(57)【要約】  核酸を選択的に放出および／または移動させるためのデバイスおよび方法が提供される。一態様では、デバイスは、使用時、コンポーネント（例えば、圧電または音響コンポーネント）が機械的力を発生して、固体支持体から１つまたは複数の群の核酸を選択的に放出および／または移動させるように、固体支持体上で１つまたは複数の特徴部と整列するように構成されたコンポーネント（例えば、圧電または音響コンポーネント）を含む。固体支持体は、複数の別個の特徴部を含み得、各々の特徴部はその上に、一群（例えば、小滴）の核酸を有する。電源が、コンポーネント（存在する場合、例えば、圧電または音響コンポーネント）に電流を提供して機械的力を発生させるために含まれ得る。デバイスは、アセンブリーの間および／または後に核酸の単一化のために使用することができる。
2020520660.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を選択的に放出するためのデバイスであって、
ａ）使用時、圧電コンポーネントが機械的力を発生して、固体支持体から１つまたは複数の群の核酸を選択的に放出するように、固体支持体上で１つまたは複数の特徴部と整列するように構成された圧電コンポーネントであって、固体支持体が複数の別個の特徴部を含み、各々の特徴部が一群の核酸と会合している、圧電コンポーネント、および
ｂ）圧電コンポーネントに電流を提供して、機械的力を発生させるための電源
を備えるデバイス。
【請求項２】
核酸を選択的に放出するためのデバイスであって、
ａ）複数の別個の特徴部を含み、各々の特徴部が一群の核酸と会合している、固体支持体、
ｂ）固体支持体から１つまたは複数の群の核酸を選択的に放出するように構成された圧電コンポーネント、および
ｃ）圧電コンポーネントに電流を提供して、機械的力を発生させて、１つまたは複数の群の核酸を選択的に放出させるための電源
を備えるデバイス。
【請求項３】
各々の群の核酸が、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドを含む、請求項１または２に記載のデバイス。
【請求項４】
１つまたは複数のオリゴヌクレオチドが、乾燥環境または液体環境中にある、請求項３に記載のデバイス。
【請求項５】
各々の群の核酸が、溶液の小滴である、請求項３に記載のデバイス。
【請求項６】
各々の特徴部が、その上に固定された複数のオリゴヌクレオチドを有する、請求項１または２に記載のデバイス。
【請求項７】
固体支持体が、複数のビーズを含むマイクロアレイまたはマルチウェルプレートである、請求項１または２に記載のデバイス。
【請求項８】
圧電コンポーネントが圧電素子のマトリックスを含み、各々の圧電素子が、特徴部に対応するように構成されている、請求項１または２に記載のデバイス。
【請求項９】
１つまたは複数のオリゴヌクレオチドが、化学、酵素および／またはレーザー開裂を介して、一群の核酸中に遊離する、請求項３に記載のデバイス。
【請求項１０】
光活性リンカーを開裂することによって、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドを一群の核酸中に選択的に遊離させるためのレーザーをさらに備える、請求項９に記載のデバイス。
【請求項１１】
圧電コンポーネントが、単一の圧電素子を含む、請求項１または２に記載のデバイス。
【請求項１２】
単一の圧電素子がニードルである、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項１３】
ニードルを所望の特徴部に動かすように構成された輸送コンポーネントをさらに備える、請求項１２に記載のデバイス。
【請求項１４】
核酸アセンブリーの方法であって、
ａ）複数の別個の特徴部を含み、各々の特徴部が一群の核酸と会合している、第１の固体支持体を用意すること、
ｂ）圧電コンポーネントを使用して、１つまたは複数の群の核酸を、第１の特徴部から第２の特徴部に選択的に放出することであって、第１の特徴部が、第２の特徴部中の第２のオリゴヌクレオチドと配列相補性または重複性を有する第１のオリゴヌクレオチドを含む、放出すること、ならびに
ｃ）第１および第２のオリゴヌクレオチドをアセンブルすること
を含む方法。
【請求項１５】
圧電コンポーネントが圧電素子のマトリックスを含み、各々の圧電素子が、特徴部に対応するように構成されている、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
各々の群の核酸が、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
１つまたは複数のオリゴヌクレオチドが、乾燥環境または液体環境中にある、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
１つまたは複数のオリゴヌクレオチドを、化学、酵素および／またはレーザー開裂を介して、一群の核酸中に遊離させることをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
固体支持体が、複数のビーズを含むマイクロアレイまたはマルチウェルプレートである、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
各々の特徴部が、その上に固定された複数のオリゴヌクレオチドを有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
第１の特徴部および第２の特徴部が、同じ固体支持体上に位置する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
第１の特徴部が第１の固体支持体上に位置し、第２の特徴部が第２の固体支持体上に位置する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
核酸を選択的に放出するためのデバイスであって、
ａ）使用時、コンポーネントが機械的力を発生して、固体支持体から１つまたは複数の群の核酸を選択的に放出するように、固体支持体上で１つまたは複数の特徴部と整列するように構成されたコンポーネントであって、固体支持体が複数の別個の特徴部を含み、各々の特徴部が一群の核酸と会合している、コンポーネント、および
ｂ）コンポーネントに電流を提供して、機械的力を発生させるための電源
を備えるデバイス。
【請求項２４】
核酸を選択的に放出するためのデバイスであって、
ａ）複数の別個の特徴部を含み、各々の特徴部が一群の核酸と会合している、固体支持体、
ｂ）固体支持体から１つまたは複数の群の核酸を選択的に放出するように構成されたコンポーネント、および
ｃ）コンポーネントに電流を提供して、機械的力を発生させて、１つまたは複数の群の核酸を放出させるための電源
を備えるデバイス。
【請求項２５】
コンポーネントが、音響コンポーネントまたは圧電コンポーネントである、請求項２３または２４に記載のデバイス。
【請求項２６】
各々の群の核酸が、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドを含む、請求項２３または２４に記載のデバイス。
【請求項２７】
１つまたは複数のオリゴヌクレオチドが、乾燥環境または液体環境中にある、請求項２６に記載のデバイス。
【請求項２８】
各々の群の核酸が、溶液の小滴である、請求項２６に記載のデバイス。
【請求項２９】
各々の特徴部が、その上に固定された複数のオリゴヌクレオチドを有する、請求項２３または２４に記載のデバイス。
【請求項３０】
固体支持体が、複数のビーズを含むマイクロアレイまたはマルチウェルプレートである、請求項２３または２４に記載のデバイス。
【請求項３１】
コンポーネントが素子のマトリックスを含み、各々の素子が、特徴部に対応するように構成されている、請求項２３または２４に記載のデバイス。
【請求項３２】
１つまたは複数のオリゴヌクレオチドが、化学、酵素および／またはレーザー開裂を介して、一群の核酸中に遊離する、請求項２６に記載のデバイス。
【請求項３３】
光活性リンカーを開裂することによって、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドを一群の核酸中に選択的に遊離させるためのレーザーをさらに備える、請求項３２に記載のデバイス。
【請求項３４】
コンポーネントが、単一の素子を含む、請求項２３または２４に記載のデバイス。
【請求項３５】
単一の素子がニードルである、請求項３４に記載のデバイス。
【請求項３６】
ニードルを所望の特徴部に動かすように構成された輸送コンポーネントをさらに備える、請求項３５に記載のデバイス。
【請求項３７】
核酸アセンブリーの方法であって、
ａ）複数の別個の特徴部を含み、各々の特徴部が一群の核酸と会合している、第１の固体支持体を用意すること、
ｂ）コンポーネントを使用して、１つまたは複数の群の核酸を、第１の特徴部から第２の特徴部に選択的に放出することであって、第１の特徴部が、第２の特徴部中の第２のオリゴヌクレオチドと配列相補性または重複性を有する第１のオリゴヌクレオチドを含む、放出すること、ならびに
ｃ）第１および第２のオリゴヌクレオチドをアセンブルすること
を含む方法。
【請求項３８】
コンポーネントが、音響コンポーネントまたは圧電コンポーネントである、請求項３７に記載のデバイス。
【請求項３９】
コンポーネントが素子のマトリックスを含み、各々の素子が、特徴部に対応するように構成されている、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
各々の群の核酸が、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
１つまたは複数のオリゴヌクレオチドが、乾燥環境または液体環境中にある、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
１つまたは複数のオリゴヌクレオチドを、化学、酵素および／またはレーザー開裂を介して、一群の核酸中に遊離させることをさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
固体支持体が、複数のビーズを含むマイクロアレイまたはマルチウェルプレートである、請求項３７に記載の方法。
【請求項４４】
各々の特徴部が、その上に固定された複数のオリゴヌクレオチドを有する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４５】
第１の特徴部および第２の特徴部が、同じ固体支持体上に位置する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４６】
第１の特徴部が、第１の固体支持体上に位置し、第２の特徴部が、第２の固体支持体上に位置する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４７】
核酸アセンブリーの方法であって、
ａ）複数の別個の特徴部を含み、各々の特徴部が一群の核酸と会合している、第１の固体支持体を用意すること、
ｂ）１つまたは複数の群の核酸を、第１の特徴部から第２の特徴部に選択的に移動させることであって、第１の特徴部が、第２の特徴部中の第２のオリゴヌクレオチドと配列相補性または重複性を有する第１のオリゴヌクレオチドを含む、移動させること、ならびに
ｃ）第１および第２のオリゴヌクレオチドをアセンブルすること
を含む方法。
【請求項４８】
各々の群の核酸が、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
１つまたは複数のオリゴヌクレオチドが、乾燥環境または液体環境中にある、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
１つまたは複数のオリゴヌクレオチドを、化学、酵素および／またはレーザー開裂を介して、一群の核酸中に遊離させることをさらに含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
固体支持体が、複数のビーズを含むマイクロアレイまたはマルチウェルプレートである、請求項４７に記載の方法。
【請求項５２】
各々の特徴部が、その上に固定された複数のオリゴヌクレオチドを有する、請求項４７に記載の方法。
【請求項５３】
第１の特徴部および第２の特徴部が、同じ固体支持体上に位置する、請求項４７に記載の方法。
【請求項５４】
第１の特徴部が第１の固体支持体上に位置し、第２の特徴部が第２の固体支持体上に位置する、請求項４７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、２０１７年５月２２日に出願された米国特許仮出願第６２／５０９，４２６号の出願日の利益を主張し、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本明細書において開示されるデバイスおよび方法は、特に多重核酸アセンブリーの間の核酸操作に関する。
【背景技術】
【０００３】
組換えおよび合成核酸は、研究、産業、農業および医薬において多くの用途を有する。組換えおよび合成核酸は、酵素、抗体、増殖因子、受容体、および種々の医療、産業または農業目的のために使用され得る他のポリペプチドを含む大量のポリペプチドを発現させ、得るために使用することができる。組換えおよび合成核酸はまた、改変された細菌、酵母、哺乳動物、植物および他の生物を含む遺伝子組換え生物を作出するために使用することができる。遺伝子組換え生物は、研究において（例えば、疾患の動物モデルとして、生物学的プロセスの理解のためのツールとしてなど）、産業において（例えば、タンパク質発現のための宿主生物として、工業製品を生成するためのバイオリアクターとして、環境修復のためのツールとして、産業用途での天然化合物の単離または改変のためなど）、農業において（例えば、収率が増加されたまたは疾患もしくは環境ストレスへの抵抗が増加された改良作物など）、および他の用途のために使用され得る。組換えおよび合成核酸はまた、治療用組成物として（例えば、遺伝子発現を改変するため、遺伝子治療のためなど）、または診断用ツールとして（例えば、疾患の状態のためのプローブとしてなど）使用され得る。
【０００４】
実際、核酸合成は、合成生物学の重要な領域である。米国エネルギー省（ＤＯＥ）によると、２０１３年７月のその議会報告書において、「合成生物学」とは、「新しい生物部分およびシステムの設計および大規模な構築、ならびに目的に合わせた既存の天然生物システムの再設計であり、工学およびコンピューター支援設計手法を生物学的研究と統合するものだ」としている。ＤＮＡ合成およびアセンブリーは、ＤＯＥの報告書における合成生物学の継続的発展のための基本的な課題として認識されている。具体的には、「合成生物学における実験の主要な限界のうちの１つは、大きなＤＮＡコンストラクトの合成およびアセンブリーであり、これは費用および時間がかかり、誤りが起きやすいままである。新しいバイオプロダクションシステムの実用化は、遺伝子設計を迅速、安価かつ正確に合成およびアセンブルするための新しい手法を必要とする」。
【０００５】
多数の技術が、既存の核酸（例えば、天然に存在する核酸）を改変して組換え核酸を生成するために開発されている。例えば、核酸増幅、変異誘発、ヌクレアーゼ消化、ライゲーション、クローニングおよび他の技術の組合せを使用して、多くの様々な組換え核酸を生成することができる。化学合成ポリヌクレオチドは、多くの場合、核酸増幅、変異誘発およびクローニングのためのプライマーまたはアダプターとして使用される。
【０００６】
固体支持体上でのデノボ核酸合成のための技術もまた開発されている。例えば、所定の核酸配列の短鎖オリゴヌクレオチドを、通常の支持体上にインサイチュ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）で合成することができ、各々の所定の核酸配列は、支持体上の分離したまたは別個の特徴部（またはスポット）上で合成される。
【０００７】
デノボ核酸アセンブリーのための技術もまた利用可能であり、これにより、核酸が作製（例えば、支持体上で化学合成）され、アセンブルされて、目的のより長い標的核酸が生成される。例えば、オリゴヌクレオチドを、研究、産業、農業および／または医薬において使用できるより大きな合成核酸にアセンブルするための様々な多重アセンブリー技術が開発されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、近年の発展にも関わらず、現在利用可能な支持体に基づく合成およびアセンブリー技術の１つの限界は、目的の１つまたは複数の標的を同定し選択する能力である。そのため、高精度、高選択性の核酸単一化（ｓｉｎｇｕｌａｔｉｏｎ）およびアセンブリー技術が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
一態様では、核酸を選択的に放出および／または移動させるためのデバイスであって、使用時、圧電コンポーネントが機械的力を発生して、固体支持体から１つまたは複数の群の核酸（ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ  ｖｏｌｕｍｅｓ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）を選択的に放出するように、固体支持体上で１つまたは複数の特徴部と整列するように構成された圧電コンポーネントを備えるデバイスが提供される。固体支持体は、複数の別個の特徴部を含み、各々の特徴部は、その上に一群の核酸を有するか、または一群の核酸と会合している。電源により、圧電コンポーネントに電流が提供されて、機械的力が発生する。
【００１０】
一態様では、核酸を選択的に放出するためのデバイスであって、ａ）使用時、圧電コンポーネントが機械的力を発生して、固体支持体から１つまたは複数の群の核酸を選択的に放出するように、固体支持体上で１つまたは複数の特徴部と整列するように構成された圧電コンポーネントであって、固体支持体が複数の別個の特徴部を含み、各々の特徴部がその上に一群の核酸を有するか、または一群の核酸と会合している、圧電コンポーネント、およびｂ）圧電コンポーネントに電流を提供して、機械的力を発生させるための電源を備えるデバイスが提供される。
【００１１】
別の態様では、核酸を選択的に放出するためのデバイスであって、（ａ）複数の別個の特徴部を含み、各々の特徴部が一群の核酸をその上に有するか、または一群の核酸と会合している、固体支持体、（ｂ）固体支持体から１つまたは複数の群の核酸を選択的に放出するように構成された圧電コンポーネント、および（ｃ）圧電コンポーネントに電流を提供して、機械的力を発生させて、１つまたは複数の群の核酸を放出させるための電源を備えるデバイスが提供される。
【００１２】
本明細書において開示されるデバイスのうちの任意のものの種々の実施形態では、デバイスによって選択的に放出された一群の核酸は、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドを含み得る。種々の実施形態では、デバイスによって選択的に放出された一群の核酸は、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドを含有し得る。１つまたは複数のオリゴヌクレオチドは、乾燥環境（例えば、固体ビーズと会合している）、または液体環境（例えば、水溶液中）中にあり得る。１つまたは複数のオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の特徴部上に最初に固定（共有結合または非共有結合により）され、化学、酵素および／またはレーザー開裂を介して、一群の核酸中に遊離し得る。一実施形態では、光活性リンカーを開裂することによって、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドを一群の核酸中に選択的に遊離させるために、レーザーが使用され得る。
【００１３】
一部の実施形態では、デバイスの固体支持体は、その上に固定された複数のオリゴヌクレオチドを有し得る。例えば、様々な配列を有する各々のオリゴヌクレオチドは、別個のアドレッサブルな特徴部上にあり得る。一部の実施形態では、各々の特徴部は、その上に固定された複数のオリゴヌクレオチドを含有し得る。一部の実施形態では、固体支持体は、複数のビーズを含有するマイクロアレイまたはマルチウェルプレートであり得る。
【００１４】
一部の実施形態では、圧電コンポーネントは、圧電素子のマトリックスを含み、各々の圧電素子は、特徴部に対応するように構成されていてもよい。
【００１５】
ある特定の実施形態では、圧電コンポーネントは、単一の圧電素子を含む。一部の実施形態では、単一の圧電素子は、ニードルであり得る。デバイスは、ニードルを所望の特徴部に動かすように構成された輸送コンポーネントをさらに備え得る。
【００１６】
さらなる態様では、核酸アセンブリーのための方法であって、（ａ）複数の別個の特徴部を含み、各々の特徴部がその上に一群の核酸を有するか、または一群の核酸と会合している、第１の固体支持体を用意すること、（ｂ）圧電コンポーネントを使用して、１つまたは複数の群の核酸を、第１の特徴部から第２の特徴部に選択的に放出する（および／または移動させる）ことであって、第１の特徴部が、第２の特徴部中の第２のオリゴヌクレオチドと相補的である（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）かまたは重複する配列を有する第１のオリゴヌクレオチドを含む、放出すること、ならびに（ｃ）第１および第２のオリゴヌクレオチドをアセンブルすることを含む、方法が提供される。
【００１７】
一部の実施形態では、圧電コンポーネントは、圧電素子のマトリックスを含み、各々の圧電素子は、特徴部に対応するように構成されていてもよい。一部の実施形態では、圧電コンポーネントは、圧電素子のマトリックスを含み、各々の圧電素子は、特徴部に対応するように構成されている。一部の実施形態では、各々の群の核酸は、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、各々の群の核酸は、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドを含有し得る。１つまたは複数のオリゴヌクレオチドは、乾燥環境（例えば、固体ビーズと会合している）、または液体環境（例えば、水溶液中）中にあり得る。一部の実施形態では、各々の特徴部は、その上に固定された複数のオリゴヌクレオチドを含有し得る。１つまたは複数のオリゴヌクレオチドは、化学、酵素および／またはレーザー開裂を介して、一群の核酸中に遊離し得る。一部の実施形態では、第１の特徴部および第２の特徴部は、同じ固体支持体上に位置し得る。ある特定の実施形態では、第１の特徴部は第１の固体支持体上に位置し得、第２の特徴部は第２の固体支持体上に位置し得る。
【００１８】
さらなる態様では、核酸を選択的に放出するためのデバイスであって、ａ）使用時、コンポーネントが機械的力を発生して、固体支持体から１つまたは複数の群の核酸を選択的に放出するように、固体支持体上で１つまたは複数の特徴部と整列するように構成されたコンポーネントであって、固体支持体が複数の別個の特徴部を含み、各々の特徴部が一群の核酸と会合している、コンポーネント、およびｂ）コンポーネントに電流を提供して、機械的力を発生させるための電源を備えるデバイスが提供される。
【００１９】
さらなる態様では、核酸を選択的に放出するためのデバイスであって、ａ）複数の別個の特徴部を含み、各々の特徴部が一群の核酸と会合している、固体支持体、ｂ）固体支持体から１つまたは複数の群の核酸を選択的に放出するように構成されたコンポーネント、およびｃ）コンポーネントに電流を提供して、機械的力を発生させて、１つまたは複数の群の核酸を放出させるための電源を備えるデバイスが提供される。一部の実施形態では、コンポーネントは、１つまたは複数の特徴部と相互作用し、機械的変位により１つまたは複数の群の核酸の移動を実行するように構成されている。一部の実施形態では、コンポーネントは、音響コンポーネントまたは圧電コンポーネントである。
【００２０】
一部の実施形態では、各々の群の核酸は、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドは、乾燥環境または液体環境中にある。一部の実施形態では、各々の群の核酸は、溶液の小滴である。
【００２１】
一部の実施形態では、各々の特徴部は、その上に固定された複数のオリゴヌクレオチドを有する。ある特定の実施形態では、固体支持体は、複数のビーズを含むマイクロアレイまたはマルチウェルプレートである。一部の実施形態では、コンポーネントは、素子のマトリックスを含む、各々の素子は、特徴部に対応するように構成されている。
【００２２】
一部の実施形態では、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドは、化学、酵素および／またはレーザー開裂を介して、一群の核酸中に遊離する。
【００２３】
一部の実施形態では、デバイスは、光活性リンカーを開裂することによって、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドを一群の核酸中に選択的に遊離させるためのレーザーを備える。一部の実施形態では、コンポーネントは、単一の素子を含む。ある特定の実施形態では、単一の素子は、ニードルである。
【００２４】
一部の実施形態では、デバイスは、ニードルを所望の特徴部に動かすように構成された輸送コンポーネントを備える。
【００２５】
一態様では、核酸アセンブリーの方法であって、ａ）複数の別個の特徴部を含み、各々の特徴部が一群の核酸と会合している、第１の固体支持体を用意すること、ｂ）コンポーネントを使用して、１つまたは複数の群の核酸を、第１の特徴部から第２の特徴部に選択的に放出することであって、第１の特徴部が、第２の特徴部中の第２のオリゴヌクレオチドと配列相補性または重複性を有する第１のオリゴヌクレオチドを含む、放出すること、ならびにｃ）第１および第２のオリゴヌクレオチドをアセンブルすることを含む方法が提供される。一部の実施形態では、コンポーネントは、１つまたは複数の特徴部と相互作用し、機械的変位により１つまたは複数の群の核酸の移動を実行するように構成されている。ある特定の実施形態では、コンポーネントは、音響コンポーネントまたは圧電コンポーネントである。一部の実施形態では、コンポーネントは、素子のマトリックスを含み、各々の素子は、特徴部に対応するように構成されている。
【００２６】
ある特定の実施形態では、各々の群の核酸は、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドは、乾燥環境または液体環境中にある。
【００２７】
具体的な実施形態では、方法は、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドを、化学、酵素および／またはレーザー開裂を介して、一群の核酸中に遊離させることを含む。一部の実施形態では、固体支持体は、複数のビーズを含むマイクロアレイまたはマルチウェルプレートである。ある特定の実施形態では、各々の特徴部は、その上に固定された複数のオリゴヌクレオチドを有する。
【００２８】
一部の実施形態では、第１の特徴部および第２の特徴部は、同じ固体支持体上に位置する。ある特定の実施形態では、第１の特徴部は、第１の固体支持体上に位置し、第２の特徴部は、第２の固体支持体上に位置する。
【００２９】
さらなる態様では、核酸アセンブリーの方法であって、ａ）複数の別個の特徴部を含み、各々の特徴部が一群の核酸と会合している、第１の固体支持体を用意すること、ｂ）１つまたは複数の群の核酸を、第１の特徴部から第２の特徴部に選択的に移動させることであって、第１の特徴部が、第２の特徴部中の第２のオリゴヌクレオチドと配列相補性または重複性を有する第１のオリゴヌクレオチドを含む、移動させること、ならびにｃ）第１および第２のオリゴヌクレオチドをアセンブルすることを含む方法。
【００３０】
一部の実施形態では、各々の群の核酸は、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドは、乾燥環境または液体環境中にある。ある特定の実施形態では、方法は、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドを、化学、酵素および／またはレーザー開裂を介して、一群の核酸中に遊離させることをさらに含む。
【００３１】
一部の実施形態では、固体支持体は、複数のビーズを含むマイクロアレイまたはマルチウェルプレートである。一部の実施形態では、各々の特徴部は、その上に固定された複数のオリゴヌクレオチドを有する。ある特定の実施形態では、第１の特徴部および第２の特徴部は、同じ固体支持体上に位置する。具体的な実施形態では、第１の特徴部は第１の固体支持体上に位置し、第２の特徴部は第２の固体支持体上に位置する。
【００３２】
本開示の実施形態を、添付の図を参照してさらに説明する。図は必ずしも縮尺通りに示されるとは限らず、その代わり、一般に、本開示の実施形態の原理の例示は強調される。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は、一実施形態における、２チップ多重核酸アセンブリーを例示する。
【図２】図２Ａは、伸長されたオリゴヌクレオチドのアセンブリーのための例示的な方法を例示する。            図２Ｂは、伸長されたオリゴヌクレオチドのアセンブリーのための例示的な方法を例示する。
【図３】図３は、一実施形態における、完全または部分的にアセンブルされた標的核酸および選択された標的核酸の単一化を例示する。
【図４】図４は、伸長されたオリゴヌクレオチドおよび／または完全もしくは部分的にアセンブルされた標的核酸のアセンブリーのための例示的な方法を例示する。
【図５】図５は、伸長されたオリゴヌクレオチドおよび／または完全もしくは部分的にアセンブルされた標的核酸のアセンブリーのための例示的な方法を例示する。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
上述の図は本開示の実施形態を示しているが、議論において述べられるように他の実施形態もまた企図される。本開示は、限定ではなく代表例として、例示的な実施形態を提示している。本開示の実施形態の原理の範囲および趣旨に含まれる多数の他の改変例および実施形態が当業者によって考案され得る。
【００３５】
本明細書において開示されるデバイスおよび方法は、特に多重核酸アセンブリーの間の核酸操作に関する。一部の実施形態では、圧電に基づく単一化を使用して、多重核酸アセンブリーの前、間および／または後に、例えば、固体支持体上で合成および／またはこれに固定されていてもよい合成オリゴヌクレオチドから１つまたは複数の標的を選択的に取り出すことができる。一部の実施形態では、多重核酸アセンブリーの前、間および／または後に、例えば、本明細書において記載される方法により固体支持体（例えば、マイクロアレイ、チップおよび／またはビーズ）上で合成および／またはこれに固定されていてもよい合成オリゴヌクレオチドから標的を脱会合（例えば、エアロゾル脱会合または液体脱会合）するための任意の方法を使用して、それぞれの群の核酸中の標的を単一化または単離することができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の別個の位置（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０またはそれよりも多い特徴部またはアドレス、固体支持体上の最大ですべての特徴部、およびすべての特徴部を含む）から１つまたは複数の（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０またはそれよりも多い）オリゴヌクレオチドが一度に脱会合される。ある特定の場合、選択されたオリゴヌクレオチドのみが固体支持体から脱会合され、他のオリゴヌクレオチドは結合したままである。非限定例として、液体脱会合を使用して、オリゴヌクレオチドを支持体から選択された位置で脱会合することができ、これらの脱会合されたオリゴヌクレオチドは、任意の手段（例えば、圧電または音響コンポーネントを使用することによって、機械的変位を実行する任意の手段を使用した移動、または別の固体支持体との接触などの別の方法を使用して移動させることによって）によって別の支持体（第２の固体支持体）または同じ支持体上の別の特徴部に移動させることができる。
【００３６】
定義
便宜上、本明細書、実施例および添付の特許請求の範囲で用いられるある特定の用語をここでまとめる。他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、本開示が属する分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味を有する。
【００３７】
冠詞「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、本明細書において、その冠詞の文法的対象のうちの１つまたは１つよりも多く（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用される。例として、「１つの要素」は、１つの要素または１つよりも多い要素を意味する。
【００３８】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、２０％以内、より好ましくは１０％以内、最も好ましくは５％以内を意味する。「実質的に」という用語は、５０％超、好ましくは８０％超、最も好ましくは９０％または９５％超を意味する。
【００３９】
本明細書で使用される場合、「複数の」は、１よりも多い、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０もしくはそれよりも多い、例えば、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００もしくはそれよりも多い、またはその間任意の整数を意味する。
【００４０】
「アセンブリー」または「アセンブルする」は、短いＤＮＡ配列（構築オリゴヌクレオチド）を、特定の順序で結合して、より長いＤＮＡ配列（標的オリゴヌクレオチド）を形成するプロセスを意味する。「サブアセンブリー」、「サブアセンブリーオリゴヌクレオチド」、「サブコンストラクトオリゴヌクレオチド」または「サブコンストラクト」は、構築オリゴヌクレオチドのサブセットが結合して、最終標的の一部分であるサブコンストラクトを形成する中間工程または生成物を意味する。「サブアセンブルする」は、構築オリゴヌクレオチドのサブセットのアセンブリーにより「サブアセンブリー」または「サブコンストラクト」を作ることを意味する。
【００４１】
「ＣＥＬ」または「付着末端ライゲーション」は、ＤＮＡ断片を、互いに少なくとも部分的に相補的である付着末端を使用して、事前に設計した順序で連結するプロセスを指す。付着末端は、制限酵素消化によって生成することができ、または例えば、固体支持体上で直接合成することができる。
【００４２】
本明細書で使用される場合、「チップ」は、多くのオリゴヌクレオチドが平面に結合したＤＮＡマイクロアレイを指す。チップ上のオリゴヌクレオチドは、任意の長さであってよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、約１０〜１，０００、２０〜８００、５０〜５００、１００〜３００または約２００ヌクレオチド、またはより長いもしくはより短い、またはその間の任意の数もしくは範囲である。オリゴヌクレオチドは、一本鎖であっても、二本鎖であってもよい。
【００４３】
本明細書で使用される場合、「相補的」または「相補性」は、２つの核酸配列が、標準のＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ相補性規則に従って、互いに、少なくとも部分的に塩基対合することが可能であることを意味する。例えば、２つの粘着性の末端は、部分的に相補的であり得、ここで、１つのオーバーハングの領域は別のオーバーハングの領域またはすべての別のオーバーハングで補完されアニーリングされる。ギャップは、存在する場合、ポリメラーゼおよび単一ヌクレオチドの存在下で鎖延長、続いてまたは同時にライゲーション反応によって埋められ得る。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「コンストラクト」は、完全標的配列を含むＤＮＡ配列を指す。一般に、コンストラクトはアセンブルされていることが含意される。「サブコンストラクト」は、典型的には、階層式アセンブリーの間の中間生成物である、完全標的配列の一部分を意味する。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「特徴部」は、固体支持体、例えば、チップ、マルチウェルトレイまたはマイクロアレイ上の別個の位置（またはスポット）を指す。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、特徴部上で合成するおよび／またはこれに固定することができる。別個の特徴部の配置構成は、さらなる反応のためにオリゴヌクレオチドまたは相補的オリゴヌクレオチドを保存、ルーティング、増幅、遊離およびそうでなければ操作するために、固体支持体上に提示され得る。一部の実施形態では、各々の特徴部は、アドレッサブルであり、つまり、各々の特徴部は、支持体上の事前に記録された特定の所定の位置（すなわち、「アドレス」）で位置決めされる。したがって、各々のオリゴヌクレオチドは、支持体上の既知の定められた位置に局在する。各々のオリゴヌクレオチドの配列は、支持体上のその位置から決定することができる。特徴部のサイズは、各小滴が互いから分離したままであるミクロ容量（例えば、１〜１０００マイクロリットル、１〜１０００ナノリットルまたは１〜１０００ピコリットル）の小滴の特徴部上での形成が可能であるように選択することができる。本明細書で使用される場合、特徴部は、必須ではないが典型的には、２つの隣接する特徴部間の小滴が融合しないことを確実にするために特徴部間の空間によって分離されている。特徴部間は、典型的には、その表面にオリゴヌクレオチドを有さず、内部空間に対応する。一部の実施形態では、特徴部および特徴部間は、それらの親水性または疎水性特性が異なり得る。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「核酸」、「核酸配列」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」、「遺伝子」または本明細書で使用される通りの他の文法的等価物は、一緒に共有結合した少なくとも２つのヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはその類似体を意味する。ポリヌクレオチドは、例えば、１０、２０、５０、１００、２００、３００、５００、１０００などを含む任意の長さのポリマーであるが、これらの具体例に限定されない。本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」は、少なくとも２つの共有結合したヌクレオチド残基を含む核酸分子であり得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１０〜１，０００ヌクレオチド長であり得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、１０〜５００ヌクレオチド長、または５００〜１，０００ヌクレオチド長であり得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、約２０〜約８００ヌクレオチド長（例えば、約２０〜４００、約４００〜８００ヌクレオチド長）であり得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、約５０〜約５００ヌクレオチド長（例えば、約５０〜２５０ヌクレオチド長、または約２５０〜５００ヌクレオチド長）であり得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、約１００〜約３００ヌクレオチド長（例えば、約１００〜１５０ヌクレオチド長、または約１５０〜３００ヌクレオチド長）であり得る。しかしながら、より短いまたはより長いオリゴヌクレオチドを使用してもよい。オリゴヌクレオチドは、一本鎖であっても、二本鎖核酸であってもよい。本明細書で使用される場合、「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、交換可能に使用され、天然に存在するまたは天然に存在しない合成高分子形態のヌクレオチドを指す。一般に、「核酸」という用語は、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」の両方を含み、「ポリヌクレオチド」は比較的長い核酸（例えば、１，０００ヌクレオチド超、５，０００ヌクレオチド超、１０，０００ヌクレオチド超など）を指し得、「オリゴヌクレオチド」は比較的短い核酸（例えば、１０〜５００ヌクレオチド、２０〜４００ヌクレオチド、４０〜２００ヌクレオチド、５０〜１００ヌクレオチドなど）を指し得る。
【００４７】
本開示の核酸分子は、例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）分子を形成する天然に存在するヌクレオチドから形成することができる。あるいは、核酸は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはロックド核酸（ＬＮＡ）などにおけるように、それらの特性を変更する構造的な修飾を含み得る。天然に存在するまたは人工塩基を用いた核酸分子の固相合成は、当技術分野において公知である。用語は、等価物、ヌクレオチド類似体から作製された、記載されている実施形態に適用可能であるＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかの類似体、一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチドを含むと理解されるべきである。本開示において有用なヌクレオチドとしては、例えば、天然に存在するヌクレオチド（例えば、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド）、ヌクレオチドの天然または合成修飾体および人工塩基が挙げられる。一部の実施形態では、核酸の配列は、天然に存在しない（例えば、ｃＤＮＡもしくは相補的ＤＮＡ配列、または人工設計配列）。
【００４８】
核酸ヌクレオシド中のヌクレオシドは、ホスホジエステル結合によって連結され得る。核酸が文字の配列で表される場合、それは必ず、左から右に、ヌクレオシドの５’から３’の順序であると理解されることになる。ＩＵＰＡＣ命名法に従い、「Ａ」はアデニンを示し、「Ｃ」はシトシンを示し、「Ｇ」はグアニンを示し、「Ｔ」はチミンを示し、「Ｕ」はリボヌクレオシド、ウリジンを示す。さらに、１つよりも多い種類のヌクレオチドがその位置にあり得る場合に使用される文字も存在する：「Ｗ」（すなわち、弱い相互作用、２Ｈ結合）はＡまたはＴを表し、「Ｓ」（強い相互作用、３Ｈ結合）はＧまたはＣを表し、「Ｍ」（アミノについて）はＡまたはＣを表し、「Ｋ」（ケトについて）はＧまたはＴを表し、「Ｒ」（プリンについて）はＡまたはＧを表し、「Ｙ」（ピリミジンについて）はＣまたはＴを表し、「Ｂ」はＣ、ＧまたはＴを表し、「Ｄ」はＡ、ＧまたはＴを表し、「Ｈ」はＡ、Ｃ、またはＴを表し、「Ｖ」はＡ、ＣまたはＧを表し、「Ｎ」は任意の塩基Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ（Ｕ）を表す。核酸配列は、４つの天然デオキシヌクレオチドに限定されるのではなく、リボヌクレオシドおよび非天然ヌクレオチドも含み得ることが理解される。ヌクレオチド配列中の「／」または括弧書きで示されるヌクレオチドは、代替のヌクレオチド、例えば、ＤＮＡ配列中でのＴに代えてＲＮＡ配列中では代替のＵを指す。したがって、Ｕ／ＴまたはＵ（Ｔ）は、ＵまたはＴのいずれかであり得る１つのヌクレオチド位置を示す。同様に、Ａ／Ｔは、ヌクレオチドＡまたはＴを指し、Ｇ／ＣはヌクレオチドＧまたはＣを指す。ＵおよびＴ間の機能的同一性に起因して、本明細書におけるＵまたはＴへのいずれの言及も、ＴまたはＵのもう一方への開示としてもみなされることになる。例えば、配列ＵＵＣＧ（ＲＮＡでの）への言及はまた、配列ＴＴＣＧ（対応するＤＮＡでの）の開示としても理解されることになる。簡潔さだけのために、これらの選択肢のうちの１つのみが本明細書において記載される。相補的ヌクレオチドまたは塩基は、ＡおよびＴ（またはＵ）、ＧおよびＣ、またはＧおよびＵ（ゆらぎ塩基対）などの塩基対合可能なものである。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「圧電コンポーネント」または「圧電素子」は、一群の核酸を１つの位置から別の位置に動かすのに必要な機械的力を発生させるために圧電推進力を使用するデバイスまたはデバイスの一部分を指す。一部の実施形態では、そうして発生した機械的力は、それにより標的核酸が固体支持体に結合している開裂可能リンカーにおいて標的核酸を開裂するのに十分であり得る。一般的に述べると、ある特定の結晶またはセラミックが、機械的力の存在下で電場を発生し得る特性を示す。これらの材料はまた逆圧電効果も受け得、それによって、それらは、印加された電場から生じた内部機械歪みを発生する。核酸の射出に使用されるのは後者の効果である。圧電コンポーネントは、圧電素子のボード、グリッドまたはマトリックスの形態であり得る。圧電コンポーネントはまた、ノズルまたはニードルなどの単一の圧電素子の形態であってもよい。
【００５０】
本明細書で使用される場合、「固体支持体」、「支持体」および「基材」は、交換可能に使用され、核酸などのポリマーが合成または固定される多孔質または非多孔質固体（例えば、溶媒可溶性）材料を指す。本明細書で使用される場合、「多孔質」は、材料が、実質的に均一な直径（例えば、ｎｍの範囲の）を有する細孔を含有することを意味する。多孔質材料としては、紙、合成フィルターなどを挙げることができるが、これらに限定されない。そのような多孔質材料において、反応は細孔内で起こり得る。支持体は、ピン、ストリップ、プレート、ディスク、ロッド、曲管、円柱状構造または粒子（ビーズ、ナノ粒子などを含むがこれらに限定されない）などの多数の形状のうちの任意の１つを有し得る。一部の実施形態では、支持体は平面（例えば、チップ）である。支持体は、可変幅を有し得る。固体支持体は、マイクロアレイなどの組織化されたマトリックスまたはネットワークのウェルであり得る。一部の実施形態では、支持体は、１つまたは複数のマルチウェル（ｍｕｌｔｉｗａｌｌ）プレート中に位置決めされてもよい複数のビーズまたは粒子を含み得る。
【００５１】
支持体は、親水性である、または親水性にすることができ得る。支持体としては、無機粉末、例えば、シリカ、硫酸マグネシウムおよびアルミナ；天然高分子材料、特にセルロース系材料およびセルロース由来の材料、例えば、繊維含有紙、例えば、フィルター紙、クロマトグラフ紙など；合成または修飾された天然に存在するポリマー、例えば、ニトロセルロース、酢酸セルロース、ポリ（塩化ビニル）、ポリアクリルアミド、架橋デキストラン、アガロース、ポリアクリレート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（４−メチルブテン）、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリ（エチレンテレフタレート）、ナイロン、ポリ（ビニルブチレート）、フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）膜、ガラス、制御細孔ガラス、磁性制御細孔ガラス、セラミック、金属などを挙げることができるがこれらに限定されず、それら自体で、または本明細書に列挙したものなどであるがこれらに限定されない他の材料と組み合わせて使用される。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「アレイ」という用語は、さらなる反応のためにオリゴヌクレオチドまたは相補的オリゴヌクレオチドを保存、ルーティング、増幅および遊離させるための別個の特徴部の配置構成を指す。アレイは、平面であり得る。ある実施形態では、支持体またはアレイは、アドレッサブルであり得る。アドレッサブルな支持体またはアレイにより、小滴などの個々の単離容量の直接制御が可能になり得る。
【００５３】
本明細書で使用される場合、「固定」という用語は、その５’または３’末端により結合し得る、固体支持体に結合したオリゴヌクレオチドを指す。支持体に結合したオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド配列（例えば、変性結合配列）またはリンカー（例えば、光活性リンカーまたは化学的リンカー）を介してチップ上に固定され得る。３’末端によって、５’末端への下流方向の配列が意味され、５’末端によって、３’末端への上流方向の配列が意味されることを認識されたい。例えば、オリゴヌクレオチドは、配列反応に関与しないヌクレオチド配列またはリンカーを介してチップ上に固定され得る。特定の固定方法は、Nimse et al., Sensors 2014, 14, 22208-22229によって概説されており、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００５４】
本明細書で使用される場合、「化学開裂」という用語は、化学開裂または分解を受けやすい不安定連結を開裂または分解し、したがって、固定されたオリゴヌクレオチドを解き放つことにより、固定されたオリゴヌクレオチドを遊離させることを指す。例えば、連結の領域は、局所環境のｐＨの変化に反応して化学修飾されて加水分解または分解される領域を含有し得る。特定の化学開裂性リンカーはLeriche et al., Bioorganic and Medicinal Chemistry 20 (2012) 571-582によって概説されており、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。非限定例として、オリゴヌクレオチドは、３’末端ヌクレオチド残基の３’−Ｏを、気体アンモニア、水酸化アンモニウム水溶液、メチルアミン水溶液またはそれらの混合物を使用してユニバーサルリンカーに結合させるＰ−Ｏ結合の加水分解性開裂によって、固体支持体上の１つまたは複数の特徴部から遊離し得る。
【００５５】
本明細書で使用される場合、「酵素開裂」という用語は、酵素分解を受けやすい領域を含有する不安定結合を開裂または分解し、したがって、固定されたオリゴヌクレオチドを解き放つことにより、固定されたオリゴヌクレオチドを遊離させることを指す。例示的な開裂可能な基としては、ＴＥＶプロテアーゼ、トリプシン、トロンビン、カテプシンＢ、カテプシン（ｃａｔｈｅｓｐｉｎ）Ｄ、カテプシンＫ、カスパーゼ１およびメタロプロテイナーゼのマトリックスなどのプロテアーゼにより開裂可能なペプチド配列、ならびにホスホジエステル、リン脂質、エステルおよびβ−ガラクトース基などの基が挙げられるが、これらに限定されない。特定の酵素開裂性リンカーは、Leriche et al., Bioorganic and Medicinal Chemistry 20 (2012) 571-582によって概説されており、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。さらに、連結は、制限酵素による開裂を受けやすい核酸配列を含有し得る。制限酵素開裂部位の例としては、一般的な制限酵素、例えば、ＡａｔＩ、ＡａｔＩＩ、ＡｃｃＩ、ＡｆｌＩＩ、ＡｌｕＩ、Ａｌｗ４４Ｉ、ＡｐａＩ、ＡｓｅＩ、ＡｖａＩ、ＢａｍＨＩ、ＢａｎＩ、ＢａｎＩＩ、ＢａｎＩＩＩ、ＢｂｒＰＩ、ＢｃｌＩ、ＢｆｒＩ、ＢｇｌＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢｓｉＷＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｓＨＩＩ、ＢｓｔＥＩＩ、ＢｓｔＸＩ、Ｃｆｒ９Ｉ、Ｃｆｒ１０Ｉ、Ｃｆｒｌ３Ｉ、ＣｓｐＩ、Ｃｓｐ４５Ｉ、ＤｄｅＩ、ＤｒａＩ、Ｅｃｏ４７Ｉ、Ｅｃｏ４７ＩＩＩ、Ｅｃｏ５２Ｉ、Ｅｃｏ８ｌＩ、Ｅｃｏ１０５Ｉ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＩＩ、ＥｃｏＲＶ、ＥｃｏＴ２２Ｉ、ＥｈｅＩ、ＦｓｐＩ、ＨａｅＩＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＨｈａＩ、Ｈｉｎ１Ｉ、ＨｉｎｃＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＨｉｎｆＩ、ＨｐａＩ、ＨｐａＩＩ、ＫｐｎＩ、ＭｂｏＩＩ、ＭｌｕＩ、ＭｒｏＩ、ＭｓｃＩ、ＭｓｐＩ、ＭｖａＩ、ＮａｅＩ、ＮａｒＩ、ＮｃｉＩ、ＮｃｏＩ、ＮｈｅＩ、ＮｏｔＩ、ＮｒｕＩ、ＮｓｐＶ、ＰａｃＩ、ＰｐｕＭＩ、ＰｓｔＩ、ＰｖｕＩ、ＰｖｕＩＩ、ＲｓａＩ、ＳａｃＩ、ＳａｃＩＩ、ＳａｌＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、Ｓａｕ９６Ｉ、ＳｃａＩ、ＳｃｒＦＩ、ＳｆｉＩ、ＳｍａＩ、ＳｐｅＩ、ＳｐｈＩ、ＳｒｆＩ、ＳｓｐＩ、ＴａｑＩ、ＴｓｐＥＩ、ＸｂａＩおよびＸｈｏＩによって認識されるものが挙げられるが、これらに限定されない。当技術分野で公知の他の制限酵素も、使用することができる。
【００５６】
本明細書で使用される場合、「光活性リンカーの開裂」という用語は、レーザーなどの光からの光および／または熱を受けやすい不安定な連結を開裂または分解し、したがって、固定されたオリゴヌクレオチドを解き放つことにより、固定されたオリゴヌクレオチドを遊離させることを指す。例えば、連結の領域は、連結へのレーザーの適用の結果として熱によって分解され得る。他の光（ｌｉｇｈｔ）または光（ｐｈｏｔｏ）開裂性基としては、２−ニトロベンジル誘導体、フェナシルエステル、８−キノリニルベンゼンスルホネート、クマリン、ホスホトリエステル、ビス−アリールヒドラゾンおよびビマンビチオプロピオン酸誘導体が挙げられる。特定の光活性性リンカーは、Leriche et al., Bioorganic and Medicinal Chemistry 20 (2012) 571-582によって概説されており、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００５７】
「標的」または「標的オリゴヌクレオチド」は、本明細書において開示される１つまたは複数の方法を使用して、同定、合成および／またはアセンブルされることになる既知ヌクレオチド配列（例えば、顧客に指示された通りの）の核酸を意味する。一部の実施形態によると、標的核酸配列は、コンピューター支援方式で設計および／または分析することができて、分解された二本鎖または一本鎖オリゴヌクレオチドのセットが生成される。本明細書で使用される場合、「分解」は、標的核酸の配列が、例えば、コンピューター支援方式で表示されて、標的核酸を一緒に含む一連の隣接する連続構築断片を同定することを意味する。隣接する構築断片は、一本鎖または二本鎖であり得、適切な数（例えば、３〜２０、３〜３０、３〜４０、３〜５０、４〜２０、４〜３０、４〜４０、４〜５０、５〜２０、５〜３０、５〜４０、５〜５０または別の適切な数）のヌクレオチドだけ互いに重複してアセンブリーを促進し得る。
【００５８】
本明細書で使用される場合、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する」、「含有する」および「関与する」、ならびにそれらの変化形は、それらの後に列挙された項目およびそれらの等価物だけでなく、さらなる項目も包含することを意味する。「からなる」は、限定された範囲の要素または特徴部に関するクローズエンドとして理解されることになる。「から本質的になる」は、範囲を示された要素または工程に限定するが、特許請求される発明の基本的かつ新規の特徴部に実質的に影響を及ぼさないものは除外しない。
【００５９】
本明細書で使用される場合、「単一化」という用語は、分子または本質的に同一の分子のセット（例えば、オリゴヌクレオチド）の同定および／または単離を指し得る。「単一化」という用語はまた、単一の分子または本質的に同一の分子のセット（例えば、オリゴヌクレオチド）を同定および／または単離することができるプロセスまたは状態も指し得る。
【００６０】
本明細書で使用される場合、「一群の核酸」という用語は、特定の（別個の）位置または特徴部における、同種または異種のグループのオリゴヌクレオチドを指す。一群の核酸は、「湿って」いてもよく（すなわち、１種または複数の緩衝溶液および／または水を含むがこれらに限定されない１種または複数の液体要素を含み得る）、または乾燥していてもよい（すなわち、液体要素を含まない）。複数の群の核酸が、それぞれの数の特定の（別個の）位置または特徴部に存在することになる。非限定例として、３つの群の核酸が、３つの特定の（別個の）位置または特徴部に存在し、３つの特定の（別個の）位置または特徴部の各々に１つの群の核酸が存在する。
【００６１】
本明細書で使用される場合、組換え核酸技術、合成生物学および分子生物学の分野において使用される他の用語は、一般に、該当分野の当業者によって理解されるであろう。
【００６２】
合成オリゴヌクレオチド
合成オリゴヌクレオチドは、多重核酸アセンブリーにおいて構築オリゴヌクレオチドとして使用することができる。標的核酸をアセンブルするための１つの戦略は、標的核酸の配列を分析し、それを、標的核酸中にアセンブル（例えば、ライゲーション）することができる２つ以上の構築オリゴヌクレオチドに分解することである。
【００６３】
一部の実施形態では、１つまたは複数の構築オリゴヌクレオチドは、アセンブリーの前に増幅され得る。増幅を促進するために、１つまたは複数の構築オリゴヌクレオチドおよび／またはサブコンストラクトは、ポリメラーゼ連鎖反応中にプライマーが結合またはアニーリングし得る１つまたは複数のプライマー結合部位を含むように設計することができる。プライマー結合部位は、すべての構築オリゴヌクレオチドもしくはそのサブセット、または２つ以上のサブコンストラクトにユニバーサル（すなわち、同じ）であるように設計することができる。ユニバーサルプライマー結合部位（および対応するユニバーサルプライマー）は、ポリメラーゼ連鎖反応中に、そのようなユニバーサルプライマー結合部位を有するすべての構築オリゴヌクレオチドまたはサブコンストラクトを増幅するために使用することができる。１つまたは複数の選択構築オリゴヌクレオチドおよび／またはサブコンストラクトに特異的なプライマー結合部位もまた、選択構築オリゴヌクレオチドおよび／またはサブコンストラクトの標的化された特異的増幅を可能にするように設計することができる。一部の実施形態では、すべてのプライマー結合部位はユニークである。一部の実施形態では、１つまたは複数の構築オリゴヌクレオチドおよび／またはサブコンストラクトは、入れ子になったまたは連続プライマー結合部位を、一方または両方の末端に含有し得、１つまたは複数の外側プライマーと内側プライマーが結合することができる。一例では、構築オリゴヌクレオチドおよび／またはサブコンストラクトは、外側プライマーの対および内側プライマーの対のための結合部位を各々有する。外側プライマーの対の一方または両方は、ユニバーサルプライマーであり得る。あるいは、外側プライマーの一方または両方は、ユニークプライマーであり得る。一部の実施形態では、アセンブリーの前に、構築オリゴヌクレオチドの各々は、個々に増幅される。構築オリゴヌクレオチドはまた、増幅のための１つまたは複数のプールにプールすることができる。一例では、すべての構築オリゴヌクレオチが、単一のプールにおいて増幅される。ある特定の実施形態では、増幅された構築オリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼに基づくアセンブリーまたはライゲーションを介してアセンブルされる。増幅された構築オリゴヌクレオチドは、階層式または順次式または１工程反応で標的核酸にアセンブルされ得る。
【００６４】
プライマー結合部位の１つまたは複数を、最終標的核酸に組み込まれる構築オリゴヌクレオチドの一部分として設計することができる。一部の実施形態では、各々のプライマー結合部位のすべてまたは一部は、構築オリゴヌクレオチドの中心部分の外側のフランキング領域の形態であり得、中心部分は最終標的核酸に組み込まれ、フランキング領域はアセンブリーの前に除去される必要がある。そのために、１つまたは複数の制限酵素（ＲＥ）部位を、フランキング領域の除去が可能になるように設計することができる。
【００６５】
一部の実施形態では、ＲＥ部位は、ＩＩＰまたはＩＩＳ型などのＩＩ型ＲＥ部位および修飾またはハイブリッド部位であり得る。ＩＩＰ型酵素は、４〜８塩基対長の対称（回文）ＤＮＡ配列を認識し、一般にその配列内で開裂する。ＩＩＰ型制限酵素の非限定例としては、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＮｏｔＩ、ＰａｃＩ、ＭｓｐＩ、ＨｉｎＰ１Ｉ、ＢｓｔＮＩ、ＮｃｉＩ、ＳｆｉＩ、ＮｇｏＭＩＶ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｆＩ、Ｃａｃ８Ｉ、ＡｌｗＮＩ、ＰｓｈＡＩ、ＢｇｌＩ、ＸｃｍＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｄｅＩ、ＳａｃＩ、ＰｖｕＩ、ＥｃｏＲＶ、ＮｃｉＩ、ＴｓｅＩ、ＰｓｐＧＩ、ＢｇｌＩＩ、ＡｐｏＩ、ＡｃｃＩ、ＢｓｔＮＩおよびＮｃｉＩが挙げられる。ＩＩＳ型制限酵素により、認識部位から０〜２０塩基離れて切断された単一の二本鎖が作製される。ＩＩＳ型制限酵素の非限定例としては、ＢｓｔＦ５Ｉ、ＢｔｓＣＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｔｓＩ、ＡｌｗＩ、ＢｃｃＩ、ＢｓｍＡＩ、ＥａｒＩ、ＭｌｙＩ（ブラント）、ＰｌｅＩ、ＢｍｒＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｍＢＩ、ＦａｕＩ、ＭｎｌＩ、ＳａｐＩ、ＢｂｓＩ、ＢｃｉＶＩ、ＨｐｈＩ、ＭｂｏＩＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｐＭＩ、ＳｆａＮＩ、ＨｇａＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｂｖＩ、ＥｃｉＩ、ＦｏｋＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓｇＩ、ＭｍｅＩ、ＢｓｅＧＩ、Ｂｓｅ３ＤＩ、ＢｓｅＭＩ、ＡｃＩＷＩ、Ａｌｗ２６Ｉ、Ｂｓｔ６Ｉ、ＢｓｔＭＡＩ、Ｅａｍ１１０４Ｉ、Ｋｓｐ６３２Ｉ、ＰｐｓＩ、ＳｃｈＩ（ブラント）、ＢｆｉＩ、Ｂｓｏ３１Ｉ、ＢｓｐＴＮＩ、Ｅｃｏ３１Ｉ、Ｅｓｐ３Ｉ、ＳｍｕＩ、ＢｆｕＩ、ＢｐｉＩ、ＢｐｕＡＩ、ＢｓｔＶ２Ｉ、ＡｓｕＨＰＩ、Ａｃｃ３６Ｉ、ＬｗｅＩ、ＡａｒＩ、ＢｓｅＭＩＩ、ＴｓｐＤＴＩ、ＴｓｐＧＷＩ、ＢｓｅＸＩ、ＢｓｔＶ１Ｉ、Ｅｃｏ５７Ｉ、Ｅｃｏ５７ＭＩ、ＧｓｕＩおよびＢｃｇＩが挙げられる。そのような酵素、ならびにそれらの認識および開裂部位に関する情報は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．（Ｉｐｓｗｉｃｈ、Ｍａｓｓ．、Ｕ．Ｓ．Ａ．）などの商業供給元から入手可能である。
【００６６】
制限酵素（ＲＥ）部位は、それらが、ＭｓｐＪＩ、ＳｇｅＩおよび／またはＦｓｐＥＩなどのメチル化感受性ヌクレアーゼにより消化され得るようにメチル化することができる。そのようなメチル化感受性ヌクレアーゼは、ＩＩＭ型およびＩＩＳ型特性の両方を共有し、したがって、それは、メチル化特異的４−ｂｐ部位、ｍＣＮＮＲ（Ｎ＝ＡまたはＴまたはＣまたはＧ、Ｒ＝ＡまたはＧ）のみを認識し、この認識配列の外側でＤＮＡを切断する。
【００６７】
標的核酸に基づく構築オリゴヌクレオチドの設計に続き、構築オリゴヌクレオチドは、当技術分野で公知の任意の方法を使用して合成することができ、またはそうでなければ商業ベンダーによって供給され得る。典型的には、オリゴヌクレオチド合成には、合成全体を通してサイクルでまたは繰り返し方式で、各々のサイクルで成長オリゴヌクレオチド鎖に１つのヌクレオチドを付加して、実施されるいくつかの化学工程が関与する。サイクルに関与する化学工程は、さらなる鎖延長のために官能基を遊離させる脱保護工程、ヌクレオチドを合成されることになるオリゴヌクレオチドに組み込むカップリング工程、およびオリゴヌクレオチド合成に使用される特定の化学による必要に応じた他の工程、例えば、ホスホラミダイト化学で必要とされる酸化工程である。適宜、カップリング工程で延長されなかった官能基を遮断するキャッピング工程をサイクルに挿入してもよい。ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド合成が３’→５’方向に行われる場合、末端ヌクレオチドの５’−ヒドロキシル基に、またはオリゴヌクレオチド合成が５’→３’方向に行われる場合、末端ヌクレオチドの３’−ヒドロキシル基に付加することができる。
【００６８】
明瞭性のために、二本鎖核酸の２つの相補的鎖は、本明細書において、プラス（Ｐ）鎖およびマイナス（Ｎ）鎖と称する。この略号は、鎖がコード配列のセンスおよびアンチセンス鎖であることを含意することを意図しない。それらは、核酸の配列または機能に関わらず、核酸（例えば、標的核酸、中間核酸断片など）の２つの相補的鎖のみを指す。したがって、一部の実施形態では、Ｐ鎖は、コード配列のセンス鎖であり得、他方、他の実施形態では、Ｐ鎖は、コード配列のアンチセンス鎖であり得る。本明細書において相補的核酸または相補的核酸領域への言及は、互いに逆相補である配列を有し、そのためそれらは天然ＤＮＡに典型的である逆平行様式でハイブリダイズすることができる核酸またはその領域を指すこと認識されたい。
【００６９】
本開示の一部の態様では、本明細書において記載される方法に従って合成または他に調製されたオリゴヌクレオチドは、目的の（例えば、所定のまたは事前に定められた配列の）標的ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのアセンブリーのためのビルディングブロックとして使用することができる。
【００７０】
オリゴヌクレオチドは、当技術分野で公知の方法を使用して固体支持体上で合成することができる。一部の実施形態では、複数の異なる一本鎖オリゴヌクレオチドが、固体支持体の異なる特徴部上に固定される。一部の実施形態では、支持体に結合したオリゴヌクレオチドは、それらの５’末端またはそれらの３’末端により結合し得る。一部の実施形態では、支持体に結合したオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド配列（例えば、変性結合配列）またはリンカー（例えば、光開裂性または化学的リンカー）を介して支持体に固定され得る。３’末端によって、５’末端への下流方向の配列が意味され、５’末端によって、３’末端への上流方向の配列が意味されることを認識されたい。例えば、オリゴヌクレオチドは、後続の反応に関与しないヌクレオチド配列またはリンカーを介して支持体に固定され得る。
【００７１】
本開示のある特定の実施形態では、不活性基材および多孔質反応層で構成される固体支持体が使用され得る。多孔質反応層は、事前に合成されたオリゴヌクレオチドの固定のため、またはオリゴヌクレオチドの合成のための化学官能性基を提供し得る。一部の実施形態では、アレイの表面は、核酸の固定または共有結合のために好適な反応性基を含む材料を用いて処理またはコーティングされ得る。当技術分野で公知であり、固定またはオリゴヌクレオチドのインサイチュでの合成に好適な反応性基を有する任意の材料を使用することができる。
【００７２】
一部の実施形態では、多孔質反応層は、ヒドロキシル反応性基を含むように処理され得る。例えば、多孔質反応層は、スクロースを含み得る。
【００７３】
本開示の一部の態様によると、末端が３’ホスホリル基オリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを、固体支持体に結合した化学リン酸化試薬を有する固体支持体上で３’→５’方向に合成することができる。一部の実施形態では、リン酸化試薬は、オリゴヌクレオチドの合成前に多孔質層にカップリングされ得る。例示的な実施形態では、リン酸化試薬は、スクロースにカップリングされ得る。例えば、リン酸化試薬は、２−［２−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）エチルスルホニル］エチル−（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホラミダイトであり得る。一部の実施形態では、３’リン酸化オリゴヌクレオチドは、固体支持体から遊離し、本明細書において記載される方法に従って後続の修飾を受け得る。一部の実施形態では、３’リン酸化オリゴヌクレオチドは、エアロゾル脱会合または液体脱会合を使用して遊離し得る。一部の実施形態では、３’リン酸化オリゴヌクレオチドは、気体アンモニア、水酸化アンモニウム水溶液、メチルアミン水溶液またはこれらのコンポーネントの２種以上の混合物を使用して固体支持体から遊離し得る。
【００７４】
一部の実施形態では、アセンブリーのための合成オリゴヌクレオチドが設計（例えば、設計されたまたは所定の配列、サイズおよび／または数を有する）され得る。合成オリゴヌクレオチドは、標準ＤＮＡ合成化学を使用して（例えば、ホスホラミダイト法の使用により）生成することができる。合成オリゴヌクレオチドは、本明細書においてより詳細に記載される通りの任意の適切な技術を使用して、マイクロアレイを含むがこれに限定されない固体支持体上で合成することができる。オリゴヌクレオチドは、増幅にかける前にマイクロアレイから溶出することができ、またはマイクロアレイ上で増幅することができる。様々なオリゴヌクレオチドを、異なる長さを有するように設計することができることを認識されたい。
【００７５】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，５６３，６００号、米国特許出願第１３／５９２，８２７号および／またはＷＯ２０１４／００４３９３として公開されたＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０４７３７０において記載される通りに合成（例えば、アレイ形式で）される。例えば、一本鎖オリゴヌクレオチドは、一般的な支持体上でインサイチュで合成することができ、各々のオリゴヌクレオチド（例えば、所与の配列の個々のオリゴヌクレオチドまたは、同じ配列の１つよりも多いオリゴヌクレオチド）は、基材上の分離したまたは別個の特徴部（またはスポット）上で合成される。一部の実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、支持体の表面または特徴部に結合している。本明細書で使用される場合、「アレイ」という用語は、さらなる反応のためにオリゴヌクレオチドまたは相補的オリゴヌクレオチドを保存、ルーティング、増幅および遊離させるための別個の特徴部の配置構成を指す。アレイは、平面であり得る。ある実施形態では、支持体またはアレイは、アドレッサブルであり、支持体は、支持体上の特定の所定の位置（すなわち、「アドレス」）に２つ以上の別個のアドレッサブルな特徴部を含む。したがって、アレイの各々のオリゴヌクレオチド分子は、支持体上の既知の定められた位置に局在する。各々のオリゴヌクレオチドの配列は、支持体上のその位置から決定することができる。一部の実施形態では、その特徴部における各々のオリゴヌクレオチドが同じ配列を有する場合にのみ、各々の特徴部（支持体上の定められた位置）は、１つよりも多いオリゴヌクレオチドを有し得る。さらに、アドレッサブルな支持体またはアレイにより、小滴などの個々の単離容量の直接制御が可能になる。定められた特徴部のサイズは、各小滴が互いから分離したままであるミクロ容量の小滴の特徴部上での形成が可能であるように選択することができる。本明細書において記載される通り、特徴部は、必須ではないが典型的には、２つの隣接する特徴部間の小滴が融合しないことを確実にするために特徴部間の空間によって分離されている。特徴部間は、典型的には、その表面にオリゴヌクレオチドを有さず、内部空間に対応する。一部の実施形態では、特徴部および特徴部間は、それらの親水性または疎水性特性が異なり得る。
【００７６】
オリゴヌクレオチドは、一本鎖核酸であってもよい。しかしながら、一部の実施形態では、二本鎖（少なくとも部分的に）オリゴヌクレオチドが、本明細において記載される通りに使用され得る。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、本明細書において記載される通りに化学的に合成され得る。一部の実施形態では、合成オリゴヌクレオチドは、使用前に増幅され得る。得られた生成物は、二本鎖であり得る。
【００７７】
１つまたは複数の修飾塩基（例えば、ヌクレオチド類似体）を組み込むことができる。修飾の例としては、メチル化塩基、例えば、シトシンおよびグアニン；ユニバーサル塩基、例えば、ニトロインドール、ｄＰおよびｄＫ、イノシン、ウラシル；ハロゲン化塩基、例えば、ＢｒｄＵ；蛍光標識塩基；非放射性標識、例えば、ビオチン（ｄＴの誘導体）およびジゴキシゲニン（ＤＩＧ）；２，４−ジニトロフェニル（ＤＮＰ）；放射性ヌクレオチド；カップリング後修飾、例えば、ｄＲ−ＮＨ２（デオキシリボース−ＮＥｂ）；アクリジン（６−クロロ−２−メトキシアクリジン）；ならびに配列にスペーサー「アーム」を付加するために合成の間に使用されるスペーサーホスホラミド、例えば、Ｃ３、Ｃ８（オクタンジオール）、Ｃ９、Ｃ１２、ＨＥＧ（ヘキサエチレン（ｈｅｘａｅｔｈｌｅｎｅ）グリコール）およびＣ１８が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７８】
種々の実施形態では、合成一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドは、天然に存在しないものであり得る。一部の実施形態では、合成オリゴヌクレオチドは、非メチル化、またはそれらがヘミメチル化（ｈｅｍｉ−ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ）（１つの鎖のみがメチル化される）、セミメチル化（ｓｅｍｉ−ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ）（１つまたは両方の鎖で通常のメチル化部位の一部のみがメチル化される）、ハイポメチル化（ｈｙｐｏｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ）（１つまたは両方の鎖で通常のメチル化部位よりも多くがメチル化される）になるかまたはそうでなければ天然に存在しないメチル化パターンを有する（通常のメチル化部位の一部分が１つもしくは両方の鎖でメチル化されるおよび／または通常の非メチル化部位がメチル化される）ように修飾（例えば、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で化学的にまたは生物化学的に修飾）され得る。これとは対照的に、天然に存在するＤＮＡは、典型的には、後成的修飾、例えば、インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）におけるＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）によるＤＮＡのシトシン環のＣ−５位でのメチル化を含有する。ＤＮＡメチル化は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるJin et al., Genes & Cancer 2011 Jun; 2(6): 607-617によって概説されている。
【００７９】
多重核酸アセンブリー
多重核酸アセンブリーを使用して、１つまたは複数の標的核酸を調製することができ、各々の標的について、複数の構築オリゴヌクレオチドが、事前に設計した順序に従って互いに接触し得る。構築オリゴヌクレオチドは、一本鎖であり得、設計によって、１つの構築オリゴヌクレオチドが部分的に次の構築オリゴヌクレオチドとアニーリングし、一緒に二本鎖（少なくとも部分的に）生成物を形成するようにプラスおよびマイナス鎖間で交互し得る。構築オリゴヌクレオチドはまた、二本鎖であり得、少なくとも部分的に互いにアニーリングする適合性付着末端を有して、構築オリゴヌクレオチドを事前に設計した順序で整列して二本鎖生成物を形成するように設計され得る。二本鎖生成物は、ギャップを含まず、ライゲーション時に標的核酸を生成し得る。二本鎖生成物は、ポリメラーゼによって埋めることができるギャップを含有し得る。
【００８０】
一部の実施形態では、アセンブリーは、複数の標的核酸が同時に調製される平行様式で行われ得る。例えば、２〜１００，０００、５〜１０，０００、１０〜１０００、１００〜５００または任意の他の数の標的を、平行して生成することができる。
【００８１】
アセンブリーは、階層式、順次式および／または１工程アセンブリーを使用して実施することができる。単なる例として、オリゴヌクレオチドＡ、Ｂ、ＣおよびＤ（各々、構築オリゴヌクレオチド）のＡ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ標的への階層式アセンブリーは、Ａ＋ＢおよびＣ＋Ｄオリゴヌクレオチドを最初にアセンブルし（各々、サブコンストラクトまたはサブアセンブリー）、次いで、Ａ＋ＢおよびＣ＋ＤサブコンストラクトをＡ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ（標的）オリゴヌクレオチドにアセンブルすることを含み得る。順次式アセンブリーは、Ａ＋Ｂ（一次サブコンストラクトまたはサブアセンブリー）、次いで、Ａ＋Ｂ＋Ｃ（二次サブコンストラクトまたはサブアセンブリー）、最後に、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ（標的）をアセンブルすることを含み得る。１工程アセンブリーは、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤを１反応で合わせて、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ標的を生成する。様々な戦略を混合することができ、この場合、構築オリゴヌクレオチドの一部分は１つの戦略を使用し、別の部分は異なる戦略を使用してアセンブルされることに留意されたい。
【００８２】
構築オリゴヌクレオチドは、上記の通り、例えば、固体支持体上で化学的に合成することができる。一部の実施形態では、構築オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の構築オリゴヌクレオチドを増幅する必要なしに、直接サブアセンブリーまたは全アセンブリーが可能であるような十分な量で合成され得る。ある特定の実施形態では、化学合成後、構築オリゴヌクレオチドは、最初にサブコンストラクトへのサブアセンブリーにかけられ、これにより、増幅され得（例えば、ポリメラーゼに基づく反応で）、次いで、二次サブコンストラクトまたは最終標的へのさらなるアセンブリーにかけられ得る。一部の実施形態では、１つまたは複数の構築オリゴヌクレオチドは、アセンブリーの前に増幅され得る。一部の実施形態では、１つまたは複数のサブコンストラクト（またはサブアセンブリー）は、アセンブリーの前に増幅され得る。そのために、構築オリゴヌクレオチドおよび／またはサブコンストラクトは、本明細書において開示される通り、１つまたは複数のユニバーサルまたは特異的（例えば、ユニーク）プライマー結合部位を有するように設計することができる。
【００８３】
アセンブリーは、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１１／０６６１８５およびＷＯ２０１１／０５６８７２に開示されるものなどのマイクロ流体デバイスによって支援されていてもよい、固体支持体上で実施することができ、その各々の開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００８４】
１つの固体支持体に基づくアセンブリー戦略が、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開ＷＯ２０１２／０７８３１２に開示されている。簡潔に述べると、一部の実施形態では、２つ以上のチップが、多重核酸アセンブリーのために設計され得る。各々のチップは、複数の別個のアドレッサブルな特徴部を有するように設計される。例えば、図１を参照すると、チップＡが、特徴部Ａ１、Ａ２、Ａ３、…Ａｎを有するように設計され、チップＢは、特徴部Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、…Ｂｎを有する。Ａ１およびＢ１は、一緒に標的核酸Ｘ１を含むその上に固定されたオリゴヌクレオチドを有し、Ａ２およびＢ２は、一緒に標的核酸Ｘ２を含むその上に固定されたオリゴヌクレオチドを有し、…ＡｎおよびＢｎは、一緒に標的核酸Ｘｎを含むその上に固定されたオリゴヌクレオチドを有する。より多くのチップを、より長い標的核酸のアセンブリーのために使用することができる。単一チップ内の特徴部は、互いに距離Ｄ（例えば、１０ミクロン、１５ミクロン、２０ミクロン、２５ミクロン、３０ミクロン、３５ミクロン、４０ミクロン、４５ミクロン、５０ミクロン、５５ミクロン、６０ミクロン、６５ミクロン、７０ミクロン、７５ミクロン、８０ミクロン、８５ミクロン、９０ミクロン、９５ミクロン、１００ミクロンまたは任意の他の好適な距離）によって分離されている。アセンブリーの間、２つのチップ（例えば、ＡおよびＢ）は、互いに相対して整列され得、その結果、特徴部Ａ１は、特徴部Ｂ１と整列し、特徴部Ａ２は特徴部Ｂ２と整列し、…特徴部Ａｎは特徴部Ｂｎと整列している。２つのチップ間の距離ｄは、特徴部Ａ１、Ａ２、Ａ３、…Ａｎ内のオリゴヌクレオチドが、それぞれ特徴部Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、…Ｂｎ内のオリゴヌクレオチドと接触し得るように十分小さい。例えば、オリゴヌクレオチドが、平均して１００ｂｐ長の場合、ｄは、およそ３０ナノメートル（３ｎｍ／ｂｐ×１００ｂｐ）である。距離Ｄおよびｄは、１つのチップのオリゴが、同じチップの隣接する特徴部のオリゴと接触することなく、別のチップのオリゴと接触することを確実にするために、ｄ＜＜Ｄとなるように設計することができる。このように、特徴部Ａ１、Ａ２、Ａ３、…およびＡｎ内のオリゴヌクレオチドは、例えば、ライゲーションおよび／またはポリメラーゼに基づくアセンブリーによって、特徴部Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、…およびＢｎ内のオリゴヌクレオチドとアセンブルされ得る。したがって、アセンブルされた生成物Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、…およびＸｎは、例えば、化学、酵素または光活性開裂を介して、一方または両方のチップから遊離し得る。
【００８５】
図２Ａは、１つの特徴部における、伸長されたオリゴヌクレオチドのアセンブリーのための例示的な方法を例示している。オリゴヌクレオチド１〜４の各々は、アセンブルされることになる標的核酸断片の２つの鎖の一部分を示している。オリゴヌクレオチド１は、アンカーチップ１００上の特徴部上に固定され得る。オリゴヌクレオチド２〜４は、例えば、本明細書に開示される通りの圧電に基づく単一化を介して、オリゴヌクレオチド１と接触され得る。アセンブリーは、オリゴヌクレオチド１とオリゴヌクレオチド２の相補的部分の塩基対合、オリゴヌクレオチド２とオリゴヌクレオチド３の相補的部分の塩基対合、およびオリゴヌクレオチド３とオリゴヌクレオチド４の相補的部分の塩基対合によって起こり得る。鎖延長（１と３または２と４の間にギャップが存在する程度に）および／またはライゲーション反応を使用して、オリゴヌクレオチド１〜４を、二本鎖生成物にアセンブルすることができる。より多くのオリゴヌクレオチドを、同じ戦略を使用して、単一のワンポット反応または逐次付加によってアセンブルすることができる。
【００８６】
図２Ｂは、２つのチップ、アンカーチップ１００および構築チップ２００を使用した、伸長されたオリゴヌクレオチドのアセンブリーのための例示的な方法を例示している。オリゴヌクレオチド１０は、アンカーチップ１００の特徴部上に固定される。オリゴヌクレオチド１０と部分的にアニーリングされ、オリゴヌクレオチド３０と配列相補性を有する部分をさらに含有するオリゴヌクレオチド２０が提供される。オリゴヌクレオチド３０は、構築チップ２００上で、ポリメラーゼに基づく反応で合成され得、構築チップ２００上に固定されたオリゴヌクレオチド４０と相補的であるかまたはこれと配列相補性を有する部分を含有する。合成後、オリゴヌクレオチド３０は、構築チップ２００から遊離し、構築オリゴヌクレオチド３０’としてアンカーチップ１００に移動され得る。構築オリゴヌクレオチド３０’は、設計によって、オリゴヌクレオチド２０とアニーリングし、したがって、オリゴヌクレオチド１０と近接する。鎖延長（１０と３０’の間にギャップが存在する程度に）および／またはライゲーション反応を使用して、オリゴヌクレオチド１０、２０および３０’を、二本鎖生成物にアセンブルすることができる。構築オリゴヌクレオチド３０’同様、オリゴヌクレオチド２０もまた、構築チップ２００と同じであっても異なっていてもよい構築チップから提供され得る。より多くのオリゴヌクレオチドを、同じ戦略を使用して、単一のワンポット反応または逐次付加によってアセンブルすることができる。
【００８７】
単一化
本明細書において開示されるオリゴヌクレオチド合成および多重核酸アセンブリー法の任意の工程の間、１つまたは複数の核酸を、さらな操作のために元の位置から選択的に放出および／または移動させることが望ましいことがある。例えば、一部の実施形態では、アセンブルされたＸ１、Ｘ２、Ｘ３、…およびＸｎ標的核酸は、１つのチップ（例えば、アンカーチップ）に結合したままであり得、１つまたは複数の標的核酸の選択的取り出しまたは単一化が実施され得る。あるいは、選択的単一化の前に標的核酸はチップから遊離するが、アドレッサブルな特徴部内に吸着されたまま（例えば、ミクロ容量の溶液によって保持される）であり得る。選択的単一化は、アドレッサブルな特徴部上のそれらの位置に基づいて目的の特異的標的核酸を選択するために望ましいことがある。一部の実施形態では、１つまたは複数の標的核酸は、品質確認の目的のために、ランダムに取り出され得る。例えば、ｍ個の標的核酸を、チップ上のｎ個の特徴部からランダムに取り出し（例えば、ｍ＜＜ｎ）、アセンブリー品質の確認のために配列決定にかけることができる。
【００８８】
本明細書において開示される単一化デバイスおよび方法の１つの利点は、選択された核酸を接触なしに射出することであり、これにより、機械式取り出し装置において使用され得るピペットチップの交換の必要性が回避される。これはまた、相互汚染の可能性を最小にする一方、望ましい核酸の大規模な射出および選択の可能性を提供する。
【００８９】
一部の実施形態では、選択的単一化は、圧電コンポーネントを使用して達成され得る。圧電コンポーネントは、圧電素子のボード、グリッドまたはマトリックスの形態であり得、これは、各々の圧電素子が特徴部に対応するように、固体支持体の上に、下にまたは一体化部分として配置することができる。圧電素子は、例えば、１つまたは複数の素子を通して電流を通過させることによって選択的に活性化されて、機械的力を発生して、選択標的核酸を放出、移動またはそうでなければ輸送することができる。機械的力は、例えば、標的核酸を、それによって標的核酸がチップに結合している開裂性リンカーで開裂するのに十分な強さになるように制御することができる。あるいは、標的核酸は、一群の核酸（例えば、ミクロ容量の液体溶液）中に、事前に遊離してもよく、または、例えば、化学、酵素および／または光活性開裂を介して同時に（共に）遊離してもよく、制御可能な機械的力は、一群の核酸を放出、移動またはそうでなければ輸送するのに十分であり得る。一部の実施形態では、レーザーを使用して、光活性リンカーを開裂することによって１つまたは複数の標的核酸を選択的に遊離させることができる。
【００９０】
圧電コンポーネントはまた、選択された特徴部に動かされて、その特徴部に結合した標的核酸を放出、移動またはそうでなければ輸送することができる単一の圧電素子（例えば、ノズルまたはニードル）の形態であり得る。一部の実施形態では、１つよりも多い素子（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個などの素子）が、選択された特徴部に動かされ得、特徴部に結合した標的核酸を一度に放出、移動またはそうでなければ輸送するために使用され得る。一部の実施形態では、特徴部自体が、圧電材料を含有し得、電流は、１つまたは複数の特徴部を（同時にまたは異なる時点で）選択的に通過して、特徴部に結合した標的核酸を放出、移動またはそうでなければ輸送することができる。
【００９１】
一部の実施形態では、チップ上の各々の特徴部は、外部電場が、印加されると、圧電コンポーネントを伸長または圧縮して、試薬（例えば、水溶液中または乾燥環境中の）が、動かされる特徴部上に位置されるように圧電コンポーネントを含むように構成され得る。圧電コンポーネントは、各々の特徴部の最外側層であり得、オリゴヌクレオチドの堆積（それが堆積すること）または固定を可能にする表面化学を有するように処理されてもよい。あるいは、材料の別の層（表面材料）が、圧電コンポーネントの上面に配置されてもよく、表面材料を使用して、オリゴヌクレオチドを堆積または固定することができる。外部電場は、すべての特徴部に均一に印加されてもよく、または目的の１つまたは複数の特徴部に選択的に印加されてもよい。圧電コンポーネントの種類に応じて、外部電場は、印加されると、圧電コンポーネントを、例えば、特徴部の上に配置された試薬に実質的に垂直に伸長または圧縮して、試薬が特徴部から放出、移動またはそうでなければ輸送され得る。一部の実施形態では、第１のチップから放出または移動した試薬が、第２のチップに輸送され得るように２つのチップが整列され得る。試薬は、アセンブリーのための１つまたは複数のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドの輸送を促進する容量の液体、ならびにライゲーション、ＰＣＲおよび／または制限反応のためのリガーゼ、ｄＮＴＰ、ＤＮＡポリメラーゼ、制限酵素および緩衝液／塩のうちの１つまたは複数を含み得る。
【００９２】
一部の実施形態では、チップ内に含有された第１の圧電コンポーネントに加えて、第２の圧電コンポーネントが、試薬を放出、移動またはそうでなければ輸送するのを補助するために付加され得る。第２の圧電コンポーネントは、圧電素子のボード、グリッドまたはマトリックスの形態であり得、これは、各々の圧電素子が特徴部に対応するようにチップの上または下に配置することができる。まとめると、第１および第２の圧電コンポーネントは、１つまたは複数の特徴部上の試薬の移動の制御に向けられている。
【００９３】
好適な圧電材料としては、天然材料、例えば、ベルリナイト（ＡｌＰＯ４）、石英およびトパーズ；または人工水晶、例えば、オルトリン酸ガリウム（ＧａＰＯ４）もしくはランガサイト（Ｌａ３Ｇａ５ＳｉＯ１４）が挙げられる。好適な人工セラミックとしては、チタン酸バリウム（ＢａＴｉＯ３）、チタン酸鉛（ＰｂＴｉＯ３）、チタン酸ジルコン酸鉛、ニオブ酸リチウム（ＬｉＮｂＯ３）、タンタル酸（ｔａｎｔａｌｉｔｅ）リチウム（ＬｉＴａＯ３）およびタングステン酸ナトリウム（Ｎａ２ＷＯ３）が挙げられる。フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）などの一部のポリマーもまた好適であり得る。当業者であれば、本明細書において記載される組成物および方法における使用に好適な圧電材料の種類を決定することができるであろう。
【００９４】
これらの圧電材料は、核酸単一化を達成するために微小電気機械システム（ＭＥＭＳ）アクチュエーターに組み込むことができる。一実施形態では、圧電層は、電極間に挟持されたおよび／または垂直方向に支持されたカンチレバーの上面に製作され得る。電場は、上部および底部電極間に、圧電層の分極に平行に印加することができ、これにより横方向にマイナス歪みが発生し得るが、カンチレバーの残りでは発生しない。結果として、カンチレバーは、上に折れ曲がる。別の実施形態では、圧電層は、カンチレバーの上面、互いに組み合わされた電極の下に製作され得る。電場は、平面であり得、圧電層は、平面で支持される。支持に平行なＥに関して、圧電層は、その長さ方向にプラスの歪みを発生し得、カンチレバーは下に折れ曲がる。いずれの実施形態でも、カンチレバーは、核酸射出を達成するように位置決めされ得る。
【００９５】
一部の実施形態では、櫛歯アクチュエーターもまた使用され得る。櫛歯アクチュエーターは、典型的には、２つの互いに組み合わされた指構造を含有し、一方の櫛は固定され、他方はコンプライアントサスペンションに連結される。典型的には、歯は、各々の歯が反対側の櫛のスロットを占有するまで互いにスライドし得るように配置構成される。圧電材料全体の駆動電圧により、トラス材料の変形が引き起こされ、これにより、固定された指に対する移動可能な指のさらなる変位がもたらされる。機械的力が、ばね構造にわたって発生する。圧電コンポーネントはまた、ＭＥＭＳ分野の当業者によって一般に理解される通り、計算尺、インチワームおよび／またはフリッパーなどの形態で提供され得る。
【００９６】
ある特定の実施形態では、圧電材料は、各々の特徴部で固体支持体に一体化したコンポーネントであり得る。核酸は、圧電材料に結合し得る。任意選択の弾力性のバッキング材料が含まれ得る。作動時の圧電材料における分極の変化が、凹または凸射出に使用され得る。
【００９７】
一部の実施形態では、選択的単一化は、音響コンポーネントを使用して達成され得る。音響コンポーネントは、音響素子のボード、グリッドまたはマトリックスの形態であり得、これは、各々の音響素子が特徴部に対応するように、固体支持体の上に、下に、または一体化した部分として配置することができる。音響素子は、選択的に活性化されて、機械的力を発生して、選択標的核酸を放出、移動またはそうでなければ輸送することができる。機械的力は、例えば、標的核酸を、それによって標的核酸がチップに結合している開裂性リンカーで開裂するのに十分な強さになるように制御することができる。あるいは、標的核酸は、一群の核酸（例えば、ミクロ容量の液体溶液）中に、事前に遊離させてもよく、または、例えば、化学、酵素および／または光活性開裂を介して同時に（共に）遊離させてもよく、制御可能な機械的力は、一群の核酸を放出、移動またはそうでなければ輸送するのに十分であり得る。一部の実施形態では、レーザーを使用して、光活性リンカーを開裂することによって１つまたは複数の標的核酸を選択的に遊離させることができる。
【００９８】
ある特定の実施形態では、選択的単一化は、コンポーネントが、特徴部と相互作用し、機械的変位により１つまたは複数の群の核酸の移動を実行するように構成された方法を含む、任意の方法によって達成され得る。一部の実施形態では、選択的単一化は、そのような機械的変位なしに（例えば、本明細書において記載される圧電または音響素子以外のコンポーネントを使用する方法により）、達成され得る。非限定例として、１つまたは複数の特異的標的核酸は、例えば、化学、酵素および／または光活性開裂を介して、固体支持体から一群の核酸（例えば、ミクロ容量の液体溶液）中に事前に遊離させてもよく、または、同時に（共に）遊離させてもよく、固体支持体（例えば、マイクロアレイ、チップまたはマイクロウェルプレート）は、一群の核酸が固体支持体の１つの特徴部（アドレッサブルポイント）を第２の固体支持体（例えば、マイクロアレイ、チップまたはマイクロウェルプレート）の特徴部と連結する流体チャンバを形成するように別の固体支持体の近くに位置決めされてもよい。さらなる機械的力（例えば、圧電または音響素子によってもたらされるものなど）ありまたはなしでのそのような接触は、一群の核酸を移動またはそうでなければ輸送するのに十分であり得る。一部の実施形態では、レーザーを使用して、光活性リンカーを開裂することによって１つまたは複数の標的核酸を選択的に遊離させることができる。
【００９９】
別の実施形態では、核酸は、微粒子またはビーズに固定され得る。同じ核酸を有する１つまたは複数のビーズを、マルチウェルプレートの単一のウェルに配置することができる。一部の実施形態では、各々のウェルは、対応する圧電または音響素子（または１つまたは複数の特徴部と相互作用し、機械的変位により１つまたは複数の群の核酸の移動を実行するように構成された他のコンポーネント）を有するアドレッサブルな特徴部であり、作動時、そのウェル内に配置されたビーズを射出し得る。この実施形態では、ビーズは、乾燥環境中に提供され得る。一部の実施形態では、各々のウェルは、１つまたは複数の特徴部と相互作用し、機械的変位により１つまたは複数の群の核酸の移動を実行するように構成された対応するコンポーネント（例えば、圧電または音響素子）を有さないアドレッサブルな特徴部である。そのような実施形態では、マルチウェルプレートは、一群の核酸（例えば、液体形態の）が、１つの特徴部（アドレッサブルポイントまたはマイクロウェル）を第２の固体支持体（例えば、マイクロアレイ、チップまたはマイクロウェルプレート）の特徴部と連結する流体チャンバを形成するように、別の（第２の）マルチウェルプレートまたは他の固体支持体（例えば、チップまたはマイクロアレイ）の近くに位置決めされ得る。さらなる機械的力（例えば、圧電もしくは音響素子、または機械的変位を使用して移動を実行し得る任意の他の素子によってもたらされるものなど）ありまたはなしでのそのような接触は、一群の核酸を移動またはそうでなければ輸送するのに十分であり得る。液体がまた、制限消化、鎖延長およびライゲーションなどの種々の反応を促進するためにウェルに添加され得る。
【０１００】
図３は、本明細書において記載される方法および／または組成物の例示的な実施形態を例示している。各々が複数のアセンブルされた核酸遺伝子１（３００）、遺伝子２（３１０）、遺伝子３（３２０）、遺伝子Ｘ（３４０）、…などを含むまたはこれに結合された複数のアドレッサブルな特徴部２００、２１０、２２０、…などを含むアンカーチップ１００が提供される。遺伝子Ｘ（３４０）などの１つまたは複数の標的核酸の選択的取り出しまたは単一化を実施することができる。遺伝子Ｘの位置は、各々の特徴部のアドレスに基づいて決定することができる。ミクロ容量の溶液４００を堆積することができ、これは、標的核酸３４０の化学、酵素または光活性開裂を達成するために望ましい試薬を含み得る。開裂し、溶液４００中に遊離すると、次いで、標的核酸３４０は、圧電素子５００によって選択的に放出、移動またはそうでなければ輸送され得る。一部の実施形態では、圧電素子５００は、音響素子または１つもしくは複数の特徴部と相互作用し、機械的変位により移動を実行するように構成された他の好適なコンポーネントと置き換えられ得る。ある特定の実施形態では、圧電素子または音響素子または１つもしくは複数の特徴部と相互作用し、機械的変位により移動を実行するように構成された他のコンポーネントは、標的核酸の輸送のために必要ではない（すなわち、素子５００は存在しない）。
【０１０１】
選択的取り出しまたは単一化は、アセンブリーの完了後、ならびに／または１つもしくは複数のサブコンストラクトが、増幅、配列決定および／もしくはさらなるアセンブリーなどのさらなる操作のために取り出され得るアセンブリーの間に実施することができる。さらに、アセンブリーの前に、構築オリゴヌクレオチドはまた、増幅、配列決定および／またはアセンブリーのために選択的に取り出す（例えば、選択（ｓｅｌｅｃｔｅｄ）または選択（ｃｈｏｓｅｎ）する）ことができる
【０１０２】
小滴に基づくアセンブリー
一部の実施形態では、本明細書において開示される通りの選択的取り出しまたは単一化を使用して、小滴を操作、例えば、１つまたは複数の小滴を１つの特徴部から別の特徴部におよび／または１つの固体支持体から別の固体支持体に移動させることができる。小滴の形成およびその使用は、例えば、国際公開ＷＯ２０１０／０２５３１０、ＷＯ２０１１／０５６８７２、ＷＯ２０１１／０６６１８６、ならびに米国特許第８，７１６，４６７号および第９，２９５，９６５号に開示されており、これらの各々の全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０３】
図４および５は、チップなどの固体支持体上の小滴に基づくアセンブリーの実施形態を例示している。例示的な標的核酸の分解された相補的鎖の断片が、図４、パートＡに構築断片ａ〜ｈとして図示されている。より多いまたはより少ない構築断片を、標的核酸に応じて（例えば、標的核酸の複雑さおよび／または長さに応じて）設計することができる。断片ａの複数のコピーが、１つまたは複数の特徴部、例えば、チップＡ上のａ１、ａ２およびａ３上に固定され、断片ｂの複数のコピーが、１つまたは複数の特徴部、例えば、チップＢ上のｂ１、ｂ２およびｂ３上に固定される。チップＢの各々の特徴部は、図４、パートＢに示されるように溶液の小滴によって被覆され得る。本発明の一実施形態によると、断片ｂは、チップＢ上の１つまたは複数の特徴部の表面から開裂され、脱カップリングされまたはそうでなければ結合が外れ、小滴中に遊離する。チップＡおよびＢは、特徴部ａ１〜ａ３が特徴部ｂ１〜ｂ３に相対するように整列される。チップＡおよびＢは、特徴部ｂ１〜ｂ３を被覆する小滴が、チップＢから移動してチップＡ上の特徴部ａ１〜ａ３を被覆するように近接され、断片ｂの非結合コピーが特徴部ａ１〜ａ３に輸送される。一実施形態によると、小滴の移動は、本明細書において開示される通りの圧電コンポーネントによって作動された振動もしくは射出、音波もしくは超音波振動、または他の動的手段を含むがこれらに限定されない任意の手段によって達成され得る。小滴の移動を行う他の方法は、エレクトロウェッティング技術または他の電子工学的手段を含み得る。あるいはまたはさらに、チップＡおよび／もしくはＢ上の特徴部もしくは周囲表面の親水性および／もしくは疎水性、または特徴部のサイズもしくは形状の変更または制御を使用して、チップＢからＡへの小滴の移動を行うことができる。
【０１０４】
図４、パートＣでは、チップＡおよびＢは分離しており、ここで移動された小滴はチップＡ上の特徴部ａ１〜ａ３を被覆している。特徴部は、断片ｂの固定断片ａへのハイブリダイゼーションに好適な条件にかけられる。ある特定の実施形態では、断片は、例えば、ハイブリダイゼーション時、二重断片ａ／ｂが、非結合末端での一本鎖オーバーハングを含むように分解されている。このプロセスは、標的核酸が逐次様式でアセンブルされるように、断片ｃの複数のコピーを含む特徴部と整列された特徴部ａ１〜ａ３で繰り返し、次いで、断片ｄの複数のコピーを含む特徴部で繰り返すなどすることができる。あるいはまたはさらに、標的核酸は、断片ａおよびｂを１つの特徴部で一緒にし、断片ｃおよびｄを別の特徴部で一緒にする（それぞれ、断片ａ／ｂおよび断片ｃ／ｄが形成する）などし、次いで、二重断片ａ／ｂを二重断片ｃ／ｄと一緒にすることによって階層様式でアセンブルすることができる。これには、アセンブルされた二重断片ａｃ／ｂｄを同様にアセンブルされた二重断片ｅｇ／ｆｈと一緒にすることが続き得る。そのようなアセンブリーは、標的（すなわち、標的オリゴヌクレオチド）が、合成されるまで反復して繰り返され得る。
【０１０５】
図５、パートＡでは、標的核酸の分解された相補的鎖の断片が、断片ａ〜ｆとして図示されている。チップＡにおいて、断片ｃおよびｆの複数のコピーは、それぞれ特徴部ｃおよびｆで固定されている。チップＢにおいて、断片ａ、ｂ、ｄおよびｅの複数のコピーは、それぞれ特徴部ａ、ｂ、ｄおよびｅで固定されている。チップＢ上の各々の特徴部は、図５、パートＢに示されるように溶液の小滴によって被覆されている。本発明の一実施形態によると、断片ａ、ｂ、ｄおよびｅは、チップＢ上の各々の特徴部の表面から開裂され、脱カップリングされまたはそうでなければ結合が外れ、各々のそれぞれの特徴部で小滴中に遊離する。チップＢにおいて、特徴部ａおよびｂの小滴は、単一の小滴に融合し、特徴部ｄおよびｅの小滴も同様である。融合した小滴は、１つの融合した小滴中の断片ａおよびｂ、ならびに他方の融合した小滴中の断片ｄおよびｅのハイブリダイゼーションに好適な条件にかけられ、それぞれ断片ａ／ｂおよび断片ｄ／ｅが形成される。ある特定の実施形態では、断片は、ハイブリダイゼーション時、例えば、断片ａ／ｂが非結合末端で一本鎖オーバーハングを含み、この一本鎖オーバーハングが、断片ｃの一部分に相補的であるように分解されている。図５、パートＣに示されるように、次いで、チップＡおよびＢは、特徴部ａ／ｂが、特徴部ｃに相対し、特徴部ｄ／ｅが特徴部ｆに相対するように整列される。チップＡおよびＢは、特徴部ａ／ｂを被覆する融合した小滴がチップＢから移動してチップＡ上の特徴部ｃを被覆し、二重断片ａ／ｂの非結合コピーが特徴部ｃに輸送され、特徴部ｄ／ｅを被覆する融合した小滴がチップＢから移動してチップＡの特徴部ｆを被覆し、二重断片ｄ／ｅの非結合コピーが特徴部ｆに輸送されるように近接される。小滴は、再度、二重断片ａ／ｂの一本鎖オーバーハングが断片ｃとハイブリダイズし、二重断片ｄ／ｅの一本鎖オーバーハングが断片ｆとハイブリダイズするように、ハイブリダイゼーションに好適な条件にかけられる。一実施形態によると、小滴の移動は、圧電材料によって作動された振動、音波もしくは超音波振動、または他の動的手段を含むがこれらに限定されない任意の手段によって達成され得る。小滴の移動を行う他の方法は、エレクトロウェッティング技術または他の電子工学的手段を含み得る。あるいはまたはさらに、チップＡおよび／もしくはＢ上の特徴部もしくは周囲表面の親水性および／もしくは疎水性、または特徴部のサイズもしくは形状の変更または制御を使用して、チップＢからＡへの小滴の移動を行うことができる。図５、パートＤでは、チップＡおよびＢは分離しており、ここで移動された小滴はチップＡ上の特徴部ｃおよびｆを被覆している。このプロセスは、標的核酸が逐次および／または階層様式でアセンブルされるように繰り返すことができる。
【０１０６】
本開示の種々の態様は、単独で、組み合わせて、または前述において記載される実施形態で具体的に論じられていない種々の配置構成で使用することができ、したがって、その適用は、前述の記載で示されるまたは図面で例示されるコンポーネントの詳細および１構成に限定されない。例えば、一実施形態で記載された態様は、他の実施形態で記載された態様と任意の方式で組み合わせることができる。また、本明細書で使用される表現および用語は、説明のためのものであり、限定とみなされるべきではない。
【０１０７】
特許請求の範囲において請求要素を修飾する「第１の」、「第２の」、「第３の」などの順序を示す用語の使用は、それ自体は、優先度、先行性、または１つの請求要素の別のものに対する順序もしくは方法の行為が実施される時間的順序を含意するのではなく、請求要素を区別するために、ある特定の名前を有する１つの請求要素を（順序を示す用語を使用しなければ）同じ名前を有する別の要素と区別するための単なる標識として使用される。
【０１０８】
参照による組込み
本明細書で言及されるすべての出版物、特許および配列データベースエントリーは、各々個々の出版物または特許が具体的かつ個別に参照によって組み込まれることが示されるかのように、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。特に、国際公開第ＷＯ２０１０／０２５３１０、ＷＯ２０１１／０５６８７２、ＷＯ２０１１／０６６１８６、ならびに米国特許第８，７１６，４６７号および第９，２９５，９６５号が参照され、これらの各々の全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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