(57)【要約】本発明は、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する抗体を用いることによってＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する細胞中に抗癌剤を送達する方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する細胞中に抗癌剤を送達する方法であって、前記細胞による前記抗癌剤の取り込みを増大させるのに有効な量及び濃度の前記ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する少なくとも１種の多量体抗体、その機能的断片又は誘導体と前記細胞を接触させるステップを含み、前記抗体が細胞膜内の孔形成などの透過性欠陥を生じる、前記方法。
【請求項２】
（ｉ）少なくとも１種の抗癌剤及び（ｉｉ）ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する少なくとも１種の多量体抗体、その機能的断片又は誘導体を含む、前記ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する細胞中への抗癌剤の送達のための組成物であって、前記ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する前記少なくとも１種の抗体が、腫瘍細胞による前記少なくとも１種の抗癌剤の取り込みを増強する、前記組成物。
【請求項３】
癌を処置及び／又は防止するためにＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する細胞中への少なくとも１種の抗癌剤の選択的送達に使用される、前記ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する多量体抗体、その機能的断片又は誘導体。
【請求項４】
前記ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する前記抗体、その機能的断片又は誘導体が、ａ）アミノ酸配列配列番号１の軽鎖可変領域（ＶＬ）ポリペプチド及びｂ）アミノ酸配列配列番号２の重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、請求項２に記載の組成物、又は請求項３に記載の使用のための抗体。
【請求項５】
前記ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する前記抗体、その機能的断片又は誘導体が、
配列番号３９及び配列番号４０を含む若しくはそれからなる群において選択されたアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）ポリペプチド、並びに／又は
配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０及び配列番号５１を含む若しくはそれからなる群において選択されたアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＶＨ）
を含む、請求項２に記載の組成物、又は請求項３に記載の使用のための抗体。
【請求項６】
前記ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する前記抗体の前記機能的断片が重鎖及び軽鎖可変領域の単鎖断片（ｓｃＦｖ）の形である、請求項２に記載の組成物、又は請求項３に記載の使用のための抗体。
【請求項７】
前記ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する前記抗体の機能的断片が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の単鎖部分である、請求項２に記載の組成物、又は請求項３に記載の使用のための抗体。
【請求項８】
前記ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する前記抗体、その機能的断片又は誘導体が、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９及び配列番号４０を含む若しくはそれからなる群において選択されたアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）ポリペプチド、並びに／又は配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０及び配列番号５１を含む若しくはそれからなる群において選択されたアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、請求項２に記載の組成物、又は請求項３に記載の使用のための抗体。
【請求項９】
前記ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する前記少なくとも１種の抗体、その機能的断片又は誘導体が、
ａ）アミノ酸配列配列番号１４の軽鎖可変領域（ＶＬ）ポリペプチド、及び
ｂ）アミノ酸配列配列番号１５の重鎖可変領域（ＶＨ）
を含む、請求項２に記載の組成物、又は請求項３に記載の使用のための抗体。
【請求項１０】
前記ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する前記少なくとも１種の抗体、その機能的断片又は誘導体が、
ａ）アミノ酸配列配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８の３つの重鎖相補領域（ＣＤＲ）と免疫グロブリン重鎖由来の重鎖フレームワーク配列とを含む重鎖、並びに
ｂ）アミノ酸配列配列番号１９、配列番号２０及び配列番号２１の３つの軽鎖相補領域（ＣＤＲ）と免疫グロブリン軽鎖由来の軽鎖フレームワーク配列とを含む軽鎖
を含む、請求項２に記載の組成物、又は請求項３に記載の使用のための抗体。
【請求項１１】
前記抗体が免疫複合体である、請求項２に記載の組成物、又は請求項３に記載の使用のための抗体。
【請求項１２】
前記少なくとも１種の抗癌剤が、アルキル化剤、代謝拮抗物質、抗腫瘍抗体、抗腫瘍性抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、有糸分裂阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、コルチコステロイド、ホルモン又はホルモン様薬物、サイトカイン、ヌクレオシド類似体、核酸、こうした二本鎖合成短鎖ＲＮＡ分子（ｍｉＲＮＡ）又は合成ＤＮＡ／ＲＮＡ様オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）などの抗癌剤を含む又はそれからなる群から選択される、請求項２に記載の組成物、又は請求項３に記載の使用のための抗体。
【請求項１３】
前記少なくとも１種の抗癌剤が癌細胞の細胞膜を単独で通過できない、請求項２に記載の組成物、又は請求項３に記載の使用のための抗体。
【請求項１４】
前記ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する癌が、神経芽細胞腫、神経膠腫、網膜芽細胞腫、腫瘍のユーイングファミリー、肉腫（すなわち、横紋筋肉腫、骨肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫及び線維肉腫）、小細胞肺癌、乳癌、黒色腫、転移性腎癌、頭頚部癌並びに血液癌（すなわち、白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫及び骨髄腫）を含む又はそれからなる群から選択される、請求項３から１３のいずれか一項に記載の使用のための抗体。
【請求項１５】
前記少なくとも１種の抗癌剤が、シクロホスファミド、ドキソルビシン、トポテカン、イリノテカン、テモゾロマイド（ＴＭＺ）、レチノイン酸（ＲＡ）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フルダラビン、カルボプラチン及びシスプラチンを含む又はそれからなる群から選択される、請求項１４に記載の使用のための抗体。
【請求項１６】
前記少なくとも１種の抗癌剤がテモゾロマイド、トポテカン、イリノテカン、フルダラビン、シクロホスファミド又はそれらの混合物であり、前記ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する前記癌が神経芽細胞腫である、請求項３から１５のいずれか一項に記載の使用のための抗体。
【請求項１７】
抗癌剤を含むＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する癌の処置の有効性を高める方法であって、（ｉ）分子量１００ダルトン〜２００，０００ダルトンの少なくとも１種の抗癌剤と、（ｉｉ）前記ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する少なくとも１種の抗体、その機能的断片又は誘導体と、場合によっては（ｉｉｉ）薬学的に許容される担体とを含む有効量の組成物をそれを必要とする患者に投与するステップを含む、前記方法。
【請求項１８】
ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する癌に罹患した患者における抗癌剤に対する感受性を高める方法であって、（ｉ）分子量１００ダルトン〜２００，０００ダルトンの少なくとも１種の抗癌剤と、（ｉｉ）前記ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する少なくとも１種の抗体、その機能的断片又は誘導体と、場合によっては（ｉｉｉ）薬学的に許容される担体とを含む有効量の組成物をそれを必要とする患者に投与するステップを含む、前記方法。
【請求項１９】
ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する癌に罹患した患者における抗癌剤に対して抵抗性の癌の発生を防止又は遅延させる方法であって、（ｉ）分子量１００ダルトン〜２００，０００ダルトンの少なくとも１種の抗癌剤と、（ｉｉ）前記ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する少なくとも１種の抗体、その機能的断片又は誘導体と、場合によっては（ｉｉｉ）薬学的に許容される担体とを含む有効量の組成物をそれを必要とする患者に投与するステップを含む、前記方法。
【請求項２０】
（ｉ）分子量１００ダルトン〜２００，０００ダルトンの少なくとも１種の抗癌剤と（ｉｉ）ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する少なくとも１種の多量体抗体、その機能的断片又は誘導体との相乗的組合せを特定するインビトロ／エクスビボ方法であって、
ａ）分子量１００ダルトン〜２００，０００ダルトンの少なくとも１種の抗癌剤と（ｉｉ）前記ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する少なくとも１種の抗体、その機能的断片又は誘導体とを含む組成物と一緒に、ＧＤ２ガングリオシドのＯアセチル化体を発現する原発腫瘍細胞又は癌細胞系細胞をインビトロでインキュベートするステップ、並びに
ｂ）Ｃｈｏｕ及びＴａｌａｌａｙによって開示された方法に従ってＣＩ５０指数を測定し、１未満のＣＩ５０が相乗作用を表すステップ
を含む、前記方法。
【請求項２１】
ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する癌の処置に適したキットであって、（ｉ）分子量１００ダルトン〜２００，０００ダルトンの少なくとも１種の抗癌剤と、（ｉｉ）前記ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する少なくとも１種の多量体抗体、その機能的断片又は誘導体と、場合によっては（ｉｉｉ）薬学的に許容される担体とを含む、前記キット。
【請求項２２】
ＧＤ２ガングリオシドのＯアセチル化体を発現する細胞において分子量１００ダルトン〜２００，０００ダルトンの抗癌剤の細胞内取り込みを増強するための、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する多量体抗体、その機能的断片又は誘導体の使用。
【請求項２３】
ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する癌に罹患した患者における難治性又は再発癌を処置する方法であって、（ｉ）分子量１００ダルトン〜２００，０００ダルトンの少なくとも１種の抗癌剤と、（ｉｉ）前記ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する少なくとも１種の多量体抗体、その機能的断片又は誘導体とを含む有効量の組成物をそれを必要とする患者に投与するステップを含み、前記癌が、アルキル化剤、代謝拮抗物質、抗腫瘍性抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、有糸分裂阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤及びヌクレオシド類似体からなる群から選択される１種以上の抗癌剤を含む第一選択の癌処置に対して難治性であり、又はその後に再発する、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本特許出願は、参照により本明細書に援用する２０１６年１２月５日に出願された欧州特許出願公開第１６００２５７６．３号の優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明は、抗癌剤と、癌細胞による前記抗癌剤の取り込みを増大させるＧＤ２ガングリオシドの特定のＯアセチル化体（すなわち、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシド）を認識する抗体とを含む組成物、並びにＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する細胞を特徴とする、特定の癌を処置、防止及び／又は管理する方法におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
細胞への抗癌剤の送達は、癌に対する治療手法の一中心的態様である。抗癌剤の生化学的性質は、その分子量、環境ｐＨ及びその親油性対親水性プロファイルに依拠する。
【０００４】
負に帯電した細胞膜を通過することは、抗癌剤を細胞に送達するための第１ステップである。ｐＨ勾配が動物腫瘍において生じることは現在十分証明されている。抗癌剤は水性媒体中でイオン化可能であるので、腫瘍細胞における酸性細胞外ｐＨは、弱い塩基性又は酸性の抗癌剤の活性を異なって変調する（非特許文献１）。溶液中、大部分の抗癌剤は、非イオン型とイオン型の両方として存在する。非イオン型抗癌剤は、通常、より脂溶性であり、細胞膜を通って容易に拡散することができる。それに対して、イオン型抗癌剤は低脂溶性であり、通常は生理学的基質に使用される輸送体に寄生せずに脂質膜を透過することができない。それで、このイオントラッピング機構によって、薬物蓄積を変え、化学療法効率をかなり調節することができる。
【０００５】
抗癌剤を癌細胞及び腫瘍に移送するのに直面する生物学的障壁を乗り越える能力は、毒性度と均衡が保たれなければならない。従来の抗癌剤の中でも、アルキル化剤、代謝拮抗物質又は抗腫瘍性抗生物質は、ＤＮＡ又はＲＮＡを直接的に損傷又は妨害して、癌細胞を成長及び増殖させない。トポイソメラーゼ阻害剤又は有糸分裂阻害剤などの他の薬物は、細胞周期に関与する酵素を特異的に標的にする。異なる薬剤又はホルモンも癌細胞を正常細胞に成熟させ、又は癌の増殖を遅くするのに使用される。ほぼすべての抗癌剤は有毒であり、化学療法は、激しい悪心、骨髄抑制、及び免疫抑制を含めて、重大な、しばしば危険な副作用を生じる。
【０００６】
さらに、従来の抗癌剤への曝露は、抗癌剤を組み合せて投与しても、化学療法の失敗及び腫瘍の進行を招く可能性がある。この現象は、既存の前駆細胞又は新生薬剤耐性クローンによることが多い。さらに、抗癌剤は、心臓若しくは神経損傷などの重大な副作用を生じる可能性があり、又は更により劇的に、薬物投与後数年で二次癌のリスクを高める可能性がある。
【０００７】
より最近では、標的遺伝子を高い効率及び特異性で発現停止させるＲＮＡ干渉の能力を利用して、ヒト細胞におけるＲＮＡを標的にした薬物が開発された（非特許文献２）。癌治療のために開発されたＲＮＡベースの療法は、二本鎖合成短鎖ＲＮＡ分子（ｍｉＲＮＡ）又は合成ＤＮＡ／ＲＮＡ様オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）の使用に依拠する。癌細胞の細胞膜を通るこれらの分子の移動は、それらの負電荷のためにかなり問題になる。この欠点は、オリゴヌクレオチド構造を化学的に改変することによって、並びに／又はウイルスベクター、生体適合性カチオン性ポリマー及びコポリマー、無機ナノ粒子、アテロコラーゲン及びリポソームを含めた送達系を使用することによって、減じることができる。しかし、これらの送達系は、ｍｉＲＮＡベースの治療法の薬物動態学的プロセスに影響し、毒性を有する可能性もある。さらに、送達系は、細胞型ごとにパラメータ最適化を必要とすることが多い。
【０００８】
したがって、癌細胞及び腫瘍における薬物取り込みの欠点を克服して、その治療可能性を改善し、毒性などのその副作用も抑制する、新しい組成物及び方法が必要とされる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】ＭＡＨＯＮＥＹら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．６６、ｐ：１２０７〜１２１８、２００３
【非特許文献２】ＢＡＲＡＴＡら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、ｖｏｌ．５０、ｐ：３５〜４７、２０１６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、ＧＤ２ガングリオシドのＯアセチル化体（すなわち、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシド）を特異的に標的にしたマウス治療抗体が、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する癌の処置に有益な効果を示すことを以前に立証した（欧州特許第２０７６５４２号Ｂ１）。
【００１１】
本発明者らは、今回、驚くべきことに、この抗体が、それ自体の抗癌活性に加えて、別の抗癌剤のアジュバントとして用いたときに癌を処置するのに有効であることを見いだした。それらは、より具体的には、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する癌に対する、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを特異的に標的にした抗体と種々の抗癌剤との併用治療の相乗効果を示し、抗癌剤の投与量、したがって有毒な副作用を減少させることが可能になる。
【００１２】
したがって、本発明は、（ｉ）少なくとも１種の抗癌剤及び（ｉｉ）ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する少なくとも１種の抗体、その機能的断片又は誘導体を含む、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する細胞中への抗癌剤の送達のための組成物であって、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する少なくとも１種の抗体が、細胞による少なくとも１種の抗癌剤の取り込み、ひいてはその活性に有利に働く、前記組成物に関する。ここで、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する前記少なくとも１種の抗体、その機能的断片又は誘導体は、前記ガングリオシドに特異的である。
【００１３】
一実施形態においては、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する少なくとも１種の抗体、その機能的断片又は誘導体は、
ａ）アミノ酸配列配列番号１の軽鎖可変領域（ＶＬ）ポリペプチド、及び
ｂ）アミノ酸配列配列番号２の重鎖可変領域（ＶＨ）
を含む。
【００１４】
さらに、ある実施形態においては、少なくとも１種の抗癌剤は、抗癌剤、こうしたアルキル化剤、代謝拮抗物質、抗腫瘍抗体、抗腫瘍性抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、有糸分裂阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、コルチコステロイド、ホルモン又はホルモン様薬物、サイトカイン、ヌクレオシド類似体、核酸、こうした二本鎖合成短鎖ＲＮＡ分子（ｍｉＲＮＡ）又は合成ＤＮＡ／ＲＮＡ様オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を含む又はそれからなる群から選択される。
【００１５】
少なくとも１種の抗癌剤は、癌細胞の細胞膜を単独で通過できない可能性がある。
【００１６】
少なくとも１種の抗癌剤は、分子量が１００ダルトン〜２００，０００ダルトンである。
【００１７】
本発明の別の目的は、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する癌を処置するために、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する細胞中への抗癌剤の選択的送達に使用される、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する抗体、その機能的断片又は誘導体を提供することである。
【００１８】
本発明の別の目的は、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する細胞中に抗癌剤を送達する方法であって、細胞による抗癌剤の取り込みを増大させるのに有効な量及び濃度のＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する少なくとも１種の抗体と癌細胞を接触させるステップを含み、抗体が細胞膜内の孔形成などの透過性欠陥を生じる、前記方法を提供することである。
【００１９】
本発明の更に別の目的は、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する癌を防止及び／又は処置する方法であって、（ｉ）少なくとも１種の抗癌剤と、（ｉｉ）ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する少なくとも１種の抗体、その機能的断片又は誘導体と、場合によっては（ｉｉｉ）薬学的に許容される担体とを含む組成物をそれを必要とする患者に投与するステップを含む、前記方法を提供することである。
【００２０】
本発明の更に別の目的は、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する癌に罹患した患者における抗癌剤に対する感受性を高める方法であって、（ｉ）少なくとも１種の抗癌剤と、（ｉｉ）ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する少なくとも１種の抗体、その機能的断片又は誘導体と、場合によっては（ｉｉｉ）薬学的に許容される担体とを含む組成物をそれを必要とする患者に投与するステップを含む、前記方法を提供することである。
【００２１】
本発明の更に別の目的は、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する癌に罹患した患者における抗癌剤に対して抵抗性の癌の発生を防止又は遅延させる方法であって、（ｉ）少なくとも１種の抗癌剤と、（ｉｉ）ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する少なくとも１種の抗体、その機能的断片又は誘導体と、場合によっては（ｉｉｉ）薬学的に許容される担体とを含む組成物をそれを必要とする患者に投与するステップを含む、前記方法を提供することである。
【００２２】
本発明の別の目的は、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する癌の防止及び／又は処置に適切な、（ｉ）少なくとも１種の抗癌剤と（ｉｉ）ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する少なくとも１種の抗体、その機能的断片又は誘導体との相乗的組合せを特定する、前記方法を提供することである。
【００２３】
本発明の更に別の目的は、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する細胞における抗癌剤の細胞内取り込みを増大させるための、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する抗体、その機能的断片又は誘導体の新しい使用を提供することである。
【００２４】
最後に、本発明は、（ｉ）少なくとも１種の抗癌剤と、（ｉｉ）ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する少なくとも１種の抗体、その機能的断片又は誘導体と、場合によっては（ｉｉｉ）薬学的に許容される担体とを含むキットに関する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】４０μｇ／ｍｌの抗ＯＡｃＧＤ２ｍＡｂ８Ｂ６と一緒に３０分間インキュベートした神経芽細胞腫細胞系及び神経膠芽腫初代細胞に対して走査型電子顕微鏡法を行ったことを示す図である。未処理（又はアイソタイプの一致した負の対照マウスＩｇＧ３で処理された）ＩＭＲ５（パネルＡ）、ＬＡＮ−１（パネルＣ）及びＤＵＡＳＯＩＩ（パネルＥ）細胞が連続円形を共有するのに対して、抗ＯＡｃＧＤ２ｍＡｂ８Ｂ６処理ＩＭＲ５（パネルＢ）、ＬＡＮ−１（パネルＤ）及びＤＵＡＳＯＩＩ（パネルＦ）細胞の膜には幾つかの孔が出現する。倍率は、それぞれ２．５キロ倍（ＫＸ）（パネルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＦ）並びに２．０ＫＸ（パネルＥ）である。
【図２】細胞及び孔の直径及び表面の測定を、４０μｇ／ｍｌの抗ＯＡｃＧＤ２ｍＡｂ８Ｂ６と一緒に３０分間インキュベートした神経芽細胞腫細胞系及び神経膠芽腫初代細胞：ＩＭＲ５（パネルＡ）、ＬＡＮ−１（パネルＢ及びＣ）並びにＤＵＡＳＯＩＩ（パネルＤ及びＥ）細胞に対して行ったことを示す図である。倍率は、それぞれ５．０２ＫＸ（パネルＡ）、４．５ＫＸ（パネルＢ及びＣ）並びに７．５ＫＸ（パネルＤ及びＥ）である。
【図３】神経芽細胞腫細胞における５−ＦＵ、シスプラチン及びドキソルビシンの内部移行を示す図である。ＬＡＮ−１細胞を、アイソタイプの一致した負の対照マウスＩｇＧ３（４０μｇ／ｍｌ）又は抗ＯＡｃＧＤ２ｍＡｂ８Ｂ６、抗ＯＡｃＧＤ２ｍＡｂ  ｃ８Ｂ６．１４ｂ、抗ＯＡｃＧＤ２ｍＡｂ  ｃ８Ｂ６．１５ｂ（４０μｇ／ｍｌ）の組合せで、５−ＦＵ（１．５２μＭ）−パネルＡ、又はシスプラチン（１．５２μＭ）−パネルＢ、又はドキソルビシン（４．７μＭ）−パネルＣ及びＤで処理した。抗癌剤及びｍＡｂを、３０分間３７℃でインキュベートした。神経芽細胞腫細胞を、ＦＡＣＳ取得前にＰＦＡ４％で固定した。正の対照は、固定されたＬＡＮ−１細胞を抗癌剤と組み合わせたサポニン０．０５％で３０分間処理して行われた。腫瘍細胞における抗癌剤の取り込みを、フローサイトメトリー（５３５ｎｍレーザーで励起）によって評価し、結果を全細胞集団における抗癌剤が取り込まれた細胞の割合で表す。
【図４−１】黒色腫（Ｍ２１細胞）、乳癌（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞）、小細胞肺癌（Ｈ５２４細胞）、ユーイング肉腫細胞（ＴＣ７１細胞）におけるドキソルビシンの内部移行を示す図である。細胞をアイソタイプの一致した負の対照マウスＩｇＧ３（４０μｇ／ｍｌ）又は抗ＯＡｃＧＤ２ｍＡｂ８Ｂ６（４０μｇ／ｍｌ）の組合せで抗癌剤０．２６μＭ（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、０．１８μＭを除く）で処理した。抗癌剤及びｍＡｂを３０分間３７℃でインキュベートした。腫瘍細胞をＦＡＣＳ取得前にＰＦＡ４％で固定した。正の対照は、固定された腫瘍細胞を抗癌剤と組み合わせたサポニン０．０５％で３０分間処理して行われた。黒色腫（Ｍ２１）−パネルＡ、乳癌（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）−パネルＢ、小細胞肺癌（Ｈ５２４）−パネルＣ、ユーイング肉腫（ＴＣ７１）−パネルＤ細胞における抗癌剤の取り込みを、フローサイトメトリー（５３５ｎｍレーザーで励起）によって評価し、結果を全細胞集団における抗癌剤が取り込まれた細胞の割合で表す。
【図４−２】神経膠芽腫細胞（ＤｕＧａｎ）におけるドキソルビシンの内部移行を示す図である。細胞をアイソタイプの一致した負の対照マウスＩｇＧ３（４０μｇ／ｍｌ）又は抗ＯＡｃＧＤ２ｍＡｂ８Ｂ６（４０μｇ／ｍｌ）の組合せで抗癌剤０．２６μＭ（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、０．１８μＭを除く）で処理した。抗癌剤及びｍＡｂを３０分間３７℃でインキュベートした。腫瘍細胞をＦＡＣＳ取得前にＰＦＡ４％で固定した。正の対照は、固定された腫瘍細胞を抗癌剤と組み合わせたサポニン０．０５％で３０分間処理して行われた。神経膠芽腫（ＤｕＧａｎ）−パネルＥ細胞における抗癌剤の取り込みを、フローサイトメトリー（５３５ｎｍレーザーで励起）によって評価し、結果を全細胞集団における抗癌剤が取り込まれた細胞の割合で表す。
【図５】インビボ神経芽細胞腫実験肝転移マウスモデルにおける抗ＯＡｃＧＤ２ｍＡｂ８Ｂ６による化学療法抗腫瘍活性の増強を示す図である。マウス（ｎ＝１０／群）に２．５×１０５個のＮＸＳ２マウス神経芽細胞腫細胞を静脈内注射によって接種した。週２回連続３週間（累積用量＝１５０μｇ、Ａ〜Ｃ）の腫瘍細胞接種後３日目に８Ｂ６ｍＡｂ処理を開始した。すべての化学療法処置を、腫瘍接種後１０日目に開始した。パネルＡ：イソトレチノインを１０ｍｇ／ｋｇで経口で毎週５回２週間投与した。パネルＢ：トポテカンを腹腔内注射によって０．３６ｍｇ／ｋｇで週５回１週間投与した。パネルＣ：ドキソルビシンを腹腔内注射によって１ｍｇ／ｋｇで毎週５回２週間投与した。マウスを腫瘍接種後２８日目に安楽死させた。ビヒクルのみで処置したマウスに比べて新しい検体の肝臓重量を測定することによって抗腫瘍効率を評価した。肝臓重量は、肝転移数を示す。ｙ軸は、平均正常肝臓重量に相当する０．８ｇから始まる。データを平均±ＳＥＭとして示す。
【図６】イソトレチノイン（パネルＡ）、トポテカン（パネルＢ）及びドキソルビシン（パネルＣ）と組み合わせた抗ＯＡｃＧＤ２ｍＡｂ８Ｂ６の全身的耐容性を示す図である。図６の０日目に示したマウス群（ｎ＝１０）の平均重量を１００％重量として定義した。各群の重量は、処置期間安定していた。△、ｍＡｂ８Ｂ６で処置したマウス；○、抗癌剤で処置したマウス；□、化学療法薬＋ｍＡｂ８Ｂ６で処置したマウス。
【図７】抗ＯＡｃＧＤ２ｍＡｂ８Ｂ６がインビボ神経膠芽腫異種移植マウスモデルにおける患者由来のＴＭＺ難治性ＧＢＭ−１０細胞（ＧＢＭ−１０ＴＭＺＲ））において腫瘍抵抗性を克服することを示す図である。１×１０６個のＧＢＭ−１０細胞をマウスに０日目に皮下注射した。次いで、マウスを２群に分割し、第１の群のマウスにテモゾロマイド（ＴＭＺ）を腹腔内注射によって単一用量０．０５ｍｇ／マウスで１２、２２及び３２日目に投与し、第２の群のマウスを未処置で放置した。腫瘍体積（パネルＡ）をモニターした。ＯＡｃＧＤ２発現を、ＴＭＺ処置マウスと未処置マウスとの両方から単離されたＧＢＭ−１０細胞において評価した（パネルＢ）。次に、ＴＭＺ難治性レベルを限界希釈アッセイによって決定し、腫瘍異種移植片における神経膠芽腫癌幹細胞（ＧＳＣ）頻度として表した。ＧＳＣ生存に対する単独療法（８Ｂ６又はＴＭＺ）と２種の薬剤の組合せ（ＴＭＺ＋８Ｂ６）の効果を、未処置（パネルＣ、ＧＢＭ−１０ＣＴＬ（ＴＭＺｓ））及び再発ＧＢＭ−１０異種移植片（パネルＤ、ＧＢＭ−１０ＴＭＺＲ）から単離されたＧＢＭ−１０細胞において比較した。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
第１の態様においては、本発明は、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する細胞中に抗癌剤を送達する方法であって、細胞による抗癌剤の取り込みを増大させるのに有効な量及び濃度のＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する少なくとも１種の抗体、その機能的断片又は誘導体と細胞を接触させるステップを含み、抗体が細胞膜内の孔形成などの欠陥を生じる、前記方法に関する。
【００２７】
好ましくは、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する前記少なくとも１種の抗体は、多量体抗体である。
【００２８】
実際、本発明者らは、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識し、同時に多量体化特性を有する抗体（例えば、凝集性を有する８Ｂ６  ＩｇＧ３抗体、及び多量体化特性（すなわち、六量体形成）を有するキメラ化ＩｇＧ１定常領域を含むキメラ化８Ｂ６抗体）が抗癌剤の透過を誘導するのに対して、こうした多量体化特性をもたない抗体（例えば、ＩｇＧ１定常領域を含むキメラ化８Ｂ６抗体）がこうした透過に対して効果がないことを証明した。したがって、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシド結合と多量体化特性との両方が、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する細胞の細胞膜中の孔形成に必要であると思われる。本明細書では「多量体抗体」という用語は、二量体、三量体、四量体、．．．又は凝集体を指し得る。
【００２９】
本発明では、細胞膜、細胞質膜、外側細胞膜及び原形質膜という用語は、同義であり、区別無く使用することができる。
【００３０】
「細胞中への抗癌剤の送達」という用語は、細胞内部の抗癌剤の放出を指し、その結果、抗癌剤はその細胞内標的に到達することができる。
【００３１】
好ましい一実施形態によれば、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する細胞は、細胞膜に固定されたＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを有する腫瘍細胞、癌細胞、癌幹細胞又は過剰増殖細胞である。「癌幹細胞」という用語は、当該技術分野におけるその一般的な意味を有し、正常幹細胞に付随する特性、特に特定の癌試料中に見られるすべての細胞型を生じる能力を有する（固形腫瘍及び血液癌内に見られる）癌細胞の亜集団を指す。それらは、自己複製、複数の癌細胞系譜への分化、及び広範な増殖の能力を有する。それらは、少量の癌幹細胞だけで新しい腫瘍を惹起することができ、化学療法及び放射線療法を含めた従来の療法に対して抵抗性である傾向がある。癌幹細胞は、急性骨髄性白血病及び急性リンパ性白血病を含めた白血病、乳癌、神経膠芽腫を含めた神経膠腫、結腸直腸癌、膵癌、前立腺癌、肺癌、肝癌、膀胱癌又は胃癌を含めて、ただしそれらに限定されない、極めて種々のタイプの癌において同定された。種々のマーカーが癌細胞の塊の中で癌幹細胞を同定する際に観察され、こうしたマーカーは多様であり、癌タイプに依存する。癌幹細胞の同定に使用することができるマーカーの例としては、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ１９、インターロイキン−３受容体α（ＣＤ１２３）、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４７、ＣＤ２４、ＥｐＣＡＭ（ＥＳＡ）、Ｌｉｎ、ＣＤ１３３、Ａ２Ｂ５、ＳＳＥＡ−１、ＣＤ１６６、ＣＤ２６、ＣＤ２００、α２β１、Ｓｃａ、ＣＤ４５、Ｐｅｃａｍ、ＡＬＤＨ、ＡＬＤＨ１、Ｏｃｔ４、ＡＢＣＧ２、ＣＸＣＲ４、ＡＦＰ、ＥＭＡ、ＩＧＦ−ＩＲが挙げられるが、それらに限定されない。
【００３２】
「細胞による抗癌剤の取り込み」という用語は、腫瘍細胞、癌細胞、癌幹細胞、又は過剰増殖細胞などの標的細胞中への抗癌剤の接触及び内部移行／透過を指す。細胞膜の通過は抗癌剤がその細胞内標的に到達する第１の律速ステップであることは、現在十分証明されている。
【００３３】
「欠陥」という用語は、細胞膜透過性を増加させる細胞の一過性の変形を生じる局所的な細胞膜の乱れを指す。例えば、細胞膜の局所的陥入又は膨出は、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する細胞への、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する少なくとも１種の抗体、その機能的断片又は誘導体の結合に起因し得る。換言すれば、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する細胞の細胞膜透過性の一過性増加は、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する少なくとも１種の抗体、その機能的断片又は誘導体の存在下でのみ生じる。欠陥は一過性であり得、したがって細胞膜はその本来の構造に戻ることができる。
【００３４】
「孔形成」という用語は、細胞膜内に穴を形成するグリセロリン脂質二重層の物理的な改変又は乱れを指す。これは、細胞膜の透過性を一過的に増加させ、細胞外分子のエンドサイトーシスにおいてある役割を果たすこともできる。孔形成によって、細胞外区画から細胞内区画に分子が入ることができる。孔の数及び直径は、細胞型、細胞膜組成、細胞に接触する抗体の量及び時間などの幾つかのパラメータに依存する。孔径は、本発明の方法によって細胞の細胞質中に送達することができる薬剤のサイズを決定する。走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ：Ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）及び原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ：ａｔｏｍｉｃ  ｆｏｒｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）を使用して、孔径を測定することができる（ＺＨＡＯら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ、１６：１、１８〜２５、２００８）。
【００３５】
好ましい一実施形態によれば、膜孔の平均直径は、約１ｎｍ〜約１００ｎｍ、好ましくは約１ｎｍ〜約５０ｎｍ、最も好ましくは約１ｎｍ〜約１０ｎｍである。
【００３６】
脂質二重層細胞膜は、厚さ４〜１０ｎｍである。したがって、孔の平均直径は、ある場合には、細胞膜厚さよりも大幅に大きい可能性がある。
【００３７】
すべての実施形態においては、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する抗体、その機能的断片又は誘導体は、細胞膜上で非選択孔を生成する。「非選択孔」は、非荷電分子又はイオン型抗癌剤などの荷電分子が細胞膜のリン脂質二重層を通って拡散できるようにする孔を意図する。孔径は、細胞膜を通過する非荷電又は荷電化合物の選択の関連基準である。
【００３８】
ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する細胞と適切な条件下で接触すると、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する抗体、その機能的断片又は誘導体は、細胞膜内に孔を生ずることによって所与の細胞培養集団の一部又は全細胞内の抗癌剤の細胞透過を誘導する能力を有する。「細胞透過」は、受動拡散よりもかなり良好な条件下の細胞内環境における外部環境からの抗癌剤の通過を意図する。
【００３９】
この発見は、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する癌を処置する全く新しい手法を提供する。癌細胞における非選択孔の役割を果たすことによって、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する抗体、その機能的断片又は誘導体は、抗癌剤に対する癌細胞の透過性を大きく高める。これは、それらの治療効果（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｆｆｅｃｔ）を高めるだけでなく、それらの関連する潜在的副作用を減少させ得る。
【００４０】
インビトロ及び／又はエクスビボで使用されるときには、本発明の方法は、薬物スクリーニング目的で実行される。したがって、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する細胞、好ましくは腫瘍細胞中への抗癌剤のインビトロ及び／又はエクスビボ送達方法は、抗癌剤とＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する抗体、その機能的断片又は誘導体との相乗的組合せのスクリーニングに適している。
【００４１】
したがって、本発明は、（ｉ）少なくとも１種の抗癌剤、（ｉｉ）ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する少なくとも１種の抗体、その機能的断片又は誘導体を含む、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する細胞、好ましくは腫瘍細胞中への抗癌剤の送達のための組成物であって、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する少なくとも１種の抗体が、細胞、好ましくは腫瘍細胞による少なくとも１種の抗癌剤の取り込みを増大させる、前記組成物にも関する。
【００４２】
インビボで使用されるときには、本発明の方法は治療目的で実行される。したがって、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する細胞、好ましくは腫瘍細胞中への抗癌剤のインビボ送達方法は、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する癌の治療に適している。
【００４３】
したがって、本発明は、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する癌の処置及び／又は防止方法に使用される（ｉ）少なくとも１種の抗癌剤と、（ｉｉ）ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する少なくとも１種の抗体、その機能的断片又は誘導体と、場合によっては（ｉｉｉ）薬学的に許容される担体とを含む組成物にも関する。
【００４４】
本発明は、癌を処置及び／又は防止するためにＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する細胞中への少なくとも１種の抗癌剤の選択的送達に使用される、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する抗体、その機能的断片又は誘導体にも関する。
【００４５】
本発明は、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する癌を防止及び／又は処置する方法であって、（ｉ）少なくとも１種の抗癌剤と、（ｉｉ）ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する少なくとも１種の抗体、その機能的断片又は誘導体と、場合によっては（ｉｉｉ）薬学的に許容される担体とを含む有効量の組成物をそれを必要とする患者に投与するステップを含む、前記方法にも関する。
【００４６】
「ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する癌の処置方法」又は「ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する癌を処置する方法」という用語は、同義であり、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する癌の有害作用若しくはＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する癌の進行を治癒、逆転、減衰、緩和、最小化、抑制若しくは停止すること、又はＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する癌の進行を減衰させることを指す。好ましくは、こうした処置は、腫瘍増殖又は転移拡散の後退、すなわち、測定可能な腫瘍のサイズの減少ももたらす。最も好ましくは、こうした処置は、腫瘍の完全な後退をもたらす。
【００４７】
「ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する癌」という用語は、ＧＤ２ガングリオシドのＯアセチル化体をその表面で発現する細胞を有する癌を指す。一般に、前記細胞は、１，０００個を超えるＯＡｃＧＤ２ガングリオシド分子をその細胞表面で発現し、好ましくは１０，０００個を超える、より好ましくは５０，０００個を超えるＯＡｃＧＤ２ガングリオシド分子をその細胞表面で発現する。前記ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する癌は、神経芽細胞腫、神経膠腫、網膜芽細胞腫、腫瘍のユーイングファミリー、肉腫（すなわち、横紋筋肉腫、骨肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫及び線維肉腫）、小細胞肺癌、乳癌、黒色腫、転移性腎癌、頭頚部癌並びに血液癌（すなわち、白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫及び骨髄腫）を含む又はそれからなる群から選択される。より一般的には、「ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する癌」という用語は、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する細胞の１０％超、好ましくは１５％超、更により好ましくは２０％超を提示する癌を指す。好ましくは、前記細胞は、癌幹細胞（ＣＳＣ：Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ）である。ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する癌の処置とは、腫瘍を破壊するための、又はＯＡｃＧＤ２ガングリオシドをその表面で発現する癌細胞を破壊するための、（ｉ）少なくとも１種の抗癌剤と、（ｉｉ）ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する少なくとも１種の抗体、その機能的断片又は誘導体と、場合によっては（ｉｉｉ）薬学的に許容される担体とを含む組成物の投与を指す。
【００４８】
ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する癌の「防止」とは、腫瘍増殖を低減するための、又は転移拡散を妨げるための、又は更には腫瘍再発を阻止するための、（ｉ）少なくとも１種の抗癌剤と、（ｉｉ）ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する少なくとも１種の抗体、その機能的断片又は誘導体と、場合によっては（ｉｉｉ）薬学的に許容される担体とを含む組成物の投与を指す。好ましくは、防止の成果は、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する癌に既に罹患した対象における再発前に処置が施された場合、転移拡散の発生を防止することであり得る。最も好ましくは、防止の別の成果は、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する癌の治療が既になされた対象における腫瘍再発を防止することであり得る。
【００４９】
本明細書では「患者」という用語は、ヒトを含めた任意の哺乳動物を指す。該用語は、特定の年齢又は性別に限定されるものではない。したがって、成体及び新生対象並びに小児が、雄でも雌でも、該用語に包含される。
【００５０】
「抗癌剤」という用語は、腫瘍成長、増殖及び／又は発生を阻害するのに使用することができる抗増殖性、抗発癌性及び／又は制癌性を有する化学的、物理的又は生物学的製剤又は化合物を指す。好ましくは、抗癌剤は、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する癌に対する活性を有する。
【００５１】
少なくとも１種の抗癌剤は、アルキル化剤、代謝拮抗物質、抗腫瘍抗体、抗腫瘍性抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、有糸分裂阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、コルチコステロイド、ホルモン又はホルモン様薬物、サイトカイン、ヌクレオシド類似体、核酸、こうした二本鎖合成短鎖ＲＮＡ分子（ｍｉＲＮＡ）又は合成ＤＮＡ／ＲＮＡ様オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）などの抗癌剤を含む又はそれからなる群から選択することができる。
【００５２】
少なくとも１種の抗癌剤は、癌細胞の細胞膜を単独で通過できない可能性がある。
【００５３】
すべての実施形態においては、抗癌剤は、約１ｎｍ〜約２μｍの孔のサイズに適合した立体障害を有し、細胞とＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する抗体、その機能的断片又は誘導体との接触によって生じる孔を経由して細胞膜を通過することができる。
【００５４】
一部の実施形態においては、抗癌剤は、生体適合性及び生分解性ナノ粒子中に包埋することができる。これは、抗癌剤が核酸、こうした二本鎖合成短鎖ＲＮＡ分子（ｍｉＲＮＡ）若しくは合成ＤＮＡ／ＲＮＡ様オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）又はヌクレアーゼ若しくはプロテアーゼによる切断からそれらを保護する短鎖ポリペプチドであるときに特に適切である。
【００５５】
この場合、ナノ粒子のタイプは、そのサイズ並びにその物理化学的及び薬物動態学的特性に基づいて当業者が選択することができる。例えば、ｍｉＲＮＡは、胃腺癌の動物モデルにおいて酸化鉄ナノ粒子（ＨＩＲＡＫＩら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ（２０１５）４、ｅ２３１）、結腸直腸腺癌の動物モデルにおいて炭酸アパタイトナノ粒子（ＳＵＮら、２０１４、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、ｖｏｌ．３９０、ｐｐ１９〜３０）を用いることによって癌細胞に送達することに成功した。ナノ粒子のサイズ分布は、原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）、透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ：ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）、動的光散乱（ＤＬＳ：ｄｙｎａｍｉｃ  ｌｉｇｈｔ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）などの様々な技術を用いて測定することができる。例えば、酸化鉄ナノ粒子の単一粒径は１０〜６０ｎｍであり、炭酸アパタイトナノ粒子で構成されるものは７０〜８０ｎｍ、凝集体を形成する場合には最高２００〜３００ｎｍであった。
【００５６】
患者の体内に均一に分布し、癌細胞を正常細胞から区別できない、化学療法に使用される抗癌剤にナノ粒子を使用することもできる。
【００５７】
近年、癌治療のための超小型無機粒子（ＵＳＮＰ）に多大な努力が向けられている。金ＵＳＮＰは、コアサイズ１〜３ｎｍである。
【００５８】
ナノ粒子及び超小型ナノ粒子のサイズは、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する抗体と一緒にインキュベートしたときに、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する癌細胞の細胞膜内で観察される孔のサイズに適合する。
【００５９】
一部の実施形態においては、抗癌剤は、ナノ粒子中に包埋されない。この場合、溶液中の抗癌剤は、非球状であり、動的（転回）であり、溶媒和している。動的、水和、溶媒和抗癌剤の見かけサイズは、したがって、抗癌剤の拡散性を利用して測定することができる。動的光散乱（ＤＬＳ）は、観察中の分子と同じ速度で拡散する等価な剛体球の半径として定義される流体力学半径（Ｒｈ）を計算する最良の技術と考えられる。Ｒｈは、動的水和／溶媒和分子の見かけサイズを示す。Ｒｈは、一般に、拡散係数からストークス−アインシュタイン式を用いて計算される。回転半径（Ｒｇ）は、分子のコアから分子中の各質量要素までの質量加重平均距離として定義され、分子のサイズの測定を可能にする別のパラメータである。しかし、小角中性子散乱（ＳＡＮＳ：ｓｍａｌｌ  ａｎｇｌｅ  ｎｅｕｔｒｏｎ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）、小角Ｘ線散乱（ＳＡＸＳ：ｓｍａｌｌ  ａｎｇｌｅ  ｘ−ｒａｙ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）などの別の技術を用いて、又は高分解能Ｘ線構造から、分子のＲｇを得ることができる。
【００６０】
癌を処置するのに使用される組成物の抗癌剤形成部をその分子量によって特徴づけることも適切であり得る。
【００６１】
好ましい一実施形態においては、抗癌剤は、分子量が１００ダルトン〜２００，０００ダルトンである。
【００６２】
「分子量」は、分子を定義する分子式中の原子の原子量を合計することによって計算される前記分子の平均質量を意味する。質量と重量という語は、本発明においては区別なく使用される。「原子量」は、メンデレーエフの周期表で示された元素の一般的な地球上の試料に見られる同位体質量の加重平均を意味する。
【００６３】
ダルトンの定義は、Ｇｒｅｅｎ  Ｂｏｏｋに見出すことができる（ＩＵＰＡＣ、Ｇｒｅｅｎ  ｂｏｏｋ、第３版、「Ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ，Ｕｎｉｔｓ  ａｎｄ  Ｓｙｍｂｏｌｓ  ｉｎ  ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、２００７）。ダルトン、記号Ｄａは、統合原子質量単位、記号ｕの代替名として使用される。ダルトンは、炭素１２核種の質量に関係し、炭素１２原子の１／１２質量として定義される（ｍａ（１２Ｃ）／１２≒１．６６６  ５３８  ７８２（８３）×１０−２７ｋｇ＝１０−３／Ｎａ（ｋｇ）、ここでＮａはアボガドロ定数であり、６．０２２  １４×１０２３ｍｏｌ−１に等しい）。したがって、炭素１２のモル質量は正確に１２ｇ／ｍｏｌということになる。その結果、モル質量は、ＳＩ単位ｇ／ｍｏｌ（ｇ．ｍｏｌ−１に等しい）で表されるとき、原子量と数値的に同一である。一例として、水（Ｈ２Ｏ）のモル質量は１８ｇ．ｍｏｌ−１であり、その分子量は１８Ｄａである。ダルトンは、ＳＩ接頭辞と組み合わせて、大分子の質量をキロダルトン（ｋＤＡ）又はメガダルトン（ＭＤａ）で表すことができる。例えば、モル質量２００，０００ｇ・ｍｏｌ−１の抗癌剤は、分子量２００，０００Ｄａであり、２００ｋＤａと定義することもできる。
【００６４】
また、ある実施形態においては、本発明に係る組成物の抗癌剤は分子量が１０ｋＤａ〜１５ｋＤａ、より好ましくは１１ｋＤａ〜１４ｋＤａ、より好ましくは１２ｋＤａ〜１３ｋＤａである。最も好ましくは、本発明に係る組成物の抗癌剤は分子量が１０ｋＤａ〜１３ｋＤａである。
【００６５】
別の実施形態においては、本発明に係る組成物の抗癌剤は分子量が８０ｋＤａ〜２００ｋＤａ、より好ましくは１００ｋＤａ〜１８０ｋＤａ、より好ましくは１２０ｋＤａ〜１６０ｋＤａである。最も好ましくは、本発明に係る組成物の抗癌剤は分子量が１５０ｋＤａ〜２００ｋＤａである。
【００６６】
別の実施形態においては、本発明に係る組成物の抗癌剤は分子量が１２０ダルトン〜８００ダルトン、より好ましくは１５０ダルトン〜６００ダルトン、より好ましくは２５０ダルトン〜５５０ダルトンである。最も好ましくは、本発明に係る組成物の抗癌剤は分子量が１２０ダルトン〜５５０ダルトンである。
【００６７】
さらに、ある実施形態においては、少なくとも１種の抗癌剤は、アントラサイクリンなどの抗腫瘍性抗生物質、カンプトセシンなどのトポイソメラーゼ阻害剤、イミダゾテトラジン又はシクロホスファミドなどのアルキル化剤、プレノール脂質、ジアジンなどの代謝拮抗物質、及び遷移金属塩を含む又はそれからなる抗癌剤の群から選択される。
【００６８】
アントラサイクリンは、癌の処置において最も効率的な薬物クラスの一つである。１９５０年代に始まり、これらの分子は、最初に、土壌細菌ストレプトミセス  ペウセティウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ）から同定された。アントラサイクリンは、隣接するキノン及びヒドロキノン部分を有する硬質平面状四環系構造、Ｃ−１３にカルボニル基を有する短い側鎖、及び四環系環のＣ−７にグリコシド結合によって結合したアミノ糖ダウノサミンで構成される。アントラサイクリンは、受動拡散によって細胞に入り、トポイソメラーゼ−ＤＮＡ複合体と相互作用することができ、それによって細胞の増殖を阻害する。癌細胞を死滅させる効率的活性にもかかわらず、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、エピルビシン、バルルビシン、ミトキサントロン、ピクサントロンなど、それらのうちごく少数しか薬用に認可されていない。さらに、それらの臨床有用性は、不可逆的心不全を起こし得る累積用量依存的な心毒性によって限定される。好ましくは、本発明の組成物に使用されるアントラサイクリンは、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、バルルビシン及びそれらの他の誘導体を含む又はそれからなる群から選択される。最も好ましくは、本発明の組成物に使用されるアントラサイクリンは、ドキソルビシン又はその誘導体の一つである。
【００６９】
すべての実施形態においては、本発明に係る組成物は、治療有効量の少なくとも１種の抗癌剤及び治療有効量のＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する少なくとも１種の抗体、その機能的断片又は誘導体を含む。
【００７０】
本明細書では「治療有効量」という用語は、所望の治療効果又は生物学的効果が得られる任意の量を包含するものとする。治療効果は、処置されるＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する癌又は所望の生物学的効果に依存する。したがって、治療効果は、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する癌に付随する症候の重症度の低下、及び／又はＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する癌の進行の（部分的又は完全な）阻害であり得る。治療反応を誘発するのに必要とされる量は、癌タイプ、患者の年齢、健康、体格及び性別に基づいて決定することができる。
【００７１】
好ましい一実施形態によれば、ドキソルビシン又はその誘導体の一つは、成体対象の場合４０ｍｇ／ｍ２〜６０ｍｇ／ｍ２の用量で１〜３日間３又は４週ごとに投与することができる。ドキソルビシン又はその誘導体の一つの最大累積用量は、６００ｍｇ／ｍ２を超えるべきではない。用量は、子供の場合２５ｍｇ／ｍ２〜３０ｍｇ／ｍ２に低減される（ＭＡＴＴＨＡＹら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ、１９９９、ｖｏｌ．３４１、ｐｐ．１１６５〜１１７３）。ｍｇ／ｍ２単位の用量をｍｇ／ｋｇ単位の用量に変換するには、ヒトの場合、単に３７で割る（ＮＡＩＲ及びＪＡＣＯＢ、Ｊ  Ｂａｓｉｃ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍ．、２０１６、ｖｏｌ．７（２）：ｐｐ．２７〜３１）
本明細書に記載の用量は、成人及び／又は子供のヒトの場合であるが、重量又は平方メートルサイズに応じて、他の哺乳動物のサイズに合わせて調節することができる。
【００７２】
カンプトセシンは、ピロロ［３，４−ベータ］−キノリン部分（環Ａ、Ｂ及びＣ）、共役ピリドン部分（環Ｄ）並びに（Ｓ）配置のアルファ−ヒドロキシラクトン環（Ｅ環）内の２０位における１個のキラル中心を含む、平面状五環系環構造を含む複素環式化合物である。これらのキノリン系アルカロイドは、アジアの木であるカンレンボクから最初に抽出された。トポテカン及びイリノテカンは、癌の処置にそれらの使用が認可されたわずか２種のカンプトセシン誘導体薬物である。好ましくは、本発明の組成物に使用されるカンプトセシンは、トポテカン、イリノテカン、ルビテカン及び他の誘導体を含む又はそれからなる群から選択される。最も好ましくは、本発明の組成物に使用されるカンプトセシンは、トポテカン、イリノテカン又はそれらの誘導体の一つである。
【００７３】
好ましい一実施形態によれば、トポテカン又はその誘導体の一つは、成体対象の場合、開始用量１．５ｍｇ／ｍ２で５日間３週ごとに、次いで用量１ｍｇ／ｍ２〜１．５ｍｇ／ｍ２で５日間３週ごとに投与することができる。用量は、子供の場合、０．７５ｍｇ／ｍ２に低減され、５日間２８日ごとである（ＤＩ  ＧＩＡＮＮＡＴＡＬＥら、Ｐｈａｓｅ  ＩＩ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ  ｉｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｏｐｏｔｅｃａｎ（ＴＯＴＥＭ）  ｉｎ  ｒｅｌａｐｓｅｄ  ｏｒ  ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ：ａ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｗｉｔｈ  Ｃａｎｃｅｒ−ＳＩＯＰ−Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａｓｔｕｄｙ  ａｎｄ  Ｒｅｚａ  Ｒａｈｂａｒ，Ｃａｒｌｏｓ  Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｇａｌｉｎｄｏ，Ｊｏｈｎ  Ｇ．Ｍｅａｒａ，Ｅｄｗａｒｄ  Ｒ．Ｓｍｉｔｈ，Ａｎｔｏｎｉｏ  Ｒ．Ｐｅｒｅｚ−Ａｔａｙｄｅ．２  ｄｅｃｅｍｂｒｅ  ２０１３  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｍｅｄｉａ）。
【００７４】
別の好ましい一実施形態によれば、イリノテカン又はその誘導体の一つは、成体対象の場合、３４０〜３５０ｍｇ／ｍ２で９０分間の静脈内注入によって３週ごとに投与することができる（ＦＲＩＥＤＭＡＮら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、ｖｏｌ．２７（２８）、ｐ：４７３３〜４７４０、２００９）。
【００７５】
本明細書に記載の用量は、成人及び／又は子供のヒトの場合であるが、重量又は平方メートルサイズに応じて、他の哺乳動物のサイズに合わせて調節することができる。
【００７６】
イミダゾテトラジンは、オルト縮合イミダゾール及びテトラジン環を含むヘテロ二環式化合物の一クラスである。これらの化合物のうち、テモゾロマイド（Ｔｅｍｏｄａｒ（登録商標）、Ｔｅｍｏｄａｌ（登録商標）、ＴＭＺ）が、新規に診断された多形性膠芽腫（ＧＢＭ）の処置に認可され、難治性未分化星細胞腫にも認可された。このプロドラッグは、活性であるために活性化される必要がある。神経膠芽腫に罹患した患者の一部に明らかに有益であるにもかかわらず、ＴＭＺは、ＴＭＺ抵抗性の出現に付随する進行性腫瘍増殖も誘導する。好ましくは、本発明の組成物に使用されるイミダゾテトラジンは、テモゾロマイド又はその誘導体の一つである。
【００７７】
好ましい一実施形態によれば、テモゾロマイド又はその誘導体の一つは、成体対象の場合７５ｍｇ／ｍ２〜２００ｍｇ／ｍ２の用量で１日投与することができる。
【００７８】
本明細書に記載の用量は、ヒトの場合であるが、重量又は平方メートルサイズに応じて、他の哺乳動物及び小児のサイズに合わせて調節することができる。
【００７９】
プレノール脂質は、主にメバロン酸経路を介して生成される５炭素前駆体イソペンテニル二リン酸及びジメチルアリル二リン酸から合成される。単純なイソプレノイド（線状アルコール、二リン酸など）は、Ｃ５単位の連続的な付加によって形成されるので、それらをこのようにして分類するのは好都合であり、これらの構造のポリテルペンサブクラスは４０個を超える炭素（すなわち、８超のイソプレノイド単位）を含む。例えば、ビタミンＡ及びその誘導体並びにフィタン酸及びその酸化生成物プリスタン酸は、Ｃ２０イソプレノイドに分類される。カロテノイドは、抗酸化剤として、また、ビタミンＡの前駆体として機能する重要な単純なイソプレノイドである。別の生物学的に重要なクラスの分子は、非イソプレノイド起源のキノン類似のコアに結合したイソプレノイド末端を含むキノン及びヒドロキノンによって例示される。ビタミンＥ及びＫ並びにユビキノンは、このクラスの例である。プレノール脂質のうち、レチノイドは、ビタミンＡの天然及び合成誘導体である。幾つかの研究は、強力な分化誘導物質、又は急性骨髄性白血病（ＡＭＬ：ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）などの癌を処置するための腫瘍細胞アポトーシスの誘導物質としてのそれらの使用を報告した。例えば、ビタミンＡ誘導体としては、レチノイン酸（ＲＡ：ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、全トランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ：ａｌｌ−ｔｒａｎｓ  ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、９−シスＲＡ、４−ＨＰＰＲ、１３−シスＲＡ、及びＡＭ５８０などのレチノイン酸の合成類似体が挙げられる。最近、１３−シスＲＡは、骨髄移植後のハイリスクな神経芽細胞腫の処置において有益であることが判明した（Ｍａｔｔｈａｙら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ；３４１：１１６５〜１１７３、１９９９）。好ましくは、本発明の組成物に使用されるプレノール脂質は、ＡＴＲＡ、９−シスＲＡ及び１３−シスＲＡを含む又はそれからなる群から選択される。最も好ましくは、本発明の組成物に使用されるプレノール脂質は、イソトレチノインとも呼ばれる１３−シスＲＡである。
【００８０】
好ましい一実施形態によれば、イソトレチノインは、成体対象の場合、用量８０ｍｇ／ｍ２〜１６０ｍｇ／ｍ２で投与することができる（ＹＵら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．、２０１０、ｖｏｌ．３６３（１４）：ｐｐ．１３２４〜１３３４）。
【００８１】
本明細書に記載の用量は、ヒトの場合であるが、重量又は平方メートルサイズに応じて、他の哺乳動物及び小児のサイズに合わせて調節することができる。
【００８２】
ジアジンは、５個の窒素原子、並びに１及び２位（ピリダジン）、１及び３位（ピリミジン）、又は１及び４位（ピラジン）における２個の窒素原子を有する５員複素環式化合物を含む有機化合物である。好ましくは、本発明の組成物に使用されるジアジンは、チオグアニン、フルダラビン、クラドリビン、シタラビン、ゲムシタビン、６−メルカプトプリン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）及び類縁体を含む又はそれからなるピリミジン及びピリミジン誘導体の群から選択される。最も好ましくは、本発明の組成物に使用されるジアジンは、５−ＦＵ又はフルダラビンである。
【００８３】
好ましい一実施形態によれば、５−ＦＵは、成体対象の場合、用量３５０ｍｇ／ｍ２〜４００ｍｇ／ｍ２で４〜５日間４週ごとに投与することができる。
【００８４】
好ましい一実施形態によれば、フルダラビンは、経口用量４０ｍｇ／ｍ２／日で連続５日間２８日ごとに投与することができる。本明細書に記載の用量は、ヒトの場合であるが、重量又は平方メートルサイズに応じて、他の哺乳動物及び小児のサイズに合わせて調節することができる。
【００８５】
ＩＵＰＡＣは、不完全な副殻を有する、又は不完全なｄ副殻とのみ安定なイオンを形成し得る任意の元素として遷移金属を定義する。遷移金属は、元素周期表で２１〜３０、３９〜４８、７１〜８０及び１０３〜１１２の４０種の化学元素である。好ましくは、本発明の組成物に使用される遷移金属は、シスプラチン、オキサリプラチン、エプタプラチン、ロバプラチン、ネダプラチン、カルボプラチン、イプロプラチン、サトラプラチン、テトラプラチン、ＤＣＰ、ＰＬＤ−１４７、ＪＭ１１８、ＪＭ１２６、ＪＭ３３５及び他の誘導体を含む又はそれからなる群から選択される。最も好ましくは、本発明の組成物に使用される遷移金属は、カルボプラチン又はシスプラチンである。
【００８６】
好ましい一実施形態によれば、シスプラチンは、成体対象の場合、用量５０ｍｇ／ｍ２〜１００ｍｇ／ｍ２で３又は４週ごとに投与することができる。用量は、子供の場合、２８日ごとに６０ｍｇ／ｍ２である。
【００８７】
好ましい一実施形態によれば、カルボプラチンは、成体対象の場合、用量３００ｍｇ／ｍ２〜４００ｍｇ／ｍ２で３又は４週ごとに投与することができる。用量は、子供の場合、２１日ごとに２００ｍｇ／ｍ２である（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ（２０１３）４９、３６７１〜３６７９）。
【００８８】
本明細書に記載の用量は、成人及び／又は子供のヒトの場合であるが、重量又は平方メートルサイズに応じて、他の哺乳動物のサイズに合わせて調節することができる。
【００８９】
ナイトロジェンマスタード化合物は、窒素原子に結合した２個のベータ−ハロアルキル基を有する化合物である。このクラスの化合物のうち、シクロホスファミドは、多様な癌の処置に使用されている。
【００９０】
好ましい一実施形態によれば、シクロホスファミドは、成体対象の場合、用量４００ｍｇ／ｍ２〜１８００ｍｇ／ｍ２で２〜５日間分割して投与することができ、間欠療法の場合、２〜４週間の間隔で繰り返すことができ、毎日の連続療法の場合、６０ｍｇ／ｍ２〜１２０ｍｇ／ｍ２／日で繰り返すことができる。用量は、子供においては、１．５ｍｇ／ｍ２〜３ｍｇ／ｍ２／日で５日間である。
【００９１】
本明細書に記載の用量は、成人及び／又は子供のヒトの場合であるが、重量又は平方メートルサイズに応じて、他の哺乳動物のサイズに合わせて調節することができる。
【００９２】
好ましい一実施形態によれば、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する少なくとも１種の抗体、その機能的断片又は誘導体を含む組成物を使用して、神経芽細胞腫、神経膠腫、網膜芽細胞腫、腫瘍のユーイングファミリー、肉腫（すなわち、横紋筋肉腫、骨肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫及び線維肉腫）、小細胞肺癌、乳癌、黒色腫、転移性腎癌、頭頚部癌並びに血液癌（すなわち、白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫及び骨髄腫）を含む又はそれからなる群から選択される、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する癌を防止及び／又は処置するときには、少なくとも１種の抗癌剤は、シクロホスファミド、ドキソルビシン、トポテカン、イリノテカン、テモゾロマイド（ＴＭＺ）、レチノイン酸（ＲＡ）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フルダラビン、カルボプラチン及びシスプラチンを含む又はそれからなる群から選択される。
【００９３】
別の好ましい一実施形態によれば、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する少なくとも１種の抗体、その機能的断片又は誘導体を含む組成物を使用して、神経芽細胞腫を防止及び／又は処置するときには、抗癌剤は、テモゾロマイド、トポテカン、イリノテカン、フルダラビン、シクロホスファミド又はそれらの混合物である。
【００９４】
この好ましい実施形態においては、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する癌の処置として組み合わせて特許請求される化合物（すなわち、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する抗体と抗癌剤）の各々は、同じ疾患又は関連する症状に対して治療活性を有することが別途知られている。ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する抗体と抗癌剤を組み合わせると、予想外の技術的効果、すなわち相乗作用を生じる。
【００９５】
ある実施形態においては、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する少なくとも１種の抗体、その機能的断片又は誘導体は、
ａ）アミノ酸配列配列番号１の軽鎖可変領域（ＶＬ）ポリペプチド、及び
ｂ）アミノ酸配列配列番号２の重鎖可変領域（ＶＨ）
を含む。
【００９６】
「可変領域」という用語は、抗原への抗体の結合に関与する抗体重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）のドメインを指す。
【００９７】
好ましい一実施形態によれば、軽鎖可変領域（ＶＬ）ポリペプチドは、アミノ酸配列配列番号３である。
【００９８】
好ましくは、軽鎖可変領域（ＶＬ）ポリペプチドは、配列番号４、配列番号５、配列番号６及び配列番号７を含む又はそれからなる群において選択される。
【００９９】
別の好ましい一実施形態によれば、軽鎖可変領域（ＶＬ）ポリペプチドは、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９及び配列番号４０を含む又はそれからなる群において選択されるアミノ酸配列を有する。
【０１００】
好ましくは、軽鎖可変領域（ＶＬ）ポリペプチドは、配列番号３９及び配列番号４０を含む又はそれからなる群において選択されたアミノ酸配列を有する。
【０１０１】
別の好ましい一実施形態によれば、重鎖可変領域（ＶＨ）ポリペプチドは、アミノ酸配列配列番号８である。
【０１０２】
好ましくは、重鎖可変領域（ＶＨ）ポリペプチドは、配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１を含む又はそれからなる群において選択される。
【０１０３】
別の好ましい一実施形態によれば、重鎖可変領域（ＶＨ）ポリペプチドは、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、及び配列番号５１を含む又はそれからなる群において選択されたアミノ酸配列を有する。
【０１０４】
好ましくは、重鎖可変領域（ＶＨ）ポリペプチドは、配列番号４８、配列番号４９及び配列番号５０を含む又はそれからなる群において選択されたアミノ酸配列を有する。
【０１０５】
別の好ましい一実施形態によれば、軽鎖可変領域（ＶＬ）ポリペプチドは、アミノ酸配列配列番号１２である。
【０１０６】
別の好ましい一実施形態によれば、重鎖可変領域（ＶＨ）ポリペプチドは、アミノ酸配列配列番号１３である。
【０１０７】
更により好ましくは、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する少なくとも１種の抗体、その機能的断片又は誘導体は、
ａ）アミノ酸配列配列番号１４の軽鎖可変領域（ＶＬ）ポリペプチド、及び
ｂ）アミノ酸配列配列番号１５の重鎖可変領域（ＶＨ）
を含む。
【０１０８】
配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８のアミノ酸配列を有する重（ＶＨ）鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）、並びに配列番号１９、配列番号２０及び配列番号２１のアミノ酸配列を有する軽（ＶＬ）鎖可変領域の相補性決定領域。
【０１０９】
別の特定の一実施形態においては、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する少なくとも１種の抗体、その機能的断片又は誘導体は、
ａ）アミノ酸配列配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８の３つの重鎖相補領域（ＣＤＲ）と免疫グロブリン重鎖由来の重鎖フレームワーク配列とを含む重鎖、並びに
ｂ）アミノ酸配列配列番号１９、配列番号２０及び配列番号２１の３つの軽鎖相補領域（ＣＤＲ）と免疫グロブリン軽鎖由来の軽鎖フレームワーク配列とを含む軽鎖
を含む。
【０１１０】
相補性決定領域（ＣＤＲ）は、それぞれ、配列番号１５のアミノ酸残基２６〜３５（ＣＤＲ１＿ＶＨ）、５０〜６８（ＣＤＲ２＿ＶＨ）、９９〜１０８（ＣＤＲ３＿ＶＨ）、及び配列番号１４のアミノ酸残基２４〜３９（ＣＤＲ１＿ＶＬ）、５４〜６０（ＣＤＲ２＿ＶＬ）、９４〜１０２（ＣＤＲ３＿ＶＬ）に生じる。
【０１１１】
各ＣＤＲへのアミノ酸の割当ては、ＩＭＧＴ、Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａシステムを含めて、周知の付番システムに従う（ＩＭＧＴ、Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）、ＬＥＦＲＡＮＣら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ｖｏｌ．２７、ｐ：２０９−２１２、１９９９；ＫＡＢＡＴ、ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５版、Ｕ．Ｓ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、ＮＩＨ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、Ｎｏ９１−３２４２、９９１；ＣＬＯＴＨＩＡ＆ＬＥＳＫ、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．、ｖｏｌ．１９６（４）、ｐ：９０１〜９１７、１９８７）。
【０１１２】
「ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する抗体」という用語は、２５℃で２×１０５Ｍを超えるＯＡｃＧＤ２ガングリオシドに対する抗体の平衡結合定数（ＫＡ）、好ましくは２×１０６Ｍ以下のＫＡ、より好ましくは１×１０７Ｍ以上、又は更には２×１０７Ｍ以上のＫＡを指す。こうした親和性は、当該技術分野において利用可能な技術、例えば、スキャッチャード分析、競合ＥＬＩＳＡ、ＢＩＡＣＯＲＥアッセイ又はＫＩＮＥＸＡアッセイによって簡単に測定することができる。
【０１１３】
本発明によれば、本発明に係る組成物に使用される抗体は、ＧＤ２ガングリオシドに特異的ではない。本発明に係る組成物に使用される抗体の平衡結合定数（ＫＡ）は、ＧＤ２ガングリオシドに対してＯＡｃＧＤ２ガングリオシドに対するよりも少なくとも１／１０、より好ましくは少なくとも１／１００である。好ましくは、２５℃で１０５Ｍ未満のＧＤ２ガングリオシドに対する抗体の平衡結合定数（ＫＡ）、好ましくはＧＤ２ガングリオシドに対して１０４Ｍ未満のＫＡ。
【０１１４】
「機能的断片」という用語は、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドに特異的に結合する抗体断片を指す。こうした断片は、当業者が簡単に同定することができ、一例として、ｓｃＦｖ断片、Ｆａｂ断片（例えば、パパイン消化による）、Ｆａｂ’断片（例えば、ペプシン消化及び部分的還元による）、Ｆ（ａｂ’）２断片（例えば、ペプシン消化による）、Ｆａｃｂ（例えば、プラスミン消化による）、並びにＦｖ及びＦｄ（例えば、ペプシン消化、部分的還元及び再凝集による）断片を含み、本発明によって包含される。
【０１１５】
こうした断片は、ＳＴＡＮＷＯＲＴＨら（Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．１、ｃｈａｐｔｅｒ  ８、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１９７８）に記載のものなどの当該技術分野において周知の方法を用いて、酵素切断、合成又は組換え技術によって生成することができる。抗体は、抗体遺伝子を用いて種々の切断型で生成することもでき、１個以上の終止コドンが天然の終結部位の上流に導入される。例えば、Ｆ（ａｂ’）２重鎖部分をコードする組合せ遺伝子は、重鎖のＣＨ１ドメイン及び／又はヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列を含むように設計することができる。抗体の様々な部分を従来技術によって化学的に連結することができ、又は遺伝子操作技術を用いて隣接タンパク質として調製することができる。
【０１１６】
ここで、これらの断片は、前述の重鎖及び軽鎖の少なくとも可変領域を含む。
【０１１７】
これらの断片は、可溶性とすることができるが、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ：ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）の単鎖可変部として細胞膜内に固定することもできる。
【０１１８】
本明細書では「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」という用語は、抗体の少なくとも１個の抗原結合性ドメイン及び少なくとも１個のエフェクター細胞シグナル伝達ドメインを含む人工ハイブリッドポリペプチドを指す。こうしたＣＡＲは、人工的な特異性を特定の免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞及びＮＫＴ細胞）上に移植する操作された受容体を包含する。ＣＡＲを使用して、モノクローナル抗体の特異性をＭＨＣに拘束されない様式でＴ細胞上に付与することができ、したがってモノクローナル抗体の抗原結合性を活用することができる。Ｔ細胞中で発現されると、ＣＡＲは、生理学的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ：Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）とは異なる主要な組織適合性抗原のそれらの発現とは無関係に未処理の抗原を認識し、したがって腫瘍エスケープの２つの主要な機序、ＨＬＡ発現の下方制御又はプロテオソーム抗原プロセシングを迂回する。特異抗原へのＣＡＲの結合は、免疫応答を誘発する。
【０１１９】
特定の態様においては、ＣＡＲは、外部ドメイン、膜貫通ドメイン及び内部ドメインを含む。ここで、配列は、二重特異性抗体又はまた多量体などの多重結合であり得る（例えば、国際公開第２０１６／０１６３４３号に記載の多連鎖キメラ抗原受容体）。
【０１２０】
外部ドメインは、抗原結合性ドメイン及びスペーサードメイン（柄領域）に対応する。抗原結合性ドメインは、好ましくは、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。こうしたｓｃＦｖは、ＰＬＵＣＫＴＨＵＮにおいて一例として開示された柔軟なペプチドリンカーによって連結された、免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖、又はＶＨ、ＶＬなどのその一部から通常はなる遺伝子操作された抗体断片である（Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ｖｏｌ．１１３、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク、ｐ：２６９〜３１５、１９９４）。柔軟なペプチドリンカーは、６〜４０個のアミノ酸残基のペプチドであり得る。アラニン及びグリシンなどの小さいアミノ酸の使用は、柔軟なリンカーを作るのに有用である。例示的な柔軟なリンカーとしては、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、例えば、（ＧＳ）ｎ、ＧＳＧＧＳｎ（配列番号２２）ｎ、ＧＧＧＳｎ（配列番号２３）ｎ及びＧＧＧＧＳｎ（配列番号２４）ｎなどのグリシン−セリンポリマー、ここでｎは少なくとも１の整数である、グリシン−アラニンポリマー若しくはグリシン−セリンポリマー、又は当該技術分野で公知の他の柔軟なリンカーが挙げられる。有用なポリマーの例としては、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（（Ｇ４Ｓ）３；配列番号２５）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（ＣＤ１９リンカー；配列番号２６）、ＧＧＳＳＲＳＳＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（１８量体；配列番号２７）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（（Ｇ４Ｓ）４；配列番号２８）、ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（配列番号２９）、ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴ（配列番号３０）、ＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ（配列番号３１）、ＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号３２）又はＧＧＧＧＧＧ（配列番号３３）を挙げることができる。最後に、これらのｓｃＦｖ断片は、ＧＩＬＬＩＬＡＮＤら（Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ、ｖｏｌ．４７、ｐｐ．１〜２０、１９９６）によって記述されたものなどの当業者に周知の方法によって得ることができる。本明細書では「柄領域」という用語は、「スペーサー又はヒンジドメイン」とも呼ばれ、膜貫通ドメインを外部ドメインに連結するように機能する任意のオリゴ又はポリペプチドを指す。特に、柄領域を使用して、より大きい柔軟性及び到達性を外部ドメインに付与する。スペーサー配列は、ＣＡＲにおいて主に構造上の役割を果たす。スペーサーは、標的部分をＴ細胞膜から物理的に分離する。必要な最適距離は、各抗原で異なる可能性がある。効率的な標的接近を可能にするために、ＣＡＲが標的細胞膜に近いエピトープに結合する場合、又は抗原のサイズ及びグリコシル化状態が複雑であるときに、スペーサーが必要であると思われる。ヒトＩｇＧ由来のスペーサー（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）は、ＣＡＲ発現に対するその安定化作用のために一般に使用されるが、骨髄細胞上のスペーサーのＦｃドメインとＦｃガンマ受容体（ＦｃｇＲ）との相互作用は、Ｔ細胞の活性化誘導細胞死をもたらし、インビボでの存続が限定される可能性がある。これは、ＦｃｇＲ結合に不可欠である定常重鎖（ＣＨ）２ドメインの領域を除��又は改変することによって克服され、それによって前臨床モデルにおいてインビボでのＣＡＲ  Ｔ細胞存続及び抗腫瘍活性を改善することができる。一般に使用される他のヒンジドメインとしては、ＣＤ２８若しくはＣＤ８から誘導されるもの、又はヒトＩｇＧ由来のスペーサーからの他の切断断片が挙げられる。好ましい一実施形態においては、ＣＡＲは、外部ドメインと膜貫通ドメインの間の柄領域を含む。柄領域は、最高３００個のアミノ酸、好ましくは１０〜１００個のアミノ酸及び最も好ましくは２５〜５０個のアミノ酸を含むことができる。この柄領域は、ＣＤ８、ＣＤ４若しくはＣＤ２８の細胞外領域の一部などの天然の分子のすべて若しくは一部、又は抗体定常領域のすべて若しくは一部に由来することができる。あるいは、この柄領域は、合成配列とすることができる。
【０１２１】
膜貫通ドメインは、膜アンカードメインであり、外部ドメインと内部ドメインとの間のリンカーでもある。この膜貫通ドメインは、ヒトＩｇＧ４Ｆｃヒンジ領域、Ｆｃ領域、ＣＤ４膜貫通ドメイン、Ｔ細胞受容体膜貫通、又はＣＤ１６などの他のヒト膜貫通シグナル伝達タンパク質由来の他の膜貫通ドメイン、ＴＣＲゼータ鎖（ＣＤ３ζ）、ＣＤ２８及びＣＤ８及びエリスロポイエチン受容体、並びにそれらの変異体であり得る。好ましくは、この膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体膜貫通ドメインである。好ましくは、Ｔ細胞受容体膜貫通ドメインは、抗原のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と複合体を形成することができる膜貫通タンパク質に由来する。好ましくは、Ｔ細胞受容体膜貫通ドメインは、ＴＣＲゼータ鎖（ＣＤ３ζ）、ＣＤ２８、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、４−１ＢＢ／ＣＤ１３７／ＴＮＦＲＳＦ９、ＦｃεＲＩγ、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＩＬＲＢ／ＣＤ１２２、ＩＬ−２ＲＧ／ＣＤ１３２、ＣＤ２７、ＤＡＰ１０及びＣＤ４０の１つ以上の一部又は全部を含む。
【０１２２】
内部ドメインは、細胞内シグナル伝達ドメインであり、これは、免疫細胞を活性化させる標的抗原への外部ドメインの結合後の細胞内シグナル伝達を担う。換言すれば、細胞内シグナル伝達ドメインは、キメラ受容体が発現される免疫細胞の正常エフェクター機能の少なくとも１つの活性化の原因である。「エフェクター機能」という用語は、細胞溶解性活性、又はサイトカインの分泌を含めたヘルパー活性であり得る、Ｔ細胞の特殊機能を指す。したがって、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを伝達し、特殊機能を果たすように細胞を誘導する、タンパク質の部分を指す。通常は全細胞内シグナル伝達ドメインが使用されるが、多くの場合において、全細胞内ポリペプチドを使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの切断部分を使用することができる程度に、こうした切断部分は、エフェクター機能シグナルを依然として伝達する限り、完全な鎖の代わりに使用することができる。細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、したがって、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な細胞内シグナル伝達ドメインの任意の切断部分を含むことを意味する。
【０１２３】
多連鎖ＣＡＲに使用されるシグナル伝達ドメインの好ましい例は、Ｆｃ受容体又はＴ細胞受容体及び協調して働いて抗原受容体結合後にシグナル伝達を開始する共受容体の細胞質配列、並びにこれらの配列の任意の誘導体又は変異体、及び同じ機能的能力を有する任意の合成配列であり得る。シグナル伝達ドメインは、抗原依存性一次活性化を惹起するもの、及び抗原非依存的に働いて、二次又は共刺激シグナルを与えるものの２つの異なるクラスの細胞質シグナル伝達配列を含む。一次細胞質シグナル伝達配列は、ＩＴＡＭの免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフとして知られるシグナル伝達モチーフを含むことができる。ＩＴＡＭは、ｓｙｋ／ｚａｐ７０クラスチロシンキナーゼの結合部位として働く種々の受容体の細胞質内末端に見られる明確に定義されたシグナル伝達モチーフである。本発明に使用されるＩＴＡＭの例としては、非限定的例として、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＦｃＲイプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ及びＣＤ６６ｄから誘導されるものが挙げられる。好ましい一実施形態においては、多連鎖ＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン、又はＦｃイプシロンＲＩベータ若しくはガンマ鎖の細胞質内ドメインを含むことができる。
【０１２４】
特定の実施形態においては、本発明の多連鎖ＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル分子を含む。共刺激分子は、効率的免疫応答に必要である抗原受容体以外の細胞表面分子又はそれらのリガンドである。
【０１２５】
「共刺激リガンド」とは、Ｔ細胞上の同族の共刺激分子に特異的に結合し、それによって、例えば、ペプチドを含むＭＨＣ分子とのＴＣＲ／ＣＤ３複合体の結合によって与えられる一次シグナルに加えて、増殖活性化、分化などを含めて、ただしそれらに限定されない、Ｔ細胞応答を媒介するシグナルを与える、抗原提示細胞上の分子を指す。共刺激リガンドとしては、ＣＤ７、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、誘導性共刺激リガンド（ＩＣＯＳ−Ｌ）、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８３、ＨＬＡ−Ｇ、ＭＩＣＡ、Ｍ１ＣＢ、ＨＶＥＭ、リンホトキシンベータ受容体、３／ＴＲ６、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４）、Ｔｏｌｌリガンド受容体に結合する作動物質又は抗体、Ｂ７−Ｈ３に特異的に結合するリガンドなどが挙げられるが、それらに限定されない。共刺激リガンドは、とりわけ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−ＩＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ−１０、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＴＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３に特異的に結合するリガンドなど、ただしそれらに限定されない、Ｔ細胞上に存在する共刺激分子に特異的に結合する抗体も包含する。
【０１２６】
「共刺激分子」とは、共刺激リガンドに特異的に結合し、それによって増殖など、ただしそれに限定されない、細胞による共刺激反応を媒介する、Ｔ細胞上の同族の結合パートナーを指す。共刺激分子としては、ＭＨＣクラスＩ分子、ＢＴＬＡ及びＴｏｌｌリガンド受容体が挙げられるが、それらに限定されない。共刺激分子の例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ−１０、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、及びＣＤ８３に特異的に結合するリガンドなどが挙げられる。
【０１２７】
「その誘導体」という用語は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０及び配列番号５１を含む又はそれからなる群において選択されたアミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％（すなわち、それぞれ約１２、６及び２個のアミノ酸置換に対応する）、好ましくは少なくとも９９％（すなわち、約１個のアミノ酸置換に対応する）の同一性の割合を有するアミノ酸配列を指す。
【０１２８】
ＣＤＲ配列に関連して、その誘導体という用語は、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０及び配列番号２１を含む又はそれからなる群において選択されたアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％（すなわち、それぞれ約２個及び１個のアミノ酸置換に対応する）の同一性の割合を有するアミノ酸配列を指す。
【０１２９】
こうした誘導体は、当業者がその個人的な知識及び本特許出願の教示を考慮して簡単に同定することができる。天然アミノ酸を化学修飾アミノ酸で置き換え得ることも理解される。一般に、こうした化学修飾アミノ酸は、ポリペプチド半減期を増加させる。
【０１３０】
本明細書では２個のアミノ酸配列間の「同一性の割合」は、比較される２個の配列間の、前記配列の最良の整列で得られる同一のアミノ酸の割合を意味し、この割合は純粋に統計学的なものであり、これら２個の配列間の相違はアミノ酸配列上で無作為に分布している。本明細書では「最良の整列」又は「最適な整列」は、求められた同一性の割合（下記参照）が最高である整列を意味する。２個のアミノ酸配列間の配列比較は、通常、最良の整列に従って前もって整列されたこれらの配列を比較することによって実施され、この比較は、類似性の局所的領域を同定し、比較するために、比較のセグメント上で実施される。比較を行う最良の配列整列は、手作業のほかに、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄ．Ａｐｐ．Ｍａｔｈ．、ｖｏｌ．２、ｐ：４８２、１９８１）によって開発された局所的相同性アルゴリズムを用いて、Ｎｅｄｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、ｖｏｌ．４８、ｐ：４４３、１９７０）によって開発された全体的相同性アルゴリズムを用いて、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍｏｌａｎ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、ｖｏｌ．８５、ｐ：２４４４、１９８８）によって開発された類似性の方法を用いて、こうしたアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ  ＵＳＡ中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ  Ｐ、ＢＬＡＳＴ  Ｎ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡ）を用いたコンピュータソフトウェアを用いて、ＭＵＳＣＬＥ多重整列アルゴリズム（Ｅｄｇａｒ、Ｒｏｂｅｒｔ  Ｃ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ｖｏｌ．３２、ｐ：１７９２、２００４）を用いて、実施することができる。最良の局所的整列を得るために、好ましくは、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスを有するＢＬＡＳＴソフトウェアを使用することができる。２個のアミノ酸配列間の同一性割合は、最適に整列させたこれら２個の配列を比較することによって求められ、アミノ酸配列は、これら２個の配列間の最適な整列を得るために、参照配列に対する追加又は欠失を包含することができる。同一性の割合は、これら２個の配列間の同一の位置の数を求め、この数を比較位置の全数で割り、得られる結果に１００を掛けて、これら２個の配列間の同一性の割合を得ることによって計算される。
【０１３１】
本発明の組成物に使用される抗体は、組換えによって生成される。
【０１３２】
本発明の組成物に使用される抗体は、グリコシル化されても、されなくてもよいが、グリコシル化抗体が好ましい。好ましい一実施形態においては、本発明の組成物に使用される抗体を低フコースとすることができる。
【０１３３】
本発明の組成物に使用される抗体を、免疫複合体とすることができる。
【０１３４】
本明細書では「免疫複合体」という用語は、第２の分子、好ましくは免疫調節剤、細胞傷害性薬物又は放射性同位体に結合した少なくとも１種の抗体、その機能的断片又は誘導体を含む複合分子を指す。こうした免疫複合体は、抗体薬物複合体（ＡＤＣ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）、免疫サイトカイン（ＩＣＫ）又は抗体ラジオ複合体（ＡＲＣ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｒａｄｉｏ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）であり得る。ここで、この第２の分子は、別の抗原に対して結合特異性を有する抗体とすることができ、形成される免疫複合体は、ＢｉＴＥ（二重特異性Ｔ細胞結合体）などの二重特異性抗体である。前記抗体又はその断片は、前記第２の分子と複合化又は共有結合する（例えば、融合タンパク質）。好ましくは、前記抗体又はその断片は、共有結合によって前記第２の分子に結合する。この第２の分子は、糖類と特異的に相互作用して、レクチンなどの非共有結合を形成することができるタンパク質又は糖タンパク質とすることができる。
【０１３５】
本発明の組成物に使用される抗体は、二重特異性又は多重特異性抗体とすることができる。二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ）、二重特異性Ｔ細胞結合体（ＢｉＴＥ）、二重特異性抗体、四価タンデム抗体（ＴａｎｄＡｂｓ）又は二重親和性再標的分子（ＤＡＲＴ）などの幾つかの形式が、組成物に使用される抗体の適切な形式である（ＷＥＩＤＬＥら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ＆  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、２０１３、ｖｏｌ．１０、ｐｐ．１〜１８）。
【０１３６】
好ましくは、患者がヒトであるときには、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する癌の処置に使用される抗体は、抗体のヒト又はヒト化（ＣＤＲグラフト）バージョンであるが、抗体のマウスバージョンを使用することもできる。反復処置を考えるときには、ヒト又はヒト化ＩｇＧ抗体は、患者から抗ＩｇＧ免疫応答を発生する可能性が低い。
【０１３７】
すべての実施形態においては、本発明に係る組成物は、治療有効量の少なくとも１種の抗癌剤及び治療有効量のＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する少なくとも１種の抗体、その機能的断片又は誘導体を含む。
【０１３８】
好ましい一実施形態によれば、抗体、その機能的断片又は誘導体は、注射によって対象１ｍ２当たり用量２〜２，０００ｍｇ、好ましくは用量５〜１，０００ｍｇ／ｍ２、最も好ましくは用量１０〜５００ｍｇ／ｍ２で投与することができる。
【０１３９】
本明細書に記載の用量は、ヒトの場合であるが、重量又は平方メートルサイズに応じて、他の哺乳動物及び小児のサイズに合わせて調節することができる。
【０１４０】
本明細書では「治療有効量」という用語は、所望の治療効果又は生物学的効果が得られる任意の量を包含するものとする。治療効果は、処置されるＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する癌又は所望の生物学的効果に依存する。したがって、治療効果は、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する癌に付随する症候の重症度の低下、及び／又はＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する癌の進行の（部分的又は完全な）阻害であり得る。治療反応を誘発するのに必要とされる量は、癌タイプ、患者の年齢、健康、体格及び性別に基づいて決定することができる。
【０１４１】
最適な量は、処置に対する患者の反応のモニタリングに基づいて決定することもできる。
【０１４２】
ある実施形態においては、組成物は、療法に使用される薬学的に許容される担体も含む。
【０１４３】
「薬学的に許容される」という表現は、生理学的に容認でき、ヒトに投与したときにアレルギー反応又は胃の不調、めまいなどの類似の望ましくない反応を一般に生じない、分子的実体及び組成物を指す。好ましくは、本明細書では、「薬学的に許容される」という表現は、連邦若しくは州政府の規制行政機関によって承認可能であること、又は米国薬局方若しくは動物用、より具体的にはヒト用の他の一般に認知された薬局方に記載されていることを意味する。
【０１４４】
「担体」という用語は、化合物が一緒に投与される溶媒、アジュバント、賦形剤又はビヒクルを指す。こうした薬剤担体は、落花生油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などの石油、動物、野菜又は合成起源のものを含めて、水及び油などの無菌液体とすることができる。
【０１４５】
前記組成物は、溶液剤、懸濁液剤、凍結乾燥散剤、カプセル剤及び錠剤を含めて、ただしそれらに限定されない、患者への投与に適切な任意の剤形とすることができる。ここで、本発明の組成物の投与経路は好ましくは非経口であり、本明細書では「非経口」という用語は、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、直腸、膣、粘膜、髄腔内、頭蓋内又は腫瘍内投与を含む。したがって、医薬組成物は、注射しようとする製剤に対して薬学的に許容されたビヒクルを含む。これらは、特に、等張性無菌食塩水（リン酸一ナトリウム若しくはリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、カリウム、カルシウム若しくはマグネシウムなど、又はこうした塩の混合物）、或いは症例に応じて滅菌水若しくは生理食塩水を添加して注射液を構成することができる乾燥、特に凍結乾燥組成物とすることができる。適切な薬剤担体は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。
【０１４６】
最も好ましくは、組成物は、患者への静脈内投与に適切な任意の剤形である。
【０１４７】
本発明の抗体、機能的断片又は誘導体は、緩衝剤若しくは水に可溶化することができ、又は乳濁液、マイクロエマルジョン、ヒドロゲル（例えば、ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＰＬＧＡトリブロックコポリマーベースのヒドロゲル）、ミクロスフェア、ナノスフェア、微粒子、ナノ粒子（例えば、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）微粒子（例えば、ポリ乳酸（ＰＬＡ：ｐｏｌｙ  ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ）；ポリ（ラクチド−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）；ポリグルタミン酸ミクロスフェア、ナノスフェア、微粒子又はナノ粒子）、リポソーム、若しくは他のガレヌス製剤に入れることができる。すべての場合において、製剤は、無菌であり、注射器に許容される程度の流体でなければならない。製剤は、製造及び貯蔵条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。
【０１４８】
分散液剤は、グリセロール、液状ポリエチレングリコール及びそれらの混合物中並びにオイル中で調製することもできる。通常の貯蔵及び使用条件下では、これらの製剤は、微生物の増殖を防止するために防腐剤を含む。
【０１４９】
本発明の抗体、機能的断片又は誘導体は、組成物中に中性又は塩の形で処方することができる。薬学的に許容される塩としては、例えば、塩酸、リン酸などの無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸と一緒に形成される（タンパク質の遊離アミノ基と一緒に形成される）酸付加塩が挙げられる。遊離カルボキシル基と一緒に形成される塩は、例えば、水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム又は鉄（ＩＩＩ）などの無機塩基、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導することもできる。
【０１５０】
担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液状ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、及び植物油を含む、溶媒又は分散媒とすることもできる。本発明の抗体は、その生物学的利用能を高めるように、一例としてＰＥＧ化によって、改変することもできる。
【０１５１】
適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液剤の場合には必要な粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって、維持することができる。微生物の作用は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって防止することができる。多くの場合において、等張化剤、例えば、糖又は塩化ナトリウムを含むことが好ましい。
【０１５２】
注射用組成物の吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン、ポリオール並びに半減期延長共有結合性及び非共有結合性製剤を、組成物中で使用することによって延長することができる。
【０１５３】
加水分解及び変性を含めて、ペプチドの不安定性又は劣化の多数の原因が存在する。疎水性相互作用は、分子の集塊（すなわち、凝集）を生じ得る。安定剤を添加して、こうした問題を減少又は防止することができる。
【０１５４】
安定剤としては、シクロデキストリン及びその誘導体が挙げられる（米国特許第５，７３０，９６９号参照）。スクロース、マンニトール、ソルビトール、トレハロース、デキストラン、グリセリンなどの適切な防腐剤を添加して、最終製剤を安定化することもできる。イオン及び非イオン界面活性剤、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロース、Ｄ−ガラクツロン酸、トレハロース、デキストラン、ヒドロキシエチルデンプン並びにそれらの混合物から選択される安定剤を、製剤に添加することができる。アルカリ金属塩又は塩化マグネシウムの添加は、ペプチドを安定化することができる。ペプチドは、それをデキストラン、コンドロイチン硫酸、デンプン、グリコーゲン、デキストリン及びアルギン酸塩からなる群から選択される糖類と接触させることによって安定化することもできる。添加することができる別の糖としては、単糖、二糖、糖アルコール及びそれらの混合物（例えば、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、スクロース、マルトース、ラクトース、マンニトール、キシリトール）が挙げられる。ポリオールは、ペプチドを安定化することができ、水混和性又は水可溶性である。適切なポリオールは、マンニトール、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、トリメチルグリコール、ビニルピロリドン、グルコース、フルクトース、アラビノース、マンノース、マルトース、スクロース及びそれらのポリマーを含めて、ポリヒドロキシアルコール、単糖及び二糖とすることができる。血清アルブミン、アミノ酸、ヘパリン、脂肪酸及びリン脂質、界面活性剤、金属、ポリオール、還元剤、金属キレート剤、ポリビニルピロリドン、加水分解ゼラチン及び硫酸アンモニウムを含めた種々の賦形剤も、ペプチドを安定化することができる。
【０１５５】
すべての実施形態においては、分子量１００ダルトン〜２００，０００ダルトンの少なくとも１種の抗癌剤、及びＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する少なくとも１種の抗体、その機能的断片又は誘導体を別々に、同時に又は逐次的に投与することができる。
【０１５６】
ある実施形態においては、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する少なくとも１種の抗体、機能的断片又は誘導体と別々に、同時に又は逐次的に投与される少なくとも１種の抗癌剤は、分子量が１０ｋＤａ〜１５ｋＤａである。
【０１５７】
さらに、ある実施形態においては、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する少なくとも１種の抗体、機能的断片又は誘導体と別々に、同時に又は逐次的に投与される少なくとも１種の抗癌剤は、分子量が８０ｋＤａ〜２００ｋＤａである。
【０１５８】
さらに、ある実施形態においては、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する少なくとも１種の抗体、機能的断片又は誘導体と別々に、同時に又は逐次的に投与される少なくとも１種の抗癌剤は、分子量が１２０〜８００ダルトンである。
【０１５９】
例えば、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する少なくとも１種の抗体、その機能的断片又は誘導体は、分子量１００ダルトン〜２００，０００ダルトンの少なくとも１種の抗癌剤の投与前に投与することができる。投与の方法及び順序は、組合せの有効性を最大にすることを目指し、各投与は、迅速な総投与から持続注入まで、時間を変えることができる。結果として、分子量１００ダルトン〜２００，０００ダルトンの少なくとも１種の抗癌剤とＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する少なくとも１種の抗体、その機能的断片又は誘導体との組合せは、それらの物理的結合によって得られるものにも、同時又は逐次的とすることができる別々の投与を許容するものにも限定されない。
【０１６０】
ある実施形態においては、医薬組成物は、アルキル化剤、代謝拮抗物質、抗腫瘍抗体、抗腫瘍性抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、有糸分裂阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、コルチコステロイド、ホルモン又はホルモン様薬物、サイトカイン、ヌクレオシド類似体などを含めて、ただしそれらに限定されない、第２、第３、第４、第ｎの抗癌剤も含む。
【０１６１】
別々に又は同じ組成物で投与される、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する癌の処置及び／又は防止方法に使用される、（ｉ）分子量１００ダルトン〜２００，０００ダルトンの少なくとも１種の抗癌剤と、（ｉｉ）ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する少なくとも１種の抗体、その機能的断片又は誘導体と、場合によっては（ｉｉｉ）薬学的に許容される担体とを含む組成物と組み合わせることができる別の抗癌剤の例としては、
（ａ）アルキル化剤：メクロラミン（ｍｅｃｈｌｏｒａｍｉｎｅ）、クロラムブシル、イホスファミド、メルファランなど、
（ｂ）代謝拮抗物質：６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）、カペシタビン、シタラビン、フロクスウリジン、フルダラビン、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、メトトレキサート、ペメトレキセドなど、
（ｃ）抗腫瘍性抗生物質：アクチノマイシン−Ｄ、ブレオマイシン、マイトマイシン−Ｃ、ミトキサントロンなど、
（ｄ）トポイソメラーゼ阻害剤：エトポシド（ＶＰ−１６）、テニポシドなど、
（ｅ）有糸分裂阻害剤：パクリタキセル、ドセタキセルなど、
（ｆ）チロシンキナーゼ阻害剤：イマチニブ、ゲフィニニブ（ｇｅｆｉｎｉｎｉｂ）、スニチニブなど、
（ｇ）コルチコステロイド：プレドニゾン、メチルプレドニゾン、デキサメタゾンなど、
（ｈ）ホルモン又はホルモン様薬物：フルベストラント、タモキシフェン、トレミフェン、アナストロゾール、エキセメスタン、レトロゾール、酢酸メゲストロール、エストロゲン、ビカルタミド、フルタミド、ニルタミド、ロイプロリド、ゴセレリンなど、
（ｉ）サイトカイン：特異抗原と接触すると１つの細胞集団（例えば、初回刺激Ｔ−リンパ球）によって放出され、細胞間の細胞間媒介物質として作用する約５〜２０ｋＤａの可溶性低分子タンパク質。サイトカインの例としては、リンホカイン、モノカイン、インターロイキン、並びに腫瘍壊死因子（ＴＮＦ：ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ）及びインターフェロンなどの幾つかの関連したシグナル伝達分子が挙げられる、
（ｊ）ヌクレオシド類似体：クラドリビン、フルダラビン、ペントスタチンなど
が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１６２】
ある実施形態においては、医薬組成物は、核酸、こうした二本鎖合成短鎖ＲＮＡ分子（ｍｉＲＮＡ）又は合成ＤＮＡ／ＲＮＡ様オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を含めて、ただしそれらに限定されない、第２、第３、第４、第ｎの抗癌剤も含む。マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、ｍＲＮＡ翻訳の転写後減衰に関与する１６〜２５ヌクレオチドの内在性一本鎖非コードＲＮＡである。それらの調節解除は、癌を含めた多数の疾患で頻繁に認められる。ｍｉｒ−３４ファミリー及びｍｉｒ−１７−９２クラスターの重要性は、神経芽細胞腫における腫瘍形成と転移との両方で確立されたのに対して、ｍｉｒ−１８４の過剰発現は、神経芽細胞腫腫瘍増殖を減少させる（Ｃｈｕ及びＬｅｅ、２０１２、Ｉｎｔｅｃｈ、ＭｉｃｒｏＲＮＡ  ｔａｒｇｅｔ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ  ｉｎ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  ｓｔａｇｅ  Ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ，Ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ−Ｐｒｅｓｅｎｔ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ、Ｐｒｏｆ．Ｈｉｒｏｙｕｋｉ  Ｓｈｉｍａｄａ、ＩＢＳＮ９７８−９５３−３０７−０１６−２、１３章、ｐｐ．２７１〜２８６）。したがって、ｍｉＲＮＡ活性を上方調節するｍｉＲＮＡ模倣物又はアゴミル、個々のｍｉＲＮＡ分子をノックダウンするｍｉＲＮＡ阻害剤又はアンタゴミルなどの種々のタイプの小さい一本鎖又は二本鎖化学合成及び最適化核酸（約２２ヌクレオチドから）の設計によって、特定のｍｉＲＮＡ活性を制御する、又は細胞におけるｍｉＲＮＡ細胞レベルを厳重に調節することが可能である。ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する癌に関与するｍｉＲＮＡを標的にしたこうした短鎖化学合成核酸を、本発明に係る組成物に使用することができる。
【０１６３】
本発明の第２の態様は、抗癌剤を含むＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する癌の処置の有効性を高める方法であって、（ｉ）分子量１００ダルトン〜２００，０００ダルトンの少なくとも１種の抗癌剤と、（ｉｉ）ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する少なくとも１種の抗体、その機能的断片又は誘導体と、場合によっては（ｉｉｉ）薬学的に許容される担体とを含む有効量の組成物をそれを必要とする患者に投与するステップを含む、前記方法に関する。
【０１６４】
ある実施形態においては、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する癌の処置の有効性を高める方法に使用される組成物において、少なくとも１種の抗癌剤は分子量が１０ｋＤａ〜１５ｋＤａである。
【０１６５】
さらに、ある実施形態においては、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する癌の処置の有効性を高める方法に使用される組成物において、少なくとも１種の抗癌剤は分子量が８０ｋＤａ〜２００ｋＤａである。
【０１６６】
さらに、ある実施形態においては、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する癌の処置の有効性を高める方法に使用される組成物において、少なくとも１種の抗癌剤は分子量が１２０〜８００ダルトンである。
【０１６７】
「処置の有効性を高める」という表現は、唯一の抗癌剤を用いた処置と比べた本発明の方法によって得られる癌細胞死の数の増加を指す。
【０１６８】
分子量１００ダルトン〜２００，０００ダルトンの抗癌剤の有効性は、抗癌処置において分子量１００ダルトン〜２００，０００ダルトンの抗癌剤とは異なる作用機序を有するＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する少なくとも１種の抗体、その機能的断片又は誘導体と組み合わせて投与するとかなり改善することができる。
【０１６９】
本発明に係る組合せの改善された有効性は、治療相乗作用を求めることによって実証することができる。「相乗作用」の明確な十分認められた定義は、各薬物の効果の知識から個々に予想される単純な相加作用よりも組み合わせた薬物の効果が大きいことである。相乗作用の可能な好都合な結果は、治療効果の有効性を高めることができる。好ましくは、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する癌は、本発明の組成物を使用したときに、より有効に処置される。
【０１７０】
分子量１００ダルトン〜２００，０００ダルトンの少なくとも１種の抗癌剤とＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する少なくとも１種の抗体、その機能的断片又は誘導体との組合せの有効性は、Ｃｈｏｕ及びＴａｌａｌａｙによって開発されたＣｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｉｎｄｅｘ（ＣＩ）手法を用いて測定実験データから解釈することができる（Ｃｈｏｕ  ＴＣ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｖ  ５８：６２１〜６８１、２００６）。手短に述べると、２種の薬物（Ｄ）１と（Ｄ）２の組合せ比（Ｄ）１：（Ｄ）２＝Ｐ：Ｑの組合せの場合、組合せ（Ｄ）１，２＝（Ｄ）１＋（Ｄ）２において、本発明者らは（Ｄ）１＝（Ｄ）１，２×［Ｐ／（Ｐ＋Ｑ）］及び（Ｄ）２＝（Ｄ）１，２×［Ｑ／（Ｐ＋Ｑ）］を得る。組合せ指数式ＣＩｘ＝［（Ｄ）１／（Ｄｘ）１］＋［（Ｄ）２／（Ｄｘ）２］の示すところによれば、系のｘ％阻害Ｄｘに対する（Ｆａ）ｘの所与の効果では、各薬物の分割用量の合計に対する組合せ相加作用（Ｄ）１／（Ｄｘ）１及び（Ｄ）２／（Ｄｘ）２は１に等しいはずである。ＣＩ＝１は相加作用を示し、ＣＩ＜１は相乗効果を示し、ＣＩ＞１は拮抗作用を示す。
【０１７１】
固形腫瘍に対する組合せの有効性は、例えば、処置前後の腫瘍サイズの数値を比較することによって実験的に求めることもできる。好ましくは、本明細書に開示される分子量１００ダルトン〜２００，０００ダルトンの少なくとも１種の抗癌剤とＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する少なくとも１種の抗体、その機能的断片又は誘導体との組合せは、腫瘍サイズが少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、１００％、より好ましくは少なくとも５０〜７０％減少すると有効である。
【０１７２】
固形腫瘍に対する組合せの有効性は、例えば、癌細胞数、末梢臓器への癌細胞浸潤、又は腫瘍転移の追跡調査によって求めることもできる。
【０１７３】
癌治療の有効性は、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する癌に罹患した患者の生存期間、無増悪生存期間（ＰＦＳ：ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｆｒｅｅ  ｓｕｒｖｉｖａｌ）、奏効率（ＲＲ：ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｒａｔｅ）、反応の持続時間、及び／又は生活の質を評価することによって測定することもできる。
【０１７４】
好ましい実施形態においては、本発明に係る組成物の分子量１００ダルトン〜２００，０００ダルトンの少なくとも１種の抗癌剤は、単一の薬剤としてＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する癌を処置するために最初に選択されたものと同じである。
【０１７５】
相乗作用の別の可能な好都合な成果は、少なくとも１種の抗癌剤の投与量の削減であり得るが、毒性を回避するために同じ有効性を高める、又は維持することができる。
【０１７６】
本発明の第３の態様は、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する癌に罹患した患者における抗癌剤に対する感受性を高める方法であって、（ｉ）分子量１００ダルトン〜２００，０００ダルトンの少なくとも１種の抗癌剤と、（ｉｉ）ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する少なくとも１種の抗体、その機能的断片又は誘導体と、場合によっては（ｉｉｉ）薬学的に許容される担体とを含む有効量の組成物をそれを必要とする患者に投与するステップを含む、前記方法に関する。
【０１７７】
ある実施形態においては、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する癌に罹患した患者における抗癌剤に対する感受性を高める方法に使用される組成物において、少なくとも１種の抗癌剤は分子量が１０ｋＤａ〜１５ｋＤａである。
【０１７８】
さらに、ある実施形態においては、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する癌に罹患した患者における抗癌剤に対する感受性を高める方法に使用される組成物において、少なくとも１種の抗癌剤は分子量が８０ｋＤａ〜２００ｋＤａである。
【０１７９】
さらに、ある実施形態においては、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する癌に罹患した患者における抗癌剤に対する感受性を高める方法に使用される組成物において、少なくとも１種の抗癌剤は分子量が１２０〜８００ダルトンである。
【０１８０】
癌の改善された処置を提供することに加えて、本明細書に記載のある組合せの投与は、患者の生活の質を、異なる処置を受けた同じ患者が経験する生活の質に比べて改善することができる。例えば、それを必要とする患者に対する本明細書に記載のＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する少なくとも１種の抗体、その機能的断片又は誘導体と抗癌剤の組合せの投与は、同じ患者が抗癌剤のみを療法として受けた場合に経験するであろう生活の質に比べて改善された生活の質を提供することができる。例えば、本明細書に記載の組合せとの併用療法は、必要な抗癌剤の用量を削減し、それによって治療に付随する副作用（例えば、悪心、嘔吐、脱毛、発疹、食欲減退など）を軽減することができる。組合せは、腫瘍量及び疼痛、臓器障害、体重減少などの関連有害事象を減少させることもできる。
【０１８１】
相乗作用の別の可能な好都合な成果は、薬剤耐性の発生及びその劇的な結果、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する癌の再発を最小限にする、又は遅延させることができる。
【０１８２】
本発明の第４の態様は、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する癌に罹患した患者における抗癌剤に対して抵抗性の癌の発生を防止又は遅延させる方法であって、（ｉ）分子量１００ダルトン〜２００，０００ダルトンの少なくとも１種の抗癌剤と、（ｉｉ）ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する少なくとも１種の抗体、その機能的断片又は誘導体と、場合によっては（ｉｉｉ）薬学的に許容される担体とを含む有効量の組成物をそれを必要とする患者に投与するステップを含む、前記方法に関する。
【０１８３】
ある実施形態においては、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する癌に罹患した患者における抗癌剤に対して抵抗性の癌の発生を防止又は遅延させる方法に使用される組成物において、少なくとも１種の抗癌剤は分子量が１０ｋＤａ〜１５ｋＤａである。
【０１８４】
さらに、ある実施形態においては、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する癌に罹患した患者における抗癌剤に対して抵抗性の癌の発生を防止又は遅延させる方法に使用される組成物において、少なくとも１種の抗癌剤は分子量が８０ｋＤａ〜２００ｋＤａである。
【０１８５】
さらに、ある実施形態においては、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する癌に罹患した患者における抗癌剤に対して抵抗性の癌の発生を防止又は遅延させる方法に使用される組成物において、少なくとも１種の抗癌剤は分子量が１２０〜８００ダルトンである。
【０１８６】
単一の抗癌剤を用いた癌の一次処置（すなわち、第一選択の癌処置）後、患者が癌又は癌の徴候及び症候の再発前にその癌のいかなる徴候も症候もなしに短期間生存することは異常なことではない。分子量１００ダルトン〜２００，０００ダルトンの少なくとも１種の抗癌剤と（ｉｉ）ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する少なくとも１種の抗体、その機能的断片又は誘導体の組合せを使用することによって、目的は、耐性細胞の増殖をもたらすクローン選択を防止することである。
【０１８７】
好ましい一実施形態においては、本発明に係る組成物の分子量１００ダルトン〜２００，０００ダルトンの少なくとも１種の抗癌剤は、癌の抵抗性の始まりにおけるものとは異なる。
【０１８８】
治療抵抗性の機序は、抗癌剤によって損傷されたＤＮＡの認識及び修復の増加、細胞周期チェックポイント制御の変化、アポトーシス経路の機能障害、並びに抗癌剤を流出するＡＢＣ輸送体の発現増加の結果としての薬物蓄積の減少を含む。癌幹細胞（ＣＳＣ：Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ）が化学及び放射線療法に対する抵抗性の増加を特徴とする癌内の細胞の亜集団であるという証拠が現れ、従来の抗癌手法が、腫瘍形成を惹起し永続させる細胞サブセットを根絶するのに失敗することが多いことを示している。そこで、ＣＳＣ以外の癌細胞が、もしかすると類似経路を利用することによって化学及び放射線療法に対する抵抗性を増加させる可能性がある。化学療法抵抗性の逆転は、ヒト黒色腫で示されるように、多剤耐性ＡＢＣ輸送体の特異的遮断によって行うことができる。
【０１８９】
驚くべきことに、本発明者らは、特にＣＳＣ集団において、抗癌剤摂取に関与する多剤耐性トランスポーター又はシャトルの妨害を必要とせずに、化学療法抵抗性を逆転させる新しい方法を特定した。
【０１９０】
本発明のこの第４の態様は、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する癌に罹患した患者における難治性又は再発癌を処置する方法であって、（ｉ）分子量１００ダルトン〜２００，０００ダルトンの少なくとも１種の抗癌剤と（ｉｉ）ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する少なくとも１種の抗体、その機能的断片又は誘導体とを含む有効量の組成物をそれを必要とする患者に投与するステップを含み、前記癌が、アルキル化剤、代謝拮抗物質、抗腫瘍性抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、有糸分裂阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤及びヌクレオシド類似体からなる群から選択される１種以上の抗癌剤を含む第一選択の癌処置に対して難治性であり、又はその後に再発する、前記方法にも関する。
【０１９１】
本発明のこの第４の態様は、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する癌に罹患した患者における難治性又は再発癌の処置に使用される、（ｉ）分子量１００ダルトン〜２００，０００ダルトンの少なくとも１種の抗癌剤と（ｉｉ）ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する少なくとも１種の抗体、その機能的断片又は誘導体とを含む組成物であって、前記癌が、アルキル化剤、代謝拮抗物質、抗腫瘍性抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、有糸分裂阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤及びヌクレオシド類似体からなる群から選択される１種以上の抗癌剤を含む第一選択の癌処置に対して難治性であり、又はその後に再発する、前記組成物にも関する。
【０１９２】
ある実施形態においては、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する癌に罹患した患者における難治性又は再発癌を処置する方法に使用される組成物において、少なくとも１種の抗癌剤は分子量が１０ｋＤａ〜１５ｋＤａである。
【０１９３】
さらに、ある実施形態においては、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する癌に罹患した患者における難治性又は再発癌を処置する方法に使用される組成物において、少なくとも１種の抗癌剤は分子量が８０ｋＤａ〜２００ｋＤａである。
【０１９４】
さらに、ある実施形態においては、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する癌に罹患した患者における難治性又は再発癌を処置する方法に使用される組成物において、少なくとも１種の抗癌剤は分子量が１２０〜８００ダルトンである。
【０１９５】
さらに、ある実施形態においては、難治性又は再発癌は神経芽細胞腫である。
【０１９６】
別の好ましい一実施形態によれば、組成物が難治性又は再発神経芽細胞腫を処置する方法に使用されるときには、少なくとも１種の抗癌剤は、テモゾロマイド、トポテカン、イリノテカン、シクロホスファミド、フダラビン（ｆｕｄａｒａｂｉｎｅ）、シスプラチン、ドキソルビシン、イソトレチノイン、エトポシド又はそれらの混合物である。
【０１９７】
さらに、ある実施形態においては、難治性又は再発癌は神経膠芽腫である。
【０１９８】
別の好ましい一実施形態によれば、組成物が難治性又は再発神経膠芽腫を処置する方法に使用されるときには、少なくとも１種の抗癌剤は、テモゾロマイド、トポテカン、イリノテカン、シクロホスファミド、フルダラビン、シスプラチン、カルボプラチン又はそれらの混合物である。
【０１９９】
好ましい実施形態においては、難治性又は再発癌を処置する方法に使用される組成物の分子量１００ダルトン〜２００，０００ダルトンの少なくとも１種の抗癌剤は、第一選択の癌処置に使用されるものと同じである。
【０２００】
相乗作用の別の可能な好都合な成果は、相乗作用と細胞毒性とのバランスに依拠する相乗的組合せを提供することであり得る。
【０２０１】
本発明の第５の態様は、分子量１００ダルトン〜２００，０００ダルトンの少なくとも１種の抗癌剤と（ｉｉ）ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する少なくとも１種の抗体、その機能的断片又は誘導体との相乗的組合せを特定するインビトロ／エクスビボ方法であって、
ａ）分子量１００ダルトン〜２００，０００ダルトンの少なくとも（ｉ）１種の抗癌剤と（ｉｉ）ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する少なくとも１種の抗体、その機能的断片又は誘導体とを含む組成物と一緒に、ＧＤ２ガングリオシドのＯアセチル化体を発現する原発腫瘍細胞又は癌細胞系細胞をインビトロでインキュベートするステップ、並びに
ｂ）Ｃｈｏｕ及びＴａｌａｌａｙによって開示された方法に従ってＣＩ５０指数を測定し、１未満のＣＩ５０が相乗作用を表すステップ
を含む、前記方法に関する。
【０２０２】
原発腫瘍細胞は、例えば、外植ヒト腫瘍細胞である。これらの細胞の任意の誘導体は、例えば、癌細胞系を生じ得る。
【０２０３】
ある実施形態においては、本発明のインビトロ／エクスビボ方法によって特定される相乗的組合せにおいては、少なくとも１種の抗癌剤は分子量が１０ｋＤａ〜１５ｋＤａである。
【０２０４】
さらに、ある実施形態においては、本発明のインビトロ／エクスビボ方法によって特定される相乗的組合せにおいては、少なくとも１種の抗癌剤は分子量が８０ｋＤａ〜２００ｋＤａである。
【０２０５】
さらに、ある実施形態においては、本発明のインビトロ／エクスビボ方法によって特定される相乗的組合せにおいては、少なくとも１種の抗癌剤は分子量が１２０〜８００ダルトンである。
【０２０６】
本発明の第６の態様は、分子量１００ダルトン〜２００，０００ダルトンの少なくとも１種の抗癌剤と（ｉｉ）ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する少なくとも１種の抗体、その機能的断片又は誘導体との相乗的組合せのインビトロスクリーニング用キットに関する。
【０２０７】
ある実施形態においては、本発明の相乗的組合せのインビトロスクリーニング用キットにおいては、少なくとも１種の抗癌剤は分子量が１０ｋＤａ〜１５ｋＤａである。
【０２０８】
さらに、ある実施形態においては、本発明の相乗的組合せのインビトロスクリーニング用キットにおいては、少なくとも１種の抗癌剤は分子量が８０ｋＤａ〜２００ｋＤａである。
【０２０９】
さらに、ある実施形態においては、本発明の相乗的組合せのインビトロスクリーニング用キットにおいては、少なくとも１種の抗癌剤は分子量が１２０〜８００ダルトンである。
【０２１０】
本発明の第７の態様は、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する癌の処置に適したキットに関する。すべての実施形態においては、前記キットは、（ｉ）分子量１００ダルトン〜２００，０００ダルトンの少なくとも１種の抗癌剤と、（ｉｉ）ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する少なくとも１種の抗体、その機能的断片又は誘導体と、場合によっては（ｉｉｉ）薬学的に許容される担体とを含む。
【０２１１】
ある実施形態においては、本発明のＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する癌の処置に適したキットにおいては、少なくとも１種の抗癌剤は分子量が１０ｋＤａ〜１５ｋＤａである。
【０２１２】
さらに、ある実施形態においては、本発明のＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する癌の処置に適したキットにおいては、少なくとも１種の抗癌剤は分子量が８０ｋＤａ〜２００ｋＤａである。
【０２１３】
さらに、ある実施形態においては、本発明のＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを発現する癌の処置に適したキットにおいては、少なくとも１種の抗癌剤は分子量が１２０〜８００ダルトンである。
【０２１４】
特定の選択された投与経路を介してキット成分を送達可能な装置を含むこともできる。
【０２１５】
キット成分は、一緒にパッケージすることができ、又は２個以上の容器に分けることができる。一部の実施形態においては、容器は、再構成に適した組成物の無菌凍結乾燥製剤を含むバイアルとすることができる。キットは、別の試薬の再構成及び／又は希釈に適した１種以上の緩衝剤を含むこともできる。使用することができる別の容器としては、ポーチ、トレイ、ボックス、チューブなどが挙げられるが、それらに限定されない。キット成分は、容器内で無菌でパッケージ及び維持することができる。含むことができる別の成分は、その使用のためのキット使用者への説明書である。
【０２１６】
ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する抗体、その機能的断片又は誘導体は、抗腫瘍療法においてアジュバントとして有用である。
【０２１７】
本発明の第８の態様は、ＧＤ２ガングリオシドのＯアセチル化体を発現する細胞において分子量１００ダルトン〜２００，０００ダルトンの抗癌剤の細胞内取り込みを増強するためのＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する抗体、その機能的断片又は誘導体の使用に関する。
【０２１８】
ある実施形態においては、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する抗体、その機能的断片又は誘導体は、分子量１０ｋＤａ〜１５ｋＤａの抗癌剤の細胞内取り込みを増強するために使用される。
【０２１９】
さらに、ある実施形態においては、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する抗体、その機能的断片又は誘導体は、分子量８０ｋＤａ〜２００ｋＤａの抗癌剤の細胞内取り込みを増強するために使用される。
【０２２０】
さらに、ある実施形態においては、ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを認識する抗体、その機能的断片又は誘導体は、分子量１２０〜８００ダルトンの抗癌剤の細胞内取り込みを増強するために使用される。
【０２２１】
以下の実施例は、本発明のある好ましい実施形態及び態様を実証し、更に説明するために提供されるが、その範囲を限定するものと解釈すべきではない。
【実施例】
【０２２２】
１．抗ＯＡｃＧＤ２ｍＡｂ８Ｂ６を用いた神経芽細胞腫及び神経膠芽腫細胞の処置は、細胞膜内で孔形成を誘導する
抗ＯＡｃＧＤ２ｍＡｂ８Ｂ６（マウス、ＩｇＧ３）又はアイソタイプの一致した負の対照マウスＩｇＧ３（ＣＴＲＬ−）と一緒にインキュベーションする２４時間前に、培養皿（６ウェル）を５００  ０００  ＩＭＲ５、ＬＡＮ−１又はＤＵＡＳＯＩＩ細胞／ウェルで被覆した。次いで、４０μｇ／ｍｌの抗体を各ウェルに３０分間添加した。上清を遠心沈殿させ、細胞をその支持体から機械的強度（トリプシンなし）を利用して剥離し、遠心沈殿させた。ＰＢＳで洗浄後、細胞を０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝剤中のグルタルアルデヒド２％、ｐＨ７．４で１時間４℃で固定した。固定を、１％ＯｓＯ４を用いて１５分間続けた。脱水をエチルアルコール浴中で２５％、５０％、７５％及び１００％エチルアルコールを用いて各浴で１５分間行った。最後に、細胞を金属スタブに載せ、走査型電子顕微鏡法によって分析した。
【０２２３】
図１に示すように、ＩＭＲ５（パネルＢ）、ＬＡＮ−１（パネルＤ）及びＤＵＡＳＯＩＩ（パネルＦ）細胞の膜中の孔形成は、３０分間のｍＡｂ８Ｂ６処理によって現れる。細胞及び孔径及び直径を３つの細胞型について求めた。図２Ａに示すように、ＩＭＲ５においてｍＡｂ８Ｂ６によって誘導される孔の直径は約１．９１４μｍであり、その表面は約２．８７７μｍ２である。この場合、孔は、細胞の全表面の少なくとも４％を占める。ＬＡＮ−１及びＤＵＡＳＯＩＩで得られた結果もかなり類似している。図２Ｂ及び２Ｃに示すように、ＬＡＮ−１においてｍＡｂ８Ｂ６によって誘導される孔の直径は約１．７６０μｍであり、その表面は約２．４３３μｍ２である。この場合、孔は、細胞の全表面の少なくとも０．７％を占める。図２Ｄ及び２Ｅに示すように、ＤＵＡＳＯＩＩにおいてｍＡｂ８Ｂ６によって誘導される孔の直径は約１．４５９μｍであり、その表面は約１．６７２μｍ２である。この場合、孔は、細胞の全表面の少なくとも２．８％を占める。
【０２２４】
さらに、本発明者らは、より低い抗体濃度がヨウ化プロピジウムの透過の増加を誘導することを確認した。
【０２２５】
２．イソトレチノイン、トポテカン又はドキソルビシン処理は、神経芽細胞腫（ｎｅｕｒｏｂｌａｔｏｍａ）細胞系上のＯＡｃＧＤ２発現に影響しない
本発明者らは、神経芽細胞腫細胞系におけるＯＡｃＧＤ２の発現を以前に報告した（Ａｌｖａｒｅｚ−Ｒｕｅｄａら、ＰＬｏｓ  Ｏｎｅ  ２０１１  ６：ｅ２５２２０）。以前の研究によれば、ＧＤ２発現−ＯＡｃＧＤ２の前駆体−は、神経芽細胞腫細胞においてレチノイン酸に曝露すると変化し得ることが示されている（Ｒｅｂｈａｎら、Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ．１９９４  Ａｐｒ  １４；５（８）：９４１〜４及びＨｅｔｔｍｅｒら、Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．２００４  Ｊｕｌ  １９；９１（２）：３８９〜３９７）。したがって、本発明者らは、抗癌剤曝露がｍＡｂ８Ｂ６結合レベルに影響するかどうか試験した。このために、本発明者らは、フローサイトメトリー分析によってＯＡｃＧＤ２発現を調べる前に、検査されたマウス及びヒト神経芽細胞腫細胞系を各単一薬剤で４８時間処理した。これらの実験で使用された薬物の濃度を表１に示す。
【０２２６】
表１：神経芽細胞腫細胞系の処置に使用された薬物濃度
【表１】
2020504092.tif 000002
【０２２７】
神経芽細胞腫細胞系上の細胞表面ＯＡｃＧＤ２発現の分析を、フローサイトメトリーによって測定した間接蛍光抗体法によって評価した。本発明者らは、５×１０５個の細胞を９６ウェルマイクロプレート中でｍＡｂ８Ｂ６（Ｃｅｒａｔｏら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １９９７、１６：３０７〜３１６）又はｍＡｂ７Ｈ２（Ｏ−アセチルＧＤ３に対するマウスモノクローナル抗体を負の対照抗体として使用した）と一緒に１０μｇ／ｍｌで６０分間４℃でＰＢＳ１％−ＢＳＡ中でインキュベートした。ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＶＨ＋ＶＬ）のフルオレセイン−イソチオシアナート複合Ｆ（ａｂ’）２断片を二次抗体として用いた（Ｊａｃｋｓｏｎ、Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｏｈａｍ、ＵＫ）６０分間４℃の反応後に抗体結合を分析した。細胞蛍光をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）フローサイトメータ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）及びＣｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔ（商標）Ｐｒｏソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。１０，０００個の細胞の相対蛍光強度を単一パラメータヒストグラムとして記録し（対数目盛、１０２４チャネル、及び４０）及び平均蛍光強度（ＭＦＩ：ｍｅａｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を各ヒストグラムで計算した。抗原特異的ｍＡｂで染色された細胞のフローサイトメトリーＭＦＩ値を負の対照ｍＡｂ７Ｈ２で染色された同じ細胞のＭＦＩ値で割って計算されたＭＦＩ比として結果を表した。この手法は、グループ内及び異なるグループ間の複数の試験試料の比較を可能にする。
【０２２８】
表２に示すように、ＮＸＳ２細胞上のｍＡｂ８Ｂ６結合のレベルは、未処理細胞に比べて、イソトレチノイン、トポテカン又はドキソルビシンと一緒に４８時間インキュベーション後、不変であった。
【０２２９】
本発明者らは、薬物インキュベーションの４８時間後にＩＭＲ５、ＬＡＮ−１及びＬＡＮ−５細胞上のｍＡｂ８Ｂ６結合レベルを調べると、ほとんど又は全く変化がないことも認めた（表２）。
【０２３０】
表２：４８時間の抗癌剤曝露後の神経芽細胞腫細胞系におけるＯＡｃＧＤ２の発現レベルａ
【表２】
2020504092.tif 000003
ａ抗ＯＡｃＧＤ２ｍＡｂ８Ｂ６で染色された腫瘍細胞の幾何平均蛍光強度（ＭＦＩ）をｍＡｂ７Ｈ２対照抗体で染色された腫瘍細胞のＭＦＩに対して規準化した。データを平均±ＳＤ（ｎ＝３）として示す。
ｂ未処理細胞。
Ｃこれらの実験に使用された抗癌剤濃度を表１に示す。
【０２３１】
３．抗ＯＡｃＧＤ２ｍＡｂ８Ｂ６は、神経芽細胞腫細胞系において化学療法薬と相乗効果を示す。
抗ＯＡｃＧＤ２ｍＡｂ８Ｂ６が化学療法を強化し得るかどうか試験するために、本発明者らは、次に、４つの異なる神経芽細胞腫細胞系においてイソトレチノイン、トポテカン及びドキソルビシンと組み合わせてｍＡｂ８Ｂ６の腫瘍細胞生存率に対する効果を特徴づけた。
【０２３２】
抗癌剤の抗増殖活性を、ＭＴＴ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＵＳＡ）を用いて評価した。ＭＴＴアッセイは、紫色ホルマザン結晶を形成する代謝活性細胞による黄色テトラゾリウムＭＴＴ（臭化３−（４，５−ジメチルチアゾリル−２）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム）の還元に基づく。紫色ホルマザンを洗浄剤で可溶化し、分光光度的に５７０ｎｍで定量化する。
【０２３３】
増殖の対数期の細胞を９６ウェル（ＬＡＮ−１及びＮＸＳ２細胞の場合５×１０３、ＩＭＲ５及びＬＡＮ−５細胞の場合１×１０４）処理プレート中の完全培地１００μｌに播いた。試験薬剤で処理する前に、細胞を終夜インキュベーション中に付着させた。試験薬剤を完全培地で段階希釈し、各ウェルに体積５０／６５μｌで全最終体積１６５μｌ／ウェルで添加した。等量の培地体積を対照ウェルに添加した。３つの条件を使用した：抗癌剤単独、ｍＡｂ８Ｂ６単独、ｍＡｂ８Ｂ６＋抗癌剤。細胞を試験薬剤に４８時間曝露した。試験薬剤に曝露後、ＭＴＴ試薬１５μｌを各ウェルに添加した。プレートを恒温器に４時間戻した。インキュベーション期間後、キットから供給される洗浄剤試薬（１００μｌ）をすべてのウェルに添加した。プレートをプラスチックラップに包んで、蒸発を防止し、室温で暗所で終夜放置した。翌日、５７０ｎｍにおける吸光度を、ｉＭａｒｋ（商標）Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ  Ｒｅａｄｅｒプレートリーダー（ＢｉｏＲａｄ）で測定した。分析を四つ組で行い、実験を３回繰り返した。
【０２３４】
吸光度値を対照のパーセント（Ｐｅｒｃｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）に変換し、ＣｏｍｐｕＳｙｎ（登録商標）ソフトウェア（ＣｏｍｂｏＳｙｎ、Ｐａｒａｍｕｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）を用いた最大半減有効濃度（ＥＣ５０）計算の試験薬剤濃度に対してプロットした。ＣｏｍｐｕＳｙｎ（登録商標）は、中央値効果式を用いた単一薬物及び中央値効果式と組合せ指数式の両方を用いた多剤混合の用量効果分析に使用することができるＣｈｏｕ及びＭａｒｔｉｎによって開発されたＰＣ用コンピュータソフトウェアである（２００５、ＣｏｍｐｕＳｙｎ  ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ：ＰＣ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ：Ａ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｐｒｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｙｎｅｒｇｉｓｍ  ａｎｄ  Ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ，ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩＣ５０  ａｎｄ  ＥＤ５０  ａｎｄ  ＬＤ５０  Ｖａｌｕｅｓ．ＣｏｍｂｏＳｙｎ、Ｐａｒａｍｕｓ、ＮＪ．）。ＣｏｍｐｕＳｙｎ（登録商標）ソフトウェアによって使用される中央値効果式は、平衡定常状態における質量作用の法則原理に由来した。最大半減有効濃度（ＥＣ５０）という用語は、薬物、ベースラインと指定曝露時間後の最大との中間で応答を誘導する抗体の濃度を指す。各試験ウェルの吸光度値を無薬物対照（Ｎｏ  Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）平均で割り、１００を掛けることによって、対照のパーセント値を計算した。
【０２３５】
組合せデータをＣｏｍｐｕＳｙｎ（登録商標）ソフトウェアを用いて分析して、組合せ指数値を計算して、相乗作用を評価した。罹患割合（Ｆａ）を対照のパーセントから次式を用いて計算した：１−パーセント対照／１００）、ここで１は１００％効果に対応し、０は効果なしに対応する。投与量、罹患割合及び組み合わせて試験された化合物のモル比をＣｏｍｐｕＳｙｎ（登録商標）ソフトウェアに入力して相乗作用の有無を評価した。ＣｏｍｐｕＳｙｎ（登録商標）は、細胞増殖の５０％を阻害する化合物レベルを評価する組合せ指数値を割り当てる。１未満のＣＩ値は相乗作用の存在を示し、１を超えるＣＩ値は拮抗作用を示す。１に等しいＣＩ５０値は、相加効果を示す。Ｃｈｏｕ、ＰＨＡＲＭＡＣＯＬ．ＲＥＶ．、５８（３）：６２１〜８１（２００６）参照。
【０２３６】
ＮＸＳ２細胞をＤＭＥＭ４．５ｇ／Ｌグルコース中で１０％熱失活ウシ胎仔血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００単位／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを用いて３７℃で５％ＣＯ２中で増殖させた。ＩＭＲ５、ＬＡＮ−１及びＬＡＮ−５細胞をＲＰＭＩ１６４０中で１０％熱失活ウシ胎仔血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００単位／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを用いて３７℃で５％ＣＯ２中で増殖させた。
【０２３７】
本発明者らは、神経芽細胞腫細胞系ＮＸＳ２、ＩＭＲ５、ＬＡＮ−１及びＬＡＮ−５を試験したときに同様の観察結果を見いだした。各試験化学療法薬の計算ＥＣ５０値は、２種の薬剤の組合せ（すなわち、抗癌剤とｍＡｂ８Ｂ６）で有意に低下した（ｐ＜０．０５、表３）。
【０２３８】
表３：神経芽細胞腫細胞系におけるｍＡｂ８Ｂ６と一緒のインキュベーション後の薬物細胞傷害性の増強ａ
【表３】
2020504092.tif 000004
ａＥＣ５０濃度を３つの独立した実験の平均として示す。
ｂ抗ＯＡｃＧＤ２ｍＡｂ８Ｂ６を化学療法と濃度４０μｇ／ｍｌで組み合わせた。
【０２３９】
最後に、本発明者らは、中央値組合せ指数値を計算して、試験したすべての組合せの効果を特徴づけた。本発明者らは、中央値組合せ指数値が試験したすべての組合せで有意に１．０未満（ｐ＜０．０５）であり、相乗的相互作用を示すことを見いだした（表４参照）。イソトレチノインとｍＡｂ８Ｂ６の組合せは、組合せ指数値が０．３３〜０．８１であった（ＮＸＳ２＝０．７４、ＩＭＲ５＝０．８１、ＬＡＮ−１＝０．４７、ＬＡＮ−５＝０．３３）（表４）。トポテカンは、より強力な相乗作用を示し、組合せ指数値が０．２８〜０．６０であった（ＮＸＳ２＝０．６０、ＩＭＲ５＝０．５０、ＬＡＮ−１＝０．５８、ＬＡＮ−５＝０．２８）（表４）。ドキソルビシンとの組合せは、試験神経芽細胞腫細胞系でより強力な相乗作用を示し、組合せ指数値が０．３０以下であった（ＮＸＳ２＝０．３０、ＩＭＲ５＝０．１０、ＬＡＮ−１＝０．０５、ＬＡＮ−５＝０．１６）（表４）。これらのデータは、抗ＯＡｃＧＤ２ｍＡｂ８Ｂ６と一緒に使用したときの化学療法のより強力な抗神経芽細胞腫有効性を示唆している。
【０２４０】
表４：組合せ指数値
【表４】
2020504092.tif 000005
＊０．０５〜０．９０＝相乗作用；０．９〜１．１０、相加；１．１０〜１０；拮抗作用。
【０２４１】
抗ＯＡｃＧＤ２ｍＡｂ８Ｂ６と別の抗癌剤の組合せについてもＬＡＮ−１神経芽細胞腫細胞系で分析した。この実験においては、ｍＡｂ８Ｂ６又はＣＴＲＬ−（ＩｇＧ）の存在下で細胞内の５−ＦＵ、シスプラチン及びドキソルビシンの取り込みをフローサイトメトリーによって検出した（５３５ｎｍレーザー励起）。抗癌剤及びｍＡｂを３０分間３７℃でインキュベートした。正の対照（サポニン０．０５％）は、ＬＡＮ−１細胞において化学療法の取り込みが最大である。
【０２４２】
図３に示すように、５−ＦＵ（パネルＡ）、シスプラチン（パネルＢ）１．５２μＭ及びドキソルビシン（パネルＣ）４．７μＭでは、ｍＡｂ８Ｂ６と一緒にインキュベートしたときに、抗癌剤単独及びＣＴＲＬ−（ＩｇＧ）と一緒にインキュベートした同じ細胞よりも多くの細胞が陽性であった。さらに、ドキソルビシン（パネルＤ）４．７μＭでは、ｍＡｂ  ｃ８Ｂ６．１４ｂ及びｍＡｂ  ｃ８Ｂ６．１５ｂと一緒にインキュベートしたときに、抗癌剤単独及びＣＴＲＬ−（ＩｇＧ）と一緒にインキュベートした同じ細胞よりも多くの細胞が陽性であった。
【０２４３】
これらの結果はすべて、抗ＯＡｃＧＤ２ｍＡｂ８Ｂ６が腫瘍細胞における抗癌剤の透過を促進することを明瞭に示している。
【０２４４】
４．抗ＯＡｃＧＤ２ｍＡｂ８Ｂ６は、神経膠芽腫初代細胞においてテモゾロマイド（ＴＭＺ）と相乗効果を示す。
ｍＡｂ８Ｂ６が化学療法を強化し得るかどうか試験するために、本発明者らは次に６つの異なる神経膠芽腫初代細胞におけるテモゾロマイドと組み合わせたｍＡｂ８Ｂ６の腫瘍細胞生存率に対する効果を特徴づけた。
【０２４５】
腫瘍検体をＧＢＭの組織学的診断を受けた患者から収集した。腫瘍を外科的切除時に収集し、腫瘍の解離後ｇｅｎｔｌｅＭＡＣｓ（商標）Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いて製造者の指示に従ってすぐに培養した。すべての検体収集及び分析を治験審査委員会に認可された手順に従って行い、すべての患者又はその保護者は書面のインフォームドコンセントを提出した（Ｃｏｍｉｔｅ  ｄｅ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｄｅｓ  Ｐｅｒｓｏｎｎｅｓ  Ｏｕｅｓｔ  ＩＶ、手順＃ＤＣ−２０１２−１５５５）。細胞を５％ＣＯ２及び９５％湿度雰囲気で限定培地（２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、Ｂ２７補助剤、Ｎ２補助剤、２μｇ／ｍｌヘパリン、４０ｎｇ／ｍｌβ−ＦＧＦ及び４０ｎｇ／ｍｌＥＧＦを含むＤＭＥＭ／Ｈａｍ  Ｆ１２）中で維持して、神経球を形成した。
【０２４６】
増殖の対数期の細胞を、９６ウェル（ＡＭＢＭａ、ＤＵＧＡｎ、ＤＵＡＳＯＩＩ、ＧＬＩＯ５、ＧＵＩＴｈ及びＨＡＲＣｌ神経膠芽腫細胞の場合１×１０４）処理プレート中の完全培地１００μｌに播いた。試験薬剤で処理する前に、細胞を終夜インキュベーション中に付着させた。試験薬剤を完全培地で段階希釈し、各ウェルに体積５０／６５μｌで全最終体積１６５μｌ／ウェルで添加した。等量の培地体積を対照ウェルに添加した。３つの条件を使用した：テモゾロマイド単独、ｍＡｂ８Ｂ６単独、ｍＡｂ８Ｂ６＋テモゾロマイド。細胞を試験薬剤に７２時間曝露した。試験薬剤に曝露後、ＭＴＴ試薬１５μｌを各ウェルに添加した。プレートを恒温器に４時間戻した。インキュベーション期間後、キットから供給される洗浄剤試薬（１００μｌ）をすべてのウェルに添加した。プレートをプラスチックラップに包んで、蒸発を防止し、室温で暗所で終夜放置した。翌日、５７０ｎｍにおける吸光度をｉＭａｒｋ（商標）Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ  Ｒｅａｄｅｒプレートリーダー（ＢｉｏＲａｄ）で測定した。分析を四つ組で行い、実験を３回繰り返した。
【０２４７】
細胞生存率をＭＴＴアッセイによって測定し、最大半減有効濃度（ＥＣ５０）を前に開示したように計算した。結果を下表５に示す。本発明者らは、神経膠芽腫初代細胞ＡＭＢＭａ、ＤＵＧＡｎ、ＤＵＡＳＯＩＩ、ＧＬＩＯ５、ＧＵＩＴｈ及びＨＡＲＣｌを試験したときに同様の観察結果を見いだした。各試験化学療法薬の計算ＥＣ５０値は、２種の薬剤の組合せ（すなわち、テモゾロマイドとｍＡｂ８Ｂ６）で低下した。
【０２４８】
表５：グリア芽細胞腫初代細胞におけるｍＡｂ８Ｂ６と一緒のインキュベーション後の化学療法薬細胞傷害性の増強ａ
【表５】
2020504092.tif 000006
ａＥＣ５０濃度を３つの独立した実験の平均として示す。
ｂ抗ＯＡｃＧＤ２ｍＡｂ８Ｂ６を化学療法と濃度４０μｇ／ｍｌで組み合わせた。
【０２４９】
最後に、本発明者らは、中央値組合せ指数値を計算して、試験したＴＭＺと抗ＯＡｃＧＤ２ｍＡｂ８Ｂ６の組合せの効果を特徴づけた。本発明者らは、中央値組合せ指数値が試験したすべての組合せで有意に１．０未満（ｐ＜０．０５）であり、相乗的相互作用を示すことを見いだした（表６参照）。ＴＭＺとｍＡｂ８Ｂ６の組合せは、組合せ指数値が０．２７〜０．６６であった（ＧＵＩＴｈ＝０．６６、ＤＵＧＡｎ＝０．５８、ＡＭＢＭａ＝０．２７及びＨＡＲＣＩ＝０．３０、ＧＬＩＯ５＝０．４１及びＤＵＡＳＯＩＩ＝０．６５）（表６）。これらのデータは、抗ＯＡｃＧＤ２ｍＡｂ８Ｂ６と一緒に使用したときのＴＭＺのより強力な抗神経膠芽腫有効性を示唆している。
【０２５０】
表６：グリア芽細胞腫初代細胞における組合せ指数値
【表６】
2020504092.tif 000007
＊０．０５〜０．９０＝相乗作用；０．９〜１．１０、相加；１．１０〜１０；拮抗作用。
【０２５１】
５．抗ＯＡｃＧＤ２ｍＡｂ８Ｂ６は、別のタイプの癌において化学療法薬と相乗効果を示す。
抗ＯＡｃＧＤ２ｍＡｂ８Ｂ６が化学療法を神経芽細胞腫及び神経膠芽腫以外でも強化し得るかどうか試験するために、黒色腫（Ｍ２１細胞）、乳癌（ＯＡｃＧＤ２ガングリオシドを過剰発現させるＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞）、小細胞肺癌（Ｈ５２４細胞）、神経膠芽腫（ＤＵＧＡｎ細胞）及びユーイング肉腫（ＴＣ７１細胞）の説明のための細胞系をドキソルビシン（０．２６μＭ、ドキソルビシンの濃度が０．１８μＭであったＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞及びドキソルビシンの濃度が１μＭであったＤＵＧＡｎ細胞を除く）とｍＡｂ８Ｂ６又はＣＴＲＬ−（ＩｇＧ）との特定の組合せと一緒に３０分間インキュベートした。フローサイトメトリーを使用して、実施例のパート３に前に開示したドキソルビシン陽性細胞の数を算定した。
【０２５２】
図４に示したように、抗ＯＡｃＧＤ２ｍＡｂ８Ｂ６は、すべてのタイプの癌においてドキソルビシン陽性細胞の割合を有意に増加させる。より具体的には、ドキソルビシン陽性細胞の６倍の増加がＭ２１黒色腫細胞系で認められ（パネルＡ）、ドキソルビシン陽性細胞の２倍を超える増加がＴＣ７１ユーイング肉腫細胞系で認められ（パネルＤ）、ドキソルビシン陽性細胞のほぼ２倍の増加がＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞系で認められ（パネルＢ）、ドキソルビシン陽性細胞の１．５倍の増加がＨ５２４小細胞肺癌細胞系で認められ（パネルＣ）、ドキソルビシン陽性細胞の１．１６倍の増加がＤＵＧＡｎ神経膠芽腫細胞で認められる（パネルＥ）。
【０２５３】
総合すると、これらの結果は、抗ＯＡｃＧＤ２ｍＡｂ８Ｂ６が幾つかのタイプの癌、特にＯアセチル化ＧＤ２ガングリオシドを発現する細胞を有する癌において抗癌剤の透過を促進することを実証した。
【０２５４】
６．抗ＯＡｃＧＤ２  ８Ｂ６ｍＡｂは、マウス神経芽細胞腫肝転移モデルにおいて化学療法薬の抗腫瘍活性を増強する
６．１−マウス腫瘍モデル
抗ＯＡｃＧＤ２ｍＡｂ８Ｂ６及び化学療法処置の抗神経芽細胞腫有効性を、Ｌｏｄｅらによって以前に記述されたＡ／ＪマウスにおけるマウスＮＸＳ２神経芽細胞腫実験肝転移モデルにおいて求めた（Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  １９９７、８９：１５８６〜１５９４）。この研究を、Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｒｅｎｃｈ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅにおける推奨に従って厳格に行った。手順は、Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｅｔｈｉｃｓ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｅｇｉｏｎ  Ｐａｙｓ  ｄｅ  ｌａ  Ｌｏｉｒｅによって認可された。マウスをＵＴＥ−ＵＮ動物施設（Ｎａｎｔｅｓ、フランス）で飼育した。雌性及び雄性Ａ／Ｊマウス（６〜８週齢）をＨａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｇａｎｎａｔ、フランス）から得た。本発明者らは、２．５×１０５個の腫瘍細胞を尾静脈によってＰＢＳ中で接種した。本発明者らは、マウスを各１０匹のマウスの９群に分けた：１）ビヒクル処置群；２）対照抗体処置群；３）抗ＯＡｃＧＤ２ｍＡｂ８Ｂ６処置群；４）イソトレチノイン処置群；５）トポテカン処置群；６）ドキソルビシン処置群；７）イソトレチノイン＋ｍＡｂ８Ｂ６処置群、８）トポテカン＋ｍＡｂ８Ｂ６処置群；及び９）ドキソルビシン＋ｍＡｂ８Ｂ６処置群。抗ＯＡｃＧＤ２ｍＡｂ８Ｂ６処置を腫瘍細胞注射後３日目に開始した。マウスに静脈内注射によって週２回ｍＡｂ８Ｂ６  ２５μｇを連続３週間投与した（３、７、１０、１４、１７及び２１日目；全用量＝１５０μｇ）。イソトレチノインをＯｒａ−Ｐｌｕｓ（Ｃ）で希釈して１０ｍｇ／ｋｇで毎日２週間連続して経口投与した（１０〜１４及び１７〜２１日目）。ＰＢＳで希釈されたトポテカンを腹腔内注射によって０．３６ｍｇ／ｋｇで毎日１週間（１０〜１４日目）投与した。ドキソルビシンを腹腔内注射によって１ｍｇ／ｋｇで毎日２週間（１０〜１４及び１７〜２１日目）投与した。マウスを接種から２８日後に屠殺し、抗腫瘍効率を新しい検体の肝臓重量及び肝転移数によって評価した。
【０２５５】
６．２−結果
インビトロで得られた本発明者らの観察を拡張するために、本発明者らは、次にｍＡｂ８Ｂ６／化学療法組合せの潜在的治療効果をインビボで評価した。本発明者らは、Ａｌｖａｒｅｚ−Ｒｕｅｄａらによって開示されたマウスＮＸＳ２神経芽細胞腫実験肝転移モデルを用いてインビボ検査を行った（ＡＬＶＡＲＥＺ−ＲＵＥＤＡら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２０１１、ｖｏｌ．６（９）、ｐ：ｅ２５２２０）。関連副作用を最小限にするために、抗癌剤を文献に既報の低用量で投与した。静脈内ＮＳＸ２腫瘍細胞接種の３日後、１０匹のマウスを、前に記載したように単一薬剤又は前述のｍＡｂ８Ｂ６と抗癌剤の組合せで処置した。腫瘍細胞接種後２８日目に、本発明者らはマウス安楽死後の肝転移数及び肝臓重量を測定した。本発明者らがこの検査で用いたｍＡｂ８Ｂ６の用量（累積用量＝１５０μｇ）は、ビヒクル処置マウスに比べた肝臓重量によって示されるように、ＮＸＳ２肝転移の有意な減少をもたらした。ｍＡｂ８Ｂ６処置群における平均肝臓重量は、ビヒクル処置群の２．５±０．１８ｇに比べて１．５±０．１５ｇであった（ｐ＜０．０５、図５）。等量の非特異抗体による処置が完全に無効であったので（ビヒクル処置マウス（データ示さず）に比べて平均肝臓重量＝２．５±０．１８ｇ、ｐ＞０．０５）、抗ＯＡｃＧＤ２ｍＡｂ８Ｂ６療法の特異性が実証された。抗体８Ｂ６はイソトレチノイン（１０ｍｇ／ｋｇ、経口、週５回２週間）と協働して、ＮＸＳ２転移増殖のイソトレチノイン阻害の有意な感作をもたらした（ｐ＜０．０５、図５パネルＡ）。イソトレチノイン＋ｍＡｂ８Ｂ６処置群における平均肝臓重量は１．０±０．０６ｇであり、イソトレチノイン処置群は２．０±０．２４ｇであった。トポイソメラーゼＩトポテカン（０．３６ｍｇ／ｋｇ、腹腔内、週５回１週間）＋ｍＡｂ８Ｂ６の組合せも、トポテカン（１．２２±０．０９ｇ）又はｍＡｂ８Ｂ６単独に比べて肝臓重量を有意に減少させた（０．９±０．０３ｇ）（ｐ＜０．０５、図５パネルＢ）。アントラサイクリン抗生物質ドキソルビシン（１ｍｇ／ｋｇ、腹腔内、週５回２週間）の組合せは、ドキソルビシン（１．７５±０．０９ｇ）又はｍＡｂ８Ｂ６単独による処置に比べて肝臓重量を有意に減少させた（１．３３±０．１２ｇ）（ｐ＜０．０５、図５パネルＣ）。ｍＡｂ８Ｂ６とイソトレチノイン又はトポテカンの組合せは、試験した３つの組合せ投薬計画の中で最も強い治療効果をもたらした（図５）。
【０２５６】
重量減少は、健康監視の敏感なマーカーとして使用される。本発明者らは、したがって、処置期間にわたる体重の平行分析を行った。本発明者らは体重減少を認めず（図６）、ｍＡｂ８Ｂ６、イソトレチノイン、イソトレチノイン＋ｍＡｂ８Ｂ６、トポテカン、又はトポテカン＋ｍＡｂ８Ｂ６で処置したマウスにおける処置関連毒性のないことが示唆された。ドキソルビシン又はドキソルビシン＋ｍＡｂ８Ｂ６を投与したマウスは、ｍＡｂ８Ｂ６のみを投与したマウスに比べて１７日目後に体重減少を示した。しかし、非ドキソルビシン群に比べたドキソルビシンで処置した２つの群の体重差は、処置期間中に有意でなかった（ｐ＞０．０５）。これらの観察の示唆するところによれば、抗癌剤＋ｍＡｂ８Ｂ６の組合せは、インビボでいずれの薬剤単独よりも強力な抗腫瘍効率を検出可能な毒性なしに示す。
【０２５７】
７．抗ＯＡｃＧＤ２  ８Ｂ６ｍＡｂは、難治性神経膠芽腫モデルにおいて化学療法薬の制癌効果を回復する
７．１−材料及び方法
７．１．１−薬理作用物質
抗ＯＡｃＧＤ２ｍＡｂ８Ｂ６及びアイソタイプ対照抗体（ＣＴＲＬ）を既述のように得た。テモゾロマイド（ＴＭＺ）をＩｎｔｅｒｃｈｉｍ（モンリュソン、フランス）から購入した。ＴＭＺをＤＭＳＯを用いて再構成し、一定分量を−２０℃で貯蔵した。ＴＭＺ溶液と同じ最終割合のＤＭＳＯは、すべての研究でビヒクル対照として役立った。
【０２５８】
７．１．２−細胞培養
患者由来の神経膠芽腫ＧＢＭ−１０細胞を、Ｌ−グルタミン、Ｂ２７、Ｎ２補助剤及びヘパリン（２μｇ／ｍｌ）を補充した１％ペニシリン及びストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ／ＨａｍＦ１２中で神経球として維持し、追加の増殖因子β−ＦＧＦ（４０ｎｇ／ｍｌ）及びＥＧＦ（４０ｎｇ／ｍｌ）を、それぞれ即座に添加した。培養試薬をＧｉｂｃｏ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）から得た。すべての細胞型を初期継代で維持し、ＰＣＲによってマイコプラズマに対して常法に従って検査した。
【０２５９】
７．１．３−ＧＢＭ１０細胞におけるＯ−アセチル−ＧＤ２発現
ＧＢＭ細胞におけるＯＡｃＧＤ２発現の分析を、フローサイトメトリーによって測定された間接蛍光抗体法によって行った。細胞を冷ＰＢＳで洗浄し、ＰＦＡ４％（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈａｔｆｉｅｌｄ、ＰＡ）で１０分間４℃で固定し、次いでｍＡｂ８Ｂ６（１０μｇ／ｍｌ）と一緒に４５分間インキュベートした。ヤギ抗マウスＩｇＧのフルオレセインイソチオシアナート標識Ｆ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｏｈａｍ、ＵＫ）と一緒に６０分間４℃でインキュベーションすることによって抗体８Ｂ６結合を検出した。別の実験を、対照ＩｇＧを用いて行った。細胞蛍光を、ＦＡＣＳＣａｎｔｏフローサイトメータ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）及びＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｆｌｏｗｊｏ  ＬＬＣ、Ｏｒｅｇｏｎ、ＯＲ、ＵＳＡ）を用いて分析した。結果をＭＦＩ比で表した。
【０２６０】
７．１．４−限界希釈分析
限界希釈アッセイのために、ＧＢＭ腫瘍を解離させ、単離細胞を初濃度１０３細胞／ｍＬで播き、そこから段階希釈を９６ウェルプレート中で行った。細胞を１５日間培養し、その後、各細胞培養密度に対して神経球を含まないウェルの割合を計算し、データをＥＬＤＡソフトウェア（ＥＬＤＡ、Ｌｉｎｚ、オーストリア）で分析して、試料中の神経膠芽腫幹細胞（ＧＳＣ：Ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ）の頻度及び種々の処置の影響を定量化した。
【０２６１】
７．１．４−神経膠芽腫異種移植マウスモデル
Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）から購入したＮＳＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）マウスを、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎａｎｔｅｓ（ＵＴＥ、ＳＦＲ  Ｆ．Ｂｏｎａｍｙ）の動物施設でＳＰＦ状態で飼育し、施設ガイドライン（Ａｇｒｅｅｍｅｎｔ＃００１８６．０２；Ｒｅｇｉｏｎａｌ  ｅｔｈｉｃｓ  ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐａｙｓ  ｄｅ  ｌａ  Ｌｏｉｒｅ、フランス）に従って６〜１２週齢で使用した。ＧＢＭ−１０細胞（１００μｌ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ中１×１０６個、Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ、ＵＳＡ）を０日目に皮下注射した。ＴＭＺを、腹腔内注射によって０．０５ｍｇ／マウスの単一用量で１２、２２及び３２日目に投与した。
【０２６２】
７．２−結果−
ＴＭＺ難治性ＧＢＭ−１０細胞（ＧＢＭ−１０ＴＭＺＲ）を、ＴＭＺ化学療法後に再発ＧＢＭ−１０細胞から単離した（図７パネルＡ）。Ｏ−アセチル−ＧＤ２発現レベルを、材料＆方法セクションで記述したようにフローサイトメトリー分析によって測定した。結果の示すところによれば、Ｏ−アセチルＧＤ２発現は、未処置マウスから単離されたＧＢＭ−１０細胞に比べて、ＴＭＺ化学療法後に存続している（図７パネルＢ）。
【０２６３】
次に、ＴＭＺ難治性レベルを限界希釈アッセイによって決定し、腫瘍異種移植片における神経膠芽腫癌幹細胞頻度として表した。結果の示すところによれば、幹細胞頻度は、ＴＭＺ化学療法によって増加した（図７パネルＣ＆Ｄ）。実際、未処置マウスにおいては、ＴＭＺ又はｍＡｂ８Ｂ６曝露の両方が幹細胞生存を減少させた（図７パネルＣ）。より重要なことには、２種の薬剤の組合せ（ＴＭＺ＋８Ｂ６）によって誘導される効果は、それぞれ単独療法として用いた２種の薬剤よりも有意に高い。
【０２６４】
ＴＭＺ化学療法の効果は、再発ＧＢＭ−１０異種移植片から単離されたＧＢＭ−１０細胞における幹細胞生存を阻害するのに効率が極めて低かった（図７パネルＤ）。驚くべきことに、２種の薬剤の組合せ（ＴＭＺ＋８Ｂ６）は、ＧＳＣ生存を減少させることができた。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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