(57)【要約】  本発明は、ＩＬ−７等の生理活性分子を誘導性に発現し、腫瘍抗原に結合するＴ細胞受容体またはキメラ抗原受容体等の抗原受容体を構成的に発現する改変Ｔ細胞に関する。改変Ｔ細胞は、生理活性分子をコードする第１のヌクレオチド配列と、抗原受容体をコードする第２のヌクレオチド配列と、第１のヌクレオチド配列に作動可能に連結された誘導性プロモーターと、第２のヌクレオチドに作動可能に連結された構成的プロモーターと、を含む核酸構築物を含んでもよい。核酸構築物およびベクターが提供され、また、そのような構築物およびベクターを含むＴ細胞、ならびにその治療的方法および使用も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸構築物であって、
（ｉ）生理活性分子をコードする第１のヌクレオチド配列と、
（ｉｉ）抗原受容体をコードする第２のヌクレオチド配列と、
（ｉｉｉ）前記第１のヌクレオチド配列に作動可能に連結された誘導性プロモーターと、
（ｉｖ）前記第２のヌクレオチドに作動可能に連結された構成的プロモーターと、を含む、核酸構築物。
【請求項２】
前記誘導性プロモーターからの発現は、Ｔ細胞の活性化によって誘導される、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項３】
前記誘導性プロモーターは、活性化Ｔ細胞核内因子（ＮＦＡＴ）転写応答エレメント（ＴＲＥ）を含む、請求項１または２のいずれか一項に記載の核酸構築物。
【請求項４】
前記ＮＦＡＴ  ＴＲＥは、配列番号１４の核酸配列またはその変異体を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸構築物。
【請求項５】
前記誘導性プロモーターは、前記ＮＦＡＴ  ＴＲＥの３つ以上のコピーを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸構築物。
【請求項６】
前記核酸構築物は、配列番号１の配列を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸構築物。
【請求項７】
前記構成的プロモーターは、ヒト伸長因子１αプロモーターである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の核酸構築物。
【請求項８】
前記第１のヌクレオチド配列はサイトカインをコードする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸構築物。
【請求項９】
前記サイトカインはインターロイキン７（ＩＬ−７）である、請求項８に記載の核酸構築物。
【請求項１０】
前記ＩＬ−７はヒトＩＬ−７である、請求項９に記載の核酸構築物。
【請求項１１】
前記抗原受容体はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の核酸構築物。
【請求項１２】
前記ＴＣＲは高親和性ＴＣＲである、請求項１１に記載の核酸構築物。
【請求項１３】
前記ＴＣＲは、抗原のペプチド断片を提示するＭＨＣに特異的に結合する、請求項１１または請求項１２に記載の核酸構築物。
【請求項１４】
前記抗原は、癌細胞によって発現される腫瘍抗原である、請求項１３に記載の核酸構築物。
【請求項１５】
前記ＴＣＲは、配列番号５、６または１１のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の核酸構築物。
【請求項１６】
前記抗原受容体はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の核酸構築物。
【請求項１７】
前記ＣＡＲは、細胞によって発現される抗原に特異的に結合する、請求項１６に記載の核酸構築物。
【請求項１８】
前記抗原は、前記癌細胞によって発現される腫瘍抗原である、請求項１７に記載の核酸構築物。
【請求項１９】
前記腫瘍抗原はＮＹ−ＥＳＯ−１またはＭＡＧＥ−Ａ１０である、請求項１４または１８に記載の核酸構築物。
【請求項２０】
前記第１のヌクレオチド配列は、第１の方向に発現するように構成され、前記第２のヌクレオチド配列は、第１の方向に発現するように構成される、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の核酸構築物。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の核構築物を含む、ベクター。
【請求項２２】
前記ベクターはレンチウイルスベクターである、請求項２１に記載のベクター。
【請求項２３】
請求項２１または２２に記載のベクターを含む、ウイルス粒子。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれか一項に記載の核構築物、ベクター、またはウイルス粒子を含む、Ｔ細胞集団。
【請求項２５】
Ｔ細胞活性化に伴って、異種抗原受容体を構成的に発現し、生理活性分子を誘導性に発現する、Ｔ細胞集団。
【請求項２６】
前記生理活性分子をコードする前記ヌクレオチド配列は、誘導性プロモーターに作動可能に連結され、前記異種抗原受容体をコードする前記ヌクレオチド配列は、構成的プロモーターに作動可能に連結される、請求項２５に記載の集団。
【請求項２７】
前記誘導性プロモーターは、活性化Ｔ細胞核内因子（ＮＦＡＴ）転写応答エレメント（ＴＲＥ）を含む、請求項２６に記載の集団。
【請求項２８】
前記ＮＦＡＴ  ＴＲＥは、配列番号１４の核酸配列またはその変異体を有する、請求項２７に記載の集団。
【請求項２９】
前記誘導性プロモーターは、前記ＮＦＡＴ  ＴＲＥの３つ以上のコピーを含む、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の集団。
【請求項３０】
前記構成的プロモーターは、ヒト伸長因子１αプロモーターである、請求項２６〜２９のいずれか一項に記載の集団。
【請求項３１】
前記第１のヌクレオチド配列はサイトカインをコードする、請求項２５〜３０のいずれか一項に記載の集団。
【請求項３２】
前記サイトカインはインターロイキン７（ＩＬ−７）である、請求項３１に記載の集団。
【請求項３３】
前記抗原受容体は、請求項１１〜１７のいずれか一項に定義される通りである、請求項２５〜３２のいずれか一項に記載の集団。
【請求項３４】
請求項２４〜３３のいずれか一項に記載のＴ細胞集団および薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項３５】
ヒトまたは動物の体の治療方法に使用するための、請求項２４〜３３のいずれか一項に記載のＴ細胞集団。
【請求項３６】
個体における癌の治療方法に使用するための、請求項２４〜３３のいずれか一項に記載のＴ細胞集団。
【請求項３７】
個体における癌の治療のための薬物の製造における、請求項２４〜３３のいずれか一項に記載のＴ細胞集団の使用。
【請求項３８】
癌を有する個体に請求項２４〜３３のいずれか一項に記載のＴ細胞集団を投与することを含む、癌を治療する方法。
【請求項３９】
請求項３６による使用のための集団、請求項３７による使用、または請求項３８による方法であって、前記癌は、前記抗原受容体に結合する１つ以上の癌細胞の存在によって特徴付けられる、使用のための集団、使用、または方法。
【請求項４０】
前記Ｔ細胞は自己由来である、請求項３６〜３９のいずれか一項に記載の、使用のための集団、使用、または方法。
【請求項４１】
前記Ｔ細胞は同種由来である、請求項３６〜４０のいずれか一項に記載の、使用のための集団、使用、または方法。
【請求項４２】
改変Ｔ細胞集団を生成する方法であって、
請求項１〜２２のいずれか一項に記載の核酸構築物またはベクターを、ドナー個体から得られたＴ細胞集団に導入して改変Ｔ細胞集団を生成すること、を含む、方法。
【請求項４３】
前記改変Ｔ細胞を拡大培養するおよび／または保存する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記改変Ｔ細胞集団を薬学的に許容される賦形剤と配合することを含む、請求項４２または４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記改変Ｔ細胞集団をレシピエント個体に投与することを含む、請求項４２〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記レシピエント個体は癌状態を有する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記癌状態は、前記抗原受容体に結合する１つ以上の癌細胞の存在によって特徴付けられる、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記ドナー個体と前記レシピエント個体とが同じである、請求項４２〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記ドナー個体と前記レシピエント個体とが異なる、請求項４２〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞傷害活性を増加させるためのＴ細胞の改変、および、例えば癌の治療のための、免疫療法における改変Ｔ細胞の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｔ細胞（またはＴリンパ球）は、組織および腫瘍環境内に広く分布している。Ｔ細胞は、細胞表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の存在によって他のリンパ球と区別される。ＴＣＲは、Ｔ細胞の抗原特異的活性化を媒介するマルチサブユニット膜貫通複合体である。ＴＣＲは、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子によって標的細胞上に提示される抗原ペプチドリガンドを認識することにより、Ｔ細胞に抗原特異性を付与する。
【０００３】
腫瘍標的細胞内の変化または突然変異したタンパク質に由来するペプチドは、特異的ＴＣＲを発現するＴ細胞によって異物として認識され得るが、腫瘍細胞上の多くの抗原は、単に上方制御されるかまたは過剰発現されるだけで（いわゆる自己抗原）、機能的Ｔ細胞応答を誘導しない。したがって、悪性細胞型において発現または高発現されるが、正常細胞型には発現されない標的腫瘍抗原を同定することに研究の重点が置かれてきた。そのような標的の例として、多数のヒト癌に発現されるが、正常組織には限定された発現を示す癌／精巣（ＣＴ）抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１（Ｃｈｅｎ  Ｙ−Ｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９７；９４（５）：１９１４−１９１８）、および非常に限定された数の健康な組織に発現されるＣＴ抗原のＭＡＧＥ−Ａファミリー（Ｓｃａｎｌａｎ  Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ．２００２；１８８：２２−３２）が挙げられる。
【０００４】
そのような抗原の同定は、特異的かつ有効な癌治療を提供する可能性を有する、標的化Ｔ細胞に基づく免疫療法の開発を促進してきた（Ｈｏ，Ｗ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２００３；３：１３１８−１３２８；Ｍｏｒｒｉｓ，Ｅ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３；１３１：１−７；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．Ｎａｔｕｒｅ  ２００１；４１１：３８０−３８４；Ｂｏｏｎ，Ｔ．ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｒｕｇｇｅｎ  Ｐ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９６；１８３：７２５−７２９）。
【０００５】
インターロイキン７（ＩＬ−７）の静脈内投与は、Ｔ細胞に基づく免疫療法の転帰を改善するために提唱されている。インターロイキン７（ＩＬ−７）の静脈内投与は、Ｔ細胞に基づく免疫療法の結果を改善するために提唱されている。ＩＬ−７は、腫瘍特異的Ｔ細胞の持続性を支持することが知られており（Ｍｅｌｃｈｉｏｎｄａ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００５；１１５：１１７７−８７）、ＩＬ−７を分泌するようにまたは（投与されたＩＬ−７と併せて）ＩＬ−７受容体を過剰発現するように遺伝子改変されたＴ細胞は、前臨床モデルにおいて増強された抗腫瘍効果を示す（Ｖｅｒａ，Ｊ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２００９；１７：８８０−８，Ｍａｒｋｌｅｙ，Ｊ．Ｃ．ａｎｄ  Ｓａｄｅｌａｉｎ，Ｍ．Ｂｌｏｏｄ  ２０１０；１１５：３５０８−３５１９）。しかしながら、癌を有する患者へのサイトカインの全身投与は有意な毒性を引き起こした（Ｓｐｏｒｔｅｓ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１０；１６：７２７−３５，Ｃｏｎｌｏｎ，Ｋ．Ｃ．ｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２０１５；３３：７４−８２，Ｂｒｕｄｎｏ，Ｊ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  ２０１６；１２７：３３２１−３１）。サイトカインを分泌またはトランス提示するためのＴ細胞の遺伝子改変等の代替のアプローチ（Ｈｕｔｔｏｎ  Ｌ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２０１６；１１３：Ｅ７７８８−９７）は、神経毒性、および分泌されたサイトカインの全身蓄積によるサイトカイン放出症候群を含む重篤な有害事象のリスクを伴うが（Ｚｈａｎｇ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２１；２１：２２７８−８８）、サイトカイン受容体を過剰発現するＴ細胞は、外因性サイトカインの必要性を排除しない（Ｖｅｒａ，Ｊ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２００９；１７：８８０−８）。したがって、ＩＬ−７等のサイトカインおよび他の生理活性分子をＴ細胞に安全に送達するための方法は依然として不明である。
【発明の概要】
【０００６】
本発明者らは予想外にも、Ｔ細胞活性化に伴って、抗原受容体の構成的発現およびインターロイキン７（ＩＬ−７）等の生理活性分子の誘導性発現を提供する核酸構築物を含むＴ細胞が、Ｔ細胞において生理活性分子が構成的に発現される場合に観察される高い毒性を示すことなく、改善された抗腫瘍特性を示すことを認識した。
【０００７】
本発明の第１の態様は、核酸構築物であって、
（ｉ）生理活性分子をコードする第１のヌクレオチド配列と、
（ｉｉ）抗原受容体をコードする第２のヌクレオチド配列と、
（ｉｉｉ）第１のヌクレオチド配列に作動可能に連結された誘導性プロモーターと、
（ｉｖ）第２のヌクレオチドに作動可能に連結された構成的プロモーターと、を含む、核酸構築物を提供する。
【０００８】
好ましくは、生理活性分子はサイトカインであり、最も好ましくはＩＬ−７である。
【０００９】
本発明の第２の態様は、第１の態様の核構築物を含むベクター、例えばレンチウイルスベクターを提供する。
【００１０】
本発明の第３の態様は、第１または第２の態様による核構築物またはベクターを含むＴ細胞集団を提供する。
【００１１】
本発明の第４の態様は、Ｔ細胞活性化に伴って、異種抗原受容体を構成的に発現し、ＩＬ−７等の生理活性分子を誘導性に発現するＴ細胞集団を提供する。
【００１２】
本発明の第５の態様は、第３または第４の態様によるＴ細胞集団および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【００１３】
本発明の第５の態様は、ヒトまたは動物の体の治療方法、例えば、個体における癌の治療方法に使用するための、第３または第４の態様によるＴ細胞集団を提供する。関連する態様は、個体における癌の治療のための薬物の製造における第３または第４の態様によるＴ細胞集団の使用、ならびに癌を有する個体に第３または第４の態様によるＴ細胞集団を投与することを含む、癌を治療する方法を提供する。
【００１４】
本発明の第６の態様は、改変Ｔ細胞集団を生成する方法であって、
第１または第２の態様による核酸構築物またはベクターを、ドナー個体から得られたＴ細胞集団に導入して改変Ｔ細胞集団を生成すること、を含む、方法を提供する。
【００１５】
本発明の第７の態様は、それを必要とする個体における癌を治療する方法であって、
第１または第２の態様による核酸構築物またはベクターを、ドナー個体から得られたＴ細胞集団に導入して改変Ｔ細胞集団を生成することと、
改変Ｔ細胞集団をレシピエント個体に投与することと、を含む、方法を提供する。
【００１６】
ドナー個体とレシピエント個体とは同じであってもよい（すなわち、自己治療；改変Ｔ細胞は、後にその改変Ｔ細胞で治療される個体から得られる）、またはドナー個体とレシピエント個体とは異なってもよい（すなわち、同種治療；改変Ｔ細胞がある個体から得られ、後に異なる個体を治療するために使用される）。
【００１７】
本発明の他の態様および実施形態を以下に記載する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
図１は、ＮＦＡＴ誘導性ＩＬ−７発現インサートの配列およびアノテーションを示す。配列は５’から３’の方向に示され、カセットの個々の構成要素が強調表示されている。これらは、ＮＦＡＴ  ＩＬ−２  ＴＲＥ  ＧＧＡＧＧＡＡＡＡＡＣＴＧＴＴＴＣＡＴＡＣＡＧＡＡＧＧＣＧＴ、最小ＣＭＶプロモーター、ＩＬ−７コード配列（コドン最適化）およびＳＶ４０ポリＡの３つのコピーを含む。
【００１９】
【図１】は、ＧｅｎｅＡｒｔによって供給されたＮＦＡＴ−ＩＬ−７プラスミドのマップを示す。ＮＦＡＴ−ＩＬ−７カセットは、ＡｇｅＩおよびＭｌｕＩで消化することにより除去した。
【図２】は、ＴＣＲ１を発現するレンチウイルスベクターのベクターマップを示す。強調表示されているのは、特有のＡｇｅＩおよびＭｌｕＩ制限部位である。
【図３】は、構築物ＡＤＢ９６７のベクターマップを示す。ＮＦＡＴ−ＩＬ−７カセットは、ＡｇｅＩ制限部位とＭｌｕＩ制限部位の間にクローニングした。ＩＬ−７の転写は、アンチセンス鎖から、ＴＣＲ１のアンチセンス鎖とは逆方向に行った。
【図４】は、ＡＤＢ１０９９  ＩＬ７＿Ｔ２Ａ＿ＴＣＲ１のベクターマップを示す。ＩＬ７＿Ｔ２Ａ＿ＴＣＲ１は、ＩＬ−７を有する単一のＯＲＦとして発現され、ＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖が２Ａ様スキップ配列によって隔てられる。
【図６】は、ＮＦＡＴ誘導性ＩＬ−７  ＴＣＲ２のプラスミドマップを示す。
【図７】は、構成的ＩＬ−７＿ＴＣＲ２のベクターマップを示す。ＩＬ−７＿ＴＣＲ２は、ＮｈｅＩ部位とＳａｌＩ部位の間でベクターＡＢ１２２４にクローニングした。
【図８】は、本試験で使用される３つの主なレンチウイルス構築物の設計の概略図である。ＩＬ−２プロモーター配列に由来するＮＦＡＴプロモーターの３つの反復配列の制御下でＩＬ−７を一方向に発現するか、またはＳＰＥＡＲ  ＴＣＲおよびＳＰＥＡＲ  ＴＣＲの構成的発現の存在下でＩＬ−７を構成的に発現する構築物を生成した。注：構築物の様々な構成要素のサイズは縮尺通りには示されていない。
【図９】は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージならびにＴ細胞形質導入効率の評価を示す。ＮＴＤ  Ｔ細胞（白丸）、ＴＣＲで形質導入されたＴ細胞（黒い四角）、構成的ＩＬ−７＿ＴＣＲ（黒い三角）、またはＮＦＡＴ＿ＩＬ−７＿ＴＣＲ（黒丸）。データは平均±ＳＤを示す。（Ａ）データは、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋のいずれかであったＣＤ３＋Ｔ細胞のパーセンテージとして示されている。（Ｂ）データは、ＣＤ３＋およびＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋のいずれかであり、かつＴＣＲ  Ｖα２４＋であった細胞のパーセンテージとして示されている。（Ｃ）データは、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋のいずれかのＶα２４＋集団における平均蛍光強度（ＭＦＩ）として示されている。
【図１０】は、ＣＤ４＋Ｔ細胞上の４−１ＢＢ、ＣＤ１２７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ−４０、ＰＤ−１およびＴＩＭ−３の発現の評価を示す。ＮＴＤ  Ｔ細胞（白丸）、ＴＣＲで形質導入されたＴ細胞（黒い四角）、構成的ＩＬ−７＿ＴＣＲ（黒い三角）、またはＮＦＡＴ＿ＩＬ−７＿ＴＣＲ（黒丸）。データは平均±ＳＤを示す。データは、４−１ＢＢ＋、ＣＤ１２７＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ４０Ｌ＋、ＯＸ−４０＋、ＰＤ−１＋またはＴＩＭ−３＋のいずれか、および（Ａ）ＣＤ４＋（Ｂ）ＣＤ４＋Ｖα２４＋または（Ｂ）ＣＤ４＋Ｖα２４のいずれかであった細胞のパーセンテージとして示されている。
【図１１】は、ＣＤ８＋Ｔ細胞上の４−１ＢＢ、ＣＤ１２７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ−４０、ＰＤ−１およびＴＩＭ−３の発現の評価を示す。ＮＴＤ  Ｔ細胞（白丸）、ＭＡＧＥ−Ａ４ｃ１０３２  ＴＣＲで形質導入されたＴ細胞（黒い四角）、構成的ＩＬ−７＿ＭＡＧＥ−Ａ４ｃ１０３２  ＴＣＲ（黒い三角）またはＮＦＡＴ＿ＩＬ−７＿ＭＡＧＥ−Ａ４ｃ１０３２ＴＣＲ（黒丸）。データは平均±ＳＤを示す。データは、４１ＢＢ＋、ＣＤ１２７＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ４０Ｌ＋、ＯＸ−４０＋、ＰＤ−１＋またはＴＩＭ−３＋のいずれか、および（Ａ）ＣＤ８＋（Ｂ）ＣＤ８＋Ｖα２４＋または（Ｂ）ＣＤ８＋Ｖα２４−のいずれかであった細胞のパーセンテージとして示されている。
【図１２】は、無処置およびメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞の割合の評価を示す。ＮＴＤ  Ｔ細胞（白丸）、ＴＣＲで形質導入されたＴ細胞（黒い四角）、構成的ＩＬ−７＿ＴＣＲ（黒い三角）、またはＮＦＡＴ＿ＩＬ−７＿ＴＣＲ（黒丸）。データは平均±ＳＤを示す。データは、ＣＣＲ７−ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＣＲ７−ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＣＲ７−ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＣＲ７−ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−またはＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ＋のいずれか、および（Ａ）ＣＤ４＋（Ｂ）ＣＤ４＋Ｖα２４＋または（Ｂ）ＣＤ４＋Ｖα２４−のいずれかであった細胞のパーセンテージとして示されている。
【図１３】は、無処置およびメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の割合の評価を示す。ＮＴＤ  Ｔ細胞（白丸）、ＴＣＲで形質導入されたＴ細胞（黒い四角）、構成的ＩＬ−７＿ＴＣＲ（黒い三角）、またはＮＦＡＴ＿ＩＬ−７＿ＴＣＲ（黒丸）。データは平均±ＳＤを示す。データは、ＣＣＲ７−ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＣＲ７−ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＣＲ７−ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＣＲ７−ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−またはＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ＋のいずれか、および（Ａ）ＣＤ８＋（Ｂ）ＣＤ８＋Ｖα２４＋または（Ｂ）ＣＤ８＋Ｖα２４−のいずれかであった細胞のパーセンテージとして示されている。
【図１４】は、抗原陽性細胞および陰性細胞に対応するＴ細胞によるＩＬ−７産生を示す。ＮＴＤ  Ｔ細胞（白丸）、ＴＣＲで形質導入されたＴ細胞（黒い四角）、構成的ＩＬ−７＿ＴＣＲ（黒い三角）、またはＮＦＡＴ＿ＩＬ−７＿ＴＣＲ（黒丸）を、４８時間単独でインキュベートするか、またはＡ３７５、Ｍｅｌ６２４、もしくはＣｏｌｏ２０５細胞とともにインキュベートした。外因性ペプチドまたはＣＤ３／ＣＤ２８ビーズでパルスされたＡ３７５細胞を対照として含めた。データは６人のドナーに由来していた。Ｔ細胞由来の上清を１：５または１：１０のいずれかで希釈した。標準曲線上の最大濃度は、１０００ｐｇ／ｍｌであるため、任意の値＞２０００ｐｇ／ｍｌ、５０００ｐｇ／ｍｌまたは１０．０００ｐｇ／ｍｌは、それぞれ２０００ｐｇ／ｍｌ、５０００ｐｇ／ｍｌまたは１０．０００ｐｇ／ｍｌの値に割り当てられた。データは、３通りのウェルの平均±ＳＤを示す。
【図１５】は、照射されたＡ３７５細胞を用いた反復刺激に対応する、ドナーＦＸＡ−００６およびＦＦＡ−００４からの総Ｔ細胞数を示す（アッセイ参照番号：ＡＣＦ１１４１）。２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７の存在下または非存在下で照射されたＡ３７５（ＨＬＡ−Ａ２＋／ＮＹ−ＥＳＯ＋）細胞で毎週再刺激したＮＴＤ  Ｔ細胞（白丸）、ＴＣＲで形質導入されたＴ細胞（黒い四角）、構成的ＩＬ−７＿ＴＣＲ（黒い三角）、またはＮＦＡＴ＿ＩＬ−７＿ＴＣＲ（黒丸）を用いた共培養物からの総生細胞数（トリパンブルー陰性細胞）。０、７、１４および２１日目に再刺激を行い、それらが矢印で示されている。Ｔ細胞は、ＩＬ−７の非存在下ではドナー（Ａ）ＦＸＡ−００６もしくは（Ｂ）ＦＦＡ−００４、またはＩＬ−７の非存在下では（Ｃ）ＦＸＡ−００６もしくは（Ｄ）ＦＦＡ−００４に由来するものであった。総細胞数は７、１４、２１および２８日目に評価した。
【図１６】は、ＴＣＲを単独で発現するかまたはＴＣＲを構成的ＩＬ−７とともに発現するＴ細胞と比較して、誘導性ＩＬ−７と操作されたＴＣＲを共発現するＴ細胞を注射したマウスの生存を示す。示されるように、０日目に１×１０６個のＭｅｌ６２４腫瘍細胞を静脈内注射し、続いて７日目に２×１０６個の全Ｔ細胞を静脈内注射したマウスについて生存曲線を示す。形質導入されたＴ細胞（ＴＣＲ  Ｖβ＋／ＣＤ３＋）のパーセンテージを、ＮＴＤ  Ｔ細胞を用いた注射前に約４２％に正規化した。要求される状態不良／体重減少に従ってマウスを間引き、グラフは試験期間にわたる各群の生存率を示している。（Ａ〜Ｅ）腫瘍のみを注射したマウス（実線）または示される様々なＴ細胞を注射したマウス（破線および点線）の生存率。
【００２０】
発明の詳細な説明
本発明は、ＩＬ−７等の生理活性分子を誘導性に発現し、抗原受容体を構成的に発現する改変Ｔ細胞に関する。改変Ｔ細胞は、
（ｉ）生理活性分子をコードする第１のヌクレオチド配列と、
（ｉｉ）抗原受容体をコードする第２のヌクレオチド配列と、
（ｉｉｉ）第１のヌクレオチド配列に作動可能に連結された誘導性プロモーターと、
（ｉｖ）第２のヌクレオチドに作動可能に連結された構成的プロモーターと、を含む、核酸構築物を含んでもよい。
【００２１】
Ｔ細胞（Ｔリンパ球とも称される）は、細胞媒介性免疫において中心的役割を果たす白血球である。Ｔ細胞は、細胞表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の存在によって他のリンパ球と区別することができる。Ｔ細胞にはいくつかの種類があり、それぞれの種類が別個の機能を有する。
【００２２】
Ｔヘルパー細胞（ＴＨ細胞）は、ＣＤ４表面糖タンパク質を発現するため、ＣＤ４＋Ｔとして知られている。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、適応免疫系において重要な役割を果たし、Ｔ細胞サイトカインを放出することによって、および免疫応答の抑制または調節を助けることによって、他の免疫細胞の活性を助ける。これらは細胞傷害性Ｔ細胞の活性化および増殖に不可欠である。
【００２３】
細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＣ細胞、ＣＴＬ、キラーＴ細胞）は、ＣＤ８表面糖タンパク質を発現するため、ＣＤ８＋Ｔ細胞として知られている。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞を破壊するように作用する。ほとんどのＣＤ８＋Ｔ細胞は、クラスＩ  ＭＨＣ分子によって感染細胞または損傷細胞の表面上に提示される特異的抗原を認識することができるＴＣＲを発現する。抗原およびＭＨＣ分子へのＴＣＲおよびＣＤ８糖タンパク質の特異的結合は、感染細胞または損傷細胞のＴ細胞媒介性破壊をもたらす。
【００２４】
本明細書に記載される使用のためのＴ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞であり得る。例えば、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞の混合集団であってもよい。
【００２５】
本明細書に記載される使用に好適なＴ細胞は、ドナー個体から得ることができる。いくつかの実施形態において、ドナー個体は、本明細書に記載される改変および拡大培養の後にＴ細胞が投与されるレシピエント個体と同じ人物であってもよい（自己治療）。他の実施形態において、ドナー個体は、本明細書に記載される改変および拡大培養の後にＴ細胞が投与されるレシピエント個体とは異なる人物であってもよい（同種治療）。例えば、ドナー個体は、癌に罹患するレシピエント個体と（提供の前または後のいずれかに）ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）が一致する健康な個体であってもよい。
【００２６】
本明細書に記載される方法は、ドナー個体からＴ細胞を得るステップおよび／または癌を有する個体から得られた試料からＴ細胞を単離するステップを含んでもよい。
【００２７】
Ｔ細胞集団は、血液試料から単離されてもよい。Ｔ細胞の単離に好適な方法は当該技術分野で周知であり、例えば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ：例えば、Ｒｈｅｉｎｈｅｒｚ  ｅｔ  ａｌ（１９７９）ＰＮＡＳ  ７６  ４０６１を参照）、細胞パニング（例えば、Ｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ（１９８２）Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ７２  １２２を参照）および抗体で被覆された磁気ビーズを使用した単離（例えば、Ｇａｕｄｅｒｎａｃｋ  ｅｔ  ａｌ  １９８６  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ９０  １７９を参照）が挙げられる。
【００２８】
ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞は、血液試料から得られた末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の集団から単離されてもよい。ＰＢＭＣは、標準的な技術を用いて血液試料から抽出することができる。例えば、Ｆｉｃｏｌｌを勾配遠心分離と組み合わせて使用して（Ｂｏｙｕｍ  Ａ．Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ．１９６８；２１（Ｓｕｐｐｌ．９７）：７７−８９）、全血を血漿の最上層、続いて、ＰＢＭＣの層、ならびに多形核細胞および赤血球の底画分に分離してもよい。いくつかの実施形態において、ＰＢＭＣからＣＤ１４＋細胞（単球）を枯渇させてもよい。
【００２９】
単離に続いて、Ｔ細胞を活性化してもよい。Ｔ細胞を活性化するのに好適な方法は当該技術分野で周知である。例えば、単離されたＴ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アゴニストに曝露されてもよい。好適なＴＣＲアゴニストは、樹状細胞等の抗原提示細胞の表面上のクラスＩまたはＩＩのＭＨＣ分子上に提示されるペプチド等のリガンド、および抗ＴＣＲ抗体等の可溶性因子を含む。
【００３０】
抗ＴＣＲ抗体は、例えばεＣＤ３、αＣＤ３、またはαＣＤ２８等の、ＴＣＲの構成要素に特異的に結合し得る。ＴＣＲ刺激に好適な抗ＴＣＲ抗体は、当該技術分野で周知であり（例えば、ＯＫＴ３）、商業的な供給業者（例えば、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＣＯ  ＵＳＡ）から入手可能である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、抗αＣＤ３抗体およびＩＬ２への曝露によって活性化され得る。より好ましくは、Ｔ細胞は、抗αＣＤ３抗体および抗αＣＤ２８抗体への曝露によって活性化される。活性化は、ＣＤ１４＋単球の存在下または非存在下で起こり得る。好ましくは、Ｔ細胞は、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体でコーティングされたビーズで活性化され得る。例えば、ＰＢＭＣ、またはＣＤ４＋および／もしくはＣＤ８＋細胞を含むＴ細胞のサブセットは、フィーダー細胞（抗原提示細胞）または抗原なしで、抗体でコーティングされたビーズ、例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  Ｔ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ＣＤ３／ＣＤ２８（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）等の抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体でコーティングされた磁気ビーズを使用して活性化され得る。
【００３１】
単離および活性化に続いて、核酸構築物を組み込むようにＴ細胞を改変してもよい。
【００３２】
改変Ｔ細胞において発現される生理活性分子および抗原受容体は、異種核酸によってコードされる組換えタンパク質であり、すなわち、生理活性分子および抗原受容体は、組換え技術によってＴ細胞に組み込まれたコード核酸から発現される。
【００３３】
生理活性分子および抗原受容体を発現させるためのＴ細胞の改変は、核酸構築物をＴ細胞に導入することを含んでもよい。Ｔ細胞への異種核酸の導入および発現に好適な方法は、当該技術分野で周知であり、より詳細に後述される。
【００３４】
生理活性分子は、成長因子またはサイトカイン、好ましくはインターロイキン７（ＩＬ−７）であり得る。インターロイキン７（ＩＬ−７）は、ヒトＩＬ−７であってもよく、配列番号３のアミノ酸配列を有し得る。
【００３５】
誘導性プロモーターからのＩＬ−７の発現は、Ｔ細胞活性化によって誘導される。
【００３６】
誘導性プロモーターは、活性化Ｔ細胞核内因子（ＮＦＡＴ）／ＡＰ１転写応答エレメント（ＴＲＥ）を含んでもよい。同族ペプチドＭＨＣ１複合体を認識すると、ＮＦＡＴはＣａ２＋依存性核内移行を起こし、ＮＦＡＴ  ＴＲＥを内部に有する遺伝子の転写を促進する。好適なＮＦＡＴ  ＴＲＥは当該技術分野で周知であり、配列番号１４またはその変異体を有するヒトＩＬ２プロモーターＮＦＡＴ  ＴＲＥを含む（Ｍａｃｉａｎ  ｅｔ  ａｌ  （２００１）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２００１  Ａｐｒ  ３０；２０（１９）：２４７６−８９）。
【００３７】
誘導性プロモーターは、ＮＦＡＴ  ＴＲＥの１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の反復配列を含んでもよい。
【００３８】
誘導性プロモーターは、追加のプロモーターエレメント、例えば、ＣＭＶ等の最小ウイルスプロモーターをさらに含んでもよい。好適なプロモーターエレメントは当該技術分野で周知であり、配列番号１５またはその変異体の最小ＣＭＶプロモーターを含む。
【００３９】
ＩＬ−７をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された好適な誘導性プロモーター配列は、配列番号１のヌクレオチド配列またはその変異体を含んでもよい。
【００４０】
構成的プロモーターからの発現は、転写因子に応じて変化しないが、第２の核酸配列は、Ｔ細胞内で連続的に発現される。好適な構成的プロモーターは当該技術分野で周知であり、ヒト伸長因子１α（ＥＦ１α）等の哺乳動物プロモーターを含む。
【００４１】
好適な抗原受容体は、標的細胞、好ましくは癌細胞に特異的に結合し得る。
【００４２】
抗原受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）であってもよい。ＴＣＲは、典型的には、不変ＣＤ３鎖分子との複合体として発現される可変性の高いアルファ（α）鎖およびベータ（β）鎖を含む、ジスルフィド結合された膜アンカー型ヘテロ二量体タンパク質である。これらの種類のＴＣＲを発現するＴ細胞は、α：β（またはαβ）Ｔ細胞と称される。少数のＴ細胞は、可変ガンマ（γ）およびデルタ（δ）鎖を含む代替的なＴＣＲを発現し、γδ  Ｔ細胞と称される。
【００４３】
好適なＴＣＲは、腫瘍抗原のペプチド断片を提示する癌細胞の表面上の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）に特異的に結合する。ＭＨＣは、獲得免疫系が「外来性」分子を認識することを可能にする細胞表面タンパク質のセットであるタンパク質は、細胞内で分解され、ＭＨＣによって細胞表面上に提示される。ウイルスまたは癌関連ペプチド等の「外来性」ペプチドを提示するＭＨＣは、適切なＴＣＲを有するＴ細胞によって認識され、細胞破壊経路を促進する。癌細胞の表面上のＭＨＣは、腫瘍抗原のペプチド断片、すなわち、癌細胞上に存在するが、対応する非癌性細胞上には存在しない抗原を提示し得る。これらのペプチド断片を認識するＴ細胞は、癌細胞に対して細胞傷害性効果を発揮し得る。
【００４４】
好適なＴＣＲは当該技術分野で周知であり、配列番号６および１１のＴＣＲおよびその変異体を含む。
【００４５】
いくつかの実施形態において、ＴＣＲの個々の鎖（例えば、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖）のコード配列は、切断認識配列によって分離されてもよい。これは、ＴＣＲの鎖が、細胞内切断を受けて２つの別個のタンパク質を形成する単一の融合物として発現されることを可能にする。好適な切断認識配列は当該技術分野で周知であり、２Ａ−フューリン配列を含む。
【００４６】
好ましくは、ＴＣＲは、Ｔ細胞によって天然では発現されない（すなわち、ＴＣＲは外因性または異種性である）。異種ＴＣＲは、αβＴＣＲヘテロ二量体を含んでもよい。好適な異種ＴＣＲは、腫瘍抗原を発現する癌細胞に特異的に結合し得る。例えば、Ｔ細胞は、特定の癌患者の癌細胞によって発現される腫瘍抗原のペプチド断片を提示するＭＨＣに特異的に結合する異種ＴＣＲを発現するように改変されてもよい。癌患者の癌細胞によって発現される腫瘍抗原は、標準的な技術を用いて同定され得る。
【００４７】
異種ＴＣＲは、合成または人工ＴＣＲ、すなわち、天然には存在しないＴＣＲであってもよい。例えば、異種ＴＣＲは、腫瘍抗原に対するその親和性または結合活性を増加するように操作されてもよい（すなわち、高親和性ＴＣＲ）。高親和性ＴＣＲは、天然に存在するＴＣＲに対する１つ以上の突然変異、例えば、ＴＣＲのα鎖およびβ鎖の可変領域の超可変相補性決定領域（ＣＤＲ）に１つ以上の突然変異を含んでもよい。これらの突然変異は、癌細胞によって発現される腫瘍抗原のペプチド断片を提示するＭＨＣに対するＴＣＲの親和性を増加させる。作製された高親和性ＴＣＲの好適な方法は、ファージディスプレイまたは酵母ディスプレイを使用してＴＣＲ突然変異体のライブラリをスクリーニングすることを含み、また当該技術分野で周知である（例えば、Ｒｏｂｂｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００８）１８０（９）：６１１６；Ｓａｎ  Ｍｉｇｕｅｌ  ｅｔ  ａｌ（２０１５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２８（３）２８１−２８３；Ｓｃｈｍｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ  （２０１３）Ｂｌｏｏｄ  １２２  ３４８−２５６；Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ（２０１５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ５  ９０１を参照）。
【００４８】
好ましい高親和性ＴＣＲは、腫瘍抗原ＮＹ−ＥＳＯ１、ＰＲＡＭＥ、α−フェトタンパク質（ＡＦＰ）、ＭＡＧＥ  Ａ４、ＭＡＧＥ  Ａ１、ＭＡＧＥ  Ａ１０およびＭＡＧＥ  Ｂ２のうち１つ以上を発現する癌細胞に結合し得る。
【００４９】
代替として、抗原受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であってもよい。ＣＡＲは、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）等の免疫グロブリン抗原結合ドメインを含むように操作された人工受容体である。ＣＡＲは、例えば、ＴＣＲ  ＣＤ３膜貫通領域およびエンドドメインに融合されたｓｃＦｖを含んでもよい。ｓｃＦｖは、約１０個〜２５個のアミノ酸の短いリンカーペプチドに接合され得る、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である（Ｈｕｓｔｏｎ  Ｊ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９８８；８５（１６）：５８７９−５８８３）。リンカーは、柔軟性のためにグリシンリッチであってもよく、また溶解度のためにセリンもしくはトレオニンリッチであってもよく、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端に接続得るか、またはその逆であってもよい。小胞体、およびその後にＴ細胞表面にタンパク質を誘導するシグナルペプチドが、ｓｃＦｖに先行してもよい。ＣＡＲにおいて、ｓｃＦｖは、ＴＣＲ膜貫通ドメインおよびエンドドメインに融合されてもよい。可変的な方向および抗原結合を可能にするために、柔軟なスペーサーがｓｃＦｖとＴＣＲ膜貫通ドメインの間に含まれ得る。エンドドメインは、受容体の機能的シグナル伝達ドメインである。ＣＡＲのエンドドメインは、例えば、ＣＤ３  ζ鎖、またはＣＤ２８、４１ＢＢ、もしくはＩＣＯＳ等の受容体に由来する細胞内シグナル伝達ドメインを含んでもよい。ＣＡＲは、複数のシグナル伝達ドメイン、例えば、限定されないが、ＣＤ３ｚ−ＣＤ２８−４１ＢＢまたはＣＤ３ｚ−ＣＤ２８−ＯＸ４０を含んでもよい。
【００５０】
ＣＡＲは、癌細胞によって発現される腫瘍特異的抗原に特異的に結合し得る。例えば、Ｔ細胞は、特定の癌患者の癌細胞によって発現される腫瘍抗原に特異的に結合するＣＡＲを発現するように改変されてもよい。癌患者の癌細胞によって発現される腫瘍抗原は、標準的な技術を用いて同定され得る。
【００５１】
異種のＴＣＲまたはＣＡＲ等の異種抗原受容体の発現は、癌を有する個体の癌細胞の表面上に存在する１つ以上の腫瘍抗原を認識するように、またはその認識の改善を示すように、Ｔ細胞の免疫原性特異性を変化させ得る。
【００５２】
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、異種抗原受容体の非存在下では癌細胞に対する結合の減少を示す場合があるかまたは結合をまったく示さない場合がある。例えば、異種抗原受容体の発現は、改変されていないＴ細胞と比較して改変Ｔ細胞の癌細胞結合の親和性および／または特異性を増加させ得る。
【００５３】
「異種」という用語は、宿主細胞等の特定の生物系にとって異物であり、その系には天然に存在しないポリペプチドまたは核酸を指す。異種ポリペプチドまたは核酸は、例えば、組換え技術を用いて、人工的手段によって生物系に導入されてもよい。例えば、ポリペプチドをコードする異種核酸を好適な発現構築物に挿入し、今度はそれを用いてポリペプチドを産生するように宿主細胞を形質転換することができる。異種ポリペプチドまたは核酸は、合成または人工であってもよいか、または異なる種もしくは細胞型等の異なる生物系に存在してもよい内因性ポリペプチドまたは核酸は、宿主細胞等の特定の生物系が起源であり、その系に天然に存在する。組換えポリペプチドは、人工的手段によって、例えば組換え技術を用いて、細胞に導入された異種核酸から発現される。組換えポリペプチドは、細胞に天然に存在するポリペプチドと同一であってもよいか、またはその細胞に天然に存在するポリペプチドとは異なってもよい。
【００５４】
本明細書に記載される参照アミノ酸またはヌクレオチド配列の変異体は、参照配列に対して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の配列同一性を持つ配列を含んでもよい。特定のアミノ酸配列変異体は、１個のアミノ酸、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個またはそれ以上のアミノ酸の挿入、付加、置換または欠失によって上に示す反復ドメインと異なり得る。特定のヌクレオチド配列変異体は、１個のアミノ酸、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個またはそれ以上のアミノ酸の挿入、付加、置換または欠失によって本明細書に記載される基準配列と異なり得る。
【００５５】
配列類似性および同一性は、一般的にアルゴリズムＧＡＰ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ａｃｃｅｌｅｒｙｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＵＳＡ）を参照して定義される。ＧＡＰは、ＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈのアルゴリズムを使用して、マッチ数を最大にし、ギャップ数を最小にする２つの完全な配列を整合させる。一般的に、デフォルトのパラメータが使用され、ギャップ生成ペナルティ＝１２であり、ギャップ伸長ペナルティ＝４である。ＧＡＰの使用が好ましい場合があるが、他のアルゴリズム、例えば、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０５−４１０の方法を使用する）、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ  （１９８８）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ８５：２４４４−２４４８の方法を使用する）、またはＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７）、またはＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）（上記参照）のＴＢＬＡＳＴＮプログラムが使用されてもよく、通常はデフォルトパラメータが用いられる。特に、ｐｓｉ−Ｂｌａｓｔアルゴリズム（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９７）２５  ３３８９−３４０２）が使用されてもよい。
【００５６】
配列比較は、本明細書に記載される関連配列の全長にわたって行われ得る。
【００５７】
第２のヌクレオチド配列によってコードされる異種抗原受容体は、癌患者の癌細胞に特異的に結合し得る。癌患者は、その後、改変Ｔ細胞で治療されてもよい。改変Ｔ細胞を用いた治療に好適な癌患者は、
癌を有する個体から癌細胞の試料を得ることと、
該癌細胞が、第２のヌクレオチド配列によってコードされ、改変Ｔ細胞によって発現される抗原受容体に結合すると同定することと、を含む方法によって同定され得る。
【００５８】
癌細胞は、癌細胞によって発現される１つ以上の腫瘍抗原を同定することにより、第２のヌクレオチド配列によってコードされる抗原受容体に結合すると同定され得る。癌を有する個体から得られた癌細胞の表面上の抗原を同定する方法は、当該技術分野で周知である。
【００５９】
いくつかの実施形態において、特定の癌患者の治療に好適な異種抗原受容体は、
癌を有する個体から癌細胞の試料を得ることと、
該癌細胞に特異的に結合する抗原受容体を同定することと、によって同定され得る。
【００６０】
癌細胞に特異的に結合する抗原受容体は、例えば、癌細胞によって発現される１つ以上の腫瘍抗原を同定することによって同定されてもよい。癌を有する個体から得られた癌細胞の表面上の抗原を同定する方法は、当該技術分野で周知である。１つ以上の腫瘍抗原に結合するまたは１つ以上の抗原のＭＨＣ提示ペプチド断片に結合する抗原受容体は、次いで、例えば、既知の特異性の抗原受容体から、または多様な特異性を有する抗原受容体のパネルもしくはライブラリをスクリーニングすることによって同定され得る。１つ以上の定義された腫瘍抗原を有する癌細胞に特異的に結合する抗原受容体は、日常的な技術を用いて生成され得る。
【００６１】
同定された抗原受容体をコードする核酸は、本明細書に記載される核酸構築物中の第２のヌクレオチド配列として使用されてもよい。
【００６２】
本明細書に記載される治療に好適な個体の癌細胞は、抗原を発現する場合があり、抗原受容体に結合するのに適正なＨＬＡ型であり得る。
【００６３】
癌細胞は、１つ以上の抗原（すなわち、腫瘍抗原）の発現によって個体の正常な体細胞と区別され得る。個体の正常な体細胞は、１つ以上の抗原を発現しない場合があるか、または異なる方法で、例えば、より低いレベルで、異なる組織において、および／もしくは異なる発達段階で、それらを発現する場合がある。腫瘍抗原は、個体における免疫応答を誘発し得る。特に、腫瘍抗原は、腫瘍抗原を発現する個体の癌細胞に対してＴ細胞媒介性免疫応答を誘発することができる。患者の癌細胞によって発現される１つ以上の腫瘍抗原は、改変Ｔ細胞上の異種受容体の標的抗原として選択され得る。
【００６４】
癌細胞によって発現される腫瘍抗原は、例えば、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ５、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ７、ＭＡＧＥ−Ａ８、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１１、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＧＡＧＥ−Ｉ、ＧＡＧＥ−２、ＧＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−４、ＧＡＧＥ−５、ＧＡＧＥ−６、ＧＡＧＥ−７、ＧＡＧＥ−８、ＢＡＧＥ−Ｉ、ＲＡＧＥ−１、ＬＢ３３／ＭＵＭ−１、ＰＲＡＭＥ、ＮＡＧ、ＭＡＧＥ−Ｘｐ２（ＭＡＧＥ−Ｂ２）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ３（ＭＡＧＥ−Ｂ３）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ４（ＭＡＧＥ−Ｂ４）、ＭＡＧＥ−Ｃ１／ＣＴ７、ＭＡＧＥ−Ｃ２、ＮＹ−ＥＳＯ−Ｉ、ＬＡＧＥ−Ｉ、ＳＳＸ−Ｉ、ＳＳＸ−２（ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０）、ＳＳＸ−３、ＳＳＸ−４、ＳＳＸ−５、ＳＣＰ−ＩおよびＸＡＧＥ等の癌−生殖系列遺伝子によってコードされる癌−精巣（ＣＴ）抗原、ならびにそれらの免疫原性断片を含んでもよい（Ｓｉｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ（２００５）５，６１５−６２５、Ｇｕｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ（２００５）１１，８０５５−８０６２；Ｖｅｌａｚｑｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎ（２００７）７，１  １；Ａｎｄｒａｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎ（２００８）８，２；Ｔｉｎｇｕｅｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００８）；Ｎａｐｏｌｅｔａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  ｏｆ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎ（２００８）１９８，９９  ｅ９１−９７）。
【００６５】
他の腫瘍抗原は、例えば、過剰発現された、上方制御された、または突然変異したタンパク質および分化抗原、特に、ｐ５３、ｒａｓ、ＣＥＡ、ＭＵＣ１、ＰＭＳＡ、ＰＳＡ、チロシナーゼ、Ｍｅｌａｎ−Ａ、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００、ｇｐ７５、α−アクチニン−４、Ｂｃｒ−Ａｂｌ融合タンパク質、Ｃａｓｐ−８、β−カテニン、ｃｄｃ２７、ｃｄｋ４、ｃｄｋｎ２ａ、ｃｏａ−１、ｄｅｋ−ｃａｎ融合タンパク質、ＥＦ２、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１融合タンパク質、ＬＤＬＲ−フコシルトランスフェラーゼＡＳ融合タンパク質、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ１１、ｈｓｐ７０−２、ＫＩＡＡＯ２０５、Ｍａｒｔ２、Ｍｕｍ−２、および３、ｎｅｏ−ＰＡＰ、ミオシンクラスＩ、ＯＳ−９、ｐｍｌ−ＲＡＲ．α．融合タンパク質、ＰＴＰＲＫ、Ｋ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ＧｎＴＶ、Ｈｅｒｖ−Ｋ−ｍｅｌ、ＮＡ−８８、ＳＰ１７、およびＴＲＰ２−Ｉｎｔ２、（ＭＡＲＴ−Ｉ）、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲ、エプスタインバールウイルス抗原、ＥＢＮＡ、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６およびＥ７、ＴＳＰ−１８０、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ−３、ｃ−ｍｅｔ、ｎｍ−２３Ｈ１、ＰＳＡ、ＴＡＧ−７２−４、ＣＡ  １９−９、ＣＡ  ７２−４、ＣＡＭ  １７．１、ＮｕＭａ、Ｋ−ｒａｓ、α．−フェトタンパク質、１３ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ  １２５、ＣＡ  １５−３（ＣＡ  ２７．２９／ＢＣＡＡ）、ＣＡ  １９５、ＣＡ  ２４２、ＣＡ−５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８／ＫＰ１、ＣＯ−０２９、ＦＧＦ−５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３（ＥｐＣＡＭ）、ＨＴｇｐ−１７５、Ｍ３４４、ＭＡ−５０、ＭＧ７−Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／１７０Ｋ、ＮＹ−ＣＯ−１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ−９０（Ｍａｃ−２結合タンパク質／シクロフィリンＣ関連タンパク質）、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、ＴＰＳ等のメラノサイト分化抗原、ならびにＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２等のチロシンキナーゼ関連タンパク質を含む。
【００６６】
他の腫瘍抗原は、「ストレスを受けた」癌細胞によって用いられる非ＡＵＧ翻訳開始機構によって作製される、アウトオブフレームのペプチド−ＭＨＣ複合体を含む（Ｍａｌａｒｋａｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １９９９  Ｊｕｎ；１０（６）：６８１−９０）。
【００６７】
他の腫瘍抗原は当該技術分野で周知である（例えば、ＷＯ００／２０５８１；Ｃａｎｃｅｒ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ（２０００）Ｅｄｓ  Ｓｔｅｒｎ，Ｂｅｖｅｒｌｅｙ  ａｎｄ  Ｃａｒｒｏｌｌ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅを参照）。これらの腫瘍抗原の配列は、公的なデータベースから容易に入手可能であるが、ＷＯ１９９２／０２０３５６  Ａ１、ＷＯ１９９４／００５３０４  Ａ１、ＷＯ１９９４／０２３０３１  Ａ１、ＷＯ１９９５／０２０９７４  Ａ１、ＷＯ１９９５／０２３８７４  Ａ１およびＷＯ１９９６／０２６２１４  Ａ１にも見られる。
【００６８】
好ましい腫瘍抗原は、ＮＹ−ＥＳＯ１、ＰＲＡＭＥ、α−フェトタンパク質（ＡＦＰ）、ＭＡＧＥ  Ａ４、ＭＡＧＥ  Ａ１、ＭＡＧＥ  Ａ１０およびＭＡＧＥ  Ｂ２、最も好ましくはＮＹ−ＥＳＯ−１およびＭＡＧＥ−Ａ１０を含む。
【００６９】
ＮＹ−ＥＳＯ−１は、癌／精巣（ＣＴ）ファミリーのヒト腫瘍抗原であり、黒色腫、前立腺癌、移行上皮癌、膀胱癌、乳癌、肺癌、甲状腺癌、胃癌、頭頸部癌、および子宮頸癌を含む様々な癌において頻繁に発現される（ｖａｎ  Ｒｈｅｅ  Ｆ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  ２００５；１０５（１０）：３９３９−３９４４）。さらに、ＮＹ−ＥＳＯ−１の発現は、通常、生殖細胞に限定されており、体細胞では発現されない（Ｓｃａｎｌａｎ  Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎ．２００４；４（１））。ＮＹ−ＥＳＯ−１を発現する癌細胞に結合する好適な高親和性ＴＲＣは、ＮＹ−ＥＳＯ−１ｃ２５９を含む。
【００７０】
ＮＹ−ＥＳＯ−１ｃ２５９は、野生型ＴＣＲと比較してα鎖９５：９６ＬＹの９５位および９６位が突然変異した高親和性ＴＣＲである。ＮＹ−ＥＳＯ−１ｃ２５９は、ＨＬＡ−Ａ２＋クラス１対立遺伝子との関係において、ヒト癌精巣Ａｇ  ＮＹ−ＥＳＯ−１（ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ）のアミノ酸残基１５７〜１６５に対応するペプチドに、改変されていない野生型ＴＣＲと比較して高い親和性で結合する（Ｒｏｂｂｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００８）１８０（９）：６１１６）。
【００７１】
ＭＡＧＥ−Ａ１０は、ＣＴ抗原のＭＡＧＥ−Ａファミリーの免疫原性の高いメンバーであり、生殖細胞において発現されるが、健康な組織では発現されない。ＭＡＧＥ−Ａ１０は、多くの腫瘍に由来する高いパーセンテージの癌細胞で発現される（Ｓｃｈｕｌｔｚ−Ｔｈａｔｅｒ    Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．２０１１；１２９（５）：１１３７−１１４８）。
【００７２】
Ｔ細胞への核酸構築物の導入、およびその後の拡大培養は、インビトロおよび／またはエクスビボで行われ得る。
【００７３】
生理活性分子をコードする第１のヌクレオチド配列および抗原受容体をコードする第２のヌクレオチド配列は、同じ発現ベクターにおいてＴ細胞に導入される。これは、形質導入後に両方の遺伝子を発現するＴ細胞の割合を増加させる。
【００７４】
第１のヌクレオチド配列は、核酸構築物において第１の方向に発現するように構成されてもよく、第２のヌクレオチド配列は、第２の方向に発現するように構成されてもよい。例えば、ＩＬ−７をコードする第１のヌクレオチド配列が、核酸構築物において順方向にあってもよく、かつ抗原受容体をコードする第２のヌクレオチド配列が逆方向にあってもよいか、またはＩＬ−７をコードする第１のヌクレオチド配列が逆方向にあってもよく、かつ抗原受容体をコードする第２のヌクレオチド配列が順方向にあってもよい。第１のヌクレオチド配列が、核酸構築物のセンス鎖から転写されてもよく、かつ第２のヌクレオチド配列が、核酸構築物のアンチセンス鎖から転写されてもよいか、または第１のヌクレオチド配列が、核酸構築物のアンチセンス鎖から転写されてもよく、かつ第２のヌクレオチド配列が、核酸構築物のセンス鎖から転写されてもよい。
【００７５】
核酸構築物は、さらなる操作を容易にするために、１つ以上の固有の制限部位を含んでもよい。
【００７６】
いくつかの実施形態において、核酸構築物は、遺伝子編集技術を用いてＴ細胞まで直接導入されてもよい。
【００７７】
他の実施形態において、核酸構築物は、発現ベクターに組み込まれてもよい。好適なベクターは当該技術分野で周知であり、本明細書により詳細に記載される。好適なベクターの例として、以下に記載されるＡＢ１５８１およびＡＤＢ９６７が挙げられる。プロモーター配列、ターミネーター断片、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子、および必要に応じて他の配列を含む、適切な調節配列を含む好適なベクターを選択または構築することができる。好ましくは、ベクターは、哺乳動物細胞において核酸の発現を駆動するように適切な調節配列を含む。ベクターはまた、Ｅ．ｃｏｌｉ等の細菌宿主においてその選択、発現、および複製を可能にする、複製起点、プロモーター領域、および選択マーカー等の配列も含み得る。
【００７８】
好ましくは、核酸構築物は、ウイルスベクター、最も好ましくはガンマレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター、例えばＶＳＶｇ偽型レンチウイルスベクターに含まれる。Ｔ細胞は、核酸を含むウイルス粒子との接触によって形質導入されてもよい。形質導入のためのウイルス粒子は、既知の方法に従って生成され得る。例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、ウイルスのパッケージングおよびエンベロープ要素をコードするプラスミド、ならびにコード核酸を含むレンチウイルスベクターでトランスフェクトされ得る。ＶＳＶｇ偽型ウイルスベクターは、偽型ウイルス粒子を産生するように、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶｇ）のウイルスエンベロープ糖タンパク質Ｇと組み合わせて産生されてもよい。
【００７９】
レンチウイルス等のウイルスベクターは、１つ以上のウイルスタンパク質によってカプセル化された核酸ベクターを含むウイルス粒子に含まれてもよい。ウイルス粒子は、本明細書に記載されるウイルスベクターと、１つ以上のウイルスパッケージングおよびエンベロープベクターとを用いて哺乳動物細胞を形質導入することと、形質導入された細胞が培養培地中に放出されるレンチウイルス粒子を産生するように培地で細胞を培養することと、を含む方法によって産生することができる。
【００８０】
ウイルス粒子の放出に続いて、ウイルス粒子を含む培養培地を回収してもよく、任意選択的にウイルス粒子を濃縮してもよい。
【００８１】
産生および任意選択的な濃縮に続いて、例えば、Ｔ細胞の形質導入に使用できる状態にして−８０℃で凍結させることによって、ウイルス粒子を保存してもよい。
【００８２】
核酸構築物またはベクターは、任意の好都合な方法によってＴ細胞に導入され得る。異種核酸をＴ細胞に導入するまたは組み込む場合、当業者に周知の特定の懸案事項を考慮に入れる必要がある。挿入される核酸は、Ｔ細胞における転写を駆動する有効な調節エレメントを含む構築物またはベクター内で組み立てられるべきである。Ｔ細胞にコンストラクターベクターを輸送するのに好適な技術は、当該技術分野で周知であり、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、電気穿孔、リポソーム媒介トランスフェクション、およびレトロウイルスまたは他のウイルス、例えば、ワクシニアウイルスもしくはレンチウイルスを用いた形質導入を含む。例えば、固相形質導入は、レトロネクチンでコーティングされた、レトロウイルスベクターで前処理した組織培養プレート上での培養によって、選択せずに行われてもよい。
【００８３】
例えば、核酸構築物の調製、細胞へのＤＮＡの導入、および遺伝子発現における、核酸の操作および形質転換に関する多くの既知の技術およびプロトコルは、Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９２に詳細に記載されている。
【００８４】
Ｔ細胞への核酸の導入に続いて、改変Ｔ細胞が増殖して集団を拡大培養するように、改変Ｔ細胞の初期集団をインビトロで培養することができる。
【００８５】
改変Ｔ細胞集団は、例えば、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８でコーティングされた磁気ビーズを使用して拡大培養され得る。改変Ｔ細胞は、拡大培養された集団を生じるように任意の好都合な技術を用いて培養することができる。好適な培養系は、撹拌タンク発酵槽、エアリフト発酵槽、ローラーボトル、培養バッグまたは培養皿、および他のバイオリアクター、特に中空繊維バイオリアクターを含む。このようなシステムの使用は、当該技術分野で周知である。
【００８６】
エクスビボでのＴ細胞の増殖における使用に好適な多数の培養培地、特にＡＩＭ−Ｖ，Ｉｓｃｏｖｅｓ培地およびＲＰＭＩ−１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−ＧＩＢＣＯ）等の完全培地が利用可能である。培地は、血清、血清タンパク質および選択剤等の他の因子で補充されてもよい。例えば、いくつかの実施形態において、２ｍＭグルタミン、１０％  ＦＢＳ、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン、および５５μＭ  β−メルカプトエタノールを含み、任意選択的に２０ｎｇ／ｍｌの組換えＩＬ−２で補充されたＲＰＭＩ−１６４０培地が用いられてもよい。培養培地は、日常的な実験を用いて当業者によって容易に決定され得る標準濃度の前述のアゴニスト因子またはアンタゴニスト因子で補充されてもよい。
【００８７】
好都合には、好適な培養培地において、５％  ＣＯ２を含む湿潤雰囲気中３７℃で細胞が培養される。
【００８８】
Ｔ細胞および他の哺乳動物細胞の培養についての方法および技術は当該技術分野で周知である（例えばＢａｓｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｃ．Ｈｅｌｇａｓｏｎ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．Ｕ．Ｓ．（１５  Ｏｃｔ  ２００４）ＩＳＢＮ：１５８８２９５４５１；Ｈｕｍａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｓ．）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｕ．Ｓ．（９  Ｄｅｃ  ２００４）ＩＳＢＮ：１５８８２９２２２３；Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，Ｒ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ（２  Ａｕｇ  ２００５）ＩＳＢＮ：０４７１４５３２９３，Ｈｏ  ＷＹ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．（２００６）３１０：４０−５２を参照）。
【００８９】
いくつかの実施形態において、集団から改変Ｔ細胞を単離および／または精製することが好都合であり得る。ＦＡＣＳおよび抗体でコーティングされた磁気粒子を含む任意の好都合な技術が用いられ得る。
【００９０】
任意選択的に、本明細書に記載されるように生成された改変Ｔ細胞集団は、例えば、使用前に凍結乾燥および／または凍結保存によって保存されてもよい。
【００９１】
改変Ｔ細胞集団は、緩衝液、担体、希釈剤、保存剤、および／または薬学的に許容される賦形剤等の他の試薬と混合されてもよい。好適な試薬は、より詳細に後述される。本明細書に記載される方法は、改変Ｔ細胞集団と薬学的に許容される賦形剤とを混合することを含んでもよい。
【００９２】
投与（例えば、注入による）に好適な医薬組成物は、抗酸化剤、緩衝剤、保存剤、安定剤、静菌剤、および意図されるレシピエントの血液と製剤を等張にする溶質を含み得る、水性および非水性の等張なパイロジェンフリーの無菌注射溶液、ならびに懸濁剤および増粘剤を含み得る水性および非水性の無菌懸濁液を含む。このような製剤に使用するのに好適な等張性ビヒクルの例として、塩化ナトリウム注射液、リンゲル液、または乳酸リンゲル注射液が挙げられる。好適なビヒクルは、標準的な薬学の教科書、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９０に見ることができる。
【００９３】
いくつかの好ましい実施形態において、改変Ｔ細胞は、個体への静脈内注入に好適な医薬組成物に製剤化され得る。
【００９４】
本明細書で使用される「薬学的に許容される」という用語は、健全な医学的判断の範囲内で、合理的なベネフィット／リスク比に見合った、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴わない、対象（例えば、ヒト）の組織と接触させる使用に好適な化合物、材料、組成物、および／または剤形に関する。各担体、賦形剤等は、製剤の他の成分と適合性であるという意味で「許容される」必要もある。
【００９５】
本発明の他の態様は、本明細書に記載される核構築物またはベクターを発現する改変Ｔ細胞集団と、Ｔ細胞活性化に伴って、異種抗原受容体を構成的に発現し、ＩＬ−７を誘導性に発現するＴ細胞集団とを提供する。
【００９６】
Ｔ細胞は、癌細胞に特異的に結合し得る。好適な集団は、前述の方法によって生成され得る。
【００９７】
改変Ｔ細胞集団は、薬物として使用するためのものであってもよい。例えば、本明細書に記載される改変Ｔ細胞集団は、癌免疫療法による治療、例えば、養子Ｔ細胞療法に使用されてもよい。
【００９８】
本発明の他の態様は、癌の治療のための薬物の製造のための本明細書に記載される改変Ｔ細胞集団の使用、癌の治療のための本明細書に記載される改変Ｔ細胞集団を提供し、癌の治療方法は、本明細書に記載される改変Ｔ細胞集団を、それを必要とする個体に投与することを含んでもよい。
【００９９】
改変Ｔ細胞集団は自己由来であってもよく、すなわち、改変Ｔ細胞は元々、それらが後に投与されるのと同じ個体から得られた（すなわち、ドナー個体とレシピエント個体とが同じである）。個体への投与に好適な改変Ｔ細胞集団は、個体から得られたＴ細胞の初期集団を提供することと、本明細書に記載されるように、ＩＬ−７を誘導性に発現し、個体の癌細胞に特異的に結合する抗原受容体を構成的に発現するようにＴ細胞を改変することと、改変Ｔ細胞を培養することと、を含む方法によって生成されてもよい。
【０１００】
改変Ｔ細胞集団は同種由来であってもよく、すなわち、改変Ｔ細胞は元々、それらが後に投与される個体とは異なる個体から得られた（すなわち、ドナー個体とレシピエント個体が異なる）。ＧＶＨＤおよび他の望ましくない免疫作用を回避するために、ドナー個体とレシピエント個体とはＨＬＡ適合性であり得る。レシピエント個体への投与に好適な改変Ｔ細胞集団は、ドナー個体から得られたＴ細胞の初期集団を提供することと、本明細書に記載されるように、ＩＬ−７を誘導性に発現し、レシピエント個体の癌細胞に特異的に結合する抗原受容体を構成的に発現するようにＴ細胞を改変することと、改変Ｔ細胞を培養することと、を含む方法によって生成されてもよい。
【０１０１】
改変Ｔ細胞の投与に続いて、レシピエント個体は、レシピエント個体の癌細胞に対するＴ細胞媒介性免疫応答を呈し得る。これは、個体の癌状態に有益な効果を有し得る。
【０１０２】
癌状態は、悪性癌細胞の異常な増殖により特徴付けることができ、例えば、ＡＭＬ、ＣＭＬ、ＡＬＬおよびＣＬＬ等の白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫および多発性骨髄腫等のリンパ腫、ならびに肉腫、皮膚癌、黒色腫、膀胱癌、脳癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、肝臓癌、頭頸部癌、食道癌、膵癌、腎臓癌、副腎癌、胃癌、精巣癌、胆嚢と胆道の癌、甲状腺癌、胸腺癌、骨癌、および大脳癌等の固形癌だけではなく、原発不明癌（ＣＵＰ）も含み得る。
【０１０３】
個体における癌細胞は、個体の正常な体細胞とは免疫学的に異なり得る（すなわち、癌性腫瘍が免疫原性であり得る）。例えば、癌細胞は、個体において癌細胞によって発現される１つ以上の抗原に対する全身免疫応答を誘発することが可能であり得る。免疫応答を誘発する腫瘍抗原は、癌細胞に特異的であり得るか、または個体において１つ以上の正常細胞によって共有され得る。
【０１０４】
前述の治療に好適な個人は、げっ歯類（例えば、モルモット、ハムスター、ラット、マウス）、ネズミ科動物（例えば、マウス）、イヌ科動物（例えば、イヌ）、ネコ科動物（例えば、ネコ）、ウマ科動物（例えば、ウマ）、霊長類、サル（例えば、サルまたは類人猿）、サル（例えば、マーモセット、ヒヒ）、類人猿（例えば、ゴリラ、チンパンジー、オランウータン、テナガザル）、またはヒト等の哺乳動物であり得る。
【０１０５】
好ましい実施形態において、個体はヒトである。他の好ましい実施形態において、非ヒト哺乳動物、特に、ヒトにおける治療有効性を実証するためのモデルとして従来使用されている哺乳動物、（例えば、マウス、霊長類、ブタ、イヌ、またはウサギ動物｝が用いられてもよい。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、最初の癌治療の後に、個体は微小残存病変（ＭＲＤ）を有する場合がある。
【０１０７】
癌を有する個体は、当該技術分野で既知の臨床標準に従って癌の診断を行うのに十分な少なくとも１つの識別可能な兆候、症状、または検査所見を示し得る。このような臨床基準の例は、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｆａｕｃｉ  ＡＳ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１等の医学の教科書に見ることができる。場合によっては、個体における癌の診断は、個体から得られた体液または組織の試料における特定の細胞型（例えば、癌細胞）の同定を含んでもよい。
【０１０８】
治療は、ヒトまたは動物（例えば、獣医学的用途）にかかわらず、いくつかの所望の治療効果、例えば、状態の進行の阻害または遅延が達成される任意の処置および治療法であり得、進行速度の低下、進行速度の停止、状態の改善、状態の治癒もしくは寛解（部分もしくは完全にかかわらず）、状態の１つ以上の症状および／もしくは兆候の予防、遅延、軽減、もしくは阻止、または治療の非存在下で予想されるものを超える対象もしくは患者の生存期間の延長を含む。
【０１０９】
治療はまた、予防的（すなわち、予防）であってもよい。例えば、癌を発生もしくは再発しやすいまたはそのリスクがある個体が、本明細書に記載されるように治療されてもよい。そのような治療は、個体において発生または再発を予防または遅延することができる。
【０１１０】
具体的には、治療は、癌の完全寛解、および／または癌転移の阻害を含む、癌増殖を阻害することを含んでもよい。癌増殖は、通常、癌におけるより発達した形態への変化を示す多くの指標のいずれか１つを指す。したがって、癌増殖の阻害を測定するための指標は、癌細胞生存の減少、腫瘍体積または形態の減少（例えば、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、超音波検査、または他の画像診断法を用いて決定される）、腫瘍増殖の遅延、腫瘍血管系の破壊、遅延型過敏症皮膚試験における成績の向上、Ｔ細胞の活性における増加、および腫瘍特異抗原のレベルの低下を含む。本明細書に記載されるように改変されたＴ細胞の投与は、癌増殖、特に、対象に既に存在する癌の増殖に抵抗する、および／または個体における癌増殖の傾向を減少させる、個体の能力を改善し得る。
【０１１１】
改変Ｔ細胞または改変Ｔ細胞を含む医薬組成物は、全身的に／局所的であるかまたは所望の作用部位であるかにかかわらず、限定されないが、非経口、例えば注入によるものを含む、任意の好都合な投与経路によって対象に投与され得る。注入は、針またはカテーテルを介した好適な組成物中のＴ細胞の投与を含む。典型的には、Ｔ細胞は静脈内または皮下に注入されるが、Ｔ細胞は、筋肉内注射および硬膜外経路等の他の非経口経路を介して注入されてもよい。好適な注入技術は当該技術分野で既知であり、治療において一般的に使用される（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆ  Ｍｅｄ．，３１９：１６７６，１９８８を参照）。
【０１１２】
典型的には、投与される細胞の数は、典型的には３０分の間に、体重１ｋｇ当たり約１０５〜約１０１０個、典型的には１個体当たり２×１０８〜２×１０１０個の細胞であり、必要に応じて、例えば、数日から数週間の間隔で治療が繰り返される。改変Ｔ細胞および改変Ｔ細胞を含む組成物の適切な投薬量は、患者によって異なり得ることが理解されよう。最適な投薬量を決定することは、通常、本発明の治療の任意のリスクまたは有害な副作用に対する治療効果のレベルのバランスを取ることを含む。選択された投薬量レベルは、限定されないが、特定の細胞の活性、投与経路、投与時間、細胞の喪失もしくは不活性化の速度、治療期間、併用される他の薬物、化合物、および／もしくは物質、ならびに患者の年齢、性別、体重、状態、全身健康状態、及び以前の病歴を含む、様々な因子に依存する。細胞の量および投与経路は、最終的には医師の裁量によるが、一般的に、投薬量は、実質的な悪影響または有害な副作用を引き起こすことなく所望の効果を達成する、作用部位における局所濃度を達成するためのものである。
【０１１３】
改変Ｔ細胞は単独で投与され得るが、状況によっては、改変Ｔ細胞は、改変Ｔ細胞集団のインビボでの拡大培養を促進するように、標的抗原、標的抗原を提示するＡＰＣ、および／またはＩＬ−２と組み合わせて投与される細胞であってもよい。
【０１１４】
改変Ｔ細胞集団は、サイトカイン、例えばＩＬ−２、細胞傷害性化学療法、放射線、および癌免疫療法剤（例えば、抗−Ｂ７−Ｈ３、抗−Ｂ７−Ｈ４、抗−ＴＩＭ３、抗−ＫＩＲ、抗−ＬＡＧ３、抗−ＰＤ−１、抗−ＰＤ−Ｌ１、および抗ＣＴＬＡ４抗体等のチェックポイント阻害剤を含む）等の１つ以上の他の治療と組み合わせて投与されてもよい。
【０１１５】
１つ以上の他の治療は、好ましくは改変Ｔ細胞の投与部位とは別個の部位に、任意の好都合な手段によって施され得る。
【０１１６】
改変Ｔ細胞の投与は、治療過程全体を通して、１回の投与で、連続的に、または断続的に（例えば、適切な間隔で分割された用量で）達成され得る。投与の最も効果的な手段および投与量を決定する方法は、当業者には周知であり、治療に使用される製剤、治療の目的、治療される標的細胞、および治療される対象によって異なる。主治医によって選択される用量レベルおよびパターンで、単回または複数回投与が行われ得る。好ましくは、改変Ｔ細胞は、少なくとも１×１０９個のＴ細胞の単回注入において投与される。
【０１１７】
上記の説明において、または以下の特許請求の範囲において、または添付の図面において開示される特徴は、必要に応じて、それらの特定の形態において表されるか、あるいは開示される機能を実行するための手段、または開示される結果を得るための方法もしくはプロセスに関して表され、本発明をその多様な形態で実現するために、別々に、またはそのような特徴の任意の組み合わせにおいて利用され得る。
【０１１８】
本出願は、文脈上別段の要求がない限り、上記の態様および前述の実施形態の互いとの全ての組み合わせを開示することを理解されたい。同様に、本出願は、文脈上別段の要求がない限り、好ましいおよび／または任意の特徴の全ての組み合わせを、単独でまたは他の態様のいずれかと組み合わせて開示する。
【０１１９】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上明確に別段の指示がない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。範囲は、本明細書では「約」１つの特定の値から、および／または「約」別の特定の値までとして表され得る。そのような範囲が表される場合、別の実施形態は、１つの特定の値からおよび／または他の特定の値までを含む。同様に、値が近似値として表される場合、先行詞「約」の使用によって、特定の値が別の実施形態を形成することが理解されるであろう。
【０１２０】
上記実施形態の修正例、さらなる実施形態およびその修正例は、本開示を読むことにより当業者に明らかとなり、それ自体が本発明の範囲内である。
【０１２１】
本明細書で言及される全ての文書および配列データベースエントリーは、参照により全ての目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１２２】
「および／または」は、本明細書で使用される場合、２つの特定された特徴または構成要素の各々の、他方を含むかまたは含まない、具体的な開示として理解される。例えば、「Ａおよび／またはＢ」は、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、ならびに（ｉｉｉ）ＡおよびＢの各々の具体的な開示として、各々が本明細書に個別に述べられているかのように理解される。
【０１２３】
本発明の他の態様および実施形態は、用語「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」によって置き換えられる用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を有する前述の態様および実施形態と、用語「〜から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」によって置き換えられる用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を有する前述の態様および実施形態とを提供する。
【０１２４】
次に、本発明の特定の態様および実施形態を、例として、前述の図を参照して説明する。
【０１２５】
実験
１．方法
１．１．ＩＬ−７発現構築物の設計および生成
同族ペプチドＭＨＣ１複合体の認識後にＩＬ−７の誘導性発現を可能にするレンチウイルス発現ベクターを設計した。誘導性エレメントは、ヒトＩＬ２プロモーターに存在するＮＦＡＴ／ＡＰ１転写応答エレメント（ＴＲＥ）に基づいていた（Ｍａｃｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）。ＩＬ−７の選択的な誘導性発現は、ＴＣＲ活性化と、ＮＦＡＴ  ＴＲＥを内部に有する遺伝子の転写を促進することができるＮＦＡＴのＣａ２＋依存性核内移行の結果である。
【０１２６】
ＩＬ−７発現カセットは、図１に示すように４つの要素からなっていた。
１．赤色で強調表示されたヒトＩＬ２プロモーターＮＦＡＴ  ＴＲＥの３つのタンデム反復配列（ＧＧＡＧＧＡＡＡＡＡＣＴＧＴＴＴＣＡＴＡＣＡＧＡＡＧＧＣＧＴ）
２．最小ＣＭＶプロモーター（緑色）
３．Ｋｏｚａｋ配列（ＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧ）およびコドン最適化ＩＬ−７コード配列（黄色）。補足図１は野生型ヌクレオチド配列を含む。
４．ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（紫色）
ＥｃｏＲＶ制限部位（図１中、緑色で強調表示）の上流の配列は、レンチウイルスベクターのバックボーン配列に対応し、ＥＦ１Ａプロモーターのコード配列を維持するために合成構築物中に含まれた。必要に応じて構築物のさらなる操作を可能にするために、追加の固有の制限部位も合成構築物の設計に組み入れられた。それらは以下を含む：
１．ＮＦＡＴＩＬ−２  ＴＲＥの上流のＥｃｏＲＶ（ＧＡＴＡＴＣ）およびＮＳＩ−Ｉ（ＡＴＧＣＡＴ）制限部位
２．ＩＬ−７ＣＤＳのすぐ上流のＮｄｅＩ制限部位ＣＡＴＡＴＧ
３．ＩＬ−７ＣＤＳのＴＧＡ停止コドンの直後のＸｈｏＩ（ＣＴＣＧＡＧ）
４．ｍＣＭＶプロモーターのすぐ上流のＡａＴｉＩ制限部位（ＧＡＣＧＴＣ）。
【０１２７】
この構築物は、ＴＣＲのみを発現する構築物内のＡｇｅＩ制限部位とＭｌｕＩ制限部位の間にクローニングされるように設計され（図２）、アンチセンス鎖から、ＳＰＥＡＲ  ＴＣＲに対して逆方向のＩＬ−７の転写を可能にする。ＩＬ−７およびＳＰＥＡＲ  ＴＣＲの構成的発現を可能にする追加の構築物を設計した。これらの構築物は、ＩＬ−７ならびにＴＣＲαおよびＴＣＲβ鎖を、単一のオープンリーディングフレームとしてコードする。個々のポリペプチドは、リボソームスキッピング、および単一の転写物からの複数のポリペプチドの発現を可能にする、自己切断２Ａ様ペプチドによって隔てられる。
【０１２８】
１．２  ＡＤＢ９６７ＮＦＡＴ  ＩＬ−７＿ＴＣＲ１の作製
ＮＦＡＴ＿ＩＬ−７カセット（配列番号１）を、５’ＡｇｅＩ（ＡＣＣＧＧＴ）３’ＭｌｕＩ（ＡＣＧＣＧＴ）制限部位を用いてＧｅｎｅＡｒｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により人工的に合成し、標準的なクローニングベクター（ｐＭＳ−ＲＱ）中に提供した（図２）。ベクターおよびＡＤＢ９３４（ＴＣＲ１）を含むＮＦＡＴ＿ＩＬ−７をＡｇｅＩおよびＭｌｕＩで消化し、該当する断片を製造業者の指示に従ってＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ゲル抽出キットを使用してゲル抽出により精製した。消化された断片を、標準プロトコルに従ってＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を用いてライゲーションした。クローンを制限酵素消化によりスクリーニングし、シークエンシングにより検証した（図４のベクターマップを参照）。
【０１２９】
１．３  ＡＤＢ１０９９構成的ＩＬ−７＿ＴＣＲ１の作製
ＩＬ−７＿Ｔ２Ａ＿ＴＣＲ１インサートを重複ＰＣＲにより作製した。ＩＬ−７ＣＤＳは、プライマーＮＨＥＩ＿ＩＬ＿７ＦおよびＩＬ７＿Ｔ２ＡＲを用いて増幅した。ＴＣＲ１  ＣＤＳは、プライマーＴ２ＡＦおよびＢＥＴＡ＿ＳＡＬ＿ＲＥＶＩＩＩを用いて増幅した。ＴＣＲ１  ＣＤＳは、既存のインハウスの構築物ＡＤＢ９５１から増幅した。標準プロトコルに従ってＱ５  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を用いてＰＣＲ反応を行い、ＰＣＲ産物を製造業者の指示に従ってＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ゲル抽出キットを使用してゲル抽出により精製した。ＮｈｅＩ（ＧＣＴＡＧＣ）およびＳａｌＩ（ＧＴＣＧＡＣ）制限部位（下線）を含むＮＨＥＩ＿ＩＬ＿７ＦおよびＢＥＴＡ＿ＳＡＬ＿ＲＥＶＩＩＩプライマーを用いて重複ＰＣＲにより２つの断片を一緒に融合した。消化された断片を、標準プロトコルに従ってＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を用いてライゲーションした。クローンを制限酵素消化によりスクリーニングし、シークエンシングにより検証した（図５のベクターマップを参照）。
【表１】
2020532959.tif 000002
【０１３０】
１．４  ＡＤＢ１５８１  ＮＦＡＴ  ＩＬ−７＿ＴＣＲ２の作製
ＴＣＲ２インサートをインハウスの構築物ＡＤＢ１５３５からＡＤＢ１２２４にサブクローニングした。ＡＢＤ１５３５およびＡＤＢ１２２４をＮｈｅＩおよびＳａｌＩ制限酵素で消化し、該当する断片を製造業者の指示に従ってＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ゲル抽出キットを使用してゲル抽出により精製した。消化された断片を、標準プロトコルに従ってＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を用いてライゲーションした。ＮＦＡＴ  ＩＬ−７カセットを、ＡＤＢ９６７（ＮＦＡＴ−ＩＬ−７＿ＴＣＲ１）から、ＡｇｅＩ制限部位とＭｌｕＩ制限部位の間のこの新しいＴＣＲ２レンチウイルス発現ベクターにサブクローニングした。クローンを制限酵素消化によりスクリーニングし、シークエンシングにより検証した（図６のベクターマップを参照）。
【０１３１】
１．５  ＡＤＢ１５８０構成的ＩＬ−７＿Ｆ２Ａ＿ＴＣＲ２の作製
以下のプライマーを用いてＩＬ−７  ＣＤＳをＡＢＤ１０９９からＰＣＲ増幅した：順方向−５’ＴＡＡＴＧＣＴＡＧＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＴＣＣＡＣＧＴＧＴＣＣ３’および逆方向５’−ＣＴＴＣＡＣＧＧＧＣＧＣＧＣＣＡＧＡＧＣＣＧＣＴＴＣＴＣＴＴＧＧ−３’。これらは、ＮｈｅＩ（ＧＣＴＡＧＣ）およびＡｓＣｉ（ＧＧＣＧＣＧＣＣ）制限部位（下線）を含む。ＰＣＲ産物を製造業者の指示に従ってＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ゲル抽出キットを使用してゲル抽出により精製した。ＰＣＲ産物および（ＡＤＢ１４８８）をＮｈｅＩおよびＡＳＣＩで消化し、該当する断片を製造業者のプロトコルに従ってＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ゲル抽出キットを使用してゲル抽出により精製した。消化された断片を、標準プロトコルに従ってＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を用いてライゲーションした。クローンを制限酵素消化によりスクリーニングし、シークエンシングにより検証した（図７のベクターマップを参照）。
【０１３２】
１．６  Ｔ細胞の生成
６人のドナーからのＰＢＬを、ＭＡＣＳ単離キットおよび関連する製造業者のプロトコルを使用して、追加的なＣＤ１４枯渇（ＰＢＬ）により全血から分離した。以下を含む異なるレンチウイルス構築物でＴ細胞を形質導入した：ＴＣＲおよびＮＦＡＴ＿ＩＬ−７  ＴＣＲ（図１を参照）。Ｔ細胞の形質導入は、１ｍｇ／ＭｌのＦ１０８ポロクサマーの存在下で行った。Ｆ１０８ポロクサマーは、１００ｍｇ／ｍｌのストック溶液を作製するために予め水に溶解しておき、次いで０．２μｍフィルターを使用して滅菌した後、４℃で保存した。レンチウイルス粒子の添加と同時に、各ウェルの細胞（ＮＴＤ細胞を含む）に１ｍｇ／ＭｌのＦ１０８ポロクサマーを加えた。
【０１３３】
形質導入した細胞を１４日間拡大培養した。１０日目に１００Ｕ／ｍｌのＰｒｏｌｅｕｋｉｎをＴ細胞に供給したが、１２日目にはＰｒｏｌｅｕｋｉｎを含まない新鮮培地を供給し、アッセイ、特に増殖アッセイに使用する前に細胞をより長く静置させた。
【０１３４】
１４日目に細胞を凍結させた。非形質導入（ＮＴＤ）Ｔ細胞を形質導入Ｔ細胞と同時に生成したが、レンチウイルス粒子の代わりに新鮮なウイルス培地（Ｒ１０＋Ｈｅｐｅｓ）を刺激Ｔ細胞に加えた。
【０１３５】
１．７  ＥＬＩＳＡのためのサイトカイン分泌アッセイ
サイトカイン産生アッセイを、典型的には以下のように行った。アッセイ当日、Ａ３７５、Ｍｅｌ６２４およびＣｏｌｏ２０５細胞を採取し、Ｒ１０に再懸濁し、計数した。Ａ３７５細胞の一部を１０μＭ  ＭＡＧＥ−Ａ４ペプチドを用いて３７℃／５％  ＣＯ２で２時間パルスした後、３回洗浄した。標的細胞は、典型的には、３通りのウェルの９６ウェル平底プレートに、１００μｌの体積中５０，０００細胞／ウェルで播種した。Ｔ細胞を解凍し、洗浄し、１×１０６細胞／ｍｌ未満でＲ１０に再懸濁し、３７℃／５％  ＣＯ２で１〜２時間静置した。非形質導入および形質導入エフェクター細胞を計数し、３通りのウェルに、１００μｌのアッセイ培地にウェル当たり１２０，０００細胞で播種し、２００μｌの最終体積を得た。注：異なる構築物間の形質導入の差異を考慮に入れるために、同じドナーからのＮＴＤ  Ｔ細胞を加えることにより細胞を正規化し、同等の形質導入効率を得た。次いで、プレートを３７℃／５％  ＣＯ２で４８時間インキュベーターに入れた。４８時間後、アッセイプレートを遠心分離し、上清を新しい９６ウェルプレートに移し、後日ＥＬＩＳＡを行うまで−２０℃で保存した。
【０１３６】
１．８  ＩＬ−７  ＥＬＩＳＡ
このアッセイは、変更点を伴う製造業者のプロトコルに従ってＤｕｏｓｅｔ  Ｈｕｍａｎ  ＩＬ−７  ＥＬＩＳＡキットを使用して、９６ウェルハーフエリアプレートで行った。簡潔に述べると、９６ウェルハーフエリアプレートを使用したため、プロトコルに示される１００μｌの代わりに、全ての試薬を２５μｌ／ウェル（または５０μｌの遮断試薬）で使用した。ほとんどの場合、試料は無希釈で使用した。希釈した場合、それらはアッセイ培地中に希釈された。市販のＴＭＢ基質溶液を約１０分間使用してアッセイを展開し、１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４で反応を停止した。波長補正を５４０ｎｍに設定して、Ｓｐｅｃｔｒａｓｔａｒ  Ｏｍｅｇａを４５０ｎｍで使用してアッセイを読み取った。Ｓｐｅｃｔｒａｓｔａｒデータ解析ソフトウェアを使用してデータを分析した。標準曲線上の最大濃度を超えるデータ点には、通常、最大濃度の値を割り当てた。ほとんどのアッセイで、製造業者によって示されるよりも広い範囲を提供するように標準曲線を延長し、最大濃度は１０００ｐｇ／ｍｌであった。試料および標準曲線は、２通りまたは３通りのいずれかのウェルを使用して行い、曲線のあてはめは、可能であれば、４パラメータロジスティック曲線のあてはめを用いて行った。
【０１３７】
１．９  Ｔ細胞表現型決定
アッセイ当日に、Ｔ細胞を解凍し、ＰＢＳ中で２回洗浄し、計数し、ＰＢＳ中１×１０６細胞／ｍｌに調節した。Ｔ細胞のフローサイトメトリーを行った。使用した抗体のリストは、表１および表２に見ることができる。
【表２】
2020532959.tif 000003
【表３】
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【０１３８】
１．１０  再刺激アッセイ
再刺激アッセイを以下のように行った。アッセイの初日（０日目）にＴ細胞を解凍し、洗浄し、１×１０６細胞／ｍｌ未満でＲ１０に再懸濁し、静置した。細胞を計数し、異なるレンチウイルス調製物間の形質導入の差異を考慮に入れるために、同じドナーからのＮＴＤ  Ｔ細胞を加えることにより細胞を正規化し、ドナーＴ細胞のバッチ内で同等の形質導入効率を得た。
【０１３９】
Ｔ細胞を１×１０６／ｍｌでＲ１０に播種し、２４ウェルプレートにウェル当たり１ｍｌのＴ細胞とした。Ａ３７５標的細胞を採取し、次いで照射した（４８Ｇｙ）。Ａ３７５細胞を約１×１０６／ｍｌで再懸濁し、Ｔ細胞を含むウェルにウェル当たり１ｍｌを加えた。これによりＴ細胞と照射されたＡ３７５細胞が１：１の２ｍｌ／ウェルの最終体積を得た。対照ウェルにおいて、２０ｎｇ／ｍｌの最終濃度で組換えヒトＩＬ−７を細胞に加えた。次いで、外因性ＩＬ−７を用いてまたは用いずに、Ｔ細胞と照射されたＡ３７５細胞の共培養物を３７℃／５％  ＣＯ２で７日間培養した。
【０１４０】
７、１４、２１および２８日目に、Ｔ細胞を採取して半自動計数法を用いて計数し、トリパンブルー陽性細胞（死細胞）を排除した。ＴＣＲ１を発現しなかったＴ細胞を含むウェルの場合、トリパンブルー陰性（生）細胞がＴ細胞よりもはるかに大きかったことから、それら全てがＴ細胞というわけではなかった。これらは、トリパンブルー染色に対してまだ陽性ではなかった、照射されたＡ３７５標的である可能性が最も高かった。より大きな、明らかな非Ｔ細胞（Ａ３７５）は、可能な限り多くカウントから手動で除外したが、それらのウェル（ＮＴＤを含む）は依然としていくつかの「外見上の」生Ａ３７５標的を含んでいたため、それらの生Ｔ細胞数は過大評価である可能性が高い。Ａ３７５細胞はＴ細胞よりも大きいため、それらの試料の細胞のより大きな平均サイズもまた、このことに影響を及ぼした。しかしながら、ＴＣＲ１を発現するＴ細胞を含むウェルでは、大きな生Ａ３７５細胞がほとんどまたは全く残っていなかったため、絶対数および細胞サイズはより正確である可能性が高い。次いで、総生Ｔ細胞数を計算した。
【０１４１】
生Ｔ細胞の総数が計算されてから、Ｔ細胞を以下のように分割した。Ｔ細胞が増殖していた場合、適正最終濃度になるまで（「古い」Ｒ１０中の）既存の体積のＴ細胞に新鮮なＲ１０を加えることにより、１×１０６／ｍｌ（１ｍｌ未満を四捨五入）の濃度までそれらを希釈した。「古い」Ｒ１０は、前の週に細胞が培養された培地として定義される。しかしながら、Ｔ細胞が感染していた（すなわち、最初に播種した濃度と比較して生Ｔ細胞の数が減少した）場合、細胞を遠心分離し（１５００ｒｐｍ、５分）、次いで適切な体積の「古い」Ｒ１０に再懸濁した。
【０１４２】
Ｔ細胞を２４ウェルプレートに１ｍｌ／ウェル（約１×１０６個のＴ細胞／ｍｌ）で播種した。可能であれば、図中に提示されたＴ細胞の総数が実際に生成されたＴ細胞の総数となるように、全てのＴ細胞をそれらが拡大培養したまま播種した。場合によっては、特に、より後の時点でＴ細胞の数が次第に大きくなるにつれて（通常８〜１２×１０６個を超える細胞）、８〜１２×１０６個のＴ細胞のみを再刺激のために播種した。次いで、前の時点で最初に播種されたＴ細胞の数を考慮に入れることにより、後の時点でのそれらの試料のＴ細胞の総数を再計算した。例えば、２１日目に２０×１０６個のＴ細胞を計数した場合、２１日目には、これらの細胞のうち８×１０６個のみを再刺激のために播種した。２０×１０６個の細胞を全て播種した場合に生成されたであろう２８日目の総細胞数は、以下のように再計算した：
１．細胞数の倍数変化＝再刺激後の細胞数（２８日目）／再刺激のために播種した細胞数（２１日目に最初に播種した８×１０６個）
２．２８日目に再計算した総細胞数＝細胞数の倍数変化（２１〜２８日目）×２１日目に播種するために使用可能な細胞の総数（例えば、２０×１０６個）
Ａ３７５標的細胞を採取し、４８Ｇｙで照射してそれらの増殖を阻止し、次いで、Ｒ１０中に約１×１０６／ｍｌ、１ｍｌ／ウェル（１：１のＴ細胞：Ａ３７５）でＴ細胞に加えた。対照ウェルにおいて、２０μｇ／ｍｌの最終濃度で組換えヒトＩＬ−７を細胞に加えた（ウェル内の全てのＩＬ−７が「消費された」と仮定）。この再刺激プロセスを、７、１４および２１日目に繰り返した。
【０１４３】
１．１１  インビボ試験
ＬｅｕｋｏｐａｋからのＰＢＬは、以前に記載した方法を用いてＣＤ１４を枯渇させた。Ｔ細胞を以前に記載したように形質導入し、１４日間拡大培養した後で凍結させた。ＮＴＤ  Ｔ細胞、およびＴＣＲ１、ＮＦＡＴ−ＩＬ−７＿ＴＣＲ１または構成的ＩＬ−７＿ＴＣＲ１を発現する構築物で形質導入されたＴ細胞に加えて、ＮＦＡＴ−ＩＬ−７＿無関係ＴＣＲを発現する構築物でもＴ細胞を形質導入した。
【０１４４】
０日目に、６〜８週齢の免疫不全ＣＩＥＡ  ＮＯＧ（（ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｇｔｍ１Ｓｕｇ／ＪｉｃＴａｃ）雌マウスに、ＧＦＰ／ルシフェラーゼを発現するレンチウイルス構築物で予め形質導入しておいた１×１０６個のＭｅｌ６２４腫瘍細胞を静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。腫瘍細胞移植後６日目に、マウスを撮像し、ルシフェラーゼシグナル強度に基づいて８群のマウス８匹の群に無作為化し、各群が等しい平均全流束を有するようにした。７日目に、Ｔ細胞を解凍し、異なる構築物間の形質導入されたＴ細胞の頻度を、ＮＴＤ  Ｔ細胞を用いて約４２％のＴＣＲ  Ｖβ＋／ＣＤ３＋に正規化した。次いで、マウスに、何も注射しないか（腫瘍のみの対照）、または２×１０６個の全Ｔ細胞（ＮＴＤ、ＴＣＲ１、ＮＦＡＴ−ＩＬ−７＿ＴＣＲ１、構成的ＩＬ−７＿ＴＣＲ１、ＮＦＡＴ−ＩＬ−７＿対照ＴＣＲ）を静脈内注射した。
【０１４５】
６日目、およびその後は週１回、ＢｒｕｋｅｒのＩｎ−Ｖｉｖｏ  Ｘｔｒｅｍｅ画像化システムを使用して動物を撮像し、疾病負荷を測定して疾患進行を追跡した。試験の後期段階には、動物を週２回撮像した。撮像する前に、動物に１５０ｍｇ／ｋｇのルシフェリン（５ｍｌ／ｋｇ）を腹腔内注射し、イソフルランで麻酔した。曝露後、方向および器官の位置決めを補助するためにＸ線画像を撮影した。分析時には、画像を光子／秒／ｍｍ２（Ｐ／ｓ／ｍｍ２）に変換して異なる曝露時間を用いて取得した画像の比較を可能にし、縮尺を調整し、生物発光画像をＸ線画像に重ね合わせた。該当する領域を動物全体からの生物発光シグナルを測定するように設定した。ＲＯＩのサイズは、全ての画像について同一に維持した。またマウスは、少なくとも週３回は体重を量り、体重減少または状態不良のいずれかが示された場合は間引いた。
【０１４６】
結果
誘導性ＩＬ−７を操作されたＴＣＲと共発現するＴ細胞を注射したマウスは、ＴＣＲを単独でまたはＴＣＲを構成的ＩＬ−７とともに発現する細胞と比較して改善された生存率を示すことが分かった（図１６）。
配列
ＡＣＣＧＧＴＴＣＡＡＴＴＧＣＣＧＡＣＣＣＣＴＣＣＣＣＣＣＡＡＣＴＴＣＴＣＧＧＧＧＡＣＴＧＴＧＧＧＣＧＡＴＧＴＧＣＧＣＴＣＴＧＣＣＣＡＣＴＧＡＣＧＧＧＣＡＣＣＧＧＡＧＣＣＴＣＡＣＧＡＴＧＣＡＴＧＡＴＡＴＣＧＧＣＣＴＡＡＣＴＧＧＣＣＧＧＴＡＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧＣＴＡＧＣＧＧＡＧＧＡＡＡＡＡＣＴＧＴＴＴＣＡＴＡＣＡＧＡＡＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＡＡＡＡＡＣＴＧＴＴＴＣＡＴＡＣＡＧＡＡＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＡＡＡＡＡＣＴＧＴＴＴＣＡＴＡＣＡＧＡＡＧＧＣＧＴｇａｃｇｔｃＴＡＧＧＣＧＴＧＴＡＣＧＧＴＧＧＧＡＧＧＣＣＴＡＴＡＴＡＡＧＣＡＧＡＧＣＴＣＧＴＴＴＡＧＴＧＡＡＣＣＧＴＣＡＧＡＴＣＧＣＣＴＧＧＡＧＡＣＧＣＣＡＴＣＣＡＣＧＣＴＧＴＴＴＴＧＡＣＣＴＣＣＡＴＡＧＡＡＧＡＣＡＣＣＧＧＧＡＣＣＧＡＴＣＣＡＧＣＣＴＣＴＣＧＡＣＡＴＴＣＧＴＴＧＧＡＴＣＣＡＴＡＴＧＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＴＣＣＡＴＧＴＴＴＣＴＴＴＴＡＧＧＴＡＴＡＴＣＴＴＴＧＧＡＣＴＴＣＣＴＣＣＣＣＴＧＡＴＣＣＴＴＧＴＴＣＴＧＴＴＧＣＣＡＧＴＡＧＣＡＴＣＡＴＣＴＧＡＴＴＧＴＧＡＴＡＴＴＧＡＡＧＧＴＡＡＡＧＡＴＧＧＣＡＡＡＣＡＡＴＡＴＧＡＧＡＧＴＧＴＴＣＴＡＡＴＧＧＴＣＡＧＣＡＴＣＧＡＴＣＡＡＴＴＡＴＴＧＧＡＣＡＧＣＡＴＧＡＡＡＧＡＡＡＴＴＧＧＴＡＧＣＡＡＴＴＧＣＣＴＧＡＡＴＡＡＴＧＡＡＴＴＴＡＡＣＴＴＴＴＴＴＡＡＡＡＧＡＣＡＴＡＴＣＴＧＴＧＡＴＧＣＴＡＡＴＡＡＧＧＡＡＧＧＴＡＴＧＴＴＴＴＴＡＴＴＣＣＧＴＧＣＴＧＣＴＣＧＣＡＡＧＴＴＧＡＧＧＣＡＡＴＴＴＣＴＴＡＡＡＡＴＧＡＡＴＡＧＣＡＣＴＧＧＴＧＡＴＴＴＴＧＡＴＣＴＣＣＡＣＴＴＡＴＴＡＡＡＡＧＴＴＴＣＡＧＡＡＧＧＣＡＣＡＡＣＡＡＴＡＣＴＧＴＴＧＡＡＣＴＧＣＡＣＴＧＧＣＣＡＧＧＴＴＡＡＡＧＧＡＡＧＡＡＡＡＣＣＡＧＣＴＧＣＣＣＴＧＧＧＴＧＡＡＧＣＣＣＡＡＣＣＡＡＣＡＡＡＧＡＧＴＴＴＧＧＡＡＧＡＡＡＡＴＡＡＡＴＣＴＴＴＡＡＡＧＧＡＡＣＡＧＡＡＡＡＡＡＣＴＧＡＡＴＧＡＣＴＴＧＴＧＴＴＴＣＣＴＡＡＡＧＡＧＡＣＴＡＴＴＡＣＡＡＧＡＧＡＴＡＡＡＡＡＣＴＴＧＴＴＧＧＡＡＴＡＡＡＡＴＴＴＴＧＡＴＧＧＧＣＡＣＴＡＡＡＧＡＡＣＡＣＴＧＡＣＴＣＧＡＧＡＡＣＴＴＧＴＴＴＡＴＴＧＣＡＧＣＴＴＡＴＡＡＴＧＧＴＴＡＣＡＡＡＴＡＡＡＧＣＡＡＴＡＧＣＡＴＣＡＣＡＡＡＴＴＴＣＡＣＡＡＡＴＡＡＡＧＣＡＴＴＴＴＴＴＴＣＡＣＴＧＣＡＴＴＣＴＡＧＴＴＧＴＧＧＴＴＴＧＴＣＣＡＡＡＣＴＣＡＴＣＡＡＴＧＴＡＴＣＴＴＡＡＣＧＣＧＴ
配列番号１    ＮＦＡＴ  ＩＬ−７誘導性カセットのヌクレオチド配列。
キー：
赤色（完全下線）＝ヒトＩＬ２プロモーターＮＦＡＴ  ＴＲＥのタンデム反復配列（ＧＧＡＧＧＡＡＡＡＡＣＴＧＴＴＴＣＡＴＡＣＡＧＡＡＧＧＣＧＴ）。
緑色（破線）＝最小ＣＭＶプロモーター。
黒色＝Ｋｏｚａｋ配列（ＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧ）およびコドン最適化ＩＬ−７コード配列。
青色（点線下線）＝ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル。
ａｔｇｔｔｃｃａｔｇｔｔｔｃｔｔｔｔａｇｇｔａｔａｔｃｔｔｔｇｇａｃｔｔｃｃｔｃｃｃｃｔｇａｔｃｃｔｔｇｔｔｃｔｇｔｔｇ
Ｍ  Ｆ  Ｈ  Ｖ  Ｓ  Ｆ  Ｒ  Ｙ  Ｉ  Ｆ  Ｇ  Ｌ  Ｐ  Ｐ  Ｌ  Ｉ  Ｌ  Ｖ  Ｌ  Ｌ
ｃｃａｇｔａｇｃａｔｃａｔｃｔｇａｔｔｇｔｇａｔａｔｔｇａａｇｇｔａａａｇａｔｇｇｃａａａｃａａｔａｔｇａｇａｇｔｇｔｔ
Ｐ  Ｖ  Ａ  Ｓ  Ｓ  Ｄ  Ｃ  Ｄ  Ｉ  Ｅ  Ｇ  Ｋ  Ｄ  Ｇ  Ｋ  Ｑ  Ｙ  Ｅ  Ｓ  Ｖ
ｃｔａａｔｇｇｔｃａｇｃａｔｃｇａｔｃａａｔｔａｔｔｇｇａｃａｇｃａｔｇａａａｇａａａｔｔｇｇｔａｇｃａａｔｔｇｃｃｔｇ
Ｌ  Ｍ  Ｖ  Ｓ  Ｉ  Ｄ  Ｑ  Ｌ  Ｌ  Ｄ  Ｓ  Ｍ  Ｋ  Ｅ  Ｉ  Ｇ  Ｓ  Ｎ  Ｃ  Ｌ
ａａｔａａｔｇａａｔｔｔａａｃｔｔｔｔｔｔａａａａｇａｃａｔａｔｃｔｇｔｇａｔｇｃｔａａｔａａｇｇａａｇｇｔａｔｇｔｔｔ
Ｎ  Ｎ  Ｅ  Ｆ  Ｎ  Ｆ  Ｆ  Ｋ  Ｒ  Ｈ  Ｉ  Ｃ  Ｄ  Ａ  Ｎ  Ｋ  Ｅ  Ｇ  Ｍ  Ｆ
ｔｔａｔｔｃｃｇｔｇｃｔｇｃｔｃｇｃａａｇｔｔｇａｇｇｃａａｔｔｔｃｔｔａａａａｔｇａａｔａｇｃａｃｔｇｇｔｇａｔｔｔｔ
Ｌ  Ｆ  Ｒ  Ａ  Ａ  Ｒ  Ｋ  Ｌ  Ｒ  Ｑ  Ｆ  Ｌ  Ｋ  Ｍ  Ｎ  Ｓ  Ｔ  Ｇ  Ｄ  Ｆ
ｇａｔｃｔｃｃａｃｔｔａｔｔａａａａｇｔｔｔｃａｇａａｇｇｃａｃａａｃａａｔａｃｔｇｔｔｇａａｃｔｇｃａｃｔｇｇｃｃａｇ
Ｄ  Ｌ  Ｈ  Ｌ  Ｌ  Ｋ  Ｖ  Ｓ  Ｅ  Ｇ  Ｔ  Ｔ  Ｉ  Ｌ  Ｌ  Ｎ  Ｃ  Ｔ  Ｇ  Ｑ
ｇｔｔａａａｇｇａａｇａａａａｃｃａｇｃｔｇｃｃｃｔｇｇｇｔｇａａｇｃｃｃａａｃｃａａｃａａａｇａｇｔｔｔｇｇａａｇａａ
Ｖ  Ｋ  Ｇ  Ｒ  Ｋ  Ｐ  Ａ  Ａ  Ｌ  Ｇ  Ｅ  Ａ  Ｑ  Ｐ  Ｔ  Ｋ  Ｓ  Ｌ  Ｅ  Ｅ
ａａｔａａａｔｃｔｔｔａａａｇｇａａｃａｇａａａａａａｃｔｇａａｔｇａｃｔｔｇｔｇｔｔｔｃｃｔａａａｇａｇａｃｔａｔｔａ
Ｎ  Ｋ  Ｓ  Ｌ  Ｋ  Ｅ  Ｑ  Ｋ  Ｋ  Ｌ  Ｎ  Ｄ  Ｌ  Ｃ  Ｆ  Ｌ  Ｋ  Ｒ  Ｌ  Ｌ
ｃａａｇａｇａｔａａａａａｃｔｔｇｔｔｇｇａａｔａａａａｔｔｔｔｇａｔｇｇｇｃａｃｔａａａｇａａｃａｃｔｇａ
Ｑ  Ｅ  Ｉ  Ｋ  Ｔ  Ｃ  Ｗ  Ｎ  Ｋ  Ｉ  Ｌ  Ｍ  Ｇ  Ｔ  Ｋ  Ｅ  Ｈ  −
コドン最適化ＩＬ−７の翻訳されたヌクレオチド配列（配列番号２）およびタンパク質配列（配列番号３）
ＭＦＨＶＳＦＲＹＩＦＧＬＰＰＬＩＬＶＬＬＰＶＡＳＳＤＣＤＩＥＧＫＤＧＫＱＹＥＳＶＬＭＶＳＩＤＱＬＬＤＳＭＫＥＩＧＳＮＣＬＮＮＥＦＮＦＦＫＲＨＩＣＤＡＮＫＥＧＭＦＬＦＲＡＡＲＫＬＲＱＦＬＫＭＮＳＴＧＤＦＤＬＨＬＬＫＶＳＥＧＴＴＩＬＬＮＣＴＧＱＶＫＧＲＫＰＡＡＬＧＥＡＱＰＴＫＳＬＥＥＮＫＳＬＫＥＱＫＫＬＮＤＬＣＦＬＫＲＬＬＱＥＩＫＴＣＷＮＫＩＬＭＧＴＫＥＨ＊
配列番号３  ＩＬ−７タンパク質配列
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配列番号４  ＮｈｅＩ部位とＳａｌＩ部位の間のヌクレオチド配列
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配列番号５  ＴＣＲ１のタンパク質配列
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配列番号６  ＴＣＲ１  ＣＤＳ
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配列番号７  ＭｌｕＩ制限部位とＳａｌＩ制限部位の間の領域に及ぶセンス鎖５’から３’配列。
ＧＣＴＡＧＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＴＣＣＡＣＧＴＧＴＣＣＴＴＣＣＧＧＴＡＣＡＴＣＴＴＣＧＧＣＣＴＧＣＣＣＣＣＣＣＴＧＡＴＣＣＴＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＣＴＧＴＧＧＣＣＡＧＣＡＧＣＧＡＣＴＧＣＧＡＣＡＴＣＧＡＧＧＧＣＡＡＧＧＡＣＧＧＣＡＡＧＣＡＧＴＡＣＧＡＧＡＧＣＧＴＧＣＴＧＡＴＧＧＴＧＴＣＣＡＴＣＧＡＣＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＧＣＡＴＧＡＡＧＧＡＡＡＴＣＧＧＣＡＧＣＡＡＣＴＧＣＣＴＧＡＡＣＡＡＣＧＡＧＴＴＣＡＡＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＣＧＧＣＡＣＡＴＣＴＧＣＧＡＣＧＣＣＡＡＣＡＡＡＧＡＡＧＧＣＡＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＣＡＧＡＧＣＣＧＣＣＡＧＡＡＡＧＣＴＧＣＧＧＣＡＧＴＴＣＣＴＧＡＡＧＡＴＧＡＡＣＡＧＣＡＣＣＧＧＣＧＡＣＴＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＴＣＴＧＣＴＧＡＡＡＧＴＧＴＣＣＧＡＧＧＧＣＡＣＣＡＣＣＡＴＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＴＧＣＡＣＣＧＧＣＣＡＡＧＴＧＡＡＧＧＧＣＡＧＡＡＡＧＣＣＴＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＡＧＡＡＧＣＣＣＡＧＣＣＴＡＣＣＡＡＧＡＧＣＣＴＧＧＡＡＧＡＧＡＡＣＡＡＧＴＣＣＣＴＧＡＡＡＧＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＡＣＴＧＡＡＣＧＡＣＣＴＧＴＧＣＴＴＣＣＴＧＡＡＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＣＡＧＧＡＡＡＴＣＡＡＧＡＣＣＴＧＣＴＧＧＡＡＣＡＡＧＡＴＣＣＴＧＡＴＧＧＧＣＡＣＣＡＡＡＧＡＧＣＡＣＧＧＡＡＧＣＡＧＡＧＣＣＡＡＧＡＧＡＡＧＣＧＧＣＴＣＴＧＧＣＧＡＧＧＧＣＡＧＡＧＧＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＡＣＡＴＧＴＧＧＣＧＡＣＧＴＧＧＡＡＧＡＡＡＡＣＣＣＴＧＧＣＣＣＴＡＴＧＧＡＧＡＣＣＣＴＧＣＴＧＧＧＣＣＴＧＣＴＧＡＴＣＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＧＣＴＣＣＡＧＴＧＧＧＴＧＴＣＣＡＧＣＡＡＧＣＡＧＧＡＧＧＴＧＡＣＣＣＡＧＡＴＣＣＣＴＧＣＣＧＣＣＣＴＧＡＧＣＧＴＧＣＣＣＧＡＧＧＧＣＧＡＧＡＡＣＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＡＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＡＣＣＧＡＣＴＣＣＧＣＣＡＴＣＴＡＣＡＡＣＣＴＧＣＡＧＴＧＧＴＴＣＣＧＧＣＡＧＧＡＣＣＣＣＧＧＣＡＡＧＧＧＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＣＡＧＡＧＣＡＧＣＣＡＧＣＧＧＧＡＧＣＡＧＡＣＣＡＧＣＧＧＡＣＧＧＣＴＧＡＡＣＧＣＣＡＧＣＣＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＣＧＧＣＣＧＧＡＧＣＡＣＣＣＴＧＴＡＣＡＴＣＧＣＣＧＣＣＡＧＣＣＡＧＣＣＣＧＧＣＧＡＣＡＧＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＣＴＧＴＧＣＧＣＴＧＴＧＣＧＧＣＣＴＣＴＧＴＡＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＴＡＣＡＴＣＣＣＣＡＣＣＴＴＣＧＧＣＡＧＡＧＧＣＡＣＣＡＧＣＣＴＧＡＴＣＧＴＧＣＡＣＣＣＣＴＡＣＡＴＣＣＡＧＡＡＣＣＣＣＧＡＣＣＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＣＡＧＣＴＧＣＧＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＡＧＣＡＧＣＧＡＣＡＡＧＴＣＴＧＴＧＴＧＣＣＴＧＴＴＣＡＣＣＧＡＣＴＴＣＧＡＣＡＧＣＣＡＧＡＣＣＡＡＴＧＴＧＡＧＣＣＡＧＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＴＧＴＡＣＡＴＣＡＣＣＧＡＣＡＡＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＧＣＧＧＡＧＣＡＴＧＧＡＣＴＴＣＡＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＣＧＣＣＧＴＧＧＣＣＴＧＧＡＧＣＡＡＣＡＡＧＡＧＣＧＡＣＴＴＣＧＣＣＴＧＣＧＣＣＡＡＣＧＣＣＴＴＣＡＡＣＡＡＣＡＧＣＡＴＴＡＴＣＣＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＴＴＣＴＴＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＧＣＡＧＣＴＧＣＧＡＣＧＴＧＡＡＡＣＴＧＧＴＧＧＡＧＡＡＧＡＧＣＴＴＣＧＡＧＡＣＣＧＡＣＡＣＣＡＡＣＣＴＧＡＡＣＴＴＣＣＡＧＡＡＣＣＴＧＡＧＣＧＴＧＡＴＣＧＧＣＴＴＣＡＧＡＡＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＡＡＧＧＴＧＧＣＣＧＧＡＴＴＣＡＡＣＣＴＧＣＴＧＡＴＧＡＣＣＣＴＧＣＧＧＣＴＧＴＧＧＡＧＣＡＧＣＧＧＣＴＣＣＣＧＧＧＣＣＡＡＧＡＧＡＡＧＣＧＧＡＴＣＣＧＧＣＧＣＣＡＣＣＡＡＣＴＴＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＡＧＧＣＣＧＧＡＧＡＣＧＴＧＧＡＡＧＡＡＡＡＣＣＣＴＧＧＣＣＣＴＡＧＧＡＴＧＡＧＣＡＴＣＧＧＣＣＴＧＣＴＧＴＧＣＴＧＣＧＣＣＧＣＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＣＴＧＴＧＧＧＣＡＧＧＡＣＣＣＧＴＧＡＡＣＧＣＣＧＧＡＧＴＧＡＣＣＣＡＧＡＣＣＣＣＣＡＡＧＴＴＣＣＡＧＧＴＧＣＴＧＡＡＡＡＣＣＧＧＣＣＡＧＡＧＣＡＴＧＡＣＣＣＴＧＣＡＧＴＧＣＧＣＣＣＡＧＧＡＣＡＴＧＡＡＣＣＡＣＧＡＧＴＡＣＡＴＧＡＧＣＴＧＧＴＡＴＣＧＧＣＡＧＧＡＣＣＣＣＧＧＣＡＴＧＧＧＣＣＴＧＣＧＧＣＴＧＡＴＣＣＡＣＴＡＣＴＣＴＧＴＧＧＧＡＧＣＣＧＧＡＡＴＣＡＣＣＧＡＣＣＡＧＧＧＣＧＡＧＧＴＧＣＣＣＡＡＣＧＧＣＴＡＣＡＡＴＧＴＧＡＧＣＣＧＧＡＧＣＡＣＣＡＣＣＧＡＧＧＡＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＡＧＣＧＣＴＧＣＣＣＣＣＡＧＣＣＡＧＡＣＣＡＧＣＧＴＧＴＡＣＴＴＣＴＧＣＧＣＣＡＧＣＡＧＣＴＡＴＧＴＧＧＧＣＡＡＣＡＣＣＧＧＣＧＡＧＣＴＧＴＴＣＴＴＣＧＧＣＧＡＧＧＧＣＴＣＣＡＧＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＧＧＡＣＣＴＧＡＡＧＡＡＣＧＴＧＴＴＣＣＣＣＣＣＣＧＡＧＧＴＧＧＣＣＧＴＧＴＴＣＧＡＧＣＣＣＡＧＣＧＡＧＧＣＣＧＡＧＡＴＣＡＧＣＣＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＧＴＧＴＧＴＣＴＧＧＣＣＡＣＣＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＧＡＣＣＡＣＧＴＧＧＡＧＣＴＧＴＣＣＴＧＧＴＧＧＧＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＴＣＴＡＣＣＧＡＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＴＧＡＡＧＧＡＧＣＡＧＣＣＣＧＣＣＣＴＧＡＡＣＧＡＣＡＧＣＣＧＧＴＡＣＴＧＣＣＴＧＴＣＣＴＣＣＡＧＡＣＴＧＡＧＡＧＴＧＡＧＣＧＣＣＡＣＣＴＴＣＴＧＧＣＡＧＡＡＣＣＣＣＣＧＧＡＡＣＣＡＣＴＴＣＣＧＧＴＧＣＣＡＧＧＴＧＣＡＧＴＴＣＴＡＣＧＧＣＣＴＧＡＧＣＧＡＧＡＡＣＧＡＣＧＡＧＴＧＧＡＣＣＣＡＧＧＡＣＣＧＧＧＣＣＡＡＧＣＣＣＧＴＧＡＣＣＣＡＧＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＣＣＧＡＧＧＣＣＴＧＧＧＧＣＡＧＧＧＣＣＧＡＣＴＧＣＧＧＣＴＴＣＡＣＣＡＧＣＧＡＧＡＧＣＴＡＣＣＡＧＣＡＧＧＧＣＧＴＧＣＴＧＡＧＣＧＣＣＡＣＣＡＴＣＣＴＧＴＡＣＧＡＧＡＴＣＣＴＧＣＴＧＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＣＣＴＧＴＡＣＧＣＣＧＴＧＣＴＧＧＴＧＴＣＴＧＣＣＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＴＧＧＣＴＡＴＧＧＴＧＡＡＧＣＧＧＡＡＧＧＡＣＡＧＣＣＧＧＧＧＣＴＡＡＧＴＣＧＡＣ
配列番号８  構成的−ＩＬ−７＿Ｔ２Ａ＿ＴＣＲ１のヌクレオチド配列。この配列は、ＮｈｅＩ制限部位とＳａｌＩ制限部位の間の領域を網羅する。
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配列番号９  構成的ＩＬ−７＿ＴＣＲ１  ＩＬ７のタンパク質配列が下線で示され、ＴＣＲがイタリック体で示されている。
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配列番号１０  ＭｌｕＩ制限部位とＳａｌＩ制限部位の間の領域に及ぶセンス鎖５’から３’配列（図６参照）。
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配列番号１１  ＴＣＲ２配列
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配列番号１２  ＮｈｅＩ制限部位とＳａｌＩ制限部位の間の領域を網羅するヌクレオチド配列。
ＭＦＨＶＳＦＲＹＩＦＧＬＰＰＬＩＬＶＬＬＰＶＡＳＳＤＣＤＩＥＧＫＤＧＫＱＹＥＳＶＬＭＶＳＩＤＱＬＬＤＳＭＫＥＩＧＳＮＣＬＮＮＥＦＮＦＦＫＲＨＩＣＤＡＮＫＥＧＭＦＬＦＲＡＡＲＫＬＲＱＦＬＫＭＮＳＴＧＤＦＤＬＨＬＬＫＶＳＥＧＴＴＩＬＬＮＣＴＧＱＶＫＧＲＫＰＡＡＬＧＥＡＱＰＴＫＳＬＥＥＮＫＳＬＫＥＱＫＫＬＮＤＬＣＦＬＫＲＬＬＱＥＩＫＴＣＷＮＫＩＬＭＧＴＫＥＨＧＳＲＡＫＲＳＧＳＧＡＰＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰＭＫＫＨＬＴＴＦＬＶＩＬＷＬＹＦＹＲＧＮＧＫＮＱＶＥＱＳＰＱＳＬＩＩＬＥＧＫＮＣＴＬＱＣＮＹＴＶＳＰＦＳＮＬＲＷＹＫＱＤＴＧＲＧＰＶＳＬＴＩＬＴＦＳＥＮＴＫＳＮＧＲＹＴＡＴＬＤＡＤＴＫＱＳＳＬＨＩＴＡＳＱＬＳＤＳＡＳＹＩＣＶＶＳＧＧＴＤＳＷＧＫＬＱＦＧＡＧＴＱＶＶＶＴＰＤＩＱＮＰＤＰＡＶＹＱＬＲＤＳＫＳＳＤＫＳＶＣＬＦＴＤＦＤＳＱＴＮＶＳＱＳＫＤＳＤＶＹＩＴＤＫＴＶＬＤＭＲＳＭＤＦＫＳＮＳＡＶＡＷＳＮＫＳＤＦＡＣＡＮＡＦＮＮＳＩＩＰＥＤＴＦＦＰＳＰＥＳＳＣＤＶＫＬＶＥＫＳＦＥＴＤＴＮＬＮＦＱＮＬＳＶＩＧＦＲＩＬＬＬＫＶＡＧＦＮＬＬＭＴＬＲＬＷＳＳＧＳＲＡＫＲＳＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰＲＭＡＳＬＬＦＦＣＧＡＦＹＬＬＧＴＧＳＭＤＡＤＶＴＱＴＰＲＮＲＩＴＫＴＧＫＲＩＭＬＥＣＳＱＴＫＧＨＤＲＭＹＷＹＲＱＤＰＧＬＧＬＲＬＩＹＹＳＦＤＶＫＤＩＮＫＧＥＩＳＤＧＹＳＶＳＲＱＡＱＡＫＦＳＬＳＬＥＳＡＩＰＮＱＴＡＬＹＦＣＡＴＳＧＱＧＡＹＥＥＱＦＦＧＰＧＴＲＬＴＶＬＥＤＬＫＮＶＦＰＰＥＶＡＶＦＥＰＳＥＡＥＩＳＨＴＱＫＡＴＬＶＣＬＡＴＧＦＹＰＤＨＶＥＬＳＷＷＶＮＧＫＥＶＨＳＧＶＳＴＤＰＱＰＬＫＥＱＰＡＬＮＤＳＲＹＣＬＳＳＲＬＲＶＳＡＴＦＷＱＮＰＲＮＨＦＲＣＱＶＱＦＹＧＬＳＥＮＤＥＷＴＱＤＲＡＫＰＶＴＱＩＶＳＡＥＡＷＧＲＡＤＣＧＦＴＳＥＳＹＱＱＧＶＬＳＡＴＩＬＹＥＩＬＬＧＫＡＴＬＹＡＶＬＶＳＡＬＶＬＭＡＭＶＫＲＫＤＳＲＧ＊＊
配列番号１３  構成的ＩＬ−７＿ＴＣＲ２の翻訳されたタンパク質配列
ＧＧＡＧＧＡＡＡＡＡＣＴＧＴＴＴＣＡＴＡＣＡＧＡＡＧＧＣＧＴ
配列番号１４  ヒトＩＬ２プロモーターＮＦＡＴ  ＴＲＥ
ＴＡＧＧＣＧＴＧＴＡＣＧＧＴＧＧＧＡＧＧＣＣＴＡＴＡＴＡＡＧＣＡＧＡＧＣＴＣＧＴＴＴＡＧＴＧＡＡＣＣＧＴＣＡＧＡＴＣＧＣＣＴＧＧＡＧＡＣＧＣＣＡＴＣＣＡＣＧＣＴＧＴＴＴＴＧＡＣＣＴＣＣＡＴＡＧＡＡＧＡＣＡＣＣＧＧＧＡＣＣＧＡＴＣＣＡＧＣＣＴＣＴＣＧＡＣＡＴＴＣＧＴＴＧＧＡＴＣ
配列番号１５  最小ＣＭＶプロモーター
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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