(57)【要約】  本発明は、新規なセルラーゼ、洗浄剤組成物などの様々な用途における新規なセルラーゼの使用、および新規なセルラーゼを含む組成物に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
触媒ドメインモチーフ［ＳＴＡ］−Ｔ−Ｒ−Ｙ−［ＦＹＷ］−Ｄ−ｘ（５）−［ＣＡ］、および配列番号３と少なくとも８０％の配列同一性を有する炭水化物結合ドメインまたはタグモチーフＶ−［ＰＳＣ］−［ＤＱＥＮ］−Ｓ−Ｇ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｐを含む炭水化物結合ドメインを含む、セルラーゼ。
【請求項２】
触媒ドメインモチーフが、Ｔ−Ｔ−Ｒ−Ｙ−［ＦＹＷ］−Ｄ−ｘ（５）−［ＣＡ］である、請求項１に記載のセルラーゼ。
【請求項３】
触媒ドメインモチーフが、Ｔ−Ｔ−Ｒ−Ｙ−Ｗ−Ｄ−ｘ（５）−Ｃである、請求項１または２に記載のセルラーゼ。
【請求項４】
触媒ドメインモチーフが、Ｔ−Ｔ−Ｒ−Ｙ−Ｗ−Ｄ−Ｃ−Ｃ−Ｋ−Ｐ−Ｓ−Ｃである、請求項１〜３のいずれか一つに記載のセルラーゼ。
【請求項５】
配列番号１と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１〜４のいずれか一つに記載のセルラーゼ。
【請求項６】
リンカーをさらに含む、請求項１〜５のいずれか一つに記載のセルラーゼ。
【請求項７】
リンカーが、配列番号５と少なくとも８０％の配列同一性を有する、請求項６に記載のセルラーゼ。
【請求項８】
リンカーが、配列番号７と少なくとも８０％の配列同一性を有する、請求項６に記載のセルラーゼ。
【請求項９】
リンカーが［ＡＧＳＶＴ］（５，６５）のアミノ酸配列を含む、請求項６または７に記載のセルラーゼ。
【請求項１０】
リンカーが（［ＳＧ］−Ｐ）（５，１０）のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載のセルラーゼ。
【請求項１１】
繊維、飼料、食物、バイオマス加水分解、植物油精製、洗浄剤、ならびにパルプおよび紙加工用途における、請求項１〜１０のいずれか一つに記載のセルラーゼの使用。
【請求項１２】
バイオ仕上げ剤、例えば、毛玉除去剤または毛羽除去剤；バイオストーン剤；布ケア剤、例えば、色澄明化剤、灰色化防止剤、柔軟剤、毛玉防止剤；洗濯剤、例えば、再汚染防止剤、汚れ除去剤；麦芽製造および醸造剤、例えば、濾過剤、色抽出剤；製パン剤、例えば、テクスチャ剤；飼料剤、例えば、粘度低下剤；果実加工剤、例えば、抗酸化物質放出剤、圧搾剤、色抽出剤、果汁清澄化剤；植物油抽出剤；パルプおよび紙加工剤、例えば、脱インキ剤、繊維光沢剤、水抜き剤および／または漂白剤としての、請求項１１に記載のセルラーゼの使用。
【請求項１３】
請求項１〜１０のいずれか一つに記載の少なくとも１つのセルラーゼを含む組成物。
【請求項１４】
少なくとも１種の界面活性剤、ビルダー、コビルダー、再汚染防止剤、分散剤、蛍光増白剤、漂白剤、染料、酵素、キレート剤、ポリマー、ｐＨ緩衝化剤、フィラー、凝集剤、布柔軟剤、気泡増強剤、香料、消泡剤、殺菌剤、殺真菌剤、酵素阻害剤、安定剤、可溶化剤、抗酸化剤、腐蝕防止剤および／または顔料をさらに含む、請求項１３に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なセルラーゼ、洗浄剤組成物などの様々な用途における新規なセルラーゼの使用、および新規なセルラーゼを含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
セルラーゼは、様々な用途に用いられ、洗浄剤組成物の性能など洗浄用途の良好な性能に特に重要である。
【０００３】
当技術分野で公知の様々なセルラーゼが存在するが、消費者が高い洗浄性能を期待するため、機能的要求は高まり続けており、その一方で製造コストひいては最終製品のコストは低く抑えられねばならない。さらに、環境的側面は重要性を増し、販売承認に対する要求は高まり続けている。これまでのところ、布の白色度は、塩素含有組成物などの漂白剤の実施により得られる場合が多い。これは、布を損傷するだけでなく、コストを増加させ、環境に有害でもある。このような現技術水準の酵素は、例えば、米国特許第２００５０７０００３Ａ１号（特許文献１）に開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許第２００５０７０００３Ａ１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、本発明の発明者らは、当技術分野で公知のセルラーゼを鑑みて顕著に改善された特性を示す、洗浄剤組成物中での使用に好適な新規なセルラーゼを開発することを課題とした。改善されたＡＲＤ（再汚染防止（Ａｎｔｉ  Ｒｅ−Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）；用語「再汚染防止」および各方法は例において定義される）効果により、布の白色度が上昇する一方で、布の損傷または変質は最小限に抑えられているか、または回避され得ることが、本発明の発明者らに特に重要であった。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の発明者らは今回、この課題を、触媒ドメインモチーフ［ＳＴＡ］−Ｔ−Ｒ−Ｙ−［ＦＹＷ］−Ｄ−ｘ（５）−［ＣＡ］、および配列番号３と少なくとも８０％の配列同一性を有する炭水化物結合ドメインまたはタグモチーフＶ−［ＰＳＣ］−［ＤＱＥＮ］−Ｓ−Ｇ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｐを含む炭水化物結合ドメインを含む、セルラーゼにより満たすことができることを驚くべきことに見出した。
【０００７】
本発明のセルラーゼは、優れた洗浄性能および布の白色度の顕著な上昇だけでなく、優れた毛玉除去（ｄｅ−ｐｉｌｌｉｎｇ）効果も示す。これまでの洗浄剤および特に洗濯組成物はしばしばセルラーゼのブレンド（すなわち、白色度のためのセルラーゼおよび毛玉除去のためのさらなるセルラーゼ）を含有している。これは、洗浄剤の酵素含有量、用量当たりのコストおよび洗浄サイクルの最後で洗い流される酵素の量を増加させる。さらに、異なるセルラーゼは、異なった安定性および活性の必要条件および最適条件を有し得、これにより配合および洗浄の指示が難しくなる。
【０００８】
さらに、本発明のセルラーゼは、４０℃、３５℃または３５℃未満、好ましくは２５℃未満、最大２０℃および２０℃未満の温度などの低温でも優れた白色度（ＡＲＤ）および毛玉除去効果を示す。
【０００９】
本発明のセルラーゼのさらなる利点は、製造コストをさらに削減する、本発明のセルラーゼの高い発現率である。
【００１０】
本発明において、用語「セルラーゼ」は、セルロースおよび関連の多糖の分解であるセルロース分解を触媒する任意の酵素を指すと理解されるべきである。本発明において、用語「セルラーゼ」はまた、連続的または相乗的に作用して、セルロース系材料を分解する、このような酵素の任意の天然に存在する混合物または複合体を指す。本発明のセルラーゼは、真菌、細菌または原生動物起源であり得る。用語「セルラーゼ」は、特に、セルロースを、βグルコースなどの単糖、またはより短い多糖およびオリゴ糖に分解することができる任意の酵素を指す。
【００１１】
用語「毛玉除去」は、綿毛（ｃｏｔｔｏｎ  ｆｕｚｚ）を除去し、布中のまたは布上の表面繊維を取り除くセルラーゼ酵素の能力を指す。このプロセスはまた、「毛玉除去（ｄｅｐｉｌｌｉｎｇ）」、「バイオ研磨（ｂｉｏｐｏｌｉｓｈｉｎｇ）」および「バイオ仕上げ（ｂｉｏｆｉｎｉｓｈｉｎｇ）」と称され、布の表面を滑らかにし、同様にその柔軟性および外観を改善する。セルラーゼ処理はまた、衣類を使い古したように見せる繊維の毛玉のその後の形成の防止に役立つ。毛玉除去中、セルラーゼの加水分解作用による繊維強度の損失を最小限に抑えることが所望される。
【００１２】
本発明のセルラーゼは、触媒ドメインモチーフ［ＳＴＡ］−Ｔ−Ｒ−Ｙ−［ＦＹＷ］−Ｄ−ｘ（５）−［ＣＡ］を含む。本出願内において称されるように任意のモチーフまたは修飾は、当業者に周知のアミノ酸一文字コードを用いて定義される。
【００１３】
アミノ酸は以下のようにコードされる：Ｇグリシン、Ｐプロリン、Ａアラニン、Ｖバリン、Ｌロイシン、Ｉイソロイシン、Ｍメチオニン、Ｃシステイン、Ｆフェニルアラニン、Ｙチロシン、Ｗトリプトファン、Ｈヒスチジン、Ｋリジン、Ｒアルギニン、Ｑグルタミン、Ｎアスパラギン、Ｅグルタミン酸、Ｄアスパラギン酸、Ｓセリン、Ｔスレオニン。
【００１４】
角括弧内のアミノ酸は、各位置の代替物として理解されるべきである。「ｘ」は、各位置が、すべての既存のアミノ酸から選択され得ることを示している。丸括弧内の数字（この定義内で変数「ｚ」と称される）（例えば、触媒ドメインモチーフ内に含有される５）は、丸括弧の前の用語（「用語」は、アミノ酸、または［ＡＣＴ］などの任意のモチーフを意味する）がｚ回繰り返されることを示している（例えば、Ａ（５）は、アミノ酸Ａが５回繰り返されることを示している）。（５，１０）など２つ数字が示されている場合、丸括弧の前の用語（上に定義した通り）は、５〜１０回繰り返され得る。
【００１５】
本発明の好ましい実施形態において、触媒ドメインモチーフは、Ｔ−Ｔ−Ｒ−Ｙ−［ＦＹＷ］−Ｄ−ｘ（５）−［ＣＡ］である。
【００１６】
本発明の特に好ましい実施形態において、触媒ドメインモチーフは、Ｔ−Ｔ−Ｒ−Ｙ−Ｗ−Ｄ−ｘ（５）−Ｃであり、触媒ドメインモチーフＴ−Ｔ−Ｒ−Ｙ−Ｗ−Ｄ−Ｃ−Ｃ−Ｋ−Ｐ−Ｓ−Ｃ（配列番号９とも称される）が最も好ましい。
【００１７】
本発明のセルラーゼは、配列番号３に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９２％、また好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは少なくとも９８％および最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する炭水化物結合ドメイン、または炭水化物結合タグモチーフＶ−［ＰＳＣ］−［ＤＱＥＮ］−Ｓ−Ｇ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｐをさらに含み、炭水化物結合ドメインタグＶ−Ｐ−Ｄ−Ｓ−Ｇ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｐが最も好ましい。
【００１８】
本発明内において、用語「炭水化物結合ドメインタグ」は、セルラーゼ触媒ドメインに直接、またはリンカー、好ましくは本明細書に定義されるリンカーを介して結合され得る、モチーフＶ−［ＰＳＣ］−［ＤＱＥＮ］−Ｓ−Ｇ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｐを含む、任意の配列を指す。
【００１９】
２つのアミノ酸配列間の配列同一性は、好ましくはバージョン５．０．０以降のＥＭＢＯＳＳパッケージのＮｅｅｄｌｅプログラム（ＥＭＢＯＳＳ：  Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ、Ｒｉｃｅら、２０００、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．  １６：  ２７６〜２７７）に実装されるＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ、１９７０、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：  ４４３〜４５３）を用いて決定される。使用するパラメーターは、ギャップオープンペナルティ１０およびギャップ伸長ペナルティ０．５、ならびにＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。標識された「最長同一性」（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）Ｎｅｅｄｌｅの出力は、パーセント同一性として用いられ、以下のように計算される：（同一残基×１００）／（アラインメントの長さ−アラインメント中のギャップ総数）。
【００２０】
特定の好ましい実施形態において、本発明のセルラーゼは、配列番号１に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９２％、また好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは少なくとも９８％および最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含むことを含む。
【００２１】
好ましい実施形態において、本発明のセルラーゼは、リンカーをさらに含む。用語「リンカー」は、触媒ドメインおよび炭水化物結合ドメインまたは炭水化物結合ドメインタグを結合または「連結」するのに好適な当業者に公知の任意の配列を指す。「リンカー」または「スペーサー」は、単一タンパク質中の複数のドメインを分離するための、自然に生じた短いアミノ酸配列である。各ドメインの機能を妨害せずに、触媒ドメインと炭水化物結合ドメインまたは炭水化物結合ドメインタグとの間の望ましくない相互作用を妨げる機能。いくつかのリンカーは、驚くべきことに、本発明のセルラーゼの性能に寄与し、ＡＲＤ（再汚染防止）および毛玉除去効果を高めることが判明し、本発明の発明者らはさらにリンカーモチーフを同定することができた。
【００２２】
好ましい実施形態において、リンカーは、配列番号５に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９２％、また好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは少なくとも９８％および最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する。したがって、リンカーが［ＡＧＳＶＴ］（５，６５）のアミノ酸配列を含むことが、さらに好ましい。
【００２３】
別の好ましい実施形態において、リンカーは、配列番号７に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９２％、また好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは少なくとも９８％および最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する。したがって、リンカーが（［ＳＧ］−Ｐ）（５，１０）のアミノ酸配列を含むことが、さらに好ましい。
【００２４】
特に好ましい実施形態において、本発明のセルラーゼは、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５または配列番号１７に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９２％、また好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは少なくとも９８％および最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する任意の配列から選択される。
【００２５】
本発明のセルラーゼは、本発明の目的に好適であるとして当業者に公知の任意の方法により調製され得る。好適な宿主細胞による本発明のセルラーゼの発現が好ましい。用語「宿主細胞」は、本発明のセルラーゼの核酸配列を含む核酸コンストラクトまたは発現ベクターによる形質転換、トランスフェクション、形質導入などに好適である、任意の細胞型を指す。用語「宿主細胞」はまた、複製中に起こる突然変異により親細胞と同一ではない、親細胞の任意の子孫を包含する。宿主細胞は、好ましくは真菌、酵母および細菌からなる群から選択される。本発明において、宿主細胞は、好ましくは酵母細胞、例えば、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイウェロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）；ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス（Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）またはヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）であり、クルイウェロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、サッカロマイセス・カルスベルゲンシス（Ｋａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・ジアスタチクス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロマイセス・ドウグラシイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロマイセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  Ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロマイセス・ノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）、サッカロマイセス・オビホルミス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  Ｉｉｐｏｌｙｔｉｃａ）およびピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｏｔｉｓ）が好ましい。
【００２６】
用語「発現」は、それだけに限定されないが転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾および分泌など、本発明のセルラーゼの産生に関わる任意のステップを含む。
【００２７】
別の態様において、本発明は、繊維、飼料、食物、バイオマス加水分解、植物油精製、洗浄剤、ならびにパルプおよび紙加工用途における出願において定義される本発明のセルラーゼの使用に関する。好ましい実施形態において、本発明のセルラーゼは、バイオ仕上げ剤、例えば、毛玉除去（ｄｅｐｉｌｌｉｎｇ）剤または毛羽除去剤（ｄｅｆｕｚｚｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）；バイオストーン剤（ｂｉｏｓｔｏｎｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）；布ケア剤（ｆａｂｒｉｃ  ｃａｒｅ  ａｇｅｎｔ）、例えば、色澄明化剤（ｃｏｌｏｒ  ｃｌａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｇｅｎｔ）、灰色化防止剤（ａｎｔｉ  ｇｒｅｙｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、柔軟剤、毛玉防止剤（ａｎｔｉｐｉｌｌｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）；洗濯剤（ｌａｕｎｄｒｙ  ａｇｅｎｔ）、例えば、再汚染防止剤、汚れ除去剤；麦芽製造および醸造剤（ｍａｌｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｂｒｅｗｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、例えば、濾過剤、色抽出剤；製パン剤（ｂａｋｅｒｙ  ａｇｅｎｔ）、例えば、テクスチャ剤；飼料剤（ｆｅｅｄ  ａｇｅｎｔ）、例えば、粘度低下剤；果実加工剤、例えば、抗酸化物質放出剤（ｒｅｌｅａｓｅ  ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ  ａｇｅｎｔ）、圧搾剤（ｐｒｅｓｓｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、色抽出剤、果汁清澄化剤（ｃｌａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｊｕｉｃｅ  ａｇｅｎｔ）；植物油抽出剤；パルプおよび紙加工剤、例えば、脱インキ剤（ｄｅｉｎｋｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、繊維光沢剤、水抜き剤（ｄｒａｉｎａｇｅ  ａｇｅｎｔ）または漂白剤として用いられる。
【００２８】
洗浄および洗濯用途での使用などの繊維用途が好ましい。したがって、洗浄剤組成物などの洗濯および洗浄用途での使用のための組成物の構成要素として、本発明のセルラーゼを使用することが特に好ましい。
【００２９】
別の態様において、本発明は、少なくとも１つの本発明のセルラーゼを含む組成物に関する。好ましい実施形態において、組成物は、少なくとも１つの界面活性剤、ビルダー、コビルダー、再汚染防止剤、分散剤、蛍光増白剤、漂白剤、染料、酵素、キレート剤、ポリマー、ｐＨ緩衝化剤、フィラー、凝集剤、布柔軟剤、気泡増強剤（ｆｏａｍ  ｂｏｏｓｔｅｒ）、香料、消泡剤（ｓｕｄｓ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ）、殺菌剤、殺真菌剤、酵素阻害剤、安定剤、可溶化剤、抗酸化剤、腐蝕防止剤、シェーディング染料および／または顔料を含む。特に好ましい実施形態において、本発明の組成物は、繊維（複数可）もしくは繊維材料のための洗浄剤組成物、または非布用の洗浄剤組成物である。
【００３０】
本発明の洗浄剤組成物は、バー、均質タブレット、２層以上を有するタブレット、１つ以上のコンパートメントを有するパウチ、通常または圧縮粉末、顆粒、ペースト、ゲルまたは通常、圧縮または濃縮液体などの任意の好都合な形態であり得る。
【００３１】
パウチは、単一または複数のコンパートメントとして構成され得る。パウチは、本発明の目的に好適であるとして当業者に公知であり、水に接触する前のパウチからの組成物の放出を防止する、任意の形態、形状および材料のものであってよい。パウチは、好ましくは、内部容積を有する水溶性フィルムから製造される。内部容積は、パウチの複数のコンパートメントに分割され得る。好ましいフィルムは、ポリマー材料、好ましくはフィルムまたはシートに成形されるポリマーである。好ましいポリマー、コポリマーまたはそれらの誘導体は、ポリアクリレート、および水溶性アクリレートコポリマー、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、デキストリンナトリウム、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、マルトデキストリン、ポリメタクリレート、最も好ましくはポリビニルアルコールコポリマーおよびヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）から選択される。
【００３２】
液体またはゲル洗浄剤は、好ましくは少なくとも２０重量％および最大９５重量％の水、例えば、最大約７０重量％の水、最大６５重量％の水、最大５５重量％の水、最大４５重量％の水、最大３５重量％の水を含有する水性であり得、約２〜４０重量％の含水量が好ましい。他の種類の液体は、水性液体またはゲル中にアルカノール、アミン、ジオール、エーテルおよびポリオールを含む。水性液体またはゲル洗浄剤は、０〜３０重量％の有機溶媒を含有し得る。液体またはゲル洗浄剤はまた、非水性であり得る。
【００３３】
用語「繊維（ｔｅｘｔｉｌｅ）」は、織布（ｗｏｖｅｎ  ｆａｂｒｉｃｓ）、ならびにヤーン（ｙａｒｎ）、織布、編地および不織布への転換またはこれらとしての使用に好適であるステープルファイバー（ｓｔａｐｌｅ  ｆｉｂｅｒｓ）およびフィラメントを指す。当該用語は、天然および合成（例えば、製造された）繊維から製造されるヤーンを包含する。用語「繊維材料」は、繊維、ヤーン中間体、ヤーン、布、布から製造された製品（例えば、衣類および他の物品）のための包括的用語である。
【００３４】
用語「非布用の洗浄剤組成物」は、硬質表面洗浄用組成物（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｈａｒｄ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｃｌｅａｎｉｎｇ）、例えば、食器洗浄剤組成物、口腔洗浄剤組成物、義歯洗浄剤組成物、およびパーソナル洗浄組成物（ｐｅｒｓｏｎａｌ  ｃｌｅａｎｓｉｎｇ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）を含むがこれらに限定されない非繊維性の表面洗浄剤組成物を含む。
【００３５】
洗濯液での使用のための組成物は、組成物の重量に対して０．０００１〜１０重量％、好ましくは０．０００５〜８重量％、例えば、０．００１〜５重量％、好ましくは０．００２〜２重量％、特に好ましくは０．００３〜１重量％の本発明のセルラーゼを含み得、０．０００５〜０．５重量％、例えば、０．０００５〜０．０５重量％の範囲も好ましい。
【００３６】
本発明のセルラーゼは、従来の安定化剤、例えば、ポリオール、例えば、プロピレングリコールまたはグリセロール、糖または糖アルコール、乳酸、ホウ酸またはホウ酸誘導体、例えば、芳香族ホウ酸エステル、またはフェニルボロン酸誘導体、例えば、４−ホルミルフェニルボロン酸、ペプチドアルデヒドまたはケトンを用いて安定化され得る。
【００３７】
好ましい実施形態において、前記組成物はシェーディング染料を含む。好ましくは、シェーディング染料は青またはバイオレットシェーディング染料である（他の色相も本発明の範囲内であるが）。青またはバイオレットシェーディング染料の使用は、白色度および／または清浄度（ｃｌｅａｎｎｅｓｓ）の知覚を高め得る。
【００３８】
好適なシェーディング染料は、国際公開第２０１１／０４７９８７号に記載されており、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００３９】
好ましくは、シェーディング染料は、ポリマーと共有結合する反応性染料である。より好ましくは、前記ポリマーはポリイミンであり、任意ではあるが好ましくは、ポリイミンは、２−ヒドロキシプロパン−１−イル基で置換されている。
【００４０】
シェーディング染料は、好ましくは、次式
【００４１】
【化１】
2020513820.tif 000003
（式中、−−−−は結合点を表す）
の発色団を含み得る。
【００４２】
例示的および好ましいシェーディング染料は、ＵＢ４０であり、以下の構造
【００４３】
【化２】
2020513820.tif 000004
を有する。
【００４４】
場合によっては、シェーディング染料は、好ましくは直接染料、例えば、アジン染料である。
【００４５】
好適なアジン染料は、国際公開第２００８／０１７５７０号に記載されており、その内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【００４６】
場合によっては、染料は好ましくはＡＶ５０であり、以下の構造
【００４７】
【化３】
2020513820.tif 000005
を有する。
【００４８】
シェーディング染料は、好ましくは、０．０００１〜１重量％、より好ましくは０．０００１〜０．１重量％、さらにより好ましくは０．０００１〜０．０１重量％、最も好ましくは０．０００５〜０．００１重量％の量で組成物中に存在する。
【００４９】
好ましい実施形態において、前記組成物は、０．１〜８０重量％、好ましくは１〜７０重量％、より好ましくは２〜６０重量％、特に好ましくは４〜４０重量％、さらにより好ましくは５〜３５重量％および最も好ましくは６〜３３重量％の界面活性剤を含む。
【００５０】
好適な界面活性剤は、「Ｓｕｒｆａｃｅ  Ａｃｔｉｖｅ  Ａｇｅｎｔｓ」、第１巻、Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ＆  Ｐｅｒｒｙ著、Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  １９４９、第２巻、Ｓｃｈｗａｒｔｚ，  Ｐｅｒｒｙ  ＆  Ｂｅｒｃｈ著、Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  １９５８、Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｃｏｎｆｅｃｔｉｏｎｅｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ刊行「ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ’ｓ  Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ」の最新版または「Ｔｅｎｓｉｄｅ−Ｔａｓｃｈｅｎｂｕｃｈ」、Ｈ．  Ｓｔａｃｈｅ、第２版、Ｃａｒｌ  Ｈａｕｓｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、１９８１またはＨｅｌｍｕｔ  Ｗ．  Ｓｔａｃｈｅ著のＡｎｉｏｎｉｃ  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ：  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  １９９６）に記載されている界面活性剤から選択され得る。
【００５１】
好ましい実施形態において、本発明の組成物は、約８〜約２２個の炭素原子を含有するアルキル基を有する有機スルフェートおよびスルホネートの水溶性アルカリ金属塩から好ましくは選択される少なくとも１つのアニオン洗浄剤化合物（またはアニオン界面活性剤）を含み、用語アルキルは、高級アルキル基のアルキル部分を含むように用いられる。
【００５２】
好適な合成アニオン洗浄剤化合物の例としては、アルキル硫酸ナトリウムおよびカリウム、とりわけ、例えば、獣脂またはヤシ油から製造される高級Ｃ８〜Ｃ１８アルコールを硫酸化することにより得られるもの、アルキルエーテルカルボン酸；アルキルＣ９〜Ｃ２０ベンゼンスルホン酸ナトリウムおよびカリウム、特に直鎖二級アルキルＣ１０〜Ｃ１５ベンゼンスルホン酸ナトリウム；ならびにアルキルグリセリルエーテル硫酸ナトリウム、とりわけ、獣脂またはヤシ油由来の高級アルコールおよび石油由来の合成アルコールのエーテル、好ましくは直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩から選択されるもの；アルキル硫酸塩；アルキルエーテル硫酸塩；アルキルエーテルカルボン酸塩；石鹸；アルキル（好ましくはメチル）エステルスルホン酸塩、ならびにこれらの混合物がある。平均１〜３ＥＯ（エトキシレート）単位のＣ１２〜Ｃ１４ｎ−アルキルエーテル硫酸塩などのアルキルエーテル硫酸塩が特に好ましい。ラウリルエーテル硫酸ナトリウム（ＳＬＥＳ）は特に好ましい。好ましくは、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩は、Ｃ１１〜Ｃ１５アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウムである。好ましくは、アルキル硫酸塩は直鎖または分岐のＣ１２〜Ｃ１８アルキル硫酸ナトリウムである。ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ、また第１級アルキル硫酸塩としても公知）が特に好ましい。
【００５３】
好ましい実施形態において、２つ以上のアニオン洗浄剤化合物、例えばアルキルエーテル硫酸塩とともに直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩、が組成物中に存在する。
【００５４】
特に好ましい実施形態において、アニオン洗浄剤化合物は、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩；アルキル硫酸塩；アルキルエーテル硫酸塩；およびこれらの混合物から選択される。
【００５５】
前記組成物は、アニオンおよび／または非イオン洗浄剤化合物（界面活性剤）を含み得る。
【００５６】
好ましい実施形態において、前記組成物は、脂肪族疎水性基および反応性水素原子を有する化合物、例えば、脂肪族アルコール、酸またはアミドと、とりわけ、エチレンオキシド単独との反応生成物、またはエチレンオキシドおよびプロピレンオキシドとの反応生成物から好ましくは選択される少なくとも１つの非イオン洗浄剤化合物（または界面活性剤）を含有する。具体的な非イオン洗浄剤化合物は、脂肪族Ｃ８〜Ｃ１８第１級または第２級直鎖または分岐アルコールとエチレンオキシドとの縮合生成物である。
【００５７】
好ましくは、アルキルエトキシル化非イオン界面活性剤は、７ＥＯ〜９ＥＯ単位の平均エトキシル化度を有するＣ８〜Ｃ１８第１級アルコールである。
【００５８】
非イオン界面活性剤が存在する場合、最も好ましくは、前記の非イオン界面活性剤は、アルコールエトキシレート、より好ましくは平均３〜１０モルのエチレンオキシドを有するＣ１０〜Ｃ１８アルコールエトキシレート、最も好ましくは平均５〜９モルのエチレンオキシドを有するＣ１２〜１５アルコールエトキシレートである。
【００５９】
特に好ましい実施形態において、本発明の組成物は、好ましくは直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩を含むアニオン界面活性剤および非イオン界面活性剤を含む、４〜４０重量％、より好ましくは５〜３５重量％、最も好ましくは６〜３３重量％の界面活性剤からなる、界面活性剤組成物を含む。この好ましい界面活性剤混合物において、最も好ましくは、非イオン界面活性剤とアニオン界面活性剤との重量分率は＜０．５、例えば、０．１〜＜０．５である。これは、アニオン界面活性剤のレベルが、洗浄剤組成物中の非イオン界面活性剤のレベルを超えることが好ましいことを意味する。
【００６０】
好ましい実施形態において、本発明の組成物は、好ましくは香料を含む。好ましくは、香料は、α−イソメチルイオノン、サリチル酸ベンジル；シトロネロール；クマリン；ヘキシルシンナマル；リナロール；ペンタン酸、２−メチル−、エチルエステル；オクタナール；酢酸ベンジル；１、６−オクタジエン−３−オール、３，７−ジメチル−、３−アセテート；シクロヘキサノール、２−（１，１−ジメチルエチル）−、１−アセテート；δ−ダマスコン；β−イオノン；酢酸ベルジル（ｖｅｒｄｙｌ  ａｃｅｔａｔｅ）；ドデカナール；ヘキシルシンナムアルデヒド；シクロペンタデカノリド；ベンゼン酢酸、２−フェニルエチルエステル；サリチル酸アミル；β−カリオフィレン；ウンデシレン酸エチル；アントラニル酸ゲラニル；α−イロン；安息香酸β−フェニルエチル；α−サンタロール；セドロール；酢酸セドリル；ギ酸セドリル；サリチル酸シクロヘキシル；ガンマ−ドデカラクトン；ならびに酢酸βフェニルエチルフェニルからの少なくとも１つのノート（化合物）を含む。
【００６１】
好ましい実施形態において、本発明の組成物は、好ましくは蛍光剤（蛍光増白剤）を含む。蛍光剤は周知であり、このような蛍光剤は数多く市販されている。通常、これらの蛍光剤は、それらのアルカリ金属塩、例えば、ナトリウム塩の形態で供給され、用いられる。
【００６２】
好ましいクラスの蛍光体としては、ジスチリルビフェニル化合物、例えば、Ｔｉｎｏｐａｌ（商標）ＣＢＳ−Ｘ、ジアミンスチルベンジスルホン酸化合物、例えば、Ｔｉｎｏｐａｌ  ＤＭＳ  ｐｕｒｅ  ＸｔｒａおよびＢｌａｎｋｏｐｈｏｒ（商標）ＨＲＨ、およびピラゾリン化合物、例えば、Ｂｌａｎｋｏｐｈｏｒ  ＳＮがある。
【００６３】
好ましい蛍光体としては、２（４−スチリル−３−スルホフェニル）−２Ｈ−ナフトール［１，２−ｄ］トリアゾールナトリウム、４，４’−ビス｛［（４−アニリノ−６−（Ｎメチル−Ｎ−２ヒドロキシエチル）アミノ１，３，５−トリアジン−２−イル）］アミノ｝スチルベン−２−２’ジスルホン酸二ナトリウム、４，４’−ビス｛［（４−アニリノ−６−モルホリノ−１，３，５−トリアジン−２−イル）］アミノ｝スチルベン−２−２’ジスルホン酸二ナトリウム、および４，４’−ビス（２−スルホスチリル）ビフェニル二ナトリウムがある。
【００６４】
前記組成物中で用いられる蛍光剤（複数可）の総量は、好ましくは０．０００１〜０．５重量％、より好ましくは０．００５〜２重量％、最も好ましくは０．０５〜０．２５重量％、である。
【００６５】
好ましい実施形態において、本発明の組成物は、好ましくは少なくとも１つのさらなる酵素を含む。存在する場合、本発明の洗濯組成物中の各酵素のレベルは、０．０００１重量％〜０．１重量％、好ましくは０．００５〜０．１重量％である。さらなる酵素は、好ましくは、プロテアーゼ、α−アミラーゼ、他のセルラーゼ（出願された特許請求の範囲により定義される本発明において特定されるもの以外のセルラーゼ）、リパーゼ、ペルオキダーゼ／オキシダーゼ、ペクテートリアーゼ、マンナナーゼまたはこれらの混合物の群から選択される。
【００６６】
特定の好ましい実施形態において、少なくとも１つのさらなる酵素は、プロテアーゼ、α−アミラーゼおよびリパーゼから選択される。
【００６７】
好ましい実施形態において、本発明の組成物は、好ましくは、好ましくはカルシウム金属イオン封鎖材（ｃａｌｃｉｕｍ  ｓｅｑｕｅｓｔｒａｎｔ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ）、沈殿材、カルシウムイオン交換材およびこれらの混合物から選択される、少なくとも１つのビルダーを含む。
【００６８】
好ましいカルシウム金属イオン封鎖ビルダー材には、アルカリ金属ポリリン酸塩、例えば、トリポリリン酸ナトリウム、および有機金属イオン封鎖剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸が含まれる。
【００６９】
好ましい沈殿ビルダー材には、オルトリン酸ナトリウムおよび炭酸ナトリウムが含まれる。
【００７０】
好ましいカルシウムイオン交換ビルダー材には、各種の水不溶性の結晶質または非晶質アルミノシリケートが含まれ、そのうちゼオライトは、周知の代表例であり、例えば、ゼオライトＡ、ゼオライトＢ（ゼオライトＰとしても公知）、ゼオライトＣ、ゼオライトＸ、ゼオライトＹ、およびまたＥＰ−Ａ−０，３８４，０７０号に記載のＰ型ゼオライトがある。
【００７１】
好ましい実施形態において、本発明の組成物は、好ましくは、０．００１〜６５重量％、好ましくは０．０１〜５０重量％、さらに好ましくは０．１〜３５重量％および最も好ましくは０．５〜３０重量％のビルダーまたは錯化剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、アルキル−もしくはアルケニルコハク酸またはニトリロ三酢酸を含む。
【００７２】
好ましくは、洗濯洗浄調製物（ｌａｕｎｄｒｙ  ｃｌｅａｎｉｎｇ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）は、無ホスフェート製（ｎｏｎ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｉｌｔ）の洗濯洗浄剤配合物であり、すなわち、１重量％未満、好ましくは０．８重量％未満、さらに好ましくは０．５重量％未満のホスフェートを含有し、そこで０．００１〜５重量％および０．００１〜１重量％の範囲も好ましい。
【００７３】
好ましい実施形態において、本発明の組成物は、好ましくは１つ以上のポリマーを含む。ポリマーの例としては、ポリエチレンイミン、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルピリジン−Ｎ−オキシド）、ポリ（ビニルイミダゾール）、カルボキシメチルセルロース、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリカルボキシレート、例えば、ポリアクリレート、マレイン／アクリル酸コポリマー、およびラウリルメタクリレート／アクリル酸コポリマーがある。好ましいポリマーはポリエチレンイミンである。
【００７４】
本発明はまた、布を、本出願内で定義される組成物を含む水溶液と接触させることを含む、白色布を洗濯する方法に関する。好ましい実施形態において、布と水溶液との接触は、６０℃以下、５０℃以下、４０℃以下、３０℃以下、好ましくは２５℃以下および最も好ましくは２２℃以下で行われる。
【００７５】
本明細書に記載されるように、本発明の組成物中のセルラーゼは、より高い温度で安定であり得るが、より低い温度で良好な活性を示す。より低い温度での洗浄は、環境に優しく、安価であり、典型的には布およびトリムを損傷する可能性が低いので好ましいであろう。
【００７６】
例
以下、本発明を以下の例および図面により説明する。例および図面は、例示的であって、本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】例４の結果を示す：配列番号１および配列番号１１のｄＬ＊値の比較。
【図２】例５の結果を示す：異なるセルラーゼ変異体を適用すると、異なったＬ＋−値となり、本発明のセルラーゼ配列番号１５、配列番号１３および配列番号１７のＡＲＤ効果が様々であることを示している。
【図３】例６の結果を示す：カーペット汚れについてＣｅｌｌｕｃｌｅａｎ（登録商標）と比較した配列番号１１のＡＲＤ洗浄活性。
【図４】例８の結果を示す：２０℃で０．６２５ｍｇ／Ｌの濃度で配列番号１１を適用すると、ｄＬ＊値が４．５になった。
【図５】例９の結果を示す：配列番号１１の温度最適条件。
【図６】例１０の結果を示す：配列番号１１のｐＨ最適条件。
【図７】例１１の結果を示す：配列番号１１の熱安定性。
【図８】例１２の結果を示す：配列番号１１、Ｃｅｌｌｕｃｌｅａｎ（登録商標）および／またはＡＶ５０のｄＬ＊値の比較。
【図９】例１３の結果を示す：複数の機械洗浄試験での白色度効果の持続性。
【００７８】
例１：ピチア・パストリス中のセルラーゼのセルラーゼ発現
タンパク質の発現のために（以下の方法は、例として配列番号１５および配列番号１について言及している）、最初に、対応する遺伝子（配列番号２および配列番号１６）を標準ベクターにクローン化した。したがって、２つの遺伝子を、オーバーハングとして制限部位を有するプライマーでＰＣＲ増幅した。ＫｐｎＩおよびＸｂａＩで消化したＰＣＲ産物およびベクター（ｐＧＡＰＺα  Ａ、ｐＰＩＣＺα  Ａ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））を供給業者のマニュアルに従ってライゲートした。得られたベクターを表１に列挙する。
【００７９】
【表１】
2020513820.tif 000006
【００８０】
ＢｇｌＩでの直線化後、ベクターを、供給業者のマニュアルに従ってＸ−３３株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））に形質転換した。各プラスミドに対して９６個の形質転換体を、ディープウェルプレートで高タンパク質産物についてスクリーニングした。各形質転換体系列から、上位５位から１０位までのクローンを、検証のため３００ｍｌの振とうフラスコ（１％グリセロールを含む５０ｍｌのＹＰ基本培地；２７℃、２５０ｒｐｍ、湿度８０％；４０時間、４８時間、６６時間および７２時間後グリセリンまたはメタノールを２ｍｌショット；９６時間後採取）で培養した。最後に、タンパク質の活性を、Ａｚｏ−ＣＭＣアッセイ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ、アイルランド）で決定した。
【００８１】
例２：標的バンドのゲル定量化による酵素濃度の決定
配列番号１、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５および配列番号１７の発酵上清を、外部タンパク質の較正曲線を用いたインハウスのＳＤＳゲル定量化法により定量化した。酵素試料を、ＳＤＳゲルにアプライし、その後、Ｓｙｐｒｏ  Ｒｕｂｙ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ：Ｓ１２０００）で染色した。ゲル画像を、標準Ｂｉｏ−Ｒａｄゲルドキュメンテーション装置（ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ｇｅｌ  ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）で記録した。画像分析を、ＩｍａｇｅＬａｂソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて行った。同じＳＤＳゲル（例えば、ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン）上の外部タンパク質の較正曲線を用いて標的タンパク質特異的ＳＤＳゲルバンドのシグナルを積分することにより、タンパク質濃度を決定した。
【００８２】
例３：特異的酵素活性を用いた発酵上清中のセルラーゼ定量化
配列番号１および配列番号１１をＮｉ−ＮＴＡ精製により均質になるまで精製し、次いで、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５１０／３００ＧＬカラムを用いてサイズ排除クロマトグラフィーを行った。タンパク質配列を、インタクト質量測定およびＮ末端配列決定により実験的に決定した。実験的に決定したタンパク質配列から計算したモル吸光係数を用いて、ＵＶ２８０シグナル検出を含むＨＰＬＣにより、均質な試料のタンパク質定量化を行った。簡単に言うと、ＨＰＬＣランを以下のように行った。タンパク質を、末端を密閉したＮｕｃｌｅｏｓｉｌ  Ｃ４カラムに施し、緩衝液Ａ（水９０％、アセトニトリル１０％、ＴＦＡ０．１％）および緩衝液Ｂ（アセトニトリル１００％、ＴＦＡ０．１％）の直線勾配により溶出した。ピークＵＶ２８０シグナルを積分し、タンパク質濃度を計算した。精製した配列番号１および配列番号１１の試料、または粗タンパク質上清の容積酵素活性を、変更された９６ウェル対応Ｃｅｌｌａｚｙｍｅ（登録商標）Ｃアッセイ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ）を用いて測定した。サイズ排除クロマトグラフィー精製した配列番号１および配列番号１１の比活性およびモル活性を使用して、粗発酵上清中の標的タンパク質濃度を計算した。
【００８３】
例４：セルラーゼのＡＲＤ（再汚染防止）洗浄活性
セルラーゼの活性を、ターゴトメータースケール（Ｔｅｒｇｏｔｏｍｅｔｅｒ  ｓｃａｌｅ）でＡＲＤ洗浄試験で試験した。白色綿試験片（ｓｗａｔｃｈｅｓ）（Ｔ４６０−４０、Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  ｔｅｓｔｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｂ．Ｖ．３１３３ＫＴ  Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ、オランダ）を、４０℃にて８００ｍＬ中で２０分間４回洗浄した。洗浄液は、規定されたフランス硬度２７、Ｃａ：Ｍｇ  ２：１の水中で１．５ｇ／Ｌの使用量の洗浄剤ＡＡＴＣＣ  ＷＯＢ９３からなっていた。各洗浄サイクルに対して、カーボンブラックおよびオリーブ油で汚れた８個の新しい綿試験片（８×１０ｃｍ；１０１  Ｓｗｉｓｓａｔｅｓｔ  Ｔｅｓｔｍａｔｅｒｉａｌｉｅｎ  ＡＧ、９０１５  Ｓｔ  Ｇａｌｌｅｎ、スイス）を、汚れバラスト（ｂａｌｌａｓｔ）として添加した。綿布８０Ａおよび１０Ａ（ｗｆｋ  Ｔｅｓｔｇｅｗｅｂｅ  ＧｍｂＨ、４１３７９  Ｂｒｕｅｇｇｅｎ、ドイツ）をバラストとして添加することにより、液とクロスとの比（ｌｉｑｕｏｒ  ｃｌｏｔｈ  ｒａｔｉｏ）を２５に設定した。繊維の空気乾燥後、白色綿試験片のＬ＊ａ＊ｂ＊値をＤ６５，１０°の分光光度計（ＣｏｌｏｒＦｌｅｘ  ＥＺ、Ｈｕｎｔｅｒｌａｂ）を用いて記録した。供給された白色基準で測定前に装置を較正した。セルラーゼで処理した綿試験片のＬ＊から、酵素なしのブランク対照のＬ＊を引くことにより、ｄＬ＊値を計算した。ｄＬ＊は布の白色度を反映し、したがって、ｄＬ＊が高ければ高いほど、酵素のＡＲＤ効果が高いことを示している。酵素を、ｍｇの活性酵素タンパク質（ＡＥＰ）として分注した。各調製物のＡＥＰ含有量を特定の酵素活性に基づいて計算した。タンパク質定量化を例３に記載するように行った。酵素調製物の使用量は、洗浄液１リットルあたり０．６２５ｍｇの活性酵素タンパク質であり、対照試料は酵素を含有していなかった。
【００８４】
結果を図１に示す。同じタンパク質濃度の酵素を適用すると、配列番号１と比較して（２．９４）、配列番号１１のｄＬ＊値はより高くなり（３．８５）、配列番号１１のＡＲＤ効果が高まったことを示している。
【００８５】
例５：セルラーゼバリアントのＡＲＤ（再汚染防止）洗浄活性
セルラーゼの活性をターゴトメータースケールでＡＲＤ洗浄試験で試験した。白色綿試験片（Ｔ４６０−４０、Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  ｔｅｓｔｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｂ．Ｖ．３１３３ＫＴ  Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ、オランダ）を、４０℃にて８００ｍＬ中で２０分間４回洗浄した。洗浄液は、規定されたフランス硬度２７、Ｃａ：Ｍｇ  ２：１の水中で１．５ｇ／Ｌの使用量の洗浄剤ＡＡＴＣＣ  ＷＯＢ９３からなっていた。各洗浄サイクルに対して、カーボンブラックおよびオリーブ油で汚れた８個の新しい綿試験片（８×１０ｃｍ；１０１  Ｓｗｉｓｓａｔｅｓｔ  Ｔｅｓｔｍａｔｅｒｉａｌｉｅｎ  ＡＧ、９０１５  Ｓｔ  Ｇａｌｌｅｎ、スイス）を、汚れバラストとして添加した。綿布８０Ａおよび１０Ａ（ｗｆｋ  Ｔｅｓｔｇｅｗｅｂｅ  ＧｍｂＨ、４１３７９  Ｂｒｕｅｇｇｅｎ、ドイツ）をバラストとして添加することにより、液とクロスとの比を２５に設定した。繊維の空気乾燥後、白色綿試験片のＬ＊ａ＊ｂ＊値をＤ６５，１０°の分光光度計（ＣｏｌｏｒＦｌｅｘ  ＥＺ、Ｈｕｎｔｅｒｌａｂ）を用いて記録した。供給された白色基準で測定前に装置を較正した。セルラーゼで処理した綿試験片のＬ＊から、酵素なしのブランク対照のＬ＊を引くことにより、ｄＬ＊値を計算した。ｄＬ＊は布の白色度を反映し、したがって、ｄＬ＊が高ければ高いほど、酵素のＡＲＤ効果が高いことを示している。酵素を、ｍｇの活性酵素タンパク質（ＡＥＰ）として分注した。各調製物のＡＥＰ含有量をタンパク質定量化のためにアプライしたＳＤＳ−ＰＡＧＥ（例２）に基づいて計算した。酵素調製物の使用量は、洗浄液１リットルあたり１．５ｍｇの活性酵素タンパク質であり、対照試料は酵素を含有していなかった。
【００８６】
結果を図２に示す。異なるセルラーゼバリアントを適用すると、異なったＬ＋−値となり、これはセルラーゼバリアントのＡＲＤ効果が異なることを示している。
【００８７】
例６：カーペット汚れでの酵素のＡＲＤ（再汚染防止）洗浄活性
セルラーゼの洗浄活性をターゴトメータースケールでＡＲＤ洗浄試験で試験した。白色綿試験片（Ｔ４６０−４０、Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  ｔｅｓｔｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｂ．Ｖ．３１３３ＫＴ  Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ、オランダ）を、３５℃にて８００ｍＬ中で２０分間７回洗浄した。洗浄液は、規定されたフランス硬度２６、Ｃａ：Ｍｇ  ２：１の水中で２ｇ／Ｌの使用量の洗浄剤ＡＡＴＣＣｌｉｑＤからなっていた。綿布８０Ａおよび１０Ａ（ｗｆｋ  Ｔｅｓｔｇｅｗｅｂｅ  ＧｍｂＨ、４１３７９  Ｂｒｕｅｇｇｅｎ、ドイツ）をバラストとして添加することにより、液とクロスとの比を２９に設定した。汚れとして、１０ｇ／Ｌのカーペット汚れｗｆｋ０９Ｗ（ｗｆｋ  Ｔｅｓｔｇｅｗｅｂｅ  ＧｍｂＨ、４１３７９Ｂｒｕｅｇｇｅｎ、ドイツ）を洗浄液に各洗浄サイクルで添加した。
【００８８】
酵素を０．６２５ｍｇ／Ｌ（ＡＥＰ；活性タンパク質；例２）の濃度で分注した。繊維の空気乾燥後、白色綿試験片のＬ＊ａ＊ｂ＊値をＤ６５，１０°の分光光度計（ＣｏｌｏｒＦｌｅｘ  ＥＺ、Ｈｕｎｔｅｒｌａｂ）を用いて記録した。供給された白色基準（Ｈｕｎｔｅｒｌａｂ）で各測定前に装置を毎日較正した。セルラーゼで処理した綿試験片のＬ＊から、酵素なしのブランク対照のＬ＊を引くことにより、ｄＬ＊値を計算した。ｄＬ＊は布の白色度を示し、したがって、ｄＬ＊が高ければ高いほど、酵素のＡＲＤ効果が高いことを示している。
【００８９】
結果を図３に示す。配列番号１１は、酵素処理なしで洗浄した布と比較して、約２のｄＬ＊であり、正のＡＲＤ効果を示している。一方でＣｅｌｌｕｃｌｅａｎ（登録商標）５０００Ｌは、カーペット汚れに対して平均して最小限の負のＡＲＤ洗浄効果を示している。
【００９０】
例７：液体洗浄剤用途でのセルラーゼのＬａｕｎｄｅｒ−Ｏ−ｍｅｔｅｒ試験
試験を国際公開第２０１６０６６８９６号）に開示されているように行った。セルラーゼ（配列番号１１）を、例１に記載したようにピチア・パストリス中で産生し、４０℃のＡＡＴＣＣｌｉｑ洗浄剤でそれらの性能を試験した。使用した綿繊維を代表するモニターＥ−２５３を、毛玉除去効果を実証するために使用した。試験布を、各色（黒、赤、緑、青）の全幅ストライプを含有する試験片（約２９ｃｍ×１５〜１６．５ｃｍ、２つの試験片の総重量約２４ｇ）に切断した。
【００９１】
セルラーゼ処理を、Ａｔｌａｓ  ＬＰ−２  Ｌａｕｎｄｅｒ−Ｏ−ｍｅｔｅｒ（ＳＤＳ  Ａｔｌａｓ、Ｒｏｃｋ  Ｈｉｌｌ、ＳＣ２９７３２、ＵＳＡ）で以下のように行った。最初に、Ｌａｕｎｄｅｒ−Ｏ−ｍｅｔｅｒを４０℃に予熱した。その後、６０ｇの鋼球（直径０．６ｃｍ）および２４０ｍｌの洗浄液および希釈した酵素（＜１．０ｍｌ）を１．２リットル容器に添加した。その後、Ｅ−２５３の１つの試験片を容器に入れ、Ｌａｕｎｄｅｒ−Ｏ−ｍｅｔｅｒを４０℃で６０分間作動させた。
【００９２】
酵素をｍｇの活性酵素タンパク質（ＡＥＰ）として分注した。各調製物のＡＥＰ含有量をタンパク質定量化のためにアプライしたＳＤＳ−ＰＡＧＥ（例２）に基づいて計算した。酵素調製物の使用量は、洗浄液１リットルあたり０．４ｍｇの活性酵素タンパク質であり、対照試料は酵素を含有していなかった。洗浄液は合成水道水（１６°ｄＨ）１リットルあたり５ｇのＡＡＴＣＣｌｉｑを含有していた。硬度１６°ｄＨの合成水道水の調製物を、例４において国際公開第２０１６０６６８９６号に記載されているように調製した。Ｌａｕｎｄｅｒ−Ｏ−ｍｅｔｅｒでのセルラーゼ処理後、最初に上記試験片を個別に流水で洗い流し（周囲温度約２０℃）、次いで脱水機（ＴＨＯＭＡＳ，Ｎｅｕｋｉｒｃｈｅｎ；型：７７６ＳＥＬ２０２）で５分間乾燥した。
【００９３】
Ｌ＊ａ＊ｂ＊色空間座標を用いて分光光度計（ＣｏｌｏｒＦｌｅｘＥＺ、Ｈｕｎｔｅｒｌａｂ）で反射率値として色を測定することにより、洗浄剤用途でのセルラーゼの性能を評価した。試験モニターの各４つのストライプの色を、５回の洗浄サイクル後測定した。セルラーゼなしでの処理と比較した明度（Ｌ＊）の低下、すなわち、暗度の増加を、セルラーゼ効果の指標として使用した。ヤーンから突出し、毛玉を形成し、布を灰色がかったように見せる表面繊維およびフィブリルがセルラーゼにより除去されたとき、布の明度が低下し、布の表面が暗く見え、色が明るくなる（国際公開第２０１６０６６８９６号）。
【００９４】
セルラーゼの性能を例４において国際公開第２０１６０６６８９６号に従って計算した。モニターの４つの試験ストリップすべてのＬ＊値の合計は、負（−２．５０）になると思われた。上記のように、負のＬ＊値は、ヤーンから突出し、毛玉を形成し、布を灰色がかったように見せる繊維およびフィブリルの除去を示している。また、分光光度的結果も、視覚評価により確認した。
【００９５】
例８：２０℃でのセルラーゼのＡＲＤ（再汚染防止）洗浄活性
配列番号１１の活性を、２０℃にてターゴトメータースケールでＡＲＤ洗浄試験で試験した。白色綿試験片（ＷＫ０５、ｗｆｋ  Ｔｅｓｔｇｅｗｅｂｅ  ＧｍｂＨ、４１３７９  Ｂｒｕｅｇｇｅｎ、ドイツ）を、２０℃にて８００ｍＬ中で２０分間洗浄した。洗浄液は、規定されたフランス硬度２６、Ｃａ：Ｍｇ  ２：１の水中で０．７２ｇ／Ｌの使用量の洗浄剤ＩＫＥＡ１２からなっていた。各洗浄サイクルに対して、０．０４ｇ／Ｌを添加した。
ＩＫＥＡ１２の組成物
【００９６】
【表２】
2020513820.tif 000007
【００９７】
綿織布をバラストとして添加することにより、液とクロスとの比を３３に設定した。繊維を２５℃；湿度１０％で一晩乾燥した後、白色綿試験片のＬ＊ａ＊ｂ＊値を、Ｄ６５，１０°の分光光度計（ＣｏｌｏｒＦｌｅｘ  ＥＺ、Ｈｕｎｔｅｒｌａｂ）で記録した。供給された白色基準で測定前に装置を較正した。セルラーゼで処理した綿試験片のＬ＊から、酵素なしのブランク対照のＬ＊を引くことにより、ｄＬ＊値を計算した。ｄＬ＊は布の白色度を反映し、したがって、ｄＬ＊が高ければ高いほど、酵素のＡＲＤ効果が高いことを示している。酵素を、ｍｇの活性酵素タンパク質（ＡＥＰ）として分注した。各調製物のＡＥＰ含有量を例２に記載する方法に基づいて計算した。酵素調製物の使用量は、洗浄液１リットルあたり０．６２５ｍｇの活性酵素タンパク質であり、対照試料は酵素を含有していなかった。
【００９８】
結果を図４に示す。０．６２５ｍｇ／Ｌの濃度の配列番号１１を適用すると、ｄＬ＊値は４．５になった。
【００９９】
例９：配列番号１１の温度最適条件の決定
温度最適条件を決定するために、１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５中の１００μＬ酵素溶液を１００μＬの１％カルボキシメチルセルロース水溶液と混合し、振とうしながら１０℃、２０℃、３０℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃、９０℃および９９℃で１０分間インキュベートした。反応混合物を９５℃で５分間インキュベートすることにより、反応を停止した。ｐ−ヒドロキシベンズ−ヒドラジドアッセイを用いて、遊離還元末端を測定することにより、活性を決定した。
【０１００】
還元末端の決定のために、０．５Ｍ  ＨＣｌ中の５％（ｗ／ｖ）ｐ−ヒドロキシベンズ−ヒドラジド原液を、０．５Ｍ  ＮａＯＨ中で１：３に希釈し、ｐ−ヒドロキシベンズ−ヒドラジド使用液を生成した。５０μＬの試料を１５０μＬの使用液と混合し、反応物を９５℃で５分間インキュベートした。４℃に冷却した後、４１０ｎｍの吸光度を決定し、グルコース較正曲線を用いて遊離還元末端を計算した。
【０１０１】
結果から、配列番号１１は、洗浄（ｃｌｅａｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｗａｓｈｉｎｇ）用途に適したすべての温度での活性を保証することが分かる。低温でも、２０％超の活性が維持される。
【０１０２】
例１０：配列番号１１のｐＨ最適条件の決定
ｐＨ最適条件を決定するために、酵素原液を、ｐＨ２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１および１２各々に調整した１２０ｍＭ  Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎユニバーサル緩衝液中で希釈した。１００μＬのこれらの希釈物を１００μＬの１％カルボキシメチルセルロース水溶液と混合し、振とうしながら７０℃で１０分間インキュベートした。反応混合物を９５℃で５分間インキュベートすることにより、反応を停止した。例９に記載したｐ−ヒドロキシベンズ−ヒドラジドアッセイを用いて、遊離還元末端を測定することにより、活性を決定した。
【０１０３】
結果から、配列番号１１は、広範なｐＨ範囲にわたって活性を保証し、洗浄および洗濯（ｗａｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｌｅａｎｉｎｇ）用途に適した高／塩基性ｐＨ値（最大ｐＨ９）で非常に良好な活性を依然として示すことが分かる。
【０１０４】
例１１：配列番号１１の温度最適条件およびｐＨ、ならびに熱安定性の決定
温度安定性を決定するために、１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５中の１００μＬの酵素溶液を、１０℃、２０℃、３０℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃、９０℃および９９℃で３０分間インキュベートした。溶液を４℃に冷却した。その後、１００μＬの１％カルボキシメチルセルロース水溶液を添加し、試料を５０℃で１０分間インキュベートした。４０μＬの１Ｍカルボン酸ナトリウム溶液を添加することにより、反応を停止した。例９に記載したｐ−ヒドロキシベンズ−ヒドラジドアッセイを用いて、遊離還元末端を測定することにより、活性を決定した。
【０１０５】
結果から、配列番号１１は、優れた温度安定性を保証し、広範な温度範囲に対して活性を示すことが分かる。
【０１０６】
例１２：ｄＬ＊に関する配列番号１１、Ｃｅｌｌｕｃｌｅａｎ（登録商標）および／またはＡＶ５０の比較および相乗効果の証明
ターゴトメーター洗浄試験
洗浄プロセスで使用した条件は以下の通りであった：
温度：２０℃
酵素濃度：０．６２５ｐｐｍ
製品使用量：０．７２ｇｐｌ  ＩＫＥＡ１２
汚れ使用量：０．０４ｇｐｌ  カーボンブラック
シェーディング染料使用量：０．００６％  ＡＶ５０
洗浄時間：１×２０分  洗浄
すすぎ時間：１×１０秒  すすぎ
【０１０７】
この例から、セルラーゼ配列番号１１とシェーディング染料（ＡＶ５０）との組み合わせは、配列番号１１、Ｃｅｌｌｕｃｌｅａｎ（登録商標）およびシェーディング染料により個別にもたらされる効果を超えるおよび上回る白色度という点で相乗効果をもたらすことが分かる。
【０１０８】
【表３】
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【０１０９】
セルラーゼ配列番号１１とシェーディング染料（ＡＶ５０）との組み合わせは、Ｃｅｌｌｕｃｌｅａｎ（登録商標）とシェーディング染料との組み合わせ（測定値が計算された白色度を下回る）と比較して、相乗的利益（測定値対計算値）をもたらすことが顕著である。結果を図８に示す。
【０１１０】
例１３：白色度効果の持続性
複数の機械洗浄試験
使用した綿モニターをＯＭＯパウダーで２０回洗浄することにより、事前にエイジングさせた。１、３、５、１０、１５、２０、２５および３０回洗浄の洗浄時点ごとに３つの複製を使用した。使用した汚れモニターは、３×Ｅ１０１モニターを含んでいた。布を、調製物＋／−Ｃｅｌｌｕｃｌｅａｎ（登録商標）およびＡＶ５０（シェーディング染料）の範囲で洗浄し、存在する酵素により、再汚染に何らかの改善があったか否かを評価した。試験に使用した機械は、Ａｓｉａｎ  ＴＬＡ４５Ｌであった。洗浄を４０℃、２６ＦＨ（２：１  Ｃａ：Ｍｇ）の４５Ｌの洗浄液で行った。使用したバラスト量は１．５ｋｇであった。
【０１１１】
【表４】
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【０１１２】
【表５】
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【０１１３】
この例からは、増強された白色度効果が、Ｃｅｌｌｕｃｌｅａｎ（登録商標）と比較して、セルラーゼ配列番号１１については何回もの（３０回）洗浄にわたって持続したことが分かる。効果は、エイジングさせた綿編物で示され、ベース調製物はＯＭＯパウダーであった。Δ４６０反射値で示された値は、未洗浄の布から標準化され、従ってこれらは負の値として与えられる。負の値が小さければ小さいほど、洗浄した布が、初期の未洗浄の値に近いことを意味する。図９は、以下の表からのいくつかの選択された結果（ＯＭＯ、ＯＭＯ＋Ｃｅｌｌｕｃｌｅａｎ（登録商標）およびＯＭＯ＋配列番号１１に関して）をグラフ形式で示している。
【０１１４】
本発明内で同定された配列
配列番号１：触媒ドメインモチーフ［ＳＴＡ］−Ｔ−Ｒ−Ｙ−［ＦＹＷ］−Ｄ−ｘ（５）−［ＣＡ］を含む配列
配列番号２：配列番号１に対応するヌクレオチド配列
配列番号３：炭水化物結合ドメイン
配列番号４：配列番号３に対応するヌクレオチド配列
配列番号５：リンカー配列
配列番号６：配列番号５に対応するヌクレオチド配列
配列番号７：リンカー配列
配列番号８：配列番号７に対応するヌクレオチド配列
配列番号９：好ましい触媒ドメインモチーフＴ−Ｔ−Ｒ−Ｙ−Ｗ−Ｄ−Ｃ−Ｃ−Ｋ−Ｐ−Ｓ−Ｃ
配列番号１０：配列番号９に対応するヌクレオチド配列
配列番号１１：本発明による好ましいセルラーゼ
配列番号１２：配列番号１１に対応するヌクレオチド配列
配列番号１３：本発明による好ましいセルラーゼ
配列番号１４：配列番号１３に対応するヌクレオチド配列
配列番号１５：本発明による好ましいセルラーゼ
配列番号１６：配列番号１５に対応するヌクレオチド配列
配列番号１７：本発明による好ましいセルラーゼ
配列番号１８：配列番号１７に対応するヌクレオチド配列
配列番号１９：好ましい炭水化物結合ドメインタグ
配列番号２０：配列番号１９に対応するヌクレオチド配列
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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