(57)【要約】ヒトＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−Ｇ、またはＨＬＡ−ＤＲを標的とする新規キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、およびそれらの治療的使用方法が、本明細書で開示される。ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−Ｇ、またはＨＬＡ−ＤＲは、甲状腺、前立腺、結腸、乳房、卵巣および腎がんを含む固形腫瘍、ならびにＢ細胞白血病およびリンパ腫を含む、多くのヒトがんの状況下で発現される。本明細書はまた、上記ＣＡＲを発現する免疫細胞を作製する方法もまた開示する。
2020501512.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）抗黄体形成ホルモン受容体（「ＬＨＲ」）抗体の抗原結合性ドメイン、（ｂ）ＣＤ８αヒンジドメイン；（ｃ）ＣＤ８α膜貫通ドメイン；（ｄ）２つまたはこれを超える共刺激性シグナル伝達領域；および（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【請求項２】
前記２つまたはこれを超える共刺激性シグナル伝達領域が、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−ＩＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、およびＢ７−Ｈ３から選択される、請求項１に記載のＣＡＲ。
【請求項３】
前記抗ＬＨＲ抗体の抗原結合性ドメインが、抗ＬＨＲ重鎖（ＨＣ）可変領域および抗ＬＨＲ軽鎖（ＬＣ）可変領域を含む、請求項１または２に記載のＣＡＲ。
【請求項４】
前記抗ＬＨＲ  ＨＣ可変領域と前記抗ＬＨＲ  ＬＣ可変領域の間に配置されたリンカーポリペプチドをさらに含む、請求項３に記載のＣＡＲ。
【請求項５】
前記ＨＣが、
（ａ）ＧＹＳＩＴＳＧＹＧのアミノ酸配列もしくはそれらの各々の同等物を含むＣＤＲ１；および／または
（ｂ）ＩＨＹＳＧＳＴのアミノ酸配列もしくはそれらの各々の同等物を含むＣＤＲ２；および／または
（ｃ）ＡＲＳＬＲＹのアミノ酸配列もしくはそれらの各々の同等物を含むＣＤＲ３
を含み；かつ／あるいは
前記ＬＣが、
（ａ）ＳＳＶＮＹのアミノ酸配列もしくはそれらの各々の同等物を含むＣＤＲ１；および／または
（ｂ）ＤＴＳのアミノ酸配列もしくはそれらの各々の同等物を含むＣＤＲ２；および／または
（ｃ）ＨＱＷＳＳＹＰＹＴのアミノ酸配列もしくはそれらの各々の同等物を含むＣＤＲ３
を含む、請求項３または４に記載のＣＡＲ。
【請求項６】
前記ＨＣが、
（ａ）ＧＦＳＬＴＴＹＧのアミノ酸配列もしくはそれらの各々の同等物を含むＣＤＲ１；および／または
（ｂ）ＩＷＧＤＧＳＴのアミノ酸配列もしくはそれらの各々の同等物を含むＣＤＲ２；および／または
（ｃ）ＡＥＧＳＳＬＦＡＹのアミノ酸配列もしくはそれらの各々の同等物を含むＣＤＲ３
を含み；かつ／あるいは
前記ＬＣが、
（ａ）ＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹのアミノ酸配列もしくはそれらの各々の同等物を含むＣＤＲ１；および／または
（ｂ）ＷＡＳのアミノ酸配列もしくはそれらの各々の同等物を含むＣＤＲ２；および／または
（ｃ）ＱＮＤＹＳＹＰＬＴのアミノ酸配列もしくはそれらの各々の同等物を含むＣＤＲ３
を含む、請求項３または４に記載のＣＡＲ。
【請求項７】
前記ＨＣが、
（ａ）ＧＹＳＦＴＧＹＹのアミノ酸配列もしくはそれらの各々の同等物を含むＣＤＲ１；および／または
（ｂ）ＩＹＰＹＮＧＶＳのアミノ酸配列もしくはそれらの各々の同等物を含むＣＤＲ２；および／または
（ｃ）ＡＲＥＲＧＬＹＱＬＲＡＭＤＹのアミノ酸配列もしくはそれらの各々の同等物を含むＣＤＲ３
を含み；かつ／あるいは
前記ＬＣが、
（ａ）ＱＳＩＳＮＮのアミノ酸配列もしくはそれらの各々の同等物を含むＣＤＲ１；および／または
（ｂ）ＮＡＳのアミノ酸配列もしくはそれらの各々の同等物を含むＣＤＲ２；および／または
（ｃ）ＱＱＳＮＳＷＰＹＴのアミノ酸配列もしくはそれらの各々の同等物を含むＣＤＲ３
を含む、請求項３または４に記載のＣＡＲ。
【請求項８】
前記抗ＬＨＲ重鎖可変領域が、本明細書で開示される配列から選択されるポリペプチドまたはそれらの各々の同等物を含む、請求項３または４に記載のＣＡＲ。
【請求項９】
前記抗ＬＨＲ軽鎖可変領域が、本明細書で開示される配列から選択されるポリペプチドまたはそれらの各々の同等物を含む、請求項３または４に記載のＣＡＲ。
【請求項１０】
前記抗ＬＨＲ重鎖可変領域が、本明細書で開示される配列から選択されるコンセンサス配列を有するポリペプチドまたはそれらの各々の同等物を含む、請求項３または４に記載のＣＡＲ。
【請求項１１】
前記抗ＬＨＲ軽鎖可変領域が、本明細書で開示される配列から選択されるコンセンサス配列を有するポリペプチドまたはそれらの各々の同等物を含む、請求項３または４に記載のＣＡＲ。
【請求項１２】
同等物が、ポリペプチドに対して少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、または前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの相補体と高ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを含む、請求項８から１１のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
【請求項１３】
検出可能なマーカーまたは精製マーカーをさらに含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
【請求項１４】
ＭＵＣ−１６に対する抗体またはメソテリンに対する抗体に由来する抗原結合性ドメインをさらに含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
【請求項１５】
請求項１から１４のいずれか一項に記載のＣＡＲをコードする単離核酸配列。
【請求項１６】
本明細書で開示される配列のいずれか１つまたはそれらの各々の同等物から選択される配列を含む、請求項１５に記載の単離核酸配列。
【請求項１７】
前記抗ＬＨＲ抗体の抗原結合性ドメインの上流に配置されたＫｏｚａｋコンセンサス配列、またはエンハンサーをさらに含む、請求項１５または１６に記載の単離核酸配列。
【請求項１８】
抗生物質耐性ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１５から１７のいずれか一項に記載の単離核酸配列。
【請求項１９】
前記ＣＡＲの発現および／または活性化を制御するためのスイッチメカニズムをさらに含む、請求項１５から１８のいずれか一項に記載の単離核酸配列。
【請求項２０】
請求項１５から１９のいずれか一項に記載の単離核酸配列を含むベクター。
【請求項２１】
プラスミドである、請求項２０に記載のベクター。
【請求項２２】
レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターからなる群より選択される、請求項２０に記載のベクター。
【請求項２３】
ＣＲＩＳＰＲベクターである、請求項２０に記載のベクター。
【請求項２４】
請求項１から１４のいずれか一項に記載のＣＡＲ；および／または請求項１５から１９のいずれか一項に記載の単離核酸；および／または請求項２０から２３のいずれか一項に記載のベクターを含む単離細胞。
【請求項２５】
免疫細胞である、請求項２４に記載の単離細胞。
【請求項２６】
前記免疫細胞が、Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、請求項２５に記載の単離細胞。
【請求項２７】
担体と、請求項１から１４のいずれか一項に記載のＣＡＲ；および／または請求項１５から１９のいずれか一項に記載の単離核酸；および／または請求項２０から２３のいずれか一項に記載のベクター；および／または請求項２４から２６のいずれか一項に記載の単離細胞のうちの１または複数とを含む組成物。
【請求項２８】
ＬＨＲタンパク質またはその断片を含むペプチドに結合することが可能な抗原結合断片をさらに含む、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記ペプチドが、細胞と会合する、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
前記ペプチドが、固体支持体に結合する、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３１】
前記ペプチドが、溶液中に配置される、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３２】
前記ペプチドが、マトリックスと会合する、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３３】
抗ＬＨＲ  ＣＡＲ発現細胞を作製する方法であって、
（ｉ）請求項１から１４のいずれか一項に記載のＣＡＲをコードする核酸配列を免疫細胞の集団に導入するステップと；
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の前記核酸配列の形質導入に成功した免疫細胞の亜集団を選択し、これにより、抗ＬＨＲ  ＣＡＲ発現細胞を作製するステップと
を含む方法。
【請求項３４】
前記免疫細胞が、Ｔ細胞である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
Ｔ細胞の集団が、内因性Ｔ細胞受容体の発現を低減または消失させるように改変されている、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
Ｔ細胞の前記集団が、ＲＮＡ干渉またはＣＲＩＳＰＲを利用する方法を使用して改変された、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
それを必要とする対象における腫瘍の増殖を阻害するおよび／またはがんを処置する方法であって、前記対象へと、有効量の、請求項３３から３６のいずれか一項に記載の抗ＬＨＲ  ＣＡＲ発現細胞を投与するステップを含む方法。
【請求項３８】
前記ＬＨＲ  ＣＡＲ発現細胞が、処置される前記対象に対して自家または同種である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記腫瘍またはがんが、ＬＨＲを発現または過剰発現させる、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記腫瘍が、固形腫瘍、任意選択で、卵巣腫瘍もしくは前立腺がん腫瘍であり、および／または前記がんが、卵巣がんもしくは前立腺がんである、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記対象が、ヒト、動物、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ヒツジ、マウス、ウマ、またはウシである、請求項３７から４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
（ａ）Ｂ７−Ｈ４抗体の抗原結合性ドメイン、（ｂ）ＣＤ８αヒンジドメイン；（ｃ）ＣＤ８α膜貫通ドメイン；（ｄ）２つまたはこれを超える共刺激性シグナル伝達領域；および（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【請求項４３】
前記２つまたはこれを超える共刺激性シグナル伝達領域が、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−ＩＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、およびＢ７−Ｈ３から選択される、請求項４２に記載のＣＡＲ。
【請求項４４】
前記抗Ｂ７−Ｈ４抗体の抗原結合性ドメインが、抗Ｂ７−Ｈ４重鎖（ＨＣ）可変領域および抗Ｂ７−Ｈ４軽鎖（ＬＣ）可変領域を含む、請求項４２または４３に記載のＣＡＲ。
【請求項４５】
前記抗Ｂ７−Ｈ４  ＨＣ可変領域と前記抗Ｂ７−Ｈ４  ＬＣ可変領域の間に配置されたリンカーポリペプチドをさらに含む、請求項４４に記載のＣＡＲ。
【請求項４６】
前記ＨＣが、
（ｄ）ＧＸＴＦのアミノ酸配列もしくはそれらの各々の同等物を含むＣＤＲ１；および／または
（ｅ）（ｉ）ＩＳＳＸＸＸＴ、（ｉｉ）ＩＮＰＮＮＧＧＴのアミノ酸配列もしくはそれらの各々の同等物を含むＣＤＲ２；および／または
（ｆ）ＡＲＰＸＹＹのアミノ酸配列もしくはそれらの各々の同等物を含むＣＤＲ３
を含み；かつ／あるいは
前記ＬＣが、
（ｄ）（ｉ）ＱＳＩＶＨＸＮＧＴＹ、（ｉｉ）ＥＮＩＧＳＹのアミノ酸配列もしくはそれらの各々の同等物を含むＣＤＲ１；および／または
（ｅ）（ｉ）ＫＶＳ、（ｉｉ）ＡＡＴのアミノ酸配列もしくはそれらの各々の同等物を含むＣＤＲ２；および／または
（ｆ）（ｉ）ＦＱＧＳＸＶＰＸＴ、（ｉｉ）ＱＨＹＹＳＴＬＶＴのアミノ酸配列もしくはそれらの各々の同等物を含むＣＤＲ３
を含む、請求項４４または４５に記載のＣＡＲ。
【請求項４７】
前記ＨＣが、
（ｄ）（ｉ）ＧＦＴＦＳＳＦＧ、（ｉｉ）ＧＦＴＦＳＳＹＧ、（ｉｉｉ）ＧＹＴＦＴＤＹのアミノ酸配列もしくはそれらの各々の同等物を含むＣＤＲ１；および／または
（ｅ）（ｉ）ＩＳＳＧＳＳＴＬ、（ｉｉ）ＩＳＳＳＮＳＴＩのアミノ酸配列もしくはそれらの各々の同等物を含むＣＤＲ２；および／または
（ｆ）（ｉ）ＡＲＰＬＹＹＹＧＳＶＭＤＹ、（ｉｉ）ＡＲＰＹＹＹＧＳＳＹＤＹのアミノ酸配列もしくはそれらの各々の同等物を含むＣＤＲ３
を含み；かつ／あるいは
前記ＬＣが、
（ｄ）（ｉ）ＱＳＩＶＨＲＮＧＮＴＹ、（ｉｉ）ＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹのアミノ酸配列もしくはそれらの各々の同等物を含むＣＤＲ１；および／または
（ｅ）（ｉ）ＦＱＧＳＹＶＰＰＴ、（ｉｉ）ＦＱＧＳＨＶＰＬＴのアミノ酸配列もしくはそれらの各々の同等物を含むＣＤＲ３
を含む、請求項４６に記載のＣＡＲ。
【請求項４８】
前記抗Ｂ７−Ｈ４重鎖可変領域が、本明細書で開示される配列から選択されるポリペプチドまたはそれらの各々の同等物を含む、請求項４４または４５に記載のＣＡＲ。
【請求項４９】
前記抗Ｂ７−Ｈ４軽鎖可変領域が、本明細書で開示される配列から選択されるポリペプチドまたはそれらの各々の同等物を含む、請求項４４または４５に記載のＣＡＲ。
【請求項５０】
前記抗Ｂ７−Ｈ４重鎖可変領域が、本明細書で開示される配列から選択されるコンセンサス配列を有するポリペプチドまたはそれらの各々の同等物を含む、請求項４４または４５に記載のＣＡＲ。
【請求項５１】
前記抗Ｂ７−Ｈ４軽鎖可変領域が、本明細書で開示される配列から選択されるコンセンサス配列を有するポリペプチドまたはそれらの各々の同等物を含む、請求項４４または４５に記載のＣＡＲ。
【請求項５２】
同等物が、ポリペプチドに対して少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、または前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの相補体と高ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを含む、請求項４８から５１のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
【請求項５３】
検出可能なマーカーまたは精製マーカーをさらに含む、請求項４２から５２のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
【請求項５４】
請求項４２から５３のいずれか一項に記載のＣＡＲをコードする単離核酸配列。
【請求項５５】
本明細書で開示される配列のいずれか１つまたはそれらの各々の同等物から選択される配列を含む、請求項５４に記載の単離核酸配列。
【請求項５６】
前記抗Ｂ７−Ｈ４抗体の抗原結合性ドメインの上流に配置されたＫｏｚａｋコンセンサス配列、またはエンハンサーをさらに含む、請求項５４または５５に記載の単離核酸配列。
【請求項５７】
抗生物質耐性ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項５４から５６のいずれか一項に記載の単離核酸配列。
【請求項５８】
前記ＣＡＲの発現および／または活性化を制御するためのスイッチメカニズムをさらに含む、請求項５４から５７のいずれか一項に記載の単離核酸配列。
【請求項５９】
請求項５４から５８のいずれか一項に記載の単離核酸配列を含むベクター。
【請求項６０】
プラスミドである、請求項５９に記載のベクター。
【請求項６１】
レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターからなる群より選択される、請求項５９に記載のベクター。
【請求項６２】
ＣＲＩＳＰＲベクターである、請求項５９に記載のベクター。
【請求項６３】
請求項４２から５３のいずれか一項に記載のＣＡＲ；および／または請求項５４から５８のいずれか一項に記載の単離核酸；および／または請求項５９から６２のいずれか一項に記載のベクターを含む単離細胞。
【請求項６４】
免疫細胞である、請求項６３に記載の単離細胞。
【請求項６５】
前記免疫細胞が、Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、請求項６４に記載の単離細胞。
【請求項６６】
担体と、請求項４２から５３のいずれか一項に記載のＣＡＲ；および／または請求項５４から５８のいずれか一項に記載の単離核酸；および／または請求項５９から６２のいずれか一項に記載のベクター；および／または請求項６３から６５のいずれか一項に記載の単離細胞のうちの１または複数とを含む組成物。
【請求項６７】
Ｂ７−Ｈ４タンパク質またはその断片を含むペプチドに結合することが可能な抗原結合断片をさらに含む、請求項６６に記載の組成物。
【請求項６８】
前記ペプチドが、細胞と会合する、請求項６７に記載の組成物。
【請求項６９】
前記ペプチドが、固体支持体に結合する、請求項６７に記載の組成物。
【請求項７０】
前記ペプチドが、溶液中に配置される、請求項６７に記載の組成物。
【請求項７１】
前記ペプチドが、マトリックスと会合する、請求項６７に記載の組成物。
【請求項７２】
抗Ｂ７−Ｈ４  ＣＡＲ発現細胞を作製する方法であって、
（ｉ）請求項４２から５３のいずれか一項に記載のＣＡＲをコードする核酸配列を免疫細胞の集団に導入するステップと；
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の前記核酸配列の形質導入に成功した免疫細胞の亜集団を選択し、これにより、抗Ｂ７−Ｈ４  ＣＡＲ発現細胞を作製するステップと
を含む方法。
【請求項７３】
前記免疫細胞が、Ｔ細胞である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
Ｔ細胞の集団が、内因性Ｔ細胞受容体の発現を低減または消失させるように改変されている、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
Ｔ細胞の前記集団が、ＲＮＡ干渉またはＣＲＩＳＰＲを利用する方法を使用して改変された、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
それを必要とする対象における腫瘍の増殖を阻害するおよび／またはがんを処置する方法であって、前記対象へと、有効量の、請求項７２から７５のいずれか一項に記載の抗Ｂ７−Ｈ４  ＣＡＲ発現細胞を投与するステップを含む方法。
【請求項７７】
前記Ｂ７−Ｈ４  ＣＡＲ発現細胞が、処置される前記対象に対して自家または同種である、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記腫瘍またはがんが、Ｂ７−Ｈ４を発現または過剰発現させる、請求項７６または７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記腫瘍が、固形腫瘍、任意選択で、乳房、結腸もしくは絨毛癌腫瘍であり、および／または前記がんが、乳、結腸もしくは絨毛癌である、請求項７６から７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記対象が、ヒト、動物、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ヒツジ、マウス、ウマ、またはウシを含む、請求項７６から７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
（ａ）抗ＨＬＡ−Ｇ抗体の抗原結合性ドメイン、（ｂ）ＣＤ８αヒンジドメイン；（ｃ）ＣＤ８α膜貫通ドメイン；（ｄ）２つまたはこれを超える共刺激性シグナル伝達領域；および（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【請求項８２】
前記２つまたはこれを超える共刺激性シグナル伝達領域が、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−ＩＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、およびＢ７−Ｈ３から選択される、請求項８１に記載のＣＡＲ。
【請求項８３】
前記抗ＨＬＡ−Ｇ抗体の抗原結合性ドメインが、抗ＨＬＡ−Ｇ重鎖（ＨＣ）可変領域および抗ＨＬＡ−Ｇ軽鎖（ＬＣ）可変領域を含む、請求項８１または８２に記載のＣＡＲ。
【請求項８４】
前記抗ＨＬＡ−Ｇ  ＨＣ可変領域と前記抗ＨＬＡ−Ｇ  ＬＣ可変領域の間に配置されたリンカーポリペプチドをさらに含む、請求項８３に記載のＣＡＲ。
【請求項８５】
前記ＨＣが、
（ｇ）（ｉ）ＧＦＮＩＫＤＴＹ、（ｉｉ）ＧＦＴＦＮＴＹＡのアミノ酸配列もしくはそれらの各々の同等物を含むＣＤＲ１；および／または
（ｈ）（ｉ）ＩＤＰＡＮＧＮＴ、（ｉｉ）ＩＲＳＫＳＮＮＹＡＴのアミノ酸配列もしくはそれらの各々の同等物を含むＣＤＲ２；および／または
（ｉ）（ｉ）ＡＲＳＹＹＧＧＦＡＹ、（ｉｉ）ＶＲＧＧＹＷＳＦＤＶのアミノ酸配列もしくはそれらの各々の同等物を含むＣＤＲ３
を含み；かつ／あるいは
前記ＬＣが、
（ｇ）（ｉ）ＫＳＶＳＴＳＧＹＳＹ、（ｉｉ）ＫＳＬＬＨＳＮＧＮＴＹのアミノ酸配列もしくはそれらの各々の同等物を含むＣＤＲ１；および／または
（ｈ）（ｉ）ＬＶＳ、（ｉｉ）ＲＭＳのアミノ酸配列もしくはそれらの各々の同等物を含むＣＤＲ２；および／または
（ｉ）（ｉ）ＱＨＳＲＥＬＰＲＴ、（ｉｉ）ＭＱＨＬＥＹＰＹＴのアミノ酸配列もしくはそれらの各々の同等物を含むＣＤＲ３
を含む、請求項８３または８４に記載のＣＡＲ。
【請求項８６】
前記抗ＨＬＡ−Ｇ重鎖可変領域が、本明細書で開示される配列から選択されるポリペプチドまたはそれらの各々の同等物を含む、請求項８３または８４に記載のＣＡＲ。
【請求項８７】
前記抗ＨＬＡ−Ｇ軽鎖可変領域が、本明細書で開示される配列から選択されるポリペプチドまたはそれらの各々の同等物を含む、請求項８３または８４に記載のＣＡＲ。
【請求項８８】
前記抗ＨＬＡ−Ｇ重鎖可変領域が、本明細書で開示される配列から選択されるコンセンサス配列を有するポリペプチドまたはそれらの各々の同等物を含む、請求項８３または８４に記載のＣＡＲ。
【請求項８９】
前記抗ＨＬＡ−Ｇ軽鎖可変領域が、本明細書で開示される配列から選択されるコンセンサス配列を有するポリペプチドまたはそれらの各々の同等物を含む、請求項８３または８４に記載のＣＡＲ。
【請求項９０】
同等物が、ポリペプチドに対して少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、または前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの相補体と高ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを含む、請求項８６から８９のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
【請求項９１】
検出可能なマーカーまたは精製マーカーをさらに含む、請求項８１から９０のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
【請求項９２】
請求項８１から９１のいずれか一項に記載のＣＡＲをコードする単離核酸配列。
【請求項９３】
本明細書で開示される配列のいずれか１つまたはそれらの各々の同等物から選択される配列を含む、請求項９２に記載の単離核酸配列。
【請求項９４】
前記抗ＨＬＡ−Ｇ抗体の抗原結合性ドメインの上流に配置されたＫｏｚａｋコンセンサス配列、またはエンハンサーをさらに含む、請求項９２または９３に記載の単離核酸配列。
【請求項９５】
抗生物質耐性ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項９２から９４のいずれか一項に記載の単離核酸配列。
【請求項９６】
前記ＣＡＲの発現および／または活性化を制御するためのスイッチメカニズムをさらに含む、請求項９２から９５のいずれか一項に記載の単離核酸配列。
【請求項９７】
請求項９２から９６のいずれか一項に記載の単離核酸配列を含むベクター。
【請求項９８】
プラスミドである、請求項９７に記載のベクター。
【請求項９９】
レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターからなる群より選択される、請求項９７に記載のベクター。
【請求項１００】
ＣＲＩＳＰＲベクターである、請求項９７に記載のベクター。
【請求項１０１】
請求項８１から９１のいずれか一項に記載のＣＡＲ；および／または請求項９２から９６のいずれか一項に記載の単離核酸；および／または請求項９７から１００のいずれか一項に記載のベクターを含む単離細胞。
【請求項１０２】
免疫細胞である、請求項１０１に記載の単離細胞。
【請求項１０３】
前記免疫細胞が、Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、請求項１０２に記載の単離細胞。
【請求項１０４】
担体と、請求項８１から９１のいずれか一項に記載のＣＡＲ；および／または請求項９２から９６のいずれか一項に記載の単離核酸；および／または請求項９７から１００のいずれか一項に記載のベクター；および／または請求項１０１から１０３のいずれか一項に記載の単離細胞のうちの１または複数とを含む組成物。
【請求項１０５】
ＨＬＡ−Ｇタンパク質またはその断片を含むペプチドに結合することが可能な抗原結合断片をさらに含む、請求項１０４に記載の組成物。
【請求項１０６】
前記ペプチドが、細胞と会合する、請求項１０５に記載の組成物。
【請求項１０７】
前記ペプチドが、固体支持体に結合する、請求項１０５に記載の組成物。
【請求項１０８】
前記ペプチドが、溶液中に配置される、請求項１０５に記載の組成物。
【請求項１０９】
前記ペプチドが、マトリックスと会合する、請求項１０５に記載の組成物。
【請求項１１０】
抗ＨＬＡ−Ｇ  ＣＡＲ発現細胞を作製する方法であって、
（ｉ）請求項８１から９１のいずれか一項に記載のＣＡＲをコードする核酸配列を免疫細胞の集団に導入するステップと；
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の前記核酸配列の形質導入に成功した免疫細胞の亜集団を選択し、これにより、抗ＨＬＡ−Ｇ  ＣＡＲ発現細胞を作製するステップと
を含む方法。
【請求項１１１】
前記免疫細胞が、Ｔ細胞である、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
Ｔ細胞の集団が、内因性Ｔ細胞受容体の発現を低減または消失させるように改変されている、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
Ｔ細胞の前記集団が、ＲＮＡ干渉またはＣＲＩＳＰＲを利用する方法を使用して改変された、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
それを必要とする対象における腫瘍の増殖を阻害するおよび／またはがんを処置する方法であって、前記対象へと、有効量の、請求項１１０から１１３のいずれか一項に記載の抗ＨＬＡ−Ｇ  ＣＡＲ発現細胞を投与するステップを含む方法。
【請求項１１５】
前記ＨＬＡ−Ｇ  ＣＡＲ発現細胞が、処置される前記対象に対して自家または同種である、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
前記腫瘍またはがんが、ＨＬＡ−Ｇを発現または過剰発現させる、請求項１１４または１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
前記腫瘍が、固形腫瘍、任意選択で、甲状腺腫瘍、卵巣腫瘍もしくは前立腺がん腫瘍であり、および／または前記がんが、甲状腺がん、卵巣がんもしくは前立腺がんである、請求項１１４から１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
前記対象が、ヒト、動物、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ヒツジ、マウス、ウマ、またはウシを含む、請求項１１４から１１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１９】
（ａ）抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体の抗原結合性ドメイン、（ｂ）ＣＤ８αヒンジドメイン；（ｃ）ＣＤ８α膜貫通ドメイン；（ｄ）２つまたはこれを超える共刺激性シグナル伝達領域；および（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【請求項１２０】
前記２つまたはこれを超える共刺激性シグナル伝達領域が、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−ＩＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、およびＢ７−Ｈ３から選択される、請求項１１９に記載のＣＡＲ。
【請求項１２１】
前記抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体の抗原結合性ドメインが、抗ＨＬＡ−ＤＲ重鎖（ＨＣ）可変領域および抗ＨＬＡ−ＤＲ軽鎖（ＬＣ）可変領域を含む、請求項１１９または１２０に記載のＣＡＲ。
【請求項１２２】
前記抗ＨＬＡ−ＤＲ  ＨＣ可変領域と前記抗ＨＬＡ−ＤＲ  ＬＣ可変領域の間に配置されたリンカーポリペプチドをさらに含む、請求項１２２に記載のＣＡＲ。
【請求項１２３】
前記ＨＣが、
（ｊ）（ｉ）Ｌｙｍ−１抗体のＣＤＲＨ１、（ｉｉ）Ｌｙｍ−２抗体のＣＤＲＨ１のアミノ酸配列、もしくはそれらの各々の同等物を含むＣＤＲ１；および／または
（ｋ）（ｉ）Ｌｙｍ−１抗体のＣＤＲＨ２、（ｉｉ）Ｌｙｍ−２抗体のＣＤＲＨ２のアミノ酸配列、もしくはそれらの各々の同等物を含むＣＤＲ２；および／または
（ｌ）（ｉ（ｉ）Ｌｙｍ−１抗体のＣＤＲＨ３、（ｉｉ）Ｌｙｍ−２抗体のＣＤＲＨ１のアミノ酸配列、もしくはそれらの各々の同等物を含むＣＤＲ３
を含み；かつ／あるいは
前記ＬＣが、
（ｊ）（ｉ）Ｌｙｍ−１抗体のＣＤＲＬ１、（ｉｉ）Ｌｙｍ−２抗体のＣＤＲＬ１のアミノ酸配列、もしくはそれらの各々の同等物を含むＣＤＲ１；および／または
（ｋ）（ｉ）Ｌｙｍ−１抗体のＣＤＲＬ２、（ｉｉ）Ｌｙｍ−２抗体のＣＤＲＬ２のアミノ酸配列、もしくはそれらの各々の同等物を含むＣＤＲ２；および／または
（ｌ）（ｉ）Ｌｙｍ−１抗体のＣＤＲＬ３、（ｉｉ）Ｌｙｍ−２抗体のＣＤＲＬ３のアミノ酸配列、もしくはそれらの各々の同等物を含むＣＤＲ３
を含む、請求項１２１または１２２に記載のＣＡＲ。
【請求項１２４】
前記抗ＨＬＡ−ＤＲ重鎖可変領域が、本明細書で開示される配列から選択されるポリペプチドまたはそれらの各々の同等物を含む、請求項１２１または１２２に記載のＣＡＲ。
【請求項１２５】
前記抗ＨＬＡ−ＤＲ軽鎖可変領域が、本明細書で開示される配列から選択されるポリペプチドまたはそれらの各々の同等物を含む、請求項１２１または１２２に記載のＣＡＲ。
【請求項１２６】
前記抗ＨＬＡ−ＤＲ重鎖可変領域が、本明細書で開示される配列から選択されるコンセンサス配列を有するポリペプチドまたはそれらの各々の同等物を含む、請求項１２１または１２２に記載のＣＡＲ。
【請求項１２７】
前記抗ＨＬＡ−ＤＲ軽鎖可変領域が、本明細書で開示される配列から選択されるコンセンサス配列を有するポリペプチドまたはそれらの各々の同等物を含む、請求項１２１または１２２に記載のＣＡＲ。
【請求項１２８】
同等物が、ポリペプチドに対して少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、または前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの相補体と高ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを含む、請求項１１９から１２７のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
【請求項１２９】
検出可能なマーカーまたは精製マーカーをさらに含む、請求項１１９から１２８のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
【請求項１３０】
請求項１１９から１２９のいずれか一項に記載のＣＡＲをコードする単離核酸配列。
【請求項１３１】
本明細書で開示される配列のいずれか１つまたはそれらの各々の同等物から選択される配列を含む、請求項１３０に記載の単離核酸配列。
【請求項１３２】
前記抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体の抗原結合性ドメインの上流に配置されたＫｏｚａｋコンセンサス配列、またはエンハンサーをさらに含む、請求項１３０または１３１に記載の単離核酸配列。
【請求項１３３】
抗生物質耐性ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１３０から１３２のいずれか一項に記載の単離核酸配列。
【請求項１３４】
前記ＣＡＲの発現および／または活性化を制御するためのスイッチメカニズムをさらに含む、請求項１３０から１３３のいずれか一項に記載の単離核酸配列。
【請求項１３５】
請求項１３０から１３４のいずれか一項に記載の単離核酸配列を含むベクター。
【請求項１３６】
プラスミドである、請求項１３５に記載のベクター。
【請求項１３７】
レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターからなる群より選択される、請求項１３５に記載のベクター。
【請求項１３８】
ＣＲＩＳＰＲベクターである、請求項１３５に記載のベクター。
【請求項１３９】
請求項１１９から１２９のいずれか一項に記載のＣＡＲ；および／または請求項１３０から１３４のいずれか一項に記載の単離核酸；および／または請求項１３５から１３８のいずれか一項に記載のベクターを含む単離細胞。
【請求項１４０】
免疫細胞である、請求項１３９に記載の単離細胞。
【請求項１４１】
前記免疫細胞が、Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、請求項１４０に記載の単離細胞。
【請求項１４２】
担体と、請求項１１９から１２９のいずれか一項に記載のＣＡＲ；および／または請求項１３０から１３４のいずれか一項に記載の単離核酸；および／または請求項１３５から１３８のいずれか一項に記載のベクター；および／または請求項１３９から１４１のいずれか一項に記載の単離細胞のうちの１または複数とを含む組成物。
【請求項１４３】
ＨＬＡ−ＤＲタンパク質またはその断片を含むペプチドに結合することが可能な抗原結合断片をさらに含む、請求項１４２に記載の組成物。
【請求項１４４】
前記ペプチドが、細胞と会合する、請求項１４３に記載の組成物。
【請求項１４５】
前記ペプチドが、固体支持体に結合する、請求項１４３に記載の組成物。
【請求項１４６】
前記ペプチドが、溶液中に配置される、請求項１４３に記載の組成物。
【請求項１４７】
前記ペプチドが、マトリックスと会合する、請求項１４３に記載の組成物。
【請求項１４８】
抗ＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ発現細胞を作製する方法であって、
（ｉ）請求項１１９から１２９のいずれか一項に記載のＣＡＲをコードする核酸配列を免疫細胞の集団に導入するステップと；
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の前記核酸配列の形質導入に成功した免疫細胞の亜集団を選択し、これにより、抗ＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ発現細胞を作製するステップと
を含む方法。
【請求項１４９】
前記免疫細胞が、Ｔ細胞である、請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５０】
Ｔ細胞の集団が、内因性Ｔ細胞受容体の発現を低減または消失させるように改変されている、請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５１】
Ｔ細胞の前記集団が、ＲＮＡ干渉またはＣＲＩＳＰＲを利用する方法を使用して改変された、請求項１５０に記載の方法。
【請求項１５２】
それを必要とする対象における腫瘍の増殖を阻害するおよび／またはがんを処置する方法であって、前記対象へと、有効量の、請求項１４８から１５２のいずれか一項に記載の抗ＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ発現細胞を投与するステップを含む方法。
【請求項１５３】
前記ＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ発現細胞が、処置される前記対象に対して自家または同種である、請求項１５２に記載の方法。
【請求項１５４】
前記腫瘍またはがんが、ＨＬＡ−ＤＲを発現させるか、または正常な非がん性の対応細胞と比較して過剰発現させる、請求項１５２または１５３に記載の方法。
【請求項１５５】
前記腫瘍が、Ｂ細胞リンパ腫腫瘍もしくは白血病腫瘍であり、および／または前記がんが、Ｂ細胞リンパ腫もしくは白血病である、請求項１５２から１５４に記載の方法。
【請求項１５６】
前記対象が、ヒト、動物、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ヒツジ、マウス、ウマ、またはウシを含む、請求項１５２から１５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５７】
本明細書で開示されるＣＡＲ、単離核酸配列、ベクター、単離細胞、および組成物のうちの１または複数と、本明細書で開示される１または複数の方法に従って使用するための指示とを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１６年９月２３日に出願された米国仮出願番号第６２／３９９，２４４号への米国特許法第１１９条（ｅ）項の下の優先権を主張しており、その内容は、その全体が参考として本明細書によって援用される。
【０００２】
技術分野
本開示は、新規の黄体形成ホルモン受容体（ＬＨＲ）、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と、これを含む細胞または組成物と、固形腫瘍を含む治療のためにこれらを使用する方法とに関する。本明細書ではまた、黄体形成ホルモン受容体、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲキメラ抗原受容体の免疫原性決定基を含有する単離ペプチドおよび融合タンパク質も提示される。
【背景技術】
【０００３】
背景
本開示の背景についての以下の論述は、読者による本発明の理解を助けるために提示するものに過ぎず、本発明に対する先行技術を記載するまたは構成することを認めるものではない。
【０００４】
卵巣癌は、婦人科腫瘍からのがんによる死亡の、最も一般的な原因である（Ｓｉｅｇｅｌ，  Ｒ．ら（２０１２年）、ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．、Ｃｌｉｎ．、６２巻：１０〜２９頁）。米国では毎年、約２５，０００例の新規の症例と、１４，０００例の死亡例とが、発生すると予測されている（Ｓｉｅｇｅｌ，  Ｒ．ら（２０１２年）、ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．、Ｃｌｉｎ．、６２巻：１０〜２９頁）。１９６０年代における生存中央値は、現今の３８カ月間と比較して、約１２カ月間であったので、卵巣癌の全生存は、最近の３０年間で改善されていると考えられる。しかし、病期ＩＩＩの卵巣がんの５年間生存率は、それほど変化しておらず、２５％のままである。生存中央値の改良は部分的に、最新の化学療法の改良のためであると説明することができる。卵巣がんを伴う患者のための、標準的な初期化学療法は、白金−パクリタキセルベースのレジメンを伴う（Ｍａｒｃｕｓ，  Ｃ．  Ｓ．ら（２０１４年）、Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ、５巻：２５〜３０頁）。患者の約７０％は、この療法に対する臨床応答を達成する。これにも拘らず、大半の女性は、再発し、ついには、その疾患に屈服する。したがって、遠隔転移を減少させ、再発までの時間を延長し、全生存を改良しようとする試みでは、新規の治療標的を同定し、新規の薬剤を開発することが不可欠である。
【０００５】
２０１４年には、推定２３２，６７０件の新たな要因、浸潤性乳がんの症例が、米国女性において診断され、推定４０，０００名の米国女性が、転移性疾患で死亡する。７７％の症例が診断の時点で５０歳の年齢を超えているように、乳がんに罹患するリスクは年齢とともに増加する。一般に、乳がんを有する患者の死亡率は、より早期の検出、処置の向上、およびことによると閉経後ホルモン療法の使用減少のために発生率が低下したことに起因して、１９８９年以降低下してきている。早期に検出された場合、限局性乳がんの５年生存率は、９９％である。対照的に、局所性疾患の５年生存率は８４％であり、重要なこととして、転移性疾患についてはそれが２４％へと急降下する。
【０００６】
今年、米国において推定６３，９２０名の成人（男性３９，１４０名および女性２４，７８０名）が、腎がんと診断されている。この疾患による１３，８６０件の死亡（男性８，９００名および女性４，９６０名）が今年発生すると推定される。腎がんは、６番目に多いがんであり、男性については１０番目に多いがん死亡原因であり、女性については８番目に多いがんの原因である。腎がん患者の５年生存率は、７２％である。症例のおおよそ６３％には、診断時に転移性疾患がない。この群については、５年生存率が９２％に向上する。対照的に、腎盂における腎がん（転移性疾患）の５年生存率は、５１％である。
したがって、卵巣がんおよび他の固形腫瘍によるがん、例えば、前立腺がんの、安全で有効な処置が必要とされている。本開示は、この必要を満たし、関連する利点もまた提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｓｉｅｇｅｌ，Ｒ．ら、ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．Ｃｌｉｎ．（２０１２年）６２巻：１０〜２９頁
【非特許文献２】Ｍａｒｃｕｓ，Ｃ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（２０１４年）５巻：２５〜３０頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
開示の概要
遺伝子操作されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞による自家処置を使用して、Ｂ細胞性リンパ腫および白血病において最近得られつつある、いまだかつてない結果のために、いくつかの研究室が、この手法を、卵巣がんを含む固形腫瘍に適用し始めている。ＣＡＲ改変Ｔ細胞は、モノクローナル抗体の、ＨＬＡに依存しないターゲティング特異性を、活性化Ｔ細胞の、細胞溶解活性、増殖およびホーミング特性と組み合わせるが、チェックポイント抑制に応答しない。抗原を発現させる標的を直接死滅させるそれらの能力のために、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、任意の抗原陽性細胞または組織に対して高度に毒性であることから、高度に腫瘍特異的な抗体を伴うＣＡＲを構築することが要件となっている。現況では、卵巣癌に対するＣＡＲ改変Ｔ細胞は、α−葉酸受容体、メソテリン、およびＭＵＣ−ＣＤに対して構築されているが、これらの全ては、ある程度の抗原オフターゲット発現を示す。
【０００９】
例えば、一態様では、新規抗Ｂ７−Ｈ４抗体ならびにそれらの診断的および治療的使用方法が、本明細書で開示される。一態様では、これに関連して、本明細書では、重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列と軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列とを含む単離抗体であって、アミノ酸配列：
【００１０】
IGEDGILSCTFEPDIKLSDIVIQWLKEGVLGLVHEFKEGKDELSEQDEMFRGRTAVFADQVIVGNASLRLKNVQLTDAGTYKCYIITSKGKGNANLEYKTGAFSMPEVNVDYNASSETLRCEAPRWFPQPTVVWASQVDQGANFSEVSNTSFELNSENVTMKVVSVLYNVTINNTYSCMIENDIAKATGDIKVTESEIKRRSHLQLLNSKAまたはその同等物を含むヒトＢ７−Ｈ４のエピトープに結合する抗体が提示される。
【００１１】
ＨＬＡ−Ｇは、細胞傷害性免疫細胞機能を抑制するために、特に阻害性ＮＫ細胞受容体のリガンドとして、主として用いられる非古典的ＭＨＣクラスＩ分子である。
【００１２】
例えば、一態様では、新規抗ＨＬＡ−Ｇ抗体ならびにそれらの診断的および治療的使用方法が、本明細書で開示される。一態様では、これに関連して、本明細書では、重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列と軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列とを含む単離抗体であって、アミノ酸配列：
【００１３】
GSHSMRYFSA  AVSRPGRGEP  RFIAMGYVDD  TQFVRFDSDS  ACPRMEPRAP  WVEQEGPEYW  EEETRNTKAH  AQTDRMNLQT  LRGYYNQSEA  SSHTLQWMIG  CDLGSDGRLL  RGYEQYAYDG  KDYLALNEDL  RSWTAADTAA  QISKRKCEAA  NVAEQRRAYL  EGTCVEWHLA-G  YLENGKEMLQ  RADPPKTHVT  HHPVFDYEAT  LRCWALGFYP  AEIILTWQRD  GEDQTQDVEL  VETRPAGDGT  FQKWAAVVVP  SGEEQRYTCH  VQHEGLPEPL  MLRWKQSSLP  TIPIMGI  VAGLVVLAAV  VTGAAVAAVL  WRKKSSDまたはその同等物を含むヒトＨＬＡ−Ｇのエピトープに結合する抗体が提示される。
【００１４】
Ｌｙｍ−１およびＬｙｍ−２は、ヒトＢ細胞、樹状細胞の表面上にならびにＢ細胞由来リンパ腫および白血病の表面に主として発現される、ＭＨＣクラスＩＩ  ＨＬＡ−ＤＲ分子に対して向けられたものである。本開示の態様は、抗体であるＬｙｍ１またはＬｙｍ−２  ＣＡＲをコードする単離核酸配列、および単離核酸配列を含むベクターに関する。
【００１５】
本開示は、卵巣、乳、腎および前立腺癌を含むがこれらに限定されない固形腫瘍、ならびにＢ細胞リンパ腫または白血病の処置のための新規標的を提示する。ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧおよびＨＬＡ−ＤＲを含む標的は、これらの腫瘍の大部分において発現されることが多いが、オフターゲットの陽性度が限定的であり、したがって、望ましい安全性プロファイルを有する。したがって、一態様では、組成物は、ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−Ｇ、ＨＬＡ−ＤＲを発現または過剰発現させる腫瘍またはがん性細胞の処置において特に有用である。
【００１６】
一態様では、抗体は、少なくとも１０−６Ｍの特異的結合アフィニティーを有する。ある特定の態様では、抗体は、少なくとも約１０−７Ｍ、好ましくは、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、または１０−１２Ｍのアフィニティーで結合する。
【００１７】
一態様では、本開示は、重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列と、軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列とを含み、黄体形成ホルモン受容体（ＬＨＲ）、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲのエピトープに結合する単離抗体を提供する。さらなる態様では、本開示は、本明細書で開示される単離抗ＬＨＲ、抗Ｂ７−Ｈ４、抗ＨＬＡ−Ｇもしくは抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体またはその断片と、単独であるか、またはＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧもしくはＨＬＡ−ＤＲ抗原またはその断片と組み合わせた、検出可能な標識または精製標識とを提供する。本明細書ではさらに、この抗原／抗体複合体を含むｅｘ  ｖｉｖｏ細胞が提供される。
【００１８】
本開示の態様は、（ａ）ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ抗体の抗原結合性ドメイン；（ｂ）ヒンジドメイン；（ｃ）膜貫通ドメイン；および（ｄ）細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に関する。本開示のさらなる態様は、（ａ）ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ抗体の抗原結合性ドメイン；（ｂ）ヒンジドメイン；（ｃ）ＣＤ２８膜貫通ドメイン；（ｄ）ＣＤ２８共刺激性シグナル伝達領域、４−１ＢＢ共刺激性シグナル伝達領域、ＩＣＯＳ共刺激性シグナル伝達領域、およびＯＸ４０共刺激性領域から選択される、１または複数の共刺激性領域；ならびに（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインおよびその代替物を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に関する。
【００１９】
さらなる態様では、本開示は、（ａ）抗黄体形成ホルモン受容体（「ＬＨＲ」）、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ抗体の抗原結合性ドメイン、（ｂ）ＣＤ８αヒンジドメイン；（ｃ）ＣＤ８α膜貫通ドメイン；（ｄ）ＣＤ２８および／または４−１ＢＢ共刺激性シグナル伝達領域；ならびに（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインおよびその代替物を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。
【００２０】
別の態様では、本開示は、抗ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧもしくはＨＬＡ−ＤＲ抗体または抗ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧもしくはＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲをコードする単離核酸配列を提供する。
【００２１】
別の態様では、本開示は、抗ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧもしくはＨＬＡ−ＤＲ抗体または抗ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧもしくはＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲをコードする単離核酸配列を含むベクターを提供する。
【００２２】
別の態様では、本開示は、抗ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧもしくはＨＬＡ−ＤＲ抗体または抗ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧもしくはＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲをコードする単離核酸配列を含むベクターを提供する。
【００２３】
別の態様では、本開示は、担体と、抗ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧもしくはＨＬＡ−ＤＲ抗体；および／または抗ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧもしくはＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ；および／または抗ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧもしくはＨＬＡ−ＤＲ抗体もしくは抗ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧもしくはＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲをコードする単離核酸；および／または抗ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧもしくはＨＬＡ−ＤＲ抗体もしくは抗ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧもしくはＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲをコードする単離核酸配列を含むベクター；および／または抗ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧもしくはＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲを含む単離細胞のうちの１または複数とを含む組成物を提供する。
【００２４】
本開示の他の態様は、ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲを含む単離細胞、およびこのような細胞を作製する方法に関する。本開示のさらに他の方法態様は、腫瘍、例えば、固形腫瘍の増殖を阻害するための、およびがん患者を処置するための方法であって、有効量の単離細胞を投与するステップを含む方法に関する。
【００２５】
一態様では、本開示は、担体と、抗体もしくはその断片、抗体もしくはその断片をコードする核酸、抗ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧもしくはＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲを含む単離細胞；および／またはこのＣＡＲをコードする単離核酸；および／またはこのＣＡＲをコードする核酸を含むベクター；および／または抗ＬＨＲ  ＣＡＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧもしくはＨＬＡ−ＤＲを発現させる単離細胞；および／または抗ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧもしくはＨＬＡ−ＤＲ抗体のうちの１または複数とを含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはなおさらにこれらからなる組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｃは、（図１Ａ）ＴＯＶ２１Ｇ細胞株上のＬＨＲ、（図１Ｂ）ＳＫＯＶ３細胞株上のメソテリン、および（図１Ｃ）ＣＡＯＶ３細胞株上のＭＵＣ１６についてのフローサイトメトリープロファイルを示す。
【図１Ｂ】図１Ａ〜１Ｃは、（図１Ａ）ＴＯＶ２１Ｇ細胞株上のＬＨＲ、（図１Ｂ）ＳＫＯＶ３細胞株上のメソテリン、および（図１Ｃ）ＣＡＯＶ３細胞株上のＭＵＣ１６についてのフローサイトメトリープロファイルを示す。
【図１Ｃ】図１Ａ〜１Ｃは、（図１Ａ）ＴＯＶ２１Ｇ細胞株上のＬＨＲ、（図１Ｂ）ＳＫＯＶ３細胞株上のメソテリン、および（図１Ｃ）ＣＡＯＶ３細胞株上のＭＵＣ１６についてのフローサイトメトリープロファイルを示す。
【００２７】
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｃは、（図２Ａ）病期２の漿液性乳頭状腺癌についてのＬＨＲ抗体；（図２Ｂ）病期ＩＩＩＣの類内膜腺癌についてのＭＵＣ１６抗体；および（図２Ｃ）病期１Ｃの漿液性乳頭状腺癌についてのメソテリン抗体による、陽性の免疫組織化学染色パターンを示す。
【図２Ｂ】図２Ａ〜２Ｃは、（図２Ａ）病期２の漿液性乳頭状腺癌についてのＬＨＲ抗体；（図２Ｂ）病期ＩＩＩＣの類内膜腺癌についてのＭＵＣ１６抗体；および（図２Ｃ）病期１Ｃの漿液性乳頭状腺癌についてのメソテリン抗体による、陽性の免疫組織化学染色パターンを示す。
【図２Ｃ】図２Ａ〜２Ｃは、（図２Ａ）病期２の漿液性乳頭状腺癌についてのＬＨＲ抗体；（図２Ｂ）病期ＩＩＩＣの類内膜腺癌についてのＭＵＣ１６抗体；および（図２Ｃ）病期１Ｃの漿液性乳頭状腺癌についてのメソテリン抗体による、陽性の免疫組織化学染色パターンを示す。
【００２８】
【図３】図３は、ＬＨＲ−Ｆｃを作出するのに使用される配列を示す。ＬＨＲ  ＣＡＲの作出に有用な、潜在的ＬＨＲ結合性抗体を同定する、免疫化およびスクリーニング法において使用されるＬＨＲ−Ｆｃを作出するのに使用される配列（枠囲いされた領域）を示す、ＬＨＲ  Ｇタンパク質のアミノ酸構造。
【００２９】
【図４】図４は、ＥＳ−２卵巣癌細胞株上の、ＬＨＲ−Ｆｃ  ＥＬＩＳＡ陽性抗体についての、典型的なフローサイトメトリースクリーニングであって、ハイブリドーマ８Ｂ７だけによる強い反応性を裏付けるフローサイトメトリースクリーニングを示す。
【００３０】
【図５】図５は、ＥＳ−２ヒト卵巣癌細胞上のＭＦＩ値が最高である、５つの候補ＬＨＲ抗体サブクローンについてのフローサイトメトリーを示す。
【００３１】
【図６】図６は、細胞膜内の抗ＬＨＲ  ＣＡＲの、ＤＮＡ配列および理論構造についての概略図を示す。
【００３２】
【図７】図７は、ＬＨＲ抗体サブクローンの、重鎖および軽鎖配列についてのアラインメントを示す。
【００３３】
【図８Ａ】図８Ａ〜Ｄは、ＬＨＲ陽性がんの分布（図８Ａ）；複数の腫瘍組織学群によるＬＨＲ強度（図８Ｂ）；卵巣がん、腹膜がん、または卵管がんを伴う患者におけるＬＨＲ染色強度（図８Ｃ）；および腫瘍病理学的病期群によるＬＨＲ染色強度（図８Ｄ）の分布を示す。
【図８Ｂ】図８Ａ〜Ｄは、ＬＨＲ陽性がんの分布（図８Ａ）；複数の腫瘍組織学群によるＬＨＲ強度（図８Ｂ）；卵巣がん、腹膜がん、または卵管がんを伴う患者におけるＬＨＲ染色強度（図８Ｃ）；および腫瘍病理学的病期群によるＬＨＲ染色強度（図８Ｄ）の分布を示す。
【図８Ｃ】図８Ａ〜Ｄは、ＬＨＲ陽性がんの分布（図８Ａ）；複数の腫瘍組織学群によるＬＨＲ強度（図８Ｂ）；卵巣がん、腹膜がん、または卵管がんを伴う患者におけるＬＨＲ染色強度（図８Ｃ）；および腫瘍病理学的病期群によるＬＨＲ染色強度（図８Ｄ）の分布を示す。
【図８Ｄ】図８Ａ〜Ｄは、ＬＨＲ陽性がんの分布（図８Ａ）；複数の腫瘍組織学群によるＬＨＲ強度（図８Ｂ）；卵巣がん、腹膜がん、または卵管がんを伴う患者におけるＬＨＲ染色強度（図８Ｃ）；および腫瘍病理学的病期群によるＬＨＲ染色強度（図８Ｄ）の分布を示す。
【００３４】
【図９】図９Ａ〜Ｄは、前立腺がんにおけるＬＨＲ発現であって、組織学（図９Ａ）、（ＡＤ）前立腺がんおよび去勢抵抗性（ＣＲ）前立腺がんにおける、相対ｍＲＮＡレベル（図９Ｂ）、ならびにウェスタンブロット（図９Ｃ〜Ｄ）におけるＬＨＲ発現を示す。
【００３５】
【図１０】図１０は、遺伝子移入ベクターの骨格が、ＨＩＶ−１  ５’末端反復（ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ）（ＬＴＲ）およびＨＩＶ−１  ３’末端反復、パッケージングシグナル（Ψ）、ＥＦ１αプロモーター、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、緑色蛍光タンパク質であるＺｓＧｒｅｅｎ、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、およびサルウイルス４０起点（ＳＶ４０）を含有する、ＨＩＶベースの、バイシストロニックのレンチウイルスベクターである、ｐＬＶＸ−ＩＲＥＳ−ＺｓＧｒｅｅｎであることを示す。ＥＦ−１αプロモーターの存在により、ＬＨＲに特異的なｓｃＦＶ、ＣＤ８ヒンジおよび膜貫通領域、ならびにＣＤ２８、４−１ＢＢ、およびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む導入遺伝子が確実に構成的に発現される。検出タンパク質であるＺｓＧｒｅｅｎの発現は、ＩＲＥＳ領域により実行する。ベクターの統合は、蛍光顕微鏡法を介して、細胞内のＺｓＧｒｅｅｎの存在によりアッセイした。
【００３６】
【図１１】図１１は、ＬＨＲ  ＣＡＲ  Ｔ細胞についての細胞傷害アッセイの結果を描示する。ＬＨＲ  ＣＡＲを発現させるＴ細胞の細胞傷害は、方法において記載される、ＬＤＨ細胞傷害キットを使用して決定した。アッセイの前に、Ｔ細胞は、αＣＤ３／ＣＤ８ビーズ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；２ｍｌの培地に対して、３０ｕｌ）を使用して活性化させた。活性化Ｔ細胞に、ＬＨＲレンチウイルス粒子を用いて形質導入し、これに続き、αＣＤ３／ＣＤ８ビーズを使用して、Ｔ細胞を活性化させた。形質導入されていない活性化Ｔ細胞を、対照として使用した。ウェル１つ当たり３，０００個のＳＫＯＶ３細胞を播種した。ＬＨＲを形質導入されたＴ細胞を、２０：１、１０：１、５：１、および１：１の比（６０，０００〜３，０００個）で、ウェルへと添加した。各データ点は、三連の測定値の平均を表す。
【００３７】
【図１２】図１２は、初代Ｔ細胞内の、ＬＨＲ  ＣＡＲのｍＲＮＡ発現を描示する。ＬＨＲ  ＣＡＲを形質導入された初代Ｔ細胞は、ＬＨＲ  ｍＲＮＡの発現を示す。使用されたプライマーは、ＣＤ８ヒンジドメインと、４−１ＢＢシグナル伝達ドメインとの間の領域（３００ｂｐ）にわたった。
【００３８】
【図１３Ａ−１３Ｃ】図１３Ａ〜１３Ｃは、抗原として使用されるヒトＢ７−Ｈ４−Ｆｃ融合タンパク質の概略図およびＨＰＬＣ解析を示す。（図１Ａ）遺伝子を構築するために使用されるベクター；（図１Ｂ）Ｂ７−Ｈ４をヒトＩｇＧ１の免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端に融合させて、抗原として使用される二量体タンパク質を作製した、完全Ｂ７−Ｈ４−Ｆｃ融合タンパク質。（図１Ｃ）精製Ｂ７−Ｈ４−Ｆｃについての、その分子量を示す予想滞留時間を示す、ＨＰＬＣ解析。
【００３９】
【図１４】図１４は、乳腺癌、結腸直腸腺癌、絨毛癌および乳管癌にそれぞれ由来するＳＫＢＲ−３、ＨＴ−２９、ＪＡＲおよびＴ４７Ｄ細胞株上のマウスモノクローナル抗ヒトＢ７−Ｈ４についての代表的なフローサイトメトリーデータを示す。濃い方の線は、Ｂ７−Ｈ４が染色された細胞を表し、薄い方の線は、アイソタイプ対照で染色された細胞を表す。ＦＩＴＣとコンジュゲートさせたヒツジ抗マウスＩｇＧを二次抗体として使用した。Ｂ７−Ｈ４の細胞表面発現は、これらの細胞株におけるｂ７−ｈ４発現のｑ−ＰＣＲデータと一致する（データは示されていない）。
【００４０】
【図１５】図１５は、ヒトＢ７−Ｈ４に対して新たに作出され、精製されたモノクローナル抗体のフローサイトメトリースクリーニングデータを示す。陽性ハイブリドーマ（３５−８および５Ｆ６−６）のサブクローンを、これらの結果に基づいてＣＡＲ  Ｔ細胞の作出のために選択した。次いで、クローン３５−８を配列決定し、免疫療法用のＢ７−Ｈ４  ＣＡＲ  Ｔ細胞の作製に使用した。
【００４１】
【図１６】図１６Ａ〜Ｂは、１６の正常およびがん組織マイクロアレイでのＢ７−Ｈ４抗体（クローン＃３５−８）染色の代表的な画像を示す。（図１６Ａ）正常組織に対するＢ７−Ｈ４染色。（図１６Ｂ）乳房の正常およびがん組織に対するＢ７−Ｈ４染色。Ｂ７−Ｈ４陽性度が陰性と判明した他の正常組織（示されていない）は、以下のもの：副腎、骨髄、小脳、食道、下垂体、腸、リンパ節、卵巣、前立腺、胃、精巣、甲状腺、胸腺、舌、子宮、皮膚および神経組織を含む。
【００４２】
【図１７】図１７は、細胞膜内の第３世代抗Ｂ７−Ｈ４  ＣＡＲのＤＮＡ配列および理論構造の概略図を示す。
【００４３】
【図１８】図１８Ａ〜Ｂは、抗原に対する細胞表面陽性度（褐色染色）を示す、（図１８Ａ）ヒト乳癌生検試料の切片および（図１８Ｂ）ＳＫＢＲ３ヒト乳がん細胞株ペレットの切片でのＢ７−Ｈ４の免疫組織化学染色を示す。
【００４４】
【図１９】図１９は、遺伝子移入ベクターのおよび導入遺伝子の模式図を示す。遺伝子移入ベクターの骨格は、ＨＩＶ−１  ５’末端反復（ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ）（ＬＴＲ）およびＨＩＶ−１  ３’末端反復、パッケージングシグナル（Ψ）、ＥＦ１αプロモーター、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、緑色蛍光タンパク質であるＺｓＧｒｅｅｎ、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、およびサルウイルス４０起点（ＳＶ４０）を含有する、ＨＩＶベースの、バイシストロニックのレンチウイルスベクターである、ｐＬＶＸ−ＩＲＥＳ−ＺｓＧｒｅｅｎである。ＥＦ−１αプロモーターの存在により、Ｂ７−Ｈ４に特異的なｓｃＦＶ、ＣＤ８ヒンジおよび膜貫通領域、ならびにＣＤ２８、４−１ＢＢ、およびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む導入遺伝子が確実に構成的に発現される。検出タンパク質であるＺｓＧｒｅｅｎの発現は、ＩＲＥＳ領域により実行する。ベクターの統合は、蛍光顕微鏡法を介して、細胞内のＺｓＧｒｅｅｎの存在によりアッセイされ得る。
【００４５】
【図２０】図２０は、Ｂ７−Ｈ４  ＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞傷害を示す。Ｂ７−Ｈ４  ＣＡＲを発現させるＴ細胞の細胞傷害は、方法において記載される、ＬＤＨ細胞傷害キットを使用して決定した。アッセイの前に、αＣＤ３／ＣＤ８ビーズ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、２ｍｌの培地に対して３０μｌ）を使用してＴ細胞を活性化させた。活性化Ｔ細胞に、Ｂ７−Ｈ４レンチウイルス粒子を用いて形質導入し、これに続き、αＣＤ３／ＣＤ８ビーズを使用して、Ｔ細胞を活性化させた。形質導入されていない活性化Ｔ細胞を、対照として使用した。ウェル１つ当たり３０００個のＳＫＢＲ３細胞を播種した。Ｂ７−Ｈ４を形質導入されたＴ細胞を、２０：１、１０：１、５：１、および１：１の比（細胞６０，０００〜３０００個）で、ウェルへと添加した。各データ点は、三連の測定値の平均を表す。
【００４６】
【図２１】図２１は、ヒトＨＬＡ−Ｇに対して新たに作出されたモノクローナル抗体のフローサイトメトリースクリーニングデータを示す。陽性ハイブリドーマ（３Ｈ１１−１２および４Ｅ３−１）のサブクローンを、これらの結果に基づいてＣＡＲ  Ｔ細胞の作出のために選択した。
【００４７】
【図２２Ａ】図２２Ａ〜２２Ｄは、ＨＬＡ−ＡＢＣ対照染色を伴う乳頭様甲状腺がんおよび正常甲状腺組織におけるＨＬＡ−Ｇ反応性の免疫組織化学を示す。図２２Ａは、抗体４Ｅ３−１を使用して低倍率（１００×）のＨＬＡ−Ｇ陽性乳頭様甲状腺癌切片を示す。図２２Ｂは、より高倍率（２５０×）の、ＨＬＡ−Ｇに対して陽性の第２の乳頭様甲状腺癌を示す。図２２Ｃは、正常甲状腺組織のＨＬＡ−Ｇ対する陰性反応性を示し（２５０×）、図２２Ｄは、正常甲状腺組織のＨＬＡ−ＡＢＣに対する陽性反応性を示す（１００×）。
【図２２Ｂ】図２２Ａ〜２２Ｄは、ＨＬＡ−ＡＢＣ対照染色を伴う乳頭様甲状腺がんおよび正常甲状腺組織におけるＨＬＡ−Ｇ反応性の免疫組織化学を示す。図２２Ａは、抗体４Ｅ３−１を使用して低倍率（１００×）のＨＬＡ−Ｇ陽性乳頭様甲状腺癌切片を示す。図２２Ｂは、より高倍率（２５０×）の、ＨＬＡ−Ｇに対して陽性の第２の乳頭様甲状腺癌を示す。図２２Ｃは、正常甲状腺組織のＨＬＡ−Ｇ対する陰性反応性を示し（２５０×）、図２２Ｄは、正常甲状腺組織のＨＬＡ−ＡＢＣに対する陽性反応性を示す（１００×）。
【図２２Ｃ】図２２Ａ〜２２Ｄは、ＨＬＡ−ＡＢＣ対照染色を伴う乳頭様甲状腺がんおよび正常甲状腺組織におけるＨＬＡ−Ｇ反応性の免疫組織化学を示す。図２２Ａは、抗体４Ｅ３−１を使用して低倍率（１００×）のＨＬＡ−Ｇ陽性乳頭様甲状腺癌切片を示す。図２２Ｂは、より高倍率（２５０×）の、ＨＬＡ−Ｇに対して陽性の第２の乳頭様甲状腺癌を示す。図２２Ｃは、正常甲状腺組織のＨＬＡ−Ｇ対する陰性反応性を示し（２５０×）、図２２Ｄは、正常甲状腺組織のＨＬＡ−ＡＢＣに対する陽性反応性を示す（１００×）。
【図２２Ｄ】図２２Ａ〜２２Ｄは、ＨＬＡ−ＡＢＣ対照染色を伴う乳頭様甲状腺がんおよび正常甲状腺組織におけるＨＬＡ−Ｇ反応性の免疫組織化学を示す。図２２Ａは、抗体４Ｅ３−１を使用して低倍率（１００×）のＨＬＡ−Ｇ陽性乳頭様甲状腺癌切片を示す。図２２Ｂは、より高倍率（２５０×）の、ＨＬＡ−Ｇに対して陽性の第２の乳頭様甲状腺癌を示す。図２２Ｃは、正常甲状腺組織のＨＬＡ−Ｇ対する陰性反応性を示し（２５０×）、図２２Ｄは、正常甲状腺組織のＨＬＡ−ＡＢＣに対する陽性反応性を示す（１００×）。
【００４８】
【図２３】図２３は、細胞膜内の第３世代抗ＨＬＡ−Ｇ  ＣＡＲのＤＮＡ配列および理論構造の概略図を示す。
【００４９】
【図２４】図２４は、図１において記載したような、さらなる抗体スクリーニングを示す。
【００５０】
【図２５】図２５は、遺伝子移入ベクターのおよび導入遺伝子の概略図を描示する。遺伝子移入ベクターの骨格は、ＨＩＶ−１  ５’末端反復（ＬＴＲ）およびＨＩＶ−１  ３’末端反復、パッケージングシグナル（Ψ）、ＥＦ１αプロモーター、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、緑色蛍光タンパク質であるＺｓＧｒｅｅｎ、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、およびサルウイルス４０起点（ＳＶ４０）を含有する、ＨＩＶベースの、バイシストロニックのレンチウイルスベクターである、ｐＬＶＸ−ＩＲＥＳ−ＺｓＧｒｅｅｎである。ＥＦ−１αプロモーターの存在により、ＨＬＡ−Ｇに特異的なｓｃＦＶ、ＣＤ８ヒンジおよび膜貫通領域ならびにＣＤ２８、４−１ＢＢおよびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む導入遺伝子が、確実に構成的に発現される。検出タンパク質であるＺｓＧｒｅｅｎの発現は、ＩＲＥＳ領域により実行される。ベクターの組込みは、蛍光顕微鏡法を介して、細胞内のＺｓＧｒｅｅｎの存在によりアッセイすることができる。
【００５１】
【図２６】図２６は、ＨＬＡ−Ｇ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞傷害を示す。ＨＬＡ−Ｇ  ＣＡＲを発現させるＴ細胞の細胞傷害は、方法において記載される、ＬＤＨ細胞傷害キットを使用して決定した。アッセイの前に、αＣＤ３／ＣＤ８ビーズ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、２ｍｌの培地に対して３０ｕｌ）を使用してＴ細胞を活性化させた。活性化Ｔ細胞に、ＨＬＡ−Ｇレンチウイルス粒子を用いて形質導入し、これに続き、αＣＤ３／ＣＤ８ビーズを使用して、Ｔ細胞を活性化させた。形質導入されていない活性化Ｔ細胞およびＴＬＢＲ−２  Ｔリンパ腫細胞株を、対照として使用した。ウェル１つ当たり３，０００個のＳＫＯＶ３またはＴＬＢＲ−２細胞を播種した。ＨＬＡ−Ｇを形質導入されたＴ細胞を、２０：１、１０：１、５：１、および１：１の比（細胞６０，０００〜３０００個）で、ウェルへと添加した。各データ点は、三連の測定値の平均を表す。
【００５２】
【図２７】図２７は、ＨＬＡ−Ｇ  ＣＡＲのタンパク質発現を示す。ＨＬＡ−Ｇ  ＣＡＲレンチウイルス粒子を用いて形質導入されたＴ細胞は、ＨＬＡ−Ｇ  ＣＡＲのタンパク質を発現する。ＣＡＲタンパク質の推定サイズは、６０ｋＤａである。ＣＤ３ζ抗体を使用してそのタンパク質を検出した。５０μｇのタンパク質をウェスタブロットに使用した。β−アクチンを負荷対照として使用した。
【００５３】
【図２８Ａ−２８Ｆ】図２８Ａ〜２８Ｆは、患者の正常末梢血リンパ球との（図２８Ａ）陰性対照；（図２８Ｂ）Ｌｙｍ−１；（図２８Ｃ）Ｌｙｍ−１およびＢ１；（図２８Ｄ）Ｂ１のみ；（図２８Ｅ）Ｌｙｍ−２；ならびに（図２８Ｆ）Ｌｙｍ−２およびＢ１の染色反応性についてのフローサイトメトリー解析を示す。Ｌｙｍ−１およびＬｙｍ−２の両方は、正常ヒト末梢Ｂ細胞への結合について異なるプロファイルを有する。
【００５４】
【図２９Ａ−２９Ｂ】図２９Ａ〜２９Ｂは、Ｂ細胞胚中心における膜陽性度を裏付ける、正常ヒト扁桃のＬｙｍ−１およびＬｙｍ−２染色を示す。Ｌｙｍ−１（図２９Ａ）とＬｙｍ−２（図２９Ｂ）間の染色パターンの相違は、明らかである。Ｔ細胞ゾーン内に散在している濾胞間樹状細胞のみが、両方の抗体に対して陽性である（ＩＨＣ、凍結切片、×３２５）。
【００５５】
【図３０Ａ−３０Ｂ】図３０Ａおよび３０Ｂは、中悪性度の悪性Ｂ細胞リンパ腫についてのＬｙｍ−１およびＬｙｍ−２モノクローナル抗体の免疫ペルオキシダーゼ染色を示す。中悪性度の悪性Ｂ細胞リンパ腫（凍結切片、×７２０）についてのＬｙｍ−１（図３０Ａ）およびＬｙｍ−２（図３０Ｂ）モノクローナル抗体の免疫ペルオキシダーゼ染色。切片における細胞の大部分についての顕著な膜染色パターンに注目されたい。
【００５６】
【図３１Ａ】図３１Ａ〜３１Ｃは、（図３１Ａ）ラジ細胞へのＬｙｍ−１モノクローナル抗体の、およびＡＲＨ−７７細胞へのＬｙｍ−２モノクローナル抗体の、結合プロファイル；（図３１Ｂ）ラジ細胞に関するＬｙｍ−１モノクローナル抗体の散布図解析；（図３１Ｃ）ＡＲＨ−７７細胞に関するＬｙｍ−２モノクローナル抗体の散布図解析である、結合プロファイルおよび散布図を示す。
【図３１Ｂ】図３１Ａ〜３１Ｃは、（図３１Ａ）ラジ細胞へのＬｙｍ−１モノクローナル抗体の、およびＡＲＨ−７７細胞へのＬｙｍ−２モノクローナル抗体の、結合プロファイル；（図３１Ｂ）ラジ細胞に関するＬｙｍ−１モノクローナル抗体の散布図解析；（図３１Ｃ）ＡＲＨ−７７細胞に関するＬｙｍ−２モノクローナル抗体の散布図解析である、結合プロファイルおよび散布図を示す。
【図３１Ｃ】図３１Ａ〜３１Ｃは、（図３１Ａ）ラジ細胞へのＬｙｍ−１モノクローナル抗体の、およびＡＲＨ−７７細胞へのＬｙｍ−２モノクローナル抗体の、結合プロファイル；（図３１Ｂ）ラジ細胞に関するＬｙｍ−１モノクローナル抗体の散布図解析；（図３１Ｃ）ＡＲＨ−７７細胞に関するＬｙｍ−２モノクローナル抗体の散布図解析である、結合プロファイルおよび散布図を示す。
【００５７】
【図３２Ａ−３２Ｂ】図３２Ａおよび３２Ｂは、３５Ｓ−メチオニンおよび１４Ｃ−ロイシン標識ラジタンパク質の、Ｌｙｍ−１（図３２Ａ）およびＳＣ−２抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（図３２Ｂ）による、免疫沈降を示す。
【００５８】
【図３３Ａ】図３３Ａおよび３３Ｂは、免疫療法のための（図３３Ａ）Ｌｙｍ−１および（図３３Ｂ）Ｌｙｍ−２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の構築概略図を示す。図６Ａおよび６Ｂは、可撓性リンカー配列を開示する。
【図３３Ｂ】図３３Ａおよび３３Ｂは、免疫療法のための（図３３Ａ）Ｌｙｍ−１および（図３３Ｂ）Ｌｙｍ−２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の構築概略図を示す。図６Ａおよび６Ｂは、可撓性リンカー配列を開示する。
【００５９】
【図３４】図３４は、非限定的な例示的Ｌｙｍ−１遺伝子移入ベクターおよび導入遺伝子の概略図を描示する。遺伝子移入ベクターの骨格は、ＨＩＶ−１  ５’末端反復（ＬＴＲ）およびＨＩＶ−１  ３’末端反復、パッケージングシグナル（Ψ）、ＥＦ１αプロモーター、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、緑色蛍光タンパク質であるＺｓＧｒｅｅｎ、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、およびサルウイルス４０起点（ＳＶ４０）を含有する、ＨＩＶベースの、バイシストロニックのレンチウイルスベクターである、ｐＬＶＸ−ＩＲＥＳ−ＺｓＧｒｅｅｎである。ＥＦ−１αプロモーターの存在により、ＣＤ８リーダー配列、Ｌｙｍ−１に特異的なｓｃＦＶ、ＣＤ８ヒンジおよび膜貫通領域ならびに４−１ＢＢおよびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む導入遺伝子が、確実に構成的に発現される。検出タンパク質であるＺｓＧｒｅｅｎの発現は、ＩＲＥＳ領域により実行される。ベクターの組込みは、蛍光顕微鏡法を介して、細胞内のＺｓＧｒｅｅｎの存在によりアッセイすることができる。
【００６０】
【図３５】図３５は、初代ヒトＴ細胞上でのＬｙｍ−１  ＣＡＲの発現を示す。Ｌｙｍ−１  ＣＡＲを用いてＴ細胞に形質導入し、それらをビオチン−プロテインＬ（Biotein-Protein  L）、続いてＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＰＥで染色した。細胞をフローサイトメトリーにより解析した。
【００６１】
【図３６】図３６は、Ｌｙｍ−１−ＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞傷害を示す。Ｌｙｍ−１  ＣＡＲを発現させるＴ細胞の細胞傷害は、方法において記載される、ＬＤＨ細胞傷害キットを使用して決定した。アッセイの前に、Ｔ細胞は、αＣＤ３／ＣＤ８ビーズ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；２ｍｌの培地に対して、３０ｕｌ）を使用して活性化させた。活性化Ｔ細胞に、Ｌｙｍ−１  ＣＡＲレンチウイルス粒子を用いて形質導入し、これに続き、αＣＤ３／ＣＤ８ビーズを使用して、Ｔ細胞を活性化させた。形質導入されていない活性化Ｔ細胞を、対照として使用した。ウェル１つ当たり１５，０００個のラジ細胞を播種した。Ｌｙｍ−１  ＣＡＲを形質導入されたＴ細胞を、２０：１、１０：１、５：１、および１：１の比で、ウェルへと添加した。各データ点は、三連の測定値の平均を表す。
【００６２】
【図３７】図３７は、非限定的な例示的Ｌｙｍ−２遺伝子移入ベクターおよび導入遺伝子の概略図を描示する。遺伝子移入ベクターの骨格は、ＨＩＶ−１  ５’末端反復（ＬＴＲ）およびＨＩＶ−１  ３’末端反復、パッケージングシグナル（Ψ）、ＥＦ１αプロモーター、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、緑色蛍光タンパク質であるＺｓＧｒｅｅｎ、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、およびサルウイルス４０起点（ＳＶ４０）を含有する、ＨＩＶベースの、バイシストロニックのレンチウイルスベクターである、ｐＬＶＸ−ＩＲＥＳ−ＺｓＧｒｅｅｎである。ＥＦ−１αプロモーターの存在により、ＣＤ８リーダー配列、Ｌｙｍ−２に特異的なｓｃＦＶ、ＣＤ８ヒンジおよび膜貫通領域ならびにＣＤ２８、４−１ＢＢおよびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む導入遺伝子が、確実に構成的に発現される。検出タンパク質であるＺｓＧｒｅｅｎの発現は、ＩＲＥＳ領域により実行される。ベクターの組込みは、蛍光顕微鏡法を介して、細胞内のＺｓＧｒｅｅｎの存在によりアッセイすることができる。
【００６３】
【図３８】図３８は、初代ヒトＴ細胞上でのＬｙｍ−２  ＣＡＲの発現を示す。Ｌｙｍ−２  ＣＡＲを用いてＴ細胞に形質導入し、それらをビオチン−プロテインＬ、続いてＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＰＥで染色した。細胞をフローサイトメトリーにより解析した。
【００６４】
【図３９】図３９は、Ｌｙｍ−２−ＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞傷害を示す。Ｌｙｍ−２  ＣＡＲを発現させるＴ細胞の細胞傷害は、方法において記載される、ＬＤＨ細胞傷害キットを使用して決定した。アッセイの前に、αＣＤ３／ＣＤ８ビーズ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、２ｍｌの培地に対して３０ｕｌ）を使用してＴ細胞を活性化させた。活性化Ｔ細胞に、Ｌｙｍ−２  ＣＡＲレンチウイルス粒子を用いて形質導入し、これに続き、αＣＤ３／ＣＤ８ビーズを使用して、Ｔ細胞を活性化させた。形質導入されていない活性化Ｔ細胞を、対照として使用した。ウェル１つ当たり１５，０００個のラジ細胞を播種した。Ｌｙｍ−２  ＣＡＲを形質導入されたＴ細胞を、２０：１、１０：１、５：１、および１：１の比で、ウェルへと添加した。各データ点は、三連の測定値の平均を表す。
【００６５】
【図４０】図４０は、Ｌｙｍ−１、Ｌｙｍ−２およびＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞がヒトリンパ腫ラジ細胞に対して高細胞傷害性であることを裏付ける。ラジバーキットリンパ腫細胞は、Ｌｙｍ−１およびＬｙｍ−２の標的とされるＨＬＡ−Ｄｒに対しても、またＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞の陽性対照としての役割を果すＣＤ１９に対しても、陽性である。陰性対照は、ＣＤ３＋Ｔ細胞およびＺｓｇｒｅｅｎ細胞からなった。
【００６６】
【図４１】図４１は、Ｌｙｍ−１、Ｌｙｍ−２が、ＨＬＡ−Ｄｒ陽性、しかしＣＤ１９陰性のＴＬＢＲ−２ヒトＴリンパ腫細胞に対してｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて高細胞溶解性であること、しかしＣＤ１９  ＣＡＲがそうでないことを裏付ける。乳房インプラント関連リンパ腫に由来するＴＬＢＲ−２ヒトＴリンパ腫細胞は、ＨＬＡ−Ｄｒに対して陽性であるが、ＣＤ１９に対して陽性でない（Lechnerら（２０１２年）Clin.  Cancer  Res.  １８巻（１７号）：４５４９〜４５５９頁）。これらの結果は、Ｌｙｍ−１およびＬｙｍ−２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の特異性、ならびにＨＬＡ−Ｄｒ陽性腫瘍の殺滅におけるそれらの効力を裏付ける。Ｌｙｍ−１  ＣＡＲ−ＴおよびＣＤ１９  ＣＡＲ−Ｔ陽性細胞の百分率を、通常の、形質導入されていない、初代Ｔ細胞を使用して５０％に調整した。Ｌｙｍ−２  ＣＡＲ−Ｔ細胞の百分率は、２４％であった。
【００６７】
【図４２】図４２は、トランスフェクトされたＮＫ細胞のＦＡＣｓ解析の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６８】
詳細な説明
本開示は、当然ながら変動しうるので、記載される特定の態様に限定されないことを理解されたい。また、本開示の範囲は、付属の特許請求の範囲だけによって限定されるので、本明細書で使用される用語法は、特定の態様について記載することだけを目的とするものであり、限定的であることを意図するものではないことも理解されたい。
【００６９】
そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本技術が属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。本技術の実施または試行では、本明細書で記載される方法および材料と類似または同等の、任意の方法および材料を使用しうるが、ここでは、好ましい方法、デバイス、および材料について記載する。本明細書で引用される全ての技術的刊行物および特許公開は、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる。本明細書のいかなる内容も、本技術が、先行発明により、このような開示に先行する権利がないことの容認とはみなされないものとする。
【００７０】
本技術の実施では、そうでないことが指し示されない限りにおいて、当技術分野の技量の範囲内にある、組織培養、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、および組換えＤＮＡについての従来の技法を利用する。例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ編（２００１年）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、３版；Ａｕｓｕｂｅｌら編（２００７年）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙシリーズ；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙシリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．、Ｎ．Ｙ．）；ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎら（１９９１年）、ＰＣＲ  １：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ内、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）；ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎら（１９９５年）、ＰＣＲ  ２：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編（１９９９年）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（２００５年）、Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：  Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、５版；Ｇａｉｔ編（１９８４年）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；米国特許第４，６８３，１９５号；ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ編（１９８４年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；Ａｎｄｅｒｓｏｎ（１９９９年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ編（１９８４年）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６年））；Ｐｅｒｂａｌ（１９８４年）、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；ＭｉｌｌｅｒおよびＣａｌｏｓ編（１９８７年）、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍａｋｒｉｄｅｓ編（２００３年）、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ；ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編（１９８７年）、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ）；ならびにＨｅｒｚｅｎｂｅｒｇら編（１９９６年）、Ｗｅｉｒ’ｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙを参照されたい。
【００７１】
範囲を含む、全ての数値表示、例えば、ｐＨ、温度、時間、濃度、および分子量は、必要に応じて、（＋）もしくは（−）１．０もしくは０．１の増分、または代替的に±１５％、または代替的に１０％、または代替的に５％、または代替的に２％の変動で変わる概数である。常に明示的に言明されているわけではないが、全ての数値表示には、「約」という用語を前置することを理解されたい。また、常に明示的に言明されているわけではないが、本明細書で記載される試薬は、単に例示的なものであり、当技術分野では、このような試薬の同等物が公知であることも理解されたい。
【００７２】
明示的な列挙を伴わないが、そうでないことが意図されない限りにおいて、本技術が、ポリペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、または抗体に関する場合、このようなポリペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、または抗体の、同等物または生物学的同等物が、本技術の範囲内にあることが意図されることを推察されたい。
【００７３】
定義
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、単数形の「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」、および「その」は、そうでないことが文脈により明確に指示されない限りにおいて、複数の指示対象を含む。例えば、「細胞」という用語は、それらの混合物を含む、複数の細胞を含む。
【００７４】
本明細書で使用される場合、「動物」という用語は、例えば、哺乳動物および鳥類を含む類別である、生きている多細胞性の脊椎動物を指す。「哺乳動物」という用語は、ヒトおよび非ヒト哺乳動物の両方を含む。
【００７５】
本明細書では、「対象」、「宿主」、「個体」、および「患者」という用語は、ヒトおよび獣医学的対象、例えば、ヒト、動物、非ヒト霊長動物、イヌ、ネコ、ヒツジ、マウス、ウマ、およびウシを指すように、互換的に使用される。一部の実施形態では、対象は、ヒトである。
【００７６】
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、例を目的として、限定せずに述べると、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ、これらの組合せと、任意の脊椎動物、例えば、ヒト、ヤギ、ウサギ、およびマウスなどの哺乳動物のほか、サメ免疫グロブリンなど、非哺乳動物種における免疫応答中に産生される同様の分子とを含む、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン様分子をまとめて指す。そうでないことが具体的に言及されない限り、「抗体」という用語は、他の分子への結合を実質的に除外して、目的の分子（または目的の分子と酷似する分子の群）に特異的に結合する、無傷の免疫グロブリンおよび「抗体断片」または「抗原結合性断片」（例えば、目的の分子に対する結合定数が、生物学的試料中の他の分子に対する結合定数を、少なくとも１０３Ｍ−１超えるか、少なくとも１０４Ｍ−１超えるか、または少なくとも１０５Ｍ−１超える抗体および抗体断片）を含む。「抗体」という用語はまた、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）、ヘテロコンジュゲート抗体（二特異性抗体など）などの遺伝子操作形態も含む。また、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃａｔａｌｏｇ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、１９９４〜１９９５年（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．）；Ｋｕｂｙ，  Ｊ．、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、３版、Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９７年も参照されたい。抗体の「抗原結合性断片」は、抗体の標的抗原に特異的に結合する能力を保持する、抗体の部分である。
【００７７】
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、Ｂリンパ球の単一のクローン、または単一の抗体の軽鎖遺伝子および重鎖遺伝子をトランスフェクトした細胞により産生される抗体を指す。モノクローナル抗体は、当業者に公知の方法、例えば、ハイブリッドの抗体形成細胞を、骨髄腫細胞の、脾臓免疫細胞との融合体から作ることにより作製する。モノクローナル抗体は、ヒト化モノクローナル抗体およびヒト抗体を含む。
【００７８】
抗体構造との関連で、免疫グロブリンは、ジスルフィド結合により相互接続された、重（Ｈ）鎖と軽（Ｌ）鎖とを有する。ラムダ（λ）およびカッパ（κ）という、２つの種類の軽鎖が存在する。抗体分子の機能的活性を決定する、５つの主要な重鎖クラス（またはアイソタイプ）：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥが存在する。各重鎖および軽鎖は、定常領域および可変領域（領域は「ドメイン」としてもまた公知）を含有する。組み合わせて、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とは、抗原に特異的に結合する。軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」ともまた呼ばれる、３つの超可変領域により中断される、「フレームワーク」領域を含有する。フレームワーク領域およびＣＤＲの広がりについては、規定されている（参照により本明細書に組み込まれる、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｕ．  Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、１９９１年を参照されたい）。今日では、Ｋａｂａｔによるデータベースは、オンラインで維持されている。異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、種内で比較的保存されている。構成要素である軽鎖および重鎖のフレームワーク領域の組合せである、抗体のフレームワーク領域は、大部分、β−シートコンフォメーションを採用し、ＣＤＲは、ループを形成し、これは、β−シート構造を接続し、場合によって、その一部を形成する。したがって、フレームワーク領域は、鎖間の非共有結合的相互作用により、ＣＤＲを、適正な配向性で位置決めする足場を形成するように作用する。
【００７９】
ＣＤＲは主に、抗原のエピトープへの結合を担う。各鎖のＣＤＲは、Ｎ末端から始めて、順に番号付けされる、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と称することが典型的であり、また、特定のＣＤＲが配置される鎖により同定されることも典型的である。したがって、ＶＨ  ＣＤＲ３が、それが見出される抗体の重鎖の可変ドメイン内に位置するのに対し、ＶＬ  ＣＤＲ１は、それが見出される抗体の軽鎖の可変ドメインに由来するＣＤＲ１である。ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲに結合する抗体は、特異的ＶＨ領域およびＶＬ領域配列を有し、したがって、特異的ＣＤＲ配列を有する。異なる特異性（すなわち、異なる抗原に対する、異なる結合性部位）を伴う抗体は、異なるＣＤＲを有する。抗体によって変動するのはＣＤＲであるが、ＣＤＲ内の限定された数のアミノ酸位置だけが、抗原への結合に直接関与する。ＣＤＲ内のこれらの位置を、特異性決定残基（ＳＤＲ）と呼ぶ。
【００８０】
本明細書で使用される場合、「抗原」という用語は、抗体分子またはＴ細胞受容体など、特異的な体液性または細胞性免疫の産物が特異的に結合しうる、化合物、組成物、または物質を指す。抗原は、例えば、ハプテン、単純な中間代謝物、糖（例えば、オリゴ糖）、脂質、およびホルモンのほか、複合炭水化物（例えば、多糖）、リン脂質、およびタンパク質などの高分子を含む、任意の種類の分子でありうる。抗原の一般的な類別は、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、原虫および他の寄生生物抗原、腫瘍抗原、自己免疫疾患、アレルギー、および移植片拒絶に関与する抗原、毒素、ならびにその他の抗原を含むがこれらに限定されない。
【００８１】
本明細書で使用される場合、「抗原結合性ドメイン」という用語は、抗原標的に特異的に結合しうる、任意のタンパク質またはポリペプチドドメインを指す。
【００８２】
「キメラ抗原受容体」（ＣＡＲ）という用語は、本明細書で使用される場合、抗原に結合することが可能な細胞外ドメインと、細胞外ドメインが由来するポリペプチドとは異なるポリペプチドに由来する膜貫通ドメインと、少なくとも１つの細胞内ドメインとを含む融合タンパク質を指す。「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」は、場合によって、「キメラ受容体」、「Ｔボディー」、または「キメラ免疫受容体（ＣＩＲ）」と呼ばれる。「抗原に結合することが可能な細胞外ドメイン」とは、ある特定の抗原に結合しうる、任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。「細胞内ドメイン」とは、細胞内の生物学的過程の活性化または阻害を引き起こすシグナルを伝達するドメインとして機能することが公知である、任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。ある特定の実施形態では、細胞内ドメインは、一次シグナル伝達ドメインに加えて１または複数の共刺激性シグナル伝達ドメインを含みうるか、代替的にこれらから本質的になりうるか、またはなおさらにこれらを含みうる。「膜貫通ドメイン」とは、細胞膜にわたることが公知であり、細胞外ドメインと、シグナル伝達ドメインとを連結するように機能しうる、任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。キメラ抗原受容体は、任意選択で、細胞外ドメインと、膜貫通ドメインとの間のリンカーとして用いられる「ヒンジドメイン」を含みうる。本明細書では、各ドメインの構成要素をコードする、非限定的な例示的ポリヌクレオチド配列、例えば、
【００８３】
ヒンジドメイン：ＩｇＧ１重鎖ヒンジ配列：
【００８４】
ＣＴＣＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＧ
【００８５】
膜貫通ドメイン：ＣＤ２８膜貫通領域：
【００８６】
ＴＴＴＴＧＧＧＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＣＴＧＧＣＴＴＧＣＴＡＴＡＧＣＴＴＧＣＴＡＧＴＡＡＣＡＧＴＧＧＣＣＴＴＴＡＴＴＡＴＴＴＴＣＴＧＧＧＴＧ
【００８７】
細胞内ドメイン：４−１ＢＢ共刺激性シグナル伝達領域：
【００８８】
ＡＡＡＣＧＧＧＧＣＡＧＡＡＡＧＡＡＡＣＴＣＣＴＧＴＡＴＡＴＡＴＴＣＡＡＡＣＡＡＣＣＡＴＴＴＡＴＧＡＧＡＣＣＡＧＴＡＣＡＡＡＣＴＡＣＴＣＡＡＧＡＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＴＧＴＡＧＣＴＧＣＣＧＡＴＴＴＣＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＧＡＧＧＡＴＧＴＧＡＡＣＴＧ
【００８９】
細胞内ドメイン：ＣＤ２８共刺激性シグナル伝達領域：
【００９０】
ＡＧＧＡＧＴＡＡＧＡＧＧＡＧＣＡＧＧＣＴＣＣＴＧＣＡＣＡＧＴＧＡＣＴＡＣＡＴＧＡＡＣＡＴＧＡＣＴＣＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＧＧＧＣＣＣＡＣＣＣＧＣＡＡＧＣＡＴＴＡＣＣＡＧＣＣＣＴＡＴＧＣＣＣＣＡＣＣＡＣＧＣＧＡＣＴＴＣＧＣＡＧＣＣＴＡＴＣＧＣＴＣＣ
【００９１】
細胞内ドメイン：ＣＤ３ゼータシグナル伝達領域：
【００９２】
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA
【００９３】
各例示的なドメインの構成要素についてのさらなる実施形態は、類似の生物学的機能を有する他のタンパク質であって、上記で開示した核酸配列によりコードされるタンパク質と、少なくとも７０％、または代替的に、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を共有するタンパク質を含む。さらに、本明細書では、このようなドメインの非限定的な例が提示される。
【００９４】
本明細書で使用される場合、「ＨＬＡ−ＤＲ」という用語は、この名称と関連するＭＨＣクラスＩＩ細胞表面受容体と、類似の生物学的機能を有する他の任意の分子であって、任意のＨＬＡ−ＤＲ改変体と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは９０％の配列同一性、または代替的に少なくとも９５％の配列同一性を共有する他の任意の分子とを指し、任意のＨＬＡ−ＤＲ改変体は、ＨＬＡ−ＤＲＡおよびＨＬＡ−ＤＲＢハプロタイプの組合せを含むＨＬＡ−ＤＲ血清型ＤＲ１〜ＤＲ７５を含むがこれらに限定されない、そのいくつかの改変体のいずれか１つを含むが、これらに限定されない。ＨＬＡ−ＤＲ配列の例は、当技術分野で公知であり、このようなＨＬＡ−ＤＲ配列の非限定的な例は、Rose,  L.M.ら（１９９６年）Cancer  Immunol.  Immunother.４３巻：２６〜３０頁において開示されている：
【００９５】
HLA-DRB1*1001  [DR10]
GDTRPRFLEEVKFECHFFNGTERVRLLERRVHNQEEYARYDSDVGEYRAVTELGRPDAEYWNSQKDLLERRRAAVDTYCRHNYGVGESFTVQRRVQPKVTVYPSKTQPLQHHNLLVCSVNGFYPGSIEVRWFRNGQEEKTGVVSTGLIQNGDWTFQTLVMLETVPQSGEVYTCQVEHPSVMSPLTVEWRARSESAQSKMLSGVGGFVLGLLFLGAGLFIYFRNQKGHSGLPPTGFLS;
【００９６】
HLA-DRB3*0201  [DR52]
GDTRPRFLELLKSECHFFNGTERVRFLERHFHNQEEYARFDSDVGEYRAVFELGRPDAEYWNSQKDLLEQKRGQVDNYCRHNYGVVESFTVQRRVHPQVTVYPAKTQPLQHHNLLVCSVSGFYPGSIEVRWFRNGQEEKAGVVSTGLIQNGDWTFQTLVMLETFPRSGEVYTCQVEHPSVTSPLTVEWSARSESAQSKMLSGVGGFVLGLLFLGAGLFIYFRNQKGHSGLQPTGFLS;
【００９７】
HLA-DRB1*0301  [DR17  (3)]
GDTRPRFLEYSTSECHFFNGTERVRYLDRYFHNQEENVRFDSDVGEFRAVTELGRPDAEYWNSQKDLLEQKRGRVDNYCRHNYGVVESFTVQRRVHPKVTVYPSKTQPLQHHNLLVCSVSGFYPGSIEVRWFRNGQEEKTGVVSTGLIQNGDWTFQTLVMLETVPRSGEVYTCQVEHPSVTSPLTVEWRARSESAQSKMLSGVGGFVLGLLFLGAGLFIYFRNQKGHSGLQPRGFLS、ならびにそれらのそれぞれの同等物。
【００９８】
Ｒｏｓｅらは、ＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体が結合しうる、それ故、さらなる抗体、モノクローナル抗体およびこれらの各々の抗原結合性断片の作出のために免疫原として用いることができる、例示的エピトープも開示している。列挙されている参考文献の各々に関連する配列と、ＨＬＡ−ＤＲという名称に対応する、または指定されたＨＬＡ−ＤＲサブタイプを含むがそれらに限定されない、その同等物に対応する、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号とが、さらなる非限定的な例として参照により本明細書に組み込まれる。
【００９９】
「組成物」は典型的に、活性薬剤、例えば、ＣＡＲ  Ｔ細胞またはＣＡＲ  ＮＫ細胞、抗体、化合物または組成物と、希釈剤、結合剤、安定化剤、緩衝剤、塩、親油性溶媒、保存剤、アジュバントなど、不活性（例えば、検出可能な薬剤または標識）または活性な、天然に存在するまたは天然に存在しない担体との組合せを意図し、薬学的に許容される担体を含む。担体はまた、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、および炭水化物（例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、およびオリゴ糖を含む糖；アルジトール、アルドン酸、エステル化糖などの誘導体化糖；ならびに多糖または糖ポリマー）などの医薬賦形剤および添加剤も含み、これらは単独または組合せで存在することが可能であり、単独または組合せにより、重量または容量で、１〜９９．９９％を構成する。例示的なタンパク質賦形剤は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などの血清アルブミン、組換えヒトアルブミン（ｒＨＡ）、ゼラチン、カゼインなどを含む。緩衝能においてもまた機能しうる、代表的なアミノ酸／抗体構成要素は、アラニン、アルギニン、グリシン、アルギニン、ベタイン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン、リシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、アスパルタームなどを含む。炭水化物賦形剤もまた、本技術の範囲内において意図されており、その例は、フルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ−マンノース、ソルボースなどの単糖；ラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオースなどの二糖；ラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、デンプンなどの多糖；ならびにマンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトール  ソルビトール（グルシトール）、およびミオイノシトールなどのアルジトールを含むがこれらに限定されない。
【０１００】
本明細書で使用される「コンセンサス配列」という用語は、複数の配列のシリーズをアラインメントすることにより決定されるアミノ酸または核酸配列であり、複数の配列の各対応する位置における、アミノ酸または塩基の主要な選択肢を表す、理想的な配列を規定する、アミノ酸または核酸配列を指す。複数の配列シリーズの配列に基づき、シリーズのコンセンサス配列は、配列の各々と、ゼロ、１つ、少数、またはこれを超える置換により異なりうる。複数の配列シリーズの配列に応じてまた、シリーズの、１つを超えるコンセンサス配列を決定することができる。コンセンサス配列の生成は、精緻な数学的解析下に置かれている。多様なソフトウェアプログラムを使用して、コンセンサス配列を決定することができる。
【０１０１】
本明細書で使用される場合、「黄体形成ホルモン受容体」（ＬＨＲ）という用語は、この名称と関連する特異的分子と、類似の生物学的機能を有する他の任意の分子であって、本明細書で示されるＬＨＲ配列と、少なくとも７０％、または代替的に、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を共有する他の任意の分子とを指す。ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＡＢ１９９１７．２（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、またはＡＡＡ３９４３２．１（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、またはＡＡＡ４１５２９．１（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）と関連するタンパク質配列は、ＬＨＲについてのさらなる配列例を提示する。このような配列の非限定的な例は、
【０１０２】
黄体形成ホルモン受容体［Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ］：
MKQRFSALQLLKLLLLLQPPLPRALREALCPEPCNCVPDGALRCPGPTAGLTRLSLAYLPVKVIPSQAFRGLNEVIKIEISQIDSLERIEANAFDNLLNLSEILIQNTKNLRYIEPGAFINLPRLKYLSICNTGIRKFPDVTKVFSSESNFILEICDNLHITTIPGNAFQGMNNESVTLKLYGNGFEEVQSHAFNGTTLTSLELKENVHLEKMHNGAFRGATGPKTLDISSTKLQALPSYGLESIQRLIATSSYSLKKLPSRETFVNLLEATLTYPSHCCAFRNLPTKEQNFSHSISENFSKQCESTVRKVNNKTLYSSMLAESELSGWDYEYGFCLPKTPRCAPEPDAFNPCEDIMGYDFLRVLIWLINILAIMGNMTVLFVLLTSRYKLTVPRFLMCNLSFADFCMGLYLLLIASVDSQTKGQYYNHAIDWQTGSGCSTAGFFTVFASELSVYTLTVITLERWHTITYAIHLDQKLRLRHAILIMLGGWLFSSLIAMLPLVGVSNYMKVSICFPMDVETTLSQVYILTILILNVVAFFIICACYIKIYFAVRNPELMATNKDTKIAKKMAILIFTDFTCMAPISFFAISAAFKVPLITVTNSKVLLVLFYPINSCANPFLYAIFTKTFQRDFFLLLSKFGCCKRRAELYRRKDFSAYTSNCKNGFTGS  NKPSQSTLKLSTLHCQGTALLDKTRYTEC
【０１０３】
黄体形成ホルモン受容体［Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ］：
MGRRVPALRQLLVLAMLVLKQSQLHSPELSGSRCPEPCDCAPDGALRCPGPRAGLARLSLTYLPVKVIPSQAFRGLNEVVKIEISQSDSLERIEANAFDNLLNLSEILIQNTKNLLYIEPGAFTNLPRLKYLSICNTGIRTLPDVSKISSSEFNFILEICDNLYITTIPGNAFQGMNNESITLKLYGNGFEEVQSHAFNGTTLISLELKENIYLEKMHSGTFQGATGPSILDVSSTKLQALPSHGLESIQTLIATSSYSLKTLPSREKFTSLLVATLTYPSHCCAFRNLPKKEQNFSFSIFENFSKQCESTVREANNETLYSAIFEENELSGWDYDYDFCSPKTLQCTPEPDAFNPCEDIMGYAFLRVLIWLINILAIFGNLTVLFVLLTSRYKLTVPRFLMCNLSFADFCMGLYLLLIASVDSQTKGQYYNHAIDWQTGSGCSAAGFFTVFASELSVYTLTVITLERWHTITYAVQLDQKLRLRHAIPIMLGGWIFSTLMATLPLVGVSSYMKVSICLPMDVESTLSQVYILSILLLNAVAFVVICACYVRIYFAVQNPELTAPNKDTKIAKKMAILIFTDFTCMAPISFFAISAAFKVPLITVTNSKVLLVLFYPVNSCANPFLYAVFTKAFQRDFFLLLSRFGCCKHRAELYRRKEFSACTFNSKNGFPRSSKPSQAALKLSIVHCQQPTPPRVLIQ
【０１０４】
黄体形成ホルモン受容体［Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ］：
MGRRVPALRQLLVLAVLLLKPSQLQSRELSGSRCPEPCDCAPDGALRCPGPRAGLARLSLTYLPVKVIPSQAFRGLNEVVKIEISQSDSLERIEANAFDNLLNLSELLIQNTKNLLYIEPGAFTNLPRLKYLSICNTGIRTLPDVTKISSSEFNFILEICDNLHITTIPGNAFQGMNNESVTLKLYGNGFEEVQSHAFNGTTLISLELKENIYLEKMHSGAFQGATGPSILDISSTKLQALPSHGLESIQTLIALSSYSLKTLPSKEKFTSLLVATLTYPSHCCAFRNLPKKEQNFSFSIFENFSKQCESTVRKADNETLYSAIFEENELSGWDYDYGFCSPKTLQCAPEPDAFNPCEDIMGYAFLRVLIWLINILAIFGNLTVLFVLLTSRYKLTVPRFLMCNLSFADFCMGLYLLLIASVDSQTKGQYYNHAIDWQTGSGCGAAGFFTVFASELSVYTLTVITLERWHTITYAVQLDQKLRLRHAIPIMLGGWLFSTLIATMPLVGISNYMKVSICLPMDVESTLSQVYILSILILNVVAFVVICACYIRIYFAVQNPELTAPNKDTKIAKKMAILIFTDFTCMAPISFFAISAAFKVPLITVTNSKILLVLFYPVNSCANPFLYAIFTKAFQRDFLLLLSRFGCCKRRAELYRRKEFSAYTSNCKNGFPGASKPSQATLKLSTVHCQQPIPPRALTH
【０１０５】
本明細書で使用される場合、「Ｂ７−Ｈ４」という用語（ＶＴＣＮ１、Ｈ４、Ｂ７ｈ．５、Ｂ７Ｓ１、Ｂ７Ｘ、またはＰＲＯ１２９としてもまた公知）は、この名称と関連する特異的分子と、類似の生物学的機能を有する他の任意の分子であって、Ｂ７−Ｈ４と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を共有する他の任意の分子とを指す。Ｂ７−Ｈ４配列の例は、本明細書で提示される。加えて、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ２８０９７３．１（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）およびＮＰ＿０７８９０２（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）と関連するタンパク質配列は、多様な動物におけるＢ７−Ｈ４についての配列例を提示する；言及した遺伝子は、８７％相同性を有する。列挙したＧｅｎＢａｎｋ受託番号の各々に関連する配列は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で使用される場合、抗体または受容体に言及して「抗Ｂ７−Ｈ４」という用語は、Ｂ７−Ｈ４に特異的に結合する抗体または受容体を指し、Ｂ７−Ｈ４に対して作出される任意の抗体への言及を含む。
【０１０６】
新規抗Ｂ７−Ｈ４抗体ならびにそれらの診断的および治療的使用方法が提示される。一態様では、これに関連して、本明細書では、重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列と軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列とを含む単離抗体であって、アミノ酸配列：
【０１０７】
IGEDGILSCTFEPDIKLSDIVIQWLKEGVLGLVHEFKEGKDELSEQDEMFRGRTAVFADQVIVGNASLRLKNVQLTDAGTYKCYIITSKGKGNANLEYKTGAFSMPEVNVDYNASSETLRCEAPRWFPQPTVVWASQVDQGANFSEVSNTSFELNSENVTMKVVSVLYNVTINNTYSCMIENDIAKATGDIKVTESEIKRRSHLQLLNSKAまたはその同等物を含むヒトＢ７−Ｈ４のエピトープに結合する抗体が提示される。
【０１０８】
本明細書で開示されるある特定の実施形態では、抗体は、重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列および軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、抗体は、ＨＣが、以下の、アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＳＦＧ、ＧＦＴＦＳＳＹＧもしくはＧＹＴＦＴＤＹを含むＨＣ  ＣＤＲＨ１；および／またはアミノ酸配列ＩＳＳＧＳＳＴＬ、ＩＳＳＳＮＳＴＩもしくはＩＮＰＮＮＧＧＴを含むＨＣ  ＣＤＲＨ２；および／またはアミノ酸配列ＡＲＰＬＹＹＹＧＳＶＭＤＹもしくはＲＰＹＹＹＧＳＳＹＤＹを含むＨＣ  ＣＤＲＨ３のいずれか１つを含む、アミノ酸配列を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる、ヒトＢ７−Ｈ４のエピトープに結合する。
【０１０９】
本明細書で開示されるある特定の実施形態では、抗体は、重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列および軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、抗体は、ＬＣが、アミノ酸配列ＱＳＩＶＨＲＮＧＮＴＹ、ＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹもしくはＥＮＩＧＳＹを含むＬＣ  ＣＤＲＬ１；および／またはアミノ酸配列ＫＶＳもしくはＡＡＴを含むＬＣ  ＣＤＲＬ２；および／またはアミノ酸配列ＦＱＧＳＹＶＰＰＴ、ＦＱＧＳＨＶＰＬＴ、ＱＨＹＹＳＴＬＶＴを含むＬＣ  ＣＤＲＬ３を含む、アミノ酸配列を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる、ヒトＢ７−Ｈ４のエピトープに結合する。
【０１１０】
本明細書で使用される場合、「ＨＬＡ−Ｇ」という用語（Ｂ２ミクログロブリンまたはＭＨＣ−Ｇとしてもまた公知）は、この名称と関連する特異的分子と、類似の生物学的機能を有する他の任意の分子であって、ＨＬＡ−Ｇと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を共有する他の任意の分子とを指し、ＨＬＡ−Ｇは、膜結合アイソフォーム（例えば、ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ３、ＨＬＡ−Ｇ４）、可溶性アイソフォーム（例えば、ＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ６、ＨＬＡ−Ｇ７）、および膜結合アイソフォームのタンパク質切断により作出される可溶性形態（例えば、ｓＨＬＡ−Ｇ１）を含むがこれらに限定されない（including  by  not  limited  to）、そのいくつかのアイソフォームのいずれか１つを含むが、これらに限定されない。ＨＬＡ−Ｇ配列の例は、本明細書で提示される。加えて、ＧｅｎＢａｎ受託番号と関連するタンパク質配列は、例示的な：ＮＭ＿００２１２７．５  ＸＭ＿００６７１５０８０．１  ＸＭ＿００６７２５０４１．１  ＸＭ＿００６７２５７００．１  ＸＭ＿００６７２５９０９．１である。例は、ＮＭ＿００２１２７．５配列：
MVVMAPRTLFLLLSGALTLTETWAGSHSMRYFSAAVSRPGRGEPRFIAMGYVDDTQFVRFDSDSACPRMEPRAPWVEQEGPEYWEEETRNTKAHAQTDRMNLQTLRGYYNQSEASSHTLQWMIGCDLGSDGRLLRGYEQYAYDGKDYLALNEDLRSWTAADTAAQISKRKCEAANVAEQRRAYLEGTCVEWLHRYLENGKEMLQRADPPKTHVTHHPVFDYEATLRCWALGFYPAEIILTWQRDGEDQTQDVELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPLMLRWKQSSLPTIPIMGIVAGLVVLAAVVTGAAVAAVLWRKKSSDである。
【０１１１】
上記で列挙したＧｅｎＢａｎｋ受託番号の各々に関連する配列は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１２】
本明細書で使用される場合、「ＣＤ８αヒンジドメイン」という用語は、この名称と関連する特異的タンパク質断片と、類似の生物学的機能を有する他の任意の分子であって、本明細書で示されるＣＤ８αヒンジドメインの配列と、少なくとも７０％、または代替的に、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を共有する他の任意の分子とを指す。ヒト、マウス、および他の種のＣＤ８αヒンジドメインの配列例は、Ｐｉｎｔｏ，  Ｒ．  Ｄ．ら（２００６年）、Ｖｅｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．、１１０巻：１６９〜１７７頁において提示されている。このような配列の非限定的な例は、
【０１１３】
ヒトＣＤ８アルファヒンジドメイン：
ＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹ
【０１１４】
マウスＣＤ８アルファヒンジドメイン：
ＫＶＮＳＴＴＴＫＰＶＬＲＴＰＳＰＶＨＰＴＧＴＳＱＰＱＲＰＥＤＣＲＰＲＧＳＶＫＧＴＧＬＤＦＡＣＤＩＹ
【０１１５】
ネコＣＤ８アルファヒンジドメイン：
ＰＶＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＱＡＰＩＴＴＳＱＲＶＳＬＲＰＧＴＣＱＰＳＡＧＳＴＶＥＡＳＧＬＤＬＳＣＤＩＹ
を含む。
【０１１６】
本明細書で使用される場合、「ＣＤ８α膜貫通ドメイン」という用語は、この名称と関連する特異的タンパク質断片と、類似の生物学的機能を有する他の任意の分子であって、本明細書で示されるＣＤ８α膜貫通ドメインの配列と、少なくとも７０％、または代替的に、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を共有する他の任意の分子とを指す。ヒトＴ細胞表面糖タンパク質ＣＤ８アルファ鎖（ＮＣＢＩ基準配列：ＮＰ＿００１７５９．３）のアミノ酸位置１８３〜２０３、またはマウスＴ細胞表面糖タンパク質ＣＤ８アルファ鎖（ＮＣＢＩ基準配列：ＮＰ＿００１０７４５７９．１）のアミノ酸位置１９７〜２１７、およびラットＴ細胞表面糖タンパク質ＣＤ８アルファ鎖（ＮＣＢＩ基準配列：ＮＰ＿１１３７２６．１）のアミノ酸位置１９０〜２１０と関連する断片配列は、ＣＤ８α膜貫通ドメインについてのさらなる配列例を提示する。列挙したＮＣＢＩの各々と関連する配列を、以下の通りに提示する：
【０１１７】
ヒトＣＤ８アルファ膜貫通ドメイン：
ＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴ
【０１１８】
マウスＣＤ８アルファ膜貫通ドメイン：
ＩＷＡＰＬＡＧＩＣＶＡＬＬＬＳＬＩＩＴＬＩ
【０１１９】
ラットＣＤ８アルファ膜貫通ドメイン：
ＩＷＡＰＬＡＧＩＣＡＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＩ
【０１２０】
本明細書で使用される場合、「ＣＤ２８膜貫通ドメイン」という用語は、この名称と関連する特異的タンパク質断片と、類似の生物学的機能を有する他の任意の分子であって、本明細書で示されるＣＤ２８膜貫通ドメインの配列と、少なくとも７０％、または代替的に、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、または代替的に、少なくとも９５％の配列同一性を共有する他の任意の分子とを指す。ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＸＭ＿００６７１２８６２．２およびＸＭ＿００９４４４０５６．１と関連する断片配列は、ＣＤ２８膜貫通ドメインについてのさらなる非限定的配列例を提示する。列挙した受託番号の各々と関連する配列を、本明細書に援用する。
【０１２１】
本明細書で使用される場合、「４−１ＢＢ共刺激性シグナル伝達領域」という用語は、この名称と関連する特異的タンパク質断片と、類似の生物学的機能を有する他の任意の分子であって、本明細書で示される４−１ＢＢ共刺激性シグナル伝達領域の配列と、少なくとも７０％、または代替的に、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を共有する他の任意の分子とを指す。４−１ＢＢ共刺激性シグナル伝達領域の配列例は、米国特許出願第１３／８２６，２５８号において提示されている。米国特許出願第１３／８２６，２５８号において開示されている、関連する４−１ＢＢ共刺激性シグナル伝達領域の配列を、以下の通りに列挙する：
【０１２２】
４−１ＢＢ共刺激性シグナル伝達領域：
ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ
【０１２３】
本明細書で使用される場合、「ＣＤ２８共刺激性シグナル伝達領域」という用語は、この名称と関連する特異的タンパク質断片と、類似の生物学的機能を有する他の任意の分子であって、本明細書で示されるＣＤ２８共刺激性シグナル伝達領域の配列と、少なくとも７０％、または代替的に、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を共有する他の任意の分子とを指す。例示的なＣＤ２８共刺激性シグナル伝達ドメインは、米国特許第５，６８６，２８１号；Ｇｅｉｇｅｒ，  Ｔ．  Ｌ．ら、Ｂｌｏｏｄ、９８巻：２３６４〜２３７１頁（２００１年）；Ｈｏｍｂａｃｈ，  Ａ．ら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６７巻：６１２３〜６１３１頁（２００１年）；Ｍａｈｅｒ，  Ｊ．ら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２０巻：７０〜７５頁（２００２年）；Ｈａｙｎｅｓ，  Ｎ．  Ｍ．ら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６９巻：５７８０〜５７８６頁（２００２年）；Ｈａｙｎｅｓ，  Ｎ．  Ｍ．ら、Ｂｌｏｏｄ、１００巻：３１５５〜３１６３頁（２００２年）において提示されている。非限定的な例は、下記のＣＤ２８配列：ＭＬＲＬＬＬＡＬＮＬ  ＦＰＳＩＱＶＴＧＮＫ  ＩＬＶＫＱＳＰＭＬＶ  ＡＹＤＮＡＶＮＬＳＣ  ＫＹＳＹＮＬＦＳＲＥ  ＦＲＡＳＬＨＫＧＬＤＳＡＶＥＶＣＶＶＹＧ  ＮＹＳＱＱＬＱＶＹＳ  ＫＴＧＦＮＣＤＧＫＬ  ＧＮＥＳＶＴＦＹＬＱ  ＮＬＹＶＮＱＴＤＩＹ  ＦＣＫＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧ  ＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬ  ＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳ  ＫＰＦＷＶＬＶＶＶＧ  ＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＲ  ＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤ  ＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧ  ＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡ  ＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳの残基１１４〜２２０、およびそれらの同等物を含む。
【０１２４】
本明細書で使用される場合、「ＩＣＯＳ共刺激性シグナル伝達領域」という用語は、この名称と関連する特異的タンパク質断片と、類似の生物学的機能を有する他の任意の分子であって、本明細書で示されるＩＣＯＳ共刺激性シグナル伝達領域の配列と、少なくとも７０％、または代替的に、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を共有する他の任意の分子とを指す。ＩＣＯＳ共刺激性シグナル伝達領域の非限定的な配列例は、米国特許出願公開第２０１５／００１７１４１Ａ１号に提示されており、下記に提示される例示的なポリヌクレオチド配列を含む。
【０１２５】
ＩＣＯＳ共刺激性シグナル伝達領域：
【０１２６】
ＡＣＡＡＡＡＡＡＧＡ  ＡＧＴＡＴＴＣＡＴＣ  ＣＡＧＴＧＴＧＣＡＣ  ＧＡＣＣＣＴＡＡＣＧ  ＧＴＧＡＡＴＡＣＡＴ  ＧＴＴＣＡＴＧＡＧＡ  ＧＣＡＧＴＧＡＡＣＡ  ＣＡＧＣＣＡＡＡＡＡ  ＡＴＣＣＡＧＡＣＴＣ  ＡＣＡＧＡＴＧＴＧＡ  ＣＣＣＴＡ
【０１２７】
本明細書で使用される場合、「ＯＸ４０共刺激性シグナル伝達領域」という用語は、この名称と関連する特異的タンパク質断片と、類似の生物学的機能を有する他の任意の分子であって、本明細書で示されるＯＸ４０共刺激性シグナル伝達領域の配列と、少なくとも７０％、または代替的に、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、または代替的に、９０％の配列同一性、または代替的に、少なくとも９５％の配列同一性を共有する他の任意の分子とを指す。ＯＸ４０共刺激性シグナル伝達領域の非限定的な配列例は、米国特許出願公開第２０１２／２０１４８５５２Ａ１号に開示されており、下記に提示される、例示的な配列を含む。
【０１２８】
ＯＸ４０共刺激性シグナル伝達領域：
【０１２９】
ＡＧＧＧＡＣＣＡＧ  ＡＧＧＣＴＧＣＣＣＣ  ＣＣＧＡＴＧＣＣＣＡ  ＣＡＡＧＣＣＣＣＣＴ  ＧＧＧＧＧＡＧＧＣＡ  ＧＴＴＴＣＣＧＧＡＣ  ＣＣＣＣＡＴＣＣＡＡ  ＧＡＧＧＡＧＣＡＧＧ  ＣＣＧＡＣＧＣＣＣＡ  ＣＴＣＣＡＣＣＣＴＧ  ＧＣＣＡＡＧＡＴＣ
【０１３０】
本明細書で使用される場合、「ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン」という用語は、この名称と関連する特異的タンパク質断片と、類似の生物学的機能を有する他の任意の分子であって、本明細書で示されるＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインの配列と、少なくとも７０％、または代替的に、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を共有する他の任意の分子とを指す。ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインの配列例は、米国特許出願公開第２０１３／０２６６５５１Ａ１号において提示されている。ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインと関連する配列を、以下の通りに列挙する：
【０１３１】
ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン：
ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ
【０１３２】
本明細書で使用される場合、「Ｂ細胞」という用語は、獲得性免疫系の体液性免疫におけるリンパ球の種類を指す。Ｂ細胞は主に、抗体を作り、抗原提示細胞として用いられ、サイトカインを放出し、抗原との相互作用による活性化の後で、メモリーＢ細胞を発生させるように機能する。Ｂ細胞は、Ｔ細胞など、他のリンパ球から、細胞表面上のＢ細胞受容体の存在により識別される。Ｂ細胞は、単離することもでき、市販の供給源から得ることもできる。市販のＢ細胞株の非限定的な例は、細胞株である、ＡＨＨ−１（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−８１４６（商標））、ＢＣ−１（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２２３０（商標））、ＢＣ−２（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２２３１（商標））、ＢＣ−３（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２２７７（商標））、ＣＡ４６（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１６４８（商標））、ＤＧ−７５［Ｄ．Ｇ．−７５］（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２６２５（商標））、ＤＳ−１（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１１１０２（商標））、ＥＢ−３［ＥＢ３］（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−８５（商標））、Ｚ−１３８（ＡＴＣＣ  ＃ＣＲＬ−３００１）、ＤＢ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２２８９）、Ｔｏｌｅｄｏ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２６３１）、Ｐｆｉｆｆｅｒ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２６３２）、ＳＲ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２２６２）、ＪＭ−１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１０４２１）、ＮＦＳ−５  Ｃ−１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６９３）；ＮＦＳ−７０  Ｃ１０（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６９４）、ＮＦＳ−２５  Ｃ−３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６９５）、およびＳＵＰ−Ｂ１５（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１９２９）を含む。さらなる例は、未分化大細胞リンパ腫に由来する細胞株、例えば、ＤＥＬ、ＤＬ−４０、ＦＥ−ＰＤ、ＪＢ６、Ｋａｒｐａｓ  ２９９、Ｋｉ−ＪＫ、Ｍａｃ−２Ａ  Ｐｌｙ１、ＳＲ−７８６、ＳＵ−ＤＨＬ−１、ＳＵ−ＤＨＬ−２、ＳＵ−ＤＨＬ−４、ＳＵ−ＤＨＬ−５、ＳＵ−ＤＨＬ−６、ＳＵ−ＤＨＬ−７、ＳＵ−ＤＨＬ−８、ＳＵ−ＤＨＬ−９、ＳＵ−ＤＨＬ−１０、およびＳＵ−ＤＨＬ−１６、ＤＯＨＨ−２、ＮＵ−ＤＨＬ−１、Ｕ−９３７、Ｇｒａｎｄａ  ５１９、ＵＳＣ−ＤＨＬ−１、ＲＬ；ホジキンリンパ腫に由来する細胞株、例えば、ＤＥＶ、ＨＤ−７０、ＨＤＬＭ−２、ＨＤ−ＭｙＺ、ＨＫＢ−１、ＫＭ−Ｈ２、Ｌ  ４２８、Ｌ  ５４０、Ｌ１２３６、ＳＢＨ−１、ＳＵＰ−ＨＤ１、ＳＵ／ＲＨ−ＨＤ−１を含むがこれらに限定されない。このような市販の細胞株の非限定的な例示的供給源は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎすなわちＡＴＣＣ（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／）およびＧｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｄｓｍｚ．ｄｅ／）を含む。
【０１３３】
本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞」という用語は、胸腺内で成熟するリンパ球の種類を指す。Ｔ細胞は、細胞媒介性免疫において重要な役割を果たし、Ｂ細胞など、他のリンパ球から、細胞表面上のＴ細胞受容体の存在により識別される。Ｔ細胞は、単離することもでき、市販の供給源から得ることもできる。「Ｔ細胞」は、ＣＤ３を発現させる、全ての種類の免疫細胞であって、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋細胞）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋細胞）、ナチュラルキラーＴ細胞、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、およびガンマ−デルタＴ細胞を含む免疫細胞を含む。「細胞傷害性細胞」は、細胞傷害応答を媒介することが可能な細胞である、ＣＤ８＋  Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、および好中球を含む。市販のＴ細胞株の非限定的な例は、細胞株である、ＢＣＬ２（ＡＡＡ）Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２９０２（商標））、ＢＣＬ２（Ｓ７０Ａ）Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２９００（商標））、ＢＣＬ２（Ｓ８７Ａ）Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２９０１（商標））、ＢＣＬ２  Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２８９９（商標））、Ｎｅｏ  Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２８９８（商標））、ＴＡＬＬ−１０４ヒト細胞傷害性Ｔ細胞株（ＡＴＣＣ  ＃ＣＲＬ−１１３８６）を含む。さらなる例は、例えば、Ｄｅｇｌｉｓ、ＥＢＴ−８、ＨＰＢ−ＭＬｐ−Ｗ、ＨＵＴ  ７８、ＨＵＴ  １０２、Ｋａｒｐａｓ  ３８４、Ｋｉ  ２２５、Ｍｙ−Ｌａ、Ｓｅ−Ａｘ、ＳＫＷ−３、ＳＭＺ−１、およびＴ３４などの成熟Ｔ細胞株；ならびに未成熟Ｔ細胞株、例えば、ＡＬＬ−ＳＩＬ、Ｂｅ１３、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＣＭＬ−Ｔ１、ＤＮＤ−４１、ＤＵ．５２８、ＥＵ−９、ＨＤ−Ｍａｒ、ＨＰＢ−ＡＬＬ、Ｈ−ＳＢ２、ＨＴ−１、ＪＫ−Ｔ１、Ｊｕｒｋａｔ、Ｋａｒｐａｓ  ４５、ＫＥ−３７、ＫＯＰＴ−Ｋ１、Ｋ−Ｔ１、Ｌ−ＫＡＷ、Ｌｏｕｃｙ、ＭＡＴ、ＭＯＬＴ−１、ＭＯＬＴ  ３、ＭＯＬＴ−４、ＭＯＬＴ  １３、ＭＯＬＴ−１６、ＭＴ−１、ＭＴ−ＡＬＬ、Ｐ１２／Ｉｃｈｉｋａｗａ、Ｐｅｅｒ、ＰＥＲ０１１７、ＰＥＲ−２５５、ＰＦ−３８２、ＰＦＩ−２８５、ＲＰＭＩ−８４０２、ＳＴ−４、ＳＵＰ−Ｔ１〜ＳＵＰ−Ｔ１４、ＴＡＬＬ−１、ＴＡＬＬ−１０１、ＴＡＬＬ−１０３／２、ＴＡＬＬ−１０４、ＴＡＬＬ−１０５、ＴＡＬＬ−１０６、ＴＡＬＬ−１０７、ＴＡＬＬ−１９７、ＴＫ−６、ＴＬＢＲ−１、ＴＬＢＲ−２、ＴＬＢＲ−３、およびＴＬＢＲ−４、ＣＣＲＦ−ＨＳＢ−２（ＣＣＬ−１２０．１）、Ｊ．ＲＴ３−Ｔ３．５（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ−１５３）、Ｊ４５．０１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１９９０）、Ｊ．ＣａＭ１．６（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２０６３）、ＲＳ４；１１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１８７３）、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ（ＡＴＣＣ  ＣＲＭ−ＣＣＬ−１１９）；ならびに皮膚Ｔ細胞リンパ腫細胞株、例えば、ＨｕＴ７８（ＡＴＣＣ  ＣＲＭ−ＴＩＢ−１６１）、ＭＪ［Ｇ１１］（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−８２９４）、ＨｕＴ１０２（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ−１６２）を含むがこれらに限定されない。ＲＥＨ、ＮＡＬＬ−１、ＫＭ−３、Ｌ９２−２２１を含むがこれらに限定されないヌル白血病細胞株は、Ｋ５６２赤白血病、���ＨＰ−１単球性白血病、Ｕ９３７リンパ腫、ＨＥＬ赤白血病、ＨＬ６０白血病、ＨＭＣ−１白血病、ＫＧ−１白血病、Ｕ２６６骨髄腫などの他の白血病およびリンパ腫に由来する細胞株と同様、免疫細胞の、別の市販の供給源である。このような市販の細胞株の非限定的な例示的供給源は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎすなわちＡＴＣＣ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／）およびＧｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｄｓｍｚ．ｄｅ／）を含む。
【０１３４】
本明細書で使用される場合、ナチュラルキラー細胞としてもまた公知の「ＮＫ細胞」という用語は、骨髄に由来し、生得性免疫系において極めて重要な役割を果たすリンパ球の種類を指す。ＮＫ細胞は、抗体および細胞表面上の主要組織適合性複合体の非存在下であってもなお、ウイルス感染細胞、腫瘍細胞、またはストレスを受けた他の細胞に対して、迅速な免疫応答をもたらす。ＮＫ細胞は、単離することもでき、市販の供給源から得ることもできる。市販のＮＫ細胞株の非限定的な例は、細胞株である、ＮＫ−９２（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２４０７（商標））、ＮＫ−９２ＭＩ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２４０８（商標））を含む。さらなる例は、ＮＫ細胞株である、ＨＡＮＫ１、ＫＨＹＧ−１、ＮＫＬ、ＮＫ−ＹＳ、ＮＯＩ−９０、およびＹＴを含むがこれらに限定されない。このような市販の細胞株の非限定的な例示的供給源は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎすなわちＡＴＣＣ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／）およびＧｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｄｓｍｚ．ｄｅ／）を含む。
【０１３５】
本明細書で使用される場合、「核酸配列」および「ポリヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチドであれ、デオキシリボヌクレオチドであれ、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指すように互換的に使用される。したがって、この用語は、一本鎖、二本鎖、または多重鎖の、ＤＮＡまたはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド体、あるいはプリンおよびピリミジン塩基、または他の天然のヌクレオチド塩基、化学的もしくは生化学的に修飾されたヌクレオチド塩基、非天然のヌクレオチド塩基、または誘導体化ヌクレオチド塩基を含むポリマーを含むがこれらに限定されない。
【０１３６】
核酸配列へと適用される場合の、「〜をコードする」という用語は、その天然状態にあるか、または当業者に周知の方法により操作されるときに、ポリペプチドおよび／またはその断片のｍＲＮＡを産生するように転写および／または翻訳されうる場合、ポリペプチド「をコードする」と言われるポリヌクレオチドを指す。アンチセンス鎖とは、このような核酸の相補体であり、ここから、コード配列を推定することができる。
【０１３７】
本明細書で使用される場合、シグナルペプチドまたはシグナルポリペプチドという用語は、新たに合成された分泌または膜ポリペプチドまたはタンパク質のＮ末端に通常は存在するアミノ酸配列を意図する。シグナルペプチドまたはシグナルポリペプチドは、細胞膜を越えてまたは細胞膜内へとポリペプチドを方向付けるように作用し、次いで、その後、除去される。このようなシグナルペプチドまたはシグナルポリペプチドの例は、当技術分野において周知である。非限定的な例は、米国特許第８，８５３，３８１号および同第５，９５８，７３６号に記載されているものである。
【０１３８】
本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、プラスミド、ウイルス、コスミド、ファージ、ＢＡＣ、ＹＡＣなどを含むがこれらに限定されない、異なる宿主間の移入のためにデザインされた核酸構築物を指す。一部の実施形態では、プラスミドベクターは、市販のベクターから調製することができる。他の実施形態では、ウイルスベクターは、当技術分野で公知の技法に従い、バキュロウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶなどから作製することができる。一実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。
【０１３９】
本明細書で使用される「プロモーター」という用語は、遺伝子など、コード配列の発現を調節する、任意の配列を指す。プロモーターは、例えば、構成的、誘導的、抑制的、または組織特異的でありうる。「プロモーター」とは、転写の開始および速度を制御するポリヌクレオチド配列の領域である、制御配列である。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子などの調節タンパク質および分子が結合しうる遺伝子エレメントを含有しうる。
【０１４０】
本明細書で使用される場合、「単離細胞」という用語は一般に、組織の他の細胞から実質的に分離されている細胞を指す。「免疫細胞」は、例えば、骨髄中で産生される造血幹細胞（ＨＳＣ）に由来する白血球（ｗｈｉｔｅ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ））、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）、および骨髄由来細胞（好中球、好酸球、好塩基球、単球、マクロファージ、樹状細胞）、ならびに免疫系列にコミットされたその前駆体を含む。Ｔ細胞の前駆体は、成熟Ｔ細胞を産生するように分化する能力がある系列限定幹および前駆細胞である。Ｔ細胞の前駆体は、ＨＳＣ、長期ＨＳＣ、短期ＨＳＣ、多能性前駆細胞（ＭＰＰ）、巨核球系および赤芽球系への分化能の弱くなったリンパ球系前駆細胞（lymphoid  primed  multipotent  progenitor  cell）（ＬＭＰＰ）、初期リンパ球系前駆細胞（ＥＬＰ）、リンパ球性共通前駆細胞（ＣＬＰ）、プロＴ細胞（ＰｒｏＴ）、初期Ｔ細胞系列前駆細胞／ダブルネガティブ１細胞（ＥＴＰ／ＤＮ１）、ダブルネガティブ（ＤＮ）２ａ、ＤＮ２ｂ、ＤＮ３ａ、ＤＮ３ｂ、ＤＮ４、およびダブルポジティブ（ＤＰ）細胞を含む。ヒトにおけるこのようなＴ細胞前駆体のマーカーは、ＨＳＣ：ＣＤ３４＋および、任意選択で、ＣＤ３８−；長期ＨＳＣ：ＣＤ３４＋  ＣＤ３８−および系列陰性（ここで、系列陰性は、ＴＥＲ１１９、Ｍａｃ１、Ｇｒ１、ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０、ＣＤ３、ＣＤ４およびＣＤ８の群より選択される１または複数の系列特異的マーカーに対して陰性を意味する）；ＭＰＰ：ＣＤ３４＋  ＣＤ３８−  ＣＤ４５ＲＡ−  ＣＤ９０−  および、任意選択で、系列陰性；ＣＬＰ：ＣＤ３４＋  ＣＤ３８＋  ＣＤ１０＋および、任意選択で系列陰性；ＬＭＰＰ／ＥＬＰ：ＣＤ４５ＲＡ＋  ＣＤ６２Ｌ＋  ＣＤ３８−および、任意選択で、系列陰性；ＤＮ１：ＣＤ１１７−  ＣＤ３４＋  ＣＤ３８−  ＣＤ１ａ−；ＤＮ２：ＣＤ１１７＋  ＣＤ３４＋  ＣＤ３８＋  ＣＤ１ａ−；ＤＮ３：ＣＤ３４＋  ＣＤ３８＋  ＣＤ１ａ＋；ＤＮ４：ＣＤ４＋  ＣＤ３−；ＤＰ：ＣＤ４＋  ＣＤ８＋および、任意選択で、ＣＤ３＋を含むが、これらに限定されない。ＮＫ細胞の前駆体は、成熟ＮＫ細胞を産生するように分化する能力がある系列限定幹および前駆細胞である。ＮＫ前駆体は、ＨＳＣ、長期ＨＳＣ、短期ＨＳＣ、多能性前駆細胞（ＭＰＰ）、骨髄球性共通前駆細胞（ＣＭＰ）、顆粒球マクロファージ前駆細胞（ＧＭＰ）、プロＮＫ、プレＮＫ、および未熟ＮＫ（ｉＮＫ）を含む。このようなＮＫ前駆体のマーカーは、ＣＭＰ：ＣＤ５６−  ＣＤ３６−  ＣＤ３３＋  ＣＤ３４＋  ＮＫＧ２Ｄ−  ＮＫｐ４６−；ＧＭＰ：ＣＤ５６−  ＣＤ３６−  ＣＤ３３＋  ＣＤ３４＋  ＮＫＧ２Ｄ−  ＮＫｐ４６−；プロＮＫ：ＣＤ３４＋  ＣＤ４５ＲＡ＋  ＣＤ１０＋  ＣＤ１１７−  ＣＤ１６１−；プレＮＫ：ＣＤ３４＋  ＣＤ４５ＲＡ＋  ＣＤ１０−  ＣＤ１１７＋  ＣＤ１６１＋／−；およびｉＮＫ：ＣＤ３４−  ＣＤ１１７＋  ＣＤ１６１＋  ＮＫｐ４６−  ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ−を含むが、これらに限定されない。一部の態様では、ＮＫ細胞前駆体のマーカーは、ＣＤ１１７＋  ＣＤ１６１＋  ＣＤ２４４＋  ＣＤ３３＋  ＣＤ５６−  ＮＣＲ−  ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ−およびＬＦＡ��１−を含むが、これらに限定されない。前駆体細胞表面マーカーを検出するための表現型決定用試薬は、例えば、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）およびＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から入手することができる。「Ｔ細胞」とは、ＣＤ３を発現させる、全ての種類の免疫細胞であって、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋細胞）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋細胞）、ナチュラルキラーＴ細胞、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、およびガンマ−デルタＴ細胞を含む免疫細胞を含む。「細胞傷害性細胞」とは、細胞傷害応答を媒介することが可能な細胞である、ＣＤ８＋  Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、および好中球を含む。  
【０１４１】
キメラ抗原受容体細胞の作製に適用される場合の、「形質導入する」または「形質導入」という用語は、外来のヌクレオチド配列を、細胞へと導入する工程を指す。一部の実施
形態では、この形質導入は、ベクターを介して行う。
【０１４２】
本明細書で使用される場合、「ＣＲＩＳＰＲ」という用語は、クラスター化して規則的に間隔があいた短い回文構造の繰り返しの経路（ＣＲＩＳＰＲ）に依存する配列特異的遺伝子操作技術を指す。ＣＲＩＳＰＲは、遺伝子編集および／または遺伝子調節を行うために使用することができ、特定の遺伝子位置へのタンパク質の単なるターゲティングに使用することもできる。遺伝子編集は、標的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列がポリヌクレオチド配列への欠失、挿入または塩基置換の導入によって変更される遺伝子操作の種類を指す。一部の態様では、ＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子編集は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同組換えの経路を利用して、編集を行う。遺伝子調節は、タンパク質またはＲＮＡなどの特定の遺伝子産物の産生を増加させることまたは減少させることを指す。
【０１４３】
「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」という用語は、本明細書で使用される場合、細胞のゲノムの特定の領域などの特定のヌクレオチド配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体のターゲティングに使用されるガイドＲＮＡ配列を指す。標的特異性のためのｇＲＮＡおよびドナー治療用ポリペプチドを設計する技術は、当技術分野で周知である。例えば、Doench,  J.ら、Nature  biotechnology  ２０１４年、３２巻（１２号）：１２６２〜７頁、Mohr,  S.ら（２０１６年）FEBS  Journal  ２８３巻：３２３２〜３８頁、およびGraham,  D.ら、Genome  Biol.  ２０１５年、１６巻：２６０頁。ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化ＣＲＩＰＳＰＲ  ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とを含む融合ポリヌクレオチド；またはＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化ＣＲＩＰＳＰＲ  ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とを含むポリヌクレオチドを含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる。一部の態様では、ｇＲＮＡは、合成のものである（Kelley,  M.ら（２０１６年）J  of  Biotechnology  ２３３巻（２０１６年）７４〜８３頁）。
【０１４４】
「阻害性ＲＮＡ」という用語は、阻害性ＲＮＡ分子がメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子を標的とし、その結果として遺伝子発現および／または翻訳の阻害が生じるメカニズムであるＲＮＡ干渉が可能なＲＮＡ分子を指す。ＲＮＡ干渉は、転写後遺伝子サイレンシングとしてもまた公知である。例示的な阻害性ＲＮＡは、アンチセンスＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）およびこれらの中間体を含むが、それらに限定されない。阻害性ＲＮＡの設計、クローニングおよび発現方法は、当技術分野で公知であり（例えば、McIntyreら、BMC  Biotechnol  ２００６年、６巻：１号；Mooreら、Methods  Mol  Biol.  ２０１０年、６２９巻：１４１〜１５８頁）、カスタムＲＮＡｉキットが市販されている（例えば、ＧｅｎｅＡｓｓｉｓｔ（商標）Ｃｕｓｔｏｍ  ｓｉＲＮＡ  Ｂｕｉｌｄｅｒ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）。
【０１４５】
本明細書で使用される場合、細胞に言及して「自家」という用語は、同じ対象（レシピエントまたは宿主）から単離され、注入し戻される細胞を指す。「同種」とは、非自家細胞を指す。
【０１４６】
「有効（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ）量」または「有効（ｅｆｆｉｃａｃｉｏｕｓ）量」とは、薬剤の量、または２つもしくはこれを超える薬剤の組合せ量であって、哺乳動物または他の対象を処置するために投与されると、疾患のためのこのような処置を施すのに十分である、量または組合せ量を指す。「有効（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ）量」とは、薬剤、疾患およびその重症度、ならびに処置される対象の年齢、体重などに応じて変動するであろう。
【０１４７】
「固形腫瘍」とは、通例、嚢胞も液体領域も含有しない、組織の異常な塊である。固形腫瘍は、良性の場合もあり、悪性の場合もある。異なる種類の固形腫瘍は、それらを形成する細胞型にちなんで名付けられている。固形腫瘍の例は、肉腫、癌腫、およびリンパ腫を含む。
【０１４８】
「卵巣がん」という用語は、卵巣の組織内で形成されるがんの種類であり、がん内の細胞を、体の他の部分に浸潤するか、またはこれらへと拡散する能力により、宿主生物に対して病的とする、悪性の形質転換を経たがんの種類を指す。本明細書における卵巣がんは、組織学的グレードが低度なＩ型がんと、組織学的グレードが高度なＩＩ型がんとを含む。特に、卵巣がんは、上皮性癌、漿液性癌、明細胞癌、性索間質腫瘍、生殖細胞腫瘍、未分化胚細胞腫、混合腫瘍、続発性卵巣がん、低悪性度潜在性腫瘍を含むがこれらに限定されない。
【０１４９】
「前立腺がん」という用語は、男性生殖系内の腺である、前立腺内で発生するがんの種類を指す。本明細書における前立腺がんは、腺癌、肉腫、小細胞癌、神経内分泌腫瘍、移行上皮癌を含むがこれらに限定されない。
【０１５０】
「Ｂ細胞リンパ腫または白血病」という用語は、リンパ系または骨髄の組織（issues）内で形成するがんの種類であり、がん内の細胞を、体の他の部分に浸潤するか、またはこれらへと拡散する能力により、宿主生物に対して病的とする、悪性の形質転換を経たがんの種類を指す。
【０１５１】
「甲状腺がん」という用語は、甲状腺内で発生するがんの種類を指す。
【０１５２】
本明細書で使用される場合、「〜を含むこと」という用語は、組成物および方法が、列挙される要素を含むが、他の要素を除外しないことを意味するように意図される。組成物および方法を規定するのに使用される場合の「〜から本質的になること」とは、意図される使用のための組合せにとって本質的に重要な他の要素を除外することを意味するものとする。例えば、本明細書で規定される通り、要素から本質的になる組成物は、単離および精製法、ならびにリン酸緩衝食塩水、保存剤など、薬学的に許容される担体から、微量の夾雑物を除外しないであろう。「〜からなること」とは、本明細書で開示される組成物を投与するための、微量を超える他の成分の要素、および実質的な方法ステップを除外することを意味するものとする。これらの移行句の各々により規定される態様は、本開示の範囲内にある。
【０１５３】
本明細書で使用される場合、「検出可能なマーカー」という用語は、直接的にまたは間接的に、検出可能なシグナルを発生させることが可能な、少なくとも１つのマーカーを指す。このマーカーの非網羅的なリストは、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼなどの、例えば比色定量、蛍光、発光による検出可能なシグナルを発生させる酵素、蛍光、発光色素などの発色団、電子顕微鏡法、または伝導性、電流滴定、ボルタンメトリー、インピーダンスなど、それらの電気的特性により検出される電子密度を伴う群、例えば、それらの分子が、それらの物理的および／または化学的特性の、検出可能な修飾を誘導するのに十分なサイズである、検出可能な群を含み、このような検出は、回折、表面プラズモン共鳴、表面の変動、接触角の変化などの光学法、または原子間力分光法、トンネル効果などの物理学的方法、または３２Ｐ、３５Ｓ、もしくは１２５Ｉなどの放射性分子により達成することができる。
【０１５４】
本明細書で使用される場合、「精製マーカー」という用語は、精製または同定に有用な、少なくとも１つのマーカーを指す。このマーカーの非網羅的なリストは、Ｈｉｓ、ｌａｃＺ、ＧＳＴ、マルトース結合性タンパク質、ＮｕｓＡ、ＢＣＣＰ、ｃ−ｍｙｃ、ＣａＭ、ＦＬＡＧ、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ｃｈｅｒｒｙ、チオレドキシン、ｐｏｌｙ（ＮＡＮＰ）、Ｖ５、Ｓｎａｐ、ＨＡ、キチン結合性タンパク質、Ｓｏｆｔａｇ  １、Ｓｏｆｔａｇ  ３、Ｓｔｒｅｐ、またはＳタンパク質を含む。適切な直接的または間接的蛍光マーカーは、ＦＬＡＧ、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ｄＴｏｍａｔｏ、ｃｈｅｒｒｙ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＤＮＰ、ＡＭＣＡ、ビオチン、ジゴキシゲニン、Ｔａｍｒａ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、ローダミン、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ、ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣ、または他の任意の蛍光色素もしくはハプテンを含む。
【０１５５】
本明細書で使用される場合、「発現」という用語は、ポリヌクレオチドが、ｍＲＮＡへと転写される過程および／または転写されたｍＲＮＡが、その後、ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質へと翻訳される過程を指す。ポリヌクレオチドが、ゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核細胞内のｍＲＮＡのスプライシングを含みうる。遺伝子の発現レベルは、細胞または組織試料中のｍＲＮＡまたはタンパク質の量を測定することにより決定することができる。一態様では、１つの試料に由来する遺伝子の発現レベルを、対照または基準試料に由来する、この遺伝子の発現レベルと直接比較することができる。別の態様では、１つの試料に由来する遺伝子の発現レベルを、化合物の投与後に、同じ試料に由来するこの遺伝子の発現レベルと直接比較することができる。
【０１５６】
本明細書で使用される場合、「スイッチ」という用語は、ＣＡＲまたはＣＡＲの成分の発現、活性化または安定性を制御するメカニズム（すなわち、ＣＡＲを「オン」または「オフ」にするメカニズム）を指す。スイッチメカニズムは、活性化される１つより多くの構築物の共発現を必要とするＣＡＲ発現系、自殺スイッチ、安全スイッチ、および活性化のために多量体化を必要とするＣＡＲを含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、スイッチは、誘導性である。
【０１５７】
「Ｋｏｚａｋコンセンサス配列」または「Ｋｏｚａｋ配列」は、リボソームにより翻訳開始部位として認識されるｍＲＮＡ配列である。Ｋｏｚａｋ配列は、翻訳の開始のための開始コドン（イニシエーションコドンとしてもまた公知）、およびさらなる隣接ヌクレオチドを含む。開始コドンは、翻訳されるポリペプチドのＮ末端におけるメチオニンアミノ酸を指定する。脊椎動物のＫｏｚａｋコンセンサス配列は、当技術分野で公知である（例えば、Kozak,  M.  １９８７年  Nucleic  Acids  Res.  １５巻（２０号）：８１２５〜４８頁）。一部の実施形態では、Ｋｏｚａｋ配列を「強い」ものになるように改変することができ、「強い」は、ヌクレオチド配列が、コンセンサス配列とよくマッチすること、特に、１番ヌクレオチドを基準にして＋４および−３位ヌクレオチドがマッチすることを意味する。「妥当な」Ｋｏｚａｋ配列は、これらのマッチするヌクレオチドの一方のみを有するが、「弱い」Ｋｏｚａｋ配列は、どちらのマッチするヌクレオチドも有さない。Ｋｏｚａｋ配列の強さは、発現されるｍＲＮＡから翻訳されるポリペプチドの量と直接相関する。一般に、強いＫｏｚａｋ配列は、発現されるｍＲＮＡの、より高い翻訳効率をもたらし、その一方で、弱いＫｏｚａｋ配列を有するｍＲＮＡからは、より少ないポリペプチドが転写される。
【０１５８】
本明細書で使用される場合、「相同性」または「同一な」、「同一性」パーセントまたは「類似性」パーセントとは、２つまたはこれを超える核酸配列またはポリペプチド配列の文脈で使用される場合、２つまたはこれを超える配列または部分配列であって、同じであるか、または指定された百分率の、同じヌクレオチドもしくはアミノ酸残基を有する配列または部分配列、例えば、指定された領域（例えば、本明細書で記載される抗体をコードするヌクレオチド配列または本明細書で記載される抗体のアミノ酸配列）にわたり、少なくとも６０％の同一性、好ましくは少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはこれを超える同一性を有する配列または部分配列を指す。相同性は、比較を目的としてアラインメントされうる、各配列内の位置を比較することにより決定することができる。比較される配列内の位置が、同じ塩基またはアミノ酸により占有される場合、分子は、この位置において相同である。配列間の相同性の程度は、配列により共有される、マッチする位置または相同な位置の数の関数である。アラインメントおよび相同性パーセントまたは配列同一性パーセントは、当技術分野で公知のソフトウェアプログラム、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７年）、補遺３０巻、７．７．１８節、表７．７．１において記載されているソフトウェアプログラムを使用して決定することができる。アラインメントのためには、デフォルトのパラメータを使用することが好ましい。好ましいアラインメントプログラムは、デフォルトのパラメータを使用するＢＬＡＳＴである。特に、好ましいプログラムは、以下のデフォルトのパラメータ：遺伝子コード＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；期待値＝１０；行列＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記載＝５０の配列；ソート＝高スコア；データベース＝非冗長、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲを使用する、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰである。これらのプログラムの詳細については、以下のインターネットアドレス：ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴにおいて見出すことができる。「相同性」または「同一な」、「同一性」パーセントまたは「類似性」パーセントという用語はまた、被験配列の相補体も指すか、またはこれに適用することもできる。用語はまた、欠失および／または付加を有する配列のほか、置換を有する配列も含む。本明細書で記載される通り、好ましいアルゴリズムは、ギャップなどに対処しうる。好ましくは、同一性は、少なくとも約２５アミノ酸もしくはヌクレオチドの長さである領域にわたり存在するか、またはより好ましくは少なくとも５０〜１００アミノ酸もしくはヌクレオチドの長さである領域にわたり存在する。「非類縁の」または「非相同な」配列は、本明細書で開示される配列のうちの１つと、４０％未満の同一性、または代替的に２５％未満の同一性を共有する。
【０１５９】
「第１選択」または「第２選択」または「第３選択」という語句は、患者により受容される処置の順序を指す。第１選択治療レジメンは、最初に施される処置であるのに対し、第２または第３選択治療は、それぞれ、第１選択治療の後、または第２選択治療の後で施される。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅは、第１選択治療を、「疾患または状態のための最初の処置」として規定している。がんを伴う患者では、一次処置は、手術、化学療法、放射線療法、またはこれらの治療の組合せでありうる。当業者はまた、第１選択治療を、「一次治療および一次処置」とも称する。２００８年５月１日が最後の閲覧日である、ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖにおけるＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのウェブサイトを参照されたい。患者が、第１選択治療に対して、ポジティブな臨床応答を示さなかったか、または不顕性の応答を示したか、または第１選択治療を停止しているために、患者には、その後の化学療法レジメンを施すのが典型的である。
【０１６０】
一態様では、抗体の「同等物」または「生物学的同等物」という用語は、抗体が、そのエピトープタンパク質またはその断片に選択的に結合する能力であって、ＥＬＩＳＡまたは他の適切な方法により測定される能力を意味する。生物学的に同等な抗体は、基準抗体と同じエピトープに結合する、抗体、ペプチド、抗体断片、抗体の改変体、抗体の誘導体、および抗体の模倣体（ｍｉｍｅｔｉｃ）を含むがこれらに限定されない。
【０１６１】
明示的な列挙を伴わないが、そうでないことが意図されない限りにおいて、本開示が、ポリペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、または抗体に関する場合、このようなポリペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、または抗体の、同等物または生物学的同等物は、本開示の範囲内にあることが意図されることを推察されたい。本明細書で使用される場合、「その生物学的同等物」という用語は、基準タンパク質、抗体、ポリペプチド、または核酸に言及する場合、「その同等物」と同義であることを意図し、所望の構造または機能性をなおも維持しながら、最小限の相同性を有する、タンパク質、抗体、ポリペプチド、または核酸を意図する。本明細書で具体的に列挙されない限りにおいて、本明細書で言及される、任意のポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはタンパク質はまた、その同等物も含むことが想定される。例えば、同等物は、少なくとも約７０％の相同性もしくは同一性、または少なくとも８０％の相同性もしくは同一性、または代替的に少なくとも約８５％、または代替的に少なくとも約９０％、または代替的に少なくとも約９５％、または代替的に９８％の相同性パーセントもしくは同一性パーセントを意図し、基準タンパク質、ポリペプチド、または核酸と実質的に同等な生体活性を呈する。代替的に、ポリヌクレオチドに言及する場合、その同等物は、ストリンジェントな条件下で、基準ポリヌクレオチドまたはその相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドである。
【０１６２】
別の配列と、ある特定の百分率（例えば、８０％、８５％、９０％、または９５％）の「配列同一性」を有するポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域（またはポリペプチドもしくはポリペプチド領域）とは、アラインメントし、２つの配列を比較するときに、その百分率の塩基（またはアミノ酸）が同じであることを意味する。アラインメントおよび相同性パーセントまたは配列同一性パーセントは、当技術分野で公知のソフトウェアプログラム、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７年）、補遺３０巻、７．７．１８節、表７．７．１において記載されているソフトウェアプログラムを使用して決定することができる。アラインメントのためには、デフォルトのパラメータを使用することが好ましい。好ましいアラインメントプログラムは、デフォルトのパラメータを使用するＢＬＡＳＴである。特に、好ましいプログラムは、以下のデフォルトのパラメータ：遺伝子コード＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；期待値＝１０；行列＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記載＝５０の配列；ソート＝高スコア；データベース＝非冗長、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲを使用する、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰである。これらのプログラムの詳細については、以下のインターネットアドレス：ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴにおいて見出すことができる。
【０１６３】
「ハイブリダイゼーション」とは、１または複数のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合を介して安定化する複合体を形成する反応を指す。水素結合は、ワトソンクリック塩基対合により生じる場合もあり、フーグスティーン結合により生じる場合もあり、他の任意の配列特異的な形で生じる場合もある。複合体は、二重鎖構造を形成する２つの鎖、多重鎖複合体を形成する３つもしくはこれを超える鎖、自己ハイブリダイズする一本鎖、またはこれらの任意の組合せを含みうる。ハイブリダイゼーション反応は、ＰＣＲ反応の開始、またはリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素的切断など、より広範な工程内のステップを構成しうる。
【０１６４】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、約２５℃〜約３７℃のインキュベーション温度；約６倍濃度のＳＳＣ〜約１０倍濃度のＳＳＣのハイブリダイゼーション緩衝液濃度；約０％〜約２５％のホルムアミド濃度；および約４倍濃度のＳＳＣ〜約８倍濃度のＳＳＣの洗浄溶液を含む。中程度のハイブリダイゼーション条件の例は、約４０℃〜約５０℃のインキュベーション温度；約９倍濃度のＳＳＣ〜約２倍濃度のＳＳＣの緩衝液濃度；約３０％〜約５０％のホルムアミド濃度；および約５倍濃度のＳＳＣ〜約２倍濃度のＳＳＣの洗浄溶液を含む。高ストリンジェンシー条件の例は、約５５℃〜約６８℃のインキュベーション温度；約１倍濃度のＳＳＣ〜約０．１倍濃度のＳＳＣの緩衝液濃度；約５５％〜約７５％のホルムアミド濃度；および約１倍濃度のＳＳＣ、０．１倍濃度のＳＳＣ、または脱イオン水の洗浄溶液を含む。一般に、ハイブリダイゼーションインキュベーション時間は、５分間〜２４時間であり、１つ、２つ、またはこれを超える洗浄ステップを伴い、洗浄インキュベーション時間は、約１、２、または１５分間である。ＳＳＣとは、０．１５ＭのＮａＣｌおよび１５ｍＭのクエン酸緩衝液である。他の緩衝液系を使用する、ＳＳＣの同等物も利用しうることが理解される。
【０１６５】
「腫瘍組織型に対応する正常細胞」とは、腫瘍組織と同じ組織型に由来する正常細胞を指す。非限定的な例は、肺腫瘍を有する患者に由来する正常肺細胞、または結腸腫瘍を有する患者に由来する正常結腸細胞である。
【０１６６】
本明細書で使用される「単離された」という用語は、他の材料を実質的に含まない、分子または生物学的薬剤または細胞材料を指す。一態様では、「単離された」という用語は、天然の供給源中に存在する、他のＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはタンパク質もしくはポリペプチド、または細胞もしくは細胞小器官、または組織もしくは器官のそれぞれから分離された、ＤＮＡもしくはＲＮＡなどの核酸、またはタンパク質もしくはポリペプチド（例えば、抗体またはその誘導体）、または細胞もしくは細胞小器官、または組織もしくは器官を指す。「単離された」という用語はまた、組換えＤＮＡ法により作製される場合、細胞材料、ウイルス材料、もしくは培養培地を実質的に含まない核酸もしくはペプチド、または化学合成される場合、化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない核酸もしくはペプチドも指す。さらに、「単離核酸」とは、断片としては天然に存在しておらず、天然の状態では見出されない核酸断片を含むことを意図する。本明細書では、「単離された」という用語はまた、他の細胞性タンパク質から単離されたポリペプチドを指すようにも使用され、精製ポリペプチドおよび組換えポリペプチドの両方を包含することを意図する。本明細書では、「単離された」という用語はまた、他の細胞または組織から単離された細胞または組織を指すようにも使用され、培養細胞または培養組織および操作細胞または操作組織の両方を包含することを意図する。
【０１６７】
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、Ｂリンパ球の単一のクローン、または単一の抗体の軽鎖遺伝子および重鎖遺伝子をトランスフェクトした細胞により産生される抗体を指す。モノクローナル抗体は、当業者に公知の方法、例えば、ハイブリッドの抗体形成細胞を、骨髄腫細胞の、脾臓免疫細胞との融合体から作ることにより作製する。モノクローナル抗体は、ヒト化モノクローナル抗体を含む。
【０１６８】
「タンパク質」、「ペプチド」、および「ポリペプチド」という用語は、２つまたはこれを超えるサブユニットのアミノ酸、アミノ酸類似体、またはペプチド模倣体の化合物を指すように、互換的に、かつ、それらの最も広い意味で使用する。サブユニットは、ペプチド結合で連結することができる。別の実施形態では、サブユニットは、他の結合、例えば、エステル、エーテルなどで連結することができる。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含有しなければならないが、アミノ酸の最大数には、限定がなされず、タンパク質の配列を含む場合もあり、ペプチドの配列を含む場合もある。本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、グリシン、ならびにＤ光学異性体およびＬ光学異性体の両方、アミノ酸類似体およびペプチド模倣体を含む、天然および／または非天然もしくは合成のアミノ酸を指す。
【０１６９】
「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、互換的に使用され、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドまたはそれらの類似体である、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有することが可能であり、公知または未知の任意の機能を果たしうる。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子断片（例えば、プローブ、プライマー、ＥＳＴまたはＳＡＧＥタグ）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ＲＮＡｉ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体を含みうる。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリヌクレオチドのアセンブリーの前に付与することもでき、その後に付与することもできる。ヌクレオチドの配列は、ヌクレオチド以外の構成要素で中断させることができる。ポリヌクレオチドは、標識化構成要素とのコンジュゲーションを介するなど、重合化の後でさらに修飾することができる。用語はまた、二本鎖分子および一本鎖分子の両方を指す。そうでないことが指定または要求されない限りにおいて、ポリヌクレオチドである本技術の任意の態様は、二本鎖形態と、二本鎖形態を構成することが公知であるかまたは予測される、２つの相補的な一本鎖形態の各々との両方を包含する。
【０１７０】
本明細書で使用される場合、「精製された」という用語は、絶対的な純度を要求するのではなく、相対的な用語として意図されている。したがって、例えば、精製された核酸、ペプチド、タンパク質、生物学的複合体、または他の活性化合物とは、全部または一部において、タンパク質または他の夾雑物から単離された、核酸、ペプチド、タンパク質、生物学的複合体、または他の活性化合物である。一般に、本開示の範囲内の使用のための、実質的に精製されたペプチド、タンパク質、生物学的複合体、または他の活性化合物は、ペプチド、タンパク質、生物学的複合体、または他の活性化合物の、治療的投与のための完全医薬製剤中の、医薬担体、賦形剤、緩衝液、吸収増強剤、安定化剤、保存剤、アジュバントまたは他の共成分（ｃｏ−ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ）との混合または製剤化の前に、調製物中に存在する、全ての高分子種のうちの８０％超を構成する。より典型的には、ペプチド、タンパク質、生物学的複合体、または他の活性化合物は、他の製剤成分との混合の前に、精製調製物中に存在する、全ての高分子種のうちの９０％超、しばしば９５％超を表すように精製する。他の場合、精製調製物は、本質的に均質であることが可能であり、この場合、従来の技法では、他の高分子種は、検出可能でない。
【０１７１】
本明細書で使用される場合、「特異的結合」という用語は、抗体と抗原との、少なくとも１０−６Ｍの結合アフィニティーによる接触を意味する。ある特定の態様では、抗体は、少なくとも約１０−７Ｍ、好ましくは、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、または１０−１２Ｍのアフィニティーで結合する。
【０１７２】
本明細書で使用される場合、「組換えタンパク質」という用語は、組換えＤＮＡ法により作製されるポリペプチドを指し、この場合、一般に、ポリペプチドをコードするＤＮＡを、適切な発現ベクターへと挿入し、次にこれを使用して、異種タンパク質を作製するように、宿主細胞を形質転換する。
【０１７３】
本明細書で使用される場合、対象における疾患「を処置すること」またはその「処置」とは、（１）疾患の素因があるか、もしくはその症状をいまだ提示していない対象において、症状もしくは疾患が生じることを防止すること；（２）疾患を阻害するか、もしくはその発症を停止させること；または（３）疾患もしくは疾患の症状を改善するか、もしくは退縮を引き起こすことを指す。当技術分野で理解される通り、「処置」とは、臨床結果を含む、有益なまたは所望の結果を得るための手法である。本技術の目的では、有益なまたは所望の結果は、検出可能であれ、検出不能であれ、１または複数の症状の緩和または改善、状態（疾患を含む）の広がりの減殺、状態（疾患を含む）の安定した（すなわち、増悪させない）状況、状態（疾患を含む）の進行の遅延または緩徐化、状態（疾患を含む）の改善または軽減、および寛解（部分的であれ、完全であれ）のうちの１または複数を含みうるがこれらに限定されない。疾患が、がんである場合、以下の臨床的エンドポイント：腫瘍容量の低減、腫瘍増殖の緩徐化、より長い全生存期間、腫瘍進行までのより長い時間、転移の阻害、または腫瘍の転移の低減が、処置の非限定的な例である。
【０１７４】
本明細書で使用される場合、細胞、組織、または器官に関して、「〜を過剰発現させる」という用語は、タンパク質を、対照細胞、対照組織、または器官内で産生される量を超える量まで発現させることを意味する。過剰発現するタンパク質は、宿主細胞に対して内因性の場合もあり、宿主細胞に対して外因性の場合もある。本明細書で使用される場合、「内因性」は、細胞内に天然に存在する遺伝子または遺伝子産物であって、遺伝子物質のトランスフェクションまたは形質導入などの遺伝子操作によって導入されたものではない、遺伝子または遺伝子産物を指す。
【０１７５】
本明細書で使用される場合、「リンカー配列」という用語は、１〜１０回、または代替的に、１〜約８回、または代替的に、１〜約６回、または代替的に、約５もしくは４回、または代替的に、３回、または代替的に、２回反復されうる、１〜１０、または代替的に、８アミノ酸、または代替的に、６アミノ酸、または代替的に、５アミノ酸を含む、任意のアミノ酸配列に関する。例えば、リンカーは、３回反復されるペンタペプチドからなる、最大で１５アミノ酸残基を含みうる。一態様では、リンカー配列は、ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｓｅｒの３つのコピーを含む、（グリシン４セリン）３の可撓性ポリペプチドリンカーまたはその同等物である。リンカー配列の非限定的な例は、当技術分野で公知であり、例えば、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（およびその同等物）；トリペプチドＥＦＭ；またはＧｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ、およびこれらの各々の同等物である。
【０１７６】
本明細書で使用される場合、「マトリックス」という用語は、電気泳動法および／またはウェスタンブロット法などのイムノブロット法に有用である、ゲル電気泳動用のゲル、またはウェスタンブロット法に一般に使用されるマトリックス（例えば、ニトロセルロース製またはポリビニリデンジフルオリド製の膜）などの、組成物を指す。本明細書で使用される場合、「固体支持体」は、ペプチドおよび／またはペプチド合成を支持することが可能な材料、複合材料、表面、または官能化された表面を指す。例示的な固体支持体は、安定したビーズ状のゲル状樹脂、アクリロイル末端基を有する長鎖ポリエチレングリコール、ポリスチレン樹脂、およびアミド結合不含のＰＥＧ系樹脂を含むが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、「溶液」という用語は、液相混合物または組成物を指す。
【０１７７】
本明細書で使用される場合、「エンハンサー」という用語は、発現させる核酸配列との関連における、その場所および配向性に関わらず、核酸配列の転写を増進、改良、または改善する配列エレメントを表す。エンハンサーは、単一のプロモーターからの転写を増強する場合もあり、１つを超えるプロモーターからの転写を同時に増強する場合もある。転写を改良するこの機能性が、保持されるか、または実質的に保持される（例えば、野生型活性、すなわち全長配列の活性の少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％）限りにおいて、野生型エンハンサー配列の、任意の切断された、変異された、またはこれら以外の修飾された改変体もまた、上記の規定の範囲内にある。
【０１７８】
本明細書で使用される場合、「ＷＰＲＥ」または「ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント」という用語は、この名称と関連する特異的ヌクレオチド断片と、類似の生物学的機能を有し、本明細書で示されるＷＰＲＥ配列と、少なくとも７０％、または代替的に、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を共有する他の任意の分子とを指す。例えば、ＷＰＲＥとは、ウッドチャック肝炎ウイルスゲノム配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：Ｊ０４５１４）内に存在する、ヒトＢ型肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＨＢＶＰＲＥ）と同様の領域を指し、このゲノムの配列のうちの、１０９３〜１６８４位の５９２ヌクレオチドが、転写後調節領域に対応することを指す（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７２巻、５０８５〜５０９２頁、１９９８年）。レトロウイルスベクターを使用する解析は、目的の遺伝子の３’末端非翻訳領域へと挿入されたＷＰＲＥが、産生されるタンパク質の量を、５〜８倍増大させることを明らかにした。また、ＷＰＲＥの導入が、ｍＲＮＡの分解を抑制することも報告されている（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７３巻、２８８６〜２８９２頁、１９９９年）。広い意味では、ｍＲＮＡを安定化させることにより、アミノ酸への翻訳の効率を増大させる、ＷＰＲＥなどのエレメントもまた、エンハンサーであると考えられる。
略語一覧
【０１７９】
ＣＡＲ：キメラ抗原受容体
【０１８０】
ＨＬＡ：組織適合性リンパ球抗原
【０１８１】
Ｉｐ：腹膜内
【０１８２】
ＩＲＥＳ：内部リボソーム侵入部位
【０１８３】
ＬＨＲ：黄体形成ホルモン受容体
【０１８４】
ＭＦＩ：平均蛍光強度
【０１８５】
ＭＯＩ：感染多重度
【０１８６】
ＰＢＭＣ：末梢血単核細胞
【０１８７】
ＰＢＳ：リン酸緩衝食塩水
【０１８８】
ｓｃＦｖ：単鎖可変断片
【０１８９】
ＷＰＲＥ：ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント
【０１９０】
上記で列挙したＧｅｎＢａｎｋ受託番号、ＵｎｉＰｒｏｔ参照番号、および参考文献の各々と関連する配列は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１９１】
本開示を実施するための様態
遺伝子操作されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞による自家処置を使用して、Ｂ細胞リンパ腫および白血病において近年得られた前例のない結果に起因する（Maude,  S.L.  ら（２０１４年）New  Engl.  J.  Med.  ３７１巻：１５０７〜１５１７頁；Porter,  D.L.ら（２０１１年）New  Engl.  J.  Med。
【０１９２】
ＣＡＲ  Ｔ細胞とは、単鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）またはリガンドを、Ｔ細胞の活性化を促進することが可能な、Ｔ細胞シグナル伝達ドメインへと接合させた、遺伝子操作型自家Ｔ細胞である（Ｍａｈｅｒ，  Ｊ．（２０１２年）、ＩＳＲＮ  Ｏｎｃｏｌ．、２０１２巻：２７８０９３；Ｃｕｒｒａｎ，  Ｋ．  Ｊ．ら（２０１２年）、Ｊ．  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．、１４巻：４０５〜４１５頁；Ｆｅｄｏｒｏｖ，  Ｖ．  Ｄ．ら（２０１４年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．、２０巻：１６０〜１６５頁；Ｂａｒｒｅｔｔ，  Ｄ．  Ｍ．ら（２０１４年）、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｍｅｄ．、６５巻：３３３〜３４７頁）。ＣＡＲは、モノクローナル抗体の、ＨＬＡに依存しないターゲティング特異性を、活性化Ｔ細胞の、細胞溶解活性およびホーミング特性と組み合わせる。これらの特性は、宿主の免疫応答を回避するのに腫瘍が利用する２つの一般的な方法である、ＨＬＡの発現の低減または抗原プロセシング経路の下方調節を伴う標的細胞の認識を可能とする（Ｊａｋｏｂｓｅｎ，  Ｍ．  Ｋ．ら（１９９５年）、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  Ｅｍｐｈａｓｉｓ  Ｔｕｍｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１７巻：２２２〜２２８頁；Ｌｏｕ，  Ｙ．ら（２００８年）、Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１４巻：１４９４〜１５０１頁；Ｓｉｎｇｈ，  Ｒ．ら（２００７年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、６７巻：１８８７〜１８９２頁）。ＣＡＲ改変Ｔ細胞は、卵巣癌を含む多様な疾患における新規の治療剤として、前臨床および臨床状況において、多大な有望性を示している（Ｃｈｕ，  Ｃ．  Ｓ．ら（２００８年）、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．、８巻：２４３〜２５７頁；Ｃｈｅｋｍａｓｏｖａ，  Ａ．  Ａ．ら（２０１０年）、Ｄｉｓｃｏｖ．  Ｍｅｄ．、９巻：６２〜７０頁；Ｐｏｒｔｅｒ，  Ｄ．  Ｌ．ら（２０１１年）、ＮＥＪＭ、３６５巻：７２５〜７３３頁）。現況では、メソテリンに対して作出されたＣＡＲ  Ｔ細胞（Ｋｅｌｌｙ，  Ｒ．  Ｊ．ら（２０１２年）、Ｍｏｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．、１１巻：５１７〜５２５頁；Ｂｅａｔｔｙ，  Ｇ．  Ｌ．ら（２０１４年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｓ．、２巻：１１２〜１２０頁）が、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（プロトコールＩＤ：１２０１１１；ＮＣＴ０１５８３６８６）、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（患者の登録中）、および中国（４例の患者が終了）において、目下のところ、臨床試験中である。これらの研究は、ごく予備的なものであり、α−葉酸受容体（Ｋａｎｄａｌａｆｔ，  Ｌ．  Ｅ．ら（２０１２年）、Ｊ．  Ｔｒａｎｓｌ．  Ｍｅｄ．、１０巻：１５７〜１６７頁）およびＭＵＣ１６（Ｃｈｅｋｍａｓｏｖａ，  Ａ．  Ａ．ら（２０１０年）、Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１６巻：３５９４〜６０６頁；Ｒａｏ，  Ｔ．  Ｄ．ら（２０１０年）、Ａｐｐｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．  Ｍｏｌ．  Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ、１８巻：４６２〜４７２頁）を除き、本発明者らが知る限り、卵巣がんの処置のための他の標的は、目下のところ開発されていない。
【０１９３】
現況では、ヒト固形腫瘍に対するＣＡＲ改変Ｔ細胞は、α−葉酸受容体、メソテリン、およびＭＵＣ−ＣＤ、ＰＳＭＡ、ならびに他の標的に対して構築されているが、ほとんどは、正常組織においてある程度の抗原オフターゲット発現を示す。これらの構築物は、患者において同じ異例の結果を示しておらず、このことにより、固形腫瘍に対して使用することができる新規の標的およびＣＡＲ  Ｔ細胞構築方法を同定するためのさらなる研究の必要が力説されている。
【０１９４】
加えて、本開示は、ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−Ｇ、ＨＬＡ−ＤＲに特異的な抗体、ならびにそれらの使用および作製に関する方法および組成物を提示する。加えて、本開示は、一部の態様では抗ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−Ｇ、ＨＬＡ−ＤＲ抗体の抗原結合性ドメインである、ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−Ｇ、ＨＬＡ−ＤＲに特異的な抗原結合性ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、ならびにその使用および作製に関する方法および組成物を提示する。
【０１９５】
これらの原理および発見に沿って、本開示は、以下の実施形態を提示する。
【０１９６】
本明細書では、（ａ）抗黄体形成ホルモン受容体（「ＬＨＲ」）抗体の抗原結合性ドメイン、（ｂ）ＣＤ８αヒンジドメイン；（ｃ）ＣＤ８α膜貫通ドメイン；（ｄ）２つまたはこれを超える共刺激性シグナル伝達領域；および（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が提示される。一部の実施形態では、２つまたはこれを超える共刺激性シグナル伝達領域は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−ＩＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、およびＢ７−Ｈ３から選択される。
【０１９７】
一部の実施形態では、ＣＡＲの抗ＬＨＲ抗体の抗原結合性ドメインは、抗ＬＨＲ重鎖（ＨＣ）可変領域および抗ＬＨＲ軽鎖（ＬＣ）可変領域を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。一部の実施形態では、ＣＡＲは、さらに、抗ＬＨＲ  ＨＣ可変領域と抗ＬＨＲ  ＬＣ可変領域の間に配置されたリンカーポリペプチドを含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。
【０１９８】
一部の実施形態では、ＣＡＲの抗ＬＨＲ抗体のＨＣは、ＧＹＳＩＴＳＧＹＧのアミノ酸配列またはそれらの各々の同等物を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になるＣＤＲ１；および／またはＩＨＹＳＧＳＴのアミノ酸配列またはそれらの各々の同等物を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になるＣＤＲ２；および／またはＡＲＳＬＲＹのアミノ酸配列もしくはそれらの各々の同等物を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になるＣＤＲ３を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。一部の実施形態では、ＬＣは、ＳＳＶＮＹのアミノ酸配列もしくはそれらの各々の同等物を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になるＣＤＲ１；および／またはＤＴＳのアミノ酸配列もしくはそれらの各々の同等物を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になるＣＤＲ２；および／またはＨＱＷＳＳＹＰＹＴのアミノ酸配列もしくはそれらの各々の同等物を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になるＣＤＲ３を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。
【０１９９】
一部の実施形態では、ＣＡＲの抗ＬＨＲ抗体のＨＣは、ＧＦＳＬＴＴＹＧのアミノ酸配列またはそれらの各々の同等物を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になるＣＤＲ１；および／またはＩＷＧＤＧＳＴのアミノ酸配列またはそれらの各々の同等物を含むＣＤＲ２；および／またはＡＥＧＳＳＬＦＡＹのアミノ酸配列もしくはそれらの各々の同等物を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になるＣＤＲ３を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。一部の実施形態では、ＬＣは、ＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹのアミノ酸配列もしくはそれらの各々の同等物を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になるＣＤＲ１；および／またはＷＡＳのアミノ酸配列もしくはそれらの各々の同等物を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になるＣＤＲ２；および／またはＱＮＤＹＳＹＰＬＴのアミノ酸配列もしくはそれらの各々の同等物を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になるＣＤＲ３を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。
【０２００】
一部の実施形態では、ＣＡＲの抗ＬＨＲ抗体のＨＣは、ＧＹＳＦＴＧＹＹのアミノ酸配列またはそれらの各々の同等物を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になるＣＤＲ１；および／またはＩＹＰＹＮＧＶＳのアミノ酸配列またはそれらの各々の同等物を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になるＣＤＲ２；および／またはＡＲＥＲＧＬＹＱＬＲＡＭＤＹのアミノ酸配列もしくはそれらの各々の同等物を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になるＣＤＲ３を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。一部の実施形態では、ＬＣは、ＱＳＩＳＮＮのアミノ酸配列もしくはそれらの各々の同等物を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になるＣＤＲ１；および／またはＮＡＳのアミノ酸配列もしくはそれらの各々の同等物を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になるＣＤＲ２；および／またはＱＱＳＮＳＷＰＹＴのアミノ酸配列もしくはそれらの各々の同等物を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になるＣＤＲ３を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。
【０２０１】
一部の実施形態では、ＣＡＲの抗ＬＨＲ抗体のＨＣ可変領域は、本明細書で開示される配列から選択されるポリペプチドまたはそれらの各々の同等物を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になる。一部の実施形態では、抗ＬＨＲ軽鎖可変領域は、本明細書で開示される配列から選択されるポリペプチドまたはそれらの各々の同等物を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になる。一部の実施形態では、抗ＬＨＲ重鎖可変領域は、本明細書で開示される配列から選択されるコンセンサス配列を有するポリペプチドまたはそれらの各々の同等物を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になる。一部の実施形態では、抗ＬＨＲ軽鎖可変領域は、本明細書で開示される配列から選択されるコンセンサス配列を有するポリペプチドまたはそれらの各々の同等物を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になる。
【０２０２】
一部の実施形態では、ポリペプチドの同等物は、ポリペプチドに対して少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの相補体と高ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを含むか、これからなるか、またはこれから本質的になる。
【０２０３】
一部の実施形態では、ＣＡＲは、さらに、検出可能なマーカーまたは精製マーカーを含むか、これからなるか、またはこれから本質的になる。
【０２０４】
一部の実施形態では、さらに、ＭＵＣ−１６に対する抗体またはメソテリンに対する抗体に由来する抗原結合性ドメインを含むか、これからなるか、またはこれから本質的になる。
【０２０５】
本明細書では、（ａ）抗黄体形成ホルモン受容体（「ＬＨＲ」）抗体の抗原結合性ドメイン、（ｂ）ＣＤ８αヒンジドメイン；（ｃ）ＣＤ８α膜貫通ドメイン；（ｄ）２つまたはこれを超える共刺激性シグナル伝達領域；および（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離核酸配列も提示される。一部の実施形態では、単離核酸配列は、本明細書で開示される配列のいずれか１つまたはそれらの各々の同等物から選択される配列を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になる。
【０２０６】
一部の実施形態では、単離核酸配列は、さらに、抗ＬＨＲ抗体の抗原結合性ドメインの上流に配置されたＫｏｚａｋコンセンサス配列、またはエンハンサーを含むか、これからなるか、またはこれから本質的になる。
【０２０７】
一部の実施形態では、単離核酸配列は、さらに、抗生物質耐性ポリヌクレオチドを含むか、これからなるか、またはこれから本質的になる。
【０２０８】
一部の実施形態では、単離核酸配列は、さらに、ＣＡＲの発現および／または活性化を制御するためのスイッチメカニズムを含むか、これからなるか、またはこれから本質的になる。
【０２０９】
本明細書では、（ａ）抗黄体形成ホルモン受容体（「ＬＨＲ」）抗体の抗原結合性ドメイン、（ｂ）ＣＤ８αヒンジドメイン；（ｃ）ＣＤ８α膜貫通ドメイン；（ｄ）２つまたはこれを超える共刺激性シグナル伝達領域；および（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離核酸配列を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になるベクターも提示される。一部の実施形態では、ベクターは、プラスミドである。一部の実施形態では、ベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターの群より選択される。一部の実施形態では、ベクターは、ＣＲＩＳＰＲベクター、またはＣＲＩＳＰＲを含むベクターである。
【０２１０】
本明細書では、（ａ）抗黄体形成ホルモン受容体（「ＬＨＲ」）抗体の抗原結合性ドメイン、（ｂ）ＣＤ８αヒンジドメイン；（ｃ）ＣＤ８α膜貫通ドメイン；（ｄ）２つまたはこれを超える共刺激性シグナル伝達領域；および（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む単離細胞も提示される。一部の実施形態では、本明細書では、（ａ）抗黄体形成ホルモン受容体（「ＬＨＲ」）抗体の抗原結合性ドメイン、（ｂ）ＣＤ８αヒンジドメイン；（ｃ）ＣＤ８α膜貫通ドメイン；（ｄ）２つまたはこれを超える共刺激性シグナル伝達領域；および（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離核酸配列を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になる単離細胞が提示される。一部の実施形態では、本明細書では、（ａ）抗黄体形成ホルモン受容体（「ＬＨＲ」）抗体の抗原結合性ドメイン、（ｂ）ＣＤ８αヒンジドメイン；（ｃ）ＣＤ８α膜貫通ドメイン；（ｄ）２つまたはこれを超える共刺激性シグナル伝達領域；および（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離核酸配列を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になるベクターを含むか、これからなるか、またはこれから本質的になる単離細胞が提示される。一部の実施形態では、単離細胞は、ＣＡＲ、単離核酸またはベクターのうちの１または複数を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。
【０２１１】
一部の実施形態では、単離細胞は、免疫細胞である。一部の実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。一部の実施形態では、単離細胞は、Ｔ細胞前駆体またはＮＫ細胞前駆体である。
【０２１２】
本明細書では、担体と、（ａ）抗黄体形成ホルモン受容体（「ＬＨＲ」）抗体の抗原結合性ドメイン、（ｂ）ＣＤ８αヒンジドメイン、（ｃ）ＣＤ８α膜貫通ドメイン、（ｄ）２つもしくはこれを超える共刺激性シグナル伝達領域、および（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になるＣＡＲ、ＣＡＲをコードする単離核酸、単離核酸を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になるベクター、またはＣＡＲ、単離核酸および／もしくはベクターを含む単離細胞のうちの１または複数とを含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる組成物が提示される。
【０２１３】
一部の実施形態では、組成物は、さらに、ＬＨＲタンパク質またはその断片を含むペプチドに結合することが可能な抗原結合性断片を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になる。一部の実施形態では、ペプチドは、細胞と会合する。一部の実施形態では、ペプチドは、固体支持体に結合する。一部の実施形態では、ペプチドは、溶液中に配置される。一部の実施形態では、ペプチドは、マトリックスと会合する。
【０２１４】
本明細書では、抗ＬＨＲ  ＣＡＲ発現細胞を作製する方法であって、（ｉ）（ａ）抗黄体形成ホルモン受容体（「ＬＨＲ」）抗体の抗原結合性ドメイン、（ｂ）ＣＤ８αヒンジドメイン；（ｃ）ＣＤ８α膜貫通ドメイン；（ｄ）２つまたはこれを超える共刺激性シグナル伝達領域；および（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になるＣＡＲをコードする核酸配列を免疫細胞の集団に導入するステップと；（ｉｉ）ステップ（ｉ）の前記核酸配列の形質導入に成功した免疫細胞の亜集団を選択し、これにより、抗ＬＨＲ  ＣＡＲ発現細胞を作製するステップとを含む、これらからなる、またはこれらから本質的になる方法も提示される。
【０２１５】
方法についての一部の実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞である。方法についての一部の実施形態では、Ｔ細胞の集団は、内因性Ｔ細胞受容体の発現を低減または消失させるように改変されている。
【０２１６】
方法についての一部の実施形態では、Ｔ細胞の集団は、ＲＮＡ干渉またはＣＲＩＳＰＲを利用する方法を使用して改変された。
【０２１７】
本明細書では、それを必要とする対象における腫瘍の増殖を阻害するおよび／またはがんを処置する方法であって、対象へと、有効量の、本明細書で提示される実施形態のいずれかに従う単離抗ＬＨＲ  ＣＡＲ発現細胞を投与するステップを含む、これからなる、またはこれから本質的になる方法も提示される。
【０２１８】
方法についての一部の実施形態では、抗ＬＨＲ  ＣＡＲ発現細胞は、処置される対象に対して自家または同種である。
【０２１９】
方法についての一部の実施形態では、腫瘍またはがんは、ＬＨＲを発現または過剰発現させる。一部の実施形態では、腫瘍は、固形腫瘍、任意選択で、卵巣腫瘍もしくは前立腺がん腫瘍であり、および／またはがんは、卵巣がんもしくは前立腺がんである。
【０２２０】
方法についての一部の実施形態では、それを必要とする対象は、ヒト、動物、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ヒツジ、マウス、ウマ、またはウシである。
【０２２１】
本明細書では、（ａ）Ｂ７−Ｈ４抗体の抗原結合性ドメイン、（ｂ）ＣＤ８αヒンジドメイン；（ｃ）ＣＤ８α膜貫通ドメイン；（ｄ）２つまたはこれを超える共刺激性シグナル伝達領域；および（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が提示される。一部の実施形態では、２つまたはこれを超える共刺激性シグナル伝達領域は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−ＩＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、およびＢ７−Ｈ３から選択される。
【０２２２】
一部の実施形態では、ＣＡＲの抗Ｂ７−Ｈ４抗体の抗原結合性ドメインは、抗Ｂ７−Ｈ４重鎖（ＨＣ）可変領域および抗Ｂ７−Ｈ４軽鎖（ＬＣ）可変領域を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。一部の実施形態では、ＣＡＲは、さらに、抗Ｂ７−Ｈ４  ＨＣ可変領域と抗Ｂ７−Ｈ４  ＬＣ可変領域の間に配置されたリンカーポリペプチドを含む。
【０２２３】
一部の実施形態では、抗Ｂ７−Ｈ４抗体のＨＣは、ＧＸＴＦのアミノ酸配列またはそれらの各々の同等物を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になるＣＤＲ１；および／または（ｉ）ＩＳＳＸＸＸＴ、（ｉｉ）ＩＮＰＮＮＧＧＴのアミノ酸配列またはそれらの各々の同等物を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になるＣＤＲ２；および／またはＡＲＰＸＹＹのアミノ酸配列もしくはそれらの各々の同等物を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になるＣＤＲ３を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になるか；ならびに／あるいは、ＬＣは、（ｉ）ＱＳＩＶＨＸＮＧＴＹ、（ｉｉ）ＥＮＩＧＳＹのアミノ酸配列もしくはそれらの各々の同等物を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になるＣＤＲ１；および／または（ｉ）ＫＶＳ、（ｉｉ）ＡＡＴのアミノ酸配列もしくはそれらの各々の同等物を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になるＣＤＲ２；および／または（ｉ）ＦＱＧＳＸＶＰＸＴ、（ｉｉ）ＱＨＹＹＳＴＬＶＴのアミノ酸配列もしくはそれらの各々の同等物を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になるＣＤＲ３を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。
【０２２４】
一部の実施形態では、抗Ｂ７−Ｈ４抗体のＨＣは、（ｉ）ＧＦＴＦＳＳＦＧ、（ｉｉ）ＧＦＴＦＳＳＹＧ、（ｉｉｉ）ＧＹＴＦＴＤＹのアミノ酸配列、もしくはそれらの各々の同等物を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になるＣＤＲ１；および／または（ｉ）ＩＳＳＧＳＳＴＬ、（ｉｉ）ＩＳＳＳＮＳＴＩのアミノ酸配列、もしくはそれらの各々の同等物を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になるＣＤＲ２；および／または（ｉ）ＡＲＰＬＹＹＹＧＳＶＭＤＹ、（ｉｉ）ＡＲＰＹＹＹＧＳＳＹＤＹのアミノ酸配列、もしくはそれらの各々の同等物を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になるＣＤＲ３を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になるか、これらからなるか、またはこれらから本質的になり、かつ／あるいはＬＣは、（ｉ）ＱＳＩＶＨＲＮＧＮＴＹ、（ｉｉ）ＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹのアミノ酸配列、もしくはそれらの各々の同等物を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になるＣＤＲ１；および／または（ｉ）ＦＱＧＳＹＶＰＰＴ、（ｉｉ）ＦＱＧＳＨＶＰＬＴのアミノ酸配列、もしくはそれらの各々の同等物を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になるＣＤＲ３を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。
【０２２５】
一部の実施形態では、ＣＡＲの抗Ｂ７−Ｈ４重鎖可変領域は、本明細書で開示される配列から選択されるポリペプチドまたはそれらの各々の同等物を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になる。一部の実施形態では、ＣＡＲの抗Ｂ７−Ｈ４軽鎖可変領域は、本明細書で開示される配列から選択されるポリペプチドまたはそれらの各々の同等物を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になる。一部の実施形態では、ＣＡＲの抗Ｂ７−Ｈ４重鎖可変領域は、本明細書で開示される配列から選択されるコンセンサス配列を有するポリペプチドまたはそれらの各々の同等物を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になる。一部の実施形態では、抗Ｂ７−Ｈ４軽鎖可変領域は、本明細書で開示される配列から選択されるコンセンサス配列を有するポリペプチドまたはそれらの各々の同等物を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になる。
【０２２６】
一部の実施形態では、ＣＡＲは、さらに、検出可能なマーカーまたは精製マーカーを含むか、これからなるか、またはこれから本質的になる。
【０２２７】
本明細書では、（ａ）Ｂ７−Ｈ４抗体の抗原結合性ドメイン、（ｂ）ＣＤ８αヒンジドメイン；（ｃ）ＣＤ８α膜貫通ドメイン；（ｄ）２つまたはこれを超える共刺激性シグナル伝達領域；および（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離核酸配列も提示される。一部の実施形態では、単離核酸配列は、本明細書で開示される配列のいずれか１つまたはそれらの各々の同等物から選択される配列を含む。
【０２２８】
一部の実施形態では、単離核酸配列は、さらに、抗Ｂ７−Ｈ４抗体の抗原結合性ドメインの上流に配置されたＫｏｚａｋコンセンサス配列、またはエンハンサーを含むか、これからなるか、またはこれから本質的になる。
【０２２９】
一部の実施形態では、単離核酸配列は、さらに、抗生物質耐性ポリヌクレオチドを含むか、これからなるか、またはこれから本質的になる。
【０２３０】
一部の実施形態では、単離核酸配列は、さらに、ＣＡＲの発現および／または活性化を制御するためのスイッチメカニズムを含むか、これからなるか、またはこれから本質的になる。
【０２３１】
本明細書では、（ａ）抗Ｂ７−Ｈ４抗体の抗原結合性ドメイン、（ｂ）ＣＤ８αヒンジドメイン；（ｃ）ＣＤ８α膜貫通ドメイン；（ｄ）２つまたはこれを超える共刺激性シグナル伝達領域；および（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離核酸配列を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になるベクターが提示される。一部の実施形態では、ベクターは、プラスミドである。一部の実施形態では、ベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターから選択される。一部の実施形態において、ベクターは、ＣＲＩＳＰＲベクターである。
【０２３２】
本明細書では、（ａ）抗Ｂ７−Ｈ４抗体の抗原結合性ドメイン、（ｂ）ＣＤ８αヒンジドメイン；（ｃ）ＣＤ８α膜貫通ドメイン；（ｄ）２つもしくはこれを超える共刺激性シグナル伝達領域；および（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）；ならびに／またはＣＡＲをコードする単離核酸；ならびに／または単離核酸を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になるベクターを含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる単離細胞も提示される。一部の実施形態では、単離細胞は、免疫細胞である。一部の実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。一部の実施形態では、単離細胞は、Ｔ細胞前駆体またはＮＫ細胞前駆体である。
【０２３３】
本明細書では、担体と、（ａ）抗Ｂ７−Ｈ４抗体の抗原結合性ドメイン、（ｂ）ＣＤ８αヒンジドメイン；（ｃ）ＣＤ８α膜貫通ドメイン；（ｄ）２つもしくはこれを超える共刺激性シグナル伝達領域；および（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）；ＣＡＲをコードする単離核酸配列；単離核酸配列を含むベクター；ならびに／またはＣＡＲ、ベクターもしくは単離核酸配列を含む単離細胞のうちの１または複数とを含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる組成物が提示される。
【０２３４】
一部の実施形態では、組成物は、Ｂ７−Ｈ４タンパク質またはその断片を含むペプチドに結合することが可能な抗原結合性断片をさらに含む。一部の実施形態では、ペプチドは、細胞と会合する。一部の実施形態では、ペプチドは、固体支持体に結合する。一部の実施形態では、ペプチドは、溶液中に配置される。一部の実施形態では、ペプチドは、マトリックスと会合する。
【０２３５】
本明細書では、抗Ｂ７−Ｈ４  ＣＡＲ発現細胞を作製する方法であって、（ｉ）（ａ）抗Ｂ７−Ｈ４抗体の抗原結合性ドメイン、（ｂ）ＣＤ８αヒンジドメイン；（ｃ）ＣＤ８α膜貫通ドメイン；（ｄ）２つまたはこれを超える共刺激性シグナル伝達領域；および（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を免疫細胞の集団に導入するステップと；（ｉｉ）ステップ（ｉ）の前記核酸配列の形質導入に成功した免疫細胞の亜集団を選択し、これにより、抗Ｂ７−Ｈ４  ＣＡＲ発現細胞を作製するステップとを含む方法が提示される。一部の実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞の集団は、内因性Ｔ細胞受容体の発現を低減または消失させるように改変されている。一部の実施形態では、Ｔ細胞の集団は、ＲＮＡ干渉またはＣＲＩＳＰＲを利用する方法を使用して改変された。
【０２３６】
それを必要とする対象における腫瘍の増殖を阻害するおよび／またはがんを処置する方法であって、対象へと、有効量の、抗Ｂ７−Ｈ４  ＣＡＲ発現細胞を投与するステップを含み、抗Ｂ７−Ｈ４  ＣＡＲ発現細胞が、（ａ）抗Ｂ７−Ｈ４抗体の抗原結合性ドメイン、（ｂ）ＣＤ８αヒンジドメイン；（ｃ）ＣＤ８α膜貫通ドメイン；（ｄ）２つもしくはこれを超える共刺激性シグナル伝達領域；および（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）；ならびに／またはＣＡＲをコードする単離核酸；ならびに／または単離核酸を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になるベクターを含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる、方法も提示される。一部の実施形態では、抗Ｂ７−Ｈ４  ＣＡＲ発現細胞は、処置される対象に対して自家または同種である。一部の実施形態では、腫瘍またはがんは、Ｂ７−Ｈ４を発現または過剰発現させる。一部の実施形態では、腫瘍は、固形腫瘍、任意選択で、乳房、結腸もしくは絨毛癌腫瘍であり、および／またはがんは、乳、結腸もしくは絨毛癌である。一部の実施形態では、対象は、ヒト、動物、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ヒツジ、マウス、ウマ、またはウシである。
【０２３７】
本明細書では、（ａ）ＨＬＡ−Ｇ抗体の抗原結合性ドメイン、（ｂ）ＣＤ８αヒンジドメイン；（ｃ）ＣＤ８α膜貫通ドメイン；（ｄ）２つまたはこれを超える共刺激性シグナル伝達領域；および（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が提示される。一部の実施形態では、２つまたはこれを超える共刺激性シグナル伝達領域は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−ＩＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、およびＢ７−Ｈ３から選択される。
【０２３８】
一部の実施形態では、抗ＨＬＡ−Ｇ抗体の抗原結合性ドメインは、抗ＨＬＡ−Ｇ重鎖（ＨＣ）可変領域および抗ＨＬＡ−Ｇ軽鎖（ＬＣ）可変領域を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。一部の実施形態では、ＣＡＲは、さらに、抗ＨＬＡ−Ｇ  ＨＣ可変領域と抗ＨＬＡ−Ｇ  ＬＣ可変領域の間に配置されたリンカーポリペプチドを含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。
【０２３９】
一部の実施形態では、抗ＨＬＡ−Ｇ抗体のＨＣは、（ｉ）ＧＦＮＩＫＤＴＹ、（ｉｉ）ＧＦＴＦＮＴＹＡのアミノ酸配列またはそれらの各々の同等物を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になるＣＤＲ１；および／または（ｉ）ＩＤＰＡＮＧＮＴ、（ｉｉ）ＩＲＳＫＳＮＮＹＡＴのアミノ酸配列またはそれらの各々の同等物を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になるＣＤＲ２；および／または（ｉ）ＡＲＳＹＹＧＧＦＡＹ、（ｉｉ）ＶＲＧＧＹＷＳＦＤＶのアミノ酸配列もしくはそれらの各々の同等物を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になるＣＤＲ３を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる；ならびに／あるいはＬＣは、（ｉ）ＫＳＶＳＴＳＧＹＳＹ、（ｉｉ）ＫＳＬＬＨＳＮＧＮＴＹのアミノ酸配列もしくはそれらの各々の同等物を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になるＣＤＲ１；および／または（ｉ）ＬＶＳ、（ｉｉ）ＲＭＳのアミノ酸配列もしくはそれらの各々の同等物を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になるＣＤＲ２；および／または（ｉ）ＱＨＳＲＥＬＰＲＴ、（ｉｉ）ＭＱＨＬＥＹＰＹＴのアミノ酸配列もしくはそれらの各々の同等物を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になるＣＤＲ３を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。
【０２４０】
一部の実施形態では、ＣＡＲの抗ＨＬＡ−Ｇ重鎖可変領域は、本明細書で開示される配列から選択されるポリペプチドまたはそれらの各々の同等物を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になる。一部の実施形態では、抗ＨＬＡ−Ｇ軽鎖可変領域は、本明細書で開示される配列から選択されるポリペプチドまたはそれらの各々の同等物を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になる。一部の実施形態では、抗ＨＬＡ−Ｇ重鎖可変領域は、本明細書で開示される配列から選択されるコンセンサス配列を有するポリペプチドまたはそれらの各々の同等物を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になる。一部の実施形態では、抗ＨＬＡ−Ｇ軽鎖可変領域は、本明細書で開示される配列から選択されるコンセンサス配列を有するポリペプチドまたはそれらの各々の同等物を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になる。
【０２４１】
一部の実施形態では、ＣＡＲは、さらに、検出可能なマーカーまたは精製マーカーを含む。
【０２４２】
本明細書で提供されるのは、（ａ）抗ＨＬＡ−Ｇ抗体の抗原結合性ドメイン、（ｂ）ＣＤ８αヒンジドメイン；（ｃ）ＣＤ８α膜貫通ドメイン；（ｄ）２つまたはこれを超える共刺激性シグナル伝達領域；および（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離核酸配列である。一部の実施形態では、核酸配列は、本明細書で開示される配列のいずれか１つまたはそれらの各々の同等物から選択される配列を含む。
【０２４３】
一部の実施形態では、単離核酸は、さらに、抗ＨＬＡ−Ｇ抗体の抗原結合性ドメインの上流に配置されたＫｏｚａｋコンセンサス配列、またはエンハンサーを含むか、これからなるか、またはこれから本質的になる。一部の実施形態では、単離核酸は、さらに、抗生物質耐性ポリヌクレオチドを含むか、これからなるか、またはこれから本質的になる。一部の実施形態では、単離核酸は、さらに、ＣＡＲの発現および／または活性化を制御するためのスイッチメカニズムを含むか、これからなるか、またはこれから本質的になる。
【０２４４】
本明細書では、（ａ）抗ＨＬＡ−Ｇ抗体の抗原結合性ドメイン、（ｂ）ＣＤ８αヒンジドメイン；（ｃ）ＣＤ８α膜貫通ドメイン；（ｄ）２つまたはこれを超える共刺激性シグナル伝達領域；および（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離核酸配列を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になるベクターも提示される。一部の実施形態では、ベクターは、プラスミドである。一部の実施形態では、ベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターからなる群より選択される。一部の実施形態では、ベクターは、ＣＲＩＳＰＲベクター、またはＣＲＩＳＰＲを含むベクターである。
【０２４５】
本明細書では、（ａ）抗ＨＬＡ−Ｇ抗体の抗原結合性ドメイン、（ｂ）ＣＤ８αヒンジドメイン；（ｃ）ＣＤ８α膜貫通ドメイン；（ｄ）２つもしくはこれを超える共刺激性シグナル伝達領域；および（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）；ならびに／またはＣＡＲをコードする単離核酸配列；ならびに／または単離核酸配列を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になるベクターを含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる単離細胞が提示される。一部の実施形態では、単離細胞は、免疫細胞である。一部の実施形態では、単離細胞は、Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。一部の実施形態では、単離細胞は、Ｔ細胞前駆体またはＮＫ細胞前駆体である。
【０２４６】
本明細書では、担体と、（ａ）抗ＨＬＡ−Ｇ抗体の抗原結合性ドメイン、（ｂ）ＣＤ８αヒンジドメイン；（ｃ）ＣＤ８α膜貫通ドメイン；（ｄ）２つもしくはこれを超える共刺激性シグナル伝達領域；および（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）；ならびに／またはＣＡＲをコードする単離核酸配列；単離核酸配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になるベクター；ならびに／またはＣＡＲ、単離核酸配列もしくはベクターを含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる単離細胞のうちの１または複数とを含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる組成物も提示される。
【０２４７】
一部の実施形態では、組成物は、さらに、ＨＬＡ−Ｇタンパク質またはその断片を含むペプチドに結合することが可能な抗原結合性断片を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になる。一部の実施形態では、ペプチドは、細胞と会合する。一部の実施形態では、ペプチドは、固体支持体に結合する。一部の実施形態では、ペプチドは、溶液中に配置される。一部の実施形態では、ペプチドは、マトリックスと会合する。
【０２４８】
本明細書では、抗ＨＬＡ−Ｇ  ＣＡＲ発現細胞を作製する方法であって、（ｉ）（ａ）抗ＨＬＡ−Ｇ抗体の抗原結合性ドメイン、（ｂ）ＣＤ８αヒンジドメイン；（ｃ）ＣＤ８α膜貫通ドメイン；（ｄ）２つまたはこれを超える共刺激性シグナル伝達領域；および（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を免疫細胞の集団に導入するステップと；（ｉｉ）ステップ（ｉ）の前記核酸配列の形質導入に成功した免疫細胞の亜集団を選択し、これにより、抗ＨＬＡ−Ｇ  ＣＡＲ発現細胞を作製するステップとを含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる方法が提示される。一部の実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞の集団は、内因性Ｔ細胞受容体の発現を低減または消失させるように改変されている。一部の実施形態では、Ｔ細胞の集団は、ＲＮＡ干渉またはＣＲＩＳＰＲを利用する方法を使用して改変された。
【０２４９】
本明細書では、それを必要とする対象における腫瘍の増殖を阻害するおよび／またはがんを処置する方法であって、対象へと、有効量の、抗ＨＬＡ−Ｇ  ＣＡＲ発現細胞を投与するステップを含むか、これからなるか、またはこれから本質的になり、抗ＨＬＡ−Ｇ  ＣＡＲ発現細胞が、（ａ）抗ＨＬＡ−Ｇ抗体の抗原結合性ドメイン、（ｂ）ＣＤ８αヒンジドメイン；（ｃ）ＣＤ８α膜貫通ドメイン；（ｄ）２つもしくはこれを超える共刺激性シグナル伝達領域；および（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）；ならびに／またはＣＡＲをコードする単離核酸配列；ならびに／または単離核酸配列を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になるベクターを含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる、方法も提示される。一部の実施形態では、抗ＨＬＡ−Ｇ  ＣＡＲ発現細胞は、処置される対象に対して自家または同種である。
【０２５０】
方法についての一部の実施形態では、腫瘍またはがんは、ＨＬＡ−Ｇを発現または過剰発現させる。一部の実施形態では、腫瘍は、固形腫瘍、任意選択で、甲状腺腫瘍、卵巣腫瘍もしくは前立腺がん腫瘍であり、および／またはがんは、甲状腺がん、卵巣がんもしくは前立腺がんである。
【０２５１】
方法についての一部の実施形態では、対象は、ヒト、動物、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ヒツジ、マウス、ウマ、またはウシである。
【０２５２】
本明細書では、（ａ）抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体の抗原結合性ドメイン、（ｂ）ＣＤ８αヒンジドメイン；（ｃ）ＣＤ８α膜貫通ドメイン；（ｄ）２つまたはこれを超える共刺激性シグナル伝達領域；および（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が提示される。一部の実施形態では、２つまたはこれを超える共刺激性シグナル伝達領域は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−ＩＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、およびＢ７−Ｈ３から選択される。
【０２５３】
一部の実施形態では、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体の抗原結合性ドメインは、抗ＨＬＡ−ＤＲ重鎖（ＨＣ）可変領域および抗ＨＬＡ−ＤＲ軽鎖（ＬＣ）可変領域を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。一部の実施形態では、ＣＡＲは、さらに、抗ＨＬＡ−ＤＲ  ＨＣ可変領域と抗ＨＬＡ−ＤＲ  ＬＣ可変領域の間に配置されたリンカーポリペプチドを含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。
【０２５４】
一部の実施形態では、ＣＡＲの抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体のＨＣは、（ｉ）Ｌｙｍ−１抗体のＣＤＲＨ１、（ｉｉ）Ｌｙｍ−２抗体のＣＤＲＨ１のアミノ酸配列、もしくはそれらの各々の同等物を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になるＣＤＲ１；および／または（ｉ）Ｌｙｍ−１抗体のＣＤＲＨ２、（ｉｉ）Ｌｙｍ−２抗体のＣＤＲＨ２のアミノ酸配列、もしくはそれらの各々の同等物を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になるＣＤＲ２；および／または（ｉ（ｉ）Ｌｙｍ−１抗体のＣＤＲＨ３、（ｉｉ）Ｌｙｍ−２抗体のＣＤＲＨ１のアミノ酸配列、もしくはそれらの各々の同等物を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になるＣＤＲ３を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になり；かつ／あるいはＬＣは、（ｉ）Ｌｙｍ−１抗体のＣＤＲＬ１、（ｉｉ）Ｌｙｍ−２抗体のＣＤＲＬ１のアミノ酸配列、もしくはそれらの各々の同等物を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になるＣＤＲ１；および／または（ｉ）Ｌｙｍ−１抗体のＣＤＲＬ２、（ｉｉ）Ｌｙｍ−２抗体のＣＤＲＬ２のアミノ酸配列、もしくはそれらの各々の同等物を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になるＣＤＲ２；および／または（ｉ）Ｌｙｍ−１抗体のＣＤＲＬ３、（ｉｉ）Ｌｙｍ−２抗体のＣＤＲＬ３のアミノ酸配列、もしくはそれらの各々の同等物を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になるＣＤＲ３を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。
【０２５５】
一部の実施形態では、抗ＨＬＡ−ＤＲ重鎖可変領域は、本明細書で開示される配列から選択されるポリペプチドまたはそれらの各々の同等物を含む。一部の実施形態では、抗ＨＬＡ−ＤＲ軽鎖可変領域は、本明細書で開示される配列から選択されるポリペプチドまたはそれらの各々の同等物を含む。一部の実施形態では、抗ＨＬＡ−ＤＲ重鎖可変領域は、本明細書で開示される配列から選択されるコンセンサス配列を有するポリペプチドまたはそれらの各々の同等物を含む。一部の実施形態では、抗ＨＬＡ−ＤＲ軽鎖可変領域は、本明細書で開示される配列から選択されるコンセンサス配列を有するポリペプチドまたはそれらの各々の同等物を含む。
【０２５６】
一部の実施形態では、ＣＡＲは、さらに、検出可能なマーカーまたは精製マーカーを含むか、これからなるか、またはこれから本質的になる。
【０２５７】
本明細書では、（ａ）抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体の抗原結合性ドメイン、（ｂ）ＣＤ８αヒンジドメイン；（ｃ）ＣＤ８α膜貫通ドメイン；（ｄ）２つまたはこれを超える共刺激性シグナル伝達領域；および（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離核酸配列が提示される。一部の実施形態では、核酸配列は、本明細書で開示される配列のいずれか１つまたはそれらの各々の同等物から選択される配列を含む。
【０２５８】
一部の実施形態では、単離核酸は、さらに、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体の抗原結合性ドメインの上流に配置されたＫｏｚａｋコンセンサス配列、またはエンハンサーを含むか、これからなるか、またはこれから本質的になる。
【０２５９】
一部の実施形態では、単離核酸は、さらに、抗生物質耐性ポリヌクレオチドを含むか、これからなるか、またはこれから本質的になる。
【０２６０】
一部の実施形態では、単離核酸は、さらに、ＣＡＲの発現および／または活性化を制御するためのスイッチメカニズムを含むか、これからなるか、またはこれから本質的になる。
【０２６１】
本明細書では、（ａ）抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体の抗原結合性ドメイン、（ｂ）ＣＤ８αヒンジドメイン；（ｃ）ＣＤ８α膜貫通ドメイン；（ｄ）２つまたはこれを超える共刺激性シグナル伝達領域；および（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離単離核酸配列を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になるベクターが提示される。一部の実施形態では、ベクターは、プラスミドである。一部の実施形態では、ベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターからなる群より選択される。一部の実施形態では、ベクターは、ＣＲＩＳＰＲベクター、またはＣＲＩＳＰＲを含むベクターである。
【０２６２】
本明細書では、（ａ）抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体の抗原結合性ドメイン、（ｂ）ＣＤ８αヒンジドメイン；（ｃ）ＣＤ８α膜貫通ドメイン；（ｄ）２つもしくはこれを超える共刺激性シグナル伝達領域；および（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）；ならびに／またはＣＡＲをコードする単離核酸；ならびに／またはＣＡＲをコードする単離核酸を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になるベクターを含む単離細胞が提示される。一部の実施形態では、単離細胞は、免疫細胞である。一部の実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。一部の実施形態では、単離細胞は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞前駆体である。
【０２６３】
本明細書では、担体と、（ａ）抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体の抗原結合性ドメイン、（ｂ）ＣＤ８αヒンジドメイン、（ｃ）ＣＤ８α膜貫通ドメイン、（ｄ）２つもしくはこれを超える共刺激性シグナル伝達領域、および（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になるＣＡＲ；ならびに／またはＣＡＲをコードする単離核酸；ならびに／またはＣＡＲをコードする単離核酸配列を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になるベクター；ならびに／またはＣＡＲ、単離核酸配列およびベクターのうちの少なくとも１つを含む単離細胞のうちの１または複数とを含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる組成物が提示される。
【０２６４】
一部の実施形態では、組成物は、さらに、ＨＬＡ−ＤＲタンパク質またはその断片を含むペプチドに結合することが可能な抗原結合性断片を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になる。一部の実施形態では、ペプチドは、細胞と会合する。一部の実施形態では、ペプチドは、固体支持体に結合する。一部の実施形態では、ペプチドは、溶液中に配置される。一部の実施形態では、ペプチドは、マトリックスと会合する。
【０２６５】
本明細書では、（ａ）抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体の抗原結合性ドメイン、（ｂ）ＣＤ８αヒンジドメイン；（ｃ）ＣＤ８α膜貫通ドメイン；（ｄ）２つもしくはこれを超える共刺激性シグナル伝達領域；および（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）；ならびに／またはＣＡＲをコードする単離核酸；ならびに／またはＣＡＲをコードする単離核酸を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になるベクターを含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる抗ＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ発現細胞を作製する方法であって、（ｉ）請求項１１９から１２９のいずれか一項に記載のＣＡＲをコードする核酸配列を免疫細胞の集団に導入するステップと；（ｉｉ）ステップ（ｉ）の前記核酸配列の形質導入に成功した免疫細胞の亜集団を選択し、これにより、抗ＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ発現細胞を作製するステップとを含む方法が提示される。一部の実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞の集団は、内因性Ｔ細胞受容体の発現を低減または消失させるように改変されている。一部の実施形態では、Ｔ細胞の集団は、ＲＮＡ干渉またはＣＲＩＳＰＲを利用する方法を使用して改変された。
【０２６６】
本明細書では、それを必要とする対象における腫瘍の増殖を阻害するおよび／またはがんを処置する方法であって、対象へと、有効量の、抗ＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ発現細胞を投与するステップを含み、抗ＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ発現細胞が、（ａ）抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体の抗原結合性ドメイン、（ｂ）ＣＤ８αヒンジドメイン；（ｃ）ＣＤ８α膜貫通ドメイン；（ｄ）２つもしくはこれを超える共刺激性シグナル伝達領域；および（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）；ならびに／またはＣＡＲをコードする単離核酸；ならびに／またはＣＡＲをコードする単離核酸を含むか、これからなるか、またはこれから本質的になるベクターを含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる、方法も提示される。一部の実施形態では、抗ＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ発現細胞は、処置される対象に対して自家または同種である。
【０２６７】
方法についての一部の実施形態では、腫瘍またはがんは、ＨＬＡ−ＤＲを発現させるか、または正常な非がん性の対応細胞と比較して過剰発現させる。一部の実施形態では、腫瘍は、Ｂ細胞リンパ腫腫瘍もしくは白血病腫瘍であり、および／またはがんは、Ｂ細胞リンパ腫もしくは白血病である。
【０２６８】
方法についての一部の実施形態では、対象は、ヒト、動物、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ヒツジ、マウス、ウマ、またはウシである。
【０２６９】
本明細書で開示されるＣＡＲ、単離核酸配列、ベクター、単離細胞、および組成物のうちの１または複数と、本明細書で開示される１または複数の方法に従って使用するための指示とを含むキットが提示される。
【０２７０】
抗体およびそれらの使用
Ｉ．組成物
当技術分野では、抗体の一般的構造が公知であり、ここでは、短くまとめるにとどめる。免疫グロブリンの単量体は、ジスルフィド結合により接続された、２つの重鎖と、２つの軽鎖とを含む。各重鎖は、軽鎖のうちの１つと対合し、重鎖は、軽鎖に、ジスルフィド結合により、直接結合する。各重鎖は、定常領域（抗体のアイソタイプに応じて変化する）と、可変領域とを含む。可変領域は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３と指定され、フレームワーク領域内で支持される、３つの超可変領域（または相補性決定領域）を含む。各軽鎖は、定常領域と、可変領域とを含み、可変領域は、フレームワーク領域により、重鎖の可変領域と同様の形で支持される、３つの超可変領域（指定されたＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３）を含む。
【０２７１】
重鎖と軽鎖との各対による超可変領域は、互いに協同して、標的抗原に結合することが可能な抗原結合性部位をもたらす。重鎖と軽鎖との対の結合特異性は、重鎖および軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の配列により規定される。したがって、特定の結合特異性をもたらす、ＣＤＲ配列のセット（すなわち、重鎖および軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の配列）を決定したら、同じ抗原結合特異性を伴う、異なる抗体をもたらすために、原則として、ＣＤＲ配列のセットを、任意の抗体の定常領域と連結された、他の任意の抗体のフレームワーク領域内の適切な位置へと挿入することができる。
【０２７２】
一実施形態では、本開示は、重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列と、軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列とを含む単離抗体であって、黄体形成ホルモン受容体（ＬＨＲ）、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−Ｇ、またはＨＬＡ−ＤＲのエピトープに結合する抗体を提示する。
【０２７３】
抗ＬＨＲ抗体
下記でより詳細に記載される通り、本発明者らは、ＬＨＲが、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法のための強力な標的であることを裏付けた。下記の表１および図１に示す通り、９つの十分に樹立されたヒト卵巣細胞株を活用する、フローサイトメトリー研究は、ＬＨＲが、被験細胞株のうちの半分またはそれ未満だけにおいて陽性である、メソテリンおよびＭＵＣ１６と比較して優れた標的であることを示した。これらの標的は、表２において示される通り、免疫組織化学により、ヒト卵巣がんのマルチブロックスライド上でも調べた。これらの方法により、被験腫瘍の病期またはグレードに関わらず、ＬＨＲの陽性度が、メソテリンおよびＭＵＣ１６の陽性度より一貫して見られたことは、フローサイトメトリーの結果と符合する。図２において示される通り、免疫組織化学による染色パターンは、各抗体により、いくぶんか異なった。ＭＵＣ１６抗体およびメソテリン抗体の両方とも、腫瘍小結節の内腔面を染色する傾向があり、全ての細胞、とりわけ、腫瘍小結節の周縁部により多い細胞の細胞表面は染色しなかった。これに対し、ＬＨＲ抗体は、細胞質および細胞表面の両方を染色し、腫瘍小結節の全ての細胞を染色する傾向があった。最後に、正常組織の多重組織アレイ上で、各抗体によるオフターゲット染色について調べた。これらの研究結果を、下記の表３に示すが、これらは、正常組織上では、３つの標的のいずれの反応性も限定的であることを示す。
【０２７４】
一態様では、抗体のＨＣは、ＧＹＳＩＴＳＧＹＧのアミノ酸配列もしくはその同等物を含むＣＤＲ１；および／またはＩＨＹＳＧＳＴのアミノ酸配列もしくはその同等物を含むＣＤＲ２；および／またはＡＲＳＬＲＹのアミノ酸配列もしくはその同等物を含むＣＤＲ３のうちの１または複数を含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはなおさらにこれらからなり；かつ／あるいは抗体のＬＣは、ＳＳＶＮＹのアミノ酸配列もしくはその同等物を含むＣＤＲ１；および／またはＤＴＳのアミノ酸配列もしくはその同等物を含むＣＤＲ２；および／またはＨＱＷＳＳＹＰＹＴのアミノ酸配列もしくはその同等物を含むＣＤＲ３を含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはなおさらにこれらからなる。
【０２７５】
一態様では、抗体は、ＧＦＳＬＴＴＹＧのアミノ酸配列もしくはその同等物を含むＣＤＲ１；および／またはＩＷＧＤＧＳＴのアミノ酸配列もしくはその同等物を含むＣＤＲ２；および／またはＡＥＧＳＳＬＦＡＹのアミノ酸配列もしくはその同等物を含むＣＤＲ３のうちの１または複数を含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはなおさらにこれらからなるＨＣを含み；かつ／あるいは抗体のＬＣは、ＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹのアミノ酸配列もしくはその同等物を含むＣＤＲ１；および／またはＷＡＳのアミノ酸配列もしくはその同等物を含むＣＤＲ２；および／またはＱＮＤＹＳＹＰＬＴのアミノ酸配列もしくはその同等物を含むＣＤＲ３を含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはなおさらにこれらからなる。
【０２７６】
別の態様では、抗体のＨＣは、ＧＹＳＦＴＧＹＹのアミノ酸配列もしくはその同等物を含むＣＤＲ１；および／またはＩＹＰＹＮＧＶＳのアミノ酸配列もしくはその同等物を含むＣＤＲ２；および／またはＡＲＥＲＧＬＹＱＬＲＡＭＤＹのアミノ酸配列もしくはその同等物を含むＣＤＲ３のうちの１または複数を含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはなおさらにこれらからなり；かつ／あるいは抗体のＬＣは、ＱＳＩＳＮＮのアミノ酸配列もしくはその同等物を含むＣＤＲ１；および／またはＮＡＳのアミノ酸配列もしくはその同等物を含むＣＤＲ２；および／またはＱＱＳＮＳＷＰＹＴのアミノ酸配列もしくはその同等物を含むＣＤＲ３を含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはなおさらにこれらからなる。
【０２７７】
一態様では、本開示は、ＬＨＲ断片に対して作出される、単離抗ＬＨＲ抗体を提示する。
【０２７８】
一実施形態では、ＬＨＲ断片は、以下のアミノ酸配列：
ＲＥＡＬＣＰＥＰＣＮＣＶＰＤＧＡＬＲＣＰＧＰＴＡＧＬＴＲＬＳＬＡＹＬＰＶＫＶＩＰＳＱＡＦＲＧＬＮＥＶＩＫＩＥＩＳＱＩＤＳＬＥＲＩＥＡＮＡＦＤＮＬＬＮＬＳＥＩＬＩＱＮＴＫ
を伴うＬＨＲ  Ｇタンパク質の一部である。
【０２７９】
別の実施形態では、ＬＨＲ断片は、以下のアミノ酸配列：
【０２８０】
ＲＡＬＲＥＡＬＣＰＥＰＣＮＣＶＰＤＧＡＬＲＣＰＧＰＴＡＧＬＴＲＬＳＬＡＹＬＰＶＫＶＩＰＳＱＡＦＲＧＬＮＥＶＩＫＩＥＩＳＱＩＤＳＬＥＲＩＥＡＮＡＦＤＮＬＬＮＬＳＥＩＬＩＱＮＴＫＮＬＲＹＩＥＰＧＡＦＩＮＬＰＲＬＫＹＬＳＩＣＮＴＧＩＲＫＦＰＤＶＴＫＶＦＳＳＥＳＮＦＩＬＥＩＣＤＮＬＨＩＴＴＩＰＧＮＡＦＱＧＭＮＮＥＳＶＴＬＫＬＹＧＮＧＦＥＥＶＱＳＨＡＦＮＧＴＴＬＴＳＬＥＬＫＥＮＶＨＬＥＫＭＨＮＧＡＦＲＧＡＴＧＰＫＴＬＤＩＳＳＴＫＬＱＡＬＰＳＹＧＬＥＳＩＱＲＬＩＡＴＳＳＹＳＬＫＫＬＰＳＲＥＴＦＶＮＬＬＥＡＴＬＴＹＰＳ
を伴うＬＨＲタンパク質のＮ末端である。
【０２８１】
別の実施形態では、抗体は、本明細書に開示のものまたはそれらの各々の同等物から選択されるポリペプチドを含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる、抗ＬＨＲ重鎖可変領域と、本明細書に開示のものまたはそれらの各々の同等物から選択されるポリペプチドを含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる抗ＬＨＲ軽鎖可変領域とを含むモノクローナル抗体である。
【０２８２】
別の態様では、抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体である。
【０２８３】
一部の実施形態では、開示される抗体は、少なくとも１０−６Ｍの結合アフィニティーを有する。ある特定の態様では、抗体は、少なくとも約１０−７Ｍ、好ましくは、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、または１０−１２Ｍのアフィニティーで結合する。
【０２８４】
別の態様では、重鎖可変領域は、本明細書に開示のから選択されるコンセンサス配列を伴うポリペプチドを含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなり、抗ＬＨＲ軽鎖可変領域は、本明細書に開示のものから選択されるコンセンサス配列を伴うポリペプチドを含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる。
【０２８５】
別の態様では、本開示は、単離抗ＬＨＲ抗体をコードする単離核酸を提示する。さらなる実施形態では、単離核酸は、本明細書に開示のものまたはそれらの各々の同等物から選択される核酸配列を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる。
【０２８６】
一態様では、抗体のＨＣは、ＧＹＳＩＴＳＧＹＧのアミノ酸配列もしくはその同等物を含むＣＤＲ１；および／またはＩＨＹＳＧＳＴのアミノ酸配列もしくはその同等物を含むＣＤＲ２；および／またはＡＲＳＬＲＹのアミノ酸配列もしくはその同等物を含むＣＤＲ３のうちの１または複数に続く、カルボキシ末端における、さらなる５０アミノ酸、または代替的に約４０アミノ酸、または代替的に約３０アミノ酸、または代替的に約２０アミノ酸、または代替的に約１０アミノ酸、または代替的に約５アミノ酸、または代替的に約４、もしくは３、もしくは２、もしくは１アミノ酸を含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはなおさらにこれらからなる。
【０２８７】
一部の実施形態では、抗体の軽鎖可変領域は、ＳＳＶＮＹのアミノ酸配列もしくはその同等物を含むＣＤＲ１；および／またはＤＴＳのアミノ酸配列もしくはその同等物を含むＣＤＲ２；および／またはＨＱＷＳＳＹＰＹＴのアミノ酸配列もしくはその同等物を含むＣＤＲ３のうちの１または複数に続く、カルボキシ末端における、さらなる５０アミノ酸、または代替的に約４０アミノ酸、または代替的に約３０アミノ酸、または代替的に約２０アミノ酸、または代替的に約１０アミノ酸、または代替的に約５アミノ酸、または代替的に約４、もしくは３、もしくは２、もしくは１アミノ酸を含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはなおさらにこれらからなる。
【０２８８】
一態様では、抗体のＨＣは、ＧＦＳＬＴＴＹＧのアミノ酸配列もしくはその同等物を含むＣＤＲ１；および／またはＩＷＧＤＧＳＴのアミノ酸配列もしくはその同等物を含むＣＤＲ２；および／またはＡＥＧＳＳＬＦＡＹのアミノ酸配列もしくはその同等物を含むＣＤＲ３のうちの１または複数を含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはなおさらにこれらからなり；かつ／あるいは抗体のＬＣは、ＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹのアミノ酸配列もしくはその同等物を含むＣＤＲ１；および／またはＷＡＳのアミノ酸配列もしくはその同等物を含むＣＤＲ２；および／またはＱＮＤＹＳＹＰＬＴのアミノ酸配列もしくはその同等物を含むＣＤＲ３に続く、カルボキシ末端における、さらなる５０アミノ酸、または代替的に約４０アミノ酸、または代替的に約３０アミノ酸、または代替的に約２０アミノ酸、または代替的に約１０アミノ酸、または代替的に約５アミノ酸、または代替的に約４、もしくは３、もしくは２、もしくは１アミノ酸を含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはなおさらにこれらからなる。
【０２８９】
別の態様では、抗体のＨＣは、ＧＹＳＦＴＧＹＹのアミノ酸配列もしくはその同等物を含むＣＤＲ１；および／またはＩＹＰＹＮＧＶＳのアミノ酸配列もしくはその同等物を含むＣＤＲ２；および／またはＡＲＥＲＧＬＹＱＬＲＡＭＤＹのアミノ酸配列もしくはその同等物を含むＣＤＲ３のうちの１または複数を含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはなおさらにこれらからなり；かつ／あるいは抗体のＬＣは、ＱＳＩＳＮＮのアミノ酸配列もしくはその同等物を含むＣＤＲ１；および／またはＮＡＳのアミノ酸配列もしくはその同等物を含むＣＤＲ２；および／またはＱＱＳＮＳＷＰＹＴのアミノ酸配列もしくはその同等物を含むＣＤＲ３を含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはなおさらにこれらからなる。
【０２９０】
一態様では、本開示は、ＬＨＲ断片に対して作出される、単離抗ＬＨＲ抗体を提示する。
【０２９１】
一実施形態では、抗体が惹起されるＬＨＲ断片は、以下のアミノ酸配列：
ＲＥＡＬＣＰＥＰＣＮＣＶＰＤＧＡＬＲＣＰＧＰＴＡＧＬＴＲＬＳＬＡＹＬＰＶＫＶＩＰＳＱＡＦＲＧＬＮＥＶＩＫＩＥＩＳＱＩＤＳＬＥＲＩＥＡＮＡＦＤＮＬＬＮＬＳＥＩＬＩＱＮＴＫ
を伴うＬＨＲタンパク質の一部である。
【０２９２】
別の実施形態では、ＬＨＲ断片は、以下のアミノ酸配列を伴うＬＨＲタンパク質のＮ末端である：
【０２９３】
ＲＡＬＲＥＡＬＣＰＥＰＣＮＣＶＰＤＧＡＬＲＣＰＧＰＴＡＧＬＴＲＬＳＬＡＹＬＰＶＫＶＩＰＳＱＡＦＲＧＬＮＥＶＩＫＩＥＩＳＱＩＤＳＬＥＲＩＥＡＮＡＦＤＮＬＬＮＬＳＥＩＬＩＱＮＴＫＮＬＲＹＩＥＰＧＡＦＩＮＬＰＲＬＫＹＬＳＩＣＮＴＧＩＲＫＦＰＤＶＴＫＶＦＳＳＥＳＮＦＩＬＥＩＣＤＮＬＨＩＴＴＩＰＧＮＡＦＱＧＭＮＮＥＳＶＴＬＫＬＹＧＮＧＦＥＥＶＱＳＨＡＦＮＧＴＴＬＴＳＬＥＬＫＥＮＶＨＬＥＫＭＨＮＧＡＦＲＧＡＴＧＰＫＴＬＤＩＳＳＴＫＬＱＡＬＰＳＹＧＬＥＳＩＱＲＬＩＡＴＳＳＹＳＬＫＫＬＰＳＲＥＴＦＶＮＬＬＥＡＴＬＴＹＰＳ。
【０２９４】
別の実施形態では、抗体は、本明細書に開示のものまたはそれらの各々の同等物から選択されるポリペプチドを含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる抗ＬＨＲ重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体である。
【０２９５】
別の実施形態では、抗体は、本明細書に開示のものまたはそれらの各々の同等物から選択されるポリペプチドを含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる抗ＬＨＲ軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体である。
【０２９６】
別の態様では、抗ＬＨＲ抗体は、キメラ抗体、ヒトまたはヒト化抗体である。
【０２９７】
別の態様では、重鎖可変領域は、本明細書に開示のものから選択されるコンセンサス配列を伴うポリペプチドを含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなり、抗ＬＨＲ軽鎖可変領域は、本明細書に開示のものまたはそれらの各々の同等物から選択されるコンセンサス配列を伴うポリペプチドを含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる。
【０２９８】
本技術についての別の態様では、単離抗体は、以下の特徴：
（ａ）軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列が、開示される軽鎖配列のうちのいずれかの軽鎖可変ドメインのＣＤＲと少なくとも８５％同一である、１または複数のＣＤＲを含むこと；
（ｂ）重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列が、開示される重鎖配列のうちのいずれかの重鎖可変ドメインのＣＤＲと少なくとも８５％同一である、１または複数のＣＤＲを含むこと；
（ｃ）軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列が、開示される軽鎖配列のうちのいずれかの軽鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一であること；
（ｄ）ＨＣ免疫グロブリン可変ドメイン配列が、開示される重鎖配列のうちのいずれかの重鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一であること；および
（ｅ）抗体が、開示される配列のうちのいずれかが結合するエピトープと重なり合うエピトープに結合すること
のうちの１または複数を含む。
【０２９９】
一態様では、本開示は、抗ＬＨＲ抗体、例えば、本明細書で開示される、５Ｆ４−２１、４Ａ７−４、８Ｂ７−３、または１３８−２と少なくとも８５％同一である単離抗体を提示する。
【０３００】
本明細書で提示される抗体についての態様の一部では、抗体は、ヒトＬＨＲに、１０−４Ｍ、１０−５Ｍ、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、または１０−１２Ｍ未満の解離定数（ＫＤ）で結合する。本明細書で提示される抗体についての態様の一部では、抗原結合性部位は、ヒトＬＨＲに特異的に結合する。
【０３０１】
抗Ｂ７−Ｈ４抗体
一態様では、本開示は、重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列と軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列とを含む単離抗体であって、重鎖および軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列が、ヒトＢ７−Ｈ４のエピトープに結合する抗原結合性部位を形成する、単離抗体を提示する。一態様では、抗体は、少なくとも１０−６Ｍの結合アフィニティーを有する。ある特定の態様では、抗体は、少なくとも約１０−７Ｍ、好ましくは、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、または１０−１２Ｍのアフィニティーで結合する。
【０３０２】
一部の実施形態では、重鎖可変領域は、カルボキシ末端において、ＧＸＴＦで始まり、それにさらなる５０アミノ酸、または代替的に約４０アミノ酸、または代替的に約３０アミノ酸、または代替的に約２０アミノ酸、または代替的に約１０アミノ酸、または代替的に約５アミノ酸、または代替的に約４、もしくは３、もしくは２もしくは１アミノ酸が続く、アミノ酸配列を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなるＣＤＲＨ１配列を含む。さらなる実施形態では、ＣＤＲＨ１配列は、カルボキシ末端において、次の配列：（ｉ）ＧＦＴＦＳＳＦＧ、（ｉｉ）ＧＦＴＦＳＳＹＧ、（ｉｉｉ）ＧＹＴＦＴＤＹまたはその同等物のうちのいずれか１つで始まり、それにさらなる５０アミノ酸、または代替的に約４０アミノ酸、または代替的に約３０アミノ酸、または代替的に約２０アミノ酸、または代替的に約１０アミノ酸、または代替的に約５アミノ酸、または代替的に約４、もしくは３、もしくは２もしくは１アミノ酸が続く、アミノ酸配列を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる。
【０３０３】
一部の実施形態では、重鎖可変領域は、カルボキシ末端において、ＩＳＳＸＸＸＴで始まり、それにさらなる５０アミノ酸、または代替的に約４０アミノ酸、または代替的に約３０アミノ酸、または代替的に約２０アミノ酸、または代替的に約１０アミノ酸、または代替的に約５アミノ酸、または代替的に約４、もしくは３、もしくは２もしくは１アミノ酸が続く、アミノ酸配列を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなるＣＤＲＨ２配列を含む。さらなる実施形態では、ＣＤＲＨ２配列は、カルボキシ末端において、次の配列：（ｉ）ＩＳＳＧＳＳＴＬ、（ｉｉ）ＩＳＳＳＮＳＴＩまたはその同等物のうちのいずれか１つで始まり、それにさらなる５０アミノ酸、または代替的に約４０アミノ酸、または代替的に約３０アミノ酸、または代替的に約２０アミノ酸、または代替的に約１０アミノ酸、または代替的に約５アミノ酸、または代替的に約４、もしくは３、もしくは２もしくは１アミノ酸が続く、アミノ酸配列を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる。
【０３０４】
他の実施形態では、重鎖可変領域は、カルボキシ末端において、ＩＮＰＮＮＧＧＴまたはその同等物で始まり、それにさらなる５０アミノ酸、または代替的に約４０アミノ酸、または代替的に約３０アミノ酸、または代替的に約２０アミノ酸、または代替的に約１０アミノ酸、または代替的に約５アミノ酸、または代替的に約４、もしくは３、もしくは２もしくは１アミノ酸が続く、アミノ酸配列を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなるＣＤＲＨ２配列を含む。
【０３０５】
一部の実施形態では、重鎖可変領域は、カルボキシ末端において、ＡＲＰＸＹＹで始まり、それにさらなる５０アミノ酸、または代替的に約４０アミノ酸、または代替的に約３０アミノ酸、または代替的に約２０アミノ酸、または代替的に約１０アミノ酸、または代替的に約５アミノ酸、または代替的に約４、もしくは３、もしくは２もしくは１アミノ酸が続く、アミノ酸配列を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなるＣＤＲＨ３配列を含む。さらなる実施形態では、ＣＤＲＨ３配列は、カルボキシ末端において、次の配列：（ｉ）ＡＲＰＬＹＹＹＧＳＶＭＤＹ、（ｉｉ）ＡＲＰＹＹＹＧＳＳＹＤＹまたはその同等物のうちのいずれか１つで始まり、それにさらなる５０アミノ酸、または代替的に約４０アミノ酸、または代替的に約３０アミノ酸、または代替的に約２０アミノ酸、または代替的に約１０アミノ酸、または代替的に約５アミノ酸、または代替的に約４、もしくは３、もしくは２もしくは１アミノ酸が続く（followed  by  followed  by）、アミノ酸配列を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる。
【０３０６】
一部の実施形態では、重鎖可変領域は、下記のポリヌクレオチド配列：
GAGGTGCAGCTGGAGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGGTCCCGGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTTTGGAATGCACTGGGTTCGTCAGGCTCCAGAGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCATACATTAGTAGTGGCAGTAGTACCCTCCACTATGCAGACACAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATCCCAAGAACACCCTGTTCCTGCAAATGAAACTACCCTCACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCによりコードされるポリペプチドもしくはその抗原結合性断片またはそれらの各々の同等物を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる。
【０３０７】
一部の実施形態では、重鎖可変領域は、アミノ酸配列：
EVQLEESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISSGSSTLHYADTVKGRFTISRDNPKNTLFLQMKLPSLCYGLLGSRNLSHRLL（Ｂ７−Ｈ４  ５Ｆ６重鎖可変）もしくはその抗原結合性断片またはそれらの各々の同等物を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる。
【０３０８】
一部の実施形態では、重鎖可変領域は、下記のポリヌクレオチド配列：
GATGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGTTTAGTGCAGCCTGGAGGGTCCCGGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTATGGAATTCACTGGGTTCGTCAGGTTCCAGAGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCATTTATTAGTAGTAGCAATTCTACCATCTACTATGCAGACACAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCGAGAACACCCTGTTCCTGCAAATGACCAGTCTAAGGTCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTGCAAGACCCCTTTACTACTATGGTAGCGTTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCTGTCACCGTCTCCTCAによりコードされるポリペプチドもしくはその抗原結合性断片またはそれらの各々の同等物を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる。
【０３０９】
一部の実施形態では、重鎖可変領域は、アミノ酸配列：
DVQLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFSSYGIHWVRQVPEKGLEWVAFISSSNSTIYYADTVKGRFTISRDNAENTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARPLYYYGSVMDYWGQGTSVTVSS（Ｂ７−Ｈ４  ＃３３−１４重鎖可変）もしくはその抗原結合性断片またはそれらの各々の同等物を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる。
【０３１０】
一部の実施形態では、重鎖可変領域は、下記のポリヌクレオチド配列：
GAGGTCCAGCTGCAACAATCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGTAAGGCTTCTGGATACACGTTCACTGACTACTACATGAACTGGATGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGTCTTGAGTGGATTGGAGATATTAATCCTAACAATGGTGGTACTAGCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTAGACAAGTCCTCCAGCACAGCCTACATGGAACTCCGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGACCTTATTACTACGGTAGTAGCTACGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAによりコードされるポリペプチドもしくはその抗原結合性断片またはそれらの各々の同等物を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる。
【０３１１】
一部の実施形態では、重鎖可変領域は、アミノ酸配列：
EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYYMNWMKQSHGKSLEWIGDINPNNGGTSYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARPYYYGSSYDYWGQGTTLTVS（Ｂ７−Ｈ４  ＃３６−１重鎖可変）もしくはその抗原結合性断片またはそれらの各々の同等物を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる。
【０３１２】
一部の実施形態では、軽鎖可変領域は、カルボキシ末端において、ＱＳＩＶＨＸＮＧＴＹで始まり、それにさらなる５０アミノ酸、または代替的に約４０アミノ酸、または代替的に約３０アミノ酸、または代替的に約２０アミノ酸、または代替的に約１０アミノ酸、または代替的に約５アミノ酸、または代替的に約４、もしくは３、もしくは２もしくは１アミノ酸が続く、アミノ酸配列を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなるＣＤＲＬ１配列を含む。さらなる実施形態では、ＣＤＲＬ１配列は、カルボキシ末端において、次の配列：（ｉ）ＱＳＩＶＨＲＮＧＮＴＹ、（ｉｉ）ＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹまたはその同等物のうちのいずれか１つで始まり、それにさらなる５０アミノ酸、または代替的に約４０アミノ酸、または代替的に約３０アミノ酸、または代替的に約２０アミノ酸、または代替的に約１０アミノ酸、または代替的に約５アミノ酸、または代替的に約４、もしくは３、もしくは２もしくは１アミノ酸が続く、アミノ酸配列を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる。
【０３１３】
一部の実施形態では、軽鎖可変領域は、カルボキシ末端において、ＥＮＩＧＳＹまたはその同等物で始まり、それにさらなる５０アミノ酸、または代替的に約４０アミノ酸、または代替的に約３０アミノ酸、または代替的に約２０アミノ酸、または代替的に約１０アミノ酸、または代替的に約５アミノ酸、または代替的に約４、もしくは３、もしくは２もしくは１アミノ酸が続く、アミノ酸配列を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなるＣＤＲＬ１配列を含む。
【０３１４】
一部の実施形態では、軽鎖可変領域は、カルボキシ末端において、ＫＶＳで始まり、それにさらなる５０アミノ酸、または代替的に約４０アミノ酸、または代替的に約３０アミノ酸、または代替的に約２０アミノ酸、または代替的に約１０アミノ酸、または代替的に約５アミノ酸、または代替的に約４、もしくは３、もしくは２もしくは１アミノ酸が続く、アミノ酸配列を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなるＣＤＲＬ２配列を含む。
【０３１５】
他の実施形態では、軽鎖可変領域は、カルボキシ末端において、ＡＡＴまたはその同等物で始まり、それにさらなる５０アミノ酸、または代替的に約４０アミノ酸、または代替的に約３０アミノ酸、または代替的に約２０アミノ酸、または代替的に約１０アミノ酸、または代替的に約５アミノ酸、または代替的に約４、もしくは３、もしくは２もしくは１アミノ酸が続く、アミノ酸配列を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなるＣＤＲＬ２配列を含む。
【０３１６】
一部の実施形態では、軽鎖可変領域は、カルボキシ末端において、ＦＱＧＳＸＶＰＸＴで始まり、それにさらなる５０アミノ酸、または代替的に約４０アミノ酸、または代替的に約３０アミノ酸、または代替的に約２０アミノ酸、または代替的に約１０アミノ酸、または代替的に約５アミノ酸、または代替的に約４、もしくは３、もしくは２もしくは１アミノ酸が続く、アミノ酸配列を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなるＣＤＲＬ３配列を含む。さらなる実施形態では、ＣＤＲＬ１配列は、カルボキシ末端において、次の配列：（ｉ）ＦＱＧＳＹＶＰＰＴ、（ｉｉ）ＦＱＧＳＨＶＰＬＴまたはその同等物のうちのいずれか１つで始まり、それにさらなる５０アミノ酸、または代替的に約４０アミノ酸、または代替的に約３０アミノ酸、または代替的に約２０アミノ酸、または代替的に約１０アミノ酸、または代替的に約５アミノ酸、または代替的に約４、もしくは３、もしくは２もしくは１アミノ酸が続く（followed  by  followed  by）、アミノ酸配列を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる。
【０３１７】
他の実施形態では、軽鎖可変領域は、カルボキシ末端において、ＱＨＹＹＳＴＬＶＴまたはその同等物で始まり、それにさらなる５０アミノ酸、または代替的に約４０アミノ酸、または代替的に約３０アミノ酸、または代替的に約２０アミノ酸、または代替的に約１０アミノ酸、または代替的に約５アミノ酸、または代替的に約４、もしくは３、もしくは２もしくは１アミノ酸が続く、アミノ酸配列を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなるＣＤＲＬ３配列を含む。
【０３１８】
一部の実施形態では、軽鎖可変領域は、ポリヌクレオチド配列：
GACATTGTGATCACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTACATAGGAATGGAAACACCTATTTAGAATGGTACTTGCAGCAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAAGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCATATGTTCCTCCGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAAによりコードされるポリペプチドもしくはその抗原結合性断片またはそれらの各々の同等物を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる。
【０３１９】
一部の実施形態では、軽鎖可変領域は、アミノ酸配列：
DIVITQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHRNGNTYLEWYLQQPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSYVPPTFGGGTKLEIK（Ｂ７−Ｈ４  ５Ｆ６軽鎖可変）もしくはその抗原結合性断片またはそれらの各々の同等物を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる。
【０３２０】
一部の実施形態では、軽鎖可変領域は、ポリヌクレオチド配列：
GATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTACATAGTAATGGAAACACCTATTTAGAATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATAAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCTCTCACGTTCGGTGCAGGGACCAAGCTGGAACTGAAAによりコードされるポリペプチドもしくはその抗原結合性断片またはそれらの各々の同等物を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる。
【０３２１】
一部の実施形態では、軽鎖可変領域は、アミノ酸配列：
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGAGTKLELK（Ｂ７−Ｈ４  ＃３３−１４軽鎖可変）もしくはその抗原結合性断片またはそれらの各々の同等物を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる。
【０３２２】
一部の実施形態では、軽鎖可変領域は、ポリヌクレオチド配列：
GACATCCAGATGACTCAGTCTCCAGCTTCCCTGTCTGCATCTGTGGGAGAAACTGTCACCATCACATGTCGAGCAAGTGAAAATATTGGCAGTTATTTAGCATGGTATCAGCAGAAACAGGGAAAATCTCCTCAGCTCCTGGTCTATGCTGCAACACTCTTAGCAGATGGTGTGCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACACAGTTTTCTCTCAAGATCAACAGCCTGCAGTCTGAAGATGTTGCGAGATATTACTGTCAACATTATTATAGTACTCTGGTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAACTGAAAによりコードされるポリペプチドもしくはその抗原結合性断片またはそれらの各々の同等物を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる。
【０３２３】
一部の実施形態では、軽鎖可変領域は、アミノ酸配列：
DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIGSYLAWYQQKQGKSPQLLVYAATLLADGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQSEDVARYYCQHYYSTLVTFGAGTKLELK（Ｂ７−Ｈ４  ＃３６−１軽鎖可変）もしくはその抗原結合性断片またはそれらの各々の同等物を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる。
【０３２４】
本技術についての別の態様では、単離抗体は、以下の特徴：
（ａ）軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列が、開示される軽鎖配列のうちのいずれかの軽鎖可変ドメインのＣＤＲと少なくとも８５％同一である、１または複数のＣＤＲを含むこと；
（ｂ）重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列が、開示される重鎖配列のうちのいずれかの重鎖可変ドメインのＣＤＲと少なくとも８５％同一である、１または複数のＣＤＲを含むこと；
（ｃ）軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列が、開示される軽鎖配列のうちのいずれかの軽鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一であること；
（ｄ）ＨＣ免疫グロブリン可変ドメイン配列が、開示される重鎖配列のうちのいずれかの重鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一であること；および
（ｅ）抗体が、開示される配列のうちのいずれかが結合するエピトープと重なり合うエピトープに結合すること
のうちの１または複数を含む。
【０３２５】
一態様では、本開示は、Ｂ７Ｈ４  ５Ｆ６、Ｂ７Ｈ４＃３３−１４、およびＢ７Ｈ４＃３６−１からなる群より選択される抗体と少なくとも８５％同一である単離抗体を提示する。
【０３２６】
さらなる態様では、上記で同定された抗体は、少なくとも１０−６Ｍの結合アフィニティーを有する。ある特定の態様では、抗体は、少なくとも約１０−７Ｍ、好ましくは、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、または１０−１２Ｍのアフィニティーで結合する。
【０３２７】
一態様では、本開示は、Ｂ７Ｈ４  ５Ｆ６のＣＤＲを含む単離抗体を提示する。一態様では、本開示は、Ｂ７Ｈ４  ５Ｆ６と少なくとも８５％同一である単離抗体を提示する。
【０３２８】
一態様では、本開示は、Ｂ７Ｈ４  ＃３３−１４のＣＤＲを含む単離抗体を提示する。一態様では、本開示は、Ｂ７Ｈ４  ＃３３−１４と少なくとも８５％同一である単離抗体を提示する。
【０３２９】
一態様では、本開示は、Ｂ７Ｈ４  ＃３６−１のＣＤＲを含む単離抗体を提示する。一態様では、本開示は、Ｂ７Ｈ４  ＃３６−１と少なくとも８５％同一である単離抗体を提示する。
【０３３０】
本明細書で提示される抗体の一部の態様では、ＨＣ可変ドメイン配列は、Ｂ７Ｈ４  ５Ｆ６の可変ドメイン配列を含み、ＬＣ可変ドメイン配列は、Ｂ７Ｈ４  ５Ｆ６の可変ドメイン配列を含む。
【０３３１】
本明細書で提示される抗体の一部の態様では、ＨＣ可変ドメイン配列は、Ｂ７Ｈ４  ＃３３−１４の可変ドメイン配列を含み、ＬＣ可変ドメイン配列は、Ｂ７Ｈ４  ＃３３−１４の可変ドメイン配列を含む。
【０３３２】
本明細書で提示される抗体の一部の態様では、ＨＣ可変ドメイン配列は、Ｂ７Ｈ４  ＃３６−１の可変ドメイン配列を含み、ＬＣ可変ドメイン配列は、Ｂ７Ｈ４  ＃３６−１の可変ドメイン配列を含む。
【０３３３】
本明細書で提示される抗体についての態様の一部では、抗体は、ヒトＢ７−Ｈ４に、１０−４Ｍ、１０−５Ｍ、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、または１０−１２Ｍ未満の解離定数（ＫＤ）で結合する。本明細書で提示される抗体についての態様の一部では、抗原結合性部位は、ヒトＢ７−Ｈ４に特異的に結合する。
【０３３４】
本明細書で提示される抗体の一部の態様では、抗体は、Ｂ７Ｈ４  ５Ｆ６、Ｂ７Ｈ４＃３３−１４、およびＢ７Ｈ４＃３６−１抗体が結合するエピトープに結合する。
【０３３５】
本明細書で提示される抗体の一部の態様では、Ｂ７−Ｈ４特異的抗体は、ヒトＢ７−Ｈ４への結合について、Ｂ７Ｈ４  ５Ｆ６、Ｂ７Ｈ４＃３３−１４、およびＢ７Ｈ４＃３６−１と競合する。
【０３３６】
抗ＨＬＡ−Ｇ抗体
一態様では、本開示は、重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列と軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列とを含む単離抗体であって、重鎖および軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列が、ヒトＨＬＡ−Ｇのエピトープに結合する抗原結合性部位を形成する、単離抗体を提示する。
【０３３７】
一部の実施形態では、重鎖可変領域は、カルボキシ末端において、次の配列：（ｉ）ＧＦＮＩＫＤＴＹ、（ｉｉ）ＧＦＴＦＮＴＹＡ（、またはそのそれぞれの同等物のうちのいずれか１つで始まり、それにさらなる５０アミノ酸、または代替的に約４０アミノ酸、または代替的に約３０アミノ酸、または代替的に約２０アミノ酸、または代替的に約１０アミノ酸、または代替的に約５アミノ酸、または代替的に約４、もしくは３、もしくは２もしくは１アミノ酸が続く、アミノ酸配列を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなるＣＤＲＨ１配列を含む。
【０３３８】
一部の実施形態では、重鎖可変領域は、カルボキシ末端において、次の配列：（ｉ）ＩＤＰＡＮＧＮＴ、（ｉｉ）ＩＲＳＫＳＮＮＹＡＴまたはそのそれぞれの同等物のうちのいずれか１つで始まり、それにさらなる５０アミノ酸、または代替的に約４０アミノ酸、または代替的に約３０アミノ酸、または代替的に約２０アミノ酸、または代替的に約１０アミノ酸、または代替的に約５アミノ酸、または代替的に約４、もしくは３、もしくは２もしくは１アミノ酸が続く、アミノ酸配列を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなるＣＤＲＨ２配列を含む。
【０３３９】
一部の実施形態では、重鎖可変領域は、カルボキシ末端において、次の配列：（ｉ）ＡＲＳＹＹＧＧＦＡＹ、（ｉｉ）ＶＲＧＧＹＷＳＦＤＶまたはそのそれぞれの同等物のうちのいずれか１つで始まり、それにさらなる５０アミノ酸、または代替的に約４０アミノ酸、または代替的に約３０アミノ酸、または代替的に約２０アミノ酸、または代替的に約１０アミノ酸、または代替的に約５アミノ酸、または代替的に約４、もしくは３、もしくは２もしくは１アミノ酸が続く、アミノ酸配列を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなるＣＤＲＨ３配列を含む。
【０３４０】
一部の実施形態では、重鎖可変領域は、下記のポリヌクレオチド配列：
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCAGGGGCAGAGCTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACACCTATATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGCGAATGGTAATACTAAATATGACCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACTATAACAGCAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTAGGAGTTACTACGGGGGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAによりコードされるポリペプチドもしくはその抗原結合性断片またはそれらの各々の同等物を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる。
【０３４１】
一部の実施形態では、重鎖可変領域は、アミノ酸配列：
QVQLQESGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDTYMHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGNTKYDPKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCARSYYGGFAYWGQGTLVTVSA（３Ｈ１１重鎖可変鎖）もしくはその抗原結合性断片またはそれらの各々の同等物を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる。
【０３４２】
一部の実施形態では、重鎖可変領域は、下記のポリヌクレオチド配列：
GAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGTGGAGGATTGGTGCAGCCTAAAGGATCATTGAAACTCTCATGTGCCGCCTTTGGTTTCACCTTCAATACCTATGCCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGAAAGGGTTTGGAATGGGTTGCTCGCATAAGAAGTAAAAGTAATAATTATGCAACATATTATGCCGATTCAGTGAAAGACAGATTCACCATCTCCAGAGATGATTCACAAAGCATGCTCTCTCTGCAAATGAACAACCTGAAAACTGAGGACACAGCCATTTATTACTGTGTGAGAGGGGGTTACTGGAGCTTCGATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAによりコードされるポリペプチドもしくはその抗原結合性断片またはそれらの各々の同等物を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる。
【０３４３】
一部の実施形態では、重鎖可変領域は、アミノ酸配列：
EVQLQESGGGLVQPKGSLKLSCAAFGFTFNTYAMHWVRQAPGKGLEWVARIRSKSNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQSMLSLQMNNLKTEDTAIYYCVRGGYWSFDVWGAGTTVTVSS（ＨＬＡ−Ｇ  ４Ｅ３重鎖可変鎖）もしくはその抗原結合性断片またはそれらの各々の同等物を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる。
【０３４４】
一部の実施形態では、軽鎖可変領域は、カルボキシ末端において、次の配列：（ｉ）ＫＳＶＳＴＳＧＹＳＹ、（ｉｉ）ＫＳＬＬＨＳＮＧＮＴＹまたはそのそれぞれの同等物のうちのいずれか１つで始まり、それにさらなる５０アミノ酸、または代替的に約４０アミノ酸、または代替的に約３０アミノ酸、または代替的に約２０アミノ酸、または代替的に約１０アミノ酸、または代替的に約５アミノ酸、または代替的に約４、もしくは３、もしくは２もしくは１アミノ酸が続く、アミノ酸配列を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなるＣＤＲＬ１配列を含む。
【０３４５】
一部の実施形態では、軽鎖可変領域は、カルボキシ末端において、次の配列：ＬＶＳまたはその同等物で始まり、それにさらなる５０アミノ酸、または代替的に約４０アミノ酸、または代替的に約３０アミノ酸、または代替的に約２０アミノ酸、または代替的に約１０アミノ酸、または代替的に約５アミノ酸、または代替的に約４、もしくは３、もしくは２もしくは１アミノ酸が続く、アミノ酸配列を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなるＣＤＲＬ２配列を含む。
【０３４６】
他の実施形態では、軽鎖可変領域は、カルボキシ末端において、次の配列：ＲＭＳまたはその同等物で始まり、それにさらなる５０アミノ酸、または代替的に約４０アミノ酸、または代替的に約３０アミノ酸、または代替的に約２０アミノ酸、または代替的に約１０アミノ酸、または代替的に約５アミノ酸、または代替的に約４、もしくは３、もしくは２もしくは１アミノ酸が続く、アミノ酸配列を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなるＣＤＲＬ２配列を含む。
【０３４７】
一部の実施形態では、軽鎖可変領域は、カルボキシ末端において、次の配列：（ｉ）ＱＨＳＲＥＬＰＲＴ、（ｉｉ）ＭＱＨＬＥＹＰＹＴまたはそのそれぞれの同等物のうちのいずれか１つで始まり、それにさらなる５０アミノ酸、または代替的に約４０アミノ酸、または代替的に約３０アミノ酸、または代替的に約２０アミノ酸、または代替的に約１０アミノ酸、または代替的に約５アミノ酸、または代替的に約４、もしくは３、もしくは２もしくは１アミノ酸が続く、アミノ酸配列を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなるＣＤＲＬ３配列を含む。
【０３４８】
一部の実施形態では、軽鎖可変領域は、ポリヌクレオチド配列：
GATATTGTGCTCACACAGTCTCCTGCTTCCTTAGCTGTATCTCTGGGGCAGAGGGCCACCATCTCATGCAGGGCCAGCAAAAGTGTCAGTACATCTGGCTATAGTTATATGCACTGGTACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATCTTGTATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCACAGTAGGGAGCTTCCTCGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAAによりコードされるポリペプチドもしくはその抗原結合性断片またはそれらの各々の同等物を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる。
【０３４９】
一部の実施形態では、軽鎖可変領域は、アミノ酸配列：
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLVSNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSRELPRTFGGGTKLEIK（３Ｈ１１軽鎖可変鎖）もしくはその抗原結合性断片またはそれらの各々の同等物を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる。
【０３５０】
一部の実施形態では、軽鎖可変領域は、ポリヌクレオチド配列：
GATATTGTGATCACACAGACTACACCCTCTGTACCTGTCACTCCTGGAGAGTCAGTATCCATCTCCTGTAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTGCATAGTAATGGCAACACTTACTTGTATTGGTTCCTGCAGAGGCCAGGCCAGTCTCCTCAGCTCCTGATATCTCGGATGTCCAGCCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCAGGAACTGCTTTCACACTGAGAATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATGTGGGTGTTTATTACTGTATGCAACATCTAGAATATCCGTATACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAAによりコードされるポリペプチドもしくはその抗原結合性断片またはそれらの各々の同等物を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる。
【０３５１】
一部の実施形態では、軽鎖可変領域は、アミノ酸配列：
DIVITQTTPSVPVTPGESVSISCRSSKSLLHSNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLISRMSSLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGGTKLEIK（ＨＬＡ−Ｇ  ４Ｅ３軽鎖可変鎖）もしくはその抗原結合性断片またはそれらの各々の同等物を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる。
【０３５２】
本技術についての別の態様では、単離抗体は、以下の特徴：
（ａ）軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列が、開示される軽鎖配列のうちのいずれかの軽鎖可変ドメインのＣＤＲと少なくとも８５％同一である、１または複数のＣＤＲを含むこと；
（ｂ）重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列が、開示される重鎖配列のうちのいずれかの重鎖可変ドメインのＣＤＲと少なくとも８５％同一である、１または複数のＣＤＲを含むこと；
（ｃ）軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列が、開示される軽鎖配列のうちのいずれかの軽鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一であること；
（ｄ）ＨＣ免疫グロブリン可変ドメイン配列が、開示される重鎖配列のうちのいずれかの重鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一であること；および
（ｅ）抗体が、開示される配列のうちのいずれかが結合するエピトープと重なり合うエピトープに結合すること
のうちの１または複数を含む。
【０３５３】
開示されるＣＤＲ配列ならびに重鎖および軽鎖可変配列を含む例示的抗体は、表１および表２でそれぞれ開示される。
【０３５４】
一態様では、本開示は、３Ｈ１１およびＨＬＡ−Ｇ  ４Ｅ３からなる群より選択される抗体と少なくとも８５％同一である単離抗体を提示する。
【０３５５】
一態様では、本開示は、３Ｈ１１のＣＤＲを含む単離抗体を提示する。一態様では、本開示は、３Ｈ１１と少なくとも８５％同一である単離抗体を提示する。
【０３５６】
一態様では、本開示は、ＨＬＡ−Ｇ  ４Ｅ３のＣＤＲを含む単離抗体を提示する。一態様では、本開示は、ＨＬＡ−Ｇ  ４Ｅ３と少なくとも８５％同一である単離抗体を提示する。
【０３５７】
本明細書で提示される抗体についての一部の態様では、ＨＣ可変ドメイン配列は、３Ｈ１１の可変ドメイン配列を含み、ＬＣ可変ドメイン配列は、３Ｈ１１の可変ドメイン配列を含む。
【０３５８】
本明細書で提示される抗体についての一部の態様では、ＨＣ可変ドメイン配列は、ＨＬＡ−Ｇ  ４Ｅ３の可変ドメイン配列を含み、ＬＣ可変ドメイン配列は、ＨＬＡ−Ｇ  ４Ｅ３の可変ドメイン配列を含む。
【０３５９】
本明細書で提示される抗体についての態様の一部では、抗体は、ヒトＨＬＡ−Ｇに、１０−４Ｍ、１０−５Ｍ、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、または１０−１２Ｍ未満の解離定数（ＫＤ）で結合する。本明細書で提示される抗体についての態様の一部では、抗原結合性部位は、ヒトＨＬＡ−Ｇに特異的に結合する。
【０３６０】
抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体
一部の実施形態では、重鎖可変領域は、カルボキシ末端において、次の配列：（ｉ）ＧＦＳＬＴＳＹＧ、（ｉｉ）ＧＦＴＦＳＮＹＷ、またはそのそれぞれの同等物のうちのいずれか１つで始まり、それにさらなる５０アミノ酸、または代替的に約４０アミノ酸、または代替的に約３０アミノ酸、または代替的に約２０アミノ酸、または代替的に約１０アミノ酸、または代替的に約５アミノ酸、または代替的に約４、もしくは３、もしくは２もしくは１アミノ酸が続く、アミノ酸配列を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなるＣＤＲＨ１配列を含む。
【０３６１】
一部の実施形態では、重鎖可変領域は、カルボキシ末端において、次の配列：（ｉ）ＩＷＳＤＧＳＴ、（ｉｉ）ＩＲＦＫＳＨＮＹＡＴまたはそのそれぞれの同等物のうちのいずれか１つで始まり、それにさらなる５０アミノ酸、または代替的に約４０アミノ酸、または代替的に約３０アミノ酸、または代替的に約２０アミノ酸、または代替的に約１０アミノ酸、または代替的に約５アミノ酸、または代替的に約４、もしくは３、もしくは２もしくは１アミノ酸が続く、アミノ酸配列を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなるＣＤＲＨ２配列を含む。
【０３６２】
一部の実施形態では、重鎖可変領域は、カルボキシ末端において、次の配列：（ｉ）ＡＳＨＹＧＳＴＬＡＦＡＳ、（ｉｉ）ＴＲＲＩＧＮＳＤＹＤＷＷＹＦＤＶまたはそのそれぞれの同等物のうちのいずれか１つで始まり、それにさらなる５０アミノ酸、または代替的に約４０アミノ酸、または代替的に約３０アミノ酸、または代替的に約２０アミノ酸、または代替的に約１０アミノ酸、または代替的に約５アミノ酸、または代替的に約４、もしくは３、もしくは２もしくは１アミノ酸が続く、アミノ酸配列を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなるＣＤＲＨ３配列を含む。
【０３６３】
一部の実施形態では、重鎖可変領域は、下記のポリヌクレオチド配列：
CAGGTGCAGCTGAAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCATCACATGCACCATCTCAGGGTTCTCATTAACCAGCTATGGTGTACACTGGGTTCGCCAGCCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGTAGTGATATGGAGTGATGGAAGCACAACCTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGAGCATCAGCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTCCAAACTGATGACACAGCCATATACTACTGTGCCAGTCACTACGGTAGTACCCTTGCCTTTGCTTCCTGGGGCCACGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA（Ｌｙｍ−１重鎖可変鎖）によりコードされるポリペプチドもしくはその抗原結合性断片またはそれらの各々の同等物を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる。
【０３６４】
一部の実施形態では、重鎖可変領域は、アミノ酸配列：
QLKESGPGLVAPSQSLSITCTISGFSLTSYGVHWVRQPPGKGLEWLVVIWSDGSTTYNSALKSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCASHYGSTLAFASWGHGTLVTVSA（Ｌｙｍ−１重鎖可変鎖）もしくはその抗原結合性断片またはそれらの各々の同等物を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる。
【０３６５】
一部の実施形態では、重鎖可変領域は、下記のポリヌクレオチド配列：
GAAGTGCAGCTTGAGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCAACCTGGAGGCTCCATGAAACTCTCCTGTGTTGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACTATTGGATGAACTGGGTCCGCCAGTCTCCAGAGAAGGGGCTTGAGTGGGTTGCTGAAATTAGATTTAAATCTCATAATTATGCAACACATTTTGCGGAGTCTGTGAAAGGGAGGTTCACCATCTCAAGAGATGATTCCAAAAGTAGTGTCTACCTGCAAATGAACAACTTAAGAGCTGAAGACACTGGCATTTATTACTGTACCAGGAGGATAGGAAACTCTGATTACGACTGGTGGTACTTCGATGTCTGGGGCGCAGGGACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCTAGC（Ｌｙｍ−２軽重鎖（Lym-2  Light  Heavy  Chain））によりコードされるポリペプチドもしくはその抗原結合性断片またはそれらの各々の同等物を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる。
【０３６６】
一部の実施形態では、重鎖可変領域は、アミノ酸配列：
EVQLEESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRFKSHNYATHFAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTRRIGNSDYDWWYFDVWGAGTSVTVSSAS（Ｌｙｍ−２重鎖可変鎖）もしくはその抗原結合性断片またはそれらの各々の同等物を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる。
【０３６７】
一部の実施形態では、軽鎖可変領域は、カルボキシ末端において、次の配列：（ｉ）ＶＮＩＹＳＹ、（ｉｉ）ＱＮＶＧＮＮまたはそのそれぞれの同等物のうちのいずれか１つで始まり、それにさらなる５０アミノ酸、または代替的に約４０アミノ酸、または代替的に約３０アミノ酸、または代替的に約２０アミノ酸、または代替的に約１０アミノ酸、または代替的に約５アミノ酸、または代替的に約４、もしくは３、もしくは２もしくは１アミノ酸が続く、アミノ酸配列を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなるＣＤＲＬ１配列を含む。
【０３６８】
一部の実施形態では、軽鎖可変領域は、カルボキシ末端において、次の配列：（ｉ）ＮＡＫ、（ｉｉ）ＳＡＳまたはそのそれぞれの同等物で始まり、それにさらなる５０アミノ酸、または代替的に約４０アミノ酸、または代替的に約３０アミノ酸、または代替的に約２０アミノ酸、または代替的に約１０アミノ酸、または代替的に約５アミノ酸、または代替的に約４、もしくは３、もしくは２もしくは１アミノ酸が続く、アミノ酸配列を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなるＣＤＲＬ２配列を含む。
【０３６９】
他の実施形態では、軽鎖可変領域は、カルボキシ末端において、（ｉ）ＱＨＨＹＧＴＦＴ、（ｉｉ）ＱＱＹＮＴＹＰＦＴまたはそのそれぞれの同等物で始まり、それにさらなる５０アミノ酸、または代替的に約４０アミノ酸、または代替的に約３０アミノ酸、または代替的に約２０アミノ酸、または代替的に約１０アミノ酸、または代替的に約５アミノ酸、または代替的に約４、もしくは３、もしくは２もしくは１アミノ酸が続く、アミノ酸配列を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなるＣＤＲＬ３配列を含む。
【０３７０】
一部の実施形態では、軽鎖可変領域は、ポリヌクレオチド配列：
GACATCCAGATGACTCAGTCTCCAGCCTCCCTATCTGCATCTGTGGGAGAAACTGTCACCATCATATGTCGAGCAAGTGTGAATATTTACAGTTATTTAGCATGGTATCAGCAGAAACAGGGAAAATCTCCTCAGCTCCTGGTCTATAATGCCAAAATCTTAGCAGAAGGTGTGCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACACAGTTTTCTCTGAAGATCAACAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGGGAGTTATTACTGTCAACATCATTATGGTACATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAA（Ｌｙｍ−１軽鎖可変鎖）によりコードされるポリペプチドもしくはその抗原結合性断片またはそれらの各々の同等物を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる。
【０３７１】
一部の実施形態では、軽鎖可変領域は、アミノ酸配列：
DIQMTQSPASLSASVGETVTIICRASVNIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKILAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCQHHYGTFTFGSGTKLEIK（Ｌｙｍ−１軽鎖可変鎖）もしくはその抗原結合性断片またはそれらの各々の同等物を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる。
【０３７２】
一部の実施形態では、軽鎖可変領域は、ポリヌクレオチド配列：
GACATTGTGATGACCCAGTCTCACAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCGTCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGGTAATAATGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGGCAATCTCCTAAAGTACTGATTTACTCGGCATCCTACCGGTACAGTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGTAATGTGCAGTCTGAAGACTTGGCAGAGTATTTCTGTCAGCAATATAACACCTATCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAA（Ｌｙｍ−２軽鎖可変鎖）によりコードされるポリペプチドもしくはその抗原結合性断片またはそれらの各々の同等物を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる。
【０３７３】
一部の実施形態では、軽鎖可変領域は、アミノ酸配列：
DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGNNVAWYQQKPGQSPKVLIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYNTYPFTFGSGTKLEIK（Ｌｙｍ−２軽鎖可変鎖）もしくはその抗原結合性断片またはそれらの各々の同等物を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる。
【０３７４】
本技術についての別の態様では、単離抗体は、以下の特徴のうちの１または複数を含む：
【０３７５】
（ａ）軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列が、開示される軽鎖配列のうちのいずれかの軽鎖可変ドメインのＣＤＲと少なくとも８５％同一である、１または複数のＣＤＲを含むこと；
（ｂ）重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列が、開示される重鎖配列のうちのいずれかの重鎖可変ドメインのＣＤＲと少なくとも８５％同一である、１または複数のＣＤＲを含むこと；
（ｃ）軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列が、開示される軽鎖配列のうちのいずれかの軽鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一であること；
（ｄ）ＨＣ免疫グロブリン可変ドメイン配列が、開示される重鎖配列のうちのいずれかの重鎖可変ドメインと少なくとも８５％同一であること；および
（ｅ）抗体が、開示される配列のうちのいずれかが結合するエピトープと重なり合うエピトープに結合すること。
【０３７６】
一態様では、本開示は、Ｌｙｍ−１およびＬｙｍ−２からなる群より選択される抗体と少なくとも８５％同一である単離抗体を提示する。
【０３７７】
一態様では、本開示は、Ｌｙｍ−１のＣＤＲを含む単離抗体を提示する。一態様では、本開示は、Ｌｙｍ−１と少なくとも８５％同一である単離抗体を提示する。
【０３７８】
一態様では、本開示は、Ｌｙｍ−２のＣＤＲを含む単離抗体を提示する。一態様では、本開示は、Ｌｙｍ−２と少なくとも８５％同一である単離抗体を提示する。
【０３７９】
本明細書で提示される抗体についての一部の態様では、ＨＣ可変ドメイン配列は、Ｌｙｍ−１の可変ドメイン配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなり、ＬＣ可変ドメイン配列は、Ｌｙｍ−１の可変ドメイン配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる。
【０３８０】
本明細書で提示される抗体についての一部の態様では、ＨＣ可変ドメイン配列は、Ｌｙｍ−２の可変ドメイン配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなり、ＬＣ可変ドメイン配列は、Ｌｙｍ−２の可変ドメイン配列を含むか、またはこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる。
【０３８１】
本明細書で提示される抗体についての態様の一部では、抗体は、ヒトＨＬＡ−ＤＲに、１０−４Ｍ、１０−５Ｍ、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、または１０−１２Ｍ未満の解離定数（ＫＤ）で結合する。本明細書で提示される抗体についての態様の一部では、抗原結合性部位は、ヒトＨＬＡ−ＤＲに特異的に結合する。
【０３８２】
抗体の特徴および機能
本明細書で提示される抗体についての態様の一部では、抗体は、可溶性Ｆａｂである。
【０３８３】
本明細書で提示される抗体についての態様の一部では、ＨＣ可変ドメイン配列とＬＣ可変ドメイン配列とは、同じポリペプチド鎖の構成要素である。本明細書で提示される抗体についての態様の一部では、ＨＣ可変ドメイン配列とＬＣ可変ドメイン配列とは、異なる
ポリペプチド鎖の構成要素である。
【０３８４】
本明細書で提示される抗体についての態様の一部では、抗体は、全長抗体である。他の態様では、抗体の抗原結合性断片が提示される。
【０３８５】
本明細書で提示される抗体についての態様の一部では、抗体は、モノクローナル抗体である。
【０３８６】
本明細書で提示される抗体についての態様の一部では、抗体は、キメラまたはヒト化である。
【０３８７】
本明細書で提示される抗体についての態様の一部では、抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）’２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、およびＦｖからなる群より選択される。
【０３８８】
本明細書で提示される抗体についての態様の一部では、抗体は、Ｆｃドメインを含む。本明細書で提示される抗体についての態様の一部では、抗体は、ウサギ抗体である。本明細書で提示される抗体についての態様の一部では、抗体は、ヒトもしくはヒト化抗体であるか、またはヒトにおいて非免疫原性である。本明細書で提示される抗体についての態様の一部では、ヒト抗体フレームワーク領域を含む。
【０３８９】
他の態様では、本明細書で提示される抗体のＣＤＲ内の、１または複数のアミノ酸残基を、別のアミノ酸で置換する。置換は、アミノ酸の同じファミリー内の置換であるという意味で「保存的」でありうる。天然に存在するアミノ酸は、以下の４つのファミリー：
１）塩基性側鎖を伴うアミノ酸：リシン、アルギニン、ヒスチジン；
２）酸性側鎖を伴うアミノ酸：アスパラギン酸、グルタミン酸；
３）非荷電極性側鎖を伴うアミノ酸：アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン；
４）非極性側鎖を伴うアミノ酸：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、システイン
に分けることができ、保存的置換は、これらのファミリー内で生じる。
【０３９０】
別の態様では、１または複数のアミノ酸残基を、抗体の１または複数のＣＤＲに付加するか、またはこれらから欠失させる。このような付加または欠失は、ＣＤＲのＮもしくはＣ末端、またはＣＤＲ内の位置に施す。
【０３９１】
抗体のＣＤＲのアミノ酸配列を、アミノ酸の付加、欠失、または置換により変化させることにより、標的抗原に対する結合アフィニティーの増大など、多様な効果を得ることができる。
【０３９２】
このような変化させたＣＤＲ配列を含む本開示の抗体もやはり、開示される抗体と同様の特異性および感受性プロファイルで、ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−Ｇ、またはＨＬＡ−ＤＲに結合することを察知されたい。これは、結合アッセイにより調べることができる。
【０３９３】
抗体の定常領域もまた、変化させることができる。例えば、任意のアイソタイプ：ＩｇＡ（ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、またはＩｇＭのＦｃ領域を伴う抗体を提示することができる。定常領域配列の非限定的な例は、以下を含む：
【０３９４】
ヒトＩｇＤ定常領域；Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８８０
APTKAPDVFPIISGCRHPKDNSPVVLACLITGYHPTSVTVTWYMGTQSQPQRTFPEIQRRDSYYMTSSQLSTPLQQWRQGEYKCVVQHTASKSKKEIFRWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVYLLTPAVQDLWLRDKATFTCFVVGSDLKDAHLTWEVAGKVPTGGVEEGLLERHSNGSQSQHSRLTLPRSLWNAGTSVTCTLNHPSLPPQRLMALREPAAQAPVKLSLNLLASSDPPEAASWLLCEVSGFSPPNILLMWLEDQREVNTSGFAPARPPPQPGSTTFWAWSVLRVPAPPSPQPATYTCVVSHEDSRTLLNASRSLEVSYVTDHGPMK
【０３９５】
ヒトＩｇＧ１定常領域；Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８５７
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
【０３９６】
ヒトＩｇＧ２定常領域；Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８５９
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDISVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
【０３９７】
ヒトＩｇＧ３定常領域；Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８６０
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYTCNVNHKPSNTKVDKRVELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFKWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK
【０３９８】
ヒトＩｇＭ定常領域；Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８７１
GSASAPTLFPLVSCENSPSDTSSVAVGCLAQDFLPDSITLSWKYKNNSDISSTRGFPSVLRGGKYAATSQVLLPSKDVMQGTDEHVVCKVQHPNGNKEKNVPLPVIAELPPKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESDWLGQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVPDQDTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASICEDDWNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLLPPAREQLNLRESATITCLVTGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAPGRYFAHSILTVSEEEWNTGETYTCVAHEALPNRVTERTVDKSTGKPTLYNVSLVMSDTAGTCY
【０３９９】
ヒトＩｇＧ４定常領域；Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８６１
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
【０４００】
ヒトＩｇＡ１定常領域；Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８７６
ASPTSPKVFPLSLCSTQPDGNVVIACLVQGFFPQEPLSVTWSESGQGVTARNFPPSQDASGDLYTTSSQLTLPATQCLAGKSVTCHVKHYTNPSQDVTVPCPVPSTPPTPSPSTPPTPSPSCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGVTFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGCAEPWNHGKTFTCTAAYPESKTPLTATLSKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRLAGKPTHVNVSVVMAEVDGTCY
【０４０１】
ヒトＩｇＡ２定常領域；Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８７７
ASPTSPKVFPLSLDSTPQDGNVVVACLVQGFFPQEPLSVTWSESGQNVTARNFPPSQDASGDLYTTSSQLTLPATQCPDGKSVTCHVKHYTNPSQDVTVPCPVPPPPPCCHPRLSLHRPALEDLLLGSEANLTCTLTGLRDASGATFTWTPSSGKSAVQGPPERDLCGCYSVSSVLPGCAQPWNHGETFTCTAAHPELKTPLTANITKSGNTFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRMAGKPTHVNVSVVMAEVDGTCY
【０４０２】
ヒトＩｇカッパ定常領域；Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８３４
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC。
【０４０３】
一部の態様では、抗体は、本明細書で開示されるもののいずれか１つと少なくとも８０％同一である重鎖定常領域を含む。
【０４０４】
一部の態様では、抗体は、本明細書で開示されるもののいずれか１つと少なくとも８０％同一である軽鎖定常領域を含む。
【０４０５】
本明細書で提示される抗体についての一部の態様では、抗体は、急速な結合、ならびに細胞への取込みおよび／または緩徐な放出を容易とするように、構造的修飾を含有する。一部の態様では、ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧもしくはＨＬＡ−ＤＲ抗体は、急速な結合、ならびに細胞への取込みおよび／または緩徐な放出を容易とするように、抗体のＣＨ２定常重鎖領域内の欠失を含有する。一部の態様では、Ｆａｂ断片を使用して、急速な結合、ならびに細胞への取込みおよび／または緩徐な放出を容易とする。一部の態様では、Ｆ（ａｂ）’２断片を使用して、急速な結合、ならびに細胞への取込みおよび／または緩徐な放出を容易とする。
【０４０６】
抗体、断片、およびそれらの同等物は、使用および／または保管のための製剤をもたらすように、担体、例えば、薬学的に許容される担体または他の薬剤と組み合わせることができる。
【０４０７】
さらに、ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧもしくはＨＬＡ−ＤＲまたはその断片のアミノ酸配列を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる単離ポリペプチドであって、ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲに結合する抗体を作出するのに有用な単離ポリペプチドのほか、それらをコードする単離ポリヌクレオチドも提供される。一態様では、単離ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、標識もしくは選択マーカーおよび／もしくは連続的ポリペプチド配列（例えば、スカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）担体タンパク質）または、ポリヌクレオチドの場合、ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドへと作動的にカップリングさせた配列をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、多様な担体、例えば、リン酸緩衝食塩水と組み合わせることができる。さらに、単離ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを含む、宿主細胞、例えば、原核細胞または真核細胞、例えば、細菌、酵母、哺乳動物（ラット、サル、ハムスター、またはヒト）細胞が提供される。宿主細胞は、担体と組み合わせることができる。
【０４０８】
なおさらに、本明細書で開示される抗体およびそれらの断片をコードする単離核酸が提供される。単離核酸は、ベクターもしくは適切な宿主細胞、および／または診断的もしくは治療的使用に適する担体と組み合わせることができる。一態様では、核酸は、ポリペプチドおよびタンパク質の組換えによる作製のための宿主細胞と共に含有される。宿主細胞は、真核細胞の場合もあり、原核細胞の場合もある。
【０４０９】
ＩＩ．組成物を調製するための工程
抗体、それらの製造および使用については周知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗ，  Ｅ．およびＬａｎｅ，  Ｄ．、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９９９年において開示されている。抗体は、当技術分野で公知の標準的な方法を使用して作出することができる。抗体の例は、モノクローナル抗体、単鎖抗体、および抗体の機能的断片を含む（がこれらに限定されない）。このような抗体を作出する方法は、当技術分野で公知である；例えば、Collariniら（２００９年）J.  Immunol.  １８３巻（１０号）：６３３８〜６３４５頁を参照されたい。
【０４１０】
抗体は、一連の宿主、例えば、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト、および他の宿主において産生させることができる。宿主は、標的抗原またはＬＨＲもしくはＢ−７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧもしくはＨＬＡ−ＤＲのＣ末端断片、それらの単離ポリペプチドなど、免疫原特性を有するその断片もしくはオリゴペプチドを注射することにより免疫化することができる。宿主種に応じて、多様なアジュバントを添加および使用して、免疫学的応答を増大させることができる。このようなアジュバントは、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、ならびにリソレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、スカシガイヘモシアニン、およびジニトロフェノールなどの界面活性物質を含むがこれらに限定されない。ヒトにおいて使用されるアジュバントでは、ＢＣＧ（カルメット−ゲラン桿菌）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍが特に有用である。本開示はまた、単離ポリペプチドおよびアジュバントも提示する。
【０４１１】
ある特定の態様では、本開示の抗体は、ポリクローナル抗体、すなわち、異なるアミノ酸配列を有する、複数種類の抗ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ抗体の混合物である。一態様では、ポリクローナル抗体は、異なるＣＤＲを有する、複数種類の抗ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ抗体の混合物を含む。したがって、異なる抗体を産生する細胞の混合物を培養し、結果として得られる培養物から精製された抗体を使用することができる（ＷＯ２００４／０６１１０４を参照されたい）。
【０４１２】
モノクローナル抗体の作製：ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧもしくはＨＬＡ−ＤＲに対するモノクローナル抗体は、培養物中の連続的な細胞株による抗体分子の産生をもたらす任意の技法を使用して調製することができる。このような技法は、ハイブリドーマ法（例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻：４９５〜４９７頁（１９７５年）を参照されたい）；トリオーマ法；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（例えば、Ｋｏｚｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｔｏｄａｙ、４巻：７２頁（１９８３年）を参照されたい）およびヒトモノクローナル抗体を作製するＥＢＶハイブリドーマ法（例えば、Ｃｏｌｅら、ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＮＤ  ＣＡＮＣＥＲ  ＴＨＥＲＡＰＹ、Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．、７７〜９６頁（１９８５年）を参照されたい）を含むがこれらに限定されない。ヒトモノクローナル抗体は、本技術の実施において活用することができ、ヒトハイブリドーマを使用すること（例えば、Ｃｏｔｅら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、８０巻：２０２６〜２０３０頁（１９８３年）を参照されたい）により作製することもでき、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ヒトＢ細胞を、エプスタインバーウイルスで形質転換すること（例えば、Ｃｏｌｅら、ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＮＤ  ＣＡＮＣＥＲ  ＴＨＥＲＡＰＹ、Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．、７７〜９６頁（１９８５年）を参照されたい）により作製することもできる。例えば、抗体の領域をコードする核酸の集団を単離することができる。抗体の保存的領域をコードする配列に由来するプライマーを活用するＰＣＲを使用して、抗体の部分をコードする配列を、集団から増幅し、次いで、抗体または可変ドメインなど、それらの断片をコードするＤＮＡを、増幅された配列から再構築する。このような増幅された配列はまた、ファージまたは細菌上に、融合ポリペプチドを発現させ、提示するための他のタンパク質（例えば、バクテリオファージコートまたは細菌細胞表面タンパク質）をコードするＤＮＡへと融合させることもできる。次いで、増幅された配列を発現させ、例えば、発現させた抗体またはその断片の、ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧもしくはＨＬＡ−ＤＲポリペプチド上に存在する抗原またはエピトープに対するアフィニティーに基づき、さらに選択または単離することができる。代替的に、抗ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧもしくはＨＬＡ−ＤＲモノクローナル抗体を発現させるハイブリドーマは、対象を、例えば、ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧもしくはＨＬＡ−ＤＲまたはそれらの断片のアミノ酸配列を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる単離ポリペプチドで免疫化し、次いで、慣例的な方法を使用して、ハイブリドーマを、対象の脾臓から単離することにより調製することができる。例えば、Ｍｉｌｓｔｅｉｎら（ＧａｌｆｒｅおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ、７３巻：３〜４６頁（１９８１年））を参照されたい。標準的な方法を使用してハイブリドーマをスクリーニングすることにより、特異性（すなわち、異なるエピトープに対する）およびア��ィニティーを変化させたモノクローナル抗体を作製する。所望の特性、例えば、ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧもしくはＨＬＡ−ＤＲへの結合を伴う選択されたモノクローナル抗体は、（ｉ）ハイブリドーマにより発現された形で使用することもでき、（ｉｉ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの分子に結合させて、その特性を変更することもでき、（ｉｉｉ）モノクローナル抗体をコードするｃＤＮＡを、単離し、配列決定し、多様な形で操作することができる。一態様では、抗ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧもしくはＨＬＡ−ＤＲモノクローナル抗体は、ヒト重鎖導入遺伝子と、軽鎖導入遺伝子とを含むゲノムを有するトランスジェニックの非ヒト動物、例えば、トランスジェニックマウスから得られたＢ細胞であって、不死化細胞へと融合させたＢ細胞を含むハイブリドーマにより作製する。ハイブリドーマ法は、当技術分野で公知であり、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、３４９頁（１９８８年）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、５６３〜６８１頁（１９８１年）において教示されているハイブリドーマ法を含む。
【０４１３】
ファージディスプレイ法：上記で言及した通り、本開示の抗体は、組換えＤＮＡおよびファージディスプレイ技術の適用を介して作製することができる。例えば、抗ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧもしくはＨＬＡ−ＤＲ抗体は、当技術分野で公知の、多様なファージディスプレイ法を使用して調製することができる。ファージディスプレイ法では、機能的な抗体ドメインを、それらをコードするポリヌクレオチド配列を保有するファージ粒子の表面に提示する。所望の結合特性を伴うファージは、抗原、典型的には、固体表面またはビーズに結合させるかまたは捕捉した抗原により、直接選択することにより、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒトまたはマウス）から選択する。これらの方法において使用されるファージは典型的に、ｆｄおよびＭ１３を含む糸状ファージであって、Ｆａｂ、Ｆｖ、またはジスルフィド安定化Ｆｖ抗体ドメインを、組換えにより、ファージ遺伝子ＩＩＩまたはＶＩＩＩタンパク質へと融合させた、糸状ファージである。加えて、方法を、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築（例えば、Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６巻：１２７５〜１２８１頁、１９８９年を参照されたい）に適応させて、ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧもしくはＨＬＡ−ＤＲポリペプチド、例えば、ポリペプチド、またはその誘導体、断片、類似体、もしくは相同体に所望の特異性を伴うモノクローナルＦａｂ断片の迅速かつ有効な同定を可能とすることができる。本開示の単離抗体を作製するのに使用しうるファージディスプレイ法の他の例は、Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、Ｕ．Ｓ．Ａ．、８５巻：５８７９〜５８８３頁（１９８８年）；Ｃｈａｕｄｈａｒｙら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、Ｕ．Ｓ．Ａ．、８７巻：１０６６〜１０７０頁（１９９０年）；Ｂｒｉｎｋｍａｎら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ、１８２巻：４１〜５０頁（１９９５年）；Ａｍｅｓら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ、１８４巻：１７７〜１８６頁（１９９５年）；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４巻：９５２〜９５８頁（１９９４年）；Ｐｅｒｓｉｃら、Ｇｅｎｅ、１８７巻：９〜１８頁（１９９７年）；Ｂｕｒｔｏｎら、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、５７巻：１９１〜２８０頁（１９９４年）；ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；ＷＯ９０／０２８０９；ＷＯ９１／１０７３７；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９３／１１２３６；ＷＯ９５／１５９８２；ＷＯ９５／２０４０１；ＷＯ９６／０６２１３；ＷＯ９２／０１０４７（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌら）；ＷＯ９７／０８３２０（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ）；ＷＯ９２／０１０４７（ＣＡＴ／ＭＲＣ）；ＷＯ９１／１７２７１（Ａｆｆｙｍａｘ）；ならびに米国特許第５，６９８，４２６号、同第５，２２３，４０９号、同第５，４０３，４８４号、同第５，５８０，７１７号、同第５，４２７，９０８号、同第５，７５０，７５３号、同第５，８２１，０４７号、同第５，５７１，６９８号、同第５，４２７，９０８号、同第５，５１６，６３７号、同第５，７８０，���２５号、同第５，６５８，７２７号、および同第５，７３３，７４３号において開示されているファージディスプレイ法を含む。
【０４１４】
ジスルフィド結合を介してポリペプチドを接合させることにより、バクテリオファージ粒子の表面上にポリペプチドを提示するために有用な方法については、Ｌｏｈｎｉｎｇ、米国特許第６，７５３，１３６号により記載されている。上記の参考文献に記載されている通り、ファージを選択した後で、ファージに由来する抗体をコードする領域を単離し、ヒト抗体を含む全抗体、または他の任意の所望の抗原結合性断片を作出し、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、および細菌を含む、任意の所望の宿主内で発現させるのに使用することができる。例えば、ＷＯ９２／２２３２４；Ｍｕｌｌｉｎａｘら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１２巻：８６４〜８６９頁（１９９２年）；Ｓａｗａｉら、ＡＪＲＩ、３４巻：２６〜３４頁（１９９５年）；およびＢｅｔｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０巻：１０４１〜１０４３頁（１９８８年）において開示されている方法など、当技術分野で公知の方法を使用して、組換えにより、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２断片を作製する技法もまた、利用することができる。
【０４１５】
一般に、抗体または抗体断片は、ファージまたはファージミド粒子の表面上に存在するため、良好な結合活性を維持する改変体を同定するために、ディスプレイベクターへとクローニングされたハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体断片を、適切な抗原に対して選択することができる。例えば、Ｂａｒｂａｓ  ＩＩＩら、Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、２００１年）を参照されたい。しかし、選択および／またはスクリーニングのために、抗体断片ライブラリーを、溶解性のファージベクター（改変Ｔ７またはラムダＺａｐ系）へとクローニングすることなど、他のベクターフォーマットをこの工程のために使用しうるであろう。
【０４１６】
抗体作製のための代替法：抗体はまた、リンパ球集団内で、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける産生を誘導することにより作製することもでき、組換え免疫グロブリンライブラリーまたは高度に特異的な結合試薬のパネルをスクリーニングすることにより作製することもできる（Ｏｒｌａｎｄｉら、ＰＮＡＳ、８６巻：３８３３〜３８３７頁（１９８９年）；Ｗｉｎｔｅｒ，  Ｇ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、３４９巻：２９３〜２９９頁（１９９１年））。
【０４１７】
代替的に、単鎖抗体を作製するための技法を使用することができる。単鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、リンカーペプチド（典型的には、ほぼ５〜２５アミノ酸の長さ）により接続された、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。ｓｃＦｖにおける重鎖および軽鎖の可変領域は、同じ抗体から導出することもでき、異なる抗体から導出することもできる。ｓｃＦｖは、組換え法を使用して、例えば、ｓｃＦｖをコードするベクターの、Ｅ．ｃｏｌｉなどの宿主生物内の発現により合成することができる。ｓｃＦｖをコードするＤＮＡは、上述の抗体の重鎖または重鎖の可変領域をコードするＤＮＡと、その軽鎖または軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡとから選択されるＤＮＡの、全アミノ酸配列または所望のアミノ酸配列をコードする部分的ＤＮＡを鋳型として使用し、その両端を規定するプライマー対を使用するＰＣＲにより増幅を実施し、リンカーの両端を、重鎖および軽鎖のそれぞれへとライゲーションするように、ポリペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡと、その両端を規定するプライマー対とを組み合わせる増幅をさらに実施することにより得ることができる。ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターと、発現ベクターにより形質転換された宿主とは、当技術分野で公知の、従来の方法に従い得ることができる。
【０４１８】
また、抗原結合性断片、例えば、抗体分子のペプシン消化により作製しうるＦ（ａｂ’）２断片、およびＦ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を還元することにより作出しうるＦａｂ断片も、作出することができる。代替的に、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築して、所望の特異性を伴うモノクローナルＦａｂ断片の、迅速かつ簡易な同定を可能とすることができる（Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５６巻：１２７５〜１２８１頁（１９８９年））。
【０４１９】
抗体の修飾。本開示の抗体は、抗原に対するアフィニティーを増大させるように、多量体化することができる。多量体化される抗体は、１種類の抗体の場合もあり、同じ抗原の複数のエピトープを認識する、複数の抗体の場合もある。抗体の多量体化の方法としては、ＩｇＧ  ＣＨ３ドメインの、２つのｓｃＦｖ分子への結合、ストレプトアビジンへの結合、ヘリックス−ターン−ヘリックスモチーフの導入などを例示することができる。
【０４２０】
本明細書で開示される抗体組成物は、これらの抗体のうちのいずれかと、別の薬剤との間で形成される、コンジュゲートの形態（免疫コンジュゲート）でありうる。一態様では、本明細書で開示される抗体を、放射性物質へとコンジュゲートさせる。別の態様では、本明細書で開示される抗体を、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など、多様な種類の分子に結合させることができる。
【０４２１】
抗体のスクリーニング。所望の特異性を有する抗体を同定するスクリーニングのために、多様なイムノアッセイを使用することができる。当技術分野では、特異性が確立された、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を使用する、競合的結合またはイムノラジオメトリックアッセイのための多数のプロトコールが周知である。このようなイムノアッセイは、ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧもしくはＨＬＡ−ＤＲまたはそれらの任意の断片もしくはオリゴペプチドと、その特異的抗体との間の複合体の形成についての測定を伴うことが典型的である。２つの非干渉的ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧもしくはＨＬＡ−ＤＲエピトープに特異的なモノクローナル抗体を活用する、２部位型の、モノクローナルベースのイムノアッセイを使用しうるが、競合的結合アッセイもまた、利用することができる（Ｍａｄｄｏｘら、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．、１５８巻：１２１１〜１２１６頁（１９８３年））。
【０４２２】
潜在的な抗ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧもしくはＨＬＡ−ＤＲ抗体についての、自動式免疫組織化学（ＩＨＣ）スクリーニングは、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ（ＶＭＳＩ）Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＸＴと、スライドガラス上に、ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋したヒト組織とを使用して実施することができる。組織試料にまず、脱パラフィン、抗原回復（ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｔｒｉｅｖａｌ）を施すのに続き、潜在的な抗ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧもしくはＨＬＡ−ＤＲ抗体および検出抗体を添加する。ＶＭＳＩ製の色原体検出試薬を使用して、検出抗体を視覚化する。染色されたスライドは、顕微鏡下、手作業でスクリーニングする。適正な一次抗体染色パターンを有する試料を、潜在的な抗ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧもしくはＨＬＡ−ＤＲ候補として選択する。
【０４２３】
抗体の精製。本明細書で開示される抗体は、均質性まで精製することができる。抗体の分離および精製は、従来のタンパク質分離および精製法を利用することにより実施することができる。
【０４２４】
例だけを目的として述べると、抗体は、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析、調製用ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動などの使用を適切に選択し、組み合わせることにより、分離および精製することができる。Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ、Ｄａｎｉｅｌ  Ｒ．  Ｍａｒｓｈａｋら編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６年）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ＨａｒｌｏｗおよびＤａｖｉｄ  Ｌａｎｅ編、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８年）。
【０４２５】
クロマトグラフィーの例は、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、および吸着クロマトグラフィーを含む。一態様では、クロマトグラフィーは、ＨＰＬＣまたはＦＰＬＣなどの液体クロマトグラフィーを利用することにより実施することができる。
【０４２６】
一態様では、アフィニティークロマトグラフィーにおいて、プロテインＡカラムまたはプロテインＧカラムを使用することができる。他の例示的なカラムは、プロテインＡカラムである、ＨｙｐｅｒＤ、ＰＯＲＯＳ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）などを含む。
【０４２７】
ＩＩＩ．使用法
総論。本明細書で開示される抗体は、ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧもしくはＨＬＡ−ＤＲポリペプチドの位置特定および／または定量化と関連する、当技術分野で公知の方法（例えば、適切な生理学的試料中のＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧもしくはＨＬＡ−ＤＲポリペプチドのレベルの測定における使用のための方法、診断法における使用のための方法、ポリペプチドのイメージングにおける使用のための方法など）において有用である。本明細書で開示される抗体は、アフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降など、標準的な技法によるＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧもしくはＨＬＡ−ＤＲポリペプチドの単離において有用である。本明細書で開示されるＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧもしくはＨＬＡ−ＤＲ抗体は、天然のＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧもしくはＨＬＡ−ＤＲポリペプチドの、生物学的試料、例えば、哺乳動物の血清または細胞からの精製のほか、組換えにより作製されるＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧもしくはＨＬＡ−ＤＲポリペプチドであって、宿主系内で発現させるＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧもしくはＨＬＡ−ＤＲポリペプチドの精製も容易としうる。さらに、ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧもしくはＨＬＡ−ＤＲ抗体を使用して、ポリペプチドの存在度および発現パターンについて評価するために、ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧもしくはＨＬＡ−ＤＲポリペプチド（例えば、血漿、細胞溶解物、または細胞上清中）を検出することができる。本明細書で開示されるＬＨＲ抗体を診断的に使用して、組織内のＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧもしくはＨＬＡ−ＤＲレベルを、臨床検査手順の一部としてモニタリングする、例えば、所与の処置レジメンの有効性を決定することができる。検出は、本明細書で開示されるＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧもしくはＨＬＡ−ＤＲ抗体を、検出可能な物質へとカップリングすること（すなわち、物理的に連結すること）により、容易とすることができる。
【０４２８】
別の態様では、本明細書では、本明細書で開示される抗体または抗原結合性断片であって、例えば、ヒトＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧもしくはＨＬＡ−ＤＲタンパク質またはその断片を含むペプチドに結合した抗体または抗原結合性断片を含む組成物が提示される。一態様では、ペプチドを、細胞と会合させる。例えば、組成物は、本明細書で開示される抗体または抗体断片で標識された非凝集細胞試料を含むことが可能であり、この組成物は、例えば、細胞を単離するためのアフィニティークロマトグラフィー法において、またはフローサイトメトリーベースの細胞解析もしくは細胞分取のために有用である。別の例として、組成物は、本明細書で開示される抗体または抗体断片で標識された、固定組織試料または細胞スミアを含むことが可能であり、この組成物は、例えば、免疫組織化学または細胞学解析において有用である。別の態様では、抗体または抗体断片を、例えば、ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧもしくはＨＬＡ−ＤＲタンパク質もしくはそれらの断片、ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧもしくはＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞、またはＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧもしくはＨＬＡ−ＤＲおよび他の細胞成分を含有する複合体を単離するためのＥＬＩＳＡ；アフィニティークロマトグラフィー；または免疫沈降法において有用な固体支持体に結合させる。別の態様では、ペプチドを、固体支持体に結合させる。例えば、ペプチドを、ペプチドに特異的な二次抗体であって、例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡにおいて有用な二次抗体を介して、固体支持体に結合させることができる。別の例として、ペプチドを、例えば、本技術に従う抗体の単離または精製において有用な、クロマトグラフィーカラムに結合させることができる。別の態様では、ペプチドを、例えば、ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧもしくはＨＬＡ−ＤＲタンパク質もしくはそれらの断片、またはＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧもしくはＨＬＡ−ＤＲおよび他の細胞成分を含有する複合体を単離するＥＬＩＳＡおよびアフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降法において有用な、分画された細胞の細胞内画分（ｓｕｂ−ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）を含有する溶解液または溶液などの溶液中に入れる。別の態様では、ペプチドを、例えば、ゲル電気泳動用のゲルまたはウェスタンブロット法に一般に使用されるマトリックス（ニトロセルロース製またはポリビニリデンジフルオリド製の膜など）などのマトリックスと会合させるが、この組成物は、電気泳動および／またはウェスタンブロット法などのイムノブロット法に有用である。
【０４２９】
ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧもしくはＨＬＡ−ＤＲポリペプチドの検出。生物学的試料中のＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧもしくはＨＬＡ−ＤＲポリペプチドのレベルを検出するための例示的な方法は、生物学的試料を、対象から得るステップと、生物学的試料を、ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧもしくはＨＬＡ−ＤＲポリペプチドを検出することが可能な本明細書で開示されるＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧもしくはＨＬＡ−ＤＲ抗体と接触させるステップとを伴う。
【０４３０】
一態様では、開示された抗体（例えば、５Ｆ４−２１、４Ａ７−４、８Ｂ７−３、１３８−２、Ｂ７−Ｈ４  ５Ｆ６、Ｂ７−Ｈ４  ＃３３−１４、Ｂ７−Ｈ４  ＃３６−１、ＨＬＡ−Ｇ  ４Ｅ３、３Ｈ１１、Ｌｙｍ−１もしくはＬｙｍ−２）、またはそれらの断片を、検出可能に標識する。抗体に関する「標識された」という用語は、検出可能な物質を、抗体へとカップリングすること（すなわち、物理的に連結すること）による抗体の直接的な標識のほか、直接的に標識された別の化合物との反応性による抗体の間接的な標識も包含することを意図する。間接的な標識の非限定的な例は、蛍光標識された二次抗体を使用する一次抗体の検出と、それを、蛍光標識されたストレプトアビジンにより検出しうるように、ＤＮＡプローブを、ビオチンで末端標識することとを含む。
【０４３１】
本開示の検出法を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏならびにｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、生物学的試料中のＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲポリペプチドの発現レベルを検出することができる。ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲポリペプチドを検出するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法は、酵素免疫測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、フローサイトメトリー、免疫沈降、ラジオイムノアッセイ、および免疫蛍光（例えば、ＩＨＣ）を含む。さらに、ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲポリペプチドを検出するためのｉｎ  ｖｉｖｏ法は、対象へと標識された抗ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ抗体を導入するステップを含む。例だけを目的として述べると、抗体は、対象におけるその存在および場所を、標準的なイメージング技法により検出しうる放射性マーカーで標識することができる。一態様では、生物学的試料は、被験対象に由来するポリペプチド分子を含有する。
【０４３２】
イムノアッセイおよびイメージング。抗体ベースの技法を使用して、生物学的試料（例えば、ヒト血漿）中のＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲポリペプチドレベルをアッセイするのに、本明細書で開示されるＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ抗体を使用することができる。例えば、組織内のタンパク質発現は、古典的な免疫組織化学（ＩＨＣ）染色法で研究することができる（Ｊａｌｋａｎｅｎ，  Ｍ．ら、Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．、１０１巻：９７６〜９８５頁（１９８５年）；Ｊａｌｋａｎｅｎ，  Ｍ．ら、Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．、１０５巻：３０８７〜３０９６頁（１９８７年））。タンパク質の遺伝子発現を検出するために有用な、他の抗体ベースの方法は、酵素免疫測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）などのイムノアッセイを含む。当技術分野では、適切な抗体アッセイ標識が公知であり、グルコースオキシダーゼなどの酵素標識、ならびにヨウ素（１２５Ｉ、１２１Ｉ、１３１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１２Ｉｎ）、およびテクネシウム（９９ｍＴｃ）などの放射性同位体または他の放射性薬剤、ならびにフルオレセインおよびローダミンなどの蛍光標識、ならびにビオチンを含む。
【０４３３】
生物学的試料中のＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲポリペプチドレベルについてアッセイすることに加えて、ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲポリペプチドレベルはまた、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、イメージングにより検出することもできる。ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲポリペプチドレベルについてのｉｎ  ｖｉｖｏイメージングのために、抗ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ抗体と共に組み込みうる標識は、Ｘ線造影法、ＮＭＲ、またはＥＳＲにより検出可能な標識を含む。Ｘ線造影法に適する標識は、バリウムまたはセシウムなどの放射性同位体であって、検出可能な放射線を放出するが、対象に対して明白に有害ではない放射性同位体を含む。ＮＭＲおよびＥＳＲに適するマーカーは、対象となるｓｃＦｖクローンのための養分を標識することにより、ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ抗体へと組み込みうる、重水素など、検出可能な特徴的なスピンを伴うマーカーを含む。
【０４３４】
放射性同位元素（例えば、１３１Ｉ、１１２Ｉｎ、９９ｍＴｃ）、放射線不透過物質、または核磁気的共鳴により検出可能な材料など、適切な検出可能なイメージング部分で標識されたＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ抗体を、対象へと導入（例えば、非経口、皮下、または腹腔内）する。当技術分野では、対象のサイズと、使用されるイメージングシステムとが、診断画像を作製するのに必要とされるイメージング部分の数量を決定することが理解されるであろう。ヒト対象のための放射性同位元素部分の場合、注射される放射能の量は通常、９９ｍＴｃ約５〜２０ミリキュリーの範囲となろう。次いで、標識されたＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ抗体は、特異的な標的ポリペプチドを含有する細胞の場所に、優先的に蓄積されるであろう。例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける腫瘍イメージングについては、Ｓ．  Ｗ．  Ｂｕｒｃｈｉｅｌら、Ｔｕｍｏｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ：  Ｔｈｅ  Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ、１３（１９８２年）において記載されている。
【０４３５】
一部の態様では、急速な結合、ならびに細胞への取込みおよび／または緩徐な放出を容易とする構造的修飾を含有するＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏイメージング検出法において有用である。一部の態様では、ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ抗体は、急速な結合、ならびに細胞への取込みおよび／または緩徐な放出を容易とするように、抗体のＣＨ２定常重鎖領域内の欠失を含有する。一部の態様では、Ｆａｂ断片を使用して、急速な結合、ならびに細胞への取込みおよび／または緩徐な放出を容易とする。一部の態様では、Ｆ（ａｂ）’２断片を使用して、急速な結合、ならびに細胞への取込みおよび／または緩徐な放出を容易とする。
【０４３６】
ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ抗体の診断的使用。本明細書で開示されるＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ抗体組成物は、診断および予後診断法において有用である。したがって、本開示は、対象における、ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲに関連する医学的状態の診断において、本明細書で開示される抗体を使用するための方法を提示する。本明細書で開示される抗体は、それらが、ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲポリペプチドに対して、高レベルのエピトープ結合特異性および高結合アフィニティーを有するように選択することができる。一般に、抗体の結合アフィニティーが高いほど、標的ポリペプチドを除去せずに、非特異的に結合した材料を除去するように、イムノアッセイにおいて、よりストリンジェントな洗浄条件を実施することができる。したがって、診断アッセイにおいて有用な本技術のＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ抗体は通例、少なくとも１０−６、１０−７、１０−８、１０−９、１０−１０、１０−１１、または１０−１２Ｍの結合アフィニティーを有する。ある特定の態様では、診断試薬として使用されるＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ抗体は、標準的な条件下、少なくとも１２時間、少なくとも５時間、少なくとも１時間、または少なくとも３０分間で、平衡に達するのに十分な動態会合速度（ｋｉｎｅｔｉｃ  ｏｎ−ｒａｔｅ）を有する。
【０４３７】
本技術の一部の方法は、抗ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ抗体のポリクローナル調製物およびポリクローナル抗ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ抗体の組成物を診断試薬として利用し、他の方法は、モノクローナル単離物を利用する。上記で記載した方法に従い調製されたヒト抗ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲポリクローナル抗体を利用する方法では、調製物は、ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ抗体、例えば、標的ポリペプチドに対する、異なるエピトープ特異性を伴う抗体の取合せを含有することが典型的である。本開示の抗ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲモノクローナル抗体は、近縁の抗原の存在下または潜在的存在下で、単一の抗原を検出するために有用である。
【０４３８】
本開示のＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ抗体を、任意の種類の生物学的試料についての診断試薬として使用することができる。一態様では、本明細書で開示されるＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ抗体は、ヒト生物学的試料についての診断試薬として有用である。ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ抗体を使用して、様々な標準的アッセイフォーマットで、ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲポリペプチドを検出することができる。このようなフォーマットは、免疫沈降、ウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、フローサイトメトリー、ＩＨＣ、および免疫測定アッセイを含む。ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８年）；米国特許第３，７９１，９３２号；同第３，８３９，１５３号；同第３，８５０，７５２号；同第３，８７９，２６２号；同第４，０３４，０７４号、同第３，７９１，９３２号；同第３，８１７，８３７号；同第３，８３９，１５３号；同第３，８５０，７５２号；同第３，８５０，５７８号；同第３，８５３，９８７号；同第３，８６７，５１７号；同第３，８７９，２６２号；同第３，９０１，６５４号；同第３，９３５，０７４号；同第３，９８４，５３３号；同第３，９９６，３４５号；同第４，０３４，０７４号；および同第４，０９８，８７６号を参照されたい。生物学的試料は、対象の任意の組織（生検材料を含む）、細胞、または体液から得ることができる。
【０４３９】
ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ抗体の予後診断的使用。本開示はまた、対象に、ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲポリペプチドの発現または活性の増大と関連する医学的疾患または状態を発症する危険性があるのかどうかを決定するための予後診断（または予測）アッセイ（例えば、前がん性細胞の検出）も提示する。このようなアッセイを、予後診断または予測の目的で使用して、これにより、ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲポリペプチドの発現を特徴とするかまたはこれと関連する、医学的疾患または状態の発症の前に、個体を予防的に処置することができる。
【０４４０】
本開示の別の態様は、対象におけるＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲの発現を決定して、これにより、この対象に適切な治療用または予防用化合物を選択するための方法を提示する。
【０４４１】
代替的に、予後診断アッセイを活用して、がんおよび／または固形腫瘍を有するか、またはこれらを発症する危険性がある対象を同定することができる。特定の実施形態では、がんおよび／または腫瘍は、甲状腺、乳房、結腸、前立腺、卵巣またはより特異的には絨毛癌のものであるか、あるいは、がんおよび／または腫瘍は、Ｂ細胞リンパ腫または白血病である。したがって、本開示は、ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲポリペプチドの発現レベルの上昇と関連する疾患または状態を同定するための方法であって、被験試料を対象から得、ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲポリペプチドを検出し、ここで、ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲポリペプチドのレベルの、対照試料と比較した上昇の存在により、ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲポリペプチドの発現レベルの上昇と関連する疾患または状態を有するか、またはこれらを発症する危険性がある対象が予測される方法を提示する。一部の態様では、ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲポリペプチドの発現レベルの上昇と関連する疾患または状態は、がんおよび／または固形腫瘍からなる群より選択される。特定の実施形態では、がんおよび／または腫瘍は、甲状腺、乳房、結腸、前立腺、卵巣または絨毛癌のものであるか、あるいは、Ｂ細胞リンパ腫または白血病である。
【０４４２】
別の態様では、本開示は、対象を、ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲポリペプチド発現の増大と関連する障害または状態のための化合物で有効に処置しうるのかどうかを決定するための方法であって、生物学的試料を対象から得、ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ抗体を使用して、ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲポリペプチドを検出する方法を提示する。対象から得られる生物学的試料中のＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲポリペプチドの発現レベルを決定し、無病である対象から得られるまたは無病である患者集団から単離される生物学的試料中で見出されるＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲの発現レベルと比較する。疾患または状態を有することが疑われる対象から得られた試料中のＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲポリペプチドレベルの、健常対象から得られた試料と比較した上昇は、被験対象における、ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ関連疾患または状態を示す。ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲポリペプチドの発現の、無病患者からの患者試料におけるポリペプチドまたはタンパク質の発現レベルと比較した増加は、患者が、本開示のＣＡＲ  Ｔ細胞またはＣＡＲ  ＮＫ細胞療法に応答する可能性が高いことを指し示し、発現上昇の欠如は、患者が、ＣＡＲ  Ｔ細胞またはＣＡＲ  ＮＫ細胞療法に応答する可能性が高くないことを指し示す。試料の非限定的な例は、例えば、任意の体液を含み、これは、例えば、痰、血清、血漿、リンパ、嚢胞液、尿、糞便、脳脊髄液、腹水または血液を含むがこれらに限定されず、および体組織の生検試料を含む。試料はまた、腫瘍細胞でもある。上記で記載した方法で使用される被験試料は、アッセイフォーマットと、検出法の性格と、アッセイされる試料として使用される組織、細胞または抽出物とに基づき変化するであろう。
【０４４３】
特定の態様では、本開示は、患者が、ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ療法に応答する可能性が高いのか、高くないのかを決定するための方法に関する。具体的な実施形態では、この方法は、患者から単離された腫瘍試料を、有効量のＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ結合剤、例えば、ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ抗体と接触させるステップ、および腫瘍試料に結合した任意の薬剤または抗体の存在を検出するステップとを含む。さらなる実施形態では、腫瘍試料に結合した薬剤または抗体の存在は、患者が、ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ療法に応答する可能性が高いことを指し示し、腫瘍試料に結合した抗体の非存在は、患者が、ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ療法に応答する可能性が高くないことを指し示す。試料の非限定的な例は、例えば、任意の体液を含み、これは、例えば、痰、血清、血漿、リンパ、嚢胞液、尿、糞便、脳脊髄液、腹水または血液を含むがこれらに限定されず、および体組織の生検試料を含む。試料はまた、腫瘍細胞でもある。上記で記載した方法で使用される被験試料は、アッセイフォーマットと、検出法の性格と、アッセイされる試料として使用される組織、細胞または抽出物とに基づき変化するであろう。一部の実施形態では、方法は、有効量のＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ療法を、ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ療法に応答する可能性が高いと決定された患者へと投与する、さらなるステップを含む。一部の実施形態では、患者は、ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ発現腫瘍および／またはがん＿＿＿。
【０４４４】
ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲポリペプチドの発現レベルの上昇により、疾患を伴う対象が、特定の種類の治療または処置に応答する可能性が高いのかどうかが示されることが公知である疾患状態は、いくつか存在する。このような疾患状態の非限定的な例は、がん、例えば、癌腫、肉腫または白血病を含む。したがって、生物学的試料中のＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲポリペプチドを検出する方法を、予後診断法として、例えば、対象が、治療または処置に応答する尤度について評価するために使用することができる。対象に由来する適切な組織または体液試料中のＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲポリペプチドのレベルを決定し、適切な対照、例えば、同じ疾患を伴うが、処置に対して良好に応答した対象におけるレベルと比較する。試料の非限定的な例は、例えば、任意の体液を含み、これは、例えば、痰、血清、血漿、リンパ、嚢胞液、尿、糞便、脳脊髄液、腹水または血液を含むがこれらに限定されず、および体組織の生検試料を含む。試料はまた、腫瘍細胞でもある。上記で記載した方法で使用される被験試料は、アッセイフォーマットと、検出法の性格と、アッセイされる試料として使用される組織、細胞または抽出物とに基づき変化するであろう。当技術分野では、細胞のタンパク質抽出物または膜抽出物を調製するための方法が公知であり、活用されるシステムと適合性の試料を得るために、たやすく適応させることができる。
【０４４５】
一態様では、本開示は、薬剤（例えば、薬物、化合物、または低分子）の、ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲポリペプチドの発現に対する影響をモニタリングする方法を提示する。このようなアッセイは、基礎的な薬物スクリーニングおよび臨床試験において適用することができる。例えば、薬剤がＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲポリペプチドレベルを低下させる有効性は、ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲの発現の増大を呈する対象、例えば、がんと診断された患者についての臨床試験においてモニタリングすることができる。ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲポリペプチドの発現に影響を及ぼす薬剤は、薬剤を投与し、応答を観察することにより同定することができる。このようにして、ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲポリペプチドの発現パターンを、対象の、薬剤への生理学的応答を示す、マーカーとして用いることができる。したがって、この応答状態は、対象の、薬剤による処置の前、およびこの間の多様な時点において決定することができる。一部の実施形態では、方法は、有効量のＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ療法を、さらなる療法を必要とすると決定された患者へと投与する、さらなるステップをさらに含む。
【０４４６】
本開示のさらなる態様は、患者が、ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ療法に応答する可能性が高いのか、高くないのかを決定するための方法に関する。具体的な実施形態では、この方法は、患者から単離された腫瘍試料を、有効量のＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ抗体と接触させるステップと、腫瘍試料に結合した任意の抗体の存在を検出するステップとを含む。さらなる実施形態では、腫瘍試料に結合した抗体の存在は、患者が、ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ療法に応答する可能性が高いことを指し示し、腫瘍試料に結合した抗体の非存在は、患者が、ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ療法に応答する可能性が高くないことを指し示す。一部の実施形態では、方法は、有効量のＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ療法を、ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ療法に応答する可能性が高いと決定された患者へと投与する、さらなるステップを含む。.一部の実施形態では、患者は、Ｂ７−Ｈ４発現腫瘍および／またはがんである。一部の実施形態では、腫瘍および／またはがんは、固形腫瘍、例えば、乳房、結腸、前立腺、甲状腺または絨毛癌である。一部の実施形態では、がん／腫瘍は、Ｂ細胞リンパ腫または白血病である。
【０４４７】
自動化実施形態。当業者は、本明細書で開示されるＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ抗体を使用するための方法についての態様を、自動化しうることを察知するであろう。ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ染色手順についての特定の態様は、多様な自動化工程を使用して行うことができる。
【０４４８】
ＩＶ．キット
本明細書で明示される通り、本開示は、ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲの発現レベルを決定するための診断法を提示する。特定の一態様では、本開示は、これらの方法を実施するためのキットのほか、組織を回収し、かつ／またはスクリーニングを実施し、かつ／または結果を解析することなど、本開示の方法を実行するための指示も提示する。
【０４４９】
キットは、本明細書で開示されるＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ抗体組成物（例えば、モノクローナル抗体）と、使用のための指示とを含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはなおさらにこれらからなる。キットは、例えば、痰、血清、血漿、リンパ、嚢胞液、尿、糞便、脳脊髄液、腹水、または血液を含むがこれらに限定されない、例えば、任意の体液であり、身体組織についての生検試料を含む生物学的試料中のＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲポリペプチドの存在を検出するために有用である。被験試料はまた、腫瘍細胞、腫瘍に隣接する正常細胞、腫瘍組織型に対応する正常細胞、血液細胞、末梢血リンパ球、またはこれらの組合せでもありうる。上記で記載した方法で使用される被験試料は、アッセイフォーマットと、検出法の性格と、アッセイされる試料として使用される、組織、細胞、または抽出物とに基づき変化するであろう。当技術分野では、細胞のタンパク質抽出物または膜抽出物を調製するための方法が公知であり、活用されるシステムと適合性の試料を得るために、たやすく適応させることができる。
【０４５０】
一部の態様では、キットは、生物学的試料中のＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲポリペプチドに結合することが可能な、１または複数のＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ抗体（例えば、ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ抗体である、Ｂ７Ｈ４  ５Ｆ６、Ｂ７Ｈ４  ＃３３−１４、またはＢ７Ｈ４  ＃３６−１と同じ抗原結合特異性を有する抗体またはその抗原結合性断片）と；試料中のＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲポリペプチドの量を決定するための手段と；試料中のＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲポリペプチドの量を、標準物質と比較するための手段とを含みうる。ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ抗体のうちの１または複数は、標識することができる。キットの構成要素（例えば、試薬）は、適切な容器内にパッケージングすることができる。キットは、キットを使用して、ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲポリペプチドを検出するための指示をさらに含みうる。ある特定の態様では、キットは、１）例えば、固体支持体へと接合させた第１の抗体であって、ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲポリペプチドに結合する第１の抗体と；任意選択で；２）ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲポリペプチドまたは第１の抗体に結合し、検出可能な標識へとコンジュゲートさせた異なる第２の抗体とを含む。
【０４５１】
キットはまた、例えば、緩衝剤、保存剤またはタンパク質安定化剤も含みうる。キットは、検出可能な標識を検出するために必要な構成要素、例えば、酵素または基質をさらに
含みうる。キットはまた、アッセイし、被験試料と比較しうる、１つの対照試料または対照試料のシリーズも含有しうる。キットの各構成要素は、個別の容器内に封入することができ、多様な容器の全ては、キットを使用して実施されるアッセイの結果を解釈するための指示と共に、単一のパッケージ内にあってよい。本開示のキットは、キットの容器上または容器内に書面を含有しうる。書面は、キット内に含有される試薬を、どのようにして使用するのかについて記載する。
【０４５２】
適宜、これらの示唆されるキットの構成要素は、当業者による使用に好都合なように、パッケージングすることができる。例えば、これらの示唆されるキットの構成要素は、溶液中または液体分散物などとして提供することができる。
【０４５３】
Ｖ．担体
本開示の抗体はまた、多くの異なる担体に結合させることもできる。したがって、本開示はまた、抗体と、活性または不活性の、別の物質とを含有する組成物も提示する。周知の担体の例は、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、およびマグネタイトを含む。本開示の目的では、担体の性格は、可溶性の場合もあり、不溶性の場合もある。当業者は、結合性抗体に適する他の担体について知っているか、または慣例的な実験を使用して、このような担体を確認することができるであろう。
【０４５４】
キメラ抗原受容体およびそれらの使用
Ｉ．組成物
本開示は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含む細胞活性化部分を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になるＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲに結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提示する。細胞外ドメインは、他に抗原結合性ドメインと称する、標的特異的な結合性エレメントを含む。細胞内ドメインまたは細胞質ドメインは、少なくとも１つの共刺激性シグナル伝達領域およびゼータ鎖部分を含む。
【０４５５】
スペーサードメイン。ＣＡＲは、任意選択で、最大で３００アミノ酸、好ましくは１０〜１００アミノ酸、より好ましくは２５〜５０アミノ酸のスペーサードメインをさらに含みうる。例えば、スペーサーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０アミノ酸でありうる。スペーサードメインは、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧもしくはＩｇＭなどの任意の免疫グロブリンまたはその改変体のヒトＦｃドメイン、ＣＨ３ドメインまたはヒンジ領域の部分を含みうる。例えば、一部の実施形態は、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅおよび／またはＮ２９７Ｑ変異（Ｋａｂａｔ番号付けに従う）を有するかまたは有さないＩｇＧ４ヒンジを含みうる。さらなるスペーサーは、ＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ２８ヒンジ領域を含むが、これらに限定されない。
【０４５６】
抗原結合性ドメイン。ある特定の態様では、本開示は、ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲに特異的な抗原結合性ドメインを含むか、これからなるか、または代替的にこれから本質的になるＣＡＲを提示する。一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、抗ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ抗体の抗原結合性ドメインを含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおこれからなる。さらなる実施形態では、抗ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、抗ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ抗体の抗原結合性ドメインを含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおこれからなる。一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、標的特異的抗体（すなわち、抗ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ抗体）の断片、例えば、ｓｃＦｖを含むか、これからなるか、またはこれから本質的になる。
【０４５７】
ｓｃＦｖ領域は、単鎖リンカーペプチドで接続された、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）可変領域と軽鎖（ＶＬ）可変領域とを含みうる。リンカーペプチドは、１〜５０アミノ酸、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０アミノ酸でありうる。一部の実施形態では、リンカーは、グリシンに富むが、セリンまたはトレオニンも含有しうる。
【０４５８】
一部の実施形態では、抗体の重鎖可変領域は、本明細書で開示されるものもしくはそれらの各々の同等物を含むか、またはこれらから本質的になるか、またはこれらからなり、および／または本明細書で開示されるものもしくはそれらの各々の同等物を含む１もしくは複数のＣＤＲ領域を含む。一部の実施形態では、抗体の軽鎖可変領域は、本明細書で開示されるものもしくはそれらの各々の同等物を含むか、またはこれらから本質的になるか、またはこれらからなり、および／または本明細書で開示されるものもしくはそれらの各々の同等物を含む１もしくは複数のＣＤＲ領域を含む。
【０４５９】
膜貫通ドメイン。膜貫通ドメインは、天然の供給源から導出することもでき、合成の供給源から導出することもできる。供給源が、天然である場合、ドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来しうる。本開示で特に使用される膜貫通領域は、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤＳ、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＴＣＲに由来しうる。代替的に、膜貫通ドメインは、合成であることが可能であり、この場合、膜貫通ドメインは主に、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を含むであろう。フェニルアラニン、トリプトファン、およびバリンの三残基の組（ｔｒｉｐｌｅｔ）が、合成の膜貫通ドメインの各末端において見出されることが好ましい。任意選択で、好ましくは、２〜１０アミノ酸の間の長さの、短鎖オリゴペプチドリンカー、またはポリペプチドリンカーは、ＣＡＲの膜貫通ドメインと、細胞質シグナル伝達ドメインとの連結を形成しうる。グリシン−セリンの二残基の組（ｄｏｕｂｌｅｔ）は、特に適切なリンカーをもたらす。
【０４６０】
細胞質ドメイン。ＣＡＲの細胞質ドメインまたは細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲが配置された免疫細胞の、従来のエフェクター機能のうちの少なくとも１つの活性化を担う。細胞内シグナル伝達ドメインとは、エフェクター機能シグナルを伝達し、免疫細胞を、その特異的機能を果たすように導く、タンパク質の部分を指す。シグナル伝達ドメインの全体を使用することもでき、切断部分が、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分である限りにおいて、その切断部分を使用することもできる。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）および共受容体のほか、それらの誘導体または改変体の細胞質配列は、ＣＡＲにおける使用のための細胞内シグナル伝達ドメインとして機能しうる。本開示で特に使用される細胞内シグナル伝達ドメインは、ＦｃＲ、ＴＣＲ、ＣＤ３、ＣＤＳ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ６６ｄに由来しうる。一部の実施形態では、ＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３  ζシグナル伝達ドメインを含みうる。
【０４６１】
ＴＣＲを介して発生するシグナルは、単独では、Ｔ細胞の完全な活性化には不十分であるので、二次または共刺激性シグナルもまた、要求されうる。したがって、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−ＩＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、またはＣＤ８３に特異的に結合するリガンドを含むがこれらに限定されない少なくとも一つの共刺激性シグナル伝達分子の細胞内領域もまた、ＣＡＲの細胞質ドメインに組み入れることができる。本開示のＣＡＲは、１または複数の共刺激性ドメインを含みうる。例えば、ＣＡＲは、シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン）に加えて、１つ、２つまたはこれを超える共刺激性ドメインを含みうる。
【０４６２】
一部の実施形態では、キメラ抗原受容体の細胞活性化部分は、ＣＤ８タンパク質、ＣＤ２８タンパク質、４−１ＢＢタンパク質、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびＣＤ３−ゼータタンパク質からなる群より選択される、１または複数のタンパク質またはそれらの断片を含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはなおさらにこれらからなる、Ｔ細胞シグナル伝達ドメインである。
【０４６３】
具体的な実施形態では、ＣＡＲは、抗ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ抗体の抗原結合性ドメインまたはそれらの断片（例えば、ｓｃＦｖ）、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、少なくとも一つの共刺激性シグナル伝達領域、およびＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはなおこれらからなる。さらなる実施形態では、共刺激性シグナル伝達領域は、ＣＤ２８共刺激性シグナル伝達領域および４−１ＢＢ共刺激性シグナル伝達領域の一方または両方を含む。
【０４６４】
一部の実施形態では、ＣＡＲは、検出可能なマーカーまたは精製マーカーをさらに含みうる。
【０４６５】
スイッチメカニズム。一部の実施形態では、ＣＡＲはまた、ＣＡＲの発現および／または活性化を制御するためのスイッチメカニズムも含みうる。例えば、ＣＡＲは、標的細胞上でまたは標的細胞により発現される標的抗原以外の分子に特異的である標識、結合ドメインまたはタグを含む標的特異的結合エレメントを含む細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインとを含みうるか、これらからなりうるか、またはこれらから本質的になりうる。このような実施形態では、ＣＡＲの特異性は、標的抗原結合性ドメイン（例えば、抗ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧもしくはＨＬＡ−ＤＲ抗体またはその断片、あるいはＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲとＣＡＲ上の標識もしくはタグとに結合する二重特異性抗体）と、ＣＡＲにより認識されるかまたはＣＡＲ上の標識、結合ドメインもしくはタグに結合するドメインとを含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる第２の構築物によりもたらされる。例えば、ＷＯ２０１３／０４４２２５、ＷＯ２０１６／０００３０４、ＷＯ２０１５／０５７８３４、ＷＯ２０１５／０５７８５２、ＷＯ２０１６／０７００６１、ＵＳ９，２３３，１２５、ＵＳ２０１６／０１２９１０９を参照されたい。このようにして、ＣＡＲを発現するＴ細胞を対象へと投与することができるが、Ｔ細胞は、ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ特異的結合ドメインを含む第２の組成物を投与するまで、その標的抗原（すなわち、ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ）に結合することができない。
【０４６６】
同様に、本開示のＣＡＲは、それらのシグナル伝達機能を活性化させるために多量体化を必要とすることがあり（例えば、ＵＳ２０１５／０３６８３４２、ＵＳ２０１６／０１７５３５９、ＵＳ２０１５／０３６８３６０を参照されたい）、および／またはＴ細胞応答を惹起するために、小分子薬（ＵＳ２０１６／０１６６６１３、Yungら、Science、２０１５年）などの外因性シグナルを必要とすることもある。
【０４６７】
さらに、開示されるＣＡＲは、処置後ＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞死を誘導するために（Buddeeら、PLoS  One、２０１３年）、または標的抗原への結合後ＣＡＲの発現を下方調節するために（ＷＯ２０１６／０１１２１０）、「自殺スイッチ」または「安全スイッチ」を含むことができる。例えば、投与してＣＡＲ活性を止めることができる抗体またはプロドラッグに対する感受性を付与する自殺遺伝子を用いて、ＣＡＲを改変することができる。一部の実施形態では、抗体またはプロドラッグは、有害事象の発生時にＣＡＲ療法を受けた対象へと投与される。例示的な自殺遺伝子は、細胞をガンシクロビルの作用を受けやすいようにさせる単純ヘルペスウイルス−チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）（Boniniら、Science  ２７６巻：１７１９〜１７２４頁（１９９７年））、二量体化薬により活性化されたとき二量体化およびアポトーシスの活性化を可能にする誘導性カスパーゼ９（Gargettら、Front  Pharmacol、２０１４年５巻：２３５頁）、および細胞をセツキシマブの作用を受けやすいようにさせる切断型ＥＧＦＲ（Wangら、Blood  １１８巻：１２５５〜６３頁（２０１１年））を含むが、これらに限定されない。
【０４６８】
さらなる態様では、本開示は、その標的細胞に結合したＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ細胞を含む複合体を提示する。さらなる態様では、複合体は、検出可能に標識される。検出可能な標識は、当技術分野で公知であり、本明細書で簡潔に記載される。
【０４６９】
ＩＩ．ＣＡＲを調製するための工程
本明細書では、ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ発現細胞を作製する方法であって、（ｉ）本明細書で記載されるＣＡＲをコードする核酸配列を単離細胞の集団に形質導入するステップと；（ｉｉ）ステップ（ｉ）の前記核酸配列の形質導入に成功した前記単離細胞の亜集団を選択し、これにより、ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ発現細胞を作製するステップとを含む、または代替的にこれらから本質的になる、またはなおさらにこれらからなる方法も提示される。一態様では、単離細胞は、Ｔ細胞およびＮＫ細胞からなる群より選択される。
【０４７０】
本開示の態様は、ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ特異的ＣＡＲを含む単離細胞と、このような細胞を作製する方法とに関する。細胞は、原核細胞または真核細胞である。一態様では、細胞は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞である。真核細胞は、任意の好ましい種に由来することが可能であり、例えば、動物細胞、ヒト、ネコ科動物、またはイヌ科動物細胞などの哺乳動物細胞でありうる。
【０４７１】
本開示の一部の態様では、本明細書で記載されるＣＡＲをコードする核酸配列を形質導入される単離細胞の集団は、ＮＫ前駆体細胞および／またはＴ細胞前駆体細胞の集団である。前駆体細胞の形質導入は、ＣＡＲ  Ｔ細胞および／またはＣＡＲ  ＮＫ細胞へと分化する能力がある長寿命の細胞集団をもたらす。Ｔ細胞前駆体は、ＨＳＣ；長期ＨＳＣ；ＭＰＰ；ＣＬＰ；ＬＭＰＰ／ＥＬＰ；ＤＮ１；ＤＮ２；ＤＮ３；ＤＮ４；ＤＰを含むが、これらに限定されない。ＮＫ前駆体は、ＨＳＣ、長期ＨＳＣ、ＭＰＰ、ＣＭＰ、ＧＭＰ、プロＮＫ、プレＮＫ、およびｉＮＫ細胞を含むが、これらに限定されない。具体的な態様では、単離細胞の集団は、対象への移植のための短寿命エフェクターＣＡＲ  Ｔ細胞と長寿命ＣＡＲ  Ｔ細胞前駆体の両方を提供するために、成熟Ｔ細胞とＴ細胞前駆体の両方を含む。別の態様では、単離細胞の集団は、対象への移植のための短寿命エフェクターＣＡＲ  ＮＫ細胞と長寿命ＣＡＲ  ＮＫ前駆体の両方を提供するために、成熟ＮＫ細胞とＮＫ前駆体の両方を含む。
【０４７２】
具体的な実施形態では、単離細胞は、抗ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ抗体の抗原結合性ドメイン、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ２８共刺激性シグナル伝達領域および／または４−１ＢＢ共刺激性シグナル伝達領域、ならびにＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはなおさらにこれらからなる外因性ＣＡＲを含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる。ある特定の実施形態では、単離細胞は、Ｔ細胞、例えば、動物Ｔ細胞、哺乳動物Ｔ細胞、ネコ科動物Ｔ細胞、イヌ科動物Ｔ細胞、またはヒトＴ細胞である。ある特定の実施形態では、単離細胞は、ＮＫ細胞、例えば、動物ＮＫ細胞、哺乳動物ＮＫ細胞、ネコ科動物ＮＫ細胞、イヌ科動物ＮＫ細胞、またはヒトＮＫ細胞である。
【０４７３】
ある特定の実施形態では、ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ発現細胞を作製する方法であって、（ｉ）単離細胞の集団に、ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲをコードする核酸配列を形質導入するステップと；（ｉｉ）ステップ（ｉ）の前記核酸配列を形質導入することに成功した、細胞の亜集団を選択するステップとを含むか、または代替的にこれらから本質的になる方法が開示される。一部の実施形態では、単離細胞は、Ｔ細胞、動物Ｔ細胞、哺乳動物Ｔ細胞、ネコ科動物Ｔ細胞、イヌ科動物Ｔ細胞またはヒトＴ細胞であり、これにより、ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を作製する。ある特定の実施形態では、単離細胞は、ＮＫ細胞、例えば、動物ＮＫ細胞、哺乳動物ＮＫ細胞、ネコ科動物ＮＫ細胞、イヌ科動物ＮＫ細胞、またはヒトＮＫ細胞であり、これにより、ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ  ＮＫ細胞を作製する。
【０４７４】
一部の実施形態では、開示されるＣＡＲを発現するＴ細胞は、内因性ＴＣＲの発現を低減または消失させるようにさらに改変されうる。内因性ＴＣＲの低減または消失は、オフターゲット効果を低減させ、Ｔ細胞の有効性を増大させる。機能的ＴＣＲの発現を安定的に欠いているＴ細胞は、様々な手法を使用して作製することができる。Ｔ細胞は、複合体としてＴ細胞受容体全体を内在化し、分類し、分解し、半減期は、休止Ｔ細胞では約１０時間、刺激したＴ細胞では３時間である（von  Essen,  M.ら、２００４年、J.  Immunol.  １７３巻：３８４〜３９３頁）。ＴＣＲ複合体が適切に機能するには、ＴＣＲ複合体を構成するタンパク質の適切な化学量論比が必要である。ＴＣＲ機能にはまた、ＩＴＡＭモチーフを有する２つの機能性ＴＣＲゼータタンパク質も必要である。そのＭＨＣ−ペプチドリガンドの結合によるＴＣＲの活性化には、同じＴ細胞上のいくつかのＴＣＲの結合が必要であり、いくつかのＴＣＲ全てが、適切にシグナル伝達しなければならない。したがって、ＴＣＲ複合体が、適切に会合しないまたは最適にシグナル伝達することができないタンパク質で不安定化されると、Ｔ細胞は、細胞応答を開始できるほど十分に活性化されないであろう。
【０４７５】
したがって、一部の実施形態では、初代Ｔ細胞においてＲＮＡ干渉（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなど）、ＣＲＩＳＰＲ、または特定のＴＣＲ（例えば、ＴＣＲ−αおよびＴＣＲ−β）および／もしくはＣＤＲ３鎖をコードする核酸を標的とする他の方法を使用して、ＴＣＲ発現を消失させることができる。これらのタンパク質の１または複数についての発現を阻止することにより、Ｔ細胞は、ＴＣＲ複合体の重要な成分の１または複数をもはや産生しなくなり、それによって、ＴＣＲ複合体が不安定化され、機能的ＴＣＲの細胞表面発現が防止される。ＲＮＡ干渉を使用すると、たとえ一部のＴＣＲ複合体が細胞表面にリサイクルされることがあったとしても、ＲＮＡ（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなど）が、ＴＣＲタンパク質の新たな産生を防止し、その結果、ＴＣＲ複合体全体が分解され、除去されることになり、その結果、機能的ＴＣＲ発現の安定的欠損を有するＴ細胞が作製されることになる。
【０４７６】
初代Ｔ細胞における阻害性ＲＮＡ（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなど）の発現は、任意の従来の発現系、例えば、レンチウイルス発現系を使用して達成することができる。レンチウイルスは、休止初代Ｔ細胞のターゲティングに有用であるが、全てのＴ細胞がｓｈＲＮＡを発現するわけではない。これらのＴ細胞の一部は、Ｔ細胞の機能活性を変化させるのに十分なＴＣＲ発現阻害を可能にするのに十分な量のＲＮＡを発現しないことがある。したがって、ウイルス形質導入後に中等度から高度のＴＣＲ発現を保持するＴ細胞を、例えば細胞分取または分離技術により、除去することができ、その結果、残存するＴ細胞は、細胞表面ＴＣＲまたはＣＤ３が欠損しており、機能的ＴＣＲまたはＣＤ３の発現が欠損しているＴ細胞の単離集団の拡大が可能になる。
【０４７７】
初代Ｔ細胞におけるＣＲＩＳＰＲの発現は、従来のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系と標的ＴＣＲに特異的なガイドＲＮＡとを使用して達成することができる。適切な発現系、例えば、レンチウイルスまたはアデノウイルス発現系は、当技術分野で公知である。阻害性ＲＮＡの送達と同様に、ＣＲＩＳＰＲ系は、ＣＡＲ細胞療法のための休止初代Ｔ細胞または他の適切な免疫細胞の特異的ターゲティングに使用することができる。さらに、ＣＲＩＳＰＲ編集が不成功である場合、上記で開示した方法に従って成功のために細胞を選択することができる。例えば、上記で言及した通り、ウイルス形質導入後に中等度から高度のＴＣＲ発現を保持するＴ細胞を、例えば、細胞分取または分離技術により、除去することができ、その結果、残存するＴ細胞は、細胞表面ＴＣＲまたはＣＤ３が欠損しており、機能的ＴＣＲまたはＣＤ３の発現が欠損しているＴ細胞の単離集団の拡大が可能になる。ＣＲＩＳＰＲ編集構築物が、内因性ＴＣＲのノックアウトおよび本明細書で開示されるＣＡＲ構築物のノックインの両方に有用でありうることは、さらに察知される。したがって、ＣＲＩＳＰＲ系を、これらの目的の一方または両方を果すように設計することができることは、察知される。
【０４７８】
単離細胞の供給源。本明細書で開示される細胞の拡大および遺伝子改変の前に、細胞を、対象から−例えば、自家療法を含む実施形態の場合−得ることができ、または例えばＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能である、市販の培養物から得ることができる。
【０４７９】
細胞は、対象におけるいくつかの供給源であって、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位に由来する組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍を含む供給源から得ることができる。
【０４８０】
当技術分野では、対象となる細胞を単離する方法が周知であり、本出願にたやすく適応させることができ；例示的な方法については、下記の実施例で記載する。本開示と関連する使用のための単離法は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）システム；ＳＴＥＭｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＥａｓｙＳｅｐ（商標）、ＲｏｂｏＳｅｐ（商標）、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（商標）、ＳｅｐＭａｔｅ（商標）；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＭＡＣＳ（商標）細胞分離キット、ならびに他の市販の細胞分離および単離キットを含むがこれらに限定されない。免疫細胞および前駆細胞の特定の亜集団は、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）、ビーズまたはこのようなキットで利用可能な他の結合剤であって、固有の細胞表面マーカーに特異的なビーズまたは結合剤を使用することにより単離することができる。例えば、ＭＡＣＳ（商標）ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓを使用して、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を単離することができる。
【０４８１】
代替的に、細胞は、Ｔ細胞については、細胞株である、ＢＣＬ２（ＡＡＡ）Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２９０２（商標））、ＢＣＬ２（Ｓ７０Ａ）Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２９００（商標））、ＢＣＬ２（Ｓ８７Ａ）Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２９０１（商標））、ＢＣＬ２  Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２８９９（商標））、Ｎｅｏ  Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２８９８（商標））を含むがこれらに限定されず；ＮＫ細胞については、細胞株である、ＮＫ−９２（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２４０７（商標））、ＮＫ−９２ＭＩ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２４０８（商標））を含むがこれらに限定されない、市販の細胞培養物を介して得ることができる。
【０４８２】
一部の態様では、対象から細胞を得る前に、末梢血への前駆体細胞動員を誘導するための移植前処置を対象へと投与することができる。例えば、対象からの細胞の単離の２週間前までに、または対象からの細胞の単離と同時に、有効量の、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、フィルグラスチム（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ）、サルグラモスチム（Ｌｅｕｋｉｎｅ）、ペグフィルグラスチム（Ｎｅｕｌａｓｔａ）およびモゾビル（Ｐｌｅｒｉｘａｆｏｒ）のうちの少なくとも１つを、対象へと投与することができる。動員された前駆体細胞を、対象から、移植前処置の投与の１〜１４日後に、例えば白血球アフェレーシスをはじめとする当技術分野で公知の任意の方法により得ることができる。一部の実施形態では、特定の前駆体細胞集団がさらに単離される。
【０４８３】
ベクター。ベクターを使用してＣＡＲを調製することができる。本開示の態様は、ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲをコードする単離核酸配列と、ＣＡＲをコードする単離核酸配列およびその相補体ならびにそれらの各々の同等物を含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはなおさらにこれらからなるベクターとに関する。
【０４８４】
例示的なベクターの調製および前記ベクターを使用するＣＡＲ発現細胞の作出については、下記の実施例で詳細に論じる。まとめると、天然または合成の、ＣＡＲをコードする核酸の発現は、ＣＡＲポリペプチドまたはその部分をコードする核酸を、プロモーターへと作動可能に連結し、構築物を、発現ベクターへと組み込むことにより達成することが典型的である。ベクターは、真核細胞における複製および組込みに適しうる。
【０４８５】
一部の実施形態では、単離核酸配列は、抗ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ抗体の抗原結合性ドメイン、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ２８共刺激性シグナル伝達領域および／または４−１ＢＢ共刺激性シグナル伝達領域、ならびにＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはなおさらにこれらからなるＣＡＲをコードする。具体的な実施形態では、単離核酸配列は、（ａ）抗ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ抗体の抗原結合性ドメインに続き、（ｂ）ＣＤ８αヒンジドメイン、（ｃ）ＣＤ８α膜貫通ドメインに続き、（ｄ）ＣＤ２８共刺激性シグナル伝達領域および／または４−１ＢＢ共刺激性シグナル伝達領域に続き、（ｅ）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインをコードする配列を含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはなおさらにこれらからなる。
【０４８６】
一部の実施形態では、単離核酸配列は、抗ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ抗体の抗原結合性ドメインをコードする配列の上流におけるＫｏｚａｋコンセンサス配列を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる。一部の実施形態では、単離核酸は、抗生物質耐性を付与するポリヌクレオチドを含む。
【０４８７】
一部の実施形態では、単離核酸配列は、ベクター内に含まれる。ある特定の実施形態では、ベクターは、プラスミドである。他の実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。具体的な実施形態では、ベクターは、レンチウイルスベクターである。
【０４８８】
例示的なベクターの調製および前記ベクターを使用するＣＡＲ発現細胞の作出については、下記の実施例で詳細に論じる。まとめると、天然または合成の、ＣＡＲをコードする核酸の発現は、ＣＡＲポリペプチドまたはその部分をコードする核酸を、プロモーターへと作動可能に連結し、構築物を、発現ベクターへと組み込むことにより達成することが典型的である。ベクターは、真核細胞における複製および組込みに適しうる。当技術分野では、ベクターおよび／または外因性核酸を含む細胞を作製するための方法が周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照されたい。
【０４８９】
一態様では、「ベクター」という用語は、非分裂細胞および／または緩徐に分裂する細胞に、感染および形質導入し、標的細胞のゲノムへと組み込む能力を保持する組換えベクターを意図する。いくつかの態様では、ベクターは、野生型ウイルスに由来するか、またはこれに基づく。さらなる態様では、ベクターは、野生型レンチウイルスに由来するか、またはこれに基づく。このようなベクターの例は、限定せずに述べると、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、サル免疫不全症ウイルス（ＳＩＶ）、およびネコ免疫不全症ウイルス（ＦＩＶ）を含む。代替的に、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）など、他のレトロウイルスを、ベクター骨格のためのベースとして使用しうることも想定される。本開示に従うウイルスベクターが、特定のウイルスの構成要素に必ずしも制約されないことは明らかであろう。ウイルスベクターは、２つまたはこれを超える、異なるウイルスに由来する構成要素を含むことが可能であり、また、合成の構成要素も含みうる。ベクターの構成要素を操作して、標的細胞への特異性など、所望の特徴を得ることができる。
【０４９０】
本開示の組換えベクターは、霊長動物および非霊長動物に由来しうる。霊長動物レンチウイルスの例は、ヒト後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因作用物質である、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）、およびサル免疫不全症ウイルス（ＳＩＶ）を含む。非霊長動物のレンチウイルス群は、原型的な「遅発性ウイルス」である、ビスナ／マエディウイルス（ＶＭＶ）のほか、類縁の、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ならびに、より近年になって記載された、ネコ免疫不全症ウイルス（ＦＩＶ）およびウシ免疫不全症ウイルス（ＢＩＶ）を含む。当技術分野では、先行技術による組換えレンチウイルスベクターが公知であり、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，９２４，１２３号；同第７，０５６，６９９号；同第７，０７，９９３号；同第７，４１９，８２９号；および同第７，４４２，５５１号を参照されたい。
【０４９１】
米国特許第６，９２４，１２３号は、ある特定のレトロウイルス配列が、標的細胞ゲノムへの組込みを容易とすることについて開示する。この特許は、各レトロウイルスゲノムがｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖと呼ばれる遺伝子であって、ビリオンタンパク質および酵素をコードする遺伝子を含むことについて教示する。これらの遺伝子は、両方の末端において、末端反復（ＬＴＲ）と呼ばれる領域で挟まれている。ＬＴＲは、プロウイルスの組込みおよび転写を担う。ＬＴＲはまた、エンハンサー−プロモーター配列としても用いられる。言い換えると、ＬＴＲは、ウイルス遺伝子の発現を制御しうる。レトロウイルスＲＮＡによるカプシド形成は、ウイルスゲノムの５’末端に配置されたプサイ配列により生じる。ＬＴＲ自体は、Ｕ３、Ｒ、およびＵ５と呼ばれる３つのエレメントに分けうる、同一な配列である。Ｕ３は、ＲＮＡの３’末端に固有の配列に由来する。Ｒは、ＲＮＡの両方の末端において反復される配列に由来し、Ｕ５は、ＲＮＡの５’末端に固有の配列に由来する。３つのエレメントのサイズは、異なるレトロウイルスの間で大幅に変動しうる。ウイルスゲノムでは、ポリ（Ａ）付加部位（終結）は、右側のＬＴＲ内のＲとＵ５との間の境界にある。Ｕ３は、細胞性タンパク質と、場合によって、ウイルス転写活性化タンパク質とに応答性の、プロモーター配列および複数のエンハンサー配列を含む、プロウイルスの転写制御エレメントの大半を含有する。
【０４９２】
構造遺伝子である、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ自体に関しては、ｇａｇは、ウイルスの内部構造タンパク質をコードする。ｇａｇタンパク質は、タンパク質分解により、成熟タンパク質ＭＡ（マトリックス）、ＣＡ（カプシド）、およびＮＣ（ヌクレオカプシド）へとプロセシングされる。ｐｏｌ遺伝子は、ゲノムの複製を媒介するＤＮＡポリメラーゼ、関連するＲＮａｓｅ  Ｈおよびインテグラーゼ（ＩＮ）を含有する逆転写酵素（ＲＴ）をコードする。
【０４９３】
ウイルスベクター粒子を作製するためには、ベクターのＲＮＡゲノムを、宿主細胞内で、それをコードするＤＮＡ構築物から発現させる。ベクターゲノムによりコードされない粒子の構成要素は、宿主細胞内で発現する、さらなる核酸配列（通例、ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子およびｅｎｖ遺伝子の一方または両方を含む「パッケージング系」）により、トランスでもたらされる。ウイルスベクター粒子の作製のために要求される配列のセットは、一過性トランスフェクションにより宿主細胞へと導入することもでき、宿主細胞ゲノムへと組み込むこともでき、諸方法を組み合わせた形でもたらすこともできる。当業者には、関与する技法が公知である。
【０４９４】
本開示における使用のためのレトロウイルスベクターは、Ｌｅｎｔｉｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．製の、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｐＬｅｎｔｉシリーズ、ｖｅｒｓｉｏｎ  ４、６、および６．２の「ＶｉｒａＰｏｗｅｒ」系；Ｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｏｐｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの研究室で作出され、使用されているｐＨＩＶ−７−ＧＦＰ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製の「Ｌｅｎｔｉ−Ｘ」レンチウイルスベクターである、ｐＬＶＸ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製のｐＬＫＯ．１−ｐｕｒｏ；Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製のｐＬｅｍｉＲ；およびＣｈａｒｉｔｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（ＣＢＦ）、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙの研究室で作出され、使用されているｐＬＶを含むがこれらに限定されない。
【０４９５】
外因性核酸を、宿主細胞へと導入するか、または、そうではなく、細胞を、本開示の阻害剤へと曝露するのに使用される方法に関わらず、宿主細胞内の組換えＤＮＡ配列の存在を確認するために、様々なアッセイを実施することができる。このようなアッセイは、例えば、サザンおよびノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲならびにＰＣＲなど、当業者に周知の「分子生物学」アッセイ；例えば、免疫学的手段（ＥＬｌＳＡおよびウェスタンブロット）または本明細書で記載されるアッセイにより、特定のペプチドの存在または非存在を検出して、本開示の範囲内に収まる薬剤を同定するアッセイなどの「生化学」アッセイを含む。
【０４９６】
パッケージングベクターおよび細胞株。ＣＡＲは、パッケージングベクターおよび細胞株を使用することにより、レンチウイルスまたはレトロウイルスパッケージング系へとパッケージングすることができる。パッケージングプラスミドは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクターを含むがこれらに限定されない。パッケージングベクターは、遺伝子物質の、細胞への送達を容易とするエレメントおよび配列を含有する。例えば、レトロウイルス構築物は、複製能力のないレトロウイルスベクターをパッケージングするのに要求される全てのビリオンタンパク質をトランスでコードする、複製能力のないレトロウイルスゲノムに由来する、少なくとも１つのレトロウイルスヘルパーＤＮＡ配列を含む、パッケージングプラスミドであり、複製能力のあるヘルパーウイルスの産生を伴わずに、高力価で、複製能力のないレトロウイルスベクターをパッケージングすることが可能なビリオンタンパク質を作製するためのレトロウイルス構築物である。レトロウイルスＤＮＡ配列は、ウイルス５’ＬＴＲの、天然のエンハンサーおよび／またはプロモーターをコードする領域を欠き、ヘルパーゲノムをパッケージングする一因となるプサイ機能配列、および３’ＬＴＲの両方を欠くが、外来のポリアデニル化部位、例えば、ＳＶ４０ポリアデニル化部位と、ウイルスの産生が所望される細胞型内の効率的な転写を導く外来のエンハンサーおよび／またはプロモーターとをコードする。レトロウイルスは、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）、またはテナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）などの白血病ウイルスである。外来のエンハンサーおよびプロモーターは、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）最初期（ＩＥ）エンハンサーおよびプロモーター、モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭＭＳＶ）のエンハンサーおよびプロモーター（Ｕ３領域）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のＵ３領域、脾臓病巣形成ウイルス（Ｓｐｌｅｅｎ  Ｆｏｃｕｓ  Ｆｏｒｍｉｎｇ  Ｖｉｒｕｓ）（ＳＦＦＶ）のＵ３領域、または天然のモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）プロモーターへと接続されたＨＣＭＶ  ＩＥエンハンサーでありうる。レトロウイルスパッケージングプラスミドは、プラスミドベースの発現ベクターによりコードされる、２つのレトロウイルスヘルパーＤＮＡ配列からなることが可能であり、この場合、例えば、第１のヘルパー配列は、同種指向性（ｅｃｏｔｒｏｐｉｃ）であるＭＭＬＶまたはＧＡＬＶのｇａｇおよびｐｏｌタンパク質をコードするｃＤＮＡを含有し、第２のヘルパー配列は、ｅｎｖタンパク質をコードするｃＤＮＡを含有する。宿主範囲を決定するｅｎｖ遺伝子は、異種指向性（ｘｅｎｏｔｒｏｐｉｃ）、両種指向性（ａｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ）、同種指向性、多種指向性（ｐｏｌｙｔｒｏｐｉｃ）（ミンク病巣形成）、もしくは１０Ａ１マウス白血病ウイルスｅｎｖタンパク質、またはテナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）ｅｎｖタンパク質、ヒト免疫不全症ウイルスｅｎｖ（ｇｐ１６０）タンパク質、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）Ｇタンパク質、ヒトＩ型およびＩＩ型Ｔ細胞白���病（ＨＴＬＶ）ｅｎｖ遺伝子産物をコードする遺伝子、前述のｅｎｖ遺伝子のうちの１もしくは複数の組合せに由来するキメラエンベロープ遺伝子、または前述のｅｎｖ遺伝子生成物の細胞質ドメインおよび膜貫通ドメインをコードするキメラエンベロープ遺伝子、および所望の標的細胞上の特異的表面分子を指向するモノクローナル抗体に由来しうる。
【０４９７】
パッケージング工程では、パッケージングプラスミドと、ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲを発現させるレトロウイルスベクターとを、ヒト胎児性腎細胞、例えば、２９３細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１５７３、ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．）など、ウイルスを産生することが可能な、哺乳動物細胞の第１の集団へと一過性に共トランスフェクトして、高力価の組換えレトロウイルス含有上清を作製する。本発明の別の方法では、次いで、この、一過性にトランスフェクトされた細胞の第１の集団を、哺乳動物の標的細胞、例えば、ヒトリンパ球と共培養して、標的細胞に、外来遺伝子を、高効率で形質導入する。本発明のさらに別の方法では、上記で記載した一過性にトランスフェクトされた細胞の第１の集団に由来する上清を、哺乳動物の標的細胞、例えば、ヒトリンパ球または造血幹細胞とインキュベートして、標的細胞に、外来遺伝子を、高効率で形質導入する。
【０４９８】
別の態様では、パッケージングプラスミドを、ヒト胎児性腎細胞、例えば、２９３細胞など、ウイルスを産生することが可能な、哺乳動物細胞の第１の集団内で安定的に発現させる。レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターは、選択可能なマーカーによる共トランスフェクションまたは偽型ウイルスの感染により、細胞へと導入する。いずれの場合にも、ベクターは、組み込まれる。代替的に、ベクターは、エピソームで維持されたプラスミドに導入することができる。高力価の組換えレトロウイルス含有上清が作製される。
【０４９９】
Ｔ細胞の活性化および拡大：所望のＣＡＲを発現させるＴ細胞の遺伝子的改変の前であれ、後であれ、細胞は、米国特許第６，３５２，６９４号；同第６，５３４，０５５号；同第６，９０５，６８０号；同第６，６９２，９６４号；同第５，８５８，３５８号；同第６，８８７，４６６号；同第６，９０５，６８１号；同第７，１４４，５７５号；同第７，０６７，３１８号；同第７，１７２，８６９号；同第７，２３２，５６６号；同第７，１７５，８４３号；同第５，８８３，２２３号；同第６，９０５，８７４号；同第６，７９７，５１４号；同第６，８６７，０４１号において記載されている方法など、一般に公知の方法を使用して、活性化させ、拡大することができる。ｅｘ  ｖｉｖｏにおけるＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ抗原による刺激は、選択されたＣＡＲを発現させるＴ細胞亜集団を活性化させ、拡大することができる。代替的に、細胞は、ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ抗原との相互作用により、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて活性化させることができる。
【０５００】
当技術分野では、対象となる細胞を活性化させる方法が周知であり、本出願にたやすく適応させることができ；例示的な方法については、下記の実施例で記載する。本開示と関連する使用のための単離法は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）システム活性化および拡大キット；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈｏｓｆｌｏｗ（商標）活性化キット、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＭＡＣＳ（商標）活性化／拡大キット、および対象となる細胞の活性化部分に特異的な、他の市販の細胞キットを含むがこれらに限定されない。免疫細胞の特定の亜集団は、ビーズまたはこのようなキットにおいて利用可能な他の薬剤を使用することにより活性化させるかまたは拡大することができる。例えば、α−ＣＤ３／α−ＣＤ２８  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）を使用して、単離Ｔ細胞の集団を活性化させ、拡大することができる。
【０５０１】
ＩＩＩ．使用法
治療的適用。本開示のＣＡＲ  Ｔ細胞を使用して、腫瘍およびがんを処置することができる。本発明のＣＡＲ−Ｔ細胞は、単独で投与することもでき、希釈剤、公知の抗がん治療剤、および／またはサイトカインもしくは免疫刺激性である他の細胞集団など、他の構成要素と組み合わせて投与することもできる。
【０５０２】
従って、本開示の方法態様は、それを必要とする対象における腫瘍の増殖を阻害し、かつ／またはそれを必要とするがん患者を処置するための方法に関する。一部の実施形態では、腫瘍は、固形腫瘍またはＢ細胞リンパ腫もしくは白血病である。一部の実施形態では、腫瘍／がんは、甲状腺腫瘍／甲状腺がん、乳房の腫瘍／乳がん、結腸腫瘍／卵巣がん、絨毛腫瘍／卵巣がん、卵巣腫瘍／卵巣がん、または前立腺腫瘍／前立腺がん、またはＢ細胞リンパ腫もしくは白血病である。一部の実施形態では、腫瘍またはがんは、ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲを発現または過剰発現させる。ある特定の実施形態では、これらの方法は、対象または患者へと、有効量の単離細胞を投与するステップを含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる。さらなる実施形態では、この単離細胞は、ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲを含む。なおさらなる実施形態では、単離細胞は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞である。一部の実施形態では、単離細胞は、処置される対象または患者に対して自家である。さらなる態様では、腫瘍は、ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ抗原を発現させ、対象は、本明細書で記載される診断法などの診断法により、治療のために選択されている。
【０５０３】
本明細書で開示されるＣＡＲ細胞は、単独で投与することもでき、希釈剤、公知の抗がん治療剤、および／またはサイトカインもしくは免疫刺激性である他の細胞集団など、他の構成要素と組み合わせて投与することもできる。これらを、第１選択治療、第２選択治療、第３選択治療、またはさらなる治療として投与することができる。したがって、開示されるＣＡＲを他の治療（例えば、化学療法、放射線など）と組み合わせることができる。さらなる治療の非限定的な例は、化学療法剤または生物学的薬剤を含む。適切な処置レジメンは、主治医または主治獣医が決定する。
【０５０４】
一部の実施形態では、開示されるＣＡＲは、腫瘍組織の切除により形成される腔に送達もしくは投与することができ（すなわち、腔内送達）、または切除前に直接腫瘍に送達もしくは投与することができる（すなわち、腫瘍内送達）。一部の実施形態では、開示されるＣＡＲは、静脈内投与、髄腔内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与することができ、または他の適切な投与手段により投与することができる。
【０５０５】
本発明の医薬組成物は、処置または防止される疾患に適切な形で投与することができる。投与の数量および頻度は、患者の状態、ならびに患者の疾患の種類および重症度などの因子により決定されるが、適切な投与量は、臨床試験により決定することができる。
【０５０６】
ＩＶ．担体
本発明のさらなる態様は、担体と、本明細書で開示される実施形態において記載される生成物（例えば、ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲを含む単離細胞、任意の抗ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ抗体またはＣＡＲ細胞のための単離核酸、ベクター、単離細胞、抗ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ）のうちの１または複数とを含む組成物に関する。
【０５０７】
略述すると、特許請求される組成物のうちのいずれか１つを含むがこれに限定されない、本発明の医薬組成物は、１または複数の、薬学的または生理学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせた、本明細書で記載される標的細胞集団を含みうる。このような組成物は、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水などの緩衝液；グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールなどの炭水化物；タンパク質；ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸；抗酸化剤；ＥＤＴＡまたはグルタチオンなどのキレート剤；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；および保存剤を含みうる。本開示の組成物は、経口、静脈内、局所、経腸、および／または非経口投与のために製剤化することができる。ある特定の実施形態では、本開示の組成物を、静脈内投与のために製剤化する。
【０５０８】
細胞または組成物の投与を、１用量で、連続的に、または処置過程を通して間欠的に行うことができる。投与の最も有効な手段および投与量を決定する方法は、当業者に公知であり、治療に使用される組成物、治療の目的、および処置される対象によって変化するであろう。単回または複数回投与を行うことができ、用量レベルおよびパターンは、主治医により選択される。適切な投与製剤、および薬剤の投与方法は、当技術分野で公知である。さらなる態様では、本発明の細胞および組成物を他の処置と組み合わせて投与することができる。
【０５０９】
細胞および細胞集団は、当技術分野で公知のおよび例えばＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０６４１９１に記載されている方法を使用して、宿主に投与される。本発明の細胞または組成物のこの投与を行って、実験アッセイおよびスクリーニングアッセイのための、所望の疾患、障害または状態の動物モデルを作出することができる。
【０５１０】
本発明のさらなる態様は、担体と、本明細書で開示される実施形態において記載される生成物（例えば、ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲを含む単離細胞、任意の抗ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ抗体またはＣＡＲ細胞のための単離核酸、ベクター、単離細胞、抗ＬＨＲ、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＧまたはＨＬＡ−ＤＲ）のうちの１または複数とを含む組成物に関する。
【０５１１】
略述すると、特許請求される組成物のうちのいずれか１つを含むがこれに限定されない、本発明の医薬組成物は、１または複数の、薬学的または生理学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせた、本明細書で記載される標的細胞集団を含みうる。このような組成物は、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水などの緩衝液；グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールなどの炭水化物；タンパク質；ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸；抗酸化剤；ＥＤＴＡまたはグルタチオンなどのキレート剤；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；および保存剤を含みうる。本開示の組成物は、経口、静脈内、局所、経腸、および／または非経口投与のために製剤化することができる。ある特定の実施形態では、本開示の組成物を、静脈内投与のために製剤化する。
【０５１２】
略述すると、特許請求される組成物のうちのいずれか１つを含むがこれに限定されない、本発明の医薬組成物は、１または複数の、薬学的または生理学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせた、本明細書で記載される標的細胞集団を含みうる。このような組成物は、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水などの緩衝液；グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールなどの炭水化物；タンパク質；ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸；抗酸化剤；ＥＤＴＡまたはグルタチオンなどのキレート剤；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；および保存剤を含みうる。本発明の組成物は、静脈内投与のために製剤化することが好ましい。
【０５１３】
本開示の医薬組成物は、処置または防止される疾患に適切な形で投与することができる。投与の数量および頻度は、患者の状態、ならびに患者の疾患の種類および重症度などの因子により決定されるが、適切な投与量は、臨床試験により決定することができる。
【０５１４】
以下の実施例は、本開示を実行に移す際、様々な場合に使用することができる手順の説明に役立つ。
【実施例】
【０５１５】
（実施例１）
マウス抗ＬＨＲモノクローナル抗体の作出
ＬＨＲのリシンに富む細胞外ホルモン結合性ドメインに対する抗体を、４週齢のＢＡＬＢ／ｃおよびＮＩＨ  Ｓｗｉｓｓマウスの、遺伝子操作されたＬＨＲ−Ｆｃによる免疫化の反復を介して作出した。下記の図３に示される通り、ヒトＬＨＲ  Ｇタンパク質のリーダー配列および最初の部分を使用して、高結合性抗体を作出し、同定する、免疫化およびスクリーニング法において使用されるＬＨＲ−Ｆｃを作出した。フローサイトメトリーは既に、ＣＡＲ作出のための機能的な抗体の最良の予測法であることが示されているので、この方法を使用して、研究室で実施した、７回を超える融合から、潜在的な候補抗体を同定した。ＬＨＲ−Ｆｃでコーティングしたプレートを使用する初期のＥＬＩＳＡスクリーニングで陽性のハイブリドーマについて、典型的なフローサイトメトリースクリーニングを、ＥＳ−２卵巣癌細胞株を使用して下記の図４に示す。この図で、ハイブリドーマである８Ｂ７について見られる通り、稀なＬＨＲハイブリドーマだけがフローサイトメトリーによる高ＭＦＩをもたらすことが示された。次いで、これらの少数の候補ハイブリドーマを、９６ウェルプレート内の希釈によりサブクローニングし、バイアル内での凍結のために拡大した。フローサイトメトリーによるさらなるスクリーニングの後、特異的サブクローンを、２Ｌの容器（ＧＲｒｅｘ、１００Ｌ、Ｗｏｌｆｓｏｎ）を使用する大スケールの作製のために選択した。次いで、濾過された上清を、研究室で慣例的に実施されるタンデム（ｔａｎｄｏｎ）のプロテインＡまたはＧおよびイオン交換クロマトグラフィー法を使用して抗体精製に供した。精製したら、下記で記載される、ＬＨＲ  ＣＡＲの構築のために使用される、単鎖遺伝子の操作を容易とするように、８Ｂ７−３、５Ｆ４−２１、５Ｂ１−１、２Ｈ１１−３７、および１３８−２と指定される、５つの抗体サブクローンを配列決定した。比較のために、選択された５つのハイブリドーマサブクローンを、ＥＳ−２ヒト卵巣癌細胞株上で、フローサイトメトリーにより調べて、それらの相対平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示した（図５）。
【０５１６】
（実施例２）
卵巣がん内のＬＨＲの発現を検出する、抗ＬＨＲモノクローナル抗体
全体的な仮説は、卵巣がんを、ＬＨＲキメラ抗原受容体で改変されたＴ細胞で、有効かつ安全に処置しうることである。標的として、ＬＨＲは、卵巣がん上のその共通の発現と、正常ヒト組織上のその発現の欠如とのために、他の標的を上回る著明な利点を有する。ＬＨＲ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおいて作製して、その後の臨床試験、または二重ターゲティングＣＡＲ改変Ｔ細胞を伴う使用のための、潜在的な臨床候補を同定する。
【０５１７】
単鎖ＬＨＲ抗体遺伝子の構築および合成
５つの高結合性抗ＬＨＲ抗体のＤＮＡ配列（８Ｂ７−３、５Ｆ４−２１、５Ｂ１−１、２Ｈ１１−３７、および１３８−２）は、ＭＣＬＡＢ（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）により配列決定された。５つの抗体全てを試験して、下記で記載されるアッセイにおいて、どの抗体が、最も有効なＣＡＲをもたらすのかを決定する。下記の図６に示される通り、以下のタンデム遺伝子：コザックコンセンサス配列；ＣＤ８シグナルペプチド；抗ＬＨＲ重鎖可変領域；（グリシン４セリン）３可撓性ポリペプチドリンカー；それぞれの抗ＬＨＲ軽鎖可変領域；ＣＤ８ヒンジおよび膜貫通ドメイン；ならびにＣＤ２８、４−１ＢＢ、およびＣＤ３ζ細胞内共刺激性シグナル伝達ドメインからなる第３世代ＣＡＲベクターを構築した。当技術分野では、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、およびシグナル伝達ドメインのＤＮＡ配列が公知であった（米国特許出願第２０１３０２８７７４８Ａ１号を参照されたい）。抗ＬＨＲ  ＣＡＲ遺伝子は、ベクター宿主にアンピシリン耐性を付与する、ベータ−ラクタマーゼ（「ｂｌａ」）遺伝子を含有するｐＵＣ５７ベクター骨格内で合成することができる。本明細書では、ｐＵＣ５７ベクター配列を、掲載したＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号において開示されているベータ−ラクタマーゼ遺伝子の配列を伴うＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号：Ｙ１４８３７に言及することにより開示する。掲載したＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号と関連する配列は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０５１８】
ＣＡＲ遺伝子の、レンチウイルスプラスミドへのサブクローニング
ＮｏｖａＢｌｕｅ  Ｓｉｎｇｌｅｓ（商標）化学的コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞を、抗ＬＨＲプラスミドｃＤＮＡで形質転換した。形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ細胞の増殖後、ＣＡＲプラスミドを精製し、一晩にわたるＴ４  ＤＮＡリガーゼ反応（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を介して、ＨＩＶ−１末端反復（ＬＴＲ）、パッケージングシグナル（Ψ）、ＥＦ１αプロモーター、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、およびウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含有するＨＩＶ−１ベースのレンチウイルスベクターへと挿入されるように、適切な制限酵素で消化した。次いで、ＮｏｖａＢｌｕｅ  Ｓｉｎｇｌｅｓ（商標）化学的コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞を、結果として得られる、抗ＬＨＲを含有するレンチウイルスプラスミドで形質転換する。
【０５１９】
レンチウイルス粒子の作製
トランスフェクションの前に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０ｍＬのｃｏｍｐｌｅｔｅ−Ｔｅｔ−ＤＭＥＭ中に、１００ｍｍの組織培養処理プレート１枚当たりの細胞４．０×１０６個で播種し、加湿された５％ＣＯ２インキュベーター内、３７℃で、一晩にわたりインキュベートした。８０〜９０％コンフルエントに達したら、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ＣＡＲ遺伝子のレンチウイルスプラスミドと、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に結合するプラスミド含有ナノ粒子の形成を容易とするように、レンチウイルスのエンベロープ構成要素およびカプシド構成要素を形成するのに必要な遺伝子を含有するレンチウイルスパッケージングプラスミドとを共トランスフェクトした。トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞培養物を、３７℃で、４時間にわたりインキュベートした後で、トランスフェクション培地を、新鮮なｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｔｅｔ  ＤＭＥＭ  １０ｍＬで置きかえた。次いで、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、さらなる４８時間にわたりインキュベートし、その後、細胞上清を採取し、主要なレンチウイルスカプシドタンパク質である、ｐ２４に対するサンドイッチＥＬＩＳＡを介して、レンチウイルス粒子について調べる。レンチウイルス含有上清をアリコートに分け、標的であるＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞に形質導入するために使用するまで、−８０℃で保管した。
【０５２０】
ヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋末梢血Ｔ細胞の精製、活性化、および濃縮
Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；Ｌｉｔｔｌｅ  
Ｃｈａｌｆｏｎｔ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）を伴う密度勾配遠心分離により濃縮された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、０．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および２ｍＭのＥＤＴＡを含有するＰＢＳを伴う遠心分離により回収および洗浄した。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞についてポジティブ選択するように、磁気的に活性化させたＬＳカラムを使用して、これらのヒトＴ細胞サブセットを単離するのに、ＭＡＣＳ  ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）キットを使用することができる。次いで、磁気的に結合したＴ細胞を、ＭＡＣＳ磁気分離器から取り出し、ＬＳカラムからフラッシュ洗浄し、新鮮な完全培地中で洗浄した。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞集団の純度は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ａｃｏｕｓｔｉｃ  Ａｔｔｕｎｅ（登録商標）Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを使用するフローサイトメトリーにより評価し、必要な場合、ＵＳＣのフローサイトメトリーコア施設で実施される蛍光活性化細胞分取により濃縮した。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、適切な細胞培養容器内で、１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を補充された完全培地中、１ｍＬ当たりの細胞１．０×１０６個の密度で維持し、これに、α−ＣＤ３／α−ＣＤ２８  Ｈｕｍａｎ  Ｔ−ｃｅｌｌ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を添加して、培養Ｔ細胞を活性化させた。ＣＡＲ−レンチウイルス粒子で形質導入する前に、Ｔ細胞を、５％ＣＯ２インキュベーター内、３７℃で、２日間にわたりインキュベートした。
【０５２１】
ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のレンチウイルス形質導入
活性化Ｔ細胞を回収し、死細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離、またはＭＡＣＳ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｍｏｖａｌ  Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）の使用により除去した。６ウェルプレートに、活性化Ｔ細胞を、１ｍＬの完全培地当たりの細胞１．０×１０６個の濃度で播種した。種々のウェルに対して、ＬＨＲ  ＣＡＲ含有レンチウイルス粒子を、細胞懸濁液へと、１、５、１０、および５０など、感染多重度（ＭＯＩ）を変化させて添加した。レンチウイルス粒子と、標的細胞表面との間の相互作用を容易とすることにより、形質導入を支援するカチオン性ポリマーであるポリブレンを、４μｇ／ｍＬの最終濃度で添加した。プレートを、３２℃、８００×ｇで、１時間にわたり遠心分離した。遠心分離後、レンチウイルス含有培地を吸引し、細胞ペレットを、１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む、新鮮な完全培地中に再懸濁させた。細胞を、５％ＣＯ２の加湿されたインキュベーター内、３７℃で一晩にわたり静置した。形質導入の３日後、細胞をペレット化させ、ＩＬ−２および４００μｇ／ｍＬのジェネティシン（Ｇ４１８スルフェート）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を含む、新鮮な完全培地中に再懸濁させた。ＬＨＲ  ＣＡＲ改変Ｔ細胞は、フローサイトメトリーおよびサザンブロット解析により評価して、形質導入手順の成功を裏付けた。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏアッセイの前に、ＬＨＲ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、ＦＡＣＳにより濃縮し、ｉｎ  ｖｉｖｏ研究のために、１：１に混合した。
【０５２２】
カルセイン放出細胞傷害アッセイによる、ＣＡＲの有効性についてのｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価
ＬＨＲ抗原陽性および陰性標的細胞を、回収し、洗浄し、完全培地中に１ｍＬ当たりの細胞１．０×１０６個の濃度で再懸濁させた。カルセインアセトキシメチル（ＡＭ）を、１５μＭで、標的細胞試料へと添加し、次いで、これを、５％ＣＯ２の加湿されたインキュベーター内、３７℃で、３０分間にわたりインキュベートした。染色した陽性および陰性標的細胞を、２回洗浄し、遠心分離により、完全培地中に再懸濁させ、ウェル１つ当たりの細胞１．０×１０４個で、９６ウェルプレートへと添加した。ＬＨＲ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、完全培地中に、５０：１、５：１、および１：１のエフェクター対標的細胞比で、プレートへと添加した。完全培地および２％のｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を伴う完全培地中に懸濁させた染色標的細胞を、それぞれ、自発的放出対照および最大放出対照として用いた。プレートを、３６５×ｇおよび２０℃で、２分間にわたり遠心分離してから、インキュベーターに戻して、３時間にわたり静置した。次いで、プレートを、１０分間にわたり遠心分離し、細胞上清を、黒色のポリスチレン製９６ウェルプレート上のそれぞれのウェルへとアリコートに分け、Ｂｉｏ−Ｔｅｋ（登録商標）Ｓｙｎｅｒｇｙ（商標）ＨＴマイクロプレートリーダー上、それぞれ４８５／２０ｎｍおよび５２８／２０ｎｍの励起および発光で、蛍光について評価した。
【０５２３】
Ｌｕｍｉｎｅｘバイオアッセイによるヒトサイトカインの定量化
当技術分野で公知の標準的な手順を使用して、ＬＨＲ  ＣＡＲ改変Ｔ細胞ならびにＬＨＲ陽性および陰性腫瘍細胞株の上清を、ＣＡＲ  Ｔ細胞活性化の尺度としてのサイトカインの分泌について測定した。バックグラウンドの活性を同定するために、活性化されていないヒトＴ細胞を使用して、データを、培地単独および培養物と比較した。ＩＬ−２、ＩＦＮ−ｇ、ＩＬ−１２、および他の関連するサイトカインの濃度を、インキュベーション工程中の時間にわたり測定した。
【０５２４】
２つの卵巣がん異種移植片モデルにおける、ＣＡＲ  Ｔ細胞有効性についてのｉｎ  ｖｉｖｏ評価
２つの異なるヒト卵巣細胞異種移植片腫瘍モデルを使用して、ＬＨＲ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、さらに評価する。第１のモデルでは、５×１０６個のＬＨＲ陽性卵巣がん細胞株またはＬＨＲ陰性固形腫瘍細胞株の注射により、ヒト卵巣固形腫瘍を、ヌードマウスの皮下において確立する。腫瘍が、０．５ｃｍの直径に達したら、マウス（ｎ＝５）の群を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究の結果に基づき、最も活性のＬＨＲ抗体から構築された１または３×１０７個の、陰性対照としてのヒトＴ細胞またはＬＨＲ  ＣＡＲで、静脈内において処置する。次いで、腫瘍容量を、キャリパーにより、毎週３回測定し、容量増大曲線を作成して、実験的処置の、対照を上回る有効性を裏付ける。Ｃｈｅｋｍａｓｏｖａら（Ｃｈｅｋｍａｓｏｖａ，  Ａ．  Ａ．ら（２０１０年）、Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１６巻：３５９４〜６０６頁）から改変された、第２の腫瘍モデルでは、６〜８週齢のＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γ−鎖−／−雌マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）の群（ｎ＝５）に、ＬＨＲ陽性または陰性（対照）ヒト細胞株に由来する、３×１０６個のＧＦＰトランスフェクト腫瘍細胞を腹腔内注射する。しかし、植込みの７日後にマウスを処置したＣｈｅｋｍａｓｏｖａら（Ｃｈｅｋｍａｓｏｖａ，  Ａ．  Ａ．ら（２０１０年）、Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１６巻：３５９４〜６０６頁）と異なり、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法は、植込みの３週間後における、腹水の確立まで開始しない。この時点で、１または３×１０７個のＬＨＲ  ＣＡＲ  Ｔ細胞調製物を、腹腔内注射し、次いで、その後毎週、腫瘍容量を、蛍光イメージングによりモニタリングする。腫瘍の進行を示すマウスは、適切な時点で屠殺して、有病状態を緩和する。対照処置群の生存と、実験的処置群の生存とを比較するために、マウスの生存についてのカプランマイヤープロットを、データから作成する。屠殺時に、ヒト特異的抗体およびフローサイトメトリーを使用して血液および腹水を、ＣＡＲ  Ｔ細胞の存在について解析する。加えて、サイトカインの分泌を、Ｌｕｍｉｎｅｘビーズアッセイ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）により、ＣＡＲ  Ｔ細胞活性化の尺度としての、１型および２型サイトカインについて定量化する。
【０５２５】
二重発現ＣＡＲ改変Ｔ細胞による研究
ＬＨＲ  ＣＡＲ改変Ｔ細胞の特異性を増大させるために、ＭＵＣ−ＣＤまたはメソテリン単鎖を含む、二重ＬＨＲ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を調製する。二重ターゲティングＣＡＲ  Ｔ細胞の原理は、ＥＲＢ／２およびＭＵＣ１（Ｗｉｌｋｉｅ，  Ｓ．ら（２０１２年）、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３２巻：１０５９〜１０７０頁）、メソテリンおよびα−葉酸受容体（Ｌａｎｉｔｉｓ，  Ｅ．ら（２０１３年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｓ．、１巻：４５〜５３頁）を使用する乳がんにおいて成功裏に試験され、前立腺がんの処置のためのＰＳＭＡおよびＰＳＣＡ（Ｋｌｏｓｓ，  Ｃ．  Ｃ．ら（２０１３年）、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３１巻：７１〜７５頁）について成功裏に試験された。ムチンファミリーメンバーである、ＭＵＣ１６は、大半の卵巣がん上で過剰発現し、卵巣がんの進行および検出のための確立された代理血清マーカー（ＣＡ１２５）である。ＭＵＣ１６は、切断される大型のドメインであるＣＡ１２５と、細胞外断片、膜貫通ドメイン、および細胞質テールを含有する保持ドメイン（ＭＵＣ−ＣＤ）とからなる（Ｒａｏ，  Ｔ．  Ｄ．ら（２０１０年）、Ａｐｐｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．  Ｍｏｌ．  Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ、１８巻：４６２〜４７２頁）。ＭＵＣ１６はまた、子宮、子宮内膜、卵管、卵巣、ならびに腹腔および胸腔の漿膜においても、低レベルで発現する。ＣＡＲ改変ＭＵＣ−ＣＤターゲティングＴ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける、ヒト卵巣がん細胞株に対する、効果的なＭＵＣ−ＣＤ特異的細胞溶解活性のほか、ＳＣＩＤ−Ｂｅｉｇｅマウスにおける、確立された腹膜卵巣腫瘍の根絶の成功も呈した（Ｃｈｅｋｍａｓｏｖａ，  Ａ．  Ａ．ら（２０１０年）、Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１６巻：３５９４〜６０６頁）。よって、ＭＵＣ−ＣＤは、ＣＡＲ療法のために用いることが可能な標的であり、潜在的なオン標的オフ腫瘍効果（ｏｎ−ｔａｒｇｅｔ  ｏｆｆ−ｔｕｍｏｒ  ｅｆｆｅｃｔ）を低減する、二重ターゲティングＣＡＲ改変Ｔ細胞のための優れた選択肢である。ＭＵＣ−ＣＤ  ＣＡＲ改変Ｔ細胞およびメソテリンＣＡＲ改変Ｔ細胞の両方とも、有効であることが示されており、ＬＨＲと組み合わせて、最適な臨床使用に要求されると、より安全な代替物を提供しうる。
【０５２６】
データおよび統計学的解析の計画
ｉｎ  ｖｉｔｒｏカルセイン放出アッセイのためには、一元ＡＮＯＶＡに続き、一元ＡＮＯＶＡにおいて有意性（ｐ＜０．０５）が見出される場合、適切な多重比較検定を使用して、溶解した標的細胞のパーセントを比較する。腹水異種移植片モデルの実験群および対照群において使用されるＣＡＲ  Ｔ細胞の間で、生存を比較するために、カプランマイヤープロットを構築し、ログランク検定を使用して、有意性（ｐ＜０．０５）について検定する。皮下腫瘍モデルのためには、ＡＮＯＶＡを使用して、腫瘍容量曲線を比較するのに続き、ＡＮＯＶＡにおいて有意性（ｐ＜０．０５）が見出される場合、適切な多重比較検定を行う。
【表１】
2020501512.tif 000003
【表２】
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【表３−１】
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【表３−２】
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【表４】
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【表５】
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【０５２７】
実施例３
抗ＬＨＲ  ＣＡＲ  Ｔ細胞
ＣＡＲレンチウイルス構築物の構築
ＣＡＲは、ＬＨＲに結合する、細胞外抗原結合性部分またはｓｃＦＶからなる。ｓｃＦＶは、ＣＤ８ヒンジ領域を介して、ＣＤ８膜貫通領域を含む細胞質シグナル伝達ドメイン、ならびにＣＤ２８、４−１ＢＢ、およびＣＤ３ｚに由来するシグナル伝達ドメインへと接続される。シグナル伝達ドメインを含む全ＣＡＲ配列は、合成により、Ｇｅｎｅｗｉｚ  Ｇｅｎｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）が合成した（図１０）。プラスミドを精製し、一晩にわたるＴ４  ＤＮＡリガーゼ反応（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を介して、ＨＩＶ−１  ５’および３’末端反復（ＬＴＲ）、パッケージングシグナル（Ψ）、ＥＦ１αプロモーター、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、およびサルウイルス４０起点（ＳＶ４０）を含有するＨＩＶ−１ベースのバイシストロニックレンチウイルスベクター（ｐＬＶＸ−ＩＲＥＳ−ＺｓＧｒｅｅｎ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｓｉｇｎａｌ  Ｈｉｌｌ、ＣＡ）へと挿入するように、適切な制限酵素で消化する。次いで、ＮｏｖａＢｌｕｅ  Ｓｉｎｇｌｅｓ（商標）化学的コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞を、結果として得られる、ＬＨＲ−ＣＡＲを含有するレンチウイルスプラスミドで形質転換する。
【０５２８】
レンチウイルス粒子の作製
トランスフェクションの前に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０％透析ＦＣＳを補充した、２０ｍＬのＤＭＥＭ中に、１５０ｃｍ２の組織培養処理フラスコ１つ当たりの細胞４．０×１０６個で播種し、加湿された５％ＣＯ２インキュベーター内、３７℃で、一晩にわたりインキュベートする。８０〜９０％コンフルエントに達したら、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、３７℃で５％ＣＯ２の加湿されたインキュベーター内のペニシリン／ストレプトマイシンを伴わない、１％の透析ＦＣＳを補充した、２０ｍｌのＤＭＥＭ中、２時間にわたりインキュベートする。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、特異的ｐＬＶＸ−ＣＡＲプラスミドと、レンチウイルスのエンベロープ構成要素およびカプシド構成要素を形成するのに必要な遺伝子を含有するレンチウイルスパッケージングプラスミドとを共トランスフェクトする。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に結合するプラスミド含有ナノ粒子の形成を容易とするように、特許権のある反応緩衝液およびポリマーもまた添加する。トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞培養物を、３７℃で、２４時間にわたりインキュベートした後で、トランスフェクション培地を、新鮮な完全ＤＭＥＭ  ２０ｍＬで置きかえる。レンチウイルス上清を、２４時間ごと、３日間にわたり回収し、上清を、４℃、１，２５０ｒｐｍで、５分間にわたりスピンダウンするのに続き、濾過滅菌および超遠心分離機内、４℃、２０，０００ｇで、２時間にわたる遠心分離を行う。濃縮されたレンチウイルスは、長期にわたる保管のために、７％のトレハロースおよび１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中に再懸濁させる。レンチウイルスを、アリコートに分け、標的であるＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞に形質導入するために使用するまで、−８０℃で保管する。２４時間後に採取した細胞上清を、主要なレンチウイルスカプシドタンパク質である、ｐ２４に対するサンドイッチＥＬＩＳＡを介して、レンチウイルス粒子について調べる。タンパク質マーカーであるＺｓＧｒｅｅｎの発現により決定されるトランスフェクション効率は、蛍光顕微鏡下の可視化により、２０％〜５０％の間であると推定された。
【０５２９】
ヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋末梢血Ｔ細胞の精製、活性化、および濃縮
Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）を伴う密度勾配遠心分離により濃縮された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、０．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および２ｍＭのＥＤＴＡを含有するＰＢＳを伴う遠心分離により回収および洗浄する。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞についてのネガティブ選択を使用して、これらのヒトＴ細胞サブセットを磁気的に単離するのに、Ｔ細胞濃縮キット（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用する。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞集団の純度は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ａｃｏｕｓｔｉｃ  Ａｔｔｕｎｅ（登録商標）Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを使用するフローサイトメトリーにより評価し、蛍光活性化細胞分取により濃縮する。１：１に混合されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、適切な細胞培養容器内で、１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を補充された完全な５０％のクリック培地／５０％のＲＰＭＩ−１６４０培地中、１ｍＬ当たりの細胞１．０×１０６個の密度で維持し、これに、α−ＣＤ３／α−ＣＤ２８  Ｈｕｍａｎ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｏｒビーズ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加して、培養Ｔ細胞を活性化させる。Ｔ細胞に、ＣＡＲレンチウイルス粒子を用いて形質導入する前に、５％ＣＯ２インキュベーター内、３７℃で、２日間にわたりインキュベートする。
【０５３０】
ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のレンチウイルス形質導入
活性化Ｔ細胞を回収し、死細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離、またはＭＡＣＳ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｍｏｖａｌ  Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）の使用により除去する。６ウェルプレートに、活性化Ｔ細胞を、完全培地中、１ｍＬ当たりの細胞１．０×１０６個の濃度で播種する。細胞に、細胞へのトランスフェクション補助剤である、Ｌｅｎｔｉｂｌａｓｔ（Ｏｚ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を補充したレンチウイルス粒子を用いて形質導入する。形質導入された細胞を、加湿された５％ＣＯ２インキュベーター内、３７℃で、２４時間にわたりインキュベートする。次いで、遠心分離により、細胞をペレット化させ、培地を交換するのに続き、Ｔ−ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｏｒビーズ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を添加する。
【０５３１】
ｍＲＮＡ発現についてのＲＴ−ＰＣＲ
形質導入されたＴ細胞に由来するｍＲＮＡは、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  ＲＮＡキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｓｉｇｎａｌ  Ｈｉｌｌ、ＣＡ）を使用して単離する。ＲＴ−ＰＣＲは、以下のプライマー：５’ＣＧＣＣＴＧＴＧＡＴＡＴＣＴＡＣＡＴＣＴＧＧＧＣ３’（配列番号７３）および５’ＡＴＣＧＧＣＡＧＣＴＡＣＡＧＣＣＡＴＣＴ３’（配列番号７４）を使用する、ＯｎｅＴａｑ  Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＲＮＡキット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）を使用して行う。試料は、１％アガロースゲル上で泳動させる。
【０５３２】
細胞傷害アッセイ
ＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞傷害は、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）細胞傷害キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して決定する。活性化Ｔ細胞を回収し、１×１０６個の細胞に、上記で記載した、適切なＣＡＲレンチウイルス構築物を形質導入する。Ｔ−ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｏｒビーズ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して、２日間にわたり細胞を活性化させてから、細胞傷害アッセイを行った。製造元のプロトコールに従い、標的細胞の最適数を決定する。アッセイのために、適切な標的細胞を、５％ＣＯ２インキュベーター内、３７℃で、２４時間にわたり、９６ウェルプレート内で三連で平板培養するのに続き、活性化ＣＡＲ  Ｔ細胞を、２０：１、１０：１、５：１、および１：１の比で添加し、５％ＣＯ２インキュベーター内、３７℃で、２４時間にわたりインキュベートする。次いで、細胞を、３７℃で、４５分間にわたり溶解させ、１，２５０ｒｐｍで、５分間にわたり遠心分離する。上清を、未使用の９６ウェルプレートへと移すのに続き、反応混合物を、３０分間にわたり添加する。次いで、停止溶液を使用して、反応を停止させ、６５０ｎｍで吸光度補正して、プレートを、４５０ｎｍで読み取る。
【０５３３】
ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍退縮アッセイ
Ｆｏｘｎ１ヌルマウスに、ＬＨＲを発現させる卵巣腫瘍細胞株であるＳＫＯＶ３を注射する。０．２ｍＬの接種物を使用して、２００ｕｌのリン酸緩衝食塩水中の２×１０６個の細胞を、マウスの左脇腹へと注射する。αＣＤ３／ＣＤ２８  ａｃｔｉｖａｔｏｒ複合体（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して、ナイーブＴ細胞を、２日間にわたり活性化させる。次いで、活性化Ｔ細胞に、上記で記載したｐＬＶＸ−ＬＨＲ−ＣＡＲレンチウイルス粒子を用いて形質導入し、２日間にわたり活性化させる。ＬＨＲ  ＣＡＲを発現させる、２．５×１０６個の活性化Ｔ細胞を、腫瘍接種後７日目に、マウスへと静脈内注射する。ノギスを使用して、毎週２回、腫瘍サイズを評価し、容量を計算する。
【０５３４】
ＬＨＲ  ＣＡＲ  Ｔ細胞についての細胞傷害
標的細胞としてのＳＫＯＶ３卵巣がん細胞株を使用して、ＬＨＲ  ＣＡＲ−Ｔ細胞の細胞溶解活性について検討した。ＦＡＣＳ解析により、ＳＫＯＶ３は、ＬＨＲを発現させることが示された。ＣＡＲ  Ｔ細胞を、２０：１、１０：１、５：１、および１：１のエフェクター細胞  対  標的細胞比で添加した。２４時間のインキュベーション後、ＬＨＲ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、１０：１の比で、ＳＫＯＶ３を、有効に溶解し、３０％の溶解率を示した（図１１）。これと比較して、導入されていないＴ細胞は、使用されるエフェクター細胞  対  標的細胞比のいずれでも、何ら細胞傷害活性を示さなかった。
【０５３５】
ＬＨＲ  ＣＡＲについてのＲＮＡ発現
ＬＨＲ  ＣＡＲを形質導入されたＴ細胞から単離されるｍＲＮＡを使用するＲＴ−ＰＣＲは、キメラＣＡＲのｍＲＮＡの発現を示す（図１２）。ＲＴ−ＰＣＲは、ＣＤ８ヒンジドメインと、４−１ＢＢシグナル伝達ドメインとの間のキメラＣＡＲにわたるプライマーにより実施され、したがって、ＣＡＲの発現に対して、高度に特異的である。
【０５３６】
実施例４
マウス抗ヒトＢ７−Ｈ４モノクローナル抗体の作出
Ｂ７−Ｈ４−Ｆｃ融合タンパク質の構築
ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域へと融合させたヒトＢ７−Ｈ４シグナルおよび細胞外ドメインをコードする発現ベクターは、次の通り構築した：ヒトＢ７−Ｈ４のシグナルおよび細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡを、Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）から購入した完全長ｃＤＮＡからＰＣＲ増幅により作出した。ｃＤＮＡは、シグナル配列内の開始Ｍｅｔから、総タンパク質配列のＧｌｙ２３６にわたる。Ｂ７−Ｈ４の一次ＰＣＲは、５’および３’プライマーである５’−ＴＣＧ  ＡＴＣ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＧＣＣ  ＧＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＧＣＴ  ＴＣＣ  ＣＴＧ  ＧＧＧ  ＣＡＧ  ＡＴＣ−３’および５’−ＴＧＴ  ＧＴＧ  ＡＧＴ  ＴＴＴ  ＧＴＣ  ＡＧＣ  ＣＴＴ  ＴＧＡ  ＣＡＧ  ＣＴＧ−３’をそれぞれ用いて行った。５’プライマーである５’−ＣＴＡ  ＡＡＣ  ＴＣＡ  ＡＡＧ  ＧＣＴ  ＧＡＣ  ＡＡＡ  ＡＣＴ  ＣＡＣ  ＡＣＡ  ＴＧＣ  ＣＣＡ−３’および３’プライマーである５’−ＴＧＡ  ＴＴＡ  ＡＴＧ  ＡＴＣ  ＡＡＴ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＴＣＡ  ＴＴＴ  ＡＣＣ  ＣＧＧ  ＡＧＡ  ＣＡＧ  ＧＧＡ−３’を用いて、ヒトＩｇＧ１のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３部分をＰＣＲ増幅した。Ｂ７−Ｈ４の５’プライマーおよびヒトＦｃの３’プライマーをそれぞれ用いてアセンブリーすることにより、ｈｕＢ７−Ｈ４−Ｆｃをコードする遺伝子を作製した。
【化１】
2020501512.tif 000009
【０５３７】
次いで、Ｂ７Ｈ４−Ｆｃ融合遺伝子をＨｉｎｄ３およびＥｃｏＲＩで消化し、ｐＮ２４発現ベクターのＨｉｎｄ３およびＥｃｏＲＩ部位へと挿入して、発現ベクターであるｐＮ２４／Ｂ７−Ｈ４−Ｆｃを得た。
【０５３８】
Ｂ７−Ｈ４−Ｆｃ抗原の発現、精製および特徴付け
Ｂ７−Ｈ４−Ｆｃ融合タンパク質を、長期安定発現のためにＮＳ０マウス骨髄腫細胞において製造元のプロトコール（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ．）に従って発現させた。最高生産クローンを、３％の熱不活性化された透析ウシ胎仔血清を使用して、通気３Ｌ撹拌フラスコバイオリアクターでのインキュベーションのためにスケールアップした。次いで、融合タンパク質を、濾過した使用済み培養培地から、逐次的なプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィー手順により精製した。融合タンパク質を、還元条件下でＨＰＬＣおよびドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により解析し、クーマシーブルーで染色して、適正なアセンブリーおよび純度を裏付けた。完成したベクターおよび分子の概略図を、そのサイズを立証するＨＰＬＣデータとともに、図１３Ａ〜１３Ｃに示す。
【０５３９】
免疫化手順
Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した４週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを、フロイント完全アジュバント（初回および２回目の免疫化）またはフロイント不完全アジュバント（３回目および４回目の免疫化）で乳化させた１０ｕｇのＫＬＨコンジュゲートｈｕＢ７−Ｈ４−Ｆｃで、２週間ごとに４回、免疫化した。マウスに、合計２５ｕｇの抗原／アジュバントを免疫化ごとにマウスの背部の別々の３点へと分割して皮内注射した。最後の免疫化の１０日後、血液試料を得、抗原をコーティングしたプレートを用いてＥＬＩＳＡ手順により力価測定した。次いで、最高力価を示すマウスには、１０ｕｇを滅菌リン酸緩衝食塩水の１００ｕｌ溶液で外側尾静脈を介して注射する、アジュバント伴わないまたはＫＬＨとコンジュゲートしていないＢ７−Ｈ４−Ｆｃの５回目の免疫化ブーストを、静脈内に施した。
【０５４０】
ハイブリドーマ作製
追加免疫したマウスを４日後に屠殺し、ハイブリドーマ手順のために脾臓を除去した。Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ抗生物質を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地の溶液に脾細胞を分散させた後、ＰＥＧ（Ｈｙｂｒｉ  ＭＡＸ、分子量１４５０、カタログ番号ｐ７１８１、Ｓｉｇｍａ）を使用して碑細胞をマウスＮＳＯ細胞と融合させた。次いで、ＨＡＴ選択を使用して、融合細胞のみが増殖できるようにした。次いで、増殖中のハイブリドーマ細胞が入っているウェルからの上清を、まず、Ｂ７−Ｈ４−Ｆｃ抗原をコーティングしたプレートに対するＥＬＩＳＡにより、次に、Ｂ７−Ｈ４陽性および陰性ヒト腫瘍細胞株（それぞれ、ＳＫ−ＢＲ−３およびＨＴ−２９）についてのフローサイトメトリーにより、スクリーニングした。Ｂ７−Ｈ４−ＦｃのＦｃ領域に対する陽性ハイブリドーマを排除するために、ＩＬ−２−Ｆｃをコーティングしたプレートに対しても上清をスクリーニングし、両方の抗原に対して陽性度を示すクローンを、さらなる研究から排除した。陽性の高い平均蛍光指数（ＭＦＩ）を示すハイブリドーマを限界希釈法によるサブクローニングに選択した。次いで、サブクローンをフローサイトメトリーにより再び調べ、液体窒素で凍結させ、２Ｌの容器内で拡大させ、その後、抗体をタンドリ（tandori）プロテインＡまたはＧおよびイオン交換クロマトグラフィー法により精製した。次いで、精製された抗体をバイアルに入れ、使用するまで−２０℃で保管した。
【０５４１】
フローサイトメトリーデータ
最良の結合性抗体を決定するために、精製された抗体のアリコートを使用して、Ｂ７−Ｈ４陽性（ＳＫ−ＢＲ−３）および陰性（ＨＴ−２９、ＪＡＲ、およびＴ４７Ｄ）細胞株についてフローサイトメトリーを行った。図１４に示す通り、陽性細胞株には、陰性抗体アイソタイプ対照と比較して結合特性の増加があった。陽性サブクローンの比較により、ハイブリドーマ３５−８および５Ｆ６−６が、Ｂ７−Ｈ４発現ＳＫ−ＢＲ−３細胞株に対して最高のＭＦＩを生じさせることが明らかになったので（図１５）、それらを、下記で記載するＣＡＲ  Ｔ細胞構築の候補として選択した。
【０５４２】
免疫組織化学データ
これらのモノクローナル抗体を使用して、ヒト正常組織の組織マイクロアレイ（ＦＤＡ８０８ｃ、Ｂｉｏｍａｘ，Ｉｎｃ．）をスクリーニングして、１器官当たり３名のドナーで２４の器官において抗体結合を判定した。大部分の組織は、染色陰性であったが、消化管の上皮細胞においてならびに腎臓の近位および遠位曲尿細管において矛盾する細胞質染色があった（図１６Ａ〜１６Ｂ）。強い、一貫した膜染色は、乳管細胞の頂端部分においておよび腎臓の尿細管の一部においてのみ見出された（図１６Ａ〜１６Ｂ）。しかし、正常乳房組織における染色は、強い膜および細胞質染色が５件の異なるがん症例のうちの５件で認められた、下記で示す乳がん組織における染色と比較して、薄くなった。
【０５４３】
ヒトＢ７−Ｈ４−Ｆｃに対して作出した抗体からの２つのモノクローナル抗体は、フローサイトメトリーにより、Ｂ７−Ｈ４陽性の腫瘍細胞株に対して高結合プロファイルを生じさせるが、Ｂ７−Ｈ４陰性の腫瘍細胞株に対しては生じさせないことが示された。Ｂ７−Ｈ４  ＣＡＲ  Ｔ細胞に対するヒト抗マウス応答の可能性を防止するために、患者におけるそれらの使用前にそれらの構築のためにヒト化抗体を作出することができる。
【０５４４】
実施例５
Ｂ７−Ｈ４  ＣＡＲ  Ｔ細胞の作出
単鎖抗ヒトＢ７−Ｈ４抗体遺伝子の構築および合成
作出された３５−８および５Ｆ６−６高結合性抗Ｂ７−Ｈ４抗体についてのＤＮＡ配列は、ＭＣＬＡＢ（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）から得られる。両方の抗体を試験して、どちらの抗体が、下記で記載するアッセイで最も有効なＣＡＲ  Ｔ細胞を産生するのかを決定する。これらの研究のために、次のタンデム遺伝子：ｋｏｚａｋコンセンサス配列；ＣＤ８シグナルペプチド；抗Ｂ７−Ｈ４重鎖可変領域；（グリシン４セリン）３可撓性ポリペプチドリンカー；それぞれの抗Ｂ７−Ｈ４軽鎖可変領域；ＣＤ８ヒンジおよび膜貫通ドメイン；ならびにＣＤ２８、４−１ＢＢおよびＣＤ３ζ細胞内共刺激性シグナル伝達ドメインからなる、第２または第３（図１７）世代ＣＡＲベクターを構築する。ヒンジ、膜貫通およびシグナル伝達ドメインＤＮＡ配列は、Carl  Juneによる特許（ＵＳ２０１３０２８７７４８  Ａ１を参照されたい）から突き止められる。抗Ｂ７−Ｈ４  ＣＡＲ遺伝子は、Ｇｅｎｅｗｉｚ，Ｉｎｃ．（Ｓｏｕｔｈ  Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ、ＮＪ）により、ベクター宿主にアンピシリン耐性を付与するｂｌａ遺伝子を含有するｐＵＣ５７ベクター骨格内に合成される。
【０５４５】
ＣＡＲ遺伝子の、レンチウイルスプラスミドへのサブクローニング
ＮｏｖａＢｌｕｅ  Ｓｉｎｇｌｅｓ（商標）化学的コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞を、抗Ｂ７−Ｈ４プラスミドｃＤＮＡで形質転換する。形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ細胞の増殖後、ＣＡＲプラスミドを精製し、一晩にわたるＴ４  ＤＮＡリガーゼ反応（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を介して、ＨＩＶ−１末端反復（ＬＴＲ）、パッケージングシグナル（Ψ）、ＥＦ１αプロモーター、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、およびウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含有するＨＩＶ−１ベースのレンチウイルスベクターへと挿入されるように、適切な制限酵素で消化する。次いで、ＮｏｖａＢｌｕｅ  Ｓｉｎｇｌｅｓ（商標）化学的コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞を、結果として得られる、抗Ｂ７−Ｈ４を含有するレンチウイルスプラスミドで形質転換する。
【０５４６】
レンチウイルス粒子の作製
トランスフェクションの前に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０ｍＬのｃｏｍｐｌｅｔｅ−Ｔｅｔ−ＤＭＥＭ中に、１００ｍｍの組織培養処理プレート１枚当たりの細胞４．０×１０６個で播種し、加湿された５％ＣＯ２インキュベーター内、３７℃で、一晩にわたりインキュベートする。８０〜９０％コンフルエントに達したら、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ＣＡＲ遺伝子のレンチウイルスプラスミドと、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に結合するプラスミド含有ナノ粒子の形成を容易とするように、適切な反応緩衝剤およびポリマーに加えて、レンチウイルスのエンベロープ構成要素およびカプシド構成要素を形成するのに必要な遺伝子を含有するレンチウイルスパッケージングプラスミドとを共トランスフェクトする。トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞培養物を、３７℃で、４時間にわたりインキュベートした後で、トランスフェクション培地を、新鮮なｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｔｅｔ  ＤＭＥＭ  １０ｍＬで置きかえる。次いで、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、さらなる４８時間にわたりインキュベートし、その後、細胞上清を採取し、主要なレンチウイルスカプシドタンパク質である、ｐ２４に対するサンドイッチＥＬＩＳＡを介して、レンチウイルス粒子について調べる。レンチウイルス含有上清をアリコートに分け、標的であるＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞に形質導入するために使用するまで、−８０℃で保管する。
【０５４７】
ヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋末梢血Ｔ細胞の精製、活性化、および濃縮
Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；Ｌｉｔｔｌｅ  
Ｃｈａｌｆｏｎｔ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）を伴う密度勾配遠心分離により濃縮された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、０．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および２ｍＭのＥＤＴＡを含有するＰＢＳを伴う遠心分離により回収および洗浄する。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞についてポジティブ選択するように、磁気的に活性化させたＬＳカラムを使用して、これらのヒトＴ細胞サブセットを単離するのに、ＭＡＣＳ  ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）キットを使用する。次いで、磁気的に結合したＴ細胞を、ＭＡＣＳ磁気分離器から取り出し、ＬＳカラムからフラッシュ洗浄し、新鮮な完全培地中で洗浄する。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞集団の純度は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ａｃｏｕｓｔｉｃ  Ａｔｔｕｎｅ（登録商標）Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを使用するフローサイトメトリーにより評価し、必要な場合、ＵＳＣのフローサイトメトリーコア施設で実施される蛍光活性化細胞分取により濃縮する。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、適切な細胞培養容器内で、１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を補充された完全培地中、１ｍＬ当たりの細胞１．０×１０６個の密度で維持し、これに、α−ＣＤ３／α−ＣＤ２８  Ｈｕｍａｎ  Ｔ−ｃｅｌｌ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を添加して、培養Ｔ細胞を活性化させる。ＣＡＲ−レンチウイルス粒子で形質導入する前に、Ｔ細胞を、５％ＣＯ２インキュベーター内、３７℃で、２日間にわたりインキュベートする。
【０５４８】
ＣＤ４＋ＣＤ８＋  Ｔ細胞のレンチウイルス形質導入
活性化Ｔ細胞を回収し、死細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離、またはＭＡＣＳ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｍｏｖａｌ  Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）の使用により除去する。６ウェルプレートに、活性化Ｔ細胞を、１ｍＬの完全培地当たりの細胞１．０×１０６個の濃度で播種する。種々のウェルに対して、Ｂ７−Ｈ４  ＣＡＲ含有レンチウイルス粒子を、細胞懸濁液へと、１、５、１０、および５０など、感染多重度（ＭＯＩ）を変化させて添加する。レンチウイルス粒子と、標的細胞表面との間の相互作用を容易とすることにより、形質導入を支援するカチオン性ポリマーであるポリブレンを、４μｇ／ｍＬの最終濃度で添加する。プレートを、３２℃、８００×ｇで、１時間にわたり遠心分離する。遠心分離後、レンチウイルス含有培地を吸引し、細胞ペレットを、１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む、新鮮な完全培地中に再懸濁させる。細胞を、５％ＣＯ２の加湿されたインキュベーター内、３７℃で一晩にわたり静置する。形質導入の３日後、細胞をペレット化させ、ＩＬ−２および４００μｇ／ｍＬのジェネティシン（Ｇ４１８スルフェート）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を含む、新鮮な完全培地中に再懸濁させる。Ｂ７−Ｈ４  ＣＡＲ改変Ｔ細胞は、フローサイトメトリーおよびサザンブロット解析により評価して、形質導入手順の成功を裏付ける。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏアッセイの前に、Ｂ７−Ｈ４  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、ＦＡＣＳにより濃縮し、ｉｎ  ｖｉｖｏ研究のために、１：１に混合する。
【０５４９】
カルセイン放出細胞傷害アッセイによる、ＣＡＲの有効性についてのｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価
Ｂ７−Ｈ４抗原陽性および陰性ヒト細胞株を、回収し、洗浄し、完全培地中に１ｍＬ当たりの細胞１．０×１０６個の濃度で再懸濁させる。カルセインアセトキシメチル（ＡＭ）を、１５μＭで、標的細胞試料へと添加し、次いで、これを、５％ＣＯ２の加湿されたインキュベーター内、３７℃で、３０分間にわたりインキュベートする。染色した陽性および陰性標的細胞を、２回洗浄し、遠心分離により、完全培地中に再懸濁させ、ウェル１つ当たりの細胞１．０×１０４個で、９６ウェルプレートへと添加する。Ｂ７−Ｈ４  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、完全培地中に、５０：１、５：１、および１：１のエフェクター対標的細胞比で、プレートへと添加する。完全培地および２％のｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を伴う完全培地中に懸濁させた染色標的細胞を、それぞれ、自発的放出対照および最大放出対照として用いる。プレートを、３６５×ｇおよび２０℃で、２分間にわたり遠心分離してから、インキュベーターに戻して、３時間にわたり静置する。次いで、プレートを、１０分間にわたり遠心分離し、細胞上清を、黒色のポリスチレン製９６ウェルプレート上のそれぞれのウェルへとアリコートに分け、Ｂｉｏ−Ｔｅｋ（登録商標）Ｓｙｎｅｒｇｙ（商標）ＨＴマイクロプレートリーダー上、それぞれ４８５／２０ｎｍおよび５２８／２０ｎｍの励起および発光で、蛍光について評価する。
【０５５０】
Ｌｕｍｉｎｅｘバイオアッセイによるヒトサイトカインの定量化
実験室で慣用的に行われる標準的な手順を使用して、Ｂ７−Ｈ４  ＣＡＲ改変Ｔ細胞ならびにＢ７−Ｈ４陽性および陰性腫瘍細胞株の上清を、ＣＡＲ  Ｔ細胞活性化の尺度としてのサイトカインの分泌について測定する。バックグラウンドの活性を同定するために、活性化されていないヒトＴ細胞を使用して、データを、培地単独および培養物と比較する。ＩＬ−２、ＩＦＮ−ｇ、ＩＬ−１２、および他の関連するサイトカインの濃度を、インキュベーション工程中の時間にわたり測定する。
【０５５１】
２つの異種移植片Ｂ７−Ｈ４陽性がんモデルにおける、ＣＡＲ  Ｔ細胞有効性についてのｉｎ  ｖｉｖｏ評価
２つの異なるヒト腫瘍細胞株異種移植片腫瘍モデルを使用して、Ｂ７−Ｈ４  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、さらに評価する。両方について、５×１０６個のＢ７−Ｈ４陽性または陰性固形腫瘍細胞株の注射により、固形腫瘍を、６〜８週齢の雌ヌードマウスの皮下において確立する。腫瘍が、０．５ｃｍの直径に達したら、マウス（ｎ＝５）の群を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究の結果に基づき、１または３×１０７個の、陰性対照としてのヒトＴ細胞、または候補Ｂ７−Ｈ４抗体から構築されたＢ７−Ｈ４  ＣＡＲ  Ｔ細胞で、静脈内において処置する。次いで、腫瘍容量を、キャリパーにより、毎週３回測定し、容量増大曲線を作成して、実験的処置の、対照を上回る有効性を裏付ける。
【０５５２】
一般に、Ｂ７−Ｈ４が腫瘍上で発現されて、免疫応答を抑制する。正常組織上でのその発現は、極わずかであることから、Ｂ７−Ｈ４は、ＣＡＲ  Ｔ細胞の見込みのある標的である。
【０５５３】
実施例６
抗Ｂ７−Ｈ４  ＣＡＲ  Ｔ細胞
ＣＡＲレンチウイルス構築物の構築
ＣＡＲは、Ｂ７−Ｈ４に結合する、細胞外抗原結合性部分またはｓｃＦＶからなる。ｓｃＦＶは、ＣＤ８ヒンジ領域を介して、ＣＤ８膜貫通領域を含む細胞質シグナル伝達ドメイン、ならびにＣＤ２８、４−１ＢＢ、およびＣＤ３ｚ（図１９）に由来するシグナル伝達ドメインへと接続される。シグナル伝達ドメインを含むｓｃＦＶ配列は、合成により、Ｇｅｎｅｗｉｚ  Ｇｅｎｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｓｅｒｖｉｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）が合成した。プラスミドを精製し、一晩にわたるＴ４  ＤＮＡリガーゼ反応（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を介して、ＨＩＶ−１  ５’および３’末端反復（ＬＴＲ）、パッケージングシグナル（Ψ）、ＥＦ１αプロモーター、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、およびサルウイルス４０起点（ＳＶ４０）を含有するＨＩＶ−１ベースのバイシストロニックレンチウイルスベクター（ｐＬＶＸ−ＩＲＥＳ−ＺｓＧｒｅｅｎ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｓｉｇｎａｌ  Ｈｉｌｌ、ＣＡ）へと挿入するように、適切な制限酵素で消化する。次いで、ＮｏｖａＢｌｕｅ  Ｓｉｎｇｌｅｓ（商標）化学的コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞を、結果として得られる、ＣＡＲを含有するレンチウイルスプラスミドで形質転換する。
【０５５４】
レンチウイルス粒子の作製
トランスフェクションの前に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０％透析ＦＣＳを補充した、２０ｍＬのＤＭＥＭ中に、１５０ｃｍ２の組織培養処理フラスコ１つにおいて４．０×１０６個で播種し、加湿された５％ＣＯ２インキュベーター内、３７℃で、一晩にわたりインキュベートする。８０〜９０％コンフルエントに達したら、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、３７℃で５％ＣＯ２の加湿されたインキュベーター内のペニシリン／ストレプトマイシンを伴わない、１％の透析ＦＣＳを補充した、２０ｍＬのＤＭＥＭ中、２時間にわたりインキュベートする。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ｐＬＶＸ−Ｂ７−Ｈ４−ＣＡＲプラスミドと、レンチウイルスのエンベロープ構成要素およびカプシド構成要素を形成するのに必要な遺伝子を含有するレンチウイルスパッケージングプラスミドとを共トランスフェクトする。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に結合するプラスミド含有ナノ粒子の形成を容易とするように、特許権のある反応緩衝液およびポリマーもまた添加する。トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞培養物を、３７℃で、２４時間にわたりインキュベートした後で、トランスフェクション培地を、新鮮な完全ＤＭＥＭ  ２０ｍＬで置きかえる。その後、レンチウイルス上清を、２４時間ごと、３日間にわたり回収し、上清を、４℃、１，２５０ｒｐｍで、５分間にわたり遠心分離するのに続き、濾過滅菌および超遠心分離機内、４℃、２０，０００ｇで、２時間にわたる遠心分離を行う。濃縮されたレンチウイルスは、７％のトレハロースおよび１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中に再懸濁させる。その後、レンチウイルスを、アリコートに分け、標的であるＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞に形質導入するために使用するまで、−８０℃で保管する。２４時間後に採取した細胞上清を、主要なレンチウイルスカプシドタンパク質である、ｐ２４に対するサンドイッチＥＬＩＳＡを介して、レンチウイルス粒子について調べる。タンパク質マーカーであるＺｓＧｒｅｅｎの発現により決定されるトランスフェクション効率は、蛍光顕微鏡下の可視化により、２０％〜５０％の間であると推定された。
【０５５５】
ヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋末梢血Ｔ細胞の精製、活性化、および濃縮
Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）を伴う密度勾配遠心分離により濃縮された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、０．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および２ｍＭのＥＤＴＡを含有するＰＢＳを伴う遠心分離により回収および洗浄する。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞についてのネガティブ選択を磁気的に使用して、これらのヒトＴ細胞サブセットを単離するのに、Ｔ細胞濃縮キット（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用する。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞集団の純度は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ａｃｏｕｓｔｉｃ  Ａｔｔｕｎｅ（登録商標）Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを使用するフローサイトメトリーにより評価し、蛍光活性化細胞分取により濃縮する。１：１に混合されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、適切な細胞培養容器内で、１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を補充された完全な５０％のクリック培地／５０％のＲＰＭＩ−１６４０培地中、１ｍＬ当たりの細胞１．０×１０６個の密度で維持し、これに、αＣＤ３／αＣＤ２８  Ｈｕｍａｎ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｏｒビーズ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加して、培養Ｔ細胞を活性化させる。その後、Ｔ細胞に、ＣＡＲレンチウイルス粒子を用いて形質導入する前に、５％ＣＯ２インキュベーター内、３７℃で、２日間にわたりインキュベートする。
【０５５６】
ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のレンチウイルス形質導入
活性化Ｔ細胞を回収し、死細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離、またはＭＡＣＳ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｍｏｖａｌ  Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）の使用により除去する。６ウェルプレートに、活性化Ｔ細胞を、完全培地中、１ｍＬ当たりの細胞１．０×１０６個の濃度で播種する。その後、細胞に、細胞へのトランスフェクション補助剤である、Ｌｅｎｔｉｂｌａｓｔ（Ｏｚ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を補充したレンチウイルス粒子を用いて形質導入する。形質導入された細胞を、加湿された５％ＣＯ２インキュベーター内、３７℃で、２４時間にわたりインキュベートする。次いで、細胞をスピンダウンし、培地を交換するのに続き、Ｔ−ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｏｒビーズ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を添加する。
【０５５７】
細胞傷害アッセイ
ＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞傷害は、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）細胞傷害キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して決定する。活性化Ｔ細胞を回収し、１×１０６個の細胞に、上記で記載した、Ｂ７−Ｈ４  ＣＡＲレンチウイルス構築物を形質導入する。Ｔ−ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｏｒビーズ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して、２日間にわたり細胞を活性化させてから、細胞傷害アッセイを行った。製造元のプロトコールに従い、標的細胞の最適数を決定する。アッセイのために、適切な標的細胞を、５％ＣＯ２インキュベーター内、３７℃で、２４時間にわたり、９６ウェルプレート内で三連で平板培養するのに続き、活性化ＣＡＲ  Ｔ細胞を、２０：１、１０：１、５：１、および１：１の比で添加し、５％ＣＯ２インキュベーター内、３７℃で、２４時間にわたりインキュベートする。次いで、細胞を、３７℃で、４５分間にわたり溶解させ、１，２５０ｒｐｍで、５分間にわたり遠心分離する。上清を、未使用の９６ウェルプレートへと移すのに続き、反応混合物を、３０分間にわたり添加する。次いで、停止溶液を使用して、反応を停止させ、６５０ｎｍで吸光度補正して、プレートを、４５０ｎｍで読み取る。
【０５５８】
ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍退縮アッセイ
Ｆｏｘｎ１ヌルマウスに、Ｂ７−Ｈ４を発現させる不死化乳癌細胞株であるＭＤＡ−ＭＢ−４６８を注射する。０．２ｍＬの接種物を使用して、２００ｕｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の２×１０６個の腫瘍細胞を、マウスの左脇腹へと注射する。αＣＤ３／ＣＤ２８  ａｃｔｉｖａｔｏｒ複合体（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて、Ｔ細胞を、２日間にわたり活性化させる。次いで、活性化Ｔ細胞に、Ｂ７−Ｈ４  ＣＡＲレンチウイルス粒子を用いて形質導入するのに続き、さらに２日間にわたりαＣＤ３／ＣＤ２８  ａｃｔｉｖａｔｏｒ複合体で活性化させる。次いで、活性化Ｂ７−Ｈ４  ＣＡＲ  Ｔ細胞（２．５×１０６個）を、腫瘍接種後７日目に、マウスへと静脈内注射する。ノギスを使用して、毎週２回、腫瘍サイズを評価し、容量を計算する。
【０５５９】
Ｂ７−Ｈ４  ＣＡＲ  Ｔ細胞についての細胞傷害
乳癌細胞株であるＳＫＢＲ３を使用して、Ｂ７−Ｈ４  ＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞溶解活性を検討した。ＦＡＣＳ解析により判定して、ＳＫＢＲ３は、Ｂ７−Ｈ４を発現させる（図２０）。Ｂ７−Ｈ４  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、ＳＫＢＲ３に、２０：１、１０：１、５：１および１：１のエフェクター細胞  対  標的細胞比で添加した。１０，０００：１の比で、Ｂ７−Ｈ４  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、標的ＳＫＢＲ３細胞の溶解増加を示し、溶解率は２５％である。これと比較して、形質導入されていないＴ細胞は、調べた比のいずれでもＳＫＢＲ３細胞を溶解しなかった。
【０５６０】
実施例７
マウス抗ヒトＨＬＡ−Ｇモノクローナル抗体の作出
抗原
アルファ鎖Ｇ抗原であるＨＬＡクラスＩ組織適合性抗原を、ＭｙｂｉｏＳｏｕｒｃｅ．ｃｏｍから購入した（カタログ番号ＭＢＳ７１７４１０）。これは、細菌で作られる組換えタンパク質であり、ＨＩＳタグ、５０ＫＤの分子量（純度９０％）、および
GSHSMRYFSA  AVSRPGRGEP  RFIAMGYVDD  TQFVRFDSDS  ACPRMEPRAP  WVEQEGPEYW  EEETRNTKAH  AQTDRMNLQT  LRGYYNQSEA  SSHTLQWMIG  CDLGSDGRLL  RGYEQYAYDG  KDYLALNEDL  RSWTAADTAA  QISKRKCEAA  NVAEQRRAYL  EGTCVEWHLA-G  YLENGKEMLQ  RADPPKTHVT  HHPVFDYEAT  LRCWALGFYP  AEIILTWQRD  GEDQTQDVEL  VETRPAGDGT  FQKWAAVVVP  SGEEQRYTCH  VQHEGLPEPL  MLRWKQSSLP  TIPIMGI  VAGLVVLAAV  VTGAAVAAVL  WRKKSSDの配列を有する。
【０５６１】
免疫化手順
Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した４週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを、フロイント完全アジュバント（初回および２回目の免疫化）またはフロイント不完全アジュバント（３回目および４回目の免疫化）で乳化させた１０μｇの抗原で、２週間ごとに４回、免疫化した。マウスに、合計２５μｇの抗原／アジュバントを免疫化ごとにマウスの背部の別々の３点へと分割して皮内注射した。最後の免疫化の１０日後、血液試料を得、抗原をコーティングしたプレートを用いてＥＬＩＳＡ手順により力価測定した。次いで、最高力価を示すマウスには、１０μｇを滅菌リン酸緩衝食塩水の１００μｌ溶液で、外側尾静脈を介して注射する、アジュバント伴わない５回目の免疫化ブーストを静脈内に施した。
【０５６２】
ハイブリドーマの作出
４日後、これらのマウスを屠殺し、ハイブリドーマ手順のために脾臓を除去した。Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ抗生物質を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地の溶液に脾細胞を分散させた後、ＰＥＧ（Ｈｙｂｒｉ  ＭＡＸ、分子量１４５０、カタログ番号ｐ７１８１、Ｓｉｇｍａ）を使用して碑細胞をマウスＮＳＯ細胞と融合させた。次いで、ＨＡＴ選択を使用して、融合細胞のみが増殖できるようにした。次いで、増殖中のハイブリドーマ細胞が入っているウェルからの上清を、まず、抗原をコーティングしたプレートに対するＥＬＩＳＡにより、次に、ＨＬＡ−Ｇ陽性および陰性ヒト腫瘍細胞株（ＪＡＲ絨毛癌）についてのフローサイトメトリーにより、スクリーニングした。陽性の高い平均蛍光指数（ＭＦＩ）を示すハイブリドーマを限界希釈法によるサブクローニングに選択した。次いで、サブクローンをフローサイトメトリーにより再び調べ、液体窒素で凍結させ、２Ｌの容器内で拡大させ、その後、抗体をタンデム（tandon）のプロテインＡまたはＧおよびイオン交換クロマトグラフィー法により精製した。次いで、精製された抗体をバイアルに入れ、使用するまで−２０℃で保管した。
【０５６３】
フローサイトメトリー手順およびデータ
フローサイトメトリーを使用するスクリーニング方法は、抗原をコーティングしたプレートに対してＥＬＩＳＡにより陽性と判明したハイブリドーマからの上清を使用して、ＨＬＡ−Ｇ陽性（ＪＥＧ−３絨毛癌）および陰性（Ｋ５６２、Ｊｕｒｋａｔ）細胞株を用いて行った。次いで、高い平均蛍光指数（ＭＦＩ）を生じさせるハイブリドーマをサブクローニングし、ＨＬＡ−Ｇに対する選択的陽性度について再スクリーニングした。下記の図２１に示す通り、親ハイブリドーマ３Ｈ１１および４Ｅ３のサブクローンは、ＨＬＡ−Ｇ発現ＪＥＧ−３細胞株に対して高いＭＦＩを生じさせ続けた。これらのデータから、３Ｈ１１−１２および４Ｅ３−１を、下記で記載するＣＡＲ−Ｔ細胞の作出に選択した。
【０５６４】
選択した抗体に関する免疫組織化学
標準的な免疫組織化学手順および抗原回復法を使用して、抗体４Ｅ３およびそのサブクローンは、ＨＬＡ−Ｇ陽性組織を染色することを見出した。図２２Ａ〜２２Ｄに示す通り、ＨＬＡ−Ｇ陽性度は、乳頭様甲状腺癌などの抗原陽性腫瘍の細胞質と細胞膜の両方において見られた（図２２Ａ、２２Ｂ）が、正常甲状腺組織では陰性であり（図２２Ｃ）、正常甲状腺組織は、そのＨＬＡ発現を保持した（図２２Ｄ）。免疫組織化学を使用してＨＬＡ−Ｇに対するコンパニオン診断抗体を入手できることにより、次回の臨床試験でＨＬＡ−Ｇ  ＣＡＲ  Ｔ細胞療法による恩恵に浴する可能性が高い患者の同定が可能になる。
【０５６５】
実施例８
ＨＬＡ−Ｇ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の作出
単鎖ＨＬＡ−Ｇ抗体遺伝子の構築および合成
本発明者らの研究室で作出した２つの高結合性抗ＨＬＡ−Ｇ抗体（４Ｅ３−１および３Ｈ１１−１２）についてのＤＮＡ配列は、ＭＣＬＡＢ（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）から得た。両方の抗体を試験して、どちらの抗体が、下記で記載するアッセイで最も有効なＣＡＲを産生するのかを決定する。下記に示す通り、次のタンデム遺伝子：Ｋｏｚａｋコンセンサス配列；ＣＤ８シグナルペプチド；抗ＨＬＡ−Ｇ重鎖可変領域；（グリシン４セリン）３可撓性ポリペプチドリンカー；それぞれの抗ＨＬＡ−Ｇ軽鎖可変領域；ＣＤ８ヒンジおよび膜貫通ドメイン；ならびにＣＤ２８、４−１ＢＢおよびＣＤ３ζ細胞内共刺激性シグナル伝達ドメインからなる、第２または第３（図２３）世代ＣＡＲベクターを構築する。ヒンジ、膜貫通およびシグナル伝達ドメインＤＮＡ配列は、Carl  Juneによる特許（ＵＳ２０１３０２８７７４８Ａ１を参照されたい）から突き止められる。抗ＨＬＡ−Ｇ  ＣＡＲ遺伝子は、Ｇｅｎｅｗｉｚ，Ｉｎｃ．（Ｓｏｕｔｈ  Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ、ＮＪ）により、ベクター宿主にアンピシリン耐性を付与するｂｌａ遺伝子を含有するｐＵＣ５７ベクター骨格内に合成される。
【０５６６】
ＣＡＲ遺伝子の、レンチウイルスプラスミドへのサブクローニング
ＮｏｖａＢｌｕｅ  Ｓｉｎｇｌｅｓ（商標）化学的コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞を、抗ＨＬＡ−ＧプラスミドｃＤＮＡで形質転換する。形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ細胞の増殖後、ＣＡＲプラスミドを精製し、一晩にわたるＴ４  ＤＮＡリガーゼ反応（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を介して、ＨＩＶ−１末端反復（ＬＴＲ）、パッケージングシグナル（Ψ）、ＥＦ１αプロモーター、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、およびウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含有する、ＨＩＶ−１ベースのレンチウイルスベクターへと挿入されるように、適切な制限酵素で消化する。次いで、得られる抗ＨＬＡ−Ｇ含有レンチウイルスプラスミドで、ＮｏｖａＢｌｕｅ  Ｓｉｎｇｌｅｓ（商標）化学的コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞を形質転換することになる。
【０５６７】
レンチウイルス粒子の作製
トランスフェクションの前に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０ｍＬのｃｏｍｐｌｅｔｅ−Ｔｅｔ−ＤＭＥＭ中に、１００ｍｍの組織培養処理プレート１枚当たりの細胞４．０×１０６個で播種し、加湿された５％ＣＯ２インキュベーター内、３７℃で、一晩にわたりインキュベートする。８０〜９０％コンフルエントに達したら、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ＣＡＲ遺伝子のレンチウイルスプラスミドと、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に結合するプラスミド含有ナノ粒子の形成を容易とするための特許権のある反応緩衝液およびポリマーに加えて、レンチウイルスのエンベロープ構成要素およびカプシド構成要素を形成するのに必要な遺伝子を含有するレンチウイルスパッケージングプラスミドとを、共トランスフェクトする。トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞培養物を、３７℃で、４時間にわたりインキュベートした後、トランスフェクション培地を、新鮮なｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｔｅｔ  ＤＭＥＭ  １０ｍＬで置きかえる。次いで、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、さらなる４８時間にわたりインキュベートし、その後、細胞上清を採取し、主要なレンチウイルスカプシドタンパク質であるｐ２４に対するサンドイッチＥＬＩＳＡを介して、レンチウイルス粒子について調べる。レンチウイルス含有上清をアリコートに分け、標的であるＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞に形質導入するために使用するまで、−８０℃で保管する。
【０５６８】
ヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋末梢血Ｔ細胞の精製、活性化、および濃縮
Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）を伴う密度勾配遠心分離により濃縮された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、０．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および２ｍＭのＥＤＴＡを含有するＰＢＳを伴う遠心分離により回収および洗浄する。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞についてポジティブ選択するように、磁気的に活性化させたＬＳカラムを使用して、これらのヒトＴ細胞サブセットを単離するのに、ＭＡＣＳ  ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）キットを使用する。次いで、磁気的に結合したＴ細胞を、ＭＡＣＳ磁気分離器から取り出し、ＬＳカラムからフラッシュ洗浄し、新鮮な完全培地中で洗浄する。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞集団の純度は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ａｃｏｕｓｔｉｃ  Ａｔｔｕｎｅ（登録商標）Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを使用するフローサイトメトリーにより評価し、必要な場合、ＵＳＣのフローサイトメトリーコア施設で実施される蛍光活性化細胞分取により濃縮する。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、適切な細胞培養容器内で、１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を補充された完全培地中、１ｍＬ当たりの細胞１．０×１０６個の密度で維持し、これに、α−ＣＤ３／α−ＣＤ２８  Ｈｕｍａｎ  Ｔ−ｃｅｌｌ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｃａｒｓｌｂａｄ、ＣＡ）を添加して、培養Ｔ細胞を活性化させる。ＣＡＲ−レンチウイルス粒子で形質導入する前に、Ｔ細胞を、５％ＣＯ２インキュベーター内、３７℃で、２日間にわたりインキュベートする。
【０５６９】
ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のレンチウイルス形質導入
活性化Ｔ細胞を回収し、死細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離、またはＭＡＣＳ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｍｏｖａｌ  Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）の使用により除去する。６ウェルプレートに、活性化Ｔ細胞を、１ｍＬの完全培地当たりの細胞１．０×１０６個の濃度で播種する。種々のウェルに対して、ＨＬＡ−Ｇ  ＣＡＲ含有レンチウイルス粒子を、細胞懸濁液へと、１、５、１０、および５０など、感染多重度（ＭＯＩ）を変化させて添加する。レンチウイルス粒子と標的細胞表面との間の相互作用を容易とすることにより、形質導入を支援するカチオン性ポリマーであるポリブレンを、４μｇ／ｍＬの最終濃度で添加する。プレートを、３２℃、８００×ｇで、１時間にわたり遠心分離する。遠心分離後、レンチウイルス含有培地を吸引し、細胞ペレットを、１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む新鮮な完全培地中に再懸濁させる。細胞を、５％ＣＯ２の加湿されたインキュベーター内、３７℃で一晩にわたり静置する。形質導入の３日後、細胞をペレット化させ、ＩＬ−２および４００μｇ／ｍＬのジェネティシン（Ｇ４１８スルフェート）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を含む、新鮮な完全培地中に再懸濁させる。ＨＬＡ−Ｇ  ＣＡＲ改変Ｔ細胞を、フローサイトメトリーおよびサザンブロット解析により評価して、形質導入手順の成功を裏付ける。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏアッセイの前に、ＨＬＡ−Ｇ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、ＦＡＣＳにより濃縮し、ｉｎ  ｖｉｖｏ研究のために、１：１に混合する。
【０５７０】
カルセイン放出細胞傷害アッセイによる、ＣＡＲの有効性についてのｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価
ＨＬＡ−Ｇ抗原陽性および陰性ヒト細胞株を回収し、洗浄し、完全培地中に１ｍＬ当たりの細胞１．０×１０６個の濃度で再懸濁させた。カルセインアセトキシメチル（ＡＭ）を、１５μＭで、標的細胞試料へと添加し、次いで、これを、５％ＣＯ２の加湿されたインキュベーター内、３７℃で、３０分間にわたりインキュベートすることになる。染色した陽性および陰性標的細胞を、２回洗浄し、遠心分離により完全培地中に再懸濁させ、ウェル１つ当たりの細胞１．０×１０４個で、９６ウェルプレートへと添加する。ＨＬＡ−Ｇ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、完全培地中に、５０：１、５：１、および１：１のエフェクター対標的細胞比で、プレートへと添加する。完全培地および２％のｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を伴う完全培地中に懸濁させた染色標的細胞を、それぞれ、自発的放出対照および最大放出対照として用いる。プレートを、３６５×ｇおよび２０℃で、２分間にわたり遠心分離してから、インキュベーターに戻して、３時間にわたり静置する。次いで、プレートを、１０分間にわたり遠心分離し、細胞上清を、黒色のポリスチレン製９６ウェルプレート上のそれぞれのウェルへとアリコートに分け、Ｂｉｏ−Ｔｅｋ（登録商標）Ｓｙｎｅｒｇｙ（商標）ＨＴマイクロプレートリーダーを用いて、それぞれ４８５／２０ｎｍおよび５２８／２０ｎｍの励起および発光で、蛍光について評価する。
【０５７１】
Ｌｕｍｉｎｅｘバイオアッセイによるヒトサイトカインの定量化。
研究室で慣例的に実施される標準的な手順を使用して、ＨＬＡ−Ｇ  ＣＡＲ改変Ｔ細胞ならびにＨＬＡ−Ｇ陽性および陰性腫瘍細胞株の上清を、ＣＡＲ  Ｔ細胞活性化の尺度としてのサイトカインの分泌について測定する。バックグラウンドの活性を同定するために、活性化されていないヒトＴ細胞を使用して、データを、培地単独および培養物と比較する。ＩＬ−２、ＩＦＮ−ｇ、ＩＬ−１２、および他の関連するサイトカインの濃度を、インキュベーション工程中の時間にわたり測定する。
【０５７２】
２つのＨＬＡ−Ｇ陽性がん異種移植片モデルにおける、ＣＡＲ  Ｔ細胞有効性についてのｉｎ  ｖｉｖｏ評価
２つの異なるヒト腫瘍細胞株異種移植片腫瘍モデルを使用して、ＨＬＡ−Ｇ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、さらに評価する。両方について、５×１０６個のＨＬＡ−Ｇ陽性またはＨＬＡ−Ｇ陰性固形腫瘍細胞株の注射により、固形腫瘍を、６〜８週齢の雌ヌードマウスの皮下において確立する。腫瘍が、０．５ｃｍの直径に達したら、マウス（ｎ＝５）の群を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究の結果に基づき、１または３×１０７個の、陰性対照としてのヒトＴ細胞、または最も活性のＨＬＡ−Ｇ抗体から構築されたＨＬＡ−Ｇ  ＣＡＲ  Ｔ細胞で、静脈内において処置する。次いで、腫瘍容量を、キャリパーにより、毎週３回測定し、容量増大曲線を作成して、実験的処置の、対照を上回る有効性を裏付ける。
【０５７３】
ＨＬＡ−Ｇは、免疫認識を回避するためにそれらのＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ発現を喪失するヒト固形腫瘍を処置するためのＣＡＲ  Ｔ細胞の開発の卓越した標的であることが分かる。ＨＬＡ−Ｇは、妊娠中の胎盤を除いて正常な組織では最小限の発現を有し、したがって、患者におけるオフターゲット陽性度および毒性は極わずかであるはずである。
【０５７４】
実施例９
抗ＨＬＡ−Ｇ  ＣＡＲ  Ｔ細胞
ＣＡＲレンチウイルス構築物の構築
ＣＡＲは、ＨＬＡ−Ｇに特異的に結合する、細胞外抗原結合性部分またはｓｃＦＶからなる。ｓｃＦＶは、ＣＤ８ヒンジ領域を介して、ＣＤ８膜貫通領域を含む細胞質シグナル伝達ドメイン、ならびにＣＤ２８、４−１ＢＢ、およびＣＤ３ｚに由来するシグナル伝達ドメインへと接続される（図２５）。シグナル伝達ドメインを含むｓｃＦｖ配列は、合成により、Ｇｅｎｅｗｉｚ  Ｇｅｎｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｓｅｒｖｉｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）が合成した。プラスミドを精製し、一晩にわたるＴ４  ＤＮＡリガーゼ反応（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を介して、ＨＩＶ−１  ５’および３’末端反復（ＬＴＲ）、パッケージングシグナル（Ψ）、ＥＦ１αプロモーター、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、およびサルウイルス４０起点（ＳＶ４０）を含有するＨＩＶ−１ベースのバイシストロニックレンチウイルスベクター（ｐＬＶＸ−ＩＲＥＳ−ＺｓＧｒｅｅｎ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｓｉｇｎａｌ  Ｈｉｌｌ、ＣＡ）へと挿入するように、適切な制限酵素で消化する。次いで、その結果として得られる、ＣＡＲ含有レンチウイルスプラスミドで、ＮｏｖａＢｌｕｅ  Ｓｉｎｇｌｅｓ（商標）化学的コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞を形質転換する。
【０５７５】
レンチウイルス粒子の作製
トランスフェクションの前に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１５０ｃｍ２の組織培養処理フラスコ内で、１０％透析ＦＣＳを補充した２０ｍＬのＤＭＥＭ中に細胞４．０×１０６個で播種し、加湿された５％ＣＯ２インキュベーター内、３７℃で、一晩にわたりインキュベートする。８０〜９０％コンフルエントに達したら、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、加湿された５％ＣＯ２インキュベーター内、３７℃で、ペニシリン／ストレプトマイシンを伴わない、１％の透析ＦＣＳを補充した、２０ｍｌのＤＭＥＭ中、２時間にわたりインキュベートする。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ｐＬＶＸ−Ｂ７−Ｈ４−ＣＡＲプラスミドと、レンチウイルスのエンベロープ構成要素およびカプシド構成要素を形成するのに必要な遺伝子を含有するレンチウイルスパッケージングプラスミドとを、共トランスフェクトする。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に結合するプラスミド含有ナノ粒子の形成を容易とするための、特許権のある反応緩衝液およびポリマーもまた添加する。トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞培養物を、３７℃で、２４時間にわたりインキュベートした後で、トランスフェクション培地を、新鮮な完全ＤＭＥＭ  ２０ｍＬで置きかえる。レンチウイルス上清を、２４時間ごと、３日間にわたり回収し、上清を、４℃、１，２５０ｒｐｍで、５分間にわたり遠心分離するのに続き、濾過滅菌、および超遠心分離機内、４℃、２０，０００ｇで、２時間にわたる遠心分離を行う。濃縮されたレンチウイルスを、７％トレハロースおよび１％ＢＳＡを補充したＰＢＳ中に再懸濁させる。次いで、レンチウイルスを、標的であるＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞に形質導入するために使用するまで、−８０℃で、アリコートで保管する。２４時間後に採取した細胞上清を、主要なレンチウイルスカプシド（cased）タンパク質であるｐ２４に対するサンドイッチＥＬＩＳＡを介して、レンチウイルス粒子について調べる。トランスフェクション効率は、蛍光顕微鏡下で、蛍光タンパク質マーカーであるＺｓＧｒｅｅｎの可視化により判定して、３０％〜６０％の間であると推定された。
【０５７６】
ヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋末梢血Ｔ細胞の精製、活性化、および濃縮
Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）を伴う密度勾配遠心分離により濃縮された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、０．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および２ｍＭのＥＤＴＡを含有するＰＢＳを伴う遠心分離により回収および洗浄する。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞についてのネガティブ選択を使用して、これらのヒトＴ細胞サブセットを磁気的に単離するのに、Ｔ細胞濃縮キット（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用する。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞集団の純度は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ａｃｏｕｓｔｉｃ  Ａｔｔｕｎｅ（登録商標）Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを使用するフローサイトメトリーにより評価し、蛍光活性化細胞分取により濃縮する。１：１に混合されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、適切な細胞培養容器内で、１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を補充された完全な５０％のクリック培地／５０％のＲＰＭＩ−１６４０培地中、１ｍＬ当たりの細胞１．０×１０６個の密度で維持し、これに、α−ＣＤ３／α−ＣＤ２８  Ｈｕｍａｎ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｏｒビーズ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加して、培養Ｔ細胞を活性化させる。次いで、ＣＡＲレンチウイルス粒子で形質導入する前に、Ｔ細胞を、５％ＣＯ２インキュベーター内、３７℃で、２日間にわたりインキュベートする。
【０５７７】
ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のレンチウイルス形質導入
活性化Ｔ細胞を回収し、死細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離、またはＭＡＣＳ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｍｏｖａｌ  Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）の使用により除去する。６ウェルプレートに、活性化Ｔ細胞を、１ｍＬの完全培地当たりの細胞１．０×１０６個の濃度で播種する。細胞に、細胞へのトランスフェクション補助剤であるＬｅｎｔｉｂｌａｓｔ（Ｏｚ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を補充したレンチウイルス粒子を用いて形質導入する。次いで、形質導入された細胞を、加湿された５％ＣＯ２インキュベーター内、３７℃で、２４時間にわたりインキュベートする。細胞をスピンダウンし、培地を交換するのに続き、Ｔ−ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｏｒビーズ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を添加する。
【０５７８】
細胞傷害アッセイ
ＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞傷害は、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）細胞傷害キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して決定する。活性化Ｔ細胞を回収し、１×１０６個の細胞に、上記で記載したＨＬＡ−Ｇ  ＣＡＲレンチウイルス構築物を用いて形質導入する。Ｔ−ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｏｒビーズ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して、２日間にわたり細胞を活性化させてから、細胞傷害アッセイを行う。製造元のプロトコールに従い、標的細胞の最適数を決定する。アッセイのために、適切な標的細胞を、５％ＣＯ２インキュベーター内、３７℃で、２４時間にわたり、９６ウェルプレート内で三連で平板培養するのに続き、活性化ＣＡＲ  Ｔ細胞を、２０：１、１０：１、５：１、および１：１の比で添加し、５％ＣＯ２インキュベーター内、３７℃で、２４時間にわたりインキュベートする。細胞を、３７℃で、４５分間にわたり溶解させ、１，２５０ｒｐｍで、５分間にわたり遠心分離する。次いで、上清を、未使用の９６ウェルプレートへと移すのに続き、反応混合物を、３０分間にわたり添加する。停止溶液を使用して、反応を停止させ、６５０ｎｍで吸光度補正して、プレートを、４５０ｎｍで読み取る。
【０５７９】
ウェスタンブロット法
ＨＬＡ−ＣＡＲを発現させるＴ細胞を、ＲＩＰＡ緩衝液を使用して溶解させる。タンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法により推定する。５０マイクログラムのタンパク質溶解物を、１２％還元ポリアクリルアミドゲルで泳動させるのに続き、ニトロセルロース膜に移す。膜を、０．０５％Ｔｗｅｅｎを補充したＴＢＳ中の５％脱脂乳中で、１時間にわたってブロックする。次いで、膜を、ＣＤ３ζに特異的な抗体を使用して（１：２５０）、４℃で一晩にわたってインキュベートする。３回の洗浄後、膜を二次抗体中でインキュベートし、化学発光を使用してバンドを検出する。膜を剥がし、β−アクチンについて再び精査する。
【０５８０】
ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍退縮アッセイ
Ｆｏｘｎ１ヌルマウスに、ＨＬＡ−Ｇを発現させる悪性卵巣がん細胞株であるＳＫＯＶ３を注射することになる。０．２ｍＬの接種物を使用して、２００ｕｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の２×１０６個のＳＫＯＶ３細胞を、マウスの左脇腹へと注射する。αＣＤ３／ＣＤ２８  ａｃｔｉｖａｔｏｒ複合体（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて、Ｔ細胞を、２日間にわたり活性化させる。次いで、活性化Ｔ細胞に、ＨＬＡ−Ｇ  ＣＡＲレンチウイルス粒子を用いて形質導入するのに続き、さらに２日間にわたりαＣＤ３／ＣＤ２８  ａｃｔｉｖａｔｏｒ複合体で活性化させる。ＨＬＡ−Ｇ  ＣＡＲを発現させる活性化Ｔ細胞（２．５×１０６個）を、腫瘍接種後７日目に、マウスへと注射する。ノギスを使用して、毎週２回、腫瘍サイズを評価し、容量を計算する。
【０５８１】
ＨＬＡ−ＧＣＡＲ  Ｔ細胞についての細胞傷害
卵巣細胞株であるＳＫＯＶ３を使用して、ＨＬＡ−Ｇ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞溶解活性を検討した（図２６）。ＦＡＣＳ解析により判定して、ＳＫＯＶ３は、ＨＬＡ−Ｇを発現させる。ＨＬＡ−Ｇ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、ＳＫＯＶ３へと、２０：１、１０：１、５：１および１：１のエフェクター細胞  対  標的細胞比で添加した。１０：１の比で、ＨＬＡ−Ｇ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、標的ＳＫＯＶ３細胞の溶解増加を示し、溶解率は４２％である。これと比較して、形質導入されていないＴ細胞は、調べた比のいずれでもＳＫＯＶ３細胞を溶解しなかった。
【０５８２】
ＨＬＡ−Ｇ  ＣＡＲのタンパク質発現
ＨＬＡ−Ｇ  ＣＡＲを形質導入されたＴ細胞は、ウェスタンブロット法により示される通り、ＣＡＲのタンパク質を発現させる（図２７）。ＣＡＲの推定サイズは、約６０ｋＤＡである。β−アクチンを負荷対照として使用した。ＣＡＲに使用したシグナル伝達ドメインを標的とするＣＤ３ζ抗体を使用して、ＣＡＲタンパク質を検出した。
【０５８３】
実施例１０
マウス抗ヒトＨＬＡ−ＤＲモノクローナル抗体の作出
抗原
ラジアフリカバーキットリンパ腫細胞核を、Ｌｙｍ−１抗体を作製するための抗原として使用した。ＣＬＬ生検細胞核を、Ｌｙｍ−２抗体を作製するための抗原として使用した。
【０５８４】
免疫化手順
Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した４週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを、フロイント完全アジュバント（初回および２回目の免疫化）またはフロイント不完全アジュバント（３回目および４回目の免疫化）で乳化させた１０７個の核で、２週間ごとに４回、免疫化した。マウスに、合計１０７個の核／アジュバントを免疫化ごとにマウスの背部の別々の３点へと分割して皮内注射した。最後の免疫化の１０日後、血液試料を得、抗原をコーティングしたプレートを用いてＥＬＩＳＡ手順により力価測定した。次いで、最高力価を示すマウスには、１０６個の核を滅菌リン酸緩衝食塩水の１００μｌ溶液で、外側尾静脈を介して注射する、アジュバント伴わない５回目の免疫化ブーストを静脈内に施した。
【０５８５】
ハイブリドーマの作出
４日後、これらのマウスを屠殺し、ハイブリドーマ手順のために脾臓を除去した。Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ抗生物質を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地の溶液に脾細胞を分散させた後、ＰＥＧ（Ｈｙｂｒｉ  ＭＡＸ、分子量１４５０、カタログ番号ｐ７１８１、Ｓｉｇｍａ）を使用して碑細胞をマウスＮＳＯ細胞と融合させた。次いで、ＨＡＴ選択を使用して、融合細胞のみが増殖できるようにした。次いで、増殖中のハイブリドーマ細胞が入っているウェルからの上清を、まず、抗原をコーティングしたプレートに対するＥＬＩＳＡにより、次に、ＨＬＡ−ＤＲ陽性（ラジ）および陰性ヒト腫瘍細胞株（ＣＥＭ  Ｔ細胞白血病）についてのフローサイトメトリーにより、スクリーニングした。陽性の高い平均蛍光指数（ＭＦＩ）を示すハイブリドーマを限界希釈法によるサブクローニングに選択した。次いで、サブクローンをフローサイトメトリーにより再び調べ、液体窒素で凍結させ、２Ｌの容器内で拡大させ、その後、抗体をタンデム（tandon）のプロテインＡまたはＧおよびイオン交換クロマトグラフィー法により精製した。次いで、精製された抗体をバイアルに入れ、使用するまで−２０℃で保管した。
【０５８６】
フローサイトメトリー手順およびデータ
フローサイトメトリーを使用するスクリーニング方法は、抗原をコーティングしたプレートに対してＥＬＩＳＡにより陽性と判明したハイブリドーマからの上清を使用して、ＨＬＡ−ＤＲ陽性（ラジ）および陰性（ＣＥＭ）細胞株を用いて行った。次いで、高い平均蛍光指数（ＭＦＩ）を生じさせるハイブリドーマをサブクローニングし、ＨＬＡ−ＤＲに対する選択的陽性度について再スクリーニングした。下記の図２８Ａ〜２８Ｆに示す通り、Ｌｙｍ−１およびＬｙｍ−２は、Ｂ１抗体とは異なるプロファイルで、ＨＬＡ−ＤＲ発現ラジ細胞株に対して高いＭＦＩを生じさせた。これらのデータから、Ｌｙｍ−１およびＬｙｍ−２を、下記で記載するＣＡＲ−Ｔ細胞の作出に選択した。
【０５８７】
選択した抗体に関する免疫組織化学
標準的な免疫組織化学手順および抗原回復方法を使用して、抗体であるＬｙｍ−１およびＬｙｍ−２は、図２９Ａ〜２９Ｂに示す通り、ヒト扁桃組織の胚中心におけるＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞を染色することを見出した。胸腺、脾臓および骨髄における染色は、ＨＬＡ−ＤＲ抗原を発現させるＢ細胞または樹状細胞に限定された（表６）。
【表６】
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【０５８８】
図３０Ａ〜３０Ｂに示す通り、中悪性度Ｂ細胞リンパ腫などの抗原陽性腫瘍の細胞膜上で、ＨＬＡ−ＤＲ陽性度が見られた。最後に、正常組織および器官からの組織切片は、皮膚のリンパ系Ｂ細胞およびマクロファージに限定された反応性を示した（表７）。免疫組織化学を使用してＨＬＡ−ＤＲに対するコンパニオン診断抗体を入手できることにより、次回の臨床試験でＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ  Ｔ細胞療法による恩恵に浴する可能性が高い患者の同定が可能になる。
【表７】
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【０５８９】
肝臓細胞ラジオイムノアッセイ
Ｌｙｍ−１およびＬｙｍ−２を使用して、ヒトリンパ腫および固形腫瘍細胞株のパネルを、肝臓細胞ラジオイムノアッセイ手順を使用して結合についてスクリーニングした。このアッセイのために、ＥＤＴＡ−トリプシンが入っているフラスコから取り出した懸濁培養物および固形腫瘍細胞株を、ＰＢＳ、ウシ血清アルブミン（１ｍｇ／ｍｌ）および０．０２％アジ化ナトリウムからなる冷たい緩衝液中で２回洗浄した。１００μｌの洗浄緩衝液に再懸濁させた細胞（５×１０５個）を、ウェルへの抗体の結合を防止するためにＰＢＳ中のＢＳＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）で一晩にわたって前処理したマイクロウェルへと、ピペットで移した。次いで、９６ウェルプレート用のマイクロシェーカー装置を使用して継続的に振盪させながら３０分のインキュベーション期間にわたり、室温で、Ｌｙｍ−１およびＬｙｍ−２上清を添加した（１００μｌ／ウェル）。４回の洗浄後に、継続的に振盪させながらの、さらなる３０分のインキュベーションのために、１００，０００ｃｐｍのＩ−１２５ヤギ抗マウスＩｇＧを１００μｌで添加して細胞とともにインキュベートした。４回の最終洗浄後、ウェルをガンマカウンターでカウントして、各細胞調製物への抗体結合を判定した。これらの研究の結果は、ヒトリンパ腫および白血病生検試料の大きなパネルについて、Ｌｙｍ−１およびＬｙｍ−２の反応性が、Ｔ細胞起源のものではなく、Ｂ細胞起源の腫瘍に限定されることを示した（表８）。
【表８】
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【０５９０】
これらの結果と一致して、Ｌｙｍ−１およびＬｙｍ−２は、表９に示すような一部の選ばれたヒトリンパ腫および白血病細胞株に結合することが見出された。
【表９−１】
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【表９−２】
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【０５９１】
対照的に、Ｌｙｍ−１およびＬｙｍ−２は、上記で記載した生細胞ラジオイムノアッセイ手順を使用して、３５のヒト固形腫瘍細胞株に結合することが見出されなかった（表１０）。
【表１０】
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【０５９２】
Ｌｙｍ−１およびＬｙｍ−２抗体の結合プロファイルならびにＬｙｍ−１抗原の同定
ラジ細胞とのＬｙｍ−１の結合についての結合プロファイルおよび散布図解析を図３１Ａに示す。同様に、ＡＲＨ−７７骨髄腫細胞株とのＬｙｍ−２の結合についての散布図解析を図３１Ｂに示す。これらのデータは、両方の抗体が、抗原陽性腫瘍細胞株に対して１０８Ｍ−１の結合アフィニティーを有することを裏付けた。表１１に示す通り、正常末梢血Ｂ細胞と比較したとき、腫瘍細胞で見られたものと比較して結合アフィニティーの２〜４倍減少があった。加えて、３５Ｓ−メチオニンおよび１４Ｃ−ロイシンでのラジ細胞の代謝標識は、ＨＬＡ−ＤＲに見られる特徴的なバンド形成パターンを示した（図３２Ａ〜３２Ｂ）。対照として、ＳＣ−１抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体を並行して使用し、ＳＤＳゲル電気泳動により同一のタンパク質分子量で同じバンド形成パターンを得た。
【表１１】
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【０５９３】
実施例１１
ＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の作出
単鎖ＨＬＡ−ＤＲ抗体遺伝子の構築および合成
研究室で作出した２つの高結合性抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（Ｌｙｍ−１およびＬｙｍ−２）についてのＤＮＡ配列は、ＭＣＬＡＢ（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）から得る。両方の抗体を試験して、どちらの抗体が、下に記載するアッセイで最も有効なＣＡＲを産生するのかを決定する。下記に示す通り、次のタンデム遺伝子：Ｋｏｚａｋコンセンサス配列；ＣＤ８シグナルペプチド；抗ＨＬＡ−ＤＲ重鎖可変領域；（グリシン４セリン）３可撓性ポリペプチドリンカー；それぞれの抗ＨＬＡ−ＤＲ軽鎖可変領域；ＣＤ８ヒンジおよび膜貫通ドメイン；ならびにＣＤ２８、４−１ＢＢおよびＣＤ３ζ細胞内共刺激性シグナル伝達ドメインからなる、第２または第３（図３３）世代ＣＡＲベクターを構築する。ヒンジ、膜貫通およびシグナル伝達ドメインＤＮＡ配列は、Carl  Juneによる特許（米国特許出願公開第２０１３／０２８７７４８Ａ１号を参照されたい）から突き止められる。抗ＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ遺伝子は、Ｇｅｎｅｗｉｚ，Ｉｎｃ．（Ｓｏｕｔｈ  Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ、ＮＪ）により、ベクター宿主にアンピシリン耐性を付与するｂｌａ遺伝子を含有するｐＵＣ５７ベクター骨格内に合成される。
【０５９４】
ＣＡＲ遺伝子の、レンチウイルスプラスミドへのサブクローニング
ＮｏｖａＢｌｕｅ  Ｓｉｎｇｌｅｓ（商標）化学的コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞を、抗ＨＬＡ−ＤＲプラスミドｃＤＮＡで形質転換する。形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ細胞の増殖後、ＣＡＲプラスミドを精製し、一晩にわたるＴ４  ＤＮＡリガーゼ反応（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を介して、ＨＩＶ−１末端反復（ＬＴＲ）、パッケージングシグナル（Ψ）、ＥＦ１αプロモーター、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、およびウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含有するＨＩＶ−１ベースのレンチウイルスベクターへと挿入されるように、適切な制限酵素で消化する。次いで、その結果として得られる、抗ＨＬＡ−ＤＲを含有するレンチウイルスプラスミドで、ＮｏｖａＢｌｕｅ  Ｓｉｎｇｌｅｓ（商標）化学的コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞を形質転換する。
【０５９５】
レンチウイルス粒子の作製
トランスフェクションの前に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０ｍＬのｃｏｍｐｌｅｔｅ−Ｔｅｔ−ＤＭＥＭ中に、１００ｍｍの組織培養処理プレート１枚当たりの細胞４．０×１０６個で播種し、加湿された５％ＣＯ２インキュベーター内、３７℃で、一晩にわたりインキュベートする。８０〜９０％コンフルエントに達したら、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ＣＡＲ遺伝子のレンチウイルスプラスミドと、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に結合するプラスミド含有ナノ粒子の形成を容易とするための特許権のある反応緩衝液およびポリマーに加えて、レンチウイルスのエンベロープ構成要素およびカプシド構成要素を形成するのに必要な遺伝子を含有するレンチウイルスパッケージングプラスミドとを、共トランスフェクトする。トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞培養物を、３７℃で、４時間にわたりインキュベートした後、トランスフェクション培地を、新鮮なｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｔｅｔ  ＤＭＥＭ  １０ｍＬで置きかえる。次いで、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、さらなる４８時間にわたりインキュベートし、その後、細胞上清を採取し、主要なレンチウイルスカプシドタンパク質であるｐ２４に対するサンドイッチＥＬＩＳＡを介して、レンチウイルス粒子について調べる。レンチウイルス含有上清をアリコートに分け、標的であるＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞に形質導入するために使用するまで、−８０℃で保管する。
【０５９６】
ヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋末梢血Ｔ細胞の精製、活性化、および濃縮
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）を伴う密度勾配遠心分離により濃縮し、０．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および２ｍＭのＥＤＴＡを含有するＰＢＳを伴う遠心分離により回収および洗浄する。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞についてポジティブ選択するように、磁気的に活性化させたＬＳカラムを使用して、これらのヒトＴ細胞サブセットを単離するのに、ＭＡＣＳ  ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）キットを使用する。次いで、磁気的に結合したＴ細胞を、ＭＡＣＳ磁気分離器から取り出し、ＬＳカラムからフラッシュ洗浄し、新鮮な完全培地中で洗浄する。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞集団の純度は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ａｃｏｕｓｔｉｃ  Ａｔｔｕｎｅ（登録商標）Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを使用するフローサイトメトリーにより評価し、必要な場合、ＵＳＣのフローサイトメトリーコア施設で実施される蛍光活性化細胞分取により濃縮する。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、適切な細胞培養容器内で、１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を補充された完全培地中、１ｍＬ当たりの細胞１．０×１０６個の密度で維持し、これに、α−ＣＤ３／α−ＣＤ２８  Ｈｕｍａｎ  Ｔ−ｃｅｌｌ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｃａｒｓｌｂａｄ、ＣＡ）を添加して、培養Ｔ細胞を活性化させる。ＣＡＲ−レンチウイルス粒子で形質導入する前に、Ｔ細胞を、５％ＣＯ２インキュベーター内、３７℃で、２日間にわたりインキュベートする。
【０５９７】
ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のレンチウイルス形質導入
活性化Ｔ細胞を回収し、死細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離、またはＭＡＣＳ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｍｏｖａｌ  Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）の使用により除去する。６ウェルプレートに、活性化Ｔ細胞を、１ｍＬの完全培地当たりの細胞１．０×１０６個の濃度で播種する。種々のウェルに対して、ＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ含有レンチウイルス粒子を、細胞懸濁液へと、１、５、１０、および５０など、感染多重度（ＭＯＩ）を変化させて添加する。レンチウイルス粒子と標的細胞表面との間の相互作用を容易とすることにより形質導入を支援するカチオン性ポリマーであるポリブレンを、４μｇ／ｍＬの最終濃度で添加する。プレートを、３２℃、８００×ｇで、１時間にわたり遠心分離する。遠心分離後、レンチウイルス含有培地を吸引し、細胞ペレットを、１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む新鮮な完全培地中に再懸濁させる。細胞を、５％ＣＯ２の加湿されたインキュベーター内、３７℃で一晩にわたり静置する。形質導入の３日後、細胞をペレット化させ、ＩＬ−２および４００μｇ／ｍＬのジェネティシン（Ｇ４１８スルフェート）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を含む、新鮮な完全培地中に再懸濁させる。ＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ改変Ｔ細胞を、フローサイトメトリーおよびサザンブロット解析により評価して、形質導入手順の成功を裏付ける。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏアッセイの前に、ＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、ＦＡＣＳにより濃縮し、ｉｎ  ｖｉｖｏ研究のために、１：１に混合する。
【０５９８】
カルセイン放出細胞傷害アッセイによる、ＣＡＲの有効性についてのｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価
ＨＬＡ−ＤＲ抗原陽性および陰性ヒト細胞株を、回収し、洗浄し、完全培地中に１ｍＬ当たりの細胞１．０×１０６個の濃度で再懸濁させる。カルセインアセトキシメチル（ＡＭ）を、１５μＭで、標的細胞試料へと添加し、次いで、これを、５％ＣＯ２の加湿されたインキュベーター内、３７℃で、３０分間にわたりインキュベートする。染色した陽性および陰性標的細胞を、２回洗浄し、遠心分離により、完全培地中に再懸濁させ、ウェル１つ当たりの細胞１．０×１０４個で、９６ウェルプレートへと添加する。ＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、完全培地中に、５０：１、５：１、および１：１のエフェクター対標的細胞比で、プレートへと添加する。完全培地および２％のｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を伴う完全培地中に懸濁させた染色標的細胞を、それぞれ、自発的放出対照および最大放出対照として用いる。プレートを、３６５×ｇおよび２０℃で、２分間にわたり遠心分離してから、インキュベーターに戻して、３時間にわたり静置する。次いで、プレートを、１０分間にわたり遠心分離し、細胞上清を、黒色のポリスチレン製９６ウェルプレート上のそれぞれのウェルへとアリコートに分け、Ｂｉｏ−Ｔｅｋ（登録商標）Ｓｙｎｅｒｇｙ（商標）ＨＴマイクロプレートリーダーを用いて、それぞれ４８５／２０ｎｍおよび５２８／２０ｎｍの励起および発光で、蛍光について評価する。
【０５９９】
Ｌｕｍｉｎｅｘバイオアッセイによるヒトサイトカインの定量化
研究室で慣例的に実施される標準的な手順を使用して、ＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ改変Ｔ細胞ならびにＨＬＡ−ＤＲ陽性および陰性腫瘍細胞株の上清を、ＣＡＲ  Ｔ細胞活性化の尺度としてのサイトカインの分泌について測定する。バックグラウンドの活性を同定するために、活性化されていないヒトＴ細胞を使用して、データを、培地単独および培養物と比較する。ＩＬ−２、ＩＦＮ−ｇ、ＩＬ−１２、および他の関連するサイトカインの濃度を、インキュベーション工程中の時間にわたり測定する。
【０６００】
２つのＨＬＡ−ＤＲ陽性がん異種移植片モデルにおける、ＣＡＲ  Ｔ細胞有効性についてのｉｎ  ｖｉｖｏ評価
２つの異なるヒト腫瘍細胞株異種移植片腫瘍モデルを使用して、ＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、さらに評価する。両方について、５×１０６個のＨＬＡ−ＤＲ陽性またはＨＬＡ−ＤＲ陰性固形腫瘍細胞株の注射により、固形腫瘍を、６〜８週齢の雌ヌードマウスの皮下において確立する。腫瘍が、０．５ｃｍの直径に達したら、マウス（ｎ＝５）の群を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究の結果に基づき、１または３×１０７個の、陰性対照としてのヒトＴ細胞、または最も活性のＨＬＡ−ＤＲ抗体から構築されたＨＬＡ−ＤＲ  ＣＡＲ  Ｔ細胞で、静脈内において処置する。次いで、腫瘍容量を、キャリパーにより、毎週３回測定し、容量増大曲線を作成して、実験的処置の、対照を上回る有効性を裏付ける。
【０６０１】
ＨＬＡ−ＤＲは、ＣＡＲ  Ｔ細胞開発の卓越した標的であることが分かる。
【０６０２】
実施例１２
Ｌｙｍ−１  ＣＡＲ細胞
ＣＡＲレンチウイルス構築物の構築
Ｌｙｍ−１  ＣＡＲベクターは、ＣＤ８リーダー配列に続いて、Ｌｙｍ−１抗原に特異的に結合する細胞外抗原結合部分またはｓｃＦｖを含有する。ｓｃＦＶは、ＣＤ８ヒンジ領域を介して、ＣＤ８膜貫通領域を含む細胞質シグナル伝達ドメイン、ならびに４−１ＢＢおよびＣＤ３ζに由来するシグナル伝達ドメインへと接続される（図７）。シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲ配列は、合成により、Ｇｅｎｅｗｉｚ  Ｇｅｎｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｓｅｒｖｉｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）が合成した。プラスミドを精製し、一晩にわたるＴ４  ＤＮＡリガーゼ反応（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を介して、ＨＩＶ−１  ５’および３’末端反復（ＬＴＲ）、パッケージングシグナル（Ψ）、ＥＦ１αプロモーター、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、およびサルウイルス４０起点（ＳＶ４０）を含有する、ＨＩＶ−１ベースのレンチウイルスベクター（ｐＬＶＸ−ＩＲＥＳ−ＺｓＧｒｅｅｎ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｓｉｇｎａｌ  Ｈｉｌｌ、ＣＡ）へと挿入するように、適切な制限酵素で消化するのに続き、制限酵素消化を使用するＩＲＥＳ−ＺｓＧｒｅｅｎの削除、およびＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いるライゲーションを行う。次いで、その結果として得られる、ＣＡＲ含有レンチウイルスプラスミドで、ＮｏｖａＢｌｕｅ  Ｓｉｎｇｌｅｓ（商標）化学的コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞を形質転換する。
【０６０３】
レンチウイルス粒子の作製
トランスフェクションの前に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１５０ｃｍ２の組織培養処理フラスコ内で、１０％透析ＦＣＳを補充した２０ｍＬのＤＭＥＭ中に細胞４．０×１０６個で播種し、加湿された５％ＣＯ２インキュベーター内、３７℃で、一晩にわたりインキュベートする。８０〜９０％コンフルエントに達したら、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、加湿された５％ＣＯ２インキュベーター内、３７℃で、ペニシリン／ストレプトマイシンを伴わない、１％の透析ＦＣＳを補充した、２０ｍｌのＤＭＥＭ中、２時間にわたりインキュベートする。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ＣＡＲプラスミドと、レンチウイルスのエンベロープ構成要素およびカプシド構成要素を形成するのに必要な遺伝子を含有するレンチウイルスパッケージングプラスミドとを、共トランスフェクトする。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に結合するプラスミド含有ナノ粒子の形成を容易とするための、特許権のある反応緩衝液およびポリマーもまた添加する。トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞培養物を、３７℃で、２４時間にわたりインキュベートした後で、トランスフェクション培地を、新鮮な完全ＤＭＥＭ  ２０ｍＬで置きかえる。レンチウイルス上清を、２４時間ごと、３日間にわたり回収し、上清を、４℃、１，２５０ｒｐｍで、５分間にわたり遠心分離するのに続き、濾過滅菌、および超遠心分離機内、４℃、２０，０００ｇで、２時間にわたる遠心分離を行う。濃縮されたレンチウイルスを、７％トレハロースおよび１％ＢＳＡを含有するＰＢＡ中に再懸濁させる。次いで、レンチウイルスをアリコートに分け、標的であるＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞に形質導入するために使用するまで、−８０℃で保管する。２４時間後に採取した細胞上清を、主要なレンチウイルスカプシドタンパク質であるｐ２４に対するサンドイッチＥＬＩＳＡを介して、レンチウイルス粒子について調べる。ビオチン標識プロテインＬ抗体（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）での染色に続いて、ＰＥとコンジュゲートしているストレプトアビジンとのインキュベーション、そしてＦＡＣＳ解析による検出により、トランスフェクション効率を２０％〜５０％の間と推定した。
【０６０４】
ヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋末梢血Ｔ細胞の精製、活性化、および濃縮
Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）を伴う密度勾配遠心分離により濃縮された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、０．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および２ｍＭのＥＤＴＡを含有するＰＢＳを伴う遠心分離により回収および洗浄する。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞についてのネガティブ選択を使用して、これらのヒトＴ細胞サブセットを磁気的に単離するのに、Ｔ細胞濃縮キット（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用する。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞集団の純度は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ａｃｏｕｓｔｉｃ  Ａｔｔｕｎｅ（登録商標）Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを使用するフローサイトメトリーにより評価し、蛍光活性化細胞分取により濃縮する。１：１に混合されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、適切な細胞培養容器内で、１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を補充された完全な５０％のクリック培地／５０％のＲＰＭＩ−１６４０培地中、１ｍＬ当たりの細胞１．０×１０６個の密度で維持し、これに、α−ＣＤ３／α−ＣＤ２８  Ｈｕｍａｎ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｏｒビーズ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加して、培養Ｔ細胞を活性化させる。次いで、ＣＡＲレンチウイルス粒子で形質導入する前に、Ｔ細胞を、５％ＣＯ２インキュベーター内、３７℃で、２日間にわたりインキュベートする。
【０６０５】
ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のレンチウイルス形質導入
活性化Ｔ細胞を回収し、死細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離、またはＭＡＣＳ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｍｏｖａｌ  Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）の使用により除去する。６ウェルプレートに、活性化Ｔ細胞を、完全培地中、１ｍＬ当たり細胞１．０×１０６個の濃度で播種することになる。細胞に、細胞へのトランスフェクション補助剤であるＬｅｎｔｉｂｌａｓｔ（Ｏｚ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を補充したレンチウイルス粒子を用いて形質導入することになる。形質導入された細胞を、加湿された５％ＣＯ２インキュベーター内、３７℃で、２４時間にわたりインキュベートした。細胞をスピンダウンし、培地を交換するのに続き、Ｔ−ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｏｒビーズ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を添加する。
【０６０６】
フローサイトメトリーによるＬｙｍ−１  ＣＡＲ発現の検出
レンチウイルス形質導入の７日後に、洗浄緩衝液（ＰＢＳ中の４％ＢＳＡ）を使用して初代Ｔ細胞を３回洗浄する。細胞を、ビオチン−プロテインＬ（２ｕｇ、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）とともに、４℃で４５分間にわたってインキュベートする。細胞を洗浄緩衝液で３回、再び洗浄するのに続き、２ｕｌのＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＰＥ（ＢＤ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）とともに４℃で４５分間にわたってインキュベートする。細胞を、３回洗浄し、フローサイトメトリー（Ａｔｔｕｎｅ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して解析する。
【０６０７】
細胞傷害アッセイ
Ｌｙｍ−１  ＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞傷害は、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）細胞傷害キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して決定する。活性化Ｔ細胞を回収し、１×１０６個の細胞に、上記で記載したＬｙｍ−１  ＣＡＲレンチウイルス構築物を用いて形質導入する。Ｔ−ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｏｒビーズ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して、２日間にわたり細胞を活性化させてから、細胞傷害アッセイを行う。製造元のプロトコールに従い、標的細胞の最適数を決定する。アッセイのために、適切な標的細胞を、５％ＣＯ２インキュベーター内、３７℃で、２４時間にわたり、９６ウェルプレート内で三連で平板培養するのに続き、活性化ＣＡＲ  Ｔ細胞を、２０：１、１０：１、５：１、および１：１の比で添加し、５％ＣＯ２インキュベーター内、３７℃で、２４時間にわたりインキュベートする。細胞を、３７℃で、４５分間にわたり溶解させ、１，２５０ｒｐｍで、５分間にわたりスピンダウンする。上清を、未使用の９６ウェルプレートへと移すのに続き、反応混合物を、３０分間にわたり添加する。停止溶液を使用して、反応を停止させ、６５０ｎｍで吸光度補正して、プレートを、４５０ｎｍで読み取る。
【０６０８】
ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍退縮アッセイ
Ｆｏｘｎ１ヌルマウスに、Ｌｙｍ−１抗原を発現させる不死化Ｂリンパ腫細胞株であるラジを注射する。２００ｕｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の２×１０６個のラジ細胞と１×１０６個のヒト線維芽細胞を、異種移植片の高頻度の植込みを可能にする循環ＮＫ細胞の数を低減させるために事前に照射したマウス（４００ｒａｄ）の左脇腹へと注射する。αＣＤ３／ＣＤ２８  ａｃｔｉｖａｔｏｒ複合体（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて、Ｔ細胞を、２日間にわたり活性化させる。次いで、活性化Ｔ細胞に、Ｌｙｍ−１  ＣＡＲレンチウイルス粒子を用いて形質導入するのに続き、さらなる２日間にわたるαＣＤ３／ＣＤ２８  ａｃｔｉｖａｔｏｒ複合体での活性化を行う。Ｌｙｍ−１  ＣＡＲを発現させる活性化Ｔ細胞（２．５×１０６個）を、腫瘍接種後７日目に、外側尾静脈を介してマウスへと静脈内注射する。ノギスを使用して、毎週３回、腫瘍サイズを評価し、腫瘍容量を計算する。
【０６０９】
Ｌｙｍ−１  ＣＡＲ発現の検出
Ｌｙｍ−１  ＣＡＲの発現についてのＬｙｍ−１  ＣＡＲ  Ｔ細胞の解析は、Ｌｙｍ−１に対して陽性の、形質導入Ｔ細胞の６２．５％を示した（図３５の中央パネル）。対照的に、対照として使用した、形質導入されていないＴ細胞の１％のみが、ＣＡＲ発現に対して陽性であった（図３５の左側パネル）。ＣＤ１９形質導入Ｔ細胞を陽性対照として使用し、これらの細胞は、ＣＤ１９  ＣＡＲの５２％発現を示した（図３５の右側パネル）。
【０６１０】
Ｌｙｍ−１  ＣＡＲ  Ｔ細胞についての細胞傷害
Ｂ細胞リンパ腫細胞株であるラジを使用して、Ｌｙｍ−１  ＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞溶解活性を検討した。ラジは、ＦＡＣＳ解析により判定して、Ｌｙｍ−１抗原（ＨＬＡ−Ｄｒ１０）を発現する。Ｌｙｍ−１  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、ラジ細胞へと、２０：１、１０：１、５：１および１：１のエフェクター細胞  対  標的細胞比で添加した。Ｌｙｍ−１  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、５：１、１０：１および２０：１の比で、標的ラジ細胞の溶解増加を示し、溶解率は２２％であった。これと比較して、形質導入されていないＴ細胞は、調べた比のいずれでもラジ細胞を溶解しなかった。
【０６１１】
実施例１３
Ｌｙｍ−２  ＣＡＲ細胞
ＣＡＲレンチウイルス構築物の構築
Ｌｙｍ−２  ＣＡＲベクターは、ＣＤ８リーダー配列に続いて、Ｌｙｍ−２抗原（ＨＬＡ−Ｄｒ）に特異的に結合する細胞外抗原結合部分またはｓｃＦｖを含有する。ｓｃＦＶは、ＣＤ８ヒンジ領域を介して、ＣＤ８膜貫通領域を含む細胞質シグナル伝達ドメイン、ならびに４−１ＢＢおよびＣＤ３ζに由来するシグナル伝達ドメインへと接続される。シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲ配列は、合成により、Ｇｅｎｅｗｉｚ  Ｇｅｎｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｓｅｒｖｉｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）が合成した。プラスミドを精製し、一晩にわたるＴ４  ＤＮＡリガーゼ反応（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を介して、ＨＩＶ−１  ５’および３’末端反復（ＬＴＲ）、パッケージングシグナル（Ψ）、ＥＦ１αプロモーター、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、およびサルウイルス４０起点（ＳＶ４０）を含有する、ＨＩＶ−１ベースのレンチウイルスベクター（ｐＬＶＸ−ＩＲＥＳ−ＺｓＧｒｅｅｎ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｓｉｇｎａｌ  Ｈｉｌｌ、ＣＡ）へと挿入するように、適切な制限酵素で消化するのに続き、制限酵素消化を使用するＩＲＥＳ−ＺｓＧｒｅｅｎの削除、およびＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いるライゲーションを行う。次いで、その結果として得られる、ＣＡＲ含有レンチウイルスプラスミドで、ＮｏｖａＢｌｕｅ  Ｓｉｎｇｌｅｓ（商標）化学的コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞を形質転換する。
【０６１２】
レンチウイルス粒子の作製
トランスフェクションの前に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１５０ｃｍ２の組織培養処理フラスコ内で、１０％透析ＦＣＳを補充した２０ｍＬのＤＭＥＭ中に細胞４．０×１０６個で播種し、加湿された５％ＣＯ２インキュベーター内、３７℃で、一晩にわたりインキュベートする。８０〜９０％コンフルエントに達したら、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、３７℃の加湿された５％ＣＯ２インキュベーター内で、ペニシリン／ストレプトマイシンを伴わない、１％の透析ＦＣＳを補充した、２０ｍｌのＤＭＥＭ中、２時間にわたりインキュベートする。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ＣＡＲプラスミドと、レンチウイルスのエンベロープ構成要素およびカプシド構成要素を形成するのに必要な遺伝子を含有するレンチウイルスパッケージングプラスミドとを、共トランスフェクトする。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に結合するプラスミド含有ナノ粒子の形成を容易とするための、特許権のある反応緩衝液およびポリマーもまた添加する。トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞培養物を、３７℃で、２４時間にわたりインキュベートした後で、トランスフェクション培地を、新鮮な完全ＤＭＥＭ  ２０ｍＬで置きかえる。レンチウイルス上清を、２４時間ごと、３日間にわたり回収し、上清を、４℃、１，２５０ｒｐｍで、５分間にわたり遠心分離するのに続き、濾過滅菌、および超遠心分離機内、４℃、２０，０００ｇで、２時間にわたる遠心分離を行う。濃縮されたレンチウイルスを、７％トレハロースおよび１％ＢＳＡを含有するＰＢＡ中に再懸濁させる。レンチウイルスをアリコートに分け、標的であるＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞に形質導入するために使用するまで、−８０℃で保管する。２４時間後に採取した細胞上清を、主要なレンチウイルスカプシドタンパク質であるｐ２４に対するサンドイッチＥＬＩＳＡを介して、レンチウイルス粒子について調べる。ビオチン標識プロテインＬ抗体（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）での染色に続いて、ＰＥとコンジュゲートしているストレプトアビジンとのインキュベーション、およびＦＡＣＳ解析による検出により、トランスフェクション効率を２０％〜５０％の間と推定した。
【０６１３】
ヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋末梢血Ｔ細胞の精製、活性化、および濃縮
Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）を伴う密度勾配遠心分離により濃縮された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、０．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および２ｍＭのＥＤＴＡを含有するＰＢＳを伴う遠心分離により回収および洗浄する。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞についてのネガティブ選択を使用して、これらのヒトＴ細胞サブセットを磁気的に単離するのに、Ｔ細胞濃縮キット（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用する。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞集団の純度は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ａｃｏｕｓｔｉｃ  Ａｔｔｕｎｅ（登録商標）Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを使用するフローサイトメトリーにより評価し、蛍光活性化細胞分取により濃縮することになる。１：１に混合されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、適切な細胞培養容器内で、１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を補充された完全な５０％のクリック培地／５０％のＲＰＭＩ−１６４０培地中、１ｍＬ当たりの細胞１．０×１０６個の密度で維持し、これに、α−ＣＤ３／α−ＣＤ２８  Ｈｕｍａｎ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｏｒビーズ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加して、培養Ｔ細胞を活性化させる。次いでＣＡＲレンチウイルス粒子で形質導入する前に、Ｔ細胞を、５％ＣＯ２の加湿されたインキュベーター内、３７℃で、２日間にわたりインキュベートする。
【０６１４】
ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のレンチウイルス形質導入
活性化Ｔ細胞を回収し、死細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離、またはＭＡＣＳ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｍｏｖａｌ  Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）の使用により除去する。６ウェルプレートに、活性化Ｔ細胞を、１ｍＬの完全培地当たりの細胞１．０×１０６個の濃度で播種する。細胞に、細胞へのトランスフェクション補助剤であるＬｅｎｔｉｂｌａｓｔ（Ｏｚ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を補充したレンチウイルス粒子を用いて形質導入する。形質導入された細胞を、３７℃の加湿された５％ＣＯ２インキュベーター内、３７℃で、２４時間にわたりインキュベートする。細胞をスピンダウンし、培地を交換するのに続き、Ｔ−ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｏｒビーズ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を添加する。
【０６１５】
細胞傷害アッセイ
Ｌｙｍ−２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞傷害は、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）細胞傷害キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して決定する。活性化Ｔ細胞を回収し、１×１０６個の細胞に、上記で記載したＬｙｍ−２  ＣＡＲレンチウイルス構築物を用いて形質導入する。Ｔ−ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｏｒビーズ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して、２日間にわたり細胞を活性化させてから、細胞傷害アッセイを行う。製造元のプロトコールに従い、標的細胞の最適数を決定することになる。アッセイのために、適切な標的細胞を、３７℃の加湿された５％ＣＯ２インキュベーター内、３７℃で、２４時間にわたり、９６ウェルプレート内で三連で平板培養するのに続き、活性化ＣＡＲ  Ｔ細胞を、２０：１、１０：１、５：１、および１：１の比で添加し、２４にわたり、上記の通りにインキュベートすることになる。細胞を、３７℃で、４５分間にわたり溶解させ、１，２５０ｒｐｍで、５分間にわたり遠心分離することになる。上清を、未使用の９６ウェルプレートへと移すのに続き、反応混合物を、３０分間にわたり添加する。停止溶液を使用して、反応を停止させ、６５０ｎｍで吸光度補正して、プレートを、４５０ｎｍで読み取る。
【０６１６】
ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍退縮アッセイ
Ｆｏｘｎ１ヌルマウスに、Ｌｙｍ−２抗原を発現させる不死化Ｂリンパ腫細胞株であるラジを注射する。２００ｕｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の２×１０６個のラジ細胞と１×１０６個のヒト線維芽細胞を、高い腫瘍生着率を確実にするために（in  insure  a  high  take  rate  of  tumor）事前に照射した（４００ｒａｄ）ＢＡＬＢ／ｃマウスの左脇腹へと注射する。αＣＤ３／ＣＤ２８  ａｃｔｉｖａｔｏｒ複合体（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて、Ｔ細胞を、２日間にわたり活性化させる。次いで、活性化Ｔ細胞に、Ｌｙｍ−２  ＣＡＲレンチウイルス粒子を用いて形質導入するのに続き、さらなる２日間にわたるαＣＤ３／ＣＤ２８  ａｃｔｉｖａｔｏｒ複合体での活性化を行う。Ｌｙｍ−２  ＣＡＲを発現させる活性化Ｔ細胞（２．５×１０６個）を、腫瘍接種後７日目に、マウスへと静脈内注射する。ノギスを使用して、毎週３回、腫瘍サイズを評価し、腫瘍容量を計算する。
【０６１７】
Ｌｙｍ−２  ＣＡＲ発現の検出
Ｌｙｍ−１  ＣＡＲの発現についてのＬｙｍ−２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の解析は、形質導入Ｔ細胞の２８％がＬｙｍ−２に対して陽性であることを示した（図３８の中央パネル）。対照的に、対照として使用した、形質導入されていないＴ細胞の１％のみが、ＣＡＲ発現に対して陽性であった（図３８の左側パネル）。ＣＤ１９形質導入Ｔ細胞を陽性対照として使用し、これらの細胞は、ＣＤ１９  ＣＡＲの５２％発現を示した（図３８の右側パネル）。
【０６１８】
Ｌｙｍ−２  ＣＡＲ  Ｔ細胞についての細胞傷害
Ｂ細胞リンパ腫細胞株であるラジを使用して、Ｌｙｍ−２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞溶解活性を判定した。ラジは、ＦＡＣＳ解析により判定して、Ｌｙｍ−２抗原を発現する。Ｌｙｍ−２  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、ラジ細胞へと、２０：１、１０：１、５：１および１：１のエフェクター細胞  対  標的細胞比で添加した。Ｌｙｍ−２  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、５：１および１０：１の比で、標的ラジ細胞の溶解増加を示し、溶解率は２２％である。これと比較して、形質導入されていないＴ細胞は、調べた比のいずれでもラジ細胞を溶解しなかった。
【０６１９】
実施例１４
ＮＫ細胞形質導入
ＮＫ−９２ＭＩ形質導入
ＮＫ−９２Ｍｉ細胞株を、ＡＴＣＣ（ＣＲＬ−２４０８）から購入し、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０中で維持した。形質導入前に、組織処理していない２４のウェルを、３００μＬのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の１０μｇのＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｔ１００Ａ）とともに、室温で、２時間にわたりインキュベートした。１，０００，０００個のＮＫ−９２Ｍｉ細胞とレンチウイルス（ＭＯＩ＝５）を混合し、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎをコーティングしたプレートに添加した。次いで、プレートを２８℃、８００ｇで９０分間にわたり遠心分離した。遠心分離後、細胞を、細胞培養インキュベーター内で一晩にわたり維持した。インキュベーション後、細胞を、翌朝、ＰＢＳで３回洗浄し、次いで、形質導入されたＮＫ−９２Ｍｉ細胞を拡大のために２４ウェルＧ−Ｒｅｘ（Ｗｉｌｓｏｎ  Ｗｏｌｆ）プレートに移した。レンチウイルス形質導入の７日後に、細胞を、洗浄緩衝液（ＰＢＳ中の４％ＢＳＡ）中で３回洗浄し、ビオチン−プロテインＬ（細胞１，０００，０００個当たり１ｕｇ、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）を用いて４℃で４５分間にわたり染色し、洗浄緩衝液で３回洗浄してから、２ｕｌのＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＡＰＣ（ＢＤ  ｓｃｉｅｎｃｅ）を４℃で４５分間にわたり添加した。洗浄緩衝液中での３回の最終洗浄後、細胞をＦＡＣｓ（Ａｔｔｕｎｅ）により解析した（図４２）。
【０６２０】
均等物
そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本技術が属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。
【０６２１】
本明細書で例示的に記載される本技術は、本明細書では具体的に開示されない、任意の１または複数の要素、１または複数の限定の非存在下で、適切に実施することができる。したがって、例えば、「〜を含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「〜を含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「〜を含有すること」などの用語は、広く、限定を伴わずに読み取られるべきものである。加えて、本明細書で利用される用語および表現は、限定的な用語ではなく、記載的な用語として使用されており、このような用語および表現の使用において、示され、記載される特徴の、任意の均等物またはそれらの部分を除外する意図は存在しないが、特許請求される本技術の範囲内では、多様な改変が可能であることが認識されている。
【０６２２】
したがって、本明細書で提示される材料、方法、および例は、好ましい態様を表すものであり、例示的なものであり、本技術の範囲に対する限定として意図されるものではないことを理解すべきである。
【０６２３】
本明細書では、本技術について、広く、かつ、一般的に記載してきた。一般的開示の中に収まるより狭い種および亜属的群分けの各々もまた、本技術の一部を形成する。これは、本技術についての一般的記載であって、排除される材料が、本明細書で具体的に列挙されるのかどうかに関わらず、任意の対象物を属から除外する条件または否定的限定を伴う記載を含む。
【０６２４】
加えて、マーカッシュ群との関係で、本技術の特徴または態様について記載する場合、当業者は、本技術が、これにより、マーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたはメンバーの亜群との関係でもまた記載されることを認識するであろう。
【０６２５】
本明細書で言及される、全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、各々が参照により個別に組み込まれた場合と同じ程度に、参照によりそれらの全体において明示的に組み込まれる。矛盾する場合は、定義を含む本明細書が支配する。
【０６２６】
他の態様は、以下の特許請求の範囲において明示される。
【図１Ａ】
2020501512.tif 000017
【図１Ｂ】
2020501512.tif 000018
【図１Ｃ】
2020501512.tif 000019
【図２Ａ】
2020501512.tif 000020
【図２Ｂ】
2020501512.tif 000021
【図２Ｃ】
2020501512.tif 000022
【図３】
2020501512.tif 000023
【図４】
2020501512.tif 000024
【図５】
2020501512.tif 000025
【図６】
2020501512.tif 000026
【図７】
2020501512.tif 000027
【図８Ａ】
2020501512.tif 000028
【図８Ｂ】
2020501512.tif 000029
【図８Ｃ】
2020501512.tif 000030
【図８Ｄ】
2020501512.tif 000031
【図９】
2020501512.tif 000032
【図１０】
2020501512.tif 000033
【図１１】
2020501512.tif 000034
【図１２】
2020501512.tif 000035
【図１３Ａ−１３Ｃ】
2020501512.tif 000036
【図１４】
2020501512.tif 000037
【図１５】
2020501512.tif 000038
【図１６】
2020501512.tif 000039
【図１７】
2020501512.tif 000040
【図１８】
2020501512.tif 000041
【図１９】
2020501512.tif 000042
【図２０】
2020501512.tif 000043
【図２１】
2020501512.tif 000044
【図２２Ａ】
2020501512.tif 000045
【図２２Ｂ】
2020501512.tif 000046
【図２２Ｃ】
2020501512.tif 000047
【図２２Ｄ】
2020501512.tif 000048
【図２３】
2020501512.tif 000049
【図２４】
2020501512.tif 000050
【図２５】
2020501512.tif 000051
【図２６】
2020501512.tif 000052
【図２７】
2020501512.tif 000053
【図２８Ａ−２８Ｆ】
2020501512.tif 000054
【図２９Ａ−２９Ｂ】
2020501512.tif 000055
【図３０Ａ−３０Ｂ】
2020501512.tif 000056
【図３１Ａ】
2020501512.tif 000057
【図３１Ｂ】
2020501512.tif 000058
【図３１Ｃ】
2020501512.tif 000059
【図３２Ａ−３２Ｂ】
2020501512.tif 000060
【図３３Ａ】
2020501512.tif 000061
【図３３Ｂ】
2020501512.tif 000062
【図３４】
2020501512.tif 000063
【図３５】
2020501512.tif 000064
【図３６】
2020501512.tif 000065
【図３７】
2020501512.tif 000066
【図３８】
2020501512.tif 000067
【図３９】
2020501512.tif 000068
【図４０】
2020501512.tif 000069
【図４１】
2020501512.tif 000070
【図４２】
2020501512.tif 000071
【配列表】
2020501512000001.app
【国際調査報告】
2020501512.tif 000072
2020501512.tif 000073
2020501512.tif 000074