(57)【要約】Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に対して抗原特異性を有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が提供される。また、該ＣＡＲに関連する関連核酸、組み換え発現ベクター、宿主細胞、細胞の集団、及び医薬組成物も提供される。哺乳類におけるがんを治療又は予防する方法も提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原認識ドメインと、膜貫通（ＴＭ）ドメインと、Ｔ細胞活性化ドメインとを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に対する抗原特異性を有し、前記抗原認識ドメインが、
（ａ）配列番号１〜３、
（ｂ）配列番号４〜６、
（ｃ）配列番号７〜９、又は
（ｄ）配列番号１０〜１２
のアミノ酸配列を含むＣＡＲ。
【請求項２】
前記ＣＡＲの全てのドメインがヒトのである、請求項１に記載のＣＡＲ。
【請求項３】
前記抗原認識ドメインが、約８〜約４０アミノ酸残基の長さを有するリンカーペプチドを含まない、請求項１又は２に記載のＣＡＲ。
【請求項４】
前記ＣＡＲが抗体軽鎖可変領域を含まない、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
【請求項５】
前記抗原認識ドメインが、
（ａ）配列番号１３、
（ｂ）配列番号１４、
（ｃ）配列番号１５、又は
（ｄ）配列番号１６
のアミノ酸配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
【請求項６】
前記Ｔ細胞活性化ドメインが、以下のタンパク質のうちのいずれか１つのＴ細胞シグナル伝達ドメインを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のＣＡＲ：ヒトＣＤ２８タンパク質、ヒトＣＤ３−ゼータタンパク質、ヒトＦｃＲγタンパク質、ＣＤ２７タンパク質、ＯＸ４０タンパク質、ヒト４−１ＢＢタンパク質、ヒト誘導性Ｔ細胞共刺激タンパク質（ＩＣＯＳ）、前述のいずれかの改変バージョン、又は前述の任意の組み合わせ。
【請求項７】
配列番号１７〜２８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のＣＡＲをコードしているヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項９】
配列番号２９〜４０のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、請求項８に記載の核酸。
【請求項１０】
請求項８又は９に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載のベクターを含む単離された宿主細胞。
【請求項１２】
前記宿主細胞がＴ細胞である、請求項１１に記載の単離された宿主細胞。
【請求項１３】
前記宿主細胞がナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、請求項１１に記載の単離された宿主細胞。
【請求項１４】
請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の少なくとも１つの宿主細胞を含む細胞の集団。
【請求項１５】
哺乳類におけるがんを治療又は予防する方法において使用するための、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＣＡＲ、請求項８若しくは９に記載の核酸、請求項１０に記載のベクター、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の宿主細胞、又は請求項１４に記載の集団。
【請求項１６】
前記がんが、多発性骨髄腫又はホジキンリンパ腫である、請求項１５に記載の使用のためのＣＡＲ、核酸、ベクター、又は宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
この特許出願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、２０１７年６月３０日出願の米国仮特許出願第６２／５２７，５５６号の利益を主張する。
【０００２】
連邦支援の研究又は開発に関する記述
本発明は、米国国立衛生研究所、国立がん研究所によって、プロジェクト番号ＺＩＡＢＣ０１１４３９０５の下、政府の支援を受けて成された。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
電子的に提出された文献の参照による援用
本明細書と同時に提出され、以下の通り特定されるコンピュータ可読ヌクレオチド／アミノ酸配列表は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる：２０１８年６月２５日付の「７３９５３４＿ＳＴ２５．ＴＸＴ」という名称の６７，０６１バイトのＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイル。
【背景技術】
【０００４】
がんは、公衆衛生上の懸念である。化学療法等の治療の進歩にもかかわらず、多くのがんの予後が不良である場合がある。例えば、多発性骨髄腫（ＭＭ）の治療によって寛解する場合もあるが、多くの患者は最終的に再発し、死に至る。したがって、がんの更なる治療法に対するアンメットニーズが存在する。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の実施形態は、抗原認識ドメインと、膜貫通（ＴＭ）ドメインと、Ｔ細胞活性化ドメインとを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に対する抗原特異性を有し、該抗原認識ドメインが、（ａ）配列番号１〜３、（ｂ）配列番号４〜６、（ｃ）配列番号７〜９、又は（ｄ）配列番号１０〜１２のアミノ酸配列を含むＣＡＲを提供する。
【０００６】
本発明の更なる実施形態は、本発明のＣＡＲに関連する関連核酸、組み換え発現ベクター、宿主細胞、細胞の集団、及び医薬組成物を提供する。
【０００７】
本発明の追加の実施形態は、哺乳類におけるがんを治療又は予防する関連方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１−１】図１Ａ〜１Ｄは、ＣＤ８α分子のヒンジ及び膜貫通の領域、ＣＤ２８共刺激分子の細胞質部分、並びにＣＤ３ζＴ細胞活性化ドメインの細胞質部分と組み合わせた、ＦＨＶＨ７４（Ａ）、ＦＨＶＨ３２（Ｂ）、ＦＨＶＨ３３（Ｃ）、又はＦＨＶＨ９３（Ｄ）の完全ヒト重鎖のみ抗原認識ドメインを含むＣＡＲを表す図である。
【図１−２】図１Ｅ〜１Ｈは、ＣＤ８α分子のヒンジ及び膜貫通の領域、４−１ＢＢ共刺激分子の細胞質部分、並びにＣＤ３ζＴ細胞活性化ドメインの細胞質部分と組み合わせた、ＦＨＶＨ７４（Ｅ）、ＦＨＶＨ３２（Ｆ）、ＦＨＶＨ３３（Ｇ）、又はＦＨＶＨ９３（Ｈ）の完全ヒト重鎖のみ抗原認識ドメインを含むＣＡＲを表す図である。
【図１−３】図１Ｉ〜１Ｌは、ＣＤ８α分子のヒンジ及び膜貫通の領域、誘導性Ｔ細胞共刺激タンパク質（ＩＣＯＳ）の細胞質部分、並びにＣＤ３ζＴ細胞活性化ドメインの細胞質部分と組み合わせた、ＦＨＶＨ７４（Ｉ）、ＦＨＶＨ３２（Ｊ）、ＦＨＶＨ３３（Ｋ）、又はＦＨＶＨ９３（Ｌ）の完全ヒト重鎖のみ抗原認識ドメインを含むＣＡＲを表す図である。
【図２】図２は、実施例２に記載の通り、図示されている４つのＦＨＶＨ  ＣＡＲが初代ヒトＴ細胞によって発現されたことを示す実験データを表す一連のグラフである。非形質導入（ＵＴ）Ｔ細胞がネガティブコントロールとして含まれ、１１Ｄ５−３−ＣＤ８２８ＺがポジティブコントロールＣＡＲとして提供される。培養２日目にＴ細胞に形質導入し、培養７日目に該細胞をＢＣＭＡ−Ｆｃタンパク質試薬で染色した。プロットは、ゲートした生リンパ球である。プロット上の数字は、ＣＡＲを発現している（上）又はＣＡＲを発現していない（下）ＣＤ３＋細胞の百分率である。
【図３】図３は、ＦＨＶＨ  ＣＡＲを発現しているＴ細胞によるＢＣＭＡ特異的脱顆粒を示す実験データを表す一連のグラフである。これらグラフは、抗原特異的機能を評価するためのＣＤ１０７ａ脱顆粒アッセイにおける、４つのＦＨＶＨ  ＣＡＲのうちの１つが形質導入された初代ヒトＴ細胞の結果を示す。実施例３に記載の通り、ＢＣＭＡ陰性標的細胞（ＮＧＦＲ−Ｋ５６２）と比べて、ＢＣＭＡ＋標的細胞（ＢＣＭＡ−Ｋ５６２）と共に培養したとき、各ＣＡＲを発現しているＴ細胞はより多く脱顆粒した。ＵＴ細胞がネガティブコントロールとして含まれ、１１Ｄ５−３−ＣＤ８２８ＺがポジティブコントロールＣＡＲとして提供される。プロットは、ゲートしたＣＤ３＋リンパ球である。プロット上の数字は、ＣＤ１０７ａをアップレギュレートしている（上）又はＣＤ１０７ａをアップレギュレートしていない（下）ＣＤ３＋細胞の百分率である。
【図４−１】図４Ａは、１１Ｄ５−３−ＣＤ８２８Ｚ  ＣＡＲがＢＣＭＡ特異的に増殖したことを示す実験データを表すグラフである。プロットは、ゲートした生ＣＤ３＋リンパ球である。白色ヒストグラムは、ＢＣＭＡ−Ｋ５６２（ＢＣＭＡを発現している）標的細胞で刺激されたＣＡＲ＋Ｔ細胞を表し、黒色ヒストグラムは、ＮＧＦＲ−Ｋ５６２（ＢＣＭＡ陰性）細胞で刺激されたＣＡＲ＋Ｔ細胞を表す。全ての結果は、同じ患者由来の細胞を用いて同時に得られた。図４Ｂ〜４Ｃは、実施例５に記載の通り、ＦＨＶＨ７４−ＣＤ８２８Ｚ（Ｂ）、又はＦＨＶＨ３２−ＣＤ８２８Ｚ（Ｃ）ＣＡＲがＢＣＭＡ特異的に増殖したことを示す実験データを表すグラフである。
【図４−２】図４Ｄ〜４Ｅは、実施例５に記載の通り、ＦＨＶＨ３３−ＣＤ８２８Ｚ（Ｄ）、又はＦＨＶＨ９３−ＣＤ８２８Ｚ（Ｅ）ＣＡＲがＢＣＭＡ特異的に増殖したことを示す実験データを表すグラフである。図４Ｆは、表示したＣＡＲを形質導入したＴ細胞をＢＣＭＡ＋標的細胞と共に培養したときにＣＡＲ＋Ｔ細胞の絶対数が増加したことを示す実験データを表すグラフである。ＣＡＲ  Ｔ細胞をＢＣＭＡ−Ｋ５６２細胞と共に培養したとき、全てのＣＡＲを発現しているＴ細胞についてＣＡＲ＋Ｔ細胞の数が増加した。Ｙ軸は、ＣＡＲ＋Ｔ細胞の数（×１０６）を表す。Ｘ軸は、Ｔ細胞をＢＣＭＡ＋標的細胞と共に培養した日数を表す。
【図５】図５Ａは、ＵＴ細胞のＢＣＭＡ＋標的細胞を殺傷する能力と比べた、ＦＨＶＨ３３−ＣＤ８２８Ｚ  ＣＡＲのＢＣＭＡ＋標的細胞を殺傷する能力を示す実験データを表すグラフである。ＦＨＶＨ３３−ＣＤ８２８Ｚ  ＣＡＲを発現しているＴ細胞をＲＰＭＩ８２２６標的細胞と共に、インビトロで４時間、表示したエフェクタ対標的比で培養した。細胞傷害性をデュープリケートで判定した。結果を平均の＋／−標準誤差として提示する。Ｙ軸は、ＣＡＲの細胞傷害性％を表す。Ｘ軸は、Ｔ細胞の標的細胞に対する比を表す。図５Ｂは、ＵＴ細胞のＢＣＭＡ＋標的細胞を殺傷する能力と比べた、ＦＨＶＨ３３−ＣＤ８ＢＢＺ  ＣＡＲのＢＣＭＡ＋標的細胞を殺傷する能力を示す実験データを表すグラフである。ＦＨＶＨ３３−ＣＤ８ＢＢＺ  ＣＡＲを発現しているＴ細胞をＲＰＭＩ８２２６標的細胞と共に、インビトロで４時間、表示したエフェクタ対標的比で培養した。細胞傷害性をデュープリケートで判定した。結果を平均の＋／−標準誤差として提示する。Ｙ軸は、ＣＡＲの細胞傷害性％を表す。Ｘ軸は、Ｔ細胞の標的細胞に対する比を表す。
【図６】図６は、４−１ＢＢ共刺激ドメインを有するＣＡＲが初代ヒトＴ細胞の表面上で発現し、ＦＨＶＨ３３−ＣＤ８ＢＢＺが最も高発現を示すことを示す実験データを示す一連のグラフである。プロットは、４つのＦＨＶＨ  ＣＡＲのＢＣＭＡ−Ｆｃ染色、１１Ｄ５−３−ＣＤ８２８Ｚ対照ＣＡＲの染色、及びＵＴ細胞の染色を示す。プロットは、ゲートした生リンパ球である。プロット上の数字は、ＢＣＭＡ−Ｆｃで染色されている（上の数字）又は染色されていない（下の数字）細胞の百分率である。
【図７−１】図７Ａ〜７Ｂは、ＦＨＶＨ３３−ＣＤ８ＢＢＺを発現しているＴ細胞（Ｂ）と比べた、ＵＴ細胞（Ａ）におけるこのＣＡＲの発現を表す。プロットは、ゲートした生ＣＤ３＋リンパ球である。プロットにおける数字は、ＢＣＭＡ−ＰＥ＋（上）及びＢＣＭＡ−ＰＥ−（下）の百分率である。
【図７−２】図７Ｃ〜７Ｆは、ＣＤ１０７ａ染色によって評価したとき、ＦＨＶＨ３３−ＣＤ８ＢＢＺが形質導入されたＴ細胞が、ＢＣＭＡ特異的に脱顆粒したことを示す実験データを示す。このデータは、ＦＨＶＨ３３＋ＢＣＭＡ−Ｋ５６２（Ｅ）及びＦＨＶＨ３３＋ＮＧＦＲ−Ｋ５６２細胞（Ｆ）におけるＣＤ１０７ａのアップレギュレーションと比べた、ＵＴ＋ＢＣＭＡ−Ｋ５６２（Ｃ）及びＵＴ＋ＮＧＦＲ−Ｋ５６２細胞（Ｄ）におけるＣＤ１０７ａのアップレギュレーションを示す。図７Ａ〜７Ｂに提示したのと同じＴ細胞培養物を使用した。プロットは、ゲートした生ＣＤ３＋リンパ球である。プロットにおける数字は、ＣＤ１０７ａ＋（上）及びＣＤ１０７ａ−（下）の百分率である。
【図７−３】図７Ｃ〜７Ｆは、ＣＤ１０７ａ染色によって評価したとき、ＦＨＶＨ３３−ＣＤ８ＢＢＺが形質導入されたＴ細胞が、ＢＣＭＡ特異的に脱顆粒したことを示す実験データを示す。このデータは、ＦＨＶＨ３３＋ＢＣＭＡ−Ｋ５６２（Ｅ）及びＦＨＶＨ３３＋ＮＧＦＲ−Ｋ５６２細胞（Ｆ）におけるＣＤ１０７ａのアップレギュレーションと比べた、ＵＴ＋ＢＣＭＡ−Ｋ５６２（Ｃ）及びＵＴ＋ＮＧＦＲ−Ｋ５６２細胞（Ｄ）におけるＣＤ１０７ａのアップレギュレーションを示す。図７Ａ〜７Ｂに提示したのと同じＴ細胞培養物を使用した。プロットは、ゲートした生ＣＤ３＋リンパ球である。プロットにおける数字は、ＣＤ１０７ａ＋（上）及びＣＤ１０７ａ−（下）の百分率である。
【図７−４】図７Ｇは、ＣＡＲを発現しているＴ細胞がＢＣＭＡ特異的にＩＦＮγを生成したことを示す実験データを示す。Ｔ細胞をＢＣＭＡ＋細胞株ＢＣＭＡ−Ｋ５６２及びＲＰＭＩ８２２６と共に培養したとき、大量のＩＦＮγが放出された。Ｙ軸は、ＩＦＮγの量（ｐｇ／ｍＬ）を表す。Ｘ軸は、実験で使用した標的細胞を表す。
【図８】図８は、標的初代ヒト骨髄腫骨髄細胞（黒色バー）又は対照標的ＰＢＭＣ（灰色バー）と共に共培養した際の、非形質導入（ＵＴ）又はＦＨＶＨ３３−ＣＤ８２８Ｚ若しくはＦＨＶＨ３３−ＣＤ８ＢＢＺ  ＣＡＲが形質導入されたＴ細胞によって分泌されたＩＦＮγの量（ｐｇ／ｍＬ）を示すグラフである。
【図９−１】図９Ａは、マウスにおけるＦＨＶＨ３３−ＣＤ８ＢＢＺ  Ｔ細胞の用量の力価測定を示す概略図である。雌（Ｆ）の７〜８週（ｗｋ）齢のＮＳＧマウスに、８００万（Ｍ）個のＲＰＭＩ８２２６細胞を皮内（ｉ．ｄ．）注射し、腫瘍を１０日間成長させた。０日目に、様々な数のＦＨＶＨ３３−ＣＤ８ＢＢＺ発現Ｔ細胞をマウスに静脈内（ＩＶ）注入した。３日毎に（ｄ）腫瘍を測定した。
【図９−２】図９Ｂは、ＣＡＲ  Ｔ細胞注入後の表示した日数における、０．２×１０６（黒三角）、０．７×１０６（黒丸）、又は２．２×１０６（白丸）個のＦＨＶＨ３３−ＣＤ８ＢＢＺを発現しているＴ細胞で図９Ａに示す通り処理されたマウスにおいて測定された腫瘍体積（ｍｍ３）を示すグラフである。未処理マウスを白三角によって表す。図９Ｃは、ＣＡＲ  Ｔ細胞注入後の表示した日数における、０．２×１０６（黒三角）、０．７×１０６（黒丸）、又は２．２×１０６（白丸）個のＦＨＶＨ３３−ＣＤ８ＢＢＺを発現しているＴ細胞による処理後の図９Ｂに示すマウスの生存率を示すグラフである。未処理マウスを白三角によって表す。
【図１０−１】図１０Ａは、ＣＡＲ  Ｔ細胞注入後の表示した日数における、ＳＰ６−ＣＤ８２８Ｚ（三角）、１１Ｄ５−３−ＣＤ８ＢＢＺ（四角）、ＦＨＶＨ３３−ＣＤ８ＢＢＺ（白丸）、又はＦＨＶＨ３３−ＣＤ８２８Ｚ（黒丸）ＣＡＲを発現しているＴ細胞で処理されたマウスにおいて測定された腫瘍体積（ｍｍ３）を示すグラフである。未処理マウスを菱形によって表す。
【図１０−２】図１０Ｂは、ＣＡＲ  Ｔ細胞注入後の表示した日数における、ＳＰ６−ＣＤ８２８Ｚ（三角）、１１Ｄ５−３−ＣＤ８ＢＢＺ（四角）、ＦＨＶＨ３３−ＣＤ８ＢＢＺ（白丸）、又はＦＨＶＨ３３−ＣＤ８２８Ｚ（黒丸）ＣＡＲを発現しているＴ細胞で処理されたマウスの生存率を示すグラフである。未処理マウスを菱形によって表す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の実施形態は、抗原認識ドメインと、ＴＭドメインと、Ｔ細胞活性化ドメインとを含むＣＡＲであって、ＢＣＭＡに対して抗原特異性を有するＣＡＲを提供する。ＣＡＲは、Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン又はＴ細胞活性化ドメインに連結されている抗体の抗原認識ドメインを含有する、人工的に構築されたハイブリッドタンパク質又はポリペプチドである。ＣＡＲは、モノクローナル抗体の抗原結合特性を利用して、選択された標的に対するＴ細胞の特異性及び反応性を非ＭＨＣ拘束的にリダイレクトする能力を有する。非ＭＨＣ拘束性抗原認識は、抗原処理とは無関係に抗原を認識し、それによって、腫瘍エスケープの主な機序をバイパスする能力を、ＣＡＲを発現しているＴ細胞に与える。更に、Ｔ細胞で発現するとき、ＣＡＲは、有利なことに、内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のアルファ及びベータ鎖とは二量体化しない。
【００１０】
本発明のＣＡＲは、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ、ＣＤ２６９としても知られている）に対して抗原特異性を有する。ＢＣＭＡは、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーである（例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１９２（１）：１２９−１３５（２０００）及びＭａｃｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２１：２３１−２６４（２００３）を参照）。ＢＣＭＡは、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）及び増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）に結合する（例えば、Ｍａｃｋａｙら、前記、及びＫａｌｌｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，２０４：４３−５４（２００５）を参照）。良性細胞の中でも、ＢＣＭＡは、大部分がプラズマ細胞及び成熟Ｂ細胞のサブセットにおいて発現すると報告されている（例えば、Ｌａａｂｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１１（１１）：３８９７−３９０４（１９９２）；Ｌａａｂｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２２（７）：１１４７−１１５４（１９９４）；Ｋａｌｌｅｄら、前記；Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１９９（１）：９１−９７（２００４）；及びＮｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７３（２）：８０７−８１７（２００４）を参照）。ＢＣＭＡ  ＲＮＡは、多発性骨髄腫細胞において普遍的に検出されており、ＢＣＭＡタンパク質は、数人の研究者らによって多発性骨髄腫患者からプラズマ細胞の表面上で検出されている（例えば、Ｎｏｖａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０３（２）：６８９−６９４（２００４）；Ｎｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３（１９）：５９０３−５９０９（２００７）；Ｂｅｌｌｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０５（１０）：３９４５−３９５０（２００５）；及びＭｏｒｅａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０３（８）：３１４８−３１５７（２００４）を参照）。ＢＣＭＡの発現は、ホジキンリンパ腫細胞の表面上でも検出されている（例えば、Ｃｈｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０９（２）：７２９−７３９（２００７）を参照）。ヒトＢＣＭＡは、配列番号４２のアミノ酸配列を有する。
【００１１】
「抗原特異性を有する」及び「抗原特異的応答を惹起する」という言い回しは、本明細書で使用するとき、ＣＡＲの抗原への結合が免疫応答を惹起するように、ＣＡＲが抗原に特異的に結合し、抗原を免疫学的に認識することができることを意味する。
【００１２】
本発明のＣＡＲは、様々な利点のうちのいずれか１つ以上を提供することができる。例えば、本発明のＣＡＲは、抗ＣＡＲ免疫原性を低下させることができる。非ヒトドメイン（例えば、マウスドメイン）及び人工リンカーペプチドの一方又は両方を含むＣＡＲは、患者に投与された際に抗ＣＡＲ免疫応答を惹起し得る。このような抗ＣＡＲ免疫応答は、ＣＡＲ発現細胞の持続性を低下させ、ＣＡＲ療法の有効性を低下させるか又はなくす場合がある。特定の理論又は機序に束縛されるものではないが、本発明のＣＡＲの以下の特徴のうちのいずれか１つ以上が、抗ＣＡＲ免疫原性の潜在的ソースを低減又は排除することができると考えられる：（ｉ）ＣＡＲの全てのドメインがヒトのである；（ｉｉ）ＣＡＲが、人工リンカーペプチド、例えば、約１０〜約２５アミノ酸残基の長さを有し、グリシン、セリン、及びトレオニンのうちのいずれか１つ以上からなるリンカーペプチドを含まない；（ｉｉｉ）ＣＡＲが、抗体軽鎖可変領域を含まない；並びに（ｉｖ）抗原認識ドメインが、単一抗体重鎖可変領域しか含まない。抗ＣＡＲ免疫原性の潜在的ソースが低減又は排除されることによって、ＣＡＲ発現細胞の持続性及びＣＡＲ療法の有効性が改善されると考えられる。更に、前述の特徴（ｉｉ）〜（ｉｖ）のうちのいずれか１つ以上は、ＢＣＭＡに加えて１つ以上の異なる抗原（ＢＣＭＡ以外）を標的とするＣＡＲの調製を容易にすることができる。
【００１３】
本発明のＣＡＲは、従来のＣＡＲと比べて低い抗ＣＡＲ免疫原性を有し得る。従来のＣＡＲは、以下の特徴のうちのいずれか１つ以上を有し得る：（ｉ）従来のＣＡＲのドメインの全てがヒトのである訳ではない；（ｉｉ）従来のＣＡＲは、人工リンカーペプチド、例えば、約１０〜約２５アミノ酸残基の長さを有し、グリシン、セリン、及びトレオニンのうちのいずれか１つ以上からなるリンカーペプチドを含む；並びに（ｉｉｉ）従来のＣＡＲは、抗体軽鎖可変領域を含む（以後「従来のＣＡＲ」と称する）。
【００１４】
従来のＣＡＲに対する免疫応答と比べて本発明のＣＡＲに対する免疫応答が定量的に又は定性的に減弱する場合、抗ＣＡＲ免疫原性は本発明により低減される。抗ＣＡＲ免疫原性の定量的減少は、抗ＣＡＲ免疫応答の大きさ又は程度の減少を包含する。抗ＣＡＲ免疫原性の大きさ又は程度は、任意の数の既知のパラメータ、例えば、サイトカイン（例えば、ＣＡＲ特異的サイトカイン）生成レベル（サイトカイン濃度）の低下、活性化（例えば、リンパ球（例えば、ＣＡＲ特異的リンパ球）の増殖）若しくは動員されたリンパ球の数の減少、及び／又は抗体（ＣＡＲ特異的抗体）の生成（抗体濃度）の減少、宿主（レシピエント）Ｔ細胞のＣＡＲ発現Ｔ細胞を殺傷する能力の低下等に基づいて測定することができる。抗ＣＡＲ免疫原性の定性的減少は、ＣＡＲの細胞傷害活性の低減の媒介における抗ＣＡＲ免疫応答の有効性を低下させる、抗ＣＡＲ免疫応答の性質の任意の変化を包含する。抗ＣＡＲ免疫原性を測定する方法は、当技術分野において公知である。例えば、生成されるサイトカインの種類及びレベルの測定によって、抗ＣＡＲ免疫原性を測定することができる。抗ＣＡＲ免疫原性の低下は、サイトカイン、例えばＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、及びグランザイムＢのうちのいずれか１つ以上の生成の減少、並びに／又は細胞媒介性抗ＣＡＲ免疫応答の刺激減少、例えば、従来のＣＡＲで得られるものと比べた本発明のＣＡＲに特異的なＴ細胞及び／若しくはマクロファージの増殖及び活性化の減少を特徴とし得る。抗ＣＡＲ免疫原性の低下は、抗ＣＡＲ  Ｔ細胞の刺激の減少、抗ＣＡＲ  Ｔ細胞の増殖の減少、抗ＣＡＲ  Ｔ細胞のＩＦＮγ及び／又はグランザイムＢの分泌の減少、並びにＣＡＲ発現Ｔ細胞を殺傷する宿主Ｔ細胞の能力の低下のうちのいずれか１つ以上を特徴とし得る。抗ＣＡＲ免疫原性の定性的及び定量的な減弱は同時に生じ得、相互排他的ではない。「抗ＣＡＲ免疫原性」という言い回しは、本明細書で使用するとき、ＣＡＲ自体に対する免疫応答を指し、ＣＡＲが提供し得る標的抗原ＢＣＭＡに対する免疫応答のいずれの態様を指すものでもない。
【００１５】
ＣＡＲは、抗原認識ドメインを含む。抗原認識ドメインは、ＢＣＭＡを認識し、結合する。本発明の実施形態では、抗原認識ドメインは、ヒト抗ＢＣＭＡ抗体の重鎖可変領域を含む。抗体全体は、典型的には、４つのポリペプチド：重（Ｈ）鎖ポリペプチドの２つの同一コピーと軽（Ｌ）鎖ポリペプチドの２つの同一コピーからなる。各重鎖は、１つのＮ末端可変（ＶＨ）領域と３つのＣ末端定常（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）領域とを含み、各軽鎖は、１つのＮ末端可変（ＶＬ）領域と１つのＣ末端定常（ＣＬ）領域とを含む。ＶＨ及びＶＬ領域は同じ一般構造を有し、各領域は４つのフレームワーク領域を含み、その配列は比較的保存されている。フレームワーク領域は、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３によって接続されている。しかし、上に説明した通り、本発明の実施形態では、ＣＡＲは、抗体軽鎖可変領域を含まない。したがって、本発明の実施形態では、抗原認識ドメインは、単一抗体重鎖可変領域しか含まない。
【００１６】
実施形態では、抗原認識ドメインは、ヒト抗ＢＣＭＡ抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、及びＣＤＲ３領域を含む。これに関連して、本発明の実施形態では、抗原認識ドメインは、
（ａ）配列番号１を含む重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号２を含む重鎖ＣＤＲ２領域、及び配列番号３を含む重鎖ＣＤＲ３領域（ＦＨＶＨ７４重鎖可変領域のＣＤＲ領域）のうちの１つ以上；
（ｂ）配列番号４を含む重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号５を含む重鎖ＣＤＲ２領域、及び配列番号６を含む重鎖ＣＤＲ３領域（ＦＨＶＨ３２重鎖可変領域のＣＤＲ領域）のうちの１つ以上；
（ｃ）配列番号７を含む重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号８を含む重鎖ＣＤＲ２領域、及び配列番号９を含む重鎖ＣＤＲ３領域（ＦＨＶＨ３３重鎖可変領域のＣＤＲ領域）のうちの１つ以上；又は
（ｄ）配列番号１０を含む重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号１１を含む重鎖ＣＤＲ２領域、及び配列番号１２を含む重鎖ＣＤＲ３領域（ＦＨＶＨ９３重鎖可変領域のＣＤＲ領域）のうちの１つ以上
を含み得る。
好ましくは、抗原認識ドメインは、（ａ）配列番号１〜３の全て、（ｂ）配列番号４〜６の全て、（ｃ）配列番号７〜９の全て、又は（ｄ）配列番号１０〜１２の全てのアミノ酸配列を含む。
【００１７】
本発明の実施形態では、抗原認識ドメインは、ヒト抗ＢＣＭＡ抗体の重鎖可変領域を含む。これに関連して、抗原認識ドメインは、（ａ）配列番号１３（ＦＨＶＨ７４重鎖可変領域）、（ｂ）配列番号１４（ＦＨＶＨ３２重鎖可変領域）、（ｃ）配列番号１５（ＦＨＶＨ３３重鎖可変領域）、又は（ｄ）配列番号１６（ＦＨＶＨ９３重鎖可変領域）のアミノ酸配列を含んでいてよい。
【００１８】
本発明の実施形態では、抗原認識ドメインは、リンカーペプチドを含まない。従来のＣＡＲの抗原認識ドメインは、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）で構成されていてよい。ｓｃＦｖは、人工リンカーペプチドによって連結されたＦｖ断片の２つのドメイン（すなわち、ＶＬ及びＶＨ）を含む一価分子であり、該リンカーペプチドによって該２つのドメインを単一ポリペプチド鎖として合成することが可能になる。本発明のＣＡＲの以下の特徴のうちのいずれか１つ以上は、有利なことに、ＣＡＲの異なる構成要素を連結する潜在的に免疫原性の連結部、例えば、従来のＣＡＲで使用されるｓｃＦｖのＶＬ及びＶＨにリンカーペプチドを連結させる２つの潜在的に免疫原性の連結部を低減又は排除することができる：（ｉ）例えば、従来のＣＡＲで使用されるｓｃＦｖにおいて典型的にみられるもの等のリンカーペプチドが存在しない、（ｉｉ）抗体軽鎖可変領域（これも従来のＣＡＲで使用される）が存在しない、及び（ｉｉｉ）単一抗体重鎖可変領域しか存在しない。連結部及びリンカーペプチド（複数可）は、ヒトでは通常みられない人工配列であるので、免疫原性である可能性がある。あるいは又は更に、前述の特徴（ｉ）〜（ｉｉｉ）のうちのいずれか１つ以上は、ペプチドリンカー及び抗体軽鎖可変領域の一方又は両方における任意の潜在的に免疫原性の領域を排除することができる。リンカーペプチドの目的は、一般的に、２つの他のペプチド又はタンパク質間（例えば、抗体重鎖と抗体軽鎖との間）に柔軟な連結を形成することである。リンカーペプチドは、任意の長さであってよく、多くが任意のアミノ酸配列を含む。本発明の実施形態では、リンカーペプチドは、約５〜約１００アミノ酸残基、約８〜約７５アミノ酸残基、約８〜約５０アミノ酸残基、約１０〜約２５アミノ酸残基、約８〜約３０アミノ酸残基、約８〜約４０アミノ酸残基、又は約８〜約５０アミノ酸残基の長さを有し得る。本発明の実施形態では、抗原認識ドメインは、約８〜約４０アミノ酸残基の長さを有するリンカーペプチドを含まない。例えば、リンカーペプチドは、他のアミノ酸残基の有り無しで、グリシン、セリン、トレオニンのうちのいずれか１つ以上を含んでいてもよく、からなっていてもよい。本発明の実施形態では、抗原認識ドメインは、約８〜約４０アミノ酸残基の長さを有し、グリシン、セリン、トレオニンのうちのいずれか１つ以上からなるリンカーペプチドを含まない。
【００１９】
別の実施形態では、本発明のＣＡＲは、リーダードメインを含む。リーダードメインは、抗原認識ドメイン（例えば、抗ＢＣＭＡ抗体の重鎖可変領域）のアミノ末端に位置していてよい。リーダードメインは、任意の好適なリーダー配列を含んでいてよい。好ましくは、リーダードメインは、ヒトリーダードメインである。一実施形態では、リーダードメインは、ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）受容体配列又はヒトＣＤ８αリーダー配列である。
【００２０】
別の実施形態では、ＣＡＲは、ヒンジドメインを含む。当業者であれば、ヒンジドメインが抗体の柔軟性を促進する短いアミノ酸配列であることを理解する（例えば、Ｗｏｏｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４（２）：８９−９９（２００４）を参照）。ヒンジドメインは、抗原認識ドメインとＴ細胞活性化ドメインとの間に位置していてよい。ヒンジドメインは、任意の好適な分子に由来するか又は該分子から得られる任意の好適な配列を含んでいてよい。好ましくは、ヒンジドメインは、ヒト配列を含む。一実施形態では、例えば、ヒンジドメインは、ヒトＣＤ８α分子又はヒトＣＤ２８分子の一部である。
【００２１】
ＣＡＲは、ＴＭドメインを含んでいてよい。ＴＭドメインは、当技術分野において公知の任意の分子に由来するか又は該分子から得られる任意のＴＭドメインであってよい。好ましくは、ＴＭドメインは、ヒトＴＭドメインである。例えば、ＴＭドメインは、ヒトＣＤ８α分子又はヒトＣＤ２８分子のＴＭドメインを含んでいてよい。ＣＤ８は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に対して共受容体として機能するＴＭ糖タンパク質であり、細胞傷害性Ｔ細胞の表面上で主に発現する。ＣＤ８の最も一般的な形態は、ＣＤ８α及びＣＤ８β鎖で構成される二量体として存在する。ＣＤ２８は、Ｔ細胞上で発現し、Ｔ細胞の活性化に必要な共刺激シグナルを提供する。ＣＤ２８は、ＣＤ８０（Ｂ７．１）及びＣＤ８６（Ｂ７．２）の受容体である。
【００２２】
ＣＡＲは、Ｔ細胞活性化ドメインを含んでいてよい。Ｔ細胞活性化ドメインは、細胞内（すなわち、細胞質）Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含んでいてよい。細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８分子、ＣＤ３ゼータ（ζ）分子、Ｆｃ受容体ガンマ（ＦｃＲγ）鎖、ＣＤ２７分子、ＯＸ４０分子、４−１ＢＢ分子、誘導性Ｔ細胞共刺激タンパク質（ＩＣＯＳ）、若しくは当技術分野において公知の他の細胞内シグナル伝達分子、又は前述のいずれかの改変バージョンから得ることができるか、又は由来し得る。上記検討の通り、ＣＤ２８は、Ｔ細胞の共刺激において重要なＴ細胞マーカーである。ＣＤ３ζはＴＣＲと会合してシグナルを生じさせ、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。ＣＤ１３７としても知られている４−１ＢＢは、強力な共刺激シグナルをＴ細胞に伝達し、Ｔリンパ球の分化を促進し、長期間にわたる生存を増強する。ＩＣＯＳは、活性化Ｔ細胞で発現するＣＤ２８スーパーファミリー共刺激分子である。好ましい実施形態では、ＣＤ２８、ＣＤ３ゼータ、ＦｃＲγ、ＩＣＯＳ、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、及びＣＤ２７はヒトのである。
【００２３】
本発明のＣＡＲは、前述のＴＭドメインのうちのいずれか１つと、前述の細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインのうちのいずれか１つ以上とを任意の組み合わせで含んでいてよい。例えば、本発明のＣＡＲは、ＣＤ８αのＴＭドメインと、ＣＤ２８及びＣＤ３ゼータの細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインとを含んでいてよい。あるいは、例えば、本発明のＣＡＲは、ＣＤ８αのＴＭドメインと、ＣＤ３ゼータ及び４−１ＢＢの細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインとを含んでいてよい。更に別の例では、本発明のＣＡＲは、ＣＤ８αのＴＭドメインと、ＩＣＯＳ及びＣＤ３ゼータの細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインとを含んでいてよい。
【００２４】
一実施形態では、本発明のＣＡＲは、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、ヒトＣＤ８αリーダードメイン、ヒト抗ＢＣＭＡ抗体重鎖可変領域、ヒトＣＤ８α分子のヒンジ及び膜貫通領域、ヒトＣＤ２８分子の細胞質Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン、並びにヒトＣＤ３ζ分子の細胞質Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含む。別の実施形態では、本発明のＣＡＲは、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、ヒトＣＤ８αリーダードメイン、ヒト抗ＢＣＭＡ抗体重鎖可変領域、ヒトＣＤ８α分子のヒンジ及び膜貫通領域、ヒト４−１ＢＢ分子の細胞質Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン、並びにヒトＣＤ３ζ分子の細胞質Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含む。更に別の実施形態では、本発明のＣＡＲは、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、ヒトＣＤ８αリーダードメイン、ヒト抗ＢＣＭＡ抗体重鎖可変領域、ヒトＣＤ８α分子のヒンジ及び膜貫通領域、ヒトＩＣＯＳ分子の細胞質Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン、並びにヒトＣＤ３ζ分子の細胞質Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含む。本発明の更なる実施形態は、配列番号１７〜２８のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、からなる、又はから本質的になるＣＡＲを提供する。配列番号１７〜２８のＣＡＲの構成要素を以下の表Ａに記載する。
【００２５】
【表１】
2020529841.tif 000002
【００２６】
本発明の実施形態では、ＣＡＲの全てのドメインがヒトのである。これに関連して、リーダードメイン、ヒンジドメイン、抗原認識ドメイン、ＴＭドメイン、及びＴ細胞活性化ドメインの全てがヒトのである。したがって、本発明のＣＡＲは、有利なことに、非ヒトリーダードメイン、非ヒトヒンジドメイン、非ヒト抗原認識ドメイン、非ヒトＴＭドメイン、及び非ヒトＴ細胞活性化ドメインのうちのいずれか１つ以上を含むＣＡＲと比べて、本発明の他の態様に関して本明細書に記載される通り、低い抗ＣＡＲ免疫原性を有し得る。
【００２７】
本明細書に記載される本発明のＣＡＲの機能的部分は、本発明の範囲に含まれる。用語「機能的部分」は、ＣＡＲに関連して使用されるとき、本発明のＣＡＲの任意の部分又は断片であって、該部分又は断片が一部であるＣＡＲ（親ＣＡＲ）の生物活性を保持している部分又は断片を指す。機能的部分は、例えば、親ＣＡＲと同様の程度、同一程度、又はより高程度、標的細胞を認識するか又は疾患を検出、治療、若しくは予防する能力を保持しているＣＡＲの部分を包含する。親ＣＡＲを基準にして、機能的部分は、例えば、親ＣＡＲの約１０％、約２５％、約３０％、約５０％、約６８％、約８０％、約９０％、約９５％、又はそれ以上を含み得る。
【００２８】
機能的部分は、該部分のアミノ若しくはカルボキシ末端又は両末端に追加のアミノ酸を含んでいてもよく、該追加のアミノ酸は、親ＣＡＲのアミノ酸配列にはみられない。望ましくは、追加のアミノ酸は、例えば、標的細胞を認識する、がんを検出する、がんを治療又は予防する等の機能的部分の生物学的機能に干渉しない。より望ましくは、追加のアミノ酸は、親ＣＡＲの生物活性と比べて、生物活性を増強する。
【００２９】
本明細書に記載される本発明のＣＡＲの機能的変異体は、本発明の範囲に含まれる。用語「機能的変異体」とは、本明細書で使用するとき、親ＣＡＲに対して実質的な又は著しい配列同一性又は類似性を有するＣＡＲ、ポリペプチド、又はタンパク質を指し、該機能的変異体は、該変異体が変異体であるＣＡＲの生物活性を保持している。機能的変異体は、例えば、親ＣＡＲと同様の程度、同一程度、又はより高程度、標的細胞を認識する能力を保持している本明細書に記載されるＣＡＲ（親ＣＡＲ）の変異体を包含する。親ＣＡＲを基準にして、機能的変異体は、例えば、親ＣＡＲとアミノ酸配列が少なくとも約３０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９８％、又はそれ以上同一であってよい。
【００３０】
機能的変異体は、例えば、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する、親ＣＡＲのアミノ酸配列を含み得る。あるいは又は更に、機能的変異体は、少なくとも１つの非保存的アミノ酸置換を有する、親ＣＡＲのアミノ酸配列を含んでいてもよい。この場合、非保存的アミノ酸置換が機能的変異体の生物活性に干渉もせず、阻害もしないことが好ましい。非保存的アミノ酸置換は、機能的変異体の生物活性を増強し得、その結果、機能的変異体の生物活性は親ＣＡＲと比べて増大する。
【００３１】
本発明のＣＡＲのアミノ酸置換は、好ましくは、保存的アミノ酸置換である。保存的アミノ酸置換は、当技術分野において公知であり、特定の物理的及び／又は化学的特性を有するあるアミノ酸が、同じ又は類似の化学的又は物理的特性を有する別のアミノ酸に交換されるアミノ酸置換を含む。例えば、保存的アミノ酸置換は、酸性／負に帯電している極性アミノ酸への、別の酸性／負に帯電している極性アミノ酸（例えば、Ａｓｐ又はＧｌｕ）の置換、非極性側鎖を有するアミノ酸への、別の非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｃｙｓ、Ｖａｌ等）の置換、塩基性／正に帯電している極性アミノ酸への、別の塩基性／正に帯電している極性アミノ酸（例えば、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ等）の置換、極性側鎖を有する非帯電アミノ酸への、別の極性側鎖を有する非帯電アミノ酸（例えば、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ等）の置換、ベータ分枝側鎖を有するアミノ酸への、別のベータ分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、及びＶａｌ）の置換、芳香族側鎖を有するアミノ酸への、別の芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、及びＴｙｒ）の置換等であってよい。
【００３２】
ＣＡＲは、他の構成要素、例えば他のアミノ酸が、機能的変異体の生物活性を実質的に変化させることのないように、本明細書に記載される特定のアミノ酸配列（複数可）から本質的になっていてよい。
【００３３】
本発明の実施形態のＣＡＲ（機能的部分及び機能的変異体を含む）は、ＣＡＲ（又はその機能的部分若しくは機能的変異体）が、その生物活性、例えば、抗原に特異的に結合する能力、哺乳類における罹患細胞を検出する能力、又は哺乳類における疾患を治療若しくは予防する能力等を保持している限り、任意の長さであってよい、すなわち、任意の数のアミノ酸を含んでいてよい。例えば、ＣＡＲは、約５０〜約１０００アミノ酸長、例えば、５０、７０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、又はそれ以上のアミノ酸長であってよい。
【００３４】
本発明の実施形態のＣＡＲ（本発明の機能的部分及び機能的変異体を含む）は、１つ以上の天然に存在するアミノ酸の代わりに合成アミノ酸を含んでいてもよい。このような合成アミノ酸は、当技術分野において公知であり、例えば、アミノシクロヘキサンカルボン酸、ノルロイシン、α−アミノｎ−デカン酸、ホモセリン、Ｓ−アセチルアミノメチル−システイン、トランス−３−及びトランス−４−ヒドロキシプロリン、４−アミノフェニルアラニン、４−ニトロフェニルアラニン、４−クロロフェニルアラニン、４−カルボキシフェニルアラニン、β−フェニルセリンβ−ヒドロキシフェニルアラニン、フェニルグリシン、α−ナフチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、シクロヘキシルグリシン、インドリン−２−カルボン酸、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、アミノマロン酸、アミノマロン酸モノアミド、Ｎ’−ベンジル−Ｎ’−メチル−リジン、Ｎ’，Ｎ’−ジベンジル−リジン、６−ヒドロキシリジン、オルニチン、α−アミノシクロペンタンカルボン酸、α−アミノシクロヘキサンカルボン酸、α−アミノシクロヘプタンカルボン酸、α−（２−アミノ−２−ノルボルナン）−カルボン酸、α，γ−ジアミノ酪酸、α，β−ジアミノプロピオン酸、ホモフェニルアラニン、及びα−ｔｅｒｔ−ブチルグリシンが挙げられる。
【００３５】
本発明の実施形態のＣＡＲ（機能的部分及び機能的変異体を含む）を、グリコシル化、アミド化、カルボキシル化、リン酸化、エステル化、Ｎ−アシル化、例えばジスルフィド結合を介して環化、又は酸付加塩に変換、及び／又は任意で二量体化若しくは多量体化、又はコンジュゲートしてもよい。
【００３６】
本発明の実施形態のＣＡＲ（その機能的部分及び機能的変異体を含む）は、当技術分野において公知の方法によって得ることができる。ＣＡＲは、ポリペプチド又はタンパク質を作製する任意の好適な方法によって作製することができる。例えば、ＣＡＲは、標準的な組み換え法を使用し、本明細書に記載される核酸を使用して組み換え的に生成することができる。例えば、Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ  ２０１２を参照。あるいは、本明細書に記載されるＣＡＲ（その機能的部分及び機能的変異体を含む）は、例えば、Ｓｙｎｐｅｐ（Ｄｕｂｌｉｎ，ＣＡ）、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、及びＭｕｌｔｉｐｌｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）等の会社が商業的に合成することもできる。これに関連して、本発明のＣＡＲは、合成であってよい、組み換えであってよい、単離されていてよい、及び／又は精製されていてよい。
【００３７】
更に、本明細書に記載されるＣＡＲ（その機能的部分及び機能的変異体を含む）のいずれかをコードしているヌクレオチド配列を含む核酸が本発明の実施形態によって提供される。本発明の核酸は、本明細書に記載されるリーダードメイン、ヒンジドメイン、抗原認識ドメイン、ＴＭドメイン、及びＴ細胞活性化ドメインのいずれかをコードしているヌクレオチド配列を含んでいてよい。本発明の実施形態では、核酸は、配列番号２９（ＦＨＶＨ７４−ＣＤ８２８Ｚ）、配列番号３０（ＦＨＶＨ３２−ＣＤ８２８Ｚ）、配列番号３１（ＦＨＶＨ３３−ＣＤ８２８Ｚ）、配列番号３２（ＦＨＶＨ９３−ＣＤ８２８Ｚ）、配列番号３３（ＦＨＶＨ７４−ＣＤ８ＢＢＺ）、配列番号３４（ＦＨＶＨ３２−ＣＤ８ＢＢＺ）、配列番号３５（ＦＨＶＨ３３−ＣＤ８ＢＢＺ）、配列番号３６（ＦＨＶＨ９３−ＣＤ８ＢＢＺ）、配列番号３７（ＦＨＶＨ７４−ＣＤ８ＩＣＯＳＺ）、配列番号３８（ＦＨＶＨ３２−ＣＤ８ＩＣＯＳＺ）、配列番号３９（ＦＨＶＨ３３−ＣＤ８ＩＣＯＳＺ）、及び配列番号４０（ＦＨＶＨ９３−ＣＤ８ＩＣＯＳＺ）のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含んでいてもよく、からなっていてもよく、又はから本質的になっていてもよい。
【００３８】
「核酸」は、本明細書で使用するとき、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、及び「核酸分子」を含み、一般的に、ＤＮＡ又はＲＮＡのポリマーを意味し、これらは、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、合成されても天然のソースから入手（例えば、単離及び／又は精製）されてもよく、天然の、非天然の、又は改変されたヌクレオチドを含有していてもよく、そして、改変されていないオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間にみられるホスホジエステルの代わりに、天然の、非天然の、又は改変されたヌクレオチド間結合、例えば、ホスホロアミデート結合又はホスホロチオエート結合を含有していてもよい。幾つかの実施形態では、核酸は、任意の挿入、欠失、逆位、及び／又は置換を含まない。しかし、幾つかの例では、本明細書における検討の通り、核酸が１つ以上の挿入、欠失、逆位、及び／又は置換を含むことが好適であり得る。
【００３９】
本発明の実施形態の核酸は、組み換えであってもよい。本明細書で使用するとき、用語「組み換え」とは、（ｉ）天然若しくは合成の核酸セグメントを生細胞で複製可能な核酸分子に連結させることによって生細胞の外部で構築される分子、又は（ｉｉ）上記（ｉ）に記載されているものの複製から得られる分子に対して言う。本明細書における目的のために、複製は、インビトロ複製であってもインビボ複製であってもよい。
【００４０】
組み換え核酸は、天然には存在しない配列を有するか、又は組み換えでなければ配列が分離した２つのセグメントの人工的な組み合わせによって作製される配列を有するものであってよい。この人工的な組み合わせは、多くの場合、化学合成によって、又はより一般的には、例えば、Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ、前記に記載されているもの等の遺伝子工学技術によって、核酸の単離されたセグメントを人工的に操作することによって実現される。核酸は、当技術分野において公知の手順を使用して、化学合成及び／又は酵素ライゲーション反応に基づいて構築され得る。例えば、Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ、前記を参照。例えば、核酸は、天然に存在するヌクレオチド、又は分子の生物学的安定性を増大させるか若しくはハイブリダイゼーションの際に形成される二本鎖の物理的安定性を増大させるために設計された様々に改変されたヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート誘導体及びアクリジン置換ヌクレオチド）を使用して、化学的に合成することができる。核酸を作製するために使用することができる改変ヌクレオチドの例としては、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−置換アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、及び２，６−ジアミノプリンが挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、本発明の核酸のうちの１つ以上は、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（Ｆｏｒｔ  Ｃｏｌｌｉｎｓ，ＣＯ）及びＳｙｎｔｈｅｇｅｎ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）等の会社から購入することができる。
【００４１】
核酸は、ＣＡＲ又はその機能的部分若しくは機能的変異体のいずれかをコードしている、任意の単離又は精製されたヌクレオチド配列を含んでいてよい。あるいは、ヌクレオチド配列は、配列のいずれかに縮重しているヌクレオチド配列又は縮重配列の組み合わせを含んでいてもよい。
【００４２】
また、本発明の実施形態は、本明細書に記載される核酸のいずれかのヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列、又は本明細書に記載される核酸のいずれかのヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、単離又は精製された核酸を提供する。
【００４３】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列は、高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる。「高ストリンジェントな条件」とは、ヌクレオチド配列が、非特異的ハイブリダイゼーションよりも検出可能に多い量で、標的配列（本明細書に記載される核酸のいずれかのヌクレオチド配列）に特異的にハイブリダイズすることを意味する。高ストリンジェントな条件は、正確な相補的配列を有するポリヌクレオチド、又は幾つかの散在しているミスマッチしか含有していないものを、該ヌクレオチド配列に一致している幾つかの小さな領域（例えば、３〜１０塩基）を偶然有するランダム配列から識別する条件を含む。このような相補的な小さな領域は、１４〜１７又はそれ以上の塩基の完全長相補体よりも容易に融解し、それらは高ストリンジェントなハイブリダイゼーションによって容易に識別可能になる。比較的高ストリンジェントな条件は、例えば、例えば約５０〜７０℃の温度で約０．０２〜０．１Ｍ  ＮａＣｌ又はその当量によって提供されるもの等の低塩及び／又は高温条件を含む。このような高ストリンジェントな条件は、ヌクレオチド配列とテンプレート又は標的鎖との間の（もし存在するとしても）わずかなミスマッチしか許容せず、本発明のＣＡＲのいずれかの発現を検出するのに特に好適である。一般的に、漸増量のホルムアミドを添加することによって、条件をよりストリンジェントにすることができると理解される。
【００４４】
また、本発明は、本明細書に記載される核酸のいずれかと少なくとも約７０％以上、例えば、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。
【００４５】
実施形態では、本発明の核酸を組み換え発現ベクターに組み込むことができる。これに関連して、本発明の実施形態は、本発明の核酸のいずれかを含む組み換え発現ベクターを提供する。本明細書における目的のために、用語「組み換え発現ベクター」は、コンストラクトがｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含み、宿主細胞内で該ｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドを発現させるのに十分な条件下でベクターを該細胞と接触させるときに、該細胞に該ｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドを発現させる、遺伝的に改変されたオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドのコンストラクトを意味する。本発明のベクターは、全体として天然には存在しない。しかし、ベクターの一部が天然に存在していてもよい。本発明の組み換え発現ベクターは、ＤＮＡ及びＲＮＡが挙げられるがこれらに限定されない任意の種類のヌクレオチドを含んでいてよく、該ＤＮＡ及びＲＮＡは、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、合成されても天然のソースから部分的に入手されてもよく、天然の、非天然の、又は改変されたヌクレオチドを含有していてもよい。組み換え発現ベクターは、天然に存在するか若しくは天然には存在しないヌクレオチド間結合、又は両方の種類の結合を含んでいてよい。好ましくは、天然には存在しないか又は改変されたヌクレオチド又はヌクレオチド間結合は、ベクターの転写も複製も妨げない。
【００４６】
実施形態では、本発明の組み換え発現ベクターは、任意の好適な組み換え発現ベクターであってよく、任意の好適な宿主細胞を形質転換又はトランスフェクトするために使用することができる。好適なベクターとしては、プラスミド及びウイルス等、伝播及び増殖用、若しくは発現用、又は両方のために設計されたものが挙げられる。ベクターは、ｐＵＣシリーズ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｌｅｎ  Ｂｕｒｎｉｅ，ＭＤ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔシリーズ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）、ｐＥＴシリーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ｐＧＥＸシリーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、及びｐＥＸシリーズ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）からなる群から選択され得る。λＧＴ１０、λＧＴ１１、λＺａｐＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、λＥＭＢＬ４、及びλＮＭ１１４９等のバクテリオファージベクターを使用してもよい。植物発現ベクターの例としては、ｐＢＩ０１、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＩ１０１．３、ｐＢＩ１２１、及びｐＢＩＮ１９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられる。動物発現ベクターの例としては、ｐＥＵＫ−Ｃｌ、ｐＭＡＭ、及びｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられる。組み換え発現ベクターは、ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター（例えば、ガンマレトロウイルスベクター）又はレンチウイルスベクターであってよい。
【００４７】
実施形態では、本発明の組み換え発現ベクターは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎ、前記に記載されている標準的な組み換えＤＮＡ技術を使用して調製することができる。円形又は線形である発現ベクターのコンストラクトは、原核又は真核の宿主細胞において機能する複製系を含有するように調製することができる。複製系は、例えば、ＣｏｌＥｌ、２μプラスミド、λ、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルス等に由来していてよい。
【００４８】
組み換え発現ベクターは、例えば、必要に応じて、そして、ベクターがＤＮＡベースであるかＲＮＡベースであるかを考慮して、ベクターが導入される宿主細胞の種類（例えば、細菌、真菌、植物、又は動物）に特異的な、転写の、並びに翻訳の開始及び終止コドン等の、調節配列を含んでいてよい。組み換え発現ベクターは、クローニングを容易にするために制限酵素部位を含んでいてよい。ＣＡＲをコードしている本発明の核酸配列に加えて、組み換え発現ベクターは、好ましくは、宿主細胞において核酸配列を発現させる発現制御配列、例えば、プロモータ、エンハンサ、ポリアデニル化シグナル、転写ターミネータ、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）等を含む。
【００４９】
組み換え発現ベクターは、形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞の選別を可能にする１つ以上のマーカー遺伝子を含んでいてよい。マーカー遺伝子は、殺生物剤耐性、例えば、抗生物質、重金属等に対する耐性、原栄養性を与えるための栄養要求性宿主における相補等を含む。本発明の発現ベクターに好適なマーカー遺伝子は、例えば、ネオマイシン／Ｇ４１８耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ヒスチジノール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、及びアンピシリン耐性遺伝子を含む。
【００５０】
組み換え発現ベクターは、ＣＡＲをコードしているヌクレオチド配列（その機能的部分及び機能的変異体を含む）に、又はＣＡＲをコードしているヌクレオチド配列に相補的であるか若しくはハイブリダイズするヌクレオチド配列に作動可能に連結しているネイティブ又は非ネイティブのプロモータを含んでいてよい。例えば、強い、弱い、誘導性、組織特異的、及び発生段階特異的なプロモータの選別は、当業者の通常の技能の範囲内である。同様に、ヌクレオチド配列とプロモータとの組み合わせも当業者の技能の範囲内である。プロモータは、非ウイルスプロモータであってもよく、ウイルスプロモータ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ、ＳＶ４０プロモータ、ＲＳＶプロモータ、又はマウス幹細胞ウイルスの長鎖末端反復配列にみられるプロモータであってもよい。
【００５１】
本発明の組み換え発現ベクターは、一過的発現用、安定的発現用のいずれか、又は両方のために設計することができる。また、組み換え発現ベクターは、構成的発現用又は誘導性発現用に作製することができる。
【００５２】
更に、組み換え発現ベクターは、自殺遺伝子を含むように作製してもよい。本明細書で使用するとき、用語「自殺遺伝子」とは、自殺遺伝子を発現している細胞を死に至らしめる遺伝子を指す。自殺遺伝子は、該遺伝子が発現する細胞に対して剤、例えば薬物に対する感受性を付与し、そして、該細胞が該剤と接触又は該剤に曝露されるときに該細胞を死に至らしめる遺伝子であってよい。自殺遺伝子は、当技術分野において公知であり、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、シトシンデアミナーゼ、プリンヌクレオチドホスホリラーゼ、及びニトロレダクターゼが挙げられる。
【００５３】
本発明の実施形態は、更に、本明細書に記載される組み換え発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞を提供する。本明細書で使用するとき、用語「宿主細胞」とは、本発明の組み換え発現ベクターを含有し得る任意の種類の細胞を指す。宿主細胞は、真核細胞、例えば、植物、動物、真菌、又は藻類であってもよく、原核細胞、例えば、細菌又は原生動物であってもよい。宿主細胞は、培養細胞又は初代細胞、すなわち、生物、例えばヒトから直接単離された細胞であってよい。宿主細胞は、接着細胞又は懸濁細胞、すなわち、懸濁液中で増殖する細胞であってよい。好適な宿主細胞は、当技術分野において公知であり、例えば、ＤＨ５α大腸菌細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、サルＶＥＲＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ２９３細胞等が挙げられる。組み換え発現ベクターを増幅又は複製する目的のために、宿主細胞は、原核細胞、例えば、ＤＨ５α細胞であってよい。組み換えＣＡＲを生成する目的のために、宿主細胞は、哺乳類細胞であってよい。宿主細胞は、ヒト細胞であってよい。宿主細胞は、任意の細胞種であってよく、任意の種類の組織に由来していてよく、任意の発生段階であってよい。宿主細胞は、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）又は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）であってよい。
【００５４】
本発明の実施形態では、宿主細胞はＴ細胞である。本明細書における目的のために、Ｔ細胞は、任意のＴ細胞、例えば、培養Ｔ細胞、例えば初代Ｔ細胞、又は培養Ｔ細胞株由来のＴ細胞、例えばＪｕｒｋａｔ、ＳｕｐＴ１等、又は哺乳類から得られたＴ細胞であってよい。哺乳類から得られる場合、Ｔ細胞は、血液、骨髄、リンパ節、胸腺、又は他の組織若しくは流体を含むがこれらに限定されない多数のソースから得ることができる。Ｔ細胞は、濃縮又は精製されていてもよい。Ｔ細胞は、ヒトＴ細胞であってよい。Ｔ細胞は、ヒトから単離されたＴ細胞であってよい。Ｔ細胞は、任意の種類のＴ細胞であってよく、任意の発生段階であってよく、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋二重陽性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、例えば、Ｔｈ１及びＴｈ２細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）、腫瘍浸潤細胞、記憶Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞等が挙げられるが、これらに限定されない。Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞又はＣＤ４＋Ｔ細胞であってよい。
【００５５】
本発明の実施形態では、宿主細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。ＮＫ細胞は、先天性免疫系において役割を果たす細胞傷害性リンパ球の種類である。ＮＫ細胞は、大型顆粒リンパ球として定義され、Ｂリンパ球及びＴリンパ球も生じるリンパ球共通前駆細胞から分化する第３の種類の細胞を構成する（例えば、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，９ｔｈ  ｅｄ．，Ｊａｎｅｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（２０１６）を参照）。ＮＫ細胞は、骨髄、リンパ節、脾臓、扁桃腺、及び胸腺で分化し、成熟する。成熟後、ＮＫ細胞は、特徴的な細胞傷害性顆粒を有する大リンパ球として循環血液中に入る。ＮＫ細胞は、幾つかの異常細胞、例えば、幾つかの腫瘍細胞及びウイルス感染細胞等を認識し、殺傷することができ、細胞内病原体に対する先天性免疫防御において重要であると考えられる。Ｔ細胞に関して上記した通り、ＮＫ細胞は、任意のＮＫ細胞、例えば、培養ＮＫ細胞、例えば初代ＮＫ細胞、又は培養ＮＫ細胞株由来のＮＫ細胞、又は哺乳類から得られたＮＫ細胞であってよい。哺乳類から得られる場合、ＮＫ細胞は、血液、骨髄、リンパ節、胸腺、又は他の組織若しくは流体を含むがこれらに限定されない多数のソースから得ることができる。ＮＫ細胞は、濃縮又は精製されていてもよい。ＮＫ細胞は、好ましくは、（例えば、ヒトから単離された）ヒトＮＫ細胞である。ＮＫ細胞株は、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手可能であり、例えば、ＮＫ−９２細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２４０７）、ＮＫ９２ＭＩ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２４０８）、及びこれらの派生物を含む。
【００５６】
また、本明細書に記載される少なくとも１つの宿主細胞を含む細胞の集団が本発明の実施形態によって提供される。細胞の集団は、組み換え発現ベクターのいずれも含まない少なくとも１つの他の細胞、例えば、宿主細胞（例えば、Ｔ細胞）、又はＴ細胞以外の細胞、例えば、Ｂ細胞、マクロファージ、好中球、赤血球、肝細胞、内皮細胞、上皮細胞、筋肉細胞、脳細胞等に加えて、記載される組み換え発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞を含む不均質な集団であってよい。あるいは、細胞の集団は、実質的に均質な集団（該集団が組み換え発現ベクターを含む宿主細胞を主に含む（例えば、から本質的になる））であってよい。また、集団は、該集団の全ての細胞が、組み換え発現ベクターを含む１つの宿主細胞のクローンであり、その結果、該集団の全ての細胞が組み換え発現ベクターを含む、細胞のクローン集団であってもよい。本発明の一実施形態では、細胞の集団は、本明細書に記載される通りの組み換え発現ベクターを含む宿主細胞を含むクローン集団である。
【００５７】
ＣＡＲをコードしている本発明の組み換え発現ベクターは、「トランスフェクション」、「形質転換」、又は「形質導入」によって細胞に導入され得る。「トランスフェクション」、「形質転換」、又は「形質導入」とは、本明細書で使用するとき、物理的又は化学的方法を使用することによって１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入することを指す。多くのトランスフェクション技術が当技術分野において公知であり、例えば、リン酸カルシウムＤＮＡ共沈；ＤＥＡＥ−デキストラン；エレクトロポレーション；カチオン性リポソーム媒介トランスフェクション；タングステン粒子促進性微粒子銃；及びリン酸ストロンチウムＤＮＡ共沈が挙げられる。その多くが市販されている好適なパッケージング細胞において感染粒子を増殖させた後、ファージ又はウイルスのベクターを宿主細胞に導入してよい。
【００５８】
本発明のＣＡＲ（その機能的部分又は変異体のいずれかを含む）、核酸、組み換え発現ベクター、宿主細胞、又は宿主細胞の集団のいずれかを含むコンジュゲート、例えばバイオコンジュゲートは本発明の範囲に含まれる。コンジュゲート、及び一般にコンジュゲートを合成する方法は、当技術分野において公知である。
【００５９】
ＣＡＲ（その機能的部分及び変異体を含む）、核酸、組み換え発現ベクター、及び宿主細胞（その集団を含む）（以後、これらの全てをまとめて「本発明のＣＡＲ材料」と称する」）は、単離及び／又は精製されていてもよい。用語「単離された」は、本明細書で使用するとき、その天然環境から取り出されていることを意味する。用語「精製された」又は「単離された」は、絶対的な純度又は単離を必要とするものではなく、相対的な用語であることを意図する。したがって、例えば、精製された（又は単離された）宿主細胞調製物は、宿主細胞が、体内の天然環境における細胞よりも純粋であるものである。このような宿主細胞は、例えば、標準的な精製技術によって生成され得る。幾つかの実施形態では、宿主細胞の調製物は、該宿主細胞が該調製物の全細胞含有量の少なくとも約５０％、例えば、少なくとも約７０％になるように精製される。例えば、純度は、少なくとも約５０％であってよく、約６０％超、約７０％超、又は約８０％超であってもよく、約１００％であってもよい。
【００６０】
本発明のＣＡＲ材料を組成物、例えば医薬組成物に製剤化してもよい。これに関連して、本発明の実施形態は、ＣＡＲ、機能的部分、機能的変異体、核酸、発現ベクター、又は宿主細胞（その集団を含む）のいずれかと、医薬的に許容し得る担体とを含む医薬組成物を提供する。本発明のＣＡＲ材料のいずれかを含有する本発明の医薬組成物は、１つを超える本発明のＣＡＲ材料、例えば、ＣＡＲ及び核酸、又は２つ以上の異なるＣＡＲを含んでいてもよい。あるいは、医薬組成物は、他の医薬的活性剤又は薬物、例えば、化学療法剤、例えば、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、メトトレキサート、パクリタキセル、リツキシマブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン等と組み合わせて本発明のＣＡＲ材料を含んでいてもよい。好ましい実施形態では、医薬組成物は、本発明の宿主細胞又はその集団を含む。
【００６１】
好ましくは、担体は、医薬的に許容し得る担体である。医薬組成物に関して、担体は、検討中の特定の本発明のＣＡＲ材料に従来使用されているもののいずれかであってよい。このような医薬的に許容し得る担体は、当業者に周知であり、公的に容易に入手可能である。医薬的に許容し得る担体は、使用条件下で有害な副作用も毒性も有しないものであることが好ましい。
【００６２】
担体の選択は、具体的な本発明のＣＡＲ材料によって、及び本発明のＣＡＲ材料を投与するために使用される具体的な方法によって部分的に決定される。好ましい実施形態では、ＣＡＲは、好ましくはＴ細胞又はＮＫ細胞である宿主細胞によって発現され、ＣＡＲを発現している宿主細胞が患者に投与される。これら細胞は、細胞のレシピエントに対して自己又は同種であってよい。ガンマ−レトロウイルス、レンチウイルス、又はトランスポゾン系による形質導入を含むがこれらに限定されない様々な遺伝子改変方法のいずれかによって、ＣＡＲをコードしている核酸を細胞に導入してよい。本発明の医薬組成物の様々な好適な製剤が存在する。好適な製剤は、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腫瘍内、動脈内、くも膜下腔内、又は腹腔内に投与するもののいずれかを含み得る。１つを超える経路を使用して本発明のＣＡＲ材料を投与してもよく、特定の例では、特定の経路が別の経路よりも即時かつ有効な応答を提供し得る。
【００６３】
好ましくは、本発明のＣＡＲ材料は、例えば静脈内に注射することによって投与される。本発明のＣＡＲ材料が、本発明のＣＡＲ（又はその機能的変異体）を発現している宿主細胞であるとき、注射用の細胞のための医薬的に許容し得る担体は、任意の等張担体、例えば、通常生理食塩水（水中約０．９０％ｗ／ｖ  ＮａＣｌ、水中約３００ｍＯｓｍ／Ｌ  ＮａＣｌ、又は水１リットルあたり約９．０ｇ  ＮａＣｌ）、ＮＯＲＭＯＳＯＬ  Ｒ電解質溶液（Ａｂｂｏｔｔ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）、ＰＬＡＳＭＡ−ＬＹＴＥ  Ａ（Ｂａｘｔｅｒ，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）、水中約５％デキストロース、又は乳酸リンゲル液等を含んでいてよい。実施形態では、医薬的に許容し得る担体にヒト血清アルブミンを補給する。
【００６４】
組成物は、本発明の組成物の送達が、治療される部位の感作前にかつ感作させるのに十分な時間行われるように、徐放性、遅延放出性、及び持続放出性の送達系を使用してよい。多くの種類の放出送達系が、入手可能でありかつ当業者に公知である。このような系は、組成物の反復投与を回避し、それによって、被験体及び医師の利便性を増大することができ、本発明の特定の組成物の実施形態に特に好適であり得る。
【００６５】
特定の理論又は機序に束縛されるものではないが、ＢＣＭＡに対する抗原特異的応答を惹起することによって、本発明のＣＡＲが以下のうちの１つ以上を提供すると考えられる：ＢＣＭＡ発現がん細胞を標的とし、破壊すること、がん細胞を低減又は排除すること、免疫細胞の腫瘍部位（複数可）への浸潤を促進すること、及び抗がん応答を増強／延長すること。
【００６６】
哺乳類における疾患、例えばがんを治療又は予防する方法において本発明のＣＡＲ材料を使用できることが企図される。特定の理論又は機序に束縛されるものではないが、本発明のＣＡＲは、生物活性、例えば、ＢＣＭＡ等の抗原を認識する能力を有し、その結果、細胞によって発現されたとき、ＣＡＲは、該ＣＡＲが特異的な抗原、例えばＢＣＭＡを発現している細胞に対する免疫応答を媒介することができる。これに関連して、本発明の実施形態は、哺乳類におけるがんを治療又は予防する方法であって、哺乳類におけるがんを治療又は予防するのに有効な量の、本発明のＣＡＲ、核酸、組み換え発現ベクター、宿主細胞、細胞の集団、及び／又は医薬組成物のいずれかを該哺乳類に投与することを含む方法を提供する。好ましい実施形態では、該方法は、本発明のＣＡＲで形質導入された宿主細胞を哺乳類に注入することを含む。
【００６７】
本明細書に記載される本発明のＢＣＭＡ  ＣＡＲを発現している１つ以上の単離された宿主細胞を、エクスビボ、インビボ、又はインビトロでＢＣＭＡを発現するがん細胞の集団と接触させてよい。「エクスビボ」とは、天然条件からの変更を最小限に抑えた生物外の人工環境における細胞又は組織の内部又は上で実施される方法を指す。対照的に、用語「インビボ」とは、その正常なインタクトな状態における生体内で実施される方法を指し、一方、「インビトロ」法は、その通常の生物学的状況から単離されている生物の構成要素を使用して実施される。本発明の方法は、好ましくは、エクスビボ及びインビボの構成要素を含む。これに関連して、例えば、上記単離された宿主細胞は、本発明の抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲを発現する条件下でエクスビボにおいて培養し、次いで、ＢＣＭＡ陽性がん、例えば、多発性骨髄腫に罹患している哺乳類（好ましくは、ヒト）に直接移入してよい。このような細胞移入法は、当技術分野では「養子細胞移入（ＡＣＴ）」と称され、この方法では、免疫由来細胞をレシピエントに移入して、免疫由来細胞の機能を宿主に移行させる。免疫由来細胞は、レシピエント又は別の個体に由来していてよい。骨髄腫等の血液がんを含む様々な種類のがんを治療するための養子細胞移入法。
【００６８】
本発明のＣＡＲをコードしている核酸配列を発現している宿主細胞を含む組成物又は本発明のＣＡＲをコードしている核酸配列を含むベクターを哺乳類（例えば、ヒト）に投与したら、当技術分野において公知の任意の好適な方法によってＣＡＲの生物活性を測定することができる。本発明の方法によれば、ＣＡＲががんにおけるＢＣＭＡに結合し、がん細胞が破壊される。がん細胞の表面上のＢＣＭＡへのＣＡＲの結合は、例えば、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定吸着法）及びフローサイトメトリーを含む、当技術分野において公知の任意の好適な方法を使用してアッセイすることができる。ＣＡＲの細胞（ｃｅｌｌｓ  ｃｅｌｌｓ）を破壊する能力は、例えば、Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，３２（７）：６８９−７０２（２００９）及びＨｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２８５（１）：２５−４０（２００４）に記載されている細胞傷害性アッセイ等の、当技術分野において公知の任意の好適な方法を使用して測定することができる。ＣＡＲの生物活性は、ＣＤ１０７ａ、ＩＦＮγ、ＩＬ−２、及びＴＮＦ等の特定のサイトカインの発現をアッセイすることによって測定することもできる。
【００６９】
本発明の実施形態は、更に、本発明のＣＡＲ材料を投与する前に哺乳類をリンパ球枯渇させることを含む。リンパ球枯渇の例としては、骨髄非破壊的リンパ球枯渇化学療法、骨髄破壊的リンパ球枯渇化学療法、全身照射等が挙げられるが、これらに限定されない場合がある。
【００７０】
宿主細胞又は細胞の集団が投与される本発明の方法の目的のために、細胞は、哺乳類に対して同種又は自己である細胞であってよい。好ましくは、細胞は、哺乳類に対して自己である。
【００７１】
「有効量」又は「治療に有効な量」とは、個体におけるがんを予防又は治療するのに適切な用量を指す。治療的又は予防的使用に有効な量は、例えば、治療される疾患又は障害の段階及び重篤度、患者の年齢、体重、及び一般的健康状態、並びに処方する医師の判断に依存する。用量のサイズは、選択される具体的なＣＡＲ材料、投与方法、投与のタイミング及び頻度、特定のＣＡＲ材料の投与に付随し得る任意の有害な副作用の存在、性質、及び程度、並びに所望の生理学的効果によっても決定される。様々な疾患又は障害（例えば、がん）には、恐らくそれぞれの又は様々な投与ラウンドにおいて本発明のＣＡＲ材料を使用する複数回の投与を含む長期治療が必要となる場合があることを当業者であれば理解する。一例として、本発明を限定することを意図するものではないが、本発明のＣＡＲ材料の用量は、約０．００１〜約１０００ｍｇ／ｋｇ（治療される被験体の体重）／日、約０．０１〜約１０ｍｇ／ｋｇ（体重）／日、約０．０１〜約１ｍｇ／ｋｇ（体重）／日であってよい。本発明の実施形態では、用量は、体重１ｋｇあたり本発明のＣＡＲを発現している細胞約１×１０４〜約１×１０１０個であってよい。本発明のＣＡＲ材料が宿主細胞であるとき、宿主細胞の例示的な用量は、最低１００万個の細胞（１ｍｇ細胞／投与）、例えば、体重１ｋｇあたり１×１０９個の細胞であってよい。本発明のＣＡＲ材料がウイルスにパッケージ化された核酸であるとき、ウイルスの例示的な用量は１ｎｇ／投与であってよい。
【００７２】
本発明の目的のために、投与される本発明のＣＡＲ材料の量又は用量は、適切な時間枠にわたって被験体又は動物において治療的又は予防的応答をもたらすのに十分でなければならない。例えば、本発明のＣＡＲ材料の用量は、投与時点から約２時間以上、例えば、約１２〜約２４時間又はそれ以上の期間、抗原に結合するか又は疾患、例えばがんを検出、治療、若しくは予防するのに十分でなければならない。特定の実施形態では、期間は更に長くてもよい。用量は、具体的な本発明のＣＡＲ材料の有効性及び動物（例えば、ヒト）の状態、並びに治療される動物（例えば、ヒト）の体重によって決定される。
【００７３】
本発明の目的のために、例えば、Ｔ細胞の種々の用量がそれぞれ与えられる１組の哺乳動物間で、哺乳動物への、そのようなＴ細胞のある特定の用量の投与の際に、本発明のＣＡＲを発現するＴ細胞により標的細胞が溶解され及び／又はＩＦＮ−γが分泌される程度を比較することを含むアッセイが、哺乳動物に投与する開始用量を決定するために用いられ得る。特定の用量の投与の際に標的細胞が溶解する及び／又はＩＦＮ−γが分泌される程度は、当技術分野において公知の方法によってアッセイすることができる。
【００７４】
本発明のＣＡＲ材料を１つ以上の追加の治療剤と共に投与するとき、１つ以上の追加の治療剤を哺乳類に共投与してもよい。「共投与」とは、１つ以上の追加の治療剤及び本発明のＣＡＲ材料の投与が、本発明のＣＡＲ材料が１つ以上の追加の治療剤の効果を増強することができ、逆もまた同様であるような十分に近い時間内に行われることを意味する。これに関連して、本発明のＣＡＲ材料を最初に投与し、１つ以上の追加の治療剤を２番目に投与してよく、逆もまた同様である。あるいは、本発明のＣＡＲ材料及び１つ以上の追加の治療剤を同時に投与してよい。ＣＡＲ材料と共投与し得る例示的な治療剤は、ＩＬ−２である。ＩＬ−２は本発明のＣＡＲ材料の治療効果を増強すると考えられる。特定の理論又は機序に束縛されるものではないが、ＩＬ−２は、本発明のＣＡＲを発現している細胞の数のインビボ増大を増強することによって治療を増強すると考えられる。
【００７５】
本明細書で参照される哺乳類は、任意の哺乳類であってよい。本明細書で使用するとき、用語「哺乳類」とは、げっ歯目の哺乳類、例えばマウス及びハムスター、並びにウサギ目の哺乳類、例えばウサギを含むがこれらに限定されない任意の哺乳類を指す。哺乳類は、ネコ科動物（ネコ）及びイヌ科動物（イヌ）を含むネコ目の哺乳類であってもよい。哺乳類は、ウシ及びブタを含む偶蹄目、又はウマを含む奇蹄目（Ｐｅｒｓｓｏｄａｃｔｙｌａ）の哺乳類であってもよい。哺乳類は、霊長目、サル目（Ｃｅｂｏｉｄｓ又はＳｉｍｏｉｄｓ）（サル）、又は真猿亜目（ヒト及び類人猿）の哺乳類であってもよい。好ましくは、哺乳類は、ヒトである。
【００７６】
本発明の方法に関して、がんは、任意のがんであってよい。本発明の実施形態では、がんは、ＢＣＭＡ発現がんである。本発明の実施形態では、がんは、多発性骨髄腫又はホジキンリンパ腫である。
【００７７】
本明細書における検討の通り、形質細胞性骨髄腫又はカーラー病としても知られている多発性骨髄腫は、通常抗体の生成に関与する白血球の一種である形質細胞のがんである（Ｒａａｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，３７４：３２４−３２９（２００９））。多発性骨髄腫には、１年間に１００，０００人あたり１〜４人が罹患する。この疾患は、男性により多く、理由については未だ分かっていないが、コーカサス系アメリカ人よりもアフリカ系アメリカ人において２倍多い。多発性骨髄腫は、最も少ない血液悪性腫瘍（１４％）であり、全てのがんの１％を構成している（Ｒａａｂら、前記）。多発性骨髄腫の治療は、典型的には、高用量化学療法に続いて、造血幹細胞移植（同種又は自己）を含むが、このような治療を受けている多発性骨髄腫患者では通常再発率が高い。上記検討の通り、ＢＣＭＡは、多発性骨髄腫細胞によって高発現される（例えば、Ｎｏｖａｋら、前記；Ｎｅｒｉら、前記；Ｂｅｌｌｕｃｃｉら、前記；及びＭｏｒｅａｕｘら、前記）。
【００７８】
ホジキンリンパ腫（以前はホジキン病として知られていた）は、リード・スタンバーグ細胞と呼ばれる多核細胞型の存在を特徴とする免疫系のがんである。ホジキンリンパ腫の２つの主な種類は、古典的ホジキンリンパ腫及び結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫を含む。現在、ホジキンリンパ腫は、放射線療法、化学療法、又は造血幹細胞移植で治療され、治療法の選択は、患者の年齢及び性別、並びに疾患の段階、容積、及び組織学的亜型に依存する。ＢＣＭＡ発現は、ホジキンリンパ腫細胞の表面上で検出されている（例えば、Ｃｈｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０９（２）：７２９−７３９（２００７）を参照）。
【００７９】
用語「治療する」及び「予防する」、並びにそれから派生する語は、本明細書で使用するとき、必ずしも１００％、すなわち、完全な治療又は予防を意味するものではない。どちらかといえば、当業者が潜在的な利点又は治療効果を有すると認識する、様々な程度の治療又は予防が存在する。これに関連して、本発明の方法は、哺乳類における任意の量の任意のレベルのがんの治療又は予防を提供することができる。更に、本発明の方法によって提供される治療又は予防は、治療又は予防される疾患、例えばがんの１つ以上の状態又は症状の治療又は予防を含み得る。また、本明細書における目的のために、「予防」は、疾患、例えばがん又はその症状若しくは状態の発生を遅らせることを包含し得る。
【００８０】
本発明の別の実施形態は、哺乳類におけるがんを治療又は予防する方法において使用するための、本発明の他の態様に関連して本明細書に記載されるＣＡＲ、核酸、組み換え発現ベクター、宿主細胞、細胞の集団、及び／又は医薬組成物のいずれかを提供する。本発明の更に別の実施形態は、哺乳類におけるがんを治療又は予防するための医薬の製造における、本発明の他の態様に関連して本明細書に記載されるＣＡＲ、核酸、組み換え発現ベクター、宿主細胞、細胞の集団、及び／又は医薬組成物のいずれかの使用を提供する。がんは、本明細書に記載されるがんのいずれであってもよい。
【００８１】
以下の実施例は、本発明を更に説明するが、無論、いかなる方法でもその範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【実施例】
【００８２】
実施例１〜１０で使用される材料及び方法を以下に提供する。
【００８３】
細胞株及び初代細胞
多発性骨髄腫ＢＣＭＡ＋細胞株Ｈ９２９、Ｕ２６６、及びＲＰＭＩ８２２６は、ＡＴＣＣから入手した。ＢＣＭＡ陰性肺がん細胞株Ａ５４９は、ＡＴＣＣから入手した。ＢＣＭＡ陰性肉腫細胞株は、ＡＴＣＣから入手した。
【００８４】
以下の実験前に研究室において、ＡＴＣＣから入手したＢＣＭＡ−Ｋ５６２及びＫ５６２の細胞に完全長ＢＣＭＡの遺伝子を形質導入した。以下の実験前に研究室において、ＮＧＦＲ−Ｋ５６２及びＫ５６２の細胞に低親和性神経成長因子の遺伝子を形質導入した。同じガンマレトロウイルスベクター及び方法を使用して、ＢＣＭＡ−Ｋ５６２及びＮＧＦＲ−Ｋ５６２の細胞を形質導入した。
【００８５】
多発性骨髄腫の６人の患者由来の組織サンプル又は末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）を骨髄腫患者１〜６と命名した。骨髄腫の３人の被験体由来のＰＢＭＣを使用し、ドナーをドナーＡ、ドナーＢ、及びドナーＣと命名した。３人の健常ドナー由来の初代ＣＤ３４＋造血細胞も入手した。使用したヒトサンプルは全て、米国国立がん研究所における施設内審査委員会によって承認された臨床試験に登録した患者から入手した。
【００８６】
完全ヒト重鎖のみ（ＦＨＶＨ）ＣＡＲの構築
完全ヒト重鎖のみ抗原認識（ＦＨＶＨ）ドメインを含有している一連のＣＡＲを調製した。各ＣＡＲの配列は、５’末端から３’末端に向かって、このパターンに従っていた：ＣＤ８αリーダー配列、４つの単一重鎖可変領域ドメインのうちの１つ、並びにヒトＣＤ８α分子のヒンジ及び膜貫通領域。次いで、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、又は誘導性Ｔ細胞共刺激（ＩＣＯＳ）分子のいずれかの細胞質部分を付加し、続いて、ＣＤ３ζ分子の細胞質部分を付加した。これらＣＡＲの完全アミノ酸配列を配列番号１７〜２８に提供する。
【００８７】
図１Ａ〜１Ｌに示す通り、４つの完全ヒト重鎖のみＣＡＲ抗原認識ドメインを、ＦＨＶＨ７４、３２、３３、及び９３と命名した。また、ＣＡＲの名称は、ＣＤ８αのヒンジ及び膜貫通ドメイン、含まれる共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζドメインも含む。例えば、ＦＨＶＨ７４−ＣＤ８２８Ｚは、ＦＨＶＨ７４抗原認識ドメイン、ＣＤ８α由来のヒンジ及び膜貫通ドメイン、ＣＤ２８共刺激ドメイン、並びにＣＤ３ζＴ細胞活性化ドメインを有する。１１Ｄ５−３−ＣＤ８２８Ｚ抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲをポジティブコントロールとして使用した。
【００８８】
これらＣＡＲを構築し、標準的な方法によってＣＡＲヌクレオチド配列をＭＳＧＶガンマレトロウイルスベクター骨格にライゲーションした。ＣＡＲの完全ヌクレオチド配列を配列番号２９〜４０に提供する。ＢＣＭＡ特異的可変重鎖配列をＧＢＬＯＣＫ断片（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ），Ｓｋｏｋｉｅ，ＩＬ）として合成した。各合成された断片は、ＧＴＣトリヌクレオチド、Ｎｃｏｌ部位、ＣＤ８αリーダー配列、ＦＨＶＨ配列、ＣＤ８αのヒンジ及び膜貫通ドメインの一部、Ｂｌｐｌ部位、並びにＴＡＴＣＧＴヘキサヌクレオチドを含有していた（配列番号４１として提供）。Ｎｃｏｌ及びＢｌｐｌによる完璧な末端切断を保証するために、ＧＴＣ及びＴＡＴＣＧＴ（配列番号４１）ヌクレオチドを付加した。断片を３７℃で２時間Ｂｌｐｌ及びＮＣＯＩ−ＨＦ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）で切断した。次いで、切断された断片を、ＱＩＡＱＵＩＣＫ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。ＧＢＬＯＣＫ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ），Ｓｋｏｋｉｅ，ＩＬ）断片に含まれないＣＡＲの他の構成要素も含む、Ｂｌｐｌ／Ｎｃｏｌ−ＨＦ消化され、ゲル精製されたＭＳＧＶベクター骨格に断片をライゲーションした。
【００８９】
ＭＳＧＶベクター骨格に含まれるＣＡＲ構成要素は、ＧＢＬＯＣＫ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ），Ｓｋｏｋｉｅ，ＩＬ）断片に含まれていなかったＣＤ８αドメインの残り、ＣＤ２８又は４−１ＢＢ又はＩＣＯＳのいずれかの共刺激ドメインをコードしている配列、及びＣＤ３ζドメインであった。Ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用することによって、各ＧＢＬＯＣＫ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ），Ｓｋｏｋｉｅ，ＩＬ）ＣＡＲ断片及びＭＳＧＶベクター骨格断片のライゲーションを実施した。
【００９０】
Ｔ細胞におけるＣＡＲ検出
ＣＡＲベクターのうちの１つを形質導入したＴ細胞及び形質導入していないＴ細胞を洗浄し、細胞表面ＣＡＲ分子を検出するためにフィコエリトリンで標識されたＢＣＭＡ−Ｆｃタンパク質で染色した。５０万個のＴ細胞を染色バッファ５０ｍＬに懸濁させ、力価測定された量のＢＣＭＡ−Ｆｃ−ＰＥ試薬を添加した。また、標準的な方法を使用することによって、ＣＤ３、ＣＤ４、及びＣＤ８の染色も実施した。７−ＡＡＤ（７−アミノ−アシノマイシン色素、（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））を使用することによって死細胞を取り除いた。
【００９１】
Ｔ細胞の培養
ＰＢＭＣを解凍し、ＡＩＭ  Ｖ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）＋５％ＡＢ血清（Ｖａｌｌｅｙ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｗｉｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＶＡ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有しているＴ細胞培地で洗浄した。形質導入前に、Ｔ細胞培地＋５０ｎｇ／ｍＬ抗ＣＤ３モノクローナル抗体ＯＫＴ３（Ｏｒｔｈｏ，Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，ＮＪ）及び３００ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ−２中１×１０６細胞／ｍＬの濃度でＰＢＭＣを懸濁させた。形質導入後、Ｔ細胞をＴ細胞培地＋ＩＬ−２中で維持した。
【００９２】
ガンマレトロウイルスの形質導入
複製能力のないガンマレトロウイルスを生成するために、ＲＤ１１４エンベロープタンパク質をコードしているプラスミドと共にＣＡＲをコードしているプラスミドをパッケージング細胞にトランスフェクトした。Ｔ細胞培養開始の２日間後に、Ｔ細胞のガンマレトロウイルス形質導入を実施した。
【００９３】
インターフェロン−γ及び腫瘍壊死因子アルファのＥＬＩＳＡ
１０万個のＢＣＭＡ＋又はＢＣＭＡ陰性標的細胞を、９６ウェル丸底プレートのデュープリケートのウェルにおいて、ＡＩＭ−Ｖ培地＋５％ヒト血清２００μＬ中で１００，０００個のＣＡＲ形質導入Ｔ細胞と混合した。該プレートを３７℃で１８〜２０時間インキュベートした。インキュベーション後、標準的な方法（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、インターフェロンガンマ（ＩＮＦγ）についてのＥＬＩＳＡを実施した。標準的な方法（Ｒ＆Ｄ）を使用して腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ）のＥＬＩＳＡを実施した。
【００９４】
ＣＤ１０７ａアッセイ
試験した各Ｔ細胞培養物につき、２本のチューブを準備した。一方のチューブはＢＣＭＡ−Ｋ５６２細胞を含有し、他方のチューブはＮＧＦＲ−Ｋ５６２細胞を含有していた。両チューブは、ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞、ＡＩＭ−Ｖ培地＋５％ヒトＡＢ血清１ｍＬ、力価測定された濃度の抗ＣＤ１０７ａ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、クローンｅＢｉｏＨ４Ａ３）、及びＧＯＬＧＩ  ＳＴＯＰ（ｍｏｎｅｓｉｎ，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）１μＬを含有していた。全てのチューブを３７℃で４時間インキュベートし、次いで、ＣＤ３、ＣＤ４、及びＣＤ８について染色した。
【００９５】
フローサイトメトリー
抗ＢＣＭＡ染色のために、ポリクローナルビオチン標識ヤギ抗ヒト（ａｎｔ−ｈｕｍａｎ）ＢＣＭＡ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＢＡＦ  １９３）、続いて、ストレプトアビジン（ＢＤ）で細胞を染色した。また、骨髄細胞を抗ＣＤ３８（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で染色した。また、骨髄細胞を抗ＣＤ３８（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及び抗ＣＤ５６（ＢＤ）で染色した。ＦＬＯＷＪＯソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ．Ｏｒｅｇｏｎ，ＵＳ）を使用して、全ての実験のフローサイトメトリー分析を実施した。
【００９６】
増殖アッセイ
２４ウェルプレートに共培養物を構成した。共培養物に含められた標的細胞は、０．５×１０６個の放射線照射されたＢＣＭＡ−Ｋ５６２細胞又は０．５×１０６個の放射線照射されたＮＧＦＲ−Ｋ５６２細胞のいずれかであった。共培養物は、抗ｂｃｍａ２又はＳＰ６のいずれかが形質導入された培養物由来のＴ細胞も１×１０６個含んでいた。既に記載した通り、カルボキシフルオレセイン二酢酸サクシニミジルエステル（ＣＦＳＥ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でＴ細胞を標識した。共培養で使用した培地は、ＡＩＭ  Ｖ＋５％ヒトＡＢ血清であった。ＩＬ−２は培地に添加しなかった。開始の４日間後、各共培養物中の生細胞を、死細胞を除外するためのトリパンブルーでカウントし、フローサイトメトリーを実施した。
【００９７】
細胞傷害性アッセイ
ネガティブコントロールであるＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞の生存に対してＢＣＭＡ＋標的細胞の生存を比較することによって、細胞傷害性を測定した。これら細胞型の両方を、ＣＡＲを形質導入したＴ細胞と同じチューブ内で混合した。ＣＣＲＦ−ＣＥＭネガティブコントロール細胞を蛍光色素５−（及び６）−（（（４−クロロメチル）ベンゾイル）アミノ）テトラメチルローダミン（ＣＭＴＭＲ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識し、ＢＣＭＡ＋標的細胞をＣＦＳＥで標識した。共培養物を、複数のＴ細胞対標的細胞比で、５ｍＬの滅菌試験管（ＢＤ）内にデュープリケートで構成した。５０，０００個のＣＣＲＦ−ＣＥＭネガティブコントロール細胞と共に、該管に含有されていた標的細胞は、５０，０００個のＢＣＭＡ＋標的細胞であった。培養物を３７℃で４時間インキュベートした。インキュベートした直後、７ＡＡＤ（７−アミノ−アクチノマイシンＤ）（ＢＤ）を添加し、フローサイトメトリー取得を実施した。各Ｔ細胞＋標的細胞培養物について、生存ＢＣＭＡ＋細胞の百分率を生存ＣＣＲＦ−ＣＥＭネガティブコントロール細胞の百分率で除すことによって、ＢＣＭＡ＋標的細胞の生存率を求めた。各Ｔ細胞＋標的細胞培養物中のＢＣＭＡ＋標的細胞の生存率を、エフェクタＴ細胞を含まずＢＣＭＡ＋標的細胞及びＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞のみを含有するチューブ内における生存ＢＣＭＡ＋標的細胞の百分率の生存ＣＣＲＦ−ＣＥＭネガティブコントロール細胞の百分率に対する比で除すことによって、補正されたＢＣＭＡ＋標的細胞の生存率を計算した。この補正は、出発細胞数におけるばらつき及び標的細胞の自然死を説明するために必要であった。細胞傷害性を以下の通り計算した：ＢＣＭＡ＋標的細胞の細胞傷害率＝１００−補正されたＢＣＭＡ＋標的細胞の生存率。
【００９８】
インビボにおけるマウスモデル処理実験
Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手したＮＳＧマウス（ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）を使用した。マウスにＲＰＭＩ８２２６細胞を皮内注射した。腫瘍を１０日間成長させた。次いで、実施例９（図９Ｂ〜９Ｃ）又は実施例１０に記載の用量の、実施例９（図９Ｂ〜９Ｃ）若しくは実施例１０で表示したＣＡＲを形質導入した又は形質導入しなかったヒトＴ細胞をマウスに静脈内注入した。３日毎にカリパスで腫瘍を測定した。最も長い長さ及び該最も長い長さに垂直な長さを乗じて、腫瘍サイズ（面積）（ｍｍ２）を得た。最も長い長さが１５ｍｍに達したとき、マウスを屠殺した。動物実験は、米国国立がん研究所の動物実験委員会によって承認された。
【００９９】
実施例１
この実施例は、重鎖のみ抗原認識ドメインを有するＣＡＲの設計を示す。
【０１００】
図１Ａ〜１Ｌに示す通り、完全ヒト重鎖のみ抗原認識ドメインを有する１２個のＣＡＲを設計した。これらＣＡＲの一般的な設計は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＣＤ８ａリーダー配列、完全ヒト重鎖可変領域、ＣＤ８ａのヒンジ及び膜貫通ドメイン、３つの共刺激ドメインのうちの１つの細胞質部分、ＣＤ３ζ活性化ドメインの細胞質部分を含む。試験した３つの共刺激ドメインは、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、及び誘導性Ｔ細胞共刺激（ＩＣＯＳ）であった。この実施例は、重鎖のみ抗原認識ドメインを有すると報告される最初のＣＡＲを示す。
【０１０１】
実施例２
この実施例は、重鎖のみＣＡＲがＴ細胞の表面上で発現したことを示す。
【０１０２】
実験を実施するために、多発性骨髄腫（ＭＭ）患者由来の初代ヒトＴ細胞に、図２に示す重鎖のみＣＡＲを形質導入した。ＢＣＭＡ−Ｆｃ試薬で細胞を染色し、続いて、フローサイトメトリーを行うことによって、ＣＡＲ表面発現を評価した（図２）。図２に示す通り、４つのＦＨＶＨ  ＣＡＲは全てＴ細胞の表面上で構成的に発現した。理由は分からないが、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の両方を含有する１１Ｄ５−３−ＣＤ８２８Ｚ対照ＣＡＲでは染色の中央蛍光強度が若干高かった。
【０１０３】
実施例３
この実施例は、重鎖のみＣＡＲがＢＣＭＡ特異的に脱顆粒したことを示す。
【０１０４】
図３に示す４つのＦＨＶＨ  ＣＡＲのそれぞれ及び１１Ｄ５−３−ＣＤ８２８Ｚ  ＣＡＲを発現しているＴ細胞のＢＣＭＡ特異的脱顆粒を測定した。図３に示す通り、各ＦＨＶＨ  ＣＡＲを形質導入したＴ細胞は、ＢＣＭＡ発現標的細胞による刺激に応答してＣＤ１０７ａを特異的にアップレギュレートしたが、ＢＣＭＡ陰性標的細胞ではアップレギュレートしなかった。１１Ｄ５−３を発現しているＴ細胞もＣＤ１０７ａをアップレギュレートした（図３）。ＣＤ１０７ａのアップレギュレーションは、パーフォリン媒介細胞傷害プロセスの一部である、Ｔ細胞のＢＣＭＡ特異的脱顆粒を示す。
【０１０５】
実施例４
この実施例は、重鎖のみＣＡＲを発現しているＴ細胞がＢＣＭＡ特異的にサイトカインを放出したことを示す。
【０１０６】
インビトロで様々な標的細胞株と共に培養したときにインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）及び腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ）を放出する能力について、ＭＭ患者由来の初代ヒトＴ細胞を評価した。表１〜３に示す全てのＦＨＶＨ  ＣＡＲは、それぞれ表１〜３に記載の通り、高度にＢＣＭＡ特異的にこれらサイトカインを放出することが見出された。
【０１０７】
【表２】
2020529841.tif 000003
【０１０８】
表１を参照すると、培養したＴ細胞に表示したＣＡＲを形質導入し、表示した標的細胞（最上行）と共に一晩培養した。一晩インキュベートした後、培養上清に対して標準的なＥＬＩＳＡアッセイを実施した。ＢＣＭＡ−Ｋ５６２及びＲＰＭＩ８２２６は、ＢＣＭＡ＋である。ＮＧＦＲ−Ｋ５６２、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、及び２９３ＧＰは、ＢＣＭＡ陰性である。ＢＣＭＡ−Ｆｃ−ＰＥ試薬で染色し、続いて、フローサイトメトリーを行うことによって、表示したＣＡＲを発現しているＴ細胞の百分率を求めた。％ＣＡＲ＋は、ＢＣＭＡ−Ｆｃ−ＰＥ試薬で染色された各ＣＡＲが形質導入されたＣＤ３＋細胞の百分率から、ＢＣＭＡ−Ｆｃ−ＰＥ試薬で染色された非形質導入ＣＤ３＋リンパ球の百分率を減じたものに等しい。％ＣＡＲ＋の列を除いて、全ての数字はインターフェロンガンマのｐｇ／ｍＬである。
【０１０９】
【表３】
2020529841.tif 000004
【０１１０】
表２を参照すると、培養したＴ細胞に表示したＣＡＲを形質導入し、表示した標的細胞（最上行）と共に一晩培養した。一晩インキュベートした後、培養上清に対して標準的なＥＬＩＳＡアッセイを実施した。ＢＣＭＡ−Ｋ５６２は、ＢＣＭＡ＋である。全ての他の標的は、ＢＣＭＡ陰性である。ＢＣＭＡ−Ｆｃ−ＰＥ試薬で染色し、続いて、フローサイトメトリーを行うことによって、表示したＣＡＲを発現しているＴ細胞の百分率を求めた。％ＣＡＲ＋は、ＢＣＭＡ−Ｆｃ−ＰＥ試薬で染色された各ＣＡＲが形質導入されたＣＤ３＋細胞の百分率から、ＢＣＭＡ−Ｆｃ−ＰＥ試薬で染色された非形質導入ＣＤ３＋リンパ球の百分率を減じたものに等しい。％ＣＡＲ＋の列を除いて、全ての数字はインターフェロンガンマのｐｇ／ｍＬである。
【０１１１】
表１及び２の結果は、表示した（ｉｎｄｉｃｔｅｄ）ＣＡＲがＢＣＭＡ＋標的細胞を特異的に認識することを示す。
【０１１２】
【表４】
2020529841.tif 000005
【０１１３】
表３を参照すると、培養したＴ細胞に表示したＣＡＲを形質導入し、表示した標的細胞（最上行）と共に一晩培養した。一晩インキュベートした後、培養上清に対して標準的なＥＬＩＳＡアッセイを実施した。ＢＣＭＡ−Ｋ５６２は、ＢＣＭＡ＋である。全ての他の標的は、ＢＣＭＡ陰性である。ＢＣＭＡ−Ｆｃ−ＰＥ試薬で染色し、続いて、フローサイトメトリーを行うことによって、表示したＣＡＲを発現しているＴ細胞の百分率を求めた。％ＣＡＲ＋は、ＢＣＭＡ−Ｆｃ−ＰＥ試薬で染色された各ＣＡＲが形質導入されたＣＤ３＋細胞の百分率から、ＢＣＭＡ−Ｆｃ−ＰＥ試薬で染色された非形質導入ＣＤ３＋リンパ球の百分率を減じたものに等しい。％ＣＡＲ＋の列を除いて、全ての数はインターフェロンガンマのｐｇ／ｍＬである。
【０１１４】
表３の結果は、ＦＨＶＨ−ＣＤ８２８Ｚ又はＦＨＶＨ−ＣＤ８２８Ｚを発現しているＴ細胞がＢＣＭＡ＋標的細胞を特異的に認識することを示す。
【０１１５】
実施例５
この実施例は、重鎖のみＣＡＲを発現しているＴ細胞がインビトロにおいてＢＣＭＡ特異的に増殖したことを示す。
【０１１６】
ＭＭ患者由来のＣＦＳＥで標識されたＣＡＲを発現している初代Ｔ細胞を、放射線照射されたＢＣＭＡ＋又はＢＣＭＡ陰性標的細胞と共に培養した。図４Ｂ〜４Ｅに示す通り、図４Ｂ〜４Ｅに示す４つのＦＨＶＨ  ＣＡＲは全てＢＣＭＡ特異的に増殖した。１１Ｄ５−３−ＣＤ８２８Ｚ  ＣＡＲを発現しているＴ細胞もＢＣＭＡ特異的に増殖した（図４Ａ）。ＣＦＳＥの希釈によってＢＣＭＡ特異的増殖を考証することに加えて、ＢＣＭＡ特異的増殖は、ＢＣＭＡ＋標的細胞と共に培養したＣＡＲ発現Ｔ細胞の絶対数の増加によっても実証された。図４Ｆに示す通り、Ｔ細胞をＢＣＭＡ＋標的細胞と共に培養したときにＣＡＲ＋Ｔ細胞の絶対数が増加した。
【０１１７】
実施例６
この実施例は、重鎖のみＣＡＲを発現しているＴ細胞がＢＣＭＡ＋標的細胞を殺傷することを示す。
【０１１８】
ＦＨＶＨ  ＣＡＲ  Ｔ細胞のＢＣＭＡ＋標的細胞を殺傷する能力を評価した。図５Ａ及び５Ｂに示す通り、ＵＴ細胞と比較して、ＦＨＶＨ３３−ＣＤ８２８Ｚ及びＦＨＶＨ３３−ＣＤ８ＢＢＺがＢＣＭＡ＋ＲＰＭＩ２２６細胞を殺傷する能力を有することが示された。
【０１１９】
実施例７
この実施例は、４−１ＢＢ共刺激ドメインを有する重鎖のみＣＡＲが発現し、機能することを示す。
【０１２０】
４−１ＢＢ共刺激ドメインを有する、図６に示す４つの完全ヒト重鎖のみＣＡＲを構築し、評価した。これらＣＡＲの４つ全てが初代ヒトＴ細胞の表面上で発現したが、ＦＨＶＨ３３−ＣＤ８ＢＢＺが一貫して最も高い発現を有した（図６）ので、更なる試験のために選択した。ＦＨＶＨ３３−ＣＤ８ＢＢＺの機能的評価から得られた結果を図７Ａ〜７Ｆに示す。これらＣＡＲ発現Ｔ細胞は、ＢＣＭＡ特異的にＩＦＮγを生成し、脱顆粒した。
【０１２１】
実施例８
この実施例は、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲを形質導入したＴ細胞が初代多発性骨髄腫細胞を認識することを示す。
【０１２２】
形質導入されていないか、又はＦＨＶＨ３３−ＣＤ８２８Ｚ若しくはＦＨＶＨ３３−ＣＤ８ＢＢＺ  ＣＡＲを発現しているかのいずれかのＴ細胞を、自己骨髄骨髄腫細胞（純度９０％）と共に４時間インキュベートした。ＣＤ１０７ａのアップレギュレーションをＴ細胞脱顆粒のマーカーとして測定し、ＣＤ８又はＣＤ４の共発現についても測定した。表示した表現型を有する細胞の百分率を表４に示す。表４に示す通り、ＦＨＶＨ３３−ＣＤ８２８Ｚ又はＦＨＶＨ３３−ＣＤ８ＢＢＺ  ＣＡＲが形質導入されたＴ細胞は、標的骨髄骨髄腫細胞と共に共培養された後、ＣＤ１０７ａ発現をアップレギュレートした。
【０１２３】
【表５】
2020529841.tif 000006
【０１２４】
形質導入されていない（ＵＴ）か、又はＦＨＶＨ３３−ＣＤ８２８Ｚ若しくはＦＨＶＨ３３−ＣＤ８ＢＢＺ  ＣＡＲを発現しているかのいずれかのＴ細胞を、自己骨髄骨髄腫細胞（純度９０％）又は対照ＰＢＭＣと共に一晩インキュベートした。標準的なＥＬＩＳＡアッセイを使用して、インターフェロンガンマ放出を測定した。結果を図８に示す。図８に示す通り、ＦＨＶＨ３３−ＣＤ８２８Ｚ又はＦＨＶＨ３３−ＣＤ８ＢＢＺ  ＣＡＲが形質導入された細胞は、標的骨髄骨髄腫細胞と共に共培養された後、ＩＦＮγを分泌した。
【０１２５】
実施例９
この実施例は、マウスにおけるＦＨＶＨ３３−ＣＤ８ＢＢＺ発現Ｔ細胞の用量の力価測定を示す。
【０１２６】
図９Ａに示す通り、ＮＳＧマウスにＲＰＭＩ８２２６細胞を皮内注射した。腫瘍を１０日間成長させた。０日目に、表示した数のＦＨＶＨ３３−ＣＤ８ＢＢＺ発現Ｔ細胞をマウスに静脈内注入した。マウスに、３つの異なる用量のＦＨＶＨ３３−ＣＤ８ＢＢＺ  ＣＡＲ  Ｔ細胞のうちの１つを投与し、別の群のマウスは未処理のままにした。全てのマウスがＴ細胞注入時には腫瘍を確立していた。
【０１２７】
図９Ｂに示す通り、２．２×１０６個のＦＨＶＨ３３−ＣＤ８ＢＢＺ  Ｔ細胞は、全てのマウスから腫瘍を根絶することができ、ＦＨＶＨ３３−ＣＤ８ＢＢＺ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の有効性は用量依存的に減少した。未処理のマウス全てで腫瘍が進行的に拡大した。（ｎ＝５マウス／群）。
【０１２８】
マウスの生存率を図９Ｃに示す。２．２×１０６個のＦＨＶＨ３３−ＣＤ８ＢＢＺ発現Ｔ細胞を投与したマウスは全て生存しており、実験期間中健常であった。
【０１２９】
実施例１０
この実施例は、ＮＳＧマウスにおけるＢＣＭＡ＋腫瘍の根絶を示す。
【０１３０】
マウスにＲＰＭＩ８２２６細胞を皮内注射した。腫瘍を１０日間成長させた。０日目に、ＳＰ６−ＣＤ８２８Ｚ、１１Ｄ５−３−ＣＤ８ＢＢＺ、ＦＨＶＨ３３−ＣＤ８ＢＢＺ、若しくはＦＨＶＨ３３−ＣＤ８２８Ｚ  ＣＡＲを発現しているＴ細胞１×１０６個をマウスに静脈内注入したか、又はマウスを未処理のままにした。
【０１３１】
図１０Ａに示す通り、ネガティブコントロールであるＳＰ６−ＣＤ８２８Ｚ  ＣＡＲを発現しているＴ細胞を注入したマウス及び未処理マウスでは、進行的に腫瘍が成長した。１１Ｄ５−３−ＣＤ８ＢＢＺ、ＦＨＶＨ３３−ＣＤ８ＢＢＺ、又はＦＨＶＨ３３−ＣＤ８２８Ｚ  ＣＡＲのいずれかを発現しているＴ細胞を投与したマウスでは、腫瘍が根絶された。
【０１３２】
マウスの生存率を図１０Ｂに示す。１１Ｄ５−３−ＣＤ８ＢＢＺ、ＦＨＶＨ３３−ＣＤ８ＢＢＺ、又はＦＨＶＨ３３−ＣＤ８２８Ｚ  ＣＡＲのいずれかを発現しているＴ細胞を投与したマウスは、生存していた。
【０１３３】
実施例１１
この実施例は、重鎖のみＣＡＲを発現しているＴ細胞がＢＣＭＡ特異的にＩＦＮガンマを放出することを示す。
【０１３４】
エフェクタＴ細胞を表５に表示した標的細胞と共に一晩培養した。エフェクタＴ細胞は、形質導入されていないＴ細胞、ＦＨＶＨ３３−ＣＤ８２８Ｚをコードしているヌクレオチド配列が形質導入されたＴ細胞、又はＦＨＶＨ３３−ＣＤ８ＢＢＺをコードしているヌクレオチド配列が形質導入されたＴ細胞のいずれかであった。Ｔ細胞は、全て同じヒトドナーに由来していた。ＦＨＶＨ３３−ＣＤ８２８Ｚが形質導入されたＴ細胞は、７１％ＣＡＲ発現をもたらした。ＦＨＶＨ３３−ＣＤ８ＢＢＺが形質導入されたＴ細胞は、８０％ＣＡＲ発現をもたらした。
【０１３５】
ＢＣＭＡ＋標的細胞は、ＢＣＭＡ−Ｋ５６２及びＲＰＭＩ８２２６であった。ＢＣＭＡ陰性標的細胞は、Ｐａｎｃ１０．０５、Ｕ２５１、２９３ＧＰ、初代正常ヒト気管支上皮細胞（ＮＨＢＥ）、初代ヒト毛細血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ）、初代ヒト腸上皮細胞（ＩｎＥｐＣ）であった。
【０１３６】
インターフェロン（ＩＦＮ）ガンマのＥＬＩＳＡを実施した。結果を表５に示す。エフェクタＴ細胞のみによるインターフェロンガンマ生成も表５に示す。表５における全ての値は、ＩＦＮガンマのｐｇ／ｍＬである。
【０１３７】
【表６】
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【０１３８】
表５に示す通り、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＢＣＭＡ＋標的の存在下でより多くのインターフェロンガンマを生成した。
【０１３９】
本明細書に引用した刊行物、特許出願、及び特許を含む全ての参照文献は、各参照文献が個々にかつ具体的に参照によって組み入れられると示されており、その全体が本明細書に記載されているのと同程度に、参照によって本明細書に組み入れられる。
【０１４０】
本発明の説明に関連して（特に以下の特許請求の範囲に関連して）用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」及び「少なくとも１つ」、並びに類似の参照対象の使用は、本明細書において他の指定がない限り又は文脈から明らかに矛盾していない限り、単数形及び複数形の両方を網羅すると解釈されるべきである。１つ以上の項目のリストが続く用語「少なくとも１つ」の使用（例えば、「Ａ及びＢのうちの少なくとも１つ」）は、本明細書において他の指定がない限り又は文脈から明らかに矛盾していない限り、列挙される項目から選択される１つの項目（Ａ又はＢ）又は列挙される項目のうちの２つ以上の任意の組み合わせ（Ａ及びＢ）を意味すると解釈されるべきである。用語「含む（comprising）」、「有する（having）」、「含む（including）」、及び「含有する（containing）」は、特に断らない限り、オープンエンドな用語である（すなわち、「含むがこれらに限定されない」を意味する）と解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書において他の指定がない限り、単に、範囲内の各別個の値を個々に参照する省略法として機能することを意図し、各別個の値が、本明細書に個々に列挙されているかのように明細書に組み込まれる。本明細書に記載される全ての方法は、本明細書において他の指定がない限り又は文脈から特に明らかに矛盾していない限り、任意の好適な順序で実施することができる。本明細書に提供される任意の及び全ての例又は例示的な表現（例えば、「など」）の使用は、特に特許請求しない限り、単に本発明をより深く解明することを意図し、本発明の範囲の限定を提起するものではない。明細書中の表現はいずれも、任意の特許請求されていない要素が本発明の実施に必須であることを示すと解釈されるべきではない。
【０１４１】
本発明の好ましい実施形態は、本発明を実施するための本発明者らに公知の最良の形態を含む、本明細書に記載される。好ましい実施形態の変形は、前述の記載を読んだときに当業者に明らかになり得る。本発明者らは、当業者がこのような変形を適宜使用すると予想し、そして、本発明者らは、本明細書に具体的に記載されているのとは別の方法で本発明が実施されることを意図している。したがって、本発明は、準拠法によって認められている通り、本明細書に添付される特許請求の範囲に列挙される発明主題の全ての変形及び均等物を含む。更に、その全ての可能な変形における上記要素の任意の組み合わせは、本明細書において他の指定がない限り又は文脈から特に明らかに矛盾していない限り、本発明によって包含される。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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