(57)【要約】  本発明は、配列番号1のドデカペプチドNX210の調製のための改善された方法であって、副生成物の形成を最小限に抑えた方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号1のペプチドを調製する方法であって、配列番号1のペプチドが、配列番号1のペプチドの精製工程、任意の濃縮工程、及び有利には凍結乾燥又は噴霧乾燥によって行われる乾燥工程にわたり、有機溶媒を含む水溶液中で常に維持されることを特徴とする方法。
【請求項２】
配列番号1のペプチドを調製する方法であって、配列番号1のペプチドの精製工程及び/又は有利には凍結乾燥若しくは噴霧乾燥によって行われる乾燥工程が、有機溶媒を含む水溶液中で行われることを特徴とする、方法。
【請求項３】
有機溶媒がアセトニトリルであることを特徴とする、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
水溶液中の有機溶媒の体積が、精製工程及び任意の濃縮工程中、水溶液の総体積の1〜90%、特に1〜10%、好ましくは約5%の割合を占めるように維持及び/又は調整されることを特徴とする、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
有利には凍結乾燥又は噴霧乾燥によって乾燥される水溶液中の有機溶媒の体積が、水溶液の総体積の1〜30%、特に1〜10%、好ましくは約5%の割合を占めるように維持及び/又は調整されることを特徴とする、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
a)樹脂にFmoc-Gly残基をグラフトする工程、
b)側鎖が保護されているFmoc保護アミノ酸を用いてペプチド鎖を伸長する工程、
c)アミノ酸の側鎖の脱保護と樹脂からのポリペプチドの切断とを同時に行い、配列番号1のポリペプチドを得る工程、
d)配列番号1のペプチドを任意で沈殿させる工程、
e)配列番号1のペプチドを精製し、任意で濃縮する工程、
f)工程e)で得られた配列番号1のペプチドを、有利には凍結乾燥又は噴霧乾燥によって乾燥する工程
を含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
樹脂が、4-メチルベンズヒドリルアミン基を含むジビニルベンゼン架橋ポリスチレン樹脂であることを特徴とする、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
工程a)のFmoc-Gly残基が、Fmoc-Gly-MPPA-OH残基であることを特徴とする、請求項6又は7に記載の方法。
【請求項９】
・  Argの側鎖の保護基が、2,2,4,6,7-ペンタメチルジヒドロベンゾフラン-5-スルホニルであり、
・  Cysの側鎖の保護基が、トリチルであり、
・  Serの側鎖の保護基が、t-ブチルであり、
・  Trpの側鎖の保護基が、t-ブトキシカルボニルである
ことを特徴とする、請求項6から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
工程c)が、トリフルオロ酢酸、水、及び1,4-ジチオトレイトールの混合物、とりわけ、混合物の総質量に対して、85〜95質量%のトリフルオロ酢酸、3〜10質量%の1,4-ジチオトレイトール、及び100質量%に達するまでの水からなる混合物を用いて行われることを特徴とする、請求項6から9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
沈殿させる工程d)を含み、配列番号1のペプチドの前記沈殿が、好ましくは、MTBE及びヘプタンの混合物を用いて行われることを特徴とする、請求項6から10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
工程e)の精製が、少なくとも1回の分取逆相クロマトグラフィーを含むことを特徴とする、請求項6から11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
工程e)の精製が、逆相クロマトグラフィー固定相又はイオン交換樹脂におけるイオン交換を更に含むことを特徴とする、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
a)4-メチルベンズヒドリルアミン基を含む、ジビニルベンゼン架橋ポリスチレン樹脂にFmoc-Gly-MMPA-OH残基をグラフトする工程、
b)Fmoc保護cys、ser、arg、ser、cys、ser、ser、trp、gly、ser、及びtrpを用いてペプチド鎖を伸長して、側鎖が保護されている配列番号1のペプチドを得る工程であって、Argの側鎖の保護基が、2,2,4,6,7-ペンタメチルジヒドロベンゾフラン-5-スルホニルであり、Cysの側鎖の保護基が、トリチルであり、Serの側鎖の保護基が、t-ブチルであり、Trpの側鎖の保護基が、t-ブトキシカルボニルである、工程、
c)トリフルオロ酢酸、水、及び1,4-ジチオトレイトールの混合物を用いて、アミノ酸の側鎖の脱保護及び樹脂からのポリペプチドの切断を同時に行い、配列番号1のポリペプチドを得る工程、
d)ヘプタン及びMTBEの混合物を用いて、配列番号1のペプチドを沈殿させる工程、
e)分取逆相クロマトグラフィーによって配列番号1のペプチドを精製する工程であって、配列番号1のペプチドが、有機溶媒、好ましくはアセトニトリルを含む水溶液中で常に維持されることを特徴とする、工程、
f)工程e)で得られた配列番号1のペプチドを含有する溶液を濃縮して、配列番号1のペプチド及び有機溶媒、好ましくはアセトニトリルを含有する濃縮された水溶液を得る工程、
g)逆相クロマトグラフィー固定相又はイオン交換樹脂において、トリフルオロ酢酸イオンを、薬学的に許容されるイオン、特に酢酸イオンで交換する工程、
h)工程g)で得られた配列番号1のペプチドを含有する水溶液を濃縮して、配列番号1のペプチド及び有機溶媒、好ましくはアセトニトリルを含有する濃縮された水溶液を得る工程、
i)工程h)で得られた水溶液を有利には噴霧乾燥又は凍結乾燥によって乾燥して、配列番号1のペプチドを得る工程
を含む、配列番号1のペプチドを調製する方法。
【請求項１５】
とりわけ配列番号1のペプチドの精製工程、任意の濃縮工程、及び有利には噴霧乾燥又は凍結乾燥によって行われる乾燥工程中における配列番号1のペプチドの二量体化を防ぐための、水性溶媒中の有機溶媒、特にアセトニトリルの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチドNX210を調製する方法を対象とする。
【背景技術】
【０００２】
SCOスポンジン中に発見されたトロンボスポンジン1型繰り返し配列(TSR)の最も保存された配列に由来する配列Trp-Ser-Gly-Trp-Ser-Ser-Cys-Ser-Arg-Ser-Cys-Gly(W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G、配列番号1)のドデカペプチドであるNX210は、細胞生存を促進するその能力と併せて、とりわけ、細胞分化及び神経成長を誘導するその能力から、神経障害の治療のための候補である。
【０００３】
複数のシステインを含有する、オリゴペプチド及びポリペプチドの数によって、NX210は、オリゴマー形成を起こしやすく、より具体的には、分子内環化を起こしやすい。この後者の反応は、NX210のそれとは異なる生物学的特性を有する、環化代謝産物(2つのシステイン間にジスルフィド架橋を含有するNX218)の形成をもたらす。
【０００４】
生成物の許容される品質を得るための製造方法は、特に、注入可能な薬物の場合、合成不純物の存在が、薬物生成物の有効性又は安全性に深刻な影響を及ぼす可能性があるため、とりわけ重要である。このため、医薬品は、極めて高い純度を有していなければならず、いかなる二次生成物も正確に特徴付けられなければならない。結果として、保健局によって課された規定は、患者の安全性という明白な理由のために極めて厳格である。
【０００５】
NX210は、ペプチド合成中に問題となることが公知のアミノ酸からなる:チオール官能基が遊離されると、システイン残基は、上記のオリゴマー形成及び環化を招くことがあり、システイン及びトリプトファンは、トリフルオロ酢酸によるペプチドの脱保護中に直面するような酸性条件に対する感度が高く、アルギニン残基の側鎖(2,2,5,7,8-ペンタメチル-クロマン-6-スルホニル(pmc)等)又は4-メトキシ-2,3,6-トリメチルベンゼンスルホニル(Mtr)に対する従来の保護基は、脱保護中に、他のアミノ酸の側鎖と反応する能力のある、反応性の高い中間体をもたらし、この他のアミノ酸とは相いれない反応時間を必要とする。
【０００６】
このため、このような問題となるアミノ酸を含有するオリゴペプチドの合成は、ペプチドの分解を回避しつつ、その全てのアミノ酸の側鎖を脱保護させる、より多くの又はより少ない複合切断カクテルの使用を必要とする(すなわち、より多数又はより少数の試薬を含有する)。
【０００７】
例として、以下のカクテルに関して言及される場合がある:
・  トリフルオロ酢酸(88%v/v)、フェノール(5%v/v)、水(5%v/v)、及びトリイソプロピルシラン(2%v/v)の混合物(試薬B)、
・  トリフルオロ酢酸(81%w/w)、フェノール(5%w/w)、チオアニソール(5%w/w)、1,2-エタンジチオール(2.5%w/w)、水(3%w/w)、硫化ジメチル(2%w/w)、及びヨウ化アンモニウム(1.5%w/w)の混合物(試薬H)、
・  トリフルオロ酢酸(82.5%v/v)、フェノール(5%v/v)、水(5%v/v)、チオアニソール(5%v/v)、及び1.2-エタンジチオール(2.5%v/v)の混合物(試薬K)、
・  トリフルオロ酢酸(88%v/v)、トリイソプロピルシラン(2%v/v)、1,4-ジチオトレイトール(5%w/v)、及び水(5%w/w)の(低臭性)混合物(試薬L)、
・  トリフルオロ酢酸(90%v/v)、チオアニソール(5%v/v)、1,2-エタンジチオール(3%v/v)、及びアニソール(2%v/v)の混合物(試薬R)。
【０００８】
理想的には、使用されるカクテルは、固相合成シーケンシングの終了時に、ペプチドが結合している樹脂からのペプチドの切断をもたらす能力も有していると予想される。
【０００９】
このため、複数の問題となるアミノ酸を含有するNX210のようなポリペプチドの場合、とりわけ、最終生成物の純度が綿密に管理されなければならない際は、脱保護カクテルの選択は、決して些細なことではない。
【００１０】
これに加えて、その調製中に、このペプチドの二量体化及び/又はオリゴマー形成を最小限に抑えやすい条件は、大いに望ましい。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Peptides: Chemistry and Biology、第2版(DOI :10.1002/9783527626038)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の第1の目的は、NX210を単離する方法であって、NX210の環状形態の形成を制限することを可能とする方法である。
【００１３】
本発明の第2の目的は、最終的な脱保護工程に適合する保護基、とりわけ、NX210のオリゴマー又は(NX218として公知の)NX210の環状形態の形成を制限することを可能とする保護基を、側鎖上に持つアミノ酸の使用を特徴とする方法である。
【００１４】
本発明の第3の目的は、NX210を単離する方法であって、NX210の環状形態の形成を制限することを可能とする方法である。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
当業者に周知のとおり、この方法の全ての工程は、NX210のシステインの硫黄原子が酸化するのを回避するために、不活性雰囲気下で行われる(別段の指示がない限り)。
【００１６】
第1の実施形態において、本発明は、配列番号1のペプチドを調製する方法であって、配列番号1のペプチドが、配列番号1のペプチドの精製工程、任意の濃縮工程、及び有利には凍結乾燥又は噴霧乾燥によって行われる乾燥工程にわたり、有機溶媒を含む水溶液中で常に維持されることを特徴とする方法に関する。
【００１７】
本発明は、配列番号1のペプチドを調製する方法であって、配列番号1のペプチドの精製工程、及び/又は有利には凍結乾燥又は噴霧乾燥によって行われる乾燥工程が、有機溶媒を含む水溶液中で行われることを特徴とする、方法にも関する。
【００１８】
まったく予想外の形で、本発明者らは、配列番号1のペプチドの精製工程及び乾燥工程中の配列番号1のペプチドを含有する水溶液中の有機溶媒の存在が、副生成物の形成、とりわけ、配列番号1のペプチドの環化された形態の形成を防ぐことを証明した。
【００１９】
本発明の意味において、i)「配列番号1のペプチドが、精製工程、任意の濃縮工程、及び有利には凍結乾燥又は噴霧乾燥によって行われる乾燥工程にわたり、有機溶媒を含む水溶液中で常に維持される」及びii)「配列番号1のペプチドの精製工程、及び/又は有利には凍結乾燥又は噴霧乾燥によって行われる乾燥工程が、有機溶媒を含む水溶液中で行われる」が意味することは、固相合成及び任意の沈殿後に、配列番号1のペプチドが、とりわけ、その塩の形態で溶解する溶液が、常に有機溶媒を含有することである。
【００２０】
これは、配列番号1のペプチドを含有する水溶液の体積を減少させることを目的とするいずれの工程も、全ての有機溶媒が前記水溶液から除去される前に、停止されるべきであることを、とりわけ意味する。
【００２１】
有利には、水溶液に含まれる有機溶媒は、アセトニトリルである。
【００２２】
本発明による方法において、アセトニトリルは、精製工程中、とりわけ、ペプチドのクロマトグラフィーによる精製中に移動相として使用することができ、配列番号1のペプチドの二量体化を減少させることを可能にするため、最適な溶媒である。
【００２３】
水溶液中の有機溶媒、とりわけ、アセトニトリルの体積は、精製及び任意の濃縮中に水溶液の総体積の1〜90%、特に1〜10%の割合を占めるように、有利に維持及び/又は調整される。好ましくは、この水溶液は、約5%の有機溶媒、とりわけアセトニトリルを含有する。
【００２４】
有利には凍結乾燥又は噴霧乾燥によって乾燥される、水溶液中の有機溶媒、とりわけアセトニトリルの体積は、水溶液の総体積の1〜30%、特に1〜10%、好ましくは約5%の割合を占めるように維持及び/又は調整される。
【００２５】
本発明の文脈では、「乾燥される水溶液」は、精製工程後の、配列番号1のペプチドを含有する水溶液である。これは、乾燥工程にかける水溶液を定義している。
【００２６】
第2の実施形態において、本発明は、上記の方法であって、
a)樹脂にFmoc-Gly残基をグラフトする工程、
b)側鎖が保護されているFmoc保護アミノ酸を用いてペプチド鎖を伸長する工程、
c)アミノ酸の側鎖の脱保護及び樹脂からのポリペプチドの切断とを同時に行い、配列番号1のポリペプチドを得る工程、
d)配列番号1のペプチドを任意で沈殿させる工程、
e)配列番号1のペプチドを精製し、任意で濃縮する工程、
f)工程e)で得られた配列番号1のペプチドを、有利には凍結乾燥又は噴霧乾燥によって乾燥する工程
を含む方法に関する。
【００２７】
工程a)では、第1のグリシン残基を、当業者公知の実質的に任意の樹脂、例えば、Wang樹脂又は修飾Wang樹脂にグラフトしてよい。
【００２８】
有利には、この樹脂は、あまり厳しくない条件下で、ペプチドの切断を可能にすることから、4-メチルベンズヒドリルアミン基を含むジビニルベンゼン架橋ポリスチレン樹脂である。前記架橋樹脂は、当業者公知であり、例えば、Peptides: Chemistry and Biology、第2版(DOI :10.1002/9783527626038)のような出版物に記載されている。これらの樹脂は、例えば、Sigma-Aldrich社又はPolypeptide Laboratories社等の供給業者から市販されている。リンカーによって直接官能化された樹脂及び任意で第1のアミノ酸も、市販で入手しうる。
【００２９】
有利には、第1のグリシン残基を、スペーサーを介して、樹脂にグラフトする。本発明の意味において、「スペーサー」とは、樹脂と第1のアミノ酸のカルボニル基の間に位置する鎖を意味する。
【００３０】
より有利には、従来の反応条件下で、Fmoc-Gly残基を、メチルフェノキシプロピオン酸(MPPA)スペーサーによって、カルボニル官能基を介して、樹脂にグラフトする。代替方法として、ヒドロキシメチルフェノキシ酢酸(HMPA)スペーサーを、MPPAの代わりに使用してよい。
【００３１】
第1の残基が樹脂に固定されたら、配列番号1の配列の(側鎖が)保護されたドデカペプチドが得られるまで、(Fmoc基の脱保護)/(アミン上のFmoc基及び側鎖上の保護基によって保護されたアミノ酸とのカップリング)/精製のシーケンシングからなる反復方法を使用することによって、ペプチドを合成する。
【００３２】
ペプチド合成のこれらの反復方法は、当業者周知の従来の条件下で、例えば、本出願の実施例に記載の条件下で行われうる。とりわけ、DIC/HOBtシステムは、ペプチドカップリング行うために使用されてよい。Fmoc基の脱保護は、ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)を用いて有利に行われる。
【００３３】
ある実施形態において、アミノ酸は、特定の基で保護されている側鎖を有する。先に説明したように、適切な保護基の選択は、ペプチド合成において些細なことではない。
【００３４】
有利には、本発明は、
・  Argの側鎖の保護基が、2,2,4,6,7-ペンタメチルジヒドロベンゾフラン-5-スルホニルであり、
・  Cysの側鎖の保護基が、トリチルであり、
・  Serの側鎖の保護基が、t-ブチルであり、
・  Trpの側鎖の保護基が、t-ブトキシカルボニルである、上記の方法に関する。
【００３５】
これらの特定の保護基を使用することで、脱保護及び樹脂からの切断の工程が、効率的に行われうることが認められた。
【００３６】
次に、樹脂に結合した保護ドデカペプチドを、この樹脂のC末端アミノ酸の切断、及びそれを構成しているアミノ酸の側鎖の脱保護を同時に行うことを可能にする反応条件下に置く。予想外に、問題となる可能性のあるアミノ酸の存在にも関わらず、このアミノ酸の側鎖の脱保護及び同時に行われる樹脂からのポリペプチドの切断は、試薬として、トリフルオロ酢酸、水、及び1,4-ジチオトレイトールを含有する混合物を用いて行われうることが、実証された。有利には、前記混合物は、混合物の総質量に対して85〜95質量%のトリフルオロ酢酸、3〜10質量%の1,4-ジチオトレイトール、及び100質量%に達するまでの水で構成される。
【００３７】
脱保護及び樹脂からの切断の終了時に、反応媒体は、配列番号1のペプチド、切断及び脱保護の試薬、並びに前記脱保護工程から生じた副産物を含有する。
【００３８】
この生成物は、クロマトグラフィー法によって直接精製されるか、又は1回若しくは複数回の精製工程にかけ、次に、クロマトグラフィー法によって任意で精製されてよい。
【００３９】
有利な実施形態において、配列番号1のペプチドを含有する混合物を、沈殿工程にかける。配列番号1のペプチドを調製する状況において、エーテル等の従来使用される溶媒は、配列番号1の粗ペプチドの単離を妨げるゲルの形成を招くことが、実証された。本発明者らは、エーテル、とりわけメチル-tert-ブチルエーテル(MTBE)及びアルカン、とりわけヘプタンの混合物を使用することで、配列番号1のペプチドを部分的に精製することが可能となることを発見した。有利には、エーテル及びアルカンの1:1の混合物を使用する。より有利には、ヘプタン及びMTBEの1:1の比の混合物を使用する。
【００４０】
次に、上記で定義された工程c)又は工程d)の終了時に、好ましくは、沈殿工程d)後に得られた配列番号1のペプチドを精製にかける。前記精製を、患者に更に投与するのに十分な純度を有する生成物をもたらすことを条件として、当業者公知の任意の手段によって行ってよい。
【００４１】
有利には、精製工程は、少なくとも1回の分取逆相クロマトグラフィーによって達成される。この条件(すなわち、固定相、移動相、流量)は、当業者によって決定されうる。分取クロマトグラフィーは、患者に投与するのに十分な純度であって、HPLC、NMR、及び/又はGC等の分析手段によって決定された、有利には90%を超える、とりわけ95%を超える純度を有する生成物を得るための有効な方法である。
【００４２】
分取逆相クロマトグラフィーは、移動相にトリフルオロ酢酸を使用して、通常行われる。このため、得られた生成物は、配列番号1のペプチドのトリフルオロ酢酸塩である。
【００４３】
このため、この方法は、とりわけ、薬学的に許容される塩を得るために、トリフルオロ酢酸イオンを別のイオンに置き換えるためのイオン交換の更なる工程を含むことがある。
【００４４】
本発明の意味において、「薬学的に許容される塩」とは、一般的に安全で、非毒性で、生物学的にもそうでなくとも望ましくないものではない塩が、ヒトへの投与に許容され、親化合物の望ましい薬理活性を有することを意味する。前記塩は、溶解特性若しくは加水分解特性を変更するために使用されうるか、又は徐放性若しくはプロドラッグ製剤に使用されうる。これらの塩を、標準的な手順によって、例えば、遊離酸を適当な有機塩基又は無機塩基と反応させることによって、調製してよい。
【００４５】
このような塩には、酢酸塩、ラクトビオン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ラウリン酸塩、安息香酸塩、リンゴ酸塩、重炭酸塩、マレイン酸塩、重硫酸塩、マンデル酸塩、重酒石酸塩、メシル酸塩、ホウ酸塩、臭化メチル、臭化物、メチル硝酸塩、エデト酸カルシウム、メチル硫酸塩、カンシル酸塩、粘液酸塩、炭酸塩、ナプシル酸塩、塩化物、硝酸塩、クラブラン酸塩、N-メチルグルカミン、クエン酸塩、アンモニウム塩、二塩酸塩、オレイン酸塩、エデト酸塩、シュウ酸塩、エジシル酸塩、パモ酸塩(エンボン酸塩)、エストル酸塩、パルミチン酸塩、エシル酸塩、パントテン酸塩、フマル酸塩、リン酸塩/二リン酸塩、グルセプト酸塩、ポリガラクツロン酸塩、グルコン酸塩、サリチル酸塩、グルタミン酸塩、ステアリン酸塩、グリコリルアルサニル酸塩、硫酸塩、ヘキシルレゾルシン酸塩、塩基性酢酸塩、ヒドラバミン、コハク酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、スルホン酸塩、タンニン酸塩、塩酸塩、酒石酸塩、トリフル酸塩、ヒドロキシナフトエ酸塩、テオクル酸塩、ヨウ化物、トシル酸塩、イソチオン酸塩、トリエチオジド、乳酸塩、パモ酸塩(panoate)、吉草酸塩が含まれる。
【００４６】
有利には、対応する酸を、移動相又はイオン交換樹脂上に使用した逆相クロマトグラフィーによって、イオン交換を行ってよい。より有利には、前記イオン交換を、逆相クロマトグラフィー固定相で行ってよい。とりわけ、分取逆相クロマトグラフィーによって、前記イオン交換を、精製まで連続的に行ってよい。
【００４７】
本発明の文脈内で、「連続的に」とは、例えば、溶媒の蒸発又は当業者公知の任意の他の手段によって、水溶液を濃縮することなく、工程e)で得られ、ペプチドを含有する水溶液を、イオン交換手順にかけることを意味する。
【００４８】
好ましくは、前記イオン交換工程を、生成物の精製に使用されたものと同じ固定相で(前記固定相の再生後に)行う。
【００４９】
配列番号1のペプチドは、精製後に、最終的に乾燥される。このペプチドを、この生成物の純度に影響を及ぼさないことを条件として、当業者公知の任意の手段によって乾燥してよい。
【００５０】
有利には、配列番号1のペプチドを、凍結乾燥又は噴霧乾燥によって乾燥する。これらの乾燥方法は、穏やかであり、生成物の分解を回避する。本発明者らが発見したとおり、乾燥工程の開始時において、有機溶媒、とりわけアセトニトリルの存在は、配列番号1のペプチドの二量体化を防ぐために不可欠である。
【００５１】
乾燥工程、有利には、凍結乾燥工程又は噴霧乾燥工程の開始時において、水溶液中の有機溶媒、とりわけアセトニトリルの体積は、水溶液の総体積の1〜30%、特に1〜10%、好ましくは約5%の割合を占めるように維持及び/又は調整される。
【００５２】
このため、本発明は、上記で定義された方法であって、水溶液の総体積の1〜30%、特に1〜10%、好ましくは約5%の有機溶媒、とりわけアセトニトリルを含む、水溶液中の配列番号1のペプチドを、好ましくは、凍結乾燥又は噴霧乾燥によって乾燥する方法に関する。
【００５３】
本発明は、好ましくは、配列番号1のペプチドを調製する上記の方法であって、
a)4-メチルベンズヒドリルアミン基を含む、ジビニルベンゼン架橋ポリスチレン樹脂にFmoc-Gly-MMPA-OH残基をグラフトする工程、
b)Fmoc保護cys、ser、arg、ser、cys、ser、ser、trp、gly、ser、及びtrpを用いてペプチド鎖を伸長して、側鎖が保護されている配列番号1のペプチドを得る工程であって、Argの側鎖の保護基が、2,2,4,6,7-ペンタメチルジヒドロベンゾフラン-5-スルホニルであり、Cysの側鎖の保護基が、トリチルであり、Serの側鎖の保護基が、t-ブチルであり、Trpの側鎖の保護基が、t-ブトキシカルボニルである、工程、
c)トリフルオロ酢酸、水、及び1,4-ジチオトレイトールの混合物を用いて、このアミノ酸の側鎖の脱保護及び樹脂からのポリペプチドの切断を同時に行い、配列番号1のポリペプチドを得る工程、
d)ヘプタン及びMTBEの混合物を用いて、配列番号1のペプチドを沈殿させる工程、
e)分取逆相クロマトグラフィーによって配列番号1のペプチドを精製する工程であって、配列番号1のペプチドが、有機溶媒、好ましくはアセトニトリルを含む水溶液中で常に維持されることを特徴とする、工程、
f)工程e)で得られた配列番号1のペプチドを含有する溶液を濃縮して、配列番号1のペプチド及び有機溶媒、好ましくはアセトニトリルを含有する濃縮した水溶液を得る工程、
g)逆相クロマトグラフィー固定相又はイオン交換樹脂において、トリフルオロ酢酸イオンを、薬学的に許容されるイオン、特に酢酸イオンで交換する工程、
h)工程g)で得られた配列番号1のペプチドを含有する水溶液を濃縮して、配列番号1のペプチド及び有機溶媒、好ましくはアセトニトリルを含有する濃縮した水溶液を得る工程、
i)工程h)で得られた水溶液を、有利には、噴霧乾燥又は凍結乾燥によって乾燥して、配列番号1のペプチドを得る工程
を含む方法に関する。
【００５４】
第2の実施形態において、本発明は、とりわけ配列番号1のペプチドの精製、任意の濃縮、及び有利には噴霧乾燥又は凍結乾燥による乾燥中における配列番号1のペプチドの二量体化を防ぐための、水性溶媒中の有機溶媒、特にアセトニトリルの使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１Ａ】配列番号1のドデカペプチドを調製するための一般的スキームを示す図である。
【図１Ｂ】図１Ａの続きを示す。
【図２】特別な工程、すなわち、精製及び乾燥で、アセトニトリルを使用して、方法を行う場合に得られるクロマトグラムを示す図である。
【図３】精製、乾燥、及びクロマトグラフィー工程中に、アセトニトリルを使用しないで、方法を行う場合に得られるクロマトグラムを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００５６】
(実施例1)
配列番号1のペプチドの調製
以下の試薬を使用した。
【００５７】
【表１】
2020506210.tif 000002
【００５８】
【表２】
2020506210.tif 000003
【００５９】
【表３】
2020506210.tif 000004
【００６０】
【表４】
2020506210.tif 000005
【００６１】
【表５】
2020506210.tif 000006
【００６２】
NX210の製造方法は、ペプチドの組み立てにおいて、ビルディングブロックとしてN-α-Fmoc(側鎖)保護アミノ酸を適用する、固相ペプチド合成(SPPS)に基づいている。
【００６３】
採用されたプロトコルは、MBHA樹脂上のMPPAリンカーに結合させたC末端グリシンのN-α-Fmoc保護アミノ酸のカップリング、続くFmocのカップリング/脱保護のシーケンシングで構成される。
【００６４】
樹脂上のペプチドの組み立て後に、樹脂からのペプチドの切断及びこのアミノ酸の側鎖の脱保護の同時の工程を行う。
【００６５】
配列番号1の粗ペプチドを、沈殿させ、濾過し、乾燥する。分取逆相クロマトグラフィーによる精製前に、配列番号1のペプチドを、アセトニトリルを含有する水溶液に溶解する。次に、その酢酸塩の形態で、配列番号1のペプチドを得るための、イオン交換工程を施す前に、この溶液中の精製したペプチドを濃縮する。
【００６６】
工程1:ペプチドの組み立て:
DMF(MBHA/FmocGlyMPPA/DIC/HOBt:1、1.35、1.35、1.35の比)中、DIC/HOBtシステムを用いて、Fmoc-Gly-MPPA-OHの形態の第1のグリシン残基を、樹脂にカップリングする。
【００６７】
各カップリング工程前に、DMF中25%ピペリジンを用いて、Fmoc保護基を除去し、過剰なピペリジンを除去するために、DMFを用いて樹脂を洗浄する。DMF中で、DIC/HOBtシステムを使用し、Fmoc保護アミノ酸のカップリングを達成する。
【００６８】
1つのアミノ酸を用いたカップリングの完了後に、同様の条件下で、次のカップリングを行う。
【００６９】
トリプトファンの末端アミノ酸のカップリング及び末端Fmoc基の脱保護後に、DMF及び2-プロパノールを用いて、樹脂を洗浄し、一定質量まで乾燥する。
【００７０】
工程2:同時に生じる樹脂からのペプチドの切断及び側鎖の脱保護:
脱保護及び切断のための様々な条件を採用した。トリフルオロ酢酸/水/1,4-ジチオトレイトールカクテル(86/5/9v/v/m)で、最良の結果が得られた。次に、濾過によって、樹脂を除去すると、ペプチドは、試薬及び副産物の複合混合物と共に溶液中に残留する。
【００７１】
工程3:HPLCによる精製前のペプチドの沈殿及び濾過:
配列番号1のペプチドを含有する濾液の体積を低減し、MTBE及びヘプタンの混合物を使用して、ペプチドを沈殿させる。従来使用される他の溶媒(例えば、ジエチルエーテル又はMTBE単独)の使用によって、濾過することができないゲルが形成される。
【００７２】
濾過後、減圧下で、一定質量までこの固体を乾燥させる。
【００７３】
工程4:HPLCによる精製前の沈殿物の溶解:
精製前に、沈殿によって得られた不純なNX210を、アセトニトリル/水/酢酸混合物に溶解する。
【００７４】
水溶液へのアセトニトリルの添加は、十分に高い純度のペプチドを得るために重要である。実際に、水/酢酸混合物を用いると、二量体の形成は増加することが観察された。これらの二量体は、より複雑なオリゴマーの形成を招き、これらは、とりわけ、髄腔内直接投与に不適合な凝集体を形成する傾向のため、もはや治療剤開発に適さない。
【００７５】
溶解時のアセトニトリルのこのような影響は、特に珍しく、これまでに説明がついていない。別の帰結は、この生成物の分析には、測定のオペレーターが何であれ、信頼性が高く、生成物の実際の不純物含有率を反映するため、生成物を、アセトニトリルを含有する混合物に溶解する必要があるという発見である。
【００７６】
工程5:HPLCによる第1の精製:
逆相HPLCによる中間の精製を伴わない2段階で、精製及び酢酸塩への変換を行う。工程4で得られたNX210を、カラムに吸着させ、希トリフルオロ酢酸水溶液中のアセトニトリルの勾配を用いて(室温で)、カラムから溶出させる。
【００７７】
以下の条件下で、クロマトグラフィーを行う:
カラム:LC110多目的(固定相Luna(登録商標)C18グラフトシリカ、15μm、100Å、注入する12gの粗NX210に対して約1250g、すなわち、約1%の充填)。
流量:450mL/分
溶出勾配:7〜32%移動相(アセトニトリル/水(80/20、v/v)中0.1%酢酸)で30分間。
【００７８】
固定相、注入量、流速、及び勾配の選択は、不純物の分離を向上するために、当然ながら改変することができる。
【００７９】
工程6:第2の精製及び酢酸塩への変換:
多目的LC110カラムでの分取逆相CHLPによって、第2の精製及び酢酸塩への変換を行う。固定相は、Luna(登録商標)C18グラフトシリカ(15μm、100Å、19gの注入する粗ペプチドに対して約1250g)である。カラムの充填及び洗浄を行う。
【００８０】
(実施例2)
比較試験:
精製工程におけるアセトニトリルの添加の重要性を評価した。工程の間にアセトニトリルを蒸発させ、凍結乾燥前にアセトニトリルを除去することによって、実施例1のそれと同じ手順を行った。
【００８１】
結果を、以下の表に提示する:
【００８２】
【表６】
2020506210.tif 000007
【００８３】
分析の結果により示されるとおり、アセトニトリルの非存在下で、調製方法の終了時に得られた生成物は、二量体を著しく高い割合で含有する。アセトニトリルを用いない場合、分析中に三量体種も観察される。
【図１Ａ】
2020506210.tif 000008
【図１Ｂ】
2020506210.tif 000009
【図２】
2020506210.tif 000010
【図３】
2020506210.tif 000011
【配列表】
2020506210000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年10月10日(2019.10.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号1のペプチドを調製する方法であって、配列番号1のペプチドが、配列番号1のペプチドの精製工程及び乾燥工程にわたり、有機溶媒を含む水溶液中で常に維持される、方法。
【請求項２】
配列番号1のペプチドを調製する方法であって、配列番号1のペプチドの精製工程及び/又は乾燥工程が、有機溶媒を含む水溶液中で行われる、方法。
【請求項３】
水溶液中の有機溶媒の体積が、精製工程中、水溶液の総体積の1〜90%の割合を占めるように維持及び/又は調整される、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
乾燥される水溶液中の有機溶媒の体積が、水溶液の総体積の1〜30%の割合を占めるように維持及び/又は調整される、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記割合が、1〜10%である、請求項3又は4に記載の方法。
【請求項６】
前記割合が、約5%である、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
a)樹脂にFmoc-Gly残基をグラフトする工程、
b)側鎖が保護されているFmoc保護アミノ酸を用いてペプチド鎖を伸長する工程、
c)アミノ酸の側鎖の脱保護と樹脂からのポリペプチドの切断とを同時に行い、配列番号1のポリペプチドを得る工程、
d)配列番号1のペプチドを任意で沈殿させる工程、
e)配列番号1のペプチドを精製し、任意で濃縮する工程、
f)工程e)で得られた配列番号1のペプチドを乾燥する工程
を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
樹脂が、4-メチルベンズヒドリルアミン基を含むジビニルベンゼン架橋ポリスチレン樹脂である、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
工程a)のFmoc-Gly残基が、Fmoc-Gly-MPPA-OH残基である、請求項7又は8に記載の方法。
【請求項１０】
・  Argの側鎖の保護基が、2,2,4,6,7-ペンタメチルジヒドロベンゾフラン-5-スルホニルであり、
・  Cysの側鎖の保護基が、トリチルであり、
・  Serの側鎖の保護基が、t-ブチルであり、
・  Trpの側鎖の保護基が、t-ブトキシカルボニルである
請求項7から9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
工程c)が、トリフルオロ酢酸、水、及び1,4-ジチオトレイトールの混合物を用いて行われる、請求項7から10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記混合物が、混合物の総質量に対して、85〜95質量%のトリフルオロ酢酸、3〜10質量%の1,4-ジチオトレイトール、及び100質量%に達するまでの水からなる、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
配列番号1のペプチドを沈殿させる工程であって、MTBE及びヘプタンの混合物を用いて行われる工程を含む、請求項7から12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
工程e)の精製が、少なくとも1回の分取逆相クロマトグラフィーを含む、請求項7から13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
工程e)の精製が、逆相クロマトグラフィー固定相又はイオン交換樹脂におけるイオン交換を更に含む、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
ペプチドが、追加の濃縮工程中も前記有機溶媒中で維持される、請求項1から15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
a)4-メチルベンズヒドリルアミン基を含む、ジビニルベンゼン架橋ポリスチレン樹脂にFmoc-Gly-MMPA-OH残基をグラフトする工程、
b)Fmoc保護cys、ser、arg、ser、cys、ser、ser、trp、gly、ser、及びtrpを用いてペプチド鎖を伸長して、側鎖が保護されている配列番号1のペプチドを得る工程であって、Argの側鎖の保護基が、2,2,4,6,7-ペンタメチルジヒドロベンゾフラン-5-スルホニルであり、Cysの側鎖の保護基が、トリチルであり、Serの側鎖の保護基が、t-ブチルであり、Trpの側鎖の保護基が、t-ブトキシカルボニルである、工程、
c)トリフルオロ酢酸、水、及び1,4-ジチオトレイトールの混合物を用いて、アミノ酸の側鎖の脱保護及び樹脂からのポリペプチドの切断を同時に行い、配列番号1のポリペプチドを得る工程、
d)ヘプタン及びMTBEの混合物を用いて、配列番号1のペプチドを沈殿させる工程、
e)分取逆相クロマトグラフィーによって配列番号1のペプチドを精製する工程であって、配列番号1のペプチドが、有機溶媒を含む水溶液中で常に維持されることを特徴とする、工程、
f)工程e)で得られた配列番号1のペプチドを含有する溶液を濃縮して、配列番号1のペプチド及び有機溶媒を含有する濃縮された水溶液を得る工程、
g)逆相クロマトグラフィー固定相又はイオン交換樹脂において、トリフルオロ酢酸イオンを、薬学的に許容されるイオンで交換する工程、
h)工程g)で得られた配列番号1のペプチドを含有する水溶液を濃縮して、配列番号1のペプチド及び有機溶媒を含有する濃縮された水溶液を得る工程、
i)工程h)で得られた水溶液を乾燥して、配列番号1のペプチドを得る工程
を含む、配列番号1のペプチドを調製する方法。
【請求項１８】
有機溶媒が、アセトニトリルである、請求項1から17のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
乾燥が、凍結乾燥又は噴霧乾燥によって行われる、請求項1から18のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
配列番号1のペプチドの精製工程及び乾燥工程中における配列番号1のペプチドの二量体化を防ぐための、水性溶媒中の有機溶媒の使用。
【請求項２１】
前記有機溶媒が、アセトニトリルである、請求項20に記載の使用。
【請求項２２】
乾燥が、噴霧乾燥又は凍結乾燥によって行われる、請求項20又は21に記載の使用。
【請求項２３】
前記有機溶媒が、濃縮工程中にも使用される、請求項20〜22のいずれか一項に記載の使用。
【国際調査報告】
2020506210.tif 000012
2020506210.tif 000013
2020506210.tif 000014