(57)【要約】エクソンスキッピングまたはエクソンインクルージョンを誘導するために、誤ってスプライシングされたｍＲＮＡ転写産物における挿入、欠失、重複、あるいは改質を引き起こす分子および医薬組成物が本明細書で開示される。エクソンスキッピングまたはエクソンインクルージョンを誘導するために誤ってスプライシングされたｍＲＮＡ転写産物における挿入、欠失、重複、あるいは改質を引き起こす分子あるいは医薬組成物を含む疾患または障害を処置する方法が本明細書でさらに記載される。【選択図】図１５Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
疾患または障害を処置する方法であって、前記方法が、
被験体にポリ核酸分子抱合体を投与する工程を含み、
ポリ核酸分子抱合体が、標的細胞結合部分と、標的とされたｍＲＮＡ前駆体特異的スプライス調節ポリ核酸部分とを含み、標的細胞結合部分が標的とされた細胞に特異的に結合し、および、標的とされたｍＲＮＡ前駆体特異的スプライス調節ポリ核酸部分が、ｍＲＮＡ転写産物を生成するために、標的とされたｍＲＮＡ前駆体の転写産物においてスプライシング事象を誘発するべく、標的とされた細胞中の標的とされたｍＲＮＡ前駆体の転写産物の挿入、欠失、重複、あるいは改質を誘発し、および、ｍＲＮＡ転写産物は、未処理の標的細胞中の同じタンパク質と比較して、修飾されるタンパク質をコードし、それによって、被験体の疾患または障害を処置する、
方法。
【請求項２】
スプライシング事象がエクソンスキッピングである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
スプライシング事象がエクソンインクルージョンである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
疾患または障害はさらに、ｍＲＮＡ前駆体中の１つ以上の突然変異を特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
疾患または障害は、神経筋疾患、遺伝病、癌、遺伝性疾患、あるいは心血管疾患を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
疾患または障害は筋ジストロフィーである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
疾患または障害はデュシェンヌ型筋ジストロフィーである、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
スプライシング事象は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン８、２３、３５、４３、４４、４５、５０、５１、５２、５３、または、５５のものである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
スプライシング事象がＤＭＤ遺伝子のエクソン２３のものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
スプライシング事象はＰＡＨ、ＭＳＴＮ、またはＫ−Ｒａｓ遺伝子のエクソンのものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ポリ核酸分子抱合体は、式（Ｉ）の構造を含み、
Ａ−Ｘ−Ｂ
式Ｉ
式中、
Ａは結合部分を含み、
Ｂはポリヌクレオチドからなり、
および、Ｘは単結合または第１のリンカーからなる、
請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ポリ核酸分子抱合体は、式（ＩＩ）の構造を含み、
Ａ−Ｘ−Ｂ−Ｙ−Ｃ
式ＩＩ
式中、
Ａは結合部分を含み、
Ｂはポリヌクレオチドからなり、
Ｃはポリマーからなり、
Ｘは単結合または第１のリンカーからなり、
および、Ｙは単結合または第２のリンカーからなる、
請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ポリ核酸分子抱合体は、式（ＩＩＩ）の構造を含み、
Ａ−Ｘ−Ｃ−Ｙ−Ｂ
式ＩＩＩ
式中、
Ａは結合部分を含み、
Ｂはポリヌクレオチドからなり、
Ｃはポリマーからなり、
Ｘは単結合または第１のリンカーからなり、
および、Ｙは単結合または第２のリンカーからなる、
請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ポリ核酸分子抱合体は随意に、少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチド、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間結合、あるいは少なくとも１つの逆脱塩基部分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチドは、モルホリノ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル、２’−デオキシ、Ｔ−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、Ｔ−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、または、２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）修飾ヌクレオチドを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチドは、ロックド核酸（ＬＮＡ）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、あるいはペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチドはモルホリノを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも１つの逆塩基部分は少なくとも１つの末端である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエート結合あるいはジチオリン酸結合を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
ポリ核酸分子は、少なくとも約１０から約３０ヌクレオチド長さを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
ポリ核酸分子は少なくとも約１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の修飾を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
ポリ核酸分子は一本鎖を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
ポリ核酸分子は二本以上の鎖を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
ポリ核酸分子は、二本鎖ポリ核酸分子を形成するために、第１のポリヌクレオチドと、第１のポリヌクレオチドにハイブリダイズされた第２のポリヌクレオチドとを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
第２のポリヌクレオチドは少なくとも１つの修飾を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドはＲＮＡ分子を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドはｓｉＲＮＡ分子を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
Ｘは単結合である、請求項１１に記載の方法。
【請求項２９】
ＸとＹは独立して、単結合、分解性リンカー、非分解性リンカー、切断リンカー、あるいは非ポリマーリンカー基である、請求項１２に記載の方法。
【請求項３０】
ＸとＹは独立して、単結合、分解性リンカー、非分解性リンカー、切断リンカー、あるいは非ポリマーリンカー基である、請求項１３に記載の方法。
【請求項３１】
ＸはＣ１−Ｃ６アルキル基である、請求項１１に記載の方法。
【請求項３２】
ＸまたはＹはＣ１−Ｃ６アルキル基である、請求項１２に記載の方法。
【請求項３３】
ＸまたはＹはＣ１−Ｃ６アルキル基である、請求項１３に記載の方法。
【請求項３４】
結合部分は抗体またはその結合フラグメントである、請求項１１に記載の方法。
【請求項３５】
結合部分は抗体またはその結合フラグメントである、請求項１２に記載の方法。
【請求項３６】
結合部分は抗体またはその結合フラグメントである、請求項１３に記載の方法。
【請求項３７】
Ｃはポリエチレングリコールである、請求項１２に記載の方法。
【請求項３８】
Ｃはポリエチレングリコールである、請求項１３に記載の方法。
【請求項３９】
Ａ−ＸはＢの５’末端へ共役し、Ｙ−ＣはＢの３’末端へ共役する、請求項１２に記載の方法。
【請求項４０】
Ｙ−ＣはＢの５’末端へ共役し、Ａ−ＸはＢの３’末端へ共役する、請求項１２に記載の方法。
【請求項４１】
さらにＤを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項４２】
ＤはＣあるいはＡに共役する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
少なくとも第２の結合部分Ａをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項４４】
少なくとも第２の結合部分Ａをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項４５】
少なくとも第２の結合部分Ａをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項４６】
標的とされたｍＲＮＡ前駆体転写産物においてスプライシング事象を誘導する方法であって、
前記方法は、
ａ）標的細胞をポリ核酸分子抱合体に接触させる工程であって、ポリ核酸分子抱合体が、標的細胞結合部分とポリ核酸部分を調節する標的とされたｍＲＮＡ前駆体スプライスとを含む、工程と、
ｂ）ｍＲＮＡ転写産物を産生するために標的とされたｍＲＮＡ前駆体の転写産物においてスプライシング事象を誘発するべく、標的細胞内の標的とされたｍＲＮＡ前駆体の転写産物へ、ポリ核酸部分を調節する標的とされたｍＲＮＡ前駆体スプライスをハイブリダイズする工程と、
ｃ）タンパク質を産生するために標的細胞において工程ｂ）のｍＲＮＡ転写産物を随意に翻訳する工程を含む、
方法。
【請求項４７】
スプライシング事象がエクソンスキッピングである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
スプライシング事象がエクソンインクルージョンである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
標的とされたｍＲＮＡ前駆体の転写産物が疾患または障害を誘発する、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
疾患または障害は、神経筋疾患、遺伝病、癌、遺伝性疾患、あるいは心血管疾患を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
ポリ核酸分子抱合体は、
ａ）式（Ｉ）の構造を含み、
Ａ−Ｘ−Ｂ
式Ｉ
式中、
Ａは結合部分を含み、
Ｂはポリヌクレオチドからなり、
および、Ｘは単結合または第１のリンカーからなり；
ｂ）式（ＩＩ）の構造を含み、
Ａ−Ｘ−Ｂ−Ｙ−Ｃ
式ＩＩ
式中、
Ａは結合部分を含み、
Ｂはポリヌクレオチドからなり、
Ｃはポリマーからなり、
Ｘは単結合または第１のリンカーからなり、
および、Ｙは単結合または第２のリンカーであり；または、
ｃ）式（ＩＩＩ）の構造を含み、
Ａ−Ｘ−Ｃ−Ｙ−Ｂ
式ＩＩＩ
式中、
Ａは結合部分を含み、
Ｂはポリヌクレオチドからなり、
Ｃはポリマーからなり、
Ｘは単結合または第１のリンカーからなり、
および、Ｙは単結合または第２のリンカーからなる、
請求項４６に記載の方法。
【請求項５２】
ポリ核酸分子抱合体は随意に、少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチド、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間結合、あるいは少なくとも１つの逆脱塩基部分を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項５３】
少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチドは、モルホリノ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル、２’−デオキシ、Ｔ−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、Ｔ−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、または、２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）修飾ヌクレオチドを含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチドは、ロックド核酸（ＬＮＡ）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチドはモルホリノを含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５６】
少なくとも１つの逆塩基部分は少なくとも１つの末端である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５７】
少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエート結合あるいはジチオリン酸結合を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５８】
ポリ核酸分子は、少なくとも約１０から約３０ヌクレオチド長さを含む、請求項４６−５７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項５９】
ポリ核酸分子は少なくとも約１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の修飾を含む、請求項４６−５８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６０】
ポリ核酸分子は少なくとも約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、または約２２以上の修飾を含む、請求項４６−５９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６１】
ＸとＹは独立して、単結合、分解性リンカー、非分解性リンカー、切断リンカー、あるいは非ポリマーリンカー基である、請求項４６−６０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６２】
Ｘは単結合である、請求項４６−６１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６３】
ＸはＣ１−Ｃ６アルキル基である、請求項４６−６１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６４】
ＹはＣ１−Ｃ６アルキル基である、請求項４６−６３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６５】
Ｘは、随意にＣ１−Ｃ６アルキル基に共役した、ホモ二機能性リンカーあるいはヘテロ二機能性リンカーである、請求項４６−６３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６６】
Ｙはホモ二機能性リンカーあるいはヘテロ二機能性リンカーである、請求項４６−６３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６７】
結合部分は抗体またはその結合フラグメントである、請求項４６−６６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６８】
Ｃはポリエチレングリコールである、請求項４６−６７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６９】
Ａ−ＸはＢの５’末端へ共役し、Ｙ−ＣはＢの３’末端へ共役する、請求項４６−６８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７０】
Ｙ−ＣはＢの５’末端へ共役し、Ａ−ＸはＢの３’末端へ共役する、請求項４６−６９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７１】
Ａ−Ｘ、Ｙ−Ｃ、またはその組み合わせはヌクレオチド間結合群に共役する、請求項４６−７０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７２】
さらにＤを含む、請求項４６−７１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７３】
ＤはＣあるいはＡに共役する、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
少なくとも第２の結合部分Ａをさらに含む、請求項４６−７３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７５】
標的細胞結合部分と、標的とされたｍＲＮＡ前駆体特異的スプライス調節ポリ核酸部分とを含む、ポリ核酸分子抱合体組成物であって、
標的とされたｍＲＮＡ前駆体特異的スプライス調節ポリ核酸部分は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４−９７２に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する配列を含む、
ポリ核酸分子抱合体組成物。
【請求項７６】
ポリ核酸分子抱合体は、
ａ）式（Ｉ）の構造を含み、
Ａ−Ｘ−Ｂ
式Ｉ
式中、
Ａは結合部分を含み、
Ｂはポリヌクレオチドからなり、
および、Ｘは単結合または第１のリンカーからなり；
ｂ）式（ＩＩ）の構造を含み、
Ａ−Ｘ−Ｂ−Ｙ−Ｃ
式ＩＩ
式中、
Ａは結合部分を含み、
Ｂはポリヌクレオチドからなり、
Ｃはポリマーからなり、
Ｘは単結合または第１のリンカーからなり、
および、Ｙは単結合または第２のリンカーからなり；または、
ｃ）式（ＩＩＩ）の構造を含み、
Ａ−Ｘ−Ｃ−Ｙ−Ｂ
式ＩＩＩ
式中、
Ａは結合部分を含み、
Ｂはポリヌクレオチドからなり、
Ｃはポリマーからなり、
Ｘは単結合または第１のリンカーからなり、
および、Ｙは単結合または第２のリンカーからなる、
請求項７５に記載のポリ核酸分子抱合体組成物。
【請求項７７】
医薬組成物はナノ粒子製剤として製剤される、請求項７５または７６のいずれか１つに記載のポリ核酸分子抱合体組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、２０１７年９月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／５６１，９３９号の利益と、２０１７年１月６日に出願された米国仮特許出願第６２／４４３，５１４号の利益を主張するものであり、当該文献はそれぞれ、全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は配列表を包含しており、これは、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、その全体を引用することで本明細書に組み込まれる。２０１７年１２月２２日に作成された上記ＡＳＣＩＩのコピーは、４５５３２−７１５＿６０１＿ＳＬ．ｔｘｔのファイル名であり、２１０，５３４バイトのサイズである。
【背景技術】
【０００３】
ＲＮＡ機能の調節は治療的関心を集める発展途上の領域である。アンチセンスオリゴヌクレオチドと低分子干渉ＲＮＡのようにｍＲＮＡ安定性に影響を与える薬物は、ＲＮＡ機能を調節する一つの方法である。オリゴヌクレオチドの別の群は、最終的な遺伝子産物：コードされたタンパク質からｍＲＮＡ前駆体の特定の領域を包含または除外するために、ｍＲＮＡ前駆体の処理を変更することにより、ＲＮＡ機能を調節することができる。したがって、オリゴヌクレオチド治療薬は、疾患状態におけるタンパク質発現を調節する手段を表し、したがって、治療薬としての有用性を有している。
【発明の概要】
【０００４】
本明細書では、特定の実施形態において、ＲＮＡプロセシングを調節するための分子および医薬組成物が開示される。
【０００５】
本明細書では、ある実施形態において、被験体の誤ってスプライシングされたｍＲＮＡ転写産物によって引き起こされた疾患または障害を処置する方法が開示され、該方法は、被験体にポリ核酸分子抱合体を投与する工程を含み、ここで、ポリ核酸分子抱合体は細胞標的結合部分に共役し、ここで、ポリヌクレオチドは随意に、少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチド、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間結合、あるいは少なくとも１つの逆脱塩基部分を含み、ここで、ポリ核酸分子抱合体は、完全に処理されたｍＲＮＡ転写産物を生成するために、誤ってスプライシングされたｍＲＮＡ転写産物中のエクソンスキッピングまたはエクソンインクルージョンを誘発するべく、誤ってスプライシングされたｍＲＮＡ転写産物の挿入、欠失、重複、あるいは改質を誘発し、および、ここで、完全に処理されたｍＲＮＡ転写産物は、機能タンパク質をコードし、それによって、被験体の疾患または障害を処置する。いくつかの実施形態において、疾患または障害はさらに、ｍＲＮＡ中の１つ以上の突然変異を特徴とする。いくつかの実施形態において、疾患または障害は、神経筋疾患、遺伝病、癌、遺伝性疾患、あるいは心血管疾患を含む。いくつかの実施形態において、疾患または障害は筋ジストロフィーである。いくつかの実施形態において、疾患または障害はデュシェンヌ型筋ジストロフィーである。いくつかの実施形態において、エクソンスキッピングは、ＤＭＤ遺伝子のエクソン８、２３、３５、４３、４４、４５、５０、５１、５２、５３、または、５５のものである。いくつかの実施形態において、エクソンスキッピングはＤＭＤ遺伝子のエクソン２３のものである。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子抱合体は、式（Ｉ）の構造を含み、
Ａ−Ｘ−Ｂ
式Ｉ
式中、
Ａは結合部分を含み、
Ｂはポリヌクレオチドからなり、および、
Ｘは単結合または第１のリンカーからなる。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子抱合体は、式（ＩＩ）の構造を含み、
Ａ−Ｘ−Ｂ−Ｙ−Ｃ
式ＩＩ
式中、
Ａは結合部分を含み、
Ｂはポリヌクレオチドからなり、
Ｃはポリマーからなり、
Ｘは単結合または第１のリンカーからなり、および、
Ｙは単結合または第２のリンカーからなる。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子抱合体は、式（ＩＩＩ）の構造を含み、
Ａ−Ｘ−Ｃ−Ｙ−Ｂ
式ＩＩＩ
式中、
Ａは結合部分を含み、
Ｂはポリヌクレオチドからなり、
Ｃはポリマーからなり、
Ｘは単結合または第１のリンカーからなり、および、
Ｙは単結合または第２のリンカーからなる。
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチドは、モルホリノ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル、２’−デオキシ、Ｔ−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、Ｔ−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、または、２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチドは、ロックド核酸（ＬＮＡ）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、あるいはペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチドは、モルホリノを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの逆塩基部分は少なくとも１つの末端である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエート結合あるいはジチオリン酸結合を含む。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は、少なくとも約１０から約３０ヌクレオチド長さである。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、約１５から約３０、約１８から約２５、約１８から約２４、約１９から約２３、約２０から約２２ヌクレオチド長さの少なくとも１つである。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は、少なくとも約１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド長さである。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は以下の少なくとも１つを含む：約５％から約１００％の修飾、約１０％から約１００％の修飾、約２０％から約１００％の修飾、約３０％から約１００％の修飾、約４０％から約１００％の修飾、約５０％から約１００％の修飾、約６０％から約１００％の修飾、約７０％から約１００％の修飾、約８０％から約１００％の修飾、および、約９０％から約１００％の修飾。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は以下の少なくとも１つを含む：約１０％から約９０％の修飾、約２０％から約９０％の修飾、約３０％から約９０％の修飾、約４０％から約９０％の修飾、約５０％から約９０％の修飾、約６０％から約９０％の修飾、約７０％から約９０％の修飾、および、約８０％から約１００％の修飾。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は以下の少なくとも１つを含む：約１０％から約８０％の修飾、約２０％から約８０％の修飾、約３０％から約８０％の修飾、約４０％から約８０％の修飾、約５０％から約８０％の修飾、約６０％から約８０％の修飾、および、約７０％から約８０％の修飾。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は以下の少なくとも１つを含む：約１０％から約７０％の修飾、約２０％から約７０％の修飾、約３０％から約７０％の修飾、約４０％から約７０％の修飾、約５０％から約７０％の修飾、および、約６０％から約７０％の修飾。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は以下の少なくとも１つを含む：約１０％から約６０％の修飾、約２０％から約６０％の修飾、約３０％から約６０％の修飾、約４０％から約６０％の修飾、および約５０％から約６０％の修飾。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は以下の少なくとも１つを含む：約１０％から約５０％の修飾、約２０％から約５０％の修飾、約３０％から約５０％の修飾、および約４０％から約５０％の修飾。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は以下の少なくとも１つを含む：約１０％から約４０％の修飾、約２０％から約４０％の修飾、および約３０％から約４０％の修飾。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は以下の少なくとも１つを含む：約１０％から約３０％の修飾、および約２０％から約３０％の修飾。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約１０％から約２０％の修飾を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約１５％から約９０％、約２０％から約８０％、約３０％から約７０％、あるいは約４０％から約６０％の修飾を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は少なくとも約１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の修飾を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は少なくとも約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、または約２２以上の修飾を含む。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は、少なくとも約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、またはそれ以上の修飾されたヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は一本鎖を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は二本以上の鎖を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、二本鎖ポリ核酸分子を形成するために、第１のポリヌクレオチドと、第１のポリヌクレオチドにハイブリダイズされた第２のポリヌクレオチドとを含む。いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドは少なくとも１つの修飾を含む。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドはＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドはｓｉＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態において、ＸとＹは独立して、単結合、分解性リンカー、非分解性リンカー、切断リンカー、あるいは非ポリマーリンカー基である。いくつかの実施形態において、Ｘは単結合である。いくつかの実施形態において、ＸはＣ１−Ｃ６アルキル基である。いくつかの実施形態において、ＹはＣ１−Ｃ６アルキル基である。いくつかの実施形態において、Ｘは、随意にＣ１−Ｃ６アルキル基に共役した、ホモ二機能性リンカーあるいはヘテロ二機能性リンカーである。いくつかの実施形態において、Ｙはホモ二機能性リンカーあるいはヘテロ二機能性リンカーである。いくつかの実施形態では、結合部分は、抗体またはその結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体またはその結合フラグメントは、ヒト化抗体またはその結合フラグメント、キメラ抗体またはその結合フラグメント、モノクローナル抗体またはその結合フラグメント、一価Ｆａｂ’、二価Ｆａｂ２、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、ナノボディ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、またはラクダ抗体、あるいはその結合フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、Ｃはポリエチレングリコールである。いくつかの実施形態では、Ｃは約５，０００Ｄａの分子量を有する。いくつかの実施形態において、Ａ−ＸはＢの５’末端へ共役し、Ｙ−ＣはＢの３’末端へ共役する。いくつかの実施形態において、Ｙ−ＣはＢの５’末端へ共役し、Ａ−ＸはＢの３’末端へ共役する。いくつかの実施形態において、Ａ−Ｘ、Ｙ−Ｃ、またはその組み合わせはヌクレオチド間結合群に共役する。いくつかの実施形態では、方法はＤをさらに含む。いくつかの実施形態において、ＤはＣあるいはＡに共役する。いくつかの実施形態において、Ｄは、式（ＩＶ）に係る式（ＩＩ）の分子抱合体に共役し、
（Ａ−Ｘ−Ｂ−Ｙ−Ｃｃ）−Ｌ−Ｄ
式ＩＶ
式中、
Ａは結合部分を含み、
Ｂはポリヌクレオチドからなり、
Ｃはポリマーからなり、
Ｘは単結合または第１のリンカーからなり、
Ｙは単結合または第２のリンカーからなり、
Ｌは単結合または第３のリンカーからなり、
Ｄはエンドソーム溶解性部分からなり、および、
ｃは０と１の間の整数であり、
ここで、ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチド、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間結合、あるいは少なくとも１つの逆脱塩基部分を含み、および、Ｄは、Ａ、Ｂ、またはＣのいかなる場所に共役している。
いくつかの実施形態では、ＤはＩＮＦ７またはメリチンである。いくつかの実施形態では、ＬはＣ１−Ｃ６アルキル基である。いくつかの実施形態において、Ｌはホモ二機能性リンカーあるいはヘテロ二機能性リンカーである。いくつかの実施形態において、方法はさらに少なくとも第２の結合部分Ａを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも第２の結合部分Ａは、Ａ、Ｂ、またはＣに共役する。
【０００６】
いくつかの実施形態において、誤ってスプライシングされたｍＲＮＡ転写産物中のエクソンスキッピングあるいはエクソンインクルージョンを誘発するために、誤ってスプライシングされたｍＲＮＡ転写産物の挿入、欠失、重複、または改質を誘発する方法が本明細書で開示され、前記方法が：標的細胞をポリ核酸分子抱合体に接触させる工程であって、ポリヌクレオチドが、少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチド、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間結合、あるいは少なくとも１つの逆脱塩基部分を含む、結合と、エクソンスキッピングまたはエクソンインクルージョンを誘発するために、誤ってスプライシングされたｍＲＮＡ転写産物の挿入、欠失、重複あるいは改質を誘発するべく、標的細胞内の誤ってスプライシングされたｍＲＮＡ転写産物へポリ核酸分子抱合体をハイブリダイズする工程であって、誤ってスプライシングされたｍＲＮＡ転写産物がタンパク質の機能形態をコードすることができる、工程と、および、前の工程の完全に処理されたｍＲＮＡ転写産物のタンパク質の機能形態を翻訳する工程を、含む。いくつかの実施形態において、標的細胞は被験体の標的細胞である。いくつかの実施形態において、誤ってスプライシングされたｍＲＮＡ転写産物はさらに疾患または障害を誘発する。いくつかの実施形態において、疾患または障害はさらに、ｍＲＮＡ中の１つ以上の突然変異を特徴とする。いくつかの実施形態において、疾患または障害は、神経筋疾患、遺伝病、癌、遺伝性疾患、あるいは心血管疾患を含む。いくつかの実施形態において、疾患または障害は筋ジストロフィーである。いくつかの実施形態において、疾患または障害はデュシェンヌ型筋ジストロフィーである。いくつかの実施形態において、エクソンスキッピングは、ＤＭＤ遺伝子のエクソン８、２３、３５、４３、４４、４５、５０、５１、５２、５３、または、５５のものである。いくつかの実施形態において、エクソンスキッピングはＤＭＤ遺伝子のエクソン２３のものである。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子抱合体は、式（Ｉ）の構造を含み、
Ａ−Ｘ−Ｂ
式Ｉ
式中、
Ａは結合部分を含み、
Ｂはポリヌクレオチドからなり、および、
Ｘは単結合または第１のリンカーからなる。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子抱合体は、式（ＩＩ）の構造を含み、
Ａ−Ｘ−Ｂ−Ｙ−Ｃ
式ＩＩ
式中、
Ａは結合部分を含み、
Ｂはポリヌクレオチドからなり、
Ｃはポリマーからなり、
Ｘは単結合または第１のリンカーからなり、および、
Ｙは単結合または第２のリンカーからなる。
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子抱合体は、式（ＩＩＩ）の構造を含み、
Ａ−Ｘ−Ｃ−Ｙ−Ｂ
式ＩＩＩ
式中、
Ａは結合部分を含み、
Ｂはポリヌクレオチドからなり、
Ｃはポリマーからなり、
Ｘは単結合または第１のリンカーからなり、および、
Ｙは単結合または第２のリンカーからなる。
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチドは、モルホリノ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル、２’−デオキシ、Ｔ−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、Ｔ−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、または、２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチドは、ロックド核酸（ＬＮＡ）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチドは、モルホリノを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの逆塩基部分は少なくとも１つの末端である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエート結合あるいはジチオリン酸結合を含む。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は、少なくとも約１０から約３０ヌクレオチド長さである。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、約１５から約３０、約１８から約２５、約１８から約２４、約１９から約２３、約２０から約２２ヌクレオチド長さの少なくとも１つである。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は、少なくとも約１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド長さである。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は以下の少なくとも１つを含む：約５％から約１００％の修飾、約１０％から約１００％の修飾、約２０％から約１００％の修飾、約３０％から約１００％の修飾、約４０％から約１００％の修飾、約５０％から約１００％の修飾、約６０％から約１００％の修飾、約７０％から約１００％の修飾、約８０％から約１００％の修飾、および、約９０％から約１００％の修飾。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は以下の少なくとも１つを含む：約１０％から約９０％の修飾、約２０％から約９０％の修飾、約３０％から約９０％の修飾、約４０％から約９０％の修飾、約５０％から約９０％の修飾、約６０％から約９０％の修飾、約７０％から約９０％の修飾、および、約８０％から約１００％の修飾。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は以下の少なくとも１つを含む：約１０％から約８０％の修飾、約２０％から約８０％の修飾、約３０％から約８０％の修飾、約４０％から約８０％の修飾、約５０％から約８０％の修飾、約６０％から約８０％の修飾、および、約７０％から約８０％の修飾。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は以下の少なくとも１つを含む：約１０％から約７０％の修飾、約２０％から約７０％の修飾、約３０％から約７０％の修飾、約４０％から約７０％の修飾、約５０％から約７０％の修飾、および、約６０％から約７０％の修飾。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は以下の少なくとも１つを含む：約１０％から約６０％の修飾、約２０％から約６０％の修飾、約３０％から約６０％の修飾、約４０％から約６０％の修飾、および約５０％から約６０％の修飾。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は以下の少なくとも１つを含む：約１０％から約５０％の修飾、約２０％から約５０％の修飾、約３０％から約５０％の修飾、および約４０％から約５０％の修飾。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は以下の少なくとも１つを含む：約１０％から約４０％の修飾、約２０％から約４０％の修飾、および約３０％から約４０％の修飾。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は以下の少なくとも１つを含む：約１０％から約３０％の修飾、および約２０％から約３０％の修飾。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約１０％から約２０％の修飾を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約１５％から約９０％、約２０％から約８０％、約３０％から約７０％、あるいは約４０％から約６０％の修飾を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は少なくとも約１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の修飾を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は少なくとも約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、または約２２以上の修飾を含む。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は、少なくとも約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、またはそれ以上の修飾されたヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は一本鎖を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は二本以上の鎖を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、二本鎖ポリ核酸分子を形成するために、第１のポリヌクレオチドと、第１のポリヌクレオチドにハイブリダイズされた第２のポリヌクレオチドとを含む。いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドは少なくとも１つの修飾を含む。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドはＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドはｓｉＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態において、ＸとＹは独立して、単結合、分解性リンカー、非分解性リンカー、切断リンカー、あるいは非ポリマーリンカー基である。いくつかの実施形態において、Ｘは単結合である。いくつかの実施形態において、ＸはＣ１−Ｃ６アルキル基である。いくつかの実施形態において、ＹはＣ１−Ｃ６アルキル基である。いくつかの実施形態において、Ｘは、随意にＣ１−Ｃ６アルキル基に共役した、ホモ二機能性リンカーあるいはヘテロ二機能性リンカーである。いくつかの実施形態において、Ｙはホモ二機能性リンカーあるいはヘテロ二機能性リンカーである。いくつかの実施形態では、結合部分は、抗体またはその結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体またはその結合フラグメントは、ヒト化抗体またはその結合フラグメント、キメラ抗体またはその結合フラグメント、モノクローナル抗体またはその結合フラグメント、一価Ｆａｂ’、二価Ｆａｂ２、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、ナノボディ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、またはラクダ抗体、あるいはその結合フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、Ｃはポリエチレングリコールである。いくつかの実施形態では、Ｃは約５，０００Ｄａの分子量を有する。いくつかの実施形態において、Ａ−ＸはＢの５’末端へ共役し、Ｙ−ＣはＢの３’末端へ共役する。いくつかの実施形態において、Ｙ−ＣはＢの５’末端へ共役し、Ａ−ＸはＢの３’末端へ共役する。いくつかの実施形態において、Ａ−Ｘ、Ｙ−Ｃ、またはその組み合わせはヌクレオチド間結合群に共役する。いくつかの実施形態では、方法はＤをさらに含む。いくつかの実施形態において、ＤはＣあるいはＡに共役する。いくつかの実施形態において、Ｄは、式（ＩＶ）に係る式（ＩＩ）の分子抱合体に共役し、
（Ａ−Ｘ−Ｂ−Ｙ−Ｃｃ）−Ｌ−Ｄ
式ＩＶ
式中、
Ａは結合部分を含み、
Ｂはポリヌクレオチドからなり、
Ｃはポリマーからなり、
Ｘは単結合または第１のリンカーからなり、
Ｙは単結合または第２のリンカーであり、
Ｌは単結合または第３のリンカーからなり、
Ｄはエンドソーム溶解性部分からなり、および、
ｃは０と１の間の整数であり、
ここで、ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチド、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間結合、あるいは少なくとも１つの逆脱塩基部分を含み、および、Ｄは、Ａ、Ｂ、またはＣのいかなる場所に共役している。
いくつかの実施形態では、ＤはＩＮＦ７またはメリチンである。いくつかの実施形態では、ＬはＣ１−Ｃ６アルキル基である。いくつかの実施形態において、Ｌはホモ二機能性リンカーあるいはヘテロ二機能性リンカーである。いくつかの実施形態において、方法はさらに少なくとも第２の結合部分Ａを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも第２の結合部分Ａは、Ａ、Ｂ、またはＣに共役する。いくつかの実施形態において、方法はインビボ方法である。いくつかの実施形態において、方法はインビトロ方法である。いくつかの実施形態では、被験体はヒトである。
【０００７】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法のいずれか１つによって得られた分子と薬学的に許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物が開示される。いくつかの実施形態において、医薬組成物はナノ粒子製剤として製剤される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、非経口投与、経口投与、鼻腔内投与、バッカル投与、直腸投与、または経皮投与のために製剤される。
【０００８】
ある実施形態において、本明細書に開示される方法のいずれか１つによって得られた分子を含むキットが本明細書で開示される。
【０００９】
ある実施形態において、ポリ核酸分子抱合体を含む組成物が本明細書で開示され、ここで、ポリ核酸分子抱合体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４−９７２に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する配列を含むポリヌクレオチドを含んでいる。ある実施形態において、ポリ核酸分子抱合体を含む組成物が本明細書で開示され、ここで、ポリ核酸分子抱合体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４−９７２に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する配列を含むポリヌクレオチドを含んでいる。ある実施形態において、ポリ核酸分子抱合体は、式（Ｉ）の構造を含み、
Ａ−Ｘ−Ｂ
式Ｉ
式中、
Ａは結合部分を含み、
Ｂはポリヌクレオチドからなり、および、
Ｘは単結合または第１のリンカーからなる。
ある実施形態において、ポリ核酸分子抱合体は、式（ＩＩ）の構造を含み、
Ａ−Ｘ−Ｂ−Ｙ−Ｃ
式ＩＩ
式中、
Ａは結合部分を含み、
Ｂはポリヌクレオチドからなり、
Ｃはポリマーからなり、
Ｘは単結合または第１のリンカーからなり、および、
Ｙは単結合または第２のリンカーからなる。
ある実施形態において、ポリ核酸分子抱合体は、式（ＩＩＩ）の構造を含み、
Ａ−Ｘ−Ｃ−Ｙ−Ｂ
式ＩＩＩ
式中、
Ａは結合部分を含み、
Ｂはポリヌクレオチドからなり、
Ｃはポリマーからなり、
Ｘは単結合または第１のリンカーからなり、および、
Ｙは単結合または第２のリンカーからなる。
ある実施形態において、少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチドは、モルホリノ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル、２’−デオキシ、Ｔ−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、Ｔ−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、または、２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）修飾ヌクレオチドを含む。ある実施形態において、少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチドはモルホリノを含む。
【００１０】
ある実施形態において、疾患または障害を処置する方法が本明細書で開示され、該方法は、被験体にポリ核酸分子抱合体を投与する工程を含み、ポリ核酸分子抱合体が、標的細胞結合部分と、標的とされたｍＲＮＡ前駆体特異的スプライス調節ポリ核酸部分とを含み、標的細胞結合部分が標的とされた細胞に特異的に結合し、および、標的とされたｍＲＮＡ前駆体特異的スプライス調節ポリ核酸部分が、ｍＲＮＡ転写産物を生成するために、標的とされたｍＲＮＡ前駆体の転写産物においてスプライシング事象を誘発するべく、標的とされた細胞中の標的とされたｍＲＮＡ前駆体の転写産物の挿入、欠失、重複、あるいは改質を誘発し、および、ｍＲＮＡ転写産物は、未処理の標的細胞中の同じタンパク質と比較して、修飾されるタンパク質をコードし、それによって、被験体の疾患または障害を処置する。ある実施形態では、スプライシング事象はエクソンスキッピングである。ある実施形態では、スプライシング事象はエクソンインクルージョンである。ある実施形態において、疾患または障害はさらに、ｍＲＮＡ前駆体中の１つ以上の突然変異を特徴とする。ある実施形態において、疾患または障害は、神経筋疾患、遺伝病、癌、遺伝性疾患、あるいは心血管疾患を含む。ある実施形態において、疾患または障害は筋ジストロフィーである。ある実施形態において、疾患または障害はデュシェンヌ型筋ジストロフィーである。ある実施形態において、スプライシング事象は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン８、２３、３５、４３、４４、４５、５０、５１、５２、５３、または、５５のものである。ある実施形態において、スプライシング事象はＤＭＤ遺伝子のエクソン２３のものである。ある実施形態では、スプライシング事象はＰＡＨ、ＭＳＴＮ、またはＫ−Ｒａｓ遺伝子のエクソンのものである。ある実施形態において、ポリ核酸分子抱合体は、式（Ｉ）の構造を含み、
Ａ−Ｘ−Ｂ
式Ｉ
式中、
Ａは結合部分を含み、
Ｂはポリヌクレオチドからなり、および、
Ｘは単結合または第１のリンカーからなる。
ある実施形態において、ポリ核酸分子抱合体は、式（ＩＩ）の構造を含み、
Ａ−Ｘ−Ｂ−Ｙ−Ｃ
式ＩＩ
式中、
Ａは結合部分を含み、
Ｂはポリヌクレオチドからなり、
Ｃはポリマーからなり、
Ｘは単結合または第１のリンカーからなり、および、
Ｙは単結合または第２のリンカーからなる。
ある実施形態において、ポリ核酸分子抱合体は、式（ＩＩＩ）の構造を含み、
Ａ−Ｘ−Ｃ−Ｙ−Ｂ
式ＩＩＩ
式中、
Ａは結合部分を含み、
Ｂはポリヌクレオチドからなり、
Ｃはポリマーからなり、
Ｘは単結合または第１のリンカーからなり、および、
Ｙは単結合または第２のリンカーからなる。
ある実施形態において、ポリ核酸分子抱合体は随意に、少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチド、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間結合、あるいは少なくとも１つの逆脱塩基部分を含む。ある実施形態において、少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチドは、モルホリノ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル、２’−デオキシ、Ｔ−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、Ｔ−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、または、２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）修飾ヌクレオチドを含む。ある実施形態において、少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチドは、ロックド核酸（ＬＮＡ）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、あるいはペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む。ある実施形態において、少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチドはモルホリノを含む。ある実施形態において、少なくとも１つの逆塩基部分は少なくとも１つの末端である。ある実施形態において、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエート結合あるいはジチオリン酸結合を含む。ある実施形態において、ポリ核酸分子は、少なくとも約１０から約３０ヌクレオチド長さを含む。ある実施形態において、ポリ核酸分子は少なくとも約１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の修飾を含む。ある実施形態において、ポリ核酸分子は一本鎖を含む。ある実施形態において、ポリ核酸分子は二本以上の鎖を含む。ある実施形態において、ポリ核酸分子は、二本鎖ポリ核酸分子を形成するために、第１のポリヌクレオチドと、第１のポリヌクレオチドにハイブリダイズされた第２のポリヌクレオチドとを含む。ある実施形態において、第２のポリヌクレオチドは少なくとも１つの修飾を含む。ある実施形態において、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドはＲＮＡ分子を含む。ある実施形態において、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドはｓｉＲＮＡ分子を含む。ある実施形態において、Ｘは単結合である。ある実施形態において、ＸとＹは独立して、単結合、分解性リンカー、非分解性リンカー、切断リンカー、あるいは非ポリマーリンカー基である。ある実施形態において、ＸとＹは独立して、単結合、分解性リンカー、非分解性リンカー、切断リンカー、あるいは非ポリマーリンカー基である。ある実施形態において、ＸはＣ１−Ｃ６アルキル基である。ある実施形態において、ＸまたはＹはＣ１−Ｃ６アルキル基である。ある実施形態において、ＸまたはＹはＣ１−Ｃ６アルキル基である。ある実施形態において、結合部分は、抗体またはその結合フラグメントである。ある実施形態において、結合部分は、抗体またはその結合フラグメントである。ある実施形態において、結合部分は、抗体またはその結合フラグメントである。ある実施形態において、Ｃはポリエチレングリコールである。ある実施形態において、Ｃはポリエチレングリコールである。ある実施形態において、Ａ−ＸはＢの５’末端へ共役し、Ｙ−ＣはＢの３’末端へ共役する。ある実施形態において、Ｙ−ＣはＢの５’末端へ共役し、Ａ−ＸはＢの３’末端へ共役する。いくつかの実施形態では、方法はＤをさらに含む。ある実施形態において、ＤはＣまたはＡに共役する。ある実施形態において、方法はさらに少なくとも第２の結合部分Ａを含む。ある実施形態において、方法はさらに少なくとも第２の結合部分Ａを含む。ある実施形態において、方法はさらに少なくとも第２の結合部分Ａを含む。
【００１１】
ある実施形態において、標的とされたｍＲＮＡ前駆体の転写産物においてスプライシング事象を誘発する方法が本明細書で開示され、該方法は、（ａ）標的細胞をポリ核酸分子抱合体に接触させる工程であって、ポリ核酸分子抱合体が、標的細胞結合部分とポリ核酸部分を調節する標的とされたｍＲＮＡ前駆体スプライスとを含む、工程と、（ｂ）ｍＲＮＡ転写産物を産生するために標的とされたｍＲＮＡ前駆体の転写産物においてスプライシング事象を誘発するべく、標的細胞内の標的とされたｍＲＮＡ前駆体の転写産物へ、ポリ核酸部分を調節する標的とされたｍＲＮＡ前駆体スプライスをハイブリダイズする工程と、（ｃ）タンパク質を産生するために標的細胞において工程（ｂ）のｍＲＮＡ転写産物を随意に翻訳する工程を含む。ある実施形態では、スプライシング事象はエクソンスキッピングである。ある実施形態では、スプライシング事象はエクソンインクルージョンである。ある実施形態では、標的とされたｍＲＮＡ前駆体の転写産物が疾患または障害を誘発する。ある実施形態において、疾患または障害は、神経筋疾患、遺伝病、癌、遺伝性疾患、あるいは心血管疾患を含む。ある実施形態において、ポリ核酸分子抱合体は、
ａ）式（Ｉ）の構造を含み、
Ａ−Ｘ−Ｂ
式Ｉ
式中、
Ａは結合部分を含み、
Ｂはポリヌクレオチドからなり、および、
Ｘは単結合または第１のリンカーからなり、
ｂ）化式（ＩＩ）の構造を含み、
Ａ−Ｘ−Ｂ−Ｙ−Ｃ
式ＩＩ
式中、
Ａは結合部分を含み、
Ｂはポリヌクレオチドからなり、
Ｃはポリマーからなり、
Ｘは単結合または第１のリンカーからなり、および、
Ｙは単結合または第２のリンカーからなり、または、
ｃ）化式（ＩＩＩ）の構造を含み、
Ａ−Ｘ−Ｃ−Ｙ−Ｂ
式ＩＩＩ
式中、
Ａは結合部分を含み、
Ｂはポリヌクレオチドからなり、
Ｃはポリマーからなり、
Ｘは単結合または第１のリンカーからなり、および、
Ｙは単結合または第２のリンカーからなる。
ある実施形態において、ポリ核酸分子抱合体は随意に、少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチド、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間結合、あるいは少なくとも１つの逆脱塩基部分を含む。ある実施形態において、少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチドは、モルホリノ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル、２’−デオキシ、Ｔ−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、Ｔ−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、または、２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）修飾ヌクレオチドを含む。ある実施形態において、少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチドは、ロックド核酸（ＬＮＡ）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む。ある実施形態において、少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチドはモルホリノを含む。ある実施形態において、少なくとも１つの逆塩基部分は少なくとも１つの末端である。ある実施形態において、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエート結合あるいはジチオリン酸結合を含む。ある実施形態において、ポリ核酸分子は、少なくとも約１０から約３０ヌクレオチド長さを含む。ある実施形態において、ポリ核酸分子は少なくとも約１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の修飾を含む。ある実施形態において、ポリ核酸分子は少なくとも約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、または約２２以上の修飾を含む。ある実施形態において、ＸとＹは独立して、単結合、分解性リンカー、非分解性リンカー、切断リンカー、あるいは非ポリマーリンカー基である。ある実施形態において、Ｘは単結合である。ある実施形態において、ＸはＣ１−Ｃ６アルキル基である。ある実施形態において、ＹはＣ１−Ｃ６アルキル基である。ある実施形態において、Ｘは、随意にＣ１−Ｃ６アルキル基に共役した、ホモ二機能性リンカーあるいはヘテロ二機能性リンカーである。ある実施形態において、Ｙはホモ二機能性リンカーあるいはヘテロ二機能性リンカーである。ある実施形態において、結合部分は、抗体またはその結合フラグメントである。ある実施形態において、Ｃはポリエチレングリコールである。ある実施形態において、Ａ−ＸはＢの５’末端へ共役し、Ｙ−ＣはＢの３’末端へ共役する。ある実施形態において、Ｙ−ＣはＢの５’末端へ共役し、Ａ−ＸはＢの３’末端へ共役する。ある実施形態において、Ａ−Ｘ、Ｙ−Ｃ、またはその組み合わせはヌクレオチド間結合群に共役する。いくつかの実施形態では、方法はＤをさらに含む。ある実施形態において、ＤはＣまたはＡに共役する。ある実施形態において、方法はさらに少なくとも第２の結合部分Ａを含む。
【００１２】
ある実施形態において、標的細胞結合部分と、標的とされたｍＲＮＡ前駆体特異的スプライス調節ポリ核酸部分とを含むポリ核酸分子抱合体組成物が本明細書で開示され、標的とされたｍＲＮＡ前駆体特異的スプライス調節ポリ核酸部分は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４−９７２に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する配列を含む。ある実施形態において、ポリ核酸分子抱合体は、
ａ）式（Ｉ）の構造を含み、
Ａ−Ｘ−Ｂ
式Ｉ
式中、
Ａは結合部分を含み、
Ｂはポリヌクレオチドからなり、および、
Ｘは単結合または第１のリンカーからなり、
ｂ）化式（ＩＩ）の構造を含み、
Ａ−Ｘ−Ｂ−Ｙ−Ｃ
式ＩＩ
式中、
Ａは結合部分を含み、
Ｂはポリヌクレオチドからなり、
Ｃはポリマーからなり、
Ｘは単結合または第１のリンカーからなり、および、
Ｙは単結合または第２のリンカーからなり、または、
ｃ）化式（ＩＩＩ）の構造を含み、
Ａ−Ｘ−Ｃ−Ｙ−Ｂ
式ＩＩＩ
式中、
Ａは結合部分を含み、
Ｂはポリヌクレオチドからなり、
Ｃはポリマーからなり、
Ｘは単結合または第１のリンカーからなり、および、
Ｙは単結合または第２のリンカーからなる。
ある実施形態において、医薬組成物はナノ粒子製剤として製剤される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】末端ヌクレオチドを拡張したホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）配列を描く（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）。
【図２Ａ】末端ヌクレオチドを拡張したホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＰＳ  ＡＳＯ）配列を描く（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）。
【図２Ｂ−１】完全に拡張したホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＰＳ  ＡＳＯ）配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）を描く。
【図２Ｂ−２】完全に拡張したホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＰＳ  ＡＳＯ）配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）を描く。
【図２Ｂ−３】完全に拡張したホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＰＳ  ＡＳＯ）配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）を描く。
【図２Ｂ−４】完全に拡張したホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＰＳ  ＡＳＯ）配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）を描く。
【図３】Ｔａｑｍａｎ  ｑＰＣＲを使用した、全ＲＮＡにおけるスキップされたＤＭＤ  ｍＲＮＡを定量化するために使用される方法を描く。
【図４】疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）方法２を使用した、産生された抗ＣＤ７１  ｍＡｂ−ＰＭＯ反応混合物のクロマトグラムを描く。
【図５Ａ】サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）方法１を使用した、産生された抗ＣＤ７１  ｍＡｂのクロマトグラムを描く。
【図５Ｂ】サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）方法１を使用した、産生された抗ＣＤ７１  ｍＡｂ−ＰＭＯＤＡＲ１，２のクロマトグラムを描く。
【図５Ｃ】サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）方法１を使用した、産生された抗ＣＤ７１  ｍＡｂ−ＰＭＯＤＡＲ＞２のクロマトグラムを描く。
【図６Ａ】疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）方法２を使用した、産生された抗ＣＤ７１  ｍＡｂのクロマトグラムを描く。
【図６Ｂ】疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）方法２を使用した、産生された精製された抗ＣＤ７１  ｍＡｂ−ＰＭＯＤＡＲ１，２抱合体のクロマトグラムを描く。
【図６Ｃ】疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）方法２を使用した、産生された精製された抗ＣＤ７１  ｍＡｂ−ＰＭＯＤＡＲ＞２抱合体のクロマトグラムを描く。
【図７Ａ】疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）方法３を使用した、抗ＣＤ７１Ｆａｂ−ＰＭＯの高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）精製のクロマトグラムを描く。
【図７Ｂ】ＳＥＣ方法１を使用した、産生された抗ＣＤ７１  Ｆａｂのクロマトグラムを描く。
【図７Ｃ】ＳＥＣ方法１を使用した、産生された抗ＣＤ７１  Ｆａｂ−ＰＭＯ  ＤＡＲ１抱合体のクロマトグラムを描く。
【図７Ｄ】ＳＥＣ方法１を使用した、産生された抗ＣＤ７１  Ｆａｂ−ＰＭＯ  ＤＡＲ２抱合体のクロマトグラムを描く。
【図７Ｅ】ＳＥＣ方法１を使用した、産生された抗ＣＤ７１  Ｆａｂ−ＰＭＯ  ＤＡＲ３抱合体のクロマトグラムを描く。
【図７Ｆ】ＨＩＣ方法４を使用した、産生された抗ＣＤ７１  Ｆａｂのクロマトグラムを描く。
【図７Ｇ】ＨＩＣ方法４を使用した、産生された抗ＣＤ７１  Ｆａｂ−ＰＭＯ  ＤＡＲ１抱合体のクロマトグラムを描く。
【図７Ｈ】ＨＩＣ方法４を使用した、産生された抗ＣＤ７１  Ｆａｂ−ＰＭＯ  ＤＡＲ２抱合体のクロマトグラムを描く。
【図７Ｉ】ＨＩＣ方法４を使用した、産生された抗ＣＤ７１  Ｆａｂ−ＰＭＯ  ＤＡＲ３抱合体のクロマトグラムを描く。
【図８Ａ】ＳＡＸ方法２を使用して産生された抗ＣＤ７１  ｍＡｂ−ＰＳ  ＡＳＯ反応混合物のクロマトグラムを描く。
【図８Ｂ】ＳＥＣ方法１を使用した、産生された抗ＣＤ７１  ｍＡｂのクロマトグラムを描く。
【図８Ｃ】ＳＥＣ方法１を使用した、産生された抗ＣＤ７１  ｍＡｂ−ＰＳ  ＡＳＯ  ＤＡＲ１抱合体のクロマトグラムを描く。
【図８Ｄ】ＳＥＣ方法１を使用した、産生された抗ＣＤ７１  ｍＡｂ−ＰＳ  ＡＳＯ  ＤＡＲ２抱合体のクロマトグラムを描く。
【図８Ｅ】ＳＥＣ方法１を使用した、産生された抗ＣＤ７１  ｍＡｂ−ＰＳ  ＡＳＯ  ＤＡＲ３抱合体のクロマトグラムを描く。
【図８Ｆ】ＳＡＸ方法２を使用した、産生された抗ＣＤ７１  ｍＡｂ−ＰＳ  ＡＳＯ  ＤＡＲ１抱合体のクロマトグラムを描く。
【図８Ｇ】ＳＡＸ方法２を使用した、産生された抗ＣＤ７１  ｍＡｂ−ＰＳ  ＡＳＯ  ＤＡＲ２抱合体のクロマトグラムを描く。
【図８Ｈ】ＳＡＸ方法２を使用した、産生された抗ＣＤ７１  ｍＡｂ−ＰＳ  ＡＳＯ  ＤＡＲ３抱合体のクロマトグラムを描く。
【図９】ＰＭＯおよび抗ＣＤ７１  ｍＡｂ−ＰＭＯ抱合体を使用した、分化したＣ２Ｃ１２細胞におけるエクソン２３スキッピングを検出するネステッドＰＣＲのアガロースゲルを描く。
【図１０】ＰＭＯ、抗ＣＤ７１  ｍＡｂ−ＰＭＯ、および抗ＣＤ７１  ｍＡｂ−ＰＭＯ抱合体を使用した、分化したＣ２Ｃ１２細胞におけるエクソン２３スキッピングを検出するネステッドＰＣＲのアガロースゲルを描く。
【図１１】ＰＭＯ、ＡＳＯ、ＤＡＲ１（「ＡＳＣ−ＤＡＲ１」）の共役した抗ＣＤ７１  ｍＡｂ−ＡＳＯ、ＤＡＲ２（「ＡＳＣ−ＤＡＲ２」）の共役した抗ＣＤ７１  ｍＡｂ−ＡＳＯ、および、ＤＡＲ３（「ＡＳＣ−ＤＡＲ３」）の共役した抗ＣＤ７１  ｍＡｂ−ＡＳＯを使用した、分化したＣ２Ｃ１２細胞におけるエクソン２３スキッピングを検出するネステッドＰＣＲのアガロースゲルを描く。
【図１２Ａ】抗ＣＤ７１  ｍＡｂ−ＰＭＯ抱合体の単回静脈内注射を投与された野生型のマウスの腓腹筋においてエクソン２３スキッピングを検出するネステッドＰＣＲのアガロースゲルを描く。
【図１２Ｂ】腓腹筋からのＰＣＲ産物の定量化のグラフである。
【図１２Ｃ】野生型のマウスからの腓腹筋のＴａｑｍａｎ  ｑＰＣＲを使用した、インビボのエクソンスキッピングの定量化のグラフである。
【図１３Ａ】単回静脈内注射後に野生型のマウスの心臓筋においてエクソン２３スキッピングを検出するネステッドＰＣＲのアガロースゲルを描く。
【図１３Ｂ】心臓筋からのＰＣＲ産物の定量化のグラフである。
【図１４】スキッピングされた野生型のＰＣＲ産物（それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ  ９７６−９７７）からのＤＮＡフラグメントの配列決定データを描く。
【図１５Ａ】Ｔａｑｍａｎ  ｑＰＣＲを使用した、腓腹筋における野生型マウス中のインビボのエクソンスキッピングの定量化のグラフである。
【図１５Ｂ】ネステッドＰＣＲを使用した、腓腹筋における野生型マウス中のインビボのエクソンスキッピングの定量化のグラフである。
【図１５Ｃ】Ｔａｑｍａｎ  ｑＰＣＲを使用した、横隔膜筋における野生型マウス中のインビボのエクソンスキッピングの定量化のグラフである。
【図１５Ｄ】ネステッドＰＣＲを使用した、横隔膜筋における野生型マウス中のインビボのエクソンスキッピングの定量化のグラフである。
【図１５Ｅ】Ｔａｑｍａｎ  ｑＰＣＲを使用した、心臓筋における野生型マウス中のインビボのエクソンスキッピングの定量化のグラフである。
【図１５Ｆ】ネステッドＰＣＲを使用した、心臓筋における野生型マウス中のインビボのエクソンスキッピングの定量化のグラフである。
【図１６Ａ】単回の静脈内（ｉ．ｖ．）注射後に野生型マウスにおける横隔膜筋組織中のＭＳＴＮエクソン２スキッピングのＣＤ７１  ｍＡｂ−ＰＭＯ抱合体誘導を検出するＰＣＲのアガロースゲルを描く。
【図１６Ｂ】単回の静脈内（ｉ．ｖ．）注射後に野生型マウスにおける心臓筋組織中のＭＳＴＮエクソン２スキッピングのＣＤ７１  ｍＡｂ−ＰＭＯ抱合体誘導を検出するＰＣＲのアガロースゲルを描く。
【図１６Ｃ】単回の静脈内（ｉ．ｖ．）注射後に野生型マウスにおける腓腹筋組織中のＭＳＴＮエクソン２スキッピングのＣＤ７１  ｍＡｂ−ＰＭＯ抱合体誘導を検出するＰＣＲのアガロースゲルを描く。
【図１７】初代マウス肝細胞におけるＰＡＨエクソン１１スキッピングのＡＳＧＰＲ  ｍＡｂ−ＰＭＯ抱合体誘導を検出するＰＣＲのアガロースゲルを描く。
【図１８】単回の静脈内（ｉ．ｖ．）注射後に野生型マウスの肝臓中のＰＡＨエクソン１１スキッピングのＡＳＧＰＲ  ｍＡｂ−ＰＭＯ抱合体誘導を検出するＰＣＲのアガロースゲルを描く。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
核酸（例えば、ＲＮＡｉ）治療は高い選択率と特異性を誇る標的療法である。しかしながら、いくつかの例では、核酸治療も、脆弱な細胞内取り込み、標的細胞の不十分な細胞内濃度、および低い有効性によって妨げられる。こうした諸問題に対応するために、核酸組成物の様々な修飾、例えば、より優れた安定化および／またはより低い毒性のための新規なリンカー、増加した標的特異性および／または標的送達用の結合部分の最適化、ならびに、安定性の増加および／または的外れの効果の減少のための核酸ポリマー修飾などが探求されている。
【００１５】
いくつかの例では、オリゴヌクレオチドが使用されるそのような１つの領域は、筋ジストロフィーを処置するためのものである。筋ジストロフィーは、筋肉に影響を与える複数の疾患を包含する。デュシェンヌ型筋ジストロフィーは筋ジストロフィーの重症の形態であり、ＤＭＤ遺伝子中の突然変異によって引き起こされる。いくつかの例では、ＤＭＤ遺伝子中の突然変異は、翻訳のリーディングフレームを破壊し、非機能的なジストロフィンタンパク質をもたらす。
【００１６】
ある実施形態において、翻訳のリーディングフレームを回復させるために使用されるエクソンスキッピングあるいはエクソンインクルージョンを誘発するために、誤ってスプライシングされたｍＲＮＡ転写産物の挿入、欠失、重複、あるいは改質を誘発するための核酸療法に関連する方法と組成物である。いくつかの実施形態において、誤ってプロセシングされたｍＲＮＡ転写産物を特徴とする疾患または障害を処置するための方法と組成物も本明細書で記載され、エクソンの除去の後、ｍＲＮＡは機能タンパク質をコードすることができ、それによって疾患または障害を処置する。さらなる実施形態において、上記の疾患または障害を処置するための医薬組成物とキットが本明細書に記載される。
【００１７】
ＲＮＡプロセシング
ＲＮＡは遺伝子発現と細胞生理の調節における中心的な役割を有する。ＲＮＡの適切なプロセシングは機能タンパク質の翻訳のために重要である。ＲＮＡの誤ったスプライシングの結果などのＲＮＡプロセシングの改質は疾患をもたらす可能性がある。例えば、スプライス部位の突然変異は、早熟な終止コドンの曝露、エクソンの喪失、あるいはイントロンのインクルージョンを引き起こす。いくつかの例では、ＲＮＡプロセシングの改質は、挿入、欠失、あるいは重複をもたらす。いくつかの例では、ＲＮＡプロセシングの改質は、エクソンの挿入、欠失、あるいは重複をもたらす。ＲＮＡプロセシングの改質は、場合によっては、イントロンの挿入、欠失、あるいは重複をもたらす。
【００１８】
代替的な転写またはスプライシングの事象は、限定されないが、エクソンスキッピング、代替的な３’スプライス部位の選択、代替的な５’スプライス部位の選択、イントロン保持、相互に排他的なエクソン、代替的なプロモーター使用法、および代替的なポリアデニル化を含む。いくつかの実施形態では、スプライシング事象は、例えば、エクソンスキッピングまたはエクソンインクルージョンによる、エクソンの挿入、欠失、あるいは重複をもたらす。
【００１９】
エクソンスキッピング
エクソンスキッピングはＲＮＡスプライシングの形態である。場合によっては、エクソンがプロセシングされたｍＲＮＡでスキッピングされるか、プロセシングされたｍＲＮＡからスプライシングされるときに、エクソンスキッピングが生じる。エクソンスキッピングの結果、プロセシングされたｍＲＮＡはスキッピングされたエクソンを含まない。いくつかの例では、エクソンスキッピングは改変された生成物の発現をもたらす。
【００２０】
いくつかの例では、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）はエクソンスキッピングを誘発するために使用される。いくつかの例では、ＡＯＮは、特定のｍＲＮＡあるいはｍＲＮＡ前駆体配列と結合する短い核酸配列である。例えば、ＡＯＮはスプライス部位あるいはエクソンエンハンサーに結合する。いくつかの例では、特定のｍＲＮＡあるいはｍＲＮＡ前駆体配列にＡＯＮを結合することにより、二本鎖領域が生成される。いくつかの例では、二本鎖領域の形成は、スプライソソームまたはスプライソソームに関連するタンパク質が通常結合することになる場所で生じ、エクソンをスキッピングさせる。いくつかの例では、エクソンのスキッピングは転写産物リーディングフレームの回復を引き起こし、部分的に機能的なタンパク質の産生を可能にする。
【００２１】
エクソンインクルージョン
いくつかの例では、ＲＮＡ中の突然変異はエクソンスキッピングに帰着する。場合によっては、突然変異は、スプライス部位、スプライス部位の近く、およびスプライス部位から距離をおいた場所の少なくとも１つである。いくつかの例では、突然変異は、スプライス部位の不活性化または脆弱化、エクソンスプライスエンハンサーあるいはイントロンスプライスエンハンサーの破壊、およびエクソンスプライスサイレンサーまたはイントロンスプライスエンハンサーの作成の少なくとも１つをもたらす。いくつかの例において、突然変異はＲＮＡ二次構造を変質する。場合によっては、突然変異はＲＮＡ二次構造を変質し、エクソン認識にとって重要なシグナルのアクセシビリティーの破壊を引き起こす。
【００２２】
いくつかの例では、ＡＯＮの使用はスキッピングされたエクソンのインクルージョンをもたらす。いくつかの例では、ＡＯＮは、スプライス部位、スプライス部位の近くの部位、スプライス部位から離れた部位の少なくとも１つに結合する。場合によっては、ＡＯＮは、エクソンスプライスエンハンサーあるいはイントロンスプライスエンハンサーの破壊を防ぐために、ＲＮＡのある部位で結合する。場合によっては、ＡＯＮは、エクソンスプライスサイレンサーあるいはイントロンスプライスサイレンサーの生成を防ぐために、ＲＮＡのある部位で結合する。
【００２３】
イントロン保持
いくつかの例では、ＲＮＡ中の突然変異はイントロン保持をもたらす。イントロン保持は成熟ｍＲＮＡ転写産物中に残るイントロンをもたらす。いくつかの例では、保持されたイントロンの存在は、機能タンパク質の翻訳を防ぐか減少させる。いくつかの例では、イントロン保持は、コード領域、非コード領域、５’ＵＴＲ、あるいは３’ＵＴＲで生じる。イントロン保持がコード領域で生じる場合、いくつかの例では、保持されたイントロンはフレーム内のアミノ酸をコードするか、あるいはずれており、これが終止コドンまたはフレームシフトにより切断されたタンパク質または非機能的なタンパク質を生成する。いくつかの例では、イントロンは、５’ＵＴＲに位置しているか、または、３’ＵＴＲに位置している２つのエクソン間で保持される。
【００２４】
いくつかの例では、ＡＯＮは、保持されたイントロンの除去を開始するために、部分的にプロセシングされたｍＲＮＡをハイブリダイズするために使用される。いくつかの例では、ＡＯＮはイントロンスプライシングエンハンサーあるいはイントロンスプライシングサイレンサーにハイブリダイズする。いくつかの例では、ＡＯＮは、５’スプライス部位で、あるいは５’スプライス部位から距離をおいて、３’スプライス部位で、あるいは３’スプライス部位から距離をおいて、枝分かれ部位で、あるいは枝分かれ部位から距離をおいて、ポリピリミジントラクトで、あるいはポリピリミジントラクトから距離をおいて、イントロンサイレンサー部位で、あるいはイントロンサイレンサー部位から距離をおいて、隠れたイントロンスプライス部位で、あるいは隠れたイントロンスプライス部位から距離をおいて、偽のスプライス部位で、あるいは偽のスプライス部位から距離をおいて、または、イントロンのイントロンエンハンサーで、あるいはイントロンのイントロンエンハンサーから距離をおいて、ハイブリダイズする。いくつかの例では、ＡＯＮはイントロンの内部領域へハイブリダイズする。
【００２５】
兆候
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたポリ核酸分子あるいは医薬組成物は、欠損したｍＲＮＡを特徴とする疾患または障害の処置に使用される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたポリ核酸分子あるいは医薬組成物は、スプライシング事象を誘発するために、誤ってスプライシングされたｍＲＮＡ転写産物の挿入、欠失、重複、あるいは改質を誘導することにより疾患または障害の処置に使用される。いくつかの実施形態では、スプライシング事象はエクソンスキッピングまたはエクソンインクルージョンである。いくつかの実施形態では、スプライシング事象はイントロン保持である。
【００２６】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたポリ核酸分子あるいは医薬組成物は、エクソンスキッピングまたはエクソンインクルージョンを誘発するために、誤ってスプライシングされたｍＲＮＡ転写産物の挿入、欠失、重複、あるいは改質を誘導することにより疾患または障害の処置に使用される。
【００２７】
ヒトのタンパク質コード遺伝子の大部分が代替的にスプライシングされる。いくつかの例では、突然変異は不適当にスプライシングされたか、部分的にスプライシングされたｍＲＮＡを引き起こす。例えば、突然変異は、タンパク質コード遺伝子、サイレンサーまたはエンハンサー配列、エクソン配列、あるいはイントロン配列中のスプライス部位の少なくとも１つにある。いくつかの例では、突然変異は遺伝子機能障害を引き起こす。いくつかの例では、突然変異は疾患または障害を引き起こす。
【００２８】
いくつかの例では、不適当にスプライシングされたか、部分的にスプライシングされたｍＲＮＡに起因する疾患または障害としては、限定されないが、神経筋疾患、遺伝病、癌、遺伝性疾患、あるいは心血管疾患が挙げられる。
【００２９】
いくつかの例では、遺伝病または障害は、常染色体優性障害、常染色体劣性障害、Ｘ連鎖優性障害、Ｘ連鎖劣性障害、Ｙ連鎖障害、ミトコンドリア遺伝病、あるいは多因子または多遺伝子障害を含む。
【００３０】
いくつかの例では、高コレステロール血症などの心血管疾患は、不適当にスプライシングされたか、部分的にスプライシングされたｍＲＮＡに起因する。高コレステロール血症において、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）のエクソン１２中の一塩基多型がエクソンスキッピングを促進することが示されてきた。
【００３１】
いくつかの例では、不適当にスプライシングされたか、部分的にスプライシングされたｍＲＮＡは、癌を引き起こす。例えば、不適当にスプライシングされたか、部分的にスプライシングされたｍＲＮＡは、限定されないが、増殖、運動、および薬物応答を含む、癌に関与する細胞のプロセスに影響を与える。いくつかの例では、固形癌あるいは血液の癌がある。いくつかの例では、癌は、膀胱癌、肺癌、脳癌、黒色腫、乳癌、非ホジキンリンパ腫、子宮頚癌、卵巣癌、大腸癌、膵臓癌、食道癌、前立腺癌、腎臓癌、皮膚癌、白血病、甲状腺癌、肝臓癌、または子宮癌である。
【００３２】
いくつかの例では、不適当にスプライシングされたか、部分的にスプライシングされたｍＲＮＡは神経筋疾患または障害を引き起こす。例示的な神経筋疾患としては、デュシェンヌ型筋ジストロフィ、ベッカー型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、あるいは筋緊張性ジストロフィーなどの筋ジストロフィーが挙げられる、いくつかの例では、筋ジストロフィーは遺伝的である。いくつかの例では、筋ジストロフィーは自然突然変異によって引き起こされる。ベッカー型筋ジストロフィーとデュシェンヌ型筋ジストロフィーは、タンパク質ジストロフィンをコードするＤＭＤ遺伝子中の突然変異に関与していることが示されてきた。顔面肩甲上腕型筋ジストロフィーは二重ホメオボックス４（ＤＵＸ４）遺伝子中の突然変異に関与していることが示されている。
【００３３】
いくつかの例では、不適当にスプライシングされたか、部分的にスプライシングされたｍＲＮＡは、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを引き起こす。デュシェンヌ型筋ジストロフィーは重度の筋衰弱を引き起こし、機能的なジストロフィンの産生を消失させるＤＭＤ遺伝子中の突然変異によって引き起こされる。いくつかの例では、デュシェンヌ型筋ジストロフィーは、ＤＭＤ遺伝子中のエクソンの突然変異の結果である。いくつかの例では、デュシェンヌ型筋ジストロフィーは、ＤＭＤ遺伝子中のエクソン１、２、３、４、５、６、７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６  ７７、７８、および７９の少なくとも１つの突然変異の結果である。いくつかの例では、デュシェンヌ型筋ジストロフィーは、ＤＭＤ遺伝子中のエクソン３、４、５、６、７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、および６３の少なくとも１つの突然変異の結果である。いくつかの例では、デュシェンヌ型筋ジストロフィーは、ＤＭＤ遺伝子中のエクソン８、２３、３５、４３、４４、４５、５０、５１、５２、５３、および５５の少なくとも１つの突然変異の結果である。いくつかの例では、多くのエクソンが突然変異する。例えば、エクソン４８−５０の突然変異はデュシェンヌ型筋ジストロフィー患者において一般的である。いくつかの例では、デュシェンヌ型筋ジストロフィーはエクソン５１の突然変異の結果である。いくつかの例では、デュシェンヌ型筋ジストロフィーはエクソン２３の突然変異の結果である。いくつかの例では、突然変異は、エクソンの欠失に関与している。いくつかの例では、突然変異は、エクソンの重複に関与している。いくつかの例では、突然変異はエクソンを点突然変異に関与している。例えば、患者の中にはＤＭＤ遺伝子のエクソン５１のナンセンス点突然変異を抱えているものもいることが示されている。
【００３４】
いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子あるいは医薬組成物は、筋ジストロフィーの処置に使用される。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子あるいは医薬組成物は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィーあるいは筋緊張性ジストロフィーの処置に使用される。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子あるいは医薬組成物は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの処置に使用される。
【００３５】
ポリ核酸分子
いくつかの実施形態において、エクソンスキッピングまたはエクソンインクルージョンを誘発するために、誤ってスプライシングされたｍＲＮＡ転写産物の挿入、欠失、重複、あるいは改質を誘発するポリ核酸分子が本明細書に記載される。いくつかの例では、ポリ核酸分子は翻訳のリーディングフレームを回復させる。いくつかの例では、ポリ核酸分子は機能的かつ切断されたタンパク質をもたらす。
【００３６】
いくつかの例では、ポリ核酸分子はｍＲＮＡ配列を標的とする。いくつかの例では、ポリ核酸分子はスプライス部位を標的とする。いくつかの例では、ポリ核酸分子はシス調節因子を標的とする。いくつかの例では、ポリ核酸分子はトランス調節因子を標的とする。いくつかの例では、ポリ核酸分子はエクソンスプライスエンハンサーあるいはイントロンスプライスエンハンサーを標的とする。いくつかの例では、ポリ核酸分子はエクソンスプライスサイレンサーあるいはイントロンスプライスサイレンサーを標的とする。
【００３７】
いくつかの例では、ポリ核酸分子は、イントロンまたはエクソンで見られる配列を標的とする。例えば、ポリ核酸分子は、前記エクソンのスプライシングを媒介するエクソン中で見られる配列を標的とする。いくつかの例では、ポリ核酸分子はエクソン認識配列を標的とする。いくつかの例では、ポリ核酸分子はエクソンの上流の配列を標的とする。いくつかの例では、ポリ核酸分子はエクソンの下流の配列を標的とする。
【００３８】
上に記載されたように、ポリ核酸分子は、限定されないが、神経筋疾患、遺伝病、癌、遺伝性疾患、あるいは心血管疾患などの疾患または障害をもたらす誤ってプロセシングされたｍＲＮＡ転写産物を標的とする。
【００３９】
いくつかの例では、ポリ核酸分子は、疾患または障害を引き起こす遺伝子中で突然変異するエクソンを標的とする。例示的な疾患あるいは障害は、限定されないが、家族性自律神経不全（ＦＤ）、脊髄筋萎縮症（ＳＭＡ）、中鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＭＣＡＤ）欠損症、ハッチンソン・ギルフォード早老症候群（ＨＧＰＳ）、筋緊張性ジストロフィー１型（ＤＭ１）、筋緊張性ジストロフィー２型（ＤＭ２）、常染色体優性網膜色素変性症（ＲＰ）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、小頭骨異形成原発性小人症（ｍｉｃｒｏｃｅｐｈａｌｉｃ  ｓｔｅｏｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ  ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ  ｄｗａｒｆｉｓｍ）１型（ＭＯＰＤ１）（テイビ−リンダー症候群（Ｔａｙｂｉ−Ｌｉｎｄｅｒ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（ＴＡＬＳ））、パーキンソン症候群−１７（ＦＴＤＰ−１７）を伴う前頭側頭型認知症、福山型先天性筋ジストロフィー（ＦＣＭＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、高コレステロール血症、および嚢胞性線維症（ＣＦ）を含む。疾患または障害に関与する例示的な遺伝子は、限定されないが、ＩＫＢＫＡＰ、ＳＭＮ２、ＭＣＡＤ、ＬＭＮＡ、ＤＭＰＫ、ＺＮＦ９、ＭＡＰＴ、ＦＫＴＮ、ＴＤＰ−４３、ＬＤＬＲ、ＣＦＴＲ、ＤＭＤ、ＰＡＨ、ＭＳＴＮ、およびＫ−Ｒａｓを含む。いくつかの実施形態において、遺伝子はＤＭＤ、ＰＡＨ、ＭＳＴＮ、あるいはＫ−Ｒａｓである。
【００４０】
いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、疾患または障害を引き起こす遺伝子のエクソンのエクソン・イントロンジャンクションにある領域を標的とする。いくつかの実施形態において、遺伝子は、ＩＫＢＫＡＰ、ＳＭＮ２、ＭＣＡＤ、ＬＭＮＡ、ＤＭＰＫ、ＺＮＦ９、ＭＡＰＴ、ＦＫＴＮ、ＴＤＰ−４３、ＬＤＬＲ、ＣＦＴＲ、ＤＭＤ、ＰＡＨ、ＭＳＴＮ、あるいはＫ−Ｒａｓである。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＭＳＴＮのエクソン１、２、あるいは３のエクソン・イントロンジャンクションにある領域を標的とする。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＭＳＴＮのエクソン２のエクソン・イントロンジャンクションにある領域を標的とする。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＰＡＨのエクソン１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１のエクソン・イントロンジャンクションにある領域を標的とする。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＰＡＨのエクソン１１のエクソン・イントロンジャンクションにある領域を標的とする。
【００４１】
いくつかの例では、ポリ核酸分子は、疾患または障害を引き起こす遺伝子のエクソンの少なくとも１つの５’イントロン・エクソン・ジャンクションあるいは３’エクソン・イントロンジャンクションのいずれかにある標的領域にハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、遺伝子は、ＩＫＢＫＡＰ、ＳＭＮ２、ＭＣＡＤ、ＬＭＮＡ、ＤＭＰＫ、ＺＮＦ９、ＭＡＰＴ、ＦＫＴＮ、ＴＤＰ−４３、ＬＤＬＲ、ＣＦＴＲ、ＤＭＤ、ＰＡＨ、ＭＳＴＮ、あるいはＫ−Ｒａｓである。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＭＳＴＮのエクソン１、２、あるいは３の５’イントロン・エクソン・ジャンクションあるいは３’エクソン・イントロンジャンクションのいずれかを標的とする。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＭＳＴＮのエクソン２の５’イントロン・エクソン・ジャンクションあるいは３’エクソン・イントロンジャンクションのいずれかである領域を標的とする。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＰＡＨのエクソン１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１の５’イントロン・エクソン・ジャンクションあるいは３’エクソン・イントロン・ジャンクションのいずれかである領域を標的とする。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＰＡＨのエクソン１１の５’イントロン・エクソン・ジャンクションあるいは３’エクソン・イントロン・ジャンクションのいずれかである領域を標的とする。
【００４２】
場合によっては、ポリ核酸分子は、疾患または障害を引き起こす遺伝子のエクソンの少なくとも１つの５’イントロン・エクソン・ジャンクションにある標的領域にハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、遺伝子は、ＩＫＢＫＡＰ、ＳＭＮ２、ＭＣＡＤ、ＬＭＮＡ、ＤＭＰＫ、ＺＮＦ９、ＭＡＰＴ、ＦＫＴＮ、ＴＤＰ−４３、ＬＤＬＲ、ＣＦＴＲ、ＤＭＤ、ＰＡＨ、ＭＳＴＮ、あるいはＫ−Ｒａｓである。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＭＳＴＮのエクソン１、２、あるいは３の５’イントロン・エクソン・ジャンクションにある領域を標的とする。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＭＳＴＮのエクソン２の５’イントロン・エクソン・ジャンクションにある領域を標的とする。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＰＡＨのエクソン１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１の５’イントロン・エクソン・ジャンクションにある領域を標的とする。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＰＡＨのエクソン１１の５’イントロン・エクソン・ジャンクションにある領域を標的とする。
【００４３】
場合によっては、ポリ核酸分子は、疾患または障害を引き起こす遺伝子のエクソンの少なくとも１つの３’エクソン・イントロンジャンクションにある標的領域にハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、遺伝子は、ＩＫＢＫＡＰ、ＳＭＮ２、ＭＣＡＤ、ＬＭＮＡ、ＤＭＰＫ、ＺＮＦ９、ＭＡＰＴ、ＦＫＴＮ、ＴＤＰ−４３、ＬＤＬＲ、ＣＦＴＲ、ＤＭＤ、ＰＡＨ、ＭＳＴＮ、あるいはＫ−Ｒａｓである。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＭＳＴＮのエクソン１、２、あるいは３の３’エクソン・イントロンジャンクションにある領域を標的とする。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＭＳＴＮのエクソン２の３’エクソン・イントロンジャンクションにある領域を標的とする。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＰＡＨのエクソン１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１の３’エクソン・イントロンジャンクションにある領域を標的とする。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＰＡＨのエクソン１１の３’エクソン・イントロンジャンクションにある領域を標的とする。
【００４４】
場合によっては、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、疾患または障害を引き起こす遺伝子のエクソンのスプライス部位を標的とする。いくつかの実施形態において、遺伝子は、ＩＫＢＫＡＰ、ＳＭＮ２、ＭＣＡＤ、ＬＭＮＡ、ＤＭＰＫ、ＺＮＦ９、ＭＡＰＴ、ＦＫＴＮ、ＴＤＰ−４３、ＬＤＬＲ、ＣＦＴＲ、ＤＭＤ、ＰＡＨ、ＭＳＴＮ、あるいはＫ−Ｒａｓである。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＭＳＴＮのエクソン１、２、あるいは３のスプライス部位を標的とする。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＭＳＴＮのエクソン２のスプライス部位を標的とする。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＰＡＨのエクソン１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１のスプライス部位を標的とする。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＰＡＨのエクソン１１のスプライス部位を標的とする。本明細書で使用されるように、スプライス部位は、エクソンスキッピングまたはエクソンインクルージョンを誘発するために、誤ってスプライシングされたｍＲＮＡ転写産物の挿入、欠失、重複、あるいは改質を誘発することができる、基準スプライス部位、隠れたスプライス部位、あるいは代替的なスプライス部位を含む。
【００４５】
いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、疾患または障害を引き起こす遺伝子のエクソンの（あるいは５’から）少なくとも１０００ヌクレオチド（ｎｔ）、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３００ｎｔ、２００ｎｔ、１００ｎｔ、８０ｎｔ、６０ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔ、あるいは５ｎｔ上流にある領域を標的とする。いくつかの実施形態において、遺伝子は、ＩＫＢＫＡＰ、ＳＭＮ２、ＭＣＡＤ、ＬＭＮＡ、ＤＭＰＫ、ＺＮＦ９、ＭＡＰＴ、ＦＫＴＮ、ＴＤＰ−４３、ＬＤＬＲ、ＣＦＴＲ、ＤＭＤ、ＰＡＨ、ＭＳＴＮ、あるいはＫ−Ｒａｓである。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＭＳＴＮ遺伝子のエクソン１、２、あるいは３の（あるいは５’から）少なくとも１０００ｎｔ、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３００ｎｔ、２００ｎｔ、１００ｎｔ、８０ｎｔ、６０ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔ、あるいは５ｎｔ上流にある領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＭＳＴＮ遺伝子のエクソン２の（あるいは５’から）少なくとも１０００ｎｔ、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３００ｎｔ、２００ｎｔ、１００ｎｔ、８０ｎｔ、６０ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔ、あるいは５ｎｔ上流にある領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＰＡＨ遺伝子のエクソン１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１の（あるいは５’から）少なくとも１０００ｎｔ、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３００ｎｔ、２００ｎｔ、１００ｎｔ、８０ｎｔ、６０ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔ、あるいは５ｎｔ上流にある領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＰＡＨ遺伝子のエクソン１１の（あるいは５’から）少なくとも１０００ｎｔ、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３００ｎｔ、２００ｎｔ、１００ｎｔ、８０ｎｔ、６０ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔ、あるいは５ｎｔ上流にある領域を標的とする。
【００４６】
いくつかの例では、ポリ核酸分子は、疾患または障害を引き起こす遺伝子のエクソンの少なくとも１つの上流（あるいは５’）である標的領域にハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、遺伝子は、ＩＫＢＫＡＰ、ＳＭＮ２、ＭＣＡＤ、ＬＭＮＡ、ＤＭＰＫ、ＺＮＦ９、ＭＡＰＴ、ＦＫＴＮ、ＴＤＰ−４３、ＬＤＬＲ、ＣＦＴＲ、ＤＭＤ、ＰＡＨ、ＭＳＴＮ、あるいはＫ−Ｒａｓである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、ＭＳＴＮ遺伝子のエクソン１、２、あるいは３の少なくとも１つの上流（あるいは５’）である標的領域にハイブリダイズする。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、ＭＳＴＮ遺伝子のエクソン２の少なくとも１つの約５、１０、１５、２０、５０、１００、２００、３００、４００、あるいは５００ｂｐ上流（あるいは５’）である標的領域にハイブリダイズする。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、ＰＡＨ遺伝子のエクソン１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１の少なくとも１つの上流（５’）である標的領域にハイブリダイズする。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、ＰＡＨ遺伝子のエクソン１１の少なくとも１つの約５、１０、１５、２０、５０、１００、２００、３００、４００、あるいは５００ｂｐ上流（あるいは５’）である標的領域にハイブリダイズする。
【００４７】
いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、疾患または障害を引き起こす遺伝子のエクソンの（あるいは３’から）少なくとも１０００ヌクレオチド（ｎｔ）、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３００ｎｔ、２００ｎｔ、１００ｎｔ、８０ｎｔ、６０ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔ、あるいは５ｎｔ下流にある領域を標的とする。いくつかの実施形態において、遺伝子は、ＩＫＢＫＡＰ、ＳＭＮ２、ＭＣＡＤ、ＬＭＮＡ、ＤＭＰＫ、ＺＮＦ９、ＭＡＰＴ、ＦＫＴＮ、ＴＤＰ−４３、ＬＤＬＲ、ＣＦＴＲ、ＤＭＤ、ＰＡＨ、ＭＳＴＮ、あるいはＫ−Ｒａｓである。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＭＳＴＮ遺伝子のエクソン１、２、あるいは３の（あるいは５’から）少なくとも１０００ヌクレオチド（ｎｔ）、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３００ｎｔ、２００ｎｔ、１００ｎｔ、８０ｎｔ、６０ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔ、あるいは３ｎｔ下流にある領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＭＳＴＮ遺伝子のエクソン２の（あるいは３’から）少なくとも１０００ヌクレオチド（ｎｔ）、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３００ｎｔ、２００ｎｔ、１００ｎｔ、８０ｎｔ、６０ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔ、あるいは５ｎｔ下流にある領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＰＡＨ遺伝子のエクソン１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１の（あるいは３’から）少なくとも１０００ヌクレオチド（ｎｔ）、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３００ｎｔ、２００ｎｔ、１００ｎｔ、８０ｎｔ、６０ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔ、あるいは５ｎｔ下流にある領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＰＡＨ遺伝子のエクソン１１の（あるいは３’から）少なくとも１０００ヌクレオチド（ｎｔ）、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３００ｎｔ、２００ｎｔ、１００ｎｔ、８０ｎｔ、６０ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔ、あるいは５ｎｔ下流にある領域を標的とする。
【００４８】
いくつかの例では、ポリ核酸分子は、疾患または障害を引き起こす遺伝子のエクソンの少なくとも１つの下流（あるいは３’）である標的領域にハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、遺伝子は、ＩＫＢＫＡＰ、ＳＭＮ２、ＭＣＡＤ、ＬＭＮＡ、ＤＭＰＫ、ＺＮＦ９、ＭＡＰＴ、ＦＫＴＮ、ＴＤＰ−４３、ＬＤＬＲ、ＣＦＴＲ、ＤＭＤ、ＰＡＨ、ＭＳＴＮ、あるいはＫ−Ｒａｓである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、ＭＳＴＮ遺伝子のエクソン１、２、あるいは３の少なくとも１つの約５、１０、１５、２０、５０、１００、２００、３００、４００、あるいは５００ｂｐ下流（あるいは３’）である標的領域にハイブリダイズする。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、ＭＳＴＮ遺伝子のエクソン２の少なくとも１つの約５、１０、１５、２０、５０、１００、２００、３００、４００、あるいは５００ｂｐ下流（あるいは３’）である標的領域にハイブリダイズする。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、ＰＡＨ遺伝子のエクソン１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１の少なくとも１つの約５、１０、１５、２０、５０、１００、２００、３００、４００、あるいは５００ｂｐ下流（３’）である標的領域にハイブリダイズする。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、ＰＡＨ遺伝子のエクソン１１の少なくとも１つの約５、１０、１５、２０、５０、１００、２００、３００、４００、あるいは５００ｂｐ下流（あるいは３’）である標的領域にハイブリダイズする。
【００４９】
いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、疾患または障害を引き起こす遺伝子のエクソン内の内部領域を標的とする。いくつかの実施形態において、遺伝子は、ＩＫＢＫＡＰ、ＳＭＮ２、ＭＣＡＤ、ＬＭＮＡ、ＤＭＰＫ、ＺＮＦ９、ＭＡＰＴ、ＦＫＴＮ、ＴＤＰ−４３、ＬＤＬＲ、ＣＦＴＲ、ＤＭＤ、ＰＡＨ、ＭＳＴＮ、あるいはＫ−Ｒａｓである。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＭＳＴＮ遺伝子のエクソン１、２、あるいは３内の内部領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＭＳＴＮ遺伝子のエクソン２内の内部領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＰＡＨ遺伝子の領域１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１内の内部領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＰＡＨ遺伝子のエクソン１１内の内部領域を標的とする。
【００５０】
場合によっては、ポリ核酸分子は、神経筋疾患または障害を引き起こす誤ってプロセシングされたｍＲＮＡ転写産物を標的とする。場合によっては、神経筋疾患または障害は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、あるいは筋緊張性ジストロフィーである。場合によっては、ポリ核酸分子は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、あるいは筋緊張性ジストロフィーを引き起こす誤ってプロセシングされたｍＲＮＡ転写産物を標的とする。場合によっては、ポリ核酸分子は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを引き起こす誤ってプロセシングされたｍＲＮＡ転写産物を標的とする。
【００５１】
いくつかの例では、ポリ核酸分子は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを引き起こすＤＭＤ遺伝子中で突然変異するエクソンを標的とする。いくつかの例では、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを引き起こすＤＭＤ遺伝子中で突然変異する典型的なエクソンは、限定されないが、エクソン３、４、５、６、７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、および６３を含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子は突然変異したエクソンに隣接する配列を標的とする。例えば、エクソン５０の欠失がある場合、エクソン５１がスキッピングされるように、ポリ核酸分子はエクソン５１中の配列を標的とする。別の例では、エクソン２３に突然変異がある場合、エクソン２３がスキッピングされるように、ポリ核酸分子はエクソン２２中の配列を標的とする。
【００５２】
いくつかの例では、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン３、４、５、６、７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、または６３のエクソン・イントロンジャンクションにある領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン８、２３、３５、４３、４４、４５、５０、５１、５２、５３、または５５のエクソン・イントロンジャンクションにある領域を標的とする。場合によっては、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン８のエクソン・イントロンジャンクションにある領域を標的とする。場合によっては、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン２３のエクソン・イントロンジャンクションにある領域を標的とする。場合によっては、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン３５のエクソン・イントロンジャンクションにある領域を標的とする。場合によっては、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４３のエクソン・イントロンジャンクションにある領域を標的とする。場合によっては、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４４のエクソン・イントロンジャンクションにある領域を標的とする。場合によっては、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４５のエクソン・イントロンジャンクションにある領域を標的とする。場合によっては、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４８のエクソン・イントロンジャンクションにある領域を標的とする。場合によっては、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４９のエクソン・イントロンジャンクションにある領域を標的とする。場合によっては、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５０のエクソン・イントロンジャンクションにある領域を標的とする。場合によっては、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５１のエクソン・イントロンジャンクションにある領域を標的とする。場合によっては、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５２のエクソン・イントロンジャンクションにある領域を標的とする。場合によっては、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５３のエクソン・イントロンジャンクションにある領域を標的とする。場合によっては、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５５のエクソン・イントロンジャンクションにある領域を標的とする。
【００５３】
いくつかの例では、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン３、４、５、６、７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、および、６３の少なくとも１つの５’イントロン・エクソン・ジャンクションあるいは３’エクソン・イントロンジャンクションにある標的領域にハイブリダイズする。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン８、２３、３５、４３、４４、４５、５０、５１、５２、５３、または５５の５’イントロン・エクソン・ジャンクションあるいは３’エクソン・イントロンジャンクションにある標的領域にハイブリダイズする。
【００５４】
場合によっては、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン３、４、５、６、７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、および、６３の少なくとも１つの５’イントロン・エクソン・ジャンクションにある標的領域にハイブリダイズする。場合によっては、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン８、２３、３５、４３、４４、４５、５０、５１、５２、５３、または５５の５’イントロン・エクソン・ジャンクションにある標的領域にハイブリダイズする。場合によっては、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン８の５’イントロン・エクソン・ジャンクションにある標的領域にハイブリダイズする。場合によっては、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン２３の５’イントロン・エクソン・ジャンクションにある標的領域にハイブリダイズする。場合によっては、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン３５の５’イントロン・エクソン・ジャンクションにある標的領域にハイブリダイズする。場合によっては、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４３の５’イントロン・エクソン・ジャンクションにある標的領域にハイブリダイズする。場合によっては、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４４の５’イントロン・エクソン・ジャンクションにある標的領域にハイブリダイズする。場合によっては、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４５の５’イントロン・エクソン・ジャンクションにある標的領域にハイブリダイズする。場合によっては、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５０の５’イントロン・エクソン・ジャンクションにある標的領域にハイブリダイズする。場合によっては、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５１の５’イントロン・エクソン・ジャンクションにある標的領域にハイブリダイズする。場合によっては、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５２の５’イントロン・エクソン・ジャンクションにある標的領域にハイブリダイズする。場合によっては、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５３の５’イントロン・エクソン・ジャンクションにある標的領域にハイブリダイズする。場合によっては、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５５の５’イントロン・エクソン・ジャンクションにある標的領域にハイブリダイズする。
【００５５】
場合によっては、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン３、４、５、６、７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、および、６３の少なくとも１つの３’エクソン・イントロンジャンクションにある標的領域にハイブリダイズする。場合によっては、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン８、２３、３５、４３、４４、４５、５０、５１、５２、５３、または５５の３’エクソン・イントロンジャンクションにある標的領域にハイブリダイズする。場合によっては、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン８の３’エクソン・イントロンジャンクションにある標的領域にハイブリダイズする。場合によっては、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン２３の３’エクソン・イントロンジャンクションにある標的領域にハイブリダイズする。場合によっては、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン３５の３’エクソン・イントロンジャンクションにある標的領域にハイブリダイズする。場合によっては、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４３の３’エクソン・イントロンジャンクションにある標的領域にハイブリダイズする。場合によっては、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４４の３’エクソン・イントロンジャンクションにある標的領域にハイブリダイズする。場合によっては、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４５の３’エクソン・イントロンジャンクションにある標的領域にハイブリダイズする。場合によっては、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５０の３’エクソン・イントロンジャンクションにある標的領域にハイブリダイズする。場合によっては、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５１の３’エクソン・イントロンジャンクションにある標的領域にハイブリダイズする。場合によっては、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５２の３’エクソン・イントロンジャンクションにある標的領域にハイブリダイズする。場合によっては、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５３の３’エクソン・イントロンジャンクションにある標的領域にハイブリダイズする。場合によっては、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５５の３’エクソン・イントロンジャンクションにある標的領域にハイブリダイズする。
【００５６】
いくつかの例では、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン３、４、５、６、７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、または６３のスプライス部位を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン８、２３、３５、４３、４４、４５、５０、５１、５２、５３、または５５のスプライス部位を標的とする。場合によっては、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン８のスプライス部位を標的とする。場合によっては、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン２３のスプライス部位を標的とする。場合によっては、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン３５のスプライス部位を標的とする。場合によっては、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４３のスプライス部位を標的とする。場合によっては、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４４のスプライス部位を標的とする。場合によっては、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４５のスプライス部位を標的とする。場合によっては、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４８のスプライス部位を標的とする。場合によっては、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４９のスプライス部位を標的とする。場合によっては、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５０のスプライス部位を標的とする。場合によっては、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５１のスプライス部位を標的とする。場合によっては、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５２のスプライス部位を標的とする。場合によっては、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５３のスプライス部位を標的とする。場合によっては、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５５のスプライス部位を標的とする。本明細書で使用されるように、スプライス部位は、エクソンスキッピングまたはエクソンインクルージョンを誘発するために、誤ってスプライシングされたｍＲＮＡ転写産物の挿入、欠失、重複、あるいは改質を誘発することができる、基準スプライス部位、隠れたスプライス部位、あるいは代替的なスプライス部位を含む。
【００５７】
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、エクソン３、４、５、６、７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、または、６３などのデュシェンヌ型筋ジストロフィーに関与する追加のエクソンを含む部分的にスプライシングされたｍＲＮＡ配列を標的とする。
【００５８】
いくつかの例では、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン３、４、５、６、７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、あるいは６３の少なくとも１０００ヌクレオチド（ｎｔ）、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３００ｎｔ、２００ｎｔ、１００ｎｔ、８０ｎｔ、６０ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔ、あるいは５ｎｔ上流（あるいは５’の）領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン８、２３、３５、４３、４４、４５、５０、５１、５２、５３、または５５の（あるいは５’から）少なくとも１０００ｎｔ、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３００ｎｔ、２００ｎｔ、１００ｎｔ、８０ｎｔ、６０ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔ、あるいは５ｎｔ上流にある領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン８の（あるいは５’から）少なくとも１０００ｎｔ、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３００ｎｔ、２００ｎｔ、１００ｎｔ、８０ｎｔ、６０ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔ、あるいは５ｎｔ上流にある領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン２３の（あるいは５’から）少なくとも１０００ｎｔ、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３００ｎｔ、２００ｎｔ、１００ｎｔ、８０ｎｔ、６０ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔ、あるいは５ｎｔ上流にある領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン３５の（あるいは５’から）少なくとも１０００ｎｔ、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３００ｎｔ、２００ｎｔ、１００ｎｔ、８０ｎｔ、６０ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔ、あるいは５ｎｔ上流にある領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４３の（あるいは５’から）少なくとも１０００ｎｔ、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３００ｎｔ、２００ｎｔ、１００ｎｔ、８０ｎｔ、６０ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔ、あるいは５ｎｔ上流にある領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４４の（あるいは５’から）少なくとも１０００ｎｔ、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３００ｎｔ、２００ｎｔ、１００ｎｔ、８０ｎｔ、６０ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔ、あるいは５ｎｔ上流にある領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４５の（あるいは５’から）少なくとも１０００ｎｔ、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３００ｎｔ、２００ｎｔ、１００ｎｔ、８０ｎｔ、６０ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔ、あるいは５ｎｔ上流にある領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４８の（あるいは５’から）少なくとも１０００ヌクレオチド（ｎｔ）、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３００ｎｔ、２００ｎｔ、１００ｎｔ、８０ｎｔ、６０ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔ、あるいは５ｎｔ上流にある領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４９の（あるいは５’から）少なくとも１０００ヌクレオチド（ｎｔ）、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３００ｎｔ、２００ｎｔ、１００ｎｔ、８０ｎｔ、６０ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔ、あるいは５ｎｔ上流にある領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５０の（あるいは５’から）少なくとも１０００ヌクレオチド（ｎｔ）、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３００ｎｔ、２００ｎｔ、１００ｎｔ、８０ｎｔ、６０ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔ、あるいは５ｎｔ上流にある領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５１の（あるいは５’から）少なくとも１０００ヌクレオチド（ｎｔ）、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３００ｎｔ、２００ｎｔ、１００ｎｔ、８０ｎｔ、６０ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔ、あるいは５ｎｔ上流にある領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５２の（あるいは５’から）少なくとも１０００ヌクレオチド（ｎｔ）、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３００ｎｔ、２００ｎｔ、１００ｎｔ、８０ｎｔ、６０ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔ、あるいは５ｎｔ上流にある領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５３の（あるいは５’から）少なくとも１０００ｎｔ、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３００ｎｔ、２００ｎｔ、１００ｎｔ、８０ｎｔ、６０ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔ、あるいは５ｎｔ上流にある領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５５の（あるいは５’から）少なくとも１０００ｎｔ、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３００ｎｔ、２００ｎｔ、１００ｎｔ、８０ｎｔ、６０ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔ、あるいは５ｎｔ上流にある領域を標的とする。
【００５９】
いくつかの例では、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン３、４、５、６、７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、および、６３の少なくとも１つの上流（または５’）である標的領域にハイブリダイズする。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン８、２３、３５、４３、４４、４５、５０、５１、５２、５３、または５５の少なくとも１つの上流（または５’）にある標的領域にハイブリダイズする。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン３、４、５、６、７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、および、６３の少なくとも１つの約５、１０、１５、２０、５０、１００、２００、３００、４００、あるいは５００ｂｐ上流（あるいは５’）である標的領域にハイブリダイズする。
【００６０】
いくつかの例では、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン３、４、５、６、７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、あるいは６３の少なくとも１０００ヌクレオチド（ｎｔ）、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３００ｎｔ、２００ｎｔ、１００ｎｔ、８０ｎｔ、６０ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔ、あるいは５ｎｔ下流（あるいは３’の）にある領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン８、２３、３５、４３、４４、４５、５０、５１、５２、５３、または５５の（あるいは３’から）少なくとも１０００ヌクレオチド（ｎｔ）、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３００ｎｔ、２００ｎｔ、１００ｎｔ、８０ｎｔ、６０ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔ、あるいは５ｎｔ下流にある領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン８の（あるいは３’から）少なくとも１０００ヌクレオチド（ｎｔ）、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３００ｎｔ、２００ｎｔ、１００ｎｔ、８０ｎｔ、６０ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔ、あるいは５ｎｔ下流にある領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン２３の（あるいは３’から）少なくとも１０００ヌクレオチド（ｎｔ）、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３００ｎｔ、２００ｎｔ、１００ｎｔ、８０ｎｔ、６０ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔ、あるいは５ｎｔ下流にある領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン３５の（あるいは３’から）少なくとも１０００ヌクレオチド（ｎｔ）、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３００ｎｔ、２００ｎｔ、１００ｎｔ、８０ｎｔ、６０ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔ、あるいは５ｎｔ下流にある領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４３の（あるいは３’から）少なくとも１０００ヌクレオチド（ｎｔ）、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３００ｎｔ、２００ｎｔ、１００ｎｔ、８０ｎｔ、６０ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔ、あるいは５ｎｔ下流にある領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４４の（あるいは３’から）少なくとも１０００ヌクレオチド（ｎｔ）、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３００ｎｔ、２００ｎｔ、１００ｎｔ、８０ｎｔ、６０ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔ、あるいは５ｎｔ下流にある領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４５の（あるいは３’から）少なくとも１０００ヌクレオチド（ｎｔ）、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３００ｎｔ、２００ｎｔ、１００ｎｔ、８０ｎｔ、６０ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔ、あるいは５ｎｔ下流にある領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４８の（あるいは３’から）少なくとも１０００ヌクレオチド（ｎｔ）、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３００ｎｔ、２００ｎｔ、１００ｎｔ、８０ｎｔ、６０ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔ、あるいは５ｎｔ下流にある領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４９の（あるいは３’から）少なくとも１０００ヌクレオチド（ｎｔ）、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３００ｎｔ、２００ｎｔ、１００ｎｔ、８０ｎｔ、６０ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔ、あるいは５ｎｔ下流にある領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５０の（あるいは３’から）少なくとも１０００ヌクレオチド（ｎｔ）、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３００ｎｔ、２００ｎｔ、１００ｎｔ、８０ｎｔ、６０ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔ、あるいは５ｎｔ下流にある領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５１の（あるいは３’から）少なくとも１０００ヌクレオチド（ｎｔ）、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３００ｎｔ、２００ｎｔ、１００ｎｔ、８０ｎｔ、６０ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔ、あるいは５ｎｔ下流にある領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５２の（あるいは３’から）少なくとも１０００ヌクレオチド（ｎｔ）、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３００ｎｔ、２００ｎｔ、１００ｎｔ、８０ｎｔ、６０ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔ、あるいは５ｎｔ下流にある領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５３の（あるいは３’から）少なくとも１０００ヌクレオチド（ｎｔ）、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３００ｎｔ、２００ｎｔ、１００ｎｔ、８０ｎｔ、６０ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔ、あるいは５ｎｔ下流にある領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５５の（あるいは３’から）少なくとも１０００ヌクレオチド（ｎｔ）、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３００ｎｔ、２００ｎｔ、１００ｎｔ、８０ｎｔ、６０ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔ、あるいは５ｎｔ下流にある領域を標的とする。
【００６１】
いくつかの例では、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン３、４、５、６、７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、および、６３の少なくとも１つの下流（または３’）である標的領域にハイブリダイズする。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン３、４、５、６、７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、および、６３の少なくとも１つの約５、１０、１５、２０、５０、１００、２００、３００、４００、あるいは５００ｂｐ下流（あるいは５’）である標的領域にハイブリダイズする。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン８、２３、３５、４３、４４、４５、５０、５１、５２、５３、または５５の少なくとも１つの約５、１０、１５、２０、５０、１００、２００、３００、４００、あるいは５００ｂｐ下流（あるいは３’）である標的領域にハイブリダイズする。
【００６２】
いくつかの例では、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン３、４、５、６、７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、または６３内の内部領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン８、２３、３５、４３、４４、４５、５０、５１、５２、５３、または５５内の内部領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン８内の内部領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン２３内の内部領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン３５内の内部領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４３内の内部領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４４内の内部領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４５内の内部領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４８内の内部領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４９内の内部領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５０内の内部領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５１内の内部領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５２内の内部領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５３内の内部領域を標的とする。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン５５内の内部領域を標的とする。
【００６３】
いくつかの例では、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン３、４、５、６、７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、および、６３の少なくとも１つの内部である標的領域にハイブリダイズする。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン８、２３、３５、４３、４４、４５、５０、５１、５２、５３、または５５の少なくとも１つの内部にある標的領域にハイブリダイズする。
【００６４】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、エクソン５１を含む部分的にスプライシングされたｍＲＮＡ配列を標的とする。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、エクソン５１に対して上流（あるいは５’）である標的領域にハイブリダイズする。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、エクソン５１の約５、１０、１５、２０、５０、１００、２００、３００、４００、あるいは５００ｂｐ上流（あるいは５’）である標的領域にハイブリダイズする。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、エクソン５１に対して下流（あるいは３’）である標的領域にハイブリダイズする。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、エクソン５１の約５、１０、１５、２０、５０、１００、２００、３００、４００、あるいは５００ｂｐ下流（あるいは３’）である標的領域にハイブリダイズする。
【００６５】
いくつかの例では、ポリ核酸分子は、エクソン５１内にある標的領域にハイブリダイズする。場合によっては、ポリ核酸分子は、５’イントロン・エクソン５１ジャンクションあるいは３’エクソン５１・イントロンジャンクションにある標的領域にハイブリダイズする。
【００６６】
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、対象の標的配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、対象の標的配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、対象の標的配列に対して少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、対象の標的配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、対象の標的配列に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、対象の標的配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、対象の標的配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、対象の標的配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、対象の標的配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、対象の標的配列に対して少なくとも９６％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、対象の標的配列に対して少なくとも９７％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、対象の標的配列に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、対象の標的配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は対象の標的配列からなる。
【００６７】
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドを含む。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、対象の標的配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、対象の標的配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、対象の標的配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する第１のポリヌクレオチドと、対象の標的配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する第２のポリヌクレオチドを含む。
【００６８】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたポリ核酸分子はＲＮＡまたはＤＮＡを含む。場合によっては、ポリ核酸分子はＲＮＡを含む。いくつかの例では、ＲＮＡは低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、またはヘテロ核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）を含む。いくつかの例では、ＲＮＡはｓｈＲＮＡを含む。いくつかの例では、ＲＮＡはｍｉＲＮＡを含む。いくつかの例では、ＲＮＡはｄｓＲＮＡを含む。いくつかの例では、ＲＮＡはｔＲＮＡを含む。いくつかの例では、ＲＮＡはｒＲＮＡを含む。いくつかの例では、ＲＮＡはｈｎＲＮＡを含む。いくつかの例では、ＲＮＡはｓｉＲＮＡを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子はｓｉＲＮＡを含む。
【００６９】
いくつかの実施形態では、核酸ポリマーは、約１０から約５０ヌクレオチド長さである。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、約１０から約３０、約１５から約３０、約１８から約２５、約１８から約２４、約１９から約２３、あるいは約２０から約２２ヌクレオチド長さである。
【００７０】
いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は、約５０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約４５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約４０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約３５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約３０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約２５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約２０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１９ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１８ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１７ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１６ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１４ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１３ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１２ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１１ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１０から約５０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１０から約４５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１０から約４０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１０から約３５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１０から約３０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１０から約２５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１０から約２０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１５から約２５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１５から約３０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、約１２から約３０ヌクレオチド長さである。
【００７１】
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は第１のポリヌクレオチドを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子は第２のポリヌクレオチドを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子は第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドを含む。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドはセンス鎖またはパッセンジャー鎖である。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドはアンチセンス鎖またはガイド鎖である。
【００７２】
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は第１のポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、約１０から約５０ヌクレオチド長さである。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、約１０から約３０、約１５から約３０、約１８から約２５、約１８から約２４、約１９から約２３、あるいは約２０から約２２ヌクレオチド長さである。
【００７３】
いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約５０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約４５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約４０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約３５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約３０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約２５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約２０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約１９ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約１８ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約１７ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約１６ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約１５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約１４ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約１３ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約１２ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約１１ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約１０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約１０から約５０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約１０から約４５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約１０から約４０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約１０から約３５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約１０から約３０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約１０から約２５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約１０から約２０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約１５から約２５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約１５から約３０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第１のポリヌクレオチドは、約１２から約３０ヌクレオチド長さである。
【００７４】
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は第２のポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、約１０から約５０ヌクレオチド長さである。いくつかの実施形態において、第２のポリヌクレオチドは、約１０から約３０、約１５から約３０、約１８から約２５、約１８から約２４、約１９から約２３、あるいは約２０から約２２ヌクレオチド長さである。
【００７５】
いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約５０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約４５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約４０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約３５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約３０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約２５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約２０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約１９ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約１８ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約１７ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約１６ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約１５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約１４ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約１３ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約１２ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約１１ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約１０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約１０から約５０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約１０から約４５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約１０から約４０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約１０から約３５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約１０から約３０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約１０から約２５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約１０から約２０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約１５から約２５ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約１５から約３０ヌクレオチド長さである。いくつかの例では、第２のポリヌクレオチドは、約１２から約３０ヌクレオチド長さである。
【００７６】
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子はさらに平滑末端、オーバーハングあるいはその組み合わせを含む。いくつかの例では、平滑末端は、５’平滑末端、３’平滑末端、あるいはその両方である。場合によっては、オーバーハングは５’オーバーハング、３’オーバーハング、またはその両方である。場合によっては、オーバーハングは１、２、３、４、５、６、７、８、９、あるいは１０の非塩基対ヌクレオチドを含む。場合によっては、オーバーハングは１、２、３、４、５、あるいは６の非塩基対ヌクレオチドを含む。場合によっては、オーバーハングは１、２、３、あるいは４の非塩基対ヌクレオチドを含む。場合によっては、オーバーハングは１つの非塩基対ヌクレオチドを含む。場合によっては、オーバーハングは２つの非塩基対ヌクレオチドを含む。場合によっては、オーバーハングは３つの非塩基対ヌクレオチドを含む。場合によっては、オーバーハングは４つの非塩基対ヌクレオチドを含む。
【００７７】
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子の配列は、本明細書に記載された標的配列に対して、少なくとも４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、あるいは９９．５％相補的である。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子の配列は本明細書に記載された標的配列に少なくとも５０％相補的である。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子の配列は本明細書に記載された標的配列に少なくとも６０％相補的である。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子の配列は本明細書に記載された標的配列に少なくとも７０％相補的である。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子の配列は本明細書に記載された標的配列に少なくとも８０％相補的である。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子の配列は本明細書に記載された標的配列に少なくとも９０％相補的である。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子の配列は本明細書に記載された標的配列に少なくとも９５％相補的である。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子の配列は本明細書に記載された標的配列に少なくとも９９％相補的である。いくつかの例では、ポリ核酸分子の配列は本明細書に記載された標的配列に１００％相補的である。
【００７８】
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子の配列は本明細書に記載された標的配列に対して５つ以下のミスマッチを有する。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子の配列は本明細書に記載された標的配列に対して４つ以下のミスマッチを有する。場合によっては、ポリ核酸分子の配列は本明細書に記載された標的配列に対して３つ以下のミスマッチを有する。場合によっては、ポリ核酸分子の配列は本明細書に記載された標的配列に対して２つ以下のミスマッチを有する。場合によっては、ポリ核酸分子の配列は本明細書に記載された標的配列に対して１つ以下のミスマッチを有する。
【００７９】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載された標的配列にハイブリダイズするポリ核酸分子の特異性は、標的配列に対するポリ核酸分子の９５％、９８％、９９％、９９．５％、あるいは１００％の配列相補性である。いくつかの例では、ハイブリダイゼーションは高いストリンジェントなハイブリダイゼーション状態である。
【００８０】
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子はオフターゲット効果を減少させた。いくつかの例において、「オフターゲット」あるいは「オフターゲット効果」とは、所定の標的に対するポリ核酸ポリマーが、別のｍＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列、あるいは細胞タンパク質またはその他の部分を直接的あるいは間接的に相互作用することによって意図しない効果を引き起こすあらゆる例を指す。いくつかの例では、その他の転写産物とポリ核酸分子のセンスおよび／またはアンチセンス鎖との間の部分的な相同性あるいは相補性によって他の転写産物の同時の分解がある場合に、「オフターゲット効果」が生じる。
【００８１】
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は天然または合成または人工のヌクレオチドアナログまたは塩基を含む。場合によっては、ポリ核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および／またはヌクレオチドアナログの組み合わせを含む。いくつかの例では、合成または人工のヌクレオチドアナログまたは塩基は、リボース部分、リン酸塩部分、ヌクレオシド部分、あるいはその組み合わせの１つ以上で修飾を含む。
【００８２】
いくつかの実施形態において、ヌクレオチドアナログあるいは人工ヌクレオチド塩基は、リボース部分の２’水酸基で修飾を有する核酸を含む。いくつかの例では、修飾はＨ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、あるいはＣＮを含み、ここで、Ｒはアルキル部分である。例示的なアルキル部分としては、限定されないが、ハロゲン、硫黄、チオール、チオエーテル、チオエステル、アミン（一級、二級、または三級）、アミド、エーテル、エステル、アルコール、および酸素が挙げられる。いくつかの例では、アルキル部分はさらに修飾を含む。いくつかの例では、修飾はアゾ基、ケト基、アルデヒド基、カルボキシル基、ニトロ基、ニトロソ基、ニトリル基、複素環（例えば、イミダゾール、ヒドラジノ、あるいはヒドロキシルアミノ）基、イソシアネートまたはシアナート基、あるいは硫黄含有基（例えば、スルホキシド、スルホン、スルフィド、およびジスルフィド）を含む。いくつかの例では、アルキル部分はさらにヘテロ置換を含む。いくつかの例では、複素環基の炭素は窒素、酸素、あるいは硫黄によって置換される。いくつかの例では、複素環式置換は、限定されないが、モルホリノ、イミダゾール、および、ピロリジノを含む。
【００８３】
いくつかの事例では、２’ヒドロキシル基の修飾は、２’−Ｏ−メチル修飾または２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）修飾である。場合によっては、２’−Ｏ−メチル修飾は、メチル基をリボース部分の２’ヒドロキシル基に加え、一方で２’Ｏ−メトキシエチル修飾は、メトキシエチル基をリボース部分の２’ヒドロキシル基に加える。アデノシン分子の２’−Ｏ−メチル修飾およびウリジンの２’Ｏ−メトキシエチル修飾の典型的な化学構造が、以下に例証される。
【００８４】
【化１】
2020505330.tif 000003
【００８５】
いくつかの実施形態では、２’ヒドロキシル基の修飾は、プロピルリンカーを含む伸長したアミン基がアミン基を２’酸素に結合する２’−Ｏ−アミノプロピル修飾である。いくつかの例では、この修飾は、１糖当たりアミン基から１つの正電荷を導入することによってオリゴヌクレオチド分子のリン酸塩由来の全体的な負電荷を中和し、それによって、その双性イオン特性による細胞取り込み特性を改善する。２’−Ｏ−アミノプロピル・ヌクレオシド・ホスホラミダイトの典型的な化学構造が、以下に例証される。
【００８６】
【化２】
2020505330.tif 000004
【００８７】
いくつかの例では、２’水酸基の修飾はロックドまたは架橋リボース修飾（例えば、ロックド核酸またはＬＮＡ）であり、ここで、２’炭素の酸素分子境界はメチレン基によって４’炭素に結合され、したがって、２’−Ｃ、４’−Ｃ−オキシ−メチレン結合二環式リボヌクレオチド単量体を形成する。ＬＮＡの化学構造の代表例が以下に例証される。左に示される代表例は、ＬＮＡ単量体の化学結合性を強調している。右に示される代表例は、ＬＮＡ単量体のフラノース環のロックされた３’−ｅｎｄｏ（３Ｅ）構造を強調している。
【００８８】
ＬＮＡ（ロックド核酸）
【００８９】
【化３】
2020505330.tif 000005
【００９０】
いくつかの実施形態では、２’ヒドロキシル基での修飾は、糖構造を３’−ｅｎｄｏ糖のパッカリング構造（ｓｕｇａｒ  ｐｕｃｋｅｒｉｎｇ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）へとロックする、例えば２’−４’−エチレン架橋した核酸などの、エチレン核酸（ＥＮＡ）を含む。ＥＮＡは、ＬＮＡも含む修飾された核酸の架橋された核酸クラスの一部である。ＥＮＡおよび架橋された核酸の典型的な化学構造は、以下に例証される。
【００９１】
【化４】
2020505330.tif 000006
【００９２】
いくつかの実施形態では、２’ヒドロキシル基での追加の修飾は、２’−デオキシ、Ｔ−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、Ｔ−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、または２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）を含む。
【００９３】
いくつかの実施形態において、ヌクレオチドアナログは、限定されないが、５−プロピルウリジン、５−プロピニルシチジン、６−メチルアデニン、６−メチルグアニン、Ｎ，Ｎ，−ジメチルアデニン、２−プロピルアデニン、２プロピルグアニン、２−アミノアデニン、１−メチルイノシン、３−メチルウリジン、５−メチルシチジン、５−メチルウリジン、および、５位置で修飾を有する他のヌクレオチド、５−（２−アミノ）プロピルウリジン、５−ハロシチジン、５−ハロウリジン、４−アセチルシチジン、１−メチルアデノシン、２−メチルアデノシン、３−メチルシチジン、６−メチルウリジン、２−メチルグアノシン、７−メチルグアノシン、２，２−ジメチルグアノシン、５−メチルアミノエチルウリジン、５−メトキシウリジン、７−デアザ−アデノシンなどのデアザヌクレオチド、６−アゾウリジン、６−アゾシチジン、６−アゾチミジン、５−メチル−２−チオウリジン、２−チオウリジンと４−チオウリジン、および２−チオシチジンなどの他のチオ塩基、ジヒドロウリジン、プソイドウリジン、キューオシン、アルカエオシン、ナフチルおよび置換されたナフチル基、Ｎ６−メチルアデノシンなどのＯ−およびＮ−アルキル化プリンおよびピリミジン、５−メチルカルボニルメチルウリジン、ウリジン、５−オキシ酢酸、ピリジン−４−オン、ピリジン−２−オン、フェニル、および、アミノフェノールまたは２，４，６−トリメトキシベンゼンなどの修飾フェニル基、Ｇクランプヌクレオチドとして作用する修飾されたシトシン、８−置換されたアデニンおよびグアニン、５−置換されたウラシルおよびチミン、アザピリミジン、カルボキシヒドロキシアルキルヌクレオチド、カルボキシアルキルアミノアルキルヌクレオチド、および、アルキルカルボニルアルキル化ヌクレオチドなどの修飾塩基を含む。修飾されたヌクレオチドはさらに、リボシルではない糖あるいはそのアナログを有するヌクレオチドと同様に、糖部に対して修飾されるヌクレオチドを含む。例えば、場合によっては、糖部は、マンノース、アラビノース、グルコピラノース、ガラクトピラノース、４’−チオリボース、および、その他の糖類、複素環、あるいは炭素環であるか、または、これらがベースである。ヌクレオチドとの用語はさらに、普遍的な塩基として当技術分野で知られているものを含む。一例として、普遍的な塩基は、限定されないが、３−ニトロピロール、５−ニトロインドール、またはネブラリンを含む。
【００９４】
いくつかの実施形態では、ヌクレオチドアナログは、モルホリノ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、メチルホスホネートヌクレオチド、チオールホスホネートヌクレオチド、２’−フルオロＮ３−Ｐ５’−ホスホラミダイト、１’，５’−アンヒドロヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、またはそれらの組み合わせをさらに含む。モルホリノまたはホスホロジアミデートモルホリノオリゴ（ＰＭＯ）は合成分子を含み、その構造は、正常な糖およびリン酸塩構造からの偏差（ｄｅｖｉａｔｅｓ）によって天然の核酸構造を模倣している。いくつかの例では、５員のリボース環は、４つの炭素、１つの窒素、および１つの酸素を含有している６員のモルホリノ環で置換される。いくつかの場合では、リボース単量体は、リン酸基の代わりにホスホロジアミデート基によって結合される。場合によっては、骨格の変質は、荷電オリゴヌクレオチドによって使用されるような細胞送達剤（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ａｇｅｎｔｓ）の助けを借りることなく細胞膜を横断することができるモルホリノ中性分子を作るすべての正および負の電荷を除去する。
【００９５】
【化５】
2020505330.tif 000007
【００９６】
いくつかの実施形態において、ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、糖骨格環もリン酸塩結合を含まず、塩基は結合し、オリゴグリシンのような分子によって適切に間隔を置かれ、ゆえに、骨格電荷を除去する。
【００９７】
【化６】
2020505330.tif 000008
【００９８】
いくつかの実施形態において、１つ以上の修飾が随意にヌクレオチド間結合で生じる。いくつかの例では、修飾されたヌクレオチド間結合は、限定されないが、ホスホロチオエート、ジチオリン酸、メチルホスホン酸、５’−アルキレンホスホン酸塩、５’−メチルホスホナート、３’−アルキレンホスホン酸塩、三フッ化ホウ素（ｂｏｒｏｎｔｒｉｆｌｕｏｒｉｄａｔｅｓ）、３’−５’結合あるいは２’−５’結合のボラノリン酸エステルおよびセレノリン酸塩、リン酸トリエステル、チオノアルキルホスホトリエステル、水素ホスホン酸塩結合、アルキル・ホスホン酸塩、アルキルホスホロチオエート、アリールホスホロチオエート、ホスホロセレノアート、ホスホロジセレノアート、ホスフィン酸塩、ホスホルアミデート、３’−アルキルホスホルアミデート、アミノアルキルホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、ホスホロピペラジデート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニリデート、ケトン、スルホン、スルホンアミド、炭酸塩、カルバマート、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルジメチルヒドラゾ、ホルムアセタル、チオホルムアセタル、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、チオアミデート、リボアセチル基との結合、アミノエチルグリシン、シリル、あるいはシロキサン結合、例えば、飽和または不飽和の、および／または、置換されたおよび／またはヘテロ原子を含む１〜１０の炭素のヘテロ原子を含むまたは含まないアルキルあるいはシクロアルキル結合、モルホリノ構造との結合、アミド、塩基が骨格のアザ窒素に直接的あるいは間接的に結合したポリアミド、またはこれらの組み合わせを含む。ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＰＳ  ＡＳＯ）は、ホスホロチオエート結合を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。例示的なＰＳ  ＡＳＯが以下に説明される。
【００９９】
【化７】
2020505330.tif 000009
【０１００】
いくつかの例では、修飾は、メチルホスホナートあるいはチオールホスホナート修飾などのメチルまたはチオール修飾である。典型的なチオールホスホネートヌクレオチド（左）およびメチルホスホナートヌクレオチド（右）が、以下に例証される。
【０１０１】
【化８】
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【０１０２】
いくつかの例では、修飾されたヌクレオチドは、限定されないが、以下のように例示される２’−フルオロＮ３−Ｐ５’−ホスホロアミダイトを含む：
【０１０３】
【化９】
2020505330.tif 000011
【０１０４】
いくつかの例では、修飾されたヌクレオチドは、限定されないが、以下のように例示されるヘキシトール核酸（あるいは、１’、５’−アンヒドロヘキシトール核酸（ＨＮＡ））を含む：
【０１０５】
【化１０】
2020505330.tif 000012
【０１０６】
いくつかの実施形態において、１つ以上の修飾はさらに、リボース部分、リン酸塩骨格、およびヌクレオシドの修飾、あるいは３’または５’末端のヌクレオチドアナログ修飾を含む。例えば、３’末端は随意に３’カチオン基を含み、あるいは、３’−３’結合を含む３’−末端でヌクレオシドを反転することによって３’カチオン基を含む。別の代替物では、３’−末端は随意に、アミノアルキル基、例えば、３’Ｃ５−アミノアルキルｄＴと共役する。追加の代替物では、３’−末端は随意に、脱塩基部位、例えば、アプリン酸またはアピリミジン酸部位と共役する。いくつかの例では、５’−末端は、アミノアルキル基、例えば、５’−Ｏ−アミノアルキル置換基と共役する。場合によっては、５’−末端は、脱塩基部位、例えば、アプリン酸またはアピリミジン酸部位と共役する。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログの１つ以上を含む。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２５以上の本明細書に記載される人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態では、人工ヌクレオチドアナログは、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル、２’−デオキシ、Ｔ−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、Ｔ−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、あるいは、修飾された２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）、ＬＮＡ、ＥＮＡ、ＰＮＡ、ＨＮＡ、モルホリノ、メチルホスホナートヌクレオチド、チオールホスホナートヌクレオチド、２’−フルオロＮ３−Ｐ５’−ホスホラミダイト、あるいはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル、２’−デオキシ、Ｔ−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、Ｔ−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、あるいは、修飾された２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）、ＬＮＡ、ＥＮＡ、ＰＮＡ、ＨＮＡ、モルホリノ、メチルホスホナートヌクレオチド、チオールホスホナートヌクレオチド、２’−フルオロＮ３−Ｐ５’−ホスホラミダイト、あるいはこれらの組み合わせから選択された１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２５以上の人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２５以上の２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２５以上の２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２５以上のチオールホスホナートヌクレオチドを含む。
【０１０８】
いくつかの例では、ポリ核酸分子は以下の少なくとも１つを含む：約５％から約１００％の修飾、約１０％から約１００％の修飾、約２０％から約１００％の修飾、約３０％から約１００％の修飾、約４０％から約１００％の修飾、約５０％から約１００％の修飾、約６０％から約１００％の修飾、約７０％から約１００％の修飾、約８０％から約１００％の修飾、および、約９０％から約１００％の修飾。
【０１０９】
いくつかの例では、ポリ核酸分子は以下の少なくとも１つを含む：約１０％から約９０％の修飾、約２０％から約９０％の修飾、約３０％から約９０％の修飾、約４０％から約９０％の修飾、約５０％から約９０％の修飾、約６０％から約９０％の修飾、約７０％から約９０％の修飾、および、約８０％から約１００％の修飾。
【０１１０】
いくつかの例では、ポリ核酸分子は以下の少なくとも１つを含む：約１０％から約８０％の修飾、約２０％から約８０％の修飾、約３０％から約８０％の修飾、約４０％から約８０％の修飾、約５０％から約８０％の修飾、約６０％から約８０％の修飾、および、約７０％から約８０％の修飾。
【０１１１】
いくつかの例では、ポリ核酸分子は以下の少なくとも１つを含む：約１０％から約７０％の修飾、約２０％から約７０％の修飾、約３０％から約７０％の修飾、約４０％から約７０％の修飾、約５０％から約７０％の修飾、および、約６０％から約７０％の修飾。
【０１１２】
いくつかの例では、ポリ核酸分子は、以下の少なくとも１つを含む：約１０％から約６０％の修飾、約２０％から約６０％の修飾、約３０％から約６０％の修飾、約４０％から約６０％の修飾、および約５０％から約６０％の修飾。
【０１１３】
いくつかの例では、ポリ核酸分子は以下の少なくとも１つを含む：約１０％から約５０％の修飾、約２０％から約５０％の修飾、約３０％から約５０％の修飾、および約４０％から約５０％の修飾。
【０１１４】
いくつかの例では、ポリ核酸分子は以下の少なくとも１つを含む：約１０％から約４０％の修飾、約２０％から約４０％の修飾、および約３０％から約４０％の修飾。
【０１１５】
いくつかの例では、ポリ核酸分子は以下の少なくとも１つを含む：約１０％から約３０％の修飾、および約２０％から約３０％の修飾。
【０１１６】
場合によっては、ポリ核酸分子は約１０％から約２０％の修飾を含む。
【０１１７】
場合によっては、ポリ核酸分子は約１５％から約９０％、約２０％から約８０％、約３０％から約７０％、あるいは約４０％から約６０％の修飾を含む。
【０１１８】
さらなる場合には、ポリ核酸分子は少なくとも約１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の修飾を含む。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、ポリ核酸分子は、少なくとも約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、またはそれ以上の修飾を含む。
【０１２０】
いくつかの例では、ポリ核酸分子は、少なくとも約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、またはそれ以上の修飾されたヌクレオチドを含む。
【０１２１】
いくつかの例では、約５％から約１００％のポリ核酸分子は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％は、本明細書に記載される人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約５％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約１０％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約１５％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約２０％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約２５％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約３０％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約３５％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約４０％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約４５％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約５０％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約５５％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約６０％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約６５％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約７０％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約７５％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約８０％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約８５％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約９０％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約９５％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約９６％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約９７％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約９８％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約９９％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子の約１００％は、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態では、人工ヌクレオチドアナログは、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル、２’−デオキシ、Ｔ−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、Ｔ−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、あるいは、修飾された２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）、ＬＮＡ、ＥＮＡ、ＰＮＡ、ＨＮＡ、モルホリノ、メチルホスホナートヌクレオチド、チオールホスホナートヌクレオチド、２’−フルオロＮ３−Ｐ５’−ホスホラミダイト、あるいはこれらの組み合わせを含む。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約１〜約２５の修飾の含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約１の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約２の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約３の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約４の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約５の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約６の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約７の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約８の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約９の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約１０の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約１１の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約１２の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約１３の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約１４の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約１５の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約１６の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約１７の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約１８の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約１９の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約２０の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約２１の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約２２の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約２３の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約２４の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は約２５の修飾を含み、ここで、修飾は本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログを含む。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は２つの別個のポリヌクレオチドから組み立てられ、ここで、１つのポリヌクレオチドはセンス鎖を含み、第２のポリヌクレオチドはポリ核酸分子のアンチセンス鎖を含む。他の実施形態では、センス鎖はリンカー分子によってアンチセンス鎖に接続され、これは、いくつかの例では、ポリヌクレオチドリンカーあるいは非ヌクレオチドリンカーである。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子はセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、ここで、センス鎖中のピリミジンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルピリミジンヌクレオチドを含み、センス鎖中のプリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子はセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、ここで、センス鎖中に存在するピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドを含み、センス鎖中に存在するプリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドを含む。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子はセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、ここで、ピリミジンヌクレオチドは、前記アンチセンス鎖中に存在する場合、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、プリンヌクレオチドは前記アンチセンス鎖中に存在する場合、２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子はセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、ここで、ピリミジンヌクレオチドは、前記アンチセンス鎖中に存在する場合、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、プリンヌクレオチドは前記アンチセンス鎖中に存在する場合、２’−デオキシ−プリンヌクレオチドを含む。
【０１２７】
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子はセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、ここで、センス鎖は、センス鎖の５’−末端、３’−末端、あるいは５’と３’の末端の両方でキャップ部分を含む。他の実施形態では、末端のキャップ部分は反転デオキシ脱塩基部分である。
【０１２８】
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子はセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、ここで、アンチセンス鎖はアンチセンス鎖の３’末端にリン酸塩骨格修飾を含む。いくつかの例では、リン酸塩骨格修飾は、ホスホロチオエートである。
【０１２９】
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子はセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、ここで、アンチセンス鎖はアンチセンス鎖の３’末端にグリセリル修飾を含む。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子はセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、ここで、センス鎖は、１つ以上、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、あるいは１０以上）の２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、ならびに／あるいは、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）に関するおよび／または、普遍的な塩基修飾ヌクレオチド、ならびに、随意にセンス鎖の３’−末端、５’−末端、あるいは３’−と５’−の末端の両方で末端キャップ分子を含み；および、アンチセンス鎖は、約１から約１０の、とりわけ、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、あるいは１０以上）の２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、ならびに／あるいは、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）の普遍的な塩基修飾ヌクレオチド、ならびに、随意にアンチセンス鎖の３’−末端、５’−末端、あるいは３’−と５’−の末端の両方で末端キャップ分子を含む。他の実施形態において、１つ以上、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９あるいは１０以上の、センス鎖および／またはアンチセンス鎖のピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、および／または２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドを用いて、あるいは１つ以上、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または、同じあるいは異なる鎖に存在する３’−末端、５’−末端、あるいは３’−と５’−の末端の両方の末端キャップ分子を用いて、または、用いずに、化学修飾される。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子はセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、ここで、センス鎖は、約１〜約２５、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、あるいは１０以上）の２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、ならびに／あるいは、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）の普遍的な塩基修飾ヌクレオチド、ならびに、随意にセンス鎖の３’−末端、５’−末端、あるいは３’−と５’−の末端の両方で末端キャップ分子を含み；および、アンチセンス鎖は、約１から約２５の、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、あるいは１０以上）の２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、ならびに／あるいは、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）の普遍的な塩基修飾ヌクレオチド、ならびに、随意にアンチセンス鎖の３’−末端、５’−末端、あるいは３’−と５’−の末端の両方で末端キャップ分子を含む。他の実施形態において、１つ以上、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９あるいは１０以上の、センス鎖および／またはアンチセンス鎖のピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、および／または２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドを用いて、約１から約２５以上の、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または、同じあるいは異なる鎖に存在する３’−末端、５’−末端、あるいは３’−と５’−の末端の両方の末端キャップ分子を用いて、または、用いずに、化学修飾される。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子はセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、ここで、アンチセンス鎖は、１つ以上、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または、約１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、あるいは１０以上）の２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、ならびに／あるいは、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）の普遍的な塩基修飾ヌクレオチド、ならびに、随意にセンス鎖の３’−末端、５’−末端、あるいは３’−と５’−の末端の両方で末端キャップ分子を含み；および、アンチセンス鎖は、約１から約１０の、とりわけ、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、あるいは１０以上）の２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、ならびに／あるいは、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）の普遍的な塩基修飾ヌクレオチド、ならびに、随意にアンチセンス鎖の３’−末端、５’−末端、あるいは３’−と５’−の末端の両方で末端キャップ分子を含む。他の実施形態において、１つ以上、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上の、センス鎖および／またはアンチセンス鎖のピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、および／または２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドを用いて、１つ以上、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または、同じあるいは異なる鎖に存在する３’−末端、５’−末端、あるいは３’と５’−の末端の両方の末端キャップ分子を用いて、または、用いずに、化学修飾される。
【０１３３】
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子はセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、ここで、アンチセンス鎖は、約１から約２５の、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、あるいは１０以上）の２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、ならびに／あるいは、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）の普遍的な塩基修飾ヌクレオチド、ならびに、随意にセンス鎖の３’−末端、５’−末端、あるいは３’−と５’−の末端の両方で末端キャップ分子を含み、および、アンチセンス鎖は、約１から約２５の、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、あるいは１０以上）の２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、ならびに／あるいは、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）の普遍的な塩基修飾ヌクレオチド、ならびに、随意にアンチセンス鎖の３’−末端、５’−末端、あるいは３’−と５’−の末端の両方で末端キャップ分子を含む。他の実施形態において、１つ以上、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９あるいは１０以上の、センス鎖および／またはアンチセンス鎖のピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、および／または２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドを用いて、約１から約５、例えば、約１、２、３、４、５以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または、同じあるいは異なる鎖に存在する３’−末端、５’−末端、あるいは３’−と５’−の末端の両方の末端キャップ分子を用いて、または、用いずに、化学修飾される。
【０１３４】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、ポリ核酸分子の各鎖において、約１〜約２５、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する化学修飾された短干渉核酸分子である。
【０１３５】
別の実施形態では、本明細書に記載されたポリ核酸分子は２’−５’ヌクレオチド間結合を含む。いくつかの例では、２’−５’ヌクレオチド間結合は、一方または両方の配列の３’−末端、５’−末端、あるいは３’−末端と５’−末端の両方にある。追加の例では、２’−５’ヌクレオチド間結合は、存在する一方あるいは両方の配列鎖内の様々な他の位置に存在し、例えば、ポリ核酸分子の一方または両方の鎖中のピリミジンヌクレオチドのすべてのヌクレオチド間結合の約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上は、２’−５’ヌクレオチド間結合を含み、あるいは、ポリ核酸分子の一方または両方の鎖中にプリンヌクレオチドのすべてのヌクレオチド間結合の約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上は、２’−５’ヌクレオチド間結合を含む。
【０１３６】
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、細胞中のＲＮＡｉ活性を媒介するか、インビトロ系で再構成された単鎖ポリ核酸分子であり、ここで、ポリ核酸分子は、標的核酸配列に対する相補性を有する単鎖ポリヌクレオチドを含み、および、ポリ核酸中に存在する１つ以上のピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり（例えば、ここで、ピリミジンヌクレオチドはすべて２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、あるいは、代替的に、複数のピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである）、および、ポリ核酸中に存在する任意のプリンヌクレオチドは、２’−デオキシプリンヌクレオチドであり（例えば、すべてのプリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドであるか、あるいは代替的に、複数のプリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドである）、および、末端のキャップ修飾は、アンチセンス配列の３’−末端、５’−末端、あるいは３’と５’−末端の両方で随意に存在する。ポリ核酸分子は、ポリ核酸分子の３’末端に約１〜約４（例えば約１、２、３、あるいは４）の末端２’−デオキシリボヌクレオチドを随意にさらに含み、ここで、末端のヌクレオチドはさらに、１つ以上（例えば、１、２、３、あるいは４）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、および、ポリ核酸分子は随意に５’−末端リン酸基などの末端リン酸基をさらに含む。
【０１３７】
場合によっては、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログの１つ以上は、天然のポリ核酸分子と比較して、例えば、ＲＮａｓｅＨなどのリボヌクレアーゼ、ＤＮａｓｅなどのデオキシリボヌクレアーゼ、または、５’−３’エキソヌクレアーゼや３’−５’エキソヌクレアーゼなどのエキソヌクレアーゼなどのヌクレアーゼに対して抵抗性である。いくつかの例では、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル、２’−デオキシ、Ｔ−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、Ｔ−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、あるいは、修飾された２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）、ＬＮＡ、ＥＮＡ、ＰＮＡ、ＨＮＡ、モルホリノ、メチルホスホナートヌクレオチド、チオールホスホナートヌクレオチド、２’−フルオロＮ３−Ｐ５’−ホスホラミダイト、あるいは、これらの組み合わせを含む人工ヌクレオチドアナログは、ＲＮａｓｅＨなどのリボヌクレアーゼ、ＤＮａｓｅなどのデオキシリボヌクレアーゼ、または、５’−３’エキソヌクレアーゼや３’−５’エキソヌクレアーゼなどのエキソヌクレアーゼなどのヌクレアーゼに対して抵抗性である。いくつかの例では、２’−Ｏメチル修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’−３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’−５’エキソヌクレアーゼ抵抗性）である。いくつかの例では、２’Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’−３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’−５’エキソヌクレアーゼ抵抗性）である。いくつかの例では、２’−Ｏ−アミノプロピル修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’−３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’−５’エキソヌクレアーゼ抵抗性）である。いくつかの例では、２’−デオキシ修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’−３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’−５’エキソヌクレアーゼ抵抗性）である。いくつかの例では、Ｔ−デオキシ−２’−Ｏ−フルオロ修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’−３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’−５’エキソヌクレアーゼ抵抗性）である。いくつかの例では、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’−３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’−５’エキソヌクレアーゼ抵抗性）である。いくつかの例では、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’−３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’−５’エキソヌクレアーゼ抵抗性）である。いくつかの例では、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’−３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’−５’エキソヌクレアーゼ抵抗性）である。いくつかの例では、Ｔ−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’−３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’−５’エキソヌクレアーゼ抵抗性）である。いくつかの例では、２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’−３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’−５’エキソヌクレアーゼ抵抗性）である。いくつかの例では、ＬＮＡ修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’−３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’−５’エキソヌクレアーゼ抵抗性）である。いくつかの例では、ＥＮＡ修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’−３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’−５’エキソヌクレアーゼ抵抗性）である。いくつかの例では、ＨＮＡ修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’−３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’−５’エキソヌクレアーゼ抵抗性）である。いくつかの例では、モルホリノは、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’−３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’−５’エキソヌクレアーゼ抵抗性）である。いくつかの例では、ＰＮＡ修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼに対する耐性を有する（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’−３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’−５’エキソヌクレアーゼ抵抗性）。いくつかの例では、メチルホスホナートヌクレオチド修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’−３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’−５’エキソヌクレアーゼ抵抗性）である。いくつかの例では、チオールホスホナートヌクレオチド修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’−３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’−５’エキソヌクレアーゼ抵抗性）である。いくつかの例では、２’−フルオロＮ３−Ｐ５’−ホスホラミダイトを含むポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮａｓｅ、５’−３’エキソヌクレアーゼ、あるいは３’−５’エキソヌクレアーゼ抵抗性）である。いくつかの例では、本明細書に記載された５’抱合体は５’−３’エキソヌクレアーゼ切断を阻害する。いくつかの例では、本明細書に記載された３’抱合体は３’−５’エキソヌクレアーゼ切断を阻害する。
【０１３８】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載された人工ヌクレオチドアナログの１つ以上は、同等の天然のポリ核酸分子と比して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル、２’−デオキシ、Ｔ−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、Ｔ−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、あるいは、修飾された２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）、ＬＮＡ、ＥＮＡ、ＰＮＡ、ＨＮＡ、モルホリノ、メチルホスホナートヌクレオチド、チオールホスホナートヌクレオチド、または２’−フルオロＮ３−Ｐ５’−ホスホラミダイトを含む人工ヌクレオチドアナログの１つ以上を含むポリ核酸分子は、同等の天然のポリ核酸分子と比して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。いくつかの例では、２’−Ｏ−メチル修飾ポリ核酸分子は、同等の天然のポリ核酸分子と比して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。いくつかの例では、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）修飾ポリ核酸分子は、同等の天然のポリ核酸分子と比して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。いくつかの例では、２’−Ｏ−アミノプロピル修飾ポリ核酸分子は、同等の天然のポリ核酸分子と比して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。いくつかの例では、２’−デオキシ修飾ポリ核酸分子は、同等の天然のポリ核酸分子と比して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。いくつかの例では、Ｔ−デオキシ−２’−フルオロ修飾ポリ核酸分子は、同等の天然のポリ核酸分子と比して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。いくつかの例では、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）修飾ポリ核酸分子は、同等の天然のポリ核酸分子と比して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。いくつかの例では、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）修飾ポリ核酸分子は、同等の天然のポリ核酸分子と比して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。いくつかの例では、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）修飾ポリ核酸分子は、同等の天然のポリ核酸分子と比して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。いくつかの例では、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）修飾ポリ核酸分子は、同等の天然のポリ核酸分子と比して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。いくつかの例では、２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）修飾ポリ核酸分子は、同等の天然のポリ核酸分子と比して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。いくつかの例では、ＬＮＡ修飾ポリ核酸分子は、同等の天然のポリ核酸分子と比して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。いくつかの例では、ＥＮＡ修飾ポリ核酸分子は、同等の天然のポリ核酸分子と比して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。いくつかの例では、ＰＮＡ修飾ポリ核酸分子は、同等の天然のポリ核酸分子と比して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。いくつかの例では、ＨＮＡ修飾ポリ核酸分子は、同等の天然のポリ核酸分子と比して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。いくつかの例では、モルホリノ修飾ポリ核酸分子は、同等の天然のポリ核酸分子と比して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。いくつかの例では、メチルホスホナートヌクレオチド修飾ポリ核酸分子は、同等の天然のポリ核酸分子と比して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。いくつかの例では、チオールホスホナートヌクレオチド修飾ポリ核酸分子は、同等の天然のポリ核酸分子と比して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。いくつかの例では、２’−フルオロＮ３−Ｐ５’−ホスホラミダイトを含むポリ核酸分子は、同等の天然のポリ核酸分子と比して、そのｍＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大させた。場合によっては、増加した親和性は、低Ｋｄ、高融解温度（Ｔｍ）、あるいはその組み合わせで例証される。
【０１３９】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、キラル純粋（あるいはステレオ純粋）なポリ核酸分子、あるいは単一のエナンチオマーを含むポリ核酸分子である。いくつかの例では、ポリ核酸分子はＬ−ヌクレオチドを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子はＤ−ヌクレオチドを含む。いくつかの例において、ポリ核酸分子組成物は、その鏡像異性体の３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、あるいは１％以下を含む。場合によっては、ポリ核酸分子組成物は、ラセミ混合物の３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、あるいは１％以下を含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、米国特許出願公開第：２０１４／１９４６１０号と２０１５／２１１００６号；ＷＯ２０１５１０７４２５に記載されるポリ核酸分子である。
【０１４０】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、アプタマー共役部分を含めるようにさらに修飾される。いくつかの例では、アプタマー共役部分はＤＮＡアプタマー共役部分である。いくつかの例では、アプタマー共役部分は、Ａｌｐｈａｍｅｒ（Ｃｅｎｔａｕｒｉ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）であり、これは、特定細胞表面標的と、循環抗体に結合するための特定のエピトープを示す部分とを認識するアプタマー部分を含んでいる。いくつかの例において、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、米国特許第８，６０４，１８４号、８，５９１，９１０号、および、７，８５０，９７５号に記載されるようなアプタマー共役部分を含めるようにさらに修飾される。
【０１４１】
追加の実施形態では、本明細書に記載されたポリ核酸分子はその安定性を増大させるために修飾される。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子はＲＮＡ（例えばｓｉＲＮＡ）である。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、その安定性を増大させるために上に記載された修飾の１つ以上によって修飾されている。場合によっては、ポリ核酸分子は、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル、２’−デオキシ、Ｔ−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、Ｔ−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、または、２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）修飾、あるいは、ロックドまたは架橋リボース構造（例えば、ＬＮＡまたはＥＮＡ）によるなどして、２ヒドロキシル位置で修飾される。場合によっては、ポリ核酸分子は２’−Ｏ−メチルおよび／または２’−Ｏ−メトキシエチルリボースによって修飾される。場合によっては、ポリ核酸分子はさらに、その安定性を増大させるために、モルホリノ、ＰＮＡ、ＨＮＡ、メチルホスホナートヌクレオチド、チオールホスホナートヌクレオチド、および／または２’−フルオロＮ３−Ｐ５’−ホスホラミダイトを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子はキラル純粋な（あるいはステレオ純粋な）ポリ核酸分子である。いくつかの例では、キラル純粋な（あるいはステレオ純粋な）ポリ核酸分子はその安定性を増大させるために修飾されている。送達の安定性を増大させるためのＲＮＡの適切な修飾は当業者には明らかである。
【０１４２】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、限定されないが、ＩＫＢＫＡＰ、ＳＭＮ２、ＭＣＡＤ、ＬＭＮＡ、ＤＭＰＫ、ＺＮＦ９、ＭＡＰＴ、ＦＫＴＮ、ＴＤＰ−４３、ＬＤＬＲ、ＣＦＴＲ、ＤＭＤ、ＰＡＨ、ＭＳＴＮ、あるいはＫ−Ｒａｓなどの疾患または障害に関与する遺伝子によってコードされたＲＮＡの発現を調節するＲＮＡｉ活性を有する。いくつかの例では、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＩＫＢＫＡＰ、ＳＭＮ２、ＭＣＡＤ、ＬＭＮＡ、ＤＭＰＫ、ＺＮＦ９、ＭＡＰＴ、ＦＫＴＮ、ＴＤＰ−４３、ＬＤＬＲ、ＣＦＴＲ、ＤＭＤ、ＰＡＨ、ＭＳＴＮ、あるいはＫ−Ｒａｓの少なくとも１つの発現をダウンレギュレートする二本鎖ｓｉＲＮＡ分子であり、ここで、二本鎖ｓｉＲＮＡ分子の鎖の１つは、ＩＫＢＫＡＰ、ＳＭＮ２、ＭＣＡＤ、ＬＭＮＡ、ＤＭＰＫ、ＺＮＦ９、ＭＡＰＴ、ＦＫＴＮ、ＴＤＰ−４３、ＬＤＬＲ、ＣＦＴＲ、ＤＭＤ、ＰＡＨ、ＭＳＴＮ、あるいはＫ−Ｒａｓの少なくとも１つ、または、ＩＫＢＫＡＰ、ＳＭＮ２、ＭＣＡＤ、ＬＭＮＡ、ＤＭＰＫ、ＺＮＦ９、ＭＡＰＴ、ＦＫＴＮ、ＴＤＰ−４３、ＬＤＬＲ、ＣＦＴＲ、ＤＭＤ、ＰＡＨ、ＭＳＴＮ、あるいはＫ−Ｒａｓの少なくとも１つによってコードされたＲＮＡ、またはその一部のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、および、二本鎖ｓｉＲＮＡ分子の鎖の第２の鎖は、ＩＫＢＫＡＰ、ＳＭＮ２、ＭＣＡＤ、ＬＭＮＡ、ＤＭＰＫ、ＺＮＦ９、ＭＡＰＴ、ＦＫＴＮ、ＴＤＰ−４３、ＬＤＬＲ、ＣＦＴＲ、ＤＭＤ、ＰＡＨ、ＭＳＴＮ、あるいはＫ−Ｒａｓの少なくとも１つ、または、ＩＫＢＫＡＰ、ＳＭＮ２、ＭＣＡＤ、ＬＭＮＡ、ＤＭＰＫ、ＺＮＦ９、ＭＡＰＴ、ＦＫＴＮ、ＴＤＰ−４３、ＬＤＬＲ、ＣＦＴＲ、ＤＭＤ、ＰＡＨ、ＭＳＴＮ、あるいはＫ−Ｒａの少なくとも１つによってコードされたＲＮＡ、またはその一部のヌクレオチド配列に実質的に類似するヌクレオチド配列を含む。場合によっては、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＩＫＢＫＡＰ、ＳＭＮ２、ＭＣＡＤ、ＬＭＮＡ、ＤＭＰＫ、ＺＮＦ９、ＭＡＰＴ、ＦＫＴＮ、ＴＤＰ−４３、ＬＤＬＲ、ＣＦＴＲ、ＤＭＤ、ＰＡＨ、ＭＳＴＮ、あるいはＫ−Ｒａｓの少なくとも１つの発現をダウンレギュレートする二本鎖ｓｉＲＮＡ分子であり、ここで、ｓｉＲＮＡ分子のそれぞれの鎖は、約１５〜２５、１８〜２４、あるいは１９〜約２３のヌクレオチドを含み、および、それぞれの鎖は、別の鎖のヌクレオチドに相補的な少なくとも約１４、１７、あるいは１９のヌクレオチドを含む。場合によっては、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＩＫＢＫＡＰ、ＳＭＮ２、ＭＣＡＤ、ＬＭＮＡ、ＤＭＰＫ、ＺＮＦ９、ＭＡＰＴ、ＦＫＴＮ、ＴＤＰ−４３、ＬＤＬＲ、ＣＦＴＲ、ＤＭＤ、ＰＡＨ、ＭＳＴＮ、あるいはＫ−Ｒａｓの少なくとも１つの発現をダウンレギュレートする二本鎖ｓｉＲＮＡ分子であり、ここで、ｓｉＲＮＡ分子のそれぞれの鎖は約１９〜約２３のヌクレオチドを含み、および、それぞれの鎖は、別の鎖のヌクレオチドに相補的な少なくとも約１９のヌクレオチドを含む。いくつかの例では、ＲＮＡｉ活性は細胞内で生じる。他の例では、ＲＮＡｉ活性は再構成されたインビトロ系で生じる。
【０１４３】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、限定されないが、ＤＭＤ、ＤＵＸ４、ＤＹＳＦ、ＥＭＤ、あるいはＬＭＮＡなどの筋ジストロフィーに関与する遺伝子によってコードされたＲＮＡの発現を調節するＲＮＡｉ活性を有する。いくつかの例では、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＤＭＤ、ＤＵＸ４、ＤＹＳＦ、ＥＭＤ、あるいはＬＭＮＡの少なくとも１つの発現をダウンレギュレートする二本鎖ｓｉＲＮＡ分子であり、ここで、二本鎖ｓｉＲＮＡ分子の鎖の１つは、ＤＭＤ、ＤＵＸ４、ＤＹＳＦ、ＥＭＤ、あるいはＬＭＮＡの少なくとも１つ、または、ＤＭＤ、ＤＵＸ４、ＤＹＳＦ、ＥＭＤ、あるいはＬＭＮＡの少なくとも１つによってコードされたＲＮＡ、またはその一部のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、ここで、二本鎖ｓｉＲＮＡ分子の鎖の第２の鎖は、ＤＭＤ、ＤＵＸ４、ＤＹＳＦ、ＥＭＤ、あるいはＬＭＮＡの少なくとも１つ、または、ＤＭＤ、ＤＵＸ４、ＤＹＳＦ、ＥＭＤ、あるいはＬＭＮＡの少なくとも１つによってコードされたＲＮＡ、またはその一部のヌクレオチド配列に実質的に類似するヌクレオチド配列を含む。場合によっては、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＤＭＤ、ＤＵＸ４、ＤＹＳＦ、ＥＭＤ、あるいはＬＭＮＡの少なくとも１つの発現をダウンレギュレートする二本鎖ｓｉＲＮＡ分子であり、ここで、ｓｉＲＮＡ分子のそれぞれの鎖は、約１５〜２５、１８〜２４、あるいは１９〜約２３のヌクレオチドを含み、および、それぞれの鎖は、別の鎖のヌクレオチドに相補的な少なくとも約１４、１７、あるいは１９のヌクレオチドを含む。場合によっては、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＤＭＤ、ＤＵＸ４、ＤＹＳＦ、ＥＭＤ、あるいはＬＭＮＡの少なくとも１つの発現をダウンレギュレートする二本鎖ｓｉＲＮＡ分子であり、ここで、ｓｉＲＮＡ分子のそれぞれの鎖は約１９〜約２３のヌクレオチドを含み、および、それぞれの鎖は、別の鎖のヌクレオチドに相補的な少なくとも約１９のヌクレオチドを含む。いくつかの例では、ＲＮＡｉ活性は細胞内で生じる。他の例では、ＲＮＡｉ活性は再構成されたインビトロ系で生じる。
【０１４４】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるポリ核酸分子は、ＤＭＤ遺伝子によってコードされたＲＮＡの発現を調節するＲＮＡｉ活性を有する。いくつかの例では、本明細書に記載されるポリ核酸分子はＤＭＤの発現をダウンレギュレートする単鎖ｓｉＲＮＡ分子であり、ここで、単鎖ｓｉＲＮＡ分子は、ＤＭＤ、またはＤＭＤによってコードされたＲＮＡ、またはその一部のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。場合によっては、本明細書に記載されるポリ核酸分子はＤＭＤの発現をダウンレギュレートする単鎖ｓｉＲＮＡ分子であり、ここで、ｓｉＲＮＡ分子は、約１５〜２５、１８〜２４、あるいは１９〜約２３のヌクレオチドを含む。場合によっては、本明細書に記載されるポリ核酸分子はＤＭＤの発現をダウンレギュレートする単鎖ｓｉＲＮＡ分子であり、ここで、ｓｉＲＮＡ分子は約１９〜約２３のヌクレオチドを含む。いくつかの例では、ＲＮＡｉ活性は細胞内で生じる。他の例では、ＲＮＡｉ活性は再構成されたインビトロ系で生じる。
【０１４５】
いくつかの例では、ポリ核酸分子は、自己相補的なセンスおよびアンチセンス領域を含む、二本鎖ポリヌクレオチド分子であり、ここで、アンチセンス領域は、標的核酸分子またはその一部中のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス領域は標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を有する。いくつかの例では、ポリ核酸分子は２つの別々のポリヌクレオチドから組み立てられ、１つの鎖はセンス鎖であり、もう一つの鎖はアンチセンス鎖であり、ここで、アンチセンス鎖とセンス鎖は自己相補的であり（例えば、それぞれの鎖は、別の鎖のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む；アンチセンス鎖とセンス鎖が二重鎖または二本鎖構造を形成する場合など。例えば、二本鎖領域は約１９、２０、２１、２２、２３以上の塩基対である）；アンチセンス鎖は、標的核酸分子またはその一部のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス鎖は標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を含む。代替的に、ポリ核酸分子は単一のオリゴヌクレオチドから組み立てられ、ポリ核酸分子の自己相補的なセンス領域とアンチセンス領域は、核酸ベースまたは非核酸ベースのリンカーによって結合される。
【０１４６】
場合によっては、ポリ核酸分子は、自己相補的なセンス領域とアンチセンス領域を有する、二重の、非対称的で二重の、ヘアピン型の、または非対称的なヘアピン型の二次構造を有するポリヌクレオチドであり、ここで、アンチセンス領域は、別の標的核酸分子またはその一部のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス領域は標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を有する。他の場合には、ポリ核酸分子は、２つ以上のループ構造と、自己相補的なセンス領域とアンチセンス領域を含む基部とを有する、環状の単鎖ポリヌクレオチドであり、ここで、アンチセンス領域は、標的核酸分子またはその一部のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス領域は標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を有し、環状ポリヌクレオチドは、ＲＮＡｉを媒介することが可能な活性なポリ核酸分子を生成するためにインビボまたはインビトロで処理される。さらなる場合には、ポリ核酸分子はさらに、標的核酸分子またはその一部のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有する単鎖ポリヌクレオチドを含み（例えば、そのようなポリ核酸分子は、標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列のポリ核酸分子内に存在することを必要としない）、単鎖ポリヌクレオチドはさらに、５’−リン酸塩（例えば、Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００２、Ｃｅｌｌ．，１１０、５６３−５７４  ａｎｄ  Ｓｃｈｗａｒｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ、１０、５３７−５６８を参照）あるいは５’，３’−二リン酸塩などの末端のリン酸基を含む。
【０１４７】
いくつかの例では、アンチセンス領域と、ヌクレオチドあるいは非ヌクレオチドを含むループ部分と、センス領域とを含む、線形のポリ核酸分子が非対称的であり、センス領域がアンチセンス領域を有する塩基対に対して十分相補的なヌクレオチドを有し、ループを有する二重鎖を形成する程度に、アンチセンス領域よりも少ないヌクレオチドを含む。例えば、非対称的なヘアピン型のポリ核酸分子は、細胞中またはインビトロ系でＲＮＡｉを媒介するのに十分な長さを有するアンチセンス領域（例えば約１９〜約２２のヌクレオチド）、および約４〜約８のヌクレオチドを含むループ領域、ならびにアンチセンス領域に相補的な約３〜約１８のヌクレオチドを有するセンス領域を含む。場合によっては、非対称的なヘアピン型のポリ核酸分子はさらに、化学修飾された５’末端のリン酸基を含む。さらなる場合には、非対称的なヘアピン型のポリ核酸分子のループ部分は、ヌクレオチド、非ヌクレオチド、リンカー分子、あるいは抱合体分子を含む。
【０１４８】
いくつかの実施形態において、非対称的な二重鎖は、センス領域およびアンチセンス領域を含む２つの別々の鎖を有するポリ核酸分子であり、センス領域は、センス領域がアンチセンス領域との塩基対に対して十分な相補的なヌクレオチドを有し、かつ、二重鎖を形成する程度で、アンチセンス領域よりも少ないヌクレオチドを含む。例えば、非対称的な二重のポリ核酸分子は、細胞中またはインビトロ系でＲＮＡｉを媒介するのに十分な長さを有するアンチセンス領域（例えば約１９約２２のヌクレオチド）、および、アンチセンス領域に相補的な約３〜約１８のヌクレオチドを有するセンス領域を含む。
【０１４９】
場合によっては、普遍的な塩基とは、ほとんど識別されない天然のＤＮＡ／ＲＮＡ塩基の各々と塩基対を形成するヌクレオチド塩基アナログを指す。普遍的な塩基の非限定的な例は、従来技術で知られているようなＣ−フェニル、Ｃ−ナフチル、および他の芳香族誘導体、イノシン、アゾールカルボキサミド、ならびに、３−ニトロピロール、４−ニトロインドール、５−ニトロインドール、および６−ニトロインドールなどのニトロアゾール誘導体を含む（例えば、Ｌｏａｋｅｓ、２００１、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２９、２４３７−２４４７を参照）。
【０１５０】
ポリ核酸分子合成
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたポリ核酸分子は、当該技術分野で知られている手順を用いて、化学合成および／または酵素ライゲーション反応を用いて構築される。例えば、ポリ核酸分子は、自然発生のヌクレオチドを使用して、あるいは、分子の生体安定性を増大させるために、または、ポリ核酸分子と標的核酸との間で形成された二重鎖の物理安定度を増大させるために設計されたさまざまな修飾ヌクレオチドを用いて、化学合成される。例示的な方法は、米国特許第５，１４２，０４７号；第５，１８５，４４４号；第５，８８９，１３６号；第６，００８，４００号；および、第６，１１１，０８６号；ＰＣＴ公開公報第ＷＯ２００９０９９９４２号；あるいは、欧州公開公報第１５７９０１５号に記載されるものを含む。追加の例示的な方法は、以下に記載されるものを含む：Ｇｒｉｆｆｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  “２’−Ｏ−ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：  ａ  ｚｗｉｔｔｅｒｉｏｎｉｃ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｔｈａｔ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｈｅ  ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，”  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ３９（２６）：５１００−５１０９  （１９９７））；  Ｏｂｉｋａ，  ｅｔ  ａｌ．  “Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ２’−Ｏ，４’−Ｃ−ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｕｒｉｄｉｎｅ  ａｎｄ  −ｃｙｔｉｄｉｎｅ．  Ｎｏｖｅｌ  ｂｉｃｙｃｌｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ｈａｖｉｎｇ  ａ  ｆｉｘｅｄ  Ｃ３，  −ｅｎｄｏ  ｓｕｇａｒ  ｐｕｃｋｅｒｉｎｇ”．  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３８  （５０）：  ８７３５  （１９９７）；  Ｋｏｉｚｕｍｉ，  Ｍ．  “ＥＮＡ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ８  （２）：  １４４−１４９  （２００６）；  ａｎｄ  Ａｂｒａｍｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｎｏｖｅｌ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｓｕｂｕｎｉｔｓ−ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ：  ｎｅｗ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｉｅｓ，”  Ｉｎｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４８Ｂ：１７２１−１７２６  （２００９）代替的に、ポリ核酸分子は、ポリ核酸分子がアンチセンス配向にサブクローン化された発現ベクターを用いて生物学的に生成される（つまり、挿入されたポリ核酸分子の転写されたＲＮＡは所望の標的ポリ核酸分子に対してアンチセンス配向になる）。
【０１５１】
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子はタンデム合成方法によって合成され、ここで、両方の鎖は切断リンカーによって分離された単一の隣接するオリゴヌクレオチドフラグメントあるいは鎖として合成され、これはその後切断されることで、二重鎖をハイブリダイズして二重鎖の精製を可能にする別々のフラグメントまたは鎖をもたらす。
【０１５２】
いくつかの例では、ポリ核酸分子も２つの明確な核酸鎖あるいはフラグメントから組み立てられ、ここで、１つのフラグメントはセンス領域を含み、第２のフラグメントは分子のアンチセンス領域を含む。
【０１５３】
例えば、糖、塩基、およびリン酸塩修飾を組み込むためのさらなる修飾方法は、以下を含む：Ｅｃｋｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ＰＣＴ  Ｎｏ．  ＷＯ  ９２／０７０６５；  Ｐｅｒｒａｕｌｔ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ，  １９９０，  ３４４，  ５６５−５６８；  Ｐｉｅｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １９９１，  ２５３，  ３１４−３１７；  Ｕｓｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉ°Ｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．，  １９９２，  １７，  ３３４−３３９；  Ｕｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ＰＣＴ  Ｎｏ．  ＷＯ  ９３／１５１８７；  Ｓｐｒｏａｔ，  Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ．  ５，３３４，７１１  ａｎｄ  Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７０，  ２５７０２；  Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＰＣＴ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ＷＯ  ９７／２６２７０；  Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ．  ５，７１６，８２４；  Ｕｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ．  ５，６２７，０５３；  Ｗｏｏｌｆ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＰＣＴ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ＷＯ  ９８／１３５２６；  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｕ．Ｓ．  Ｓｅｒ．  Ｎｏ．  ６０／０８２，４０４  ｗｈｉｃｈ  ｗａｓ  ｆｉｌｅｄ  ｏｎ  Ａｐｒ．  ２０，  １９９８；  Ｋａｒｐｅｉｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，  ３９，  １１３１；  Ｅａｒｎｓｈａｗ  ａｎｄ  Ｇａｉｔ，  １９９８，  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  （Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ），  ４８，  ３９−５５；  Ｖｅｒｍａ  ａｎｄ  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，  １９９８，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉ°Ｃｈｅｍ．，  ６７，  ９９−１３４；  ａｎｄ  Ｂｕｒｌｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．，  ５，  １９９９−２０１０．上記公報は、触媒作用を調節することなく、核酸分子へ糖、塩基、および／またはリン酸塩修飾を取り込むための位置を決定するための方法や戦術を記載している。
【０１５４】
いくつかの例では、ホスホロチオエート、ジチオリン酸、および／または５’−メチルホスホナート結合とのポリ核酸分子のヌクレオチド間結合の化学修飾が安定性を改善する一方で、過度の修飾はしばしば毒性または活性の減少を引き起こす。したがって、核酸分子を設計する場合、これらのヌクレオチド間結合の量は場合によっては最小限に抑えられる。そのような場合、これらの結合の濃度の減少は、これらの分子の毒性を低下させ、有効性と高い特異性を増加させる。
【０１５５】
核酸ポリペプチド抱合体
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子はさらに、所望の部位へ送達されるポリペプチドＡに共役する。場合によっては、ポリ核酸分子はポリペプチドＡと随意にポリマー部分に共役する。
【０１５６】
いくつかの例では、少なくとも１つのポリペプチドＡは少なくとも１つのＢに共役する。いくつかの例では、少なくとも１つのポリペプチドＡは、Ａ−Ｂ抱合体を形成するために少なくとも１つのＢに共役する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＡは、Ｂの５’末端、Ｂの３’末端、Ｂの内部部位、あるいはその任意の組み合わせに共役する。いくつかの例では、少なくとも１つのポリペプチドＡは少なくとも２つのＢに共役する。いくつかの例では、少なくとも１つのポリペプチドＡは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、あるいはそれ以上のＢに共役する。
【０１５７】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つのポリペプチドＡは少なくとも１つのＢの１つの末端で共役し、その一方で、少なくとも１つのＣは、Ａ−Ｂ−Ｃ抱合体を形成するために少なくとも１つのＢの反対側の末端で共役する。いくつかの例では、少なくとも１つのポリペプチドＡは少なくとも１つのＢの１つの末端で共役し、その一方で、Ｃの少なくとも１つは少なくとも１つのＢの内部部位で共役する。いくつかの例では、少なくとも１つのポリペプチドＡは少なくとも１つのＣに直接共役する。いくつかの例では、少なくとも１つのＢは、Ａ−Ｃ−Ｂ抱合体を形成するために少なくとも１つのＣを介して少なくとも１つのポリペプチドＡに間接的に共役する。
【０１５８】
いくつかの例では、少なくとも１つのＢおよび／または少なくとも１つのＣ、ならびに随意に少なくとも１つのＤは、少なくとも１つのポリペプチドＡに共役する。いくつかの例では、少なくとも１つのＢは、少なくとも１つのポリペプチドＡに末端（例えば、５’末端あるいは３’末端）で共役され、あるいは少なくとも１つのポリペプチドＡに内部部位を介して共役する。場合によっては、少なくとも１つのＣは、少なくとも１つのポリペプチドＡに直接的に、あるいは少なくとも１つのＢによって間接的に共役する。間接的に、少なくとも１つのＢによって、少なくとも１つのＣは、Ｂ上の少なくとも１つのポリペプチドＡと同じ末端で、少なくとも１つのポリペプチドＡからの対抗する末端で、あるいは、独立して内部部位で共役する。いくつかの例では、少なくとも１つの追加のポリペプチドＡはさらに、少なくとも１つのポリペプチドＡ、Ｂ、あるいはＣに共役する。さらなる例では、少なくとも１つのＤは随意に、少なくとも１つのポリペプチドＡ、少なくとも１つのＢ、あるいは少なくとも１つのＣに、直接的あるいは間接的に共役する。直接的に少なくとも１つのポリペプチドＡに共役する場合、少なくとも１つのＤもＡ−Ｄ−Ｂ抱合体を形成するために少なくとも１つのＢに随意に共役され、あるいは、Ａ−Ｄ−Ｂ−Ｃ抱合体を形成するために少なくとも１つのＢと少なくとも１つのＣに随意に共役する。いくつかの例では、Ｄ−Ａ−Ｂ−Ｃ抱合体を形成するために、少なくとも１つのＤは、少なくとも１つのポリペプチドＡに直接的に、および少なくとも１つのＢと少なくとも１つのＣに間接的に共役する。間接的に少なくとも１つのポリペプチドＡに共役する場合、少なくとも１つのＤもＡ−Ｂ−Ｄ抱合体を形成するために少なくとも１つのＢに随意に共役され、あるいは、Ａ−Ｂ−Ｄ−Ｃ抱合体を形成するために少なくとも１つのＢと少なくとも１つのＣに随意に共役する。いくつかの例では、少なくとも１つの追加のＤはさらに、少なくとも１つのポリペプチドＡ、Ｂ、あるいはＣに共役する。
【０１５９】
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子抱合体は、例示されるような構築物を含む：
【０１６０】
【化１１】
2020505330.tif 000013
【０１６１】
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子抱合体は、例示されるような構築物を含む：
【０１６２】
【化１２】
2020505330.tif 000014
【０１６３】
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子抱合体は、例示されるような構築物を含む：
【０１６４】
【化１３】
2020505330.tif 000015
【０１６５】
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子抱合体は、例示されるような構築物を含む：
【０１６６】
【化１４】
2020505330.tif 000016
【０１６７】
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子抱合体は、例示されるような構築物を含む：
【０１６８】
【化１５】
2020505330.tif 000017
【０１６９】
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子抱合体は、例示されるような構築物を含む：
【０１７０】
【化１６】
2020505330.tif 000018
【０１７１】
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子抱合体は、例示されるような構築物を含む：
【０１７２】
【化１７】
2020505330.tif 000019
【０１７３】
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子抱合体は、例示されるような構築物を含む：
【０１７４】
【化１８】
2020505330.tif 000020
【０１７５】
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子抱合体は、例示されるような構築物を含む：
【０１７６】
【化１９】
2020505330.tif 000021
【０１７７】
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子抱合体は、例示されるような構築物を含む：
【０１７８】
【化２０】
2020505330.tif 000022
【０１７９】
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子抱合体は、例示されるような構築物を含む：
【０１８０】
【化２１】
2020505330.tif 000023
【０１８１】
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子抱合体は、例示されるような構築物を含む：
【０１８２】
【化２２】
2020505330.tif 000024
【０１８３】
上記に示されるような
【０１８４】
【化２３】
2020505330.tif 000025
は、例示目的のために過ぎず、ヒト化抗体またはその結合フラグメント、キメラ抗体またはその結合フラグメント、モノクローナル抗体またはその結合フラグメント、一価Ｆａｂ’、二価Ｆａｂ２、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、ナノボディ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、またはラクダ抗体、あるいはその結合フラグメントを包含する。
【０１８５】
結合部分
いくつかの実施形態において、結合部分Ａはポリペプチドである。いくつかの例では、ポリペプチドは、抗体またはそのフラグメントである。場合によっては、フラグメントは結合フラグメントである。いくつかの例では、抗体またはその結合フラグメントは、ヒト化抗体あるいはその結合フラグメント、マウス抗体あるいはその結合フラグメント、キメラ抗体あるいはその結合フラグメント、モノクローナル抗体あるいはその結合フラグメント、一価Ｆａｂ’、二価Ｆａｂ２、Ｆ（ａｂ）’３フラグメント、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ビス−ｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ）２、ダイアボディ、ミニボディ、ナノボディ、三重特異性抗体、四重特異性抗体、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（ｄｓＦｖ）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、Ｉｇ  ＮＡＲ、ラクダ科抗体あるいはその結合フラグメント、二重特異性抗体あるいはその結合フラグメント、あるいはその化学修飾された誘導体を含む。
【０１８６】
いくつかの例では、Ａは抗体またはその結合フラグメントである。いくつかの例では、Ａは、ヒト化抗体あるいはその結合フラグメント、マウス抗体あるいはその結合フラグメント、キメラ抗体あるいはその結合フラグメント、モノクローナル抗体あるいはその結合フラグメント、一価Ｆａｂ’、二価Ｆａｂ２、Ｆ（ａｂ）’３フラグメント、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ビス−ｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ）２、ダイアボディ、ミニボディ、ナノボディ、三重特異性抗体、四重特異性抗体、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、Ｉｇ  ＮＡＲ、ラクダ科抗体あるいはその結合フラグメント、二重特異性抗体あるいはその結合フラグメント、あるいはその化学修飾された誘導体である。いくつかの例では、Ａはヒト化抗体またはその結合フラグメントである。いくつかの例では、Ａはマウス抗体またはその結合フラグメントである。いくつかの例では、Ａはキメラ抗体またはその結合フラグメントである。いくつかの例では、Ａはモノクローナル抗体またはその結合フラグメントである。いくつかの例では、Ａは一価Ｆａｂ’である。いくつかの例では、Ａは二価Ｆａｂ２である。いくつかの例では、Ａは単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、結合部分Ａは、二重特異性抗体またはその結合フラグメントである。いくつかの例では、二重特異性抗体は三機能性抗体あるいは二重特異性ミニ抗体である。場合によっては、二重特異性抗体は三機能性抗体である。いくつかの例では、三機能性抗体は、２つの異なる抗原のための結合部位を含む完全長のモノクローナル抗体である。
【０１８８】
場合によっては、二重特異性抗体は二重特異性ミニ抗体である。いくつかの例では、二重特異性ミニ抗体は、二価Ｆａｂ２、Ｆ（ａｂ）’３フラグメント、ビス−ｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ）２、ダイアボディ、ミニボディ、三重特異性抗体、四重特異性抗体、あるいは二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）を含む。いくつかの実施形態において、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、２つのｓｃＦｖｓが２つの異なる抗原のエピトープを標的とする２つの単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖｓ）を含む融合タンパク質である。
【０１８９】
いくつかの実施形態において、結合部分Ａは二重特異性ミニ抗体である。いくつかの例では、Ａは二重特異性Ｆａｂ２である。いくつかの例では、Ａは二重特異性Ｆ（ａｂ）’３フラグメントである。場合によっては、Ａは二重特異性ビス−ｓｃＦｖである。場合によっては、Ａは二重特異性（ｓｃＦｖ）であるいくつかの実施形態では、Ａは二重特異性ダイアボディである。いくつかの実施形態では、Ａは二重特異性ミニボディである。いくつかの実施形態では、Ａは二重特異性の三重特異性抗体である。他の実施形態では、Ａは二重特異性の四重特異性抗体である。他の実施形態では、Ａは二重特異性のＴ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）である。
【０１９０】
いくつかの実施形態において、結合部分Ａは三重特異性抗体である。いくつかの例では、三重特異性抗体はＦ（ａｂ）’３フラグメントあるいは三重特異性抗体を含む。いくつかの例では、Ａは三重特異性Ｆ（ａｂ）’３フラグメントである。場合によっては、Ａは三重特異性抗体である。いくつかの実施形態において、Ａは、Ｄｉｍａｓ、ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｔｒｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｔｏ  ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ  ｔａｒｇｅｔ  ｔｈｒｅｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｏｎ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ，”  Ｍｏｌ．  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ、１２（９）：  ３４９０−３５０１（２０１５）に記載されるような三重特異性抗体である。
【０１９１】
いくつかの実施形態において、結合部分Ａは、細胞表面タンパク質を認識する抗体またはその結合フラグメントである。いくつかの例では、結合部分Ａは、筋細胞上の細胞表面タンパク質を認識する抗体またはその結合フラグメントである。抗体あるいはその結合フラグメントによって認識される例示的な細胞表面タンパク質は、限定されないが、Ｓｃａ−１、ＣＤ３４、Ｍｙｏ−Ｄ、ミオゲニン、ＭＲＦ４、ＮＣＡＭ、ＣＤ４３、およびＣＤ９５（Ｆａｓ）を含む。
【０１９２】
いくつかの例では、細胞表面タンパク質は、分化（ＣＤ）細胞表面マーカーのクラスタを含む。例示的なＣＤ細胞表面マーカーは、限定されないが、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｄ、ＣＤｗ１２、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１５ｓ、ＣＤ１６、ＣＤｗ１７、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４２、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５０、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５３、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤｗ６０、ＣＤ６１、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｌ（Ｌ−セレクチン）、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６３、ＣＤ６４、ＣＤ６５、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ７９（例えば、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ）、ＣＤ９０、ＣＤ９５（Ｆａｓ）、ＣＤ１０３、ＣＤ１０４、ＣＤ１２５  （ＩＬ５ＲＡ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ−４）、ＣＤ２２１、ＣＤ２７４、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）、ＣＤ３１９（ＳＬＡＭＦ７）、ＣＤ３２６（ＥｐＣＡＭ）などを含む。
【０１９３】
いくつかの例では、制限する部分Ａは抗体あるいはその結合フラグメントである、それはＣＤ細胞表面マーカーを認識する。いくつかの例では、結合部分Ａは、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｄ、ＣＤｗ１２、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１５ｓ、ＣＤ１６、ＣＤｗ１７、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４２、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５０、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５３、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤｗ６０、ＣＤ６１、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｌ（Ｌ−セレクチン）、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６３、ＣＤ６４、ＣＤ６５、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ７９（例えば、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ）、ＣＤ９０、ＣＤ９５（Ｆａｓ）、ＣＤ１０３、ＣＤ１０４、ＣＤ１２５（ＩＬ５ＲＡ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ−４）、ＣＤ２２１、ＣＤ２７４、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）、ＣＤ３１９（ＳＬＡＭＦ７）、ＣＤ３２６（ＥｐＣＡＭ）、または、これらの組み合わせを認識する抗体あるいはその結合フラグメントである。
【０１９４】
いくつかの実施形態において、結合部分Ａは、ポリ核酸分子（Ｂ）に非特異的に共役する。いくつかの例では、結合部分Ａは、非部位特異的なやり方で、リシン残基またはシステイン残基を介してポリ核酸分子（Ｂ）に共役する。いくつかの例では、結合部分Ａは、非部位特異的なやり方で、リシン残基を介してポリ核酸分子（Ｂ）に共役する。場合によっては、結合部分Ａは、非部位特異的なやり方で、システイン残基を介してポリ核酸分子（Ｂ）に共役する。
【０１９５】
いくつかの実施形態において、結合部分Ａは、非部位特異的なやり方で、ポリ核酸分子（Ｂ）に共役する。いくつかの例では、結合部分Ａは、部位特異的なやり方で、リシン残基、システイン残基を介して、５’−末端で、３’−末端で、非天然アミノ酸、あるいは酵素修飾または酵素触媒された残留物で、ポリ核酸分子（Ｂ）に共役する。いくつかの例では、結合部分Ａは、部位特異的なやり方で、リシン残基を介してポリ核酸分子（Ｂ）に共役する。いくつかの例では、結合部分Ａは、部位特異的なやり方で、システイン残基を介してポリ核酸分子（Ｂ）に共役する。いくつかの例では、結合部分Ａは、部位特異的なやり方で、５’末端でポリ核酸分子（Ｂ）に共役する。いくつかの例では、結合部分Ａは、部位特異的なやり方で、３’末端でポリ核酸分子（Ｂ）に共役する。いくつかの例では、結合部分Ａは、部位特異的なやり方で、非天然アミノ酸を介してポリ核酸分子（Ｂ）に共役する。いくつかの例では、結合部分Ａは、部位特異的なやり方で酵素修飾または酵素触媒された残留物を介してポリ核酸分子（Ｂ）に共役する。
【０１９６】
いくつかの実施形態において、１つ以上のポリ核酸分子（Ｂ）は結合部分Ａに共役する。いくつかの例では、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６あるいはそれ以上のポリ核酸分子は、１つの結合部分Ａに共役する。いくつかの例では、約１のポリ核酸分子が１つの結合部分Ａに共役する。いくつかの例では、約２のポリ核酸分子が１つの結合部分Ａに共役する。いくつかの例では、約３のポリ核酸分子が１つの結合部分Ａに共役する。いくつかの例では、約４のポリ核酸分子が１つの結合部分Ａに共役する。いくつかの例では、約５のポリ核酸分子が１つの結合部分Ａに共役する。いくつかの例では、約６のポリ核酸分子が１つの結合部分Ａに共役する。いくつかの例では、約７のポリ核酸分子が１つの結合部分Ａに共役する。いくつかの例では、約８のポリ核酸分子が１つの結合部分Ａに共役する。いくつかの例では、約９のポリ核酸分子が１つの結合部分Ａに共役する。いくつかの例では、約１０のポリ核酸分子が１つの結合部分Ａに共役する。いくつかの例では、約１１のポリ核酸分子が１つの結合部分Ａに共役する。いくつかの例では、約１２のポリ核酸分子が１つの結合部分Ａに共役する。いくつかの例では、約１３のポリ核酸分子が１つの結合部分Ａに共役する。いくつかの例では、約１４のポリ核酸分子が１つの結合部分Ａに共役する。いくつかの例では、約１５のポリ核酸分子が１つの結合部分Ａに共役する。いくつかの例では、約１６のポリ核酸分子が１つの結合部分Ａに共役する。場合によっては、１つ以上のポリ核酸分子が同じである。他の例では、１つ以上のポリ核酸分子が異なる。
【０１９７】
いくつかの実施形態において、結合部分Ａに共役したポリ核酸分子（Ｂ）の数は、比率を形成する。いくつかの例では、比率はＤＡＲ（薬物対抗体の）比率と呼ばれ、本明細書で言及されるような薬物はポリ核酸分子（Ｂ）である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６以上である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約１以上である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約２以上である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約３以上である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約４以上である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約５以上である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約６以上である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約７以上である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約８以上である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約９以上である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約１０以上である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約１１以上である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約１２以上である。
【０１９８】
いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約１である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約２である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約３である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約４である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約５である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約６である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約７である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約８である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約９である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約１０である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約１１である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約１２である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約１３である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約１４である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約１５である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、約１６である。
【０１９９】
いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、１である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、２である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、４である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、６である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、８である。いくつかの例では、結合部分Ａに対するポリ核酸分子（Ｂ）のＤＡＲ比率は、１２である。
【０２００】
いくつかの例では、結合部分Ａを伴わないポリ核酸分子（Ｂ）を含む抱合体と比較して、ポリ核酸分子（Ｂ）と結合部分Ａを含む抱合体は、活性を改善させた。いくつかの例では、改善された活性は、生物学的に関連する機能の増強、例えば、疾患状態の処置または予防における安定性、親和性、結合、機能的な活性、および有効性の改善をもたらす。いくつかの例では、疾患状態は、遺伝子の１つ以上の突然変異エクソンの結果である。いくつかの例では、結合部分Ａを伴わないポリ核酸分子（Ｂ）を含む抱合体と比較して、ポリ核酸分子（Ｂ）と結合部分Ａを含む抱合体は、１つ以上の突然変異したエクソンのエクソンスキッピングの増加をもたらす。いくつかの例では、結合部分Ａを伴わないポリ核酸分子（Ｂ）を含む抱合体と比較して、エクソンスキッピングは、ポリ核酸分子（Ｂ）と結合部分Ａを含む抱合体において、少なくともまたは約５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、あるいは、９５％以上増加する。
【０２０１】
いくつかの実施形態において、抗体またはその結合フラグメントは、単独であるいは組み合わせて、当該技術分野で知られている従来の技術を使用して、例えば、アミノ酸の欠失、挿入、置換、追加を用いることによって、および／または、組換え、ならびに／あるいは、当該技術分野で知られている他の修飾（例えば、グリコシル化とリン酸化などの翻訳後および化学的な修飾）によって、さらに修飾される。いくつかの例では、修飾は、Ｆｃ受容体との相互作用を調節するための修飾をさらに含む。いくつかの例では、１つ以上の修飾は、例えば、国際公開第ＷＯ９７／３４６３１に記載されるものを含み、当該文献はＦｃドメインとＦｃＲｎ受容体との間の相互作用を関与するアミノ酸残基を開示している。抗体またはその結合フラグメントのアミノ酸配列の基礎となる核酸配列にそのような修飾を導入する方法は、当業者に周知である。
【０２０２】
いくつかの例では、抗体結合フラグメントはさらにその誘導体を包含し、少なくとも１つのＣＤＲを含むポリペプチド配列を含んでいる。
【０２０３】
いくつかの例では、本明細書に記載されるような「単鎖」との用語は、二重特異性の単鎖構築物の第１と第２のドメインが、好ましくは、単一核酸分子によってコードすることができる共線形アミノ酸配列の形態で共有結合されるということを意味する。
【０２０４】
いくつかの例では、二重特異性単鎖抗体構築物は２つの抗体由来の結合ドメインを含む構築物に関する。そのような実施形態では、二重特異性の単鎖抗体構築物はタンデムｂｉ−ｓｃＦｖあるいはダイアボディである。いくつかの例では、ｓｃＦｖは、リンカーペプチドによって接続されたＶＨとＶＬのドメインを含む。いくつかの例では、リンカーは、第１と第２のドメインのそれぞれが、互いから独立して、その差次的な結合特異性を保持することができる十分な長さと配列である。
【０２０５】
いくつかの実施形態において、本明細書で使用されるように、〜との結合または〜による相互作用とは、互いに少なくとも２つの抗原相互作用部位の結合／相互作用を定義する。いくつかの例では、抗原相互作用部位は、特異性抗原または抗原の特異的な群との特定の相互作用の能力を示すポリペプチドのモチーフを定義する。場合によっては、結合／相互作用は特定の認識を定義するとも理解される。そのような場合、特定の認識は、抗体あるいはその結合フラグメントが、標的分子の各々の少なくとも２つのアミノ酸に特異的に相互作用および／または結合することができるということを指す。例えば、特定の認識は、抗体分子の特異性、あるいは標的分子の特定の範囲を区別するその能力に関する。追加の例では、抗原相互作用部位のその特異性抗原との特定の相互作用は、例えば、抗原の立体配座の変化、抗原のオリゴマー化などの誘導による、シグナルの開始をもたらす。さらなる実施形態では、結合は「鍵と鍵穴の原則（ｋｅｙ−ｌｏｃｋ−ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ）」の特異性によって例証される。したがって、いくつかの例では、抗原相互作用部位および抗原のアミノ酸配列における特定のモチーフは、上記構造の第２の修飾の結果と同様に、その１次、２次、または３次構造の結果として互いに結合する。そのような場合、抗原相互作用部位のその特異性抗原との特定の相互作用は、その部位の抗原への簡単な結合をもたらす。
【０２０６】
いくつかの例では、特異的な相互作用はさらに、抗体またはその結合フラグメントの減少した交差反応性、あるいは減少したオフターゲット効果を指す。例えば、所望のポリペプチド／タンパク質に結合するが、他のポリペプチドのいずれにも本質的には結合しない抗体あるいはその結合フラグメントは、所望のポリペプチド／タンパク質に対して特異的であるとみなされる。抗原相互作用部位の特異性抗原との特定の相互作用の例は、リガンドのその受容体との特異性、例えば、抗原決定基群（エピトープ）の、抗体の抗原結合部位との相互作用を含む。
【０２０７】
共役化学
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子Ｂは結合部分に共役する。いくつかの例では、結合部分はアミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、抗原、毒素、ホルモン、脂質、ヌクレオチド、ヌクレオシド、糖類、炭水化物、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールなどのポリマー、同様に、これらのクラスの物質のすべてのアナログあるいは誘導体を含む。結合部分の追加の例はさらに、コレステロール、リン脂質、ジアシルグリセロールおよびトリアシルグリセロール、脂肪酸、炭化水素（例えば、飽和、不飽和、または、置換を含む）、酵素基質、ビオチン、ジゴキシゲニン、および多糖類などのステロイドを含む。いくつかの例では、結合部分は、抗体またはその結合フラグメントである。いくつかの例では、ポリ核酸分子はさらにポリマーに共役され、随意にエンドソーム溶解性部分に共役する。
【０２０８】
いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は化学的なライゲーションプロセスによって結合部分に共役する。いくつかの例では、ポリ核酸分子は天然のライゲーションによって結合部分に共役する。いくつかの例では、共役は、Ｄａｗｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．  “Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  ｎａｔｉｖｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｌｉｇａｔｉｏｎ，”  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９４，  ２６６，  ７７６−７７９；  Ｄａｗｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．  “Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  Ｎａｔｉｖｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｔｈｉｏｌ  Ａｄｄｉｔｉｖｅｓ，”  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １９９７，  １１９，  ４３２５−４３２９；  Ｈａｃｋｅｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．  “Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｂｙ  ｎａｔｉｖｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｌｉｇａｔｉｏｎ：  Ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｓｃｏｐｅ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ｓｔｒａｉｇｈｔｆｏｒｗａｒｄ  ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ．，”  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １９９９，  ９６，  １００６８−１００７３；  ｏｒ  Ｗｕ，  ｅｔ  ａｌ．  “Ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅｓ：  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｆｒｅｅ  ｎａｔｉｖｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ，”  Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  ２００６，  ４５，  ４１１６−４１２５．に記載されるとおりである。いくつかの例では、共役は米国特許第８，９３６，９１０号に記載されるとおりである。いくつかの実施形態において、ポリ核酸分子は、天然のライゲーション化学を介して、結合部分に部位特異的あるいは非特異的に共役する。
【０２０９】
いくつかの例では、ポリ核酸分子は、「トレースレス（ｔｒａｃｅｌｅｓｓ）」カップリング技術（ＰｈｉｌｏＣｈｅｍ）を利用する部位指定的な方法によって結合部分に共役する。いくつかの例では、「トレースレス」カップリング技術は、アルデヒド基を含むポリ核酸分子とその後共役する結合部分のＮ末端  １，２−アミノチオール基を利用する。（Ｃａｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｒａｃｅｌｅｓｓ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｏｆ  ｐｏｔｅｎｔ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｄｒｕｇｓ  ｔｏ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｐｈａｒｍａｃｏｄｅｌｉｖｅｒｙ，”  ＪＡＣＳ  １３４（１３）：  ５８８７−５８９２  （２０１２）を参照）
【０２１０】
いくつかの例では、ポリ核酸分子は、結合部分に導入された非天然のアミノ酸を利用する部位指定的な方法によって結合部分に共役する。いくつかの例では、非天然アミノ酸はｐ−アセチルフェニルアラニン（ｐＡｃＰｈｅ）を含む。いくつかの例では、ｐＡｃＰｈｅのケト基は、オキシム結合を形成するために、アルコキシ−アミン由来の共役部分に選択的に結合される。（Ａｘｕｐ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ，”  ＰＮＡＳ  １０９（４０）：  １６１０１−１６１０６  （２０１２）を参照）。
【０２１１】
いくつかの例では、ポリ核酸分子は、酵素触媒プロセスを利用する部位指定的な方法によってに共役する。いくつかの例では、部位指定的な方法はＳＭＡＲＴａｇ（商標）技術（Ｒｅｄｗｏｏｄ）を利用する。いくつかの例では、ＳＭＡＲＴａｇ（商標）技術は、アルデヒドタグの存在下での酸化プロセスを介するホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）によるシステインからのホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）残留物の生成、および、ヒドラジノ−Ｐｉｃｔｅｔ−Ｓｐｅｎｇｌｅｒ（ＨＩＰＳ）ライゲーションを介するアルキルヒドラジン機能化ポリ核酸分子へのＦＧｌｙのその後の共役を含む。（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ａｌｄｅｈｙｄｅ  ｔａｇ，”  ＰＮＡＳ  １０６（９）：  ３０００−３００５  （２００９）；  Ａｇａｒｗａｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  “Ａ  Ｐｉｃｔｅｔ−Ｓｐｅｎｇｌｅｒ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，”  ＰＮＡＳ  １１０（１）：  ４６−５１  （２０１３）を参照）
【０２１２】
いくつかの例では、酵素触媒プロセスは、微生物トランスグルタミナーゼ（ｍＴＧ）を含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、微生物トランスグルタミナーゼ触媒プロセスを用いて結合部分に共役するいくつかの例では、ｍＴＧは、認識配列内のグルタミンのアミド側鎖と機能化されたポリ核酸分子の一級アミンとの間の共有結合の形成を触媒する。いくつかの例では、ｍＴＧはストレプトマイセス・モバラエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｏｂａｒｅｎｓｉｓ）から産生される。（Ｓｔｒｏｐ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｌｏｃａｔｉｏｎ  ｍａｔｔｅｒｓ：  ｓｉｔｅ  ｏｆ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，”  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０（２）  １６１−１６７  （２０１３）を参照）
【０２１３】
いくつかの例では、ポリ核酸分子は、配列特異的なトランスペプチダーゼを利用するＷＯ２０１４／１４０３１７号に記載される方法によって結合部分に共役する。
【０２１４】
いくつかの例では、ポリ核酸分子は、米国特許公報第２０１５／０１０５５３９号および第２０１５／０１０５５４０号に記載されるような方法によって結合部分に共役する。
【０２１５】
抗体あるいはその結合フラグメントの産生
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるポリペプチドは（例えば、抗体とその結合フラグメント）は、特に化学合成による、あるいは組換え発現による、ポリペプチド（例えば抗体）の合成に役立つように当該技術分野で知られている任意の方法を使用して生成され、および、好ましくは組換え体発現技術によって生成される。
【０２１６】
いくつかの例では、抗体あるいはその結合フラグメントは組換え発現され、抗体またはその結合フラグメントをコードする核酸は、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドから組み立てられ（例えばＫｕｔｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４，  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １７：２４２に記載されるように）、これは、ＰＣＲを抗体をコードする配列の重複するオリゴヌクレオチド含有部分の合成、それらのオリゴヌクレオチドのアニーリングとライゲーション、およびその後のライゲートされたオリゴヌクレオチドの増幅の合成を含んでいる。
【０２１７】
代替的に、抗体をコードする核酸分子は、配列の３’と５’の末端へハイブリダイズすることができる合成プライマーを使用するＰＣＲ増幅によって、あるいは特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用してクローンを作ることによって、適切なソース（例えば、抗体ｃＤＮＡライブラリー、あるいは免疫グロブリンを発現する任意の組織あるいは細胞から生成されたｃＤＮＡライブラリー）から随意に生成される。
【０２１８】
いくつかの例では、抗体またはその結合は、ポリクローナル抗体を生成するためにウサギなどの動物を免疫化することにより、あるいは、より好ましくは、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５，  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７）によって記載されるように、あるいは、Ｋｏｚｂｏｒら（１９８３，  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２）またはＣｏｌｅら（１９８５  ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．，  ｐｐ．  ７７−９６）によって記載されるように、モノクローナル抗体を生成することによって、随意に生成される。代替的に、少なくとも抗体のＦａｂ部分をコードするクローンは、特異性抗原に結合するＦＡｂフラグメントのクローンのためにＦａｂ発現ライブラリー（例えば、Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１に記載されるように）をスクリーニングすることにより、あるいは抗体ライブラリー（Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１，  Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４；  Ｈａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９４：４９３７を参照）をスクリーニングにより、随意に得られる。
【０２１９】
いくつかの実施形態において、適切な生物学的活性のヒト抗体分子の遺伝子と一緒に、適切な抗原特異性のマウス抗体分子からの遺伝子をスプライシングすることにより、「キメラ抗体」（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８４，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ８１：８５１−８５５；  Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８４，  Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４−６０８；  Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８５，  Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２−４５４）の生成のために開発された技術が使用される。キメラ抗体は、異なる部分が、マウスのモノクローナル抗体に由来する可変領域、およびヒト免疫グロブリン定常領域（例えばヒト化抗体）を有する動物種などの様々な動物種に由来する分子である。
【０２２０】
いくつかの実施形態において、単鎖抗体（Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ．  ４，６９４，７７８；  Ｂｉｒｄ，  １９８８，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２；  Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３；  ａｎｄ  Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５４４−５４）の生成のために記載された技術は、単鎖抗体を生成するのに適している。単鎖抗体は、アミノ酸ブリッジによってＦｖ領域の重鎖または軽鎖のフラグメントを結合することによって形成され、単鎖ポリペプチドを生じさせる。大腸菌中の機能的なＦｖフラグメントの組み立てのための技術も随意に使用される（Ｓｋｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：１０３８−１０４１）。
【０２２１】
いくつかの実施形態において、抗体のヌクレオチド配列を含む発現ベクターあるいは抗体のヌクレオチド配列は、従来の技術（例えば、エレクトロポレーション、リポソームトランスフェクション、およびリン酸カルシウム沈澱反応）によって宿主細胞に導入され、トランスフェクトされた細胞はその後、抗体を生成するために従来の技術によって培養される。特定の実施形態では、抗体の発現は、構成的、誘導可能、あるいは組織特異的なプロモーターによって調節される。
【０２２２】
いくつかの実施形態において、様々な宿主発現ベクター系は、本明細書に記載される抗体またはその結合フラグメントを発現するために利用される。そのような宿主発現系は、抗体のコード配列が生成され、その後精製されるビヒクルを表すが、適切なヌクレオチドコード配列で変形されるかトランスフェクトされるときに、抗体またはその結合フラグメントをインサイチュで発現する細胞を表す。これらは、限定されないが、組み換え体バクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、あるいは抗体またはその結合フラグメントコード配列を含むコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えば、大腸菌と枯草菌）などの微生物；抗体あるいはその結合フラグメントコード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、サッカロミケス・ピキア）；抗体あるいはその結合フラグメントコード配列を含む組替えウイルス発現ベクターに感染した昆虫細胞系（例えばバキュロウィルス）；組替えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）およびタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））に感染した、または、抗体あるいはその結合フラグメントコード配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；あるいは、哺乳動物細胞（例えば、メタロチオネイン・プロモーター）のゲノム、あるいは、哺乳動物ウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）に由来するプロモーターを含む組換え発現構築物を保護する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨ、２９３、２９３Ｔ、３Ｔ３細胞）を含む。
【０２２３】
組換え型タンパク質の長期的かつ高収率の生成のためには、安定した発現は好ましい。いくつかの例では、安定して抗体を発現する細胞株が随意に任意に操作される。ウイルスの複製開始点を含む発現ベクターを使用するのではなく、宿主細胞は、適切な発現制御要素（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）と選択可能なマーカーによって制御されたＤＮＡで形質転換される。外来性ＤＮＡの導入後に、細胞を操作して栄養強化培地で１−２日間成長させ、その後、選択培地に切り替える。組換えプラスミド中の選択可能なマーカーは、選択に対する耐性を与え、細胞に、プラスミドをその染色体へと安定的に統合させ、クローン化されて細胞株へと広げられるフォーカスを形成するように成長させる。この方法は、抗体またはその結合フラグメントを有利に発現する細胞株を操作するために有利に使用可能である。
【０２２４】
いくつかの例では、限定されないが、それぞれｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−、あるいはａｐｒｔ−細胞で採用される単純疱疹ウイルス・チミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７７，  Ｃｅｌｌ  １１：２２３）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ  ＆  Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，  １９２，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ４８：２０２）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８０，  Ｃｅｌｌ  ２２：８１７）遺伝子を含む、多くの選択系が使用される。同様に、代謝拮抗薬の耐性は、以下の遺伝子のための選定基準として使用される：メトトレキサートに対する耐性を与えるｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８０，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７７：３５７；  Ｏ’Ｈａｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８１，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７８：１５２７）；ミコフェノール酸に対する耐性を与えるｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ＆  Ｂｅｒｇ，  １９８１，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７８：２０７２）；アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を与えるｎｅｏ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １２：４８８−５０５；  Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，  １９９１，  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７−９５；  Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，  １９９３，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｔｏｘｉｃｏｌ．  ３２：５７３−５９６；  Ｍｕｌｌｉｇａｎ，  １９９３，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２；  ａｎｄ  Ｍｏｒｇａｎ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  １９９３，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６２：１９１−２１７；  Ｍａｙ，  １９９３，  ＴＩＢ  ＴＥＣＨ  １１（５）：１５５−２１５）、およびヒグロマイシンに対する耐性を与えるｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８４，  Ｇｅｎｅ  ３０：１４７）。使用可能な組換えＤＮＡ技術の当該技術分野で知られている既知の方法は一般に、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．，  １９９３，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  ＮＹ；  Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，  １９９０，  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  ＮＹ；  ａｎｄ  ｉｎ  Ｃｈａｐｔｅｒｓ  １２  ａｎｄ  １３，  Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ），  １９９４，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  ＮＹ．；  Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８１，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １５０：１）に記載される。
【０２２５】
いくつかの例では、抗体の発現レベルはベクター増幅によって増大する（レビューのために、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｈｅｎｔｓｃｈｅｌ，  Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｇｅｎｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｖｏｌ．  ３．  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８７を参照）。抗体を発現するベクター系中のマーカーが増幅可能であるとき、宿主細胞の培養物中に存在する阻害剤のレベルの増大は、標識遺伝子のコピーの数を増大させる。増幅された領域が抗体のヌクレオチド配列に関連しているため、抗体の産生も増加する（Ｃｒｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８３，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ３：２５７）。
【０２２６】
いくつかの例では、抗体または抗体抱合体の精製あるいは分析のための当該技術分野で知られているいかなる方法が、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、とりわけ、プロテインＡの後の特異性抗原への親和性、および、サイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、差次的溶解性、あるいはタンパク質の精製のための他の標準的な技術によって使用される。例示的なクロマトグラフィー方法としては、限定されないが、強力な陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、および高速タンパク質液体クロマトグラフィーが挙げられる。
【０２２７】
ポリマー共役部分
いくつかの実施形態において、ポリマー部分Ｃはさらに、本明細書に記載されたポリ核酸分子、本明細書に記載される結合部分、あるいはこれらの組み合わせに共役する。いくつかの例では、ポリマー部分Ｃはポリ核酸分子に共役する。場合によっては、ポリマー部分Ｃは結合部分に共役する。他の場合には、ポリマー部分Ｃはポリ核酸分子結合部分分子に共役する。さらなる場合には、ポリマー部分Ｃは上で例証されるように共役する。
【０２２８】
いくつかの例では、ポリマー部分Ｃは分枝したあるいは分枝していない単量体、および／または、二次元または三次元の単量体の架橋したネットワークの長鎖からなる、天然または合成のポリマーである。いくつかの例では、ポリマー部分Ｃは多糖、リグニン、ゴム、あるいはポリアルキルエンオキシド（例えば、ポリエチレングリコール）を含む。いくつかの例では、少なくとも１つのポリマー部分Ｃは、限定されないが、アルファ、オメガ−ジヒドロキシルポリエチレングリコール、生物分解性ラクトンベースのポリマー、例えば、ポリアクリル酸、ポリラクチド酸（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリオレフィン、ポリアミド、ポリシアノアクリレート、ポリイミド、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ、ＰＥＴＧ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴＥ）、ポリテトラメチレン・グリコール（ＰＴＧ）、あるいはポリウレタン、およびこれらの混合物を含む。本明細書で使用されるように、混合物は、ブロックコポリマーに関連する場合と同様に、同じ化合物内の様々なポリマーの使用を指す。場合によっては、ブロックコポリマーは、ポリマーの少なくとも１つの部分が別のポリマーの単量体から構築されるポリマーである。いくつかの例では、ポリマー部分Ｃはポリアルキレンオキシドを含む。いくつかの例では、ポリマー部分ＣはＰＥＧを含む。いくつかの例では、ポリマー部分Ｃはポリエチレン・イミド（ＰＥＩ）またはヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）を含む。
【０２２９】
いくつかの例では、ＣはＰＥＧ部分である。いくつかの例では、ＰＥＧ部分はポリ核酸分子の５’末端で共役するが、結合部分はポリ核酸分子の３’末端で共役する。いくつかの例では、ＰＥＧ部分はポリ核酸分子の３’末端で共役するが、結合部分はポリ核酸分子の５’末端で共役する。いくつかの例では、ＰＥＧ部分はポリ核酸分子の内部部位へ共役する。いくつかの例では、ＰＥＧ部分、結合部分、あるいはその組み合わせは、ポリ核酸分子の内部部位へ共役する。いくつかの例において、抱合体は直接抱合体である。いくつかの例では、共役は天然のライゲーションを介するものである。
【０２３０】
いくつかの実施形態において、ポリアルキレンオキシド（例えばＰＥＧ）は多分散または単分散の化合物である。いくつかの例では、多分散材料は、平均重量（重量平均）サイズおよび分散度を特徴とする、異なる分子量の材料の分散した分布を含む。いくつかの例では、単分散のＰＥＧは１つのサイズの分子を含む。いくつかの実施形態において、Ｃは多分散または単分散のポリアルキレンオキシド（例えばＰＥＧ）であり、示された分子量は、ポリアルキレンオキシド（例えば、ＰＥＧ）分子の分子量の平均を表わす。
【０２３１】
いくつかの実施形態において、ポリアルキレンオキシド（例えばＰＥＧ）の分子量は、約２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１４５０、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３２５０、３３５０、３５００、３７５０、４０００、４２５０、４５００、４６００、４７５０、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、１０，０００、１２，０００、２０，０００、３５，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、または１００，０００  Ｄａである。
【０２３２】
いくつかの実施形態において、Ｃはポリアルキレンオキシド（例えばＰＥＧ）であり、約２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１４５０、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３２５０、３３５０、３５００、３７５０、４０００、４２５０、４５００、４６００、４７５０、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、１０，０００、１２，０００、２０，０００、３５，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、または１００，０００  Ｄａの分子量を有する。いくつかの実施形態において、ＣはＰＥＧであり、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１４５０、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３２５０、３３５０、３５００、３７５０、４０００、４２５０、４５００、４６００、４７５０、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、１０，０００、１２，０００、２０，０００、３５，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、または１００，０００  Ｄａの分子量を有する。いくつかの例では、Ｃの分子量は約２００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約３００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約４００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約５００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約６００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約７００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約８００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約９００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約１０００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約１１００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約１２００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約１３００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約１４００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約１４５０Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約１５００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約１６００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約１７００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約１８００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約１９００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約２０００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約２１００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約２２００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約２３００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約２４００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約２５００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約２６００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約２７００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約２８００Ｄａ��ある。いくつかの例では、Ｃの分子量は約２９００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約３０００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約３２５０Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約３３５０Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約３５００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約３７５０Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約４０００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約４２５０Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約４５００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約４６００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約４７５０Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約５０００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約５５００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約６０００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約６５００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約７０００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約７５００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約８０００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約１００００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約１２０００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約２００００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約３５０００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約４００００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約５００００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約６００００Ｄａである。いくつかの例では、Ｃの分子量は約１０００００Ｄａである。
【０２３３】
いくつかの実施形態において、ポリアルキレンオキシド（例えばＰＥＧ）は、別々のエチレンオキシド単位（例えば、４〜約４８のエチレンオキシド単位）を含む。いくつかの例では、別々エチレンオキシド単位を含むポリアルキレンオキシドは直鎖である。他の症例では、別々エチレンオキシド単位を含むポリアルキレンオキシドは分枝鎖である。
【０２３４】
いくつかの例では、ポリマー部分Ｃは別々エチレンオキシド単位を含むポリアルキレンオキシド（例えばＰＥＧ）である。場合によっては、ポリマー部分Ｃは約４〜約４８エチレンオキシド単位を含む。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、または約４８エチレンオキシド単位を含む。
【０２３５】
いくつかの例では、ポリマー部分Ｃは例えば、約４〜約４８エチレンオキシド単位を含む別のＰＥＧを含む。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、または約４８エチレンオキシド単位を含む、別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約４エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約５エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約６エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約７エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約８エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約９エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約１０エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約１１エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約１２エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約１３エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約１４エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約１５エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約１６エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約１７エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約１８エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約１９エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約２０エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約２１エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約２２エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約２３エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約２４エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約２５エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約２６エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約２７エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約２８エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約２９エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約３０エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約３１エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約３２エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約３３エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約３４エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約３５エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約３６エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約３７エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約３８エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約３９エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約４０エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約４１エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約４２エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約４３エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約４４エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約４５エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約４６エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約４７エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。場合によっては、ポリマー部分Ｃは、例えば、約４８エチレンオキシド単位を含む別々のＰＥＧである。
【０２３６】
場合によっては、ポリマー部分Ｃは、ｄＰＥＧＲ（Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ  Ｌｔｄ）である。
【０２３７】
いくつかの実施形態において、ポリマー部分Ｃはカチオン性ムチン酸ベースのポリマー（ｃＭＡＰ）を含む。いくつかの例では、ｃＭＡＰは少なくとも１つの繰り返しサブユニットの１つ以上のサブユニットを含み、サブユニット構造は式（∨）として表される：
【０２３８】
【化２４】
2020505330.tif 000026
【０２３９】
ここで、ｍは、各出現時、独立して１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、好ましくは、４−６、または５であり、および、ｎは、各出現時、独立して、０、１、２、３、４、または５である。いくつかの実施形態において、ｍとｎは、例えば、約１０である。
【０２４０】
いくつかの例では、ｃＭＡＰはさらにＰＥＧ部分に共役され、ｃＭＡＰ−ＰＥＧコポリマー、ｍＰＥＧ−ｃＭＡＰ−ＰＥＧｍトリブロックポリマー、あるいはｃＭＡＰ−ＰＥＧ−ｃＭＡＰトリブロックポリマーを生成する。いくつかの例では、ＰＥＧ部分は約５００Ｄａ〜約５０，０００Ｄａまでの範囲である。いくつかの例では、ＰＥＧ部分は、約５００Ｄａから約１０００Ｄａ、１０００Ｄａ以上〜約５０００Ｄａ、５０００Ｄａ以上〜約１０，０００Ｄａ、１０，０００以上〜約２５，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ以上〜約５０，０００Ｄａ、あるいはこれらの範囲の２以上の任意の組み合わせである。
【０２４１】
いくつかの例では、ポリマー部分Ｃは、ｃＭＡＰ−ＰＥＧコポリマー、ｍＰＥＧ−ｃＭＡＰ−ＰＥＧｍトリブロックポリマー、あるいはｃＭＡＰ−ＰＥＧ−ｃＭＡＰトリブロックポリマーである。場合によっては、ポリマー部分ＣはｃＭＡＰ−ＰＥＧコポリマーである。他の場合には、ポリマー部分ＣはｍＰＥＧ−ｃＭＡＰ−ＰＥＧｍトリブロックポリマーである。さらなる場合には、ポリマー部分ＣはｃＭＡＰ−ＰＥＧ−ｃＭＡＰトリブロックポリマーである。
【０２４２】
いくつかの実施形態において、ポリマー部分Ｃは、上で例証されるように、ポリ核酸分子、結合部分、および、随意にエンドソーム溶解性部分に共役する。
【０２４３】
エンドソーム溶解性部分
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の分子：Ａ−Ｘ−Ｂ−Ｙ−Ｃはさらに、追加の共役部分を含む。いくつかの例では、追加の共役部分はエンドソーム溶解性部分である。場合によっては、エンドソーム溶解性部分は、エンドソーム、リソソーム、小胞体（ＥＲ）、ゴルジ体、微小管、ペルオキシソーム、あるいは細胞を有する他の小胞体などの、当該技術分野で知られている細胞の区分のいずれかから放出することができる化合物などの細胞区画放出成分である。場合によっては、エンドソーム溶解性部分は、エンドソーム溶解性ポリペプチド、エンドソーム溶解性ポリマー、エンドソーム溶解性脂質、あるいはエンドソーム溶解性小分子を含む。場合によっては、エンドソーム溶解性部分はエンドソーム溶解性ポリペプチドを含む。他の場合には、エンドソーム溶解性部分はエンドソーム溶解性ポリマーを含む。
【０２４４】
エンドソーム溶解性ポリペプチド
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の分子、Ａ−Ｘ−Ｂ−Ｙ−Ｃはさらに、エンドソーム溶解性ポリペプチドへ共役する。場合によっては、エンドソーム溶解性ポリペプチドはｐＨ依存性膜活性ペプチドである。場合によっては、エンドソーム溶解性ポリペプチドは両親媒性ポリペプチドである。追加の場合には、エンドソーム溶解性ポリペプチドはペプチド模倣薬である。いくつかの例では、エンドソーム溶解性ポリペプチドは、ＩＮＦ、メリチン、ムチン（ｍｅｕｃｉｎ）、あるいはそのそれぞれの誘導体を含む。いくつかの例では、エンドソーム溶解性ポリペプチドはＩＮＦまたはそのそれぞれの誘導体を含む。他の場合には、エンドソーム溶解性ポリペプチドはメリチンまたはそのそれぞれの誘導体を含む。さらなる場合には、エンドソーム溶解性ポリペプチドはムチンまたはそのそれぞれの誘導体を含む。
【０２４５】
いくつかの例では、ＩＮＦ７は２４残留物ポリペプチドであり、これらの配列は、ＣＧＩＦＧＥＩＥＥＬＩＥＥＧＬＥＮＬＩＤＷＧＮＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、あるいはＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を含む。いくつかの例では、ＩＮＦ７またはその誘導体は、以下の配列を含む：ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＷＤＹＧＳＧＳＣＧ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３）、ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧ  ＷＹＧ−（ＰＥＧ）６−ＮＨ２  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４）、または  ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＷＤＹＧ−ＳＧＳＣ−Ｋ（ＧａｌＮＡｃ）２  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５）．
【０２４６】
場合によっては、メリチンは２６残基ポリペプチドであり、この配列は、ＣＬＩＧＡＩＬＫＶＬＡＴＧＬＰＴＬＩＳＷＩＫＮＫＲＫＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、あるいはＧＩＧＡＶＬＫＶＬＴＴＧＬＰＡＬＩＳＷＩＫＲＫＲＱＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）を含む。いくつかの例では、メリチンは米国特許第８，５０１，９３０号に記載されるポリペプチド配列を含む。
【０２４７】
いくつかの例では、ムチンは、サソリ（Ｍｅｓｏｂｕｔｈｕｓ  ｅｕｐｅｕｓ）の毒液腺に由来する抗菌ペプチド（ＡＭＰ）である。いくつかの例では、ムチンはムチン−１３から構成され、これらの配列は、ＩＦＧＡＩＡＧＬＬＫＮＩＦ−ＮＨ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）を含み、ムチン−１８配列は、ＦＦＧＨＬＦＫＬＡＴＫＩＩＰＳＬＦＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）を含む。
【０２４８】
いくつかの例では、エンドソーム溶解性ポリペプチドは、その配列がＩＮＦ７あるいはその誘導体に対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、あるいは９９％の配列同一性であるポリペプチド、メリチンあるいはその誘導体、または、ムチンあるいはその誘導体を含む。いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、ＩＮＦ７またはその誘導体、メリチンまたはその誘導体、あるいはムチンまたはその誘導体を含む。
【０２４９】
いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分はＩＮＦ７またはその誘導体である。いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−５に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２−５に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。場合によっては、エンドソーム溶解性部分はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を含む。場合によっては、エンドソーム溶解性部分はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２−５を含む。場合によっては、エンドソーム溶解性部分はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１からなる。場合によっては、エンドソーム溶解性部分はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２−５からなる。
【０２５０】
いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分はメリチンまたはその誘導体である。いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６または７に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。場合によっては、エンドソーム溶解性部分はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６を含む。場合によっては、エンドソーム溶解性部分はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７を含む。場合によっては、エンドソーム溶解性部分はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６からなる。場合によっては、エンドソーム溶解性部分はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７からなる。
【０２５１】
いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分はムチンまたはその誘導体である。いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８または９に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。場合によっては、エンドソーム溶解性部分はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８を含む。場合によっては、エンドソーム溶解性部分はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９を含む。場合によっては、エンドソーム溶解性部分はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８からなる。場合によっては、エンドソーム溶解性部分はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９からなる。
【０２５２】
いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は表１で例証されるような配列を含む。
【０２５３】
【表１−１】
2020505330.tif 000027
【０２５４】
【表１−２】
2020505330.tif 000028
【０２５５】
場合によっては、エンドソーム溶解性部分は、Ｂｃｌ−２および／またはＢｃｌ−ｘＬなどの抑制遺伝子標的の拮抗を介してアポトーシスを誘発するＢａｋ  ＢＨ３ポリペプチドを含む。いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、Ａｌｂａｒｒａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｗｉｔｈ  ａ  ｐＨ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｃａｒｒｉｅｒ，”  Ｒｅａｃｔｉｖｅ  ＆  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ７１：  ２６１−２６５  （２０１１）に記載されるＢａｋ  ＢＨ３ポリペプチドを含む。
【０２５６】
いくつかの例では、エンドソーム溶解性部分は、ＰＣＴ公開公報ＷＯ２０１３／１６６１５５号またはＷＯ２０１５／０６９５８７号に記載されるようなポリペプチド（例えば、細胞透過性ポリペプチド）を含む。
【０２５７】
リンカー
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたリンカーは切断可能なリンカーまたは切断不可能なリンカーである。いくつかの例では、リンカーは切断可能なリンカーである。他の例では、リンカーは切断不可能なリンカーである。
【０２５８】
場合によっては、リンカーは非ポリマーリンカーである。非ポリマーリンカーは、重合プロセスによって生成された単量体の反復単位を含まないリンカーを指す。例示的な非ポリマーリンカーとしては、限定されないが、Ｃ１−Ｃ６アルキル基（例えば、Ｃ５、Ｃ４、Ｃ３、Ｃ２、あるいはＣ１アルキル基）、ホモ二機能性架橋リンカー、ヘテロ二機能性架橋リンカー、ペプチドリンカー、トレースレスリンカー、自壊性リンカー、マレイミドベースのリンカー、あるいはこれらの組み合わせが挙げられる。場合によっては、非ポリマーリンカーは、Ｃ１−Ｃ６アルキル基（例えば、Ｃ５、Ｃ４、Ｃ３、Ｃ２、あるいはＣ１アルキル基）、ホモ二機能性架橋リンカー、ヘテロ二機能性架橋リンカー、ペプチドリンカー、トレースレスリンカー、自壊性リンカー、マレイミドベースのリンカー、あるいはこれらの組み合わせを含む。さらなる場合には、非ポリマーリンカーは、２つを超える同じタイプのリンカー、例えば、２つを超えるホモ二機能性架橋リンカー、あるいは２つを超えるペプチドリンカーを含まない。さらなる場合には、非ポリマーリンカーは随意に１つ以上の反応性官能基を含む。
【０２５９】
いくつかの例では、非ポリマーリンカーは、上に記載されたポリマーを包含しない。いくつかの例では、非ポリマーリンカーは、ポリマー部分Ｃによって囲まれたポリマーを包含しない。場合によっては、非ポリマーリンカーはポリアルキレンオキシド（例えばＰＥＧ）を包含しない。場合によっては、非ポリマーリンカーはＰＥＧを包含しない。
【０２６０】
いくつかの例では、リンカーはホモ二機能性リンカーを含む。例示的なホモ二機能性リンカーは、限定されないが、Ｌｏｍａｎｔの試薬ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）ＤＳＰ、３’３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロプリオネート（ＤＴＳＳＰ）、ジスクシンイミジルスベリン酸塩（ＤＳＳ）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベリン酸塩（ＢＳ）、ジスクシンイミジル酒石酸塩（ＤＳＴ）、ジスルホスクシンイミジル酒石酸塩（スルホＤＳＴ）、エチレングリコビス（スクシンイミジルスクシネート）、ジスクシンイミジルグルタル酸塩（ＤＳＧ）（ＥＧＳ）））、Ｎ、Ｎ’−ジスクシンイミジル炭酸塩（ＤＳＣ）、アジプイミド酸ジメチル（ＤＭＡ）、ジメチルピメリミデートピメリミデート（ＤＭＰ）、ジメチルスベリミデート（ＤＭＳ）、ジメチル−３，３’−ジチオビスプロピオンイミデート（ＤＴＢＰ）、１，４−ジ−３’−（２’−ピリジルジチオ）プロピオンアミド）ブタン（ＤＰＤＰＢ）、ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）、例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン、１，３−ジフルオロ−４，６−ジニトロベンゼンなどのハロゲン化アリール含有化合物（ＤＦＤＮＢ）、４、４’−ジフルオロ−３、３’−ジニトロフェニルスルホン（ＤＦＤＮＰＳ）、ビス−［β−（４−アジドサリチルアミド）エチル］ジスルフィド（ＢＡＳＥＤ）、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、１，４−ブタンジオール・ジグリシジルエーテル、アジピン酸ジヒドラジド、カルボヒドラジド、ｏ−トルイジン、３、３’−ジメチルベンジジン、ベンジジン、α，α’−ｐ−ジアミノジフェニル、ジヨード−ｐ−キシレン・スルホン酸、Ｎ，Ｎ’−エチレン−ビス（ヨードアセトアミド）、あるいは、Ｎ，Ｎ’−ヘキサメチレン−ビス（ヨードアセトアミド）を含む。
【０２６１】
いくつかの実施形態では、リンカーはヘテロ二機能性リンカーを含む。例示的なヘテロ二機能性リンカーは、限定されないが、アミン反応的およびスルフヒドリル架橋リンカー、例えば、Ｎ−スクシンイミジル  ３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸塩（ｓＰＤＰ）、長鎖Ｎ−スクシンイミジル  ３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸塩（ＬＣ−ｓＰＤＰ）、水溶性の長鎖Ｎ−スクシンイミジル  ３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸塩（スルホ−ＬＣ−ｓＰＤＰ）、スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルエン（ｓＭＰＴ）、スルホスクシンイミジル−６−［α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルアミド］ヘキサン酸塩（スルホＬＣ−ｓＭＰＴ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸塩（ｓＭＣＣ）、スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸塩（スルホ−ｓＭＣＣ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢｓ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＭＢ）、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノ安息香酸塩（ｓＩＡＢ）、スルホスクシンイミジル（４−ｉｏｄｏａｃｔｅｙｌ）アミノ安息香酸塩（スルホ−ｓＩＡＢ）、スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）酪酸塩（ｓＭＰＢ）、スルホスクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）酪酸塩、Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミド・エステル（ＧＭＢ））（スルホ−ｓＭＰＢ）−Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）スルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＧＭＢ）、スクシンイミジル  ６−（（ヨードアセチル）アミノ）ヘキサン酸塩（ｓＩＡＸ）、スクシンイミジル  ６−［６−（（（ヨードアセチル）アミノ）ヘキサノイル）アミノ］ヘキサン酸塩（ｓＩＡＸＸ）、スクシンイミジル  ４−（（（ヨードアセチル）アミノ）メチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸塩（ｓＩＡＣ）、スクシンイミジル  ６−（（（（４−ヨードアセチル）アミノ）メチル）シクロヘキサン−１−カルボニル）アミノ）ヘキサン酸塩（ｓＩＡＣＸ）、ｐ−ニトロフェニルヨード酢酸塩（ＮＰＩＡ）、４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド（ＭＰＢＨ）、４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシル−ヒドラジド−８（Ｍ２Ｃ２Ｈ）、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニルヒドラジド（ＰＤＰＨ）などのカルボニル反応的およびスルフヒドリル反応的な架橋リンカー、アミン反応的および光反応性の架橋リンカー、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−４−アジドサリチル酸（ＮＨ−ＡｓＡ）、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル−４−アジドサリチル酸（スルホ−ＮＨ−ＡｓＡ）、スルホスクシンイミジル−（４−アジドサリチルアミド）ヘキサン酸塩（スルホ−ＮＨ−ＬＣ−ＡｓＡ）、スルホスクシンイミジル−２−（ρ−アジドサリチルアミド）エチル−１，３’−ジチオプロピオネート（ｓＡｓＤ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−４−アジド安息香酸塩（ＨｓＡＢ）、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル−４−アジド��息香酸塩（スルホ−ＨｓＡＢ）、Ｎ−スクシンイミジル−６−（４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ）ヘキサン酸塩（ｓＡＮＰＡＨ）、スルホスクシンイミジル−６−（４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ）ヘキサン酸塩（スルホ−ｓＡＮＰＡＨ）、Ｎ−５−アジド−２−ニトロベンゾイルオキシスクシンイミド（ＡＮＢ−ＮＯｓ）、スルホスクシンイミジル−２−（ｍ−アジド−ｏ−ニトロベンズアミド）−エチル−１，３’−ジチオプロピオネート（ｓＡＮＤ）、Ｎ−スクシンイミジル−４（４−アジドフェニル）１，３’−ジチオプロピオネート（ｓＡＤＰ）、Ｎ−スルホスクシンイミジル（４−アジドフェニル）−１，３’−ジチオプロピオネート（スルホ−ｓＡＤＰ）、スルホスクシンイミジル  ４−（ρ−アジドフェニル）酪酸塩（スルホ−ｓＡＰＢ）、スルホスクシンイミジル  ２−（７−アジド−４−メチルクマリン−３−アセトアミド）エチル−１，３’−ジチオプロピオネート（ｓＡＥＤ）、スルホスクシンイミジル  ７−アジド−４−メチルクマリン−３−酢酸塩（スルホ−ｓＡＭＣＡ）、ρ−ニトロフェニル・ジアゾピルバート（ρＮＰＤＰ）、ρ−ニトロフェニル−２−ジアゾ−３，３，３−トリフルオロプロピオネート（ＰＮＰ−ＤＴＰ）、スルフヒドリル反応的および光反応性の架橋リンカー、例えば、１−（ρ−アジドサリチルアミド）−４−（ヨードアセトアミド）ブタン（ＡｓＩＢ）、Ｎ−［４−（ρ−アジドサリチルアミド）ブチル］−３’−（２’−ピリジルジチオ）プロピオンアミド（ＡＰＤＰ）、ベンゾフェノン−４−ヨードアセトアミド、ベンゾフェノン−４−マレイミドカルボニル反応的および光反応性の架橋リンカー、例えば、ρ−アジドベンゾイルヒドラジド（ＡＢＨ）、カルボン酸塩反応的および光反応性の架橋リンカー、例えば、４−（ρ−アジドサリチルアミド）ブチルアミン（ＡｓＢＡ）、および、アルギニン反応的および光反応性の架橋リンカー、例えば、ρ−アジドフェニルグリオキサール（ＡＰＧ）を含む。
【０２６２】
いくつかの例では、リンカーは反応性官能基を含む。場合によっては、反応性官能基は、結合部分に存在する求電子基に反応的な求核基を含む。例示的な求電子基は、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、エステル、アミド、エノン、ハロゲン化アシル、または酸無水物などのカルボニル基を含む。いくつかの実施形態において、反応性官能基はアルデヒドである。例示的な求核基は、ヒドラジド、オキシム、アミノ、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボン酸塩、およびアリールヒドラジドを含む。
【０２６３】
いくつかの実施形態では、リンカーはマレイミド基を含む。いくつかの例では、マレイミド基はマレイミドスペーサーとも呼ばれる。いくつかの例では、マレイミド基はさらにカプロン酸を包含し、マレイミドカプロイル（ｍｃ）を形成する。場合によっては、リンカーはマレイミドカプロイル（ｍｃ）を含む。場合によっては、リンカーはマレイミドカプロイル（ｍｃ）である。他の例では、マレイミド基は、上に記載されたスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸塩（ｓＭＣＣ）、あるいは、スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸塩（スルホ−ｓＭＣＣ）などのマレイミドメチル基を含む。
【０２６４】
いくつかの実施形態において、マレイミド基は自己安定化マレイミドである。いくつかの例では、自己安定化マレイミドは、チオスクシンイミド環加水分解の分子内の触媒作用をもたらすために、マレイミドに隣接する塩基性アミノ基を取り込むべくジアミノプロピオン酸（ＤＰＲ）を利用し、それによって、マレイミドがレトロマイケル反応による脱離反応を経験することのないようにする。いくつかの例では、自己安定化マレイミドは、Ｌｙｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｓｅｌｆ−ｈｙｄｒｏｌｙｚｉｎｇ  ｍａｌｅｉｍｉｄｅｓ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ｔｈｅ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，”  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ３２（１０）：１０５９−１０６２  （２０１４）に記載されるマレイミド基である。いくつかの例では、リンカーは自己安定化マレイミドを含む。いくつかの例では、リンカーは自己安定化マレイミドである。
【０２６５】
いくつかの実施形態では、リンカーはペプチド部分を含む。いくつかの例では、ペプチドは少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８またはそれ以上のアミノ酸残基を。いくつかの例では、ペプチド部分は切断可能なペプチド部分（例えば、酵素的または化学的に）である。いくつかの例では、ペプチド部分は切断不可能なペプチド部分である。いくつかの例では、ペプチド部分は、Ｖａｌ−Ｃｉｔ  （バリン−シトルリン）、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ９７３）、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ａｒｇ、Ｌｅｕ−Ｃｉｔ、Ｉｌｅ−Ｃｉｔ、Ｔｒｐ−Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ９７４）、またはＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ９７５）を含む。いくつかの例では、リンカーは、などのペプチド部分を含む：Ｖａｌ−Ｃｉｔ  （バリン−シトルリン）、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ９７３）、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ａｒｇ、Ｌｅｕ−Ｃｉｔ、Ｉｌｅ−Ｃｉｔ、Ｔｒｐ−Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ９７４）、またはＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ９７５）場合によっては、リンカーはＶａｌ−Ｃｉｔを含む。場合によっては、リンカーはＶａｌ−Ｃｉｔである。
【０２６６】
いくつかの実施形態において、リンカーは安息香酸基あるいはその誘導体を含む。いくつかの例では、安息香酸基あるいはその誘導体はパラアミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）を含む。いくつかの例では、安息香酸基あるいはその誘導体はγ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）を含む。
【０２６７】
いくつかの実施形態において、リンカーは、任意の組み合わせにおける、マレイミド基、ペプチド部分、および／または、安息香酸基の１つ以上を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、マレイミド基、ペプチド部分、および／または、安息香酸基の組み合わせを含む。いくつかの例では、マレイミド基はマレイミドカプロイル（ｍｃ）である。いくつかの例では、ペプチド基はｖａｌ−ｃｉｔである。いくつかの例では、安息香酸基はＰＡＢＡである。いくつかの例では、リンカーはｍｃ−ｖａｌ−ｃｉｔ基を含む。場合によっては、リンカーはｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢＡ基を含む。さらなる場合には、リンカーはｍｃ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢＡ基を含む。
【０２６８】
いくつかの実施形態において、リンカーは自壊性リンカーあるいは自己排除リンカーである。場合によっては、リンカーは自壊性リンカーである。他の場合には、リンカーは自己排除リンカー（例えば環化自己排除リンカー）である。いくつかの例では、リンカーは、米国特許第９，０８９，６１４号あるいはＰＣＴ公開公報ＷＯ２０１５０３８４２６に記載されるリンカーを含む。
【０２６９】
いくつかの実施形態において、リンカーは樹状型リンカーである。いくつかの例では、樹状型リンカーは分岐した多機能リンカー部分を含む。いくつかの例では、樹状型リンカーはポリヌクレオチドＢ対結合部分Ａのモル比を増加させるために使用される。いくつかの例では、樹状型リンカーはＰＡＭＡＭデンドリマーを含む。
【０２７０】
いくつかの実施形態において、リンカーは、トレースレスリンカーであるか、または、切断後に、結合部分Ａ、ポリヌクレオチドＢ、ポリマーＣ、あるいはエンドソーム溶解性部分Ｄに対するリンカー部分（例えば、原子あるいはリンカー基）を残さないリンカーである。例示的なトレースレスリンカーは、限定されないが、ゲルマニウムリンカー、ケイ素リンカー、硫黄リンカー、セレンリンカー、窒素リンカー、リンリンカー、ホウ素リンカー、クロムリンカー、あるいはフェニルヒドラジドリンカーを含む。場合によっては、リンカーは、Ｈｅｊｅｓｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  “Ａ  ｔｒａｃｅｌｅｓｓ  ａｒｙｌ−ｔｒｉａｚｅｎｅ  ｌｉｎｋｅｒ  ｆｏｒ  ＤＮＡ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，”  Ｏｒｇ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｃｈｅｍ  １１（１５）：  ２４９３−２４９７  （２０１３）に記載されるようなトレースレスアリール−トリアゼンリンカーである。いくつかの例では、リンカーは、Ｂｌａｎｅｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｔｒａｃｅｌｅｓｓ  ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，”  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｖ．  １０２：  ２６０７−２０２４  （２００２）に記載されるトレースレスリンカーである。いくつかの例では、リンカーは米国特許第６，８２１，７８３号に記載されるトレースレスリンカーである。
【０２７１】
いくつかの例では、リンカーンは、米国特許第６，８８４，８６９号；第７，４９８，２９８号；第８，２８８，３５２号；第８，６０９，１０５号；あるいは、第８，６９７，６８８号；米国特許公開第２０１４／０１２７２３９号；第２０１３／０２８９１９号；第２０１４／２８６９７０号；第２０１３／０３０９２５６号；第２０１５／０３７３６０号；あるいは、第２０１４／０２９４８５１号；あるいはＰＣＴ公開公報ＷＯ２０１５０５７６９９；ＷＯ２０１４０８０２５１；ＷＯ２０１４１９７８５４；ＷＯ２０１４１４５０９０；あるいは、第ＷＯ２０１４１７７０４２に記載されるリンカーである。
【０２７２】
いくつかの実施形態において、Ｘ、ＹおよびＬは独立して単結合またはリンカーである。いくつかの例では、Ｘ、Ｙ、およびＬは独立して単結合である。場合によっては、Ｘ、Ｙ、およびＬは独立してリンカーである。
【０２７３】
いくつかの例では、Ｘは単結合あるいはリンカー、例えば、非ポリマーリンカーである。いくつかの例では、Ｘは単結合である。いくつかの例では、Ｘは非ポリマーリンカーである。いくつかの例では、非ポリマーリンカーはＣ１−Ｃ６アルキル基である。場合によっては、Ｘは、例えば、Ｃ５、Ｃ４、Ｃ３、Ｃ２、あるいはＣ１アルキル基などのＣ１−Ｃ６アルキル基である。場合によっては、Ｃ１−Ｃ６アルキル基は非置換のＣ１−Ｃ６アルキル基である。非ポリマーリンカーの文脈において、とりわけ、Ｘの文脈において使用されるように、アルキルは最大で６つの炭素原子を含む飽和した直鎖または分岐鎖の炭化水素ラジカルを意味する。いくつかの例では、Ｘは上方で記載されたホモ二機能性リンカーあるいはヘテロ二機能性リンカーを含む。場合によっては、Ｘはヘテロ二機能性リンカーを含む。場合によっては、ＸはｓＭＣＣを含む。他の例では、ＸはＣ１−Ｃ６アルキル基に随意に共役したヘテロ二機能性リンカーを含む。他の例では、ＸはＣ１−Ｃ６アルキル基に随意に共役したｓＭＣＣを含める。追加の例では、Ｘはポリマー部分Ｃによって包含されるポリマーを包含せず、例えば、Ｘはポリアルキレンオキシド（例えばＰＥＧ分子）を包含しない。
【０２７４】
いくつかの例では、Ｙは単結合あるいはリンカー、例えば、非ポリマーリンカーである。いくつかの例では、Ｙは単結合である。他の場合には、Ｙは非ポリマーリンカーである。いくつかの実施形態において、ＹはＣ１−Ｃ６アルキル基である。いくつかの例では、Ｙは上方で記載されたホモ二機能性リンカーあるいはヘテロ二機能性リンカーである。いくつかの例では、Ｙは上方で記載されたホモ二機能性リンカーである。いくつかの例では、Ｙは上方で記載されたヘテロ二機能性リンカーである。いくつかの例では、Ｙは、上に記載されたマレイミドカプロイル（ｍｃ）などのマレイミド基、あるいは自己安定化マレイミド基を含む。いくつかの例では、ＹはＶａｌ−Ｃｉｔなどのペプチド部分を含む。いくつかの例では、ＹはＰＡＢＡなどの安息香酸基を含む。さらなる例では、Ｙは、マレイミド基、ペプチド部分、および／または、安息香酸基の組み合わせを含む。追加の例では、Ｙはｍｃ基を含む。追加の例では、Ｙはｍｃ−ｖａｌ−ｃｉｔ基を含む。追加の例では、Ｙはｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢＡ基を含む。追加の例では、Ｙはｍｃ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢＡ基を含む。場合によっては、Ｙはポリマー部分Ｃによって包含されるポリマーを包含せず、例えば、Ｙはポリアルキレンオキシド（例えばＰＥＧ分子）を包含しない。
【０２７５】
いくつかの例では、Ｌは単結合またはリンカー、随意に非ポリマーリンカーを含む。場合によっては、Ｌは単結合である。他の場合には、Ｌは任意にリンカー、随意に非ポリマーリンカーである。いくつかの実施形態において、ＬはＣ１−Ｃ６アルキル基である。いくつかの例では、Ｌは上方で記載されたホモ二機能性リンカーあるいはヘテロ二機能性リンカーである。いくつかの例では、Ｌは上方で記載されたホモ二機能性リンカーである。いくつかの例では、Ｌは上方で記載されたヘテロ二機能性リンカーである。いくつかの例では、Ｌは、上に記載されたマレイミドカプロイル（ｍｃ）などのマレイミド基、あるいは自己安定化マレイミド基を含む。いくつかの例では、ＬはＶａｌ−Ｃｉｔなどのペプチド部分を含む。いくつかの例では、ＬはＰＡＢＡなどの安息香酸基を含む。さらなる例では、Ｌは、マレイミド基、ペプチド部分、および／または、安息香酸基の組み合わせを含む。追加の例では、Ｌはｍｃ基を含む。追加の例では、Ｌはｍｃ−ｖａｌ−ｃｉｔ基を含む。追加の例では、Ｌはｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢＡ基を含む。追加の例では、Ｌはｍｃ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢＡ基を含む。場合によっては、Ｌが随意に非ポリマーリンカーとしてある場合には、ポリマー部分Ｃによって包含されるポリマーを包含せず、例えば、Ｙはポリアルキレンオキシド（例えばＰＥＧ分子）を包含しない。
【０２７６】
医薬製剤
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される医薬製剤は、限定されないが、非経口（例えば、静脈内、皮下、筋肉内）、経口、鼻腔内、頬側、局所、直腸、または経皮の投与経路を含む複数の投与経路によって、被験体に投与される。いくつかの例では、本明細書に記載される医薬組成物は、非経口（例えば、静脈内、皮下、筋肉内、動脈内、腹腔内、髄腔内、大脳内、脳室内、頭蓋内）投与のために製剤される。他の例において、本明細書に記載される医薬組成物は経口投与のために製剤される。また他の例において、本明細書に記載される医薬組成物は経鼻投与のために製剤される。
【０２７７】
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、限定されないが、水性分散液、自己乳化分散液、固溶体、リポソーム分散液、エアロゾル、固形剤形、粉末、即時放出製剤、制御放出製剤、速溶製剤、錠剤、カプセル、丸剤、遅延放出製剤、拡張放出製剤、パルス放出製剤、多粒子製剤（例えば、ナノ粒子製剤）、および、即時放出と制御放出の混合製剤を含む。
【０２７８】
いくつかの例では、医薬製剤は多粒子製剤を含む。いくつかの例では、医薬製剤はナノ粒子製剤を含む。いくつかの例では、ナノ粒子はｃＭＡＰ、シクロデキストリン、あるいは脂質を含む。場合によっては、ナノ粒子は、固体脂質ナノ粒子、ポリマーナノ粒子、自己乳化ナノ粒子、リポソーム、マイクロエマルジョン、あるいはミセル溶液を含む。さらなる例示的なナノ粒子は、限定されないが、常磁性ナノ粒子、超常磁性ナノ粒子、金属ナノ粒子、フラーレン様材料、無機ナノチューブ、デンドリマー（共有結合した金属キレートを有するものなど）、ナノファイバー、ナノホーン、ナノオニオン、ナノロッド、ナノロープ、および量子ドットを含む。いくつかの例では、ナノ粒子は、金属ナノ粒子、例えば、スカンジウム、チタン、バナジウム、クロム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル、銅、亜鉛、イットリウム、ジルコニウム、ニオブ、モリブデン、ルテニウム、ロジウム、パラジウム、銀、カドミウム、ハフニウム、タンタル、タングステン、レニウム、オスミウム、イリジウム、白金、金、ガドリニウム、アルミニウム、ガリウム、インジウム、スズ、タリウム、鉛、ビスマス、マグネシウム、カルシウム、ストロンチウム、バリウム、リチウム、ナトリウム、カリウム、ホウ素、シリコン、リン、ゲルマニウム、ヒ素、アンチモン、およびこれらの組み合わせ、その合金またはオキシドのナノ粒子である。
【０２７９】
いくつかの例では、ナノ粒子は、コア、あるいは、コア・シェル・ナノ粒子におけるように、コアとシェルを含む。
【０２８０】
いくつかの例では、ナノ粒子は、（例えば、本明細書に記載されたポリ核酸分子または結合部分の１つ以上を有する）機能要素の結合のために分子でさらにコーティングされる。いくつかの例では、コーティングは、硫酸コンドロイチン、硫酸デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、アルギン酸、ペクチン、カラギーナン、フコイダン、アガロペクチン、ポルフィラン、カラヤゴム、ジェランガム、キサンタンガム、ヒアルロン酸、グルコサミン、ガラクトサミン、キチン（あるいはキトサン）、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、リゾチーム、チトクロムＣ、リボヌクレアーゼ、トリプシノゲン、キモトリプシノーゲン、α−キモトリプシン、ポリリシン、ポリアルギニン、ヒストン、プロタミン、オバルブミン、またはデキストリンあるいはシクロデキストリンを含む。いくつかの例では、ナノ粒子はグラフェンコーティングされたナノ粒子を含む。
【０２８１】
場合によっては、ナノ粒子が少なくとも約５００ｎｍ、４００ｎｍ、３００ｎｍ、２００ｎｍあるいは１００ｎｍ未満の寸法を有する。
【０２８２】
いくつかの例では、ナノ粒子製剤は、常磁性ナノ粒子、超常磁性ナノ粒子、金属ナノ粒子、フラーレン様材料、無機ナノチューブ、デンドリマー（共有結合した金属キレートを有するものなど）、ナノファイバー、ナノホーン、ナノオニオン、ナノロッド、ナノロープ、または量子ドットを含む。いくつかの例では、本明細書に記載されたポリ核酸分子あるいは結合部分は、ナノ粒子に直接的あるいは間接的に共役する。いくつかの例では、本明細書に記載された少なくとも１、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、あるいは１００以上のポリ核酸分子あるいは結合部分は、ナノ粒子に直接的あるいは間接的に共役する。
【０２８３】
いくつかの実施形態において、医薬製剤は、送達ベクター、例えば、細胞中へのポリ核酸分子の送達のための組換えベクターを含む。いくつかの例では、組換えベクターはＤＮＡプラスミドである。他の例において、組換えベクターは、ウイルスベクターである。例示的なウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、あるいはアルファウイルスに由来したベクターを含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子を発現することができる組換えベクターは、標的細胞中での安定した発現をもたらす。さらなる例では、ポリ核酸分子の一時的発現をもたらすウイルスベクターが使用される。
【０２８４】
いくつかの実施形態において、医薬製剤は、本明細書に開示される組成物との適合性ならびに所望の投与形態の放出プロフィール特性に基づいて選択された担体または担体材料を含む。模範的な担体物質としては、例えば、結合剤、懸濁剤、崩壊剤、充填剤、界面活性剤、可溶化剤、安定化剤、滑沢剤、加湿剤、希釈剤などが含まれる。薬学的に適合可能な担体材料は、アカシア、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、グリセロリン酸カルシウム、乳酸カルシウム、マルトデキストリン、グリセリン、ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、コレステロール、コレステロールエステル、カゼイン酸ナトリウム、大豆レシチン、タウロコール酸、ホスファチジルコリン、塩化ナトリウム、リン酸三カルシウム、リン酸二カリウム、セルロースおよびセルロース抱合体、糖ステアロイル乳酸ナトリウム（ｓｕｇａｒｓ  ｓｏｄｉｕｍ  ｓｔｅａｒｏｙｌ  ｌａｃｔｙｌａｔｅ）、カラギーナン、モノグリセリド、ジグリセリド、α化デンプンなどを含むが、これらに限定されない。参照（例えばレミングトン）：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  Ｎｉｎｅｔｅｅｎｔｈ  Ｅｄ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．：  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  １９９５）、Ｈｏｏｖｅｒ，Ｊｏｈｎ  Ｅ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ  １９７５、Ｌｉｂｅｒｍａｎ，Ｈ．Ａ．ａｎｄ  Ｌａｃｈｍａｎ，Ｌ．，Ｅｄｓ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｃｋｅｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８０、および、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｅｄ．（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ１９９９）（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ１９９９）。
【０２８５】
いくつかの例では、医薬製剤はさらに、酢酸、ホウ酸、クエン酸、乳酸、リン酸、および、塩酸などの酸；水酸化ナトリウム、リン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、およびトリスヒドロキシメチルアミノメタンなどの塩基、ならびに、クエン酸塩／デキストロース、重炭酸ナトリウム、および塩化アンモニウムなどの緩衝剤、を含むｐＨ調節剤または緩衝剤を含む。このような酸、塩基、および緩衝液は、組成物のｐＨを許容可能な範囲で維持することに必要とされる量で含まれる。
【０２８６】
いくつかの例では、医薬製剤は、組成物の浸透圧を許容可能な範囲にするのに必要な量の１つ以上の塩を含む。こうした塩は、ナトリウム、カリウム、またはアンモニウムのカチオン、ならびに塩化物、クエン酸塩、アスコルビン酸塩、ホウ酸塩、リン酸塩、炭酸水素塩、硫酸塩、チオ硫酸塩、または重亜硫酸塩のアニオンを含み、適切な塩は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、チオ硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、および、硫酸アンモニウムを含む。
【０２８７】
いくつかの例では、医薬製剤は、より多くの安定した環境を提供することから化合物を安定させるために使用される希釈剤をさらに含む。緩衝液中に溶解した塩（ｐＨの制御あるいは維持ももたらす）は、限定されないが、リン酸緩衝生理食塩水を含む当該技術分野の希釈剤として利用される。特定の例において、希釈剤は、圧縮を促進するか、またはカプセル充填のための均質混合のために十分な大きさ（ｂｕｌｋ）を作成するために、組成物の大きさを増大させる。そのような化合物は、例えばラクトース、デンプン、マンニトール、ソルビトール、デキストロース、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）などの微結晶性セルロース；リン酸水素カルシウム、リン酸カルシウム二水和物；リン酸三カルシウム、リン酸カルシウム；無水乳糖、噴霧乾燥したラクトース；α化デンプン、Ｄｉ−Ｐａｃ（登録商標）（Ａｍｓｔａｒ）などの圧縮可能な糖；マンニトール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース・アセタート・ステアラート、スクロース系の希釈剤、粉砂糖；一塩基の硫酸カルシウム一水和物、硫酸カルシウム二水和物；乳酸カルシウム三水和物、デキストラート（ｄｅｘｔｒａｔｅｓ）；加水分解したシリアル固形物、アミロース；粉末セルロース、炭酸カルシウム；グリシン、カオリン；マンニトール、塩化ナトリウム；イノシトール、ベントナイトなどを含む。
【０２８８】
場合によっては、医薬製剤は、物質の分解または崩壊を促進するための崩壊剤（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ａｇｅｎｔｓ）または錠剤分解物質（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｎｔｓ）を含む。用語「分解する」は、胃腸液と接触した際の剤形の溶解と分散の両方を含む。崩壊剤の例は、デンプン、例えば天然のデンプン、例えばトウモロコシデンプンまたはジャガイモデンプン、α化デンプン、例えばＮａｔｉｏｎａｌ  １５５１またはＡｍｉｊｅｌ（登録商標）、またはナトリウムデンプングリコラート、例えばＰｒｏｍｏｇｅｌ（登録商標）またはＥｘｐｌｏｔａｂ（登録商標）、セルロース、例えば木製品、メチル結晶セルロース、例えばＡｖｉｃｅｌ（登録商標）、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）ＰＨ１０１、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）ＰＨ１０２、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）ＰＨ１０５、Ｅｌｃｅｍａ（登録商標）Ｐ１００、ＥｍｃｏＣｅｌ（登録商標）、Ｖｉｖａｃｅｌ（登録商標）、Ｍｉｎ  Ｔｉａ（登録商標）、およびＳｏｌｋａ−Ｆｌ°Ｃ（登録商標））、メチルセルロース、クロスカルメロース、または架橋セルロース、例えば架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム（Ａｃ−Ｄｉ−Ｓｏｌ（登録商標））、架橋カルボキシメチルセルロース、または架橋クロスカルメロース、の架橋デンプン、例えばナトリウムデンプングリコラート、クロスポビドンなどの架橋ポリマー、架橋ポリビニルピロリドン、アルギン酸塩、例えばアルギン酸またはアルギン酸ナトリウムなどのアルギン酸の塩、Ｖｅｅｇｕｍ（登録商標）ＨＶ（ケイ酸アルミニウムマグネシウム）などの粘土、ゴム（寒天、グアー、ローカストビーン、カラヤ、ペクチン、またはトラガカントなど）、ナトリウムデンプングリコラート、ベントナイト、天然のスポンジ、界面活性剤、陽イオン交換樹脂などの樹脂、柑橘類のパルプ、ラウリル硫酸ナトリウム、デンプンを組み合わせたラウリル硫酸ナトリウムなど、を含む。などが挙げられる。
【０２８９】
いくつかの例では、医薬製剤は、ラクトース、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、第二リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、微結晶性セルロース、セルロース粉末、デキストロース、デキストラート、デキストラン、デンプン、α化デンプン、スクロース、キシリトール、ラクチトール、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウム、ポリエチレングリコールなどの充填剤を含む。
【０２９０】
潤滑剤と滑剤も、材料の癒着あるいは摩擦を防ぎ、減少させ、阻害するための本明細書に記載される医薬製剤に随意に含まれる。典型的な潤滑剤は、例えばステアリン酸、水酸化カルシウム、タルク、ナトリウム・ステアリル・フマラート、鉱油などの炭化水素、水素添加大豆油（Ｓｔｅｒｏｔｅｘ（登録商標））などの硬化植物油、高級脂肪酸、およびアルカリ金属とアルカリ土類金属塩、例えばアルミニウム、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、ステアリン酸、ステアリン酸ナトリウム、グリセロール、タルク、ワックス、Ｓｔｅａｒｏｗｅｔ（登録商標）、ホウ酸、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ロイシン、ポリエチレングリコール（例えばＰＥＧ−４０００）またはメトキシポリエチレン・グリコール、例えばＣａｒｂｏｗａｘ（商標）、オレイン酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム、ベへン酸グリセリル、ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸マグネシウムまたはラウリル硫酸ナトリウム、Ｓｙｌｏｉｄ（商標）などのコロイダルシリカ、Ｃａｂ−Ｏ−Ｓｉｌ（登録商標）、トウモロコシデンプンなどのデンプン、シリコーン油、界面活性剤などを含む。
【０２９１】
可塑剤は、マイクロカプセル化材料またはフィルムコーティングを軟化することでそれらの脆さを抑えるために使用される化合物を含む。適切な可塑剤は、例えば、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１４５０、ＰＥＧ３３５０、およびＰＥＧ８００などのポリエチレングリコール、ステアリン酸、プロピレングリコール、オレイン酸、トリエチルセルロース、トリアセチンを含む。可塑剤は分散剤または湿潤剤としても機能する。
【０２９２】
可溶化剤は、トリアセチン、クエン酸トリエチル、オレイン酸エチル、カプリル酸エチル、ラウリル硫酸ナトリウム、ドクサートナトリウム、ビタミンＥ  ＴＰＧＳ、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン、Ｎ−ヒドロキシエチルピロリドン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルシクロデキストリン、エタノール、ｎ−ブタノール、イソプロピルアルコール、コレステロール、胆汁塩、ポリエチレングリコール２００−６００、グリコフロール、トランスクトール、プロピレングリコール、およびジメチルイソソルビドなどの化合物を含む。
【０２９３】
安定剤は、任意の抗酸化剤、緩衝液、酸、防腐剤などの化合物を含む。
【０２９４】
懸濁化剤は、ポリビニルピロリドン、例えば、ポリビニルピロリドンＫ１２、ポリビニルピロリドンＫ１７、ポリビニルピロリドンＫ２５、あるいは、ポリビニルピロリドンＫ３０、ビニルピロリドン／酢酸ビニルコポリマー（Ｓ６３０）、ポリエチレングリコール（例えば、ポリエチレングリコールは、約３００から約６０００まで、約３３５０から約４０００まで、または約７０００から約５４００までの分子量を有し）、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロースステアリン酸アセテート、ポリソルベート８０、ヒドロキシエチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、例えば、トラガカントゴム、アラビアゴム、グアーゴム、キサンタンゴムを含むキサンタンなどの、ゴム、糖、セルロース系、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリソルベート８０、アルギン酸ナトリウム、ポリエトキシル化ソルビタンモノラウレート、ポリエトキシル化ソルビタンモノラウレート、ポビドンなどの、化合物を含む。
【０２９５】
界面活性剤は、ラウリル硫酸ナトリウム、ナトリウムドクセート、Ｔｗｅｅｎ６０または８０、トリアセチン、ビタミンＥ  ＴＰＧＳ、ソルビタンモノオレート、ポリオキシエチレン・ソルビタンモノオレート、ポリソルベート、ポロクサマー（ｐｏｌａｘｏｍｅｒ）、胆汁塩、グリセリルモノステアレート、エチレンオキシドおよびプロピレンオキシドのコポリマー、例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）（ＢＡＳＦ）などの化合物を含む。付加的な界面活性剤は、ポリオキシエチレン脂肪酸グリセリドおよび植物油（例えばポリオキシエチレン（６０）水素化ヒマシ油）；および、ポリオキシエチレンアルキルエーテルとアルキルフェニルエーテル、例えば、オクトキシノール１０、オクトキシノール４０などが挙げられる。しばしば、界面活性剤は、物理的安定性を高めるために、または他の目的のために含まれる。
【０２９６】
粘度増強剤は、例えば、メチルセルロース、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートステアレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタラート、カルボマー、ポリビニルアルコール、アルギン酸塩、アカシア、キトサン、およびこれらの組み合わせを含む。
【０２９７】
湿潤剤は、オレイン酸、モノステアリン酸グリセリル、モノオレイン酸ソルビタン、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミン、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、ドクサートナトリウム、オレイン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ドキュセートナトリウム、トリアセチン、Ｔｗｅｅｎ８０、ビタミンＥ  ＴＰＧＳ、アンモニウム塩などの化合物を含む。
【０２９８】
治療レジメン
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される医薬組成物は治療用途のために投与される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は１日当たり一度、１日当たり２度、１日当たり３度、またはそれ以上投与される。医薬組成物は、毎日、１日おき、週５日、週１日、１週おき、１か月当たり２週、１か月当たり３週、月１回、月２回、１か月当たり３回、またはそれ以上投与される。医薬組成物は、少なくとも１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、１８か月、２年、３年、またはそれ以上の間投与される。
【０２９９】
いくつかの実施形態では、１以上の医薬組成物は同時に、連続して、またはある時間間隔で投与される。いくつかの実施形態では、１以上の医薬組成物は同時に投与される。場合によっては、１つ以上の医薬組成物は連続して投与される。さらなる場合には、１以上の医薬組成物は、ある時間間隔で投与される（例えば、第１の医薬組成物の第１の投与は１日目であり、その後、少なくとも第２の医薬組成物の投与前に少なくとも１、２、３、４、５日またはそれ以上の間隔を空ける）。
【０３００】
いくつかの実施形態において、２つ以上の様々な医薬組成物は同時投与される。いくつかの例では、２以上の異なる医薬組成物が同時に投与される。場合によっては、２つ以上の異なる医薬組成物が、投与間の間隔なく連続して同時投与される。他の場合には、２つ以上の異なる医薬組成物は、投与間に約０．５時間、１時間、２時間、３時間、１２時間、１日、２日の間隔をおいて連続して投与される。
【０３０１】
患者の状態が改善する場合、医者の判断で、組成物の投与は継続的に行われ；代替的に、投与されている組成物の用量は、一時的に減少されるか、または特定の期間の間一時的に中断される（つまり、「休薬期間」）。いくつかの事例では、休薬期間の長さは、ほんの一例として、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、１２日、１５日、２０日、２８日、３５日、５０日、７０日、１００日、１２０日、１５０日、１８０日、２００日、２５０日、２８０日、３００日、３２０日、３５０日、または３６５日を含む、２日から１年の間で変わる。休薬日中の投与量の減少は、ほんの一例として、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、あるいは１００％を含む、１０％−１００％である。
【０３０２】
いったん患者の状態が改善すると、必要に応じて維持量が投与される。その後、投与量または投与頻度、あるいはその両方は、症状に応じて、改善された疾患、障害、または疾病が保持されるレベルにまで減少可能である。
【０３０３】
いくつかの実施形態では、このような量に相当する所定の薬剤の量は、特定の化合物、疾患の重症度、処置を必要としている被験体または宿主の性質（例えば、体重）などの要因に左右されるが、それにもかかわらず、例えば、投与されている具体的な薬剤、投与経路、および処置されている被験体または宿主を含む、症例を取り囲む特定の環境に従って、当該技術分野で既知の方法で日常的に判定される。いくつかの例では、所望の投与量は一回量で、あるいは、例えば、１日当たり２、３、あるいは４以上の下位用量として、同時に（または短時間にわたって）あるいは適切なインターバルを置いて投与された分割量として都合よく提示される。
【０３０４】
個々の処置レジメンに関する変数の数が大きいため、前述の範囲は単なる示唆的なものに過ぎず、これらの推奨値から大きく逸脱することは珍しいことではない。そのような投与量は、限定されないが、使用される化合物の活性、処置される疾患または疾病、投与の様式、個々の被験体の必要条件、処置されている疾患または疾病の重症度、および医師の判断を含む、多くの変数に依存して変更される。
【０３０５】
いくつかの実施形態において、こうした治療レジメンの毒性と治療の有効性は、限定されないが、ＬＤ５０（母集団の５０％までの致死投与量）と、ＥＤ５０（母集団の５０％に治療上有効な投与量）の決定を含む、細胞培養または実験動物における標準的な製薬手順によって決定される。毒性と治療効果との間の用量比が治療指数であり、これはＬＤ５０とＥＤ５０との間の比率として表される。高い治療指数を示す化合物が好ましい。細胞培養アッセイと動物研究から得られたデータは、ヒトで使用される一連の投与量を製剤するのに使用される。こうした化合物の投与量は好ましくは、最小限の毒性を備えるＥＤ５０を含む一連の循環濃度内に位置する。投与量は、使用された剤形と利用される投与経路に応じてこの範囲内で変わる。
【０３０６】
キット／製品
ある実施形態において、本明細書に記載される１つ以上の組成物と方法とともに使用されるキットおよび製品が本明細書で開示される。このようなキットは、バイアル、チューブなどの１以上の容器を収容するために仕切られた運搬装置、包装または容器を含み、各容器は本明細書中に記載されている方法を使用するための分けられた要素の１つを備える。適切な容器は、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、および試験管を含む。他の実施形態において、容器は、ガラスまたはプラスチックのような様々な材料から形成される。
【０３０７】
本明細書で提供される製品は包装材料を含む。製薬用包装材料の例としては、限定されないが、ブリスターパック、瓶、チューブ、バッグ、容器、瓶、および選択された製剤と意図した投与および処置のモードに適する任意の包装材料が挙げられる。
【０３０８】
例えば、容器は、本明細書に記載される標的核酸分子を含む。そのようなキットは、識別用の記載またはラベル、あるいは本明細書に記載される方法における使用に関する説明書を随意に含む。
【０３０９】
キットは典型的には、内容物および／または使用説明書を列挙するラベルと、使用説明書を備えた添付文書とを含んでいる。１セットの説明書も典型的に含まれる。
【０３１０】
１つの実施形態では、ラベルが容器上にあるか容器に付随する。１つの実施形態において、ラベルを形成する文字、数字または他の表示が、容器自体に貼り付けられるか、成形されるかまたは刻まれている場合は、ラベルは容器上に取付けられる。ラベルは、例えば添付文書として容器を保持するレセプタクルまたは運搬装置内に存在するとき、容器に付随する。の実施形態において、ラベルは、内容物が特定の治療用途に用いられるべきものであるということを示すために用いられる。ラベルは、例えば、本明細書に記載の方法で、内容物を用いる使用するための指示を示すように使用されてもよい。
【０３１１】
ある実施形態では、医薬組成物は、本明細書で提供された化合物を含む１以上の単位剤形を含むパックまたはディスペンサー装置で提示される。実施形態において、パックは、例えば、ブリスターパックなどの金属またはプラスチックホイルを含む。さらなる実施形態において、パックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための説明書が添付してある。別の実施形態において、パックまたはディスペンサーには、医薬品の製造、使用または販売を制御する政府機関によって規定された形態の容器に付属の通知書が添付してあり、この通知書は、ヒトまたは動物の投与のための薬物の形態についての、政府機関の承認を反映するものである。実施形態において、このような通知書は、例えば、処方薬または承認された生成物の挿入に関して、米国食品医薬品局により承認されたラベルである。１つの実施形態において、適合性の製薬担体で製剤される本明細書で提供される化合物を含む組成物が調製され、適切な容器に入れられ、示された疾病の処置のためにラベル付けされる。
【０３１２】
特定の用語
別段の定めのない限り、本明細書で使用される技術用語と科学用語はすべて、主題が属する当該技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。前述の一般的な記載と以下の詳細な記載は典型的で説明的なものに過ぎず、任意の主題に限定されるものではないことが理解されよう。本出願では、単数の使用は、特別に別記しない限り、複数を含む。明細書および添付の請求項内で用いられる通り、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、その文脈が明確に他のことを定めていない限り、複数の指示対象を含む。本出願において、「または」の使用は特に明記しない限り、「および／または」を意味する。さらに、用語「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」といった他の形態と同じく、限定的なものではない。
【０３１３】
本明細書で使用されるように、範囲と量は「約」特定の値または範囲として表現可能である。「約」は正確な量も含んでいる。したがって、「約５μＬ」は、「約５μＬ」と「５μＬ」も意味する。一般に、用語「約」は、実験誤差内にあると予想される量を含んでいる。
【０３１４】
本明細書に使用される段落の見出しは、組織化するためのものに過ぎず、記載される主題を制限するものと解釈されてはならない。
【０３１５】
本明細書で使用されるように、用語「個体」、「被験体」、および「患者」は任意の哺乳動物を意味する。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。いくつかの実施形態では、哺乳動物は非ヒトである。いかなる用語も、保健従事者（例えば、医者、正看護師、臨床看護師、医師助手、看護助手、あるいはホスピスの職員）の監督（例えば、常時または断続的）を特徴とする状況に制限されない。
【０３１６】
本明細書で使用されるように、用語「ＤＭＤ」、「ＤＭＤ遺伝子」、およびその同等物は、タンパク質ジストロフィンをコードするＤＭＤ遺伝子を指す。加えて、「ＤＭＤ」、「ＤＭＤ遺伝子」という用語は交換可能に使用され、両方の用語はジストロフィン遺伝子を指す。
【実施例】
【０３１７】
これらの実施例は説明目的のために提供されるにすぎず、請求項の範囲を制限するものではない。
【０３１８】
実施例１．アンチセンスオリゴヌクレオチド配列および合成
【０３１９】
ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）、ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＰＳ  ＡＳＯ）、およびアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）が合成された。
【０３２０】
ＰＭＯ配列は５’ＧＧＣＣＡＡＡＣＣＴＣＧＧＣＴＴＡＣＣＴＧＡＡＡＴ３’一級アミン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）であり、末端ヌクレオチドの拡張した状態で図１で見られる。ＰＭＯは共役する分子の３’末端にＣ３−ＮＨ２抱合体ハンドルを含む。ＰＭＯは、標準的な固相合成プロトコルを使用して固相上で完全に組み立てられ、ＨＰＬＣで精製された。
【０３２１】
ＰＳ  ＡＳＯ配列はアミン−Ｃ６−ＧＧＣＣＡＡＡＣＣＵＣＧＧＣＵＵＡＣＣＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）であり、末端ヌクレオチドの拡張した状態で図２Ａ−２Ｂで見られる。ＰＳ  ＡＳＯの構造は、１００％のホスホロチオエート結合だったリン酸塩骨格を含んでおり、リボース糖類はすべて２’２’ＯＭｅ修飾を含んでいた。ＰＳ  ＡＳＯは、共役する分子の５’末端にＣ６−ＮＨ２抱合体ハンドルを含んでいた。ＰＭＯは、標準的な固相ホスホラミダイト化学を使用して固相上で完全に組み立てられ、ＨＰＬＣで精製された。
【０３２２】
ＡＳＯは、標準的な固相ホスホラミダイト化学を使用して固相上で完全に組み立てられ、ＨＰＬＣで精製された。ＡＳＯは、共役する分子の５’末端にＣ６−ＮＨ２抱合体ハンドルを含んでいた。
【０３２３】
実施例２：ＤＭＤエクソンスキッピングの検出
【０３２４】
分化したＣ１Ｃ１２細胞におけるＤＭＤエクソン２３スキッピングを判定するための方法
【０３２５】
マウス筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２細胞は、０．５ｍＬの１０％ＦＢＳ  ＲＰＭＩ  １６４０培地中の２４ウェルプレート中で５０，０００−１００，０００／ウェルで蒔かれ、５％のＣＯ２を用いて３７  °Ｃで夜通しインキュベートされた。２日目に、細胞を分化培地（２％のウマ血清ＲＰＭＩ  １６４０と１μＭインスリン）に移し、３−５日間インキュベートした。インキュベーション後、サンプルを加え、２４時間インキュベートした。サンプル処置の後、１ｍＬの新鮮な培地（化合物を含まない）を２日間毎日変えた。処置開始後７２時間目に、細胞を採取した。ＩｎｖｉＴｒａｐ  ＲＮＡ細胞ＨＴＳ  ９６キット（Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＃７０６１３００４００）を用いてＲＮＡを単離して、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ逆転写キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ＃４３６８８１３）を使用して逆転写した。ＤｒｅａｍＴａｑＴＭ  ＰＣＲマスターミックス（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ＃Ｋ１０７２）を使用してＰＣＲ反応を実施した。表２のプロトコルを使用して、スキッピングされたおよびスキッピングされていない分子を増幅するために、一次ＰＣＲは、エクソン２０（Ｅｘ２０Ｆ  ５’−ＣＡＧＡＡＴＴＣＴＧＣＣＡＡＴＴＧＣＴＧＡＧ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）およびエクソン２６（Ｅｘ２６Ｒ  ５’−ＴＴＣＴＴＣＡＧＣＴＴＧＴＧＴＣＡＴＣＣ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１）においてプライマーを使用した。
【０３２６】
【表２】
2020505330.tif 000029
【０３２７】
ネステッドＰＣＲについては、一次ＰＣＲ反応を水で１００Ｘに希釈し、ネストＰＣＲ反応に５μｌが使用された（５０μｌ総反応量）。表３のプロトコルを使用して、スキッピングされたおよびスキッピングされていない分子を増幅するために、ネステッドＰＣＲは、エクソン２０（Ｅｘ２０Ｆ２：  ５’−  ＡＣＣＣＡＧＴＣＴＡＣＣＡＣＣＣＴＡＴＣ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２）およびエクソン２５（Ｅｘ２５Ｒ：  ５’−  ＣＴＣＴＴＴＡＴＣＴＴＣＴＧＣＣＣＡＣＣＴＴ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３）中のプライマーを使用した。
【０３２８】
【表３】
2020505330.tif 000030
【０３２９】
ＰＣＲ反応は、４％のＴＡＥアガロースゲルを使用して分析された。野生型の（ＷＴ）ＤＭＤ生成物は、予想されたサイズの７８８の塩基対と５７５の塩基対のスキッピングされたＤＭＤΔ２３を有していた。
【０３３０】
動物
【０３３１】
動物研究は、「Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ」と同様にＵＳＤＡ  Ａｎｉｍａｌ  Ｗｅｌｆａｒｅ  Ａｃｔ  で概説された規則を厳守する、Ｅｘｐｌｏｒａ  ＢｉｏＬａｂｓのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）に基づくプロトコルに従って行われた。マウスはすべてＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓまたはＨａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのいずれかから入手した。
【０３３２】
インビボのマウスモデル
【０３３３】
ＷＴ  ＣＤ−１マウス（４−６週齢）に、指示されたアンチセンス抱合体（ＡＳＣ）および投与量で静脈内（ｉｖ）注射によって投薬した。「ネイキッド」ＰＭＯあるいはＡＳＯを、指示された投与量で筋肉内注射によって投薬した。４、７、あるいは１４日後、心臓と腓腹筋の組織を採取して液体窒素で急速凍結した。ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ  ａｎｄ  ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  ９６  Ｋｉｔ  （Ｑｉａｇｅｎ，  ＃７４１９２）で単離し、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ＃４３６８８１３）を用いて逆転写した。ネステッドＰＣＲ反応を記載されるように実施した。ＰＣＲ反応を、デンシトメトリーによって定量化された４％（あるいは１％）のＴＡＥアガロースゲル中で分析した。
【０３３４】
処置されたマウスにおけるエクソン２３スキッピングを確認するために、ＤＮＡフラグメントを４％のアガロースゲルから単離して配列決定した。
【０３３５】
スキッピングされたＤＭＤ  ｍＲＮＡのコピー数を定量的に決定するために、ｑＰＣＲプライマー／プローブセットは、スキッピングされたおよびＷＴ  ＤＭＤ  ｍＲＮＡ（図３）を定量化するために設計された。ｑＰＣＲ定量化標準が設計され、表４で見られるような設計されたＰＣＲプライマーを使用して、ＰＣＲで生成された。ＷＴとＤＭＤのためのｑＰＣＲ標準については、ＰＣＲの後で、７３３の塩基対フラグメントをアガロースゲルから単離した。スキッピングされたＤＭＡのｑＰＣＲ標準については、ネステッドプライマーは使用された。
【０３３６】
ｑＰＣＲプライマー／プローブの増幅効率は、予想される効率の１０％以内にあると判定された。ｑＰＣＲ反応は、メーカーの説明書に従って、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  ７およびＴａｑｍａｎ（商標）ＰＣＲ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ  ＩＩ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ＃４４４００４１）で実施された。
【０３３７】
【表４】
2020505330.tif 000031
【０３３８】
実施例３：抱合体合成
【０３３９】
分析および精製方法
【０３４０】
分析および精製方法は表５−１１に従って行われた。
【０３４１】
【表５】
2020505330.tif 000032
【０３４２】
【表６】
2020505330.tif 000033
【０３４３】
【表７】
2020505330.tif 000034
【０３４４】
【表８】
2020505330.tif 000035
【０３４５】
【表９】
2020505330.tif 000036
【０３４６】
【表１０】
2020505330.tif 000037
【０３４７】
【表１１】
2020505330.tif 000038
【０３４８】
抗トランスフェリン受容体抗体
【０３４９】
使用された抗マウストランスフェリン受容体抗体あるいは抗ＣＤ７１  ｍＡｂは、マウスＣＤ７１またはマウストランスフェリン受容体１（ｍＴｆＲ１）に結合するラットＩｇＧ２ａサブクラスモノクローナル抗体であった。抗体はＢｉｏＸｃｅｌｌによって産生され、市販で入手可能である（カタログ＃  ＢＥ０１７５）。
【０３５０】
抗ＣＤ７１抗体モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチド抱合体（抗ＣＤ７１  ｍＡｂ−ＰＭＯ）
【０３５１】
抗ＣＤ７１  ｍＡｂ−ＰＭＯ抱合体
【０３５２】
ホウ酸塩緩衝液（２５ｍＭの四ホウ酸ナトリウム、２５ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのジエチレントリアミンペンタ酢酸、ｐＨ８．０）中の抗ＣＤ７１抗体（１０ｍｇ／ｍＬ）は、水中に４当量のトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を加え、および４時間３７°Ｃでインキュベートすることによって、還元された。１時間ＤＭＳＯ中の１０当量のＳＭＣＣ（１０ｍｇ／ｍＬ）を用いてＤＭＳＯ中のＰＭＯ（５０ｍｇ／ｍＬ）をインキュベートすることにより、４（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＭＣＣ）を、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）の３’末端で一級アミンに結合させた。非共役ＳＭＣＣは、３ｋＤａのＭＷＣＯを有するＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５遠心濾過機ユニットを使用して、限外濾過により除去された。ＰＭＯ−ＳＭＣＣは、緩衝酢酸溶液（１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０）を用いて３回洗浄され、すぐに使用された。還元された抗体を、２．２５当量のＰＭＯ−ＳＭＣＣと混合し、４°Ｃで夜通しインキュベートした。その後、反応混合物のｐＨを７．５まで減らし、８当量のＮ−エチルマレイミドを３０分間室温で混合物に加えて、未反応のシステインをクエンチした。疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）方法２による反応混合物の分析は、未反応の抗体およびＰＭＯと共に抗体−ＰＭＯ抱合体を示した（図４）。図４は、ＨＩＣ方法２で産生された抗ＣＤ７１  ｍＡｂ−ＰＭＯ反応混合物のクロマトグラムを示しており、遊離抗体ピーク（１）、遊離ＰＭＯ（２）、ＤＡＲ  １（３）、ＤＡＲ  ２（４）、ＤＡＲ  ３（５）、ＤＡＲ＞３（６）を示している。「ＤＡＲ」は薬物対抗体の比率を指す。括弧中の数はクロマトグラム中のピークを指す。
【０３５３】
精製
【０３５４】
反応混合物はＨＩＣ方法１を使用して、ＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  ＦＰＬＣで精製された。１（ＤＡＲ１）と２（ＤＡＲ２）の薬物対抗体の比率の抱合体を含む画分が組み合わされ、２よりも大きいＤＡＲを有する抱合体とは別に、５０ｋＤａのＭＷＣＯを用いるＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ１５遠心濾過機ユニットで濃縮された。濃縮抱合体を、分析の前にＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ１５遠心濾過機ユニットを使用して、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）と緩衝液交換した。
【０３５５】
精製された抱合体の分析
【０３５６】
単離させた抱合体を、立体排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）およびＨＩＣで特徴づけた。ポリマー量の凝集塊と未共役ＰＭＯ（図５Ａ−５Ｃ）が存在しないことを確認するために、ＳＥＣ方法１を用いた。図５Ａは、ＳＥＣ方法１を使用して産生された抗ＣＤ７１  ｍＡｂのクロマトグラムを示す。図５Ｂは、ＳＥＣ方法１を使用して産生された抗ＣＤ７１  ｍＡｂ−ＰＭＯ  ＤＡＲ  １および２のクロマトグラムを示す。図５Ｃは、ＳＥＣ方法１を使用して産生された２以上の抗ＣＤ７１  ｍＡｂ−ＰＭＯ  ＤＡＲのクロマトグラムを示す。「ＤＡＲ」は薬物対抗体の比率を指す。
【０３５７】
抱合体の純度はＨＩＣ方法２を使用して分析的ＨＰＬＣによって評価された（図６Ａ−６Ｃ）。図６Ａは、ＨＩＣ方法２を使用して産生された抗ＣＤ７１  ｍＡｂのクロマトグラムを示す。図６Ｂは、ＨＩＣ方法２を使用して産生された抗ＣＤ７１  ｍＡｂ−ＰＭＯ  ＤＡＲ  １および２抱合体のクロマトグラムを示す。図６Ｃは、ＨＩＣ方法２を使用して産生された抗ＣＤ７１  ｍＡｂ−ＰＭＯ  ＤＡＲ＞２抱合体のクロマトグラムを示す。各サンプルの２６０／２８０ｎｍ  ＵＶ吸光度比率は、ＤＡＲを確認するためにＰＭＯと抗体の既知の比率の標準曲線と比較された。ＤＡＲ  １と２のサンプルは〜１．６の平均ＤＡＲを有していたが、その一方で２を超えるサンプルのＤＡＲは〜３．７の平均ＤＡＲを有していた。「ＤＡＲ」は薬物対抗体の比率を指す。
【０３５８】
抗ＣＤ７１Ｆａｂモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチド抱合体（抗ＣＤ７１  Ｆａｂ−ＰＭＯ）
【０３５９】
ペプシンによる抗体消化
【０３６０】
２０ｍＭの緩衝酢酸溶液（ｐＨ４．０）中の抗ＣＤ７１抗体（５ｍｇ／ｍＬ）は、３７°Ｃで３時間、固定されたペプシンを用いてインキュベートされた。樹脂を取り除き、反応混合物は、３０ｋＤａのＭＷＣＯのＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ１５遠心濾過機ユニットを使用して、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄された。残余分を集めて、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）方法２を使用して精製し、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを単離した。
【０３６１】
抗ＣＤ７１（Ｆａｂ）−ＰＭＯ抱合体
【０３６２】
ホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）中のＦ（ａｂ’）２フラグメント（１５ｍｇ／ｍＬ）は、水中に１０当量のＴＣＥＰを加え、２時間３７°Ｃでインキュベートすることにより還元された。ＳＭＣＣは、１時間ＤＭＳＯ中の１０当量のＳＭＣＣ（１０ｍｇ／ｍＬ）を用いてＤＭＳＯ中のＰＭＯ（５０ｍｇ／ｍＬ）をインキュベートすることにより、ＰＭＯの３’末端の一級アミンに加えた。非共役ＳＭＣＣは、３ｋＤａのＭＷＣＯを有するＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５遠心濾過機ユニットを使用して、限外濾過により除去された。ＰＭＯ−ＳＭＣＣを、緩衝酢酸溶液（ｐＨ６．０）で３回洗浄してすぐに使用した。還元されたＦ（ａｂ’）フラグメント（Ｆａｂ）を、１０ｋＤａのＭＷＣＯのＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ１５遠心濾過機ユニットを使用して、ホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）へ緩衝液交換し、１．７５当量のＰＭＯ−ＳＭＣＣを加え、４°Ｃで夜通しインキュベートした。その後、反応混合物のｐＨを７．５まで減らし、６当量のＮ−エチルマレイミドを３０分間室温で混合物に加えて、未反応のシステインをクエンチした。疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）方法３による反応混合物の分析は、未反応のＦａｂとともに抗ＣＤ７１（Ｆａｂ）−ＰＭＯ抱合体を示した（図１４ａ）。図７Ａは、ＨＩＣ方法３を使用して抗ＣＤ７１  Ｆａｂ−ＰＭＯのＦＰＬＣ精製のクロマトグラムを示す。
【０３６３】
精製
【０３６４】
反応混合物はＨＩＣ方法３を使用して、ＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  ＦＰＬＣで精製された。１、２、および３のＤＡＲの抱合体を含む画分を組み合わせ、別々に濃縮した。濃縮抱合体を、分析の前に１０ｋＤａのＭＷＣＯのＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ１５遠心濾過機ユニットを使用して、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）と緩衝液交換した。
【０３６５】
精製された抱合体の分析
【０３６６】
単離させた抱合体をＳＥＣとＨＩＣで特徴づけた。ＳＥＣ方法１は、ポリマー量凝集塊と未共役ＰＭＯが存在しないことを確認するために使用された。図７Ｂ−図７Ｅを参照する。図７Ｂは、ＳＥＣ方法１を使用して産生された抗ＣＤ７１  Ｆａｂのクロマトグラムを示す。図７Ｃは、ＳＥＣ方法１を使用して産生された抗ＣＤ７１  Ｆａｂ−ＰＭＯ  ＤＡＲ１抱合体のクロマトグラムを示す。図７Ｄは、ＳＥＣ方法１を使用して産生された抗ＣＤ７１  Ｆａｂ−ＰＭＯ  ＤＡＲ２抱合体のクロマトグラムを示す。図７Ｅは、ＳＥＣ方法１を使用して産生された抗ＣＤ７１  Ｆａｂ−ＰＭＯ  ＤＡＲ３抱合体のクロマトグラムを示す。抱合体の純度を、ＨＩＣ方法４を使用して分析的ＨＰＬＣによって評価した。図７Ｆ−図７Ｉを参照。図７Ｆは、ＨＩＣ方法４を使用して産生された抗ＣＤ７１  Ｆａｂのクロマトグラムを示す。図７Ｇは、ＨＩＣ方法４を使用して産生された抗ＣＤ７１  Ｆａｂ−ＰＭＯ  ＤＡＲ１抱合体のクロマトグラムを示す。図７Ｈは、ＨＩＣ方法４を使用して産生された抗ＣＤ７１  Ｆａｂ−ＰＭＯ  ＤＡＲ２抱合体のクロマトグラムを示す。図７Ｉは、ＨＩＣ方法４を使用して産生された抗ＣＤ７１  Ｆａｂ−ＰＭＯ  ＤＡＲ３抱合体のクロマトグラムを示す。「ＤＡＲ」は薬物対抗体の比率を指す。各サンプルの２６０／２８０ｎｍ  ＵＶ吸光度比率は、ＤＡＲを確認するためにＰＭＯとＦａｂの既知の比率の標準曲線と比較された。
【０３６７】
抗ＣＤ７１抗体ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド抱合体（抗ＣＤ７１  ｍＡｂ−ＰＳ  ＡＳＯ）
【０３６８】
抗ＣＤ７１  ｍＡｂ−ＰＳ  ＡＳＯ
【０３６９】
ホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）中の抗ＣＤ７１（１０ｍｇ／ｍＬ）は、水中に４当量のＴＣＥＰを加え、４時間３７°Ｃでインキュベートすることにより還元された。１時間ＤＭＳＯ中に１０当量のＳＭＣＣ（１０ｍｇ／ｍＬ）を有する２５０ｍＭのＰＢ（ｐＨ７．５）およびＤＭＳＯの１：１混合物においてＰＳ  ＡＳＯ（５０ｍｇ／ｍＬ）をインキュベートすることにより、４（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＭＣＣ）を、ＰＳ−ＡＳＯの５’末端の一級アミンに添加した。非共役ＳＭＣＣは、３ｋＤａのＭＷＣＯを有するＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５遠心濾過機ユニットを使用して、限外濾過により除去された。ＰＳ  ＡＳＯ−ＳＭＣＣを、緩衝酢酸溶液（ｐＨ６．０）で３回洗浄してすぐに使用した。還元された抗体を、１．７当量のＰＳ  ＡＳＯ−ＳＭＣＣと混合し、４°Ｃで夜通しインキュベートした。その後、反応混合物のｐＨを７．４まで減らし、８当量のＮ−エチルマレイミドを３０分間室温で混合物に加えて、未反応のシステインをクエンチした。強力な陰イオン交換クロマトグラフィー（ＳＡＸ）方法２による反応混合物の分析は、未反応の抗体およびＡＳＯと共に抗体−ＰＳ  ＡＳＯ抱合体を示した（図８Ａ）。図８Ａは、ＳＡＸ方法２で産生された抗ＣＤ７１  ｍＡｂ−ＰＳ  ＡＳＯ反応混合物のクロマトグラムを示しており、遊離抗体ピーク（１）、遊離ＰＳ  ＡＳＯ（５）、ＤＡＲ  １（２）、ＤＡＲ  ２（３）、ＤＡＲ＞２（４）を示している。「ＤＡＲ」は薬物対抗体の比率を指す。括弧中の数はピークを指す。
【０３７０】
精製
【０３７１】
反応混合物は、ＳＡＸ方法１を使用して、ＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  ＦＰＬＣで精製された。１、２、および３の薬物対抗体比率（ＤＡＲ）の抱合体を含む画分を組み合わせ、別々に濃縮し、分析の前に５０ｋＤａのＭＷＣＯのＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ１５遠心濾過機ユニットを使用して、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で緩衝液交換した。
【０３７２】
精製された抱合体の分析
【０３７３】
単離させた抱合体を、立体排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）およびＳＡＸで特徴づけた。サイズ排除クロマトグラフィー方法１は、ポリマー量凝集塊と未共役ＡＳＯが存在しないことを確認するために使用された。図８Ｂ−図８Ｅを参照する。図８Ｂは、ＳＥＣ方法１を使用して産生された抗ＣＤ７１  ｍＡｂのクロマトグラムを示す。図８Ｃは、ＳＥＣ方法１を使用して産生された抗ＣＤ７１  ｍＡｂ−ＰＳ  ＡＳＯ  ＤＡＲ１抱合体のクロマトグラムを示す。図８Ｄは、ＳＥＣ方法１を使用して産生された抗ＣＤ７１  ｍＡｂ−ＰＳ  ＡＳＯ  ＤＡＲ２抱合体のクロマトグラムを示す。図８Ｅは、ＳＥＣ方法１を使用して産生された抗ＣＤ７１  ｍＡｂ−ＰＳ  ＡＳＯ  ＤＡＲ３抱合体のクロマトグラムを示す。抱合体の純度を、ＳＡＸ方法２を使用して分析的ＨＰＬＣによって評価した。図８Ｆ−図８Ｈを参照する。図８Ｆは、ＳＡＸ方法２を使用して産生された抗ＣＤ７１  ｍＡｂ−ＰＳ  ＡＳＯ  ＤＡＲ１抱合体のクロマトグラムを示す。図８Ｇは、ＳＡＸ方法２を使用して産生された抗ＣＤ７１  ｍＡｂ−ＰＳ  ＡＳＯ  ＤＡＲ２抱合体のクロマトグラムを示す。図８Ｈは、ＳＡＸ方法２を使用して産生された抗ＣＤ７１  ｍＡｂ−ＰＳ  ＡＳＯ  ＤＡＲ３抱合体のクロマトグラムを示す。各サンプルの２６０／２８０ｎｍ  ＵＶ吸光度比率は、薬物対抗体比率（ＤＡＲ）を確認するためにＡＳＯと抗体の既知の比率の標準曲線と比較された。
【０３７４】
実施例４：抗ＣＤ７１  ｍＡｂ−ＰＭＯ抱合体のインビトロ活性
【０３７５】
実施例３に記載されるように、抗ＣＤ７１  ｍＡｂ−ＰＭＯ抱合体は作られ、特徴づけられた。抱合体は、実施例２に類似する方法を使用するネステッドＰＣＲを利用して、分化したＣ２Ｃ１２細胞においてインビトロのエクソンスキッピングを媒介する能力について評価された。簡潔に言えば、「ネイキッド」モルホリノＡＳＯ（「ＰＭＯ」）の効能は、関連するビヒクル対照を有する複数の濃度の抗ＣＤ７１  ｍＡｂ−ＰＭＯ抱合体と比較された。対照はビヒクル（「Ｖｅｈ」）、５０ｕＭのスクランブル・モルホリノ（「Ｓｃｒ５０」）を含んでおり、抗体（「Ｎｅｇ−Ａｂ」）は含んでいなかった。使用されたＰＭＯの濃度は、５０ｕＭ、１ｕＭ、および０．０２ｕＭを含んでいた。使用された抗ＣＤ７１  ｍＡＢ−ＰＭＯ  ＤＡＲ  １および２の濃度は、２００ｎＭ、２０ｎＭ、および２ｎＭを含んでいた。「ＤＡＲ」は薬物対抗体の比率を指す。
【０３７６】
ｃＤＮＡ合成の後で、２回のＰＣＲ増幅（一次ＰＣＲおよびネステッドＰＣＲ）がエクソンスキッピングを検知するために使用された。ＰＣＲ反応は４％のＴＡＥアガロースゲル中で分析された（図９）。
【０３７７】
図９を参照すると、抗ＣＤ７１  ｍＡｂ−ＰＭＯ抱合体は、分化したＣ２Ｃ１２細胞で、および「ネイキッド」ＰＭＯ対照よりも低い濃度で、測定可能なエクソン２３スキッピングをもたらした。野生型の生成物は、予想されたサイズの７８８の塩基対と５７５の塩基対のスキッピングされたＤＭＤΔ２３を有していた。
【０３７８】
別の実験は抗ＣＤ７１Ｆａｂ−ＰＭＯ抱合体と、および陰性対照として抗ＥＧＦＲ（「Ｚ−ＰＭＯ」）で標的化されたＰＭＯを含んでいた（図１０）。使用されたＰＭＯの濃度は、１０ｕＭと２ｕＭを含んでいた。使用された抗ＣＤ７１ｍＡｂ−ＰＭＯの濃度は０．２ｕＭと０．０４ｕＭを含んでいた。抗ＣＤ７１ｍＡｂ−ＰＭＯは２のＤＡＲを有していた。Ｚ−ＰＭＯは０．２ｕＭの濃度で使用され、２のＤＡＲを有していた。抗ＣＤ７１Ｆａｂ−ＰＭＯの濃度は０．６ｕＭと０．１２ｕＭを含んでいた。０．６ｕＭおよび０．１２ｕＭの抗ＣＤ７１  ｍＡｂ−ＰＭＯのための１、２、および、３のＤＡＲが分析された。
【０３７９】
図１０を参照すると、トランスフェリン受容体、抗ＣＤ７１  ｍＡｂ−ＰＭＯ、および抗ＣＤ７１  Ｆａｂ−ＰＭＯ抱合体を利用する受容体を媒介とする取り込みは、Ｃ２Ｃ１２細胞で、かつ、「ネイキッド」ＰＭＯ対照よりも低い濃度で測定可能なエクソン２３スキッピングをもたらした。抗ＣＤ７１抱合体からのスキッピングをもたらした試験された濃度でＺ−ＰＭＯから測定可能なエクソン２３スキッピングはなかった。
【０３８０】
実施例５：抗−ＣＤ７１−ＡＳＯ  ｍＡｂ  ＰＳ抱合体のインビトロ活性
【０３８１】
実施例３に記載されるように、抗ＣＤ７１  ｍＡｂ−ＰＳ  ＡＳＯ抱合体は作られ特徴づけられた。抱合体は、実施例２に記載されるような類似する方法を使用するネステッドＰＣＲを利用して、分化したＣ２Ｃ１２細胞においてインビトロのエクソンスキッピングを媒介する能力について評価された。簡潔に言えば、「ネイキッド」ホスホロチオエートＡＳＯ（ＰＳ  ＡＳＯ）の効能は、関連するビヒクル対照を有する複数の濃度の抗ＣＤ７１  ｍＡｂ−ＰＳ  ＡＳＯ抱合体と比較された。２回のＰＣＲ増幅（一次ＰＣＲとネステッドＰＣＲ）は、エクソンスキッピングを検知するためにｃＤＮＡ合成の後で実施された。ＰＣＲ反応は４％のＴＡＥアガロースゲル中で分析された（図１１）。図１１は、ＰＭＯ、ＡＳＯ、ＤＡＲ１の共役した抗ＣＤ７１  ｍＡｂ−ＡＳＯ（「ＡＳＣ−ＤＡＲ１」）、ＤＡＲ２の共役した抗ＣＤ７１  ｍＡｂ−ＡＳＯ（「ＡＳＣ−ＤＡＲ２」）、および、ＤＡＲ３の共役した抗ＣＤ７１  ｍＡｂ−ＡＳＯ（「ＡＳＣ−ＤＡＲ３」）のアガロースゲルを示す。「ＰＭＯ」および「ＡＳＯ」は（抗体に共役していない）遊離ＰＭＯおよびＡＳＯを指す。「Ｖｅｈ」はビヒクルのみを指す。試験された濃度は０．２、１、および５マイクロモル（μＭ）を含んでいた。
【０３８２】
図１１を参照すると、抗ＣＤ７１  ｍＡｂ−ＰＳ  ＡＳＯ抱合体は、分化したＣ２Ｃ１２細胞で、および「ネイキッド」ＰＳ  ＡＳＯ対照よりも低い濃度で、測定可能なエクソン２３スキッピングをもたらした。野生型の生成物は、予想されたサイズの７８８の塩基対と５７５の塩基対のスキッピングされたＤＭＤΔ２３を有していた。
【０３８３】
実施例６：抗ＣＤ７１  ｍＡｂ−ＰＭＯ抱合体のインビボ活性
【０３８４】
実施例３に記載されるように、抗ＣＤ７１  ｍＡｂ−ＰＭＯ抱合体は作られ、特徴づけられた。抱合体抗ＣＤ７１  ｍＡｂ−ＰＭＯ  ＤＡＲ１、２  抗ＣＤ７１とｍＡｂ−ＰＭＯ  ＤＡＲ＞２は、実施例２に記載されるような類似する方法を用いて、野生型のＣＤ−１マウスにおいてインビボのエクソンスキッピングを媒介するその能力について評価された。「ＤＡＲ」は薬物対抗体の比率を指す。
【０３８５】
表１２で提供されるような投与量で静脈内（ｉｖ）注射によって、ｍＡｂ、ビヒクル対照、およびアンチセンス抱合体（ＡＳＣ）をマウスに投与した。「ＤＡＲ」は薬物対抗体の比率を指す。「ネイキッド」ＰＭＯは、表１２に提供される投与量で腓腹筋へ筋肉内注射によって投与された。４、７、あるいは１４日後、心臓と腓腹筋の組織を採取して液体窒素で急速凍結した。ＲＮＡを単離し、逆転写し、ネステッドＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応を４％のＴＡＥアガロースゲル中で分析し、デンシトメトリーによって定量化した。
【０３８６】
【表１２】
2020505330.tif 000039
【０３８７】
図１２Ａは、４、７、あるいは１４日間、抗ＣＤ７１  ｍＡｂ−ＰＭＯ  ＤＡＲ  １、２、抗ＣＤ７１  ｍＡｂ−ＰＭＯ  ＤＡＲ＞２、抗ＣＤ７１  ｍＡｂ、ＰＭＯ、およびビヒクルビヒクルを投与されたマウスの腓腹筋サンプルのゲル電気泳動を示す。野生型の生成物は、予想されたサイズの７８８の塩基対と５７５の塩基対のスキッピングされたＤＭＤΔ２３を有していた。抗ＣＤ７１  ｍＡｂ−ＰＭＯ  ＤＡＲ  １、２、および抗ＣＤ７１  ｍＡｂ−ＰＭＯ  ＤＡＲ＞は、腓腹筋において、かつ、「ネイキッド」ＰＭＯ対照よりも低い濃度で、測定可能なエクソン２３スキッピングをもたらした。ゲル（図１２Ａ）上のバンドの強度は、図１２Ｂで見られるようなデンシトメトリーによって定量化された。図１２Ｃは、Ｔａｑｍａｎ  ｑＰＣＲを使用して、野生型のマウス腓腹筋におけるインビボのエクソンスキッピングの定量化を示す。
【０３８８】
図１３Ａは、４、７、あるいは１４日間、抗ＣＤ７１  ｍＡｂ−ＰＭＯ  ＤＡＲ  １、２、抗ＣＤ７１  ｍＡｂ−ＰＭＯ  ＤＡＲ＞２、抗ＣＤ７１  ｍＡｂ、ＰＭＯ、およびビヒクルビヒクルを投与されたマウスの心臓サンプルのゲル電気泳動を示す。野生型の生成物は、予想されたサイズの７８８の塩基対と５７５の塩基対のスキッピングされたＤＭＤΔ２３を有していた。ゲル（図１３Ａ）上のバンドの強度は、図１３Ｂで見られるようなデンシトメトリーによって定量化された。腓腹筋サンプルを用いても同様の結果が得られた。抗ＣＤ７１  ｍＡｂ−ＰＭＯ  ＤＡＲ  １、２、および抗ＣＤ７１  ｍＡｂ−ＰＭＯ  ＤＡＲ＞は、腓腹筋において、かつ、「ネイキッド」ＰＭＯ対照よりも低い濃度で、測定可能なエクソン２３スキッピングをもたらした。
【０３８９】
その後、ＤＮＡフラグメントを、４％のアガロースゲルから単離して、配列決定した。配列決定データは、図１４で見られるようなスキッピングされた野生型の生成物における適切な配列を確認した。
【０３９０】
実施例７．アンチセンスオリゴヌクレオチド配列および合成
【０３９１】
表１３の配列は様々な遺伝子中の様々なエクソンを標的として作られた。
【０３９２】
【表１３】
2020505330.tif 000040
【０３９３】
実施例８．複数の組織中のＣＤ７１  ｍＡｂ−ＰＭＯ抱合体のインビボ活性
【０３９４】
実施例３に記載されるように、ＣＤ７１  ｍＡｂ−ＰＭＯ抱合体は作られ、特徴づけられた。抱合体（ＤＡＲ３＋）は、野生型ＣＤ−１マウスにおいてインビボのエクソンスキッピングを媒介するその能力について評価された。実験の完全な詳細については実施例２を参照すること。簡潔に言えば、マウスに、静脈内（ｉｖ）注射によってビヒクル対照を指示された投与量で指示されたＡＳＣ投与した。図７Ａを参照すること。７、１４、あるいは２８日後、横隔膜、心臓、および腓腹筋の組織を採取して液体窒素で急速凍結した。ＲＮＡを単離し、逆転写し、適切なプライマー／プローブセットを使用して、実施例２に記載されるように、リアルタイムｑＰＣＲおよびネステッドＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、１％のＴＡＥアガロースゲル中で分析された。
【０３９５】
野生型マウス中のエクソン２３スキッピングを媒介するＣＤ７１  ｍＡｂ−ＰＭＯ抱合体の能力を評価するためのインビボの試験デザインが表１４で示されている。
【０３９６】
【表１４】
2020505330.tif 000041
【０３９７】
図１５Ａ、図１５Ｃ、および図１５Ｅを参照すると、インビボのエクソンスキッピングは、Ｔａｑｍａｎ  ｑＰＣＲを使用して、腓腹筋（図１５Ａ）、横隔膜（図１５Ｃ）、および心臓筋（図１５Ｅ）において野生型マウスで測定された。図１５Ｂ、図１５Ｄ、および図１５Ｆを参照すると、ＣＤ７１  ｍＡｂ−ＰＭＯ抱合体は、ネステッドＰＣＲを使用して、腓腹筋（図１５Ｂ）、横隔膜（図１５Ｄ）、および心臓筋（図１５Ｆ）中で測定可能なエクソン２３スキッピングをもたらした。野生型の生成物は、７８８ｂｐの予想されるサイズを有しており、スキッピングされたＤＭＤΔ２３は、５７５ｂｐのサイズを有していた。ゲル上のバンドの強度はデンシトメトリーによって定量化され、データは野生型のジストロフィンと比較して、スキッピングされた生成物の％として提示される。
【０３９８】
実施例９．マウスＭＳＴＮに対するＣＤ７１  ｍＡｂ−ＰＭＯ抱合体のインビボ活性
【０３９９】
実施例３に記載されるように、マウスミオスタチン（５’ＡＧＣＣＣＡＴＣＴＴＣＴＣＣＴＧＧＴＣＣＴＧＧＧＡＡＧＧ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）のエクソン２を標的とするＣＤ７１  ｍＡｂ−ＰＭＯ抱合体が作られ、特徴づけられた。抱合体（ＤＡＲ１／２およびＤＡＲ３＋）は、実施例２に記載されるような類似の方法を使用して、野生型ＣＤ−１マウスにおけるインビボのエクソンスキッピングを媒介するその能力について評価された。簡潔に言えば、マウスに、静脈内（ｉｖ）注射によって、ｍＡｂ、ビヒクル対照、および、指示されたＡＳＣを、表１５で見られるような指示された投与量で投与した。
【０４００】
【表１５】
2020505330.tif 000042
【０４０１】
７、１４、あるいは２８日後、横隔膜、心臓、および腓腹筋の組織を採取して液体窒素で急速凍結した。ＲＮＡを単離して逆転写した。ＰＣＲ反応は、フォワードプライマー（ｍＭＳＴＮ−Ｆ１：５’ＣＣＴＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＣＣＴＡＡＣＡＴＣ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０）およびリバースプライマー（ｍＭＳＴＮ−Ｒ１：５’ＣＡＧＴＣＡＡＧＣＣＣＡＡＡＧＴＣＴＣＴＣ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１）を用いて行われた（ホットスタート：２分間９５°Ｃ、４５秒間９５°Ｃでの変性、３０秒間５６°Ｃでプライマーのアニーリング、３５サイクルで４０秒間７２°Ｃでのプライマー伸長）。ＰＣＲ反応は、図１６Ａ−１６Ｃで見られるような１％のＴＡＥアガロースゲル中で分析された。ＣＤ７１  ｍＡｂ−ＰＭＯ抱合体は、マウス横隔膜（図１６Ａ）、心臓（図１６Ｂ）、および腓腹筋（図１６Ｃ）筋組織中で測定可能なエクソン２スキッピングをもたらした。野生型の生成物は、６２２ｂｐの予想されるサイズ、および、２４８ｂｐのスキッピングされたＭＳＴＮΔ２を有していた。
【０４０２】
実施例１０．ＰＡＨ遺伝子に対するＡＳＧＰＲ  ｍＡｂ−ＰＭＯ抱合体のインビトロ活性
【０４０３】
実施例３に記載されるように、マウスＰＡＨのエクソン１１を標的とするＡＳＧＰＲ  ｍＡｂ−ＰＭＯ（５’ＡＴＣＣＴＣＴＴＴＧＧＴＡＡＣＣＴＣＡＣＣＴＣＡＣ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）抱合体が作られ特徴づけられた。抱合体は、ＰＣＲ（フォワードプライマー５’−ＣＴＡＧＴＧＣＣＣＴＴＧＴＴＴＴＣＡＧＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２）およびリバースプライマー５’−ＡＧＧＡＴＣＴＡＣＣＡＣＴＧＡＴＧＧＧＴ−３’）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３）を使用する初代マウス肝細胞においてインビトロのマウスＰＡＨ遺伝子中のエクソン１１スキッピングを媒介とするその能力について、評価された。簡潔に言えば、ＡＳＧＰＲ  ｍＡｂ−ＰＡＨ  ＰＭＯ抱合体の効能は、関連するビヒクル対照を有する、複数の濃度のＡＳＧＰＲ  ｍＡｂ−スクランブルＰＭＯと比較された。ＲＮＡｉＭＡＸも陽性対照として抱合体をトランスフェクトするために使用された。ＰＣＲ反応は、図１７で見られるような１％のＴＡＥアガロースゲル中で分析された。図１７のゲルから見られるように、ＡＳＧＰＲ  ｍＡｂ−ＰＭＯ抱合体は、ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクト対照に匹敵する測定可能なｅｘｏｎ１１スキッピングをもたらした。野生型の生成物は、７０３ｂｐの予想されるサイズ、および、５６９ｂｐのスキッピングされたＰＡＨΔ１１を有していた。
【０４０４】
実施例１１．ＡＳＧＰＲ  ｍＡｂ−ＰＭ抱合体のインビボ活性
【０４０５】
実施例３に記載されるように、マウスＰＡＨのエクソン１１を標的とするＡＳＧＰＲ  ｍＡｂ−ＰＭＯ（５’ＡＴＣＣＴＣＴＴＴＧＧＴＡＡＣＣＴＣＡＣＣＴＣＡＣ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）抱合体が作られ特徴づけられた。抱合体（ＤＡＲ１／２およびＤＡＲ３＋）は、実施例２に記載されるような方法を用いて、野生型ＣＤ−１マウスにおけるインビボのエクソンスキッピングを媒介するその能力について評価された。簡潔に言えば、マウスに、静脈内（ｉｖ）注射によって、ｍＡｂ、ビヒクル対照、および、指示されたＡＳＣを、表１６で見られるような指示された投与量で投与した。
【０４０６】
【表１６】
2020505330.tif 000043
【０４０７】
ＲＮＡを、採取した肝臓組織から単離し、逆転写した。フォワードプライマー５’−ＣＴＡＧＴＧＣＣＣＴＴＧＴＴＴＴＣＡＧＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２）およびリバースプライマー５’−ＡＧＧＡＴＣＴＡＣＣＡＣＴＧＡＴＧＧＧＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３）を使用するＰＣＲ反応は、図１８で見られるような１％のＴＡＥアガロースゲル中で分析された。図１８のゲルで見られるように、ＡＳＧＰＲ  ｍＡｂ−ＰＭＯ抱合体は、最大で２週間、マウス肝臓中の測定可能なエクソン１１スキッピングをもたらした。野生型の生成物は、７０３ｂｐの予想されるサイズ、および、５６９ｂｐのスキッピングされたＰＡＨΔ１１を有していた。
【０４０８】
実施例１２．配列
【０４０９】
表１７は、本明細書に記載されるような組成物および方法を使用して、ＤＭＤ遺伝子の挿入、欠失、重複、あるいは改質を誘発するための例示的な標的配列を説明する。表１８は、本明細書に記載されるような組成物および方法を使用して、ＤＭＤ遺伝子の挿入、欠失、重複、あるいは改質を誘発するための例示的なヌクレオチド配列を説明する。表１９および表２０は、遺伝子の挿入、欠失、重複、あるいは改質の誘発のためのいくつかの遺伝子中の例示的な標的配列を説明する。表２１は、本明細書に記載されるような組成物および方法を使用して、遺伝子の挿入、欠失、重複、あるいは改質を誘発するためにＤＭＤ遺伝子中の配列を含む例示的な配列を説明する。
【０４１０】
【表１７】
2020505330.tif 000044
【０４１１】
【表１８−１】
2020505330.tif 000045
【０４１２】
【表１８−２】
2020505330.tif 000046
【０４１３】
【表１８−３】
2020505330.tif 000047
【０４１４】
【表１８−４】
2020505330.tif 000048
【０４１５】
【表１８−５】
2020505330.tif 000049
【０４１６】
【表１９】
2020505330.tif 000050
【０４１７】
【表２０−１】
2020505330.tif 000051
【０４１８】
【表２０−２】
2020505330.tif 000052
【０４１９】
【表２１−１】
2020505330.tif 000053
【０４２０】
【表２１−２】
2020505330.tif 000054
【０４２１】
【表２１−３】
2020505330.tif 000055
【０４２２】
【表２１−４】
2020505330.tif 000056
【０４２３】
【表２１−５】
2020505330.tif 000057
【０４２４】
【表２１−６】
2020505330.tif 000058
【０４２５】
【表２１−７】
2020505330.tif 000059
【０４２６】
【表２１−８】
2020505330.tif 000060
【０４２７】
【表２１−９】
2020505330.tif 000061
【０４２８】
【表２１−１０】
2020505330.tif 000062
【０４２９】
【表２１−１１】
2020505330.tif 000063
【０４３０】
【表２１−１２】
2020505330.tif 000064
【０４３１】
【表２１−１３】
2020505330.tif 000065
【０４３２】
【表２１−１４】
2020505330.tif 000066
【０４３３】
【表２１−１５】
2020505330.tif 000067
【０４３４】
【表２１−１６】
2020505330.tif 000068
【０４３５】
【表２１−１７】
2020505330.tif 000069
【０４３６】
【表２１−１８】
2020505330.tif 000070
【０４３７】
【表２１−１９】
2020505330.tif 000071
【０４３８】
【表２１−２０】
2020505330.tif 000072
【０４３９】
【表２１−２１】
2020505330.tif 000073
【０４４０】
【表２１−２２】
2020505330.tif 000074
【０４４１】
【表２１−２３】
2020505330.tif 000075
【０４４２】
【表２１−２４】
2020505330.tif 000076
【０４４３】
【表２１−２５】
2020505330.tif 000077
【０４４４】
【表２１−２６】
2020505330.tif 000078
【０４４５】
工程１：マレイミド−ＰＥＧ−ＮＨＳによる、その後、ｓｉＲＮＡ−ＤＭＤ抱合体による抗体共役
【０４４６】
抗ジストロフィン抗体は１Ｘリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）と交換され、最大で５ｍｇ／ｍｌの濃度にされた。この溶液に、２当量のＳＭＣＣリンカーあるいはマレイミド−ＰＥＧｘｋＤａ−ＮＨＳ（ｘ＝１、５、１０、２０）を加え、室温で４時間回転させる。未反応のマレイミド−ＰＥＧを、５０ｋＤａ  ＭＷＣＯ  ＡｍｉｃｏｎスピンフィルターおよびＰＢＳ  ｐＨ７．４を使用する回転濾過によって除去した。抗体−ＰＥＧＭａｌ抱合体を集めて、反応容器に移した。様々なｓｉＲＮＡ抱合体が表１３−１７に列挙された配列を使用して合成される。ｓｉＲＮＡ−ＤＭＤ抱合体（２当量）をＰＢＳ中の抗体−ＰＥＧマレイミドへ室温で加え、夜通し回転させた。反応混合物を分析的ＳＡＸカラムクロマトグラフィーによって分析して、未反応の抗体およびｓｉＲＮＡと共に抱合体が見える。
【０４４７】
工程２：精製
【０４４８】
粗製反応混合物を、陰イオン交換クロマトグラフィーを使用するＡＫＴＡ  ｅｘｐｌｏｒｅｒ  ＦＰＬＣによって精製した。抗体−ＰＥＧ−ＤＭＤ抱合体を含む画分をプールし、濃縮し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）と緩衝液交換した。ＳＭＣＣリンカー、ＰＥＧ１ｋＤａ、ＰＥＧ５ｋＤａ、およびＰＥＧ１０ｋＤａを含む抗体ｓｉＲＮＡ抱合体を、ｓｉＲＮＡ負荷に基づいて分離される。
【０４４９】
工程３：精製された抱合体の分析
【０４５０】
単離させた抱合体を、質量スペクトルまたはＳＤＳ−ＰＡＧＥのいずれかによって特徴付けた。抱合体の純度を、陰イオン交換クロマトグラフィ−を使用して分析的ＨＰＬＣによって評価した。
【０４５１】
本明細書に記載される実施例と実施形態は説明の目的のためのものに過ぎず、当業者に示唆される様々な修飾や変化は、本明細書の精神と範囲、および添付の請求項の範囲内に含まれるものとする。
【図１】
2020505330.tif 000079
【図２Ａ】
2020505330.tif 000080
【図２Ｂ−１】
2020505330.tif 000081
【図２Ｂ−２】
2020505330.tif 000082
【図２Ｂ−３】
2020505330.tif 000083
【図２Ｂ−４】
2020505330.tif 000084
【図３】
2020505330.tif 000085
【図４】
2020505330.tif 000086
【図５Ａ】
2020505330.tif 000087
【図５Ｂ】
2020505330.tif 000088
【図５Ｃ】
2020505330.tif 000089
【図６Ａ】
2020505330.tif 000090
【図６Ｂ】
2020505330.tif 000091
【図６Ｃ】
2020505330.tif 000092
【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図７Ｈ】
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【図７Ｉ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
2020505330.tif 000103
【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図８Ｈ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１５Ｅ】
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【図１５Ｆ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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