(57)【要約】本発明は、対象から回収されたＣＳＦ及び血漿サンプルにおけるタウ、ならびに他のタンパク質、ペプチドフラグメント、及びプロテオフォームの絶対濃度を測定するための方法を提供する。そのような生体分子は、１つまたは複数の神経系及び神経変性の疾患または障害に関わり得る。治療剤が、中枢神経系に由来する生体分子のＣＳＦまたは血漿濃度に影響を及ぼすかどうかを判定するための方法も提供される。本発明の方法を実施するためのキットも提供される。2020511668.tif 000008
2020511668.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
安定同位体標識されたタウタンパク質を定量用内部標準物質として用いる段階、及び標識されていないタウタンパク質対標識されたタウタンパク質の比率を検量線に関連付けして、サンプルにおけるタウタンパク質の濃度の測定を可能にする段階を含む、サンプルにおけるタウタンパク質またはそのフラグメントの量を測定するための方法。
【請求項２】
前記サンプルは、ＣＳＦ、血液、または血漿サンプルである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記同位体は、２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、３３Ｓ、３４Ｓ、及び３６Ｓからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記同位体標識されたタウタンパク質は１５Ｎ標識されたタウである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
測定することは質量分析法による分析を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記サンプル中の前記タウタンパク質を消化酵素で消化する段階をさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記酵素はトリプシンである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記消化する段階は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８〜８５からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するタウタンパク質フラグメントを生成する、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
ａ）安定同位体標識されたタウタンパク質またはそのフラグメント；及び
ｂ）サンプルからタウタンパク質を単離しかつ任意で前記タウタンパク質を消化するための、１種または複数種の試薬
を含む、キット。
【請求項１０】
前記同位体は、２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、３３Ｓ、３４Ｓ、及び３６Ｓからなる群より選択される、請求項９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下、２０１７年２月１０日に出願された米国特許出願第６２／４５７，７１５号、２０１７年３月１７日に出願された米国特許出願第６２／４７３，２１２号、及び２０１７年５月２日に出願された米国特許出願第６２／５００，３４４号の優先権の恩典を主張するものであり、その全内容はすべて、参照によりその全体として本明細書に組み入れられる。
【０００２】
配列表の組み入れ
添付の配列表における資料は、本出願の参照により本明細書によって組み入れられる。Ｃ２Ｎ１１４０＿３ＷＯ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇという名前の添付の配列表テキストファイルは、２０１８年２月９日に作成され、３６ｋｂである。当該ファイルは、Ｗｉｎｄｏｗｓ  ＯＳを用いるコンピューターでＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｏｒｄを用いて査定され得る。
【０００３】
発明の分野
本発明は、概して、神経系及び神経変性の疾患、障害、及び関連過程の診断及び治療のための分析法に関する。
【背景技術】
【０００４】
背景情報
アルツハイマー病（ＡＤ）は、認知症の最も一般的な原因であり、ますます増加する公衆衛生問題である。それは、現在、米国で５００万人の人々を苦しめていると推定され、２０５０年までに１３００万人へと増加することが予想される（Ｈｅｒｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ，２００１，Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  Ｄｉｓ．Ａｓｓｏｃ．Ｄｉｓｏｒｄ．１５（４）：１６９−１７３（非特許文献１））。ＡＤは、他の中枢神経系（ＣＮＳ）変性疾患と同様に、タンパク質の産生、蓄積、及びクリアランスの乱れを特徴とする。ＡＤにおいて、アミロイド−ベータ（Ａβ）というタンパク質の代謝の調節異常は、当該疾患を有する人の脳におけるアミロイドプラークという形態でのこのタンパク質の大量の集積によって示される。加えて、タウタンパク質は、タウのもつれという形態で脳内に集積する。ＡＤは、記憶、認知機能、及び最終的に自立の喪失、ならびに死につながる。当該疾患は、患者、家族、及び社会に人的及び金銭的な重い犠牲を強いる。この疾患の重症度及び集団におけるますます増加する罹患率が理由で、より優れた診断法及び治療が開発されることが急務である。
【０００５】
現在、症状を改変するいくつかの医薬は存在するが、疾患修飾性治療は存在しない。疾患修飾性治療は、不可逆的な脳損傷の発症前に与えられた場合、最も有効である可能性が高い。しかしながら、ＡＤの臨床診断がなされる時までに、広範囲に及ぶニューロン喪失がすでに生じている（Ｐｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．２００１，Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．５８（９）：１３９５−１４０２（非特許文献２））。したがって、ＡＤを発症する危険性がある人を同定する手法は、ＡＤの発症を予防するまたは遅延させるのに最も有用であろう。現在、臨床症状の発症前にＡＤにおいて生じる病態生理学的変化を同定する手段も、当該疾患の発症を予防し得るもしくは進行を遅らせ得る治療の効果を有効に測定する手段も存在しない。
【０００６】
したがって、ヒトの血液ならびに脳脊髄液（ＣＳＦ）中の診断用生体分子を定量化するための高感度で正確でかつ再現性のある方法の必要性がある。絶対定量に用いられる以前の技術には、捕捉する抗体を用いて濃度を測定する酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）が含まれる。しかしながら、ＥＬＩＳＡは総濃度を定量するかまたは定量のためにアイソフォーム特異的抗体に依存し、ほとんどは、アッセイあたり１つのみの種の濃度を測定するために用いられ得る。ＥＬＩＳＡアッセイに用いられる抗体は、それらが結合するタンパク質種及びタンパク質の立体構造に高度に特異的でなければならず、関心対象のタンパク質への２種の抗体の結合に依存することは、ＥＬＩＳＡアッセイからの報告されるタンパク質濃度のアッセイ間及びアッセイ内の高い変動性につながり得る。そのため、ヒトから獲得された血漿もしくは血清またはＣＳＦ中の１種または複数種の神経変性障害特異的なタンパク質またはタンパク質形態の絶対濃度を測定するための方法が必要とされ、当該タンパク質または生体分子は、疾患の診断及び／または進行と関連付けされる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｈｅｒｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ，２００１，Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  Ｄｉｓ．Ａｓｓｏｃ．Ｄｉｓｏｒｄ．１５（４）：１６９−１７３
【非特許文献２】Ｐｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．２００１，Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．５８（９）：１３９５−１４０２
【発明の概要】
【０００８】
本発明の様々な態様には、対象のサンプルにおける１種または複数種の生体分子の濃度を算出するための方法の提供がある。方法は、対象由来のサンプルと定量用内部標準物質とを接触させる段階を含み、当該定量用内部標準物質は、既知の濃度の関心対象の標識された生体分子である。定量用標準物質は、サンプル中に存在する関心対象の内因性生体分子の単離前またはサンプルからの内因性生体分子の単離後のいずれかに、対象由来のサンプルと接触し得る。方法は、血漿、血清、またはＣＳＦサンプルから関心対象の内因性生体分子を単離する段階、及びサンプルにおける標識された定量用内部標準物質対標識されていない内因性生体分子の比率を決定する段階であって、それによってそれを用いてサンプル中の内因性生体分子の濃度を算出する、段階をさらに含む。１つの実施形態において、方法は、算出濃度を検量線に対して正規化する段階をさらに含み、当該検量線は、内因性生体分子対定量用標準物質の２つまたはそれを上回る数の比率を決定することによって作り出され、そこで当該内因性生体分子の濃度がわかる。
【０００９】
別の態様において、本発明は、関心対象の内因性タンパク質またはプロテオフォームに由来しかつヒトの血漿、血清、またはＣＳＦ中に存在する１種または複数種のペプチドフラグメントの濃度を定量化する方法を提供する。方法は、内因性タンパク質またはペプチドフラグメントまたはプロテオフォーム濃度を変化させ得る任意の治療的介入（薬物、化学物質、行動）に対象が曝露される前及び／または後に、対象から血漿、血清、またはＣＳＦサンプルまたは組織を獲得する段階をさらに含む。次いで、サンプルを定量用内部標準物質と接触させ、当該定量用内部標準物質は、既知の濃度の標識された生体分子である。上記のように、関心対象の内因性タンパク質またはペプチドフラグメントまたはプロテオフォームの濃度の、介入によりもたらされた変化を算出することは、サンプルにおける標識された定量用内部標準物質対標識されていない内因性生体分子の比率によって決定される。工程の別の提供は、対象における内因性タンパク質、ペプチドフラグメント、またはプロテオフォーム濃度の変化と、適切な対照の値または対象とを比較することを含み、当該対照の値または対象からの変化は、治療的介入が、対象の血漿、血清、またはＣＳＦにおける当該タンパク質、ペプチドフラグメント、またはプロテオフォーム濃度にどのくらい影響を及ぼすかを示す。
【００１０】
さらに別の実施形態において、内因性の及び標識されたタンパク質、ペプチドフラグメント、またはプロテオフォームの算出濃度は、それらの個々の検量線のそれぞれに対して正規化され、当該検量線は、標識されていない内因性生体分子及び標識された生体分子対定量用内部標準物質の比率を決定することによって作り出され、そこで標識されていない内因性生体分子及び標識された生体分子の濃度がわかる。
【００１１】
別の態様において、本発明は、本発明の方法を実施するためのキットを提供する。１つの実施形態において、キットは、対象における神経系または神経変性疾患の進行または治療を診断する及び／またはモニターするために提供される。キットは、対象から生物学的サンプルを一定の時間間隔で獲得するための手段を含む。ある特定の実施形態において、キットは、凍結するのに及び適切な分析実験室に運搬するのに適切な状態にするように生物学的サンプルを処理するための指示書も含む。ある特定の実施形態において、キットは、標識された関心対象の内因性タンパク質、ペプチドフラグメント、またはプロテオフォーム対標識されていない関心対象の内因性タンパク質、ペプチドフラグメント、またはプロテオフォームの比率を経時的に検出する及び決定するためにサンプルを調製するための、ならびに当該内因性タンパク質、ペプチドフラグメント、またはプロテオフォームの濃度を算出するための指示書も含む。１つの実施形態において、指示書は、算出濃度と、本明細書において開示されるある特定の標準物質及び／または対照とを比較するための方法を開示する。
【００１２】
一部の態様において、定量用内部標準物質は、２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、３３Ｓ、３４Ｓ、及び３６Ｓからなる群より選択される非放射性同位体を含有する。１つの実施形態において、標識部分は、４４１個のアミノ酸残基を有する均一に標識された１５Ｎ−タウである。一部の態様において、内因性生体分子は、タウ等、中枢神経系に存在するタンパク質、ペプチドフラグメント、またはプロテオフォームであり得る。２種またはそれを上回る種類の生体分子がアッセイされる本発明の態様において、生体分子は、同じタンパク質のアイソフォームであり得る。そのため、１つの実施形態において、生体分子は、タウ−４Ｒ２Ｎ、タウ−４Ｒ１Ｎ、タウ−４Ｒ０Ｎ、タウ−３Ｒ２Ｎ、タウ−３Ｒ１Ｎ、タウ−３Ｒ０Ｎのうちの１つまたは複数であり得る。
【００１３】
本発明の他の態様及び特徴は、下でより詳細に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１Ａは、どのように１５Ｎ−タウ−４４１が定量用内部標準物質として用いられ、既知の濃度で生物学的サンプルに添加されるか、どのように定量用内部標準物質及び内因性タンパク質がトリプシンまたは別のタンパク質分解酵素で消化されて、由来するタンパク質に特異的であるペプチドフラグメントを形成するかについての概観を示している。内因性タンパク質及び１５Ｎ−タウ−４４１タンパク質に由来するペプチドの質量、アミノ酸配列、及び相対存在量は、質量分析計を用いて決定される。内因性タウに由来する各ペプチドの濃度は、１５Ｎ−タウ−４４１に由来する対応する１５Ｎ標識されたペプチドに関するシグナル強度に対する比率として表現される、各ペプチドに関する質量分析計シグナル強度によって決定される。種々のしかしながら既知の分量の内因性タウ及び１５Ｎ−タウ−４４１を含有し、かつ生物学的サンプルと精確に同じく処理されている一連の標準物質を用いて、定量用検量線を作り出す。当業者に対し、図１Ｂは、選択内因性タウペプチドから獲得されたマスフラグメンテーションパターン、１５Ｎ−タウ−４４１定量用内部標準物質に存在する対応するペプチドから獲得されたマスフラグメンテーションパターン、ならびにいくつかの内因性の及び１５Ｎ標識されたフラグメントに関して質量分析によって獲得された相対存在量（ガウスピークまたはシグナル）（ｙ−及びａ−イオン）を詳述している。この態様において、マスフラグメンテーションパターンは、このタウペプチドに対するアミノ酸配列を特異的に同定し、既知の濃度の１５Ｎ標識されたフラグメントに関する相対存在量シグナルを用いて、内因性１４Ｎ−タウペプチドの濃度を算出する。
【図２】サンプル及び標準物質の調製、処理、及び分析ワークフロー全体を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
発明の詳細な説明
本発明は、一部には、安定同位体標識されたタンパク質及びペプチドが、それらの対応する内因性タンパク質及びペプチドよりもわずかに大きな既知の分子量を有するが、それらのより大きな質量を除けば、それらは同一の物理的または化学的特性を有し、質量分析計において同じように挙動し、そのことがそれらを理想的な定量用内部標準物質にするという原理に基づく。本明細書において提供される技法を用いて、内因性タンパク質、ペプチドフラグメント、及びプロテオフォームを定量化し、それを用いて、神経系または神経変性障害を有するまたは発症する危険性がある対象を診断し得る及び／または治療し得る。したがって、本発明は、対象における関心対象の１種または複数種のタンパク質、ペプチドフラグメント、及びプロテオフォームの濃度を算出するのに有用な方法及びキットを提供する。
【００１６】
本発明は、治療的介入が、対象におけるタンパク質、ペプチドフラグメント、及びプロテオフォームの濃度に影響を及ぼすかどうかを査定する方法も提供し、当該生体分子は神経系または神経変性疾患に関連している。したがって、本方法を用いて、治療的介入の最適な用量及び／または最適な投薬レジメンを決定し得る。加えて、本方法を用いて、どの対象が特定の治療的介入により良好に応答するかを判定し得る。例えば、高いタンパク質、ペプチドフラグメント、プロテオフォーム濃度を有する対象は、１種の治療剤に良好に応答し得るが、一方で通常の濃度を有する対象は、神経変性障害を発生させる危険性がより低い可能性があり、実験的な治療剤または介入の臨床試験に登録するのに適格ではない。あるいは、１つの特定の遺伝子型またはプロテオタイプを有する対象は、異なる遺伝子型またはプロテオタイプを有する人よりも特定の治療剤により良好に応答し得る。最後に、アイソフォーム特異的な定量を可能にすることによって、本方法を用いて、治療剤が、同じタンパク質の一方のアイソフォームのもう一方のアイソフォームに対する相対濃度を変調させ得るかどうかを判定し得る。
【００１７】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用するとき、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」という単数形は、文脈上別様にはっきりと述べられていない限り、複数形の指示対象を含む。ゆえに、例えば、「方法（ｔｈｅ  ｍｅｔｈｏｄ）」への言及は、本明細書において記載されるタイプの１つまたは複数の方法及び／またはステップを含み、それは、本開示等を読めば当業者に明白になるであろう。
【００１８】
別様に定義されていない限り、本明細書において用いられるすべての技術的及び科学的な用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書において記載されるものと類似のまたは等価の任意の方法及び材料が本発明の実践または試験において用いられ得るものの、好ましい方法及び材料がここで記載される。
【００１９】
本明細書において用いられる「対象」という用語は、本方法が実施される任意の個体または患者を指す。一般的に、対象はヒトであるが、とはいえ当業者によって解されるであろうように、対象は動物であり得る。ゆえに、齧歯類（マウス、ラット、ハムスター、及びモルモットを含む）、ネコ、イヌ、ウサギ等の哺乳類を含めた他の動物、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ等を含めた家畜、及び霊長類（サル、チンパンジー、オランウータン、及びゴリラを含む）は、対象の定義の中に含まれる。加えて、「対象」という用語は細胞の培養物を指し得、本発明の方法は、例えば治療剤の効力を査定するためにインビトロで実施される。
【００２０】
本明細書において使用するとき、「サンプル」及び「生物学的サンプル」という用語は、本発明によって提供される方法に適切な任意のサンプルを指す。本方法において用いられる細胞のサンプルは、対象由来の組織サンプルもしくは体液から、または生検処置（例えば、針生検）もしくは外科処置によって獲得された組織から獲得され得る。ある特定の実施形態において、本発明の生物学的サンプルは、体液、例えば脳脊髄液（ＣＳＦ）、血液、血漿、尿、唾液、及び涙液のサンプルである。
【００２１】
本明細書において開示されるように、安定同位体標識された定量用内部標準物質は、それらの内因性対応物よりもわずかに高い分子量を有するが、当該タンパク質、ペプチドフラグメント、及びプロテオフォームの物理的または化学的特性を変更しない。ゆえに、これらの生体分子及びそれらの安定同位体標識された対応物は、同一の形式で抗体に結合し、液体クロマトグラフィーカラムから溶出すると考えられる。質量分析計等の高感度機器は、標識された及び標識されていない生体分子間での質量のわずかな差を測定し得る能力を提供する。
【００２２】
したがって、１つの態様において、本発明は、対象における生体分子の濃度を算出する方法を提供する。１つの実施形態において、方法は、対象由来のサンプルと定量用内部標準物質とを接触させることを含む。本明細書において使用するとき、「定量用内部標準物質」とは、既知の濃度の安定同位体標識された生体分子を指し、それは、サンプル中に存在し得る標識されたまたは標識されていない他の生体分子とは異なる分子量を有する。その後、質量分析計、タンデム質量分析計、またはその両方の組み合わせ等の高感度測定装置を用いて、標識された対標識されていない生体分子の比率を測定する。標識された及び標識されていない生体分子の物理的特性は同一であるため、質量分析計によって測定される比率は、元のサンプルにおける比率と同一である。ゆえに、それぞれが固有の同位体標識で標識された既知の量の１種または複数種の生体分子を添加することによって、本発明は、異なる同位体組成を有するそれら生体分子の量を定量し得る能力を提供する。
【００２３】
本明細書において使用するとき、「生体分子」という用語は、生きた生物における任意の有機分子を指す。例示的な生体分子は、タンパク質、ペプチド、プロテオフォームを含むが、それらに限定されるわけではない。１つの実施形態において、生体分子は、対象の中枢神経系（ＣＮＳ）において合成されるタンパク質等のペプチドである。本発明の方法によって測定され得る例示的なタンパク質は、タウ、及びホスホ−タウ（アルツハイマー病に関連する）等の翻訳後修飾されたものを含むが、それらに限定されるわけではない。１つの実施形態において、そのインビボ濃度が測定されるタンパク質は、タウまたはその変種もしくはアイソフォームであり得る。その濃度が測定され得るタウの例示的なアイソフォームは、以下のタウのリン酸化されたまたはリン酸化されていないアイソフォーム：タウ−４Ｒ２Ｎ、タウ−４Ｒ１Ｎ、タウ−４Ｒ０Ｎ、タウ−３Ｒ２Ｎ、タウ−３Ｒ１Ｎ、タウ−３Ｒ０Ｎを含むが、それらに限定されるわけではない。以下は、タウの６種の異なるアイソフォームの多重配列アラインメントを示している。
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【００２４】
例としてであり限定ではなく、タウのいくつかの固有のアイソフォームはＣＳＦ及び血漿中に存在すること、ならびにこれらのアイソフォームは、リン酸化を含むいくつかの手法で翻訳後修飾され得ることが知られている。タウのトリプシン消化は、各アイソフォームに固有であってもなくてもよいいくつかのペプチドを産出する、表１を参照されたい。ゆえに、これらペプチドの一部についての定量は、元の生物学的流体におけるこれらアイソフォームの濃度の算出を可能にする。
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【００２５】
そのため、方法は、エンドプロテアーゼ（例えば、トリプシン、ＬｙｓＮ、またはＶ８プロテアーゼ）による消化後に産生されるフラグメント等、タウの様々なアイソフォームの濃度を測定し得る能力を提供する。タウアイソフォームの例示的なフラグメントは、Ｎ末領域（２Ｎ／１Ｎ／０Ｎ）及びＣ末反復領域（４Ｒ／３Ｒ）等、種々のアイソフォーム及びそれらの境界の間で異なるタウの領域を含むが、それらに限定されるわけではない。
【００２６】
本明細書において使用するとき、「核酸」という用語は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、その一本鎖、二本鎖、または三本鎖、及び任意の化学的修飾を指す。核酸の事実上任意の修飾が企図される。「核酸分子」は、長さが１０、２０、３０、４０、５０、６０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、７５，０００、１００，０００、１５０，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、１，５００，０００、２，０００，０００、５，０００，０００個、またはさらにそれを上回る数の塩基から最高で全長の染色体ＤＮＡ分子まで、ほぼ任意の長さのものであり得る。
【００２７】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、ペプチド結合または改変されたペプチド結合、すなわちペプチドイソスターによって互いに接合した２個またはそれを上回る数のアミノ酸残基を指すために本明細書において互換可能に用いられる。当該用語は、１個または複数個のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工の化学的模倣体であるアミノ酸ポリマーに、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマー、改変された残基を含有するもの、及び天然に存在しないアミノ酸ポリマーに適用される。「ポリエプチド（Ｐｏｌｙｅｐｔｉｄｅ）」とは、一般にペプチド、オリゴペプチド、またはオリゴマーと称される短い鎖、及び一般的にタンパク質と称されるより長い鎖の両方を指す。ポリペプチドは、２０種の遺伝子コードアミノ酸以外のアミノ酸を含有し得る。同様に、「タンパク質」とは、少なくとも２個の共有結合で付着したアミノ酸を指し、それはタンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、及びペプチドを含む。タンパク質は、天然に存在するアミノ酸及びペプチド結合、または合成ペプチド模倣構造体から作製され得る。ゆえに、本明細書において用いられる「アミノ酸」または「ペプチド残基」は、天然に存在する及び合成のアミノ酸の両方を意味する。例えば、ホモ−フェニルアラニン、シトルリン、及びノレロイシン（ｎｏｒｅｌｅｕｃｉｎｅ）は、本発明の目的上、アミノ酸と見なされる。「アミノ酸」には、プロリン及びヒドロキシプロリン等のイミノ酸残基も含まれる。側鎖は、（Ｒ）または（Ｓ）配置のいずれかにあり得る。
【００２８】
いくつかの異なる部分を用いて、関心対象の生体分子を標識し得る。一般的に言えば、本発明の方法において利用される２つのタイプの標識化部分は、放射性同位体及び非放射性（安定）同位体である。１つの実施形態において、非放射性同位体が用いられ得、質量分析によって測定され得る。好ましい安定同位体には、デューテリウム（２Ｈ）、１３Ｃ、１５Ｎ、１７または１８Ｏ、及び３３、３４、または３６Ｓが含まれるが、広く行き渡った天然形態において見られるよりも多いまたは少ない中性子によって原子の質量を変化させるいくつかの他の安定同位体も有効であろうことが認識されている。適切な標識は、一般的に、検討中の生体分子の質量を変化させ、それによりそれは質量分析計で検出され得る。１つの実施形態において、測定される対象となる生体分子はペプチドまたはタンパク質であり得、標識部分は、非放射性同位体（例えば、１３Ｃ）を含むアミノ酸であり得る。別の実施形態において、測定される対象となる生体分子は核酸であり得、標識部分は、非放射性同位体（例えば、１５Ｎ）を含むヌクレオシド三リン酸であり得る。あるいは、放射性同位体が用いられ得、標識された生体分子はシンチレーションカウンターで（または、核シンチグラフィーにより）、ならびに質量分析計によって測定され得る。１種または複数種の標識部分が同時にまたは順々に用いられ得る。
【００２９】
ゆえに、１つの実施形態において、本方法を採用してタンパク質の濃度を測定する場合、標識部分は典型的にアミノ酸である。当業者であれば、いくつかのアミノ酸を用いて、生体分子の標識を提供し得ることを解するであろう。一般的に、アミノ酸の選定は、多様な因子に基づく。例えば、（１）当該アミノ酸は、一般的に、関心対象のタンパク質またはペプチドの少なくとも１個の残基内に存在する。（２）当該アミノ酸は、一般的に、タンパク質産生の部位に達し得、組織または細胞の壁を迅速に平衡化し得る。及び（３）所望のアミノ酸の商業的入手可能性（すなわち、一部のアミノ酸は、他のものよりも、製造するのがはるかに高価であるまたはより困難である）。
【００３０】
１つの実施形態において、アミノ酸は必須アミノ酸（身体によって産生されない）であり、それによりより高いパーセントの標識化が達成され得る。別の実施形態において、アミノ酸は非必須アミノ酸である。例示的なアミノ酸は、ロイシン、イソロイシン、及びフェニルアラニンを含むが、それらに限定されるわけではない。そのため、１つの実施形態において、標識アミノ酸は、１５Ｎ−標識されたアミノ酸、ｘ＝１〜９である１３Ｃｘ−標識されたフェニルアラニン、ｘ＝１〜６である１３Ｃｘ−標識されたイソロイシンのうちの１つまたは複数である。例えば、６個の１３Ｃ原子を含有する１３Ｃ６−フェニルアラニンを用いて、関心対象の生体分子（例えば、ＣＮＳに由来するタンパク質）を標識し得る。別の実施形態において、１３Ｃ６−ロイシンを用いて、関心対象の生体分子（例えば、ＣＮＳに由来するタンパク質）を標識し得る。さらに別の実施形態において、１３Ｃ６−ロイシンを用いて、アミロイド−ベータ（Ａβ）を標識する。
【００３１】
非放射性同位体でも放射性同位体でも、標識アミノ酸の数多くの商業的供給元が存在する。一般的に、標識アミノ酸は、生物学的にまたは合成的に産生され得る。生物学的に産生されるアミノ酸は、生物がタンパク質を産生するときにアミノ酸に組み入れられる１３Ｃ、１５Ｎ、または別の同位体の富化混合物中で成長した生物（例えば、昆布／海藻）から獲得され得る。次いで、アミノ酸を分離し精製する。あるいは、アミノ酸は、公知の合成化学工程を用いて作製され得る。
【００３２】
いったん疾患が確立し、治療プロトコールが開始されると、本発明の方法を定期的に繰り返して、対象における関心対象の生体分子（複数可）の濃度（複数可）をモニターし得る。連続的アッセイから得られた結果を用いて、数日から数ヶ月に及ぶ期間にわたる治療の効力を示し得る。したがって、本発明の別の態様は、神経系または神経変性障害を有する対象を治療するための治療レジメンをモニターするための方法に向けられている。療法前及び療法中の関心対象の生体分子（複数可）の濃度（複数可）の比較は、当該療法の効力を示す。したがって、当業者であれば、必要に応じて治療的アプローチを識別し得かつ調整し得るであろう。
【００３３】
本発明の方法は、関心対象の１種または複数種の生体分子のインビボ濃度が決定され得るような対象からサンプルが獲得されることを条件とする。１つの実施形態において、サンプルは体液である。適切な体液は、脳脊髄液（ＣＳＦ）、血漿、血清、尿、唾液、汗、及び涙液を含むが、それらに限定されるわけではない。生物学的流体は、典型的に、多数の定量化可能な生体分子を含有することが理解されるべきである。例えば、サンプルがＣＳＦである場合、定量化され得る例示的な生体分子は、タウ、タウの変種、アミロイド−ベータタンパク質、アミロイド−ベータタンパク質（Ａβ）の変種、アミロイド−ベータタンパク質の消化産物、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ｊ、アルファ−シヌクレイン、またはその任意の組み合わせを含むが、それらに限定されるわけではない。別の実施形態において、サンプルは、中枢神経系（ＣＮＳ）由来の組織のサンプル等の組織サンプルである。サンプルは、一般的に、当業者に周知の標準的手順を用いて回収される。
【００３４】
１つの実施形態において、サンプルは、中枢神経系由来の組織を含むがそれらに限定されないＣＮＳサンプルであり、それは脳組織及び脊髄組織を含む。本発明の１つの実施形態において、ＣＮＳサンプルは、前脳（例えば、大脳皮質、大脳基底核、海馬）、間脳（例えば、視床、視床下部、視床腹部）、中脳（例えば、蓋、被蓋）、または後脳（例えば、橋、小脳、延髄）を含むがそれらに限定されない脳組織から採取され得る。別の実施形態において、ＣＮＳサンプルは、脊髄組織から回収され得る。さらに他の実施形態において、１箇所を上回る数のＣＮＳ領域からのＣＮＳサンプルが採取され得る。したがって、関心対象の生体分子の濃度は、種々のＣＮＳサンプルにおいて、例えば皮質及び海馬において、同時に測定され得る。
【００３５】
ＣＮＳサンプルは、公知の技法によって獲得され得る。例えば、脳組織または脊髄組織は、解剖または切除により獲得され得る。あるいは、ＣＮＳサンプルは、レーザーマイクロダイセクションを用いて獲得され得る。対象は、所望されるＣＮＳサンプル及び利用される対象に応じて、サンプルを獲得するために屠殺される必要があってもなくてもよい。
【００３６】
一般的に、検討中の生体分子がペプチドまたはタンパク質である場合、本発明は、ベースライン濃度を提供するために、治療剤の投与前に第一のサンプルが対象から採取され得ることを条件とする。治療剤の投与後、１つまたは複数のサンプルが対象から獲得される。当業者によって解されるであろうように、サンプルの数及びサンプルがいつ採取されるかは、一般的に、分析のタイプ、投与のタイプ、関心対象のタンパク質、代謝の速度、検出のタイプ、及び対象のタイプ等、いくつかの因子に依存する。
【００３７】
種々の時点におけるサンプルが所望される場合、１つを上回る数の対象が用いられ得ることが理解されるべきである。例えば、１つの対象はベースラインサンプルに、別の対象は治療剤の投与後１時間の時点に、別の対象は治療剤の投与後６時間の時点に用いられ得る。
【００３８】
したがって、本発明は、サンプルにおける標識された生体分子の量及び標識されていない生体分子の量の検出を用いて、標識された生体分子対標識されていない生体分子の比率を決定し得、今度はそれを用いて、対象における関心対象の生体分子の濃度を算出し得ることを提供する。１つの実施形態において、比率は、標識されていない生体分子に対する、標識された生体分子（例えば、ペプチドまたはタンパク質）の質量の変化を検出する手段によって決定される。標識された及び標識されていない生体分子間での質量の差を検出するための例示的な手段は、液体クロマトグラフィー質量分析、ガスクロマトグラフィー質量分析、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析、及びタンデム質量分析を含むが、それらに限定されるわけではない。
【００３９】
しかしながら、標識された生体分子対標識されていない生体分子の比率を検出する前に、サンプルにおける他の生体分子から関心対象の生体分子を単離する及び／または分離することが望まれ得る。ゆえに、１つの実施形態において、免疫沈降を用いて、関心対象の生体分子（例えば、ペプチドまたはタンパク質）を、それが分析される前に単離し得かつ精製し得る。別の実施形態において、関心対象の生体分子は、アフィニティークロマトグラフィーまたは免疫アフィニティークロマトグラフィーによって単離され得るまたは精製され得る。あるいは、クロマトグラフィー設定を有する質量分析計を用いて、免疫沈降なしで生体分子を分離し得、次いで関心対象の生体分子を直接測定し得る。例示的な実施形態において、関心対象のタンパク質を免疫沈降し得、次いで、エレクトロスプレーイオン化源を備えたタンデムＭＳユニットとつなぎ合わせた液体クロマトグラフィーシステム（ＬＣ−ＥＳＩ−タンデムＭＳ）によって分析し得る。３種の異なる抗体を用いて、同じヒトＣＳＦサンプルの３つのアリコートからタウタンパク質を免疫沈降すること、それに続くタウタンパク質の消化、及び種々のタウペプチドの相対存在量の定量の１つの例が、表２に示されている。この態様は、異なる抗体が、タウタンパク質の異なる部分に対して異なるアフィニティーを有し、免疫沈降抗体の選択を用いて、定量分析をタウ生体分子の異なる部分またはプロテオフォームに集中させ得るという観察結果を含む。
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＊値は、タウペプチドに特異的なものに対して最も高い存在量（１．０）を提供した免疫沈降抗体に対する存在量の割合として報告されている。
【００４０】
別の態様において、本発明は、同じサンプル中の多数の生体分子が同時に測定され得ることを提供する。つまり、標識されていない生体分子及び標識された生体分子の量の両方が、多数の生体分子に関して別個にまたは一斉に検出され得かつ測定され得る。そのため、本発明は、１種または複数種の生体分子の濃度の変化を大規模にスクリーニングするための有用な方法（すなわち、プロテオミクス／メタボロミクス）を提供し、根底にある病態生理に関与する生体分子を検出しかつ測定する高感度の手段を提供する。この態様において、本発明は、多数のタイプの生体分子を測定する手段も提供する。この背景において、例えば、タンパク質及び脂質が、同時にまたは逐次的に測定され得る。
【００４１】
標識された生体分子及び標識されていない生体分子の量がサンプルにおいていったん検出されると、標識された生体分子対標識されていない生体分子の比率またはパーセントが決定され得る。その後、サンプルにおける標識されていない生体分子の濃度が決定され得る。言い換えれば、既知の量の標識された生体分子が未知の量の生体分子に添加され、標識されたもの対標識されていないものの比率が測定されるため、標識されていない生体分子の濃度は、以下のように：
（ｉ）標識されていないものの濃度＝（標識されていないもの対標識されたものの比率）×（標識されたものの濃度）
比率から算出され得る。方程式は、
（ｉｉ）標識されていないものの濃度＝（標識されていないもの：定量用内部標準物質の比率）×（定量用内部標準物質の濃度）
として単純化され得る。
【００４２】
反対に、既知の量の標識されていないものが未知の量の標識されたものに添加される場合、標識されたものの濃度は以下のように算出され得る。
（ｉｉｉ）標識されたものの濃度＝（標識されたもの対標識されていないものの比率）×（標識されていないものの濃度）
【００４３】
加えて、標識１で標識された既知の量の生体分子１が、標識２で標識された未知の量の生体分子２に添加される場合、生体分子２の濃度は、以下のように算出され得る。
（ｉｖ）標識２の濃度＝（標識２対標識１の比率）×（標識１の濃度）
【００４４】
同様に、標識１で標識された既知の量の生体分子１が、未知の量の、標識２で標識された生体分子２及び標識３で標識された生体分子３に添加される場合、生体分子２及び生体分子３の濃度は、以下のように算出され得る。
（ｖ）標識２の濃度＝（標識２対標識１の比率）×（標識１の濃度）
（ｖｉ）標識３の濃度＝（標識３対標識１の比率）×（標識１の濃度）
【００４５】
最後に、標識１で標識された既知の量の生体分子１が、標識２で標識された未知の量の生体分子２、及び未知の量の標識されていない生体分子３に添加される場合、生体分子２及び標識されていない生体分子の濃度は、以下のように算出され得る。
（ｖｉｉ）標識２の濃度＝（標識２対標識１の比率）×（標識１の濃度）
（ｖｉｉｉ）標識されていないものの濃度＝（標識されていないもの対標識１の比率）×（標識１の濃度）
【００４６】
別の実施形態において、方法は、検量線によって作り出される曲線適合方程式に基づき、算出濃度を検量線に対して正規化するステップをさらに含む。本明細書において用いられる検量線は、標識されていない生体分子対それらそれぞれの定量用内部標準物質の２つまたはそれを上回る数の比率を決定することによって作り出され、そこで関心対象の標識されていない生体分子の濃度がわかる。
【００４７】
別の態様において、本発明は、標識されたタンパク質及び標識されていないタンパク質の一斉の測定を可能にし、それにより、標識されたタンパク質対標識されていないタンパク質の比率、ならびに他の算出がなされ得る。
【００４８】
１つの態様において、タウは、タウを認識する抗体を用いた免疫沈降によって、生物学的サンプルから単離される。この実施形態において、単離されたペプチドは、例えばギ酸を用い、次いでトリプシンまたは別のプロテアーゼで消化されることによって、当該抗体から溶出される。本発明は、タウペプチドの濃度を測定する。
【００４９】
本発明において用いられる「抗体」という用語は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体の無傷分子、ならびにエピトープ決定基に結合し得る、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２、Ｆｖ、及びＳＣＡフラグメント等、そのフラグメントを含むことが意図される。「特異的に結合する」または「特異的に相互作用する」という用語は、抗体に関して用いられる場合、抗体と特定のエピトープとの相互作用が、少なくとも約１×１０−６、一般的には少なくとも約１×１０−７、通常では少なくとも約１×１０−８、及び特に少なくとも約１×１０−９もしくは１×１０−１０、またはそれを下回る数の解離定数を有することを意味する。
【００５０】
本発明の方法を用いて、対象における関心対象の１種または複数種の生体分子のインビボ濃度を測定することによって、神経系または神経変性疾患の進行を診断し得るまたはモニターし得る。加えて、本発明の方法を用いて、対象における関心対象の生体分子のインビボ濃度を測定することによって、神経系または神経変性疾患の治療をモニターし得る。生体分子の濃度は神経系または神経変性疾患に関連付けされ得、それにより、任意の増加または減少は当該疾患の存在または進行を示し得る。ゆえに、関心対象の１種または複数種の生体分子の算出濃度を、対応する正常サンプルにおける同じ生体分子の濃度と、既知の神経系もしくは神経変性疾患状態の対象における同じ生体分子の濃度と、その時以前に判定された同じ対象由来の同じ生体分子の濃度と、またはその任意の組み合わせと比較し得る。
【００５１】
加えて、そのような方法は、前記疾患の発生の素因を有するとして個体を同定するのに役立ち得る、または実際の臨床症状の出現前に前記疾患を検出するための手段を提供し得る。このタイプのより確定的な診断は、医療従事者が、より早期に予防的方策または積極的治療を採用し、それによって疾患の発生またはさらなる進行を予防するのを可能にし得る。
【００５２】
本明細書において使用するとき、「対応する正常サンプル」とは、調べられているサンプルと同じ臓器由来の及び／または同じタイプのサンプルを指す。１つの態様において、対応する正常サンプルは、健常個体から獲得された細胞のサンプルを含む。そのような対応する正常サンプルは、調べられているサンプルを提供する個体と年齢がマッチしている及び／または同じ性別である個体由来であり得るが、そうである必要はない。別の態様において、対応する正常サンプルは、検査されているサンプルが獲得される対象の組織のその他の点では健常な部分から獲得された細胞のサンプルを含む。
【００５３】
既知の神経系または神経変性疾患状態の対象における生体分子の濃度への言及は、神経系または神経変性疾患に関連付けされる生体分子の既定の濃度を含む。ゆえに、濃度は、単一個体のサンプルから獲得された生体分子の既知の濃度と比較され得る、または対象のものと同じタイプの確立された細胞株からのものであり得る。１つの態様において、確立された細胞株は、そのような細胞株のパネルの１つであり得、当該パネルは、同じタイプの疾患の種々の細胞株、及び／または同じ生体分子と関連した異なる疾患の種々の細胞株を含み得る。細胞株のそのようなパネルは、例えば、治療されるべき対象からほんの少数の細胞しか獲得され得ない場合に本方法を実践するのに有用であり得、ゆえに対象の細胞の代理サンプルを提供し、及び本方法を実践する際に対照サンプルとして含むのにも有用であり得る。
【００５４】
関心対象の生体分子の濃度範囲に関連付けされ得る例示的な神経系または神経変性疾患は、アルツハイマー病、ピック病、パーキンソン病、脳卒中、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、ハンチントン病、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、老化関連の障害及び認知症、多発性硬化症、プリオン病（例えば、クロイツフェルト・ヤコブ病、牛海綿状脳症または狂牛病、及びスクレイピー）、レビー小体病、統合失調症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳまたはルー・ゲーリック病）、または他の運動ニューロン疾患、レストレスレッグス症候群、てんかんまたは他の発作性障害、振戦、うつ病、躁病、不安障害、脳の外傷または負傷、ナルコレプシー、不眠症または他の睡眠障害、自閉症、正常圧水頭症、疼痛障害または症候群、片頭痛、群発頭痛または頭痛の他の形態、脊髄小脳障害、筋ジストロフィー、重症筋無力症、網膜色素変性症または網膜変性の他の形態を含むが、それらに限定されるわけではない。本発明の方法を用いて、ＣＮＳの正常な生理、代謝、及び機能を研究し得ることも想定される。
【００５５】
別の態様において、本発明は、神経系または神経変性疾患を治療するために用いられる治療剤が、対象における関心対象の生体分子の濃度に影響を及ぼすかどうかを査定するための方法を提供する。例えば、生体分子の濃度を測定して、所定の治療剤が、当該生体分子の濃度の増加または減少をもたらすかどうかを判定し得る。１つの実施形態において、方法は、本明細書において記載されるようにインビボで実施される。別の実施形態において、方法は、細胞の培養物を利用したインビトロで実施され、当該細胞の培養物は、本明細書において記載される方法における「対象」である。したがって、本明細書において提供される方法の使用により、当業者は、関心対象の生体分子の濃度の変化の程度を正確に判定し、これらの測定結果と疾患修飾性治療の臨床転帰とを相関させることが可能となる。したがって、本発明のこの態様からの結果は、治療剤の最適な用量及び投薬の頻度を決定するのに役立ち得、臨床試験のデザインに関する意思決定を支援し得、最終的には神経系または神経変性疾患の治療のための有効な治療剤の検証を加速させ得る。
【００５６】
ゆえに、本発明の方法を用いて、どの対象が特定の治療剤に応答するかを予測し得る。例えば、増加した濃度の特定の生体分子を有する対象は、減少した濃度の当該生体分子を有する対象とは異なって特定の治療剤に応答し得る。特に、本方法からの結果を用いて、特定の対象に対する適当な治療（例えば、生体分子の産生を妨げる作用物質、または生体分子のクリアランスを増加させる作用物質）を選択し得る。同様に、本方法からの結果を用いて、特定の遺伝子型を有する対象に対する適当な治療を選択し得る。
【００５７】
当業者であれば、治療剤が、治療される対象となる神経系もしくは神経変性の疾患もしくは障害、及び／またはその代謝が分析されている生体分子に応じて変動し得る及び変動することを解するであろう。生体分子がタウである実施形態において、適切な治療剤の非限定的な例には、タウ代謝変調因子、タウキナーゼ阻害剤、カテプシンＤ阻害剤、タウオートファジー活性化因子、及びタウ凝集阻害剤が含まれる。他の適切なＡＤ治療剤には、ホルモン、神経保護剤、及び細胞死阻害剤が含まれる。上記治療剤の多くは、神経変性障害に関わる他のタンパク質のインビボ代謝にも影響を及ぼし得る。さらに、シヌクレインのインビボ代謝に影響を及ぼし得る治療剤には、サーチュイン２阻害剤、シヌクレイン凝集阻害剤、プロテアソーム阻害剤等が含まれる。
【００５８】
治療剤は、公知の方法に従って対象に投与され得る。典型的に、治療剤は経口投与されるが、非経口または局所など、投与の他の経路も用いられ得る。対象に投与される治療剤の量は、作用物質のタイプ、対象、及び投与の特定の様式に応じて変動し得る及び変動する。当業者であれば、投薬量は、Ｇｏｏｄｍａｎ＆Ｇｏｌｄｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｔｅｎｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（２００１），Ａｐｐｅｎｄｉｘ  ＩＩ，ｐｐ．４７５−４９３、及びｔｈｅ  Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅからの指針により決定され得ることを解するであろう。
【００５９】
本明細書において記載される本発明の方法は、ハイスループット形式に適応し得、ゆえに、別々に同じであり得るまたは異なり得る複数（すなわち、２、３、４、またはそれを上回る数）のサンプル及び／または生体分子の調査を並行して可能にすることが理解されるべきである。ハイスループット形式は、数々の利点を提供する。例えば、ハイスループット形式は、単独または組み合わせでの、対象の２、３、４種などの異なる生体分子の調査／定量を可能にする。最後に、ハイスループット形式は、例えば対照サンプル（陽性対照または陰性対照）を試験サンプルと並行してランさせることを可能にする。加えて、ハイスループット法は、多数の抗体を用いた、多数のタンパク質の一斉の免疫沈降を可能にし得る。
【００６０】
別の態様において、本発明は、本発明の方法を実施するためのキットを提供する。１つの実施形態において、キットは、対象における神経系または神経変性疾患の進行または治療を診断する及び／またはモニターするために提供される。キットは、適当な定量用内部標準物質、及び対象から生物学的サンプルを一定時間間隔で獲得するための手段をさらに含み得る。ある特定の実施形態において、キットは、標識された対標識されていない関心対象の生体分子の比率を経時的に検出する及び決定するための、ならびに内因性の標識されていない生体分子の濃度を算出するための指示書も含む。１つの実施形態において、指示書は、算出濃度と、本明細書において開示されるある特定の標準物質及び／または対照とを比較するための方法を開示する。
【００６１】
別の実施形態において、本発明のキットは、定量用内部標準物質及び本発明の方法を実施するための様々な手段を含有する１つまたは複数の容器を含めた、区分化された運搬体を提供する。
【００６２】
以下の実施例は、本発明の利点及び特徴をさらに例示するために提供されるが、本発明の範囲を限定することを意図されるわけではない。それらは、用いられ得るものの典型であるが、当業者に公知の他の手順、方法論、または技法が代替的に用いられ得る。
【実施例】
【００６３】
ＳＩＳＡＱによるタウの定量
１５Ｎ標識されたタウを定量用内部標準物質として用い、０．０５ｐｇ／ｍＬ〜１００ｐｇ／ｍＬの範囲のタウの濃度を含有するサンプルの検量線にスパイクした。加えて、定量用内部標準物質を、２つの異なる個体由来のＣＳＦ及び血漿にスパイクした。タウを、免疫沈降を用いてサンプルから単離し、次いでトリプシンで消化し、質量分析によって分析した。標識されていない内因性タウ対定量用内部標準物質の比率をすべてのサンプルに対して算出し、検量線を作り出した。検量線は、試験された範囲（０．０５ｐｇ／ｍＬ〜１００ｐｇ／ｍＬ）において線形であり、それを用いて、ＣＳＦ及び血漿サンプルにおけるタウの濃度を算出した。タウの濃度は、ＣＳＦサンプルにおいておよそ５ｐｇ／ｍＬ及び血漿において大体０．１ｐｇ／ｍＬであり、ＣＳＦ及び血漿タウ濃度についての三つ組測定に対するアッセイ内及びアッセイ間ＣＶは２５％未満であった。本発明者らのデータは、濃度にかかわらず、タウが、本発明の方法を用いて確実にかつ再現性よく測定され得ることを示している。ヒトＣＳＦ中に存在するいくつかのタウペプチドを定量化するためのアッセイ内及びアッセイ間信頼度（％ＣＶ）の例が、表３＆４に示されている。同じ分析ランに含まれる多くの他の検量線サンプル及び未知のサンプルの間でこれらのインジェクション反復分析を分散させた、単一のプールしたヒトＣＳＦサンプルについての三つ組分析によって、アッセイ内信頼度（表３）を算出した。多くの他のサンプル及び標準物質を含む異なる分析ランにおいて別個の３日間に調製されかつ分析された（工程反復）、単一のヒトＣＳＦプールについての三つ組分析によって、アッセイ間信頼度（表４）を算出した。
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【００６４】
これは、安定同位体標識されたタウを定量用内部標準物質として用いること、及び標識されていないタウ対標識されたタウの比率を検量線に関連付けして、未知のサンプルにおけるタウの濃度の測定を可能にすることの実現可能性を例示している。
【００６５】
本発明は、上記の実施例を参照して記載されているものの、改変及び変動は、本発明の精神及び範囲の内に包含されることが理解されるであろう。したがって、本発明は、以下の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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