(57)【要約】  本発明は、コチニンに特異的に結合する抗コチニンキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するナチュラルキラー細胞、およびそれを含む細胞療法剤に関する。本発明の、コチニンに特異的に結合するキメラ抗原受容体を発現するナチュラルキラー細胞は、コチニンに結合された結合物質に応じて、癌の種類を問わず効果的に腫瘍組織に赴くことができる。したがって、本発明のナチュラルキラー細胞は、効果の高い抗癌作用を示す遺伝子療法として有用でありうる。
2020505014.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するナチュラルキラー細胞において、
該キメラ抗原受容体は、１）抗原結合ドメイン、２）膜貫通ドメイン、および３）細胞内シグナル伝達ドメインを含み、
該抗原結合ドメインはコチニンに特異的に結合するドメインである、
ナチュラルキラー細胞。
【請求項２】
前記抗原結合ドメインが、コチニンに特異的に結合する抗体または抗体フラグメントである、請求項１に記載のナチュラルキラー細胞。
【請求項３】
前記抗体フラグメントがｓｃＦｖである、請求項２に記載のナチュラルキラー細胞。
【請求項４】
前記抗体または抗体フラグメントが、配列番号１のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む、請求項２に記載のナチュラルキラー細胞。
【請求項５】
前記抗体または抗体フラグメントが、配列番号２のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、請求項２に記載のナチュラルキラー細胞。
【請求項６】
前記抗体または抗体フラグメントがリンカーをさらに含む、請求項２に記載のナチュラルキラー細胞。
【請求項７】
前記リンカーが、配列番号３のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列からなる、請求項６に記載のナチュラルキラー細胞。
【請求項８】
前記抗原結合ドメインが前記膜貫通ドメインに、ヒンジ領域、スペーサー領域またはそれらの組み合わせによって連結されている、請求項１に記載のナチュラルキラー細胞。
【請求項９】
前記ヒンジ領域、スペーサー領域またはそれらの組み合わせが、Ｍｙｃエピトープ、ＣＤ８ヒンジ領域、およびＦｃから選択される少なくとも１つである、請求項８に記載のナチュラルキラー細胞。
【請求項１０】
前記膜貫通ドメインが、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７およびＣＤ１５４からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質の膜貫通ドメインを含む、請求項１に記載のナチュラルキラー細胞。
【請求項１１】
前記膜貫通ドメインが、ＣＤ２８の膜貫通ドメインを含む、請求項１０に記載のナチュラルキラー細胞。
【請求項１２】
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ＤＡＰ１０、ＣＤ３ζ、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載のナチュラルキラー細胞。
【請求項１３】
前記抗原結合ドメインがシグナルペプチドを含む、請求項１に記載のナチュラルキラー細胞。
【請求項１４】
前記シグナルペプチドが、ＣＤ８αまたはマウス軽鎖κシグナルペプチドである、請求項１３に記載のナチュラルキラー細胞。
【請求項１５】
前記コチニンが、結合物質とコンジュゲートした複合体の形態である、請求項１に記載のナチュラルキラー細胞。
【請求項１６】
前記結合物質が、ペプチド、アプタマー、ホルモン、タンパク質および化学物質からなる群から選択される、請求項１５に記載のナチュラルキラー細胞。
【請求項１７】
請求項１に記載のナチュラルキラー細胞を含む、細胞療法剤。
【請求項１８】
請求項１に記載のナチュラルキラー細胞を活性成分として含む、癌の予防または治療用の医薬組成物。
【請求項１９】
請求項１に記載のナチュラルキラー細胞を対象に投与するステップを含む、癌の予防または治療方法。
【請求項２０】
対象から単離されたサンプルに請求項１に記載のナチュラルキラー細胞を接触させることを含む、癌の診断方法。
【請求項２１】
癌を予防または治療するための、請求項１に記載のナチュラルキラー細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コチニンに特異的に結合する抗コチニンキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するナチュラルキラー細胞、およびそれを含む細胞療法剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌の治療方法は、数十年の間に着実に変化し進化している。１８００年代から１９００年代にかけては、手術、化学療法および放射線療法のような方法が主に用いられたが、その限界が見え始めた。最も典型的には、それまでの治療法は、転移を起こしていない初期の癌にのみ効果的であり、転移がすでに起こっている症例では、手術を行っても再発の可能性が高い。また、化学療法は固形腫瘍においては治療効果が低く、癌細胞以外の正常細胞の増殖をも阻害する副作用をもたらすことが報告されている。そのような問題を克服するために、最近は、抗癌免疫療法についての研究が盛んに行われている。抗癌免疫療法とは、患者自身が癌細胞と闘うことができるように、増強された免疫反応をもたらすことを指す。
【０００３】
最近は、体内の免疫細胞を取り出し、強化または遺伝子改変して体内に戻す免疫細胞療法である細胞療法に対する関心が高まっている。その典型的な例には、腫瘍浸潤リンパ球法（ＴＩＬ）、キメラ抗原受容体法（ＣＡＲ）、およびＴ細胞受容体法（ＴＣＲ）がある。それらのうち、遺伝子組換え／改変によって得られる人工受容体ＣＡＲを用いる研究が盛んに行われている。
【０００４】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、抗原を特異的にＴ細胞に導くよう設計された人工受容体である。そのような受容体は、抗原特異的成分、膜貫通成分、およびＴ細胞を活性化し特異的免疫を提供するよう選択された細胞内成分を含む。キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞は、癌治療を包含するさまざまな治療において用いられうる。
【０００５】
ＣＡＲ−Ｔのような治療剤は、腫瘍に対して有効である。しかしながら、そのような治療法は、部分的な、健常組織に対する非特異的攻撃により、副作用を引き起こす場合がある。この問題を克服するために、第３世代ＣＡＲ−Ｔの研究が現在行われており、そのような研究は、正常細胞攻撃の副作用を最小限にするために「癌細胞抗原認識能」を高めるよう、共刺激シグナルおよび人工受容体（さらなる改変受容体）として機能する２つのシグナルドメインを付加することによって特徴付けられる。それでもなお、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法剤の開発は、次のような問題に直面している：現在のＣＡＲ−Ｔ法における制約として、ＣＡＲ−Ｔは癌細胞において発現される１つのタンパク質のみを認識するように作られるので、個々の療法剤の開発には多大な費用が掛かる；一旦ＣＡＲ−Ｔが輸注されると、癌細胞が除去された後も、傷害性Ｔ細胞は機能し続け傷害性を発揮し続ける；さらに、標的タンパク質を提示する正常細胞が存在する場合に、ＣＡＲ−Ｔはそれに対する非特異的攻撃を誘導して、回復不可能な致命的副作用を引き起こす。
【０００６】
したがって、上記の問題を解決することのできる改善された新たな細胞療法剤についての研究は喫緊に必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従来の療法剤における課題を解消するための研究の結果、本発明者は、コチニンに特異的に結合する抗原結合ドメインを用いるキメラ抗原受容体を発現するナチュラルキラー細胞を作製した。それにより本発明者は、該ナチュラルキラー細胞が、既存のＣＡＲ−Ｔ療法剤における課題の解決を可能にし、またそれと同時に、多目的の療法剤の容易な開発を可能にすることを確認して、本発明を完成した。
【０００８】
したがって、本発明の課題は、コチニンに特異的に結合する抗原結合ドメインを発現するナチュラルキラー細胞を利用する細胞療法剤、およびそれを用いる癌の処置方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するために、本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するナチュラルキラー細胞において、キメラ抗原受容体は、１）抗原結合ドメイン、２）膜貫通ドメイン、および３）細胞内シグナル伝達ドメインを含み、該抗原結合ドメインはコチニンに特異的に結合するドメインである、ナチュラルキラー細胞を提供する。
【００１０】
本発明はさらに、該ナチュラルキラー細胞を含む細胞療法剤を提供する。
【００１１】
本発明はさらに、該ナチュラルキラー細胞を有効成分として含む、癌の予防または治療用の医薬組成物を提供する。
【００１２】
本発明はさらに、該ナチュラルキラー細胞を対象に投与するステップを含む、癌を予防または治療する方法を提供する。
【００１３】
本発明はさらに、該ナチュラルキラー細胞を有効成分として含む、癌の診断用の医薬組成物を提供する。
【００１４】
本発明はさらに、該ナチュラルキラー細胞を含む、癌診断用キットを提供する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のコチニンに特異的に結合するキメラ抗原受容体を発現するナチュラルキラー細胞は、コチニンにコンジュゲートした結合物質に応じて、癌の種類を問わず腫瘍組織に効果的に赴くことができる。したがって、本発明のナチュラルキラー細胞は、高い有効性で抗癌作用を示す遺伝子療法として有用でありうる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１に、本発明において使用されるpLVX-AcGFP-C1ベクターを示す。
【図２】図２に、コチニン特異的ＣＡＲ−ＮＫ細胞、およびコチニンコンジュゲートの例を図示する。
【図３】図３に、コチニン特異的ＣＡＲ−ＮＫ細胞であるＣｏｔ−ＣＡＲ−ＮＫ細胞の作用を示す。
【図４】図４に、本発明において使用される特定の関連する配列を示す。
【図５】図５に、抗コチニンキメラ抗原受容体およびその発現系の例を図示する。
【図６】図６に、ＮＫ９２細胞におけるＣＡＲの発現をフローサイトメトリーにより測定することにより得られた結果を示す。
【図７】図７に、本発明のコチニン−ＣＡＲ ＮＫ９２の、ＡＵ５６５細胞に対する細胞傷害作用を確認する結果を示す。
【図８】図８に、さまざまな癌細胞について、Ｈｅｒ２発現レベルをフローサイトメトリーにより確認する結果を示す。
【図９】図９に、Ｈｅｒ２−コチニンコンジュゲートの存在または不存在に依存する、本発明のコチニン−ＣＡＲ ＮＫ９２細胞の細胞傷害作用を、カルセイン−ＡＭ法により確認する結果を示す。
【図１０】図１０に、コチニン−ＣＡＲ ＮＫ９２細胞におけるサイトカイン分泌レベルをＥＬＩＳＡにより確認する結果を示す。
【図１１】図１１に、細胞におけるＣＤ１０７ａ発現レベルをフローサイトメトリーにより確認する結果を示す。
【図１２】図１２に、コチニン−ＣＡＲ ＮＫ９２の細胞内ドメインにおけるＥｒｋリン酸化をフローサイトメトリーにより確認する結果を示す。
【図１３】図１３に、コチニン−ＣＡＲ ＮＫ９２細胞の細胞傷害作用をカルセイン−ＡＭ法により確認する結果を示す。
【図１４】図１４に、ＡＵ５６５、ＳＫ−ＯＶ−３、Ａ４３１およびＡ４５９細胞におけるＨｅｒ２およびＥＧＦＲの発現レベルをフローサイトメトリーにより確認する結果を示す。
【図１５】図１５に、コンジュゲートの存在または不存在に依存するコチニン−ＣＡＲ ＮＫ９２の細胞傷害作用をカルセイン−ＡＭ法により確認する結果を示す。
【図１６】図１６に、癌細胞に対するコチニン−ＣＡＲ ＮＫ細胞およびコンジュゲートによる処理に依存するサイトカイン分泌の変化をＥＬＩＳＡにより確認する結果を示す。
【図１７】図１７に、ＡＵ５６５細胞に対するＣＤ１０７ａの発現レベルをフローサイトメトリーにより確認する結果を示す。
【図１８】図１８に、Ａ４３１細胞に対するＣＤ１０７ａの発現レベルをフローサイトメトリーにより確認する結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明を、以下、詳細に説明する。
本発明は一側面において、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するナチュラルキラー細胞において、該キメラ抗原受容体が、１）抗原結合ドメイン、２）膜貫通ドメイン、および３）細胞内シグナル伝達ドメインを含み、該抗原結合ドメインが、コチニンに特異的に結合するドメインである、ナチュラルキラー細胞を提供する。
【００１８】
本発明のコチニンに特異的に結合するキメラ抗原受容体を発現するナチュラルキラー細胞は、コチニンにコンジュゲートする結合物質に応じて、癌の種類を問わず腫瘍組織に効果的に赴くことができる。したがって、本発明のナチュラルキラー細胞は、高い有効性で抗癌作用を示す遺伝子療法として有用でありうる。
【００１９】
本発明のキメラ抗原受容体を発現するナチュラルキラー細胞は、コチニンへの特異的結合によって特徴付けられるので、該細胞は、コチニンに特異的に結合する抗原結合ドメインを含む。
【００２０】
抗原結合ドメインは、コチニンに特異的に結合する抗体または抗体フラグメントでありうる。本発明のキメラ抗原受容体発現ＮＫ細胞は、コチニンを融合したコンジュゲートと共に、癌治療のために患者に投与しうる。
【００２１】
特に、本発明のキメラ抗原受容体発現ナチュラルキラー細胞（ＣＡＲ−ＮＫ細胞）は、永続的な傷害性、自己免疫疾患のリスク、異種細胞移植による移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）、および標的化されない傷害性といった、既存のＣＡＲ−Ｔ療法剤を用いる癌免疫療法における課題を、反応オン／オフスイッチによって解決できるだけでなく、さまざまな癌細胞を標的とすることができ、したがって多目的の処置剤として使用しうる点でも有利である。本発明のＣＡＲ−ＮＫ細胞は、同種異系移植が可能であるので、患者自身の免疫細胞を用いるＣＡＲ−Ｔとは対照的に、有効性の高い細胞を予め作製しておくことができる。したがって、本発明のＣＡＲ−ＮＫ細胞は、処置剤投与の時期を短縮して処置効率を高めるだけでなく、開発および処置の費用を低減することによって、多様な疾患のための処置剤の開発のために有用でもありうる。
【００２２】
本書において「抗体」とは、免疫系において抗原による刺激によって産生される物質を指し、その種類は特に限定されない。さらに、本書において抗体は、それに限定されないが、抗原結合能を維持する抗体のフラグメント、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖを包含する。
【００２３】
本書において「キメラ抗体」とは、その可変領域および相補性決定領域（ＣＤＲ）が、それ以外の抗体領域とは異なる動物に由来する抗体を指す。そのような抗体は、例えば、可変領域がヒト以外の動物（マウス、ウサギ、および家禽）に由来し、定常領域がヒトに由来する抗体でありうる。そのようなキメラ抗体は、当分野で知られる方法、例えば遺伝子組換えによって作製しうる。
【００２４】
本書において「重鎖」とは、完全長の重鎖およびそのフラグメントの両方を指し、ここで、完全長の重鎖は、抗原に対する特異性を持つのに十分な可変領域のアミノ酸配列を有する可変領域ドメインＶＨ、ならびに３つの定常領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。
【００２５】
本書において「軽鎖」とは、完全長の軽鎖およびそのフラグメントの両方を指し、ここで、完全長の軽鎖は、抗原に対する特異性を持つのに十分な可変領域のアミノ酸配列を有する可変領域ドメインＶＬ、および定常領域ドメインＣＬを含む。
【００２６】
本発明のキメラ抗原受容体を構成する抗原結合ドメインとは、細胞膜の外側に位置して特異的抗原を持つ標的細胞の細胞膜リガンド（受容体に結合し、それを活性化する物質）を認識する、そこで主要なシグナルが変換される部位を指す。
【００２７】
本発明の膜貫通ドメインは、細胞膜を横切って、抗原結合ドメインを共刺激ドメインおよび必須のシグナル伝達ドメインに連結する部位である。この細胞内シグナル伝達ドメインは、抗原結合ドメインの結合によりＮＫ細胞の免疫応答を活性化する部位である。
【００２８】
本発明のキメラ抗原受容体は、その抗原結合ドメインがコチニンに特異的に結合することによって特徴付けられ、コチニンとは、下記式１で示される構造を有する、ニコチンの主要な代謝産物を指す：
【化１】
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【００２９】
コチニンは好ましくは、結合物質とコンジュゲートされたコンジュゲートであり、結合物質は、ペプチド、アプタマー、ホルモン、タンパク質および化学物質からなる群から選択されることによって特徴付けられうる。結合物質は、より好ましくはアプタマーであるが、それに限定されない。
【００３０】
本発明において、コチニンをコンジュゲートするコンジュゲートを作製するのに、少なくとも１つのポリペプチド、典型的には１つのポリペプチドを、異種構造分子としての少なくとも１つの非ポリペプチド部分、例えばポリマー分子、親油性化合物、炭水化物部分、または有機誘導体化剤、特にポリマー部分に、共有結合により結合させることができる。さらに、コンジュゲートは、少なくとも１つの炭水化物部分に、特にＮ−またはＯ−グリコシル化によって、結合させることができる。共有結合による結合とは、ポリペプチド部分と非ポリペプチド部分とが、共有結合により直接に連結されること、または結合橋、スペーサー、連結部分もしくは部分構造のような介在部分構造もしくは部分等を介して共有結合により間接的に連結されることを意味する。例えば、本書に開示する結合物質をコチニンにコンジュゲートすることによって得られるコンジュゲートは、この定義に含まれる。
【００３１】
本発明の結合物質とコチニンとのコンジュゲートに抗コチニン抗体が結合した複合体において、コチニンは、複合体が結合物質と抗体の両方の本来の性質を保持しうるように、ハプテンとして用いられる。すなわち、複合体は、それら分子の特異的な反応性および機能、ならびに抗体に特徴的な、補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）および長いインビボ半減期を保持しうる。
【００３２】
結合物質は、例えば、ペプチド、アプタマー、ホルモン、タンパク質および化学物質からなる群から選択し得、例えば、WKYMVm-NH2ペプチド（WKYMVm-NH2）、wkymvm-NH2ペプチド（wkymvm-NH2）、AS1411アプタマー、ペガプタニブ、アブシキマブおよびインスリンからなる群から選択しうる。本発明のいくつかの態様において、前記タンパク質は抗体であり得、特に抗Ｈｅｒ２抗体または抗ＥＧＦＲ抗体でありうる。
【００３３】
したがって、本発明は、コチニンに結合物質をコンジュゲートすることによって得たコンジュゲートに抗コチニン抗体を結合させることによって、結合物質のインビボ半減期を延長する方法を提供する。
【００３４】
本発明はさらに、コチニンに結合物質をコンジュゲートすることによって得たコンジュゲートに抗コチニン抗体を結合させることによって、結合物質が結合する細胞に対し補体依存性傷害を誘導する方法を提供する。
【００３５】
本発明の抗原結合ドメインは、コチニンに特異的に結合する物質であり、抗体または抗体フラグメントであり得、ここで、抗体フラグメントはｓｃＦｖでありうる。コチニンに結合する抗体または抗体フラグメントの配列のうち、コチニン−ｓｃＦｖは、例えば、配列番号１１のアミノ酸配列からなり得、限定されないが、その修飾または置換の結果得られる配列であって、前記アミノ酸配列との配列同一性が好ましくは８０％またはそれ以上、より好ましくは９０％またはそれ以上、より一層好ましくは９５％またはそれ以上であり、配列番号１１のアミノ酸配列と実質的に同じ生理学的活性を示す配列を包含しうる。
【００３６】
さらに、コチニン−ｓｃＦｖは、配列番号１７のヌクレオチド配列、および該ヌクレオチド配列との配列同一性が好ましくは８０％またはそれ以上、より好ましくは９０％またはそれ以上、より一層好ましくは９５％またはそれ以上であるヌクレオチド配列によってコードされうる。
【００３７】
コチニンに特異的に結合することができる抗コチニンキメラ抗原受容体において、抗原結合ドメインは、重鎖可変領域、リンカー配列、および軽鎖可変領域からなりうる。この重鎖可変領域は、配列番号１のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列からなるか、または配列番号１のヌクレオチド配列との配列同一性が７０％またはそれ以上、好ましくは８０％またはそれ以上、より好ましくは９０％またはそれ以上、より一層好ましくは９５％またはそれ以上で、配列番号１のヌクレオチド配列により発現されるアミノ酸配列の機能的等価物をコードしうるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列からなりうる。
【００３８】
上記の軽鎖可変領域は、配列番号２のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列からなるか、または配列番号２のヌクレオチド配列との配列同一性が７０％またはそれ以上、好ましくは８０％またはそれ以上、より好ましくは９０％またはそれ以上、より一層好ましくは９５％またはそれ以上で、配列番号２のヌクレオチド配列により発現されるアミノ酸配列の機能的等価物をコードしうるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列からなりうる。
【００３９】
配列番号１の塩基配列または配列番号２のヌクレオチド配列との配列同一性が９５％またはそれ以上である塩基配列によりコードされるアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１および配列番号２のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列と実質的に同じ生理学的活性を示しうる。
【００４０】
本発明の抗体または抗体フラグメントは、リンカーをさらに含み得、重鎖可変領域および軽鎖可変領域は該リンカーを介して連結されうる。リンカーは、それが重鎖可変領域および軽鎖可変領域を連結してＶＨ−リンカー−ＶＬドメインを形成することができる成分である限り、制約なく使用しうる。好ましくは、リンカーは、配列番号３のヌクレオチド配列またはそれとの同一性が９５％またはそれ以上である塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなりうる。
【００４１】
本発明の抗コチニンキメラ抗原受容体における抗原結合ドメインは、膜貫通ドメインに、ヒンジ領域、スペーサー領域、またはそれらの組み合わせによって連結されうる。本発明のヒンジ領域またはスペーサー領域は、Ｍｙｃエピトープ、ＣＤ８ヒンジ領域およびＦｃから選択される少なくとも１つであり得、好ましくはＭｙｃエピトープおよびＣＤ８ヒンジ領域を含みうる。本発明のＭｙｃエピトープおよびＣＤ８ヒンジ領域は、連結ドメイン（スペーサー）として機能する。
【００４２】
本発明のＣＤ８ヒンジ領域は、配列番号１２のアミノ酸配列、または配列番号１２との配列同一性が７０％またはそれ以上、好ましくは８０％またはそれ以上、より好ましくは９０％またはそれ以上、より一層好ましくは９５％またはそれ以上で、配列番号１２のアミノ酸配列と実質的に等価な機能を示すアミノ酸配列からなりうる。Ｍｙｃエピトープは、配列番号１３のアミノ酸配列、または配列番号１３との配列同一性が７０％またはそれ以上、好ましくは８０％またはそれ以上、より好ましくは９０％またはそれ以上、より一層好ましくは９５％またはそれ以上で、配列番号１３のアミノ酸配列と実質的に等価な機能を示すアミノ酸配列からなりうる。したがって、本発明のヒンジ領域またはスペーサー領域は、好ましくは、配列番号１２のアミノ酸配列もしくはそれとの同一性が９５％またはそれ以上であるアミノ酸配列；または配列番号１３のアミノ酸配列もしくはそれとの同一性が９５％またはそれ以上であるアミノ酸配列からなる。
【００４３】
本発明において、Ｍｙｃエピトープをコードする塩基配列は、配列番号１３のアミノ酸配列をコードすることができるいずれのヌクレオチド配列をも包含し得、好ましくは配列番号７のヌクレオチド配列でありうる。ヒトＣＤ８ヒンジ領域をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１２のアミノ酸配列をコードすることができるいずれのヌクレオチド配列をも包含し得、好ましくは配列番号４のヌクレオチド配列でありうる。
【００４４】
本発明のキメラ抗原受容体の成分である膜貫通ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７およびＣＤ１５４からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含みうる。例えば、膜貫通ドメインは、配列番号１６のアミノ酸配列またはそれとの同一性が９５％またはそれ以上であるアミノ酸配列からなりうるがそれに限定されない、ＣＤ２８の膜貫通ドメインでありうる。
【００４５】
さらに、本発明のキメラ抗原受容体の成分である細胞内シグナル伝達ドメインとして、当分野で知られる細胞内シグナル伝達ドメインを制約なく使用しうる。本発明の一態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、限定されないが、ＤＡＰ１０、ＣＤ３ζまたはそれらの組み合わせを含みうる。
【００４６】
ＮＫ細胞が癌細胞に対して高い傷害活性を示すことができるように、本発明のキメラ抗原受容体には、細胞内シグナル伝達ドメインとしてＤＡＰ１０およびＣＤ３ζを用いうる。その場合、ＤＡＰ１０は共刺激ドメインとして機能し、配列番号１４のアミノ酸配列、または配列番号１４との配列同一性が７０％またはそれ以上、好ましくは８０％またはそれ以上、より好ましくは９０％またはそれ以上、より一層好ましくは９５％またはそれ以上で、配列番号１４のアミノ酸配列と実質的に等価な機能を示すアミノ酸配列からなりうる。ＣＤ３ζはＮＫ細胞活性化ドメインとして機能し、配列番号１５のアミノ酸配列、または配列番号１５との配列同一性が７０％またはそれ以上、好ましくは８０％またはそれ以上、より好ましくは９０％またはそれ以上、より一層好ましくは９５％またはそれ以上で、配列番号１５のアミノ酸配列と実質的に等価な機能を示すアミノ酸配列からなりうる。したがって、本発明の細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列またはそれとの同一性が９５％もしくはそれ以上であるアミノ酸配列；または配列番号１５のアミノ酸配列またはそれとの同一性が９５％もしくはそれ以上であるアミノ酸配列からなりうる。
【００４７】
さらに、本発明の抗原結合ドメインは、ドメインの暴露のためのシグナルペプチドを含みうる。シグナルペプチドは、ＣＤ８αまたはマウス軽鎖κシグナルペプチドでありうる。ＣＤ８αである場合、本発明のシグナルペプチドは、配列番号１０のアミノ酸配列、またはそれとの同一性が９５％またはそれ以上であるアミノ酸配列からなりうる。さらに、ＣＤ８α領域をコードする塩基配列は、配列番号１０のアミノ酸配列をコードすることのできるいずれの塩基配列をも包含し得、好ましくは配列番号６のヌクレオチド配列でありうる。
【００４８】
さらに、本発明において、ＮＫ細胞をキメラ抗原受容体で形質転換するために、前記抗コチニンキメラ抗原受容体をコードすることができるポリヌクレオチドを含むベクターを使用しうる。
【００４９】
本発明において使用するベクターとして、当分野で知られるさまざまなベクターを使用し得、ベクターにおいて、発現調節配列、例えばプロモーター、ターミネーターおよびエンハンサー、膜標的化または分泌のための配列等は、抗原受容体を発現させようとする宿主細胞の種類に応じて適切に選択され得、目的に応じてさまざまに組み合わせられうる。本発明におけるベクターは、プラスミドベクター、コスミドベクター、バクテリオファージベクター、ウイルスベクター等を包含するが、それに限定されない。適当なベクターは、膜標的化または分泌のためのシグナル配列またはリーダー配列、ならびに発現調節要素、例えばプロモーター、オペレーター、開始コドン、終止コドン、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを含み、目的に応じて多様に構成されうる。
【００５０】
本発明において、好ましい例として、レンチウイルスベクター（Clontech, 632155）を使用しうる。具体例として、本発明の実施例において用いられるベクターであるpLVX-AcGFP-C1を図１に示す。
【００５１】
いくつかの態様において、ナチュラルキラー細胞は、骨髄、末梢血、末梢血単核細胞または臍帯血から取得または誘導される。いくつかの態様において、該細胞はヒト細胞である。
【００５２】
図２に、本発明の抗コチニンキメラ抗原受容体を発現するＮＫ細胞、およびコチニンコンジュゲートを図示する。
【００５３】
抗原受容体の導入により形質転換された前記ＮＫ細胞は、コチニンを抗原として認識してコチニンに特異的に結合することができ、コチニン特異的キメラ抗原受容体を細胞表面上に発現することができる。特に、該受容体は、例えば、腫瘍抗原との接触および連結によって細胞内シグナル伝達ドメインを介してＮＫ細胞活性化を誘導し、ＮＫ細胞による腫瘍特異的傷害を誘導するように、ＣＡＲ−ＮＫ細胞と同じ活性を誘導することができる。
【００５４】
図３に、本発明のコチニン特異的ＮＫ細胞であるＣｏｔ−ＣＡＲ−ＮＫ細胞の作用を図示する。
【００５５】
本発明において、特に、ＣＡＲ−ＮＫ細胞とは、キメラ抗原受容体が導入されているナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を指す。前記細胞は、従来のＣＡＲ−Ｔ療法剤の利点である、癌特異的な標的化された療法であるという利点を有し、次の利点をも有する：本発明の細胞は、本発明によるキメラ抗原受容体の導入によって、治療的応答のオン／オフを切り替えることができるスイッチ機能によって、従来の傷害性の問題を解消することができるだけでなく、キメラ抗原受容体に結合することができるコチニンが融合するコンジュゲートの末端修飾によって、多目的処置剤として使用することができる。すなわち、本発明によるコチニンに特異的に結合するキメラ抗原受容体を発現するＮＫ細胞は、コチニンにコンジュゲートさせた結合物質に応じて、癌の種類を問わず、腫瘍組織に効果的に赴くことができる。したがって、本発明の細胞は、高い特異性で優れた抗癌作用を示す遺伝子療法として有用でありうる。
【００５６】
したがって、本発明は一側面において、本発明のナチュラルキラー細胞を含む細胞療法剤、それを有効成分として含む癌の予防または治療用の医薬組成物、または本発明の細胞を個体に投与することを含む癌の予防または治療方法を提供する。
【００５７】
本発明において、本発明の細胞は、細胞療法、例えば抗癌治療における細胞療法のために使用しうる。細胞は、ドナー由来のものでありうるか、または患者から得られた細胞でありうる。細胞は、例えば、冒された細胞の機能を補うよう、再生のために使用しうる。細胞はまた、生物学的製剤の送達、例えば冒された骨髄または転移デポジットのような特定の微小環境への送達を可能とするように、異種遺伝子を発現するよう改変されうる。
【００５８】
さらに、本発明の癌の予防または治療用医薬組成物は、結合物質をコチニンに融合させたコンジュゲートをさらに含み得、癌を予防または治療する方法は、結合物質をコチニンに融合させたコンジュゲートを投与するステップをさらに含みうる。本発明のナチュラルキラー細胞は、コチニンにコンジュゲートした結合物質に応じて標的細胞に特異的に結合し、優れた抗癌作用を示す。
【００５９】
特に、本発明が提供する細胞は、コチニンに特異的に結合する抗原結合ドメインを有するキメラ抗原受容体を発現するナチュラルキラー細胞であり、ここで、該キメラ抗原受容体は、例えば、コチニンと融合したコンジュゲートまたは中間体と共同で、従来のＣＡＲ療法剤の標的細胞に対するオン／オフ応答を調節することができる。したがって、本発明のナチュラルキラー細胞は、後続の細胞療法または当該処置用細胞の効果を増強または減弱する必要のある状況において非常に有益な安全スイッチを含む。例えば、キメラ抗原受容体を発現するＮＫ細胞を患者に提供する場合、状況によっては、オフ-ターゲット傷害のような副作用が生じうる。あるいは、例えば、処置用細胞は、腫瘍細胞数または腫瘍サイズを低減するよう機能し得、もはや必要でなくなりうる。この状況において、コチニンが調節され得、それによって、処置用細胞がもはや活性化されないよう調節されることが可能となる。
【００６０】
本発明において、癌は、制約なく、当分野で知られるすべての種類の癌腫を包含しうる。
【００６１】
本書において、用語「単位用量」とは、哺乳動物に対する単位投与量として適当な個々の物理的単位を指し、各単位は、所望の希釈剤との組み合わせで所望の免疫原刺激作用が得られるように計算された、予め決定された量の医薬組成物を含む。接種物の単位用量の詳細は、医薬組成物に固有の特性、および達成すべき特定の免疫学的効果による影響を受け、それにしたがって決定される。
【００６２】
特定の適用のための有効量は、処置する疾患もしくは状態、投与する特定の組成物、対象の体格、および／または疾患もしくは状態の重篤度のような因子によって変わりうる。本書に記載される特定の組成物の有効量は、過度の実験の必要なく試験に基づいて決定しうる。
【００６３】
本発明はさらなる一側面において、癌の診断用組成物および癌の診断用キットであって、本発明のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するナチュラルキラー細胞をそれぞれ含むものを提供する。本発明はさらに別の一側面において、本発明のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するナチュラルキラー細胞を含む組成物を、個体から単離されたサンプルと接触させるステップを含む、癌診断のための情報を提供する方法を提供する。前記組成物またはキットは、限定されないが、結合物質がコチニンに融合されたコンジュゲートをさらに含みうる。
【００６４】
本書において、用語「診断」とは、ある特定の疾患または障害について対象の罹患し易さを決定すること、個体が現在ある特定の疾患または障害に罹患しているかを決定すること、ある特定の疾患または障害に罹患している個体の予後を決定すること、またはセラメトリクス（therametrics）（例えば、治療効果についての情報を提供するために個体の状態をモニターすること）を包含することが意図される。
【００６５】
本発明はさらに別の一側面において、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するナチュラルキラー細胞の、癌の予防または治療のための使用を提供する。
【００６６】
キメラ抗原受容体、それを発現するナチュラルキラー細胞、および癌の予防または治療のためのその使用は、上記に説明したとおりである。
【００６７】
本発明の態様
本発明を、以下、実施例によって、より詳細に説明する。しかしながら、実施例は本発明を説明するためのものであって、本発明の範囲は実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００６８】
ベクターバックボーン
本発明に使用するベクターとして、レンチウイルスベクター（Clontech, 632155）を使用した。具体的には、図１に示すpLVX-AcGFP-C1を使用した。本実験において使用するために、コザック配列 (CTCGAG; n.t. 2801-2806) および AcGFP1 (Aequorea coerulescens 緑色蛍光タンパク質; n.t. 2807-3604) を欠失させ、XhoIを制限酵素として使用した。特定の関連する配列を図４に示す。
【実施例２】
【００６９】
標的抗原およびコチニンコンジュゲートの調製
標的抗原として用いる小分子物質であるコチニン（トランス−４−コチニンカルボン酸）を下記式１に示す。Sigma-Aldrichから購入したコチニンを使用した。
【化２】
2020505014.tif 000004
【００７０】
さらに、コチニンおよび結合物質が融合したコンジュゲートを、以下の方法で調製した。
すなわち、ＨＥＲ２−コチニンコンジュゲートのために、コチニンおよび抗ＨＥＲ２抗体がコンジュゲートしたコンジュゲートを、抗ＨＥＲ２抗体であるトラスツズマブ（Genentech, USA）を用いて調製した。ここで、コンジュゲートのコンジュゲート化のために、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド（ＥＤＣ）カップリング法を用いた。まず、抗ＨＥＲ２抗体を、２５μＭの濃度となるようＰＢＳに溶解することによって調製した。一方、トランス−４−コチニンカルボン酸（Sigma-Aldrich）を、５ｍＭの濃度となるよう１ｍｌのＭＥＳ緩衝液［０．１Ｍ  ２−［モルホリノ］エタンスルホン酸（ＭＥＳ）および０．５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ６．０］に溶解することによって調製した。得られた混合物に、ＥＤＣを５０ｍＭの濃度で、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ、Thermo Scientific, USA）を１２５ｍＭの濃度で加えた。得られた混合物を室温で１５分間撹拌して溶解させ、コチニン−ＮＨＳエステルが生成している活性溶液を調製した。コチニン−ＮＨＳエステルとタンパク質のアミン基との間の反応を誘導するために、水酸化ナトリウム溶液を加えて活性溶液のｐＨを７またはそれ以上に調節した。そこから１ｍｌを取った。そこに、コチニンにコンジュゲートする抗ＨＥＲ２抗体を２５μＭの濃度で、活性溶液と同じ量で加えた。混合物を、室温で３時間撹拌しながら反応させて、ＥＤＣカップリング反応により生成したコチニン−ＨＥＲ２抗体コンジュゲートを得た。得られたコチニン−ＨＥＲ２抗体コンジュゲートを、Slide-A-lyzer（商標）透析カセット (Thermo Fisher Scientific, USA) を用いてＰＢＳに対して透析するか、Amicon Ultra Centrifugal Filter (EMD Millipore, USA) を用いて緩衝液をＰＢＳに交換し、使用した。
【００７１】
さらに、抗ＥＧＦＲアフィボディをコチニンと融合させたコンジュゲートとしてのＥＧＦＲ−コチニンコンジュゲートを、ANYGENから購入し（コチニン−ｚＥＧＦＲ：９５）、使用した。使用した抗ＥＧＦＲアフィボディの配列は、具体的には次のとおりである：
trsn-4-コチニンカルボン酸−VDNKFNKEMWAAWEEIRNLPNLNGWQMTAFIASLVDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK (配列番号３０)
【実施例３】
【００７２】
抗コチニンキメラ抗原受容体
本発明の、コチニンに特異的に結合するキメラ抗原受容体の各ドメインをコードする核酸を含むプラスミドを、下記方法によって調製した。
【００７３】
（１）シグナルペプチド
ヒトＴ細胞表面糖タンパク質ＣＤ８α鎖（GenBank: AK300089.1）に基づき、それぞれＸｈｏＩおよびＸｂａＩの制限酵素部位を含む２種類のプライマー（フォワードプライマー：配列番号１８、リバースプライマー：配列番号１９）を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行い、次いでクローニングを行った。
【００７４】
（２）標的特異的な認識ドメイン - ｓｃＦｖ
コチニンに特異的に結合することができる抗原結合ドメインとして、抗コチニンキメラ抗体またはその抗体フラグメントを得ることが意図された。ＳｃＦｖの配列については、韓国特許第１０−１６４８９６０号におけるＳｃＦｖに関する情報を参照した。すなわち、該抗原結合ドメインは、配列番号１７のヌクレオチド配列を含み、ＶＨ−リンカー−ＶＬとして構成された。
【００７５】
（３）連結ドメイン（スペーサー）
（Ａ）Ｍｙｃエピトープ
本発明者が所有するプラスミド（抗コチニン２８Ｚ−１  ＣＡＲ  ＯＲＦ、ｃｏｔ２８ｚ−１）に基づき、それぞれｓｆｉＩおよびＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素部位を含む２種類のプライマー（フォワードプライマー：配列番号２０、リバースプライマー：配列番号２１）を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行い、次いでクローニングを行った。
【００７６】
（Ｂ）ヒトＣＤ８ヒンジ領域
本発明者が所有するプラスミド（抗コチニン２８Ｚ−１  ＣＡＲ  ＯＲＦ、ｃｏｔ２８ｚ−１）に基づき、それぞれＨｉｎｄＩＩＩの単一の制限酵素部位を含む２種類のプライマー（フォワードプライマー：配列番号２２、リバースプライマー：配列番号２３）を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行い、次いでクローニングを行った。
【００７７】
（４）膜貫通領域
ヒトＣＤ２８遺伝子のヒンジの細胞質領域を膜貫通領域として用いた。フォワードプライマーに制限酵素ＢａｍＨ１の配列を付加することによって（配列番号２４）、リバースプライマーに制限酵素ＥｃｏＲＩの配列を付加することによって（配列番号２５）、プライマーを作製した。
【００７８】
上記プライマーを用いてＪｕｒｋａｔ細胞のｃＤＮＡにおいてＰＣＲを行って、膜貫通領域のＤＮＡを得た。
【００７９】
（５）１つまたはそれ以上の細胞内シグナル伝達ドメイン
（Ａ）共刺激ドメイン
ＤＡＰ１０を共刺激ドメインとして使用し、フォワードプライマーに制限酵素ＥｃｏＲＩの配列を付加することによって（配列番号２６）、リバースプライマーに制限酵素ＮｏｔＩの配列を付加することによって（配列番号２７）、プライマーを作製した。
【００８０】
上記プライマーを用いて初代成熟ＮＫ細胞のｃＤＮＡにおいてＰＣＲを行って、共刺激ドメインを作製した。
【００８１】
（Ｂ）ＮＫ細胞活性化ドメイン
ＣＤ３ζをＮＫ細胞活性化ドメインとして使用した。具体的には、２種類のプライマー（フォワードプライマー：配列番号２８、リバースプライマー：配列番号２９）を用いて、Ｊｕｒｋａｔ細胞のｃＤＮＡにおいてＰＣＲを行って、該活性化ドメインを作製した。
【００８２】
上記各ドメインを、それぞれの制限酵素を用いて順次連結した。各ドメインに対応する特定の配列の情報を、下記表１に示す。
【００８３】
【表１】
2020505014.tif 000005
【００８４】
表１に示す配列が前記構造と一致するとき、シグナルペプチドはヒトＣＤ８α領域に対応する配列番号６で表され；標的特異的認識ドメインの、重鎖可変領域は配列番号１で表され、リンカーは配列番号３で表され、軽鎖可変領域は配列番号２で表される。連結ドメイン（スペーサー）は、Ｍｙｃエピトープの配列番号７、またはヒトＣＤ８ヒンジ領域の配列番号４で表され、膜貫通領域としてのＣＤ２８は配列番号５で表される。１つまたはそれ以上の細胞内シグナル伝達ドメインとして、共刺激ドメインとしてのＤＡＰ１０は配列番号８で表され、ＮＫ細胞活性化領域としてのＣＤ３ζは配列番号９で表される。
【実施例４】
【００８５】
抗コチニンキメラ抗原受容体が導入されたＮＫ細胞の作製
実施例３に記載される抗コチニンキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドをベクターに挿入し、得られたベクターを用いて形質転換ナチュラルキラー細胞を作製した。図５に、コチニン特異的抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体、およびその発現系を示す。
【００８６】
まず、基本のベクターとして、実施例１のpLVX-AcGFP-C1からAcGFPを除去することによって得たベクターを使用して、該ベクターに、そのＭＣＳの制限酵素ＸｈｏＩおよびＸｂａＩを用いて、実施例３の抗コチニンキメラ抗原受容体（コチニン−ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドを挿入した。
【００８７】
次に、ウイルスパッケージングベクター（PMDLg/RRE、RSV/REV、VSVG）と共に、コチニン−ＣＡＲを含むベクターを導入することによって、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を形質転換し、そこからコチニン−ＣＡＲを発現するレンチウイルスを得た。レンチウイルスを超高速遠心によって濃縮し、濃縮したコチニン−ＣＡＲ発現レンチウイルスを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞またはＨｅｌａ細胞の感染に使用した。次いで、フローサイトメトリーによってコチニン−ＣＡＲのＭｙｃエピトープの量を決定し、感染単位を計算した。ＮＫ細胞の数およびレンチウイルスの量を、多重感染度（ＭＯＩ）が１０となるように計算した。コチニン−ＣＡＲ発現レンチウイルスは、スピノキュレーション（spinoculation）法（３６０ｇ、９０分、ＲＴ）によってＮＫ細胞に感染させた。感染ＮＫ細胞を３７℃および５％ＣＯ２の条件で５時間培養し、その後、培養培地を新たな培養培地と交換した。３日後、感染ＮＫ細胞の選択のために３μｇ／ｍｌの濃度のピューロマイシンによる処理を行い、培養を続けた。
【００８８】
対照としての未感染ＮＫ細胞もピューロマイシンで処理し、対照細胞がピューロマイシンによって完全に死滅するまで、ピューロマイシン処理培養培地を用いる培養を続けた。対照細胞が完全に死滅した時点で、感染ＮＫ細胞用の培養培地を、増殖のためにピューロマイシン不含有培地に交換した。選択された細胞の増殖のために、１２．５％ウシ胎児血清、１２．５％ウマ血清、０．２ｍＭイノシトール、０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０．０２ｍＭ葉酸、および２００Ｕ／ｍｌ組換えＩＬ−２を含むαＭＥＭを含む培地を用いて実験を行った。
【実施例５】
【００８９】
抗コチニンキメラ抗原受容体を導入したＮＫ細胞におけるＣＡＲ発現の確認
本発明の抗コチニンキメラ抗原受容体を導入した、実施例４において作製したＮＫ細胞におけるＣＡＲの発現を、フローサイトメトリーにより確認した。
【００９０】
コチニン−ＣＡＲのＭｙｃエピトープに対応するＭｙｃ抗体（ＣＴＳ；９Ｂ１１）を、コチニン−ＣＡＲ発現ＮＫ細胞と反応させ（暗所において４℃で３０分間）、フローサイトメトリーによりＭｙｃ発現を確認するか；またはＨｅｒ２抗体を融合したコチニンコンジュゲートを、コチニン−ＣＡＲ発現ＮＫ細胞と４℃で３０分間反応させ、Ｈｅｒ２抗体のＦｃ領域に対応するＦｃ抗体（eBiosciende; 12-4988-82）との二次反応を行った後、フローサイトメトリーによる確認を行った。対照として、ＣＡＲを発現しない元のＮＫ細胞を使用した。結果を図６に示す。
【００９１】
図６に示すように、抗コチニンキメラ抗原受容体を導入した本発明のＮＫ細胞が、抗コチニン抗体フラグメントを発現することが確認された。
【実施例６】
【００９２】
コチニンに対するコチニンＣＡＲ ＮＫ細胞の結合特異性の確認
コチニンポリマーであるＣｏｔ−ＳＷＮＴおよびＨＥＲ２腫瘍細胞を用いて、コチニンＣＡＲ ＮＫ細胞のコチニンＳｃＦｖがコチニンに特異的に結合するすることを確認した。
【００９３】
すなわち、ＡＵ５６５（ヒト乳癌）をカルセイン−ＡＭ（Life Technologies; C1430）で染色した。次いで、それをコチニン−ＣＡＲ発現ＮＫ細胞と１：１の比で、２００μｌのＲＰＭＩ１６４０（１０％ＦＢＳ）中で混合し、混合物を、１μｇ／ｍｌの濃度の、Ｈｅｒ２抗体と融合したコチニンコンジュゲート、およびいくつかの濃度（０、０．００５、０．０５、０．５および５ｍｇ／ｍｌ）のｃｏｔ−ＳＷＮＴによる同時の処理に付して、ｃｏｔ−ＳＷＮＴとＨｅｒ２−コチニンコンジュゲート（Ｈｅｒ２−ｃｏｔ）の間で競合が起こるようにした。さらに、ｃｏｔ−ＳＷＮＴ単独の効果を決定するために、ｃｏｔ−ＳＷＮＴ（５ｍｇ／ｍｌ）単独による処理のための条件を追加し、その条件下に処理を行った。３７℃および５％ＣＯ２で４時間反応させた後、上清１００μｌを取り、上清中に存在するカルセインの量を測定することにより、各条件での細胞傷害作用を決定した。対照として、カルセイン染色ＡＵ５６５をＲＰＭＩ１６４０（１０％ＰＢＳ）のみで処理した群（自然値）、およびカルセイン染色ＡＵ５６５を２％Triton X-100で処理した群（最大値）を用いた。細胞傷害作用は、次式により計算した：
細胞傷害作用（％）＝（条件によるカルセイン放出値−自然値）／（最大値−自然値）×１００
得られた細胞傷害作用の結果を、図７に示す。
【００９４】
図７に示すように、ｃｏｔ−ＳＷＮＴの濃度を高めると、ｈｅｒ２発現癌細胞に対するコチニン−ＣＡＲ ＮＫ細胞の傷害効果が低下することがわかった。このことから、本発明のコチニン−ＣＡＲ ＮＫ細胞は、コンジュゲートの結合物質に応じて標的細胞に特異的に作用することが確認された。
【実施例７】
【００９５】
ハーセプチン（Ｈｅｒ２）−コチニンコンジュゲートが仲介するコチニン−ＣＡＲ ＮＫ細胞の細胞傷害作用の確認
実施例３において作製した抗Ｈｅｒ２−コチニンコンジュゲート、および実施例４において作製したコチニン−ＣＡＲ ＮＫ９２細胞を使用して、該コンジュゲートが癌表面上のＨｅｒ２を認識することにより、本発明の抗コチニンキメラ抗原受容体を導入したＮＫ細胞の細胞傷害作用が発揮されることを観察した。
【００９６】
まず、ＡＵ５６５（ヒト乳癌; RPMI1640 (10% FBS; 200 nm HEPES)）、ＳＫ−ＯＶ−３（ヒト卵巣癌; RPMI1640 (10% FBS)）、ＳＫ−ＢＲ−３（ヒト乳癌; DMEM (10% FBS)）、およびＫ５６２（慢性骨髄性白血病; RPMI1640 (10% FBS)）の４つの細胞系のそれぞれを、１μｇ／１００μｌの抗Ｈｅｒ２抗体（Invitrogen; BMS120FI）で処理し、暗所において４℃で３０分間反応させた。反応後、各細胞系について、そのＨｅｒ２発現レベルをフローサイトメトリー（BD；FacsCantoII）により調べた。結果を図８に示す。
【００９７】
図８に示すように、Ｈｅｒ２はＡＵ５６５、ＳＫ−ＯＶ−３およびＳＫ−ＢＲ−３細胞において発現され、Ｋ５６２細胞においては発現されなかったことがわかった。
【００９８】
次に、Ｈｅｒ２−コチニンコンジュゲートの存否に依存する、コチニン−ＣＡＲ ＮＫ細胞の細胞傷害作用を、カルセイン−ＡＭ法によって調べた。すなわち、ＡＵ５６５、ＳＫ−ＯＶ−３、ＳＫ−ＢＲ−３およびＫ５６２の４細胞系のそれぞれを、５μｇ／ｍｌの濃度のカルセイン−ＡＭで処理し、暗所において３７℃および５％ＣＯ２の条件で１時間反応させた。反応後、元のＮＫ９２、ＡｃＧＦＰを欠失させたｐＬＶＸエンプティベクターである対照ベクターを導入したＮＫ９２（Ｐｕｒｏ−９２）、およびコチニン−ＣＡＲ ＮＫ９２細胞（ｃｏｔ−１０ｚ−９２）をそれぞれ上記細胞系と５：１、１：１および０．５：１の比で（エフェクター細胞；ＮＫ９２、Ｐｕｒｏ−９２、Ｃｏｔ−１０ｚ−９２：標的細胞；ＡＵ５６５、ＳＫ−ＯＶ−３、ＳＫ−ＢＲ−３、Ｋ５６２）、２００μｌのＲＰＭＩ（１０％ＰＢＳ）中で混合し、３７℃および５％ＣＯ２の条件で４時間反応させた。次いで、上清１００μｌを取り、上清中に存在するカルセインの量を測定することにより、各条件による細胞傷害作用を決定した。結果を図９に示す。
【００９９】
図９に示すように、コチニン−ＣＡＲ ＮＫ９２細胞は、Ｈｅｒ２を発現するＡＵ５６５、ＳＫ−ＯＶ−３およびＳＫ−ＢＲ−３細胞に対して細胞傷害活性を示し、Ｈｅｒ２を発現しないＫ５６２細胞に対しては細胞傷害活性を示さないことがわかった。さらに、Ｈｅｒ２−コチニンコンジュゲートは、ＮＫ９２およびＰｕｒｏ−９２の細胞傷害作用に影響を及ぼさないが、コチニン−ＣＡＲ ＮＫ９２には影響を及ぼすことが確認された。これらの結果から、本発明のコチニン−ＣＡＲ ＮＫ細胞は、コチニコンジュゲートを介して特異的に細胞傷害を誘導することが確認された。
【実施例８】
【０１００】
コチニン−ＣＡＲ ＮＫ細胞の細胞活動の検証
ＮＫ細胞の活動を、ＮＫ細胞におけるサイトカインおよび顆粒の放出を調べることにより検証した。すなわち、サイトカインの放出を次のようにして調べた。ＲＰＭＩ１６４０（１０％ＦＢＳ）中で、元のＮＫ９２、ＰＵＲＯ−９２およびｃｏｔ−１０ｚ−９２のそれぞれを、ＡＵ５６５と１：１で混合した。そこにコチニンコンジュゲートを加え、３７℃および５％ＣＯ２の条件で６時間反応させた。次いで、上清を取り、上清中に存在するサイトカインＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αをＥＬＩＳＡにより調べた。対照として、元のＮＫ９２、ＰＵＲＯ−９２およびｃｏｔ−１０ｚ−９２のそれぞれが単独で分泌したサイトカインの量を用いた。結果を図１０に示す。
【０１０１】
さらに、ＣＤ１０７ａの発現を次のようにして調べた。ＲＰＭＩ１６４０（１０％ＦＢＳ）中で、元のＮＫ９２、ＰＵＲＯ−９２およびｃｏｔ−１０ｚ−９２のそれぞれを、ＡＵ５６５と１：１で混合した。その混合物を、コチニンコンジュゲートおよびＣＡ１０７ａ抗体（BD; 555801）の組み合わせで処理し、３７℃および５％ＣＯ２の条件で４時間反応させた。反応後、細胞からＮＫ９２細胞を選別することができるように、ＣＤ５６抗体を用いる染色を行った。その後、元のＮＫ９２、ＰＵＲＯ−ＮＫ９２およびｃｏｔ−１０ｚ−９２におけるＣＤ１０７ａ発現レベルを、フローサイトメトリーによって比較した。対照として、元のＮＫ９２、ＰＵＲＯ−９２およびＣｏｔ−１０ｚ−９２におけるＣＤ１０７ａの基礎発現レベル、ならびにコチニコンジュゲート不存在下にＡＵ５６５と混合された状態でのそれら細胞におけるＣＤ１０７ａ発現レベルを用いた。結果を図１１に示す。
【０１０２】
図１０および図１１に示すように、コチニン−ＣＡＲ ＮＫ細胞およびＨｅｒ２−コチニンコンジュゲートが存在する場合にのみ、癌細胞に応答してＮＫ細胞におけるサイトカインおよび顆粒の放出が起こることがわかった。
【実施例９】
【０１０３】
Ｈｅｒ２−コチニンコンジュゲートによって誘導される、コチニン−ＣＡＲ ＮＫ細胞のシグナルの変化
コチニン−ＣＡＲ ＮＫ細胞の活動を、ＮＫ細胞が活動を示す際に変化するシグナルを測定することによって調べた。すなわち、Ｅｒｋのリン酸化を、コチニン−ＣＡＲ ＮＫ９２の細胞内ドメインを通るシグナルを利用して、フローサイトメトリーにより調べた。結果を図１２に示す。
【０１０４】
図１２に示すように、細胞内Ｅｒｋのリン酸化は、コチニン−ＣＡＲ ＮＫ９２細胞が単独で存在した場合には増加せず（ｈｅｒ２−ｃｏｔなし；対照）、癌細胞が存在した場合には、ｈｅｒ２−コチニンコンジュゲート（ｈｅｒ２−ｃｏｔ）によりコチニン−ＣＡＲ ＮＫ９２細胞におけるＥｒｋリン酸化が増加した（ｈｅｒ２−ｃｏｔ有り；ｈｅｒ２−ｃｏｔ処理群）ことがわかった。
【実施例１０】
【０１０５】
ハーセプチン（Ｈｅｒ２）−コチニンコンジュゲートのコチニン−ＣＡＲ ＮＫ細胞に対する特異性の検証
Ｈｅｒ２−コチニンコンジュゲートに対するコチニン−ＣＡＲ ＮＫ細胞の特異性を検証するために、該コンジュゲートに依存する細胞傷害作用を調べた。
【０１０６】
最初に、Ｈｅｒ２−コチニンコンジュゲートに対する対照として、ＲＳウイルス（respiratory syncytial virus）（ＲＳＶ）−コチニンコンジュゲートを使用した。ＲＳＶ−コチニンコンジュゲートは、コチニンと融合させる抗体として抗ＲＳＶ抗体（パリビズマブ、Synagis（登録商標）、AstraZeneca, UK）を使用したことを除いては実施例２のコチニンコンジュゲート作製方法と同様の方法で作製した。
【０１０７】
次に、ＲＰＭＩ１６４０（１０％ＦＢＳ）中でコチニン−ＣＡＲ−ＮＫ９２細胞およびカルセイン染色ＡＵ５６５を、５：１、１：１および０．５：１の比で混合し、ＡＵ５６５細胞において発現される抗原であるＨｅｒ２に対するＨｅｒ２−コチニンコンジュゲート、および発現されないＲＳウイルス抗体（ＲＳＶ；パリビズマブ；Synagis（登録商標）、AstraZeneca, UK）−コチニンコンジュゲートを、それぞれ１μｇ／ｍｌの濃度で用いる処理を行った。３７℃および５％ＣＯ２の条件で４時間反応させた。その後、コチニン−ＣＡＲ ＮＫ９２細胞の細胞傷害作用をカルセイン−ＡＭ法により調べた。結果を図１３に示す。
【０１０８】
図１３に示すように、コチニン−ＣＡＲ ＮＫ細胞は、Ｈｅｒ２−コチニンコンジュゲートに対する特異性を以て活性を示すことがわかった。
【実施例１１】
【０１０９】
ハーセプチン（Ｈｅｒ２）−コチニンコンジュゲートおよびＥＧＦＲ（アフィボディ）−コチニンコンジュゲートによって引き起こされるコチニン−ＣＡＲ ＮＫ細胞の細胞傷害作用の検証
実施例３において作製した抗Ｈｅｒ２−コチニンコンジュゲート、および抗ＥＧＦＲ−コチニンコンジュゲートを、実施例４において作製したコチニン−ＣＡＲ ＮＫ９２細胞と共に使用して、本発明の抗コチニンキメラ抗原受容体が導入されたＮＫ細胞による細胞傷害作用が、癌細胞表面上のＨｅｒ２またはＥＧＦＲのコチニンコンジュゲートによる認識を介して発揮されることを確認した。
【０１１０】
まず、ＡＵ５６５（ヒト乳癌）、ＳＫ−ＯＶ−３（ヒト卵巣癌）、Ａ４３１（ヒト皮膚癌; DMEM (10% FBS)）、およびＡ５４９（ヒト肺癌; RPMI1640 (10% FBS)）の４細胞系のそれぞれを、それぞれ１μｇ／１００μｌの量の抗Ｈｅｒ２抗体および抗ＥＧＦＲ抗体（ＢＤ; ５６３５７７）で処理し、暗所において４℃で３０分間反応させた。その後、各細胞系について、そのＨｅｒ２およびＥＧＦＲの発現レベルをフローサイトメトリーにより調べた。結果を図１４に示す。
【０１１１】
図１４に示すように、４細胞系におけるＨｅｒ２およびＥＧＦＲの発現レベルは、細胞系によって異なることがわかった。
【０１１２】
次に、４細胞系に対する、Ｈｅｒ２−コチニンコンジュゲートまたはＥＧＦＲ−コチニンコンジュゲートの存在または不存在による、コチニン−ＣＡＲ ＮＫ９２の細胞傷害作用を、カルセイン−ＡＭ法によって調べた。すなわち、ＡＵ５６５、ＳＫ−ＯＶ−３、Ａ４３１およびＡ５４９細胞のそれぞれを、カルセインで染色した後、ｃｏｔ−１０ｚ−９２細胞と、５：１、１：１および０．５：１の比で（ｃｏｔ−１０ｚ−９２：癌細胞）、２００μｌのＲＰＭＩ１６４０（１０％ＰＢＳ）中で混合した。各条件によって、ｃｏｔ−１０ｚ−９２および癌細胞を単に反応させるか、またはｃｏｔ−１０ｚ−９２および癌細胞をＨｅｒ２−コチニンコンジュゲート（１μｇ／ｍｌ）またはＥＧＦＲ−コチニンコンジュゲート（１００ｎｇ／ｍｌ）での処理を伴って反応させた。３７℃および５％ＣＯ２の条件で４時間反応させた。各条件による細胞傷害作用を調べた。結果を図１５に示す。
【０１１３】
図１５に示すように、コチニン−ＣＡＲ ＮＫ９２細胞は、標的抗原Ｈｅｒ２またはＥＧＦＲの発現レベルに応じた細胞傷害作用を示した。このことから、本発明のコチニン−ＣＡＲ ＮＫ細胞の細胞傷害作用は、コチニンコンジュゲートの種類に依存することが確認される。
【実施例１２】
【０１１４】
ＥＧＦＲ−ｃｏｔコンジュゲートによって誘導されるコチニン−ＣＡＲ ＮＫ細胞の細胞活動の検証
Ｈｅｒ２またはＥＧＦＲを発現する癌細胞に対して、ｈｅｒ２−コチニンコンジュゲートまたはＥＧＦＲ−コチニンコンジュゲートによって引き起こされる活動の変化を、サイトカインおよび顆粒の放出によって調べた。
【０１１５】
すなわち、ＲＰＭＩ１６４０（１０％ＦＢＳ）中で、ＡＵ５６５またはＡ４３１細胞とｃｏｔ−１０ｚ−９２とを、１：１の比で混合した。ｈｅｒ２−ｃｏｔコンジュゲートまたはＥＧＦＲ−ｃｏｔコンジュゲートによる処理を行い、３７℃および５％ＣＯ２の条件で６時間反応させた。その後、上清において、サイトカイン（ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α）の分泌の変化をＥＬＩＳＡにより調べた。結果を図１６に示す。
【０１１６】
さらに、顆粒の放出を、ＣＤ１０７ａの発現レベルによって調べた。すなわち、元のＮＫ９２、ＰＵＲＯ−９２およびｃｏｔ−１０ｚ−９２のそれぞれを、ＡＵ５６５またはＡ４３１細胞と１：１で混合した。その混合物を、ｈｅｒ２−ｃｏｔコンジュゲートまたはＥＧＦＲ−ｃｏｔコンジュゲートで処理し、ＣＤ１０７ａ抗体で処理した。３７℃および５％ＣＯ２の条件で４時間反応させた。反応後、ＮＫ９２細胞を選抜することができるように、ＣＤ５６抗体を用いる染色を行った。その後、フローサイトメトリーによる測定を行った。ＡＵ５６５およびＡ４３１細胞に対しての結果をそれぞれ図１７および図１８に示す。
【０１１７】
図１６〜１８に示すように、コチニン−ＣＡＲ ＮＫ細胞の活動は、抗原に対する抗体−コチニンコンジュゲートによって高められることがわかった。
【０１１８】
本発明の特定の態様を上記に詳細に説明した。該特定の説明は好ましい態様を示すに過ぎないこと、本発明の範囲はそれに限定されるものではないことは、当業者には明白である。したがって、本発明の真の範囲は、特許請求の範囲およびその等価物によって限定されうる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年9月10日(2019.9.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するナチュラルキラー細胞において、
該キメラ抗原受容体は、１）抗原結合ドメイン、２）膜貫通ドメイン、および３）細胞内シグナル伝達ドメインを含み、
該抗原結合ドメインはコチニンに特異的に結合するドメインである、
ナチュラルキラー細胞。
【請求項２】
前記抗原結合ドメインが、コチニンに特異的に結合する抗体または抗体フラグメントである、請求項１に記載のナチュラルキラー細胞。
【請求項３】
前記抗体フラグメントがｓｃＦｖである、請求項２に記載のナチュラルキラー細胞。
【請求項４】
前記抗体または抗体フラグメントが、配列番号１のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む、請求項２に記載のナチュラルキラー細胞。
【請求項５】
前記抗体または抗体フラグメントが、配列番号２のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、請求項２に記載のナチュラルキラー細胞。
【請求項６】
前記抗体または抗体フラグメントがリンカーをさらに含む、請求項２に記載のナチュラルキラー細胞。
【請求項７】
前記リンカーが、配列番号３のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列からなる、請求項６に記載のナチュラルキラー細胞。
【請求項８】
前記抗原結合ドメインが前記膜貫通ドメインに、ヒンジ領域、スペーサー領域またはそれらの組み合わせによって連結されている、請求項１に記載のナチュラルキラー細胞。
【請求項９】
前記ヒンジ領域、スペーサー領域またはそれらの組み合わせが、Ｍｙｃエピトープ、ＣＤ８ヒンジ領域、およびＦｃから選択される少なくとも１つである、請求項８に記載のナチュラルキラー細胞。
【請求項１０】
前記膜貫通ドメインが、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７およびＣＤ１５４からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質の膜貫通ドメインを含む、請求項１に記載のナチュラルキラー細胞。
【請求項１１】
前記膜貫通ドメインが、ＣＤ２８の膜貫通ドメインを含む、請求項１０に記載のナチュラルキラー細胞。
【請求項１２】
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ＤＡＰ１０、ＣＤ３ζ、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載のナチュラルキラー細胞。
【請求項１３】
前記抗原結合ドメインがシグナルペプチドを含む、請求項１に記載のナチュラルキラー細胞。
【請求項１４】
前記シグナルペプチドが、ＣＤ８αまたはマウス軽鎖κシグナルペプチドである、請求項１３に記載のナチュラルキラー細胞。
【請求項１５】
前記コチニンが、結合物質とコンジュゲートした複合体の形態である、請求項１に記載のナチュラルキラー細胞。
【請求項１６】
前記結合物質が、ペプチド、アプタマー、ホルモン、タンパク質および化学物質からなる群から選択される、請求項１５に記載のナチュラルキラー細胞。
【請求項１７】
請求項１に記載のナチュラルキラー細胞を含む、細胞療法剤。
【請求項１８】
請求項１に記載のナチュラルキラー細胞を活性成分として含む、癌の予防または治療用の医薬組成物。
【請求項１９】
請求項１に記載のナチュラルキラー細胞を含む、癌の診断用の医薬組成物。
【請求項２０】
対象から単離されたサンプルに接触させる、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
癌の予防または治療用医薬を製造するための、請求項１に記載のナチュラルキラー細胞の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
キメラ抗原受容体、それを発現するナチュラルキラー細胞、および癌の予防または治療のためのその使用は、上記に説明したとおりである。
本発明の実施形態を、以下、さらに記載する：
［項１］
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するナチュラルキラー細胞において、
該キメラ抗原受容体は、１）抗原結合ドメイン、２）膜貫通ドメイン、および３）細胞内シグナル伝達ドメインを含み、
該抗原結合ドメインはコチニンに特異的に結合するドメインである、
ナチュラルキラー細胞。
［項２］
前記抗原結合ドメインが、コチニンに特異的に結合する抗体または抗体フラグメントである、上記項１に記載のナチュラルキラー細胞。
［項３］
前記抗体フラグメントがｓｃＦｖである、上記項２に記載のナチュラルキラー細胞。
［項４］
前記抗体または抗体フラグメントが、配列番号１のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む、上記項２に記載のナチュラルキラー細胞。
［項５］
前記抗体または抗体フラグメントが、配列番号２のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、上記項２に記載のナチュラルキラー細胞。
［項６］
前記抗体または抗体フラグメントがリンカーをさらに含む、上記項２に記載のナチュラルキラー細胞。
［項７］
前記リンカーが、配列番号３のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列からなる、上記項６に記載のナチュラルキラー細胞。
［項８］
前記抗原結合ドメインが前記膜貫通ドメインに、ヒンジ領域、スペーサー領域またはそれらの組み合わせによって連結されている、上記項１に記載のナチュラルキラー細胞。
［項９］
前記ヒンジ領域、スペーサー領域またはそれらの組み合わせが、Ｍｙｃエピトープ、ＣＤ８ヒンジ領域、およびＦｃから選択される少なくとも１つである、上記項８に記載のナチュラルキラー細胞。
［項１０］
前記膜貫通ドメインが、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７およびＣＤ１５４からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質の膜貫通ドメインを含む、上記項１に記載のナチュラルキラー細胞。
［項１１］
前記膜貫通ドメインが、ＣＤ２８の膜貫通ドメインを含む、上記項１０に記載のナチュラルキラー細胞。
［項１２］
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ＤＡＰ１０、ＣＤ３ζ、またはそれらの組み合わせを含む、上記項１に記載のナチュラルキラー細胞。
［項１３］
前記抗原結合ドメインがシグナルペプチドを含む、上記項１に記載のナチュラルキラー細胞。
［項１４］
前記シグナルペプチドが、ＣＤ８αまたはマウス軽鎖κシグナルペプチドである、上記項１３に記載のナチュラルキラー細胞。
［項１５］
前記コチニンが、結合物質とコンジュゲートした複合体の形態である、上記項１に記載のナチュラルキラー細胞。
［項１６］
前記結合物質が、ペプチド、アプタマー、ホルモン、タンパク質および化学物質からなる群から選択される、上記項１５に記載のナチュラルキラー細胞。
［項１７］
上記項１に記載のナチュラルキラー細胞を含む、細胞療法剤。
［項１８］
上記項１に記載のナチュラルキラー細胞を活性成分として含む、癌の予防または治療用の医薬組成物。
［項１９］
上記項１に記載のナチュラルキラー細胞を対象に投与するステップを含む、癌の予防または治療方法。
［項２０］
対象から単離されたサンプルに上記項１に記載のナチュラルキラー細胞を接触させることを含む、癌の診断方法。
［項２１］
癌を予防または治療するための、上記項１に記載のナチュラルキラー細胞の使用。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７７】
（４）膜貫通領域
ヒトＣＤ２８遺伝子のヒンジ由来の細胞質領域を膜貫通領域として用いた。フォワードプライマーに制限酵素ＢａｍＨ１の配列を付加することによって（配列番号２４）、リバースプライマーに制限酵素ＥｃｏＲＩの配列を付加することによって（配列番号２５）、プライマーを作製した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図７】
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【国際調査報告】
2020505014.tif 000025
2020505014.tif 000026
2020505014.tif 000027
2020505014.tif 000028
2020505014.tif 000029
2020505014.tif 000030