地中にあるＷｎｔポリペプチド−シャペロン複合体；および、
ｃ）Ｗｎｔポリペプチドをコードする第１の発現ベクターとシャペロンをコードする第２の発現ベクターをトランスフェクトされた操作された細胞株からの細胞を含み、ここで、Ｗｎｔポリペプチドとシャペロンは、細胞中で共発現され、細胞は最小血清培地の存在下で育てられる、Ｗｎｔ培養系。
【請求項７８】
シャペロンはＦｒｉｚｚｌｅｄタンパク質を含む、請求項７７に記載のＷｎｔ培養系。
【請求項７９】
シャペロンはＦｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質を含む、請求項７７に記載のＷｎｔ培養系。
【請求項８０】
Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質は、切断されたＦｒｉｚｚｌｅｄ−８タンパク質を含む、請求項７９に記載のＷｎｔ培養系。
【請求項８１】
切断されたＦｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８のシステインに富んだ領域（ＣＲＤ）を含む、請求項８０に記載のＷｎｔ培養系。
【請求項８２】
切断されたＦｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸残基１からアミノ酸残基１５１、あるいは、アミノ酸残基１からアミノ酸残基１７２まで及ぶ領域を含む、請求項８０に記載のＷｎｔ培養系。
【請求項８３】
Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質はＩｇＧ  Ｆｃ部分を含む、請求項７９−８２のいずれか１つに記載のＷｎｔ培養系。
【請求項８４】
Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質は：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、あるいは９９％の配列同一性；または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、あるいは９９％の配列同一性を含む、請求項７９−８３のいずれか１つに記載のＷｎｔ培養系。
【請求項８５】
Ｗｎｔポリペプチドは、タグ、随意に、ＨＩＳ−タグ、ＦＬＡＧタグ、あるいはＰＡタグを含む、請求項７７に記載のＷｎｔ培養系。
【請求項８６】
Ｗｎｔポリペプチドは、異種のシグナル配列あるいは天然のシグナル配列を含む、請求項７７−８５のいずれか１つに記載のＷｎｔ培養系。
【請求項８７】
ＷｎｔポリペプチドはＷｎｔ３Ａポリペプチドである、請求項７７−８６のいずれか１つに記載のＷｎｔ培養系。
【請求項８８】
Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対して、約９０％、９５％、９９％、あるいはそれよりも高い配列同一性を含む、請求項８７に記載のＷｎｔ培養系。
【請求項８９】
Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、約１〜約３３のアミノ酸の切断、随意にＣ末端切断を含む、請求項８７に記載のＷｎｔ培養系。
【請求項９０】
Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に対して、約９０％、９５％、９９％、あるいはそれよりも高い配列同一性を含むか、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２からなる、請求項８７に記載のＷｎｔ培養系。
【請求項９１】
Ｗｎｔポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に記載のアミノ酸残基２０９に対応するアミノ酸位置において脂質修飾を含む、請求項７７−９０のいずれか１つに記載のＷｎｔ培養系。
【請求項９２】
Ｗｎｔポリペプチドはパルミチン酸で修飾される、請求項７７−９１のいずれか１つに記載のＷｎｔ培養系。
【請求項９３】
ＷｎｔポリペプチドはＷｎｔ５ＢポリペプチドあるいはＷｎｔ１０Ｂポリペプチドである、請求項７７−８６のいずれか１つに記載のＷｎｔ培養系。
【請求項９４】
操作された細胞株は、ｃＧＭＰ適合性細胞株である、請求項７７−９３のいずれか１つに記載のＷｎｔ培養系。
【請求項９５】
ｃＧＭＰ適合性細胞株は、ｃＧＭＰ適合性哺乳動物細胞株である、請求項９４に記載のＷｎｔ培養系。
【請求項９６】
ｃＧＭＰ適合性哺乳動物細胞株は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞株、あるいはベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞株である、請求項９５に記載のＷｎｔ培養系。
【請求項９７】
ｃＧＭＰ適合性哺乳動物細胞株は、ＣＨＯ−ＳあるいはＣＨＯ−ｋ１誘導体細胞株である、請求項９５に記載のＷｎｔ培養系。
【請求項９８】
第１の発現ベクターおよび第２の発現ベクターはそれぞれ独立して、ｃＧＭＰ適合性ベクターである、請求項７７−９７のいずれか１つに記載のＷｎｔ培養系。
【請求項９９】
第１の発現ベクターおよび第２の発現ベクターはそれぞれ独立して、哺乳動物のベクターである、請求項７７−９８のいずれか１つに記載のＷｎｔ培養系。
【請求項１００】
哺乳動物のベクターは、ＯｐｔｉｃＶｅｃ、ｐＴａｒｇｅｔ、ｐｃＤＮＡ４ＴＯ４、ｐｃＤＮＡ４．０、ＵＣＯＥ発現ベクター、あるいはＧＳ系発現ベクターである、請求項９９に記載のＷｎｔ培養系。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、２０１７年８月１日に出願された米国仮出願第６２／５３９，９６０号と２０１８年２月１４日に出願された米国仮出願第６２／６３０，４４８号の利益を主張するものであり、文献の各々は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、参照により全体として本明細書に組み込まれる配列表を含んでいる。２０１８年７月３０日に作成された上記ＡＳＣＩＩのコピーは、４７２７１−７０８＿６０１＿ＳＬ．ｔｘｔのファイル名であり、６３，８５５バイトのサイズである。
【背景技術】
【０００３】
Ｗｎｔタンパク質は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄおよび低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）によってコードされた細胞表面受容体に結合する高度に保存された分泌シグナル伝達分子のファミリーを形成する。ＷＮＴ遺伝子ファミリーは、分泌シグナル伝達タンパク質をコードする構造上関連する遺伝子からなる。これらのタンパク質は、細胞運命の調節と胚形成中のパターン形成を含む、腫瘍形成と複数の発生過程に関与している。リガンドは、いったん結合すると、細胞内の事象のカスケードを開始し、最終的には、β−カテニンとＤＮＡ結合タンパク質ＴＣＦ核活性を介して標的遺伝子の転写を引き起こす。
【発明の概要】
【０００４】
ある実施形態では、Ｗｎｔ組成物と無血清条件からＷｎｔを生成する方法が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ組成物はＷｎｔ３Ａ組成物を含む。いくつかの実施形態において、無血清条件からＷｎｔ３Ａを生成する方法が本明細書に記載される。
【０００５】
ある実施形態では、機能的に活性なＷｎｔポリペプチドを調製する方法が本明細書に開示され、上記方法は：（ａ）機能的に不活性なＷｎｔポリペプチドとシャペロン組成物を含む第１のＷｎｔ組成物を含む混合物を生成するために、糖界面活性剤（ｓｕｇａｒ  ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）を含む緩衝液を用いて、複数のＷｎｔポリペプチド−シャペロン複合体をインキュベートする工程；（ｂ）機能的に活性なＷｎｔポリペプチドと糖界面活性剤を含む第２のＷｎｔ組成物を生成するために、スルホン化された多環芳香族化合物で固定されたカラムを用いて上記混合物から第１のＷｎｔ組成物を分離する工程；（ｃ）少なくとも一度、第３のＷｎｔ組成物を生成するために、抗体のＦｃ部分と相互作用するポリペプチドを含む親和性クロマトグラフィーカラム、混合モードカラム、サイズ排除クロマトグラフィーカラム、あるいはこれらの組み合わせを用いて第２のＷｎｔ組成物を随意に精製する工程；および、（ｄ）機能的に活性なＷｎｔポリペプチドを含む最終的なＷｎｔ組成物を生成するために、第２のＷｎｔ組成物あるいは随意に第３のＷｎｔ組成物を、リポソームの水溶液に接触させる工程、を含む。いくつかの実施形態において、糖界面活性剤はグルコシド界面活性剤を含む。いくつかの実施形態において、グルコシド界面活性剤は、ｎ−ヘキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−オクチル−α−Ｄ−グルコピラノシド、オクチルβ−Ｄ−１−チオグルコピラノシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、ｎ−ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−デシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、あるいはメチル−６−Ｏ−（Ｎ−ヘプチルカルバモイル）−α−Ｄ−グルコピラノシドである。いくつかの実施形態において、グルコシド界面活性剤は、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドおよびオクチルβ−Ｄ−１−チオグルコピラノシドから選択される。いくつかの実施形態において、グルコシド界面活性剤はｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドである。いくつかの実施形態において、グルコシド界面活性剤はオクチルβ−Ｄ−１−チオグルコピラノシドである。いくつかの実施形態において、糖界面活性剤はマルトシド界面活性剤を含む。いくつかの実施形態において、マルトシド界面活性剤は、ｎ−デシル−β−Ｄ−マルトピラノシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド、あるいは６−シクロヘキシル−１−ヘキシル−β−Ｄ−マルトピラノシドである。いくつかの実施形態において、緩衝液中の糖界面活性剤の濃度は、約０．１％ｗ／ｖから約５％ｗ／ｖである。いくつかの実施形態において、緩衝液中の糖界面活性剤の濃度は、約０．１％、０．５％、１％、１．５％、あるいは約２％ｗ／ｖである。いくつかの実施形態において、複数のＷｎｔポリペプチド−シャペロン複合体はさらに、第１のＷｎｔ組成物を含む混合物を生成するために、緩衝液を用いてインキュベートする前に、抗体のＦｃ部分と相互作用するポリペプチドを含む親和性クロマトグラフィーカラムを用いて精製される。いくつかの実施形態において、親和性クロマトグラフィーカラムはプロテインＡカラムである。いくつかの実施形態において、複数のＷｎｔポリペプチド−シャペロン複合体は、５未満、４未満、あるいは３未満のｐＨを含む緩衝液を用いて、親和性クロマトグラフィーカラムから溶出される。いくつかの実施形態では、上記方法は：（ａ）Ｗｎｔポリペプチド−シャペロン複合体の溶出した混合物を生成するために、抗体のＦｃ部分と相互作用するポリペプチドを含む第１の親和性クロマトグラフィーカラムで複数のＷｎｔポリペプチド−シャペロン複合体を精製する工程；（ｂ）機能的に不活性なＷｎｔポリペプチドとシャペロン組成物を含む第１のＷｎｔ組成物を含む混合物を生成するために、糖界面活性剤を含む緩衝液を用いて、Ｗｎｔポリペプチド−シャペロン複合体の溶出した混合物をインキュベートする工程；（ｃ）機能的に活性なＷｎｔポリペプチドと糖界面活性剤を含む第２のＷｎｔ組成物を生成するために、スルホン化された多環芳香族化合物で固定されたカラムを用いて上記混合物から第１のＷｎｔ組成物を分離する工程；（ｄ）第３のＷｎｔ組成物を生成するために、抗体のＦｃ部分と相互作用するポリペプチドを含む第２の親和性クロマトグラフィーカラム、混合モードカラム、およびサイズ排除クロマトグラフィーカラムと並行して第２のＷｎｔ組成物を随意に精製する工程；および、（ｅ）機能的に活性なＷｎｔポリペプチドを含む最終的なＷｎｔ組成物を生成するために、第３のＷｎｔ組成物を、リポソームの水溶液に接触させる工程、を含む。いくつかの実施形態において、第１の親和性クロマトグラフィーカラムと第２の親和性クロマトグラフィーカラムはそれぞれ独立して、プロテインＡカラムである。いくつかの実施形態において、混合モードカラムの溶出緩衝液は、約０．１Ｍから約２Ｍ、約０．１Ｍから約１Ｍ、あるいは約０．１Ｍから約０．５Ｍのアルギニンを含む。いくつかの実施形態において、第２の親和性クロマトグラフィーカラム、混合モードカラム、およびサイズ排除クロマトグラフィーカラムの各々の溶出緩衝液は、糖界面活性剤を含む。いくつかの実施形態において、工程ｂ）の分離は、第１の塩濃度の第１の緩衝溶液と第２の塩濃度の第２の緩衝溶液を含むステップ勾配で第１のＷｎｔ組成物を溶出することを含む。いくつかの実施形態では、第１の緩衝溶液は、約１０ｍＭから約１００ｍＭの濃度の塩を含む。いくつかの実施形態において、第１の緩衝溶液は、約１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、あるいはそれよりも高い濃度の塩を含む。いくつかの実施形態において、第２の緩衝溶液は、約１Ｍ、１．５Ｍ、２Ｍ、あるいはそれよりも高い濃度の塩を含む。いくつかの実施形態において、塩は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、リン酸カルシウム、リン酸カリウム、リン酸マグネシウム、リン酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、あるいはリン酸アンモニウムを含む。いくつかの実施形態では、シャペロンはＦｒｉｚｚｌｅｄ  タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、シャペロンはＷｎｔｌｅｓｓを含む。いくつかの実施形態では、シャペロンはＡｆａｍｉｎを含む。いくつかの実施形態では、シャペロンはＦｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質を含む���いくつかの実施形態において、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質は、切断されたＦｒｉｚｚｌｅｄ−８タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、切断されたＦｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質のシステイン豊富領域（ＣＲＤ）を含む。いくつかの実施形態において、切断されたＦｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸残基２５からアミノ酸残基１７２まで及ぶ領域を含む。いくつかの実施形態において、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質はＩｇＧ  Ｆｃ部分を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、あるいは９９％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、あるいは９９％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔポリペプチドは異種のシグナル配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔポリペプチドは天然のシグナル配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔポリペプチドはタグを含む。いくつかの実施形態において、タグはＨＩＳ（６ｘ）−タグ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）、ＦＬＡＧタグ、あるいはＰＡタグを含む。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ３Ａポリペプチド、Ｗｎｔ５Ｂポリペプチド、あるいはＷｎｔ１０Ｂポリペプチドである。いくつかの実施形態において、ＷｎｔポリペプチドはＷｎｔ３Ａポリペプチドである。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対して、約９０％、９５％、９９％、あるいはそれよりも高い配列同一性を含むポリペプチドである。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、約１〜約３３のアミノ酸の切断を含む。いくつかの実施形態では、切断はＣ末端切断である。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、Ｃ末端切断を有するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のポリペプチドである。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に対して、約９０％、９５％、９９％、あるいはよりも多い配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２からなる。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に記載のアミノ酸残基２０９に対応するアミノ酸位置において脂質修飾を含む。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔポリペプチドはパルミチン酸で修飾される。いくつかの実施形態において、第２の親和性クロマトグラフィーカラムは、第２のＷｎｔ組成物から残りのＦｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質を取り除く。いくつかの実施形態において、混合モードカラムは、第２のＷｎｔ組成物からＷｎｔポリペプチド断片を取り除く。いくつかの実施形態において、サイズ排除クロマトグラフィーカラムは、第３のＷｎｔ組成物を生成するために、第２のＷｎｔ組成物から残りのＷｎｔポリペプチド断片を取り除く。いくつかの実施形態��おいて、第２のＷｎｔ組成物は、糖界面活性剤のない状態で精製される同等のＷｎｔ組成物に対して、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、あるいは９９％を超えて純粋である。いくつかの実施形態において、第３のＷｎｔ組成物は、糖界面活性剤のない状態で精製される同等のＷｎｔ組成物に対して、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、あるいは９９％を超えて純粋である。いくつかの実施形態において、最終的なＷｎｔ組成物は、約１０ｎｍから約Ιμｍ、１０ｎｍから約５００ｎｍ、約５０ｎｍから約３００ｎｍ、約５０ｎｍから約２００ｎｍ、約１００ｎｍから約５００ｎｍ、約１００ｎｍから約３００ｎｍ、あるいは約１００ｎｍから約２００ｎｍまでのリポソーム粒度分布を有する。いくつかの実施形態において、最終的なＷｎｔ組成物は、約１μｍ未満、約５００ｎｍ未満、約３００ｎｍ未満、約２００ｎｍ未満、あるいは約１５０ｎｍ未満のリポソーム粒度分布を有する。いくつかの実施形態において、複数のＷｎｔポリペプチド−シャペロン複合体はさらに、Ｗｎｔポリペプチドとシャペロンを共発現する細胞を含む調整培地から収穫される。いくつかの実施形態では、細胞はｃＧＭＰ適合性細胞である。いくつかの実施形態において、ｃＧＭＰ適合性細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞株、あるいはベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞株から随意に選択された、ｃＧＭＰ適合性哺乳動物細胞である。
【０００６】
ある実施形態では、機能的に活性なＷｎｔポリペプチドを調製する方法が本明細書に開示され、上記方法は：（ａ）複数のＷｎｔポリペプチド−シャペロン複合体を生成するために、調整培地中の細胞においてＷｎｔポリペプチドとシャペロンを共発現する工程；（ｂ）調整培地から複数のＷｎｔポリペプチド−シャペロン複合体を収穫する工程；（ｃ）機能的に不活性なＷｎｔポリペプチドとシャペロン組成物を含む第１のＷｎｔ組成物を含む混合物を生成するために、糖界面活性剤を含む緩衝液を用いて、複数のＷｎｔポリペプチド−シャペロン複合体をインキュベートする工程；（ｄ）機能的に活性なＷｎｔポリペプチドと糖界面活性剤を含む第２のＷｎｔ組成物を生成するために、スルホン化された多環芳香族化合物で固定されたカラムを用いて上記混合物から第１のＷｎｔ組成物を分離する工程；および、（ｅ）機能的に活性なＷｎｔポリペプチドを含む最終的なＷｎｔ組成物を生成するために、第２のＷｎｔ組成物を、リポソームの水溶液に接触させる工程、を含む。いくつかの実施形態において、糖界面活性剤はグルコシド界面活性剤を含む。いくつかの実施形態において、グルコシド界面活性剤は、ｎ−ヘキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−オクチル−α−Ｄ−グルコピラノシド、オクチルβ−Ｄ−１−チオグルコピラノシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、ｎ−ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−デシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、あるいはメチル−６−Ｏ−（Ｎ−ヘプチルカルバモイル）−α−Ｄ−グルコピラノシドである。いくつかの実施形態において、グルコシド界面活性剤は、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドおよびオクチルβ−Ｄ−１−チオグルコピラノシドから選択される。いくつかの実施形態において、グルコシド界面活性剤はｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドである。いくつかの実施形態において、グルコシド界面活性剤はオクチルβ−Ｄ−１−チオグルコピラノシドである。いくつかの実施形態において、糖界面活性剤はマルトシド界面活性剤を含む。いくつかの実施形態において、マルトシド界面活性剤は、ｎ−デシル−β−Ｄ−マルトピラノシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド、あるいは６−シクロヘキシル−１−ヘキシル−β−Ｄ−マルトピラノシドである。いくつかの実施形態において、緩衝液中の糖界面活性剤の濃度は：約０．１％〜約５％ｗ／ｖ；あるいは、約０．１％、０．５％、１％、１．５％、あるいは約２％ｗ／ｖである。いくつかの実施形態では、第２のＷｎｔ組成物は、少なくとも一度、第３のＷｎｔ組成物を生成するために、抗体のＦｃ部分と相互作用するポリペプチドを含む親和性クロマトグラフィーカラム、混合モードカラム、サイズ排除クロマトグラフィー−カラム、あるいはこれらの組み合わせを用いてさらに精製される。いくつかの実施形態において、複数のＷｎｔポリペプチド−シャペロン複合体はさらに、第１のＷｎｔ組成物を含む混合物を生成するために、緩衝液を用いてインキュベートする前に、抗体のＦｃ部分と相互作用するポリペプチドを含む親和性クロマ��グラフィーカラムを用いて精製される。いくつかの実施形態において、親和性クロマトグラフィーカラムはプロテインＡカラムである。いくつかの実施形態において、複数のＷｎｔポリペプチド−シャペロン複合体は、５未満、４未満、あるいは３未満のｐＨを含む緩衝液を用いて、親和性クロマトグラフィーカラムから溶出される。いくつかの実施形態では、上記方法は：（ａ）Ｗｎｔポリペプチド−シャペロン複合体の溶出した混合物を生成するために、抗体のＦｃ部分と相互作用するポリペプチドを含む第１の親和性クロマトグラフィーカラムで複数のＷｎｔポリペプチド−シャペロン複合体を精製する工程；（ｂ）機能的に不活性なＷｎｔポリペプチドとシャペロン組成物を含む第１のＷｎｔ組成物を含む混合物を生成するために、糖界面活性剤を含む緩衝液を用いて、Ｗｎｔポリペプチド−シャペロン複合体の溶出した混合物をインキュベートする工程；（ｃ）機能的に活性なＷｎｔポリペプチドと糖界面活性剤を含む第２のＷｎｔ組成物を生成するために、スルホン化された多環芳香族化合物で固定されたカラムを用いて上記混合物から第１のＷｎｔ組成物を分離する工程；（ｄ）第３のＷｎｔ組成物を生成するために、抗体のＦｃ部分と相互作用するポリペプチドを含む第２の親和性クロマトグラフィーカラム、混合モードカラム、およびサイズ排除クロマトグラフィー−カラムと並行して第２のＷｎｔ組成物を随意に精製する工程；および、（ｅ）機能的に活性なＷｎｔポリペプチドを含む最終的なＷｎｔ組成物を生成するために、第３のＷｎｔ組成物を、リポソームの水溶液に接触させる工程、を含む。いくつかの実施形態において、第１の親和性クロマトグラフィーカラムと第２の親和性クロマトグラフィーカラムはそれぞれ独立して、プロテインＡカラムである。いくつかの実施形態において、混合モードカラムの溶出緩衝液は、約０．１Ｍから約２Ｍ、約０．１Ｍから約１Ｍ、あるいは約０．１Ｍから約０．５Ｍのアルギニンを含む。いくつかの実施形態において、第２の親和性クロマトグラフィーカラム、混合モードカラム、およびサイズ排除クロマトグラフィー−カラムの各々の溶出緩衝液は、糖界面活性剤を含む。いくつかの実施形態において、工程ｄ）の分離は、第１の塩濃度の第１の緩衝溶液と第２の塩濃度の第２の緩衝溶液を含むステップ勾配で第１のＷｎｔ組成物を溶出することを含む。いくつかの実施形態において、第１の緩衝溶液は、約１０ｍＭから約１００ｍＭ；あるいは、約１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、またはそれよりも高い濃度の塩を含む。いくつかの実施形態において、第２の緩衝溶液は、約１Ｍ、１．５Ｍ、２Ｍ、あるいはそれよりも高い濃度の塩を含む。いくつかの実施形態において、塩は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、リン酸カルシウム、リン酸カリウム、リン酸マグネシウム、リン酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、あるいはリン酸アンモニウムを含む。いくつかの実施形態では、シャペロンはＦｒｉｚｚｌｅｄ  タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、シャペロンはＦｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質は、切断されたＦｒｉｚｚｌｅｄ−８タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、切断されたＦｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質のシステイン豊富領域（ＣＲＤ）を含む。いくつかの実施形態において、切断されたＦｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸残基２５からアミノ酸残基１７２まで及ぶ領域を含む。いくつかの実施形態において、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質はＩｇＧ  Ｆｃ部分を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、あるいは９９％の配列同一性；または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、あるいは９９％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔポリペプチドは、異種のシグナル配列あるいは天然のシグナル配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔポリペプチドは、タグ、随意にＨＩＳ（６ｘ）−タグ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）、ＦＬＡＧタグ、あるいはＰＡタグを含む。いくつかの実施形態において、ＷｎｔポリペプチドはＷｎｔ３Ａポリペプチドである。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対して、約９０％、９５％、９９％、あるいはそれよりも高い配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、約１〜約３３のアミノ酸の切断、随意にＣ末端切断を含む。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に対して、約９０％、９５％、９９％、あるいはそれよりも高い配列同一性を含むか、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２からなる。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に記載のアミノ酸残基２０９に対応するアミノ酸位置において脂質修飾を含む。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔポリペプチドはパルミチン酸で修飾される。いくつかの実施形態において、第２の親和性クロマトグラフィーカラムは、第２のＷｎｔ組成物から残りのＦｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質を取り除く。いくつかの実施形態において、混合モードカラムは、第２のＷｎｔ組成物からＷｎｔポリペプチド断片を取り除く。いくつかの実施形態において、サイズ排除クロマトグラフィーカラムは、第３のＷｎｔ組成物を生成するために、第２のＷｎｔ組成物から残りのＷｎｔポリペプチド断片を取り除く。いくつかの実施形態において、第２のＷｎｔ組成物は、糖界面活性剤のない状態で精製される同等のＷｎｔ組成物に対して、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、あるいは９９％を超えて純粋である。いくつかの実施形態において、第３のＷｎｔ組成物は、糖界面活性剤のない状態で精製される同等のＷｎｔ組成物に対して、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、あるいは９９％を超えて純粋である。いくつかの実施形態において、最終的なＷｎｔ組成物は、以下のリポソーム粒度分布を有する：約��０ｎｍから約１μｍ、１０ｎｍから約５００ｎｍ、約５０ｎｍから約３００ｎｍ、約５０ｎｍから約２００ｎｍ、約５０ｎｍから約１５０ｎｍ、約１００ｎｍから約５００ｎｍ、約１００ｎｍから約３００ｎｍ、あるいは約１００ｎｍから約２００ｎｍまで；約１μｍ未満、約５００ｎｍ未満、約３００ｎｍ未満、約２００ｎｍ未満、あるいは約１５０ｎｍ未満；または、約５０ｎｍ、約１００ｎｍ、あるいは、約１５０ｎｍ。
【０００７】
ある実施形態では、上記の方法によって生成された機能的に活性なＷｎｔポリペプチドが本明細書に開示される。
【０００８】
ある実施形態では、上記の方法によって生成された機能的に活性なＷｎｔポリペプチドを含むリポソームＷｎｔ組成物が本明細書に開示される。
【０００９】
ある実施形態では、被験体の骨移植片における細胞生存を増強する方法が本明細書に開示され、上記方法は：（ａ）上記の方法によって生成されたリポソームＷｎｔポリペプチドを含む組成物を用いて、エクスビボで細胞を含む単離された哺乳動物の骨移植片材料を含むサンプルをインキュベートする工程；および、（ｂ）標的部位へ増強された細胞を移植する工程、を含む。いくつかの実施形態において、工程ａ）の細胞は、少なくとも１０分、２０分、３０分、１時間、２時間、３時間、６時間、あるいはそれ以上インキュベートされる。いくつかの実施形態において、工程ａ）の細胞は、ほぼ室温あるいは約３７°Ｃでインキュベートされる。いくつかの実施形態において、増強された細胞は、暴露されていない哺乳動物の骨移植片材料に対して増強された骨形成能力を含む。
【００１０】
ある実施形態では、被験体の骨欠損部位における細胞生存を増強する方法が本明細書に開示され、上記方法は：上記方法によって生成されたリポソームＷｎｔポリペプチドを含む組成物を、骨欠損部位へ投与する工程を含み、リポソームＷｎｔポリペプチドは骨欠損部位における細胞生存を増強する。いくつかの実施形態において、上記方法はさらに、骨欠損部位における歯科用あるいは整形外科用インプラントを投与する工程を含む。いくつかの実施形態において、歯科用あるいは整形外科用インプラントは、リポソームＷｎｔポリペプチドを含む組成物の投与前に、骨欠損部位に投与される。いくつかの実施形態において、歯科用あるいは整形外科用インプラントは、リポソームＷｎｔポリペプチドを含む組成物の投与後に、骨欠損部位に投与される。いくつかの実施形態において、歯科用あるいは整形外科用インプラントは、リポソームＷｎｔポリペプチドを含む組成物の投与の約１日、２日、５日、７日、２週間、３０日、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、あるいはそれ以上後に、骨欠損部位に投与される。いくつかの実施形態において、歯科用あるいは整形外科用インプラントと、リポソームＷｎｔポリペプチドを含む組成物は、骨欠損部位に同時に投与される。いくつかの実施形態において、リポソームＷｎｔポリペプチドは、歯科用あるいは整形外科用インプラントの骨結合を増強する。いくつかの実施形態では、被験体はヒトである。
【００１１】
ある実施形態では、精製されたＷｎｔポリペプチド中間体と約０．１％から約５％ｗ／ｖの濃度の糖界面活性剤とを含むＷｎｔ組成物が本明細書に開示される。いくつかの実施形態において、糖界面活性剤はグルコシド界面活性剤を含む。いくつかの実施形態において、グルコシド界面活性剤は、ｎ−ヘキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−オクチル−α−Ｄ−グルコピラノシド、オクチルβ−Ｄ−１−チオグルコピラノシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、ｎ−ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−デシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、あるいはメチル−６−Ｏ−（Ｎ−ヘプチルカルバモイル）−α−Ｄ−グルコピラノシドである。いくつかの実施形態において、グルコシド界面活性剤は、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドおよびオクチルβ−Ｄ−１−チオグルコピラノシドから選択される。いくつかの実施形態において、グルコシド界面活性剤はｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドである。いくつかの実施形態において、グルコシド界面活性剤はオクチルβ−Ｄ−１−チオグルコピラノシドである。いくつかの実施形態において、糖界面活性剤はマルトシド界面活性剤を含む。いくつかの実施形態において、マルトシド界面活性剤は、ｎ−デシル−β−Ｄ−マルトピラノシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド、あるいは６−シクロヘキシル−１−ヘキシル−β−Ｄ−マルトピラノシドである。いくつかの実施形態において、糖界面活性剤の濃度は、約０．１％、０．５％、１％、１．５％、あるいは約２％ｗ／ｖである。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔ組成物は約５、５．５、あるいは６のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔ組成物は、約１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、あるいは５０ｍＭの濃度で酢酸塩を含む緩衝液を含んでいる。いくつかの実施形態において、精製されたＷｎｔポリペプチド中間体は、以下の工程から得られる：（ａ）複数のＷｎｔポリペプチド−シャペロン複合体を生成するために、調整培地中の細胞においてＷｎｔポリペプチドとシャペロンを共発現する工程；（ｂ）調整培地から複数のＷｎｔポリペプチド−シャペロン複合体を収穫する工程；（ｃ）機能的に不活性なＷｎｔポリペプチドとシャペロン組成物を含む第１のＷｎｔ組成物を含む混合物を生成するために、糖界面活性剤を含む緩衝液を用いて、複数のＷｎｔポリペプチド−シャペロン複合体をインキュベートする工程；および、（ｄ）精製されたＷｎｔポリペプチド中間体と糖界面活性剤を含むＷｎｔ組成物を生成するために、スルホン化された多環芳香族化合物を用いて固定されたカラム、抗体のＦｃ部分と相互作用するポリペプチドを含む親和性クロマトグラフィーカラム、混合モードカラム、サイズ排除クロマトグラフィー−カラム、あるいはこれらの組み合わせを用いて、上記混合物から第１のＷｎｔ組成物を精製する工程、を含む。いくつかの実施形態において、ＷｎｔポリペプチドはＷｎｔ３Ａポリペプチドである。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ���１に対して、約９０％、９５％、９９％、あるいはそれよりも高い配列同一性を含むポリペプチドである。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、約１〜約３３のアミノ酸の切断、随意にＣ末端切断を含む。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に対して、約９０％、９５％、９９％、あるいはそれよりも高い配列同一性を含むか、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２からなる。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に記載のアミノ酸残基２０９に対応するアミノ酸位置において脂質修飾を含む。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔポリペプチドはパルミチン酸で修飾される。いくつかの実施形態において、精製されたＷｎｔポリペプチド中間体の濃度は、約２０ｇ／ｍＬ〜約５０  ｇ／ｍＬ、約２５μｇ／ｍＬ〜約５０μｇ／ｍＬ、約３０μｇ／ｍＬ〜約５０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ  ｍＬ〜約４０μｇ／ｍＬ、約２５μｇ／ｍＬ〜約４０μｇ／ｍＬ、約２５μｇ／ｍＬ〜約３０μｇ／ｍＬ、約３０μｇ／ｍＬ〜約５０μｇ／ｍＬ、あるいは、約３０μｇ／ｍＬ〜約４０μｇ／ｍＬ；または、約２０μｇ／ｍＬ、約２５μｇ  ｍＬ、約３０μｇ／ｍＬ、約３５μｇ／ｍＬ、約４０μｇ  ｍＬ、約４５μｇ／ｍＬ、あるいは、約５０μｇ／ｍＬである。
【００１２】
ある実施形態において、Ｗｎｔ培養系が本明細書に開示され、上記Ｗｎｔ培養系は、（ａ）最小血清培地；（ｂ）最小血清培地にあるＷｎｔポリペプチド−シャペロン複合体；および、（ｃ）Ｗｎｔポリペプチドをコードする第１の発現ベクターとシャペロンをコードする第２の発現ベクターをトランスフェクトされた操作された細胞株からの細胞を含み、ここで、Ｗｎｔポリペプチドとシャペロンは、細胞中で共発現され、細胞は最小血清培地の存在下で育てられる。いくつかの実施形態では、シャペロンはＦｒｉｚｚｌｅｄ  タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、シャペロンはＷｎｔｌｅｓｓを含む。いくつかの実施形態では、シャペロンはＡｆａｍｉｎを含む。いくつかの実施形態では、シャペロンはＦｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質は、切断されたＦｒｉｚｚｌｅｄ−８タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、切断されたＦｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質のシステイン豊富領域（ＣＲＤ）を含む。いくつかの実施形態において、切断されたＦｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸残基１からアミノ酸残基１５１、あるいは、アミノ酸残基１からアミノ酸残基１７２まで及ぶ領域を含む。いくつかの実施形態において、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質はＩｇＧ  Ｆｃ部分を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、あるいは９９％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、あるいは９９％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔポリペプチドはタグを含む。いくつかの実施形態において、タグはＨＩＳ−タグ、ＦＬＡＧタグ、あるいはＰＡタグを含む。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔポリペプチドは異種のシグナル配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔポリペプチドは天然のシグナル配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ３Ａポリペプチド、Ｗｎｔ５Ｂポリペプチド、あるいはＷｎｔ１０Ｂポリペプチドである。いくつかの実施形態において、ＷｎｔポリペプチドはＷｎｔ３Ａポリペプチドである。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対して、約９０％、９５％、９９％、あるいはそれよりも高い配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、約１〜約３３のアミノ酸の切断を含む。いくつかの実施形態では、切断はＣ末端切断である。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、Ｃ末端切断を有するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のポリペプチドである。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に対して、約９０％、９５％、９９％、あるいはよりも多い配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは��ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２からなる。いくつかの実施形態では、操作された細胞株は、ｃＧＭＰ適合性細胞株である。いくつかの実施形態では、操作された細胞株は、ｃＧＭＰ適合性哺乳動物細胞株である。いくつかの実施形態において、ｃＧＭＰ適合性哺乳動物細胞株は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞株、あるいはベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞株である。いくつかの実施形態において、ｃＧＭＰ適合性哺乳動物細胞株は、ＣＨＯ−ＳあるいはＣＨＯ−ｋ１誘導体細胞株である。いくつかの実施形態において、第１の発現ベクターおよび第２の発現ベクターはそれぞれ独立して、ｃＧＭＰ適合性ベクターである。いくつかの実施形態において、第１の発現ベクターおよび第２の発現ベクターはそれぞれ独立して、哺乳動物のベクターである。いくつかの実施形態において、哺乳動物のベクターは、ＯｐｔｉｃＶｅｃ、ｐＴａｒｇｅｔ、ｐｃＤＮＡ４ＴＯ４、ｐｃＤＮＡ４．０、ＵＣＯＥ発現ベクター、あるいはＧＳ系発現ベクターである。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
本開示の様々な態様が、添付の請求項において具体的に明記されている。本開示の特徴と利点についてのよりよい理解は、本開示の原則が用いられている例証的な実施形態と添付の図面を説明する以下の詳細な記載を参照することによって得られる：
【図１】外因性のＦｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質（Ｆｚ−１５１−Ｆｃ）の存在下における、あるいいは、共発現されたＦｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質（Ｆｚ−１５１−Ｆｃ）の存在下におけるＷｎｔ３Ａ発現に関する比較研究を例証する。
【図２Ａ】Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質（Ｆｚ−１５１−Ｆｃ）の共発現は、Ｗｎｔ３Ａ凝集を減少させ（図２Ａ）、Ｗｎｔ３Ａ単量体の量をさらに増加させる（図２Ｂ）。Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは安定した細胞株から生成された。
【図２Ｂ】Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質（Ｆｚ−１５１−Ｆｃ）の共発現は、Ｗｎｔ３Ａ凝集を減少させ（図２Ａ）、Ｗｎｔ３Ａ単量体の量をさらに増加させる（図２Ｂ）。Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは安定した細胞株から生成された。
【図３】本明細書に記載された４つの例示的な精製戦略を例証する。
【図４Ａ】戦略１の精製の詳細を例証する。図４Ａは、戦略１の例示的な精製スキームを示す。
【図４Ｂ】戦略１の精製の詳細を例証する。図４Ｂは、様々な画分の銀染色を示す。条件は非還元条件である。
【図４Ｃ】戦略１の精製の詳細を例証する。図４Ｃは、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドの存在と濃度を判定するための様々な画分のウエスタンブロット分析を示す。
【図４Ｄ】戦略１の精製の詳細を例証する。図４Ｄは、ＬＳＬアッセイにおけるＷｎｔ３Ａポリペプチドの活性を例証する。
【図５Ａ】戦略２の精製の詳細を例証する。図５Ａは、プロテインＡ画分のクマシー染色を例証する。
【図５Ｂ】戦略２の精製の詳細を例証する。図５Ｂは、様々な画分の銀染色を示す。
【図５Ｃ】戦略２の精製の詳細を例証する。図５Ｃは、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドの存在と濃度を判定するための様々な画分のウエスタンブロット分析を示す。
【図５Ｄ】戦略２の精製の詳細を例証する。図５Ｄは、ＬＳＬアッセイにおけるＷｎｔ３Ａポリペプチドの活性を例証する。
【図６Ａ】戦略３の精製の詳細を例証する。図６Ａは様々な画分の銀染色を示す。
【図６Ｂ】戦略３の精製の詳細を例証する。図６Ｂは、ＬＳＬアッセイにおけるＷｎｔ３Ａポリペプチドの活性を例証する。
【図７Ａ】戦略４のための精製の詳細を例証する。図７Ａは、プロテインＡ画分のクマシー染色を示す。
【図７Ｂ】戦略４のための精製の詳細を例証する。図７Ｂは、様々な画分の銀染色を示す。
【図７Ｃ】戦略４のための精製の詳細を例証する。図７Ｃは、ＬＳＬアッセイにおけるＷｎｔ３Ａポリペプチドの活性を例証する。
【図８Ａ】Ｗｎｔｌｅｓｓ（ＷＬＳ）を用いるＷｎｔ３Ａポリペプチドの共発現を例証する。図８Ａは、共発現したＷｎｔｌｅｓｓの存在下でのＷｎｔ３Ａ発現の増加を示す。
【図８Ｂ】Ｗｎｔｌｅｓｓ（ＷＬＳ）を用いるＷｎｔ３Ａポリペプチドの共発現を例証する。図８Ｂは、ＬＳＬアッセイにおけるＷｎｔ３Ａポリペプチドの活性を示す。
【図８Ｃ】Ｗｎｔｌｅｓｓ（ＷＬＳ）を用いるＷｎｔ３Ａポリペプチドの共発現を例証する。図８Ｃは、安定した細胞株におけるＷｎｔ３Ａの発現を示す。
【図９】Ａｆａｍｉｎを用いるＷｎｔ３Ａの共発現を例証する。
【図１０Ａ】それぞれＰＡ、ＦＬＡＧ、および、Ｈｉｓタグでタグ付けされた、３つの例示的なＷｎｔ３Ａポリペプチドの発現と活性を例証する。図１０Ａは、分泌されたタグ付きＷｎｔ３Ａポリペプチドの濃度を例証する。
【図１０Ｂ】それぞれＰＡ、ＦＬＡＧ、および、Ｈｉｓタグでタグ付けされた、３つの例示的なＷｎｔ３Ａポリペプチドの発現と活性を例証する。図１０Ｂは、ＬＳＬアッセイにおけるＷｎｔ３Ａポリペプチドの活性を示す。
【図１１】様々なＨｉｓ−タグ−リンカー構築物を含むＷｎｔ３Ａ変異体（ΑΚΤ３５２ｈｉｓ変異体）の活性を示す。
【図１２】Ｎｉ−ＮＴＡカラムからのＷｎｔ３Ａ変異体−ＡＲＴ３５２ｈｉｓの様々な画分の活性を示す。
【図１３Ａ】ＥＬＩＳＡアッセイにおけるＷｎｔ３Ａポリペプチドの濃度を示す。
【図１３Ｂ】ＥＬＩＳＡアッセイにおけるＷｎｔ３Ａポリペプチドの濃度を示す。
【図１３Ｃ】ＥＬＩＳＡアッセイにおけるＷｎｔ３Ａポリペプチドの濃度を示す。
【図１４】ＦＬＡＧ−タグ付けされたＷｎｔ３Ａポリペプチド：ＦＬＡＧ−ＴＥＶ−ｈＷｎｔ３Ａの精製の精製スキームを例証する。
【図１５Ａ】ＦＬＡＧ−タグ付けされたＷｎｔ３Ａポリペプチドの活性と濃度を示す。図１５Ａ〜図１５Ｃは、ＬＳＬアッセイにおけるＷｎｔ３Ａポリペプチドの活性を示す。
【図１５Ｂ】ＦＬＡＧ−タグ付けされたＷｎｔ３Ａポリペプチドの活性と濃度を示す。図１５Ａ〜図１５Ｃは、ＬＳＬアッセイにおけるＷｎｔ３Ａポリペプチドの活性を示す。
【図１５Ｃ】ＦＬＡＧ−タグ付けされたＷｎｔ３Ａポリペプチドの活性と濃度を示す。図１５Ａ〜図１５Ｃは、ＬＳＬアッセイにおけるＷｎｔ３Ａポリペプチドの活性を示す。
【図１５Ｄ】ＦＬＡＧ−タグ付けされたＷｎｔ３Ａポリペプチドの活性と濃度を示す。図１５Ｄ〜図１５Ｆは、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドの濃度を示す。
【図１５Ｅ】ＦＬＡＧ−タグ付けされたＷｎｔ３Ａポリペプチドの活性と濃度を示す。図１５Ｄ〜図１５Ｆは、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドの濃度を示す。
【図１５Ｆ】ＦＬＡＧ−タグ付けされたＷｎｔ３Ａポリペプチドの活性と濃度を示す。図１５Ｄ〜図１５Ｆは、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドの濃度を示す。
【図１６Ａ】０．７５Ｌの培養物から培養されたＷｎｔ３Ａの活性を示す。図１６Ａ：ヘパリン精製から得られた画分；
【図１６Ｂ】０．７５Ｌの培養物から培養されたＷｎｔ３Ａの活性を示す。図１６Ｂ：標準偏差を例証する；
【図１６Ｃ】０．７５Ｌの培養物から培養されたＷｎｔ３Ａの活性を示す。図１６Ｃ：ヘパリン画分あたりのＬＵＣ／ＬＡＣ。
【図１７Ａ】１０Ｌの培養物から培養されたＷｎｔ３Ａの活性と濃度を示す。図１７Ａ：ヘパリン精製から得られた画分；
【図１７Ｂ】１０Ｌの培養物から培養されたＷｎｔ３Ａの活性と濃度を示す。図１７Ｂ：標準偏差を例証する；
【図１７Ｃ】１０Ｌの培養物から培養されたＷｎｔ３Ａの活性と濃度を示す。図１７Ｃ：ヘパリン画分あたりのＬＵＣ／ＬＡＣ；
【図１７Ｄ】１０Ｌの培養物から培養されたＷｎｔ３Ａの活性と濃度を示す。図１７Ｄ：採取された１つの画分当たりのＷｎｔ３Ａの濃度；
【図１７Ｅ】１０Ｌの培養物から培養されたＷｎｔ３Ａの活性と濃度を示す。図１７Ｅ：図１７Ｄに関して標準偏差を例証する；
【図１７Ｆ】１０Ｌの培養物から培養されたＷｎｔ３Ａの活性と濃度を示す。図１７Ｆ：例示的な画分からの最終濃度を例証する。
【図１８】ｈＦＺＤ８  ＣＲＤ−Ｆｃを有する複合体中のＷｎｔ３Ａの活性を例証する。
【図１９】本明細書に記載された例示的な精製スキームを例証する。
【図２０Ａ】１％ＣＨＡＰＳ（図２０Ａ）あるいは１％ＯＧＰ（図２０Ｂ）のいずれかによるＷｎｔ３Ａ（ＡＲＴ３５２）精製の例示的なゲル画像を示す。
【図２０Ｂ】１％ＣＨＡＰＳ（図２０Ａ）あるいは１％ＯＧＰ（図２０Ｂ）のいずれかによるＷｎｔ３Ａ（ＡＲＴ３５２）精製の例示的なゲル画像を示す。
【図２１Ａ】１％ＯＧＰ（図２１Ａ）あるいは１％ＣＨＡＰＳ（図２１Ｂ）中のＷＮＴ３Ａ（ＡＲＴ３５２）溶出液のＬＳＬ活性を例証する。
【図２１Ｂ】１％ＯＧＰ（図２１Ａ）あるいは１％ＣＨＡＰＳ（図２１Ｂ）中のＷＮＴ３Ａ（ＡＲＴ３５２）溶出液のＬＳＬ活性を例証する。
【図２２】混合モードカラムによる精製の例示的なゲル画像を例証する。
【図２３Ａ】１％ＣＨＡＰＳ（図２３Ａ）あるいは１％ＯＧＰ（図２３Ｂ）を含むいずれかの緩衝液で精製されたＷｎｔ３Ａポリペプチドを例証する。
【図２３Ｂ】１％ＣＨＡＰＳ（図２３Ａ）あるいは１％ＯＧＰ（図２３Ｂ）を含むいずれかの緩衝液で精製されたＷｎｔ３Ａポリペプチドを例証する。
【図２４Ａ】ＣＨＡＰＳと比較して、２つの異なる温度、４°Ｃ（図２４Ａ）と２３°Ｃ（図２４Ｂ）でＯＧＰがＷＮＴ３Ａタンパク質を安定させることを例証する。
【図２４Ｂ】ＣＨＡＰＳと比較して、２つの異なる温度、４°Ｃ（図２４Ａ）と２３°Ｃ（図２４Ｂ）でＯＧＰがＷＮＴ３Ａタンパク質を安定させることを例証する。
【図２５】例示的なリポソームＷｎｔ３Ａ製剤化プロセスを例証する。
【図２６】例示的なＷｎｔ３ＡポリペプチドＡＲＴ３５２を使用して、代表的な標準曲線を例証する。感度範囲は、約０．００３μｇ／ｍＬから約１．６μｇ／ｍＬまでであった。
【図２７】自家移植片における細胞の生存率に対する溶液条件の効果を示す。ゼロ時点（白い棒）と比較して、２時間の生理食塩水中のインキュベーションは、自家移植片においてアポトーシス細胞の割合の倍加を引き起こす。これに対して、ＡＲＴ３５２−Ｌでのインキュベーションは、アポトーシスの時間依存性および温度依存性の増加を、対照自家移植片で観察されたレベルまで、再度減少させる。
【図２８】自家移植片における細胞の生存率に対する温度効果を示す。生理食塩水中で保持されたサンプルについては、４°Ｃの保持温度は自家移植片における細胞死を減少させるが、その一方で、３７°Ｃの保持温度は、自家移植片中における細胞死を増加させる。
【図２９】例示的なリポソームＷｎｔ３ＡポリペプチドＡＲＴ３５２−Ｌのエンドサイトーシスに対する時間と温度の効果を示す。ＤｉＩ標識されたＡＲＴ３５２−Ｌのエンドサイトーシスは、時間と温度に応じて増加する。これらのデータは、１５分から２時間のエクスビボ保持の意図された期間について、３７°Ｃでのインキュベーションが栄養吸収を支持することを示唆している。データは、ＡＲＴ３５２−Ｌの取り込みが、標準的な自家移植片の取扱いに関連する細胞死を改善することを実証している。
【図３０】時間と温度に応じたＡＲＴ３５２−Ｌ安定性を示す。２時間の間に、ＡＲＴ３５２−Ｌは最小限の活性低下（４．９％）を示す。
【図３１】インキュベーション溶液からの活性なＡＲＴ３５２−Ｌのエンドサイトーシス除去を示す。自家移植片のない状態では、ＡＲＴ３５２−Ｌレベルはインキュベーション溶液中で１００％のままである。自家移植片のある状態では、溶液からの活性なＡＲＴ３５２−Ｌの除去は、温度と時間に依存して起こる。
【図３２】ＡＲＴ３５２−Ｌで処置された自家移植片に関連づけられる、遊離した活性なＡＲＴ３５２−Ｌの評価を示す。ＡＲＴ３５２−Ｌで処置された自家移植片は、エクスビボのインキュベーション工程の温度または持続時間にかかわらず、残りの、遊離した、活性なＡＲＴ３５２のいかなる証拠も示していない。
【図３３】インキュベーション溶液からのＡＲＴ３５２−Ｌ除去と自家移植片に由来する細胞による取り込みを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
Ｗｎｔｓは、骨形成のプログラムに関連する多種多様な細胞の決定に関与する。例えば、Ｗｎｔｓは、間葉系前駆細胞の骨格形成運命に影響を与える２つの転写因子であるｓｏｘ９とＲｕｎｘ２の発現レベルを調節する。Ｗｎｔｓはさらに、骨芽細胞または軟骨細胞のいずれかへの細胞の分化に影響を与える。成体動物では、Ｗｎｔシグナル伝達が骨量を調節するという多くの証拠がある。例えば、Ｗｎｔシグナル伝達を増加させる機能獲得突然変異は、１型骨粗鬆症を含むいくつかの高骨量症候群、および、骨内膜の過骨症あるいは常染色体優性骨硬化症に関連する。Ｗｎｔシグナル伝達を減少させる機能突然変異の喪失は、低骨量疾患、骨粗鬆症偽神経膠腫を引き起こす。Ｗｎｔ阻害剤Ｄｋｋｌの増加した生成は、目立った特徴の１つとして増加した骨吸収を有する疾患である多発性骨髄腫に関連付けられ、Ｗｎｔ阻害剤スクレロスチンの喪失は、硬化症とｖａｎ  Ｂｕｃｈｅｍ病を含む高骨量疾患に関連付けられる。
【００１５】
細胞決定におけるＷｎｔシグナル伝達の役割は、Ｗｎｔシグナル伝達が抑制または遮断されるインビトロで行なわれる実験によって大部分が決定されてきた。いくつかの例では、Ｗｎｔシグナルは、その受容体の過剰なリガンド結合ドメインＦｒｉｚｚｌｅｄによって遮断される。
【００１６】
Ｗｎｔポリペプチドは、細胞発達および生物学的プロセスを組み合わせるシグナル分子のファミリーを含む。いくつかの例では、Ｗｎｔポリペプチドは幹細胞自己複製、アポトーシス、および細胞運動を調節する。他の例では、Ｗｎｔポリペプチドは、例えば、組織ホメオスタシスなどの発達に寄与する。Ｗｎｔポリペプチドは高度に疎水性タンパク質であり、いくつかの例（例えば、特定の培地条件）下では、減少するか、生体機能を失う。場合によっては、外因性の薬剤（例えば、リポソーム）によるＷｎｔポリペプチドの製剤化により、Ｗｎｔポリペプチドは生体機能を維持することができる。例えば、脂質小胞（例えば、リポソーム）とＷｎｔポリペプチドを組み合わせることで、生物学的活性を有する（Ｍｉｎｅａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｗｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｂｏｎｅ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．  Ｓｃｉ．  Ｔｒａｎｓｌ．  Ｍｅｄ．  ２，  ２９ｒａ３０  （２０１０）；  ａｎｄ  Ｐｏｐｅｌｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｐｌａｎｔ  ｏｓｓｅｏｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  Ｗｎｔ３Ａ，  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉｏｌｓ  ３１  ９１７３ｅ９１８１  （２０１０）；  Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏｓ．  ７，３３５，６４３  ａｎｄ  ７，  １５３，８３２）Ｗｎｔ製剤が形成される（Ｍｏｒｒｅｌｌ  ＮＴ，  Ｌｅｕｃｈｔ  Ｐ，  Ｚｈａｏ  Ｌ，  Ｋｉｍ  Ｊ−Ｂ，  ｔｅｎ  Ｂｅｒｇｅ  Ｄ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｇｅｎｅｒａｔｅｓ  Ｗｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｉｔｈ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ．  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ３（８）：  ｅ２９３０；  ａｎｄ  Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  ｔｈｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｎｔ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｒｎｏｌ  ４６５：  ３３１−４７  （２００９））。
【００１７】
いくつかの例では、Ｗｎｔポリペプチドは血清の存在下において培養物細胞から分泌される。血清は様々な脂質成分を含有しており、これは、場合によっては、インビトロで高疎水性のＷｎｔポリペプチドを安定化させる。疎水性は、Ｗｎｔ活性に必要とされるパルミトイル化の存在に基づく。しかしながら、安全上の理由から、ＦＤＡとＥＭＡを含む取締機関は一般に、ヒトでの使用を意図した薬物からすべての動物性生成物の除去を必要とする。加えて、ウイルスや他の病原体による汚染を防ぐために適切な手順が踏まれなかった場合には、ＦＤＡによって規制された医療品の製造中に使用されるウシ胎仔血清は禁止される。
【００１８】
場合によっては、Ｗｎｔポリペプチドが界面活性剤によって安定化する。界面活性剤は凝集から疎水性のＷｎｔを守るが、Ｗｎｔポリペプチドを安定化させることができる濃度レベルは、ヒト細胞によっては細胞毒性であり、場合によっては細胞溶解を引き起こす。
【００１９】
最小血清条件（例えば、無血清条件）下でＷｎｔポリペプチドを生成する方法と培養系が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は：（ａ）機能的に不活性なＷｎｔポリペプチドとシャペロン組成物を含む第１のＷｎｔ組成物を含む混合物を生成するために、糖界面活性剤を含む緩衝液を用いて、複数のＷｎｔポリペプチド−シャペロン複合体をインキュベートする工程；（ｂ）機能的に活性なＷｎｔポリペプチドと糖界面活性剤を含む第２のＷｎｔ組成物を生成するために、スルホン化された多環芳香族化合物で固定されたカラムを用いて上記混合物から第１のＷｎｔ組成物を分離する工程；（ｃ）少なくとも一度、第３のＷｎｔ組成物を生成するために、抗体のＦｃ部分と相互作用するポリペプチドを含む親和性クロマトグラフィーカラム、混合モードカラム、サイズ排除クロマトグラフィー−カラム、あるいはこれらの組み合わせを用いて第２のＷｎｔ組成物を随意に精製する工程；および、（ｄ）機能的に活性なＷｎｔポリペプチドを含む最終的なＷｎｔ組成物を生成するために、第２のＷｎｔ組成物あるいは随意に第３のＷｎｔ組成物を、リポソームの水溶液に接触させる工程、を含む。
【００２０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は：（ａ）複数のＷｎｔポリペプチド−シャペロン複合体を生成するために、調整培地中の細胞においてＷｎｔポリペプチドをシャペロンと共発現する工程；（ｂ）調整培地からＷｎｔポリペプチド−シャペロン複合体を収穫する工程；（ｃ）溶出したＷｎｔポリペプチド−シャペロン複合体を生成するために、スルホン化された多環芳香族化合物を用いて固定されたカラムに、Ｗｎｔポリペプチド−シャペロン複合体を導入する工程；（ｄ）処理されたＷｎｔポリペプチドを生成するために、抗体のＦｃ部分と相互作用するポリペプチドを含む親和性クロマトグラフィーカラムを介して溶出したＷｎｔポリペプチド−シャペロン複合体を処理する工程；および、（ｅ）リポソームＷｎｔポリペプチドを生成するために、処理されたＷｎｔポリペプチドをリポソームの水溶液に接触させる工程、を含む。
【００２１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は：（ａ）複数のＷｎｔポリペプチド−シャペロン複合体を生成するために、調整培地中の細胞においてＷｎｔポリペプチドをシャペロンと共発現する工程；（ｂ）調整培地からＷｎｔポリペプチド−シャペロン複合体を収穫する工程；（ｃ）溶出したＷｎｔポリペプチド−シャペロン複合体を生成するために、抗体のＦｃ部分と相互作用するポリペプチドを含む親和性クロマトグラフィーカラムに、Ｗｎｔポリペプチド−シャペロン複合体を導入する工程；（ｄ）処理されたＷｎｔポリペプチドを生成するために、スルホン化された多環芳香族化合物を用いて固定されたカラムを介して溶出したＷｎｔポリペプチド−シャペロン複合体を処理する工程；および、（ｅ）リポソームＷｎｔポリペプチドを生成するために、処理されたＷｎｔポリペプチドをリポソームの水溶液に接触させる工程、を含む。
【００２２】
追加の実施形態では、Ｗｎｔ培養系が本明細書に記載され、上記Ｗｎｔ培養系は、（ａ）最小血清培地；（ｂ）最小血清培地にあるＷｎｔポリペプチド−シャペロン複合体；および、（ｃ）Ｗｎｔポリペプチドをコードする第１の発現ベクターとシャペロンをコードする第２の発現ベクターをトランスフェクトされた操作された細胞株からの細胞を含み、ここで、Ｗｎｔポリペプチドとシャペロンは、細胞中で共発現され、細胞は最小血清培地の存在下で育てられる。
【００２３】
Ｗｎｔポリペプチド
Ｗｎｔポリペプチドあるいはタンパク質は、胚形成中の細胞間相互作用を調節する高度に保存された分泌シグナル分子のファミリーを形成する。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２Ｂ（あるいは、Ｗｎｔ１３）、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３Ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５Ａ、Ｗｎｔ５Ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７Ａ、Ｗｎｔ７Ｂ、Ｗｎｔ８Ａ、Ｗｎｔ８Ｂ、Ｗｎｔ９Ａ（Ｗｎｔ１４またはＷｎｔ１４Ｂ）、Ｗｎｔ９Ｂ（Ｗｎｔ１４ＢまたはＷｎｔ１５）、Ｗｎｔ１０Ａ、Ｗｎｔ１０Ｂ（あるいはＷｎｔ１２）、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ−１６Ａ、およびＷｎｔ−１６Ｂのポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ３Ａポリペプチド、Ｗｎｔ５Ａポリペプチド、およびＷｎｔ１０Ｂポリペプチドから選択される。いくつかの実施形態において、ＷｎｔポリペプチドはＷｎｔ３Ａポリペプチドである。いくつかの実施形態において、ＷｎｔポリペプチドはＷｎｔ５Ａポリペプチドである。いくつかの実施形態において、ＷｎｔポリペプチドはＷｎｔ１０Ｂポリペプチドである。「Ｗｎｔｓ」あるいは「Ｗｎｔ遺伝子産物」あるいは「Ｗｎｔポリペプチド」との用語は、本明細書で使用されるとき、天然の配列Ｗｎｔポリペプチド、Ｗｎｔポリペプチド変異体、Ｗｎｔポリペプチド断片、およびキメラＷｎｔポリペプチドを包含する。
【００２４】
「天然の配列」ポリペプチドは、自然由来のＷｎｔポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するものである。そのような天然の配列ポリペプチドは、内因性のＷｎｔタンパク質を生成する細胞から単離可能であるか、あるいは、組み換え体または合成手段によって生成可能である。したがって、天然の配列ポリペプチドは、例えば、自然発生のヒトのポリペプチド、マウスのポリペプチド、他の哺乳動物種あるいは哺乳動物以外の種、例えば、ポリペプチド、例えば、ショウジョウバエ、線虫などからのポリペプチドなどのアミノ酸配列を有することができる。
【００２５】
「天然の配列ポリペプチド」との用語は、限定されないが、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２Ｂ（あるいは、Ｗｎｔ１３）、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３Ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５Ａ、Ｗｎｔ５Ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７Ａ、Ｗｎｔ７Ｂ、Ｗｎｔ８Ａ、Ｗｎｔ８Ｂ、Ｗｎｔ９Ａ（Ｗｎｔ１４またはＷｎｔ１４Ｂ）、Ｗｎｔ９Ｂ（Ｗｎｔ１４ＢまたはＷｎｔ１５）、Ｗｎｔ１０Ａ、Ｗｎｔ１０Ｂ（あるいはＷｎｔ１２）、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ−１６Ａ、およびＷｎｔ−１６Ｂのポリペプチドを含む。いくつかの例では、「天然の配列Ｗｎｔポリペプチド」との用語は、ヒトＷｎｔポリペプチドを含む。場合によっては、ヒトＷｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２Ｂ（あるいは、Ｗｎｔ１３）、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３Ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５Ａ、Ｗｎｔ５Ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７Ａ、Ｗｎｔ７Ｂ、Ｗｎｔ８Ａ、Ｗｎｔ８Ｂ、Ｗｎｔ９Ａ（Ｗｎｔ１４またはＷｎｔ１４Ｂ）、Ｗｎｔ９Ｂ（Ｗｎｔ１４ＢまたはＷｎｔ１５）、Ｗｎｔ１０Ａ、Ｗｎｔ１０Ｂ（あるいはＷｎｔ１２）、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ−１６Ａ、およびＷｎｔ−１６Ｂのポリペプチドを含む。場合によっては、ヒトＷｎｔポリペプチドはヒトＷｎｔ３Ａポリペプチドである。場合によっては、ヒトＷｎｔポリペプチドはヒトＷｎｔ５Ａである。さらなる場合には、ヒトＷｎｔポリペプチドはヒトＷｎｔ１０Ｂである。
【００２６】
いくつかの例では、Ｗｎｔ１は、ＧｅｎＢａｎｋ  レファレンスＮＰ００５４２１．１およびＡＡＨ７４７９９．１によって参照される。Ｗｎｔ２はＧｅｎＢａｎｋ  レファレンスＮＰ００３３８２．１およびＡＡＨ７８１７０．１によって参照される。一般的に、Ｗｎｔ２は、脳、視床、胎児と成人の両方の肺、あるいは胎盤で発現される。Ｗｎｔ２Ｂは２つのアイソフォームを有し、これらのＧｅｎＢａｎｋ  レファレンス番号はそれぞれＮＰ００４１７６．２とＮＰ０７８６１３．１である。場合によっては、アイソフォーム１は、成人の心臓、脳、胎盤、肺、前立腺、睾丸、卵巣、小腸、および／または結腸で発現される。成人の脳では、それは、主として尾状核、視床下核、および視床で見られる。いくつかの例では、それは胎児の脳、肺、および腎臓でも検出される。場合によっては、アイソフォーム２は、胎児の脳、胎児の肺、胎児の腎臓、尾状核、睾丸、および／または癌細胞株で発現される。
【００２７】
Ｗｎｔ３とＷｎｔ３Ａは、発達中の神経管の形態形成中に細胞間のシグナル伝達で特徴的な役割を果たす。いくつかの例では、ヒトＷｎｔ３のｍＲＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋ  レファレンスＡＢ０６７６２８．１を有し、ヒトＷｎｔ３のタンパク質配列はＧｅｎＢａｎｋ  レファレンスＢＡＢ７０５０２．１を有する。ヒトＷｎｔ３ＡのｍＲＮＡ配列はＧｅｎＢａｎｋ  レファレンスＡＢ０６０２８４．１を有し、ヒトＷｎｔ３Ａのタンパク質配列はＧｅｎＢａｎｋ  レファレンスＢＡＢ６１０５２．１とＡＡＩ０３９２４．１を有する。加えて、ヒトＷｎｔ３Ａは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＣ１０３９２２とアクセッション番号ＢＣ１０３９２１を有する。いくつかの例では、「天然の配列Ｗｎｔタンパク質」あるいは「天然の配列Ｗｎｔポリペプチド」との用語は、導入されるＮ末端メチオニン（Ｍｅｔ）を含むまたは含まない、および、天然のシグナル伝達配列を含むまたは含まない、Ｗｎｔ３Ａ天然ポリペプチド（例えば、アクセッション番号ＢＡＢ６１０５２．１とＡＡＩ０３９２４．１のポリペプチド）を含む。場合によっては、この用語は、Ｎ末端メチオニン（Ｍｅｔ）を含むまたは含まない、および、天然のシグナル伝達配列を含むまたは含まない、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の３５２のアミノ酸天然ヒトＷｎｔ３Ａポリペプチドを含む。
【００２８】
いくつかの実施形態において、Ｗｎｔ４は、ＧｅｎＢａｎｋ  レファレンスＮＰ１  １０３８８．２およびＢＡＣ２３０８０．１を有する。Ｗｎｔ５Ａは、ＧｅｎＢａｎｋ  レファレンスＮＰ００３３８３．１およびＮＰ００３３８３．２を有する。Ｗｎｔ５Ｂは、ＧｅｎＢａｎｋ  レファレンスＢＡＢ６２０３９．１およびＡＡＧ３８６  ９を有する。Ｗｎｔ６は、ＧｅｎＢａｎｋ  レファレンスＮＰ００６５１３．１およびＢＡＢ  ５６０３．１を有する。Ｗｎｔ７Ａは、ＧｅｎＢａｎｋ  レファレンスＮＰ００４６１６．２およびＢＡＡ８２５０９．１を有する。いくつかの例では、それは、胎盤、腎臓、睾丸、子宮、胎児の肺、胎児の脳、あるいは成人の脳で発現される。Ｗｎｔ７Ｂは、ＧｅｎＢａｎｋ  レファレンスＮＰ４７８６７９．１およびＢＡＢ６８３９９．１を有する。場合によっては、それは、胎児の脳、肺、および／または腎臓、あるいは成人の脳、肺、および／または前立腺で発現される。Ｗｎｔ８Ａは、少なくとも２つの代替的な転写産物、ＧｅｎＢａｎｋ  レファレンスＮＰ１１４１３９．１とＮＰ４９０６４５．１を有する。Ｗｎｔ８Ｂは前脳で発現される。それはＧｅｎＢａｎｋ  レファレンスＮＰ００３３８４．１を有する。Ｗｎｔ１０ＡはＧｅｎＢａｎｋ  レファレンスＡＡＧ４５１５３およびＮＰ０７９４９２．２を有する。Ｗｎｔ１０Ｂはほとんどの成人の組織で検出され、心臓と骨格の筋肉で最高レベルである。それはＧｅｎＢａｎｋ  レファレンスＮＰ００３３８５．２を有する。場合によっては、Ｗｎｔ１１は、胎児の肺、腎臓、成人の心臓、肝臓、骨格筋、および膵臓で発現される。それはＧｅｎＢａｎｋ  レファレンスＮＰ００４６１７．２を有する。Ｗｎｔ１４はＧｅｎＢａｎｋ  レファレンスＮＰ００３３８６．１を有する。Ｗｎｔ１５は胎児の腎臓または成人の腎臓で発現されるか、あるいは脳で発現される。それはＧｅｎＢａｎｋ  レファレンスＮＰ００３３８７．１を有する。Ｗｎｔ１６は、選択的スプライシングによって生成される２つのアイソフォーム、Ｗｎｔ１６ＡとＷｎｔ１６Ｂを有する。アイソフォームＷｎｔ１６Ａは膵臓で発現される。アイソフォームＷｎｔ１６Ｂは、脾臓、虫垂、およびリンパ節などの末梢リンパ系器官あるいは腎臓で発現されるが、骨髄では発現されなかった。ＧｅｎＢａｎｋ  レファレンスはそれぞれ、Ｗｎｔｌ６ＡとＷｎｔｌ６ＢのためのＮＰ４７６５０９．１とＮＰ０５７１７１．２である。表記されたＧｅｎＢａｎｋ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、および他のデータベース配列はすべて、本明細書で参照により明確に本明細書に組み込まれる。
【００２９】
「変異体」ポリペプチドとは、天然の配列ポリペプチドと１００％未満の配列同一性を有する、以下に定義されるような生物学的に活性なポリペプチドを意味する。そのような変異体はポリペプチドを含み、ここで、１つ以上のアミノ酸残基は、天然の配列のＮ末端またはＣ末端で、あるいは、天然の配列内部で加えられ；約１〜４０のアミノ酸残基が欠失し、随意に、１つ以上のアミノ酸残基によって置換され；および、そのような変異体は、上記のポリペプチドの誘導体を含み、ここで、アミノ酸残基は、結果として生じる生成物が非自然発生のアミノ酸を有するように、共有結合的に修飾される。
【００３０】
いくつかの例では、生物学的に活性なＷｎｔ変異体は、天然の配列Ｗｎｔポリペプチドと少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの例では、生物学的に活性なＷｎｔ変異体は、天然の配列Ｗｎｔポリペプチドと少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９６％、９７％、あるいは９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。場合によっては、生物学的に活性なＷｎｔ変異体は、天然の配列Ｗｎｔポリペプチドと少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。場合によっては、生物学的に活性なＷｎｔ変異体は、天然の配列Ｗｎｔポリペプチドと少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、生物学的に活性なＷｎｔ変異体は、Ｗｎｔ３Ａ、Ｗｎｔ５Ａ、あるいはＷｎｔ１０Ｂである。いくつかの実施形態において、生物学的に活性なＷｎｔ変異体は、Ｗｎｔ３Ａ変異体、例えば、Ｗｎｔ３Ａの天然の配列と少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９６％、９７％、あるいは９９％のアミノ酸配列同一性を有するＷｎｔ３Ａ変異体のアミノ酸配列である。いくつかの実施形態において、生物学的に活性なＷｎｔ変異体はヒトＷｎｔ３Ａ変異体である。
【００３１】
いくつかの実施形態において、生物学的に活性なＷｎｔ変異体は切断されたＷｎｔポリペプチドである。いくつかの例では、切断はＮ末端からのものである。他の例では、切断はＣ末端からのものである。場合によっては、Ｗｎｔポリペプチドは、５〜４０のアミノ酸、５〜３５のアミノ酸、１０〜３５のアミノ酸、１０〜３３のアミノ酸、１０〜３０のアミノ酸、１５〜３３のアミノ酸、１５〜３０のアミノ酸、２０〜３５のアミノ酸、２０〜３３のアミノ酸、２０〜３０のアミノ酸、２５〜３３のアミノ酸、あるいは２５〜３０のアミノ酸によって切断される。場合によっては、Ｗｎｔポリペプチドは、５〜４０のアミノ酸、５〜３５のアミノ酸、１０〜３５のアミノ酸、１０〜３３のアミノ酸、１０〜３０のアミノ酸、１５〜３３のアミノ酸、１５〜３０のアミノ酸、２０〜３５のアミノ酸、２０〜３３のアミノ酸、２０〜３０のアミノ酸、２５〜３３のアミノ酸、あるいは２５〜３０のアミノ酸によってＣ末端で切断される。場合によっては、切断されたＷｎｔポリペプチドは、切断されたＷｎｔ３Ａポリペプチド、切断されたＷｎｔ５Ａポリペプチド、あるいは切断されたＷｎｔ１０Ｂポリペプチドである。
【００３２】
いくつかの実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、またはそれ以上のアミノ酸によってＣ末端で切断される。場合によっては、Ｗｎｔポリペプチドは５つ以上のアミノ酸によってＣ末端で切断される。場合によっては、Ｗｎｔポリペプチドは１０以上のアミノ酸によってＣ末端で切断される。場合によっては、Ｗｎｔポリペプチドは１５以上のアミノ酸によってＣ末端で切断される。場合によっては、Ｗｎｔポリペプチドは２０以上のアミノ酸によってＣ末端で切断される。場合によっては、Ｗｎｔポリペプチドは２５以上のアミノ酸によってＣ末端で切断される。場合によっては、Ｗｎｔポリペプチドは３０以上のアミノ酸によってＣ末端で切断される。場合によっては、Ｗｎｔポリペプチドは３１以上のアミノ酸によってＣ末端で切断される。場合によっては、Ｗｎｔポリペプチドは３２以上のアミノ酸によってＣ末端で切断される。場合によっては、Ｗｎｔポリペプチドは３３以上のアミノ酸によってＣ末端で切断される。場合によっては、Ｗｎｔポリペプチドは３４以上のアミノ酸によってＣ末端で切断される。場合によっては、Ｗｎｔポリペプチドは３５以上のアミノ酸によってＣ末端で切断される。場合によっては、ポリペプチドが生物学的活性を維持するという条件で、ＷｎｔポリペプチドはＮ末端でさらに切断される。場合によっては、切断されたＷｎｔポリペプチドは、切断されたＷｎｔ３Ａポリペプチド、切断されたＷｎｔ５Ａポリペプチド、あるいは切断されたＷｎｔ１０Ｂポリペプチドである。
【００３３】
いくつかの実施形態において、切断されたＷｎｔポリペプチドは、切断されたＷｎｔ３Ａポリペプチドである。いくつかの例では、切断はＮ末端からのものである。他の例では、切断はＣ末端からのものである。場合によっては、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、５〜４０のアミノ酸、５〜３５のアミノ酸、１０〜３５のアミノ酸、１０〜３３のアミノ酸、１０〜３０のアミノ酸、１５〜３３のアミノ酸、１５〜３０のアミノ酸、２０〜３５のアミノ酸、２０〜３３のアミノ酸、２０〜３０のアミノ酸、２５〜３３のアミノ酸、あるいは２５〜３０のアミノ酸によって切断される。場合によっては、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、５〜４０のアミノ酸、５〜３５のアミノ酸、１０〜３５のアミノ酸、１０〜３３のアミノ酸、１０〜３０のアミノ酸、１５〜３３のアミノ酸、１５〜３０のアミノ酸、２０〜３５のアミノ酸、２０〜３３のアミノ酸、２０〜３０のアミノ酸、２５〜３３のアミノ酸、あるいは２５〜３０のアミノ酸によってＣ末端で切断される。
【００３４】
いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、またはそれ以上のアミノ酸によってＣ末端で切断される。場合によっては、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは５つ以上のアミノ酸によってＣ末端で切断される。場合によっては、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは１０以上のアミノ酸によってＣ末端で切断される。場合によっては、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは１５以上のアミノ酸によってＣ末端で切断される。場合によっては、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは２０以上のアミノ酸によってＣ末端で切断される。場合によっては、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは２５以上のアミノ酸によってＣ末端で切断される。場合によっては、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは３０以上のアミノ酸によってＣ末端で切断される。場合によっては、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは３１以上のアミノ酸によってＣ末端で切断される。場合によっては、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは３２以上のアミノ酸によってＣ末端で切断される。場合によっては、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは３３以上のアミノ酸によってＣ末端で切断される。場合によっては、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは３４以上のアミノ酸によってＣ末端で切断される。場合によっては、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは３５以上のアミノ酸によってＣ末端で切断される。場合によっては、ポリペプチドが生物学的活性を維持するという条件で、Ｗｎｔ３ＡポリペプチドはＮ末端でさらに切断される。
【００３５】
いくつかの例では、生物学的に活性なＷｎｔ変異体は１つ以上のアミノ酸位置で脂質修飾を含む。場合によっては、脂質修飾は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に記載される位置２０９と同等のＷｎｔ変異体上の位置にある。いくつかの例では、生物学的に活性なＷｎｔ変異体は、Ｗｎｔ３Ａ、Ｗｎｔ５Ａ、あるいはＷｎｔ１０Ｂである。場合によっては、Ｗｎｔ変異体はＷｎｔ３Ａである。場合によっては、Ｗｎｔ３Ａ変異体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に記載される残留物２０９と同等の位置で脂質修飾を含む。場合によっては、Ｗｎｔポリペプチドは、脂肪酸、例えば、飽和脂肪酸、あるいは不飽和脂肪酸で修飾される。場合によっては、Ｗｎｔポリペプチドは、不飽和脂肪酸（例えば、パルミトレイン酸などの一価不飽和脂肪酸）で修飾される。その他の場合では、Ｗｎｔポリペプチドは飽和脂肪酸（例えば、パルミチン酸）で修飾される。さらなる場合には、Ｗｎｔポリペプチドはパルミチン酸で修飾される。いくつかの例では、修飾はパルミトイル化である。いくつかの例では、Ｗｎｔ３Ａ変異体は切断されたＷｎｔ３Ａポリペプチドであり、これは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に記載される残留物２０９と同等の位置に脂質修飾（例えば、パルミチン酸などの飽和脂肪酸修飾）を含む。
【００３６】
いくつかの例では、生物学的に活性なＷｎｔ変異体はさらに、グリコシル化によって修飾された残基を含む。場合によっては、修飾は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に記載される位置８２および／または２９８と同等の位置で生じる。いくつかの例では、生物学的に活性なＷｎｔ変異体は、Ｗｎｔ３Ａ、Ｗｎｔ５Ａ、あるいはＷｎｔ１０Ｂである。場合によっては、Ｗｎｔ変異体はＷｎｔ３Ａである。場合によっては、Ｗｎｔ３Ａ変異体はさらに、グリコシル化によって修飾された残基を含む。場合によっては、Ｗｎｔ３Ａ変異体が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に記載される残基８２および／または残基２９８と同等の１つ以上の位置にグリコシル化された残基を含む。場合によっては、Ｗｎｔ３Ａ変異体は切断されたＷｎｔ３Ａポリペプチドである。
【００３７】
いくつかの例では、生物学的に活性なＷｎｔ変異体はタグをさらに含む。いくつかの例では、タグはアフィニティータグである。他の例では、タグはエピトープタグである。本明細書に記載された例示的なタグとしては、限定されないが、ポリヒスチジンタグ、ＰＡ−タグ、ＦＬＡＧタグ、ヒトインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、カルモジュリン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ＡＢＤｚｌタグ（アルブミン）、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）、ヘパリン結合ペプチド（ＨＢ）タグ、ポリ−Ａｒｇタグ、ポリ−Ｌｙｓタグ、Ｓ−タグ、Ｓｔｒｅｐ−ＩＩタグ、およびＳＵＭＯタグが挙げられる。いくつかの例では、ポリヒスチジンタグは、前後に並んだ（ｉｎ ｔａｎｄｅｍ）約６〜１２、約６〜１０、あるいは約６〜８のヒスチジン残基を含む。いくつかの例では、ポリヒスチジンタグは、前後に並んだ約６〜１０のヒスチジン残基を含む。いくつかの例では、ポリヒスチジンタグは、前後に並んだ約６〜８のヒスチジン残基を含む。場合によっては、ポリヒスチジンタグは１０のヒスチジン残基（１０ｘＨｉｓ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０））を含む。場合によっては、ポリヒスチジンタグは６のヒスチジン残基（６ｘＨｉｓ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９））を含む。いくつかの例では、ＰＡ−タグは、抗ヒトポドプラニン抗体ＮＺ−１からのドデカペプチドを含む。場合によっては、ドデカペプチドは、配列ＧＶＡＭＰＧＡＥＤＤＶＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）を含む。いくつかの例では、ＦＬＡＧタグは小さなペプチドタグであり、随意に配列ＤＹＫＤＤＤＤＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）を含む。いくつかの例では、ＨＡ−タグは、インフルエンザウイルスがその宿主を感染させる能力を助長する表面糖タンパク質に由来し、随意に配列ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）を含む。いくつかの例では、Ｍｙｃタグはｃ−ｍｙｃ遺伝子によってコードされたＭｙｃタンパク質に由来し、随意に配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）を含む。いくつかの例では、生物学的に活性なＷｎｔ変異体は、Ｗｎｔ３Ａ、Ｗｎｔ５Ａ、あるいはＷｎｔ１０Ｂである。場合によっては、Ｗｎｔ変異体はＷｎｔ３Ａである。場合によっては、Ｗｎｔ３Ａ変異体は切断されたＷｎｔ３Ａポリペプチドである。
【００３８】
いくつかの実施形態において、タグは、生物学的に活性なＷｎｔ変異体に直接接続される。そのような場合、タグは、生物学的に活性なＷｎｔ変異体のＮ末端に直接接続される。その他の場合において、タグは、生物学的に活性なＷｎｔ変異体のＣ末端に直接接続される。いくつかの例では、生物学的に活性なＷｎｔ変異体は、Ｗｎｔ３Ａ、Ｗｎｔ５Ａ、あるいはＷｎｔ１０Ｂである。場合によっては、Ｗｎｔ変異体はＷｎｔ３Ａである。場合によっては、Ｗｎｔ３Ａ変異体は切断されたＷｎｔ３Ａポリペプチドである。
【００３９】
いくつかの実施形態において、タグは、リンカーを介して生物学的に活性なＷｎｔ変異体に間接的に接続される。場合によっては、リンカーは、例えば、トロンビン、第Ｘａ因子、ＴＥＶ、あるいはエンテロキナーゼポリペプチドモチーフを含む、切断リンカーである。場合によっては、トロンビン切断リンカーは、ＬＶＰＲＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）認識モチーフを含む。場合によっては、第Ｘａ因子リンカーはコンセンサス部位Ｉ−（Ｅ／Ｄ）−Ｇ−Ｒを含む。場合によっては、ＴＥＶリンカーはコンセンサス部位Ｅ−Ｎ−Ｌ−Ｙ−Ｆ−Ｑ−（Ｇ／Ｓ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）を含む。場合によっては、エンテロキナーゼリンカーは、モチーフＤＤＤＤＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）を含む。場合によっては、タグは、生物学的に活性なＷｎｔ変異体のＣ末端に、リンカーを介して、間接的に接続される。その他の場合において、タグは、生物学的に活性なＷｎｔ変異体のＮ末端に、リンカーを介して、間接的に接続される。いくつかの例では、生物学的に活性なＷｎｔ変異体は、Ｗｎｔ３Ａ、Ｗｎｔ５Ａ、あるいはＷｎｔ１０Ｂである。場合によっては、Ｗｎｔ変異体はＷｎｔ３Ａである。場合によっては、Ｗｎｔ３Ａ変異体は切断されたＷｎｔ３Ａポリペプチドである。
【００４０】
いくつかの例では、リンカーは切断不可能なリンカーである。場合によっては、切断不可能なリンカーは、例えば、ポリグリシン残基、ポリアラニン残基、あるいはグリシンとアラニン残基の組み合わせを含む。例示的な切断不可能なリンカーとしては、限定されないが、ＧＧＧ、ＧＧＧＧＧＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）、およびＧＧＧＧＡＧＧＧＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）が挙げられる。いくつかの例では、生物学的に活性なＷｎｔ変異体は、Ｗｎｔ３Ａ、Ｗｎｔ５Ａ、あるいはＷｎｔ１０Ｂである。場合によっては、Ｗｎｔ変異体はＷｎｔ３Ａである。場合によっては、Ｗｎｔ３Ａ変異体は切断されたＷｎｔ３Ａポリペプチドである。
【００４１】
いくつかの例では、生物学的に活性なＷｎｔ変異体は、１つ以上のタグ（例えば、２、３、４、あるいは５以上のタグ）を含む。場合によっては、１つ以上のタグは、生物学的に活性なＷｎｔ変異体のＮ末端に、直接的に、あるいは、リンカーを介して間接的に接続され、および、随意に１つ以上の追加のタグは、生物学的に活性なＷｎｔ変異体のＣ末端に、直接的に、あるいは、リンカーを介して間接的に接続される。１つの実施形態では、生物学的に活性なＷｎｔ変異体のＮ末端は、（例えば、リンカーを介して間接的に）ポリヒスチジンタグを含み、生物学的に活性なＷｎｔ変異体のＣ末端は追加のタグを含む。別の実施形態では、生物学的に活性なＷｎｔ変異体のＣ末端は、（例えば、リンカーを介して間接的に）ポリヒスチジンタグを含み、生物学的に活性なＷｎｔ変異体のＮ末端は追加のタグを含む。いくつかの例では、生物学的に活性なＷｎｔ変異体は、Ｗｎｔ３Ａ、Ｗｎｔ５Ａ、あるいはＷｎｔ１０Ｂである。場合によっては、Ｗｎｔ変異体はＷｎｔ３Ａである。場合によっては、Ｗｎｔ３Ａ変異体は切断されたＷｎｔ３Ａポリペプチドである。
【００４２】
用語「アミノ酸」とは、アミノ基とカルボキシル基の両方を含有している分子を指す。適切なアミノ酸は、限定することなく、自然発生のアミノ酸のＤ−異性体およびＬ−異性体の両方の他に、有機合成または他の代謝経路によって調製された非自然発生のアミノ酸のＤ−異性体およびＬ−異性体の両方も含む。アミノ酸との用語は、本明細書で使用されるように、限定なく、アミノ酸酸性物質、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、およびアミノ酸アナログを含む。
【００４３】
「α−アミノ酸」との用語は、α−炭素と指定される炭素に結合されたアミノ基とカルボキシル基の両方を含有する分子を指す。
【００４４】
「β−アミノ酸」との用語は、β構成のアミノ基とカルボキシル基の両方を含有する分子を指す。
【００４５】
「自然発生のアミノ酸」とは、自然で合成されたペプチドにおいて一般に見られる、および１文字の略語Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｃ、Ｄ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、およびＶによって知られている、２０のアミノ酸のいずれか１つを指す。
【００４６】
以下の表１は、天然アミノ酸の特性の概要を示す：
【００４７】
【表１】
2020529845.tif 000003
【００４８】
「疎水性アミノ酸」は、小さな疎水性アミノ酸と大きな疎水性アミノ酸を含む。「小さな疎水性アミノ酸」は、グリシン、アラニン、プロリン、およびそのアナログであり、「大きな疎水性アミノ酸」は、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、およびそのアナログである。「極性アミノ酸」は、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、チロシン、およびそのアナログであり、「荷電アミノ酸」は、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩、およびそのアナログである。
【００４９】
「アミノ酸アナログ」との用語は、アミノ酸に構造的に類似しており、および、ペプチド模倣大環状分子の形成においてアミノ酸に置換される分子を指す。アミノ酸アナログは、限定することなく、アミノ基またはカルボキシ基が、類似する反応基によって置換される（例えば、第一級アミンの第二級または第三級アミンとの置換、あるいはカルボキシ基とエステルとの置換）、β−アミノ酸およびアミノ酸を含む。
【００５０】
「非天然アミノ酸」との用語は、自然に合成されたペプチドにおいて一般に見られる、および、１文字の略語Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｃ、Ｄ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、およびＶによって知られている、２０のアミノ酸の１つではないアミノ酸を指す。非天然アミノ酸またはアミノ酸アナログは、限定なく、以下のアミノ酸アナログを含む。
【００５１】
アミノ酸アナログは、β−アミノ酸アナログを含む。β−アミノ酸アナログの例は、限定されないが、以下を含む：環状β−アミノ酸アナログ；β−アラニン；（Ｒ）−β−フェニルアラニン；（Ｒ）−１，２，３，４−テトラヒドロ−イソキノリン−３−酢酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（１−ナフチル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（２，４−ジクロロフェニル）酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（２−クロロフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（２−シアノフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（２−フルオロフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（２−フリル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（２−メチルフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（２−ナフチル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（２−チエニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（２−トリフルオロメチルフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（３，４−ジクロロフェニル）酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（３，４−ジフルオロフェニル）酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（３−ベンゾチエニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（３−クロロフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（３−シアノフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（３−フルオロフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（３−メチルフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（３−ピリジル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（３−チエニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（３−トリフルオロメチルフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（４−ブロモフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（４−クロロフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（４−シアノフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（４−フルオロフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（４−ヨードフェニル−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（４−メチルフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（４−ニトロフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（４−ピリジル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（４−トリフルオロメチルフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−ペンタフルオロ−フェニル酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−５−ヘキセン酸；（Ｒ）−３−アミノ−５−ヘキシン酸；（Ｒ）−３−アミノ−５−フェニルペンタン酸；（Ｒ）−３−アミノ−６−フェニル−５−ヘキセン酸；（Ｓ）−１，２，３，４−テトラヒドロ−イソキノリン−３−酢酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（１−ナフチル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（２，４−ジクロロフェニル）酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（２−クロロフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（２−シアノフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（２−フルオロフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（２−フラニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（２−メチルフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（２−ナフチル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（２−チエニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（２−トリフルオロメチルフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（３，４−ジクロロフェニル）酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（３，４−ジフルオロフ��ニル）酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（３−ベンゾチエニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（３−クロロフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（３−シアノフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（３−フルオロフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（３−メチルフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（３−ピリジル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（３−チエニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（３−トリフルオロメチルフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（４−ブロモフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（４−クロロフェニル）酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（４−シアノフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（４−フルオロフェニル）酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（４−ヨードフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（４−メチルフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（４−ニトロフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（４−ピリジル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（４−トリフルオロメチルフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−ペンタフルオロ−フェニル酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−５−ヘキセン酸；（Ｓ）−３−アミノ−５−ヘキシン酸；（Ｓ）−３−アミノ−５−フェニルペンタン酸；（Ｓ）−３−アミノ−６−フェニル−５−ヘキセン酸；１，２，５，６−テトラヒドロピリジン−３−カルボン酸；１，２，５，６−テトラヒドロピリジン−４−カルボン酸；３−アミノ−３−（２−クロロフェニル）−プロピオン酸；３−アミノ−３−（２−チエニル）−プロピオン酸；３−アミノ−３−（３−ブロモフェニル）−プロピオン酸；３−アミノ−３−（４−クロロフェニル）−プロピオン酸；３−アミノ−３−（４−メトキシフェニル）−プロピオン酸；３−アミノ−４，４，４−トリフルオロ−酪酸；３−アミノアジビン酸；Ｄ−β−フェニルアラニン；β−ロイシン；Ｌ−β−ホモアラニン；Ｌ−β−ホモアスパラギン酸γ−ベンジルエステル；Ｌ−β−ホモグルタミン酸δ−ベンジルエステル；Ｌ−β−ホモイソロイシン；Ｌ−β−ホモロイシン；Ｌ−β−ホモメチオニン；Ｌ−β−ホモフェニルアラニン；Ｌ−β−ホモプロリン；Ｌ−β−ホモトリプトファン；Ｌ−β−ホモバリン；Ｌ−Ｎω−ベンジルオキシカルボニル−β−ホモリジン；Ｎω−Ｌ−β−ホモアルギニン；Ｏ−ベンジル−Ｌ−β−ホモヒドロキシプロリン；Ｏ−ベンジル−Ｌ−β−ホモセリン；Ｏ−ベンジル−Ｌ−β−ホモトレオニン；Ｏ−ベンジル−Ｌ−β−ホモチロシン；γ−トリチル−Ｌ−β−ホモアスパラギン；（Ｒ）−β−フェニルアラニン；Ｌ−β−ホモアスパラギン酸γ−ｔ−ブチルエステル；Ｌ−β−ホモグルタミン酸δ−ｔ−ブチルエステル；Ｌ−Νω−β−ホモリジン；Ｎδ−トリチル−Ｌ−β−ホモグルタミン；Ｎω−２，２，４，６，７−ペンタメチル−ジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル−Ｌ−β−ホモアルギニン；Ｏ−ｔ−ブチル−Ｌ−β−ホモヒドロキシ−プロリン；Ｏ−ｔ−ブチル−Ｌ−β−ホモセリン；Ｏ−ｔ−ブチル−Ｌ−β−ホモトレオニン；Ｏ−ｔ−ブチル−Ｌ−β−ホモチロシン；２−アミノシクロペンタンカルボン酸；および、２−アミノシクロヘキサンカルボン酸。
【００５２】
アミノ酸アナログは、アラニン、バリン、グリシン、またはロイシンのアナログを含む。アラニン、バリン、グリシンおよびロイシンのアミノ酸アナログの例は、限定されないが、以下を含む：α−メトキシグリシン；α−アリル−Ｌ−アラニン；α−アミノイソ酪酸；α−メチル−ロイシン；β−（１−ナフチル）−Ｄ−アラニン；β−（１−ナフチル）−Ｌ−アラニン；β−（２−ナフチル）−Ｄ−アラニン；β−（２−ナフチル）−Ｌ−アラニン；β−（２−ピリジル）−Ｄ−アラニン；β−（２−ピリジル）−Ｌ−アラニン；β−（２−チエニル）−Ｄ−アラニン；β−（２−チエニル）−Ｌ−アラニン；β−（３−ベンゾチエニル）−Ｄ−アラニン；β−（３−ベンゾチエニル）−Ｌ−アラニン；β−（３−ピリジル）−Ｄ−アラニン；β−（３−ピリジル）−Ｌ−アラニン；β−（４−ピリジル）−Ｄ−アラニン；β−（４−ピリジル）−Ｌ−アラニン；β−クロロ−Ｌ−アラニン；β−シアノ−Ｌ−アラニン；β−シクロヘキシル−Ｄ−アラニン；β−シクロヘキシル−Ｌ−アラニン；β−シクロペンテン−１−イル−アラニン；β−シクロペンチル−アラニン；β−シクロプロピル−Ｌ−Ａｌａ−ＯＨ．ジシクロヘキシルアンモニウム塩；β−ｔ−ブチル−Ｄ−アラニン；β−ｔ−ブチル−Ｌ−アラニン；γ−アミノ酪酸；Ｌ−α，β−ジアミノプロピオン酸；２，４−ジニトロ−フェニルグリシン；２，５−ジヒドロ−Ｄ−フェニルグリシン；２−アミノ−４，４，４−トリフルオロ酪酸；２−フルオロ−フェニルグリシン；３−アミノ−４，４，４−トリフルオロ−酪酸；３−フルオロ−バリン；４，４，４−トリフルオロ−バリン；４，５−デヒドロ−Ｌ−ｌｅｕ−ＯＨ．ジシクロヘキシルアンモニウム塩；４−フルオロ−Ｄ−フェニルグリシン；４−フルオロ−Ｌ−フェニルグリシン；４−ヒドロキシ−Ｄ−フェニルグリシン；５，５，５−トリフルオロ−ロイシン；６−アミノヘキサン酸；シクロペンチル−Ｄ−Ｇｌｙ−ＯＨ．ジシクロヘキシルアンモニウム塩；シクロペンチル−Ｇｌｙ−ＯＨ．ジシクロヘキシルアンモニウム塩；Ｄ−α，β−ジアミノプロピオン酸；Ｄ−α−アミノ酪酸；Ｄ−α−ｔ−ブチルグリシン；Ｄ−（２−チエニル）グリシン；Ｄ−（３−チエニル）グリシン；Ｄ−２−アミノカプロン酸；Ｄ−２−インダニルグリシン；Ｄ−アリルグリシン−ジシクロヘキシルアンモニウム塩；Ｄ−シクロヘキシルグリシン；Ｄ−ノルバリン；Ｄ−フェニルグリシン；β−アミノ酪酸；β−アミノイソ酪酸；（２−ブロモフェニル）グリシン；（２−メトキシフェニル）グリシン；（２−メチルフェニル）グリシン；（２−チアゾリル）グリシン；（２−チエニル）グリシン；２−アミノ−３−（ジメチルアミノ）−プロピオン酸；Ｌ−α，β−ジアミノプロピオン酸；Ｌ−α−アミノ酪酸；Ｌ−α−ｔ−ブチルグリシン；Ｌ−（３−チエニル）グリシン；Ｌ−２−アミノ−３−（ジメチルアミノ）−プロピオン酸；Ｌ−２−アミノカプロン酸ジシクロヘキシル−アンモニウム塩；Ｌ−２−インダニルグリシン；Ｌ−アリルグリシン．ジシクロヘキシルアンモニウム塩；Ｌ−シクロヘキシルグリシン；Ｌ−フェニルグリシン；Ｌ−プロパルギルグリシン；Ｌ−ノルバリン；Ｎ−α−アミノメチル−Ｌ−アラニン；Ｄ−α，γ���ジアミノ酪酸；Ｌ−α，γ−ジアミノ酪酸；β−シクロプロピル−Ｌ−アラニン；（Ν−β−（２，４−ジニトロフェニル））−Ｌ−α，β−ジアミノプロピオン酸；（Ｎ−β−１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキサ−１−イリデン）エチル）−Ｄ−α，β−ジアミノプロピオン酸；（Ν−β−１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキサ−１−イリデン）エチル）−Ｌ−α，β−ジアミノプロピオン酸；（Ｎ−β−４−メチルトリチル）−Ｌ−α，β−ジアミノプロピオン酸；（Ｎ−β−アリルオキシカルボニル）−Ｌ−α，β−ジアミノプロピオン酸；（Ｎ−γ−１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキサ−１−イリデン）エチル）−Ｄ−α，γ−ジアミノ酪酸；（Ν−γ−１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキサ−１−イリデン）エチル）−Ｌ−α，γ−ジアミノ酪酸；（Ｎ−γ−４−メチルトリチル）−Ｄ−α，γ−ジアミノ酪酸；（Ν−γ−４−メチルトリチル）−Ｌ−α，γ−ジアミノ酪酸；（Ｎ−γ−アリルオキシカルボニル）−Ｌ−α，γ−ジアミノ酪酸；Ｄ−α，γ−ジアミノ酪酸；４，５−デヒドロ−Ｌ−ロイシン；シクロペンチル−Ｄ−Ｇｌｙ−ＯＨ；シクロペンチル−Ｇｌｙ−ＯＨ；Ｄ−アリルグリシン；Ｄ−ホモシクロヘキシルアラニン；Ｌ−１−ピレニルアラニン；Ｌ−２−アミノカプロン酸；Ｌ−アリルグリシン；Ｌ−ホモシクロヘキシルアラニン；およびＮ−（２−ヒドロキシ−４−メトキシ−Ｂｚｌ）−Ｇｌｙ−ＯＨ。
【００５３】
アミノ酸アナログは、アルギニンまたはリシンのアナログを含む。アルギニンとリシンのアミノ酸アナログの例は、限定されないが、以下を含む：シトルリン；Ｌ−２−アミノ−３−グアニジノプロピオン酸；Ｌ−２−アミノ−３−ウレイドプロピオン酸；Ｌ−シトルリン；Ｌｙｓ（Ｍｅ）２−ＯＨ；Ｌｙｓ（Ｎ３）−ＯＨ；Νδ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−オルニチン；Νω−ニトロ−Ｄ−アルギニン；Νω−ニトロ−Ｌ−アルギニン；α−メチル−オルニチン；２，６−ジアミノヘプタン二酸；Ｌ−オルニチン；（Ｎδ−１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソ−シクロヘキサ−１−イリデン）エチル）−Ｄ−オルニチン；（Ｎδ−１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソ−シクロヘキサ−１−イリデン）エチル）−Ｌ−オルニチン；（Νδ−４−メチルトリチル）−Ｄ−オルニチン；（Νδ−４−メチルトリチル）−Ｌ−オルニチン；Ｄ−オルニチン；Ｌ−オルニチン；Ａｒｇ（Ｍｅ）（Ｐｂｆ）−ＯＨ；Ａｒｇ（Ｍｅ）２−ＯＨ（非対称的）；Ａｒｇ（Ｍｅ）２−ＯＨ（対称的）；Ｌｙｓ（ｉｖＤｄｅ）−ＯＨ；Ｌｙｓ（Ｍｅ）２−ＯＨ．ＨＣｌ；Ｌｙｓ（Ｍｅ３）−ＯＨクロリド；Νω−ニトロ−Ｄ−アルギニン；および、Νω−ニトロ−Ｌ−アルギニン。
【００５４】
アミノ酸アナログは、アスパラギン酸またはグルタミン酸のアナログを含む。アスパラギン酸およびグルタミン酸のアミノ酸アナログの例は、限定されないが、以下を含む：α−メチル−Ｄ−アスパラギン酸；α−メチル−グルタミン酸；α−メチル−Ｌ−アスパラギン酸；γ−メチレン−グルタミン酸；（Ｎ−γ−エチル）−Ｌ−グルタミン；［Ｎ−α−（４−アミノベンゾイル）］−Ｌ−グルタミン酸；２，６−ジアミノピメリン酸；Ｌ−α−アミノスベリン酸；Ｄ−２−アミノアジピン酸；Ｄ−α−アミノスベリン酸；α−アミノピメリン酸；イミノ二酢酸；Ｌ−２−アミノアジピン酸；トレオ−β−メチル−アスパラギン酸；γ−カルボキシ−Ｄ−グルタミン酸γ，γ−ジ−ｔ−ブチルエステル；γ−カルボキシ−Ｌ−グルタミン酸γ，γ−ジ−ｔ−ブチルエステル；Ｇｌｕ（ＯＡｌｌ）−ＯＨ；Ｌ−Ａｓｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ；および、ピログルタミン酸。
【００５５】
アミノ酸アナログは、システインおよびメチオニンのアナログを含む。システインとメチオニンのアミノ酸アナログの例としては、限定されないが、Ｃｙｓ（ファルネシル）−ＯＨ、Ｃｙｓ（ファルネシル）−ＯＭｅ、α−メチル−メチオニン、Ｃｙｓ（２−ヒドロキシエチル）−ＯＨ、Ｃｙｓ（３−アミノプロピル）−ＯＨ、２−アミノ−４−（エチルチオ）酪酸、ブチオニン、ブチオニンスルホキシイミン、エチオニン、メチオニンメチルスルホニウムクロリド、セレノメチオニン、システイン酸、［２−（４−ピリジル）エチル］−ＤＬ−ペニシラミン、［２−（４−ピリジル）エチル］−Ｌ−システイン、４−メトキシベンジル−Ｄ−ペニシラミン、４−メトキシベンジル−Ｌ−ペニシラミン、４−メチルベンジル−Ｄ−ペニシラミン、４−メチルベンジル−Ｌ−ペニシラミン、ベンジル−Ｄ−システイン、ベンジル−Ｌ−システイン、ベンジル−ＤＬ−ホモシステイン、カルバモイル−Ｌ−システイン、カルボキシエチル−Ｌ−システイン、カルボキシメチル−Ｌ−システイン、ジフェニルメチル−Ｌ−システイン、エチル−Ｌ−システイン、メチル−Ｌ−システイン、ｔ−ブチル−Ｄ−システイン、トリチル−Ｌ−ホモシステイン、トリチル−Ｄ−ペニシラミン、シスタチオニン、ホモシスチン、Ｌ−ホモシスチン、（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン、セレノ−Ｌ−シスチン、シスタチオニン、Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＨ、およびアセトアミドメチル−Ｄ−ペニシラミンが挙げられる。
【００５６】
アミノ酸アナログは、フェニルアラニンとチロシンのアナログを含む。フェニルアラニンおよびチロシンのアミノ酸アナログの例は、β−メチル−フェニルアラニン、β−ヒドロキシフェニルアラニン、α−メチル−３−メトキシ−ＤＬ−フェニルアラニン、α−メチル−Ｄ−フェニルアラニン、α−メチル−Ｌ−フェニルアラニン、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、２，４−ジクロロ−フェニルアラニン、２−（トリフルオロメチル）−Ｄ−フェニルアラニン、２−（トリフルオロメチル）−Ｌ−フェニルアラニン２−、２−ブロモ−Ｄ−フェニルアラニン、２−ブロモ−Ｌ−フェニルアラニン、２−クロロ−Ｄ−フェニルアラニン、２−クロロ−Ｌ−フェニルアラニン、２−シアノ−Ｄ−フェニルアラニン、２−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、２−フルオロ−Ｄ−フェニルアラニン、２−フルオロ−Ｌ−フェニルアラニン、２−メチル−Ｄ−フェニルアラニン、２−メチル−Ｌ−フェニルアラニン、２−ニトロ−Ｄ−フェニルアラニン、２−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン、２，４，５−トリヒドロキシ−フェニルアラニン、３，４，５−トリフルオロ−Ｄ−フェニルアラニン、３，４，５−トリフルオロ−Ｌ−フェニルアラニン、３，４−ジクロロ−Ｄ−フェニルアラニン、３，４−ジクロロ−Ｌ−フェニルアラニン、３，４−ジフルオロ−Ｄ−フェニルアラニン、３，４−ジフルオロ−Ｌ−フェニルアラニン、３，４−ジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン、３，４−ジメトキシ−Ｌ−フェニルアラニン、３，５，３’−トリヨード−Ｌ−チロニン、３，５−ジヨード−Ｄ−チロシン、３，５−ジヨード−Ｌ−チロシン、３，５−ジヨード−Ｌ−チロニン、３−（トリフルオロメチル）−Ｄ−フェニルアラニン、３−（トリフルオロメチル）−Ｌ−フェニルアラニン、３−アミノ−Ｌ−チロシン、３−ブロモ−Ｄ−フェニルアラニン、３−ブロモ−Ｌ−フェニルアラニン、３−クロロ−Ｄ−フェニルアラニン、３−クロロ−Ｌ−フェニルアラニン、３−クロロ−Ｌ−チロシン、３−シアノ−Ｄ−フェニルアラニン、３−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、３−フルオロ−Ｄ−フェニルアラニン、３−フルオロ−Ｌ−フェニルアラニン、３−フルオロ−チロシン、３−ヨード−Ｄ−フェニルアラニン、３−ヨード−Ｌ−フェニルアラニン、３−ヨード−Ｌ−チロシン、３−メトキシ−Ｌ−チロシン、３−メチル−Ｄ−フェニルアラニン、３−メチル−Ｌ−フェニルアラニン、３−ニトロ−Ｄ−フェニルアラニン、３−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン、３−ニトロ−Ｌ−チロシン、４−（トリフルオロメチル）−Ｄ−フェニルアラニン、４−（トリフルオロメチル）−Ｌ−フェニルアラニン、４−アミノ−Ｄ−フェニルアラニン、４−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、４−ベンゾイル−Ｄ−フェニルアラニン、４−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、４−ビス（２−クロロエチル）アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、４−ブロモ−Ｄ−フェニルアラニン、４−ブロモ−Ｌ−フェニルアラニン、４−クロロ−Ｄ−フェニルアラニン、４−クロロ−Ｌ−フェニルアラニン、４−シアノ−Ｄ−フェニルアラニン、４−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、４−フルオロ−Ｄ−フェニルアラニン、４−フルオロ−Ｌ��フェニルアラニン、４−ヨード−Ｄ−フェニルアラニン、４−ヨード−Ｌ−フェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、チロキシン、３，３−ジフェニルアラニン、チロニン、エチル−チロシン、およびメチル−チロシンを含む。
【００５７】
アミノ酸アナログはプロリンのアナログを含む。プロリンのアミノ酸アナログの例は、限定されないが、３，４−デヒドロ−プロリン、４−フルオロ−プロリン、シス−４−ヒドロキシ−プロリン、チアゾリジン−２−カルボン酸、およびトランス−４−フルオロ−プロリンを含む。
【００５８】
アミノ酸アナログは、セリンおよびトレオニンのアナログを含む。セリンとトレオニンのアミノ酸アナログの例は、限定されないが、３−アミノ−２−ヒドロキシ−５−メチルヘキサン酸、２−アミノ−３−ヒドロキシ−４−メチルペンタン酸、２−アミノ−３−エトキシブタン酸、２−アミノ−３−メトキシブタン酸、４−アミノ−３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸、２−アミノ−３−ベンジルオキシプロピオン酸、２−アミノ−３−ベンジルオキシプロピオン酸、２−アミノ−３−エトキシプロピオン酸、４−アミノ−３−ヒドロキシブタン酸、およびα−メチルセリンを含む。
【００５９】
アミノ酸アナログは、トリプトファンのアナログを含む。トリプトファンのアミノ酸アナログの例は、限定されないが、以下を含む：α−メチル−トリプトファン；β−（３−ベンゾチエニル）−Ｄ−アラニン；β−（３−ベンゾチエニル）−Ｌ−アラニン；１−メチル−トリプトファン；４−メチル−トリプトファン；５−ベンジルオキシ−トリプトファン；５−ブロモ−トリプトファン；５−クロロ−トリプトファン；５−フルオロ−トリプトファン；５−ヒドロキシ−トリプトファン；５−ヒドロキシ−Ｌ−トリプトファン；５−メトキシ−トリプトファン；５−メトキシ−Ｌ−トリプトファン；５−メチル−トリプトファン；６−ブロモ−トリプトファン；６−クロロ−Ｄ−トリプトファン；６−クロロ−トリプトファン；６−フルオロ−トリプトファン；６−メチル−トリプトファン；７−ベンジルオキシ−トリプトファン；７−ブロモ−トリプトファン；７−メチル−トリプトファン；Ｄ−１，２，３，４−テトラヒドロ−ノルハルマン−３−カルボン酸；６−メトキシ−１，２，３，４−テトラヒドロノルハルマン−１−カルボン酸；７−アザトリプトファンアミド；Ｌ−１，２，３，４−テトラヒドロ−ノルハルマン−３−カルボン酸；５−メトキシ−２−メチル−トリプトファン；および、６−クロロ−Ｌ−トリプトファン。
【００６０】
いくつかの実施形態では、アミノ酸アナログはラセミ化合物である。いくつかの実施形態では、アミノ酸アナログのＤ異性体が使用される。いくつかの実施形態では、アミノ酸アナログのＬ異性体が使用される。他の実施形態では、アミノ酸アナログは、ＲまたはＳの構成であるキラル中心を含む。さらに他の実施形態では、β−アミノ酸アナログのアミノ基は、保護基、例えば、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ基）、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）、トシルなどで置換される。さらに他の実施形態では、β−アミノ酸アナログのカルボン酸官能基は、例えば、そのエステル誘導体として保護される。いくつかの実施形態では、アミノ酸アナログの塩が使用される。
【００６１】
「必須でない」アミノ酸残基は、その必須の生物学的あるいは生物化学的な活性（例えば、受容体結合または活性化）を消失させたり、あるいは実質的に変化させたりすることなく、ポリペプチドの野生型の配列から変化可能な残基である。「必須」アミノ酸残基は、ポリペプチドの野生型の配列から変化すると、ポリペプチドの必須の生物学的あるいは生物化学的な活性を消失させたり、あるいは実質的に変化させたりする、残基である。
【００６２】
「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基と取り替えられるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性の側鎖（例えば、Ｋ、Ｒ、Ｈ）、酸性の側鎖（例えば、Ｄ、Ｅ）、非荷電の極性側鎖（例えば、Ｇ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｃ）、非極性側鎖（例えば、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｍ、Ｗ）、β−分枝側鎖（例えば、Ｔ、Ｖ、Ｉ）、および、芳香族側鎖（例えば、Ｙ、Ｆ、Ｗ、Ｈ）を有するアミノ酸を含む。したがって、ポリペプチド中の予測された非必須アミノ酸残基は、例えば、同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸残基と取り替えられる。許容可能な置換の他の例は、等配電子の検討（例えば、メチオニンのためのノルロイシン）あるいは他の特性（例えば、フェニルアラニンでは２−チエニルアラニン、あるいはトリプトファンでは６−Ｃｌ−トリプトファン）に基づく置換である。
【００６３】
無血清条件下でのＷｎｔポリペプチドの培養
いくつかの実施形態では、無血清条件下でＷｎｔポリペプチドを生成する方法が本明細書に開示される。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔポリペプチドはシャペロンと共発現される。場合によっては、Ｗｎｔポリペプチドは、共発現されたシャペロンと複合体を形成し、Ｗｎｔポリペプチド−シャペロン複合体はＷｎｔポリペプチドを安定化させ、Ｗｎｔポリペプチド発現を増強する。いくつかの例では、Ｗｎｔポリペプチドは、生物学的に活性なＷｎｔポリペプチド（例えば、ヒトの生物学的に活性なＷｎｔポリペプチド）である。場合によっては、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ３Ａ、Ｗｎｔ５Ｂ、あるいはＷｎｔ１０Ｂポリペプチドである。場合によっては、ＷｎｔポリペプチドはＷｎｔ３Ａポリペプチドである。場合によっては、ＷｎｔポリペプチドはヒトＷｎｔ３Ａポリペプチドである。場合によっては、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、例えば、修飾および／または切断を含む、本明細書に記載されるＷｎｔ３Ａ変異体である。
【００６４】
いくつかの例では、巨大分子構造の組み立てまたは分解を促進するタンパク質あるいはその断片を含む、本明細書に記載されるシャペロンである。いくつかの例では、シャペロンは、分泌、発現、安定性、および／または精製を促す、タンパク質あるいはその断片を含む。Ｗｎｔポリペプチドの文脈において本明細書で使用されるように、シャペロンは、Ｗｎｔポリペプチドの分泌、発現、安定性、および／または精製を促す、タンパク質あるいはその断片を含む。さらに、Ｗｎｔポリペプチドの文脈において本明細書で使用されるように、シャペロンは、操作された細胞株からの細胞においてＷｎｔポリペプチドと共発現されるタンパク質あるいはその断片である。そのような場合、培養条件は無血清条件である。
【００６５】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたシャペロンは、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ、Ｗｎｔｌｅｓｓ、Ａｆａｍｉｎ、あるいはＰｏｒｃｕｐｉｎｅを含む。いくつかの例では、シャペロンはＦｒｉｚｚｌｅｄを含む。Ｆｒｉｚｚｌｅｄは、Ｗｎｔシグナル伝達経路の受容体として役立つＧタンパク質共役受容体タンパク質のファミリーである。いくつかの例では、このファミリーには、１０のメンバー、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−１（ＦＺＤ１）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−２（ＦＺＤ２）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−３（ＦＺＤ３）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−４（ＦＺＤ４）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−５（ＦＺＤ５）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−６（ＦＺＤ６）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−７（ＦＺＤ７）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８（ＦＺＤ８）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−９（ＦＺＤ９）、および、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−１０（ＦＺＤ１０）がある。いくつかの例では、Ｆｒｉｚｚｌｅｄタンパク質は、例えば、１：１の複合体を形成するＷｎｔポリペプチドと共発現される。場合によっては、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、およびＦＺＤ１０から選択されたＦｒｉｚｚｌｅｄ  タンパク質は、Ｗｎｔポリペプチドと共発現される。いくつかの例では、Ｗｎｔポリペプチドと共発現されるＦｒｉｚｚｌｅｄタンパク質は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄタンパク質のない状態のＷｎｔポリペプチドと比較して、Ｗｎｔポリペプチドの分泌を改善し、Ｗｎｔポリペプチドを安定化させ、および／または、Ｗｎｔポリペプチドの発現を増強する。いくつかの例では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ５Ａポリペプチド、Ｗｎｔ１０Ｂポリペプチド、あるいはＷｎｔ３Ａポリペプチドである。場合によっては、ＷｎｔポリペプチドはＷｎｔ３Ａポリペプチドである。
【００６６】
いくつかの実施形態において、シャペロンはＦｒｉｚｚｌｅｄ−８（ＦＺＤ８）を含む。ＦＺＤ８遺伝子によってコードされるＦｒｉｚｚｌｅｄ−８は、７回膜貫通ドメインタンパク質およびＷｎｔポリペプチドのための受容体である。いくつかの例では、ＦＺＤ８はＷｎｔポリペプチドと共発現される。場合によっては、ＦＺＤ８対Ｗｎｔポリペプチドのモル比は、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、あるいは４：１である。いくつかの例では、ＦＺＤ８対Ｗｎｔポリペプチドのモル比は、１：４である。いくつかの例では、ＦＺＤ８対Ｗｎｔポリペプチドのモル比は、１：２である。いくつかの例では、ＦＺＤ８対Ｗｎｔポリペプチドのモル比は、１：１である。いくつかの例では、ＦＺＤ８対Ｗｎｔポリペプチドのモル比は、２：１である。場合によっては、ＦＺＤ８対Ｗｎｔポリペプチドのモル比は、４：１である。いくつかの例では、Ｗｎｔポリペプチドと共発現されるＦＺＤ８は、ＦＺＤ８のない状態のＷｎｔポリペプチドと比較して、Ｗｎｔポリペプチドの分泌を改善し、Ｗｎｔポリペプチドを安定化させ、および／または、Ｗｎｔポリペプチドの発現を増強する。いくつかの例では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ５Ａポリペプチド、Ｗｎｔ１０Ｂポリペプチド、あるいはＷｎｔ３Ａポリペプチドである。場合によっては、ＷｎｔポリペプチドはＷｎｔ３Ａポリペプチドである。
【００６７】
いくつかの例では、ヒトのＦｒｉｚｚｌｅｄ−８（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑ：ＮＰ＿１１４０７２．１；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）は、６９４アミノ酸長さを含む。場合によっては、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８は、２７アミノ酸シグナル配列、２４８アミノ酸細胞外Ｎ末端、および、８９アミノ酸Ｃ末端を含む。場合によっては、Ｎ末端はさらに、２つの推定上のＮ結合型グリコシル化部位、ポリプロリンセグメントとポリグリシンセグメントを含む。加えて、Ｎ末端は、約１２０アミノ酸長さである、システインに富んだドメイン（ＣＲＤ）を含む。Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８のＣ末端は、Ｔｈｒ−ｘ−Ｖａｌトリペプチド、Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−ｘ−ｘ−ｘ−Ｔｒｐモチーフ、および２５アミノ酸長さのポリグリシン反復を含む。いくつかの例では、ヒトＦＺＤ８はＷｎｔポリペプチドと共発現される。場合によっては、ヒトのＦＺＤ８対Ｗｎｔポリペプチドのモル比は、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、あるいは４：１である。いくつかの例では、ヒトのＦＺＤ８対Ｗｎｔポリペプチドのモル比は、１：４である。いくつかの例では、ヒトのＦＺＤ８対Ｗｎｔポリペプチドのモル比は、１：２である。いくつかの例では、ヒトのＦＺＤ８対Ｗｎｔポリペプチドのモル比は、１：１である。いくつかの例では、ヒトのＦＺＤ８対Ｗｎｔポリペプチドのモル比は、２：１である。場合によっては、ヒトのＦＺＤ８対Ｗｎｔポリペプチドのモル比は、４：１である。いくつかの例では、Ｗｎｔポリペプチドと共発現されるヒトのＦＺＤ８は、ヒトのＦＺＤ８のない状態のＷｎｔポリペプチドと比較して、Ｗｎｔポリペプチドの分泌を改善し、Ｗｎｔポリペプチドを安定化させ、および／または、Ｗｎｔポリペプチドの発現を増強する。いくつかの例では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ５Ａポリペプチド、Ｗｎｔ１０Ｂポリペプチド、あるいはＷｎｔ３Ａポリペプチドである。場合によっては、ＷｎｔポリペプチドはＷｎｔ３Ａポリペプチドである。
【００６８】
いくつかの例では、本明細書に記載されたＦｒｉｚｚｌｅｄ−８ポリペプチドは、ヒトのＦｒｉｚｚｌｅｄ−８に対して約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、あるいは９９％の配列同一性を含む。いくつかの例では、本明細書に記載されたＦｒｉｚｚｌｅｄ−８ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に対して約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、あるいは９９％の配列同一性を含む。いくつかの例では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に対して約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、あるいは９９％の配列同一性を含むＦｒｉｚｚｌｅｄ−８ポリペプチドは、Ｗｎｔポリペプチドと共発現される。場合によっては、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８ポリペプチド対Ｗｎｔポリペプチドのモル比は、例えば、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、あるいは４：１である。いくつかの例では、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８ポリペプチド対Ｗｎｔポリペプチドのモル比は、１：４である。いくつかの例では、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８ポリペプチド対Ｗｎｔポリペプチドのモル比は、１：２である。いくつかの例では、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８ポリペプチド対Ｗｎｔポリペプチドのモル比は、１：１である。いくつかの例では、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８ポリペプチド対Ｗｎｔポリペプチドのモル比は、２：１である。場合によっては、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８ポリペプチド対Ｗｎｔポリペプチドのモル比は、４：１である。いくつかの例では、Ｗｎｔポリペプチドと共発現されるＦｒｉｚｚｌｅｄ−８タンパク質は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８タンパク質のない状態のＷｎｔポリペプチドと比較して、Ｗｎｔポリペプチドの分泌を改善し、Ｗｎｔポリペプチドを安定化させ、および、Ｗｎｔポリペプチドの発現を増強する。いくつかの例では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ５Ａポリペプチド、Ｗｎｔ１０Ｂポリペプチド、あるいはＷｎｔ３Ａポリペプチドである。場合によっては、ＷｎｔポリペプチドはＷｎｔ３Ａポリペプチドである。
【００６９】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたシャペロンは、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８タンパク質８融合タンパク質を含む。場合によっては、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質は、切断されたＦｒｉｚｚｌｅｄ−８タンパク質を含む。いくつかの例では、切断されたＦｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８のシステインに富んだ領域（ＣＲＤ）を含む。いくつかの例では、切断されたＦｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸残基１からアミノ酸残基１５１まで及ぶ領域を含む。他の例では、切断されたＦｒｉｚｚｌｅｄ−８タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸残基１からアミノ酸残基１７２まで及ぶ領域を含む。
【００７０】
いくつかの例では、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質は、抗体のＦｃ部分を含む。いくつかの例では、抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、あるいはＩｇＭから選択される。場合によっては、抗体はＩｇＧである。場合によっては、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質は、切断されたＦｒｉｚｚｌｅｄ−８タンパク質（例えば、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８のＣＲＤ部分）およびＩｇＧ  Ｆｃ部分を含む。
【００７１】
場合によっては、切断されたＦｒｉｚｚｌｅｄ−８タンパク質は直接的にＦｃ部分に共有結合される。その他の場合において、切断されたＦｒｉｚｚｌｅｄ−８タンパク質は、リンカーを介して間接的にＦｃ部分に共有結合される。いくつかの例では、リンカーは一連のグリシン、アラニン、あるいはこれらの組み合わせを含む。いくつかの例では、リンカーはアミノ酸配列ＩＥＧＲＭＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）を含む。
【００７２】
場合によっては、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、あるいは９９％の配列同一性を含む。場合によっては、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に対して少なくとも８０％の配列同一性を含む。場合によっては、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に対して少なくとも８５％の配列同一性を含む。場合によっては、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む。場合によっては、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に対して少なくとも９５％の配列同一性を含む。場合によっては、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に対して少なくとも９６％の配列同一性を含む。場合によっては、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に対して少なくとも９７％の配列同一性を含む。場合によっては、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に対して少なくとも９８％の配列同一性を含む。場合によっては、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に対して少なくとも９９％の配列同一性を含む。場合によっては、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に対して少なくとも１００％の配列同一性を含む。場合によっては、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に記載される配列からなる。
【００７３】
いくつかの例では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、あるいは９９％の配列同一性を含むＦｒｉｚｚｌｅｄ−８ポリペプチドは、Ｗｎｔポリペプチドと共発現される。場合によっては、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８ポリペプチド対Ｗｎｔポリペプチドのモル比は、例えば、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、あるいは４：１である。いくつかの例では、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８ポリペプチド対Ｗｎｔポリペプチドのモル比は、１：４である。いくつかの例では、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８ポリペプチド対Ｗｎｔポリペプチドのモル比は、１：２である。いくつかの例では、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８ポリペプチド対Ｗｎｔポリペプチドのモル比は、１：１である。いくつかの例では、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８ポリペプチド対Ｗｎｔポリペプチドのモル比は、２：１である。場合によっては、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８ポリペプチド対Ｗｎｔポリペプチドのモル比は、４：１である。いくつかの例では、Ｗｎｔポリペプチドと共発現されるＦｒｉｚｚｌｅｄ−８タンパク質は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８タンパク質のない状態のＷｎｔポリペプチドと比較して、Ｗｎｔポリペプチドの分泌を改善し、Ｗｎｔポリペプチドを安定化させ、および、Ｗｎｔポリペプチドの発現を増強する。いくつかの例では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ５Ａポリペプチド、Ｗｎｔ１０Ｂポリペプチド、あるいはＷｎｔ３Ａポリペプチドである。場合によっては、ＷｎｔポリペプチドはＷｎｔ３Ａポリペプチドである。場合によっては、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、例えば、修飾および／または切断を含む、本明細書に記載されるＷｎｔ３Ａ変異体である。
【００７４】
場合によっては、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、あるいは９９％の配列同一性を含む。場合によっては、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８に対して少なくとも８０％の配列同一性を含む。場合によっては、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８に対して少なくとも８５％の配列同一性を含む。場合によっては、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む。場合によっては、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８に対して少なくとも９５％の配列同一性を含む。場合によっては、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８に対して少なくとも９６％の配列同一性を含む。場合によっては、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８に対して少なくとも９７％の配列同一性を含む。場合によっては、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８に対して少なくとも９８％の配列同一性を含む。場合によっては、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８に対して少なくとも９９％の配列同一性を含む。場合によっては、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８に対して少なくとも１００％の配列同一性を含む。場合によっては、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８に記載される配列からなる。
【００７５】
いくつかの例では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、あるいは９９％の配列同一性を含むＦｒｉｚｚｌｅｄ−８ポリペプチドは、Ｗｎｔポリペプチドと共発現される。場合によっては、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８ポリペプチド対Ｗｎｔポリペプチド対のモル比は、例えば、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１  、３：１、または４：１である。いくつかの例では、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８ポリペプチド対Ｗｎｔポリペプチドのモル比は、１：４である。いくつかの例では、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８ポリペプチド対Ｗｎｔポリペプチドのモル比は、１：２である。いくつかの例では、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８ポリペプチド対Ｗｎｔポリペプチドのモル比は、１：１である。いくつかの例では、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８ポリペプチド対Ｗｎｔポリペプチドのモル比は、２：１である。場合によっては、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８ポリペプチド対Ｗｎｔポリペプチドのモル比は、４：１である。いくつかの例では、Ｗｎｔポリペプチドと共発現されたＦｒｉｚｚｌｅｄ−８タンパク質は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８タンパク質の不在下でのＷｎｔポリペプチドと比較して、Ｗｎｔポリペプチドの分泌を改善し、Ｗｎｔポリペプチドを安定化させ、およびＷｎｔポリペプチドの発現を増強する。いくつかの例では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ５Ａポリペプチド、Ｗｎｔ１０Ｂポリペプチド、あるいはＷｎｔ３Ａポリペプチドである。場合によっては、ＷｎｔポリペプチドはＷｎｔ３Ａポリペプチドである。場合によっては、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、例えば、修飾および／またはトランケーションを含む、本明細書に記載されるＷｎｔ３Ａ変異体である。
【００７６】
Ｗｎｔｌｅｓｓ
幾つかの実施形態において、シャペロンはＷｎｔｌｅｓｓを含む。Ｇタンパク質共役受容体１７７（ＧＰＲ１７７）あるいはタンパク質平等中断ホモログ（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｖｅｎｎｅｓｓ  ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｅｄ  ｈｏｍｏｌｏｇ）（ＥＶＩ）としても知られるＷｎｔｌｅｓｓは、脂質で修飾されたＷｎｔタンパク質のシャペロンとして機能するマルチパス膜貫通タンパク質であり、それは、Ｗｎｔ発現、細胞内位置、結合、Ｗｎｔタンパク質の細胞小器官に特有の関連性を調節する。ヒトＷｎｔｌｅｓｓは、Ｗｎｔｌｅｓｓ  ＷＮＴリガンド分泌メディエーター（ＷＬＳ）遺伝子（ＥＶＩ、ＦＬＩ２３０９１、ｍｉｇ−１４、ＭＲＰ、あるいはＷｎｔｌｅｓｓホモログとしても知られる）によってコード化される。いくつかの例では、ヒトＷｎｔｌｅｓｓはアイソフォーム１、２、および３を含む。
【００７７】
いくつかの例では、Ｗｎｔｌｅｓｓは、本明細書に記載されるＷｎｔポリペプチドと相互作用する。場合によっては、Ｗｎｔｌｅｓｓが、本明細書に記載される生物学的に機能的なＷｎｔポリペプチドと選択的に相互作用する。場合によっては、生物学的に機能的なＷｎｔポリペプチドは、脂質で修飾されたＷｎｔポリペプチドである。
【００７８】
場合によっては、Ｗｎｔポリペプチドと共発現されたＷｎｔｌｅｓｓは、Ｗｎｔポリペプチド発現を増強し、Ｗｎｔポリペプチド分泌を改善し、および／またはＷｎｔポリペプチドを安定化させる。場合によっては、これが、Ｗｎｔｌｅｓｓの不在下での同等な細胞のＷｎｔポリペプチドに関連する。いくつかの例では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ５Ａポリペプチド、Ｗｎｔ１０Ｂポリペプチド、あるいはＷｎｔ３Ａポリペプチドである。場合によっては、ＷｎｔポリペプチドはＷｎｔ３Ａポリペプチドである。
【００７９】
いくつかの実施形態では、Ｗｎｔｌｅｓｓポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、あるいは９９％の配列同一性を含む。場合によっては、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、あるいは９９％の配列同一性を含むＷｎｔｌｅｓｓポリペプチドは、Ｗｎｔポリペプチドと共発現される。場合によっては、Ｗｎｔｌｅｓｓポリペプチド対Ｗｎｔポリペプチドのモル比が、例えば、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、または４：１である。場合によっては、Ｗｎｔポリペプチドと共発現されたＷｎｔｌｅｓｓポリペプチドは、Ｗｎｔポリペプチド発現を増強し、Ｗｎｔポリペプチド分泌を改善し、および／またはＷｎｔポリペプチドを安定化させる。場合によっては、これが、Ｗｎｔｌｅｓｓの不在下での同等な細胞のＷｎｔポリペプチドに関連する。いくつかの例では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ５Ａポリペプチド、Ｗｎｔ１０Ｂポリペプチド、あるいはＷｎｔ３Ａポリペプチドである。場合によっては、ＷｎｔポリペプチドはＷｎｔ３Ａポリペプチドである。場合によっては、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、例えば、修飾および／またはトランケーションを含む、本明細書に記載されるＷｎｔ３Ａ変異体である。
【００８０】
Ａｆａｍｉｎ
幾つかの実施形態において、シャペロンはＡｆａｍｉｎを含む。血清糖タンパク質であるＡｆａｍｉｎは、アルブミン遺伝子ファミリーのメンバーであり、ＡＦＭ遺伝子によってコード化される。いくつかの例では、Ａｆａｍｉｎは、本明細書に記載されるＷｎｔポリペプチドと相互作用する。場合によっては、Ａｆａｍｉｎは、本明細書に記載される生物学的に機能的なＷｎｔポリペプチドと選択的に相互作用する。場合によっては、生物学的に機能的なＷｎｔポリペプチドは、脂質で修飾されたＷｎｔポリペプチドである。
【００８１】
いくつかの例において、Ｗｎｔポリペプチドと共発現されたＡｆａｍｉｎは、Ｗｎｔポリペプチド発現を増強し、Ｗｎｔポリペプチド分泌を改善し、および／またはＷｎｔポリペプチドを安定化させる。場合によっては、これが、Ａｆａｍｉｎの不在下での同等な細胞のＷｎｔポリペプチドに関連する。いくつかの例では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ５Ａポリペプチド、Ｗｎｔ１０Ｂポリペプチド、あるいはＷｎｔ３Ａポリペプチドである。場合によっては、ＷｎｔポリペプチドはＷｎｔ３Ａポリペプチドである。
【００８２】
いくつかの実施形態では、Ａｆａｍｉｎポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、あるいは９９％の配列同一性を含む。場合によっては、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、あるいは９９％の配列同一性を含むＡｆａｍｉｎポリペプチドは、Ｗｎｔポリペプチドと共発現される。場合によっては、Ａｆａｍｉｎポリペプチド対Ｗｎｔポリペプチドのモル比が、例えば、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、または４：１である。場合によっては、Ｗｎｔポリペプチドと共発現されたＡｆａｍｉｎポリペプチドは、Ｗｎｔポリペプチド発現を増強し、Ｗｎｔポリペプチド分泌を改善し、および／またはＷｎｔポリペプチドを安定化させる。場合によっては、これが、Ａｆａｍｉｎの不在下での同等な細胞のＷｎｔポリペプチドに関連する。いくつかの例では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ５Ａポリペプチド、Ｗｎｔ１０Ｂポリペプチド、あるいはＷｎｔ３Ａポリペプチドである。場合によっては、ＷｎｔポリペプチドはＷｎｔ３Ａポリペプチドである。場合によっては、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、例えば、修飾および／またはトランケーションを含む、本明細書に記載されるＷｎｔ３Ａ変異体である。
【００８３】
Ｐｏｒｃｕｐｉｎｅ
幾つかの実施形態において、シャペロンはＰｏｒｃｕｐｉｎｅを含む。遺伝子ＰＯＲＣＮ（あるいはＰｏｒｃｕｐｉｎｅホモログ、ＰＰＮ、ＭＧ６１、予想されるタンパク質−システインＮ−パルミトイルトランスフェラーゼ、あるいはタンパク質−セリンＯ−パルミトレオイルトランスフェラーゼ  ｐｏｒｃｕｐｉｎｅ）によってコード化されたｐｏｒｃｕｐｉｎｅは、Ｗｎｔタンパク質の処理に関与するマルチパス膜貫通小胞体タンパク質である。いくつかの例では、Ｐｏｒｃｕｐｉｎｅは５つの異なるアイソフォーム（アイソフォーム１−５）をさらに含む。
【００８４】
いくつかの例では、Ｐｏｒｃｕｐｉｎｅは、本明細書に記載されるＷｎｔポリペプチドと相互作用する。場合によっては、Ｐｏｒｃｕｐｉｎｅは、本明細書に記載される生物学的に機能的なＷｎｔポリペプチドと選択的に相互作用する。場合によっては、生物学的に機能的なＷｎｔポリペプチドは、脂質で修飾されたＷｎｔポリペプチドである。
【００８５】
いくつかの例では、Ｐｏｒｃｕｐｉｎｅは、例えば、Ｗｎｔポリペプチド発現を増強し、Ｗｎｔポリペプチド分泌を改善し、および／またはＷｎｔポリペプチドを安定化させるために、Ｗｎｔポリペプチドと共発現される。場合によっては、これが、Ｐｏｒｃｕｐｉｎｅの不在下での同等な細胞のＷｎｔポリペプチドに関連する。いくつかの例では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ５Ａポリペプチド、Ｗｎｔ１０Ｂポリペプチド、あるいはＷｎｔ３Ａポリペプチドである。場合によっては、ＷｎｔポリペプチドはＷｎｔ３Ａポリペプチドである。
【００８６】
いくつかの実施形態では、Ｐｏｒｃｕｐｉｎｅポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、あるいは９９％の配列同一性を含む。場合によっては、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、あるいは９９％の配列同一性を含むＰｏｒｃｕｐｉｎｅポリペプチドは、Ｗｎｔポリペプチドと共発現される。場合によっては、Ｐｏｒｃｕｐｉｎｅポリペプチド対Ｗｎｔポリペプチドのモル比が、例えば、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、または４：１である。場合によっては、Ｗｎｔポリペプチドと共発現されたＰｏｒｃｕｐｉｎｅポリペプチドは、Ｗｎｔポリペプチド発現を増強し、Ｗｎｔポリペプチド分泌を改善し、および／またはＷｎｔポリペプチドを安定化させる。場合によっては、これが、Ｐｏｒｃｕｐｉｎｅの不在下での同等な細胞のＷｎｔポリペプチドに関連する。いくつかの例では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ５Ａポリペプチド、Ｗｎｔ１０Ｂポリペプチド、あるいはＷｎｔ３Ａポリペプチドである。場合によっては、ＷｎｔポリペプチドはＷｎｔ３Ａポリペプチドである。場合によっては、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、例えば、修飾および／またはトランケーションを含む、本明細書に記載されるＷｎｔ３Ａ変異体である。
【００８７】
最小血清条件から生成されたＷｎｔポリペプチドを処理する方法
いくつかの実施形態において、最小血清条件を含む培養物からＷｎｔポリペプチド（例えば、Ｗｎｔポリペプチド−シャペロン複合体）を採取し、その後、単離されたＷｎｔポリペプチドを生成するためにＷｎｔポリペプチドを精製する方法が本明細書に記載される。いくつかの実施形態において、安定したＷｎｔポリペプチドシャペロン複合体が収集され、その後、活性Ｗｎｔポリペプチドを生成するために処理される。いくつかの例では、安定したＷｎｔポリペプチド−シャペロン複合体からのＷｎｔポリペプチドは不活性であるが、一旦ＷｎｔポリペプチドがＷｎｔポリペプチド−シャペロン複合体から分離すると活性になる。
【００８８】
いくつかの実施形態において、上記方法は、Ｗｎｔポリペプチド−シャペロン複合体を生成するために、調整培地中の細胞においてＷｎｔポリペプチドとシャペロンを共発現させる工程と、調整培地からＷｎｔポリペプチド−シャペロン複合体を収集する工程と、処理されたＷｎｔポリペプチドを生成するために、スルホン化された多環芳香族の化合物で固定された複数のビーズ、あるいは抗体のＦｃ部分と相互作用するポリペプチドを含む親和性クロマトグラフィーカラムのいずれかへとＷｎｔポリペプチド−シャペロン複合体を導入する工程と、リポソームＷｎｔポリペプチドを生成するために、処理されたＷｎｔポリペプチドをリポソームの水溶液と接触させる工程と、を含む。
【００８９】
いくつかの実施形態において、上記方法は、（ａ）Ｗｎｔポリペプチド−シャペロン複合体を生成するために、調整培地中の細胞においてＷｎｔポリペプチドをシャペロンと共発現させる工程と；（ｂ）調整培地からのＷｎｔポリペプチド−シャペロン複合体を収集する工程と；（ｃ）溶出したＷｎｔポリペプチド−シャペロン複合体を生成するために、スルホン化された多環芳香族の化合物で固定されたカラムへとＷｎｔポリペプチド−シャペロン複合体を導入する工程と；（ｄ）処理されたＷｎｔポリペプチドを生成するために、抗体のＦｃ部分と相互作用するポリペプチドを含む親和性クロマトグラフィーカラムによって溶出されたＷｎｔポリペプチド−シャペロン複合体を処理する工程と；（ｅ）リポソームＷｎｔポリペプチドを生成するために、リポソームの水溶液と処理されたＷｎｔポリペプチドを接触させる工程と、を含む。
【００９０】
いくつかの実施形態において、（ａ）Ｗｎｔポリペプチド−シャペロン複合体を生成するために、調整培地中の細胞においてＷｎｔポリペプチドをシャペロンと共発現させる工程と；（ｂ）調整培地からＷｎｔポリペプチド−シャペロン複合体を収集する工程と；（Ｃ）溶出されたＷｎｔポリペプチド−シャペロン複合体を生成するために、抗体のＦｃ部分と相互作用するポリペプチドを含む親和性クロマトグラフィーカラムへと、Ｗｎｔポリペプチド−シャペロン複合体を導入する工程と；（ｄ）処理されたＷｎｔポリペプチドを生成するために、スルホン化された多環芳香族の化合物で固定されたカラムによって、溶出されたＷｎｔポリペプチド−シャペロン複合体を処理する工程と；（ｅ）リポソームＷｎｔポリペプチドを生成するために、リポソームの水溶液と処理されたＷｎｔポリペプチドを接触させる工程と、を含む方法も本明細書に記載される。
【００９１】
いくつかの実施形態において、機能的に活性なＷｎｔポリペプチドを調製する方法が本明細書にさらに記載され、上記方法は：（ａ）機能的に不活性のＷｎｔポリペプチドとシャペロン組成物を含む第１のＷｎｔ組成物を含む混合物を生成するために、糖界面活性剤を含む緩衝液で複数のＷｎｔポリペプチド−シャペロン複合体をインキュベートする工程と；（ｂ）機能的に活性なＷｎｔポリペプチドと糖界面活性剤を含む第２のＷｎｔ組成物を生成するために、スルホン化された多環芳香族の化合物で固定されたカラムを用いて混合物から第１のＷｎｔ組成物を分離する工程と；（ｃ）第３のＷｎｔ組成物を生成するために、抗体のＦｃ部分と相互作用するポリペプチドを含む親和性クロマトグラフィーカラム、混合モードカラム、サイズ排除クロマトグラフィーカラム、あるいはそれらの組み合わせを用いて、第２のＷｎｔ組成物を随意に少なくとも一回精製する工程と；（ｄ）機能的に活発なＷｎｔポリペプチドを含む最終Ｗｎｔ組成物を生成するために、リポソームの水溶液を第２のＷｎｔ組成物あるいは随意に第３のＷｎｔ組成物と接触させる工程と、を含む。
【００９２】
いくつかの実施形態において、機能的に活性なＷｎｔポリペプチドを調製する方法が本明細書にさらに記載され、上記方法は：（Ｃ）溶出されたＷｎｔポリペプチド−シャペロン複合体の混合物を生成するために、抗体のＦｃ部分と相互作用するポリペプチドを含む第１の親和性クロマトグラフィーカラム上で、複数のＷｎｔポリペプチド−シャペロン複合体を精製する工程と；（ａ）機能的に不活性のＷｎｔポリペプチドとシャペロン組成物を含む第１のＷｎｔ組成物を含む混合物を生成するために、糖界面活性剤を含む緩衝液でＷｎｔポリペプチド−シャペロン複合体の溶解された混合体をインキュベートする工程と；（ｂ）機能的に活性なＷｎｔポリペプチドと糖界面活性剤を含む第２のＷｎｔ組成物を生成するために、スルホン化された多環芳香族の化合物で固定されたカラムを用いて混合物から第１のＷｎｔ組成物を分離する工程と；（ｄ）第３のＷｎｔ組成物を生成するために、抗体のＦｃ部分と相互作用するポリペプチドを含む第２の親和性クロマトグラフィーカラム、混合モードカラム、およびサイズ排除クロマトグラフィーカラムを用いて第２のＷｎｔ組成物を精製する工程と；（ｅ）機能的に活発なＷｎｔポリペプチドを含む最終Ｗｎｔ組成物を生成するために、リポソームの水溶液を第２のＷｎｔ組成物あるいは随意に第３のＷｎｔ組成物と接触させる工程と、を含む。
【００９３】
いくつかの例では、スルホン化された多環芳香族の化合物の非限定的な例は、シバクロンブルーＦ３ＧＡである。いくつかの例では、シバクロンブルーＦ３ＧＡは、トリアジニル染料（ａｔｒｉａｚｉｎｙｌ  ｄｙｅ）である。いくつかの例では、トリアジニル染料で固定されたビーズは、上に記載された精製工程で使用される。いくつかの例では、シバクロンブルーＦ３ＧＡで固定されたクロマトグラフィーカラムの非限定的な例は、ブルーセファロースカラムである。
【００９４】
いくつかの実施形態において、精製は、スルホン化された多環芳香族の化合物で固定された複数のビーズを使用してバッチモードで実行される。一般的に、Ｗｎｔポリペプチド（例えば、Ｗｎｔポリペプチド−シャペロン複合体）は、低濃度の塩を含有している結合緩衝液中のスルホン化された多環芳香族の化合物で固定されたビーズと結合する。高濃度の塩は、タンパク質とビーズの間の非共有結合性イオン相互作用を不安定にし、そのために、Ｗｎｔポリペプチド（例えば、Ｗｎｔポリペプチド−シャペロン複合体）の溶出を可能にする。いくつかの実施形態において、結合緩衝液に使用される塩の濃度は、最大で０、０．０１、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０ｍＭ、あるいはそれ以下である。いくつかの実施形態において、結合緩衝液に使用される塩の濃度は、少なくとも０、０．０１、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０ｍＭ、あるいはそれ以上である。いくつかの実施形態において、１以上の洗浄緩衝液は、非結合の不純物を取り除くために使用される。いくつかの実施形態において、最大で１、２、３、４、５、あるいはそれ以上の洗浄工程が使用される。いくつかの実施形態において、少なくとも１、２、３、４、５、あるいはそれ以下の洗浄工程が使用される。いくつかの実施形態において、洗浄緩衝液に使用される塩の濃度は、少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ｍＭ、あるいはそれ以上である。いくつかの実施形態において、洗浄緩衝液に使用される塩の濃度は、最大で３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ｍＭ、あるいはそれ以下である。幾つかの実施形態では、１つ以上の溶出工程が続く。いくつかの実施形態において、溶出緩衝液中の塩の濃度は、少なくとも８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１５００、２０００ｍＭ、あるいはそれ以上である。いくつかの実施形態において、溶出緩衝液中の塩の濃度は、最大で８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１５００、２０００ｍＭ、あるいはそれ以下である。例示的な塩は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、リン酸カルシウム、リン酸カリウム、リン酸マグネシウム、リン酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、燐酸アンモニウムなどを含む。いくつかの例では、本明細書に記載される緩衝液（例えば、結合緩衝液、洗浄緩衝液、および／または溶出緩衝液）のｐＨは、少なくとも４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、あるいはそれ以上である。いくつかの例では、緩衝液のｐＨは、最大で４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、あるいはそれ以下である。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ３Ａポリペプチド、Ｗｎｔ５Ａポリペプチド、あるいはＷｎｔ１０Ｂポリペプチドである。幾つかの実施形態において、ＷｎｔポリペプチドはＷｎｔ３Ａポリペプチドである。場合によっては、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、例えば、修飾および／またはトランケーションを含む、本明細書に記載されるＷｎｔ３Ａ変異体である。
【００９５】
いくつかの実施形態において、精製は、スルホン化された多環芳香族の化合物で固定されたカラムを使用して実行される。一般的に、Ｗｎｔポリペプチド（例えば、Ｗｎｔポリペプチド−シャペロン複合体）は、低濃度の塩を含有している結合緩衝液中のスルホン化された多環芳香族の化合物で固定されたカラムと結合する。高濃度の塩は、タンパク質とカラムビーズの間の非共有結合性イオン相互作用を不安定にし、そのために、Ｗｎｔポリペプチド（例えば、Ｗｎｔポリペプチド−シャペロン複合体）の溶出を可能にする。いくつかの実施形態において、結合緩衝液に使用される塩の濃度は、最大で０、０．０１、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０ｍＭ、あるいはそれ以下である。いくつかの実施形態において、結合緩衝液に使用される塩の濃度は、少なくとも０、０．０１、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０ｍＭ、あるいはそれ以上である。いくつかの実施形態において、１以上の洗浄緩衝液は、非結合の不純物を取り除くために使用される。いくつかの実施形態において、最大で１、２、３、４、５、あるいはそれ以上の洗浄工程が使用される。いくつかの実施形態において、少なくとも１、２、３、４、５、あるいはそれ以下の洗浄工程が使用される。いくつかの実施形態において、洗浄緩衝液に使用される塩の濃度は、少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ｍＭ、あるいはそれ以上である。いくつかの実施形態において、洗浄緩衝液に使用される塩の濃度は、最大で３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ｍＭ、あるいはそれ以下である。幾つかの実施形態では、１つ以上の溶出工程が続く。いくつかの実施形態において、溶出緩衝液中の塩の濃度は、少なくとも８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１５００、２０００ｍＭ、あるいはそれ以上である。いくつかの実施形態において、溶出緩衝液中の塩の濃度は、最大で８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１５００、２０００ｍＭ、あるいはそれ以下である。例示的な塩は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、リン酸カルシウム、リン酸カリウム、リン酸マグネシウム、リン酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、燐酸アンモニウムなどを含む。いくつかの例では、本明細書に記載される緩衝液（例えば、結合緩衝液、洗浄緩衝液、および／または溶出緩衝液）のｐＨは、少なくとも４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、あるいはそれ以上である。いくつかの例では、緩衝液のｐＨは、最大で４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、あるいはそれ以下である。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ３Ａポリペプチド、Ｗｎｔ５Ａポリペプチド、あるいはＷｎｔ１０Ｂポリペプチドである。幾つかの実施形態において、ＷｎｔポリペプチドはＷｎｔ３Ａポリペプチドである。場合によっては、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、例えば、修飾および／またはトランケーションを含む、本明細書に記載されるＷｎｔ３Ａ変異体である。
【００９６】
いくつかの実施形態において、親和性クロマトグラフィーを用いた本明細書に記載されるＷｎｔポリペプチドの精製は、バッチモードで、あるいはカラムを使用して実行され、例えば、本明細書に記載されるタグを精製するために様々な固定されたビーズを使用する。上に記載されるように、本明細書で熟考される１つ以上のタグは次のものを含む：ポリ−ヒスチジンタグ、ＰＡ−タグ、ＦＬＡＧタグ、ヒトインフルエンザ赤血球凝集素（ＦＬＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、グルタチオン−Ｓトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、カルモジュリン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ＡＢＤｚｌ−タグ（アルブミン）、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）、ヘパリン−結合ペプチド（ＨＢ）タグ、ポリ−アルギニンタグ、ポリ−リジンタグ、Ｓ−タグ、Ｓｔｒｅｐ−ＩＩタグ、およびＳＵＭＯタグ。
【００９７】
場合によっては、親和性クロマトグラフィーの方法は、抗体ベースの精製方法である。例えば、そのような場合、複数のビーズは、抗体（例えば、プロテインＡ）のＦｃ部分を認識するポリペプチドで固定化される。一般的に、Ｗｎｔポリペプチド（例えば、Ｗｎｔポリペプチド−シャペロン複合体）および、具体的にシャペロンは、約６．５以上のｐＨ（例えば、約６．８、７、７．２、７．５、７．７、７．８、８、８．５、あるいはそれ以上のｐＨ）で、例えば、結合緩衝液中のプロテインＡポリペプチドで固定されたカラムに結合される。場合によっては、プロテインＡポリペプチドを含む、親和性クロマトグラフィーと使用される溶出緩衝液は、酸性のｐＨを含み、Ｗｎｔポリペプチドを溶出させるために使用される。場合によっては、溶出緩衝液が、約２、２．５、３、３．５、４、５、あるいは約６のｐＨを含む。場合によっては、溶出緩衝液は、約３のｐＨを含む。いくつかの例では、溶出工程は段階的なｐＨ勾配を含む。場合によっては、段階的なｐＨ勾配は、約６から約３へのｐＨの減少を含む。場合によっては、ｐＨの減少は、約６、約５、約４、約３．５、および約３である。場合によっては、Ｗｎｔポリペプチドを含む溶出されたフラクションは、トリス−ＨＣｌ緩衝液によってさらに中和される。場合によっては、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液は、約９．５のｐＨを含み、１Ｍの濃度である。いくつかの例では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ５Ａポリペプチド、Ｗｎｔ１０Ｂポリペプチド、あるいはＷｎｔ３Ａポリペプチドである。場合によっては、ＷｎｔポリペプチドはＷｎｔ３Ａポリペプチドである。場合によっては、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、例えば、修飾および／またはトランケーションを含む、本明細書に記載されるＷｎｔ３Ａ変異体である。
【００９８】
いくつかの実施形態において、混合モードクロマトグラフィーカラムは、本明細書に記載されるＷｎｔポリペプチドを精製するために利用される。混合モードクロマトグラフィー（ＭＭＣ）は、固定相と分析物との間の相互作用の２つ以上の様々な形態を利用して、それらの分離を達成するクロマトグラフィー法を記載している。いくつかの例では、混合モードクロマトグラフィー方法は、２つのサブタイプ、つまり、物理的なＭＭＣと化学的なＭＭＣとにさらに分割される。物理的なＭＭＣ方法は、「タンデムカラム」としての２つの異なるカラム、「二相性カラム」などの同じカラムの両端、あるいは「混床カラム」などの単一カラム中の均質化された相において、２つ以上のタイプの充填材料含む固定相を利用する。化学的なＭＭＣ方法は、２つ以上の機能を含む１つのタイプの充填材料を利用する。例えば、化学的なＭＭＣは、精製中に選択性を増大させるために、イオン交換相互作用とともに疎水性および／または親水性相互作用を利用することがある。例示的なタイプの化学的なＭＭＣとしては、限定されないが、陰イオン交換／逆相  （ＡＥＸ／ＲＰ）を含む、陽イオン交換／逆相  （ＣＥＸ／ＲＰ）、陰イオン交換／陽イオン交換／逆相  （ＡＥＸ／ＣＥＸ／ＲＰ）、ＡＥＸ／ＨＩＬＩＣ、ＣＥＸ／ＨＩＬＩＣ、およびＡＥＸ／ＣＥＸ  ＨＩＬＩＣが挙げられる。例示的なＭＭＣカラムとしては、限定されないが、Ａｃｃｌａｉｍ  Ｔｒｉｎｉｔｙ  ＰＩ  ＬＣカラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、Ａｃｃｌａｉｍ混合モードＷＣＸ−１  ＬＣカラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、Ａｃｃｌａｉｍ混合モードＨＩＬＩＣ−１  ＬＣカラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ＯｍｎｉＰａｃ  ＰＡＸおよびＰＣＸシリーズのＨＰＬＣカラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ならびにＢｉｏ−Ｇｅｌ（商標登録）  ＨＴカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）が挙げられる。
【００９９】
いくつかの実施形態において、混合モードクロマトグラフィーカラムは、Ｗｎｔポリペプチドの精製のために利用される。いくつかの例では、物理的なＭＭＣカラムは、Ｗｎｔポリペプチドの精製のために利用される。他の例では、化学的なＭＭＣカラムは、Ｗｎｔポリペプチドの精製のために利用される。場合によっては、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ３Ａポリペプチド、Ｗｎｔ５Ａポリペプチド、あるいはＷｎｔ１０Ｂポリペプチドである。場合によっては、ＷｎｔポリペプチドはＷｎｔ３Ａポリペプチドである。場合によっては、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、例えば、修飾および／またはトランケーションを含む、本明細書に記載されるＷｎｔ３Ａ変異体である。
【０１００】
いくつかの実施形態において、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）カラムは、本明細書に記載されるＷｎｔポリペプチドの精製のために利用される。分子ふるいクロマトグラフィーとしても知られるサイズ−排除クロマトグラフィーは、それらのサイズに基づいて、場合によっては、それらの分子量に基づいて溶液中の分子を分離する。例示的なＳＥＣカラムとしては、限定されないが、ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）ＳＷ型カラム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）などのシリカベースのカラム；ＴＳＫｇｅｌ  ＰＷ型カラム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）などのポリメタクリレートベースのカラムが挙げられる。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）カラムは、Ｗｎｔポリペプチドの精製のために利用される。いくつかの例では、シリカベースのＳＥＣカラムは、Ｗｎｔポリペプチドの精製のために利用される。他の例では、ポリメタクリレートベースのＳＥＣカラムは、Ｗｎｔポリペプチドの精製のために利用される。場合によっては、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ３Ａポリペプチド、Ｗｎｔ５Ａポリペプチド、あるいはＷｎｔ１０Ｂポリペプチドである。場合によっては、ＷｎｔポリペプチドはＷｎｔ３Ａポリペプチドである。場合によっては、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、例えば、修飾および／またはトランケーションを含む、本明細書に記載されるＷｎｔ３Ａ変異体である。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、界面活性剤は、上に記載された結合緩衝液、洗浄緩衝液、および／または溶出緩衝液へと製剤化される。例示的な界面活性剤は、陰イオン界面活性剤、例えば、アルキルベンゼンスルホン酸塩、カルボン酸塩、スルホン酸塩、石油スルホン酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、ナフタレンスルホン酸塩、オレフィンスルホン酸塩、アルキル硫酸塩、硫酸塩、硫酸化天然油および脂肪、硫酸化エステル、ならびに硫酸化アルカノールアミド；陽イオン界面活性剤、例えば、第四級アンモニウム塩、アミド結合、ポリオキシエチレンアルキルおよび脂環式アミン、η、η、η’、η’テトラキス置換エチレンジアミン、ならびに２−アルキル１−ヒドロキシエチル２−イミダゾリン；非イオン界面活性剤、例えば、ポリオキシエチレン（例えば、Ｔｗｅｅｎ、トリトン、およびＢｒｉｊシリーズの界面活性剤）ならびに糖界面活性剤（例えば、オクチルチオグルコシドおよびマルトシド）；ならびに、両性イオンあるいは双性イオン界面活性剤、例えばＣＨＡＰＳを含む。いくつかの例では、界面活性剤は、本明細書に記載されるＷｎｔポリペプチドを安定化させる。いくつかの例では、界面活性剤は、シャペロン（例えば、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ融合タンパク質）と結合するためにＷｎｔポリペプチドと競合することによって、競合的拮抗剤として作用する。
【０１０３】
幾つかの実施形態では、界面活性剤は糖界面活性剤である。場合によっては、糖界面活性剤はグルコシド界面活性剤である。他の場合では、界面活性剤はマルトシド界面活性剤である。例示的なグルコシド界面活性剤としては、限定されないが、ｎ−ヘキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−ヘプチル−β−Ｄグルコピラノシド、ｎ−オクチル−β−Ｄグルコピラノシド、ｎ−オクチル−α−Ｄ−グルコピラノシド、オクチルβ−Ｄ−１−チオグルコピラノシド、ｎ−オクチル−β−Ο−ガラクトピラノシド、ｎ−ノニル−β−Ｄグルコピラノシド、ｎ−デシル−β−Ｄグルコピラノシド、ｎ−ドデシル−β−Ο−グルコピラノシド、およびメチル−６−０−（Ｎ−ヘプチルカルバモイル）−α−Ｄ−グルコピラノシドが挙げられる。例示的なマルトシド界面活性剤としては、限定されないが、ｎ−デシル−β−Ｄ−マルトピラノシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド、および６−シクロヘキシル−１−ヘキシル−Ｐ−Ｄ−マルトピラノシドが挙げられる。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、上に記載される結合緩衝液、洗浄緩衝液、および／または溶出緩衝液などの緩衝液は、糖界面活性剤を含む。場合によっては、緩衝液（例えば、結合緩衝液、洗浄緩衝液および／または溶出緩衝液）は、グルコシド界面活性剤を含む。そのような場合、緩衝液（例えば、結合緩衝液、洗浄緩衝液および／または溶出緩衝液）は、ｎ−ヘキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−オクチル−β−Ｄグルコピラノシド、ｎ−オクチル−α−Ｄ−グルコピラノシド、オクチルβ−Ｄ−１−チオグルコピラノシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、ｎ−ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−デシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、あるいはメチル−６−Ｏ−（Ｎ−ヘプチルカルバモイル）−α−Ｄ−グルコピラノシドを含む。場合によっては、緩衝液は、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドあるいはオクチル−β−Ｄ−１−チオグルコピラノシド  を含む。一実施形態では、緩衝液は、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ｎ−オクチルグルコシド、ＯＧＰ、ＯＧ、Ｃ８Ｇｌｃ、オクチル−β−グルコピラノシド、あるいはオクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドとしても知られる）を含む。別の実施形態では、緩衝液は、オクチルβ−Ｄ−１−チオグルコピラノシド（オクチルチオグルコシドあるいはＯＴＧとしても知られる）を含む。
【０１０５】
幾つかの実施形態では、緩衝液（例えば、結合緩衝液、洗浄緩衝液および／または溶出緩衝液）は、マルトシド界面活性剤を含む。そのような場合、緩衝液（例えば、結合緩衝液、洗浄緩衝液および／または溶出緩衝液）は、ｎ−デシル−β−Ｄ−マルトピラノシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド、あるいは６−シクロヘキシル−１−ヘキシル−β−Ｄ−マルトピラノシドを含む。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される緩衝液中の糖界面活性剤の濃度は、約０．０５％〜約５％ｗ／ｖ（重量／容量）である。いくつかの例では、緩衝液中の糖界面活性剤の濃度は、約０．１％〜約５％、約０．５％〜約４％、約１％〜３％、約２％〜約５％、あるいは約３％〜約５％ｗ／ｖである。場合によっては、緩衝液中の糖界面活性剤の濃度は、約０．０５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、あるいは約５％ｗ／ｖである。場合によっては、緩衝液中の糖界面活性剤の濃度は約０．１％ｗ／ｖである。場合によっては、緩衝液中の糖界面活性剤の濃度は約０．５％ｗ／ｖである。場合によっては、緩衝液中の糖界面活性剤の濃度は約１％ｗ／ｖである。場合によっては、緩衝液中の糖界面活性剤の濃度は約１．５％ｗ／ｖである。場合によっては、緩衝液中の糖界面活性剤の濃度は約２％ｗ／ｖである。場合によっては、緩衝液中の糖界面活性剤の濃度は約２．５％ｗ／ｖである。場合によっては、緩衝液中の糖界面活性剤の濃度は約３％ｗ／ｖである。場合によっては、緩衝液中の糖界面活性剤の濃度は約４％ｗ／ｖである。場合によっては、緩衝液中の糖界面活性剤の濃度は約５％ｗ／ｖである。場合によっては、緩衝液が、酢酸塩ベースの緩衝液（例えば、約１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、５０ｍＭ、あるいはそれ以上の濃度）である。いくつかの例では、緩衝液は、約５、５．５、６、６．５、あるいは７のｐＨを示す。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、糖界面活性剤はグルコシド界面活性剤である。いくつかの例では、緩衝液中のグルコシド界面活性剤の濃度は、約０．０５％〜約５％、約０．１％〜約５％、約０．５％〜約４％、約１％〜約３％、約２％〜約５％、あるいは３％〜約５％ｗ／ｖである。場合によっては、緩衝液中のグルコシド界面活性剤の濃度は、約０．０５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、あるいは約５％ｗ／ｖである。場合によっては、緩衝液中のグルコシド界面活性剤の濃度は約０．１％ｗ／ｖである。場合によっては、緩衝液中のグルコシド界面活性剤の濃度は約０．５％ｗ／ｖである。場合によっては、緩衝液中のグルコシド界面活性剤の濃度は約１％ｗ／ｖである。場合によっては、緩衝液中のグルコシド界面活性剤の濃度は約１．５％ｗ／ｖである。場合によっては、緩衝液中のグルコシド界面活性剤の濃度は約２％ｗ／ｖである。場合によっては、緩衝液中のグルコシド界面活性剤の濃度は約２．５％ｗ／ｖである。場合によっては、緩衝液中のグルコシド界面活性剤の濃度は約３％ｗ／ｖである。場合によっては、緩衝液中のグルコシド界面活性剤の濃度は約４％ｗ／ｖである。場合によっては、緩衝液中のグルコシド界面活性剤の濃度は約５％ｗ／ｖである。場合によっては、緩衝液は、酢酸塩ベースの緩衝液（例えば、約１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、５０ｍＭ、あるいはそれ以上の濃度）である。いくつかの例では、緩衝液は、約５、５．５、６、６．５、あるいは７のｐＨを示す。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、糖界面活性剤はｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドである。いくつかの例では、緩衝液中のｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドの濃度は、約０．０５％〜約５％、約０．１％〜約５％、約０．５％〜約４％、約１％〜約３％、約２％〜約５％、あるいは３％〜約５％ｗ／ｖである。場合によっては、緩衝液中のｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドの濃度は、約０．０５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、あるいは約５％ｗ／ｖである。場合によっては、緩衝液中のｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドの濃度は約０．１％ｗ／ｖである。場合によっては、緩衝液中のｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドの濃度は約０．５％ｗ／ｖである。場合によっては、緩衝液中のｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドの濃度は約１％ｗ／ｖである。場合によっては、緩衝液中のｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドの濃度は約１．５％ｗ／ｖである。場合によっては、緩衝液中のｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドの濃度は約２％ｗ／ｖである。場合によっては、緩衝液中のｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドの濃度は約２．５％ｗ／ｖである。場合によっては、緩衝液中のｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドの濃度は約３％ｗ／ｖである。場合によっては、緩衝液中のｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドの濃度は約４％ｗ／ｖである。場合によっては、緩衝液中のｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドの濃度は約５％ｗ／ｖである。場合によっては、緩衝液は、酢酸塩ベースの緩衝液（例えば、約１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、５０ｍＭ、あるいはそれ以上の濃度）である。いくつかの例では、緩衝液は、約５、５．５、６、６．５、あるいは７のｐＨを示す。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、糖界面活性剤はオクチルβ−１−チオグルコピラノシドである。いくつかの例では、緩衝液中のオクチルβ−Ｄ−１−チオグルコピラノシドの濃度は、約０．０５％〜約５％、約０．１％〜約５％、約０．５％〜約４％、約１％〜約３％、約２％〜約５％、あるいは約３％〜約５％ｗ／ｖである。場合によっては、緩衝液中のオクチルβ−Ｄ−１−チオグルコピラノシドの濃度は、約０．０５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％あるいは約５％ｗ／ｖである。場合によっては、緩衝液中のオクチルβ−Ｄ−１−チオグルコピラノシドの濃度が約０．１％ｗ／ｖである。場合によっては、緩衝液中のオクチルβ−Ｄ−１−チオグルコピラノシドの濃度が約０．５％ｗ／ｖである。場合によっては、緩衝液中のオクチルβ−Ｄ−１−チオグルコピラノシド  の濃度が約１％ｗ／ｖである。場合によっては、緩衝液中のオクチルβ−Ｄ−１−チオグルコピラノシドの濃度が約１．５％ｗ／ｖである。場合によっては、緩衝液中のオクチルβ−Ｄ−１−チオグルコピラノシドの濃度が約２％ｗ／ｖである。場合によっては、緩衝液中のオクチルβ−Ｄ−１−チオグルコピラノシドの濃度が約２．５％ｗ／ｖである。場合によっては、緩衝液中のオクチルβ−Ｄ−１−チオグルコピラノシドの濃度が約３％ｗ／ｖである。場合によっては、緩衝液中のオクチルβ−Ｄ−１−チオグルコピラノシドの濃度が約４％ｗ／ｖである。場合によっては、緩衝液中のオクチルβ−Ｄ−１−チオグルコピラノシド  の濃度が約５％ｗ／ｖである。場合によっては、緩衝液は、酢酸塩ベースの緩衝液（例えば、約１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、５０ｍＭ、あるいはそれ以上の濃度）である。いくつかの例では、緩衝液は、約５、５．５、６、６．５、あるいは７のｐＨを示す。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、糖界面活性剤はマルトシド界面活性剤である。いくつかの例では、緩衝液中のマルトシド界面活性剤の濃度は、約０．０５％〜約５％、約０．１％〜約５％、約０．５％〜約４％、約１％〜約３％、約２％〜約５％、あるいは３％〜約５％ｗ／ｖである。場合によっては、緩衝液中のマルトシド界面活性剤の濃度は、約０．０５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、あるいは約５％ｗ／ｖである。場合によっては、緩衝液中のマルトシド界面活性剤の濃度は約０．１％ｗ／ｖである。場合によっては、緩衝液中のマルトシド界面活性剤の濃度は約０．５％ｗ／ｖである。場合によっては、緩衝液中のマルトシド界面活性剤の濃度は約１％ｗ／ｖである。場合によっては、緩衝液中のマルトシド界面活性剤の濃度は約１．５％ｗ／ｖである。場合によっては、緩衝液中のマルトシド界面活性剤の濃度は約２％ｗ／ｖである。場合によっては、緩衝液中のマルトシド界面活性剤の濃度は約２．５％ｗ／ｖである。場合によっては、緩衝液中のマルトシド界面活性剤の濃度は約３％ｗ／ｖである。場合によっては、緩衝液中のマルトシド界面活性剤の濃度は約４％ｗ／ｖである。場合によっては、緩衝液中のマルトシド界面活性剤の濃度は約５％ｗ／ｖである。場合によっては、緩衝液は、酢酸塩ベースの緩衝液（例えば、約１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、５０ｍＭ、あるいはそれ以上の濃度）である。いくつかの例では、緩衝液は、約５、５．５、６、６．５、あるいは７のｐＨを示す。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、界面活性剤は、ＣＨＡＰＳ、トリトンＸ−１００、あるいはポリソルベート８０である。いくつかの実施形態において、ＣＨＡＰＳ、トリトンＸ−１００、あるいはポリソルベート８０の割合は、少なくとも０．０１％、０．１％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、あるいはそれ以上である。いくつかの実施形態において、ＣＨＡＰＳ、トリトンＸ−１００、あるいはポリソルベート８０の割合は、最大で０．０１％、０．１％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、あるいはそれ以下である。場合によっては、界面活性剤の割合が重量／容量（ｗ／ｖ）の割合である。
【０１１２】
いくつかの例では、緩衝液成分、例えば、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミンＨＣ１（トリス−ＨＣ１）、３−｛［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝プロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（ビシン）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン（トリシン）、３−［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、４−２−ヒドロキシエチル−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−（Ν−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）などが使用される。いくつかの例において、緩衝剤のｐＨは、少なくとも４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、あるいは１２以上である。いくつかの例では、緩衝液のｐＨは、最大で４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、あるいはそれ以下である。
【０１１３】
いくつかの例では、塩基性アミノ酸は、上に記載される結合緩衝液、洗浄緩衝液、および／または溶出緩衝液へと製剤化される。例示的な塩基性アミノ酸は、ヒスチジン、アルギニン、リジン、ヒドロキシリシン、オルニチン、およびシトルリンを含む。いくつかの例では、ヒスチジン、アルギニン、リジン、ヒドロキシリシン、オルニチン、あるいはシトルリンから選択される塩基性アミノ酸は、上に記載される結合緩衝液、洗浄緩衝液、および／または溶出緩衝液へと製剤化される。場合によっては、結合緩衝液、洗浄緩衝液、および／または溶出緩衝液中の塩基性アミノ酸の濃度は、約０．１〜約２Ｍ（例えば、約０、１約〜１．５Ｍ、約０．１Ｍ〜約１Ｍ、約０．１Ｍ〜約０．５Ｍ、約０．２Ｍ〜約１．５Ｍ、約０．２Ｍ〜約１Ｍ、約０．３Ｍ〜約１Ｍ、あるいは約０．３Ｍ〜約０．５Ｍである。
【０１１４】
場合によっては、塩基性アミノ酸はアルギニンである。場合によっては、結合緩衝液、洗浄緩衝液、および／または溶出緩衝液中のアルギニンの濃度は、約０．１Ｍ〜約２Ｍである。場合によっては、溶出緩衝液中のアルギニンの濃度は、約０．１Ｍ〜約２Ｍである。場合によっては、溶出緩衝液中のアルギニンの濃度は、約０．１〜約１．５Ｍ、約０．１〜約１Ｍ、約０．１Ｍ〜約０．５Ｍ、約０．２Ｍ〜約１．５Ｍ、約０．２Ｍ〜約１Ｍ、約０．３Ｍ〜約１Ｍ、約０．３Ｍ〜約０．５Ｍである。場合によっては、溶出緩衝液中のアルギニンの濃度は、約０．１Ｍ〜約０．５Ｍである。場合によっては、溶出緩衝液中のアルギニンの濃度は、約０．１Ｍ、０．２Ｍ、０．３Ｍ、０．４Ｍ、０．５Ｍ、０．６Ｍ、０．７Ｍ、０．８Ｍ、０．９Ｍ、１Ｍ、あるいは約１．５Ｍである。
【０１１５】
いくつかの例では、混合モードクロマトグラフィーカラムのための溶出緩衝液は、約０．１Ｍ〜約２Ｍの濃度のアルギニンを含む。場合によっては、溶出緩衝液が約０．１Ｍ〜約１．５Ｍ、約０．１〜約１Ｍ、約０．１Ｍ〜約０．５Ｍ、約０．２Ｍ〜約１．５Ｍ、約０．２Ｍ〜約１Ｍ、約０．３Ｍ〜約１Ｍ、あるいは約０．３Ｍ〜約０．５の濃度のアルギニンを含む。場合によっては、溶出緩衝液が、約０．１Ｍ〜約０．５Ｍの濃度のアルギニンを含む。場合によっては、溶出緩衝液が、約０．１Ｍ、０．２Ｍ、０．３Ｍ、０．４Ｍ、０．５Ｍ、０．６Ｍ、０．７Ｍ、０．８Ｍ、０．９Ｍ、１Ｍ、あるいは約１．５Ｍの濃度のアルギニンを含む。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、精製戦略は、溶出したＷｎｔポリペプチド−シャペロン複合体の混合物を生成するために、Ｗｎｔポリペプチド−シャペロン複合体を含む溶液（例えば、調整培地）が、抗体のＦｃ部分と相互作用するポリペプチドを含む第１の親和性クロマトグラフィーカラムに充填される、第１の工程を含む。いくつかの例では、第１の親和性クロマトグラフィーカラムからの溶出液は、糖界面活性剤（例えば、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドあるいはオクチルβ−Ｄ−１−チオグルコピラノシドなどのグルコシド界面活性剤）を含む緩衝液中でさらにインキュベートされる。場合によっては、緩衝液中の糖界面活性剤（例えば、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドあるいはオクチルβ−Ｄ−１−チオグルコピラノシドなどのグルコシド界面活性剤）の濃度は、約０．１％、０．５％  １％  １．５％、あるいは約２％ｗ／ｖ；あるいは約１％ｗ／ｖである。その後、いくつかの例では、溶出液は、機能的に活性なＷｎｔポリペプチドおよび糖界面活性剤を含む第２のＷｎｔ組成物を生成して、例えば、第２のＷｎｔ組成物からシャペロン（例えば、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質）を取り除くために、スルホン化された多環芳香族の化合物で固定されたカラムに充填される。場合によっては、スルホン化された多環芳香族の化合物で固定されたカラムのための溶出緩衝液は、ステップ勾配を含む。その他の場合において、スルホン化された多環芳香族の化合物で固定されたカラムのための溶出緩衝液は、約０．５Ｍ〜約２Ｍの塩、約０．６Ｍ〜約２Ｍの塩、あるいは約０．８Ｍから約２Ｍの塩の塩濃度勾配を含む。いくつかの例では、第２のＷｎｔ組成物は、第３のＷｎｔ組成物を生成するために、抗体のＦｃ部分と相互作用するポリペプチドを含む第２の親和性クロマトグラフィーカラム、混合モードカラム、サイズ排除クロマトグラフィーカラム、あるいはその組み合わせでさらに精製される。いくつかの例では、第２のＷｎｔ組成物は、第３のＷｎｔ組成物を生成するために、抗体のＦｃ部分と相互作用するポリペプチド含む第２の親和性クロマトグラフィーカラム、続いて、混合モードカラム、最後に、サイズ排除クロマトグラフィーカラムを用いてさらに精製される。場合によっては、第２の親和性クロマトグラフィーカラムは、第２のＷｎｔ組成物から残存するシャペロン（例えば、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質）を取り除く。場合によっては、混合モードカラムは、第２のＷｎｔ組成物からＷｎｔポリペプチド断片を取り除く。場合によっては、サイズ排除クロマトグラフィーカラムは、第３のＷｎｔ組成物を生成するために、第２のＷｎｔ組成物から残存するＷｎｔポリペプチド断片を取り除く。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、精製戦略は、Ｗｎｔポリペプチド−シャペロン複合体を含む溶液（例えば、調整培地）が、スルホン化された多環芳香族の化合物で固定されたカラムに充填される第１の工程と、その後の、精製されたＷｎｔポリペプチドを生成するために、第１の工程から溶出したＷｎｔポリペプチド（例えば、Ｗｎｔポリペプチド−シャペロン複合体）が親和性クロマトグラフィーカラム上でさらに処理される第二の工程とを含む。場合によっては、スルホン化された多環芳香族の化合物で固定されたカラムに充填される前に、界面活性剤がＷｎｔポリペプチド（例えば、Ｗｎｔポリペプチド−シャペロン複合体）を含む溶液にさらに添加される。場合によっては、リポソームＷｎｔポリペプチドを生成するために、リポソームの水溶液を用いて精製されたＷｎｔポリペプチドがさらに処理される。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、精製戦略は、Ｗｎｔポリペプチド−シャペロン複合体を含む溶液（例えば、調整培地）が親和性クロマトグラフィーカラムに充填される第１の工程と、その後の、スルホン化された多環芳香族の化合物で固定されたカラムを含む第２の工程とを含む。場合によっては、スルホン化された多環芳香族の化合物で固定されたカラム上に界面活性剤を含むＷｎｔポリペプチドを充填する前に、界面活性剤が第１の工程からの溶出したＷｎｔポリペプチドに加えられる。場合によっては、リポソームＷｎｔポリペプチドを生成するために、スルホン化された多環芳香族の化合物で固定されたカラムから溶出した、精製されたＷｎｔポリペプチドが、リポソームの水溶液を用いてさらに処理される。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、精製戦略は、調整培地からＷｎｔポリペプチド−シャペロン複合体を採取し、親和性クロマトグラフィーカラム上に充填することを含む。場合によっては、リポソームＷｎｔポリペプチドを生成するために、カラムからの溶出液がリポソームの水溶液を用いてさらに処理される。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、図３に例示される精製戦略は、本明細書に記載されるＷｎｔポリペプチドを精製するために利用される。いくつかの例では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ５Ａポリペプチド、Ｗｎｔ１０Ｂポリペプチド、あるいはＷｎｔ３Ａポリペプチドである。場合によっては、ＷｎｔポリペプチドはＷｎｔ３Ａポリペプチドである。場合によっては、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、例えば、修飾および／または切断を含む、本明細書に記載されるＷｎｔ３Ａ変異体である。
【０１２１】
いくつかの例では、Ｗｎｔ３Ａタンパク質とその結合パートナーとの親和性は、少なくとも約１．１Ｍ、１．３ｎＭ、１．５ｎＭ、１．７ｎＭ、２ｎＭ、２．３ｎＭ、２．５ｎＭ、２．７ｎＭ、３ｎＭ、３．１Ｍ、３．２ｎＭ、３．３ｎＭ、３．４ｎＭ、３．５ｎＭ、３．６ｎＭ、３．７ｎＭ、３．８ｎＭ、３．９ｎＭ、あるいはそれ以上である。いくつかの例では、Ｗｎｔ３ａタンパク質とその結合パートナーとの親和性は、最大で約１．１Ｍ、１．３ｎＭ、１．５ｎＭ、１．７ｎＭ、２ｎＭ、２．３ｎＭ、２．５ｎＭ、２．７ｎＭ、３ｎＭ、３．１ｎＭ、３．２ｎＭ、３．３ｎＭ、３．４ｎＭ、３．５ｎＭ、３．６ｎＭ、３．７ｎＭ、３．８ｎＭ、３．９ｎＭ、あるいはそれ以下である。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、溶出したＷｎｔポリペプチドの濃度および収率は、さらなる精製工程にさらされる前に測定される。いくつかの実施形態において、収率は、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、あるいはそれ以上である。いくつかの実施形態において、収率は、最大で約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、あるいはそれ以下である。いくつかの実施形態において、純度は、少なくとも約２０、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、あるいはそれ以上である。いくつかの実施形態において、純度は、最大で約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、あるいはそれ以下である。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、Ｗｎｔポリペプチド（例えば、Ｗｎｔ３Ａポリペプチド）は、少なくとも約５μｇ／ｍｌ；一般に少なくとも約１０ｍｌμｇ、より一般に少なくとも約５０μｇ／ｍｌの初濃度に精製され、約１００μｇｍｌを超えて存在してもよい。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、単離されたＷｎｔポリペプチド（例えば、Ｗｎｔ３Ａポリペプチド）は、リポソームにおいてさらに製剤化される。場合によっては、Ｗｎｔポリペプチド（例えば、Ｗｎｔ３Ａポリペプチド）は、界面活性剤を有する製剤中で安定化される。場合によっては、Ｗｎｔポリペプチド（例えば、Ｗｎｔ３Ａポリペプチド）は、脂質を含む製剤中で安定化される。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、リポソームは当技術分野において周知の方法を用いて作られる。リポソームは、ラメラ相脂質二重層および水性のコアを構成する人工的に調製された球状の小胞である。多層ベシクル（ＭＬＶ）、小さな単層のリポソーム小胞（ＳＵＶ）、大きな単層の小胞（ＬＵＶ）および渦巻状の小胞など、いくつかのタイプのリポソームがある。いくつかの例では、リポソームはリン脂質によって形成される。いくつかの実施形態において、リン脂質は、ジアシルグリセリド構造を有するものあるいはリンスフィンゴ脂質に由来するものに分離される。いくつかの実施形態において、ジアシルグリセリド構造は、ホスファチジン酸（ホスファチジン酸塩）（ＰＡ）、ホスファチジルエタノールアミン（ケファリン）（ＰＥ）、ホスファチジルコリン（レシチン）（ＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、およびホスホイノシチド、例えば、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルイノシトールリン酸塩（ＰＩＰ）、ホスファチジルイノシトールビスリン酸（ＰＩＰ２）、およびホスファチジルイノシトール三リン酸（ＰＩＰ３）を含む。いくつかの実施形態において、リンスフィンゴ脂質は、セラミドホスホリルコリン、セラミドホスホリルエタノールアミン、およびセラミドホスホリルリピドを含む。いくつかの実施形態において、リポソームはホスファチジルコリンから形成される。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、脂質はまた、その転移相温度（Ｔｍ）、あるいは液体の結晶相とゲル相との間の温度界面に基づいて選択されている。いくつかの実施形態において、Ｔｍは、頭部種、炭化水素長さ、不飽和、および電荷によって影響を受ける。例えば、短い脂質（８、１０、あるいは１２の尾部炭素鎖長さを含有する脂質）は、４°Ｃより低い温度の液晶相を有する。しかし、これらの短鎖炭素脂質から作られたリポソームは、細胞膜を溶解するため、細胞に対して毒性である。より長い炭素鎖脂質から作られたリポソームは細胞に対して毒性ではないが、それらの転移温度はより高くなる。例えば、１６の尾部炭素長さを有する１，２−ジパルミトイル−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）は、約４１°ＣのＴｍを有する。いくつかの実施形態において、本明細書に使用される脂質は、約１０°Ｃ〜約３７°Ｃ、約１５°Ｃ〜約３０°Ｃ、約１８°Ｃ〜２７°Ｃ、あるいは約２１°Ｃ〜２５°ＣのＴｍを有する。いくつかの実施形態において、本明細書に使用される脂質は、少なくとも２２°Ｃ、２３°Ｃ、２４°Ｃ、あるいはそれ以上のＴｍを有する。いくつかの実施形態において、本明細書に使用される脂質は、最大で２２°Ｃ、２３°Ｃ、２４°Ｃ、あるいはそれ以下のＴｍを有する。いくつかの実施形態において、本明細書に使用される脂質は、１２、１３、１４、あるいはそれ以上の尾部炭素長さを有する。いくつかの実施形態において、本明細書に使用される脂質は、最大で約１２、１３、１４、あるいはそれ以下の尾部炭素長さを有する。
【０１２７】
いくつかの実施形態において、脂質は、リポソームの正味荷電に基づいてさらに選択される。いくつかの実施形態では、リポソームは、約４．０〜約１０．０、約５．０〜約９．０、約６．５〜約８．０、約７．０〜約７．８、あるいは約７．２〜約７．６のｐＨで０の正味電荷を有する。いくつかの実施形態において、リポソームは、約７．３、約７．４、あるいは約７．５のｐＨで０の正味電荷を有する。いくつかの実施形態では、リポソームは、約４．０〜約１０．０、約５．０〜約９．０、約６．５〜約８．０、約７．０〜約７．８、あるいは約７．２〜約７．６のｐＨで正味正電荷を有する。いくつかの実施形態において、リポソームは、約７．３、約７．４、あるいは約７．５のｐＨで正味正電荷を有する。いくつかの実施形態では、リポソームは、約４．０〜約１０．０、約５．０〜約９．０、約６．５〜約８．０、約７．０〜約７．８、あるいは約７．２〜約７．６のｐＨで正味負電荷を有する。いくつかの実施形態において、リポソームは、約７．３、約７．４、あるいは約７．５のｐＨで正味負電荷を有する。
【０１２８】
いくつかの実施形態において、脂質は、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１−テトラデカノイル−２−ヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＭＰＰＣ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−Ｌ−セリン（ＤＭＰＳ）、および１，２−ジヘキサノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＧ）から選択される。いくつかの実施形態では、脂質はＤＭＰＣである。
【０１２９】
いくつかの実施形態において、追加の脂質はリポソームへと作り上げられる。いくつかの実施形態では、追加の脂質はコレステロールである。いくつかの例では、ＤＭＰＣおよびコレステロールなどのホスファチジルコリンの濃度は、比率などの値によって定義される。いくつかの実施形態において、ＤＭＰＣおよびコレステロールなどのホスファチジルコリンの濃度の比率は、約５０：５０、約５５：４５、約６０：４０、約６５：３５、約７０：３０、約７５：２５、約８０：２０、約８５：１５、約９０：１０、約９５：５、約９９：１、あるいは約１００：０の間である。いくつかの実施形態において、ＤＭＰＣおよびコレステロールなどのホスファチジルコリンの濃度の比率は、約９０：１０である。いくつかの実施形態において、濃度単位はモルである。いくつかの実施形態において、比率はモル：モルである。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、リポソームはエタノール注射ベースの方法により調製される。いくつかの例では、上記方法は、Ｗａｇｎｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．  “Ｔｈｅ  Ｃｒｏｓｓｆｌｏｗ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ：  Ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｔｈａｎｏｌ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  Ｍｅｈｏｄ，”  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １２（３）：  ２５９−２７０  （２００２）に記載される通りである。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、Ｗｎｔポリペプチドは、少なくとも約０．０１、０．０１５、０．０２、０．０２５、０．０３、０．０３５、０．０４、０．０４５、０．０５、０．０５５、０．０６、０．０６５、０．０７、０．０７５、０．０８、０．０８５、０．０９、０．０９５、０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、ｎｇ／μＬ、あるいはそれ以上の濃度のリポソームで再構成される。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔポリペプチドは、最大で約０．０１、０．０１５、０．０２、０．０２５、０．０３、０．０３５、０．０４、０．０４５、０．０５、０．０５５、０．０６、０．０６５、０．０７、０．０７５、０．０８、０．０８５、０．０９、０．０９５、０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５  ２  ２．５、３、３．５、４ｎｇ／μＬ、あるいはそれ以下の濃度のリポソームで再構成される。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔポリペプチドは、約０．０１、０．０１５、０．０２、０．０２５、０．０３、０．０３５、０．０４、０．０４５、０．０５、０．０５５、０．０６、０．０６５、０．０７、０．０７５、０．０８、０．０８５、０．０９、０．０９５、０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４ｎｇ／μＬの濃度のリポソームで再構成される。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ３Ａポリペプチド、Ｗｎｔ５Ａポリペプチド、あるいはＷｎｔ１０Ｂポリペプチドである。いくつかの実施形態において、ＷｎｔポリペプチドはＷｎｔ３Ａポリペプチドである。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、Ｗｎｔポリペプチドは、少なくとも約０．１：５０、０．５：３０、１：２０、あるいは１：１４のリポソーム対Ｗｎｔポリペプチド、あるいはそれ以上の比率のリポソームを用いて再構成される。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔポリペプチドは、最大で約０．１：５０、０．５：３０、１：２０、あるいは１：１４のリポソーム対Ｗｎｔポリペプチド、あるいはそれ以下の比率のリポソームで再構成される。いくつかの例では、比率は容量対容量の比率である。いくつかの例では、Ｗｎｔポリペプチドの単位はナノグラム単位である。
【０１３３】
いくつかの実施形態において、Ｗｎｔポリペプチドがリポソームで再構成される温度は、少なくともの約１５°Ｃ〜３７°Ｃ、約１８°Ｃ〜３３°Ｃ、約２０°Ｃ〜３０°Ｃ、約２０°Ｃ〜２８°Ｃ、あるいは約２５°Ｃ〜３０°Ｃの間である。幾つかの実施形態では、温度は、少なくとも約１５℃〜約３７℃である。幾つかの実施形態では、温度は、少なくとも約１８℃〜約３３℃である。幾つかの実施形態では、温度は、少なくとも約２０℃〜約３０℃である。いくつかの実施形態において、温度は、少なくとも約２１°Ｃ、２２°Ｃ、２３°Ｃ、２４°Ｃ、２５°Ｃ、２６°Ｃ、２７°Ｃ、２８°Ｃ、２９°Ｃ、３０°Ｃ、あるいはそれ以上である。いくつかの実施形態において、温度は、最大で約２１°Ｃ、２２°Ｃ、２３°Ｃ、２４°Ｃ、２５°Ｃ、２６°Ｃ、２７°Ｃ、２８°Ｃ、２９°Ｃ、３０°Ｃ、あるいはそれ以下である。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ３Ａポリペプチド、Ｗｎｔ５Ａポリペプチド、あるいはＷｎｔ１０Ｂポリペプチドである。いくつかの実施形態において、ＷｎｔポリペプチドはＷｎｔ３Ａポリペプチドである。
【０１３４】
いくつかの実施形態において、Ｗｎｔポリペプチドは、少なくとも１０分、２０分、３０分、１時間、１．５時間、２時間、２．５時間、３時間、４時間、５時間、６時間、あるいはそれ以上の間、リポソームでインキュベートされる。いくつかの例では、Ｗｎｔポリペプチドは、約１０分、２０分、３０分、１時間、１．５時間、２時間、２．５時間、３時間、４時間、５時間、６時間、あるいはそれ以上の間、リポソームでインキュベートされる。いくつかの例では、Ｗｎｔポリペプチドは、少なくとも３０分間、リポソームでインキュベートされる。いくつかの例では、Ｗｎｔポリペプチドは、少なくとも１時間、リポソームでインキュベートされる。いくつかの例では、Ｗｎｔポリペプチドは、少なくとも１．５時間、リポソームでインキュベートされる。いくつかの例では、Ｗｎｔポリペプチドは、少なくとも２時間、リポソームでインキュベートされる。いくつかの例では、Ｗｎｔポリペプチドは、少なくとも３時間、リポソームでインキュベートされる。
【０１３５】
いくつかの実施形態において、Ｗｎｔポリペプチドはリポソーム膜に統合される。場合によっては、Ｗｎｔポリペプチドは、リポソーム膜から脂質膜の表面へと突き出ている。いくつかの例では、Ｗｎｔポリペプチドは、リポソームの水性のコアへに取り込まれない。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ３Ａポリペプチド、Ｗｎｔ５Ａポリペプチド、あるいはＷｎｔ１０Ｂポリペプチドである。いくつかの実施形態において、ＷｎｔポリペプチドはＷｎｔ３Ａポリペプチドである。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドはリポソーム膜に統合される。ある場合には、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドはリポソーム薄膜から脂質膜の表面へと突き出ている。いくつかの例では、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、リポソームの水性のコアに取り込まれない。
【０１３６】
いくつかの実施形態において、リポソームＷｎｔポリペプチドは、約１０ｎｍ〜１μｍ、１０ｎｍ〜約５００ｎｍ、約５０ｎｍ〜約３００ｎｍ、約５０ｎｍ〜約２００ｎｍ、約１００ｎｍ〜約５００ｎｍ、約１００ｎｍ〜約３００ｎｍ、あるいは約１００ｎｍ〜約２００ｎｍのリポソーム粒度分布を有する。いくつかの例では、リポソームＷｎｔポリペプチドは、１０ｎｍ〜約５００ｎｍのリポソーム粒度分布を有する。いくつかの例では、リポソームＷｎｔポリペプチドは、約５０ｎｍ〜約３００ｎｍのリポソーム粒度分布を有する。いくつかの例では、リポソームＷｎｔポリペプチドは、約５０ｎｍ〜約２００ｎｍのリポソーム粒度分布を有する。いくつかの例では、リポソームＷｎｔポリペプチドは、約１００ｎｍ〜約２００ｎｍのリポソーム粒度分布を有する。いくつかの例では、リポソームＷｎｔポリペプチドは、約１５０ｎｍ〜約２００ｎｍのリポソーム粒度分布を有する。いくつかの例では、リポソームＷｎｔポリペプチドは、約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍのリポソーム粒度分布を有する。
【０１３７】
いくつかの実施形態において、リポソームＷｎｔポリペプチドは、約１μｍ未満、約５００ｎｍ未満、約３００ｎｍ未満、約２００ｎｍ未満、あるいは約１５０ｎｍ未満のリポソーム粒度分布を有する。いくつかの例では、リポソームＷｎｔポリペプチドは、約１μｍ未満のリポソーム粒度分布を有する。いくつかの例では、リポソームＷｎｔポリペプチドは、約５００ｎｍ未満のリポソーム粒度分布を有するいくつかの例では、リポソームＷｎｔポリペプチドは、約３００ｎｍ未満のリポソーム粒度分布を有する。いくつかの例では、リポソームＷｎｔポリペプチドは、約２００ｎｍ未満のリポソーム粒度分布を有する。いくつかの例では、リポソームＷｎｔポリペプチドは、約１７０ｎｍ未満のリポソーム粒度分布を有する。いくつかの例では、リポソームＷｎｔポリペプチドは、約１５０ｎｍ未満のリポソーム粒度分布を有する。
【０１３８】
いくつかの実施形態において、リポソームで再構成されたＷｎｔポリペプチドは、リポソームＷｎｔポリペプチドあるいはＬ−Ｗｎｔと呼ばれる。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ３Ａポリペプチド、Ｗｎｔ５Ａポリペプチド、あるいはＷｎｔ１０Ｂポリペプチドである。いくつかの実施形態において、ＷｎｔポリペプチドはＷｎｔ３Ａポリペプチドである。いくつかの実施形態において、リポソームで再構成されたＷｎｔ３Ａポリペプチドは、リポソームＷｎｔ３ＡポリペプチドあるいはＬ−Ｗｎｔ３Ａと呼ばれる。いくつかの実施形態において、ＷｎｔポリペプチドはＷｎｔ５Ａポリペプチドである。いくつかの実施形態において、リポソームで再構成されたＷｎｔ５Ａポリペプチドは、リポソームＷｎｔ５ＡポリペプチドあるいはＬ−Ｗｎｔ５Ａと呼ばれる。いくつかの実施形態において、ＷｎｔポリペプチドはＷｎｔ１０Ｂポリペプチドである。いくつかの実施形態において、リポソームで再構成されたＷｎｔ１０Ｂポリペプチドは、リポソームＷｎｔ１０ＢポリペプチドあるいはＬ−Ｗｎｔ１０Ｂと呼ばれる。
【０１３９】
いくつかの実施形態において、Ｌ−Ｗｎｔは遠心分離工程を経験し、その後、緩衝剤中で懸濁される。例示的な緩衝液としては、限定されないが、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）あるいはスクロースベースの緩衝液、例えば、リン酸塩／スクロース緩衝液、ヒスチジン／スクロース緩衝液、クエン酸塩／スクロース緩衝液、酢酸塩／スクロース緩衝液、スクロース／ＮａＣｌベースの緩衝液、リン酸塩／スクロース／ＮａＣｌ緩衝液、ヒスチジン／スクロース／ＮａＣｌ緩衝液、クエン酸塩／スクロース／ＮａＣｌ緩衝液、あるいは酢酸塩／スクロース／ＮａＣｌ緩衝液が挙げられる。いくつかの例では、スクロースベースの緩衝液は、約５０ｍＭのスクロース〜約５００ｍＭのスクロースを含む。場合によっては、スクロースベースの緩衝液は、約３００ｍＭのスクロースを含む。いくつかの例では、リン酸塩／スクロース緩衝液は、約５ｍＭのリン酸塩〜約５０ｍＭのリン酸塩、および約５０ｍＭのスクロース〜約５００ｍＭのスクロースを含む。場合によっては、リン酸塩／スクロース緩衝液は、約１０ｍＭのリン酸塩および約３００ｍＭのスクロースを含む。場合によっては、ヒスチジン／スクロース緩衝液は、約１０ｍＭヒスチジンおよび約３００ｍＭのスクロースを含む。いくつかの例では、クエン酸塩／スクロース緩衝液は、約５ｍＭのクエン酸塩〜約５０ｍＭのクエン酸塩、および約５０ｍＭのスクロース〜約５００ｍＭのスクロースを含む。場合によっては、クエン酸塩／スクロース緩衝液は、約１０ｍＭのクエン酸塩および約３００ｍＭのスクロースを含む。いくつかの例では、酢酸塩／スクロース緩衝液は、約５ｍＭの酢酸塩〜約５０ｍＭの酢酸塩、および約５０ｍＭのスクロース〜約５００ｍＭのスクロースを含む。場合によっては、酢酸塩／スクロース緩衝液は、約１０ｍＭの酢酸塩および約３００ｍＭのスクロースを含む。いくつかの例では、スクロース／ＮａＣｌベースの緩衝液は、約５０ｍＭのスクロース〜約３００ｍＭのスクロース、および約５ｍＭのＮａＣｌ〜約２００ｍＭのＮａＣｌを含む。場合によっては、スクロース／ＮａＣｌベースの緩衝液は、約１００ｍＭのスクロースおよび１００ｍＭ  のＮａＣｌを含む。いくつかの例では、リン酸塩／スクロース／ＮａＣｌ緩衝液は、約５ｍＭのリン酸塩〜約５０ｍＭのリン酸塩、約５０ｍＭのスクロース〜約３００ｍＭのスクロース、および約５ｍＭのＮａＣｌ〜約２００ｍＭのＮａＣｌを含む。場合によっては、リン酸塩／スクロース／ＮａＣｌ緩衝液は、約１０ｍＭのリン酸塩、約１００ｍＭのスクロース、および約１００ｍＭのＮａＣｌを含む。いくつかの例では、ヒスチジン／スクロース／ＮａＣｌ緩衝液は、約５ｍＭのヒスチジン〜約５０ｍＭのヒスチジン、約５０ｍＭのスクロース〜約３００ｍＭのスクロース、および約５ｍＭのＮａＣｌ〜約２００ｍＭのＮａＣｌを含む。場合によっては、ヒスチジン／スクロースＮａＣｌ緩衝液は、約１０ｍＭのヒスチジン、約１００ｍＭのスクロース、および１００ｍＭのＮａＣｌを含む。いくつかの例では、クエン酸塩／スクロース／ＮａＣｌ緩衝液は、約５ｍＭのクエン酸塩〜約５０ｍＭのクエン酸塩、約５０ｍＭのスクロース〜約３００ｍＭのスクロース、および約５ｍＭのＮａ���ｌ〜約２００ｍＭのＮａＣｌを含む。場合によっては、クエン酸塩／スクロース／ＮａＣｌ緩衝液は、約１０ｍＭクエン酸塩、１００ｍＭスクロース、および１００ｍＭのＮａＣｌを含む。いくつかの例では、酢酸塩／スクロースＮａＣｌ緩衝液は、約５ｍＭの酢酸塩〜約５０ｍＭの酢酸塩、約５０ｍＭのスクロース〜約３００ｍＭのスクロース、および約５ｍＭのＮａＣｌ〜約２００ｍＭのＮａＣｌを含む。場合によっては、酢酸塩／スクロース／ＮａＣｌ緩衝液は、約１０ｍＭの酢酸塩、約１００ｍＭのスクロース、および約１００ｍＭのＮａＣｌを含む。
【０１４０】
いくつかの実施形態において、Ｌ−Ｗｎｔは濾過工程を経験する。いくつかの例では、濾過工程は、限外濾過、ダイアフィルトレーション、ナノ濾過、除菌濾過、あるいはその組み合わせを含む。例示的な濾過膜としては、限定されないが、酢酸セルロース（ＣＡ）、ポリスルホン（ＰＳ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリビニリデンフルオライド（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｉｅｎｅ）（ＰＶＤＦ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリエチレン（ＰＥ）、およびポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）が挙げられる。いくつかの例では、Ｌ−Ｗｎｔは、限外濾過、ダイアフィルトレーション、ナノ濾過、除菌濾過、あるいはその組み合わせなどの１つ以上濾過を経験する。いくつかの例では、Ｌ−Ｗｎｔは、タンパク質汚染物質および微生物汚染物質などの１つ以上の生体汚染物質を除去するために、限外濾過およびナノ濾過を経験する。いくつかの例では、ナノ濾過は１つ以上のウイルスの汚染物質を除去する。いくつかの例では、Ｌ−Ｗｎｔは、緩衝液交換のためのダイアフィルトレーション工程をさらに経験する。例示的な緩衝液としては、限定されないが、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）あるいはスクロースベースの緩衝液、例えば、リン酸塩／スクロース緩衝液、ヒスチジン／スクロース緩衝液、クエン酸塩／スクロース緩衝液、酢酸塩／スクロース緩衝液、スクロース／ＮａＣｌベースの緩衝液、リン酸塩／スクロース／ＮａＣｌ緩衝液、ヒスチジン／スクロース／ＮａＣｌ緩衝液、クエン酸塩／スクロース／ＮａＣｌ緩衝液、あるいは酢酸塩／スクロースＮａＣｌ緩衝液が挙げられる。いくつかの例では、スクロースベースの緩衝液は、約５０ｍＭのスクロース〜約５００ｍＭのスクロースを含む。場合によっては、スクロースベースの緩衝液は、約３００ｍＭのスクロースを含む。いくつかの例では、リン酸塩／スクロース緩衝液は、約５ｍＭのリン酸塩〜約５０ｍＭのリン酸塩、および約５０ｍＭのスクロース〜約５００ｍＭのスクロースを含む。場合によっては、リン酸塩／スクロース緩衝液は、約１０ｍＭのリン酸塩および約３００ｍＭのスクロースを含む。場合によっては、ヒスチジン／スクロース緩衝液は、約１０ｍＭヒスチジンおよび約３００ｍＭのスクロースを含む。いくつかの例では、クエン酸塩／スクロース緩衝液は、約５ｍＭのクエン酸塩〜約５０ｍＭのクエン酸塩、および約５０ｍＭのスクロース〜約５００ｍＭのスクロースを含む。場合によっては、クエン酸塩／スクロース緩衝液は、約１０ｍＭのクエン酸塩および約３００ｍＭのスクロースを含む。いくつかの例では、酢酸塩／スクロース緩衝液は、約５ｍＭの酢酸塩〜約５０ｍＭの酢酸塩、および約５０ｍＭのスクロース〜約５００ｍＭのスクロースを含む。場合によっては、酢酸塩／スクロース緩衝液は、約１０ｍＭの酢酸塩および約３００ｍＭのスクロースを含む。いくつかの例では、スクロース／ＮａＣｌベースの緩衝液は、約５０ｍＭのスクロース〜約３００ｍＭのスクロース、および約５ｍＭのＮａＣｌ〜約２００ｍＭのＮａＣｌを含む。場合によっては、スクロース／ＮａＣｌベースの緩衝液は、約１００ｍＭのスクロースおよび１００ｍＭのＮａＣｌを含む。いくつかの例では、リン酸塩／スクロース／ＮａＣｌ緩衝液は、約５ｍＭのリン酸塩〜約５０ｍＭのリン酸塩、約５０ｍＭのスクロース〜約３００ｍＭのスクロース、および約５ｍＭのＮａＣｌ〜約２００ｍＭのＮａＣｌを含む。場合によっては、リン酸塩／スクロース／ＮａＣｌ緩衝液は、約１０ｍＭのリン酸塩、約１００ｍＭのスクロース、および約１００ｍＭのＮａＣｌを含む。いくつかの例では、ヒスチジン／スクロース／ＮａＣｌ緩衝液は、約５ｍＭのヒスチジン〜約５０ｍＭのヒスチジン、約５０ｍＭのスクロース〜約３００ｍＭのスクロース、および約５ｍＭのＮａＣｌ〜約２００ｍＭのＮａＣｌを含む。場合によっては、ヒスチジン／スクロース／ＮａＣｌ緩衝液は、約１０ｍＭのヒスチジン、約１００ｍＭのスクロース、および１００ｍＭのＮａＣｌを含む。いくつかの例では、クエン酸塩／スクロース／ＮａＣｌ緩衝液は、約５ｍＭのクエン酸塩〜約５０ｍＭのクエン酸塩、約５０ｍＭのスクロース〜約３００ｍＭのスクロース、および約５ｍＭのＮａＣｌ〜約２００ｍＭのＮａＣｌを含む。場合によっては、クエン酸塩／スクロース／ＮａＣｌ緩衝液は、約１０ｍＭクエン酸塩、１００ｍＭスクロース、および１００ｍＭのＮａＣｌを含む。いくつかの例では、酢酸塩／スクロース／ＮａＣｌ緩衝液は、約５ｍＭの酢酸塩〜約５０ｍＭの酢酸塩、約５０ｍＭのスクロース〜約３００ｍＭのスクロース、および約５ｍＭのＮａＣｌ〜約２００ｍＭのＮａＣｌを含む。場合によっては、酢酸塩／スクロース／ＮａＣｌ緩衝液は、約１０ｍＭの酢酸塩、約１００ｍＭのスクロース、および約１００ｍＭのＮａＣｌを含む。場合によっては、Ｌ−Ｗｎｔは除菌工程を経験する。
【０１４１】
いくつかの例では、Ｌ−Ｗｎｔは窒素下で保存される。いくつかの例では、Ｌ−Ｗｎｔは窒素下で活性の実質的な損失なく安定している。
【０１４２】
いくつかの例では、Ｌ−Ｗｎｔは約１°Ｃ〜約８°Ｃの温度で保存される。いくつかの実例では、Ｌ−Ｗｎｔは、少なくとも約１°Ｃ、２°Ｃ、３°Ｃ、４°Ｃ、５°Ｃ、６°Ｃ、７°Ｃ、８°Ｃ、あるいはそれ以上の温度で、活性の実質的な損失なく安定している。いくつかの実例では、Ｌ−Ｗｎｔは、最大で約１°Ｃ、２°Ｃ、３°Ｃ、４°Ｃ、５°Ｃ、６°Ｃ、７°Ｃ、８°Ｃ、あるいはそれ以下の温度で、活性の実質的な損失なく安定している。
【０１４３】
いくつかの例では、Ｌ−Ｗｎｔは約−８０°Ｃ〜約−２０°Ｃの温度で保存される。いくつかの例では、Ｌ−Ｗｎｔは、約−８０°Ｃの温度で活性の実質的な損失なく安定している。いくつかの例では、Ｌ−Ｗｎｔは、約−２０°Ｃの温度で活性の実質的な損失なく安定している。
【０１４４】
いくつかの実施形態において、Ｌ−Ｗｎｔは、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１５、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、３００、３５６、４００、７００、１０００日、あるいはそれ以上の間、活性の実質的な損失なく安定している。いくつかの実施形態において、Ｌ−Ｗｎｔは、最大で約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１５、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、３００、３５６、４００、７００、１０００日、あるいはそれ以下の間、活性の実質的な損失なく安定している。
【０１４５】
いくつかの実施形態において、Ｌ−Ｗｎｔ３Ａは遠心分離工程を経験し、その後、緩衝剤中で懸濁される。例示的な緩衝液としては、限定されないが、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）あるいはスクロースベースの緩衝液、例えば、リン酸塩／スクロース緩衝液、ヒスチジン／スクロース緩衝液、クエン酸塩／スクロース緩衝液、酢酸塩／スクロース緩衝液、スクロース／ＮａＣｌベースの緩衝液、リン酸塩／スクロース／ＮａＣｌ緩衝液、ヒスチジン／スクロース／ＮａＣｌ緩衝液、クエン酸塩／スクロース／ＮａＣｌ緩衝液、あるいは酢酸塩／スクロース／ＮａＣｌ緩衝液が挙げられる。いくつかの例では、スクロースベースの緩衝液は、約５０ｍＭのスクロース〜約５００ｍＭのスクロースを含む。場合によっては、スクロースベースの緩衝液は、約３００ｍＭのスクロースを含む。いくつかの例では、リン酸塩／スクロース緩衝液は、約５ｍＭのリン酸塩〜約５０ｍＭのリン酸塩、および約５０ｍＭのスクロース〜約５００ｍＭのスクロースを含む。場合によっては、リン酸塩／スクロース緩衝液は、約１０ｍＭのリン酸塩および約３００ｍＭのスクロースを含む。場合によっては、ヒスチジン／スクロース緩衝液は、約１０ｍＭヒスチジンおよび約３００ｍＭのスクロースを含む。いくつかの例では、クエン酸塩／スクロース緩衝液は、約５ｍＭのクエン酸塩〜約５０ｍＭのクエン酸塩、および約５０ｍＭのスクロース〜約５００ｍＭのスクロースを含む。場合によっては、クエン酸塩／スクロース緩衝液は、約１０ｍＭのクエン酸塩および約３００ｍＭのスクロースを含む。いくつかの例では、酢酸塩／スクロース緩衝液は、約５ｍＭの酢酸塩〜約５０ｍＭの酢酸塩、および約５０ｍＭのスクロース〜約５００ｍＭのスクロースを含む。場合によっては、酢酸塩／スクロース緩衝液は、約１０ｍＭの酢酸塩および約３００ｍＭのスクロースを含む。いくつかの例では、スクロース／ＮａＣｌベースの緩衝液は、約５０ｍＭのスクロース〜約３００ｍＭのスクロース、および約５ｍＭのＮａＣｌ〜約２００ｍＭのＮａＣｌを含む。場合によっては、スクロース／ＮａＣｌベースの緩衝液は、約１００ｍＭのスクロースおよび１００ｍＭ  のＮａＣｌを含む。いくつかの例では、リン酸塩／スクロース／ＮａＣｌ緩衝液は、約５ｍＭのリン酸塩〜約５０ｍＭのリン酸塩、約５０ｍＭのスクロース〜約３００ｍＭのスクロース、および約５ｍＭのＮａＣｌ〜約２００ｍＭのＮａＣｌを含む。場合によっては、リン酸塩／スクロース／ＮａＣｌ緩衝液は、約１０ｍＭのリン酸塩、約１００ｍＭのスクロース、および約１００ｍＭのＮａＣｌを含む。いくつかの例では、ヒスチジン／スクロース／ＮａＣｌ緩衝液は、約５ｍＭのヒスチジン〜約５０ｍＭのヒスチジン、約５０ｍＭのスクロース〜約３００ｍＭのスクロース、および約５ｍＭのＮａＣｌ〜約２００ｍＭのＮａＣｌを含む。場合によっては、ヒスチジン／スクロース／ＮａＣｌ緩衝液は、約１０ｍＭのヒスチジン、約１００ｍＭのスクロース、および１００ｍＭのＮａＣｌを含む。いくつかの例では、クエン酸塩／スクロース／ＮａＣｌ緩衝液は、約５ｍＭのクエン酸塩〜約５０ｍＭのクエン酸塩、約５０ｍＭのスクロース〜約３００ｍＭのスクロース、および約５ｍＭ���ＮａＣｌ〜約２００ｍＭのＮａＣｌを含む。場合によっては、クエン酸塩／スクロース／ＮａＣｌ緩衝液は、約１０ｍＭクエン酸塩、１００ｍＭスクロース、および１００ｍＭのＮａＣｌを含む。いくつかの例では、酢酸塩／スクロースＮａＣｌ緩衝液は、約５ｍＭの酢酸塩〜約５０ｍＭの酢酸塩、約５０ｍＭのスクロース〜約３００ｍＭのスクロース、および約５ｍＭのＮａＣｌ〜約２００ｍＭのＮａＣｌを含む。場合によっては、酢酸塩／スクロース／ＮａＣｌ緩衝液は、約１０ｍＭの酢酸塩、約１００ｍＭのスクロース、および約１００ｍＭのＮａＣｌを含む。
【０１４６】
いくつかの実施形態において、Ｌ−Ｗｎｔ３Ａは濾過工程を経験する。いくつかの例では、濾過工程は、限外濾過、ダイアフィルトレーション、ナノ濾過、除菌濾過、あるいはその組み合わせを含む。例示的な濾過膜としては、限定されないが、酢酸セルロース（ＣＡ）、ポリスルホン（ＰＳ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリビニリデンフルオライド（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｉｅｎｅ）（ＰＶＤＦ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリエチレン（ＰＥ）、およびポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）が挙げられる。いくつかの例では、Ｌ−Ｗｎｔ３Ａは、限外濾過、ダイアフィルトレーション、ナノ濾過、除菌濾過、あるいはその組み合わせなどの１つ以上濾過を経験する。いくつかの例では、Ｌ−Ｗｎｔ３Ａは、タンパク質汚染物質および微生物汚染物質などの１つ以上の生体汚染物質を除去するために、限外濾過およびナノ濾過を経験する。いくつかの例では、ナノ濾過は１つ以上のウイルスの汚染物質を除去する。いくつかの例では、Ｌ−Ｗｎｔ３Ａは、緩衝液交換のためのダイアフィルトレーション工程をさらに経験する。例示的な緩衝液としては、限定されないが、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）あるいはスクロースベースの緩衝液、例えば、リン酸塩／スクロース緩衝液、ヒスチジン／スクロース緩衝液、クエン酸塩／スクロース緩衝液、酢酸塩／スクロース緩衝液、スクロース／ＮａＣｌベースの緩衝液、リン酸塩／スクロース／ＮａＣｌ緩衝液、ヒスチジン／スクロース／ＮａＣｌ緩衝液、クエン酸塩／スクロース／ＮａＣｌ緩衝液、あるいは酢酸塩／スクロース／ＮａＣｌ緩衝液が挙げられる。いくつかの例では、スクロースベースの緩衝液は、約５０ｍＭのスクロース〜約５００ｍＭのスクロースを含む。場合によっては、スクロースベースの緩衝液は、約３００ｍＭのスクロースを含む。いくつかの例では、リン酸塩／スクロース緩衝液は、約５ｍＭのリン酸塩〜約５０ｍＭのリン酸塩、および約５０ｍＭのスクロース〜約５００ｍＭのスクロースを含む。場合によっては、リン酸塩／スクロース緩衝液は、約１０ｍＭのリン酸塩および約３００ｍＭのスクロースを含む。場合によっては、ヒスチジン／スクロース緩衝液は、約１０ｍＭヒスチジンおよび約３００ｍＭのスクロースを含む。いくつかの例では、クエン酸塩／スクロース緩衝液は、約５ｍＭのクエン酸塩〜約５０ｍＭのクエン酸塩、および約５０ｍＭのスクロース〜約５００ｍＭのスクロースを含む。場合によっては、クエン酸塩／スクロース緩衝液は、約１０ｍＭのクエン酸塩および約３００ｍＭのスクロースを含む。いくつかの例では、酢酸塩／スクロース緩衝液は、約５ｍＭの酢酸塩〜約５０ｍＭの酢酸塩、および約５０ｍＭのスクロース〜約５００ｍＭのスクロースを含む。場合によっては、酢酸塩／スクロース緩衝液は、約１０ｍＭの酢酸塩および約３００ｍＭのスクロースを含む。いくつかの例では、スクロース／ＮａＣｌベースの緩衝液は、約５０ｍＭのスクロース〜約３００ｍＭのスクロース、および約５ｍＭのＮａＣｌ〜約２００ｍＭのＮａＣｌを含む。場合によっては、スクロース／ＮａＣｌベースの緩衝液は、約１００ｍＭのスクロースおよび１００ｍＭのＮａＣｌを含む。いくつかの例では、リン酸塩／スクロース／ＮａＣｌ緩衝液は、約５ｍＭのリン酸塩〜約５０ｍＭのリン酸塩、約５０ｍＭのスクロース〜約３００ｍＭのスクロース、および約５ｍＭのＮａＣｌ〜約２００ｍＭのＮａＣｌを含む。場合によっては、リン酸塩／スクロース／ＮａＣｌ緩衝液は、約１０ｍＭのリン酸塩、約１００ｍＭのスクロース、および約１００ｍＭのＮａＣｌを含む。いくつかの例では、ヒスチジン／スクロース／ＮａＣｌ緩衝液は、約５ｍＭのヒスチジン〜約５０ｍＭのヒスチジン、約５０ｍＭのスクロース〜約３００ｍＭのスクロース、および約５ｍＭのＮａＣｌ〜約２００ｍＭのＮａＣｌを含む。場合によっては、ヒスチジン／スクロース／ＮａＣｌ緩衝液は、約１０ｍＭのヒスチジン、約１００ｍＭのスクロース、および１００ｍＭのＮａＣｌを含む。いくつかの例では、クエン酸塩／スクロース／ＮａＣｌ緩衝液は、約５ｍＭのクエン酸塩〜約５０ｍＭのクエン酸塩、約５０ｍＭのスクロース〜約３００ｍＭのスクロース、および約５ｍＭのＮａＣｌ〜約２００ｍＭのＮａＣｌを含む。場合によっては、クエン酸塩／スクロース／ＮａＣｌ緩衝液は、約１０ｍＭクエン酸塩、１００ｍＭスクロース、および１００ｍＭのＮａＣｌを含む。いくつかの例では、酢酸塩／スクロース／ＮａＣｌ緩衝液は、約５ｍＭの酢酸塩〜約５０ｍＭの酢酸塩、約５０ｍＭのスクロース〜約３００ｍＭのスクロース、および約５ｍＭのＮａＣｌ〜約２００ｍＭのＮａＣｌを含む。場合によっては、酢酸塩／スクロース／ＮａＣｌ緩衝液は、約１０ｍＭの酢酸塩、約１００ｍＭのスクロース、および約１００ｍＭのＮａＣｌを含む。場合によっては、Ｌ−Ｗｎｔ３Ａは除菌工程を経験する。
【０１４７】
いくつかの例では、Ｌ−Ｗｎｔ３Ａは窒素下で保存される。いくつかの例では、Ｌ−Ｗｎｔ３Ａは窒素下で活性の実質的な損失なく安定している。
【０１４８】
いくつかの例では、Ｌ−Ｗｎｔ３Ａは約１°Ｃ〜約８°Ｃの温度で保存される。いくつかの実例では、Ｌ−Ｗｎｔ３Ａは、少なくとも約１°Ｃ、２°Ｃ、３°Ｃ、４°Ｃ、５°Ｃ、６°Ｃ、７°Ｃ、８°Ｃ、あるいはそれ以上の温度で、活性の実質的な損失なく安定している。いくつかの例では、Ｌ−Ｗｎｔ３Ａは、最大で約１°Ｃ、２°Ｃ、３°Ｃ、４°Ｃ、５°Ｃ、６°Ｃ、７°Ｃ、８°Ｃ、あるいはそれ以下の温度で、活性の実質的な損失なく安定している。
【０１４９】
いくつかの例では、Ｌ−Ｗｎｔ３Ａは約−８０°Ｃ〜約−２０°Ｃの温度で保存される。いくつかの例では、Ｌ−Ｗｎｔ３Ａは、約−８０°Ｃの温度で活性の実質的な損失なく安定している。いくつかの例では、Ｌ−Ｗｎｔ３Ａは、約−２０°Ｃの温度で活性の実質的な損失なく安定している。
【０１５０】
いくつかの実施形態において、Ｌ−Ｗｎｔ３Ａは、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０  ９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、３００、３５６、４００、７００、１０００日、あるいはそれ以上の間、活性の実質的な損失なく安定している。いくつかの実施形態において、Ｌ−Ｗｎｔ３Ａは、最大で約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０  ９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、３００、３５６、４００、７００、１０００日、あるいはそれ以下の間、活性の実質的な損失なく安定している。
【０１５１】
いくつかの例では、用語「活性の実質的な損失なく」とは、リポソームＷｎｔポリペプチドの機能活性が、リポソームの不在下で対応する天然Ｗｎｔポリペプチドの機能活性と近いことを指す。いくつかの例では、リポソームＷｎｔポリペプチドの機能活性は、天然Ｗｎｔポリペプチドの機能活性と比較して、少なくとも約１００％、９９％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６０％、５０％、４０％、あるいはそれ以上である。いくつかの例では、リポソームＷｎｔポリペプチドの機能活性は、天然Ｗｎｔポリペプチドの機能活性と比較して、最大で約１００％、９９％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６０％、５０％、４０％、あるいはそれ以下である。いくつかの例では、Ｗｎｔポリペプチドの機能活性は、例えば、本明細書の他の場所に記載される質量分析法、バイオマーカー分析関連アッセイなどのアッセイ、移植手術、例えば、腎被膜下移植手術、脊椎固定術外科、ＡＬＰ、ＴＲＡＰ、およびＴＵＮＥＬ染色、免疫組織化学的検査、ならびにマイクロＣＴ分析および移植片成長の定量化を使用して検出される。
【０１５２】
用語「安定している」とは、折り畳まれた状態のＷｎｔポリペプチドを指しており、折り畳まれていないものや、分解されないものを指していない。いくつかの例では、用語「安定している」とはさらに、活性の実質的な損失なく機能活性を保持するＷｎｔポリペプチドを指す。いくつかの例では、上に記載されるようなＷｎｔポリペプチドの活性を確立する安定性アッセイを決定するために使用されるアッセイは、ＬＳＬ細胞ベースのアッセイ、例えば、マウスのＬＳＬ細胞ベースのアッセイをさらに含む。
【０１５３】
いくつかの実施形態において、ＷｎｔポリペプチドならびにリポソームＷｎｔポリペプチド（例えば、Ｗｎｔ３Ａポリペプチド、Ｌ−Ｗｎｔ３Ａのそれぞれ）の量、純度、効能、および安全性がさらに評価される。いくつかの例では、ＷｎｔポリペプチドならびにリポソームＷｎｔポリペプチド（例えば、Ｗｎｔ３Ａポリペプチド、Ｌ−Ｗｎｔ３Ａのそれぞれ）の量（あるいは濃度）は、クロマトグラフィー法（例えば、ＨＰＬＣ方法）を利用することによって決定される。幾つかの例において、ＨＰＬＣ法はＲＰ−ＨＰＬＣ  法である。
【０１５４】
いくつかの例では、ＷｎｔポリペプチドならびにリポソームＷｎｔポリペプチド（例えば、Ｗｎｔ３Ａポリペプチド、Ｌ−Ｗｎｔ３Ａのそれぞれ）の純度は、クロマトグラフィー法（例えば、ＨＰＬＣ法）、サイズ分離法（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、あるいは電荷分離法（キャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）法）を利用することによって決定される。
【０１５５】
いくつかの実施形態において、ＷｎｔポリペプチドならびにリポソームＷｎｔポリペプチド（例えば、Ｗｎｔ３Ａポリペプチド、Ｌ−Ｗｎｔ３Ａのそれぞれ）の効能は、本明細書に記載されるＬＳＬアッセイを利用することによって決定される。
【０１５６】
いくつかの実施形態において、ＷｎｔポリペプチドならびにリポソームＷｎｔポリペプチド（例えば、Ｗｎｔ３Ａポリペプチド、Ｌ−Ｗｎｔ３Ａのそれぞれ）の安全性は、例えば、生菌数試験（例えば、ＵＳＰ  ６１（ＵＳＰ２９−ＮＦ２４）に記載されるような）および／または、エンドトキシン試験（例えば、ＵＳＰ  ８５（ＵＳＰ２９−ＮＦ２４）に記載されるような）を利用することによって決定される。
【０１５７】
いくつかの実施形態において、ＷｎｔポリペプチドならびにリポソームＷｎｔポリペプチド（例えば、Ｗｎｔ３Ａポリペプチド、Ｌ−Ｗｎｔ３Ａのそれぞれ）の重量モル浸透圧濃度が決定される。いくつかの例では、ＷｎｔポリペプチドならびにリポソームＷｎｔポリペプチド（例えば、Ｗｎｔ３Ａポリペプチド、Ｌ−Ｗｎｔ３Ａのそれぞれ）の重量モル浸透圧濃度は、ＵＳＰ  ７８５（ＵＳＰ２９−ＮＦ２４）に記載されるようなガイドラインに従って決定される。
【０１５８】
いくつかの実施形態において、ＷｎｔポリペプチドならびにリポソームＷｎｔポリペプチド（例えば、Ｗｎｔ３Ａポリペプチド、Ｌ−Ｗｎｔ３Ａのそれぞれ）は未満を含む。
【０１５９】
発現構築物
いくつかの実施形態において、１つ以上の変異体を含むＷｎｔポリペプチドは、組み換え法によって生成される。いくつかの例では、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ３Ａ、ＷｎｔＡ、あるいはＷｎｔ１０Ｂポリペプチドである。いくつかの例では、１つ以上の変異体を含むＷｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドである。いくつかの例では、１つ以上の変異体を含むＷｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ５Ａポリペプチドである。いくつかの例では、１つ以上の変異体を含むＷｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ１０Ｂポリペプチドである。
【０１６０】
Ｃ末端で切断された変異体を含むアミノ酸配列変異体は、適切なヌクレオチド変化をＷｎｔポリペプチドＤＮＡに導入することによって調製される。そのような変異体は、自然発生のＷｎｔポリペプチドのアミノ酸配列の末端の一方あるいは両末端内における、あるいは末端の一方あるいは両末端での残基の挿入、置換、および／または特定の欠失を表す。挿入、置換、および／またはは特定の欠失（例えば、切断）の任意の組み合わせは、最終構築物が本明細書に定義されるような所望の生物学的活性を保有する場合に限り、最終構築物に到達するようになっている。アミノ酸変化はまた、例えば、糖鎖付加部位の数または位置を変更すること、膜固定特性（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｃｈｏｒｉｎｇ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ）を変更すること、および／または、Ｗｎｔポリペプチドのリーダー配列を挿入、欠失、あるいは他の方法で影響を与えることによりＷｎｔポリペプチドの細胞内の位置を変更することによって、Ｗｎｔポリペプチドの翻訳後のプロセスを変更することができる。
【０１６１】
いくつかの実施形態において、Ｗｎｔポリペプチド内の１つ以上の変異体は、置換、挿入、欠失、あるいはそれらの組み合わせを含む。いくつかの例では、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、置換、挿入、欠失、あるいはそれらの組み合わせを含む。ある場合には、Ｗｎｔ５Ａポリペプチドは、置換、挿入、欠失、あるいはそれらの組み合わせを含む。その他の場合において、Ｗｎｔ１０Ｂポリペプチドは、置換、挿入、欠失、あるいはそれらの組み合わせを含む。
【０１６２】
場合によっては、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドをコード化するＤＮＡは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２によって表される。場合によっては、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドをコード化するＤＮＡは、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の配列を切断することによって、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の配列の利用することによって、調製される。いくつかの例では、Ｗｎｔポリペプチドのコード化遺伝子は、当技術分野において知られているように、オリゴヌクレオチド合成、増幅などによっても得られる。
【０１６３】
Ｗｎｔポリペプチドをコード化する核酸（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）は、発現のために複製可能なベクターに挿入される。多くのそのようなベクターが利用可能である。ベクターの構成要素は一般的に、限定されないが、以下のものの１以上を含む：複製起点、１以上の標識遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、および転写終結配列。好ましくは、ＧＭＰ適合性ベクター、例えば、市販のベクターＯｐｔｉｃＶｅｃ、ｐＴａｒｇｅｔ、ｐｃＤＮＡ４Ｔ０４、ｐｃＤＮＡ４．０が選択される。
【０１６４】
いくつかの例では、Ｗｎｔポリペプチドをコード化する第１の核酸を含むベクターは、操作可能に第１の核酸に結合された、シャペロンをコード化する第２の核酸をさらに含む。いくつかの例では、シャペロンは、Ｆｒｉｚｚｌｅｄタンパク質、Ｗｎｔｌｅｓｓ、Ａｆａｍｉｎ、あるいはＰｏｒｃｕｐｉｎｅである。幾つかの場合では、シャペロンはＦｒｉｚｚｌｅｄ−８である。場合によっては、シャペロンはＦｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）である。いくつかの例では、ベクターはマルチシストロニック（例えば、バイシストロニック）ベクターであり、それは、第１の核酸および第２の核酸が同じプロモーター下にあり、第１の核酸と第２の核酸との間のベクトル領域はＩＲＥＳ要素あるいは２Ａペプチドを含む。いくつかの例では、２Ａペプチドは：Ｔ２Ａ（［ＧＳＧ］−  ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）、Ｐ２Ａ（［Ｇ  ＳＧ］−ＡＴＮＦ  ＳＬＬＫＱ  ＡＧＤ  ＶＥＥＮＰＧＰ）（ＳＥＱ  ＴＤ  ＮＯ：  ３１）、Ｅ２Ａ（［ＧＳＧ］−ＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２）、およびＦ２Ａ（［ＧＳＧ’ｊ−  ＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３）を含む。いくつかの例では、ベクターは、第１の核酸および第２の核酸を含むが、その２つの核酸は２つの異なるプロモーター下にある。
【０１６５】
いくつかの実施形態において、Ｗｎｔポリペプチドをコード化する第１の核酸、およびシャペロンをコード化する第２の核酸は、２つの異なるベクターにおいて構築される。
【０１６６】
いくつかの実施形態において、最小血清培養条件に寛容な発現ベクターが使用される。いくつかの例では、最小血清培養条件は、減少血清培養条件、タンパク質を含まない培養条件、合成培地条件、あるいは無血清培養条件を含む。いくつかの実施形態では、減少血清培養条件に寛容な発現ベクターが使用される。いくつかの実施形態において、タンパク質を含まない培養条件に寛容な発現ベクターが使用される。いくつかの実施形態において、合成培地条件に寛容な発現ベクターが使用される。
【０１６７】
いくつかの実施形態において、無血清培養条件に寛容な発現ベクターが使用される。場合によっては、発現ベクターが、対象のタンパク質の所望の転写産物の高いコピー数および分泌につながる。いくつかの例では、発現ベクターはｃＧＭＰ適合性哺乳動物細胞株と適合する。哺乳動物の発現ベクターの非限定的な例は、ｐＯｐｔｉｖｅｃベクター、ｐＴａｒｇｅＴ（商標）ベクター、ＢａｃＭａｍ  ｐＣＭＶ−Ｄｅｓｔベクター、Ｆｌｐ−Ｉｎ（商標）コアシステム、ベクターのＧａｔｅｗａｙ（登録商標）ｓｕｉｔｅ  、Ｈａｌｏ  Ｔａｇ（登録商標）ベクター、Ｆｌｅｘｉ（登録商標）ベクター、ｐＣＭＶＴＮＴ（商標）ベクター、ｐｃＤＮＡ４．０、およびｐｃＤＮＡ（商標）４／ＴＯベクターを含む。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、ｐＯｐｔｉｖｅｃおよびｐＴａｒｇｅＴ（商標）ベクターから選択される。ｐＯｐｔｉｖｅｃベクターは、哺乳動物分泌シグナルを含有する遺伝子およびＣＭＶプロモーター下流の対象の遺伝子の迅速なクローニングを可能にするＴＯＰＯ（登録商標）適応バイシストロニックプラスミドである。ジヒドロ葉還元酵素選択マーカーは、迅速な選択を可能にする。場合によっては、このベクターは、ＣＨＯ−Ｓ細胞の一過性トランスフェクションのために使用される。いくつかの例では、ｐＴａｒｇｅＴ（商標）ベクターは、ＣＨＯ−Ｓ細胞の一過性トランスフェクションのために、およびＷｎｔポリペプチド（例えば、Ｗｎｔ３Ａ）を発現する安定した細胞株の作成のために使用される。
【０１６８】
コード化配列は、Ｗｎｔの分泌を可能にするシグナル配列も含む。シグナル配列は、ベクターの構成要素であってもよく、あるいは、ベクターに挿入されるＷｎｔコード化ＤＮＡの一部であってもよい。選択される異種のシグナル配列は、宿主細胞によって認識されかつ処理される（すなわち、シグナルペプチターゼによって切断される）ものが好ましい。哺乳動物細胞の発現では、天然シグナル配列が使用され得るか、あるいは、他の動物Ｗｎｔポリペプチドのシグナル配列、同じまたは近縁種の分泌されたポリペプチドのシグナル配列、およびウイルスの分泌のリーダー、例えば、単純ヘルペスｇＤシグナルなどの他の哺乳動物シグナル配列が適し得る。
【０１６９】
発現ベクターは、選択可能マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含み得る。この遺伝子は、選択培養培地中で増殖した、形質転換した宿主細胞の生存または成長に必要なタンパク質をコード化する。選択遺伝子を含有するベクターで形質転換されない宿主細胞は、培地中に生存しない。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質又は他のトキシン、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、あるいはテトラサイクリンに対する耐性を与え、（ｂ）栄養要求性の欠失を捕捉し、または（ｃ）複合培地から利用可能でない重大な栄養素を供給する、タンパク質をコード化する。
【０１７０】
発現ベクター及びは、宿主生物によって認識され、且つＷｎｔコード配列に操作可能に連結されるプロモーターを含む。プロモーターは、操作可能に結合される特定の核酸配列の転写および翻訳を制御する構造遺伝子（通常、約１００〜１０００ｂｐ内）の開始コドンの上流（５’）に位置する非翻訳配列である。そのようなプロモーターは典型的に、誘導性と構成的という２つのクラスに分類される。誘導性プロモーターは、培養条件（例えば、栄養素の有無、あるいは温度の変化）における変化に応じたその管理下で、ＤＮＡからの転写のレベルの増加を引き起こすプロモーターである。様々な可能な宿主細胞によって認識される多くのプロモーターが周知である。天然Ｗｎｔポリペプチドプロモーター配列および多くの異種のプロモーターの両方が、Ｗｎｔポリペプチドの発現を指示するために使用されてもよい。しかし、異種プロモーターが好ましく、なぜなら、それは一般により大きな転写とより高い収率を可能にするためである。
【０１７１】
哺乳動物宿主細胞におけるベクターからの転写は、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２など）、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、および、最も好ましくは、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから、異種の哺乳動物プロモーター（例えば、アクチンプロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ  ）、あるいは免疫グロブリンプロモーター）から、熱ショックプロモーターから得られたプロモーターによって制御されるが、そのようなプロモーターは、宿主細胞システムと互換性を持つ場合に限る。ＳＶ４０ウイルスの早期及び後期のプロモーターは、複製物のＳＶ４０ウイルス起点も含むＳＶ４０制限フラグメントとして、都合良く得られる。ヒトサイトメガロウイルスの早急な早期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｅ制限フラグメントとして都合良く得られる。
【０１７２】
転写は、ベクターにエンハンサー配列を挿入することにより増大することができる。エンハンサーは、転写を増大するためにプロモーターに作用する、ＤＮＡ（通常約１０〜３００ｂｐ）のシスエレメントである。エンハンサーは、配向と位置に比較的依存せず、イントロン内、ならびにコード配列自体内での転写ユニットの５’および３’で見られる。現在、多くのエンハンサー配列が、哺乳類遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、およびインスリン）から知られている。しかし、典型的には、真核細胞ウイルスからのエンハンサーを使用するだろう。例は、複製起点の側面（ｌａｔｅ  ｓｉｄｅ）上のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス早期プロモーターエンハンサー、複製起点の側面上のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーを含む。エンハンサーは、コード配列の位置５’あるいは３’で発現ベクターにスプライスされてもよいが、好ましくは、プロモーターから部位５’に位置付けられる。
【０１７３】
哺乳類宿主細胞において使用される発現ベクターはまた、転写の終了およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含む。そのような配列は、真核生物又はウイルスＤＮＡあるいはｃＤＮＡの、５’の、及び時には３’の引翻訳領域から共通して利用可能である。これら領域は、Ｗｎｔポリペプチドをコード化するｍＲＮＡの非翻訳部分においてポリアデニル化されたフラグメントとして転写される、ヌクレオチドセグメントを含む。
【０１７４】
上に表記された成分の１つ以上を含有する適切なベクターの構造は、標準的技法を使用する。単離されたプラスミドあるいはＤＮＡフラグメントは、必要なベクターを生成するために、所望の形態で切断され、調整され、および再連結される。
【０１７５】
いくつかの例では、哺乳動物細胞における一過性発現をもたらす発現ベクターが使用される。一般的に、一過性発現は、宿主細胞が発現ベクターの多くのコピーを蓄積し、発現ベクターによってコード化された高レベルの所望のポリペプチドを合成するように、宿主細胞において効率的に複製することができる発現ベクターの使用を含む。適切な発現ベクターおよび宿主細胞を含む一過性発現系は、クローン化ＤＮＡによってコード化されたポリペプチドの便利な確実な同定、ならびに、所望生物学的あるいは生理学的性質についてのそのようなポリペプチドの迅速なスクリーニングを可能にする。
【０１７６】
いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞において安定した発現をもたらす発現ベクターが使用される。そのような場合、適切な発現ベクターおよび宿主細胞を含む安定した発現系は、大量生産（例えば、４０Ｌ以上、５０Ｌ以上、１００Ｌ以上、１５０Ｌ以上、２００Ｌ以上、２５０Ｌ以上、あるいは３００Ｌ以上の培養物）を提供する。
【０１７７】
いくつかの例において、無血清培地が使用される。無血清培地の非限定的な例には、ＣＤ  ＣＨＯ培地、ＣＤ  ＣＨＯ  ＡＧＴ（商標）培地、ＣＤ  ＯｐｔｉＣＨＯ（商標）培地、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ  ＩＩ（随意にヒポキサンチンおよびチミジンを含む）、ＣＤ  ２９３  ＡＧＴ（商標）培地、アデノウイルス発現培地（ＡＥＭ）、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現培地、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＣＨＯ発現培地、ＣＤ  ＦｏｒｔｉＣＨＯ（商標）培地、ＥＸ−ＣＥＬＬＲ  ３０２無血清培地、ＥＸ−ＣＥＬＬＲ  ３２５  ＰＦ  ＣＨＯ無血清培地、ＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）ＣＤ  ＣＨＯ−２培地（動物構成要成分含まず）、ＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）ＣＤ  ＣＨＯ−３培地、ＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）ＣＤＨＯ  ＤＨＦＲ−培地（動物構成成分含まず）、およびＡｃｔｉＰｒｏ培地が挙げられる。
【０１７８】
本発明の方法は、ＧＭＰ産生のためのＦＤＡまたはＷＨＯのガイドラインに順守するように実行され得る。そのようなものに対するガイドラインは関連規制当局から入手できる場合がある。例えば、“ＷＨＯ  ｇｏｏｄ  ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  ｐｒａｃｔｉｃｅｓ：  ｍａｉｎ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｆｏｒ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ．  Ａｎｎｅｘ  ３  ｉｎ：  ＷＨＯ  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ．  Ｆｏｒｔｙ−ｆｉｆｔｈ  ｒｅｐｏｒｔ．  Ｇｅｎｅｖａ，  Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，  ２０１１  （ＷＨＯ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ  Ｓｅｒｉｅｓ，  Ｎｏ．  ９６１）”；“ＩＣＨ  Ｑ５Ｂ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ．  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ  ｉｎ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｅｄ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒ−ＤＮＡ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ．  Ｇｅｎｅｖａ，  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｈａｒｍｏｎｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｕｓｅ，  １９９５”；および“Ｈａｎｄｂｏｏｋ：  ｇｏｏｄ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  （ＧＬＰ）：  ｑｕａｌｉｔｙ  ｐｒａｃｔｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｎｏｎ−ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，  ２ｎｄ  ｅｄ．  Ｇｅｎｅｖａ，  ＵＮＤＰ／Ｗｏｒｌｄ  Ｂａｎｋ  ＷＨＯ，  Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｐｒｏｇｒａｍｍｅ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｒａｉｎｉｎｇ  ｉｎ  Ｔｒｏｐｉｃａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，  ２００９”を参照されたい。これらは各々、参照により具体的に組み込まれる。
【０１７９】
典型的に、組換えＤＮＡ由来の生物学的治療薬は、マスターセルバンクに由来する製造者のワーキングセルバンク（ＷＣＢ）を含むセルバンクシステムを使用して産生される。本発明は、ＷＮＴ３Ａタンパク質の分泌のためにベクターによりトランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）（例えばＣＨＯ−ＳまたはＣＨＯ−Ｋ１）細胞の冷凍アリコートを備えており、細胞はマスターセルバンクまたはワーキングセルバンクとして使用可能である。
【０１８０】
いくつかの実施形態において、生産規模（または細胞培養規模）は、４０Ｌより多い、５０Ｌより多い、１００Ｌより多い、１５０Ｌより多い、２００Ｌより多い、２５０Ｌより多い、または３００Ｌより多い。いくつかの例において、生産規模（または細胞培養スケール）は１００Ｌより多い。いくつかの例において、生産規模（または細胞培養スケール）は２００Ｌより多い。いくつかの例において、生産規模（または細胞培養スケール）は３００Ｌより多い。いくつかの例において、生産規模（または細胞培養スケール）は約１００Ｌである。いくつかの例において、生産規模（または細胞培養スケール）は約２００Ｌである。いくつかの例において、生産規模（または細胞培養スケール）は約３００Ｌである。
【０１８１】
いくつかの実施形態において、宿主細胞は懸濁液中で成長させられる。
【０１８２】
細胞株
いくつかの実施形態において、ｃＧＭＰ適合性の細胞株は、Ｗｎｔポリペプチドをコードする発現ベクターによりトランスフェクトされる。典型的なｃＧＭＰ適合性の細胞株には、哺乳動物細胞株、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞株、またはベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞株など；または昆虫細胞株、例えばＳｆ９細胞株、Ｓｆ２１細胞株、Ｔｎ−３６８細胞株、またはＨｉｇｈ  Ｆｉｖｅ（ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ  １−４）細胞株などが挙げられる。
【０１８３】
いくつかの例において、Ｗｎｔポリペプチドをコードする発現ベクターは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞株、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞株、Ｓｆ９細胞株、Ｓｆ２１細胞株、Ｔｎ−３６８細胞株、またはＨｉｇｈ  Ｆｉｖｅ（ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ  １  −４）細胞株から選択される、ｃＧＭＰ適合性の細胞株中でトランスフェクトされる。いくつかの例において、Ｗｎｔポリペプチドをコードする発現ベクターは、ＣＨＯ細胞株中でトランスフェクトされる。いくつかの例において、Ｗｎｔポリペプチドをコードする発現ベクターは、ＢＨＫ細胞株中でトランスフェクトされる。いくつかの例において、Ｗｎｔポリペプチドをコードする発現ベクターは、ＨＥＫ細胞株中でトランスフェクトされる。いくつかの例において、Ｗｎｔポリペプチドをコードする発現ベクターは、Ｓｆ９細胞株中でトランスフェクトされる。いくつかの例において、Ｗｎｔポリペプチドをコードする発現ベクターは、Ｓｆ２１細胞株中でトランスフェクトされる。いくつかの例において、Ｗｎｔポリペプチドをコードする発現ベクターは、Ｔｎ−３６８細胞株中でトランスフェクトされる。いくつかの例において、Ｗｎｔポリペプチドをコードする発現ベクターは、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ細胞株中でトランスフェクトされる。場合によっては、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ３Ａポリペプチド、Ｗｎｔ５Ａポリペプチド、またはＷｎｔ１０Ｂポリペプチドである。
【０１８４】
いくつかの実施形態において、ＷｎｔポリペプチドはＷｎｔ３Ａポリペプチドである。いくつかの例において、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドをコードする発現ベクターは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞株、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞株、Ｓｆ９細胞株、Ｓｆ２１細胞株、Ｔｎ−３６８細胞株、またはＨｉｇｈ  Ｆｉｖｅ（ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ  １−４）細胞株から選択される、ｃＧＭＰ適合性の細胞株中でトランスフェクトされる。いくつかの例において、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドをコードする発現ベクターは、ＣＨＯ細胞株中でトランスフェクトされる。いくつかの例において、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドをコードする発現ベクターは、ＢＨＫ細胞株中でトランスフェクトされる。いくつかの例において、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドをコードする発現ベクターは、ＨＥＫ細胞株中でトランスフェクトされる。いくつかの例において、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドをコードする発現ベクターは、Ｓｆ９細胞株中でトランスフェクトされる。いくつかの例において、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドをコードする発現ベクターは、Ｓｆ２１細胞株中でトランスフェクトされる。いくつかの例において、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドをコードする発現ベクターは、Ｔｎ−３６８細胞株中でトランスフェクトされる。いくつかの例において、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドをコードする発現ベクターは、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ細胞株中でトランスフェクトされる。
【０１８５】
典型的なＣＨＯ細胞株には、限定されないが、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＸＢ  １１（またはＣＨＯ−ＤＵＫＸ）、およびＣＨＯ−ＤＧ４４細胞株が挙げられる。いくつかの例において、Ｗｎｔポリペプチドをコードする発現ベクターは、ＣＨＯ−Ｓ細胞株またはＣＨＯ−Ｋ１細胞株中でトランスフェクトされる。場合によっては、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｗｎｔ３Ａポリペプチド、Ｗｎｔ５Ａポリペプチド、またはＷｎｔ１０Ｂポリペプチドである。いくつかの例において、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドをコードする発現ベクターは、ＣＨＯ−Ｓ細胞株中でトランスフェクトされる。いくつかの例において、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドをコードする発現ベクターは、ＣＨＯ−Ｋ１細胞株中でトランスフェクトされる。場合によっては、Ｗｎｔ３ＡポリペプチドのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２をコードする発現ベクターは、ＣＨＯ−Ｓ細胞株中でトランスフェクトされる。場合によっては、Ｗｎｔ３ＡポリペプチドのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２をコードする発現ベクターは、ＣＨＯ−Ｋ１細胞株中でトランスフェクトされる。更なる場合、変異体（例えば欠失またはトランケーション）を含むＷｎｔ３Ａポリペプチドをコードする発現ベクターは、ＣＨＯ−Ｓ細胞株中でトランスフェクトされる。更なる場合、変異体（例えば欠失またはトランケーション）を含むＷｎｔ３Ａポリペプチドをコードする発現ベクターは、ＣＨＯ−Ｋ１細胞株中でトランスフェクトされる。
【０１８６】
いくつかの例において、欠失またはトランケーションを含むＷｎｔ３Ａポリペプチドをコードする発現ベクターによりトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｓ細胞の組み合わせにより、タンパク質の最小血清培養培地（例えば無血清条件）への有効な分泌が可能になる。場合によっては、欠失またはトランケーションはＣ末端の欠失またはトランケーションである。いくつかの例において、Ｗｎｔ３ＡポリペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に例示されるようなものである。場合によっては、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１（ＢＣ１０３９２１）に対してＣ末端が切断されるＷｎｔ３Ａポリペプチドをコードする発現ベクターによりトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｓ細胞の組み合わせにより、タンパク質の培養培地への有効な分泌が血清または他の動物産物の不在下で可能になる。
【０１８７】
いくつかの例において、欠失またはトランケーションを含むＷｎｔ３Ａポリペプチドをコードする発現ベクターによりトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｋ１細胞の組み合わせにより、タンパク質の最小血清培養培地（例えば無血清条件）への有効な分泌が可能になる。場合によっては、欠失またはトランケーションはＣ末端の欠失またはトランケーションである。いくつかの例において、Ｗｎｔ３ＡポリペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に例示されるようなものである。場合によっては、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１（ＢＣ１０３９２１）に対してＣ末端が切断されるＷｎｔ３Ａポリペプチドをコードする発現ベクターによりトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｓ細胞の組み合わせにより、タンパク質の培養培地への有効な分泌が血清または他の動物産物の不在下で可能になる。場合によっては、ＣＨＯ−Ｋ１細胞は懸濁液中で成長させられる。
【０１８８】
本明細書に別記されるように、最小血清培地は時折、９％未満の血清を含む。場合によっては、血清はＦＢＳである。場合によっては、最小血清培地に存在するＦＢＳは、多くとも約０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、またはそれ以下である。場合によっては、最小血清培地に存在するＦＢＳは、少なくとも約０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、またはそれ以上である。場合によっては、最小血清培地に存在するＦＢＳは約０．０５％である。場合によっては、最小血清培地に存在するＦＢＳは約０．１％である。場合によっては、最小血清培地に存在するＦＢＳは約０．５％である。場合によっては、最小血清培地に存在するＦＢＳは約１％である。場合によっては、最小血清培地に存在するＦＢＳは約２％である。場合によっては、最小血清培地に存在するＦＢＳは約３％である。場合によっては、最小血清培地に存在するＦＢＳは約４％である。場合によっては、最小血清培地に存在するＦＢＳは約５％である。場合によっては、最小血清培地に存在するＦＢＳは約６％である。場合によっては、最小血清培地に存在するＦＢＳは約７％である。場合によっては、最小血清培地に存在するＦＢＳは約８％である。場合によっては、最小血清培地に存在するＦＢＳは約９％である。他の場合、最小血清培地は無血清培地である。
【０１８９】
時折、最小血清培地は、植物水解物から得たペプチドおよび／またはポリペプチドなどの成分を含むが、動物由来のタンパク質または成分を含まない。他の場合、最小血清培地は組換え型タンパク質および／またはホルモンを含むが、ＦＢＳ、ウシ血清アルブミン、またはヒト血清アルブミンを含まない。更なる場合、最小血清培地は低分子量構成要素、および随意に合成ペプチドおよび／またはホルモンを含む。
【０１９０】
いくつかの実施形態において、最小血清培地は１つ以上の追加の補足物を含む。いくつかの実施形態において、追加の補足物は脂質補足物である。脂質補足物の非限定的な例には、Ｌｉｐｉｄ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  １（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｌｉｐｉｄ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  ２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｌｉｐｏｇｒｏ（登録商標）（Ｒｏｃｋｙ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、およびＣｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｌｉｐｉｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が挙げられる。いくつかの実施形態において、無血清培地は脂質補足物を包含する。
【０１９１】
いくつかの例において、最小血清培地は血清、即ち化学的特定培地である。場合によっては、無血清培地、化学的特定培地は、動物由来の成分を実質的に含まない。
【０１９２】
いくつかの実施形態において、本開示の方法は、Ｗｎｔポリペプチド（例えばＷｎｔ３Ａポリペプチド）を含む発現ベクターによりトランスフェクトされた無血清培地においてＣＨＯ細胞（例えばＣＨＯ−Ｓ細胞またはＣＨＯ−Ｋ１細胞）を培養する工程を含み、前記Ｗｎｔポリペプチドは分泌のためのシグナル配列を含み、該シグナル配列は天然Ｗｎｔ（例えばＷｎｔ３Ａ）シグナル配列または異種シグナル配列であり、Ｗｎｔポリペプチド（例えばＷｎｔ３Ａポリペプチド）が発現され且つ分泌される条件下で、プロモーターへと動作可能に結合される。いくつかの例において、Ｗｎｔポリペプチドは、Ｃ末端切断されたＷｎｔポリペプチド（例えばＷｎｔ３Ａポリペプチド）であり、該Ｗｎｔポリペプチドは分泌のためのシグナル配列を含み、該シグナル配列は天然Ｗｎｔ（例えばＷｎｔ３Ａ）シグナル配列または異種シグナル配列であり、Ｗｎｔポリペプチド（例えばＷｎｔ３Ａポリペプチド）が発現され且つ分泌される条件下で、プロモーターへと動作可能に結合される。いくつかの実施形態において、前記方法は更に、細胞を発現ベクターによりトランスフェクトする初期工程を含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、培地から産生されるポリペプチドを精製する工程を含む。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔポリペプチド（例えばＷｎｔ３Ａポリペプチド）は、ＧＭＰ臨床的用途に適している程度に精製される。いくつかの実施形態において、精製されたＷｎｔポリペプチド（例えばＷｎｔ３Ａポリペプチド）は、単位投与製剤において包装される。
【０１９３】
いくつかの実施形態において、ＣＨＯ細胞は懸濁液中で成長させられる。
【０１９４】
他の実施形態において、ＣＨＯ細胞は接着性である。
【０１９５】
いくつかの実施形態において、培地は代用血清を含む。いくつかの実施形態において、代用血清は動物産物を含まない。いくつかの実施形態において、代用血清は、精製されたタンパク質、例えば、インスリン、トランスフェリン、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミンなどの１つ以上を含むが、例えば、成長因子、ステロイドホルモン、グルココルチコイド、細胞接着因子、検出可能なＩｇ、有系分裂促進物質などを欠いている。代用血清は、培地中に最大約０．１％、最大約０．２５％、最大約０．５％、最大約０．７５％、最大約１％、最大約２．５％、最大約５％、最大約７．５％、または最大約１０％の濃度で存在し得る。代用血清は、培地中の最大約０．１％の濃度で存在し得る。代用血清は、培地中の最大約０．２５％の濃度で存在し得る。代用血清は、培地中の最大約０．５％の濃度で存在し得る。代用血清は、培地中の最大約０．７５％の濃度で存在し得る。代用血清は、培地中の最大約１％の濃度で存在し得る。代用血清は、培地中の最大約２．５％の濃度で存在し得る。代用血清は、培地中の最大約５％の濃度で存在し得る。代用血清は、培地中の最大約７．５％の濃度で存在し得る。代用血清は、培地中の最大約１０％の濃度で存在し得る。
【０１９６】
適切な培地は当業者に既知のものから選択されてもよく、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０、ＭＥＭ、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ、ＣＨＯ  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｄｉｕｍなどが挙げられる。適切な代用血清には、動物産物を含まず産生されたもの、または、精製された動物タンパク質成分のみを含むものが挙げられる。この目的に適している市販の補足物には、限定されないが、ＣｅｌｌＥｓｓ、ＩＴＳ（例えばｒｒＳ３またはＩＴＳ３＋）、Ｅｘｃｙｔｅ、ＯｎｅＳｈｏｔ、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ、および当業者に既知のものが挙げられる。いくつかの例において、ＩＴＳ補足物は、インスリン、トランスフェリン、およびセレンの混合物を含有する補足物である。培地は更に、限定されないが、ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）（グルタミンベースのジペプチド）、抗生物質（例えばドキシサイクリン）、Ｇ４１８、非必須アミノ酸、ブラストサイジンなどの成分を含む。
【０１９７】
Ｗｎｔポリペプチドの無血清培養培地への分泌のレベルは、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１μｇ／ｍｌ、少なくとも約１．１μｇ／ｍｌ、少なくとも約１．２５μｇ／ｍｌ、少なくとも約１．５μｇ／ｍｌ、少なくとも約１．７５μｇ／ｍｌ、少なくとも約２．５μｇ／ｍｌ、少なくとも約５μｇ／ｍｌ、少なくとも約７．５μｇ／ｍｌ、少なくとも約１０μｇ／ｍｌ、少なくとも約１５μｇ／ｍｌ、少なくとも約２０μｇ／ｍｌ、少なくとも約２５μｇ／ｍｌ、少なくとも約３０μｇ／ｍｌ、またはそれ以上であり得る。Ｗｎｔポリペプチドの無血清培養培地への分泌のレベルは、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌであり得る。Ｗｎｔポリペプチドの無血清培養培地への分泌のレベルは、少なくとも約２５ｎｇ／ｍｌであり得る。Ｗｎｔポリペプチドの無血清培養培地への分泌のレベルは、少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌであり得る。Ｗｎｔポリペプチドの無血清培養培地への分泌のレベルは、少なくとも約７５ｎｇ／ｍｌであり得る。Ｗｎｔポリペプチドの無血清培養培地への分泌のレベルは、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌであり得る。Ｗｎｔポリペプチドの無血清培養培地への分泌のレベルは、少なくとも約２５０ｎｇ／ｍｌであり得る。Ｗｎｔポリペプチドの無血清培養培地への分泌のレベルは、少なくとも約５００ｎｇ／ｍｌであり得る。Ｗｎｔポリペプチドの無血清培養培地への分泌のレベルは、少なくとも約７５０ｎｇ／ｍｌであり得る。Ｗｎｔポリペプチドの無血清培養培地への分泌のレベルは、少なくとも約１μｇ／ｍｌであり得る。Ｗｎｔポリペプチドの無血清培養培地への分泌のレベルは、少なくとも約１．１μｇ／ｍｌであり得る。Ｗｎｔポリペプチドの無血清培養培地への分泌のレベルは、少なくとも約１．２５μｇ／ｍｌであり得る。Ｗｎｔポリペプチドの無血清培養培地への分泌のレベルは、少なくとも約１．５μｇ／ｍｌであり得る。Ｗｎｔポリペプチドの無血清培養培地への分泌のレベルは、少なくとも約１．７５μｇ／ｍｌであり得る。Ｗｎｔポリペプチドの無血清培養培地への分泌のレベルは、少なくとも約２．５μｇ／ｍｌであり得る。Ｗｎｔポリペプチドの無血清培養培地への分泌のレベルは、少なくとも約５μｇ／ｍｌであり得る。Ｗｎｔポリペプチドの無血清培養培地への分泌のレベルは、少なくとも約７．５μｇ／ｍｌであり得る。Ｗｎｔポリペプチドの無血清培養培地への分泌のレベルは、少なくとも約１０μｇ／ｍｌであり得る。Ｗｎｔポリペプチドの無血清培養培地への分泌のレベルは、少なくとも約１５μｇ／ｍｌであり得る。Ｗｎｔポリペプチドの無血清培養培地への分泌のレベルは、少なくとも約２０μｇ／ｍｌであり得る。Ｗｎｔポリペプチドの無血清培養培地への分泌のレベルは、少なくとも約２５μｇ／ｍｌであり得る。Ｗｎｔポリペプチドの無血清培養培地への分泌のレベルは、少なくとも約３０μｇ／ｍｌであり得る。いくつかの例において、ＷｎｔポリペプチドはＷｎｔ３Ａポリペプチドである。場合によっては、Ｗｎｔポリペプチド��Ｗｎｔ５Ａポリペプチドである。場合によっては、ＷｎｔポリペプチドはＷｎｔ１０Ｂポリペプチドである。
【０１９８】
いくつかの例において、ＷｎｔポリペプチドはＷｎｔ３Ａポリペプチドである。場合によっては、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドの無血清培養培地への分泌のレベルは、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１μｇ／ｍｌ、少なくとも約１．１μｇ／ｍｌ、少なくとも約１．２５μｇ／ｍｌ、少なくとも約１．５μｇ／ｍｌ、少なくとも約１．７５μｇ／ｍｌ、少なくとも約２．５μｇ／ｍｌ、少なくとも約５μｇ／ｍｌ、少なくとも約７．５μｇ／ｍｌ、少なくとも約１０μｇ／ｍｌ、少なくとも約１５μｇ／ｍｌ、少なくとも約２０μｇ／ｍｌ、少なくとも約２５μ／ｍｌ、少なくとも約３０μｇ／ｍｌ、またはそれ以上である。
【０１９９】
Ｗｎｔ３Ａポリペプチドの無血清培養培地への分泌のレベルは、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌであり得る。Ｗｎｔ３Ａポリペプチドの無血清培養培地への分泌のレベルは、少なくとも約２５ｎｇ／ｍｌであり得る。Ｗｎｔ３Ａポリペプチドの無血清培養培地への分泌のレベルは、少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌであり得る。Ｗｎｔ３Ａポリペプチドの無血清培養培地への分泌のレベルは、少なくとも約７５ｎｇ／ｍｌであり得る。Ｗｎｔ３Ａポリペプチドの無血清培養培地への分泌のレベルは、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌであり得る。Ｗｎｔ３Ａポリペプチドの無血清培養培地への分泌のレベルは、少なくとも約２５０ｎｇ／ｍｌであり得る。Ｗｎｔ３Ａポリペプチドの無血清培養培地への分泌のレベルは、少なくとも約５００ｎｇ／ｍｌであり得る。Ｗｎｔ３Ａポリペプチドの無血清培養培地への分泌のレベルは、少なくとも約７５０ｎｇ／ｍｌであり得る。Ｗｎｔ３Ａポリペプチドの無血清培養培地への分泌のレベルは、少なくとも約１μｇ／ｍｌであり得る。Ｗｎｔ３Ａポリペプチドの無血清培養培地への分泌のレベルは、少なくとも約１．１μｇ／ｍｌであり得る。Ｗｎｔ３Ａポリペプチドの無血清培養培地への分泌のレベルは、少なくとも約１．２５μｇ／ｍｌであり得る。Ｗｎｔ３Ａポリペプチドの無血清培養培地への分泌のレベルは、少なくとも約１．５μｇ／ｍｌであり得る。Ｗｎｔ３Ａポリペプチドの無血清培養培地への分泌のレベルは、少なくとも約１．７５μｇ／ｍｌであり得る。Ｗｎｔ３Ａポリペプチドの無血清培養培地への分泌のレベルは、少なくとも約２．５μｇ／ｍｌであり得る。Ｗｎｔ３Ａポリペプチドの無血清培養培地への分泌のレベルは、少なくとも約５μｇ／ｍｌであり得る。Ｗｎｔ３Ａポリペプチドの無血清培養培地への分泌のレベルは、少なくとも約７．５μｇ／ｍｌであり得る。Ｗｎｔ３Ａポリペプチドの無血清培養培地への分泌のレベルは、少なくとも約１０μｇ／ｍｌであり得る。Ｗｎｔ３Ａポリペプチドの無血清培養培地への分泌のレベルは、少なくとも約１５μｇ／ｍｌであり得る。Ｗｎｔ３Ａポリペプチドの無血清培養培地への分泌のレベルは、少なくとも約２０μｇ／ｍｌであり得る。Ｗｎｔ３Ａポリペプチドの無血清培養培地への分泌のレベルは、少なくとも約２５μｇ／ｍｌであり得る。Ｗｎｔ３Ａポリペプチドの無血清培養培地への分泌のレベルは、少なくとも約３０μｇ／ｍｌであり得る。
【０２００】
いくつかの実施形態において、発現且つ分泌されたＷｎｔポリペプチドのＣ末端は、５〜４０のアミノ酸により切断される。いくつかの例において、発現且つ分泌されたＷｎｔポリペプチドのＣ末端は、５〜３５のアミノ酸、１０〜３５のアミノ酸、１０〜３３のアミノ酸、１０〜３０のアミノ酸、１５〜３３のアミノ酸、１５〜３０のアミノ酸、２０〜３５のアミノ酸、２０〜３３のアミノ酸、２０〜３０のアミノ酸、２５〜３３のアミノ酸、または２５〜３０のアミノ酸により切断される。
【０２０１】
いくつかの実施形態において、発現且つ分泌されたＷｎｔポリペプチドのＣ末端は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、またはそれ以上のアミノ酸により切断され、および、付加的にＮ末端またはＣ末端にて切断される場合があるが、タンパク質は生物活性を維持するものとする。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔポリペプチドは５のアミノ酸により切断される。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔポリペプチドは１０のアミノ酸により切断される。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔポリペプチドは１５のアミノ酸により切断される。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔポリペプチドは２０のアミノ酸により切断される。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔポリペプチドは２５のアミノ酸により切断される。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔポリペプチドは３０のアミノ酸により切断される。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔポリペプチドは３３のアミノ酸により切断される。
【０２０２】
いくつかの例において、ＷｎｔポリペプチドはＷｎｔ３Ａポリペプチドである。いくつかの実施形態において、発現且つ分泌されたＷｎｔ３ＡポリペプチドのＣ末端は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、またはそれ以上のアミノ酸により切断され、および、付加的にＮ末端またはＣ末端にて切断される場合があるが、タンパク質は生物活性を維持するものとする。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは５のアミノ酸により切断される。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは１０のアミノ酸により切断される。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは１５のアミノ酸により切断される。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは２０のアミノ酸により切断される。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは２５のアミノ酸により切断される。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは３０のアミノ酸により切断される。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは３３のアミノ酸により切断される。
【０２０３】
いくつかの実施形態において、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を持つ配列を有している。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対して少なくとも７０％の配列同一性を持つ配列を有している。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対して少なくとも８０％の配列同一性を持つ配列を有している。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対して少なくとも８５％の配列同一性を持つ配列を有している。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対して少なくとも９０％の配列同一性を持つ配列を有している。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対して少なくとも９５％の配列同一性を持つ配列を有している。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対して少なくとも９６％の配列同一性を持つ配列を有している。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対して少なくとも９７％の配列同一性を持つ配列を有している。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対して少なくとも９８％の配列同一性を持つ配列を有している。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対して少なくとも９９％の配列同一性を持つ配列を有している。
【０２０４】
いくつかの実施形態において、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を持つ配列を有している。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に対して少なくとも７０％の配列同一性を持つ配列を有している。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に対して少なくとも８０％の配列同一性を持つ配列を有している。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に対して少なくとも８５％の配列同一性を持つ配列を有している。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に対して少なくとも９０％の配列同一性を持つ配列を有している。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に対して少なくとも９５％の配列同一性を持つ配列を有している。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に対して少なくとも９６％の配列同一性を持つ配列を有している。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に対して少なくとも９７％の配列同一性を持つ配列を有している。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に対して少なくとも９８％の配列同一性を持つ配列を有している。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に対して少なくとも９９％の配列同一性を持つ配列を有している。
【０２０５】
Ｗｎｔポリペプチド組成物および製剤
組成物が本明細書において提供され、該組成物において、最小血清培地（例えば、無血清の化学的特定培地などの無血清培地）へと分泌される、あるいは薬学的に許容可能な賦形剤中の生物学的に活性なＷｎｔポリペプチドは、少なくとも約０．１μｇ／ｍｌ；少なくとも約０．２５μｇ／ｍｌ；少なくとも約０．５μｇ／ｍｌ；少なくとも約０．７５μｇ／ｍｌ；少なくとも約１μｇ／ｍｌ；少なくとも約２．５μｇ／ｍｌ；少なくとも約５μｇ／ｍｌ；少なくとも約７．５μｇ／ｍｌ；少なくとも約１０μｇ／ｍｌ；少なくとも約２５μｇ／ｍｌ；少なくとも約３０μｇ／ｍｌ；少なくとも約５０μｇ／ｍｌ；少なくとも約７５μｇ／ｍｌ；少なくとも約１００μｇ／ｍｌ；少なくとも約２５０μｇ／ｍｌ；少なくとも約５００μｇ／ｍｌ；少なくとも約７５０μｇ／ｍｌ；少なくとも約１ｍｇ／ｍｌ；少なくとも約２．５ｍｇ／ｍｌ；少なくとも約５ｍｇ／ｍｌ；少なくとも約７．５ｍｇ／ｍｌ；少なくとも約１０ｍｇ／ｍｌ；少なくとも約２５ｍｇ／ｍｌ；少なくとも約５０ｍｇ／ｍｌ；少なくとも約７５ｍｇ／ｍｌ；少なくとも約１００ｍｇ／ｍｌ；またはそれ以上の濃度である。
【０２０６】
いくつかの実施形態において、本発明の方法および培養システムにより産生されるタンパク質は、治療を施すために様々な製剤へと組み込まれる。一態様において、薬剤は、適切で薬学的に許容可能な担体または希釈剤との組み合わせにより医薬組成物へと製剤され、および、固体、半固体、あるいは液体の形態、例えば錠剤、カプセル、粉末、顆粒、軟膏、溶液、座薬、注射、吸入剤、ゲル、小球体などにおける調製物へと製剤される。そのため、タンパク質および／または他の化合物の投与は様々な方法において達成可能である。タンパク質および／または他の化合物は、投与後に全身に行き渡るか、あるいは、製剤により、または移植部位にて有効投与量を保持するように作用するインプラントの使用により局在化され得る。
【０２０７】
医薬剤形において、タンパク質および／または他の化合物は、薬学的に許容可能な塩の形態で投与され、あるいは、単独で、または適切な会合において、更には他の薬学的に活性な化合物と組み合わせて使用され得る。薬剤は組み合わされて活性の混合物を提供する場合がある。以下の方法および賦形剤は例示的なものであり、本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０２０８】
医薬製剤は単位剤形において提供されてもよく、この場合、用語「単位剤形」は、ヒト被験体に対する単一の用量として適切な物理的に別個の単位を指し、各単位は、薬学的に許容可能な希釈剤、担体、またはビヒクルと合わせて所望の効果をもたらすのに十分であると推定される量において、所定の質量のタンパク質を含有する。本発明の単位剤形に対する仕様は、利用される特定の組成物と達成される効果、および宿主中の組成物に関連する薬力学に依存する。
【０２０９】
ビヒクル、アジュバント、担体、または希釈剤などの薬学的に許容可能な賦形剤は、市販で入手可能である。更に、薬学的に許容可能な補助物質、例えばｐＨ調節剤および緩衝化剤、等張化剤、安定化剤、湿潤剤などが、市販で入手可能である。本発明の方法および組成物に有用なあらゆる化合物が、薬学的に許容可能な塩基付加塩として提供可能である。「薬学的に許容可能な塩基付加塩」は、遊離酸の生物学的効果と特性を保持する塩を指し、これは生物学的または他の方法で不要なものではない。これらの塩は、無機塩基または有機塩基を遊離酸に添加することによって調製される。無機塩基由来の塩には、限定されないが、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、アルミニウムの塩などが挙げられる。好ましい無機塩には、アンモニウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、およびマグネシウムの塩が挙げられる。有機塩基由来の塩には、限定されないが、第一級アミン、第二級アミン、および第三級アミン、自然に生じる置換アミンを含む置換アミン、環状アミンおよび塩基イオン交換樹脂、例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、２−ジメチルアミノエタノール、２−ジエチルアミノエタノール、ジシクロヘキシルアミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、エチレンジアミン、グルコサミン、メチルグルカミン、テオブロミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン、Ｎ−エチルピペリジン、ポリアミン樹脂などの塩を含む。特に好ましい有機塩基は、イソプロピルアミン、ジエチルアミン、エタノールアミン、トリメチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、コリン、およびカフェインである。
【０２１０】
患者または患者サンプル、および処置されている疾病と投与経路に依存して、タンパク質は、患者サンプルに約０．００１μｇ〜約１０μｇの用量で、あるいは、患者に（１日当たり）体重１ｋｇあたり約０．００１μｇ〜約１０μｇの用量で投与され得る。
【０２１１】
当業者は容易に、投与量レベルは特定の酵素、症状の重症度と感度、および被験体の副作用に対する感受性に応じて変動し得ることを、認識する。タンパク質の一部は他のタンパク質よりも強力である。所定の酵素の好ましい用量は、様々な手段によって当業者により容易に決定可能である。好ましい手段は、所定の化合物の生理学的効力を測定することである。
【０２１２】
本発明の組成物は、予防目的の他、治療目的のために使用され得る。本明細書において使用されるように、用語「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、疾患の予防と、疾患または事前に存在する状態の処置の両方を指すものであり、より一般的には所望の組織、部位、タイミングなどにおけるＷｎｔ３Ａ活性の増強を指す。本発明は、進行中の疾患の処置における有意な進展を提供し、患者の臨床症状を安定化および／または改善するのを助ける。そのような処置は望ましくは、影響を受けた組織の機能の損失の前に行われるが、失った機能の回復または更なる機能損失の予防を助けることも可能である。治療効果の証拠は、疾患の重症度の何らかの減少、あるいは、疾病の改善、例えば、骨治癒の向上などであり得る。治療効果は、臨床結果の観点において測定可能であり、または、生化学物質検査により判定可能である。代替的に、疾患の症状における減少を探すことができる。
【０２１３】
本発明の他の実施形態において、細胞組成物が提供され、該細胞組成物において、細胞は、分泌のためのシグナル配列を含むＣ末端切断されたＷｎｔ３Ａタンパク質を包含する発現ベクターを含んでおり、前記シグナル配列は、天然Ｗｎｔ３Ａシグナル配列または異種シグナル配列であり、プロモーターに動作可能に結合される。いくつかの実施形態において、細胞はＣＨＯ細胞（例えばＣＨＯ−Ｓ細胞またはＣＨＯ−Ｋ１細胞）である。いくつかの実施形態において、細胞は無血清培地を含む組成物として提供される。他の実施形態において、細胞は冷凍され生存可能であり、培養物を播種するのに適したアリコートにおいて随意に提供される。
【０２１４】
細胞は、容器、例えば冷凍アリコートにおいて、約１０３の細胞／ｍｌ、１０４細胞／ｍｌ、１０５細胞／ｍｌ、１０６細胞／ｍｌ、１０７細胞／ｍｌ、最大約１０８細胞／ｍｌ、またはそれ以上の濃度で提供され得る。細胞は任意の適切な培地において冷凍されることで細胞の生存率を維持することができ、およびＤＭＳＯを含み得る。細胞組成物は、ＧＭＰフォーマット、例えばマスターセルバンクまたはワーキングセルバンクにおいて有用な組成物において提供可能であり、これは、定められた条件およびクローニング履歴の下で単一の宿主細胞から得たものであり、後に複数の容器へと分注される。
【０２１５】
いくつかの実施形態において、組成物中のＷｎｔポリペプチドの比活性は、機能的アッセイにおける活性のレベルを判定すること、例えば、β−カテニンの安定化、幹細胞の成長促進など、非機能的アッセイに存在するＷｎｔポリペプチドの量を定量化すること、例えば、免疫染色、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、クマシンまたは銀で染色したゲルに対する定量化など、および生物学的に活性なＷｎｔと総Ｗｎｔとの比率を判定することにより、測定される。一般的に、実質的に均質な組成物において定められるような比活性は、出発物質の少なくとも約５％、つい以上は出発物質の少なくとも約１０％であり、および、約２５％、約５０％、約９０％、またはそれ以上の場合もある。
【０２１６】
Ｗｎｔの生物活性に対するアッセイはβ−カテニンの活性化を含み、これは例えばＷｎｔ組成物の系列希釈により測定可能である。Ｗｎｔ生物活性に対する典型的なアッセイは、Ｗｎｔ組成物を細胞、例えばマウスＬ細胞と接触させ、Ｗｎｔ反応性ルシフェラーゼレポータープラスミドおよび構成的ＬａｃＺ発現構築物により安定してトランスフェクトさせる。ルシフェラーゼ／βガラクトシダーゼ（ｌｕｃ／ｌａｃ）比率は、細胞数ごとの活性の標準化を可能にする。細胞は、β−カテニンを活性化させるのに十分な時間、通常は１時間培養されて、溶解される。細胞溶解物は、市販のＷｎｔタンパク質により生成された標準曲線と比較することにより、ｌｕｃ／ｌａｃ発現レベルに対して分析される。他のアッセイは、アフリカツメガエル・アニマルキャップアッセイにおける標的遺伝子のＣ５７ＭＧ形質転換および誘導を含む。
【０２１７】
いくつかの実施形態において、Ｗｎｔ組成物は、投与量間の均一性を含む。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔ組成物における投与量間のＷｎｔ濃度の変動は、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．５％未満、０．１％未満、またはそれ以下である。いくつかの例において、Ｗｎｔ組成物における投与量間のＷｎｔ濃度の変動は、２０％未満である。いくつかの例において、Ｗｎｔ組成物における投与量間のＷｎｔ濃度の変動は、１５％未満である。いくつかの例において、Ｗｎｔ組成物における投与量間のＷｎｔ濃度の変動は、１０％未満である。いくつかの例において、Ｗｎｔ組成物における投与量間のＷｎｔ濃度の変動は、５％未満である。いくつかの例において、Ｗｎｔ組成物における投与量間のＷｎｔ濃度の変動は、４％未満である。いくつかの例において、Ｗｎｔ組成物における投与量間のＷｎｔ濃度の変動は、３％未満である。いくつかの例において、Ｗｎｔ組成物における投与量間のＷｎｔ濃度の変動は、２％未満である。いくつかの例において、Ｗｎｔ組成物における投与量間のＷｎｔ濃度の変動は、１％未満である。いくつかの例において、Ｗｎｔ組成物における投与量間のＷｎｔ濃度の変動は、０．５％未満である。いくつかの例において、Ｗｎｔ組成物における投与量間のＷｎｔ濃度の変動は、０．１％未満である。
【０２１８】
いくつかの実施形態において、Ｗｎｔ組成物は実質的に、生物的汚染物質（例えば細菌、ウイルス、またはマイコバクテリウムなどの微生物；あるいは宿主細胞または細胞デブリ）を含まない。いくつかの例において、Ｗｎｔ組成物は、最大で５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、またはそれ以下の生物的汚染物質を含む。
【０２１９】
いくつかの実施形態において、Ｗｎｔ組成物は実質的に、化学汚染物質（例えば、精製工程および／またはリポソーム再構成工程中に利用される１つ以上の緩衝液成分）を含まない。いくつかの例において、Ｗｎｔ組成物は、最大で５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、０．００５％、０．００１％、またはそれ以下の化学汚染物質を含む。いくつかの例において、化学汚染物質はエタノールを含む。いくつかの例において、化学汚染物質は界面活性剤を含む。いくつかの例において、化学汚染物質は、糖界面活性剤（例えば、ｎ−ヘキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−オクチル−α−Ｄ−グルコピラノシド、オクチルβ−Ｄ−１−チオグルコピラノシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、ｎ−ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−デシル−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、またはｍエチル−６−０−（Ｎ−ヘプチルカルバモイル）−α−Ｄ−グルコピラノシド）を含む。
【０２２０】
使用の方法
特定の実施形態において、本明細書には、上述の方法により調製されるリポソームＷｎｔポリペプチドにより骨移植片における細胞生存を増強する方法が記載される。いくつかの実施形態において、必要とする被験体において骨移植片における細胞生存を増強する方法は、エクスビボ細胞を含む単離された哺乳動物骨移植片を含有するサンプルを、上述の方法により調製されるリポソームＷｎｔポリペプチドを含む組成物によりインキュベートする工程；および増強された細胞を標的部位へと移植する工程を含む。
【０２２１】
場合によっては、細胞は、少なくとも５分、１０分、１５分、２０分、３０分、１時間、２時間、３時間、６時間、またはそれ以上にわたりインキュベートされる。場合によっては、細胞は少なくとも５分間インキュベートされる。場合によっては、細胞は少なくとも１０分間インキュベートされる。場合によっては、細胞は少なくとも１５分間インキュベートされる。場合によっては、細胞は少なくとも２０分間インキュベートされる。場合によっては、細胞は少なくとも３０分間インキュベートされる。場合によっては、細胞は少なくとも６０分間インキュベートされる。場合によっては、細胞は少なくとも２時間インキュベートされる。場合によっては、細胞は少なくとも６時間以上インキュベートされる。
【０２２２】
場合によっては、細胞は、３０分間以下、１時間以下、１．５時間以下、２時間以下、３時間以下、４時間以下、５時間以下、６時間以下、またはそれ以下にわたりインキュベートされる。場合によっては、細胞は３０分以下にわたりインキュベートされる。場合によっては、細胞は１時間以下にわたりインキュベートされる。場合によっては、細胞は１．５時間以下にわたりインキュベートされる。場合によっては、細胞は２時間以下にわたりインキュベートされる。場合によっては、細胞は３時間以下にわたりインキュベートされる。場合によっては、細胞は６時間以下にわたりインキュベートされる。
【０２２３】
場合によっては、細胞は、約５分〜約６時間、約１０分〜約６時間、約３０分〜約６時間、約５分〜約３時間、約１０分〜約３時間、約１５分〜約３時間、約３０分〜約３時間、約５分〜約２時間、約１０分〜約２時間、約１５分〜約２時間、約２０分〜約２時間、約３０分〜約２時間、約５分〜約１時間、約１０分〜約１時間、約１５分〜約１時間、または約３０分〜約１時間かけてインキュベートされる。場合によっては、細胞は約５分〜約６時間かけてインキュベートされる。場合によっては、細胞は約１０分〜約６時間かけてインキュベートされる。場合によっては、細胞は約３０分〜約６時間かけてインキュベートされる。場合によっては、細胞は約５分〜約３時間かけてインキュベートされる。場合によっては、細胞は約１０分〜約３時間かけてインキュベートされる。場合によっては、細胞は約１５分〜約３時間かけてインキュベートされる。場合によっては、細胞は約２０分〜約３時間かけてインキュベートされる。場合によっては、細胞は約３０分〜約３時間かけてインキュベートされる。場合によっては、細胞は約５分〜約２時間かけてインキュベートされる。場合によっては、細胞は約１０分〜約２時間かけてインキュベートされる。場合によっては、細胞は約１５分〜約２時間かけてインキュベートされる。場合によっては、細胞は約２０分〜約２時間かけてインキュベートされる。場合によっては、細胞は約３０分〜約２時間かけてインキュベートされる。場合によっては、細胞は約５分〜約１時間かけてインキュベートされる。場合によっては、細胞は約１０分〜約１時間かけてインキュベートされる。場合によっては、細胞は約１５分〜約１時間かけてインキュベートされる。場合によっては、細胞は約２０分〜約１時間かけてインキュベートされる。場合によっては、細胞は約３０分〜約１時間かけてインキュベートされる。
【０２２４】
場合によっては、細胞は、ほぼ室温、または約３７℃でインキュベートされる。いくつかの例において、室温には、３０℃未満、２９℃未満、２８℃未満、２７℃未満、２６℃未満、２５℃未満、２４℃未満、２３℃未満、または２２℃未満が挙げられる。いくつかの例において、室温は、約２０℃〜約３０℃、約２２℃〜約２８℃、または約２４℃〜約２６℃を含む。いくつかの例において、室温は、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、または約２８℃を含む。
【０２２５】
場合によっては、細胞は約３４℃〜約３９℃の温度でインキュベートされる。場合によっては、細胞は、約３５℃〜約３８℃、約３５℃〜約３７℃、約３６℃〜約３９℃、約３６℃〜約３８℃、または約３６℃〜約３７℃でインキュベートされる。場合によっては、細胞は約３５℃〜約３８℃の温度でインキュベートされる。場合によっては、細胞は約３５℃〜約３７℃の温度でインキュベートされる。場合によっては、細胞は約３５℃〜約３９℃の温度でインキュベートされる。場合によっては、細胞は約３６℃〜約３８℃の温度でインキュベートされる。場合によっては、細胞は約３６℃〜約３７℃の温度でインキュベートされる。場合によっては、細胞は約３７℃でインキュベートされる。
【０２２６】
場合によっては、細胞は、約２℃〜約８℃、約２℃〜約６℃、約４℃〜約８℃、または約２℃〜約４℃でインキュベートされる。
【０２２７】
場合によっては、増強された細胞は、暴露されていない哺乳動物骨移植片材料に比べて増強された骨形成能力を含む。
【０２２８】
いくつかの例において、細胞は外科手術により被験体から得られる。場合によっては、細胞は外科部位から除去されない。更なる場合、細胞は遺伝子的に修飾されず、培養物中で拡張されず、あるいは、処置した細胞を被験体に戻す前に遠心分離などにより更に処理されない。
【０２２９】
いくつかの実施形態において、本明細書にはまた、上述の方法により調製されるリポソームＷｎｔポリペプチドにより骨欠損部位における細胞生存を増強する方法が記載される。いくつかの実施形態において、必要とする被験体において骨欠損部位における細胞生存を増強する方法は、骨欠損部位に、上述の方法により生成されたリポソームＷｎｔポリペプチドを含む組成物を投与する工程を含み、ここで、リポソームＷｎｔポリペプチドは、骨欠損部位にて細胞生存を増強する。場合によっては、前記方法は更に、骨欠損部位にて歯科用または整形外科用インプラントを投与する工程を含む。
【０２３０】
場合によっては、骨欠損部位は、損傷部位、例えば、骨折または外科手術による歯または骨の損傷の部位である。
【０２３１】
場合によっては、骨欠損部位は、歯の欠損部位、例えば歯科用インプラントのための部位である。歯科用インプラントは、ネジ、シリンダ、またはプレートを含む、顎骨における配置のための骨内膜インプラント；および、歯茎の下であるが顎骨上への配置のための骨膜下インプラントを含む。場合によっては、歯科用インプラントは二段階インプラントを含み、これは、例えば顎骨へとインプラントを配するための初期の外科手術、その後の時点で当接具を付けるための次の外科手術に関与する。他の場合、歯科用インプラントは一段階インプラントを含み、そこでは、インプラントへの当接具の取り付けは、第２の外科手術を必要とすることなく達成され得る。
【０２３２】
いくつかの例において、歯科用または整形外科用のインプラントは、リポソームＷｎｔポリペプチドを含む組成物の投与前に骨欠損部位へ投与される。例えば、歯科用または整形外科用のインプラントは、リポソームＷｎｔポリペプチドを含む組成物の投与の前に、骨欠損部位へ、約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、２週間、３０日、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、１年、またはそれ以上にわたり投与される。
【０２３３】
他の例において、歯科用または整形外科用のインプラントは、リポソームＷｎｔポリペプチドを含む組成物の投与後に骨欠損部位へ投与される。例えば、歯科用または整形外科用のインプラントは、リポソームＷｎｔポリペプチドを含む組成物の投与の後に、骨欠損部位へ、約１日、２日、５日、７日、２週間、３０日、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、またはそれ以上にわたり投与され得る。
【０２３４】
更なる場合、歯科用または整形外科用のインプラント、およびリポソームＷｎｔポリペプチドを含む組成物は、骨欠損部位へ同時に投与される。
【０２３５】
場合によっては、リポソームＷｎｔポリペプチドは、歯科用または整形外科用のインプラントの骨結合を増強する。
【０２３６】
キット／製品
本明細書には、特定の実施形態において、本明細書に記載される１つ以上の方法、プロセス、および組成物を使用するためのキットおよび製品が開示される。このようなキットは、バイアルやチューブなどの１以上の容器を収容するために仕切られた運搬装置、パッケージ、または容器を含み、容器の各々は本明細書に記載される方法において使用される別個の要素の１つを備えている。適切な容器として、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、および試験管が挙げられる。いくつかの実施形態において、容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成される。いくつかの例において、容器は単回用容器である。
【０２３７】
本明細書で提供される製品は、包装材料を含む。包装材料の例としては、限定されないが、ボトル、チューブ、バッグ、容器、ボトル、および、選択された製剤と投与および処置の意図した形態に適切な任意の包装材料が挙げられる。
【０２３８】
例えば、容器はＷｎｔポリペプチドまたはリポソームＷｎｔポリペプチドを含有する。容器には随意に、バイアル、例えば単回用ガラスバイアルなどのガラスバイアルが挙げられる。キットは更に、識別用の記載またはラベル、あるいは本明細書に記載される方法における使用に関する説明書を随意に含む。
【０２３９】
キットは典型的に、内容物を列挙するラベルおよび／または使用説明書と、使用説明書を備えた添付文書とを含んでいる。１セットの説明書も典型的に含まれる。
【０２４０】
一実施形態において、ラベルは容器上にあるかまたは容器に付随される。一実施形態において、ラベルを形成する文字、数字または他の表示が、容器自体に貼り付けられるか、成形されるか、あるいは刻まれている場合、ラベルは容器上に取り付けられる。ラベルが例えば添付文書として容器を保持するレセプタクルまたは運搬装置内に存在する時、ラベルは容器に付随する。一実施形態において、ラベルは、内容物が特定の治療用途に用いられるべきであることを示すために用いられる。ラベルはまた、例えば本明細書に記載の方法などにおける内容物の使用に関する指示を示す。
【０２４１】
特定の用語
別段の定めのない限り、本明細書で使用される技術用語と科学用語は全て、主張される主題が属する当該技術分野の当業者により一般に理解されるのと同じ意味を持っている。前述の一般的な説明および以下の詳細な説明は、典型的且つ例示的なものにすぎず、請求された主題の内容を限定するものではないことを理解されたい。本出願において、単数形の使用は、特に別記しない限り複数を含む。明細書と添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、他にその内容が明確に指示しない限り、複数の指示対象を含むということに留意しなければならない。本出願において、「または」の使用は、特に明記しない限り、「および／または」を意味する。更に、用語「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」といった他の形態と同じく、制限されない。
【０２４２】
本明細書で使用されるように、範囲および量は、「およその（ａｂｏｕｔ）」特定の値または範囲として表現可能である。「約」は正確な量も含んでいる。従って、「約５μＬ」とは「約５μＬ」と「５μＬ」を意味する。一般に、用語「約」は、実験誤差の範囲内、例えば、±５％、±１０％、または±１５％以内であると予想される量を含む。
【０２４３】
本明細書に使用されるセクションの見出しは、単に構成上の目的のためであり、記載される主題を制限すると解釈されるものではない。
【０２４４】
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野における当業者により共通して理解されるのと同じ意味を有する。「Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２ｎｄ  ｅｄ．，  Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  （Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ  １９９４）」では、当業者に、本出願において使用される用語の多くに関する一般的な手引が提供されている。
【０２４５】
本開示の方法の他、特定の被験体または用途におけるそれらの効果を判定する試験は、当該技術分野における処置の標準を用いて、本明細書中の教示に従い実行可能である。故に、本開示の実施は、当業者の考え得る範囲内にある、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来技術を利用する場合がある。このような技術は、次のような文献に説明されており、例えば、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，  ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ  （Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９）；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”  （Ｍ．Ｊ．  Ｇａｉｔ，  ｅｄ．，  １９８４）；“Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ”  （Ｒ．Ｉ．  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  ｅｄ．，  １９８７）；“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．）；“Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”  （Ｄ．Ｍ．  Ｗｅｉｒ  ＆  Ｃ．Ｃ．  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，  ｅｄｓ．）；“Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ”  （Ｊ．Ｍ．  Ｍｉｌｌｅｒ  ＆  Ｍ．Ｐ．  Ｃａｌｏｓ，  ｅｄｓ．，  １９８７）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”  （Ｆ．Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  １９８７）；“ＰＣＲ：  Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｍ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ”  （Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  １９９４）；および“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”  （Ｊ．Ｅ．  Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  １９９１）；更には前述の全ての文献の最新版と改訂版が挙げられる。
【０２４６】
本明細書において使用されるように、「市販」されている化合物は、以下の商業供給源から入手可能であり、例えば、限定されないが、Ａｃｒｅｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ  （Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ  ＰＡ）、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  （Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ  ＷＩ、Ｓｉｇｍａ  ＣｈｅｍｉｃａｌおよびＦｌｕｋａを含む）、Ａｐｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｌｔｄ．  （Ｍｉｌｔｏｎ  Ｐａｒｋ  ＵＫ）、Ａｖｏｃａｄｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  （Ｌａｎｃａｓｈｉｒｅ  Ｕ．Ｋ．）、ＢＤＨ  Ｉｎｃ．  （Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｃａｎａｄａ）、Ｂｉｏｎｅｔ  （Ｃｏｒｎｗａｌｌ，Ｕ．Ｋ．）Ｃｈｅｍｓｅｒｖｉｃｅ  Ｉｎｃ．  （Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ  ＰＡ）、Ｃｒｅｓｃｅｎｔ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．  （Ｈａｕｐｐａｕｇｅ  ＮＹ）、Ｅａｓｔｍａｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ  Ｃｏｍｐａｎｙ  （Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ  ＮＹ）、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏ．  （Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ  ＰＡ）、Ｆｉｓｏｎｓ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  （Ｌｅｉｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ  ＵＫ）、Ｆｒｏｎｔｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  （Ｌｏｇａｎ  ＵＴ）、ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．  （Ｃｏｓｔａ  Ｍｅｓａ  ＣＡ）、Ｋｅｙ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ  （Ｃｏｒｎｗａｌｌ  Ｕ．Ｋ．）、Ｌａｎｃａｓｔｅｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  （Ｗｉｎｄｈａｍ  ＮＨ）、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．  Ｌｔｄ．  （Ｃｏｒｎｗａｌｌ  Ｕ．Ｋ．）、Ｐａｒｉｓｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．  （Ｏｒｅｍ  ＵＴ）、Ｐｆａｌｔｚ  ＆  Ｂａｕｅｒ，Ｉｎｃ．  （Ｗａｔｅｒｂｕｒｙ  ＣＮ）、Ｐｏｌｙｏｒｇａｎｉｘ  （Ｈｏｕｓｔｏｎ  ＴＸ）、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．  （Ｒｏｃｋｆｏｒｄ  ＩＬ）、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．  （Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ  ＭＮ）、Ｒｉｅｄｅｌ  ｄｅ  Ｈａｅｎ  ＡＧ  （Ｈａｎｎｏｖｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔ，Ｉｎｃ．  （Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，ＮＪ）、ＴＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａ  （Ｐｏｒｔｌａｎｄ  ＯＲ）、Ｔｒａｎｓ  Ｗｏｒｌｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．  （Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ  ＭＤ）、Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ＵＳＡ，Ｉｎｃ．  （Ｒｉｃｈｍｏｎｄ  ＶＡ）、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ  ａｎｄ  Ａｒｇｏｎａｕｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙが挙げられる。
【０２４７】
化合物はまた、当業者に既知の方法により作成可能である。本明細書で使用されるように、「当業者に既知の方法」は、様々な参考図書およびデータベースを経由して確認され得る。本発明の化合物の調製に役立つ反応物の合成を詳述する、あるいはその調製について記載した記事への言及を提供する、適切な参考文献および論文は、例えば次のものを含む：“Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．  ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｓ．  Ｒ．  Ｓａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｒｏｕｐ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，”  ２ｎｄ  Ｅｄ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８３；Ｈ．  Ｏ．  Ｈｏｕｓｅ，  “Ｍｏｄｅｒｎ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ”，  ２ｎｄ  Ｅｄ．，  Ｗ．  Ａ．  Ｂｅｎｊａｍｉｎ，  Ｉｎｃ．  Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，  Ｃａｌｉｆ．  １９７２；Ｔ．  Ｌ．  Ｇｉｌｃｈｒｉｓｔ，  “Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，  ２ｎｄ  Ｅｄ．，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９２；Ｊ．  Ｍａｒｃｈ，  “Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ”，  ４ｔｈ  Ｅｄ．，  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９２。特定の反応物および類似の反応物も、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙによって調製される既知の化学物質の指数を介して確認することができ、これらは、オンラインデータベースを介するだけでなく、大半の公共および大学の図書館にて利用可能である（更なる詳細についてはｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．Ｃ．に問い合わせされたい）。既知ではあるがカタログで市販されていない化学物質は、慣習化学合成室（ｃｕｓｔｏｍ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｈｏｕｓｅ）によって調製され得、そこでは、標準の化学合成室（例えば、上記に記載のもの）の多くは、慣習合成サービスを提供している。
【０２４８】
本明細書において使用されるように、最小血清条件は、血清の存在が減少した血清条件であり、例えば、約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１．５％、１％、０．５％、０．２５％、０．２％、０．１％、０．０５％、またはそれ以下の血清が含まれる。いくつかの例において、最小血清条件は、９％〜０％、５％〜０．０５％、５％〜０．１％、５％〜０．２５％、４％〜０．０５％、４％〜０．１％、４％〜０．２５％、３％〜０．０５％、３％〜０．１％、３％〜０．２５％、２％〜０．０５％、２％〜０．１％、２％〜０．２５％、または２％〜０．５％の血清を含む。いくつかの例において、最小血清条件は、減少した血清培地、無タンパク質培地、化学的特定培地、または無血清培地を含む。場合によっては、減少した血清培地は、約１％〜約５％の血清（例えばウシ胎仔血清）を含む。場合によっては、無タンパク質培地は、動物由来のあらゆるタンパク質または構成要素を含まないが、時折、植物水解物から得られたペプチドおよび／またはポリペプチドを含む。場合によっては、化学的特定培地は、組換え型タンパク質および／またはホルモン（例えば組換えアルブミンおよびインスリン、並びに化学的に定義された脂質）を含み、ウシ胎仔血清、ウシ血清アルブミン、またはヒト血清アルブミンを含まない。場合によっては、化学的特定培地は、タンパク質を含まない化学的特定培地であり、これは低分子量の成分を含み、時折、合成ペプチドおよび／またはホルモンを含む。場合によっては、化学的特定培地は、ペプチドを含まずタンパク質を含まない化学的特定培地である。場合によっては、無血清培地（または定義された培地）は、定義されていない動物由来の産物、例えば血清アルブミン、水解物、成長因子、ホルモン、担体タンパク質、および結合因子などを含む。いくつかの実施形態において、本明細書で使用される最小血清培地は、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１．５％、１％、０．５％、０．２５％、０．２％、０．１％、または０．０５％未満の血清を含む培地条件を指す。いくつかの実施形態において、本明細書で使用される最小血清条件は、９％〜０％、５％〜０．０５％、５％〜０．１％、５％〜０．２５％、４％〜０．０５％、４％〜０．１％、４％〜０．２５％、３％〜０．０５％、３％〜０．１％、３％〜０．２５％、２％〜０．０５％、２％〜０．１％、２％〜０．２５％、または２％〜０．５％の血清を含む培地条件を指す。いくつかの実施形態において、本明細書で使用される最小血清条件は、血清が減少した培地条件を指す。いくつかの実施形態において、本明細書で使用される最小血清条件は、無タンパク質培地条件を指す。いくつかの実施形態において、本明細書で使用される最小血清条件は、化学的特定培地条件を指す。いくつかの実施形態において、本明細書で使用される最小血清条件は、無血清培地条件を指す。いくつかの実施形態において、本明細書で使用される最小血清条件は、無血清の化学的特定培地条件を指す。
【実施例】
【０２４９】
これら実施例は例示目的のためだけに提供され、本明細書に提供される請求の範囲を制限するものではない。
【０２５０】
実施例１−一般的な方法
プラスミドＤＮＡスケールアップ
【０２５１】
各ＤＮＡ発現構築物を、トランスフェクションに適切な量にスケールアップした。プラスミドＤＮＡを、トランスフェクションに進む前に確認された品質評価および配列に対して、アガロースゲル上で実行した（ｒｕｎ）。
【０２５２】
ＣＨＯ細胞の一時的なトランスフェクション
【０２５３】
懸濁ＣＨＯ細胞を振盪フラスコ中に蒔き、４ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸを補足したＣＤ  ＯｐｔｉＣＨＯ培地を使用して拡張させた。トランスフェクションの当日、拡張された細胞を、新鮮な培地を伴う新しいフラスコに蒔いた。各ＤＮＡ構築物を一時的に、ＣＨＯ細胞へと、ＯＣ−４００処理アセンブリを伴うＭａｘＣｙｔｅ  ＳＴＸ  Ｓｃａｌａｂｌｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを使用してトランスフェクトした。細胞を、トランスフェクションの１日後に３７℃から３２℃に温度推移させて、産生が７日目に終わるまで、毎日３．４％のＭａｘＣｙｔｅフィードを添加した流加培養物（ｂａｔｃｈ−ｆｅｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ）として維持した。表２は、例示的なＷｎｔ３Ａ変異体のトランスフェクションの詳細を例示する。
【０２５４】
【表２】
2020529845.tif 000004
【０２５５】
Ｈｉｓタグ付きタンパク質のＩＭＡＣ精製
【０２５６】
一時的な産生の実行からの調整培地を採取して、遠心分離および濾過により透明にした。上清をＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｍｅｔａｌ（ニッケル）Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙＩＭＡＣ）カラムに置き、結合緩衝液［例えば２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５００ｍＭのＮａＣｌ、１％のＣＨＡＰＳ］により予め平衡化した。洗浄緩衝液［例えば２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５００ｍＭのＮａＣｌ、１％のＣＨＡＰＳ］を、４０ｍＭのイミダゾールを含んだ状態で、ＯＤ２８０値（ＮａｎｏＤｒｏｐ，  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が０に近づくまでカラムに通した。標的タンパク質を、最大０．５Ｍに増大するイミダゾール濃度の直線濃度勾配により溶出した。溶出物を画分中に集めた。
【０２５７】
ＣＥ−ＳＤＳ解析
【０２５８】
溶出された画分各々のＣＥ−ＳＤＳ解析を、ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸＩＩ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して実行し、解析した。
【０２５９】
実施例２−Ｗｎｔ３ＡポリペプチドのＦｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質との共発現
Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）は可用性タンパク質であり、これは、ポリ−Ｇｌｙのリンカーを介してＩｇＧｌのＦｃ領域に結合されるＦｒｉｚｚｌｅｄ−８の最初の１５１のアミノ酸残基を含むものである。いくつかの例において、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質のＷｎｔ３Ａとの共発現は、Ｗｎｔ３Ａの発現を増大させ、Ｗｎｔ３Ａ凝集を減少させる。場合によっては、Ｗｎｔ３Ａ−Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８の複合体は、Ｗｎｔ３Ａを不活性化し、Ｗｎｔ３Ａを安定させる。複合体からのＦｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質の除去はＷｎｔ３Ａを再活性化する。
【０２６０】
図１は、外因性Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質（Ｆｚ−１５１−Ｆｃ）の存在下、あるいは、共発現されたＦｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質（Ｆｚ−１５１−Ｆｃ）の存在下でのＷｎｔ３Ａ発現の比較研究を例示する。レーン２に例示されるように、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質と共発現されたＷｎｔ３Ａの発現は、外因性Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質の存在下で、Ｗｎｔ３Ａ発現に比べて約５倍増大した。レーン１は、外因性Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質の存在下でのＷｎｔ３Ａの発現を示す。
【０２６１】
図２は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８融合タンパク質（Ｆｚ−１５１−Ｆｃ）の共発現がＷｎｔ３Ａ凝集を減少し、更にＷｎｔ３Ａ単量体の量を増大させることを示す。Ｗｎｔ３Ａポリペプチドを安定した細胞株から産生した。
【０２６２】
図３は、本明細書に記載される４つの典型的な精製戦略を例示する。
【０２６３】
図４は、戦略１の精製の詳細を例示する。図４Ａは、戦略１の典型的な精製スキームを示す。図４Ｂは、様々な画分の銀染色法を示す。条件は非還元条件である。図４Ｃは、様々な画分のウエスタンブロット解析によりＷｎｔ３Ａポリペプチドの存在および濃度を判定することを示す。図４Ｄは、ＬＳＬアッセイにおけるＷｎｔ３Ａポリペプチドの活性を例示する。
【０２６４】
図５は、戦略２の精製の詳細を例示する。図５Ａは、プロテインＡ画分のクマシー染色を例示する。図５Ｂは、様々な画分の銀染色法を示す。図５Ｃは、様々な画分のウエスタンブロット解析によりＷｎｔ３Ａポリペプチドの存在および濃度を判定することを示す。図５Ｄは、ＬＳＬアッセイにおけるＷｎｔ３Ａポリペプチドの活性を例示する。
【０２６５】
図６は、戦略３の精製の詳細を例示する。図６Ａは、様々な画分の銀染色法を示す。図６Ｂは、ＬＳＬアッセイにおけるＷｎｔ３Ａポリペプチドの活性を例示する。
【０２６６】
図７は、戦略４の精製の詳細を例示する。図７Ａは、プロテインＡ画分のクマシー染色を例示する。図７Ｂは、様々な画分の銀染色法を示す。図７Ｃは、ＬＳＬアッセイにおけるＷｎｔ３Ａポリペプチドの活性を例示する。
【０２６７】
実施例３−Ｗｎｔ３Ａポリペプチドのシャペロンとの共発現
Ｗｎｔｌｅｓｓは、機能的で脂質修飾されたＷｎｔポリペプチドに結合する細胞内シャペロンであり、ポリペプチドのゴルジ体から細胞表面への輸送に必要とされる。
【０２６８】
図８は、Ｗｎｔ３ＡポリペプチドのＷｎｔｌｅｓｓ（ＷＬＳ）との共発現を例示する。図８Ａは、共発現されたＷｎｔｌｅｓｓの存在下でのＷｎｔ３Ａ発現の増加を示す。図８Ｂは、ＬＳＬアッセイにおけるＷｎｔ３Ａポリペプチドの活性を示す。図８Ｃは、安定した細胞株におけるＷｎｔ３Ａの発現を示す。
【０２６９】
図９は、Ｗｎｔ３ＡのＡｆａｍｉｎとの共発現を例示する。いくつかの例において、Ａｆａｍｉｎの共発現はＷｎｔ３Ａ濃度を約１０％増大させる。
【０２７０】
実施例４−タグ付きＷｎｔ３Ａポリペプチドの発現と産生
図１０は、ＰＡ、ＦＬＡＧ、およびＨｉｓのタグそれぞれによりタグ付けされた３つの典型的なＷｎｔ３Ａポリペプチドの発現および活性を例示する。図１０Ａは、分泌されたタグ付きＷｎｔ３Ａポリペプチドの濃度を例示する。図１０Ｂは、ＬＳＬアッセイにおけるＷｎｔ３Ａポリペプチドの活性を示す。
【０２７１】
図１１は、異なるＨｉｓタグ−リンカー構築物を含むＷｎｔ３Ａ変異体（ΑΚΤ３５２ｈｉｓ変異体）の活気を示す。
【０２７２】
図１２は、Ｎｉ−ＮＴＡカラムからのＷｎｔ３Ａ変異体−ＡＲＴ３５２ｈｉｓの様々な画分の活性を示す。
【０２７３】
図１３−１５は、Ｎ末端タグ付きＷｎｔ３Ａポリペプチドの発現および産生を示す。図１３−１５に関する本明細書で使用されるＷｎｔ３Ａポリペプチド構築物は次のとおりである：
【０２７４】
ＴＴ６０９３：ＰＡ−ＴＥＶ−Ｗｎｔ３Ａ
【０２７５】
ＴＴ６０９４：ＦＬＡＧ−ＴＥＶ−Ｗｎｔ３Ａ
【０２７６】
ＴＴ６０９５：Ｈｉｓ−ＴＥＶ−Ｗｎｔ３Ａ
【０２７７】
ＴＴ６０９６：Ｗｎｔ３Ａ
【０２７８】
調整培地を７日目に採取した。
【０２７９】
図１３Ａ−図１３Ｃは、ＥＬＩＳＡアッセイにおけるＮ末端タグ付きＷｎｔ３Ａポリペプチドの濃度を例示する。
【０２８０】
図１４は、ＦＬＡＧタグ付きＷｎｔ３Ａポリペプチド：ＦＬＡＧ−ＴＥＶ−ｈＷｎｔ３Ａの精製に対する精製スキームを例示する。ＣＨＯ細胞を一時的に、４０ｍＬの調整培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａ）においてトランスフェクトした。ＣＨＡＰＳを、１％の最終濃度での調整培地に添加した。その後、その溶液を０．２５ｍＬのＨＭ２−アガロースカラムに載せ、１Ｘ  ＰＢＳの緩衝液および１％のＣＨＡＰＳ中に１００μｇ／ｍＬのＦＬＡＧペプチドを含む溶出緩衝液の５つのカラム容量により溶離させた。
【０２８１】
図１５は、ＦＬＡＧタグ付きＷｎｔ３Ａポリペプチドの活性および濃度を示す。図１５Ａ−図１５Ｃは、ＬＳＬアッセイにおけるＷｎｔ３Ａポリペプチドの活性を示す。図１５Ｄ−図１５ＦはＷｎｔ３Ａポリペプチドの濃度を示す。
【０２８２】
実施例５−２つの異なる培養容量におけるＷｎｔ３Ａポリペプチドの精製
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２を含むＷｎｔ３Ａを、０．７５Ｌの培養物または１０Ｌの培養物の何れかから精製した。調整培地を最初に、５ｍＬのＢｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム上に置き、その後、ヘパリンカラムを用いて精製した。図１６は、０．７５Ｌの培養物から培養されたＷｎｔ３Ａの活性を示す。図１７は、１０Ｌの培養物から培養されたＷｎｔ３Ａの活性および濃度を示す。
【０２８３】
実施例６−典型的な糖界面活性剤ＯＧＰによるＷｎｔ３Ａポリペプチドの精製
この実験において、典型的な糖界面活性剤ＯＧＰを、リポソームによるインキュベーション前に、Ｗｎｔタンパク質に対する競合アンタゴニストと安定化剤の両方として利用した。ＯＧＰは、本明細書ではｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ＯＧ、Ｃ８Ｇｌｃ、オクチル−β−グルコシド、オクチル−β−グルコピラノシド、またはｎ−オクチル−ｐ−Ｄ−グルコピラノシドとも称されており、ヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ５受容体のシステインが豊富なドメイン（ＣＲＤ）と相互に作用すると示された非イオン性界面活性剤である。この研究において、ＯＧＰは、Ｗｎｔポリペプチド複合体の精製中に融合Ｆｒｉｚｚｌｅｄ８タンパク質とのＷｎｔの結合を排除し（ｏｕｔ−ｃｏｍｐｅｔｅ）、同時に精製中にＷｎｔポリペプチドを安定させることができると示された。
【０２８４】
ＣＨＯ細胞を操作して、典型的な先細りのＷｎｔ３Ａポリペプチド、およびＦｃタグ付きＣＲＤドメイン（ｈＦＺＤ８  ＣＲＤ−Ｆｃ）を含む修飾されたヒトＦｒｉｚｚｌｅｄ８タンパク質を共発現した。分泌されたＷｎｔ３Ａポリペプチドは、ｈＦＺＤ８  ＣＲＤ−Ｆｃとの可溶性複合体を形成する。活性は、ＬＳＬ細胞ベースのアッセイに基づいて、複合体中のＷｎｔ３Ａポリペプチドに対して検出されなかった（図１８）。
【０２８５】
精製スキームを図１９に例示する。簡潔に言えば、Ｗｎｔ３Ａポリペプチド−ｈＦＺＤ  ８  ＣＲＤ−Ｆｃの複合体を、調整培地から採取して、第１のプロテインＡカラム上に載せた。溶出緩衝液のｐＨは約４．０未満である。第１のプロテインＡカラムからの溶出物を、約１％のＯＧＰを含む緩衝液によりインキュベートした。その後、インキュベートされた溶出物をＢｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム上に載せて、Ｗｎｔ３ＡポリペプチドからｈＦＺＤ  ８  ＣＲＤ−Ｆｃを分離した。０．８−２ＭのＮａＣｌの線形勾配（更に約１％のＯＧＰを含む溶出緩衝液における）を使用して、Ｗｎｔ３Ａポリペプチドを集めた。Ｗｎｔ３Ａポリペプチドを更に第２のプロテインＡカラムにさらして、その後、混合モードカラムおよびサイズ排除クロマトグラフィーカラムを共に用いて、精製Ｗｎｔ３Ａポリペプチドを生成した。
【０２８６】
ＣＨＡＰＳを対照として使用した。
【０２８７】
図２０Ａ−図２０Ｂは、１％のＣＨＡＰＳまたは１％のＯＧＰの何れかによるＷｎｔ３Ａ精製の典型的なゲル画像を示す。図２０Ｂに示されるように、ＣＨＡＰＳのＯＧＰへの置換は、図２０Ａに比べて、Ｗｎｔ３Ａ（ＡＲＴ３５２）−ＦＺＤ複合体のより効率的な分離を可能とする。更に、ＯＧＰを含むことで、一旦ＦＺＤとの相互作用から放たれた場合にＷｎｔ３Ａ（ＡＲＴ３５２）を安定させる。
【０２８８】
図２１Ａ−図２１Ｂは、１％のＯＧＰ（図２１Ａ）または１％のＣＨＡＰＳ（図２１Ｂ）におけるＷＮＴ３Ａ（ＡＲＴ３５２）溶出物のＬＳＬ活性を例示する。
【０２８９】
図２２は、混合モードカラムによる精製の典型的なゲル画像を例示する。Ｗｎｔ３Ａ溶出物の純度は約９０％より大きかった。
【０２９０】
図２３Ａ−図２３Ｂは、１％のＣＨＡＰＳまたは１％のＯＧＰの何れかを含む緩衝液により精製されたＷｎｔ３Ａポリペプチドを例示する。不純物は、１％のＣＨＡＰＳ（図２３Ａ）を含む緩衝液により精製されたＷｎｔ３Ａポリペプチドを含む溶液において、１％のＯＧＰ（図２３Ｂ）を含む緩衝液よりも多く観察された。
【０２９１】
図２４Ａ−図２４Ｂは、ＯＧＰがＷＮＴ３Ａタンパク質を、２つの異なる温度、４℃（図２４Ａ）および２３℃（図２４Ｂ）においてＣＨＡＰＳに比べて安定させることを例示する。
【０２９２】
図２５は典型的なリポソームのＷｎｔ３Ａ製剤プロセスを説明する。
【０２９３】
実施例７−２つの異なるＷｎｔ３Ａ製造プロセスの比較
Ｗｎｔ３Ａおよび典型的なＷｎｔ３ＡポリペプチドＡＲＴ３５２に対する製造プロセスを比較した。表３は、それぞれのＷｎｔ３Ａポリペプチドの製造の詳細を例示する。
【０２９４】
【表３】
2020529845.tif 000005
【０２９５】
表４は、Ｌ−Ｗｎｔ３Ａおよび典型的なリポソームＷｎｔ３ＡポリペプチドＡＲＴ３５２−Ｌの製造の詳細を示す。
【０２９６】
【表４】
2020529845.tif 000006
【０２９７】
表５は、２つのプロセスの効力および純度における差異を例示する。
【０２９８】
【表５】
2020529845.tif 000007
【０２９９】
実施例８−効力の判定
効力の計算
【０３００】
ルシフェリンのオキシルシフェリンへの変換をルシフェラーゼ酵素によって行い、この反応により放たれたエネルギーのほぼ全てが、プレートリーダーにより検出される光の形をとる。ルシフェラーゼの発現がＴＣＦ／ＬＥＦ結合部位の制御下にあるため、ルシフェラーゼの発現はＷｎｔ活性に比例する。
【０３０１】
４−パラメータ・ロジスティック曲線あてはめプログラム（４−ｐａｒａｍｅｔｅｒ  ｌｏｇｉｓｔｉｃ  ｃｕｒｖｅ−ｆｉｔｔｉｎｇ  ｐｒｏｇｒａｍ）を使用して、標準曲線を、μｇ／ｍＬで表したＡＲＴ３５２（ｘ）濃度に対して相対的な発光ユニット（ＲＬＵ）によって生成する：
【０３０２】
ここで：ｘ＝独立変数、即ち投与量
【０３０３】
Ａ＝左漸近線
【０３０４】
Ｂ＝湾曲勾配（ｃｕｒｖａｔｕｒｅ  ｈｉｌｌ  ｓｌｏｐｅ）
【０３０５】
Ｃ＝有効な濃度であり、それにおいて薬物が最大の反応（ＥＣ５０）（μｇ／ｍＬ）の２分の１をもたらす
【０３０６】
Ｄ＝右漸近線
【０３０７】
対照およびサンプルに対する特異的な効力の割合を、以下の式を使用して算出する：
【０３０８】
【数１】
2020529845.tif 000008
【０３０９】
ここで：ＥＣ５０＝最大の有効な濃度の２分の１
【０３１０】
典型的なＷｎｔ３ＡポリペプチドＡＲＴ３５２およびリポソームＷｎｔ３ＡポリペプチドＡＲＴ３５２−Ｌの効力を、サンプルの読み出しと参照標準（以下の参照標準のセクションを参照）の読み出しとを比較することにより定めて、既知の濃度で試験する。０．００３−１．６μｇ／ｍＬの範囲における代表的な標準曲線を図２６に示す。
【０３１１】
ＷＮＴ３Ａ／Ｌ−ＷＮＴ３ＡおよびＡＲＴ３５２／ＡＲＴ３５２−Ｌに対する効力の結果を表６において比較する。
【０３１２】
【表６】
2020529845.tif 000009
【０３１３】
ＧＭＰプロセスの仕上げ前の製造プロセスの進行中に、ＡＲＴ３５２−Ｌの第１の５０Ｌバッチを、第２の５０Ｌバッチと比較して最適以下のプロセスを使用して製造した。結果として、第１のバッチのＡＲＴ３５２およびＡＲＴ３５２−Ｌは、第２のバッチから精製されたＡＲＴ３５２およびＡＲＴ３５２−Ｌから生じる対応する結果に比べて低い効力を示した。これらのデータは、ＬＳＬアッセイが効力における有意なバッチ間の差異を検出するのに適切に敏感であったことを示した。
【０３１４】
実施例９−自家移植片の処置および取り扱いのプロセス進行
自家移植片における細胞生存率に対する溶液条件および温度の効果
【０３１５】
自家移植片を腸骨稜から採取した。アポトーシスに対するベースラインを確立するために、自家移植片の部分集合を直ちに、ＴＵＮＥＬ染色のために処理した（白色バー、図２７）。これは、０のエクスビボ時点を表わした。
【０３１６】
残りの自家移植片を、生理食塩水、またはＡＲＴ３５２−Ｌを含有する生理食塩水（有効な濃度＝０．５ｎｇ／μＬ）に入れた。自家移植片を、エクスビボ保持の最大持続時間、例えば２時間にわたりインキュベートし、且つ最高温度、例えば３７℃を利用した。細胞生存率およびアポトーシスを、Ａｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ，  “Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，”  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３７（４）：２１５−２２８  （１９９７）；およびＫａｐｕｓｃｉｎｓｋｉ，  Ｊ．  “Ｄａｐｉ：  Ａ  ＤＮＡ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｂｅ，”  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃ  ＆  ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｉｎ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ．  ７０（５）：２２０−２３３  （１９９５）にそれぞれ記載されるようなＴＵＮＥＬおよびＤＡＰＩを使用して定量化した。これらの試験は以下を示す：
【０３１７】
−対照自家移植片とゼロ時点にて比較して、生理食塩水中に３７℃で２時間保持された自家移植片は、著しく多くの死細胞を示した（図２７）。
【０３１８】
−生理食塩水中に３７℃で２時間保持された自家移植片におけるアポトーシスの程度と比較して、ＡＲＴ３５２−Ｌにより処置した自家移植片は、同じ条件下で保持され、著しく少ない死細胞を示した（図２７）。
【０３１９】
採取して直ちに分析された自家移植片（例えば、ゼロ時点サンプル）を、ＴＵＮＥＬのための陰性対照として使用した。残りの自家移植片を採取して、その後、生理食塩水中に４℃、２３℃、または３７℃で、５分間、または６０分間入れた。細胞生存率の定量化を、トリパンブルー色素排除により行った（図２８）。２３℃で保持されたサンプルをＴＵＮＥＬのための陽性対照として使用した。自家移植片を生理食塩水に入れた。これらのデータは以下を示す：
【０３２０】
−採取の時点での細胞生存率は、ゼロ時点、即ちベースライン条件を表した（白色バー、図２８）。
【０３２１】
−自家移植片を４℃で５分間保持することで、ゼロ時点で観察された壊死の量は２４％増大する（図２８）。
【０３２２】
−自家移植片を２３℃で保持することで、ゼロ時点で観察された壊死細胞の数がおよそ２倍になる（図２８）。２３℃の保持温度も、４℃の保持温度と比較して壊死細胞の数を大幅に増大させる（図２８）。
【０３２３】
−自家移植片を３７℃で保持することで、ゼロ時点で観察された壊死細胞の数がおよそ３倍になる（図２８）。３７℃の保持温度も、４℃の保持温度と比較して壊死細胞の数を大幅に増大させる（図２８）。
【０３２４】
エンドサイトーシスによる栄養摂取に対する時間、温度、および溶液条件の併用効果
【０３２５】
エンドサイトーシスによる栄養摂取をモニタリングおよび定量化するために、自家移植片を採取し、骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）を、標準プロトコルを使用して単離した。試験前に、ＢＭＳＣを培地から取り除き、洗浄し、その後、ＡＲＴ３５２−Ｌ（０．８ｎｇ／μＬ）により処置した。リポソームに脂肪好性蛍光染料、ＤｉＩをタグ付けし、それらの分布を追跡した。
【０３２６】
その後、ＡＲＴ３５２−Ｌにより処置されたＢＭＳＣを、２３℃または３７℃のいずれかで、１５−１２０分間、例えばエクスビボインキュベーション工程の提唱された期間にわたり保持した。これらのデータは以下を実証する：
【０３２７】
−蛍光標識されたリポソーム、即ちＡＲＴ３５２−Ｌの摂取は時間に応じて増大する（図２９）。
【０３２８】
−蛍光標識されたリポソームの摂取の速度は温度に応じて増大する；例えば、２３℃での線の勾配＝１１４２．３、および３７℃での線の勾配＝２７９２．９（図２９）。
【０３２９】
これらのデータは、エクスビボ保持期間の意図した持続時間にわたり、３７℃でのインキュベーションが、エンドサイトーシスによる栄養摂取を２３℃のインキュベーション温度よりも優れて支持することを示唆している。次の実験は、薬物製品ＡＲＴ３５２−Ｌが、インキュベーション温度が３７℃に設定された場合にエクスビボ保持期間の意図した持続時間にわたり安定したかどうかを試験した。
【０３３０】
時間および温度に応じたリポソームＷｎｔ３ａポリペプチドＡＲＴ３５２−Ｌの安定性
【０３３１】
ＡＲＴ３５２−Ｌの安定性の評価を、３７℃で、エクスビボインキュベーション工程の関連時間経過、例えば１５分〜２時間にわたり行った。４℃でのＡＲＴ３５２−Ｌの安定性を陽性対照として使用した。安定性評価からの結果は、非ＧＬＰ  ＡＲＴ３５２−Ｌにより実施された安定性試験からの回帰分析によって判定されるように、ＡＲＴ３５２−Ｌが、４℃で２時間維持された場合に、活性における検出可能な変化を示さなかったことを示している（図３０）。
【０３３２】
ＡＲＴ３５２−Ｌは、３７℃で２時間維持された場合に活性において４．９％の変化を示す（図３０）。それ故、エクスビボインキュベーション工程の意図した持続時間、例えば１５分〜２時間にわたり、ＡＲＴ３５２−Ｌは、活性の損失が最小であったことを示す。これらのデータは、３７℃の保持温度が使用される自家移植片取り扱い手順の進行を支援する。
【０３３３】
エンドサイトーシスによるインキュベーション溶液からの活性ＡＲＴ３５２−Ｌ除去の速度を評価する試験
【０３３４】
ＡＲＴ３５２−Ｌを自家移植片中の細胞により形質膜陥入し、結果として、ＡＲＴ３５２−Ｌ活性はインキュベーション溶液からなくなった。エクスビボインキュベーション溶液からのＡＲＴ３５２−Ｌの濃度の低下の速度を、時間および温度に応じてモニタリングした。
【０３３５】
自家移植片のアリコートを、ＡＲＴ３５２−Ｌにおいて、示された温度で、示された時間にわたりインキュベートした。期間の終わりに、自家移植片のアリコートをインキュベーション溶液から取り除き、ＬＳＬアッセイを使用して、インキュベーション溶液に残る活性ＡＲＴ３５２−Ｌを検出した。
【０３３６】
骨移植片が含まれていない場合、初期のＡＲＴ３５２−Ｌ活性の１００％がインキュベーション溶液に留まる（図３１）。自家移植片がインキュベーション溶液に含まれる場合、４℃で１５分のインキュベーション後、初期のＡＲＴ３５２−Ｌ活性の大部分（６８％）がインキュベーション溶液に留まる（図３１）。２３℃で１５分のインキュベーション後、初期のＡＲＴ３５２−Ｌ活性の５６％がインキュベーション溶液に留まる（図３１）。
【０３３７】
３７℃の意図した標的温度で１５分のインキュベーション後、初期のＡＲＴ３５２−Ｌ活性の２４％がインキュベーション溶液に留まる（図３１）。３０分間のインキュベーション後、元のＡＲＴ３５２−Ｌ活性の６％が留まる（図３１）。６０分後、インキュベーション溶液に留まる活性ＡＲＴ３５２−Ｌの量は２％である（図３１）。
【０３３８】
ＡＲＴ３５２−Ｌにより処置した自家移植片の評価
【０３３９】
ＬＳＬ細胞ベースのアッセイを利用して、残存する遊離した活性ＡＲＴ３５２−ＬがＡＲＴ３５２−Ｌにより処置した自家移植片に関連付けられるかどうかを検出した。陽性対照および陰性対照をこの一連の実験に使用した。陰性対照は、空の発現ベクターを運ぶＣＨＯ−Ｋ１株で構成される（図３２）。陽性対照は、ＡＲＴ３５２発現ベクターを運ぶ同じＣＨＯ−Ｋ１株で構成される（図３２）。ＣＨＯ−Ｋ１の空のベクター細胞において検出されたＷｎｔ活性のレベルを、ベースラインとして確立した（図３２）。
【０３４０】
自家移植片を成体ラットから採取し、ＡＲＴ３５２−Ｌにより処置し（有効な濃度＝０．８６μｇ／ｍＬ）、その後、１５分間、３０分間、または６０分間、４℃（青色バー）、２３℃（緑色バー）、または３７℃でインキュベートした（図３２）。示されたエクスビボ保持期間の後、ＡＲＴ３５２−Ｌ自家移植片をＬＳＬ細胞上に配して、１８時間インキュベートし、その後、ルシフェラーゼ発現レベルを定量化した。
【０３４１】
図３２に示されるように、残存する遊離した活性ＡＲＴ３５２−Ｌは、あらゆるＡＲＴ３５２−Ｌにより処置した自家移植片に関連付けられるとは見出されなかった。
【０３４２】
インキュベーション溶液からの活性ＡＲＴ３５２−Ｌの時間依存的および温度依存的な除去、および自家移植片由来の細胞によるエンドサイトーシス取込み
【０３４３】
２つの定量分析を実行して、インキュベーション溶液からの残りの遊離した活性のＡＲＴ５３２−Ｌの除去の速度を評価し、且つ、自家移植片中の細胞によりＡＲＴ３５２−Ｌエンドサイトーシスの速度を評価した。
【０３４４】
−インキュベーション溶液からの遊離した活性のＡＲＴ３５２−Ｌの除去を測定するために、自家移植片を採取し、ＡＲＴ３５２−Ｌ（有効な濃度＝０．８６ｎｇ／μＬ）を含むインキュベーション溶液中に直ちに入れた。インキュベーション溶液中の自家移植片を２３℃または３７℃の何れかにおいて保持した。１５分、３０分、および６０分後、様々なインキュベーション溶液のアリコートを除去し、ＬＳＬアッセイを使用してＡＲＴ３５２−Ｌ活性に対して試験した。
【０３４５】
−自家移植片中の細胞によりＡＲＴ３５２−Ｌエンドサイトーシスの速度を評価するために、自家移植片を採取し、ＢＭＳＣを標準処置後に単離した。細胞数を標準化し、その後ウェルを、蛍光脂肪好性染料であるＤｉＩでタグ付けしたＡＲＴ３５２−Ｌにより処置した。細胞を２３℃または３７℃の何れかにおいて保持した。１５分、３０分、６０分、および１２０分後、細胞は小球状になり、ＰＢＳ中で懸濁させ、その後、プレートリーダーを使用して蛍光シグナルを定量化した。
【０３４６】
これらデータは、インキュベーション溶液からのＡＲＴ３５２−Ｌの、自家移植片の細胞への移動が、時間と温度に応じることを実証した（図３３）。
【０３４７】
実施例１０
以下の表７は、本出願に開示された配列を例示する。
【０３４８】
【表７−１】
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【０３４９】
【表７−２】
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【０３５０】
【表７−３】
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【０３５１】
【表７−４】
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【０３５２】
【表７−５】
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【０３５３】
本開示の好ましい実施形態が本明細書で示され記載されてきたが、こうした実施形態はほんの一例として提供されているに過ぎないということは当業者にとって明白である。多数の変形、変更、および置き換えは、本開示から逸脱することなく、当業者によって現在想到されるものである。本明細書に記載される開示の実施形態の様々な代案が、本開示の実施において利用されるかもしれないことを理解されたい。以下の特許請求の範囲は本開示の範囲を定義するものであり、これら特許請求の範囲およびその同等物の範囲内の方法および構造は、それにより包含されることが、意図されている。
【図１】
2020529845.tif 000015
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
2020529845.tif 000036
【図１０Ｂ】
2020529845.tif 000037
【図１１】
2020529845.tif 000038
【図１２】
2020529845.tif 000039
【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
2020529845.tif 000041
【図１３Ｃ】
2020529845.tif 000042
【図１４】
2020529845.tif 000043
【図１５Ａ】
2020529845.tif 000044
【図１５Ｂ】
2020529845.tif 000045
【図１５Ｃ】
2020529845.tif 000046
【図１５Ｄ】
2020529845.tif 000047
【図１５Ｅ】
2020529845.tif 000048
【図１５Ｆ】
2020529845.tif 000049
【図１６Ａ】
2020529845.tif 000050
【図１６Ｂ】
2020529845.tif 000051
【図１６Ｃ】
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【図１７Ａ】
2020529845.tif 000053
【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１７Ｆ】
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【図１８】
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【図１９】
2020529845.tif 000060
【図２０Ａ】
2020529845.tif 000061
【図２０Ｂ】
2020529845.tif 000062
【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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