(57)【要約】  本発明は、ゲノムサイトの可視化標識方法及びその細胞と生体の老化レベル検出への応用を開示する。本発明は、転写活性化様エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質のＣ端にチオレドキシンＴＲＸを融合することで、ゲノム可視化標識ツールＴＴＡＬＥを構築し、異なるヒト細胞においてテロメア、セントロメア、ｒＤＮＡなどのゲノム反復配列を標識し、遺伝子座をコードすることに用いられる。本発明はさらに、ヒト細胞ゲノムにおけるｒＤＮＡコピー数を検出し、被検細胞又は生体の老化レベルを検出又は補助的に検出するためのキット及び方法を開示する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の１）〜８）のいずれかであるゲノムサイトの可視化標識のためのキット。
１）ゲノムの標的配列を認識又は結合するための転写活性化様エフェクタータンパク質ＴＡＬＥとチオレドキシンＴＲＸとを含有する融合タンパク質を含む。
２）ゲノムの標的配列を認識又は結合するための転写活性化様エフェクタータンパク質ＴＡＬＥと、蛍光タンパク質とチオレドキシンＴＲＸとを含有する融合タンパク質を含む。
３）ゲノムの標的配列を認識又は結合するための転写活性化様エフェクタータンパク質ＴＡＬＥとチオレドキシンＴＲＸとを含有するタンパク質組成物を含む。
４）ゲノムの標的配列を認識又は結合するための転写活性化様エフェクタータンパク質ＴＡＬＥと、蛍光タンパク質とチオレドキシンＴＲＸとを含有するタンパク質組成物を含む。
５）前記融合タンパク質をコードするＤＮＡ分子。
６）前記タンパク質組成物中のタンパク質をコードするＤＮＡ分子を含むＤＮＡ分子組成物。
７）１）又は２）に記載の融合タンパク質を発現させるベクターを含む。
８）前記タンパク質組成物中のタンパク質を発現させるベクターを含むベクター組成物。
【請求項２】
前記標的配列がテロメアＤＮＡ、セントロメアＤＮＡ、核小体形成領域リボソームＲＮＡコーディング遺伝子又はＭＵＣ４タンパク質コーディング遺伝子であり、
あるいは、前記テロメアＤＮＡの標的配列が配列番号１４であり、
あるいは、前記セントロメアＤＮＡの標的配列が配列番号１５であり、
あるいは、前記核小体形成領域リボソームＲＮＡコーディング遺伝子の標的配列が配列番号１６であり、
あるいは、前記ＭＵＣ４タンパク質コーディング遺伝子の標的配列が配列番号１７であることを特徴とする、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
ゲノム中の前記テロメアＤＮＡの標的配列を認識又は結合するための融合タンパク質がａ１）又はａ２）である、
ａ１）核局在配列、ゲノム中のテロメアＤＮＡの標的配列を認識又は結合するための転写活性化様エフェクタータンパク質ＴＡＬＥ、及びチオレドキシンＴＲＸを融合させて得られるタンパク質
ａ２）核局在配列、ゲノム中のテロメアＤＮＡの標的配列を認識又は結合するための転写活性化様エフェクタータンパク質ＴＡＬＥ、蛍光タンパク質、及びチオレドキシンＴＲＸを融合させて得られるタンパク質
あるいは、ゲノム中の前記セントロメアＤＮＡの標的配列を認識又は結合するための融合タンパク質がａ３）又はａ４）である、
ａ３）核局在配列、ゲノム中のセントロメアＤＮＡの標的配列を認識又は結合するための転写活性化様エフェクタータンパク質ＴＡＬＥ、及びチオレドキシンＴＲＸを融合させて得られるタンパク質
ａ４）核局在配列、ゲノム中のセントロメアＤＮＡの標的配列を認識又は結合するための転写活性化様エフェクタータンパク質ＴＡＬＥ、蛍光タンパク質、及びチオレドキシンＴＲＸを融合させて得られるタンパク質
あるいは、ゲノム中の前記核小体形成領域リボソームＲＮＡコーディング遺伝子の標的配列を認識又は結合するための融合タンパク質が、核局在配列、ゲノム中の核小体形成領域リボソームＲＮＡコーディング遺伝子の標的配列を認識又は結合するための転写活性化様エフェクタータンパク質ＴＡＬＥ、蛍光タンパク質、及びチオレドキシンＴＲＸを融合させて得られるタンパク質である、
あるいは、ゲノム中のＭＵＣ４タンパク質コーディング遺伝子の標的配列を認識又は結合するための融合タンパク質が、核局在配列、ゲノム中のＭＵＣ４タンパク質コーディング遺伝子の標的配列を認識又は結合するための転写活性化様エフェクタータンパク質ＴＡＬＥ、蛍光タンパク質、及びチオレドキシンＴＲＸを融合させて得られるタンパク質であることを特徴とする、請求項２に記載のキット。
【請求項４】
前記蛍光タンパク質がＥＧＦＰタンパク質又はｍＣｈｅｒｒｙタンパク質であり、
前記ａ１）に記載の融合タンパク質のアミノ酸配列が配列番号４であり、
前記ａ２）に記載の融合タンパク質のアミノ酸配列が配列番号７であり、
前記ａ３）に記載の融合タンパク質のアミノ酸配列が配列番号５であり、
前記ａ４）に記載の融合タンパク質のアミノ酸配列が配列番号８であり、
ゲノム中の前記核小体形成領域リボソームＲＮＡコーディング遺伝子の標的配列を認識又は結合するための融合タンパク質のアミノ酸配列が配列番号１０であり、
ゲノム中の前記ＭＵＣ４タンパク質コーディング遺伝子の標的配列を認識又は結合するための融合タンパク質のアミノ酸配列が配列番号１２であることを特徴とする、請求項３に記載のキット。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のキット又は請求項１〜４のいずれか一項に記載のキット中の融合タンパク質又は請求項１〜４のいずれか一項に記載のキット中のタンパク質組成物のゲノム可視化への応用、
あるいは、請求項１〜４のいずれか一項に記載のキット又は請求項１〜４のいずれか一項に記載のキット中の融合タンパク質又は請求項１〜４のいずれか一項に記載のキット中のタンパク質組成物のゲノム可視化製品の製造への応用。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のキット又は請求項１〜４のいずれか一項に記載のキット中の融合タンパク質又は請求項１〜４のいずれか一項に記載のキット中のタンパク質組成物の以下のｂ１）〜ｂ１４）のいずれかへの応用。
ｂ１）ゲノムサイトの可視化標識
ｂ２）ゲノムサイトの可視化標識製品の製造
ｂ３）細胞ゲノムにおけるテロメアの可視化標識
ｂ４）細胞ゲノムにおけるテロメアの可視化標識製品の製造
ｂ５）細胞ゲノムにおけるセントロメアの可視化標識
ｂ６）細胞ゲノムにおけるセントロメアの可視化標識製品の製造
ｂ７）細胞ゲノムにおける核小体形成領域リボソームＲＮＡの可視化標識
ｂ８）細胞ゲノムにおける核小体形成領域リボソームＲＮＡの可視化標識製品の製造
ｂ９）細胞ゲノムにおけるＭＵＣ４コーディング遺伝子サイトの可視化標識
ｂ１０）細胞ゲノムにおけるＭＵＣ４コーディング遺伝子サイトの可視化標識製品の製造
ｂ１１）細胞分裂の異なる時期のテロメア又はセントロメアの動的変化の可視化検出
ｂ１２）細胞分裂の異なる時期のテロメア又はセントロメアの動的変化の可視化検出製品の製造
ｂ１３）テロメアの異なる細胞老化モデルでの動的変化の可視化検出
ｂ１４）テロメアの異なる細胞老化モデルでの動的変化の可視化検出製品の製造
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のキット中の融合タンパク質又は請求項１〜４のいずれか一項に記載のキット中のタンパク質組成物のゲノムの可視化ツールとしての応用。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のキット中の融合タンパク質又は請求項１〜４のいずれか一項に記載のキット中のタンパク質組成物をコードするＤＮＡ分子のゲノムの可視化ツールの製造への応用。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のキット中の融合タンパク質又は請求項１〜４のいずれか一項に記載のキット中の前記融合タンパク質を発現させるベクターを細胞に導入し、細胞のゲノムサイトの可視化を実現することを含む、ゲノムサイトの可視化標識方法。
【請求項１０】
前記細胞はヒト又は動物細胞である
ことを特徴とする請求項６に記載の応用又は請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
被検細胞又は生体におけるｒＤＮＡのコピー数を検出する物質の、被検細胞又は生体の老化レベルの検出又は補助検出への応用、
あるいは、被検細胞又は生体におけるｒＤＮＡのコピー数を検出する物質の、被検細胞又は生体の老化レベルの検出又は補助検出製品の製造への応用。
【請求項１２】
被検細胞又は生体におけるｒＤＮＡのコピー数を検出する物質の、被検細胞又は生体におけるテロメアのコピー数の検出又は補助検出への応用、
あるいは、被検細胞又は生体におけるｒＤＮＡのコピー数を検出する物質の、被検細胞又は生体におけるテロメアのコピー数の検出又は補助検出製品の製造への応用。
【請求項１３】
前記被検細胞又は生体におけるｒＤＮＡのコピー数を検出する物質が、プライマー１とプライマー２からなるプライマー対又はプローブ又は請求項３に記載のゲノム中の前記核小体形成領域リボソームＲＮＡコーディング遺伝子の標的配列を認識又は結合するための融合タンパク質であり、
前記プライマー１が以下のａ１）又はａ２）であり、
ａ１）配列番号１８に示される一本鎖ＤＮＡ分子
ａ２）ａ１）で限定される一本鎖ＤＮＡ分子に一つ以上の塩基を欠失、挿入及び／又は変化させて得られる、ａ１）で限定される一本鎖ＤＮＡ分子と同じ機能を有する一本鎖ＤＮＡ分子
前記プライマー２が以下のｂ１）又はｂ２）であり、
ｂ１）配列番号１９に示される一本鎖ＤＮＡ分子
ｂ２）ｂ１）で限定される一本鎖ＤＮＡ分子に一つ以上の塩基を欠失、挿入及び／又は変化させて得られる、ｂ１）で限定される一本鎖ＤＮＡ分子と同じ機能を有する一本鎖ＤＮＡ分子
前記プローブが以下のｃ１）又はｃ２）である、
ｃ１）配列番号２０に示される一本鎖ＤＮＡ分子
ｃ２）ｃ１）で限定される一本鎖ＤＮＡ分子に一つ以上の塩基を欠失、挿入及び／又は変化させて得られる、ｃ１）で限定される一本鎖ＤＮＡ分子と同じ機能を有する一本鎖ＤＮＡ分子
ことを特徴とする請求項１１又は１２に記載の応用。
【請求項１４】
被検細胞又は生体におけるｒＤＮＡのコピー数を検出する物質を含む、被検細胞又は生体の老化レベルを検出又は補助的に検出するキット。
【請求項１５】
前記キットはさらに、以下の判断基準Ａが記載されている可読キャリアＡ１）又はＡ２）を含むことを特徴とする、請求項１４に記載のキット。
Ａ１）ｒＤＮＡコピー数が高い細胞又は生体はｒＤＮＡコピー数が低い細胞又は生体よりも老化レベルが低い。
Ａ２）ｒＤＮＡコピー数が高ければ高くなるほど、細胞又は生体の老化レベルが低くなる。
【請求項１６】
被検細胞又は生体におけるｒＤＮＡのコピー数を検出する物質を含む、被検細胞又は生体におけるテロメアのコピー数を検出又は補助的に検出するキット。
【請求項１７】
前記キットはさらに、以下の判断基準Ｂが記載されている可読キャリアＢ１）又はＢ２）を含むことを特徴とする請求項１６に記載のキット。
Ｂ１）ｒＤＮＡコピー数が高い細胞又は生体はｒＤＮＡコピー数が低い細胞又は生体よりもテロメアコピー数が低い。
Ｂ２）ｒＤＮＡコピー数が高ければ高くなるほど、細胞又は生体におけるテロメアのコピー数が高くなる。
【請求項１８】
前記被検細胞又は生体におけるｒＤＮＡのコピー数を検出する物質は、以下のＸ１）〜Ｘ６）であることを特徴とする請求項１４〜１７のいずれか一項に記載のキット。
Ｘ１）配列表における配列番号１８に示される一本鎖ＤＮＡ分子と配列表における配列番号１９に示される一本鎖ＤＮＡ分子からなるプライマー対Ａ
Ｘ２）配列Ｃに示される一本鎖ＤＮＡ分子と配列Ｄに示される一本鎖ＤＮＡ分子からなるプライマー対Ｂ
前記配列Ｃは、配列番号１８に一つ以上のヌクレオチドを削除又は増加又は変化させ、且つ配列番号１８と同じ機能を有するヌクレオチドである。
前記配列Ｄは、配列番号１９に一つ以上のヌクレオチドを削除又は増加又は変化させ、且つ配列番号１９と同じ機能を有するヌクレオチドである。
Ｘ３）配列表における配列番号２０に示される一本鎖ＤＮＡ分子
Ｘ４）配列Ｅに示される一本鎖ＤＮＡ分子
前記配列Ｅは、配列番号２０に一つ以上のヌクレオチドを削除又は増加又は変化させ、且つ配列番号２０と同じ機能を有するヌクレオチドである。
Ｘ５）Ｘ１）に記載のプライマー対Ａ又はＸ２）に記載のプライマー対Ｂ又はＸ３）に記載の一本鎖ＤＮＡ分子又はＸ４）に記載の一本鎖ＤＮＡ分子を含有するＰＣＲ試薬
Ｘ６）請求項３に記載のゲノム中の前記核小体形成領域リボソームＲＮＡコーディング遺伝子の標的配列を認識又は結合するための融合タンパク質
【請求項１９】
請求項１４又は１５に記載のキット又は請求項１５に記載の可読キャリアＡ１）又はＡ２）の、被検細胞又は生体の老化レベルの検出又は補助検出への応用、
あるいは、請求項１４又は１５に記載のキット又は請求項１５に記載の可読キャリアＡ１）又はＡ２）の、被検細胞又は生体の老化レベルの検出又は補助検出製品の製造への応用。
【請求項２０】
請求項１６又は１７に記載のキット又は請求項１７に記載の可読キャリアＢ１）又はＢ２）の、被検細胞又は生体におけるテロメアのコピー数の検出又は補助検出への応用、
あるいは、請求項１６又は１７に記載のキット又は請求項１７に記載の可読キャリアＢ１）又はＢ２）の、被検細胞又は生体におけるテロメアのコピー数の検出又は補助検出製品の製造への応用。
【請求項２１】
被検細胞又は生体におけるｒＤＮＡのコピー数を検出し、請求項１５に記載の可読キャリアＡ１）又はＡ２）に従って被検細胞又は生体の老化レベルを判断する工程を含む、被検細胞又は生体の老化レベルの検出方法又は補助検出方法。
【請求項２２】
被検細胞又は生体におけるｒＤＮＡのコピー数を検出し、請求項１７に記載の可読キャリアＢ１）又はＢ２）に従って被検細胞又は生体におけるテロメアのコピー数を判断する工程を含む、被検細胞又は生体におけるテロメアのコピー数の検出方法又は補助検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジーの分野に属し、具体的には、ゲノムサイトの可視化標識方法及びその細胞と生体の老化レベル検出への応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト細胞の細胞核では、約３２億対の塩基から巨大なヒトゲノムが構成されており、さらに凝集して大きさの異なる２３対の染色体を形成している。ヒトゲノム計画の完成によって、ヒトゲノムの全ての配列の情報が得られるが、これはただ、ヒトゲノムの構造を認識し、またゲノムからなるクロマチンの３次元構造とヒトの発育、老化や疾病などの重要な生物学的過程との関係を理解するための第一歩である。実際は、多くの研究により、ゲノム構造の混乱が老化や若干の重篤な疾病の要因であることが証明される（非特許文献１〜３）。そのため、ヒトゲノムとそれからなるクロマチンのスペース構造、並びにそれとタンパク質及びＲＮＡレギュロンとの直接の相互作用を明確することは、ヒトの老化や疾病を招く細胞生物学的プロセスに対する理解に大きく寄与する（非特許文献４〜６）。
【０００３】
可視化的なゲノム標識技術は、ゲノムやクロマチンの構造と機能に対する研究の効率を大きく向上できる。現在、科学研究には、多種のゲノム可視化標識技術が応用されているが、蛍光標識Ｌａｃ又はＴｅｔシステムには、約１０ｋｂの外因的な大断片をゲノムの標的サイトにインテグレートする必要があるため、低い標識効率や、潜在的なゲノム損傷などの問題がある（非特許文献７〜８）。また、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）は、現在特定の配列のゲノムでの局在化を研究するための至適基準であるが、当該方法には、化学的固定した細胞で行われる必要があるため、生細胞中のゲノム可視化標識が実現できない（非特許文献９）。近年盛んになるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術によっては、テロメアなどのゲノムの特別サイトの生細胞精確標識が実現できるが、細胞核内の高いバックグラウンドによる低いシグナルノイズ比や、繁雑なシステムなどの欠点で、腫瘍細胞系以外のほかのヒト細胞（例えば多能性幹細胞、最終分化細胞など）においてゲノムサイトの精確標識が実現できない（非特許文献１０）。また、遺伝子編集技術に使用される転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）は同様にゲノムサイトの可視化標識に用いられるが、既存の報告ではＦＩＳＨ至適基準を用いてＴＡＬＥ媒介のゲノム標識の正確性を検証することもなく、それとともに異なる細胞タイプでの標識の強異種性も示される（非特許文献１１）。
【０００４】
上述したように、従来のゲノムの可視化標識技術はいずれも欠点があるため、ヒト細胞のゲノム要素や特別サイトを精確に標識するニーズを満たせない。そのため、現在科学研究でも臨床市場でも、ヒト老化や重要疾病の基礎的研究及び臨床診断・治療技術の発展を促進できる、精確性、簡便性及び長期有効性を備える生細胞ゲノム可視化標識技術が期待されている。
【０００５】
人口高齢化は全世界、特に中国が直面している、益々厳しくなる社会問題である。老化及びその関連疾病は、中国内外の科学研究の分野において突破が大いに必要となる焦点問題であることが疑うまでもない。従来の研究によっては、ヒト細胞の老化が遺伝学、エピジェネティクス、細胞生物学及び代謝生物学などのレベルで多重制御されていることが示される（非特許文献１２）。一方、ヒト細胞は、ゲノム、エピゲノム、メタボローム及び細胞生物学などの多種のレベルで異なる老化表現型を表現し、異なる細胞老化のプロセスを反映することもできる。そして、老化細胞の形態及び代謝機能の異常や変化は、当該細胞からなる組織や臓器が正常の構造と機能を維持できないことを引き起こし、さらにヒト個体の生命活動を影響し、結果として個体の老化及び老化関連疾病を引き起こしてしまう。そのため、異なるレベルでの細胞老化表現型に対する精確な検出は、個体の老化レベルの判断に基礎的なデータを提供し、個体の老化及び老化関連疾病の精確予後及び事前介入に重要の根拠を提供する。
【０００６】
現在、細胞老化の検出指標には、ゲノムレベルのテロメアコピー数検出、細胞生物学レベルの成長速率検出、転写レベルのｐ１６とｐ２１標識物検出、及び生物化学や代謝レベルの老化に関するｂ−ｇａｌ検出とＩＬ６、ＩＬ８検出などがある。この中でも、他の指標はいずれもある程度で環境などの外因の影響を受けることで検出結果には大きい誤差があり得ることから、ゲノムレベルでテロメアコピー数の変化を検出することだけは、細胞老化を評価する唯一の至適基準であると考えられる。しかしながら、人口高齢化の程度が益々高くなることに伴い、老化及び老化関連疾病の検出、診断及び予後、並びに関連薬物及び治療技術の研究開発に対しては、益々多くのニーズや要求が出されるため、テロメアコピー数の変化を検出することのみで細胞や生体の老化を評価することは、目前のニーズを満たすことができないので、科学研究でも臨床市場でも、新規の細胞や生体老化の検出技術が空白を埋めるように求められ、さらに検出精度の向上も求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｚｈａｎｇ，Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｇｉｎｇ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ａ  Ｗｅｒｎｅｒ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｍｏｄｅｌ  ｕｎｖｅｉｌｓ  ｈｅｔｅｒｏｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ａｓ  ａ  ｄｒｉｖｅｒ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｇｉｎｇ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１５．  ３４８（６２３９）：ｐ．  １１６０−３．
【非特許文献２】Ｌｉｕ，Ｇ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ＬＲＲＫ２．  Ｎａｔｕｒｅ，２０１２．  ４９１（７４２５）：ｐ．  ６０３−７．
【非特許文献３】Ｍｉｓｔｅｌｉ，Ｔ．，Ｈｉｇｈｅｒ−ｏｒｄｅｒ  ｇｅｎｏｍｅ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ  Ｂｉｏｌ，２０１０．  ２（８）：ｐ．  ａ０００７９４．
【非特許文献４】Ｌｏｐｅｚ−Ｏｔｉｎ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ｈａｌｌｍａｒｋｓ  ｏｆ  ａｇｉｎｇ．  Ｃｅｌｌ，２０１３．  １５３（６）：ｐ．  １１９４−２１７．
【非特許文献５】Ｍｉｓｔｅｌｉ，Ｔ．，Ｂｅｙｏｎｄ  ｔｈｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．  Ｃｅｌｌ，２００７．  １２８（４）：ｐ．  ７８７−８００．
【非特許文献６】Ｍｉｓｔｅｌｉ，Ｔ．，Ｔｈｅ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｅｓ：ｂｒｉｎｇｉｎｇ  ｔｈｅ  ｄｏｕｂｌｅ  ｈｅｌｉｘ  ｔｏ  ｌｉｆｅ．  Ｃｅｌｌ，２０１３．  １５２（６）：ｐ．  １２０９−１２．
【非特許文献７】Ｒｏｂｉｎｅｔｔ，Ｃ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｌａｃ  ｏｐｅｒａｔｏｒ／ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ．  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，１９９６．  １３５（６  Ｐｔ  ２）：ｐ．  １６８５−７００．
【非特許文献８】Ｈｅｕｎ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｙｅａｓｔ  ｉｎｔｅｒｐｈａｓｅ  ｎｕｃｌｅｕｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００１．  ２９４（５５４９）：ｐ．  ２１８１−６．
【非特許文献９】Ｌｅｖｓｋｙ，Ｊ．Ｍ．  ａｎｄ  Ｒ．Ｈ．  Ｓｉｎｇｅｒ，Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ｐａｓｔ，ｐｒｅｓｅｎｔ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ．  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ，２００３．  １１６（Ｐｔ  １４）：ｐ．  ２８３３−８．
【非特許文献１０】Ｌｅｖｓｋｙ，Ｊ．Ｍ．  ａｎｄ  Ｒ．Ｈ．  Ｓｉｎｇｅｒ，Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ｐａｓｔ，ｐｒｅｓｅｎｔ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ．  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ，２００３．  １１６（Ｐｔ  １４）：ｐ．  ２８３３−８．
【非特許文献１１】Ｍａ，Ｈ．，Ｐ．  Ｒｅｙｅｓ−Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ，ａｎｄ  Ｔ．  Ｐｅｄｅｒｓｏｎ，Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  ｗｉｔｈ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，２０１３．  １１０（５２）：ｐ．  ２１０４８−５３．
【非特許文献１２】Ｌｏｐｅｚ−Ｏｔｉｎ，Ｃ．，Ｂｌａｓｃｏ，Ｍ．  Ａ．，Ｐａｒｔｒｉｄｇｅ，Ｌ．，Ｓｅｒｒａｎｏ，Ｍ．  ＆  Ｋｒｏｅｍｅｒ，Ｇ．  Ｔｈｅ  ｈａｌｌｍａｒｋｓ  ｏｆ  ａｇｉｎｇ．  Ｃｅｌｌ  １５３，１１９４−１２１７
【発明の概要】
【０００８】
本発明の第一の目的は、ゲノムサイトの可視化標識のためのキットを提供することである。
【０００９】
本発明で提供されるゲノムサイトの可視化標識のためのキットは、以下の１）〜８）のいずれかである。
１）ゲノムの標的配列を認識又は結合するための転写活性化様エフェクタータンパク質ＴＡＬＥとチオレドキシンＴＲＸとを含有する融合タンパク質を含む。
２）ゲノムの標的配列を認識又は結合するための転写活性化様エフェクタータンパク質ＴＡＬＥと、蛍光タンパク質とチオレドキシンＴＲＸとを含有する融合タンパク質を含む。
３）ゲノムの標的配列を認識又は結合するための転写活性化様エフェクタータンパク質ＴＡＬＥとチオレドキシンＴＲＸとを含有するタンパク質組成物を含む。
４）ゲノムの標的配列を認識又は結合するための転写活性化様エフェクタータンパク質ＴＡＬＥと、蛍光タンパク質とチオレドキシンＴＲＸとを含有するタンパク質組成物を含む。
５）前記融合タンパク質をコードするＤＮＡ分子。
６）前記タンパク質組成物中のタンパク質をコードするＤＮＡ分子を含むＤＮＡ分子組成物。
７）１）又は２）に記載の融合タンパク質を発現させるベクターを含む。
８）前記タンパク質組成物中のタンパク質を発現させるベクターを含むベクター組成物。
【００１０】
前記キットにおいて、前記標的配列がテロメアＤＮＡ、セントロメアＤＮＡ、核小体形成領域リボソームＲＮＡコーディング遺伝子又はＭＵＣ４タンパク質コーディング遺伝子である。
【００１１】
前記キットにおいて、前記標的配列については、本分野における周知の常識に基づいて、それらの一部の配列を選択して標的配列とすることができる。好ましくは、本発明は、以下の配列を選択して標的配列とする。
前記テロメアＤＮＡの標的配列が配列番号１４である。
前記セントロメアＤＮＡの標的配列が配列番号１５である。
前記核小体形成領域リボソームＲＮＡコーディング遺伝子の標的配列が配列番号１６である。
前記ＭＵＣ４タンパク質コーディング遺伝子の標的配列が配列番号１７である。
【００１２】
前記キットにおいて、
ゲノム中の前記テロメアＤＮＡの標的配列を認識又は結合するための融合タンパク質がａ１）又はａ２）である。
ａ１）Ｎ端からＣ端まで、核局在配列、ゲノム中のテロメアＤＮＡの標的配列を認識又は結合するための転写活性化様エフェクタータンパク質ＴＡＬＥ、及びチオレドキシンＴＲＸを、その順に含むように融合させて得られるタンパク質
ａ２）Ｎ端からＣ端まで、核局在配列、ゲノム中のテロメアＤＮＡの標的配列を認識又は結合するための転写活性化様エフェクタータンパク質ＴＡＬＥ、蛍光タンパク質、及びチオレドキシンＴＲＸを、その順に含むように融合させて得られるタンパク質
あるいは、ゲノム中の前記セントロメアＤＮＡの標的配列を認識又は結合するための融合タンパク質がａ３）又はａ４）である。
ａ３）Ｎ端からＣ端まで、核局在配列、ゲノム中のセントロメアＤＮＡの標的配列を認識又は結合するための転写活性化様エフェクタータンパク質ＴＡＬＥ、及びチオレドキシンＴＲＸを、その順に含むように融合させて得られるタンパク質
ａ４）Ｎ端からＣ端まで、核局在配列、ゲノム中のセントロメアＤＮＡの標的配列を認識又は結合するための転写活性化様エフェクタータンパク質ＴＡＬＥ、蛍光タンパク質、及びチオレドキシンＴＲＸを、その順に含むように融合させて得られるタンパク質
あるいは、ゲノム中の前記核小体形成領域リボソームＲＮＡコーディング遺伝子の標的配列を認識又は結合するための融合タンパク質は、Ｎ端からＣ端まで、核局在配列、ゲノム中の核小体形成領域リボソームＲＮＡコーディング遺伝子の標的配列を認識又は結合するための転写活性化様エフェクタータンパク質ＴＡＬＥ、蛍光タンパク質、及びチオレドキシンＴＲＸを、その順に含むように融合させて得られるタンパク質である。
あるいは、ゲノム中のＭＵＣ４タンパク質コーディング遺伝子の標的配列を認識又は結合するための融合タンパク質は、Ｎ端からＣ端まで、核局在配列、ゲノム中のＭＵＣ４タンパク質コーディング遺伝子の標的配列を認識又は結合するための転写活性化様エフェクタータンパク質ＴＡＬＥ、蛍光タンパク質、及びチオレドキシンＴＲＸを、その順に含むように融合させて得られるタンパク質である。
【００１３】
前記キットにおいて、
前記蛍光タンパク質がＥＧＦＰタンパク質又はｍＣｈｅｒｒｙタンパク質である。
ａ１）に記載の融合タンパク質のアミノ酸配列が配列番号４である。
ａ２）に記載の融合タンパク質のアミノ酸配列が配列番号７である。
ａ３）に記載の融合タンパク質のアミノ酸配列が配列番号５である。
ａ４）に記載の融合タンパク質のアミノ酸配列が配列番号８である。
ゲノム中の前記核小体形成領域リボソームＲＮＡコーディング遺伝子の標的配列を認識又は結合するための融合タンパク質のアミノ酸配列が配列番号１０である。
ゲノム中の前記ＭＵＣ４タンパク質コーディング遺伝子の標的配列を認識又は結合するための融合タンパク質のアミノ酸配列が配列番号１２である。
【００１４】
前記キットにおいて、
前記融合タンパク質のＮ端には、Ｆｌａｇタグ配列、具体的に３ｘＦｌａｇタグ配列が備わっている。実際の応用では、Ｎ端のＦｌａｇタグ配列を利用し、免疫蛍光染色実験により細胞ゲノムサイトの可視化検出を実現できる。
【００１５】
前記キットにおいて、
前記ＥＧＦＰタンパク質のコーディング遺伝子が、配列番号１３の第７３８２〜８０９８位に示されるＤＮＡ分子である。
前記ｍＣｈｅｒｒｙタンパク質のコーディング遺伝子が、配列番号６に示されるＤＮＡ分子である。
前記チオレドキシンＴＲＸのコーディング遺伝子が配列番号３に示されるＤＮＡ分子である。
前記３ｘＦｌａｇタグ配列のコーディング遺伝子が配列番号１の第２１１３〜２１８１位に示されるＤＮＡ分子である。
前記核局在配列のコーディング遺伝子が配列番号１の第２１８２〜２２３２位に示されるＤＮＡ分子である。
前記ゲノム中のテロメアＤＮＡの標的配列を認識又は結合するための転写活性化様エフェクタータンパク質ＴＡＬＥのコーディング遺伝子が配列番号１の第２２３３〜４７２５位に示されるＤＮＡ分子である。
前記ゲノム中のセントロメアＤＮＡの標的配列を認識又は結合するための転写活性化様エフェクタータンパク質ＴＡＬＥのコーディング遺伝子が配列番号２の第１２１〜２６１３位に示されるＤＮＡ分子である。
前記ゲノム中の核小体形成領域リボソームＲＮＡコーディング遺伝子の標的配列を認識又は結合するための転写活性化様エフェクタータンパク質ＴＡＬＥのコーディング遺伝子が配列番号９の第１２１〜２６１３位に示されるＤＮＡ分子である。
前記ゲノム中のＭＵＣ４タンパク質コーディング遺伝子の標的配列を認識又は結合するための転写活性化様エフェクタータンパク質ＴＡＬＥのコーディング遺伝子が配列番号１１の第１２１〜２６１３位に示されるＤＮＡ分子である。
【００１６】
前記キットにおいて、
ａ１）に記載の融合タンパク質を発現させるベクターは、テロメアＤＮＡの標的配列を認識又は結合するためのＴＡＬＥベクターをバックボーンベクターとし、配列番号３に示されるヒトチオレドキシンＴＲＸのコーディング遺伝子配列をバックボーンベクターのサイトであるＫｐｎＩとＸｈｏＩとの間に挿入して得られるベクターである。ただし、前記テロメアＤＮＡの標的配列を認識又は結合するためのＴＡＬＥベクターのヌクレオチド配列が配列番号１である。
ａ２）に記載の融合タンパク質を発現させるベクターは、テロメアＤＮＡの標的配列を認識又は結合するためのＴＴＡＬＥベクターをバックボーンベクターとし、配列番号６に示されるｍＣｈｅｒｒｙコーディング遺伝子配列をバックボーンベクターのサイトであるＨｐａＩとＫｐｎＩとの間に挿入して得られるベクターである。ただし、前記テロメアＤＮＡの標的配列を認識又は結合するためのＴＴＡＬＥベクターは、前記テロメアＤＮＡの標的配列を認識又は結合するためのＴＡＬＥベクターをバックボーンベクターとし、配列番号３に示されるヒトチオレドキシンＴＲＸのコーディング遺伝子配列をバックボーンベクターのサイトであるＫｐｎＩとＸｈｏＩとの間に挿入して得られるベクターである。
ａ３）に記載の融合タンパク質を発現させるベクターは、セントロメアＤＮＡの標的配列を認識又は結合するためのＴＡＬＥベクターをバックボーンベクターとし、配列番号３に示されるヒトチオレドキシンのコーディング遺伝子配列をバックボーンベクターのサイトであるＫｐｎＩとＸｈｏＩとの間に挿入して得られるベクターである。ただし、前記セントロメアＤＮＡの標的配列を認識又は結合するためのＴＡＬＥベクターのヌクレオチド配列が、配列番号１の第２１１３〜４７２５位に示されるＤＮＡ断片を配列番号２に示されるＤＮＡ断片に置換して得られる配列である。
ａ４）に記載の融合タンパク質を発現させるベクターは、セントロメアＤＮＡの標的配列を認識又は結合するためのＴＴＡＬＥベクターをバックボーンベクターとし、配列番号１３の第７３８２〜８０９８位に示されるＥＧＦＰコーディング遺伝子配列をバックボーンベクターのサイトであるＨｐａＩとＫｐｎＩとの間に挿入して得られるベクターである。ただし、前記セントロメアＤＮＡの標的配列を認識又は結合するためのＴＴＡＬＥベクターは、前記セントロメアＤＮＡの標的配列を認識又は結合するためのＴＡＬＥベクターをバックボーンベクターとし、配列番号３に示されるヒトチオレドキシンＴＲＸのコーディング遺伝子配列をバックボーンベクターのサイトであるＫｐｎＩとＸｈｏＩとの間に挿入して得られるベクターである。
ゲノム中の前記核小体形成領域リボソームＲＮＡコーディング遺伝子の標的配列を認識又は結合するための融合タンパク質を発現させるベクターは、核小体形成領域リボソームＲＮＡコーディング遺伝子の標的配列を認識又は結合するためのＴＡＬＥベクターをバックボーンベクターとし、配列番号３に示されるヒトチオレドキシンＴＲＸのコーディング遺伝子配列をバックボーンベクターのサイトであるＡｓｃＩとＸｈｏＩとの間に挿入して得られるベクターである。ただし、前記核小体形成領域リボソームＲＮＡコーディング遺伝子の標的配列を認識又は結合するためのＴＡＬＥベクターのヌクレオチド配列は、配列番号１の第２１１３〜４７２５位に示されるＤＮＡ断片を配列番号９に示されるＤＮＡ断片に置換し、且つ配列番号１３の第７３８２〜８０９８位に示されるＥＧＦＰコーディング遺伝子配列を配列番号１のサイトであるＨｐａＩとＫｐｎＩとの間に挿入して得られる配列である。
ゲノム中のＭＵＣ４タンパク質コーディング遺伝子の標的配列を認識又は結合するための融合タンパク質を発現させるベクターは、ＭＵＣ４タンパク質コーディング遺伝子の標的配列を認識又は結合するためのＴＡＬＥベクターをバックボーンベクターとし、配列番号３に示されるヒトチオレドキシンＴＲＸのコーディング遺伝子配列をバックボーンベクターのサイトであるＡｓｃＩとＸｈｏＩとの間に挿入して得られるベクターである。ただし、前記ＭＵＣ４タンパク質コーディング遺伝子の標的配列を認識又は結合するためのＴＡＬＥベクターのヌクレオチド配列は、配列番号１の第２１１３〜４７２５位に示されるＤＮＡ断片を配列番号１１に示されるＤＮＡ断片に置換し、且つ配列番号１３の第７３８２〜８０９８位に示されるＥＧＦＰコーディング遺伝子配列を配列番号１のサイトであるＨｐａＩとＫｐｎＩとの間に挿入して得られる配列である。
【００１７】
本発明の第二の目的は、前記キット又は前記キット中の融合タンパク質又は前記キット中のタンパク質組成物の新たな用途を提供することである。
【００１８】
本発明は、前記キット又は前記キット中の融合タンパク質又は前記キット中のタンパク質組成物のゲノム可視化への応用を提供する。
【００１９】
本発明はさらに、前記キット又は前記キット中の融合タンパク質又は前記キット中のタンパク質組成物のゲノム可視化製品の製造への応用を提供する。
【００２０】
本発明はさらに、前記キット又は前記キット中の融合タンパク質又は前記キット中のタンパク質組成物の以下のｂ１）〜ｂ１４）のいずれかへの応用を提供する。
ｂ１）ゲノムサイトの可視化標識
ｂ２）ゲノムサイトの可視化標識製品の製造
ｂ３）細胞ゲノムにおけるテロメアの可視化標識
ｂ４）細胞ゲノムにおけるテロメアの可視化標識製品の製造
ｂ５）細胞ゲノムにおけるセントロメアの可視化標識
ｂ６）細胞ゲノムにおけるセントロメアの可視化標識製品の製造
ｂ７）細胞ゲノムにおける核小体形成領域リボソームＲＮＡの可視化標識
ｂ８）細胞ゲノムにおける核小体形成領域リボソームＲＮＡの可視化標識製品の製造
ｂ９）細胞ゲノムにおけるＭＵＣ４コーディング遺伝子サイトの可視化標識
ｂ１０）細胞ゲノムにおけるＭＵＣ４コーディング遺伝子サイトの可視化標識製品の製造
ｂ１１）細胞分裂の異なる時期のテロメア又はセントロメアの動的変化の可視化検出
ｂ１２）細胞分裂の異なる時期のテロメア又はセントロメアの動的変化の可視化検出製品の製造
ｂ１３）テロメアの異なる細胞老化モデルでの動的変化の可視化検出
ｂ１４）テロメアの異なる細胞老化モデルでの動的変化の可視化検出製品の製造
【００２１】
本発明の第三の目的は、前記キット中の融合タンパク質又は前記キット中のタンパク質組成物の新たな用途を提供する。
【００２２】
本発明は、前記キット中の融合タンパク質又は前記キット中のタンパク質組成物のゲノムの可視化ツールとしての応用を提供する。
【００２３】
前記キット中の融合タンパク質又は前記キット中のタンパク質組成物をコードするＤＮＡ分子のゲノムの可視化ツールの製造への応用も、本発明の保護範囲に含まれる。
【００２４】
本発明の第四の目的は、ゲノムサイトの可視化標識方法を提供することである。
【００２５】
本発明で提供されるゲノムサイトの可視化標識方法は、前記キット中の融合タンパク質又は前記融合タンパク質を発現させるベクターを細胞に導入し、細胞のゲノムサイトの可視化を実現することを含む。
【００２６】
前記応用又は前記方法において、
前記細胞はヒト又は動物細胞である。前記ヒト又は動物細胞は、ヒト腫瘍細胞、ヒト胚性腎細胞、ヒト多能性幹細胞、ヒト体性幹細胞、ヒト最終分化細胞又はマウスＯＰ９細胞である。前記ヒト又は動物細胞は、具体的にヒト腫瘍細胞系（Ｕ２ＯＳ、ＨｅＬａ、ＭＣＦ７及びＨｅｐＧ２）、ヒト胚性腎細胞系（ＨＥＫ２９３）、ヒト多能性幹細胞（胚性幹細胞ｈＥＳＣ）、ヒト多能性幹細胞（誘導多能性幹細胞ｉＰＳＣ）、体性幹細胞（間葉系幹細胞）、体性幹細胞（神経幹細胞ｈＮＳＣ）、最終分化細胞（血管平滑筋細胞ｈＶＳＭＣ）又はマウスＯＰ９細胞である。
【００２７】
本発明は、従来の転写活性化様エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質のＣ端に、チオレドキシンＴＲＸを融合することで、新規なゲノムの可視化標識ツールＴＴＡＬＥを構築する。実験により、ＴＴＡＬＥは、腫瘍細胞系、胚性幹細胞、体性幹細胞、最終分化細胞など、異なるヒト細胞でテロメア、セントロメア及びリボソームＲＮＡコーディング配列（Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＤＮＡ，ｒＤＮＡ）などのゲノム反復配列を精確に標識し、遺伝子座（ＭＵＣ４）をコードすることに用いられることが証明される。ＴＴＡＬＥ技術は、現在科学研究や臨床市場での、精確性、簡便性及び長期有効性を備える生細胞ゲノムの可視化標識技術の欠乏の空白を埋め、ヒト老化や重要疾病の基礎的研究及び臨床診断・治療技術の発展を促進することができる。
【００２８】
本発明の第五の目的は、被検細胞又は生体におけるｒＤＮＡのコピー数を検出する物質の新たな用途を提供することである。
【００２９】
本発明は、被検細胞又は生体におけるｒＤＮＡのコピー数を検出する物質の、被検細胞又は生体の老化レベルの検出又は補助検出への応用を提供する。
【００３０】
本発明はさらに、被検細胞又は生体におけるｒＤＮＡのコピー数を検出する物質の、被検細胞又は生体の老化レベルの検出又は補助検出製品の製造への応用を提供する。
【００３１】
本発明はさらに、被検細胞又は生体におけるｒＤＮＡのコピー数を検出する物質の被検細胞又は生体におけるテロメアのコピー数の検出又は補助検出への応用を提供する。
【００３２】
本発明はさらに、被検細胞又は生体におけるｒＤＮＡのコピー数を検出する物質の被検細胞又は生体におけるテロメアのコピー数の検出又は補助検出製品の製造への応用を提供する。
【００３３】
前記応用において、前記被検細胞又は生体におけるｒＤＮＡのコピー数を検出する物質は、プライマー１とプライマー２からなるプライマー対又はプローブ又は前記ゲノム中の前記核小体形成領域リボソームＲＮＡコーディング遺伝子の標的配列を認識又は結合するための融合タンパク質である。
【００３４】
前記プライマー１は、以下のａ１）又はａ２）である。
ａ１）配列番号１８に示される一本鎖ＤＮＡ分子
ａ２）ａ１）で限定される一本鎖ＤＮＡ分子に一つ以上の塩基を欠失、挿入及び／又は変化させて得られる、ａ１）で限定される一本鎖ＤＮＡ分子と同じ機能を有する一本鎖ＤＮＡ分子
【００３５】
前記プライマー２は、以下のｂ１）又はｂ２）である。
ｂ１）配列番号１９に示される一本鎖ＤＮＡ分子
ｂ２）ｂ１）で限定される一本鎖ＤＮＡ分子に一つ以上の塩基を欠失、挿入及び／又は変化させて得られる、ｂ１）で限定される一本鎖ＤＮＡ分子と同じ機能を有する一本鎖ＤＮＡ分子
【００３６】
前記プローブは、以下のｃ１）又はｃ２）である。
ｃ１）配列番号２０に示される一本鎖ＤＮＡ分子
ｃ２）ｃ１）で限定される一本鎖ＤＮＡ分子に一つ以上の塩基を欠失、挿入及び／又は変化させて得られる、ｃ１）で限定される一本鎖ＤＮＡ分子と同じ機能を有する一本鎖ＤＮＡ分子
【００３７】
本発明の第六の目的は、被検細胞又は生体の老化レベルを検出又は補助的に検出するキットを提供することである。
【００３８】
本発明で提供される被検細胞又は生体の老化レベルを検出又は補助的に検出するキットは、被検細胞又は生体におけるｒＤＮＡのコピー数を検出する物質を含む。
【００３９】
前記キットにおいて、前記キットはさらに、以下の判断基準Ａが記載されている可読キャリアＡ１）又はＡ２）を含む。
Ａ１）ｒＤＮＡコピー数が高い細胞又は生体はｒＤＮＡコピー数が低い細胞又は生体よりも老化レベルが低い。
Ａ２）ｒＤＮＡコピー数が高ければ高くなるほど、細胞又は生体の老化レベルが低くなる。
【００４０】
本発明の第七の目的は、被検細胞又は生体におけるテロメアのコピー数を検出又は補助的に検出するキットを提供することである。
【００４１】
本発明で提供される被検細胞又は生体におけるテロメアのコピー数を検出又は補助的に検出するキットは、被検細胞又は生体におけるｒＤＮＡのコピー数を検出する物質を含む。
【００４２】
前記キットにおいて、前記キットはさらに、以下の判断基準Ｂが記載されている可読キャリアＢ１）又はＢ２）を含む。
Ｂ１）ｒＤＮＡコピー数が高い細胞又は生体はｒＤＮＡコピー数が低い細胞又は生体よりもテロメアコピー数が低い。
Ｂ２）ｒＤＮＡコピー数が高ければ高くなるほど、細胞又は生体におけるテロメアのコピー数が高くなる。
【００４３】
前記キットにおいて、前記被検細胞又は生体におけるｒＤＮＡのコピー数を検出する物質は、以下のＸ１）〜Ｘ６）である。
Ｘ１）配列表における配列番号１８に示される一本鎖ＤＮＡ分子と配列表における配列番号１９に示される一本鎖ＤＮＡ分子からなるプライマー対Ａ
Ｘ２）配列Ｃに示される一本鎖ＤＮＡ分子と配列Ｄに示される一本鎖ＤＮＡ分子からなるプライマー対Ｂ
前記配列Ｃは、配列番号１８に一つ以上のヌクレオチドを削除又は増加又は変化させ、且つ配列番号１８と同じ機能を有するヌクレオチドである。
前記配列Ｄは、配列番号１９に一つ以上のヌクレオチドを削除又は増加又は変化させ、且つ配列番号１９と同じ機能を有するヌクレオチドである。
Ｘ３）配列表における配列番号２０に示される一本鎖ＤＮＡ分子
Ｘ４）配列Ｅに示される一本鎖ＤＮＡ分子
前記配列Ｅは、配列番号２０に一つ以上のヌクレオチドを削除又は増加又は変化させ、且つ配列番号２０と同じ機能を有するヌクレオチドである。
Ｘ５）Ｘ１）に記載のプライマー対Ａ又はＸ２）に記載のプライマー対Ｂ又はＸ３）に記載の一本鎖ＤＮＡ分子又はＸ４）に記載の一本鎖ＤＮＡ分子を含有するＰＣＲ試薬
Ｘ６）前記ゲノム中の前記核小体形成領域リボソームＲＮＡコーディング遺伝子の標的配列を認識又は結合するための融合タンパク質
【００４４】
本発明の第八の目的は、前記被検細胞又は生体の老化レベルを検出又は補助的に検出するキット、あるいは、前記可読キャリアＡ１）又はＡ２）の新たな用途を提供することである。
【００４５】
本発明は、前記被検細胞又は生体の老化レベルを検出又は補助的に検出するキット、あるいは、前記可読キャリアＡ１）又はＡ２）の被検細胞又は生体の老化レベルの検出又は補助検出への応用を提供する。
【００４６】
本発明はさらに、前記被検細胞又は生体の老化レベルを検出又は補助的に検出するキット、あるいは、前記可読キャリアＡ１）又はＡ２）の被検細胞又は生体の老化レベルの検出又は補助検出製品の製造への応用を提供する。
【００４７】
本発明の第九の目的は、前記被検細胞又は生体におけるテロメアのコピー数を検出又は補助的に検出するキット、あるいは、可読キャリアＢ１）又はＢ２）の新たな用途を提供することである。
【００４８】
本発明は、被検細胞又は生体におけるテロメアのコピー数を検出又は補助的に検出するキット、あるいは、可読キャリアＢ１）又はＢ２）の被検細胞又は生体におけるテロメアのコピー数の検出又は補助検出への応用を提供する。
【００４９】
本発明はさらに、被検細胞又は生体におけるテロメアのコピー数を検出又は補助的に検出するキット、あるいは、可読キャリアＢ１）又はＢ２）の被検細胞又は生体におけるテロメアのコピー数の検出又は補助検出製品の製造への応用を提供する。
【００５０】
本発明の第十の目的は、被検細胞又は生体の老化レベルの検出方法又は補助検出方法を提供することである。
【００５１】
本発明で提供される被検細胞又は生体の老化レベルの検出方法又は補助検出方法は、被検細胞又は生体におけるｒＤＮＡのコピー数を検出し、前記可読キャリアＡ１）又はＡ２）に従って被検細胞又は生体の老化レベルを判断する工程を含む。
【００５２】
本発明の第十一の目的は、被検細胞又は生体におけるテロメアのコピー数の検出方法又は補助検出方法を提供することである。
【００５３】
本発明で提供される被検細胞又は生体におけるテロメアのコピー数の検出方法又は補助検出方法は、被検細胞又は生体におけるｒＤＮＡのコピー数を検出し、前記可読キャリアＢ１）又はＢ２）に従って被検細胞又は生体におけるテロメアのコピー数を判断する工程を含む。
【００５４】
前記応用又はキット又は方法において、前記被検細胞又は生体におけるｒＤＮＡのコピー数の検出方法は、以下の（１）又は（２）である。
（１）被検細胞又は生体のゲノムＤＮＡをテンプレートとし、プライマー１とプライマー２を採用してリアルタイム定量ＰＣＲを行う。
（２）プローブで被検細胞又は生体中のｒＤＮＡを標識し、フローサイトメトリーにより被検細胞又は生体におけるｒＤＮＡのコピー数を検出する。前記プローブは、蛍光標識プローブであり、具体的には５’端にＣｙ３を標識したプローブである。
【００５５】
前記応用又はキットにおいて、
前記ｒＤＮＡコピー数は、細胞核のゲノムＤＮＡにおける４５Ｓ核小体形成領域リボソームＲＮＡをコードするＤＮＡ配列（Ｎｕｃｌｅｏｌａｒ  ｏｒｇａｎｉｚｅｒ  ｒｅｇｉｏｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＤＮＡｓ，ＮＯＲ−ｒＤＮＡ）のコピー数のことをいう。
前記テロメアコピー数は、ヒトゲノムにおけるテロメア反復配列ＴＴＡＧＧＧのコピー数のことをいい、そのコピー数は、染色体末端のテロメアの長さを示す。
【００５６】
前記応用又はキットにおいて、前記細胞又は生体は、具体的にヒトの細胞又は生体であってもよい。
【００５７】
本発明では、初めてｑＰＣＲ方法によるヒト細胞ゲノムにおけるｒＤＮＡコピー数の検出により細胞の老化レベルを評価する。体外培養の間葉系幹細胞と年齢の異なる人の血液ゲノムとの比較研究から、ヒト細胞ゲノムにおけるｒＤＮＡコピー数が細胞の老化レベルを正確に反映できることが証明される。この方法は、細胞老化、さらには個体老化の評価に新たな検出指標を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】本発明は、チオレドキシンＴＲＸをＴＡＬＥのＣ端に融合させることで、細胞ゲノムにおけるテロメア（Ｔｅｌｏｍｅｒｅ）及びセントロメア（Ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｅ）を精確に標識できるゲノム可視化標識技術（ＴＴＡＬＥ）を構築する。そのうち、Ａは、ＴＴＡＬＥによるゲノムサイトの標識の模式図である。Ｂは、テロメア（Ｔｅｌｏｍｅｒｅ）を認識するＴＴＡＬＥによる細胞核内の標識結果であり、左から右までの順に、ＦＬＡＧタグ標識ＴＴＡＬＥによるテロメアの標識結果、ＦＩＳＨプローブによるテロメアの標識結果、前の２つの図を重ねた結果（ＴＴＡＬＥとＦＩＳＨの信号が良好である共局在化効果を示した）、重ねた図の一部拡大結果である。Ｃは、テロメア（Ｔｅｌｏｍｅｒｅ）を認識するＴＴＡＬＥにより細胞核内で標識された蛍光ドットの分布図である。Ｄは、テロメア（Ｔｅｌｏｍｅｒｅ）を特異的に標識するＦＩＳＨプローブにより細胞核内で標識された蛍光ドットの分布図である。Ｅは、セントロメア（Ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｅ）を認識するＴＴＡＬＥによる細胞核内の標識結果である。Ｆは、セントロメア（Ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｅ）を認識するＴＴＡＬＥにより細胞核内で標識された蛍光ドットの分布図である。Ｇは、セントロメア（Ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｅ）を特異的に標識するＦＩＳＨプローブにより細胞核内で標識された蛍光ドットの分布図である。
【図２】ＴＴＡＬＥを利用してヒト腫瘍細胞系におけるテロメア（Ｔｅｌｏｍｅｒｅ）及びセントロメア（Ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｅ）を精確に標識する。そのうち、Ａは、テロメア（Ｔｅｌｏｍｅｒｅ）を認識するＴＴＡＬＥによる、細胞間期にあるヒト腫瘍細胞系での標識結果である。Ｂは、セントロメア（Ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｅ）を認識するＴＴＡＬＥによる、細胞間期にあるヒト腫瘍細胞系での標識結果である。Ｃは、蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ又はｍＣｈｅｒｒｙ）融合発現のテロメア（Ｔｅｌｏｍｅｒｅ）又はセントロメア（Ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｅ）を認識するＴＴＡＬＥにより細胞分裂周期の異なる時期にあるＨｅＬａ細胞のゲノムを同時に標識する結果である。
【図３】ＴＴＡＬＥを利用してヒト多能性幹細胞（胚性幹細胞ｈＥＳＣ又は誘導多能性幹細胞ｉＰＳＣ）及びそれに由来する体性幹細胞（間葉系幹細胞ｈＭＳＣ及び神経幹細胞ｈＮＳＣ）、並びに最終分化細胞（神経細胞ｈＮｅｕｒｏｎ及び血管平滑筋細胞ｈＶＳＭＣ）におけるテロメア（Ｔｅｌｏｍｅｒｅ）及びセントロメア（Ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｅ）を精確に標識する。そのうち、Ａは、セントロメア（Ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｅ）を認識するＴＴＡＬＥによる標識結果である。Ｂは、テロメア（Ｔｅｌｏｍｅｒｅ）を認識するＴＴＡＬＥによる標識結果である。
【図４】ＴＴＡＬＥを利用してヒト細胞中の核小体形成領域リボソームＲＮＡコーディング配列（ＮＯＲ−ｒＤＮＡ）を精確に標識する。そのうち、Ａは、核小体形成領域リボソームＲＮＡコーディング配列を認識するＴＡＬＥベクターの標識結果である。Ｂは、ｈＭＳＣにおいてＮＯＲ−ｒＤＮＡを認識するＴＴＡＬＥによる標識結果がＮＯＲ−ｒＤＮＡのＦＩＳＨハイブリダイゼーション信号と共局在でき、且つその標識信号が核小体形成領域の分子標識物であるＮｕｃｌｅｏｌｉｎ及びＦｉｂｒｉｌｌａｒｉｎを囲んでいる。Ｃは、ＴＴＡＬＥを利用してヒト腫瘍細胞（ＨｅＬａ及びＵ２ＯＳ）及びヒト多能性幹細胞（ｈＥＳＣ、ｈＭＳＣ及びｈＮＳＣ）におけるＮＯＲ−ｒＤＮＡを精確に標識する。
【図５】ＴＴＡＬＥを利用してヒト細胞における遺伝子コーディング配列（ＭＵＣ４）を精確に標識する。Ａは、コーディング遺伝子サイト（ＭＵＣ４）を認識するＴＡＬＥベクターの標識結果である。Ｂは、ＴＴＡＬＥを利用してヒト腫瘍細胞（ＨｅＬａ）及びヒト多能性幹細胞（ｈＭＳＣ）におけるＭＵＣ４遺伝子サイトを精確に標識する。Ｃは、蛍光タンパク質（ｍＣｈｅｒｒｙ）融合発現のＭＵＣ４遺伝子サイトを認識するＴＴＡＬＥにより細胞分裂周期の異なる時期にあるＨｅＬａ細胞のゲノムを標識する結果である。
【図６】テロメア（Ｔｅｌｏｍｅｒｅ）を認識するＴＴＡＬＥを利用して異なる細胞老化モデルにおいて細胞老化プロセスに伴うゲノムにおけるテロメア（Ｔｅｌｏｍｅｒｅ）の動的変化を可視化標識する。Ａは、異なる細胞老化モデルの模式図である。Ｂは、テロメア（Ｔｅｌｏｍｅｒｅ）を認識するＴＴＡＬＥにより異なる細胞老化モデルにおいてゲノムにおけるテロメア（Ｔｅｌｏｍｅｒｅ）を可視化標識する結果である。Ｃは、ＷＲＮ遺伝子欠失の間葉系幹細胞の検証結果（ＷＲＮ遺伝子欠失検証実験）である。Ｄは、ＨＧＰＳ患者由来の間葉系幹細胞の検証結果（Ｐｒｏｇｅｒｉｎ発現検証実験）である。Ｅは、三つの細胞老化モデルでのテロメア短縮のｑＰＣＲ検証である。Ｆは、テロメア（Ｔｅｌｏｍｅｒｅ）を認識するＴＴＡＬＥにより異なる細胞老化モデルにおいてゲノムにおけるテロメア（Ｔｅｌｏｍｅｒｅ）を可視化標識する蛍光強度の統計結果である。
【図７】テロメア（Ｔｅｌｏｍｅｒｅ）を認識するＴＴＡＬＥにより動物体内でゲノムにおけるテロメア（Ｔｅｌｏｍｅｒｅ）を可視化標識する結果である。Ａは、ＥＧＦＰ融合ＴＴＡＬＥを発現させるレンチウィルスベクター（Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）を構築する模式図である。Ｂは、ＥＧＦＰ融合ＴＴＡＬＥを発現させるレンチウィルスベクターをヒト腫瘍細胞Ｕ２ＯＳに感染させる結果である。Ｃは、ＥＧＦＰ融合ＴＴＡＬＥを発現させるレンチウィルスベクターをマウス細胞ＯＰ９に感染させる結果である。Ｄは、ＥＧＦＰ融合ＴＴＡＬＥを発現させるレンチウィルスベクター（Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）を利用してマウス体内でゲノムにおけるテロメア（Ｔｅｌｏｍｅｒｅ）を可視化標識する模式図である。Ｅは、ＥＧＦＰ融合ＴＴＡＬＥを発現させるレンチウィルスベクター（Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）を利用してマウス筋肉、肝臓及び脳組織でゲノムにおけるテロメア（Ｔｅｌｏｍｅｒｅ）を可視化標識する結果である。
【図８】本発明で使用されるＷＲＮ遺伝子欠失のヒト間葉系幹細胞系（ＷＳ−ＭＳＣ）の同定結果である。そのうち、Ａは、ＷＳ−ＭＳＣにおいてＷＲＮ遺伝子の転写産物の発現レベルが野生型ヒト間葉系幹細胞系（ＷＴ−ＭＳＣ）よりも遥かに低いことを示す。Ｂは、Ｐ６代ＷＴ−ＭＳＣと比べ、Ｐ６代ＷＳ−ＭＳＣにおけるテロメアの長さが顕著に短縮したことを示す。
【図９】野生型間葉系幹細胞（ＷＴ−ＭＳＣと記す）とＷＲＮ遺伝子欠失のヒト間葉系幹細胞系（ＷＳ−ＭＳＣと記す）におけるｒＤＮＡのコピー数の検出結果である。そのうち、Ａは、Ｐ６代ＷＴ−ＭＳＣと比べ、Ｐ６代ＷＳ−ＭＳＣにおけるｒＤＮＡのコピー数が顕著に低下したことを示す。Ｂは、ＷＴ−ＭＳＣとＷＳ−ＭＳＣにおいて、コントロールである単一コピー遺伝子ＧＡＰＤＨに顕著な差がないことを示す。
【図１０】フローサイトメトリーによるＷＳ−ＭＳＣにおけるｒＤＮＡのコピー数低下の検証結果である。そのうち、Ａは、フローサイトメトリーによる検出のオリジナル結果を示す。Ｂは、図Ａでの細胞蛍光強度の統計結果を示す。その結果から、Ｐ６代ＷＴ−ＭＳＣと比べ、Ｐ６代ＷＳ−ＭＳＣにおいて蛍光プローブでｒＤＮＡを標識した細胞の蛍光強度が顕著に低下したことが分かっており、ｒＤＮＡのコピー数が顕著に低下したことを直接反映しており、上述した定量ＰＣＲの結果が検証された。
【図１１】年齢の異なる人の血液ゲノムにおけるテロメアとＮＯＲ−ｒＤＮＡコピー数の検出結果である。そのうち、Ａは、０〜１０歳の人の末梢血と比べ、７０〜８０歳の人の末梢血ゲノムにおけるテロメア長さが顕著に低下したことを示す。Ｂは、０〜１０歳の人の末梢血と比べ、７０〜８０歳の人の末梢血ゲノムにおけるｒＤＮＡのコピー数も顕著に低下したことを示しており、上述したＷＳ−ＭＳＣでの検出結果が検証された。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
以下の実施例で使用される実験方法は、特別の断りのない限り、いずれも常用の方法である。
【００６０】
以下の実施例で使用される材料、試薬などは、特別の断りのない限り、いずれも商業的に入手可能である。
【００６１】
以下の実施例において、定量試験は、いずれも実験を三回繰り返して行い、その結果を平均として得る。
【００６２】
以下の実施例において、ＨＧＰＳ患者由来のｉＰＳＣ（ＨＧＰＳ−ｉＰＳＣｓと略称する）は、“Ｌｉｕ，Ｇ．Ｈ．，Ｂａｒｋｈｏ，Ｂ．Ｚ．，Ｒｕｉｚ，Ｓ．，Ｄｉｅｐ，Ｄ．，Ｑｕ，Ｊ．，Ｙａｎｇ，Ｓ．Ｌ．，Ｐａｎｏｐｏｕｌｏｓ，Ａ．Ｄ．，Ｓｕｚｕｋｉ，Ｋ．，Ｋｕｒｉａｎ，Ｌ．，Ｗａｌｓｈ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．  （２０１１ａ）．  Ｒｅｃａｐｉｔｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  ａｇｅｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｉＰＳＣｓ  ｆｒｏｍ  Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ−Ｇｉｌｆｏｒｄ  ｐｒｏｇｅｒｉａ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４７２，２２１−２２５．”に記載されており、本発明の実験を繰り返すことだけのために出願者から入手できる。ＨＧＰＳ患者由来のｉＰＳＣ（ＨＧＰＳ−ｉＰＳＣｓ）におけるＬＭＮＡ遺伝子は突然変異し（ＬＭＮＡゲノム配列はＧｅｎＢａｎｋ：ＮＧ＿００８６９２．２である。ｃＤＮＡ配列はＧｅｎＢａｎｋ：ＮＭ＿１７０７０７．３である）、突然変異のタイプがＣ１８２４Ｔ（ＧＧＣＧＧがＧＧＴＧＧに変異する）であり、当該サイトの参照配列は、ＬＭＮＡ  ｃＤＮＡ配列ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＭ＿１７０７０７．３中のＣＤＳ領域である。
【００６３】
以下の実施例において、ＨＧＰＳ−ＧＣ−ｉＰＳＣｓは、ＨＧＰＳ−ｉＰＳＣと同じ遺伝背景を有する、遺伝子を修正した対照細胞系であり、“Ｌｉｕ，Ｇ．Ｈ．，Ｓｕｚｕｋｉ，Ｋ．，Ｑｕ，Ｊ．，Ｓａｎｃｈｏ−Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｉ．，Ｙｉ，Ｆ．，Ｌｉ，Ｍ．，Ｋｕｍａｒ，Ｓ．，Ｎｉｖｅｔ，Ｅ．，Ｋｉｍ，Ｊ．，Ｓｏｌｉｇａｌｌａ，Ｒ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）．  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌａｍｉｎｏｐａｔｈｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ＬＭＮＡ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉＰＳＣｓ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ８，６８８−６９４．”に記載されており、本発明の実験を繰り返すことだけのために出願者から入手できる。
【００６４】
以下の実施例において、ＷＲＮ遺伝子欠失のヒト胚性幹細胞系（ＷＳ−ＥＳＣ）は、第一発明者により構築され、“Ｚｈａｎｇ，Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａｇｉｎｇ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ａ  Ｗｅｒｎｅｒ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｍｏｄｅｌ  ｕｎｖｅｉｌｓ  ｈｅｔｅｒｏｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ａｓ  ａ  ｄｒｉｖｅｒ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｇｉｎｇ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４８，１１６０−１１６３”に記載されており、本発明の実験を繰り返すことだけのために出願者から入手できる。ＷＲＮタンパク質は、細胞核内の構成的ヘテロクロマチンの構造維持に対して非常に重要であり、細胞老化に密接に関連しており、その機能欠損がウェルナー症候群発生の直接原因であり、多くの組織臓器の老化及び老化関連疾病を引き起こす可能性がある。
【００６５】
以下の実施例において、ｐＬＥ４ベクターは、“Ｈｕｉｚｅ  Ｐａｎ，Ｄｉ  Ｇｕａｎ，Ｘｉａｏｍｅｎｇ  Ｌｉｕ，Ｊｉｎｇｙｉ  Ｌｉ，Ｌｉｘｉａ  Ｗａｎｇ，Ｊｕｎ  Ｗｕ，Ｊｕｎｚｈｉ  Ｚｈｏｕ，Ｗｅｉｚｈｏｕ  Ｚｈａｎｇ，Ｒｕｏｔｏｎｇ  Ｒｅｎ，Ｗｅｉｑｉ  Ｚｈａｎｇ，Ｙｉｎｇ  Ｌｉ，Ｊｉｐｉｎｇ  Ｙａｎｇ，Ｙｉｎｇ  Ｈａｏ，Ｔｉｎｇｔｉｎｇ  Ｙｕａｎ，Ｇｕｏｈｏｎｇ  Ｙｕａｎ，Ｈｕ  Ｗａｎｇ，Ｚｈｅｎｙｕ  Ｊｕ，Ｚｈｉｙｏｎｇ  Ｍａｏ，Ｊｉａｎ  Ｌｉ，Ｊｉｎｇ  Ｑｕ，Ｆｕｃｈｏｕ  Ｔａｎｇ，Ｇｕａｎｇ−Ｈｕｉ  Ｌｉｕ  （２０１６）．  ＳＩＲＴ６  ｓａｆｅｇｕａｒｄｓ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ  ｂｙ  ｃｏａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ＮＲＦ２．  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２６，１９０−２０５．”に記載されており、本発明の実験を繰り返すことだけのために出願者から入手できる。
【００６６】
以下の実施例において、ヒト胚性幹細胞Ｈ９細胞系（ＷＴ−ＥＳＣ）は、ＷｉＣｅｌｌ会社の製品である。品番：ＷＡ０９（Ｈ９）−ＤＬ−７。
【００６７】
以下の実施例における培地の処方は以下のとおりである。
【００６８】
（１）ＣＤＦ１２培地処方：
ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１１３２０−０３３）；
０．１ｍＭ  可欠アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１１１４０−０５０）；
１ｍＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、３５０５０−０６１）；
２０％（体積百分率含有量）Ｋｎｏｃｋｏｕｔ血清代替品（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｎ１０８２８−０２８）；
１％（１ｇ／１００ｍｌ）ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１５０７０−０６３）；
５５μＭ  β−メルカプトエタノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、２１９８５−０２３）；
１０ｎｇ／ｍｌ  ヒトＦＧＦ２（Ｊｏｉｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｅｎｔｒａｌ）。
【００６９】
（２）間葉系幹細胞（ＭＳＣ）培地処方：
ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１２５７１０７１）；
１０％（体積百分率含有量）ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１００９１１４８）；
１％（１ｇ／１００ｍｌ）ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１５０７０−０６３）；
１０ｎｇ／ｍｌ  組換えヒト線維芽細胞増殖因子（ＪＰＣ、ｂＦＧＦ）；
ＭＳＣ分化培地には別に５ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦβを添加する必要がある（Ｈｕｍａｎｚｙｍｅ、ＨＺ１１３１）。
【００７０】
以下の実施例における細胞系は以下のとおりである。
【００７１】
ヒト胚性幹細胞Ｈ９細胞系（ＷＴ−ＥＳＣ）は、ＷｉＣｅｌｌ会社の製品である。品番：ＷＡ０９（Ｈ９）−ＤＬ−７。
【００７２】
ＷＲＮ遺伝子欠失のヒト胚性幹細胞系（ＷＳ−ＥＳＣ）は、第一発明者により構築され、文献“Ｚｈａｎｇ，Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａｇｉｎｇ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ａ  Ｗｅｒｎｅｒ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｍｏｄｅｌ  ｕｎｖｅｉｌｓ  ｈｅｔｅｒｏｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ａｓ  ａ  ｄｒｉｖｅｒ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｇｉｎｇ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４８，１１６０−１１６３”に開示されており、中国科学院生物物理研究所から当該細胞系を入手できる。ＷＲＮタンパク質は、細胞核内の構成的ヘテロクロマチンの構造維持に対して非常に重要であり、細胞老化に密接に関連しており、その機能欠損がウェルナー症候群発生の直接原因であり、多くの組織臓器の老化及び老化関連疾病を引き起こす可能性がある。
【００７３】
以下の実施例において、ヒト胚性幹細胞Ｈ９細胞系（ＷＴ−ＥＳＣ）の培養方法は以下のとおりである。
（１）Ｈ９細胞を、マイトマイシン（米国Ｓｉｇｍａ会社の製品、品番：Ｍ０５０３）で失活化されたマウス胚性線維芽細胞（米国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ会社の製品、品番：Ｓ１５２０−１００）を予め培養した培養プレートに播種し、ヒト胚性幹細胞培地（ＣＤＦ１２培地）を使用してマウス胚性線維芽細胞と共培養する。
（２）Ｈ９細胞を、予め細胞外マトリックス（ｑｕａｌｉｆｉｅｄ−Ｍａｔｒｉｇｅｌ、米国ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの製品、品番：３５４２７７）で被覆された培養プレートに播種し、ｍＴｅＳＲ培地（米国ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの製品）を使用して培養する。
【００７４】
以下の実施例において、フローサイトメトリーによるＭＳＣの選別に用いられる蛍光標識抗体は、以下のとおりである。
フルオレセインＦＩＴＣ標識の抗ヒト細胞表面認識分子ＣＤ９０抗体、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、品番：５５５５９５。
フルオレセインＰＥ標識の抗ヒト細胞表面認識分子ＣＤ７３抗体、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、品番：５５０２５７。
フルオレセインＡＰＣ標識の抗ヒト細胞表面認識分子ＣＤ１０５抗体、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、品番：１７−１０５７−４２。
フルオレセインＡＰＣ標識アイソタイプコントロール抗体、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、品番：５５５７５１。
フルオレセインＰＥ標識アイソタイプコントロール抗体、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、品番：５５５７４９。
フルオレセインＦＩＴＣ標識アイソタイプコントロール抗体、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、品番：５５５７４２。
【００７５】
以下の実施例において、ｒＤＮＡは、細胞核内の核小体形成領域リボソームＲＮＡのコーディング配列（Ｎｕｃｌｅｏｌａｒ  ｏｒｇａｎｉｚｅｒ  ｒｅｇｉｏｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＤＮＡｓ，ＮＯＲ−ｒＤＮＡ）のことをいい、４０〜４００のコピーからなる直列反復配列であり、各コピーには１８Ｓ、５．８Ｓ及び２８ＳリボソームＲＮＡのコーディング配列が含まれる。
【００７６】
以下の実施例において、ｒＤＮＡコピー数は、細胞核内のゲノムＤＮＡにおける４５Ｓ核小体形成領域リボソームＲＮＡをコードするＤＮＡ配列（Ｎｕｃｌｅｏｌａｒ  ｏｒｇａｎｉｚｅｒ  ｒｅｇｉｏｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＤＮＡｓ，ＮＯＲ−ｒＤＮＡ）のコピー数のことをいう。
【００７７】
以下の実施例において、テロメアは、染色体末端のクロマチン凝集領域であり、そのうちのＤＮＡ配列は、ＴＴＡＧＧＧ（一つのコピーと記す）からなる直列反復配列であり、現在、細胞の老化につれ、テロメア領域の直列反復配列のコピー数が少なくなると考えられる。
【００７８】
以下の実施例において、テロメアコピー数は、ヒトゲノムにおけるテロメア反復配列ＴＴＡＧＧＧのコピー数のことをいい、そのコピー数は染色体末端のテロメアの長さを反映している。
【実施例】
【００７９】
実施例１、細胞ゲノムにおけるテロメア（Ｔｅｌｏｍｅｒｅ）及びセントロメア（Ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｅ）を精確に標識するゲノム可視化標識技術（ＴＴＡＬＥ）の構築
一、ＴＡＬＥとＴＲＸを融合させて発現させる発現ベクターＴＴＡＬＥの構築
１、テロメア及びセントロメアを認識するＴＡＬＥベクター
文献“Ｚｈａｎｇ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＴＡＬ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１１．  ２９（２）：ｐ．１４９−５３”を参照とし、Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ  Ａｓｓｅｍｂｌｙの方法により、ＴＡＬＥ  Ｔｏｏｌｂｏｘ  Ｋｉｔ（米国Ａｄｄｇｅｎｅ、品番１０００００００１９）を利用してテロメアを認識するＴＡＬＥベクター及びセントロメアを認識するＴＡＬＥベクターをそれぞれ構築した。
【００８０】
（１）テロメアを認識するＴＡＬＥベクター
テロメアを認識するＴＡＬＥベクターのヌクレオチド配列を配列番号１に示す。テロメアを認識するＴＡＬＥベクターは、融合タンパク質ＴＡＬＥｔｅｌｏを発現させ、融合タンパク質ＴＡＬＥｔｅｌで認識されるテロメア領域のＤＮＡ配列の標的配列は、５’−ＡＡＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴ−３’（配列番号１４）である。
【００８１】
（２）セントロメアを認識するＴＡＬＥベクター
セントロメアを認識するＴＡＬＥベクターのヌクレオチド配列は、配列番号１の第２１１３〜４７２５位に示されるＤＮＡ断片を配列番号２に示されるＤＮＡ断片に置換して得られる配列である。セントロメアを認識するＴＡＬＥベクターは、融合タンパク質ＴＡＬＥｃｅｎｔｒｏを発現させ、当該融合タンパク質のＮ端にはＦＬＡＧタグ配列及び核局在配列ＮＬＳが備わっている。融合タンパク質ＴＡＬＥｃｅｎｔｒｏで認識されるセントロメア領域のＤＮＡ配列の標的配列は、５’−ＣＣＡＴＴＣＣＡＴＴＣＣＡＴＴＣＣＡ−３’（配列番号１５）である。
【００８２】
２、テロメア及びセントロメアを認識するＴＴＡＬＥベクター
（１）テロメアを認識するＴＴＡＬＥベクター
工程１でのテロメアを認識するＴＡＬＥをバックボーンベクターとし、配列番号３に示されるヒトチオレドキシンＴＲＸのコーディング遺伝子配列をバックボーンベクターのサイトであるＫｐｎＩとＸｈｏＩとの間に挿入し、組換えベクターを得、それをテロメアを認識するＴＴＡＬＥベクターと記した（図１Ａ）。テロメアを認識するＴＴＡＬＥベクターは、融合タンパク質ＴＡＬＥｔｅｌｏ−ＴＲＸを発現させ、当該融合タンパク質のＮ端にはＦＬＡＧタグ配列及び核局在配列ＮＬＳが備わっている。融合タンパク質ＴＡＬＥｔｅｌｏ−ＴＲＸのアミノ酸配列を配列番号４に示す。
【００８３】
（２）セントロメアを認識するＴＴＡＬＥベクター
工程１でのセントロメアを認識するＴＡＬＥをバックボーンベクターとし、配列番号３に示されるヒトチオレドキシンのコーディング遺伝子配列をバックボーンベクターのサイトであるＫｐｎＩとＸｈｏＩとの間に挿入し、組換えベクターを得、それをセントロメアを認識するＴＴＡＬＥベクターと記した（図１Ａ）。セントロメアを認識するＴＴＡＬＥベクターは、融合タンパク質ＴＡＬＥｃｅｎｔｒｏ−ＴＲＸを発現させ、当該融合タンパク質のＮ端にはＦＬＡＧタグ配列及び核局在配列ＮＬＳが備わっている。融合タンパク質ＴＡＬＥｃｅｎｔｒｏ−ＴＲＸのアミノ酸配列を配列番号５に示す。
【００８４】
二、細胞ゲノムにおけるテロメア及びセントロメアの分布部位の検出
１、トランスフェクション
工程一で調製されたテロメアを認識するＴＴＡＬＥベクター及びセントロメアを認識するＴＴＡＬＥベクターを、それぞれＵ２ＯＳ細胞（米国ＡＴＣＣ、品番：ＨＴＢ−９６）にトランスフェクトするとともに、テロメアを認識するＴＡＬＥベクター及びセントロメアを認識するＴＡＬＥベクターを対照ベクター（Ｎｏ  ＴＲＸ）とし、２４〜４８時間トランスフェクトした後、それぞれトランスフェクション後の細胞が得られた。
【００８５】
２、免疫蛍光染色実験による細胞ゲノムにおけるテロメア及びセントロメアの分布部位の検出
テロメアを認識するＴＴＡＬＥベクター、セントロメアを認識するＴＴＡＬＥベクター及び対照ベクターＮ端のＦＬＡＧタグ配列を利用して免疫蛍光染色実験を行い、トランスフェクション後の細胞ゲノムにおけるテロメア及びセントロメアの分布部位を検出した。具体的な工程は、４％パラホルムアルデヒド（北京鼎国昌盛生物技術有限責任会社、品番：ＡＲ−０２１１）を用いてトランスフェクション後の細胞を固定し、その後０．４％ＴｒｉｔｏｎＸ１００（米国Ｓｉｇｍａ会社、品番Ｔ９２８４）を含有するＰＢＳを使用して室温で１５分間透過処理を行った。一次抗体希釈液（１０％ロバ血清を含むＰＢＳ）を用いて室温で３０分間ブロッキングし、一次抗体希釈液で調製されたマウス抗ＦＬＡＧ抗体で４℃、徹夜インキュベートした。ＰＢＳで室温、１０分間ずつ３回洗浄し、ＡＬＥＸＡ−４８８標識ロバ抗マウスＩｇＧで室温、１時間インキュベートし、ＰＢＳで室温、１０分間ずつ３回洗浄し、１：２０００のＨｏｅｃｈｓｔで細胞核を標識し、最後に蛍光顕微鏡により観察を行い、そしてＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて蛍光強度の計算及び統計分析を行った。ＦＩＳＨプローブとの共局在化分析が必要であれば、マウス抗ＦＬＡＧ抗体をインキュベートした後、ＦＩＳＨプローブによるインキュベートを行い、さらにＢｉｏｔｉｎ標識抗マウスＩｇＧで室温、１時間インキュベートし、最後にＡＬＥＸＡ−４８８標識Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（Ｖｅｃｔｏｒｌａｂｓ、品番ＳＡ−５４８８）で１時間インキュベートした。
【００８６】
３、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション実験による細胞ゲノムにおけるテロメア及びセントロメアの分布部位の検出
テロメア及びセントロメアを特異的に認識するＦＩＳＨプローブにより蛍光インサイチューハイブリダイゼーション実験を完成した。具体的な工程は、４％パラホルムアルデヒドを用いてトランスフェクション後の細胞を固定し、その後０．４％ＴｒｉｔｏｎＸ１００（米国Ｓｉｇｍａ会社、品番Ｔ９２８４）を含有するＰＢＳを使用して室温で１５分間透過処理を行った。さらに１００マイクログラム／ミリリットルのＲＮＡａｓｅ  Ａ（米国Ｓｉｇｍａ会社、品番８３８３１）を用いて３７℃で３０分間インキュベートし、９０℃で５分間変性させた濃度５０ｎＭのＦＩＳＨプローブ（韓国ＰＡＮＡＧＥＮＥ会社、テロメアＦＩＳＨプローブの品番Ｆ１００２、セントロメアＦＩＳＨプローブの品番Ｆ３００３）で８５℃、１０分間インキュベートした。その後、室温で遮光、徹夜インキュベートした。ＰＢＳで室温、１０分間ずつ３回洗浄し、１：２０００のＨｏｅｃｈｓｔで細胞核を標識し、最後に蛍光顕微鏡により観察を行い、そしてＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて蛍光強度の計算及び統計分析を行った。
【００８７】
結果を図１に示した。図１から分かるように、テロメア又はセントロメアを認識するＴＡＬＥ（図１ＢのＮｏ  ＴＲＸ、図１ＥのＮｏ  ＴＲＸ）と比べ、細胞核でのテロメア又はセントロメアを認識するＴＴＡＬＥ標識蛍光ドットとＦＩＳＨプローブ標識蛍光ドットとはほとんど完全に重なっており（図１Ｂ及び図１Ｅ）、且つその蛍光ドットの分布がＦＩＳＨプローブ標識蛍光ドットの分布と非常に類似し（図１Ｃ、１Ｄ、１Ｆ、１Ｇ）、本発明に係るＴＴＡＬＥによりヒト細胞ゲノムにおけるテロメア又はセントロメアのサイトを精確に標識できることが証明された。
【００８８】
実施例２、タイプの異なるヒト細胞におけるテロメア、セントロメア、核小体形成領域リボソームＲＮＡコーディング配列（ＮＯＲ−ｒＤＮＡ）及びコーディング遺伝子サイト（ＭＵＣ４）の精確標識へのＴＴＡＬＥの応用
一、タイプの異なるヒト細胞におけるテロメア及びセントロメアの精確標識へのＴＴＡＬＥの応用
実施例１のＵ２ＯＳ細胞の代わりに、それぞれ、ヒト腫瘍細胞系（ＭＣＦ７とＨｅｐＧ２、米国ＡＴＣＣ会社、それぞれの品番：ＨＴＢ−２２とＨＢ−８０６５）、ヒト胚性腎細胞系（ＨＥＫ２９３、米国ＡＴＣＣ会社、品番ＣＲＬ−１５７３）、ヒト多能性幹細胞（胚性幹細胞ｈＥＳＣ、Ｗｉｃｅｌｌ会社、品番ＷＡ−０９）、ヒト多能性幹細胞（誘導多能性幹細胞ｉＰＳＣ、Ｗｉｃｅｌｌ会社、品番ＩＩＳＨ６ｉ−ＣＭＬ１７）、体性幹細胞（間葉系幹細胞、Ｌｏｎｚａ会社、品番ＰＴ−２５０１）、体性幹細胞（神経幹細胞ｈＮＳＣ、Ｗｉｃｅｌｌ会社、品番ＮＳＣ−Ｈ９）、最終分化細胞（血管平滑筋細胞ｈＶＳＭＣ、Ｌｏｎｚａ会社、品番ＣＣ−２５７１）を用い、それ以外の工程を変更せず、その後蛍光顕微鏡を使用して観察を行い、そしてＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて蛍光強度の計算及び統計分析を行った。
【００８９】
その結果から分かるように、ＴＴＡＬＥによりタイプの異なるヒト細胞ゲノムにおけるテロメア及びセントロメアを精確に標識でき、前記各細胞でのテロメア及びセントロメアの可視化を実現できた（図２Ａ〜Ｂ、図３）。
【００９０】
二、蛍光タンパク質融合発現のテロメア又はセントロメアを認識するＴＴＡＬＥのヒト細胞におけるテロメア及びセントロメアの精確標識への応用
１、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質融合発現のテロメアを認識するＴＴＡＬＥの調製
実施例１におけるテロメアを認識するＴＴＡＬＥをバックボーンベクターとし、配列番号６に示されるｍＣｈｅｒｒｙコーディング遺伝子配列をバックボーンベクターのサイトであるＨｐａＩとＫｐｎＩとの間に挿入し、組換えベクターを得、それをｍＣｈｅｒｒｙ融合発現のテロメアを認識するＴＴＡＬＥベクターと記した。ｍＣｈｅｒｒｙ融合発現のテロメアを認識するＴＴＡＬＥベクター（ｍＣｈｅｒｒｙ−ＴＴＡＬＥｔｅｌｏ）は、融合タンパク質ＴＴＡＬＥｔｅｌｏ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＴＲＸを発現させ、当該融合タンパク質のＮ端にはＦＬＡＧタグ配列及び核局在配列ＮＬＳが備わっている。融合タンパク質ＴＴＡＬＥｔｅｌｏ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＴＲＸのアミノ酸配列を配列番号７に示す。
【００９１】
２、ＥＧＦＰ蛍光タンパク質融合発現のセントロメアを認識するＴＴＡＬＥの調製
セントロメアを認識するＴＴＡＬＥをバックボーンベクターとし、配列番号１３の第７３８２〜８０９８位に示されるＥＧＦＰコーディング遺伝子配列をバックボーンベクターのサイトであるＨｐａＩとＫｐｎＩとの間に挿入し、ＥＧＦＰ融合発現のセントロメアを認識するＴＴＡＬＥを得た。ＥＧＦＰ融合発現のセントロメアを認識するＴＴＡＬＥ（ＥＧＦＰ−ＴＴＡＬＥｃｅｎｔｒｏ）は、融合タンパク質ＴＴＡＬＥｃｅｎｔｒｏ−ＥＧＦＰ−ＴＲＸを発現させ、当該融合タンパク質のＮ端にはＦＬＡＧタグ配列及び核局在配列ＮＬＳが備わっている。融合タンパク質ＴＴＡＬＥｃｅｎｔｒｏ−ＥＧＦＰ−ＴＲＸのアミノ酸配列を配列番号８に示す。
【００９２】
３、蛍光タンパク質融合発現のテロメア又はセントロメアを認識するＴＴＡＬＥによるＨｅＬａ細胞の標識
ｍＣｈｅｒｒｙ融合発現のテロメアを認識するＴＴＡＬＥ（ｍＣｈｅｒｒｙ−ＴＴＡＬＥｔｅｌｏ）とＥＧＦＰ融合発現のセントロメアを認識するＴＴＡＬＥ（ＥＧＦＰ−ＴＴＡＬＥｃｅｎｔｒｏ）を、それぞれ細胞分裂周期の異なる時期にあるＨｅＬａ細胞にトランスフェクトし、２４〜４８時間トランスフェクトした後、４％パラホルムアルデヒドを用いて細胞を固定し、その後蛍光顕微鏡を使用して観察を行い、そしてＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて蛍光強度の計算及び統計分析を行った。
【００９３】
その結果から分かるように、蛍光タンパク質融合発現のテロメア又はセントロメアを認識するＴＴＡＬＥによりヒト細胞におけるテロメア及びセントロメアを精確に標識でき、細胞分裂周期の異なる時期にある細胞におけるテロメア及びセントロメアの可視化を実現できた（図２Ｃ）。
【００９４】
三、タイプの異なるヒト細胞における核小体形成領域リボソームＲＮＡコーディング配列（ＮＯＲ−ｒＤＮＡ）の精確標識へのＴＴＡＬＥの応用
１、ＥＧＦＰ融合発現の核小体形成領域リボソームＲＮＡコーディング遺伝子を認識するＴＡＬＥの調製
文献“Ｚｈａｎｇ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＴＡＬ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１１．  ２９（２）：ｐ．１４９−５３”を参照とし、Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ  Ａｓｓｅｍｂｌｙの方法により、ＴＡＬＥ  Ｔｏｏｌｂｏｘ  Ｋｉｔ（米国Ａｄｄｇｅｎｅ、品番１０００００００１９）を利用して核小体形成領域リボソームＲＮＡコーディング配列を認識するＴＡＬＥベクターを構築した。
【００９５】
核小体形成領域リボソームＲＮＡコーディング遺伝子を認識するＴＡＬＥベクターのヌクレオチド配列は、配列番号１の第２１１３〜４７２５位に示されるＤＮＡ断片を配列番号９に示されるＤＮＡ断片に置換し、且つ配列番号１３の第７３８２〜８０９８位に示されるＥＧＦＰコーディング遺伝子配列を配列番号１のサイトであるＨｐａＩとＫｐｎＩとの間に挿入して得られた配列である。核小体形成領域リボソームＲＮＡコーディング遺伝子を認識するＴＡＬＥベクターは、融合タンパク質ＴＡＬＥｒＤＮＡ−ＥＧＦＰを発現させ、当該融合タンパク質のＮ端にはＦＬＡＧタグ配列及び核局在配列ＮＬＳが備わっている。融合タンパク質ＴＡＬＥｒＤＮＡ−ＥＧＦＰで認識される核小体形成領域リボソームＲＮＡコーディング遺伝子の標的配列は、５’−ＡＣＣＣＴＡＣＴＧＡＴＧＡＴＧＴＧＴ−３’（配列番号１６）である。
【００９６】
２、蛍光タンパク質融合発現の核小体形成領域リボソームＲＮＡコーディング遺伝子を認識するＴＴＡＬＥの調製
工程１での核小体形成領域リボソームＲＮＡコーディング遺伝子を認識するＴＡＬＥをバックボーンベクターとし、配列番号３に示されるヒトチオレドキシンＴＲＸのコーディング遺伝子配列をバックボーンベクターのサイトであるＡｓｃＩとＸｈｏＩとの間に挿入し、組換えベクターを得、核小体形成領域リボソームＲＮＡコーディング遺伝子を認識するＴＴＡＬＥベクター（ＥＧＦＰ−ＴＴＡＬＥｒＤＮＡ）と記した。核小体形成領域リボソームＲＮＡコーディング遺伝子を認識するＴＴＡＬＥベクター（ＥＧＦＰ−ＴＴＡＬＥｒＤＮＡ）は、融合タンパク質ＴＡＬＥｒＤＮＡ−ＥＧＦＰ−ＴＲＸを発現させた。融合タンパク質ＴＡＬＥｒＤＮＡ−ＥＧＦＰ−ＴＲＸのアミノ酸配列を配列番号１０に示す。
【００９７】
核小体形成領域リボソームＲＮＡコーディング配列を認識するＴＴＡＬＥベクター（ＥＧＦＰ−ＴＴＡＬＥｒＤＮＡ）におけるＥＧＦＰコーディング遺伝子を配列番号６に示されるｍＣｈｅｒｒｙコーディング遺伝子に置換し、核小体形成領域リボソームＲＮＡコーディング遺伝子を認識するＴＴＡＬＥベクター（ｍＣｈｅｒｒｙ−ＴＴＡＬＥｒＤＮＡ）を得た。核小体形成領域リボソームＲＮＡコーディング遺伝子を認識するＴＴＡＬＥベクター（ｍＣｈｅｒｒｙ−ＴＴＡＬＥｒＤＮＡ）は、融合タンパク質ＴＡＬＥｒＤＮＡ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＴＲＸを発現させた。
【００９８】
３、核小体形成領域リボソームＲＮＡコーディング遺伝子を認識するＴＴＡＬＥによる細胞の標識
核小体形成領域リボソームＲＮＡコーディング遺伝子を認識するＴＡＬＥベクターと核小体形成領域リボソームＲＮＡコーディング遺伝子を認識するＴＴＡＬＥを、それぞれヒト腫瘍細胞（ＨｅＬａとＵ２ＯＳ）及びヒト多能性幹細胞（ｈＥＳＣ、ｈＭＳＣ及びｈＮＳＣ）にトランスフェクトし、２４〜４８時間トランスフェクトした後、４％パラホルムアルデヒドを用いて細胞を固定し、その後蛍光顕微鏡を使用して観察を行い、そしてＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて蛍光強度の計算及び統計分析を行い、異なる細胞における核小体形成領域リボソームＲＮＡコーディング遺伝子の蛍光分布様子をそれぞれ検出した。
【００９９】
その結果から分かるように、核小体形成領域リボソームＲＮＡコーディング遺伝子を認識するＴＡＬＥベクターと比べ（図４Ａ）、核小体形成領域リボソームＲＮＡコーディング遺伝子を認識するＴＴＡＬＥにより、ヒト腫瘍細胞（ＨｅＬａとＵ２ＯＳ）及びヒト多能性幹細胞（ｈＥＳＣ、ｈＭＳＣ及びｈＮＳＣ）におけるリボソームＲＮＡを精確に標識でき、核小体形成領域リボソームＲＮＡコーディング遺伝子の可視化を実現できた（図４Ｂ、４Ｃ）。
【０１００】
四、タイプの異なるヒト細胞中のコーディング遺伝子サイト（ＭＵＣ４）の精確標識へのＴＴＡＬＥの応用
１、ＥＧＦＰ融合発現のコーディング遺伝子サイト（ＭＵＣ４）を認識するＴＡＬＥの調製
文献“Ｚｈａｎｇ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＴＡＬ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１１．  ２９（２）：ｐ．１４９−５３”を参照とし、Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ  Ａｓｓｅｍｂｌｙの方法により、ＴＡＬＥ  Ｔｏｏｌｂｏｘ  Ｋｉｔ（米国Ａｄｄｇｅｎｅ、品番１０００００００１９）を利用してコーディング遺伝子サイト（ＭＵＣ４）を認識するＴＡＬＥベクターを構築した。
【０１０１】
コーディング遺伝子サイト（ＭＵＣ４）を認識するＴＡＬＥベクターのヌクレオチド配列は、配列番号１の第２１１３〜４７２５位に示されるＤＮＡ断片を配列番号１１に示されるＤＮＡ断片に置換し、且つ配列番号１３の第７３８２〜８０９８位に示されるＥＧＦＰコーディング遺伝子配列を配列番号１のサイトであるＨｐａＩとＫｐｎＩとの間に挿入して得られた配列である。コーディング遺伝子サイト（ＭＵＣ４）を認識するＴＡＬＥベクターは、融合タンパク質ＴＡＬＥＭＵＣ４−ＥＧＦＰを発現させ、当該融合タンパク質のＮ端にはＦＬＡＧタグ配列及び核局在配列ＮＬＳが備わっている。融合タンパク質ＴＡＬＥ  ＭＵＣ４−ＥＧＦＰで認識されるコーディング遺伝子サイト（ＭＵＣ４）の標的配列は、５’−ＣＣＴＧＴＣＡＣＣＧＡＣＡＣＴＴＣＣ−３’（配列番号１７）である。
【０１０２】
２、蛍光タンパク質融合発現のコーディング遺伝子サイト（ＭＵＣ４）を認識するＴＴＡＬＥの調製
工程１でのコーディング遺伝子サイト（ＭＵＣ４）を認識するＴＡＬＥをバックボーンベクターとし、配列番号３に示されるヒトチオレドキシンＴＲＸのコーディング遺伝子配列をバックボーンベクターのサイトであるＡｓｃＩとＸｈｏＩとの間に挿入し、組換えベクターを得、それをコーディング遺伝子サイト（ＭＵＣ４）を認識するＴＴＡＬＥベクター（ＥＧＦＰ−ＴＴＡＬＥＭＵＣ４）と記した。コーディング遺伝子サイト（ＭＵＣ４）を認識するＴＴＡＬＥベクターは、融合タンパク質ＴＴＡＬＥＭＵＣ４−ＥＧＦＰ−ＴＲＸを発現させた。融合タンパク質ＴＴＡＬＥＭＵＣ４−ＥＧＦＰ−ＴＲＸのアミノ酸配列を配列番号１２に示す。
【０１０３】
コーディング遺伝子サイト（ＭＵＣ４）を認識するＴＴＡＬＥベクター（ＥＧＦＰ−ＴＴＡＬＥＭＵＣ４）におけるＥＧＦＰコーディング遺伝子を配列番号６に示されるｍＣｈｅｒｒｙコーディング遺伝子に置換し、核小体形成領域リボソームＲＮＡコーディング配列を認識するＴＴＡＬＥベクター（ｍＣｈｅｒｒｙ−ＴＴＡＬＥＭＵＣ４）を得た。核小体形成領域リボソームＲＮＡコーディング配列を認識するＴＴＡＬＥベクター（ｍＣｈｅｒｒｙ−ＴＴＡＬＥＭＵＣ４）は、融合タンパク質ＴＡＬＥＭＵＣ４−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＴＲＸを発現させた。
【０１０４】
３、コーディング遺伝子サイト（ＭＵＣ４）を認識するＴＴＡＬＥによる細胞の標識
コーディング遺伝子サイト（ＭＵＣ４）を認識するＴＡＬＥとコーディング遺伝子サイト（ＭＵＣ４）を認識するＴＴＡＬＥを、それぞれ細胞間期と細胞分裂周期にあるｈＭＳＣとＨｅＬａ細胞にトランスフェクトし、２４〜４８時間トランスフェクトした後、４％パラホルムアルデヒドを用いて細胞を固定し、その後蛍光顕微鏡を使用して観察を行い、そしてＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて蛍光強度の計算及び統計分析を行った。
【０１０５】
その結果から分かるように、コーディング遺伝子サイト（ＭＵＣ４）を認識するＴＡＬＥベクターと比べ（図５Ａ）、コーディング遺伝子サイト（ＭＵＣ４）を認識するＴＴＡＬＥにより、細胞間期と細胞分裂周期のｈＭＳＣとＨｅＬａ細胞中のコーディング遺伝子サイト（ＭＵＣ４）を精確に標識でき、コーディング遺伝子サイト（ＭＵＣ４）の可視化を実現できた（図５Ｂ〜Ｃ）。
【０１０６】
実施例３、ＴＴＡＬＥによる異なる細胞老化モデルにおけるテロメアの標識の、細胞老化プロセスの動的変化の可視化への応用
１、ＥＧＦＰ融合発現のテロメアを認識するＴＴＡＬＥベクターの調製
配列番号１３の第７３８２〜８０９８位に示されるＥＧＦＰコーディング遺伝子配列により実施例２の工程二の１におけるｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質融合発現のテロメアを認識するＴＴＡＬＥベクター（ｍＣｈｅｒｒｙ−ＴＴＡＬＥｔｅｌｏ）中のｍＣｈｅｒｒｙコーディング遺伝子配列を置換し、ＥＧＦＰ融合発現のテロメアを認識するＴＴＡＬＥベクター（ＥＧＦＰ−ＴＴＡＬＥｔｅｌｏ）を得、当該融合タンパク質のＮ端にはＦＬＡＧタグ配列及び核局在配列ＮＬＳが備わっている。
【０１０７】
２、ＥＧＦＰ融合発現のテロメアを認識するＴＴＡＬＥベクターによる異なる老化モデルのヒト間葉系幹細胞の標識
（１）異なる老化モデルのヒト間葉系幹細胞の構築
１）野生型ヒト間葉系幹細胞（ＷＴ−ＭＳＣ）とＷＲＮ遺伝子欠失のヒト間葉系幹細胞（ＷＳ−ＭＳＣ）の調製
本発明では、野生型ヒト胚性幹細胞Ｈ９細胞系（ＷＴ−ＥＳＣ）とＷＲＮ遺伝子欠失のヒト胚性幹細胞系（ＷＳ−ＥＳＣ）を、さらに体外で間葉系幹細胞（ＷＴ−ＭＳＣ）とＷＲＮ遺伝子欠失のヒト間葉系幹細胞（ＷＳ−ＭＳＣ）へ分化誘導した。具体的な方法は以下のとおりである。
【０１０８】
Ａ、野生型ヒト胚性幹細胞Ｈ９細胞系（ＷＴ−ＥＳＣ）とＷＲＮ遺伝子欠失のヒト胚性幹細胞系（ＷＳ−ＥＳＣ）のそれぞれに対して胚様体（ＥＢ）分化を行い、胚様体（ＥＢ）を得た。胚様体（ＥＢ）分化の具体的な工程は、３００〜５００個の細胞を含んで大きさが均一であるＥＳＣクローンを用意し、室温でＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、１００１００２３）で一回洗浄し、Ｄｉｓｐａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ会社、品番１７１０５０４１）で３７℃、２０〜３０ｍｉｎ消化した。ＥＳＣクローンが球体を形成した後、ＣＤＦ１２培地で再懸濁させ、その後低接着培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ会社、品番３４７１）に加え、３７℃、５％  ＣＯ２条件で１〜３日間培養した後、胚様体を形成した。
【０１０９】
Ｂ、工程Ａで得られた胚様体（ＥＢ）をマトリゲル（ｍａｔｒｉｇｅｌ）で被覆された６ウェルプレートに播種して培養し、線維状細胞が出るまで２週間培養を続けた。一回継代した後、フローサイトメトリーによりその中からＣＤ７３、ＣＤ９０及びＣＤ１０５がいずれも陽性である細胞グループを選別し（図１）、それらは野生型間葉系幹細胞（ＷＴ−ＭＳＣと記す）とＷＲＮ遺伝子欠失のヒト間葉系幹細胞系（ＷＳ−ＭＳＣと記す）であった。
【０１１０】
２）ＨＧＰＳ患者由来の（ＨＧＰＳ−ＭＳＣ）、及び遺伝子を修正したヒト間葉系幹細胞（ＨＧＰＳ−ＧＣ−ＭＳＣ）の調製
本実施例では、ＨＧＰＳ−ｉＰＳＣｓとＨＧＰＳ−ＧＣ−ｉＰＳＣｓを、さらに体外で間葉系幹細胞ＨＧＰＳ−ＭＳＣとＨＧＰＳ−ＧＣ−ＭＳＣへ分化誘導した。具体的な方法は以下のとおりである。
【０１１１】
ＨＧＰＳ−ｉＰＳＣｓとＨＧＰＳ−ＧＣ−ｉＰＳＣｓのそれぞれに対して胚様体（ＥＢ）分化を１４日間行い、ＥＢをマトリゲル（ｍａｔｒｉｇｅｌ）で被覆された６ウェルプレートに播種して培養し、線維状細胞が出るまで２週間培養を続けた。一回継代した後、フローサイトメトリーによりその中からＣＤ７３、ＣＤ９０及びＣＤ１０５がいずれも陽性である細胞グループを選別し、それらはＨＧＰＳ患者由来の間葉系幹細胞（ＨＧＰＳ−ＭＳＣと記す）と遺伝子を修正したヒト間葉系幹細胞（ＨＧＰＳ−ＧＣ−ＭＳＣと記す）であった。
【０１１２】
３）野生型間葉系幹細胞の早期継代細胞（ＥＰ−ＷＴ−ＭＳＣ）と後期継代細胞（ＬＰ−ＷＴ−ＭＳＣ）の調製
工程（１）での野生型間葉系幹細胞（ＷＴ−ＭＳＣ）を１２代（Ｐ１２代と記す）まで連続継代培養を行い、Ｐ１〜Ｐ６代細胞を早期継代間葉系幹細胞（ＥＰ−ＷＴ−ＭＳＣと記す）とし、Ｐ１０〜Ｐ１２代細胞を後期継代間葉系幹細胞（ＬＰ−ＷＴ−ＭＳＣと記す）とした。Ｐ６代とＰ１２代のＷＴ−ＭＳＣ細胞をＥＰ−ＷＴ−ＭＳＣとＬＰ−ＷＴ−ＭＳＣの代表として以下の関連実験を行った。
【０１１３】
（２）ＥＧＦＰ融合発現のテロメアを認識するＴＴＡＬＥベクターによる異なる老化モデルのヒト間葉系幹細胞の標識
ＥＧＦＰ融合発現のテロメアを認識するＴＴＡＬＥベクターを化学的トランスフェクション方法により異なる老化モデルのヒト間葉系幹細胞に導入し（図６Ａ、６Ｃ及び６Ｄ）、２４〜４８時間トランスフェクトした後、４％パラホルムアルデヒドを用いて細胞を固定し、その後蛍光顕微鏡を使用して観察を行い、そしてＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて蛍光強度の計算及び統計分析を行った。
【０１１４】
３、ｑＰＣＲ方法による異なる老化モデルのヒト間葉系幹細胞におけるテロメア長さの検出
工程２での異なる老化モデルのヒト間葉系幹細胞を被検細胞とした。それぞれ被検細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、リアルタイム定量ＰＣＲ方法により被検細胞におけるテロメア長さを検出した。そのうち、３６Ｂ４をテロメア長さ検出の対照遺伝子とした。プライマー配列は以下のとおりである。
Ｔｅｌ−Ｆ：５’−ＧＧＴＴＴＴＴＧＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧＴ−３’；
Ｔｅｌ−Ｒ：５’−ＴＣＣＣＧＡＣＴＡＴＣＣＣＴＡＴＣＣＣＴＡＴＣＣＣＴＡＴＣＣＣＴＡＴＣＣＣＴＡ−３’；
３６Ｂ４ｕ：５’−ＣＡＧＣＡＡＧＴＧＧＧＡＡＧＧＴＧＴＡＡＴＣＣ−３’；
３６Ｂ４ｄ：５’−ＣＣＣＡＴＴＣＴＡＴＣＡＴＣＡＡＣＧＧＧＴＡＣＡＡ−３’。
【０１１５】
その結果から分かるように、テロメアを認識するＴＴＡＬＥにより異なる細胞老化モデルでゲノムにおけるテロメアを可視化標識でき、老化細胞で標識テロメアの蛍光強度が顕著に低下したことも示され（図６Ｂ、６Ｆ）、この結果はｑＰＣＲ方法で検出された老化細胞におけるテロメア長さが短縮した結果と一致し（図６Ｅ）、ＴＴＡＬＥ技術によりゲノムにおける細胞老化プロセスに伴うテロメアの動的変化を精確に可視化標識できることが示された。
【０１１６】
実施例４、テロメアを認識するＴＴＡＬＥの体外及び動物体内でのゲノムにおけるテロメアの可視化標識への応用
一、テロメアを認識するＴＴＡＬＥの体外でのゲノムにおけるテロメアの可視化標識への応用
１、ＥＧＦＰ融合発現のテロメアを認識するＴＴＡＬＥレンチウィルスベクタープラスミドの調製及びパッケージング
ＥＧＦＰ融合発現のテロメアを認識するＴＴＡＬＥのコーディング遺伝子配列をｐＬＥ４ベクターの制限エンドヌクレアーゼ切断サイトであるＭｌｕＩとＳａｌＩとの間に挿入し、且つｐＬＥ４ベクターの他の配列を変化せず、レンチウィルスベクタープラスミドｐＬＥ４−ＥＧＦＰ−ＴＴＡＬＥ（そのヌクレオチド配列を配列番号１３に示す）を得た。そして、レンチウィルスベクタープラスミドｐＬＥ４−ＥＧＦＰ−ＴＴＡＬＥをＨＥＫ２９３Ｔ（米国ＡＴＣＣ、品番：ＣＲＬ−３２１６）細胞でレンチウィルスのウィルスパッケージングを行い、レンチウィルスパッケージングプラスミドは、Ａｄｄｇｅｎｅから購入され、品番は、ｐｓＰＡＸ（１２２６０）、ｐＭＤ２．Ｇ（１２２５９）であった。
【０１１７】
レンチウィルスベクタープラスミドｐＬＥ４−ＥＧＦＰ−ＴＴＡＬＥをパッケージングプラスミドｐｓＰＡＸとｐＭＤ．２ＧとともにＨＥＫ２９３Ｔ細胞に共トランスフェクトし、トランスフェクトした後４８時間に培養上清を回収し、超高速遠心でレンチウィルス粒子を精製した。
【０１１８】
２、ＥＧＦＰ融合発現のテロメアを認識するレンチウィルスベクタープラスミドによるヒト又はマウス細胞の標識
ＥＧＦＰ融合発現のテロメアを認識するＴＴＡＬＥを発生するレンチウィルスを用いてヒトＵ２ＯＳ細胞（米国ＡＴＣＣ、品番：ＨＴＢ−９６）とマウスＯＰ９細胞（米国ＡＴＣＣ、品番：ＣＲＬ−２７４９）に感染させ、２４〜７２時間感染させた後、４％パラホルムアルデヒドを用いて細胞を固定し、その後蛍光顕微鏡を使用して観察を行った。
【０１１９】
その結果から分かるように、ＥＧＦＰ融合のテロメアを認識するＴＴＡＬＥを発現させるレンチウィルスベクターにより、体外でヒト及びマウス細胞ゲノムにおけるテロメアを可視化標識できた（図７Ｂ、７Ｃ）。
【０１２０】
二、ＥＧＦＰ融合発現のテロメアを認識するＴＴＡＬＥの動物体内でのゲノムにおけるテロメアの可視化標識への応用
Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ会社、品番：５１９８５０４２）を用いて工程一で調製されたＥＧＦＰ融合のテロメアを認識するＴＴＡＬＥを発現させるレンチウィルスベクターを１０８ウィルス／マイクロリットルの量に希釈し、それぞれマウスの前脛骨筋、肝臓及び大脳海馬にウィルス液を５マイクロリットル注射し（図７Ｄ）、注射から７〜１０日間後、前記マウス組織を分離し、４％パラホルムアルデヒドを用いて固定した後凍結切片し、それぞれＷＧＡ抗体（筋肉）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ会社、品番：Ｗ３２４６４）、ＡＬＢ抗体（肝臓）（Ａｂｃａｍ会社、品番：ａｂ８９４０）及びＮｅｕＮ抗体（大脳海馬）（Ａｂｃａｍ会社、品番：ａｂ１７７４８７）で免疫蛍光染色を行い、最後に蛍光顕微鏡により観察を行った。免疫蛍光染色の具体的な工程は、４％パラホルムアルデヒド（北京鼎国昌盛生物技術有限責任会社、品番：ＡＲ−０２１１）を用いて室温で切片を１０分間固定し、その後０．４％ＴｒｉｔｏｎＸ１００（米国Ｓｉｇｍａ会社、品番Ｔ９２８４）を含有するＰＢＳを使用して室温で３０分間透過処理を行い、一次抗体希釈液（１０％ロバ血清を含むＰＢＳ）を用いて室温で４５分間ブロッキングし、一次抗体希釈液で調製されたＷＧＡ抗体（筋肉）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ会社、品番：Ｗ３２４６４）、ＡＬＢ抗体（肝臓）（Ａｂｃａｍ会社、品番：ａｂ８９４０）及びＮｅｕＮ抗体（大脳海馬）（Ａｂｃａｍ会社、品番：ａｂ１７７４８７）でそれぞれ４℃、徹夜インキュベートした。そしてＰＢＳで室温、１０分間ずつ３回洗浄し、それぞれＡＬＥＸＡ−４８８標識ＩｇＧで室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳで室温、１０分間ずつ３回洗浄し、１：２０００のＨｏｅｃｈｓｔで細胞核を標識し、最後に蛍光顕微鏡により観察を行い、そしてＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて蛍光強度の計算及び統計分析を行った。
【０１２１】
その結果から分かるように、ＥＧＦＰ融合のテロメアを認識するＴＴＡＬＥを発現させるレンチウィルスベクターにより、マウスの異なる組織でゲノムにおけるテロメアの可視化標識を実現できた（図７Ｅ）。
【０１２２】
実施例５、ｒＤＮＡコピー数の細胞老化レベル評価への応用
一、野生型ヒト間葉系幹細胞（ＷＴ−ＭＳＣ）及びＷＲＮ遺伝子欠失のヒト間葉系幹細胞（ＷＳ−ＭＳＣ）の調製及びＷＲＮ転写産物の相対的発現レベルの検出
１、野生型ヒト間葉系幹細胞（ＷＴ−ＭＳＣ）及びＷＲＮ遺伝子欠失のヒト間葉系幹細胞（ＷＳ−ＭＳＣ）の調製
本発明では、野生型ヒト胚性幹細胞Ｈ９細胞系（ＷＴ−ＥＳＣ）とＷＲＮ遺伝子欠失のヒト胚性幹細胞系（ＷＳ−ＥＳＣ）を、さらに体外で間葉系幹細胞（ＷＴ−ＭＳＣ）とＷＲＮ遺伝子欠失のヒト間葉系幹細胞（ＷＳ−ＭＳＣ）へ分化誘導した。具体的な方法は以下のとおりである。
【０１２３】
（１）野生型ヒト胚性幹細胞Ｈ９細胞系（ＷＴ−ＥＳＣ）とＷＲＮ遺伝子欠失のヒト胚性幹細胞系（ＷＳ−ＥＳＣ）のそれぞれに対して胚様体（ＥＢ）分化を行い、胚様体（ＥＢ）を得た。胚様体（ＥＢ）分化の具体的な工程は、３００〜５００個の細胞を含んで大きさが均一であるＥＳＣクローンを用意し、室温でＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、１００１００２３）で一回洗浄し、Ｄｉｓｐａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ会社、品番１７１０５０４１）で３７℃、２０〜３０ｍｉｎ消化した。ＥＳＣクローンが球体を形成した後、ＣＤＦ１２培地で再懸濁させ、その後低接着培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ会社、品番３４７１）に加え、３７℃、５％  ＣＯ２条件で１〜３日間培養した後、胚様体を形成した。
【０１２４】
（２）工程（１）で得られた胚様体（ＥＢ）をマトリゲル（ｍａｔｒｉｇｅｌ）で被覆された６ウェルプレートに播種して培養し、線維状細胞が出るまで２週間培養を続けた。さらに、一回継代した後、フローサイトメトリーによりその中からＣＤ７３、ＣＤ９０及びＣＤ１０５がいずれも陽性である細胞グループを選別し（図１）、それらは野生型間葉系幹細胞（ＷＴ−ＭＳＣと記す）とＷＲＮ遺伝子欠失のヒト間葉系幹細胞系（ＷＳ−ＭＳＣと記す）であった。
【０１２５】
２、ＷＲＮ転写産物の相対的発現レベルの検出
２×１０５／ウェルの播種密度で、工程１でのＷＴ−ＭＳＣとＷＳ−ＭＳＣを６ウェルプレートで第６代まで連続継代培養（各代は４日間培養し、１日おきに液を取り換える）を行い、第２〜３代（第２〜３代をそれぞれＰ２代、Ｐ３代と記す）及び第５〜６代（第５〜６代をそれぞれＰ５代、Ｐ６代と記す）のＷＴ−ＭＳＣとＷＳ−ＭＳＣをそれぞれ早期継代ＷＴ−ＭＳＣとＷＳ−ＭＳＣ、後期継代ＷＴ−ＭＳＣとＷＳ−ＭＳＣとした。第６代ＷＴ−ＭＳＣとＷＳ−ＭＳＣにおけるＷＲＮ転写産物の相対的発現レベルをそれぞれ検出した。具体的な工程は以下のとおりである。
【０１２６】
第６代のＷＴ−ＭＳＣとＷＳ−ＭＳＣを被検細胞とし、被検細胞のＲＮＡをそれぞれ抽出してｃＤＮＡに逆転写し、それぞれ以下のプライマーを用いてリアルタイム定量ＰＣＲを行い、被検細胞におけるＷＲＮ遺伝子の発現量を検出した。
ＷＲＮ−Ｆ：ＣＣＡＡＣＡＴＣＣＣＡＧＣＴＴＧＣＴＴ；
ＷＲＮ−Ｒ：ＧＡＧＣＡＧＧＣＣＣＡＴＧＴＴＡＣＣＴＧＡ；
【０１２７】
ＷＲＮ転写産物の検出結果を図８Ａに示した。図から分かるように、ＷＳ−ＭＳＣは野生型ヒト間葉系幹細胞系（ＷＴ−ＭＳＣ）よりもＷＲＮ遺伝子の転写産物の発現レベルが遥かに低かった。
【０１２８】
二、間葉系幹細胞におけるテロメア長さとｒＤＮＡコピー数の検出
それぞれ工程一でのＰ６代のＷＴ−ＭＳＣとＷＳ−ＭＳＣ細胞を被検細胞とした。被検細胞のそれぞれからゲノムＤＮＡを抽出し、リアルタイム定量ＰＣＲ方法により被検細胞におけるテロメア長さとｒＤＮＡコピー数を検出した。そのうち、３６Ｂ４をテロメア長さ検出の対照遺伝子とし、ＧＡＰＤＨをｒＤＮＡコピー数検出の対照遺伝子とした。プライマー配列は以下のとおりである。
ｒＤＮＡ−Ｆ：５’−ＣＴＴＧＧＧＡＡＴＧＣＡＧＣＣＣＡＡＡＧ（配列番号１８）−３’；
ｒＤＮＡ−Ｒ：５’−ＧＡＡＴＣＣＴＣＣＧＧＧＣＧＧＡＣＴＧ（配列番号１９）−３’；
Ｔｅｌ−Ｆ：５’−ＧＧＴＴＴＴＴＧＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧＴ−３’；
Ｔｅｌ−Ｒ：５’−ＴＣＣＣＧＡＣＴＡＴＣＣＣＴＡＴＣＣＣＴＡＴＣＣＣＴＡＴＣＣＣＴＡＴＣＣＣＴＡ−３’；
３６Ｂ４ｕ：５’−ＣＡＧＣＡＡＧＴＧＧＧＡＡＧＧＴＧＴＡＡＴＣＣ−３’；
３６Ｂ４ｄ：５’−ＣＣＣＡＴＴＣＴＡＴＣＡＴＣＡＡＣＧＧＧＴＡＣＡＡ−３’；
ＧＡＰＤＨ−Ｆ：５’−ＧＣＡＧＣＴＧＡＧＣＴＡＧＧＣＡＧＣＡ−３’；
ＧＡＰＤＨ−Ｒ：５’−ＣＴＴＡＡＧＧＣＡＴＧＧＣＴＧＣＡＡＣＴＧ−３’。
【０１２９】
テロメア長さの検出結果を図８Ｂに示した。図から分かるように、Ｐ６代ＷＴ−ＭＳＣと比べ、Ｐ６代ＷＳ−ＭＳＣのテロメア長さが顕著に短縮した。
【０１３０】
ｒＤＮＡコピー数の検出結果を図９Ａに示した。図から分かるように、Ｐ６代ＷＴ−ＭＳＣと比べ、Ｐ６代ＷＳ−ＭＳＣにおけるｒＤＮＡコピー数が顕著に低下した。また、図９Ｂから、ＷＴ−ＭＳＣとＷＳ−ＭＳＣにおいて、コントロールである単一コピー遺伝子ＧＡＰＤＨには顕著な差がないことを示した。
【０１３１】
上述した結果から分かるように、ｒＤＮＡコピー数とテロメア長さの検出結果が一致した。
【０１３２】
三、フローサイトメトリーによるｒＤＮＡコピー数の検出結果の検証
それぞれＷＴ−ＭＳＣとＷＳ−ＭＳＣ細胞を被検細胞とし（第２〜３代と第５〜６代）、フローサイトメトリーにより被検細胞におけるｒＤＮＡコピー数を検出した。具体的な工程は以下のとおりである。
【０１３３】
１、４％パラホルムアルデヒド（北京鼎国昌盛生物技術有限責任会社、品番：ＡＲ−０２１１）を用いて被検細胞を室温条件で１０分間固定した後、０．４％ＴｒｉｔｏｎＸ１００（米国Ｓｉｇｍａ会社、品番：Ｔ８７８７）を含有するＰＢＳを使用して室温で被検細胞を１５分間インキュベートし、さらに１００ｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅ  Ａを用いて３７℃で被検細胞を３０分間インキュベートした。
【０１３４】
２、Ｃｙ３蛍光標識付きのｒＤＮＡ蛍光プローブを用いて以下の条件で工程１で得られた細胞をインキュベートした。まず、８５℃で１０分間、そして３７℃で２〜３時間インキュベートした。ＰＢＳで細胞を５分間ずつ１〜２回洗浄した。最後にフローサイトメトリーにより細胞の蛍光強度を検出した。前記Ｃｙ３蛍光標識付き（５’端）のｒＤＮＡ蛍光プローブは韓国ＰＡＮＡＧＥＮＥ会社により合成され、プローブの配列は、５’−ＡＣＣＣＴＡＣＴＧＡＴＧＡＴＧＴＧＴ（配列番号２０）−３’である。
【０１３５】
その結果を図１０に示した。そのうち、図１０Ａはフローサイトメトリーにより検出されたオリジナル結果であり、図１０Ｂは図１０Ａにおいて細胞蛍光強度の統計結果である。図から分かるように、Ｐ６代ＷＴ−ＭＳＣと比べ、Ｐ６代ＷＳ−ＭＳＣにおいて蛍光プローブでｒＤＮＡを標識した細胞の蛍光強度が顕著に低下し、ｒＤＮＡコピー数の顕著な低下を直接示し、工程二での定量ＰＣＲの検出結果が検証された。
【０１３６】
実施例６、年齢の異なるヒト血液ゲノムにおけるテロメア長さとＮＯＲ−ｒＤＮＡ（核小体形成領域ｒＤＮＡ）コピー数の検出
それぞれ０〜１０歳（Ｙｏｕｎｇ  Ｂｌｏｏｄ）と７０〜８０歳（Ｏｌｄ  Ｂｌｏｏｄ）健康人の末梢血を被検サンプルとした（各１０例）。被検末梢血からゲノムＤＮＡを抽出し、リアルタイム定量ＰＣＲによりテロメア長さとｒＤＮＡコピー数を検出した。具体的な工程は実施例１の工程二の方法を参照した。
【０１３７】
その結果を図１１に示した。図から分かるように、０〜１０歳の人の末梢血と比べ、７０〜８０歳の人の末梢血ゲノムにおけるテロメア長さが顕著に低下した（図１１Ａ）。また、０〜１０歳の人の末梢血と比べ、７０〜８０歳の人の末梢血ゲノムにおけるｒＤＮＡコピー数も顕著に低下した（図１１Ｂ）。この結果は実施例１における検出結果と一致した。それは、ｒＤＮＡコピー数が細胞又は生体の老化レベルと逆相関関係にあり、すなわちｒＤＮＡコピー数が高ければ高くなるほど、老化レベルが低くなることを示した。ｒＤＮＡコピー数が高い細胞又は生体の老化レベルはｒＤＮＡコピー数が低い細胞又は生体よりも低い。ｒＤＮＡコピー数は細胞及び生体の老化レベルを検出するために用いられる。
【産業上の利用可能性】
【０１３８】
本発明は、従来の転写活性化様エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質のＣ端に、チオレドキシンＴＲＸを融合することで、新規なゲノムの可視化標識ツールＴＴＡＬＥを構築する。実験により、ＴＴＡＬＥは、腫瘍細胞系、胚性幹細胞、体性幹細胞、最終分化細胞など、異なるヒト細胞でテロメア、セントロメア及びリボソームＲＮＡコーディング配列（Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＤＮＡ，ｒＤＮＡ）などのゲノム反復配列を精確に標識し、遺伝子座（ＭＵＣ４）をコードすることに用いられることが証明され、そしてヒト細胞ゲノムにおけるｒＤＮＡコピー数が細胞の老化レベルを正確に反映でき、細胞の老化レベルを評価できることを初めて見出し、細胞老化、さらには個体老化の評価に新たな検出指標を提供する。本発明に係るＴＴＡＬＥ技術は、現在科学研究や臨床市場での、精確性、簡便性及び長期有効性を備える生細胞ゲノムの可視化標識技術の欠乏の空白を埋め、ヒト老化や重要疾病の基礎的研究及び臨床診断・治療技術の発展を促進することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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