(57)【要約】  ＳＩＲＰアルファ−４１ＢＢＬ融合タンパク質を提供する。したがって、ＳＩＲＰアルファと４１ＢＢＬとの間に１アミノ酸リンカーを含むＳＩＲＰアルファ−４１ＢＢＬ融合タンパク質を提供する。また、少なくともホモ三量体の形態のＳＩＲＰアルファ−４１ＢＢＬ融合タンパク質も提供する。また、ＳＩＲＰアルファ−４１ＢＢＬ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよび核酸構築物、ＳＩＲＰアルファ−４１ＢＢＬ融合タンパク質を発現する宿主細胞、ならびにその使用方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＩＲＰαと４１ＢＢＬとの間に１アミノ酸リンカーを含む、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質。
【請求項２】
少なくともホモ三量体の形態である、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質。
【請求項３】
前記少なくともホモ三量体のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定した分子量が少なくとも１４０ｋＤである、請求項２に記載のＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質。
【請求項４】
前記ＳＩＲＰαと前記４１ＢＢＬとの間にリンカーを含む、請求項２または３に記載のＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質。
【請求項５】
前記リンカーのアミノ酸長が１〜６である、請求項４に記載のＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質。
【請求項６】
前記リンカーが１アミノ酸リンカーである、請求項４に記載のＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質。
【請求項７】
前記リンカーが、抗体またはその断片のＦｃドメインではない、請求項４に記載のＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質。
【請求項８】
前記リンカーがグリシンである、請求項１、４、および６のいずれか一項に記載のＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質。
【請求項９】
可溶性である、請求項１〜８のいずれか一項に記載のＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質。
【請求項１０】
前記ＳＩＲＰαが、前記ＳＩＲＰαの細胞外ドメインまたはその機能的断片を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質。
【請求項１１】
前記４１ＢＢＬが、前記４１ＢＢＬの細胞外ドメインまたはその機能的断片を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質。
【請求項１２】
前記融合タンパク質が、
（ｉ）ＣＤ４７および４１ＢＢに結合すること、
（ｉｉ）前記４１ＢＢを発現する細胞において、前記４１ＢＢのシグナル伝達経路を活性化すること、
（ｉｉｉ）前記４１ＢＢを発現する免疫細胞を共刺激すること、および／または
（ｉｖ）食細胞による、前記ＣＤ４７を発現する病的細胞に対する食作用を、前記ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質の非存在下の食作用と比較して増進させること
のうちの少なくとも１つを実行可能である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質。
【請求項１３】
前記ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質。
【請求項１４】
前記ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号１のアミノ酸配列からなる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載のＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１６】
請求項１５に記載のポリヌクレオチドと、宿主細胞における前記ポリヌクレオチドを発現せしめる調節エレメントとを含む、核酸構築物。
【請求項１７】
前記ポリヌクレオチドが配列番号８の核酸配列を含む、請求項１５に記載のポリヌクレオチド、または請求項１６に記載の核酸構築物。
【請求項１８】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載のＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質、または請求項１５〜１７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドもしくは核酸構築物を含む、宿主細胞。
【請求項１９】
請求項１５〜１７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは核酸構築物を宿主細胞中で発現させることを含む、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質を作製する方法。
【請求項２０】
前記融合タンパク質を単離することを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞が、ＣＨＯ、ＰＥＲＣ．６、および２９３からなる群から選択される、請求項１８に記載の宿主細胞、または請求項１９もしくは２０に記載の方法。
【請求項２２】
がんの処置を必要とする対象に、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質を投与することを含む、がんを処置する方法。
【請求項２３】
免疫細胞の活性化による恩恵を受け得る疾患を処置する方法であって、疾患の処置を必要とする対象に、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドもしくは核酸構築物、または請求項１８もしくは２１に記載の宿主細胞を投与することを含む、方法。
【請求項２４】
免疫細胞の活性化による恩恵を受け得る疾患の処置のために特定された製品であって、前記疾患を処置するための治療剤をパッケージングするパッケージング材料と、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質をコードする核酸構築物、またはＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質を発現する宿主細胞とを含む、製品。
【請求項２５】
前記疾患が、過剰増殖性疾患を含む、請求項２３に記載の方法または請求項２４に記載の製品。
【請求項２６】
前記過剰増殖性疾患が、硬化症もしくは線維症、特発性肺線維症、乾癬、全身性硬化症／強皮症、原発性胆汁性胆管炎、原発性硬化性胆管炎、肝線維症、放射線誘発肺線維症の防止、骨髄線維症または後腹膜線維症を含む、請求項２５に記載の方法または製品。
【請求項２７】
前記過剰増殖性疾患が、がんを含む、請求項２５に記載の方法または製品。
【請求項２８】
がんの処置を必要とする対象に、抗がん剤と、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質をコードする核酸構築物、またはＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質を発現する宿主細胞とを投与することを含む、がんを処置する方法。
【請求項２９】
前記がんが、リンパ腫、白血病、結腸がん、膵がん、卵巣がん、肺がん、および扁平上皮癌からなる群から選択される、請求項２２および２７〜２８のいずれか一項に記載の方法または製品。
【請求項３０】
前記がんの細胞がＣＤ４７を発現する、請求項２２および２７〜２９のいずれか一項に記載の方法または製品。
【請求項３１】
前記疾患が、免疫抑制に関連する疾患または薬物誘導免疫抑制を含む、請求項２３に記載の方法または請求項２４に記載の製品。
【請求項３２】
前記疾患が、ＨＩＶ、麻疹、インフルエンザ、ＬＣＣＭ、ＲＳＶ、ヒトライノウイルス、ＥＢＶ、ＣＭＶ、またはパルボウイルスによるものを含む、請求項３１に記載の方法または製品。
【請求項３３】
前記疾患が、感染症を含む、請求項２３に記載の方法または請求項２４に記載の製品。
【請求項３４】
前記対象の罹患細胞がＣＤ４７を発現する、請求項２３〜２９および３１〜３３のいずれか一項に記載の方法または製品。
【請求項３５】
ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質およびＣＤ４７を発現する細胞の存在下において、Ｔ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化することを含む、Ｔ細胞を活性化する方法。
【請求項３６】
ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質およびＣＤ４７を発現する細胞の存在下において、食細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化することを含む、食細胞を活性化する方法。
【請求項３７】
ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質をコードする核酸構築物、またはＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質を発現する宿主細胞の存在下において、免疫細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化することを含む、免疫細胞を活性化する方法。
【請求項３８】
前記活性化することが、ＣＤ４７を発現する細胞または外因性ＣＤ４７の存在下で行われる、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＣＤ４７を発現する前記細胞が、病的細胞を含む、請求項３５〜３６および３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記病的細胞が、がん細胞を含む、請求項１２に記載のＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質または請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記がんが、リンパ腫、癌腫、および白血病からなる群から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記活性化を抗がん剤の存在下で行う、請求項３６〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記抗がん剤が抗体を含む、請求項２４もしくは２７に記載の製品、または請求項２８もしくは４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記抗体が、リツキシマブ、セツキシマブ、トラスツズマブ、エドレコロマブ、アレムツズマブ、ゲムツズマブ、イブリツモマブ、パニツムマブ、ベリムマブ、ベバシズマブ、ビバツズマブメルタンシン、ブリナツモマブ、ブロンツベトマブ、ブレンツキシマブベドチン、カツマキソマブ、シズツムマブ、ダクリズマブ、アダリムマブ、ベズロトクスマブ、セルトリズマブペゴール、シタツズマブボガトクス、ダラツムマブ、ジヌツキシマブ、エロツズマブ、エルツマキソマブ、エタラシズマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、ギレンツキシマブ、ネシツムマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、ペルツズマブ、ラムシルマブ、シルツキシマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、およびイピリムマブからなる群から選択される、請求項４３に記載の製品または方法。
【請求項４５】
前記抗体が、リツキシマブ、セツキシマブ、およびアレムツズマブからなる群から選択される、請求項４３に記載の製品または方法。
【請求項４６】
免疫細胞の養子移入を必要とする対象に対して、前記活性化の後の免疫細胞を養子移入することを含む、請求項３７〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記対象が、前記ＣＤ４７を発現する細胞に関連する疾患に罹患している、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質が、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質を含み、前記ポリヌクレオチドまたは前記核酸構築物が、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは核酸構築物を含み、前記宿主細胞が、請求項１８または２１に記載の宿主細胞を含む、請求項２３〜４７のいずれか一項に記載の方法または製品。
【請求項４９】
前記免疫細胞がＴ細胞を含む、請求項３７〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記免疫細胞が食細胞を含む、請求項３７〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
二重シグナル伝達タンパク質（ＤＳＰ）は、シグナル変換タンパク質（ＳＣＰ）としても公知であり、これらは現在、Ｉ型膜タンパク質の細胞外部分（細胞外アミノ末端）をＩＩ型膜タンパク質の細胞外部分（細胞外カルボキシル末端）に結合させた、２つの活性側面を有する融合タンパク質を形成する二機能性融合タンパク質として、当技術分野において公知である（例えば、米国特許第７，５６９，６６３号および同第８，０３９，４３７号を参照されたい。両特許は、本明細書に完全に記載のように、参照により本明細書に組み込まれている）。
【０００２】
ＳＩＲＰα（シグナル調節タンパク質アルファ）は、免疫グロブリンスーパーファミリーの細胞表面受容体である。ＳＩＲＰαは、マクロファージおよび樹状細胞（ＤＣ）のような食細胞系統の免疫細胞の表面で主に発現する。ＣＤ４７は、ＳＩＲＰαのリガンドである。ＣＤ４７は、免疫グロブリンスーパーファミリーの細胞表面分子である。ＣＤ４７は、食細胞の発現するＳＩＲＰαのライゲーションにより、食作用の阻害剤として機能する。ＣＤ４７は、正常組織の大部分で広く発現する。このように、ＣＤ４７は、「ｄｏｎ’ｔ  ｅａｔ  ｍｅシグナル」および自己のマーカーとして機能し、ＣＤ４７の喪失は、老齢細胞または損傷細胞の恒常的な食作用をもたらす。ＣＤ４７は、複数のヒト腫瘍型で発現することが分かっている。腫瘍は、ＣＤ４７を含む抗食作用性シグナルの発現を通して、マクロファージによる食作用を回避する。ＣＤ４７は正常細胞において低レベルで普遍的に発現するが、複数の腫瘍は、それらに対応する正常細胞と比較して、上昇したレベルのＣＤ４７を発現し、ＣＤ４７の過剰発現により食作用を回避することによって、腫瘍は自然免疫系のサーベイランスを逃れることが可能になった。
【０００３】
４−１ＢＢＬは、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーであり、強力な活性化誘導性のＴ細胞共刺激分子である４１ＢＢ受容体（ＣＤ１３７）の活性化リガンドである。４１ＢＢＬはホモ三量体を自然に形成するが、４−１ＢＢを介したシグナル伝達には４−１ＢＢＬの著しいオリゴマー化が必要である。４−１ＢＢＬは、樹状細胞（ＤＣ）、Ｂ細胞、およびマクロファージをはじめとする種々の抗原提示細胞（ＡＰＣ）に存在する。４−１ＢＢ受容体は、休止Ｔ細胞またはＴ細胞株では検出されない（＜３％）が、Ｔ細胞が活性化されると、４−１ＢＢは安定に上方制御される。４−１ＢＢの活性化は、生存遺伝子を上方制御し、細胞分裂を増進させ、サイトカイン生成を誘導し、Ｔ細胞の活性化誘導性細胞死を防止する。
【０００４】
さらなる背景技術は、
国際公開第２０１７／０５９１６８号、
国際公開第２００１／０４９３１８号、
国際公開第２０１６／１３９６６８号、
国際公開第２０１４／１０６８３９号、
国際公開第２０１２／０４２４８０号、
米国特許出願公開第２０１５０１８３８８１号明細書、
米国特許出願公開第２００７０１１０７４６号明細書、
米国特許出願公開第２００７００３６７８３号明細書、および
米国特許第９５６２０８７号を含む。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の一部の実施形態の態様によると、ＳＩＲＰαと４１ＢＢＬとの間に１アミノ酸リンカーを含むＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質を提供する。
【０００６】
本発明の一部の実施形態の態様によると、少なくともホモ三量体の形態である、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質を提供する。
【０００７】
本発明の一部の実施形態によると、少なくともホモ三量体のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定した分子量は、少なくとも１４０ｋＤである。
【０００８】
本発明の一部の実施形態によると、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質は、ＳＩＲＰαと４１ＢＢＬとの間にリンカーを含む。
【０００９】
本発明の一部の実施形態によると、リンカーのアミノ酸長は１〜６である。
【００１０】
本発明の一部の実施形態によると、リンカーは１アミノ酸リンカーである。
【００１１】
本発明の一部の実施形態によると、リンカーは、抗体またはその断片のＦｃドメインではない。
【００１２】
本発明の一部の実施形態によると、リンカーはグリシンである。
【００１３】
本発明の一部の実施形態によると、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質は、可溶性である。
【００１４】
本発明の一部の実施形態によると、ＳＩＲＰαは、ＳＩＲＰαの細胞外ドメインまたはその機能的断片を含む。
【００１５】
本発明の一部の実施形態によると、４１ＢＢＬは、４１ＢＢＬの細胞外ドメインまたはその機能的断片を含む。
【００１６】
本発明の一部の実施形態によると、融合タンパク質は、
（ｉ）ＣＤ４７および４１ＢＢに結合すること、
（ｉｉ）４１ＢＢを発現する細胞において、４１ＢＢのシグナル伝達経路を活性化すること、
（ｉｉｉ）４１ＢＢを発現する免疫細胞を共刺激すること、および／または
（ｉｖ）食細胞による、ＣＤ４７を発現する病的細胞に対する食作用を、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質の非存在下の食作用と比較して増進させること
のうちの少なくとも１つを実行可能である。
【００１７】
本発明の一部の実施形態によると、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列を含む。
【００１８】
本発明の一部の実施形態によると、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列からなる。
【００１９】
本発明の一部の実施形態によると、本発明のＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００２０】
本発明の一部の実施形態によると、本発明のポリヌクレオチドと、宿主細胞におけるポリヌクレオチドを発現せしめる調節エレメントとを含む、核酸構築物を提供する。
【００２１】
本発明の一部の実施形態によると、ポリヌクレオチドは配列番号８の核酸配列を含む。
【００２２】
本発明の一部の実施形態によると、本発明のＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質、または本発明のポリヌクレオチドもしくは核酸構築物を含む、宿主細胞を提供する。
【００２３】
本発明の一部の実施形態によると、本発明のポリヌクレオチドまたは核酸構築物を宿主細胞中で発現させることを含む、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質を作製する方法を提供する。
【００２４】
本発明の一部の実施形態によると、本方法は、融合タンパク質を単離することを含む。
【００２５】
本発明の一部の実施形態によると、細胞は、ＣＨＯ、ＰＥＲＣ．６、および２９３からなる群から選択される。
【００２６】
本発明の一部の実施形態によると、がんの処置を必要とする対象に、本発明のＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質を投与することを含む、がんを処置する方法を提供する。
【００２７】
本発明の一部の実施形態によると、免疫細胞の活性化による恩恵を受け得る疾患を処置する方法であって、疾患の処置を必要とする対象に、本発明のＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質、本発明のポリヌクレオチドもしくは核酸構築物、または本発明のいずれか１つの宿主細胞を投与することを含む、方法を提供する。
【００２８】
本発明の一部の実施形態の態様によると、免疫細胞の活性化による恩恵を受け得る疾患の処置のために特定された製品であって、疾患を処置するための治療剤をパッケージングするパッケージング材料と、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質をコードする核酸構築物、またはＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質を発現する宿主細胞とを含む、製品を提供する。
【００２９】
本発明の一部の実施形態によると、疾患は、過剰増殖性疾患を含む。
【００３０】
本発明の一部の実施形態によると、過剰増殖性疾患は、硬化症もしくは線維症、特発性肺線維症、乾癬、全身性硬化症／強皮症、原発性胆汁性胆管炎、原発性硬化性胆管炎、肝線維症、放射線誘発肺線維症の防止、骨髄線維症、または後腹膜線維症を含む。
【００３１】
本発明の一部の実施形態によると、過剰増殖性疾患は、がんを含む。
【００３２】
本発明の一部の実施形態の態様によると、がんの処置を必要とする対象に、抗がん剤と、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質をコードする核酸構築物、またはＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質を発現する宿主細胞とを投与することを含む、がんを処置する方法を提供する。
【００３３】
本発明の一部の実施形態によると、がんは、リンパ腫、白血病、結腸がん、膵がん、卵巣がん、肺がん、および扁平上皮癌からなる群から選択される。
【００３４】
本発明の一部の実施形態によると、がんの細胞はＣＤ４７を発現する。
【００３５】
本発明の一部の実施形態によると、疾患は、免疫抑制に関連する疾患または薬物誘導免疫抑制を含む。
【００３６】
本発明の一部の実施形態によると、疾患は、ＨＩＶ、麻疹、インフルエンザ、ＬＣＣＭ、ＲＳＶ、ヒトライノウイルス、ＥＢＶ、ＣＭＶ、またはパルボウイルスによるものを含む。
【００３７】
本発明の一部の実施形態によると、疾患は、感染症を含む。
【００３８】
本発明の一部の実施形態によると、対象の罹患細胞はＣＤ４７を発現する。
【００３９】
本発明の一部の実施形態の態様によると、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質およびＣＤ４７を発現する細胞の存在下において、Ｔ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化することを含む、Ｔ細胞を活性化する方法を提供する。
【００４０】
本発明の一部の実施形態の態様によると、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質およびＣＤ４７を発現する細胞の存在下において、食細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化することを含む、食細胞を活性化する方法を提供する。
【００４１】
本発明の一部の実施形態の態様によると、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質をコードする核酸構築物、またはＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質を発現する宿主細胞の存在下において、免疫細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化することを含む、免疫細胞を活性化する方法を提供する。
【００４２】
本発明の一部の実施形態によると、活性化することは、ＣＤ４７を発現する細胞または外因性ＣＤ４７の存在下で行われる。
【００４３】
本発明の一部の実施形態によると、ＣＤ４７を発現する細胞は、病的細胞を含む。
【００４４】
本発明の一部の実施形態によると、病的細胞は、がん細胞を含む。
【００４５】
本発明の一部の実施形態によると、がんは、リンパ腫、癌腫、および白血病からなる群から選択される。
【００４６】
本発明の一部の実施形態によると、活性化することは、抗がん剤の存在下で行う。
【００４７】
本発明の一部の実施形態によると、抗がん剤は抗体を含む。
【００４８】
本発明の一部の実施形態によると、抗体は、リツキシマブ、セツキシマブ、トラスツズマブ、エドレコロマブ、アレムツズマブ、ゲムツズマブ、イブリツモマブ、パニツムマブ、ベリムマブ、ベバシズマブ、ビバツズマブメルタンシン、ブリナツモマブ、ブロンツベトマブ、ブレンツキシマブベドチン、カツマキソマブ、シズツムマブ、ダクリズマブ、アダリムマブ、ベズロトクスマブ、セルトリズマブペゴール、シタツズマブボガトクス、ダラツムマブ、ジヌツキシマブ、エロツズマブ、エルツマキソマブ、エタラシズマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、ギレンツキシマブ、ネシツムマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、ペルツズマブ、ラムシルマブ、シルツキシマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、およびイピリムマブからなる群から選択される。
【００４９】
本発明の一部の実施形態によると、抗体は、リツキシマブ、セツキシマブ、およびアレムツズマブからなる群から選択される。
【００５０】
本発明の一部の実施形態によると、本方法は、免疫細胞の養子移入を必要とする対象に対して、活性化の後に免疫細胞を養子移入することを含む。
【００５１】
本発明の一部の実施形態によると、対象は、ＣＤ４７を発現する細胞に関連する疾患に罹患している。
【００５２】
本発明の一部の実施形態によると、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質は、本発明のＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質を含み、ポリヌクレオチドまたは核酸構築物は、本発明のポリヌクレオチドまたは核酸構築物を含み、宿主細胞は、本発明の宿主細胞を含む。
【００５３】
本発明の一部の実施形態によると、免疫細胞はＴ細胞を含む。
【００５４】
本発明の一部の実施形態によると、免疫細胞は食細胞を含む。
【００５５】
特に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術および／または科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様のまたは等価な方法および材料を、本発明の実施形態の実践または試験に使用することができるが、例示的な方法および／または材料を下記に記載する。矛盾する場合、定義を含む特許明細書が優先する。加えて、材料、方法、および実施例は単なる例示であり、必ずしも限定を意図するものではない。
【００５６】
本発明のいくつかの実施形態について、その例示のみを目的として添付の図面を参照して本明細書に記載する。以下、特に図面を詳細に参照して示す細部は、例示を目的とし、また本発明の実施形態の詳細な説明を目的とすることを強調する。同様に、図面と共に説明を見ることで、本発明の実施形態をどのように実践し得るかが当業者には明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】還元条件下または非還元条件下でのＨｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ（配列番号５）のウエスタンブロット分析写真である。親和性精製に続き、記載の変性条件下または非変性条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルでタンパク質（２５０ｎｇ／ウェル）を分離し、その後、抗Ｈｉｓタグ抗体を用いてイムノブロッティングを行った。
【図２】図２Ａ〜Ｂは、還元条件下または非還元条件下でのＨｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ（配列番号５）のウエスタンブロット分析写真である。親和性精製に続き、変性条件下（図２Ａ）または非変性条件下（図２Ｂ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルでタンパク質（２５０ｎｇ／ウェル）を分離し、その後、抗４１ＢＢＬ抗体を用いてイムノブロッティングを行った。図２Ｃは、デグリコシラーゼ処置有りまたは無処置の、還元条件下のＨｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ（配列番号５）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のクーマシーブルー染色写真である。Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬのバンドには、小さい黒矢印を付した。
【図３】バイオレイヤー干渉法Ｂｌｉｔｚ（登録商標）アッセイによって決定した、Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ（配列番号５）の対応するリガンドとの相互作用を示す図である。図３Ａは、ＣＤ４７への結合を示す。バイオセンサにＣＤ４７：Ｆｃを予めロードしておき、その後、Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ（配列番号５）またはＰＤ１−ＣＤ７０（配列番号６、陰性対照）と共にインキュベートした。図３Ｂは、４１ＢＢへの結合を示す。バイオセンサに４１ＢＢ：Ｆｃを予めロードしておき、その後、Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ（配列番号５）またはＰＤ１−ＣＤ７０（配列番号６、陰性対照として）と共にインキュベートした。
【図４】ＣＨＯ−Ｋ１−ＷＴ細胞（図４Ａ）およびＣＨＯ−ＫＩ−ＣＤ４７細胞（図４Ｂ）における、記載の受容体の発現パターンを示すヒストグラム図である。４１ＢＢおよびＣＤ４７の表面発現レベルは、各細胞株を対応する抗体で免疫染色し、続いてフローサイトメトリー分析を行うことによって決定した。
【図５】Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質（配列番号５）がＣＨＯ−Ｋ１−４７細胞には結合するが（図５Ａ）、ＣＨＯ−Ｋ１−ＷＴ細胞には結合しないこと（図５Ｂ）を示す図である。様々な濃度のＨｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質（配列番号５）と共に細胞を３０分間インキュベートした後、抗４１ＢＢＬ抗体による免疫染色およびフローサイトメトリー分析を行った。ＧＭＦＩ値を使用し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて、結合曲線グラフを作成した。
【図６】ＦＢＳ含有培地中のＨＴ１０８０−４１ＢＢ細胞によるＩＬ−８の分泌によって示されるように、Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質（配列番号５）がＴＮＦＲシグナル伝達を促進することを示す図である。
【図７】無血清培地中のＨＴ１０８０−４１ＢＢ細胞によるＩＬ−８の分泌によって示されるように、Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質（配列番号５）がＴＮＦＲシグナル伝達を促進することを示す図である。
【図８】Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質（配列番号５）が４１ＢＢ共刺激シグナル伝達を誘起し、Ｔ細胞活性化を強化することを示す図である。図８Ａは、Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質（配列番号５）で処置した後の、ＨＴ１０８０−４１ＢＢ細胞培養物ならびにＨＴ１０８０−４１ＢＢとＣＨＯ細胞との共培養物の上清におけるＩＬ−８濃度を示すグラフである。図８Ｂは、Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質（配列番号５）で処置した後の、ＨＴ１０８０−４１ＢＢ細胞培養物ならびにＨＴ１０８０−４１ＢＢとＣＨＯ−ＣＤ４７細胞との共培養物の上清におけるＩＬ−８濃度を示すグラフである。図８Ｃは、ＣＤ４７：Ｆｃでコーティングした９６ウェルプレートで３日間培養し、最適未満の濃度の抗ＣＤ３／抗ＣＤ３８ビーズ、および漸増濃度のＨｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ（配列番号５）で処置したＴ細胞における、ＣＤ２５発現によって評価したＴ細胞の活性化を示すグラフである。図８Ｄ〜Ｅは、代表的なドットプロット（図８Ｄ）および結果をまとめたグラフ（平均±標準誤差）を示す。２つの独立した実験で２名の独立したドナーを用いた。各ドナーを三連で分析した。図８Ｅは、健康なボランティアの末梢血から単離したＴ細胞をＤＬＤ−１細胞と混合し、Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質（配列番号５）有りまたは無しで、最適未満の濃度の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズで３日間処置した共培養物におけるＣＤ２５発現によって評価した、Ｔ細胞の活性化を示すドットプロットである。
【図９】ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬが、ＭＶ４−１１がん細胞に対して直接的な死滅効果を及ぼさないことを示す図である。図９Ａは、ＭＶ４−１１細胞の表面におけるＣＤ４７発現を示すヒストグラムであり、図９Ｂは、Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質（配列番号５）のＭＶ４−１１細胞に対する結合を示す。細胞をＦｃブロッカーと共に氷上で１５分間インキュベートし、その後、様々な濃度のＨｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質（配列番号５）と共に３０分間インキュベートしてから、抗４１ＢＢＬ抗体による免疫染色およびフローサイトメトリー分析を行った。図９Ｃは、ＰＩ染色によって判定したところ、様々な濃度のＨｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質（配列番号５）と共にＭＶ４−１１細胞を最長７２時間にわたりインキュベートしても、直接的な死滅効果が示されなかったことを示すグラフである。
【図１０】ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬが、抗ＣＤ３で予備刺激したヒトＰＢＭＣからのＩＮＦ−γ分泌を促進することを示す図である。図１０Ａは、記載のように、抗ＣＤ３の存在下または抗ＣＤ３とＩＬ２との存在下で様々な濃度のＨｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質（配列番号５）と共に４０時間インキュベートしたヒトＰＢＭＣの培養上清から検出された、ＩＦＮ−γ濃度を示すグラフである。図１０Ｂは、ヒトがんＭＶ−４−１１細胞と共培養し、記載のように、抗ＣＤ３有りまたは無し、そしてＩＬ２有りまたは無しで、様々な濃度のＨｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質（配列番号５）と共に４０時間インキュベートしたヒトＰＢＭＣの培養上清から検出された、ＩＦＮ−γ濃度を示すグラフである。
【図１１−１】ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬが顆粒球媒介性食作用を強化することを示す図である。図１１Ａは、フローサイトメトリー食作用分析の代表的なゲーティング戦略を示す。図１１Ｂは、記載の濃度のＨｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質（配列番号５）で処置した後の顆粒球による、Ｂ細胞リンパ腫細胞株ＢＪＡＢの食作用を示すグラフである。図１１Ｃは、Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質（配列番号５）有りまたは無しでインキュベートした２〜３名の個々のドナーから得た顆粒球による、記載のＢ細胞リンパ腫細胞株の食作用を示すグラフである。図１１Ｄは、Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質（配列番号５）有りまたは無しでリツキシマブを用いて処置した後の顆粒球による、記載のＢ細胞リンパ腫細胞株の食作用を示すグラフである。図１１Ｅは、Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質（配列番号５）有りまたは無しでインキュベートした３〜６名の個々のドナーから得た顆粒球による、記載の癌腫細胞株の食作用を示すグラフである。図１１Ｆは、Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質（配列番号５）有りまたは無しでセツキシマブを用いて処置した後の顆粒球による、記載の癌腫細胞株の食作用を示すグラフである。図１１Ｇは、Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質（配列番号５）有りまたは無しで２時間インキュベートした３名の個々のドナーから得た顆粒球による、記載の骨髄性白血病細胞株の食作用を示すグラフである。図１１Ｈは、Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質（配列番号５）有りまたは無しで２４時間インキュベートした３名の個々のドナーから得た顆粒球による、記載の骨髄性白血病細胞株の食作用を示すグラフである。図１１Ｉは、記載の濃度のＨｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質（配列番号５）で処置した後の顆粒球による、ＨＬ６０およびＭＯＬＭ１３の食作用を示すグラフである。図１１Ｊは、記載の濃度のＨｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質（配列番号５）で２時間または２４時間処置した後の顆粒球による、初代急性骨髄性白血病細胞の食作用を示すグラフである。図１１Ｋは、２．５μｇ／ｍｌのＨｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質（配列番号５）有りまたは無しで２時間または２４時間インキュベートした後の５名の個々のドナーから得た同種顆粒球による、初代急性骨髄性白血病細胞の食作用（平均±標準誤差）を示すグラフである。
【図１１−２】図１１Ｌは、可溶性ＳＩＲＰα、可溶性４１ＢＢＬ、両方の組み合わせ、またはＨｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質（配列番号５）で２時間処置した多形核細胞による、ＤＬＤ１がん細胞の食作用を示す。
【図１２】ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬがマクロファージ媒介性食作用を強化することを示す図である。図１２Ａは、Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質（配列番号５）有りまたは無しで、そしてモノクローナル抗体リツキシマブ（ｍＡｂ）有りまたは無しで２時間インキュベートした後の、マクロファージとＶ４５０で予備染色したＢ細胞リンパ腫細胞株Ｕ２９３２との共培養物の代表的な顕微鏡写真を示す。付着したマクロファージが明視野に見られ、Ｖ４５０で標識されたがん細胞は明るい細胞として見られる。暗い矢印は、生きた腫瘍細胞を示す。白い矢印は、マクロファージに貪食された腫瘍細胞を示す。図１２Ｂは、記載の濃度のＨｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質（配列番号５）で処置した後のＵ２９３２細胞のマクロファージ媒介性食作用を示すグラフである。図１２Ｃは、Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質（配列番号５）有りまたは無しでリツキシマブを用いて処置した後のＵ２９３２細胞のマクロファージ媒介性食作用を示すグラフである。図１２Ｄは、Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質（配列番号５）有りまたは無しで、そしてアレムツズマブ有りまたは無しでインキュベートした原発性Ｂ細胞悪性慢性リンパ球性白血病のマクロファージ媒介性食作用（平均±標準誤差）を示すグラフである。
【図１３】ＣＴ−２６接種マウスをＨｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質（配列番号５）で処置すると腫瘍体積が低減することを示す図である。図１３Ａは、実験タイムラインの概略図である。マウスには、１×１０６個のＣＴ−２６細胞を０日目に皮下（Ｓ．Ｃ．）接種し、ＰＢＳ対照、αＰＤ１、またはＳＩＲＰα−４１ＢＢＬを３日目、７日目、および１０日目に注射した。図１３Ｂは、３つの処置群における腫瘍体積の平均±標準誤差を示すグラフである。
【図１４】Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質（配列番号５）が、Ｐ３８８同系白血病腫瘍を接種したマウスの処置に有効であることを示す図である。図１４Ａは、実験タイムラインの概略図である。マウスには、１×１０６個のＰ３８８細胞を０日目に腹腔内（Ｉ．Ｐ．）接種し、ＰＢＳ対照、αＰＤ１、またはＳＩＲＰα−４１ＢＢＬを１日目、３日目、５日目、および７日目に注射した。図１４Ｂは、３つの処置群の屠殺時の脾臓重量を示すグラフである。
【図１５】Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質（配列番号５）が、ヒト白血病腫瘍を接種したＮＳＧマウスの骨髄（ＢＭ）中の腫瘍量を減少させることを示す図である。図１５Ａは、実験タイムラインの概略図である。マウスには、ＭＶ４．１１細胞を接種する２４時間前に放射線照射し、１３日後、マウスにヒトＰＢＭＣを接種し、４時間後に処置を開始した。１群当たり５匹の動物に、Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質（１００μｇ／注射）またはその可溶性バッファー（ＰＢＳ）の４回の腹腔内注射を、１日おきに（ＥＯＤ）（１３日目、１５日目、１７日目、および１９日目に）投与した。最後の注射から２４時間後にマウスを屠殺した。図１５Ｂは、フローサイトメトリーを使用して決定したＢＭ中の白血病細胞の数を示す。図１５Ｃは、ｍｇ単位の脾臓重量を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
本発明は、その一部の実施形態において、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質およびその使用方法に関する。
【００５９】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明の用途が必ずしも以下の説明に示される詳細または実施例によって例示される詳細に限定されるとは限らないことを理解されたい。本発明は、他の実施形態、または様々な方法で実践もしくは実行することが可能である。
【００６０】
二重シグナル伝達タンパク質（ＤＳＰ）は、シグナル変換タンパク質（ＳＣＰ）としても公知であり、これらは現在、Ｉ型膜タンパク質の細胞外部分（細胞外アミノ末端）をＩＩ型膜タンパク質の細胞外部分（細胞外カルボキシル末端）に結合させ、２つの活性側面を有する融合タンパク質を形成する二機能性融合タンパク質として、当技術分野において公知である。
【００６１】
驚くべきことに、特定の融合タンパク質は、がん性疾患を患う対象に有利に投与され得ることが分かった。このようながん性疾患は、腫瘍微小環境に腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を有する腫瘍、ならびに腫瘍細胞上または腫瘍微小環境にＣＤ４７が比較的高発現する腫瘍の存在に依存する。
【００６２】
本明細書において後述し、さらに実施例の項において例証するように、本発明者らは、ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質（配列番号５）を作製し、この融合タンパク質（配列番号５）が、両ドメインを含有し、少なくとも三量体の形態で作製されることを示す（実験１Ａ〜Ｂ、図１および２Ａ〜Ｃ）。続いて、本発明者らは、作製されたｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質（配列番号５）が、その同族受容体ＣＤ４７および４１ＢＢに対する機能的な結合活性を保持し（実験１Ｃ〜Ｄ、図３Ａ〜Ｂ、４Ａ〜Ｂ、および５Ａ〜Ｂ）、４１ＢＢ共刺激および４１ＢＢを発現する細胞（例えば、Ｔ細胞、ＰＢＭＣ）の活性化を誘起することができ、ＣＤ４７の存在がこの活性を増強させる（実験２〜３および３Ａ〜Ｂ、図６〜７、８Ａ〜Ｅ、９Ａ〜Ｃ、および１０Ａ〜Ｂ）ことを示す。加えて、本発明者らは、Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ（配列番号５）が、そのＳＩＲＰαドメインにより、特に、現在臨床で使用されている様々な治療用モノクローナル抗体との併用処置において、初代悪性細胞をはじめとする様々な悪性細胞型の食作用による取り込みを増強することを示す（実験４、図１１Ａ〜Ｌおよび１２Ａ〜Ｄ）。本発明者らはさらに、ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質（配列番号５）が、ｉｎ  ｖｉｖｏでの結腸癌および白血病のマウス腫瘍モデルにおいて示されるように（実験５および５Ａ〜Ｃ、図１３Ａ〜Ｂ、１４Ａ〜Ｂ、および１５Ａ〜Ｃ）、腫瘍の処置に有効であることを示す。
【００６３】
結果として、本教示は、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質を発現する宿主細胞、ならびに、例えば、一般的な免疫細胞の（共刺激による）活性化、および特に免疫細胞の活性化による恩恵を受け得る疾患（例えばがん）の処置におけるこれらの使用を示唆する。
【００６４】
よって、本発明の第１の態様によると、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質またはその任意の変異体もしくは断片、または、配列番号４に示される配列と少なくとも約７０％相同であり、ＳＩＲＰαと４１ＢＢＬとの間に任意選択でリンカーを含むＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質を提供する。
【００６５】
本発明の別の態様によると、ＳＩＲＰαと４１ＢＢＬとの間に１アミノ酸リンカーを含むＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質を提供する。
【００６６】
本発明の別の態様によると、少なくともホモ三量体の形態のＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質を提供する。
【００６７】
特定の実施形態によると、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％が、少なくともホモ三量体の形態である。上記それぞれの可能な態様が、本発明の別個の実施形態を表す。
【００６８】
特定の実施形態によると、少なくともホモ三量体は、ホモ三量体を含む。
【００６９】
特定の実施形態によると、少なくともホモ三量体は、ホモ四量体を含む。
【００７０】
特定の実施形態によると、少なくともホモ三量体は、ホモ五量体を含む。
【００７１】
特定の実施形態によると、少なくともホモ三量体は、ホモ六量体を含む。
【００７２】
三量体形成を検出する方法は、当技術分野で周知であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＮＡＴＩＶＥ−ＰＡＧＥ、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ、２Ｄゲル、ゲル濾過、ＳＥＣ  ＭＡＬＬＳ、分析超遠心（ＡＵＣ）質量分析（ＭＳ）、キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）を含むが、これらに限定されない。
【００７３】
特定の実施形態によると、少なくともホモ三量体のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定した分子量は、少なくとも１４０ｋＤ、少なくとも１６０ｋＤ、少なくとも１８０ｋＤ、少なくとも２００ｋＤ、少なくとも２２０ｋＤ、少なくとも２４０ｋＤである。
【００７４】
特定の実施形態によると、少なくともホモ三量体のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定した分子量は、少なくとも１４０ｋＤである。
【００７５】
特定の実施形態によると、少なくともホモ三量体のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定した分子量は、少なくとも２００ｋＤである。
【００７６】
本明細書において使用する場合、「ＳＩＲＰα（シグナル調節タンパク質アルファ、別名ＣＤ１７２ａ）」という用語は、ＳＩＲＰＡ遺伝子（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：１４０８８５）のポリペプチドまたはその機能的ホモログ、例えば機能的断片を指す。特定の実施形態によると、「ＳＩＲＰα」という用語は、ＳＩＲＰαポリペプチドの機能的ホモログを指す。特定の実施形態によると、ＳＩＲＰαは、ヒトＳＩＲＰαである。特定の実施形態によると、ＳＩＲＰαタンパク質は、次のＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＰ＿００１０３５１１１、ＮＰ＿００１０３５１１２、ＮＰ＿００１３１７６５７、またはＮＰ＿５４２９７０で提供されているものなどのヒトタンパク質を指す。
【００７７】
本明細書において使用する場合、「機能的ＳＩＲＰα」は、その同族受容体ＣＤ４７［別名、インテグリン結合タンパク質（ＩＡＰ）］に結合することができる。
【００７８】
本明細書において使用する場合、ＳＩＲＰαの「機能的ホモログ」または「機能的断片」という表現は、ポリペプチドのうち、完全長ＳＩＲＰαの活性、例えばＣＤ４７結合を維持する部分を指す。
【００７９】
特定の実施形態によると、ＣＤ４７タンパク質はヒトタンパク質を指し、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＰ＿００１７６８またはＮＰ＿９４２０８８として提供されているものなどである。
【００８０】
結合を試験するためのアッセイは、当技術分野で周知であり、フローサイトメトリー、ＢｉａＣｏｒｅ、バイオレイヤー干渉法Ｂｌｉｔｚ（登録商標）アッセイ、ＨＰＬＣを含むが、これらに限定されない。
【００８１】
特定の実施形態によると、ＳＩＲＰαのＣＤ４７に対する結合は、ＳＰＲによって決定したＫｄが、０．１〜１００μＭ、０．１〜１０μＭ、１〜１０μＭ、０．１〜５μＭ、または１〜２μＭであり、それぞれの可能な態様が、本発明の別個の実施形態を表す。
【００８２】
特定の実施形態によると、ＳＩＲＰαは、当該ＳＩＲＰαの細胞外ドメインまたはその機能的断片を含む。
【００８３】
特定の実施形態によると、ＳＩＲＰαのアミノ酸配列は、配列番号９のアミノ酸配列を含む。
【００８４】
特定の実施形態によると、ＳＩＲＰαのアミノ酸配列は、配列番号９のアミノ酸配列からなる。
【００８５】
特定の実施形態によると、ＳＩＲＰαの核酸配列は、配列番号１０の核酸配列を含む。
【００８６】
特定の実施形態によると、ＳＩＲＰαの核酸配列は、配列番号１０の核酸配列からなる。
【００８７】
特定の実施形態によると、ＳＩＲＰαのアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列を含む。
【００８８】
特定の実施形態によると、ＳＩＲＰαのアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列からなる。
【００８９】
特定の実施形態によると、ＳＩＲＰαの核酸配列は、配列番号１１の核酸配列を含む。
【００９０】
特定の実施形態によると、ＳＩＲＰαの核酸配列は、配列番号１１の核酸配列からなる。
【００９１】
「ＳＩＲＰα」という用語には、所望の活性（すなわち、ＣＤ４７への結合）を示す機能的ホモログ（天然の、または合成／組換えで作製されたもの）も包含される。そのようなホモログは、例えば、配列番号２または９のポリペプチドと、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一もしくは相同であるか、または配列番号２または９のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一であり得る（本明細書でさらに後述する）。
【００９２】
配列の同一性または相同性は、Ｂｌａｓｔ、ＣｌｕｓｔａｌＷ、およびＭＵＳＣＬＥといった、タンパク質または核酸の配列アライメントアルゴリズムのいずれかを使用して決定してもよい。
【００９３】
ホモログは、本明細書でさらに後述するように、オルソログ、欠失変異体、挿入変異体、またはアミノ酸置換を含む置換変異体を指す場合もある。
【００９４】
特定の実施形態によると、ＳＩＲＰαポリペプチドは、本明細書でさらに後述するように、保存的アミノ酸置換を含み得る。
【００９５】
特定の実施形態によると、ＳＩＲＰαのアミノ酸配列は、１００〜５００アミノ酸、１５０〜４５０アミノ酸、２００〜４００アミノ酸、２５０〜４００アミノ酸、３００〜４００アミノ酸、３２０〜４２０アミノ酸、３４０〜３５０アミノ酸を含み、それぞれの可能な態様が、本発明の別個の実施形態を表す。
【００９６】
特定の実施形態によると、ＳＩＲＰαのアミノ酸配列は、３００〜４００アミノ酸長である。
【００９７】
特定の実施形態によると、ＳＩＲＰαのアミノ酸配列は、３４０〜４５０アミノ酸長である。
【００９８】
特定の実施形態によると、ＳＩＲＰαのアミノ酸配列は、３４３アミノ酸長である。
【００９９】
本明細書において使用する場合、「４１ＢＢＬ（別名ＣＤ１３７ＬおよびＴＮＦＳＦ９）」という用語は、ＴＮＦＳＦ９遺伝子（ＧｅｎｅＩＤ：８７４４）のポリペプチドまたはその機能的ホモログ、例えば機能的断片を指す。特定の実施形態によると、「４１ＢＢＬ」という用語は、４１ＢＢＬポリペプチドの機能的ホモログを指す。特定の実施形態によると、４１ＢＢＬは、ヒト４１ＢＢＬである。特定の実施形態によると、４１ＢＢＬタンパク質はヒトタンパク質を指し、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＰ＿００３８０２で提供されるものなどである。
【０１００】
特定の実施形態によると、４１ＢＢＬは、当該４１ＢＢＬの細胞外ドメインまたはその機能的断片を含む。
【０１０１】
特定の実施形態によると、４１ＢＢＬのアミノ酸配列は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。
【０１０２】
特定の実施形態によると、４１ＢＢＬのアミノ酸配列は、配列番号１２のアミノ酸配列からなる。
【０１０３】
特定の実施形態によると、４１ＢＢＬの核酸配列は、配列番号１３の核酸配列を含む。
【０１０４】
特定の実施形態によると、４１ＢＢＬの核酸配列は、配列番号１３の核酸配列からなる。
【０１０５】
特定の実施形態によると、４１ＢＢＬのアミノ酸配列は、配列番号３のアミノ酸配列を含む。
【０１０６】
特定の実施形態によると、４１ＢＢＬのアミノ酸配列は、配列番号３のアミノ酸配列からなる。
【０１０７】
特定の実施形態によると、４１ＢＢＬの核酸配列は、配列番号１４の核酸配列を含む。
【０１０８】
特定の実施形態によると、４１ＢＢＬの核酸配列は、配列番号１４の核酸配列からなる。
【０１０９】
「４１ＢＢＬ」という用語には、所望の活性（本明細書で以下に定義する）を示す機能的ホモログ（天然の、または合成／組換えで作製されたもの）も包含される。そのようなホモログは、例えば、配列番号３、１２のポリペプチドと、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一もしくは相同であるか、または配列番号３、１２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一であり得る（本明細書でさらに後述する）。
【０１１０】
特定の実施形態によると、４１ＢＢＬポリペプチドは、本明細書でさらに後述するように、保存的アミノ酸置換を含み得る。
【０１１１】
特定の実施形態によると、４１ＢＢＬのアミノ酸配列は、１００〜３００アミノ酸、１５０〜２５０アミノ酸、１００〜２５０アミノ酸、１５０〜２２０アミノ酸、１８０〜２２０アミノ酸、１９０〜２１０アミノ酸を含み、それぞれの可能な態様が、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１１２】
特定の実施形態によると、４１ＢＢＬのアミノ酸配列は、１９０〜２１０アミノ酸長である。
【０１１３】
特定の実施形態によると、４１ＢＢＬのアミノ酸配列は、２０４アミノ酸長である。
【０１１４】
本明細書において使用する場合、「機能的４１ＢＢＬ」は、
（ｉ）その同族受容体４１ＢＢ（別名ＣＤ１３７）に結合すること、
（ｉｉ）４１ＢＢを発現する免疫細胞において、４１ＢＢのシグナル伝達経路を活性化すること、および／または
（ｉｉｉ）４１ＢＢを発現する免疫細胞を活性化すること
のうちの少なくとも１つを実行可能である。
【０１１５】
特定の実施形態によると、機能的４１ＢＢＬは、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉ）＋（ｉｉ）、（ｉ）＋（ｉｉｉ）、（ｉｉ）＋（ｉｉｉ）を実行可能である。
【０１１６】
特定の実施形態によると、機能的４１ＢＢＬは、（ｉ）＋（ｉｉ）＋（ｉｉｉ）を実行可能である。
【０１１７】
本明細書において使用する場合、４１ＢＢＬの「機能的ホモログ」または「機能的断片」という表現は、ポリペプチドのうち、完全長４１ＢＢＬの活性、例えば、４１ＢＢへの結合、４１ＢＢシグナル伝達経路の活性化、４１ＢＢを発現する免疫細胞の活性化を維持する部分を指す。
【０１１８】
特定の実施形態によると、４１ＢＢタンパク質はヒトタンパク質を指し、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＰ＿００１５５２として提供されているものなどである。
【０１１９】
結合を試験するためのアッセイは、当技術分野で周知であり、本明細書においてさらに上述されている。
【０１２０】
特定の実施形態によると、４１ＢＢＬの４１ＢＢに対する結合は、ＳＰＲによって決定したＫｄが、約０．１〜１０００ｎＭ、０．１〜１００ｎＭ、１〜１００ｎＭ、または５５．２ｎＭであり、それぞれの可能な態様が、特許請求される本発明の別個の実施形態を表す。
【０１２１】
本明細書において使用する場合、「活性化すること」または「活性化」という用語は、細胞の増殖、成熟化、サイトカインの生成、食作用および／または調節機能もしくはエフェクター機能の誘導をもたらす、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、貪食細胞）を刺激するプロセスを指す。
【０１２２】
特定の実施形態によると、活性化することは、共刺激することを含む。
【０１２３】
本明細書において使用する場合、「共刺激すること」または「共刺激」という用語は、二次抗原非依存性刺激シグナル（例えば４１ＢＢシグナル）を伝達し、免疫細胞の活性化をもたらすことを指す。
【０１２４】
特定の実施形態によると、活性化することは、阻害シグナル（例えばＣＤ４７シグナル）を抑制し、免疫細胞の活性化をもたらすことを含む。
【０１２５】
刺激シグナルまたは阻害シグナルのシグナル伝達を決定する方法は、当技術分野で周知であり、続く実施例の項にも開示されている。例えば、ＢｉａＣｏｒｅ、ＨＰＬＣ、またはフローサイトメトリーを使用した結合アッセイ、キナーゼ活性アッセイなどの酵素活性アッセイ、ならびに、シグナル伝達カスケードに関与する分子の、例えば、ＰＣＲ、ウエスタンブロット、免疫沈降、および免疫組織化学的検査を使用した発現の検出を含むが、これらに限定されない。これに加えて、またはこの代わりに、（共刺激性または阻害性の）シグナル伝達を決定することで、免疫細胞の活性化または機能を評価することができる。免疫細胞の活性化または機能を評価する方法は、当技術分野で周知であり、ＣＦＳＥ染色、ＭＴＳ、アラマーブルー（Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ）、ＢＲＤＵおよびチミジンの組み込みなどの増殖アッセイ、ＣＦＳＥ染色、クロム遊離、カルセインＡＭ（Ｃａｌｃｉｎ  ＡＭ）などの細胞傷害性アッセイ、細胞内サイトカイン染色、ＥＬＩＳＰＯＴおよびＥＬＩＳＡなどのサイトカイン分泌アッセイ、フローサイトメトリーを使用したＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＰＤ１、およびＣＤ６２Ｌなどの活性化マーカーの発現を含むが、これらに限定されない。
【０１２６】
特定の実施形態によると、シグナル伝達活性またはその活性化の決定は、本明細書でさらに後述するように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで、例えば混合リンパ球反応（ＭＬＲ）によって実施することができる。
【０１２７】
同じ培養条件の場合、シグナル伝達活性または免疫細胞の活性化もしくは機能は、概して、同じ種の細胞であって、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、もしくはＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質をコードする宿主細胞と接触させていない細胞、または対照とも呼ばれる、ビヒクル対照と接触させた細胞におけるシグナル伝達、活性化、または機能との比較として表される。
【０１２８】
「ＤＳＰ」および「融合タンパク質」、「キメラタンパク質」または「キメラ」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、天然の単一アミノ酸配列においては一緒に見出されることのない、２つ以上の部分を有するアミノ酸配列を指す。
【０１２９】
一実施形態において、本発明は、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬを含む融合タンパク質（以降、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質）またはそのいずれかの変異体もしくは断片であって、ＳＩＲＰαと４１ＢＢＬとの間に任意選択でリンカーを含むものを対象とする。
【０１３０】
ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬは、２つの異なるヒト膜タンパク質の細胞外ドメインを融合した、二重シグナル伝達タンパク質（ＤＳＰ）キメラタンパク質である。このキメラのＮ末端側ドメインは、１型膜タンパク質であるヒトＳＩＲＰα（遺伝子：ＳＩＲＰＡ）の細胞外ドメインであり、Ｃ末端側ドメインは、２型膜タンパク質であるヒト４１ＢＢＬ（遺伝子：４１ＢＢＬ）の細胞外ドメインである。
【０１３１】
特定の実施形態によると、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質は、可溶性である（すなわち、合成または天然の表面に固定化されていない）。
【０１３２】
特定の実施形態によると、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質は、合成または天然の表面に固定化される。
【０１３３】
特定の実施形態によると、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬは、ＳＩＲＰαと４１ＢＢＬとの間にリンカーを含まない。
【０１３４】
一部の実施形態では、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬは、任意の長さであり得るリンカーを含む。
【０１３５】
よって、特定の実施形態によると、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質は、当該ＳＩＲＰαと当該４１ＢＢＬとの間にリンカーを含む。
【０１３６】
当技術分野で公知の任意のリンカーを、本発明の特定の実施形態と共に使用することができる。
【０１３７】
特定の実施形態によると、リンカーは、天然のマルチドメインタンパク質に由来し得るか、または、例えば、その全内容が参照により本明細書に組み込まれているChichili et al., (2013), Protein Sci. 22 (2): 153-167や、Chen et al., (2013), Adv Drug Deliv Rev. 65 (10): 1357-1369に記載されている実験的リンカーである。一部の実施形態では、リンカーは、全内容が参照により本明細書に組み込まれているChen et al., (2013), Adv Drug Deliv Rev. 65 (10): 1357-1369およびCrasto et al (2000), Protein Eng. 13 (5):309-312に記載されているものといった、リンカー設計データベースおよびコンピュータプログラムを使用して設計され得る。
【０１３８】
特定の実施形態によると、リンカーは、ＰＥＧなどの合成リンカーである。
【０１３９】
特定の実施形態によると、リンカーは、抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥの）またはその断片のＦｃドメインもしくはヒンジ領域である。
【０１４０】
他の特定の実施形態によると、リンカーは、抗体またはその断片のＦｃドメインもしくはヒンジ領域ではない。
【０１４１】
特定の実施形態によると、リンカーは、機能的であり得る。例えば、限定されるものではないが、リンカーは、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質のフォールディングおよび／または安定性を改善し、発現を改善し、薬物動態を改善し、さらに／あるいは生理活性を改善するように機能し得る。別の例において、リンカーは、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質の標的を特定の細胞型または位置に定めるように機能し得る。
【０１４２】
特定の実施形態によると、リンカーは、ポリペプチドである。
【０１４３】
一部の実施形態では、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬは、１〜６アミノ酸長のリンカーを含む。
【０１４４】
特定の実施形態によると、リンカーは、グリシンおよび／またはセリン残基を実質的に含む（例えば、約３０％、または約４０％、または約５０％、または約６０％、または約７０％、または約８０％、または約９０％、または約９５％、または約９７％、または１００％がグリシンおよびセリンである）。
【０１４５】
特定の実施形態によると、リンカーは１アミノ酸リンカーである。
【０１４６】
本発明の一部の実施形態では、ＳＩＲＰαと４１ＢＢＬとを結合するアミノ酸はグリシンであり、本明細書ではＳＩＲＰα−Ｇ−４１ＢＢＬ融合タンパク質とも呼ぶ。
【０１４７】
特定の実施形態によると、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質のアミノ酸配列は配列番号１のアミノ酸配列を含む。
【０１４８】
特定の実施形態によると、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質のアミノ酸配列は配列番号１のアミノ酸配列からなる。
【０１４９】
一部の実施形態では、「ＳＩＲＰα−Ｇ−４１ＢＢＬ融合タンパク質」という用語は、配列番号１によって特定されるタンパク質を指す。
【０１５０】
キメラタンパク質（ＳＩＲＰα−Ｇ−４１ＢＢＬ）のアミノ酸配列：
【化１】
2020505010.tif 000002
【０１５１】
ヒトＳＩＲＰαタンパク質の細胞外ドメインは下線部分、すなわち、以下の配列である。
EEELQVIQPDKSVLVAAGETATLRCTATSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQKEGHFPRVTTVSDLTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAKPSAPVVSGPAARATPQHTVSFTCESHGFSPRDITLKWFKNGNELSDFQTNVDPVGESVSYSIHSTAKVVLTREDVHSQVICEVAHVTLQGDPLRGTANLSETIRVPPTLEVTQQPVRAENQVNVTCQVRKFYPQRLQLTWLENGNVSRTETASTVTENKDGTYNWMSWLLVNVSAHRDDVKLTCQVEHDGQPAVSKSHDLKVSAHPKEQGSNTAAENTGSNERNIY（配列番号２）
【０１５２】
ヒト４１ＢＢＬの細胞外ドメインは、太字部分、すなわち、以下の配列である。
ACPWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE（配列番号３）
【０１５３】
特定の実施形態によると、ＳＩＲＰα−Ｇ−４１ＢＢＬのアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列と、または配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列と、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相同である。
【０１５４】
一部の実施形態では、配列番号４に示される配列と、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相同であり、ＳＩＲＰαペプチドまたはそのＥＣＤと、４１ＢＢＬペプチドまたはそのＥＣＤとの間に任意選択でリンカーを含む、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質を提供する。ここで配列番号４は、下記の配列である。
【０１５５】
【化２】
2020505010.tif 000003
【０１５６】
一部の実施形態では、ＳＩＲＰαペプチドまたはそのＥＣＤと、４１ＢＢＬペプチドまたはそのＥＣＤとの間に任意選択でリンカーを含む、配列番号４に示されるＳＩＲＰα−４１ＢＢＬを提供する。ここで配列番号４は、下記の配列である。
【０１５７】
【化３】
2020505010.tif 000004
【０１５８】
さらなる実施形態において、ＳＩＲＰΑ−Ｇ−４１ＢＢＬ融合タンパク質は、配列番号１に示されるアミノ酸配列の変異体および／または誘導体であり得る。そのような変異体は、いくつかが当技術分野で公知である。例として、Weiskopf et al, 2013、Young Won, et al, 2010、およびRabu, et al, 2005を参照されたい。これらの文献は、本明細書に完全に記載したかのように、参照により本明細書に組み込まれている。
【０１５９】
特定の実施形態によると、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質は、
（ｉ）ＣＤ４７および４１ＢＢに結合すること、
（ｉｉ）４１ＢＢを発現する免疫細胞（例えばＴ細胞）において、４１ＢＢのシグナル伝達経路を活性化すること、
（ｉｉｉ）４１ＢＢを発現する免疫細胞（例えばＴ細胞）を活性化すること、および／または
（ｉｖ）食細胞による、ＣＤ４７を発現する病的細胞に対する食作用を、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質の非存在下の食作用と比較して増進させること
のうちの少なくとも１つを実行可能である。
【０１６０】
特定の実施形態によると、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質は、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｉ）＋（ｉｉ）、（ｉ）＋（ｉｉｉ）、（ｉ）＋（ｉｖ）、（ｉｉ）＋（ｉｉｉ）、（ｉｉ）＋（ｉｖ）、（ｉ）＋（ｉｉ）＋（ｉｉｉ）、（ｉ）＋（ｉｉ）＋（ｉｖ）、（ｉｉ）＋（ｉｉｉ）＋（ｉｖ）を実行可能である。
【０１６１】
特定の実施形態によると、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質は、（ｉ）＋（ｉｉ）＋（ｉｉｉ）＋（ｉｖ）を実行可能である。
【０１６２】
結合、４１ＢＢシグナル伝達経路の活性化、および免疫細胞の活性化を決定する方法は、当技術分野で周知であり、本明細書において上述および後述しており、続く実施例の項にもさらに記載している。
【０１６３】
特定の実施形態によると、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質は、ＣＤ４７を発現する病的細胞に対する、食細胞による食作用を増進させる。
【０１６４】
食作用を分析する方法は、当技術分野で周知であり、続く実施例の項の実験４においても開示されており、例えば、死滅アッセイ、フローサイトメトリー、および／または顕微鏡的評価（生細胞イメージング、蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡、電子顕微鏡）を含む。
【０１６５】
特定の実施形態によると、例えばフローサイトメトリーまたは顕微鏡的評価によって決定した食作用の増進は、本発明のＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドもしくは核酸構築物、またはＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質を発現する宿主細胞の非存在下の食作用と比較して、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、または少なくとも２０倍である。
【０１６６】
他の特定の実施形態によると、例えばフローサイトメトリーまたは顕微鏡的評価によって決定した生存率の増加は、本発明のＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドもしくは核酸構築物、またはＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質を発現する宿主細胞の非存在下の生存率と比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％である。
【０１６７】
本発明の一部の実施形態の組成物（例えば、融合タンパク質、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドもしくは核酸、または融合タンパク質を発現する宿主細胞）は、免疫細胞を活性化することが可能であるため、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、および／またはｉｎ  ｖｉｖｏで、免疫細胞を活性化する方法において使用することができる。
【０１６８】
よって、本発明のある態様によると、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質をコードする核酸構築物、またはＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質を発現する宿主細胞の存在下において、免疫細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで活性化することを含む、免疫細胞を活性化する方法を提供する。
【０１６９】
本発明の別の態様によると、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質およびＣＤ４７を発現する細胞の存在下において、Ｔ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで活性化することを含む、Ｔ細胞を活性化する方法を提供する。
【０１７０】
本発明の別の態様によると、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質およびＣＤ４７を発現する細胞の存在下において、食細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性化することを含む、食細胞を活性化する方法を提供する。
【０１７１】
特定の実施形態によると、免疫細胞は、４１ＢＢを発現する。
【０１７２】
特定の実施形態によると、免疫細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む。
【０１７３】
本明細書において使用する場合、「末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）」という用語は、単核の血液細胞を指し、リンパ球、単球、および樹状細胞（ＤＣ）を含む。
【０１７４】
特定の実施形態によると、ＰＢＭＣは、樹状細胞（ＤＣ）、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、およびＮＫＴ細胞からなる群から選択される。
【０１７５】
特定の実施形態によると、ＰＢＭＣは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、およびＮＫＴ細胞を含む。
【０１７６】
ＰＢＭＣを得る方法は、対象から全血を採血し、抗凝固薬（例えばヘパリンまたはクエン酸塩）を含む容器に収集すること、およびアフェレーシスなど、当技術分野で周知である。続いて、特定の実施形態によると、少なくとも１種類のＰＢＭＣを末梢血から精製する。全血からＰＢＭＣを精製するためには、白血球アフェレーシス、沈降、密度勾配遠心分離（例えばｆｉｃｏｌｌ）、遠心溶出法、分画、例えば赤血球の化学的溶解（例えばＡＣＫによるもの）、細胞表面マーカーを使用した特定の細胞型の選択（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｃｅｌｌｐｒｏ社、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ社、またはＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社等から市販されている、ＦＡＣＳソーターまたは磁気細胞分離技術の使用）、および、特定の細胞型を除去する方法であって、特異的な抗体を用いる根絶（例えば死滅）に基づく方法や、（例えば、磁気細胞分離技術、ＦＡＣＳソーターおよび／または捕捉ＥＬＩＳＡ標識化を使用する）負の選択による親和性に基づく精製といった、当業者に公知のいくつかの方法および試薬がある。そのような方法は、例えば、THE HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY, Volumes 1 to 4, (D.N. Weir, editor)、およびFLOW CYTOMETRY AND CELL SORTING (A. Radbruch, editor, Springer Verlag, 2000)に記載されている。
【０１７７】
特定の実施形態によると、免疫細胞は、腫瘍浸潤リンパ球を含む。
【０１７８】
本明細書において使用する場合、「腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）」という用語は、血流から離れて腫瘍中に遊走した単核白血球を指す。
【０１７９】
特定の実施形態によると、ＴＩＬは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、および単球からなる群から選択される。
【０１８０】
ＴＩＬを得るための方法は、例えば生検または剖検によって対象から腫瘍試料を得て、その単細胞懸濁液を調製する方法のように、当技術分野で周知である。単細胞懸濁液は、任意の好適な様式、例えば、機械的に（例えば、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（商標）Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（カリフォルニア州、オーバーンのＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社製）を使用した、腫瘍の脱凝集）または酵素的に（例えば、コラゲナーゼまたはＤＮａｓｅで）得ることができる。続いて、この細胞懸濁液から、少なくとも１種類のＴＩＬが精製され得る。所望の種類のＴＩＬを精製するためには、細胞表面マーカーを使用した特定の細胞型の選択（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｃｅｌｌｐｒｏ社、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ社、またはＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社等から市販されている、ＦＡＣＳソーターまたは磁気細胞分離技術の使用）、および、特定の細胞型を除去する方法であって、特異的な抗体を用いる根絶（例えば死滅）に基づく方法や、（例えば、磁気細胞分離技術、ＦＡＣＳソーターおよび／または捕捉ＥＬＩＳＡ標識化を使用する）負の選択による親和性に基づく精製といった、当業者に公知のいくつかの方法および試薬がある。そのような方法は、例えば、THE HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY, Volumes 1 to 4, (D.N. Weir, editor)、およびFLOW CYTOMETRY AND CELL SORTING (A. Radbruch, editor, Springer Verlag, 2000)に記載されている。
【０１８１】
特定の実施形態によると、免疫細胞は、食細胞を含む。
【０１８２】
本明細書において使用する場合、「食細胞」という用語は、食作用を実行可能である細胞を指し、プロフェッショナル食細胞およびノンプロフェッショナル食細胞の両方を含む。食作用を分析する方法は、当技術分野で周知であり、本明細書で上述し、さらに後述している。特定の実施形態によると、貪食細胞は、単球、樹状細胞（ＤＣ）、および顆粒球からなる群から選択される。
【０１８３】
特定の実施形態によると、食細胞は、顆粒球を含む。
【０１８４】
特定の実施形態によると、食細胞は、単球を含む。
【０１８５】
特定の実施形態によると、免疫細胞は、単球を含む。
【０１８６】
特定の実施形態によると、「単球」という用語は、組織内に存在する循環単球およびマクロファージ（別称、単核食細胞）の両方を指す。
【０１８７】
特定の実施形態によると、単球は、マクロファージを含む。典型的には、マクロファージの細胞表面表現型は、ＣＤ１４、ＣＤ４０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ６４、Ｆ４／８０（マウス）／ＥＭＲ１（ヒト）、リゾチームＭ、ＭＡＣ−１／ＭＡＣ−３、およびＣＤ６８を含む。
【０１８８】
特定の実施形態によると、単球は、循環単球を含む。典型的には、循環単球の細胞表面表現型は、ＣＤ１４およびＣＤ１６（例えばＣＤ１４＋＋ＣＤ１６−、ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋＋、ＣＤ１４＋＋ＣＤ１６＋）を含む。
【０１８９】
特定の実施形態によると、免疫細胞は、ＤＣを含む。
【０１９０】
本明細書において使用する場合、「樹状細胞（ＤＣ）」という用語は、リンパ様または非リンパ様の組織内に見出される、形態学的に同様な細胞型の多様な集団のうちの任意のメンバーを指す。ＤＣは、プロフェッショナル抗原提示細胞のクラスであり、ＨＬＡ制限Ｔ細胞を感作する能力が高い。ＤＣとしては、例えば、形質細胞様樹状細胞、骨髄樹状細胞（未成熟型および成熟型の樹状細胞を含む）、ランゲルハンス細胞、指状嵌入細胞、濾胞樹状細胞が挙げられる。樹状細胞は、機能によって、または表現型によって、特に細胞表面表現型によって認識され得る。これらの細胞は、ベール様の突起を細胞表面に有する特徴的な形態、中レベルから高レベルの表面ＨＬＡクラスＩＩの発現、およびＴ細胞（特にナイーブＴ細胞）に対して抗原提示する能力を特徴とする（Steinman R, et al., Ann. Rev. Immunol. 1991; 9:271-196を参照されたい）。典型的には、ＤＣの細胞表面表現型としては、ＣＤｌａ＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８６＋、またはＨＬＡ−ＤＲが挙げられる。ＤＣという用語には、未成熟型ＤＣおよび成熟型ＤＣの両方が包含される。
【０１９１】
特定の実施形態によると、免疫細胞は、顆粒球を含む。
【０１９２】
本明細書において使用する場合、「顆粒球」という用語は、細胞質内の顆粒の存在を特徴とする、多形核白血球を指す。
【０１９３】
特定の実施形態によると、顆粒球は、好中球を含む。
【０１９４】
特定の実施形態によると、顆粒球は、マスト細胞を含む。
【０１９５】
特定の実施形態によると、免疫細胞は、Ｔ細胞を含む。
【０１９６】
本明細書において使用する場合、「Ｔ細胞」という用語は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋のいずれかの表現型を有する、ＣＤ３＋、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）＋の分化型リンパ球を指す。Ｔ細胞は、エフェクターＴ細胞または調節性Ｔ細胞のいずれであってもよい。
【０１９７】
本明細書において使用する場合、「エフェクターＴ細胞」という用語は、例えばサイトカインを生成することによって他の免疫細胞を活性化するもしくは方向付けるＴ細胞、または細胞傷害活性を有するＴ細胞であり、例えば、ＣＤ４＋、Ｔｈ１／Ｔｈ２、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球を指す。
【０１９８】
本明細書において使用する場合、「調節性Ｔ細胞」または「Ｔｒｅｇ」という用語は、エフェクターＴ細胞を含む他のＴ細胞、ならびに自然免疫系細胞の活性化を負に調節するＴ細胞を指す。Ｔｒｅｇ細胞は、エフェクターＴ細胞応答の持続的抑制を特徴とする。特定の実施形態によると、Ｔｒｅｇは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞である。
【０１９９】
特定の実施形態によると、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞である。
【０２００】
他の特定の実施形態によると、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。
【０２０１】
特定の実施形態によると、Ｔ細胞は、メモリーＴ細胞である。メモリーＴ細胞の非限定的な例としては、ＣＤ３＋／ＣＤ４＋／ＣＤ４５ＲＡ−／ＣＣＲ７−の表現型を有するエフェクターメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ３＋／ＣＤ４＋／ＣＤ４５ＲＡ−／ＣＣＲ７＋の表現型を有するセントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ３＋／ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ−／ＣＣＲ７−の表現型を有するエフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞、およびＣＤ３＋／ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ−／ＣＣＲ７＋の表現型を有するセントラルメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞が挙げられる。
【０２０２】
特定の実施形態によると、Ｔ細胞は、目的の発現産物をコードする核酸配列が形質導入された、工学的に操作されたＴ細胞を含む。
【０２０３】
特定の実施形態によると、目的の発現産物は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。
【０２０４】
本明細書において使用する場合、「ＴＣＲをコードする核酸配列が形質導入された」または「ＴＣＲをコードする核酸配列を形質導入する」という表現は、ＭＨＣとの関連で提示される所望の抗原に対して特異性を有するＴ細胞から、可変α−鎖およびβ−鎖をクローニングすることを指す。ＴＣＲを形質導入する方法は、当技術分野で公知であり、例えば、Nicholson et al. Adv Hematol. 2012; 2012:404081、Wang and Riviere Cancer Gene Ther. 2015 Mar;22 (2):85-94)、およびLamers et al, Cancer Gene Therapy (2002) 9, 613-623に開示されている。
【０２０５】
本明細書において使用する場合、「ＣＡＲをコードする核酸配列が形質導入された」または「ＣＡＲをコードする核酸配列を形質導入する」という表現は、抗原認識部分およびＴ細胞活性化部分を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列のクローニングを指す。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、Ｔ細胞シグナル伝達ドメインまたはＴ細胞活性化ドメインに結合した抗体の抗原結合ドメイン（例えば、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ））を含有する、人工的に構築されたハイブリッドタンパク質またはポリペプチドである。ＣＡＲを形質導入する方法は、当技術分野で公知であり、例えば、Davila et al. Oncoimmunology. 2012 Dec 1;1 (9):1577-1583、Wang and Riviere Cancer Gene Ther. 2015 Mar;22 (2):85-94)、Maus et al. Blood. 2014 Apr 24;123 (17):2625-35、Porter DL The New England journal of medicine. 2011, 365 (8):725-733、Jackson HJ, Nat Rev Clin Oncol. 2016;13 (6):370-383、およびGloberson-Levin et al. Mol Ther. 2014;22 (5):1029-1038に開示されている。
【０２０６】
特定の実施形態によると、免疫細胞は、Ｂ細胞を含む。
【０２０７】
本明細書において使用する場合、「Ｂ細胞」という用語は、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）＋、ＣＤ１９＋、およびまたはＢ２２０＋の表現型を有するリンパ球を指す。Ｂ細胞は、特異的抗原に結合し、液性応答を引き起こす能力を特徴とする。
【０２０８】
特定の実施形態によると、免疫細胞は、ＮＫ細胞を含む。
【０２０９】
本明細書において使用する場合、「ＮＫ細胞」という用語は、ＣＤ１６＋ＣＤ５６＋および／またはＣＤ５７＋ＴＣＲ−の表現型を有する分化型リンパ球を指す。ＮＫは、「自己」ＭＨＣ／ＨＬＡ抗原を発現できない細胞に結合し、特異的な細胞溶解性酵素の活性化によってこの細胞を死滅させる能力、ＮＫ活性化受容体のリガンドを発現する腫瘍細胞または他の罹患細胞を死滅させる能力、および免疫応答を刺激もしくは阻害するサイトカインと呼ばれるタンパク質分子を放出する能力を特徴とする。
【０２１０】
特定の実施形態によると、免疫細胞は、ＮＫＴ細胞を含む。
【０２１１】
本明細書において使用する場合、「ＮＫＴ細胞」という用語は、セミインバリアントなαβＴ細胞受容体を発現するが、典型的にはＮＫ細胞に関連する種々の分子マーカー（例えばＮＫ１．１）も発現する、特殊化したＴ細胞集団を指す。ＮＫＴ細胞としては、ＮＫ１．１＋およびＮＫ１．１−、ならびにＣＤ４＋、ＣＤ４−、ＣＤ８＋およびＣＤ８−の細胞が挙げられる。ＮＫＴ細胞のＴＣＲは、ＭＨＣ  Ｉ様分子ＣＤ１ｄによって提示される糖脂質抗原を認識するという点で独特である。ＮＫＴ細胞は、炎症または免疫寛容のいずれかを促進するサイトカインを生成する能力があるため、保護効果を有する場合もあれば、有害効果を有する場合もある。
【０２１２】
特定の実施形態によると、免疫細胞は、健康な対象から得る。
【０２１３】
特定の実施形態によると、免疫細胞は、病気（例えば、がん）を患う対象から得る。
【０２１４】
特定の実施形態によると、活性化は、ＣＤ４７を発現する細胞または外因性ＣＤ４７の存在下で行う。
【０２１５】
特定の実施形態によると、活性化は、外因性ＣＤ４７の存在下で行う。
【０２１６】
特定の実施形態によると、外因性ＣＤ４７は、可溶性である。
【０２１７】
他の特定の実施形態によると、外因性ＣＤ４７は、固体支持体に固定化する。
【０２１８】
特定の実施形態によると、活性化は、ＣＤ４７を発現する細胞の存在下で行う。
【０２１９】
特定の実施形態によると、ＣＤ４７を発現する細胞は、病的（罹患）細胞を含む。
【０２２０】
特定の実施形態によると、ＣＤ４７を発現する細胞は、がん細胞を含む。
【０２２１】
特定の実施形態によると、活性化は、細胞の増殖、成熟化、サイトカインの生成、食作用、および／または免疫細胞の調節機能もしくはエフェクター機能の誘導をもたらす、少なくとも一次活性化シグナル［例えば、抗原提示細胞（ＡＰＣ）における主要組織適合抗原（ＭＨＣ）／ペプチド複合体とＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のライゲーション］を伝達することが可能な刺激剤の存在下で行う。特定の実施形態によると、刺激因子剤は、二次共刺激シグナルを伝達することもできる。
【０２２２】
刺激剤の量および刺激剤と免疫細胞との間の比を決定する方法は、十分に当業者の能力の範疇にあるため、本明細書では特定しない。
【０２２３】
刺激剤は、抗原依存的様式または抗原非依存的（すなわちポリクローナル）様式で免疫細胞を活性化することができる。
【０２２４】
特定の実施形態によると、刺激剤は、抗原非特異的な刺激因子を含む。
【０２２５】
非特異的な刺激因子は、当業者に公知である。よって、免疫細胞がＴ細胞を含む場合、抗原非特異的な刺激因子の非限定的な例は、これらに限定されるものではないが、抗ＣＤ２８抗体などの共刺激タンパク質と組み合わせた抗ＣＤ３抗体といった、Ｔ細胞表面構造に結合し、Ｔ細胞のポリクローナル刺激を誘導することが可能な薬剤であり得る。他の非限定的な例としては、単独、または抗ＣＤ３との様々な組み合わせにおける、抗ＣＤ２、抗ＣＤ１３７、抗ＣＤ１３４、Ｎｏｔｃｈリガンド（例えばＤｅｌｔａ様１／４）、Ｊａｇｇｅｄ１／２が挙げられる。Ｔ細胞のポリクローナル刺激を誘導し得る他の薬剤としては、マイトジェン、ＰＨＡ、ＰＭＡ−イオノマイシン、ＣＥＢ、およびＣｙｔｏＳｔｉｍ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態によると、抗原非特異的な刺激因子は、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を含む。特定の実施形態によると、Ｔ細胞刺激因子は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社から得られる、ＣＤ３ＣＤ２８  ＭＡＣＳｉＢｅａｄｓなどの抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８被覆ビーズを含む。
【０２２６】
特定の実施形態によると、刺激剤は、抗原特異的な刺激因子を含む。
【０２２７】
抗原特異的なＴ細胞刺激因子の非限定的な例としては、抗原を担持した抗原提示細胞［ＡＰＣ、例えば樹状細胞］、およびペプチドを担持した組換えＭＨＣが挙げられる。よって、例えば、Ｔ細胞刺激因子は、所望の抗原（例えば腫瘍抗原）を予め担持しておいた樹状細胞、または所望の抗原をコードするｍＲＮＡをトランスフェクトした樹状細胞であり得る。
【０２２８】
特定の実施形態によると、抗原は、がん抗原である。
【０２２９】
本明細書において使用する場合、「がん抗原」という用語は、抗原が、がん性細胞によって、非がん性細胞と比較して過剰発現されること、またはがん性細胞のみによって発現されることを指す。がん抗原は、公知のがん抗原、またはがん細胞において発生する新たな特異的抗原（すなわちネオ抗原）であり得る。
【０２３０】
公知のがん抗原の非限定的な例としては、ＭＡＧＥ−ＡＩ、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−ＡＳ、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ７、ＭＡＧＥ−ＡＳ、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−ＡＩＯ、ＭＡＧＥ−Ａｌｌ、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＧＡＧＥ−Ｉ、ＧＡＧＥ−２、ＧＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−４、ＧＡＧＥ−５、ＧＡＧＥ−６、ＧＡＧＥ−７、ＧＡＧＥ−８、ＢＡＧＥ−ｌ、ＲＡＧＥ−１、ＬＢ３３／ＭＵＭ−１、ＰＲＡＭＥ、ＮＡＧ、ＭＡＧＥ−Ｘｐ２（ＭＡＧＥ−Ｂ２）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ３（ＭＡＧＥ−Ｂ３）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ４（ＭＡＧＥ−Ｂ４）、ＭＡＧＥ−Ｃｌ／ＣＴ７、ＭＡＧＥ−Ｃ２、ＮＹ−ＥＳ０−１、ＬＡＧＥ−１、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−２（ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０）、ＳＳＸ−３、ＳＳＸ−４、ＳＳＸ−５、ＳＣＰ−１およびＸＡＧＥ、メラノサイト分化抗原、ｐ５３、ｒａｓ、ＣＥＡ、ＭＵＣＩ、ＰＭＳＡ、ＰＳＡ、チロシナーゼ、メランＡ、ＭＡＲＴ−Ｉ、ｇｐｌＯＯ、ｇｐ７５、アルファアクチニン−４、Ｂｃｒ−Ａｂｌ融合タンパク質、Ｃａｓｐ−８、ベータ−カテニン、ｃｄｃ２７、ｃｄｋ４、ｃｄｋｎ２ａ、ｃｏａ−１、ｄｅｋ−ｃａｎ融合タンパク質、ＥＦ２、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１融合タンパク質、ＬＤＬＲ−フコシルトランスフェラーゼＡＳ融合タンパク質、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａｌｌ、ｈｓｐ７０−２、ＫＩＡＡ０２０５、Ｍａｒｔ２、Ｍｕｍ−２および３、ｎｅｏ−ＰＡＰ、ミオシンクラスＩ、ＯＳ−９、ｐｍｌ−ＲＡＲアルファ融合タンパク質、ＰＴＰＲＫ、Ｋ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ＧｎＴＶ、Ｈｅｒｖ−Ｋ−ｍｅｌ、ＮＡ−８８、ＳＰ１７、およびＴＲＰ２−Ｉｎｔ２、（ＭＡＲＴ−Ｉ）、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲ、エプスタイン・バーウイルス抗原、ＥＢＮＡ、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６およびＥ７、ＴＳＰ−１８０、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐｌＳＯｅｒｂＢ−３、ｃ−ｍｅｔ、ｎｍ−２３Ｈｌ、ＰＳＡ、ＴＡＧ−７２−４、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＣＡＭ１７．１、ＮｕＭａ、Ｋ−ｒａｓ、アルファ−フェトプロテイン、１３ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３（ＣＡ２７．２９＼ＢＣＡＡ）、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、ＣＡ−５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８＼ＫＰ１、Ｃ０−０２９、ＦＧＦ−５、０２５０、Ｇａ７３３（ＥｐＣＡＭ）、ＨＴｇｐ−１７５、Ｍ３４４、ＭＡ−５０、ＭＧ７−Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ＼１７０Ｋ、ＮＹＣＯ−Ｉ、ＲＣＡＳＩ、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ−９０（Ｍａｃ−２結合タンパク質＼シクロフィリンＣ関連タンパク質）、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、ＴＰＳ、チロシナーゼ関連タンパク質、ＴＲＰ−１、またはＴＲＰ−２が挙げられる。
【０２３１】
発現させることができる他の腫瘍抗原は、当技術分野で周知である（例えば、国際公開第００／２０５８１号、Cancer Vaccines and Immunotherapy (2000) Eds Stern, Beverley and Carroll, Cambridge University Press, Cambridgeを参照されたい）。これらの腫瘍抗原の配列は、公知データベースから容易に入手可能であるが、国際公開第１９９２／０２０３５６号Ａ１、国際公開第１９９４／００５３０４号Ａ１、国際公開第１９９４／０２３０３１号Ａ１、国際公開第１９９５／０２０９７４号Ａ１、国際公開第１９９５／０２３８７４号Ａ１、および国際公開第１９９６／０２６２１４号Ａ１でも確認することができる。
【０２３２】
上記の代わりに、または上記に加えて、腫瘍抗原は、例えば生検によって対象から得られたがん細胞を使用して識別することもできる。
【０２３３】
よって、特定の実施形態によると、刺激剤は、がん細胞を含む。
【０２３４】
特定の実施形態によると、活性化することは、抗がん剤の存在下で行われる。
【０２３５】
特定の実施形態によると、免疫細胞は、活性化の後に精製する。
【０２３６】
よって、本発明は、本発明の方法によって得ることができる単離された免疫細胞も企図する。
【０２３７】
特定の実施形態によると、本発明において使用するおよび／または得られる免疫細胞は、新鮮に単離し、例えば液体窒素温度において、任意の段階で、将来使用するために長期間（例えば、数か月、数年）にわたって保存（例えば凍結保存）（すなわち冷凍）されたもの、および細胞株であり得る。
【０２３８】
凍結保存の方法は、当業者に広く公知であり、例えば、国際公開第２００７／０５４１６０号および同第２００１／０３９５９４号、ならびに米国特許出願公開第２０１２／０１４９１０８号明細書に開示されている。
【０２３９】
特定の実施形態によると、本発明によって得られる細胞は、細胞バンクまたは保管所または保存施設において保存されてもよい。
【０２４０】
結果として、本教示は、免疫細胞の活性化によって恩恵を受け得る疾患（例えば過剰増殖性疾患）や、免疫抑制および感染症に関連する疾患のための養子免疫細胞療法の原料としての、本発明の単離された免疫細胞の使用および方法をさらに示唆するが、これに限定されるものではない。
【０２４１】
よって、特定の実施形態によると、本発明の方法は、免疫細胞の養子移入を必要とする対象に対して、活性化の後に免疫細胞を養子移入することを含む。
【０２４２】
特定の実施形態によると、養子細胞療法において使用するための、本発明の方法によって得ることができる免疫細胞を提供する。
【０２４３】
本発明の特定の実施形態において使用する細胞は、自家性であっても非自家性であってもよく、同系であっても非同系であってもよく、対象に対して同種であっても異種であってもよい。それぞれの可能な態様が、本発明の別個の実施形態を表す。
【０２４４】
本教示はまた、免疫細胞を活性化することによって恩恵を受け得る疾患を処置する方法における、本発明の組成物（例えば、融合タンパク質、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドもしくは核酸構築物、または融合タンパク質を発現する宿主細胞）の使用を企図する。
【０２４５】
よって、本発明の別の態様によると、免疫細胞の活性化による恩恵を受け得る疾患を処置する方法であって、疾患の処置を必要とする対象に対して、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドもしくは核酸構築物、またはＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質をコードする宿主細胞を投与することを含む、方法を提供する。
【０２４６】
本発明の別の態様によると、免疫細胞の活性化による恩恵を受け得る疾患の処置に使用するための、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドもしくは核酸構築物、またはＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質をコードする宿主細胞を提供する。
【０２４７】
「処置すること」または「処置」という用語は、病気（疾患、障害、または医学的状態）の発症を阻害、防止、もしくは抑止すること、および／または病気もしくは病気の症状の低減、軽快、もしくは軽減をもたらすことを指す。当業者は、病気の発症を評価するために様々な方法論およびアッセイを使用することができ、同様に、病気の低減、軽快、または軽減を評価するために様々な方法論およびアッセイが使用可能であることが理解されよう。
【０２４８】
本明細書において使用する場合、「対象」という用語には、任意の年齢および任意の性別の哺乳動物、例えば、ヒトが含まれる。特定の実施形態によると、「対象」という用語は、病気（疾患、障害、または医学的状態）を患う対象を指す。特定の実施形態によると、この用語には、病気を発症するリスクの個体が包含される。
【０２４９】
特定の実施形態によると、対象は、ＣＤ４７を発現する細胞に関連する疾患に罹患している。
【０２５０】
特定の実施形態によると、対象の罹患細胞はＣＤ４７を発現する。
【０２５１】
本明細書において使用する場合、「免疫細胞の活性化による恩恵を受け得る疾患」という表現は、対象の免疫応答活性が、少なくとも疾患の症状を寛解させるまたは症状の発症を遅延させるには十分であり得るが、これを行う対象の免疫応答の活性が何らかの理由で最適未満である疾患を指す。
【０２５２】
免疫細胞の活性化による恩恵を受け得る疾患の非限定的な例としては、過剰増殖性疾患、免疫抑制に関連する疾患、薬物（例えば、ｍＴＯＲ阻害剤、カルシニューリン阻害剤、ステロイド）により引き起こされる免疫抑制、および感染症が挙げられる。
【０２５３】
特定の実施形態によると、疾患は、過剰増殖性疾患を含む。
【０２５４】
特定の実施形態によると、過剰増殖性疾患は、硬化症もしくは線維症、特発性肺線維症、乾癬、全身性硬化症／強皮症、原発性胆汁性胆管炎、原発性硬化性胆管炎、肝線維症、放射線誘発肺線維症の防止、骨髄線維症または後腹膜線維症を含む。
【０２５５】
他の特定の実施形態によると、過剰増殖性疾患は、がんを含む。
【０２５６】
よって、本発明の別の態様によると、がんの処置を必要とする対象に、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質を投与することを含む、がんを処置する方法を提供する。
【０２５７】
本明細書において使用する場合、がんという用語には、悪性がんおよび前悪性がんの両方が包含される。
【０２５８】
前悪性または良性形態のがんに関しては、任意選択で、前悪性がんが悪性形態に進行することを停止するために、本組成物およびその方法を適用することができる。
【０２５９】
本発明の一部の実施形態の方法によって処置され得るがんは、任意の固形がんもしくは非固形がん、および／または転移がんであり得る。
【０２６０】
特定の実施形態によると、がんは、悪性がんを含む。
【０２６１】
がんの例としては、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病が挙げられるが、これらに限定されない。このようながんのより具体的な例としては、扁平上皮がん、肺がん（小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺腺癌、および肺扁平上皮癌を含む）、腹膜がん、肝細胞がん、（胃腸がんを含む）胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒまたはｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、膵がん、神経膠芽腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝がん、膀胱がん、肝細胞腫、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓がんまたは腎がん、肝がん、前立腺がん、外陰がん、甲状腺がん、肝癌および様々な種類の頭頸部がん、ならびにＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小型非切れ込み核細胞性ＮＨＬ；巨大腫瘤病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；およびワルデンシュトレームマクログロブリン血症を含む）；Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）、ヘアリーセル白血病；慢性骨髄芽球性白血病（ＣＭＬ）；および移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）、ならびに母斑症に関連する異常な血管増殖、浮腫（例えば脳腫瘍に関連するもの）、およびメイグス症候群が挙げられる。好ましくは、がんは、乳がん、結腸直腸がん、直腸がん、非小細胞肺がん、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、腎細胞がん、前立腺がん、肝がん、膵がん、軟部組織肉腫、カポジ肉腫、カルチノイド癌腫、頭頸部がん、黒色腫、卵巣がん、中皮腫、および多発性骨髄腫からなる群から選択される。本発明の処置に適したがん性状態としては、転移性がんが挙げられる。
【０２６２】
特定の実施形態によると、がんは、前悪性がんを含む。
【０２６３】
前悪性がん（または前がん）は、十分に特徴付けられ、当技術分野で公知である（例えば、Berman JJ. and Henson DE., 2003. Classifying the precancers: a metadata approach. BMC Med Inform Decis Mak. 3:8を参照されたい）。本発明の方法による処置に適した前悪性がんのクラスとしては、後天的な小型または顕微鏡的前悪性がん、核異型を伴う後天的な大型病変、がんへと進行する遺伝性過形成症候群と共に起こる前駆病変、ならびに後天的なびまん性過形成およびびまん性異形成が挙げられる。小型または顕微鏡的前悪性がんの例としては、ＨＧＳＩＬ（子宮頸部の高悪性度扁平上皮内病変）、ＡＩＮ（肛門上皮内腫瘍）、声帯の形成異常、（結腸の）異常腺窩巣、ＰＩＮ（前立腺上皮内腫瘍）が挙げられる。核異型を伴う後天的な大型病変の例としては、管状腺腫、ＡＩＬＤ（タンパク異常血症を伴う血管免疫芽球性リンパ節症）、非定型髄膜腫、胃ポリープ、大斑型の類乾癬、骨髄形成異常、乳頭状移行上皮内癌、過剰な芽細胞を伴う難治性貧血、およびシュナイダー乳頭腫が挙げられる。がんへと進行する遺伝性過形成症候群と共に起こる前駆病変の例としては、異常なほくろ症候群（ａｔｙｐｉｃａｌ  ｍｏｌｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、Ｃ細胞腺腫症（Ｃ  ｃｅｌｌ  ａｄｅｎｏｍａｔｏｓｉｓ）、およびＭＥＡが挙げられる。後天的なびまん性過形成およびびまん性異形成の例としては、ＡＩＤＳ、非定型リンパ増殖、骨パジェット病、移植後リンパ増殖性疾患、および潰瘍性大腸炎が挙げられる。
【０２６４】
本発明の一部の実施形態では、ＳＩＲＰαまたはそのＥＣＤと４１ＢＢＬまたはそのＥＣＤとを含む融合タンパク質、例えばＳＩＲＰα−Ｇ−４１ＢＢＬ、によって処置される疾患は、白血病、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）、急性前駆Ｂリンパ芽球性白血病（ｐｒｅ−Ｂ  ＡＬＬ）、平滑筋肉腫、卵巣がん、乳がん、結腸がん、膀胱がん、神経膠芽腫、肝細胞癌、前立腺がん、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、多発性骨髄腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、結腸直腸がん、黒色腫、頭頸部がん、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、膵管腺癌、脳がんである。
【０２６５】
本発明の一部の実施形態によると、ＳＩＲＰαまたはそのＥＣＤと４１ＢＢＬまたはそのＥＣＤとを含む融合タンパク質、例えばＳＩＲＰα−Ｇ−４１ＢＢＬ、によって処置される疾患の適応症は、急性骨髄性白血病、膀胱がん、乳がん、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸直腸がん、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、卵巣上皮がん、上皮性腫瘍、卵管がん、濾胞性リンパ腫、多形神経膠芽腫、肝細胞癌、頭頸部がん、白血病、リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、黒色腫、中皮腫、多発性骨髄腫、上咽頭がん、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、卵巣がん、前立腺がん、腎細胞癌である。
【０２６６】
特定の実施形態によると、がんは、リンパ腫、白血病、結腸がん、膵がん、卵巣がん、肺がん、および扁平上皮癌からなる群から選択される。
【０２６７】
特定の実施形態によると、がんは、リンパ腫、癌腫、および白血病からなる群から選択される。
【０２６８】
特定の実施形態によると、がんは、結腸癌である。
【０２６９】
特定の実施形態によると、がんは、卵巣癌である。
【０２７０】
特定の実施形態によると、がんは、肺癌である。
【０２７１】
特定の実施形態によると、がんは、頭頸部癌である。
【０２７２】
特定の実施形態によると、がんは、白血病である。
【０２７３】
特定の実施形態によると、白血病は、急性非リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性顆粒球白血病、慢性顆粒球白血病、急性前骨髄球性白血病、成人Ｔ細胞白血病、非白血性白血病、白血球性（ｌｅｕｋｏｃｙｔｈｅｍｉｃ）白血病、好塩基球性白血病、芽細胞白血病、ウシ白血病、慢性骨髄球性白血病、皮膚白血病、胎生細胞性白血病、好酸球性白血病、グロス白血病、ヘアリーセル白血病、血球母細胞性（ｈｅｍｏｂｌａｓｔｉｃ）白血病、血球芽細胞性（ｈｅｍｏｃｙｔｏｂｌａｓｔｉｃ）白血病、組織球白血病、幹細胞白血病、急性単球性白血病、白血球減少性白血病、リンパ性白血病、リンパ芽球性白血病、リンパ球性白血病、リンパ向性白血病、リンパ様白血病、リンパ肉腫細胞白血病、マスト細胞白血病、巨核球性白血病、小骨髄芽球性白血病、単球性白血病、骨髄芽球性白血病、骨髄球性白血病、骨髄顆粒球白血病、骨髄単球性白血病、ネーゲリ白血病、形質細胞白血病、形質細胞性白血病、前骨髄球性白血病、Ｒｉｅｄｅｒ細胞白血病、Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ白血病、幹細胞白血病、亜白血性白血病、および未分化細胞白血病からなる群から選択される。
【０２７４】
特定の実施形態によると、白血病は、前骨髄球性白血病、急性骨髄性白血病、または慢性骨髄性白血病である。
【０２７５】
特定の実施形態によると、がんは、リンパ腫である。
【０２７６】
特定の実施形態によると、リンパ腫は、Ｂ細胞リンパ腫である。
【０２７７】
特定の実施形態によると、リンパ腫は、Ｔ細胞リンパ腫である。
【０２７８】
他の特定の実施形態によると、リンパ腫は、ホジキンリンパ腫である。
【０２７９】
特定の実施形態によると、リンパ腫は、非ホジキンリンパ腫である。
【０２８０】
特定の実施形態によると、非ホジキンリンパ腫は、侵襲性ＮＨＬ、形質転換ＮＨＬ、緩徐進行性ＮＨＬ、再発性ＮＨＬ、難治性ＮＨＬ、低悪性度非ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、大細胞型リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、ＮＫ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、急性リンパ芽球性リンパ腫、および菌状息肉症／Ｓｅｚｒｙ症候群を含む皮膚Ｔ細胞がんからなる群から選択される。
【０２８１】
特定の実施形態によると、がんは、多発性骨髄腫である。
【０２８２】
少なくとも一部の実施形態によると、多発性骨髄腫は、カッパ型の軽鎖および／またはラムダ型の軽鎖を生成する多発性骨髄腫がん；原発性形質細胞白血病（ＰＣＬ）を含む侵襲性多発性骨髄腫；多発性骨髄腫へと進行し得るＭＧＵＳ（良性単クローン性ガンマグロブリン血症）、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症（ＷＭ、別名、リンパ形質細胞性リンパ腫）などの良性形質細胞障害；くすぶり型多発性骨髄腫（ＳＭＭ）、緩徐進行性多発性骨髄腫、同様に多発性骨髄腫へと進行し得る前悪性形態の多発性骨髄腫；原発性アミロイドーシスからなる群から選択される。
【０２８３】
ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬの推奨する作用様式
本発明の一実施形態において、キメラＳＩＲＰα−４１ＢＢＬは、以下の可能な作用様式によって、がんを処置するために使用することができる。
【０２８４】
・腫瘍細胞の表面および腫瘍微小環境におけるＣＤ４７の発現が比較的高いことから、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬキメラのＳＩＲＰα部分は、分子の標的を腫瘍部位および転移部位に定め、腫瘍微小環境内のＣＤ４７にキメラを結合させる。
【０２８５】
・キメラの標的を腫瘍細胞または／および腫瘍微小環境に定めることにより、腫瘍微小環境内のＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ濃度が増加し、その後、腫瘍部位においてキメラの４−１ＢＢＬ部分がオリゴマー化することが容易になる。４−１ＢＢＬのオリゴマー化は４−１ＢＢシグナル伝達に必要なステップであるため、この４−１ＢＢＬの結合およびオリゴマー化は、腫瘍部位におけるＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、特に腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、および他の免疫細胞の活性化を促進する４−１ＢＢ共刺激シグナルを送達して、がん細胞を死滅させる。
【０２８６】
・４１ＢＢＬ−４１ＢＢ共刺激シグナルに加えて、キメラのＳＩＲＰα部分が腫瘍部位においてＣＤ４７と結合し、マクロファージおよび樹状細胞で発現する内因性ＳＩＲＰαと競合することにより、これらの細胞に対する阻害作用が取り除かれ、腫瘍微小環境における腫瘍細胞の食作用ならびに樹状細胞およびＴ細胞の活性化にさらに寄与する。
【０２８７】
上記のＳＩＲＰΑ−４１ＢＢＬの活性は、腫瘍微小環境におけるＴＩＬ、樹状細胞、およびマクロファージの活性化に対して相乗効果をもたらすと期待される。この相乗効果は、各ペプチドまたはそのＥＣＤのそれぞれ単独の効果、ならびに２つの異なるペプチドまたはそのＥＣＤを併用した場合と比較して、より特異的かつロバストな効果であることが予想される。
【０２８８】
よって、特定の実施形態によると、がんは、腫瘍微小環境内に腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を有する腫瘍および／または腫瘍微小環境内でＣＤ４７が発現する腫瘍の存在によって定義される。
【０２８９】
特定の実施形態によると、がんは、腫瘍微小環境内に腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を有する腫瘍および／または腫瘍微小環境内でＣＤ４７が比較的高発現する腫瘍の存在によって定義される。
【０２９０】
特定の実施形態によると、がんの細胞はＣＤ４７を発現する。
【０２９１】
特定の実施形態によると、疾患は、免疫抑制に関連する疾患、または薬物（例えばｍＴＯＲ阻害剤、カルシニューリン阻害剤、ステロイド）により引き起こされる免疫抑制を含む。
【０２９２】
特定の実施形態によると、疾患は、ＨＩＶ、麻疹、インフルエンザ、ＬＣＣＭ、ＲＳＶ、ヒトライノウイルス、ＥＢＶ、ＣＭＶ、パルボウイルスによるものを含む。
【０２９３】
特定の実施形態によると、疾患は、感染症を含む。
【０２９４】
本明細書において使用する場合、「感染症」または「感染性疾患」という用語は、病原体によって引き起こされる疾患を指す。病原体の特定例としては、ウイルス病原体、細菌病原体、例えば、細胞内マイコバクテリア病原体（例えば、Mycobacterium tuberculosisなど）、細胞内細菌病原体（例えば、Listeria monocytogenesなど）、または細胞内原虫病原体（例えば、LeishmaniaおよびTrypanosomaなど）が挙げられる。
【０２９５】
本発明の教示に従って処置可能な感染性疾患を引き起こす特定の種類のウイルス病原体としては、レトロウイルス、サーコウイルス、パルボウイルス、パポーバウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、イリドウイルス、ポックスウイルス、ヘパドナウイルス、ピコルナウイルス、カリシウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、オルソミクソウイルス、パラミクソウイルス、ラブドウイルス、ブニヤウイルス、コロナウイルス、アレナウイルス、およびフィロウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２９６】
本発明の教示に従って処置され得るウイルス感染症の特定例としては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）誘導性後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、インフルエンザ、ライノウイルス感染症、ウイルス性髄膜炎、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）感染症、Ａ型、Ｂ型、またはＣ型肝炎ウイルス感染症、麻疹、パピローマウイルス感染症／疣贅、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染症、単純ヘルペスウイルス感染症、黄熱、エボラウイルス感染症、狂犬病などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２９７】
特定の実施形態によると、本発明の組成物（例えば、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドもしくは核酸構築物、および／またはＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質を発現する宿主細胞）は、鎮痛薬、化学療法剤、放射線治療剤、細胞傷害性療法（コンディショニング）、ホルモン療法、抗体、および当技術分野で周知の他の処置レジメン（例えば、手術）を含むが、これらに限定されない、免疫細胞の活性化による恩恵を受け得る疾患（例えば、がん）を処置するための他の確立された治療レジメンまたは実験的な治療レジメンと組み合わせて、対象に投与することができる。
【０２９８】
特定の実施形態によると、本発明の組成物（例えば、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドもしくは核酸構築物、および／またはＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質を発現する宿主細胞）は、骨髄細胞、造血幹細胞、ＰＢＭＣ、臍帯血幹細胞、および／または誘導多能性幹細胞の移植などの養子細胞移植と組み合わせて、対象に投与することができるが、これに限定されるものではない。
【０２９９】
特定の実施形態によると、本発明の組成物と組み合わせて投与される治療剤は、抗がん剤を含む。
【０３００】
よって、本発明の別の態様によると、がんの処置を必要とする対象に、抗がん剤と、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質をコードする核酸構築物、またはＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質を発現する宿主細胞とを投与することを含む、がんを処置する方法を提供する。
【０３０１】
本発明の特定の実施形態と共に使用することができる抗がん剤としては、抗がん薬であるアシビシン、アクラルビシン、アコダゾール塩酸塩、アクロニン、アドリアマイシン、アドゼレシン、アルデスロイキン、アルトレタミン、アンボマイシン、酢酸アメタントロン、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アントラマイシン、アスパラギナーゼ、アスペルリン、アザシチジン、アゼテパ、アゾトマイシン、バチマスタット、ベンゾデパ、ビカルタミド、ビサントレン塩酸塩、メシル酸ビスナフィド、ビセレシン、ブレオマイシン硫酸塩、ブレキナルナトリウム、ブロピリミン、ブスルファン、カクチノマイシン、カルステロン、カラセミド、カルベチマー、カルボプラチン、カルムスチン、カルビシン塩酸塩、カルゼレシン、セデフィンゴール、クロラムブシル、シロレマイシン、シスプラチン、クラドリビン、メシル酸クリスナトール、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン塩酸塩、デシタビン、デキソルマプラチン、デザグアニン、メシル酸デザグアニン、ジアジコン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ドキソルビシン塩酸塩、ドロロキシフェン、ドロロキシフェンクエン酸塩、プロピオン酸ドロモスタノロン、デュアゾマイシン、エダトレキサート、塩酸エフロルニチン、エルサミトルシン、エンロプラチン、エンプロマート、エピプロピジン、エピルビシン塩酸塩、エルブロゾール、エソルビシン塩酸塩、エストラムスチン、リン酸エストラムスチンナトリウム、エタニダゾール、エトポシド、リン酸エトポシド、エトプリン、塩酸ファドロゾール、ファザラビン、フェンレチニド、フロクスウリジン、リン酸フルダラビン、フルオロウラシル、フルロシタビン、ホスキドン、ホストリエシンナトリウム、ゲムシタビン、ゲムシタビン塩酸塩、ヒドロキシ尿素、イダルビシン塩酸塩、イホスファミド、イルモホシン、インターフェロンアルファ−２ａ、インターフェロンアルファ−２ｂ、インターフェロンアルファ−ｎ１、インターフェロンアルファ−ｎ３、インターフェロンベータ−Ｉａ、インターフェロンガンマ−Ｉｂ、イプロプラチン、イリノテカン塩酸塩、ランレオチド酢酸塩、レトロゾール、リュープロリド酢酸塩、リアロゾール塩酸塩、ロメトレキソールナトリウム、ロムスチン、ロソキサントロン塩酸塩、マソプロコール、マイタンシン、塩酸メクロレタミン、酢酸メゲストロール、酢酸メレンゲストロール、メルファラン、メノガリル、メルカプトプリン、メトトレキサート、メトトレキサートナトリウム、メトプリン、メツレデパ、ミチンドミド、ミトカルシン、ミトクロミン、ミトギリン、ミトマルシン、マイトマイシン、ミトスペル、ミトタン、ミトキサントロン塩酸塩、ミコフェノール酸、ノコダゾール、ノガラマイシン、オルマプラチン、オキシスラン、パクリタキセル、ペグアスパラガーゼ、ペリオマイシン、ペンタムスチン、ペプロマイシン硫酸塩、ペルホスファミド、ピポブロマン、ピポスルファン、ピロキサントロン塩酸塩、プリカマイシン、プロメスタン、ポルフィマーナトリウム、ポルフィロマイシン、プレドニムスチン、プロカルバジン塩酸塩、ピューロマイシン、ピューロマイシン塩酸塩、ピラゾフリン、リボプリン、ログレチミド、サフィンゴール、サフィンゴール塩酸塩、セムスチン、シムトラゼン、スパルフォセート二ナトリウム、スパルソマイシン、スピロゲルマニウム塩酸塩、スピロムスチン、スピロプラチン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、スロフェヌル、タリソマイシン、タキソール、テコガランナトリウム、テガフール、テロキサントロン塩酸塩、テモポルフィン、テニポシド、テロキシロン、テストラクトン、チアミプリン、チオグアニン、チオテパ、チアゾフリン、チラパザミン、トポテカン塩酸塩、トレミフェンクエン酸塩、酢酸トレストロン、リン酸トリシリビン、トリメトレキサート、グルクロン酸トリメトレキサート、トリプトレリン、ツブロゾール塩酸塩、ウラシルマスタード、ウレデパ、バプレオチド、ベルテポルフィン、ビンブラスチン硫酸塩、ビンクリスチン硫酸塩、ビンデシン、ビンデシン硫酸塩、硫酸ビネピジン、硫酸ビングリシナート、硫酸ビンロイロシン、ビノレルビン酒石酸塩、硫酸ビンロシジン、硫酸ビンゾリジン、ボロゾール、ゼニプラチン、ジノスタチン、ゾルビシン塩酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。さらなる抗悪性腫瘍剤としては、Goodman and Gilman's "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Eighth Edition, 1990, McGraw-Hill, Inc. (Health Professions Division)の第５２章のAntineoplastic Agents (Paul Calabresi and Bruce A. Chabner)、およびその序章である、1202-1263頁に開示されているものが挙げられる。
【０３０２】
特定の実施形態によると、抗がん剤は抗体を含む。
【０３０３】
特定の実施形態によると、抗体は、リツキシマブ、セツキシマブ、トラスツズマブ、エドレコロマブ、アレムツズマブ、ゲムツズマブ、イブリツモマブ、パニツムマブ、ベリムマブ、ベバシズマブ、ビバツズマブメルタンシン、ブリナツモマブ、ブロンツベトマブ、ブレンツキシマブベドチン、カツマキソマブ、シズツムマブ、ダクリズマブ、アダリムマブ、ベズロトクスマブ、セルトリズマブペゴール、シタツズマブボガトクス、ダラツムマブ、ジヌツキシマブ、エロツズマブ、エルツマキソマブ、エタラシズマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、ギレンツキシマブ、ネシツムマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、ペルツズマブ、ラムシルマブ、シルツキシマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、およびイピリムマブからなる群から選択される。
【０３０４】
特定の実施形態によると、抗体は、リツキシマブおよびセツキシマブからなる群から選択される。
【０３０５】
特定の実施形態によると、本発明の組成物と組み合わせて投与される治療剤は、抗感染症剤（例えば、抗生物質および抗ウイルス剤）を含む。
【０３０６】
特定の実施形態によると、本発明の組成物と組み合わせて投与される治療剤は、免疫抑制剤（例えば、ＧＣＳＦおよび他の骨髄刺激因子、ステロイド）を含む。
【０３０７】
特定の実施形態によると、併用療法には、相加効果がある。
【０３０８】
特定の実施形態によると、併用療法には、相乗効果がある。
【０３０９】
本発明の別の態様によると、免疫細胞の活性化による恩恵を受け得る疾患の処置のために特定された製品であって、当該疾患を処置するための治療剤をパッケージングするパッケージング材料と、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質をコードする核酸構築物、またはＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質を発現する宿主細胞とを含む、製品を提供する。
【０３１０】
特定の実施形態によると、疾患を処置するための治療剤と、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質をコードする核酸構築物、またはＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質を発現する宿主細胞とを、別々の容器に収容する。
【０３１１】
特定の実施形態によると、当該疾患を処置するための治療剤と、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドもしくは核酸、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質をコードする核酸構築物、またはＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質を発現する宿主細胞とを、合剤として収容する。
【０３１２】
本明細書において使用する場合、一実施形態において、「アミノ酸誘導体」または「誘導体」という用語は、本明細書に記載および例示されるように、天然のアミノ酸または非天然のアミノ酸から誘導可能な群を指す。アミノ酸誘導体は当業者にとって明らかであり、限定されるものではないが、天然のアミノ酸および非天然のアミノ酸のエステル、アミノアルコール、アミノアルデヒド、アミノラクトン、およびＮ−メチル誘導体を含む。ある実施形態では、本明細書に記載の化合物の置換基としてアミノ酸誘導体が提供され、この置換基は、−ＮＨ−Ｇ（Ｓｃ）−Ｃ（Ｏ）−Ｑまたは−ＯＣ（Ｏ）Ｇ（Ｓｃ）−Ｑである（式中、Ｑは、−ＳＲ、−ＮＲＲ、またはアルコキシルであり、Ｒは、水素またはアルキルであり、Ｓｃは、天然のアミノ酸または非天然のアミノ酸の側鎖であり、Ｇは、Ｃ１〜Ｃ２アルキルである）。ある特定の実施形態では、Ｇは、Ｃｉアルキルであり、Ｓｃは、水素、アルキル、ヘテロアルキル、アリールアルキル、およびヘテロアリールアルキルからなる群から選択される。
【０３１３】
本明細書において使用する場合、一実施形態において、本明細書において交換可能に使用される「ペプチド」、「ポリペプチド」、または「タンパク質」という用語は、天然の生物学的起源に由来するものでも、合成されたものでも、または組換え技術によって作製されたものでもよい。化学合成によるものを含め、ペプチドまたはタンパク質合成の技術分野において公知の任意の様式で作出されてもよい。固相ペプチド合成については、多くの技術の概要を、J. M. Stewart and J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, W. H. Freeman Co. (San Francisco), 1963、およびJ. Meienhofer, Hormonal Proteins and Peptides, vol. 2, p. 46, Academic Press (New York), 1973において確認することができる。従来型の溶液合成については、G. Schroder and K. Lupke, The Peptides, vol. 1, Academic Press (New York), 1965を参照されたい。アミノ酸のうちの１つまたは複数は、例えば、炭水化物基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、アシル基（例えば、アセチル基）、コンジュゲーションや官能化のためのリンカー、または他の公知の保護基／ブロッキング基などの化学物質の付加によって修飾されてもよい。ペプチドまたはタンパク質に対する修飾は、例えば、遺伝子合成、エキソヌクレアーゼ欠失による部位指向性（例えば、ＰＣＲベースの）突然変異誘発もしくはランダム突然変異誘発（例えば、ＥＭＳ）によって、化学修飾によって、または異種ドメインもしくは結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の融合によって導入することができる。
【０３１４】
本明細書において使用する場合、一実施形態において、「ペプチド」という用語は、前述のペプチドの断片、誘導体、類似体、または変異体、およびこれらの任意の組み合わせであり得る。ペプチドの断片には、この用語または表現を本明細書において使用する場合、タンパク質分解断片ならびに欠失断片が含まれる。ペプチドの変異体には、アミノ酸の置換、欠失、または挿入によってアミノ酸配列が改変された断片およびペプチドが含まれる。
【０３１５】
変異体は、天然のものであっても、非天然のものであってもよい。例としては、融合タンパク質、１つまたは複数の残基が機能性側鎖の反応によって化学的に誘導体化されたペプチド、および２０種の標準的なアミノ酸の天然のアミノ酸誘導体を１つまたは複数含有するペプチドが挙げられる。こうした修飾は、Ｄ−アミノ酸、または他の非コードアミノ酸の組み込みを含む場合もある。一実施形態において、修飾のうちのいずれも、ペプチドやその断片の所望の生物学的活性に実質的に干渉してはならない。別の実施形態では、修飾は、ペプチドやその断片の所望の生物学的活性に干渉することなく、ペプチドやその断片の特徴、例えば安定性または半減期を改変し得る。一実施形態では、本明細書において使用する場合、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、すべて同じ意味および資質を有し、交換可能に使用され得る。
【０３１６】
一実施形態において、発現されるコード配列は、回収を容易にするために、本発明のペプチドをコードし、切断可能部分と融合するように、工学的に操作することができる。一実施形態において、融合タンパク質は、アフィニティークロマトグラフィーにより、例えば、切断可能部分に対して特異的なカラムに固定化することにより、ペプチドが容易に単離され得るように設計することができる。一実施形態では、ペプチドと切断可能部分との間に切断部位を工学的操作で設け、この部位で融合タンパク質を特異的に切断する適切な酵素または薬剤を用いて処置することにより、クロマトグラフィーカラムからペプチドを遊離させることができる［例えば、Booth et al., Immunol. Lett. 19:65-70 (1988)、およびGardella et al., J. Biol. Chem. 265:15854-15859 (1990)を参照されたい］。
【０３１７】
一実施形態において、本発明の融合タンパク質を形成するペプチドのそれぞれ（ここでは「ペプチド（ｔｈｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ）」とも呼ばれる）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現系を使用して合成することもできる。一実施形態において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成法は当技術分野で周知であり、システムの構成要素は市販されている。
【０３１８】
一実施形態において、本発明のペプチドの作製は、組換えＤＮＡ技術を使用する。「組換え」ペプチドまたはタンパク質とは、組換えＤＮＡ技術によって作製された、すなわち、所望のペプチドまたはタンパク質をコードする外因性ＤＮＡ構築物によって形質転換された細胞によって生成された、ペプチドまたはタンパク質を指す。
【０３１９】
よって、本発明の別の態様によると、上述の融合タンパク質のいずれかをコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【０３２０】
特定の実施形態によると、ポリヌクレオチドは、配列番号８の核酸配列を含む。
【０３２１】
特定の実施形態によると、ポリヌクレオチドは、配列番号８の核酸配列からなる。
【０３２２】
特定の実施形態によると、ポリヌクレオチドは、配列番号８に示される核酸配列と、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相同である。
【０３２３】
本明細書において使用する場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、単離され、ＲＮＡ配列、相補的ポリヌクレオチド配列（ｃＤＮＡ）、ゲノムポリヌクレオチド配列、および／または複合ポリヌクレオチド配列（例えば、上記のものの組み合わせ）の形態で提供される、一本鎖または二本鎖の核酸配列を指す。
【０３２４】
哺乳動物細胞において外因性ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬを発現させるためには、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬをコードするポリヌクレオチド配列を、好ましくは、哺乳動物細胞での発現に好適な核酸構築物中にライゲーションする。そのような核酸構築物は、細胞におけるポリヌクレオチド配列の転写を構成的または誘導性の様式で指示するプロモーター配列を含む。
【０３２５】
よって、特定の実施形態によると、ポリヌクレオチドと、宿主細胞における当該ポリヌクレオチドを発現せしめる調節エレメントとを含む、核酸構築物を提供する。
【０３２６】
本発明の一部の実施形態の核酸構築物（本明細書では「発現ベクター」とも呼ばれる）は、このベクターを、原核生物、真核生物、または好ましくは両方における複製および組み込みに好適なもの（例えば、シャトルベクター）にする、さらなる配列を含む。加えて、典型的なクローニングベクターは、転写および翻訳開始配列、転写および翻訳ターミネーター、ならびにポリアデニル化シグナルも含有し得る。例として、そのような構築物は、典型的には、５’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、第２鎖ＤＮＡ合成起点、および３’ＬＴＲまたはその一部分を含む。
【０３２７】
本発明の一部の実施形態の核酸構築物は、典型的には、構築物が入っている宿主細胞からペプチドを分泌させるためのシグナル配列を含む。好ましくは、この目的のためのシグナル配列は、哺乳動物のシグナル配列か、または本発明の一部の実施形態のポリペプチド変異体のシグナル配列である。
【０３２８】
真核生物プロモーターは、典型的には、ＴＡＴＡボックスおよび上流プロモーターエレメントという２種類の認識配列を含有する。転写開始部位から２５〜３０塩基対上流に位置するＴＡＴＡボックスは、ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ合成の開始に関与していると考えられている。他方の上流プロモーターエレメントは、転写開始の頻度を決定する。
【０３２９】
本発明の一部の実施形態の核酸構築物に用いられるプロモーターは、形質転換された特定の細胞集団において活性を示すものが好ましい。細胞型特異的プロモーターおよび／または組織特異的プロモーターの例としては、肝臓特異的であるアルブミンなどのプロモーター［Pinkert et al., (1987) Genes Dev. 1:268-277］、リンパ様特異的プロモーター［Calame et al., (1988) Adv. Immunol. 43:235-275］；特に、Ｔ細胞受容体のプロモーター［Winoto et al., (1989) EMBO J. 8:729-733］および免疫グロブリンのプロモーター；［Banerji et al. (1983) Cell 33729-740］、ニューロン特異的プロモーター、例えば神経フィラメントプロモーター［Byrne et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5473-5477］、膵臓特異的プロモーター［Edlunch et al. (1985) Science 230:912-916］、または乳腺特異的プロモーター、例えば乳清プロモーター（米国特許第４，８７３，３１６号および欧州特許出願公開第２６４，１６６号）が挙げられる。
【０３３０】
エンハンサーエレメントは、結合した相同プロモーターまたは異種プロモーターによる転写を最大で１，０００倍まで増加させることができる。エンハンサーは、転写開始部位から下流にあっても上流にあっても活性がある。ウイルスに由来する多くのエンハンサーエレメントが、広い宿主範囲を有し、種々の組織において活性を示す。例えば、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサーは、多くの細胞型に好適である。本発明の一部の実施形態に好適な他のエンハンサー／プロモーターの組み合わせとしては、ポリオーマウイルス、ヒトまたはマウスサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来するものや、マウス白血病ウイルス、マウスまたはラウス肉腫ウイルス、およびＨＩＶなどの様々なレトロウイルスに由来する末端反復配列が挙げられる。参照により本明細書に組み込まれている、Enhancers and Eukaryotic Expression, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York, 1983を参照されたい。
【０３３１】
発現ベクターの構築において、プロモーターは、その天然の環境における転写開始部位からの距離とほぼ同じ距離だけ異種の転写開始部位から離れた位置にあるのが好ましい。しかしながら、当技術分野で公知であるように、プロモーター機能を失うことなく、この距離のいくらかの差異が許容され得る。
【０３３２】
ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬのｍＲＮＡ翻訳効率を増加させるために、ポリアデニル化配列を発現ベクターに付加することもできる。正確かつ効率的なポリアデニル化には、２つの特徴的な配列エレメントが必要である。それらは、ポリアデニル化部位の下流に位置するＧＵリッチ配列またはＵリッチ配列と、１１〜３０ヌクレオチド上流に位置する、高度に保存された６つのヌクレオチドからなるＡＡＵＡＡＡ配列である。本発明の一部の実施形態に好適な終結シグナルおよびポリアデニル化シグナルとしては、ＳＶ４０に由来するものが挙げられる。
【０３３３】
本発明の一部の実施形態の発現ベクターは、既に記載したエレメントに加えて、典型的には、クローニングされた核酸の発現レベルを上昇させること、または組換えＤＮＡを有する細胞の識別を容易にすることを目的とした、他の特殊化したエレメントを含有し得る。例えば、いくつかの動物ウイルスは、許容細胞型におけるウイルスゲノムの染色体外複製を促進するＤＮＡ配列を含有する。こうしたウイルスのレプリコンを有するプラスミドは、プラスミド上または宿主細胞のゲノム上の遺伝子によって適切な因子が提供される限り、エピソームとして複製される。
【０３３４】
ベクターは、真核生物レプリコンを含む場合もあれば、含まない場合もある。真核生物レプリコンが存在する場合、ベクターは、適切な選択可能マーカーを使用して真核細胞において増幅可能である。ベクターが真核生物レプリコンを含まない場合、エピソームの増幅は不可能である。その代わり、組換えＤＮＡが、工学的に操作された細胞のゲノムに組み込まれ、ここでプロモーターが所望の核酸を発現せしめる。
【０３３５】
本発明の一部の実施形態の発現ベクターは、例えば、単一のｍＲＮＡからいくつかのタンパク質を翻訳することを可能にする、さらなるポリヌクレオチド配列、例えば、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）およびプロモーターキメラポリペプチドのゲノム組み込みのための配列をさらに含むことができる。
【０３３６】
発現ベクターに含まれる個々のエレメントが種々の構成で配置され得ることは理解されよう。例えば、エンハンサーエレメント、プロモーターなど、そしてさらにはＳＩＲＰα−４１ＢＢＬをコードするポリヌクレオチド配列は、「ヘッドトゥテール」構成で配置されてもよく、逆相補鎖として、または逆平行鎖中の相補鎖として存在してもよい。このような構成の多様性は、発現ベクターの非コードエレメントで生じる可能性がより高いが、発現ベクターにおけるコード配列の代替的な構成も考えられる。
【０３３７】
哺乳動物の発現ベクターの例としては、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から入手可能なｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／−）、ｐＧＬ３、ｐＺｅｏＳＶ２（＋／−）、ｐＳｅｃＴａｇ２、ｐＤｉｓｐｌａｙ、ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＳｉｎＲｅｐ５、ＤＨ２６Ｓ、ＤＨＢＢ、ｐＮＭＴ１、ｐＮＭＴ４１、ｐＮＭＴ８１、Ｐｒｏｍｅｇａ社から入手可能なｐＣＩ、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ社から入手可能なｐＭｂａｃ、ｐＰｂａｃ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、およびｐＢＫ−ＣＭＶ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社から入手可能なｐＴＲＥＳ、ならびにこれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３３８】
レトロウイルスなどの真核生物ウイルスに由来する調節エレメントを含有する発現ベクターを使用することもできる。ＳＶ４０ベクターには、ｐＳＶＴ７およびｐＭＴ２が含まれる。ウシパピローマウイルスに由来するベクターとしては、ｐＢＶ−１ＭＴＨＡが挙げられ、エプスタイン・バーウイルスに由来するベクターとしては、ｐＨＥＢＯおよびｐ２Ｏ５が挙げられる。他の例示的なベクターとしては、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、および、ＳＶ−４０初期プロモーター、ＳＶ−４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または真核細胞における発現に有効であることが報告されている他のプロモーターの指示の下で、タンパク質の発現を可能にする任意の他のベクターが挙げられる。
【０３３９】
上述のように、ウイルスは、多くの場合、宿主の防御機構を回避するように進化してきた、非常に特殊化した感染性因子である。典型的には、ウイルスは特定の細胞型に感染し、伝播する。ウイルスベクターの標的化特異性は、所定の細胞型を特異的に標的とする天然の特異性を用いることにより、組換え遺伝子を感染細胞に導入する。よって、本発明の一部の実施形態によって使用するベクターの種類は、形質転換される細胞型によって決まる。形質転換する細胞型によって好適なベクターを選択する能力は十分に当業者の能力の範疇にあり、したがって本明細書では、選択に関する検討事項の概説は提供しない。例えば、骨髄細胞は、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）を使用して標的化することができ、腎臓細胞は、Liang CY et al., 2004 (Arch Virol. 149: 51-60)に記載の、バキュロウイルスであるAutographa californica核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）に存在する異種プロモーターを使用して標的化することができる。
【０３４０】
組換えウイルスベクターは、水平感染および標的化特異性などの利点をもたらすため、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬのｉｎ  ｖｉｖｏ発現に有用である。水平感染は、例えばレトロウイルスの生活環に固有であり、単一の感染細胞が出芽して隣接細胞に感染する、多くの子孫ビリオンを生成するプロセスである。その結果、広い範囲が急速に感染する。そのほとんどは、最初は元のウイルス粒子に感染していなかったものである。これは、感染性因子が娘子孫を通してのみ伝播する垂直型の感染と対照的である。水平に伝播することができないウイルスベクターを作製することもできる。この特徴は、特定の遺伝子を限局的な数の標的細胞のみに導入することが所望の目的である場合には有用であり得る。
【０３４１】
本発明の一部の実施形態の発現ベクターを細胞に導入するためには、様々な方法を使用することができる。そのような方法は、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1989, 1992)、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1989)、Chang et al., Somatic Gene Therapy, CRC Press, Ann Arbor, Mich. (1995)、Vega et al., Gene Targeting, CRC Press, Ann Arbor Mich. (1995)、Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston Mass. (1988)、およびGilboa et at. [Biotechniques 4 (6): 504-512, 1986]に概説されており、例えば、安定トランスフェクションまたは一過性トランスフェクション、リポフェクション、電気穿孔、および組換えウイルスベクターによる感染を含む。加えて、陽性−陰性の選択方法に関しては、米国特許第５，４６４，７６４号および同第５，４８７，９９２号を参照されたい。
【０３４２】
ウイルス感染による核酸の導入には、リポフェクションおよび電気穿孔などの他の方法と比べていくつかの利点がある。これは、ウイルスの感染性の性質のため、より高いトランスフェクション効率を得ることができるからである。
【０３４３】
現在好ましいｉｎ  ｖｉｖｏでの核酸移入技術としては、アデノウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ型、またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、および脂質ベースの系といった、ウイルス構築物または非ウイルス構築物のトランスフェクションが挙げられる。脂質を介した遺伝子の移入に有用な脂質は、例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、およびＤＣ−Ｃｈｏｌである［Tonkinson et al., Cancer Investigation, 14 (1): 54-65 (1996)］。遺伝子療法において使用するのに最も好ましい構築物はウイルスであり、最も好ましくはアデノウイルス、ＡＡＶ、レンチウイルス、またはレトロウイルスである。レトロウイルス構築物などのウイルス構築物は、少なくとも１つの転写プロモーター／エンハンサーまたは遺伝子座決定エレメント、またはメッセンジャーの選択的スプライシング、核ＲＮＡ輸送、もしくは翻訳後修飾といった他の手段によって遺伝子発現を制御する他のエレメントを含む。そのようなベクター構築物は、ウイルス構築物に既に存在する場合を除き、パッケージングシグナル、末端反復配列（ＬＴＲ）またはその一部分、ならびに使用されるウイルスに適切なプラス鎖およびマイナス鎖のプライマー結合部位も含む。加えて、そのような構築物は、典型的には、構築物が入っている宿主細胞からペプチドを分泌させるためのシグナル配列を含む。好ましくは、この目的のためのシグナル配列は、哺乳動物のシグナル配列か、または本発明の一部の実施形態のポリペプチド変異体のシグナル配列である。任意選択で、構築物は、ポリアデニル化をもたらすシグナル、ならびに１つまたは複数の制限部位および翻訳終結配列を含んでもよい。例として、そのような構築物は、典型的には、５’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、第２鎖ＤＮＡ合成起点、および３’ＬＴＲまたはその一部分を含む。カチオン性脂質、ポリリジン、およびデンドリマーなど、ウイルスではない他のベクターを使用してもよい。
【０３４４】
既に述べたように、本発明の一部の実施形態の発現構築物は、挿入されるコード配列の転写および翻訳のために必要なエレメントを含有する他にも、発現されるペプチドの安定性、生成、精製、収率、または毒性を増進するように工学的に操作された配列を含むこともできる。例えば、融合タンパク質、または本発明の一部の実施形態のＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質と異種タンパク質とを含む切断可能な融合タンパク質の発現を工学的に操作することができる。そのような融合タンパク質は、アフィニティークロマトグラフィーにより、例えば、異種タンパク質に対して特異的なカラムに固定化することにより、融合タンパク質が容易に単離され得るように設計することができる。ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質と異種タンパク質との間に切断部位を工学的操作によって設けた場合、切断部位を破壊する適切な酵素または薬剤を用いて処置することにより、クロマトグラフィーカラムからＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質を遊離させることができる［例えば、Booth et al. (1988) Immunol. Lett. 19:65-70、およびGardella et al., (1990) J. Biol. Chem. 265:15854-15859を参照されたい］。
【０３４５】
本発明は、本明細書に記載の組成物を含む細胞も企図する。
【０３４６】
よって、特定の実施形態によると、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、またはＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質をコードする核酸構築物を含む、宿主細胞を提供する。
【０３４７】
本明細書で上述したように、本発明の一部の実施形態のポリペプチドを発現させるための宿主発現系として、種々の原核細胞または真核細胞を使用することができる。これらは、コード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌；コード配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換した酵母などの微生物；コード配列を含有する、組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染させた、またはＴｉプラスミドなどの組換えプラスミド発現ベクターで形質転換した、植物細胞系を含むが、これらに限定されない。哺乳動物の発現系を使用して、本発明の一部の実施形態のポリペプチドを発現させることもできる。
【０３４８】
細菌構築物の例としては、ｐＥＴシリーズのＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターが挙げられる（Studier et al. (1990) Methods in Enzymol. 185:60-89）。
【０３４９】
本発明の教示と併せて使用され得る真核細胞の例としては、哺乳動物細胞、真菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、藻細胞、または植物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３５０】
酵母においては、米国特許出願第５，９３２，４４７号に開示されているように、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含有するいくつかのベクターを使用することができる。代替的には、酵母染色体への外来ＤＮＡ配列の組み込みを促進するベクターを使用してもよい。
【０３５１】
植物発現ベクターを使用する場合、いくつかのプロモーターによってコード配列の発現を駆動することができる。例えば、ＣａＭＶの３５Ｓ  ＲＮＡおよび１９Ｓ  ＲＮＡプロモーターなどのウイルスプロモーター［Brisson et al. (1984) Nature 310:511-514］、またはＴＭＶのコートタンパク質プロモーター［Takamatsu et al. (1987) EMBO J. 6:307-311］を使用することができる。代替的には、植物プロモーター、例えばＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニット［Coruzzi et al. (1984) EMBO J. 3:1671-1680およびBrogli et al., (1984) Science 224:838-843］、または熱ショックプロモーター、例えばダイズｈｓｐ１７．５−Ｅまたはｈｓｐ１７．３−Ｂ［Gurley et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:559-565］を使用してもよい。これらの構築物は、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、植物ウイルスベクター、直接ＤＮＡ形質転換、マイクロインジェクション、電気穿孔、および当業者に周知の他の技術を使用して、植物細胞に導入することができる。例えば、Weissbach & Weissbach, 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Section VIII, pp 421-463を参照されたい。
【０３５２】
当技術分野で周知である昆虫および哺乳動物の宿主細胞系といった他の発現系も、本発明の一部の実施形態によって使用され得る。
【０３５３】
特定の実施形態によると、細胞は、哺乳動物細胞である。
【０３５４】
特定の実施形態によると、細胞は、ヒト細胞である。
【０３５５】
特定の実施形態によると、細胞は、細胞株である。
【０３５６】
別の特定の実施形態によると、細胞は、初代細胞である。
【０３５７】
細胞は、血液、筋肉、神経、脳、心臓、肺、肝臓、膵臓、脾臓、胸腺、食道、胃、腸、腎臓、精巣、卵巣、毛髪、皮膚、骨、乳房、子宮、膀胱、脊髄、または様々な種類の体液を含むがこれらに限定されない、好適な組織に由来し得る。細胞は、胚期、胎生期、および成体期を含む任意の発生段階、ならびに任意の発生起源、すなわち外胚葉起源、中胚葉起源、および内胚葉起源に由来してよい。
【０３５８】
哺乳動物細胞の非限定的な例としては、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ、例えばＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胎児由来腎臓株（ＨＥＫ２９３細胞または懸濁培養下で増殖させるためにサブクローニングしたＨＥＫ２９３細胞、Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 1977）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 1980）；サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；ＮＩＨ３Ｔ３、Ｊｕｒｋａｔ、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 1982）；ＭＲＣ  ５細胞；ＦＳ４細胞；ならびにヒト肝細胞腫株（Ｈｅｐ  Ｇ２）、ＰＥＲ．Ｃ６、Ｋ５６２、およびチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）が挙げられる。
【０３５９】
本発明の一部の実施形態によると、哺乳動物細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＨＴ１０８０細胞、ＮＳ０細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＢＨＫ細胞、Ｎａｍａｌｗａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、およびＶｅｒｏ細胞からなる群から選択される。
【０３６０】
本発明の一部の実施形態によると、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、および２９３（例えば、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ）細胞を含む。
【０３６１】
本発明の別の態様によると、本明細書に記載のポリヌクレオチドまたは核酸構築物を宿主細胞中で発現させることを含む、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質を作製する方法を提供する。
【０３６２】
特定の実施形態によると、本方法は、融合タンパク質を単離することを含む。
【０３６３】
特定の実施形態によると、組換えポリペプチドの回収は、適切な時間に亘り培養した後で実施する。「組換えポリペプチドを回収する」という表現は、ポリペプチドを含有する培養培地全体を収集することを指し、必ずしもさらなる分離または精製のステップを暗示するとは限らない。上記内容にかかわらず、本発明の一部の実施形態のポリペプチドは、限定されるものではないが、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、濾過、電気泳動、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、コンカナバリンＡクロマトグラフィー、ミックスモードクロマトグラフィー、金属アフィニティークロマトグラフィー、レクチンアフィニティークロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、およびＤＳ法（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）など、種々の標準的なタンパク質精製技術を使用して精製することができる。
【０３６４】
一部の実施形態では、組換えペプチド、その断片、またはペプチドが合成および精製され、それらの治療有効性は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏのいずれかで検出することができる。一実施形態において、本発明の組換え断片またはペプチドの活性は、細胞生存率、トランスジェニックマウスの生存、ならびに巨核球マーカーおよびリンパ様ＲＮＡマーカーの発現を含む様々なアッセイを使用して確認することができる。
【０３６５】
一実施形態において、本発明のペプチドは、少なくとも３個のアミノ酸を含む。別の実施形態では、ペプチドは、少なくとも５個のアミノ酸を含む。別の実施形態では、ペプチドは、少なくとも１０個のアミノ酸を含む。別の実施形態では、ペプチドは、少なくとも２０個のアミノ酸を含む。別の実施形態では、ペプチドは、少なくとも２５個のアミノ酸を含む。他の実施形態では、ペプチドは、少なくとも３０個のアミノ酸、または少なくとも５０個のアミノ酸、または７５個のアミノ酸、または１００個のアミノ酸、または１２５個のアミノ酸、または１５０個のアミノ酸、または２００個のアミノ酸、または２５０個のアミノ酸、または３００個のアミノ酸、または３５０個のアミノ酸、または４００個のアミノ酸を含む。一実施形態において、本発明のペプチドは、少なくとも５個のアミノ酸から実質的になる。別の実施形態では、ペプチドは、少なくとも１０個のアミノ酸から実質的になる。他の実施形態では、ペプチドは、少なくとも３０個のアミノ酸、または少なくとも５０個のアミノ酸、または７５個のアミノ酸、または１００個のアミノ酸、または１２５個のアミノ酸、または１５０個のアミノ酸、または２００個のアミノ酸、または２５０個のアミノ酸、または３００個のアミノ酸、または３５０個のアミノ酸、または４００個のアミノ酸から実質的になる。一実施形態において、本発明のペプチドは、少なくとも５個のアミノ酸からなる。別の実施形態では、ペプチドは、少なくとも１０個のアミノ酸からなる。他の実施形態では、ペプチドは、少なくとも３０個のアミノ酸、または少なくとも５０個のアミノ酸、または７５個のアミノ酸、または１００個のアミノ酸、または１２５個のアミノ酸、または１５０個のアミノ酸、または２００個のアミノ酸、または２５０個のアミノ酸、または３００個のアミノ酸、または３５０個のアミノ酸、または４００個のアミノ酸、または５００個、もしくは６００個、もしくは７００個のアミノ酸からなる。
【０３６６】
本明細書において使用する場合、一実施形態において、「ペプチド」および「断片」という用語は、すべて同じ意味および資質を有し、交換可能に使用され得る。本明細書において使用する場合、一実施形態において、「ペプチド」という用語は、天然ペプチド（分解産物、合成的に製造されたペプチド、または組換えペプチドのいずれか）、およびペプチド模倣薬（典型的には、合成的に製造されたペプチド）、例えばペプチド類似体であるペプトイドおよびセミペプトイドを含み、これらは、例えば、ペプチドが体内にある間の安定性を高めたり、細菌細胞に侵入する能力を高めたりする修飾を有し得る。このような修飾としては、Ｎ末端修飾、Ｃ末端修飾、ペプチド結合修飾（ＣＨ２−ＮＨ、ＣＨ２−Ｓ、ＣＨ２−Ｓ＝Ｏ、Ｏ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ２−Ｏ、ＣＨ２−ＣＨ２、Ｓ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ＝ＣＨ、またはＣＦ＝ＣＨを含むがこれらに限定されない）、骨格修飾、および残基修飾が挙げられるが、これらに限定されない。ペプチド模倣化合物を調製するための方法は、当技術分野で周知であり、例えば、Quantitative Drug Design, C.A. Ramsden Gd., Chapter 17.2, F. Choplin Pergamon Press (1992)において特定されている。この文献は、本明細書に完全に記載されているかのように、参照により組み込まれている。これに関するさらなる詳細を本明細書で後述する。
【０３６７】
ペプチド内のペプチド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）は、例えば、Ｎ−メチル化結合（−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＯ−）、エステル結合（−Ｃ（Ｒ）Ｈ−Ｃ−Ｏ−Ｏ−Ｃ（Ｒ）−Ｎ−）、ケトメチレン結合（−ＣＯ−ＣＨ２−）、α−アザ結合（−ＮＨ−Ｎ（Ｒ）−ＣＯ−）（式中、Ｒは任意のアルキル、例えばメチルである）、カルバ結合（−ＣＨ２−ＮＨ−）、ヒドロキシエチレン結合（−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−）、チオアミド結合（−ＣＳ−ＮＨ−）、オレフィン二重結合（−ＣＨ＝ＣＨ−）、レトロアミド結合（−ＮＨ−ＣＯ−）、ペプチド誘導体（−Ｎ（Ｒ）−ＣＨ２−ＣＯ−）（式中、Ｒは、炭素原子に天然で生じる「正常な」側鎖である）によって置換され得る。
【０３６８】
これらの修飾は、ペプチド鎖に沿った結合のうちのいずれかにおいて起こればよく、さらには、いくつか（２〜３）の結合において同時に起こってもよい。
【０３６９】
天然の芳香族アミノ酸であるＴｒｐ、Ｔｙｒ、およびＰｈｅは、ＴＩＣ、ナフチルアミン（Ｎｏｌ）、Ｐｈｅの環メチル化誘導体、Ｐｈｅまたはｏ−メチル−Ｔｙｒのハロゲン化誘導体などの合成の非天然酸に置換され得る。
【０３７０】
一実施形態において、本発明のペプチドは、検出可能なタグをさらに含む。本明細書において使用する場合、一実施形態において、「検出可能なタグ」という用語は、当業者が当技術分野で公知の技術を使用することにより検出することができる任意の部分を指す。本発明のスクリーニング方法において使用される検出可能なタグは、ペプチド配列であり得る。任意選択で、検出可能なタグは、化学薬品によって、またはタンパク質分解などの酵素的手段によって除去可能であってもよい。例えば、「検出可能なタグ」という用語は、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）タグ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、ポリ（Ｈｉｓ）タグ、ＦＬＡＧタグ、エピトープタグ、例えばＶ５タグ、ｃ−ｍｙｃタグ、およびＨＡタグ、ならびに蛍光タグ、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、およびシアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、ならびにこれらのタグの誘導体、または当技術分野で公知の任意のタグを含む。「検出可能なタグ」という用語は、「検出可能なマーカー」という用語も含む。
【０３７１】
一実施形態において、本発明のペプチドは、単離されたペプチドである。そのような単離されたペプチドは、ペプチドタグを含み得る。
【０３７２】
本発明の一部の実施形態のペプチドは、好ましくは線状形態で用いられるが、環化がペプチドの特徴に著しく干渉しない場合は環状形態のペプチドを用いてもよいことが理解されよう。
【０３７３】
本明細書において使用する場合、一実施形態において、「アミノ酸」という用語は、天然のおよび合成のα、β、γまたはδアミノ酸を指し、タンパク質に見られるアミノ酸、すなわちグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパルテート、グルタメート、リジン、アルギニン、およびヒスチジンを含むが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、アミノ酸は、Ｌ型である。代替的には、アミノ酸は、アラニル、バリニル、ロイシニル、イソロイシニル、プロリニル、フェニルアラニル、トリプトファニル、メチオニル、グリシニル、セリニル、トレオニル、システイニル、チロシニル、アスパラギニル、グルタミニル、アスパルトイル、グルタロイル、リシニル、アルギニル、ヒスチジニル、β−アラニル、β−バリニル、β−ロイシニル、β−イソロイシニル、β−プロリニル、β−フェニルアラニル、β−トリプトファニル、β−メチオニル、β−グリシニル、β−セリニル、β−トレオニル、β−システイニル、β−チロシニル、β−アスパラギニル、β−グルタミニル、β−アスパルトイル、β−グルタロイル、β−リシニル、β−アルギニルまたはβ−ヒスチジニルの誘導体であり得る。
【０３７４】
本ペプチドは、好ましくは、ペプチドが可溶性形態にあることを必要とする治療薬または診断薬において用いられる。よって、本発明の一部の実施形態のペプチドは、好ましくは、セリンおよびスレオニンを含むがこれらに限定されない１つまたは複数の非天然もしくは天然の極性アミノ酸を含む。セリンおよびスレオニンは、ヒドロキシル含有側鎖をもつため、ペプチドの溶解性を増加させることができる。
【０３７５】
本明細書において使用する場合、一実施形態において、「保存的に修飾された変異体」という表現は、アミノ酸および核酸配列の両方に適用される。「アミノ酸変異体」とは、アミノ酸配列を指す。特定の核酸配列に関して、保存的に修飾された変異体とは、同一または実質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を指すか、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合は、実質的に同一の、または関連した（例えば、天然に連続した）配列を指す。遺伝コードの縮重のため、多数の機能的に同一な核酸がほとんどのタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。よって、アラニンがコドンによって特定されるすべての位置において、このコドンは、コードされるポリペプチドを改変することなく、記載した対応するコドンを別のものに改変することができる。このような核酸変異を「サイレント変異」という。これは、保存的に修飾された変異の一種である。本明細書における、ポリペプチドをコードするすべての核酸配列は、その核酸のサイレント変異のことも表す。ある特定の文脈において、機能的に同一な分子をもたらすように核酸内の各コドン（通常はメチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常はトリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧを除く）が修飾され得ることは、当業者には認識されよう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸のサイレント変異は、発現産物に関して記載される配列に黙示されている。
【０３７６】
アミノ酸配列については、コードされる配列において、単一のアミノ酸またはわずかなパーセンテージのアミノ酸を改変、付加、または欠失させる、核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列に対する個々の置換、欠失、または付加が、「保存的に修飾された変異体」である（その改変が、あるアミノ酸と、その化学的に同様のアミノ酸との置換をもたらす場合を含む）ことは、当業者には認識されよう。機能的に同様なアミノ酸を提供する保存的置換表は、当技術分野で周知である。どのアミノ酸変化が表現型的にサイレントである可能性が高いかに関する指針は、Bowie et al., 1990, Science 247: 1306 1310においても確認することができる。このような保存的に修飾された変異体は、多型変異体、種間ホモログ、および対立遺伝子に追加されるものであり、これらを除外するものではない。典型的な保存的置換としては、１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）が挙げられるが、これらに限定されない（例えば、Creighton, Proteins (1984)を参照されたい）。アミノ酸は、側鎖に関連する特性に基づいて置換することができる。例えば、極性側鎖を有するアミノ酸、例えばセリン（Ｓ）およびスレオニン（Ｔ）、側鎖の電荷に基づくアミノ酸、例えば、アルギニン（Ｒ）およびヒスチジン（Ｈ）、ならびに疎水性側鎖を有するアミノ酸、例えばバリン（Ｖ）およびロイシン（Ｌ）の置換が可能である。示されるように、典型的に変化はわずかな性質のものであり、例えば、タンパク質のフォールディングまたは活性に著しく影響しない保存的アミノ酸置換などである。
【０３７７】
タンパク質の化学修飾
本発明において、本発明のタンパク質の任意の部分は、任意選択で、化学修飾してもよい。すなわち、官能基の付加によって変化させてもよい。例えば、天然の配列に存在する側鎖アミノ酸残基は、任意選択で修飾されてもよい。しかし代替的には、後述するように、タンパク質の他の部分が、側鎖アミノ酸残基に加えて、またはその代わりに、任意選択で修飾されてもよい。化学合成プロセスが続く場合、修飾は、任意選択で、分子の合成中に、例えば、化学修飾されたアミノ酸を付加することによって行ってもよい。しかしながら、分子中に既に存在するアミノ酸の化学修飾（「ｉｎ  ｓｉｔｕ」修飾）も可能である。
【０３７８】
（概念上は「化学修飾されている」とみなされるペプチドにおいて、）分子の配列領域のうちのいずれのアミノ酸も、任意選択で、次の例示的な種類の修飾のうちのいずれか１つによって修飾することができる。非限定的な例示的な修飾の種類としては、カルボキシメチル化、アシル化、リン酸化、グリコシル化、または脂肪酸アシル化が挙げられる。エーテル結合を任意選択で使用して、セリンまたはスレオニンのヒドロキシルを糖のヒドロキシルに結合させてもよい。アミド結合を任意選択で使用して、グルタメートまたはアスパルテートのカルボキシル基を糖のアミノ基に結合させてもよい（Garg and Jeanloz, Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry, Vol. 43, Academic Press (1985)、Kunz, Ang. Chem. Int. Ed. English 26:294-308 (1987)）。アミノ酸と炭水化物との間にアセタール結合およびケタール結合を任意選択で形成してもよい。例えば、遊離アミノ基（例えば、リジン）のアシル化により、脂肪酸アシル誘導体を任意選択で作ってもよい（Toth et al., Peptides: Chemistry, Structure and Biology, Rivier and Marshal, eds., ESCOM Publ., Leiden, 1078-1079 (1990)）。
【０３７９】
本明細書において使用する場合、「化学修飾」という用語は、本発明に係るタンパク質またはペプチドに言及している場合、そのアミノ酸残基のうちの少なくとも１つが、プロセシングもしくは他の翻訳後修飾などの天然プロセス、または当技術分野で周知の化学修飾技術のいずれかによって修飾されているタンパク質またはペプチドを指す。多数の公知の修飾の例としては、典型的には、アセチル化、アシル化、アミド化、ＡＤＰ−リボシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、脂質もしくは脂質誘導体の共有結合、メチル化、ミリスチル化、ＰＥＧ化、プレニル化、リン酸化、ユビキチン化、または任意の同様のプロセスが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３８０】
他の種類の修飾には、本明細書に完全に記載かのように参照により本明細書に組み込まれている国際出願第２００６／０５０２６２号に記載のように、タンパク質などの生体分子へのシクロアルカン部分の付加が任意選択で含まれる。これらの部分は、生体分子と共に使用されるように設計され、任意選択で、様々な特性をタンパク質に与えるために使用され得る。
【０３８１】
さらに、任意選択で、タンパク質のいずれの部分を修飾してもよい。例えば、本明細書に完全に記載かのように参照により本明細書に組み込まれている国際出願第２００６／０５０２４７号に記載のように、タンパク質のグリコシル化部分のＰＥＧ化を任意選択で行ってもよい。１つまたは複数のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基を、Ｏ−結合型および／またはＮ−結合型グリコシル化に任意選択で付加してもよい。ＰＥＧ基は、任意選択で、分枝状であっても直鎖状であってもよい。任意選択で、任意の種類の水溶性ポリマーを、グリコシルリンカーを介してタンパク質のグリコシル化部位に結合させてもよい。
【０３８２】
「ＰＥＧ化されたタンパク質」とは、タンパク質のアミノ酸残基にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分が共有結合した、生物学的活性を有するタンパク質またはその断片を意味する。
【０３８３】
「ポリエチレングリコール」または「ＰＥＧ」とは、ポリアルキレングリコール化合物またはその誘導体を意味し、カップリング剤、またはカップリング部分もしくは活性化部分での（例えば、チオール、トリフレート、トレシレート、アジリジン、オキシランでの、または好ましくはマレイミド部分での）誘導体化の有無を問わない。マレイミドモノメトキシＰＥＧなどの化合物が、例示的な、または活性化された本発明のＰＥＧ化合物である。本発明では、他のポリアルキレングリコール化合物、例えばポリプロピレングリコールを使用してもよい。他の適切なポリアルキレングリコール化合物としては、次の種類の荷電ポリマーまたは中性ポリマー：デキストラン、コロミン酸、または他の炭水化物ベースのポリマー、アミノ酸のポリマー、およびビオチン誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３８４】
改変されたグリコシル化タンパク質修飾
本発明のタンパク質は、改変された（すなわち、元のまたは本来のグリコシル化パターンから改変された）グリコシル化パターンを有するように修飾され得る。本明細書において使用する場合、「改変された」とは、１つまたは複数の炭水化物部分が欠失していること、および／または少なくとも１つのグリコシル化部位が元のタンパク質に付加されていることを意味する。
【０３８５】
タンパク質のグリコシル化は、典型的には、Ｎ−結合型またはＯ−結合型のいずれかである。Ｎ−結合型とは、炭水化物部分がアスパラギン残基の側鎖に結合していることを指す。アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−スレオニンのトリペプチド配列（ここで、Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への酵素的な炭水化物部分の結合のための認識配列である。よって、ポリペプチド内にこれらのトリペプチド配列のうちのいずれかが存在すると、潜在的なグリコシル化部位が生じる。Ｏ−結合型グリコシル化とは、ヒドロキシアミノ酸（５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンも使用され得るが、最も一般的にはセリンまたはスレオニン）に対する、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースの糖類のうちの１つの結合を指す。
【０３８６】
本発明のタンパク質へのグリコシル化部位の付加は、タンパク質のアミノ酸配列が上述のトリペプチド配列のうちの１つまたは複数を含有するようにこれを改変することによって、簡便に遂行される（Ｎ−結合型グリコシル化部位の場合）。改変は、本来のタンパク質の配列における１つまたは複数のセリンまたはスレオニン残基の付加、またはこれらによる置換によって作製することもできる（Ｏ−結合型グリコシル化部位の場合）。タンパク質のアミノ酸配列は、ＤＮＡレベルで変化を導入することによって改変することもできる。
【０３８７】
タンパク質に存在する炭水化物部分の数を増加させる別の手段は、タンパク質のアミノ酸残基にグリコシドを化学的または酵素的にカップリングする方法である。使用するカップリング様式に応じて、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）遊離スルフヒドリル基、例えばシステインのもの、（ｄ）遊離ヒドロキシル基、例えばセリン、スレオニン、もしくはヒドロキシプロリンのもの、（ｅ）芳香族残基、例えばフェニルアラニン、チロシン、もしくはトリプトファンのもの、または（ｆ）グルタミンのアミド基に糖類を結合させてもよい。これらの方法は、国際公開第８７／０５３３０号、およびAplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., 22: 259-306 (1981)に記載されている。
【０３８８】
本発明のタンパク質に存在するいずれかの炭水化物部分の除去は、化学的に、酵素的に、またはＤＮＡレベルで変化を導入することにより遂行されてもよい。化学的脱グリコシル化は、トリフルオロメタンスルホン酸または同等の化合物にタンパク質を曝露させることを必要とする。この処置は、結合糖（ｌｉｎｋｉｎｇ  ｓｕｇａｒ）（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）を除くほとんどまたはすべての糖の切断をもたらし、アミノ酸配列を未変化のままにする。
【０３８９】
化学的脱グリコシル化は、Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys., 259: 52 (1987)、およびEdge et al., Anal. Biochem., 118: 131 (1981)に記載されている。タンパク質にある炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138: 350 (1987)に記載されているように、種々のエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼを使用することによって達成することができる。
【０３９０】
医薬組成物
本発明の一部の実施形態の組成物（例えば、ＳＲＩＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質、ＳＲＩＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ＳＲＩＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質をコードする核酸構築物、および／または細胞）は、それ自体で、または組成物を好適な担体もしくは賦形剤と混合した医薬組成物として生物に投与することができる。
【０３９１】
本発明は、一部の実施形態において、本発明に係る治療剤を治療有効量で含む医薬組成物を特色とする。本発明によると、治療剤は、本明細書に記載のポリペプチドであり得る。本発明に係る医薬組成物はさらに、本明細書に記載のように、がんまたは免疫関連障害を処置するために使用する。本発明の治療剤は、対象に単独で提供してもよいし、または治療剤を薬学的に許容される担体と混合した医薬組成物の一部として提供してもよい。
【０３９２】
本明細書において使用する場合、「医薬組成物」とは、本明細書に記載の活性成分のうちの１つまたは複数と、生理学的に好適な担体および賦形剤などの他の化学成分との調製物を指す。医薬組成物の目的は、生物への化合物の投与を容易にすることである。
【０３９３】
本明細書において、「活性成分」という用語は、生物学的効果の原因となる組成物（例えば、本明細書に記載のＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質、ポリヌクレオチド、核酸構築物、および／または細胞）を指す。
【０３９４】
本明細書において、「賦形剤」という用語は、活性成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性物質を指す。限定されるものではないが、賦形剤の例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖類および各種のデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、およびポリエチレングリコールが挙げられる。
【０３９５】
以降、交換可能に使用され得る「生理学的に許容される担体」および「薬学的に許容される担体」という表現は、生物に著しい刺激作用をもたらさず、また、投与される化合物の生物学的活性および特性を無効にすることのない、担体または希釈剤を指す。これらの表現には、アジュバントが含まれる。
【０３９６】
本明細書において使用する場合、「薬学的に許容される担体」は、生理学的に適合性のある、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。好ましくは、担体は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、非経口投与、脊髄投与、または上皮投与（例えば、注射または注入による投与）に好適である。活性化合物、すなわち、本明細書に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチド、核酸構築物、および／または細胞は、投与ルートに応じて１つまたは複数の薬学的に許容される塩を含み得る。「薬学的に許容される塩」とは、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、望まれない毒性効果を与えない塩を指す（例えば、Berge, S. M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66: 1-19を参照されたい）。そのような塩の例としては、酸付加塩および塩基付加塩が挙げられる。酸付加塩としては、無毒の無機酸、例えば塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸などに由来するもの、ならびに、無毒の有機酸、例えば脂肪族のモノカルボン酸およびジカルボン酸、フェニル置換アルカノン酸、ヒドロキシアルカノン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族のスルホン酸などに由来するものが挙げられる。塩基付加塩としては、アルカリ土類金属、例えばナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどに由来するもの、ならびに、無毒の有機アミン、例えばＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどに由来するものが挙げられる。
【０３９７】
本発明の少なくとも一部の実施形態に係る医薬組成物は、薬学的に許容される抗酸化剤を含んでもよい。薬学的に許容される抗酸化剤の例としては、（１）水溶性抗酸化剤、例えばアスコルビン酸、システイン塩酸塩、硫酸水素ナトリウム、二亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど；（２）油溶性抗酸化剤、例えばパルミチン酸アスコルビル、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ−トコフェロールなど；および（３）金属キレート剤、例えばクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などが挙げられる。本発明の少なくとも一部の実施形態に係る医薬組成物は、洗剤および可溶化剤（例えば、ＴＷＥＥＮ  ２０（ポリソルベート−２０）、ＴＷＥＥＮ  ８０（ポリソルベート−８０））、および保存剤（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール）、および増量物質（ｂｕｌｋｉｎｇ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ）（例えば、ラクトース、マンニトール）などの添加剤を含んでもよい。
【０３９８】
本発明の少なくとも一部の実施形態に係る医薬組成物に用いられ得る好適な水性および非水性の担体の例としては、水、様々なバッファー成分（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨおよびイオン強度の緩衝食塩水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、ならびにこれらの好適な混合物、オリーブ油などの植物油、ならびにオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルが挙げられる。
【０３９９】
適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用によって、分散液の場合は必要な粒径を維持することによって、そして界面活性剤の使用によって、維持することができる。
【０４００】
これらの組成物は、保存剤、湿潤剤、乳化剤、および分散剤などのアジュバントを含有してもよい。微生物の存在は、滅菌手順（上記参照）と、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの包含との両方によって、確実に防止することができる。糖類、塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物に含めることが望ましい場合もある。加えて、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの包含により、注射用医薬品形態の持続的吸収がもたらされ得る。
【０４０１】
薬学的に許容される担体には、滅菌水溶液または分散液、および滅菌注射用溶液または分散液を即時調製するための滅菌粉末が含まれる。このような媒体および薬剤を薬学的活性物質に使用することは、当技術分野で公知である。いずれかの従来の媒体または薬剤が活性化合物と不適合である場合を除き、本発明の少なくとも一部の実施形態に係る医薬組成物におけるその使用が企図される。補助的な活性化合物を組成物に組み込むこともできる。
【０４０２】
治療用組成物は、典型的には、製造および保存の条件下で無菌かつ安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルション、リポソーム、または高い薬物濃度に好適な他の秩序構造として製剤化することができる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびこれらの好適な混合物を含有する溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合は必要な粒径の維持、そして界面活性剤の使用によって維持することができる。多くの場合、等張剤、例えば糖類、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、または塩化ナトリウムを組成物に含めることが好ましい。吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物に含めることにより、注射用組成物の持続的吸収がもたらされ得る。滅菌注射用溶液は、必要な量の活性化合物を適切な溶媒に、必要に応じて上記に列挙した成分のうちの１つまたは組み合わせと共に組み込み、続いて滅菌精密濾過を行うことによって調製することができる。一般に、分散液は、基礎分散媒、および上記に列挙したもののうち必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに、活性化合物を組み込むことによって調製する。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥およびフリーズドライ（凍結乾燥）である。これらの方法により、予め滅菌濾過された活性成分と任意のさらなる所望の成分の溶液から、それらの粉末が得られる。
【０４０３】
滅菌注射用溶液は、必要な量の活性化合物を適切な溶媒に、必要に応じて上記に列挙した成分のうちの１つまたは組み合わせと共に組み込み、続いて滅菌精密濾過を行うことによって調製することができる。一般に、分散液は、基礎分散媒、および上記に列挙したもののうち必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに、活性化合物を組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥およびフリーズドライ（凍結乾燥）である。これらの方法により、予め滅菌濾過された活性成分と任意のさらなる所望の成分の溶液から、それらの粉末が得られる。
【０４０４】
単一の剤形を作製するために担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、処置される対象、および特定の投与様式に応じて異なる。単一の剤形を作製するために担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、概して、治療効果をもたらす組成物の量である。この量は概して、１００パーセントのうち、活性成分の約０．０１パーセント〜約９９パーセント、好ましくは、薬学的に許容される担体と組み合わせた活性成分の約０．１パーセント〜約７０パーセント、最も好ましくは約１パーセント〜約３０パーセントの範囲である。
【０４０５】
投薬レジメンは、最適な所望の応答（例えば、治療応答）をもたらすように調整する。例えば、単回ボーラス投与でもよいし、いくつかの分割用量を経時的に投与してもよいし、または、治療状況の緊急性により必要に応じて用量を相対的に低減もしくは増加させてもよい。非経口組成物は、投与を容易にし投薬量を均一にするために、単位剤形で製剤化することが特に有利である。本明細書において使用される単位剤形とは、処置される対象のための単位投薬量として適切な物理的に別個の単位を指し、各単位が、必要な薬学的担体と関連して所望の治療効果をもたらすように計算された所定量の活性化合物を含有する。本発明の少なくとも一部の実施形態に係る単位剤形の仕様は、（ａ）活性化合物の独特の特徴および達成すべき特定の治療効果、ならびに（ｂ）個体の感受性を処置するためにかかる活性化合物を調合する技術分野に固有の制約によって決まり、これらに直接左右される。
【０４０６】
薬物の製剤化および投与のための技術は、参照により本明細書に組み込まれている"Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, PAの最新版において確認することができる。
【０４０７】
本発明の一部の実施形態の医薬組成物は、当技術分野で周知のプロセス、例えば、従来の混合、溶解、造粒、ドラジェ作製、湿式粉砕（ｌｅｖｉｇａｔｉｎｇ）、乳化、カプセル封入、捕捉、または凍結乾燥のプロセスによって製造することができる。
【０４０８】
本発明の組成物は、当技術分野で公知である種々の方法のうちの１つまたは複数を使用して、１つまたは複数の投与ルートを介して投与することができる。当業者には理解されるであろうが、投与のルートおよび／または様式は、所望の結果に応じて異なる。本発明の少なくとも一部の実施形態に係る治療剤の好ましい投与ルートとしては、血管内送達（例えば注射または注入）、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄、経口、経腸、直腸、肺（例えば吸入）、経鼻、局所（経皮、頬側、および舌下を含む）、膀胱内、硝子体内、腹腔内、腟内、脳送達（例えば脳室内、脳内、および対流強化拡散（ｃｏｎｖｅｃｔｉｏｎ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ））、ＣＮＳ送達（例えばくも膜下腔内、脊髄周囲（ｐｅｒｉｓｐｉｎａｌ）、および脊髄内）、もしくは非経口（皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内（ＩＶ）、および皮内を含む）、経皮（受動的か、またはイオン泳動もしくは電気穿孔の使用のいずれか）、経粘膜（例えば、舌下投与、経鼻、腟内、直腸、または舌下）の各種投与、またはインプラントによる投与、または例えば注射もしくは注入による他の非経口投与ルート、または当技術分野で公知の他の送達ルートおよび／もしくは投与形態が挙げられる。本明細書において使用される「非経口投与」という表現は、経腸投与および局所投与以外の投与様式を意味し、通常は注射によるものである。限定されるものではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外、および胸骨下の注射および注入、または生体内分解性挿入物の使用を含み、各投与ルートに適切な剤形で製剤化することができる。特定の実施形態において、本発明の少なくとも一部の実施形態に係るタンパク質、治療剤、または医薬組成物は、腹腔内または静脈内に投与することができる。
【０４０９】
本発明の組成物は、空気動力学的直径が約５ミクロン未満のエアロゾルまたは噴霧乾燥粒子のいずれかとして送達された場合、吸入中に肺に送達され、肺上皮層を横断して血流に入ることができる。治療用製剤を肺に送達するように設計された様々な機械デバイスを使用することができる。この機械デバイスは、限定されるものではないが、ネブライザー、計量式吸入器、および粉末吸入器を含み、これらはすべて、当業者にはよく知られている。市販のデバイスのいくつかの特定例は、Ｕｌｔｒａｖｅｎｔネブライザー（ミズーリ州、セントルイス、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ  Ｉｎｃ．製）、Ａｃｏｒｎ  ＩＩネブライザー（コロラド州、エングルウッド、Ｍａｒｑｕｅｓｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社製）、Ｖｅｎｔｏｌｉｎ計量式吸入器（ノースカロライナ州、リサーチ・トライアングル・パーク、Ｇｌａｘｏ  Ｉｎｃ．製）、およびＳｐｉｎｈａｌｅｒ粉末吸入器（マサチューセッツ州、ベドフォード、Ｆｉｓｏｎｓ  Ｃｏｒｐ製．）である。Ｎｅｋｔａｒ社、Ａｌｋｅｒｍｅｓ社、およびＭａｎｎｋｉｎｄ社の各社は、吸入可能なインスリン粉末調製物が承認されているか、またはこの技術が本明細書に記載の製剤に適用され得る臨床試験段階にある。
【０４１０】
いくつかのｉｎ  ｖｉｖｏアプローチでは、本明細書で開示する組成物を治療有効量で対象に投与する。本明細書において使用する場合、「有効量」または「治療有効量」という用語は、処置されている障害の１つまたは複数の症状を処置、阻害、もしくは緩和するのに十分であるか、さもなければ所望の薬理的効果および／または生理学的効果をもたらすのに十分な投薬量を意味する。精確な投薬量は、対象に依存する可変要素（例えば、齢、免疫系の健康状態など）、疾患、および実施されている処置などの種々の要因に応じて異なる。本明細書で開示するポリペプチド組成物、これをコードするポリヌクレオチドおよび核酸構築物、ならびに本明細書に記載の細胞については、さらなる研究が行われるに従い、様々な患者における様々な状態の処置に適切な投薬量レベルに関する情報が明らかになるであろう。また、当業者であれば、レシピエントの治療状況、年齢、および全体的な健康を考慮して、適切な投薬を確定することができるであろう。選択する投薬量は、所望の治療効果、投与ルート、および所望される処置の期間に依存する。ポリペプチド組成物については、一般に１日当たり０．０００１〜１００ｍｇ／体重１ｋｇ、より一般的には０．００１〜２０ｍｇ／ｋｇの投薬量レベルが哺乳動物に投与される。例えば、投薬量は、０．３ｍｇ／体重１ｋｇ、１ｍｇ／体重１ｋｇ、３ｍｇ／体重１ｋｇ、５ｍｇ／体重１ｋｇ、または１０ｍｇ／体重１ｋｇ、または１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であり得る。例示的な処置レジメンは、１週間当たり５回、１週間当たり４回、１週間当たり３回、１週間当たり２回、１週間当たり１回、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、１か月に１回、３か月毎に１回、または３〜６か月毎に１回の投与を必要とする。概して、静脈内注射または注入の場合、投薬量は比較的低くてよい。投薬レジメンは、最適な所望の応答（例えば、治療応答）をもたらすように調整される。例えば、単回ボーラス投与、いくつかの分割用量の経時的な投与、または、治療状況の緊急性により必要に応じて用量を相対的に低減もしくは増加させてもよい。非経口組成物は、投与を容易にし投薬量を均一にするために、単位剤形で製剤化することが特に有利である。本明細書において使用される単位剤形とは、処置される対象のための単位投薬量として適切な物理的に別個の単位を指し、各単位が、必要な薬学的担体と関連して所望の治療効果をもたらすように計算された所定量の活性化合物を含有する。本発明の少なくとも一部の実施形態に係る単位剤形の仕様は、（ａ）活性化合物の独特の特徴および達成すべき特定の治療効果、ならびに（ｂ）個体の感受性を処置するためにかかる活性化合物を調合する技術分野に固有の制約によって決まり、これらに直接依存する。
【０４１１】
任意選択で、ポリペプチド製剤は、任意の好適なタイミングレジメンに従って、０．０００１〜１００ｍｇ／患者の体重１ｋｇ／日、好ましくは０．００１〜２０．０ｍｇ／ｋｇ／日の量で投与してよい。本発明の少なくとも一部の実施形態に係る治療用組成物は、例えば、１日３回、１日２回、１日１回、１週間に３回、１週間に２回または１週間に１回、２週間毎または３週間毎、４週間毎、５週間毎、６週間毎、７週間毎もしくは８週間毎に１回投与してもよい。さらに、組成物は、短期間または長期間（例えば、１週間、１か月、１年間、５年間）にわたって投与してもよい。
【０４１２】
代替的には、本明細書で開示する組成物などの治療剤は、持続放出性製剤として投与してもよく、この場合、より低頻度での投与が必要とされる。投薬量および頻度は、患者における治療剤の半減期に応じて異なる。一般に、ヒト抗体が最も長い半減期を示し、その後にヒト化抗体、キメラ抗体、および非ヒト抗体が続く。融合タンパク質の半減期は大きく異なり得る。投薬量および投与の頻度は、処置が予防的であるか治療的であるかに応じて異なり得る。予防的用途では、比較的低い投薬量が、頻度の比較的低い間隔で長期間にわたって投与される。一部の患者は、その生涯にわたって処置を受け続ける。治療的用途では、場合により、疾患の進行が減速または終結するまで、好ましくは患者が疾患症状の部分的または完全な寛解を示すまで、比較的短い間隔で比較的高い投薬量が必要とされる。その後、予防的レジメンで患者に投与され得る。
【０４１３】
本発明の医薬組成物における活性成分の実際の投薬量レベルは、患者に対して有毒となることなく、特定の患者、組成物、および投与様式に関して所望される治療応答を達成するために有効な量の活性成分が得られるように変更してもよい。選択する投薬量レベルは、用いる特定の本発明の組成物の活性、投与ルート、投与時間、用いる特定の化合物の排泄速度、処置の期間、用いる特定の組成物と併用する他の薬物、化合物、および／または材料、処置する患者の年齢、性別、体重、状態、全体的な健康、および過去の病歴を含む種々の薬物動態学的要因、ならびに医学分野で周知である同様の要因に依存する。
【０４１４】
本明細書で開示するポリペプチドの「治療有効投薬量」は、好ましくは、疾患症状の重症度の減少、疾患症状のない期間の頻度および持続期間の増加、寿命の延長、疾患の軽快、または疾患に罹患しることに起因する機能障害もしくは能力障害の防止もしくは低減をもたらす。
【０４１５】
当業者は、特に、本明細書に提供する詳細な開示内容を踏まえれば、対象のサイズ、対象の症状の重症度、および選択される特定の組成物または投与ルートなどの要因に基づいて、治療有効量を決定することができるであろう。
【０４１６】
ある特定の実施形態では、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、核酸構築物、または細胞の組成物は、例えば、処置すべき部位に直接注射することにより、局所投与される。典型的には、注射により、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、核酸構築物、または細胞の組成物の局所濃度が、全身投与によって達成され得る濃度よりも高い濃度に上昇する。ポリペプチド組成物を上述のマトリックスと組み合わせると、処置すべき部位から出るポリペプチドの受動的拡散を低減させることにより、ポリペプチド組成物の局所濃度の上昇をもたらすのに役立ち得る。
【０４１７】
本発明の医薬組成物は、当技術分野で公知の医療デバイスを用いて投与することができる。例えば、任意選択の実施形態において、本発明の少なくとも一部の実施形態に係る医薬組成物は、米国特許第５，３９９，１６３号、同第５，３８３，８５１号、同第５，３１２，３３５号、同第５，０６４，４１３号、同第４，９４１，８８０号、同第４，７９０，８２４号、または同第４，５９６，５５６号に開示されているデバイスなどの、無針皮下注射デバイスを用いて投与することができる。本発明において有用な周知のインプラントおよびモジュールの例としては、制御された速度で薬物を分注するための植込み型微量注入ポンプを開示する米国特許第４，４８７，６０３号、皮膚を通して薬品を投与するための治療デバイスを開示する米国特許第４，４８６，１９４号、精確な注入速度で薬物を送達するための薬物注入ポンプを開示する米国特許第４，４４７，２３３号、持続的な薬物送達のための流量可変植込み型注入装置を開示する米国特許第４，４４７，２２４号、マルチチャンバコンパートメントを有する浸透圧性薬物送達系を開示する米国特許第４，４３９，１９６号、および浸透圧性薬物送達系を開示する米国特許第４，４７５，１９６号が挙げられる。これらの特許は、参照により本明細書に組み込まれる。このようなインプラント、送達系、およびモジュールは、他にも多くが当業者に公知である。
【０４１８】
活性化合物は、化合物の急速な放出を防ぐ担体と共に調製することができ、これは例えば徐放性製剤であり、インプラント、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化送達系を含む。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸など、生分解性、生体適合性ポリマーを使用してもよい。このような製剤を調製するための多くの方法が特許取得済みであるか、または一般的に当業者に公知である。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照されたい。
【０４１９】
治療用組成物は、当技術分野で公知の医療デバイスを用いて投与することができる。例えば、任意選択の実施形態において、本発明の少なくとも一部の実施形態に係る治療用組成物は、米国特許第５，３９９，１６３号、同第５，３８３，８５１号、同第５，３１２，３３５号、同第５，０６４，４１３号、同第４，９４１，８８０号、同第４，７９０，８２４号、または同第４，５９６，５５６号に開示されているデバイスなどの、無針皮下注射デバイスを用いて投与することができる。本発明において有用な周知のインプラントおよびモジュールの例としては、制御された速度で薬物を分注するための植込み型微量注入ポンプを開示する米国特許第４，４８７，６０３号、皮膚を通して薬品を投与するための治療デバイスを開示する米国特許第４，４８６，１９４号、精確な注入速度で薬物を送達するための薬物注入ポンプを開示する米国特許第４，４４７，２３３号、持続的な薬物送達のための流量可変植込み型注入装置を開示する米国特許第４，４４７，２２４号、マルチチャンバコンパートメントを有する浸透圧性薬物送達系を開示する米国特許第４，４３９，１９６号、および浸透圧性薬物送達系を開示する米国特許第４，４７５，１９６号が挙げられる。これらの特許は、参照により本明細書に組み込まれている。このようなインプラント、送達系、およびモジュールは、他にも多くが当業者に公知である。
【０４２０】
ある特定の実施形態では、本発明の少なくとも一部の実施形態に係る治療用化合物がＢＢＢを通過することを確実にするために（所望される場合）、これらの治療用化合物は、例えばリポソームで製剤化することができる。リポソームの製造方法については、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号、同第５，３７４，５４８号、および同第５，３９９，３３１号を参照されたい。リポソームは、特定の細胞または臓器に選択的に輸送されることにより、標的の薬物送達を増進する、１つまたは複数の部分を含み得る（例えば、V. V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685を参照されたい）。例示的な標的化部分としては、葉酸塩またはビオチン（例えば、Ｌｏｗらの米国特許第５，４１６，０１６号を参照されたい）；マンノシド（Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038）；抗体（P. G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140、M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180）；界面活性剤プロテインＡ受容体（Briscoe et al. (1995) Am. J Physiol. 1233:134）；ｐ１２０（Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090）が挙げられる。K. Keinanen; M. L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123、J. J. Killion; I. J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273も参照されたい。
【０４２１】
非経口投与のための製剤
さらなる実施形態において、本明細書で開示する組成物は、ペプチドおよびポリペプチドを含有するものを含め、非経口注射により、水溶液において投与される。製剤は、懸濁液またはエマルションの形態であってもよい。概して、本明細書に記載のペプチドもしくはポリペプチド、ポリヌクレオチド、核酸構築物、または細胞を有効量で含む医薬組成物が提供され、これは任意選択で、薬学的に許容される希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント、および／または担体を含む。このような組成物は、任意選択で、希釈剤、滅菌水、様々なバッファー内容物（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨ、およびイオン強度の緩衝食塩水；ならびに、洗剤および可溶化剤（例えば、ＴＷＥＥＮ  ２０（ポリソルベート−２０）、ＴＷＥＥＮ  ８０（ポリソルベート−８０））、抗酸化剤（例えば、水溶性抗酸化剤、例えばアスコルビン酸、二亜硫酸ナトリウム、システイン塩酸塩、硫酸水素ナトリウム、二亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム；油溶性抗酸化剤、例えばパルミチン酸アスコルビル、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロール；および金属キレート剤、例えばクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸）、および保存剤（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール）、および増量物質（例えば、ラクトース、マンニトール）などの添加剤のうちの１つまたは複数を含む。非水性の溶媒またはビヒクルの例は、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油およびトウモロコシ油などの植物油、ゼラチン、およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルである。製剤は、フリーズドライ（凍結乾燥）または真空乾燥し、使用直前に再溶解／再懸濁してもよい。製剤は、例えば、細菌保持フィルタを通して濾過すること、組成物に滅菌剤を組み込むこと、組成物を照射処理すること、または組成物を加熱することにより、滅菌することができる。
【０４２２】
局所投与のための製剤
本明細書で開示する様々な組成物（例えば、ポリペプチド）は、局所適用することができる。局所投与は、ほとんどのペプチド製剤では効果的でないが、特に肺、鼻腔、口腔（舌下、頬側）、腟内、または直腸の粘膜に適用した場合には有効であり得る。
【０４２３】
組成物は、空気動力学的直径が約５ミクロン未満のエアロゾルまたは噴霧乾燥粒子のいずれかとして送達された場合、吸入中に肺に送達され、肺上皮層を横断して血流に入ることができる。
【０４２４】
治療用製剤を肺送達するように設計した様々な機械デバイスを使用することができる。この機械デバイスは、限定されるものではないが、ネブライザー、計量式吸入器、および粉末吸入器を含み、これらはすべて、当業者にはよく知られている。市販のデバイスのいくつかの特定例は、Ｕｌｔｒａｖｅｎｔネブライザー（ミズーリ州、セントルイス、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ  Ｉｎｃ．製）、Ａｃｏｒｎ  ＩＩネブライザー（コロラド州、エングルウッド、Ｍａｒｑｕｅｓｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社製）、Ｖｅｎｔｏｌｉｎ計量式吸入器（ノースカロライナ州、リサーチ・トライアングル・パーク、Ｇｌａｘｏ  Ｉｎｃ．製）、およびＳｐｉｎｈａｌｅｒ粉末吸入器（マサチューセッツ州、ベドフォード、Ｆｉｓｏｎｓ  Ｃｏｒｐ製．）である。Ｎｅｋｔａｒ社、Ａｌｋｅｒｍｅｓ社、およびＭａｎｎｋｉｎｄ社の各社は、吸入可能なインスリン粉末調製物が承認されているか、またはこの技術が本明細書に記載の製剤に適用され得る臨床試験段階にある。
【０４２５】
粘膜に投与するための製剤は、典型的には、噴霧乾燥した薬物粒子であり、これは、錠剤、ゲル、カプセル、懸濁液、またはエマルションに組み込むことができる。標準的な薬学的賦形剤は、いずれの製薬会社からも入手可能である。経口製剤は、チューインガム、ゲル片、錠剤、またはロゼンジの形態であり得る。
【０４２６】
経皮製剤を調製することもできる。これらは典型的には軟膏、ローション、スプレー、またはパッチであり、これらはすべて、標準的な技術を使用して調製することができる。経皮製剤は、浸透促進剤の包含を必要とする。
【０４２７】
制御送達ポリマーマトリックス
本明細書で開示する様々な組成物（例えば、ポリペプチド）は、徐放性製剤として投与することもできる。ポリマーデバイス（ロッド、シリンダー、フィルム、ディスク）の植込みまたは注射（微粒子）の後に長期にわたって全身に放出するための徐放性ポリマーデバイスを製造することができる。マトリックスは、ペプチドが固体ポリマーマトリックス中に分散したマイクロスフェア、または、コアがポリマーシェルとは異なる材料からなり、ペプチドがコア内に分散もしくは懸濁されたマイクロカプセル（このコアは、実質的に液体であっても固体であってもよい）などの、微粒子の形態であり得る。本明細書において明確に定義されない限り、微粒子、マイクロスフェア、およびマイクロカプセルは、交換可能に使用される。代替的には、ポリマーは、数ナノメートルから４センチメートルまでの範囲の薄いスラブまたはフィルムとしてキャスティングしてもよいし、粉砕もしくは他の標準的な技術によって作製された粉末であってもよいし、またはヒドロゲルなどのゲルであってもよい。
【０４２８】
ポリペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸を送達するには、生分解性ではないマトリックスまたは生分解性であるマトリックスのいずれを使用してもよいが、生分解性であるマトリックスが好ましい。これらは天然ポリマーであっても合成ポリマーであってもよいが、合成ポリマーの分解および放出プロファイルの特徴がより良好であるため、合成ポリマーが好ましい。ポリマーは、放出が所望される期間に基づいて選択する。場合によっては、線形放出が最も有用であり得るが、他の場合では、パルス放出または「バルク放出」がより有効な結果をもたらし得る。ポリマーは、ヒドロゲル（典型的には最大約９０重量％の水を吸収する）の形態であってよく、任意選択で、多価イオンまたはポリマーと架橋させてもよい。
【０４２９】
マトリックスは、溶媒蒸発、噴霧乾燥、溶媒抽出、および当業者に公知の他の方法によって形成することができる。生体内分解性マイクロスフェアは、例えば、Mathiowitz and Langer, J. Controlled Release, 5:13-22 (1987)、Mathiowitz, et al., Reactive Polymers, 6:275-283 (1987)、およびMathiowitz, et al., J. Appl Polymer ScL, 35:755-774 (1988)に記載されているような、薬物送達のためのマイクロスフェアを作るために開発された方法のうちのいずれを使用して調製してもよい。
【０４３０】
これらのデバイスは、典型的には体全体の処置のための投薬量よりも大幅に低い投薬量を送達する植込みもしくは注射した領域を処置する局所放出用に製剤化してもよいし、全身送達用に製剤化してもよい。これらのデバイスは、皮下、筋肉内、脂肪内に植込みまたは注射してもよいし、嚥下してもよい。
【０４３１】
本発明の一部の実施形態の組成物は、所望の場合、活性成分を含有する１つまたは複数の単位剤形を含み得る、ＦＤＡ承認キットなどのパックまたはディスペンサーデバイスとして提供することができる。パックは、例えば、金属箔またはプラスチック箔、例えばブリスターパックを含み得る。パックまたはディスペンサーデバイスには、投与に関する説明書が付属していてもよい。パックまたはディスペンサーには、医薬品の製造、使用、または販売を規制する行政機関が規定した形態における、容器に付随した通知が収容されていてもよい。この通知は、組成物の形態またはヒトもしくは動物への投与が当該機関によって承認されたことを反映するものである。このような通知は、例えば、米国食品医薬品局によって承認された処方薬のラベル、または承認された製品の添付文書に関するものであり得る。また、適合性のある薬学的担体において製剤化された本発明の調製物を含む組成物を調製し、適切な容器に入れ、詳細に上述した適応症状の処置に関するラベルを付してもよい。
【０４３２】
本明細書において使用する場合、「約」という用語は、±１０％を指す。
【０４３３】
「具備する（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「具備している（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語およびその活用形は、「限定されるものではないが、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」を意味する。
【０４３４】
「からなる」という用語は、「含み、限定される」ことを意味する。
【０４３５】
「から実質的になる」という用語は、組成物、方法または構造が追加の成分、工程および／または部分を含み得ることを意味する。但しこれは、追加の成分、工程および／または部分が、請求項に記載の組成物、方法または構造の基本的かつ新規な特性を実質的に変更しない場合に限られる。
【０４３６】
本明細書において、単数形を表す「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他を示さない限り、複数をも対象とする。例えば、「化合物（a compound）」または「少なくとも１種の化合物」には、複数の化合物が含まれ、それらの混合物をも含み得る。
【０４３７】
本願全体を通して、本発明のさまざまな実施形態は、範囲形式にて示され得る。範囲形式での記載は、単に利便性および簡潔さのためであり、本発明の範囲の柔軟性を欠く制限ではないことを理解されたい。したがって、範囲の記載は、可能な下位の範囲の全部、およびその範囲内の個々の数値を特異的に開示していると考えるべきである。例えば、１〜６といった範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６等の部分範囲のみならず、その範囲内の個々の数値、例えば１、２、３、４、５および６も具体的に開示するものとする。これは、範囲の大きさに関わらず適用される。
【０４３８】
本明細書において数値範囲を示す場合、それは常に示す範囲内の任意の引用数（分数または整数）を含むことを意図する。第１の指示数と第２の指示数「との間の範囲」という表現と、第１の指示数「から」第２の指示数「までの範囲」という表現は、本明細書で代替可能に使用され、第１の指示数および第２の指示数と、それらの間の分数および整数の全部を含むことを意図する。
【０４３９】
本明細書で使用する「方法」という用語は、所定の課題を達成するための様式、手段、技術および手順を意味し、化学、薬理学、生物学、生化学および医療の各分野の従事者に既知のもの、または既知の様式、手段、技術および手順から従事者が容易に開発できるものが含まれるが、これらに限定されない。
【０４４０】
特定の配列表を参照する場合、そのような参照は、例えば、シーケンシングエラー、クローニングエラー、または塩基置換、塩基欠失、もしくは塩基付加をもたらす他の改変に起因する、わずかな配列変化を含む相補的配列に実質的に対応する配列も包含するものと理解されたい。ただし、そのような変化の頻度は、５０ヌクレオチド中１未満、代替的には１００ヌクレオチド中１未満、代替的には２００ヌクレオチド中１未満、代替的には５００ヌクレオチド中１未満、代替的には１０００ヌクレオチド中１未満、代替的には５，０００ヌクレオチド中１未満、代替的には１０，０００ヌクレオチド中１未満であることを条件とする。
【実施例】
【０４４１】
概念実証（ＰＯＣ）実験
Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬの製造
最初のＰＯＣ分析のために、ヒスチジンタグ付きタンパク質を作製する。６−Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬをコードするｃＤＮＡ配列を、哺乳動物の発現ベクターにサブクローニングする。トランスフェクショングレードのプラスミド調製物を使用して、Ｅｘｐｉ２９３細胞または他の細胞株にプラスミドをトランスフェクトする。Ｅｘｐｉ２９３発現細胞の上清（１００ｍｌスケール）中のＳＩＲＰα−４１ＢＢＬの生成量を、抗Ｈｉｓ抗体を用いた還元型および非還元型のＳＤＳ−ＰＡＧＥならびにウエスタンブロット（ＷＢ）によって評価する。次に、親和性ベースの１ステップ精製（ニッケルビーズ）により、Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬを陽性上清から精製する。分子の各ドメイン（すなわち、ＳＩＲＰαおよび４１ＢＢＬの細胞外ドメインのそれぞれ）に対する特異的抗体を使用したＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析により、タグ付きキメラタンパク質の作製を検証する。
【０４４２】
実験１Ａ−Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質の作製
完全な融合タンパク質のコード配列をクローニングしたｐｃＤＮＡ３．４発現ベクターをトランスフェクトしたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞による、ＨｉｓタグＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質（配列番号５）の産生を実施する。ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素を使用してこの配列をベクターにクローニングし、Ｋｏｚａｋ配列、人工シグナルペプチド、および６ＨｉｓタグをＮ末端に、Ｃ末端に終止コドンを付加した（配列番号１５）。
【０４４３】
細胞培養物の上清からタンパク質を収集し、ＨｉｓＴｒａｐ（商標）ＦＦ  Ｃｒｕｄｅカラムによる１ステップ精製によって精製した。
【０４４４】
実験１Ｂ−作製したＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質は両方のドメインを含有する
材料−本明細書において上述した実験１Ａに記載のように作製したＨｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質（配列番号５）のタンパク質マーカーは、以下の通りである：Ｓｐｅｃｔｒａ  ＢＲ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、カタログ番号２６６３４）、抗ＳＩＲＰα（ＳＨＰＳ１）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製、カタログ番号１３３７９）、抗４１ＢＢ−Ｌ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ社製、５３６９−１００）、マウス抗Ｈｉｓ  ｍＡｂ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製、カタログ番号Ａ００１８６）、二次ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＨＲＰコンジュゲート（１：３３３３）（Ｒ＆Ｄ社製、カタログ番号１７０−６５１５）、組換えｈＳＩＲＰα  ０．１ｍｇ／ｍｌ（４５４６−ＳＡ−０５０）Ｒ＆Ｄ社製、組換えｈ４１ＢＢ−Ｌ（ＴＮＦＳＦ９）０．１ｍｇ／ｍｌ（８４６０ＬＦ）Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製、ストリッピングバッファー（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、カタログ番号２１０５９）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  Ｍｉｘ：（ＮＥＢ  ｐ６０４４）。
【０４４５】
方法−タンパク質（１レーン当たり２５０ｎｇ）を変性条件または非変性条件（それぞれ、β−メルカプトエタノールを含有する試料バッファー中で５分間にわたり９５℃で煮沸、またはβ−メルカプトエタノールを含まない試料バッファー中で加熱なし）で処置し、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、その後ウエスタンブロッティングを行った。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  Ｍｉｘの製造元の説明書に従って、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ酵素による脱グリコシル化処置を実施した。
【０４４６】
結果−変性条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、抗Ｈｉｓタグ抗体（図１）または抗４１ＢＢＬ抗体（図２Ａ）を用いてイムノブロッティングを行ったＨｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ（配列番号５）のウエスタンブロット分析は、分子のＮ末端側と分子のＣ末端側との両方が存在することを示した。タンパク質のアミノ酸配列による予想分子量はおよそ６０ｋＤａであるが、変性条件下のタンパク質は、およそ８５ｋＤａのサイズだけ移動した。このシフトは、糖タンパク質からほぼすべてのＮ結合型オリゴ糖を除去するＰＮＧａｓｅ  Ｆ酵素でタンパク質を処置することにより決定して、タンパク質のグリコシル化に関連していることが分かった。処置後、約６０ｋＤａの主要なバンドが観察された（図２Ｃ）。
【０４４７】
非変性条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離したとき（図１および２Ｂ）、Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ（配列番号５）は、変性条件下（図１、２Ａ、および２Ｂ）と同じ分子量で検出された。より高い分子量のさらなるバンドも検出されたが、これらは、変性条件と比較して非変性条件下でより強かった。これは、多量体（多量体のサイズおよび４１ＢＢＬタンパク質は自然と三量体を形成する傾向にあるという事実によると、おそらく三量体）の形成を示唆し得る（Eun-Young et al, 2010, THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 285, NO. 12, pp. 9202-9210）。
【０４４８】
実験１Ｃ−キメラのＳＩＲＰα部分および４−１ＢＢＬ部分に対するＣＤ４７および４１ＢＢの結合分析
ＣＤ４７に対する分子のＳＩＲＰαドメインの結合、および４１ＢＢに対する分子の４１ＢＢＬドメインの結合を、バイオレイヤー干渉法Ｂｌｉｔｚ（登録商標）アッセイによって決定した。
【０４４９】
材料−ＣＤ４７：ＦＣ（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社、カタログ番号１２２８３−Ｈ０２Ｈ）、４１ＢＢ：ＦＣ（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社、カタログ番号１００４１−Ｈ０３Ｈ）、本明細書上文の実験１Ａの記載に従って作製したＨｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質（配列番号５）、ＰＤ１−ＣＤ７０タンパク質（配列番号６、陰性対照として）。
【０４５０】
方法および結果−バイオセンサにＣＤ４７：Ｆｃを予めロードした場合、安定な会合プラトーが得られた（図３Ａ）。その後、ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ（配列番号５）と共にインキュベートすると、ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬのＣＤ４７：Ｆｃへの急速な会合が検出された（図３Ａ）。対照タンパク質ＰＤ１−ＣＤ７０（ＣＤ７０に融合したＰＤ−１ドメインからなる、配列番号６）と共に同様にインキュベートしても、ＣＤ４７：Ｆｃへの結合は得られなかった（図３Ａ）。さらに、バイオセンサにＣＤ４７：Ｆｃを予めロードしておかなかった場合、ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬは会合しなかった（図３Ａ、一番下の線）。安定な会合プラトーに達したら、バイオセンサを培地で洗浄して、ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬのＣＤ４７：Ｆｃからのオフ速度を決定した。ＣＤ４７：Ｆｃをロードしたバイオセンサからのｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬの解離は非常に遅く、ＣＤ４７とＳＩＲＰαの安定な相互作用を示唆している。
【０４５１】
バイオセンサに４１ＢＢ：Ｆｃを同様にロードし、ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ（配列番号５）の４１ＢＢＬユニットの結合を評価した（図３Ｂ）。ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬの４１ＢＢＬドメインは、ＳＩＲＰαドメインと同様に、その標的受容体に急速に結合した（図３Ｂ）。最後の解離段階の間に生じた解離が限定的であったことから明らかなように、４１ＢＢＬ／４１ＢＢ相互作用のオフ速度も非常に遅かった。４１ＢＢＬドメインが欠如しているＰＤ１−ＣＤ７０（配列番号６）による対照処置では、４１ＢＢＬ：Ｆｃへの検出可能な結合は生じなかった（図３Ｂ）。さらに、４１ＢＢ：Ｆｃを予めロードしておかなかった場合、Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬは、検出できるほどにはバイオセンサに結合しなかった（図３Ｂ、一番下の線）。
【０４５２】
まとめると、Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ（配列番号５）の両ドメインが、それらの同族受容体に対する機能的な結合活性を保持する。
【０４５３】
実験１Ｄ−ＣＤ４７に対するキメラのＳＩＲＰα部分および４１ＢＢＬ部分の結合の分析
ＨＴ１０８０細胞もしくはＣＨＯ−Ｋ１細胞、またはＣＤ４７を過剰発現する別の細胞株を使用することにより、またはＣＤ４７を高レベルで発現することが公知であるがん細胞株を用いて、ヒトＣＤ４７に対する分子のＳＩＲＰαドメインの結合を評価する。ＣＤ４７ノックアウト細胞を陰性対照とする。様々な濃度のＨｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬで細胞を染色し、次に二次抗４１ＢＢＬ抗体によって染色する。蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）を使用したフローサイトメトリーによって結合を分析する。様々な濃度のキメラを使用することで、ＣＤ４７に対する分子の親和性を決定することができる。この結合試験では、結合の特異性を検証するために、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬの競合相手として組換えＳＩＲＰαも使用する。ＳＩＲＰαとＣＤ４７との間の相互作用を遮断する抗体を同じ目的に使用することもできる。
【０４５４】
ＨＴ１０８０細胞または４１ＢＢを過剰発現している別の細胞株を使用することにより、ヒト４１ＢＢに対するキメラの４１ＢＢＬ部分の結合を試験する。様々な濃度のＳＩＲＰα−４１ＢＢＬで細胞を染色し、次に二次抗ＳＩＲＰα抗体によって染色し、結合親和性をＦＡＣＳによって分析する。この結合試験では、結合の特異性を検証するために、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬの競合相手として組換え４１ＢＢＬを使用する。４１ＢＢと４１ＢＢＬとの間の相互作用を遮断する抗体を同じ目的に使用することもできる。
【０４５５】
材料−本明細書で上述した実験１Ａの記載に従ってして作製したＨｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質（配列番号５）、ＣＨＯ−ＷＴ細胞株およびＣＨＯ−ＣＤ４７細胞株（Bommel et al, 2017）、Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、カタログ番号５６２２４７）、ヒトＦｃブロッカー、Ｔｒｕｅ  ｓｔａｉｎ  ＦＣＸ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製、カタログ番号４２２３０２）、および下記表の抗体を使用した。
【０４５６】
【表１】
2020505010.tif 000005
【０４５７】
方法−発現アッセイとしては、記載の抗体で細胞（０．５Ｍ細胞／試料）を免疫染色し、続いてフローサイトメトリー分析を行った。結合アッセイでは、細胞をヒトＦｃブロッカーと共にプレインキュベートしてから、様々な濃度（０．０１〜５０μｇ／ｍｌ）のＨｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質（配列番号５）と共に３０分間にわたり氷上でインキュベートし、その後、分子の「自由な」アーム（４１ＢＢＬ）に対する抗体で免疫染色し、固定化し、フローサイトメトリーによって分析した。
【０４５８】
結果−図４Ａ〜Ｂに示したように、ＣＨＯ−Ｋ１−ＷＴ細胞はＣＤ４７も４１ＢＢも発現しない。一方、ＣＨＯ−Ｋ１−ＣＤ４７細胞はＣＤ４７を発現するが、４１ＢＢは発現しない。
【０４５９】
結合アッセイにより、Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ（配列番号５）は、ＣＨＯ−ＣＤ４７細胞に用量依存的様式で結合するが、ＣＨＯ−ＷＴ細胞には結合しないことが示された（図５Ａ〜Ｂ）。
【０４６０】
まとめると、Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質（配列番号５）のＮ末端は、細胞表面で過剰発現するＣＤ４７に結合することができる。
【０４６１】
実験２−キメラによる４１ＢＢ受容体の活性化
ＨＴ１０８０細胞または４１ＢＢ受容体を過剰発現している別の細胞株を使用することにより、Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬによる４１ＢＢ受容体の活性化効果を試験する。具体的に述べると、ＨＴ１０８０−４１ＢＢ細胞株は４１ＢＢを過剰発現し、４１ＢＢＬが結合するとＩＬ−８を分泌することが公知である（Wyzgol, et al, 2009, The Journal of Immunology）。これらの細胞の表面にある４１ＢＢ受容体に４１ＢＢＬが結合すると、シグナル伝達経路が活性化され、結果としてＩＬ８が分泌される。様々な濃度のＨｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬの存在下で細胞をインキュベートし、培養培地へのＩＬ８の分泌をＥＬＩＳＡによって決定する。抗Ｈｉｓタグ架橋抗体を様々な濃度で添加することにより、オリゴマー化を試験する。抗ＨｉｓタグＡｂの添加により、キメラ分子が架橋されてオリゴマーを形成し、結果としてＩＬ８分泌量が増加する。抗ＳＩＲＰα抗体を同じ目的（分子のＳＩＲＰα部分の架橋）に使用することもできる。
【０４６２】
オリゴマー化は、ヒトＣＤ４７を過剰発現しているＨＴ１０８０細胞、またはＣＤ４７を高発現しているがん細胞株と、４１ＢＢ受容体を過剰発現する細胞を共培養することによっても試験する。ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬは、ＨＴ１０８０またはがん細胞で発現するＣＤ４７に結合し、４１ＢＢＬ部分は、４１ＢＢ受容体を過剰発現しているＨＴ１０８０に提示される。このように、いくつかの分子が接近して提示されることにより、オリゴマー化の要件が満たされる。
【０４６３】
Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬによる４１ＢＢＬ受容体の活性化は、その部分、すなわち組換えＳＩＲＰαもしくは４１ＢＢＬ単独または組み合わせによる活性化と比較することができる。
【０４６４】
材料−本明細書で上述した実験１Ａの記載に従って作製したＨｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質（配列番号５）、ＨＴ１０８０−４１ＢＢ細胞（Lang et al 2015）、ＩＬ−８  ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号Ｄ８０００Ｃ、Ｒ＆Ｄ社製）、ＤＭＥＭ（カタログ番号０１−０５５−１Ａ、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製）、ＦＢＳ（カタログ番号１０２７０１０６、Ｒｈｅｎｉｕｍ社製）、ＡＩＭ  Ｖ（無血清培地）（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）。
【０４６５】
方法−ＨＴ１０８０−４１ＢＢ細胞（ウェル当たり５０００）を様々な濃度のＨｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質（配列番号５）と共に２４時間インキュベートした。製造元のプロトコールに従い、ＩＬ−８  ＥＬＩＳＡキットにより、上清中のＩＬ−８濃度を決定した。実験の一部では無血清培地を使用し、ＦＢＳを含む培地を使用して検出した比較的高いバックグラウンドを除去した。
【０４６６】
結果−いくつかの独立した実験により、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬの機能性が示された。Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質（配列番号５）は、ＩＬ８分泌量により決定した、ＨＴ１０８０−４１ＢＢＬ細胞によるＴＮＦＲシグナル伝達を誘起することが可能であり、この誘起は、ＦＢＳを含有する培地（図６）および無血清培地（図７）の両方において、用量依存的様式であった。
【０４６７】
実験３−ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬによるＴ細胞の活性化
健康なヒトドナーのＰＢＭＣ中のＴ細胞またはヒトＴＩＬを使用することにより、Ｔ細胞の活性化に対するＳＩＲＰα−４１ＢＢＬの効果を試験する。Ｔ細胞をまず、ヒト癌腫がん細胞と共培養し、Ｔ細胞活性化を誘導するために抗ＣＤ３および抗Ｅｐｃａｍ１の二重特異性抗体で処置し、次にＳＩＲＰα−４１ＢＢＬで処置する。抗ＣＤ３／Ｅｐｃａｍ１抗体は、Ｅｐｃａｍ１発現がん細胞に対して、Ｔ細胞を活性化するための第１のシグナルを送達する。ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ分子は、がん細胞の表面で発現したＣＤ４７と相互作用する。この相互作用は、分子の提示およびオリゴマー化を容易にし、これにより、Ｔ細胞の４１ＢＢ受容体と４１ＢＢＬ部分との相互作用、およびＴ細胞への第２の共刺激シグナルの送達が可能になる。Ｔ細胞の活性化レベルは、いくつかのパラメータを測定することによって決定する。第１には、Ｔ細胞表面の活性化マーカー（例えば、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＰＤ１など）の発現を試験する。活性化マーカーの発現は、特異的抗体での細胞の染色およびフローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）によって試験する。Ｔ細胞活性化を決定する第２の方法は、炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ２、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＮＦガンマなど）の分泌を測定することによる。炎症性サイトカインの分泌は、ＥＬＩＳＡによって試験する。Ｔ細胞の増殖の測定には、Ｔ細胞をＣＦＳＥ（カルボキシフルオレセインサクシニミジルエステル）で予備染色し、ＦＡＣＳによって求める、ＣＦＳＥ希釈による細胞の偏向を決定する。試験するさらなるパラメータは、がん細胞の死滅である。これは、カルシンＡＭ試薬を使用してがん細胞を予備標識し、発光プレートリーダーを使用して培養培地へのカルシンの放出を測定することによって測定する。
【０４６８】
ＴＩＬの活性化に対するＳＩＲＰα−４１ＢＢＬの効果は、腫瘍から抽出した後に腫瘍がん細胞と共培養し、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬで処置したＴＩＬで試験する。Ｔ細胞を活性化するための第１のシグナルは、がん細胞により、ＭＨＣクラスＩ：ペプチド−ＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）経路を介して送達される。ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質は、腫瘍細胞の表面で発現したＣＤ４７と相互作用する。この相互作用は、分子の提示およびオリゴマー化を容易にし、したがって、Ｔ細胞の４１ＢＢ受容体と４１ＢＢＬ部分との相互作用、およびＴ細胞への第２の共刺激シグナルの送達が可能になる。ＴＩＬの活性化レベルおよび腫瘍細胞の死滅は、記載したものと同じ方法（活性化マーカー、サイトカイン分泌、腫瘍細胞の増殖および死滅）で決定する。
【０４６９】
Ｈｉｓ−ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬによるＴ細胞の活性化は、その部分、すなわち組換えＳＩＲＰαもしくは４１ＢＢＬ単独または組み合わせによる活性化と比較することができる。
【０４７０】
実験３Ａ−ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質はＴ細胞共刺激活性を示す
材料−本明細書で上述した実験１Ａの記載に従って作製したＨｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質（配列番号５）；ＨＴ１０８０−４１ＢＢ細胞株、ＣＨＯ−ＷＴ細胞株、ＣＨＯ−Ｋ１−ＣＤ４７細胞株、およびＤＬＤ１細胞株（Bommel et al 2017、Lang et al 2015、ＡＴＣＣ−ＣＣＬ−２２１）、単離したばかりのヒトＴ細胞、ＩＬ８  Ｅｌｉｓａキット（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製、カタログ番号ＤＹ２０８）、ＣＤ４７：ＦＣ（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製、カタログ番号１２２８３−Ｈ０２Ｈ）、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８活性化ビーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、カタログ番号１１１３１Ｄ）、抗ＣＤ２５抗体（Ｉｍｍｕｎｏ  Ｔｏｏｌｓ社製、カタログ番号２１２７０２５６）、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ社製、０７８５１）名称：ＣＤ１４  ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ，ｈｕｍａｎ（ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社製、１３０−０５０−２０１）。
【０４７１】
方法および結果−４１ＢＢで形質転換したＨＴ１０８０細胞（ＨＴ１０８０−４１ＢＢ）の単一培養物をＨｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ（配列番号５）で処置したところ、２４時間のインキュベーションの後にＩＬ−８のごくわずかな生成が検出された（図８Ａ）。同様に、ＨＴ１０８０−４１ＢＢ細胞を野生型ＣＨＯ細胞と混合したとき、Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ（配列番号５）での処置は、ＩＬ−８の分泌をごくわずかに誘導した（図８Ａ）。しかしながら、ＨＴ１０８０−４１ＢＢとＣＨＯ−ＣＤ４７との混合培養物を、Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ（配列番号５）で処置すると、（ＳＩＲＰαドメインのＣＨＯ−ＣＤ４７への結合、および架橋された４１ＢＢＬのＨＴ１０８０−４１ＢＢへの提示が可能となり）、ＩＬ−８分泌量の大きな増加が誘起され、ＩＬ−８分泌量は２０００ｐｇ／ｍＬでピークに達した（図８Ｂ）。よって、Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質（配列番号５）のＣＤ４７に対する結合は、４１ＢＢＬ／４１ＢＢの相互作用に応じてＩＬ−８の分泌を刺激するために有益である。
【０４７２】
次に、Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ（配列番号５）の４１ＢＢＬドメインによるＴ細胞活性化の誘導の可能性を評価した。Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐを製造元の説明書に従って用い、健康なドナーの血液からＰＢＭＣを単離した。細胞をＣＤ１４  ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓで染色し、ＭＡＣＳ分取システムを用い、製造元の説明書に従ってＴ細胞を単離した。この目標を達成するために、ＣＤ４７−Ｆｃでコーティングしたプレートに単離したばかりのＴ細胞を加え、最適未満の濃度の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８活性化ビーズを用いて３日間活性化した。処置後、活性化したＣＤ２５＋Ｔ細胞のパーセンテージの明らかな増加が、Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬで処置した細胞において検出され（図８Ｃ）、最適な誘導は約２．５μｇ／ｍｌにおいて生じた。その後のＤＬＤ−１細胞およびＴ細胞の混合培養では、Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質（配列番号５）での処置により、ＣＤ２５＋Ｔ細胞のパーセンテージが増加し（図８Ｃ〜Ｅ）、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質がＴ細胞を活性化し得ることが示された。よって、Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質（配列番号５）のＣＤ４７に対する結合により、４１ＢＢＬ／４１ＢＢを介したＴ細胞の共刺激および活性化が可能になる。
【０４７３】
まとめると、これらのデータは、ＣＤ４７を介して結合すると、Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質（配列番号５）が、Ｔ細胞活性化を増強させることができる４１ＢＢＬを介した共刺激活性を得るということの、明らかな証拠を提供する。
【０４７４】
実験３Ｂ−ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質はヒトＰＢＭＣの活性化を増強する
材料−本明細書で上述した実験１Ａの記載に従って作製したＨｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質（配列番号５）；ＩＮＦ−γ  ＥＬＩＳＡキット［カタログ番号９００−ＴＭ２７、カタログ番号９００−Ｔ００−Ｅｌｉｓａ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｋｉｔ（ＴＭＢ）］、ＲＰＭＩ（カタログ番号０１−１００−１Ａ、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製）、ＦＢＳ（カタログ番号１２６５７−０２９、Ｇｉｂｃｏ社製）、Ｌ−グルタミン（カタログ番号２５０３０−２４、Ｇｉｂｃｏ社製）、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（カタログ番号１５１４０−１２２、Ｇｉｂｃｏ社製）、葉から精製された抗ヒトＣＤ３（カタログ番号ＢＬＧ−３１７３１５、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）、組換えヒトＩＬ２（カタログ番号２０２−ＩＬ−５００、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、健康なドナーの末梢血からＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（カタログ番号１７−１４４０−０３、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）によって単離されたヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、抗ＣＤ４７抗体（カタログ番号ＭＣＡ２５１４Ａ６４７、Ｂｉｏｒａｄ社製）、抗４１ＢＢＬ抗体（カタログ番号３１１５０４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、ＭＶ４−１１ヒト白血病細胞（ＡＴＣＣ、Abraham et al 2017）。
【０４７５】
方法−フローサイトメトリーにより、ＣＤ４７の発現およびＨｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬの結合について、ＭＶ４−１１細胞を試験した。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ法（Grienvic et al. 2016）を使用し、健康なドナーの末梢血からヒトＰＢＭＣを単離した。続いて、様々な濃度のＨｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質（配列番号５）を添加し、抗ＣＤ３（３０ｎｇ／ｍｌ）または抗ＣＤ３＋ＩＬ２（１０００Ｕ／ｍｌ）の存在下で、ＰＢＭＣを４０時間にわたって培養した。この実験は、ＣＤ４７を発現するヒトがん細胞株ＭＶ４−１１との共培養（１：１比）有りまたは無しで実施した。製造元のプロトコールに従い、ＩＮＦ−γＥＬＩＳＡキットにより、細胞上清中のＩＮＦ−γ濃度を決定した。
【０４７６】
結果−ヒトＰＢＭＣは、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋エフェクター細胞を含め、活性化に応答して炎症促進性インターフェロン−γ（ＩＮＦ−γ）を分泌することが公知である。Ｔ細胞の活性化は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）における主要組織適合抗原（ＭＨＣ）／ペプチド複合体とＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のライゲーション、およびＴ細胞の共刺激受容体と対応するＡＰＣのリガンドとの架橋という、２つのシグナルを必要とする。４１ＢＢは、４１ＢＢＬのライゲーションによって誘導されるＴ細胞共刺激受容体である。４１ＢＢは、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞の両方に強力な共刺激シグナルを伝達し、それらの拡大、生存、分化、およびサイトカイン発現を促進する。そのリガンドである４１ＢＢＬは、共刺激シグナルをＴ細胞にもたらす膜タンパク質である。
【０４７７】
この実験では、ヒトＰＢＭＣの活性化の増進における、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ分子の機能性を評価した。
【０４７８】
ＭＶ４−１１細胞の表面にはＣＤ４７が存在し、Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質（配列番号５）は、これらの細胞に用量依存的様式で結合した（図９Ａ〜Ｂ）。最長７２時間にわたり、様々な濃度のＨｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質（配列番号５）と共にＭＶ４−１１細胞をインキュベートしたが、直接的な死滅効果は示されなかった（図９Ｃ）。
【０４７９】
ＩＬ２を添加した場合または添加しなかった場合の、抗ＣＤ３抗体で刺激したＰＢＭＣによるＩＮＦ−γ分泌量の増加から見られるように、Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質（配列番号５）の添加は、ＰＢＭＣの活性化を用量依存的に増進させた（図１０Ａ）。
【０４８０】
ＰＢＭＣをヒト細胞株ＭＶ４−１１と共培養し、抗ＣＤ３抗体で細胞を刺激すると、ＩＮＦ−γの分泌が得られた。これはおそらく、ＭＶ４−１１細胞によるＰＢＭＣ細胞の直接的刺激に起因する。Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質（配列番号５）での処置による効果は中等度であったが、この効果は、ＩＬ２と一緒に添加した場合はより顕著であった（図１０Ｂ）。
【０４８１】
まとめると、Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質（配列番号５）は、ＩＦＮ−γ分泌量の増加からわかるように、ヒトＰＢＭＣの活性化を増強させる。
【０４８２】
実験４−顆粒球およびマクロファージに対するＳＩＲＰα−４１ＢＢＬの効果
ＳＩＲＰαは、例えば貪食細胞の細胞表面で発現する阻害性受容体である。ＳＩＲＰαのリガンドであるＣＤ４７は、腫瘍細胞において多く発現する。ＳＩＲＰαがＣＤ４７に結合すると、ＳＩＲＰαは「ｄｏｎ’ｔ  ｅａｔ  ｍｅ」シグナルを貪食細胞に送達する。ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬとＣＤ４７との相互作用により、ＳＩＲＰαとＣＤ４７との内因性相互作用が遮断され、それによって「ｄｏｎ’ｔ  ｅａｔ  ｍｅ」シグナルが遮断され、貪食細胞による腫瘍細胞の貪食が可能になるはずである。
【０４８３】
蛍光標識されたＣＤ４７発現がん細胞と共培養した、健康なドナーから得た顆粒球またはＭ１マクロファージを使用した共培養アッセイにおいて、顆粒球、マクロファージ、および他の貪食細胞に対するＳＩＲＰα−４１ＢＢＬの効果をｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験する。ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬを異なる濃度で共培養物に添加し、フローサイトメトリーを使用し、顆粒球またはＭ１マクロファージによる蛍光の取り込みを測定することによって、食作用を決定する。特異的な表面マーカー（例えばＣＤ１１ｂ）を染色することにより、貪食細胞を識別し、がん細胞と区別する。
【０４８４】
この実験における食作用効果は、治療用抗腫瘍抗体（例えばリツキシマブ、セツキシマブ、トラスツズマブ、アレムツズマブなど）を使用して増進することができる。
【０４８５】
初代自家性悪性細胞と共培養したがん患者由来の自家性顆粒球を使用した同様の実験も行う。
【０４８６】
材料−本明細書で上述した実験１Ａの記載に従って作製したＨｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質（配列番号５）、末梢血から単離したヒト白血球、腫瘍細胞株：ＢＪＡＢ、Ｕ２９３２、Ｒａｊｉ、Ｓｕｄｈｌ６、ＤＬＤ１、Ｈ２９２、ＦＡＤＵ、ＯＶＣＲ、ＭＯＬＭ１３、Ｋ５６２、ＯＣＩＡＭＬ３、ＨＬ６０（ＡＴＣＣ）、ｖｙｂｒａｎｔ  ＤｉＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、カタログ番号Ｖ２２８８７）、細胞増殖色素Ｖ４５０（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ社製、６５−０８４２−８５）、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、０７８５１）組換えヒトＳＩＲＰα（ｓｉｎｏ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製、１１６１２−Ｈ０８Ｈ）組換えヒト４１ＢＢＬ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製、２２９５−４Ｌ／ＣＦ）。
【０４８７】
方法および結果−健康なドナーの末梢血から白血球を単離した。簡潔に述べると、ＥＤＴＡを含有するＰＢＳと全血を１：１の比で混合し、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐと混合した。好中球を得るために、ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐの後にＰＢＭＣを除去し、細胞ペレットを採取した。細胞ペレットを１：１０の比で赤血球溶解バッファーと混合し、４℃で３０〜４５分間インキュベートした。続いて、４５０ｇ／５分の遠心分離によって好中球を採取し、ＥＤＴＡを含有するＰＢＳで２回洗浄した。単離した白血球を、ｖｙｂｒａｎｔ  ＤｉＤで予備染色しておいた腫瘍細胞と１：１の比で混合した。その後、フローサイトメトリーを使用して、顆粒球による腫瘍細胞の取り込みを評価した（ゲーティング戦略については図１１Ａを参照されたい）。このような混合培養物中における顆粒球は、刺激がまったくなければ腫瘍細胞をごくわずかにしか貪食しない（図１１Ａ）。しかしながら、白血球およびＲａｍｏｓ  Ｂ−ＮＨＬ細胞の混合培養物を漸増濃度のＨｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ（配列番号５）で処置すると、顆粒球による食作用の明らかな用量依存性誘導が検出され、最適な効果は２．５μｇ／ｍｌで達成された（図１１Ａ〜Ｂ）。Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質（配列番号５）の単剤処置でも、一団のＢ細胞リンパ腫細胞株に対する同様の食作用促進活性が検出され、無処置の培養物と比較して１５％〜２０％の食作用の増加が得られた（図１１Ｃ）。
【０４８８】
続いて、Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質（配列番号５）および抗ＣＤ２０抗体リツキシマブを併用して混合培養物を処置した。図１１Ｄに示したように、最適未満の低濃度のリツキシマブでの処置は、既に顆粒球による食作用を誘起した。その程度は、白血球のドナーおよび細胞株に依存した（図１１Ｄ、白のひし形）。しかしながら、リツキシマブおよびＨｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質（配列番号５）の併用処置により、試験したすべてのＢ−ＮＨＬ細胞株の食作用による取り込みがさらに増加した（図１１Ｄ、黒のひし形）。
【０４８９】
ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬを他の治療用抗体と組み合わせても同様に食作用が増強するかどうかを決定するために、癌腫細胞株のパネルを白血球と混合した。抗ＥＧＦＲ抗体セツキシマブ有りまたは無しで、Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質（配列番号５）で処置した場合の、顆粒球による食作用を評価した。試験したすべての癌腫細胞株において、Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬの単剤処置は既に、がん細胞の食作用による取り込みを強く誘起し（図１１Ｅ）、顆粒球の最大８０％がＤＬＤ−１細胞を貪食した。Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬとセツキシマブとを併用して処置すると、がん細胞の食作用による取り込みはなお一層増加した（図１１Ｆ）。例えば、扁平上皮癌株ＦａＤｕでは９０％超が貪食され、ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬとセツキシマブとには、この細胞株に対してだけでなく、他の細胞株に対しても相加効果またはさらには相乗効果があることを示唆している。
【０４９０】
いくつかの急性骨髄性白血病細胞株の食作用に関する後続分析により、これらの細胞株のほとんどは、Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質（配列番号５）の単独処置に応答しなかったことが明らかになった（図１１Ｇ）。ここでの注目すべき例外は、急性前骨髄球性白血病細胞株のＨＬ６０であり、ＨＬ６０の食作用は、２時間のインキュベーション後、無処置の培養物と比較して約１０〜２０％（ドナーによる）増加した。最長２４時間にわたって持続的に処置したところ、Ｋ５６２（慢性骨髄性白血病）およびＯｃｉ−ＡＭＬ３（急性骨髄性白血病）の顆粒球媒介性食作用も無処置の培養物と比較して大きく増加したが、この長時間の時点におけるＨＬ６０の取り込みは、無処置の対照培養物において既に非常に高かった（図１１Ｈ）。Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ（配列番号５）の用量を２時間の時点で増加させると、ＨＬ６０の食作用がさらに増加したが、ＭＯＬＭ１３の食作用は増加しなかった（図１１Ｉ）。
【０４９１】
重要なことに、複雑な核型をもつＡＭＬ患者から得た初代ＡＭＬ芽細胞も、Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ（配列番号５）で処置すると、用量依存的様式で貪食された（図１１Ｊ）。５名の健康なドナーから得た同種顆粒球の拡張されたパネルにおいて、これらの初代ＡＭＬ芽細胞は２時間以内に強く貪食され、食作用増加の中央値は、無処置の培養物と比較して約３５％であった（図１１Ｋ）。さらに、２４時間後の無処置の培養物における食作用は増加していたが、Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ（配列番号５）で処置したところ、さらに増進された（図１１Ｋ）。
【０４９２】
ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬが食作用を刺激する可能性をさらに立証するため、単球由来マクロファージを使用して同様の実験を行った。手短に述べると、健康なドナーから単離されたＰＢＭＣから、ＣＤ１４磁気ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社製）を使用したＭＡＣＳ分取によって単球を濃縮した。ＧＭ−ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）およびＭ−ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）を追加したＲＰＭＩ  １６４０培養培地＋１０％  ＦＣＳにおいて、７日間にわたって単球をマクロファージ（Ｍ０）に分化させた。１型マクロファージを作出するために、Ｍ０細胞をＬＰＳおよびＩＦＮ−γによってさらに２４時間予備刺激した。続いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化させたマクロファージを、細胞増殖色素Ｖ４５０で予備染色したＢ細胞リンパ腫細胞株Ｕ２９３２と混合した。マクロファージをＵ２９３２と２時間混合し、がん細胞の食作用による取り込みを蛍光顕微鏡によって決定した（代表的な顕微鏡写真を図１２Ａに示す。暗い矢印は生きたがん細胞を示し、白い矢印はマクロファージに貪食されたがん細胞を示す）。この環境において、Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ（配列番号５）での処置による活性は限られていた（図１２Ｂ）。リツキシマブでの処置は、食作用の大きな増加を誘導した（図１２Ｃ、白のひし形）。食作用は、ドナーの大多数において、様々なリツキシマブ濃度におけるＨｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ（配列番号５）との同時処置によってさらに増強された（図１２Ｃ、黒のひし形）。
【０４９３】
さらに、原発性Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）芽細胞および自家性患者由来マクロファージを用いた混合培養実験において、抗ＣＤ５２抗体アレムツズマブでの処置は、（これらの芽細胞がＣＤ５２に対して強陽性であったため、）単独でほぼ４０％のマクロファージ誘導性食作用を誘導した（図１１Ｄ）。Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ（配列番号５）の単独処置による食作用促進活性はごくわずかであったが、この一次試料において、Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ（配列番号５）およびアレムツズマブの併用は、食作用を（アレムツズマブでの処置と比較して約２０％）増強した（図１２Ｄ）。
【０４９４】
さらに、食細胞に対するｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質（配列番号５）の効果は、可溶性ＳＩＲＰα単独、可溶性４１ＢＢＬ単独、またはそれらの組み合わせの効果と比較して優れていた（図１１Ｌ）。
【０４９５】
まとめると、Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ（配列番号５）は、そのＳＩＲＰαドメインにより、特に、現在臨床で使用されている様々な治療用モノクローナル抗体との併用処置において、初代悪性細胞をはじめとする様々な悪性細胞型の、顆粒球媒介性およびマクロファージ媒介性両方の食作用による取り込みを増強する。
【０４９６】
実験５−ｉｎ  ｖｉｖｏ概念実証
Ｔ細胞、ＮＫ細胞、およびＢ細胞の標的化および活性化と、貪食細胞および樹状細胞の活性化との両方に対するＳＩＲＰα−４１ＢＢＬの効果を、マウスモデルにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで試験する。ヒト分子と同じ方法で、マウスＨｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質をタグ付きタンパク質として作製および精製する。マウスＣＤ４７を発現する腫瘍を形成することが公知であるマウスがん細胞をマウスに注射することにより、マウス腫瘍モデルを作出する。マウスまたはヒトのＨｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ融合タンパク質分子でマウスを処置する。腫瘍サイズ、マウスの生存率、および腫瘍部位における炎症反応をモニタリングする。
【０４９７】
ヒト腫瘍を使用したヒト化マウスモデルにおいて、同様の実験を行ってもよい。このモデルは、いずれかのマウス免疫系が欠如しているマウス（ヌード／ＳＣＩＤ／ＮＳＧマウス）を使用して構築する。これらのマウスにおいて、ヒトＴ細胞もしくはＰＢＭＣのみの注射、または完全にヒト化された免疫系を有する遺伝子工学操作されたマウスの使用により、ヒト様免疫系を確立する。マウスにヒトがん細胞を接種し、ヒトＨｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬ分子で処置する。このモデルにおいても、腫瘍サイズ、マウスの生存率、および腫瘍部位における炎症反応をモニタリングする。
【０４９８】
Ｈｉｓ−ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬのｉｎ  ｖｉｖｏでの有効性は、その部分、すなわち組換えＳＩＲＰαもしくは４１ＢＢＬ単独または組み合わせによる有効性と比較することができる。
【０４９９】
実験５Ａ−ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質は、同系結腸癌を接種したマウスにおける腫瘍増殖を阻害する
材料−マウス用オートクレーブ滅菌済み飼料および床材（ドイツ国、ゾースト、Ｓｓｎｉｆｆ社製）、雌Ｂａｌｂ／Ｃマウス（フランス国、サン＝ベルトヴァン、Ｊａｎｖｉｅｒ社）、ＣＴ−２６マウス結腸癌細胞株（ＡＴＣＣ−ＣＲＬ−２６３８）、抗マウスＰＤ−１抗体（米国、ウェスト・レバノン、ＢｉｏＸｃｅｌｌ社製）、本明細書で上述した実験１Ａの記載に従って作製したＨｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質（配列番号５）、ＰＢＳ。
【０５００】
方法−マウスを、１ケージ当たりマウス４匹からなる群に分け、個別換気ケージで飼育した。マウスには、オートクレーブ滅菌済み飼料および床材、ならびに酸性化した（ｐＨ４．０）水道水を不断で与えた。動物施設は、自動の１２時間明／暗調節機能、２２±２℃の温度調節機能を備えており、相対湿度は５０±１０％であった。雌Ｂａｌｂ／Ｃマウスの皮下に１×１０６個のＣＴ−２６細胞を接種し、３日後に処置を開始した。無作為割り当ての後、１群当たり１０匹の動物に、Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質（配列番号５）（１００μｇ／注射）またはその可溶性バッファー（ＰＢＳ）の３回の静脈内注射を、１週間に２回投与した。同じスケジュールで５ｍｇ／ｋｇの抗マウスＰＤ１を治療的基準として含めた（図１３Ａ）。投与はすべて、麻酔なしで午前中に行った。キャリパー測定を使用して腫瘍体積を１週間に３回決定し、個々の体積を次式によって計算した：Ｖ＝（［幅］２×長さ）／２。動物実験はすべて、英国癌研究調整委員会（United Kingdom Coordinating Committee on Cancer Research）の動物福祉に関する規制（Workman et al., Committee of the National Cancer Research Institute. Guidelines for the welfare of animals in cancer research. Br J Cancer 2010; 102:1555-77）、およびドイツ動物保護法の規制に従って行われ、現地の責任機関（Ｇｅｎ００３０／１５）によって承認された。
【０５０１】
結果−この実験では、ＣＴ−２６マウス結腸がんモデルを使用してＳＩＲＰα−４１ＢＢＬのｉｎ  ｖｉｖｏ効果を評価した。ＣＴ−２６接種マウスをＨｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質（配列番号５）で処置すると、腫瘍体積が（最大約３６％）低減した（図１３Ｂ）。
【０５０２】
実験５Ｂ−ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質は、同系白血病腫瘍を接種したマウスの処置に有効である
材料−マウス用オートクレーブ滅菌済み飼料および床材（ドイツ国、ゾースト、Ｓｓｎｉｆｆ社製）、、雌ＤＢＡ／２マウス（フランス国、サン＝ベルトヴァン、Ｊａｎｖｉｅｒ社）、Ｐ３８８白血病細胞株（ドイツ国、ベルリン、Ｍａｘ−Ｄｅｌｂｒｕｅｃｋ−Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ社製）、抗マウスＰＤ−１抗体（米国、ウェスト・レバノン、ＢｉｏＸｃｅｌｌ社製）、Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質（配列番号５）、ＰＢＳ。
【０５０３】
方法−マウスを、１ケージ当たりマウス４匹からなる群に分け、個別換気ケージで飼育した。マウスには、オートクレーブ滅菌済み飼料および床材、ならびに酸性化した（ｐＨ４．０）水道水を不断で与えた。動物施設は、自動の１２時間明／暗調節機能、２２±２℃の温度調節機能を備えており、相対湿度は５０±１０％であった。雌ＤＢＡ／２マウスの腹腔内に１×１０６個のＰ３８８細胞を接種し、翌日に処置を開始した。無作為割り当ての後、１群当たり１０匹の動物に、Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質（配列番号５）（１００μｇ／注射）またはその可溶性バッファー（ＰＢＳ）の４回の静脈内注射を、１日おきに投与した。同じスケジュールで５ｍｇ／ｋｇの抗マウスＰＤ１を治療的基準として含めた。投与はすべて、麻酔なしで午前中に行った。Ｐ３８８を有するマウスの体重を毎日量り、マウスが瀕死になったら屠殺し、腹水量を決定した。さらに、各マウスの脾臓および肝臓を取り、秤量した。
【０５０４】
動物実験はすべて、英国癌研究調整委員会（United Kingdom Coordinating Committee on Cancer Research）の動物福祉に関する規制（Workman et al., Committee of the National Cancer Research Institute. Guidelines for the welfare of animals in cancer research. Br J Cancer 2010; 102:1555-77）、およびドイツ動物保護法の規制に従って行い、現地の責任機関（Ｇｅｎ００３０／１５）によって承認された。
【０５０５】
結果−この実験では、Ｐ３８８マウス腹水白血病モデルを使用してＳＩＲＰα−４１ＢＢＬのｉｎ  ｖｉｖｏ効果を評価した。脾臓が腹水の流入領域リンパ節として機能するという事実のため、このモデルにおいては、脾臓重量は疾患重症度のマーカーとなる。より良好な疾患予後を示す脾臓重量の有意な低減（１９％、Ｐ値＝０．０３）（図１４Ｂ）から見ることができるように、Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質（配列番号５）によるＰ３８８マウス白血病接種マウスの処置は有効であった。
【０５０６】
実験５Ｃ−ＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質は、ヒト白血病腫瘍を接種したＮＳＧマウスのＢＭ中の腫瘍量を減少させる
材料−１２〜１６週齢の雌ＮＳＧ（ＮＯＤ−ｓｃｉｄガンマ）マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社）、ＭＶ４．１１急性骨髄性白血病細胞株（ＡＴＣＣ−ＣＲＬ−９５９１）、抗マウスＣＤ４５抗体（米国、カリフォルニア州、サンディエゴ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、抗ヒトＣＤ４５抗体（米国、カリフォルニア州、サンディエゴ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、抗ヒトＣＤ１２３抗体（米国、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）、本明細書で上述した実験１Ａの記載に従って作製したＨｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質（配列番号５）、ＰＢＳ。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ法（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｉｓｒａｅｌ  Ｌｔｄ．製）を使用し、健康なドナーの末梢血からヒトＰＢＭＣを単離した。
【０５０７】
方法−マウスを１ケージ当たりマウス５匹からなる群に分け、個別換気ケージで飼育した。マウスには、オートクレーブ滅菌済み飼料および床材、ならびに酸性化した（ｐＨ４．０）水道水を不断で与えた。動物施設は、自動の１２時間明／暗調節機能、２２±２℃の温度調節機能を備えており、相対湿度は５０±１０％であった。雌ＮＳＧマウスには、尾静脈を通して総体積２００μｌのＰＢＳ中７．８×１０６個のＭＶ４．１１細胞を静脈内接種する２４時間前に、２００ラドを照射した。１３日後、マウスに尾静脈を通して１．５×１０６個のヒトＰＢＭＣを接種し、４時間後に処置を開始した。無作為割り当ての後、１群当たり５匹の動物に、Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質（配列番号５、１００μｇ／注射）またはその可溶性バッファー（ＰＢＳ）の４回の腹腔内注射を、１日おきに（ＥＯＤ）（１３日目、１５日目、１７日目、および１９日目に）投与した（図１５Ａ）。投与はすべて、麻酔なしで午前中に行った。最後の注射から２４時間後にマウスを屠殺し、血液、骨髄（ＢＭ）、および脾臓を収集した。脾臓を秤量し、ｈＣＤ４５、ｍＣＤ４５、およびＣＤ１２３で染色した後、ＢＭ抽出細胞をＦＡＣＳによって分析した。
【０５０８】
動物実験はすべて、ハダサー医療センター（Ｈａｄａｓｓａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ）委員会の動物福祉に関する規制およびイスラエル動物保護法（Ｉｓｒａｅｌｉ  Ａｎｉｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ｌａｗ）の規制に従って行い、現地の責任機関によって承認された。
【０５０９】
結果−ＭＶ４．１１を接種し、放射線を照射し、ヒトＰＢＭＣで再構築していないＮＳＧマウスを、Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質（配列番号５）で処置したところ、ＢＭ中の白血病細胞の数に影響はなかった（図１５Ｂ）。ＭＶ４．１１接種ＮＳＧマウスをヒトＰＢＭＣで処置すると、骨髄中の腫瘍量が（１０％）低減し（図１５Ｂ）、脾臓重量は増加しなかった（図１５Ｃ）。しかしながら、ヒトＰＢＭＣと一緒にＨｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質（配列番号５）でＭＶ４．１１接種ＮＳＧマウスを処置すると、骨髄中の腫瘍量が（３８％）低減し（図１５Ｂ）、脾臓重量も増加した（図１５Ｃ）。Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰα−４１ＢＢＬタンパク質およびヒトＰＢＭＣを組み合わせた場合にのみ見られた脾臓重量の増加は、ＢＭ中の移植片対白血病（ＧＶＬ）効果の増加を示し、これは、ＢＭ中の白血病細胞数の低減にも関連していた（図１５Ｂ〜Ｃ、ｐ値＝０．０１）。
【配列表フリーテキスト】
【０５１０】
配列番号１：  キメラタンパク質（ＳＩＲＰ  ａｌｐｈａ−Ｇ−４１ＢＢＬ）のアミノ酸配列
配列番号４：  キメラタンパク質（ＳＩＲＰ  ａｌｐｈａ−４１ＢＢＬ、リンカーなし）のアミノ酸配列
配列番号５：  Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰ  ａｌｐｈａ−４１ＢＢＬのアミノ酸配列
配列番号６：  ＰＤ１−ＣＤ７０のアミノ酸配列
配列番号７：  ＳＩＲＰ  ａｌｐｈａ−４１ＢＢＬ（Ｈｉｓタグ付き）の核酸配列
配列番号８：  ＳＩＲＰ  ａｌｐｈａ−４１ＢＢＬの核酸配列
配列番号９：  全長ＳＩＲＰ  ａｌｐｈａのアミノ酸配列
配列番号１０：  全長ＳＩＲＰ  ａｌｐｈａの核酸配列
配列番号１１：  ヒトＳＩＲＰ  ａｌｐｈａタンパク質の細胞外ドメインをコードする核酸配列
配列番号１２：  全長４１ＢＢＬのアミノ酸配列
配列番号１３：  全長４１ＢＢＬの核酸配列
配列番号１４：  ヒト４１ＢＢＬの細胞外ドメインをコードする核酸配列
配列番号１５：  ベクター内のＨｉｓタグ付きＳＩＲＰ  ａｌｐｈａ−４１ＢＢＬのクローニング配列
【図１】
2020505010.tif 000006
【図２】
2020505010.tif 000007
【図３】
2020505010.tif 000008
【図４】
2020505010.tif 000009
【図５】
2020505010.tif 000010
【図６】
2020505010.tif 000011
【図７】
2020505010.tif 000012
【図８】
2020505010.tif 000013
【図９】
2020505010.tif 000014
【図１０】
2020505010.tif 000015
【図１１−１】
2020505010.tif 000016
【図１１−２】
2020505010.tif 000017
【図１２】
2020505010.tif 000018
【図１３】
2020505010.tif 000019
【図１４】
2020505010.tif 000020
【図１５】
2020505010.tif 000021
【配列表】
2020505010000001.app
【国際調査報告】
2020505010.tif 000022
2020505010.tif 000023