(57)【要約】  ヒト化ＣＸＣＲ３抗体、ならびにこの抗体を使用して、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）、特には初発Ｔ１Ｄ、および乾癬のようなＣＸＣＲ３関連障害を治療する方法を提供する。特定の実施形態では、抗ＣＸＣＲ３抗体は、ＣＸＣＲ３をその表面に発現する細胞に対するエフェクター機能を強化したヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体である。また、この抗体をコードする核酸配列、およびこの抗体を含む医薬組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔ細胞性自己免疫疾患を有する対象において、ＣＸＣＲ３を発現する細胞を枯渇させる方法における使用のための、重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）を含むヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体であって、
ａ）該ＨＣは、配列番号２５のアミノ酸配列を含み、該ＬＣは、配列番号１３５のアミノ酸配列を含み、
ｂ）該ＨＣは、配列番号２６のアミノ酸配列を含み、該ＬＣは、配列番号１３５のアミノ酸配列を含み、
ｃ）該ＨＣは、配列番号２７のアミノ酸配列を含み、該ＬＣは、配列番号１３５のアミノ酸配列を含み、
ｄ）該ＨＣは、配列番号１３９のアミノ酸配列を含み、該ＬＣは、配列番号１３５のアミノ酸配列を含み、
ｅ）該ＨＣは、配列番号３１のアミノ酸配列を含み、該ＬＣは、配列番号１３７のアミノ酸配列を含み、
ｆ）該ＨＣは、配列番号３２のアミノ酸配列を含み、該ＬＣは、配列番号１３７のアミノ酸配列を含み、
ｇ）該ＨＣは、配列番号３２のアミノ酸配列を含み、該ＬＣは、配列番号１３７のアミノ酸配列を含み、または
ｈ）該ＨＣは、配列番号１４０のアミノ酸配列を含み、該ＨＣは、配列番号１３７のアミノ酸配列を含む、
前記ヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体。
【請求項２】
Ｔ細胞性自己免疫疾患が、初発１型糖尿病である、請求項１に記載の使用のためのヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体。
【請求項３】
Ｔ細胞性自己免疫疾患が、乾癬である、請求項２に記載の使用のためのヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体。
【請求項４】
重鎖可変領域（ＶＨ）を有する重鎖（ＨＣ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を有する軽鎖（ＬＣ）を含むヒト化抗ヒトＣ−Ｘ−Ｃモチーフケモカイン受容体３（ＣＸＣＲ３）抗体であって、
ａ）該ＶＨおよびＶＬは、配列番号２０／２４、１８／２２、８０／１３０、８１／２４、８２／１３０、８２／２４、８３／１２６、８３／１３０、８３／２４、８４／１２６、８４／２４、８５／２４、８６／１２６、８７／１２６、８７／１３３、８７／２４、８８／２４、８９／２４、９０／１２６、９１／１２６、９１／１３０、９２／１３０、９２／２４、９３／１２６、９４／１２６、９５／１２６、９６／１２６、９７／１２６、９８／１２６、９９／１２６、１００／１２６、１０１／１２６、１０２／１２６、１０３／１２６、１０４／１２６、１０５／１２６、１０６／１２６、１０７／１２６、１０８／１２６、１０９／１２６、１１０／１２６、１１１／１２６、１２１／２４、１１３／１３０、１１３／２４、１１４／１３０、１１５／１２６、１１５／１３０、１１５／２４、１１６／１２６、１１６／１３０、１１６／２４、１１７／１２６、１１８／１２６、２０／１２３、２０／１２４、２０／１２５、２０／１２６、２０／１２７、２０／１２８、２０／１２９、２０／１３０、２０／１３１、２０／１３２、２０／１３３、２０／１３４、１１９／１２６、１２２／１２６および１２０／１３０からなる群から選択される配列対のアミノ酸配列をそれぞれ含み、
ｂ）該重鎖は、配列番号９、２、３、４、５、６、７、８、１０および１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域を含む、前記ヒト化抗ヒトＣ−Ｘ−Ｃモチーフケモカイン受容体３（ＣＸＣＲ３）抗体。
【請求項５】
ＶＨが、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、ＶＬが、配列番号２４のアミノ酸配列を含む、請求項４に記載のヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体。
【請求項６】
ＶＨが、配列番号１８のアミノ酸配列を含み、ＶＬが、配列番号２２のアミノ酸配列を含む、請求項４に記載のヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体。
【請求項７】
ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域が、配列番号２、９、１０および１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項５または６に記載のヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体。
【請求項８】
であって、
ａ）ＨＣは、配列番号２５のアミノ酸配列を含み、ＬＣは、配列番号１３５のアミノ酸配列を含み、
ｂ）ＨＣは、配列番号２６のアミノ酸配列を含み、ＬＣは、配列番号１３５のアミノ酸配列を含み、
ｃ）ＨＣは、配列番号２７のアミノ酸配列を含み、ＬＣは、配列番号１３５のアミノ酸配列を含み、
ｄ）ＨＣは、配列番号１３９のアミノ酸配列を含み、ＬＣは、配列番号１３５のアミノ酸配列を含み、
ｅ）ＨＣは、配列番号３１のアミノ酸配列を含み、ＬＣは、配列番号１３７のアミノ酸配列を含み、
ｆ）ＨＣは、配列番号３２のアミノ酸配列を含み、ＬＣは、配列番号１３７のアミノ酸配列を含み、
ｇ）ＨＣは、配列番号３２のアミノ酸配列を含み、ＬＣは、配列番号１３７のアミノ酸配列を含み、または
ｈ）ＨＣは、配列番号１４０のアミノ酸配列を含み、ＨＣは、配列番号１３７のアミノ酸配列を含む、
請求項４〜７のいずれか１項に記載のヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体。
【請求項９】
ＨＣが、フコース含量を減少させたヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域を含む、請求項４〜８のいずれか１項に記載のヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体。
【請求項１０】
グリコシル化阻害物質の存在下で培養された宿主細胞において生成される、請求項４〜８のいずれか１項に記載のヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体。
【請求項１１】
グリコシル化阻害物質が、キフネンシンである、請求項１０に記載のヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体。
【請求項１２】
請求項４〜１１のいずれか１項に記載のヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１３】
Ｔ細胞性自己免疫疾患を治療する方法における使用のための、請求項４〜１２のいずれか１項に記載のヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体、または請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
Ｔ細胞性自己免疫疾患が、初発１型糖尿病である、請求項１３に記載の使用のための、ヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体またはその医薬組成物。
【請求項１５】
Ｔ細胞性自己免疫疾患が、乾癬である、請求項１３に記載の、ヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体またはその医薬組成物。
【請求項１６】
ＣＸＣＲ３を発現する細胞を対象において枯渇させる方法における使用のための、請求項４〜１１のいずれか１項に記載のヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体、または請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
対象が、Ｔ細胞性自己免疫疾患を有する、請求項１６に記載の使用のための、ヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体またはその医薬組成物。
【請求項１８】
Ｔ細胞性自己免疫疾患が、初発１型糖尿病である、請求項１６に記載の使用のための、ヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体またはその医薬組成物。
【請求項１９】
Ｔ細胞による自己免疫疾患が、乾癬である、請求項１６に記載の使用のための、ヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体またはその医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１６年１２月２２日申請の米国仮特許出願第６２／４３７，８６７号および２０１７年１月２１日申請の欧州特許出願第１７３０５０４２．８号の利点を主張し、この全内容を参照により本明細書に組み入れる。
【０００２】
ヒト化抗ＣＸＣＲ３抗体、ならびに抗体を使用して、糖尿病の１型（１型糖尿病（ｔｙｐｅ  １  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ）；Ｔ１Ｄ）および乾癬のような、ＣＸＣＲ３のシグナル伝達と関連する障害を治療する方法を本明細書において提供する。
【背景技術】
【０００３】
１型糖尿病は、十分なインスリンを産生してグルコース恒常性を維持できないことを特徴とする。この障害は、自己免疫による膵β細胞の破壊によって生じると考えられている。１型糖尿病と関連する自己免疫は、自己反応性ＢとＴリンパ球の両方の関与を伴う。１型糖尿病の進行は、活性化Ｔ細胞が浸潤した膵島を明らかにする、Ｔ１Ｄ診断の前後に得られる組織生検から明らかとなるように、自己反応性Ｔ細胞により媒介されることがある（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７）。
【０００４】
１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）は、小児における最も一般的な慢性疾患のうちの１つであり、＜２０歳の若年者における、すべての糖尿病症例の≧８５％を占める（非特許文献８；非特許文献９）。懸念されることには、Ｔ１Ｄの発症において３％の年次増加が世界的に予想されており、毎年８６，０００人の若者が新規に診断されている（非特許文献１０）。
【０００５】
乾癬は、厚く銀色の鱗屑およびそう痒性で乾燥した赤い斑点を特徴とする、一般的で慢性的な皮膚疾患である。乾癬は、関節炎（乾癬性関節炎）として、またはこれを伴って現れることもある。乾癬は、免疫系の過活性Ｔ細胞によって生じるとも考えられている。
【０００６】
Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカイン受容体３（ＣＸＣＲ３）は、抗原を経験した（メモリー）エフェクターおよび活性化Ｔ細胞上に主に発現するケモカイン受容体であり、その主なリガンド：ＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）、ＣＸＣＬ１０（ＩＰ−１０）、およびＣＸＣＬ１１（Ｉ−ＴＡＣ）に反応して、このようなＴ細胞のサブセットを組織炎症部位に動員することに関与する。ＣＸＣＲ３およびＣＸＣＬ１０は、ヒトＴ１Ｄ患者において発現する（非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３）。このような患者において、ＣＸＣＬ１０は、膵島内の残存するインスリン産生ベータ細胞において発現する。ＣＸＣＲ３は、膵島を囲む、浸潤性のＴ細胞上に発現する。類似の発現パターンが、１型糖尿病マウスモデルである非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスにおいて再現されている（非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６）。
【０００７】
ＣＸＣＲ３は、真皮ＣＤ３＋リンパ球および形質細胞様樹状細胞により発現し、そのケモカインリガンドであるＣＸＣＬ１０およびＣＸＣＬ９は、乾癬病変において上方制御される（非特許文献１７；非特許文献１８）。
【０００８】
ＣＸＣＲ３はまた、特定の種類の炎症組織に存在する浸潤性のＴ細胞上で発現するが、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０およびＣＸＣＬ１１は、炎症病変の近くの細胞により産生されることが多い。
【０００９】
ＣＸＣＲ３の上方制御は、様々な自己免疫障害に関係づけられている。ＣＸＣＲ３発現は、ナイーブＴ細胞ではほとんどないが、抗原によって活性化されると上方制御される。ＣＸＣＲ３は、その主なリガンドに反応して、ヘルパー１Ｔ（Ｔｈ１）細胞を含め、これらの細胞を組織炎症部位に動員する。ランゲルハンス島内のベータ細胞は、ＣＸＣＬ９およびＣＸＣＬ１０を発現し（非特許文献１９）、膵臓に浸潤したＴ細胞は、ＣＸＣＲ３を発現する（非特許文献２０；非特許文献２１；非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１６）。Ｙｏｕｄらに対して与えられた特許文献１は、抗ＣＸＣＲ３抗体について述べている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第８，８６５，８７０号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｂｏｔｔａｚｚｏら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３１３：３５３〜６０（１９８５年）
【非特許文献２】Ｈａｎｎｉｎｅｎら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９０：１９０１〜１０（１９９２年）
【非特許文献３】Ｉｔｏｈら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９２：２３１３〜２２（１９９３年）
【非特許文献４】Ｉｍａｇａｗａら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５０：１２６９〜７３（２００１年）
【非特許文献５】Ｗｉｌｃｏｘら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１５５：１７３〜１８１（２００９年）
【非特許文献６】Ｒｏｗｅら、Ｓｅｍｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ  ３：２９〜４３（２０１１年）
【非特許文献７】Ｃｏｐｐｉｅｔｅｒｓら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０９：５１〜６０（２０１２年）
【非特許文献８】Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ．２００６年１０月；１１８（４）：１５１０〜８
【非特許文献９】Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｐｒａｃｔ．２００８年１１月；８２（２）：２４７〜５５
【非特許文献１０】Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ．２０１２年８月；５５（８）：２１４２〜７
【非特許文献１１】Ｕｎｏら、Ｅｎｄｏｃｒ  Ｊ  ５７：９９１〜９６（２０１０年）
【非特許文献１２】Ｒｏｅｐら、Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５９：３３８〜４３（２００３年）
【非特許文献１３】Ｔａｎａｋａら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５８：２２８５〜２２９１（２００９年）
【非特許文献１４】Ｍｏｒｉｍｏｔｏら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７３：７０１７〜２４（２００４年）
【非特許文献１５】Ｌｉら、Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  １１（３０）：４７５０〜２（２００５年）
【非特許文献１６】Ｓａｒｋａｒら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ６１（２）：４３６〜４６（２０１２年）
【非特許文献１７】Ｒｏｔｔｍａｎら、Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ  ８１（３）：３３５〜４７（２００１年）
【非特許文献１８】Ｃｈｅｎら、Ａｒｃｈ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  Ｒｅｓ  ３０２（２）：１１３〜２３（２０１０年）
【非特許文献１９】Ｆｒｉｇｅｒｉｏら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ８：１４１４〜２０（２００２年）
【非特許文献２０】Ｃｈｒｉｓｔｅｎら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７１：６８３８〜４５（２００３年）
【非特許文献２１】Ｖａｎ  Ｈａｌｔｅｒｅｎら、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ４８：７５〜８２（２００５年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
現在、Ｔ１Ｄに対する非インスリン治療の認められた選択肢はない。作用薬については、疾患の経過を変化させる可能性のあるＴ１Ｄおよび乾癬の治療について研究中である。それにもかかわらず、Ｔ１Ｄは、慢性疾患の顕著な重荷を抱えており、世界的に、主要な公衆衛生上の懸念であり続けている。Ｔ１Ｄ、乾癬およびＣＸＣＲ３関連障害の増悪を治療する、または減少させるための、さらなる作用薬の必要性が存在している。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
ヒトＣＸＣＲ３に特異的に結合するヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントを本明細書において提供する。特定の実施形態では、本明細書において提供する抗ＣＸＣＲ３抗体は、ＣＸＣＲ３を発現する細胞の枯渇を導く能力を有するか、またはこれらの抗ＣＸＣＲ３抗体を、ＣＸＣＲ３を発現する細胞の枯渇を導く能力を強化するように改変して、ＣＸＣＲ３関連疾患および障害を治療することができる。ＣＸＣＲ３に特異的に結合するヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントを投与することによりＴ１Ｄを治療する方法を本明細書において提供する。ＣＸＣＲ３に特異的に結合するヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントを投与することを含む、乾癬を治療するための方法を本明細書において提供する。
【００１４】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供するヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントは、少なくとも０．８８５（ＶＨのＤ領域の残基を除いたＶＨおよびＶＬ鎖のすべての残基と比較した場合）または少なくとも０．９５０（ＩＭＴＧにより特定されたものに限定したフレームワーク領域の残基と比較した場合）のジャーミナリティ（ｇｅｒｍｉｎａｌｉｔｙ）スコアを有する。いくつかの実施形態では、本明細書において提供するヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントは、少なくとも１×１０−９ＭのＫＤを有する。いくつかの実施形態では、本発明において提供するヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントは、７×１０−５１／Ｍｓ未満のｋｄを有する。いくつかの実施形態では、本発明において提供するヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントは、少なくとも０．８８５（ＶＨのＤ領域の残基を除いたＶＨおよびＶＬ鎖のすべての残基と比較した場合）または少なくとも０．９５０（ＩＭＴＧにより特定されたものに限定したフレームワーク領域の残基と比較した場合）のジャーミナリティスコア、および少なくとも１×１０−９ＭのＫＤを有する。いくつかの実施形態では、本発明において提供するヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントは、少なくとも０．８８５（ＶＨのＤ領域の残基を除いたＶＨおよびＶＬ鎖のすべての残基と比較した場合）または少なくとも０．９５０（ＩＭＴＧにより特定されたものに限定したフレームワーク領域の残基と比較した場合）のジャーミナリティスコア、少なくとも１×１０−９ＭのＫＤ、および７×１０−５１／Ｍｓ未満のｋｄを有する。
【００１５】
特定の実施形態では、特定の重鎖可変領域と対をなす特定の軽鎖可変領域を含むヒト化ＣＸＣＲ３抗体を提供する。特定の実施形態では、本明細書において提供するヒト化ＣＸＣＲ３抗体は、ヒトＣＸＣＲ３をその表面に発現する細胞に対するエフェクター機能の強化を付与する変異ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域を含む。
【００１６】
第１の態様では、重鎖可変領域（ＶＨ）を有する重鎖（ＨＣ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を有する軽鎖（ＬＣ）を含む、ヒト化抗ヒトＣ−Ｘ−Ｃモチーフケモカイン受容体３（ＣＸＣＲ３）抗体、またはその医薬製剤を本明細書において提供する。
【００１７】
第１の態様の一実施形態では、本明細書において提供するヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体の、ＶＨおよびＶＬは、表１に示す配列対のアミノ酸配列を含み、ＨＣは、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１のうちの任意の１つのアミノ酸配列を含むヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域をさらに含む。
【００１８】
【表１】
2020504744.tif 000002
【００１９】
第１の態様の別の実施形態では、本明細書において提供するヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体のＶＨは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号２４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域は、配列番号２または配列番号９または配列番号１０または配列番号１１のアミノ酸配列を含む。
【００２０】
第１の態様の別の実施形態では、本明細書において提供するヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体のＶＨは、配列番号１８のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号２２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域は、配列番号２または配列番号９または配列番号１０または配列番号１１のアミノ酸配列を含む。
【００２１】
第１の態様の他の実施形態では、本明細書において提供するヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体のＨＣおよびＬＣは、表２に示す配列番号対のアミノ酸配列を含む。
【００２２】
【表２】
2020504744.tif 000003
【００２３】
第１の態様の別の実施形態では、本明細書において提供するヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体のＨＣは、フコース含量を減少させたヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域を含む。いくつかの実施形態では、提供するヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体は、グリコシル化阻害物質を含む培地で培養した宿主細胞において産生される。一実施形態では、グリコシル化阻害物質は、キフネンシン（ｋｉｆｕｎｅｎｓｉｎｅ）である。
【００２４】
第２の態様では、重鎖可変領域（ＶＨ）を有する重鎖（ＨＣ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を有する軽鎖（ＬＣ）を含むヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体をコードする核酸を本明細書において提供する。
【００２５】
第３の態様では、ＣＸＣＲ３を発現する細胞を対象において枯渇させる方法における使用のための、ヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体またはその医薬組成物であって、重鎖可変領域（ＶＨ）を有する重鎖（ＨＣ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を有する軽鎖（ＬＣ）を含む、ヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体またはその医薬組成物を本明細書において提供する。いくつかの実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、枯渇している。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、枯渇している。いくつかの実施形態では、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞は、枯渇している。いくつかの実施形態では、ＣＤ４＋メモリーＴ細胞は、枯渇している。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋メモリーＴ細胞は、枯渇している。いくつかの実施形態では、ＣＤ４＋メモリーＴ細胞およびＣＤ８＋メモリーＴ細胞は、枯渇している。一実施形態では、対象は、Ｔ細胞性自己免疫疾患を有する。別の実施形態では、対象は、初発１型糖尿病を有する。別の実施形態では、対象は、乾癬を有する。
【００２６】
第４の態様では、Ｔ細胞性自己免疫疾患を治療する方法における使用のための、ヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体またはその医薬組成物であって、重鎖可変領域（ＶＨ）を有する重鎖（ＨＣ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を有する軽鎖（ＬＣ）を含む、ヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体またはその医薬組成物を本明細書において提供する。一実施形態では、Ｔ細胞性疾患は、初発１型糖尿病である。別の実施形態では、Ｔ細胞性疾患は、乾癬である。
【００２７】
第５の態様では、重鎖可変領域（ＶＨ）を有する重鎖（ＨＣ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を有する軽鎖（ＬＣ）を含むヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体を、それを必要とする対象に投与することを含む、Ｔ細胞性自己免疫疾患を治療する方法を本明細書において提供する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞性自己免疫疾患は、初発１型糖尿病である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞性自己免疫疾患は、乾癬である。
【００２８】
第６の態様では、重鎖可変領域（ＶＨ）を有する重鎖（ＨＣ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を有する軽鎖（ＬＣ）を含むヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体を、それを必要とする対象に投与するための説明書を用意することを含む、Ｔ細胞性自己免疫疾患を治療する方法を本明細書において提供する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞性自己免疫疾患は、初発１型糖尿病である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞性自己免疫疾患は、乾癬である。
【００２９】
第７の態様では、重鎖可変領域（ＶＨ）を有する重鎖（ＨＣ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を有する軽鎖（ＬＣ）を含むヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体、ならびにヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３を、それを必要とするヒト対象に投与するための説明書を含む、Ｔ細胞性自己免疫疾患を治療するためのキットを本明細書において提供する。
【００３０】
本明細書において提供する、第２、３、４、５、６および７の態様のいくつかの実施形態では、ヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体のＶＨおよびＶＬは、表１に示す配列対のアミノ酸配列を含み、ＨＣは、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１のアミノ酸配列を含むヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域を含む。別の実施形態では、ＶＨは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号２４のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ＶＨは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号２４のアミノ酸配列を含み、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域は、配列番号２または配列番号９または配列番号１０または配列番号１１のアミノ酸配列を含む。
【００３１】
本明細書において提供する、第２、３、４、５、６および７の態様の他の実施形態では、ＶＨは、配列番号１８のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号２２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域は、配列番号２または配列番号９または配列番号１０または配列番号１１のアミノ酸配列を含む。
【００３２】
本明細書において提供する、第２、３、４、５、６および７の態様の他の実施形態では、抗体のＨＣおよびＬＣは、表２に示す配列対のアミノ酸配列を含む。
【００３３】
本明細書において提供する、第２、３、４、５、６および７の態様の他の実施形態では、本明細書において提供するヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体のＨＣは、フコース含量を減少させたヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域を含む。いくつかの実施形態では、提供するヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体は、グリコシル化阻害物質を含む培地で培養した宿主細胞において産生される。いくつかの実施形態では、グリコシル化阻害物質は、キフネンシンである。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】次の抗体処理後の血中の種々のＴ細胞サブセットの量を示す６つの一連のグラフである：「ハムスターＣＸＣＲ３−１７３」（ハムスター抗マウスＣＸＣＲ３）、「ＣＸＣＲ３  ｍＩｇＧ２ａ  Ｄａｂ」（マウスＩｇＧ２ａ定常領域を変異に置換してエフェクター機能を除去するように改変したハムスターＣＸＣＲ３−１７３）、「ＣＸＣＲ３  ｍＩｇＧ２ａ  ＷＴ」（マウス野生型ＩｇＧ２ａ定常領域を置換するように改変したハムスターＣＸＣＲ３−１７３）、「ＣＸＣＲ３  ｍＩｇＧ１−ａｇｌｙ」（マウスＩｇＧ１定常領域をＮ２９７Ｇ変異に置換するように改変したハムスターＣＸＣＲ３−１７３）、および無処理対照を表する「無処理」。
【図２Ａ】表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ社）結合アッセイにより測定した場合の、組換えマウスＦｃγＲＩ（ｍＦｃＲＩ）によるＣＸＣＲ３−１７３の種々のＦｃ改変バージョンの結合を示す６つの一連のグラフである。ＢＭＰ５、抗ＭＢＰ５  ｍＩｇＧ１アイソタイプ対照；ｍＩｇＧ１  ａｇｌｙ、マウスＩｇＧ１定常領域をＮ２９７Ｇ変異に置換するように改変したＣＸＣＲ３−１７３；ｍＩｇＧ２ａ  ＷＴ、マウス野生型ＩｇＧ２ａ定常領域を置換するように改変したＣＸＣＲ３−１７３；ｍＩｇＧ２ａ  Ｄａｂ、マウスＩｇＧ２ａ定常領域を変異に置換してエフェクター機能を除去するように改変したＣＸＣＲ３−１７３；ｍＩｇＧ３、マウス野生型ＩｇＧ３定常領域を置換するように改変したＣＸＣＲ３−１７３；ハムスターＣＸＣＲ３、親ハムスターｍＡｂ  ＣＸＣＲ３−１７３。
【図２Ｂ】Ｂｉａｃｏｒｅ結合アッセイにより測定した場合の、組換えマウスＦｃγＲＩＩｂ（ｍＦｃＲＩＩｂ）によるＣＸＣＲ３−１７３の種々のＦｃ改変バージョンの結合を示す６つの一連のグラフである。指定する抗体は、図２Ａのものと同じである。
【図２Ｃ】Ｂｉａｃｏｒｅ結合アッセイにより測定した場合の、組換えマウスＦｃγＲＩＩＩ（ｍＦｃＲＩＩＩ）によるＣＸＣＲ３−１７３の種々のＦｃ改変バージョンの結合を示す６つの一連のグラフである。指定する抗体は、図２Ａのものと同じである。
【図２Ｄ】Ｂｉａｃｏｒｅ結合アッセイにより測定した場合の、組換えマウスＦｃγＲＩＶ（ｍＦｃＲＩＶ）によるＣＸＣＲ３−１７３の種々のＦｃ改変バージョンの結合を示す６つの一連のグラフである。指定する種々の抗体は、図２Ａのものと同じである。
【図３Ａ】ヒトＩｇＧ１定常領域を改変した抗ヒトＣＸＣＲ３抗体の構造−エフェクター機能特性を集約する表である。
【図３Ｂ】種々の抗ヒトＣＸＣＲ３抗体によるＣＨＯヒトＣＸＣＲ３標的細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）を介した溶解率を、指示濃度および５：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比において示す棒グラフである。エフェクター細胞は、単一のドナー由来のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。ＩｇＧは、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照である。試験した抗ヒトＣＸＣＲ３  ｍＡｂは、クローン４（ＣＸＣＲ３  ＣＬ４）、クローン１２（ＣＸＣＲ３  ＣＬ１２）、クローン８２（ＣＸＣＲ３  ＣＬ８２）、クローン１３５（ＣＸＣＲ３  ＣＬ１３５）、５３Ｈｕ３７、ならびに図３Ａに記載のような、５３Ｈｕ３７の改変Ｆｃ変異体Ｍ１、Ｍ２およびＭ３であった。Ｋｉｆは、キフネンシン処理である。ＡＬＥＭは、アレムツズマブである。
【図３Ｃ】種々の抗体によるＣＨＯヒトＣＸＣＲ３標的細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＡＤＣＣを介した溶解率を、指示濃度および３：１のエフェクター対標的細胞（Ｅ：Ｔ）比において示す棒グラフである。エフェクター細胞は、ＮＫ様細胞株（ＮＫ９２−ＣＤ１６Ｖ）由来である。ＩｇＧは、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照である。試験した抗ヒトＣＸＣＲ３  ｍＡｂは、５３Ｈｕ３７および図３Ａの改変Ｆｃ変異体Ｍ１であった。ＣＸＣＲ３  ＣＬ４は、抗ヒトＣＸＣＲ３  ｍＡｂクローン４である。Ｋｉｆは、キフネンシン処理である。ＡＬＥＭは、アレムツズマブである。
【図４】５３Ｈｕ３７のＢｉａｃｏｒｅデータを集約する表であり、指示する変異体は、ヒトＦｃγＲＩＩａ（ｒｈＦｃγＲＩＩａ）、ヒトＦｃγＲＩＩＩ−Ｆ１５８（ｒｈＦｃγＲＩＩＩ−Ｆ１５８）、ヒトＦｃγＲＩＩＩ−Ｖ１５８（ｒｈＦｃγＲＩＩＩ−Ｖ１５８）、およびマウスＦｃγＲＩＶ（ｒｍＦｃγＲＩＶ）に対する結合親和性、ＫＤを示す。Ｍ１〜Ｍ３は、図３Ａに記載するものであり、ｋｉｆは、脱フコシル化５３Ｈｕ３７である。
【図５Ａ】用量２ｍｇ／ｋｇ体重で投与した指示抗体で処置したカニクイザルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏでの指示するＴ細胞サブセットの枯渇を示す６つの一連のグラフである。Ｍ１：５３Ｈｕ３７のＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ変異体；Ｋｉｆ：脱フコシル化５３Ｈｕ３７；Ｖｅｈ：溶媒対照。ＣＸＣＲ３抗体群についてＮ＝８。溶媒対照群についてＮ＝６。
【図５Ｂ】用量２ｍｇ／ｋｇ体重で投与した指示抗体の単回投与により、あらかじめ指示時間処置したカニクイザルの血清中の指示抗体の濃度を評価する薬物動態の総合データを示すグラフである。試験した抗ヒトＣＸＣＲ３  ｍＡｂは、５３Ｈｕ３７、キフネンシン処理５３Ｈｕ３７（５３Ｈｕ３７ｋｉｆ）、および５３Ｈｕ３７のＭ１変異体（５３Ｈｕ３７Ｍ１）であった。
【図６−１】配列番号および対応する配列を示す表である。
【図６−２】図６−１の続き。
【図６−３】図６−２の続き。
【図６−４】図６−３の続き。
【図６−５】図６−４の続き。
【図６−６】図６−５の続き。
【図６−７】図６−６の続き。
【図６−８】図６−７の続き。
【図６−９】図６−８の続き。
【図６−１０】図６−９の続き。
【図６−１１】図６−１０の続き。
【図６−１２】図６−１１の続き。
【図６−１３】図６−１２の続き。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
これより、本開示により特定の例示的実施形態を詳細に参照し、その特定の実施例を添付の図面において示す。
【００３６】
ヒトＣＸＣＲ３に特異的に結合するヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントを本明細書において提供する。特定の実施形態では、本明細書において提供する抗ＣＸＣＲ３抗体は、ＣＸＣＲ３を発現する細胞の枯渇を導く能力を有するか、またはこれらの抗ＣＸＣＲ３抗体を、ＣＸＣＲ３を発現する細胞の枯渇を導く能力を強化するように改変して、ＣＸＣＲ３関連疾患および障害を治療する。いくつかの実施形態では、療法は、ＣＸＣＲ３を標的化してＴ１Ｄを治療するために開示し、いくつかの実施形態では、療法は、ＣＸＣＲ３を標的化して乾癬を治療するために開示する。
【００３７】
抗体
本明細書において使用する場合、用語「抗体」は、４つのポリペプチド鎖、ジスルフィド結合により相互連結する２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖、ならびにそれらの多量体（例えば、ＩｇＭ）を含む免疫グロブリン分子を指す。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨまたはＶＨと略す）および重鎖定常領域（ＣＨまたはＣＨ）を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。重鎖のＦｃ部分は、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。
【００３８】
各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬと略す）および軽鎖定常領域（ＣＬまたはＣＬ）を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ１）を含む。
【００３９】
ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ぶ、より保存された領域が散在した、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ぶ、超可変領域にさらに細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなり、次の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４でアミノ末端からカルボキシ末端へ配置される。
【００４０】
本明細書において使用する場合、抗体の「抗原結合フラグメント」の用語は、抗原に特異的に結合して複合体を形成する、天然の、酵素的に入手可能な、合成の、または遺伝子改変の任意のポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。抗体の抗原結合フラグメントは、タンパク質分解、または抗体の可変ドメインおよび場合により定常ドメインをコードするＤＮＡの操作および発現を含む組換え遺伝子改変技術のような任意の適した標準技術を使用して、例えば、完全な抗体分子から得ることができる。抗原結合部分の非限定的な例としては、（ｉ）Ｆａｂフラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉｉ）Ｆｄフラグメント；（ｉｖ）Ｆｖフラグメント；（ｖ）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子；（ｖｉ）ｄＡｂフラグメント；および（ｖｉｉ）抗体の超可変領域（例えば、単離した相補性決定領域（ＣＤＲ））を模倣するアミノ酸残基を含む最小認識単位が挙げられる。二重、三重、四重特異性抗体のような他の改変分子、およびミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）はまた、「抗原結合フラグメント」の語句に包含する。
【００４１】
特定の実施形態では、ＣＸＣＲ３抗体または抗原結合フラグメントは、少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗体またはフラグメントは、多特異的であり、２つまたはそれ以上（例えば、２、３、４、５またはそれ以上）の抗原結合ドメインを含み、そのため、抗体またはフラグメントが、２つもしくはそれ以上のＣＸＣＲ３分子に、同一もしくは異なるエピトープにおいて結合可能となるか、またはＣＸＣＲ３および少なくとも１つの他の抗原に高い親和性で結合可能となる。抗原結合部分は、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つまたはそれ以上のフラグメントを含むことができる。このようなフラグメントは、親抗体由来または親抗体の変異体由来の重鎖および／または軽鎖可変領域を含んでもよい。
【００４２】
本明細書において使用する場合、用語「抗原」は、抗体またはその抗原結合フラグメントにより認識される、結合部位またはエピトープを指す。
【００４３】
「エピトープ」または「抗原決定基」は、抗体の抗原結合ドメインとの特異的相互作用の原因となる抗原分子の部分である。
【００４４】
本明細書において使用する場合、抗体またはその抗原結合フラグメントに関する「結合する」は、抗体の抗体結合部位と抗原との間の非共有相互作用により、同種抗原との１つまたはそれ以上の非共有結合を形成する、抗体または抗原結合フラグメントの能力を指す。抗原は、単離した抗原であってもよく、または細胞表面上のポリペプチドに関連するような別の実体に付随して存在してもよい。
【００４５】
本明細書において使用する場合、用語「に特異的に結合する」は、少なくとも約１×１０−６Ｍ、１×１０−７Ｍ、１×１０−８Ｍ、１×１０−９Ｍ、１×１０−１０Ｍ、１×１０−１１Ｍ、１×１０−１２Ｍまたはそれ以上のＫｄを有する抗原に結合する、抗体またはその抗原結合フラグメントの能力を指す。特定の実施形態では、この用語は、非特異的抗原に対するその親和性よりも少なくとも２倍超高い親和性で抗原に結合する、抗体またはその抗原結合フラグメントの能力を指す。しかし、抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列が関連する、２つまたはそれ以上の抗原に特異的に結合することが可能であることが理解される（例えば、ヒトまたはカニクイザルＣＸＣＲ３）。非特異的結合は、通常、中等度から高度までの結合能力を有しながら親和性が低い。必要に応じて、非特異的結合は、結合条件を変えることによって特異的結合に実質的に影響させることなく減少することができる。このような条件は、当分野において既知であり、常用技術を使用する当業者は、適切な条件を選択することができる。条件は、通常、抗体濃度、溶液のイオン強度、温度、結合させる時間、ならびに血清アルブミンおよびミルクカゼインのようなブロッキング分子の濃度に関して定義される。
【００４６】
親和定数は、抗体反応について標準の動態学的方法、例えば、イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）または表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）により決定することができる。結合率のリアルタイム検出およびモニタリングのための器具使用および方法は、既知であり、市販されている（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ  ２０００、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ社、ウプサラ、スウェーデンおよびＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）。
【００４７】
本明細書において使用する場合、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」は、抗体の抗原結合部位をともに形成する、抗体または抗原結合フラグメントの各可変領域内の複数の部分のうちの１つを指す。各可変領域ドメインは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と名付けられている３つのＣＤＲを含む。したがって、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）は、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）は、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含む。３つのＣＤＲは、直鎖状のアミノ酸配列に沿って隣接はしていないが、折りたたまれたポリペプチド中で近接している。ＣＤＲは、可変ドメインのベータシートの平衡鎖を連結するループ内に位置している。
【００４８】
本明細書において使用する場合、用語「フレームワーク（ＦＲ）アミノ酸残基」は、Ｉｇ鎖のフレームワーク領域内のアミノ酸を指す。本明細書において使用する用語「フレームワーク領域」または「ＦＲ領域」は、可変領域の一部であるがＣＤＲの一部ではないアミノ酸残基を含む。したがって、可変領域フレームワークは、長さが約１００〜１２０個の間のアミノ酸ではあるが、ＣＤＲ以外のアミノ酸のみを含む。
【００４９】
本明明細書において使用する場合、用語「％同一」または「パーセント同一」は、特定の領域間の２つの配列を比較した場合、２つの配列が、同じ位置において同一の残基を特定の数有することを意味する。用語「％類似」または「パーセント類似」は、類似の意味を有するが、２つの配列間のアミノ酸の数が同一であることに加えて、アミノ酸は同一ではないが、保存的置換であるともみなす。パーセント同一性は、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ＳＦら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５：４０３（１９９０年））のような既知のコンピュータアルゴリズムを使用して、例えば、Ｐｅａｒｓｏｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８年）の場合のようにデフォルトのパラメータを使用して判定することができる。例えば、米国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）データベースのＢＬＡＳＴ機能を使用して同一性を判定することができる。
【００５０】
特定の実施形態では、本明細書において提供する抗体は、ヒト化抗体である。「ヒト化抗体」は、所望の抗原に結合する抗体分子であり、非ヒト種（例えば、マウス抗体）由来の１つまたはそれ以上のＣＤＲを有し、ヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域および／または定常ドメインのうちの少なくともいくつかの部分を有する。既知のヒトＩｇ配列は、例えば、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ−／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ；ａｔｃｃ．ｏｒｇ／ｐｈａｇｅ／ｈｄｂ．ｈｔｍｌ；ｓｃｉｑｕｅｓｔ．ｃｏｍ；ａｂｃａｍ．ｃｏｍ；ａｎｔｉｂｏｄｙｒｅｓｏｕｒｃｅ．ｃｏｍ／ｏｎｌｉｎｅｃｏｍｐ．ｈｔｍｌ；およびＫａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ（１９８３年）に開示されている。移入したヒト配列を使用して、当分野において既知のように、免疫原性を減少させるか、または結合、親和性、結合率、解離率、アビディティ、特異性、半減期、または他の任意の適した特性を減少、強化もしくは修飾することができる。抗体をヒト化するための当分野で認められた方法は、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２（１９８６年）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４（１９８８年）；Ｓｉｍｓら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５１：２２９６（１９９３年）；ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９６：９０１（１９８７年）；Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：４２８５（１９９２年）；Ｐｒｅｓｔａら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５１：２６２３（１９９３年）；米国特許第５，５８９，２０５号；第５，５６５，３３２号；第６，１８０，３７０号；第６，６３２，９２７号；第７，２４１，８７７号；第７，２４４，６１５号；第７，２４４，８３２号；第７，２６２，０５０号；および米国特許出願公開第２００４／０２３６０７８号（２００４年４月３０日出願）に記載されており、この全体を参照により本明細書に組み入れる。
【００５１】
特定の実施形態では、本明細書において提供するヒト化抗体の特定のフレームワーク残基は、ＣＤＲドナー抗体由来の対応する残基で置換しており、例えば、マウス抗ヒトＣＸＣＲ３抗体由来のフレームワーク残基で置換して、抗原結合を変化、例えば、向上させる。このようなフレームワーク置換は、ＣＤＲとフレームワーク残基の相互作用をモデル化して、抗原結合および特定の位置における異常なフレームワーク残基を同定するための配列比較に重要なフレームワーク残基を同定することにより同定されている。いくつかの実施形態では、４Ｄによるヒト化を使用して、本開示のヒト化抗体変異体を調製した。国際公開第２００９／０３２６６１号（この全体を参照により本明細書に組み入れる）の例えば、４Ｄによるヒト化において使用する方法についての段落［００３７］〜［００４４］を参照されたい。簡潔には、４Ｄヒト化は：（ａ）ヒト化する可変ドメインの３Ｄモデルを構築すること；（ｂ）ドメインの３Ｄモデルの分子動態シミュレーションを使用して、可変ドメイン内の可動性残基を同定すること；（ｃ）４９種のヒト生殖系列の分子動態の軌跡と３Ｄモデルの分子動態の軌跡とを比較することにより最も近いヒト生殖系列を同定すること；および（ｄ）ＣＤＲの一部ではない可動性残基をそのヒト生殖系列の対応物（工程（ｃ）において同定するような）に変異させることを含むことができる。
【００５２】
いくつかの実施形態では、表１に記載するＶＨおよびＶＬ配列を含む、ヒト化ＣＸＣＲ３抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【００５３】
いくつかの実施形態では、表２に記載する重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）配列を含む、ヒト化ＣＸＣＲ３抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【００５４】
抗体エフェクター機能／枯渇活性
特定の実施形態では、本明細書に開示の抗ＣＸＣＲ３抗体は、ＣＸＣＲ３を発現する細胞の枯渇を導く能力を有するか、またはこれらの抗ＣＸＣＲ３抗体を、ＣＸＣＲ３を発現する細胞の枯渇を導く能力を強化するように改変して、ＣＸＣＲ３関連疾患および障害を治療することができる。本明細書に開示の抗体により枯渇させることが可能なＣＸＣＲ３を発現する細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を含むことができる。本明細書において開示する抗体により枯渇させることが可能なＣＸＣＲ３を発現する細胞は、ＣＤ４＋メモリーＴ細胞および／またはＣＤ８＋メモリーＴ細胞を含むことができる。本明細書において使用する場合、ＣＸＣＲ３＋細胞（すなわち、ＣＸＣＲ３をその細胞表面上に発現する細胞）に関する「枯渇」は、このような細胞を細胞集団から除去することを指す。枯渇について言及した場合は、完全または部分的な枯渇を含む。さらに、枯渇は、恒久的または一時的であってもよく、大きさおよび／または位置の程度が変化するものであってもよい。枯渇は、アポトーシスまたはネクローシスによるもののような細胞死の結果であってもよい。枯渇は、本明細書において提供する抗体または抗原結合フラグメントへの曝露前後に、または本明細書において提供する抗体または抗原結合フラグメントの非存在および存在下で、当分野において既知の任意の方法（例えば、フローサイトメトリー、免疫組織化学的検査等）を使用して、集団におけるＣＸＣＲ３−細胞の数を測定することにより評価することができる。本明細書において提供する抗体または抗原結合フラグメントへの曝露後、ＣＸＣＲ３＋細胞は、少なくともまたは約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上枯渇させることができる。
【００５５】
特定の実施形態では、ヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体は、野生型Ｆｃ領域、例えば、野生型ヒトＩｇＧ１  Ｆｃを有する対応するヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体と比較して、ヒトＣＸＣＲ３をその表面上に発現する細胞に対するエフェクター機能が強化されることを示す。本明細書において使用する場合、「エフェクター機能の強化」は、適した標的細胞に対する、抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）、補体性細胞傷害作用（ＣＤＣ）、または抗体依存性細胞性食作用（ＡＤＣＰ）のうちの任意の１つまたはそれ以上を導く抗体の能力が、対照抗体と比較して、同じ抗原特異性および野生型ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域を有する同じ条件下で、測定可能に増加することを指す。特定の実施形態では、対照抗体は、変異ヒトＦｃ領域を含む。特定の実施形態では、エフェクター機能は、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰもしくはＣＤＣ、またはこれらの任意の組合せである。特定の実施形態では、エフェクター機能は、ＡＤＣＣもしくはＣＤＣ、またはＡＤＣＣとＣＤＣの両方である。特定の実施形態では、エフェクター機能は、ＡＤＣＣである。特定の実施形態では、エフェクター機能は、ＣＤＣである。特定の実施形態では、エフェクター機能は、ＡＤＣＣとＣＤＣの両方である。特定の実施形態では、エフェクター機能は、ＡＤＣＰである。
【００５６】
本明細書において使用する場合、「変異ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域」は、野生型ヒトＩｇＧ１  Ｆｃと比較して、１つまたはそれ以上のアミノ酸変異またはアミノ酸修飾を含むように改変または修飾したヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域を指す。特定の実施形態では、野生型ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域は、アミノ酸配列
ＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（欧州番号１９２−４４６）（配列番号２）を含む。
【００５７】
特定の実施形態では、変異ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域は、次のアミノ酸置換：Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２６７Ｅ、Ｈ２６８Ｆ、Ｓ３２４Ｔ、Ｉ３３２Ｅ（欧州番号）のうちの少なくとも１つ、またはこれらの任意の組合せを含む。特定の実施形態では、変異ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域は、次のアミノ酸置換の組：Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｇ２３６Ａ／Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ、およびＳ２３９Ｄ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ（欧州番号）のうちの少なくとも１つを含む。特定の実施形態では、変異ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域は、アミノ酸置換Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅを含む。他の実施形態では、変異ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域は、アミノ酸置換Ｇ２３６Ａ／Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅを含む。さらに他の実施形態では、変異ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域は、アミノ酸置換Ｓ２３９Ｄ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅを含む。
【００５８】
例えば、特定の実施形態では、変異ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域は、配列番号３、４、５、６、７または８のアミノ酸配列を含む。
【００５９】
特定の実施形態では、変異ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域は、配列番号３〜８のうちの任意の１つまたはそれ以上と少なくとも９０パーセント同一の配列を含むが、ただし、いかなる場合でも、特定のアミノ酸置換は、維持される。種々の実施形態では、変異ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域は、配列番号３〜８のうちの任意の１つまたはそれ以上と少なくとも９０パーセント同一、少なくとも９１パーセント同一、少なくとも９２パーセント同一、少なくとも９３パーセント同一、少なくとも９４パーセント同一、少なくとも９５パーセント同一、少なくとも９６パーセント同一、少なくとも９７パーセント同一、少なくとも９８パーセント同一、または少なくとも９９パーセント同一の配列を含むが、ただし、いかなる場合でも、特定のアミノ酸置換は、維持される。
【００６０】
特定の実施形態では、変異ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域は、次のアミノ酸置換の組：Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｇ２３６Ａ／Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２ＥおよびＳ２３９Ｄ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ（欧州番号）のうちの少なくとも１つを含む。例えば、特定の実施形態では、変異ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域は、配列番号９、１０または１１のアミノ酸配列を含む。
【００６１】
特定の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換体は、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ（欧州番号）である。他の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｇ２３６Ａ／Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ（欧州番号）である。特定の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換体は、Ｓ２３９Ｄ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ（欧州番号）である。
【００６２】
特定の実施形態では、本明細書において提供するヒト化抗ＣＸＣＲ３抗体の変異ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域は、配列番号９〜１１のうちの任意の１つと少なくとも９０パーセント同一の配列を含むが、ただし、いかなる場合でも、特定のアミノ酸置換およびエフェクター機能の強化は、維持される。種々の実施形態では、変異ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域は、配列番号９〜１１のうちの任意の１つまたはそれ以上と少なくとも９０パーセント同一、少なくとも９１パーセント同一、少なくとも９２パーセント同一、少なくとも９３パーセント同一、少なくとも９４パーセント同一、少なくとも９５パーセント同一、少なくとも９６パーセント同一、少なくとも９７パーセント同一、少なくとも９８パーセント同一、または少なくとも９９パーセント同一の配列を含むが、ただし、いかなる場合でも、特定のアミノ酸置換体は、維持される。
【００６３】
ＣＤＲ変異体：
前述の実施形態に加えて、６つのＣＤＲを含む抗ＣＸＣＲ３抗体であって、ＶＨが、アミノ酸配列：
（ｉ）  配列番号１２、配列番号３５、および配列番号１４；
（ｉｉ）  配列番号１２、配列番号３５、および配列番号４５；
（ｉｉｉ）  配列番号１２、配列番号３６、および配列番号４５；
（ｉｖ）  配列番号１２、配列番号３７、および配列番号１４；
（ｖ）  配列番号１２、配列番号３７、および配列番号４５；
（ｖｉ）  配列番号１２、配列番号３７、および配列番号４６
（ｖｉｉ）  配列番号１２、配列番号３８、および配列番号１４；
（ｖｉｉｉ）  配列番号１２、配列番号３８、および配列番号４５；
（ｉｘ）  配列番号１２、配列番号３９、および配列番号１４；
（ｘ）  配列番号１２、配列番号３９、および配列番号４７；
（ｘｉ）  配列番号１２、配列番号４０、および配列番号１４；
（ｘｉｉ）  配列番号１２、配列番号１３、および配列番号４５
（ｘｉｉｉ）  配列番号１２、配列番号１３、および配列番号４６；
（ｘｉｖ）  配列番号１２、配列番号１３、および配列番号４８；
（ｘｖ）  配列番号１２、配列番号１３、および配列番号４９；
（ｘｖｉ）  配列番号１２、配列番号１３、および配列番号５０；
（ｘｖｉｉ）  配列番号１２、配列番号１３、および配列番号５１；
（ｘｖｉｉｉ）  配列番号１２、配列番号１３、および配列番号５２；
（ｘｉｘ）  配列番号１２、配列番号１３、および配列番号５３；
（ｘｘ）  配列番号１２、配列番号１３、および配列番号５４；
（ｘｘｉ）  配列番号１２、配列番号１３、および配列番号５５；
（ｘｘｉｉ）  配列番号１２、配列番号１３、および配列番号５６；
（ｘｘｉｉｉ）  配列番号１２、配列番号１３、および配列番号５７；
（ｘｘｉｖ）  配列番号１２、配列番号１３、および配列番号５８；
（ｘｘｖ）  配列番号１２、配列番号１３、および配列番号５９；
（ｘｘｖｉ）  配列番号１２、配列番号１３、および配列番号６０；
（ｘｘｖｉｉ）  配列番号１２、配列番号１３、および配列番号６１；
（ｘｘｖｉｉｉ）  配列番号１２、配列番号１３、および配列番号６２；
（ｘｘｉｘ）  配列番号１２、配列番号１３、および配列番号６３；
（ｘｘｘ）  配列番号１２、配列番号１３、および配列番号６４；
（ｘｘｘｉ）  配列番号１２、配列番号１３、および配列番号６５；
（ｘｘｘｉｉ）  配列番号１２、配列番号１３、および配列番号６６；
（ｘｘｘｉｉｉ）  配列番号３４、配列番号１３、および配列番号１４；
（ｘｘｘｉｖ）  配列番号１２、配列番号４１、および配列番号１４；
（ｘｘｘｖ）  配列番号１２、配列番号４１、および配列番号４６；
（ｘｘｘｖｉ）  配列番号１２、配列番号４２、および配列番号１４；
（ｘｘｘｖｉｉ）  配列番号１２、配列番号４２、および配列番号４５；
（ｘｘｘｖｉｉｉ）  配列番号１２、配列番号４３、および配列番号１４；
（ｘｘｘｉｘ）  配列番号１２、配列番号４４、および配列番号１４；
（ｘｌ）  配列番号１２、配列番号４１、および配列番号１４；または
（ｘｌｉ）  配列番号１２、配列番号１３、および配列番号６８；
を有するＣＤＲを含み、ＶＬが、アミノ酸配列：
（ｉ）  配列番号６９、配列番号１６、および配列番号１７；
（ｉｉ）  配列番号７０、配列番号１６、および配列番号１７；
（ｉｉｉ）  配列番号７１、配列番号１６、および配列番号１７；
（ｉｖ）  配列番号７１、配列番号１６、および配列番号７５；
（ｖ）  配列番号７２、配列番号１６、および配列番号１７；
（ｖｉ）  配列番号７３、配列番号１６、および配列番号１７；
（ｖｉｉ）  配列番号７４、配列番号１６、および配列番号１７；
（ｖｉｉｉ）  配列番号１５、配列番号１６、および配列番号７５；
（ｉｘ）  配列番号１５、配列番号１６、および配列番号７６；
（ｘ）  配列番号１５、配列番号１６、および配列番号７７；
（ｘｉ）  配列番号１５、配列番号１６、および配列番号７８；または
（ｘｉｉ）  配列番号１５、配列番号１６、および配列番号７９
を有するＣＤＲを含む、抗ＣＸＣＲ３抗体を本明細書において提供する。
【００６４】
前述の実施形態に加えて、６つのＣＤＲを含む抗ＣＸＣＲ３抗体であって、ＶＨが、アミノ酸配列：
（ｉ）  配列番号１２、配列番号３５、および配列番号１４；
（ｉｉ）  配列番号１２、配列番号３５、および配列番号４５；
（ｉｉｉ）  配列番号１２、配列番号３６、および配列番号４５；
（ｉｖ）  配列番号１２、配列番号３７、および配列番号１４；
（ｖ）  配列番号１２、配列番号３７、および配列番号４５；
（ｖｉ）  配列番号１２、配列番号３７、および配列番号４６；
（ｖｉｉ）  配列番号１２、配列番号３８、および配列番号１４；
（ｖｉｉｉ）  配列番号１２、配列番号３８、および配列番号４５；
（ｉｘ）  配列番号１２、配列番号３９、および配列番号１４；
（ｘ）  配列番号１２、配列番号３９、および配列番号４７；または
（ｘｉ）  配列番号１２、配列番号４０、および配列番号１４；
を有するＣＤＲを含み、ＶＬが、アミノ酸配列：
（ｉ）  配列番号６９、配列番号１６、および配列番号１７；
（ｉｉ）  配列番号７０、配列番号１６、および配列番号１７；
（ｉｉｉ）  配列番号７１、配列番号１６、および配列番号１７；
（ｉｖ）  配列番号７１、配列番号１６、および配列番号１００；
（ｖ）  配列番号７２、配列番号１６、および配列番号１７；
（ｖｉ）  配列番号７３、配列番号１６、および配列番号１７；
（ｖｉｉ）  配列番号７４、配列番号１６、および配列番号１７；
（ｖｉｉｉ）  配列番号１５、配列番号１６、および配列番号７５；
（ｉｘ）  配列番号１５、配列番号１６、および配列番号７６；
（ｘ）  配列番号１５、配列番号１６、および配列番号７７；
（ｘｉ）  配列番号１５、配列番号１６、および配列番号７８；または
（ｘｉｉ）  配列番号１５、配列番号１６、および配列番号７９
を有するＣＤＲを含む、抗ＣＸＣＲ３抗体を本明細書において提供する。
【００６５】
前述の実施形態に加えて、６つのＣＤＲを含む抗ＣＸＣＲ３抗体であって、ＶＨが、アミノ酸配列：
（ｘｉｉ）  配列番号１２、配列番号１３、および配列番号４５
（ｘｉｉｉ）  配列番号１２、配列番号１３、および配列番号４６；
（ｘｉｖ）  配列番号１２、配列番号１３、および配列番号４８；
（ｘｖ）  配列番号１２、配列番号１３、および配列番号４９；
（ｘｖｉ）  配列番号１２、配列番号１３、および配列番号５０；
（ｘｖｉｉ）  配列番号１２、配列番号１３、および配列番号５１；
（ｘｖｉｉｉ）  配列番号１２、配列番号１３、および配列番号５２；
（ｘｉｘ）  配列番号１２、配列番号１３、および配列番号５３；
（ｘｘ）  配列番号１２、配列番号１３、および配列番号５４；
（ｘｘｉ）  配列番号１２、配列番号１３、および配列番号５５；または
（ｘｘｉｉ）  配列番号１２、配列番号１３、および配列番号５６；
を有するＣＤＲを含み、ＶＬが、アミノ酸配列：
（ｉ）  配列番号６９、配列番号１６、および配列番号１７；
（ｉｉ）  配列番号７０、配列番号１６、および配列番号１７；
（ｉｉｉ）  配列番号７１、配列番号１６、および配列番号１７；
（ｉｖ）  配列番号７１、配列番号１６、および配列番号７５；
（ｖ）  配列番号７２、配列番号１６、および配列番号１７；
（ｖｉ）  配列番号７３、配列番号１６、および配列番号１７；
（ｖｉｉ）  配列番号７４、配列番号１６、および配列番号１７；
（ｖｉｉｉ）  配列番号１５、配列番号１６、および配列番号７５；
（ｉｘ）  配列番号１５、配列番号１６、および配列番号７６；
（ｘ）  配列番号１５、配列番号１６、および配列番号７７；
（ｘｉ）  配列番号１５、配列番号１６、および配列番号７８；または
（ｘｉｉ）  配列番号１５、配列番号１６、および配列番号７９
を有するＣＤＲを含む、抗ＣＸＣＲ３抗体を本明細書において提供する。
【００６６】
前述の実施形態に加えて、６つのＣＤＲを含む抗ＣＸＣＲ３抗体であって、ＶＨが、アミノ酸配列：
（ｘｘｉｉｉ）  配列番号１２、配列番号１３、および配列番号５７；
（ｘｘｉｖ）  配列番号１２、配列番号１３、および配列番号５８；
（ｘｘｖ）  配列番号１２、配列番号１３、および配列番号５９；
（ｘｘｖｉ）  配列番号１２、配列番号１３、および配列番号６０；
（ｘｘｖｉｉ）  配列番号１２、配列番号１３、および配列番号６１；
（ｘｘｖｉｉｉ）  配列番号１２、配列番号１３、および配列番号６２；
（ｘｘｉｘ）  配列番号１２、配列番号１３、および配列番号６３；
（ｘｘｘ）  配列番号１２、配列番号１３、および配列番号６４；
（ｘｘｘｉ）  配列番号１２、配列番号１３、および配列番号６５；または
（ｘｘｘｉｉ）  配列番号１２、配列番号１３、および配列番号６６
を有するＣＤＲを含み、ＶＬが、アミノ酸配列：
（ｉ）  配列番号６９、配列番号１６、および配列番号１７；
（ｉｉ）  配列番号７０、配列番号１６、および配列番号１７；
（ｉｉｉ）  配列番号７１、配列番号１６、および配列番号１７；
（ｉｖ）  配列番号７１、配列番号１６、および配列番号７５；
（ｖ）  配列番号７２、配列番号１６、および配列番号１７；
（ｖｉ）  配列番号７３、配列番号１６、および配列番号１７；
（ｖｉｉ）  配列番号７４、配列番号１６、および配列番号１７；
（ｖｉｉｉ）  配列番号１５、配列番号１６、および配列番号７５；
（ｉｘ）  配列番号１５、配列番号１６、および配列番号７６；
（ｘ）  配列番号１５、配列番号１６、および配列番号７７；
（ｘｉ）  配列番号１５、配列番号１６、および配列番号７８；または
（ｘｉｉ）  配列番号１５、配列番号１６、および配列番号７９
を有するＣＤＲを含む、抗ＣＸＣＲ３抗体を本明細書において提供する。
【００６７】
前述の実施形態に加えて、６つのＣＤＲを含む抗ＣＸＣＲ３抗体であって、ＶＨが、アミノ酸配列：
（ｘｘｘｉｉｉ）  配列番号３４、配列番号１３、および配列番号１４；
（ｘｘｘｉｖ）  配列番号１２、配列番号４１、および配列番号１４；
（ｘｘｘｖ）  配列番号１２、配列番号４１、および配列番号７１；
（ｘｘｘｖｉ）  配列番号１２、配列番号４２、および配列番号１４；
（ｘｘｘｖｉｉ）  配列番号１２、配列番号４２、および配列番号７０；
（ｘｘｘｖｉｉｉ）  配列番号１２、配列番号４３、および配列番号１４；
（ｘｘｘｉｘ）  配列番号１２、配列番号４４、および配列番号１４；
（ｘｌ）  配列番号１２、配列番号４１、および配列番号１４；または
（ｘｌｉ）  配列番号１２、配列番号１３、および配列番号６８；
を有するＣＤＲを含み、ＶＬが、アミノ酸配列：
（ｉ）  配列番号６９、配列番号１６、および配列番号１７
（ｉｉ）  配列番号７０、配列番号１６、および配列番号１７；
（ｉｉｉ）  配列番号７１、配列番号１６、および配列番号１７；
（ｉｖ）  配列番号７１、配列番号１６、および配列番号７５；
（ｖ）  配列番号７２、配列番号１６、および配列番号１７；
（ｖｉ）  配列番号７３、配列番号１６、および配列番号１７；
（ｖｉｉ）  配列番号７４、配列番号１６、および配列番号１７；
（ｖｉｉｉ）  配列番号１５、配列番号１６、および配列番号７５；
（ｉｘ）  配列番号１５、配列番号１６、および配列番号７６；
（ｘ）  配列番号１５、配列番号１６、および配列番号７７；
（ｘｉ）  配列番号１５、配列番号１６、および配列番号７８；または
（ｘｉｉ）  配列番号１５、配列番号１６、および配列番号７９
を有するＣＤＲを含む、抗ＣＸＣＲ３抗体を本明細書において提供する。
【００６８】
前述の実施形態に加えて、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９または配列番号９０のアミノ酸配列を含むＶＨを含む抗ＣＸＣＲ３抗体を本明細書において提供する。
【００６９】
前述の実施形態に加えて、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００または配列番号１０１のアミノ酸配列を含むＶＨを含む抗ＣＸＣＲ３抗体を本明細書において提供する。
【００７０】
前述の実施形態に加えて、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０または配列番号１１１の選択されるアミノ酸配列を含むＶＨを含む抗ＣＸＣＲ３抗体を本明細書において提供する。
【００７１】
前述の実施形態に加えて、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１または配列番号１２２のアミノ酸配列を含むＶＨを含む抗ＣＸＣＲ３抗体を本明細書において提供する。
【００７２】
前述の実施形態に加えて、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３または配列番号１３４のアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗ＣＸＣＲ３抗体を本明細書において提供する。
【００７３】
特定の実施形態では、抗ヒトＣＸＣＲ３抗体は、表３に示すアミノ酸配列を含むＶＨ／ＶＬの対をそれぞれ含む。（指示する変異は、対応する５３Ｈｕ３７ＶＨまたはＶＬ配列（配列番号２０および２４）にそれぞれ関する。）
【００７４】
【表３】
2020504744.tif 000004
【００７５】
【表４】
2020504744.tif 000005
【００７６】
中和抗体
特定の実施形態では、本明細書において提供するヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体は、ＣＸＣＲ３中和抗体である。特定の例示的実施形態では、ＣＸＣＲ３抗体は、エフェクター機能の強化に加えて中和活性を有する。ＣＸＣＲ３の中和とＣＸＣＲ３＋細胞の枯渇との複合効果は、ＣＸＣＲ３による効果、例えば、Ｔ細胞の動員を減少または除去することが望ましい場合はいつでも利点となり得る。
【００７７】
「ＣＸＣＲ３中和抗体」は、ＣＸＣＲ３に結合し、ＣＸＣＲ３に結合するＣＸＣＲ３リガンドに起因する、典型的な生理的および遺伝的反応のような受容体の活性を遮断する。中和活性は、中和が完全（１００％中和）であっても、または部分的、例えば、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５（またはその間の任意のパーセント）またはそれ以上の中和をもたらすものであってもよく、抗体の濃度、親和性、およびエピトープ、ならびに中和活性を評価するために使用する特定のアッセイのような当業者に既知の種々の要因に依存する。ＣＸＣＲ３中和抗体の中和活性は、例えば、リガンド結合、ＧＴＰ結合、カルシウム動員、細胞走化性、および／または受容体内在化の阻害を測定するためのアッセイにより示すことができる。中和抗体、および特にはＣＸＣＲ３中和抗体の活性を判定するための多数のアッセイは、当業者に既知であり、特定の抗体が中和していることを検証するように容易に構成することができる。
【００７８】
例えば、いくつかの実施形態では、抗ＣＸＣＲ３抗体の中和活性は、クローン４９８０１により生成され、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）社により販売される抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＭＡＢ１６０）の添付文書に実質的に記載するように、走化性アッセイにより評価することができる。５０％中和量（ＮＤ５０）は、反応性細胞株における細胞表面ＣＸＣＲ３による組換えヒトＣＸＣＬ１１（ｒｈＣＸＣＬ１１）反応の最大阻害の半値を特定のｒｈＣＸＣＬ１１濃度で得るのに必要とされる、抗体濃度として定義される。ｈＣＸＣＲ３をトランスフェクトしたＢａＦ／３細胞のｒｈＣＸＣＬ１１による走化性を遮断する抗体の能力を測定するために、ｒｈＣＸＣＬ１１  ７ｎｇ／ｍＬを９６ウェル走化性チャンバー（ＮｅｕｒｏＰｒｏｂｅ社、キャビン・ジョン、Ｍｄ．）の下部コンパートメントに加える。次いで、無ＰＶＰのポリカーボネートフィルター（孔径５μｍ）を使用して走化性チャンバーを構築する。抗体の段階希釈物（例えば、０．００１〜１００００μｇ／ｍＬ）および０．２５×１０６細胞／ウェルをチャンバーの上部のウェルに加える。５％ＣＯ２の加湿したインキュベーター中、３７℃で３時間インキュベーション後、チャンバーを解体し、下部チャンバーへ遊走した細胞を作業プレートに移し、例えば、レサズリン蛍光を使用して定量化する。
【００７９】
Ｃｏｌｖｉｎら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２６：５８３８〜４９（２００６年）では、特定の実施形態において、中和抗ＣＸＣＲ３抗体の中和活性を判定するために使用することが可能な追加のアッセイについて記載している。簡潔には、ＣＸＣＲ４を機能的に発現するマウスプレＢ細胞白血病細胞株である３００−１９細胞を使用することができる。トランスフェクションの後、この株は、他のケモカイン受容体、例えば、ヒトＣＸＣＲ３を機能的に発現し得る（例えば、参照により本明細書に組み入れる、米国特許出願公開第２０１０／００６１９８３号の段落２０１〜２０９を参照）。ヒトＣＸＣＲ３を発現する３００−１９細胞は、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含む完全ＲＰＭＩ培地中で増殖させることができる。ＣＸＣＲ３リガンドのＣＸＣＲ３への結合を候補中和ＣＸＣＲ３抗体の存在下で評価するために、４００，０００個のＣＸＣＲ３／３００−１９細胞を９６ウェル組織培養プレート内の総容量１５０μＬの結合バッファー（０．５％のＢＳＡ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＣａＣｌ２、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）中に置いた。合計０．０４ｎＭの１２５Ｉ標識ＣＸＣＬ１０（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ社、ボストン、Ｍａｓｓ．）またはＣＸＣＬ１１（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ピスカタウェイ、Ｎ．Ｊ．）および５×１０６ｎＭ〜５００ｎＭの非標識ＣＸＣＬ１０またはＣＸＣＬ１１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社、ロッキーヒル、Ｎ．Ｊ．）を細胞に加え、室温、振盪下で９０分間インキュベートすることができる。０．３％のポリエチレンイミン中に予浸し、０．５ＭのＮａＣｌを添加した結合バッファー２００μＬで３回洗浄した、９６ウェルフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ビレリカ、Ｍａｓｓ．）上に細胞を移す。プレートを乾燥させ、Ｗａｌｌａｃ  Ｍｉｃｒｏｂｅｔａシンチレーションカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ボストン、Ｍａｓｓ．）内にシンチレーション液を追加した後に放射能を測定する。ＣＸＣＬ９の結合は、ＣＸＣＬ１０およびＣＸＣＬ１１と類似的に評価することができる。
【００８０】
特定の実施形態では、本明細書に開示の抗体は、ＣＸＣＲ３を発現する細胞へのカルシウム流を防止または減少させることができる。いくつかの実施形態では、カルシウム流は、ＣＸＣＲ３／３００−１９細胞のような細胞内で検出することができる。１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＲＰＭＩ培地２ｍＬ中に約５×１０６細胞を懸濁させる。Ｆｕｒａ−２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社、ユージーン、ＯＲ）１５μｇを加え、細胞を３７℃で２０分間インキュベートする。細胞をＰＢＳ中で２回洗浄し、カルシウム流バッファー（１４５ｍＭのＮａＣｌ、４ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＮａＨＰＯ４、１．８ｍＭのＣａＣｌ２、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．８ｍＭのＭｇＣｌ２および２２ｍＭのグルコース）２ｍＬ中に再懸濁する。蛍光の読取りは、ＤｅｌｔａＲＡＭ蛍光光度計（Ｐｈｏｔｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社、ローレンスビル、Ｎ．Ｊ．）により３７℃で測定する。細胞内カルシウム濃度は、ケモカイン（例えば、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０またはＣＸＣＬ１１）追加前および後に、３４０ｎｍおよび３８０ｎｍでの連続励起に反応して５１０ｎｍで発光する励起蛍光強度として記録し、３４０ｎｍでの蛍光の３８０ｎｍでの蛍光に対する相対比として示す。
【００８１】
特定の実施形態では、ＣＸＣＲ３中和は、受容体内在化の減少を測定することにより評価することができる。いくつかの実施形態では、受容体内在化アッセイは、ＣＸＣＲ３／３００−１９細胞のような細胞約２．５×１０５個を、１％のＢＳＡを含むＲＰＭＩ培地中で種々の濃度のＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１またはＣＸＣＬ９とともに３７℃で３０分間インキュベートすることにより実行することができる。次いで、氷冷フローサイトメトリー染色バッファーで細胞を洗浄し、その後、ＰＥ結合ＣＸＣＲ３抗体を使用してＣＸＣＲ３の表面発現について分析することができる。
【００８２】
任意の上記アッセイにより評価するように、中和抗ＣＸＣＲ３抗体は、特定の実施形態において、約０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．２、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、４０、５０または１００μｇ／ｍＬのＮＤ５０を有し得る。特定の実施形態では、ＮＤ５０は、０．５〜１２μｇ／ｍＬ、より特定の実施形態では、１〜６μｇ／ｍＬであり得る。
【００８３】
本明細書において提供する抗体または抗原結合フラグメントによる細胞の遊走、動員、または蓄積の阻害は、当業者に既知の任意の方法により評価することができる。このような方法は、例えば、免疫組織化学的検査、フローサイトメトリー、ＲＴ−ＰＣＲ等による生検の分析を含み、１つもしくはそれ以上の細胞集団、または体内もしくは器官内の１つもしくはそれ以上の部位における、ＣＸＣＲ３＋細胞のような細胞の数を評価することができる。細胞の遊走、動員、または蓄積は、本明細書において提供する抗体または抗原結合フラグメントの非存在下での遊走、動員、または蓄積と比較して、少なくとも、または約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上阻害することができる。
【００８４】
ヌクレオチド配列
本明明細書に開示のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列をまた、本明細書において提供する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏでＣＸＣＲ３＋細胞を枯渇させることが可能な抗体またはフラグメントをコードする。特定の実施形態では、ヌクレオチド配列を使用して、細胞における抗ＣＸＣＲ３抗体またはその抗原結合フラグメントの発現（例えば、哺乳動物細胞における発現）のための発現ベクターを調製することができる。
【００８５】
特定の実施形態では、本明細書において開示するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと実質的に同一のポリヌクレオチドをまた、本明細書において開示する。実質的に同一の配列は、多型配列、すなわち、集団における別の配列または対立遺伝子であってもよい。実質的に同一の配列はまた、サイレント変異を含む配列を有する、変異誘発した配列を含むことができる。変異は、１つまたはそれ以上のヌクレオチド残基の変異、１つまたはそれ以上のヌクレオチド残基の欠失、または１つまたはそれ以上の追加のヌクレオチド残基の挿入を含むことができる。実質的に同一の配列はまた、核酸コードの縮重のため、本明細書において開示するアミノ酸配列の任意の所与のアミノ酸の位置で同じアミノ酸をコードする種々のヌクレオチド配列を含むことができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏでＣＸＣＲ３＋細胞を枯渇させる能力を保持する抗体の鎖または複数の鎖をコードする配列をまた、実質的に同一の配列に含む。
【００８６】
特定の実施形態では、本明細書において提供する核酸は、本明細書において提供する、ＣＸＣＲ３を発現する細胞を枯渇させることが可能な抗体またはフラグメントの鎖または複数の鎖のアミノ酸配列をコードするか、または核酸は、抗体またはその抗原結合フラグメントの鎖または複数の鎖のアミノ酸配列をコードする核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる。
【００８７】
特定の実施形態では、抗ＣＸＣＲ３抗体またはその抗原結合フラグメントのＶＨドメインのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、抗体の重鎖をコードするヌクレオチド配列と少なくとも約８０〜１００％（例えば、約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）（またはその間の任意のパーセント）同一である、ポリヌクレオチド配列を本明細書において開示する。特定の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、抗体の重鎖をコードするヌクレオチド配列と比較して０、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の変異（付加、欠失、および保存的置換のような置換を含む）を有するヌクレオチド配列を含むことができる。
【００８８】
特定の実施形態では、抗ＣＸＣＲ３抗体またはフラグメントのＶＬドメインのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、抗体の軽鎖をコードするヌクレオチド配列と少なくとも約８０〜１００％（例えば、約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）（またはその間の任意のパーセント）同一である、ポリヌクレオチド配列を本明細書において開示する。特定の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、抗体の軽鎖をコードするヌクレオチド配列と比較して０、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の変異（付加、欠失、および保存的置換のような置換を含む）を有するヌクレオチド配列を含むことができる。
【００８９】
特定の実施形態では、ＶＨアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％（またはその間の任意のパーセント）同一であり、ＶＬアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％（またはその間の任意のパーセント）同一であるヌクレオチド配列を含み、本明細書において開示する任意の抗体の重鎖および軽鎖アミノ酸配列をコードする、ポリヌクレオチド配列を本明細書において開示する。
【００９０】
開示するポリヌクレオチドは、当分野において既知の任意の方法により得ることができる。例えば、抗体のヌクレオチド配列が既知である場合、抗体をコードするポリヌクレオチドは、化学的に合成したオリゴヌクレオチドから構築することができる。これは、例えば、抗体をコードする配列の部分を含む重複したオリゴヌクレオチドを合成し、そのオリゴヌクレオチドをアニーリングおよび連結反応させ、次いで、連結したオリゴヌクレオチドをＰＣＲにより増幅することを必要とし得る。開示するポリヌクレオチドはまた、抗体ｃＤＮＡライブラリー、または抗体を発現する任意の組織もしくは細胞から単離したｃＤＮＡライブラリーのような他の任意の適した核酸ソースから（例えば、抗体を発現するように選択されたハイブリドーマ細胞から）生成することができる。
【００９１】
抗ＣＸＣＲ３抗体またはその抗原結合フラグメントの発現
本明細書において提供するヒト化抗ＣＸＣＲ３抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸の操作の後、そのコードする核酸を発現ベクター中に一般的に挿入して宿主細胞中に導入し、この宿主細胞を使用して所望の量のコード化抗体またはその抗原結合フラグメントを生成する。発現に適したベクターは、当分野において既知である。適した宿主細胞は、例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、Ｓｆ９および／または他のヒトもしくは非ヒト細胞株を含む。いくつかの実施形態では、培養培地中で培養した場合、宿主細胞は、核酸をベクター上に一過性または安定性に発現し、これにより、本明細書において開示する抗体またはフラグメントを生成するための方法を提供する。
【００９２】
用語「ベクター」または「発現ベクター」は、所望の遺伝子を細胞内に導入および発現させるための媒体を説明するために本明細書において使用する。当業者に既知のこのようなベクターは、例えば、プラスミド、ファージ、ウイルスおよびレトロウイルスを含む。一般に、適したベクターは、選択マーカー、適切な制限部位を含み、所望の遺伝子のクローニング、ならびに真核または原核細胞に侵入および／または複製する能力を促進することができる。
【００９３】
本明細書において提供する抗ＣＸＣＲ３抗体を発現させることを目的として、多数の発現ベクター系を利用することができる。例えば、ある種のベクターは、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶまたはＭＯＭＬＶ）またはＳＶ４０ウイルスのような動物ウイルスから得たＤＮＡ要素を利用する。他は、内部リボソーム結合部位を有するポリシストロニック系の使用を必要とする。さらに、ＤＮＡをその染色体中に組み込んだ細胞は、トランスフェクトする宿主細胞の選択を可能とする、１つまたはそれ以上のマーカーを導入することにより選択することができる。マーカーは、栄養要求性宿主に対する原栄養性、殺傷物剤耐性（例えば、抗生物質）または銅のような重金属に対する耐性をもたらすことができる。選択マーカー遺伝子は、発現させるＤＮＡ配列に直接連鎖させるか、または同時形質転換により同じ細胞内に導入することができる。追加の要素をまた、ｍＲＮＡの最適合成に必要としてもよい。このような要素は、シグナル配列、スプライス信号、ならびに転写プロモーター、エンハンサー、および終結シグナルを含むことができる。いくつかの実施形態では、クローン化可変領域遺伝子を発現ベクター中に上述の重鎖および軽鎖定常領域遺伝子とともに挿入する。いくつかの実施形態では、重鎖および軽鎖定常領域は、ヒト由来である。
【００９４】
他の実施形態では、本明細書において提供する抗ＣＸＣＲ３抗体またはその抗原結合フラグメントは、ポリシストロニック性構築物を使用して発現させることができる。このような発現系では、抗体の重鎖および軽鎖のような、目的の多遺伝子産物は、単一のポリシストロニック性構築物から生成することができる。このような系は、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を有利に使用して、本明細書において提供するポリペプチドを比較的高いレベルで真核宿主細胞内にもたらす。適合するＩＲＥＳ配列は、米国特許第６，１９３，９８０号に開示されており、これを参照により本明細書に組み入れる。当業者は、このような発現系を使用して、本出願に開示する、あらゆるポリペプチドを効率的に生成することができることを理解するであろう。
【００９５】
ベクターまたは抗体をコードするＤＮＡ配列もしくはその抗原結合フラグメントを調製した時点で、発現ベクターを適切な宿主細胞内に導入することができる。すなわち、宿主細胞を形質転換することができる。プラスミドの宿主細胞への導入は、当業者に公知の種々の技術により達成することができる。これらの技術は、トランスフェクション（電気泳動および電気穿孔を含む）、原形質融合、リン酸カルシウム沈殿、エンベロープを有するＤＮＡによる細胞融合、マイクロインジェクションおよびインタクトなウイルスによる感染を含むが、これらに限定されない。Ｒｉｄｇｗａｙ，Ａ．Ａ．Ｇ．「Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ」Ｃｈａｐｔｅｒ２４．２、ｐｐ．４７０〜４７２  Ｖｅｃｔｏｒｓ、ＲｏｄｒｉｇｕｅｚおよびＤｅｎｈａｒｄｔ，Ｅｄｓ．（Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ社、ボストン、Ｍａｓｓ．１９８８年）を参照されたい。いくつかの実施形態では、電気穿孔によりプラスミドを宿主へ導入する。形質転換した細胞は、コードしたアミノ酸配列、例えば、抗体軽鎖および重鎖の生成に適切な条件下で増殖させ、コードしたアミノ酸配列の生成について評価する。アッセイ技術の例として、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、フローサイトメトリー、免疫組織化学的検査等が挙げられる。
【００９６】
「宿主細胞」は、組換え核酸技術を使用して構築され、少なくとも１つの異種タンパク質をコードするベクターを導入した細胞を指す。ポリペプチドを組換え宿主から単離するための方法の記載において、用語「細胞」および「細胞培養物」は、他に明白に示さない限り、互換的に使用して、コードしたタンパク質、例えば、抗体またはその抗原結合フラグメントのソースを表す。言い換えると、ポリペプチドの「細胞」からの回収は、遠心沈殿した全細胞から、または培地と懸濁した細胞の両方を含む細胞培養物からの回収を意味することができる。
【００９７】
一実施形態では、抗体発現のために使用する宿主細胞株は、哺乳動物由来である；当業者は、そこで発現する所望の遺伝子産物に最適な、特定の宿主細胞株を決定することができる。宿主細胞株の例としては、ＤＧ４４およびＤＵＸＢ１１（チャイニーズハムスター卵巣株、ＤＨＦＲマイナス）、ＨＥＬＡ（ヒト子宮頸癌）、ＣＶＩ（サル腎臓株）、ＣＯＳ（ＳＶ４０  Ｔ抗原を有するＣＶＩの誘導体）、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター線維芽細胞）、ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＳＰ２／Ｏ（マウス骨髄腫）、ＢＦＡ−１ｃ１ＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）、２９３（ヒト腎臓）が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、ＮＳ０細胞を使用してもよい。いくつかの実施形態では、ＣＨＯ細胞を使用する。宿主細胞株は、商用サービス、米国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から、または既刊文献から一般的に入手可能である。
【００９８】
一実施形態では、細胞株は、そこから発現した抗体のグリコシル化、例えば、アフコシル化の変化をもたらす（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６．ＲＴＭ．（Ｃｒｕｃｅｌｌ社）またはＦＵＴ８ノックアウトＣＨＯ細胞株（Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ．ＲＴＭ．細胞）（Ｂｉｏｗａ社、プリンストン、Ｎ．Ｊ．））。あるいは、細胞は、Ｎ−グリカンの初期のプロセシングに必要とされる１つもしくはそれ以上のグリコシダーゼが欠損していてもよく、かつ／または培養条件が、このようなグリコシダーゼのうちの１つもしくはそれ以上の活性が阻害されているものであってもよい。例えば、細胞は、アルファ−グルコシダーゼＩ、アルファ−グルコシダーゼＩＩ、およびアルファ−マンノシダーゼＩのような１つまたはそれ以上のグリコシダーゼが欠損していてもよい。さらに、または、あるいは、改変した細胞は、アルファ−グルコシダーゼＩ、アルファ−グルコシダーゼＩＩ、およびアルファ−マンノシダーゼＩのような１つまたはそれ以上のグリコシダーゼの阻害物質と接触させてもよい。特定の実施形態では、阻害物質は、アルファ−マンノシダーゼＩの阻害物質、例えば、アルファ−マンノシダーゼＩ特異的阻害物質であるキフネンシンである。宿主細胞をキフネンシンおよび他の阻害物質とともに培養するための例示的方法は、米国特許第８，０７１，３３６号に開示されており、この全体を参照により本明細書に組み入れる。特定の実施形態では、キフネンシンによる処理により、少なくとも５０％のＭａｎ５−９（ＧｌｃＮＡｃ）２Ｎ−グリカンを有する抗体が生じ、この場合、Ｍａｎ８およびＭａｎ９含有Ｎ−グリカンはともに主要な種である。
【００９９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生成により、所望のポリペプチドを大量生産するためのスケールアップが可能となる。組織培養条件下での哺乳動物細胞の培養技術は、当分野において既知であり、例えば、エアリフトリアクター内もしくは連続撹拌リアクター内での均一な懸濁培養、または例えば、中空糸、マイクロカプセル中、アガロースマイクロビーズもしくはセラミックカートリッジ上で固定もしくは封入する細胞培養を含む。必要である、かつ／または望ましい場合、ポリペプチドの溶液は、通例のクロマトグラフィー法、例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥセルロース上でのクロマトグラフィーおよび／または（イムノ）アフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。
【０１００】
本明細書において提供する、抗ＣＸＣＲ３抗体またはそのフラグメントをコードする核酸はまた、細菌もしくは酵母のような非哺乳動物細胞、または植物細胞において発現させることができる。この点について、細菌のような、単細胞で非哺乳動物である種々の微生物をまた使用して、本明細書において提供する抗体およびその抗原結合フラグメントを発現させることが可能であることが理解される。すなわち、培地中で増殖または発酵させることが可能である単細胞で非哺乳動物である微生物のことである。適した細菌は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）またはサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）菌株のような腸内細菌科（ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）；枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のようなバシラス科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）；肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）；連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）およびインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）の菌種を含む。細菌中で発現させる場合、ポリペプチドは、封入体の一部となり得ることがさらに理解される。ポリペプチドは、単離、精製し、次いで機能分子に構築しなければならない。
【０１０１】
原核生物に加えて、真核微生物をまた使用することができる。出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）または通常のパン酵母は、真核微生物の中でも最も一般的に用いられるが、他の多数の菌株が、一般的に入手可能である。酵母類（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）における発現では、例えば、プラスミドＹＲｐ７（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら、Ｎａｔｕｒｅ、２８２：３９（１９７９年）；Ｋｉｎｇｓｍａｎら、Ｇｅｎｅ、７：１４１（１９７９年）；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒら、Ｇｅｎｅ、１０：１５７（１９８０年））が一般的に用いられる。このプラスミドは、トリプトファンで増殖する能力を欠く酵母の変異株、例えば、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．４４０７６またはＰＥＰ４−１の選択マーカーをもたらすＴＲＰ１遺伝子を既に含む（Ｊｏｎｅｓ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、８５：１２（１９７７年））。酵母宿主細胞ゲノムの特性としてＴｒｐ１が破壊されていると、トリプトファンの非存在下での増殖による形質転換を検出するのに効果的な環境が生じる。
【０１０２】
医薬製剤および投与方法
本明細書において開示するヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を本明細書において提供する。
【０１０３】
本明細書において提供する抗体またはその抗原結合フラグメントを調製および対象に投与する方法は、公知であるか、または当業者により容易に決定される。抗体またはそのフラグメントの投与経路は、経口、非経口（静脈内、筋肉内、腹腔内、または皮下等）、吸入または局所によるものである。いくつかの実施形態では、本明細書において提供する抗体は、静脈内投与用に製剤化される。いくつかの実施形態では、注射用に適した医薬組成物は、バッファー（例えば、酢酸、リン酸またはクエン酸緩衝液）、界面活性物質（例えば、ポリソルベート）、場合により安定剤（例えば、ヒトアルブミン）等を含む。
【０１０４】
注射使用に適した医薬組成物は、無菌注射用溶液または分散液の即時調製用の、無菌水溶液（この場合は、水溶性）または分散液および無菌粉末を含む。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオールを含む、溶媒または分散媒（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、およびこれらの適した混合物であってもよい。例えば、レシチンのようなコーティング剤を使用することにより、分散液の場合は必要とされる粒子サイズを維持することにより、および界面活性物質を使用することにより、適切な流動性を維持することができる。種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等により、微生物活動の防止を達成することができる。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、糖、マンニトールやソルビトールのような多価アルコール、または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。吸収を遅らせる物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に含むことにより、注射用組成物の持続的吸収をもたらすことができる。
【０１０５】
いかなる場合も、無菌注射用溶液は、活性化合物（例えば、抗体それ自体または他の活性剤と組み合わせて）を必要量、本明細書において列挙する成分のうちの１つまたは組合せとともに適切な溶媒中に組み込み、必要に応じて、その後、濾過滅菌することにより調製することができる。一般に、分散液は、塩基性分散媒および上に列挙した成分のうちの必要とする他の成分を含む無菌媒体中に活性化合物を組み入れることにより調製することができる。無菌注射用溶液の調製用の無菌粉末の場合では、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより、これまでに濾過滅菌したその溶液から活性成分の粉末に加えて任意の追加の所望の成分を得る。注射剤の調製を実行し、アンプル、バッグ、ビン、シリンジまたはバイアルのような容器に充填し、当分野において既知の方法に従って無菌条件下で密封する。このような製品は、好ましくは、関連の組成物が、自己免疫性または腫瘍性の障害を患う、またはその素因を有する対象の治療に有用であることを示す表示または添付文書を有する。
【０１０６】
上記症状の治療のための本明細書において提供する抗体またはその抗原結合フラグメントの用量は、投与方法、標的部位、患者の生理的状態、患者がヒトか動物か、投与される他の薬剤、および治療が予防的か治療的かを含む、多くの種々の要因に応じて変化する。通常、患者はヒトであるが、トランスジェニック哺乳動物を含むヒトでない哺乳動物も治療することができる。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、用量は、例えば、宿主体重の約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、または０．０１〜５ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。
【０１０８】
このような用量を毎日、隔日、毎週または実証的分析により決定した他の任意のスケジュールに従って対象に投与することができる。本明細書において提供する抗体またはその抗原結合フラグメントは、複数回投与することができる。単回投与間の間隔は、例えば、毎日、毎週、毎月または毎年であり得る。間隔はまた、患者におけるポリペプチドまたは標的分子の血中濃度の測定により示されるように不規則であり得る。
【０１０９】
本明細書において提供する抗体またはその抗原結合フラグメントは、場合により、治療（例えば、予防的または治療的）を必要とする障害または症状の治療において使用する他の作用薬と組み合わせて投与することができる。好ましい追加の作用薬は、当分野で認められているものであり、特定の障害のために標準的に投与する。
【０１１０】
ＣＸＣＲ３関連疾患または障害を治療する方法
本明細書において提供するＣＸＣＲ３抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＣＸＣＲ３活性に拮抗するのに有用である。いくつかの実施形態では、抗体および抗原結合フラグメントは、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０および／もしくはＣＸＣＬ１１のような１つもしくはそれ以上のリガンドに結合するＣＸＣＲ３を阻害し；ＣＸＣＲ３＋細胞の例えば炎症部位への遊走、蓄積、動員、もしくは浸潤を阻害し；ならびに／またはＣＸＣＲ３＋細胞を枯渇させる方法において使用する。いくつかの実施形態では、抗体および抗原結合フラグメントは、ＣＸＣＲ３＋細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで枯渇させる方法において使用する。ＣＸＣＲ３＋細胞は、ＣＸＣＲ３＋／ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＸＣＲ３＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびＣＸＣＲ３＋／ＣＤ１９＋Ｂ細胞のサブセットを含むが、これらに限定されない。
【０１１１】
特定の実施形態では、１つまたはそれ以上のＣＸＣＲ３抗体またはその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することによりＣＸＣＲ３関連疾患または障害を治療するための方法を提供する。一実施形態では、Ｔ細胞性自己免疫疾患の増悪を治療する、または減少させる方法を提供する。方法は、本明細書において開示するヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体またはその抗原結合フラグメントを、それを必要とする対象に投与する工程を含み、これによりＴ細胞性自己免疫疾患の増悪を治療する、または減少させる。特定の実施形態では、Ｔ細胞性自己免疫疾患は、初発１型糖尿病である。他の実施形態では、Ｔ細胞性自己免疫疾患は、乾癬である。いくつかの実施形態では、それを必要とする対象は、本明細書に記載するように、ＣＸＣＲ３関連疾患もしくはＴ細胞性自己免疫疾患と診断されている対象を含む、またはＣＸＣＲ３関連疾患もしくはＴ細胞性自己免疫疾患が進行する素因を有する。
【０１１２】
本明細書において提供する方法により治療する対象は、ヒトまたは他の哺乳動物を含むことができる。一実施形態では、対象は、ヒトである。種々の実施形態では、対象は、予防的に、または異常なＣＸＣＲ３活性に関連する任意の症状、もしくはＣＸＣＲ３シグナル伝達の破壊が治療的に有益であり得る任意の症状の発症後に治療することができる。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、対象は、予防的に、またはＴ１Ｄの発症後に治療することができる。いくつかの実施形態では、対象は、本明細書において提供する方法を使用して、Ｔ１Ｄの発症前に予防的に治療することができる。いくつかの実施形態では、初発Ｔ１Ｄを有する対象は、本明細書において提供する方法を使用して治療することができる。
【０１１４】
「初発Ｔ１Ｄを有する対象」は、糖尿病と臨床的に診断されたときの対象の年齢に関係なく（例えば、成人、若年者、胎児、または胎芽対象を含む）、膵臓のβ細胞からのインスリン産生能が減少したが、なお検出可能である任意の対象である。最も典型的には、ヒト対象は、対象が若年者、例えば、０〜１８歳である場合に初発Ｔ１Ｄを有すると臨床的に診断される。特定の実施形態では、初発Ｔ１Ｄを有する対象は、好ましくは、Ｔ１Ｄの最も初期の臨床診断から約６ヶ月以内（例えば、約１日、１週間、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、またはその間の任意の期間内）に治療を受ける。他の実施形態では、対象は、Ｔ１Ｄの最も初期の臨床診断の後、６ヶ月より長く治療を受けてもよく、この場合、対象は、約０．２ｎｍｏｌ／Ｌよりも高いか、または同等の（例えば、少なくとも約０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．８または１．０ｎｍｏｌ／Ｌ）、最低限ではあるが測定可能な血清Ｃペプチドの基礎レベルを維持する。いくつかの実施形態では、治療は、本明細書において開示する抗体のうちの１つまたはそれ以上を含む、１回またはそれ以上の用量の投与を含む。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、対象は、予防的に、または乾癬の発症後に治療することができる。いくつかの実施形態では、対象は、乾癬の発症前に、または乾癬が広がる前に、本明細書において提供する方法を使用して予防的に治療することができる。いくつかの実施形態では、活動性乾癬を有する対象は、本明細書において提供する方法を使用して治療することができる。
【０１１６】
「活動性乾癬を有する対象」は、臨床的に顕著な皮膚、爪、または関節の、乾癬に特徴的な病変を有する任意の対象である。特定の実施形態では、「活動性乾癬を有する対象」は、臨床的に顕著な皮膚の、乾癬に特徴的な病変を有する任意の対象である。特定の実施形態では、「活動性乾癬を有する対象」は、臨床的に顕著な爪の、乾癬に特徴的な病変を有する任意の対象である。特定の実施形態では、「活動性乾癬を有する対象」は、臨床的に顕著な、乾癬に起因し得る関節炎、すなわち、乾癬性関節炎を有する任意の対象である。
【０１１７】
実施例
抗体、物質の組成物、および方法を、以下の実施例によりさらに示す。これらの実施例は、さらなる制限として解釈すべきではない。本出願を通じて引用する、配列表、図ならびにすべての参考文献、特許および公開された特許出願の内容は、参照により本明細書に明示的に組み入れる。
【実施例１】
【０１１８】
ヒト化抗ＣＸＣＲ３モノクローナル抗体の生成
抗ＣＸＣＲ３モノクローナル抗体を国際公開第２０１３／１０９９７４号に記載のように生成した。ヒト化クローン５３モノクローナル抗体を以下に記載のように生成した。
【０１１９】
ＣＸＣＲ３を発現する細胞の枯渇を導くことが可能である、クローン５３のヒト化バージョンを生成した。表４に示すＶＨおよびＶＬ配列を有するヒト化クローン５３モノクローナル抗体を生成した。
【０１２０】
各ヒト化変異体のジャーミナリティ指数スコアを表４に示す。重鎖をＩＧＨＶ３−２３＊０３／ＩＧＨＪ４＊０３生殖系列配列と比較する；軽鎖をＩＧＫＶ１−９＊０１／ＩＧＫＪ２＊０１生殖系列配列と比較する。
【０１２１】
【表５】
2020504744.tif 000006
【０１２２】
本明細書において提供する各ヒト化モノクローナル抗体の結合特性を表５に示す。
【０１２３】
【表６】
2020504744.tif 000007
【０１２４】
表６は、クローン５３（５３）、キメラクローン５３（Ｃｈ５３）およびクローン５３のヒト化バージョン（５３Ｈｕ１−５３Ｈｕ２０）の結合特性およびジャーミナリティを示す。
【０１２５】
【表７】
2020504744.tif 000008
【０１２６】
上記データが示すように、本明細書において提供するヒト化抗体は、結合特性が顕著に向上し、その上、好ましいジャーミナリティ指数を有する。
【実施例２】
【０１２７】
ＣＤＲ最適化
いくつかのＶＨ  ＣＤＲおよび／またはＶＬ  ＣＤＲ変異体を生成した。組換えヒトＣＸＣＲ３に対する結合アビディティを、Ｂｉａｃｏｒｅを使用して測定した。少なくとも５３Ｈｕ３７と同等に強力に結合する変異体を表３に示す。
【実施例３】
【０１２８】
ＣＸＣＲ３−１７３は、枯渇性抗体である。
ハムスター抗マウスＣＸＣＲ３モノクローナル抗体（クローンＣＸＣＲ３−１７３）を前臨床試験において代替抗体として使用した。ＣＸＣＲ３−１７３は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＣＤ４＋Ｔ細胞を枯渇させない遮断抗体としてこれまでに報告されている（Ｕｐｐａｌｕｒｉら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ８６：１３７〜４７（２００８年）を参照）。
【０１２９】
以下のハムスターＣＸＣＲ３−１７３ｍＡｂのＦｃ変異体を調製して、抗体のエフェクター機能を試験した：マウスＩｇＧ１のアグリコシル化Ｎ２９７Ｇ変異体（ＣＸＣＲ３  ｍＩｇＧ１  ａｇｌｙ）；野生型マウスＩｇＧ２ａキメラ（ＣＸＣＲ３  ｍＩｇＧ２ａ  ＷＴ）；枯渇能を抑制するように修飾したマウスＩｇＧ２ａキメラ（ＣＸＣＲ３  ｍＩｇＧ２ａ  Ｄａｂ）；および野生型マウスＩｇＧ３（ＣＸＣＲ３  ｍＩｇＧ３）。
【０１３０】
８〜１０週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、１群当たりｎ＝５）に抗体を単回５ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与し、次いで、２４時間後に血液を採取して、次のマーカーを使用してフローサイトメトリー分析を行った：Ｃ４およびＣＤ８Ｔ細胞は、ＴＣＲａｂ、ＣＤ４およびＣＤ８により；メモリーＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞は、ＴＣＲａｂ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ６２ＬおよびＣＤ４４による。製造者のプロトコルに従ってＣｏｕｎｔ  Ｂｒｉｇｈｔビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用して細胞を定量化し、血中の総細胞／マイクロリットルを判定した。
【０１３１】
総Ｔリンパ球およびＴリンパ球のサブセットに対するゲーティングによる結果を図１に示す。図に示すように、ハムスターＣＸＣＲ３−１７３が、マウスに投与した場合、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋メモリーＴ細胞を枯渇させることが驚くべきことに初めて実証された。
【実施例４】
【０１３２】
ＣＸＣＲ３−１７３のＦｃ変異体のエフェクター機能
Ｂｉａｃｏｒｅ３０００装置を使用して、ＣＸＣＲ３−１７３のＦｃ改変変異体のマウスＦｃγ受容体結合を、抗体捕捉法を使用して評価した。組換えタンパク質Ａ／Ｇ（Ｐｉｅｒｃｅ社）をアミンの化学的性質を利用してＣＭ５センサーチップに共有結合的に固定した。ＣＸＣＲ３−１７３抗体をＨＢＳ−ＥＰバッファー中に５μｇ／ｍＬまで希釈し、タンパク質Ａ／Ｇチップに流量１０μＬ／分で３０秒間注入した。Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社の組換えマウスＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩｂ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、およびＦｃγＩＶ（ＣＤ１６−２）をＨＢＳ−ＥＰバッファー中に３００〜３．７ｎＭまで３倍希釈し、補足した抗体に流量３０μＬ／分で２度毎注入した。表面をグリシン２．０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）で再生した。結合反応をタンパク質Ａ／Ｇ捕捉のＲＵ量に対して正規化した。結果を図２Ａ〜２Ｄに示す。
【０１３３】
図に示すように、野生型マウスＩｇＧ２ａアイソタイプを有するように修飾したハムスターＣＸＣＲ３−１７３は、４つのすべての組換えマウス（ｒｍ）Ｆｃγ受容体に結合するが、ｄＡＢ変異により、この結合が顕著に減少した。野生型マウスＩｇＧ３アイソタイプを有するように修飾したＣＸＣＲ３−１７３はまた、４つのすべての組換えマウスＦｃγ受容体に結合する。オリジナルで未修飾のハムスターＣＸＣＲ３−１７３は、ＩｇＧ２ａアイソタイプ変異体よりも良好にｒｍＦｃγＲＩＩｂおよびｒｍＦｃγＲＩＩＩに結合し、アグリコシル化ｍＩｇＧ１アイソタイプ変異体は、いかなるｒｍＦｃγＲにも結合しない。
【実施例５】
【０１３４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏエフェクター機能
ヒト化抗ＣＸＣＲ３  ｍＡｂおよびそのＦｃ改変バージョンを一連のＡＤＣＣアッセイにおいて調査した。ヒト化抗ＣＸＣＲ３  ｍＡｂのＦｃ改変バージョンを、標準的方法を使用して調製した。脱フコシル化バージョンは、キフネンシンの存在下でヒト化ｍＡｂを発現する細胞を培養することにより調製した。
【０１３５】
一次ヒトＮＫ細胞またはバリン多型（Ｃｏｎｋｗｅｓｔ社）を有するＣＤ１６を過剰発現するＮＫ９．２細胞株をエフェクター細胞として使用し、ヒトＣＸＣＲ３（Ａアイソフォーム）を過剰発現するＣＨＯトランスフェクト細胞を標的細胞として使用してＡＤＣＣアッセイを実行した。
【０１３６】
一次ＮＫ細胞をエフェクターとして使用する場合のアッセイでは、健常ドナーのｌｅｕｋｏｐａｋからＮＫ細胞を精製し、ＩＬ−２により２４時間培養し、次いで、５：１のＥ：Ｔ比で、クロムで一晩標識しておいたＣＨＯヒトＣＸＣＲ３標的細胞とともに播種した。培養物を組織培養インキュベーター内で３時間インキュベートし、その後、１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘで洗浄および溶解した後、上清をガンマカウンター上で読み取った。
【０１３７】
ＮＫ９．２細胞をエフェクターとして使用した場合のアッセイでは、ＮＫ９．２細胞を製造者の推奨に従ってＩＬ−２により２週間増殖させた。アッセイ当日に、ＮＫ９．２細胞（７０，０００細胞）をカルセインＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で標識し、適切に希釈した抗体とともに３０分間インキュベートして抗体を標的細胞上のＣＸＣＲ３に結合させた。ＮＫ細胞を３：１のエフェクター対標的細胞比で播種し、培養物を組織培養インキュベーター内で１時間インキュベートした。培養期間の終わりに細胞をＴｒｉｔｏｎＸ−１００で溶解し、Ｍ５プレートリーダー（励起４９２ｎｍおよび発光５１５ｎｍ）を使用してプレートを読み取った。
【０１３８】
ヒトＩｇＧ１（Ｓｉｇｍａ社）を陰性対照として使用し、ＣＤ５２を過剰発現するＣＨＯ細胞の溶解物を溶解物の陽性対照として作用するアレムツズマブ（モノクローナル抗ＣＤ５２抗体）で処理した。シグナルは、任意蛍光単位（ＡＦＵ）で表す。パーセント細胞傷害作用は、（実験溶解−自然溶解）／（最大溶解−自然溶解）×１００％によって表す。
【０１３９】
ヒトＩｇＧ１  Ｆｃを有するヒト化抗ＣＸＣＲ３  ｍＡｂ  ５３Ｈｕ３７およびＦｃ改変バージョンをＡＤＣＣアッセイにおいて試験した。Ｆｃ改変バージョンＭ１（Ｓ２３９Ｄ／Ｄ３３２Ｅ（ＥＵ表記））、Ｍ２（Ｇ２３６Ａ／Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ（ＥＵ表記）、「ＡＥＦＴＥ」）、およびＭ３（Ｓ２３９Ｄ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ（ＥＵ表記）、「ＤＥＴＥ」）は、ＡＤＣＣまたはＣＤＣ活性の強化を可能とするアミノ酸の変異を含む。第４のＦｃ改変バージョンは、野生型抗体を産生する細胞株をキフネンシンで処理することにより生成した。
【０１４０】
抗ヒトＣＸＣＲ３クローンであるクローン４（ＣＸＣＲ３  ＣＬ４）、クローン１２（ＣＸＣＲ３  ＣＬ１２）、クローン８２（ＣＸＣＲ３  ＣＬ８２）、クローン１３５（ＣＸＣＲ３  ＣＬ１３５）をまた試験した。独立した実験では、異なるエフェクター細胞、エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比、および抗体濃度を用いてアッセイを実行した。代表的結果を図３Ｂおよび図３Ｃに示す。
【０１４１】
図３Ａでは、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３および５３Ｈｕ３７の脱フコシル化バージョンのエフェクター機能について集約する。図３Ｂは、一次ＮＫ細胞をエフェクターとして使用したアッセイの結果を示す。図３Ｃは、ＮＫ９．２細胞をエフェクターとして使用したアッセイの結果を示す。
【実施例６】
【０１４２】
Ｆｃγ受容体結合
Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００装置を使用して、ヒト化抗ＣＸＣＲ３  ｍＡｂ  ５３Ｈｕ３７および５３Ｈｕ３７のＦｃ改変バージョンのヒトおよびマウスＦｃγ受容体結合親和性を評価した。Ｓｉｇｍａ社のタンパク質ＡをＣＭ５シリーズＳチップにアミンの化学的性質を利用して固定した。抗体をタンパク質Ａチップ中に注入し、複数の濃度の組換えヒトおよびマウスＦｃγ受容体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を捕捉抗体中に注入した。広範な濃度の受容体を使用して低親和性結合物から高親和性結合物にまで（１．２ｎＭ〜最大５μＭ）及ぶようにした。各試料を２度毎注入した。結合センサーグラムは、１：１の動態結合モデルに適合させた。定量的結果を図４に集約する。
【０１４３】
図４に示すように、Ｍ１およびＭ３のＦｃ改変バージョンでは、ｈＦｃγＲＩＩＩとｍＦｃγＲＩＶの両方に対する親和性が向上し、Ｍ２では、ｈＦｃγＲＩＩａに対する結合が増加し、キフネンシンで処理した５３Ｈｕ３７は、ｈＦｃγＲＩＩＩおよびｍＦｃγＲＩＶにおいて、Ｆｃ改変バージョンと比較して中程度の増加を示した。
【実施例７】
【０１４４】
カニクイザルに２ｍｇ／ｋｇ体重の５３Ｈｕ３７、Ｍ１変異体、キフネンシンで処理したバージョン（１抗体処置群当たりｎ＝８）、または溶媒対照（ｎ＝６）の単回静脈内注入を行った。事前と、その後注入から１、３、７および１４日後に血液試料を採取し、フローサイトメトリーにより総Ｔ細胞およびＴ細胞サブセットについて分析した。フローサイトメトリーでは、赤血球を溶解し、次のマーカーの抗体で細胞を染色して総Ｔ細胞ならびにメモリーＣＤ４Ｔ細胞およびＣＤ８Ｔ細胞を同定した：ＣＤ３（クローンＳＰ３４−２）、ＣＤ４（クローンＯＫＴ４）、ＣＤ８ａ（クローンＲＰＡ−Ｔ８）、ＣＤ４５ＲＡ（クローン５Ｈ９）、ＣＣＲ７（クローンＧ０４３Ｈ７）、およびＣＸＣＲ３（クローン１Ｃ６）。Ｃｏｕｎｔ  Ｂｒｉｇｈｔビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用して細胞を定量して、細胞／マイクロリットル（細胞／μＬ）を測定した。データは、群の各細胞サブセットの出血前の値の平均パーセントとして経時的に表す。注入後１４日目の各処置群のサブセットから得た脾臓試料の組織学的検査を、抗ヒトＣＸＣＲ３クローン４抗体および適切な二次抗体を使用してＣＸＣＲ３の固定した試料切片を染色することにより行った。結果を図５Ａ〜５Ｃに示す。ペプチドＥＬＩＳＡを使用して、血液試料由来の血清の薬物動態についてもまた、投与した抗体の血中濃度を測定して評価した。
【０１４５】
図に示すように、５３Ｈｕ３７、５３Ｈｕ３７のＭ１バージョン、およびＫｉｆ処理５３Ｈｕ３７により、エフェクターメモリーＣＤ４Ｔ細胞が減少し、５３Ｈｕ３７、Ｈｕ３７のＭ１バージョン、およびＫｉｆ処理５３Ｈｕ３７により、エフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞が減少した。さらに、５３Ｈｕ３７のＭ１バージョンおよびＫｉｆ処理５３Ｈｕ３７により、抗体の単回静脈内注入から１４日後に脾臓においてＣＸＣＲ３染色が劇的に減少した。
【実施例８】
【０１４６】
生化学的分析
熱安定性、せん断応力およびウイルス不活化に対する安定性、凍結融解ストレスに対する安定性、撹拌ストレスに対する安定性、およびｐＨ安定性を５３Ｈｕ３７、Ｍ１バージョン、およびキフネンシンで処理した５３Ｈｕ３７について測定した。
【０１４７】
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）
試料をハイスループットＶＰ−ＤＳＣ（Ｍｉｃｒｏｃａｌ社）で分析した。試料を対応するバッファーを用いて約０．５ｍｇ／ｍＬまで希釈し、９６ウェルプレート上にロードした。スキャンパラメータは、２５℃の開始温度および１００℃の終了温度で構成した。２００℃／ｈのスキャン速度を使用した。
【０１４８】
濁度
３４０〜３６０ｎｍにおける５ｎｍ刻みの試料吸光度をＳｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｐｌｕｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社）上で測定し、値を平均して最終濁度測定値を得た。９６ウェルのＵＶ平底プレートを物質１５０〜２００μＬに使用した。試料添加前にプレートをプレ読取りし、パスチェックを試料値に適用した。Ｂｒｉｇｉｔｔｅ  Ｅｃｋｈａｒｄｔによる「Ａ  Ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｔｏ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ  Ｖｉｓｕａｌ  Ａｐｐｅａｒａｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ」、Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｖｏｌ．４８、Ｎｏ．２  １９９４年３月〜４月に基づいて、試料値を濁度基準のＵＶ吸光度から得た値と比較して、濁度の程度を分類した。
【０１４９】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
ＨＰ１１００または１２００シリーズシステムには、ＴＳＫ  ＳＷＸＬサイズ排除カラムに加えてＳＷＸＬガードカラムを装備していた。２０ｍＭのリン酸ナトリウム、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０の移動相を使用して試料を３５分間実行した。流量は０．５ｍＬ／分を使用した。５０μｇの注入を実行し、ＵＶシグナルを２８０ｎｍでモニターした。
【０１５０】
熱による相対凝集傾向（ＴＩ−ＲＡＰ）
抗ヒトＣＸＣＲ３抗体（個別の抗体または混合物）０．２ｍｇ／ｍＬをＰＢＳバッファーおよび１０ｍＭのヒスチジンおよび９％のスクロースバッファー中、５℃（対照）、６４℃、６７℃、７０℃または７３℃で１０分間インキュベートすることにより、温度による凝集を生じさせた。熱インキュベーションの後、試料を７０００×ｇ、５℃で２分間遠心分離して不溶性タンパク質の沈殿物を除去し、上清をカチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）により分析した。可溶性モノマーのパーセント（および相対凝集傾向）は、熱ストレスを与えた試料のクロマトグラフのピーク面積を対照（５℃）試料のピーク面積を使用して正規化することにより算出した。
【０１５１】
撹拌による相対凝集傾向（ＡＩ−ＲＡＰ）
撹拌による相対凝集傾向に関しては、最終タンパク質濃度の抗ヒトＣＸＣＲ３抗体０．２ｍｇ／ｍＬをＰＢＳバッファーならびに１０ｍＭのヒスチジンならびに０％および０．０１％のポリソルベート８０を有する９％のスクロースバッファー中に含む５℃の溶液を厳しい撹拌ストレスに５℃で供した。抗ヒトＣＸＣＲ３抗体の溶液を、ＶＸ−２５００Ｍｕｌｔｉ−Ｔｕｂｅ  Ｖｏｒｔｅｘｅｒ（ＶＷＲ社、ウェストチェスター、ＰＡ）により最高速度で２４時間の総持続時間、撹拌した。
【０１５２】
ＣＥＸ分析用に試料の小アリコートを取り出すことにより、種々の時点を試験期間中にわたって分析した。試料のアリコートを７０００×ｇ（５℃）で２分間遠心分離して不溶性タンパク質の沈殿物を除去し、上清をＣＥＸにより分析した。可溶性モノマーのパーセント（および相対凝集傾向）は、凝集した試料のクロマトグラフのピーク面積を対照（０時間）試料のピーク面積を使用して正規化することにより算出した。
【０１５３】
カチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）
ＣＥＸ分析は、Ａｇｉｌｅｎｔ  １２９０  ｉｎｆｉｎｉｔｙ  ＨＰＬＣシステム上でＰｒｏＰａｃ  ＷＣＸ−１０分析カラム（弱カチオン交換、４×２５０ｍｍ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用して、２５℃で実行した。タンパク質試料２０μｇをカラム上にロードし、流量０．８ｍＬ／分で分析した。カラムは、バッファーＡ（２０ｍＭの酢酸ナトリウム、０．００２５％のアジ化ナトリウム、ｐＨ５．２）で平衡化し、タンパク質をバッファーＢ（２０ｍＭの酢酸ナトリウム、１Ｍの塩化ナトリウム、０．００２５％のアジ化ナトリウム、ｐＨ５．２）の直線勾配０〜１００％により４０分超溶出した。吸光度を２８０ｎｍで測定し、２８０ｎｍでの吸光度のピークを積分してタンパク質ピーク面積を判定した。
【０１５４】
実験計画
ｐＨ／温度ストレス
各クローン由来の物質の一部を２０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ５．０およびリン酸ナトリウムｐＨ７．０中にＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社ＰＮ６６８１０）を使用して透析した。対応するバッファーを使用して、この物質を希釈し、Ｍｉｌｌｅｘ  ＧＶフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社ＰＮ  ＳＬＧＶ０３３ＲＢ）を使用して約２ｍｇ／ｍＬまで濾過した。両リン酸ナトリウムｐＨ５およびｐＨ７中の試料を試験の３および５週間前に３７℃で保存した。
【０１５５】
凍結融解ストレス
指示する抗ヒトＣＸＣＲ３抗体を２０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ６．０中にＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社ＰＮ６６８１０）を使用して透析した。対応するバッファーを使用して、この物質を希釈し、Ｍｉｌｌｅｘ  ＧＶフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社ＰＮ  ＳＬＧＶ０３３ＲＢ）を使用して約１ｍｇ／ｍＬまで濾過した。凍結融解ストレス試料を−８０℃で凍結し、室温で合計５回融解した。１ないし３凍結融解サイクルの後、物質を除去して選択したアッセイにより試験した。最後の凍結融解後に分析的な一連の試験を実行した。
【０１５６】
せん断応力
抗体試料を２０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ６．０中にＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社ＰＮ６６８１０）を使用して透析した。対応するバッファーを使用して、この物質を希釈し、Ｍｉｌｌｅｘ  ＧＶフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社ＰＮ  ＳＬＧＶ０３３ＲＢ）を使用して約１ｍｇ／ｍＬまで濾過した。せん断応力試料を２００μＬのピペットで合計５０回繰り返し滴下した。
【０１５７】
偽ウイルス不活化
抗体試料を２０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ６．０中にＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社ＰＮ６６８１０）を使用して透析した。対応するバッファーを使用して、この物質を希釈し、Ｍｉｌｌｅｘ  ＧＶフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社ＰＮ  ＳＬＧＶ０３３ＲＢ）を使用して約１ｍｇ／ｍＬまで濾過した。ウイルス不活化試料を１ＮのＨＣｌでｐＨ３．５にし、室温で１００分間そのｐＨに保持した。保持期間の後、１ＮのＮａＯＨを使用して試料をｐＨ７．２に戻し、１００分間保持した。次いで、１ＮのＮＣｌを使用して試料をｐＨ６．０にして試験した。
【０１５８】
結果
示差走査熱量測定：
Ｍ１バージョン（Ｄ／Ｅ変異体）は、Ｋｉｆバージョンよりもわずかに不安定であり、次いでこのＫｉｆバージョンは、５３Ｈｕ３７よりもわずかに不安定であることが見出された。
【０１５９】
せん断応力：
Ｍ１バージョン（Ｄ／Ｅ変異体）は、５３Ｈｕ３７およびＫｉｆバージョンよりもわずかに不安定であり、後者の２つは、ほぼ等しく安定であることが見出された。
【０１６０】
ウイルス不活化ストレス：
Ｍ１バージョン（Ｄ／Ｅ変異体）は、Ｋｉｆバージョンよりも安定であり、この両方は、５３Ｈｕ３７よりも不安定であることが見出された。
【０１６１】
凍結融解ストレス：
Ｍ１バージョン（Ｄ／Ｅ変異体）、Ｋｉｆバージョン、および５３Ｈｕ３７は、ほぼ等価であることが見出された。
【０１６２】
撹拌による相対凝集傾向：
抗体のすべてのバージョンの約８０パーセントは、撹拌から２時間以内に沈殿し、ｐＨ５．５でではあるが、Ｍ１バージョン（Ｄ／Ｅ変異体）は、他の２つのバージョンよりも相対的に安定であった。
【０１６３】
凝集体の形成：
ｐＨ５．０の管理（非加速）条件下では、Ｍ１バージョン（Ｄ／Ｅ変異体）および５３Ｈｕ３７は、５週間にわたって本質的に安定であったが、Ｋｉｆバージョンは、乳白光を発した；これと同じパターンは、加速条件下で見出された。ｐＨ７．０の管理（非加速）条件下では、抗体の３つのバージョンは、５週間にわたってほぼ同じであった。加速条件下では、ＤＥ変異体は、５３Ｈｕ３７よりもわずかに安定し、次いでこの５３Ｈｕ３７は、Ｋｉｆバージョンよりも安定であった。
【０１６４】
前述の実施例は、例示することを意図するものであり、決して本開示を制限するものではない。開示する化合物および方法の他の実施形態は、本明細書において開示する化合物および方法の仕様および実施を考慮すれば当業者に明らかとなろう。
【図１】
2020504744.tif 000009
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
2020504744.tif 000012
【図２Ｄ】
2020504744.tif 000013
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
2020504744.tif 000019
【図６−１】
2020504744.tif 000020
【図６−２】
2020504744.tif 000021
【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図６−６】
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【図６−７】
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【図６−８】
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【図６−９】
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【図６−１０】
2020504744.tif 000029
【図６−１１】
2020504744.tif 000030
【図６−１２】
2020504744.tif 000031
【図６−１３】
2020504744.tif 000032
【配列表】
2020504744000001.app
【国際調査報告】
2020504744.tif 000033
2020504744.tif 000034
2020504744.tif 000035
2020504744.tif 000036
2020504744.tif 000037