(57)【要約】  本出願は、リガンド修飾がバクテリオファージゲノム内で遺伝的にコード化される、リガンド（グリカンなど）修飾バクテリオファージの「液体」アレイを生成する方法を提供する。この方法は、生体高分子および細胞のリガンド結合プロファイルの決定を可能にする。さらに、この方法により、リガンド結合が協同的で相乗的である、リガンド−タンパク質相互作用の解明が可能になる。
2020506725.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つのリガンドと標的分子との間の１つまたは複数の分子相互作用を同定する方法であって、
ａ）複数のサイレントキャリアを提供するステップであって、それぞれが複数の固有の核酸コードの１つを含み、各サイレントキャリアは外部的に化学的に同一である、提供するステップと、
ｂ）第１の核酸コードを含むサイレントキャリアの１セットに第１のリガンドを付着させ、キャリアの第１のセットを形成するステップと、
ｃ）ステップ（ｂ）を繰り返し、Ｎ≧２であるＮセットを生成するステップであって、各セットは異なるリガンドまたは異なる密度のリガンドを含み、各セットは異なる核酸コードを含む、生成するステップと、
ｄ）Ｎセットをプールして、第１の混合ライブラリを形成するステップと、
ｅ）第１の混合ライブラリを標的分子と接触させ、標的分子に結合するリガンドを同定するステップと、
を含む方法。
【請求項２】
結合リガンドのセットをプールし、１つの結合リガンドの１つのセットを除外して第２の混合ライブラリを形成し、第２の混合ライブラリを標的分子と接触させ；除外リガンドの非存在下で、どの結合リガンドが標的分子に対してより低いまたはより高い親和性を有するかを決定するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記キャリアが、ウイルスまたはファージである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記リガンドが、ペプチド、炭水化物または任意の生体分子である、請求項１、２、または３に記載の方法。
【請求項５】
前記複数の核酸コードが、ウイルスまたはファージタンパク質の一部の縮重ＤＮＡ配列を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも１つの核酸コードが、ユニークな蛍光または酵素検出マーカーをコードする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
サイレントキャリアのセットが、特定の密度でキャリアの表面にリガンドを表示するように化学的に修飾されたキャリアを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
結合リガンドの同定が、標的に結合したリガンドを含むキャリアから核酸を抽出し、核酸を増幅およびシーケンシングすることにより行われる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
リガンドの結合の定量的評価が、ＰＣＲ後のコピー数によって評価される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
結合リガンドの同定が、蛍光または酵素検出マーカーを検出することにより行われる、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
標的分子が、タンパク質、精製生体分子、細胞、器官、または無機材料である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
結合リガンドの同定が、プルダウンアッセイにおいて標的分子−リガンド−サイレントキャリア複合体を分離するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記プルダウンアッセイが、固体支持体への結合、沈殿、遠心分離、磁気捕捉、または別の溶媒への分配のステップを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
第１の混合ライブラリが、液体混合ライブラリであり、標的分子が液体に含まれ、標的分子が固体形態に変換され、標的分子に結合するリガンドと共に液体混合物から分離される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１５】
前記標的分子が、溶液、分散液、液体中のエマルジョンであるか、または液体そのものである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記標的分子が、溶液から沈殿した塩である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記塩が、炭酸カルシウムである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記標的分子が、不溶性粒子に凝集する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記標的分子が、液相から固相に変換される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記標的分子が、氷に変化する水を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記検出マーカーが、キャリアの感染時に宿主生物によって検出マーカーが発現されるように、キャリアのＤＮＡにコード化されたレポータータンパク質を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項２２】
前記レポータータンパク質が、ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、または蛍光タンパク質を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
リガンドが、リジンまたはキャリアコートタンパク質のアミノ末端と共有アミド結合を形成することにより、キャリアに付着している、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２４】
前記キャリアコートタンパク質が、リガンド上の同族反応性ハンドルと反応する反応性ハンドルを導入するように修飾され、同族反応性ハンドルが、コートタンパク質上の他の官能基と反応しない、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記反応性ハンドルが、歪んだアルキンであり、同族反応性部分がアジドである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
核酸コードでサイレントにコード化されたウイルス上にリガンドを表示する方法であって、前記核酸コードが、天然コートタンパク質の一部をコード化する縮重配列であるか、またはタンパク質をコード化しないウイルスゲノムの領域に存在するか、またはウイルスに由来しないペプチドをコード化するウイルスゲノムの領域に存在する、方法。
【請求項２７】
前記ウイルスが、ウイルスに由来する外来タンパク質の発現を必要とするディスプレイ技術と互換性がない、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ウイルスが、植物、動物または古細菌ウイルス、あるいはそれらのコートタンパク質上に外来ペプチド配列のディスプレイを可能にしないバクテリオファージである、請求項２７の記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、受容体−リガンド相互作用および分子認識の分野に関する。より詳細には、本出願は、目的の生体分子に相乗作用で結合する、リガンドまたはリガンドの組み合わせを発見する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くのタンパク質や他の高分子受容体が、複数のリガンドと相互作用することが知られている。受容体と２つのリガンドとの同時相互作用は、同じ受容体と個々のリガンドのいずれかとの相互作用とは異なる生物物理学的、生化学的および生理学的結果をもたらすことが多い。このような相互作用は、２つの分子の結合が個々のリガンドの結合よりも有利であることが判明した場合、「相乗的」または「積極的に協同的」と呼ばれる１。これらの「相乗的」相互作用は、受容体−リガンド相互作用（創薬、診断、基礎研究）を扱う分野で非常に大きな目的となり得る。
【０００３】
相乗的相互作用の特定の例は、炭水化物とタンパク質の相互作用である。２つの異なるタイプのグリカンが、いずれか１つのグリカン単独よりも著しく高い親和性で、１つのタンパク質に結合する例が知られている２−４。可能性のある要因の中で、そのような強化の生物物理学的起源は、タンパク質構造内のアロステリックな立体構造変化または２つの分子の相互作用による可能性がある。
【０００４】
リガンド発見の多くの既知の方法は、本明細書において「空間的に分離されたライブラリ」と呼ばれる、個々のタンパク質に結合する個々のリガンドを発見するために最適化されている２。例としては、マイクロタイタープレート上の個々の分子のライブラリのスクリーニング、各分子が特定の位置の表面に付着している分子アレイのスクリーニング、または個々の巨視的（ミクロンサイズの）ビーズがユニークな分子を有するｏｎｅ−ｂｅａｄ−ｏｎｅ−ｃｏｍｐｏｕｎｄライブラリのスクリーニングが挙げられる。相乗的相互作用のスクリーニングを可能にするために、「空間的に分離されたライブラリ」技術をアップグレードすることは理論的には可能であるが、実際には、指数関数的により複雑になる可能性がある。Ｎ個の異なる分子のライブラリには、約Ｎ２／２個のユニークなバイナリの組み合わせが含まれている。したがって、分子が１０００個の小さなライブラリでも、５００，０００個のバイナリの組み合わせを作成して試験する必要がある。３進数の組み合わせでは、この数は２００，０００，０００になる。したがって、実行可能な結果を達成するには、ライブラリの複雑さを損なう（つまり、試験するライブラリメンバーの数を減らす）必要がある。
【０００５】
「空間的に分離されたライブラリ」を補完するよく知られた技術は、「混合ライブラリ」技術であり、同じ溶液内に複数の分子が存在する。この技術は、分子の混合物のスクリーニングを可能にし、「ディスプレイ」技術である。ディスプレイ技術では、各分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、リボソーム、あるいはバクテリオファージまたはウイルスの粒子などのナノスケールの情報含有タグに共有結合または非共有結合する。そのような技術の変法は、ＳＥＬＥＸ（指数関数的濃縮によるリガンドの体系的進化）あるいはＲＮＡまたはＤＮＡアプタマーの開発のための類似の手順であり、コード化エンティティはＤＮＡまたはＲＮＡ分子である。しかし、ＤＮＡまたはＲＮＡは、受容体との潜在的な相互作用を有する可能性があり、その相互作用は、望まれる場合もあれば望ましくない場合もある。これらの問題は、異なる分子が同一組成のウイルスまたはバクテリオファージ粒子に固定され、および異なる組成のＤＮＡまたはＲＮＡがファージ粒子のウイルスキャプシド内に含まれるファージディスプレイ技術で最小化される。
【０００６】
混合ライブラリ技術は、すべての分子が同じ溶液に存在するため、相乗的結合の同定に適している。しかし、混合コード化ライブラリを使用した相乗的相互作用の同定は、文書化されていない。次のいくつかの要件は明白でない：（１）相乗的結合を分析するために、Ｎ個の定義済み成分のライブラリと、元のライブラリのｍ個の特定のメンバーが除外されたＮ−ｍ個の成分を有するほぼ同一のライブラリ（ｍ＜Ｎ）を作成できる必要がある。（２）混合ライブラリ技術の生成および応用では、２個以上の分子が同じ標的と相互作用できるようにする必要がある。例えば、ＬｅｒｎｅｒおよびＢｒｅｎｎｅｒ、Ｌａｍおよび共同研究者などは、アガロース、ポリスチレンで作成された、サイズが１ミクロンを超えるビーズなどの巨視的なキャリアで、コード化タグと共に表示される混合分子ライブラリの作成を教示している。キャリアビーズのサイズは、２つの異なるビーズに付着した異なる分子が、０．０１ミクロン未満のサイズの１つのタンパク質標的に同時に結合することを効果的に妨げる。
【０００７】
同一組成のナノスケールキャリア上でディスプレイライブラリを生成するための１つの技術は、ファージのコートタンパク質の１つの遺伝子に追加のＤＮＡを導入し、ビリオンまたはファージ粒子にパッケージ化されたタンパク質融合産物の産生をもたらす組換えタンパク質技術を利用する。そのようなファージおよびファージミドディスプレイ技術の複数の変異体が当技術分野で知られており、目的の受容体に結合する分子を同定するように設計されている。
【０００８】
ファージＭ１３のディスプレイは、遺伝的にコード化されたライブラリまたは「ディスプレイ技術」の特定の例である５。ファージディスプレイは、タンパク質抗原、特に目的のヒトタンパク質の分析、ディスプレイ、産生に使用されるよく知られた技術である６。Ｍ１３ファージゲノムの遺伝子工学により、目的のペプチドまたはタンパク質は、ファージビリオン表面タンパク質分子（通常はＧｅｎｅ  ＩＩＩタンパク質、ｇ３ｐ）に個々に結合する。そのようなファージ集団（ファージライブラリ）では、各ファージは、その表面に露出している異なるペプチドまたはタンパク質−ｇ３ｐ融合の遺伝子を持っている。ゲノムの修飾は、通常、化学的に同一ではないファージ粒子を生成する。これらの化学組成の違いは、これらの粒子が標的と相互作用する上での違いに寄与する可能性がある。この問題を軽減するには、サイレントコード化を使用することができる。
【０００９】
「サイレントバーコード」技術７については記述されてきている。これは、バクテリオファージ粒子内に異なる組成のＤＮＡを含み、同一組成のペプチドを表示する粒子上で、バクテリオファージディスプレイシステムを生成する方法に関する。この技術により、異なる化学修飾剤による既存のペプチドライブラリの簡便な化学修飾が可能になる。
【００１０】
ＤＮＡまたはＲＮＡにより分子にタグを付けるための様々な方法が知られている。これらの技術のタグは、異なる化学組成を持ち、標的との相互作用も形成できる。ＳＥＬＥＸ  ＲＮＡおよびＤＮＡアプタマーの技術は、異なるＤＮＡまたはＲＮＡ配列が生体分子との相互作用の程度が異なる可能性があることを教示している８，９。ＤＮＡまたはＲＮＡでタグ付けされた分子を使用するスクリーニングの結果は、標的と「タグ」との間の可能性のある望ましくない相互作用があるため、あまり予測できなかった。
【００１１】
レクチンのグリカン結合プロファイルを決定することは、困難で時間がかかる場合がある。そのような同定のための１つの現在の方法は、多くの場合ガラスである固体表面に化学的に結合したグリカンのアレイを使用する。そのようなグリカンアレイを使用して、２段階の手順を使用して表面に固定化された特定の１または複数のグリカンに対する特定のレクチンの優先度を決定する。まず、１つの空間的に異なる場所に１個のグリカンが存在するように、多数のグリカンを１つの表面に結合させる。次いで、グリカンアレイは、標識化生体分子で「パン」され、グリカンに対する生体分子の優先度は、ラベルの検出によって決定される。このシステムの主な利点は、多数の５０〜２００個のグリカンに対するレクチンまたは生体分子のグリカン結合優先度を単一の形式で評価できることである。しかし、この方法の欠点は、グリカンが別個の空間的に異なる場所に結合しているため、異なるグリカンの相乗的または協同的なヘテログリカン結合の情報を決定できないことである。さらに、空間的な考慮のため、グリカンはホモグリカンの協同結合のために十分な密度でこれらのアレイに結合しないので、グリカンに対する誘導結合定数が歪められる可能性がある。
【００１２】
ＢｏｖｉｎｇおよびＨｏｇｅｒｓｓｏｎは、蛍光マイクロビーズキャリアでのグリカンのディスプレイと、マルチプレックスフローサイトメトリー懸濁アッセイによるその分析を教示している。Ｗａｎｇらは、この方法を数百個のグリカンに拡大した。マクロビーズのディスプレイは、上記のビーズベースのライブラリと概念的に同一である（００６）。そのようなライブラリには、ビーズが標的と立体的に干渉し、相乗的結合や場合によっては非相乗的相互作用の同定を妨げるため、制限がある。
【００１３】
Ｆｌｉｔｃｈらは、ＤＮＡ分子上のグリカン分子のディスプレイを教示するが、タンパク質−炭水化物の相互作用に必要とされることが多い、調節された密度の炭水化物の多価提示をコード化するための、この一価ライブラリを使用する方法は明らかではない。
【００１４】
創薬、診断開発、およびタンパク質−リガンドの相互作用を研究する基礎研究のために、分子を同定する効果的な方法を提供する必要がある。
【００１５】
この背景情報は、本発明に関連する可能性があると出願人が考える、既知の情報を作成する目的で提供される。前述の情報のいずれかが本発明に対する先行技術を構成することを、必ずしも承認することを意図しておらず、また解釈すべきでもない。
【発明の概要】
【００１６】
一般的に言えば、本発明は、標的分子に結合するリガンドまたはリガンドの組み合わせを同定する方法、特に、リガンドが目的の生体分子と相乗的に結合するかどうかを決定する方法を含み得る。
【００１７】
一態様では、本発明は、同一組成のナノスケール物体（「サイレントキャリア」）上に表示される分子の遺伝的にコード化されたライブラリの生成方法、およびタンパク質−リガンド相互作用を解明するためのこれらのライブラリの使用を含み得る。
【００１８】
一態様では、本発明は、少なくとも２個のリガンドと標的分子との間の１つまたは複数の分子相互作用を同定する方法を含み得、本方法は以下を含み得る：
ａ）複数のサイレントキャリアを提供するステップであって、それぞれが複数の固有の核酸コードの１つを含み、各サイレントキャリアは外部的に化学的に同一である、提供するステップと、
ｂ）第１の核酸コードを含むサイレントキャリアの１セットに第１のリガンドを付着させ、キャリアの第１のセットを形成するステップと、
ｃ）ステップ（ｂ）を繰り返し、Ｎ≧２であるＮセットを生成するステップであって、各セットは異なるリガンドまたは異なる密度のリガンドを含み、各セットは異なる核酸コードを含む、生成するステップと、
ｄ）Ｎセットをプールして、第１の混合ライブラリを形成するステップと、
ｅ）第１の混合ライブラリを標的分子と接触させ、標的分子に結合するリガンドを同定するステップ。
【００１９】
いくつかの実施形態では、上記方法は、結合リガンドのセットをプールし、１つの結合リガンドの１つのセットを除外して第２の混合ライブラリを形成し、第２の混合ライブラリを標的分子と接触させ；除外リガンドの非存在下で、どの結合リガンドが標的分子に対してより低いまたはより高い親和性を有するかを決定するステップをさらに含む。
【００２０】
コード化部分またはサイレントキャリアは、ナノスケールサイズであるため、立体干渉が少なく、相乗的結合の一般的な発見のために、より適している可能性がある。キャリアの組成が同一である場合、分析を複雑にする可能性のある、標的との望ましくない分子相互作用を持つ可能性が低くなる。
【００２１】
いくつかの実施形態では、サイレントキャリアは、ウイルスまたはファージである。複数の核酸コードは、ウイルスまたはファージタンパク質の一部の縮重ＤＮＡ配列および／またはユニークな蛍光または酵素検出マーカーを含み得る。
【００２２】
いくつかの実施形態では、リガンドは、ペプチド、炭水化物、または任意の他の生体分子である。標的分子は、タンパク質または他の生体分子、細胞、器官、または任意の有機または無機材料であってもよい。好ましい一実施形態では、リガンドはグリカンを含み、標的分子はレクチンを含む。
【００２３】
いくつかの実施形態では、結合リガンドの同定は、標的に結合したリガンドを含むキャリアから核酸を抽出し、核酸を増幅およびシーケンシングすることにより行われる。リガンドの結合の定量的評価は、ＰＣＲ後のコピー数で評価できる。あるいは、またはさらに、結合リガンドの同定は、キャリアの感染時に宿主生物によって検出マーカーが発現されるように、キャリアのＤＮＡにコード化されたレポータータンパク質などの蛍光または酵素検出マーカーを検出することによって行われる。レポータータンパク質は、ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、または蛍光タンパク質、あるいは当業者に既知の他のレポータータンパク質または選択マーカーを含み得る。
【００２４】
いくつかの実施形態では、結合リガンドの同定は、プルダウンアッセイにおいて標的分子−リガンド−サイレントキャリア複合体を分離するステップを含み、これは、固体支持体への結合、沈殿、遠心分離、磁気捕捉、別の溶媒への分配のステップ、または当業者に既知の任意の他の分離方法を含み得る。
【００２５】
いくつかの実施形態では、第１の混合ライブラリは液体混合ライブラリであり、標的分子は液体に含まれ、標的分子は固体形態に変換され、標的分子に結合するリガンドと共に液体混合物から分離される。標的分子は、溶液、分散液、液体中のエマルジョンであってもよく、または液体そのものである。一実施形態では、標的分子は、炭酸カルシウムなどの溶液から沈殿した塩である。一実施形態では、標的分子は、不溶性粒子に凝集する。一実施形態では、標的分子は、氷に変化する水などの液相から固相に変換される。
【００２６】
別の態様では、本発明は、核酸コードでサイレントにコード化されたウイルス上にリガンドを表示する方法を含むことができ、核酸コードは、天然コートタンパク質の一部をコード化する縮重配列であるか、またはタンパク質をコード化しないウイルスゲノムの領域に存在するか、またはウイルスに由来しないペプチドをコード化するウイルスゲノムの領域に存在する。これにより、ウイルスに由来する外来タンパク質の発現を必要とするディスプレイ技術と互換性のないウイルスを使用して、このディスプレイ技術を使用できる。
【００２７】
キャリアは、キャリア粒子あたり特定のリガンド密度で、キャリアの表面に特定のリガンドを表示するように化学的に修飾されてもよい。したがって、キャリア内のユニークな核酸コードは、ａ）リガンドの同一性および／またはｂ）キャリア上に表示されるリガンドの密度のいずれかまたは両方を同定することができる。第１の混合ライブラリを標的分子と混合した後、結合リガンドを非結合リガンドから分離し、続いて結合リガンドキャリアから核酸を精製することができる。次いで、ＰＣＲの使用などにより、核酸を増幅することができ、リガンドの結合の評価は、ユニークな核酸コードのコピー数によって行うことができる。
【００２８】
別の態様では、本発明は、既知のリガンドで修飾されたキャリア（ファージなど）をライブラリ（対照ファージ）に添加し、続いて対照ファージのリガンドでライブラリをスクリーニングすることを含む、分子標的のライブラリを較正する方法を含み得る。既知のリガンドは、ペプチド、炭水化物または任意の生体分子であってもよい。
【００２９】
特定の態様に従って、本出願は、好ましくは、これらの粒子の内部にパッケージ化されたゲノム内の縮重ＤＮＡタグを含む核酸コードを含む、同一の外部化学組成のウイルスまたはバクテリオファージビリオンである「サイレントキャリア」を提供する。ウイルスまたはファージのゲノムは、ビリオンコートのコード化領域での縮重コドンの使用、切り取られた配列をコード化するＤＮＡ配列の変化、発現したタンパク質配列をコード化しないＤＮＡ配列の変化、またはビリオンコートに組み込まれていない成分をコードするＤＮＡ配列の変化など、ビリオンコートの化学組成の変化を生じない方法で操作できる。したがって、複数のキャリア（ファージやウイルスなど）を含むキャリアライブラリを提供でき、すべてのキャリアは、任意のリガンドに結合する前は外部的に化学的に同一であるが、その中にサイレントにコード化する異なる核酸分子を含む。
【００３０】
したがって、本発明は、２個以上の分子が１個の標的に同時に結合できる「相乗的」相互作用の発見を促進するライブラリを提供し得る。そのような相乗的結合は、通常、個々のリガンドの相互作用と比較して、結合親和性を高めることが知られている。別の態様に従って、本出願は、ライブラリからの任意の所与のリガンドとタンパク質との相互作用が相乗的であるか非相乗的であるかを、同じライブラリに存在する他のリガンドに関して、より明確に理解するために使用できるタンパク質−リガンド相互作用を同定する方法を提供する。
【００３１】
本明細書に記載されている相乗的結合剤のスクリーニングは、サイレントコード化またはＲＮＡ／ＤＮＡタグ付け技術およびその後の混合によって生成されるものなど、「手動混合ライブラリ」に最適である。そのようなスクリーニングを、ペプチドまたはタンパク質のファージディスプレイライブラリ、またはポリペプチドのｍＲＮＡまたはＤＮＡディスプレイライブラリなどの発現ディスプレイライブラリに適用することが可能であり得る。「サイレントにコード化された」化学ライブラリ技術とは異なり、定義済みの成分のみを含むおよび／または成分の１つが欠落している新しいライブラリの作成には、多大な労力が必要である。ＤＮＡの特定の組み合わせの大規模な合成の一例は、アレイ合成およびライブラリの再発現として知られている。これらには、事前にタグ付けされたセットからのＮまたは少数のＭ成分を単純に混合するよりも面倒な手順が含まれる。
【００３２】
本発明、ならびに別の態様およびそのさらなる特徴をよりよく理解するために、添付の図面と併せて使用される以下の説明を参照する：
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は、ｇ３ｐリーダーペプチドシーケンス内の核酸コード（サイレントバーコード）の構築に関連するスキームを提供し、６１４４の可能性のあるバーコード配列を生成する方法の例を示している：４（ＣＴＮ）×４（ＣＴＮ）×２（ＴＴＹ）×４（ＧＣＮ）×３（ＡＴＨ）×４（ＣＣＮ）×４（ＣＴＮ）＝６１４４。
【００３４】
【図２】図２は、サイレントにバーコード化されたファージに炭水化物を架橋する例示的なスキームを提供する。
【００３５】
【図３】図３は、異なる密度でファージ上に提示されたグリカンをコード化および検出する例示的なスキームを提供する。異なるサイレントバーコードを含む４つのサイレントキャリアを、異なる密度のグリカン、または異なる構造のグリカンで修飾できる。キャリアが一緒にプールされると、選択とプルダウンに続いてディープシーケンシングを行い、どのグリカンとどの密度のグリカンが、標的との最適な相互作用を示すかを決定できる。
【００３６】
【図４】図４は、グリカン特異的モノクローナル抗体によるポリスチレンプレートに吸着されたグリカンファージの特異的認識を示す。未修飾のファージとＤＢＣＯファージを対照として使用する。各データポイントは、３回繰り返しの平均値を表す。
【００３７】
【図５】図５は、ディープシーケンシングによって検出されたライブラリからのグリカンの回収率を示す。混合物で使用される３つのグリカンは、テトラガラクトフラノース（ｇａｌ４）、ベータマンノース（ｍａｎ）およびラクトース（ｌａｃ）である。
【００３８】
【図６】図６は、（Ａ）バクテリオファージｍ１３のゲノムおよびサイレントバーコードの導入場所の概略図を示す。（Ｂ）異なるレポータータンパク質を使用して、異なる化学修飾またはこれらの同じ修飾の密度を追跡できる。（Ｃ）比色または蛍光レポーターは、シーケンシングによって分析されるサイレントバーコードと組み合わせることができる。（Ｄ）４色スキームは、マンノース結合レクチンＣｏｎＡでコーティングされたポリスチレンプレート上で、Ｃに記載されているＬｉＧＡ１混合物の濃縮をモニタリングした。入力および出力中の粒子の数は、プラーク形成アッセイにより推定された。（Ｅ）粒子の％回収率（Ｆ）α−Ｇａｌ（＋）集団にＣｏｎＡ結合リガンドを含む、ＬｉＧＡ２で繰り返された類似の実験での％回収率。（Ｇ）同じ４色スキームを使用して、マンノース結合レクチンＤＣ−ＳＩＧＮを含む細胞など、任意の標的上のライブラリの回収率をモニタリングおよび最適化できる。
【００３９】
図６Ｈ。Ｆｕｃα１−２−修飾および抗Ｇａｌ４抗体を認識する植物レクチンＵＧＡによる７４個のグリカンのアレイのプルダウンの代表例。
【００４０】
【図７】図７（Ａ）アジドグリカンをファージのｐＶＩＩＩタンパク質に取り込み、グリカンの液体アレイを作成するために使用される化学ライゲーション戦略のスキーム。（Ｂ）ｐ８タンパク質のアミノ酸配列、ジベンゾシクロオクチンＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＤＢＣＯ−ＨＮＳ）リンカーによる修飾、およびＤＢＣＯ修飾ｐ８タンパク質に異常に結合したアジドリンカーとグリカンのライゲーションの化学概略図。（Ｃ）ＭＡＬＤＩによるコンジュゲートの性質決定。ＭＡＬＤＩは、未修飾ｐ８、部分的に修飾された中間体ＤＢＣＯ−ｐ８、および完全に修飾されたコンジュゲートを検出する。ＭＡＬＤＩのピークの比率により、不完全な反応の性質決定が可能になり、ファージ上のグリカンの最終密度を推定できる。（Ｄ）単糖、二糖、三糖、四糖で修飾されたファージの性質決定の例。（Ｅ）シナピン酸マトリックスの存在下で酸性条件にｐ８タンパク質を曝露すると、特定の場所でｐ８タンパク質が部分的に切断される。（Ｆ）ｐ８の部分的な切断を性質決定し、特定のフラグメントを示すＭＡＬＤＩスペクトルから、ｐ８の修飾の位置選択性を結論付けることができる。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
【００４２】
本明細書で使用される「サイレントキャリア」は、ディスプレイを生成するために操作できない、または現在利用可能な組換えＤＮＡ技術によって効果的に操作できないものを含む、ほぼすべての利用可能なウイルス属のウイルスを含むことができ、そのウイルスは、発現されていないか、ウイルスの表面にペプチドが表示されない核酸コードである「サイレントコード化」を含む。したがって、本発明のサイレントキャリアは、クローン化ペプチドライブラリの存在、新しいＤＮＡセグメントまたはペプチド可変領域の導入を必要としない。適したウイルスにはファージが含まれるが、他のウイルスも含み得る。
【００４３】
従来、「サイレントバーコード」は、外来ＤＮＡフラグメントである可変領域に近接して配置され、ＤＮＡシーケンシングによるこれら２つの領域の同時性質決定を可能にする。しかし、「サイレントバーコード」は、翻訳活性領域およびサイレント領域、ファージアセンブリで使用されない補助タンパク質、またはファージタンパク質から切り取られた配列（リーダーペプチドなど）を含む、ファージゲノム内の任意の場所に導入できる。
【００４４】
本発明では、ウイルスおよびバクテリオファージはまた、効率的なＤＮＡ操作を受け入れられることが知られている属に由来する必要はない。そのようなウイルスを産生する宿主生物は、少なくとも１つの修飾粒子の産生に十分な程度まで修飾ＤＮＡを摂取するだけでよい。例としては、コード化領域に冗長なコドンを導入するための、大腸菌宿主内での合成および異種操作による古細菌ウイルスのＤＮＡの修飾がある。このＤＮＡを古細菌宿主に再導入すると、効率は非常に低くなるが、コートの組成が同じで、ゲノム内のＤＮＡ組成が異なるサイレント古細菌ウイルスのセットを産生できる。一度産生されると、そのようなサイレントウイルスは、そのホストの再感染を介して増殖する可能性があり、スケールアップ産生のためのさらなる組換えＤＮＡ技術を必要としない。
【００４５】
本明細書に記載されるように、適したサイレントキャリアの実施形態は、通常、サイレントキャリアが可変領域を使用しないか、外来ＤＮＡフラグメントを含まないため、「サイレントコード化」に使用される核酸コードの位置を優先しない。結果として、サイレントキャリアに使用されるファージまたはウイルスの性質は無関係である。したがって、特定の実施形態では、キャリアは、組換えＤＮＡ技術を介した操作の影響を受けやすいウイルスなど、ディスプレイ技術と互換性のあるウイルスを必要としない。例えば、植物ウイルスのクラスは、その宿主である植物細胞が、ウイルス粒子の産生中にほぼすべての外来ペプチド配列をタンパク質分解的に切断するため、外来配列の表示に耐えられないことが知られている。切断されないこれらの配列は、粒子のパッケージ化を著しく妨げる可能性がある。これらのウイルスは、サイレントＤＮＡコードを、配列を産生しないＤＮＡ領域の天然タンパク質配列に導入できるため、本出願に従ってサイレントキャリアとして使用できる。これらの変化は、外部の化学組成に変化をもたらさないので、それらは切り取られず、通常はアセンブリを妨げない。ウイルスは外部から変更されない。
【００４６】
特定の実施形態では、サイレントコード化は、コートタンパク質自体のコード化ＤＮＡ、タンパク質をコード化しないＤＮＡの領域、あるいはスプライシングされたＲＮＡ配列または翻訳後に切り取られたペプチドリーダー配列など、アセンブルされた粒子に存在しないエンティティをコード化するゲノムの領域でＤＮＡコードを利用するサイレントキャリアの産生を含み得る。
【００４７】
このサイレントコード化により、Ｍ１３ファージまたはディスプレイを可能にする他のファージだけでなく、既知の植物、動物、古細菌ウイルスの大部分を含む実験室で発現できるウイルス、ならびにコートタンパク質上の外来ペプチド配列のディスプレイを可能にしないバクテリオファージでの作動を可能にする。サイレントバリエーションは、これらのバクテリオファージまたはウイルスのＤＮＡまたはＲＮＡに未だに組み込まれ、内部で異なる核酸コードを持つ、外部的に同一の化学組成の粒子を産生することができる。
【００４８】
サイレントにコード化されたキャリアは、当技術分野で公知の標準的なタンパク質ライゲーション戦略を使用するなどして、リガンドで化学的に修飾することができる。異なるリガンドで修飾され、異なる核酸コードでコード化された複数のそのようなキャリアを一緒に混合して、所望の組成の分子のサイレントにコード化された混合ライブラリを作成することができる。本明細書に提示する方法は、単純なスクリーニングで、これらのリガンドと目的の標的との相乗的および非相乗的相互作用を発見するための、そのようなライブラリの作成および有用性を記述する。
【００４９】
いくつかの実施形態では、リガンドは、リジンまたはキャリアコートタンパク質のアミノ末端との共有アミド結合を形成することにより、キャリアに付着することができる。キャリアコートタンパク質は、リガンド上の同族反応性ハンドルと反応する反応性ハンドルを導入するように修飾される。同族反応性ハンドルは、コートタンパク質の他の官能基と反応してはならない。例えば、反応性ハンドルは、歪んだアルキンであり、同族反応性部分はアジドである。
【００５０】
特定の実施形態では、本明細書に記載の方法は、ＤＮＡまたはＲＮＡによってタグ付けされた分子の混合物でも機能し得る。そのようなスクリーニングでは、核酸である「情報タグ」は、バクテリオファージキャプシド内に隠されていない。その結果、これは「サイレント」ではなく、リガンドや標的分子と相互作用する可能性があるため、あまり望ましくない場合がある。
【００５１】
特定の実施形態では、「サイレントバーコード」として機能するユニークな核酸コードを保有する、異なるバクテリオファージ粒子のコレクションが提供される。それらは別々に産生され、例えば、グリカン修飾などの異なる分子で修飾される。これらの修飾されたライブラリを一緒にプールすると、混合ライブラリが作成される。好ましい一実施形態では、混合ライブラリは、サイレントバーコードのシーケンシングにより、グリカン修飾を追跡できる「液体グリカンアレイ」を含む。
【００５２】
特定の実施形態では、本方法は、それぞれのセットが異なるリガンドまたは異なる密度のリガンドを有する、Ｎ個の異なるセットのサイレントキャリアの混合を含む「サイレントキャリア」上のディスプレイを提供する。特定の実施形態では、リガンドの異なるセットは、下流の分析を単純化するために等しい比率で混合されるが、他の関連する比率が実行されてもよい。同じ溶液にＮ個の異なるリガンドを含むこの混合物を使用して、標的分子でワンステップ選択を行い、Ｍ個の潜在的なリガンドのサブセットを同定する。プルダウンアッセイおよび単離された混合ＤＮＡ分子の次世代シーケンシングなどの当技術分野で公知の標準選択方法を使用して、標的に結合したリガンドに関連する核酸コードを同定することができる。同定されたＭ個の分子は標的分子に対してある程度の親和性があり、「相乗的結合剤」または「非相乗的結合剤」であり得る。例えば、ｍ個の分子のコレクションは、分子Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、．．．．Ｍｍを含むセットである（つまり、ｍ＝１０の場合、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、．．．．Ｍ１０である）。ｍ個の分子のセットは｛Ｍ｝と指定できる。したがって、セット｛Ｍ｝およびサブセット｛Ｍ−Ｍｉ｝が存在する可能性があり、サブセット｛Ｍ−Ｍｉ｝は、１つのセットメンバーＭｉを除くセット｛Ｍ｝である。
【００５３】
この特定の実施形態では、Ｎ個の異なるグリカンを有する液体グリカンアレイを、例えば、未知の炭水化物結合特性のタンパク質と混合し、続いてこのタンパク質をプルダウンすると、Ｍ個の結合グリカン（Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３など）が濃縮される。Ｍ１が成分Ｍ２、Ｍ３などと相乗的に作用するグリカンであるかどうかを試験するために、すべてのＭ個のグリカンとグリカンＭ１を除く同じセット（「Ｍ−Ｍ１」）の混合サブセットを作成する。これらの混合物のプルダウンは、グリカンＭ１が他のグリカンと相乗的または拮抗的に作用するかどうかを同定する。プロセスは単純な混合なので、この混合とプルダウンをｍ回繰り返して、すべての相互作用を「相乗的」または「非相乗的」として明確に同定できる。
【００５４】
「プルダウン」アッセイには、リガンドおよびその標的の一方または他方がビーズなどの固体支持体に固定化または結合され、未結合リガンドから、結合したキャリア−リガンド−標的複合体の分離を促進するものが含まれる。例えば、ヘキサヒスチジンタグは、標的分子上およびビーズ上のニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）などのヘキサヒスチジン結合分子上に提供され得る。他の可能性としては、タンパク質とストレプトアビジンビーズのビオチン化；またはタンパク質とタンパク質ＧビーズのＦｃ融合がある。不均一な反応条件で結合を形成することが知られており、「生体直交型ライゲーション」として知られている２つの反応物を使用することができ；一例は、テトラジンと生体直交型反応成分のトランスシクロオクテンのペアであり：テトラジンをタンパク質に配置し、シクロオクタンをビーズに固定することができる。他の例は、シクロオクチンとアジドの使用であり：シクロオクタンを使用してタンパク質を官能化し、アジドをビーズの表面に配置することができる。しかし、これらは例の非網羅的なリストの一部であり、特異的で強力で相補的な共有または非共有相互作用もプルダウンに使用するのに適している、他のプロセスを説明することを目的としている。
【００５５】
プルダウンスクリーニングに続く核酸コードの同定には、ディープシーケンシングまたは次世代シーケンシングが含まれる。例えば、選択ステップでビーズを使用する場合、ビーズは生化学的抽出条件に曝露され、ＤＮＡ材料をビーズから分離し、抽出されたＤＮＡは、抽出されたＤＮＡを増幅し、抽出されたＤＮＡに「アダプター」配列と呼ばれる新規配列を結合するポリメラーゼ連鎖反応に供され、それにより、イルミナまたはＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔなどの次世代シーケンシング技術を使用して、このＤＮＡのシーケンシングが可能になる。後処理、ＰＣＲ、またはアダプター配列の組み込みは、随意のステップであり；一例は、イルミナのシーケンシングに対応したＤＮＡへのファージゲノムの変換である。別の例には、既存のファージＤＮＡをアダプターとして使用するイルミナシーケンシング技術の変更が含まれる。あるいは、イルミナのアダプターがファージＤＮＡに存在してもよい。手順への変更の両方の例を使用して、ＰＣＲステップまたは「アダプター配列」を導入する他のステップの必要性を軽減することができる。ビーズからのＤＮＡの分離は、バクテリオファージの異なる属が使用されている場合、または異なる下流のＤＮＡ処理方法が使用されている場合（例えば、特定の試薬を使用したＰＣＲ）に異なっている可能性がある。ビーズからのＤＮＡのそのような分離は、当技術分野で公知の方法に従って容易に最適化することができる。ＰＣＲに続いて、特定の核酸コードと関連するＤＮＡ分子のコピー数が最小の閾値または比率を超える場合、適した「ヒット」が同定される。
【００５６】
特定の例示的な実施形態では、本出願は、グリカンアレイのための「液体」ベースのフォーマットの使用を提供する。液体ベースのフォーマットでは、ファージなどの自由に拡散するサイレントキャリアに付着した複数のグリカンが同時に標的生体分子に結合し、ヘテロおよびホモグリカン結合の両方が協同的に発生することを可能にする。液体フォーマットが機能するためには、通常、例えば、どのグリカンが標的に結合しているかを判断する方法が必要である。したがって、本出願は、特定の実施形態では、グリカンのサイレントコード化を使用したアレイの構築を提供し；その後、化学的に同一の粒子のコレクションが異なるグリカンで修飾され、次いで、互いに混合され、同じ溶液中にＮ個のグリカンの混合物が形成される。同じ溶液中にＮ個のグリカンを含むこの混合物を使用して、プルダウンおよび単離された混合ＤＮＡ分子の次世代シーケンシングからなるワンステップ選択を行い、Ｍ個の潜在的な結合グリカンの濃縮サブセットを同定する。当該分野で公知の標準的な選択方法が使用され得る。この例では、同定されたＭ個のグリカンは、「相乗的結合剤」または「非相乗的結合剤」と推定的に呼ばれる。
【００５７】
次いで、単一のステップで、｛Ｍ｝のサブセットから同定されたリガンドのいずれか１つが相乗的リガンドであるか、または非相乗的リガンドであるかを判定する。例えば、｛Ｍ｝リガンドのセットからのリガンドＭｉが「相乗的結合剤」であるか、または「非相乗的」結合剤であるかどうかを判定するために、｛Ｍ｝および｛Ｍ−Ｍｉ｝成分（後者はリガンドＭｉを欠く）を含む新規混合物を構築する。濃縮プロセスをそれぞれ繰り返して、成分Ｍｉの存在下または非存在下で濃縮されたリガンドを同定する。次いで、｛Ｍ｝および｛Ｍ−Ｍｉ｝セットから引き出した各リガンドのコピー数を比較する。各セットからプルダウンした後に、リガンドが同じコピー数を示す場合、それらは「非相乗的」と定義される。逆に、２つの混合物のリガンドのコピー数が著しく異なる場合、リガンドは成分Ｍｉと「相乗的」（またはおそらく拮抗的）として定義される。濃縮画分が２つの実験間で統計的に有意ではない分子は、分子Ｍｉと相乗的に作用することはなく、分子Ｍｉが存在しない場合、結合の欠損または重度の減少を示すことにより、相乗的な結合相互作用を同定するために使用することができる。
【００５８】
したがって、Ｎ個のリガンドのライブラリは、Ｍ個のサブセットに削減され、｛Ｍ｝の各メンバーが順に除外される一連の選択ステップにより、｛Ｍ｝の各メンバーと｛Ｍ｝の他の各メンバーとの相乗的結合能が提供される。約Ｎ２としてスケーリングされる分子アレイの分離された分子ライブラリを備えたスクリーニングとは異なり、このスクリーニングは、ＭがＮより著しく小さな数字である、Ｍ＋１スクリーニングのみを必要とする。
【００５９】
特定の実施形態では、本発明は、薬物発見の標的として目的のレクチンのグリカン優先度を決定する方法を含む。分子の他のクラスは、標的分子として同様に検査され得る。タンパク質アレイ、ペプチドアレイ、小分子アレイ、核酸および類似のアレイと呼ばれる「グリカンアレイ」の技術に類似した技術が知られている。それらは、グリカンアレイと同様に産生および使用され、本明細書の方法で、概念的な変更をわずかに使用し、またはまったく使用せずに使用することができる。
【００６０】
例示的な実施形態では、グリカンは、ｇ８ｐのＮ末端を介して、またはｇ８ｐの位置８に位置する露出リジン残基を介するなどにより、繊維状ファージＭ１３に化学的に結合する。植物ウイルス、動物ウイルスまたは古細菌ウイルスに対する同様の化学修飾も使用できる。この応用は、Ｎ個の別々の調製として、それぞれが核酸コードでサイレントにコード化された、それらのウイルスのＮ個のグリカン変異体の産生を提供する。変異体は混合され、Ｎ個のグリカンの液体配列であってもよい、混合ライブラリを形成する。修飾ビリオンのプルダウンおよび単離された混合ＤＮＡ分子の次世代シーケンシングである、潜在的なＭ個のリガンドの濃縮されたサブセットを同定するための残りの選択プロセスを、本明細書において記述する。
【００６１】
特定の実施形態では、本発明の方法の例は、システムを較正するための、既知の結合親和性および既知の相乗的相互作用を有する標的の使用を提供し得る。例えば、Ｎ個のグリカンの液体アレイを既知の較正用標的と組み合わせ、同じアレイを未知の標的と混合する。各々に同じ「プルダウン」アッセイを使用すると、較正用標的と未知の標的に結合するグリカンを有する分離ビーズが得られる。対照標的および未知の標的の各々からのヒットのコピー数の比較により、未知の標的の相対的な結合親和性に関する情報を提供することができる。
【００６２】
特定の実施形態では、方法の例を使用して、異なる密度でグリカンを有するキャリアをコード化することにより、多価およびホモグリカン結合を測定することができる。一例では、Ｍ１３ファージキャリアは、粒子あたり約２７００コピーのｇ８ｐを含み、これは、粒子あたり１〜２７００個のグリカンを標識できることを意味する。架橋反応における化学架橋剤と粒子の比率を変えることにより、粒子あたりの架橋剤の平均量を調節することができる。したがって、その後のグリカン結合反応において、提供されるグリカンの量が利用可能な架橋剤よりも多い場合、粒子に架橋されるグリカン部分の量の平均数は、異なるディスプレイ密度をもたらす。同じグリカンであるが、異なる核酸コードで異なる密度を表示する、いくつかの異なるライブラリを作成することにより、多価およびホモグリカンの協同的結合の効果を測定することができる。
【００６３】
本明細書に記載される本発明のより良い理解を得るために、以下の例を記載する。これらの例は、例示のみを目的とするものであることを理解する必要がある。したがって、それらは本発明の範囲を決して限定するものではない。
【００６４】
例
例１：サイレントＳＤＢおよびＳＶＥＫライブラリのクローニングおよび分離
【００６５】
サイレントにコード化されたファージライブラリは、次の手順を使用してクローン化した。サイレント遠位バーコード（ＳＤＢ）領域（図１および図６Ａ）は、ＰＣＲ増幅を使用し、続いてＮＥＢｕｉｌｄｅｒ  ＨｉＦｉ  ＤＮＡアセンブリ（ＮＥＢ）を使用してＭ１３ＫＥに導入した。インサートフラグメントを、プライマー１  ５’−ＧＡＧ  ＡＴＴ  ＴＴＣ  ＡＡＣ  ＧＴＧ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＣＴＮ  ＣＴＮ  ＴＴＹ  ＧＣＮ  ＡＴＨ  ＣＣＮ  ＣＴＮ  ＧＴＧ  ＧＴＡ  ＣＣＴ  ＴＴＣ  ＴＡＴ  ＴＣＴ  ＣＡ−３’およびプライマー２  ５’−ＴＴＡ  ＡＧＡ  ＣＴＣ  ＣＴＴ  ＡＴＴ  ＡＣＧ  ＣＡＧ  ＴＡ−３’を使用してＰＣＲ増幅し、ベクターフラグメントを、フォワードプライマーであるプライマー３  ５’−ＴＴＧ  ＣＴＡ  ＡＣＡ  ＴＡＣ  ＴＧＣ  ＧＴＡ  ＡＴＡ  ＡＧ−３’およびプライマー４  ５’−ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＣＡＣ  ＧＴＴ  ＧＡＡ  ＡＡＴ  ＣＴＣ−３’を使用してＰＣＲ増幅した。ペプチドＱＦＴ＊ＬＨＱＧＧＧに相当するスタッファー配列ＣＡＧ  ＴＴＴ  ＡＣＧ  ＴＡＧ  ＣＴＧ  ＣＡＴ  ＣＡＧ  ＧＧＴ  ＧＧＡ  ＧＧＴを含むＭ１３ＫＥクローンに基づくファージ由来のｄｓＤＮＡを、テンプレートとして使用し、＊は停止コドンを表す。ＰＣＲ増幅フラグメントを制限酵素Ｄｎｐ１で処理した後、ゲル精製した。次に、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ  Ｈｉｆｉ  ＤＮＡアセンブリを、製造元の指示に従って実行した。得られた連結ＤＮＡを大腸菌Ｋ１２  ＥＲ２７３８に形質転換し、３７℃で一晩増殖させた。次いで、一晩培養物を遠心分離して、バクテリオファージを宿主細胞から分離した。次いで、宿主細胞をＭｉｎｉＰｒｅｐキットで処理し、後続のクローニングラウンドのためにｄｓＤＮＡを抽出した。サイレントにコード化されたＳＶＥＫＮＤＱＫＴＹＨＡＧＧＧをクローン化するために、以下のプライマーを使用してペプチドを導入した。インサートフラグメントを、フォワードプライマーであるプライマー５  ５’ＧＴＧ  ＧＴＡ  ＣＣＴ  ＴＴＣ  ＴＡＴ  ＴＣＴ  ＣＡＣ  ＴＣＧ  ＡＧＹ  ＧＴＮ  ＧＡＲ  ＡＡＲ  ＡＡＹ  ＧＡＹ  ＣＡＲ  ＡＡＲ  ＡＣＮ  ＴＡＹ  ＣＡＹ  ＧＣＮ  ＧＧＮ  ＧＧＮ  ＧＧＮ  ＴＣＧ  ＧＣＣ  ＧＡＡ  ＡＣＴ  ＧＴＴ  ＧＡＡ  ＡＧ−３’およびプライマー２を使用してＰＣＲ増幅した。ベクターフラグメントを、プライマー４およびプライマー６  ５’−ＣＧＡ  ＧＴＧ  ＡＧＡ  ＡＴＡ  ＧＡＡ  ＡＧＧ  ＴＡＣ−３’を使用してＰＣＲ増幅した。得られた連結ＤＮＡがＥ．ｃｏｌｉ  ＳＳ３２０細胞（Ｌｕｃｉｇｅｎ社）に形質転換されたことを除いて、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ  Ｈｉｆｉ  ＤＮＡアセンブリを使用して、前と同じようにＰＣＲフラグメントを処理した。得られた一晩培養物を遠心分離して宿主細胞を除去し、ＰＥＧ沈殿して放出されたファージを濃縮した。ＰＥＧ沈殿ファージを１×ＰＢＳ  ５０％グリセロールに再懸濁し、−２０℃で保存した。ＳＤＢ領域でのＳＤＢサイレントコード化では、６．０×１０３の可能性のある配列の組み合わせをもたらすが、ＳＶＥＫ領域では、４．２×１０６の可能性のある配列の組み合わせをもたらす。ＳＤＢ−ＳＶＥＫライブラリの最大スペースを組み合わせると、２．６×１０１０個の可能性のある配列の組み合わせになる。モノ���ローナルでサイレントにコード化されたファージを、プラーク単離により単離した。プレートあたり１００プラークの密度でファージを播種し、個別に採取した。ファージ分離株を選択し、増殖させ、シーケンシングした。
【００６６】
次世代シーケンシングの精度を高めるために、ハミング距離は、ストリングをある配列から別の配列に変換するために必要な変更の数として定義され、ハミング距離が３を超えるバーコードのみが保持された。ユニークなバーコード化ファージを増幅し、ＰＥＧ沈殿を使用して濃縮した。
【００６７】
図１は、ｇ３ｐリーダーペプチド配列内のサイレントバーコードの構築に関連するスキームを提供する。
【００６８】
表１は、図１に記載されるサイレント遠位バーコード（ＳＤＢ）を含むファージ分離株のＤＮＡ配列の例を提供する。ＳＤＢは短縮されたストリングで、ＤＮＡコドンの縮重した変化のみが含まれるが、ＳＤＢ領域のコドン配列には、ＳＤＢ領域の完全なＤＮＡ配列が含まれる。ＳＤＢ領域のコドン配列をＳＤＢ配列と比較すると、コドン配列のＤＮＡ塩基３つごとに、ＳＤＢに対応していることが判別される。
【表１−１】
2020506725.tif 000003
【表１−２】
2020506725.tif 000004
【００６９】
例２：パニングプロトコルの比色評価のための蛍光ファージ対照の構築
【００７０】
蛍光ファージは、繊維状ファージベクターＭ１３Ｋｅの誘導体であり、ｌａｃＺαフラグメントの代わりにクローン化された蛍光タンパク質ｍＣｈｅｒｒｙおよびｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎを有している（図６Ａ）。これらのファージは、正しい波長の光を照射すると蛍光を発するプラークを生成する。蛍光タンパク質を発現するファージを、以下の手順を使用して構築した。インサートフラグメントを、プライマー７  ５’−ＧＣＧ  ＧＡＴ  ＡＡＣ  ＡＡＴ  ＴＴＣ  ＡＣＡ  ＣＡＧ  ＧＡＡ  ＡＣＡ  ＧＣＴ  ＡＴＧ  ＧＴＧ  ＡＧＣ  ＡＡＧ  ＧＧＣ  ＧＡＧ−３’およびプライマー８  ５’−ＴＴＡ  ＡＡＴ  ＴＴＴ  ＴＧＴ  ＴＡＡ  ＡＴＣ  ＡＧＣ  ＴＣＡ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＡＣＴ  ＴＧＴ  ＡＣＡ  ＧＣＴ  ＣＧＴ  ＣＣＡ−３’を使用してＰＣＲ増幅した。ベクターｍＣｈｅｒｒｙ−ｐＢＡＤを、ｍＣｈｅｒｒｙインサートのテンプレートとして使用し、ベクターｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ−ｐＢＡＤを、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎインサートのテンプレートとして使用した。ベクターフラグメントを、プライマー９  ５’−  ＡＡＡ  ＡＴＧ  ＡＧＣ  ＴＧＡ  ＴＴＴ  ＡＡＣ  ＡＡＡ  ＡＡＴ  ＴＴＡ  Ａ−３’およびプライマー１０  ５’−  ＡＧＣ  ＴＧＴ  ＴＴＣ  ＣＴＧ  ＴＧＴ  ＧＡＡ  ＡＴ−３’を使用してＰＣＲ増幅した。ＳＤＢ配列ＣＴＴ  ＣＴＡ  ＴＴＴ  ＧＣＴ  ＡＴＴ  ＣＣＴ  ＣＴＡを含むＭ１３ＫＥ誘導体を、ｍＣｈｅｒｒｙ構築物のベクターＰＣＲのテンプレートとして使用し、ＳＤＢ配列ＣＴＡ  ＣＴＧ  ＴＴＣ  ＧＣＡ  ＡＴＣ  ＣＣＧ  ＣＴＡを含む誘導体を、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ構築物のテンプレートとして使用した。両方のテンプレートは、ペプチド領域のペプチドＱＦＴ＊ＬＨＱＧＧＧに相当するスタッファー配列ＣＡＧ  ＴＴＴ  ＡＣＧ  ＴＡＧ  ＣＴＧ  ＣＡＴ  ＣＡＧ  ＧＧＴ  ＧＧＡ  ＧＧＴを含むＭ１３ＫＥ誘導体である。正確性を確保するために、単離されたファージプラークを選択し、増幅し、シーケンシングした。
【００７１】
次いで、蛍光ファージをさらに修飾して、ペプチドＳＷＹＤＬＹＨＧＧＧを発現させた。これを行うために、インサートフラグメントを、プライマー９  ５’−ＴＡ  ＧＴＧ  ＧＴＡ  ＣＣＴ  ＴＴＣ  ＴＡＴ  ＴＣＴ  ＣＡＣ  ＴＣＧ  ＡＧＹ  ＴＧＧ  ＴＡＹ  ＧＡＹ  ＣＴＮ  ＴＡＹ  ＣＡＹ  ＧＧＮ  ＧＧＮ  ＧＧＮ  ＴＣＧ  ＧＣＣ  ＧＡＡ  ＡＣＴ  ＧＴＴ  ＧＡＡ−３’およびプライマー２を使用して産生した。ベクターフラグメントは、Ｍ１３  ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎおよびｍＣｈｅｒｒｙをテンプレートとして使用して、プライマー４およびプライマー６を使用して産生した。精製後、フラグメントをＮＥＢｕｉｉｌｄｅｒ  ＨｉＦｉを使用して連結し、大腸菌１０Ｇ  Ｆ’にクローン化した。プライマー９は、８１９２の可能性のある配列のライブラリをもたらす縮重配列２×（ＡＧＹ）１×（ＴＧＧ）２×（ＴＡＹ）２×（ＧＡＹ）４×（ＣＴＮ）２×（ＴＡＹ）２×（ＣＡＹ）４×（ＧＧＮ）４×（ＧＧＮ）４×（ＧＧＮ）を含む。蛍光ファージのＳＤＢが固定されているため、これにより、シーケンシングで特定のファージを個別に同定できる。得られたファージを単離し、シーケンシングした。
【００７２】
次世代シーケンシングの精度を高めるために、ハミング距離は、ストリングをある配列から別の配列に変換するために必要な変更の数として定義され、ハミング距離が３を超えるバーコードのみが保持された。ユニークなバーコード化ファージを増幅し、ＰＥＧ沈殿を使用して濃縮した。
【００７３】
例３：Ｍ１３ブロッキングファージのクローン化
【００７４】
ブロッキングファージは、Ｍ１３誘導体であり、イルミナのプライマー領域内にサイレント変異を含む。これは、ファージのペプチド領域を増幅するために使用するプライマーが、ブロッキングファージゲノムＤＮＡに結合せず、ＰＣＲ増幅できなくするため、イルミナ配列が不可視であることを意味する。Ｍ１３ブロッキングファージは、以下の方法を使用して構築した。Ｍ１３  ｄｓＤＮＡを両方のＰＣＲ反応のテンプレートとして使用した。ベクターを、プライマー１０  ５’−  ＣＡＧ  ＡＡＡ  ＡＴＴ  ＣＡＴ  ＴＴＡ  ＣＴＡ  ＡＣＧ  ＴＣＴ  ＧＧＡ  Ａ  −  ３’およびプライマー１１  ５’−  ＡＡＡ  ＧＧＡ  ＡＣＡ  ＡＣＴ  ＡＡＡ  ＧＧＡ  ＡＴＴ  ＧＣＧ−  ３’で増幅した。インサートを、フォワードプライマー１２  ５’−ＴＡＴ  ＴＣＧ  ＣＡＡ  ＴＴＣ  ＣＴＴ  ＴＡＧ  ＴＴＧ  ＴＴＣ  ＣＴＴ  ＴＧＴ  ＡＣＡ  ＧＣＣ  ＡＴＡ  ＧＴＧ  ＣＧＧ  ＡＧＡ  ＣＣＧ  ＴＧＧ  ＡＡＡ  ＧＴＴ  ＧＴＴ  ＴＡＧ  ＣＡＡ  ＡＡＣ  ＣＣＣ  Ａ−３’およびプライマー１３  ５’−ＴＡＡ  ＡＴＧ  ＡＡＴ  ＴＴＴ  ＣＴＧ  ＴＡ−３’を使用して増幅した。インサートフラグメントおよびベクターフラグメントをＤｐｎ１で処理し、精製フラグメントをＮＥＢｕｉｌｄｅｒ  Ｈｉｆｉアセンブリに供して大腸菌ＸＬ１  Ｂｌｕｅに形質転換する前にゲル精製した。単離されたプラークは、精度を確保するためにシーケンシングした。
【００７５】
例４：グリカンの繊維状ファージへの結合。
【００７６】
グリカンの繊維状ファージビリオンへの結合は、２段階の手順およびプロパルギル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドまたはジベンゾシクロオクチンＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＤＢＣＯ−ＨＮＳ）リンカーを使用して達成された（図２および７Ａおよび７Ｂ）。
【００７７】
図７Ａは、一般に、アジドグリカンをファージのｐＶＩＩＩタンパク質に取り込み、グリカンの液体アレイを作成するために使用される化学ライゲーション戦略のスキームを示す。各反応は、修飾および未修飾のｐ８タンパク質を含むファージを産生できる。２段階の反応により、完全に修飾された生成物（「ｐｒｏｄ」）、部分的に修飾された中間体（「ｉｎｔ．」）、または未反応のｐ８タンパク質（「ｓ．ｍ」）を産生できる。これらの種の比率により、ファージの修飾密度が決定される。図７Ｂは、ｐ８タンパク質のアミノ酸配列、ジベンゾシクロオクチンＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＤＢＣＯ−ＨＮＳ）リンカーによる修飾、およびＤＢＣＯ修飾ｐ８タンパク質に異常に結合したアジドリンカーとグリカンのライゲーションの化学概略図を示す。
【００７８】
最初に、単一のサイレントバーコードを有するファージを、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基を介してリンカーと反応させる。このリンカーは、ｐＶＩＩＩポリペプチド配列のＮ末端のいずれかを介して、主要なビリオンコートタンパク質ｐＶＩＩＩによってファージビリオンに共有結合する。次いで、プロパルギル基と、炭水化物をファージビリオンに共有結合させる炭水化物のアジド誘導体との間のクリックケミストリーを使用して、架橋剤を有するファージを反応させる。この化学反応を最適化するために、グリカンβ−アジドマンノシドを使用した。ファージを最初に１ｘ、２０ｘおよび５０ｘ当量のジベンゾシクロオクチン−スルホ−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミジルエステルと共に３０分間インキュベートした（当量はファージあたりの総ｐＶＩＩＩタンパク質のモル濃度に関して計算した）。例えば：１０１２個のファージには１ｍＬあたり２７００＊１０１２個のｐＶＩＩＩタンパク質が含まれており、これはｐＶＩＩＩの
【数１】
2020506725.tif 000005
濃度に相当する。次いで、アジドエチル化マンノースをこの混合物に添加し、１時間インキュベートした。反応混合物をＺｅｂａスピンカラムで脱塩して、未反応のアジドエチル化マンノースを除去した。次いで、コンジュゲートしたファージを、マトリックスとしてシナピン酸を使用するＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを使用して分析した。図７Ｃは、ＭＡＬＤＩによるコンジュゲートの性質決定を示す。ＭＡＬＤＩは、未修飾ｐ８、部分的に修飾された中間ＤＢＣＯ−ｐ８、および完全に修飾されたコンジュゲートを検出する。ＭＡＬＤＩのピークの比率により、不完全な反応の性質決定が可能になり、ファージ上のグリカンの最終密度を推定できる。未修飾ｐＶＩＩＩ（分子量５２３９）、リンカーファージ（分子量５５５５）およびグリカン−ファージ（分子量５７６０）の標的ピークのｍ／ｚ比は、イオン付加物スペクトルからデコンボリューションされた（図７Ｄ）。グリカン−ファージピークのピーク高は、使用したリンカーおよびグリカンの化学量論に比例することが見出された。
【００７９】
ファージｐＶＩＩＩタンパク質には、修飾可能な２つの溶媒露出アミノ基が含まれる（図７Ｂ）。１つ目はＮ末端のアミノ基であり、２つ目はリジン（Ｎ末端から８番目）である。シナピン酸マトリックス（マトリックスはＴＦＡも含む）でＭＡＬＤＩ分析すると、追加のピーク約４８５０（ｍ／ｚ）が観察されたが、修飾後も同様のままであった。結果を図７Ｅに示す。いくつかのグループによる以前の研究では、アスパラギン酸（Ｄ）およびプロリン（Ｐ）の間のペプチド結合の酸感受性が示された；しかし、ファージｐＶＩＩＩタンパク質にはＤ−Ｐ結合が含まれる。この結合の切断により、５０５と４８３３に対応する質量を有する、２つのフラグメントが産生される。後者のピークの質量はグリカン修飾後も変化しなかったため、すべての修飾はＮ末端アミノ基で行われていると結論付けた。
【００８０】
例５：サイレントキャリアを使用する、リガンドの異なる多価密度のコード化
【００８１】
ファージ粒子上の表示の密度もコード化できる。図３は、異なる密度で同じグリカンを表示する粒子を産生するために、架橋化学を調節する効果の説明を提供する。
【００８２】
図３に記載されるように、各サイレントキャリアファージが、異なるグリカンまたは異なる密度のグリカンとコンジュゲートしている場合、異なるサイレントキャリアの混合物が産生される。混合物を一緒にプールすると、各々のグリカンおよび各々の異なるグリカン密度が、サイレントバーコードによって同定可能なユニークなキャリアと結合した混合物が産生される。図３に示すように、Ｐ１は、ファージ粒子あたり３個のグリカン分子の密度で、グリカン１と結合している。Ｐ２は、ファージ粒子あたり３個のグリカン分子の密度で、グリカン２と結合している。Ｐ３は、グリカン２と結合しているが、ファージ粒子あたり５個のグリカン分子の密度であり、Ｐ４は、ファージ粒子あたり１０個のグリカン分子の密度で、グリカン２と結合している。
【００８３】
例６：ＥＬＩＳＡを使用したグリカン修飾の実証
【００８４】
ファージの修飾がグリカンを破壊しないことを実証するために、グリカン結合のＥＬＩＳＡベースのコンホメーションを実施した。公開されたプロトコルに従って、ＥＬＩＳＡを完了した。最初に、マイクロタイタープレートを、ｇａｌ４−ファージの希釈勾配、ならびにＰＢＳ中の陰性対照用の未修飾ファージおよびリンカーファージで一晩コーティングした。次いで、プレートを洗浄し、１μｇ／ｍｌの抗Ｇａｌ４抗体を含む１００μＬの溶液と共に２時間インキュベートした。次いで、プレートを再度洗浄し、二次抗体ＨＲＰタグ付きヤギ抗マウス（１：５０００希釈）と共に４０分間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄し、ＨＲＰ基質ＴＭＢを添加した。構築後、１（Ｍ）リン酸で反応を停止し、４５０ｎｍで読み取り、収集したデータをオリジンのソフトウェアで処理した。
【００８５】
図４は、グリカン特異的モノクローナル抗体による、ポリスチレンプレートに吸着されたグリカンファージの特異的認識を示す。未修飾のファージとＤＢＣＯファージを対照として使用する。各データポイントは、３回繰り返しの平均値を表す。
【００８６】
図５は、ディープシーケンシングによって検出されたライブラリからのグリカンの回収率を示す。混合物で使用される３つのグリカンは、テトラガラクトフラノース（ｇａｌ４）、ベータマンノース（ｍａｎ）およびラクトース（ｌａｃ）である。標的として、対応する既知の標的−それぞれ、ｇａｌ４、ＣｏｎＡ、およびガレクチン３に対して産生されるマウスｍＡｂを使用した。各バーコードの濃縮度は、溶出サンプルで検出された読み取り数を入力サンプルの対応する数で割ることによって算出される。各パネルの点線は、１倍の濃縮度を示す。
【００８７】
例７：溶液中のグリカン結合タンパク質のパニング
【００８８】
タグなしグリカン結合タンパク質（ＧＢＰ）は、ＮＨＳ−ＰＥＧ４ビオチンで最初に化学修飾されたが、グリカン結合抗体は修飾されていなかった。次いで、液体グリカンアレイ（ＬｉＧＡ）を１０μｇのグリカン結合タンパク質と室温で１時間混合した。ＧＢＰおよび結合ＬｉＧＡファージを捕捉するために、結合バッファーで前洗浄した、ビオチン化ＧＢＰまたはグリカン結合抗体用のプロテインＧビーズのいずれか１０μＬを添加した。さらに、この時点で、ブロッキング剤として０．１％ＢＳＡを混合物に添加し、ビーズへのファージの非特異的結合を減少させた。４５分のインキュベーション後、混合物を５００ｇで１分間遠心分離し、ビーズを収集した。上清を捨て、ビーズを１ｍＬのＰＢＳＴバッファーで洗浄し、遠心分離してビーズを収集した。洗浄ステップを３回繰り返した。実験がグリカン結合を評価するための最適化実験として行われた場合、酸溶出を使用して、ファージをビーズから溶出させる。これを行うには、ビーズを０．２ＭグリシンバッファーｐＨ２と１０分間混合し；次いで、溶液を１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ９で中和し、溶出したファージをファージプレーティングにより数え上げた。ＬｉＧＡ（図６Ｃ）には、マンノースにコンジュゲートした蛍光ファージ（ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ）と、ガラクトースにコンジュゲートした蛍光ファージ（ｍＣｈｅｒｒｙ）とが含まれているため、これらの対照を使用して、マンノースおよびガラクトース結合レクチンへの結合を実証できる。これにより、ディープシーケンシングを行うことなく、パニング手順を最適化することができた（図６Ｃ）。コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）でのパニングの最適化により、マンノースを表示するｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎファージが、ガラクトースを表示するｍＣｈｅｒｒｙファージよりも高い量で保持されることが示された。この結果は、ＣｏｎＡがマンノース結合レクチンであることと一致している。
【００８９】
ディープシーケンシングを行うサンプルについては、ビーズを３０μＬのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡバッファー（Ｔｒｉｓ  １０ｍＭ＋ＥＤＴＡ  ０．０１ｍＭ  ｐＨ）に再懸濁した。次いで、３０μＬのヘキサンをビーズに添加し、室温で１０分間振盪してインキュベートし、ファージゲノムＤＮＡを分解および放出させた。次いで、ヘキサンを６８℃で８分間インキュベートすることにより蒸発させた。溶媒の蒸発後、２１，０００ｇで２分間の遠心分離により、ビーズをペレット化した。残りの上清をＰＣＲ増幅に供し、ＳＤＢ−ＳＶＥＫ領域を増幅し、イルミナのディープシーケンシングアダプターを取り付ける。Ｕｌｅｘ  Ｅｕｒｏｐａｅｕｓ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＵＥＡレクチン）でのディープシーケンシングにより、末端または分岐フコースを有するグリカンを表示するファージが保持されていることが示され（図６Ｅ）、抗Ｇａｌ４抗体でのパニングにより、Ｇａｌ４表示ファージの保持が示された。
【００９０】
図６Ａは、バクテリオファージｍ１３のゲノムおよびサイレントバーコードの導入場所の概略図を示す。バーコードは、ｐ３などのコートタンパク質の翻訳された領域にあり得る。それらは、ファージタンパク質をコードしない領域に挿入することもできる（下部のレポーターボックス）。そのような遺伝子は、ファージ中のタンパク質産物としては存在しないが、ファージによって宿主生物に形質導入される。図６Ｂは、異なるレポータータンパク質を使用して、異なる化学修飾またはこれらの同じ修飾の密度を追跡できることを示す。例では、マンノース分子の高密度（ファージあたり１５００個のマンノース分子）、中密度（ファージあたり５００個のマンノース分子）、低密度（ファージあたり２００個のマンノース分子）および欠如が、４つの異なるレポータータンパク質によってそれぞれコード化されていることを示している。高マンノース修飾を含むファージは、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ遺伝子を宿主細菌に形質導入するため、緑色の蛍光プラークを形成する。同様に、比色基質Ｘ−ｇａｌを含む寒天上において、中程度ＭａｎファージはｍＣｈｅｒｒｙタンパク質を形質導入し、赤色プラークを形成し、低密度Ｍａｎ−ファージはα−ガラクトシダーゼ（α−Ｇａｌ）遺伝子を形質導入し、青色プラークを形成する。グリカンを表示しないファージは、報告されたものを形質導入せず、白色プラークを形成する。選択前後の緑赤青白色プラークの比率を使用して、特定の標的に対する濃縮におけるマンノース密度の影響をモニタリングできる。
【００９１】
図６Ｃは、比色または蛍光レポーターが、シーケンシングによって分析されるサイレントバーコードと組み合わせることができることを示す。この例では、２つの混合物が生成される：ＬｉＧＡ１には、３つの異なる密度（ファージあたり１５００、５００または２００コピー）で、ガラクトース、ラクトースまたはＬＮＴテトラサッカライドで修飾された９つの異なるα−Ｇａｌ（＋）キャリアが含まれる。９つの組み合わせは、バーコードのシーケンシングによって区別できる。ＬｉＧＡ１には、マンノース１５００−ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎおよびラクトース１５００−ｍＣｈｅｒｒｙおよびレポーターを発現しない未修飾「ブロッキングファージ」も含まれる。伸長されたＬｉＧＡ２混合物には、ＬｉＧＡ１に含まれるすべてのものに加えて、３つの異なる密度でβ−マンノース、α−マンノース、およびα−Ｍａｎ３グリカンを含む追加の９つのクローンが含まれる。
【００９２】
図６Ｄは、４色スキームが、マンノース結合レクチンＣｏｎＡでコーティングされたポリスチレンプレート上で、図６Ｃに示すＬｉＧＡ１混合物の濃縮をモニタリングしたことを示す。入力および出力中の粒子の数は、プラーク形成アッセイにより推定された。図６Ｅは、緑色プラークとして検出された高密度のマンノースを含む粒子の回収率が１５％であることを示す。ＣｏｎＡに結合しないラクトースグリカンを含む赤色粒子の回収率は０．３％である。未修飾「ブロッキング」ファージ粒子のわずか０．０４％が回収され；この集団はＣｏｎＡに結合するリガンドを示さないため、α−Ｇａｌ（＋）「青色」集団の９個のファージクローンで同様の低い回収率（０．０６％）が観察される。図６Ｆは、α−Ｇａｌ（＋）集団にＣｏｎＡ結合リガンドを含む、ＬｉＧＡ２で繰り返された類似の実験の結果を示す。「青色」集団の回収率は、図６Ｅで観察されたものよりも有意に高く、未修飾白色ファージの回収率よりも１０倍高い。ＣｏｎＡ結合緑色クローンおよび非ＣｏｎＡ結合「赤色」クローンの回収率は、図６Ｄで観察されたものと類似している。
【００９３】
図６Ｇは、同じ４色スキームを使用して、マンノース結合レクチンＤＣ−ＳＩＧＮを含む細胞など、任意の標的上のライブラリの回収率をモニタリングおよび最適化できることを示す。最初の集団には、比率が１：１００である緑および白色プラークが含まれる。４回洗浄した後、細胞ペレットｐ４には、比率が１：１である緑色（Ｍａｎ）および白色（グリコシル化されていないファージ）が含まれ、Ｍａｎファージが１００倍濃縮されたことを示している。ＤＣ−ＳＩＧＮを含まない細胞では、回収されるＭａｎ−ｇｒｅｅｎファージクローンが少なくなる。細胞ペレットと関連するＤＮＡのシーケンシングにより濃縮が確認されるが、比色モニタリングを使用して、シーケンシングを必要とせずに選択手順を最適化できる。
【００９４】
図６Ｈは、Ｆｕｃα１−２修飾および抗Ｇａｌ４抗体を認識する植物レクチンＵＧＡによる７４個のグリカンのアレイのプルダウンの代表例を示す。Ｆｕｃα１−２修飾を含むためにアレイに存在する特定のグリカンは次のとおりである。Ｔｅ２１２：Ｆｕｃα１−２Ｇａｌｂ１−４［Ｆｕｃａ１−３］ＧｌｃＮＡｃｂ１−３Ｇａｌｂ１−４［Ｆｕｃａ１−３］ＧｌｃＮＡｃｂ−ファージ；Ｔｅ２２２：ＧａｌＮＡｃα１−３［Ｆｕｃα１−２］Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ−ファージ（濃縮が検出されない：偽陰性？）；Ｔｅ２２３：Ｇａｌａ１−３［Ｆｕｃα１−２］Ｇａｌｂ１−４ＧｌｃＮＡｃｂ−ファージ；Ｔｅ２２４：ＧａｌＮＡｃａ１−３［Ｆｕｃα１−２］Ｇａｌｂ１−４Ｇｌｃｂ−ファージ；Ｔｅ１１８：Ｆｕｃα１−２Ｇａｌｂ１−４［Ｆｕｃα１−３］ＧｌｃＮＡｃｂ−ファージ（濃縮が検出されない）；Ｔｅ３０３：Ｎｅｕ５Ａｃａ２−３［Ｎｅｕ５Ａｃａ２−３Ｇａｌｂ１−３ＧａｌＮＡｃｂ１−４］Ｇａｌｂ１−４Ｇｌｃｂ−ファージ；Ｔｒ１１６：Ｆｕｃα１−２Ｇａｌｂ１−３ＧｌｃＮＡｃｂ−ファージ
【００９５】
例８：ＬｉＧＡを使用したセルベースのスクリーニングの実証
【００９６】
ＬｉＧＡを使用して、生細胞全体のグリカン結合特性を評価できる。これを実証するために、ヒト樹状細胞特異的細胞間接着分子−３−結合ノンインテグリン受容体（ＤＣ−ＳＩＧＮ）を高度に発現するラット６線維芽細胞安定細胞株に対して、ＬｉＧＡアレイをパニングした。陰性対照として、タンパク質をまったく発現しなかったＲａｔ−６線維芽細胞株を使用した。この細胞株構築の詳細は、［４］に記載されている。ＤＣ  ＳＩＧＮは、高マンノースおよびフコース含有グリカンに親和性があるＣ型レクチンである。この実験を行うために、トリプシンを使用して対数期細胞をフラスコから剥がし、Ｈｅｐｅｓバッファー（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ、１％ＢＳＡ）に１×１０６細胞／ｍＬで再懸濁した。次いで、細胞の１ｍＬアリコートをペレット化し（１０００ｒｐｍ／４分）、１×１０８ｐｆｕのＬｉＧＡファージおよび１×１０８ｐｆｕのブロッキングファージを含む５００μＬのＨＥＰＥＳバッファーに再懸濁した。この例で使用するＬｉＧＡアレイには、洗浄の効率をモニタリングするための陽性および陰性対照の蛍光ファージが含まれる（図６Ｇ）。陽性対照ファージは、一価のマンノースに結合したｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ蛍光ファージであった。使用した陰性対照ファージは、ガラクトースに結合したｍＣｈｅｒｒｙ蛍光ファージであった。次いで、細胞を氷上で２時間インキュベートした。次いで、細胞を４ｍＬのＨｅｐｅｓバッファーを使用して３回洗浄し、３０μＬのＨ２Ｏに再懸濁した。ファージ力価を分析するために、各洗浄ステップの前に５μＬのサンプルを取り出した。サンプルを１０分間煮沸した後、細胞片を除去するために２１０００ｇで５分間遠心分離した。次いで、ＰＣＲ反応混合物を含むＰＣＲチューブに上清を移し、イルミナシーケンシング用の増幅産物を調製した。非煮沸サンプルの力価測定により、細胞を３回洗浄した後、陽性ファージ力価が陰性対照ファージよりも１０倍大きかったことが示された（図６Ｇ）。さらに、ブロッキングファージの数は１×１０８ｐｆｕから１×１０５ｐｆｕに減少した。細胞をさらに洗浄しても、ファージ力価は有意に低下しなかった。細胞に結合したままのファージのディープシーケンシングにより、マンノース含有グリカンにコンジュゲートしたファージは、パニングされた集団に保持され、他のグリカンにコンジュゲートしたファージは、保持されないことが示された。
【００９７】
定義および解釈
本発明の説明は、例示および説明の目的で提示されたものであるが、網羅的であること、または開示された形態で本発明に限定されることを意図するものではない。多くの修正および変形が、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、当業者には明らかであろう。実施形態は、本発明の原理および実際の適用を最良に説明するために、および意図された特定の用途に適した様々な修正を伴う様々な実施形態について本発明を他の当業者が理解できるように選択および記載された。以下の説明が本発明の特定の実施形態または特定の使用に関する限り、それは例示のみを意図しており、特許請求の範囲に記載された発明を限定するものではない。
【００９８】
本明細書に添付された特許請求の範囲のすべての手段またはステップおよび機能要素の対応する構造、材料、行為、および同等物は、具体的に特許請求される他の特許請求された要素と組み合わせて機能を実行するための任意の構造、材料、または行為を含むことが意図される。
【００９９】
本明細書における「一実施形態」、「一実施形態」などの参照は、記載された実施形態が特定の態様、特徴、構造、または特性を含むことができるが、必ずしもすべての実施形態がその態様、特徴、構造、または特性を含むわけではないことを示す。さらに、そのような語句は、必ずしもそうとは限らないが、本明細書の他の部分で言及される同じ実施形態を指すことができる。さらに、特定の態様、特徴、構造、または特性が実施形態に関連して説明される場合、そのような態様、特性、構造、または特性を、他の実施形態と組み合わせ、影響または接続することは、そのような接続または組み合わせが明示的に記述されているか否かにかかわらず、当業者の知識の範囲内である。言い換えれば、２つの間に明白または固有の非互換性がない限り、または具体的に除外されない限り、任意の要素または機能を異なる実施形態の他の要素または機能と組み合わせることができる。
【０１００】
特許請求の範囲は、随意の要素を除外するように起草され得ることにさらに留意する。そのため、この記述は、特許請求の範囲の要素の記載または「否定的な」制限の使用に関連して、「唯一」、「のみ」などの排他的な用語を使用するための先行詞としての役割を果たすことを意図している。「好ましくは」、「好ましくは」、「好ましい」、「任意に」、「してもよい」、および類似の用語は、参照される項目、条件、またはステップが本発明の随意の（必須ではない）特徴であることを示すために使用される。
【０１０１】
単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、文脈で明確に指示されていない限り、複数の参照が含まれる。「および／または」という用語は、項目のいずれか、項目の任意の組み合わせ、またはこの用語が関連付けられている項目のすべてを意味する。
【０１０２】
当業者によって理解されるように、あらゆる目的、特に記載された記述を提供する観点から、本明細書において列挙されるすべての範囲はまた、任意およびすべての可能な下位範囲およびその下位範囲の組み合わせ、ならびにその範囲、特に整数値を構成する個々の値を包含する。列挙された範囲（例えば、重量パーセントまたは炭素基）は、範囲内の各特定の値、整数、小数、または同一性を含む。列挙された範囲は、同じ範囲が少なくとも半分、３分の１、４分の１、５分の１、または１０分の１に分割されることを十分に説明し、可能にすることを容易に認識することができる。非限定的な例として、本明細書で説明される各範囲は、下位３分の１、中央３分の１、および上位３分の１などへ容易に分割することができる。
【０１０３】
当業者にも理解されるように、本明細書に記載されるすべての範囲、および「最大」、「少なくとも」、「より大きい」、「より小さい」、「より多い」、「以上」などのすべての言語には、列挙された数字が含まれ、そのような用語は、上述したように後に下位範囲に分割できる範囲を指す。
参考文献
2020506725.tif 000006
2020506725.tif 000007
2020506725.tif 000008
【配列表フリーテキスト】
【０１０４】
配列表１  ＜２２３＞ｎは．ａ．ｃ．ｇ又はｔである．
配列表８  ＜２２３＞ｎは．ａ．ｃ．ｇ又はｔである．
配列表４３  ＜２２３＞ｎは．ａ．ｃ．ｇ又はｔである．
【図１】
2020506725.tif 000009
【図２】
2020506725.tif 000010
【図３】
2020506725.tif 000011
【図４】
2020506725.tif 000012
【図５】
2020506725.tif 000013
【図６Ａ−Ｅ】
2020506725.tif 000014
【図６Ｇ】
2020506725.tif 000015
【図６Ｈ】
2020506725.tif 000016
【図７Ａ−Ｄ】
2020506725.tif 000017
【図７Ｃ−Ｆ】
2020506725.tif 000018
【配列表】
2020506725000001.app
【国際調査報告】
2020506725.tif 000019
2020506725.tif 000020
2020506725.tif 000021