(57)【要約】  本発明は、癌の治療または予防における使用のための葉酸代謝拮抗薬（特にＭＴＨＦＤ１阻害剤）とＢＲＤ４阻害剤の組み合わせ物に関する。本発明はまた、ＢＲＤ４阻害剤を用いた治療に対するＢＲＤ４阻害剤抵抗性癌の再感受性化における使用のための葉酸代謝拮抗薬（特にＭＴＨＦＤ１阻害剤）にも関する。さらに、本発明は、ＢＲＤ４阻害剤、葉酸代謝拮抗薬（特にＭＴＨＦＤ１阻害剤）、および医薬的に許容され得る賦形剤を含む医薬組成物を提供する。そのうえ、本発明は、ＢＲＤ４阻害剤を用いた治療に対する感受性または応答性を評価する方法を提供するものであり、ここで、該対象は、癌に罹患していると診断されたか、または癌に罹患していることが疑われており、そして、前記方法は、該対象から入手したサンプル中の核内葉酸レベルおよび／またはＭＴＨＦＤ１の発現レベルを測定することを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌の治療または予防において使用するためのＢＲＤ４阻害剤であって、前記ＢＤＲ４阻害剤が葉酸代謝拮抗薬と組み合わせて投与される、前記ＢＲＤ４阻害剤。
【請求項２】
癌の治療または予防において使用するための葉酸代謝拮抗薬であって、ＢＲＤ４阻害剤と組み合わせて投与される、前記葉酸代謝拮抗薬。
【請求項３】
癌の治療または予防において使用するためのＢＲＤ４阻害剤と葉酸代謝拮抗薬との組み合わせ物。
【請求項４】
ＢＲＤ４阻害剤、葉酸代謝拮抗薬、および医薬的に許容され得る賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項５】
癌の治療または予防において使用するための、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記癌がＢＲＤ４阻害剤抵抗性癌である、請求項１に記載の使用のためのＢＲＤ４阻害剤、請求項２に記載の使用のための葉酸代謝拮抗薬、請求項３に記載の使用のための組み合わせ物または請求項５に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項７】
ＢＲＤ４阻害剤を用いた治療に対して、ＢＲＤ４阻害剤抵抗性癌を再感受性化する際の使用のための葉酸代謝拮抗薬。
【請求項８】
前記癌が、前立腺癌、乳癌、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、膀胱癌、頭頚部癌、神経膠芽腫、中皮腫、骨肉腫、絨毛癌、およびＮＵＴ正中線癌腫から選択される、請求項１または６に記載の使用のためのＢＲＤ４阻害剤、請求項２または６に記載の使用のための葉酸代謝拮抗薬、請求項３または６に記載の使用のための組み合わせ物、請求項５または６に記載の使用のための医薬組成物、あるいは請求項７に記載の使用のための葉酸代謝拮抗薬。
【請求項９】
前記ＢＲＤ４阻害剤が、（Ｓ）−ＪＱ１、ＣｅＭＭＥＣ２、Ｉ−ＢＥＴ１５１、Ｉ−ＢＥＴ７６２、ＰＦ−１、ブロモスポリン、ＯＴＸ−０１５、ＴＥＮ−０１０、ＣＰＩ−２０３、ＣＰＩ−０６１０、ＲＶＸ−２０８、ＢＩ２５３６、ＴＧ１０１３４８、ＬＹ２９４００２、またはこれらの剤のうちのいずれかの医薬的に許容され得る塩もしくは溶媒和物である、請求項１、６または８に記載の使用のためのＢＲＤ４阻害剤、請求項２、６または８に記載の使用のための葉酸代謝拮抗薬、請求項３、６または８に記載の使用のための組み合わせ物、請求項４に記載の医薬組成物、請求項５、６または８に記載の使用のための医薬組成物、あるいは請求項７または８に記載の使用のための葉酸代謝拮抗薬。
【請求項１０】
前記ＢＲＤ４阻害剤が（Ｓ）−ＪＱ１である、請求項９に記載の使用のためのＢＲＤ４阻害剤、請求項９に記載の使用のための葉酸代謝拮抗薬、請求項９に記載の使用のための組み合わせ物、請求項９に記載の医薬組成物、請求項９に記載の使用のための医薬組成物、あるいは請求項９に記載の使用のための葉酸代謝拮抗薬。
【請求項１１】
前記葉酸代謝拮抗薬がＭＴＨＦＤ１阻害剤である、請求項１、６および８〜１０のいずれか一項に記載の使用のためのＢＲＤ４阻害剤、請求項２、６および８〜１０のいずれか一項に記載の使用のための葉酸代謝拮抗薬、請求項３、６および８〜１０のいずれか一項に記載の使用のための組み合わせ物、請求項４、９または１０のいずれか一項に記載の医薬組成物、請求項５、６および８〜１０のいずれか一項に記載の使用のための医薬組成物、あるいは請求項７〜１０のいずれか一項に記載の使用のための葉酸代謝拮抗薬。
【請求項１２】
前記葉酸代謝拮抗薬が、メトトレキサート、ペメトレキセド、トリメトレキサート、エドトレキサート、レメトレキソール、５−フルオロウラシル、プララトレキサート、アミノプテリン、またはこれらの剤のうちのいずれかの医薬的に許容され得る塩もしくは溶媒和物である、請求項１、６および８〜１１のいずれか一項に記載の使用のためのＢＲＤ４阻害剤、請求項２、６および８〜１１のいずれか一項に記載の使用のための葉酸代謝拮抗薬、請求項３、６および８〜１１のいずれか一項に記載の使用のための組み合わせ物、請求項４および９〜１１のいずれか一項に記載の医薬組成物、請求項５、６および８〜１１のいずれか一項に記載の使用のための医薬組成物、または請求項７〜１１のいずれか一項に記載の使用のための葉酸代謝拮抗薬。
【請求項１３】
前記葉酸代謝拮抗薬が、メトトレキサート、医薬的に許容され得るその塩または溶媒和物である、請求項１２に記載の使用のためのＢＲＤ４阻害剤、請求項１２に記載の使用のための葉酸代謝拮抗薬、請求項１２に記載の使用のための組み合わせ物、請求項１２に記載の医薬組成物、請求項１２に記載の使用のための医薬組成物または請求項１２に記載の使用のための葉酸代謝拮抗薬。
【請求項１４】
前記ＢＲＤ４阻害剤が（Ｓ）−ＪＱ１であり、かつ、前記葉酸代謝拮抗薬が、メトトレキサート、医薬的に許容されその得る塩または溶媒和物である、請求項１、６または８に記載の使用のためのＢＲＤ４阻害剤、請求項２、６または８に記載の使用のための葉酸代謝拮抗薬、請求項３、６または８に記載の使用のための組み合わせ物、請求項４に記載の医薬組成物、請求項５、６または８に記載の使用のための医薬組成物、あるいは請求項７または８に記載の使用のための葉酸代謝拮抗薬。
【請求項１５】
ＢＲＤ４阻害剤を用いた治療に対する対象の感受性または応答性を評価する方法であって（ここで、該対象は、癌に罹患していると診断されたか、または癌に罹患していることが疑われる）、該対象から得られたサンプル中の核内葉酸レベルおよび／またはＭＴＨＦＤ１の発現レベルを測定することを含む方法。
【請求項１６】
ＢＲＤ４阻害剤を用いた治療に対する対象の感受性または応答性を評価する方法であって（ここで、該対象は、癌に罹患していると診断されたか、または癌に罹患していることが疑われる）、該対象から得られたサンプル中の核内葉酸レベルおよび／またはＭＴＨＦＤ１の発現レベルを測定するステップを含む方法（ここで、該対象からのサンプル中の核内葉酸のより低いレベルおよび／またはＭＴＨＦＤ１のより低い発現レベルは、その対象がＢＲＤ４阻害剤を用いた治療により感受性またはより応答性であることを示唆する）。
【請求項１７】
ＢＲＤ４阻害剤を用いた治療に対する対象の感受性または応答性を評価する方法であって（ここで、該対象は、癌に罹患していると診断されたか、または癌に罹患していることが疑われる）、該対象から得られたサンプルの核内葉酸レベルを測定するステップを含む方法（ここで、該対象からのサンプル中の核内葉酸のより低いレベルは、ＢＲＤ４阻害剤を用いた治療に対してその対象がより感受性であるかまたはより応答性であることを示唆する）。
【請求項１８】
ＢＲＤ４阻害剤を用いた治療に対する対象の感受性または応答性を評価する方法であって（ここで、該対象は、癌に罹患していると診断されたか、または癌に罹患していることが疑われる）、該対象から得られたサンプルにおいてＭＴＨＦＤ１の発現レベルを測定するステップを含む方法（ここで、該対象からのサンプルにおけるＭＴＨＦＤ１のより低い発現レベルは、ＢＲＤ４阻害剤を用いた治療に対してその対象がより感受性またはより応答性であることを示唆する）。
【請求項１９】
前記癌が、前立腺癌、乳癌、膀胱癌、頭頚部癌、神経膠芽腫、中皮腫、骨肉腫、絨毛癌、およびＮＵＴ正中線癌腫から選択される、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記サンプルが癌組織生検サンプルである、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記癌が、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、および多発性骨髄腫から選択される、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記サンプルが血液サンプルである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＭＴＨＦＤ１の発現レベルが、ＭＴＨＦＤ１の翻訳レベルを測定することによって測定され、ここで、該翻訳レベルが、好ましくは、抗体ベースのアッセイ、質量分析法、ゲルベースのもしくはブロットベースのアッセイ、またはフローサイトメトリーを使用するか、より好ましくは、免疫組織化学法、酵素結合免疫吸着アッセイ、または放射免疫アッセイを使用して測定される、請求項１５、１６または１８、あるいはそれらの従属請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＭＴＨＦＤ１の発現レベルが、核内ＭＴＨＦＤ１タンパク質のレベルを測定することによって測定され、ここで、該核内ＭＴＨＦＤ１タンパク質のレベルが、好ましくは、抗体ベースのアッセイを使用するか、より好ましくは、蛍光抗体法または免疫組織化学法を使用して測定される、請求項１５、１６または１８、あるいはそれらの従属請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＭＴＨＦＤ１の発現レベルが、ＭＴＨＦＤ１の転写レベルを測定することによって測定され、ここで、該転写レベルが、好ましくは、定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応またはマイクロアレイを使用して測定される、請求項１５、１６または１８、あるいはそれらの従属請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記対象がヒトである、請求項１５〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
対象における癌治療の際の使用のためのＢＲＤ４阻害剤であって、ここで、該対象が、ＢＲＤ４阻害剤を用いた治療に対して感受性であるか、または応答性であると、請求項１５〜２６のいずれか一項に記載の方法により同定される、ＢＲＤ４阻害剤。
【請求項２８】
ＢＲＤ４阻害剤を用いた治療に対する対象の感受性または応答性を評価する方法における、遺伝子ＭＴＨＦＤ１の転写産物のための１組のプライマーの使用であって、ここで、該対象が、癌に罹患していると診断されたか、または癌に罹患していることが疑われる、使用。
【請求項２９】
ＢＲＤ４阻害剤を用いた治療に対する対象の感受性または応答性を評価する方法における、遺伝子ＭＴＨＦＤ１の転写産物のための核酸プローブの使用であって、ここで、該対象が、癌に罹患していると診断されたか、または癌に罹患していることが疑われる、使用。
【請求項３０】
ＢＲＤ４阻害剤を用いた治療に対する対象の感受性または応答性を評価する方法における、遺伝子ＭＴＨＦＤ１の転写産物のための核酸プローブを含むマイクロアレイの使用であって、ここで、該対象が、癌に罹患していると診断されたか、または癌に罹患していることが疑われる、使用。
【請求項３１】
ＢＲＤ４阻害剤を用いた治療に対する対象の感受性または応答性を評価する方法における、タンパク質ＭＴＨＦＤ１に対する抗体の使用であって、ここで、該対象が、癌に罹患していると診断されたか、または癌に罹患していることが疑われる、使用。
【請求項３２】
前記のＢＲＤ４阻害剤を用いた治療に対象の感受性または応答性を評価する方法が、請求項１５、１６または１８、あるいはそれらの従属請求項１９〜２６のいずれか一項に記載の方法である、請求項２８〜３１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３３】
癌に罹患していると診断されたか、または癌に罹患していることが疑われる対象の癌を治療する方法における使用のためのＢＲＤ４阻害剤であって、該方法が：
−該対象から得られたサンプル中の核内葉酸レベルおよび／またはＭＴＨＦＤ１の発現レベルを測定し；
−該対象が、ＢＲＤ４阻害剤を用いた治療に対して感受性または応答性であるか否かを決定し、ここで、該対象からのサンプルにおけるより低いレベルの核内葉酸および／またはより低い発現レベルのＭＴＨＦＤ１は、その対象がＢＲＤ４阻害剤を用いた治療に対してより感受性であるか、またはより応答性であることを示唆し；そして
−該対象がＢＲＤ４阻害剤を用いた治療に対して感受性であるか、または応答性であると同定された場合に、その対象にＢＲＤ４阻害剤を投与すること、
を含む、ＢＲＤ４阻害剤。
【請求項３４】
癌に罹患していると診断されたか、または癌に罹患していることが疑われる対象の癌を治療する方法における使用のためのＢＲＤ４阻害剤であって、該方法が：
−該対象から得られたサンプル中の核内葉酸レベルを測定し；
−該対象がＢＲＤ４阻害剤を用いた治療に対して感受性であるか、または応答性であるか否かを決定し、ここで、該対象からのサンプルにおけるより低いレベルの核内葉酸は、その対象がＢＲＤ４阻害剤を用いた治療に対してより感受性であるか、またはより応答性であるを示唆し；そして
−該対象がＢＲＤ４阻害剤を用いた治療に対して感受性であるか、または応答性であると同定された場合に、その対象にＢＲＤ４阻害剤を投与すること、
を含む、ＢＲＤ４阻害剤。
【請求項３５】
癌に罹患していると診断されたか、または癌に罹患していることが疑われる対象の癌を治療する方法における使用のためのＢＲＤ４阻害剤であって、該方法が：
−該対象から得られたサンプルにおいてＭＴＨＦＤ１の発現レベルを測定し；
−該対象が、ＢＲＤ４阻害剤を用いた治療に対して感受性または応答性であるか否かを決定し、ここで、該対象からのサンプルにおけるより低い発現レベルのＭＴＨＦＤ１は、その対象がＢＲＤ４阻害剤を用いた治療に対してより感受性であるか、またはより応答性であることを示唆し；そして
−該対象がＢＲＤ４阻害剤を用いた治療に対して感受性であるか、または応答性であると同定された場合に、その対象にＢＲＤ４阻害剤を投与すること、
を含む、ＢＲＤ４阻害剤。
【請求項３６】
癌に罹患していると診断されたか、または癌に罹患していることが疑われる対象の癌を治療する方法における使用のためのＢＲＤ４阻害剤であって、該方法が：
−該対象から得られたサンプル中の核内ＭＴＨＦＤ１タンパク質レベルを測定し；
−該対象が、ＢＲＤ４阻害剤を用いた治療に対して感受性または応答性であるか否かを決定し、ここで、該対象からのサンプルにおけるより低いレベルの核内ＭＴＨＦＤ１タンパク質は、その対象がＢＲＤ４阻害剤を用いた治療に対してより感受性であるか、またはより応答性であることを示唆し；そして
−該対象がＢＲＤ４阻害剤を用いた治療に対して感受性であるか、または応答性であると同定された場合に、その対象にＢＲＤ４阻害剤を投与すること、
を含む、ＢＲＤ４阻害剤。
【請求項３７】
前記癌が、前立腺癌、乳癌、膀胱癌、頭頚部癌、神経膠芽腫、中皮腫、骨肉腫、絨毛癌、およびＮＵＴ正中線癌腫から選択される、請求項３３〜３６のいずれか一項に記載の使用のためのＢＲＤ４阻害剤。
【請求項３８】
前記サンプルが癌組織生検サンプルである、請求項３３〜３７のいずれか一項に記載の使用のためのＢＲＤ４阻害剤。
【請求項３９】
前記癌が、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、および多発性骨髄腫から選択される、請求項３３〜３６のいずれか一項に記載の使用のためのＢＲＤ４阻害剤。
【請求項４０】
前記サンプルが血液サンプルである、請求項３９に記載の使用のためのＢＲＤ４阻害剤。
【請求項４１】
前記ＭＴＨＦＤ１の発現レベルが、ＭＴＨＦＤ１の翻訳レベルを測定することによって測定され、ここで、該翻訳レベルが、好ましくは、抗体ベースのアッセイ、質量分析法、ゲルベースのもしくはブロットベースのアッセイ、またはフローサイトメトリーを使用するか、より好ましくは、免疫組織化学法、酵素結合免疫吸着アッセイ、または放射免疫アッセイを使用して測定される、請求項３３または３５、あるいはそれらの従属請求項３７〜４０のいずれか一項に記載の使用のためのＢＲＤ４阻害剤。
【請求項４２】
前記ＭＴＨＦＤ１の発現レベルが、ＭＴＨＦＤ１の転写レベルを測定することによって測定され、ここで、該転写レベルが、好ましくは、定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応またはマイクロアレイを使用して測定される、請求項３３または３５、あるいはそれらの従属請求項３７〜４０のいずれか一項に記載の使用のためのＢＲＤ４阻害剤。
【請求項４３】
前記ＭＴＨＦＤ１の発現レベルが、核内ＭＴＨＦＤ１タンパク質のレベルを測定することによって測定され、ここで、該核内ＭＴＨＦＤ１タンパク質のレベルが、好ましくは、抗体ベースのアッセイを使用するか、より好ましくは、蛍光抗体法または免疫組織化学法を使用して測定される、請求項３３または３５、あるいはそれらの従属請求項３７〜４０のいずれか一項に記載の使用のためのＢＲＤ４阻害剤。
【請求項４４】
前記対象がヒトである、請求項１３３〜４３のいずれか一項に記載の使用のためのＢＲＤ４阻害剤。
【請求項４５】
前記ＢＲＤ４阻害剤が、（Ｓ）−ＪＱ１、ＣｅＭＭＥＣ２、Ｉ−ＢＥＴ１５１、Ｉ−ＢＥＴ７６２、ＰＦ−１、ブロモスポリン、ＯＴＸ−０１５、ＴＥＮ−０１０、ＣＰＩ−２０３、ＣＰＩ−０６１０、ＲＶＸ−２０８、ＢＩ２５３６、ＴＧ１０１３４８、ＬＹ２９４００２、またはこれらの剤のうちのいずれかの医薬的に許容され得る塩もしくは溶媒和物である、請求項１５〜２６のいずれか一項に記載の方法、請求項２７に記載の使用のためのＢＲＤ４阻害剤、請求項２８〜３２のいずれか一項に記載の使用、または請求項３３〜４４のいずれか一項に記載の使用のためのＢＲＤ４阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の治療または予防における使用のための葉酸代謝拮抗薬（特にＭＴＨＦＤ１阻害剤）とＢＲＤ４阻害剤の組み合わせ物に関する。本発明はまた、ＢＲＤ４阻害剤を用いた治療に対するＢＲＤ４阻害剤抵抗性癌の再感受性化における使用のための葉酸代謝拮抗薬（特にＭＴＨＦＤ１阻害剤）にも関する。さらに、本発明は、ＢＲＤ４阻害剤、葉酸代謝拮抗薬（特にＭＴＨＦＤ１阻害剤）、および医薬的に許容され得る賦形剤を含む医薬組成物を提供する。そのうえ、本発明は、ＢＲＤ４阻害剤を用いた治療に対する感受性または応答性を評価する方法を提供するものであり、ここで、該対象は、癌に罹患していると診断されたか、または癌に罹患していることが疑われており、かつ、該方法は、該対象から入手したサンプル中の核内葉酸レベルおよび／またはＭＴＨＦＤ１の発現レベルを測定することを含む。
【背景技術】
【０００２】
クロマチンは、環境シグナルに対応して遺伝子発現を制御する。このプロセスの主要な伝達物質は、クロマチン修飾酵素の補因子や阻害剤として機能する細胞内代謝物であり、細胞質からの非制御型の流入によって核に侵入すると考えられている。
【０００３】
ブロモドメイン含有タンパク質４（ＢＲＤ４）は、遺伝子活性化、ＤＮＡ損傷、細胞増殖、および癌の進行において上述の役割を有する重要なクロマチン調節物質である1-8。このブロモドメインタンパク質の少なくとも７個の阻害剤が、臨床段階に至り、そして現在、様々な癌におけるそれらの有効性について評価されている。ＢＲＤ４阻害剤の臨床的利益は、ドライバー癌遺伝子ｃ−ＭＹＣの直接的な抑制によって媒介されると主に考えられている2、7。この概念は、ＢＲＤ４阻害剤に対する主要な抵抗性機構としてのＭＹＣ発現の回復およびＷＮＴシグナル伝達の活性化に関する最近の発見によって支持される9、10。
【０００４】
その臨床的重要性やクロマチン機構におけるＢＲＤ４の幅広い役割にもかかわらず、ＢＲＤ４機能のために直接必要とされる因子に関して驚くほどわずかしか知られていない。大部分の試験の焦点は、アセチル化ヒストンリジンへのタンデムブロモドメインの結合によって媒介されると考えられる、転写因子の動員および休止ＲＮＡポリメラーゼＩＩのｐＴＥＦｂ媒介型活性化をもたらす、転写活性化因子としてのＢＲＤ４の役割である。加えて、ウイルス性タンパク質ＬＡＮＡ−１11やクロマチンタンパク質ＮＳＤ３、ＡＴＡＤ５、ＣＨＤ４、ＬＴＳＣＲ１、およびＪＭＪＤ５12-14を含めた、いくつかのタンパク質が、直接的なＢＲＤ４相互作用因子として同定された。
【０００５】
これらの、または他のタンパク質がＢＲＤ４機能に直接的に必要であるかどうかを決定するために、発明者らはＢＲＤ４の阻害を観察するためにレポーター細胞株を利用した。彼らは、機能的なＢＲＤ４阻害に関するレポータシステムの高選択性を確認し、かつ、ＢＲＤ４とＴＡＦ１ブロモドメイン阻害剤のクロストークを首尾よく指摘した、ＲＥＤＳ（エピジェネティック薬物スクリーニングレポーター）細胞株を最近樹立した15。ＲＥＤＳマーカーの作出に利用したＫＢＭ７細胞株のハプロイド性質が、Ｇｅｎｅ−Ｔｒａｐ（ＧＴ）アプローチを使用した新しいＢＲＤ４の機能的パートナーの遺伝子スクリーニングのために、それを理想的に適合させた。ここで、ＢＲＤ４の遺伝子的および物理的な相互作用因子としてメチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ１（ＭＴＨＦＤ１）の同定に通じる顕著な結果を、このストラテジーを用いて得た。本発明で同定されたこのＣ１テトラヒドロ葉酸シンターゼの核内役割の説明では、癌の後成的遺伝学と葉酸代謝とのロバスト関係を明らかにする。
【０００６】
実施例で詳しく述べられるように、発明者らは、葉酸経路酵素ＭＴＨＦＤ１の直接的な転写における役割を見出し、そしてそれは、ＢＲＤ４機能に必要とされる因子のハプロイド遺伝子スクリーニングから彼らが同定した。それは、ＭＴＨＦＤ１が核内に移行し得ること、およびそのごく一部が、ＢＲＤ４との直接的な物理的相互作用を介してクロマチン結合され、そして、ゲノム内のＢＲＤ４結合遺伝子座の一部を占有することを示した。そのうえ、それは、ＭＴＨＦＤ１の阻害または下方制御がＢＲＤ４の阻害または下方制御と類似の転写における変化を引き起こすことを、複数の細胞株において示した。それは、ＢＲＤ４またはＭＴＨＦＤ１のいずれかの阻害が、核代謝産物組成物の類似の変化をもたらすことをさらに実証した。そのうえ、２つの酵素の薬理学的阻害剤が相乗効果を示すこと、およびメトトレキサートが（Ｓ）−ＪＱ１抵抗性細胞に感受性を与え得ることがわかった。加えて、二つの酵素の薬理学的阻害剤はまた、マウス異種移植モデルにおける腫瘍増殖のインビボでの抑制にも相乗効果を与える。最終的に、ヌクレオチド生合成に必要とされる生合成酵素の大部分が、密なクロマチン結合画分の状態で存在するという知見は、遺伝子発現の制御における核代謝の直接的な役割を示し、そして、癌におけるＢＲＤ４阻害剤のための新しい臨床ストラテジーを可能にする。
【０００７】
したがって、発明者らは、ＢＲＤ４機能的な遺伝子の相互作用因子としてＭＴＨＦＤ１を認識し、ＭＴＨＦＤ１表現型模写であるＢＲＤ４阻害の損失を示した。ＭＴＨＦＤ１は葉酸代謝における主要酵素であり、その結果、ヌクレオチドおよびメチオニンの生合成のために重要な中間体を提供する。ＭＴＨＦＤ１とＢＲＤ４は核において物理的に相互作用するので、いずれかのタンパク質の阻害は核代謝産物組成物に類似の変化を引き起こす。二つの酵素の阻害剤は、複数の癌細胞株の生存率を損なう相乗効果を与えることがわかった。
【０００８】
よって、本発明との関連において、葉酸代謝拮抗薬（特にＭＴＨＦＤ１阻害剤、例えばメトトレキサートなど）と組み合わせたＢＲＤ４阻害剤（例えば（Ｓ）−ＪＱ１など）の使用が、幅広いさまざまな癌細胞に対して相乗的に高められた治療効果を提供し、これにより、改良されたが癌の治療法を可能にすることが、驚いたことに分かった。そのうえ、葉酸代謝拮抗薬（特に、メトトレキサートなどのＭＴＨＦＤ１阻害剤）が、ＢＲＤ４阻害剤を用いた治療に対するＢＲＤ４阻害剤抵抗性癌（例えば（Ｓ）−ＪＱ１抵抗性癌など）の再感受性化に使用できることがわかった。さらに、葉酸代謝拮抗薬（または、ＭＴＨＦＤ１阻害剤）と一緒のＢＲＤ４阻害剤の併用は、癌におけるＢＲＤ４阻害剤に対する抵抗性の出現を予防または低減するのを可能にするので、有利である。よって、本発明は、特に、ＢＲＤ４阻害剤抵抗性癌を含めた、癌の改良された治療法を提供するという問題を解決する。
【発明の概要】
【０００９】
したがって、本発明は、治療法における使用のための、好ましくは、癌の治療または予防において使用するための、ＢＲＤ４阻害剤と葉酸代謝拮抗薬の組み合わせ物（特に、ＢＲＤ４阻害剤とＭＴＨＦＤ１阻害剤の組み合わせ物）を提供する。
本発明はまた、治療法における使用のための、好ましくは、癌の治療または予防において使用するための、ＢＲＤ４阻害剤を提供するものでもあり、ここで、該ＢＲＤ４阻害剤は、葉酸代謝拮抗薬（特にＭＴＨＦＤ１阻害剤）と組み合わせて投与されるべきである。
【００１０】
本発明は同様に、治療法における使用のための、好ましくは、癌の治療または予防において使用するための葉酸代謝拮抗薬（特にＭＴＨＦＤ１阻害剤）に関するものであり、ここで、該葉酸代謝拮抗薬（または、ＭＴＨＦＤ１阻害剤）は、ＢＲＤ４阻害剤と組み合わせて投与されるべきである。
【００１１】
本発明は、ＢＲＤ４阻害剤、葉酸代謝拮抗薬（特にＭＴＨＦＤ１阻害剤）、および医薬的に許容され得る賦形剤を含む医薬組成物をさらに提供する。本発明はまた、癌の治療または予防において使用するための前述の医薬組成物にも関する。
そのうえ、本発明は、ＢＲＤ４阻害剤を用いた治療に対してＢＲＤ４阻害剤抵抗性癌を再感受性化する際の使用のための葉酸代謝拮抗薬（特にＭＴＨＦＤ１阻害剤）を提供する。前記ＢＲＤ４阻害剤抵抗性癌は、特にＢＲＤ４阻害剤単独療法に対して抵抗性である癌であってもよい。
【００１２】
さらに、本発明は、癌を治療するかまたは予防するための薬剤の調製のための、葉酸代謝拮抗薬（特にＭＴＨＦＤ１阻害剤）と組み合わせたＢＲＤ４阻害剤の使用に関する。本発明は同様に、癌を治療するかまたは予防するための薬剤の調製のための、ＢＲＤ４阻害剤の使用を提供するものであり、ここで、該ＢＲＤ４阻害剤は、葉酸代謝拮抗薬（特にＭＴＨＦＤ１阻害剤）と組み合わせて投与されるべきである。本発明はまた、癌を治療するかまたは予防するための薬剤の調製のための使用に関するものでもあり、ここで、葉酸代謝拮抗薬（または、ＭＴＨＦＤ１阻害剤）は、ＢＲＤ４阻害剤と組み合わせて投与されるべきである。そのうえ、本発明は、ＢＲＤ４阻害剤を用いた治療に対して、ＢＲＤ４阻害剤抵抗性癌（特にＢＲＤ４阻害剤単独療法に抵抗性である癌）を再感受性化するための薬剤の調製のための葉酸代謝拮抗薬（特にＭＴＨＦＤ１阻害剤）の使用に関する。
【００１３】
本発明は同様に、疾患または障害、好ましくは癌を治療するかまたは予防する方法であって、それを必要としている対象（例えば、ヒト）に、葉酸代謝拮抗薬（特にＭＴＨＦＤ１阻害剤）と組み合わせてＢＲＤ４阻害剤を投与することを含む方法に関する。本発明は、ＢＲＤ４阻害剤を用いた治療に対して、ＢＲＤ４阻害剤抵抗性癌を再感受性化する方法であって、それを必要としている対象（例えば、ヒト）に、葉酸代謝拮抗薬（特にＭＴＨＦＤ１阻害剤）を投与することを含む方法をさらに提供する。
【００１４】
先に記載したように、本発明は、治療法における使用のための、好ましくは、癌の治療または予防において使用するための葉酸代謝拮抗薬（特にＭＴＨＦＤ１阻害剤）とＢＲＤ４阻害剤との組み合わせ物に関する。ＢＲＤ４阻害剤と葉酸代謝拮抗薬（または、ＢＲＤ４阻害剤とＭＴＨＦＤ１阻害剤）とを別々の医薬製剤で提供することもできる。斯かる別々の製剤を同時に投与しても、または連続して投与してもよい（例えば、ＢＲＤ４阻害剤を含む製剤を最初に投与し、それに続いて、葉酸代謝拮抗薬（または、ＭＴＨＦＤ１阻害剤）を含む製剤を投与してもよく、またはその逆も同様でさる）。しかしながら、ＢＲＤ４阻害剤と葉酸代謝拮抗薬（または、ＢＲＤ４阻害剤とＭＴＨＦＤ１阻害剤）はまた、単一の医薬製剤で提供されてもよい。したがって、本発明はまた、ＢＲＤ４阻害剤、葉酸代謝拮抗薬（特にＭＴＨＦＤ１阻害剤）、および医薬的に許容され得る賦形剤を含む医薬組成物にも関する。この新規医薬組成物は、特に癌の治療または予防のために、有用である。
【００１５】
本発明によって治療されるかまたは予防される疾患／障害は、好ましくは、過剰増殖性障害であり、最も好ましくは、癌である。前記治療されるかまたは予防される癌は、例えば、消化器癌、結腸直腸癌、肝臓癌（例えば、肝細胞癌腫）、膵臓癌、胃癌、泌尿生殖器癌、膀胱癌、胆管癌、精巣癌、子宮頚癌、悪性中皮腫、食道癌、喉頭癌、前立腺癌（例えば、ホルモン抵抗性前立腺癌）、肺癌（例えば、小細胞肺癌または非小細胞肺癌）、乳癌（例えば、トリプルネガティブ乳癌、ＢＲＣＡ１および／またはＢＲＣＡ２遺伝子突然変異を有する乳癌）、血液癌、白血病（例えば、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、または慢性骨髄性白血病）、リンパ腫（例えば、ホジキンリンパ腫または非ホジキンリンパ腫、例えば、濾胞性リンパ腫またはびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫など）、多発性骨髄腫、卵巣癌、脳腫瘍、神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、骨肉腫、腎癌、類表皮癌、皮膚癌、黒色腫、頭部および／または頚部癌（例えば、頭頚部扁平上皮細胞癌）、ならびに口腔癌から選択され得る。好ましくは、前記治療されるかまたは予防される癌は、前立腺癌、乳癌、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、膀胱癌、頭頚部癌、神経膠芽腫、中皮腫、骨肉腫、絨毛癌、およびＮＵＴ正中線癌腫から選択される。（前述の特定のタイプの癌のいずれかを含めた）治療されるかまたは予防される癌は、ＢＲＤ４依存性癌および／またはｃ−ＭＹＣ依存性癌であることが特に好ましい。
【００１６】
先に記載したように、本発明はまた、本発明の複合製剤、すなわち、葉酸代謝拮抗薬（特にＭＴＨＦＤ１阻害剤）と組み合わせたＢＲＤ４阻害剤、を使用したＢＲＤ４阻害剤抵抗性癌の治療に関する。よって、（前段落で言及した特定のタイプの癌のいずれかを含めた）治療される癌はまた、ＢＲＤ４阻害剤抵抗性癌、特にＢＲＤ４阻害剤単独療法に対して抵抗性である癌であってもよい。
【００１７】
本発明にしたがって使用されるＢＲＤ４阻害剤は、これだけに特に限定されるものではなく、好ましくは、（Ｓ）−ＪＱ１、ＣｅＭＭＥＣ２、Ｉ−ＢＥＴ１５１（またはＧＳＫ１２１０１５１Ａ）、Ｉ−ＢＥＴ７６２（またはＧＳＫ５２５７６２）、ＰＦ−１、ブロモスポリン、ＯＴＸ−０１５、ＴＥＮ−０１０、ＣＰＩ−２０３、ＣＰＩ−０６１０、ＲＶＸ−２０８、ＢＩ２５３６、ＴＧ１０１３４８、ＬＹ２９４００２、またはこれらの剤のうちのいずれかの医薬的に許容され得る塩もしくは溶媒和物である。これらの化合物は市販されており、および／またはそれらの合成は文献に記載されている。例えば、化合物ＣｅＭＭＥＣ２は、AKos GmbH（Steinen、Germany）から入手できる。ＢＲＤ４阻害剤はまた、ＷＯ２０１２／１７４４８７、ＷＯ２０１４／０７６１４６、ＵＳ２０１４／０１３５３３６、ＷＯ２０１４／１３４５８３、ＷＯ２０１４／１９１８９４、ＷＯ２０１４／１９１８９６、ＵＳ２０１４／０３４９９９０、またはＷＯ２０１４／１９１９０６に開示された化合物のいずれか一つであってもよい。ＢＲＤ４阻害剤が（Ｓ）−ＪＱ１またはＣｅＭＭＥＣ２であることが特に好ましく、より一層好ましくは、それが（Ｓ）−ＪＱ１であることである。
【００１８】
【化１】
2020511401.tif 000002
【００１９】
葉酸代謝拮抗薬は、細胞プロセスに対する葉酸の効果を拮抗するかまたは妨げる薬理作用を有する物質の既存のクラスを構成する。メトトレキサートやペメトレキセドのような葉酸代謝拮抗薬は、癌化学療法で使用される承認薬である；それらは、主としてＤＨＦＲを標的とするが、また、ＭＴＨＦＤ１を含めた葉酸代謝における他の酵素を阻害することも示された。本発明にしたがって使用される葉酸代謝拮抗薬は、好ましくはＭＴＨＦＤ１阻害剤、すなわち、メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ１（ＭＴＨＦＤ１）の阻害剤である。葉酸代謝拮抗薬の例としては、特にメトトレキサート、ペメトレキセド、トリメトレキサート、エドトレキサート、レメトレキソール、５−フルオロウラシル、プララトレキサート、アミノプテリン、ならびにこれらの剤の医薬的に許容され得る塩および溶媒和物が挙げられる。本発明により特に好ましい葉酸代謝拮抗薬（または、ＭＴＨＦＤ１阻害剤）は、メトトレキサート、医薬的に許容され得るその塩または溶媒和物（例えば、メトトレキサートナトリウム）である。
【００２０】
本発明の範囲は、（本明細書中に提供した複合製剤の化合物とも呼ばれ；特に、ＢＲＤ４阻害剤、葉酸代謝拮抗薬、および本願明細書で言及されたＭＴＨＦＤ１阻害剤を含む）本発明にしたがって使用される化合物のすべての医薬に許容される塩型を含み、これらの塩は、例えばプロトン化に感受性である孤立電子対を所持する原子、例えばアミノ基の、無機酸または有機酸でのプロトン化によって、あるいは生理学的に許容されるカチオン（カルボン酸基など）の塩として、形成されることも可能である。例示的な塩基付加塩は、例えばアルカリ金属塩、例えばナトリウムまたはカリウム塩；アルカリ土類金属塩、例えばカルシウムまたはマグネシウム塩；亜鉛塩；アンモニウム塩；脂肪族アミン塩、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、プロカイン塩、メグルミン塩、エチレンジアミン塩、またはコリン塩；アラルキルアミン塩、例えばＮ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミン塩、ベンザチン塩、ベネタミン塩；複素環芳香族アミン塩、例えばピリジン塩、ピコリン塩、キノリン塩またはイソキノリン塩；四級アンモニウム塩、例えばテトラメチルアンモニウム塩、テトラエチルアンモニウム塩、ベンジルトリメチルアンモニウム塩、ベンジルトリエチルアンモニウム塩、ベンジルトリブチルアンモニウム塩、メチルトリオクチルアンモニウム塩またはテトラブチルアンモニウム塩；ならびに塩基性アミノ酸塩、例えばアルギニン塩、リジン塩またはヒスチジン塩を含む。例示的な酸付加塩は、例えば：鉱酸塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩（例えば、硫酸塩または硫酸水素塩）、硝酸塩、リン酸塩（例えばリン酸塩、リン酸水素塩、またはリン酸二水素塩）、炭酸塩、炭酸水素酸塩、過塩素酸塩、ホウ酸塩、またはチオシアン酸塩；有機酸塩、例えば酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、ペンタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヘプタン酸塩、オクタン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、デカン酸塩、ウンデカン酸塩、オレイン酸塩、ステアリン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、シュウ酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、アジピン酸塩、グルコン酸、グリコール酸塩、ニコチン酸塩、安息香酸塩、サリチル酸塩、アスコルビン酸塩、パモ酸塩（エンボナート）、ショウノウ酸塩、グルコヘプタン酸塩、またはピバル酸塩；スルホン酸塩、例えばメタンスルホン酸塩（メシレート）、エタンスルホン酸塩（エシレート）、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩（イセチオレート）、ベンゼンスルホン酸塩（ベシレート）、ｐ−トルエンスルホン酸塩（トシレート）、２−ナフタレンスルホン酸塩（ナプシレート）、３−フェニルスルホン酸塩、またはカンファースルホン酸塩；グリセロリン酸塩；ならびに酸性アミノ酸塩、例えばアスパラギン酸塩またはグルタミン酸塩を含む。
【００２１】
さらに、本発明の範囲は、任意の溶媒和型で、本発明にしたがって使用される化合物としては、例えば水との溶媒和物（すなわち、水和物など）、あるいは有機溶媒、例えばメタノール、エタノールまたはアセトニトリルなどとの溶媒和物（すなわち、メタノレート、エタノレートまたはアセトニトリレート）；あるいは任意の結晶形態のものが挙げられ、本発明にしたがって使用される化合物の斯かる溶媒和物はまた、それぞれの化合物の医薬的に許容され得る塩の溶媒和物を含むこともまた、理解されるべきである。
【００２２】
さらに、本発明にしたがって使用される化合物は、異なった異性体、特に立体異性体（例えば、幾何異性体（またはｃｉｓ／ｔｒａｎｓ異性体）、鏡像異性体およびジアステレオマーを含む）または互変異性体の形態で存在し得る。本願明細書で言及する化合物の斯かるすべての異性体は、混合物または純粋もしくは実質的に純粋な形態のいずれかで、本発明の一部として企図される。立体異性体に関して、本発明は、本発明により使用される化合物の単離された光学異性体、ならびに任意のその混合物（特にラセミ混合物／ラセミ体を含む）を含む。ラセミ体は、物理的方法、例えばジアステレオマー誘導体の分別再結晶、分離または結晶化、あるいはキラルカラムクロマトグラフィーによる分離などによって分離可能である。光学活性酸との塩形成、その後、結晶化を介して、個々の光学異性体をラセミ体から得ることも可能である。本発明はさらに、本明細書中に提供する化合物の任意の互変異性体も包含する。
【００２３】
本発明の範囲はまた、本発明にしたがって使用される化合物を含み、そしてそこで、１もしくは複数の原子が、対応する原子の特定の同位体によって置換される。例えば、本発明は、本願明細書で言及される化合物の使用を包含し、そしてそこで、１もしくは複数の水素原子（または、例えばすべての水素原子）が、重水素原子（すなわち、2Ｈ；「Ｄ」とも呼ばれる）で置換される。したがって、本発明はまた、重水素が豊富な本発明にしたがって使用される化合物も含む。天然に存在する水素は、約９９．９８ｍｏｌ−％の水素−１（1Ｈ）および約０．０１５６ｍｏｌ−％の重水素（2ＨまたはＤ）を含む同位体混合物である。本発明にしたがって使用される化合物の１もしくは複数の水素位置における重水素の含有量は、当該技術分野で知られている重水素化技術を使用して増強できる。例えば、本願明細書で言及した化合物、または対応する化合物の合成に使用されるべき反応物もしくは前駆体は、例えば、重水（Ｄ2Ｏ）を使用したＨ／Ｄ交換反応に供され得る。さらなる好適な重水素化技術は：Atzrodt J et al., Bioorg Med Chem, 20(18), 5658-5667, 2012; William JS et al., Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals, 53(11-12), 635-644, 2010；またはModvig A et al., J Org Chem, 79, 5861-5868, 2014に記載されている。重水素の含有量は、例えば質量分析法またはＮＭＲ分光法を使用して測定できる。別段の特定の指示がない限り、本発明にしたがって使用される化合物が重水素に富んでいないことが好ましい。したがって、本発明にしたがって使用される化合物内の水素原子または1Ｈ水素原子の存在が好まれる。
【００２４】
さらに、本発明は、ＢＲＤ４阻害剤を用いた治療に対する対象の感受性または応答性を評価する方法（特にインビトロ法）であって（ここで、該対象は、癌に罹患していると診断されるか、または癌に罹患していることが疑われる）、対象から得られたサンプル中の核内葉酸レベルおよび／またはＭＴＨＦＤ１の発現レベルを測定することを含む方法を提供する。
【００２５】
核内葉酸のより少ない／より低いレベルおよび／またはＭＴＨＦＤ１のより少ない／より低い発現レベル、特に対応する細胞の核内のＭＴＨＦＤ１タンパク質のより少ない／より低いレベルは、ＢＲＤ４阻害剤を用いた治療に対する対象のより高い感受性／応答性と相関することがわかった。ＭＴＨＦＤ１の総発現レベルも予測できると同時に、核内のＭＴＨＦＤ１タンパク質の量が、ＢＲＤ４阻害剤を用いた治療に対する対象の感受性／応答性のより一層正確な評価を可能にする。これにより、ＭＴＨＦＤ１の発現レベルが、核内のＭＴＨＦＤ１タンパク質のレベル、すなわち、対応する細胞の核内のＭＴＨＦＤ１タンパク質の量を測定することによって決定されることが好ましい。
【００２６】
本発明は、ＢＲＤ４阻害剤を用いた治療に対する対象の感受性または応答性を評価する方法（特にインビトロ法）であって（ここで、該対象は、癌に罹患していると診断されたか、または癌に罹患していることが疑われる）、対象から得られたサンプル中の核内葉酸レベルおよび／またはＭＴＨＦＤ１の発現レベルを測定するステップを含む方法をさらに提供する（ここで、対象からのサンプル中の核内葉酸のより低いレベルおよび／またはＭＴＨＦＤ１のより低い発現レベルは、対象がＢＲＤ４阻害剤を用いた治療により感受性またはより応答性であることを示唆する）。この方法において、核内葉酸のレベル（すなわち、対応する細胞の核内葉酸レベル）、またはＭＴＨＦＤ１の発現レベル、あるいはその両方は、ＢＲＤ４阻害剤を用いた治療に対する対象の感受性または応答性を評価するために決定されてもよい。
【００２７】
したがって、本発明はまた、ＢＲＤ４阻害剤を用いた治療に対する対象の感受性または応答性を評価する方法（特にインビトロ法）であって（ここで、該対象は、癌に罹患していると診断されたかまたは癌に罹患していることが疑われる）、対象から得られたサンプルの核内葉酸レベルを測定するステップを含む方法にも関する（ここで、該対象からのサンプル中の核内葉酸のより低いレベルは、ＢＲＤ４阻害剤を用いた治療に対して対象がより感受性であるかまたはより応答性であることを示唆する）。
【００２８】
本発明は、ＢＲＤ４阻害剤を用いた治療に対する対象の感受性または応答性を評価する方法（特にインビトロ法）であって（ここで、該対象は、癌に罹患していると診断されたか、または癌に罹患していることが疑われる）、対象から得られたサンプルにおいてＭＴＨＦＤ１の発現レベルを測定するステップを含む方法にさらに関する（ここで、該対象からのサンプルにおけるＭＴＨＦＤ１のより低い発現レベルは、ＢＲＤ４阻害剤を用いた治療に対して対象がより感受性またはより応答性であることを示唆する）。ＭＴＨＦＤ１の発現レベルは、核内ＭＴＨＦＤ１タンパク質のレベルを測定することによって、好ましくは測定される。
【００２９】
とりわけ、癌、ＢＲＤ４阻害剤、および対象／患者の説明を含め、葉酸代謝拮抗薬（または、ＭＴＨＦＤ１阻害剤）と、ＢＲＤ４阻害剤との組み合わせに関して本明細書中に提供した代表的であるまたは好ましい特徴／実施形態の説明もまた、先に記載した方法に適用される。
【００３０】
先に記載した方法で使用されるサンプルは、好ましくは癌組織生検サンプルである。癌の特定のタイプに依存して、サンプルはまた、血液サンプル（例えば、全血サンプル、または末梢血単核細胞画分）などの体液であってもよい。
【００３１】
先に記載した方法のいくつかにおいて、ＭＴＨＦＤ１の発現レベルは、調査する対象から得られたサンプルにおいて測定される。発現のレベルは、例えば、ＭＴＨＦＤ１の翻訳レベルまたは転写レベルを測定することによって、測定できる。よって、ＭＴＨＦＤ１の発現レベルを決定するために、サンプルにおけるＭＴＨＦＤ１タンパク質の量が決定されても、またはサンプルにおけるＭＴＨＦＤ１ｍＲＮＡの量が確定されてもよい。これは、例えば、Greenら2012（すなわち、Green, MR et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Fourth Edition, 2012, ISBN: 978-1936113422）に記載のとおり、当該技術分野で知られている方法を使用して達成できる。好ましくは、ＭＴＨＦＤ１の発現レベルは、ＭＴＨＦＤ１の翻訳レベルを測定することによって決定される。より好ましくは、ＭＴＨＦＤ１の発現レベルは、核内ＭＴＨＦＤ１タンパク質のレベル、すなわち、対応する細胞の核内に特有のＭＴＨＦＤ１タンパク質の量を測定することによって決定される。
【００３２】
ＭＴＨＦＤ１翻訳レベルは、例えば、免疫組織化学法、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）または放射免疫アッセイなどの抗体ベースのアッセイ（ＲＩＡ）（ここで、定量化されるＭＴＨＦＤ１タンパク質に対して特異的に指向された抗体が利用される）、あるいは質量分析法、ゲルベースのもしくはブロットベースのアッセイ、またはフローサイトメトリー（例えば、ＦＡＣＳ）を使用して決定できる。翻訳レベルが決定されるべき場合、対象からのサンプル中に１もしくは複数のプロテアーゼインヒビターを含んでいることが有利になり得る。
【００３３】
ＭＴＨＦＤ１転写レベルは、例えば、定量的（リアルタイム）逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（「ｑＲＴ−ＰＣＲ」）を使用するか、またはマイクロアレイ（例えばDing C, et al. J Biochem Mol Biol. 2004; 37(1):1-10を参照）を使用して決定できる。サンプルからの単独細胞におけるＭＴＨＦＤ１転写レベルを測定するために、単独細胞ｑＲＴ−ＰＣＲまたは単独細胞マイクロアレイ解析などの単独細胞遺伝子発現分析技術を使用することもまた可能である。転写レベルが決定されるべき場合、対象からのサンプル中に１もしくは複数のＲＮアーゼ阻害剤を含んでいることがさらに有利になり得る。
【００３４】
本発明によると、ＭＴＨＦＤ１の発現レベルが、ＭＴＨＦＤ１の翻訳レベルを測定することによって、特に核内ＭＴＨＦＤ１タンパク質のレベルを測定することによって、決定されることが好ましい。より好ましくは、ＭＴＨＦＤ１（または、核内ＭＴＨＦＤ１タンパク質のレベル）の翻訳レベルは、抗体ベースのアッセイ、質量分析法、ゲルベースのもしくはブロットベースのアッセイ、またはフローサイトメトリーを使用するか、より好ましくは、免疫組織化学法、酵素結合免疫吸着アッセイ、または放射免疫アッセイを使用して、より一層好ましくは、免疫組織化学法を使用して測定される。免疫組織化学的染色の方法は、当該技術分野で周知であり、例えば：Renshaw, S., Immunohistochemistry: Methods Express, Scion Publishing Ltd, Bloxham (UK), 2007, ISBN: 9781904842033 (particularly chapter 4 “Immunochemical staining techniques”)；Key, M., Immunohistochemical staining methods: education guide, 2006 (particularly chapter 9)；およびChen, X. et al. N Am J Med Sci 2(5), 241-245 (2010)に記載されている。
【００３５】
よって、核内ＭＴＨＦＤ１の量が決定されることが最も好ましい。蛍光抗体法および免疫組織化学は、特異的抗体を用いてタンパク質を染色するために、および（例えば、ＤＮＡ色素のようなＤＡＰＩ、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８またはＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２を用いた同時染色することよる）核内蛍光シグナルのレベルの測定に好適な方法である。あるいは、核は、図９に記載の細胞株からの単離と同様に腫瘍生検から単離される。核溶解物から、例えば：ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡおよび他の免疫学的な検出法；ＭＴＨＦＤ１触媒ステップの基質と生成物を検出することに基づく酵素法；ならびにプロテオミクス法、のうちのいずれか一つのような技術を使用して、ＭＴＨＦＤ１レベルが決定される。
【００３６】
ＭＴＨＦＤ１は、葉酸代謝における３つの酵素反応を触媒するＣ−１−テトラヒドロ葉酸シンターゼであり、テトラヒドロ葉酸（ＴＨＦ）、１０−ホルミルテトラヒドロ葉酸（１０−ＣＨＯ−ＴＨＦ）、５，１０−メテニルテトラヒドロ葉酸（５，１０−ＣＨ＝ＴＨＦ）および５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸（５，１０−ＣＨ2−ＴＨＦ）の相互変換をもたらす。ＭＴＨＦＤ１またはＢＲＤ４のいずれかのノックダウンが低レベルの５，１０−ＣＨ2−ＴＨＦをもたらすことが、発明者らによって観察された。すべての葉酸代謝産物の核内レベルは、核の分離、溶解、タンパク質の沈殿および、例えば、ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳやＥＬＩＳＡのような抗体ベースの方法を含めた方法を用いた分析に続いて、測定されてもよい。
【００３７】
本発明は、対象における癌治療の際の使用のためのＢＲＤ４阻害剤にさらに関し、ここで、該対象は、ＢＲＤ４阻害剤を用いた治療に対して感受性であるか、または応答性であると、先に記載した方法のいずれかで同定された。
【００３８】
そのうえ、本発明は、ＢＲＤ４阻害剤を用いた治療に対する対象の感受性または応答性を評価する方法（特にインビトロ法）における、（ｉ）遺伝子ＭＴＨＦＤ１の転写産物（すなわち、それに結合する）のための１組のプライマー、（ｉｉ）遺伝子ＭＴＨＦＤ１の転写産物のための（すなわち、それに結合する）核酸プローブ、（ｉｉｉ）遺伝子ＭＴＨＦＤ１の転写産物のための（すなわち、それに結合する）核酸プローブを含むマイクロアレイ、または（ｉｖ）タンパク質ＭＴＨＦＤ１に対する（すなわち、それに結合する）抗体の使用に関し、ここで、該対象は、癌に罹患していると診断されたか、または癌に罹患していることが疑われる（例えば、本明細書中で先に記載した任意の対応方法）。
【００３９】
（例えば、Green et al., 2012にも記載のように）当該技術分野で知られている方法を使用して、遺伝子ＭＴＨＦＤ１の転写産物の特異的増幅／定量化を可能にするように、プライマーが設計される。さらに、プライマーは、好ましくはＤＮＡプライマーである。
【００４０】
上述の転写産物は、好ましくは、遺伝子ＭＴＨＦＤ１のｍＲＮＡ、または遺伝子ＭＴＨＦＤ１のｍＲＮＡから合成されるｃＤＮＡである。核酸プローブは、転写産物とハイブリダイズできる核酸を含む、またはそのような核酸からなる。核酸プローブは、好ましくは１本鎖ＤＮＡプローブまたは１本鎖ＲＮＡプローブであり、より好ましくは１本鎖ＤＮＡプローブである。（例えば、１本鎖ＤＮＡであってもよく、１本鎖ＲＮＡであってもよく、好ましくは１本鎖ＤＮＡである）核酸プローブは、例えば１０〜８０ヌクレオチド、好ましくは１５〜６０ヌクレオチド、より好ましくは２０〜３５ヌクレオチド、およびよりいっそう好ましくは約２５ヌクレオチドを有する、オリゴヌクレオチドプローブであることがさらに好ましい。当技術分野において公知の（例えばGreen et al., 2012にも記載されているような）方法を使用して、対応する遺伝子の転写産物の特異的検出および定量を可能にするように、そのような核酸プローブを設計することができる。
【００４１】
タンパク質ＭＴＨＦＤ１に対する上述の抗体は、タンパク質ＭＴＨＦＤ１と特異的に結合し、例えば、ポリクローナル抗体であってもよく、またはモノクローナル抗体であってもよい。好ましくは、抗体はモノクローナル抗体である。抗体は、さらに、完全／インタクトな免疫グロブリン分子またはその断片／一部（例えば、分離された軽鎖もしくは重鎖、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ／ｃ断片、Ｆｖ断片、Ｆａｂ’断片、またはＦ（ａｂ’）2断片など）であってもよいが、断片／部分が対応する完全免疫グロブリン分子の結合特異性を実質的に保持することを条件とする。抗体は、修飾および／もしくは改変抗体、例えばキメラもしくはヒト化抗体、二重特異性もしくは三重特異性抗体、または抗体構築物（例えば、１本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）もしくは抗体融合タンパク質）であってもよい。抗体は、例えばHarlow, E. et al., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1998, ISBN: 978-0879695446にも記載されているような当技術分野において公知の方法を使用して調製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術（例えばKohler G, et al. Nature. 1975; 256(5517):495-7を参照）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（例えばKozbor D, et al. Immunol Today. 1983; 4(3):72-9を参照）またはＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（例えばCole SPC, et al. Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy. 1985; 27:77-96を参照）などの方法によって調製することができる。
【００４２】
よって、先に記載したように、本発明は、特に下記のものを提供する：
（ｉ）癌に罹患していると診断されたか、または癌に罹患していることが疑われる対象の癌を治療する方法における使用のためのＢＲＤ４阻害剤、該方法は：
−該対象から得られたサンプル中の核内葉酸レベルおよび／またはＭＴＨＦＤ１の発現レベルを測定し；
−該対象が、ＢＲＤ４阻害剤を用いた治療に対して感受性または応答性であるか否かを決定し、ここで、該対象からのサンプルにおけるより低いレベルの核内葉酸および／またはより低い発現レベルのＭＴＨＦＤ１は、その対象がＢＲＤ４阻害剤を用いた治療に対してより感受性であるか、またはより応答性であることを示唆し；そして
−該対象がＢＲＤ４阻害剤を用いた治療に対して感受性であるか、または応答性であると同定された場合に、その対象にＢＲＤ４阻害剤を投与すること、
を含む。
【００４３】
（ｉｉ）癌に罹患していると診断されたか、または癌に罹患していることが疑われる対象の癌を治療する方法における使用のためのＢＲＤ４阻害剤、該方法は：
−該対象から得られたサンプル中の核内葉酸レベルを測定し；
−該対象がＢＲＤ４阻害剤を用いた治療に対して感受性であるか、または応答性であるか否かを決定し、ここで、該対象からのサンプルにおけるより低いレベルの核内葉酸は、その対象がＢＲＤ４阻害剤を用いた治療に対してより感受性であるか、またはより応答性であるを示唆し；そして
−該対象がＢＲＤ４阻害剤を用いた治療に対して感受性であるか、または応答性であると同定された場合に、その対象にＢＲＤ４阻害剤を投与すること、
を含む。
【００４４】
（ｉｉｉ）癌に罹患していると診断されたか、または癌に罹患していることが疑われる対象の癌を治療する方法における使用のためのＢＲＤ４阻害剤、該方法は：
−該対象から得られたサンプルにおいてＭＴＨＦＤ１の発現レベルを測定し；
−該対象が、ＢＲＤ４阻害剤を用いた治療に対して感受性または応答性であるか否かを決定し、ここで、該対象からのサンプルにおけるより低い発現レベルのＭＴＨＦＤ１は、その対象がＢＲＤ４阻害剤を用いた治療に対してより感受性であるか、またはより応答性であることを示唆し；そして
−該対象がＢＲＤ４阻害剤を用いた治療に対して感受性であるか、または応答性であると同定された場合に、その対象にＢＲＤ４阻害剤を投与すること、
を含む。
【００４５】
（ｉｖ）癌に罹患していると診断されたか、または癌に罹患していることが疑われる対象の癌を治療する方法における使用のためのＢＲＤ４阻害剤、該方法は：
−該対象から得られたサンプル中の核内ＭＴＨＦＤ１タンパク質レベルを測定し；
−該対象が、ＢＲＤ４阻害剤を用いた治療に対して感受性または応答性であるか否かを決定し、ここで、該対象からのサンプルにおけるより低いレベルの核内ＭＴＨＦＤ１タンパク質は、その対象がＢＲＤ４阻害剤を用いた治療に対してより感受性であるか、またはより応答性であることを示唆し；そして
−該対象がＢＲＤ４阻害剤を用いた治療に対して感受性であるか、または応答性であると同定された場合に、その対象にＢＲＤ４阻害剤を投与すること、
を含む。
【００４６】
本発明にしたがって使用される化合物を、化合物自体として投与してもよいし、または医薬品として配合してもよい。医薬品／医薬組成物は、場合によって、１またはそれより多い医薬に許容される賦形剤、例えば担体、希釈剤、充填剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、着色剤、顔料、安定化剤、保存剤、抗酸化剤、または溶解性増進剤を含んでもよい。
【００４７】
医薬組成物は、１またはそれより多い溶解性増進剤、例えば約２００〜約５，０００Ｄａの範囲の分子量を有するポリ（エチレングリコール）を含むポリ（エチレングリコール）（例えば、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、またはＰＥＧ６００）、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール、非イオン性界面活性剤、チロキサポール、ポリソルベート８０、マクロゴール−１５−ヒドロキシステアレート、（例えば、Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）ＨＳ１５、ＣＡＳ７０１４２−３４−６）、リン脂質、レシチン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、シクロデキストリン、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−γ−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリン、ジヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、スルホブチルエチル−β−シクロデキストリン、スルホブチルエチル−γ−シクロデキストリン、グルコシル−α−シクロデキストリン、グルコシル−β−シクロデキストリン、ジグルコシル−β−シクロデキストリン、マルトシル−α−シクロデキストリン、マルトシル−β−シクロデキストリン、マルトシル−γ−シクロデキストリン、マルトトリオシル−β−シクロデキストリン、マルトトリオシル−γ−シクロデキストリン、ジマルトシル−β−シクロデキストリン、メチル−β−シクロデキストリン、カルボキシアルキルチオエーテル、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、酢酸ビニルコポリマー、ビニルピロリドン、ラウリル硫酸ナトリウム、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム、またはその組み合わせいずれかを含んでもよい。
【００４８】
医薬組成物を、当業者に知られる技術、例えば“Remington: The Science and Practice of Pharmacy”, Pharmaceutical Press, 22nd editionに公表される技術によって配合してもよい。医薬組成物を、経口、非経口、例えば筋内、静脈内、皮下、皮内、動脈内、心腔内、結腸、鼻、局所、エアロゾルまたは膣投与のための投薬型として配合してもよい。経口投与のための投薬型には、コーティングおよび非コーティング錠剤、軟ゼラチンカプセル、硬ゼラチンカプセル、ロゼンジ、トローチ、溶液、エマルジョン、懸濁物、シロップ、エリキシル剤、再構成用の粉末および顆粒、分散性粉末および顆粒、薬用ガム、咀嚼錠剤および発泡錠が含まれる。非経口投与用の投薬型には、溶液、エマルジョン、懸濁物、分散物、ならびに再構成用の粉末および顆粒が含まれる。非経口投与には、エマルジョンが好ましい投薬型である。結腸および膣投与のための投薬型には、座薬および膣座薬が含まれる。鼻投与のための投薬型を、吸入および吹送法によって、例えば計測吸入装置によって、投与してもよい。局所投与のための投薬型には、クリーム、ジェル、軟膏、膏薬、パッチおよび経皮送達系が含まれる。
【００４９】
本発明にしたがって使用される化合物、あるいは斯かる化合物を含む上記の医薬組成物を、全身性／末梢性のいずれかで、または所望の作用部位で、任意の慣用的な投与経路によって対象に投与してもよく、限定されるわけではないが：経口（例えば錠剤、カプセルとして、または摂取可能溶液として）、局所（例えば経皮、鼻内、目、頬、および舌下）、非経口（例えば注射技術または注入技術を用いて、そして例えば、注射、例えば皮下、皮内、筋内、静脈内、動脈内、心内、クモ膜下腔内、脊髄内、嚢内、嚢下、眼内、腹腔内、気管内、表皮下、関節内、クモ膜下、または胸骨内によるもの、例えば皮下または筋内へのデポーの移植によるものを含む）、肺（例えば口または鼻を通じた、例えばエアロゾルを用いた吸入または吹送療法による）、胃腸、子宮内、眼内、皮下、目（ガラス体内または前房内を含む）、結腸、または膣投与のうちの１もしくは複数が含まれる。
【００５０】
化合物または医薬組成物を非経口投与する場合、こうした投与の例には：化合物または医薬組成物の静脈内、動脈内、腹腔内、クモ膜下腔内、心室内、尿道内、胸骨内、心臓内、頭蓋内、筋内または皮下投与、および／または注入技術を用いることによる投与のうちの１もしくは複数が含まれる。非経口投与のため、化合物は、溶液を血液と等張にするため、他の物質、例えば十分な塩またはグルコースを含有してもよい無菌水溶液の形で、最適に用いられる。水溶液は、必要であれば、適切に緩衝しなければならない（好ましくは３〜９のｐＨに）。無菌条件下での適切な非経口配合物の調製は、当業者に周知の標準的医薬技術によって容易に達成される。
【００５１】
また、前記化合物または医薬組成物を、フレーバー剤または着色剤を含有してもよい、即時、遅延、修飾、持続、断続または調節放出適用のための、錠剤、カプセル、膣座薬、エリキシル剤、溶液または懸濁物の形で、経口投与してもよい。
【００５２】
錠剤は、賦形剤、例えば微結晶性セルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素カルシウムおよびグリシン、崩壊剤、例えばデンプン（好ましくはトウモロコシ、ジャガイモまたはタピオカデンプン）、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナトリウムおよび特定の複合ケイ酸、ならびに顆粒化結合剤、例えばポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、スクロース、ゼラチンおよびアカシアを含有してもよい。さらに、滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリルおよびタルクが含まれてもよい。また、類似のタイプの固形組成物をゼラチンカプセル中の充填剤として用いてもよい。これに関連して好ましい賦形剤には、ラクトース、デンプン、セルロース、または高分子量ポリエチレングリコールが含まれる。水性懸濁物および／またはエリキシル剤には、剤を、多様な甘味剤またはフレーバー剤、着色物質または顔料と、乳化剤および／または懸濁剤と、そして希釈剤、例えば水、エタノール、プロピレングリコールおよびグリセリン、ならびにその組み合わせと組み合わせてもよい。
【００５３】
あるいは、前記化合物または医薬組成物を座薬またはペッサリーの形で投与してもよいし、あるいはジェル、ヒドロゲル、ローション、溶液、クリーム、軟膏または散布剤の形で局所適用してもよい。また、本発明の化合物を、例えば皮膚パッチの使用によって、皮膚または経皮投与することも可能である。
【００５４】
また、前記化合物または医薬組成物は、徐放性システムによって投与されてもよい。徐放性組成物の好適な例は、造形品の形態での半透過性重合体マトリックス、例えば、フィルム、またはマイクロカプセルを含む。徐放性マトリックスとしては、例えば、ポリラクチド（例えばＵＳ３，７７３，９１９を参照）、Ｌ−グルタミン酸およびγ−エチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマー（Sidman, U. et al., Biopolymers 22:547-556 (1983)）、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（R. Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 (1981)およびR. Langer, Chem. Tech. 12:98-105 (1982)）、エチレン酢酸ビニル（R. Langerら、同上）またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシブチル酸（ＥＰ１３３９８８）が挙げられる。徐放性医薬組成物としては、リポソーム封入型化合物も挙げられる。本発明の化合物を含むリポソームは、例えば：ＤＥ３２１８１２１；Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82:3688-3692 (1985)；Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77:4030-4034 (1980)；ＥＰ００５２３２２；ＥＰ００３６６７６；ＥＰ０８８０４６；ＥＰ０１４３９４９；ＥＰ０１４２６４１；ＪＰ８３−１１８００８；ＵＳ４，４８５，０４５；ＵＳ４，５４４，５４５；およびＥＰ０１０２３２４のうちのいずれか１つに記載の方法など、当該技術分野で知られている方法によって調製される。
【００５５】
また、前記化合物または医薬組成物を、肺経路、直腸経路、または目の経路によって投与することも可能である。目への使用のため、これらを、等張ｐＨ調整無菌生理食塩水中の微粒子化懸濁物として、または好ましくは等張ｐＨ調整無菌生理食塩水中の溶液として、場合によって塩化ベンジルアルコニウムなどの保存剤と組み合わせて配合してもよい。あるいは、これらをペトロラタムなどの軟膏中に配合してもよい。
【００５６】
肺内投与、特に吸入法のための、本発明にしたがって使用される化合物の乾燥粉末配合物を調製することも想定される。斯かる乾燥粉末は、実質的に非結晶性ガラス質または実質的に結晶性の生理活性粉末をもたらす条件下での噴霧乾燥法によって調製され得る。したがって、本発明に使用される化合物の乾燥粉末は、ＷＯ９９／１６４１９またはＷＯ０１／８５１３６に開示された乳化／噴霧乾燥法によって作製できる。それぞれの化合物の溶液製剤の噴霧乾燥が、例えば、"Spray Drying Handbook", 5th ed., K. Masters, John Wiley & Sons, Inc., NY (1991)、ＷＯ９７／４１８３３、またはＷＯ０３／０５３４１１に一般に記載されているように実施できる。
【００５７】
皮膚への局所適用のため、例えば、１またはそれより多い以下：ミネラルオイル、流動ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、乳化ろうおよび水の混合物中に懸濁または溶解された活性化合物を含有する適切な軟膏として、前記化合物または医薬組成物を配合してもよい。あるいは、これらを、例えば、１またはそれより多い以下：ミネラルオイル、モノステアリン酸ソルビタン、ポリエチレングリコール、流動パラフィン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコールおよび水の混合物中に懸濁または溶解された適切なローションまたはクリームとして配合してもよい。
【００５８】
それにより、本発明は、本明細書中に提供する化合物または医薬組成物に関し、ここで、対応する化合物または医薬組成物は：経口経路；経皮、鼻腔内、眼、頬側、または舌下経路を含めた局所経路；皮下、皮内、筋肉内、静脈内、動脈内、心臓内、くも膜下腔内、脊髄内、嚢内、被膜下、眼窩内、腹腔内、気管内、表皮下、関節内、くも膜下、胸骨内、心室内、尿管内、または頭蓋内経路を含めた、注入技術または輸液技術を使用した腸管外経路；吸入法または吹送治療法によるものを含めた肺経路；胃腸経路；子宮内経路；眼内経路；皮下経路；硝子体内または前房内経路によるものを含めた眼経路；直腸経路；あるいは膣経路、のいずれかによって投与される。特に好ましい投与経路は、経口投与または非経口投与である。
【００５９】
典型的には、医師が、個々の対象に最も適しているであろう実際の投薬量を決定するであろう。任意の特定の個々の対象のための特定の用量レベルおよび投薬頻度は多様である可能性もあり、そして使用する特定の化合物、その化合物の代謝安定性および作用の長さ、年齢、体重、全身の健康状態、性別、食餌、投与様式および時間、排出速度、薬剤の組み合わせ、特定の状態の重症度、ならびに療法を受けている個々の対象を含む、多様な要因に応じるであろう。
【００６０】
本発明による葉酸代謝拮抗薬と（またはＭＴＨＦＤ１阻害剤と）ＢＲＤ４阻害剤との組み合わせ物はまた、癌の治療または予防のために、特に他の抗癌剤を含めた他の治療薬と組み合わせて使用されてもよい。本発明にしたがって上述の複合製剤が同じ疾患に対して活性なさらなる治療薬と組み合わせて使用されるとき、それぞれの化合物の用量は、化合物が単独で使用されるときの用量とは異なり得る。さらなる治療薬を伴った本発明の複合製剤の組み合わせ物は、本発明による複合製剤の化合物と同時に／併用してまたは連続して／別々に、さらなる治療薬の投与を含んでもよい。
【００６１】
好ましくは、本発明の複合製剤の化合物と組み合わせて投与しようとする、さらなる治療薬は、抗癌薬剤である。抗癌薬剤は：腫瘍血管新生阻害剤（例えばプロテアーゼ阻害剤、上皮増殖因子受容体キナーゼ阻害剤、または血管内皮増殖因子受容体キナーゼ阻害剤）；細胞傷害性薬剤（例えば代謝拮抗剤、例えばプリンおよびピリミジン類似体代謝拮抗剤）；有糸分裂阻害剤（例えば微小管安定化薬剤または抗有糸分裂アルカロイド）；白金配位錯体；抗腫瘍抗生物質；アルキル化剤（例えばナイトロジェンマスタードまたはニトロソ尿素）；内分泌剤（例えば副腎皮質ステロイド、アンドロゲン、抗アンドロゲン、エストロゲン、抗エストロゲン、アロマターゼ阻害剤、ゴナドトロピン放出ホルモンアゴニスト、またはソマトスタチン類似体）；あるいは腫瘍細胞において過剰発現される、および／または誤って制御されている特定の代謝経路に別の方式で関与する、酵素または受容体をターゲットとする化合物（例えばＡＴＰおよびＧＴＰホスホジエステラーゼ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、プロテインキナーゼ阻害剤（例えばセリン、スレオニンおよびチロシンキナーゼ阻害剤（例えばＡｂｅｌｓｏｎプロテインチロシンキナーゼ阻害剤など））ならびに多様な増殖因子、対応する受容体およびキナーゼ阻害剤（例えば上皮増殖因子受容体キナーゼ阻害剤、血管内皮増殖因子受容体キナーゼ阻害剤、線維芽細胞増殖因子阻害剤、インスリン様増殖因子受容体阻害剤および血小板由来増殖因子受容体キナーゼ阻害剤））；メチオニン；アミノペプチダーゼ阻害剤；プロテアソーム阻害剤；シクロオキシゲナーゼ阻害剤（例えばシクロオキシゲナーゼ−１またはシクロオキシゲナーゼ−２阻害剤）；トポイソメラーゼ阻害剤（例えばトポイソメラーゼＩ阻害剤またはトポイソメラーゼＩＩ阻害剤）、ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ阻害剤（ＰＡＲＰ阻害剤）、ならびに上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤／拮抗薬から選択されてもよい。
【００６２】
本発明の複合製剤の化合物と組み合わせて抗癌薬剤として使用可能なアルキル化剤は、例えばナイトロジェンマスタード（例えばシクロホスファミド、メクロレタミン（クロルメチン）、ウラムスチン、メルファラン、クロラムブシル、イホスファミド、ベンダムスチン、またはトロホスファミド）、ニトロソ尿素（例えばカルムスチン、ストレプトゾシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、プレドニムスチン、ラニムスチン、またはセムスチン）、アルキルスルホネート（例えば、ブスルファン、マンノスルファン、またはトレオスルファン）、アジリジン（例えばヘキサメチルメラミン（アルトレタミン）、トリエチレンメラミン、チオテパ（Ｎ，Ｎ’Ｎ’−トリエチレンチオホスホラミド）、カルボクオン、またはトリアジクオン）、ヒドラジン（例えばプロカルバジン）、トリアゼン（例えばダカルバジン）、またはイミダゾテトラジン（例えばテモゾロミド）であってもよい。
【００６３】
本発明の複合製剤の化合物と組み合わせて、抗癌薬剤として使用可能な白金配位錯体は、例えば、シスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチン、または四硝酸トリプラチンであってもよい。
【００６４】
本発明の複合製剤の化合物と組み合わせて抗癌薬剤として使用可能な細胞傷害性薬剤は、例えば、葉酸類似体代謝拮抗剤（例えばアミノプテリン、メトトレキセート、ペメトレキセド、またはラルチトレキセド）、プリン類似体代謝拮抗剤（例えばクラドリビン、クロファラビン、フルダラビン、６−メルカプトプリン（そのプロドラッグ型アザチオプリンを含む）、ペントスタチン、または６−チオグアニン）、およびピリミジン類似体代謝拮抗剤（例えばシタラビン、デシタビン、５−フルオロウラシル（そのプロドラッグ型カペシタビンおよびテガファーを含む）、フロクスウリジン、ゲムシタビン、エノシタビン、またはサパシタビン）を含む、代謝拮抗剤であってもよい。
【００６５】
本発明の複合製剤の化合物と組み合わせて抗癌薬剤として使用可能な有糸分裂阻害剤は、例えば、タキサン（例えばドセタキセル、ラロタキセル、オルタタキセル、パクリタキセル／タキソール、またはテセタキセル、ビンカアルカロイド（例えばビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンフルニン、ビンデシン、またはビノレルビン）、エポチロン（例えばエポチロンＡ、エポチロンＢ、エポチロンＣ、エポチロンＤ、エポチロンＥ、またはエポチロンＦ）あるいはエポチロンＢ類似体（例えばイキサベピロン／アザエポチロンＢ）であってもよい。
【００６６】
本発明の複合製剤の化合物と組み合わせた抗癌薬剤として使用可能な抗腫瘍抗生物質は、例えばアントラサイクリン（例えばアクラルビシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、アムルビシン、ピラルビシン、バルルビシン、またはゾルビシン）、アントラセンジオン（例えばミトキサントロン、またはピキサントロン）またはストレプトミセス属（Streptomyces）から単離された抗腫瘍抗生物質（例えばアクチノマイシン（アクチノマイシンＤを含む）、ブレオマイシン、マイトマイシン（マイトマイシンＣを含む）、またはプリカマイシン）であってもよい。
【００６７】
本発明の複合製剤の化合物と組み合わせて抗癌薬剤として使用可能なチロシンキナーゼ阻害剤は、例えば、アキシチニブ、ボスチニブ、セディラニブ、ダサチニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イマチニブ、ラパチニブ、レスタウルチニブ、ニロチニブ、セマキサニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、またはバンデタニブであってもよい。
【００６８】
本発明の複合製剤の化合物と組み合わせて抗癌薬剤として使用可能なトポイソメラーゼ阻害剤は、例えば、トポイソメラーゼＩ阻害剤（例えばイリノテカン、トポテカン、カンプトテシン、ベロテカン、ルビテカン、またはラメラリンＤ）またはトポイソメラーゼＩＩ阻害剤（例えばアムサクリン、エトポシド、リン酸エトポシド、テニポシド、またはドキソルビシン）であってもよい。
【００６９】
本発明の複合製剤の化合物と組み合わせて抗癌剤として使用できるＰＡＲＰ阻害剤は、例えば、ＢＭＮ−６７３、オラパリブ、ルカパリブ、ベリパリブ、ＣＥＰ９７２２、ＭＫ４８２７、ＢＧＢ−２９０、または３−アミノベンズアミドであってもよい。
【００７０】
本発明の複合製剤の化合物と組み合わせて抗癌剤として使用できるＥＧＦＲ阻害剤／拮抗薬は、例えば、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、アファチニブ、ネラチニブ、ＡＢＴ−４１４、ダコミチニブ、ＡＶ−４１２、ＰＤ１５３０３５、バンデタニブ、ＰＫＩ−１６６、ペリチニブ、カネルチニブ、イコチニブ、ポジオチニブ、ＢＭＳ−６９０５１４、ＣＵＤＣ−１０１、ＡＰ２６１１３、ＸＬ６４７、セツキシマブ、パニツムマブ、ザルツムマブ、ニモツズマブ、またはマツズマブであってもよい。
【００７１】
さらなる抗癌薬剤を、本発明の化合物と組み合わせて用いてもよい。抗癌薬剤は、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、タモキシフェン、アムサクリン、ベキサロテン、エストラムスチン、イロフルベン、トラベクテジン、セツキシマブ、パニツムマブ、トシツモマブ、アレムツズマブ、ベバシズマブ、エドレコロマブ、ゲムツズマブ、アルボシジブ、セリシクリブ、アミノレブリン酸、アミノレブリン酸メチル、エファプロキシラル、ポルフィマーナトリウム、タラポルフィン、テモポルフィン、ベルテポルフィン、アリトレチノイン、トレチノイン、アナグレリド、亜ヒ酸、アトラセンタン、ボルテゾミブ、カルモフール、セレコキシブ、デメコルシン、エレスクロモル、エルサミトルシン、エトグルシド、ロニダミン、ルカントン、マソプロコール、ミトブロニトール、ミトグアゾン、ミトタン、オブリメルセン、オマセタキシン、シチマジーン、セラデノベック、テガファー、テストラクトン、チアゾフリン、チピファルニブ、ボリノスタット、またはイニパリブのような生物学的または化学的分子を含んでもよい。
【００７２】
また、増殖性疾患に関与する癌または腫瘍マーカー／因子／サイトカインに対して向けられる、抗体、抗体断片、抗体構築物（例えば一本鎖構築物）、および／または修飾抗体（ＣＤＲ移植抗体、ヒト化抗体、「完全ヒト化」抗体などのようなもの）のような生物学的薬剤を、本発明の複合製剤の化合物との併用療法アプローチで使用してもよい。こうした生物学的分子の例は、抗ＨＥＲ２抗体（例えばトラスツズマブ、ハーセプチン（登録商標））、抗ＣＤ２０抗体（例えばリツキシマブ、リツキサン（登録商標）、マブテラ（登録商標）、レディタクス（登録商標））、抗ＣＤ１９／ＣＤ３構築物（例えばＥＰ１０７１７５２を参照）および抗ＴＮＦ抗体（例えばTaylor PC. Antibody therapy for rheumatoid arthritis. Curr Opin Pharmacol. 2003. 3(3):323-328を参照）である。本発明の複合製剤の化合物との併用療法アプローチにおいて使用されるさらなる抗体、抗体断片、抗体構築物および／または修飾抗体は：Taylor PC. Curr Opin Pharmacol. 2003. 3(3):323-328；またはRoxana A. Maedica. 2006. 1(1):63-65に見出され得る。
【００７３】
本発明の複合製剤の化合物と組み合わせて使用できる抗癌剤は、特に、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＯＸ４、ＣＳＦ１Ｒ、ＩＤＯ、またはＣＤ４０を標的化する、癌免疫治療薬（抗体（例えば、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体）など）、抗体フラグメント、抗体構築物（例えば、一本鎖構築物）、または修飾抗体（例えば、ＣＤＲグラフト抗体、ヒト化抗体、または「完全ヒト化」抗体）などであってもよい。斯かる癌免疫治療薬としては、例えば、抗ＣＴＬＡ−４抗体（特に拮抗性または経路遮断型抗ＣＴＬＡ−４抗体；例えば、イピリムバブまたはトレメリムマブ）、抗ＰＤ−１抗体（特に拮抗性または経路遮断型抗ＰＤ−１抗体；例えば、ニボルマブ（ＢＭＳ−９３６５５８）、ペムブロリズマブ（ＭＫ−３４７５）、ピジリズマブ（ＣＴ−０１１）、ＡＭＰ−２２４、またはＡＰＥ０２０５８）、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（特に経路遮断型抗ＰＤ−Ｌ１抗体；例えば、ＢＭＳ−９３６５５９、ＭＥＤＩ４７３６、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（ＲＧ７４４６）、ＭＤＸ−１１０５、またはＭＥＤＩ６４６９）、抗ＴＩＭ３抗体（特に経路遮断型抗ＴＩＭ３抗体）、抗ＬＡＧ３抗体（特に拮抗性または経路遮断型抗ＬＡＧ３抗体；例えば、ＢＭＳ−９８６０１６、ＩＭＰ７０１、またはＩＭＰ７３１）、抗ＯＸ４抗体（特に作動性抗ＯＸ４抗体；例えば、ＭＥＤＩ０５６２）、抗ＣＳＦ１Ｒ抗体（特に経路遮断型抗ＣＳＦ１Ｒ抗体；例えば、ＩＭＣ−ＣＳ４またはＲＧ７１５５）、抗ＩＤＯ抗体（特に経路遮断型抗ＩＤＯ抗体）、あるいは、抗ＣＤ４０抗体（特に作動性抗ＣＤ４０抗体；例えば、ＣＰ−８７０，８９３またはＣｈｉ Ｌｏｂ７／４）が挙げられる。さらなる癌免疫治療薬が、当該技術分野で知られており、例えば：Kyi C et al., FEBS Lett, 2014, 588(2):368-76；Intlekofer AM et al., J Leukoc Biol, 2013, 94(1):25-39；Callahan MK et al., J Leukoc Biol, 2013, 94(1):41-53；Ngiow SF et al., Cancer Res, 2011, 71(21):6567-71；およびBlattman JN et al., Science, 2004, 305(5681):200-5に記載されている。
【００７４】
上記のさらなる抗癌剤との組み合わせは、医薬製剤の形で使用するために好適に提示され得る。こうした組み合わせの個々の構成要素を、連続してまたは同時に／相伴ってのいずれかで、別個のまたは組み合わせた医薬製剤中で、任意の好適な経路によって、投与してもよい。投与が連続である場合、本発明の複合製剤の化合物、あるいは（単数もしくは複数の）さらなる治療薬のいずれが、最初に投与されてもよい。投与が同時である場合、組み合わせを同じ医薬組成物または異なる医薬組成物のいずれで投与されてもよい。同じ配合物中で組み合わせる場合、異なる化合物は安定で、そして互いにおよび配合物中の他の構成要素と適合しなければならないことが認識されるであろう。別個に配合される場合、これらは任意の好適な配合で提供されてもよい。
【００７５】
本発明の複合製剤の化合物を、物理的療法、例えば放射線療法と組み合わせて投与する。放射線療法は、本発明の複合製剤の化合物投与の前に、その後に、またはそれと同時に開始されてもよい。例えば、放射線療法は、対応する化合物投与の１〜１０分後、１〜１０時間後または２４〜７２時間後に開始されてもよい。なお、これらの時間枠は、限定として解釈されないものとする。対象は放射線、好ましくはガンマ線に曝露され、それによって放射線は、単回線量、あるいは数時間、数日および／または数週にわたって投与される多数回線量を提供されてもよい。ガンマ線は、標準被曝量および措置を用いた標準放射線療法プロトコールにしたがって、送達されてもよい。
【００７６】
よって、本発明は、癌の治療または予防において使用するための、本明細書中に先に記載した、葉酸代謝拮抗薬と（またはＭＴＨＦＤ１阻害剤と）ＢＲＤ４阻害剤との組み合わせ物に関し、ここで、この複合製剤（すなわち、ＢＲＤ４阻害剤と葉酸代謝拮抗薬またはＭＴＨＦＤ１阻害剤、あるいはこれらの剤を含む医薬組成物）の化合物は、さらなる抗癌剤と組み合わせて、および／または放射線療法と組み合わせて投与されるべきである。
【００７７】
本発明により治療される対象または患者は、動物（例えば、ヒト以外の動物）、脊椎動物、哺乳動物、げっ歯類（例えばモルモット、ハムスター、ラット、マウス）、ネズミ（例えばマウス）、イヌ科動物（canine）（例えばイヌ）、ネコ科動物（feline）（例えばネコ）、ブタの仲間（porcine）（例えば、ブタ（pig））、ウマの仲間（equine）（例えばウマ）、霊長類もしくはサルの仲間（simian）（例えばサル（monkey）または類人猿（ape））もしくはサル、例えばマーモセット、ヒヒ、ゴリラ、チンパンジー、オランウータン、テナガザルなど）、あるいは、ヒトであってもよい。本発明によると、経済的に、農学的に、または科学的に重要である動物が、治療されることが想定される。科学的に重要な生物には、限定されるわけではないが、マウス、ラット、およびウサギが含まれる。下等生物、例えばキイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）のようなショウジョウバエ、およびエレガンス線虫（Caenorhabditis elegans）のような線虫もまた、科学的なアプローチに使用され得る。農学的に重要な動物の限定されない例は、ヒツジ、ウシおよびブタであり、一方、例えばネコおよびイヌは、経済的に重要な動物と見なされ得る。好ましくは、対象／患者は哺乳動物である。より好ましくは、対象／患者はヒト、あるいは、ヒト以外の哺乳類（例えば、モルモット、ハムスター、ラット、マウス、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、サル、類人猿、マーモセット、ヒヒ、ゴリラ、チンパンジー、オランウータン、テナガザル、ヒツジ、ウシ、またはブタなど）である。最も好ましくは、対象／患者はヒトである。
【００７８】
障害または疾患の「治療」という用語は、本明細書において（例えば、癌の「治療」）、当該技術分野において周知である。障害または疾患の「治療」は、障害または疾患が患者／対象で疑われるか、または診断されたことを暗示する。障害または疾患を患うと推測される患者／対象は、典型的には、当業者が特定の病的状態に容易に起因させうる（すなわち障害または疾患の診断）、特定の臨床および／または病的症状を示す。
【００７９】
障害または疾患の「治療」は、例えば、障害または疾患の進行の停止（例えば症状の悪化がまったくない）あるいは障害または疾患の進行の遅延（進行の停止が一過性の性質のもののみである場合）を導くことも可能である。障害または疾患の「治療」はまた、障害または疾患を患う対象／患者の部分的反応（例えば症状の寛解）または完全反応（例えば症状の消失）を導くことも可能である。したがって、障害または疾患の「治療」はまた、例えば、障害または疾患の寛解も指し、そしてそれは、例えば、障害または疾患の進行の停止、あるいは障害または疾患の進行の遅延を導くことも可能である。こうした部分的または完全反応の後には、再発が続くこともありうる。対象／患者が、治療に対して広い範囲の反応（例えば、本明細書において上述するような、例示的な反応など）を経験しうることを理解すべきである。障害または疾患の治療は、とりわけ、治療処置（好ましくは、完全反応を導き、そして最終的に障害または疾患の治癒を導く）および緩和治療（症状軽減を含む）を含んでもよい。
【００８０】
障害または疾患の「予防」という用語は、本明細書において（例えば、癌の「予防」）、当該技術分野に周知である。例えば、障害または疾患を患う傾向があると推測される患者／対象は、特に、障害または疾患の予防から利益を受けうる。対象／患者は、限定されるわけではないが、遺伝的素因を含む、障害または疾患に対する感受性または素因を有する可能性もある。こうした素因は、例えば遺伝子マーカーまたは表現型指標を用いた標準的方法またはアッセイによって決定可能である。本発明にしたがって予防しようとする障害または疾患は、患者／対象において、診断されていないか、あるいは診断不能である（例えば患者／対象がいかなる臨床的または病的症状も示さない）ことが理解されるものとする。したがって、用語「予防」は、任意の臨床および／または病的症状が診断されるかまたは決定される、あるいは主治医によって診断されるかまたは決定されることが可能であるより前の、本発明の化合物の使用を含む。
【００８１】
本明細書中に使用される場合、別段の明確な指示がないかまたは文脈に矛盾しない限り、「a」、「an」および「the」という用語は、「１もしくは複数の」および「少なくとも１つ」と互換的に使用される。よって、例えば、「ａ」ＢＲＤ４阻害剤を含む組成物は、「１もしくは複数」のＢＲＤ４阻害剤を含む組成物を指すと解釈できる。本明細書中に使用される場合、「about」という用語は、好ましくは、示した数値の±１０％を指し、より好ましくは、示した数値の５±％を指し、そして特に、ちょうど示した数値を指す。例えば、「約１００」という表現は、好ましくは、１００±１０％、より好ましくは、１００±５％、そしてより一層好ましくは、特定値の１００を指す。
【００８２】
本明細書中に使用される場合、「含む（comprising）」（または、「含む（comprise）」、「含む（comprises）」、「含有する（contain）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」もしくは「含有する（containing）」）という用語は、別段の明確な指示がないかまたは文脈に矛盾しない限り、「とりわけ含有すること」、すなわち、「さらなる任意の要素の中に、．．．を含有すること」を意味する。それに加えて、この用語はまた、「から実質的に成る」および「から成る」といったより狭い意味も含む。例えば、「ＢとＣを含むＡ」という用語は、「ＢとＣをとりわけ含有する」という意味があり、ここで、Ａはさらなる任意の要素を含む可能性があるが（例えば、「Ｂ、ＣおよびＤを含有するＡ」が包含されるであろう）、この用語はまた、「ＢとＣから実質的に成るＡ」といった意味および「ＢとＣから成るＡ」といった意味も含む（すなわち、ＢとＣ以外の成分はＡに含まれない）。
【００８３】
本明細書中に使用される場合、「任意選択の」、「任意選択で」および「であり得る」という用語は、示した特徴が存在し得るが、不存在である可能性もあることを意味する。「任意選択の」、「任意選択で」または「であり得る」という用語が使用されるときはいつも、本発明は具体的に、両方の可能性、すなわち、対応する特徴が存在するか、または選択的に、対応する特徴が不存在である可能性に関する。例えば、組成物の成分が「任意選択」であると示されている場合、本発明は具体的には、両方の可能性、すなわち、対応する成分が存在する（組成物中に含まれる）か、または対応する成分が該組成物に不存在である可能性に関する。
【００８４】
本発明は具体的に、全体的なおよび／または好ましい特徴／実施形態のあらゆる組み合わせを含めた、本明細書中に記載した特徴および実施形態のありとあらゆる組み合わせに関することは、理解されるべきである。
【００８５】
本明細書において、特許文献および科学文献を含む多くの文書が引用される。これらの文書の開示は、本発明の特許可能性に対して関連するとは見なされないが、その全体が本明細書に援用される。より具体的には、すべての言及される文書は、各個々の文書が具体的にそして個々に、援用されると示されるのと同じ度合いに、援用される。
【００８６】
本願明細書における、あらゆる先行文献（またはそれより派生する情報）への言及は、対応する先行文献（またはそれより派生する情報）が本明細書の関連する技術分野における共通の一般知識の一部を形成するという同意もしくは承認、またはあらゆる形式の示唆と見なされないし、見なされてはならない。
【００８７】
本発明はまた、以下の例示的な図面によっても説明される。この付帯図面は、以下を示す：
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】Ｇｅｎｅ−Ｔｒａｐベースの遺伝子スクリーニングは、ＭＴＨＦＤ１がＢＲＤ４パートナーであると認定する。（Ａ）Ｇｅｎｅ−Ｔｒａｐベースの遺伝子スクリーニングの実験的アプローチの図式的概観。簡単に言えば、ＲＥＤＳ１細胞を、ＧＦＰレポーター遺伝子をコードするＧｅｎｅ−Ｔｒａｐウイルスで感染させる。遺伝子トラップした細胞は、ＧＦＰ蛍光によって認識できた。感染の１週間後に、ＧＦＰを発現する細胞およびＲＦＰ発現を、ＦＡＣＳソートし、（さらに２週間の間）増幅し、そして、配列決定のために加工した。（Ｂ）適用したＦＡＣＳソーティングストラテジーの代表的なパネル。上部パネルは、未感染ＲＥＤＳ１細胞である。下部パネルは、Ｇｅｎｅ−Ｔｒａｐ感染ＲＥＤＳ１細胞であり；３つの集団：非感染細胞（黒色）、感染およびＧＦＰ陽性細胞（緑色：７０％）および感染二重陽性（ＧＦＰ／ＲＦＰ）細胞（赤色：０．０１％）を識別できた。最後の集団を、ソートし、そして、配列決定した。各実験条件について、生物学的反復を三連おこなった。（Ｃ）Ｇｅｎｅ−Ｔｒａｐスクリーンからのヒットを例示するｃｉｒｃｕｓプロット。バブルサイズおよび中心からの距離は、それぞれ、独立した不活性化なＧｅｎｅ−Ｔｒａｐ配列決定された組み込みの数（正比例）およびｐ値（Ｆｉｓｈｅｒ検定で計算される、反比例）に比例する。（Ｄ）ＲＥＤＳ３における、表示したｓｈＲＮＡの下方制御後のＭＴＨＦＤ１タンパク質レベルを示すウエスタンブロット。ＭＴＨＦＤ１ブロット下の数字は、維持されたＭＴＨＦＤ１タンパク質のパーセンテージを示す。チューブリンをローディング対照として使用した。（Ｅ）ＭＴＨＦＤ１ ｓｈＲＮＡで処置したＲＥＤＳ１細胞の生細胞イメージング写真からのＲＦＰ陽性細胞の定量化。各実験条件（平均±ＳＴＤ）について生物学的反復を三連おこなった。（Ｆ）ＲＥＤＳ１細胞におけるＭＴＨＦＤ１ノックダウンの代表的な生細胞イメージング写真。ＲＦＰシグナルを白色で示す；スケールバーは１００μｍである。
【図２−１】ＢＲＤ４は、クロマチン上へのＭＴＨＦＤ１動員に不可欠である。（Ａ）ＭＥＧ０１、Ｋ５６２、ＭＶ４−１１、およびＭＯＬＭ−１３（角の四角形）でおこなわれたＢＲＤ４プルダウンの表示。タンパク質は円として表される：円の大きさは、そのタンパク質がＢＲＤ４相互作用因子として見出された細胞株の数を示す。
【図２−２】ＢＲＤ４は、クロマチン上へのＭＴＨＦＤ１動員に不可欠である。（Ｂ）上部パネル：ＨＡＰ１、ＫＢＭ７、およびＨＥＫ２９３Ｔ（２９３Ｔ）細胞株における核対サイトゾル画分で、表示したタンパク質のレベルを示すウエスタンブロット。ＲＣＣ１を核のローディング対照として使用し、さらに、チューブリンをサイトゾルのローディング対照として使用した。下部パネル：先に報告した３種類の細胞株の全細胞溶解液に対して実施したＭＴＨＦＤ１プルダウンアッセイを示すウエスタンブロット。
【図２−３】ＢＲＤ４は、クロマチン上へのＭＴＨＦＤ１動員に不可欠である。（Ｃ）表示した化合物を用いて２時間（ｄＢＥＴ１：０．５μＭ；ｄＢＥＴ６：０．５μＭ；ＭＴＸ：１μＭ）または２４時間（ｄＢＥＴ１：０．５μＭ；ｄＢＥＴ６：０．０５μＭ；ＭＴＸ：１μＭ）処理したＨＡＰ１細胞から抽出したクロマチン関連タンパク質サンプルに対して実施したウエスタンブロットアッセイ。Ｈ２Ｂを、クロマチンローディング対照として使用した。（Ｄ）表示した化合物で２４時間（ｄＢＥＴ１：０．５μＭ；ｄＢＥＴ６：０．０５μＭ；ＭＴＸ：１μＭ）処理したＨＡＰ１細胞における核対サイトゾル画分により、表示したタンパク質のレベルを示すウエスタンブロット。ＲＣＣ１を核ローディング対照として使用し、さらに、チューブリンを、サイトゾルローディング対照として使用した。
【図２−４】ＢＲＤ４は、クロマチン上へのＭＴＨＦＤ１動員に不可欠である。（Ｅ）図面に示したように（ＤＡＰＩは、ＢＲＤ４染色の四角形の内側の小さい四角形の中に示されている）、表示した化合物で処理し、そして、ＢＲＤ４、ＭＴＨＦＤ１およびＤＡＰＩについて染色したＨｅＬａ細胞の免疫蛍光写真。スケールバーは１０のμｍである。
【図３】ＢＲＤ４と厳密に重複するＭＴＨＦＤ１ゲノム占有率。（Ａ）ＢＲＤ４ピークとＭＴＨＦＤ１ピークの間の距離のグラフ表示；左側の小さい灰色の長方形（総ＭＴＨＦＤ１ピークの０．５の割合／ＢＲＤ４から最大５０ｋｂの距離）は、より小さい灰色のグラフに縮小される。（Ｂ）ＭＴＨＦＤ１ピークにおけるＭＴＨＦＤ１（暗灰色）、Ｈ３Ｋ２７Ａｃ（灰色）、ＢＲＤ４（明灰色）およびＩｇＧ（超明灰色）に関する遺伝子本体のカバー度の表示。ＴＳＳとは転写開始部位であり、ＴＥＳは転写終止部位である。（Ｃ）ＭＴＨＦＤ１（暗灰色）、Ｈ３Ｋ２７Ａｃ（灰色）、ＢＲＤ４（明灰色）によって占有された３つのゲノム遺伝子座の表示。
【図４ａ】ＭＴＨＦＤ１およびＢＲＤ４の下方制御は、類似した核内代謝変化を誘発する。（Ａ）葉酸経路の表示。酵素名を幾何学的図形の内側に報告し、さらに、代謝産物を矢印上に記載する。白色のそれらの酵素は、クロマチンと接触しているとわかった。クロマチン関連タンパク質を、ＨＡＰ１細胞から抽出し、ＬＣ−ＭＳによって分析した。
【図４ｂ−ｄ】ＭＴＨＦＤ１およびＢＲＤ４の下方制御は、類似した核内代謝変化を誘発する。（Ｂ）ＢＲＤ４およびＭＴＨＦＤ１を下方制御したＨＡＰ１細胞における代謝産物倍率変化を表すＶｏｌｃａｎｏプロット。ドットの寸法および色は、有意に（大きく、かつ、黒色）または有意ではなく（小さく、かつ、灰色）変動した核内代謝産物を表す。（Ｃ）核内代謝産物に対する、ＢＲＤ４またはＭＴＨＦＤ１下方制御によって誘発された変化の間の相関関係（相関係数０．６）を示すドットプロット。（Ｄ）核内葉酸代謝産物に対する、ＢＲＤ４またはＭＴＨＦＤ１下方制御によって誘発された変化の間の相関関係（相関係数０．８）を示すドットプロット。
【図５ａ】（Ａ）単独のまたは組み合わせて、表示した濃度の（Ｓ）−ＪＱ１およびＭＴＸで処理したＨ２３細胞の細胞生存率の低減を示すマトリックス（各ポイントとも二連でおこなった、等量のＤＭＳＯを対照として加えた）。
【図５ｂ】（Ｂ）単独のまたは組み合わせて、表示した濃度の（Ｓ）−ＪＱ１およびＭＴＸで処理したＲＥＤＳ１ ＲＦＰ陽性細胞の倍率変化を表すマトリックス（各ポイントとも二連でおこなった、等量のＤＭＳＯを対照として加えた）。
【図６】（Ａ）０．５μＭの（Ｓ）−ＪＱ１で処理したＲＥＤＳ１、ＲＥＤＳ２、ＲＥＤＳ３およびＲＥＤＳ４細胞の代表的なＦＡＣＳパネル；等量のＤＭＳＯを対照として使用した。各実験条件について、生物学的反復を三連おこなった。（Ｂ）ＰＩ染色およびＦＡＣＳによるＤＮＡ含量分析によって評価した代表的な細胞サイクルプロファイル。ＲＥＤＳ１、ＲＥＤＳ３およびＲＥＤＳ４細胞を、ハプロイドＷＴ−ＫＢＭ７（灰色のプロファイル）と比較する。各実験条件について、生物学的反復を三連おこなった。（Ｃ）ＤＡＰＩで染色した中期核染色体スプレッドの調製；スケールバー１０μｍ。各実験条件について、生物学的反復を三連おこなった。（Ｄ）ＰＩ染色によって評価した、（Ｓ）−ＪＱ１で一晩または（Ｒ）−ＪＱ１で１週間処理した細胞の代表的な細胞サイクルプロファイル、およびＦＡＣＳによるＤＮＡ含量分析；等量のＤＭＳＯを対照として使用した。各実験条件について、生物学的反復を三連おこなった。
【図７】（Ａ）ＲＥＤＳ１細胞でおこなわれたＦＩＳＨアッセイの代表的な写真。ＲＦＰプローブ（白色のドット）は、ＲＦＰ挿入物を染色し；ＤＡＰＩ（灰色のシグナル）は核を染色する。破線は核の外周を示す。スケールバーは１０μｍである。（Ｂ）１μＭの（Ｓ）−ＪＱ１で２４時間処理したＲＥＤＳ１の代表的な生細胞イメージング写真；等量のＤＭＳＯを対照として使用した。ＲＦＰ発現は赤色で示されている；スケールバーは１００μｍである。（Ｃ）ＢＲＤ１、ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤＴまたはＢＲＤ４を下方制御したＲＥＤＳ１細胞において、ＲＴ−ＰＣＲによって評価したＢＲＤ１、ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤＴおよびＢＲＤ４発現；各実験条件について、生物学的反復を三連おこなった（平均±ＳＴＤ）。（Ｄ）ＢＲＤ１、ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤＴまたはＢＲＤ４を下方制御したＲＥＤＳ１細胞の生細胞イメージング写真からのＲＦＰ陽性細胞の定量化。各実験条件について、生物学的反復を三連おこなった（平均±ＳＴＤ）。（Ｅ）ＲＦＰ遺伝子座の表示。ＲＦＰは、第６染色体にて（ｃｈｒ６：２０，５２０，５４２−２０，５８８，４１９）アンチセンス方向に、ＣＤＫＡＬ１遺伝子の第一イントロン（センス方向）に挿入される。
【図８】（Ａ）ＭＤＣ１およびＭＴＨＦＤ１遺伝子上のＧｅｎｅ−Ｔｒａｐ組み込み部位の表示。明灰色の矢印はセンス挿入を示し；灰色の矢印は、アンチセンス挿入を示す。（Ｂ）ＲＥＤＳ３において表示したｓｈＲＮＡを用いた下方制御後のＭＴＨＦＤ１タンパク質レベルを示すウエスタンブロット。チューブリンをローディング対照として使用した。（Ｃ）ＭＴＨＦＤ１ ｓｈＲＮＡで処理したＲＥＤＳ３細胞の生細胞イメージング写真からのＲＦＰ陽性細胞の定量化。各実験条件について、生物学的反復を三連おこなった（平均±ＳＴＤ）。（Ｄ）ＭＴＨＦＤ１ノックダウンＲＥＤＳ３細胞の代表的な生細胞イメージング写真。ＲＦＰシグナルは白色で示される；スケールバーは１００μｍである。
【図９ａ−ｂ】（Ａ）単独でＧＦＰ−ＭＴＨＦＤ１またはＧＦＰを過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔからのタンパク質抽出物を使用したＧＦＰプルダウンを示すウエスタンブロット。チューブリンをローディング対照として使用した。（Ｂ）ＨｅＬａ細胞におけるＢＲＤ４プルダウンを示すウエスタンブロット。
【図９ｃ】（Ｃ）ＭＳ分析法に使用されるプルダウン方法のパイプライン。
【図９ｄ−ｅ】（Ｄ）ギンコール酸（ＧＡ）で７２時間処理したＨＡＰ１細胞の核およびサイトゾル画分に対して実施したウエスタンブロット。ＲＣＣ１を核ローディング対照として使用し、さらに、チューブリンをサイトゾルローディング対照として使用した。（Ｅ）（Ｆ）に使用したＭＴＨＦＤ１アセチル化ペプチドを示す表。
【図９ｆ】（Ｆ）表示したＭＴＨＦＤ１アセチル化ペプチドおよびＧＳＴ−ＢＲＤ４（完全長）を用いて実施したＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイ。アッセイを二連反復試験でおこなった（平均±ＳＴＤ）。
【図９ｇ】（Ｇ）ＧＳＴ−ＢＲＤ４（完全長）と組み合わせたＭＴＨＦＤ１−Ｋ５６Ａｃペプチド力価のＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイ。アッセイを二連反復試験でおこなった（平均±ＳＴＤ）。
【図９ｈ】（Ｈ）アセチル化ＭＴＨＦＤ１（Ｋ５６ａｃ）ペプチドへのＢＲＤ４ブロモドメインの結合。ＭＴＨＦＤ１（Ｋ５６ａｃ）ペプチド（親和性（変異体））の予測される親和性を、ＢＲＤ４に対して計算されたＢＲＤ４（親和性（ＷＴ））と共結晶化されたヒストンペプチドと比較した。陰性スコアであるほど、より高い親和性を示唆している。同様に、結合形状のペプチドの安定性を、本来のヒストン（安定性（ＷＴ））およびＭＴＨＦＤ１（Ｋ５６ａｃ）ペプチドについて計算する。
【図９ｉ】（Ｉ）上部パネル：５０μＭの（Ｓ）−ＪＱ１、ＭＴＸ、ＭＴＨＦＤ１ｋ５６Ａｃ（６）ペプチドまたはＭＴＨＦＤ１Ｋ８７８Ａｃペプチド（１）で処理したＨＡＰ１の全細胞溶解液に対して実施したＭＴＨＦＤ１プルダウン；等量のＤＭＳＯを対照として使用した。下部パネル：表示したタンパク質のレベルを示すウエスタンブロット。ＨＡＰ１の全細胞抽出物を、これまでと同様に処理し、そして、チューブリンをローディング対照として使用した。
【図９ｊ】（Ｊ）ＭＴＨＦＤ１の結合ポケットへのメトトレキサートの結合。メトトレキサートは、ＭＴＨＦＤ１のＬｙｓｉｎｅ５６と相互作用すると予測され（左パネル）、そしてこの相互作用は、Ｋ５６がアセチル化されたときに消失する（右パネル）。
【図１０】クロマチン状態（Ａ）およびゲノム領域（Ｂ）のＭＴＨＦＤ１（暗灰色）、Ｈ３Ｋ２７Ａｃ（灰色）、ＢＲＤ４（明灰色）の占有率。ＴＳＳは、転写開始部位であり、ＴＥＳは転写終止部位である。（Ｃ）ＭＴＨＦＤ１ピークのＨ３Ｋ２７Ａｃ遺伝子本体カバー度およびＭＴＨＦＤ１ピークのＢＲＤ４遺伝子本体カバー度を示すヒートマップ。
【図１１】有意な遺伝子捕捉遺伝子座の一覧。その表中に報告された遺伝子座は、有意なｐ値と組み合わせて１０個を超える挿入を示した場合に選択された。灰色かつ斜体のものが、同定した長くないコードＲＮＡ（図１Ｃのｃｉｒｃｕｓプロットでは未報告）であり；黒色かつ通常のものが、同定したコード遺伝子である。値を、Ｆｉｓｈｅｒ検定を使用して計算した。
【図１２】（Ａ）核代謝産物サンプル調製に使用した実験的ワークフローの例示。ＢＲＤ４またはＭＴＨＦＤ１下方制御によって有意に減少（９４）（Ｂ）または増加（７９）（Ｃ）した核内代謝産物のオーバラップを示すベン図。
【図１３】（Ａ）癌データベース（WT；http://www.cancerrxgene.org）のWelcome Trust-Genomics of Drug Sensitivityに報告されていた（Ｓ）−ＪＱ１およびＭＴＸのＩＣ50値の表。（Ｂ）表示した細胞株における（Ｓ）−ＪＱ１（灰色）およびＭＴＸ（暗灰色）のＩＣ50測定。（Ｃ）ＲＥＤＳ１クローンにおける（Ｓ）−ＪＱ１（灰色）またはＭＴＸ（暗灰色）滴定による発赤の倍率変化。
【図１４ａ】（Ａ）上部パネル：免疫沈降反応実験に使用したＭＴＨＦＤ１およびＢＲＤ４構築物。下部パネル：表示した構築物を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞からのＧＦＰ免疫沈降反応は、ＢＲＤ４の短いアイソフォームと、ＭＴＨＦＤ１（Ｋ５６Ａ）との相互作用の増強、およびＭＴＨＦＤ１（Ｋ５６Ｒ）との相互作用の減少を示す。同様に、相互作用は、ＢＲＤ４二重ブロモドメイン変異体において損なわれる。
【図１４ｂ】（Ｂ）表示した構築物を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞からのＧＦＰ免疫沈降反応は、完全長のＭＴＨＦＤ１とＢＲＤ４との相互作用を示すが、タンパク質の個々のドメインと相互作用は示さなかった。
【図１４ｃ】（Ｃ）白血病細胞株におけるＢＲＤ４−ＭＴＨＦＤ１相互作用のウエスタンブロットによる確認。
【図１４ｄ】（Ｄ）ｄＢＥＴ６で２時間処理した、ＭＥＧ−０１、Ｋ−５６２、ＭＶ４−１１およびＭＯＬＭ−１３細胞のクロマチン画分からのウエスタンブロット。
【図１５ａ】（Ａ）ＫＥＡＰ１（左）およびＴＦＡＰ４（右）のＨ３Ｋ２７ａｃマークプロモーターに結合するＢＲＤ４およびＭＴＨＦＤ１の代表的なゲノムブラウザ像。すべてのＣｈＩＰトラックを、すべてのマッピング読み出しに対して正規化し、そしてそれぞれのＩｇＧ対照を、組み合わせた複製トラックから差し引いた。
【図１５ｂ】（Ｂ）Ｈ３Ｋ２７ａｃピーク中のＢＲＤ４およびＭＴＨＦＤ１のＣｈＩＰシグナルの集積。ピークを、Ｈ３Ｋ２７ａｃ存在量によってソートしたので、データは、マッピング読み出し１００万個あたりの塩基対あたりの読み出しに組み合わせた複製を表す。
【図１５ｃ−ｆ】（Ｃ）ｄＢＥＴ６処理とＤＭＳＯ処理との間の示差的な結合部位の上位５００個によるＢＲＤ４およびＭＴＨＦＤ１の集積。（Ｄ）ｄＢＥＴ６処理とＤＭＳＯ処理との間の示差的な結合部位の上位５００個の連結セットにおけるＢＲＤ４およびＭＴＨＦＤ１の存在量のクラスタリング。距離測定として相関関係を用いた階層的なクラスタリングを使用した。値は、対応するＩｇＧシグナルによって正規化した推定因子の存在量を表す。（Ｅ）０．１μＭのｄＢＥＴ６、１μＭの（Ｓ）−ＪＱ１、１μＭのＭＴＸ、ＢＲＤ４またはＭＴＨＦＤ１を標的化したｓｈＲＮＡで処理したＨＡＰ１細胞のトランスクリプトーム解析のためのヒートマップ。等量のＤＭＳＯ、または非標的化ヘアピンを、それぞれの対照条件として使用した。（Ｆ）ＨＡＰ１細胞のＣｈＩＰ−ＳｅｑおよびＲＮＡ−Ｓｅｑデータの統合。ＢＲＤ４またはＭＴＨＦＤ１のいずれかのノックダウンによって上方制御される（暗灰色）または下方制御される（明灰色）遺伝子に関連する部位にて結合しているＢＲＤ４およびＭＴＨＦＤ１。値は、対応するＩｇＧシグナルによって正規化した推定因子の存在量を表し、そして分布の平等をコルモゴロフ−スミルノフ検定で評価した。
【図１６ａ−ｃ】（Ａ）（左から右に向かって）ＫＭＴ５Ａ、ＢＥＮＤ３、ＫＭＴ２Ａ、ＳＫＩＤＡ１のＨ３Ｋ２７ａｃマークプロモーターに結合するＢＲＤ４およびＭＴＨＦＤ１の例示的なゲノムブラウザ像。すべてのトラックを、ゲノムのすべてのマッピング読み出しに対して正規化し、そしてそれぞれのＩｇＧ対照を組み合わせた複製トラックから差し引いた。異なった条件下の同じ因子のトラックスを、比較のために同様にスケーリングした。１μＭのｄＢＥＴ６で２時間の処理によるＢＲＤ４およびＭＴＨＦＤ１結合の損失に留意すること。（Ｂ）ｄＢＥＴ６処理とＤＭＳＯ処理との間のＭＴＨＦＤ１またはＢＲＤ４による示差的な結合部位の上位５００個におけるＢＲＤ４およびＭＴＨＦＤ１の定量化。値は、対応するＩｇＧシグナルによって正規化した推定因子の存在量を表す。エラーバーは９５％信頼区間を表す。（Ｃ）ｄＢＥＴ６処理による示差的ＢＲＤ４またはＭＴＨＦＤ１結合を有する領域の連結セットで見られる強化モチーフ。頻発性の「ＧＧＡＡ」モチーフを見出したことに留意する。
【図１６ｄ】（Ｄ）ｄＢＥＴ６処理により結合するＢＲＤ４またはＭＴＨＦＤ１による示差的な遺伝子結合の際に強化されるリアクトーム経路の期間。中央のヒートマップは、どの遺伝子がそれぞれの期間に属するか例示している。右側の強化スコアは「ログ（ｐ値）*Ｚスコア」を表し、ここで、該Ｚスコアは、Ｅｎｒｉｃｈｒによって規定される予想ランクからの遺伝子セットの偏差である。
【図１６ｅ】（Ｅ）交差相関分析によるＣｈＩＰ−ｓｅｑライブラリーの質。Ｘ軸は、それだけアラインした２つの鎖がシフトされる量（塩基対単位）であり、そして、Ｙ軸は、各シフト位置における鎖内のシグナル間の交差相関を表す。交差相関（暗灰色の破線でマークした）の最初の増大は、使用した読み出しの長さに関連したノイズなので、２番目が、免疫沈殿タンパク質の強化に関連した本当のシグナル（明灰色の破線）であり、一般的に、該タンパク質によるＤＮＡ結合の平均の長さを反映する。ベースラインで正規化した交差相関（ＮＳＣ）の量と２つの交差相関値（ＲＳＣ）の間の比は、シグナル対ノイズ比の示唆であり、そのためライブラリーの質（Ｑｔａｇ、０から２まで増加する）の示唆でもある。
【図１７】（Ａ）０．１μＭのｄＢＥＴ６、１μＭの（Ｓ）−ＪＱ１、１μＭのＭＴＸ、単独もしくは組み合わせてＢＲＤ４またはＭＴＨＦＤ１を標的化したｓｈＲＮＡで処理したＨＡＰ１細胞の相対転写変化のヒートマップ。等量のＤＭＳＯ、または非標的化ヘアピンを、それぞれの対照条件として使用した。（Ｂ）ＨＡＰ１細胞におけるＣｈＩＰ−ＳｅｑおよびＲＮＡ−Ｓｅｑデータの統合。ＢＲＤ４もしくはＭＴＨＦＤ１のいずれかのノックダウン、またはＪＱ１もしくはメトトレキサートのいずれかを用いた処理によって上方制御される（白色）または下方制御される（黒色）遺伝子に関連する部位にて結合しているＢＲＤ４およびＭＴＨＦＤ１。相対的な上方制御または下方制御されたセットとして、同じサイズのランダムなセットの遺伝子における結合を対照として示す。値は、対応するＩｇＧシグナルによって正規化した推定因子の存在量を表し、そして分布の平等をコルモゴロフ−スミルノフ検定で評価した。
【図１８】（Ａ）０．１μＭのｄＢＥＴ６、１μＭの（Ｓ）−ＪＱ１、１μＭのＭＴＸ、単独もしくは組み合わせてＢＲＤ４またはＭＴＨＦＤ１を標的化したｓｈＲＮＡで処理したＫ−５６２細胞における相対転写変化のヒートマップ。等量のＤＭＳＯ、または非標的化ヘアピンを、それぞれの対照として使用した。（Ｂ）０．１μＭのｄＢＥＴ６、１μＭの（Ｓ）−ＪＱ１、１μＭのＭＴＸ、単独もしくは組み合わせてＢＲＤ４またはＭＴＨＦＤ１を標的化したｓｈＲＮＡで処理したＡ５４９細胞における相対転写変化のヒートマップマトリックス。等量のＤＭＳＯ、または非標的化ヘアピンを、それぞれの対照として使用した。
【図１９ａ】（Ａ）葉酸経路の表示。酵素名を幾何学的図形の内側に報告し、さまざまな代謝産物を接続する。マススペクトル分析によってＨＡＰ１およびＫ−５６２細胞においてクロマチンに関連することが分かった酵素を、それぞれ明灰色および暗灰色で示した。生物学的反復を二連おこなった。
【図１９ｂ】（Ｂ）１μＭのマイトマイシンＣ、アクチノマイシンＤ、ボルテゾミブ、ＭＴＸおよび（Ｓ）−ＪＱ１、０．５μＭのｄＢＥＴ６または１２．５μＭのシクロへキサミドで６時間処理したＨＡＰ１細胞の核およびサイトゾル画分における葉酸代謝産物レベルの相対変化を示すヒートマップ。等量のＤＭＳＯを対照として使用し、各実験条件について、生物学的反復を二連おこなった。
【図２０】ＨＡＰ１クロマチン抽出物のＭＳ分析法によって確認したペプチドカウントおよびスペクトルカウント。生物学的反復を二連おこなった。クロマチンとの関連が見出された葉酸経路の酵素を通常体で表記し、それに対して、見出せなかったものを斜体で表記する。ＢＲＤ４およびヒストンを、クロマチン関連タンパク質の対照として示す。
【図２１】（Ａ）Ａ５４９細胞におけるＭＴＨＦＤ１のノックダウンと、それに続くより高い濃度の（Ｓ）−ＪＱ１を用いた７２時間の処理。（Ｂ）１９日目から、３０ｍｇ／ｋｇの（Ｓ）−ＪＱ１で週に５回および／または２５ｍｇ／ｋｇのＭＴＸで週に２回処理したＡ５４９異種移植マウスモデルからの腫瘍体積。１群あたり８匹のマウスの平均および標準偏差。アスタリスクは、有意性を示す（*ｐ＜０．０５；**ｐ＜０．００５；***ｐ＜０．０００１）。実験終了時（４３日目）の腫瘍の（Ｃ）重量および（Ｄ）画像。
【発明を実施するための形態】
【００８９】
以下の実施例の参照によって、本発明をこれから説明するが、これらの実施例は単に例示するためだけのものであり、本発明の範囲を限界するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【００９０】
方法：
細胞培養とトランスフェクション
ＫＢＭ７（ヒト慢性骨髄性白血病細胞株）、ＭＶ４−１１（Ｂ骨髄性単球性混合型白血病）、ＭＥＧ−０１（ヒト慢性骨髄性白血病）、Ｋ−５６２（ヒト慢性骨髄性白血病）およびＨＡＰ１（ＫＢＭ７由来）細胞株を、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Gibco）を補ったＩｓｃｏｖｅ’ｓ変法ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ、Gibco）中で培養した。ＨＥＫ２９３Ｔ（ヒト胚腎臓）およびＨＥＬＡ（子宮頚部腺癌）細胞株を、１０％のＦＢＳを補ったダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Gibco）中で培養した。ＭＯＬＭ−１３（ヒト急性単球性白血病）、ＮＯＭＯ−１（ヒト急性単球性白血病）およびＡ５４９（肺癌）細胞株を、１０％のＦＢＳを補ったＲＰＭＩ−１６４０（Roswell Park Memorial Institute、Gibco）中で培養した。言及したすべての細胞株を、３７℃にて５％のＣＯ2雰囲気中でインキュベートした。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、製造業者の取扱説明書にしたがって、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Invitrogen）で形質移入した。
【００９１】
レトロウイルスＧｅｎｅ−Ｔｒａｐベクター（ｐＧＴ−ＧＦＰ；以下を参照）は、the Cell biology, Signaling, Therapeutics Program, Ludwig Cancer Research (Oxford, UK)のグループリーダーであるDr. Sebastian Nijmanから進呈された。
ＧＦＰ−ＭＴＨＦＤ１プラスミドは、the Division of Nutritional Sciences, Cornell University (Ithaca, NY)のディレクターであるPatrick Stover教授（イタケー（ＮＹ））から進呈された。
【００９２】
ウエスタンブロット法と免疫沈降反応
ウエスタンブロットのために、タンパク質を、ＳＤＳ泳動バッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ、３８０ｍＭのグリシン、７ｍＭのＳＤＳ）を用いてポリアクリルアミドゲルで分離し、ニトロセルロースブロッティング膜に移した。すべての膜を、ブロッキングバッファー（ＴＢＳＴ（Ｔｗｅｅｎを伴ったＴｒｉｓ緩衝生理食塩水：５０ｍＭのＴｒｉｓ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０）、ｐＨ７．６に調整）中の５％（ｍ／ｖ）の粉ミルク（BioRad））でブロッキングした。タンパク質を、ＢＲＤ４（ａｂ１２８８７４、１：１０００、Abcam）、アクチン（ａｂ１６０３９、１：１０００、Abcam）、ＭＴＨＦＤ１（ａｂ７０２０３、Abcam；Ｈ１２０、Santa Cruz；Ａ８、Santa Cruz、すべて１：１０００にて使用）、ＧＦＰ（Ｇ１０３６２、１：１０００、Life Technology）、ＲＣＣ１（Ｃ−２０、１：１０００、Santa Cruz）、β−チューブリン（Ｔ−４０２６、１：１０００、Sigma）、ＳＨＭＴ１（ａｂ１８６１３０、１：１０００、Abcam）およびＨ２Ｂ（ａｂ１５６１９７、１：１０００、Abcam）に対する抗体で探査し、ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）複合ロバ抗ウサギＩｇＧ抗体（ａｂ１６２８４、１：５０００、Abcam）またはロバ抗マウスＩｇＧ抗体（Pierce）によって検出し、そして、提供したプロトコールにしたがって、Ｐｉｅｒｃｅ ＥＣＬウエスタンブロッティング基質（Amersham）を用いて可視化した。
【００９３】
免疫沈降反応のために、１ｍｇのタンパク質抽出物を、１μｇのＢＲＤ４（ａｂ１２８８７４、Abcam）、ＭＴＨＦＤ１（Ａ８、Santa Cruz）またはＧＦＰ（Ｇ１０３６２、Life Technology）抗体と共に４℃にて一晩プレインキュベートした、１０μｌのＤｙｎａｂｅａｄｓ（ＡまたはＧのいずれか、Life Technology）と共に４℃にて２時間インキュベートした。
【００９４】
免疫蛍光法と生細胞イメージング
免疫蛍光法のために、細胞を、Ｐｏｌｙｌｙｓｉｎｅ（Sigma）で事前にコーティングしたカバーガラス上で培養した。所望の処理後に、細胞を、ＰＢＳで洗浄し、少なくとも２４時間冷メタノールで固定した。ブロッキングを、ＰＢＳ／３％のウシ血清アルブミンの（ＢＳＡ）／０．１％のＴｒｉｔｏｎ中で３０分間実施した。次に、細胞を、一次抗体（ＭＴＨＦＤ１ Ｈ１２０、Santa Cruz、ＢＲＤ４ ａｂ１２８８７４、Abcam）と共に室温にて３０分間インキュベートした。洗浄後に、それらを、二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ヤギ抗ウサギおよびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６ロバ抗マウス、Thermo Fisher Scientific）と共に暗所において３０分間インキュベートした。最後に、それらを、洗浄し、そして、ＤＡＰＩ（４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）と共に暗所において室温にて５分間インキュベートした。３回ＰＢＳ洗浄ステップをおこない、過剰な抗体およびＤＡＰＩを取り除き、そしてカバーガラスを、没食子酸プロピル（Sigma）と共にスライド上に乗せた。写真を、Ｌｅｉｃａ ＤＭＩ６０００Ｂ倒立顕微鏡および６３×油浸対物レンズを用いて撮影し、Ｆｉｊｉ（ImageJ）を用いて分析した。
【００９５】
生細胞イメージング写真を、Ｏｐｅｒｅｔｔａ Ｈｉｇｈ Ｃｏｎｔｅｎｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（PerkinElmer）、２０×対物レンズ、および非共焦モードで、透明な平底９６ウェルまたは３８４ウェルプレート（Corning）上に播種した細胞で撮影した。ＲＦＰ定量化を、使用した特定の細胞株の核直径範囲（ＫＢＭ７、１３μｍ）に合わせた、核検出および分析のための基本的なPerkinElmerのソフトウェアを使用しておこなった。ＲＦＰ陽性核だけを検出し、カウントした。
【００９６】
細胞サイクルアッセイ
細胞周期アッセイのために、１００万個の細胞を、７０％のエタノールで２４時間固定し、ＰＢＳ／１％のＢＳＡ／０．１％のＴｗｅｅｎで洗浄し、そして、リボヌクレアーゼと共に２０分間インキュベートした。核を、５μｇ／ｍｌのＰＩ（ヨウ化プロピジウム、Sigma）で１０分間染色し、その後、ＦＡＣＳ分析（ＢＤ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）した。
【００９７】
ＲＮＡ抽出とＲＴ−ＰＣＲ
ＲＮＡ抽出を、標準的なプロトコールにしたがって、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Life Technologies）を用いておこない、そして、逆転写（ＲＴ）を、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Applied Biosystems）を使用して実施した。
ＱＰＣＲを、製造業者のプロトコールに記載のＰｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒミックス（Invitrogen）を使用して実施した。
【００９８】
使用したＱＰＣＲプライマー：
アクチン（Sigma；フォワード５’−ＡＴＧＡＴＧＡＴＡＴＣＧＣＣＧＣＧＣＴＣ、リバース５’−ＣＣＡＣＣＡＴＣＡＣＧＣＣＣＴＧＧ）。
ＢＲＤ１（Sigma；フォワード５’−ＧＡＡＧＡＡＧＣＡＧＴＴＴＧＴＧＧＡＧＣ、リバース５’−ＧＣＡＧＴＣＴＣＡＧＣＧＡＡＧＣＴＣＡＣ）。
ＢＲＤ２（Sigma；フォワード５’−ＧＣＴＴＧＧＧＡＡＧＡＣＴＴＴＧＴＴＧＧ、リバース５’−ＴＧＴＣＡＧＴＣＡＣＣＡＧＧＣＡＧＡＡＧ）。
ＢＲＤ３（Sigma；フォワード５’−ＡＡＧＡＡＧＡＡＧＧＡＣＡＡＧＧＡＧＡＡＧＧ、リバース５’−ＣＴＴＣＴＴＧＧＣＡＧＧＡＧＣＣＴＴＣＴ）。
ＢＲＤ４（Sigma；フォワード５’−ＣＡＧＧＡＧＧＧＴＴＧＴＡＣＴＴＡＴＡＧＣＡ、リバース５’−ＣＴＡＣＴＧＴＧＡＣＡＴＣＡＴＣＡＡＧＣＡＣ）。
ＢＲＤＴ（Sigma；フォワード５’−ＴＣＡＡＡＧＡＴＣＣＣＧＡＴＴＧＡＡＣＣ、リバース５’−ＣＧＧＡＡＡＧＧＴＡＣＴＴＧＧＧＡＣＡＡ）。
【００９９】
リアルタイム増幅の結果物を、内因性ハウスキーピング遺伝子であるアクチンに対して正規化した。相対量を、比較ＣＴ（サイクル閾値）法（ΔΔＣＴ法）を使用して計算した。
【０１００】
Ｇｅｎｅ−Ｔｒａｐ遺伝子スクリーニング
ｐＧＴ−ＧＦＰは、不活性な３’ＬＴＲ、強力なアデノウイルス（Ａｄ４０）スプライス受容部位、ＧＦＰおよびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含む。Ｇｅｎｅ ｔｒａｐウイルスを、レトロウイルスパッケージングプラスミドと組み合わせたｐＧＴ−ＧＦＰを用いた、Ｔ１５０ディッシュ内の２９３Ｔ細胞のトランスフェクションによって作出した。ウイルス含有上清を、トランスフェクションの３０、４８および７２時間後に回収し、そして、ＳＷ３２Ｔｉローターを使用したＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｏｐｔｉｍａ Ｌ−１００ ＸＰ超遠心機により２４１００ｒｐｍにて１．５時間超遠心を使用して濃縮した。
【０１０１】
ＲＥＤＳ１クローンを、２０００ｒｐｍにて４５分間スピン感染を使用して、１ウェルあたり１００万個の細胞を含む２４ウェル組織培養ディッシュの感染によって突然変異誘発した。ＧＴ感染細胞を、ＦＡＣＳによって評価して、感染のパーセンテージ（ＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージ）を測定した。斯かるパーセンテージが７０％を超えた場合、ＲＥＤＳ１ ＧＦＰ／ＲＦＰ二重陽性細胞を、ソートし、培養状態に２週間おいて、配列決定のためのライブラリー作成に使用するために適当な量の細胞を得た。
【０１０２】
細胞ソーティング
ＲＦＰ／ＧＦＰ二重陽性細胞ソーティングを、ＦＡＣＳＡｒｉａ（BD Biosciences）ソーターを使用して実施した。陽性または陰性ＲＦＰまたはＧＦＰ集団のためのゲートを、適切な陽性または陰性対照を使用しておこなった。ＲＦＰ／ＧＦＰ二重陽性細胞を、ＧＴ感染の７日後にソートした。ＲＦＰ／ＧＦＰ二重陽性細胞を、培養して、ＤＮＡライブラリー作成のために必要な量（３０００万個）を得た。
【０１０３】
ＤＮＡライブラリー調製
ＤＮＡを、３０００万個のＧＦＰ／ＲＦＰ二重陽性ＲＥＤＳ１細胞から、Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ単離ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡミニキット（Qiagen）を使用して抽出した。４μｇをＮｌａＩＩＩまたはＭｓｅＩで消化した（各酵素で４回消化）。スピンカラム精製（Qiagen）後に、１μｇの消化ＤＮＡを、３００μｌの体積（４回のライゲーションの合計）でＴ４ ＤＮＡリガーゼ（NEB）を使用してライゲーションした。反応混合物を精製し、そして、レトロウイルス挿入部位を、次の作出配列決定に合わせた逆ＰＣＲプロトコールによって同定した16。
【０１０４】
ＦＩＳＨアッセイ
ＲＦＰ特異的プローブ（ＲＦＰ＿プローブ）を、ＲＦＰ特異的プライマー（Sigma；フォワード５’−ＣＧＧＴＴＡＡＡＧＧＴＧＣＣＧＴＣＴＣＧ、リバース５’−ＡＧＧＣＴＴＣＣＣＡＧＧＴＣＡＣＧＡＴＧ）を使用して実施したＰＣＲにかけ、そして、ｄｉｇ−ｄＵＴＰ（ＤＩＧ Ｎｉｃｋ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｍｉｘ、Roche）を使用して標識した。ＦＩＳＨアッセイ手順を、先に記載したとおりに実施した15。
【０１０５】
ＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイ
Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ Ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ Ａｓｓａｙ（ＡｌｐｈａＬＩＳＡｃ）（均質、かつ、化学発光ベースの方法）を、ＢＲＤ４とアセチル化基質との直接的な相互作用を調査するために実施した。
【０１０６】
簡単に言えば、このアッセイでは、ビオチン化ＭＴＨＦＤ１アセチル化ペプチド（可能性のある基質）を、ストレプトアビジン結合ドナービーズによって捕獲した。ＧＳＴタグ付与ＢＲＤ４（先に記載のとおり作製15）は、アクセプタービーズと複合化した抗ＧＳＴ抗体によって認識され、そして、結合される。ＢＲＤ４とあるアセチル化ペプチドとの間の相互作用の場合、パートナー間の近接（＜２００ｎｍ）は、ドナービーズの励起（６８０ｎｍの波長）が、その後のアクセプタービーズのエネルギー移行カスケードを引き起こす一重線酸素分子（1Ｏ2）の放出を誘発し、６１５ｎｍにおける発光の鋭いピークをもたらすことを可能にする。
【０１０７】
ＧＳＴ−ＢＲＤ４および各ＭＴＨＦＤ１アセチル化ペプチドを一緒にインキュベートした。３０分後、ＧＳＨ（グルタチオン）アクセプタビーズ（PerkinElmer）を加え、３０分間のさらなるインキュベーション時間後に、ストレプトアビジン複合化ドナービーズ（PerkinElmer）を加えた。シグナルのカウント（アルファカウント）を、ＥｎＶｉｓｉｏｎ２１０４ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｒｅａｄｅｒ（PerkinElmer）によって読み取った。
【０１０８】
プロテオミクスのための有核細胞抽出物の調製
核抽出物を、５．０×１０ｅ６細胞／ｍＬにて培養した新しい細胞から作製した。細胞を、遠心分離によって回収し、ＰＢＳで洗浄し、そして、低張バッファーＡ（２５ｍｌあたり１０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．４、１．５ｍＭのＭｇＣｌ2、１０ｍＭのＫＣｌ、２５ｍＭのＮａＦ、１ｍＭのＮａ3ＶＯ4、１ｍＭのＤＴＴ、および１錠のＲｏｃｈｅプロテアーゼインヒビター錠剤）中に再懸濁した。約３分後に、細胞を、遠心処理して沈下させ、バッファーＡ中に再懸濁し、そして、ダンス型ホモジェナイザーを使用して均質化した。核を、３３００ｒｐｍにて１０分間の遠心分離によって微量遠心管内に回収し、バッファーＡで洗浄し、そして、１当量の抽出バッファーＢ（２５ｍｌあたり５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．４、１．５ｍＭのＭｇＣｌ2、２０％のグリセロール、４２０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＮａＦ、１ｍＭのＮａ3ＶＯ4、１ｍＭのＤＴＴ、４００単位／ｍｌのＤＮアーゼＩ、および１錠のＲｏｃｈｅプロテアーゼインヒビター錠剤）中で均質化した。抽出は、その抽出物を１３０００ｇの遠心分離によって浄化する前に、４℃にて３０分間、撹拌しながら進められた。抽出物を、バッファーＤ（５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．４（ＲＴ）、１．５ｍＭのＭｇＣｌ2、２５ｍＭのＮａＦ、１ｍＭのＮａ3ＶＯ4、０．６％のＮＰ４０、１ｍＭのＤＴＴ、およびＲｏｃｈｅプロテアーゼインヒビター）中に３：１で希釈し、再び遠心分離し、そして、アリコートを、液体窒素中で急冷し、−８０℃にて保存した。
【０１０９】
免疫精製（ＩＰ−ＭＳ）
抗ＢＲＤ４（Ａ３０１−９８５Ａ、Bethyl Labs）抗体（５０μｇ）を、１００μｌのＡｍｉｎｏＬｉｎｋ樹脂（Thermo Fisher Scientific）に連結した。細胞溶解物サンプル（５ｍｇ）を、予洗した免疫樹脂と共に振盪機上で４℃にて２時間インキュベートした。ビーズを、０．４％のＩｇｅｐａｌ−ＣＡ６３０を含有する溶解バッファー中で、および界面活性剤を含まない溶解バッファー中で洗浄し、続いて、１５０ｍＭのＮａＣｌを用いた２回の洗浄ステップをおこなった。サンプルを、それらを還元し、アルキル化し、トリプシンで消化する前に、Ｌｙｓ−Ｃおよびグリシンプロテアーゼを用いたビーズ上での消化によって加工した。
【０１１０】
ナノＬＣ−ＭＳ分析
使用したナノＨＰＬＣシステムは、Ｐｒｏｘｅｏｎナノスプレーソース（Thermo Fisher Scientific、Odense, Denmark）を備えたＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ質量分析計（Thermo Fisher Scientific、Bremen, Germany）に連結したＵｌｔｉＭａｔｅ３０００ＨＰＬＣ−ＲＳＬＣナノシステム（Thermo Fisher Scientific、Amsterdam, Netherlands）であった。
【０１１１】
Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ質量分析計を、完全スキャンを使用して（ｍ／ｚ範囲３５０〜１６５０、７００００の公称分解能、標的値１Ｅ６）、データ依存モードで操作し、続いて、１２種類の最も豊富なイオンのＭＳ／ＭＳスキャンをおこなった。正規化衝突エネルギー３０％、分離幅２を使用し、および標的値を５Ｅ４に設定して、ＭＳ／ＭＳスペクトルを得た。断片化のために選択した前駆イオン（荷電状態２以上）を、３０秒間、動的除外リストに載せた。さらに、アンダーフィル比を２０％に設定し、２Ｅ４の強度閾値をもたらした。ペプチドマッチ特性および除外同位体特性を有効にした。
【０１１２】
データ分析
ペプチド同定のために、ＲＡＷ−ファイルを、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ（バージョン１．４．０．２８８、Thermo Scientific）にロードした。すべての本明細書によって得られたＭＳ／ＭＳスペクトルを、ヒトｓｗｉｓｓｐｒｏｔタンパク質配列データベースに対してＭａｓｃｏｔ２．２．０７（Matrix Science, London, UK）を使用して検索した。以下の検索パラメーターを使用した：システイン上のβ−メチルチオール化を、固定修飾、メチオニンの酸化として設定した。モノアイソトピック質量を、トリプシンペプチドの無制限タンパク質質量の範囲内で検索した。ペプチド質量の許容範囲を、±５ｐｐｍに設定し、断片質量の許容範囲を±３０ｍｍｕに設定した。切れ残りの最大数を２に設定した。タンパク質領域の計算のために、Ｅｖｅｎｔ ＤｅｔｅｃｔｏｒノードおよびＰｒｅｃｕｒｓｏｒ Ｉｏｎｓ Ａｒｅａ Ｄｅｔｅｃｔｏｒノード（Ｔｈｅｒｍｏ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒに組み込まれている両方）を使用した。結果を、Ｔｈｅｒｍｏ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒに組み込まれているＰｅｒｃｏｌａｔｏｒアルゴリズムを使用して１％のＦＤＲにフィルタリングした。無標識定量化を含めた三連反復試験の実施の追加データ処理を、Ｍａｓｃｏｔデータベース検索と同じ検索パラメーターを適用したＡｎｄｒｏｍｅｄａサーチエンジンを使用したＭａｘＱｕａｎｔで実施した。その後の統計解析のために、Ｐｅｒｓｅｕｓソフトウェアプラットフォームを、Ｖｏｌｃａｎｏプロット、ヒートマップ、および階層的なクラスタリングを作成するために使用した。
【０１１３】
ＣｈＩＰｍｅｎｔａｔｉｏｎ
ＣｈＩＰｍｅｎｔａｔｉｏｎ実験を、Schmidl et al., Nature Methods 201517に記載のとおり実施した。
【０１１４】
ＣｈＩＰ−Ｓｅｑサンプル調製
７０〜８０％の集密度の細胞を伴った３枚の１５ｃｍディッシュを、１回のＣｈＩＰ実験に使用した。簡単に言えば、細胞を、１％のホルムアルデヒドを用いて、室温にて１０分間架橋処理し、次に、１２５ｍＭのグリシンで、室温にて５分間クエンチした。次に、細胞を、冷たいＰＢＳで洗浄し、１５ｍｌチューブ内に回収し、そして、４℃、１２００ｒｐｍにて５分間の遠心分離によって冷たいＰＢＳで再び洗浄して、最終的に急冷した。
【０１１５】
ＣｈＩＰを、ＢＲＤ４（Bethyl Laboratories, Inc.）およびＭＴＨＦＤ１（ｓｃ−２７１４１３、Santa Cruz）抗体を使用することによって、記載のとおり実施した18。要するに、架橋細胞溶解物を、クロマチンを２００〜５００ｂｐの断片に破砕するために超音波処理した。断片化したクロマチンを、抗体と一緒に４℃にて一晩インキュベートし、続いて、あらかじめブロッキングしておいたＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ（Thermo Fisher Scientific）と共に４℃にて２時間インキュベートした。ビーズを、低塩バッファーで２回洗浄し、高塩バッファーで２回洗浄し、ＬｉＣｌバッファーで２回洗浄し、１×ＴＥバッファーで２回洗浄し、最後に、溶出バッファーで６５℃にて２０分間溶出した。溶出生成物を、ＲＮａｓｅＡで３７℃にて３０分間処理し、続いて、プロテイナーゼＫで５５℃にて１時間処理し、次に、６５℃にて一晩インキュベートして、架橋を取り除いた。サンプルを、ＰＣＲ精製キット（Qiagen）を使用することによってさらに精製した。ＣｈＩＰ−ｓｅｑライブラリーを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ３０００／４０００プラットフォームおよび５０ｂｐのシングルエンド形状を使用して、ＣｅＭＭのＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｆａｃｉｌｉｔｙによって配列決定した。
【０１１６】
ＣｈＩＰ−ｓｅｑデータ分析
アダプターを含む読み出しを、Ｓｋｅｗｅｒ19を使用してトリミングし、「超高感度」パラメーターを用いたＢｏｗｔｉｅ２20を使用してヒトゲノムのｈｇ１９／ＧＲＣｈ３７組立物に対してアラインし、そして、二連反復試験の読み出しにマークを付し、ｓａｍｂａｍｂａを用いて除外した。ライブラリーの質を、ｐｈａｎｔｏｍＰｅａｋＱｕａｌｔｏｏｌｓスクリプト21を用いて評価した。視覚化だけのために、発明者らは、ＢＥＤＴｏｏｌｓ22のｇｅｎｏｍｅＣｏｖｅｒａｇｅＢｅｄコマンドを用いてゲノムブラウザトラックを作り出し、そして、各値が、マッピングおよびフィルタリングした読み出し１００万個あたりの１塩基対あたりの読み出しカウントを表すように正規化した。これを、個別に各サンプルについて、および組み合わせた複製についておこなった。視覚化において、発明者らは、ＩＧＶ23を使用して、それぞれ組み合わせたＩＰからそれぞれ組み合わせた対照ＩｇＧトラックを差し引いた。彼らは、「因子」モードでＨＯＭＥＲ ｆｉｎｄＰｅａｋｓ24を使用して、バックグラウンドとして対応するＩｇＧ対照を用いて両複製におけるピークを呼び出し、そして、ＤｉｆｆＢｉｎｄ25を使用して、ｄＢＥＴ６処理に依存するＨ３Ｋ２７ａｃピークにおけるＢＲＤ４またはＭＴＨＦＤ１の示差的結合を検出した。（ｐ値でソートした）各比較に関する上位５００個の示差的領域を、ＳｅｑＰｌｏｔｓ26を用いた視覚化、およびＤｉｆｆＢｉｎｄを用いて見積もられた各条件のそれぞれの因子の濃度値を使用することを伴ったクラスタリングのために使用した。同じ上位の示差的領域を、ＢＥＤファイルとしてＥｎｒｉｃｈｒ２７に入力し、そして、リアクトーム経路に関する強化を拾い出した。
【０１１７】
分子モデリング
ＢＲＤ４に対するＭＴＨＦＤ１（Ｋ５６ａｃ）の結合親和力を計算するために、任意のペプチドと共結晶化したＢＲＤ４の６つの結晶構造を、ＲＣＳＢ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａｂａｎｋ（ＰＤＢ；ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ）28からダウンロードした。Ｘ線構造を、ＭＯＥソフトウェアパッケージのＱｕｉｃｋＰｒｅｐプロトコールを使用して調製した。それで、水素となくなった原子を加え、荷電を計算し、プロトン化状態を最適化し、そして衝突と変形を、不足エネルギーを最小化することによって取り除いた。共結晶化ペプチドをＭＴＨＦＤ１（Ｋ５６ａｃ）に変異させる前に、Ａｓｎ１４０とアセチル化Ｌｙｓとの重要な相互作用を抑制した。仮想変異、ならびに親和性と安定性の計算を、ＭＯＥソフトウェアパッケージのＰｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎツール（既定の設定用いたＲｅｓｉｄｕｅ Ｓｃａｎ）を使用して実施した。
【０１１８】
ＭＴＨＦＤ１（アセチル化および非アセチル化）へのメトトレキサート（ＭＴＸ）の結合を予測するために、Ｘ線構造１Ａ４Ｉを、ＭＯＥのＱｕｉｃｋＰｒｅｐプロトコールによって調製した。１Ａ４Ｉの結合ポケットが高度に溶解性である場合、水分子が、結合実行中にＭＴＸ結合を妨げるであろう。そのため、すべての計算について、水分子を取り除いた。アセチル化対非アセチル化ＭＴＨＦＤ１の結合の比較のために、調製した結晶構造を、ＭＯＥのＰｒｏｔｅｉｎ Ｂｕｉｌｄｅｒを使用してアセチル化し、続いて、変異残基の不足エネルギーを最小化した。さらに、ＭＴＸを調製し、そして、ＭＯＥでプロトン化した。既定の設定を用いたＬｏｗＭｏｄｅＭＤ方法を使用した立体構造解析が、３７個の異なったＭＴＸ立体構造を提供する。これらの３７個の立体構造を、既定の設定を用いたＭＯＥの誘導適合型結合プロトコールを使用して、ＭＴＨＦＤ１のアセチル化および非アセチル化構造に結合させた。結合した構造の相互作用フィンガープリントを、ＭＯＥのＰＬＩＦツールを使用して計算した。
【０１１９】
クロマチン精製とＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析法
細胞画分およびクロマチンの濃縮を、いくつかの改変を加えて先に記載29のとおりおこなった。簡単に言えば、１億個の細胞に関して、クロマチン濃縮ペレットを、洗浄後に、２５０μｌのベンゾナーゼ消化バッファー（１５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＥＧＴＡ、０．１％のＮＰ４０、プロテアーゼインヒビターカクテル（ｃＯｍｐｌｅｔｅ、Roche））中に溶かし、そして、以下の設定：ピークパワー１４０；デューティーファクター１０．０；サイクル／バースト２００を用いたＣｏｖａｒｉｓ Ｓ２２０集束超音波処理器により１２０秒間、超音波処理した。０．２５Ｕのベンゾナーゼおよび２．５μｇのＲＮアーゼ添加後に、クロマチンを、回転振盪培養器上で４℃にて４０分間インキュベートした。２×ＳＤＳ溶解バッファー（１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、４％のＳＤＳ、２ｍＭのＰＭＳＦおよびプロテアーゼインヒビターカクテル（ｃＯｍｐｌｅｔｅ、Roche））を１：１の比でサンプルに追加し、室温にて１０分間インキュベートし、続いて、９９℃にて５分間変性させた。室温、１６．０００ｇにて１０分間の遠心分離後に、新しいチューブに上清を移した。ＭＳサンプル調製を、先に記載30のＦＡＳＰプロトコールを使用しておこなった。高または低ｐＨにおける逆相クロマトグラフィーを、ＭＳＭＳ分析前の二次元ペプチド分離のためにおこなった。ペプチドを、固相抽出（ＳＰＥ）（ＭａｃｒｏＳｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎｓ、３０〜３００μｇの容量、Nest Group Inc. Southboro, MA, USA）を使用して精製し、そして、２３μＬの５％のアセトニトリル、１０ｍＭのギ酸アンモニウム中で再構成した。Ｇｅｍｉｎｉ−ＮＸ Ｃ１８（１５０×２ｍｍ、３μｍ、１１０Å、Phenomenex, Torrance, US）カラムを備えたＡｇｉｌｅｎｔ１２００ＨＰＬＣシステム（Agilent Biotechnologies, Palo Alto, CA）は液体クロマトグラフィーを、最初の次元に使用した。ペプチドを、１００μＬ／分の流量にて、１０ｍＭのギ酸アンモニウム、ｐＨ１０を含有する５から９０％へのアセトニトリルの範囲に及ぶ３０分間のグラジエントの間に２０個の時間ベースの画分に分けた。サンプルを、５μＬの５％ギ酸の添加によって酸性化した。溶媒を、真空濃縮器により取り除き、そして、サンプルを５％のギ酸中で再構成した。
【０１２０】
質量分析を、Ａｇｉｌｅｎｔ１２００シリーズの複式ポンプＨＰＬＣシステム（Agilent Biotechnologies, Palo Alto, CA）にオンラインで連結したＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ質量分析計（ThermoFisher, Bremen, Germany）によりおこなった。サンプルを、４５μＬ／分の一定流量にて、サーモスタット付オートサンプラー（４℃）からトラップカラム（Ｚｏｒｂａｘ ３００ＳＢ−Ｃ１８ ５μｍ、５×０．３ｍｍ、Agilent Biotechnologies, Palo Alto, CA, USA）に移した。検体分離は、２０ｃｍの７５μｍ内径分析カラムにおいて起こり、そしてそれには、社内でＲｅｐｒｏｓｉｌ Ｃ１８（Dr. Maisch, Ammerbuch-Entringen, Germany）を充填した。６０分間のグラジエントは、２５０ｎＬ／分の一定流速にて、３％から４０％への有機相の範囲にわたった。ＨＰＬＣに使用した移動相は、それぞれ水相および有機相に０．４％のギ酸および９０％のアセトニトリル＋０．４％のギ酸であった。Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ質量分析計を、それぞれの完全スキャンに続いて、最大１０のＭＳＭＳスキャンを伴うデータ依存モードで操作した。以前に断片化したイオンを、２０秒間の反復断片化から動的に除外した。ＭＳおよびＭＳＭＳスキャンのための最大イオン射出時間として、それぞれ１００ｍｓおよび１２０ｍｓを許容した。アナライザー分解能を、ＭＳスキャンについて７０，０００に、そして、ＭＳＭＳスキャンについて３５、０００に設定した。自動利得コントロールを、Ｃ−トラップの過剰充填を予防するために、ＭＳおよびＭＳＭＳについて、それぞれ３×１０6および２×１０5に設定した。ＭＳＭＳのアンダーフィル比を６％に設定したが、それは、断片化のためのペプチドを受け入れるための１×１０5の強度閾値に相当する。３４個の正規化した衝突エネルギー（ＮＣＥ）における高衝突エネルギー誘起解離（ＨＣＤ）を、ペプチド断片化およびレポーターイオン作出のために利用した。遍在する混入シロキサンイオンＳｉ（ＣＨ3）2Ｏ）6を、内部質量較正のためにｍ／ｚ４４５．１２００２４にてシングルロック質量として使用した。
【０１２１】
ＭＳデータ分析（クロマチン画分）
取得した未加工ＭＳデータファイルを、先に記載31のとおり加工した。結果のピークリストを、サーチエンジンＭａｓｃｏｔ（ｖ．２．３．０２）およびＰｈｅｎｙｘ（ｖ．２．５．１４）を用いて、ヒトＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースバージョン２０１５０６０１に対して検索した。
【０１２２】
ＴＭＴ定量化のために、ｉｓｏｂａｒ Ｒパッケージを使用した32。定量化の第１ステップとして、レポーターイオン強度を、コンピュータ上で正規化して、それぞれのＴＭＴレポーターチャンネルにおいて等しい中央値強度をもたらした。ｉｓｏｂａｒ統計モデリングでは２つのＰ値：生物学的反復の間で見られた存在量の変化に対する処理による存在量の変化を比較するＰ値のサンプル、および質量分析データ収集におけるノイズ／変動性をモデル化するＰ値比、を考慮した。Ｐ値比を、誤発見率（ＦＤＲ）向けにさらに補正した。Ｐ値サンプルとＦＤＲ補正Ｐ値比の両方が０．０５未満である場合、タンパク質の存在量が有意に変化したと見なした。
【０１２３】
代謝学のための有核細胞抽出物の調製
核を、低浸透圧性溶解によって抽出した。簡単に言えば、（結果の項に示したように）処理した無傷細胞を、冷たいＰＢＳで２回洗浄し、そして、低浸透圧性溶解バッファー（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．９（１．５ｍＭのＭｇＣｌ2、１０ｍＭのＫＣｌおよびプロテアーゼ阻害剤カクテル（ｃＯｍｐｌｅｔｅ、Roche）を含有）；バッファー−細胞体積比５：１）と共に氷上で１０分間インキュベートした。インキュベーション中に、ペレットを３回、穏やかに再懸濁した。核を、遠心分離（４２０ｇ×５分間）によって回収し、すぐに急冷した。
【０１２４】
メタボロミックアッセイとデータ分析を、Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｉｅｓ（http://www.metabolomicdiscoveries.com；Germany）によっておこなった。簡単に言えば、ＬＣ−ＱＴＯＦ／ＭＳベースの非標的化代謝産物プロファイリングを、最高１〜２ｐｐｍの精度および質量／Δ質量＝４０．０００の分解能で、５０〜１７００Ｄａの範囲内の核内代謝産物の分析に使用した。ＬＣで計測した代謝産物を、それらの精密質量とその後の和公式予測にしたがって注釈を付した。ＬＣ−ＭＳ分析法によって注釈されなかった代謝産物を、彼らの精密質量および保持時間に応じて列挙する。
【０１２５】
代謝産物セット強化分析
代謝産物セット強化分析（ＭＳＥＡ）33を、オンラインツールＭｅｔａｂｏＡｎａｌｙｓｔ34（http://www.metaboanalyst.ca/）を使用しておこなった。簡単に言えば、それぞれのあらかじめ定義された官能基に関して、倍率変化を、観察された有意に変化する代謝産物（上方および下方調節の両方を考慮、ｐ値＜０．０５を有するｔ−検定）の数およびランダムな予測、ならびに（フィッシャーの直接確率検定を使用した）対応するｐ値の間で計算する。
【０１２６】
葉酸抽出とＬＣ ＭＳ／ＭＳ分析法
核およびサイトゾル画分内の葉酸を定量化するために、１条件あたり２０００万個のＨＡＰ１細胞を、冷たいＰＢＳで２回洗浄し、そして、２８０ｇ、４℃にて５分間の遠心分離によって５０ｍｌのｆａｌｃｏｎチューブ内に回収した。細胞分解を、暗所内の氷上で、１：５の低浸透圧性溶解バッファーと共に細胞ペレットを１０分間インキュベートすることによって実施した。核を、４２０ｇ、４℃にて５分間の遠心分離によって回収した。上清（サイトゾル画分）もまた回収した。両方の画分を、すぐに急冷した。
【０１２７】
核サンプルに関して、１０μＬのＩＳＴＤ混合物を、１．５ｍＬのエッペンドルフチューブ内の核ペレットに加え、続いて、１４５μＬの氷冷した抽出溶媒（８０％のメタノール中の１０ｍｇ／ｍＬのアスコルビン酸溶液、２０％の水、Ｖ／Ｖ）を加えた。
【０１２８】
サンプルを、１０秒間ボルテックス処理し、その後、氷上で３分間インキュベートし、そして、再び１０秒間ボルテックス処理した。遠心分離（１４０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）後に、上清をＨＰＬＣバイアル内に回収した。抽出ステップを繰り返し、そして合わせた上清をＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析法に使用した。
【０１２９】
細胞質サンプルに関して、１０μＬのＩＳＴＤ混合物を、１．５ｍＬのエッペンドルフチューブ内の７５μＬの細胞質に加え、続いて、２１５μＬの氷冷した抽出溶媒／（８０％のメタノール中の１０ｍｇ／ｍＬのアスコルビン酸溶液、２０％の水、Ｖ／Ｖ）を加えた。サンプルを、１０秒間ボルテックス処理し、その後、氷上で３分間インキュベートし、そして、再び１０秒間ボルテックス処理した。遠心分離（１４０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）後に、上清をＨＰＬＣバイアル内に回収し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析法に使用した。
【０１３０】
Ｘｅｖｏ ＴＱ−ＭＳ（Waters）三連四重極質量分析計と組み合わせたＡｃｑｕｉｔｙ ＵＨＰＬＣシステム（Waters）を、定量的な代謝物分析に使用した。分離を、４０℃にて、Ａｃｑｕｉｔｙ ＨＳＳ Ｔ３ １．８μＭ Ｖａｎｇｕａｒｄガードカラム（Waters）を備えたＡＣＱＵＩＴＹ ＨＳＳ Ｔ３、１．８μｍ、２．１×１００ｍｍカラム（Waters）によりおこなった。分離を、移動相Ａとしての水中の０．１％のギ酸（ｖ／ｖ）、および移動相Ｂとしてのメタノール中の０．１％のギ酸（ｖ／ｖ）を使用しておこなった。０．５ｍＬ／分の流量を用いたグラジエント溶出を、１０分間の総分析時間でおこなった。オートサンプラ温度を４℃に設定した。検出のために、複数の反応モードを有する陽性電界蒸発イオン化モードのＷａｔｅｒｓ Ｘｅｖｏ ＴＱ−ＭＳを利用した。すべての代謝産物の定量化を、Ｗａｔｅｒｓ製のＭａｓｓＬｙｎｘ Ｖ４．１ソフトウェアを使用しておこなった。定量化のために、内部標準化と１／ｘ秤量を用いて７点の線型検量線を構成した。
【０１３１】
マウス異種移植片試験
マウス異種移植片試験を、先に記載35したようにおこなった。マトリゲル中に１：１に希釈した２×１０6個のＡ５４９細胞を、ＮＯＤ ＳＣＩＤガンママウスに皮下移植した。
【０１３２】
処置（週５回の腹腔内注射による３０ｍｇ／ｋｇの（Ｓ）−ＪＱ１および週２回の腹腔内注射による２５ｍｇ／ｋｇのＭＴＸ）を、腫瘍が樹立された移植後１９日目に開始した。腫瘍体積を、カリパスで２つの直交する直径を計測することによって、週２回、評価した。腫瘍体積を、以下の方程式：（幅*幅*長さ）／２、を使用して計算した。処置を、Ｂｕｎｄｅｓｍｉｎｉｓｔｅｒｉｕｍ ｆｕｒ Ｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔ ｕｎｄ Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇ（ＢＭＷＦ−６６．００９／０２８０ＩＩ／３ｂ／２０１２）によって承認された動物ライセンスプロトコールにしたがって実施した。４３日目に、マウスを屠殺し、そして、腫瘍を摘出し、計量した。
【０１３３】
ＢＲＤ４経路遺伝子に関する遺伝子の機能喪失型スクリーン
有効なＧＴ遺伝子スクリーニングのための前提条件は、単一対立遺伝子性の破壊的なＧＴ組み込みが遺伝子ノックアウト（ＫＯ）をもたらすハプロイドシステムである。そのため、ＫＢＭ７細胞（ニアハプロイド核型を有する慢性骨髄性白血病細胞株）が、先に記載15のとおりＢＲＤ４レポーター細胞株の作出のために選ばれた。強力な阻害剤（Ｓ）−ＪＱ１を用いたＢＲＤ４の阻害は、ＲＥＤＳにおけるレポーター遺伝子である赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）の急激かつ恒常的な発現につながり、そしてそれは、ＦＡＣＳによって容易に検出できた（図６Ａを参照）。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）取り込みおよびＦＡＣＳ分析を、ＧＴベースの遺伝子スクリーニングに好適なハプロイドクローンを選択するために、いくつかのＲＥＤＳクローンの細胞サイクルプロファイルをアッセイするために使用した。驚いたことに、元々選択されたクローンの大部分は、増強された、有望な二倍体の、ＤＮＡ含量を示した。ＲＥＤＳ１は、同様に中期分散によって確認された、ハプロイド核型（図６Ｂを参照）を有する唯一のクローン細胞株であった（図６Ｃを参照）。この知見は、ＢＲＤ４阻害剤を用いた処理がこの特定の細胞株において二倍体様の表現型を誘導できることを示した。この複相化の動態を試験するために、ＷＴ（野性型）−ＫＢＭ７細胞を、１週間にわたり、ＤＭＳＯ、（Ｓ）−ＪＱ１またはその不活性な鏡像異性体（Ｒ）−ＪＱ１のいずれかで一晩処理し、そして、ＰＩ取り込みおよびＦＡＣＳによって細胞サイクルプロファイルを評価した。（Ｓ）−ＪＱ１処理だけがＷＴ−ＫＢＭ７複相化を引き起こし（図６Ｄを参照）、そのため、染色体数に対するＢＲＤ４阻害媒介型効果に関する仮説を確認が、染色体不安定性、染色体分離の欠陥、または増強された内部複製を通じて可能である。
【０１３４】
次いで、ＧＴベースの遺伝子スクリーニングのためのＲＥＤＳ１クローンの適合性を、さらに実証した。クローンは、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって決定されるように、シングルゲノムＲＦＰ組み込みを担持している（図７Ａを参照）。１μＭ（Ｓ）−ＪＱ１で２４時間処理したＲＥＤＳ１細胞は、ＲＦＰを強力に発現し（図７Ｂを参照）、そしてそれは、ＲＦＰは生細胞イメージングによって検出できた。（Ｓ）−ＪＱ１は、他のＢＥＴ（ブロモドメインおよび特異的末端ドメイン）タンパク質を強力に阻害するので、ＢＲＤ１、ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤＴおよびＢＲＤ４に対するショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を、それらがＲＦＰ発現を誘発できるか試験した。すべてのヘアピンが、それらのそれぞれのｍＲＮＡの＞７０％の下方制御を引き起こした（図７Ｃを参照）。生細胞イメージングから定量化したＲＦＰ発現は、ＢＲＤ４の下方制御だけがこのパラメーターの明白な増大を引き起こしたことを示した（図７Ｄを参照）。最後に、配列決定アプローチを使用して、ＲＦＰ組み込み部位を、第６染色体上のＣＤＫＡＬ１遺伝子の第一イントロン内に配置した（図７Ｅを参照）。
【０１３５】
実証されたＲＥＤＳ１クローンを用いて、ＧＴ媒介性遺伝子スクリーニングを、ＢＲＤ４の新しい機能的なパートナーを同定するためにおこなった（図１Ａを参照）。スクリーニングシステムの高い特異性は、ＢＲＤ４阻害様のパターンにおいてクロマチンのリモデリングを明確に示す直接的な読み出し（ＲＦＰシグナル）に依存する。そのため、特異的遺伝子ＫＯによるＲＦＰの発現は、斯かる遺伝子が、ＢＲＤ４が依存する遺伝子座におけるクロマチンのリモデリングに関与することを示す。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レポーター遺伝子を担持するＧＴウイルスを用いたＲＥＤＳ１細胞の感染に続いて、この細胞集団が特異的遺伝子ＫＯによりＢＲＤ４阻害を表現型模写するので、二重陽性細胞（ＲＦＰ+／ＧＦＰ+）をソートした（図１Ｂを参照）。この集団からのゲノムＤＮＡの抽出に続いて、ＧＴ組み込み部位を、増幅し、配列し、そしてゲノム上にマッピングした。データを、任意抽出の対照集団と比較した独立した組み込み数、およびＧＴベクターの破壊的なセンス組み込み対アンチセンス組み込みの分布について分析した。３つの際立ったヒット、長い非コーディングＲＮＡ ＡＣ１１３１８９．５、メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ１（ＭＴＨＦＤ１）およびＤＮＡ損傷チェックポイント１（ＭＤＣ１）のメディエーター（図１Ｃ、８Ａおよび１１を参照）がこの分析から浮上した。これらの３つの遺伝子に関して、ＤＮＡ修復にかかわる遺伝子であるＭＤＣ１だけが、ＤＮＡ損傷シグナル伝達中のＤＮＡインシュレーターとしてＢＲＤ４の短いアイソフォームの役割を通してＢＲＤ４生物学に間接的に以前につながりがあった。ＢＲＤ４の遺伝子相互作用因子としてのＭＴＨＦＤ１を実証するために、ＲＥＤＳ１細胞を、３つの様々なｓｈＲＮＡで処理し、そして、ＭＴＨＦＤ１の４４〜９２％のノックダウンがもたらされた（図１Ｄを参照）。３個のヘアピンすべてが、レポーターＲＦＰ発現を誘発し、エフェクトサイズはそれらのノックダウン効率と相関した（図１Ｅおよび１Ｆを参照）。クローン効果を除外するために、同じ実験を二倍体ＲＥＤＳ３細胞で繰り返し、そして類似の結果を得た（図８Ｂ、８Ｃおよび８Ｄを参照）。
【０１３６】
ＭＴＨＦＤ１は、ＢＲＤ４との物理的相互作用によってクロマチンに動員される
ＢＲＤ４介在性遺伝子調整におけるＭＴＨＦＤ１の役割を理解するために、これらの２つのタンパク質が物理的に相互作用するか否か試験した。そのため、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＧＦＰ−ＭＴＨＦＤ１をコードするプラスミドを用いて形質移入した。４８時間後に、ＧＦＰプルダウン（ＰＤ）を実施し、ＢＲＤ４が過剰発現した（ＯＥ）ＭＴＨＦＤ１と共免疫沈降（ｃｏ−ＩＰ）できることを示した（図９Ａを参照）。同様に、ＨｅＬａ細胞のＢＲＤ４ ＰＤは、ＭＴＨＦＤ１がこのブロモドメイン含有タンパク質の内因性形態と相互作用することを示した（図９Ｂを参照）。ＢＲＤ４は白血病進行を駆動するその役割が広く試験されているので、不偏性プロテオミクスアプローチを、Ｋ５６２、ＭＯＬＭ−１３、ＭＶ４−１１およびＭＥＧ０１細胞株におけるすべてのＢＲＤ４相互作用因子を同定するのに使用した（図２Ａおよび９Ｃを参照）。１３種類のタンパク質だけが、４種類の細胞株のすべてでＢＲＤ４と普通に相互作用した。このセットは、ＢＲＤ３、ＬＭＮＢ１、およびＳＭＣ３のような数個のクロマチンタンパク質を含んだ。加えて、ＢＲＤ４機能に必要とされる主要因として遺伝子スクリーニングで同定された葉酸経路酵素であるＭＴＨＦＤ１は、４種類の細胞株のすべてでＢＲＤ４の直接的な相互作用因子と同定された。ＭＴＨＦＤ１とＢＲＤ４との相互作用はまた、プロテオミクスアプローチに使用されるＫ５６２、ＭＯＬＭ−１３、ＭＶ４−１１、およびＭＥＧ０１細胞株で実施したプルダウン実験でも確認された（図１４Ａを参照）。
【０１３７】
ＢＲＤ４は専ら核に局在化している一方で、葉酸生合成は、細胞質およびミトコンドリアの中で起こると考えられている。しかしながら、最近、葉酸経路酵素のＳＵＭＯｙｌａｔｉｏｎ依存性核インポートが記載された36-39。ＨＡＰ１、ＫＢＭ７およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞の核対サイトゾル画分は、ＭＴＨＦＤ１が、３種類の細胞株のすべてにおいて核内で検出されることを示した（図２Ｂ、上部パネルを参照）。別の葉酸経路酵素、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ１（ＳＨＭＴ１）とは対照的に、核内ＭＴＨＦＤ１は、少しの分子量変化も示さず、ＳＵＭＯｙｌａｔｉｏｎ以外の機構がその核局在化を駆動していることを示唆した。さらにこの知見を確認するために、ＨＡＰ１細胞を、ＳＵＭＯｙｌａｔｉｏｎの低分子阻害剤であるギンコール酸（ＧＡ）で処理したが、それは、核と細胞質との間でＭＴＨＦＤ１の再分配を引き起こさなかった（図９Ｄを参照）。その細胞コンパートメントにおいて、ＢＲＤ４とＭＴＨＦＤ１との相互作用が起こることを次に試験した。そのため、ＭＴＨＦＤ１ ＰＤを、ＨＡＰ１、ＫＢＭ７およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞のサイトゾル画分と核画分で実施した。これらの実験は、ＢＲＤ４との相互作用が核で専ら起こっていることを明らかにした（図２Ｂ、下部パネルを参照）。ＢＲＤ４が、そのブロモドメインでアセチル化タンパク質、特にヒストンに結合することを前提として、発明者らは、結合のこの機構もまた、ＭＴＨＦＤ１との相互作用を駆動しているかどうか理解することを目的とした。興味深いことに、プロテオーム研究によって、ＭＴＨＦＤ１の表面の７つのリジンはアセチル化されることが知られている。そのため、合成アセチル化ＭＴＨＦＤ１ペプチド（図９Ｅを参照）を、ＧＳＴ−ＢＲＤ４へのそれらの結合に関するアルファＬＩＳＡアッセイを実施するために使用した。意外なことに、アセチル化ペプチドのうちの一つであるＭＴＨＦＤ１（４７−６６）Ｋ５６ａｃは、高濃度で使用したときに、アルファＬＩＳＡシグナルのほぼ５倍の増大を示した（図９Ｆを参照）。そのうえ、相互作用が用量応答性様式で起こり、ＭＴＨＦＤ１−Ｋ５６のアセチル化がＢＲＤ４への結合を促進したことを示唆した（図９Ｇを参照）。化学情報学的アプローチは、ＭＴＨＦＤ１Ｋ５６ａｃペプチドが、アセチル化ヒストンペプチドと同程度にまたはより良好にＢＲＤ４ブロモドメインに結合すると予測した（図９Ｈを参照）。しかしながら、ＩＰ手順中のアセチル化ＭＴＨＦＤ１ペプチドとＨＡＰ１細胞溶解物とのインキュベーションは、ＢＲＤ４−ＭＴＨＦＤ１相互作用を阻害することができず、相互作用の安定化が追加のドメインまたは他の因子に依存し得ることを示唆した。同様に、ＢＲＤ４−ＭＴＨＦＤ１相互作用は、ＢＲＤ４（（Ｓ）−ＪＱ１）またはＭＴＨＦＤ１（メトトレキサート（ＭＴＸ））の薬理学的阻害剤によって影響を受けなかった（図９Ｉを参照）。核がＢＲＤ４とＭＴＨＦＤ１との相互作用部位として確認されたことに関係して、発明者らは、ＢＲＤ４−ＭＴＨＦＤ１複合体が、クロマチンに結合しているか、むしろ可溶性の核内因子に状態で見出されるか否かを解明することを望んだ。細胞において、ＭＴＨＦＤ１のＫ５６のアセチル化がＭＴＨＦＤ１とＢＲＤ４との相互作用に関与したか試験するために、発明者らは、ＧＦＰ−ＢＲＤ４ ＷＴと一緒に、ＦＬＡＧ−ＭＴＨＦＤ１ ＷＴ、ＦＬＡＧ−ＭＴＨＦＤ１（Ｋ５６Ａ）（無電荷でアセチル化状態を模倣する）、またはＦＬＡＧ−ＭＴＨＦＤ１（Ｋ５６Ｒ）（変更アルギニンへの同じ残基の突然変異）のいずれかでＨＥＫ２９３−Ｔ細胞を同時形質移入した。ＭＴＨＦＤ１（Ｋ５６Ａ）突然変異がＢＲＤ４との相互作用を増強したのに対して、ＭＴＨＦＤ１（Ｋ５６Ｒ）は相互作用を低減した。一貫して、彼らはまた、二重ブロモドメイン変異体ＧＦＰ−ＢＲＤ４ Ｎ１４０Ｆ／Ｎ４３３Ｆが、これらの２つの構築物がＨＥＫ２９３−Ｔ細胞で一緒に過剰発現されているときに、ＦＬＡＧ−ＭＴＨＦＤ１への結合を大幅に低減することを示すことも照明した（図１４Ｂを参照）。そのうえ、細胞プルダウンアッセイにおいて、すべてのＢＲＤ４アイソフォームが、完全長のＭＴＨＦＤ１と相互作用したが、デヒドロゲナーゼ／シクロヒドロラーゼまたはホルミルテトラヒドロ葉酸−シンターゼドメイン単独とは相互作用しなかった（図１４Ｃを参照）。ＨＡＰ１細胞からの密なＤＮＡ結合タンパク質を含むクロマチン抽出物を調製し、そしてＢＲＤ４およびＭＴＨＦＤ１の存在をＷＢによって確認した。両方のタンパク質は、クロマチン結合画分において明確に検出可能であった（図２Ｃを参照）。ＢＲＤ４がクロマチンにＭＴＨＦＤ１を動員するか否か証明するために、ＨＡＰ１細胞を、小分子デグロニミドｄＢＥＴ１40およびｄＢＥＴ６41で処理した。これらの化合物を用いた２時間の処理は、クロマチンからのＢＲＤ４のほぼ完全な除去をもたらした。これらの条件下、クロマチン結合ＢＲＤ４量と相関するレベルを維持しながら、ＭＴＨＦＤ１をクロマチンから喪失させた。そのため、これらのデータは、ＢＲＤ４が、クロマチンにＭＴＨＦＤ１を動員する唯一の因子であることを強く示唆している。発明者らは、Ｋ５６２、ＭＯＬＭ−１３、ＭＶ４−１１およびＭＥＧ０１細胞株をｄＢＥＴ６で処理したときに、類似の結果を得た（図１４Ｄを参照）。唯一、別の代謝酵素（ＳＨＭＴ１）のクロマチン動員もまた、ＢＲＤ４分解によって影響を受けたが、より弱い度合いであった。驚いたことに、葉酸代謝拮抗薬ＭＴＸは、クロマチン関連ＭＴＨＦＤ１の類似の喪失を引き起こしたが、その一方で、それがＢＲＤ４レベルに影響を及ぼさなかったことが観察された。考えられる解釈は、この主要なアセチル化残基が推定上のＭＴＸ結合ポケット内にあるので、ＢＲＤ４とＭＴＨＦＤ１−Ｋ５６ａｃとの間の結合に関する直接的な競合である可能性がある（図９Ｊを参照）。重要なことには、ＢＲＤ４分解は、ＭＴＨＦＤ１（またはＳＨＭＴ１）の核局在化を損なわず、ＭＴＸ処理でもそうであり（図２Ｃおよび２Ｄを参照）、核内への輸送それ自体が別の方法で媒介され、その一方で、ＢＲＤ４との相互作用がクロマチンへのＭＴＨＦＤ１の動員の主な原因となることを示唆している。
【０１３８】
ＭＴＨＦＤ１は、ＢＲＤ４結合部位の一部において規定のゲノム遺伝子座を占有する
ＭＴＨＦＤ１のＢＲＤ４依存性クロマチン動員を特徴づけしたので、発明者らは、葉酸経路酵素のゲノム結合部位をマッピングすることを望んだ。そのため、ＣｈＩＰｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ17をＨＡＰ１細胞において実施した。ＭＴＨＦＤ１が、異なったゲノム遺伝子座に結合することを見出し、ゲノムに沿って合計２４２個のＭＴＨＦＤ１ピークを観察した。ＭＴＨＦＤ１結合部位とＢＲＤ４遺伝子座との間の重複を次に分析した。プロテオミクス実験と一致して、ＭＴＨＦＤ１結合部位の大部分は、ＢＲＤ４結合部位と重複した。ＭＴＨＦＤ１結合部位は、ＢＲＤ４ピーク付近で主に見つかった（図３Ａを参照）。ＢＲＤ４ピークとＭＴＨＦＤ１ピークとの間の共局在は、プロモーターとエンハンサー領域で主に起こり、そしてそこではまた、Ｈ３Ｋ２７Ａｃも豊富であり、転写を促進する葉酸経路酵素の基本的な役割を示唆している（図３Ｂ、１２Ａおよび１２Ｂを参照）。そのうえ、ＭＴＨＦＤ１は、わずかな量のＢＲＤ４しか存在しない遺伝子内領域でも見られる場合がある（図１０Ａ、１０Ｂおよび１０Ｃを参照）。この徴候は、ＭＴＨＦＤ１が、転写過程のすべてにわたって必要とされており、その開始を促進するだけではないことを示唆する。そのうえ、遺伝子内的に蓄積したＢＲＤ４の最少量が、クロマチン上にＭＴＨＦＤ１を動員するために十分であり続ける。そのうえ、発明者らは、ＢＲＤ４によって占有されたクロマチン遺伝子座上のＭＴＨＦＤ１の存在をさらに実証するために、ＣｈＩＰ−Ｓｅｑアッセイを実施した。ＭＴＨＦＤ１を異なったゲノム遺伝子座に結合させ、そして、結合は、ｄＢＥＴ６を用いた処理の２時間後に喪失した（図１５Ａ、１６Ａおよび１６Ｂを参照）。プロテオミクス実験と一致して、彼らは、ＭＴＨＦＤ１結合部位の大部分は、プロモーターおよびエンハンサー領域のＢＲＤ４結合部位と重複し、そしてそこではまた、Ｈ３Ｋ２７ａｃも豊富であり（図１５Ｂ、１５Ｃ、１５Ｄ、１６Ｃおよび１６Ｄを参照）、転写制御におけるＭＴＨＦＤ１の幅広い役割を示唆していることがわかった。発明者らはまたトランスクリプトーム分析も実施し、そして、ＨＡＰ１細胞において、ＢＲＤ４阻害剤、分解剤および葉酸代謝拮抗薬での処理の結果として起こる転写変化、ならびにＢＲＤ４およびＭＴＨＦＤ１のノックダウンの間に強い相関関係があることがわかった（図１５Ｅおよび１７Ａを参照）。ＣｈＩＰ−Ｓｅｑとトランスクリプトームデータの統合は、ＭＴＨＦＤ１とＢＲＤ４の両方が、これらのタンパク質のいずれかのノックダウンに続いて下方制御される遺伝子のプロモーターで濃縮されることを示した（図１５Ｆおよび１７Ｂを参照）。最終的に、発明者らは、ＨＡＰ１細胞で観察された、ＢＥＴ阻害剤の転写効果と葉酸代謝拮抗薬との間の強い相関関係、ならびにＭＴＨＦＤ１のノックダウンとＢＲＤ４との間の強い相関関係が、Ｋ−５６２およびＡ５４９細胞において保存され、細胞型独立性を示唆していることを示すことができた（図１８Ａおよび１８Ｂを参照）。
【０１３９】
ＭＴＨＦＤ１およびＢＲＤ４は、核内代謝産物組成を制御する
ＭＴＨＦＤ１は、葉酸代謝における３つの酵素反応を触媒するＣ−１−テトラヒドロ葉酸シンターゼであり、テトラヒドロ葉酸（ＴＨＦ）と１０−ホルミルテトラヒドロ葉酸（１０−ＣＨＯ−ＴＨＦ）と５，１０−メテニルテトラヒドロ葉酸（５，１０−ＣＨ＝ＴＨＦ）と５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸（５，１０−ＣＨ2−ＴＨＦ）の相互変換をもたらす。これらの葉酸は、一炭素代謝の重要中間体であり、プリン、ピリミジンおよびメチオニンの生合成のために活性化Ｃ１基を提供する。３種類のＣ１代謝生成物のすべてが、転写調節に貢献する可能性を有する。ピリミジンとプリンは核酸塩基に組み込まれ、そしてそれは、順にヌクレオチドに変換され、そしてそれは、複製機構および転写機構の基質になる。メチオニン代謝は、すべてのヒストンおよびＤＮＡ−メチルトランスフェラーゼのメチルドナーであるＳ−アデノシル−メチオニン（ＳＡＭ）の生成をもたらす。Ｃ１代謝生成物の三つの主要なクラスであるプリン、ピリミジンおよびメチオニンの生合成は、哺乳動物細胞の細胞質とミトコンドリアの中で起こると考えられている。全生合成経路が核内で起こるか否かを試験するために、クロマチン関連タンパク質画分を、代謝酵素に関して分析した。チミジル酸シンターゼとプリン生合成経路のいくつかの酵素（ＧＡＲＴ、ＰＡＩＣＳ、ＡＴＩＣ）の両方が、ＨＡＰ１細胞においてクロマチンに結合することがわかった（図４Ａ型を参照）。対照的に、メチオニンとＳＡＭ代謝における酵素のいずれも検出されなかった。これらのデータは、潜在的に、プリンおよびピリミジン合成の全体もまた、クロマチン環境下で起こることを示唆する。発明者らは、Ｋ−５６２細胞株でも同じ実験を実施し、クロマチン画分におけるピリミジンおよびプリン生合成経路の酵素の存在を確認した（図１９Ａおよび２０を参照）。そのため、発明者らは、ＢＲＤ４またはＭＴＨＦＤ１の阻害が核内代謝産物組成を変更するか否か質問した。この目的のために、彼らは、ＢＲＤ４またはＭＴＨＦＤ１のいずれかをノックダウンし、核を単離し、そして、非標的化対照ヘアピンに対して、標的化代謝学的アプローチでそれらの組成を分析した（図１２Ａを参照）。合計で２８５１種類の代謝産物を検出し、そのうち４５９種類が条件のうちの１つで有意に変化した（図４Ｂ、１２Ｂおよび１２Ｃを参照）。興味深いことに、驚くべき相関関係が、ＢＲＤ４およびＭＴＨＦＤ１ノックダウン条件下の核内メタボロームの間で観察された（図４Ｃを参照；相関係数０．７）。相関関係は、核内葉酸代謝産物における分析に注目したとき、大幅に増大した（図４Ｄを参照、相関係数０．９）。興味深いことに、これらの代謝産物の間で、１０−ＣＨＯ−ＴＨＦおよび５，１０−ＣＨ2−ＴＨＦ（共にＭＴＨＦＤ１の直接的な産物）のレベルがＭＴＨＦＤ１およびＢＲＤ４ノックダウンにおいて同様に低減した。加えて、プリンおよびピリミジン代謝産物で有意な変化を検出したが、メチオニン誘導体では検出しなかった。両方のノックダウンによって、スクシニルアデノシン、Ｎ３−ヒドロキシエチルシトシンおよびチオグアノシン−５’−ジスルファートが低減したが、その一方で、イノシン、シトシン、アデノシン、ＡＭＰ、ＣＭＰ、���ＤＰ、イソペンテニルアデノシンのレベルは大きく増強された。これらの変化の一部は、ｓｈＲＮＡ実験における長い処理期間による代償であろう。さらに、発明者らは、ＢＥＴ阻害剤およびＭＴＸが、他の細胞毒性化合物で観察されなかった核内葉酸プールに特異的な高度に相関性がある特徴的な変化を引き起こしたことを示した（図１９Ｂを参照）。全体としては、葉酸生合成およびＢＲＤ４の阻害に関する一般的な核内代謝産物の特徴が明らかになった。
【０１４０】
ＢＲＤ４阻害剤は、さまざまな癌細胞株において葉酸代謝拮抗薬との相乗効果をもたらす
ＭＴＨＦＤ１およびＢＲＤ４の喪失の結果として起こる核内代謝産物組成の類似性に基づいて、葉酸代謝拮抗薬が、癌細胞においてＢＲＤ４阻害剤との相乗効果をもたらすであろうと推測した。この仮説を試験するために、ＢＲＤ４阻害に対して応答性でないと記載された４種類の細胞株に加え、実験に日常的に使用されるＫＢＭ７およびＨＡＰ１を含めた６種類の細胞株のパネルを選択した（図１３Ａおよび１３Ｂを参照）。用量反応曲線は、（Ｓ）−ＪＱ１処理に対するこれらの細胞株の低い感受性およびＭＴＸに対する中程度〜低い感受性、ＮＯＭＯ−１が最も感受性であることを確認した。両方の単独処理に対する低い反応性にもかかわらず、両剤の組み合わせは、少しも単剤活性のない濃度にて、試験した６種類の細胞株すべてで効果的に細胞生存率を低減した（図５Ａを参照）。示差的値の計算（Ｂｌｉｓｓ検定42）は、２つの処理の間の強い度合いの相乗作用を示し、細胞生存のために核内葉酸代謝産物濃度の決定的な役割に関する仮説を実証した。可能性があるＭＴＸの的外れな効果を除外するために、発明者らは、最も強い薬物相乗作用を示す細胞株、Ａ５４９を、ＭＴＨＦＤ１のｓｈＲＮＡで処理し、そして、（Ｓ）−ＪＱ１に対する増強された感受性を実証した（図２１Ａを参照）。次いで、彼らは、ＢＥＴブロモドメイン阻害剤を、一般毒性を発揮することなく癌細胞増殖を特異的に阻害するために、インビボにおいて葉酸代謝拮抗薬と組み合わせることができることを証明した。発明者らが、Ａ５４９異種移植マウスモデル３５を、ＭＴＸおよび（Ｓ）−ＪＱ１単独で、ならびに組み合わせて処理したとき、腫瘍増殖は、個々の化合物のいずれかによって低減することはなかったが、２種類の阻害剤を一緒に与えたときに、食い止められた（図２１Ｂ、２１Ｃおよび２１Ｄを参照）。最終的に、２種類のレポーター細胞株、ＲＥＤＳ１およびＲＥＤＳ３を使用することで、クロマチンの再配列のレベルにおいても同様に、相乗作用が示された。実際には、Ｒｅｄｎｅｓｓは、３日間のＭＴＸ処理後に、わずかに増強されただけであったが（図１３Ｃを参照）、ＭＴＸおよび（Ｓ）−ＪＱ１同時処理は、（Ｓ）−ＪＱ１単独によって与えられた基礎Ｒｅｄｎｅｓｓシグナルを著しく増幅した（図５Ｂを参照）。この最後の徴候は、クロマチン再配列過程が、ＢＲＤ４およびＭＴＨＦＤ１を一緒に阻害するときに、高められることができ、そして、後成的遺伝子調節における葉酸代謝産物の基本的な役割を際立たせることが明確に示された。
【０１４１】
参考文献
【表１】
2020511401.tif 000003
【表２】
2020511401.tif 000004
【表３】
2020511401.tif 000005
【図１】
2020511401.tif 000006
【図２−１】
2020511401.tif 000007
【図２−２】
2020511401.tif 000008
【図２−３】
2020511401.tif 000009
【図２−４】
2020511401.tif 000010
【図３】
2020511401.tif 000011
【図４ａ】
2020511401.tif 000012
【図４ｂ−ｄ】
2020511401.tif 000013
【図５ａ】
2020511401.tif 000014
【図５ｂ】
2020511401.tif 000015
【図６】
2020511401.tif 000016
【図７】
2020511401.tif 000017
【図８】
2020511401.tif 000018
【図９ａ−ｂ】
2020511401.tif 000019
【図９ｃ】
2020511401.tif 000020
【図９ｄ−ｅ】
2020511401.tif 000021
【図９ｆ】
2020511401.tif 000022
【図９ｇ】
2020511401.tif 000023
【図９ｈ】
2020511401.tif 000024
【図９ｉ】
2020511401.tif 000025
【図９ｊ】
2020511401.tif 000026
【図１０】
2020511401.tif 000027
【図１１】
2020511401.tif 000028
【図１２】
2020511401.tif 000029
【図１３】
2020511401.tif 000030
【図１４ａ】
2020511401.tif 000031
【図１４ｂ】
2020511401.tif 000032
【図１４ｃ】
2020511401.tif 000033
【図１４ｄ】
2020511401.tif 000034
【図１５ａ】
2020511401.tif 000035
【図１５ｂ】
2020511401.tif 000036
【図１５ｃ−ｆ】
2020511401.tif 000037
【図１６ａ−ｃ】
2020511401.tif 000038
【図１６ｄ】
2020511401.tif 000039
【図１６ｅ】
2020511401.tif 000040
【図１７】
2020511401.tif 000041
【図１８】
2020511401.tif 000042
【図１９ａ】
2020511401.tif 000043
【図１９ｂ】
2020511401.tif 000044
【図２０】
2020511401.tif 000045
【図２１】
2020511401.tif 000046
【配列表】
2020511401000001.app
【国際調査報告】
2020511401.tif 000047
2020511401.tif 000048
2020511401.tif 000049
2020511401.tif 000050
2020511401.tif 000051
2020511401.tif 000052