(57)【要約】  本技術は、概して、骨障害を改善するために使用され得るIGFBP-2のペプチドに関する。本技術は、概して、骨障害を予防する又は治療するための方法におけるそのようなペプチドの使用、及びそのような使用のための組成物にも関する。
2020506237.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号1に記載のヘパリン結合ドメイン(HBD)の断片からなる単離されたペプチドであって、前記断片は6〜9アミノ酸長であり、配列番号14に記載のアミノ酸配列GLEEPK又はその類似体を含む、単離されたペプチド。
【請求項２】
骨障害の予防又は治療における使用のための、配列番号1に記載のヘパリン結合ドメイン(HBD)の断片からなる単離されたペプチドであって、前記断片は6〜10アミノ酸長であり、配列番号14に記載のアミノ酸配列GLEEPK又はその類似体を含む、単離されたペプチド。
【請求項３】
HBDはHBD1である、請求項1又は2に記載の単離されたペプチド。
【請求項４】
修飾されている、請求項1から3のいずれか一項に記載の単離されたペプチド。
【請求項５】
修飾はインビトロで実施されている、請求項4に記載の単離されたペプチド。
【請求項６】
修飾は翻訳後修飾である、請求項4又は5に記載の単離されたペプチド。
【請求項７】
翻訳後修飾はペグ化である、請求項6に記載の単離されたペプチド。
【請求項８】
1つ又は複数のペグ化(PEG)基にカップリングしている、請求項7に記載の単離されたペプチド。
【請求項９】
1つ又は複数のPEG基は、単離されたペプチドのN末端にある、請求項8に記載の単離されたペプチド。
【請求項１０】
1つ又は複数のPEG基は、単離されたペプチドのC末端にある、請求項8に記載の単離されたペプチド。
【請求項１１】
翻訳後修飾はアシル化である、請求項6に記載の単離されたペプチド。
【請求項１２】
1つ又は複数のアシル基にカップリングしている、請求項11に記載の単離されたペプチド。
【請求項１３】
1つ又は複数のアシル基は、単離されたペプチドのN末端にある、請求項12に記載の単離されたペプチド。
【請求項１４】
1つ又は複数のアシル基は、単離されたペプチドのC末端にある、請求項12に記載の単離されたペプチド。
【請求項１５】
アシル化は脂肪酸アシル化である、請求項11から14のいずれか一項に記載の単離されたペプチド。
【請求項１６】
脂肪酸アシル化は、単離されたペプチドに、ラウリン酸(C12:0)、トリデシル酸(C13:0)、ミリスチン酸(C14:0)、ペンタデシル酸(C15:0)、パルミチン酸(C16:0)、マルガリン酸(C17:0)、ステアリン酸(C18:0)、ノナデシル酸(C19:0)、アラキドン酸(arachidinic acid)(C20:0)、ヘンイコシル酸(C21:0)、ベヘン酸(C22:0)、トリコシル酸(C23:0)、及びリグノセリン酸(C24:0)のうちの1つ又は複数をカップリングさせることによるものである、請求項15に記載の単離されたペプチド。
【請求項１７】
脂肪酸アシル化は、単離されたペプチドに、ミリスチン酸(C14:0)、パルミチン酸(C16:0)、及びステアリン酸(C18:0)のうちの1つ又は複数をカップリングさせることによるものである、請求項15に記載の単離されたペプチド。
【請求項１８】
脂肪酸アシル化は、1つ又は複数の不飽和脂肪酸をカップリングさせることによるものである、請求項15に記載の単離されたペプチド。
【請求項１９】
1つ又は複数の不飽和脂肪酸は一価不飽和脂肪酸である、請求項18に記載の単離されたペプチド。
【請求項２０】
1つ又は複数の不飽和脂肪酸は多価不飽和脂肪酸である、請求項18に記載の単離されたペプチド。
【請求項２１】
環状である、請求項1から20のいずれか一項に記載の単離されたペプチド。
【請求項２２】
断片は、配列番号14に記載のとおりである又はその類似体である、請求項1から20のいずれか一項に記載の単離されたペプチド。
【請求項２３】
断片は、配列番号10に記載のとおりである又はその類似体である、請求項1から20のいずれか一項に記載の単離されたペプチド。
【請求項２４】
断片は、配列番号16、配列番号4、若しくは配列番号9に記載のとおりである又はその類似体である、請求項2に記載の単離されたペプチド。
【請求項２５】
断片は、配列番号77に記載のとおりである又はその類似体である、請求項1から20のいずれか一項に記載の単離されたペプチド。
【請求項２６】
その類似体はその保存的類似体である、請求項1から25のいずれか一項に記載の単離されたペプチド。
【請求項２７】
その類似体はその構造類似体である、請求項1から25のいずれか一項に記載の単離されたペプチド。
【請求項２８】
その類似体はその機能類似体である、請求項1から25のいずれか一項に記載の単離されたペプチド。
【請求項２９】
その類似体はその構造類似体でもありその機能類似体でもある、請求項1から25のいずれか一項に記載の単離されたペプチド。
【請求項３０】
連結基を含む、請求項1から29のいずれか一項に記載の単離されたペプチド。
【請求項３１】
配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号17、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号106、配列番号107、配列番号108、配列番号109、配列番号110、配列番号111、配列番号112、配列番号113、及びその任意の類似体から選択されるアミノ酸配列からなる単離されたペプチド。
【請求項３２】
配列番号7に記載のアミノ酸配列又はその類似体からなる単離されたペプチド。
【請求項３３】
配列番号10に記載のアミノ酸配列又はその類似体からなる単離されたペプチド。
【請求項３４】
配列番号15に記載のアミノ酸配列又はその類似体からなる単離されたペプチド。
【請求項３５】
配列番号73に記載のアミノ酸配列又はその類似体からなる単離されたペプチド。
【請求項３６】
配列番号77に記載のアミノ酸配列又はその類似体からなる単離されたペプチド。
【請求項３７】
配列番号97に記載のアミノ酸配列又はその類似体からなる単離されたペプチド。
【請求項３８】
配列番号100に記載のアミノ酸配列又はその類似体からなる単離されたペプチド。
【請求項３９】
配列番号101に記載のアミノ酸配列又はその類似体からなる単離されたペプチド。
【請求項４０】
配列番号106に記載のアミノ酸配列又はその類似体からなる単離されたペプチド。
【請求項４１】
配列番号107に記載のアミノ酸配列又はその類似体からなる単離されたペプチド。
【請求項４２】
配列番号108に記載のアミノ酸配列又はその類似体からなる単離されたペプチド。
【請求項４３】
配列番号109に記載のアミノ酸配列又はその類似体からなる単離されたペプチド。
【請求項４４】
配列番号112に記載のアミノ酸配列又はその類似体からなる単離されたペプチド。
【請求項４５】
配列番号113に記載のアミノ酸配列又はその類似体からなる単離されたペプチド。
【請求項４６】
骨障害の予防又は治療における使用のための、配列番号4、配列番号9、及び配列番号16から選択されるアミノ酸配列又はその類似体からなる単離されたペプチド。
【請求項４７】
それを必要とする対象における骨障害の予防又は治療における使用のための、請求項1から43のいずれか一項に記載の単離されたペプチド。
【請求項４８】
それを必要とする対象における骨障害の予防又は治療のための、請求項1から43のいずれか一項に記載の単離されたペプチドの使用。
【請求項４９】
それを必要とする対象における骨障害の予防又は治療のための医薬の製造における、請求項1から43のいずれか一項に記載の単離されたペプチドの使用。
【請求項５０】
骨障害は、骨粗鬆症、骨減少症、骨形成不全症、骨壊死、低骨量、パジェット病、骨転移、無菌性人工関節弛緩(aseptic prosthetic loosening)、歯周炎、転移性骨疾患、関節リウマチ、ループス関節炎、歯周病、歯槽骨喪失、骨切り術後、小児期特発性骨喪失、脊椎の湾曲、身長の低下、及び補綴手術から選択される、請求項46又は47に記載の使用。
【請求項５１】
骨障害は、骨折、骨欠損、骨移植、骨グラフト、骨癌、関節置換、関節修復、骨癒合、椎間関節修復、骨変性、歯科インプラント、歯科修復、及び骨髄損失から選択される、請求項46又は47に記載の使用。
【請求項５２】
それを必要とする対象における骨形成を増強するための、請求項1から43のいずれか一項に記載の単離されたペプチドの使用。
【請求項５３】
それを必要とする対象における骨形成を増強するための医薬の製造における、請求項1から43のいずれか一項に記載の単離されたペプチドの使用。
【請求項５４】
それを必要とする対象における骨吸収を阻害するための、請求項1から43のいずれか一項に記載の単離されたペプチドの使用。
【請求項５５】
それを必要とする対象における骨吸収を阻害するための医薬の製造における、請求項1から43のいずれか一項に記載の単離されたペプチドの使用。
【請求項５６】
それを必要とする対象における骨の沈着を誘導するための、請求項1から43のいずれか一項に記載の単離されたペプチドの使用。
【請求項５７】
それを必要とする対象における骨の沈着を誘導するための医薬の製造における、請求項1から43のいずれか一項に記載の単離されたペプチドの使用。
【請求項５８】
それを必要とする対象における骨の成熟を誘導するための、請求項1から43のいずれか一項に記載の単離されたペプチドの使用。
【請求項５９】
それを必要とする対象における骨の成熟を誘導するための医薬の製造における、請求項1から43のいずれか一項に記載の単離されたペプチドの使用。
【請求項６０】
対象は標的部位に骨障害を有する、請求項53から57のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６１】
標的部位は、椎間腔、椎間関節、骨折の部位、口の骨、下顎の骨、顎の骨、インプラント部位、及びその任意の組み合わせのうちの1つ又は複数である、請求項58に記載の使用。
【請求項６２】
それを必要とする対象における骨芽細胞生成を刺激するための、請求項1から43のいずれか一項に記載の単離されたペプチドの使用。
【請求項６３】
それを必要とする対象における骨障害の予防又は治療のための方法であって、前記対象における骨障害を予防する又は治療するのに有効な量の、請求項1から43のいずれか一項に記載の単離されたペプチドを前記対象に投与する工程を含む方法。
【請求項６４】
骨障害は、骨粗鬆症、骨減少症、骨形成不全症、骨壊死、低骨量、パジェット病、骨転移、無菌性人工関節弛緩、歯周炎、転移性骨疾患、関節リウマチ、ループス関節炎、歯周病、歯槽骨喪失、骨切り術後、小児期特発性骨喪失、脊椎の湾曲、身長の低下、及び補綴手術から選択される、請求項61に記載の方法。
【請求項６５】
骨障害は、先端巨大症患者における骨病、嚢胞性線維症に関連した骨疾患、無形成骨症、慢性腎疾患に伴う腎性骨異栄養症、シスチン症に伴う骨疾患、及び高シュウ酸尿症に伴う骨疾患から選択される、請求項61に記載の方法。
【請求項６６】
骨障害は、骨折、骨欠損、骨移植、骨グラフト、骨癌、関節置換、関節修復、癒合、椎間関節修復、骨変性、歯科インプラント、歯科修復、骨髄損失、及びその任意の組み合わせから選択される、請求項61に記載の方法。
【請求項６７】
それを必要とする対象における骨形成を増強するための方法であって、前記対象における骨形成を妨げる又は増強するのに有効な量の、請求項1から43のいずれか一項に記載の単離されたペプチドを前記対象に投与する工程を含む方法。
【請求項６８】
それを必要とする対象における骨吸収を阻害するための方法であって、前記対象における骨吸収を阻害するのに有効な量の、請求項1から43のいずれか一項に記載の単離されたペプチドを前記対象に投与する工程を含む方法。
【請求項６９】
それを必要とする対象における骨の沈着を誘導するための方法であって、前記対象における骨沈着を誘導するのに有効な量の、請求項1から43のいずれか一項に記載の単離されたペプチドを前記対象に投与する工程を含む方法。
【請求項７０】
それを必要とする対象における骨の成熟を誘導するための方法であって、前記対象における骨の成熟を誘導するのに有効な量の、請求項1から43のいずれか一項に記載の単離されたペプチドを前記対象に投与する工程を含む方法。
【請求項７１】
前記投与は、髄腔内投与、皮下投与、皮膚投与、経口投与、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、インプラントを介した投与、マトリックスを介した投与、ゲルを介した投与、又はその任意の組み合わせである、請求項61から70のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
有効な量は約1μg/kg〜約50mg/kgである、請求項61から71のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
前記投与する工程は1日1回、2回、又は3回実施される、請求項61から72のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
前記投与する工程は少なくとも約10週間又は約24週間の期間続く、請求項61から73のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
前記投与する工程は少なくとも約24週間の期間続く、請求項61から73のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
幹細胞をエクスビボで増殖する方法であって、請求項1から43のいずれか一項に記載の単離されたペプチドと対象由来の幹細胞とを接触させる工程を含み、前記幹細胞は、前記対象に再導入される条件下で維持される、方法。
【請求項７７】
請求項1から43のいずれか一項に記載の単離されたペプチドを薬学的に許容される担体と組み合わせて含む薬学的組成物。
【請求項７８】
薬学的に許容される担体は液体担体である、請求項77に記載の薬学的組成物。
【請求項７９】
薬学的に許容される担体は生体医用インプラントである、請求項77に記載の薬学的組成物。
【請求項８０】
対象における脂肪細胞分化の阻害のための、請求項1から43のいずれか一項に記載の単離されたペプチドの使用。
【請求項８１】
対象における脂肪細胞分化の阻害のための医薬の製造における、請求項1から43のいずれか一項に記載の単離されたペプチドの使用。
【請求項８２】
対象における脂肪量のモジュレーションのための、請求項1から43のいずれか一項に記載の単離されたペプチドの使用。
【請求項８３】
対象における脂肪量のモジュレーションのための医薬の製造における、請求項1から43のいずれか一項に記載の単離されたペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2017年2月6日に出願した米国仮特許出願第62/455,124号の優先権及び恩典を主張するものであり、その開示は参照によりその全体として本明細書に組み込まれている。
【０００２】
技術の分野
本技術は、概して、骨障害を改善するために使用され得る化合物、特にペプチドに関する。本技術は、概して、骨障害を予防及び/又は治療するための方法におけるそのような化合物の使用、並びにそのような使用のための組成物にも関する。
【背景技術】
【０００３】
背景情報
インスリン様成長因子結合タンパク質-2(IGFBP-2)は、IGFBPファミリーのメンバーである36,000ダルトンのタンパク質である。六(6)種の形態の高親和性IGF結合タンパク質が存在する。これらのタンパク質は、インスリン様成長因子I及びIIに結合し、輸送タンパク質として働くことに加えて、IGFに結合するそれらの能力とは無関係であるいくつかの作用を有することが示されている。
【０００４】
IGFBP-2は、血清中の2番目に豊富な結合タンパク質である。IGFBP-2は、ヒトにおいて100〜600ng/mlの間の様々な濃度で循環している。タンパク質濃度は胎児期及び出生時に高く、小児期及び青年期に次第に下がる。60〜80歳の間でわずかに上昇し、すなわちおよそ25%の増加が生じる。IGFBP-2の血清濃度は、ホルモン及び栄養素によって調節される。絶食はIGFBP-2の大幅な増加を引き起こし、摂食(特にタンパク質摂食)は濃度を正常に戻す。濃度は、インスリン又は成長ホルモンの投与によっても抑制され、インスリン様成長因子-Iによって増加する。これは、一部には成長ホルモン及びインスリンの抑制に起因し、その両方ともIGF-Iを投与することによって抑制される。
【０００５】
IGFBP-2は、インスリン様成長因子の担体タンパク質としての役割に加えて、骨量及び脂肪代謝を制御する。IGFBP-2ノックアウトマウス(IGFBP-2-/-)では、骨量が低下し脂肪量が増加した(DeMambro、Endocrinology、2008)。対照的に、マウスにおけるIGFBP-2の過剰発現は、食餌性肥満に対する感受性の低下及びインスリン感度の向上をもたらした(Wheatcroft、Diabetes、2007;Hedbacker、Cell Metab、2010)。インビトロにおいて、IGFBP-2は、マウス及びヒト骨芽細胞分化を直接刺激し(Xi、JBMR、2014)、対照的に前脂肪細胞分化を阻害する(Wheatcroft、Diabetes、2007)。
【０００６】
他のIGFBPのように、IGFBP-2のN末端領域はIGF-I結合部位を含有し、一方でC末端領域はIGF-I結合を促し、細胞外マトリックスに結合する能力の主要因である。IGFBP-2は、IGF結合非依存的機能を付与する2つのヘパリン結合ドメイン(HBD)も含む。HBD1は、リンカー領域に位置する固有のHBDであり、一方でHBD2はC末端領域に位置する。HBD1及びHBD2の両方とも、脂質生成を阻害するIGFBP-2能力の主要因であるものの(Xi、Endocrinology、2013)、HBD1のみが骨量獲得及び骨芽細胞分化に関する特性を媒介する(Kawai、JBC、2011;Xi、JBMR、2014)。
【０００７】
先行研究は、HBDを含むペプチドを開示している。例えば、参照により本明細書に組み込まれているWO 2005/014635は、HBD1とアミノ酸配列類似性を共有する心血管障害血漿ポリペプチド(CPP)を開示している。WO 2005/014635は、そのようなCPPに関する潜在的診断機能を示唆している。また参照により本明細書に組み込まれている米国特許第9,220,746号は、IGFBP-2の骨芽細胞生成活性を保存するあるある特定のHBD1ペプチドを開示している。米国特許第9,220,746号は、骨関連病状の治療におけるこれらのペプチドの役割を提案している。
【０００８】
ペプチドのサイズは、治療剤としてのその効率に影響する。より長いペプチドほど、通常、投与後に急速に分解され、それらのインビボ効能は、静脈内、皮下、又は筋肉内ボーラス投与後に弱いことが多い。加えて、長いペプチドを製造することは、それが固相ペプチド合成によって又は組換え技術によってのいずれに製造されるかにかかわらず、大規模で費用のかかるプロセスである。最後に、長いペプチドで患者を長期的に治療することは、免疫原性という形で患者にとっての安全性リスクとなり得る。天然ペプチドに対して中和抗体を作り上げることは、患者にとっての潜在的な重大な健康リスクである。そのため、全長ペプチドの活性を保持し、より長いペプチドの欠点を回避するより短いペプチドを獲得することが非常に望ましい。
【０００９】
上記のことを考慮すると、全長HBD1に匹敵する生物学的活性を持つが、製造するのがより容易でより低コストである、HBD1の更により小さなサイズのペプチドを同定することが非常に望ましいであろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】WO 2005/014635
【特許文献２】米国特許第9,220,746号
【特許文献３】米国特許第7,323,543号
【特許文献４】米国特許第7,482,171号
【特許文献５】米国特許第7,459,152号
【特許文献６】米国特許第7,393,919号
【特許文献７】米国特許第7,468,418号
【特許文献８】米国特許第7,402,652号
【特許文献９】米国特許第7,351,797号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】DeMambro、Endocrinology、2008
【非特許文献２】Wheatcroft、Diabetes、2007
【非特許文献３】Hedbacker、Cell Metab、2010
【非特許文献４】Xi、JBMR、2014
【非特許文献５】Xi、Endocrinology、2013
【非特許文献６】Kawai、JBC、2011
【非特許文献７】Remington、The Science And Practice of Pharmacy(第9編、1995)
【非特許文献８】Pharmaceutical Research 3(6):318(1986)
【非特許文献９】Merrifield, R.B. Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc. 1963、85、2149-2154
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
開示される技術の概要
本技術は、全長HBD1の活性を保持し、骨障害の予防又は治療において有用であり得るIGFBP-2の断片、特にHBD1の断片を提案する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
様々な態様によると、本技術は、配列番号1に記載のヘパリン結合ドメイン(HBD)の断片を含む単離されたペプチドであって、該断片は6〜9アミノ酸長であり、配列番号14に記載のアミノ酸配列GLEEPK又はその類似体を含む、単離されたペプチドに関する。
【００１４】
様々な態様によると、本技術は、ヘパリン結合ドメイン(HBD)の断片を含む単離されたペプチドであって、該HBDはアミノ酸配列KHHLGLEEPKKLR(配列番号1)を有し、該断片は6〜9アミノ酸長であり、アミノ酸配列GLEEPK(配列番号14)又はその類似体を含む、単離されたペプチドに関する。
【００１５】
様々な態様によると、本技術は、配列番号1に記載のヘパリン結合ドメイン(HBD)の断片からなる単離されたペプチドであって、該断片は6〜9アミノ酸長であり、配列番号14に記載のアミノ酸配列GLEEPK又はその類似体を含む、単離されたペプチドに関する。
【００１６】
様々な態様によると、本技術は、骨障害の予防又は治療における使用のための、配列番号1に記載のヘパリン結合ドメイン(HBD)の断片からなる単離されたペプチドであって、該断片は6〜10アミノ酸長であり、配列番号14に記載のアミノ酸配列GLEEPK又はその類似体を含む、単離されたペプチドに関する。
【００１７】
様々な態様によると、本技術は、それを必要とする対象における骨障害の予防及び/又は治療のための、本明細書において規定される単離されたペプチドの使用に関する。
【００１８】
様々な態様によると、本技術は、それを必要とする対象における骨障害の予防及び/又は治療のための医薬の製造における、本明細書において規定される単離されたペプチドの使用に関する。
【００１９】
様々な態様によると、本技術は、それを必要とする対象における骨形成の増強のための、本明細書において規定される単離されたペプチドの使用に関する。
【００２０】
様々な態様によると、本技術は、それを必要とする対象における骨形成の増強のための医薬の製造における、本明細書において規定される単離されたペプチドの使用に関する。
【００２１】
様々な態様によると、本技術は、それを必要とする対象における骨吸収を阻害するための、本明細書において規定される単離されたペプチドの使用に関する。
【００２２】
様々な態様によると、本技術は、それを必要とする対象における骨吸収を阻害するための医薬の製造における、本明細書において規定される単離されたペプチドの使用に関する。
【００２３】
様々な態様によると、本技術は、それを必要とする対象における骨の沈着を誘導するための、本明細書において規定される単離されたペプチドの使用に関する。
【００２４】
様々な態様によると、本技術は、それを必要とする対象における骨の沈着を誘導するための医薬の製造における、本明細書において規定される単離されたペプチドの使用に関する。
【００２５】
様々な態様によると、本技術は、それを必要とする対象における骨の成熟を誘導するための、本明細書において規定される単離されたペプチドの使用に関する。
【００２６】
様々な態様によると、本技術は、それを必要とする対象における骨の成熟を誘導するための医薬の製造における、本明細書において規定される単離されたペプチドの使用に関する。
【００２７】
様々な態様によると、本技術は、それを必要とする対象における骨芽細胞生成を刺激するための、本明細書において規定される単離されたペプチドの使用に関する。
【００２８】
様々な態様によると、本技術は、それを必要とする対象における骨障害の予防及び/又は治療のための方法であって、該対象における骨障害を予防する又は治療するのに有効な量の、本明細書において規定される単離されたペプチドを対象に投与する工程を含む方法に関する。
【００２９】
様々な態様によると、本技術は、それを必要とする対象における骨形成を増強するための方法であって、該対象における骨形成を妨げる又は増強するのに有効な量の、本明細書において規定される単離されたペプチドを該対象に投与する工程を含む方法に関する。
【００３０】
様々な態様によると、本技術は、それを必要とする対象における骨吸収を阻害するための方法であって、該対象における骨吸収を阻害するのに有効な量の、本明細書において規定される単離されたペプチドを該対象に投与する工程を含む方法に関する。
【００３１】
様々な態様によると、本技術は、それを必要とする対象における骨の沈着を誘導するための方法であって、該対象における骨沈着を誘導するのに有効な量の、本明細書において規定される単離されたペプチドを該対象に投与する工程を含む方法に関する。
【００３２】
様々な態様によると、本技術は、それを必要とする対象における骨の成熟を誘導するための方法であって、該対象における骨の成熟を誘導するのに有効な量の、本明細書において規定される単離されたペプチドを該対象に投与する工程を含む方法に関する。
【００３３】
様々な態様によると、本技術は、幹細胞をインビトロ又はエクスビボで増殖する方法であって、本明細書において規定される単離されたペプチドと対象由来の幹細胞とを接触させる工程を含み、該幹細胞は、該対象に再導入される条件下で維持される、方法に関する。
【００３４】
様々な態様によると、本技術は、本明細書において規定される1種又は複数の単離されたペプチドを薬学的に許容される担体と組み合わせて含む薬学的組成物に関する。
【００３５】
様々な態様によると、本技術は、対象における脂肪細胞分化の阻害のための、本明細書において規定される単離されたペプチドの使用に関する。
【００３６】
様々な態様によると、本技術は、対象における脂肪細胞分化の阻害のための医薬の製造における、本明細書において規定される単離されたペプチドの使用に関する。
【００３７】
様々な態様によると、本技術は、対象における脂肪量のモジュレーションのための、本明細書において規定される単離されたペプチドの使用に関する。
【００３８】
様々な態様によると、本技術は、対象における脂肪量のモジュレーションのための医薬の製造における、本明細書において規定される単離されたペプチドの使用に関する。
【００３９】
本技術の他の態様及び特質は、添付の図面とともに具体的な実施形態についての以下の説明を概観すれば、当業者に明白になるであろう。
【００４０】
本開示において記載される実施形態のすべての特質は、相互排他的ではなく互いに組み合わせられ得る。例えば、1つの実施形態の要素は、更に言及することなく他の実施形態において利用され得る。具体的な実施形態についての詳細な説明は、添付の図面を参照して、本明細書において下記で提供される。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】環状HBD1(3〜11)、N末端にC16:0を有するHBD1(3〜11)、N末端にC18:0を有するHBD1(3〜11)の静脈内注射後の雄性Sprague-Dawleyラットにおける、本技術の一部の実施形態に従ったペプチドの薬物動態プロファイルを示したグラフである。
【図２】環状HBD1(3〜11)、N末端にC16:0を有するHBD1(3〜11)、N末端にC18:0を有するHBD1(3〜11)の皮下注射後の雄性Sprague-Dawleyラットにおける、本技術の一部の実施形態に従ったペプチドの薬物動態プロファイルを示したグラフである。
【図３】N末端にC16:0を有するHBD1(3〜11)、N末端にC14:0を有するHBD1(3〜11)、N末端にC18:0を有するHBD1(3〜11)、及びN末端にC20:0を有するHBD1(3〜11)の皮下注射後の雄性Sprague-Dawleyラットにおける、本技術の一部の実施形態に従ったペプチドの薬物動態プロファイルを示したグラフである。
【図４】Gottingenミニブタにおける、N末端にC18:0を有するHBD1(3〜11)の単回の静脈内(iv)及び皮下(sc)注射後の、本技術の一部の実施形態に従ったペプチドの薬物動態プロファイルを示したグラフである。個々の値は、3匹の異なる対象に関して獲得された値の平均を表す。
【図５Ａ】卵巣切除ラットにおける骨に対する、本技術の一部の実施形態に従ったペプチドの効果を示したグラフである。グラフは、OVX Sprague-DawleyラットにおけるN末端にC18:0を有するHBD1(3〜11)の6週間の処理後の、脛骨骨幹端からの選択μCTパラメーターの、OVXビヒクルからのパーセント増加を示している。図5AはBV/TVを示している(OVXビヒクルに対して、*:p値<0.05、**:p値<0.01、***:p値<0.001)。
【図５Ｂ】卵巣切除ラットにおける骨に対する、本技術の一部の実施形態に従ったペプチドの効果を示したグラフである。グラフは、OVX Sprague-DawleyラットにおけるN末端にC18:0を有するHBD1(3〜11)の6週間の処理後の、脛骨骨幹端からの選択μCTパラメーターの、OVXビヒクルからのパーセント増加を示している。図5BはTb.Nを示している(OVXビヒクルに対して、*:p値<0.05、**:p値<0.01、***:p値<0.001)。
【図５Ｃ】卵巣切除ラットにおける骨に対する、本技術の一部の実施形態に従ったペプチドの効果を示したグラフである。グラフは、OVX Sprague-DawleyラットにおけるN末端にC18:0を有するHBD1(3〜11)の6週間の処理後の、脛骨骨幹端からの選択μCTパラメーターの、OVXビヒクルからのパーセント増加を示している。図5CはConc.Dを示している(OVXビヒクルに対して、*:p値<0.05、**:p値<0.01、***:p値<0.001)。
【図６Ａ】表示された骨生体力学特性に対する、本技術の一部の実施形態に従ったペプチドの効果を示したグラフである。グラフは、OVX Sprague-DawleyラットにおけるN末端にC18:0を有するHBD1(3〜11)による6週間の処理後の、腰椎(図6A)からの選択生体力学パラメーターの、OVXビヒクルからのパーセント増加を示している(OVXビヒクルに対して、*:p値<0.05)。
【図６Ｂ】表示された骨生体力学特性に対する、本技術の一部の実施形態に従ったペプチドの効果を示したグラフである。グラフは、OVX Sprague-DawleyラットにおけるN末端にC18:0を有するHBD1(3〜11)による6週間の処理後の、大腿骨頸部(図6B)からの選択生体力学パラメーターの、OVXビヒクルからのパーセント増加を示している(OVXビヒクルに対して、*:p値<0.05)。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
技術の詳細な説明
技術についてのこの本説明は、本技術が実行され得るすべての異なる手法又は本技術に付加され得るすべての特質についての詳細な目録であることを意図されるものではない。例えば、1つの実施形態に関して例示される特質は他の実施形態に組み込まれ得、特定の実施形態に関して例示される特質はその実施形態から取り除かれ得る。加えて、本明細書において示唆される様々な実施形態に対する数々の変形及び付加は、本技術から逸脱しない本開示に照らせば当業者に明白であろう。それゆえ、以下の明細書は、本技術の一部の特定の実施形態を例示することを意図されるものであり、そのすべての順列、組み合わせ、及び変形を徹底的に指定することを意図されるものではない。別様に定義されていない限り、本明細書において用いられるすべての技術的及び科学的な用語は、本技術が属する技術分野における当業者によって共通して理解されるものと同じ意味を有する。
【００４３】
本開示は、本発見者らによって実施された、IGFBP-2のペプチド断片に関する、特にIGFBP-2のヘパリン結合ドメイン(HBD)のペプチド断片に関する、及びこれらのペプチド断片が、骨障害を予防及び/又は治療する方法において等、骨を改善する方法においてどのように使用され得るかについての研究に関する仕事に端を発する。
【００４４】
A.化合物、ペプチド、その断片及び類似体
本明細書において使用する場合、「ヘパリン結合ドメイン」及び「HBD」という表現及び用語は、IGFBP-2のヘパリン結合ドメインを指す。「HBD1」という用語は、IGFBP-2のヘパリン結合ドメイン1を指す。HBD1は、配列番号1に記載のアミノ酸配列、つまり:1-KHHLGLEEPKKLR-13を有するペプチドを指すことを意図され、式中、「1」は、このHBD1ペプチドの5'末端又はN末端におけるアミノ酸残基を指し、「13」は、このHBD1ペプチドの3'末端又はC末端におけるアミノ酸残基を指す。したがって、HBD1のアミノ酸は、以下の位置:
1K2H3H4L5G6L7E8E9P10K11K12L13R
を占有する。
【００４５】
当技術分野において十分に認識された略語を用いて、左旋性アミノ酸(L-アミノ酸又はL又はL型)及び右旋性アミノ酸(D-アミノ酸又はD又はD型)、アラニン(Ala又はA)、アルギニン(Arg又はR)、アスパラギン(Asn又はN)、アスパラギン酸(Asp又はD)、システイン(Cys又はC)、グルタミン酸(Glu又はE)、グルタミン(Gln又はQ)、グリシン(Gly又はG)、ヒスチジン(His又はH)、イソロイシン(Ile又はI)、ロイシン(Leu又はL)、リジン(Lys又はK)、メチオニン(Met又はM)、フェニルアラニン(Phe又はF)、プロリン(Pro又はP)、セリン(Ser又はS)、トレオニン(Thr又はT)、トリプトファン(Trp又はW)、チロシン(Tyr又はY)、及びバリン(Val又はV)を含めたアミノ酸を記載する。天然ペプチド配列内のL-アミノ酸残基は、タンパク質においてよく見い出される20種のL-アミノ酸のいずれか1種、或いは対応するD-アミノ酸、4-ヒドロキシプロリン若しくはヒドロキシリシン等であるがそれらに限定されない希少アミノ酸、又はP-アラニン若しくはホモセリン等の非タンパク性アミノ酸のいずれか1種に変更され得る。別様に示されていない限り、本明細書において名前を挙げられるアミノ酸はL型を指す。
【００４６】
本明細書において規定されるペプチドの天然に存在する変異は、コード遺伝子若しくはその対立遺伝子のヌクレオチド配列における個別の変化により生じる、又は転写されたRNAの選択的スプライシングにより生じる、1つ又は複数のアミノ酸の置換、付加、又は欠失を含み得るものである。これらの変化は、ペプチド変種の特性、薬理学的及び生物学的な特徴に実質的に影響を及ぼさないと理解される。
【００４７】
本開示のペプチドは塩の形態であり得る。特に、分子の酸性官能基は、トリフルオロ酢酸塩等であるがそれに限定されないその塩誘導体によって置き換えられ得る。
【００４８】
「ペプチド」、「ポリペプチド」、又は「タンパク質」によって、長さ若しくは翻訳後修飾(例えば、グリコシル化又はリン酸化)若しくは化学的修飾にかかわらないアミノ酸の任意の鎖、又はD-Tyr、オルニチン、アミノアジピン酸等の非天然若しくは異常アミノ酸を含有するものを意味する。
【００４９】
一部の実施形態において、本開示のペプチドはHBD1の断片を含む。一部の実施形態において、ペプチドは10アミノ酸長である。一部の実施形態において、ペプチドは9アミノ酸長である。一部の他の実施形態において、ペプチドは8アミノ酸長である。一部の他の実施形態において、ペプチドは7アミノ酸長である。一部の他の実施形態において、ペプチドは6アミノ酸長である。一部の実施形態において、ペプチドは5アミノ酸長である。
【００５０】
本明細書において使用する場合、「断片」又は「その断片」という用語及び表現は、IGFBP-2等のペプチドのアミノ酸断片、又はIGFBP-2のHBDのアミノ酸断片、又はIGFBP-2のHBD1のアミノ酸断片を指す。HBD1の断片は、13アミノ酸残基よりも短い。したがって、HBD1の断片は、12、11、10、9、8、7、6、5、又は4アミノ酸残基長であり得る。一部の実施形態において、HBD1の断片は10アミノ酸長である。一部の実施形態において、HBD1の断片は9アミノ酸長である。一部の他の実施形態において、HBD1の断片は8アミノ酸長である。一部の他の実施形態において、HBD1の断片は7アミノ酸長である。一部の他の実施形態において、HBD1の断片は6アミノ酸長である。一部の他の実施形態において、HBD1の断片は5アミノ酸長である。一部の他の実施形態において、HBD1の断片は4アミノ酸長である。
【００５１】
1つの実施形態において、本開示は、Table 1(表1)に描写されるアミノ酸配列を有するペプチドを提供する。HBD1(1〜13)は全長HBD1を表す。Table 1(表1)に提示される残りのペプチドは、HBD1(1〜13)の断片であり、N末端における又はC末端における又はN末端及びC末端の両方におけるアミノ酸残基が欠けている。
【００５２】
【表１】
2020506237.tif 000003
【００５３】
一部の実施形態において、本開示のペプチドは、「精製されている」、「単離されている」、又は「実質的に純粋である」。ペプチドは、それらに天然に付随する成分からそれらが分離されている場合、「精製されている」、「単離されている」、又は「実質的に純粋である」。典型的に、化合物は、それがサンプルにおける全材料の少なくとも約60質量%、約65質量%、約70質量%、約75質量%、約80質量%、約85質量%、約90質量%、約91質量%、約92質量%、約93質量%、約94質量%、約95質量%、約96質量%、約97質量%、約98質量%、又は約99質量%である場合、実質的に純粋である。ペプチドを精製する又は単離するための技法は、当技術分野においてよく知られ、用いられており、当業者に公知であろう。
【００５４】
一部の他の実施形態において、本開示に従ったある特定のペプチドは環化形態でもあり得、それによりN末端又はC末端は直接的に又はリンカー部分の挿入によって頭尾連結されており、そのような部分自体は、一般的に、非環化形態に関してペプチドの三次元構造を変更するのを回避するような様式で、骨格に接合するのに要される1つ又は複数のアミノ酸残基を含む。そのようなペプチド誘導体は、非環化ペプチドと比べて、改善された安定性及び生体利用率を有し得る。
【００５５】
ペプチドを環化するための方法は、当技術分野において周知である。環化は、2つの側鎖官能基の間でのジスルフィド結合形成、1つの側鎖官能基と骨格α-アミノ基若しくはカルボキシル基との間でのアミド若しくはエステル結合形成、2つの側鎖官能基の間でのアミド若しくはエステル結合形成、又は骨格α-アミノ基及びカルボキシル基の間でのアミド結合形成によって達成され得る。これらの環化反応は、溶液中での高希釈で伝統的に行われている。環化は、一般に、ペプチドが樹脂に付着している間に達成される。固体支持体上で環状ペプチドを合成する最もよく見られる手法の1つは、アミノ酸の側鎖を樹脂に付着させることによるものである。適当な保護戦略を用いると、鎖会合の後、C末端及びN末端は選択的に脱保護され得、樹脂上で環化され得る。この戦略は広く用いられており、tert-ブチルオキシカルボニル(Boc)又は9-フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)プロトコールのいずれかと適合性である。しかしながら、それは、固体支持体に付着する適当な側鎖官能基を含有するペプチドに制限される。いくつかのアプローチを用いて、環状ペプチドの効率的な合成を達成し得る。環状ペプチドを合成するための1つの手順は、樹脂からの同時切断による環化に基づく。適当なペプチド配列が固相合成によって樹脂上に会合した後、又は直鎖状配列が樹脂に付された後、脱保護されたアミノ基は、そのアンカリング活性を有する連結と反応して、保護された環状ペプチドを産生し得る。一般的に、最終脱保護工程は、標的環状ペプチドを生成するために要される。環状ペプチドを合成するための手順は、当技術分野において周知である。
【００５６】
他の実施形態において、本開示は、本明細書において規定されるペプチドの類似体を提供する。本明細書において使用する場合、「類似体」という用語は、その親化合物の生理学的活性を有し、天然に存在する親ペプチドのアミノ酸配列とは異なる1つ又は複数(例えば、2、3、4、5、又は6個以上)のアミノ酸を含むペプチドを指す。そのような類似体は、好ましくは、親ペプチドの生理学的活性の少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、又は少なくとも約95%を有する。
【００５７】
一部の他の実施形態において、類似体は、親と同じくらい生理学的に活性であり得る(すなわち、親ペプチドの生理学的活性の100%を有する)、又は親ペプチドよりも約100%を上回って、約110%を上回って、約120%を上回って、約130%を上回って、約140%を上回って、約150%を上回って、約160%を上回って、約170%を上回って、約180%を上回って、約190%を上回って、若しくは約200%を上回って生理学的に活性であり得る。
【００５８】
そのような種々のアミノ酸は、非天然の側鎖基及び骨格連結の付加を含めた、付加、置換、欠失、又はその組み合わせであり得る。その類似体を産生するためのペプチドの修飾は公知である。例えば、米国特許第7,323,543号を参照;米国特許第7,482,171号;第7,459,152号;及び第7,393,919号も参照。それらはすべて参照により本明細書に組み込まれている。例えば、HBD1を含むペプチドの類似体、又はHBD1の断片の類似体は、HBD1のi)構造類似体;ii)機能類似体;又はiii)構造及び機能類似体のいずれかを指し、それは、とりわけ、例えば骨障害を予防する及び/又は治療することにおいて等、骨障害を改善することにおいてHBD1を置き換え得る。
【００５９】
本開示のペプチドの類似体は、その全長にわたって、本明細書において記載されるアミノ酸配列と少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%の配列相同性を有し、HBD1の代謝効果又は生物学的活性の少なくとも一方を共有する。当業者であれば、HBD1の類似体配列又はHBD1の断片の類似体配列を容易に同定するであろう。
【００６０】
HBD1の類似体又はHBD1の断片の類似体は、例えば、アラニンスキャンによって又はアミノ酸置換によって獲得される類似体である。ある場合には、HBD1の類似体又はその断片の類似体は非天然コードアミノ酸を含み得、該非天然コードアミノ酸とは、一般アミノ酸若しくはピロリシン若しくはセレノシステインのうちの1つではないアミノ酸、又は天然コードアミノ酸(20種の一般アミノ酸又はピロリシン及びセレノシステインを含むがそれらに限定されない)の修飾(例えば、翻訳後修飾)によって生じるが、それ自体は翻訳複合体によって成長中のポリペプチド鎖内に組み込まれないアミノ酸を指す。そのような天然に存在しないアミノ酸の例は、N-アセチルグルコサミニル-L-セリン、N-アセチルグルコサミニル-L-トレオニン、及びO-ホスホチロシンを含むが、それらに限定されるわけではない。
【００６１】
Table 2(表2)は、種々のアミノ酸位置にアラニン置換を有するHBD1(3〜11)の類似体の例を提示している。
【００６２】
【表２】
2020506237.tif 000004
【００６３】
Table 3(表3)は、HBD1(3〜11)の種々のアミノ酸位置にアミノ酸置換を含むHBD1断片の類似体の他の例を提示している。
【００６４】
【表３Ａ】
2020506237.tif 000005
【００６５】
【表３Ｂ】
2020506237.tif 000006
【００６６】
ある場合には、HBD1又はその断片の類似体は、1、2、3、4、5、6、7、8、又は9個のアミノ酸の置換、欠失、若しくは付加、又はその組み合わせによって、HBD1とは配列が異なり得る。
【００６７】
ある場合には、アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換である。本明細書において使用する場合、「保存的アミノ酸置換」という表現は、類似した特徴の別のもので残基を置換する置換を指す。典型的な保存的アミノ酸置換には、Gly(G)、Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、及びIle(I)の間でのもの;Ser(S)、Cys(C)、Met(M)、及びThr(T)の間でのもの;酸性残基Asp(D)及びGlu(E)の間でのもの;Asn(N)及びGln(Q)の間でのもの;塩基性残基His(H)、Lys(K)、及びArg(R)の間でのもの;並びに芳香族残基Phe(F)、Try(W)、及びTyr(Y)の間でのものが含まれる。
【００６８】
一部の実施形態において、本技術は、配列番号1に記載のHBD1の断片を有する単離されたペプチドを提供する。ある場合には、断片は、6〜10アミノ酸長であり、HBD1の残基3〜10、つまり配列番号7に記載のHLGLEEPK、又はその類似体を含む。アミノ酸配列HLGLEEPKを有するペプチドの類似体の例は、Table 4(表4)に提示されるペプチドを含むが、それらに限定されるわけではない。
【００６９】
【表４】
2020506237.tif 000007
【００７０】
一部の実施形態において、本技術は、配列番号1に記載のHBD1の断片を有する単離されたペプチドを提供する。ある場合には、断片は、6〜10アミノ酸長であり、HBD1の残基5〜10、つまり配列番号14に記載のGLEEPK、又はその類似体を含む。一部の他の実施形態において、断片は、6〜9アミノ酸長であり、HBD1の残基5〜10、つまり配列番号14に記載のGLEEPK、又はその類似体を含む。アミノ酸配列GLEEPKを有するペプチドの類似体の例は、Table 5(表5)に提示されるペプチドを含むが、それらに限定されるわけではない。
【００７１】
【表５】
2020506237.tif 000008
【００７２】
一部の他の実施形態において、本開示のペプチドは修飾され得る。本明細書において使用する場合、ペプチドに条件を付けるために用いられる場合の「修飾される」という用語は、ペプチドの長さ、ペプチドのアミノ酸配列、化合構造、翻訳時修飾、又は翻訳後修飾の変化等、ペプチドに加えられた任意の変化を指す。ある場合には、本開示のペプチドは、修飾されている1つ又は複数のアミノ酸残基を含む。
【００７３】
本明細書において使用する場合、「翻訳後修飾」という表現は、天然又は非天然アミノ酸の、それがペプチド鎖に組み込まれた後にそのようなアミノ酸に生じる、任意の修飾を指す。該用語は、ほんの一例として、翻訳時インビボ修飾、翻訳時インビトロ修飾(無細胞翻訳系等)、翻訳後インビボ修飾、及び翻訳後インビトロ修飾を包含する。翻訳後修飾の例は、グリコシル化、ペグ化、アセチル化、アシル化、アミド化、メチル化、カルボキシル化、リン酸化、塩、アミド、又はエステル、特にC末端エステルの付加、及び本開示のペプチドのN-アシル誘導体であるが、それらに限定されるわけではない。翻訳後修飾のタイプは、当技術分野において周知である。
【００７４】
一部の実施形態において、本開示のペプチドは、該ペプチドのN又はC末端のいずれかにカップリングした、分子量約10,000〜約40,000の1つ又は複数のポリ(エチレングリコール)(つまり「PEG」)部分を含む。「ポリアルキレングリコール」は、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリプロピレングリコール(PPG)、及びポリブチレングリコール(PBG)、並びに任意の組み合わせでのPEG、PPG、及びPBGのコポリマーを含むがそれらに限定されない直鎖又は分岐ポリアルキレングリコールポリマーを意味し、ポリアルキレングリコールのモノアルキルエーテルを含む。ゆえに、本技術の様々な実施形態において、本開示のペプチドにおけるポリアルキレングリコールは、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコール、及びその任意の組み合わせであり得るが、それらに限定されるわけではない。ある特定の実施形態において、ポリアルキレングリコールは、ポリエチレングリコール、つまり「PEG」である。「PEGサブユニット」という用語は、単一のポリエチレングリコール単位、すなわち-(CH2CH2O)-を指す。
【００７５】
一部の実施形態において、ポリアルキレングリコール(例えば、PEG)は、非多分散系、単分散系、実質的に単分散系、純粋な単分散系、又は実質的に純粋な単分散系であり得る。「単分散系」は、混合物中の化合物の約100パーセントが同じ分子量を有する、化合物の混合物を記載するために用いられる。「実質的に単分散系」は、混合物中の化合物の少なくとも約95パーセントが同じ分子量を有する、化合物の混合物を記載するために用いられる。「純粋な単分散系」は、混合物中の化合物の約100パーセントが同じ分子量を有し、同じ分子構造を有する、化合物の混合物を記載するために用いられる。ゆえに、純粋な単分散系混合物は単分散系混合物であるが、単分散系混合物は、必ずしも純粋な単分散系混合物ではない。「実質的に純粋な単分散系」は、混合物中の化合物の少なくとも約95パーセントが同じ分子量を有し、同じ分子構造を有する、化合物の混合物を記載するために用いられる。ゆえに、実質的に純粋な単分散系混合物は実質的に単分散系の混合物であるが、実質的に単分散系の混合物は、必ずしも実質的に純粋な単分散系混合物ではない。Table 6(表6)は、ペグ化によって修飾されている本開示のペプチドの例を提示している。
【００７６】
【表６】
2020506237.tif 000009
【００７７】
他のある場合には、本開示のペプチドは、該ペプチドの任意のアミノ酸にカップリングした1つ又は複数のアシル基を含む。ある場合には、1つ又は複数のアシル基は、N末端若しくはC末端アミノ酸に、又はその両方にカップリングしている。ある場合には、本開示のペプチドのアシル化は、脂肪酸が該ペプチドの1つ又は複数の特定のアミノ酸に付加される脂肪酸アシル化である。脂肪酸アシル化の例は、本開示のペプチドの1つ又は複数のアミノ酸への、ラウリン酸(C12:0)、トリデシル酸(C13:0)、ミリスチン酸(C14:0)、ペンタデシル酸(pentadecyclic acid)(C15:0)、パルミチン酸(C16:0)、マルガリン酸(C17:0)、ステアリン酸(C18:0)、ノナデシル酸(C19:0)、アラキドン酸(arachidinic acid)(C20:0)、ヘンイコシル酸(C21:0)、ベヘン酸(C22:0)、トリコシル酸(C23:0)、若しくはリグノセリン酸(C24:0)、又はその混合物の付加を含む。
【００７８】
一部の変種において、付加される対象となる脂肪酸は不飽和(例えば、一価不飽和又は多価不飽和)であり得る。不飽和脂肪酸の例は、i)一価不飽和脂肪酸:クロトン酸、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、サピエン酸、オレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、ガドレイン酸、エイコセン酸、エルカ酸、ネルボン酸;ii)二価不飽和脂肪酸:リノール酸、エイコサジエン酸、ドコサジエン酸;iii)三価不飽和脂肪酸:リノレン酸、ピノレン酸、エレオステアリン酸、ミード酸、ジホモ-γ-リノレン酸、エイコサトリエン酸;iv)四価不飽和脂肪酸:ステアリドン酸、アラキドン酸、エイコサテトラエン酸、アドレン酸;v)五価不飽和脂肪酸:ボセオペンタエン酸、エイコサペンタエン酸、オズボンド(ozubondo)酸、イワシ酸(sardine acid)、テトラコサノールペンタエン酸(tetracosanolpentaenoic acid);並びにvi)六価不飽和脂肪酸:ドコサヘキサエン酸及びニシン酸(herring acid)を含むが、それらに限定されるわけではない。
【００７９】
一部の実施形態において、本開示のペプチドは、1つ又は複数のカルボン酸官能基(-COOH)を含む脂肪酸にカップリングし得る。
【００８０】
ペプチドのアシル化を行うための方法は、当技術分野において周知である。Table 7(表7)は、アシル化によって修飾されている本開示のペプチドの例を提示している。
【００８１】
【表７】
2020506237.tif 000010
【００８２】
一部の付加的な実施形態において、本開示のペプチドは、リンカー又はリンカー基(例えば、リンカー部分)にカップリングし得る。本明細書において使用する場合、「リンカー」又は「連結基」という表現は、当技術分野において公知であるもの等の非アミノ酸連結基(例えば、米国特許第7,468,418号;第7,402,652号;及び第7,351,797号を参照されたく、それらはすべて参照により本明細書に組み込まれている)、又は当業者に明白であろうその変形体を含む。
【００８３】
一部の実施形態において、本開示のペプチドは、1種を上回る修飾を含み得る(例えば、PEG基及びアシル基を含み得る)。
【００８４】
一部の他の実施形態において、本開示のペプチドは、それ自体が修飾される修飾基にカップリングし得る。例えば、本開示のペプチドは、それ自体が修飾される脂肪酸にカップリングし得る。修飾された脂肪酸は、例えばリンカー又はリンカー基にカップリングし得、該リンカー又はリンカー基それ自体は、PEG基又は1つ若しくは複数のカルボン酸官能基(-COOH)等、別の修飾基にカップリングし得る。修飾の様々な組み合わせ及びそれらを達成するための方法は、当業者によって認識され、解されるであろう。
【００８５】
本技術のある特定の態様はポリヌクレオチドを使用する。これらのポリヌクレオチドには、本明細書において規定されるHBD1ペプチド、断片、及び類似体をコードする単離されたポリヌクレオチドが含まれる。
【００８６】
本明細書において使用する場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、複数のデオキシリボヌクレオチド又はヌクレオシドサブユニットから構成される分子を指す。ヌクレオシドサブユニット間の連結は、ホスフェート、ホスホネート、ホスホルアミデート、ホスホロチオエート等によって、又はペプチド核酸(PNA)において利用されるペプトイド型連結等の当技術分野において公知である非ホスフェート基によって提供され得る。連結基はキラル又はアキラルであり得る。オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは、2ヌクレオシドサブユニット〜数百又は数千ヌクレオシドサブユニット長に及び得る。オリゴヌクレオチドは、好ましくは5〜100サブユニット長、より好ましくは5〜60サブユニット長であるのに対し、ポリヌクレオチドの長さははるかにより大きくあり得る(例えば、最高で100個)。ポリヌクレオチドは、DNA及びRNAのいずれかであり得る。DNAは、ゲノムDNA、ゲノムDNAライブラリー、細胞又は組織に由来するcDNA、及び合成DNAの任意の形態であり得る。更には、本開示は、ある特定の態様において、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、又はファージミドを含むベクターを使用し得る。
【００８７】
本技術において有用であるポリペプチドは、当技術分野において公知の任意の適切な様式で調製され得る。そのようなポリペプチドには、単離された天然に存在するポリペプチド、組換えにより産生されたポリペプチド、合成により産生されたポリペプチド、又はこれらの方法の組み合わせによって産生されたポリペプチドが含まれる。そのようなポリペプチドを調製するための手段及び方法は、当技術分野において周知である。
【００８８】
B.治療作用
本明細書において使用する場合、本明細書において用いられる「治療する」、「治療すること」、及び「治療」という用語はすべて、患者の病状の改善(例えば、1つ又は複数の症状における)、疾患の進行の遅延等を含めた、疾患を患う対象に利益を与える任意のタイプの治療を指す。
【００８９】
本明細書において使用する場合、「対象」及び「患者」という用語は、概してヒト対象に関し、互換可能に用いられる。対象は雄又は雌であり得、白人、アフリカ系アメリカ人、アフリカ人、アジア人、ヒスパニック、インド人等を含むがそれらに限定されない任意の人種又は民族であり得る。対象は、新生児(newborn)、新生児(neonate)、幼児、小児、青年、成人、及び老齢者を含めた任意の年齢であり得る。一部の実施形態において、対象は骨障害を患う。対象は、獣医学的薬品又は薬学的薬物の開発目的のための、動物対象、特に、イヌ、ネコ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ブタ、齧歯類(例えば、ラット及びマウス)、ウサギ、霊長類(非ヒト霊長類を含む)等の哺乳類対象も含み得る。
【００９０】
一部の実施形態において、本開示のペプチドは、骨障害を改善及び/又は向上させるために使用され得る(又は、骨障害を改善及び/又は向上させるための方法において使用される)。ある場合には、本開示のペプチドは骨障害を予防するために使用され得、他のある場合には、本開示のペプチドは骨障害を治療するために使用され得、他のある場合には、本開示のペプチドは、骨障害の予防及び治療の両方に使用され得る。
【００９１】
本明細書において使用する場合、「骨障害」という表現は、1つ又は複数の骨及び/又は骨細胞の様々な異常又は奇形を引き起こすいくつかの疾患のうちのいずれかを指す。骨障害の例は、骨粗鬆症、くる病、骨軟化症、骨形成不全症、大理石骨病(骨化石症)、線維性骨異形成、閉経後骨粗鬆症、雄及び雌における老人性骨粗鬆症、グルココルチコイド誘発性骨粗鬆症、不活動誘発性骨粗鬆症、無重力誘発性骨粗鬆症、移植後骨粗鬆症、移動性骨粗鬆症、特発性骨粗鬆症、若年性骨粗鬆症、パジェット病、慢性副甲状腺機能亢進症、甲状腺機能亢進症、関節リウマチ、ゴーハム病、マッキューン-オルブライト症候群、様々な癌の溶骨性転移、又は多発性骨髄腫を含む。
【００９２】
本明細書において使用する場合、「骨障害」という表現は、骨量の喪失、一般的な骨脆弱性、関節変性、偽関節骨折、糖尿病によって引き起こされる整形外科的及び歯科的な問題、インプラント周囲炎、骨グラフト/インプラント/骨代用材料への応答不良、歯周病、骨格の老化、骨折、骨欠損、骨移植、骨グラフト、骨癌、関節置換、関節修復、癒合、椎間関節(facet)修復、骨変性、歯科インプラント及び修復、骨髄損失、並びに骨及び骨性組織と関連した他の病状も含む。骨欠損は、骨における間隙、変形、及び/又は偽関節骨折であり得る。骨障害は、先端巨大症患者における骨病、嚢胞性線維症に関連した骨疾患、無形成骨症、慢性腎疾患に伴う腎性骨異栄養症、シスチン症に伴う骨疾患、及び高シュウ酸尿症に伴う骨疾患も含む。
【００９３】
骨変性は、骨減少症若しくは骨粗鬆症に起因し得る(例えば、患者は、老齢性又は老人性骨粗鬆症、閉経後骨粗鬆症等を患う)、又は小人症に起因し得る。
【００９４】
治療され得る関節置換は、脊椎、膝、股関節、足根骨、指骨、肘、足首、及び/若しくは他の連接している関節、又はその置換を含む。関節修復は、脊椎、膝、股関節、足根骨、指骨、肘、足首、及び仙腸関節修復を含むが、それらに限定されるわけではない。
【００９５】
一部の実施形態において、本開示のペプチドは、骨形成を増強するために使用され得る(すなわち、蓄えられる新たな骨の量を増加させる、又は骨形成を増強する方法において使用される)。
【００９６】
一部の他の実施形態において、本開示のペプチドは、それを必要とする対象において同時に骨吸収を阻害する(すなわち、溶解される骨の量を低下させる)ために使用され得る(又は、骨吸収を阻害する方法において使用される)。そのような治療が適応されるであろう及び/又は有益であろう対象の非限定的な例は、当技術分野において公知であろうように、骨粗鬆症又は低骨量を有する女性(例えば、閉経後;閉経前)、骨粗鬆症又は低骨量を有する男性、治癒しつつある骨折を有する対象、長期にわたる不活動を経た対象、長期間動かずにいた又は動かない対象、長期にわたる不活動を経る又は経験する可能性がある対象、エストロゲン欠乏を有する対象等を含む。
【００９７】
一部のさらなる実施形態において、本開示のペプチドは、それを必要とする対象(例えば、骨障害を有する対象)における骨の沈着及び成熟を誘導するために使用され得る(又は、骨の沈着及び成熟を誘導するための方法において使用される)。ある場合には、本開示のペプチドは、骨吸収阻害剤と組み合わせて使用され得る。
【００９８】
これらの実施形態の一部の態様において、骨障害は対象の標的部位にある。標的部位は、椎間腔、椎間関節、骨折の部位、口、下顎、及び顎の骨、又はインプラント部位であり得る。
【００９９】
HBD1は、骨量獲得及び骨芽細胞分化をモジュレートすることが示された(Kawai、JBC、2011;Xi、JBMR、2014)。このことを考慮すると、HBD1の生理学的活性を保持するHBD1の断片も、骨量獲得及び骨芽細胞分化をモジュレートし得ると推測することは妥当である。そのため、一部の実施形態において、本開示のペプチドは、対象における脂肪細胞分化を阻害するために使用され得る(例えば、成熟脂肪細胞への脂肪細胞前駆体分化を阻害する)。一部の他の実施形態において、本開示のペプチドは、対象における脂肪量をモジュレートするために使用され得る。
【０１００】
一部の実施形態において、本開示のペプチドは、当技術分野において公知のプロトコールに従って行われる、幹細胞のインビトロ又はエクスビボ増殖の方法において採用され得る。ゆえに、本開示は、幹細胞をインビトロ又はエクスビボで増殖する方法であって、本開示のペプチドと対象由来の幹細胞とを接触させる工程を含み、該幹細胞は、該対象に再導入される条件下で維持される、方法を提供する。例えば、一部のエクスビボ実施形態において、幹細胞は、対象、例えばヒトから、例えば末梢血、臍帯血、又は骨髄から獲得され、該幹細胞を、該対象の身体の外で本開示の化合物と接触させる。エクスビボ実施形態は、対象から幹細胞を獲得する工程、及び(例えば、移植のための)使用前に該細胞をしばらくの間培養する工程を含む。一部の実施形態において、本開示のペプチドとの接触後、細胞は、対象、例えば該細胞を単離した同じ対象(自己供与)又は異なる対象(非自己(例えば、同系又は同種異系)供与)に送達される。これらの方法が適応されるであろう又は有益であろう対象の非限定的な例は、化学療法を有する又は有してきた対象、放射線を有する又は有してきた対象、再生不良性貧血を有する対象、骨髄異形成を有する対象、及びそれらの任意の組み合わせを含む。
【０１０１】
一部の実施形態において、本明細書において規定される使用及び方法は、対象に本明細書において規定されるペプチドの治療上有効な量を投与して、本明細書で論じられる効果を達成する(例えば、骨障害を予防する及び/又は治療する)工程を含む。
【０１０２】
本開示の任意の具体的なペプチドの治療上有効な投薬量は、ペプチドによって、患者によって、さらには対象によって異なり、数ある中でも、達成されるべき効果又は結果、患者の病状、及び送達の経路に依存する。一部の実施形態において、投薬量は約1μg/kg〜約1mg/kgである。一部の他の実施形態において、投薬量は約1mg/kg〜約50mg/kgである。
【０１０３】
ある場合には、投薬量は、約0.001mg/kg、約0.05mg/kg、約0.1mg/kg、約0.2mg/kg、約0.3mg/kg、約0.4mg/kg、約0.5mg/kg、約0.6mg/kg、約0.7mg/kg、約0.8mg/kg、約0.9mg/kg、又は約1.0mg/kgから、最高で約30mg/kg又は約40mg/kgまでである。
【０１０４】
他のある場合には、投薬量は、約1mg/kg、約2mg/kg、約3mg/kg、約4mg/kg、約5mg/kg、約6mg/kg、約7mg/kg、約8mg/kg、約9mg/kg、約10mg/kg、約11mg/kg、約12mg/kg、約13mg/kg、約14mg/kg、約15mg/kg、約16mg/kg、約17mg/kg、約18mg/kg、約19mg/kg、約20mg/kg、約21mg/kg、約22mg/kg、約23mg/kg、約24mg/kg、約25mg/kg、約26mg/kg、約27mg/kg、約28mg/kg、約29mg/kg、約30mg/kg、約31mg/kg、約32mg/kg、約33mg/kg、約34mg/kg、約35mg/kg、約36mg/kg、約37mg/kg、約38mg/kg、約39mg/kg、約40mg/kg、約41mg/kg、約42mg/kg、約43mg/kg、約44mg/kg、約45mg/kg、約46mg/kg、約47mg/kg、約48mg/kg、約49mg/kg、若しくは約50mg/kgである、又はそれを上回る量が用いられ得る。
【０１０５】
治療上有効な投薬量の付加的な例は、約1〜約50mg/kg/96hr;約1〜約50mg/kg/48hr;約1〜約50mg/kg/36hr;約1〜約50mg/kg/24hr;約1〜約50mg/kg/12hr;約1〜約25mg/kg/96hr;約1〜約25mg/kg/48hr;約1〜約25mg/kg/36hr;約1〜約25mg/kg/24hr;約1〜約25mg/kg/12hr;約1〜約10mg/kg/96hr;約1〜約10mg/kg/48hr;約1〜約10mg/kg/36hr;約1〜約10mg/kg/24hr;約1〜約10mg/kg/12hr;約1〜約5mg/kg/96hr;約1〜約5mg/kg/48hr;約1〜約5mg/kg/36hr;約1〜約5mg/kg/24hr;約1〜約5mg/kg/12hr;約0.001〜約1mg/kg/96hr;約0.001〜約1mg/kg/48hr;約0.001〜約1mg/kg/36hr;約0.001〜約1mg/kg/24hr;及び約0.001〜約1mg/kg/12hrを含む。
【０１０６】
本明細書において用いられる「並行投与すること」又は「並行投与する」は、2種以上のペプチド、化合物、又は組成物を、組み合わせ効果をもたらすのに間に合うように十分に近接して投与することを意味する(つまり、並行とは同時であり得る、又はそれは、互いの前若しくは後の短時間のうちに生じる2つ以上の事象であり得る、例えば逐次的)。同時並行投与は、例えば、投与前に化合物を混合することによって、又は同じ時点ではあるが異なる解剖学的部位に化合物を投与することによって、及び/又は投与の異なる経路を用いることによって行われ得る。
【０１０７】
C.薬学的組成物
本明細書において使用する場合、「活性剤」という表現は、本明細書において規定されるペプチドを指す。
【０１０８】
「治療上許容される」、「治療上適切な」、「薬学的に許容される」、及び「薬学的に適切な」という表現は、本明細書において互換可能に用いられ、疾患の重症度及び治療の必要性に照らして過度に有害な副作用なく、本明細書において規定される治療等、本明細書において記載される効果を達成するための対象への投与に適切であるペプチド、化合物、又は組成物を指す。
【０１０９】
上記で記載されるペプチドは、公知の技法に従って、薬学的担体中に投与のために製剤化され得る。例えば、Remington、The Science And Practice of Pharmacy(第9編、1995)を参照されたい。本開示に従った薬学的組成物の製造において、ペプチド(生理学的に許容されるその塩を含む)は、典型的に、とりわけ、許容される担体と混和される。担体は、当然、組成物中の他の任意の成分と適合性であるという意味で許容されなければならず、患者に有害であってはならない。担体は、固体若しくは液体、又はその両方であり得、好ましくは、ペプチドとともに、単位用量製剤として、例えば該ペプチドの約0.01又は約0.5質量%〜約95質量%又は約99質量%を含有し得る錠剤として製剤化される。1種又は複数の活性化合物が本開示の組成物中に組み込まれ得、それは、任意で1種又は複数の付属成分を含めた成分を混和する工程を含む、薬学の周知の技法のいずれかによって調製され得る。
【０１１０】
本開示の組成物は、経口、直腸、局所、口腔(例えば、舌下)、膣内、非経口(例えば、皮下、筋肉内、皮内、又は静脈内)、局所(すなわち、気道表面を含めた皮膚及び粘膜表面の両方)、及び経皮投与に適したものを含むが、とはいえ最も適切な経路は、どんな場合でも、治療されている病状の性質及び重症度に、並びに用いられている特定のペプチドの性質に依存する。
【０１１１】
経口投与に適した組成物は、カプセル、カシェー、ドロップ、又は錠剤等、個別の単位で提示され得、それぞれは、粉末又は顆粒として;溶液、又は水性若しくは非水性液体中の懸濁液として;或いは水中油型又は油中水型エマルジョンとして、所定量のペプチドを含有する。そのような組成物は、ペプチド及び適切な担体を会合させる工程を含む薬学の任意の適切な方法によって調製され得る(それは、上述される1種又は複数の付属成分を含有し得る)。一般的に、本開示の組成物は、ペプチドと、液体若しくは微粉化した固体担体、又はその両方とを均一且つ密に混和し、次いで必要に応じて、結果として生じた混合物を形作ることによって調製される。例えば、錠剤は、任意で1種又は複数の付属成分とともに、ペプチドを含有する粉末又は顆粒を圧縮又は成形することによって調製され得る。圧縮された錠剤は、任意で結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、及び/又は表面活性/分散剤と混合した粉末又は顆粒等の流動性のある形態に、化合物を適切な機械で圧縮することによって調製され得る。成形された錠剤は、不活性液体結合剤で湿らせた粉末化合物を適切な機械で成形することによって作製され得る。
【０１１２】
口腔(舌下)投与に適した組成物には、風味のある基剤、通常ではスクロース及びアカシア又はトラガカント中にペプチドを含むドロップ;並びに、ゼラチン及びグリセリン又はスクロース及びアカシア等の不活性基剤中にペプチドを含むトローチが含まれる。
【０１１３】
非経口投与に適した本開示の組成物は、ペプチドの無菌の水性及び非水性注射液を含み、その調製物は、好ましくは、意図されるレシピエントの血液と等張である。これらの調製物は、抗酸化物質、バッファー、静菌剤、及び組成物を意図されるレシピエントの血液と等張にする溶質を含有し得る。水性及び非水性の無菌懸濁液は、懸濁化剤及び増粘剤を含み得る。組成物は、単位-用量又は複数回-用量の容器、例えば密封アンプル及びバイアルで提示され得、使用の直前に無菌液体担体、例えば生理食塩水又は注射用水の添加のみを要するフリーズドライ(凍結乾燥)条件で保管され得る。即席の注射液及び懸濁液は、以前に記載された種類の無菌の粉末、顆粒、及び錠剤から調製され得る。例えば、本開示の1つの態様において、密封容器内での単位剤形で、本明細書において規定されるペプチド又はその塩を含む、注射可能な安定した無菌の組成物が提供される。ペプチド又は塩は、適切な薬学的に許容される担体で復元されて対象へのその注射に適した液体組成物を形成し得る凍結乾燥物の形態で提供される。単位剤形は、典型的に、約10mg〜約10グラムのペプチド又は塩を含む。ペプチド又は塩が実質的に非水溶性である場合、生理学的に許容される十分な量の乳化剤が、水性担体中に化合物又は塩を乳化するのに十分な分量で採用され得る。1つのそのような有用な乳化剤はホスファチジルコリンである。
【０１１４】
直腸投与に適した組成物は、好ましくは単位用量の坐薬として提示される。これらは、本明細書において規定されるペプチドと、1種又は複数の従来の固体担体、例えばココアバターとを混和し、次いで、結果として生じた混合物を形作ることによって調製され得る。
【０１１５】
皮膚への局所適用に適した組成物は、好ましくは、軟膏、クリーム、ローション、ペースト、ゲル、スプレー、エアロゾル、又は油の形態を取る。用いられ得る担体には、ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、アルコール、経皮増強剤、及びその2種以上の組み合わせが含まれる。
【０１１６】
経皮投与に適した組成物は、長期間にわたってレシピエントの表皮と密に接触したままの状態であることに適合した個別のパッチとして提示され得る。経皮投与に適した組成物は、イオントフォレシス(例えば、Pharmaceutical Research 3(6):318(1986)を参照されたい)によっても送達され得、典型的に、本明細書において規定されるペプチドの任意で緩衝化された水溶液の形態を取る。適切な組成物は、シトレート又はビス/トリスバッファー(pH6)又はエタノール/水を含み、0.1M〜0.2Mの活性成分を含有する。
【０１１７】
更に、本開示は、本明細書において開示されるペプチド及びその塩のリポソーム製剤を提供する。リポソーム懸濁液を形成するための技術は、当技術分野において周知である。本明細書において規定されるペプチド又はその塩が水溶性の塩である場合、従来のリポソーム技術を用いると、それは脂質小胞内に組み込まれ得る。そのような場合、ペプチド又は塩の水溶解度により、該ペプチド又は塩は、リポソームの親水性の中心部又はコア内に実質的に引き込まれる。採用される脂質層は、任意の従来の組成物のものであり得、コレステロールを含有し得る又はコレステロール不含であり得る。関心対象のペプチド又は塩が非水溶性である場合、再度従来のリポソーム形成技術を採用すると、該塩は、リポソームの構造を形成する疎水性脂質二重層内に実質的に引き込まれ得る。いずれの場合でも、産生されるリポソームは、あたかも標準的な超音波処理及びホモジナイゼーション技法の使用であるかのように、サイズが低下し得る。
【０１１８】
本明細書において開示される活性剤又はその塩を含有するリポソーム製剤を凍結乾燥して、水等の薬学的に許容される担体で復元され得る凍結乾燥物を産生して、リポソーム懸濁液を再生し得る。
【０１１９】
他の薬学的組成物は、水性基剤エマルジョン等、本明細書において開示される非水溶性活性剤又はその塩から調製され得る。そのような場合、組成物は、所望の量の活性剤又はその塩を乳化するのに十分な量の薬学的に許容される乳化剤を含有する。特に有用な乳化剤には、ホスファチジルコリン及びレシチンが含まれる。
【０１２０】
一部の実施形態において、本開示のペプチドは、医療機器を使用して、特に整形外科用医療機器を使用して、それを必要とする対象に送達され得る。本開示のペプチドを送達するのに有用であり得る医療機器の例は、スポンジ(例えば、コラーゲンスポンジ、ゼラチンスポンジ等)、包帯、ゲージ、ステント、ケージ(例えば、椎間ケージ、固定ケージ等)、骨セメント、骨ミキサー、骨代用品、ピン、アンカー、ボタン、プロテーゼ、ネジ(例えば、椎間関節スクリュー、椎弓根スクリューシステム、骨ネジ等)、スペーサー、髄内くぎ、ステム(例えば、股関節ステム等)、特注インプラント、プレート(例えば、上腕(humerous)プレート、手首プレート、橈骨プレート、頸部プレート、腰椎プレート等)、及び外傷用製品を含むが、それらに限定されるわけではない。これらの実施形態において、本開示のペプチドは、医療機器を作製するために使用される材料の中に組み込まれ得る、又は医療機器を作製するために使用される材料の上に若しくは医療機器それ自体の上に適用され得る。
【０１２１】
一部の他の実施形態において、本開示のペプチドは、粒子(例えば、ナノ粒子又はマイクロ粒子)又はカプセル化システム(例えば、マイクロカプセル、ミクロスフェア)等の送達機器を使用して、それを必要とする対象に送達され得る。ある場合には、本開示のペプチドは、例えばポリマー鎖等、送達システムを形成する材料全体に分散され得る、又は送達システム内に形成される細孔若しくは空洞内に配置され得る。ある場合には、そのような送達システムからのペプチドの放出は制御され得る(すなわち、徐放、持続放出、又は制御放出)。本開示のペプチドを送達するために使用され得る粒子、並びに粒子及びカプセル化システムの例は、当技術分野において周知である。
【０１２２】
活性化合物に加えて、薬学的組成物は、pHを調整する添加物等、他の添加物を含有し得る。特に、有用なpH調整剤には、塩酸等の酸、乳酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、又はグルコン酸ナトリウム等の塩基又はバッファーが含まれる。更に、組成物は微生物防腐剤を含有し得る。有用な微生物防腐剤には、メチルパラベン、プロピルパラベン、及びベンジルアルコールが含まれる。微生物防腐剤は、典型的に、複数回用量使用のために設計されたバイアル中に製剤が入れられる場合に採用される。
【０１２３】
一部の実施形態において、本技術は、本明細書において規定される1種又は複数のペプチドを、本明細書において規定される適用に従ったキットの使用のための指示書とともに含むキットを提供する。
【０１２４】
等価のペプチド、化合物、組成物、方法、使用、及びキットの同定は、通常の実践者の技能の十分に範囲内にあり、本開示の教示に照らして、単なる日常的実験しか要しないであろう。本開示の実践は、以下の実施例から更により完全に理解されるであろうが、それは、単に例示のために提示されるものであり、決して本開示を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１２５】
下記の実施例は、本技術の様々な実施形態の実践を例示するために与えられる。それらは、本技術の全範囲を限定する又は規定すること意図されるものではない。本技術は、本明細書において記載され、例示される特定の実施形態に限定されるわけではないが、添付の実施形態において規定される本開示の範囲内に入るすべての改変形態及び変形形態を含むと解されるべきである。
【０１２６】
(実施例1)
インビトロ骨芽細胞分化の間のオステオカルシン発現に対するHBD1断片の効果
Fmoc(9-フルオレニルメチルオキシカルボニル)戦略を用いた固相ペプチド合成(SPPS)によって、ペプチド化学における標準的製造過程に従い、ペプチドを製造した(Merrifield, R.B. Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc. 1963、85、2149-2154)。ペプチドのアイデンティティをLC-MSによって検証した。ペプチドの純度(少なくとも95%)及び正味ペプチド含有量を、それぞれRP-HPLC及び元素分析によって決定した。
【０１２７】
各ペプチドを、オステオカルシンタンパク質合成の刺激によって査定される、18〜21日間隔(Table 8(表8))又は14〜15日間隔(Table 9(表9))にわたる骨芽細胞の分化を刺激するその能力を測定する生物学的アッセイにおいて試験した。MC-3T3 E1クローン4(CL4)骨芽細胞をATCC(Manassas、VA、USA)から入手した。細胞を、10%胎仔ウシ血清(FBS;Thermo Fisher Scientific社、Pittsburgh、PA、USA)を含有するα-MEM中で培養した。コンフルエント後、試験ペプチド(Table 8(表8)では1μg/mL、又はTable 9(表9)では1μmol/L)の有無で、10%FBS+50μg/mLアスコルビン酸及び4mMβ-グリセロールリン酸を含有する分化培地(DM)に培地を変えた。試験ペプチドの有無で、新鮮なDMを72時間ごとに適用した。細胞単層を、改変した放射性免疫沈降アッセイ(RIPA)バッファー中で溶解した。溶解物中の総細胞タンパク質を、BCA(Thermo Fisher Scientific社、Rockford、IL、USA)を用いて決定した。細胞タンパク質を、SDS-PAGEゲルで分離し、分析のためにPVDF膜に転写する。オステオカルシン検出を、抗オステオカルシン抗体を1:200希釈(Santa Cruz Biotechnology社、Santa Cruz、CA、USA)で又は1:3000希釈(NPT社、Chapel Hill、NC、USA)で用いて実施し、増強化学発光(Thermo Fisher Scientific社、Rockford、IL、USA)を用いて可視化した。
【０１２８】
一連の実験において、様々な長さのHBD1の断片を、インビトロ骨芽細胞分化バイオアッセイにおいてそれらの効力について試験した。Table 8(表8)及びTable 9(表9)に提示される結果は、驚くべきことに、6、7、8、9、又は10アミノ酸長ほど短い一部の断片が、このアッセイにおいて効力を呈することを示している。HBD1(1〜12)、HBD1(1〜11)、HBD1(3〜11)、HBD1(4〜11)、及びHBD1(4〜10)等、ペプチドのC末端におけるアミノ酸R、L、及び最初のKの欠失は、生物学的に活性なペプチドをもたらした。同様に、HBD1(3〜13)及びHBD1(4〜13)等、ペプチドのN末端におけるK、H、及びHの欠失も、一部の保存された生物学的活性をもたらした。ペプチドのN-及びC末端の両方における欠失を組み合わせることによって、最短の活性断片は、配列番号14に記載の6アミノ酸長ペプチドであるHBD1(5〜10)であった。
【０１２９】
【表８】
2020506237.tif 000011
【０１３０】
【表９】
2020506237.tif 000012
【０１３１】
(実施例2)
インビトロ骨芽細胞分化の間のオステオカルシン発現に対する様々な用量のHBD1断片の効果
Fmoc(9-フルオレニルメチルオキシカルボニル)戦略を用いた固相ペプチド合成(SPPS)によって、ペプチド化学における標準的製造過程に従い、配列番号10に記載のHBD1(3〜11)ペプチドを製造した(Merrifield, R.B. Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc. 1963、85、2149-2154)。ペプチドのアイデンティティをLC-MSによって検証した。純度(少なくとも95%)及び正味ペプチドを、それぞれRP-HPLC及び元素分析によって決定した。
【０１３２】
ペプチドを、オステオカルシンタンパク質合成の刺激によって査定される、18日間隔にわたる骨芽細胞の分化を刺激するその能力を測定する生物学的アッセイにおいて、種々の濃度で試験した。MC-3T3 E1クローン4(CL4)骨芽細胞をATCC(Manassas、VA、USA)から入手した。細胞を、10%胎仔ウシ血清(FBS;Thermo Fisher Scientific社、Pittsburgh、PA、USA)を含有するα-MEM中で培養した。コンフルエント後、0.1μg/mLから4μg/mLへの上昇する用量のペプチドの有無で、10%FBS+50μg/mLアスコルビン酸及び4mM  β-グリセロールリン酸を含有する分化培地(DM)に培地を変えた。ペプチドの有無で、新鮮なDMを72時間ごとに適用した。細胞単層を、改変した放射性免疫沈降アッセイ(RIPA)バッファー中で溶解した。溶解物中の総細胞タンパク質を、BCA(Thermo Fisher Scientific社、Rockford、IL、USA)を用いて決定した。細胞タンパク質を、SDS-PAGEゲルで分離し、分析のためにPVDF膜に転写する。オステオカルシン検出を、抗オステオカルシン抗体を1:200希釈(Santa Cruz Biotechnology社、Santa Cruz、CA、USA)で用いて実施し、増強化学発光(Thermo Fisher Scientific社、Rockford、IL、USA)を用いて可視化した。
【０１３３】
この実験において、HBD1(3〜11)を骨芽細胞分化アッセイにおいていくつかの用量で試験した。この実験の結果は、下記のTable 10(表10)に要約されている。結果は、このペプチドが用量依存的形式で骨芽細胞分化を改善し、試験した最も高い用量で高い効力を呈したことを示している。このことは、単離されたペプチド、その類似体としての、或いはより大きなペプチドにおける配列、化学的部分に抱合した配列、及び単独で又は同化剤若しくは抗吸収剤と組み合わせて投与された配列としての、骨障害におけるHBD1(3〜11)の治療的潜在性を示唆する。
【０１３４】
【表１０】
2020506237.tif 000013
【０１３５】
(実施例3)
インビトロ骨芽細胞分化の間のオステオカルシン発現に対する、アラニン置換を有するHBD1断片類似体の効果
Fmoc(9-フルオレニルメチルオキシカルボニル)戦略を用いた固相ペプチド合成(SPPS)によって、ペプチド化学における標準的製造過程に従い、ペプチドを製造した(Merrifield, R.B. Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc. 1963、85、2149-2154)。ペプチドのアイデンティティをLC-MSによって検証した。ペプチドの純度(少なくとも95%)及び正味ペプチド含有量を、それぞれRP-HPLC及び元素分析によって決定した。
【０１３６】
各ペプチドを、オステオカルシンタンパク質合成の刺激によって査定される、15日間隔にわたる骨芽細胞の分化を刺激するその能力を測定する生物学的アッセイにおいて試験した。MC-3T3 E1クローン4(CL4)骨芽細胞をATCC(Manassas、VA、USA)から入手した。細胞を、10%胎仔ウシ血清(FBS;Thermo Fisher Scientific社、Pittsburgh、PA、USA)を含有するα-MEM中で培養した。コンフルエント後、試験ペプチド(1μg/mL)の有無で、10%FBS+50μg/mLアスコルビン酸及び4mMβ-グリセロールリン酸を含有する分化培地(DM)に培地を変えた。試験ペプチドの有無で、新鮮なDMを15日間72時間ごとに適用した。細胞単層を、改変した放射性免疫沈降アッセイ(RIPA)バッファー中で溶解した。溶解物中の総細胞タンパク質を、BCA(Thermo Fisher Scientific社、Rockford、IL、USA)を用いて決定した。細胞タンパク質を、SDS-PAGEゲルで分離し、分析のためにPVDF膜に転写する。オステオカルシン検出を、抗オステオカルシン抗体を1:200希釈(Santa Cruz Biotechnology社、Santa Cruz、CA、USA)で用いて実施し、増強化学発光(Thermo Fisher Scientific社、Rockford、IL、USA)を用いて可視化した。
【０１３７】
これらの実験において、配列番号10に記載の親HBD1(3〜11)ペプチドの各アミノ酸を置換する効果を検討した。各Ala-一置換ペプチドを合成し、インビトロ骨芽細胞分化アッセイで試験した。Table 11(表11)に示される結果は、位置3、8、9、10、又は11におけるHBD1(3〜11)のアラニン置換が、残存する生物学的活性を有する化合物を生み出したことを示す。位置4、5、6、又は7でのアラニン置換は生物学的活性の減少をもたらし、L(4)、G(5)、L(6)、及びE(7)の側鎖が生物学的活性にとって重要であることを示唆した。まとめると、これらのデータは、天然又は非天然アミノ酸でのアミノ酸置換が、この9アミノ酸長ペプチドに対して実施され得、保存された又は増加した生物学的活性を有する類似体を生み出し得ることを示している。
【０１３８】
【表１１】
2020506237.tif 000014
【０１３９】
(実施例5)
インビトロ骨芽細胞分化の間のオステオカルシン発現に対する、アミノ酸置換を有するHBD1断片類似体の効果
Fmoc(9-フルオレニルメチルオキシカルボニル)戦略を用いた固相ペプチド合成(SPPS)によって、ペプチド化学における標準的製造過程に従い、ペプチドを製造した(Merrifield, R.B. Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc. 1963、85、2149-2154)。ペプチドのアイデンティティをLC-MSによって検証した。ペプチドの純度(少なくとも95%)及び正味ペプチド含有量を、それぞれRP-HPLC及び元素分析によって決定した。
【０１４０】
各ペプチドを、オステオカルシンタンパク質合成の刺激によって査定される、Table 12(表12)、Table 15(表15)、及びTable 16(表16)における12日間隔、又はTable 13(表13)及びTable 14(表14)における15日間隔にわたる骨芽細胞の分化を刺激するその能力を測定する生物学的アッセイにおいて試験した。MC-3T3 E1クローン4(CL4)骨芽細胞をATCC(Manassas、VA、USA)から入手した。細胞を、10%胎仔ウシ血清(FBS;Thermo Fisher Scientific社、Pittsburgh、PA、USA)を含有するα-MEM中で培養した。コンフルエント後、試験ペプチド(1μmol/L)の有無で、10%FBS+50μg/mLアスコルビン酸及び4mMβ-グリセロールリン酸を含有する分化培地(DM)に培地を変えた。試験ペプチドの有無で、新鮮なDMを72時間ごとに適用した。細胞単層を、改変した放射性免疫沈降アッセイ(RIPA)バッファー中で溶解した。溶解物中の総細胞タンパク質を、BCA(Thermo Fisher Scientific社、Rockford、IL、USA)を用いて決定した。細胞タンパク質を、SDS-PAGEゲルで分離し、分析のためにPVDF膜に転写する。オステオカルシン検出を、抗オステオカルシン抗体を1:3000希釈(NPT社、Chapel Hill、NC、USA)で用いて実施し、増強化学発光(Thermo Fisher Scientific社、Rockford、IL、USA)を用いて可視化した。
【０１４１】
これらの実験において、親HBD1(3〜11)ペプチドの位置8、9、10、及び11に対するアミノ酸置換の効果を検討した。一置換又は多置換ペプチドのそれぞれを合成し、インビトロ骨芽細胞分化アッセイで試験した。Table 12(表12)、Table 13(表13)、及びTable 14(表14)に示される結果は、保存的又は非保存的置換が、親ペプチドHBD1(3〜11)と比較した場合に、保存された又は増強した生物学的活性を有するペプチドを生成したことを示す。
【０１４２】
例示的な例として、位置8におけるE(酸性アミノ酸)は、R(塩基性アミノ酸)、F、I、又はP(非極性、疎水性アミノ酸)、又はS(極性、非荷電アミノ酸)によって置換され得、位置8において一置換されたすべてのペプチドは、骨芽細胞分化アッセイで生物学的に活性であった(Table 12(表12)を参照されたい)。親HBD1(3〜11)ペプチドのアミノ酸9(P)、10(K)、及び11(K)の置換を実施することによって、同様の結果が得られた(Table 12(表12)及びTable 13(表13))。
【０１４３】
興味深いことに、一部の置換は、親HBD1(3〜11)ペプチドと比較した場合に、増加した効力を有するペプチドを生み出した。例えば、I、P、又はSによる位置11におけるKの置換は、親HBD1(3〜11)ペプチドの効力の2〜3倍を有するペプチドをもたらし、Q又はYによる位置10におけるKの置換は、親HBD1(3〜11)ペプチドの効力の2〜3倍を有するペプチドをもたらした。
【０１４４】
多置換は、生物学的に活性なペプチドをもたらした。例えば、位置10及び11でのKKの置換は、生物学的に活性なペプチドを生み出した(Table 13(表13)及びTable 14(表14))。特に、FV、FQ、FN、又はVMによる位置10及び11におけるKKの置換は、親HBD1(3〜11)ペプチドの効力の約3倍を有するペプチドをもたらした(Table 14(表14))。
【０１４５】
【表１２】
2020506237.tif 000015
【０１４６】
【表１３】
2020506237.tif 000016
【０１４７】
【表１４】
2020506237.tif 000017
【０１４８】
これらの実験において、親HBD1(3〜11)ペプチドの位置3、4、5、及び6に対するアミノ酸置換の効果も検討した。置換ペプチドのそれぞれを合成し、インビトロ骨芽細胞分化アッセイで試験した。Table 15(表15)に示される結果は、保存的又は非保存的置換が、親ペプチドHBD1(3〜11)と比較した場合に、保存された又は増強した生物学的活性を有するペプチドを生成したことを示す。
【０１４９】
【表１５】
2020506237.tif 000018
【０１５０】
切り取られたHBD1(3〜11)ペプチド、とりわけHBD1(3〜10)の位置10におけるアミノ酸置換の効果を検討した。置換ペプチドを合成し、インビトロ骨芽細胞分化アッセイで試験した。Table 16(表16)に示される結果は、HBD1(3〜10)の位置10における保存的置換が、HBD1(3〜11)ペプチドと比較した場合に、増強した生物学的活性を有するペプチドを生成したことを示す。特に、HBD1(3〜10)の位置10におけるKの置換は、親HBD1(3〜11)の効力の最高で約3倍を有するペプチドをもたらした。
【０１５１】
【表１６】
2020506237.tif 000019
【０１５２】
結論として、HBD1(3〜11)の位置3、4、5、6、8、9、10、及び11におけるアミノ酸の置換、並びに位置11におけるアミノ酸の切り取り、及び位置10におけるアミノ酸の置換は、生物活性ペプチドを生み出し、それらの一部は、HBD1(3〜11)自体よりも更により強力であった。したがって、天然又は非天然アミノ酸での該ペプチドのN末端における一置換又はC末端における一置換若しくは多置換は、HBD1(3〜11)の強力な類似体を設計する妥当な戦略であり得、類似体のさらなる設計が、ペプチド化学の分野における技能を有する科学者によって慣用技術に従い実施された。
【０１５３】
(実施例6)
インビトロ骨芽細胞分化の間のオステオカルシン発現に対する、ペグ化HBD1断片類似体の効果
Fmoc(9-フルオレニルメチルオキシカルボニル)戦略を用いた固相ペプチド合成(SPPS)によって、ペプチド化学における標準的製造過程に従い、ペプチド骨格を製造した(Merrifield, R.B. Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc. 1963、85、2149-2154)。ペプチドのアイデンティティをLC-MSによって検証した。ペプチドの純度(少なくとも95%)及び正味ペプチド含有量を、それぞれRP-UPLC及び元素分析によって決定した。
【０１５４】
ペプチドを、N-又はC末端のいずれかにおけるシステイン残基にカップリングした20kDa mPEG-マレイミド(NOF社、Japan)で修飾した。結果として生じた粗モノペグ化ペプチドを、カチオン交換カラムで精製した。ペグ化ペプチドを含有する画分をプールし、伝導率が安定するまで0.9%塩化ナトリウムを用いて透析濾過した(diafilter)(5,000DaのNMWLを有するポリエーテルサルフォン(polyethersulfane)(PES)を用いた)。精製されたペグ化ペプチドをMALDI-MS及びRP-UPLCによって分析して、これらの修飾ペプチドのアイデンティティ及び純度(少なくとも97%)を決定した。修飾されていないペプチド(ペグ化されていないペプチド)がないことをSDS-PAGEによって確認した。ペグ化されたペプチド濃度をUVによって決定した。
【０１５５】
各ペプチドを、オステオカルシンタンパク質合成の刺激によって査定される、18〜21日間隔にわたる骨芽細胞の分化を刺激するその能力を測定する生物学的アッセイにおいて試験した。MC-3T3 E1クローン4(CL4)骨芽細胞をATCC(Manassas、VA、USA)から入手した。細胞を、10%胎仔ウシ血清(FBS;Thermo Fisher Scientific社、Pittsburgh、PA、USA)を含有するα-MEM中で培養した。コンフルエント後、試験ペプチド(2μg/mL)の有無で、10%FBS+50μg/mLアスコルビン酸及び4mMβ-グリセロールリン酸を含有する分化培地(DM)に培地を変えた。試験ペプチドの有無で、新鮮なDMを72時間ごとに適用した。細胞単層を、改変した放射性免疫沈降アッセイ(RIPA)バッファー中で溶解した。溶解物中の総細胞タンパク質を、BCA(Thermo Fisher Scientific社、Rockford、IL、USA)を用いて決定した。細胞タンパク質を、SDS-PAGEゲルで分離し、分析のためにPVDF膜に転写する。オステオカルシン検出を、抗オステオカルシン抗体を1:200希釈(Santa Cruz Biotechnology社、Santa Cruz、CA、USA)で用いて実施し、増強化学発光(Thermo Fisher Scientific社、Rockford、IL、USA)を用いて可視化した。
【０１５６】
これらの実験において、HBD1(3〜11)、HBD1(1〜13)、又はHBD1(2〜11)とポリエチレングリコール(PEG)鎖との抱合の効果を検討した。ペグ化ペプチドのそれぞれを合成し、抱合し、インビトロ骨芽細胞分化アッセイで試験した。Table 17(表17)に示されるように、ペプチドのN末端側におけるPEG20でのペプチド(9、10、又は13アミノ酸長)のペグ化は、親非抱合ペプチドHBD1(1〜13)のものと同程度の活性を有する化合物を生み出した。興味深いことに、13アミノ酸ペプチドのHBD1(1〜13)又は10アミノ酸ペプチドのHBD1(2〜11)のC末端におけるPEG20の抱合は、インビトロの生物学的効力を増加させるように見えた。
【０１５７】
【表１７】
2020506237.tif 000020
【０１５８】
結論として、本開示のペプチドのペグ化は、インビトロの生物学的活性を保存する又は増強すると同時に、薬物動態プロファイルを改善する適切な抱合法であり得る。
【０１５９】
(実施例7)
インビトロ骨芽細胞分化の間のオステオカルシン発現に対する、アシル化HBD1断片類似体の効果
Fmoc(9-フルオレニルメチルオキシカルボニル)戦略を用いた固相ペプチド合成(SPPS)によって、ペプチド化学における標準的製造過程に従い、ペプチドを製造した(Merrifield, R.B. Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc. 1963、85、2149-2154)。ペプチドのアイデンティティをLC-MSによって検証した。ペプチドの純度(少なくとも95%)及び正味ペプチド含有量を、それぞれRP-UPLC及び元素分析によって決定した。
【０１６０】
各アシル化ペプチドを、オステオカルシンタンパク質合成の刺激によって査定される、18〜21日間隔にわたる骨芽細胞の分化を刺激するその能力を測定する生物学的アッセイにおいて試験した。MC-3T3 E1クローン4(CL4)骨芽細胞をATCC(Manassas、VA、USA)から入手した。細胞を、10%胎仔ウシ血清(FBS;Thermo Fisher Scientific社、Pittsburgh、PA、USA)を含有するα-MEM中で培養した。コンフルエント後、試験ペプチド(1μg/L)の有無で、10%FBS+50μg/mLアスコルビン酸及び4mMβ-グリセロールリン酸を含有する分化培地(DM)に培地を変えた。試験ペプチドの有無で、新鮮なDMを72時間ごとに適用した。細胞単層を、改変した放射性免疫沈降アッセイ(RIPA)バッファー中で溶解した。溶解物中の総細胞タンパク質を、BCA(Thermo Fisher Scientific社、Rockford、IL、USA)を用いて決定した。細胞タンパク質を、SDS-PAGEゲルで分離し、分析のためにPVDF膜に転写する。オステオカルシン検出を、抗オステオカルシン抗体を1:200希釈(Santa Cruz Biotechnology社、Santa Cruz、CA、USA)で用いて実施し、増強化学発光(Thermo Fisher Scientific社、Rockford、IL、USA)を用いて可視化した。
【０１６１】
これらの実験において、HBD1(3〜11)ペプチド又はHBD1(2〜11)ペプチドと様々な長さのアシル鎖との抱合の効果を検討した。アシル化ペプチドのそれぞれを合成し、インビトロ骨芽細胞分化アッセイで試験した。Table 18(表18)に示されるように、ペプチドのN末端側における14〜20個の炭素鎖(C14〜C20)でのペプチド(9又は10アミノ酸長)のアシル化は、親非アシル化ペプチド(HBD1(3〜11)及びHBD1(2〜11))のものと同程度の活性を有する化合物を生み出した。C末端端におけるアシル化は、インビトロの生物学的活性を変化させないように見えた。
【０１６２】
【表１８】
2020506237.tif 000021
【０１６３】
別個の実験において、環化の効果を、HBD1(3〜11)ペプチドに対して検討した。環状HBD1(3〜11)を合成し、インビトロ骨芽細胞分化アッセイで試験した。環化は、インビトロの生物学的活性を変化させないように見えた。
【０１６４】
結論として、本開示のペプチドのアシル化又は環化は、インビトロの生物学的活性を保存すると同時に、薬物動態プロファイルを改善する適切な方法であり得る。
【０１６５】
(実施例8)
インビトロ骨芽細胞分化の間のオステオカルシン発現に対する、様々な用量のHBD1断片類似体の効果
Fmoc(9-フルオレニルメチルオキシカルボニル)戦略を用いた固相ペプチド合成(SPPS)によって、ペプチド化学における標準的製造過程に従い、ペプチドを製造した(Merrifield, R.B. Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc. 1963、85、2149-2154)。ペプチドのアイデンティティをLC-MSによって検証した。ペプチドの純度(少なくとも95%)及び正味ペプチド含有量を、それぞれRP-HPLC及び元素分析によって決定した。
【０１６６】
ペプチドを、オステオカルシンタンパク質合成の刺激によって査定される、18日間隔にわたる骨芽細胞の分化を刺激するそれらの能力を測定する生物学的アッセイにおいて、種々の濃度で試験した。MC-3T3 E1クローン4(CL4)骨芽細胞をATCC(Manassas、VA、USA)から入手した。細胞を、10%胎仔ウシ血清(FBS;Thermo Fisher Scientific社、Pittsburgh、PA、USA)を含有するα-MEM中で培養した。コンフルエント後、上昇する用量のペプチドの有無で、10%FBS+50μg/mLアスコルビン酸及び4mMβ-グリセロールリン酸を含有する分化培地(DM)に培地を変えた。ペプチドの有無で、新鮮なDMを72時間ごとに適用した。細胞単層を、改変した放射性免疫沈降アッセイ(RIPA)バッファー中で溶解した。溶解物中の総細胞タンパク質を、BCA(Thermo Fisher Scientific社、Rockford、IL、USA)を用いて決定した。細胞タンパク質を、SDS-PAGEゲルで分離し、分析のためにPVDF膜に転写する。オステオカルシン検出を、抗オステオカルシン抗体を1:200希釈(Santa Cruz Biotechnology社、Santa Cruz、CA、USA)で用いて実施し、増強化学発光(Thermo Fisher Scientific社、Rockford、IL、USA)を用いて可視化した。この実験の結果は、下記のTable 19(表19)及びTable 20(表20)に要約されている。
【０１６７】
この実験において、Table 19(表19)、Table 20(表20)、及びTable 21(表21)において識別される、アシル化HBD1(3〜11)断片、C末端にアミノ酸置換を有するHBD1(3〜11)断片、並びにC末端にアミノ酸置換を有する切り取られたHBD1(3〜11)断片(すなわち、C末端にアミノ酸置換を有するHBD1(3〜10))を、骨芽細胞分化アッセイにおいていくつかの用量で試験した。結果は、これらのペプチドが用量依存的形式で骨芽細胞分化を改善し、試験した最も高い用量で高い効力を呈したことを示している。このことは、骨障害におけるアシル化HBD1(3〜11)の、HBD1(3〜11)のC末端類似体の、及びHBD1(3〜10)のC末端類似体の治療的潜在性を示唆する。
【０１６８】
【表１９】
2020506237.tif 000022
【０１６９】
【表２０】
2020506237.tif 000023
【０１７０】
【表２１】
2020506237.tif 000024
【０１７１】
(実施例9)
ヒト血漿中でのHBD1断片の安定性
Fmoc(9-フルオレニルメチルオキシカルボニル)戦略を用いた固相ペプチド合成(SPPS)によって、ペプチド化学における標準的製造過程に従い、HBD1(1〜13)、HBD1(3〜11)、環状HBD1(3〜11)、N末端にパルミチン酸(C16:0)を有するHBD1(1〜13)、N末端にパルミチン酸(C16:0)を有するHBD1(3〜11)、及びN末端にステアリン酸(C18:0)を有するHBD1(3〜11)ペプチドを製造した(Merrifield, R.B. Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc. 1963、85、2149-2154)。ペプチドのアイデンティティをLC-MSによって検証した。ペプチドの純度(少なくとも95%)及び正味ペプチド含有量を、それぞれRP-HPLC及び元素分析によって決定した。
【０１７２】
ペプチドを、予熱したヒトK2EDTA血漿(37℃で)中に1μg/mL(ペプチド骨格)でスパイクし、最高で48時間インキュベートした。血漿のアリコートを特異的な時点(スパイク後0、24、及び48時間)で抽出した。HBD1(1〜13)、N末端にパルミチン酸(C16:0)を有するHBD1(1〜13)、N末端にパルミチン酸(C16:0)を有するHBD1(3〜11)、及びN末端にステアリン酸(C18:0)を有するHBD1(3〜11)に関してはアセトニトリル:水(75:25、v/v)を用いて、又はHBD1(3〜11)及び環状HBD1(3〜11)に関してはアセトニトリル:水:ギ酸(75:25:0.1、v/v/v)を用いて抽出を実施した。各ペプチドに特異的な、発展したLC(C18逆相カラム)-陽イオンエレクトロスプレーMS/MS法を用いてペプチドを分析した。各時点におけるピーク面積を、t=0分の時点に対して獲得された値のパーセンテージとして表現した。結果はTable 22(表22)に提供されている。
【０１７３】
【表２２】
2020506237.tif 000025
【０１７４】
上記で提供されるデータは、HBD1(1〜13)が、ヒト血漿中で著しく分解されたことを示している(37℃での24及び48時間のインキュベーション後、それぞれ29%及び18%の残存する親ペプチド)。パルミチン酸を有するHBD1(1〜13)のN末端アシル化(配列番号78)は、親ペプチドの安定性を著しく改善した(37℃での48時間のインキュベーション後、52%対18%の残存する親ペプチド)。この結果は、N末端におけるアシル化が、ヒト血漿中でのペプチダーゼ分解からこのペプチドを保護することを示す。驚くべきことに、より短い9アミノ酸ペプチドのHBD1(3〜11)はヒト血漿中で非常に安定であり、37℃での24及び48時間のインキュベーション後に微量の分解のみが検出された(それぞれ92%及び87%の残存する親ペプチド)。環状及びN末端アシル化HBD1(3〜11)(パルミチン酸又はステアリン酸を有する)(それぞれ配列番号77、72、及び73)は、対応する非抱合直鎖状ペプチドHBD1(3〜11)のものと同様の血漿安定性プロファイルを有した。
【０１７５】
本明細書において以前に述べられたように、ヒト血漿中でのペプチドの分解が治療剤としてのそれらの使用を限定する主要な課題であることは、ペプチドを開発する技術分野における当業者によって知られている。ヒト血漿中での分解は、治療的曝露、ゆえに効能を著しく減少させる。この背景において、9アミノ酸長配列のHBD1(3〜11)が、ヒト血漿中で安定でもあり生物学的に活性でもあるという予想外の観察結果(実施例1からの結果を参照されたい)は、以前に記載された13アミノ酸長ペプチドのHBD1(1〜13)に対して関連する改善である。
【０１７６】
加えて、13及び9アミノ酸ペプチドの環化及びN末端アシル化の両方とも、生物学的に活性でもありヒト血漿中で安定でもある新たな化合物を生成させた。
【０１７７】
(実施例10)
静脈内及び皮下注射後の雄性Sprague-DawleyラットにおけるHBD1断片の薬物動態
Fmoc(9-フルオレニルメチルオキシカルボニル)戦略を用いた固相ペプチド合成(SPPS)によって、ペプチド化学における標準的製造過程に従い、HBD1(1〜13)、HBD1(3〜11)、環状HBD1(3〜11)、N末端にパルミチン酸(C16:0)を有するHBD1(3〜11)、及びN末端にステアリン酸(C18:0)を有するHBD1(3〜11)を製造した(Merrifield, R.B. Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc. 1963、85、2149-2154)。ペプチドのアイデンティティをLC-MSによって検証した。ペプチドの純度(少なくとも95%)及び正味ペプチド含有量を、それぞれRP-HPLC及び元素分析によって決定した。
【０１７８】
ペプチドを生理食塩水(0.9%NaCl)中で復元した。1群あたり3匹の雄性Sprague-Dawleyを用いた。静脈内用量を、1μmol正味ペプチド/kgの用量で外側尾静脈に投与した。皮下用量を、また1μmol正味ペプチド/kgの用量で各動物の右脇腹に投与した。投薬後、連続する全血サンプル(およそ0.25mL)を、K2EDTA処理した容器内に、外側尾静脈から回収した。各血液サンプル回収後、サンプルを4℃で冷却ブロック内に置いた。静脈内注射に関しては、投薬前、次いで投薬後2、5、15、及び30分、次いで1、2、4、6及び8、及び24時間の時点で、並びに皮下注射に関しては、投薬後15及び30分、次いで1、2、4、6、8、及び24時間の時点で、サンプルを回収した。
【０１７９】
血液サンプルを4℃にて2分間10000×gで遠心分離し、結果として生じた血漿を、完全に清潔な標識されたチューブ内に吸引で取り出した。吸引後、血漿サンプルを即座に冷凍し、次いで-80℃で保管した。実施例9に記載されるように、ペプチドを抽出し分析した。これらの方法の定量化の限度は、環状HBD1(3〜11)及びHBD1(3〜11)に関しては0.001nmol/mLであり、HBD1(1〜13)に関しては0.003nmol/mLであった。定量化のこれらの限度を下回るすべての値をゼロと見なした。
【０１８０】
HBD1(1〜13)及びHBD1(3〜11)を投薬された動物は、いずれかの投薬経路による投与後に定量化可能な曝露を示さず、したがって、これら2種のペプチドに関して、薬物動態パラメーターは算出され得なかった。興味深いことに、図1及び図2に示されるように、環状HBD1(3〜11)投与は、静脈内及び皮下投与後のそれぞれ最高で8時間及び4時間の間、検出可能な血漿レベルをもたらし、N末端にパルミチン酸(C16:0)を有するすべてのHBD1(3〜11)及びN末端にステアリン酸(C18:0)を有するHBD1(3〜11)を投薬された動物は、いずれかの投薬経路によって最高で8時間曝露を示した。図1及び図2は、それぞれ、Sprague-Dawleyラットにおける単回の静脈内及び皮下注射後の、環状HBD1(3〜11)、N末端にパルミチン酸(C16:0)を有するHBD1(3〜11)、及びN末端にステアリン酸(C18:0)を有するHBD1の薬物動態プロファイルを示したグラフを図解している。個々の値は、3匹の異なるラットに関して獲得された値の平均を表す。静脈内(iv)及び皮下(sc)注射後の、環状HBD1(3〜11)、N末端にパルミチン酸(C16:0)を有するHBD1(3〜11)、及びN末端にステアリン酸(C18:0)を有するHBD1(3〜11)に関する薬物動態パラメーターは、Table 23(表23)に要約されている。
【０１８１】
【表２３】
2020506237.tif 000026
【０１８２】
上記で提供されるデータは、環状HBD1(3〜11)が、注射の皮下部位から血液へ急速に拡散することを示している。興味深いことに、N末端にステアリン酸(C18:0)を有するHBD1(3〜11)は、N末端にパルミチン酸(C16:0)を有するHBD1(3〜11)及び環状HBD1(3〜11)よりも、ラットにおいてより良好な静脈内及び皮下曝露、並びに生体利用率を示した(それぞれ、iv注射に関しては9.28対4.46及び2.09h*nmol/mL、sc注射に関しては4.81対1.57又は0.99h*nmol/mL、並びに52対35及び48%)。
【０１８３】
結論として、これらの結果は、9アミノ酸長ペプチドの環化又はアシル化が、直鎖状ペプチドHBD1(3〜11)と比較した場合に、改善した薬物動態特性を有するペプチド(すなわち、環状HBD1(3〜11)、又はN末端にパルミチン酸(C16:0)を有するHBD1(3〜11)、及びN末端にステアリン酸(C18:0)を有するHBD1(3〜11))を生成したことを示している。本開示のペプチドの環化又はアシル化は、それらの治療的潜在性を改善させ得る。
【０１８４】
(実施例11)
皮下注射後の雄性Sprague-Dawleyラットにおけるアシル化HBD-1断片類似体の薬物動態
Fmoc(9-フルオレニルメチルオキシカルボニル)戦略を用いた固相ペプチド合成(SPPS)によって、ペプチド化学における標準的製造過程に従い、N末端にパルミチン酸(C16:0)を有するHBD1(1〜13)、N末端にパルミチン酸(C16:0)を有するHBD1(3〜11)、N末端にミリスチン酸(14:0)を有するHBD1(3〜11)、N末端にステアリン酸(C18:0)を有するHBD1(3〜11)、N末端にアラキジン酸(C20:0)を有するHBD1(3〜11)、N末端にパルミチン二酸(palmitic diacid)(C16:0-二酸)を有するHBD1(3〜11)、C末端にパルミチン酸(C16:0)を有するHBD1(3〜11)を製造した(Merrifield, R.B. Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc. 1963、85、2149-2154)。ペプチドのアイデンティティをLC-MSによって検証した。ペプチドの純度(少なくとも95%)及び正味ペプチド含有量を、それぞれRP-HPLC及び元素分析によって決定した。
【０１８５】
ペプチドを生理食塩水(0.9%NaCl)中で復元した。1群あたり3匹の雄性Sprague-Dawleyラット(大体6週齢)を用いた。皮下用量を、1μmol正味ペプチド/kgの標的用量レベルで各動物の右脇腹に投与した。投薬後、連続する全血サンプル(およそ0.3mL)を、K2EDTA処理した容器内に、後方眼窩洞(retro-orbital sinus)から回収した。各血液サンプル回収後、サンプルを4℃で冷却ブロック内に置いた。皮下注射に関しては、投薬前、次いで投薬後15及び30分、次いで1、2、4、6、8、及び24時間の時点で、サンプルを回収した。血液サンプルを4℃にて10分間3500×rpmで遠心分離し、結果として生じた血漿を、完全に清潔な標識されたチューブ内に吸引で取り出した。吸引後、血漿サンプルを即座に冷凍し、次いで-80℃で保管した。実施例9に記載されるように、ペプチドをアセトニトリル:水(75:25、v/v)で抽出し、発展したLC-MS/MS法を用いて分析した。これらの方法の検出の限度は、N末端にパルミチン酸(C16:0)を有するHBD1(1〜13)に関しては0.003nmol/mL、N末端にパルミチン酸(C16:0)を有するHBD1(3〜11)に関しては0.0008nmol/mL、N末端にステアリン酸(C18:0)を有するHBD1(3〜11)に関しては0.0070nmol/mL、及びN末端にミリスチン酸(C14:0)を有するHBD1(3〜11)、N末端にアラキジン酸(C20:0)を有するHBD1(3〜11)、N末端にパルミチン二酸(C16:0-二酸)を有するHBD1(3〜11)、C末端にパルミチン酸(C16:0)を有するHBD1(3〜11)に関しては0.0015nmol/mLである。定量化のこれらの限度を下回るすべての値をゼロと見なした。皮下注射後の各ペプチドに関する薬物動態パラメーターは、Table 24(表24)に要約されている。これらのペプチドの一部についてのPKプロファイルは、図3に示されている。
【０１８６】
興味深いことに、Table 24(表24)に示されるように、ペプチド投与は、どのアシル化ペプチドが試験されても、皮下投与後の最高で8時間の間、有意な血漿レベルをもたらした。
【０１８７】
【表２４】
2020506237.tif 000027
【０１８８】
Table 24(表24)及び図3からのデータは、N末端にステアリン酸(C18:0)を有するHBD1(3〜11)に関して、より高いペプチド曝露が獲得されたことを示している。ペプチドに抱合したより長いアシル鎖の使用は、おそらく血清タンパク質(例えば、アルブミン)とのより強い相互作用に起因して、対応するアシル化ペプチドの曝露を増加させる。しかし興味深いことに、N末端にアラキジン酸(C20:0)を有するHBD1(3〜11)は、ことによると皮下注射後のこのペプチドのより低い生体利用率に起因して、N末端にステアリン酸(C18:0)を有するHBD1(3〜11)よりも低い曝露を有する。
【０１８９】
結論として、N末端にステアリン酸(C18:0)を有するHBD1(3〜11)は、ヒト血漿中で生物学的に活性で安定しており、非アシル化HBD1ペプチド及び他のアシル化ペプチドに対して増強されるラットにおける生体利用率及び曝露を有する。ゆえに、N末端にステアリン酸(C18:0)を有するHBD1(3〜11)は、例えば1日1回の皮下投与等の投与の適切なレジメンにより、骨同化薬としてのヒトにおける潜在的薬物候補であり得る。
【０１９０】
(実施例12)
静脈内及び皮下注射後のGottingenミニブタにおけるHBD1断片の薬物動態
Fmoc(9-フルオレニルメチルオキシカルボニル)戦略を用いた固相ペプチド合成(SPPS)によって、ペプチド化学における標準的製造過程に従い、N末端にステアリン酸(C18:0)を有するHBD1(3〜11)を製造した(Merrifield, R.B. Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc. 1963、85、2149-2154)。ペプチドのアイデンティティをLC-MSによって検証した。純度(少なくとも95%)及び正味ペプチド含有量を、それぞれRP-HPLC及び元素分析によって決定した。
【０１９１】
ペプチドを生理食塩水(0.9%NaCl)中で復元した。1群あたり3匹のGottingenミニブタ(大体8〜10ヶ月齢)を用いた。静脈内用量を、0.5μmol正味ペプチド/kgの用量で耳静脈に投与した。皮下用量を、また0.5μmol正味ペプチド/kgの用量で各動物の右脇腹に投与した。投薬後、連続する全血サンプル(およそ0.25mL)を、K2EDTA処理した容器内に、頸静脈から回収した。各血液サンプル回収後、サンプルを4℃で冷却ブロック内に置いた。静脈内注射に関しては、投薬前、次いで投薬後5及び30分、次いで1、2、4、8、25、48、72、及び96時間の時点で、並びに皮下注射に関しては、投薬後15及び30分、次いで1、2、4、8、25、48、72、及び96時間の時点で、サンプルを回収した。
【０１９２】
血液サンプルを4℃にて2分間10000×gで遠心分離し、結果として生じた血漿を、完全に清潔な標識されたチューブ内に吸引で取り出した。吸引後、血漿サンプルを即座に冷凍し、次いで-80℃で保管した。実施例9に記載されるように、ペプチド抽出及び分析を実施した。この方法の定量化の限度は0.0015nmol/mLである。定量化のこの限度を下回るすべての値をゼロと見なす。結果は図4に提示されている。
【０１９３】
Gottingenミニブタへのペプチドの0.5μmol/kgの投与後、静脈内及び皮下注射後に、それぞれ、6.27及び0.29nmol/mLの平均を有する最大濃度(Cmax)、0.083及び4時間の中央値を有する最大濃度に対する投薬後時間(Tmax)、並びに3.752及び3.072h*nmol/mLの平均総曝露(AUC0-t)値が観察された。i.v.と比べた平均の算出された皮下生体利用率は83.1%であった。
【０１９４】
興味深いことに、N末端にステアリン酸(C18:0)を有するすべてのHBD1(3〜11)を投薬されたGottingenミニブタは、ラットにおいてよりも長い曝露である(実施例9を参照)、皮下投与後に最大で25時間曝露を示した。この結果は、ヒトにおいてN末端にステアリン酸(C18:0)を有するHBD1(3〜11)の毎日の皮下投薬が、該産物の少なくとも丸1日の曝露に十分であろうことを強く示唆する。
【０１９５】
(実施例13)
HBD1断片は卵巣切除ラットにおいて骨形成を誘導する
Fmoc(9-フルオレニルメチルオキシカルボニル)戦略を用いた固相ペプチド合成(SPPS)によって、ペプチド化学における標準的製造過程に従い、N末端にステアリン酸(C18:0)を有するHBD1(3〜11)を製造した(Merrifield, R.B. Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc. 1963、85、2149-2154)。ペプチドのアイデンティティをLC-MSによって検証した。純度(少なくとも95%)及び正味ペプチド含有量を、それぞれRP-HPLC及び元素分析によって決定した。
【０１９６】
骨に対するN末端にステアリン酸(C18:0)を有するHBD1(3〜11)類似体の3回の投薬の効果を、ヒト骨粗鬆症、特に閉経後骨粗鬆症の認められたモデルである卵巣切除(OVX)ラットにおいてインビボで試験した。各群は、調査の生存期の開始時に4ヶ月齢である10匹の雌性Sprague-Dawleyラットを含んだ。処理は、OVX手術の6週間後に始まり、更に6週間続いた。手術前に、体重、及びNorland Stratec XCT Research SA装置(Norland Stratec Medizintechnik社、Birkenfeld、Germany)からの末梢骨定量的コンピューター断層撮影法(pQCT)によって測定される脛骨骨幹端の骨ミネラル密度(BMD)に従って、群をランダム化した。
【０１９７】
ペプチドを生理食塩溶液(0.9%NaCl)中で復元し、1mL/kgの体積中0.8mg/kg(低)、1.6mg/kg(中)、又は3.2mg/kg(高)の用量で1日2回皮下投与した。対照群には、s.c.投与によって生理食塩水を1日2回投与した。ラットを1週間に1回計量し、投与される投薬液の体積をそれに従って調整した。
【０１９８】
骨体積、骨断面寸法、及び骨微細構造を測定するために、SkyScan 1072又は1172高分解能スキャナー(Bruker microCT社、Kontich、Belgium)を用いた高分解能マイクロコンピューター断層撮影法(μCT)測定を、処理期間の終了時に右脛骨近位においてエクスビボで実施した。図5A、図5B、及び図5Cは、以下の選択パラメーター:骨体積分率(BV/TV;%)、骨梁数(Tb.N;mm-1)、及び連結密度(Conn.D;mm-3)に関する、OVX動物のN末端にステアリン酸(C18:0)を有するHBD1(3〜11)群からのパーセント増加を示している。
【０１９９】
骨生体力学特性を、Instron 3343生体力学検査システム(Instron社、Norwood、MA、USA)を用いた圧縮試験によって判定した。生体力学試験を、処理期間の終了時に、腰椎(圧縮試験)において及び大腿骨頸部(片持梁曲げ試験)においてエクスビボで実施した。図6Aは、以下の選択パラメーター:最大負荷(N)、最大負荷におけるエネルギー吸収(mJ)、及び最大負荷における圧力(MPa)に関する、腰椎椎体における圧縮試験での、高用量のN末端にステアリン酸(C18:0)を有するHBD1(3〜11)で処理された群におけるOVX動物からのパーセント増加を示している。図6Bは、以下の選択パラメーター:最大負荷点における負荷(N)及びエネルギー(mJ);破断点における負荷(N)及びエネルギー(mJ)に関する、大腿骨頸部における片持梁曲げ試験での、高用量のN末端にステアリン酸(C18:0)を有するHBD1(3〜11)で処理された群におけるOVX動物からのパーセント増加を図解している。
【０２００】
結果は、N末端にステアリン酸(C18:0)を有するHBD1(3〜11)が、卵巣切除ラットにおいて骨に対する同化作用を有することを示している。特に、それは、図5A、図5B、及び図5Cに提示されるように、脛骨骨幹端におけるパーセント骨体積分率(BV/TV)、骨梁数(Tb.N)、及び連結密度(Conn.D)を用量依存的様式で増加させた。加えて、3.2mg/kg BID用量のN末端にステアリン酸(C18:0)を有するHBD1(3〜11)は、図6A及び図6Bに提示される腰椎(lumar vertebrae)(特に、最大負荷、最大負荷におけるエネルギー吸収、及び最大負荷における圧力)及び大腿骨頸部(特に、破断点における負荷)の改善された生体力学特性によって示されるように、骨強度を増加させた。
【０２０１】
結論として、N末端にステアリン酸(C18:0)を有するHBD1(3〜11)及び本開示のペプチドは、骨形成を誘導し得る。このことは、骨粗鬆症、骨形成不全症、及び損なわれた骨代謝を伴う他の障害を含めたいくつかの骨関連障害における治療的潜在性を暗示し得る。
【０２０２】
本明細書において報告されるデータは、単に本開示を例示するために与えられるものであり、その限定をなすものとして見なされ得ないことが理解される。
【０２０３】
本開示は、その具体的な実施形態と関連付けて記載されているものの、それはさらなる改変が可能であり、本出願は、概して本開示の原則に従い、本開示が関連する技術分野のうちの公知の又は慣習的な実践に入るような、及び上記に記載の必須の特質に適用され得るような、及び添付の特許請求の範囲に従うような、本開示からの逸脱を含む、本開示の任意の変形、使用、又は適合を網羅することを意図されることが理解されるであろう。
【０２０４】
本明細書において言及されるすべての公開文書は、参照により本明細書に組み込まれている。
【０２０５】
文献目録
2020506237.tif 000028
【図１】
2020506237.tif 000029
【図２】
2020506237.tif 000030
【図３】
2020506237.tif 000031
【図４】
2020506237.tif 000032
【図５Ａ】
2020506237.tif 000033
【図５Ｂ】
2020506237.tif 000034
【図５Ｃ】
2020506237.tif 000035
【図６Ａ】
2020506237.tif 000036
【図６Ｂ】
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【配列表】
2020506237000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年10月8日(2019.10.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号1に記載のヘパリン結合ドメイン(HBD)の断片からなる単離されたペプチドであって、前記断片は6〜9アミノ酸長であり、配列番号14に記載のアミノ酸配列GLEEPK又はその類似体を含む、単離されたペプチド。
【請求項２】
HBDはHBD1である、請求項1に記載の単離されたペプチド。
【請求項３】
翻訳後修飾されている、請求項2に記載の単離されたペプチド。
【請求項４】
翻訳後修飾はペグ化である、請求項3に記載の単離されたペプチド。
【請求項５】
翻訳後修飾はアシル化である、請求項3に記載の単離されたペプチド。
【請求項６】
脂肪酸アシル化は、単離されたペプチドに、ラウリン酸(C12:0)、トリデシル酸(C13:0)、ミリスチン酸(C14:0)、ペンタデシル酸(C15:0)、パルミチン酸(C16:0)、マルガリン酸(C17:0)、ステアリン酸(C18:0)、ノナデシル酸(C19:0)、アラキドン酸(arachidinic acid)(C20:0)、ヘンイコシル酸(C21:0)、ベヘン酸(C22:0)、トリコシル酸(C23:0)、及びリグノセリン酸(C24:0)のうちの1つ又は複数をカップリングさせることによるものである、請求項5に記載の単離されたペプチド。
【請求項７】
配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号17、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号106、配列番号107、配列番号108、配列番号109、配列番号110、配列番号111、配列番号112、配列番号113、及びその任意の類似体から選択されるアミノ酸配列からなる単離されたペプチド。
【請求項８】
配列番号73に記載のアミノ酸配列又はその類似体からなる単離されたペプチド。
【請求項９】
それを必要とする対象における骨障害の予防又は治療のための、請求項1から6のいずれか一項に記載の単離されたペプチドの使用。
【請求項１０】
請求項1から6のいずれか一項に記載の単離されたペプチドを薬学的に許容される担体と組み合わせて含む薬学的組成物。
【国際調査報告】
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2020506237.tif 000039
2020506237.tif 000040
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