(57)【要約】  本発明の技術は、植物病原体および草食動物を防除するための新規の系、方法、および戦略に関する。本発明の技術は、阻害性ＲＮＡ分子を病原体感染植物に送達するように構成された新規な組成物、系、および方法を具体的に含み得る。好ましい実施形態では、本発明は、１つ以上の阻害性ＲＮＡ分子を病原体感染植物に送達するように構成された遺伝子操作内生細菌を含み得る。１つの好ましい実施形態は、ウイルスにコードされたタンパク質を標的とするヘアピンＲＮＡの新規の生物界間送達を含み得、これにより、結果として、ウイルスタンパク質蓄積レベルの低下をもたらす。【選択図】図１
2020511472.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物病原体の生物的防除のための系であって、
−抑制されたＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有する遺伝子改変植物内生細菌を生成するステップと、
−植物病原体中の少なくとも１つの標的配列に向けられた二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）またはヘアピン（ｈｐＲＮＡ）を形成することができる少なくとも１つの小さい阻害性リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）をコードしているポリヌクレオチドを含む核酸構築物により、前記遺伝子改変内生細菌を形質転換するステップと、
前記遺伝子改変植物内生細菌を植物に導入するステップと、
前記植物においてＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）メカニズムを誘導するのに十分な時間にわたって、前記核酸構築物を発現させるステップと、を含み、前記ＲＮＡｉメカニズムにより、植物病原体における前記少なくとも１つの標的配列の下方制御が引き起こされる、系。
【請求項２】
前記遺伝子改変植物内生細菌を植物に導入する前記ステップが、１回以上の浸漬、噴霧、注入、エアロゾル散布、環境エアロゾル散布、水源での環境エアロゾル散布、凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）、凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｉｅｄ）、マイクロカプセル化、乾燥、水性キャリア中、溶液中、ブラッシング、ドレッシング、滴下、およびコーティングからなる群から選択されるステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記植物が、単子葉植物および／または双子葉植物である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記植物が、穀物、トウモロコシ、コムギ、イネ、オオムギ、オーツムギ、モロコシ、キビ、ヒマワリ、ベニバナ、綿、大豆、キャノーラ、アルファルファ、シロイヌナズナ、アサ、ジャガイモ、アブラナ属、ピーナッツ、タバコ、熱帯の果物および花、バナナ、ウキクサ、グラジオラス、サトウキビ、パイナップル、デーツ、タマネギ、パイナップル、カシューナッツ、ピスタチオ、花、観葉植物、針葉樹、落葉性、ブドウ、柑橘類、バラ、りんご、モモ、イチゴ、アーモンド、コーヒー、オーク、豆、さや、スイカ、カボチャ、キャベツ、カブ、マスタード、サボテン、ペカン、亜麻、サツマイモ、大豆、ココナッツ、アボカド、ビート、カンタロープメロン、野菜からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記植物病原体が、植物ウイルス、植物ウイロイド、真菌、有害生物、草食動物、およびカビからなる群から選択される植物病原体である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記植物ウイルスが、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）；トマト黄化えそウイルス（ＴＳＷＶ）；トマト黄化巻葉ウイルス（ＴＹＬＣＶ）；キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）；ジャガイモウイルスＹ（ＰＶＹ）；カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）；アフリカキャッサバモザイクウイルス（ＡＣＭＶ）；プラムポックスウイルス（ＰＰＶ）；ブロムモザイクウイルス（ＢＭＶ）；ジャガイモウイルスＸ（ＰＶＸ）；カンキツトリステザウイルス；オオムギ黄萎ウイルス；ジャガイモ巻葉ウイルスおよびトマトブッシースタントウイルスからなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記標的配列が、ウイルスの重要領域の配列、ウイルス科の保存された配列、および異なるウイルス科のメンバー間の保存された配列からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
抑制される前記標的配列が、前記タバコモザイクウイルス中のレプリカーゼ遺伝子、運動タンパク質、コートタンパク質；前記トマト黄化えそウイルス中の糖タンパク質（ＧＰ）、ＮＳｍタンパク質、ＮＳｓタンパク質、ウイルスＲＮＡゲノムセグメントＬ、Ｍ、Ｓ；前記トマト黄化巻葉ウイルス中のＶ１、Ｖ２、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｖ１タンパク質；前記キュウリモザイクウイルス中の１ａ、２ａ２ｂタンパク質、３ａ、コートタンパク質；前記ジャガイモウイルスＹ中のＰＩ、ＨＣ−Ｐｒｏ、Ｐ３、６ｋｌ、Ｃ１、６ｋ２、ＮＩａ、ＮＩｂ、ＣＰ；前記カリフラワーモザイクウイルス中の運動タンパク質、２つのアブラムシ伝達因子（Ｐ２および／またはＰ３）、キャプシドタンパク質の前駆体（Ｐ４）、プロテイナーゼのポリタンパク質前駆体、Ｐ５、Ｐ６タンパク質；前記アフリカキャッサバモザイクウイルス中のＡＶ１、ＡＶ２、ＡＣ１、ＡＣ２、ＡＣ３、ＡＣ４、ＢＣ１、ＢＶ１；前記プラムポックスウイルス中のＰＩ、ＨＣ−Ｐｒｏ、Ｐ３、６ｋｌ、Ｃ１、６ｋ２、ＮＩａ、ＮＩｂ、ＣＰ；前記ブロムモザイクウイルス中の１ａ、２ａ、運動タンパク質、コートタンパク質；前記ジャガイモウイルスＸ中のレプリカーゼ、ＴＧＢ１、ＴＧＢ２、ＴＧＢ３、コートタンパク質からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記真菌が、イネいもち病菌；灰色かび病菌；プッチニア属；ムギ類赤カビ病；フザリウムオキシスポラム；オオムギうどんこ病菌；コムギ葉枯病菌；コレトトリカム属；トウモロコシ黒穂病菌；アマさび病菌、ダイズさび病菌およびリゾクトニア・ソラニ−からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
前記標的配列が、真菌必須遺伝子の重要領域の配列、必須遺伝子ファミリーの保存配列、および異なるウイルス科のメンバー間の保存必須遺伝子からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記標的配列が、ＲＮＡのノンコーディング領域、ＲＮＡのコーディング領域からなる群から選択され、前記標的配列がＲＮＡのスプライス部位を含む、請求項１、７、または９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記核酸構築物がプラスミドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記プラスミドが、ｐＡＤ−ＷＲＫＹ−ＧＨＹｌ；ｐＡＤ−ＡＤＨ−ＧＨＹ２；ｐＯＸＢ−ＷＲＫＹ−ＧＨＹ３；ｐＯＸＢ−ＡＤＨ−ＧＨＹ４；ｐＡＤ−ＷＲＫＹ−ＧＨＹ５；ｈｐＲＮＡ  ｐＡＤ−ＡＤＨ−ＧＨＹ６；およびｈｐＲＮＡ  ｐＡＤ−ＷＲＫＹ−ＧＨＹ７からなるプラスミドの群からの前記標的配列を含むように改変されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
植物病原体中の少なくとも１つの標的配列に向けられる二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）またはヘアピン（ｈｐＲＮＡ）を形成することができるように構成された前記ｓｉＲＮＡが、プロモーターに作動可能に連結されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記プロモーターが、非構成的プロモーター、誘導性プロモーター、病原体誘導性プロモーター、組織優先的（ｔｉｓｓｕｅ−ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）プロモーター、組織特異的プロモーター、植物特異的プロモーター、または構成的プロモーターからなる群から選択されるプロモーターである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
抑制されたＲＮａｓｅＩＩＩを有する前記遺伝子改変植物内生細菌が、アシドバクテリア、放線菌、アルファプロテオバクテリア、アルマティモナス、バクテロイデス、ベータプロテオバクテリア、デルタプロテオバクテリア、フィルミクテス、グラムプロテオバクテリア、ＴＭ７、バチルス、大腸菌からなる群から選択される、請求項１の方法。
【請求項１７】
前記遺伝子改変植物内生細菌が、Ｍ−ＪＭ１０９−ＧＨＹ２である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記遺伝子改変植物内生細菌が枯草菌ＣＣＢ４２２である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記遺伝子改変植物内生細菌が、大腸菌ＨＴ２７またはＨＴ１１５である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
抑制されたＲＮａｓｅＩＩＩを有する前記遺伝子改変植物内生細菌が、過胞形成活性を有する遺伝子改変植物内生細菌、ＪＣ８０３１であり、かつ／または他の細菌によりナノチューブ形成を増強するのに十分な１つ以上の栄養素要求株を有する遺伝子改変植物内生細菌である、請求項１または１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記ｓｉＲＮＡが前記植物において移動する、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記植物においてＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）メカニズムを誘導するのに十分な時間にわたって、前記核酸構築物を発現させる前記ステップであって、前記ＲＮＡｉメカニズムにより、前記植物病原体において、前記少なくとも１つの標的配列の下方制御が引き起こされるステップが、前記核酸構築物を継続的に発現させ、それにより前記植物において持続的なＲＮＡｉメカニズムを開始するステップを含み、前記持続的なＲＮＡｉメカニズムが、前記植物に、前記植物病原体感染に対して野生型よりも高い耐性を持たせる、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
少なくとも１つのヘルパー遺伝子を共発現するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
植物病原体中の少なくとも１つの異なる標的配列に向けられる少なくとも１つの追加のｓｉＲＮＡ分子を共発現するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記ヘルパー遺伝子が、ＶｒｒＡ；ＳＩＤ１；ＳＩＤ２；ＡＧ０１；ＡＧ０２；ＡＧ０７；ＹｍｄＢ；ＹｍｄＢ；スタウフェン；ＲＤＥ−４；ＨｌｙＡ；Ｓｅｃ−およびＴａｔ−分泌シグナルペプチド；１つ以上の細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）；Ｔａｔ；アンテナペディア；ＡＣＣデアミナーゼ；１つ以上の師部ＲＮＡトランスポーター；ＰＰ２−Ａ１；ＰＳＲＰ１；ＤＲＢ１；ＤＲＢ４；ＨＥＮ１およびＳＴＶ１からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記共発現ヘルパー遺伝子が、前記遺伝子改変植物内生細菌内で形質転換された前記核酸構築物および／または二次核酸構築物から発現する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記植物が、病原体感染植物を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項２８】
前記植物が、前記植物病原体に感染していない植物である、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記真菌植物病原体の前記１つの標的配列が、前記イネいもち病菌中のＭｏＡＢＣ１、ＭｏＭＡＣ１およびＭｏＰＭＫ１、Ｉｕｇ６、Ｉｕｇ９およびＩｕｇ１８、ＭｏＭｐｇ１、ＭｏＥｍｐ１、ＭｏＭｈｐ１、ＭｏＭｓｐ１、ＭＣ６９、ならびにＳｌｐ１；前記灰色かび病中のＢｃｐｇ１およびＢＭＰ１；前記プッチニア属中のＡＰＫ、シクロフィリン、およびカルシニューリン調節サブユニット、ならびに分泌タンパク質；前記ムギ類赤カビ病中のＭＡＰ１、およびＭＡＰキナーゼｇｐｍｋ１；前記フザリウムオキシスポラム中のＭＡＰキナーゼ、ｐｇ１、病原性関連遺伝子、分泌タンパク質；前記オオムギうどんこ病菌中のエフェクター遺伝子Ａｖｒａ１０、病原性関連遺伝子、分泌タンパク質；前記コムギ葉枯病菌中の病原性関連遺伝子、ＭｇＳｌｔ２、ＡＢＣトランスポーター遺伝子ＭｇＡｔｒ１およびＭｇＡｔｒ２、分泌タンパク質；前記コレトトリカム属中のＣＭＫ１およびｃｌｋ１、病原性関連タンパク質１０；前記トウモロコシ黒穂病菌中の病原性関連遺伝子、Ｋｐｐ２、ｕｋｃ１、分泌タンパク質；および前記アマさび病菌中の病原性関連遺伝子、分泌タンパク質からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項３０】
前記小さい阻害性リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）が、植物病原体の少なくとも１つの必須遺伝子を下方制御するように構成され、かつ１つ以上の特異的ＲＮＡモチーフを有するように構成された小さい阻害性リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）であり、前記ＲＮＡモチーフをｄｓＲＮＡに組み込んで、これにより、前記植物の師部を介した伝達を促進し得る、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
阻害性ＲＮＡ分子を植物に送達するための生物界間系であって、
−抑制されたＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有する遺伝子改変植物内生細菌を生成するステップと、
−植物病原体の少なくとも１つの必須遺伝子を下方制御するように構成された少なくとも１つの小さい阻害性リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）をコードしているポリヌクレオチドを含む核酸構築物により、前記遺伝子改変植物内生細菌を形質転換するステップと、
−前記伝子改変植物内生細菌を植物に導入するステップと、
−前記植物において、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）メカニズムを誘導するのに十分な時間にわたって、前記核酸構築物を発現させるステップであって、前記ＲＮＡｉメカニズムにより、前記植物病原体の前記少なくとも１つの必須遺伝子の下方制御が引き起こされるステップと、を含む、系。
【請求項３２】
前記ｓｉＲＮＡが、前記植物病原体の少なくとも１つの必須遺伝子の前記標的配列に完全にまたは部分的に相補的である１つ以上のｈｐＲＮＡを含む、請求項３０に記載の、植物へ阻害性ＲＮＡ分子を送達するための生物界間系。
【請求項３３】
前記遺伝子組換え内生細菌を植物に導入する前記ステップが、１回以上の浸漬、噴霧、注入、エアロゾル散布、環境エアロゾル散布、水源での環境エアロゾル散布、凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）、凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｉｅｄ）、マイクロカプセル化、乾燥、水性キャリア中、溶液中、ブラッシング、ドレッシング、滴下、およびコーティングからなる群から選択されるステップを含む、請求項３１に記載の、植物へ阻害性ＲＮＡ分子を送達するための生物界間系。
【請求項３４】
前記植物が、単子葉植物および／または双子葉植物である、請求項３１に記載の、植物へ阻害性ＲＮＡ分子を送達するための生物界間系。
【請求項３５】
前記植物が、穀物、トウモロコシ、コムギ、イネ、オオムギ、オーツムギ、モロコシ、キビ、ヒマワリ、ベニバナ、綿、大豆、キャノーラ、アルファルファ、シロイヌナズナ、アサ、ジャガイモ、アブラナ属、ピーナッツ、タバコ、熱帯の果物および花、バナナ、ウキクサ、グラジオラス、サトウキビ、パイナップル、デーツ、タマネギ、パイナップル、カシューナッツ、ピスタチオ、花、観葉植物、針葉樹、落葉性、ブドウ、柑橘類、バラ、りんご、モモ、イチゴ、アーモンド、コーヒー、オーク、豆、さや、スイカ、カボチャ、キャベツ、カブ、マスタード、サボテン、ペカン、亜麻、サツマイモ、大豆、ココナッツ、アボカド、ビート、カンタロープメロン、野菜からなる群から選択される、請求項３３に記載の、植物へ阻害性ＲＮＡ分子を送達するための生物界間系。
【請求項３６】
前記植物病原体が、植物ウイルス、植物ウイロイド、真菌、有害生物、草食動物、およびカビからなる群から選択される植物病原体である、請求項３４に記載の、植物へ阻害性ＲＮＡ分子を送達するための生物界間系。
【請求項３７】
前記植物ウイルスが、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）；トマト黄化えそウイルス（ＴＳＷＶ）；トマト黄化巻葉ウイルス（ＴＹＬＣＶ）；キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）；ジャガイモウイルスＹ（ＰＶＹ）；カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）；アフリカキャッサバモザイクウイルス（ＡＣＭＶ）；プラムポックスウイルス（ＰＰＶ）；ブロムモザイクウイルス（ＢＭＶ）；ジャガイモウイルスＸ（ＰＶＸ）；カンキツトリステザウイルス；オオムギ黄萎ウイルス；ジャガイモ巻葉ウイルスおよびトマトブッシースタントウイルスからなる群から選択される、請求項３５に記載の、植物へ阻害性ＲＮＡ分子を送達するための生物界間系。
【請求項３８】
前記ウイルス植物病原体の前記少なくとも１つの必須遺伝子が、ウイルスの重要領域の配列、ウイルス科の保存された配列、および異なるウイルス科のメンバー間の保存された配列からなる群から選択される、請求項３６に記載の、植物へ阻害性ＲＮＡ分子を送達するための生物界間系。
【請求項３９】
ウイルス性植物病原体の前記必須遺伝子が、前記タバコモザイクウイルス中のレプリカーゼ遺伝子、運動タンパク質、コートタンパク質；前記トマト黄化えそウイルス中の糖タンパク質（ＧＰ）、ＮＳｍタンパク質、ＮＳｓタンパク質、ウイルスＲＮＡゲノムセグメントＬ、Ｍ、Ｓ；前記トマト黄化巻葉ウイルス中のＶ１、Ｖ２、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｖ１タンパク質；前記キュウリモザイクウイルス中の１ａ、２ａ２ｂタンパク質、３ａコートタンパク質；前記ジャガイモウイルスＹ中のＰＩ、ＨＣ−Ｐｒｏ、Ｐ３、６ｋｌ、Ｃ１、６ｋ２、ＮＩａ、Ｎｉｂ、ＣＰ；前記カリフラワーモザイクウイルス中の運動タンパク質、２つのアブラムシ伝達因子（Ｐ２および／またはＰ３）、キャプシドタンパク質の前駆体（Ｐ４）、プロテイナーゼのポリタンパク質前駆体、Ｐ５、Ｐ６タンパク質；前記アフリカキャッサバモザイクウイルス中のＡＶ１、ＡＶ２、ＡＣ１、ＡＣ２、ＡＣ３、ＡＣ４、ＢＣ１、ＢＶ１；前記プラムポックスウイルス中のＰＩ、ＨＣ−Ｐｒｏ、Ｐ３、６ｋｌ、Ｃ１、６ｋ２、ＮＩａ、Ｎｉｂ、ＣＰ；前記ブロムモザイクウイルス中の１ａ、２ａ、運動タンパク質、コートタンパク質；前記ジャガイモウイルスＸ中のレプリカーゼ、ＴＧＢ１、ＴＧＢ２、ＴＧＢ３、コートタンパク質からなる群より選択される、請求項３７阻害性ＲＮＡ分子を植物に送達する生物界間系。
【請求項４０】
前記真菌が、イネいもち病菌；灰色かび病菌；プッチニア属；ムギ類赤カビ病；フザリウムオキシスポラム；オオムギうどんこ病菌；コムギ葉枯病菌；コレトトリカム属；トウモロコシ黒穂病菌；アマさび菌、ダイズさび病菌およびリゾクトニア・ソラニ−からなる群から選択される、請求項３５に記載の、植物へ阻害性ＲＮＡ分子を送達するための生物界間系。
【請求項４１】
前記真菌植物病原体の前記少なくとも１つの必須遺伝子が、真菌必須遺伝子の重要領域の配列、真菌遺伝子ファミリーの保存された配列、および異なる真菌必須遺伝子ファミリーのメンバー間の保存された配列からなる群から選択される、請求項３９に記載の、植物へ阻害性ＲＮＡ分子を送達するための生物界間系。
【請求項４２】
前記真菌植物病原体の前記少なくとも１つの必須遺伝子が、前記イネいもち病菌中のＭｏＡＢＣ１、ＭｏＭＡＣ１およびＭｏＰＭＫ１、病原性関連遺伝子、エフェクターＩｕｇ６、Ｉｕｇ９およびｌｕｇ１８、ＭｏＭｐｇ１、ＭｏＥｍｐ１、ＭｏＭｈｐ１、ＭｏＭｓｐ１、ＭＣ６９、およびＳｌｐ１；前記灰色かび病中のＢｃｐｇ１およびＢＭＰ１；前記プッチニア属中のＡＰＫ、シクロフィリン、およびカルシニューリン調節サブユニット、ならびに分泌タンパク質；前記ムギ類赤カビ病中のＭＡＰ１、およびＭＡＰキナーゼｇｐｍｋ１；前記フザリウムオキシスポラム中のＭＡＰキナーゼ、ｐｇ１、病原性関連遺伝子、分泌タンパク質；前記オオムギうどんこ病菌中のエフェクター遺伝子Ａｖｒａ１０、病原性関連遺伝子、分泌タンパク質；前記コムギ葉枯病菌中の病原性関連遺伝子、ＭｇＳｌｔ２、ＡＢＣトランスポーター遺伝子ＭｇＡｔｒ１およびＭｇＡｔｒ２、分泌タンパク質；前記コレトトリカム属中のＣＭＫ１およびｃｌｋ１、病原性関連タンパク質１０；前記トウモロコシ黒穂病菌中の病原性関連遺伝子、Ｋｐｐ２、ｕｋｃ１、分泌タンパク質；および前記アマさび病菌中の病原性関連遺伝子、分泌タンパク質からなる群から選択される、請求項４０に記載の、植物へ阻害性ＲＮＡ分子を送達するための生物界間系。
【請求項４３】
前記核酸構築物がプラスミドである、請求項３０に記載の、植物へ阻害性ＲＮＡ分子を送達するための生物界間系。
【請求項４４】
前記プラスミドが、ｐＡＤ−ＷＲＫＹ−ＧＨＹｌ；ｐＡＤ−ＡＤＨ−ＧＨＹ２；ｐＯＸＢ−ＷＲＫＹ−ＧＨＹ３；ｐＯＸＢ−ＡＤＨ−ＧＨＹ４；ｐＡＤ−ＷＲＫＹ−ＧＨＹ５；ｈｐＲＮＡ  ｐＡＤ−ＡＤＨ−ＧＨＹ６；およびｈｐＲＮＡ  ｐＡＤ−ＷＲＫＹ−ＧＨＹ７からなるプラスミドの群からの前記標的配列を含むように改変されている、請求項４２に記載の、植物へ阻害性ＲＮＡ分子を送達するための生物界間系。
【請求項４５】
前記核酸構築物が、植物病原体の少なくとも１つの必須遺伝子を下方制御するように構成された少なくとも１つの小さい阻害性リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）をコードしているポリヌクレオチドを含み、プロモーターに連結されている、請求項４２に記載の、植物へ阻害性ＲＮＡ分子を送達するための生物界間系。
【請求項４６】
前記プロモーターが、非構成的プロモーター、誘導性プロモーター、病原体誘導性プロモーター、組織優先的プロモーター、組織特異的プロモーター、植物特異的プロモーター、または構成的プロモーターからなる群から選択されるプロモーターである、請求項４４に記載の、植物へ阻害性ＲＮＡ分子を送達するための生物界間系。
【請求項４７】
抑制されたＲＮａｓｅＩＩＩを有する前記遺伝子改変植物内生細菌が、アシドバクテリア、放線菌、アルファプロテオバクテリア、アルマティモナス、バクテロイデス、ベータプロテオバクテリア、デルタプロテオバクテリア、フィルミクテス、グラムプロテオバクテリア、ＴＭ７、バチルス、大腸菌からなる群から選択される、請求項３０に記載の、植物へ阻害性ＲＮＡ分子を送達するための生物界間系。
【請求項４８】
前記遺伝子改変植物内生細菌がＭ−ＪＭ１０９−ＧＨＹ２である、請求項４６に記載の、植物へ阻害性ＲＮＡ分子を送達するための生物界間系。
【請求項４９】
前記遺伝子改変植物内生細菌が枯草菌ＣＣＢ４２２である、請求項４６に記載の、植物へ阻害性ＲＮＡ分子を送達するための生物界間系。
【請求項５０】
前記遺伝子改変植物内生細菌が、大腸菌ＨＴ２７またはＨＴ１１５である、請求項４６に記載の、植物へ阻害性ＲＮＡ分子を送達するための生物界間系。
【請求項５１】
抑制されたＲＮａｓｅＩＩＩを有する前記遺伝子改変植物内生細菌が、過胞形成活性を有する遺伝子改変植物内生細菌、ＪＣ８０３１であり、かつ／または他の細菌によりナノチューブ形成を増強するのに十分な１つ以上の栄養素要求株を有する遺伝子改変植物内生細菌である、請求項３０または４９に記載の、植物へ阻害性ＲＮＡ分子を送達するための生物界間系。
【請求項５２】
前記ｓｉＲＮＡが前記植物において移動する、請求項３０に記載の、植物へ阻害性ＲＮＡ分子を送達するための生物界間系。
【請求項５３】
請求項３０に記載の、植物へ阻害性ＲＮＡ分子を送達するための生物界間系であって、前記ステップでは、前記植物においてＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）メカニズムを誘導するのに十分な時間にわたって、前記核酸構築物を発現させ、前記ＲＮＡｉメカニズムが、前記植物病原体の前記少なくとも１つの必須遺伝子の下方制御を引き起こし、前記核酸構築物を継続して発現させ、それにより前記植物において持続的ＲＮＡｉメカニズムを開始させるステップを含み、前記持続的ＲＮＡｉメカニズムが、前記植物に、野生型よりも大きい前記植物病原体感染に対する耐性を持たせるようにする、系。
【請求項５４】
少なくとも１つのヘルパー遺伝子を共発現するステップをさらに含む、請求項３０に記載の、植物へ阻害性ＲＮＡ分子を送達するための生物界間系。
【請求項５５】
前記ヘルパー遺伝子が、ＶｒｒＡ；ＳＩＤ１；ＳＩＤ２；ＡＧ０１；ＡＧ０２；ＡＧ０７；ＹｍｄＢ；ＹｍｄＢ；スタウフェン；ＲＤＥ−４；ＨｌｙＡ；Ｓｅｃ−およびＴａｔ−分泌シグナルペプチド；１つ以上の細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）；Ｔａｔ；アンテナペディア；ＡＣＣデアミナーゼ；１つ以上の師部ＲＮＡトランスポーター；ＰＰ２−Ａ１；ＰＳＲＰ１；ＤＲＢ１；ＤＲＢ４；ＨＥＮ１およびＳＴＶ１からなる群から選択される、請求項５２に記載の、植物へ阻害性ＲＮＡ分子を送達するための生物界間系。
【請求項５６】
前記小さい阻害性リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）が、植物病原体の少なくとも１つの必須遺伝子を下方制御するように構成され、かつ１つ以上の特異的ＲＮＡモチーフを有するように構成された小さい阻害性リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）であり、前記ＲＮＡモチーフをｄｓＲＮＡに組み込んで、これにより、前記植物の師部を介した伝達を促進し得る、請求項３０に記載の、植物へ阻害性ＲＮＡ分子を送達するための生物界間系。
【請求項５７】
−抑制されたＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有する遺伝子改変植物内生細菌を生成するステップと、
−前記植物におけるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）メカニズムの誘導を介して植物病原体における前記少なくとも１つの標的遺伝子の発現を下方制御するように構成された少なくとも１つの小さい阻害性リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）をコードしているポリヌクレオチドを含む核酸構築物により、前記遺伝子改変植物内生細菌を形質転換するステップと、
−前記遺伝子改変植物内生細菌を植物に導入するステップと、を含む、
植物中の病原体を抑制する方法。
【請求項５８】
癌対象に投与されているヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤療法治療の効力または有効性を評価する方法であって、
−ｔ０の時点において前記対象から得られた第１のサンプル中において測定されるバイオマーカーの発現レベルと、ｔ１の時点において前記対象から得られた第２のサンプル中の前記バイオマーカーのレベルと、を比較することを含み、
前記マーカーは、表４で特定された群から選択されたバイオマーカーであり、
前記第１のサンプルに対する前記第２のサンプル中の前記バイオマーカーの前記レベルの変化は、前記ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤治療が前記対象における癌の治療に有効であることの指標である、方法。
【請求項５９】
前記比較することが、ある時間範囲にわたって繰り返される、請求項５６に記載の方法。
【請求項６０】
植物におけるＲＮＡ媒介病原体抑制の有効性を評価する方法であって、
比較することを含む前記方法は、
−前記植物から得られた第１のサンプルにおいて、ｔ０の時点において測定された植物病原体標的遺伝子の発現レベルを決定し、
−抑制されたＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有する遺伝子改変植物内生細菌を生成することであって、核酸構築物を有する前記遺伝子改変植物内生菌が、植物病原体の少なくとも１つの標的遺伝子に向けられる二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）またはヘアピン（ｈｐＲＮＡ）を形成することができる前記少なくとも１つの低分子阻害性リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）をコードしているポリヌクレオチドを含む、生成することと、
−前記遺伝子改変植物内生細菌をｔ１の時点で植物に導入することと、
−前記核酸構築物を発現させて、前記植物においてＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）メカニズムを誘導することができるようにし、前記ＲＮＡｉメカニズムにより、植物病原体における前記少なくとも１つの標的配列の前記下方制御が引き起こされることと、を含み、
−ｔ２の時点おいて、前記植物から得られた第１のサンプルにおいて測定された前記植物病原体標的遺伝子の前記発現レベルを決定する、方法。
【請求項６１】
前記比較することが、ある時間範囲にわたって繰り返される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６２】
植物におけるＲＮＡ媒介病原体抑制の有効性を評価する方法であって、
比較することを含む前記方法は、
−ｔ０の時点において、前記植物から得られた第１のサンプル中で測定された植物病原体のレベルを決定し、
−抑制されたＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有する遺伝子改変植物内生細菌を生成することであって、核酸構築物を有する前記遺伝子改変植物内生細菌が、植物病原体の少なくとも１つの必須標的遺伝子に向けられる二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）またはヘアピン（ｈｐＲＮＡ）を形成することができる前記少なくとも１つの低分子阻害性リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）をコードしているポリヌクレオチドを含む、生成することと、
−ｔ１の時点で前記遺伝子改変植物内生細菌を植物に導入することと、
−前記核酸構築物を発現させて、前記植物においてＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）メカニズムを誘導することができるようにし、前記ＲＮＡｉメカニズムにより、植物病原体における前記少なくとも１つの標的配列の前記下方制御が引き起こされることと、を含み、
−ｔ２の時点において、前記植物から得られた第１のサンプル中で測定された植物病原体のレベルを決定する方法。
【請求項６３】
前記比較することが、ある時間範囲にわたって繰り返される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６４】
抑制されたＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有する有効量の遺伝子改変植物内生細胞を導入するステップであって、前記遺伝子改変植物内生細胞が、植物病原体において、少なくとも１つの標的配列に向けられる二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）またはヘアピン（ｈｐＲＮＡ）を形成することができる少なくとも１つの小さい阻害性リボ核酸をコードしているポリヌクレオチドを含む核酸構築物を有するステップを含む、病原体感染植物を治療する方法。
【請求項６５】
有害生物耐性植物を生成する方法であって、
−抑制されたＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有する遺伝子改変植物内生細菌を生成するステップと、
−有害生物または草食動物において、少なくとも１つの必須遺伝子に向けられる二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）またはヘアピン（ｈｐＲＮＡ）を形成することができる少なくとも１つの小さい阻害性リボ核酸をコードしているポリヌクレオチドを含む核酸構築物により前記遺伝子改変内生細胞が形質転換されるステップと、
−前記遺伝子改変植物内生細菌を植物に導入するステップと、
−前記植物中においてＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）メカニズムを誘導するのに十分な時間にわたって、前記核酸構築物を発現させるステップであって、前記植物が、前記有害生物及び／又は草食動物によって消費され、前記ＲＮＡｉメカニズムが、有害生物または草食動物における少なくとも１つの必須遺伝子に向けられているｈｐＲＮＡのｄｓＲＮＡの蓄積を引き起こし、これにより、有害生物または草食動物の少なくとも１つの必須遺伝子に向けられているｈｐＲＮＡのｄｓＲＮＡが、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）メカニズムを誘導するようにし、結果として、前記有害生物および／または草食動物における有害生物および／または草食動物における少なくとも１つの必須遺伝子の抑制をもたらすステップと、を含む方法。
【請求項６６】
前記遺伝子改変植物内生細菌が、有害生物の腸にコロニー形成することができる、請求項６０に記載の方法。
【請求項６７】
前記ｓｉＲＮＡが、昆虫の少なくとも１つの外骨格遺伝子の前記標的配列に完全にまたは部分的に相補的である１つ以上のｈｐＲＮＡを含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６８】
前記ウイルス性有害生物または草食動物の前記少なくとも１つの必須遺伝子が、有害生物または草食動物の重要領域の配列、有害生物または草食動物ファミリーの保存された配列、異なる有害生物または草食動物ファミリーのメンバー間の保存された配列からなる群から選択される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６９】
抑制されたＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有する前記遺伝子改変植物内生細菌が、桿菌および／または大腸菌である、請求項６３に記載の方法。
【請求項７０】
前記遺伝子改変植物内生細菌が、Ｍ−ＪＭ１０９−ＧＨＹ２；枯草菌ＣＣＢ４２２、ＨＴ２７、ＨＴ１１５、ＪＣ８０３１からなる群から選択される、請求項６４に記載の方法。
【請求項７１】
少なくとも１つのヘルパー遺伝子を共発現するステップをさらに含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項７２】
前記ヘルパー遺伝子が、ＶｒｒＡ；ＳＩＤ１；ＳＩＤ２；ＡＧ０１；ＡＧ０２；ＡＧ０７；ＹｍｄＢ；ＹｍｄＢ；スタウフェン；ＲＤＥ−４；ＨｌｙＡ；Ｓｅｃ−およびＴａｔ−分泌シグナルペプチド；１つ以上の細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）；Ｔａｔ；アンテナペディア；ＡＣＣデアミナーゼ；１つ以上の師部ＲＮＡトランスポーター；ＰＰ２−Ａ１；ＰＳＲＰ１；ＤＲＢ１；ＤＲＢ４；ＨＥＮ１およびＳＴＶ１からなる群から選択される、請求項６５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１６年１２月６日に出願された米国仮特許出願第６２／４３０，６７１号の利益および優先権を主張する。上記で参照した出願の明細書および図全体は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
配列表
【０００２】
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００３】
本発明の分野は、概して、植物分子生物学および植物バイオテクノロジーに関する。より具体的には、標的遺伝子の発現を抑制するため、または標的遺伝子を下方制御するための構築物および方法に関する。本発明の技術は、植物病原体、有害生物および／または草食動物の生物的防除にさらに関する。具体的には、本発明は、遺伝子改変細菌を介する阻害性ＲＮＡ分子の送達による、病害伝搬性植物病原体の生物的防除のための新規の技術、系、および方法に関し得る。
【背景技術】
【０００４】
世界中で推定２５００種以上と推定される農作物の栽培化は、収穫された産物の収量および品質を高める望ましい形質を人為的に選択することを伴う。高投入環境下における農学的標的のための育種は、世界的な作物生産性を首尾よく高めたが、比較的低い多様レベルを有する現代の作物品種を産生する傾向にあった。こうした遺伝的多様性の低下により、非最適条件下での作物の生産に適した品種の入手可能性が制限され得る。他の望ましい形質を選択した結果として、植物防御形質は、栽培植物において欠けているかまたはわずかに発現している可能性がある。農薬の使用が制限されている低投入量系では、現代の品種は、上手く機能しないことが示唆されていることから、このことは、作物生産の持続可能性を改善するための特別な課題を提起している。過去一世紀にわたって作物生産は増加してきているが、雑草、有害生物、病害による世界的な作物の合計損失は、最大４０％となり得る（ＯｅｒｋｅおよびＤｅｈｎｅ、２００４年）。すべての植生系において、葉、樹液、および根の摂食草食動物により、２０％を超える純植物生産性が失われる（Ａｇｒａｗａｌ、２０１１年）。これらの損失は、過去数十年にわたって農薬の使用が増加しているにもかかわらず発生している（ＯｅｒｋｅおよびＤｅｈｎｅ、２００４年）ため、化学物質の投入にあまり依存することなく、病原体および有害生物防除のための持続可能なアプローチを開発する必要性が強調されている。
【０００５】
病害防除は、多くの病害に対して良好な耐性を示すように発育させた植物を使用することによって、ならびに輪作、無病原菌種子の使用、適切な植栽日および植物密度、畑地水分の制御、および農薬の使用などの植物栽培アプローチによって、多くの場合達成され、かつ／または強化される。広い地域および多くの作物種において、より発達した環境では、通常、病害により、毎年１０％ずつ植物収量が減少するが、あまり発達していない環境では、多くの場合２０％を超えて、病害に対して、収量の損失となると推定されている。伝統的な栽培技術では、農業生産量の大幅な増加をもたらしてきたが、これらの技術では植物個体群に対するすべての脅威に対処することはできない。このような脅威は、資金および食料品作物にとって特に深刻である。
【０００６】
これらの傾向を念頭に置いて、深刻化する問題には、植物病原体が、世界中の生産者によって生産される食物、飼料、および繊維の品質ならびに豊富さに対する直接的な脅威であるという事実を伴う。植物病害を予防、軽減または制御するために様々なアプローチが使用され得る。生産者は、多くの場合、伝統的な農学的および園芸的慣行以外に、化学肥料および農薬に頼らざるを得ない。農業へのこれらの投入が、過去１００年間にわたって作物の生産性および品質の目覚ましい向上に大きく寄与してきた。しかし、農薬の過剰な使用および誤用によって引き起こされた環境汚染、ならびに一部の農薬反対者たちによる恐怖を利用することにより、農業における農薬の使用に対する人々の態度がかなり変化した。現在では、化学農薬の使用には厳しい規制があり、市場から信頼性の高い効果的な化学物質を排除するという政治的圧力が存在している。さらに、自然の生態系において植物病害が拡大することにより、こうした用途の適用を必要とし得る規模であるために、化学物質の適用の奏功を妨げる可能性もある。
【０００７】
農薬および除草剤の使用および／または過剰使用に対処するための１つの方法は、トランスジェニック植物の開発によるものである。トランスジェニック植物ＤＮＡは、遺伝子工学技術を用いて修飾される。その目的は、その種において自然に発生することはない新しい形質を植物に導入することである。トランスジェニック植物は、人為的に挿入された遺伝子（複数可）を含み得る。挿入された遺伝子配列は、導入遺伝子として公知であり、無関係の植物または完全に異なる種に由来し得る。こうしたトランスジェニック植物の例としては、抗ウイルスタンパク質複合体、農薬、またはベータカロチンなどの前駆体をビタミンＡに変換し得る代謝経路酵素などのタンパク質をコードしている遺伝子の挿入を挙げることができる。植物に遺伝子の組み合わせを挿入する目的は、こうしたトランスジェニック植物を可能な限り有用かつ生産的にすることである。しかしながら、こうしたトランスジェニック植物系はまた、いくつかの科学的および実用的な欠点を有する。
【０００８】
一例では、トランスジェニック植物は、Ｂｔベースの毒素の発現を介して特定の昆虫／有害生物を防除するために開発された。感受性昆虫における腸上皮細胞膜の透過処理を助けるＢｔ殺虫タンパク質の発現は、当初、有効であることが判明している。しかしながら、このアプローチは、一部の特定の作物において、いくつかの特定の有害生物を管理することに制限されており、また、一部の昆虫がＢｔに対する耐性を発現し得るという脅威もある。トランスジェニック植物系に対するさらなる制限としては、それらを選択し、かつ生成するのが困難であり、かつ時間を要するという事実が挙げられ得る。例えば、トランスジェニック株の開発は、種子をうまく繁殖させる能力、または任意の所与の環境におけるトランスジェニック植物種の自然の成長および拡散を可能にする能力によって制限され得る。さらに、トランスジェニック植物の使用に反対して、著しい社会的圧力が生じている。西欧諸国および欧州諸国における動きは、食料品におけるトランスジェニック植物の使用を妨げることを目指していた。さらに、有機産物および非トランスジェニック産物の新しい市場が、過去１０年間で同時に生じており、これにより非トランスジェニック植物を市場プレミアムで販売することが可能になっている。最後に、多くのトランスジェニック植物は、一例として、トランスジェニック植物のために、種子の供給を制限し、それによって、多くの第三世界の国々でのそれらの広範な使用を阻害する大きな農業コングロマリットによって制御されている。
【０００９】
いくつかの制限に対処するために、内生菌など、植物ベースの微生物は、有益な遺伝子の送達ベクターとして、ならびに植物病を引き起こすものなど、望ましくない遺伝子の遺伝子阻害として利用することができる。植物は、根、葉、および茎組織など、それらの表面上と同様に細胞内に複数の有益な細菌を保有し得る。植物と関連して生息する内生細菌および外生細菌としては、とりわけ、以下の亜門：アシドバクテリア、放線菌、アルファプロテオバクテリア、アルマティモナス、バクテロイデス、ベータプロテオバクテリア、デルタプロテオバクテリア、フィルミクテス、グラムプロテオバクテリア、ＴＭ７、バチルス、大腸菌に含まれるものが挙げられる。
【００１０】
これらの細菌の多くはインビトロで迅速に培養することができ、遺伝子組換えによって外来のＲＮＡ分子を発現させることができ、これにより、現在のところ特徴が十分に明らかでない生物界間（ｔｒａｎｓ−ｋｉｎｇｄｏｍ）送達系によって植物に利用可能にされ得る（Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ、２０１５年；Ｋｉｍら、２０１４年；Ａｒｇｕｅｌら、２０１２年）。例えば、トマト病原性真菌がｓＲＮＡを植物に送達できること、および維管束組織を通って真菌ｓＲＮＡを植物全体に動員させ得ることが論証されている（Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ、２０１５年；ＷｅｉｂｅｒｇおよびＪｉｎ、２０１５年）。トランスジェニック植物からのｓｉＲＮＡの生物界間送達もまた、首尾よく論証されており、ｓｉＲＮＡを摂取する線虫を防除するために使用されている（Ｂａｋｈｅｔｉら、２００５年；Ｋｎｉｐら、２０１４年）。
【００１１】
さらに、微細藻類の細胞質および葉緑体でそれぞれ産生されるｓｉＲＮＡおよびｄｓＲＮＡの生物界間送達は、蚊のトリプトファン代謝に関与する必須遺伝子である３−ヒドロキシキヌレニントランスアミナーゼ（ＨＫＴ）を不活性化することを目的とするものであり、３−ＨＫＴの発現を抑制すること、および蚊の死亡率の上昇をもたらすことが示されている（Ｋｕｍａｒら、２０１５年）。しかし、真核生物とは対照的に、細菌は、ｄｓＲＮＡ前駆体からｓｉＲＮＡを生成できるダイサー／ＲＩＳＣ複合体を有さない。しかしながら、上述したように、こうした系は未だ十分に理解されておらず、その用途および商業的実行可能性の両方において非効率的である。そのため、植物を餌とする病原体、有害生物および草食動物を防除するための阻害性ＲＮＡ分子の植物への細菌送達が効率よく論証されていないことについては驚くことではない。例えば、遺伝子の発現を制御するために植物に直接ｄｓＲＮＡまたはｓＲＮＡを適用する試みをいくつか行ったが、ＲＮＡの産生に多大な費用がかかり、分解が原因で、ＲＮＡの寿命が制限された（例えば、非特許文献１を参照されたい）。反対に、本明細書に記載の新規の系では、阻害性ＲＮＡが、遺伝子改変細菌によって作られるため、明白な費用なく、ｄｓＲＮＡまたはｓＲＮＡが連続産生される。
【００１２】
阻害性ＲＮＡ分子の効果的な細菌送達を介する植物および／または草食動物個体群に特有の病害の生物的防除に関する前述の問題は、それに対する効果的かつ経済的な解決策に対する長年の必要性を示し得るものである。実装要素が利用可能であり得る間、この必要性を満たす実際の試みは、ある程度欠けていた可能性がある。これは、当業者が問題の本質および関与する課題を十分に認識していなかったまたは理解していなかっためであり得る。
【００１３】
こうした理解の欠如の結果として、これらの長年にわたる必要性を満たすための試みは、本明細書において特定されている問題または課題のうちの１つ以上の効果的な解決とはならなかった可能性がある。これらの試みは、本発明の技術によって取られる技術的な方向から遠ざかってさえいる可能性があり、また、一部の当業者が行ったアプローチの予期せぬ結果をある程度考慮して、本発明の技術が達成したという結果にさえなり得る。以下により詳細に論じるように、本発明の技術は、真に有効なベクター生物的防除戦略の目的を達成しながら、伝統的な植物病原体防除系の限界を克服する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】国際公開第９３／１０２５１号
【特許文献２】国際公開第９４／１７１９４号
【特許文献３】国際公開第９２／２１７５７号
【特許文献４】米国特許出願公開第２００３／０１７５９６５号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２００３／０１８０９４５号明細書
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｌａｎｔｓ  ３、Ａｒｔｉｃｌｅ  ｎｕｍｂｅｒ：１６２０７（２０１７）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｌａｎｔｓ．２０１６．２０７
【非特許文献２】Ａｓｈｅ  Ｓ,  Ｍａｊｉ  Ｕ,  Ｓｅｎ  Ｒ,  Ｍｏｈａｎｔｙ  Ｓ,  Ｍａｉｔｉ  Ｎ.  ２０１４.Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｒｉｍｅｒｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｂｙ  ＰＣＲ.３  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ４（５）:４６１−４６５.
【非特許文献３】Ｄｕｎｎ  ＡＫ,  Ｈａｎｄｅｌｓｍａｎ  Ｊ.  １９９９.Ａ  ｖｅｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｔｒａｐｐｉｎｇ  ｉｎ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ.Ｇｅｎｅ  ２２６（２）:２９７−３０５.
【非特許文献４】Ｄｕｒａｎｄ  Ｓ,  Ｇｉｌｅｔ  Ｌ,  Ｃｏｎｄｏｎ  ｃ.  ２０１２.Ｔｈｅ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂ.  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＲＮａｓｅ  ＩＩＩ  ｉｓ  ｔｏ  ｓｉｌｅｎｃｅ  ｆｏｒｅｉｇｎ  ｔｏｘｉｎ  ｇｅｎｅｓ.ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８（１２）:ｅｌ００３１８１.
【非特許文献５】Ｅａｍｅｎｓ  Ａ,  Ｗａｎｇ  Ｍ−Ｂ,  Ｓｍｉｔｈ  ＮＡ,  Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ  ＰＭ.２００８.ＲＮＡ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ:  ｙｅｓｔｅｒｄａｙ,  ｔｏｄａｙ,  ａｎｄ  ｔｏｍｏｒｒｏｗ.Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １４７（２）:４５６−４６８.
【非特許文献６】Ｇｒａｕｍａｎｎ  Ｐ.  ２０１２.Ｂａｃｉｌｌｕｓ:  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ.Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｅｓｓ.
【非特許文献７】Ｈｏｎｇ  ＣＥ,  Ｊｏ  ＳＨ,  Ｍｏｏｎ  ＪＹ,  Ｌｅｅ  Ｊ−Ｓ,  Ｋｗｏｎ  Ｓ−Ｙ,  Ｐａｒｋ  ＪＭ.２０１５.Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｌｅａｆ−ｉｎｈａｂｉｔｉｎｇ  ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ｐｈｙｔｏｐｈａｔｈｏｇｅｎｓ.Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ９（６）:４５１−４５８.
【非特許文献８】Ｊｅｎｓｅｎ  ＳＩ,  Ｌｅｎｎｅｎ  ＲＭ,  Ｈｅｒｒｇａｒｄ  ＭＪ,  Ｎｉｅｌｓｅｎ  ＡＴ.２０１５.Ｓｅｖｅｎ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｓｅｖｅｎ  ｄａｙｓ:  Ｆａｓｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｔｏｌｅｒａｎｔ  ｔｏ  ａｃｅｔａｔｅ  ａｎｄ  ｏｓｍｏｔｉｃ  ｓｔｒｅｓｓ.Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ５:１７８７４.
【非特許文献９】Ｌｉｎｄｂｏ  ＪＡ.２００７.ＴＲＢＯ: ａ  ｈｉｇｈ−ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ  ＲＮＡ−ｂａｓｅｄ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ.Ｐｌａｎｔ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １４５（４）:１２３２−１２４０.
【非特許文献１０】Ｌｏｚａｎｏ  ＧＬ,  Ｈｏｌｔ  Ｊ,  Ｒａｖｅｌ  Ｊ,  Ｒａｓｋｏ  ＤＡ,  Ｔｈｏｍａｓ  ＭＧ,  Ｈａｎｄｅｌｓｍａｎ  Ｊ.  ２０１６.Ｄｒａｆｔ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ  ａｇｅｎｔ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ  ＵＷ８５.Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎｎｏｕｎｃｅｍｅｎｔｓ  ４（５）:ｅ００９１０−１６.
【非特許文献１１】Ｎｕｎｅｓ  Ｃ,  Ｂａｊｊｉ  Ｍ,  Ｓｔｅｐｉｅｎ  Ｖ,  Ｍａｎｓｏ  Ｔ,  Ｔｏｒｒｅｓ  Ｒ,  Ｕｓａｌｌ  Ｊ,  Ｊｉｊａｋｌｉ  ＭＨ.２００８.Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ＳＣＡＲ  ｍａｒｋｅｒ  ｔｏ  ｍｏｎｉｔｏｒ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｆｙ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｏｓｔｈａｒｖｅｓｔ  ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ  ａｇｅｎｔ  Ｐａｎｔｏｅａ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ  ＣＰＡ−２.Ｐｏｓｔｈａｒｖｅｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４７（３）:４２２−４２８.
【非特許文献１２】Ｏｅｈｒｌｅ  ＮＷ，  Ｋａｒｒ  ＤＢ,  Ｋｒｅｍｅｒ  ＲＪ,  Ｅｍｅｒｉｃｈ  ＤＷ.２０００.Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ  ｔｏ  ｓｏｙｂｅａｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｒｏｏｔ  ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｎａｌｌｙ  ｓｅｅｄｂｏｒｎｅ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ.Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ４６（７）:６００−６０６.
【非特許文献１３】Ｏｌｉｗａ−Ｓｔａｓｉａｋ  Ｋ,  Ｍｏｌｎａｒ  ｃ,  Ａｒｓｈａｋ  Ｋ,  Ｂａｒｔｏｓｚｃｚｅ  Ｍ,  Ａｄｌｅｙ  ｃ.  ２０１０.  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ＰＣＲ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ  ｇｒｏｕｐ  ｓｐｅｃｉｅｓ.  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １０８（ｌ）:２６６−２７３.
【非特許文献１４】Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  ＤＪ,  Ｓｈｉｓｈｉｄｏ  Ｍ,  Ｈｏｌｌ  ＦＢ,  Ｃｈａｎｗａｙ  ＣＰ.１９９５.  Ｕｓｅ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｅｓ−ａｎｄ  ｓｔｒａｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＰＣＲ  ｐｒｉｍｅｒｓ  ｆｏｒ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｎｉｆｅｒ  ｒｏｏｔ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ.  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １３３（ｌ−２）:７１−７６.
【非特許文献１５】Ｒａｆｆｅｌ  ＳＪ,  Ｓｔａｂｂ  ＥＶ,  Ｍｉｌｎｅｒ  ＪＬ,  Ｈａｎｄｅｌｓｍａｎ  Ｊ.  １９９６,  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｃ  ａｎｄ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｚｗｉｔｔｅｒｍｉｃｉｎ  Ａ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ.  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４２（１２）:３４２５−３４３６.
【非特許文献１６】Ｒａｊｅｎｄｒａｎ  Ｇ,  Ｓｉｎｇ  Ｆ,  Ｄｅｓａｉ  ＡＪ,  Ａｒｃｈａｎａ  Ｇ.  ２００８,  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｎｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｉｇｅｏｎ  ｐｅａ  ｂｙ  ｃｏ−ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐｐ.  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９９（１１）:４５４４−４５５０.
【非特許文献１７】Ｓｅｌｖａｋｕｍａｒ  Ｇ,  Ｋｕｎｄｕ  Ｓ,  Ｇｕｐｔａ  ＡＤ,  Ｓｈｏｕｃｈｅ  ＹＳ,  Ｇｕｐｔａ  ＨＳ.２００８.  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｎｒｈｉｚｏｂｉａｌ  ｐｌａｎｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｆｒｏｍ  ｎｏｄｕｌｅｓ  ｏｆ  Ｋｕｄｚｕ  （Ｐｕｅｒａｒｉａ  ｔｈｕｎｂｅｒｇｉａｎａ）  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｎ  ｗｈｅａｔ  ｓｅｅｄｌｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ.  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５６（２）:１３４−１３９.
【非特許文献１８】Ｓｍｉｔｈ  ＮＡ,  Ｓｉｎｇｈ  ＳＰ,  Ｗａｎｇ  Ｍ−Ｂ,  Ｓｔｏｕｔｊｅｓｄｉｊｋ  ＰＡ,  Ｇｒｅｅｎ  ＡＧ,  Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ  ＰＭ.  ２０００.  Ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ:  ｔｏｔａｌ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  ｉｎｔｒｏｎ−ｓｐｌｉｃｅｄ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡｓ.  Ｎａｔｕｒｅ  ４０７（６８０２）:３１９−３２０.
【非特許文献１９】Ｔａｋｉｆｆ  ＨＥ,  Ｃｈｅｎ  Ｓ−Ｍ.  １９８９.  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｎｃ  ｏｐｅｒｏｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ.  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １７１（５）:２５８１−２５９０.
【非特許文献２０】Ｗｅｉｓｂｕｒｇ  ＷＧ,  Ｂａｒｎｓ  ＳＭ，  Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ  ＤＡ,  Ｌａｎｅ  ＤＪ.１９９１.１６Ｓ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＤＮＡ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｔｕｄｙ.  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １７３（２）:６９７−７０３.
【非特許文献２１】Ｙｉｎ  Ｇ,  Ｓｕｎ  Ｚ,  Ｌｉｕ  Ｎ,  Ｚｈａｎｇ  Ｌ,  Ｓｏｎｇ  Ｙ,  Ｚｈｕ  Ｃ;  Ｗｅｎ  Ｆ.  ２００９.  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｗｉｔｈ  ＴＭＶ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  ａ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ.  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８４（２）:３２３−３３３.
【非特許文献２２】Ｂａｕｍｂｅｒｇｅｒ  Ｎ,  Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ  ＤＣ,  （２００５）  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＡＲＧＯＮＡＵＴＥ１  ｉｓ  ａｎ  ＲＮＡ  Ｓｌｉｃｅｒ  ｔｈａｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｒｅｃｒｕｉｔｓ  ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ  ａｎｄ  ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡｓ,  ＰＮＡＳ  １０２（３３）:１１９２８−３３
【非特許文献２３】Ｄｕｒａｎｄ  Ｓ,  Ｇｉｌｅｔ  Ｌ,  Ｃｏｎｄｏｎ  Ｃ,  （２０１２）  Ｔｈｅ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂ.  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＲＮａｓｅ  ＩＩＩ  Ｉｓ  ｔｏ  Ｓｉｌｅｎｃｅ  Ｆｏｒｅｉｇｎ  Ｔｏｘｉｎ  Ｇｅｎｅｓ,  Ｐｌｏｓ  Ｇｅｎｅｔ  ８（１２）: ｅｌ００３１８１
【非特許文献２４】Ｓｃｈｍｉｄｔ,  Ｇ.Ｗ.  ａｎｄ  Ｄｅｌａｎｅｙ,  Ｓ.Ｋ.２０１０.  Ｓｔａｂｌｅ  ｉｎｔｅｒｎａl  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｇｅｎｅｓ  ｆｏｒ  ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｉｎ  ｔｏｂａｃｃｏ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）  ｄｕｒｉｎｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ａｂｉｏｔｉｃ  ｓｔｒｅｓｓ.  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ.２８３:２３３−２４１.
【非特許文献２５】Ｂｉｎｄｓｃｈｅｄｌｅｒ,  Ｌ.Ｖ.,  Ｐａｎｓｔｒｕｇａ,  Ｒ,  ａｎｄ  Ｓｐａｎｕ,  Ｐ.ｄ.２０１６.  Ｍｉｌｄｅｗ−ｏｍｉｃｓ:  ｈｏｗ  ｇｌｏｂａｌ  ａｎａｌｙｓｅｓ  ａｉｄ  ｔｈｅ  ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｌｉｆｅ  ａｎｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｗｄｅｒｙ  ｍｉｌｄｅｗｓ,  Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ.７:
【非特許文献２６】Ｂｒａｄｉｎｇ,  Ｐ.Ａ.,  Ｖｅｒｓｔａｐｐｅｎ,  Ｅ.Ｃ.,  Ｋｅｍａ,  Ｇ.Ｈ.  ａｎｄ  Ｂｒｏｗｎ,  Ｊ.Ｋ.２００２.Ａ  ｇｅｎｅ−ｆｏｒ−ｇｅｎｅ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｗｈｅａｔ  ａｎｄ  Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ,  ｔｈｅ  Ｓｅｐｔｏｒｉａ  ｔｒｉｔｉｃｉ  ｂｌｏｔｃｈ  ｐａｔｈｏｇｅｎ.Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ.９２:４３９−４４５.
【非特許文献２７】Ｃａｎｎｏｎ,  Ｐ.,  Ｄａｍｍ,  Ｕ.,  Ｊｏｈｎｓｔｏｎ,  Ｐ.  ａｎｄ  Ｗｅｉｒ,  Ｂ.  ２０１２.Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ−ｃｕｒｒｅｎｔ  ｓｔａｔｕｓ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ.  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｍｙｃｏｌｏｇｙ.７３ : １８１−２１３.
【非特許文献２８】Ｃａｎｔｕ,  Ｄ.,  Ｓｅｇｏｖｉａ,  Ｖ.,  Ｍａｃｌｅａｎ,  ｄ.,  Ｂａｙｌｅｓ,  Ｒ.,  ｃｈｅｎ,  Ｘ.,  Ｋａｍｏｕｎ,  Ｓ.,  Ｄｕｂｃｏｖｓｋｙ,  Ｊ.,  Ｓａｕｎｄｅｒｓ,  ｄ.Ｇ.  ａｎｄ  Ｕａｕｙ,  ｃ.  ２０１３.  Ｇｅｎｏｍｅ  ａｎａｌｙｓｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｗｈｅａｔ  ｙｅｌｌｏｗ（ｓｔｒｉｐｅ）  ｒｕｓｔ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｓｔｒｉｉｆｏｒｍｉｓ  ｆ.  ｓｐ.  ｔｒｉｔｉｃｉ  ｒｅｖｅａｌ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ａｎｄ  ｈａｕｓｔｏｒｉａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｓ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ.  ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ.１４:２７0.
【非特許文献２９】Ｃｈｅｎ,  Ｘ.  ２００５.  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｓｔｒｉｐｅ  ｒｕｓｔ［Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｓｔｒｉｉｆｏｒｍｉｓ  ｆ.  ｓｐ.  ｔｒｉｔｉｃｉ］ｏｎ  ｗｈｅａｔ.  Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ.２７:３１４−３３７.
【非特許文献３０】Ｄｉ  Ｐｉｅｔｒｏ,  Ａ.,  Ｇａｒｃｉａ−Ｍａｃｅｉｒａ,  Ｆ.Ｉ.,  Ｍｅｇｌｅｃｚ,  Ｅ.  ａｎｄ  Ｒｏｎｃｅｒｏ,  Ｍ.Ｉ.Ｇ.２００１.Ａ  ＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｗｉｌｔ  ｆｕｎｇｕｓ  Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｒｏｏｔ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ.  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ.３９:１１４０−１１５２.
【非特許文献３１】Ｄｉ  Ｐｉｅｔｒｏ,  Ａ.  ａｎｄ  Ｒｏｎｃｅｒｏ,  Ｍ.Ｉ.Ｇ.１９９８.Ｃｌｏｎｉｎｇ,  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ,  ａｎｄ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｐｇｌ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｅｎｄｏｐｏｌｙｇａｌａｃｔｕｒｏｎａｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｗｉｌｔ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ.  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ.１１ : ９１−９８.
【非特許文献３２】Ｄｏｎｇ,  Ｙ.,  Ｌｉ,  Ｙ.,  Ｚｈａｏ,  Ｍ.,  Ｊｉｎｇ,  Ｍ.,  Ｌｉｕ,  Ｘ.,  Ｌｉｕ,  Ｍ.,  Ｇｕｏ,  Ｘ.,  Ｚｈａｎｇ,  Ｘ.,  Ｃｈｅｎ,  Ｙ.  ａｎｄ  Ｌｉｕ,  Ｙ.  ２０１５,  Ｇｌｏｂａｌ  ｇｅｎｏｍｅ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  ａｎａｌｙｓｅｓ  ｏｆ  Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｏｒｙｚａｅ  ｅｐｉｄｅｍｉｃ  ｉｓｏｌａｔｅ  ９８−０６  ｕｎｃｏｖｅｒ  ｎｏｖｅｌ  ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅｓ,  ｒｅｖｅａｌｉｎｇ  ｇｅｎｅ  ｇａｉｎ  ａｎｄ  ｌｏｓｅ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｉｎ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ.  ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ.１１: ｅｌ００４８０１.
【非特許文献３３】Ｄｕｆｒｅｓｎｅ,  Ｍ.，Ｂａｉｌｅｙ,  Ｊ.Ａ.,  Ｄｒｏｎ,  Ｍ.  ａｎｄ  Ｌａｎｇｉｎ,  Ｔ.  １９９８.ｃｌｋｌ,  ａ  ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ−ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｇｅｎｅ  ｉｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｌｉｎｄｅｍｕｔｈｉａｎｕｍ  ｏｎ  ｃｏｍｍｏｎ  ｂｅａｎ.Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ.１１:９９−１０８.
【非特許文献３４】Ｄｕｒｒｅｎｂｅｒｇｅｒ,  Ｆ.  ａｎｄ  Ｋｒｏｎｓｔａｄ,  Ｊ.  １９９９.Ｔｈｅ  ｕｋｃｌ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｅｓ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ,  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｐｉｇｍｅｎｔ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ.  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ＭＧＧ.２６１:２８１−２８９.
【非特許文献３５】Ｆｌｏｒ,Ｈ.１９５６.Ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｇｅｎｉｃ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｉｎ  ｆｌａｘ  ａｎｄ  ｆｌａｘ  ｒｕｓｔ.Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ.８:２９−５４.
【非特許文献３６】Ｇｏｏｄｗｉｎ,Ｓ.Ｂ.,Ｍ‘ｂａｒｅｋ,Ｓ.Ｂ.,Ｄｈｉｌｌｏｎ,Ｂ.,Ｗｉｔｔｅｎｂｅｒｇ,Ａ.Ｈ.,Ｃｒａｎｅ,Ｃ.Ｆ.,Ｈａｎｅ,Ｊ.Ｋ.,Ｆｏｓｔｅｒ,Ａ.Ｊ.,Ｖａｎ  Ｄｅｒ  Ｌｅｅ,Ｔ.Ａ.,Ｇｒｉｍｗｏｏｄ,Ｊ.ａｎｄ  Ａｅｒｔｓ,Ａ.２０１１.Ｆｉｎｉｓｈｅｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｕｎｇａｌ  ｗｈｅａｔ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｄｉｓｐｅｎｓｏｍｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ,ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ,ａｎｄ  ｓｔｅａｌｔｈ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ.ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ.７:ｅｌ００２０７０.
【非特許文献３７】Ｇｏｓｗａｍｉ,Ｒ.Ｓ.ａｎｄ  Ｋｉｓｔｌｅｒ,Ｈ.Ｃ.２００４.Ｈｅａｄｉｎｇ  ｆｏｒ  ｄｉｓａｓｔｅｒ:Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ  ｏｎ  ｃｅｒｅａｌ  ｃｒｏｐｓ,Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ.５:５１５−５２５.
【非特許文献３８】Ｈａｖｅ,Ａ.Ｔ.,Ｍｕｌｄｅｒ,Ｗ.,Ｖｉｓｓｅｒ,Ｊ.ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｋａｎ,Ｊ.Ａ.１９９８.Ｔｈｅ  ｅｎｄｏｐｏｌｙｇａｌａｃｔｕｒｏｎａｓｅ  ｇｅｎｅ  Ｂｃｐｇｌ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｆｕｌｌ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ.  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ.１１:１００９−１０１６.
【非特許文献３９】Ｊｅｎｃｚｍｉｏｎｋａ,Ｎ.Ｊ.,Ｍａｉｅｒ,Ｆ.Ｊ.,Ｌｏｓｃｈ,Ａ.Ｐ.ａｎｄ  Ｓｃｈａｆｅｒ,Ｗ.２００３.Ｍａｔｉｎｇ,ｃｏｎｉｄｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ,ｔｈｅ  ｍａｉｎ  ｃａｕｓａｌ  ａｇｅｎt  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅａｄ−ｂｌｉｇｈｔ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｏｆ  ｗｈｅａｔ,ａｒｅ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅ  ｇｐｍｋｌ.Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ.４３:８７−９５.
【非特許文献４０】Ｋａｍｐｅｒ,Ｊ.,Ｋａｌｌｍａｎｎ,Ｒ.,Ｂｏｌｋｅｒ,Ｍ.Ｍａ,Ｌ.−Ｊ.,Ｂｒｅｆｏｒｔ,Ｔ.,Ｓａｖｉｌｌｅ,Ｂ.Ｊ.,Ｂａｎｕｅｔｔ,Ｆ.,Ｋｒｏｎｓｔａｄ,Ｊ.Ｗ.,Ｇｏｌｄ,Ｓ.Ｅ.ａｎｄ  Ｍｉｉｌｌｅｒ,Ｏ.２００６.Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｉｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆｕｎｇａｌ  ｐｌａｎｔ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ.Ｎａｔｕｒｅ.４４４:９７−１０１.
【非特許文献４１】Ｌａｗｒｅｎｃｅ,Ｇ.,Ｍａｙｏ,Ｇ.ａｎｄ  Ｓｈｅｐｈｅｒｄ,Ｋ.１９８１.Ｌａｗｒｅｎｃｅ,Ｇ.,Ｍａｙｏ,Ｇ.ａｎｄ  Ｓｈｅｐｈｅｒｄ,Ｋ.１９８１.Ｉｎｔｅｒｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｌａｘ  ｒｕｓｔ  ｆｕｎｇｕｓ［Ｍｅｌａｍｐｓｏｒａ  ｌｉｎｉｌ.Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ （ＵＳＡ）.
【非特許文献４２】Ｌｏ,Ｓ.−Ｃ.Ｃ,Ｈｉｐｓｋｉｎｄ,Ｊ.ｄ.ａｎｄ  Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ,Ｒ.Ｌ.１９９９.ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｓｏｒｇｈｕｍ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＰＲ−１０）ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｆｅｎｓｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ  ｏｒ  Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｓｕｂｌｉｎｅｏｌｕｍ.Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ.１２:４７９−４８９.
【非特許文献４３】Ｍｅｈｒａｂｉ,Ｒ.,Ｖａｎ  Ｄｅｒ  Ｌｅｅ,Ｔ.,Ｗａａｌｗｉｊｋ,Ｃ.ａｎｄ  Ｋｅｍa,Ｇ.Ｈ.２００６.ＭｇＳｌｔ２,ａ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  ＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｕｎｇａｌ  ｗｈｅａｔ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ,ｉｓ  ｄｉｓｐｅｎｓａｂｌｅ  ｆｏｒ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ  ｂｕｔ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ.Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．１９：３８９−３９８.
【非特許文献４４】Ｍｉｃｈｉｅｌｓｅ,Ｃ.Ｂ  ａｎｄ  Ｒｅｐ,Ｍ.２００９.Ｐａｔｈｏｇｅｎ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ｕｐｄａｔｅ：Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ.Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ.１０：３１１−３２４.
【非特許文献４５】Ｍｕｌｌｅｒ,Ｐ.,Ａｉｃｈｉｎｇｅｒ,Ｃ,Ｆｅｌｄｂｒｕｇｇｅ,Ｍ.ａｎｄ  Ｋａｈｍａｎｎ,Ｒ.１９９９.Ｔｈｅ  ＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅ  ｋｐｐ２  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｍａｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｉｎ  Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ.Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ.３４：１００７−１０１７.
【非特許文献４６】Ｎｅｍｒｉ,Ａ.,Ｓａｕｎｄｅｒｓ,Ｄ.Ｇ.,Ａｎｄｅｒｓｏｎ,Ｃ,Ｕｐａｄｈｙａｙａ,Ｎ.Ｍ.,Ｗｉｎ,Ｊ.,Ｌａｗｒｅｎｃｅ,Ｇ.Ｊ.,Ｊｏｎｅｓ,Ｄ.Ａ.,Ｋａｍｏｕｎ,Ｓ.,Ｅｌｌｉｓ,Ｊ.Ｇ.ａｎｄ  Ｄｏｄｄｓ,Ｐ.Ｎ.２０１４.Ｔｈｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｌａｘ  ｒｕｓｔ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  Ｍｅｌａｍｐｓｏｒａ  ｌｉｎｉ.Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ.５：
【非特許文献４７】Ｎｏｗａｒａ,Ｄ.,Ｇａｙ,Ａ.,Ｌａｃｏｍｍｅ,Ｃ,Ｓｈａｗ,Ｊ.,Ｒｉｄｏｕｔ,Ｃ,Ｄｏｕｃｈｋｏｖ,Ｄ.,Ｈｅｎｓｅｌ,Ｇ.,Ｋｕｍｌｅｈｎ,Ｊ.ａｎｄ  Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ,Ｐ.２０１０.ＨＩＧＳ：ｈｏｓｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｏｂｌｉｇａｔｅ  ｂｉｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆｕｎｇａｌ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  Ｂｌｕｍｅｒｉａ  ｇｒａｍｉｎｉｓ.Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ.２２：３１３０−３１４１.
【非特許文献４８】Ｐａｎｗａｒ,Ｖ.,Ｍｃｃａｌｌｕｍ,Ｂ.ａｎｄ  Ｂａｋｋｅｒｅｎ,Ｇ.２０１３.Ｈｏｓｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｗｈｅａｔ  ｌｅａｆ  ｒｕｓｔ  ｆｕｎｇｕｓ  Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｔｒｉｔｉｃｉｎａ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｇｅｎｅｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ ｔｈｅ  Ｂａｒｌｅｙ  ｓｔｒｉｐｅ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ.Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ.８１：５９５−６０８.
【非特許文献４９】Ｒａｍｐｉｔｓｃｈ,Ｃ.,Ｂｙｋｏｖａ,Ｎ.Ｖ.,Ｍｃｃａｌｌｕｍ,Ｂ,,Ｂｅｉｍｃｉｋ,Ｅ.ａｎｄ  Ｅｎｓ,Ｗ.２００６.Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｗｈｅａｔ  ａｎｄ  Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｔｒｉｔｉｃｉｎａ（ｌｅａｆ  ｒｕｓｔ）ｐｒｏｔｅｏｍｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ａ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ  ｈｏｓｔ−ｐａｔｈｏｇｅｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ.Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ.６：１８９７−１９０７.
【非特許文献５０】Ｓｔａｋｍａｎ,Ｅ.Ｃ.ａｎｄ  Ｌｅｖｉｎｅ,Ｍ.Ｎ.１９４４.Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ  ｒａｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｇｒａｍｉｎｉｓ  ｔｒｉｔｉｃｉ,Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  Ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ.
【非特許文献５１】Ｔａｋａｎｏ,Ｙ.,Ｋｉｋｕｃｈｉ,Ｔ.,Ｋｕｂｏ,Ｙ.,Ｈａｍｅｒ,Ｊ.Ｅ.,Ｍｉｓｅ,Ｋ.ａｎｄ  Ｆｕｒｕｓａｗａ,Ｉ.２０００.Ｔｈｅ  Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｌａｇｅｎａｒｉｕｍ  ＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅ  ｇｅｎｅ  ＣＭＫ１  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  ｆｕｎｇａｌ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ.Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ.１３：３７４−３８３.
【非特許文献５２】Ｕｒｂａｎ,Ｍ.,Ｍｏｔｔ,Ｅ.,Ｆａｒｌｅｙ,Ｔ.ａｎｄ  Ｈａｍｍｏｎｄ−Ｋｏｓａｃｋ,Ｋ.２００３.Ｔｈｅ  Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ  ＭＡＰＩ  ｇｅｎｅ  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｅｒｉｔｈｅｃｉａ.Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ.４：３４７−３５９.
【非特許文献５３】Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ,Ｂ.,Ｔｕｄｚｙｎｓｋｉ,Ｂ.,Ｔｕｄｚｙｎｓｋｉ,Ｐ.ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｋａｎ,Ｊ.Ａ.２００７.Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ：  ｔｈｅ  ｃａｕｓｅ  ｏｆ  ｇｒｅｙ  ｍｏｕｌｄ  ｄｉｓｅａｓｅ.Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ.８：５６１-５８０.
【非特許文献５４】Ｚｈｅｎｇ,Ｌ.,Ｃａｍｐｂｅｌｌ,Ｍ.,Ｍｕｒｐｈｙ,Ｊ.,Ｌａｍ,Ｓ.ａｎｄ  Ｘｕ,Ｊ.−Ｒ.２０００.Ｔｈｅ  ＢＭＰ１  ｇｅｎｅ  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｒａｙ  ｍｏｌｄ  ｆｕｎｇｕｓ  Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ.Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ.１３：７２４−７３２.
【非特許文献５５】Ｚｈｕ,Ｌ.,Ｚｈｕ,Ｊ.,Ｌｉｕ,Ｚ.,Ｗａｎｇ,Ｚ.,Ｚｈｏｕ,Ｃ.ａｎｄ  Ｗａｎｇ,Ｈ.２０１７.Ｈｏｓｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｒｉｃｅ  ｂｌａｓｔ  ｆｕｎｇｕｓ  Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｏｒｙｚａｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｇｅｎｅｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ ｔｈｅ  Ｂｒｏｍｅ  Ｍｏｓａｉｃ  Ｖｉｒｕｓ.Ｇｅｎｅｓ.８：２４１.
【非特許文献５６】Ｚｗｉｅｒｓ,Ｌ,‐Ｈ.ａｎｄ  Ｄｅ  Ｗａａｒｄ,Ｍ.Ａ.２０００.Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＢＣ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ｇｅｎｅｓ  ＭｇＡｔｒ１  ａｎｄ  ＭｇＡｔｒ２  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｗｈｅａｔ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ.Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ.３０；１１５−１２５.
【非特許文献５７】Ｔｉｍｍｏｎｓ  Ｌ,Ｃｏｕｒｔ  ＤＬ,  Ｆｉｒｅ  Ａ（２００１）.Ｉｎｇｅｓｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｄｓＲＮＡｓ  ｃａｎ  ｐｒｏｄｕｃｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｄ  ｐｏｔｅｎｔ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ.Ｇｅｎｅ  ２６３（１−２）：１０３−１１２
【非特許文献５８】Ｇｌｉｃｋ  Ｂ（２０１３）.Ｂａｃｔｅｒｉａ  ｗｉｔｈ  ＡＣＣ  ｄｅａｍｉｎａｓｅ  ｃｓａｎ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｐｌａｎｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｈｅｌｐ  ｔｏ  ｆｅｅｄ  ｔｈｅ  ｗｏｒｌｄ.Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １６９（２０１４）：３０−３９
【非特許文献５９】Ｐａｎｄｅ  Ｓ,  Ｓｈｉｔｕｔ  Ｓ,  Ｆｒｅｕｎｄ  Ｌ,Ｗｅｓｔｅｒｍａｎ  Ｍ,Ｂｅｒｔｅｌｓ  Ｆ,Ｃｏｌｅｓｉｅ  Ｃ,Ｂｉｓｃｈｏｆｓ  ＩＢ,Ｋｏｓｔ  Ｃ（２０１５）.Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｃｒｏｓｓ−ｆｅｅｄｉｎｇ  ｖｉａ  ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  ｎａｎｏｔｕｂｅｓ  ａｍｏｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉａ.Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍ  ６：ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ７２３８
【非特許文献６０】Ｔａｋｉｆｆ  ＨＥ,Ｃｈｅｎ,ＳＭ,Ｃｏｕｒｔ  ＤＬ（１９８９）.Ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｎｃ  ｏｐｅｒｏｎ ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ.Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １７１（５）：２５８１−２５９０
【非特許文献６１】Ｄｅｒｏｕｉｃｈｅ  Ｒ,Ｂｅｎｅｄｅｔｔｉ  Ｈ,Ｌａｚｚａｒｏｎｉ  ＪＣ,Ｌａｚｄｕｎｓｋｉ  Ｃ,Ｌｌｏｕｂｅｓ  Ｒ（１９９５）.Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｗｉｔｈｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｉｎｎｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ.ｔｏｌＡ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｏｍａｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｓ  ｗｉｔｈ  ＴｏｌＱ  ａｎｄ  ＴｏｌＲ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ.Ｊ.Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７０：１１０７８−１１０８４
【非特許文献６２】Ｓｈｉｎ  ＪＤ,Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  ＭＣ,Ｓｕｔｈｅｒｌｉｎ  Ｍ,Ｈｕｎｔｅｒ  ＣＰ（２００９）.Ｔｈｅ  ＳＩＤ−１  ｄｏｕｂｌｅ  ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ｉｓ  ｎｏｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｆｏｒ  ｄｓＲＮＡ  ｌｅｎｇｔｈ.ＲＮＡ  １５：３８４−３９０
【非特許文献６３】ＭｃＥｗａｎ  ＤＬ,Ｗｅｉｓｍａｎ  ＡＳ,Ｈｕｎｔｅｒ  ＣＰ（２０１２）.Ｕｐｔａｋｅ  ｏｆ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ  ｂｙ  ＳＩＤ−２
【非特許文献６４】Ｐａｌｌａｓ  Ｖ,Ｇｏｍｅｚ  Ｇ（２０１３）.Ｐｈｌｏｅｍ  ＲＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｓ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｏｎｇ−ｄｉｓｔａｎｃｅ  ＲＮＡ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｓｙｓｔｅｍ.Ｆｒｏｎｔ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ  ４：１３０
【非特許文献６５】Ｇａｒｃｉａ−Ｒｕｉｚ  Ｈ,Ｃａｒｂｏｎｅｌｌ,Ｓｔｅｅｎ  Ｈｏｙｅｒ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ.（２０１５）Ｒｏｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｏｆ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＡＲＧＯＮＡＵＴＥ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｄｕｒｉｎｇ  Ｔｕｒｎｉｐ  Ｍｏｓａｉｃ  Ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ.ＰＬＯＳ  ｐａｔｈｏｇｅｎｓ,  ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ.ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ.ｐｐａｔ,１００４７５５
【非特許文献６６】Ｋｉｍ  Ｋ,Ｍａｎａｓｈｅｒｏｂ  Ｒ,Ｃｏｈｅｎ  ＳＮ（２００８）.ＹｍｄＢ：ａ  ｓｔｒｅｓｓ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  Ｅ.ｃｏｌｉ  ＲＮａｓｅｌｌｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ.Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２２：３４９７−３５０８.
【非特許文献６７】Ｒｅｎ  Ｚ,Ｖｅｋｓｌｅｒ−Ｌｕｂｌｉｎｓｋｙ  Ｉ,Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ  Ｄ,Ａｍｂｒｏｓ  Ｖ（２０１６）Ｓｔａｕｆｅｎ  ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ.Ｇ３  ６（５）：１２２７−１２３７
【非特許文献６８】Ｒａｍａｎ  Ｐ,Ｚａｇｈａｂ  ＳＭ,Ｔｒａｖｅｒ  Ｅｃ,Ｊｏｓｅ  ＡＭ（２０１７）.Ｔｈｅ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＲＤＥ−４  ｃａｎ  ａｃｔ  ｃｅｌｌ  ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓｌｙ  ｄｕｒｉｎｇ  ｆｅｅｄｉｎｇ  ＲＮＡｉ  ｉｎ  Ｃ.ｅｌｅｇａｎｓ.Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ４５（１４）：８４６３−８４７３
【非特許文献６９】Ｈａｎ  Ｍ,Ｇｏｕｄ  Ｓ,Ｓｏｎｇ  Ｌ,Ｆｅｄｏｒｏｆｆ  Ｎ（２００３）.Ｔｈｅ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＨＹＬ１  ｐｌａｙｓ  ａ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ.ＰＮＡＳ  １０１（４）：１０９３：１０９８
【非特許文献７０】Ａｄｅｎｏｔ  Ｘ,Ｅｌｍａｙａｎ  Ｔ,Ｌａｕｒｅｓｓｅｒｇｕｅｓ  Ｄ,Ｂｏｕｔｅｔ  Ｓ,Ｂｏｕｃｈｅ  Ｎ,Ｇａｓｃｉｏｌｌｉ  ｖ，Ｖａｃｈｅｒｅｔ  Ｈ（２００６）.ＤＲＢ４−ｄｅｐｅｄｅｎｔ  ＴＡＳ３  ｔｒａｓ−ａｃｔｉｎｇ  ｓｉＲＮＡｓ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｌｅａｆ  ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ＡＧ０７.Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  １６（９）：９２７−９３２
【非特許文献７１】Ｊi  Ｌ,Ｃｈｅｎ  Ｘ（２０１２）.Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ：ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｅｙｏｎｄ.Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ.２２：６２４−６３６
【非特許文献７２】Ｌｉ  Ｓ,Ｌｉｕ  Ｋ,Ｚｈａｎｇ  Ｓ,Ｗａｎｇ  Ｘ,Ｒｏｇｅｒｓ  Ｋ,Ｒｅｎ  Ｇ,Ｚｈａｎｇ  Ｃ,Ｙｕ  Ｂ（２０１７）.ＳＴＶ１,ａ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ,ｂｉｎｄｓ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ  ｔｏ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｔｈｅｉｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ.ＰＮＡＳ  １１４（６）：１４２４−１４２９
【非特許文献７３】Ｚｈａｎｇ  Ｆ,Ｇｒｅｉｇ  ＤＩ,Ｌｉｎｇ  Ｖ（１９９３）.Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ  Ａ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｓｉｇｎａｌ  ｂｙ  ａ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ.ＰＮＡＳ  ９０：４２１１−４２１５
【非特許文献７４】Ｎａｔａｌｅ  Ｐ,Ｂｒｕｓｅｒ  Ｔ,Ｄｒｉｅｓｓｅｎ  ＡＪＭ（２００８）.Ｓｅｃ−ａｎｄ  Ｔａｔ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｐｒｔｅｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ａｃｒｏｓｓ  ｔｈｅ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ−Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｓｅｓ  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  Ｂｉｏｐｈｙ.Ａｃｔａ  ９：１７３５−１７５６
【非特許文献７５】Ｊｏｎｅｓ  ＳＷ,Ｃｈｒｉｓｔｉｓｏｎ  Ｒ,Ｂｕｎｄｅｌｌ  Ｋ,Ｖｏｙｃｅ  ＣＪ,Ｂｒｏｃｋｂａｎｋ  ＳＭＶ,Ｎｅｗｈａｍ  Ｐ,Ｌｉｎｄｓａｙ（２００５）.Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅ；１１−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ.Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ.ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓｊ.ｂｊｐ.０７０６２７９
【非特許文献７６】ＺｕｋｅｒおよびＳｔｉｅｇｌｅｒ（１９８１年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ９（１）：１３３〜４８
【非特許文献７７】Ｚｕｋｅｒ、Ｍ．（１９８９年）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎ−ｚｙｍｏｌ．１８０：２６２−２８８
【非特許文献７８】ＣｈｕａｎｇおよびＭｅｙｅｒｏｗｉｔｚ（２０００年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：４９８５−４９９０
【非特許文献７９】Ｓｔｏｕｔｊｅｓｄｉｊｋら、（２００２年）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２９：１７２３−１７３１
【非特許文献８０】ＷａｔｅｒｈｏｕｓｅおよびＨｅｌｌｉｗｅｌｌ（２００３年）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ，４：２９−３８
【非特許文献８１】Ｐａｎｄｏｌｆｉｎｉら、ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３：７
【非特許文献８２】Ｐａｎｓｔｒｕｇａら、（２００３年）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐ．３０：１３５−１４０
【非特許文献８３】Ｗｅｓｌｅｙら（２００１年）Ｐｌａｎｔ  Ｊ  ２７：５８１−５９０
【非特許文献８４】ＷａｎｇおよびＷａｔｅｒｈｏｕｓｅ（２００１年）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．５：１４６−１５０
【非特許文献８５】ＨｅｌｌｉｗｅｌｌおよびＷａｔｅｒｈｏｕｓｅ（２００３年）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３０：２８９−２９５
【非特許文献８６】ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１年）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２
【非特許文献８７】ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３
【非特許文献８８】ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４
【非特許文献８９】ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ（１９８８年）Ｇｅｎｅ  ７３：２３７−４４
【非特許文献９０】ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ（１９８９年）ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−３
【非特許文献９１】Ｃｏｒｐｅｔら（１９８８年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：１０８８１−９０
【非特許文献９２】Ｈｕａｎｇら（１９９２年）Ｃｏｍｐ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．８：１５５−６５；
【非特許文献９３】Ｐｅａｒｓｏｎら（１９９４年）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７−３１；
【非特許文献９４】Ｔａｔｉａｎａら（１９９９年）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１７４：２４７−５０
【非特許文献９５】Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０
【非特許文献９６】Ｗａｒｄら（１９９３年）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２：３６１−３６６
【非特許文献９７】Ｓｃｈｅｎａら、（１９９１年）Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：０４２１
【非特許文献９８】Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１年）
【非特許文献９９】Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５年）
【非特許文献１００】Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８（１９９４年）
【非特許文献１０１】ＢｅａｕｃａｇｅおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｓ．２２：１８５９−１８６２（１９８１年）
【非特許文献１０２】Ｖａｎ  Ｄｅｖａｎｔｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：６１５９−６１６８（１９８４年）
【非特許文献１０３】Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｒｅａｎｉｅｒ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．２５５：１３７〜１４９（１９８３年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
一般に、本発明の技術は、植物病原体、植物ウイルス、真菌病原体、害虫などの植物病原体および有害生物の防除のための新規戦略に関する。具体的には、本発明は、選択された植物病原体および草食動物の生物的防除のための新規の技術、系、および方法を含み得る。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
いくつかの実施形態では、本発明は、ウイルスゲノムと相同である阻害性ＲＮＡの新規の生物界間送達に関し、ウイルスの複製およびウイルスタンパク質の翻訳を効率的に下方制御するか、または排除する。
【００１８】
１つの好ましい実施形態は、分解するために、病原体をコードしているＲＮＡを標的とするヘアピンＲＮＡ／ｄｓＲＮＡ分子の新規の生物界間送達を含み得、その結果、コードされたタンパク質の蓄積レベルの低下をもたらす。こうした新規生物界間送達は、病原体コード配列と相同である調節ｄｓＲＮＡまたは調節ＲＮＡ配列をコードしているヌクレオチド構築物を保有する、遺伝子改変植物内生細菌による植物の感染を介して達成され得る。
【００１９】
別の好ましい実施形態は、ウイルス性病原体にコードされたタンパク質を標的とし、ヘアピンＲＮＡの新規の生物界間送達を含み得、結果的に、ウイルスタンパク質の蓄積レベルの低下をもたらす。こうした新規の生物界間送達は、標的病原体タンパク質と相同であるヘアピンＲＮＡをコードしているヌクレオチド構築物を保有する、遺伝子改変植物内生細菌による植物の感染を介して達成され得る。
【００２０】
別の好ましい実施形態は、真菌病原体にコードされたタンパク質を標的とするヘアピンＲＮＡの新規の生物界間送達を含み得、結果的に、真菌タンパク質の蓄積レベルの低下をもたらす。こうした新規の生物界間送達は、標的病原体タンパク質と相同であるヘアピンＲＮＡをコードしているヌクレオチド構築物を保有する、遺伝子改変植物内生細菌による植物の感染を介して達成され得る。
【００２１】
１つの好ましい実施形態は、有害生物にコードされたタンパク質を標的とするヘアピンＲＮＡの新規の生物界間送達を含み得、これにより、結果として、ウイルスタンパク質の蓄積レベルの低下をもたらす。こうした新規の生物界間送達は、標的病原体タンパク質と相同であるか、または標的病原体タンパク質に向けられたヘアピンＲＮＡをコードしているヌクレオチド構築物を保有する、遺伝子改変植物内生細菌による植物の感染を介して達成され得る。
【００２２】
好ましい一実施形態では、本発明は、遺伝子操作された微生物を導入することによって、植物病原体の複製を無力化し、潜在的に死滅させ、かつ／または妨げるための、新規の生物界をまたぐ（ｃｒｏｓｓ−ｋｉｎｇｄｏｍ）メカニズムを使用して、新規の植物由来の病因物質を防除するための革新的な系および戦略を含み得る。これらは、ｈｐＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｍｉｃｒｏＲＮＡなどの阻害性ＲＮＡ分子を用いた生殖、病原性、および／または一般的な代謝に関与する病原体において、固有の標的遺伝子の不活性化を標的とし得る（これらの発現により、目的遺伝子に対する標的ｍＲＮＡの代謝回転がもたらされ得る）。目的の固有の標的遺伝子の例としては、ウイルスコートタンパク質、真菌細胞壁遺伝子、昆虫外骨格成分遺伝子、ならびに真菌および昆虫における代謝遺伝子については、種特異的な固有のｍＲＮＡ標的が挙げられる。
【００２３】
追加的実施形態では、植物の根、茎、葉および生殖器官内で見いだされ得る組換え操作された内生細菌における、ｈｐＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡおよびｍｉｃｒｏＲＮＡなどの阻害性ＲＮＡ分子の発現を含む。この実施形態では、本発明の技術は、必須のまたは他の標的植物病原体および／または草食動物遺伝子をノックダウンするための生物界をまたぐ様々なメカニズムを含み得る。ある実施形態では、これは、病原性または生殖などに必要であるか、または必須である標的植物、病原体および／または草食動物の遺伝子を下方制御し得る特異的阻害性ＲＮＡ分子を発現する植物へ、組換え操作された微生物を導入することによって達成され得る。本発明の技術の追加的実施形態は、様々なプロモーターおよび他の遺伝要素を有するプラスミドなどの遺伝子構築物を包含し、これにより、内生細菌、植物および／または草食動物系において、特異的阻害性ＲＮＡ分子および他のタンパク質を発現する標的レベルが可能になる。
【００２４】
一態様によれば、本発明は、植物細胞における配列相同性ターゲッティングによる病原体遺伝子（複数可）の下方制御方法、およびこの方法で使用するための核酸構築物、ならびに核酸構築物において使用するためのｈｐＲＮＡまたはアニールされたｄｓＲＮＡなどの阻害性ＲＮＡポリヌクレオチドを提供する。この方法は、阻害性ＲＮＡを産生することができる核酸構築物を細胞に導入すること、およびｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）またはｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を産生するのに十分な時間にわたって、核酸構築物を発現させることを含み、ｓｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡが、標的病原体遺伝子または配列の発現を阻害する。ｍｉＲＮＡ構築物は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）またはヘアピン（ｈｐＲＮＡ）を形成することができる修飾ＲＮＡ前駆体をコードしているポリヌクレオチドを含み、修飾ＲＮＡ前駆体は、修飾ｍｉＲＮＡおよび修飾ｍｉＲＮＡに相補的な配列を含み、修飾ｍｉＲＮＡは、標的配列に対して（ｉ）完全にまたは部分的に相補的であるように修飾されたｍｉＲＮＡである。当技術分野において周知であるように、プレｍｉＲＮＡは、ある場合には、二本鎖領域が非常に短い場合もある（例えば２１〜２５ｂｐ長を超えない）ヘアピンを形成する。核酸構築物は、ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターをさらに含み得る。
【００２５】
いくつかの実施形態では、以下により詳細に記載されるように、細胞は、これらに限定されないが、トウモロコシ、コムギ、イネ、オオムギ、オーツムギ、モロコシ、キビ、ヒマワリ、ベニバナ、ワタ、大豆、キャノーラ、アルファルファ、シロイヌナズナなどの植物細胞（単子葉植物または双子葉植物）であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の植物であり得、リンゴ、ブドウ、柑橘類、ナシ、モモ、プラム、オレンジ、レモン、ライム、グレープフルーツ、ザクロ、オリーブ、ピーナッツ、タバコなど、特定の双子葉植物作物でもあり得る。また、植物は、バラ、マリーゴールド、サクラソウ、ハナミズキ、パンジー、ゼラニウムなどの園芸植物であり得る。他の実施形態では、植物はＮ．ベンサミアナ、Ｎ．タバカムなどのタバコである。追加的例は、以下に提供する。プロモーターは、病原体誘導性プロモーターまたは他の誘導性プロモーターであり得る。修飾ｍｉＲＮＡが標的ＲＮＡに結合することで、標的ＲＮＡが切断される。標的ＲＮＡの標的配列は、遺伝子のノンコーディング非翻訳領域、コーディング配列、イントロンまたはスプライス部位であり得る。
【００２６】
別の態様によれば、本発明は、修飾された植物ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ前駆体をコードしている単離ポリヌクレオチドを提供し、この修飾前駆体はｄｓＲＮＡまたはヘアピンを形成することができ、かつ修飾ｍｉＲＮＡおよび修飾ｍｉＲＮＡに相補的な配列を含み、修飾ｍｉＲＮＡは、（ｉ）標的配列と完全にまたは部分的に相補的であるように修飾されたｍｉＲＮＡである。ポリヌクレオチドの発現は、標的配列の発現を阻害する成熟ｍｉＲＮＡをもたらすために宿主細胞中でプロセシングされるｍｉＲＮＡ前駆体を産生する。阻害性ＲＮＡポリヌクレオチド（複数可）は、内生細菌などの遺伝子改変微生物または中和病原菌を介して植物に送達し得るプラスミドなどの核酸構築物から形成し得る。核酸構築物は、ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターをさらに含み得る。プロモーターは、病原体誘導性プロモーターまたは他の誘導性プロモーターであり得る。修飾ｍｉＲＮＡが標的ＲＮＡに結合することで、標的ＲＮＡが切断される。標的ＲＮＡの標的配列は、遺伝子のノンコーディング非翻訳領域、コーディング配列、ノンコーディング配列またはスプライス部位であり得る。
【００２７】
別の態様によれば、本発明は、複数の標的配列を抑制するための阻害性ＲＮＡ核酸構築物を提供する。核酸構築物は、少なくとも２つ、最大で４５個またはそれ以上のポリヌクレオチドを含み、それらの各々は、ｄｓＲＮＡまたはヘアピンを形成することができるｍｉＲＮＡ前駆体をコードしている。各ｍｉＲＮＡは、本明細書に記載のように、標的と実質的に相補的であるか、または標的と相補的であるように修飾されている。いくつかの実施形態では、構築物中の前駆体ｍｉＲＮＡをコードしているポリヌクレオチドの各々が、１つのプロモーターの制御下に個別に置かれる。いくつかの実施形態では、前駆体ｍｉＲＮＡをコードしている複数のポリヌクレオチドは、それらが１つのプロモーターの制御下に置かれ得るように互いに作動可能に連結される。プロモーターは、複数のｍｉＲＮＡの構築物に作動可能に連結されてもよく、または１つのプロモーターに作動可能に連結されてもよい。プロモーターは、病原体誘導性プロモーターまたは他の誘導性プロモーターであり得る。いくつかの実施形態では、複数のポリヌクレオチドは互いに連結されており、このため、発現したときには、単一の転写物を形成するようになる。核酸構築物中にポリヌクレオチドが発現することにより、複数のｍｉＲＮＡ前駆体が産生される。これらの前駆体は、宿主細胞内でプロセシングされて、複数の成熟型ｍｉＲＮＡとなり、その各々が、標的配列の発現を阻害する。一実施形態では、成熟ｍｉＲＮＡの各々が、標的ＲＮＡの各々に結合することで、標的ＲＮＡの各々が切断される。標的ＲＮＡの標的配列は、遺伝子のノンコーディング非翻訳領域、コーディング配列、遺伝子のノンコーディング非翻訳領域、ノンコーディング配列またはスプライス部位であり得る。阻害性ＲＮＡポリヌクレオチド（複数可）は、内生細菌などの遺伝子改変微生物または中和病原菌を介して植物に送達し得るプラスミドなどの核酸構築物から形成され得る。
【００２８】
別の態様によれば、本発明は、遺伝子改変細菌を介して阻害性ＲＮＡ分子を植物細胞に送達するために有用な方法および組成物を提供する。そのような遺伝子改変細菌は、ｄｓＲＮＡおよびｈｐＲＮＡなどの阻害性ＲＮＡ分子を効率的かつ安定的に産生するための遺伝子改変を含み得る。いくつかの実施形態では、そのような遺伝子改変細菌は、ＲＮＡａｓｅＩＩＩ活性を減少させるか、または全く有さないように改変されていてもよく、これにより、細菌中に存在するｄｓＲＮＡを分解し得る。いくつかの実施形態では、そのような遺伝子改変細菌は、ＲＮＡａｓｅＩＩＩのノックアウトを含むように、または酵素活性が低下しているか、もしくは全く有さない突然変異型ＲＮＡａｓｅＩＩＩを発現するように改変されていてもよい。
【００２９】
ある実施形態では、組成物は、標的配列の領域に対して実質的な相補性を有する阻害性ＲＮＡをコードすることによって、標的遺伝子の発現を選択的に抑制する。ｍｉＲＮＡ／ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡに転写されるときに、細胞によってプロセシングされる成熟ｓｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡを生成するヘアピン構造を形成することが予測される核酸構築物中にもたらされ、次に、以下に概説する標的遺伝子または配列の発現を抑制する。
【００３０】
追加的実施形態では、核酸構築物は、任意の特定の標的病原体遺伝子の阻害性ＲＮＡをコードするためにもたらされる。これは、例えば、植物細胞内またはその周囲にコロニー形成すること、阻害性ＲＮＡを発現させて、ｍｉＲＮＡプロセシングのために植物細胞に伝達すること、その結果、本明細書に概説されている標的病原体遺伝子を抑制することが可能である遺伝子改変細菌によって発現され得るプラスミドにコードされ得る。任意の阻害性ＲＮＡは、コードされた阻害性ＲＮＡが標的病原体遺伝子を選択的に標的とし、かつ抑制するように構築物に挿入することができる。
【００３１】
追加的実施形態では、標的配列を抑制するための方法が提供される。この方法は、阻害性ＲＮＡ分子が、標的配列の領域に対して設計され、かつ細菌プラスミドなどの構築物に挿入されている上記の構築物を使用する。例えば、内生細菌を介して細胞に導入されるときに、細菌内で産生されたｍｉＲＮＡが産生されて、植物細胞に伝達され、本明細書に概説されるように標的配列の発現を抑制する。いくつかの実施形態では、遺伝子改変細菌は、選択か、または遺伝子操作による過胞形成のいずれかを介してでも呈し得る。ある実施形態では、こうした過胞形成は、細菌性プラスミドによって産生された阻害性ＲＮＡ分子の周囲の細胞、または細胞表面、または他の植物細胞構造への効率的な輸送を助け得る。
【００３２】
ある実施形態では、標的遺伝子または配列は、内因性植物遺伝子、または異種遺伝子であり得る。また、標的遺伝子は、病原性細菌もしくはウイルス、線虫、草食動物、昆虫、またはカビもしくは真菌などの植物病原体由来の遺伝子であり得る。構築物および／またはｍｉＲＮＡを含む植物、細胞および種子が提供される。典型的には、細胞は、植物由来の細胞であるが、これらに限定されることなく、酵母、昆虫、線虫、または動物細胞など、他の真核細胞もまた企図される。植物細胞としては、単子葉植物および双子葉植物由来の細胞が挙げられる。本発明はまた、構築物および／またはｍｉＲＮＡを含む植物および種子を提供する。構築物を含むウイルスおよび原核細胞もまた提供される。
【００３３】
いくつかの実施形態では、標的遺伝子または配列（これらの用語は一般に同義である）は、植物病原体から選択される。標的遺伝子に向けられているか、または病原体の阻害性ＲＮＡ分子を含む植物または細胞は、病原体に対する感受性の低下および／または耐性の増大を有すると予想される。いくつかの実施形態では、阻害性ＲＮＡ分子は、内生細菌中でさらに発現させ、かつ作動可能に連結されたプロモーターを含む細菌プラスミドなどの核酸構築物によってコードされる。いくつかの実施形態では、プロモーターは、病原体誘導性プロモーターである。
【００３４】
本発明の１つの目的には、植物における標的化された遺伝子の発現およびウイルス複製を阻止するための細菌ｄｓＲＮＡ安定化および送達系を開発することを含む。理解されるように、ｄｓＲＮＡの産生および植物への送達は、ｄｓＲＮＡ生合成、輸送、安定化、宿主への輸送および病原体複製の不活性化の調節を含む多成分プロセスである。
【００３５】
本発明の１つの目的には、細菌から植物宿主細胞へのｄｓＲＮＡの移入を増大するための系および方法を含む。ある実施形態では、これには、ｄｓＲＮＡ産生、安定化、輸送および／または送達を増強する細菌株およびヘルパー遺伝子を使用することを含み得る。例えば、あるクラスの細菌では、毒素およびタンパク質などの様々な分子が宿主生物に接近できるように、様々な分子分泌系を発生させている。６つの異なる細菌分泌系を以下に記載する。これらの６つの分泌系は、共通の、ならびに独自の作用機序を有する。ＩＩ型およびＶ型分泌系は、タンパク質が最初に細菌の内膜（ＩＭ）を通り、次いで外膜（ＯＭ）を通って輸送される二段階プロセスである。Ｉ型、ＩＩＩ型、およびＩＶ型の分泌系を介して分泌するために、材料は細胞外環境に、または宿主細胞に直接移入される。ＩＩＩ型系は、病原性細菌による因子の輸送に特異的であり、宿主細胞へ直接注入することを伴う。独特のＶＩ型分泌系では、細菌が、細菌の外膜から形成された細胞外小胞において、タンパク質および脂質の大きい複雑な群を細胞外環境に分泌できるようにする。次いで、これらの小胞が、宿主細胞と融合してそれらのカーゴを送達する。
【００３６】
本発明の目的、利点、新規な特徴、およびさらなる適用範囲は、添付の図面と併せて、以下の詳細な説明において一部説明され、また一部は、部分的に以下の検討時に当業者に明らかになるか、または本発明の実施によって習得され得る。本発明の目的および利点は、添付の特許請求の範囲において特に指摘された手段および組み合わせによって、実現され達成され得る。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】ｈｐＲＮＡベクターｐＡＤ−ＷＲＫＹ−ＧＨＹ１のマッピングを示す図である。
【図２】ｈｐＲＮＡベクターｐＡＤ−ＡＤＨ−ＧＨＹ２のマッピングを示す図である。
【図３】ｈｐＲＮＡベクターｐＯＸＢ−ＷＲＫＹ−ＧＨＹ３のマッピングを示す図である。
【図４】ｈｐＲＮＡ  ｐＯＸＢ−ＡＤＨ−ＧＨＹ４のマッピングを示す図である。
【図５】ｈｐＲＮＡ  ｐＡＤ−ＷＲＫＹ−ＧＨＹ５のマッピングを示す図である。
【図６】ｈｐＲＮＡ  ｐＡＤ−ＡＤＨ−ＧＨＹ６のマッピングを示す図である。
【図７】ｈｐＲＮＡ  ｐＡＤ−ＷＲＫＹ−ＧＨＹ７のマッピングを示す図である。
【図８】ＲＮａｓｅＩＩＩ突然変異体の構築が成功したことを検証するためのＰＣＲ分析を示す図である。
【図９】Ｂ．セレウス菌５３５２２株の同定を示す図である。レーンＭ：１ｋｂ  ＤＮＡラダー。レーン１：ＰｍｉｎｉＴ−１６ｓ  ｒＲＮＡをＸｈｏＩで消化したもの。レーン２：ＰｍｉｎｉＴ−２３ｓ  ｒＲＮＡをＸｈｏＩで消化したもの。レーン３：ＰｍｉｎｉＴ−ｍｏｔＢをＸｈｏＩで消化したもの。レーン４：ＰｍｉｎｉＴ−エンドグルカナーゼをＸｈｏＩで消化したもの。レーン５：ＰｍｉｎｉＴ−ｒｎｃＡをＸｈｏＩで消化したもの。
【図１０】７ｄｐｉ後のＮ．タバカムの浸潤の症状を示した図である。（アグロバクテリウムツメファシエンス；ＴＭＶ：ｐＪＬ−ＴＲＢＯ−Ｇ；ＭＪＭ１０９：Ｍ−ＪＭ１０９−ＧＨＹ２（ＲＮａｓｅＩＩＩ突然変異体、抗生物質なし）；ＧＨＹ５：ｐＡＤ−ＷＲＫＹ−ＧＨＹ５；ＧＨＹ６：ｐＡＤ−ＡＤＨ−ＧＨＹ６；ＧＨＹ３：ｐＯＸＢ−ＷＲＫＹ−ＧＨＹ３；ＧＨＹ４：ｐＯＸＢ−ＡＤＨ−ＧＨＹ４）。
【図１１Ａ】Ｎ．タバカムの健康な葉および浸潤葉のＵＶ照射下で検出された症状およびＧＦＰシグナルを示す図である。
【図１１Ｂ】７ｄｐｉでのＵＶ照射下でのＮ．タバカムのＴＭＶ−ＧＦＰシグナルを示す図である。
【図１１Ｃ】７ｄｐｉでのＵＶ照射下でＭ−ＪＭ１０９−ＧＨＹ２／ｐＡＤ−ＷＲＫＹ−ＧＨＹ１により処置されたＮ．タバカムのＴＭＶ−ＧＦＰシグナルを示す図である。
【図１２】タバコ植物におけるＴＭＶコードＧＦＰシグナルの拡散を阻害するｈｐＲＮＡの効率を論証する経時的画像を示す図である。
【図１３】Ｎ．タバカムにおける枯草菌ＣＣＢ４２２／ｐＡＤ−ＷＲＫＹ−ＧＨＹ５によるタバコ浸潤を示す図である。
【図１４】Ｎ．ベンサミアナの全葉浸潤におけるＡｔ／ＴＭＶシグナルの拡散の阻害におけるｈｐＲＮＡを有する過胞形成大腸菌株ＨＴ２７を示す図である。
【図１５】モデル植物生物におけるｈｐＲＮＡ媒介ＧＦＰシグナル抑制の効率の経時的論証を示す図である。
【図１６】ｓｉＲＮＡ移動の症状により、７ｄｐｉでの葉の構造を介するＴＭＶ−ＧＦＰの拡散が制限されたことを示す図である。
【図１７】ＭＪＭ１０９−ＧＨＹ２／ｐＡＤ−ＷＲＫＹ−ＧＨＹ５由来ｓｉＲＮＡは、タバコ植物モデルにおいてＴＭＶ−ＧＦＰシグナルの拡散が制限されたことを示す図である。
【図１８】Ａ）ｓｉＲＮＡがモデルタバコ植物においてＴＭＶ−ＧＦＰシグナルの拡散が制限されたことを示す図である。Ｂ）ｓｉＲＮＡがモデルタバコ植物においてＴＭＶ−ＧＦＰシグナルの拡散が制限されたことを示す図である。
【図１９】自然光により、およびフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）への曝露により観察された、４倍の倍率下でのＢｃ５３５２２／ｐＡＤ４３−２５およびＢｃ５３５２２／ｐＡＤ−ＷＲＫＹ−ＧＨＹ５のコロニーを示す図である。Ａ）自然光下において、４倍の倍率で見たＢｃ５３５２２／ｐＡＤ４３−２５のコロニーを示す。Ｂ）緑色のシグナルを示す、４倍の倍率でのＦＩＴＣへの曝露によるＢｃ５３５２２／ｐＡＤ４３−２５のコロニーを示す。Ｃ）自然光下において、４倍の倍率で見たＢｃ５３５２２／ｐＡＤ−ＷＲＫＹ−ＧＨＹ５のコロニーを示す。Ｄ）シグナルを示さない、４倍の倍率でのＦＩＴＣへの曝露によるＢｃ５３５２２／ｐＡＤ−ＷＲＫＹ−ＧＨＹ５のコロニーを示す。
【図２０】図２０は例示的タバコ植物におけるＢ．セレウス５３５２２のコロニー形成を示す図である。Ａ）タバコに接種したＢ．セレウスは、植物に有害な症状を示さなかった。Ｂ）ＵＶ下でのＧＦＰシグナル。Ｃ）蛍光立体顕微鏡下での植物の異なる領域のＧＦＰシグナル。
【図２１】ウイルスにコードされたＧＦＰを標的とするヘアピンＲＮＡの生物界間送達が、ウイルスタンパク質の蓄積レベルの低下をもたらす。Ａ）ｈｐＲＮＡの枯草菌ＣＣＢ４２２媒介生物界間送達により、宿主のＲＮＡｉ応答が首尾よく誘発され、Ｎ．タバカム植物におけるウイルスＧＦＰの蓄積を有意に減少させる。Ｂ）ＴＭＶ−ＧＦＰ感染サンプルおよびＴＭＶ−ＧＦＰ＋ｐＡＤ−ＷＲＫＹ−ＧＨＹ５（ＣＣＢ４２２）浸潤サンプル中のＧＦＰタンパク質レベルの定量化。ＲＢＣＬに対してＧＦＰシグナルを正規化した。参照として用いたＴＭＶ−ＧＦＰ複製＃１、Ｃ）ウイルスＧＦＰタンパク質は、ｈｐＲＮＡトリガーをコードするＨＴ２７を共浸潤させたＴＭＶサンプルにおいて検出不可能である。免疫検出からのＧＦＰ３ｃシグナル。添加対照としてのＲＢＣＬ（ポンソー染色）。
【図２２】ＨＴ２７／ｐＡＤ−ＷＲＫＹ−ＧＨＹ５によるＴＭＶ−ＧＦＰ  ｍＲＮＡの抑制をモニターするためのｑＰＣＲを示す図である。対照に対して、ｈｐＲＮＡを発現する細菌に感染した植物におけるＧＦＰ  ｍＲＮＡ抑制に関するｑＰＣＲデータ（ＴＭＶ−ＧＦＰ単独、ＴＭＶ−ＧＦＰ＋ｈｐＲＮＡを含まない細菌）。表および配列表もまた本明細書中に提供され、本明細書の一部である。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本発明は様々な態様を含み、それらは異なる方法で組み合わせ得る。以下の説明は、要素を列挙し、本発明の実施形態のいくつかを説明するために提供される。これらの要素は、最初の実施形態と共に列挙されているが、任意の様式で、かつ任意の数で組み合わせて、追加的実施形態を作り出し得ることを理解されたい。様々に記載された例および好ましい実施形態は、本発明を明示的に記載している系、技術、および用途のみに限定すると解釈されるべきではない。さらに、この説明は、任意の数の開示された要素、各要素のみ、および任意のおよびすべての様々な順列およびこのまたは任意のその後の用途のすべての要素の組み合わせを含むすべてのさまざまな実施形態、系、技法、方法、デバイス、および用途の説明および特許請求の範囲をサポートし、かつ包含すると理解されるべきである。
【００３９】
本明細書に開示されているのは、植物病原体、有害生物の侵入、および草食動物の遺伝的防除のための方法および組成物であり、これらはすべて一般的に植物病原体（複数可）としてまとめて記載されている。ｓｉＲＮＡ媒介干渉を増強するための標的遺伝子として使用するための植物病原体、有害生物および／または草食動物のライフサイクルに必須の１つ以上の遺伝子を同定するための方法もまた提供される。阻害性ＲＮＡ分子をコードしているＤＮＡプラスミドベクターは、植物病原体の成長、生存、発生、および／または繁殖に必須の１つ以上の標的遺伝子を抑制するように設計され得る。このような阻害性ＲＮＡ分子を効率的に感染させ、産生し、送達するように操作され得る遺伝子改変内生細菌、または他の微生物もまた本発明に記載されている。
【００４０】
いくつかの実施形態では、本発明は、植物病原体中の標的遺伝子のコーディング配列またはノンコーディング配列に相補的な核酸分子を介する、転写後の発現を抑制するため、または標的遺伝子を阻害するための方法を提供する。これらのおよびさらなる実施形態では、有害生物または草食動物は、標的遺伝子のコーディング配列またはノンコーディング配列に相補的な核酸分子のすべてまたは一部から転写された１つ以上のｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、および／またはｈｐＲＮＡ分子を摂取し得る。これにより、植物保護効果がもたらされる。
【００４１】
本発明の技術の一実施形態は、遺伝子操作された微生物による感染を介して、阻害性ＲＮＡ分子を標的植物細胞に導入するための系および方法を含み得る。一実施形態では、本発明は、植物細胞内で１つ以上の阻害性ＲＮＡ分子を発現し得る、細菌、真菌、さらにはウイルスなどの遺伝子操作された微生物を提供し得る。ある実施形態では、こうした阻害性ＲＮＡ分子は、生物学的プロセスを開始し得、そのプロセスにおいては、阻害性ＲＮＡ分子は、典型的には細胞内の特定の標的ｍＲＮＡ分子の破壊を引き起こすことによって、遺伝子の発現を阻害するか、またはノックダウンする。追加的実施形態では、植物の病因に必要な遺伝子を阻害する阻害性ＲＮＡ分子を植物系に導入し得る。こうした実施形態には、ウイルスコートタンパク質、真菌細胞壁遺伝子、ＤＮＡおよびＲＮＡの複製および産生に関与する遺伝子の抑制を標的とする固有の種特異的遺伝子配列、昆虫外骨格成分遺伝子、種特異的代謝遺伝子、ならびに草食動物を標的とし得る植物系への阻害性ＲＮＡ分子の導入を含み得る。
【００４２】
さらなる好ましい実施形態には、例えば、安定化タンパク質などの安定化因子の使用による、阻害性ＲＮＡ分子のための改善された送達系を含み得る。本発明の技術の別の好ましい実施形態には、ｓｍＲＮＡもしくはｄｓＲＮＡ前駆体安定化タンパク質またはｈｐＲＮＡ／ｄｓＲＮＡ細胞内輸送タンパク質のいずれかの共送達のいずれかによる植物細胞内での阻害性ＲＮＡ分子の伝達を促進するための改善された系を含み得る。一実施形態では、特定のＲＮＡモチーフをｄｓＲＮＡに組み込んでもよく、これにより、例えば、植物師部を介した伝達、または特定のエフェクター複合体への直接的なｓｍＲＮＡの添加が促進され得る。なおさらなる実施形態には、プロセシング酵素活性を有する特定のタンパク質をさらに共発現させ得る遺伝子構築物を含み得る遺伝子改変微生物を含み得る。
【００４３】
他の類似の実施形態には、阻害性ＲＮＡ分子の動員を増強し得るかつ／または病原経路を標的とし得る二次下流宿主遺伝子を活性化し得る様々な遺伝子を発現し得るまたは過剰発現さえし得る植物系への微生物の導入を含み得る。
【００４４】
本発明の好ましい一実施形態は、ｄｓＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｈｐＲＮＡ（いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡのヘアピンループに位置する標的生物由来のイントロンを含み得る）、ｓｉＲＮＡ、およびｍｉｃｒｏＲＮＡなど、阻害性ＲＮＡ分子を発現するようにさらに遺伝子操作され得る、葉および根の内生細菌および外生細菌を提供するものであり得る。阻害性ＲＮＡ分子は、病原体ゲノムと相同であり、また成長、生殖、代謝または病原性に関与する重要かつ必須の遺伝子を標的とする。これらの阻害性ＲＮＡ分子は、宿主のダイサー／ＲＩＳＣ複合体によって媒介される約２１〜２２ヌクレオチドのｓｉＲＮＡの生成を介して、植物ウイルス、真菌、および昆虫の病原体および有害生物におけるこれらの必須標的遺伝子の発現を不活性化し得、かつ／またはノックダウンし得る。このプロセスは、一般に、ＲＮＡ干渉またはＲＮＡｉと称され得る。
【００４５】
本明細書で使用される場合、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、特定の遺伝子の発現を妨げるために、例えばｈｐＲＮＡによってもたらされる二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子によって誘発される転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）をもたらす生物学的メカニズムである。例えば、好ましい一実施形態では、短いｈｐＲＮＡ分子を細胞質に直接インポートし、一緒にアニールしてｄｓＲＮＡを形成し、次いでダイサー酵素によって短い断片に切断することができるので、ＲＮＡ干渉を達成することができる。この酵素ダイサーによるｄｓＲＮＡのプロセシングが行われ、３’末端に２個のヌクレオチドオーバーハングを有する約２１〜２２ヌクレオチド断片、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）となり得る。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、エンドヌクレアーゼ−タンパク質複合体、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に特異的となり、その後、相同ＲＮＡを標的とし、特定の部位で相同ＲＮＡを分解し、結果として、タンパク質発現のノックダウンをもたらす。
【００４６】
ｈｐＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡおよびｍｉｃｒｏＲＮＡ種を植物に伝達し得る植物内生細菌としては、以下の亜門：アシドバクテリア、放線菌、アルファプロテオバクテリア、アルマティモナス、バクテロイデス、ベータプロテオバクテリア、デルタプロテオバクテリア、フィルミクテス、グラムプロテオバクテリア、ＴＭ７、バチルス、大腸菌などに含まれるものが挙げられる。好ましい一実施形態では、植物に感染するか、またはそうでなければ植物がコロニー形成し得るか、そうでなければ植物の表面の葉、茎または根に生息する、内生細菌、内部細菌（ｅｎｔｏｐｈｙｔｉｃ）、または任意の細菌を、阻害性ＲＮＡ分子を生成し得るプラスミドなどの人工的に作製した遺伝子構築物により形質転換し得る。こうしたプラスミドは、ある場合には広範囲の環境接種、ならびに一例として植物の子孫と植物物質を摂取する任意の有害生物または草食動物との間の垂直感染を可能にし得る抱合を介して、他の細菌に移入可能であるように構築され得る。
【００４７】
この実施形態では、こうした構築物は、プロモーター、ターミネーター、コアクチベーターおよびコリプレッサーなどの転写調節部分、ならびに原核生物系および真核生物系において調節され得る類似の制御エレメントを含み得る。そのような系では、系内で発現する阻害性ＲＮＡ分子の種類、タイミング、および量の制御が可能になり得る。追加的実施形態は、植物病原体に応答して生成されたストレス関連タンパク質、または植物病原体などによって生成されたタンパク質および他の前駆体化合物さえも含めて、植物細胞内における特定のタンパク質または化合物の存在など、外部要因によって誘導され得る遺伝子構築物を含み得る。
【００４８】
別の好ましい実施形態では、本発明の技術は、１つ以上の阻害性ＲＮＡ分子を生成する、遺伝的に形質転換された葉および根の内生細菌および外生細菌が、標的植物の系統および／または種に送達され得る系および方法を含み得、この系および方法では、阻害性ＲＮＡ分子が、標的ウイルス、真菌ならびに昆虫病原体および草食動物の発現を不活性化し、かつ／またはノックダウンし得る。ある実施形態では、１つの系統または特定の種にさえも特異的であることが知られている細菌などの微生物の選択も利用し得る。別の実施形態では、阻害性ＲＮＡ分子の転写活性化および促進は、１つの系統、または特定の植物もしくは草食動物種にさえも特異的であり得る特定の因子の存在に依存し得る。追加的実施形態は、表面タンパク質の発現または阻害、ならびに特定の植物系統またはさらに特定の植物種についてのインポート因子などの毒性因子の増加、ならびに、例えば、宿主植物細胞に免疫型防御を備えさせ得る細胞内宿主受容体によって認識され得る表面タンパク質または他の副産物タンパク質などの細菌因子の可能な阻害を含み得る。
【００４９】
別の好ましい実施形態では、本発明の技術は、病原体、ならびに１つ以上のタンパク質またはタンパク質複合体によってさらに安定化され得る種特異的阻害性ＲＮＡ分子の生物界間送達のための系および方法を含み得る。ある実施形態では、そのような安定化タンパク質としては、植物のＲＮＡサイレンシング応答を抑制する一助となり得る、植物ＲＮＡウイルス、トンブスウイルスから選択されるＰ１９タンパク質が挙げられ得る。ある実施形態では、例えば、Ｐ１９タンパク質は、典型的には二量体として、ｓｉＲＮＡを認識し、かつ結合し得る。この様式では、Ｐ１９タンパク質は、外因性であるか、または内因性であるかにかかわらず、ｓｉＲＮＡを隔離し得、その結果として、Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質への添加、およびＲＩＳＣ（ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体）の形成を妨げる。
【００５０】
別の好ましい実施形態では、本発明の技術は、植物師部を通る細菌性合成ＲＮＡの伝達を促進するために、ｄｓＲＮＡなどの阻害性ＲＮＡ分子にＲＮＡ動員モチーフを組み込むことを含み得、病原体および草食動物必須遺伝子の不活性化を標的とするＲＮＡ種とともに細菌中で共発現され得る。例えば、原形質連絡および師部は、直接的な細胞間コミュニケーションおよび植物全体への輸送を媒介する単純化したネットワークを形成する。選択された内因性ＲＮＡ、ウイルスＲＮＡは、このネットワークを介して特定の細胞または器官間の輸送を回避する。上記のように、好ましい一実施形態では、細胞境界における輸送を促進するために細胞因子と相互作用する配列／構造モチーフを含むように、阻害性ＲＮＡ分子を生成することができる。
【００５１】
特定の実施形態では、異なる配列／構造モチーフを発現する複数の阻害性ＲＮＡ分子を同時に発現させ得る。この実施形態では、異なる配列／構造モチーフにより、特定のモチーフの認識が可能になり得、これにより、複数の特定の細胞境界および／または細胞型において、阻害性ＲＮＡ分子の多方向輸送が可能になる。こうしたモチーフは、特定の系統および／または種内で特異的な活性または不活性を呈するようにさらに構成され得る。
【００５２】
本発明の技術のさらに別の実施形態は、活性抑制と一般に呼ばれる、ＲＮａｓｅＩＩＩ発現の低下、または不活性化されたＲＮａｓｅＩＩＩ機能もしくは活性を有する新規細菌株を開発することを含み得る。ＲＮＡａｓｅＩＩＩの発現および／または活性におけるこうした低下または不活性化は、ｄｓＲＮＡ種のより小さいＲＮＡ種へのＲＮａｓｅＩＩＩ媒介プロセシングを阻害し得るか、または減少させ得る。
【００５３】
追加的実施形態は、より小さいＲＮＡ種へのｄｓＲＮＡ種のプロセシングが増強されるように、ＲＮａｓｅＩＩＩを過剰発現する新規細菌株を含み得る。本発明の技術はまた、ウイルスおよび真菌の不活化を標的とする二次ｓｉＲＮＡの二次宿主（植物）ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ依存性発現を誘発するために、ウイルスｓｉＲＮＡをコードしているｄｓＲＮＡを細菌的に発現させる系および方法を開発することを含み得る。前述の系の各々は、プロモーター、ターミネーター、コアクチベーターおよびコリプレッサーなどの転写調節エレメント、ならびに原核生物系および真核生物系において調節され得る他の制御エレメントを含み得る遺伝子構築物において具体化され得る。こうした系は、系内で発現する、例えばＲＮＡａｓｅＩＩＩまたは他のタンパク質の種類、タイミングおよび量の制御を可能にし得る。追加的実施形態は、植物病原体に応答して生成されたストレス関連タンパク質、または植物病原体などによって生成されたタンパク質および他の前駆体化合物さえも含めて、植物細胞内における特定のタンパク質または化合物の存在など、外部要因によって誘導され得る遺伝子構築物を含み得る。
【００５４】
本発明の技術の別の実施形態は、ｓｉＲＮＡ動員を増強することが知られている遺伝子を有する植物宿主、外因性または遺伝的に改変された細菌株の過剰発現を促進するための系および方法を含み得る。例えば、表５〜８、および以下に示すように、以下のカラム１で同定された特定のタンパク質の過剰発現により、対象植物または他の系全体において、ｓｉＲＮＡ動員が増強され得る。
【００５５】
好ましい一実施形態では、本発明の技術の追加的実施形態は、病原体のゲノム／遺伝子と相同であるｈｐＲＮＡの生物界間送達および発現の新規系を含み得、かつ病原体の成長、代謝、または病原性などに必要な必須タンパク質のウイルス複製および翻訳を効率的に下方制御するか、または排除し得る。
【００５６】
本発明の技術の追加的実施形態は、植物の根、茎、葉および生殖器官に見出され得る組換え操作された内生細菌におけるｄｓＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡおよびｍｉｃｒｏＲＮＡなどの阻害性ＲＮＡ分子の生物界間送達および発現の新規系を含み得る。この実施形態では、本発明の技術は、ほんの数例を挙げると、例えば、寒冷、熱、塩、干ばつ、および非生物的ストレスの耐性の増強、ならびに昆虫／害虫／病原体の耐性など様々な植物種における新規形質の統合、ならびに栄養生産量の増加などを可能にし得る、標的遺伝子をノックダウンするための生物界をまたぐ様々なメカニズムを備え得る。
【００５７】
別の好ましい実施形態では、病原体タンパク質の抑制を標的とするヘアピンｄｓＲＮＡをコードしているプラスミドを保有する内生細菌のＲＮａｓｅＩＩＩ突然変異体は、病原体ゲノムにコードされた病原体遺伝子を発現する病原体に感染した植物において、タンパク質を抑制する。
【００５８】
好ましい一実施形態は、ｄｓＲＮＡの内生細菌送達、植物におけるｓｉＲＮＡへのプロセシング、および１つ以上の病原体にコードされた遺伝子の抑制を含む。別の好ましい実施形態では、ｄｓＲＮＡの内生細菌送達は、ヘアピンｄｓＲＮＡをコードしているプラスミドを保有し、病原体に感染した植物において、タンパク質を抑制し得る病原タンパク質の抑制を標的とするＲＮａｓｅＩＩＩを有さないか、またはＲＮａｓｅ  ＩＩＩが抑制されている細菌のＲＮａｓｅＩＩＩ突然変異体を含み得る。
【００５９】
本発明の一実施形態は、標的植物において自然にコロニー形成し得る１つ以上の遺伝子改変細菌を導入すること、本明細書に記載のＲＮＡ分子をコードまたは干渉することによってウイルス性および真菌性疾患などの植物病原体に対する植物の耐性を増強する方法を提供し、これにより、異種ＤＮＡを含む植物がｈｐＲＮＡなどの干渉ＲＮＡ分子を産生するようになり、かつ、干渉ＲＮＡ分子が標的植物病原体を死滅させるか、または標的植物の１つ以上の病原性もしくは重要遺伝子の発現を抑制するようになる。
【００６０】
別の実施形態は、ウイルス性疾患に対する植物の耐性を増強するための方法であって、標的ウイルス性疾患に対する植物の耐性が、標的ウイルス性疾患に対する野生型植物の耐性よりも大きい方法を提供する。別の実施形態は、有害生物に対する植物の耐性を増強する方法であって、標的有害生物に対する植物の耐性が、標的有害生物に対する野生型植物の耐性よりも大きい方法を提供する。別の実施形態は、草食動物に対する植物の耐性を増強する方法であって、標的草食動物に対する植物の耐性が、標的草食動物に対する野生型植物の耐性よりも大きい方法を提供する。
【００６１】
本発明者らが論証した別の実施形態は、病原体耐性植物の生成を含み得る。この好ましい実施形態では、宿主のＲＮＡｉ機構が病原体の必須ＲＮＡ転写物を標的とすることにより、結果として必須病原体のＲＮＡを分解することから、病原体の必須ｍＲＮＡをタンパク質に翻訳することができない。この実施形態では、病原体にコードされたタンパク質と相同であるヘアピンＲＮＡなどの阻害性ＲＮＡ分子の新規生物界間送達により、植物宿主のＲＮＡｉ防御を高めることで、植物宿主においてｓｍＲＮＡの生合成が誘発され、これにより、病原体にコードされたタンパク質の蓄積の喪失または減少がもたらされ、最終的には病原体感染に対する耐性が付与され得る。
【００６２】
本発明者らによって論証された別の実施形態は、ウイルス病原体耐性植物の生成を含み得る。この好ましい実施形態では、植物は、ウイルスにコードされた必須タンパク質と相同であるｈｐＲＮＡを産生する内生細菌に感染され得る。これらのｈｐＲＮＡ転写物は、宿主のＲＮＡｉ機構によってプロセシングされ得、結果として、必須ウイルスＲＮＡが分解されるために、ウイルス病原体の必須ｍＲＮＡがタンパク質に翻訳されない。この実施形態では、ウイルスにコードされたタンパク質と相同であるヘアピンＲＮＡなどの阻害性ＲＮＡ分子の新規生物界間送達により、植物宿主のＲＮＡｉ防御を高めることで、植物宿主において、ｓｍＲＮＡの生合成が誘発され、これにより、ウイルスにコードされた蓄積の喪失または減少がもたらされ、最終的には病原体感染に対する耐性が付与され得る。
【００６３】
一実施形態では、本発明は、植物細胞中で発現する病原体タンパク質の抑制を標的とするｈｐＲＮＡをコードしているプラスミドを発現する内生細菌としてのバチルスセレウス菌の使用を含み得る。一実施形態では、このバチルスセレウス株は、ＲＮａｓｅＩＩＩ欠失であるように遺伝子改変され得る。欠失とは、ＲＮａｓｅＩＩＩ発現の減少、またはＲＮａｓｅＩＩＩ機能の不活化を意味し得る。好ましい実施形態では、この株は本明細書に記載の株５３５２２を含み得る。
【００６４】
一実施形態では、本発明は、植物細胞中で発現する病原体タンパク質の抑制を標的とするｈｐＲＮＡをコードしているプラスミドを発現する内生細菌としての枯草菌の使用を含み得る。一実施形態では、この枯草菌株は、ＲＮａｓｅＩＩＩ欠失であるように遺伝子改変され得る。欠失は、ＲＮａｓｅＩＩＩ発現の減少、またはＲＮａｓｅＩＩＩ機能の不活性化を意味し得る。好ましい実施形態では、この株は、本明細書に記載の株ＣＣＢ４２２を含み得る。
【００６５】
一実施形態では、本発明は、植物細胞中で発現する病原体タンパク質の抑制を標的とするｈｐＲＮＡをコードしているプラスミドを発現する内生細菌としての大腸菌の使用を含み得る。一実施形態では、この株は、ＲＮａｓｅ欠失であるように遺伝子改変され得る。一実施形態では、この株は、天然であり得るか、または過胞形成遺伝子型／表現型を発現するように遺伝子改変され得る。好ましい実施形態では、この株は本明細書に記載の株ＨＴ２７を含み得る。
【００６６】
一実施形態では、本発明は、植物細胞中で発現する病原体タンパク質の抑制を標的とするｈｐＲＮＡをコードしているプラスミドを発現する内生細菌としてのＢａｓｃｉｌｌｉｓの使用を含み得る。一実施形態では、この株は、ＲＮａｓｅ欠失であるように遺伝子改変され得る。一実施形態では、この株は、天然であり得るか、または過胞形成遺伝子型／表現型を発現するように遺伝子改変され得る。好ましい実施形態では、この株は本明細書に記載の株ＨＴ２７を含み得る。
【００６７】
他のある実施形態では、これらの内生細菌株のうちの１つ以上によって生成されたｈｐＲＮＡは、最初の感染部位または導入部位から植物、葉、根または茎の至る所に移動し得る。他のある実施形態では、これらの内生細菌株のうちの１つ以上によって生成されたｈｐＲＮＡは、元の感染部位または導入部位から植物、葉、根または茎の至る所に移動し得、ならびに植物病原体移動／シグナルの移動を妨げ得る。
【００６８】
なおさらに別の実施形態は、標的植物においてコロニーを形成し、１つ以上の阻害性ＲＮＡ分子を送達して、１つ以上の植物病原体必須遺伝子を阻害し、かつ病原体耐性を高めるように構成された遺伝子改変細菌を含む組成物を含む。こうした方法は、感染の危険性がある植物または標的病原体に既に感染している植物の局所的処置として、本明細書に開示されるとおりである。
【００６９】
ある実施形態では、これには、ｄｓＲＮＡ産生、安定化、輸送および／または植物細胞へ、もしくは植物病原体が位置する場所への送達を増強する細菌株およびヘルパー遺伝子を使用することを含み得る。上記のように、細菌は、以下の複数の分泌系を発生させている：
【００７０】
Ｉ型分泌系（ＴＩＳＳ）は、大腸菌における溶血素分泌系によって例示され、グラム陰性菌の細胞エンベロープでの様々なサイズのタンパク質の通過を促進する単純な三者間系である。この系は、ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）トランスポーターまたはプロトンアンチポーター、内膜（ＩＭ）と外膜（ＯＭ）とを橋渡しするアダプタータンパク質、および外膜孔から構成されている。また、安定したペリプラズム中間体なく、単一のステップで基質を分泌する。ＴＩＳＳは、ＲＴＸ（Ｒｅｐｅａｔｓ−ｉｎ−ｔｏｘｉｎ）タンパク質ファミリー、細胞表層タンパク質、プロテアーゼ、リパーゼ、バクテリオシン、およびヘム獲得タンパク質に属する細胞毒素の分泌に関与している。
【００７１】
ＩＩ型分泌系（Ｔ２ＳＳ）は、転座のために二段階のメカニズムを使用する多成分装置である。第１のステップの間に、前駆体エフェクタータンパク質は、ＳｅｃトランスロコンまたはＴａｔ経路によって内膜を通って位置を変える。一旦ペリプラズムに入ると、エフェクタータンパク質はＴ２ＳＳによって外膜を通って位置を変える。Ｔ２ＳＳトランスロコンは、細菌膜である細胞質およびペリプラズムの両方に見出される１２〜１６個のタンパク質成分から構成されている。Ｔ２ＳＳは、ＩＶ型線毛アセンブリ装置との進化的関係を示している。
【００７２】
インジェクチソームとも呼ばれるＩＩＩ型分泌系（Ｔ３ＳＳ）は、単一ステップの分泌メカニズムを媒介するものであり、サルモネラ菌、シゲラ菌、エルシニア菌、腸管病原性大腸菌および腸管出血性大腸菌、ならびに緑膿菌など、多くの動植物病原体によって使用されている。Ｔ３ＳＳは、サルモネラエンテリカ亜種である、侵入型（Ｉｎｖ）およびＰｒｇタンパク質を使用するｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒチフス系により例示される（下図参照）。Ｔ３ＳＳは、Ｓｅｃ非依存様式で、エフェクタータンパク質を真核宿主細胞の細胞質に送達する。Ｔ３ＳＳは、遺伝的、構造的および機能的に細菌の鞭毛に関連している。それらは、細菌細胞エンベロープにおいて大きい超分子構造を形成する、２０を超える異なるタンパク質から構成される。
【００７３】
ＩＶ型分泌系は、グラム陰性菌およびグラム陽性菌内に見られる多用途系であり、単一のタンパク質からタンパク質−タンパク質およびタンパク質−ＤＮＡ複合体まで、幅広い範囲の基質を分泌する。これらの系は、アグロバクテリウムツメファシエンスＶｉｒＢ／Ｄ系により例示される。
【００７４】
Ｖ型分泌系（Ｔ５ＳＳ）には、自己輸送体およびツーパートナー分泌系が含まれる。Ｔ５ＳＳでは、２ステップで基質の位置を変える。髄膜炎菌由来のＮａｌＰなどの自己輸送体タンパク質は、Ｓｅｃ依存的プロセスにおいて、内膜で前駆体タンパク質として分泌されるマルチドメインタンパク質である。その後、タンパク質のトランスロケータードメインが外膜に挿入され、パッセンジャードメインの表面局在化を促進する。ＴＰＳでは、別個のトランスロケータータンパク質（ＴｐｓＢ）が、外膜を通るエフェクタータンパク質（ＴｐｓＡ）の分泌を媒介する。自己凝集、接着、浸潤、細胞傷害性、血清耐性、細胞間拡散およびタンパク質分解などの機能を有する７００以上のタンパク質が、単純な２ステッププロセスの間、これら２つの分泌系を使って内膜および外膜の両方を通過する。
【００７５】
ＶＩ型分泌系（Ｔ６ＳＳ）は、近年発見された分泌系であり、緑膿菌、腸管凝集性大腸菌、Ｓ．サルモネラ菌、コレラ菌、ペスト菌など、複数の病原体内に見られる。Ｔ６ＳＳは、１２〜２５のサブユニットから構成され得る多成分系である。
【００７６】
本発明の一実施形態は、植物宿主へのｄｓＲＮＡの送達を増強するために、細菌分泌系を活用することを含み得る。好ましい一実施形態では、本発明は、ｄｓＲＮＡを植物細胞に送達するために、細菌性ＩＶ型分泌系を増強するための系を含み得る。例えば、植物病原体アグロバクテリウムツメファシエンスは、ＩＶ型分泌系を用いて、ＶｉｒＤ２一本鎖ＤＮＡ複合体ならびにビルレンスタンパク質ＶｉｒＤ５、ＶｉｒＥ２、ＶｉｒＥ３、およびＶｉｒＦを宿主細胞に送達する。一実施形態は、ｄｓＲＮＡ結合タンパク質とＶｉｒタンパク質との融合を含み得、昆虫細胞へのｄｓＲＮＡの送達を促進し得る。
【００７７】
一実施形態では、本発明は、細胞に対してｄｓＲＮＡを送達するための細菌性ＶＩ型分泌系を増強するための系を含み得る。この好ましい実施形態では、細菌遺伝子ｙｆｇＬが過剰発現することで、ホスファチジルグリセロール（膜脂質）の合成および小胞生成および出芽を増強し得る。別の実施形態では、ｈｎｓ遺伝子（多くのビルレンス因子を調節する包括的な調節因子）の突然変異は、大腸菌小胞の産生の増加を引き起こし得る。別の実施形態では、ＬＰＳのＯ抗原側鎖を有さないサルモネラ菌および緑膿菌突然変異体もまた、小胞形成の増加を示す。
【００７８】
一実施形態では、本発明は、ｄｓＲＮＡの安定化および植物細胞への動員を増強するための系を含み得る。いくつかの実施形態は、これらに限定されないが、以下を含み得る：
−ヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＭＵＴ２）の共発現または過剰発現は、細胞間のＲＮＡの動員に必須である。
−ＳＵＭＯ化されたｈｎＲＮＰＡ２Ｂ  Ｉによって結合されているモチーフを有するｄｓＲＮＡ由来のｍｉｃｒｏＲＮＡは、Ｔ細胞から分泌される小胞に豊富に含まれていることが見出された。
−ＲＮＡが、ｍｉＲ−１２８９結合部位および配列モチーフ（ステムループ構造で提示されるＣＵＧＣＣ）を有する。
−ｍｉｃｒｏＲＮＡは、非鋳型３’ウリジル化を有する。
−細胞内の内因性ＲＮＡが、ｍｉＲＮＡの細胞外小胞への選別を調節することができる。
−Ａｇｏ２タンパク質が共発現または過剰発現する。
−細胞へのＲＮＡのインポートにおいて比較的十分に特徴が示された役割を有する４つの線虫タンパク質が同定された（Ｗｉｎｓｔｏｎら、２００２年）。−同じ遺伝子の追加的対立遺伝子が、他の２つのスクリーニング−摂食（摂食ＲＮＡｉ欠失）スクリーニング（Ｔｉｍｍｏｎｓら、２００３年）およびｒｓｄ（ＲＮＡｉ拡散欠失）スクリーニングで同定された。
−ｓｈＲＮＡの安定化および細胞への送達を促進するために、ブロモウイルスＰ１９タンパク質が共発現している。
−分泌エフェクタータンパク質とｄｓＲＮＡ結合タンパク質、例えばｄｓＲＮＡプロセシングに関与するＡｒｇｏｎａｕｔ（Ａｇｏ）タンパク質との間の融合タンパク質の発現により、ｓｈＲＮＡの安定化および宿主細胞への送達が促進される。
−以下の表５〜８において同定された任意の遺伝子が共発現、または過剰発現している。
−本明細書に記載の発明の一部として、下記表７に特定された株のいずれかを使用した。
【００７９】
なおさらに別の実施形態は、標的植物においてコロニーを形成し、１つ以上の阻害性ＲＮＡ分子を送達して、１つ以上の植物病原体必須遺伝子を阻害し、かつ病原体耐性を高めるように構成された遺伝子改変細菌を含む組成物を含む。こうした方法は、感染の危険性がある植物または標的病原体に既に感染している植物の空中処置として、本明細書に開示されるとおりである。好ましい実施形態では、この空中処置は、エアロゾル、液体または乾燥細菌または胞子の塗布を含み得る。
【００８０】
一実施形態では、植物は単子葉植物、または単子葉植物の細胞である。例えば、単子葉植物は、イネ科および穀類の群に属する。非限定的な例示的な単子葉植物種としては、穀物、熱帯果実および花、バナナ、トウモロコシ、イネ、オオムギ、ウキクサ、グラジオラス、サトウキビ、パイナップル、ナツメヤシ、オニオン、イネ、モロコシ、芝草およびコムギが挙げられる。
【００８１】
別の実施形態では、植物は、双子葉植物または単子葉植物の細胞である。例えば、双子葉植物は、ウルシ科（例えば、カシューナッツ、ピスタチオ）、キク科（例えば、アスターおよび他のすべての複合花）、アブラナ科（例えば、キャベツ、カブ、および他のマスタード）、サボテン科（例えば、サボテン）、ウリ科（例えば、スイカ、クワッシュ）、トウダイグサ科（例えば、キャッサバ（カサバ））、マメ科（例えば、豆および他のすべてのマメ科植物）、ブナ科（例えば、オーク）、ゲラニアール（例えば、ゼラニウム）、クルミ科（例えば、ペカン）、アマ科（例えば、亜麻）、アオイ科（例えば、綿）、モクセイ科（例えば、オリーブ、灰、ライラック）、バラ科（例えば、バラ、リンゴ、モモ、イチゴ、アーモンド）、アカネ科（例えば、コーヒー）、ミカン科（例えば、オレンジおよび他の柑橘類の果実）、ナス科（例えば、ジャガイモ、トマト、タバコ）、ツバキ科（例えば、茶）、およびブドウ科（例えば、ブドウ）からなる群から選択される。
【００８２】
用語「植物」または「標的植物」は、病原体に対して持続可能な任意の植物を含む。これには、植物全体、植物器官、植物全体または植物器官の子孫、胚、体細胞胚、胚様構造物、プロトコーム、プロトコーム様体（ＰＬＢ）、および植物細胞の懸濁液をさらに含む。植物器官は、例えば、苗条栄養器官／構造体（例えば、葉、茎および塊茎）、根、花および花器官／構造体（例えば、包葉、がく片、花弁、雄しべ、心皮、葯および胚珠）、種子（胚、胚乳、および種皮）、ならびに果実（成熟子房）、植物組織（例えば、維管束組織、基本組織など）、ならびに細胞（例えば、孔辺細胞、卵細胞、毛状突起など）である。本発明の方法で使用することができる植物のクラスは、一般に、本明細書に記載の分子生物学および植物育種技術に適した高等植物および低等植物、特に被子植物（単子葉（単子葉植物）および双子葉（双子葉植物））のクラスと同じくらい広い。このクラスの植物には、異数体、倍数体、二倍体、一倍体および半接合体など、様々な倍数性レベルの植物を含む。本明細書に記載の遺伝子改変植物は、モロコシ、トウモロコシ、コムギ、イネ、オオムギ、オーツムギ、ライムギ、キビ、およびライコムギなどの単子葉作物であり得る。本発明はまた、アサ科および他のアサ株、例えば一般にＣ．サティバを含み得る。
【００８３】
対象の追加の植物種の例としては、これらに限定されないが、トウモロコシ（トウモロコシ油）、アブラナ属（例えば、Ｂ、ｎａｐｕｓ、Ｂ．ｒａｐａ、Ｂ．ｊｕｎｃｅａ）、特に種子油の供給源として有用なアブラナ属の種、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ）、イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、ライ麦（Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ）、ソルガム［Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ、モロコシ属ｖｕｌｇａｒｅ）、キビ（例えば、パールミレット（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ  ｇｌａｕｃｕｍ）、ｐｒｏｓｏ  ｍｉｌｌｅｔ（Ｐａｎｉｃｕｍ  ｍｉｌｉａｃｅｕｍ）、アワ（Ｓｅｔａｒｉａ  ｉｔａｌｉｃａ）、シコクビエ（Ｅｌｅｕｓｉｎｅ  ｃｏｒａｃａｎａ）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ  ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ）、大豆（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、ピーナッツ（Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇａｅａ）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、サツマイモ（Ｉｐｏｍｏｅａ  ｂａｔａｔｕｓ）、カサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、コーヒー（コーヒー属）、ココナツ（Ｃｏｃｏｓ  ｎｕｃｉｆｅｒａ）、パイナップル（Ａｎａｎａｓ  ｃｏｍｏｓｕｓ）、ｃｉｔｒｕｓ  ｔｒｅｅｓ（柑橘類）、カカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ）、茶（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、バナナ（Ｍｕｓａ  ｓｐｐ．）、アボカド（Ｐｅｒｓｅａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）、イチジク（Ｆｉｃｕｓ  ｃａｓｉｃａ）、グアバ（Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｇｕａｊａｖａ）、マンゴ（Ｍａｎｇｉｆｅｒａ  ｉｎｄｉｃａ）、オリーブ（Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａ）、パパイヤ（Ｃａｒｉｃａ  ｐａｐａｙａ）、カシュー（Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ）、マカダミア（Ｍａｃａｄａｍｉａ  ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉｄ）、アーモンド（Ｐｒｕｎｕｓ  ａｍｙｇｄａｌｕｓ）、テンサイ（Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、サトウキビ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ  ｓｐｐ．）、オーツムギ、オオムギ；野菜、観賞植物、および針葉樹が挙げられる。野菜としては、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、レタス（例えば、  Ｌａｃｔｕｃａ  ｓａｔｉｖａ）、サヤマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、ライマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｌｉｍｅｎｓｉｓ）、エンドウ豆（Ｌａｔｈｙｒｕｓ  ｓｐｐ．）、およびｇｅｎｕｓキュウリ属のメンバー（キュウリ（Ｃ．ｓａｔｉｖｕｓ）、カンタロープ（Ｃ．ｃａｎｔａｌｕｐｅｎｓｉｓ）、およびマスクメロン（Ｃ．ｍｅｌｏ）など）が挙げられる。観葉植物としては、アザレア（ツツジ属）、アジサイ（Ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａｈｙｄｒａｎｇｅａ）、ハイビスカス（ブッソウゲ）、バラ（バラ科）、チューリップ（チューリップ属）、スイセン（スイセン属）、ペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａｈｙｂｒｉｄａ）、カーネーション（Ｄｉａｎｔｈｕｓｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ）、ポインセチア（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）、キクが挙げら���る。例えば、テーダマツ（Ｐｉｎｕｓ  ｔａｅｄａ）、スラッシュマツ（Ｐｉｎｕｓ  ｅｌｌｉｏｔｔｉｉ）、ポンデロサパイン（Ｐｉｎｕｓ  ｐｏｎｄｅｒｏｓａ）、ロッジポールパイン（Ｆｉｎｎｓ  ｃｏｎｔｏｒｔａ）、およびラジアータパイン（Ｍｏｎｔｅｒｅｙ  ｐｉｎｅ、Ｐｉｎｕｓ  ｒａｄｉａｔａ）などのマツ、ダグラスファー（ベイマツ（Ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａ  ｍｅｎｚｉｅｓｉｉ））、ウェスタンヘムロック（Ｔｓｕｇａ  ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）、シトカスプルース（Ｐｉｃｅａ  ｇｌａｕｃａ）、レッドウッド（Ｓｅｑｕｏｉａ  ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ）、シルバーファー（Ａｂｉｅｓ  ａｍａｂｉｌｉｓ）、およびバルサムファー（Ａｂｉｅｓ  ｂａｌｓａｍｅａ）などのｔｒｕｅ  ｆｉｒ、ならびにウエスタンレッドシダー（Ｔｈｕｊａ  ｐｌｉｃａｔａ）およびアラスカイエローシダー（Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ  ｎｏｏｔｋａｔｅｎｓｉｓ）などのシダーが挙げられる。特定の実施形態では、本発明の植物は、作物植物（例えば、上記のように、トウモロコシ、アルファルファ、ヒマワリ、アブラナ、ダイズ、ワタ、ベニバナ、ピーナッツ、モロコシ、コムギ、キビ、タバコなど）である。
【００８４】
「植物病原体」または「病原体」は、植物または植物成分に感染する生物（細菌、ウイルス、原生生物、藻類または真菌）を指す。例としては、植物または植物成分（例えば、果物、野菜、穀物、茎、根）に感染させるために、典型的には胞子を使用するカビ、真菌および腐敗が挙げられる。「植物病原体」はまた、植物における病原性もしくは病原性効果に必要なすべての遺伝子を含み、またはこれらの遺伝子が抑制されるか、もしくは排除されることによって、そのような効果が減少もしくは排除されることも含む。
【００８５】
好ましい一実施形態では、本発明は、一般に遺伝子標的と呼ばれる病原体遺伝子標的または必須遺伝子など、以下の非限定的な植物ウイルス群のうちの１つ以上に適用され得る。これらは、過度の実験をすることなく、当業者に認識され利用可能となるであろう。
2020511472.tif 000003
【００８６】
追加の植物病原体としては、カンキツトリステザウイルス、オオムギ黄萎ウイルス、ジャガイモ巻葉ウイルスおよびトマトブッシースタントウイルスが挙げられ得る。
【００８７】
好ましい一実施形態では、本発明は、一般に遺伝子標的と呼ばれる病原体遺伝子標的または必須遺伝子など、以下の非限定的な植物真菌病原体の群のうちの１つ以上に適用され得る。これらは、過度の実験をすることなく、当業者に認識され利用可能となるであろう： 
2020511472.tif 000004
【００８８】
細胞（好ましくは植物細胞）において発現している任意の遺伝子を標的とすることができる。細胞内に発現する遺伝子は、転写されてＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）および任意によりタンパク質を生じる遺伝子である。標的遺伝子は、内因性遺伝子または外因性もしくは外来遺伝子（すなわち、導入遺伝子または病原体遺伝子）であり得る。例えば、ウイルス送達構築物をゲノムへ組み込んだ結果、細胞のゲノム中に存在している導入遺伝子は、本発明による阻害性ＲＮＡを用いて調節することができる。外来遺伝子は、宿主ゲノム（好ましくは染色体ＤＮＡ）に組み込むことができるか、またはプラスミドもしくはコスミドなどの染色体外遺伝子構築物上に存在させ得る。例えば、標的遺伝子は、本明細書に記載の新規の生物界間法を介して干渉ＲＮＡが導入される細胞のゲノム中に存在し得るか、または、そのような生物または細胞に感染可能なウイルス、細菌、真菌または原生動物などの病原体のゲノム中に同様に存在し得る。
【００８９】
好ましくは、標的遺伝子は、細胞の内因性遺伝子、または病原体遺伝子など、細胞のゲノムに対して異種の遺伝子である。好ましくは、病原体の遺伝子は、真核生物に感染できる病原体に由来する。最も好ましくは、病原体は、上記のようにウイルス、細菌、真菌および線虫の群から選択される。本発明の阻害性ＲＮＡを植物に発現させることによって、植物遺伝子のみでなく、植物に感染するかまたは植物を食べる（食物または飼料として）生物の遺伝子も、遺伝子サイレンシングの標的遺伝子として機能し得る。したがって、標的遺伝子は、動物または植物病原体の遺伝子でもあり得る。標的遺伝子は、好ましくは、植物内の遺伝子または植物感染性病原体の遺伝子からなる群から選択される。好ましくは、標的遺伝子の発現（発現したＲＮＡまたはタンパク質により測定）は、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも３０％または４０％、好ましくは少なくとも５０％または６０％、より好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％または９５％または１００％減少、抑制または弱毒化される。
【００９０】
転写物またはタンパク質などの標的産物のレベルは、植物、有害生物または草食動物などの全生物において減少し得るか、または標的産物のこうした減少が、生物の１つ以上の特定の器官または組織に局在し得る。例えば、産物のレベルは、これらに限定するものではないが、根、塊茎、茎、葉、柄、果実、液果、殻果、樹皮、鞘、種子および花などの植物の組織および器官のうちの１つ以上において減少し得る。好ましい器官は、植物の種子である。植物中の遺伝子のほか、病原体、動物、またはさらにはヒトに感染するか、もしくは摂食する遺伝子もしくは植物など、本発明の方法を使用することによって、多種多様な標的遺伝子を調節することができる。好ましくは、標的遺伝子は、植物の内因性遺伝子、導入遺伝子、または植物感染性病原体由来の遺伝子からなる群から選択される。より好ましくは、植物感染性病原体は、ウイルス、真菌、細菌、昆虫、および線虫からなる群から選択される。
【００９１】
病原体の場合、標的遺伝子または必須遺伝子は、例えば、病原体の生存能力または増殖に必須であるハウスキーピング遺伝子または他の遺伝子であり得る。標的遺伝子の弱毒化またはサイレンシングは、様々な効果をもたらし得る（標的遺伝子の性質にもよる）。好ましくは、標的遺伝子をサイレンシングまたは弱毒化することは、病原体の有害な影響（すなわち病原性）の喪失または減少、または農業形質となる。農業形質は、好ましくは、病害耐性、除草剤耐性、生物的または非生物的ストレスに対する耐性、および改善された栄養価からなる群から選択され得る。これに関連して、標的遺伝子は、好ましくは、例えば、タンパク質、ペプチド、脂肪酸、脂質、ワックス、油、デンプン、糖、炭水化物、フレーバー、臭気、毒素、カロチノイド、ホルモン、ポリマー、フラビノイド、貯蔵タンパク質、フェノール酸、アルカロイド、リグニン、タンニン、セルロース、糖タンパク質、および糖脂質の合成および／または分解に関与する遺伝子からなる群から選択され得る。これらの配列はすべて当業者にはよく知られており、当業者であれば、ＤＮＡデータベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ）から容易に入手できる。
【００９２】
ある実施形態では、阻害性ＲＮＡ分子の新規の生物界間送達、すなわち本発明の方法および手段は、真核細胞または生物、特に植物細胞、および植物において病原体（例えばウイルスまたは線虫）耐性を得るのに特に好適であり得る。宿主生物（例えば、植物）中での転写によって産生された阻害性ＲＮＡ分子（またはそれらに由来するｄｓＲＮＡ分子）は、全生物において全身に広がり得ることが予想される。従って、本発明の遺伝子を含むトランスジェニック株に移植された植物の非トランスジェニック移植片の細胞における核酸の表現型発現を減少させること（またはその逆）が可能であり、園芸、ブドウ栽培、または果物の生産において重要であり得る方法である。クモ類、真菌、昆虫、線虫、原生動物、ウイルス、細菌および病害などの植物病原体に対する耐性は、成長、生存、特定の発達段階（例えば蛹化）、または特定の病原体の増殖に必須である遺伝子の遺伝子発現を減少させることによって得られる。好適な減少は、上記のステップの完全な阻害となり得るが、１つ以上のステップの遅延ともなり得る。これは、例えば病原体が侵入できるようにする植物遺伝子を含み得るが、病原体相同遺伝子でもあり得る。好ましくは、阻害性ＲＮＡ（例えば、ｈｐＲＮＡまたはそれに由来するｄｓＲＮＡ）は、病原体の遺伝子に対するものである。例えば、植物は、上記の剤の好適な配合物で処置すること、例えば噴霧または散粉することができるが、植物自体はまた、トランスジェニック生物の形態の剤を含み得、それらを病原体に、例えば胃の毒の形態で受け継いでもよい。様々な病原体の種々の必須遺伝子が当業者に公知である（例えば、線虫耐性については、特許文献１、特許文献２）。
【００９３】
本明細書に記載の阻害性ＲＮＡ分子の新規生物界間送達の方法の別の態様は、抑制のための標的遺伝子が、植物病原体（例えば、昆虫または線虫）中のタンパク質をコードする方法を提供する。この態様では、方法は、少なくとも１つのｄｓＲＮＡ分子を形成する、ｈｐＲＮＡなどの阻害性ＲＮＡに転写されるプラスミドなどのＤＮＡを含む核酸構築物を、病原体標的植物のゲノムに導入することを含み、これは、病原体（例えば、昆虫または線虫）が植物由来の細胞を摂取するかまたは感染させるとき、病原体内の標的遺伝子の発現を減少させるのに有効である。好ましい実施形態では、遺伝子抑制は病原体にとって致命的である。まだ他に記載されていない範囲において、病原体として最も好ましいのは、ジャガイモ疫病菌（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｎｉｖａｌｅ、ムギ類赤カビ病、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ、フザリウムオキシスポラム、オオムギうどんこ病菌、イネいもち病菌（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ）、菌核硬化症、敗血症、コムギ葉枯病、アブラナ科黒斑病菌（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、根朽病（Ｐｈｏｍａ  ｌｉｎｇａｍ）、ジャガイモシストセンチュウ（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ  ｒｏｓｔｏｃｈｉｅｎｓｉｓ）、ジャガイモシロシストセンチュウ（Ｇ．ｐａｌｌｉｄａ）、テンサイシストセンチュウ（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ  ｓｃｈａｃｈｔｉｉ）、ムギシストセンチュウ（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ  ａｖｅｎａｅ）、ナミクキセンチュウ（Ｄｉｔｙｌｅｎｃｈｕｓ  ｄｉｐｓａｃｉ）、コムギツブセンチュウ（Ａｎｇｕｍａ  ｔｒｉｔｉｃｉ）、およびキタネコブセンチュウ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ  ｈａｐｌａ）などの線虫の真菌病原体である。
【００９４】
病原性ウイルスに対する耐性は、例えば、ウイルスコートタンパク質、ウイルスレプリカーゼ、ウイルスプロテアーゼ、構造タンパク質、毒素などの発現を減少させることによって得ることができる。多数の植物ウイルス、および好適な標的遺伝子が当業者に知られている。本発明の方法および組成物は、線虫耐性植物を得るのに特に有用である（標的遺伝子については、例えば、特許文献１、特許文献２、特許文献３を参照されたい）。
【００９５】
また、本発明により提供されるのは、病原体耐性生物、特に植物を得るための方法であって、本方法は、本発明の阻害性ＲＮＡ分子を生物の細胞に提供するステップを含み、阻害性ＲＮＡ分子は、真核細胞中に、少なくとも部分的に二本鎖のＲＮＡ分子を提供することができる。阻害性ＲＮＡ分子は、ａ）病原体の少なくとも１つの遺伝子の標的ヌクレオチド配列の少なくとも一部と実質的に同一である、少なくとも１つの第１のリボヌクレオチド配列、ｂ）第１のヌクレオチド配列に実質的に相補的であり、かつ第１のヌクレオチド配列にハイブリダイズして、二本鎖ＲＮＡ構造を形成することができる、少なくとも１つの第２のリボヌクレオチド配列、およびｃ）少なくとも１つの除去可能なＲＮＡエレメントを含む、第１のリボヌクレオチド配列と第２のリボヌクレオチド配列との間に位置する、少なくとも１つの第３のリボヌクレオチド配列を含み、これらは、真核細胞のＲＮＡプロセシングメカニズムによって、それぞれ、第１および第２のリボヌクレオチド配列を含む得られた配列を、その後共有結合させることなく除去され得る。好ましくは、第１のリボヌクレオチド配列は、病原体のゲノムのヌクレオチド配列の少なくとも一部分と、６５〜１００％の配列同一性、好ましくは７５〜１００％の配列同一性、さらに好ましくは８５〜１００％の配列同一性、最も好ましくは９５〜１００％の配列同一性を有する。より好ましくは、病原体は、ウイルス、細菌、真菌、および線虫の群から選択される。
【００９６】
本発明は、遺伝子改変細菌を産生することを伴い、かつ組換えＤＮＡ技術を伴うため、本発明の説明を助けるために以下の定義を提供する。本明細書で使用される「単離された」、「精製された」、または「生物学的に純粋な」という用語は、その天然状態で材料に通常付随しているか、または材料が製造されるときに、成分を実質的にまたは本質的に含まない材料を指す。例示的な実施形態では、純度および均一性は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学技術を用いて決定される。調製物中に存在する優勢な種である核酸または特定の細菌は、実質的に精製されている。例示的な実施形態では、「精製された」という用語は、電気泳動ゲルにおいて本質的に１つのバンドが生じる核酸またはタンパク質を指す。典型的には、単離された核酸またはタンパク質は、範囲として表される純度レベルを有する。成分の純度範囲の下限は、約６０％、約７０％、または約８０％であり、純度範囲の上限は、約７０％、約８０％、約９０％、または約９０％以上である。
【００９７】
用語（植物との）「接触」：本明細書で使用されるとき、核酸分子に関して、生物（例えば、植物または有害生物または草食動物）との「接触」または生物による「摂取」という用語は、核酸分子の生物への内在化を含み、例えば、これらに限定されないが、生物による分子の摂取（例えば、摂食による）、核酸分子を含む組成物と生物を接触させること、核酸分子を含む溶液に生物を浸漬させること、核酸分子を含む組成物を生物に注射すること、および核酸分子を含むエアロゾル組成物を生物に噴霧することが挙げられる。
【００９８】
本明細書で使用される用語「発現」、または「コーディング配列の発現」（例えば、遺伝子または導入遺伝子）は、核酸転写単位（例えば、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡなど）のコードされた情報が、細胞の機能的、非機能的または構造的部分に変換されるプロセス（多くの場合、タンパク質の合成など）を指す。遺伝子発現は、例えば、遺伝子発現を増減させる剤に対する細胞、組織、または生物の曝露のための外部シグナルの影響を受けることができる。遺伝子の発現はまた、ＤＮＡからＲＮＡ、そしてタンパク質への経路のいずれにおいても調節することができる。遺伝子発現の調節は、例えば、転写、翻訳、ＲＮＡ輸送およびプロセシング、ｍＲＮＡなどの中間分子の分解に作用する制御を介して、あるいはそれらが作製された後か、またはそれらの組み合わせによる、特定のタンパク質分子の活性化、不活性化、区画化、または分解を介して生じる。遺伝子発現は、これらに限定されないが、ノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、ウエスタンブロット、またはインビトロ、インサイチュ、もしくはインビボタンパク質活性アッセイなど、当技術分野において公知の任意の方法によってＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルにおいて測定することができる。
【００９９】
用語「核酸」または「核酸分子」としては、一本鎖および二本鎖形態のＤＮＡ、一本鎖形態のＲＮＡ、および二本鎖形態のＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が挙げられる。用語「ヌクレオチド配列」または「核酸配列」は、個々の一本鎖または二本鎖のいずれかとしての核酸のセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を指す。用語「リボ核酸」（ＲＮＡ）は、ｌＲＮＡ（阻害性ＲＮＡ）、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）、ｈｐＲＮＡ（ヘアピンＲＮＡ）、ｔＲＮＡ（トランスファーＲＮＡ）対応するアシル化アミノ酸で帯電しているか否かにかかわらず）、およびｃＲＮＡ（相補的ＲＮＡ）を含む。用語「デオキシリボ核酸」（ＤＮＡ）は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを含む。用語「核酸セグメント」および「ヌクレオチド配列セグメント」、またはより一般的には「セグメント」は、ゲノム配列、リボソームＲＮＡ配列、トランスファーＲＮＡ配列、メッセンジャーＲＮＡ配列、オペロン配列、ならびにペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードしているか、またはコードするように適合され得る、より小さい遺伝子操作されたヌクレオチド配列を双方とも含む機能的用語として当業者によって理解されるだろう。
【０１００】
本明細書で使用される「ヘアピンＲＮＡ」（ｈｐＲＮＡ）は、任意の自己アニーリング二本鎖ＲＮＡ分子を指す。最も単純な表現では、ヘアピンＲＮＡは、一本鎖ＲＮＡループによって連結された、アニーリングＲＮＡ鎖によって構成されている二本鎖ステムからなり、「パンハンドルＲＮＡ」とも呼ばれる。しかし、「ヘアピンＲＮＡ」という用語はまた、自己アニーリング二本鎖ＲＮＡ配列、ならびに内部バルジおよびループも含む、より複雑な二次ＲＮＡ構造を包含することを意図している。適合する特定の二次構造は、ＲＮＡ分子の自由エネルギーによって決定され、またＦＯＬＤＲＮＡなどの適切なソフトウェアを使用して様々な状況について、予測され得る（非特許文献７６、非特許文献７７）。
【０１０１】
本発明のさらなる他の実施形態では、ＲＮＡｉによる１つ以上の植物病原体遺伝子産物の発現の阻害は、ヘアピンＲＮＡ（ｈｐＲＮＡ）干渉またはイントロン含有ヘアピンＲＮＡ（ｉｈｐＲＮＡ）干渉によって得られ得る。ｈｐＲＮＡ干渉のために、発現カセットが、それ自体とハイブリダイズして、一本鎖ループ領域および塩基対ステムを含むヘアピン構造を形成するＲＮＡ分子を発現させるように設計されている。塩基対ステム領域は、発現が阻害される遺伝子産物をコードしている内因性メッセンジャーＲＮＡの全部または一部に対応するセンス配列、この場合、本明細書に記載のシトクロムＰ４５０ポリペプチド、およびセンス配列とすべてがまたは部分的に相補的であるアンチセンス配列を含む。あるいは、塩基対形成ステム領域は、阻害される標的ポリペプチドをコードしている遺伝子の発現を制御するプロモーター配列の一部に対応し得る。したがって、分子の塩基対ステム領域により、一般に、ＲＮＡ干渉の特異性が決定する。ｈｐＲＮＡ分子は、内因性遺伝子の発現の阻害時に非常に効率的であり、これらの分子によって誘発されるＲＮＡ干渉は、その後の世代の植物によって受け継がれる。例えば、非特許文献７８、非特許文献７９、および非特許文献８０を参照されたい。ｈｐＲＮＡ干渉を用いて遺伝子の発現を阻害またはサイレンシングするための方法は、例えば、非特許文献７８、非特許文献７９、非特許文献８０、非特許文献８１、および特許文献４に記載されており、これらのそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれる。インビボにおける遺伝子発現のサイレンシングのためのｈｐＲＮＡ構築物の効率についての一過性アッセイは、非特許文献８２に記載されており、本明細書において、参考として援用される。
【０１０２】
ｉｈｐＲＮＡについては、干渉分子は、ｈｐＲＮＡと同じ一般構造を有するが、ＲＮＡ分子は、ｉｈｐＲＮＡが発現する細胞内でスプライスされ得るイントロンを追加として含む。イントロンを使用することで、スプライシング後のヘアピンＲＮＡ分子中のループのサイズが最小になり、これにより、干渉の効率が上昇する。例えば、非特許文献１８を参照されたい。実際には、Ｓｍｉｔｈらは、ｉｈｐＲＮＡ媒介干渉を用いることで、内因性遺伝子の発現が１００％抑制されることを示している。内因性植物遺伝子の発現を阻害するためにｉｈｐＲＮＡ干渉を使用するための方法は、例えば、非特許文献１８、非特許文献８０、非特許文献８３、非特許文献８４、非特許文献８５、および特許文献５に記載され、それぞれ、参照により本明細書に組み入れられる。
【０１０３】
本明細書で使用されるとき、オンオリゴヌクレオチドは短い核酸ポリマーである。オリゴヌクレオチドは、より長い核酸セグメントの切断によって、または個々のヌクレオチド前駆体を重合することによって形成され得る。自動合成装置により、長さが数百塩基対までのオリゴヌクレオチドの合成が可能になる。オリゴヌクレオチドは、相補的ヌクレオチド配列に結合し得るので、ＤＮＡまたはＲＮＡを検出するためのプローブとして使用され得る。ＤＮＡ（オリゴデオキシリボヌクレオチド）から構成されるオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ（ＤＮＡ配列およびＲＮＡ（ｃＤＮＡに逆転写される）配列を増幅するための技術）において使用され得る。ＰＣＲにおいて、オリゴヌクレオチドは、典型的には「プライマー」と呼ばれ、ＤＮＡポリメラーゼによりオリゴヌクレオチドが伸長し、相補鎖を複製できるようになる。
【０１０４】
「遺伝子」または「配列」という用語は、何らかの様式で遺伝子産物（例えば、ポリペプチドまたは機能的ＲＮＡ）の発現を調節できる適切な調節配列に作動可能に連結されたコーディング領域を指す。遺伝子は、コーディング領域（オープンリーディングフレーム、ＯＲＦ）の前（上流）および後（下流）に、ＤＮＡの非翻訳調節領域（例えば、プロモーター、エンハンサー、リプレッサーなど）、ならびに、該当する場合、個々のコーディング領域（すなわちエキソン）間の介在配列（すなわちイントロン）を含む。本明細書で使用される「構造遺伝子」という用語は、ｍＲＮＡに転写され、次いで、特定のポリペプチドを特徴とするアミノ酸の配列に翻訳されるＤＮＡ配列を意味することを意図している。
【０１０５】
核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド結合および／または天然に存在しないヌクレオチド結合によって一緒に連結された天然に存在するヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドのいずれかまたは両方を含み得る。当業者には容易に理解されるように、核酸分子は化学的または生化学的に修飾され得るか、または非天然もしくは誘導体化ヌクレオチド塩基を含み得る。こうした修飾としては、例えば、標識、メチル化、類似体による天然に存在するヌクレオチドのうちの１つ以上の置換、ヌクレオチド間修飾（例えば、非荷電結合：例えば、メチルホスホネート、リン酸トリエステル、ホスホルアミダート、カルバマートなど）、荷電結合：例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど、ペンダント部分：例えばペプチド、インターカレーター：例えば、アクリジン、ソラレンなど、キレート剤、アルキル化剤、および修飾結合：例えば、アルファアノマー核酸など）が挙げられる。用語「核酸分子」はまた、一本鎖、二本鎖、部分的二本鎖、三本鎖、ヘアピン型、円形、および錠型（ｐａｄｌｏｃｋｅｄ）立体配座など、任意のトポロジー的立体配座を含む。
【０１０６】
本明細書でＤＮＡに関して使用される場合、用語「コーディング配列」、「構造ヌクレオチド配列」、または「構造核酸分子」は、適切な調節配列の制御下に置かれたとき、転写およびｍＲＮＡを介してポリペプチドに最終的に翻訳されるヌクレオチド配列を指す。ＲＮＡに関して、用語「コーディング配列」は、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳されるヌクレオチド配列を指す。コーディング配列の境界は、５’末端での翻訳開始コドンおよび３’末端での翻訳終止コドンによって決定される。コーディング配列としては、これらに限定されないが、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＥＳＴ、および組換えヌクレオチド配列が挙げられる。
【０１０７】
本明細書で使用されるとき、用語「ゲノム」とは、細胞の核内に見出される染色体ＤＮＡを指し、また細胞の細胞成分内に見出されるオルガネラＤＮＡを指す。細菌に適用される場合の「ゲノム」という用語は、細菌細胞内の染色体およびプラスミドの両方を指す。本発明のいくつかの実施形態では、ＤＮＡ分子が細菌のゲノムに組み込まれるように、ＤＮＡ分子が細菌に導入され得る。これらのおよびさらなる実施形態では、ＤＮＡ分子は、染色体に組み込まれているか、または安定なプラスミドとしてもしくはその中に位置し得る。
【０１０８】
２つの核酸またはポリペプチド配列の文脈において本明細書で使用される「配列同一性」または「同一性」という用語は、指定された比較ウィンドウにおいて最大対応するように整列されたときに同一である、２つの配列中の残基を指す。
【０１０９】
本明細書で使用される場合、用語「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウィンドウにおいて２つの最適に整列させた配列（例えば、核酸配列）を比較することによって決定される値を指し得る。比較ウィンドウの配列の一部分は、２つの配列の最適アラインメントのための参照配列（付加または欠失を含まない）と比較したときの付加または欠失（すなわちギャップ）を含み得る。パーセンテージは、一致している位置の数を得るために、両方の配列において同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が生じる位置の数を決定し、その一致している位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で割り、その結果に１００を掛けることによって計算し、配列同一性のパーセンテージを求める。参照配列と比較して、あらゆる位置で同一である配列は、参照配列と１００％同一であると言われ、その逆もまた同様である。
【０１１０】
比較のために配列を整列させるための方法は、当技術分野において周知である。様々なプログラムおよびアラインメントアルゴリズムは、例えば、非特許文献８６、非特許文献８７、非特許文献８８、非特許文献８９、非特許文献９０、非特許文献９１、非特許文献９２、非特許文献９３、非特許文献９４に記載されている。配列アラインメント方法および相同性計算に関する詳細な考察は、例えば、非特許文献９５に見出すことができる。国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）基本局所アラインメント検索ツール（ＢＬＡＳＴ；Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０年））は、いくつかの配列分析プログラムに関連して使用するために、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．）など、いくつかの情報源から、およびインターネットにより入手可能である。このプログラムを使用する配列同一性の決定方法に関する説明は、インターネット上において、ＢＬＡＳＴ（登録商標）の「ヘルプ」セクションにおいて利用可能である。核酸配列の比較のために、ＢＬＡＳＴ（登録商標）（Ｂｌａｓｔｎ）プログラムの「Ｂｌａｓｔ２配列」機能は、デフォルトパラメータに設定されたデフォルトＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスを用いて、使用され得る。参照配列に対してさらに高い類似性を有する核酸配列は、この方法により評価したときに、高い同一性パーセンテージを示す。
【０１１１】
本明細書で使用される場合、用語「ハイブリダイズ可能」および「相補的」は、安定かつ特異的な結合が核酸分子と標的核酸分子との間で生じるように、十分な程度の相補性を示す用語である。２つの核酸分子間のハイブリダイゼーションは、２つの核酸分子の核酸配列間における逆平行アラインメントの形成を伴う。次いで、２つの分子は、反対鎖上の対応する塩基と水素結合を形成して二本鎖分子を形成することができ、それが十分に安定である場合、当技術分野において周知の方法を用いて検出可能である。核酸分子は、特異的にハイブリダイズ可能であるために、その標的配列に対して１００％相補的である必要はない。しかし、ハイブリダイゼーションが特異的であるように存在する必要のある配列相補性の量は、使用されるハイブリダイゼーション条件に対応しており、かつ５０％〜１００％の間であり得る。
【０１１２】
本明細書で使用される場合、近接核酸配列に関して用語「相同である」とは、適切な条件下で参照核酸配列とハイブリダイズする近接ヌクレオチド配列を指す。例えば、相同配列は、約７０％〜１００、またはより一般的には８０％〜１００％の配列同一性、例えば、約８１％；約８２％；約８３％；約８４％；約８５％；約８６％；約８７％；約８８％；約８９％；約９０％；約９１％；約９２％；約９３％；約９４％約９５％；約９６％；約９７％；約９８％；約９８．５％；約９９％；約９９．５％；および約１００％の配列同一性を有し得る。実質的な相同性の性質は、特異的ハイブリダイゼーションと密接に関連している。例えば、核酸分子は、特異的結合が所望される条件下、例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、非標的配列への核酸の非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性がある場合に、特異的にハイブリダイズ可能である。
【０１１３】
「作動可能に連結された」という用語は、調節配列およびコーディング配列に関して使用される場合、その調節配列が、連結されたコーディング配列の発現に影響を与えることを意味する。「調節配列」または「制御エレメント」は、転写のタイミングおよびレベル／量、ＲＮＡプロセシングもしくは安定性、または関連するコーディング配列の翻訳に影響を与えるヌクレオチド配列を指す。調節配列としては、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、エンハンサー、ステムループ構造、リプレッサー結合配列、終止配列、ポリアデニル化認識配列などが挙げられ得る。特定の調節配列は、それに作動可能に連結されているコーディング配列の上流および／または下流に位置し得る。また、コーディング配列に作動可能に連結された特定の調節配列は、二本鎖核酸分子の関連相補鎖に位置し得る。
【０１１４】
本明細書で使用される場合、用語「プロモーター」とは、転写の開始から上流にあり得、かつ転写を開始するためのＲＮＡポリメラーゼおよび他のタンパク質の認識および結合に関与し得る、ＤＮＡの領域を指す。プロモーターは、細胞内での発現のためのコーディング配列に作動可能に連結され得るか、またはプロモーターは、細胞内での発現のためのコーディング配列に作動可能に連結され得るシグナル配列をコードしているヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る。「植物プロモーター」は、植物細胞内で転写を開始することができるプロモーターであり得る。発生制御下のプロモーターの例としては、葉、根、種子、繊維、木部血管、仮導管、または厚膜組織などの特定の組織において、優先的に転写を開始するプロモーターが挙げられる。こうしたプロモーターは、「組織優先的（ｔｉｓｓｕｅ−ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）」と称される。特定の組織においてのみ転写を開始するプロモーターは、「組織特異的」と称される。「細胞型特異的」プロモーターは、１つ以上の器官、例えば根または葉内の血管細胞における特定の細胞型における発現を主に行う。「誘導性」プロモーターは、環境制御下にあり得るプロモーターであり得る。誘導性プロモーターが転写を開始し得る環境条件の例としては、嫌気性条件および光が存在することが挙げられる。組織特異的プロモーター、組織優先的プロモーター、細胞型特異的プロモーター、および誘導性プロモーターは、「非構成的」プロモーターのクラスを構成する。「構成的」プロモーターは、ほとんどの環境条件下で、またはほとんどの細胞型もしくは組織型において活性であり得るプロモーターである。
【０１１５】
本発明のいくつかの実施形態では、任意の誘導性プロモーターを使用することができる。非特許文献９６を参照されたい。誘導性プロモーターを用いると、誘導剤に応答して転写速度が増す。例示的な誘導性プロモーターとしては、これらに限定されないが、銅に応答するＡＣＥＩ系由来のプロモーター；ベンゼンスルホンアミド系除草剤解毒剤に応答するトウモロコシ由来のＩｎ２遺伝子；Ｔｎ１０由来のＴｅｔリプレッサー；およびステロイドホルモン遺伝子由来の誘導性プロモーターが挙げられ、グルココルチコステロイドホルモンにより誘導され得る転写活性は、一般的な例である（非特許文献９７）。
【０１１６】
本明細書で使用されるとき、用語「形質転換」または「遺伝子改変」とは、１つ以上の核酸分子の細胞への移入を指す。核酸分子が細菌によって安定に複製されるようになると、微生物は、細菌に導入された核酸分子によって「形質転換」されるか、または「遺伝子改変」される。本明細書で使用される場合、用語「形質転換」または「遺伝子改変」とは、核酸分子を細菌などに導入し得るすべての技術を包含する。
【０１１７】
「ベクター」という用語は、それによってＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、またはポリペプチドを宿主に導入することができるいくつかの手段を指す。宿主に導入されるポリヌクレオチド、タンパク質、およびポリペプチドは、本質的に治療用または予防用であり得、抗原をコードしているか、または抗原であり得、本質的に調節性であり得る。ウイルス、プラスミド、バクテリオファージ、コスミド、および細菌など、様々な種類のベクターが存在する。
【０１１８】
「発現ベクター」は、選択された宿主細胞または生物において複製できる核酸である。発現ベクターは、自律構造体として複製することができ、あるいは全体的または部分的に宿主細胞の染色体または細胞小器官の核酸に組み込むことができ、あるいは外来ＤＮＡを細胞に送達するためのシャトルとして使用され、このため、宿主細胞ゲノムと共に複製する。したがって、発現ベクターは、選択された宿主細胞、オルガネラ、または生物体（例えばプラスミド、ウイルス、人工染色体、核酸断片、および発現ベクター上の特定の遺伝子（目的遺伝子を含む）が、細胞、細胞器官または生物内のポリペプチドまたはタンパク質に転写され、翻訳されるもの）、または「発現カセット」を含む、当技術分野において公知の任意の好適な構築物を複製可能なポリヌクレオチドである。対照的に、本明細書の実施例に記載されるように、「カセット」は、本発明の発現ベクターの一部位を含むポリヌクレオチドである。カセットの使用は、発現ベクターの集合を助ける。発現ベクターは、プラスミド、ファージ、ウイルス、キメラウイルス、またはコスミドなどのレプリコンであり、発現制御配列（複数可）に作動可能に連結された所望のポリヌクレオチド配列を含む。
【０１１９】
ポリヌクレオチド配列は、発現制御配列がそのポリヌクレオチド配列の転写および／または翻訳を制御し、かつ調節するときに、発現制御配列（複数可）（例えば、プロモーターおよび任意によりエンハンサー）に作動可能に連結される。
【０１２０】
他に示されていない限り、特定の核酸配列はまた、その保存的に改変された多様体（例えば、縮重コドン置換）、相補性（または相補的）配列、および逆相補的配列、ならびに明示的に示される配列を暗示的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つ以上の選択された（またはすべての）コドンの３位が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって達成され得る（例えば、非特許文献９８、非特許文献９９、および非特許文献１００を参照されたい）。核酸コドンの縮重のために、様々な異なるポリヌクレオチドを使用して、同一のポリペプチドをコードできる。下記の表３は、核酸コドンがコードするアミノ酸に関する情報を含む。
【０１２１】
表１ａ
2020511472.tif 000005
【０１２２】
市販されていないオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは、例えば非特許文献１０１によって最初に記載された固相ホスホルアミダイトトリエステル法に従って、または非特許文献１０２に記載の自動合成装置を用いて、化学合成することができる。オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドを合成するための他の方法は、当技術分野において公知である。オリゴヌクレオチドの精製は、天然アクリルアミドゲル電気泳動または陰イオン交換ＨＰＬＣのいずれかによる（非特許文献１０３に記載されている）。
【０１２３】
例えば、細胞、核酸、タンパク質、またはベクターに関して使用される場合の用語「組換え」は、細胞、生物、核酸、タンパク質、もしくはベクターが、異種核酸もしくはタンパク質の導入、または天然の核酸もしくはタンパク質の改変によって修飾されていること、または細胞がそのように修飾された細胞に由来することを示す。したがって、例えば、組換え細胞は、その細胞の天然（非組換え型または野生型）形態内には見られない遺伝子を発現するか、そうでなければ異常に発現するか、過剰発現するか、過小発現するか、またはまったく発現しない天然発現遺伝子を発現し得る。
【０１２４】
用語「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」および「約（ａｂｏｕｔ）」は、参照数量、レベル、値または量に対して、最大で３０％、または別の実施形態では最大で２０％、第３の実施形態では最大で１０％変動する数量、レベル、値または量を指す。本明細書で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないことを指示しない限り、複数の指示対象を含む。例えば、「細菌」という用語は、単一の細菌および複数の細菌の両方を含む。
【０１２５】
本明細書で使用される場合、「抑制」または「サイレンシング」または「阻害」は、野生型生物におけるその通常の発現レベルに対する、標的配列の産物の発現の下方制御を示すために同義的に使用される。抑制は、野生型発現レベルに対して、約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％減少する発現を含む。「有効量」は、結果として、植物病原体の抑制または阻害となるのに十分な阻害性ＲＮＡの量である。
【０１２６】
本明細書で使用される場合、核酸に関して「異種」は、外来種に由来するか、または合成的に設計されている核酸であるか、または同じ種に由来する場合、ヒトの慎重な介入による組成物および／またはゲノム遺伝子座において、その天然型から実質的に改変されている核酸である。異種タンパク質は、外来種に由来し得るか、または同じ種に由来する場合には、ヒトの慎重な介入によってその元の形態から実質的に改変されている。「宿主細胞」とは、導入された核酸構築物を含み、その構築物の複製および／または発現を支持する細胞を意味する。宿主細胞は、大腸菌などの原核細胞、または真菌、酵母、昆虫、両生類、線虫、または哺乳動物細胞などの真核細胞であり得る。あるいは、宿主細胞は、単子葉植物細胞または双子葉植物細胞である。単子葉植物宿主細胞の例は、トウモロコシ宿主細胞である。
【０１２７】
ポリヌクレオチド配列は、標的遺伝子の選択された領域に対して実質的な同一性、実質的な相同性、または実質的な相補性を有し得る。本明細書で使用される「実質的同一性」および「実質的相同性」は、互いに配列同一性または相同性を有する配列を示す。一般に、実質的に同一であるか、または実質的に相同である配列は、約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有し、パーセント配列同一性は、全配列に基づいており、既存のデフォルトパラメータ（ＧＣＧ、ＧＡＰバージョン１０、Ａｃｃｅｌｒｙｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して、ＧＡＰアラインメントによって決定される。ＧＡＰでは、非特許文献８７）のアルゴリズムを使用して、一致数が最大であり、かつ配列ギャップ数が最小である２つの完全な配列のアラインメントを見つける。１００％の同一性を有する配列は、同一である。「実質的相補性」とは、互いに相補的であり、かつ互いと塩基対合することができる配列を指す。相補的配列を記載する際に、第１の配列中のすべてのヌクレオチドが第２の配列に対して塩基対合する場合、これらの配列は完全に相補的である。
【実施例１】
【０１２８】
実施例１：緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を標的とするフォールドバックＲＮＡをコードしているヘアピン（ｈｐ）ＲＮＡ構築物をコードしている細菌プラスミドの構築を論証する。
【０１２９】
本発明者らによって論証したように、ｈｐＲＮＡコードプラスミドベクターは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．製のＮＥＢｕｉｌｄｅｒ（登録商標）ＨｉＦｉ  ＤＮＡアセンブリクローニングキットを用いて構築した。ここでは、例示的な実施形態として、ｐＪＬ−ＴＲＢＯ−Ｇから発現するｍＲＮＡをコードしている緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を標的とするように、７つのｈｐＲＮＡベクターを構築した（Ｌｉｎｄｂｏ  ２００７年）。
【０１３０】
これらのプラスミドのマップを以下の図７までに示す：ｐＡＤ−ＷＲＫＹ−ＧＨＹ１（図１）、ｐＡＤ−ＡＤＨ−ＧＨＹ２（図２）、ｐＯＸＢ−ＷＲＫＹ−ＧＨＹ３（図３）、ｐＯＸＢ−ＡＤＨ−ＧＨＹ４（図４）、ｐＡＤ−ＷＲＫＹ−ＧＨＹ５（図５）、ｐＡＤ−ＡＤＨ−ＧＨＹ６（図６）。ＴＭＶ移動タンパク質を用いて設計された１つのｈｐＲＮＡ：ｐＡＤ−ＷＲＫＹ−ＧＨＹ７（図７）は、ＰＪＬ−ＴＲＢＯ−Ｇ由来の運動タンパク質およびＧＦＰの両方を標的とするように構築した。太字の塩基は、重複配列である。イタリック体の塩基は、挿入配列である。
【０１３１】
上記７つのｈｐＲＮＡのうち、５つのシャトルベクターｐＡＤ−ＷＲＫＹ−ＧＨＹ１、ｐＡＤ−ＡＤＨ−ＧＨＹ２、ｐＡＤ−ＷＲＫＹ−ＧＨＹ５、ｐＡＤ−ＡＤＨ−ＧＨＹ６、およびｐＡＤ−ＷＲＫＹ−ＧＨＹ７は、本発明者らにより、ＸｂａＩ＋Ｎｓｉｌで消化させた骨格プラスミドｐＡＤ４３−２５（ＤｕｎｎおよびＨａｎｄｅｌｓｍａｎ  １９９９年）に対して、ＧＦＰセンス断片、介在イントロン、およびＧＦＰアンチセンス断片をライゲートすることによって構築された。ＸｂａＩで消化させたｐＳＦ−ＯＸＢ１９（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）の骨格プラスミドを用いて、２つのベクターｐＯＸＢ−ＷＲＫＹ−ＧＨＹ３およびｐＯＸＢ−ＡＤＨ−ＧＨＹ４を構築した。
【０１３２】
プラスミド中にｈｐＲＮＡ挿入物を構築するためおよびＤＮＡシーケンシングのために使用される例示的なプライマーは、以下の表１に示す。ｈｐＲＮＡのすべてのマップは、ＳｎａｐＧｅｎｅ（登録商標）ソフトウェアを用いて作成した。
【実施例２】
【０１３３】
実施例２：ＧＦＰ遺伝子標的のセンス鎖とアンチセンス鎖との間に介在するイントロンをコードしている細菌プラスミドの構築を論証する。
【０１３４】
１つのイントロンは、長さ２８７ｂｐのシロイヌナズナの推定ＷＲＫＹ型ＤＮＡ結合タンパク質からのものであり、プラスミドｐＪａｗｏｈＢ−ＲＮＡｉからクローニング（アクセッション番号Ｎｏ．ＡＦ４０４８５４）（表９：配列番号２６）したものである。
【０１３５】
別のイントロンは、本発明者らが、長さが５６６ｂｐのトウモロコシ種アルコールデヒドロゲナーゼイントロンＡｄｈｌから生成し、プラスミドｐＭＣＧ１６１（アクセッション番号ＡＹ５７２８３７（表９：配列番号２７〜２９）からクローニングしたものである。
【実施例３】
【０１３６】
実施例３：例示的なｈｐＲＮＡの構築および配列表を論証する。
【０１３７】
この実施形態では、以下の表１０に示す配列番号３０〜３６を含む例示的なｈｐＲＮＡが構築された。
【実施例４】
【０１３８】
実施例４：ｄｓＲＮＡ構築物の安定発現のためのＲＮａｓｅ１Ｈ突然変異細菌株の構築を論証する。
【０１３９】
この実施形態では、本発明者らは、ＲＮａｓｅＩＩＩ突然変異体を構築するために、例示的な大腸菌株ＪＭ１０９（ＤＥ３）を使用した（遺伝子型：ｅｎｄＡｌ、ｒｅｃＡｌ、ｇｙｒＡ９６ｔ  ｔｈｉ、ｈｓｄＢＡｌ（ｒＫ−、ｍｋ＋）、ｒｅｌＡ＼、ｓｕｐＥＡＡ、Ｘ−、Δ（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）［Ｆ‘、ｔｒｄＤ３６、ｐｒｏＡＢ、／ａｄｑＺ  ΔＭ１５］、１ＤＥ３．Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）。プラスミドｐＳＩＪ８から発現するＲｅｄ媒介相同組換え系を使用することによって、２つの大腸菌ＲＮａｓｅ１Ｈ突然変異体を作製した（Ｊｅｎｓｅｎら、２０１５年）。
【０１４０】
ＲＮａｓｅ１Ｈ変異体の設計は、大腸菌ｓｔｒ．Ｋ−１２ｓｕｂｓｔｒ．ＭＧ１６５５のｒｎｃ遺伝子のＤＮＡ配列を用いて行った（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＣ＿０００９１３．３）。プライマーＲＮａｓｅＩＩＩ５０−５およびＲＮａｓｅＩＩＩ５０−３は、ｒｎｃ遺伝子と５０ｂｐの相同配列を有するカナマイシン耐性遺伝子を増幅するために使用された。ＫａｎＲを有する標的ＰＣＲ断片は、Ｑ５（登録商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いて増幅した。鋳型として、プラスミドｐＫＤ４を使用した（Ｙｉｎら、２００９年）。ＫａｎＲを有する標的ＰＣＲ断片は、Ｐｍｉｎｉ  Ｔ２．０ベクターにライゲートしてＰｍｉｎｉ４Ｔプラスミドを得、次いでＰｍｉｎｉ−４Ｔを鋳型として用いて、ホスホロチオエート化プライマーＥｃ＿ｐｈｏｓ＿５０−５およびＥｃｊｔｈｏｓ５０−３を用いて標的断片を増幅した。突然変異体は、Ｊｅｎｓｅｎら（Ｊｅｎｓｅｎら、２０１５年）により生成した。カナマイシン耐性マーカーを含有する突然変異体をＭ−ＪＭ１０９−ＧＨＹ１と標識した。カナマイシン耐性を消失させる突然変異体は、Ｍ−ＪＭ１０９−ＧＨＹ２と標識し、植物にｈｐＲＮＡを送達するために使用し得る。プライマーを表２に列挙した。突然変異体を検証するためのＰＣＲ増幅分析は、図１に示す。
【実施例５】
【０１４１】
実施例５：ｈｐＲＮＡ構築物の安定発現のためのＲＮａｓｅ１Ｈ突然変異細菌株の構築を確認するためのＰＣＲ分析を論証する。
【０１４２】
図８Ａ〜Ｃに示すように、本発明者らは、大腸菌ＲＮａｓｅＩＩＩ突然変異体の構築の成功を検証するためにＰＣＲ分析を行った。また、図８Ａに示されるように、突然変異体Ｍ−ＪＭ１０９−ＧＩＴＹ１を検証するためにＰＣＲ分析を行った。レーン１〜１６：プライマーＪＤ−５およびＪＤ−３を有するＭ−ＪＭ１０９−ＧＨＹ１により実施されたコロニーＰＣＲでは、予想断片サイズは１，９３６ｂｐであり、野生型は８７９ｂｐであった。可能性のある正しい突然変異体４、１３、１４、１５、および１６を取り出し、ＬＢ（カナマイシン、５０μｇ／ｍｌ）培地に接種させ、さらなる同定のために一晩培養した。突然変異体１３および１５は、十分に成長した。これら２つの変異体は、本発明者らによるさらなる同定のために使用された。
【０１４３】
図８Ｂに示すように、精製された突然変異体１３および１５のさらなる同定を行った。２つのコロニーを分析した。レーン１〜３：第１のコロニー変異体をそれぞれプライマーＪＤ−５とＪＤ−３、ＪＤ−５とＣａｔ−３、およびＣａｔ−５とＴＤ−３で分析した。レーン４〜６：第２のコロニー変異体をそれぞれプライマーＪＤ−５とＪＤ−３、ＪＤ−５とＣａｔ−３、およびＣａｔ−５とＪＤ−３で分析した。レーン７：野生型ＪＭ１０９（ＤＥ３）をＪＤ−５およびＪＤ−３で増幅した。正しい変異体サイズのＰＣＲ産物は、１９３６ｂｐ（プライマーＪＤ−５およびＪＤ−３で増幅）、１６６４ｂｐ（プライマーＪＤ−５およびＣａｔ−３で増幅）、および１７８７ｂｐ（プライマーＣａｔ−５およびＪＤ−３で増幅）であった。すべてのＤＮＡシーケンシング結果は正しいものであった。カナマイシン耐性マーカーを含む正しい突然変異体はＭ−ＪＭ１０９−ＧＨＹ１として標識した。
【０１４４】
図Ｃに示すように、カナマイシン耐性遺伝子を除去した突然変異体は、プライマーＪＤ−５およびＪＤ−３を用いてＰＣＲを実施し、予想された断片サイズは５４３ｂｐであった。レーン１〜８：プライマーＪＤ−５およびＪＤ−３で増幅した８個の個々の突然変異体。カナマイシン耐性マーカーを含まない正しい変異体をＭ−ＪＭ１０９−ＧＨＹ２と標識した（参照レーン＝Ｍ１：１００ｂｐ  ＤＮＡラダー；レーンＭ２：１Ｋｂ  ＤＮＡラダー）。すべてのＰＣＲ産物をシーケンシングのために送り、すべてのシーケンシング結果を確認し、以下の表１１において再現した（配列番号３７〜３９）。
【実施例６】
【０１４５】
実施例６：ウイルスにコードされた遺伝子の細菌性ｄｓＲＮＡ媒介サイレンシングの実施例として、植物の葉に浸潤し、ｄｓＲＮＡまたはｈｐＲＮＡを発現して植物に送達し、プロセシングを行ってｓｉＲＮＡとし、ＴＭＶコードＧＦＰを不活性化するｈｐＲＮＡ分子をコードしているプラスミドを含む遺伝子改変大腸菌ＲＮａｓｅＩＩＩ変異体の使用を論証する。
【０１４６】
ここで、本発明者らは、示されたプラスミドを含む２つの大腸菌ＲＮａｓｅＩＩＩ突然変異体（１つの枯草菌ＣＣＢ４２２  ＲＮａｓｅＩＩＩ突然変異体）を用いて、葉に浸透させ、ｄｓＲＮＡまたはｈｐＲＮＡを発現させて、植物に送達し、プロセシングを行ってｓｉＲＮＡとし、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）コードＧＦＰを不活性化し、これによりウイルスにコードされた遺伝子の細菌ｄｓＲＮＡ媒介サイレンシングを論証した。
【０１４７】
本発明者らは、Ｌｉｎｄｂｏ（Ｌｉｎｄｂｏ  ２００７年）に従って、ＧＦＰ遺伝子の抑制を標的とするｈｐＲＮＡをコードしているプラスミドを含有する細菌を用いて、タバコ浸潤アッセイを実施した。症状が観察され、浸潤後５日、７日、または９日後にＧＦＰシグナルがＵＶ照射下（ｄｐｉ）で検出された。２つのタバコ種：この実施形態では、ニコチアナタバカムおよびニコチアナベンサミアナを使用した。例えば、例示的な実施形態として、図１１Ａには、Ｎ．タバカムの健康な葉および浸潤葉のＵＶ照射下で検出された浸潤症状およびＧＦＰシグナルが示されている。
【０１４８】
本発明者らは、ＴＭＶコードＧＦＰがベクターｐＪＬ−ＴＲＢＯ−Ｇから発現することをさらに論証した（Ｌｉｎｄｂｏ  ２００７年）。このベクターをアグロバクテリウムツメファシエンス（Ａｔ）に形質転換し、異なるｈｐＲＮＡを含有する細菌のＲＮａｓｅＩＩＩ突然変異体を共浸潤させた。細菌濃度は、分光計を用いて測定し、すべての細菌濃度を０．９９５０〜１．００５０の間のＯＤ６００に調整した。本発明者らは、ｈｐＲＮＡが、ＴＭＶ−ＧＦＰシグナルを阻害し、かつベクターｐＪＬ−ＴＲＢＯ−Ｇを含有するアグロバクテリウムＧＶ３１０１を有するｈｐＲＮＡを含有する細菌の共浸潤によって確認されたことをさらに論証する。
【０１４９】
図１０〜図１１Ｂに示すとおり、本発明者らは、各々が異なるｈｐＲＮＡを発現するＭＪＭ１０９およびＨＴ２７の両方を論証し、その結果、ＴＭＶコードＧＦＰシグナルの拡散に対する阻害を示すことを論証した。シャトルｈｐＲＮＡベクターにより、ＧＦＰ発現のより良好な阻害が生じることが本発明者らによって示された。この例示的実施形態では、ＭＪＭ１０９は、ＨＴ２７と比較して、より良好な結果を示した。
【０１５０】
さらに図１１Ｃに示すとおり、本発明者らは、異なるｈｐＲＮＡを有するＭＪＭ１０９およびＨＴ２７の両方が、ＴＭＶコードＧＦＰシグナルの拡散に対して異なる阻害を示すことを示した。本発明者らは、シャトルｈｐＲＮＡベクターにより、ＧＦＰ発現のより良好な阻害が生じることを論証した。例えば、ＭＸＭ１０９は、ＨＴ２７と比較して、ＴＭＶ−ＧＦＰシグナルの阻害の増加を示す。本発明者らは、すべてのｈｐＲＮＡが、植物においてＲＮＡｉ効果を生じさせ得るｄｓＲＮＡ構造を生じさせることができることを論証した。これは図１１Ｂおよび他の箇所に示される病徴と一致する。
凡例１０：
−Ａｔ：アグロバクテリウムツメファシエンス；ＴＭＶ：ｐＪＬ−ＴＲＢＯ−Ｇ；ＭＪＭ１０９：Ｍ−ＪＭ１０９−ＧＨＹ２（ＲＮａｓｅＩＩＩ突然変異体、抗生物質なし）；ＧＨＹ５：ｐＡＤ−ＷＲＫＹ−ＧＨＹ５；ＧＨＹ６：ｐＡＤ−ＡＤＨ−ＧＨＹ６；ＧＨＹ３：ｐＯＸＢ−ＷＲＫＹ−ＧＨＹ３；およびＧＨＹ４：ｐＯＸＢ−ＡＤＨ−ＧＨＹ４。
凡例１１：
−Ａｔ：アグロバクテリウムツメファシエンス；ＴＭＶ、ＧＦＰ発現ＴＭＶ：ｐＪＬ−ＴＲＢＯ−Ｇ（ＴＭＶ緑色蛍光シグナル）；ＭＪＭ１０９：Ｍ−ＪＭ１０９−ＧＨＹ２（ＲＮａｓｅＩＩＩ変異体、抗生物質なし）；ＨＴ２７、ＲＮａｓｅＩＩＩ突然変異体、テトラサイクリン耐性；ＧＨＹ５：ｐＡＤ−ＷＲＫＹ−ＧＨＹ５；ＧＨＹ６：ｐＡＤ−ＡＤＨ−ＧＨＹ６；ＧＨＹ３：ｐＯＸＢ−ＷＲＫＹ−ＧＨＹ３；ＧＨＹ４：ｐＯＸＢ−ＡＤＨ−ＧＨＹ４。
−ＡおよびＧ：Ａｔ／ＴＭＶ；
−Ｂ：Ａｔ／ＴＭＶ＋ＭＪＭ１０９；
−Ｈ：Ａｔ／ＴＭＶ＋ＨＴ２７；
−Ｃ：Ａｔ／ＴＭＶ＋ＭＪＭ１０９／ＧＨＹ５；
−Ｄ：Ａｔ／ＴＭＶ＋ＭＪＭ１０９／ＧＨＹ６；
−Ｅ：Ａｔ／ＴＭＶ＋ＭＪＭ１０９／ＧＨＹ３；
−Ｆ：Ａｔ／ＴＭＶ＋ＭＪＭ１０９／ＧＨＹ４；
−Ｉ：Ａｔ／ＴＭＶ＋ＨＴ２７／ＧＨＹ５；
−Ｊ：Ａｔ／ＴＭ．Ｖ＋ＨＴ２７／ＧＨＹ６；
−Ｋ：Ａｔ／ＴＭＶ＋ＨＴ２７／ＧＨＹ３；および
−Ｌ：Ａｔ／ＴＭＶ＋ＨＴ２７／ＧＨＹ４。
【実施例７】
【０１５１】
実施例７：ｈｐＲＮＡが、モデルタバコ植物におけるＴＭＶコードＧＦＰシグナルの拡散を阻害することを論証する。
【０１５２】
図１２に示すように、本発明者らは、Ａｔ／ＴＭＶ感染後、６日間にわたってタバコ植物にｈｐＲＮＡを接種したことを論証した。本発明者らは、３日以内に、ｈｐＲＮＡの発現がＴＭＶコードＧＦＰシグナルの拡散を阻害し得ることを論証した。
凡例１２：
−Ａ：１日後に接種したｈｐＲＮＡ；
−Ｂ：２日後に接種したｈｐＲＮＡ；
−Ｃ：３日後に接種したｈｐＲＮＡ；
−Ｄ：４日後に接種したｈｐＲＮＡ；
−Ｅ：５日後に接種したｈｐＲＮＡ；および
−Ｆ：６日後に接種したｈｐＲＮＡ。
【実施例８】
【０１５３】
実施例８：Ｎ．タバカムにおける枯草菌ＣＣＢ４２２／ｐＡＤ−ＷＲＫＹ−ＧＨＹ５によるタバコ植物の浸潤を論証する。
【０１５４】
図１３に示すように、本発明者らは、ｈｐＲＮＡを発現している遺伝子改変枯草菌が、Ｎ．タバカム中のＡｔ／ＴＭＶシグナルを上手く浸潤させ、その拡散を阻害できることを論証した。この実施形態では、本発明者らは、ｈｐＲＮＡを有するＣＣＢ４２２が、Ａｔ／ＴＭＶシグナルの拡散を有意に阻害し得ることを論証した。
凡例１３：
−Ａｔ：アグロバクテリウムツメファシエンス；ＴＭＶ：ｐＪＬ−ＴＲＢＯ−Ｇ（ＴＭＶ緑色蛍光シグナル）；ＣＣＢ４２２（枯草菌ＲＮａｓｅＩＩＩ突然変異体、スペクチノマイシンおよびカナマイシン耐性）；ＧＨＹ５：ｐＡＤ−ＷＲＫＹ−ＧＨＹ５、および各処置を３回繰り返した。赤い矢印は、浸潤領域を示している。
−Ａ：ブランク陰性対照
−Ｂ：Ａｔ／ＴＭＶ（ＧＦＰ発現ＴＭＶ）
−Ｃ：ＣＣＢ４２２（プラスミドを含まない細菌のみ）
−Ｄ：ＣＣＢ４２２／ＧＨＹ５（プラスミドを有するがＴＭＶを有さない細菌）
−Ｅ：ＴＭＶ＋ＣＣＢ４２２／ＧＨＹ５（ＴＭＶおよびｈｐＲＮＡ）
【実施例９】
【０１５５】
実施例９：過胞形成細菌株は、Ｎ．ベンサミアナにおいてＡｔ／ＴＭＶシグナルの拡散を阻害する能力の増大を示す。
【０１５６】
図１４に示すように、本発明者らは、ｈｐＲＮＡを発現している遺伝子改変枯草菌がＮ．ベンサミアナ中のＡｔ／ＴＭＶシグナルを上手く浸潤させ、その拡散を阻害できることを論証した。この実施形態では、本発明者らは、ｈｐＲＮＡを有する過胞形成大腸菌株ＨＴ２７が、Ａｔ／ＴＭＶシグナルの拡散を有意に阻害し得ることを論証した。この実施形態では、本発明者らは、過胞形成株が、ｈｐＲＮＡなどの干渉ＲＮＡの能力を増強し、標的病原体遺伝子の発現を阻害し得ることを論証した。
凡例１４：
右パネル：上部、Ａｔ／ＴＭＶ処置を３回繰り返した。下部、ＴＭＶ＋ＨＴ２７／ＧＨＹ５を３回繰り返した。
−Ａｔ：アグロバクテリウムツメファシエンス；ＴＭＶ：ｐＪＬ−ＴＲＢＯＧ（ＴＭＶ緑色蛍光シグナル）；ＨＴ２７、ＲＮａｓｅＩＩＩ突然変異体、テトラサイクリン耐性；ＧＨＹ５：ｐＡＤ−ＷＲＫＹ−ＧＨＹ５、および各処置を３回繰り返した。
−Ａ：ブランク陰性対照
−Ｂ：Ａｔ／ＴＭＶ
−Ｃ：ＨＴ２７
−Ｄ：ＨＴ２７／ＧＨＹ５
−Ｅ：ＴＭＶ＋ＨＴ２７／ＧＨＹ５
【実施例１０】
【０１５７】
実施例１０：モデル植物生物におけるｈｐＲＮＡ媒介ＧＦＰシグナル抑制の効率の経時的論証。
【０１５８】
本発明者らは、規定の時間経過にわたるタバコ植物におけるｈｐＲＮＡ媒介ＧＦＰシグナルの抑制を論証した。本発明者らは、タバコ植物にｈｐＲＮＡ：ＭＪＭ１０９−ＧＨＹ２／ｐＡＤ−ＷＲＫＹ−ＧＨＹ５を接種させ、次いで、異なる日にＡｔ／ＴＭＶを接種させた。図１５に一般的に示すように、ｈｐＲＮＡ接種後、モデルタバコ植物は、少なくとも６ｄｐｉまで改変ＴＭＶウイルス感染から保護された。本発明者らは、図１６〜１７において、ｈｐＲＮＡが７ｄｐｉの葉内の浸潤領域の異なる部分に移動したことをさらに論証した。例えば、図１６〜１７では、ＴＭＶ−ＧＦＰは、７ｄｐｉでｈｐＲＮＡに囲まれていることが示された。これは、標的ウイルス遺伝子の接種および抑制の長期的かつ継続的な性質を論証している。
凡例１５：
−Ａ：１日後にＡｔ／ＴＭＶを接種
−Ｂ：２日後にＡｔ／ＴＭＶを接種
−Ｃ：３日後にＡｔ／ＴＭＶを接種
−Ｄ：４日後にＡｔ／ＴＭＶを接種
−Ｅ：５日後にＡｔ／ＴＭＶを接種
−Ｆ：６日後にＡｔ／ＴＭＶを接種
【実施例１１】
【０１５９】
実施例１１：ｈｐＲＮＡは、タバコ中でｓｉＲＮＡを効率よく産生し、Ｎ．タバカム中のＡｔ／ＴＭＶシグナルの拡散を制限できる。
【０１６０】
本発明者らは、ｈｐＲＮＡが、植物中でｓｉＲＮＡを効率よく産生し、Ａｔ／ＴＭＶシグナルの拡散および発現を制限できることを論証した。この実施形態では、ｈｐＲＮＡは、ＭＪＭ１０９−ＧＨＹ２／ｐＡＤ−ＷＲＫ  Ｙ−ＧＨＹ５浸潤Ｎ．タバカム由来のものであり、一般に上記のとおり、プロセシングを行ってｓｉＲＮＡとした。図１８に示すように、ＭＪＭ１０９−ＧＨＹ２／ｐＡＤ−ＷＲＫＹ−ＧＨＹ５由来ｓｉＲＮＡは、ＴＭＶ−ＧＦＰシグナルの拡散を制限した。
凡例１７：
−濃い矢印は、Ａｔ／ＴＭＶ浸潤処置を示す。
−白い矢印は、ｈｐＲＮＡ（ＭＪＭ１０９−ＧＨＹ２／ｐＡＤ−ＷＲＫＹ−ＧＨＹ５）浸潤処置を示す。
Ａｔ：アグロバクテリウムツメファシエンス；
−ＴＭＶ：ｐＪＬ−ＴＲＢＯ−Ｇ（ＴＭＶ緑色蛍光シグナル
【実施例１２】
【０１６１】
実施例１２：ｓｉＲＮＡは、Ｎ．タバカムにおけるＴＭＶ−ＧＦＰシグナルの拡散を効率よく制限することができる。
【０１６２】
本発明者らは、ｈｐＲＮＡが植物中でｓｉＲＮＡを効率よく産生し、ＴＭＶ−ＧＦＰシグナルの拡散および発現を制限できることを論証した。この実施形態では、Ｍ−ＪＭ１０９−ＧＨＹ２／ｐＡＤ−ＷＲＫＹ−ＧＨＹ７由来ｓｉＲＮＡが、ＴＭＶ−ＧＦＰシグナルの拡散を制限した（図１８Ａ）。さらに、本発明者らは、ＣＣＢ４２２／ｐＡＤ−ＷＲＫＹ−ＧＨＹ５由来ｓｉＲＮＡもまた、ＴＭＶ−ＧＦＰシグナルの拡散を制限することを論証した（図１８Ｂ）。この実施形態では、本発明者らは、Ｎ．タバカム中において、ｈｐＲＮＡが、用量依存的様式で、ＲＮＡｉのためのより多くのｓｉＲＮＡ産生を誘導し、ＴＭＶ−ＧＦＰシグナルの拡散を制限し得ることを論証した。
凡例１８Ａ〜Ｂ：
−濃い矢印は、Ａｔ／ＴＭＶ浸潤処置を示す。
−白い矢印は、ｈｐＲＮＡ（ＭＪＭ１０９−ＧＨＹ２／ｐＡＤ−ＷＲＫＹ−ＧＨＹ５）浸潤処置を示す。
−図１８Ａ：Ａｔ：アグロバクテリウムツメファシエンス；
−図１８Ｂ：ＴＭＶ：ｐ  ＪＬ−ＴＲＢＯ−Ｇ（ＴＭＶ緑色蛍光シグナル）
【実施例１３】
【０１６３】
実施例１３：バチルスセレウス菌の同定およびコロニー形成を論証する。
【０１６４】
例示的な実施形態として、本発明者らは、緑色蛍光タンパク質をコードしているシャトルベクターｐＡＤ４３−２５を発現させる内生細菌バチルスセレウス菌により、タバコの葉にコロニーが形成され得ることを論証する。
【０１６５】
この例示的な実施形態では、Ｂ．セレウス菌５３５２２をＡＴＣＣから入手し、同定に使用したプライマーを表４に列挙した。正しいＰＣＲ断片をＰｍｉｎｉＴ  ２，０ベクターのベクターにライゲートし、次いでＸｈｏＩで消化して正しいサイズを調べ、次いでＤＮＡ配列分析により正しいクローンを同定して、Ｂセレウス菌株の同一性を確認した（図９）。Ｂ．セレウス５３５２２（ＵＷ８５）シーケンシングの結果を表１２に提供する：１６Ｓ  ｒＲＮＡ：１５１４ｂｐ；２３Ｓ  ｒＲＮＡ：８５５ｂｐ；ｍｏｔＢ：５７４ｂｐ；エンド−ｂ−ｌ，４−グルカナーゼ遺伝子：６５９ｂｐ、ｒｎｃ遺伝子：７３８ｂｐ；ＳＣＡＰ：ＰＣＲバンドなし。
【実施例１４】
【０１６６】
実施例１４：バチルスセレウス菌におけるｈｐＲＮＡの形質転換および発現、ならびにモデル植物生物体への接種およびコロニー形成。
【０１６７】
本発明者らは、シャトルベクターｐＡＤ４３−２５およびｐＡＤ−ＷＲＫＹ−ＧＨＹ５のｈｐＲＮＡベクターをバチルスセレウス５３５２２株に形質転換した後、例示的タバコ植物に接種して、構成的プロモーターＰｕｐｐ下で、ＧＦＰシグナルの発現を確認した。このシグナルは、本発明者らによって図１９において論証されており、モデルタバコ植物における形質転換されたＢ．セレウスのコロニー形成は、図２０においてさらに論証されている。
【実施例１５】
【０１６８】
実施例１５：ヘアピンＲＮＡ内生植物送達により媒介される、ウイルスにコードされたＧＦＰタンパク質の蓄積の減少／感染重症度の低下。
【０１６９】
上記のように、宿主のＲＮＡｉ機構によりＴＭＶ−ＧＦＰ  ＲＮＡ転写物を標的化することで、ウイルスＲＮＡの分解がもたらされ、そのため、ウイルスｍＲＮＡをタンパク質に翻訳できないことが予想される。したがって、ウイルスにコードされたＧＦＰと相同であるヘアピンＲＮＡの生物界間送達により、宿主のＲＮＡｉ防御を高めることで、Ｎ．タバカム宿主においてｓｉＲＮＡの生合成が誘発され、これにより、ウイルスにコードされたＧＦＰの蓄積の喪失または減少がもたらされ、最終的にはウイルス感染に対する耐性が付与されると予測される。
【０１７０】
この仮説を評価するために、ＴＭＶ−ＧＦＰに感染させたか、またはＴＭＶ−ＧＦＰと、ｐＡＤ−ＷＲＫＹ−ＧＨＹ５構築物（ウイルスＧＦＰ相同ヘアピンＲＮＡをコードしている）を保有する細菌株とを共浸潤させたＮ．タバカム植物の浸潤領域（５ｄｐｉ）から、２ｘ０．４ｍｍの葉片、ならびに実験対照を集めた（図２１参照）。全タンパク質抽出は、ＢａｕｍｂｅｒｇｅｒおよびＢａｕｌｃｏｍｂｅ（２００５年）に従って、１００μｌのタンパク質抽出緩衝液および１５分間、１６，０００ｇ、４℃でペレット化した不溶性物質を用いて実施した。サンプルをＰＡＧＥにより分離し、セミドライトランスファーによりニトロセルロース膜にブロットした。ウエスタンブロッティングの前に膜をポンソーＳで染色して、Ｒｕｂｉｓｃｏ最大サブユニット（ＲＢＣＬ）の定量化を可能にした。ウイルスＧＦＰは、抗ＧＦＰ抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ３Ｆ８．２；１：１０，０００）とインキュベートし、続いてヤギ抗マウスＨＲＰ二次抗体（Ａｇｒｉｓｅｒａ、１：２０，０００）とインキュベートすることによって検出した。シグナルの検出、取得は、それぞれ、製造者の指示書（ＧＥ）およびＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰイメージングシステム（ＢｉｏＲａｄ）に従って、ＥＣＬウエスタン検出キットを用いて行った。ＧＦＰシグナルの定量化は、Ｉｍａｇｅ  Ｌａｂソフトウェア（ＢｉｏＲａｄ）を用いて行った。
図２１において本発明者らによって論証されているように、ＴＭＶ−ＧＦＰウイルスとＧＦＰ−ｈｐＲＮＡをコードしている内生菌枯草菌ＣＣＢ４２２（Ｄｕｒａｎｄら、２０１２年）（図２１ａ、ｂ）との共浸潤は、ＴＭＶ−ＧＦＰ単独の浸潤と比較した場合、結果として感染植物において、ＧＦＰの蓄積が減少した。重要なことに、生物界間送達用のビヒクルとして大腸菌ＨＴ２７を用いた繰り返し実験（図２１ｃ）では、共浸潤を実施したとき、いかなるウイルスコードＧＦＰの蓄積も検出できず、単独の（ｕｎｃｈａｌｌｅｎｇｅｄ）ＴＭＶ感染症において観察されたＧＦＰ蓄積と大きく対照的であった。本発明者らの結果は、ウイルスゲノムと相同であるｈｐＲＮＡの生物界間送達が、ウイルスの複製およびウイルスタンパク質の翻訳を効率的に下方制御するか、または排除することを示している。
【実施例１６】
【０１７１】
実施例１６：ＨＴ２７／ｐＡＤ−ＷＲＫＹ−ＧＦＴＹ５によるＴＭＶ−ＧＦＰ  ｍＲＮＡ抑制をモニターするためのｑＰＣＲ。
【０１７２】
ＴＭＶ−ＧＦＰ、ＴＭＶ−ＧＦＰ、ＴＭＶ−ＧＦＰ＋細菌単独、およびＴＭＶ＋ｈｐＲＮＡ−ＧＦＰを発現する細菌により感染させた異なる生物学的処置において相対ＲＮＡレベルを分析するために、定量的ＰＣＲ実験（ｑＰＣＲ）において、Ｌ２５リボソームタンパク質遺伝子のｍＲＮＡレベルをＮ．タバカム参照遺伝子として使用し、ＴＭＶ−ＧＦＰ  ＲＮＡの増幅を標的とするプライマーを使用した。ｉｗＶＶａｎａ（登録商標）ｍｉＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔを使用して、処理した様々なタバコの葉から全ＲＮＡを抽出した。ｃＤＮＡは、ＥｃｏＤｒｙＴＭ  Ｐｒｅｍｉｘキットを用いて合成した。ＱＲＴ−ＰＣＲは、ｉＴａｑ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｓ  ＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘを用いて行った。結果は、図２２および表６にまとめて示す。
【０１７３】
本発明者らは、細菌が存在することにより、ＴＭＶ−ＧＦＰが減少すること（約４３％）を論証した。本発明者らは、ｈｐＤＮＡ−ＧＦＰ発現細菌が、ＴＭＶ−ＧＦＰ  ＲＮＡレベルにおいて、ｓｉＲＮＡ媒介干渉の増強と一致して、ＧＦＰ  ＲＮＡレベルにおいてほぼ９０％の減少を有することを論証した。
【０１７４】
【表１】
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【０１７５】
【表２】
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【０１７６】
【表３】
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2020511472.tif 000009
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【０１７７】
【表４】
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【０１７８】
【表５】
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【０１７９】
【表６】
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【０１８０】
【表７】
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【０１８１】
【表８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年1月24日(2020.1.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物病原体の生物的防除のための方法であって、
−抑制されたＲＮａｓｅＩＩＩ活性を有する遺伝子改変植物内生細菌を生成するステップと、
−植物病原体中の少なくとも１つの標的配列に向けられた二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）またはヘアピン（ｈｐＲＮＡ）を形成することができる少なくとも１つの小さい阻害性リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）をコードしているプロモーターに作動可能に結合しているポリヌクレオチド配列を含む核酸構築物により、前記遺伝子改変内生細菌を形質転換するステップと、
前記遺伝子改変植物内生細菌を植物に導入するステップと、
前記植物においてＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）メカニズムを誘導するのに十分な時間にわたって、前記核酸構築物を発現させるステップと、を含み、前記ＲＮＡｉメカニズムにより、植物病原体における前記少なくとも１つの標的配列の下方制御が引き起こされる、方法。
【請求項２】
前記遺伝子改変植物内生細菌を植物に導入する前記方法が、浸漬、噴霧、注入、供給、エアロゾル散布による導入、環境エアロゾル散布をによる導入、水源での環境エアロゾル散布による導入、ブラッシング、ドレッシング、滴下、およびコーティングを施した蚊と、その導入期間の間に、細菌が水性のキャリアや溶液中で凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）、凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｉｅｄ）、マイクロカプセル化、乾燥される点からなる群から選択される方法を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記植物が、単子葉植物および／または双子葉植物である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記植物が、穀物、トウモロコシ、コムギ、イネ、オオムギ、オーツムギ、モロコシ、キビ、ヒマワリ、ベニバナ、綿、大豆、キャノーラ、アルファルファ、シロイヌナズナ、アサ、ジャガイモ、アブラナ属、ピーナッツ、タバコ、熱帯の果物および花、バナナ、ウキクサ、グラジオラス、サトウキビ、パイナップル、デーツ、タマネギ、パイナップル、カシューナッツ、ピスタチオ、花、観葉植物、針葉樹、落葉性、ブドウ、柑橘類、バラ、りんご、モモ、イチゴ、アーモンド、コーヒー、オーク、豆、さや、スイカ、カボチャ、キャベツ、カブ、マスタード、サボテン、ペカン、亜麻、サツマイモ、大豆、ココナッツ、アボカド、ビート、カンタロープメロン、野菜からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記植物病原体が、植物ウイルス、植物ウイロイド、真菌、有害生物、草食動物、およびカビからなる群から選択される植物病原体である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記植物ウイルスが、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）；トマト黄化えそウイルス（ＴＳＷＶ）；トマト黄化巻葉ウイルス（ＴＹＬＣＶ）；キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）；ジャガイモウイルスＹ（ＰＶＹ）；カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）；アフリカキャッサバモザイクウイルス（ＡＣＭＶ）；プラムポックスウイルス（ＰＰＶ）；ブロムモザイクウイルス（ＢＭＶ）；ジャガイモウイルスＸ（ＰＶＸ）；カンキツトリステザウイルス；オオムギ黄萎ウイルス；ジャガイモ巻葉ウイルスおよびトマトブッシースタントウイルスからなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記標的配列が、ウイルスの重要領域の配列、ウイルス科の保存された配列、および異なるウイルス科のメンバー間の保存された配列からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
抑制される前記標的配列が、前記タバコモザイクウイルス中のレプリカーゼ遺伝子、運動タンパク質、コートタンパク質；前記トマト黄化えそウイルス中の糖タンパク質（ＧＰ）、ＮＳｍタンパク質、ＮＳｓタンパク質、ウイルスＲＮＡゲノムセグメントＬ、Ｍ、Ｓ；前記トマト黄化巻葉ウイルス中のＶ１、Ｖ２、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｖ１タンパク質；前記キュウリモザイクウイルス中の１ａ、２ａ２ｂタンパク質、３ａ、コートタンパク質；前記ジャガイモウイルスＹ中のＰＩ、ＨＣ−Ｐｒｏ、Ｐ３、６ｋｌ、Ｃ１、６ｋ２、ＮＩａ、ＮＩｂ、ＣＰ；前記カリフラワーモザイクウイルス中の運動タンパク質、２つのアブラムシ伝達因子（Ｐ２および／またはＰ３）、キャプシドタンパク質の前駆体（Ｐ４）、プロテイナーゼのポリタンパク質前駆体、Ｐ５、Ｐ６タンパク質；前記アフリカキャッサバモザイクウイルス中のＡＶ１、ＡＶ２、ＡＣ１、ＡＣ２、ＡＣ３、ＡＣ４、ＢＣ１、ＢＶ１；前記プラムポックスウイルス中のＰＩ、ＨＣ−Ｐｒｏ、Ｐ３、６ｋｌ、Ｃ１、６ｋ２、ＮＩａ、ＮＩｂ、ＣＰ；前記ブロムモザイクウイルス中の１ａ、２ａ、運動タンパク質、コートタンパク質；前記ジャガイモウイルスＸ中のレプリカーゼ、ＴＧＢ１、ＴＧＢ２、ＴＧＢ３、コートタンパク質からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記真菌が、イネいもち病菌；灰色かび病菌；プッチニア属；ムギ類赤カビ病；フザリウムオキシスポラム；オオムギうどんこ病菌；コムギ葉枯病菌；コレトトリカム属；トウモロコシ黒穂病菌；アマさび病菌、ダイズさび病菌およびリゾクトニア・ソラニ−からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
前記標的配列が、真菌必須遺伝子の重要領域の配列、必須遺伝子ファミリーの保存配列、および異なるウイルス科のメンバー間の保存必須遺伝子からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記標的配列が、ＲＮＡのノンコーディング領域、ＲＮＡのコーディング領域からなる群から選択され、前記標的配列がＲＮＡのスプライス部位を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記核酸構築物がプラスミドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記プラスミドが、ｐＡＤ−ＷＲＫＹ−ＧＨＹｌ；ｐＡＤ−ＡＤＨ−ＧＨＹ２；ｐＯＸＢ−ＷＲＫＹ−ＧＨＹ３；ｐＯＸＢ−ＡＤＨ−ＧＨＹ４；ｐＡＤ−ＷＲＫＹ−ＧＨＹ５；ｈｐＲＮＡ  ｐＡＤ−ＡＤＨ−ＧＨＹ６；およびｈｐＲＮＡ  ｐＡＤ−ＷＲＫＹ−ＧＨＹ７からなるプラスミドの群からの前記標的配列を含むように改変されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
植物病原体中の少なくとも１つの標的配列に向けられる二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）またはヘアピン（ｈｐＲＮＡ）を形成することができるように構成された前記ｓｉＲＮＡが、プロモーターに作動可能に連結されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記プロモーターが、非構成的プロモーター、誘導性プロモーター、病原体誘導性プロモーター、組織優先的（ｔｉｓｓｕｅ−ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）プロモーター、組織特異的プロモーター、植物特異的プロモーター、または構成的プロモーターからなる群から選択されるプロモーターである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
抑制されたＲＮａｓｅＩＩＩを有する前記遺伝子改変植物内生細菌が、アシドバクテリア、放線菌、アルファプロテオバクテリア、アルマティモナス、バクテロイデス、ベータプロテオバクテリア、デルタプロテオバクテリア、フィルミクテス、グラムプロテオバクテリア、ＴＭ７、バチルス、大腸菌からなる群から選択される、請求項１の方法。
【請求項１７】
前記遺伝子改変植物内生細菌が、Ｍ−ＪＭ１０９−ＧＨＹ２である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記遺伝子改変植物内生細菌が枯草菌ＣＣＢ４２２である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記遺伝子改変植物内生細菌が、大腸菌ＨＴ２７またはＨＴ１１５である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
抑制されたＲＮａｓｅＩＩＩを有する前記遺伝子改変植物内生細菌が、過胞形成活性を有する遺伝子改変植物内生細菌、ＪＣ８０３１であり、かつ／または他の細菌によりナノチューブ形成を増強するのに十分な１つ以上の栄養素要求株を有する遺伝子改変植物内生細菌である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記ｓｉＲＮＡが前記植物において移動する、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記植物においてＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）メカニズムを誘導するのに十分な時間にわたって、前記核酸構築物を発現させる前記ステップであって、前記ＲＮＡｉメカニズムにより、前記植物病原体において、前記少なくとも１つの標的配列の下方制御が引き起こされるステップが、前記核酸構築物を継続的に発現させ、それにより前記植物において持続的なＲＮＡｉメカニズムを開始するステップを含み、前記持続的なＲＮＡｉメカニズムが、前記植物に、前記植物病原体感染に対して野生型よりも高い耐性を持たせる、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
少なくとも１つのヘルパー遺伝子をコードしているプロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を植物において共発現するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
植物病原体中の少なくとも１つの異なる標的配列に向けられる少なくとも１つの追加のｓｉＲＮＡ分子を共発現するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記ヘルパー遺伝子が、ＶｒｒＡ；ＳＩＤ１；ＳＩＤ２；ＡＧ０１；ＡＧ０２；ＡＧ０７；ＹｍｄＢ；ＹｍｄＢ；スタウフェン；ＲＤＥ−４；ＨｌｙＡ；Ｓｅｃ−およびＴａｔ−分泌シグナルペプチド；１つ以上の細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）；Ｔａｔ；アンテナペディア；ＡＣＣデアミナーゼ；１つ以上の師部ＲＮＡトランスポーター；ＰＰ２−Ａ１；ＰＳＲＰ１；ＤＲＢ１；ＤＲＢ４；ＨＥＮ１およびＳＴＶ１からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記小さい阻害性リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）が、植物病原体の少なくとも１つの必須遺伝子を下方制御するように構成され、かつ１つ以上の特異的ＲＮＡモチーフを有するように構成された小さい阻害性リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）であり、前記ＲＮＡモチーフをｄｓＲＮＡに組み込んで、これにより、前記植物の師部を介した伝達を促進し得る、請求項１に記載の方法。
【国際調査報告】
2020511472.tif 000040
2020511472.tif 000041
2020511472.tif 000042
2020511472.tif 000043