(57)【要約】  （ａ）誘発性プロモーターをコードする配列および導入遺伝子をコードする配列を含む誘発性導入遺伝子構築物、および（ｂ）構成的プロモーターをコードする配列および外因性受容体をコードする配列を含む受容体構築物を含み、構築物（ａ）および構築物（ｂ）を細胞のゲノム配列に組み込むと、外来レポーターが発現され、リガンドを結合すると、この外来レポーターは、（ａ）中の誘発性プロモーターを標的とする細胞内シグナルを伝達して遺伝子発現を修飾する、組成物が開示される。組成物を細胞に導入する方法およびその結果得られた細胞を養子細胞治療法に使用することも提供される。【選択図】図１Ａ
2020532987.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）誘発性プロモーターをコードする配列および導入遺伝子をコードする配列を含む誘発性導入遺伝子構築物、および
（ｂ）構成的プロモーターをコードする配列および外因性受容体をコードする配列を含む受容体構築物を含み、
構築物（ａ）および構築物（ｂ）を細胞のゲノム配列に組み込むと、外因性受容体が発現され、
リガンドを結合すると、外因性受容体は、（ａ）の誘発性プロモーターを標的とする細胞内シグナルを伝達して遺伝子発現を修飾する、組成物。
【請求項２】
（ｂ）の前記外因性受容体は非天然起源の受容体を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記非天然起源の受容体は合成受容体、変性受容体、組み換え受容体、変異受容体、またはキメラ受容体である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記非天然起源の受容体はＴ細胞受容体(TCR)から単離されるかそれに由来する１つ以上の配列を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記非天然起源の受容体は足場タンパク質から単離されるかそれに由来する１つ以上の配列を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記非天然起源の受容体は膜貫通ドメインを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記非天然起源の受容体は細胞内シグナルを伝達する細胞内受容体と相互作用する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記非天然起源の受容体は細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記非天然起源の受容体はキメラリガンド受容体(CLR)である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記CLRはキメラ抗原受容体である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記キメラリガンド受容体は
(a)少なくとも足場タンパク質を含むリガンド認識領域を含む外部ドメイン、
(b)膜貫通ドメイン、および
(c)少なくとも１つの共刺激ドメインを含む内部ドメイン、
を含む請求項９または１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記外部ドメイン(a)はシグナルペプチドをさらに含む請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記外部ドメイン(a)は前記リガンド認識領域と前記膜貫通ドメインの間にさらにヒンジを含む、請求項１１または１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記シグナルペプチドはヒトCD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD8α、CD19、CD28、4-1BBまたはGM-CSFRシグナルペプチドをコードする配列を含む、請求項１２または１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記シグナルペプチドはヒトCD8αシグナルペプチドをコードする配列を含む、請求項１２または１３に記載の組成物。
【請求項１６】
前記シグナルペプチドはMALPVTALLLPLALLLHAARP (配列番号：17000)を含むアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記シグナルペプチドは
【化１】
2020532987.tif 000325
(配列番号：17001)を含む核酸配列によってコードされている、請求項１５または１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記膜貫通ドメインはヒトCD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD8α、CD19、CD28、4-1BBまたはGM-CSFR膜貫通ドメインをコードする配列を含む、請求項１１〜１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記膜貫通ドメインはヒトCD8α膜貫通ドメインをコードする配列を含む、請求項１１〜１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記膜貫通ドメインはIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC (配列番号：17002)を含むアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記膜貫通ドメインは
【化２】
2020532987.tif 000326
(配列番号：17003) を含む核酸配列によりコードされている、請求項１９または２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記内部ドメインはヒトCD3ζ内部ドメインを含む、請求項１１〜２１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記少なくとも１つの共刺激ドメインはヒト4-1BB、CD28、CD3ζ、CD40、ICOS、MyD88、OX-40細胞内のセグメント、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１１〜２２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２４】
前記少なくとも１つの共刺激ドメインはヒトCD3ζおよび／または4-1BB共刺激ドメインを含む、請求項１１〜２２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２５】
前記CD3ζ共刺激ドメインは
【化３】
2020532987.tif 000327
(配列番号：17004)を含むアミノ酸配列を含む、請求項２３または２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記CD3ζ共刺激ドメインは
【化４】
2020532987.tif 000328
(配列番号：17005)を含む核酸配列によってコードされている、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記4-1BB共刺激ドメインは
【化５】
2020532987.tif 000329
(配列番号：17006)を含むアミノ酸配列を含む、請求項２３または２４に記載の組成物。
【請求項２８】
前記4-1BB 共刺激ドメインは
【化６】
2020532987.tif 000330
(配列番号：17007)を含む核酸配列によりコードされている、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記4-1BB共刺激ドメインは前記膜貫通ドメインと前記CD3ζ共刺激ドメインの間に位置する、請求項２４〜２８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３０】
前記ヒンジはヒトCD8α、IgG4、および／またはCD4配列に由来する配列を含む、請求項１１〜２９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３１】
前記ヒンジはヒトCD8α配列に由来する配列を含む、請求項１１〜２９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３２】
前記ヒンジは
【化７】
2020532987.tif 000331
(配列番号：17008)を含むアミノ酸配列を含む、請求項３０または３１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記ヒンジは
【化８】
2020532987.tif 000332
(配列番号：17028)を含む核酸配列または
【化９】
2020532987.tif 000333
(配列番号：17009)を含む核酸配列によりコードされている、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
前記少なくとも１つのタンパク質足場は前記リガンドに特異的に結合する、請求項１１〜３３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３５】
前記少なくとも１つのタンパク質足場は抗体、抗体断片、単一ドメイン抗体、単鎖抗体、抗体模倣物、またはセンチリンを含む、請求項１１〜３３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３６】
前記リガンド認識領域は抗体、抗体断片、単一ドメイン抗体、単鎖抗体、抗体模倣物、およびセンチリンのうちの１種以上を含む、請求項１１〜３３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３７】
前記単一ドメイン抗体はVHHを含むかまたはVHHからなる、請求項３５または３６に記載の組成物。
【請求項３８】
前記抗体模倣物はアフィボディ、アフィリン、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アンチカリン、アビマー、DARPin、フィノマー、クニッツドメインペプチドまたはモノボディを含むかまたはこれらからなる、請求項３５または３６に記載の組成物。
【請求項３９】
前記センチリンは少なくとも１つのフィブロネクチンIII型(FN3) ドメインの共通配列を含むかまたはこれらからなる、請求項３５または３６に記載の組成物。
【請求項４０】
前記少なくとも１つのフィブロネクチンIII型 (FN3) ドメインはヒトタンパク質に由来する、請求項３９項に記載の組成物。
【請求項４１】
前記ヒトタンパク質はテネイシン−Ｃである、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
前記共通配列は
【化１０】
2020532987.tif 000334
(配列番号：17010)を含む、請求項３９〜４１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４３】
前記共通配列は
【化１１】
2020532987.tif 000335
(配列番号：17011)を含む、請求項３９〜４１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４４】
前記共通配列は、
(a)前記共通配列の位置１３〜１６にあるアミノ酸残基TEDSを含むかまたはこれらからなるＡ−Ｂループ；
(b)前記共通配列の位置２２〜２８にあるアミノ酸残基TAPDAAFを含むかまたはこれらからなるＢ−Ｃループ； 
(c)前記共通配列の位置３８〜４３にあるアミノ酸残基SEKVGEを含むかまたはこれらからなるＣ−Ｄループ； 
(d)前記共通配列の位置５１〜５４にあるアミノ酸残基GSERを含むかまたはこれらからなるＤ−Ｅループ； 
(e)前記共通配列の位置６０〜６４にあるアミノ酸残基GLKPGを含むかまたはこれらからなるＥ−Ｆループ； 
(f)前記共通配列の位置７５〜８１にあるアミノ酸残基KGGHRSNを含むかまたはこれらからなるＦ−Ｇループ；または
(g)前記(a)から(f)の任意の組み合わせ
内の１箇所以上の位置で修飾されている、請求項３９〜４３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４５】
少なくとも５つのフィブロネクチンIII型(FN3)ドメインの共通配列を含む、請求項３９〜４４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４６】
少なくとも１０のフィブロネクチンIII型(FN3)ドメインの共通配列を含む、請求項３９〜４４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４７】
少なくとも１５のフィブロネクチンIII型(FN3)ドメインの共通配列を含む、請求項３９〜４４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４８】
前記足場は、10-9M以下、10-10M以下、10-11M以下、10-12M以下、10-13M以下、10-14M以下、および10-15M以下のKD値から選ばれた少なくとも１つの親和性で抗原と結合する、請求項３９〜４７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４９】
前記KD値は表面プラズモン共鳴で決定される、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５０】
（ｂ）の前記構成的プロモーターをコードする配列はEF1αプロモーターをコードする配列を含む、請求項１〜４９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５１】
（ｂ）の前記構成的プロモーターをコードする配列はCMVプロモーター、U6プロモーター、SV40プロモーター、PGK1プロモーター、Ubcプロモーター、ヒトβ アクチンプロモーター、CAG プロモーター、またはEF1αプロモーターをコードする配列を含む、請求項１〜４９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５２】
（ａ）の前記誘発性プロモーターをコードする配列はNFKBプロモーターをコードする配列を含む、請求項１〜５１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５３】
（ａ）の前記誘発性プロモーターをコードする配列はインターフェロン(IFN)プロモーターをコードする配列またはインターロイキン-2プロモーターをコードする配列を含む、請求項１〜５１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５４】
前記インターフェロン(IFN)プロモーターはIFNγプロモーターである、請求項５３に記載の組成物。
【請求項５５】
（ａ）の前記誘発性プロモーターをコードする配列はNR4A1プロモーターをコードする配列またはNR4A1プロモーターをコードする配列を含む、請求項１〜５１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５６】
（ａ）の前記誘発性プロモーターをコードする配列はCD5プロモーターをコードする配列またはCD5プロモーターをコードする配列を含む、請求項１〜５１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５７】
前記導入遺伝子は前記細胞のゲノム配列に関して内因性の配列を含む、請求項１〜５６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５８】
前記導入遺伝子は前記細胞のゲノム配列に関して外因性の配列を含む、請求項１〜５６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５９】
前記外因性配列は前記細胞のゲノム内の内因性の配列の配列変異体である、請求項５８に記載の組成物。
【請求項６０】
前記外因性配列は前記細胞中に完全にまたは部分的に欠けている遺伝子の野生型の配列であり、前記遺伝子は健常細胞のゲノムに完全に存在する、請求項５８に記載の組成物。
【請求項６１】
前記外因性配列は、前記細胞のゲノムに関して、合成配列、修飾配列、組み換え配列、キメラ配列、または非天然起源の配列である、請求項５８に記載の組成物。
【請求項６２】
前記導入遺伝子は分泌タンパク質をコードする、請求項５７〜６１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６３】
前記分泌タンパク質は、それを必要とする被験体の疾患または障害を治療するのに治療的に有効な水準で前記細胞から産生および／または分泌される、請求項６２に記載の組成物。
【請求項６４】
前記誘発性導入遺伝子構築物(a)は第１のトランスポゾンに含まれ、前記受容体構築物(b)は第２のトランスポゾンに含まれる、請求項１〜６３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６５】
前記第１のトランスポゾンは第１のベクターに含まれ、前記第２のトランスポゾンは第２のベクターに含まれる、請求項６４に記載の組成物。
【請求項６６】
前記第１のトランスポゾンおよび前記第２のトランスポゾンはベクターに含まれる、請求項１〜６３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６７】
前記誘発性導入遺伝子構築物(a)および前記受容体構築物(b)はトランスポゾンに含まれる、請求項１〜６１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６８】
前記トランスポゾンはベクターに含まれる、請求項６７に記載の組成物。
【請求項６９】
前記誘発性導入遺伝子構築物(a)および前記受容体構築物(b)は同じ方向に配向されている、請求項６７または６８に記載の組成物。
【請求項７０】
前記誘発性導入遺伝子構築物(a)および前記受容体構築物(b)は同じ方向に配向されていない、請求項６５または６６に記載の組成物。
【請求項７１】
前記誘発性導入遺伝子構築物(a)および前記受容体構築物(b)は反対方向に配向されている、請求項７０に記載の組成物。
【請求項７２】
前記ベクターはプラスミドまたはナノプラスミドである、請求項６５〜７１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７３】
前記トランスポゾンはpiggyBacトランスポゾン、Sleeping Beautyトランスポゾン、Helraiserトランスポゾン、またはTol2トランスポゾンである、請求項６５〜７２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７４】
前記トランスポゾンはpiggyBacトランスポゾンである、請求項６５〜７２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７５】
転位酵素をコードする配列を含むプラスミドまたはナノプラスミドをさらに含む、請求項６４〜７４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７６】
転位酵素をコードする前記配列はメッセンジャーＲＮＡ配列である、請求項７５に記載の組成物。
【請求項７７】
前記転位酵素はpiggyBac転位酵素である、請求項７６に記載の組成物。
【請求項７８】
前記piggyBac転位酵素は配列番号：17029を含むアミノ酸配列を含む、請求項７７に記載の組成物。
【請求項７９】
piggyBac転位酵素は機能亢進性変異体であり、この機能亢進性変異体は配列番号：17029の位置30、165、282 および538のうちの一箇所以上にアミノ酸置換を含む、請求項７７または７８に記載の組成物。
【請求項８０】
配列番号：17029の位置30にある前記アミノ酸置換はイソロイシン(I)がバリン(V)で置換されたもの(I30V)である、請求項７９に記載の組成物。
【請求項８１】
配列番号：17029の位置165にある前記アミノ酸置換はグリシン(G)がセリン(S)で置換されたもの(G165S)である、請求項７９に記載の組成物。
【請求項８２】
配列番号：17029の位置282にある前記アミノ酸置換はメチオニン(M)がバリン(V)で置換されたもの(M282V)である、請求項７９に記載の組成物。
【請求項８３】
配列番号：17029の位置538にある前記アミノ酸置換はアスパラギン(N)がリシン(K)で置換されたもの(N538K)である、請求項７９に記載の組成物。
【請求項８４】
前記転位酵素はSuper piggyBac(SPB)転位酵素である、請求項７８〜８３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８５】
前記Super piggyBac(SPB)転位酵素は配列番号：17030を含むアミノ酸配列を含む、請求項８４に記載の組成物。
【請求項８６】
前記第１のトランスポゾンおよび／または前記第２のトランスポゾンは選択遺伝子をさらに含む、請求項６４〜８５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８７】
前記選択遺伝子はneo、DHFR (ジヒドロ葉酸還元酵素)、TYMS (チミジル酸合成酵素)、MGMT(O(6)-メチルグアニン-DNAメチルトランスフェラーゼ)、多剤耐性遺伝子(MDR1)、ALDH1(アルデヒド脱水酵素1ファミリー、メンバーA1)、FRANCF、RAD51C (RAD51 Paralog C)、GCS(グルコシルセラミド・シンターゼ)、NKX2.2(NK2 ホメオボックス2)またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項８６に記載の組成物。
【請求項８８】
前記選択遺伝子はDHFRを含む、請求項８６に記載の組成物。
【請求項８９】
前記第１のトランスポゾンおよび／または前記第２のトランスポゾンは
(a)リガンド結合領域、
(b)リンカー、および
(c)切断型カスパーゼ９ポリペプチド、
を含む誘発性カスパーゼポリペプチドを含み、
前記誘発性カスパーゼポリペプチドは非ヒト配列を含まない、請求項６４〜８８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９０】
前記非ヒト配列は制限酵素部位である、請求項８９に記載の組成物。
【請求項９１】
前記リガンド結合領域誘発性カスパーゼポリペプチドはFK506結合タンパク質12(FKBP12)ポリペプチドを含む、請求項８９または９０に記載の組成物。
【請求項９２】
前記FK506結合タンパク質12 (FKBP12)ポリペプチドのアミノ酸配列は前記配列の位置36に修飾を含む、請求項９１に記載の組成物。
【請求項９３】
前記修飾は位置36にあるフェニルアラニン(F)がバリン(V)で置換されたもの(F36V)である、請求項９１に記載の組成物。
【請求項９４】
前記FKBP12ポリペプチドは
【化１２】
2020532987.tif 000336
(配列番号：17012)を含むアミノ酸配列によりコードされている、請求項９１〜９３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９５】
前記FKBP12ポリペプチドは
【化１３】
2020532987.tif 000337
(配列番号：17013) を含む核酸配列によりコードされている、請求項９４に記載の組成物。
【請求項９６】
前記誘発性アポトーシス促進性ポリペプチドの前記リンカー領域はGGGGS (配列番号：17014)を含むアミノ酸によりコードされている、請求項８９〜９５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９７】
前記誘発性アポトーシス促進性ポリペプチドの前記リンカー領域はGGAGGAGGAGGATCC (配列番号：17015)を含む核酸配列によりコードされている、請求項９６に記載の組成物。
【請求項９８】
前記誘発性アポトーシス促進性ポリペプチドの前記切断型カスパーゼ9ポリペプチドは前記配列の位置87にアルギニン（R）を含まないアミノ酸配列によりコードされている、請求項８９〜９７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９９】
前記誘発性アポトーシス促進性ポリペプチドの前記切断型カスパーゼ9ポリペプチドは前記配列の位置282にアラニン(A)を含まないアミノ酸配列によりコードされている、請求項８９〜９８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１００】
前記誘発性アポトーシス促進性ポリペプチドの前記切断型カスパーゼ9ポリペプチドは
【化１４】
2020532987.tif 000338
(配列番号：17016)を含むアミノ酸によりコードされている、請求項８９〜９９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０１】
前記誘発性アポトーシス促進性ポリペプチドの前記切断型カスパーゼ9ポリペプチドは
【化１５】
2020532987.tif 000339
(配列番号：17017)を含むアミノ酸配列によりコードされている、請求項１００に記載の組成物。
【請求項１０２】
前記誘発性アポトーシス促進性ポリペプチドは
【化１６】
2020532987.tif 000340
(配列番号：17018)を含むアミノ酸配列によりコードされている、請求項８９〜１０１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０３】
前記誘発性アポトーシス促進性ポリペプチドは
【化１７】
2020532987.tif 000341
(配列番号：17019)を含む核酸配列によりコードされている、請求項１０２に記載の組成物。
【請求項１０４】
前記第１のトランスポゾンおよび／または前記第２のトランスポゾンは少なくとも１種の自己切断型ペプチドを含む、請求項６４〜１０３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０５】
前記少なくとも１種の自己切断型ペプチドはT2Aペプチド、GSG-T2Aペプチド、E2Aペプチド、GSG-E2Aペプチド、F2Aペプチド、GSG-F2Aペプチド、P2Aペプチド、またはGSG-P2Aペプチドを含む、請求項１０４に記載の組成物。
【請求項１０６】
前記少なくとも１種の自己切断型ペプチドはT2Aペプチドを含む、請求項１０５に記載の組成物。
【請求項１０７】
前記T2AペプチドはEGRGSLLTCGDVEENPGP (配列番号：17020)を含むアミノ酸配列を含む、請求項１０５または１０６に記載の組成物。
【請求項１０８】
前記GSG-T2AペプチドはGSGEGRGSLLTCGDVEENPGP (配列番号：17021)を含むアミノ酸配列を含む、請求項１０５または１０６に記載の組成物。
【請求項１０９】
前記E2AペプチドはQCTNYALLKLAGDVESNPGP (配列番号：17022)を含むアミノ酸配列を含む、請求項１０５または１０６に記載の組成物。
【請求項１１０】
前記GSG-E2AペプチドはGSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP (配列番号：17023)を含むアミノ酸配列を含む、請求項１０５または１０６に記載の組成物。
【請求項１１１】
前記F2AペプチドはVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (配列番号：17024)を含むアミノ酸配列を含む、請求項１０５または１０６に記載の組成物。
【請求項１１２】
前記GSG-F2AペプチドはGSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (配列番号：17025)を含むアミノ酸配列を含む、請求項１０５または１０６に記載の組成物。
【請求項１１３】
前記P2AペプチドはATNFSLLKQAGDVEENPGP (配列番号：17026)を含むアミノ酸配列を含む、請求項１０５または１０６に記載の組成物。
【請求項１１４】
前記GSG-P2AペプチドはGSGATNFSLLKQAGDVEENPGP (配列番号：17027)を含むアミノ酸配列を含む、請求項１０５または１０６に記載の組成物。
【請求項１１５】
前記少なくとも１種の自己切断型ペプチドは 
(a)前記選択遺伝子と前記誘発性導入遺伝子構築物の間、または
(b)前記誘発性導入遺伝子構築物と前記誘発性カスパーゼポリペプチドの間
に位置する、請求項１０４〜１１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１６】
前記少なくとも１種の自己切断型ペプチドは 
(a)前記選択遺伝子と前記レポーター構築物の間、または
(b)前記レポーター構築物と前記誘発性カスパーゼポリペプチドの間
に位置する、請求項１０４〜１１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１７】
請求項１〜１１６のいずれか１項に記載の組成物を含む細胞。
【請求項１１８】
細胞中に条件遺伝子発現を誘発する方法であって、
(a)前記細胞を請求項１〜１１７のいずれか１項に記載の組成物に、前記誘発性導入遺伝子構築物の前記細胞のゲノムへの組み込みと前記外来レポーターの発現を可能にするのに適した条件で、接触させること、および
(b)前記外因性受容体とそれに特異的に結合するリガンドを接触させ、前記誘発性プロモーターを標的とする細胞内シグナルを伝達し、それにより遺伝子発現を修飾することを含む、方法。
【請求項１１９】
前記細胞は生体内、生体外、実験器具内、または原位置にある、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
前記細胞は免疫細胞である、請求項１１８または１１９に記載の方法。
【請求項１２１】
前記免疫系細胞はＴ細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、ナチュラルキラー(NK)様細胞、造血前駆体細胞、末梢血(PB) 由来のＴ細胞、または臍帯血(UCB)由来のＴ細胞である、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
前記免疫系細胞はＴ細胞である、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２３】
前記細胞は自己細胞である、請求項１１８〜１２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２４】
前記細胞は同種異系細胞である、請求項１１８〜１２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２５】
前記誘発性導入遺伝子構築物の前記細胞のゲノムへの組み込みと前記外来レポーターの発現を可能にするのに適した条件は生体内の条件を含む、請求項１１８〜１２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２６】
前記誘発性導入遺伝子構築物の前記細胞のゲノムへの組み込みと前記外来レポーターの発現を可能にするのに適した条件は、人体内の温度と実質的に同じ温度、人体内のCO2濃度と実質的に同じCO2濃度、人体内のO2濃度と実質的に同じO2濃度、および人体内の電解質濃度と実質的に同じ電解質濃度を有する水性環境または生理食塩水環境を含む、請求項１１８〜１２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２７】
前記リガンドは非天然起源である、請求項１１８〜１２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２８】
疾患または障害の治療を必要とする被験体の疾患または障害を治療する方法であって、
請求項１〜１１５のいずれか１項の組成物を前記被験体に、前記誘発性導入遺伝子構築物の前記細胞のゲノムへの組み込みと前記外来レポーターの発現を可能にするのに適した条件で、投与すること、および
前記外因性受容体が選択的に結合するリガンドを投与することを含み、
前記リガンドを前記外因性受容体に結合させることは、前記導入遺伝子を制御する前記誘発性プロモーターを標的とすべく細胞内シグナルを伝達し、前記導入遺伝子が発現され、前記導入遺伝子の産物は前記疾患または障害を治療するのに治療的に有効である、方法。
【請求項１２９】
前記導入遺伝子の産物は分泌タンパク質である、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３０】
前記分泌タンパク質は凝固因子である、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３１】
前記凝固因子は第ＩＸ因子である、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３２】
前記疾患または障害は凝固障害である、請求項１２８〜１３１のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[関連出願］
本願は、２０１７年９月８日出願の米国特許出願第６２／５５６，３１０号の利益を主張する。同出願の全内容を本明細書に援用する。
【０００２】
[配列表の援用］
２０１８年９月１０日に作成された５５，０５４ＫＢの大きさの「POTH-027/001WO SeqListing.txt」という名前のテキストファイルの全内容を本明細書に援用する。
【０００３】
[開示の分野］
本開示は分子生物学、より具体的にはキメラリガンド受容体（ＣＬＲ）介在性シグナルに応答する条件遺伝子発現系に使用する組成物および方法に関する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
[背景］
当技術分野では、治療薬の長期送達のために遺伝子修飾細胞における遺伝子発現を制御する方法が長年にわたり必要とされてきたが未だに解決していない。本開示は、細胞表面受容体を活性化すると条件付きで遺伝子を発現する遺伝子修飾細胞による解決策を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本開示は、（ａ）誘発性プロモーターをコードする配列および導入遺伝子をコードする配列を含む誘発性導入遺伝子構築物、および（ｂ）構成的プロモーターをコードする配列および外因性受容体をコードする配列を含む受容体構築物を含み、構築物（ａ）および構築物（ｂ）を細胞のゲノム配列に組み込むと、外因性受容体が発現され、リガンドを結合すると、前記外因性受容体は、（ａ）の誘発性プロモーターを標的とする細胞内シグナルを伝達して遺伝子発現を修飾する、組成物を提供する。特定の実施形態では、この組成物は遺伝子発現を増大することによって遺伝子発現を修飾する。特定の実施形態では、この組成物は遺伝子発現を低減することによって遺伝子発現を修飾する。特定の実施形態では、この組成物は一時的に（たとえば、外因性受容体へのリガンドの結合の間）遺伝子発現を修飾することによって遺伝子発現を修飾する。特定の実施形態では、この組成物は遺伝子発現を急性的に修飾する（たとえば、リガンドは可逆的に外因性受容体に結合する）。特定の実施形態では、この組成物は遺伝子発現を長期的に修飾する（たとえば、リガンドは不可逆的に外因性受容体に結合する）。
【０００６】
本開示の組成物の特定の実施形態では、この細胞は原核細胞であってもよい。本開示の原核細胞としては細菌および古細菌が挙げられるがこれらに限定されない。たとえば、本開示の細菌としてはリステリア・モノサイトゲネス（listeria monocytogenes）が挙げられるがこれに限定されない。
【０００７】
本開示の組成物の特定の実施形態では、細胞は真核細胞であってもよい。本開示の真核細胞としては、酵母、植物、藻類、昆虫、哺乳類、両生類、鳥類、爬虫類、有袋類、齧歯類、およびヒトが挙げられるがこれらに限定されない。好ましい本開示の真核細胞としてはヒト細胞が挙げられるがこれに限定されない。典型的な本開示のヒト細胞としては免疫細胞（たとえばＴ細胞）、骨髄系細胞および骨髄細胞（たとえば造血幹細胞（ＨＳＣ））が挙げられるがこれらに限定されない。
【０００８】
本開示の組成物の特定の実施形態では、（ｂ）の前記外因性受容体は細胞のゲノム配列に関して内因性の受容体を含む。典型的な受容体としては、細胞内受容体、細胞表面受容体、膜貫通受容体、リガンド開口型イオンチャネル、およびＧタンパク質共役受容体が挙げられるがこれらに限定されない。
【０００９】
本開示の組成物の特定の実施形態では、（ｂ）の前記外因性受容体は非天然起源の受容体を含む。特定の実施形態では、前記非天然起源の受容体は合成受容体、修飾受容体、組み換え受容体、変異受容体、またはキメラ受容体である。特定の実施形態では、前記非天然起源の受容体はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）から単離されるかＴＣＲに由来する１つ以上の配列を含む。特定の実施形態では、前記非天然起源の受容体は足場タンパク質から単離されるか足場タンパク質に由来する１つ以上の配列を含む。非天然起源の受容体が膜貫通ドメインを含まない実施形態を含む特定の実施形態では、非天然起源の受容体は、非天然起源の受容体との接触後に細胞内シグナルを伝達する第２の膜貫通受容体、膜結合受容体、および／または細胞内受容体と相互作用する。
【００１０】
本開示の組成物の特定の実施形態では、（ｂ）の前記外因性受容体は非天然起源の受容体を含む。特定の実施形態では、前記非天然起源の受容体は合成受容体、修飾受容体、組み換え受容体、変異受容体、またはキメラ受容体である。特定の実施形態では、前記非天然起源の受容体はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）から単離されるかＴＣＲに由来する１つ以上の配列を含む。特定の実施形態では、前記非天然起源の受容体は足場タンパク質から単離されるか足場タンパク質に由来する１つ以上の配列を含む。特定の実施形態では、前記非天然起源の受容体は膜貫通ドメインを含む。特定の実施形態では、前記非天然起源の受容体は細胞内シグナルを伝達する細胞内受容体と相互作用する。特定の実施形態では、前記非天然起源の受容体は細胞内シグナル伝達ドメインを含む。特定の実施形態では、前記非天然起源の受容体はキメラリガンド受容体（ＣＬＲ）である。特定の実施形態では、前記ＣＬＲはキメラ抗原受容体である。
【００１１】
本開示の組成物の特定の実施形態では、（ｂ）の前記外因性受容体は非天然起源の受容体を含む。特定の実施形態では、前記ＣＬＲはキメラ抗原受容体である。特定の実施形態では、前記キメラリガンド受容体は（ａ）少なくとも足場タンパク質を含むリガンド認識領域を含む外部ドメイン、（ｂ）膜貫通ドメイン、および（ｃ）少なくとも１つの共刺激ドメインを含む内部ドメインを含む。特定の実施形態では、前記外部ドメイン（ａ）はシグナルペプチドをさらに含む。特定の実施形態では、前記外部ドメイン（ａ）は前記リガンド認識領域と前記膜貫通ドメインの間にさらにヒンジを含む。特定の実施形態では、前記シグナルペプチドはヒトＣＤ２、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ１９、ＣＤ２８、４−１ＢＢまたはＧＭ−ＣＳＦＲシグナルペプチドをコードする配列を含む。特定の実施形態では、前記シグナルペプチドはヒトＣＤ８αシグナルペプチドをコードする配列を含む。特定の実施形態では、前記シグナルペプチドはMALPVTALLLPLALLLHAARP（配列番号17000）を含むアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、前記シグナルペプチドは
【化１】
2020532987.tif 000003
（配列番号17001）を含む核酸配列によってコードされている。特定の実施形態では、前記膜貫通ドメインはヒトＣＤ２、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ１９、ＣＤ２８、４−１ＢＢまたはＧＭ−ＣＳＦＲ膜貫通ドメインをコードする配列を含む。特定の実施形態では、前記膜貫通ドメインはヒトＣＤ８α膜貫通ドメインをコードする配列を含む。特定の実施形態では、前記膜貫通ドメインはIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC（配列番号17002）を含むアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、前記膜貫通ドメインは
【化２】
2020532987.tif 000004
（配列番号17003）を含む核酸配列によりコードされている。特定の実施形態では、前記内部ドメインはヒトＣＤ３ζ内部ドメインを含む。特定の実施形態では、前記少なくとも１つの共刺激ドメインはヒト４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ３ζ、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、ＭｙＤ８８、ＯＸ−４０細胞内のセグメント、またはそれらの任意の組み合わせを含む。特定の実施形態では、前記少なくとも１つの共刺激ドメインはヒトＣＤ３ζおよび／または４−１ＢＢ共刺激ドメインを含む。特定の実施形態では、前記ＣＤ３ζ共刺激ドメインは
【化３】
2020532987.tif 000005
（配列番号17004）を含むアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、前記ＣＤ３ζ共刺激ドメインは
【化４】
2020532987.tif 000006
（配列番号17005）を含む核酸配列によりコードされている。特定の実施形態では、前記４−１ＢＢ共刺激ドメインは
【化５】
2020532987.tif 000007
（配列番号17006）を含むアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、前記４−１ＢＢ共刺激ドメインは
【化６】
2020532987.tif 000008
（配列番号17007）を含む核酸配列によりコードされている。特定の実施形態では、前記４−１ＢＢ共刺激ドメインは前記膜貫通ドメインと前記ＣＤ３ζ共刺激ドメインの間に位置する。特定の実施形態では、前記ヒンジはヒトＣＤ８α、ＩｇＧ４、および／またはＣＤ４配列に由来する配列を含む。特定の実施形態では、前記ヒンジはヒトＣＤ８α配列に由来する配列を含む。特定の実施形態では、前記ヒンジは
【化７】
2020532987.tif 000009
（配列番号17008）を含むアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、前記ヒンジは
【化８】
2020532987.tif 000010
（配列番号17028）を含む核酸配列によりコードされている。特定の実施形態では、前記ヒンジは
【化９】
2020532987.tif 000011
（配列番号17009）を含む核酸配列によりコードされている。特定の実施形態では、前記少なくとも１つのタンパク質足場は前記リガンドに特異的に結合する。
【００１２】
本開示の組成物の特定の実施形態では、（ｂ）の前記外因性受容体は非天然起源の受容体を含む。特定の実施形態では、前記ＣＬＲはキメラ抗原受容体である。特定の実施形態では、前記キメラリガンド受容体は（ａ）少なくとも足場タンパク質を含むリガンド認識領域を含む外部ドメイン、（ｂ）膜貫通ドメイン、および（ｃ）少なくとも１つの共刺激ドメインを含む内部ドメインを含む。特定の実施形態では、前記少なくとも１つのタンパク質足場は抗体、抗体断片、単一ドメイン抗体、単鎖抗体、抗体模倣物、またはセンチリン（Centyrin）を含む。特定の実施形態では、前記リガンド認識領域は抗体、抗体断片、単一ドメイン抗体、単鎖抗体、抗体模倣物、およびセンチリンのうちの１種以上を含む。特定の実施形態では、前記単一ドメイン抗体はＶＨＨを含むかまたはＶＨＨからなる。特定の実施形態では、前記抗体模倣物はアフィボディ、アフィリン、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アンチカリン、アビマー、ＤＡＲＰｉｎ、フィノマー、クニッツ（Kunitz）ドメインペプチドまたはモノボディ（monobody）を含むかまたはこれらからなる。特定の実施形態では、前記センチリンは少なくとも１つのフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインの共通配列を含むかまたはこれらからなる。
【００１３】
本開示の組成物の特定の実施形態では、（ｂ）の前記外因性受容体は非天然起源の受容体を含む。特定の実施形態では、前記ＣＬＲはキメラ抗原受容体である。特定の実施形態では、前記キメラリガンド受容体は（ａ）少なくとも足場タンパク質を含むリガンド認識領域を含む外部ドメイン、（ｂ）膜貫通ドメイン、および（ｃ）少なくとも１つの共刺激ドメインを含む内部ドメインを含む。特定の実施形態では、前記センチリンは少なくとも１つのフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインの共通配列を含むかまたはこれらからなる。特定の実施形態では、前記少なくとも１つのフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインはヒトタンパク質に由来する。特定の実施形態では、前記ヒトタンパク質はテネイシンＣである。特定の実施形態では、前記共通配列は
【化１０】
2020532987.tif 000012
（配列番号17010）を含む。特定の実施形態では、前記共通配列は
【化１１】
2020532987.tif 000013
（配列番号17011）を含む。特定の実施形態では、前記共通配列は、（ａ）前記共通配列の位置１３〜１６にあるアミノ酸残基TEDSを含むかまたはこれらからなるＡ−Ｂループ；（ｂ）前記共通配列の位置２２〜２８にあるアミノ酸残基TAPDAAFを含むかまたはこれらからなるＢ−Ｃループ；（ｃ）前記共通配列の位置３８〜４３にあるアミノ酸残基SEKVGEを含むかまたはこれらからなるＣ−Ｄループ；（ｄ）前記共通配列の位置５１〜５４にあるアミノ酸残基GSERを含むかまたはこれらからなるＤ−Ｅループ；（ｅ）前記共通配列の位置６０〜６４にあるアミノ酸残基GLKPGを含むあるいはこれらからなるＥ−Ｆループ；（ｆ）前記共通配列の位置７５〜８１にあるアミノ酸残基KGGHRSNを含むあるいはこれらからなるＦ−Ｇループ；または（ｇ）前記（ａ）から（ｆ）の任意の組み合わせ内の１箇所以上で修飾されている。特定の実施形態では、前記センチリンは少なくとも５つのフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインの共通配列を含む。特定の実施形態では、前記センチリンは少なくとも１０のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインの共通配列を含む。特定の実施形態では、前記センチリンは少なくとも１５のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインの共通配列を含む。特定の実施形態では、前記足場は、１０-9Ｍ以下、１０-10Ｍ以下、１０-11Ｍ以下、１０-12Ｍ以下、１０-13Ｍ以下、１０-14Ｍ以下、および１０-15Ｍ以下のＫD値から選ばれた少なくとも１つの親和性で抗原と結合する。特定の実施形態では、前記ＫD値は表面プラズモン共鳴で決定される。本開示の組成物の特定の実施形態では、（ｂ）の前記外因性受容体は非天然起源の受容体を含む。特定の実施形態では、前記ＣＬＲはキメラ抗原受容体である。特定の実施形態では、前記キメラリガンド受容体は（ａ）少なくともＶＨＨ抗体を含むリガンド認識領域を含む外部ドメイン、（ｂ）膜貫通ドメイン、および（ｃ）少なくとも１つの共刺激ドメインを含む内部ドメインを含む。特定の実施形態では、ＶＨＨはラクダ由来である。その代わりに、あるいはそれに加えて、特定の実施形態ではＶＨＨはヒト化されている。特定の実施形態では、配列は抗体の２つの重鎖可変領域を含み、ＶＨＨの相補性決定領域（ＣＤＲ）はヒト配列である。
【００１４】
本開示の組成物の特定の実施形態では、（ｂ）の前記構成的プロモーターをコードする配列はＥＦ１αプロモーターをコードする配列を含む。本開示の組成物の特定の実施形態では、（ｂ）の前記構成的プロモーターをコードする配列はＣＭＶプロモーター、Ｕ６プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＰＧＫ１プロモーター、Ｕｂｃプロモーター、ヒトβアクチンプロモーター、ＣＡＧプロモーター、またはＥＦ１αプロモーターをコードする配列を含む。
【００１５】
本開示の組成物の特定の実施形態では、（ａ）の前記誘発性プロモーターをコードする配列はＮＦκＢプロモーターをコードする配列を含む。本開示の組成物の特定の実施形態では、（ａ）の前記誘発性プロモーターをコードする配列はインターフェロン（ＩＦＮ）プロモーターをコードする配列またはインターロイキン２プロモーターをコードする配列を含む。本開示の組成物の特定の実施形態では、（ａ）の前記誘発性プロモーターをコードする配列は核内受容体サブファミリー４グループＡメンバー１（ＮＲ４Ａ１；ＮＵＲ７７としても知られる）プロモーターをコードする配列またはＮＲ４Ａ１プロモーターをコードする配列を含む。本開示の組成物の特定の実施形態では、（ａ）の前記誘発性プロモーターをコードする配列はＴ細胞表面糖タンパク質ＣＤ５（ＣＤ５）プロモーターをコードする配列またはＣＤ５プロモーターをコードする配列を含む。特定の実施形態では、前記インターフェロン（ＩＦＮ）プロモーターはＩＦＮγプロモーターである。本開示の組成物の特定の実施形態では、誘発性プロモーターはサイトカインまたはケモカインのプロモーターから単離されるかこれらに由来する。特定の実施形態では、このサイトカインまたはケモカインはＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１７Ａ／Ｆ、ＩＬ２１、ＩＬ２２、ＩＬ２３、形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）、コロニー刺激因子２（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦα）、ＬＴα、パーフォリン、グランザイムＣ（Ｇｚｍｃ）、グランザイムＢ（Ｇｚｍｂ）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド５（ＣＣＬ５）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド４（ＣＣＬ４）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド３（ＣＣＬ３）、Ｘ−Ｃモチーフケモカインリガンド（ＸＣＬ１）、およびＬＩＦインターロイキン６ファミリーサイトカイン（Ｌｉｆ）を含む。
【００１６】
（ａ）の前記誘発性プロモーターをコードする配列がＮＲ４Ａ１プロモーターをコードする配列またはＮＲ４Ａ１プロモーターをコードする配列を含む実施形態を含む本開示の組成物の特定の実施形態では、ＮＲ４Ａ１プロモーターはＴ細胞ではＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の刺激、Ｂ細胞ではＢ細胞受容体（ＢＣＲ）の刺激によって活性化され、したがって、本開示のＴ細胞またはＢ細胞をそれぞれＴＣＲまたはＢＣＲによって活性化するとＮＲ４Ａ１プロモーターに制御されている任意の配列の発現が誘発される。
【００１７】
（ａ）の前記誘発性プロモーターをコードする配列がＣＤ５プロモーターをコードする配列またはＣＤ５プロモーターをコードする配列を含む実施形態を含む本開示の組成物の特定の実施形態では、ＣＤ５プロモーターはＴ細胞でＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の刺激によって活性化され、したがって、本開示のＴ細胞をＴＣＲによって活性化するとＣＤ５プロモーターに制御されている任意の配列の発現が誘発される。
【００１８】
本開示の組成物の特定の実施形態では、誘発性プロモーターは、細胞の分化、活性化、枯渇、および機能に関与する表面タンパク質を含む遺伝子のプロモーターから単離されるかこれらに由来する。特定の実施形態では、この遺伝子はＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ−３、ＧＩＴＲ、ＭＨＣＩＩ、ＣＯＸ−２、ＦＡＳＬ、および４−１ＢＢを含む。
【００１９】
本開示の組成物の特定の実施形態では、誘発性プロモーターは、ＣＤ代謝および分化に関与する遺伝子のプロモーターから単離されるかこれらに由来する。本開示の組成物の特定の実施形態では、誘発性プロモーターは、Ｎｒ４ａ１、Ｎｒ４ａ３、Ｔｎｆｒｓｆ９（４−１ＢＢ）、Ｓｅｍａ７ａ、Ｚｆｐ３６ｌ２、Ｇａｄｄ４５ｂ、Ｄｕｓｐ５、Ｄｕｓｐ６、およびＮｅｔｏ２のプロモーターから単離されるかこれらに由来する。
【００２０】
本開示の組成物の特定の実施形態では、前記導入遺伝子は前記細胞の前記ゲノム配列に関して内因性の配列を含む。
【００２１】
本開示の組成物の特定の実施形態では、前記導入遺伝子は前記細胞の前記ゲノム配列に関して外因性の配列を含む。特定の実施形態では、前記外因性の配列は前記細胞の前記ゲノム内の内因性の配列の配列変異体である。特定の実施形態では、前記外因性配列は前記細胞中に完全あるいは部分的に欠けている遺伝子の野生型の配列であり、前記遺伝子は健常細胞のゲノムに完全に存在する。特定の実施形態では、前記外因性配列は前記細胞のゲノムに関して、合成配列、修飾配列、組み換え型配列、キメラ配列、または非天然起源の配列である。特定の実施形態では、前記導入遺伝子は分泌タンパク質をコードする。特定の実施形態では、前記分泌タンパク質は、それを必要とする被験体の疾患または障害を治療するのに有効な水準で細胞から産生および／または分泌される。
【００２２】
本開示の組成物の特定の実施形態では、前記誘発性導入遺伝子構築物（ａ）は第１のトランスポゾンに含まれ、前記受容体構築物（ｂ）は第２のトランスポゾンに含まれる。本開示の組成物の特定の実施形態では、前記第１のトランスポゾンは第１のベクターに含まれ、前記第２のトランスポゾンは第２のベクターに含まれる。本開示の組成物の特定の実施形態では、前記第１のトランスポゾンおよび前記第２のトランスポゾンはベクターに含まれる。特定の実施形態では、前記第１のトランスポゾンおよび前記第２のトランスポゾンは同じ方向に配向されている。特定の実施形態では、前記第１のトランスポゾンおよび前記第２のトランスポゾンは反対方向に配向されている。特定の実施形態では、前記ベクターはプラスミドである。特定の実施形態では、前記ベクターはナノプラスミドである。
【００２３】
本開示の組成物の特定の実施形態では、前記ベクターはウイルスベクターである。本開示のウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、またはそれらの任意の組み合わせから単離されるかこれらに由来する配列を含んでいてもよい。ウイルスベクターはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）から単離されるかＡＶＶに由来する配列を含んでいてもよい。ウイルスベクターは組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を含んでいてもよい。本開示の典型的なアデノ随伴ウイルスおよび組み換えアデノ随伴ウイルスは、本開示の構築物をコードする配列の隣のｃｉｓに位置する２つ以上の末端逆位（ＩＴＲ）配列を含む。本開示の典型的なアデノ随伴ウイルスおよび組み換えアデノ随伴ウイルスとしてはすべての血清型（たとえば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９）が挙げられるがこれらに限定されない。本開示の典型的なアデノ随伴ウイルスおよび組み換えアデノ随伴ウイルスとしては、自己相補型ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）および１つの血清型のゲノムと別の血清型のカプシドを含むＡＡＶ複合型（たとえば、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ−ＤＪ、およびＡＡＶ−ＤＪ８）が挙げられるがこれらに限定されない。本開示の典型的なアデノ随伴ウイルスおよび組み換えアデノ随伴ウイルスとしては、ｒＡＡＶ−ＬＫ０３、ならびにＮＰ−５９およびＮＰ−８４のカプシド変異体を持つＡＡＶが挙げられるがこれらに限定されない。
【００２４】
本開示の組成物の特定の実施形態では、前記ベクターはナノ粒子である。本開示の典型的なナノ粒子ベクターとしては、核酸（たとえば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、合成ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、またはそれらの任意の組み合わせ）、アミノ酸（Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、合成アミノ酸、修飾アミノ酸、またはそれらの任意の組み合わせ）、ポリマー（たとえばポリマーソーム）、ミセル、脂質（たとえばリポソーム）、有機分子（たとえば、炭素原子、シート、繊維、チューブ）、無機分子（リン酸カルシウムまたは金）、あるいはそれらの任意の組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。ナノ粒子ベクターは受動的または能動的に細胞膜を通じて輸送されてもよい。
【００２５】
本開示の組成物の特定の実施形態では、前記第１のトランスポゾンまたは前記第２のトランスポゾンはpiggyBacトランスポゾンである。特定の実施形態では、前記第１のトランスポゾンおよび第２のトランスポゾンはpiggyBacトランスポゾンである。特定の実施形態では、前記組成物は転移酵素をコードする配列を含むプラスミドまたはナノプラスミドをさらに含む。特定の実施形態では、転移酵素をコードする前記配列はｍＲＮＡ配列である。特定の実施形態では、前記転移酵素はpiggyBac転移酵素である。特定の実施形態では、前記piggyBac転移酵素は配列番号１を含むアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、前記piggyBac転移酵素は機能亢進性変異体であり、この機能亢進性変異体は配列番号１の位置３０、１６５、２８２および５３８のうちの１箇所以上にアミノ酸置換を含む。特定の実施形態では、配列番号１の位置３０にある前記アミノ酸置換はイソロイシン（Ｉ）がバリン（Ｖ）で置換されたもの（Ｉ３０Ｖ）である。特定の実施形態では、配列番号１の位置１６５にある前記アミノ酸置換はグリシン（Ｇ）がセリン（Ｓ）で置換されたもの（Ｇ１６５Ｓ）である。特定の実施形態では、配列番号１の位置２８２にある前記アミノ酸置換はメチオニン（Ｍ）がバリン（Ｖ）で置換されたもの（Ｍ２８２Ｖ）である。特定の実施形態では、配列番号１の位置５３８にある前記アミノ酸置換はアスパラギン（Ｎ）がリシン（Ｋ）で置換されたもの（Ｎ５３８Ｋ）である。特定の実施形態では、前記転移酵素はSuper piggyBac（ＳＰＢ）転移酵素である。特定の実施形態では、前記Super piggyBac（ＳＰＢ）転移酵素は配列番号２を含むアミノ酸配列を含む。
【００２６】
本開示の特定の実施形態では、前記転移酵素はpiggyBac（商標）（ＰＢ）転移酵素である。このpiggyBac（ＰＢ）転移酵素は、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはその間の任意の割合で以下の配列と同一のアミノ酸配列を含むか、そのようなアミノ酸配列からなってもよい：
【化１２】
2020532987.tif 000014
（配列番号17029）。
【００２７】
本開示の特定の実施形態では、前記転移酵素は、以下の配列の位置３０、１６５、２８２、５３８のうちの１箇所以上にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むか、そのようなアミノ酸配列からなるpiggyBac（商標）（ＰＢ）転移酵素である：
【化１３】
2020532987.tif 000015
（配列番号17029）。
【００２８】
特定の実施形態では、前記転移酵素は配列番号１の配列の位置３０、１６５、２８２、５３８のうちの２箇所以上にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むか、そのようなアミノ酸配列からなるpiggyBac（商標）（ＰＢ）転移酵素である。特定の実施形態では、前記転移酵素は配列番号１の配列の位置３０、１６５、２８２、５３８のうちの３箇所以上にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むか、そのようなアミノ酸配列からなるpiggyBac（商標）（ＰＢ）転移酵素である。特定の実施形態では、前記転移酵素は配列番号１の配列の位置３０、１６５、２８２、および５３８のそれぞれにアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むか、そのようなアミノ酸配列からなるpiggyBac（商標）（ＰＢ）転移酵素である。特定の実施形態では、配列番号１の配列の位置３０にある前記アミノ酸置換はイソロイシン（Ｉ）がバリン（Ｖ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号１の配列の位置１６５にある前記アミノ酸置換はグリシン（Ｇ）がセリン（Ｓ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号１の配列の位置２８２にある前記アミノ酸置換はメチオニン（Ｍ）がバリン（Ｖ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号１の配列の位置５３８にある前記アミノ酸置換はアスパラギン（Ｎ）がリシン（Ｋ）で置換されたものである。
【００２９】
本開示の特定の実施形態では、前記転移酵素はSuper piggyBac（商標）（ＳＰＢ）転移酵素である。特定の実施形態では、本開示のSuper piggyBac（商標）（ＳＰＢ）転移酵素は、配列番号１の配列の位置３０にある前記アミノ酸置換はイソロイシン（Ｉ）がバリン（Ｖ）で置換されたものであり、位置１６５にある前記アミノ酸置換はグリシン（Ｇ）がセリン（Ｓ）で置換されたものであり、位置２８２にある前記アミノ酸置換はメチオニン（Ｍ）がバリン（Ｖ）で置換されたものであり、位置５３８にある前記アミノ酸置換はアスパラギン（Ｎ）がリシン（Ｋ）で置換されたものであるアミノ酸配列を含むかそのようなアミノ酸配列からなってもよい。特定の実施形態では、このSuper piggyBac（商標）（ＳＰＢ）転移酵素は、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはその間の任意の割合で以下の配列と同一のアミノ酸配列を含むか、そのようなアミノ酸配列からなってもよい：
【化１４】
2020532987.tif 000016
（配列番号17030）。
【００３０】
前記転移酵素が位置３０、１６５、２８２、および／または５３８に上記の変異を含む実施形態を含む、本開示の特定の実施形態では、piggyBac（商標）またはSuper piggyBac（商標）転移酵素は、配列番号１または配列番号２の配列の位置３、４６、８２、１０３、１１９、１２５、１７７、１８０、１８５、１８７、２００、２０７、２０９、２２６、２３５、２４０、２４１、２４３、２５８、２９６、２９８、３１１、３１５、３１９、３２７、３２８、３４０、４２１、４３６、４５６、４７０、４８６、５０３、５５２、５７０、および５９１のうちの１箇所以上にアミノ酸置換をさらに含んでもよい。前記転移酵素が位置３０、１６５、２８２、および／または５３８に上記の変異を含む実施形態を含む特定の実施形態では、piggyBac（商標）またはSuper piggyBac（商標）転移酵素は、位置４６、１１９、１２５、１７７、１８０、１８５、１８７、２００、２０７、２０９、２２６、２３５、２４０、２４１、２４３、２９６、２９８、３１１、３１５、３１９、３２７、３２８、３４０、４２１、４３６、４５６、４７０、４８５、５０３、５５２、および５７０のうちの１箇所以上にアミノ酸置換をさらに含んでもよい。特定の実施形態では、配列番号１または配列番号２の位置３にあるアミノ酸置換はセリン（Ｓ）がアスパラギン（Ｎ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号１または配列番号２の位置４６にあるアミノ酸置換はアラニン（Ａ）がセリン（Ｓ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号１または配列番号２の位置４６にあるアミノ酸置換はアラニン（Ａ）がスレオニン（Ｔ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号１または配列番号２の位置８２にあるアミノ酸置換はイソロイシン（Ｉ）がトリプトファン（Ｗ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号１または配列番号２の位置１０３にあるアミノ酸置換はセリン（Ｓ）がプロリン（Ｐ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号１または配列番号２の位置１１９にあるアミノ酸置換はアルギニン（Ｒ）がプロリン（Ｐ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号１または配列番号２の位置１２５にあるアミノ酸置換はシステイン（Ｃ）がアラニン（Ａ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号１または配列番号２の位置１２５にあるアミノ酸置換はシステイン（Ｃ）がロイシン（Ｌ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号１または配列番号２の位置１７７にあるアミノ酸置換はチロシン（Ｙ）がリシン（Ｋ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号１または配列番号２の位置１７７にあるアミノ酸置換はチロシン（Ｙ）がヒスチジン（Ｈ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号１または配列番号２の位置１８０にあるアミノ酸置換はフェニルアラニン（Ｆ）がロイシン（Ｌ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号１または配列番号２の位置１８０にあるアミノ酸置換はフェニルアラニン（Ｆ）がイソロイシン（Ｉ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号１または配列番号２の位置１８０にあるアミノ酸置換はフェニルアラニン（Ｆ）がバ���ン（Ｖ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号１または配列番号２の位置１８５にあるアミノ酸置換はメチオニン（Ｍ）がロイシン（Ｌ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号１または配列番号２の位置１８７にあるアミノ酸置換はアラニン（Ａ）がグリシン（Ｇ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号１または配列番号２の位置２００にあるアミノ酸置換はフェニルアラニン（Ｆ）がトリプトファン（Ｗ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号１または配列番号２の位置２０７にあるアミノ酸置換はバリン（Ｖ）がプロリン（Ｐ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号１または配列番号２の位置２０９にあるアミノ酸置換はバリン（Ｖ）がフェニルアラニン（Ｆ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号１または配列番号２の位置２２６にあるアミノ酸置換はメチオニン（Ｍ）がフェニルアラニン（Ｆ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号１または配列番号２の位置２３５にあるアミノ酸置換はロイシン（Ｌ）がアルギニン（Ｒ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号１または配列番号２の位置２４０にあるアミノ酸置換はバリン（Ｖ）がリシン（Ｋ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号１または配列番号２の位置２４１にあるアミノ酸置換はフェニルアラニン（Ｆ）がロイシン（Ｌ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号１または配列番号２の位置２４３にあるアミノ酸置換はプロリン（Ｐ）がリシン（Ｋ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号１または配列番号２の位置２５８にあるアミノ酸置換はアスパラギン（Ｎ）がセリン（Ｓ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号１または配列番号２の位置２９６にあるアミノ酸置換はロイシン（Ｌ）がトリプトファン（Ｗ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号１または配列番号２の位置２９６にあるアミノ酸置換はロイシン（Ｌ）がチロシン（Ｙ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号１または配列番号２の位置２９６にあるアミノ酸置換はロイシン（Ｌ）がフェニルアラニン（Ｆ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号１または配列番号２の位置２９８にあるアミノ酸置換はメチオニン（Ｍ）がロイシン（Ｌ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号１または配列番号２の位置２９８にあるアミノ酸置換はメチオニン（Ｍ）がアラニン（Ａ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号１または配列番号２の位置２９８にあるアミノ酸置換はメチオニン（Ｍ）がバリン（Ｖ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号１または配列番号２の位置３１１にあるアミノ酸置換はプロリン（Ｐ）がイソロイシン（Ｉ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号１または配列番号２の位置３１１にあるアミノ酸置換はプロリン（Ｐ）がバリンで置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号１または配列番号２の位置３１５にあるアミノ酸置換はアルギニン（Ｒ）がリシン（Ｋ）で置換されたものである。特定の���施形態では、配列番号１または配列番号２の位置３１９にあるアミノ酸置換はスレオニン（Ｔ）がグリシン（Ｇ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号１または配列番号２の位置３２７にあるアミノ酸置換はチロシン（Ｙ）がアルギニン（Ｒ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号１または配列番号２の位置３２８にあるアミノ酸置換はチロシン（Ｙ）がバリン（Ｖ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号１または配列番号２の位置３４０にあるアミノ酸置換はシステイン（Ｃ）がグリシン（Ｇ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号１または配列番号２の位置３４０にあるアミノ酸置換はシステイン（Ｃ）がロイシン（Ｌ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号１または配列番号２の位置４２１にあるアミノ酸置換はアスパラギン酸（Ｄ）がヒスチジン（Ｈ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号１または配列番号２の位置４３６にあるアミノ酸置換はバリン（Ｖ）がイソロイシン（Ｉ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号１または配列番号２の位置４５６にあるアミノ酸置換はメチオニン（Ｍ）がチロシン（Ｙ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号１または配列番号２の位置４７０にあるアミノ酸置換はロイシン（Ｌ）がフェニルアラニン（Ｆ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号１または配列番号２の位置４８５にあるアミノ酸置換はセリン（Ｓ）がリシン（Ｋ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号１または配列番号２の位置５０３にあるアミノ酸置換はメチオニン（Ｍ）がロイシン（Ｌ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号１または配列番号２の位置５０３にあるアミノ酸置換はメチオニン（Ｍ）がイソロイシン（Ｉ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号１または配列番号２の位置５５２にあるアミノ酸置換はバリン（Ｖ）がリシン（Ｋ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号１または配列番号２の位置５７０にあるアミノ酸置換はアラニン（Ａ）がスレオニン（Ｔ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号１または配列番号２の位置５９１にあるアミノ酸置換はグルタミン（Ｑ）がプロリン（Ｐ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号１または配列番号２の位置５９１にあるアミノ酸置換はグルタミン（Ｑ）がアルギニン（Ｒ）で置換されたものである。
【００３１】
前記転移酵素が位置３０、１６５、２８２、および／または５３８に上記の変異を含む実施形態を含む、本開示の特定の実施形態では、piggyBac（商標）転移酵素は、配列番号１または配列番号２の配列の位置１０３、１９４、３７２、３７５、４５０、５０９、および５７０のうちの１箇所以上にアミノ酸置換を含んでもよく、またはSuper piggyBac（商標）転移酵素は、配列番号１または配列番号２の配列の位置１０３、１９４、３７２、３７５、４５０、５０９、および５７０のうちの１箇所以上にアミノ酸置換をさらに含んでもよい。前記転移酵素が位置３０、１６５、２８２、および／または５３８に上記の変異を含む実施形態を含む、本開示の方法の特定の実施形態では、piggyBac（商標）またはSuper piggyBac（商標）転移酵素は、配列番号１または配列番号２の配列の位置１０３、１９４、３７２、３７５、４５０、５０９、および５７０のうちの２箇所、３箇所、４箇所、５箇所、６箇所またはそれ以上の箇所にアミノ酸置換をさらに含んでもよい。前記転移酵素が位置３０、１６５、２８２、および／または５３８に上記の変異を含む実施形態を含む特定の実施形態では、piggyBac（商標）またはSuper piggyBac（商標）転移酵素は、配列番号１または配列番号２の配列の位置１０３、１９４、３７２、３７５、４５０、５０９、および５７０にアミノ酸置換をさらに含んでもよい。特定の実施形態では、配列番号１または配列番号２の位置１０３にあるアミノ酸置換はセリン（Ｓ）がプロリン（Ｐ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号１または配列番号２の位置１９４にあるアミノ酸置換はメチオニン（Ｍ）がバリン（Ｖ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号１または配列番号２の位置３７２にあるアミノ酸置換はアルギニン（Ｒ）がアラニン（Ａ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号１または配列番号２の位置３７５にあるアミノ酸置換はリシン（Ｋ）がアラニン（Ａ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号１または配列番号２の位置４５０にあるアミノ酸置換はアスパラギン酸（Ｄ）がアスパラギン（Ｎ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号１または配列番号２の位置５０９にあるアミノ酸置換はセリン（Ｓ）がグリシン（Ｇ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号１または配列番号２の位置５７０にあるアミノ酸置換はアスパラギン（Ｎ）がセリン（Ｓ）で置換されたものである。特定の実施形態では、piggyBac（商標）転移酵素は配列番号１の位置１９４にメチオニン（Ｍ）のバリン（Ｖ）による置換を含んでもよい。piggyBac（商標）転移酵素が配列番号１の位置１９４にメチオニン（Ｍ）のバリン（Ｖ）による置換を含んでもよい実施形態を含む特定の実施形態では、piggyBac（商標）転移酵素は配列番号１または配列番号２の配列の位置３７２、３７５、および４５０にアミノ酸置換をさらに含んでもよい。特定の実施形態では、piggyBac（商標）転移酵素は配列番号１の位置１９４にメチオニン（Ｍ）のバリン（Ｖ）による置換、配列番号１の位置３７２にアルギニン（Ｒ）のアラニン（Ａ）による置換、および配列番号１の位置３７５にリシン（Ｋ）のアラニン（Ａ）による置換を含んでもよい。���定の実施形態では、piggyBac（商標）転移酵素は配列番号１の位置１９４にメチオニン（Ｍ）のバリン（Ｖ）による置換、配列番号１の位置３７２にアルギニン（Ｒ）のアラニン（Ａ）による置換、配列番号１の位置３７５にリシン（Ｋ）のアラニン（Ａ）による置換、および配列番号１の位置４５０にアスパラギン酸（Ｄ）のアスパラギン（Ｎ）による置換を含んでもよい。
【００３２】
本開示の特定の実施形態では、転移酵素はスリーピング・ビューティ（Sleeping Beauty、休眠状態の酵素の意味）転移酵素（たとえば米国特許第9,228,180号を参照のこと。同文献の全内容を本明細書に援用する）。特定の実施形態では、スリーピング・ビューティ転移酵素は機能亢進性スリーピング・ビューティ（ＳＢ１００Ｘ）転移酵素である。特定の実施形態では、スリーピング・ビューティ転移酵素は以下の配列と少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を含む：
【化１５】
2020532987.tif 000017
（配列番号17031）。
【００３３】
スリーピング・ビューティ転移酵素が機能亢進性スリーピング・ビューティ（ＳＢ１００Ｘ）転移酵素である実施形態を含む特定の実施形態では、スリーピング・ビューティ転移酵素は以下の配列と少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を含む：
【化１６】
2020532987.tif 000018
（配列番号17032）。
【００３４】
本開示の組成物の特定の実施形態では、前記第１のトランスポゾンおよび／または前記第２のトランスポゾンは選択遺伝子をさらに含む。特定の実施形態では、前記選択遺伝子はネオマイシン、ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸還元酵素）、ＴＹＭＳ（チミジル酸合成酵素）、ＭＧＭＴ（Ｏ（６）−メチルグアニン−ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ）、多剤耐性遺伝子（ＭＤＲ１）、ＡＬＤＨ１（アルデヒド脱水酵素１ファミリー、メンバーＡ１）、ＦＲＡＮＣＦ、ＲＡＤ５１Ｃ（ＲＡＤ５１パラログＣ）、ＧＣＳ（グルコシルセラミド・シンターゼ）、ＮＫＸ２．２（ＮＫ２ホメオボックス２）またはそれらの任意の組み合わせを含む。特定の実施形態では、前記選択遺伝子はＤＨＦＲを含む。
【００３５】
本開示の組成物の特定の実施形態では、前記第１のトランスポゾンおよび／または前記第２のトランスポゾンは（ａ）リガンド結合領域、（ｂ）リンカー、および（ｃ）切断型カスパーゼ９ポリペプチドを含む誘発性カスパーゼポリペプチドを含み、前記誘発性カスパーゼポリペプチドは非ヒト配列を含まない。特定の実施形態では、前記非ヒト配列は制限酵素部位である。特定の実施形態では、前記リガンド結合領域誘発性カスパーゼポリペプチドはＦＫ５０６結合タンパク質１２（ＦＫＢＰ１２）ポリペプチドを含む。特定の実施形態では、前記ＦＫ５０６結合タンパク質１２（ＦＫＢＰ１２）ポリペプチドのアミノ酸配列は前記配列の位置３６に修飾を含む。特定の実施形態では、前記修飾は位置３６にあるフェニルアラニン（Ｆ）がバリン（Ｖ）で置換されたもの（Ｆ３６Ｖ）である。特定の実施形態では、前記ＦＫＢＰ１２ポリペプチドは
【化１７】
2020532987.tif 000019
（配列番号17012）を含むアミノ酸配列によってコードされる。特定の実施形態では、ＦＫＢＰ１２ポリペプチドは
【化１８】
2020532987.tif 000020
（配列番号17013）を含む核酸配列によってコードされる。
【００３６】
特定の実施形態では、前記誘発性アポトーシス促進性ポリペプチドの前記リンカー領域はＧＧＧＧＳ（配列番号17014）を含むアミノ酸によりコードされている。特定の実施形態では、前記誘発性アポトーシス促進性ポリペプチドの前記リンカー領域はGGAGGAGGAGGATCC（配列番号17015）を含む核酸配列によりコードされている。
【００３７】
特定の実施形態では、前記誘発性アポトーシス促進性ポリペプチドの前記切断型カスパーゼ９ポリペプチドは前記配列の位置８７にアルギニン（Ｒ）を含まないアミノ酸配列によりコードされている。特定の実施形態では、前記誘発性アポトーシス促進性ポリペプチドの前記切断型カスパーゼ９ポリペプチドは前記配列の位置２８２にアラニン（Ａ）を含まないアミノ酸配列によりコードされている。特定の実施形態では、前記誘発性アポトーシス促進性ポリペプチドの前記切断型カスパーゼ９ポリペプチドは
【化１９】
2020532987.tif 000021
（配列番号17016）を含むアミノ酸によってコードされている。特定の実施形態では、前記誘発性アポトーシス促進性ポリペプチドの前記切断型カスパーゼ９ポリペプチドは
【化２０】
2020532987.tif 000022
（配列番号17017）を含む核酸配列によってコードされている。
【００３８】
特定の実施形態では、前記誘発性アポトーシス促進性ポリペプチドは
【化２１】
2020532987.tif 000023
（配列番号17018）を含むアミノ酸配列によってコードされている。特定の実施形態では、前記誘発性アポトーシス促進性ポリペプチドは
【化２２】
2020532987.tif 000024
（配列番号17019）を含む核酸配列によってコードされている。
【００３９】
本開示の組成物の特定の実施形態では、前記第１のトランスポゾンおよび／または前記第２のトランスポゾンは少なくとも１つの自己切断型ペプチドを含む。特定の実施形態では、前記少なくとも１つの自己切断型ペプチドはＴ２Ａペプチド、ＧＳＧ−Ｔ２Ａペプチド、Ｅ２Ａペプチド、ＧＳＧ−Ｅ２Ａペプチド、Ｆ２Ａペプチド、ＧＳＧ−Ｆ２Ａペプチド、Ｐ２Ａペプチド、またはＧＳＧ−Ｐ２Ａペプチドを含む。特定の実施形態では、前記少なくとも１つの自己切断型ペプチドはＴ２Ａペプチドを含む。特定の実施形態では、前記Ｔ２ＡペプチドはEGRGSLLTCGDVEENPGP（配列番号：17020）を含むアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、前記ＧＳＧ−Ｔ２ＡペプチドはGSGEGRGSLLTCGDVEENPGP（配列番号17021）を含むアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、前記Ｅ２ＡペプチドはQCTNYALLKLAGDVESNPGP（配列番号17022）を含むアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、前記ＧＳＧ−Ｅ２ＡペプチドはGSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP（配列番号17023）を含むアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、前記Ｆ２ＡペプチドはVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP（配列番号17024）を含むアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、前記ＧＳＧ−Ｆ２ＡペプチドはGSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP（配列番号17025）を含むアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、前記Ｐ２ＡペプチドはATNFSLLKQAGDVEENPGP（配列番号17026）を含むアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、前記ＧＳＧ−Ｐ２ＡペプチドはGSGATNFSLLKQAGDVEENPGP（配列番号17027）を含むアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、前記少なくとも１つの自己切断型ペプチドは（ａ）前記選択遺伝子と前記誘発性導入遺伝子構築物の間、または（ｂ）前記誘発性導入遺伝子構築物と前記誘発性カスパーゼポリペプチドの間に位置する。特定の実施形態では、前記少なくとも１つの自己切断型ペプチドは（ａ）前記選択遺伝子と前記レポーター構築物の間、または（ｂ）前記レポーター構築物と前記誘発性カスパーゼポリペプチドの間に位置する。
【００４０】
本開示は、本開示の組成物を含む細胞を提供する。
【００４１】
本開示は、細胞中に条件遺伝子発現を誘発する方法であって、（ａ）前記細胞を本開示の組成物に、前記誘発性導入遺伝子構築物の前記細胞のゲノムへの組み込みと前記外来レポーターの発現を可能にするのに適した条件で、接触させること、および（ｂ）前記外因性受容体とそれに特異的に結合するリガンドを接触させ、前記誘発性プロモーターを標的とする細胞内シグナルを伝達し、それにより遺伝子発現を修飾することを含む、方法を提供する。特定の実施形態では、前記細胞は生体内、生体外、実験器具内、または原位置にある。特定の実施形態では、前記細胞は免疫細胞である。特定の実施形態では、前記免疫系細胞はＴ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）様細胞、造血前駆体細胞、末梢血（ＰＢ）由来のＴ細胞、または臍帯血（ＵＣＢ）由来のＴ細胞である。特定の実施形態では、前記免疫細胞はＴ細胞である。特定の実施形態では、前記細胞は自己細胞である。特定の実施形態では、前記細胞は同種異系細胞である。
【００４２】
本開示は、疾患または障害の治療を必要とする被験体の疾患または障害を治療する方法であって、本開示の組成物を前記被験体に、前記誘発性導入遺伝子構築物の前記細胞の前記ゲノムへの組み込みと前記外来レポーターの発現を可能にするのに適した条件で、投与すること、および前記外因性受容体が選択的に結合するリガンドを投与することを含み、前記リガンドを前記外因性受容体に結合することは、前記導入遺伝子を制御する前記誘発性プロモーターを標的とすべく細胞内シグナルを伝達し、前記導入遺伝子が発現され、前記導入遺伝子の産物は前記疾患または障害の治療に有効である、方法を提供する。特定の実施形態では、前記導入遺伝子の産物は分泌タンパク質である。特定の実施形態では、前記分泌タンパク質は凝固因子である。特定の実施形態では、前記凝固因子は第ＩＸ因子である。特定の実施形態では、前記疾患または障害は凝固障害である。
【００４３】
本開示の方法の特定の実施形態では、前記誘発性導入遺伝子構築物の前記細胞の前記ゲノムへの組み込みと前記外来レポーターの発現を可能にするのに適した条件は生体内の条件である。特定の実施形態では、前記誘発性導入遺伝子構築物の前記細胞の前記ゲノムへの組み込みと前記外来レポーターの発現を可能にするのに適した条件は、人体内の温度に実質的に近い温度、人体内のＣＯ2濃度に実質的に近いＣＯ2濃度、人体内のＯ2濃度に実質的に近いＯ2濃度、および人体内の電解質濃度に実質的に近い電解質濃度を有する水性環境または生理食塩水環境を含む。
【００４４】
本開示の組成物および方法の特定の実施形態では、前記外因性受容体が特異的に結合する前記リガンドは非天然起源である。特定の実施形態では、前記リガンドは核酸、アミノ酸、ポリマー（たとえばポリマーソーム）、有機小分子、無機小分子、またはそれらの任意の組み合わせである。典型的なリガンドとしては、合成タンパク質、修飾タンパク質、組み換えタンパク質、キメラタンパク質、内因性タンパク質または非天然起源タンパク質（可溶性または膜結合型）、ステロイドホルモン、気体粒子、核酸、成長因子、神経伝達物質、ビタミン、およびミネラルが挙げられるがこれらに限定されない。
【００４５】
本開示は、（ａ）誘発性プロモーターをコードする配列および導入遺伝子をコードする配列を含む誘発性導入遺伝子構築物、および（ｂ）構成的プロモーターをコードする配列および外因性リガンドをコードする配列を含むリガンド構築物を含み、構築物（ａ）および構築物（ｂ）を細胞のゲノム配列に組み込むと、前記外因性受容体が発現され、受容体を結合すると、前記外因性リガンドは、（ａ）の誘発性プロモーターを標的とする細胞内シグナルを伝達して遺伝子発現を修飾する、組成物を提供する。特定の実施形態では、前記リガンドは非天然配列または合成配列である。特定の実施形態では、前記リガンドは融合タンパク質である。特定の実施形態では、前記リガンドは前記細胞の表面に結合されている。特定の実施形態では、前記リガンドは細胞内ドメインを含む。特定の実施形態では、前記細胞内ドメインは前記リガンドを発現する細胞内シグナルを伝達する。特定の実施形態では、前記リガンドの構造は本開示の組成物の前記受容体の構造と実質的に似ている。特定の実施形態では、前記リガンドによって伝達されるシグナルと前記受容体によって伝達されるシグナルは双方向性のシグナルである。
【００４６】
本特許または出願書類は、少なくとも１枚の色つき図面を含む。色つき図面を含む本特許または特許出願公開の写しは、依頼と必要な料金の支払いに応じて特許庁により提供される。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図１Ａ〜ＢはＮＦ−ＫＢ誘発性ベクターのＴ細胞内での発現に関する１対の概略図である。２種のＴ細胞活性化ＮＦ−ＫＢ誘発性ベクターを開発した。１つは（Ａ）の順方向の遺伝子発現系（ＧＥＳ）によるもの、もう１つは（Ｂ）の相補的方向のものであり、いずれも構成的ＥＦ１αプロモーターよりも前方にある。これらのベクターはさらに、Ｔ２Ａ配列によって隔てられたＣＡＲ分子およびＤＨＦＲ選択遺伝子の発現を指示する。条件付きのＮＦ−ＫＢ誘発性発現系およびＥＦ１αに指示される遺伝子はいずれも、電気穿孔（ＥＰ）によってＴ細胞に永久的に組み込むことのできるpiggyBacトランスポゾンの一部である。一度ゲノムに組み込まれると、Ｔ細胞は膜表面にＣＡＲ、細胞内にＤＨＦＲを構成的に発現し、ＮＦ−ＫＢ誘発性遺伝子ＧＦＰの発現量はＴ細胞を活性化するだけで最大量まで発現される。
【図２】図２は、活性化Ｔ細胞内でのＮＦ−ＫＢ誘発性ＧＦＰ発現を示す１対のグラフである。Ｔ細胞に、ＥＦ１αプロモーターの制御下で、ＧＦＰ発現を駆動するＮＦ−ＫＢ誘発性発現系を含まない（ＧＥＳなしの対照）か、順方向（ｐＮＦＫＢ−ＧＦＰ順方向）または逆方向（ｐＮＦＫＢ−ＧＦＰ逆方向）で含む、抗ＢＣＭＡ−ＣＡＲおよびＤＨＦＲ変異タンパク質遺伝子を発現するpiggyBacベクターをヌクレオフェクションした。細胞を、メトトレキサート選択しながら細胞がほぼ完全に休止する（１９日目）まで培養し、５日目と１９日目にＧＦＰ発現を評価した。５日目では、すべてのＴ細胞が増殖し高度に刺激されており、ＮＦ−ＫＢ誘発性発現カセットを内部に持つ細胞は強いＮＦκＢ活性によって多量のＧＦＰを産生している。ＧＥＳなしの対照細胞は検出可能な量のＧＦＰを発現しなかった。１９日目までに、ＧＥＳを含むＴ細胞はほぼ完全に休止し、ＮＦκＢ活性が低下するためＧＦＰ発現量は５日目よりも有意に少なかった（約１／８のＭＦＩ（平均蛍光強度））。ＧＦＰ発現は１９日目でもまだ観察されているが、これはＧＦＰタンパク質の半減期が長い（約３０時間）ことによるものであるか、たとえばＴＣＲ、ＣＡＲ、サイトカイン受容体、または成長因子受容体シグナルによる基底水準のＮＦκＢ活性によるものである。
【図３】図３はＢＣＭＡ陽性腫瘍細胞が存在する場合の抗BCMA CARによるＮＦ−ＫＢ誘発性ＧＦＰ発現の活性化を示す一連のグラフである。Ｔ細胞を修飾しない（偽Ｔ細胞）か、ＥＦ１αプロモーターの制御下で、ＧＦＰ発現を駆動するＮＦ−ＫＢ誘発性発現系を含まない（ＧＥＳなしの対照）か、順方向（ｐＮＦＫＢ−ＧＦＰ順方向）または逆方向（ｐＮＦＫＢ−ＧＦＰ逆方向）で含む、抗BCMA CARおよびＤＨＦＲ変異タンパク質遺伝子を発現するpiggyBacベクターをヌクレオフェクションした。すべての細胞を、メトトレキサート選択しながら、あるいはせずに（偽Ｔ細胞）、細胞がほぼ完全に休止するまで２２日間培養した。次いで細胞を３日間、ＢＣＭＡ陰性（Ｋ５６２）、ＢＭＣＡ陽性（ＲＰＭＩ８２２６）、または陽性対照抗ＣＤ３抗ＣＤ２８活性化試薬（ＣＤ３／２８刺激）のない状態（刺激なし）またはある状態で刺激した。ＧＥＳなしの対照または偽Ｔ細胞ではいずれの条件でもＧＦＰ発現は検出できなかった。しかし、ｐＮＦＫＢ−ＧＦＰを順方向に転移させた細胞および逆方向に転移させた細胞は、ＢＣＭＡ陰性Ｋ５６２細胞と共に培養したときには刺激なしの対照とほとんど変わらないＧＦＰ発現を示したが、ＢＣＭＡ陽性腫瘍細胞の存在条件または陽性対照条件ではいずれも劇的な遺伝子発現の増加を示した。ＢＣＭＡ陽性腫瘍細胞と共培養した場合、ｐＮＦＫＢ−ＧＦＰを順方向に転移させた細胞と逆方向に転移させた細胞ではＧＦＰ発現の差はほとんど見られなかった。
【図４】図４は、誘発性遺伝子の発現量がプロモーターよりも前方にある複数の応答配列によって制御できることを示す一連のグラフである。Ｔ細胞に、抗BCMA CARTyrinに続いて選択遺伝子をいずれもヒトＥＦ１αプロモーターの制御下でコードするpiggyBacベクターをヌクレオフェクションした。さらに、ベクターは切断型ＣＤ１９タンパク質（ｄＣＤ１９）の発現を駆動する条件ＮＦ−ＫＢ誘発遺伝子をさらにコードし、かつ０個〜５個で変動する複数のＮＦＫＢ応答配列（ＲＥ）を含んでいたか、ＧＥＳを含まなかった（ＧＥＳなし）か、電気穿孔パルスは受けたがpiggyBac核酸を含まなかった（偽）。逆（反対）方向／配向のＧＥＳについてのみデータを示す。すべての細胞を１８日間培養し、メトトレキサート添加によってpiggyBac修飾Ｔ細胞を選択した。次いで細胞を抗ＣＤ３抗ＣＤ２８ビーズ活性化試薬で３日間刺激し、ｄＣＤ１９表面発現を０日目、３日目、および１８日目にＦＡＣＳによって評価した。データをＦＡＣＳヒストグラムおよび標的タンパク質染色のＭＦＩで示す。０日目には、ＧＥＳをコードするベクターを転移させたすべてのＴ細胞で表面ｄＣＤ１９発現は低レベルで検出された。刺激後３日目、ＧＥＳを発現するすべてのＴ細胞でｄＣＤ１９発現の劇的な増加が見られ、ＲＥの数が多いほど表面発現量の増加率が高かった。したがって、表面ｄＣＤ１９発現量はＧＥＳでコードされるＲＥの数に正比例していた。ＧＥＳを含まないＴ細胞、すなわちＧＥＳなしの対照および偽対照の表面ではｄＣＤ１９は検出されなかった。
【図５】図５は、血液凝固につながるヒトの凝固経路を示す概略図である。たとえば内皮の損傷による接触活性化は、内因性凝固経路を活性化する。組織因子は、たとえば外傷後に外因性凝固経路を活性化する。いずれの経路もプロトロンビンからトロンビンへの変換に収束し、フィブリノーゲンからフィブリンへの変換を触媒する。重合フィブリンは血小板とともに凝血塊を形成する。第ＩＸ因子（丸で囲んだ部分）がない場合、凝固に欠陥がある。第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）欠乏症は血友病Ａの発症につながる。第ＩＸ因子（ＦＩＸ）欠乏症は血友病Ｂの発症につながる。本開示の組成物および方法の前、血友病Ｂの標準治療には２〜３日毎に組み換え第ＩＸ因子を注入する必要があり、年間約２５０，０００ドルの費用がかかっていた。この標準治療の選択肢とは大きく異なり、本開示のＴ細胞は数十年間ヒトの体内で維持される。
【図６】図６は、第ＩＸ因子分泌Ｔ細胞を示す一連の蛍光標示式細胞分取（Fluorescence-Activated Cell Sorting = ＦＡＣＳの図）である。ヒト第ＩＸ因子導入遺伝子をコードするＴ細胞は、細胞の約８０％にＴ細胞表現型を示した。６つのパネルを左から右の順に説明する。（１）ｘ軸は前方散乱（ＦＳＣ）であるのに対し、ｙ軸は側方散乱（ＳＳＣ）である。ｘ軸は５０Ｋ刻みで０〜２５０，０００（２５０Ｋと略記）、ｙ軸は５０Ｋ刻みで０〜２５０Ｋである。（２）ｘ軸は細胞生存マーカーである７アミノアクチノマイシンＤ（７ＡＡＤ）に対する前方散乱である。ｘ軸は０〜２５０Ｋまで５０Ｋ刻みで表示されている。ｙ軸は、上から下に−１０3、０、１０3、１０4、１０5と表示されている。（３）ｘ軸には、Ｃｙ７色素に結合した抗ＣＤ５６−ＡＰＣ（ＣＤＣ５６−ＡＰＣ−Ｃｙ７）が示され、０〜１０5の単位で１０の累乗で増加している。ｙ軸には、フィコエリトリン（ＰＥ）に結合した抗ＣＤ３が示され、０〜１０5の単位で１０の累乗で増加している。（４）ｘ軸にはフルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）に結合した抗ＣＤ８が示され、０〜１０5の単位で１０の累乗で増加している。ｙ軸にはブリリアント・バイオレット６５０（ＢＶ６５０）色素に結合した抗ＣＤ４が示され、０〜１０5の単位で１０の累乗で増加している。（５）ｘ軸にはブリリアント・バイオレット４２１（ＢＶ４２１）色素に結合した抗ＣＤ６２Ｌ抗体が示され、０〜１０5の単位で１０の累乗で増加している。ｙ軸には、ＰＥおよびＣｙ７に結合した抗ＣＤ４５ＲＡ抗体が示され、０〜１０5の単位で１０の累乗で増加している。このパネルは四角で囲まれている。（６）ｘ軸には、ブリリアント・バイオレット７８６（ＢＶ７８６）に結合した抗ＣＣＲ７抗体が示され、０〜１０5の単位で１０の累乗で増加している。ｙ軸には、ＰＥおよびＣｙ７に結合した抗ＣＤ４５ＲＡが示され、０〜１０5の単位で１０の累乗で増加している。
【図７】図７Ａは、本開示の修飾Ｔ細胞の作製中のヒト第ＩＸ因子の分泌を示すグラフである。ｙ軸には、第ＩＸ因子の濃度が０〜８０ナノグラム（ｎｇ）／ミリリットル（ｍＬ）で２０ｎｇ／ｍＬ刻みで示されている。ｘ軸には９日目と１２日目のＴ細胞が示されている。  図７Ｂは、Ｔ細胞によって産生された分泌第ＩＸ因子の凝固活性を示すグラフである。ｙ軸には、ヒトの血漿に対する第ＩＸ因子の活性（％）が０〜８％まで２％刻みで示されている。ｘ軸には９日目と１２日目のＴ細胞が示されている。
【図８】図８は、ＣＤ４陽性細胞で誘発性遺伝子の発現量がプロモーターよりも前方にある複数の応答配列によって制御できることを示す一連のグラフである。切断型ＣＤ１９（ｄＣＤ１９）を発現するＣＡＲ−Ｔ細胞をＢＣＭＡ＋Ｈ９２９多発性骨髄腫細胞で、ＣＡＲ−Ｔ：Ｈ９２９の比２：１で刺激した。ＮＦ−κＢ応答配列の０、１、２、３、４、または５回の反復によって増強された最小限のプロモーターによってｄＣＤ１９の発現を駆動した。BCMA CARの発現を、ヒトＴ細胞での遺伝子発現に一般に用いられる構成的プロモーターであるヒト伸長因子１α（ＥＦ１α）プロモーターによって駆動した。腫瘍細胞刺激の前は、ＣＡＲおよびｄＣＤ１９の発現量はいずれも偽Ｔ細胞対照に比べて基底水準であった。ＣＡＲおよびｄＣＤ１９の発現量はいずれも腫瘍細胞刺激をすると増加し（３日目）、次いで減少し（９日目、１４日目）、細胞が再び完全に休止した状態になったときに最終的にそれぞれの基底水準に達した（２０日目）。しかし、ＣＡＲの表面発現はすべてのＣＡＲ−Ｔ細胞サンプルにおいて細胞活性および休止の過程で等しく増減したのに対し、ｄＣＤ１９の発現量はＮＦ−κＢ応答配列の数に正比例していた（３日目、９日目、１４日目）。データをＦＡＣＳヒストグラムおよび標的タンパク質染色のＭＦＩで示す。したがって、表面ｄＣＤ１９発現量はＧＥＳでコードされるＲＥの数に正比例していた。ＧＥＳを含まないＴ細胞、すなわちＧＥＳなしの対照および偽対照の表面ではｄＣＤ１９は検出されなかった。
【図９】図９は、ＣＤ８陽性細胞で誘発性遺伝子の発現量がプロモーターよりも前方にある複数の応答配列によって制御できることを示す一連のグラフである。切断型ＣＤ１９（ｄＣＤ１９）を発現するＣＡＲ−Ｔ細胞をＢＣＭＡ＋Ｈ９２９多発性骨髄腫細胞で、ＣＡＲ−Ｔ：Ｈ９２９の比２：１で刺激した。ＮＦ−κＢ応答配列の０、１、２、３、４、または５回の反復によって増強された最小限のプロモーターによってｄＣＤ１９の発現を駆動した。BCMA CARの発現を、ヒトＴ細胞での遺伝子発現に一般に用いられる構成的プロモーターであるヒト伸長因子１α（ＥＦ１α）プロモーターによって駆動した。腫瘍細胞刺激の前、ＣＡＲおよびｄＣＤ１９の発現量はいずれも偽Ｔ細胞対照に比べて基底水準であった。ＣＡＲおよびｄＣＤ１９の発現量はいずれも腫瘍細胞刺激をすると増加し（３日目）、次いで減少し（９日目、１４日目）、細胞が再び完全に休止した状態になったときに最終的にそれぞれの基底水準に達した（２０日目）。しかし、ＣＡＲの表面発現はすべてのＣＡＲ−Ｔ細胞サンプルにおいて細胞活性および休止の過程で等しく増減したのに対し、ｄＣＤ１９の発現量はＮＦ−κＢ応答配列の数に正比例していた（３日目、９日目、１４日目）。データをＦＡＣＳヒストグラムおよび標的タンパク質染色のＭＦＩで示す。したがって、表面ｄＣＤ１９発現量はＧＥＳでコードされるＲＥの数に正比例していた。ＧＥＳを含まないＴ細胞、すなわちＧＥＳなしの対照および偽対照の表面ではｄＣＤ１９は検出されなかった。
【図１０】図１０は、Ｔ細胞を武装化するのに用いることのできる様々なチェックポイントのシグナル伝達タンパク質を標的とするノックアウト効率を示す棒グラフである。Ｃａｓ−ＣＬＯＶＥＲを用いて、休止状態の初代ヒト汎Ｔ細胞のチェックポイント受容体ＰＤ−１、ＴＧＦＢＲ２、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、およびＣＴＬＡ−４をノックアウトした。ノックアウト率をｙ軸に示す。遺伝子編集の結果、流動細胞計測法で測定した細胞表面でのタンパク質発現が３０〜７０％減少した。
【図１１】図１１は、野生型、欠損型および転換型受容体と、初代Ｔ細胞での細胞内シグナル伝達（抑制性または刺激性）に対するそれらの影響を示す一連の概略図である。Ｔ細胞に内因的に発現した野生型の抑制性受容体がその内因性リガンドと結合すると、抑制性シグナルが伝達され、部分的にＴ細胞のエフェクター機能が低減される。しかし、ＰＤ−１（上図）またはＴＧＦＢＲＩＩ（下図）などのチェックポイント受容体タンパク質の細胞内ドメイン（ＩＣＤ）の変異（変異・欠損型）または欠失（切断・欠損型）は、同族のリガンドが結合したときのそのシグナル伝達能力を低下または消失させる。したがって、遺伝子操作された変異または切断型の欠損型受容体が修飾Ｔ細胞表面に発現すると、遊離の内因性リガンドの結合について、内因的に発現した野生型受容体と競合し、内因的に発現した野生型受容体による抑制シグナルの伝達が効果的に低減または消失する。具体的には、変異または欠損型受容体が結合すると内因性リガンドは野生型受容体の結合から隔離され、結果として効果的に修飾Ｔ細胞へ送達されるチェックポイントシグナル伝達の全体レベルが弱くなり、修飾Ｔ細胞のチェックポイント抑制および機能的枯渇が低減または阻害される。転換型受容体は、野生型ＩＣＤを、共刺激分子（ＣＤ３ζ、ＣＤ２８、４−１ＢＢなど）または異なる抑制分子（ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１、Ｌａｇ３など）のいずれかに由来するＩＣＤで置き換えることによって作製される。前者の場合、修飾された転換型受容体が内因性リガンドに結合すると、Ｔ細胞へ陽性シグナルが伝達され、それによって修飾Ｔ細胞の刺激の増強、および標的腫瘍細胞の死滅の潜在的な増強が促される。後者の場合、修飾された転換型受容体が内因性リガンドに結合すると、Ｔ細胞へ陰性シグナルが伝達され、それによって修飾Ｔ細胞の刺激は消失され、標的腫瘍細胞の死滅が潜在的に低減される。シグナルペプチド（紫色の矢印）、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（明るい緑色）、膜貫通ドメイン（黄色）、細胞内シグナル伝達ドメイン（ＩＣＤ）（オレンジ）、および置換ＩＣＤ（緑色）が受容体図に示されている。「＊」は変異ＩＣＤを示す。「＋」はチェックポイントシグナルがあることを示す。「−」は、チェックポイントシグナルがないことを示す。
【図１２】図１２は、修飾Ｔ細胞表面の受容体の発現量の増加を促進し得る特定の変異を持つ欠損型受容体の設計例を示す概略図である。ＰＤ−１およびＴＧＦＢＲＩＩの欠損型受容体についての例を示す。ＰＤ−１（上図）およびＴＧＦＢＲＩＩ（下図）の切断型受容体のシグナルペプチドドメイン（ＳＰ）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）、および細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を表示する。上の４つの分子のうち１番目は野生型ＰＤ−１受容体であり、野生型ＰＤ−１のＳＰおよびＴＭをコードする。欠損型ＰＤ−１受容体について、ＰＤ−１の野生型ＳＰまたはＴＭドメイン（緑色、薄緑色）のヒトＴ細胞ＣＤ８α受容体のＳＰまたはＴＭドメイン（赤色）で置き換えたものを示す。２番目の分子は未変性ＰＤ−１のＴＭとともにＣＤ８αのＳＰをコードし、３番目は野生型ＰＤ−１のＳＰと代替物ＣＤ８αのＴＭをコードし、４番目は代替物ＣＤ８αのＳＰとＴＭの両方をコードする。同様に、ＴＧＦβＲＩＩの欠損型受容体について、野生型ＴＧＦＢＲＩＩのＳＰ（ピンク）をヒトＴ細胞ＣＤ８α受容体のＳＰドメイン（赤）で置き換えたものを示す。構築物の名称と各構築物タンパク質のアミノ酸長（ａａ）のリストを図の左に示す。
【図１３】図１３は流動細胞計測法で測定した修飾初代ヒトＴ細胞の表面のＰＤ−１およびＴＧＦＢＲＩＩの欠損型受容体の発現量を示す一連のヒストグラムである。図１２の６種の切断型欠損構築物のそれぞれを初代ヒトＴ細胞表面で発現させた。Ｔ細胞を抗ＰＤ−１（上、青いヒストグラム）または抗ＴＧＦβＲＩＩ（下、青いヒストグラム）、あるいはアイソタイプ（対照）または二次抗体のみ（secondary only）（灰色のヒストグラム）で染色した。ＰＤ−１またはＴＧＦβＲＩＩ発現について陽性の細胞染色はゲート型であり（頻度をゲートの上に示す）、平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を陽性の各ヒストグラムの上に示す。欠損型受容体構築物の名称を各図の上に示す。両方の欠損型受容体の方法、すなわち野生型ＳＰを代替物ＣＤ８αで置き換えたものは発現に成功した。０２．８ａＳＰ−ＰＤ−１および０２．８ａＳＰ−ＴＧＦβＲＩＩはＴ細胞表面での発現量が最大になった。０２．８ａＳＰ−ＰＤ−１欠損型受容体は４３，６８０のＭＦＩを示したが、これは内因性Ｔ細胞ＰＤ−１発現の１７７倍であり、野生型ＰＤ−１欠損型受容体の２．８倍である。０２．８ａＳＰ−ＴＧＦβＲＩＩ欠損型受容体は１３，８０９の平均蛍光強度を示したが、これは内因性Ｔ細胞ＴＧＦβＲＩＩ発現の１０２倍であり、野生型ＴＧＦβＲＩＩ欠損型受容体の１．８倍である。ＰＤ−１およびＴＧＲＢＲＩＩのいずれについても、野生型ＳＰを代替物ＣＤ８ａで置き換えると欠損型または転換型受容体の表面発現が増強された。このことは、内因性リガンドの結合および隔離の際のチェックポイント抑制の低減または阻害を最大限にするのに役に立つ可能性がある。
【図１４】図１４はＣｓｙ４−Ｔ２Ａ−Ｃｌｏ０５１−Ｇ４Ｓリンカー−ｄＣａｓ９構築マップ（実施形態２）の概略図である。
【図１５】図１５はｐＲＴ１−Ｃｌｏ０５１−ｄＣａｓ９二重ＮＬＳ構築マップ（実施形態１）の概略図である。
【図１６】図１６は、本開示のＣａｓ−Ｃｌｏｖｅｒ融合タンパク質の実施形態１（図１５に示すｐＲＴ１−Ｃｌｏ０５１−ｄＣａｓ９二重ＮＬＳ）または実施形態２（図１４に示すＣｓｙ４−Ｔ２Ａ−Ｃｌｏ０５１−Ｇ４Ｓリンカー−ｄＣａｓ９）について、汎Ｔ細胞表面のＢ２Ｍ（左）またはジャーカット細胞表面のＴ細胞受容体のα鎖（右）の発現のノックアウトによる効果を比較する１対のグラフである。右のグラフでは、示されているように、融合タンパク質を１０μｇまたは２０μｇで提供している。
【図１７】図１７は、実施形態１（レーン２；図１５に示すｐＲＴ１−Ｃｌｏ０５１−ｄＣａｓ９二重ＮＬＳ）または実施形態２（レーン３；図１４に示すＣｓｙ４−Ｔ２Ａ−Ｃｌｏ０５１−Ｇ４Ｓリンカー−ｄＣａｓ９）のそれぞれをコードするｍＲＮＡのゲル電気泳動分析の写真である。また、実施形態２をコードするｍＲＮＡの以前の標品（「旧版」）を比較のために含む（レーン４）。図示されているように、予想どおり、この２つの異なる実施形態をコードするすべてのｍＲＮＡサンプルはゲル内で明確に異なるバンドとして移動し、高品質であり、大きさが似ている。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
［発明の詳細な説明]
本開示は、（ａ）誘発性プロモーターをコードする配列および導入遺伝子をコードする配列を含む誘発性導入遺伝子構築物、および（ｂ）構成的プロモーターをコードする配列および外因性受容体をコードする配列を含む受容体構築物を含み、構築物（ａ）および構築物（ｂ）を細胞のゲノム配列に組み込むと、前記外因性受容体が発現され、リガンドを結合すると、前記外因性受容体は、（ａ）の前記誘発性プロモーターを標的とする細胞内シグナルを伝達して遺伝子発現を修飾する、組成物を提供する。
【００４９】
外因性受容体
本開示の外因性受容体は非天然起源の受容体を含んでもよい。特定の実施形態では、前記非天然起源の受容体は合成受容体、修飾受容体、組み換え受容体、変異受容体、またはキメラ受容体である。特定の実施形態では、前記非天然起源の受容体はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）から単離されるかＴＣＲに由来する１つ以上の配列を含む。特定の実施形態では、前記非天然起源の受容体は足場タンパク質から単離されるか足場タンパク質に由来する１つ以上の配列を含む。特定の実施形態では、前記非天然起源の受容体は膜貫通ドメインを含む。特定の実施形態では、前記非天然起源の受容体は細胞内シグナルを伝達する細胞内受容体と相互作用する。特定の実施形態では、前記非天然起源の受容体は細胞内シグナル伝達ドメインを含む。特定の実施形態では、前記非天然起源の受容体はキメラリガンド受容体（ＣＬＲ）である。特定の実施形態では、前記ＣＬＲはキメラ抗原受容体である。
【００５０】
本開示の組成物の特定の実施形態では、（ｂ）の前記外因性受容体は非天然起源の受容体を含む。特定の実施形態では、前記ＣＬＲはキメラ抗原受容体である。特定の実施形態では、前記キメラリガンド受容体は（ａ）少なくとも足場タンパク質を含むリガンド認識領域を含む外部ドメイン、（ｂ）膜貫通ドメイン、および（ｃ）少なくとも１つの共刺激ドメインを含む内部ドメインを含む。
【００５１】
本開示は、少なくとも１つのセンチリンを含むキメラ受容体を提供する。本開示のキメラリガンド／抗原受容体（ＣＬＲ／ＣＡＲ）は２つ以上のセンチリンを含んでもよい（本明細書ではＣＡＲＴｙｒｉｎという）。
【００５２】
本開示は少なくとも１つのＶＨＨを含むキメラ受容体を提供する。本開示のキメラリガンド／抗原受容体（ＣＬＲ／ＣＡＲ）は２つ以上のＶＨＨを含んでもよい（本明細書ではＶＣＡＲという）。
【００５３】
本開示のキメラ受容体は、ヒトＣＤ２、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ１９、ＣＤ２８、４−１ＢＢまたはＧＭ−ＣＳＦＲシグナルペプチドを含んでもよい。本開示のヒンジ／スペーサードメインは、ヒトＣＤ８α、ＩｇＧ４、および／またはＣＤ４のヒンジ／スペーサー／ストークを含んでもよい。本開示の細胞内ドメインまたは内部ドメインはヒトＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインを含んでもよく、ヒト４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、ＭｙＤ８８、ＯＸ−４０細胞内セグメント、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含んでもよい。典型的な膜貫通ドメインとしては、ヒトＣＤ２、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ１９、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、またはＧＭ−ＣＳＦＲ膜貫通ドメインが挙げられるがこれらに限定されない。
【００５４】
本開示は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、造血前駆体細胞、末梢血（ＰＢ）由来のＴ細胞（Ｇ−ＣＳＦ動員末梢血由来のＴ細胞を含む）、臍帯血（ＵＣＢ）由来のＴ細胞などの細胞に本開示のＣＬＲ／ＣＡＲ、ＣＡＲＴｙｒｉｎ、および／またはＶＣＡＲを導入することによって１種以上のリガンドまたは抗原に対し特異的にした遺伝子修飾細胞を提供する。本開示の細胞は、本開示のトランスポゾンと本開示の転移酵素をコードする配列を含むプラスミドまたはナノプラスミドとを電気泳動で転写させることによって修飾されてもよい（好ましくは、本開示の転移酵素をコードする配列はｍＲＮＡ配列である）。
【００５５】
実施形態によっては、この武装化Ｔ細胞は、（ａ）誘発性プロモーターをコードする配列および導入遺伝子をコードする配列を含む誘発性導入遺伝子構築物、および（ｂ）構成的プロモーターをコードする配列および外因性受容体（ＣＬＲまたはＣＡＲなど）をコードする配列を含む受容体構築物を含み、前記構築物（ａ）および前記構築物（ｂ）を細胞のゲノム配列に組み込むと、前記外因性受容体が発現され、リガンドまたは抗体を結合すると、前記外因性受容体は、前記誘発性導入遺伝子（ａ）の発現を制御する前記誘発性プロモーターを直接的または間接的に標的とする細胞内シグナルを伝達して遺伝子発現を修飾する、組成物を含む。
【００５６】
キメラ受容体
本開示のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および／またはキメラリガンド受容体（ＣＬＲ）は、（ａ）抗原／リガンド認識領域を含む外部ドメイン、（ｂ）膜貫通ドメイン、および（ｃ）少なくとも１つの共刺激ドメインを含む内部ドメインを含んでもよい。特定の実施形態では、前記外部ドメインはシグナルペプチドをさらに含んでもよい。その代わりまたはそれに加えて、特定の実施形態では、前記外部ドメインは抗原／リガンド認識領域と前記膜貫通ドメインの間にさらにヒンジを含んでもよい。本開示のＣＡＲの特定の実施形態では、前記シグナルペプチドはヒトＣＤ２、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ１９、ＣＤ２８、４−１ＢＢまたはＧＭ−ＣＳＦＲシグナルペプチドをコードする配列を含んでもよい。本開示のＣＡＲの特定の実施形態では、前記シグナルペプチドはヒトＣＤ８αシグナルペプチドをコードする配列を含んでもよい。特定の実施形態では、前記膜貫通ドメインはヒトＣＤ２、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ１９、ＣＤ２８、４−１ＢＢまたはＧＭ−ＣＳＦＲ膜貫通ドメインをコードする配列を含んでもよい。本開示のＣＡＲの特定の実施形態では、前記膜貫通ドメインはヒトＣＤ８α膜貫通ドメインをコードする配列を含んでもよい。本開示のＣＡＲ／ＣＬＲの特定の実施形態では、前記内部ドメインはヒトＣＤ３ζ内部ドメインを含んでもよい。
【００５７】
本開示のＣＡＲ／ＣＬＲの特定の実施形態では、前記少なくとも１つの共刺激ドメインはヒト４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、ＭｙＤ８８、ＯＸ−４０細胞内のセグメント、またはそれらの任意の組み合わせを含んでもよい。本開示のＣＡＲの特定の実施形態では、前記少なくとも１つの共刺激ドメインはヒトＣＤ２８および／または４−１ＢＢ共刺激ドメインを含んでもよい。本開示のＣＡＲの特定の実施形態では、前記ヒンジはヒトＣＤ８α、ＩｇＧ４、および／またはＣＤ４配列に由来する配列を含んでもよい。本開示のＣＡＲ／ＣＬＲの特定の実施形態では、前記ヒンジはヒトＣＤ８α配列に由来する配列を含んでもよい。
【００５８】
前記ＣＤ２８共刺激ドメインは
【化２３】
2020532987.tif 000025
（配列番号17004）を含むアミノ酸配列、あるいは
【化２４】
2020532987.tif 000026
（配列番号17004）を含むアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％同一の配列を含んでもよい。前記ＣＤ２８共刺激ドメインは、
【化２５】
2020532987.tif 000027
（配列番号17005）を含む核酸配列によってコードされてもよい。
前記４−１ＢＢ共刺激ドメインは、
【化２６】
2020532987.tif 000028
（配列番号17006）を含むアミノ酸配列あるいは
【化２７】
2020532987.tif 000029
（配列番号17006）を含むアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％同一の配列を含んでもよい。前記４−１ＢＢ共刺激ドメインは、
【化２８】
2020532987.tif 000030
（配列番号17007）を含む核酸配列によってコードされてもよい。前記４−１ＢＢ共刺激ドメインは、前記膜貫通ドメインと前記ＣＤ２８共刺激ドメインの間に位置してもよい。
【００５９】
本開示のＣＡＲ／ＣＬＲの特定の実施形態では、前記ヒンジはヒトＣＤ８α、ＩｇＧ４、および／またはＣＤ４配列に由来する配列を含んでもよい。本開示のＣＡＲ／ＣＬＲの特定の実施形態では、前記ヒンジはヒトＣＤ８α配列に由来する配列を含んでもよい。
前記ヒンジは
【化２９】
2020532987.tif 000031
（配列番号17008）を含むヒトＣＤ８αアミノ酸配列、あるいは
【化３０】
2020532987.tif 000032
（配列番号17008）を含むアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％同一の配列を含んでもよい。前記ヒトＣＤ８αヒンジアミノ酸配列は
【化３１】
2020532987.tif 000033
（配列番号17028）を含む核酸配列によってコードされてもよい。
【００６０】
ＳｃＦｖ
本開示は、特定の標的タンパク質を認識し結合する単鎖可変断片（ＳｃＦｖ）組成物およびこれらの組成物の使用方法を提供する。ＳｃＦｖ組成物は、抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含む。ＳｃＦｖ組成物は本開示のＣＡＲまたはＣＬＲの抗原／リガンド認識領域に組み込まれてもよい。本開示のＣＡＲ／ＣＬＲの抗原／リガンド認識領域は本開示のＳｃＦｖまたはＳｃＦｖ組成物を含んでもよい。実施形態によっては、ＳｃＦｖは免疫グロブリンの重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）の融合タンパク質を含み、ＶＨおよびＶＬドメインはリンカーで連結されている。ＳｃＦｖは、定常領域が除去されリンカーが導入されているが、元の免疫グロブリンの特異性を保持する。典型的なリンカーはGGGGSGGGGSGGGGS（配列番号17033）の配列を含む。
（センチリン）
【００６１】
本開示のセンチリンは、本開示の抗原またはリガンドに特異的に結合する。抗原に特異的に結合する１つ以上のセンチリンを含む本開示のＣＡＲおよび／またはＣＬＲを用いて、細胞（たとえば細胞傷害性免疫細胞）の特異性を特異的抗原を発現する細胞に向けてもよい。その代わりに、またはそれに加えて、リガンド／抗原に特異的に結合するセンチリンを含む本開示のＣＬＲは、誘発性プロモーターの制御下で配列の発現を誘発するシグナルを細胞内で伝達してもよい。
【００６２】
本開示のセンチリンは、抗原またはリガンドに特異的に結合できるタンパク質足場を含んでもよい。本開示のセンチリンは、少なくとも１つのフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインの共通配列を含む、抗原またはリガンドに特異的に結合できるタンパク質足場を含んでもよい。前記少なくとも１つのフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインはヒトタンパク質に由来してもよい。前記ヒトタンパク質はテネイシン−Ｃであってもよい。前記共通配列は
【化３２】
2020532987.tif 000034
（配列番号17010）または
【化３３】
2020532987.tif 000035
（配列番号17011）を含んでもよい。
【００６３】
前記センチリンは、
【化３４】
2020532987.tif 000036
（配列番号17010）または
【化３５】
2020532987.tif 000037
（配列番号17011）の配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、またはその間の任意の割合で同一のアミノ酸配列を含んでもよい。
【００６４】
前記センチリンは、
【化３６】
2020532987.tif 000038
（配列番号17010）または
【化３７】
2020532987.tif 000039
（配列番号17011）の配列と少なくとも７４％同一のアミノ酸配列を含んでもよい。
【００６５】
前記共通配列は
【化３８】
2020532987.tif 000040
（配列番号17034）を含む核酸配列によってコードされてもよい。
【００６６】
前記共通配列は、（ａ）前記共通配列の位置１３〜１６にあるアミノ酸残基TEDS（配列番号17035）を含むあるいはこれらからなるＡ−Ｂループ；（ｂ）前記共通配列の位置２２〜２８にあるアミノ酸残基TAPDAAF（配列番号17036）を含むあるいはこれらからなるＢ−Ｃループ；（ｃ）前記共通配列の位置３８〜４３にあるアミノ酸残基SEKVGE（配列番号17037）を含むあるいはこれらからなるＣ−Ｄループ；（ｄ）前記共通配列の位置５１〜５４にあるアミノ酸残基GSER（配列番号17038）を含むあるいはこれらからなるＤ−Ｅループ；（ｅ）前記共通配列の位置６０〜６４にあるアミノ酸残基GLKPG（配列番号17039）を含むあるいはこれらからなるＥ−Ｆループ；（ｆ）前記共通配列の位置７５〜８１にあるアミノ酸残基KGGHRSN（配列番号17040）を含むあるいはこれらからなるＦ−Ｇループ；または（ｇ）前記（ａ）から（ｆ）の任意の組み合わせ内の１箇所以上で修飾されていてもよい。本開示のセンチリンは、少なくとも５つのフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン、少なくとも１０のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン、または少なくとも１５のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインの共通配列を含んでもよい。
【００６７】
前記センチリンは、１０-9Ｍ以下、１０-10Ｍ以下、１０-11Ｍ以下、１０-12Ｍ以下、１０-13Ｍ以下、１０-14Ｍ以下、および１０-15Ｍ以下のＫD値から選ばれた少なくとも１つの親和性で抗原またはリガンドと結合してもよい。前記ＫD値は表面プラズモン共鳴で決定されてもよい。
【００６８】
抗体模倣物
「抗体模倣物」という用語は、標的配列に特異的に結合し、かつ天然抗体とは異なる構造を持つ有機化合物を表すことを意図する。抗体模倣物は、タンパク質、核酸、または小分子を含んでもよい。本開示の抗体模倣物が特異的に結合する標的配列は抗原であってもよい。抗体模倣物は、抗体に比べて優れた溶解性、組織透過性、熱および酵素に対する安定性（たとえば酵素分解耐性）、低い生産コストなどの（これらに限定されない）より優れた性質を提供してもよい。典型的な抗体模倣物としては、アフィボディ、アフィリン、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アンチカリン、アビマー（結合活性多量体としても知られる）、ＤＡＲＰｉｎ（設計アンキリン反復タンパク質）、フィノマー、クニッツドメインペプチド、およびモノボディなどが挙げられるがこれらに限定されない。
【００６９】
本開示のアフィボディ分子は、ジスルフィド架橋のない１個以上のαヘリックスを含む、またはからなる、タンパク質足場を含む。好ましくは、本開示のアフィボディ分子は、３個のαヘリックスを含む、またはからなる。たとえば、本開示のアフィボディ分子は、免疫グロブリン結合ドメインを含んでもよい。本開示のアフィボディ分子は、タンパク質ＡのＺドメインを含んでもよい。
【００７０】
本開示のアフィリン分子は、たとえばγＢクリスタリンまたはユビキチンの露出アミノ酸の修飾によって作製されたタンパク質足場を含む。アフィリン分子は機能的には抗体の抗原親和性に似ているが、構造的には抗体に似ていない。アフィリンの作製に用いられる任意のタンパク質足場において、適切に折りたたまれたタンパク質分子のうち溶媒または可能性のある結合パートナーに接近し得るアミノ酸を露出したアミノ酸と考える。これらの露出アミノ酸のうち任意の１個以上を標的配列または抗原に特異的に結合するように修飾してもよい。
【００７１】
本開示のアフィマー分子は、特異的標的配列に対して親和性の高い結合部位を提供するペプチドループを示すよう遺伝子操作された安定性の高いタンパク質を含むタンパク質足場を含む。典型的な本開示のアフィマー分子は、シスタチンタンパク質またはその三次構造に基づくタンパク質足場を含む。典型的な本開示のアフィマー分子は逆平行βシートの上面に位置するαヘリックスを含む共通の三次構造を共有していてもよい。
【００７２】
本開示のアフィチン分子は人工タンパク質足場を含み、その構造はたとえばＤＮＡ結合タンパク質（たとえばＤＮＡ結合タンパク質Ｓａｃ７ｄ）に由来してもよい。本開示のアフィチンは標的配列（抗原の全体であってもよいし一部であってもよい）に選択的に結合する。典型的な本開示のアフィチンは、１つ以上のアミノ酸配列をＤＮＡ結合タンパク質の結合表面にランダム化して得られたタンパク質をリボソーム提示および選択に供するすることにより製造される。本開示のアフィチンの標的配列は、たとえば、ペプチド、タンパク質、ウイルス、または細菌のゲノムまたは表面に見られるものであってもよい。本開示の特定の実施形態では、アフィチン分子を酵素の特異的抑制物質として用いてもよい。本開示のアフィチン分子は耐熱性タンパク質またはその誘導体を含んでもよい。
【００７３】
本開示のアルファボディ分子は細胞透過性アルファボディ（ＣＰＡＢ）ともよばれることがある。本開示のアルファボディ分子は、様々な標的配列（抗原など）に結合する小さなタンパク質（一般に１０ｋＤａ未満）を含む。アルファボディ分子は細胞内の標的配列に到達し結合できる。構造的に、本開示のアルファボディ分子は一本鎖のαヘリックス（天然の撚り合わせコイル構造に似ている）を形成する人工配列を含む。本開示のアルファボディ分子は、標的タンパク質に特異的に結合するよう修飾された１個以上のアミノ酸を含むタンパク質足場を含んでもよい。分子の結合特異性に拘わらず、本開示のアルファボディ分子は正しい折りたたみと熱安定性を維持する。
【００７４】
本開示のアンチカリン分子は、タンパク質または小分子に含まれる標的配列または部位に結合する人工タンパク質を含む。本開示のアンチカリン分子は、ヒトリポカリンに由来する人工タンパク質を含んでもよい。本開示のアンチカリン分子は、たとえばモノクローナル抗体またはその断片の代わりに用いられてもよい。アンチカリン分子は、モノクローナル抗体またはその断片よりも優れた組織透過性および熱安定性を示してもよい。典型的な本開示のアンチカリン分子は、約１８０個のアミノ酸を含んで約２０ｋＤａの質量を有していてもよい。構造的に、本開示のアンチカリン分子は、ループおよび結合したαヘリックスによって対になるよう連結された逆平行β鎖を含む筒状構造を含む。好ましい実施形態では、本開示のアンチカリン分子は、ループおよび結合したαヘリックスによって対になるよう連結された８本の逆平行β鎖を含む筒状構造を含む。
【００７５】
本開示のアビマー分子は、標的配列（抗原であってもよい）に特異的に結合する人工タンパク質を含む。本開示のアビマーは、同一の標的または別個の標的内の複数の結合部位を認識してもよい。本開示のアビマーが２つ以上の標的を認識する場合、アビマーは二重特異性抗体に似た機能を持つ。人工タンパク質アビマーは、それぞれ約３０〜３５アミノ酸の２つ以上のペプチド配列を含んでもよい。これらのペプチドは１つ以上のリンカーペプチドによって連結されていてもよい。アビマーのペプチドのうちの１つ以上のペプチドのアミノ酸配列は膜受容体のＡドメインに由来してもよい。アビマーは必要に応じてジスルフィド結合および／またはカルシウムを含んでもよい強固な構造を持つ。本開示のアビマーは抗体に比べて高い熱安定性を示してもよい。
【００７６】
本開示のＤＡＲＰｉｎ（設計アンキリン反復タンパク質）は、標的配列に対し高い特異性と高い親和性を持つ遺伝子操作、組み換え、またはキメラ型タンパク質を含む。特定の実施形態では、本開示のＤＡＲＰｉｎはアンキリンタンパク質に由来し、必要に応じて、アンキリンタンパク質の少なくとも３つの反復モチーフ（反復構造単位ともいう）を含む。アンキリンタンパク質はタンパク質とタンパク質との親和性の高い相互作用を媒介する。本開示のＤＡＲＰｉｎは大きな標的相互作用表面を構成する。
【００７７】
本開示のフィノマーは、ヒトFyn SH3ドメインに由来し標的配列に結合するよう遺伝子操作された小さな（約７ｋＤａ）結合タンパク質、ならびに抗体と同等の親和性および同等の特異性を持つ分子を含む。
【００７８】
本開示のクニッツドメインペプチドはクニッツドメインを含むタンパク質足場を含む。クニッツドメインは、プロテアーゼ活性を阻害する活性部位を含む。構造的に、本開示のクニッツドメインはジスルフィドが豊富なα＋βの折りたたみを含む。この構造の例としてウシ膵臓トリプシンインヒビターが挙げられる。クニッツドメインペプチドは特定のタンパク質構造を認識し、競合的なプロテアーゼインヒビターとして機能する。本開示のクニッツドメインはエカランチド（ヒトリポタンパク質関連凝固インヒビター（ＬＡＣＩ）に由来）を含んでもよい。
【００７９】
本開示のモノボディは単鎖抗体と同等の大きさの小さな（約９４個のアミノ酸を含み約１０ｋＤａの質量を有する）タンパク質である。これらの遺伝子操作タンパク質は抗原などの標的配列に特異的に結合する。本開示のモノボディは、１種以上の別個のタンパク質または標的配列を特異的に標的としてもよい。好ましい実施形態では、本開示のモノボディはヒトフィブロネクチンに似た構造、より好ましくはフィブロネクチンの第１０の細胞外ＩＩＩ型ドメインに似た構造のタンパク質足場を含む。このフィブロネクチンの第１０の細胞外ＩＩＩ型ドメインおよびそのモノボディ模倣物は、筒を形成する７つのβシートと、各側に抗体の３個の相補性決定領域（ＣＤＲ）に対応する３つの露出したループを含む。抗体の可変ドメインの構造とは異なり、モノボディは金属イオンとの結合部位および中心のジスルフィド結合を欠失している。ループＢＣおよびＦＧを修飾することによって多重特異性モノボディを最適化してもよい。本開示のモノボディはアドネクチンを含んでもよい。
【００８０】
ＶＨＨ
本開示の組成物および方法の特定の実施形態では、ＣＡＲまたはＣＬＲは単一ドメイン抗体（ＳｄＡｂ）を含む。特定の実施形態では、前記ＳｄＡｂはＶＨＨである。
【００８１】
本開示は、抗原またはリガンド認識領域をそれぞれ含むＣＡＲまたはＣＬＲを提供し、これらは少なくとも１つの（「ＶＣＡＲ」または「ＶＣＬＲ」を生成する）ＶＨＨを含む。本開示のＣＡＲおよびＣＬＲは２つ以上のＶＨＨを含んでもよい。たとえば、二重特異性ＶＣＡＲまたはＶＣＬＲは２つのＶＨＨを含んでもよい。この二重特異性ＶＣＡＲまたはＶＣＬＲの実施形態によっては、各ＶＨＨは別の抗原に特異的に結合する。
【００８２】
本開示のＶＨＨタンパク質は抗原またはリガンドに特異的に結合する。抗原に特異的に結合する１つ以上のＶＨＨを含む本開示のＣＡＲを用いて細胞（たとえば細胞傷害性免疫細胞）の特異性を特定の抗原を発現する標的細胞に向けてもよい。抗原に特異的に結合する１つ以上のＶＨＨを含む本開示のＣＬＲは、いずれかのＶＨＨのリガンドに結合すると、誘発性プロモーターの制御下で配列の発現を活性化する細胞内シグナルを伝達してもよい。
【００８３】
本開示のＶＨＨをコードする配列の変更、追加、および／または欠失によって免疫原性を低下させたり、結合、親和性、オン率、オフ率、結合力、特異性、半減期、安定性、溶解度、または当技術分野で公知の他の任意の適切な特性を低減、増強、または変更したりできる。
【００８４】
必要に応じて、ＶＨＨタンパク質は、抗原またはリガンドへの高い親和性や任意の有利な生物学的特性を保持しつつ遺伝子操作することができる。この目的を達成するため、ＶＨＨタンパク質は、親配列および様々な概念的な遺伝子操作産物の分析方法によって、親配列および遺伝子操作配列の三次元モデルを用いて必要に応じて調製できる。三次元モデルは当業者に一般に利用でき、よく知られている。選択された候補配列の推定三次元立体配置構造を図示・表示するコンピュータプログラム（たとえば、Xencor, Inc.（カリフォルニア州モンロビア）のImmunofilterプログラム）が利用でき、可能性のある免疫原性を測定できる。これらの表示を検討することにより、候補配列の機能において残基が果たす可能性のある役割の分析、すなわち、候補ＶＨＨタンパク質がその抗原／リガンドに結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能である。このように、標的抗原／リガンドとの親和性などの所望の特性が得られるように親配列および基準配列から残基を選択し組み合わせることができる。上記の手順の代わりに、またはそれに加えて、他の好適な遺伝子操作方法を用いることができる。
【００８５】
ＶＨ
本開示の組成物および方法の特定の実施形態では、ＣＡＲまたはＣＬＲは単一ドメイン抗体（ＳｄＡｂ）を含む。特定の実施形態では、ＳｄＡｂはＶＨである。
【００８６】
本開示は、単一ドメイン抗体（それぞれ「ＶＣＡＲ」または「ＶＣＬＲ」を生成する）を含むＣＡＲ／ＣＬＲを提供する。特定の実施形態では、単一ドメイン抗体はＶＨを含む。特定の実施形態では、ＶＨはヒトの配列から単離されるかヒトの配列に由来する。特定の実施形態では、ＶＨはヒトのＣＤＲ配列および／またはヒトのフレームワーク配列とヒト以外の配列またはヒト化配列を含む（たとえばラットのＦｃドメイン）。特定の実施形態では、ＶＨは完全ヒト化ＶＨである。特定の実施形態では、ＶＨは天然抗体でも天然抗体の断片でもない。特定の実施形態では、ＶＨはモノクローナル抗体の断片ではない。特定の実施形態では、ＶＨはUniDab（商標）抗体（TeneoBio）である。
【００８７】
特定の実施形態では、ＶＨはＶＨを作製するUniRat（商標）（TeneoBio）系および"NGS-based Discovery"を用いて完全に修飾される。この方法を用いて、天然ではなく完全に修飾された系を用いて特異的ＶＨを生成する。ＶＨは、宿主（たとえばマウス、ラット、またはヒト）から直接単離される、あるいは細胞または細胞株（ハイブリドーマ）の単一のクローンから直接単離される、天然のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）に由来しない。これらのＶＨはその後、前記細胞株からクローン化されなかった。代わりに、ＶＨ配列は、UniRat（商標）系をヒトの可変領域（ＶＨドメイン）とラットのＦｃドメインを含む導入遺伝子として用いて完全に修飾され、したがって軽鎖を持たないヒト／ラットキメラであり、標準のｍＡｂ形式とは異なっている。天然のラット遺伝子をノックアウトし、ラット体内で発現された唯一の抗体はラットＦｃに連結されたＶＨドメインを含む誘導遺伝子（UniAb）に由来している。これらはUniRatで発現する唯一の抗体である。次世代シーケンシング（ＮＧＳ）および生物情報学を用いて、免疫後にUniRat（商標）によって生成された重鎖抗体の完全な抗原特異的レパートリーを特定する。次いで特有遺伝子アセンブリ法を用いて、抗体レパートリー配列情報を、様々な機能について実験器具内で選抜できる完全ヒト重鎖抗体の大規模なコレクションに変える。特定の実施形態では、完全ヒト化ＶＨはヒトのＶＨドメインをヒトのＦｃと実験器具内で融合（して非天然の組み換えＶＨ抗体を生成）することによって生成される。特定の実施形態では、ＶＨは完全にヒト化されているが、生体内で軽鎖を含まないヒト／ラットキメラ（ヒトＶＨ、ラットＦｃ）として発現する。完全ヒト化ＶＨは生体内で軽鎖を含まないヒト／ラットキメラ（ヒトＶＨ、ラットＦｃ）として発現され、約８０ｋＤａである（１５０ｋＤａに対して）。
【００８８】
本開示のＶＣＡＲ／ＶＣＬＲは本開示の少なくとも１つのＶＨを含んでもよい。特定の実施形態では、本開示のＶＨを、Ｆｃドメインまたはその一部を除去するよう修飾してもよい。特定の実施形態では、本開示のＶＨのフレームワーク配列を、たとえば発現の改善、免疫原性の低下、または機能の改善のために修飾してもよい。
【００８９】
トランスポゾン／転移酵素
典型的な本開示のトランスポゾン／転移酵素系としては、piggyBacトランスポゾンおよび転移酵素、スリーピング・ビューティ・トランスポゾンおよび転移酵素、ヘルレイザー（Helraiser）トランスポゾンおよび転移酵素、ならびにTol2トランスポゾンおよび転移酵素が挙げられるがこれらに限定されない。
【００９０】
piggyBac転移酵素は、トランスポゾンの両端にあるトランスポゾンに特異的な末端逆位（inverted terminal repeat = ITR）配列を認識し、ＩＴＲ間にある内容をＴＴＡＡ染色体部位に移動する。piggyBacトランスポゾン系にはＩＴＲ間に含むことのできる目的遺伝子の搭載物（payload）に制限がない。特定の実施形態では、特にトランスポゾンがpiggyBacトランスポゾンである実施形態では、転移酵素はpiggyBac（商標）またはSuper piggyBac（商標）（ＳＰＢ）転移酵素である。特定の実施形態では、特に転移酵素がSuper piggyBac（商標）（ＳＰＢ）転移酵素である実施形態では、転移酵素をコードする配列はｍＲＮＡ配列である。
【００９１】
本開示の方法の特定の実施形態では、前記転移酵素はpiggyBac（商標）（ＰＢ）転移酵素である。前記piggyBac（ＰＢ）転移酵素は、以下の配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはその間の任意の割合で同一のアミノ酸配列を含むか、そのようなアミノ酸配列からなってもよい：
【化３９】
2020532987.tif 000041
（配列番号14487）。
【００９２】
本開示の方法の特定の実施形態では、前記転移酵素は以下の配列の位置３０、１６５、２８２、５３８のうちの１箇所以上にアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含むか、そのようなアミノ酸配列からなるpiggyBac（商標）（ＰＢ）転移酵素である：
【化４０】
2020532987.tif 000042
（配列番号14487）。
【００９３】
特定の実施形態では、前記転移酵素は配列番号14487の配列の位置３０、１６５、２８２、５３８のうちの２箇所以上にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むか、そのようなアミノ酸配列からなるpiggyBac（商標）（ＰＢ）転移酵素である。特定の実施形態では、前記転移酵素は配列番号14487の配列の位置３０、１６５、２８２、５３８のうちの３箇所以上にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むか、そのようなアミノ酸配列からなるpiggyBac（商標）（ＰＢ）転移酵素である。特定の実施形態では、前記転移酵素は配列番号14487の配列の位置３０、１６５、２８２、および５３８のそれぞれにアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むか、そのようなアミノ酸配列からなるpiggyBac（商標）（ＰＢ）転移酵素である。特定の実施形態では、配列番号14487の配列の位置３０にある前記アミノ酸置換はイソロイシン（Ｉ）がバリン（Ｖ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487の配列の位置１６５にある前記アミノ酸置換はグリシン（Ｇ）がセリン（Ｓ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487の配列の位置２８２にある前記アミノ酸置換はメチオニン（Ｍ）がバリン（Ｖ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487の配列の位置５３８にある前記アミノ酸置換はアスパラギン（Ｎ）がリシン（Ｋ）で置換されたものである。
【００９４】
本開示の方法の特定の実施形態では、前記転移酵素はSuper piggyBac（商標）（ＳＰＢ）転移酵素である。特定の実施形態では、本開示のSuper piggyBac（商標）（ＳＰＢ）転移酵素は、配列番号14487の配列の位置３０にあるアミノ酸置換はイソロイシン（Ｉ）がバリン（Ｖ）で置換されたものであり、位置１６５にあるアミノ酸置換はグリシン（Ｇ）がセリン（Ｓ）で置換されたものであり、位置２８２にあるアミノ酸置換はメチオニン（Ｍ）がバリン（Ｖ）で置換されたものであり、位置５３８にあるアミノ酸置換はアスパラギン（Ｎ）がリシン（Ｋ）で置換されたものであるアミノ酸配列を含むかそのようなアミノ酸配列からなってもよい。特定の実施形態では、このSuper piggyBac（商標）（ＳＰＢ）転移酵素は、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはその間の任意の割合で以下の配列と同一のアミノ酸配列を含むか、そのようなアミノ酸配列からなってもよい：
【化４１】
2020532987.tif 000043
（配列番号14484）。
【００９５】
前記転移酵素が位置３０、１６５、２８２、および／または５３８に上記の変異を含む実施形態を含む本開示の方法の特定の実施形態では、piggyBac（商標）またはSuper piggyBac（商標）転移酵素は、配列番号14487または配列番号14484の配列の位置３、４６、８２、１０３、１１９、１２５、１７７、１８０、１８５、１８７、２００、２０７、２０９、２２６、２３５、２４０、２４１、２４３、２５８、２９６、２９８、３１１、３１５、３１９、３２７、３２８、３４０、４２１、４３６、４５６、４７０、４８６、５０３、５５２、５７０、および５９１のうちの１箇所以上にアミノ酸置換をさらに含んでもよい。前記転移酵素が位置３０、１６５、２８２、および／または５３８に上記の変異を含む実施形態を含む特定の実施形態では、piggyBac（商標）またはSuper piggyBac（商標）転移酵素は、位置４６、１１９、１２５、１７７、１８０、１８５、１８７、２００、２０７、２０９、２２６、２３５、２４０、２４１、２４３、２９６、２９８、３１１、３１５、３１９、３２７、３２８、３４０、４２１、４３６、４５６、４７０、４８５、５０３、５５２、および５７０のうちの１箇所以上にアミノ酸置換をさらに含んでもよい。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置３にあるアミノ酸置換はセリン（Ｓ）がアスパラギン（Ｎ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置４６にあるアミノ酸置換はアラニン（Ａ）がセリン（Ｓ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置４６にあるアミノ酸置換はアラニン（Ａ）がスレオニン（Ｔ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置８２にあるアミノ酸置換はイソロイシン（Ｉ）がトリプトファン（Ｗ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置１０３にあるアミノ酸置換はセリン（Ｓ）がプロリン（Ｐ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置１１９にあるアミノ酸置換はアルギニン（Ｒ）がプロリン（Ｐ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置１２５にあるアミノ酸置換はシステイン（Ｃ）がアラニン（Ａ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置１２５にあるアミノ酸置換はシステイン（Ｃ）がロイシン（Ｌ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置１７７にあるアミノ酸置換はチロシン（Ｙ）がリシン（Ｋ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置１７７にあるアミノ酸置換はチロシン（Ｙ）がヒスチジン（Ｈ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置１８０にあるアミノ酸置換はフェニルアラニン（Ｆ）がロイシン（Ｌ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置１８０にあるアミノ酸置換はフェニルアラニン（Ｆ）がイソロイシン（Ｉ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置１８０にあ��アミノ酸置換はフェニルアラニン（Ｆ）がバリン（Ｖ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置１８５にあるアミノ酸置換はメチオニン（Ｍ）がロイシン（Ｌ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置１８７にあるアミノ酸置換はアラニン（Ａ）がグリシン（Ｇ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置２００にあるアミノ酸置換はフェニルアラニン（Ｆ）がトリプトファン（Ｗ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置２０７にあるアミノ酸置換はバリン（Ｖ）がプロリン（Ｐ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置２０９にあるアミノ酸置換はバリン（Ｖ）がフェニルアラニン（Ｆ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置２２６にあるアミノ酸置換はメチオニン（Ｍ）がフェニルアラニン（Ｆ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置２３５にあるアミノ酸置換はロイシン（Ｌ）がアルギニン（Ｒ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置２４０にあるアミノ酸置換はバリン（Ｖ）がリシン（Ｋ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置２４１にあるアミノ酸置換はフェニルアラニン（Ｆ）がロイシン（Ｌ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置２４３にあるアミノ酸置換はプロリン（Ｐ）がリシン（Ｋ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置２５８にあるアミノ酸置換はアスパラギン（Ｎ）がセリン（Ｓ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置２９６にあるアミノ酸置換はロイシン（Ｌ）がトリプトファン（Ｗ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置２９６にあるアミノ酸置換はロイシン（Ｌ）がチロシン（Ｙ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置２９６にあるアミノ酸置換はロイシン（Ｌ）がフェニルアラニン（Ｆ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置２９８にあるアミノ酸置換はメチオニン（Ｍ）がロイシン（Ｌ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置２９８にあるアミノ酸置換はメチオニン（Ｍ）がアラニン（Ａ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置２９８にあるアミノ酸置換はメチオニン（Ｍ）がバリン（Ｖ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置３１１にあるアミノ酸置換はプロリン（Ｐ）がイソロイシン（Ｉ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置３１１にあるアミノ酸置換はプロリン（Ｐ）がバリンで置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置３１５にあるアミノ酸置換はアルギニン（Ｒ）がリシン（Ｋ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置３１９にあるアミノ酸置換はスレオニン（Ｔ）がグリシン（Ｇ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置３２７にあるアミノ酸置換はチロシン（Ｙ）がアルギニン（Ｒ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置３２８にあるアミノ酸置換はチロシン（Ｙ）がバリン（Ｖ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置３４０にあるアミノ酸置換はシステイン（Ｃ）がグリシン（Ｇ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置３４０にあるアミノ酸置換はシステイン（Ｃ）がロイシン（Ｌ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置４２１にあるアミノ酸置換はアスパラギン酸（Ｄ）がヒスチジン（Ｈ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置４３６にあるアミノ酸置換はバリン（Ｖ）がイソロイシン（Ｉ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置４５６にあるアミノ酸置換はメチオニン（Ｍ）がチロシン（Ｙ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置４７０にあるアミノ酸置換はロイシン（Ｌ）がフェニルアラニン（Ｆ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置４８５にあるアミノ酸置換はセリン（Ｓ）がリシン（Ｋ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置５０３にあるアミノ酸置換はメチオニン（Ｍ）がロイシン（Ｌ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置５０３にあるアミノ酸置換はメチオニン（Ｍ）がイソロイシン（Ｉ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置５５２にあるアミノ酸置換はバリン（Ｖ）がリシン（Ｋ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置５７０にあるアミノ酸置換はアラニン（Ａ）がスレオニン（Ｔ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置５９１にあるアミノ酸置換はグルタミン（Ｑ）がプロリン（Ｐ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置５９１にあるアミノ酸置換はグルタミン（Ｑ）がアルギニン（Ｒ）で置換されたものである。
【００９６】
転移酵素が位置３０、１６５、２８２、および／または５３８に上記の変異を含む実施形態を含む、本開示の方法の特定の実施形態では、piggyBac（商標）またはSuper piggyBac（商標）転移酵素は、配列番号14487または配列番号14484の配列の位置１０３、１９４、３７２、３７５、４５０、５０９、および５７０のうちの１箇所以上にアミノ酸置換をさらに含んでもよい。転移酵素が位置３０、１６５、２８２、および／または５３８に上記の変異を含む実施形態を含む本開示の方法の特定の実施形態では、piggyBac（商標）またはSuper piggyBac（商標）転移酵素は、配列番号14487または配列番号14484の配列の位置１０３、１９４、３７２、３７５、４５０、５０９、および５７０のうちの２箇所、３箇所、４箇所、５箇所、６箇所またはそれ以上の箇所にアミノ酸置換をさらに含んでもよい。転移酵素が位置３０、１６５、２８２、および／または５３８に上記の変異を含む実施形態を含む特定の実施形態では、piggyBac（商標）またはSuper piggyBac（商標）転移酵素は、配列番号14487または配列番号14484の配列の位置１０３、１９４、３７２、３７５、４５０、５０９、および５７０にアミノ酸置換をさらに含んでもよい。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置１０３にあるアミノ酸置換はセリン（Ｓ）がプロリン（Ｐ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置１９４にあるアミノ酸置換はメチオニン（Ｍ）がバリン（Ｖ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置３７２にあるアミノ酸置換はアルギニン（Ｒ）がアラニン（Ａ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置３７５にあるアミノ酸置換はリシン（Ｋ）がアラニン（Ａ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置４５０にあるアミノ酸置換はアスパラギン酸（Ｄ）がアスパラギン（Ｎ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置５０９にあるアミノ酸置換はセリン（Ｓ）がグリシン（Ｇ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置５７０にあるアミノ酸置換はアスパラギン（Ｎ）がセリン（Ｓ）で置換されたものである。特定の実施形態では、piggyBac（商標）転移酵素は配列番号14487の位置１９４にメチオニン（Ｍ）のバリン（Ｖ）による置換を含んでもよい。piggyBac（商標）転移酵素が配列番号14487の位置１９４にメチオニン（Ｍ）のバリン（Ｖ）による置換を含んでもよい実施形態を含む特定の実施形態では、piggyBac（商標）転移酵素は配列番号14487または配列番号14484の配列の位置３７２、３７５、および４５０にアミノ酸置換をさらに含んでもよい。特定の実施形態では、piggyBac（商標）転移酵素は配列番号14487の位置１９４にメチオニン（Ｍ）のバリン（Ｖ）による置換、配列番号14487の位置３７２にアルギニン（Ｒ）のアラニン（Ａ）による置換、および配列番号14487の位置３７５にリシン（Ｋ）のアラニン（Ａ）による置換を含んでもよい。特定の実施形態では、piggyBac（商標）転移酵素は配列番号14487の位置１９４にメチオニン（Ｍ）のバリン（Ｖ）による置換、配列番号14487の位置３���２にアルギニン（Ｒ）のアラニン（Ａ）による置換、配列番号14487の位置３７５にリシン（Ｋ）のアラニン（Ａ）による置換、および配列番号14487の位置４５０にアスパラギン酸（Ｄ）のアスパラギン（Ｎ）による置換を含んでもよい。
【００９７】
スリーピング・ビューティトランスポゾンは、ＩＴＲを認識しＩＴＲ間にある内容をＴＡ染色体部位に移動するスリーピング・ビューティ転移酵素によって標的ゲノムに転移される。様々な実施形態で、ＳＢトランスポゾンによる遺伝子導入またはこれに似た多数のトランスポゾンのいずれかを用いた遺伝子導入を本開示の組成物および方法に用いてもよい。
【００９８】
特定の実施形態では、特にトランスポゾンがスリーピング・ビューティ・トランスポゾンである実施形態では、転移酵素はスリーピング・ビューティ転移酵素または機能亢進性のスリーピング・ビューティ転移酵素（ＳＢ１００Ｘ）である。
【００９９】
本開示の方法の特定の実施形態では、スリーピング・ビューティ転移酵素は以下の配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはその間の任意の割合で同一のアミノ酸配列を含む：
【化４２】
2020532987.tif 000044
（配列番号14485）。
【０１００】
本開示の方法の特定の実施形態では、機能亢進性のスリーピング・ビューティ（ＳＢ１００Ｘ）転移酵素は以下の配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはその間の任意の割合で同一のアミノ酸配列を含む：
【化４３】
2020532987.tif 000045
（配列番号14486）。
【０１０１】
ヘルレイザートランスポゾンは、ヘリトロン転移酵素によって転移される。ヘリトロン転移酵素は、ヘルレイザートランスポゾン（３０００万〜３６００万年前に有効であったコウモリのゲノムに由来する古い配列）を移動する。典型的な本開示のヘルレイザートランスポゾンとしてはＨｅｌｉｂａｔ１が挙げられ、これは以下を含む核酸配列を含む：
【化４４】
2020532987.tif 000046
【化４５】
2020532987.tif 000047
【化４６】
2020532987.tif 000048
（配列番号14652）。
【０１０２】
他の転移酵素とは異なり、ヘリトロン転移酵素はＲＮＡ分解酵素Ｈに似た触媒ドメインを含まないが、代わりに複製開始ドメイン（Ｒｅｐ）とＤＮＡ巻き戻し酵素ドメインで構成されるＲｅｐＨｅｌモチーフを含む。Ｒｅｐドメインは核酸分解酵素のＨＵＨスーパーファミリーの核酸分解酵素ドメインである。
【０１０３】
典型的な本開示のヘリトロン転移酵素は、以下を含むアミノ酸配列を含む：
【化４７】
2020532987.tif 000049
（配列番号14501）。
【０１０４】
ヘリトロン転移では、トランスポゾンの３’末端に近いヘアピンが転写終結コドンとして機能する。しかし、このヘアピンを転移酵素によって迂回することにより隣接配列を形質導入することができる。また、ヘルレイザー転移によって共有結合性閉環状中間体が生成される。さらに、ヘリトロン転移は標的部位の複製を欠失する可能性がある。ヘルレイザー配列では、転移酵素にはＬＴＳおよびＲＴＳと名付けられた左右の末端配列が隣接している。これらの配列は保存された５’−ＴＣ／ＣＴＡＧ−３’モチーフで終了する。ヘアピン終結構造を形成する能力のある１９ｂｐの回文配列は、ＲＴＳの１１ヌクレオチド上流に位置し、配列GTGCACGAATTTCGTGCACCGGGCCACTAG（配列番号14500）からなる。
【０１０５】
Ｔｏｌ２トランスポゾンはメダカのゲノムから単離されるかゲノムに由来してもよく、ｈＡＴファミリーのトランスポゾンに似ていてもよい。典型的な本開示のＴｏｌ２トランスポゾンは約４．７キロベースを含む配列によってコードされ、Ｔｏｌ２転移酵素をコードする遺伝子を含む。この遺伝子は４つのエキソンを含む。典型的な本開示のＴｏｌ２転移酵素は、以下を含むアミノ酸配列を含む：
【化４８】
2020532987.tif 000050
（配列番号14502）。
【０１０６】
逆方向反復、サブ末端配列、およびＴｏｌ２転移酵素を含む典型的な本開示のＴｏｌ２トランスポゾンは、以下を含む核酸配列によってコードされる：
【化４９】
2020532987.tif 000051
【化５０】
2020532987.tif 000052
（配列番号17041）。
【０１０７】
典型的な本開示のトランスポゾン／転移酵素系としては、piggyBacおよびpiggyBac様トランスポゾンおよび転移酵素が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１０８】
piggyBacおよびpiggyBac様転移酵素はトランスポゾンの両端にあるトランスポゾンに特異的な末端逆位（ＩＴＲ）配列を認識し、ＩＴＲ間にある内容をＴＴＡＡまたはＴＴＡＴ染色体部位に移動する。piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾン系にはＩＴＲ間に含むことのできる目的遺伝子の搭載物に制限がない。
【０１０９】
特定の実施形態では、特にトランスポゾンがpiggyBacトランスポゾンである実施形態では、転移酵素はpiggyBac（商標）またはSuper piggyBac（商標）（ＳＰＢ）転移酵素である。特定の実施形態では、特に転移酵素がpiggyBac（商標）またはSuper piggyBac（商標）（ＳＰＢ）転移酵素である実施形態では、転移酵素をコードする配列はｍＲＮＡ配列である。
【０１１０】
本開示の方法の特定の実施形態では、前記転移酵素はpiggyBacまたはpiggyBac様転移酵素である。
【０１１１】
本開示の方法の特定の実施形態では、前記転移酵素はpiggyBacまたはpiggyBac様転移酵素である。前記piggyBac（ＰＢ）またはpiggyBac様転移酵素は、以下の配列と少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはその間の任意の割合で同一のアミノ酸配列を含むか、そのようなアミノ酸配列からなってもよい：
【化５１】
2020532987.tif 000053
（配列番号14487）。
【０１１２】
本開示の方法の特定の実施形態では、前記転移酵素は、以下の配列の位置３０、１６５、２８２および５３８のうちの１箇所以上にアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含むか、そのようなアミノ酸配列からなるpiggyBacまたはpiggyBac様転移酵素である：
【化５２】
2020532987.tif 000054
（配列番号14487）。
【０１１３】
特定の実施形態では、前記転移酵素は配列番号14487の配列の位置３０、１６５、２８２、５３８のうちの２箇所以上にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むか、そのようなアミノ酸配列からなるpiggyBacまたはpiggyBac様転移酵素である。特定の実施形態では、前記転移酵素は配列番号14487の配列の位置３０、１６５、２８２、５３８のうちの３箇所以上にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むか、そのようなアミノ酸配列からなるpiggyBacまたはpiggyBac様転移酵素である。特定の実施形態では、前記転移酵素は配列番号14487の配列の位置３０、１６５、２８２、および５３８のそれぞれにアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むか、そのようなアミノ酸配列からなるpiggyBacまたはpiggyBac様転移酵素である。特定の実施形態では、配列番号14487の配列の位置３０にある前記アミノ酸置換はイソロイシン（Ｉ）がバリン（Ｖ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487の配列の位置１６５にある前記アミノ酸置換はグリシン（Ｇ）がセリン（Ｓ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487の配列の位置２８２にある前記アミノ酸置換はメチオニン（Ｍ）がバリン（Ｖ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487の配列の位置５３８にある前記アミノ酸置換はアスパラギン（Ｎ）がリシン（Ｋ）で置換されたものである。
【０１１４】
本開示の方法の特定の実施形態では、前記転移酵素はSuper piggyBac（商標）（ＳＰＢ）またはpiggyBac様転移酵素である。特定の実施形態では、本開示のSuper piggyBac（商標）（ＳＰＢ）またはpiggyBac様転移酵素は、配列番号14487の配列の位置３０にある前記アミノ酸置換はイソロイシン（Ｉ）がバリン（Ｖ）で置換されたものであり、位置１６５にある前記アミノ酸置換はグリシン（Ｇ）がセリン（Ｓ）で置換されたものであり、位置２８２にある前記アミノ酸置換はメチオニン（Ｍ）がバリン（Ｖ）で置換されたものであり、位置５３８にある前記アミノ酸置換はアスパラギン（Ｎ）がリシン（Ｋ）で置換されたものであるアミノ酸配列を含むかそのようなアミノ酸配列からなってもよい。特定の実施形態では、前記Super piggyBac（商標）（ＳＰＢ）またはpiggyBac様転移酵素は、以下の配列と少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはその間の任意の割合で同一のアミノ酸配列を含むか、そのようなアミノ酸配列からなってもよい：
【化５３】
2020532987.tif 000055
（配列番号14484）。
【０１１５】
前記転移酵素が位置３０、１６５、２８２、および／または５３８に上記の変異を含む実施形態を含む本開示の方法の特定の実施形態では、piggyBac（商標）またはSuper piggyBac（商標）またはpiggyBac様転移酵素は、配列番号14487または配列番号14484の配列の位置３、４６、８２、１０３、１１９、１２５、１７７、１８０、１８５、１８７、２００、２０７、２０９、２２６、２３５、２４０、２４１、２４３、２５８、２９６、２９８、３１１、３１５、３１９、３２７、３２８、３４０、４２１、４３６、４５６、４７０、４８６、５０３、５５２、５７０、および５９１のうちの１箇所以上にアミノ酸置換をさらに含んでもよい。前記転移酵素が位置３０、１６５、２８２、および／または５３８に上記の変異を含む実施形態を含む特定の実施形態では、piggyBac（商標）またはSuper piggyBac（商標）、あるいはpiggyBac様転移酵素は、位置４６、１１９、１２５、１７７、１８０、１８５、１８７、２００、２０７、２０９、２２６、２３５、２４０、２４１、２４３、２９６、２９８、３１１、３１５、３１９、３２７、３２８、３４０、４２１、４３６、４５６、４７０、４８５、５０３、５５２、および５７０のうちの１箇所以上にアミノ酸置換をさらに含んでもよい。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置３にあるアミノ酸置換はセリン（Ｓ）がアスパラギン（Ｎ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置４６にあるアミノ酸置換はアラニン（Ａ）がセリン（Ｓ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置４６にあるアミノ酸置換はアラニン（Ａ）がスレオニン（Ｔ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置８２にあるアミノ酸置換はイソロイシン（Ｉ）がトリプトファン（Ｗ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置１０３にあるアミノ酸置換はセリン（Ｓ）がプロリン（Ｐ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置１１９にあるアミノ酸置換はアルギニン（Ｒ）がプロリン（Ｐ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置１２５にあるアミノ酸置換はシステイン（Ｃ）がアラニン（Ａ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置１２５にあるアミノ酸置換はシステイン（Ｃ）がロイシン（Ｌ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置１７７にあるアミノ酸置換はチロシン（Ｙ）がリシン（Ｋ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置１７７にあるアミノ酸置換はチロシン（Ｙ）がヒスチジン（Ｈ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置１８０にあるアミノ酸置換はフェニルアラニン（Ｆ）がロイシン（Ｌ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置１８０にあるアミノ酸置換はフェニルアラニン（Ｆ）がイソロイシン（Ｉ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置１８０にあるアミノ酸置換はフェニルアラニン（Ｆ）がバリン（Ｖ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置１８５にあるアミノ酸置換はメチオニン（Ｍ）がロイシン（Ｌ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置１８７にあるアミノ酸置換はアラニン（Ａ）がグリシン（Ｇ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置２００にあるアミノ酸置換はフェニルアラニン（Ｆ）がトリプトファン（Ｗ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置２０７にあるアミノ酸置換はバリン（Ｖ）がプロリン（Ｐ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置２０９にあるアミノ酸置換はバリン（Ｖ）がフェニルアラニン（Ｆ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置２２６にあるアミノ酸置換はメチオニン（Ｍ）がフェニルアラニン（Ｆ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置２３５にあるアミノ酸置換はロイシン（Ｌ）がアルギニン（Ｒ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置２４０にあるアミノ酸置換はバリン（Ｖ）がリシン（Ｋ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置２４１にあるアミノ酸置換はフェニルアラニン（Ｆ）がロイシン（Ｌ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置２４３にあるアミノ酸置換はプロリン（Ｐ）がリシン（Ｋ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置２５８にあるアミノ酸置換はアスパラギン（Ｎ）がセリン（Ｓ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置２９６にあるアミノ酸置換はロイシン（Ｌ）がトリプトファン（Ｗ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置２９６にあるアミノ酸置換はロイシン（Ｌ）がチロシン（Ｙ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置２９６にあるアミノ酸置換はロイシン（Ｌ）がフェニルアラニン（Ｆ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置２９８にあるアミノ酸置換はメチオニン（Ｍ）がロイシン（Ｌ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置２９８にあるアミノ酸置換はメチオニン（Ｍ）がアラニン（Ａ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置２９８にあるアミノ酸置換はメチオニン（Ｍ）がバリン（Ｖ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置３１１にあるアミノ酸置換はプロリン（Ｐ）がイソロイシン（Ｉ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置３１１にあるアミノ酸置換はプロリン（Ｐ）がバリンで置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置３１５にあるアミノ酸置換はアルギニン（Ｒ）がリシン（Ｋ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置３１９にあるアミノ酸置換はスレオニン（Ｔ）がグリシン（Ｇ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置３２７にあるアミノ酸置換はチロシン（Ｙ）がアルギニン（Ｒ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置３２８にあるアミノ酸置換はチロシン（Ｙ）がバリン（Ｖ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置３４０にあるアミノ酸置換はシステイン（Ｃ）がグリシン（Ｇ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置３４０にあるアミノ酸置換はシステイン（Ｃ）がロイシン（Ｌ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置４２１にあるアミノ酸置換はアスパラギン酸（Ｄ）がヒスチジン（Ｈ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置４３６にあるアミノ酸置換はバリン（Ｖ）がイソロイシン（Ｉ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置４５６にあるアミノ酸置換はメチオニン（Ｍ）がチロシン（Ｙ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置４７０にあるアミノ酸置換はロイシン（Ｌ）がフェニルアラニン（Ｆ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置４８５にあるアミノ酸置換はセリン（Ｓ）がリシン（Ｋ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置５０３にあるアミノ酸置換はメチオニン（Ｍ）がロイシン（Ｌ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置５０３にあるアミノ酸置換はメチオニン（Ｍ）がイソロイシン（Ｉ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置５５２にあるアミノ酸置換はバリン（Ｖ）がリシン（Ｋ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置５７０にあるアミノ酸置換はアラニン（Ａ）がスレオニン（Ｔ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置５９１にあるアミノ酸置換はグルタミン（Ｑ）がプロリン（Ｐ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置５９１にあるアミノ酸置換はグルタミン（Ｑ）がアルギニン（Ｒ）で置換されたものである。
【０１１６】
前記転移酵素が位置３０、１６５、２８２、および／または５３８に上記の変異を含む実施形態を含む本開示の方法の特定の実施形態では、piggyBac（商標）またはpiggyBac様転移酵素は、配列番号14487または配列番号14484の配列の位置１０３、１９４、３７２、３７５、４５０、５０９、および５７０のうちの１箇所以上にアミノ酸置換をさらに含んでもよい。前記転移酵素が位置３０、１６５、２８２、および／または５３８に上記の変異を含む実施形態を含む本開示の方法の特定の実施形態では、piggyBac（商標）またはpiggyBac様転移酵素、あるいはSuper piggyBac（商標）転移酵素は、配列番号14487または配列番号14484の配列の位置１０３、１９４、３７２、３７５、４５０、５０９、および５７０のうちの２箇所、３箇所、４箇所、５箇所、６箇所またはそれ以上の箇所にアミノ酸置換をさらに含んでもよい。前記転移酵素が位置３０、１６５、２８２、および／または５３８に上記の変異を含む実施形態を含む特定の実施形態では、piggyBac（商標）またはpiggyBac様転移酵素、あるいはSuper piggyBac（商標）転移酵素は、配列番号14487または配列番号14484の配列の位置１０３、１９４、３７２、３７５、４５０、５０９、および５７０にアミノ酸置換をさらに含んでもよい。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置１０３にあるアミノ酸置換はセリン（Ｓ）がプロリン（Ｐ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置１９４にあるアミノ酸置換はメチオニン（Ｍ）がバリン（Ｖ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置３７２にあるアミノ酸置換はアルギニン（Ｒ）がアラニン（Ａ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置３７５にあるアミノ酸置換はリシン（Ｋ）がアラニン（Ａ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置４５０にあるアミノ酸置換はアスパラギン酸（Ｄ）がアスパラギン（Ｎ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置５０９にあるアミノ酸置換はセリン（Ｓ）がグリシン（Ｇ）で置換されたものである。特定の実施形態では、配列番号14487または配列番号14484の位置５７０にあるアミノ酸置換はアスパラギン（Ｎ）がセリン（Ｓ）で置換されたものである。特定の実施形態では、piggyBac（商標）またはpiggyBac様転移酵素は配列番号14487の位置１９４にメチオニン（Ｍ）のバリン（Ｖ）による置換を含んでもよい。piggyBac（商標）またはpiggyBac様転移酵素が配列番号14487の位置１９４にメチオニン（Ｍ）のバリン（Ｖ）による置換を含んでもよい実施形態を含む特定の実施形態では、piggyBac（商標）またはpiggyBac様転移酵素は配列番号14487または配列番号14484の配列の位置３７２、３７５、および４５０にアミノ酸置換をさらに含んでもよい。特定の実施形態では、piggyBac（商標）またはpiggyBac様転移酵素は配列番号14487の位置１９４にメチオニン（Ｍ）のバリン（Ｖ）による置換、配列番号14487の位置３７２にアルギニン（Ｒ）のアラニン（Ａ）による置換、および配列番号14487の位置３７５にリシン（Ｋ）のアラニン（Ａ）による置換を含んでもよい。特定の実施形態では、piggyBac��商標）またはpiggyBac様転移酵素は配列番号14487の位置１９４にメチオニン（Ｍ）のバリン（Ｖ）による置換、配列番号14487の位置３７２にアルギニン（Ｒ）のアラニン（Ａ）による置換、配列番号14487の位置３７５にリシン（Ｋ）のアラニン（Ａ）による置換、および配列番号14487の位置４５０にアスパラギン酸（Ｄ）のアスパラギン（Ｎ）による置換を含んでもよい。
【０１１７】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は昆虫から単離されるか昆虫に由来する。特定の実施形態では、昆虫はイラクサギンウワバ（Trichoplusia ni；GenBank登録番号AAA87375；配列番号17083）、ミツモンキンウワバ（Argyrogramma agnata；GenBank登録番号GU477713；配列番号17084、配列番号17085）、ガンビエハマダラカ（Anopheles gambiae；GenBank登録番号XP_312615（配列番号17086）；GenBank登録番号XP_320414（配列番号17087）；GenBank登録番号XP_310729（配列番号17088））、ワタアブラムシ（Aphis gossypii；GenBank登録番号GU329918；配列番号17089、配列番号17090）、エンドウヒゲナガアブラムシ（Acyrthosiphon pisum；GenBank登録番号XP_001948139；配列番号17091）、タマナヤガ（Agrotis ipsilon； GenBank登録番号GU477714；配列番号17092、配列番号17093）、カイコ（Bombyx mori；GenBank登録番号BAD11135；配列番号17094）、ニカメイチュウ（Chilo suppressalis；GenBank登録番号JX294476；配列番号17095、配列番号17096）、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster；GenBank登録番号AAL39784；配列番号17097）、オオタバコガ（Helicoverpa armigera；GenBank登録番号ABS18391；配列番号17098）、ニセアメリカタバコガ（Heliothis virescens；GenBank登録番号ABD76335；配列番号17099）、オオキクギンウワバ（Macdunnoughia crassisigna；GenBank登録番号EU287451；配列番号17100、配列番号17101）、ワタアカミムシガ（Pectinophora gossypiella；GenBank登録番号GU270322；配列番号17102、配列番号17103）、コクヌストモドキ（Tribolium castaneum；GenBank登録番号XP_001814566；配列番号17104）、ミツモンキンウワバ（Ctenoplusia agnata（Argyrogramma agnataともいう））、メソル・ボウウィエリ（Messor bouvieri；クロナガアリの一種）、アルファルファハキリバチ（Megachile rotundata）、ボンブス・インパティエンス（Bombus impatiens；マルハナバチの一種）、ヨトウガ（Mamestra brassicae）、ヘシアンバエ（Mayetiola destructor）またはセイヨウミツバチ（Apis mellifera）である。
【０１１８】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は昆虫から単離されるか昆虫に由来する。特定の実施形態では、昆虫はイラクサギンウワバ（AAA87375）である。
【０１１９】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は昆虫から単離されるか昆虫に由来する。特定の実施形態では、昆虫はカイコ（BAD11135）である。
【０１２０】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は甲殻類から単離されるか甲殻類に由来する。特定の実施形態では、甲殻類はオオビワミジンコ（Daphnia pulicaria；AAM76342、配列番号17105）である。
【０１２１】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は脊椎動物から単離されるか脊椎動物に由来する。特定の実施形態では、脊椎動物はネッタイツメガエル（Xenopus tropicalis；GenBank登録番号BAF82026；配列番号17106）、ヒト（Homo sapiens；GenBank登録番号NP_689808；配列番号17107）、ハツカネズミ（Mus musculus；GenBank登録番号NP_741958；配列番号17108）、カニクイザル（Macaca fascicularis；GenBank登録番号AB179012；配列番号17108、配列番号17109）、ドブネズミ（Rattus norvegicus；GenBank登録番号XP_220453；配列番号17110）またはコウモリ（Myotis lucifugus）である。
【０１２２】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は尾索類から単離されるか尾索類に由来する。特定の実施形態では、尾索類はカタユウレイボヤ（Ciona intestinalis；GenBank登録番号XP_002123602；配列番号17111）である。
【０１２３】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素はトランスポゾンを染色体部位の配列5’-TTAT-3’（TTAT標的配列）に挿入する。
【０１２４】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素はトランスポゾンを染色体部位の配列5’-TTAA-3’（TTAA標的配列）に挿入する。
【０１２５】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンの標的配列は、5’-CTAA-3’、5’-TTAG-3’、5’-ATAA-3’、5’-TCAA-3’、5’AGTT-3’、5’-ATTA-3’、5’-GTTA-3’、5’-TTGA-3’、5’-TTTA-3’、5’-TTAC-3’、5’-ACTA-3’、5’-AGGG-3’、5’-CTAG-3’、5’-TGAA-3’、5’-AGGT-3’、5’-ATCA-3’、5’-CTCC-3’、5’-TAAA-3’、5’-TCTC-3’、5’TGAA-3’、5’-AAAT-3’、5’-AATC-3’、5’-ACAA-3’、5’-ACAT-3’、5’-ACTC-3’、5’-AGTG-3’、5’-ATAG-3’、5’-CAAA-3’、5’-CACA-3’、5’-CATA-3’、5’-CCAG-3’、5’-CCCA-3’、5’-CGTA-3’、5’-GTCC-3’、5’-TAAG-3’、5’-TCTA-3’、5’-TGAG-3’、5’-TGTT-3’、5’-TTCA-3’、5’-TTCT-3’、および5’-TTTT-3’を含むか、からなる。
【０１２６】
本開示の方法の特定の実施形態では、前記転移酵素はpiggyBacまたはpiggyBac様転移酵素である。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素はカイコから単離されるかカイコに由来する。piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は、以下の配列と少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはその間の任意の割合で同一のアミノ酸配列を含むか、そのようなアミノ酸配列からなってもよい：
【化５４】
2020532987.tif 000056
（配列番号14504）。
【０１２７】
piggyBac（ＰＢ）またはpiggyBac様転移酵素は以下の配列と少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはその間の任意の割合で同一のアミノ酸配列を含むか、そのようなアミノ酸配列からなってもよい：
【化５５】
2020532987.tif 000057
（配列番号14505）。
【０１２８】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は核局在化シグナルと融合している。特定の実施形態では、核局在化シグナルと融合されたpiggyBacまたはpiggyBac様転移酵素のアミノ酸配列は、以下を含むポリヌクレオチド配列によってコードされる：
【化５６】
2020532987.tif 000058
（配列番号14629）。
【０１２９】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は機能亢進性である。機能亢進性piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は、その由来源である天然の変異体よりも活性の高い転移酵素である。特定の実施形態では、機能亢進性piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素はカイコから単離されるかカイコに由来する。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は配列番号14505の機能亢進性変異体である。特定の実施形態では、機能亢進性piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は以下の配列と少なくとも９０％同一の配列を含む：
【化５７】
2020532987.tif 000059
（配列番号14576）。
【０１３０】
特定の実施形態では、機能亢進性piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は配列番号14576を含む。特定の実施形態では、機能亢進性piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は以下の配列を含む：
【化５８】
2020532987.tif 000060
（配列番号14630）。
【０１３１】
特定の実施形態では、機能亢進性piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は以下の配列を含む：
【化５９】
2020532987.tif 000061
（配列番号14631）。
【０１３２】
特定の実施形態では、機能亢進性piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は以下の配列を含む：
【化６０】
2020532987.tif 000062
（配列番号14632）。
【０１３３】
特定の実施形態では、機能亢進性piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は以下の配列を含む：
【化６１】
2020532987.tif 000063
（配列番号14633）。
【０１３４】
特定の実施形態では、機能亢進性piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は以下の配列を含む：
【化６２】
2020532987.tif 000064
（配列番号14634）。
【０１３５】
特定の実施形態では、機能亢進性piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は配列番号14505よりも活性が高い。特定の実施形態では、機能亢進性piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は配列番号14505と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％、あるいはその間の任意の割合で同一である。
【０１３６】
特定の実施形態では、機能亢進性piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は位置９２、９３、９６、９７、１６５、１７８、１８９、１９６、２００、２０１、２１１、２１５、２３５、２３８、２４６、２５３、２５８、２６１、２６３、２７１、３０３、３２１、３２４、３３０、３７３、３８９、３９９、４０２、４０３、４０４、４４８、４７３、４８４、５０７、５２３、５２７、５２８、５４３、５４９、５５０、５５７、６０１、６０５、６０７、６０９、６１０またはそれらの組み合わせから選択される位置にアミノ酸置換を含む（配列番号14505に対して）。特定の実施形態では、機能亢進性piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は以下のアミノ酸置換：
【化６３】
2020532987.tif 000065
またはそれらの任意の組み合わせを含む。特定の実施形態では、機能亢進性piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は以下のアミノ酸置換を含む：
【化６４】
2020532987.tif 000066
【０１３７】
特定の実施形態では、機能亢進性piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は野生型ではない１個以上のアミノ酸の置換を含み、野生型のアミノ酸に対するこの１個以上の置換は以下の置換を含む：
【化６５】
2020532987.tif 000067
（配列番号14505に対して）。機能亢進性のアミノ酸置換の一覧は米国特許第10,041,077号に記載されている。同特許の全内容を本明細書に援用する。
【０１３８】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は組み込み能欠損型である。特定の実施形態では、組み込み能欠損piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は対応するトランスポゾンを切り出すことができるが切り出されたトランスポゾンを対応する野生型の転移酵素に比べて低い頻度で組み込む転移酵素である。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は配列番号14505の組み込み能欠損型変異体である。
【０１３９】
特定の実施形態では、切り出し能はあるが組み込み能を欠損したpiggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は、野生型ではないアミノ酸の１個以上の置換を含み、野生型のアミノ酸に対するこの１個以上の置換は、以下の置換を含む：
【化６６】
2020532987.tif 000068
（配列番号14505に対して）。
組み込み能欠損性のアミノ酸置換の一覧は米国特許第10,041,077号に記載されている。同特許の全内容を本明細書に援用する。
【０１４０】
特定の実施形態では、組み込み能欠損型piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は以下の配列を含む：
【化６７】
2020532987.tif 000069
（配列番号14606）。
特定の実施形態では、組み込み能欠損型piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は以下の配列を含む：
【化６８】
2020532987.tif 000070
（配列番号14607）。
特定の実施形態では、組み込み能欠損型piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は以下の配列を含む：
【化６９】
2020532987.tif 000071
（配列番号14608）。
特定の実施形態では、組み込み能欠損型転移酵素は配列番号14608と少なくとも９０％同一の配列を含む。
【０１４１】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンはカイコから単離されるかカイコに由来する。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは以下の配列を含む：
【化７０】
2020532987.tif 000072
（配列番号14506）。
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは以下の配列を含む：
【化７１】
2020532987.tif 000073
（配列番号14507）。
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは以下の配列を含む：
【化７２】
2020532987.tif 000074
（配列番号14508）。
特定の実施形態では、piggyBac（商標）（ＰＢ）またはpiggyBac様トランスポゾンは以下の配列を含む：
【化７３】
2020532987.tif 000075
（配列番号14509）。
【０１４２】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは配列番号14506に対応する左側配列と配列番号14507に対応する右側配列を含む。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンの一方の末端は少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはその間の任意の割合で配列番号14506と同一であり、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンのもう一方の末端は少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはその間の任意の割合で配列番号14507と同一である。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは配列番号14506および配列番号14507または配列番号14509を含む。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは配列番号14508および配列番号14507または配列番号14509を含む。特定の実施形態では、トランスポゾンの左右の末端は、5'-TTAT-3標的挿入部位のすぐ隣に１６ｂｐの末端反復配列CCCGGCGAGCATGAGG（配列番号14510）を共有しており、この配列は２つの末端で互いに逆向きになっている。特定の実施形態では、左のトランスポゾン末端は5'-TTATCCCGGCGAGCATGAGG-3（配列番号14511）を含む配列で始まり、トランスポゾンの右側はこの配列と逆相補性をもつ配列、すなわち5'-CCTCATGCTCGCCGGGTTAT-3'（配列番号14512）で終わる。
【０１４３】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは配列番号14506または配列番号14508の少なくとも１４個、１６個、１８個、２０個、３０個、または４０個の連続するヌクレオチドを含む一末端を含む。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは配列番号14507または配列番号14509の少なくとも１４個、１６個、１８個、２０個、３０個、または４０個の連続するヌクレオチドを含む一末端を含む。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは配列番号14506または配列番号14508と少なくとも９０％同一の一末端を含む。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは配列番号14507または配列番号14509と少なくとも９０％同一の一末端を含む。
【０１４４】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは以下の配列を含む：
【化７４】
2020532987.tif 000076
（配列番号14515）。
【０１４５】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは以下の配列を含む：
【化７５】
2020532987.tif 000077
（配列番号14516）。
【０１４６】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンはCCCGGCGAGCATGAGG（配列番号14510）の配列を含む。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは配列番号14510のＩＴＲ配列を含む。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンはTTATCCCGGCGAGCATGAGG（配列番号14511）の配列を含む。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは配列番号14511の少なくとも１６個の連続するヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンはCCTCATGCTCGCCGGGTTAT（配列番号14512）の配列を含む。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは配列番号14512の少なくとも１６個の連続するヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは配列番号14511の少なくとも１６個の連続するヌクレオチドを含む一末端と配列番号14512の少なくとも１６個の連続するヌクレオチドを含む一末端を含む。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは配列番号14511および配列番号14512を含む。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンはTTAACCCGGCGAGCATGAGG（配列番号14513）の配列を含む。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンはCCTCATGCTCGCCGGGTTAA（配列番号14514）の配列を含む。
【０１４７】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは配列番号14506および配列番号14507を含む、あるいは配列番号14506または配列番号14507に少なくとも９０％同一のこれらの一方または両方の変異体を含む末端を有してもよく、piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は、配列番号14504または配列番号14505の配列を有するか、配列番号14504または配列番号14505と少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％またはその間の任意の割合で同一の配列を有する。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは逆反復の対の間に挿入された異種ポリヌクレオチドを含み、トランスポゾンは配列番号14504または配列番号14505と少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％またはその間の任意の割合で同一の配列を有するpiggyBacまたはpiggyBac様転移酵素によって転移できる。特定の実施形態では、トランスポゾンは２つのトランスポゾン末端を含み、各末端は、２つのトランスポゾン末端で互いに逆向きに配列番号14510を含む。特定の実施形態では、それぞれの逆位末端配列（ＩＴＲ）は配列番号14510と少なくとも９０％同一である。
【０１４８】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンはpiggyBacまたはpiggyBac様転移酵素によって標的核酸内の配列5'-TTAT-3に挿入できる。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンの一方の末端は配列番号14506の少なくとも１６個の連続するヌクレオチドを含み、他方のトランスポゾン末端は配列番号14507の少なくとも１６個の連続するヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンの一方の末端は配列番号14506の少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２２個、少なくとも２５個、少なくとも３０個の連続するヌクレオチドを含み、他方のトランスポゾン末端は配列番号14507の少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２２個、少なくとも２５個、少なくとも３０個の連続するヌクレオチドを含む。
【０１４９】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは配列番号14506および配列番号14507に対応するトランスポゾン末端（各末端はＩＴＲを含む）を含み、5'-TTAT3'に対応する標的配列を含む。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは転移酵素（たとえば配列番号14505）をコードする配列をさらに含む。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは配列番号14506に対応する１つのトランスポゾン末端と配列番号14516に対応する第２のトランスポゾン末端を含む。配列番号14516は配列番号14507に非常に似ているが、ＩＴＲの少し前に大きな挿入物を有する。２つのトランスポゾン末端のＩＴＲ配列は同一（いずれも配列番号14510に同一）であるが、異なる標的配列を有する。すなわち、第２のトランスポゾンは5'-TTAA-3'に対応する標的配列を有し、これは標的配列特異性を変更するためにＩＴＲ配列を変更する必要がないということの証拠である。5'-TTAA-3’標的部位に関連するpiggyBacまたはpiggyBac様転移酵素（配列番号14504）は5'-TTAT-3'に関連する転移酵素（配列番号14505）とはわずか４個のアミノ酸変更（Ｄ３２２Ｙ、Ｓ４７３Ｃ、Ａ５０７Ｔ、Ｈ５８２Ｒ）による違いしかない。特定の実施形態では、5'-TTAA-3’標的部位に関連するpiggyBacまたはpiggyBac様転移酵素（配列番号14504）は5'-TTAT-3'に関連するpiggyBacまたはpiggyBac様転移酵素（配列番号14505）よりも5'-TTAT-3'末端を持つトランスポゾンに対する活性が低い。特定の実施形態では、5'-TTAA-3’標的部位を持つpiggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは、5'-TTAA-3’標的部位を5'-TTAT-3'で置き換えることによって5'-TTAT-3標的部位を持つpiggyBacまたはpiggyBac様転移酵素に変換できる。このようなトランスポゾンは、5'-TTAT-3’標的配列を認識する配列番号14504のようなpiggyBacまたはpiggyBac様転移酵素と共に用いることもできるし、本来5'-TTAA-3'トランスポゾンに関連する転移酵素の変異体と共に用いることもできる。特定の実施形態では、5'-TTAA-3'と5'-TTAT-3'のpiggyBacまたはpiggyBac様転移酵素が非常に似ていることは、piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素のアミノ酸配列のごくわずかな変化によって標的配列特異性が変わることを示す。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾン−転移酵素遺伝子導入系の5'-TTAA-3’標的配列を5'-TTAT-3'標的配列で置き換えるいかなる修飾によってもＩＴＲは同一のままであり、転移酵素は元のpiggyBacまたはpiggyBac様転移酵素、あるいは低度の変異誘発によって転移酵素に変異を導入した結果得られるその変異体である。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾン−転移酵素導入系は、5'-TTAT-3'に有効なpiggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾン−転移酵素遺伝子導入系の5'-TTAT-3’標的配列を5'-TTAA-3'標的配列で置き換える修飾によって作製されてもよく、ＩＴＲは同一のままであり、piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は元の転移酵素またはその変異体である。
【０１５０】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンはカイコから単離されるかカイコに由来してもよい。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは以下の配列を含む：
【化７６】
2020532987.tif 000078
（配列番号14577）。
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは以下の配列を含む：
【化７７】
2020532987.tif 000079
（配列番号14578）。
特定の実施形態では、トランスポゾンは配列番号14577の少なくとも１６個の連続するヌクレオチドと配列番号14578の少なくとも１６個の連続するヌクレオチド、およびCCCGGCGAGCATGAGG（配列番号14510）と少なくとも８７％同一の末端逆位配列を含む。
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは以下の配列を含む：
【化７８】
2020532987.tif 000080
（配列番号14595）。
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは以下の配列を含む：
【化７９】
2020532987.tif 000081
（配列番号14596）。
【０１５１】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは配列番号14595および配列番号14596を含み、配列番号14505のpiggyBacまたはpiggyBac様転移酵素によって転移される。特定の実施形態では、配列番号14595および配列番号14596のＩＴＲは5’-TTAA-3’配列に隣接していない。特定の実施形態では、配列番号14595および配列番号14596のＩＴＲは5’-TTAT-3’配列に隣接している。
【０１５２】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは以下の配列を含む：
【化８０】
2020532987.tif 000082
（配列番号14597）。
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは以下の配列を含む：
【化８１】
2020532987.tif 000083
（配列番号14598）。
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは以下の配列を含む：
【化８２】
2020532987.tif 000084
（配列番号14599）。
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンの左末端は配列番号14577、配列番号14595、または配列番号14597〜14599の配列を含む。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンの左末端の前方に左標的配列がある。
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは以下の配列を含む：
【化８３】
2020532987.tif 000085
（配列番号14600）。
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは以下の配列を含む：
【化８４】
2020532987.tif 000086
（配列番号14601）。
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは以下の配列を含む：
【化８５】
2020532987.tif 000087
（配列番号14602）。
【０１５３】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンの右末端は配列番号14578、配列番号14596、または配列番号14600〜14601の配列を含む。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンの右末端の後に右標的配列が続く。特定の実施形態では、トランスポゾンは配列番号14505の転移酵素によって転移される。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンの左右の末端は標的配列のすぐ隣に互いに逆向きに配列番号14510の１６ｂｐの反復配列を共有している。特定の実施形態では、左のトランスポゾン末端は配列番号14510で始まり、右のトランスポゾン末端は配列番号14510と逆相補性をもつ5’- CCTCATGCTCGCCGGG-3’（配列番号14603）で終わる。 特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは配列番号14510または配列番号14603と少なくとも９３％、少なくとも８７％、または少なくとも８１％、あるいはその間の任意の割合で同一のＩＴＲを含む。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは、標的配列の後に配列番号88、105、107から選択される配列を含む左トランスポゾン末端を含み、配列番号14578または106を含む右トランスポゾン末端の後に標的配列を含む。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14577と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％、あるいはその間の任意の割合で同一の配列を含む一末端と、配列番号14578と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％、あるいはその間の任意の割合で同一の配列を含む一末端を含む。特定の実施形態では、一方のトランスポゾン末端は配列番号14577の少なくとも１４個、少なくとも１６個、少なくとも１８個、または少なくとも２０個の連続する塩基を含み、一方のトランスポゾン末端は配列番号14578の少なくとも１４個、少なくとも１６個、少なくとも１８個、または少なくとも２０個の連続する塩基を含む。
【０１５４】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは２つのトランスポゾン末端を含み、各トランスポゾン末端は、２つのトランスポゾン末端で互いに逆向きに、配列番号14510と少なくとも８１％、少なくとも８７％、または少なくとも９３％、あるいはその間の任意の割合で同一の配列を含む。一方の末端は配列番号14599の少なくとも１４個、少なくとも１６個、少なくとも１８個、または少なくとも２０個の連続する塩基をさらに含んでもよく、他方の末端は配列番号14601の少なくとも１４個、少なくとも１６個、少なくとも１８個、または少なくとも２０個の連続する塩基をさらに含んでもよい。piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは配列番号14505の転移酵素によって転移されてもよく、この転移酵素は必要に応じて核局在化シグナルに 融合されていてもよい。
【０１５５】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは配列番号14595および配列番号14596を含み、piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は配列番号14504または配列番号14505を含む。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは配列番号14597および配列番号14596を含み、piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は配列番号14504または配列番号14505を含む。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは配列番号14595および配列番号14578を含み、piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は配列番号14504または配列番号14505を含む。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは配列番号14602および配列番号14600を含み、piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は配列番号14504または配列番号14505を含む。
【０１５６】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは、ATGAGGCAGGGTAT（配列番号14614）、ATACCCTGCCTCAT（配列番号14615）、GGCAGGGTAT（配列番号14616）、ATACCCTGCC（配列番号14617）、TAAAATTTTA（配列番号14618）、ATTTTATAAAAT（配列番号14619）、TCATACCCTG（配列番号14620）、およびTAAATAATAATAA（配列番号14621）から選択される１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、または７つの配列を含む左末端を含む。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14617、配列番号14620、および配列番号14621から選択される１つ、２つ、または３つの配列を含む右末端を含む。
含む。
【０１５７】
本開示の方法の特定の実施形態では、前記転移酵素はpiggyBacまたはpiggyBac様転移酵素である。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素はネッタイツメガエルから単離されるかネッタイツメガエルに由来する。piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は、以下の配列と少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはその間の任意の割合で同一のアミノ酸配列を含むか、そのようなアミノ酸配列からなってもよい：
【化８６】
2020532987.tif 000088
（配列番号14517）。
【０１５８】
実施形態によっては、piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は配列番号14517の機能亢進性変異体である。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は配列番号14517の組み込み能欠損型変異体である。piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は、以下の配列と少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはその間の任意の割合で同一のアミノ酸配列を含むか、そのようなアミノ酸配列からなってもよい：
【化８７】
2020532987.tif 000089
（配列番号14518）。
【０１５９】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素はネッタイツメガエルから単離されるかネッタイツメガエルに由来する。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は機能亢進性piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素である。特定の実施形態では、機能亢進性piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は以下の配列と少なくとも９０％同一の配列を含む：
【化８８】
2020532987.tif 000090
（配列番号14572）。
【０１６０】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は機能亢進性piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素である。機能亢進性piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は、その由来源である天然の変異体よりも活性の高い転移酵素である。特定の実施形態では、機能亢進性piggyBacまたはpiggyBac様 転移酵素は配列番号14517の転移酵素よりも活性が高い。特定の実施形態では、機能亢進性piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は以下の配列を含む：
【化８９】
2020532987.tif 000091
（配列番号14572）。
【０１６１】
特定の実施形態では、機能亢進性piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は以下の配列を含む：
【化９０】
2020532987.tif 000092
（配列番号14624）。
【０１６２】
特定の実施形態では、機能亢進性piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は以下の配列を含む：
【化９１】
2020532987.tif 000093
（配列番号14625）。
【０１６３】
特定の実施形態では、機能亢進性piggyBacまたはpiggyBac様 転移酵素は以下の配列を含む：
【化９２】
2020532987.tif 000094
（配列番号14627）。
【０１６４】
特定の実施形態では、機能亢進性piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は以下の配列を含む：
【化９３】
2020532987.tif 000095
（配列番号14628）。
【０１６５】
特定の実施形態では、機能亢進性piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は配列番号17042の配列を含む。
【０１６６】
特定の実施形態では、機能亢進性piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は、以下から選択されるアミノ酸：
【化９４】
2020532987.tif 000096
の位置にアミノ酸置換を含む（配列番号14517に対して）。特定の実施形態では、機能亢進性piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は以下のアミノ酸置換：
【化９５】
2020532987.tif 000097
あるいはそれらの任意の組み合わせ（これらの変異のうち少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはすべてなど）を含む（配列番号14517に対して）。
【０１６７】
特定の実施形態では、機能亢進性piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は野生型ではない１個以上のアミノ酸の置換を含み、野生型のアミノ酸に対するこの１個以上の置換は以下の置換を含む：
【化９６】
2020532987.tif 000098
【化９７】
2020532987.tif 000099
（配列番号14517に対して）。機能亢進性のアミノ酸置換の一覧は米国特許第10,041,077号に記載されている。同特許の全内容を本明細書に援用する。
【０１６８】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は組み込み能欠損型である。特定の実施形態では、組み込み能欠損piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は対応するトランスポゾンを切り出すことができるが切り出されたトランスポゾンを対応する野生型の転移酵素に比べて低い頻度で組み込む転移酵素である。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は配列番号14517の組み込み能欠損型変異体である。特定の実施形態では、組み込み能欠損型piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は配列番号14517の欠損型である。
【０１６９】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は切り出しには有効であるが組み込み能を欠損している。特定の実施形態では、組み込み能欠損型piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は以下の配列と少なくとも９０％同一の配列を含む：
【化９８】
2020532987.tif 000100
（配列番号14605）。
【０１７０】
特定の実施形態では、組み込み能欠損型piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は以下の配列と少なくとも９０％同一の配列を含む：
【化９９】
2020532987.tif 000101
（配列番号14604）。
【０１７１】
特定の実施形態では、組み込み能欠損型piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は以下の配列と少なくとも９０％同一の配列を含む：
【化１００】
2020532987.tif 000102
（配列番号14611）。
【０１７２】
特定の実施形態では、組み込み能欠損型piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は配列番号14611を含む。特定の実施形態では、組み込み能欠損型piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は以下の配列と少なくとも９０％同一の配列を含む：
【化１０１】
2020532987.tif 000103
（配列番号14612）。
【０１７３】
特定の実施形態では、組み込み能欠損型piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は配列番号14612を含む。特定の実施形態では、組み込み能欠損型piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は以下の配列と少なくとも９０％同一の配列を含む：
【化１０２】
2020532987.tif 000104
配列番号14613）。
【０１７４】
特定の実施形態では、組み込み能欠損型piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は配列番号14613を含む。特定の実施形態では、組み込み能欠損型piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は位置２１８のＡｓｎがＧｌｕまたはＡｓｐで置き換えられているアミノ酸置換（Ｎ２１８ＤまたはＮ２１８Ｅ）を含む（配列番号14517に対して）。
【０１７５】
特定の実施形態では、切り出し能はあるが組み込み能を欠損したpiggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は、野生型ではないアミノ酸の１個以上の置換を含み、野生型のアミノ酸に対するこの１個以上の置換は、以下の置換を含む：
【化１０３】
2020532987.tif 000105
【化１０４】
2020532987.tif 000106
（配列番号14517に対して）。切り出し能はあるが組み込み能を欠損するアミノ酸置換の一覧は米国特許第10,041,077号に記載されている。同特許の全内容を本明細書に援用する。
【０１７６】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は核局在化シグナルと融合している。特定の実施形態では、配列番号14517または配列番号14518は核局在化シグナルと融合している。特定の実施形態では、核局在化シグナルと融合されたpiggyBacまたはpiggyBac様転移酵素のアミノ酸配列は、以下を含むポリヌクレオチド配列によってコードされる：
【化１０５】
2020532987.tif 000107
【化１０６】
2020532987.tif 000108
（配列番号14626）。
【０１７７】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンはネッタイツメガエルから単離されるかネッタイツメガエルに由来する。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは以下の配列を含む：
【化１０７】
2020532987.tif 000109
（配列番号14519）。
【０１７８】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは以下の配列を含む：
【化１０８】
2020532987.tif 000110
（配列番号14520）。
【０１７９】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは配列番号14519および配列番号14520を含む。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは以下の配列を含む：
【化１０９】
2020532987.tif 000111
（配列番号14521）。
【０１８０】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは以下の配列を含む：
【化１１０】
2020532987.tif 000112
（配列番号14522）。
【０１８１】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは以下の配列を含む：
【化１１１】
2020532987.tif 000113
（配列番号14523）。
【０１８２】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは配列番号14520、さらに配列番号14519、配列番号14521および配列番号14523のいずれか１つを含む。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは配列番号14522、さらに配列番号14519、配列番号14521および配列番号14523のいずれか１つを含む。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは配列番号14519、配列番号14521、または配列番号14523からの少なくとも１４個、１６個、１８個、２０個、３０個、または４０個の連続するヌクレオチドを含む一末端を含む。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは配列番号14520または配列番号14522からの少なくとも１４個、１６個、１８個、２０個、３０個、または４０個の連続するヌクレオチドを含む一末端を含む。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは配列番号14519、配列番号14521、または配列番号14523と少なくとも９０％同一の一末端を含む。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは配列番号14520または配列番号14522と少なくとも９０％同一の一末端を含む。一実施形態では、一方のトランスポゾン末端は配列番号14519と少なくとも９０％同一であり、他方のトランスポゾン末端は配列番号14520と少なくとも９０％同一である。
【０１８３】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンはTTAACCTTTTTACTGCCA（配列番号14524）の配列を含む。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンはTTAACCCTTTGCCTGCCA（配列番号14526）の配列を含む。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンはTTAACCYTTTTACTGCCA（配列番号14527）の配列を含む。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンはTGGCAGTAAAAGGGTTAA（配列番号14529）の配列を含む。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンはTGGCAGTGAAAGGGTTAA（配列番号14531）の配列を含む。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンはTTAACCYTTTKMCTGCCA（配列番号14533）の配列を含む。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンの一方の末端は配列番号14524、配列番号14526、および配列番号14527から選択される配列を含む。特定の実施形態では、piggyBac（商標）（ＰＢ）またはpiggyBac様トランスポゾンの一方の末端は配列番号14529および配列番号14531から選択される配列を含む。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンの各末端逆位配列は、ＩＴＲ配列CCYTTTKMCTGCCA（配列番号14563）の配列を含む。特定の実施形態では、piggyBac（商標）（ＰＢ）またはpiggyBac様トランスポゾンの各末端は互いに逆向きに配列番号14563を含む。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンの１つのＩＴＲは配列番号14524、配列番号14526、および配列番号14527から選択される配列を含む。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンの１つのＩＴＲは配列番号14529および配列番号14531から選択される配列を含む。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは２つのトランスポゾン末端に互いに逆向きに配列番号14533を含む。
【０１８４】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは配列番号14519および配列番号14520を含む、あるいは配列番号14519または配列番号14520に少なくとも９０％同一のこれらの一方または両方の変異体を含む末端を有してもよく、piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は、配列番号14517の配列を有するか、配列番号14517または配列番号14518と少なくとも％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％またはその間の任意の割合で同一の変異体を有する。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンの一方の末端は配列番号14519、配列番号14521、または配列番号14523の少なくとも１４個の連続するヌクレオチドを含み、他方のトランスポゾン末端は配列番号14520または配列番号14522の少なくとも１４個の連続するヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、一方のトランスポゾン末端は配列番号14519、配列番号14521、または配列番号14523の少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２２個、少なくとも２５個、または少なくとも３０個の連続するヌクレオチドを含み、他方のトランスポゾン末端は配列番号14520または配列番号14522の少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２２個、少なくとも２５個、または少なくとも３０個の連続するヌクレオチドを含む。
【０１８５】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は配列番号14519に対応する左側配列および配列番号14520に対応する右側配列を持つトランスポゾン末端を認識する。この転移酵素は、ＤＮＡを一方のトランスポゾン末端の左末端の5'-TTAA-3'配列から第２のトランスポゾン末端の右末端の5'-TTAA-3'まで、その間に配置されているすべての異種ＤＮＡも含めて切断することによってトランスポゾンをＤＮＡ分子から切り出し、切り出された配列を第２のＤＮＡ分子に挿入する。特定の実施形態では、左右のトランスポゾン末端の切断型および修飾型も、piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素によって転移できるトランスポゾンの一部として機能する。たとえば、左トランスポゾン末端は配列番号14521または配列番号14523に対応する配列によって置き換えられてもよく、右トランスポゾン末端は配列番号14522に対応するより短い配列によって置き換えられてもよい。特定の実施形態では、左右のトランスポゾン末端は、5'-TTAA-3'挿入部位を含む１８ｂｐのほぼ完全に反復された配列（5'-TTAACCYTTTKMCTGCCA：配列番号14533）を末端に共有しており、この配列は２つの末端で互いに逆向きである。すなわち、配列番号14519および配列番号14523では左トランスポゾン末端は配列5'-TTAACCTTTTTACTGCCA-3'（配列番号14524）で始まり、あるいは配列番号14521では左トランスポゾン末端は配列5'-TTAACCCTTTGCCTGCCA-3'（配列番号14526）で始まり、右トランスポゾン末端はこの配列と概ね相補的な配列で終わる。配列番号14520では5'-TGGCAGTAAAAGGGTTAA-3'（配列番号14529）で終わり、配列番号14522では5'-TGGCAGTGAAAGGGTTAA-3'（配列番号14531）で終わっている。本発明の一実施形態は、２つのトランスポゾン末端の間に挿入された異種ポリヌクレオチドを含むトランスポゾンであり、各トランスポゾン末端は２つのトランスポゾン末端で互いに逆向きに配列番号14533を含む。特定の実施形態では、一方のトランスポゾン末端は配列番号14524、配列番号14526、および配列番号14527から選択される配列を含む。実施形態によっては、一方のトランスポゾン末端は配列番号14529および配列番号14531から選択される配列を含む。
【０１８６】
特定の実施形態では、piggyBac（商標）（ＰＢ）またはpiggyBac様トランスポゾンはネッタイツメガエルから単離されるかネッタイツメガエルに由来する。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは以下の配列を含む：
【化１１２】
2020532987.tif 000114
（配列番号14573）。
【０１８７】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾン は以下の配列を含む：
【化１１３】
2020532987.tif 000115
（配列番号14574）。
【０１８８】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは配列番号14573または配列番号14574の少なくとも１６個の連続する塩基、およびCCYTTTBMCTGCCA（配列番号14575）の末端逆位配列を含む。
【０１８９】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは以下の配列を含む：
【化１１４】
2020532987.tif 000116
（配列番号14579）。
【０１９０】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは以下の配列を含む：
【化１１５】
2020532987.tif 000117
（配列番号14580）。
【０１９１】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは以下の配列を含む：
【化１１６】
2020532987.tif 000118
（配列番号14581）。
【０１９２】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは以下の配列を含む：
【化１１７】
2020532987.tif 000119
（配列番号14582）。
【０１９３】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは以下の配列を含む：
【化１１８】
2020532987.tif 000120
（配列番号14583）。
【０１９４】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは以下の配列を含む：
【化１１９】
2020532987.tif 000121
（配列番号14584）。
【０１９５】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは以下の配列を含む：
【化１２０】
2020532987.tif 000122
（配列番号14585）。
【０１９６】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは以下の配列を含む：
【化１２１】
2020532987.tif 000123
（配列番号14586）。
【０１９７】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは配列番号14573および配列番号14579〜14585から選択される左トランスポゾン末端配列を含む。特定の実施形態では、左トランスポゾン末端配列は前に左標的配列がある。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは以下の配列を含む：
【化１２２】
2020532987.tif 000124
（配列番号14587）。
【０１９８】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは以下の配列を含む：
【化１２３】
2020532987.tif 000125
（配列番号14588）。
【０１９９】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは以下の配列を含む：
【化１２４】
2020532987.tif 000126
（配列番号14589）。
【０２００】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは以下の配列を含む：
【化１２５】
2020532987.tif 000127
（配列番号14590）。
【０２０１】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは配列番号14574および配列番号14587〜14590から選択される右トランスポゾン末端配列を含む。特定の実施形態では、右トランスポゾン末端配列の後に右標的配列が続く。特定の実施形態では、左右のトランスポゾン末端は２つの末端で互いに逆向きに、標的配列に隣接して１４ｂｐの反復配列（配列番号14575）を含む。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは標的配列と配列番号14582〜14584および14573から選択される配列とを含む左トランスポゾン末端と、配列番号14588〜14590および14574から選択される配列とその後に右標的配列とを含む右トランスポゾン末端を含む。
【０２０２】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンの左トランスポゾン末端は以下の配列：
【化１２６】
2020532987.tif 000128
（配列番号14591）およびＩＴＲを含む。特定の実施形態では、左トランスポゾン末端は以下の配列：
【化１２７】
2020532987.tif 000129
（配列番号14592）およびＩＴＲを含む。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンの右トランスポゾン末端は以下の配列：
【化１２８】
2020532987.tif 000130
（配列番号14593）およびＩＴＲを含む。特定の実施形態では、右トランスポゾン末端は以下の配列：
【化１２９】
2020532987.tif 000131
（配列番号14594）およびＩＴＲを含む。
【０２０３】
特定の実施形態では、一方のトランスポゾン末端は配列番号14573と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、またはその間の任意の割合で同一の配列を含み、他方のトランスポゾン末端は配列番号14574と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、またはその間の任意の割合で同一の配列を含む。特定の実施形態では、一方のトランスポゾン末端は配列番号14573の少なくとも１４個、少なくとも１６個、少なくとも１８個、少なくとも２０個、または少なくとも２５個の連続するヌクレオチドを含み、一方のトランスポゾン末端は配列番号14574の少なくとも１４個、少なくとも１６個、少なくとも１８個、少なくとも２０個、または少なくとも２５個の連続するヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、一方のトランスポゾン末端は配列番号14591のうち少なくとも１４個、少なくとも１６個、少なくとも１８個、少なくとも２０個を含み、他方の末端は配列番号14593のうち少なくとも１４個、少なくとも１６個、少なくとも１８個、少なくとも２０個を含む。特定の実施形態では、各トランスポゾン末端は配列番号14575を逆向きに含む。
【０２０４】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは配列番号14573、配列番号14579、配列番号14581、配列番号14582、配列番号14583、および配列番号14588から選択される配列と、配列番号14587、配列番号14588、配列番号14589、および配列番号14586から選択される配列を含み、piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は配列番号14517または配列番号14518を含む。
【０２０５】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは標的配列に隣接してＩＴＲ配列CCCTTTGCCTGCCA（配列番号14622）（左側ＩＴＲ）およびTGGCAGTGAAAGGG（配列番号14623）（右側ＩＴＲ）を含む。
【０２０６】
本開示の方法の特定の実施形態では、前記転移酵素はpiggyBacまたはpiggyBac様転移酵素である。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素はオオタバコガから単離されるかオオタバコガに由来する。piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は、以下の配列と少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはその間の任意の割合で同一のアミノ酸配列を含むか、そのようなアミノ酸配列からなってもよい：
【化１３０】
2020532987.tif 000132
（配列番号14525）。
【０２０７】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンはオオタバコガから単離されるかオオタバコガに由来する。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは以下の配列を含む：
【化１３１】
2020532987.tif 000133
（配列番号14570）。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは以下の配列を含む：
【化１３２】
2020532987.tif 000134
（配列番号14528）。
【０２０８】
本開示の方法の特定の実施形態では、前記転移酵素はpiggyBacまたはpiggyBac様転移酵素である。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素はワタアカミムシガから単離されるかワタアカミムシガに由来する。piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は、以下の配列と少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはその間の任意の割合で同一のアミノ酸配列を含むか、そのようなアミノ酸配列からなってもよい：
【化１３３】
2020532987.tif 000135
（配列番号14530）。
【０２０９】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンはワタアカミムシガから単離されるかワタアカミムシガに由来する。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは以下の配列を含む：
【化１３４】
2020532987.tif 000136
（配列番号14532）。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは以下の配列を含む：
【化１３５】
2020532987.tif 000137
（配列番号14571）。
【０２１０】
本開示の方法の特定の実施形態では、前記転移酵素はpiggyBacまたはpiggyBac様転移酵素である。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素はミツモンキンウワバから単離されるかミツモンキンウワバに由来する。piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は、以下の配列と少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはその間の任意の割合で同一のアミノ酸配列を含むか、そのようなアミノ酸配列からなってもよい：
【化１３６】
2020532987.tif 000138
（配列番号14534）。
【０２１１】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンはミツモンキンウワバから単離されるかミツモンキンウワバに由来する。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは以下の配列を含む：
【化１３７】
2020532987.tif 000139
（配列番号14535）。
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは以下の配列を含む：
【化１３８】
2020532987.tif 000140
（配列番号14536）。
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンはＩＴＲ配列CCCTAGAAGCCCAATC（配列番号14564）を含む。
【０２１２】
本開示の方法の特定の実施形態では、前記転移酵素はpiggyBacまたはpiggyBac様転移酵素である。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素はタマナヤガから単離されるかタマナヤガに由来する。piggyBac（ＰＢ）またはpiggyBac様転移酵素は、以下の配列と少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはその間の任意の割合で同一のアミノ酸配列を含むか、そのようなアミノ酸配列からなってもよい：
【化１３９】
2020532987.tif 000141
（配列番号14537）。
【０２１３】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンはタマナヤガから単離されるかタマナヤガに由来する。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは以下の配列を含む：
【化１４０】
2020532987.tif 000142
（配列番号14538）。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは以下の配列を含む：
【化１４１】
2020532987.tif 000143
（配列番号14539）。
【０２１４】
本開示の方法の特定の実施形態では、前記転移酵素はpiggyBacまたはpiggyBac様転移酵素である。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素はアルファルファハキリバチから単離されるかアルファルファハキリバチに由来する。piggyBac（ＰＢ）またはpiggyBac様転移酵素は、以下の配列と少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはその間の任意の割合で同一のアミノ酸配列を含むか、そのようなアミノ酸配列からなってもよい：
【化１４２】
2020532987.tif 000144
（配列番号14540）。
【０２１５】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンはアルファルファハキリバチから単離されるかアルファルファハキリバチに由来する。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは以下の配列を含む：
【化１４３】
2020532987.tif 000145
（配列番号14541）。
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは以下の配列を含む：
【化１４４】
2020532987.tif 000146
（配列番号14542）。
【０２１６】
本開示の方法の特定の実施形態では、前記転移酵素はpiggyBacまたはpiggyBac様転移酵素である。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素はボンブス・インパティエンスから単離されるかボンブス・インパティエンスに由来する。piggyBac（ＰＢ）またはpiggyBac様転移酵素は、以下の配列と少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはその間の任意の割合で同一のアミノ酸配列を含むか、そのようなアミノ酸配列からなってもよい：
【化１４５】
2020532987.tif 000147
（配列番号14543）。
【０２１７】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンはボンブス・インパティエンスから単離されるかボンブス・インパティエンスに由来する。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは以下の配列を含む：
【化１４６】
2020532987.tif 000148
（配列番号14544）。
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは以下の配列を含む：
【化１４７】
2020532987.tif 000149
（配列番号14545）。
【０２１８】
本開示の方法の特定の実施形態では、前記転移酵素はpiggyBacまたはpiggyBac様転移酵素である。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素はヨトウガから単離されるかヨトウガに由来する。piggyBac（ＰＢ）またはpiggyBac様転移酵素は、以下の配列と少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはその間の任意の割合で同一のアミノ酸配列を含むか、そのようなアミノ酸配列からなってもよい：
【化１４８】
2020532987.tif 000150
（配列番号14546）。
【０２１９】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンはヨトウガから単離されるかヨトウガに由来する。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは以下の配列を含む：
【化１４９】
2020532987.tif 000151
（配列番号14547）。
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは以下の配列を含む：
【化１５０】
2020532987.tif 000152
（配列番号14548）。
【０２２０】
本開示の方法の特定の実施形態では、前記転移酵素はpiggyBacまたはpiggyBac様転移酵素である。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素はヘシアンバエから単離されるかヘシアンバエに由来する。piggyBac（ＰＢ）またはpiggyBac様転移酵素は、以下の配列と少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはその間の任意の割合で同一のアミノ酸配列を含むか、そのようなアミノ酸配列からなってもよい：
【化１５１】
2020532987.tif 000153
（配列番号14549）。
【０２２１】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンはヘシアンバエから単離されるかヘシアンバエに由来する。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは以下の配列を含む：
【化１５２】
2020532987.tif 000154
（配列番号14550）。
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは以下の配列を含む： 
【化１５３】
2020532987.tif 000155
（配列番号14551）。
【０２２２】
本開示の方法の特定の実施形態では、前記転移酵素はpiggyBacまたはpiggyBac様転移酵素である。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素はセイヨウミツバチから単離されるかセイヨウミツバチに由来する。piggyBac（ＰＢ）またはpiggyBac様転移酵素は、以下の配列と少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはその間の任意の割合で同一のアミノ酸配列を含むか、そのようなアミノ酸配列からなってもよい：
【化１５４】
2020532987.tif 000156
（配列番号14552）。
【０２２３】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンはセイヨウミツバチから単離されるかセイヨウミツバチに由来する。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは以下の配列を含む：
【化１５５】
2020532987.tif 000157
（配列番号14553）。
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは以下の配列を含む：
【化１５６】
2020532987.tif 000158
（配列番号14554）。
【０２２４】
本開示の方法の特定の実施形態では、前記転移酵素はpiggyBacまたはpiggyBac様転移酵素である。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素はメソル・ボウウィエリから単離されるかメソル・ボウウィエリに由来する。piggyBac（ＰＢ）またはpiggyBac様転移酵素は、以下の配列と少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはその間の任意の割合で同一のアミノ酸配列を含むか、そのようなアミノ酸配列からなってもよい：
【化１５７】
2020532987.tif 000159
（配列番号14555）。
【０２２５】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンはメソル・ボウウィエリから単離されるかメソル・ボウウィエリに由来する。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは以下の配列を含む：
【化１５８】
2020532987.tif 000160
（配列番号14556）。
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは以下の配列を含む：
【化１５９】
2020532987.tif 000161
（配列番号14557）。
【０２２６】
本開示の方法の特定の実施形態では、前記転移酵素はpiggyBacまたはpiggyBac様転移酵素である。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素はイラクサギンウワバから単離されるかイラクサギンウワバに由来する。piggyBac（ＰＢ）またはpiggyBac様転移酵素は、以下の配列と少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはその間の任意の割合で同一のアミノ酸配列を含むか、そのようなアミノ酸配列からなってもよい：
【化１６０】
2020532987.tif 000162
（配列番号14558）。
【０２２７】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンはイラクサギンウワバから単離されるかイラクサギンウワバに由来する。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは以下の配列を含む：
【化１６１】
2020532987.tif 000163
（配列番号14559）。
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは以下の配列を含む：
【化１６２】
2020532987.tif 000164
（配列番号14560）。
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは以下の配列を含む：
【化１６３】
2020532987.tif 000165
（配列番号14561）。
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは以下の配列を含む：
【化１６４】
2020532987.tif 000166
（配列番号14562）。
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは以下の配列を含む：
【化１６５】
2020532987.tif 000167
（配列番号14609）。
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは以下の配列を含む：
【化１６６】
2020532987.tif 000168
（配列番号14610）。
【０２２８】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは配列番号14561および配列番号14562を含み、piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は配列番号14558を含む。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンは配列番号14609および配列番号14610を含み、piggyBacまたはpiggyBac様転移酵素は配列番号14558を含む。
【０２２９】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンはワタアブラムシから単離されるかワタアブラムシに由来する。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンはＩＴＲ配列CCTTCCAGCGGGCGCGC（配列番号14565）を含む。
【０２３０】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンはニカメイチュウから単離されるかニカメイチュウに由来する。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンはＩＴＲ配列CCCAGATTAGCCT（配列番号14566）を含む。
【０２３１】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンはニセアメリカタバコガから単離されるかニセアメリカタバコガに由来する。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンはＩＴＲ配列CCCTTAATTACTCGCG（配列番号14567）を含む。
【０２３２】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンはワタアカミムシガから単離されるかワタアカミムシガに由来する。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンはＩＴＲ配列CCCTAGATAACTAAAC（配列番号14568）を含む。
【０２３３】
特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンはハマダラカから単離されるかハマダラカに由来する。特定の実施形態では、piggyBacまたはpiggyBac様トランスポゾンはＩＴＲ配列CCCTAGAAAGATA（配列番号14569）を含む。
【０２３４】
免疫細胞および免疫前駆体細胞
特定の態様では、本開示の免疫細胞は、リンパ前駆細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｔリンパ球（Ｔ細胞）、幹細胞様記憶Ｔ細胞（ＴSCM細胞）、中央記憶Ｔ細胞（ＴCM）、幹細胞様Ｔ細胞、Ｂリンパ球（Ｂ細胞）、骨髄前駆細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球、マクロファージ、血小板、赤血球、赤血球（ＲＢＣ）、巨核球、または破骨細胞を含む。
【０２３５】
特定の態様では、免疫前駆体細胞は、１種以上の免疫細胞に分化することができる任意の細胞を含む。特定の態様では、免疫前駆体細胞は、自己再生して免疫細胞になることができる複能性幹細胞を含む。特定の態様では、免疫前駆体細胞は造血幹細胞（ＨＳＣ）またはその子孫を含む。特定の態様では、免疫前駆体細胞は、免疫細胞になることができる前駆体細胞を含む。特定の態様では、免疫前駆体細胞は、造血前駆細胞（ＨＰＣ）を含む。
【０２３６】
造血幹細胞（ＨＳＣ）
造血幹細胞（ＨＳＣ）は複能性と自己複製能を持つ細胞である。リンパ系統および骨髄系統から分化したすべての血液細胞はＨＳＣから生じる。ＨＳＣは、大人の骨髄、末梢血、動員末梢血、腹膜透析流出物、および臍帯血に見られる。
【０２３７】
本開示のＨＳＣは、一次幹細胞かまたは培養幹細胞から単離したもの、またはそれらに由来するものであってもよい。本開示のＨＳＣは、胚性幹細胞、複能性幹細胞、多能性幹細胞、成体幹細胞、または誘発性多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から単離したもの、またはそれらに由来するものであってもよい。
【０２３８】
本開示の免疫前駆体細胞は、ＨＳＣまたはＨＳＣ子孫細胞を含んでいてもよい。本開示の例示的なＨＳＣ子孫細胞としては、これらに限定されないが、複能性幹細胞、リンパ前駆細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｔリンパ球細胞（Ｔ細胞）、Ｂリンパ球細胞（Ｂ細胞）、骨髄前駆細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球、およびマクロファージが挙げられる。
【０２３９】
本開示の方法により産生されたＨＳＣは、成体幹細胞から単離かまたはそれに由来し、単一系統に関与する一方で胚性幹細胞の特性を共有する「原始」幹細胞の特徴を保持していてもよい。例えば、本開示の方法により産生される「原始」ＨＳＣは、分裂前のその「幹細胞性」を保持しているが分化していない。その結果、養子細胞治療として、本開示の方法で産生した「原始」ＨＳＣは生体内でその数を補うだけでなく、増殖する。本開示の方法で産生した「原始」ＨＳＣは、単回投与量として投与した場合に治療で有効である場合がある。実施形態によっては、本開示の原始ＨＳＣはＣＤ３４＋である。実施形態によっては、本開示の原始ＨＳＣはＣＤ３４＋およびＣＤ３８−である。実施形態によっては、本開示の原始ＨＳＣは、ＣＤ３４＋、ＣＤ３８−、およびＣＤ９０＋である。実施形態によっては、本開示の原始ＨＳＣは、ＣＤ３４＋、ＣＤ３８−、ＣＤ９０＋、およびＣＤ４５ＲＡ−である。実施形態によっては、本開示の原始ＨＳＣは、ＣＤ３４＋、ＣＤ３８−、ＣＤ９０＋、ＣＤ４５ＲＡ−、およびＣＤ４９ｆ＋である。実施形態によっては、本開示の大部分の原始ＨＳＣは、ＣＤ３４＋、ＣＤ３８−、ＣＤ９０＋、ＣＤ４５ＲＡ−、およびＣＤ４９ｆ＋である。
【０２４０】
本開示の実施形態によっては、原始ＨＳＣ、ＨＳＣ、および／またはＨＳＣ子孫細胞は、外因性配列（例えば、キメラ抗体受容体または治療用タンパク質）を発現するように本開示の方法により修飾されてもよい。本開示の実施形態によっては、修飾原始ＨＳＣ、修飾ＨＳＣ、および／または修飾ＨＳＣ子孫細胞は、これらに限定されないが本開示の修飾Ｔ細胞、修飾ナチュラルキラー細胞、および／または修飾Ｂ細胞を含む修飾免疫細胞を産生するように前方分化していてもよい。
【０２４１】
Ｔ細胞
本開示の修飾Ｔ細胞は、修飾造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）または修飾ＨＳＣに由来していてもよい。
【０２４２】
従来の生物学的治療法および化学治療法とは異なり、本開示の修飾Ｔ細胞は、抗原認識の際に素早く再生する能力を持ち、これによって繰り返し治療の必要性を取り除くことができる。これを達成するため、実施形態によっては、本開示の修飾Ｔ細胞は初期応答を駆動するだけでなく、生存能力のある記憶Ｔ細胞の安定集団として患者内に留まり、再発の可能性を防ぐ。または、実施形態によっては、望ましくない場合は本開示の修飾Ｔ細胞は患者に残存しない。
【０２４３】
抗原とは無関係の（持続性）シグナル伝達によるＴ細胞の疲弊を起こさない抗原受容体分子、および記憶Ｔ細胞、特に幹細胞記憶（ＴSCM）Ｔ細胞または幹細胞様Ｔ細胞を含む修飾Ｔ細胞生成物の開発に多くの努力が向けられてきた。本開示の幹細胞様修飾Ｔ細胞は、最も高い自己複製能と、中央記憶（ＴCM）Ｔ細胞またはＴCM様細胞、エフェクター記憶Ｔ細胞（ＴEM）、およびエフェクターＴ細胞（ＴE）を派生させる複能性を示し、これにより優れた腫瘍撲滅効果と修飾Ｔ細胞の長期生着が得られる。ナイーブＴ細胞（ＴN）＞ＴSCM＞ＴCM＞ＴEM＞ＴE＞ＴTEという線状の分化経路は、これら細胞の生成に関与する場合がある。これにより、ＴNは、直接ＴSCMを生じる親前駆体細胞であり、ＴSCMは直接ＴCMを生じる。本開示のＴ細胞の組成は、各親Ｔ細胞下位集合のうちの1種以上を含んでいてもよく、ＴSCM細胞が最も多い（例えば、ＴSCM＞ＴCM＞ＴEM＞ＴE＞ＴTE）。
【０２４４】
本開示の実施形態の方法によっては、免疫細胞前駆体は初期記憶Ｔ細胞、幹細胞様Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞（ＴN）、ＴSCM、ＴCM、ＴEM、ＴE、またはＴTEに分化している、または分化することができる。実施形態によっては、免疫細胞前駆体は本開示の原始ＨＳＣ、ＨＳＣ、またはＨＳＣ子孫細胞である。
【０２４５】
本開示の実施形態の方法によっては、免疫細胞は初期記憶Ｔ細胞、幹細胞様Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞（ＴN）、ＴSCM、ＴCM、ＴEM、ＴE、またはＴTEである。
【０２４６】
本開示の実施形態の方法によっては、免疫細胞は初期記憶Ｔ細胞である。
【０２４７】
本開示の実施形態の方法によっては、免疫細胞は幹細胞様Ｔ細胞である。
【０２４８】
本開示の実施形態の方法によっては、免疫細胞はＴSCMである。
【０２４９】
本開示の実施形態の方法によっては、免疫細胞はＴCMである。
【０２５０】
本開示の実施形態の方法によっては、これらの方法は複数の修飾Ｔ細胞を修飾および／または産生し、少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはこれらの間の任意の百分率の前記複数の修飾Ｔ細胞は、初期記憶Ｔ細胞の１つ以上の細胞表面マーカーを発現する。特定の態様では、前記複数の修飾初期記憶Ｔ細胞は少なくとも１つの修飾幹細胞様Ｔ細胞を含む。特定の態様では、前記複数の修飾初期記憶Ｔ細胞は、少なくとも１つの修飾ＴSCMを含む。特定の態様では、前記複数の修飾初期記憶Ｔ細胞は、少なくとも１つの修飾ＴCMを含む。
【０２５１】
本開示の実施形態の方法によっては、これらの方法は、複数の修飾Ｔ細胞を修飾および／または産生し、少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはこれらの間の任意の百分率の前記複数の修飾Ｔ細胞は幹細胞様Ｔ細胞の１つ以上の細胞表面マーカーを発現する。特定の態様では、前記複数の修飾幹細胞様Ｔ細胞は少なくとも１つの修飾ＴSCMを含む。特定の態様では、前記複数の修飾幹細胞様Ｔ細胞は少なくとも１つの修飾ＴCMを含む。
【０２５２】
本開示の実施形態の方法によっては、これらの方法は、複数の修飾Ｔ細胞を修飾および／または産生し、少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはこれらの間の任意の百分率の前記複数の修飾Ｔ細胞は、幹細胞様記憶Ｔ細胞（ＴSCM）のうちの１種以上の細胞表面マーカーを発現する。特定の態様では、細胞表面マーカーは、ＣＤ６２ＬおよびＣＤ４５ＲＡを含む。特定の態様では、細胞表面マーカーは、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ２８、ＣＣＲ７、ＣＤ１２７、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ９５、ＣＤ９５、およびＩＬ−２Ｒβのうち、１種以上を含む。特定の態様では、細胞表面マーカーはＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ９５、ＩＬ−２Ｒβ、ＣＣＲ７、およびＣＤ６２Ｌのうち、１種以上を含む。
【０２５３】
本開示の実施形態の方法によっては、これらの方法は、複数の修飾Ｔ細胞を修飾および／または産生し、少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはこれらの間の任意の百分率の前記複数の修飾Ｔ細胞は、中央記憶Ｔ細胞（ＴCM）の１種以上の細胞表面マーカーを発現する。特定の態様では、細胞表面マーカーは、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ９５、ＩＬ−２Ｒβ、ＣＣＲ７、およびＣＤ６２Ｌのうち、１種以上を含む
【０２５４】
本開示の実施形態の方法によっては、これらの方法は、複数の修飾Ｔ細胞を修飾および／または産生し、少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはこれらの間の任意の百分率の前記複数の修飾Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞（ＴN）の１種以上の細胞表面マーカーを発現する。特定の態様では、細胞表面マーカーは、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＣＲ７、およびＣＤ６２Ｌのうち、１種以上を含む。
【０２５５】
本開示の実施形態の方法によっては、これらの方法は、複数の修飾Ｔ細胞を修飾および／または産生し、少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはこれらの間の任意の百分率の前記複数の修飾Ｔ細胞は、エフェクターＴ細胞（修飾ＴEFF）の１種以上の細胞表面マーカーを発現する。特定の態様では、細胞表面マーカーは、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ９５、およびＩＬ−２Ｒβのうち、１種以上を含む。
【０２５６】
本開示の実施形態の方法によっては、これらの方法は、複数の修飾Ｔ細胞を修飾および／または産生し、少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはこれらの間の任意の百分率の前記複数の修飾Ｔ細胞は、幹細胞様Ｔ細胞、幹細胞性記憶Ｔ細胞（ＴSCM）、または中央記憶Ｔ細胞（ＴCM）の１種以上の細胞表面マーカーを発現する。
【０２５７】
本開示の実施形態の方法によっては、緩衝液は免疫細胞またはその前駆体を含む。緩衝液は、Ｔ細胞を含む免疫細胞またはその前駆体のあるレベルの細胞生存率および／または幹細胞様表現型を維持かまたは増強する。特定の態様では、緩衝液は、ヌクレオフェクションの前に、一次ヒトＴ細胞のあるレベルの細胞生存率および／または幹細胞様表現型を維持かまたは増強する。特定の態様では、緩衝液は、ヌクレオフェクション中に、一次ヒトＴ細胞のあるレベルの細胞生存率および／または幹細胞様表現型を維持かまたは増強する。特定の態様では、緩衝液は、ヌクレオフェクション後に、一次ヒトＴ細胞のあるレベルの細胞生存率および／または幹細胞様表現型を維持かまたは増強する。特定の態様では、緩衝液は、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ2、ＣｌＮａ、グルコース、およびＣａ（ＮＯ3）2のうち１種以上を絶対または相対存在量かまたは濃度で含み、任意でＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、およびリン酸緩衝液からなる群より選択されるサプリメント（栄養補助剤）をさらに含む。特定の態様では、緩衝液は、５ｍＭのＫＣｌ、１５ｍＭのＭｇＣｌ2、９０ｍＭのＣｌＮａ、１０ｍＭのグルコース、および０．４ｍＭのＣａ（ＮＯ3）2を含む。特定の態様では、緩衝液は、５ｍＭのＫＣｌ、１５ｍＭのＭｇＣｌ2、９０ｍＭのＣｌＮａ、１０ｍＭのグルコース、０．４ｍＭのＣａ（ＮＯ3）2、および２０ｍＭのＨＥＰＥＳと７５ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌを含むサプリメントを含む。特定の態様では、緩衝液は、５ｍＭのＫＣｌ、１５ｍＭのＭｇＣｌ2、９０ｍＭのＣｌＮａ、１０ｍＭのグルコース、０．４ｍＭのＣａ（ＮＯ3）2、およびｐＨ７．２で４０ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4／ＮａＨ2ＰＯ4を含むサプリメントを含む。特定の態様では、一次ヒトＴ細胞を含む組成物は、１００μｌの緩衝液と５×１０6〜２５×１０6個の細胞を含む。特定の態様では、組成物は、導入工程時に緩衝液または他の培地１ミリリットル当たり２５０×１０6個の測定可能量の一次ヒトＴ細胞を含む。
【０２５８】
本開示の実施形態の方法によっては、これらの方法は、本開示のＴ細胞を含む本開示の免疫細胞とＴ細胞増殖組成物を接触させることを含む。本開示の実施形態の方法によっては、トランスポゾンおよび／または本開示の転位酵素を本開示の免疫細胞に導入する工程は、免疫細胞とＴ細胞増殖組成物を接触させることをさらに含んでいてもよい。実施形態によっては、前記方法の導入工程が電気穿孔またはヌクレオフェクション工程を含む方法を含む場合、電気穿孔またはヌクレオフェクション工程は、本開示のＴ細胞増殖組成物に接触させた免疫細胞により行ってもよい。
【０２５９】
本開示の実施形態の方法によっては、Ｔ細胞増殖組成物は、リン、１種以上のオクタン酸、パルミチン酸、リノール酸、およびオレイン酸、ステロール、およびアルカンを含む、それらから本質的になる、またはそれらからなる。
【０２６０】
本開示の修飾Ｔ細胞を産生する方法の特定の実施形態において、増殖サプリメントは、１種以上のサイトカインを含む。１種以上のサイトカインは、これらに限定されないが、リンホカインを含む任意のサイトカインを含んでいてもよい。リンホカインの例としては、これらに限定されないが、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、およびインターフェロン−γ（ＩＮＦγ）が挙げられる。前記１種以上のサイトカインはＩＬ−２を含んでいてもよい。
【０２６１】
本開示の実施形態の方法によっては、Ｔ細胞増殖組成物は、ヒト血清アルブミン、組み換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、２−メルカプトエタノール、および増殖サプリメントを含む。この方法の特定の実施形態では、Ｔ細胞増殖組成物は、１種以上のオクタン酸、ニコチンアミド、２，４，７，９−テトラメチル−５−デシン−４，７−ジオール（ＴＭＤＤ）、アジピン酸ジイソプロピル（ＤＩＰＡ）、ｎ−ブチル−ベンゼンスルホンアミド、１，２−ベンゼンジカルボン酸のビス（２−メチルプロピル）エステル、パルミチン酸、リノール酸、オレイン酸、ステアリン酸ヒドラジド、オレイン酸アミド、ステロール、およびアルカンをさらに含んでいてもよい。この方法の特定の実施形態では、Ｔ細胞増殖組成物は１種以上のオクタン酸、パルミチン酸、リノール酸、オレイン酸、およびステロールをさらに含んでいてもよい。この方法の特定の実施形態では、Ｔ細胞増殖組成物は、０．９ｍｇ／ｋｇ〜９０ｍｇ／ｋｇ（上限値および下限値を含む）の濃度の１種以上のオクタン酸、０．２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ（上限値および下限値を含む）の濃度のパルミチン酸を０．２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ（上限値および下限値を含む）の濃度のリノール酸、０．２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ（上限値および下限値を含む）の濃度のオレイン酸、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ（上限値および下限値を含む）の濃度のステロールをさらに含む。この方法の特定の実施形態では、Ｔ細胞増殖組成物は、約９ｍｇ／ｋｇの濃度の１種以上のオクタン酸、約２ｍｇ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約２ｍｇ／ｋｇの濃度のリノール酸、約２ｍｇ／ｋｇの濃度のオレイン酸、および約１ｍｇ／ｋｇの濃度のステロールをさらに含む。この方法の特定の実施形態では、Ｔ細胞増殖組成物は、６．４μｍｏｌ／ｋｇ〜６４０μｍｏｌ／ｋｇ（上限値および下限値を含む）の濃度の１種以上のオクタン酸、０．７μｍｏｌ／ｋｇ〜７０μｍｏｌ／ｋｇ（上限値および下限値を含む）の濃度のパルミチン酸、０．７５μｍｏｌ／ｋｇ〜７５μｍｏｌ／ｋｇ（上限値および下限値を含む）の濃度のリノール酸、０．７５μｍｏｌ／ｋｇ〜７５μｍｏｌ／ｋｇ（上限値および下限値を含む）の濃度のオレイン酸、および０．２５μｍｏｌ／ｋｇ〜２５μｍｏｌ／ｋｇ（上限値および下限値を含む）の濃度のステロールをさらに含む。この方法の特定の実施形態では、Ｔ細胞増殖組成物は、約６４μｍｏｌ／ｋｇの濃度の１種以上のオクタン酸、約７μｍｏｌ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約７．５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のリノール酸、約７．５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオレイン酸、および約２．５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のステロールをさらに含む。
【０２６２】
特定の態様では、Ｔ細胞増殖組成物は、ヒト血清アルブミン、組み換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、２−メルカプトエタノール、および複数の発現した修飾Ｔ細胞を産生するための増殖サプリメントのうちの１種以上を含み、前記複数の修飾Ｔ細胞の少なくとも２％は、初期記憶Ｔ細胞、幹細胞様Ｔ細胞、幹細胞性記憶Ｔ細胞（ＴSCM）、および／または中央記憶Ｔ細胞（ＴCM）の１種以上の細胞表面マーカーを発現する。特定の態様では、Ｔ細胞増殖組成物は、１種以上のオクタン酸、ニコチンアミド、２，４，７，９−テトラメチル−５−デシン−４，７−ジオール（ＴＭＤＤ）、アジピン酸ジイソプロピル（ＤＩＰＡ）、ｎ−ブチル−ベンゼンスルホンアミド、１，２−ベンゼンジカルボン酸のビス（２−メチルプロピル）エステル、パルミチン酸、リノール酸、オレイン酸、ステアリン酸ヒドラジド、オレイン酸アミド、ステロール、およびアルカンをさらに含む。特定の態様では、Ｔ細胞増殖組成物は、１種以上のオクタン酸、パルミチン酸、リノール酸、オレイン酸、およびステロール（例えば、コレステロール）を含む。特定の態様では、Ｔ細胞増殖組成物は、０．９ｍｇ／ｋｇ〜９０ｍｇ／ｋｇ（上限値および下限値を含む）の濃度の１種以上のオクタン酸、０．２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ（上限値および下限値を含む）の濃度のパルミチン酸、０．２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ（上限値および下限値を含む）の濃度のリノール酸、０．２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ（上限値および下限値を含む）の濃度のオレイン酸、および約０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ（上限値および下限値を含む）の濃度のステロール（ここで、ｍｇ／ｋｇ＝百万分率）を含む。特定の態様では、Ｔ細胞増殖組成物は、約９ｍｇ／ｋｇの濃度の１種以上のオクタン酸、約２ｍｇ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約２ｍｇ／ｋｇの濃度のリノール酸、約２ｍｇ／ｋｇの濃度のオレイン酸、約１ｍｇ／ｋｇの濃度のステロール（ここで、ｍｇ／ｋｇ＝百万分率）を含む。特定の態様では、Ｔ細胞増殖組成物は、９．１９ｍｇ／ｋｇの濃度の１種以上のオクタン酸、１．８６ｍｇ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約２．１２ｍｇ／ｋｇの濃度のリノール酸、約２．１３ｍｇ／ｋｇの濃度のオレイン酸、約１．０１ｍｇ／ｋｇの濃度のステロール（ここで、ｍｇ／ｋｇ＝百万分率）を含む。特定の態様では、Ｔ細胞増殖組成物は、９．１９ｍｇ／ｋｇの濃度のオクタン酸、１．８６ｍｇ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、２．１２ｍｇ／ｋｇの濃度のリノール酸、約２．１３ｍｇ／ｋｇの濃度のオレイン酸、および１．０１ｍｇ／ｋｇの濃度のステロール（ここで、ｍｇ／ｋｇ＝百万分率）を含む。特定の態様では、Ｔ細胞増殖組成物は、６．４μｍｏｌ／ｋｇ〜６４０μｍｏｌ／ｋｇ（上限値および下限値を含む）の濃度の１種以上のオクタン酸、０．７μｍｏｌ／ｋｇ〜７０μｍｏｌ／ｋｇ（上限値および下限値を含む）の濃度のパルミチン酸、０．７５μｍｏｌ／ｋｇ〜７５μｍｏｌ／ｋｇ（上限値および下限値を含む）の濃度のリノール酸、０．７５μｍｏｌ／ｋｇ〜７５μｍｏｌ／ｋｇ（上限値および下限値を含む）の濃度のオレイン酸、０．２５μｍｏｌ／ｋｇ〜２５μｍｏｌ／ｋｇ（上限値および下限値を含む）の濃度のステ��ールを含む。特定の態様では、Ｔ細胞増殖組成物は、約６４μｍｏｌ／ｋｇの濃度の１種以上のオクタン酸、約７μｍｏｌ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約７．５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のリノール酸、約７．５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオレイン酸、および約２．５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のステロールを含む。特定の態様では、Ｔ細胞増殖組成物は、約６３．７５μｍｏｌ／ｋｇの濃度の１種以上のオクタン酸、約７．２７μｍｏｌ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約７．５７μｍｏｌ／ｋｇの濃度のリノール酸、約７．５６μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオレイン酸、および約２．６１μｍｏｌ／ｋｇの濃度のステロールを含む。特定の態様では、Ｔ細胞増殖組成物は、約６３．７５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオクタン酸、約７．２７μｍｏｌ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約７．５７μｍｏｌ／ｋｇの濃度のリノール酸、７．５６μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオレイン酸、および２．６１μｍｏｌ／ｋｇの濃度のステロールを含む。
【０２６３】
本明細書で用いられる用語「栄養補給されたＴ細胞増殖組成物」または「Ｔ細胞増殖組成物」は、３７℃でヒト血清アルブミン、組み換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、２−メルカプトエタノール、および増殖サプリメントのうちの１種以上を含む培地と互いに言い換え可能である場合がある。これに代えて、またはこれに加えて、用語「栄養補給されたＴ細胞増殖組成物」または「Ｔ細胞増殖組成物」は、リン、オクタン脂肪酸、パルミチン脂肪酸、リノール脂肪酸、およびオレイン酸のうちの１種以上を含む培地と互いに言い換え可能である場合がある。特定の態様では、これら培地は、例えば、イスコフ修飾ダルベッコ培地（(IMDM);ThermoFisher Scientificからカタログ番号１２４４００５３として入手可能）に見ることができる量よりも１０倍多い量のリンを含む。
【０２６４】
本明細書で用いられる用語「栄養補給されたＴ細胞増殖組成物」または「Ｔ細胞増殖組成物」は、３７℃でヒト血清アルブミン、組み換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、２−メルカプトエタノール、イスコフＭＤＭ、および増殖サプリメントのうちの１種以上を含む培地と互いに言い換え可能である場合がある。またはこれに加えて、用語「栄養補給されたＴ細胞増殖組成物」または「Ｔ細胞増殖組成物」は、ホウ素、ナトリウム、マグネシウム、リン、カリウム、およびカルシウム元素のうちの１種以上を含む培地と互いに言い換え可能である場合がある。特定の態様では、用語「栄養補給されたＴ細胞増殖組成物」または「Ｔ細胞増殖組成物」は、対応する平均濃度で存在する以下の元素のうち１種以上を含む培地と互いに言い換え可能である場合がある：３．７ｍｇ／Ｌのホウ素、３０００ｍｇ／Ｌのナトリウム、１８ｍｇ／Ｌのマグネシウム、２９ｍｇ／Ｌのリン、１５ｍｇ／Ｌのカリウム、および４ｍｇ／Ｌのカルシウム。
【０２６５】
本明細書で用いられる用語「栄養補給されたＴ細胞増殖組成物」または「Ｔ細胞増殖組成物」は、３７℃でヒト血清アルブミン、組み換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、２−メルカプトエタノール、および増殖サプリメントのうち１種以上を含む培地と互いに言い換え可能である場合がある。またはこれに加えて、用語「栄養補給されたＴ細胞増殖組成物」または「Ｔ細胞増殖組成物」は、以下の成分のうち１種以上を含む培地と互いに言い換え可能である場合がある：オクタン酸(CAS No.124-07-2)、ニコチンアミド(CAS No.98-92-0)、２，４，７，９−テトラメチル−５−デシン−４，７−ジオール（ＴＭＤＤ）(CAS No.126-86-3)、アジピン酸ジイソプロピル（ＤＩＰＡ）(CAS No.6938-94-9)、ｎ−ブチル−ベンゼンスルホンアミド(CAS No.3622-84-2)、１，２−ベンゼンジカルボン酸のビス（２−メチルプロピル）エステル(CAS No.84-69-5)、パルミチン酸(CAS No.57-10-3)、リノール酸(CAS No.60-33-3)、オレイン酸(CAS No.112-80-1)、ステアリン酸ヒドラジド(CAS No.4130-54-5)、オレイン酸アミド(CAS No.3322-62-1)、ステロール（例えば、コレステロール）(CAS No.57-88-5)、およびアルカン（例えば、ノナデカン）(CAS No.629-92-5)。特定の態様では、用語「栄養補給されたＴ細胞増殖組成物」または「Ｔ細胞増殖組成物」は、以下の成分のうち１種以上を含む培地と互いに言い換え可能である場合がある：オクタン酸(CAS No.124-07-2)、ニコチンアミド(CAS No.98-92-0)、２，４，７，９−テトラメチル−５−デシン−４，７−ジオール（ＴＭＤＤ）(CAS No.126-86-3）、アジピン酸ジイソプロピル（ＤＩＰＡ）(CAS No.6938-94-9)、ｎ−ブチル−ベンゼンスルホンアミド(CAS No.3622-84-2)、１，２−ベンゼンジカルボン酸のビス（２−メチルプロピル）エステル(CAS No.84-69-5)、パルミチン酸(CAS No.57-10-3)、リノール酸(CAS No.60-33-3)、オレイン酸(CAS No.112-80-1)、ステアリン酸ヒドラジド(CAS No.4130-54-5)、オレイン酸アミド(CAS No.3322-62-1)、ステロール（例えば、コレステロール）(CAS No.57-88-5)、アルカン（例えば、ナノデカン）(CAS No.629-92-5)、およびフェノールレッド(CAS No.143-74-8)。特定の態様では、 用語「栄養補給されたＴ細胞増殖組成物」または「Ｔ細胞増殖組成物」は、以下の成分のうち１種以上を含む培地と互いに言い換え可能である場合がある：オクタン酸 (CAS No.124-07-2)、ニコチンアミド(CAS No.98-92-0)、２，４，７，９−テトラメチル−５−デシン−４，７−ジオール（ＴＭＤＤ）(CAS No.126-86-3)、アジピン酸ジイソプロピル（ＤＩＰＡ）(CAS No.6938-94-9)、ｎ−ブチル−ベンゼンスルホンアミド(CAS No.3622-84-2)、１，２−ベンゼンジカルボン酸のビス（２−メチルプロピル）エステル(CAS No.84-69-5)、パルミチン酸(CAS No.57-10-3)、リノール酸(CAS No.60-33-3)、オレイン酸(CAS No.112-80-1)、ステアリン酸ヒドラジド(CAS No.4130-54-5)、オレイン酸アミド(CAS No.3322-62-1)、フェノールレッド(CAS No.143-74-8)、およびラノリンアルコール。
【０２６６】
特定の態様では、用語「栄養補給されたＴ細胞増殖組成物」または「Ｔ細胞増殖組成物」は、３７℃でヒト血清アルブミン、組み換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、２−メルカプトエタノール、および増殖サプリメントのうち１種以上を含む培地と互いに言い換え可能である場合がある。またはこれに加えて、用語「栄養補給されたＴ細胞増殖組成物」または「Ｔ細胞増殖組成物」は、以下のナトリウムイオン、アンモニウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、塩化物イオン、硫酸イオン、およびリン酸イオンのうちの１種以上を含む培地と互いに言い換え可能である。
【０２６７】
本明細書で用いられる用語「栄養補給されたＴ細胞増殖組成物」または「Ｔ細胞増殖組成物」は、３７℃でヒト血清アルブミン、組み換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、２−メルカプトエタノール、および増殖サプリメントのうち１種以上を含む培地と互いに言い換え可能である場合がある。またはこれに加えて、用語「栄養補給されたＴ細胞増殖組成物」または「Ｔ細胞増殖組成物」は、以下の遊離アミノ酸のうち１種以上を含む培地と互いに言い換え可能である：ヒスチジン、アスパラギン、セリン、グルタミン酸、アルギニン、グリシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、トレオニン、アラニン、プロリン、システイン、リジン、チロシン、メチオニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、およびトリプトファン。特定の態様では、用語「栄養補給されたＴ細胞増殖組成物」または「Ｔ細胞増殖組成物」は、対応する平均モル百分率で以下の遊離アミノ酸のうち１種以上を含む培地と互いに言い換え可能である：ヒスチジン（約１％）、アスパラギン（約０．５％）、セリン（約１．５％）、グルタミン（約６７％）、アルギニン（約１．５％）、グリシン（約１．５％）、アスパラギン酸（約１％）、グルタミン酸（約２％）、トレオニン（約２％）、アラニン（約１％）、プロリン（約１．５％）、システイン（約１．５％）、リジン（約３％）、チロシン（約１．５％）、メチオニン（約１％）、バリン（約３．５％）、イソロイシン（約３％）、ロイシン（約３．５％）、フェニルアラニン（約１．５％）、およびトリプトファン（約０．５％）。特定の態様では、用語「栄養補給されたＴ細胞増殖組成物」または「Ｔ細胞増殖組成物」は、対応する平均モル百分率で以下の遊離アミノ酸のうち１種以上を含む培地と互いに言い換え可能である：ヒスチジン（約０．７８％）、アスパラギン（約０．４％）、セリン（約１．６％）、グルタミン（約６７．０１％）、アルギニン（約１．６７％）、グリシン（約１．７２％）、アスパラギン酸（約１．００％）、グルタミン酸（約１．９３％）、トレオニン（約２．３８％）、アラニン（約１．１１％）、プロリン（約１．４９％）、システイン（約１．６５％）、リジン（約２．８４％）、チロシン（約１．６２％）、メチオニン（約０．８５％）、バリン（約３．４５％）、イソロイシン（約３．１４％）、ロイシン（約３．３％）、フェニルアラニン（約１．６４％）、およびトリプトファン（約０．３７％）。
【０２６８】
本明細書で用いられる用語「栄養補給されたＴ細胞増殖組成物」または「Ｔ細胞増殖組成物」は、３７℃でヒト血清アルブミン、組み換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、２−メルカプトエタノール、イスコフＭＤＭ、および増殖サプリメントのうちの１種以上を含む培地と互いに言い換え可能である場合がある。またはこれに加えて、用語「栄養補給されたＴ細胞増殖組成物」または「Ｔ細胞増殖組成物」は、リン、オクタン脂肪酸、パルミチン脂肪酸、リノール脂肪酸、およびオレイン酸のうちの１種以上を含む培地と互いに言い換え可能である場合がある。特定の態様では、この培地は、例えば、イスコフ修飾ダルベッコ培地（（ＩＭＤＭ）、カタログ番号１２４４００５３としてThermoFisher Scientificより入手可能）に見られる量より１０倍多い量のリンを含む。
【０２６９】
特定の態様では、用語「栄養補給されたＴ細胞増殖組成物」または「Ｔ細胞増殖組成物」は、１種以上のオクタン酸、パルミチン酸、リノール酸、オレイン酸、およびステロール（例えば、コレステロール）を含む培地と互いに言い換え可能である場合がある。特定の態様では、用語「栄養補給されたＴ細胞増殖組成物」または「Ｔ細胞増殖組成物」は、０．９ｍｇ／ｋｇ〜９０ｍｇ／ｋｇ（上限値および下限値を含む）の濃度の１種以上のオクタン酸、０．２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ（上限値および下限値を含む）の濃度のパルミチン酸、０．２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ（上限値および下限値を含む）の濃度のリノール酸、０．２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ（上限値および下限値を含む）の濃度のオレイン酸、および約０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ（上限値および下限値を含む）の濃度のステロール（ここで、ｍｇ／ｋｇ＝百万分率）を含む培地と互いに言い換え可能である場合がある。特定の態様では、用語「栄養補給されたＴ細胞増殖組成物」または「Ｔ細胞増殖組成物」は、約９ｍｇ／ｋｇの濃度の１種以上のオクタン酸、約２ｍｇ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約２ｍｇ／ｋｇの濃度のリノール酸、約２ｍｇ／ｋｇの濃度のオレイン酸、および約１ｍｇ／ｋｇの濃度のステロール（ここで、ｍｇ／ｋｇ＝百万分率）を含む培地と互いに言い換え可能である場合がある。特定の態様では、用語「栄養補給されたＴ細胞増殖組成物」または「Ｔ細胞増殖組成物」は、９．１９ｍｇ／ｋｇの濃度の１種以上のオクタン酸、１．８６ｍｇ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約２．１２ｍｇ／ｋｇの濃度のリノール酸、約２．１３ｍｇ／ｋｇの濃度のオレイン酸、約１．０１ｍｇ／ｋｇの濃度のステロール（ここで、ｍｇ／ｋｇ＝百万分率）を含む培地と互いに言い換え可能である場合がある。特定の態様では、用語「栄養補給されたＴ細胞増殖組成物」または「Ｔ細胞増殖組成物」は、９．１９ｍｇ／ｋｇの濃度の１種以上のオクタン酸、１．８６ｍｇ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、２．１２ｍｇ／ｋｇの濃度のリノール酸、約２．１３ｍｇ／ｋｇの濃度のオレイン酸、および１．０１ｍｇ／ｋｇの濃度のステロール（ここで、ｍｇ／ｋｇ＝百万分率）を含む培地と互いに言い換え可能である場合がある。特定の態様では、用語「栄養補給されたＴ細胞増殖組成物」または「Ｔ細胞増殖組成物」は、６．４μｍｏｌ／ｋｇ〜６４０μｍｏｌ／ｋｇ（上限値および下限値を含む）の濃度の１種以上のオクタン酸、０．７μｍｏｌ／ｋｇ〜７０μｍｏｌ／ｋｇ（上限値および下限値を含む）の濃度のパルミチン酸、０．７５μｍｏｌ／ｋｇ〜７５μｍｏｌ／ｋｇ（上限値および下限値を含む）の濃度のリノール酸、０．７５μｍｏｌ／ｋｇ〜７５μｍｏｌ／ｋｇ（上限値および下限値を含む）の濃度のオレイン酸、および０．２５μｍｏｌ／ｋｇ〜２５μｍｏｌ／ｋｇ（上限値および下限値を含む）の濃度のステロールを含む培地と互いに言い換え可能である場合がある。特定の態様では、用語「栄養補給されたＴ細胞増殖組成物」または「Ｔ細胞増殖組成物」は、約６４μｍｏｌ／ｋｇの濃度の１種以上のオクタン酸、約７μｍｏｌ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約７．５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のリノール酸、約７．５μｍｏｌ／��ｇの濃度のオレイン酸、および約２．５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のステロールを含む培地と互いに言い換え可能である場合がある。
【０２７０】
特定の態様では、用語「栄養補給されたＴ細胞増殖組成物」または「Ｔ細胞増殖組成物」は、約６３．７５μｍｏｌ／ｋｇの濃度の１種以上のオクタン酸、約７．２７μｍｏｌ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約７．５７μｍｏｌ／ｋｇの濃度のリノール酸、約７．５６μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオレイン酸、約２．６１μｍｏｌ／ｋｇの濃度のステロールを含む培地と互いに言い換え可能である場合がある。特定の態様では、用語「栄養補給されたＴ細胞増殖組成物」または「Ｔ細胞増殖組成物」は、約６３．７５μｍｏｌ／ｋｇの濃度の１種以上のオクタン酸、約７．２７μｍｏｌ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約７．５７μｍｏｌ／ｋｇの濃度のリノール酸、７．５６μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオレイン酸、および２．６１μｍｏｌ／ｋｇの濃度のステロールを含む培地と互いに言い換え可能である場合がある。
【０２７１】
本開示の修飾Ｔ細胞（例えば、幹細胞様Ｔ細胞、ＴSCM、および／またはＴCM）を製造する方法の特定の実施形態では、これら方法は、修飾Ｔ細胞と、Ｐ１３Ｋ−Ａｋｔ−ｍＴＯＲ経路阻害剤を接触させることを含む。１種以上のＰ１３Ｋ経路成分阻害剤を含む成長培地を用いた手順に関する方法の任意の工程で本開示の修飾Ｔ細胞（本開示の修飾幹細胞様Ｔ細胞、ＴSCM、および／またはＴCMを含む）をインキュベート、培養、成長、保存、または混合してもよい。Ｐ１３Ｋ経路成分阻害剤としては、これらに限定されないが、例えば、ＴＷＳ１１９（GSK 3B阻害剤XIIとしても知られている。化学式Ｃ18Ｈ14Ｎ4Ｏ2を持つCAS No.601514-19-6）などのＧＳＫ３β阻害剤が挙げられる。Ｐ１３Ｋ経路成分阻害剤としては、これらに限定されないが、例えば、ｂｂ００７（BLUEBIRDBIO（登録商標））が挙げられる。さらに、Ｐ１３Ｋ経路成分阻害剤としては、これらに限定されないが、例えば、アロステリックＡｋｔ阻害剤ＶＩＩＩ（化合物番号１０１９６４９９のＡｋｔｉ−１／２とも言う）、ＡＴＰ競合阻害剤（タンパク質キナーゼＢ（Ａｋｔ）のＡＴＰ結合ポケットを標的するオルソステリック阻害剤）、イソキノリン−５−スルホンアミド（Ｈ−８、Ｈ−８９、およびＮＬ−７１−１０１）、アゼパン誘導体（（−）−バラノール由来の一連の構造）、アミノフラザン（ＧＳＫ６９０６９３）、複素環（７−アザインドール、６−フェニルプリン誘導体、ピロロ［２、３−ｄ］ピリミジン誘導体、ＣＣＴ１２８９３０、３−アミノピロリジン、アニリノトリアゾール誘導体、スピロインドリン誘導体、ＡＺＤ５３６３、イパタセルチブ（ＧＤＣ−００６８、ＲＧ７４４０）、Ａ−６７４５６３、およびＡ−４４３６５４）、フェニルピラゾール誘導体（ＡＴ７８６７およびＡＴ１３１４８）、チオフェンカルボキサミド誘導体（アフレセルチブ（ＧＳＫ２１１０１８３）、２−ピリミジル−５−アミドチオフェン誘導体（ＤＣ１２０）、ウプロセルチブ（ＧＳＫ２１４１７９５））、アロステリック阻害剤（オルソステリック阻害剤より優れており、特異性が高く、副作用と毒性が少ない）、２、３−ジフェニルキノキサリン類縁体（２、３−ジフェニルキノキサリン誘導体、トリアゾロ［３、４−ｆ］［１、６］ナフチリジン−３（２Ｈ）−オン誘導体（ＭＫ−２２０６））、アルキルリン脂質（エデルフォシン（１−Ｏ−オクタデシル−２−Ｏ−メチル−ｒａｃ−グリセロ−３−ホスホコリン、ＥＴ−１８−ＯＣＨ３）イルモフォシン（ＢＭ４１．４４０）、ミルテフォシン（ヘキサデシルホスホコリン、ＨｅＰＣ）、ペリフォシン（Ｄ−２１２６６）、エルシルホスホコリン（ＥｒＰＣ）、エルフォシン（ＥｒＰＣ３、エルシルホスホホモコリン）、インドール−３−カルビノール類縁体（インドール−３−カルビノール、３−クロロアセチルインドール、ジインドリルメタン、６−メトキシ−５、７−ジヒドロインドロ［２、３−ｂ］カルバゾール−２、１０−ジカルボン酸ジエチル（ＳＲ１３６６８）、ＯＳＵ−Ａ９）、スルホンアミド誘導体（ＰＨ−３１６およびＰＨＴ−４２７）、チオ尿素誘導体（ＰＩＴ−１、ＰＩＴ−２、ＤＭ−ＰＩＴ−１、Ｎ−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）カルボニル］−Ｎ′−（３−ブロ���フェニル）−チオ尿素）、プリン誘導体（トリシリビン（ＴＣＮ、ＮＳＣ１５４０２０）、ホモリン酸トリシリビン活性類縁体（ＴＣＮ−Ｐ）、４−アミノ−ピリド［２、３−ｄ］ピリミジン誘導体ＡＰＩ−１、３−フェニル−３Ｈ−イミドアゾ［４、５−ｂ］ピリジン誘導体、ＡＲＱ０９２）、ＢＡＹ１１２５９７６、３−メチル−キサンチン、キノリン−４−カルボキサミドおよび２−［４−（シクロヘキサ−１、３−ジエン−１−イル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イル］フェノール、３−オキソ−チルカル酸、３α−および３β−アセトキシ−チルカル酸、アセトキシ−チルカル酸、および不可逆性阻害剤（抗生物質、ラクトキノマイシン、フレノリシンＢ、カラフンギン、メデルマイシン、Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−ビニルケトン、４−ヒドロキシノネナール（４−ＨＮＥ）、１、６−ナフチリジノン誘導体、およびイミドアゾ−１、２−ピリジン誘導体）が挙げられる。
【０２７２】
本開示の修飾Ｔ細胞（例えば、幹細胞様Ｔ細胞、ＴSCM、および／またはＴCM）を製造する方法の特定の実施形態では、これら方法は修飾Ｔ細胞と、Ｔ細胞エフェクター分化阻害剤を接触させることを含む。Ｔ細胞エフェクター分化阻害剤としては、これらに限定されないが、例えば、ＢＥＴ阻害剤（例えば、ＪＱ１、チエノトリアゾロジアゼピン）および／またはタンパク質のＢＥＴファミリー（例えば、ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４、およびＢＲＤＴ）阻害剤が挙げられる。
【０２７３】
本開示の修飾Ｔ細胞（例えば、幹細胞様Ｔ細胞、ＴSCM、および／またはＴCM）を製造する方法の特定の実施形態では、これら方法は、修飾Ｔ細胞と、核・細胞内アセチル−ＣｏＡ低減剤とを接触させることを含む。核・細胞内アセチル−ＣｏＡ低減剤としては、これらに限定されないが、２−ヒドロキシクエン酸塩（２−ＨＣ）、およびＡｃｓｓ１の発現増強剤が挙げられる。
【０２７４】
本開示の修飾Ｔ細胞（例えば、幹細胞様Ｔ細胞、ＴSCM、および／またはＴCM）を製造する方法の特定の実施形態では、これら方法は、修飾Ｔ細胞と、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤を含む組成物とを接触させることを含む。実施形態によっては、ＨＤＡＣ阻害剤を含む組成物は、バルプロ酸、フェニル酪酸ナトリウム（ＮａＰＢ）、またはこれらの組み合わせを含む、またはそれらからなる。実施形態によっては、ＨＤＡＣ阻害剤を含む組成物は、バルプロ酸を含む、またはそれからなる。実施形態によっては、ＨＤＡＣ阻害剤を含む組成物は、フェニル酪酸ナトリウム（ＮａＰＢ）を含む、またはそれからなる。
【０２７５】
本開示の修飾Ｔ細胞（例えば、幹細胞様Ｔ細胞、ＴSCM、および／またはＴCM）を製造する方法の特定の実施形態では、活性化サプリメントは、１種以上のサイトカインを含んでいてもよい。前記１種以上のサイトカインは、任意のサイトカインを含んでいてもよく、リンホカインが挙げられるが、これに限定されない。リンホカインとしては、これらに限定されないが、例えば、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、およびインターフェロン−γ（ＩＮＦγ）が挙げられる。前記１種以上のサイトカインは、ＩＬ−２を含んでいてもよい。
【０２７６】
本開示の修飾Ｔ細胞（例えば、幹細胞様Ｔ細胞、ＴSCM、および／またはＴCM）を製造する方法の特定の実施形態では、活性化サプリメントは、１種以上の活性化因子複合体を含んでいてもよい。例示的で非限定的な活性化因子複合体は、ＣＤ３、ＣＤ２８、およびＣＤ２のうち１つ以上に結合する単量体抗体複合体、二量体抗体複合体、三量体抗体複合体、または四量体抗体複合体を含んでいてもよい。実施形態によっては、活性化サプリメントは、ヒト抗体、ヒト化抗体、組み換え抗体、またはキメラ抗体を含む活性化因子複合体を含む、またはそれらからなる。実施形態によっては、活性化サプリメントは、ＣＤ３およびＣＤ２８に結合する活性化因子複合体を含む、またはそれらからなる。実施形態によっては、活性化サプリメントは、ＣＤ３、ＣＤ２８、およびＣＤ２に結合する活性化因子複合体を含む、またはそれらからなる。
【０２７７】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞
特定の態様では、本開示の修飾免疫細胞または免疫前駆体細胞はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。特定の態様では、ＮＫ細胞は、リンパ前駆細胞から分化した細胞毒性リンパ球である。
【０２７８】
本開示の修飾ＮＫ細胞は、修飾造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）または修飾ＨＳＣ由来のものであってもよい。
【０２７９】
特定の態様では、活性化されていないＮＫ細胞はＣＤ３枯渇白血球分離(leukapheresis)（ＣＤ１４／ＣＤ１９／ＣＤ５６＋細胞を含む）に由来する。
【０２８０】
特定の態様では、Lonza 4D nucleofectorまたはBTX ECM 830（５００Ｖ、パルス長さ：７００ｕｓｅｃ、電極の間隔：０．２ｍｍ、１パルス）を用いてＮＫ細胞を電気穿孔する。すべてのLonza 4D nucleofectorプログラムは、本開示の方法の範囲内で想起される。
【０２８１】
特定の態様では、キュベットにて１００μＬのＰ３緩衝液中で５×１０Ｅ６細胞を電気穿孔法により電気穿孔した。しかしながら、この体積あたりの細胞比率は、市販の製造方法で測定可能である。
【０２８２】
特定の態様では、ＮＫ細胞は、さらなる細胞株と共培養することで刺激された。特定の態様では、このさらなる細胞株は、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を含む。特定の態様では、刺激は、電気穿孔後の１日目、２日目、３日目、４日目、５日目、６日目、または７日目に行う。特定の態様では、刺激は電気穿孔後の２日目に行う。
【０２８３】
特定の態様では、ＮＫ細胞はＣＤ５６を発現する。
【０２８４】
Ｂ細胞
特定の態様では、本開示の修飾免疫細胞または免疫前駆体細胞はＢ細胞である。Ｂ細胞は、細胞表面にＢ細胞受容体を発現するリンパ球の一種である。Ｂ細胞受容体は、特定の抗原に結合する。
【０２８５】
本開示の修飾Ｂ細胞は、修飾造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）または修飾ＨＳＣに由来するものであってもよい。
【０２８６】
特定の態様では、ＨＳＰＣ本開示の方法を用いて修飾されており、ヒトＩＬ−３、Ｆｌｔ３Ｌ、ＴＰＯ、ＳＣＦ、およびＧ−ＣＳＦの存在下で少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、または少なくとも７日間Ｂ細胞分化のため予備刺激される。特定の態様では、ＨＳＰＣは本開示の方法を用いて修飾されて、ヒトＩＬ−３、Ｆｌｔ３Ｌ、ＴＰＯ、ＳＣＦ、およびＧ−ＣＳＦの存在下で５日間Ｂ細胞分化のため予備刺激される。
【０２８７】
特定の態様では、予備刺激の前に、修飾ＨＳＰＣ細胞を支持細胞層に移して、２週間に一度供給すると共に、修飾ＨＳＰＣ細胞を週１回新鮮な支持細胞層に移す。特定の態様では、支持細胞はＭＳ−５支持細胞である。
【０２８８】
特定の態様では、修飾ＨＳＰＣ細胞は、ＭＳ−５支持細胞と共に少なくとも７、１４、２１、２８、３０、３３、３５、４２、または４８日間培養される。特定の態様では、修飾ＨＳＰＣ細胞は、ＭＳ−５支持細胞と共に３３日間培養される。
【０２８９】
細胞修飾の方法
本開示の実施形態の方法によっては、組成物は、送達または導入工程時に緩衝液または他の培地１ミリリットルあたり２５０×１０6個の一次ヒトＴ細胞を測定可能量で含む。
【０２９０】
本開示の実施形態の方法によっては、組成物は、電気穿孔法またはヌクレオフェクションによって細胞に送達かまたは導入される。実施形態によっては、送達または導入工程は、電気穿孔法またはヌクレオフェクションを含む。
【０２９１】
本開示の実施形態の方法によっては、組成物は、電気穿孔法またはヌクレオフェクション以外の方法で細胞に送達または導入される。
【０２９２】
本開示の実施形態の方法によっては、組成物は、局所送達、吸着、吸収、電気穿孔法、スピンフェクション、共培養、形質移入、機械的送達、超音波送達、振動送達、マグネトフェクション、またはナノ粒子媒介送達のうちの１種以上によって送達または導入される。実施形態によっては、送達または導入工程は、局所送達、吸着、吸収、電気穿孔法、スピンフェクション、共培養、形質移入、機械的送達、超音波送達、振動送達、マグネトフェクション、またはナノ粒子媒介送達のうちの１種以上を含む。
【０２９３】
本開示の実施形態の方法によっては、組成物は、リポソームによる形質移入、リン酸カルシウムによる形質移入、FuGENE（登録商標）による形質移入、およびデンドリマー媒介形質移入により送達または導入される。実施形態によっては、送達または導入工程は、リポソームによる形質移入、リン酸カルシウムによる形質移入、FuGENEによる形質移入、およびデンドリマー媒介形質移入のうちの１種以上を含む。
【０２９４】
本開示の実施形態の方法によっては、組成物は、機械的形質移入によって送達または導入され、機械的形質移入は細胞圧縮（cell squeezing）、細胞照射（cell bombardment)、または遺伝子銃技術を含む。実施形態によっては、送達または導入工程は、細胞圧縮、細胞照射、または遺伝子銃技術を含む１種以上の機械的形質移入を含む。
【０２９５】
本開示の実施形態の方法によっては、組成物はリポソーム送達、ミセルによる送達、およびポリメロソームによる送達を含むナノ粒子媒介形質移入によって送達または導入される。実施形態によっては、送達または導入工程は、リポソーム送達、ミセルによる送達、およびポリメロソームによる送達のうちの１種以上を含む。
【０２９６】
送達の非転移法
本開示の組成物および方法の実施形態によっては、本開示の修飾細胞は、ある配列を本開示のＨＳＣ、ＨＳＣ子孫細胞、免疫細胞、または免疫前駆体細胞に導入することにより作製されてもよい。導入工程は、非転移送達系を介した配列および／または遺伝子編集組成物の送達を含んでいてもよい。導入工程は、生体外、生体内、実験器具内、または原位置で行われてもよい。
【０２９７】
本開示の組成物および方法の実施形態によっては、配列および／または遺伝子編集組成物を本開示のＨＳＣ、ＨＳＣ子孫細胞、免疫細胞、または免疫前駆体細胞に導入することは、局所送達、吸着、吸収、電気穿孔法、スピンフェクション、共培養、形質移入、機械的送達、超音波送達、振動送達、マグネトフェクション、およびナノ粒子媒介送達のうちの１種以上を含む。
【０２９８】
本開示の組成物および方法の実施形態によっては、核酸配列および／または遺伝子編集構築物を本開示のＨＳＣ、ＨＳＣ子孫細胞、免疫細胞、または免疫前駆体細胞に導入することは、リポソームによる形質移入、リン酸カルシウムによる形質移入、FuGENEによる形質移入、およびデンドリマー媒介形質移入を含む。
【０２９９】
本開示の組成物および方法の実施形態によっては、機械的形質移入により配列および／または遺伝子編集組成物を本開示のＨＳＣ、ＨＳＣ子孫細胞、免疫細胞、または免疫前駆体細胞に導入することは、細胞圧縮、細胞照射、または遺伝子銃技術を含む。
【０３００】
本開示の組成物および方法の実施形態によっては、ナノ粒子媒介形質移入により配列および／または遺伝子編集組成物を本開示のＨＳＣ、ＨＳＣ子孫細胞、免疫細胞、または免疫前駆体細胞に導入することは、リポソーム、ミセル、重合体、およびポリメロソームのうちの１種以上を含む。
【０３０１】
本開示の組成物および方法の実施形態によっては、配列および／または遺伝子編集組成物を本開示のＨＳＣ、ＨＳＣ子孫細胞、免疫細胞、または免疫前駆体細胞に導入することは、非ウイルスベクターを含む。実施形態によっては、非ウイルスベクターは、配列および／または遺伝子編集組成物を含む。実施形態によっては、非ウイルスベクターは、プラスミドＤＮＡ、線状二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、線状一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、DoggyBone（登録商標）ＤＮＡ、ナノプラスミド、ミニサークルＤＮＡ、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）、ＤＤＮＡオリゴヌクレオチド、一本鎖ｍＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、および二本鎖ｍＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含む。
【０３０２】
本開示の組成物および方法の実施形態によっては、配列および／または遺伝子編集組成物を本開示のＨＳＣ、ＨＳＣ子孫細胞、免疫細胞、または免疫前駆体細胞に導入することは、ウイルスベクターを含む。実施形態によっては、ウイルスベクターは非組み込みおよび／または非染色体ベクターである。非組み込み非染色体ベクターとしては、これらに限定されないが、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、およびヘルペスウイルスが挙げられる。実施形態によっては、ウイルスベクターは組み込み染色体ベクターである。組み込み染色体ベクターとしては、これらに限定されないが、例えば、アデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）、レンチウイルス、およびγ−レトロウイルスが挙げられる。実施形態によっては、ウイルスベクターは、前記配列および／または前記遺伝子編集組成物を含む。
【０３０３】
本開示の組成物および方法の実施形態によっては、配列および／または遺伝子編集組成物を本開示のＨＳＣ、ＨＳＣ子孫細胞、免疫細胞、または免疫前駆体細胞に導入することは、本開示のベクターの組み合わせを含む。非限定的な例としてのベクターの組み合わせは、ウイルスと非ウイルスベクター、複数の非ウイルスベクター、または複数のウイルスベクターが挙げられる。非限定的な例としてのベクターの組み合わせは、ＤＮＡ由来ベクターとＲＮＡ由来ベクターの組み合わせ、非ウイルス発現ベクターとウイルス送達ベクターの組み合わせ、非ウイルス発現ベクターとナノ粒子送達ベクターの組み合わせ、２つの個別の非ウイルス発現ベクターの組み合わせ、非ウイルス発現ベクターと機械的または化学的形質移入法の組み合わせが挙げられる。
【０３０４】
本開示の組成物および方法の実施形態によっては、配列および／または遺伝子編集組成物を本開示のＨＳＣ、ＨＳＣ子孫細胞、免疫細胞、または免疫前駆体細胞に導入することにより、配列を安定して組み込む、配列を一時的に組み込む、部位に特異的に配列を組み込む、または偏って組み込む。実施形態によっては、前記配列は核酸配列である。実施形態によっては、核酸配列は導入遺伝子を含む。
【０３０５】
本開示の組成物および方法の実施形態によっては、配列および／または遺伝子編集組成物を本開示のＨＳＣ、ＨＳＣ子孫細胞、免疫細胞、または免疫前駆体細胞に導入することにより、配列を安定して組み込む。実施形態によっては、前記配列は核酸配列である。実施形態によっては、安定した染色体組み込みは、ランダム組み込み、部位特異的組み込み、または偏った組み込みであってもよい。実施形態によっては、部位特異的組み込みは、補助されていなくてもよく、補助されていてもよい。実施形態によっては、補助された部位特異的組み込みは、部位に向けられたヌクレアーゼと共送達される。実施形態によっては、部位に向けられたヌクレアーゼは、ゲノム組み込み部位の上流領域および下流領域に対して百分率相同性を含む５’および３’ヌクレオチド配列伸長を持つ導入遺伝子を含む。実施形態によっては、相同であるヌクレオチド伸長を持つ導入遺伝子により、相同組み換え、マイクロホモロジー媒介末端結合、または非相同末端結合によるゲノム組み込みが可能になる。実施形態によっては、部位特異的組み込みは、安全な待避部位で起こる。遺伝子的に安全な待避部位は、新たに挿入された遺伝要素が信頼性を伴って機能し（例えば、治療的に有効な発現量で発現する）、宿主有機体に危害を及ぼすような宿主ゲノムの有害な変化を生じないように新しい遺伝子材料の組み込みを収容することができる。潜在的なゲノム的に安全な待避部位は、これらに限定されないが、例えば、ヒトアルブミン遺伝子のイントロン配列、アデノ随伴ウイルス部位１（ＡＡＶＳ１）、染色体１９でのＡＡＶウイルス組み込み天然発生部位、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体５（ＣＣＲ５）遺伝子、およびマウスＲｏｓａ２６座位のヒト相同分子種部位が挙げられる。
【０３０６】
実施形態によっては、部位特異的導入遺伝子組み込みは、標的遺伝子の発現を阻害する部位で起こる。実施形態によっては、標的遺伝子の発現の阻害は、イントロン、エクソン、プロモーター、遺伝要素、転写促進因子、抑制因子、開始コドン、終止コドン、および応答要素の部位特異的組み込みにより起こる。実施形態によっては、部位特異的組み込みにより標的された標的遺伝子としては、これらに限定されないが、例えば、ＴＲＡＣ、ＴＲＡＢ、ＰＤＩ、任意の免疫抑制遺伝子、および非自己拒絶に関与する遺伝子が挙げられる。
【０３０７】
本開示の組成物および方法の実施形態によっては、配列および／または遺伝子編集組成物を本開示の部位特異的導入遺伝子組み込みのＨＳＣ、ＨＳＣ子孫細胞、免疫細胞、または免疫前駆体細胞に導入することは、標的遺伝子の発現が高められるような部位で起こる。実施形態によっては、標的遺伝子の発現の増加は、イントロン、エクソン、プロモーター、遺伝要素、転写促進因子、抑制因子、開始コドン、終止コドン、および応答要素の部位特異的組み込みにより起こる。
【０３０８】
本開示の組成物および方法の実施形態によっては、配列および／または遺伝子編集組成物を本開示のＨＳＣ、ＨＳＣ子孫細胞、免疫細胞、または免疫前駆体細胞に導入する際に、導入遺伝子の送達または組み込みを容易にするため、酵素を用いて宿主ゲノムで鎖切断を形成してもよい。実施形態によっては、酵素は、一本鎖切断を形成する。実施形態によっては、酵素は二本鎖切断を形成する。実施形態によっては、切断誘発酵素としては、これらに限定されないが、例えば、転位酵素、インテグラーゼ、エンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、Ｃａｓ−ＣＬＯＶＥＲ（登録商標）、およびＣＰＦ１が挙げられる。実施形態によっては、切断誘発酵素は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を持つ核タンパク質複合体として、タンパク質としてＤＮＡにコードされた、またはｍＲＮＡにコードされた細胞に送達されてもよい。
【０３０９】
本開示の組成物および方法の実施形態によっては、配列および／または遺伝子編集組成物を本開示のＨＳＣ、ＨＳＣ子孫細胞、免疫細胞、または免疫前駆体細胞に導入する際に、部位特異的導入遺伝子組み込みはベクター媒介組み込み部位バイアスにより制御される。実施形態によっては、ベクター媒介組み込み部位バイアスは、選択したレンチウイルスベクターによって制御される。実施形態によっては、ベクター媒介組み込み部位バイアスは、選択したγ−レトロウイルスベクターによって制御される。
【０３１０】
本開示の組成物および方法の実施形態によっては、配列および／または遺伝子編集組成物を本開示のＨＳＣ、ＨＳＣ子孫細胞、免疫細胞、または免疫前駆体細胞に導入する際に、部位特異的導入遺伝子組み込み部位は不安定な染色体挿入である。実施形態によっては、組み込まれた導入遺伝子は発現抑制、除去、切除、またはさらに修飾されてもよい。
【０３１１】
本開示の組成物および方法の実施形態によっては、配列および／または遺伝子編集組成物を本開示のＨＳＣ、ＨＳＣ子孫細胞、免疫細胞、または免疫前駆体細胞に導入する際に、ゲノム修飾は導入遺伝子の不安定な組み込みを含む。実施形態によっては、この不安定な組み込みは、一過性の非染色体組み込み、半安定非染色体組み込み、半持続性非染色体挿入、または不安定な染色体挿入であってもよい。実施形態によっては、一過性の非染色体挿入は、染色体外または細胞内で起こってもよい。
【０３１２】
本開示の組成物および方法の実施形態によっては、配列および／または遺伝子編集組成物を本開示のＨＳＣ、ＨＳＣ子孫細胞、免疫細胞、または免疫前駆体細胞に導入する際に、導入遺伝子の一過性の非染色体挿入は染色体に組み込まれず、修飾された遺伝子材料は細胞分裂時に複製されない。
【０３１３】
本開示の組成物および方法の実施形態によっては、配列および／または遺伝子編集組成物を本開示のＨＳＣ、ＨＳＣ子孫細胞、免疫細胞、または免疫前駆体細胞に導入する際に、ゲノム修飾は導入遺伝子の半安定または持続性非染色体組み込みを含む。実施形態によっては、ＤＮＡベクターは、エピソームとして非ウイルスベクターの保持のために核マトリックスタンパク質に結合する足場／マトリックス結合領域（Ｓ−ＭＡＲ）モジュールをコードして、分裂細胞の核での自己複製を可能にする。
【０３１４】
本開示の組成物および方法の実施形態によっては、配列および／または遺伝子編集組成物を本開示のＨＳＣ、ＨＳＣ子孫細胞、免疫細胞、または免疫前駆体細胞に導入する際に、ゲノム修飾は導入遺伝子の不安定な染色体組み込みである。実施形態によっては、組み込まれた導入遺伝子は、発現抑制、除去、切除、またはさらに修飾されてもよい。
【０３１５】
本開示の組成物および方法の実施形態によっては、配列および／または遺伝子編集組成物を本開示のＨＳＣ、ＨＳＣ子孫細胞、免疫細胞、または免疫前駆体細胞に導入する際に、導入遺伝子挿入によるゲノムの修飾は、相同組み換え（ＨＲ）、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、トランスポザーゼ酵素媒介修飾、インテグラーゼ酵素媒介修飾、エンドヌクレアーゼ酵素媒介修飾、または組み換え酵素媒介修飾による宿主細胞に向けられた二本鎖切断修復（相同性修復）を介して起こってもよい。実施形態によっては、導入遺伝子挿入によるゲノムの修飾は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、Ｃａｓ−ＣＬＯＶＥＲ、およびｃｐｆ１を介して起こってもよい。
【０３１６】
ナノ粒子の送達
本開示の組成物および方法の実施形態によっては、配列および／または遺伝子編集組成物を本開示のＨＳＣ、ＨＳＣ子孫細胞、免疫細胞、または免疫前駆体細胞に導入することは、ナノ粒子ベクターを含む。ナノ粒子ベクターは、本開示の組成物を封入してもよい。これに代えて、またはこれに加えて、ナノ粒子ベクターの表面は、本開示の組成物を含んでいてもよい。実施形態によっては、前記表面は内表面である。実施形態によっては、前記表面は外表面である。実施形態によっては、前記表面は、その内側または外側に組み込まれた本開示の組成物を含む。
【０３１７】
本開示のナノ粒子ベクターの非限定的な例としては、親水性ブロック、疎水性ブロック、および電荷を帯びたブロックのうちの１つ以上を含んでいてもよい。実施形態によっては、親水性ブロックはポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）であってもよく、電荷を帯びたブロックはポリ（Ｌ−ヒスチジン）であってもよい。
【０３１８】
本開示は、二ブロックおよび三ブロック共重合体を含むナノ粒子ベクターを提供する。例示的な二ブロック共重合体は、親水性ブロック、疎水性ブロック、および電荷を帯びたブロックのうちの１つ以上を含んでいてもよい。実施形態によっては、親水性ブロックはポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）であってもよく、電荷を帯びたブロックはポリ（Ｌ−ヒスチジン）であってもよい。例示的な三ブロック共重合体は、親水性ブロック、疎水性ブロック、および電荷を帯びたブロックのうちの１つ以上を含んでいてもよい。実施形態によっては、親水性ブロックはポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）であってもよく、電荷を帯びたブロックはポリ（Ｌ−ヒスチジン）であってもよい。
【０３１９】
様々な実施形態で用いてもよい例示的な三ブロック共重合体は、ＰＥＯ−ｂ−ＰＬＡ−ｂ−ＰＨＩＳであり、設計により各ブロックの繰り返し単位の数を変えられる。
【０３２０】
ポリヒスチジン（すなわちポリ（Ｌ−ヒスチジン））は、不飽和窒素の孤立電子対を提供するイミダゾール環のためにｐＨ感受性重合体である。すなわち、ポリヒスチジンはプロトン化／脱プロトン化により酸・塩基両方の性質を持つ。様々な実施形態により、例えば、ポリヒスチジン系ミセルと複合体を形成した遺伝子編集組成物を含む本開示の組成物の細胞内送達が可能である。
【０３２１】
本実施形態の三ブロック共重合体をミセルにするための中間生成物として用いてもよい二ブロック共重合体は、様々な疎水性脂肪族ポリ無水物、ポリ核酸、ポリエステル、ポリオルトエステル、ポリペプチド、ポリホスファゼン、および多糖類と結合した親水性生体適合性ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）（ＰＥＧと化学的に同義）を含んでいてもよい。多糖類としては、これらに限定されないが、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＬＧＡ）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（ε−カプロラクトン）（ＰＣＬ）、およびポリ（カルボン酸トリメチレン）（ＰＴＭＣ）が挙げられる。
【０３２２】
１００％ＰＥＧ化された表面からなる重合体ミセルは、実験器具内での化学的安定性が向上し、生体内での生体利用性が高められ、血液循環半減期が長くなっている。例えば、重合体ミセルの膜部分を構成する脂肪族ポリエステルは、人体などの生理学的条件でそのエステル結合が加水分解されることで分解される。この生分解性により、脂肪族ポリエステルは、薬物送達装置の埋め込み可能な生体材料、生体吸収性縫合、密着性障壁、および組織工学による損傷修復用足場としての使用に関して大きな注目を集めている。
【０３２３】
特定の理論に束縛されるわけではないが、様々な実施形態の三ブロック共重合体によって形成されるミセルでは、疎水性ブロックが凝集してコアを形成し、それを取り囲む層を１つ以上形成するように親水性ブロックとポリヒスチジンブロックが両端に残ると思われる。
【０３２４】
足場タンパク質
本開示のタンパク質足場は、フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）繰り返しタンパク質、コード核酸かまたは相補核酸、ベクター、宿主細胞、組成物、組み合わせ、配合物、それらを作製および使用する装置および方法に由来していてもよい。好ましい一態様では、タンパク質足場は、ヒトのテネイシン−Ｃ（以後、「テネイシン」）に由来する複数のＦＮ３ドメインの共通配列から構成される。さらに好ましい一態様では、本開示のタンパク質足場は、１５個のＦＮ３ドメインの共通配列である。本開示のタンパク質足場は、様々な分子、例えば、細胞標的タンパク質と結合するように設計されていてもよい。好ましい一態様では、本開示のタンパク質足場は、野生型の抗原決定基および／またはリガンドかまたは抗原の変異体に結合するように設計されていてもよい。
【０３２５】
本開示のタンパク質足場は、さらなる分子または部位、例えば、抗体のＦｃ領域、アルブミン結合ドメイン、または半減期に影響を及ぼす他の部位を含んでいてもよい。さらなる実施形態では、本開示のタンパク質足場は、タンパク質足場をコードしていてもよい核酸分子に結合していてもよい。
【０３２６】
本開示は、宿主細胞において複数のＦＮ３ドメインの共通配列に基づいて少なくとも１種のタンパク質足場を発現させる少なくとも１つの方法を提供する。前記方法は、少なくとも１種のタンパク質足場が検出可能かつ／または回収可能な量で発現する条件で本明細書で記載するように宿主細胞を培養することを含む。
【０３２７】
本開示は、（ａ）本明細書で記載するような複数のＦＮ３ドメインの共通配列および／またはコード核酸に基づくタンパク質足場、および（ｂ）好適かつ／また医薬的に許容可能な担体または希釈剤を含む少なくとも１つの組成物を提供する。
【０３２８】
本開示は、フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）繰り返しタンパク質、好ましくは複数のＦＮ３ドメインの共通配列、より好ましくはヒトテネイシン由来の複数のＦＮ３ドメインの共通配列に基づくタンパク質足場のライブラリーを生成する方法を提供する。ライブラリーは、足場の部分（例えば、ループ領域）の特定の位置で（変異により）アミノ酸または分子中のアミノ酸の数を変化させることで、足場を連続生成することにより形成される。ライブラリーは、単一のループのアミノ酸組成物を変化させる、複数のループまたは足場分子のさらなる位置のアミノ酸組成物を同時に変化させることで生成されてもよい。従って、変化させたループは、長くなっても短くなってもよい。このようなライブラリーは、各位置に可能なすべてのアミノ酸を含むか、またはアミノ酸の設計された下位集合を含むように生成されてもよい。ライブラリーの構成要素は、実験器具内かまたはＣＩＳ提示法（ＤＮＡ提示法、ＲＮＡ提示法、リボソーム提示法など）、酵母菌提示法、細菌提示法、およびファージ提示法など、提示によるスクリーニングに用いてもよい。
【０３２９】
本開示のタンパク質足場は、還元条件での安定性や高濃度での溶解性など、生物物理特性が高められており、原核系（例えば、大腸菌）、真核系（例えば、酵母菌）、および実験器具内での転写／翻訳系（例えば、ウサギ網状赤血球溶解系）で発現して折りたたまれていてもよい。
【０３３０】
本開示は、特定の標的と検出用結着剤で本発明の足場ライブラリーをパニングすることで、その標的に結合する足場分子を生成する方法を提供する。他の関連する側面では、本開示は、例えば、特定の親和性を持つ標的タンパク質に結合することができるなど、所望の活性を持つ親和性成熟タンパク質足場を生成するのに用いてもよいスクリーニング方法を含む。親和性成熟は、変異生成とファージ提示法または実験器具内提示法など、系を用いた選択を繰り返すことで達成されてもよい。この過程での変異生成は、特定の足場残基に対する部位特異的変異、間違いが発生しやすいＰＣＲによるランダム変異生成、ＤＮＡシャッフリング、および／またはこれらの技術の組み合わせの結果である場合がある。
【０３３１】
本開示は、フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）繰り返しタンパク質の共通配列に基づく単離された組み換えおよび／または合成タンパク質足場を提供する。このようなタンパク質足場としては、これらに限定されないが、哺乳類由来の足場、および共通ＦＮ３配列に基づいて少なくとも１種のポリヌクレオチドをコードするタンパク質足場を含む組成物およびコード核酸分子が挙げられる。本開示は、これらに限定されないが、そのような核酸およびタンパク質足場を作製および使用する方法（診断および治療組成物、方法、および装置を含む）をさらに含む。
【０３３２】
本開示のタンパク質足場の従来の治療法に対する利点は、局所投与、経口投与、または血液脳関門を通過する能力、大腸菌の中で発現することで、哺乳類細胞で発現して複数の標的または同じ標的の複数の抗原決定基に結合する二重特異性すなわちタンデム分子に遺伝子操作する哺乳類細胞の発現能力に対する資源の関数としてタンパク質の発現量を増やす能力、薬物、重合体、およびプローブと結合する能力、高濃度に処方される能力、かつこのような分子が病気の組織および腫瘍に有効に貫通する能力である。
【０３３３】
また、前記タンパク質足場は、抗体の可変領域を模倣する折りたたみに関連した抗体の特性の多くを持つ。この指向性により、ＦＮ３ループを抗体相補性決定領域（ＣＤＲ）と同様に露出させることができる。前記タンパク質足場は、もちろん、細胞標的に結合することができ、ループを変化させる、例えば、親和性成熟させて特定の結合または関連する特性を向上させることができる。
【０３３４】
本開示のタンパク質足場の６つのループのうちの３つは、形態的に抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ１−３）、すなわち抗原結合領域に対応し、残りの３つのループは抗体ＣＤＲと同様に表面に露出している。これらのループは、共通配列の残基１３−１６、２２−２８、３８−４３、５１−５４、６０−６４、および７５−８１に、またはその周辺に広がっている。好ましくは、残基２２−２８、５１−５４、および７５−８１のループ領域かまたはその周辺のループ領域は、結合特異性と親和性について変更されている。これらループ領域の１つ以上は、他のループ領域および／または主鎖部分としてその配列を維持する他の鎖と無作為化されてライブラリーに追加されて、特定のタンパク質標的に対して高い親和性を持つライブラリーから強力な結着剤を選択してもよい。ループ領域の１つ以上は、タンパク質と抗体ＣＤＲが相互作用するように標的タンパク質と相互作用することができる。
【０３３５】
抗原／リガンド認識領域配列の送達
本開示は、本開示の結合する抗原および／またはリガンドに対して抗原／リガンド認識領域（ＡＲＲ／ＬＲＲ）配列のライブラリーを生成する方法を提供する。ライブラリーは、ＡＲＲ／ＬＲＲの特定の位置で（変異により）アミノ酸または配列中のアミノ酸の数を変化させることで、ＡＲＲ／ＬＲＲ配列を連続生成することにより形成される。実施形態によっては、このＡＲＲ／ＬＲＲは、本開示のタンパク質足場、抗体模倣物、センチリン、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、ＶＨＨ、およびＶＨのうちの１種以上を含む。実施形態によっては、ライブラリーは、（変異により）抗体、ｓｃＦｖ、ＶＨＨ、またはＶＨの特定の位置（例えば、可変領域の１種以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）および／またはフレームワーク領域）でアミノ酸または配列中のアミノ酸の数を変化させることで、ＡＲＲ／ＬＲＲ配列の連続生成より形成される。
【０３３６】
ライブラリーは、単一のＣＤＲのアミノ酸組成物を変化させる、または複数のＣＤＲまたは抗体、ｓｃＦｖ、ＶＨＨ、またはＶＨのさらなる位置（例えば、可変領域のフレームワーク配列）のアミノ酸生成物を同時に変化させることによって生成してもよい。従って、変化させた可変領域のＣＤＲおよび／またはフレームワーク配列は、長くなっても短くなってもよい。
【０３３７】
ライブラリーは、足場タンパク質すなわちセンチリンのループのアミノ酸組成物を変化させて生成してもよい。従って、変化させたループ配列は長くなっても短くなってもよい。
【０３３８】
ライブラリーは、抗体模倣物の抗原／リガンド結合領域または特異性決定領域のアミノ酸組成物を変化させて生成してもよい。
【０３３９】
このようなライブラリーは、各位置に可能なすべてのアミノ酸を含むか、またはアミノ酸の設計された下位集合を含むように生成されてもよい。ライブラリーの構成要素は、実験器具内かまたはＣＩＳ提示法（ＤＮＡ提示法、ＲＮＡ提示法、リボソーム提示法など）、酵母菌提示法、細菌提示法、およびファージ提示法など、提示によるスクリーニングに用いてもよい。
【０３４０】
本開示のＡＲＲ／ＬＲＲは、還元条件での安定性や高濃度での溶解性など、生物物理特性が高められており、原核系（例えば、大腸菌）、真核系（例えば、酵母菌）、および実験器具内での転写／翻訳系（例えば、ウサギ網状赤血球溶解系）で発現して折りたたまれていてもよい。
【０３４１】
本開示は、特定の標的と検出用結着剤で本発明のライブラリーをパニングすることで、その特定の標的に結合するＡＲＲ／ＬＲＲまたはその一部を生成する方法を提供する。他の関連する側面では、本開示は、例えば、特定の親和性を持つ標的タンパク質に結合することができるなど、所望の活性を持つ親和性成熟ＡＲＲ／ＬＲＲを生成するのに用いてもよいスクリーニング方法を含む。親和性成熟は、変異生成とファージ提示法または実験器具内提示法など、系を用いた選択を繰り返すことで達成されてもよい。この過程での変異生成は、特定のタンパク質残基に対する部位特異的変異、間違いが発生しやすいＰＣＲによるランダム変異生成、ＤＮＡシャッフリング、および／またはこれらの技術の組み合わせの結果である場合がある。
【０３４２】
本開示は、少なくとも１種のＶＨＨを含む単離された組み換えおよび／または合成タンパク質足場を提供する。本開示は、これらに限定されないが、そのような核酸およびタンパク質足場を作製および使用する方法（診断および治療組成物、方法、および装置を含む）をさらに含む。
【０３４３】
本開示の組成物の従来の治療法に対する利点は、局所投与、経口投与、または血液脳関門を通過する能力、大腸菌の中で発現することで、哺乳類細胞で発現して複数の標的または同じ標的の複数の抗原決定基に結合する二重特異性すなわちタンデム分子に遺伝子操作する哺乳類細胞の発現能力に対する資源の関数としてタンパク質の発現量を増やす能力、薬物、重合体、およびプローブと結合する能力、高濃度に処方される能力、かつこのような分子が病気の組織および腫瘍に有効に貫通する能力である。
【０３４４】
タンパク質の産生および生成
本開示のタンパク質は、当該分野でよく知られた細胞株、混合細胞株、不死化細胞、または不死化細胞のクロナール集団により任意で産生されてもよい。例えば、Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, N.Y. (1987-2001); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Harlow and Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001); Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001)を参照のこと。
【０３４５】
タンパク質をコードするアミノ酸を変更、付加、および／または削除して免疫原性を低下させる、または結合、親和性、オンレート、オフレート、結合活性、特異性、半減期、安定性、溶解性、または当該分野で知られている任意の他の好適な特徴を低下、増強、または修正してもよい。
【０３４６】
他の好ましい生物学的特性と共に、抗原またはリガンドに対する高い親和性を保持するようにタンパク質を修飾してもよい。この目標を達成するため、親配列および修飾配列の三次元モデルを用いて親配列と様々な概念的な修飾生成物の分析過程によりタンパク質を任意で調製してもよい。三次元モデルは一般に利用可能であり、当業者に知られている。選択された候補配列の起こりうる三次元高次構造を図示・表示して、可能性のある免疫原性を測定することができるコンピュータープログラムが利用可能である（例えば、Xencor社（カリフォルニア州モンロヴィア）のImmunofilterプログラム）。これらの表示を調べることにより、候補配列の機能における残基の想定される役割を分析する、すなわち、抗原に結合するタンパク質の能力に影響を及ぼす残基を分析することができる。このように、標的抗原／リガンドに対する親和性など、所望の特徴が得られるように親配列および基準配列から残基を選択して組み合わせてもよい。上記の手順に代えて、またはこれに加えて、他の好適な修飾方法を用いてもよい。
ＡＲＲ／ＬＲＲのスクリーニング
【０３４７】
類似のタンパク質またはその断片に対する特異的結合についてタンパク質ＡＲＲ／ＬＲＲかまたはその任意の部分をスクリーニングすることは、ヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ提示）かまたはペプチド提示ライブラリー（例えば、実験器具内提示）を用いて簡便に行うことができる。この方法は、所望の機能または構造を持つ個々の構成要素についてペプチドの大きな集合をスクリーニングすることを含む。提示されたヌクレオチドまたはペプチド配列は長さが、３〜５０００個かまたはそれ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸であってもよく、しばしば５〜１００個のアミノ酸、および約８〜２５個のアミノ酸である。ペプチドライブラリーを生成する直接化学合成法に加えて、いくつかの組み換えＤＮＡ法が記載されている。その１つは、バクテリオファージまたは細胞の表面でペプチド配列を提示することを含む。各バクテリオファージまたは細胞は、特定の提示ペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含む。そのような方法はＰＣＴ特許公開第91/17271号、第91/18980号、第91/19818号、第および93/08278号に記載されている。
【０３４８】
ペプチドのライブラリーを生成する他のシステムは、実験器具内化学合成と組み換え方法の両方の側面を有する。ＰＣＴ特許公開第92/05258号、第92/14843号、および第96/19256号を参照のこと。また、米国特許第5,658,754号および第5,643,768号を参照のこと。ペプチド提示ライブラリー、ベクター、およびスクリーニングキットはInvitrogen（カリフォルニア州カールスバッド）およびCambridge Antibody Technologies（英国ケンブリッジシャー）などの供給者から市販されている。例えば、米国特許第4,704,692号、第4,939,666号、第4,946,778号、第5,260,203号、第5,455,030号、第5,518,889号、第5,534,621号、第5,656,730号、第5,763,733号、第5,767,260号、第5856456号(Enzonに付与）；第5,223,409号、第5,403,484号、第5,571,698号、第5,837,500号（Dyaxに付与）、第5,427,908号、第5,580,717号（Affymaxに付与）；第5,885,793号（Cambridge Antibody Technologiesに付与）；第5,750,373号（Genentechに付与）、第5,618,920号、第5,595,898号、第5,576,195号、第5,698,435号、第5,693,493号、第5,698,417号（Xoma, Colligan（上記参照）；Ausubel（上記参照のこと）；またはSambrook（上記参照のこと）に付与）を参照のこと。
【０３４９】
本開示のタンパク質足場、抗体、ｓｃＦｖ、センチリン、単一ドメイン抗体、ＶＨＨ、またはＶＨのうちの１種以上を含む本開示のＡＲＲ／ＬＲＲは、広範囲の親和性（ＫＤ）を持つヒトまたは他の哺乳類タンパク質に結合することができる。好ましい一態様では、少なくとも１種のＡＲＲ／ＬＲＲは、例えば、これらに限定されないが０．１〜９．９（任意の範囲またはその範囲内の値）×１０-8、１０-9、１０-10、１０-11、１０-12、１０-13、１０-14、１０-15、または任意の範囲またはその範囲内の値など、約１０-7Ｍ以下のＫＤという高い親和性を持つ標的タンパク質に任意で結合することができる。ＫＤは、当業者によって実践されているように表面プラズモン共鳴またはKinexa法により決定される。好ましい一態様では、本開示の少なくとも１種のタンパク質足場、抗体、ｓｃＦｖ、センチリン、単一ドメイン抗体、ＶＨＨ、またはＶＨは、例えば、これらに限定されないが、０．１〜９．９（任意の範囲またはその範囲内の値）×１０-8、１０-9、１０-10、１０-11、１０-12、１０-13、１０-14、１０-15、または任意の範囲またはその範囲内の値など約１０-7Ｍ以下のＫＤという高い親和性を持つ標的タンパク質に任意で結合することができる。ＫＤは、当業者によって実践されているように表面プラズモン共鳴またはKinexa法により決定される。
【０３５０】
本開示のタンパク質足場、抗体、ｓｃＦｖ、センチリン、単一ドメイン抗体、ＶＨＨ、またはＶＨの抗原／リガンドに対する親和性または結合活性は、任意の好適な方法を用いて実験で決定してもよい（例えば、Berzofsky, et al., “Antibody-Antigen Interactions,” In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York, N.Y. (1984); Kuby, Janis Immunology, W.H. Freeman and Company: New York, N.Y. (1992)、および本明細書で記載する方法を参照のこと）。特定のタンパク質と抗原／リガンドの相互作用の測定された親和性は、異なる条件（例えば、塩濃度、ｐＨ）で測定すれば変動する場合がある。従って、親和性および他の抗原結合パラメータ（例えば、ＫＤ、Ｋｏｎ、Ｋｏｆｆ）の測定は、タンパク質足場（例えば、ＶＨＨ）と抗原の標準溶液および標準緩衝液（例えば、本明細書で記載する緩衝液）により行うのが好ましい。
【０３５１】
どのタンパク質、抗体、および他の拮抗薬が標的タンパク質との結合で競合し、かつ／または抗原決定基領域を共有しているかを決定するため、本開示のタンパク質足場、抗体、ｓｃＦｖ、センチリン、単一ドメイン抗体、ＶＨＨ、またはＶＨを用いて競合アッセイを行ってもよい。これらのアッセイは、タンパク質表面の限定数の結合部位に対する拮抗薬またはリガンドの競合を評価するのに当業者にはよく知られている。タンパク質および／または抗体は、競合の前または後に固定かまたは不溶化されて、例えば、デカンテーション（タンパク質／抗体が予め不溶化されている場合）かまたは遠心分離（タンパク質／抗体が競合反応後に沈殿する場合）により標的タンパク質に結合した試料は未結合の試料から分離される。また、競合結合は、機能が標的タンパク質へのタンパク質足場、抗体、ｓｃＦｖ、センチリン、単一ドメイン抗体、ＶＨＨ、またはＶＨの結合の有無（例えば、タンパク質足場、抗体、ｓｃＦｖ、センチリン、単一ドメイン抗体、ＶＨＨ、またはＶＨが例えば、標識の酵素の活性を阻害かまたは促進するか否か）により変化するか否かにより決定されてもよい。当該分野で知られているようにＥＬＩＳＡおよび他の機能アッセイを用いてもよい。
【０３５２】
治療用タンパク質
本開示の特定の実施形態では、Ｔ細胞は修飾されて治療用タンパク質（分泌されたヒトタンパク質を含む）を発現する。任意の病気または障害の治療かまたは予防において、これらの分泌されたタンパク質を単剤治療または他の治療との組み合わせで用いてもよい。これらの分泌されたタンパク質を単剤治療で、または酵素補充および／または生物学的治療薬の投与に関する他の治療と組み合わせて用いてもよい。ヒト分泌タンパク質のデータベースはproteinatlas.org/search/protein_class:Predicted%20secreted%20proteinsで見られ、その全内容を参照により本明細書に組み込む。例示的なヒト治療用タンパク質は、これらに限定されないが、表１のヒトタンパク質に示されている。
【０３５３】
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
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【表１−７】
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【表１−８】
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【表１−９】
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【表１−１０】
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【表１−１１】
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【表１−１２】
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【表１−１３】
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【表１−１４】
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【表１−１５】
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【表１−１６】
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【表１−１７】
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【表１−１８】
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【表１−１９】
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【表１−２０】
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【表１−２１】
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【表１−２２】
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【表１−２３】
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【表１−２４】
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【表１−２５】
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【表１−２６】
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【表１−２７】
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【表１−２８】
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【表１−２９】
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【表１−３０】
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【表１−３１】
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【表１−３２】
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【表１−３３】
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【表１−３４】
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【表１−３５】
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【表１−３６】
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【表１−３７】
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【表１−３８】
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【表１−３９】
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【表１−４０】
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【表１−４１】
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【表１−４２】
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【表１−４３】
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【表１−４４】
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【表１−４５】
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【表１−４６】
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【表１−４７】
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【表１−４８】
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【表１−４９】
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【表１−５０】
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【表１−５１】
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【表１−５２】
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【表１−５３】
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【表１−５４】
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【表１−５５】
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【表１−５６】
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【表１−５７】
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【表１−５８】
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【表１−５９】
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【表１−６０】
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【表１−６１】
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【表１−６２】
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【表１−６３】
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【表１−６４】
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【表１−６５】
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【表１−６６】
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【表１−６７】
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【表１−６８】
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【表１−６９】
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【表１−７０】
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【表１−７１】
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【表１−７２】
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【表１−７３】
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【表１−７４】
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【表１−７５】
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【表１−７６】
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【表１−７７】
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【表１−７８】
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【表１−７９】
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【０３５４】
細胞マーカーの発現
本開示の特定の実施形態では、Ｔ細胞は検出可能なマーカーまたは標識を発現するように修飾されている。実施形態によっては、これら検出可能なマーカーとしては蛍光タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。蛍光タンパク質の非限定的な例としては、TagBFP、mTagBFP2、Azurite、EBFP2、mKalama1、Sirius、Sapphire、T-Sapphire、ECFP、Cerulean、SCFP3A、mTurquoise、mTurquoise2、単量体Midorishi-Cyan、TagCFP、mTFP1、EGFP、Emerald、Superfolder GFP、単量体Azami Green、mUKG、mWasabi、Clover、mNeonGreen、EYFP、Citrine、Venus、SYFP2、TagYFP、単量体Kusabira Orange、mKok、mKO2、mOrange、mOrange2、mRaspberry、mCherry、mStrawberry、mTangerine、tdTomato、TagRFP、TagFRP-T、mApple、mRuby、mRuby2、mPlum、HcRed-Tandem、mKate2、mNeptune、NiRFP、TagRFP657、IFP1.4、mRFP、mKeima Red、LSS-mKate1、LSS-mKate2、mBeRFP、およびこれらのスペクトルがシフトした変異体が挙げられる。本開示の実施形態によっては、前記検出可能なマーカーまたは標識はルシフェラーゼを含む。実施形態によっては、前記検出可能なマーカーまたは標識はヒトで発現するようにコドン最適化されている。実施形態によっては、前記検出可能なマーカーまたは標識は細胞内マーカーまたは標識である。実施形態によっては、前記検出可能なマーカーまたは標識は細胞内マーカーまたは標識である。実施形態によっては、前記検出可能なマーカーまたは標識は核マーカーまたは標識である。実施形態によっては、前記検出可能なマーカーまたは標識はミトコンドリアマーカーまたは標識である。実施形態によっては、前記検出可能なマーカーまたは標識は細胞表面マーカーである。実施形態によっては、特に、マーカーまたは標識が細胞表面マーカーである場合の実施形態では、前記マーカーまたは標識は細胞膜に結合されてもよい。本開示の組成物および方法によりマーカーを発現するように修飾された細胞を生体内、生体外、実験器具内、および原位置での標識細胞として用いてもよい。本開示の特定の実施形態では、誘発性プロモーターが標的された場合にプロモーターがマーカーまたは標識の発現を誘発するように、前記マーカーまたは標識は本開示の誘発性プロモーターの制御下にある。
【０３５５】
誘発性プロモーター
本開示の組成物の特定の実施形態では、（ａ）の誘発性プロモーターをコードする配列はＮＦKＢプロモーターをコードする配列を含む。本開示の組成物の特定の実施形態では、（ａ）の誘発性プロモーターをコードする配列は、インターフェロン（ＩＦＮ）プロモーターをコードする配列またはインターロイキン−２プロモーターをコードする配列を含む。特定の態様では、インターフェロン（ＩＦＮ）プロモーターはＩＦＮγプロモーターである。本開示の組成物の特定の実施形態では、誘発性プロモーターは、サイトカインまたはケモカインのプロモーターから単離されたか、またはそれに由来する。特定の態様では、サイトカインまたはケモカインは、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１７Ａ／Ｆ、ＩＬ２１、ＩＬ２２、ＩＬ２３、形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）、コロニー刺激因子２（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）、腫瘍壊死因子（ＴNＦα）、ＬＴα、パーフォリン、グランザイムＣ（Ｇｚｍｃ）、グランザイムＢ（Ｇｚｍｂ）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド５（ＣＣＬ５）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド４（Ｃｃｌ４）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド３（Ｃｃｌ３）、Ｘ−Ｃモチーフケモカインリガンド１（Ｘｃｌ１）および、ＬＩＦインターロイキン６ファミリーサイトカイン（Ｌｉｆ）を含む。
【０３５６】
本開示の組成物の特定の実施形態では、誘発性プロモーターは、細胞分化、活性化、疲弊、および機能に関与する表面タンパク質を含む遺伝子のプロモーターから単離されたか、またはそれに由来する。特定の態様では、前記遺伝子はＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ−３、ＧＩＴＲ、ＭＨＣＩＩ、ＣＯＸ−２、ＦＡＳＬ、および４−１ＢＢを含む。
【０３５７】
本開示の組成物の特定の実施形態では、誘発性プロモーターは、ＣＤ代謝および分化に関与する遺伝子のプロモーターから単離されたか、またはそれに由来する。本開示の組成物の特定の実施形態では、誘発性プロモーターは、Ｎｒ４ａ１、Ｎｒ４ａ３、Ｔｎｆｒｓｆ９（４−１ＢＢ）、Ｓｅｍａ７ａ、Ｚｆｐ３６ｌ２、Ｇａｄｄ４５ｂ、Ｄｕｓｐ５、Ｄｕｓｐ６、およびＮｅｔｏ２のプロモーターから単離されたか、またはそれに由来する。
【０３５８】
核酸分子
タンパク質足場をコードする本開示の核酸分子は、ＲＮＡ（ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｔＲＮＡ、または任意の他の形態）、またはＤＮＡ（これらに限定されないが、クローニング、合成による産生、またはこれらの任意の組み合わせにより得られたｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含む）の形態であってもよい。前記ＤＮＡは三本鎖、二本鎖、一本鎖、またはこれらの任意の組み合わせであってもよい。前記ＤＮＡまたはＲＮＡの少なくとも１本の鎖のいずれかの部分は、コード鎖（センス鎖としても知られている）であってもよく、または非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られている）であってもよい。
【０３５９】
本開示の単離核酸分子は、任意で１種以上のイントロンを含む翻訳領域（ＯＲＦ）を含む核酸分子を含んでいてもよい。前記イントロンは、これらに限定されないが、例えば、少なくとも１種のタンパク質足場の少なくとも１つの指定部分；標的タンパク質に結合するタンパク質足場またはループ領域のコード配列を含む核酸分子；および上記のものとは実質的に異なるヌクレオチド配列を含むが、遺伝暗号の縮重により本明細書で記載のタンパク質足場および／または当該分野で知られているタンパク質足場をコードする核酸分子が挙げられる。もちろん、遺伝暗号は当該分野でよく知られている。従って、本発明の特定のタンパク質足場をコードする縮重核酸変異体を生成することは当業者には自明である。例えば、Ausubel, et al.（上記を参照のこと）およびそのような核酸変異体が本発明に含まれる。
【０３６０】
本明細書に示されるように、タンパク質足場をコードする核酸を含む本開示の核酸分子は、これらに限定されないが、タンパク質足場断片のアミノ酸配列それ自体；タンパク質足場全体またはその一部のコード配列；タンパク質足場、その断片または一部のコード配列と、上記さらなるコード配列（例えば、少なくとも１つのイントロン）を含む、または含まないさらなる配列（例えば、少なくとも１つのシグナル先導ペプチドまたは融合ペプチドのコード配列）とさらなる非コード配列（これらに限定されないが、例えば、５′および３′非コード配列（例えば、転写、ｍＲＮＡ処理（スプライシングおよびポリアデニル化シグナル（例えば、ｍＲＮＡのリボソーム結合および安定性）を含む）での役割を果たす転写された非翻訳配列を含む）；およびさらなるアミノ酸（例えば、さらなる機能を提供するアミノ酸）をコードするさらなるコード配列が挙げられる。従って、タンパク質足場をコードする配列をマーカー配列に融合させてもよい。前記マーカー配列は、例えば、タンパク質足場断片またはその一部を含む融合タンパク質足場の精製を容易にするペプチドをコードする配列である。
本明細書で記載のポリヌクレオチドに選択可能にハイブリダイズするポリヌクレオチド
【０３６１】
本開示は、本明細書で開示されるポリヌクレオチドに対して選択可能なハイブリダイゼーション条件でハイブリダイズする単離核酸を提供する。従って、本実施形態のポリヌクレオチドは、そのようなポリヌクレオチドを含む核酸の単離、検出、および／または定量に用いられてもよい。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、預託ライブラリーで部分的かまたは完全な長さのクローンを同定、単離されるか増幅するのに用いられてもよい。実施形態によっては、これらポリヌクレオチドは、ヒトまたは哺乳類核酸ライブラリーから単離されたゲノムまたはｃＤＮＡ配列、またはヒトまたは哺乳類核酸ライブラリーに由来するｃＤＮＡに相補なゲノムまたはｃＤＮＡ配列である。
【０３６２】
このｃＤＮＡライブラリーは、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％または９０％、より好ましくは少なくとも９５％完全な長さの配列を含むことが好ましい。ｃＤＮＡライブラリーを正規化して、希少な配列の表示を増加させてもよい。排除するものではないが、典型的には、相補配列に対する配列同一性が低い配列には厳密さが低いかまたは中程度のハイブリダイゼーション条件が用いられる。同一性が高い配列には中程度および高い厳密さの条件を任意で用いてもよい。厳密さの低い条件により、約７０％の配列同一性を持つ配列の選択可能なハイブリダイゼーションが可能であり、これを用いてオルソロガス配列またはパラロガス配列を同定してもよい。
【０３６３】
任意で、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載のポリヌクレオチドによりコードされたタンパク質足場の少なくとも一部をコードする。本発明のポリヌクレオチドは、本発明のタンパク質足場をコードするポリヌクレオチドに対して選択可能なハイブリダイゼーションに用いてもよい核酸配列を含む。例えば、Ausubel（上記を参照のこと）、Colligan（上記を参照のこと）を参照のこと。これらはその全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
【０３６４】
核酸の構築
当該分野でよく知られた（ａ）組み換え法、（ｂ）合成技術、（ｃ）精製技術、および／または（ｄ）これらの組み合わせを用いて本開示の単離核酸を作製してもよい。
【０３６５】
これらの核酸は、便利さのため、本発明のポリヌクレオチドに加えて複数の配列を含んでいてもよい。例えば、１つ以上のエンドヌクレアーゼ制限部位を含む多クローニング部位を核酸に挿入して、ポリヌクレオチドの単離を促進してもよい。また、複数の翻訳可能配列を挿入して、本開示の翻訳されたポリヌクレオチドの単離を促進してもよい。例えば、ヘキサヒスチジンマーカー配列は、本開示のタンパク質を精製するのに便利な手段を提供する。前記コード配列を除く本開示の核酸は、本開示のポリヌクレオチドのクローニングおよび／または発現のためのベクター、アダプター、またはリンカーであってもよい。
【０３６６】
このようなクローニング配列および／または発現配列にさらなる配列を付加して、クローニングおよび／または発現でのそれらの機能を最適にする、ポリヌクレオチドの単離を促進する、またはポリヌクレオチドの細胞への導入を向上させてもよい。クローニングベクター、発現ベクター、アダプター、およびリンカーの使用は、当該分野でよく知られている（例えば、Ausubel（上記を参照のこと）またはSambrook（上記を参照のこと）を参照のこと）。
【０３６７】
核酸を構築する組み換え法
当業者に知られている任意の数のクローニング法を用いて、生物学的源から本開示の単離核酸組成物（例えば、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはこれらの任意の組み合わせ）を得てもよい。実施形態によっては、厳密な条件で本発明のポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドプローブを用いて、ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮＡライブラリーの所望の配列を同定してもよい。ＲＮＡの単離とｃＤＮＡライブラリーおよびゲノムライブラリーの構築は、当業者にはよく知られている（例えば、Ausubel（上記を参照のこと）またはSambrook（上記を参照のこと）を参照のこと）。
【０３６８】
核酸のスクリーニングおよび単離法
本開示のポリヌクレオチドの配列に基づくプローブを用いてｃＤＮＡライブラリーおよびゲノムライブラリーをスクリーニングしてもよい。プローブを用いて、ゲノムＤＮＡ配列またはｃＤＮＡ配列とハイブリダイズして、同じまたは異なる生物の相同遺伝子を単離してもよい。当業者には自明であるように、ハイブリダイゼーションの様々な厳密さをアッセイに用いてもよく、ハイブリダイゼーション培地または洗浄培地の何れかが厳密であってもよい。ハイブリダイゼーションの条件が厳密になるほど、そのプローブと二本鎖を形成する標的との相補性の度合いが高くなる。厳密さは、温度、イオン強度、ｐＨ、および部分的変性溶媒（例えば、ホルムアミド）の存在のうちの１つ以上により制御してもよい。例えば、ハイブリダイゼーションの厳密さは、例えば、ホルムアミドの濃度を０％〜５０％の範囲で操作するなど、反応溶液の極性を変化させることで簡便に変化させられる。検出可能な結合に必要な相補性（配列同一性）の程度は、ハイブリダイゼーション培地および／または洗浄培地の厳密さによって変化する。相補性の程度は、１００％、７０〜１００％、またはこの範囲の任意の範囲かまたは値であることが最適である。ただし、自明であるが、プローブとプライマーにおける少数の配列多様性はハイブリダイゼーション培地および／または洗浄培地の厳密さを低くすることで補償されてもよい。
【０３６９】
ＲＮＡまたはＤＮＡの増幅法は、当該分野で知られており、必要以上の実験をせずに本明細書に示す教示およびガイダンスに基づき本開示により用いられてもよい。
【０３７０】
既知のＤＮＡまたはＲＮＡ増幅法は、これらに限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および関連する増幅過程（例えば、米国特許第4,683,195号、第4,683,202号、第4,800,159号、第4,965,188号（Mullis, et al.に付与）；第4,795,699号および第4,921,794号（Tabor, et alに付与）；第5,142,033号（Innisに付与）；第5,122,464号（Wilson, et al.に付与）；第5,091,310号（Innisに付与）；第5,066,584号（Gyllensten, et alに付与）；第4,889,818号（Gelfand, et alに付与）；第4,994,370号（Silver, et alに付与）；第4,766,067号（Biswasに付与）；第4,656,134号（Ringoldに付与）を参照のこと）および二本鎖ＤＮＡ合成の鋳型として標的配列に対するアンチセンスＲＮＡを用いたＲＮＡ媒介増幅（米国特許第5,130,238号（Malek, et alに付与、商品名NASBA））が挙げられる。これらは参照によりその全内容が本明細書に組み込まれる。（例えば、Ausubel（上記を参照のこと）またはSambrook（上記を参照のこと）を参照のこと）。
【０３７１】
例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いて、本開示のポリヌクレオチドの配列と、ゲノムＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーから直接得た関連する遺伝子の配列を増幅してもよい。また、ＰＣＲおよび他の実験器具内増幅法は、発現させるタンパク質をコードする核酸配列をクローニングする、または試料中で所望のｍＲＮＡの存在を検出するため、核酸の配列決定のため、または他の目的でプローブとして用いる核酸を作製するのに有用な場合がある。実験器具内増幅法により当業者を導くのに十分な技術の例はBerger（上記を参照のこと）、Sambrook（上記を参照のこと）、およびAusubel（上記を参照のこと）、Mullis, et al.の米国特許第4,683,202号(1987)；およびInnis, et al.のPCR Protocols A Guide to Methods and Applications, Eds., Academic Press Inc., San Diego, Calif. (1990)に見られる。ゲノムＰＣＲ増幅の市販キットが当該分野で知られている。例えば、Advantage-GC Genomic PCRキット(Clontech)を参照のこと。また、例えば、Ｔ４遺伝子３２タンパク質(Boehringer Mannheim)を用いて長いＰＣＲ生成物の収率を向上させてもよい。
【０３７２】
核酸を構築する合成方法
また、本開示の単離核酸を周知の方法による直接化学合成によって作製してもよい（例えば、Ausubel, et al.（上記を参照のこと）を参照のこと）。化学合成は、一般に一本鎖オリゴヌクレオチドを作製する。この一本鎖オリゴヌクレオチドを相補配列とのハイブリダイゼーションにより、または鋳型として一本鎖を用いてＤＮＡポリメラーゼとの重合により二本鎖ＤＮＡに変換することができる。当業者には自明であるが、ＤＮＡの化学合成は、約１００塩基またはそれ以上の長さの配列に限定される場合があり、それより長い配列は短い配列のライゲーションで得てもよい。
【０３７３】
組み換え発現カセット
本開示は、さらに、本開示の核酸を含む組み換え発現カセットを提供する。本開示の核酸配列、例えば、本開示のタンパク質足場をコードするｃＤＮＡ配列またはゲノム配列を用いて、少なくとも１つの所望の宿主細胞に導入することができる組み換え発現カセットを構築してもよい。組み換え発現カセットは、典型的には、転写開始調節配列に操作により結合する本開示のポリヌクレオチドを含む。この転写開始調節配列は、意図した宿主細胞でのポリヌクレオチドの転写を導く。異種プロモーターおよび同種（すなわち、内因性）プロモーターの両方を用いて、本開示の核酸の発現を導いてもよい。
【０３７４】
実施形態によっては、本開示のポリヌクレオチドの発現を上方調節または下方調節するようにプロモーター、転写促進因子、または他の要素として働く単離核酸を本開示のポリヌクレオチドの非異種性形態の適切な位置（イントロンの上流、下流、またはその中に）に導入してもよい。例えば、生体内または実験器具内で内因性プロモーターを変異、欠失、および／または置換により変更してもよい。
【０３７５】
ベクターおよび宿主細胞
本開示はまた、本開示の単離核酸分子を含むベクター、組み換えベクターで遺伝的に操作された宿主細胞、および当該分野で知られている組み換え技術による少なくとも１種のタンパク質足場の生成に関する。例えば、Sambrook, et al.（上記を参照のこと）、Ausubel, et al.（上記を参照のこと）を参照のこと。これらは参照によりその全内容が本明細書に組み込まれる。
【０３７６】
例えば、ＰＢ−ＥＦ１ａベクターを用いてもよい。前記ベクターは、以下のヌクレオチド配列を含む：
【化１６７】
2020532987.tif 000248
【化１６８】
2020532987.tif 000249
（配列番号17073）。
【０３７７】
これらのポリヌクレオチドは、宿主で増殖させるため、選択可能マーカーを含むベクターに結合させてもよい。一般に、リン酸カルシウム沈殿物などの沈殿物、または電荷を帯びた脂質との複合体にプラスミドまたはナノプラスミドベクターを導入する。ベクターがウイルスである場合、適切な梱包細胞株を用いて実験器具内に詰め込み、宿主細胞に形質導入してもよい。
【０３７８】
ＤＮＡ挿入物は、操作により適切なプロモーターに結合される。発現構築物は、さらに、転写開始部位、転写終始部位を含み、転写領域には翻訳のためのリボソーム結合部位を含む。これらの構築物によって発現された成熟転写物のコード部分は、先頭に翻訳開始コドン、および翻訳されるｍＲＮＡの終わりに適切に配置された終始コドン（例えば、ＵＡＡ、ＵＧＡ、またはＵＡＧ）を含むことが好ましい。哺乳類細胞または真核細胞の発現のためにはＵＡＡおよびＵＡＧが好ましい。
【０３７９】
発現ベクターは、少なくとも１種の選択可能マーカーを含むことが好ましいが必須ではない。そのようなマーカーとしては、これらに限定されないが、例えば、アンピシリン、ゼオシン（Sh bla遺伝子）、ピューロマイシン（ｐａｃ遺伝子）、ハイグロマイシンＢ（ｈｙｇＢ遺伝子）、Ｇ４１８／ジェネティシン（ｎｅｏ遺伝子）、ミコフェノール酸、またはグルタミン合成酵素（ＧＳ、米国特許第5,122,464号；第5,770,359号；第5,827,739号）、ブラストサイジン（ｂｓｄ遺伝子）、真核細胞培養物に対する耐性遺伝子、ンピシリン、ゼオシン（Sh bla遺伝子）、ピューロマイシン（ｐａｃ遺伝子）、ハイグロマイシンＢ（ｈｙｇＢ遺伝子）、Ｇ４１８／ジェネティシン（ｎｅｏ遺伝子）、カナマイシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、カルベニシリン、ブレオマイシン、エリスロマイシン、ポリミキシンＢ、または大腸菌および他のバクテリアまたは原核生物を培養するためのテトラサイクリン耐性遺伝子が挙げられる（上記特許は引用によりその全内容が本明細書に組み込まれる）。上記の宿主細胞にとっての適切な培養培地および条件は当該分野で知られている。当業者には好適なベクターは自明である。宿主細胞へのベクター構築物の導入は、リン酸カルシウム形質移入、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介形質移入、カチオン性脂質媒介形質移入、電気穿孔法、形質導入、感染、または他の知られている方法により達成することができる。そのような方法は当該技術分野、例えばSambrook（上記を参照のこと）の１〜４章および１６〜１８章；Ausubel（上記を参照のこと）の１章、９章、１３章、１５章、１６章に記載されている。
【０３８０】
発現ベクターは、本開示の組成物および方法により修飾された細胞を単離するため少なくとも１種の選択可能な細胞表面マーカーを含むことが好ましいが必須ではない。本開示の選択可能な細胞表面マーカーは、表面タンパク質、糖タンパク質、または１つの細胞または細胞亜集合を細胞の他の規定された亜集合と区別するタンパク質群を含む。選択可能な細胞表面マーカーは、本開示の組成物および方法によって修飾された細胞と、本開示の組成物および方法によって修飾されていない細胞とを区別することが好ましい。そのような細胞表面マーカーとしては、これらに限定されないが、例えば、「分化抗体群」または「分類決定基」タンパク質（しばしば「ＣＤ」と略され、ＣＤ１９、ＣＤ２７１、ＣＤ３４、ＣＤ２２、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ５２の切断された、または完全な長さの形態、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられる）が挙げられる。細胞表面マーカーはさらに自殺遺伝子マーカーＲＱＲ８(Philip B et al. Blood. 2014 Aug 21; 124(8):1277-87)を含む。
【０３８１】
発現ベクターは、本開示の組成物および方法により修飾された細胞を単離するための少なくとも１種の選択可能な薬物耐性マーカーを含むことが好ましいが必須ではない。本開示の選択可能な薬物耐性マーカーは、野生型または変異体のＮｅｏ、ＤＨＦＲ、ＴＹＭＳ、ＦＲＡＮＣＦ、ＲＡＤ５１Ｃ、ＧＣＳ、ＭＤＲ１、ＡＬＤＨ１、ＮＫＸ２．２、またはこれらの任意の組み合わせを含んでいてもよい。
【０３８２】
少なくとも１種の本開示のタンパク質足場は、融合タンパク質などの修飾された形態で発現してもよく、分泌シグナルだけでなく、さらなる異種性機能領域を含んでいてもよい。例えば、さらなるアミノ酸、特に電荷を帯びたアミノ酸の領域をタンパク質足場のＮ末端に付加して、精製時またはその後の取り扱いおよび保存時における宿主細胞内での安定性と持続性を向上させてもよい。また、ペプチド部位を本開示のタンパク質足場に付加して、精製を容易にしてもよい。タンパク質足場または少なくともその１つの断片を最終調製する前にそのような領域を除去してもよい。そのような方法は多くの標準的な実験マニュアル、例えば、Sambrook（上記を参照のこと）の１７．２９章〜１７．４２章および１８．１章〜１８．７４章；Ausubel（上記を参照のこと）の１６章、１７章、および１８章に記載されている。
【０３８３】
当業者であれば、本開示のタンパク質をコードする核酸の発現に利用可能な多くの発現系について知っている。または、本開示の核酸は、本開示のタンパク質足場をコードする内因性ＤＮＡを含む宿主細胞内で（操作により）スイッチを入れることで宿主細胞内で発現させてもよい。そのような方法は、例えば、米国特許第5,580,734号、第5,641,670号、第5,733,746号、および第5,733,761号など、当該分野で知られており、これらの全内容を引用により本明細書に組み込む。
【０３８４】
タンパク質足場、それらの指定された部分、またはそれらの変異体の生成に有用な例示的な細胞培養物は、当該分野で知られている真菌細胞、酵母菌細胞、および哺乳類細胞である。哺乳類細胞系は細胞の単層という形態を取ることが多いが、哺乳類細胞懸濁液または生物反応器を用いてもよい。完全なグリコシル化タンパク質を発現することができる複数の好適な宿主細胞系統が当該分野で開発されており、そのような例としてはCOS-1（例えば、ATCC CRL 1650)、COS-7（例えば、ATCC CRL-1651)、HEK293、BHK21（例えば、ATCC CRL-10)、CHO（例えば、ATCC CRL 1610)およびBSC-1（例えば、ATCC CRL-26)細胞株、Cos-7細胞、CHO細胞、hep G2細胞、P3X63Ag8.653、SP2/0-Ag14、293細胞、HeLa細胞などが挙げられる。これらは、例えば、バージニア州マナサスのアメリカ培養細胞系統保存機関(www.atcc.org)から容易に入手可能である。好ましい宿主細胞は、骨髄腫細胞およびリンパ腫細胞など、リンパ由来の細胞を含む。特に好ましい宿主細胞は、P3X63Ag8.653細胞(ATCC登録番号CRL-1580)およびSP2/0-Ag14細胞(ATCC登録番号CRL-1851)である。特に好ましい一態様では、組み換え細胞はP3X63Ab8.653細胞またはSP2/0-Ag14細胞である。
【０３８５】
これら細胞の発現ベクターは、以下の発現制御配列のうちの１種以上を含んでいてもよい。そのような例としては、これらに限定されないが、複製起点；プロモーター（例えば、後期または初期ＳＶ４０プロモーター、CMVプロモーター（米国特許第5,168,062号；第5,385,839号）、HSV tkプロモーター、pgk（ホスホグリセリン酸キナーゼ）プロモーター、ＥＦ−１αプロモーター（米国特許第5,266,491号）、少なくとも１種のヒトプロモーター；転写促進因子および／または処理情報部位（例えば、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位（例えば、SV40 large T AgポリＡ付加部位））、および転写終始配列が挙げられる。例えば、Ausubel et al.（上記を参照のこと）、Sambrook, et al.（上記を参照のこと）を参照のこと。本発明の核酸またはタンパク質の産生に有用な細胞が知られている、かつ／または、例えば、アメリカ培養細胞系統およびハイブリドーマ保存カタログ(www.atcc.org)や他の周知の源または商業源から入手可能である。
【０３８６】
真核宿主細胞を用いる場合、典型的にはポリアデニル化配列または転写終始配列をベクターに組み込む。終始配列の一例は、ウシ成長ホルモン遺伝子由来のポリアデニル化配列である。また、転写物の正確なスプライシングのための配列が含まれていてもよい。スプライシング配列の一例はＳＶ４０由来のＶＰ１イントロンである(Sprague, et al., J. Virol. 45:773-781 (1983))。また、宿主細胞内の複製を制御する遺伝子配列を当該分野で知られているようにベクターに組み込んでもよい。
アミノ酸コード
【０３８７】
本開示のタンパク質足場を構成するアミノ酸はしばしば省略される。アミノ酸の区別は、当該分野では自明であるように、その１文字のコード、その３文字のコード、名前、またはヌクレオチドコドンによってアミノ酸を区別して示してもよい（Alberts, B., et al., Molecular Biology of The Cell, Third Ed., Garland Publishing, Inc., New York, 1994を参照のこと）。本開示のタンパク質足場は、本明細書に規定するように、天然の変異または人の操作の何れかに由来するアミノ酸の置換、欠失、または付加を１つ以上含んでいてもよい。機能に重要な本開示のタンパク質足場のアミノ酸を当該分野で知られている方法、例えば、部位特異的変異導入またはアラニン走査変異導入（例えば、Ausubel（上記を参照のこと）の８章、１５章；Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085 (1989))により同定してもよい。後者の手順では分子のすべての残基に単一のアラニン変異を導入する。次いで、得られた変異体分子の生物学的活性（これに限定されないが、少なくとも１つの中性化活性など）を試験する。また、タンパク質足場の結合に重要な部位を構造分析、例えば、結晶化、核磁気共鳴、または光親和性標識(Smith, et al., J. Mol. Biol. 224:899-904 (1992) and de Vos, et al., Science 255:306-312 (1992))などにより同定してもよい。
【０３８８】
当業者には自明であるように、本発明は、本開示の少なくとも１種の生物学的活性タンパク質足場を含む。生物学的活性タンパク質足場は、天然（非合成）タンパク質足場、内因性タンパク質足場、または関連および周知のタンパク質足場の特定の活性の少なくとも２０％、３０％、または４０％、好ましくは少なくとも５０％、６０％、または７０％、最も好ましくは少なくとも８０％、９０％、または９５％〜９９％の特定の活性を有する。酵素活性および基質特異性の測定値をアッセイし定量する方法は当業者によく知られている。
【０３８９】
他の側面では、本開示は、有機部位の共有結合により修飾された本明細書で記載のタンパク質足場およびその断片に関する。そのような修飾は、向上した薬物動態特性（例えば、生体内での血清半減期の増加）を有するタンパク質足場断片を産生することができる。有機部位は、線状または分岐状の親水性重合体基、脂肪酸基、または脂肪酸エステル基であってもよい。特定の実施形態では、親水性重合体基は、約８００〜約１２０，０００ダルトンの分子量を持っていてもよく、ポリアルカングリコール（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ））、炭水化物重合体、アミノ酸重合体またはポリビニルピロリドンであってもよい。脂肪酸基または脂肪酸エステル基は約８〜４０の炭素を含んでいてもよい。
【０３９０】
白血球分離生成物から単離したＴ細胞
閉鎖系および標準的な方法（例えば、COBE Spectra Apheresisシステム）を用いて被験体または臨床施設から白血球分離生成物または血液を集めてもよい。標準的な病院かまたは施設の白血球分離手順に従って生成物を標準的な白血球分離収集袋に回収する。例えば、本開示の方法の好ましい態様では、白血球分離に通常用いられるもの以外にはさらなる抗凝血剤または血液添加剤（ヘパリンなど）が含まれない。
【０３９１】
または、白血球（ＷＢＣ）／末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）（Biosafe Sepax 2 (Closed/Automated)を用いて）かまたはＴ細胞（CliniMACS（登録商標） Prodigy (Closed/Automated)を用いて）を全血から直接単離してもよい。しかしながら、特定の被験体（例えば、癌と診断および／または癌の治療を受けている被験体）では、ＷＢＣ／ＰＢＭＣ収率は、白血球分離で単離した場合に比べて全血から単離した場合有意に低いことがある。
【０３９２】
白血球分離手順および／または直接細胞単離手順を本開示の任意の被験体に用いてもよい。
【０３９３】
白血球分離生成物、血液、ＷＢＣ／ＰＢＭＣ組成物、および／またはＴ細胞組成物は、臨床試験規約で使用が認められた標準的な病院または施設での血液採集手順に従って、断熱容器に入れて、調整された室温（＋１９℃〜＋２５℃）で保たれなければならない。これら白血球分離生成物、血液、ＷＢＣ／ＰＢＭＣ組成物、および／またはＴ細胞組成物は冷蔵してはいけない。
【０３９４】
白血球分離生成物、血液、ＷＢＣ／ＰＢＭＣ組成物、および／またはＴ細胞組成物の細胞濃度は、輸送時に１ｍＬあたり０．２×１０9細胞を超えてはいけない。白血球分離生成物、血液、ＷＢＣ／ＰＢＭＣ組成物、および／またはＴ細胞組成物を過度に混合することは避けるべきである。
【０３９５】
白血球分離生成物、血液、ＷＢＣ／ＰＢＭＣ組成物、および／またはＴ細胞組成物を例えば、一晩保存しなければならない場合、調整した室温（上記と同じ）に保たなければならない。保存時に、白血球分離生成物、血液、ＷＢＣ／ＰＢＭＣ組成物、および／またはＴ細胞組成物の濃度は１ｍＬあたり０．２×１０9細胞を超えてはいけない。
【０３９６】
白血球分離生成物、血液、ＷＢＣ／ＰＢＭＣ組成物、および／またはＴ細胞組成物の細胞を自己血漿中に保存するのが好ましい。特定の態様では、白血球分離生成物、血液、ＷＢＣ／ＰＢＭＣ組成物、および／またはＴ細胞組成物の細胞濃度が１ｍＬあたり０．２×１０9細胞よりも高い場合、生成物を自己血漿で希釈しなければならない。
【０３９７】
好ましくは、白血球分離生成物、血液、ＷＢＣ／ＰＢＭＣ組成物、および／またはＴ細胞組成物は、標識および分離手順を開始する２４時間より前のものであってはいけない。白血球分離生成物、血液、ＷＢＣ／ＰＢＭＣ組成物、および／またはＴ細胞組成物は、閉鎖系および／または自動化された系（例えば、CliniMACS Prodigy）を用いて細胞標識のために処理および／または作製されていてもよい。
【０３９８】
自動化された系は、細胞生成物（例えば、白血球分離生成物、血液、ＷＢＣ／ＰＢＭＣ組成物、および／またはＴ細胞組成物）の、できればフィコレーション（ficolation、Ficoll-Paqueなどの比重液を用いた分離法）および／または洗浄によりさらに軟膜単離を行ってもよい。
【０３９９】
閉鎖系および／または自動化された系を用いて、Ｔ細胞単離用に（例えば、白血球分離生成物、血液、ＷＢＣ／ＰＢＭＣ組成物、および／またはＴ細胞組成物由来の）細胞を作製および標識してもよい。
【０４００】
ＷＢＣ／ＰＢＭＣは直接ヌクレオフェクトしてもよい（その方が簡単で、追加の工程がいらない）が、本開示の方法はヌクレオフェクションの前にまずＴ細胞を単離することを含んでいてもよい。直接ＰＢＭＣをヌクレオフェクトするより簡単な方法は、ＣＡＲシグナル伝達によって媒介されるＣＡＲ＋細胞の選択可能な増殖を必要とするが、それ自体、機能的にＴ細胞を疲弊させることで生成物の生体内での効率を直接低下させる劣った増殖方法であることが証明されている。この生成物は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、単球、またはこれらの任意の組み合わせを含むＣＡＲ＋細胞の異種組成物であってもよいが、患者間での生成物の可変性が大きく、投与量とＣＲＳ管理をより困難にする。Ｔ細胞は、腫瘍抑制および殺傷の一次エフェクターと考えられているので、自己生成物の製造のためにＴ細胞を単離することは、他のより異種性の高い組成物に比べて有意な利点が得られる場合がある。
【０４０１】
Ｔ細胞は、１工程の標識手順で標識細胞の富化または標識細胞の減少により直接、または２工程の標識手順で間接的に単離してもよい。本開示の特定の富化方法によれば、Ｔ細胞をCell Collection Bag、非標識化細胞（非標的細胞）をNegative Fraction Bagに採集してもよい。本開示の富化方法に対して、非標識細胞（標的細胞）をCell Collection Bagに、標識細胞（非標的細胞）をNegative Fraction BagまたはNon-Target Cell Bagにそれぞれ回収する。選択試薬は、これらに限定されないが、抗体被覆ビーズを含んでいてもよい。抗体被覆ビーズは、修飾工程および／または増殖工程の前に除去してもよく、修飾工程および／または増殖工程の前に細胞表面に保持されていてもよい。細胞マーカーの以下の非限定的な例のうち１種以上を用いてＴ細胞を単離してもよい：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、抗ビオチン、ＣＤ１ｃ、ＣＤ３／ＣＤ１９、ＣＤ３／ＣＤ５６、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ５６、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１３３、ＣＤ１３７、ＣＤ２７１、ＣＤ３０４、ＩＦＮ−γ、ＴＣＲα／β、および／またはこれらの任意の組み合わせ。Ｔ細胞を単離する方法は、Ｔ細胞の単離に用いてもよい細胞マーカーの以下の非限定的な例のうちの１種以上に特異的に結合し、かつ／または検出可能に標識する１種以上の試薬を含んでいてもよい：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、抗ビオチン、ＣＤ１ｃ、ＣＤ３／ＣＤ１９、ＣＤ３／ＣＤ５６、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ５６、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１３３、ＣＤ１３７、ＣＤ２７１、ＣＤ３０４、ＩＦＮ−γ、ＴＣＲα／β、および／またはこれらの任意の組み合わせ。これらの試薬は、「適正製造規範」（「ＧＭＰ」）等級であってもなくてもよい。これらの試薬は、Thermo DynaBeadsおよびMiltenyi CliniMACS生成物を含んでいてもよいが、これらに限定されない。本開示のＴ細胞を単離する方法は、標識工程および／または単離工程を複数回繰り返すことを含んでいてもよい。本開示のＴ細胞を単離する方法の任意の時点で、望ましくない細胞および／または望ましくない細胞種を陽性選択または陰性選択して本開示のＴ細胞生成物組成物から除去してもよい。本開示のＴ細胞生成物組成物はさらなる細胞種を含んでいてもよく、これらの細胞腫はＣＤ４、ＣＤ８、および／または他のＴ細胞マーカーを発現していてもよい。
【０４０２】
Ｔ細胞をヌクレオフェクトする本開示の方法は、例えば、ＷＢＣ／ＰＢＭＣの集団または組成物中でＴ細胞をヌクレオフェクトする工程によりＴ細胞単離工程をなくしてもよい。この工程は、ヌクレオフェクションの前に、ＴＣＲシグナル伝達による単離工程または選択可能な増殖工程を含む。
【０４０３】
Ｔ細胞富化および／または選別の前または後に陽性選択または陰性選択により特定の細胞集団を減少させてもよい。細胞生成物組成物から減少させてもよい細胞組成物の例は、骨髄細胞、ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞（T Regs）、樹状細胞、マクロファージ、赤血球、マスト細胞、γ−デルタＴ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）様細胞（例えば、サイトカイン誘発キラー（ＣＩＫ）細胞）、誘発ナチュラルキラー（ｉＮＫ）Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、Ｂ細胞、またはこれらの任意の組み合わせを含んでいてもよい。
【０４０４】
本開示のＴ細胞生成物組成物はＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含んでいてもよい。ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞は、単離されるか選択手順の際に個別の回収袋に単離してもよい。ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞は、さらに個別に処理してもよく、または特定の比で再構成（組み合わせて同じ組成物にする）した後に処理してもよい。
【０４０５】
ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞が再構成される場合の特定の比は、その種類、用いる増幅技術の有効性、細胞培地、および／またはＴ細胞生成物組成物の増殖に用いる成長条件に依存していてもよい。起こりうるＣＤ４＋：ＣＤ８＋の比の例としては、これらに限定されないが、５０％：５０％、６０％：４０％、４０％：６０％、７５％：２５％、および２５％：７５％が挙げられる。
【０４０６】
ＣＤ８＋Ｔ細胞は強力な腫瘍細胞殺傷能力を示し、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖性能および機能を補助するのに必要な多くのサイトカインを提供する。正常な提供者から単離されたＴ細胞はＣＤ４＋が優位であるので、Ｔ細胞生成物組成物では実験器具内でＣＤ４＋：ＣＤ８＋の比を人工的に調整して、生体内で別の方法で(otherwise)存在するＣＤ４＋Ｔ細胞のＣＤ８＋Ｔ細胞に対する比を改善させる。また、自己Ｔ細胞生成物組成物の生体外増殖に最適にした比を用いてもよい。Ｔ細胞生成物組成物の人工的に調整したＣＤ４＋：ＣＤ８＋の比の観点から重要であるが、本開示の生成物組成物は、Ｔ細胞の任意の内因的に発生する集団よりも有意に異なっており、有意に大きな利点をもたらす場合がある。
【０４０７】
Ｔ細胞を単離する好ましい方法は、未処理の汎Ｔ細胞を得る陰性選択法を含んでいてもよい。これは、得られたＴ細胞組成物は操作されていないＴ細胞および内因的に発生する多様性／比のＴ細胞を含むＴ細胞を含んでいることを意味する。
【０４０８】
陽性選択または陰性選択に用いてもよい試薬としては、これらに限定されないが、磁性細胞分離ビーズが挙げられる。磁性細胞分離ビーズは、本開示のＴ細胞単離方法の次の工程を行う前にＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞の選択された集団、またはＣＤ４＋とＣＤ８＋Ｔ細胞の混合集団から除去されていてもいなくてもよい。
【０４０９】
Ｔ細胞組成物およびＴ細胞生成物組成物を、標準的なＴ細胞培養培地での冷凍保存または保存、および／または遺伝子修飾用に準備してもよい。
【０４１０】
高回収率、高生存率、高表現型、および／または高機能でヒト細胞を保存および回収するのに最適な標準的冷凍保存方法を用いてＴ細胞組成物、Ｔ細胞生成物組成物、未刺激のＴ細胞組成物、休止Ｔ細胞組成物、またはそれらの任意の一部を凍結保存してもよい。市販の冷凍保存培地および／または試験規約を用いてもよい。本開示の冷凍保存方法はＤＭＳＯを含まない冷凍保存剤（例えば、ＤＭＳＯを含まないCryoSOfree（登録商標）冷凍保存培地）を含んでいてもよい。この培地は冷凍に関連した毒性を低減する。
【０４１１】
Ｔ細胞組成物、Ｔ細胞生成物組成物、未刺激のＴ細胞組成物、休止Ｔ細胞組成物、またはそれらの任意の一部を培養培地に保存してもよい。本開示のＴ細胞培養培地は、細胞の保存、細胞の遺伝子修飾、細胞表現型、および／または細胞増殖に最適化されていてもよい。本開示のＴ細胞培養培地は１種以上の抗生物質を含んでいてもよい。細胞培養培地が抗生物質を含むと形質移入効率および／またはヌクレオフェクションによる遺伝子修飾後の細胞収率が低下することがあるので、特異的な抗生物質（またはそれらの組み合わせ）とそれぞれの濃度を形質移入効率および／またはヌクレオフェクションによる遺伝子修飾後の細胞収率に最適になるように変更してもよい。
【０４１２】
本開示のＴ細胞培養培地は血清を含んでいてもよく、また、血清組成物と濃度を細胞収率が最適になるように変更してもよい。Ｔ細胞の培養にはウシ胎児血清ＦＢＳ／ＦＣＳよりもヒトＡＢ血清が好ましいが、本開示のＴ細胞培養培地に用いることを想定すると、ＦＢＳ／ＦＣＳにゼノタンパク質を導入してもよい。血清は、培養物中のＴ細胞組成物を投与する被験体の血液から単離されてもよい。従って、本開示のＴ細胞培養培地は自己血清を含んでいてもよい。また、血清を含まない培地または代替血清を本開示のＴ細胞培養培地に用いてもよい。本開示のＴ細胞培養培地および方法の特定の実施形態では、血清を含まない培地または代替血清は、培地にゼノ血清で栄養補給することよりも利点がある場合がある。例えば、より高い生存率を持ち、高い効率でヌクレオフェクトされ、ヌクレオフェクション後の生存率が高く、より望ましい細胞表現型を示し、かつ／または増幅技術を加える際により多く／速い増殖を示すより健康な細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４１３】
Ｔ細胞培養培地は、市販の細胞増殖培地を含んでいてもよい。市販の細胞増殖培地としては、例えば、PBS、HBSS、OptiMEM、DMEM、RPMI 1640、AIM-V、X-VIVO 15、CellGro DC培地、CTS OpTimizer Ｔ細胞増殖SFM、TexMACS培地、PRIME-XV Ｔ細胞増殖培地、ImmunoCult-XF Ｔ細胞増殖培地、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０４１４】
Ｔ細胞組成物、Ｔ細胞生成物組成物、未刺激のＴ細胞組成物、休止Ｔ細胞組成物、またはそれらの任意の一部は、遺伝子修飾用に準備されてもよい。遺伝子修飾用にＴ細胞組成物、Ｔ細胞生成物組成物、未刺激のＴ細胞組成物、休止Ｔ細胞組成物、またはそれらの任意の一部を準備することは、細胞の洗浄および／または所望のヌクレオフェクション緩衝液での細胞の再懸濁を含んでいてもよい。冷凍保存したＴ細胞組成物を解凍して、ヌクレオフェクションによる遺伝子修飾用に準備してもよい。標準的な、または知られている試験規約に従って冷凍保存した細胞を解凍してもよい。凍結保存した細胞の解凍および準備は、より高い生存率を持ち、高い効率でヌクレオフェクトされ、ヌクレオフェクション後の生存率が高く、より望ましい細胞表現型を示し、かつ／または増幅技術を加える際により多く／速い増殖を示す細胞を得るのに最適にされていてもよい。例えば、解凍および／または準備工程にGrifols Albutein（２５％のヒトアルブミン）を用いてもよい。
【０４１５】
自己Ｔ細胞生成物組成物の遺伝子修飾
例えば、電気穿孔法などのヌクレオフェクション法を用いてＴ細胞組成物、Ｔ細胞生成物組成物、未刺激のＴ細胞組成物、休止Ｔ細胞組成物、またはそれらの任意の一部を遺伝的に修飾してもよい。より高い生存率を持ち、高い効率でヌクレオフェクトされ、ヌクレオフェクション後の生存率が高く、より望ましい細胞表現型を示し、かつ／または増幅技術を加える際により多く／速い増殖を示す細胞を得るため、ヌクレオフェクトする細胞の総数、ヌクレオフェクション反応液の総体積、および試料を調製する正確なタイミングを最適にしてもよい。
【０４１６】
例えば、Lonza Amaxa、MaxCyte PulseAgile、Harvard Apparatus BTX、および／またはInvitrogen Neonを用いてヌクレオフェクションおよび／または電気穿孔を行ってもよい。非金属電極系がヌクレオフェクションに好ましい場合があり、そのような例としては、これらに限定されないがプラスチック重合体電極が挙げられる。
【０４１７】
ヌクレオフェクションによる遺伝子修飾の前に、Ｔ細胞組成物、Ｔ細胞生成物組成物、未刺激のＴ細胞組成物、休止Ｔ細胞組成物、またはそれらの任意の一部をヌクレオフェクション緩衝液中に再懸濁してもよい。本開示のヌクレオフェクション緩衝液は市販のヌクレオフェクション緩衝液を含む。より高い生存率を持ち、高い効率でヌクレオフェクトされ、ヌクレオフェクション後の生存率が高く、より望ましい細胞表現型を示し、かつ／または増幅技術を加える際により多く／速い増殖を示す細胞を得るため、本開示のヌクレオフェクション緩衝液を最適にしてもよい。本開示のヌクレオフェクション緩衝液は、これらに限定されないが、PBS、HBSS、OptiMEM、BTXpress、Amaxa Nucleofector、ヒトＴ細胞ヌクレオフェクション緩衝液、およびこれらの任意の組み合わせを含んでいてもよい。より高い生存率を持ち、高い効率でヌクレオフェクトされ、ヌクレオフェクション後の生存率が高く、より望ましい細胞表現型を示し、かつ／または増幅技術を加える際により多く／速い増殖を示す細胞を得るため、本開示のヌクレオフェクション緩衝液は１種以上のサプリメント因子を含んでいてもよい。サプリメント因子の例としては、これらに限定されないが、組み換えヒトサイトカイン、ケモカイン、インターロイキン、およびこれらの任意の組み合わせが挙げられる。サイトカイン、ケモカイン、およびインターロイキンの例としては、これらに限定されないが、IL2、IL7、IL12、IL15、IL21、IL1、IL3、IL4、IL5、IL6、IL8、CXCL8、IL9、IL10、IL11、IL13、IL14、IL16、IL17、IL18、IL19、IL20、IL22、IL23、IL25、IL26、IL27、IL28、IL29、IL30、IL31、IL32、IL33、IL35、IL36、GM-CSF、IFN-γ、IL-1α/IL-1F1、IL-1β/IL-1F2、IL-12 p70、IL-12/IL-35 p35、IL-13、IL-17/IL-17A、IL-17A/Fヘテロ二量体、IL-17F、IL-18/IL-1F4、IL-23、IL-24、IL-32、IL-32β、IL-32γ、IL-33、LAP(TGF-β1)、リンホトキシンα/TNF-β、TGF-β、TNF-α、TRANCE/TNFSF11/RANK L、およびこれらの任意の組み合わせが挙げられる。サプリメント因子の例としては、これらに限定されないが、塩、鉱物、代謝物質、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられる。塩、鉱物、代謝物質の例としては、これらに限定されないが、ＨＥＰＥＳ、ニコチンアミド、ヘパリン、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ−グルタミン、ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液、アスコルビン酸、ヌクレオシド、ＦＢＳ／ＦＣＳ、ヒト血清、代替血清、抗生物質、ｐＨ調整剤、アール塩、２−メルカプトエタノール、ヒトトランスフェリン、組み換えヒトインスリン、ヒト血清アルブミン、Nucleofector PLUSサプリメント、ＫＣＬ、ＭｇＣｌ2、Ｎａ2ＨＰＯ4、ＮＡＨ2ＰＯ4、ラクトビオン酸ナトリウム、マンニトール、コハク酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ＣＩＮａ、グルコース、Ｃａ（ＮＯ3）2、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、Ｋ2ＨＰＯ4、ＫＨ2ＰＯ4、ポリエチレンイミン、ポリエチレングリコール、ポロクサマー１８８、ポロクサマー１８１、ポロクサマー４０７、ポリ−ビニルピロリドン、Ｐｏｐ３１３、Ｃｒｏｗｎ−５、およびこれらの任意の組み合わせが挙げられる。サプリメント因子の例としては、これらに限定されないが、PBS、HBSS、OptiMEM、DMEM、RPMI 1640、AIM-V、X-VIVO 15、CellGro DC培地、CTS OpTimizer Ｔ細胞増殖SFM、TexMACS培地、PRIME-XV Ｔ細胞増殖培地、ImmunoCult-XF Ｔ細胞増殖培地などの培地、およびこれらの任意���組み合わせが挙げられる。サプリメント因子の例としては、これらに限定されないが、細胞のＤＮＡセンシング、代謝、分化、シグナル伝達、アポトーシス経路、およびこれらの組み合わせの阻害剤が挙げられる。阻害剤の例としては、これらに限定されないが、TLR9、MyD88、IRAK、TRAF6、TRAF3、IRF-7、NF-KB、1型インターフェロン、炎症性サイトカイン、cGAS、STING、Sec5、TBK1、IRF-3、RNA pol III、RIG-1、IPS-1、FADD、RIP1、TRAF3、AIM2、ASC、カスパーゼ1、プロIL1B、P13K、Akt、Wnt3Aの阻害剤、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（GSK 3β）（例えば、TWS119）の阻害剤、バフィロマイシン、クロロキン、キナクリン、AC-YVAD-CMK、Z-VAD-FMK、Z-IETD-FMK、およびこれらの任意の組み合わせが挙げられる。サプリメント因子の例としては、これらに限定されないが、細胞の送達を高める、核の送達または輸送を高める、核酸の核への容易にされた輸送を高める、染色体外核酸の分解を高める、および／またはＤＮＡ媒介毒性を低減するように１種以上の核酸を修飾または安定化させる試薬が挙げられる。１種以上の核酸を修飾または安定化させる試薬の例としては、これらに限定されないが、ｐＨ調整剤、ＤＮＡ結合タンパク質、脂質、脂質、ＣａＰＯ4、ＮＬＳ配列を含むまたは含まない正味中性電荷ＤＮＡ結合ペプチド、ＴＲＥＸ１酵素、およびこれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【０４１８】
細胞をヌクレオフェクション緩衝液（任意でヌクレオフェクション反応バイアルまたはキュベット内に入れられている）に加える前、加えると同時、または加えた後にトランスポゾンおよび転位酵素を含む転移試薬を本開示のヌクレオフェクション反応液に加えてもよい。本開示のトランスポゾンは、プラスミドＤＮＡ、ナノプラスミド、線状プラスミドＤＮＡ、ＰＣＲ生成物、DOGGYBONE（登録商標）ＤＮＡ、ｍＲＮＡ鋳型、一本鎖または二本鎖ＤＮＡ、タンパク質と核酸の組み合わせ、またはこれらの任意の組み合わせを含んでいてもよい。本開示のトランスポゾンは、１つ以上のＴＴＡＡ部位、１つ以上の末端逆向き配列（ＩＴＲ）、１つ以上の長末端配列（ＬＴＲ）、１つ以上の隔離部位、１つ以上のプロモーター、１つ以上の完全な長さの遺伝子または切断された遺伝子、１つ以上のポリＡシグナル、１つ以上の自己開裂２Ａペプチド開裂部位、１つ以上の内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、１つ以上の転写促進因子、１つ以上の調節部位、１つ以上の複製起点、およびこれらの任意の組み合わせをコードする１つ以上の配列を含んでいてもよい。
【０４１９】
本開示のトランスポゾンは、１つ以上の完全な長さの遺伝子または切断された遺伝子をコードする１つ以上の配列を含んでいてもよい。本開示のトランスポゾンにより導入された１つ以上の完全な長さの遺伝子または切断された遺伝子は、シグナルペプチド、センチリン、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ヒンジ、膜貫通ドメイン、共促進ドメイン、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、キメラＴ細胞受容体（ＣＡＲ−Ｔ）、ＣＡＲＴｙｒｉｎ（センチリンを含むＣＡＲ−Ｔ）、受容体、リガンド、サイトカイン、薬物耐性遺伝子、腫瘍抗原、アロ抗原または自己抗原、酵素、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、蛍光タンパク質、変異タンパク質、またはこれらの任意の組み合わせのうちの１種以上をコードしていてもよい。
【０４２０】
本開示のトランスポゾンは、水、ＴＡＥ、ＴＢＥ、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ、培地、本開示のサプリメント因子、またはこれらの任意の組み合わせ中で作製されてもよい。
【０４２１】
臨床安全性を最適にし、かつ／または製造可能性を向上させるように本開示のトランスポゾンを設計してもよい。非限定的な例として、不要な配列かまたは領域を排除し、かつ／または非抗生物質選択マーカーを含めることにより、臨床安全性を最適にし、かつ／または製造可能性を向上させるように本開示のトランスポゾンを設計してもよい。本開示のトランスポゾンはＧＭＰ等級であってもなくてもよい。
【０４２２】
本開示の転位酵素は、プラスミドＤＮＡ、ナノプラスミドＤＮＡ、ｍＲＮＡ、タンパク質、タンパク質と核酸の組み合わせ、またはこれらの任意の組み合わせのうちの１種以上の配列によりコードされていてもよい。
【０４２３】
本開示の転位酵素は、水、ＴＡＥ、ＴＢＥ、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ、培地、本開示のサプリメント因子、またはこれらの任意の組み合わせ中で作製されてもよい。本開示の転位酵素またはそれらをコードかまたは送達する配列／構築物はＧＭＰ等級であってもなくてもよい。
【０４２４】
本開示のトランスポゾンおよび転位酵素は、任意の手段で細胞に送達されてもよい。
【０４２５】
本開示の組成物および方法は、プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）またはナノプラスミドＤＮＡにより本開示のトランスポゾンおよび転位酵素を細胞に送達することを含んでいるが、送達にプラスミドまたはナノプラスミドを用いることでトランスポゾンおよび／または転位酵素が細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれることがあり、これにより転位酵素の発現が継続することがある。従って、染色体組み込みの可能性を除去するために、本開示のトランスポゾンおよび転位酵素をｍＲＮＡまたはタンパク質の何れかとして細胞に送達してもよい。
【０４２６】
トランスポゾンおよび／または転位酵素をヌクレオフェクション反応液に導入する前に、本開示のトランスポゾンおよび転位酵素を単独で、または互いに２種以上を組み合わせて前もってインキュベートしてもよい。トランスポゾンおよび転位酵素のそれぞれの絶対量および相対量、例えば、トランスポゾンの転位酵素の比を最適にしてもよい。
【０４２７】
任意でバイアルまたはキュベット内でヌクレオフェクション反応液を調製した後、製造者の試験規約に従って反応液をNucleofector（登録商標）装置に充填して、電気パルスによる送達のために活性化してもよい。高められた生存率、より高いヌクレオフェクション効率、ヌクレオフェクション後のより高い生存率、望ましい細胞表現型、および／または増殖技術を加えた際のより高く速い増殖能を持つ細胞を得るため、本開示のトランスポゾンおよび／または転位酵素（または本開示のトランスポゾンおよび／または転位酵素をコードする配列）の細胞への送達に用いられる電気パルス条件を最適にしてもよい。Amaxa nucleofector技術を用いる場合、Amaxa 2Bまたは4D用の様々なヌクレオフェクションプログラムのそれぞれが考えられている。
【０４２８】
本開示のヌクレオフェクション反応の後、細胞をそっと細胞培地に加えてもよい。例えば、Ｔ細胞がヌクレオフェクション反応を受ける場合、Ｔ細胞をＴ細胞培地に加えてもよい。本開示の後ヌクレオフェクション細胞培地は市販の培地の何れか１種以上を含んでいてもよい。より高い生存率、より高いヌクレオフェクション効率、ヌクレオフェクション後のより高い生存率、より望ましい細胞表現型、および／または増殖技術を加えた際のより高く速い増殖能を持つ細胞を得るため、本開示の後ヌクレオフェクション細胞培地（本開示の後ヌクレオフェクションＴ細胞培地を含む）を最適にしてもよい。本開示の後ヌクレオフェクション細胞培地（本開示の後ヌクレオフェクションＴ細胞培地を含む）は、PBS、HBSS、OptiMEM、DMEM、RPMI 1640、AIM-V、X-VIVO 15、CellGro DC培地、CTS OpTimizer Ｔ細胞増殖SFM、TexMACS培地、PRIME-XV Ｔ細胞増殖培地、ImmunoCult-XF Ｔ細胞増殖培地、およびこれらの任意の組み合わせを含んでいてもよい。生存率、ヌクレオフェクション効率、ヌクレオフェクション後の生存率、細胞表現型、および／または増幅技術を加えた際のより高く速い増殖能を高めるため、本開示の後ヌクレオフェクション細胞培地（本開示の後ヌクレオフェクションＴ細胞培地を含む）は、本開示の１種以上のサプリメント因子を含んでいてもよい。サプリメント因子の例としては、これらに限定されないが、組み換えヒトサイトカイン、ケモカイン、インターロイキン、およびこれらの任意の組み合わせが挙げられる。サイトカイン、ケモカイン、およびインターロイキンの例としては、これらに限定されないが、IL2、IL7、IL12、IL15、IL21、IL1、IL3、IL4、IL5、IL6、IL8、CXCL8、IL9、IL10、IL11、IL13、IL14、IL16、IL17、IL18、IL19、IL20、IL22、IL23、IL25、IL26、IL27、IL28、IL29、IL30、IL31、IL32、IL33、IL35、IL36、GM-CSF、IFN-γ、IL-1α/IL-1F1、IL-1β/IL-1F2、IL-12 p70、IL-12/IL-35 p35、IL-13、IL-17/IL-17A、IL-17A/Fヘテロ二量体、IL-17F、IL-18/IL-1F4、IL-23、IL-24、IL-32、IL-32β、IL-32γ、IL-33、LAP (TGF-β1)、リンホトキシンα/TNF-β、TGF-β、TNF-α、TRANCE/TNFSF11/RANK L、およびこれらの任意の組み合わせが挙げられる。サプリメント因子の例としては、これらに限定されないが、塩、鉱物、代謝物質、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられる。塩、鉱物、代謝物質の例としては、これらに限定されないが、ＨＥＰＥＳ、ニコチンアミド、ヘパリン、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ−グルタミン、ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液、アスコルビン酸、ヌクレオシド、ＦＢＳ／ＦＣＳ、ヒト血清、代替血清、抗生物質、ｐＨ調整剤、アール塩、２−メルカプトエタノール、ヒトトランスフェリン、組み換えヒトインスリン、ヒト血清アルブミン、Nucleofector PLUSサプリメント、ＫＣＬ、ＭｇＣｌ2、Ｎａ2ＨＰＯ4、ＮＡＨ2ＰＯ4、ラクトビオン酸ナトリウム、マンニトール、コハク酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ＣＩＮａ、グルコース、Ｃａ（ＮＯ3）2、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、Ｋ2ＨＰＯ4、ＫＨ2ＰＯ4、ポリエチレンイミン、ポリエチレングリコール、ポロクサマー１８８、ポロクサマー１８１、ポロクサマー４０７、ポリ−ビニルピロリドン、Ｐｏｐ３１３、Ｃｒｏｗｎ−５、およびこれらの任意の組み合わせが挙げられる。サプリメント因子の例としては、これらに限定されないが、PBS、HBSS、OptiMEM、DMEM、RPMI 1640、AIM-V、X-VIVO 15、CellGro DC培地、CTS OpTimizer Ｔ細胞増殖SFM、TexMACS培地、PRIME-XV Ｔ細胞増殖培地、ImmunoCult-XF Ｔ細胞増殖培地などの培地、およびこれらの任意の組み合わせが挙げられる。サプリメント因子の例としては、これらに限定されないが、細胞のＤＮＡセンシング、代謝、分化、シグナル伝達、アポトーシス経路、およびこれらの組み合わせの阻害剤が挙げられる。阻害剤の例としては、これらに限定されないが、TLR9、MyD88、IRAK、TRAF6、TRAF3、IRF-7、NF-KB、1型インターフェロン、炎症性サイトカイン、cGAS、STING、Sec5、TBK1、IRF-3、RNA pol III、RIG-1、IPS-1、FADD、RIP1、TRAF3、AIM2、ASC、カスパーゼ1、プロIL1B、P13K、Akt、Wnt3Aの阻害剤、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β(GSK 3β)の阻害剤（例えば、TWS119）、バフィロマイシン、クロロキン、キナクリン、AC-YVAD-CMK、Z-VAD-FMK、Z-IETD-FMK、およびこれらの任意の組み合わせが挙げられる。サプリメント因子の例としては、これらに限定されないが、細胞の送達を高める、核の送達または輸送を高める、核酸の核への容易にされた輸送を高める、染色体外核酸の分解を高める、かつ／またはＤＮＡ媒介毒性を低減するように１種以上の核酸を修飾または安定化させる試薬が挙げられる。１種以上の核酸を修飾または安定化させる試薬の例としては、これらに限定されないが、ｐＨ調整剤、ＤＮＡ結合タンパク質、脂質、脂質、ＣａＰＯ4、ＮＬＳ配列を含む、または含まない正味中性電荷ＤＮＡ結合ペプチド、ＴＲＥＸ１酵素、およびこれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【０４２９】
本開示の後ヌクレオフェクション細胞培地（本開示の後ヌクレオフェクションＴ細胞培地を含む）を室温で用いてもよく、または、例えば、３２℃〜３７℃（上限値および下限値を含む）まで予め温めてもよい。本開示の後ヌクレオフェクション細胞培地（本開示の後ヌクレオフェクションＴ細胞培地を含む）を、本開示のトランスポゾンまたはその一部の細胞生存率および／または発現を維持かまたは増強する任意の温度まで予め温めてもよい。
【０４３０】
本開示の後ヌクレオフェクション細胞培地（本開示の後ヌクレオフェクションＴ細胞培地を含む）を組織培養フラスコまたは皿、G-Rexフラスコ、生物反応器、細胞培養袋、または任意の他の標準的な容器に入れてもよい。本開示の後ヌクレオフェクション細胞培養物（本開示の後ヌクレオフェクションＴ細胞培養物を含む）は、静置されてもよく、または摂動（例えば、揺らす、かき混ぜる、または振とうする）してもよい。
【０４３１】
本開示の後ヌクレオフェクション細胞培養物は遺伝子修飾細胞を含んでいてもよい。本開示の後ヌクレオフェクションＴ細胞培養物は遺伝子修飾Ｔ細胞を含んでいてもよい。本開示の遺伝子修飾細胞を所定の期間休止させてもよく、または、例えば、T Cell Expander技術を加えることにより増殖のために刺激してもよい。特定の態様では、本開示の遺伝子修飾細胞を所定の期間休止させてもよく、または、例えば、Ｔ細胞増殖技術を加えることで直ちに増殖刺激をしてもよい。本開示の遺伝子修飾細胞を順化させる、転位させる、かつ／または陽性選択または陰性選択をするのに十分な時間休止させてもよく、その結果、高生存率、より高いヌクレオフェクション効率、ヌクレオフェクション後のより高い生存率、望ましい細胞表現型、および／または増殖技術を加えた際のより高く速い増殖能を持つ細胞が得られる。本開示の遺伝子修飾細胞を例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４時間、またはそれ以上休止させてもよい。特定の態様では、本開示の遺伝子修飾細胞を例えば、一晩休止させてもよい。特定の側面では、一晩は約１２時間である。本開示の遺伝子修飾細胞を例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４日間、またはそれ以上休止させてもよい。
【０４３２】
ヌクレオフェクション反応の後でExpander技術を加える前に本開示の遺伝子修飾細胞を選択してもよい。遺伝子修飾細胞の最適な選択のため、細胞を後ヌクレオフェクション細胞培地で少なくとも２〜１４日間休止させて、修飾細胞の同定（例えば、修飾細胞と非修飾細胞の区別）を容易にしてもよい。
【０４３３】
本開示のトランスポゾンのヌクレオフェクションがうまく行った場合、ヌクレオフェクション後２４時間以内に本開示のＣＡＲ／ＣＡＲＴｙｒｉｎおよび選択マーカーは修飾Ｔ細胞内で検出可能であってもよい。トランスポゾンの染色体外発現により、選択マーカーのみの発現では修飾Ｔ細胞（トランスポゾンがうまく組み込まれた細胞）と無修飾Ｔ細胞（トランスポゾンがうまく組み込まれなかった細胞）とを区別できない場合がある。トランスポゾンの染色体外発現が選択マーカーによる修飾細胞の検出を不明瞭にしている場合、ヌクレオフェクトされた細胞（修飾細胞および無修飾細胞の両方）を所定の期間（例えば、２〜１４日間）休止させて、細胞が発現するのを止める、またはすべての染色体外トランスポゾン発現を消失させてもよい。このように休止期間を延長した後、修飾Ｔ細胞のみを選択マーカーの発現に対して陽性に保つ。この延長した休止期間の長さは、各ヌクレオフェクション反応および選択過程に対して最適にされていてもよい。トランスポゾンの染色体外発現が選択マーカーによる修飾細胞の検出を不明瞭にしている場合、この延長した休止期間を設けずに選択を行ってもよいが、さらなる選択工程を後の時点（例えば増殖段階中かまたはその後）で含めてもよい。
【０４３４】
本開示の遺伝子修飾細胞は任意の手段で選択されてもよい。本開示の方法の特定の実施形態では、特異的選択マーカーを発現する細胞を単離することにより本開示の遺伝子修飾細胞を選択してもよい。本開示の選択マーカーは、トランスポゾンの１つ以上の配列によりコードされていてもよい。うまく転位した結果として、修飾細胞により本開示の選択マーカーが発現されてもよい（すなわち、トランスポゾンの１つ以上の配列によりコードされていない）。特定の態様では、本開示の遺伝子修飾細胞は、後ヌクレオフェクション細胞培地の有害な化合物に対する耐性を付与する選択マーカーを含んでいてもよい。そのような有害な化合物としては、例えば、選択マーカーによって修飾細胞に付与される耐性がなければ細胞死につながるような抗生物質または薬物が挙げられる。選択マーカーの例としては、これらに限定されないが、以下の遺伝子のうちの１つ以上の野生型（ＷＴ）または変異体形態が挙げられる：ｎｅｏ、ＤＨＦＲ、ＴＹＭＳ、ＡＬＤＨ、ＭＤＲ１、ＭＧＭＴ、ＦＡＮＣＦ、ＲＡＤ５１Ｃ、ＧＣＳ、およびＮＫＸ２．２。選択マーカーの例としては、これらに限定されないが、Ａｂ被覆磁性ビーズ技術またはカラム選択により標的されてもよい表面発現選択マーカーまたは表面発現タグが挙げられる。効率的なカラム選択、洗浄、および溶出のため、タンパク質の精製の用いられるような開裂可能なタグを本開示の選択マーカーに付加してもよい。特定の態様では、本開示の選択マーカーは、内因的に修飾細胞（修飾Ｔ細胞を含む）により発現されておらず、従って、（例えば、細胞選別技術による）修飾細胞の物理的単離に有用である場合がある。内因的に修飾細胞（修飾Ｔ細胞を含む）により発現されていない本開示の選択マーカーとしては、これらに限定されないが、例えば、ＣＤ２７１、ＣＤ１９、ＣＤ５２、ＣＤ３４、ＲＱＲ８、ＣＤ２２、ＣＤ２０、ＣＤ３３の完全な長さの形態、変異形態、または切断された形態、およびこれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【０４３５】
本開示の遺伝子修飾細胞は、ヌクレオフェクション反応の後、選択可能に増殖させてもよい。特定の態様では、ＣＡＲ／ＣＡＲＴｙｒｉｎを含む修飾Ｔ細胞は、ＣＡＲ／ＣＡＲＴｙｒｉｎ刺激によって選択的に増殖されてもよい。ＣＡＲ／ＣＡＲＴｙｒｉｎを含む修飾Ｔ細胞は、標的で被覆した試薬（例えば、標的または標的内で被覆された増殖ビーズを発現する腫瘍系統または正常細胞系統）と接触させることで刺激されてもよい。または、ＣＡＲ／ＣＡＲＴｙｒｉｎを含む修飾Ｔ細胞は、照射された腫瘍細胞、同種異形の正常細胞、または自己ＰＢＭＣと接触させることで刺激されてもよい。刺激に用いた標的発現細胞による本開示の細胞生成物組成物の汚染を最小にするため、例えば、細胞生成物組成物を直接被験体に投与する場合、ＣＡＲ／ＣＡＲＴｙｒｉｎ標的タンパク質で被覆した増殖ビーズを用いて刺激を行ってもよい。ＣＡＲ／ＣＡＲＴｙｒｉｎによるＣＡＲ／ＣＡＲＴｙｒｉｎを含む修飾Ｔ細胞の選択可能な増殖は、修飾Ｔ細胞の機能的疲弊を回避するように最適にされていてもよい。
【０４３６】
本開示の遺伝子修飾細胞は、凍結保存してもよく、所定の期間休止させてもよく、またはCell Expander（細胞増殖剤）技術を加えることで増殖のために刺激されてもよい。本開示の遺伝子修飾細胞は、凍結保存してもよく、所定の期間休止させてもよく、またはCell Expander 技術を加えることで増殖のためにすぐに刺激されてもよい。選択された遺伝子修飾細胞がＴ細胞である場合、これらＴ細胞はCell Expander技術を加えることで増殖のために刺激されてもよい。選択された本開示の遺伝子修飾細胞は、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４時間、またはそれ以上休止させてもよい。特定の態様では、選択された本開示の遺伝子修飾細胞は、例えば一晩休止させてもよい。特定の側面では、一晩は約１２時間である。選択された本開示の遺伝子修飾細胞は、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４日間、またはそれ以上休止させてもよい。選択された本開示の遺伝子修飾細胞を任意の期間休止させてもよく、これにより高生存率、より高いヌクレオフェクション効率、ヌクレオフェクション後のより高い生存率、望ましい細胞表現型、および／または増殖技術を加えた際のより高く速い増殖能を持つ細胞が得られる。
【０４３７】
任意の標準的な冷凍保存方法を用いて選択された遺伝子修飾細胞（選択された本開示の遺伝子修飾Ｔ細胞を含む）を凍結保存してもよい。この方法は、高回収率、高生存率、高表現型、および／または高機能性能を持つヒト細胞を保存および／または回収するのに最適にされていてもよい。本開示の冷凍保存方法は、市販の冷凍保存培地および／または試験規約を含んでいてもよい。
【０４３８】
選択された遺伝子修飾細胞（選択された本開示の遺伝子修飾Ｔ細胞を含む）の転位効率は、任意の手段により評価されてもよい。例えば、Expander技術を用いる前に、選択された遺伝子修飾細胞（選択された本開示の遺伝子修飾Ｔ細胞を含む）によるトランスポゾンの発現量を蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって測定してもよい。選択された遺伝子修飾細胞（選択された本開示の遺伝子修飾Ｔ細胞を含む）の転位効率の決定は、トランスポゾン（例えば、ＣＡＲ）を発現する選択された細胞の百分率を決定することを含んでいてもよい。これに代えて、またはこれに加えて、Ｔ細胞の純度、トランスポゾン発現量（例えば、ＣＡＲ発現量）の平均蛍光強度（ＭＦＩ）、ＣＡＲリガンドを発現する標的細胞の脱顆粒および／または殺傷を媒介する（トランスポゾンで送達された）ＣＡＲの能力、および／または選択された遺伝子修飾細胞（選択された本開示の遺伝子修飾Ｔ細胞を含む）の表現型を任意の手段により評価してもよい。
【０４３９】
本開示の細胞生成物組成物は、特定の放出条件に合致した場合に被験体への投与のために放出されてもよい。放出条件としては、これらに限定されないが、例えば、細胞表面に検出可能な量のＣＡＲを発現する修飾、選択、および／または増殖Ｔ細胞の特定の百分率が挙げられる。
【０４４０】
自己Ｔ細胞生成物組成物の遺伝子修飾
本開示の遺伝子修飾細胞（遺伝子修飾Ｔ細胞を含む）をExpander技術を用いて増殖させてもよい。本開示のExpander技術は市販のExpander技術を含んでいてもよい。本開示のExpander技術の例としては、ＴＣＲにより本開示の遺伝子修飾Ｔ細胞を刺激することが挙げられる。本開示の遺伝子修飾Ｔ細胞を刺激するすべての手段が考えられるが、ＴＣＲにより本開示の遺伝子修飾Ｔ細胞を刺激するのが好ましい方法であり、優れた殺傷能力を持つ生成物が得られる。
【０４４１】
ＴＣＲにより本開示の遺伝子修飾Ｔ細胞を刺激するため、Thermo Expander DynaBeadsをＴ細胞に対するビーズの比を３：１として用いてもよい。Expanderビーズが生分解性でない場合、ビーズをExpander組成物から除去してもよい。例えば、ビーズを約５日後にExpander組成物から除去してもよい。ＴＣＲにより本開示の遺伝子修飾Ｔ細胞を刺激するため、ミルテニー(Miltenyi)Ｔ細胞活性化／増殖試薬を用いてもよい。ＴＣＲにより本開示の遺伝子修飾Ｔ細胞を刺激するため、StemCell TechnologiesのImmunoCultヒトCD3/CD28またはCD3/CD28/CD2 Ｔ細胞活性化試薬を用いてもよい。所定の期間後にこれら可溶性四量体抗体複合体が分解して除去工程を必要としないので、この技術が好ましい場合がある。
【０４４２】
人工抗原提示細胞（ＡＰＣ）を遺伝子操作して、標的抗原を共発現させて、これを用いて本開示のＴ細胞の細胞を本開示のＴＣＲおよび／またはＣＡＲにより刺激してもよい。人工ＡＰＣは、腫瘍細胞株（例えば、不死化された骨髄性白血病系統Ｋ５６２を含む）を含む、またはそれに由来していてもよく、また遺伝子操作されて複数の共刺激分子または技術（例えば、ＣＤ２８、４−１ＢＢＬ、ＣＤ６４、ｍｂＩＬ−２１、ｍｂＩＬ−１５、ＣＡＲ標的分子など）を共発現してもよい。本開示の人工ＡＰＣを共刺激分子と組み合わせる場合、条件は、望ましくない表現型や機能、つまり最終分化したエフェクターＴ細胞が発達かまたは出現することを防ぐように最適になっていてもよい。
【０４４３】
照射ＰＢＭＣ（自己またはアロ）は、ＣＤ１９などのいくつかの標的抗原を発現してもよく、これらを用いて本開示の細胞またはＴ細胞を本開示のＴＣＲおよび／またはＣＡＲにより刺激してもよい。これに代えて、またはこれに加えて、照射腫瘍細胞はいくつかの標的抗原を発現していてもよく、これらを用いて本開示の細胞またはＴ細胞を本開示のＴＣＲおよび／またはＣＡＲにより刺激してもよい。
【０４４４】
プレートに結合させた、かつ／または可溶性の抗ＣＤ３、抗ＣＤ２、および／または抗ＣＤ２８刺激を用いて、本開示の細胞またはＴ細胞を本開示のＴＣＲおよび／またはＣＡＲにより刺激してもよい。
【０４４５】
抗原で被覆したビーズは標的タンパク質を提示してもよく、これを用いて本開示の細胞またはＴ細胞を本開示のＴＣＲおよび／またはＣＡＲにより刺激してもよい。これに代えて、またはこれに加えて、ＣＡＲ／ＣＡＲＴｙｒｉｎ標的タンパク質で被覆したExpanderビーズを用いて、本開示の細胞またはＴ細胞を本開示のＴＣＲおよび／またはＣＡＲにより刺激してもよい。
【０４４６】
増幅方法は、ＴＣＲまたはＣＡＲ／ＣＡＲＴｙｒｉｎにより、遺伝子修飾Ｔ細胞の表面に発現したＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、および／または他のマーカーを介して本開示の細胞またはＴ細胞を刺激するのに適用される。
【０４４７】
ヌクレオフェクションの直後からヌクレオフェクションの約２４時間後まで増殖技術を本開示の細胞に用いてもよい。増殖手順の際には様々な細胞培地を用いてもよいが、本開示の望ましいＴ細胞増殖培地は、例えば、高生存率、細胞表現型、高総増殖量、または生体内で高持続能、高正着性、および／または高ＣＡＲ媒介殺傷能力を持つ細胞を産生してもよい。本開示の細胞培地は、本開示の遺伝子修飾細胞の増殖量、表現型、および機能を向上／増強するように最適になっていてもよい。増殖されたＴ細胞の好ましい表現型は、幹細胞記憶細胞、Ｔ中央記憶細胞、およびＴエフェクター記憶細胞の混合物を含んでいてもよい。Expander Dynabeadsは、臨床で優れた性能につながることがある中央記憶Ｔ細胞を主に産生する可能性がある。
【０４４８】
本開示のＴ細胞増殖培地（部分かまたは全部）としては、例えば、PBS、HBSS、OptiMEM、DMEM、RPMI 1640、AIM-V、X-VIVO 15、CellGro DC培地、CTS OpTimizer Ｔ細胞増殖SFM、TexMACS培地、PRIME-XV Ｔ細胞増殖培地、ImmunoCult-XF Ｔ細胞増殖培地、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられる。本開示のＴ細胞増殖培地は、１種以上のサプリメント因子をさらに含んでいてもよい。本開示のＴ細胞増殖培地に含まれていてもよいサプリメント因子は、生存率、細胞表現型、総増殖量を高める、または生体内での持続性、正着性、および／またはＣＡＲ媒介殺傷能力を高める。本開示のＴ細胞増殖培地に含まれていてもよいサプリメント因子としては、これらに限定されないが、組み換えヒトサイトカイン、ケモカイン、および／またはインターロイキン例えば、IL2、IL7、IL12、IL15、IL21、IL1、IL3、IL4、IL5、IL6、IL8、CXCL8、IL9、IL10、IL11、IL13、IL14、IL16、IL17、IL18、IL19、IL20、IL22、IL23、IL25、IL26、IL27、IL28、IL29、IL30、IL31、IL32、IL33、IL35、IL36、GM-CSF、IFN-γ、IL-1α/IL-1F1、IL-1β/IL-1F2、IL-12 p70、IL-12/IL-35 p35、IL-13、IL-17/IL-17A、IL-17A/Fヘテロ二量体、IL-17F、IL-18/IL-1F4、IL-23、IL-24、IL-32、IL-32β、IL-32γ、IL-33、LAP (TGF-β1)、リンホトキシンα/TNF-β、TGF-β、TNF-α、TRANCE/TNFSF11/RANK L、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられる。本開示のＴ細胞増殖培地に含まれていてもよいサプリメント因子としては、これらに限定されないが、塩、鉱物、および／または代謝物質、例えば、ＨＥＰＥＳ、ニコチンアミド、ヘパリン、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ−グルタミン、ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液、アスコルビン酸、ヌクレオシド、ＦＢＳ／ＦＣＳ、ヒト血清、代替血清、抗生物質、ｐＨ調整剤、アール塩、２−メルカプトエタノール、ヒトトランスフェリン、組み換えヒトインスリン、ヒト血清アルブミン、Nucleofector PLUSサプリメント、ＫＣＬ、ＭｇＣｌ2、Ｎａ2ＨＰＯ4、ＮＡＨ2ＰＯ4、ラクトビオン酸ナトリウム、マンニトール、コハク酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ＣＩＮａ、グルコース、Ｃａ（ＮＯ3）2、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、Ｋ2ＨＰＯ4、ＫＨ2ＰＯ4、ポリエチレンイミン、ポリエチレングリコール、ポロクサマー１８８、ポロクサマー１８１、ポロクサマー４０７、ポリ−ビニルピロリドン、Ｐｏｐ３１３、Ｃｒｏｗｎ−５、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられる。本開示のＴ細胞増殖培地に含まれていてもよいサプリメント因子としては、これらに限定されないが、細胞のＤＮＡセンシング、代謝、分化、信号伝達、アポトーシス経路の阻害剤、例えば、TLR9、MyD88、IRAK、TRAF6、TRAF3、IRF-7、NF-KB、1型インターフェロン、炎症性サイトカイン、cGAS、STING、Sec5、TBK1、IRF-3、RNA pol III、RIG-1、IPS-1、FADD、RIP1、TRAF3、AIM2、ASC、カスパーゼ1、プロIL1B、P13K、Akt、Wnt3Aの阻害剤、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β(GSK-3β)の阻害剤(例えば、TWS119)、バフィロマイシン、クロロキン、キナクリン、AC-YVAD-CMK、Z-VAD-FMK、Z-IETD-FMK、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【０４４９】
本開示のＴ細胞増殖培地に含まれていてもよいサプリメント因子としては、これらに限定されないが、細胞の送達を高める、核の送達または輸送を高める、核酸の核への容易にされた輸送を高める、染色体外核酸の分解を高める、かつ／またはＤＮＡ媒介毒性を低減するように核酸を修飾または安定化させる試薬、例えば、ｐＨ修飾剤、ＤＮＡ結合タンパク質、脂質、脂質、ＣａＰＯ4、ＮＬＳ配列を含む、または含まない正味中性電荷ＤＮＡ結合ペプチド、ＴＲＥＸ１酵素、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【０４５０】
本開示の遺伝子修飾細胞は、選択可能な薬物または化合物の使用により増殖工程中に選択されてもよい。例えば、特定の実施形態では、本開示のトランスポゾンが、培養培地に加えた薬物に対する耐性を遺伝子修飾細胞に与える選択マーカーをコードする場合、選択は増殖工程時に起きてもよく、選択が起きるのに約１〜１４日間の培養が必要である場合がある。本開示のトランスポゾンによりコードされる選択マーカーとして用いてもよい薬物耐性遺伝子の例としては、これらに限定されないが、遺伝子ｎｅｏ、ＤＨＦＲ、ＴＹＭＳ、ＡＬＤＨ、ＭＤＲ１、ＭＧＭＴ、ＦＡＮＣＦ、ＲＡＤ５１Ｃ、ＧＣＳ、ＮＫＸ２．２の野生型（ＷＴ）または変異体形態、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられる。培養培地に加えてもよく、選択マーカーが耐性を付与してもよい対応する薬物または化合物の例としては、これらに限定されないが、Ｇ４１８、ピューロマイシン、アンピシリン、カナマイシン、メトトレキサート、メファラン、テモゾロミド、ビンクリスチン、エトポシド、ドキソルビシン、ベンダムスチン、フルダラビン、アレジア（パミドロン酸ジナトリウム）、ベセヌム（カルムスチン）、ＢｉＣＮＵ（カルムスチン）、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、カルムブリス（カルムスチン）、カルムスチン、クラフェン（シクロホスファミド）、シクロホスファミド、シトキサン（シクロホスファミド）、ダラツムマブ、ダラザレックス（ダラツムマブ）、ドキシル（ドキソルビシン塩酸塩リポソーム）、ドキソルビシン塩酸塩リポソーム、Ｄｏｘ−ＳＬ（ドキソルビシン塩酸塩リポソーム）、エロツズマブ、エムプリシティ（エロツズマブ）、エヴァセット（ドキソルビシン塩酸塩リポソーム）、ファリーダック（パノビノスタット）、イキサゾミブクエン酸塩、カイプロリス（カルフィルゾミブ）、レナリドミド、リポドックス（ドキソルビシン塩酸塩リポソーム）、モゾビル（プレリキサホル）、ネオサール（シクロホスファミド）、ニンラーロ（イキサゾミブクエン酸塩）、パミドロン酸ジナトリウム、パノビノスタット、プレリキサホル、ポマリドミド、ポマリスト（ポマリドミド）、レブラミド（レナリドミド）、シノビル（サリドマイド）、サリドマイド、サロミド（サリドマイド）、ベルケイド（ボルテゾミブ）、ゾレドロン酸、ゾメタ（ゾレドロン酸）、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【０４５１】
本開示のＴ細胞増殖工程は、細胞培養袋、WAVE生物反応器、G-Rexフラスコ、または任意の他の好適な容器および／または反応器内で起きてもよい。
【０４５２】
本開示の細胞またはＴ細胞培養物は、静置してもよく、揺する、かき混ぜる、または振とうしてもよい。
【０４５３】
本開示の細胞またはＴ細胞増殖工程は、特定の条件を最適にしてもよい。そのような条件としては、これらに限定されないが、培養持続時間、細胞濃度、Ｔ細胞培地の追加／除去の予定、細胞の大きさ、総細胞数、細胞表現型、細胞集団の純度、成長中の細胞集団での遺伝子修飾細胞の百分率、サプリメントの使用および組成、Expander技術の添加／除去、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【０４５４】
本開示の細胞またはＴ細胞増殖工程は、得られた増殖細胞集団の処方の前、所定の終点まで継続してもよい。例えば、本開示の細胞またはＴ細胞増殖工程は、所定の時間、少なくとも、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４時間；少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０日間；少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２週；少なくとも１、２、３、４、５、６ヶ月間、または少なくとも１年間継続してもよい。本開示の細胞またはＴ細胞増殖工程は、得られた培養物全体の細胞密度が、体積（μｌ、ｍｌ、Ｌ）あたり１、１０、１００、１０００、１０4、１０5、１０6、１０7、１０8、１０9、１０10細胞、またはその間の任意の密度など、所定の細胞密度になるまで継続してもよい。本開示の細胞またはＴ細胞増殖工程は、得られた培養物の遺伝子修飾細胞が本開示のトランスポゾンの所定の発現レベル、例えば、発現の閾値レベル（得られた遺伝子修飾細胞が臨床的に有効であることを示す発現の最小、最大、または平均レベル）の１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％、またはこれらの間の任意の百分率を示すまで継続してもよい。本開示の細胞またはＴ細胞増殖工程は、得られた培養物の遺伝子修飾細胞の無修飾細胞に対する割合が所定の閾値、少なくとも１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、２：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、またはこれらの間の任意の比になるまで継続してもよい。
【０４５５】
放出のための遺伝子修飾自己Ｔ細胞の分析
遺伝子修飾細胞の百分率を本開示の増殖工程中またはその後に評価してもよい。本開示の遺伝子修飾細胞によるトランスポゾンの細胞発現を蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）により測定してもよい。例えば、ＦＡＣＳを用いて、本開示のＣＡＲを発現する細胞またはＴ細胞の百分率を決定してもよい。これに代えて、またはこれに加えて、遺伝子修飾細胞またはＴ細胞の純度、遺伝子修飾本開示の細胞またはＴ細胞によって発現されたＣＡＲの平均蛍光強度（ＭＦＩ）、ＣＡＲリガンドを発現する標的細胞の脱顆粒および／または殺傷を媒介するＣＡＲの能力、および／またはＣＡＲ＋Ｔ細胞の表現型を評価してもよい。
【０４５６】
被験体に投与することを意図した本開示の組成物は、前記組成物が医薬品製品として処方される、かつ／または被験体に投与されるのに安全かつ有効であることを示す１つ以上の「放出基準」を満たすことが求められてもよい。放出基準は、本開示の組成物（例えば、本開示のＴ細胞生成物）が細胞表面に検出可能な量の本開示のＣＡＲを発現する特定の百分率のＴ細胞を含むという要件を含んでいてもよい。
【０４５７】
増殖工程は、（例えば、特定総数の細胞、記憶細胞の特定集団、または、特定の大きさの集団を達成するなど）特定の基準が満たされるまで継続されなければならない。
【０４５８】
特定の基準は、増殖工程が終わる時を知らせる。例えば、細胞の大きさが３００ｆＬに達すると、細胞を処方、再活性化、または凍結保存しなければならない（さもなくば、この閾値を越えた大きさの細胞は死にはじめる）。細胞集団の平均の大きさが３００ｆＬ未満に達したら直ちに冷凍保存すると、解凍および培養時に細胞の回復が改善されることがある。というのは、これらの細胞は冷凍保存前に完全な休止状態になっていないからである（完全な休止細胞の大きさは約１８０ｆＬである）。増殖の前に本開示のＴ細胞の大きさは約１８０ｆＬであってもよいが、増殖後の３日目にはこの細胞の大きさの４倍よりも大きく約９００ｆＬまでであってもよい。次の６〜１２日間では、Ｔ細胞集団は、細胞の大きさがゆっくりと減少していき、１８０ｆＬで完全な休止状態となる。
【０４５９】
細胞集団を処方用に調製する過程は、これらに限定されないが、細胞集団の細胞を濃縮し、細胞を洗浄し、かつ／またはさらに、薬物耐性または磁性ビーズ選別により細胞を特定の表面発現マーカーに対して選択する工程を含んでいてもよい。細胞集団を処方用に調製する過程は、最終生成物の安全性および純度を確実にする選別工程をさらに含んでいてもよい。例えば、処方用に調製されている本開示の遺伝子修飾Ｔ細胞を刺激するために、被験体由来の腫瘍細胞を用いて本開示の遺伝子修飾Ｔ細胞を刺激する、または患者由来の腫瘍細胞を遺伝的に修飾した場合は、その患者由来の腫瘍細胞が最終生成物に含まれないことが重要である。
【０４６０】
細胞生成物の輸液および／または輸液用の冷凍保存
本開示の医薬品製剤を輸液、冷凍保存、および／または保存用の袋に分配してもよい。
【０４６１】
標準的な試験規約と必要に応じて不融性冷凍保存培地を用いて、本開示の医薬品製剤を凍結保存してもよい。例えば、ＤＭＳＯを含まない冷凍保存剤（例えば、ＤＭＳＯを含まないCryoSOfree（登録商標）冷凍保存培地）を用いて冷凍に関連した毒性を低減してもよい。凍結保存した本開示の医薬品製剤を後日患者に輸液に供するために保存してもよい。有効な治療は本開示の医薬品製剤を複数回の投与する必要がある場合があり、従って、医薬品製剤を予め小分けした「投与量」で包装してもよい。これは、冷凍で保存されているが、個々の投与量を解凍できるように分けられていてもよい。
【０４６２】
本開示の医薬品製剤を室温で保存してもよい。有効な治療は本開示の医薬品製剤を複数回投与する必要がある場合があり、従って、医薬品製剤を予め小分けした「投与量」で包装してもよい。これは、一緒に保存されているが、個々の投与量を投与できるように分けられていてもよい。
【０４６３】
続く再増殖および／または同じ患者へのさらなる投与量を生成するための選択のため、本開示の医薬品製剤を保管庫に保存してもよい。後者は、例えば、症状の沈静および再発の後で将来投与が必要になる患者の同種異系治療の場合である。
製剤
【０４６４】
上述のように、本開示は安定した製剤を提供する。これらの製剤は、好ましくは、生理食塩水または選択した塩を含むリン酸緩衝液、保存料を含む保存された溶液および製剤、および医薬的に許容可能な製剤中に少なくとも１種のタンパク質足場を含む、医薬品または家畜への使用に好適な多目的に使用される保存された製剤を含む。保存された製剤は、少なくとも１種の知られている保存料、または任意で少なくとも１種のフェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、ｏ−クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、硝酸フェニル水銀、フェノキシエタノール、ホルムアルデヒド、クロロブタノール、塩化マグネシウム（例えば、六水和物）、アルキルパラベン（メチル、エチル、プロピル、ブチルなど）、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、およびチメロサール、これらの重合体、またはこれらの水性希釈剤混合物からなる群より選択される保存料を含む。当該分野で知られているように、例えば、約０．００１５％、またはその任意の範囲、値、または一部など任意の好適な濃度または混合物を用いてもよい非限定的な例としては、保存料なし、約０．１〜２％のｍ−クレゾール（例えば、０．２、０．３、０．４、０．５、０．９、１．０％）、約０．１〜３％のベンジルアルコール（例えば、０．５、０．９、１．１、１．５、１．９、２．０、２．５％）、約０．００１〜０．５％のチメロサール（例えば、０．００５、０．０１）、約０．００１−２．０％のフェノール（例えば、０．０５、０．２５、０．２８、０．５、０．９、１．０％）、０．０００５〜１．０％のアルキルパラベン（例えば、０．０００７５、０．０００９、０．００１、０．００２、０．００５、０．００７５、０．００９、０．０１、０．０２、０．０５、０．０７５、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．５、０．７５、０．９、１．０％）などが挙げられる。
【０４６５】
上述のように、本発明は、包装材料、および少なくとも１つのバイアルを含む製造品を提供する。前記バイアルは、少なくとも１種のタンパク質足場溶液、所定の緩衝液および／または保存料、任意で水性希釈剤を含み、前記包装材料は、そのような溶液を１、２、３、４、５、６、９、１２、１８、２０、２４、３０、３６、４０、４８、５４、６０、６６、７２時間またはそれ以上の期間に亘って保持することができることを示す標識を含む。本発明は、包装材料、凍結乾燥した少なくとも１種のタンパク質足場を含む第一のバイアル、および所定の緩衝液または保存料の水性希釈剤を含む第二のバイアルを含む製造品を提供する。前記包装材料は、前記少なくとも１種のタンパク質足場を水性希釈剤で再構築して、２４時間以上の期間保持することができる溶液を形成するよう、患者に指示する標識を含む。
【０４６６】
本発明に従って用いられる少なくとも１種のタンパク質足場は、哺乳類細胞または遺伝子組み換え調製からを含む組み換え手段により作製されていてもよく、または本明細書で記載する、または当該分野で知られているように他の生物学的源から精製されてもよい。
【０４６７】
本発明の生成物中の少なくとも１種のタンパク質足場の範囲は、再構築した際に得られる量を含む。湿潤／乾燥系の場合、濃度は約１．０μｇ／ｍｌ〜約１０００ｍｇ／ｍｌであるが、これより低い濃度および高い濃度でも操作可能であり、意図する送達培地に依存する。例えば、溶液製剤は、経皮パッチ、経肺、経粘膜、浸透圧法、またはマイクロポンプ法とは異なる。
【０４６８】
好ましくは、前記水性希釈剤は、任意で医薬的に許容可能な保存料をさらに含む。好ましい保存料は、フェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、ｏ−クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、アルキルパラベン（メチル、エチル、プロピル、ブチルなど）、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ジヒドロ酢酸ナトリウム、およびチメロサール、またはこれらの混合物からなる群より選択されるものを含む。製剤に用いられる保存料の濃度は、抗微生物効果を得るのに十分な濃度である。そのような濃度は、選択された保存料に依存し、当業者により容易に決定される。
【０４６９】
他の賦形剤、例えば、等張剤、緩衝液、酸化防止剤、および保存増強剤を任意で希釈剤に加えるのが好ましい。グリセリンなどの等張剤は、周知の濃度で一般に用いられる。生理学的に許容された緩衝液を加えて、ｐＨの制御を向上させることが好ましい。製剤は、例えば、ｐＨ約４〜約１０、好ましくはｐＨ約５〜約９、最も好ましくは約６．０〜約８．０など、広範囲のｐＨを含んでいてもよい。本発明の製剤のｐＨは、約６．８〜約７．８であることが好ましい。好ましい緩衝液としては、リン酸緩衝液が挙げられる。最も好ましいのはリン酸ナトリウムであり、特にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。
【０４７０】
その他の添加剤を任意で製剤または組成物に添加して、凝集を低減してもよい。そのような添加剤としては、例えば、医薬的に許容可能な可溶化剤（例えばＴｗｅｅｎ２０（モノラウリン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン）、Ｔｗｅｅｎ４０（モノパルミチン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン）、Ｔｗｅｅｎ８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン）、プルロニックＦ６８（ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロック共重合体）、およびＰＥＧ（ポリエチレングリコール））、または非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルビン酸エステル２０または８０）、ポロキサマー１８４または１８８、プルロニック（登録商標）ポリオール、他のブロック共重合体、およびキレート剤（例えばＥＤＴＡおよびＥＧＴＡ）が挙げられる。これらの添加剤は、ポンプまたはプラスチック容器を用いて製剤を投与する場合に特に有用である。医薬的に許容可能な界面活性剤の存在により、タンパク質が凝集する傾向が和らげられる。
【０４７１】
本発明の製剤は、少なくとも１種のタンパク質足場と、フェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、ｏ−クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、アルキルパラベン（メチル、エチル、プロピル、ブチルなど）、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、およびチメロサール、またはこれらの混合物からなる群より選択される保存料とを水性希釈剤中で混合することを含む工程により調製されてもよい。従来の溶解および混合手順を用いて少なくとも１種のタンパク質足場と保存料を水性希釈剤中で混合する。好適な製剤を調製するため、例えば、測定量の少なくとも１種のタンパク質足場の緩衝溶液と所望の保存料の緩衝溶液をタンパク質と保存料が所望の濃度になるのに十分な量で混合する。当業者であれば、この工程の変形は自明である。例えば、成分を加える順序、さらなる添加剤を使用するか否か、製剤を調製する温度およびｐＨは、すべて、使用する投与の濃度および手段を最適にすることができる因子である。
【０４７２】
請求項の製剤は、透明溶液、または凍結乾燥された少なくとも１種のタンパク質足場のバイアルと、水、保存料および／または賦形剤、好ましくはリン酸緩衝液および／または生理食塩水、および選択した塩を含む第二のバイアルとを含む２つのバイアルとして患者に提供されてもよい。前記凍結乾燥された少なくとも１種のタンパク質足場は、前記第二のバイアルの成分と共に水性希釈剤中で再構成される。単一の溶液バイアルまたは再構成を必要とする２つのバイアルを複数回再利用してもよく、単一かまたは複数のサイクルの患者の治療に十分であり、従って現在利用できるものよりも簡便な治療計画を提供することができる。
【０４７３】
本請求項の製造品は、製造直後から２４時間以上までの期間に亘る投与に有用である。従って、本請求項の製造品は患者に有意な利益をもたらす。本発明の製剤は、必要に応じて約２℃〜約４０℃の温度で安全に保存されてもよい。また、タンパク質の生物学的活性をより長期の間保持してもよく、これにより溶液を６、１２、１８、２４、３６、４８、７２、または９６時間に亘って保持および／または使用することができることを示す包装袋用標識を用いてもよい。保存した希釈剤を用いる場合、そのような標識は、１〜１２ヶ月、半年、１年半、および／または２年までに使用することを含んでいてもよい。
【０４７４】
本発明の少なくとも１種のタンパク質足場の溶液は、少なくとも１種のタンパク質足場を水性希釈剤中で混合することを含む工程により調製されてもよい。混合は従来の溶解および混合手順を用いて行われる。好適な希釈剤を調製するため、例えば、水または緩衝液中の測定量の少なくとも１種のタンパク質足場をタンパク質および必要に応じて保存料または緩衝液が所望の濃度になるのに十分な量で混合する。当業者であれば、この工程の変形は自明である。例えば、成分を加える順序、さらなる添加剤を使用するか否か、製剤を調製する温度およびｐＨは、すべて、使用する投与の濃度および手段に最適にすることができる因子である。
【０４７５】
請求項の製剤は、透明溶液、または凍結乾燥された少なくとも１種のタンパク質足場のバイアルと、水性希釈剤を含む第二のバイアルとを含む２つのバイアルとして患者に提供される。前記凍結乾燥された少なくとも１種のタンパク質足場は、前記第二のバイアルの成分で再構成される。単一の溶液バイアルまたは再構成を必要とする２つのバイアルを複数回再利用してもよく、単一かまたは複数のサイクルの患者の治療に十分であり、従って現在利用できるものよりも簡便な治療計画を提供することができる。
【０４７６】
請求項の製剤は、薬局、診療所、またはその他の機関や施設に透明溶液かまたは凍結乾燥された少なくとも１種のタンパク質足場のバイアルと、その再構成に用いる水性希釈剤を含む第二のバイアルとを含む２つのバイアルを提供することにより患者に間接的に提供されてもよい。この場合の透明溶液は、１リットルまで、またはそれ以上の量で、大型容器で提供されてもよく、前記少なくとも１種のタンパク質足場溶液の小分けしたものをそこから１回または複数回取って小さいバイアルに移し、薬局や診療所から顧客および／または患者に提供されてもよい。
【０４７７】
単一のバイアル系を含む認識されている装置は、溶液を送達するペン型注射器装置を含み、そのような例としては以下のものが挙げられる：BD Pens, BD Autojector（登録商標）、Humaject（登録商標）、NovoPen（登録商標）、B-D（登録商標）Pen, AutoPen（登録商標）、OptiPen（登録商標）、GenotropinPen（登録商標）、Genotronorm Pen（登録商標）、Humatro Pen（登録商標）、Reco-Pen（登録商標）、Roferon Pen（登録商標）、Biojector（登録商標）、Iject（登録商標）、J-tip Needle-Free Injector（登録商標）、Intraject（登録商標）、Medi-Ject（登録商標）（例えば、Becton Dickinson（ニュージャージー州フランクリンレイクス、www.bectondickenson.com）、Disetronic（スイス、ブルグドルフ、www.disetronic.com）；Bioject、オレゴン州ポートランド(www.bioject.com)；National Medical Products, Weston Medical（英国ピーターボロ、www.weston-medical.com）、Medi-Ject Corp（ミネソタ州ミネアポリス、www.mediject.com）により製造または開発）、および同様に好適な装置。２つのバイアル系を含む認識されている装置は、再構成溶液を送達するカートリッジ内で凍結乾燥薬物を再構成するペン型注射器システムを含み、そのような装置としてはHumatroPen（登録商標）が挙げられる。他の好適な装置の例としては、前充填注射器、自動注射器、針なし注射器、および針なし静脈輸液セットが挙げられる。
【０４７８】
請求項の製品は、包装材料を含む。包装材料は、規制当局によって要求される情報に加えて、製品を用いることができる条件を提供する。本発明の包装材料は、２つのバイアルの湿潤／乾燥製品について少なくとも１種のタンパク質足場を水性希釈剤内で再構成して溶液を形成し、２〜２４時間の期間に亘ってその溶液を用いるようにという指示を患者に提供する。単一のバイアルの溶液製品の場合、標識にはそのような溶液を２〜２４時間の期間またはそれ以上の期間に亘って用いてもよいことが示されている。本請求項の製品はヒト医薬品製品として有用である。
【０４７９】
本発明の製剤は、少なくとも１種のタンパク質足場を、選択された緩衝液、好ましくは生理食塩水または選択された塩を含むリン酸緩衝液と混合することを含む工程により調製されてもよい。従来の溶解および混合手順を用いて少なくとも１種のタンパク質足場と緩衝液を水性希釈剤中で混合する。好適な製剤を調製するため、例えば、水または緩衝液中の測定量の少なくとも１種のタンパク質足場をタンパク質と緩衝液が所望の濃度になるような十分な量で所望の緩衝剤水溶液水と混合する。当業者であれば、この工程の変形は自明である。例えば、成分を加える順序、さらなる添加剤を使用するか否か、製剤を調製する温度およびｐＨは、すべて、使用する投与の濃度および手段に最適にすることができる因子である。
【０４８０】
本請求項の安定した製剤または保存された製剤は、透明溶液、または凍結乾燥されたタンパク質足場のバイアルと保存料または緩衝液および賦形剤の水性希釈剤を含む第二のバイアルとを含む２つのバイアルとして患者に提供されてもよい。前記凍結乾燥されたタンパク質足場は、第二のバイアルの成分で再構成される。単一の溶液バイアルまたは再構成を必要とする２つのバイアルを複数回再利用してもよく、単一かまたは複数のサイクルの患者の治療に十分であり、従って現在利用できるものよりも簡便な治療計画を提供することができる。
【０４８１】
タンパク質足場を安定化する他の製剤または方法は、タンパク質足場を含む凍結乾燥粉末の透明溶液以外のものであってもよい。不透明な溶液の中では、粒子懸濁液を含む製剤である。前記粒子は、様々な大きさの構造内にタンパク質足場を含む組成物であり、マイクロ球体、マイクロ粒子、ナノ粒子、ナノ球体、またはリポソームとして様々な形態で知られている。活性剤を含むこのような比較的相同な本質的に球状の粒子製剤は、米国特許第4,589,330号に教示されているように、活性剤および重合体を含む水相と非水相を接触させて、次いで非水相を蒸発させて水相由来の粒子を凝集させることにより形成されてもよい。米国特許第4,818,542号に教示されているように、連続溶媒に分散させた活性剤および重合体を含む第一の相を用いて、冷凍乾燥または希釈抽出沈殿により前記溶媒を懸濁液から除去して多孔性マイクロ粒子を調製してもよい。このような調製に好ましい重合体は、以下のものからなる群より選択される天然または合成の共重合体かまたは重合体である：寒天、でんぷん、アラビノガラクタン、アルブミン、コラーゲン、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、グリコリド−Ｌ（−）ラクチドポリ（ε−カプロラクトン）、ポリ（ε−カプロラクトン−ＣＯ−乳酸）、ポリ（ε−カプロラクトン−ＣＯ−グリコール酸）、ポリ（β−ヒドロキシ酪酸）、ポリエチレンオキシド、ポリエチレン、ポリ（２−シアノアクリル酸アルキル）、ポリ（メタクリル酸ヒドロキシエチル）、ポリアミド、ポリアミノ酸、ポリ（２−ヒドロキシエチルＤＬ−アスパルトアミド）、ポリエステル尿素、ポリ（Ｌ−フェニルアラニン／エチレングリコール／１，６−ジイソシアナトヘキサン）、およびポリメタクリル酸メチル。特に好ましい重合体は、ポリエステル、例えば、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、グリコリド−Ｌ（−）ラクチドポリ（ε−カプロラクトン、ポリ（ε−カプロラクトン−ＣＯ−乳酸）、およびポリ（ε−カプロラクトン−ＣＯ−グリコール酸）である。重合体および／または活性剤を溶解するのに有用な溶媒は、水、ヘキサフルオロイソプロピルアルコール、塩化メチレン、テトラヒドロフラン、ヘキサン、ベンゼン、またはヘキサフルオロアセトン１．５水和物が挙げられる。活性剤を含む相を第二の相で分散する工程は、前記第一の相を圧力をかけてノズルのオリフィスに通して、液滴を形成することを含んでいてもよい。
【０４８２】
乾燥粉末製剤は、冷凍乾燥以外の工程で得られてもよい。そのような工程としては、スプレー乾燥、または蒸発かまたは結晶性組成物の沈殿とその後の水性溶媒または非水性溶媒を除去する１つ以上の工程による溶媒抽出が挙げられる。スプレー乾燥したタンパク質足場の調製は、米国特許第6,019,968号に教示されている。このタンパク質足場乾燥粉末組成物は、呼吸性乾燥粉末が得られる条件で溶媒中のタンパク質足場の溶液またはスラリー、必要に応じて賦形剤をスプレー乾燥することにより得てもよい。そのような溶媒は、容易に乾燥させることができる水およびエタノールなどの極性化合物を含んでいてもよい。窒素雰囲気下、または窒素を乾燥気体として用いるなど、酸素の非存在下でスプレー乾燥手順を行うことによりタンパク質足場の安定性を高めてもよい。他の比較的乾燥した製剤は、典型的にはWO99/16419に教示されたヒドロフルオロアルカン推進剤を含む懸濁液媒質に分散した複数の穴あきミクロ構造の分散体である。これらの安定化した分散体は、定量吸入器を用いて患者の肺に投与されてもよい。スプレー乾燥薬剤の商業的な製造に有用な装置は、Buchi Ltd.またはNiro Corp.により製造されている。
【０４８３】
本明細書に記載の安定製剤かまたは溶液または保存された製剤かまたは溶液中の少なくとも１つのタンパク質足場は、本発明に従って様々な送達方法で患者に投与されてもよい。そのような方法としては、皮下注射または筋肉注射；経皮送達、経肺送達、経粘膜送達、移植、浸透圧ポンプ、カートリッジ、マイクロポンプ、または当該分野で知られている他の手段が挙げられる。
【０４８４】
治療への応用
本発明はまた、本発明の少なくとも１種のタンパク質足場を用いて、例えば、治療有効量のタンパク質足場を投与するか、または前記細胞、組織、器官、動物、または患者を治療有効量のタンパク質足場と接触させることにより、当該分野で知られている、または本明細書で記載するように、細胞、組織、器官、動物、または患者の病気を調節かまたは治療する方法を提供する。また、本発明は、細胞、組織、器官、動物、または患者の病気を調節かまたは治療する方法を提供する。
【０４８５】
本発明のいずれかの方法は、少なくとも１種のタンパク質足場を含む有効量の組成物または医薬組成物を、そのような調節、処理、または治療を必要とする細胞、組織、器官、動物、または患者に投与することを含んでいてもよい。そのような方法は、必要に応じて、そのような病気または障害を治療するための共投与または併用療法をさらに含んでいてもよく、前記少なくとも１種のタンパク質足場、その指定された部分または変異体の投与は、アルキル化剤、有糸分裂阻害剤、および放射性医薬品のうちの少なくとも一種から選択したものを前、同時、および／または後に投与することをさらに含む。好適な投与量は当該分野でよく知られている。例えば、Wells et al., eds., Pharmacotherapy Handbook, 2nd Edition, Appleton and Lange, Stamford, Conn. (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tarascon Publishing, Loma Linda, Calif. (2000); Nursing 2001 Handbook of Drugs, 21st edition, Springhouse Corp., Springhouse, Pa., 2001; Health Professional's Drug Guide 2001, ed., Shannon, Wilson, Stang, Prentice-Hall, Inc, Upper Saddle River, N.J.を参照のこと。これらはその全内容を引用により本明細書に組み込む。
【０４８６】
好適な投与量は、必要に応じて、約０．１〜９９および／または１００〜５００ｍｇ／ｋｇ／投与、またはその任意の範囲、値またはその一部、または単回または複数回の投与あたりの血清濃度が約０．１〜５０００μｇ／ｍｌを達成する血清濃度、またはその任意の範囲、値またはその一部を含んでいてもよい。本発明のタンパク質足場の好ましい投与量の範囲は、患者の体重あたり、約１ｍｇ／ｋｇ、約３、約６、または約１２ｍｇ／ｋｇまでである。
【０４８７】
または、投与量は周知の因子により変化してもよい。そのような因子としては、例えば、特定の剤の薬力学的特性、投与の形態および経路、受容者の年齢、健康、および体重、症状の性質および程度、同時治療の種類、治療の頻度、および所望の効果が挙げられる。通常、薬効成分の投与量は、体重キログラムあたり約０．１〜１００ミリグラムであってもよい。１投与かまたは徐放形態で１キログラムあたり通常０．１〜５０ミリグラム、好ましくは０．１〜１０ミリグラムが所望の結果を得るのに有効である。
【０４８８】
非限定的な例としては、ヒトまたは動物の治療は、単一の輸液または繰り返し投与を用いて本発明の少なくとも１種のタンパク質足場を１日あたり約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇまたはその任意の範囲、値、または一部として、少なくとも１〜４０日に１回、これに代えて、またはこれに加えて少なくとも１〜５２週に１回、これに代えて、またはこれに加えて少なくとも１〜２０年に１回、またはこれらの任意の組み合わせで１回または周期的に投与することとして提供されてもよい。
【０４８９】
内部投与に好適な投与形態（組成物）は一般に、単位あたりかまたは容器あたり約０．００１ミリグラム〜約５００ミリグラムの薬効成分を含む。これらの医薬組成物では、薬効成分は通常、組成物の総重量に対して約０．５〜９９．９９９重量％の量で存在する。
【０４９０】
非経口投与の場合、タンパク質足場は、医薬的に許容可能な非経口投与媒質と共に、または個別に溶液、懸濁液、乳液、粒子、粉末、または凍結乾燥粉末として処方されてもよい。そのような媒質の例は水、生理食塩水、リンガー液、ブドウ糖溶液、および約１〜１０％ヒト血清アルブミンである。また、リポソームおよび非水性媒質（例えば、固定油）を用いてもよい。媒質または凍結乾燥粉末は、等張性を維持する添加剤（例えば、塩化ナトリウム、マンニトール）および化学的安定性を維持する添加剤（例えば、緩衝液および保存料）を含んでいてもよい。この製剤を知られている、または好適な技術により殺菌する。
【０４９１】
好適な医薬品担体は、この分野の標準的な参考書であるRemington's Pharmaceutical Sciences, A. Osolの最新版に記載されている。
【０４９２】
代替え投与
多くの周知の開発された方法を本発明に従って用いて、本発明による薬学的に有効量の少なくとも１種のタンパク質足場を投与してもよい。以下の記載で経肺投与を用いるが、他の投与方法を本発明に従って用いてもよく、好適な結果が得られる。吸入または本明細書で記載かまたは当該分野で周知の他の投与に好適な様々な装置および方法の何れかを用いて、本発明のタンパク質足場を溶液、乳液、コロイド、または懸濁液などの担体中で、または乾燥粉末として送達してもよい。
【０４９３】
非経口製剤および投与
非経口投与用の製剤は、共通の賦形剤として、殺菌水または生理食塩水、ポリアルキレングリコール（例えば、ポリエチレングリコール）、野菜由来の油、水添ナフタレン類などを含んでいてもよい。適切な乳化剤または加湿剤および懸濁剤を用いて、知られている方法に従って輸液用の水性または油性懸濁液を調製してもよい。輸液用剤は、非毒性の非経口投与可能な希釈剤（例えば、水溶液、殺菌注射可能溶液、または溶媒中の懸濁液）であってもよい。用いることができる媒質または溶媒は、水、リンガー液、等張生理食塩水などである。通常の溶媒または懸濁溶媒、殺菌不揮発油を用いてもよい。これらの目的のため、任意の種類の不揮発油および脂肪酸を用いてもよい。そのような例としては、天然、合成、または半合成脂肪油または脂肪酸；天然、合成、または半合成のモノ−、ジ−、またはトリグリセリドが挙げられる。経口投与は、当該分野で知られており、これらに限定されないが、従来の注射手段、米国特許第5,851,198号に記載された針を使用しない気体加圧式注射装置、および米国特許第5,839,446号に記載されたレーザー穿孔装置が挙げられる。これらの全内容は、引用により本明細書に組み込まれる。
【０４９４】
代替え送達
本発明はさらに、非経口投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、関節内投与、気管支内投与、腹部内投与、嚢内投与、軟骨内投与、腔内投与、腔内投与、小脳内投与、脳室内投与、結腸内投与、頸部内投与、腸内投与、肝臓内投与、心筋内投与、骨内投与、骨盤内投与、心膜内投与、腹腔内投与、胸膜内投与、前立腺内投与、肺内投与、直腸内投与、腎臓内投与、網膜内投与、髄腔内投与、関節滑液嚢内投与、胸郭内投与、子宮内投与、膀胱内投与、病巣内投与、急速静注、膣投与、直腸投与、口腔投与、舌下投与、鼻腔内投与、または経皮手段による少なくとも１種のタンパク質足場の投与に関する。少なくとも１種のタンパク質足場組成物は、以下の投与に使用するために調製されてもよい：特に液体溶液または懸濁液形態での非経口投与（皮下投与、筋肉内投与、または静脈内投与）または任意の他の投与）；特に半固体固体形態、例えば、これらに限定されないがクリームおよび尿道坐薬での膣または直腸投与；これらに限定されないが、例えば、錠剤またはカプセルの形態での口腔投与または舌下投与；これらに限定されないが、例えば、粉末、経鼻液滴またはエアロゾル、または特定の剤の形態での経鼻投与；これらに限定されないが、例えば、ジメチルスルホキシドなどの化学転写促進因子を含み、皮膚構造を修飾する（Junginger, et al. In “Drug Permeation Enhancement;” Hsieh, D. S., Eds., pp. 59-90 (Marcel Dekker, Inc. New York 1994, その全内容を引用により本明細書に組み込む）、タンパク質とペプチドを含む製剤を皮膚に塗布することができる酸化剤を含む(WO98/53847)、電気穿孔法などにより電界をかけて一過性の輸送経路を形成する、またはイオン泳動などにより電荷を帯びた薬物の皮膚の移動度を高める、または音響泳動などにより超音波をかけるゲル、軟膏、ローション、懸濁液、またはパッチ送達システム（米国特許第4,309,989号および第4,767,402号）（上記広報および特許は、その全内容を引用により本明細書に組み込む）による経皮投与。
【０４９５】
養子細胞治療としての修飾細胞の注入
本開示は、それを必要とする対象に投与するために選択および／または増殖された本開示の１種以上のＣＡＲおよび／またはＣＡＲＴｙｒｉｎｓを発現する修飾細胞を提供する。本開示の修飾細胞は、室温および体温を含む任意の温度で保存するために処方されてもよい。本開示の修飾細胞は、冷凍保存および続く解凍のために処方されてもよい。本開示の修飾細胞は、殺菌した包装から直接被験体に投与するために医薬的に許容可能な担体中で処方されてもよい。本開示の修飾細胞は、最小量の細胞機能とＣＡＲ／ＣＡＲＴｙｒｉｎ発現を確実にするために、細胞生存率および／またはＣＡＲ／ＣＡＲＴｙｒｉｎ発現量の表示と共に医薬的に許容可能な担体中で処方されてもよい。本開示の修飾細胞は、さらなる増殖を阻害し、かつ／または細胞死を防ぐための１種以上の試薬と共に所定の密度で医薬的に許容可能な担体中で処方されてもよい。
【０４９６】
本開示の特定の実施形態では、本開示の修飾細胞は、注射または静脈輸液により患者に送達される。特定の態様では、治療有効投与量の本開示の組成物または本開示の修飾細胞を含む組成物は、１投与あたり患者の体重１ｋｇあたり２×１０5〜５×１０8個の細胞、またはその任意の範囲、値または一部の細胞を含む。
【０４９７】
本開示の特定の実施形態では、本開示の修飾細胞は注射または静脈輸液により患者に送達される。特定の態様では、治療有効投与量の本開示の組成物または本開示の修飾細胞を含む組成物は、１投与あたり患者の体重１ｋｇあたり０．２×１０6〜２０×１０6個の細胞を含む。特定の態様では、治療有効投与量の本開示の組成物または本開示の修飾細胞を含む組成物は、１投与あたり患者の体重１ｋｇあたり０．２×１０6個の細胞、２×１０6個の細胞、２０×１０6個の細胞、または任意の数の細胞を含む。
【０４９８】
本開示の特定の実施形態では、本開示の修飾細胞は注射または静脈輸液により患者に送達される。特定の態様では、治療有効投与量の本開示の組成物または本開示の修飾細胞を含む組成物は、１投与あたり患者の体重１ｋｇあたり１×１０6個、または約１×１０6個の細胞を含む。
【０４９９】
本開示の特定の実施形態では、本開示の修飾細胞は注射または静脈輸液により患者に送達される。特定の態様では、治療有効投与量の本開示の組成物または本開示の修飾細胞を含む組成物は、１投与あたり患者の体重１ｋｇあたり３×１０6個または約３×１０6個の細胞を含む。
【０５００】
本開示の特定の実施形態では、本開示の修飾細胞は注射または静脈輸液により患者に送達される。特定の態様では、治療有効投与量の本開示の組成物または本開示の修飾細胞を含む組成物は、１投与あたり患者の体重１ｋｇあたり０．７×１０6〜６．７×１０6個の細胞を含む。特定の態様では、治療有効投与量の本開示の組成物または本開示の修飾細胞を含む組成物は１投与あたり患者の体重１ｋｇあたり０．７×１０6個、６．７×１０6個、または任意の数の細胞を含む。
【０５０１】
本開示の特定の実施形態では、本開示の修飾細胞は注射または静脈輸液により患者に送達される。特定の態様では、治療有効投与量の本開示の組成物または本開示の修飾細胞を含む組成物は、１投与あたり患者の体重１ｋｇあたり０．７×１０6〜１６×１０6個の細胞を含む。特定の態様では、治療有効投与量の本開示の組成物または本開示の修飾細胞を含む組成物は、１投与あたり患者の体重１ｋｇあたり０．７×１０6個、２×１０6個、６×１０6個、１０．７×１０6個、１６×１０6個、または任意の数の細胞を含む。
【０５０２】
本開示の特定の実施形態では、本開示の修飾細胞は注射または静脈輸液により患者に送達される。特定の態様では、治療有効投与量の本開示の組成物または本開示の修飾細胞を含む組成物は、１投与あたり患者の体重１ｋｇあたり１．２×１０6〜７．１×１０6個の細胞を含む。特定の態様では、治療有効投与量の本開示の組成物または本開示の修飾細胞を含む組成物は、１投与あたり患者の体重１ｋｇあたり１．２×１０6個、７．１×１０6個、または任意の数の細胞を含む。特定の態様では、治療有効投与量の本開示の組成物または本開示の修飾細胞を含む組成物は、１投与あたり患者の体重１ｋｇあたり２×１０6〜３×１０6個の細胞を含む。
【０５０３】
本開示の特定の実施形態では、本開示の修飾細胞は注射または静脈輸液により患者に送達される。特定の態様では、治療有効投与量の本開示の組成物または本開示の修飾細胞を含む組成物は、１投与あたり患者の体重１ｋｇあたり１１０６×１０6〜２１０６×１０6個の細胞を含む。特定の態様では、治療有効投与量の本開示の組成物または本開示の修飾細胞を含む組成物は、１投与あたり患者の体重１ｋｇあたり１１０６×１０6個、２１０６×１０6個、または任意の数の細胞を含む。本開示の特定の実施形態では、本開示の修飾細胞は注射または静脈輸液により患者に送達される。特定の態様では、治療有効投与量の本開示の組成物または本開示の修飾細胞を含む組成物は、１投与あたり患者の体重１ｋｇあたり０．７×１０6〜１．３×１０6個の細胞を含む。特定の態様では、治療有効投与量の本開示の組成物または本開示の修飾細胞を含む組成物は、１投与あたり患者の体重１ｋｇあたり０．７×１０6個、１．３×１０6個、または任意の数の細胞を含む。
【０５０４】
本開示の特定の実施形態では、本開示の修飾細胞は注射または静脈輸液により患者に送達される。特定の態様では、治療有効投与量の本開示の組成物または本開示の修飾細胞を含む組成物は、単回または複数回の投与量を含む。特定の態様では、治療有効投与量の本開示の組成物または本開示の修飾細胞を含む組成物は、分割投与量を含む。特定の態様では、治療有効投与量の本開示の組成物または本開示の修飾細胞を含む組成物は、初期投与量および維持投与量を含む。
【０５０５】
本開示の特定の実施形態では、前記修飾細胞はＴ細胞であり、前記Ｔ細胞は、実験器具内での増殖または医薬的に許容可能な担体との製剤の前にＴ細胞マーカーに従って仕分けしてもよい。実施形態によっては、ＣＤ８＋マーカーおよび／またはＣＤ４＋マーカーを用いて修飾Ｔ細胞を仕分けしてもよい。
【０５０６】
誘発性アポトーシス促進性ポリペプチド
本開示の誘発性アポトーシス促進性ポリペプチドは免疫原性がかなり低いため、既存の誘発性ポリペプチドよりも優れている。本開示の誘発性アポトーシス促進性ポリペプチドは組み換えポリペプチドであり、従って、天然に生じないが、本開示の誘発性アポトーシス促進性ポリペプチドを産生するように組み換えた配列は、宿主ヒト免疫系が「非自己」と認識するような非ヒト配列を含まず、その結果、本開示の誘発性アポトーシス促進性ポリペプチド、前記誘発性アポトーシス促進性ポリペプチドを含む細胞、または前記誘発性アポトーシス促進性ポリペプチドと前記誘発性アポトーシス促進性ポリペプチドを含む細胞とを含む組成物を受容する被験体の免疫応答を誘発しない。
【０５０７】
本開示は、リガンド結合領域、リンカー、およびアポトーシス促進性ペプチドを含む誘発性アポトーシス促進性ポリペプチドを提供し、前記誘発性アポトーシス促進性ポリペプチドは非ヒト配列を含まない。特定の態様では、前記非ヒト配列は制限部位を含む。特定の態様では、前記アポトーシス促進性ペプチドはカスパーゼポリペプチドである。特定の態様では、前記カスパーゼポリペプチドはカスパーゼ９ポリペプチドである。特定の態様では、前記カスパーゼ９ポリペプチドは、切断型カスパーゼ９ポリペプチドである。本開示の誘発性アポトーシス促進性ポリペプチドは非天然起源であってもよい。
【０５０８】
本開示のカスパーゼポリペプチドとしては、これらに限定されないが、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、カスパーゼ１１、カスパーゼ１２、およびカスパーゼ１４が挙げられる。本開示のカスパーゼポリペプチドとしては、これらに限定されないが、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、およびカスパーゼ１０を含むアポトーシスに関連づけられたカスパーゼポリペプチドが挙げられる。本開示のカスパーゼポリペプチドとしては、これらに限定されないが、カスパーゼ２、カスパーゼ８、カスパーゼ９、およびカスパーゼ１０を含むアポトーシスを開始するカスパーゼポリペプチドが挙げられる。本開示のカスパーゼポリペプチドとしては、これらに限定されないが、カスパーゼ３、カスパーゼ６、およびカスパーゼ７を含むアポトーシスを実行するカスパーゼポリペプチドが挙げられる。
【０５０９】
本開示のカスパーゼポリペプチドは、野生型アミノ酸または核酸配列に比べて１つ以上の修飾を持つアミノ酸または核酸配列によってコードされていてもよい。本開示のカスパーゼポリペプチドをコードする核酸配列は、コドン最適化されていてもよい。本開示のカスパーゼポリペプチドのアミノ酸および／または核酸配列に対する１つ以上の修飾は、野生型アミノ酸または核酸配列に比べて本開示のカスパーゼポリペプチドの相互作用、架橋、または交差架橋、または活性化を高めてもよい。これに代えて、またはこれに加えて、本開示のカスパーゼポリペプチドのアミノ酸および／または核酸配列に対する１つ以上の修飾は、野生型アミノ酸または核酸配列に比べて本開示のカスパーゼポリペプチドの免疫原性を減じてもよい。
【０５１０】
本開示のカスパーゼポリペプチドは、野生型カスパーゼポリペプチドに比べて切断されていてもよい。例えば、カスパーゼポリペプチドを切断して、カスパーゼ活性化およびリクルートドメイン（ＣＡＲＤ）をコードする配列を除去し、誘発性本開示のカスパーゼポリペプチドを含む細胞のアポトーシスを開始することに加えて、局所の炎症性応答を活性化する可能性を除去または最小にしてもよい。本開示のカスパーゼポリペプチドをコードする核酸配列をスプライスして、野生型カスパーゼポリペプチドに比べて本開示のカスパーゼポリペプチドの変異体アミノ酸配列を形成してもよい。本開示のカスパーゼポリペプチドは、組み換えおよび／またはキメラ配列によってコードされていてもよい。本開示の組み換えカスパーゼポリペプチドおよび／またはキメラカスパーゼポリペプチドは、１種以上の異なるカスパーゼポリペプチドに由来する配列を含んでいてもよい。これに代えて、またはこれに加えて、本開示の組み換えカスパーゼポリペプチドおよび／またはキメラカスパーゼポリペプチドは、１種以上の種（例えば、ヒト配列および非ヒト配列）に由来する配列を含んでいてもよい。本開示のカスパーゼポリペプチドは非天然起源であってもよい。
【０５１１】
本開示の誘発性アポトーシス促進性ポリペプチドのリガンド結合領域は、本開示の第一の誘発性アポトーシス促進性ポリペプチドと本開示の第二の誘発性アポトーシス促進性ポリペプチドとの二量化を容易にするまたは促進する任意のポリペプチド配列を含んでいてもよく、この二量化により、アポトーシス促進性ポリペプチドの架橋および細胞のアポトーシスの開始が活性化または誘発される。
【０５１２】
リガンド結合（「二量化」）領域は、例えば、非天然起源合成リガンドなど、内因性または非天然起源リガンド（すなわち、誘発剤）を用いて誘発を可能にする任意のポリペプチドまたはその機能ドメインを含んでいてもよい。リガンド結合領域は、誘発性アポトーシス促進性ポリペプチドの性質とリガンド（すなわち、誘発剤）の選択により細胞膜の内側でも外側でもよい。受容体を含む広く多様なリガンド結合ポリペプチドおよびその機能ドメインが知られている。本開示のリガンド結合領域は、受容体由来の１つ以上の配列を含んでいてもよい。特定の対象は、リガンド（例えば、小さい有機リガンド）が知られている、または容易に作成することができるリガンド結合領域である。これらのリガンド結合領域または受容体としては、これらに限定されないが、ＦＫＢＰおよびシクロフィリン受容体、ステロイド受容体、テトラサイクリン受容体、抗体、特に重鎖サブユニットまたは軽鎖サブユニットから得てもよい「非天然起源」受容体、その変異配列、確率的手順によって得られたランダムアミノ酸配列、組み合わせ合成などが挙げられる。特定の態様では、リガンド結合領域は、ＦＫＢＰリガンド結合領域、シクロフィリン受容体リガンド結合領域、ステロイド受容体リガンド結合領域、シクロフィリン受容体、リガンド結合領域、およびテトラサイクリン受容体リガンド結合領域からなる群より選択される。
【０５１３】
１つ以上の受容体ドメインを含むリガンド結合領域は、少なくとも約５０個のアミノ酸、および約３５０個未満のアミノ酸、一般的に２００個未満のアミノ酸、内因性ドメインまたはその切断された活性部分であってもよい。この結合領域は、例えば、小さい（２５ｋＤａ未満、ウイルスベクターへの効率的な形質移入を可能にする）、単量体、非免疫原性であり、合成利用可能であり、細胞透過性であり、二量化することができる非毒性リガンドであってもよい。
【０５１４】
１つ以上の受容体ドメインを含むリガンド結合領域は、誘発性アポトーシス促進性ポリペプチドの設計や適切なリガンド（すなわち誘発剤）の利用可能性に応じて、細胞内または細胞外にあってもよい。疎水性リガンドでは、結合領域は膜のいずれの側にあってもよいが、親水性リガンド、特にタンパク質リガンドでは、リガンドが結合に有効となる形状でリガンドを内在化する輸送システムが存在しない限り、通常、結合領域は細胞膜の外側に位置する。細胞内受容体では、誘発性アポトーシス促進性ポリペプチドまたは誘発性アポトーシス促進性ポリペプチドを含むトランスポゾンまたはベクターは、受容体ドメイン配列のシグナルペプチドおよび膜貫通ドメインの５’または３’をコードするか、受容体ドメイン配列の脂質付着シグナル配列の５’を有していてもよい。受容体ドメインがシグナルペプチドと膜貫通ドメインとの間にある場合には、受容体ドメインは細胞外に存在する。
【０５１５】
高親和性結合を形成する抗体および抗体のサブユニット、例えば重鎖または軽鎖、具体的には重鎖または軽鎖の断片、より具体的にはその可変領域のすべてまたは一部、またはその融合物は、本開示のリガンド結合領域として使用できる。期待される抗体として、免疫応答を誘発せず、かつ通常は末梢部（すなわち中枢神経系（ＣＮＳ）／脳領域の外側）では発現しない細胞外ドメインなど、異なる位置で発現したヒト産物である抗体が含まれる。その例としては、限定はされないが、低親和性神経成長因子受容体（ＬＮＧＦＲ）、および胚表面タンパク質（すなわち癌胎児性抗原）が挙げられる。さらに抗体は、生体に許容可能なハプテン分子、および結合親和性により選別した個々の抗体のサブユニットに対して調製できる。サブユニットをコードするｃＤＮＡは、定常領域、可変領域の一部分、可変領域の突然変異誘発などの排除により単離かつ修飾されて、リガンドに対して適切な親和性を持つ結合タンパク質ドメインを得ることができる。このようにして、生体に許容可能な殆どすべてのハプテン化合物は、リガンドとして、またはリガンドのエピトープを提供するように使用できる。抗体単位に代えて、結合領域または結合ドメインが既知であり、また結合に対し有用かつ公知のリガンドが存在する場合に、内因性受容体を使用できる。
【０５１６】
受容体を多量体とするために、誘発性アポトーシス促進性ポリペプチドのリガンド結合領域／受容体ドメインに対するリガンドは、そのリガンドが少なくとも２個の結合部位を持つことができるという意味で多量体であってもよく、各々の結合部位はリガンド受容体領域に結合できる（すなわち、このリガンドは、第１の誘発性アポトーシス促進性ポリペプチドのリガンド結合領域に結合できる第１の結合部位と、第２の誘発性アポトーシス促進性ポリペプチドのリガンド結合領域に結合できる第２の結合部位とを有し、これら第１および第２の誘発性アポトーシス促進性ポリペプチドのリガンド結合領域は同一であっても異なっていてもよい）。したがって、本明細書で使用される「多量体リガンド結合領域」という用語は、多量体リガンドに結合する本開示の誘発性アポトーシス促進性ポリペプチドのリガンド結合領域を指す。本開示の多量体リガンドには、二量体リガンドが含まれる。本開示の二量体リガンドは、リガンド受容体ドメインに結合できる２個の結合部位を保持していてもよい。特定の実施形態では、本開示の多量体リガンドは、通常、おおよそ四量体以下の小合成有機分子の二量体またはより高次のオリゴマーであり、個々の分子は通常、少なくとも約１５０Ｄａ〜約５ｋＤａ未満であり、通常約３ｋＤａ未満である。様々な合成リガンドと受容体の対を使用できる。例えば内因性受容体を含む実施形態では、二量体ＦＫ５０６はＦＫＢＰ１２受容体とともに使用でき、例として二量体化シクロスポリンＡはシクロフィリン受容体とともに、二量体化エストロゲンはエストロゲン受容体とともに、二量体化グルココルチコイドはグルココルチコイド受容体とともに、二量体化テトラサイクリンはテトラサイクリン受容体とともに、二量化ビタミンＤはビタミンＤ受容体とともに使用できる。あるいは、より高次のリガンド、例えば三量体も使用できる。非天然起源の受容体、例えば、抗体のサブユニット、修飾抗体のサブユニット、重鎖および軽鎖可変領域を縦に並べて含みかつ柔軟なリンカーで分離された単鎖抗体、または修飾受容体、およびその変異配列などを含む実施形態では、多種の化合物を任意に使用できる。本開示の多量体リガンドを含む単位の顕著な特徴は、各結合部位が高い親和性で受容体に結合できることであり、好ましくは、それらを化学的に二量体にできることにある。またリガンドの疎水性／親水性を平衡にする方法が利用できるので、それらリガンドを機能的な濃度で血清中に溶解させ、さらに多くの用途では原形質膜を通して拡散させることができる。
【０５１７】
本開示の誘発性アポトーシス促進性ポリペプチドの活性化は、例えば、条件的に制御されたタンパク質またはポリペプチドを産生する誘発剤により媒介される化学的誘発による二量体化（ＣＩＤ）を通して達成できる。本開示のアポトーシス促進性ポリペプチドは、誘発性であるだけでなく、不安定な二量体化剤の分解または単量体の競合阻害剤の投与により、これらのポリペプチドの誘発はまた可逆的になる。
【０５１８】
特定の実施形態では、リガンド結合領域は、ＦＫ５０６結合タンパク質１２（ＦＫＢＰ１２）ポリペプチドを含む。特定の実施形態では、リガンド結合領域は、３６位（Ｆ３６Ｖ）のフェニルアラニン（Ｆ）をバリン（Ｖ）で置換したＦＫＢＰ１２ポリペプチドを含む。リガンド結合領域が３６位（Ｆ３６Ｖ）のフェニルアラニン（Ｆ）をバリン（Ｖ）で置換したＦＫＢＰ１２ポリペプチドを含む特定の実施形態では、誘発剤は、合成薬物であるＡＰ１９０３（ＣＡＳ索引名：２−ピペリジンカルボン酸，１−［（２Ｓ）−１−オキソ−２−（３，４，５−トリメトキシフェニル）ブチル］−，１，２−エタンジイルビス［イミノ（２−オキソ−２，１−エタンジイル）オキシ−３，１−フェニレン［（１Ｒ）−３−（３，４−ジメトキシフェニル）プロピリデン］］エステル，［２Ｓ−［１（Ｒ*），２Ｒ*［Ｓ*［Ｓ*［１（Ｒ*），２Ｒ*］］］］］−（９Ｃｌ）；ＣＡＳ登録番号：195514-63-7；分子式：Ｃ78Ｈ98Ｎ4Ｏ20；分子量：１４１１．６５））を含んでもよい。リガンド結合領域が３６位（Ｆ３６Ｖ）のフェニルアラニン（Ｆ）をバリン（Ｖ）で置換したＦＫＢＰ１２ポリペプチドを含む特定の実施形態では、誘発剤は、ＡＰ２０１８７（ＣＡＳ登録番号：195514-80-8、および分子式：Ｃ82Ｈ107Ｎ5Ｏ20）を含んでもよい。特定の実施形態では、誘発剤は、例えばＡＰ１５１０などのＡＰ２０１８７類似体である。本明細書で使用される誘発剤ＡＰ２０１８７、ＡＰ１９０３、およびＡＰ１５１０は、互換的に使用されてもよい。
【０５１９】
ＡＰ１９０３のＡＰＩ（有効成分）は、Alphora Research Inc.によって製造され、ＡＰ１９０３の注射用製剤は、Formatech Inc.によって製造されている。この製剤は、非イオン性可溶化剤であるSolutol HS 15（２５０ｍｇ／ｍＬ、BASF製）の２５％溶液中に、ＡＰ１９０３の５ｍｇ／ｍＬ溶液として製剤化されている。室温では、この製剤は透明で僅かに黄色の溶液である。冷蔵すると、この製剤は可逆的な相転移を引き起こして乳白色の溶液となる。この相転移は、室温まで再加温すると逆方向に動く。量として、３ｍＬのガラス製バイアル中に２．３３ｍＬを充填する（バイアル当たりの合計注入量として、ＡＰ１９０３は約１０ｍｇとなる）。ＡＰ１９０３の投与が必要と判断されると、例えば患者に、非ＤＥＨＰかつ非エチレンオキシド滅菌輸液のセットを使用して、２時間にわたって静脈内注入によって注射用ＡＰ１９０３の単回固定用量（０．４ｍｇ／ｋｇ）を投与する。ＡＰ１９０３の投与用量は、すべての患者に対して個別に計算し、体重が１０％以上変動しない限り再計算しない。計算した用量は、注入前に０．９％生理食塩水で１００ｍＬに希釈される。ＡＰ１９０３の過去のフェーズＩの研究では、２４人の健康なボランティアを、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０ｍｇ／ｋｇの用量濃度で注射用ＡＰ１９０３を２時間かけて静脈内注入して単回投与により処置した。ＡＰ１９０３血漿濃度は用量に正比例し、平均のＣｍａｘ値は０．０１〜１．０ｍｇ／ｋｇの用量範囲で約１０〜１２７５ｎｇ／ｍＬの範囲にあった。最初の注入期間の後に、血中濃度は急速な分散過程を示して、血漿濃度は投与後の０．５、２、１０時間のそれぞれで最大濃度の約１８、７、１％まで低下した。注射用ＡＰ１９０３は、すべての用量濃度で安全かつ良好な許容性があることを示し、好ましい薬物動態特性を示していた。Iuliucci J D, et al., J Clin Pharmacol. 41: 870-9, 2001を参照。
【０５２０】
注射で使用するＡＰ１９０３の固定用量として、例えば、０．４ｍｇ／ｋｇで２時間にわたって静脈内注入されてもよい。細胞の効果的なシグナル伝達のために生体外で必要なＡＰ１９０３の量は、１０〜１００ｎＭ（１６００Ｄａの分子量）である。この量は、１６〜１６０μｇ／Ｌ、または約０．０１６〜１．６μｇ／ｋｇ（１．６〜１６０μｇ／ｋｇ）に相当する。上記のＡＰ１９０３のフェーズＩ研究では、１ｍｇ／ｋｇの用量まで良好な許容性があった。したがって、治療細胞と組合わせたこのフェーズＩ研究では、０．４ｍｇ／ｋｇをＡＰ１９０３の安全かつ有効な用量とできる。
【０５２１】
本開示のリガンド結合をコードするアミノ酸配列および／または核酸配列は、野生型アミノ酸配列または核酸配列と比較して、１つ以上の修飾した配列を含んでもよい。例えば、本開示のリガンド結合領域をコードするアミノ酸配列および／または核酸配列は、コドン最適化配列であってもよい。この１つ以上の修飾は、野生型ポリペプチドと比較して、本開示のリガンド結合領域に対するリガンド（例えば誘発剤）の結合親和性を増大することができる。あるいは、またはさらに、１つ以上の修飾は、野生型ポリペプチドに比較して、本開示のリガンド結合領域の免疫原性を低下させることができる。本開示のリガンド結合領域および／または本開示の誘発剤は、非天然起源であってもよい。
【０５２２】
本開示の誘発性アポトーシス促進性ポリペプチドは、リガンド結合領域、リンカー、およびアポトーシス促進性ペプチドを含み、この誘発性アポトーシス促進性ポリペプチドは、非ヒト配列を含まない。特定の実施形態では、非ヒト配列は制限部位を含む。リンカーは、リガンド結合領域の二量体化が起こると、アポトーシス促進性ポリペプチドの相互作用または活性化が細胞内でアポトーシスを開始するように、アポトーシス促進性ポリペプチドの相互作用、架橋、交差活性化、または活性化を可能にする任意の有機材料または無機材料を含んでいてもよい。特定の実施形態では、リンカーはポリペプチドである。特定の実施形態では、リンカーは、Ｇ／Ｓに富むアミノ酸配列を含むポリペプチド（「ＧＳ」リンカー）である。特定の実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列GGGGS（配列番号：17014）を含むポリペプチドである。好ましい実施形態では、リンカーはポリペプチドであり、ポリペプチドをコードする核酸は、制限エンドヌクレアーゼの制限部位を含まない。本開示のリンカーは、非天然起源であってもよい。
【０５２３】
本開示の誘発性アポトーシス促進性ポリペプチドは、本開示の誘発性アポトーシス促進性ポリペプチドの発現を細胞内で開始および／または調節できる任意のプロモーターの転写調節下でその細胞内に発現されてもよい。本明細書で使用される「プロモーター」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼが遺伝子を転写するための最初の結合部位として作用するプロモーターを指す。例えば、本開示の誘発性アポトーシス促進性ポリペプチドは、本開示の誘発性アポトーシス促進性ポリペプチドの発現を哺乳動物細胞内で開始および／または調節できる任意のプロモーターの転写調節下で哺乳動物細胞内に発現されてもよく、このプロモーターは、限定はされないが、天然の、内因性の、外因性の、および異種のプロモーターを含む。好ましい哺乳動物細胞として、ヒト細胞が挙げられる。したがって、本開示の誘発性アポトーシス促進性ポリペプチドは、本開示の誘発性アポトーシス促進性ポリペプチドの発現をヒト細胞内で開始および／または調節できる任意のプロモーターの転写調節下でヒト細胞内に発現されてもよく、このプロモーターは、限定はされないが、ヒトプロモーターまたはウイルスプロモーターを含む。ヒト細胞内での発現のためのプロモーターの例として、限定はされないが、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス長末端反復配列、β−アクチンプロモーター、ラットインスリンプロモーター、およびグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーターが挙げられ、それぞれのプロモーターを使用して、本開示の誘発性アポトーシス促進性ポリペプチドの高濃度発現を達成できる。発現濃度が細胞内でアポトーシスを開始するのに十分である場合には、本開示の誘発性アポトーシス促進性ポリペプチドの発現を達成するために、当技術分野で周知であるその他のウイルスプロモーターまたは哺乳動物細胞プロモーターまたは細菌ファージプロモーターの使用もまた考慮される。周知の特性を持つプロモーターを使用して、遺伝子導入または形質転換後の目的のタンパク質の発現濃度および形態を最適化できる。
【０５２４】
特定の生体シグナルまたは合成シグナルに応答して調節されるプロモーターの選択により、本開示の誘発性アポトーシス促進性ポリペプチドの誘発性発現を可能にできる。エクジソンシステム（Invitrogen社、 Carlsbad, Calif.）は、そのシステムの１つである。このシステムは、哺乳類細胞中の目的の遺伝子の発現を調節できるように設計されている。このシステムは、厳密に調節された発現機構からなり、この機構では実質的には導入遺伝子の基底濃度の発現は認められないものの、２００倍以上の誘発性が可能となる。このシステムは、ショウジョウバエのヘテロ二量体エクジソン受容体に基づいており、エクジソンまたはムリステロンＡなどの類似体が受容体に結合すると、この受容体はプロモーターを活性化し、導入遺伝子の下流での発現を活性化することで高濃度のｍＲＮＡ転写産物が得られる。このシステムでは、ヘテロ二量体受容体の両方のモノマーが１つのベクターから構成として発現するが、目的の遺伝子の発現を駆動するエクジソン応答性プロモーターは異なるプラスミド上にある。したがって、このタイプのシステムを目的のベクター内に組込む操作は有用と思われる。有用と思われる別の誘発システムは、GossenおよびBujard（Gossen and Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551, 1992; Gossen et al., Science, 268:1766-1769, 1995を参照）によって最初に開発されたTet-OffTMまたはTet-OnTMシステムである。このシステムでは、テトラサイクリンまたはドキシサイクリンなどのテトラサイクリンの誘導体に応答して、高濃度の遺伝子発現を調節することもできる。Tet-OnTMシステムでは、ドキシサイクリンの存在下で遺伝子発現を活性化できるが、Tet-OffTMシステムでは、ドキシサイクリンがなくても遺伝子発現を活性化できる。これらシステムは、大腸菌のテトラサイクリン耐性オペロンに由来する２つの調節要素、すなわちテトラサイクリンオペレーター配列（テトラサイクリン抑制因子が結合する配列）およびテトラサイクリン抑制因子タンパク質に基づいている。目的の遺伝子は、その内部にテトラサイクリン応答性要素が存在するプロモーターの背後のプラスミド内にクローニングされる。別のプラスミドには、テトラサイクリン制御トランスアクチベーターと呼ばれる調節要素を含み、この要素は、Tet-OffTMシステムでは、単純ヘルペスウイルス由来のＶＰ１６ドメインと野生型テトラサイクリン抑制因子から構成される。したがって、ドキシサイクリンがないときは、転写は恒常的に活性になっている。Tet-OnTMシステムでは、テトラサイクリン抑制因子は野生型ではなく、ドキシサイクリンの存在下で転写を活性化する。遺伝子治療ベクターの産生では、テトラサイクリンまたはドキシサイクリンの存在下でプロデューサー細胞を成長させ、かつ潜在的に毒性のある導入遺伝子の発現を防ぐように、Tet-OffTMシステムを使用できるが、ベクターが患者に導入される際には、遺伝子発現は恒常的に活性となる。
【０５２５】
いくつかの場合には、遺伝子治療ベクター内の導入遺伝子の発現を調節することが望ましい。例えば、所望の発現濃度に応じて、異なる活性度を持つ異なるウイルスプロモーターが利用される。哺乳動物細胞では、ＣＭＶの最初期プロモーターを使用して、強力な転写賦活を行うことが多い。ＣＭＶプロモーターについては、Donnelly, J. J., et al., 1997. Annu. Rev. Immunol. 15:617-48に概説されている。導入遺伝子の発現濃度の低減が所望される場合には、ＣＭＶプロモーターの能力が低い修飾型もまた使用されてきた。造血細胞中の導入遺伝子の発現が所望される場合には、ＭＬＶまたはＭＭＴＶ由来のＬＴＲなどのレトロウイルスプロモーターが使用されることが多い。所望の効果に応じて使用されるその他のウイルスプロモーターとして、SV40、RSV LTR、HIV-1およびHIV-2 LTR、Ｅ１Ａ領域、Ｅ２Ａ領域、またはＭＬＰ領域などからのアデノウイルスプロモーター、AAV LTR、HSV-TK、および肉腫ウイルスが挙げられる。
【０５２６】
その他の例では、増殖するように調節され、かつ特定の分化細胞中で活性があるプロモーターを選択してもよい。したがって、例えば、プロモーターは、多能性幹細胞中では活性でなくてもよいが、例えば多能性幹細胞がより成熟した細胞に分化する場合に、プロモーターはその時に活性化されてもよい。
【０５２７】
同様に組織特異的なプロモーターを使用して、非標的組織に対する潜在的な毒性または望ましくない影響を低減するように、特定の組織または細胞内で転写を実施する。これらのプロモーターは、ＣＭＶプロモーターなどの強力なプロモーターと比較して発現が低下するが、発現が制限されて免疫原性を低減できる可能性もある（Bojak, A., et al., 2002. Vaccine. 20:1975-79; Cazeaux, N., et al., 2002. Vaccine 20:3322-31を参照）。例えば、ＰＳＡ関連プロモーターまたは前立腺特異的腺性カリクレインなどの組織特異的プロモーター、または筋肉クレアチンキナーゼ遺伝子は、それらが適切となる場合には使用されてもよい。
【０５２８】
組織特異的または分化特異的プロモーターの例として、限定はされないが、Ｂ２９（Ｂ細胞）、ＣＤ１４（単球細胞）、ＣＤ４３（白血球および血小板）、ＣＤ４５（造血細胞）、ＣＤ６８（マクロファージ）、デスミン（筋肉）、エラスターゼ−１（膵腺房細胞）、エンドグリン（内皮細胞）、フィブロネクチン（分化細胞、治癒組織）、Ｆｌｔ−１（内皮細胞）、およびＧＦＡＰ（星状細胞）が挙げられる。
【０５２９】
特定の適応症では、遺伝子治療ベクターの投与後の特定の時点での転写を活性化することが望ましい。この活性化は、調節可能なホルモンやサイトカインなどのプロモーターにより実施される。使用できるサイトカインプロモーターおよび炎症性タンパク質応答性プロモーターとして、ＫおよびＴキニノーゲン（Kageyama et al., (1987) J. Biol. Chem., 262, 2345-2351を参照）、ｃ−ｆｏｓ、ＴＮＦ−α、Ｃ−反応性タンパク質（Arcone, et al., (1988) Nucl. Acids Res., 16(8), 3195-3207を参照）、ハプトグロビン（Oliviero et al., (1987) EMBO J., 6, 1905-1912を参照）、血清アミロイドＡ２、Ｃ／ＥＢＰα、ＩＬ−１、ＩＬ−６（Poli and Cortese, (1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 86, 8202-8206を参照）、補完Ｃ３（Wilson et al., (1990) Mol. Cell. Biol., 6181-6191を参照）、ＩＬ−８、α−１酸性糖タンパク質（Prowse and Baumann, (1988) Mol Cell Biol, 8, 42-51を参照）、α−１アンチトリプシン、リポタンパク質リパーゼ（Zechner et al., Mol. Cell. Biol., 2394-2401, 1988を参照）、アンジオテンシノーゲン（Ron, et al., (1991) Mol. Cell. Biol., 2887-2895を参照）、フィブリノゲン、ｃ−ｊｕｎ（ホルボールエステル、ＴＮＦ−α、ＵＶ照射、レチノイン酸、および過酸化水素により誘発可能）、コラゲナーゼ（ホルボールエステルおよびレチノイン酸により誘発）、メタロチオネイン（重金属および糖質コルチコイドにより誘発可能）、ストロメリシン（ホルボールエステル、インターロイキン−１、およびＥＧＦにより誘発可能）、α−２マクログロブリン、およびα−１抗キモトリプシンが挙げられる。他のプロモーターとして、例えば、ＳＶ４０、ＭＭＴＶ、ヒト免疫不全ウイルス（ＭＶ）、モロニーウイルス、ＡＬＶ、エプスタインバーウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ヒトアクチン、ミオシン、ヘモグロビン、およびクレアチンが挙げられる。
【０５３０】
所望する作用に応じて、上記プロモーターのいずれか単独または他のプロモ−ターとの組合わせを使用できることが考えられる。プロモーターおよびその他の調節要素は、それらが目的の細胞または組織中で機能的であるように選択される。さらに、プロモーターの上記のリストが、全てであると、または限定的であると解釈されるべきではなく、本明細書に開示されるプロモーターおよび方法と併せて他のプロモーターも使用できる。
【０５３１】
武装化Ｔ細胞の「ノックダウン」手段
本開示のＴ細胞は、それらの治療能力を高めるように遺伝子修飾されてもよい。あるいは、またはさらに、本開示のＴ細胞を修飾して、免疫学的および／または代謝的チェックポイントに対する感受性を低下させてもよい。本開示のＴ細胞のこの種の「武装化」修飾では、修飾後には、本明細書では「武装化」Ｔ細胞と呼ぶことにする。本開示の武装化Ｔ細胞は、例えば、腫瘍免疫抑制微小環境内でＴ細胞に送達される特定の内因性チェックポイントシグナルの阻止および／または希釈（すなわちチェックポイント阻害）により産生できる。
【０５３２】
実施形態によっては、本開示の武装化Ｔ細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、造血前駆細胞、（Ｇ−ＣＳＦ動員末梢血から単離されるかそれに由来するＴ細胞を含む）末梢血（ＰＢ）由来Ｔ細胞、または臍帯血（ＵＣＢ）由来Ｔ細胞に由来する。実施形態によっては、本開示の武装化Ｔ細胞は、本開示のキメラリガンド受容体（タンパク質足場、抗体、ＳｃＦＶ、または抗体模倣体を含むＣＬＲ）／キメラ抗原受容体（タンパク質足場、抗体、ＳｃＦＶ、または抗体模倣物を含むＣＡＲ）、ＣＡＲＴｙｒｉｎ（センチリンを含むＣＡＲ）、および／またはＶＣＡＲ（ラクダ類ＶＨＨまたは単一ドメインＶＨを含むＣＡＲ）のうちの1種以上を含む。実施形態によっては、本開示の武装化Ｔ細胞は、（ａ）リガンド結合領域、（ｂ）リンカー、および（ｃ）短縮型カスパーゼ９ポリペプチドを含む誘発性アポトーシス促進性ポリペプチドを含み、誘発性アポトーシス促進性ポリペプチドは、非ヒト配列を含まない。実施形態によっては、この非ヒト配列は制限部位である。実施形態によっては、リガンド結合領域誘発性カスパーゼポリペプチドは、ＦＫ５０６結合タンパク質１２（ＦＫＢＰ１２）ポリペプチドを含む。実施形態によっては、ＦＫ５０６結合タンパク質１２（ＦＫＢＰ１２）ポリペプチドのアミノ酸配列は、この配列の３６位に修飾を含む。実施形態によっては、この修飾は、３６位（Ｆ３６Ｖ）のフェニルアラニン（Ｆ）のバリン（Ｖ）による置換である。実施形態によっては、本開示の武装化Ｔ細胞は外因性配列を含む。実施形態によっては、この外因性配列は、治療用タンパク質をコードする配列を含む。典型的な治療用タンパク質は、核、細胞質、細胞内、膜貫通、細胞表面結合、または分泌タンパク質であってもよい。武装化Ｔ細胞によって発現される典型的な治療用タンパク質は、武装化Ｔ細胞の活性を修飾でき、または別の細胞の活性を修飾できる。実施形態によっては、本開示の武装化Ｔ細胞は、選択遺伝子または選択マーカーを含む。実施形態によっては、本開示の武装化Ｔ細胞は、（本明細書では誘発性導入遺伝子構築物とも呼ばれる）合成遺伝子発現カセットを含む。
【０５３３】
実施形態によっては、本開示のＴ細胞は、阻害性チェックポイントシグナルの受容体をコードする１つ以上の遺伝子の発現をサイレンシングまたは低減するように修飾されて、本開示の武装化Ｔ細胞を産生する。阻害性チェックポイントシグナルの例として、限定はされないが、本開示のＣＡＲ−Ｔ細胞表面のＰＤ−１受容体に結合するＰＤ−Ｌ１リガンド、またはＣＡＲ−Ｔ細胞表面のＴＧＦβＲII受容体に結合するＴＧＦβサイトカインが挙げられる。阻害性チェックポイントシグナルの受容体は、Ｔ細胞の細胞表面または細胞質内で発現する。阻害性チェックポイントシグナルの受容体をコードする遺伝子の発現がサイレンシングまたは低減されると、本開示の武装化Ｔ細胞の表面または細胞質内の阻害性チェックポイント受容体のタンパク質発現が失われる。したがって、阻害性チェックポイント受容体をコードする１つ以上の遺伝子の発現がサイレンシングまたは低減された本開示の武装化Ｔ細胞は、チェックポイントシグナルに対して抵抗性があり、非受容性または非感受性である。武装化Ｔ細胞の抵抗性または阻害性チェックポイントシグナルに対する感受性の低下は、これらの阻害性チェックポイントシグナルの存在下での武装化Ｔ細胞の治療能力を向上する。阻害性チェックポイントシグナルには、限定はされないが、表２に列記した例が含まれる。本開示の武装化Ｔ細胞中でサイレンシングされる典型的な阻害性チェックポイントシグナルとして、限定はされないが、ＰＤ−１およびＴＧＦβＲIIが挙げられる。
【０５３４】
【表２−１】
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【表２−２】
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【０５３５】
実施形態によっては、本開示のＴ細胞は、チェックポイントシグナル伝達に関与する細胞内タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子の発現をサイレンシングまたは低減させるように修飾されて、本開示の武装化Ｔ細胞を産生する。本開示のＴ細胞の活性は、チェックポイントシグナル伝達経路内で関与するいずれかの細胞内シグナル伝達タンパク質を標的とすることにより高められ、それにより１つ以上のチェックポイント経路へのチェックポイント阻害または干渉を達成できる。チェックポイントシグナル伝達に関与する細胞内シグナル伝達タンパク質には、限定はされないが、表３に列記した典型的な細胞内シグナル伝達タンパク質が含まれる。
【０５３６】
【表３】
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【０５３７】
実施形態によっては、本開示のＴ細胞は、治療の有効性を妨げる転写因子をコードする１つ以上の遺伝子の発現をサイレンシングまたは低減させるように修飾されて、本開示の武装化Ｔ細胞を産生する。武装化Ｔ細胞の活性は、治療の有効性を妨げる転写因子の発現をサイレンシングまたは低減させて（または機能を抑制させて）増強または調節できる。発現をサイレンシングまたは低減させるように、またはその機能を抑制するように修飾されてもよい典型的な転写因子には、限定はされないが、表４に列記される転写因子の例が含まれる。例えば、ＦＯＸＰ３遺伝子の発現を本開示の武装化Ｔ細胞中でサイレンシングまたは低減させて、その発現または活性が治療の有効性を低減する可能性があるＴ制御性ＣＡＲ−Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔｒｅｇ細胞）の産生を防止または低減する。
【０５３８】
【表４−１】
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【表４−２】
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【表４−３】
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【表４−４】
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【表４−５】
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【表４−６】
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【表４−７】
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【表４−８】
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【表４−９】
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【表４−１０】
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【表４−１１】
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【表４−１２】
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【表４−１３】
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【表４−１４】
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【表４−１５】
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【表４−１６】
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【表４−１７】
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【表４−１８】
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【表４−１９】
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【表４−２０】
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【表４−２１】
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【表４−２２】
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【表４−２３】
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【表４−２４】
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【表４−２５】
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【表４−２６】
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【表４−２７】
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【表４−２８】
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【表４−２９】
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【表４−３０】
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【表４−３１】
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【表４−３２】
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【表４−３３】
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【表４−３４】
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【表４−３５】
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【表４−３６】
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【表４−３７】
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【表４−３８】
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【表４−３９】
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【表４−４０】
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【０５３９】
実施形態によっては、本開示のＴ細胞は、細胞死受容体または細胞アポトーシス受容体をコードする１つ以上の遺伝子の発現をサイレンシングまたは低減するように修飾されて、本開示の武装化Ｔ細胞を産生する。細胞死受容体およびその内因性リガンドの相互作用により、アポトーシスが開始される。細胞死受容体および/または細胞アポトーシス受容体および/またはリガンドの発現、活性、または相互作用の破壊により、本開示の武装化Ｔ細胞の死滅シグナルに対する感受性を低下させ、その結果として本開示の武装化Ｔ細胞の腫瘍環境での有効性を高める。本開示の武装化Ｔ細胞中で修飾される典型的な細胞死受容体は、Ｆａｓ（ＣＤ９５）である。本開示の典型的な細胞死受容体および／または細胞アポトーシス受容体およびリガンドとして、限定はされないが、表５に示される典型的な受容体およびリガンドが挙げられる。
【０５４０】
【表５】
2020532987.tif 000293
【０５４１】
実施形態によっては、本開示のＴ細胞は、代謝感知タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子の発現をサイレンシングまたは低減するように修飾されて、本開示の武装化Ｔ細胞を産生する。本開示の武装化Ｔ細胞による（低濃度の酸素、低ｐＨ、低濃度グルコース、および少量の他分子で特徴付けられる）免疫抑制性微小腫瘍環境での代謝感知の破壊は、Ｔ細胞機能の長時間の保持をもたらし、その結果として武装化Ｔ細胞当たりに死滅する腫瘍細胞の増大に繋がる。例えば、ＨＩＦ１ａおよびＶＨＬは、低酸素環境下でＴ細胞機能の役割を果たす。本開示の武装化Ｔ細胞は、ＨＩＦ１ａまたはＶＨＬをコードする１つ以上の遺伝子の発現をサイレンシングまたは低減させてしまう可能性がある。代謝感知に関与する遺伝子およびタンパク質として、限定はされないが、表６に示される典型的な遺伝子およびタンパク質が挙げられる。
【０５４２】
【表６−１】
2020532987.tif 000294
【表６−２】
2020532987.tif 000295
【０５４３】
実施形態によっては、本開示のＴ細胞は、モノクローナル抗体を含むがん治療への感受性を付与するタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子の発現をサイレンシングまたは低減するように修飾されて、本開示の武装化Ｔ細胞を産生する。したがって、本開示の武装化Ｔ細胞は、がん治療（例えば、化学療法、モノクローナル抗体療法、または別の抗腫瘍治療）の過程中に機能して、優れた機能または有効性を示すことができる。がん治療への感受性の付与に関与するタンパク質として、限定はされないが、表７に示される典型的なタンパク質が挙げられる。
【０５４４】
【表７】
2020532987.tif 000296
【０５４５】
実施形態によっては、本開示のＴ細胞は、増殖優位因子をコードする１つ以上の遺伝子の発現をサイレンシングまたは低減するように修飾されて、武装化Ｔ細胞を産生する。発癌遺伝子の発現のサイレンシングまたは低減は、本開示の武装化Ｔ細胞に増殖優位性をもたらすことができる。例えば、ＣＡＲ−Ｔの製造過程中のＴＥＴ２遺伝子の発現のサイレンシングまたは低減（例えば発現の妨害）は、この増殖能力を欠く非武装化ＣＡＲ−Ｔと比較して、腫瘍の増殖とそれに続く根絶に対して有意な能力を持つ武装化ＣＡＲ−Ｔの産生をもたらす。この手段を安全スイッチ（例えば、本開示のｉＣ９安全スイッチ）に結合してもよい。こうすると、被験体からの副作用や武装化ＣＡＲ−Ｔの制御不能な増殖が発生する場合に、武装化ＣＡＲ−Ｔ細胞を標的とする妨害が可能になる。典型的な増殖優位性因子を表８に掲げるが、これらに限定されるものではない。
【０５４６】
【表８】
2020532987.tif 000297
【０５４７】
武装化Ｔ細胞の「欠損型または転換型受容体」手段
実施形態によっては、本開示のＴ細胞は、修飾／キメラチェックポイント受容体を発現するように修飾されて、本開示の武装化Ｔ細胞を産生する。
【０５４８】
実施形態によっては、修飾／キメラチェックポイント受容体は、欠損型受容体（null receptor）、囮受容体（decoy receptor）、または優性負受容体（dominant negative receptor、細胞内ドメインを持たない受容体のこと）を含む。本開示の欠損型受容体、囮受容体、または優性負受容体は、修飾／キメラチェックポイント受容体／タンパク質であってもよい。本開示の欠損型受容体、囮受容体、または優性負受容体は、細胞内シグナル伝達ドメインの発現のために切断されていてもよい。それに代えて、またはそれに加えて、本開示の欠損型受容体、囮受容体、または優性負受容体は、効果的なシグナル伝達を決定するか、そのために必要とされる一箇所以上のアミン酸位置で、細胞内シグナル伝達ドメイン内で変異されていてもよい。本開示の欠損型受容体、囮受容体、または優性負受容体の切断または変異は、その受容体がチェックポイントシグナルを細胞にあるいは細胞内に運搬または伝達する能力の低下を招く。
【０５４９】
例えば、腫瘍細胞の表面に発現したＰＤ−Ｌ１受容体からの免疫抑制チェックポイントシグナルの希釈または封鎖は、本開示の武装化Ｔ細胞表面の修飾／キメラＰＤ−１欠損型受容体を発現することで達成されてもよく、この希釈または封鎖は、武装化Ｔ細胞の表面に発現した内因性（非修飾の）ＰＤ−１受容体と効果的に競合して、武装化Ｔ細胞の内因性ＰＤ−１受容体を通して免疫抑制チェックポイントシグナルの形質導入を低減するか阻止する。この典型的な実施形態では、腫瘍細胞表面に発現したＰＤ−Ｌ１に結合するためのこれら２つの異なる受容体間の競合は、有効チェックポイントシグナル伝達の水準を低減または消滅させ、その結果、欠損型受容体を発現する武装化Ｔ細胞の治療能力を高める。
【０５５０】
実施形態によっては、修飾／キメラチェックポイント受容体は、膜貫通受容体である欠損型受容体、囮受容体、または優性負受容体を含む。
【０５５１】
実施形態によっては、修飾／キメラチェックポイント受容体は、膜結合性すなわち膜結合した受容体／タンパク質である欠損型受容体、囮受容体、または優性負受容体を含む。
【０５５２】
実施形態によっては、修飾／キメラチェックポイント受容体は、細胞内受容体／タンパク質である欠損型受容体、囮受容体、または優性負受容体を含む。
【０５５３】
実施形態によっては、修飾／キメラチェックポイント受容体は、細胞内受容体／タンパク質である欠損型受容体、囮受容体、または優性負受容体を含む。本開示の典型的な欠損型、囮型、または優性負型の細胞内受容体／タンパク質として、限定はされないが、抑制チェックポイントシグナルの下流のシグナル伝達成分（例えば、表２および表３に示すもの）、転写因子（例えば表４に示すもの）、サイトカインまたはサイトカイン受容体、ケモカインまたはケモカイン受容体、細胞死またはアポトーシス受容体／リガンド（例えば表５に示すもの）、代謝感知分子（例えば表６に示すもの）、がん治療への感受性を付与するタンパク質（例えば表７に示すもの）、および癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子（例えば表８に示すもの）が挙げられる。本開示の典型的なサイトカイン、サイトカイン受容体、ケモカイン、およびケモカイン受容体として、限定はされないが、表９に示すようなサイトカインおよびサイトカイン受容体、ならびにケモカインおよびケモカイン受容体が挙げられる。
【０５５４】
【表９−１】
2020532987.tif 000298
【表９−２】
2020532987.tif 000299
【表９−３】
2020532987.tif 000300
【表９−４】
2020532987.tif 000301
【表９−５】
2020532987.tif 000302
【０５５５】
実施形態によっては、修飾／キメラチェックポイント受容体は、転換型受容体を含む。典型的な転換型受容体は、本開示の修飾／キメラ受容体／タンパク質を含み、天然または野生型細胞内シグナル伝達ドメインは、タンパク質に対して非天然でも野生型ドメインでもない異なる細胞内シグナル伝達ドメインにより転換または置換される。例えば、抑制シグナル伝達ドメインを刺激シグナル伝達ドメインで置換すると、免疫抑制シグナルを免疫賦活シグナルに転換することになる。あるいは、抑制シグナル伝達ドメインを異なる抑制ドメインで置換すると、抑制シグナル伝達の水準を下げるか上げることができる。転換型受容体が発現または過剰発現すると、免疫抑制腫瘍微小環境内に発現した同族チェックポイント受容体に結合するための内因性野生型チェックポイント受容体（転換型受容体ではない）との競合を経て、同族チェックポイントシグナルは希釈および／または封鎖される。本開示の武装化Ｔ細胞は、本開示の転換型受容体をコードする配列を含んでいてもよく、本開示の１種以上の転換型受容体の発現をもたらし、その結果として本開示の武装化Ｔ細胞の活性度を変える。本開示の武装化Ｔ細胞は、本開示の転換型受容体を発現してもよく、この転換型受容体は、本開示のチェックポイント受容体、転写因子、サイトカイン受容体、細胞死受容体、代謝感知分子、がん治療、がん遺伝子、および／または腫瘍抑制タンパク質または遺伝子の下流の細胞内発現タンパク質を標的とする。
【０５５６】
本開示の典型的な転換型受容体は、限定はされないが、抑制チェックポイントシグナル（例えば表２および表３に示すもの）、転写因子（例えば表４に示すもの）、サイトカインまたはサイトカイン受容体、ケモカインまたはケモカイン受容体、細胞死またはアポトーシス受容体／リガンド（例えば表５に示すもの）、代謝感知分子（例えば表６に示すもの）、がん治療に感応性を付与するタンパク質（例えば表７に示すもの）、および癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子（例えば表８に示すもの）の下流のシグナル伝達成分を含むタンパク質を含むか、そのタンパク質に由来していてもよい。本開示の典型的なサイトカイン、サイトカイン受容体、ケモカイン、およびケモカイン受容体は、限定はされないが、表９に示すサイトカインおよびサイトカイン受容体、ならびにケモカインおよびケモカイン受容体を含む。
【０５５７】
武装化Ｔ細胞「合成遺伝子発現」手段
実施形態によっては、本開示のＴ細胞は、条件遺伝子発現を媒介するキメラリガンド受容体（ＣＬＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように修飾されて、本開示の武装化Ｔ細胞を産生する。武装化Ｔ細胞の核内でＣＬＲ／ＣＡＲと条件遺伝子発現系との組合わせが起こると、同族リガンドとＣＬＲとの結合または同族抗原とＣＡＲとの結合によって条件的に活性化される合成遺伝子発現系を構成する。この系は、例えば、腫瘍環境であるいは腫瘍環境内でリガンドまたは抗原結合部位での合成遺伝子発現を低減または制限することで、変性Ｔ細胞の治療能力の「武装化」すなわち増強を促進できる。
【０５５８】
外因性受容体
実施形態によっては、武装化Ｔ細胞は、（ａ）誘発性プロモーターをコードする配列および導入遺伝子をコードする配列を含む誘発性導入遺伝子構築物、および（ｂ）恒常的なプロモーターをコードする配列およびＣＬＲまたはＣＡＲのような外因性受容体をコードする配列を含む受容体構築物を含み、（ａ）の構築物および（ｂ）の構築物が細胞のゲノム配列内に組込まれると、外因性受容体が発現され、かつリガンドまたは抗原を結合すると、外因性受容体は、誘発性導入遺伝子（ａ）の発現を制御する誘発性プロモーターを直接的または間接的に標的とする細胞内シグナルを伝達して遺伝子発現を修飾する。
【０５５９】
本開示の合成遺伝子発現系の実施形態によっては、組成物は遺伝子発現を低減することで遺伝子発現を修飾する。実施形態によっては、組成物は遺伝子発現を一時的に（例えば、リガンドが外因性受容体に結合する間に）修飾することで遺伝子発現を修飾する。実施形態によっては、組成物は遺伝子発現を急性的に修飾する（例えば、リガンドは外因性受容体に可逆的に結合する）。実施形態によっては、組成物は遺伝子発現を慢性的に修飾する（例えば、リガンドは外因性受容体に非可逆的に結合する）。
【０５６０】
本開示の組成物の実施形態によっては、（ｂ）の外因性受容体は細胞のゲノム配列に関する内因性受容体を含む。典型的な受容体は、限定はされないが、細胞内受容体、細胞表面受容体、膜貫通受容体、リガンド依存性イオンチャネル、およびＧタンパク質結合受容体を含む。
【０５６１】
本開示の組成物の実施形態によっては、（ｂ）の外因性受容体は非天然起源の受容体を含む。実施形態によっては、非天然起源の受容体は、合成受容体、修飾受容体、組換え受容体、変異受容体、またはキメラ受容体を含む。実施形態によっては、非天然起源の受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）から単離されるかそれに由来する１つ以上の配列を含む。実施形態によっては、非天然起源の受容体は、足場タンパク質から単離されるかそれに由来する１つ以上の配列を含む。実施形態によっては、非天然起源の受容体が膜貫通ドメインを含まない実施形態を含み、非天然起源の受容体は、第２の膜貫通受容体、膜結合受容体、および／または細胞内受容体と相互作用し、非天然起源の受容体と接触して細胞内シグナルを伝達する。
【０５６２】
本開示の組成物の実施形態によっては、（ｂ）の外因性受容体は非天然起源の受容体を含む。実施形態によっては、非天然起源の受容体は、合成受容体、修飾受容体、組換え受容体、変異受容体、またはキメラ受容体を含む。実施形態によっては、非天然起源の受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）から単離されるかそれに由来する１つ以上の配列を含む。実施形態によっては、非天然起源の受容体は、足場タンパク質から単離されるかそれに由来する１つ以上の配列を含む。実施形態によっては、非天然起源の受容体は膜貫通ドメインを含む。実施形態によっては、非天然起源の受容体は、細胞内シグナルを伝達する細胞内受容体と相互作用する。実施形態によっては、非天然起源の受容体は細胞内シグナル伝達ドメインを含む。実施形態によっては、非天然起源の受容体はキメラリガンド受容体（ＣＬＲ）である。実施形態によっては、ＣＬＲはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。
【０５６３】
本開示の組成物の実施形態によっては、（ｂ）の外因性受容体は非天然起源の受容体を含む。実施形態によっては、ＣＬＲはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。実施形態によっては、キメラリガンド受容体は、（ａ）少なくとも１種の足場タンパク質を含むリガンド認識領域を含む外部ドメイン、（ｂ）膜貫通ドメイン、および（ｃ）少なくとも１つの共刺激ドメインを含む内部ドメインを含む。実施形態によっては、（ａ）の外部ドメインはさらにシグナルペプチドを含む。実施形態によっては、（ａ）の外部ドメインはさらにリガンド認識領域と膜貫通ドメインの間にヒンジを含む。
【０５６４】
本開示のＣＬＲ／ＣＡＲの実施形態によっては、シグナルペプチドは、ヒトＣＤ２、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ１９、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、またはＧＭ−ＣＳＦＲシグナルペプチドをコードする配列を含む。実施形態によっては、シグナルペプチドは、ヒトＣＤ８αシグナルペプチドをコードする配列を含む。実施形態によっては、シグナルペプチドは、MALPVTALLLPLALLLHAARP（配列番号：17000）を含むアミノ酸配列を含む。実施形態によっては、シグナルペプチドは
【化１６９】
2020532987.tif 000303
（配列番号：17001）を含む核酸配列によりコードされている。
【０５６５】
本開示のＣＬＲ／ＣＡＲの実施形態によっては、膜貫通ドメインは、ヒトＣＤ２、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ１９、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、またはＧＭ−ＣＳＦＲ膜貫通ドメインをコードする配列を含む。実施形態によっては、膜貫通ドメインは、ヒトＣＤ８α膜貫通ドメインをコードする配列を含む。実施形態によっては、膜貫通ドメインは、IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC（配列番号：17002）を含むアミノ酸配列を含む。実施形態によっては、膜貫通ドメインは、
【化１７０】
2020532987.tif 000304
（配列番号：17003）を含む核酸配列によりコードされている。
【０５６６】
本開示のＣＬＲ／ＣＡＲの実施形態によっては、内部ドメインはヒトＣＤ３ζ内部ドメインを含む。実施形態によっては、少なくとも１つの共刺激ドメインは、ヒト４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ３ζ、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、ＭｙＤ８８、ＯＸ−４０細胞内セグメントまたはそれらの任意の組み合わせを含む。実施形態によっては、少なくとも１つの共刺激ドメインは、ヒトＣＤ３ζおよび／または４−１ＢＢ共刺激ドメインを含む。実施形態によっては、ＣＤ３ζ共刺激ドメインは、
【化１７１】
2020532987.tif 000305
（配列番号：17004）を含むアミノ酸配列を含む。実施形態によっては、ＣＤ３ζ共刺激ドメインは、
【化１７２】
2020532987.tif 000306
（配列番号：17005）を含む核酸配列によりコードされている。実施形態によっては、４−１ＢＢ共刺激ドメインは、
【化１７３】
2020532987.tif 000307
（配列番号：17006）を含むアミノ酸配列を含む。実施形態によっては、４−１ＢＢ共刺激ドメインは、
【化１７４】
2020532987.tif 000308
（配列番号：17007）を含む核酸配列によりコードされている。実施形態によっては、４−１ＢＢ共刺激ドメインは、膜貫通ドメインとＣＤ３ζ共刺激ドメインの間に位置する。
本開示のＣＬＲ／ＣＡＲの実施形態によっては、ヒンジは、ヒトＣＤ８α、ＩｇＧ４、および／またはＣＤ４配列に由来する配列を含む。実施形態によっては、ヒンジはヒトＣＤ８α配列に由来する配列を含む。実施形態によっては、ヒンジは、
【化１７５】
2020532987.tif 000309
（配列番号：17008）を含むアミノ酸配列を含む。実施形態によっては、ヒンジは、
【化１７６】
2020532987.tif 000310
（配列番号：17028）を含む核酸配列によってコードされている。実施形態によっては、ヒンジは、
【化１７７】
2020532987.tif 000311
（配列番号17009）を含む核酸配列によってコードされている。実施形態によっては、少なくとも１つのタンパク質足場はリガンドに特異的に結合する。
【０５６７】
本開示の組成物の実施形態によっては、（ｂ）の外因性受容体は非天然起源の受容体を含む。実施形態によっては、ＣＬＲはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。実施形態によっては、キメラリガンド受容体は、（ａ）少なくとも１種の足場タンパク質を含むリガンド認識領域を含む外部ドメイン、（ｂ）膜貫通ドメイン、および（ｃ）少なくとも１つの共刺激ドメインを含む内部ドメインを含む。実施形態によっては、少なくとも１種の足場タンパク質は、抗体、抗体断片、単一ドメイン抗体、単鎖抗体、抗体模倣物、またはセンチリン（ここではCARTyrinと呼ぶ）を含む。実施形態によっては、リガンド認識領域は、抗体、抗体断片、単一ドメイン抗体、単鎖抗体、抗体模倣物、およびセンチリンのうちの１種以上を含む。実施形態によっては、単一ドメイン抗体は、ＶＨＨまたはＶＨ（ここではＶＣＡＲと呼ぶ）を含むかこれからなる。実施形態によっては、単一ドメイン抗体は、ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むＶＨＨまたはＶＨを含むかこれからなる。実施形態によっては、ＶＨは組換えまたはキメラタンパク質である。実施形態によっては、ＶＨはヒト組換えまたはキメラタンパク質である。実施形態によっては、抗体模倣物は、アフィボディ、アフィリン、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アンチカリン、アビマー、DARPin、ファイノマー（Fynomer）、クニッツドメインペプチド（Kunitz domain peptide）、またはモノボディを含むかこれからなる。実施形態によっては、センチリンは少なくとも１種のフィブロネクチンIII 型（ＦＮ３）ドメインの共通配列を含むかこれからなる。
【０５６８】
本開示の組成物の実施形態によっては、（ｂ）の外因性受容体は非天然起源の受容体を含む。実施形態によっては、ＣＬＲはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。実施形態によっては、キメラリガンド受容体は、（ａ）少なくとも１種の足場タンパク質を含むリガンド認識領域を含む外部ドメイン、（ｂ）膜貫通ドメイン、および（ｃ）少なくとも１つの共刺激ドメインを含む内部ドメインを含む。実施形態によっては、センチリンは、少なくとも１つのフィブロネクチンIII 型（ＦＮ３）ドメインの共通配列を含むかこれからなる。実施形態によっては、少なくとも１つのフィブロネクチンIII 型（ＦＮ３）ドメインはヒトタンパク質由来である。実施形態によっては、ヒトタンパク質はテネイシン−Ｃである。実施形態によっては、共通配列は、
【化１７８】
2020532987.tif 000312
（配列番号：17010）を含む。実施形態によっては、共通配列は、
【化１７９】
2020532987.tif 000313
（配列番号：17011）を含む。実施形態によっては、共通配列は次のうちの１箇所以上の位置で修飾される：（ａ）共通配列の位置１３〜１６にあるアミノ酸残基TEDSを含むかそれからなるＡ−Ｂループ；（ｂ）共通配列の位置２２〜２８にあるアミノ酸残基TAPDAAFを含むかそれからなるＢ−Ｃループ；（ｃ）共通配列の位置３８〜４３にあるアミン酸残基SEKVGEを含むかそれからなるＣ−Ｄループ；（ｄ）共通配列の位置５１〜５４にあるアミン酸残基GSERを含むかそれからなるＤ−Ｅループ；（ｅ）共通配列の位置６０〜６４にあるアミン酸残基GLKPGを含むかそれからなるＥ−Ｆループ；（ｆ）共通配列の位置７５〜８１にあるアミン酸残基KGGHRSNを含むかそれからなるＦ−Ｇループ；または（ｇ）これら（ａ）〜（ｆ）の任意の組合わせ。実施形態によっては、センチリンは少なくとも５個のフィブロネクチンIII 型（ＦＮ３）ドメインの共通配列を含む。実施形態によっては、センチリンは少なくとも１０個のフィブロネクチンIII 型（ＦＮ３）ドメインの共通配列を含む。実施形態によっては、センチリンは少なくとも１５個のフィブロネクチンIII 型（ＦＮ３）ドメインの共通配列を含む。実施形態によっては、足場は１０-9Ｍ以下の、１０-10Ｍ以下の、１０-11Ｍ以下の、１０-12Ｍ以下の、１０-13Ｍ以下の、１０-14Ｍ以下の、また１０-15Ｍ以下のＫD値から選ばれた少なくとも１つの親和性で抗原に結合する。実施形態によっては、ＫD値は表面プラズモン共鳴により決定される。
【０５６９】
誘発性プロモーター
本開示の組成物の特定の実施形態では、（ａ）の誘発性プロモーターをコードする配列は、ＮＦKＢプロモーターをコードする配列を含む。本開示の組成物の特定の実施形態では、（ａ）の誘発性プロモーターをコードする配列は、インターフェロン（ＩＦＮ）プロモーターをコードする配列、またはインターロイキン２プロモーターをコードする配列を含む。本開示の組成物の特定の実施形態では、（ａ）の誘発性プロモーターをコードする配列は、核内受容体サブファミリー４グループＡメンバー１（ＮＲ４Ａ１；ＮＵＲ７７としても公知）プロモーターをコードする配列、すなわちＮＲ４Ａ１プロモーターをコードする配列を含む。本開示の組成物の特定の実施形態では、（ａ）の誘発性プロモーターをコードする配列は、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ５プロモーターをコードする配列、すなわちＣＤ５プロモーターをコードする配列を含む。特定の実施形態では、インターフェロン（ＩＦＮ）プロモーターはＩＦＮγプロモーターである。本開示の組成物の特定の実施形態では、誘発性プロモーターは、サイトカインまたはケモカインのプロモーターから単離されるかそのプロモーターに由来する。特定の実施形態では、サイトカインまたはケモカインは、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１７Ａ／Ｆ、ＩＬ２１、ＩＬ２２、ＩＬ２３、形質転換増殖因子β（ＴＧＦβ）、コロニー刺激因子２（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦα）、ＬＴα、パーフォリン、グランザイムＣ（Ｇｚｍｃ）、グランザイムＢ（Ｇｚｍｂ）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド５（ＣＣＬ５）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド４（ＣＣＬ４）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド３（ＣＣＬ３）、Ｘ−Ｃモチーフケモカインリガンド１（ＸＣＬ１）、およびＬＩＦインターロイキン６ファミリーサイトカイン（Ｌｉｆ）を含む。
【０５７０】
本開示の組成物の特定の実施形態では、（ａ）の誘発性プロモーターをコードする配列がＮＲ４Ａ１プロモーターをコードする配列を含む実施形態を含み、ＮＲ４Ａ１プロモーターは、Ｔ細胞中のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）刺激によって、かつＢ細胞中のＢ細胞受容体（ＢＣＲ）刺激によって活性化され、それによって、それぞれＴＣＲまたはＢＣＲを経て本開示のＴ細胞またはＢ細胞が活性化するとＮＲ４Ａ１プロモーターの制御下で任意の配列の発現が誘発される。
【０５７１】
本開示の組成物の特定の実施形態では、（ａ）の誘発性プロモーターをコードする配列がＣＤ５プロモーターをコードする配列を含む実施形態を含み、ＣＤ５プロモーターは、Ｔ細胞中のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）刺激によって活性化され、それによって、ＴＣＲを経て本開示のＴ細胞が活性化するとＣＤ５プロモーターの制御下で任意の配列の発現が誘発される。
【０５７２】
本開示の組成物の特定の実施形態では、誘発性プロモーターは、細胞分化、活性化、消耗および機能に関与する表面タンパク質を含む遺伝子のプロモーターから単離されるか、そのプロモーターに由来する。特定の実施形態では、遺伝子は、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ−３、ＧＩＴＲ、ＭＨＣII、ＣＯＸ−２、ＦＡＳＬ、および４−１ＢＢを含む。
【０５７３】
本開示の組成物の実施形態によっては、誘発性プロモーターは、ＣＤ代謝および分化に関与する遺伝子のプロモーターから単離されるか、そのプロモーターに由来する。本開示の組成物の実施形態によっては、誘発性プロモーターは、Ｎｒ４ａ１、Ｎｒ４ａ３、Ｔｎｆｒｓｆ９（４−１ＢＢ）、Ｓｅｍａ７ａ、Ｚｆｐ３６ｌ２、Ｇａｄｄ４５ｂ、Ｄｕｓｐ５、Ｄｕｓｐ６、およびＮｅｔｏ２のプロモーターから単離されるか、そのプロモーターに由来する。
【０５７４】
誘発性導入遺伝子
実施形態によっては、誘発性導入遺伝子構築物は、抑制チェックポイントシグナル（例えば表２と表３に示す）、転写因子（例えば表４に示す）、サイトカインまたはサイトカイン受容体、ケモカインまたはケモカイン受容体、細胞死またはアポトーシス受容体／リガンド（例えば表５に示す）、代謝感知分子（例えば表６に示す）、がん治療に対する感受性を付与するタンパク質（例えば表７および／または表１に示す）、および癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子（例えば表８に示す）の下流のシグナル伝達成分の発現を含むか、あるいはそれらの発現を駆動する。本開示の典型的なサイトカイン、サイトカイン受容体、ケモカインおよびケモカイン受容体として、限定はされないが、表９に示すサイトカインおよびサイトカイン受容体ならびにケモカインおよびケモカイン受容体が挙げられる。
【０５７５】
Ｃａｓ−Ｃｌｏｖｅｒ
本開示は、ガイドＲＮＡおよび融合タンパク質またはその融合タンパク質をコードする配列を含む組成物を提供し、この融合タンパク質はｄＣａｓ９およびＣｌｏ０５１エンドヌクレアーゼまたはそのヌクレアーゼドメインを含む。
【０５７６】
小Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）
本開示は、エフェクターに動作可能に結合した小Ｃａｓ９を含む組成物を提供する。特定の実施形態では、本開示はＤＮＡ局在化成分およびエフェクター分子を含むか、本質的にこれらからなるか、あるいはこれらからなる融合タンパク質を提供し、このエフェクターは小Ｃａｓ９を含む。特定の実施形態では、本開示の小Ｃａｓ９構築物は、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼを含むエフェクターを含んでもよい。
【０５７７】
活性触媒部位を有する黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９のアミノ酸配列。
【化１８０】
2020532987.tif 000314
（配列番号：17074）
【０５７８】
不活化小Ｃａｓ９（ｄＳａＣａｓ９）
本開示は、エフェクターに動作可能に結合した不活化小Ｃａｓ９（ｄＳａＣａｓ９）を含む組成物を提供する。特定の実施形態では、本開示はＤＮＡ局在化成分およびエフェクター分子を含むか、本質的にこれらからなるか、またはこれらからなる融合タンパク質を提供し、このエフェクターは不活化小Ｃａｓ９（ｄＳａＣａｓ９）を含む。特定の実施形態では、本開示の不活化小Ｃａｓ９（ｄＳａＣａｓ９）構築物は、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼを含むエフェクターを含んでもよい。
【０５７９】
ｄＳａＣａｓ９配列：Ｄ１０ＡおよびＮ５８０Ａ変異（太字、大文字、および下線付き）は、触媒部位を不活化する。
【化１８１】
2020532987.tif 000315
（配列番号：17075）
【０５８０】
不活化Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）
本開示は、エフェクターに動作可能に結合した不活化Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）を含む組成物を提供する。特定の実施形態では、本開示はＤＮＡ局在化成分およびエフェクター分子を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる融合タンパク質を提供し、このエフェクターは不活化Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）を含む。特定の実施形態では、本開示の不活化Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）構築物は、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼを含むエフェクターを含んでもよい。
【０５８１】
特定の実施形態では、本開示のｄＣａｓ９は、化膿性ブドウ球菌から単離されるかそれに由来するｄＣａｓ９を含む。特定の実施形態では、ｄＣａｓ９は、触媒部位を不活化するｄＣａｓ９のアミノ酸配列の位置１０および８４０が置換されたｄＣａｓ９を含む。特定の実施形態では、これらの置換はＤ１０ＡおよびＨ８４０Ａである。特定の実施形態では、ｄＣａｓ９のアミノ酸配列は以下の配列を含む。
【化１８２】
2020532987.tif 000316
（配列番号：17076）
【０５８２】
特定の実施形態では、ｄＣａｓ９のアミノ酸配列は以下の配列を含む。
【化１８３】
2020532987.tif 000317
（配列番号：17077）
【０５８３】
Ｃｌｏ０５１エンドヌクレアーゼ
典型的なＣｌｏ０５１ヌクレアーゼドメインは、以下の配列を含むか、本質的にそれからなるか、あるいはそれからなる。
【化１８４】
2020532987.tif 000318
（配列番号：17078）
【０５８４】
Cas-Clover融合タンパク質
特定の実施形態では、典型的なｄＣａｓ９-Ｃｌｏ０５１融合タンパク質（実施形態１）は、以下のアミノ酸配列を含んでもよいか、本質的にそれからなってもよいか、またはそれからなってもよい。以下の配列で、下線付き部はＣｌｏ０５１配列、リンカー部は太字イタリック体、およびｄＣａｓ９配列（化膿性ブドウ球菌）部はイタリック体である。
【化１８５】
2020532987.tif 000319
（配列番号：17079）
【０５８５】
特定の実施形態では、典型的なｄＣａｓ９-Ｃｌｏ０５１融合タンパク質（実施形態１）は、以下の核酸配列を含んでもよいか、本質的にそれからなってもよいか、またはそれからなってもよい。以下の配列は、化膿性ブドウ球菌由来のｄＣａｓ９配列である。
【化１８６】
2020532987.tif 000320
【化１８７】
2020532987.tif 000321
（配列番号：17080）
【０５８６】
特定の実施形態では、本開示のｄＣａｓ９-Ｃｌｏ０５１融合タンパク質（実施形態１）をコードする核酸配列はＤＮＡを含んでもよい。特定の実施形態では、本開示のｄＣａｓ９-Ｃｌｏ０５１融合タンパク質（実施形態１）をコードする核酸配列はＲＮＡを含んでもよい。
【０５８７】
特定の実施形態では、典型的なｄＣａｓ９-Ｃｌｏ０５１融合タンパク質（実施形態２）は、以下のアミノ酸配列を含んでもよいか、本質的にそれからなってもよいか、またはそれからなってもよい。以下の配列で、下線付き部はＣｌｏ０５１配列、リンカー部は太字イタリック体、およびｄＣａｓ９配列（化膿性ブドウ球菌）部はイタリック体である。
【化１８８】
2020532987.tif 000322
（配列番号：17081）
【０５８８】
特定の実施形態では、典型的なｄＣａｓ９-Ｃｌｏ０５１融合タンパク質（実施形態２）は、以下の核酸配列を含んでもよいか、本質的にそれからなってもよいか、またはそれからなってもよい。以下の配列は、化膿性ブドウ球菌由来のｄＣａｓ９配列である。
【化１８９】
2020532987.tif 000323
【化１９０】
2020532987.tif 000324
（配列番号：17082）
【０５８９】
特定の実施形態では、本開示のｄＣａｓ９-Ｃｌｏ０５１融合タンパク質（実施形態２）をコードする核酸配列はＤＮＡを含んでもよい。特定の実施形態では、本開示のｄＣａｓ９-Ｃｌｏ０５１融合タンパク質（実施形態２）をコードする核酸配列はＲＮＡを含んでもよい。
【実施例】
【０５９０】
実施例１：修飾Ｔ細胞での発現のためのＮＦ−ＫＢ誘発性ベクターの設計
２つのＴ細胞活性化ＮＦ−ＫＢ誘発性ベクターを開発した（図１ＡおよびＢ）。これらベクターの一方は順方向の遺伝子発現系（ＧＥＳ）を持ち（Ａ）、他方は相補性方向の遺伝子発現系を持ち（Ｂ）、両方とも恒常的にＥＦ１ａプロモーターに先行する位置にある。これらのベクターはまた、Ｔ２Ａ配列によって分離されたＣＡＲ分子およびＤＨＦＲ選択遺伝子の発現を誘導する。条件付きＮＦ−ＫＢ誘発系およびＥＦ１ａ誘導遺伝子の両方は、ＥＰを使用してＴ細胞内に永久的に組込みが可能なpiggyBacトランスポゾンの一部分である。ゲノム内に一旦組込まれると、Ｔ細胞は膜表面のＣＡＲおよび細胞内のＤＨＦＲを恒常的に発現するが、ＮＦ−ＫＢ誘発性遺伝子すなわちＧＦＰの発現は、Ｔ細胞の活性化のみによって最高濃度まで発現される。
【０５９１】
実施例２：修飾Ｔ細胞でのＧＦＰ発現のためのＮＦ−ＫＢ誘発性ベクター
Ｔ細胞は、順方向（ｐＮＦＫＢ−ＧＦＰ順方向）または逆方向（ｐＮＦＫＢ−ＧＦＰ逆方向）のいずれかでＧＦＰ発現を駆動するＮＦ-ＫＢ誘発性発現系の不在（遺伝子発現系（ＧＥＳ）の制御無し）または存在に併せて、抗BCMA CARおよびＤＨＦＲムテイン遺伝子を発現するpiggyBacベクターにより、ＥＦ１ａプロモーターの制御下で核酸注入された。細胞を、メトトレキサート選択の存在下で細胞がほぼ完全に休止するまで培養し（１９日目まで）、５日目と１９日目にＧＦＰ発現を評価した。５日目には、すべてのＴ細胞が増殖しかつ高度に刺激されて、その細胞は、強いＮＦκＢ活性により高濃度のＧＦＰを産生するＮＦ−ＫＢ誘発性発現カセットを持っていた（図２を参照）。ＧＥＳ制御の無い細胞では、検出可能な濃度のＧＦＰを発現しなかった。１９日目では、ＮＦκＢ活性が低くなるので、ＧＥＳ  Ｔ細胞はほぼ完全に休止し、ＧＦＰ発現は５日目よりも顕著に低かった（約１／８のＭＦＩ）。ＧＦＰ発現は１９日目でも依然観察されたが、これはＧＦＰタンパク質の半減期が長い（約３０時間）ことに起因するか、あるいは例えばＴＣＲ、ＣＡＲ、サイトカイン受容体、または成長因子受容体シグナルによるＮＦκＢの基底濃度に起因する可能性がある。
【０５９２】
実施例３：修飾Ｔ細胞での抗BCMA CAR媒介ＧＦＰ発現のためのＮＦ−ＫＢ誘発性ベクター
Ｔ細胞は、順方向（ｐＮＦＫＢ−ＧＦＰ順方向）または逆方向（ｐＮＦＫＢ−ＧＦＰ逆方向）のいずれかでＧＦＰ発現を駆動するＮＦ-ＫＢ誘発発現系の不在（遺伝子発現系（ＧＥＳ）の制御無し）または存在に併せて、抗BCMA CARおよびＤＨＦＲムテイン遺伝子を発現するpiggyBacベクターにより、ＥＦ１ａプロモーターの制御下で修飾されなかったか（偽Ｔ細胞）、または核酸注入された。すべての細胞を、メトトレキサート選択の存在あるいは不在（偽Ｔ細胞）に併せて、細胞がほぼ完全に休止するまで２２日間培養した。細胞をその後、ＢＣＭＡ−（Ｋ５６２）、ＢＭＣＡ＋（ＲＰＭＩ８２２６）、または陽性対照の抗ＣＤ３抗ＣＤ２８活性化試薬（ＣＤ３／２８による刺激）の不在下（刺激は無し）または存在下で３日間刺激した。ＧＦＰ発現は、ＧＥＳの制御が無いか、または偽Ｔ細胞を使用したすべての条件下では、検出不可であった。しかし、ｐＮＦＫＢ−ＧＦＰの順方向および逆方向での置換細胞は、ＢＣＭＡ−Ｋ５６２細胞により培養した場合に、刺激無しの制御下ではＧＦＰ発現が殆ど現れなかったが、両方の置換細胞とも、ＢＣＭＡ＋腫瘍細胞の存在下または陽性制御下のいずれでも遺伝子発現の劇的な増加を示した（図３）。ＢＣＭＡ＋腫瘍細胞と共培養されたｐＮＦＫＢ−ＧＦＰの順方向および逆方向での置換細胞間では、ＧＦＰ発現に殆ど差が見られなかった。
【０５９３】
実施例４：修飾Ｔ細胞での抗BCMA CAR媒介発現の制御
誘発性遺伝子の発現濃度は、誘発性プロモーターの上流にあるか、または先行する応答要素の数によって調節できる。抗BCMA CARTyrin、続いて選択遺伝子を、両方ともヒトＥＦ１ａプロモーターにより制御してコードするpiggyBacベクターによって、Ｔ細胞は核酸注入された（図４）。さらにベクターは、切断されたＣＤ１９タンパク質（ｄＣＤ１９）の発現を駆動する条件付きＮＦ−ＫＢ誘発性遺伝子発現系を付加的にコードし、かつ０〜５のＧＥＳで変化する複数のＮＦＫＢ応答要素（ＲＥ）を含むようにするか、または電気穿孔パルスを受けるがpiggyBac核酸（偽）を受けないようにした。データは、逆（反対）方向のＧＥＳについてのみ表示される。すべての細胞を１８日間培養し、メトトレキサートの添加を使用してpiggyBac修飾Ｔ細胞の選択を行った。次に、抗ＣＤ３抗ＣＤ２８ビーズ活性化試薬を使用して細胞を３日間刺激し、ｄＣＤ１９表面発現を０、３、および１８日目にＦＡＣＳにより評価して、データをＦＡＣＳヒストグラムおよび標的タンパク質染色のＭＦＩとして示した。表面ｄＣＤ１９発現は、ＧＥＳをコードするベクターにより置換されたすべてのＴ細胞で０日目には低濃度で検出された。刺激後３日目で、ＧＥＳを発現するすべてのＴ細胞でｄＣＤ１９発現の劇的な増加が観察され、より多数のＲＥの細胞では表面発現がより大きな倍率で増加した。したがってｄＣＤ１９表面発現は、ＧＥＳでコードされたＲＥの数に正比例していた。ＧＥＳを含まない、すなわちＧＥＳ無しおよびモック（偽）の参照ではＴ細胞の表面にｄＣＤ１９は検出されなかった。
【０５９４】
実施例５：修飾Ｔ細胞でのヒト第IX因子の発現
第IX因子の遺伝子欠損（図５）は、血友病Ｂと呼ばれる生命を脅かす病気に繋がる。血友病Ｂは、２万５千人に１人から３万人に１人の割合で発症する稀な病気である。本開示の組成物や方法の開発の以前には、血友病Ｂの標準治療は、年間約２５万ドルの費用をかけて、２〜３日毎に組換え第IX因子タンパク質が注射されてきた。
【０５９５】
Ｔ細胞は、数十年にわたってヒト内に保持されるので、頻繁な注入を必要とせずに血友病Ｂ患者に欠乏する第IX因子を供給するように第IX因子を分泌する理想的な媒介物である。Ｔ細胞をPiggyBacで置換させて、第IX因子を分泌させた。ＦＡＣＳを使用して、ヒト第IX因子導入遺伝子をコードする遺伝子導入Ｔ細胞のＴ細胞マーカーを測定した（図６）。これらの修飾Ｔ細胞は、ヒト第IX因子を分泌することができ（図７Ａ）、この分泌第IX因子は凝固活性を示した（図７Ｂ）。
【０５９６】
実施例６：武装化Ｔ細胞表面でのチェックポイントシグナル伝達タンパク質のノックダウン効率
武装化Ｔ細胞を産生する別の手段は、細胞内シグナル伝達ドメインを変化させたかまたはそのドメインを持たない様々な修飾／キメラチェックポイント受容体を発現させて、内因性チェックポイントシグナル伝達を低減または阻害することにある。武装化Ｔ細胞を産生する１つの機構は、チェックポイントシグナル伝達を阻害し、種々のチェックポイント受容体をノックアウトすることである。Cas-CLOVERTMプラットフォームを使用して、休止（または静止）した全始原Ｔ細胞中のチェックポイント受容体であるＰＤ−１、ＴＧＦβＲ２、ＬＡＧ−３、Ｔｉｍ−３、およびＣＴＬＡ−４を標的化しノックアウトした。フローサイトメトリーでの測定のように、遺伝子編集は、細胞表面でのタンパク質発現に３０〜７０％の損失をもたらした（図１０）。これらの結果は、Cas-CLOVERTMがこれらの遺伝子のノックアウトを効率的に標的化して、Ｔ細胞表面での標的タンパク質の発現に損失をもたらすことを示している。ノックアウト効率は、ガイドＲＮＡ対をさらに最適化するか、同一遺伝子および／または標的遺伝子のレギュレーターまたはプロモーターを標的とする追加のガイドＲＮＡ対を使用して、顕著に増大できる。
【０５９７】
実施例７：武装化Ｔ細胞表面での欠損型または転換型細胞内シグナル伝達タンパク質の発現手段
武装化Ｔ細胞を産生する別の手段は、細胞内シグナル伝達ドメインを変化させたかまたはそのドメインを持たない様々な修飾／キメラチェックポイント受容体を発現させて、内因性チェックポイントシグナル伝達を低減または阻害することにある。この手段を用いて標的化できるチェックポイントシグナルとして、それぞれＰＤ−Ｌ１リガンドおよびＴＧＦβサイトカインに結合するＴ細胞のＰＤ−１またはＴＧＦβＲIIが挙げられる。図１１は、２つの異なる抑制受容体（ＰＤ−１（上部の図）およびＴＧＦβＲII（下部の図））に対する囮受容体／欠損型受容体／優性負受容体（欠損型受容体）を産生するための種々の手段の概略図を示している。欠損型受容体を設計するには、ＰＤ−１またはＴＧＦβＲIIの細胞内ドメイン（ＩＣＤ）を変異（変異欠損型）または切断（切断欠損型）できる。結果として、欠損型受容体の同族リガンドが結合しても、チェックポイントシグナルはＴ細胞へ送達されない。さらに、欠損型受容体は内因性リガンドの結合において野生型受容体と競合するので、欠損型受容体によるいずれの結合も、内因性リガンドの野生型受容体への結合を引き起こさない。これにより、Ｔ細胞に効果的に送達されるチェックポイントシグナル伝達の全体的な濃度が希釈され、チェックポイントの阻害が軽減または阻止される。図１１はまた、抑制受容体ＰＤ−１（上部の図）およびＴＧＦβＲII（下部の図）の転換型受容体のための設計手段も示している。転換型受容体では、野生型ＩＣＤは、免疫刺激分子（共刺激スイッチ）または異なる抑制分子（抑制スイッチ）のいずれかからのＩＣＤにより置換される。免疫刺激分子として、限定はされないが、ＣＤ３ｚ、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、および表２に列記された例が挙げられる。抑制分子として、限定はされないが、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、Ｌａｇ３、および表２に列記された例が挙げられる。前者の場合には、修飾転換型受容体による内因性リガンドの結合は、Ｔ細胞への陽性シグナルの送達をもたらし、それによりＴ細胞の刺激の増大に役立って腫瘍の標的化および死滅の継続を促進する。後者の場合には、修飾転換型受容体による内因性リガンドの結合により、陰性シグナルがＴ細胞に送達され、それによりＴ細胞の刺激および活性を低減させるのに役立つ。
【０５９８】
実施例８：武装化Ｔ細胞表面でのＰＤ１およびＴＧＦβＲIIの欠損型または転換型細胞内シグナル伝達タンパク質の表面発現の増強
武装化Ｔ細胞を産生するように、代替シグナルペプチド（ＳＰ）および膜貫通ドメイン（ＴＭ）を発現する複数の切断欠損型受容体を設計して、修飾Ｔ細胞表面での最大発現量について試験した。図１２は、ＰＤ−１（上部の図）およびＴＧＦβＲII（下部の図）のいくつかの欠損型受容体構築物の概略図を示す。これらのタンパク質の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、野生型シグナルペプチド（ＳＰ）および／または膜貫通ドメイン（ＴＭ）がヒトＴ細胞ＣＤ８ａ受容体からのドメインにより置換される（赤い矢印）ように修飾された。図１２に示される６個の切断欠損型構築物は、それぞれＤＮＡ合成されて、mRNA IVT DNAベクター（ｐＲＴ）にサブクローニングされた。それぞれで静脈内注入を経て高品質のｍＲＮＡが産生された。６個の各々の分子をコードするｍＲＮＡの遺伝子導入は、ヒト始原Ｔ細胞への電気穿孔（ＥＰ）送達を使用して実施され、ＦＡＣＳ解析はＥＰの２４時間後に実行されて、細胞表面の各構築物の発現濃度を評価した（図１３）。フローサイトメトリーにより、WT SPを代替のＣＤ８ａ（02.8aSP-PD-1および02.8aSP-TGFβRII）により置換すると、Ｔ細胞表面で最高濃度の発現が生じた。02.8aSP-PD-1欠損型受容体は、４３，６８０のＭＦＩを示し、これは内因性Ｔ細胞ＰＤ−１発現より１７７倍高く、WT PD-1欠損型受容体より２．８倍高かった。02.8aSP-TGFβRII欠損型受容体は、１３，８０９のＭＦＩを示し、これは内因性Ｔ細胞TGFβRIIの発現より１０２倍高く、WT TGFβRII欠損型受容体より１．８倍高かった。これらの結果は、ＰＤ−１およびＴＧＦβＲII抑制タンパク質の両方について、野生型ＳＰを代替のCD8a SPで置換すると、欠損型受容体または転換型受容体の表面発現の増大に繋がることを示している。これにより、次第に天然のリガンドが結合すると、それぞれチェックポイント阻害または共刺激が最大化される。
【０５９９】
［参照による組込み］
相互参照した特許または出願あるいは関連する特許または出願を含む本明細書内に引用されたいずれの文書も、明示的に除外または他に限定されない限り、その全体が参照により本明細書内に組込まれる。任意の文書の引用は、その文書が本明細書内に開示または請求されたいずれかの発明に関する先行技術であること、あるいはその文書が単独でまたは他の参考文書と組合せてその発明を教示、示唆、または開示することを認めるものではない。さらに、本文書内の用語の意味または定義が参照により組込まれた文書内の同一の用語の意味または定義と食い違う範囲では、本文書でその用語に割当てられた意味または定義が優先される。
【０６００】
［他の形態］
本開示の特定の実施形態を図示して説明してきたが、本開示の趣旨および範囲から逸脱することなく、その他の種々の変更および修飾を施すことができる。添付の特許請求の範囲は、本開示の範囲内にあるすべてのその変更および修飾を含む。
【図１Ａ】
2020532987.tif 000342
【図１Ｂ】
2020532987.tif 000343
【図２】
2020532987.tif 000344
【図３】
2020532987.tif 000345
【図４−１】
2020532987.tif 000346
【図４−２】
2020532987.tif 000347
【図４−３】
2020532987.tif 000348
【図５】
2020532987.tif 000349
【図６】
2020532987.tif 000350
【図７】
2020532987.tif 000351
【図８】
2020532987.tif 000352
【図９】
2020532987.tif 000353
【図１０】
2020532987.tif 000354
【図１１】
2020532987.tif 000355
【図１２】
2020532987.tif 000356
【図１３】
2020532987.tif 000357
【図１４】
2020532987.tif 000358
【図１５】
2020532987.tif 000359
【図１６】
2020532987.tif 000360
【図１７】
2020532987.tif 000361
【配列表】
2020532987000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年5月8日(2020.5.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）Ｔ細胞集団を提供し、ここで、この集団中の複数のＴ細胞は少なくとも１つのキメラリガンド受容体（ＣＬＲ）および少なくとも１つの誘発性導入遺伝子構築物を含み、
ここで、ＣＬＲは、（ｉ）シグナルペプチドと少なくとも１つの足場タンパク質を含むリガンド認識領域を含む外部ドメイン；（ｉｉ）膜貫通ドメイン；および（ｉｉｉ）少なくとも１つの共刺激ドメインを含む内部ドメインを含む、膜貫通型タンパク質であり、
ここで、少なくとも１つの誘発性導入遺伝子構築物は、誘発性プロモーターをコードする配列および導入遺伝子をコードする配列を含み；そして
ｂ）Ｔ細胞集団を、少なくとも１つのＣＬＲのリガンド認識領域に結合するリガンドと接触させ、
ここで、リガンドがリガンド認識領域に結合すると、少なくとも１つのＣＬＲの内部ドドメインが、誘発性プロモーターを標的とする細胞内シグナルを伝達し、複数のＴ細胞内で導入遺伝子の発現をもたらす、
ことを含む、導入遺伝子を発現させる方法。
【請求項２】
（ｉ）の外部ドメインが、リガンド認識領域と膜貫通ドメインの間にヒンジをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも１つのタンパク質足場が、抗体、抗体断片、単一ドメイン抗体、単鎖抗体、抗体模倣物、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ＶＨ、ＶＨＨまたはセンチリンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＣＬＲが、ＢＣＭＡ、ＭＵＣ−１またはＰＳＭＡに特異的に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記導入遺伝子が、前記Ｔ細胞のゲノム配列に関して内因性である配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記導入遺伝子が、前記Ｔ細胞のゲノム配列に関して外因性である配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記外因性配列が、前記細胞のゲノムに関して、合成配列、修飾配列、組み換え配列、キメラ配列、または非天然起源の配列である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記導入遺伝子が分泌タンパク質をコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記分泌タンパク質が第ＩＸ因子である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記導入遺伝子が抗癌剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ａ）構成的プロモーターおよび少なくとも１つのキメラリガンド受容体（ＣＬＲ）をコードする配列を含む受容体配列；および
ｂ）誘発性プロモーターおよび導入遺伝子をコードする配列を含む誘発性導入遺伝子配列
を含む核酸配列。
【請求項１２】
前記構成的プロモーターが、ＣＭＶプロモーター、Ｕ６プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＰＧＫ１プロモーター、Ｕｂｃプロモーター、ヒトβアクチンプロモーター、ＣＡＧプロモーター、またはＥＦ１αプロモーターである、請求項１１に記載の核酸。
【請求項１３】
前記構成的プロモーターがＥＦ１αプロモーターである、請求項１２に記載の核酸。
【請求項１４】
前記誘発性プロモーターが、ＮＦκＢプロモーター、ＮＲ４Ａ１プロモーター、ＣＤ５プロモーター、インターフェロン（ＩＦＮ）プロモーターまたはインターロイキン−２プロモーターである、請求項１１に記載の核酸。
【請求項１５】
前記ＩＦＮプロモーターがＩＦＮγプロモーターである、請求項１４に記載の核酸。
【請求項１６】
請求項１１に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１７】
前記誘発性導入遺伝子配列および前記受容体配列が同じ方向に配向されている、請求項１６に記載のベクター。
【請求項１８】
前記誘発性導入遺伝子配列および前記受容体配列が反対方向に配向されている、請求項１６に記載のベクター。
【請求項１９】
疾患または障害の治療を必要とする被験体の疾患または障害を治療する方法であって、以下を被験体に投与することを含む、方法：
ａ）Ｔ細胞集団であって、ここで、この集団中の複数のＴ細胞は少なくとも１つのキメラリガンド受容体（ＣＬＲ）および少なくとも１つの誘発性導入遺伝子構築物を含み、
ここで、ＣＬＲは、（ｉ）シグナルペプチドと少なくとも１つの足場タンパク質を含むリガンド認識領域を含む外部ドメイン；（ｉｉ）膜貫通ドメイン；および（ｉｉｉ）少なくとも１つの共刺激ドメインを含む内部ドメインを含む、膜貫通型タンパク質であり、
ここで、少なくとも１つの誘発性導入遺伝子構築物は、誘発性プロモーターをコードする配列および導入遺伝子をコードする配列を含む、Ｔ細胞の集団；および
ｂ）少なくとも１つのＣＬＲのリガンド認識領域に結合するリガンドであって、
ここで、リガンドがリガンド認識領域に結合すると、少なくとも１つのＣＬＲの内部ドドメインが、誘発性プロモーターを標的とする細胞内シグナルを伝達し、複数のＴ細胞内で導入遺伝子の発現をもたらし、それによって被験体の疾患または障害を治療する、リガンド。
【請求項２０】
前記疾患または障害が癌である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記疾患または障害が血友病Ｂである、請求項１９に記載の方法。
【国際調査報告】
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