(57)【要約】  本発明は、配列番号１のペプチドに特異的に結合する物質を含む皮膚疾患の予防または治療用薬学組成物などに関するもので、本発明の配列番号１のペプチドに特異的に結合する物質、具体的には、配列番号１のペプチドに特異的に結合する抗体または前記ペプチドの結合断片は、配列番号１のペプチドを発現する皮膚疾患に対して適用されて皮膚疾患を効果的に予防及び治療することができるため、具体的な原因が明らかにされていない様々な皮膚疾患の治療剤として有効に活用されうる。
2020532518.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のペプチドに特異的に結合する物質を有効成分として含む、皮膚疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項２】
配列番号１のペプチドに特異的に結合する物質が、配列番号１のペプチドに特異的に結合する抗体または前記ペプチドの結合断片、化合物、ペプチド、またはアプタマーである、請求項１に記載の薬学組成物。
【請求項３】
前記抗体が、マウス抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体である、請求項２に記載の薬学組成物。
【請求項４】
前記ペプチドの結合断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、これらの二量体、ミニボディ（minibodies）、ダイアボディ（diabodies）及び多量体（multimer）または二重特異性抗体断片である、請求項２に記載の薬学組成物。
【請求項５】
前記皮膚疾患が、バラ色粃糠疹（pityriasis rosea）、帯状疱疹、慢性単純苔癬、単純疱疹、貨幣状湿疹、湿疹、水いぼ、乾癬、いぼ、アトピー性皮膚炎または接触性皮膚炎である、請求項１に記載の薬学組成物。
【請求項６】
前記皮膚疾患が、慢性単純苔癬、乾癬、貨幣状湿疹、湿疹、アトピー性皮膚炎または接触性皮膚炎である、請求項１に記載の薬学組成物。
【請求項７】
配列番号１のペプチドに特異的に結合する物質を有効成分として含む、皮膚疾患の予防または改善用化粧料組成物。
【請求項８】
前記配列番号１のペプチドに特異的に結合する物質が、配列番号１のペプチドに特異的に結合する抗体または前記ペプチドの結合断片、化合物、ペプチド、またはアプタマーである、請求項７に記載の化粧料組成物。
【請求項９】
配列番号１のペプチドに特異的に結合する物質を有効成分として含む、皮膚疾患の予防または改善用医薬部外品組成物。
【請求項１０】
前記配列番号１のペプチドに特異的に結合する物質が、配列番号１のペプチドに特異的に結合する抗体または前記ペプチドの結合断片、化合物、ペプチド、またはアプタマーである、請求項９に記載の医薬部外品組成物。
【請求項１１】
配列番号１のペプチドに特異的に結合する物質を有効成分として含む、皮膚疾患の予防または改善用皮膚外用剤。
【請求項１２】
前記配列番号１のペプチドに特異的に結合する物質が、配列番号１のペプチドに特異的に結合する抗体または前記ペプチドの結合断片、化合物、ペプチド、またはアプタマーである、請求項１１に記載の皮膚外用剤。
【請求項１３】
配列番号１のペプチドに特異的に結合する物質を有効成分として含む組成物を個体に投与する段階を含む、皮膚疾患の予防または治療方法。
【請求項１４】
配列番号１のペプチドに特異的に結合する物質を有効成分として含む組成物の、皮膚疾患の予防または治療の用途。
【請求項１５】
皮膚疾患を予防または治療する医薬を製造するための、配列番号１のペプチドに特異的に結合する物質を有効成分として含む組成物の用途。
【請求項１６】
皮膚疾患を改善する化粧料、医薬部外品、または皮膚外用剤を製造するための、配列番号１のペプチドに特異的に結合する物質を有効成分として含む組成物の用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分離されたビメンチン由来のペプチドに特異的に結合する物質を有効成分として含む皮膚疾患の予防または治療用薬学組成物に関するもので、具体的には、配列番号１のペプチドに特異的に結合する抗体または前記ペプチドの結合断片を有効成分として含む皮膚疾患の予防または治療用薬学組成物、化粧料組成物、医薬部外品組成物、皮膚外用剤、皮膚疾患の予防または治療方法、治療用途、医薬、化粧料、医薬部外品または皮膚外用剤を製造するための用途等に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚疾患は、人間を含む動物の皮膚に表われるすべての異常所見を意味するが、現代社会では産業化が高度化されることに伴って様々な有害物質が原因で過去には発生しなかった様々な皮膚疾患が発症している。特に皮膚は年を取ることによって、皮膚細胞の増殖作用や新陳代謝作用が弱化されて皮膚組織の弾力が減ったり、しわが発生する自然な老化が進行され、それ以外にも直射日光に長時間さらされたり、火傷、擦り傷などの原因によっても様々な皮膚病変が発生し、健康な肌に害を与えたりする。このように自然な老化や事故による皮膚病変は、人間の体の最外殻に存在する皮膚の防御機能低下を起こし、ウイルス、微生物またはバクテリアなどによる感染などの原因を提供し、これにより様々な皮膚疾患が発生する。
【０００３】
具体的な原因が明らかにされていない代表的な疾患であるアトピー性皮膚炎は、ほとんど幼児期や小児期に発生して好転と悪化を繰り返す慢性炎症性皮膚疾患であって、感染、精神的なストレス、季節と気候変化、刺激及びアレルゲンによって悪化されうる。これらのアトピー性皮膚炎は、免疫学的な異常が関与する遺伝的疾患と考えられているが、まだ具体的な病因論が明らかにされておらず、他の皮膚疾患である乾癬、慢性単純苔癬なども明確な発症原因が明らかにされていない状況である。
【０００４】
このように、アトピー性皮膚炎、乾癬、慢性単純苔癬、バラ色粃糠疹（pityriasis rosea）などのように具体的な原因が明らかにされていない皮膚疾患には、現在は、化学薬物で構成された抗炎症剤、抗ウイルス剤、または植物抽出物や天然物由来の化合物などで治療することがほどんどである。例えば、特許文献１では「Ａ３アデノシン受容体作動薬（ＩＢ−ＭＥＣＡ／ＣＦ−１０１）を含む乾癬の治療のための薬学組成物」を、特許文献２では「酵素分解アロニア抽出物及びツメレンゲ（Orostachys japonicus）抽出物を含有するアトピー性皮膚改善用組成物」を開示している。
【０００５】
しかし、これらの治療法では、該当する皮膚疾患が完治する確率が高くなく、患部の皮膚組織及び皮膚細胞だけを標的とする治療剤ではない点で治療効率がやや低下し、副作用が発生する可能性が比較的高いという問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】韓国登録特許第１０−１７４１２８１号公報
【特許文献２】韓国公開特許第１０−２０１７−００４１１４９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
このような背景下で、本発明者らは、前記のような問題点を解決するために鋭意努力した結果、具体的な発症原因が明らかにされていない様々な皮膚炎患者の皮膚組織にビメンチン由来のペプチドに特異的に結合する物質、具体的には、配列番号１のペプチドに特異的に結合する抗体を処理する場合、前記のような皮膚疾患を効果的に治療しうることを確認することにより、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一つの目的は、配列番号１のペプチドに特異的に結合する物質を有効成分として含む、皮膚疾患の予防または治療用薬学組成物を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、配列番号１のペプチドに特異的に結合する物質を有効成分として含む、皮膚疾患の予防または改善用化粧料組成物を提供することにある。
【０００９】
本発明のもう一つの目的は、配列番号１のペプチドに特異的に結合する物質を有効成分として含む、皮膚疾患の予防または改善用医薬部外品組成物を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、配列番号１のペプチドに特異的に結合する物質を有効成分として含む、皮膚疾患の予防または改善用皮膚外用剤を提供することにある。
【００１０】
本発明のもう一つの目的は、配列番号１のペプチドに特異的に結合する物質を有効成分として含む組成物を、それを必要とする個体に塗布する段階を含む、皮膚疾患の予防または治療方法を提供することにある。
【００１１】
本発明のもう一つの目的は、配列番号１のペプチドに特異的に結合する物質を有効成分として含む組成物の、皮膚疾患の予防または治療用途を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、皮膚疾患を予防または治療する医薬を製造するための、配列番号１のペプチドに特異的に結合する物質を有効成分として含む組成物の用途を提供することにある。
【００１２】
本発明のもう一つの目的は、皮膚疾患を改善する化粧料、医薬部外品、または皮膚外用剤を製造するための、配列番号１のペプチドに特異的に結合する物質を有効成分として含む組成物の用途を提供することにある。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の配列番号１のペプチドに特異的に結合する物質、より具体的には、配列番号１のペプチドに特異的に結合する抗体または前記ペプチドの結合断片は、ビメンチン由来ペプチドを発現する皮膚疾患に対し、皮膚疾患を効果的に予防及び治療することができるので、具体的な原因が明らかにされていない様々な皮膚疾患の治療剤として有効に活用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】キメラＶＳＦの製造のためのベクターの模式図である。
【図２】キメラＶＳＦの模式図である。
【図３】キメラＶＳＦの発現を確認した図である。
【図４】ＶＳＦのｓｃＦｖのＤＮＡ配列を示した図である。
【図５】ＶＳＦのｓｃＦｖをベクターにクローニングした模式図である。
【図６】ＶＳＦのｓｃＦｖを精製して確認した図である。
【図７】ヒト化抗体であるｈｚＶＳＦの製造のためのベクターの模式図である。
【図８】本発明のヒト化抗体であるｈｚＶＳＦの模式図である。
【図９】ヒト化抗体であるｈｚＶＳＦの発現を確認した図である。
【図１０】ヒト化抗体であるｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３の物性を確認した還元及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示した図である。
【図１１】ヒト化抗体であるｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３の物性を確認したＬＣ／ＭＳの結果を示した図である。
【図１２】ヒト化抗体であるｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３の物性を確認したＳＥＣ−ＨＰＬＣの結果を示した図である。
【図１３】ヒト化抗体であるｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３の物性を確認したＩＦ（Isoelectric focusing）を示した図である。
【図１４】５１人の血液ドナーのうち、ＫＬＨ、ｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１２及びｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３に反応してＴ細胞の増殖が起こったドナーの数を示した図である。
【図１５】ヒト化抗体であるｈｚＶＳＦの代表的な変異体であるｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１２及びｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３の５１人のＴ細胞増殖反応の程度を示した図である。
【図１６】ＫＬＨ、ｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１２及びｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３によって誘導されたＴ細胞の増殖を平均ＳＩ値で示した図である。
【図１７】ヒトの正常組織とＶＳＦ間の反応性調査結果を示した図である。
【図１８】様々な皮膚疾患でのＶＲ発現を確認した図である。
【図１９】バラ色粃糠疹（pityriasis rosea）、帯状疱疹、慢性単純苔癬、単純疱疹、貨幣状湿疹及び水いぼの皮膚疾患でのＶＲ発現を確認したものである。
【図２０】乾癬、いぼ、アトピー性皮膚炎及び接触性皮膚炎の皮膚疾患でのＶＲ発現を確認したものである。
【図２１】１番の乾癬患者に対するＶＳＦの治療効果を確認した図である。
【図２２】２番の乾癬患者に対するＶＳＦの治療効果を確認した図である。
【図２３】１番の慢性単純苔癬患者に対するＶＳＦの治療効果を確認した図である。
【図２４】２番の慢性単純苔癬患者に対するＶＳＦの治療効果を確認した図である。
【図２５】３番の慢性単純苔癬患者に対するＶＳＦの治療効果を確認した図である。
【図２６】貨幣状湿疹患者に対するＶＳＦの治療効果を確認した図である。
【図２７】ＶＳＦを適用した慢性単純苔癬（Lichen simplex chronicus）、貨幣状湿疹（Nummular dermatitis）、湿疹（Eczema）、アトピー性皮膚炎（Atopic dermatitis）、及び皮膚炎（Dermatitis）患者で紅斑、浮腫／結節／丘疹、擦傷、及び苔癬化を測定したｅｃｚｅｍａ  ａｒｅａ  ａｎｄ  ｓｅｖｅｒｉｔｙ  ｉｎｄｅｘ（ＥＡＳＩ）ｓｃｏｒｅと乾癬患者で紅斑、厚さ、鱗屑（scaling）を測定したｐｓｏｒｉａｓｉｓａｒｅａ ｓｅｖｅｔｉｒｙ ｉｎｄｅｘ（ＰＡＳＩ）ｓｃｏｒｅを示した図である。
【図２８】ＶＳＦを塗布した慢性単純苔癬、貨幣状湿疹、湿疹、アトピー性皮膚炎、皮膚炎、及び乾癬患者のかゆみ感（Visual Analogue Scale；ＶＡＳ）を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
これを具体的に説明すると、次の通りである。一方、本発明で開示された各説明及び実施形態は、それぞれの他の説明及び実施形態にも適用されうる。すなわち、本発明で開示された様々な要素のすべての組み合わせが本発明の範疇に属する。また、下記記述された具体的な叙述によって、本発明の範疇が限定されると見ることができない。
【００１６】
前記目的を達成するための本発明の一つの様態は、ビメンチン由来のペプチドに特異的に結合する物質を有効成分として含む、皮膚疾患の予防または治療用薬学組成物を提供する。
【００１７】
より具体的には、本発明は配列番号１のペプチドに特異的に結合する物質を有効成分として含む、皮膚疾患の予防または治療用薬学組成物を提供する。
本発明でビメンチンはＶＩＭ遺伝子によってコードされるタンパク質であって、細胞内小器官（organelle）を支持し、位置に固定させる機能をするもので、主に細胞の骨格、タンパク質の移動及び細胞シグナル伝達に関与することが知られている。本発明では、このようなビメンチンが正常な細胞では細胞外に発現されないが、具体的な原因が明らかにされていない様々な皮膚疾患の患者の皮膚組織では、細胞外に発現されることを確認し、ビメンチン由来のペプチドに特異的な抗体のようにこれに結合できる物質を処理する場合、様々な皮膚疾患を効果的に治療することができることを確認した。
【００１８】
具体的には、前記ビメンチン由来のペプチドは、配列番号１のペプチドであってもよい。
本発明において、「ビメンチン由来のペプチドに特異的に結合する物質」は、前記ビメンチン由来のペプチドと結合能を有する物質であって、具体的には、配列番号１のペプチドに特異的に結合する物質であってもよい。
【００１９】
本発明で配列番号１の分離されたペプチドは、ビメンチンのアミノ酸１４２番〜２９４番の位置に該当するもので、本発明の抗体またはその断片が結合できる限り、前記配列だけではなく前記配列と８０％以上、好ましくは、９０％以上、より好ましくは、９５％以上、特に好ましくは、９７％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。
【００２０】
より具体的には、前記配列番号１のペプチドに特異的に結合する物質は、配列番号１のペプチドに特異的に結合する抗体または前記ペプチドの結合断片、化合物、ペプチド、またはアプタマーであってもよく、さらに具体的には、配列番号１のペプチドに特異的に結合する抗体または前記ペプチドの結合断片であってもよいが、これに制限されない。
【００２１】
具体的には、本発明は配列番号１のペプチドに特異的に結合する抗体または前記ペプチドの結合断片を有効成分として含む、皮膚疾患の予防または治療用薬学組成物を提供する。
【００２２】
前記抗体は、これに制限されないが、その例としてマウス抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体であってもよい。
本発明の前記ヒト化抗体または前記ペプチドの結合断片は、抗原と直接結合するマウスのモノクローナルまたはモノクローナル抗体の可変領域の相補性決定部位をヒト抗体骨格に移植して、本来のマウス抗体の親和度及び特異性を維持しながら人体内でＨＡＭＡ（human anti-mouse antibody）反応を抑制する優位性を有している。また、脱免疫化（de-immunization）方法を用いて免疫原性を下げたヒト化抗体であって、人間に投与時の免疫原性を著しく下げて安全な製剤として用いることができる。つまり、これは配列番号１のペプチド部位が外部に露出された細胞に反応して影響を与えながらも、人間の免疫システムとより良好に相互作用して、例えば、補体依存性細胞傷害（complement-dependent cytotoxicity、ＣＤＣ）または抗体依存性細胞傷害（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity、ＡＤＣＣ）を起こさないようにして目的の細胞をより効率的に治療することができる。併せて、免疫原性の減少によって人間の免疫システムが前記抗体を外来のものと認識しない利点がある。また、より少ない量、より少ない頻度の薬物を投与したときにも、人間の循環器系内の半減期が天然発生抗体と類似するという利点がある。
【００２３】
本発明において、前記配列番号１の分離されたペプチドに特異的に結合するマウス抗体は、「ｍＶＳＦ（mouse Virus Suppressing Factor）」と通称されてもよく、キメラ抗体は、「ｃｈＶＳＦ（chimeric ＶＲus Suppressing Factor）」と通称されてもよく、ヒト化抗体は、「ｈｚＶＳＦ（humainzed Virus Suppressing Factor）」と通称されてもよい。本発明において、用語、ヒト化抗体ｈｚＶＳＦまたはその変異体は互いに混用されてもよく、ｈｚＶＳＦはｈｚＶＳＦ野生型（ｈｚＶＳＦ_ｗｔ）及びｈｚＶＳＦの変異体（例えば、ｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１、ｈｚＶＳＦ_ｖ１またはｈｚＶＳＦ_１などと表記）と混用されてもよい。
【００２４】
前記配列番号１の分離されたペプチドは、エピトープを含む抗原領域であって、抗体またはその断片と結合されて本発明と同様の機能を示すことができる限り、ビメンチンアミノ酸の１４２番〜２１１番または２１１番〜２９４番であってもよい。また、このような相同性を有するアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換、または付加されたアミノ酸配列も、本発明の範囲内に含まれるのは自明である。ビメンチンはＶＩＭ遺伝子によってコードされるタンパク質であって、細胞内小器官（organelle）を支持し、位置に固定させる機能をするもので、主に細胞の骨格、タンパク質の移動及び細胞シグナル伝達に関与するのが知られており、ガンのマーカーとして用いられるのが知られているが、これに結合できる抗体が皮膚疾患に対する治療用途があることについては全く知られていなかった。
【００２５】
本発明の配列番号１の分離されたペプチドに特異的に結合する抗体または前記ペプチドの結合断片は、皮膚疾患が発症した患者の皮膚細胞に特異的に反応するものであり、前記疾患が発症した部位の皮膚組織または皮膚細胞のＶＳＦ（Virus suppressing factor）の受容体、すなわち、ＶＲが外部に現れ、これに結合するものである。このような本発明の抗体または前記ペプチドの結合断片は、具体的な発症原因が明らかにされていない様々な皮膚疾患の予防または治療の分野において有用に用いてもよい。
【００２６】
前記抗体または前記ペプチドの結合断片は、具体的には、配列番号１のペプチドの９番目、４５番目、５４番目、７６番目、９４番目または１２９番目のアミノ酸残基に特異的に結合するものであってもよく、より具体的には、配列番号１のペプチドの９番目、４５番目、５４番目、７６番目、９４番目及び１２９番目のアミノ酸残基に特異的に結合するものであってもよいが、配列番号１の分離されたペプチドに特異的に結合する限り、これに制限されない。
【００２７】
本発明において、用語、「抗体」は、免疫学的に特定の抗原と反応性を有する免疫グロブリン分子を含む抗原を特異的に認識するリガンドの役割をするタンパク質分子を意味し、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、全体（whole）抗体及び抗体断片のすべてを含む。また、前記用語は、キメラ性抗体（例えば、ヒト化ミュリン抗体）及び二価（bivalent）または二重特異性分子（例えば、二重特異性抗体）、ダイアボディ、トリアボディ及びテトラボディをさらに含む。前記用語はＦｃＲｎに対する結合機能を保有する短鎖抗体、スケープ、抗体不変領域の誘導体及びタンパク質スキャフォールドに基づいた人工抗体を含む。全体抗体は、２つの全長の軽鎖及び２つの全長の重鎖を有する構造であり、それぞれの軽鎖は重鎖とジスルフィド結合で連結されている。前記全体抗体はＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、及びＩｇＧを含み、ＩｇＧは亜型（subtype）としてＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含む。ここで使用される用語、「断片」、「ペプチドの結合断片」及び「抗体断片」は、抗体の抗原結合活性を保持している本発明の抗体の任意の断片を指すものと互換的に使用される。例示的な抗体断片は、単一鎖抗体、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｄｓＦｖまたはｓｃＦｖを含むが、これ限定されない。前記Ｆｄは、Ｆａｂ断片に含まれている重鎖部分を意味する。前記Ｆａｂは、軽鎖及び重鎖の可変領域と軽鎖の不変領域及び重鎖の最初の不変領域（ＣＨ１ドメイン）を有する構造で１つの抗原結合部位を有する。Ｆａｂ’は、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ末端に１つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域（hinge region）を有するという点でＦａｂとの違いがある。Ｆ（ａｂ’）２抗体は、Ｆａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合をなしながら生成される。Ｆｖ（variable Fragment）は、重鎖可変部位及び軽鎖可変部位のみを有している最小の抗体断片を意味する。二重ジスルフィドＦｖ（dsＦｖ）は、ジスルフィド結合で重鎖可変部位と軽鎖可変部位が連結されており、短鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、一般的にペプチドリンカーを介して重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域が共有結合で連結されている。これらの抗体断片は、タンパク質加水分解酵素を用いて得ることができ（例えば、全体抗体をパパインで制限切断してＦａｂを得ることができ、ペプシンで切断するとＦ（ａｂ’）２断片を得ることができる）、好ましくは、遺伝子組換え技術を介して作製することができる。
【００２８】
具体的には、前記ペプチドの結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、これらの二量体、ミニボディ（minibodies）、ダイアボディ（diabodies）及び多量体（multimer）または二重特異性抗体断片であってもよい。
【００２９】
本発明において、用語、「モノクローナル抗体」は、実質的に同一の抗体集団から収得した単一分子組成の抗体分子を指し、これらのモノクローナル抗体は特定のエピトープに対して単一結合特異性及び親和性を示す。
【００３０】
典型的には、免疫グロブリンは重鎖及び軽鎖を有し、それぞれの重鎖及び軽鎖は不変領域及び可変領域（前記部位はドメインとしても知られている）を含む。軽鎖及び重鎖の可変領域は、相補性決定領域（complementarity-determining region、以下「ＣＤＲ」という）と呼ばれる３つの多変可能な領域及び４つの構造領域（Framework region、以下「ＦＲ」という）を含んでいる。前記ＣＤＲは、主に抗原のエピトープ（epitope）に結合する役割をする。それぞれの鎖のＣＤＲは典型的にＮ末端から開始して順次的にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３と呼ばれ、特定ＣＤＲが位置している鎖によってさらに識別される。
【００３１】
また、前記のような本発明の抗体が不変領域を含む場合、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ由来またはこれらの組み合わせ（combination）またはこれらの混成（hybrid）による不変領域を含んでもよい。
【００３２】
本発明において、用語、「組み合わせ（combination）」とは、二量体または多量体を形成するとき、同じ起源の短鎖免疫グロブリン不変領域を暗号化するポリペプチドが異なる起源の短鎖ポリペプチドと結合を形成することを意味する。その例として、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭの不変領域からなるグループから選択された２つ以上の不変領域から二量体または多量体を形成することができる。
【００３３】
本発明において、用語、「ハイブリッド（hybrid）」とは、短鎖免疫グロブリンの重鎖不変領域内に２つ以上の異なる起源の免疫グロブリン重鎖不変領域に該当する配列が存在することを意味し、その例として、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭのＣＨ１、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４からなるグループから選択される１つ〜４つのドメインからなるドメインのハイブリッドが可能である。
【００３４】
本発明のヒト化抗体は、これに制限されないが、ヒト免疫グロブリンγ４に基づいてヒト化することができ、補体結合性がなくＣＤＣを起こさない利点を有することがある。
前記ヒト化抗体または前記ペプチドの結合断片は、配列番号２に記載された重鎖ＣＤＲ１；配列番号３または配列番号１４（配列番号３の９番目のアミノ酸であるトレオニンがアスパラギン酸に置換）に記載された重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号４または配列番号１５（配列番号４の４番目のアミノ酸であるトレオニンがアスパラギンに置換）に記載された重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び配列番号５に記載された軽鎖ＣＤＲ１；配列番号６、配列番号１６（配列番号６の３番目のアミノ酸であるトレオニンがアスパラギン酸に置換）、配列番号１７（配列番号６の３番目のアミノ酸であるトレオニンがアスパラギン酸に、６番目のアミノ酸であるアラニンがグリシンに置換）、または配列番号１８（配列番号６の３番目のアミノ酸であるトレオニンがアスパラギン酸に、５番目のアミノ酸であるロイシンがアルギニンに、６番目のアミノ酸であるアラニンがグリシンに置換）に記載された軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号７または配列番号１９（配列番号７の６番目のアミノ酸であるセリンがトレオニンに置換）に記載された軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体または前記ペプチドの結合断片であってもよい。
【００３５】
また、前記ヒト化抗体または前記ペプチドの結合断片は、ヒトのＦＲ（Framework region）を含み、これに制限されないが、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１に記載されたヒト免疫グロブリンガンマであってもよく、または配列番号２０に記載された重鎖ＦＲ１（Framework region 1）；配列番号２１に記載された重鎖ＦＲ２；配列番号２２または配列番号２８（配列番号２２の８番目のアミノ酸であるリジンがトレオニンに、１０番目のアミノ酸であるイソロイシンがアラニンに置換）に記載された重鎖ＦＲ３；及び配列番号２３に記載された重鎖ＦＲ４を含む重鎖可変領域、及び配列番号２４に記載された軽鎖ＦＲ１；配列番号２５に記載された軽鎖ＦＲ２；配列番号２６に記載された軽鎖ＦＲ３；及び配列番号２７に記載された軽鎖ＦＲ４を含む軽鎖可変領域であってもよい。
【００３６】
前記ヒト化抗体または前記ペプチドの結合断片は、具体的には、（ａ）配列番号２、配列番号３、及び配列番号４にそれぞれ記載された重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、及び重鎖ＣＤＲ３、及び配列番号５、配列番号６、及び配列番号７にそれぞれ記載された軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、軽鎖ＣＤＲ３；（ｂ）配列番号２、配列番号３、及び配列番号４にそれぞれ記載された重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、及び重鎖ＣＤＲ３、及び配列番号５、配列番号１６、及び配列番号７にそれぞれ記載された軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、軽鎖ＣＤＲ３；（ｃ）配列番号２、配列番号３、及び配列番号４にそれぞれ記載された重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、及び重鎖ＣＤＲ３、及び配列番号５、配列番号１７、及び配列番号７にそれぞれ記載された軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、軽鎖ＣＤＲ３；（ｄ）配列番号２、配列番号３、及び配列番号４にそれぞれ記載された重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、及び重鎖ＣＤＲ３、及び配列番号５、配列番号１８、及び配列番号７にそれぞれ記載された軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、軽鎖ＣＤＲ３；（ｅ）配列番号２、配列番号３、及び配列番号４にそれぞれ記載された重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、及び重鎖ＣＤＲ３、及び配列番号５、配列番号１８、及び配列番号１９にそれぞれ記載された軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、軽鎖ＣＤＲ３；（ｆ）配列番号２、配列番号１４、及び配列番号４にそれぞれ記載された重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、及び重鎖ＣＤＲ３、及び配列番号５、配列番号６、及び配列番号７にそれぞれ記載された軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、軽鎖ＣＤＲ３；（ｇ）配列番号２、配列番号３、及び配列番号４にそれぞれ記載された重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、及び重鎖ＣＤＲ３、及び配列番号２０、配列番号２１、配列番号２８、及び配列番号２３にそれぞれ記載された重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４、及び配列番号５、配列番号６、及び配列番号７にそれぞれ記載された軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、軽鎖ＣＤＲ３及び配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、及び配列番号２７にそれぞれ記載された軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４；（ｈ）配列番号２、配列番号１４、及び配列番号４にそれぞれ記載された重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、及び重鎖ＣＤＲ３、及び配列番号２０、配列番号２１、配列番号２８、及び配列番号２３にそれぞれ記載された重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４、及び配列番号５、配列番号６、及び配列番号７にそれぞれ記載された軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、軽鎖ＣＤＲ３及び配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、及び配列番号２７にそれぞれ記載された軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４；（ｉ）配列番号２、配列番号１４、及び配列番号１５にそれぞれ記載された重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、及び重鎖ＣＤＲ３、及び配列番号２０、配列番号２１、配列番号２８、及び配列番号２３にそれぞれ記載された重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４、及び配列番号５、配列番号６、及び配列番号７にそれぞれ記載された軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、軽鎖ＣＤＲ３及び配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、及び配列番号２７にそれぞれ記載された軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４；（ｊ）配列番号２、配列番号１４、及び配列番号４にそれぞれ記載された重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、及び重鎖ＣＤＲ３、及び配列番号２０、配列番号２１、配列番号２８、及び配列番号２３にそれぞれ記載された重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４、及び配列番号５、配列番号１８、及び配列番号７にそれぞれ記載された軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、軽鎖ＣＤＲ３及び配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、及び配列番号２７にそれぞれ記載された軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４；（ｋ）配列番号２、配列番号１４、及び配列番号１５にそれぞれ記載された重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、及び重鎖ＣＤＲ３、及び配列番号２０、配列番号２１、配列番号２８、及び配列番号２３にそれぞれ記載された重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４、及び配列番号５、配列番号１８、及び配列番号７にそれぞれ記載された軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、軽鎖ＣＤＲ３及び配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、及び配列番号２７にそれぞれ記載された軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４；（ｌ）配列番号２、配列番号１４、及び配列番号４にそれぞれ記載された重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、及び重鎖ＣＤＲ３、及び配列番号２０、配列番号２１、配列番号２８、及び配列番号２３にそれぞれ記載された重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４、及び配列番号５、配列番号１８、及び配列番号１９にそれぞれ記載された軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、軽鎖ＣＤＲ３及び配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、及び配列番号２７にそれぞれ記載された軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４；（ｍ）配列番号２、配列番号１４、及び配列番号１５にそれぞれ記載された重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、及び重鎖ＣＤＲ３、及び配列番号２０、配列番号２１、配列番号２８、及び配列番号２３にそれぞれ記載された重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４、及び配列番号５、配列番号１８、及び配列番号１９にそれぞれ記載された軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、軽鎖ＣＤＲ３及び配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、及び配列番号２７にそれぞれ記載された軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４；または（ｎ）配列番号２、配列番号１４、及び配列番号４にそれぞれ記載された重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、及び重鎖ＣＤＲ３、及び配列番号５、配列番号１６、及び配列番号７にそれぞれ記載された軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、軽鎖ＣＤＲ３を含む抗体または前記ペプチドの結合断片であってもよい。
【００３７】
前記（ａ）抗体はｈｚＶＳＦ_ＷＴ、（ｂ）抗体はｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１、（ｃ）抗体はｈｚＶＳＦ_ｖａｒ２、（ｄ）抗体はｈｚＶＳＦ_ｖａｒ３、（ｅ）抗体はｈｚＶＳＦ_ｖａｒ４、（ｆ）抗体はｈｚＶＳＦ_ｖａｒ５、（ｇ）抗体はｈｚＶＳＦ_ｖａｒ６、（ｈ）抗体はｈｚＶＳＦ_ｖａｒ７、（ｉ）抗体はｈｚＶＳＦ_ｖａｒ８、（ｊ）抗体はｈｚＶＳＦ_ｖａｒ９、（k）抗体はｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１０、（ｌ）抗体はｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１１、（ｍ）抗体はｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１２、（ｎ）抗体はｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３をそれぞれ含んでもよい。
【００３８】
前記ヒト化抗体及び前記ペプチドの結合断片は、これに制限されないが、それぞれ配列番号１０及び配列番号１２；配列番号３２及び配列番号３４；配列番号３６及び配列番号３８；配列番号４０及び配列番号４２；配列番号４４及び配列番号４６；配列番号４８及び配列番号５０；配列番号５２及び配列番号５４；配列番号５６及び配列番号５８；配列番号６０及び配列番号６２；配列番号６４及び配列番号６６；配列番号６８及び配列番号７０；配列番号７２及び配列番号７４；配列番号７６及び配列番号７８；または配列番号８０及び配列番号８２に記載された重鎖及び軽鎖可変領域を含む抗体または前記ペプチドの結合断片であってもよい。
【００３９】
前記マウス抗体は、具体的には、配列番号１３７に記載された重鎖ＣＤＲ１；配列番号１３８に記載された重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号１３９に記載された重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び配列番号１３４に記載された軽鎖ＣＤＲ１；配列番号１３５に記載された軽鎖ＣＤＲ２；配列番号１３６に記載された軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含んでもよく、より具体的には、配列番号９に記載された重鎖可変領域及び配列番号８に記載された軽鎖可変領域を含むものであってもよいが、これに制限されるものではない。
【００４０】
前記キメラ抗体は、具体的には、配列番号１４１または配列番号１４２に記載された重鎖可変領域及び配列番号１４０に記載された軽鎖可変領域を含むものであってもよく、さらに具体的には、配列番号１４６または配列番号１４８に記載された重鎖及び配列番号１４４で記載された軽鎖を含むものであってもよいが、これに制限されるものではない。
【００４１】
前記ｓｃＦｖは、これに制限されるものではないが、ｍＶＳＦの安全性のために製造したｓｃＦｖも含まれてもよい。その例として、図４に記載された配列によって製造されたｓｃＦｖであってもよい。また、配列番号１３１に記載された重鎖可変領域及び配列番号１３３に記載された軽鎖可変領域がリンカーに連結された形態であってもよい。また、配列番号１３０の塩基配列でコードされる重鎖可変領域及び配列番号１３２の塩基配列でコードされる軽鎖可変領域がリンカーに連結された形態であってもよい。このようなｓｃＦｖは、Ｅ. ｃｏｌｉ発現ベクター内に配列番号１５０の塩基配列でクローニングされてもよい。
【００４２】
本発明の具体的な実施例によると、本発明者らはｈｚＶＳＦ_ｗｔ、３つのオルタナティブ（alternative）及びその１３つの変異体であるヒト化抗体を製造した（実施例５）。また、ＦＤＡの承認を受けて市販されている医薬品と免疫原性を比較した結果、免疫原性が最も低い人間の抗体であるＨｕｍｉｒａと類似なレベルの免疫原性を示すことを確認し（表７）、皮膚疾患治療剤として使用時に引き起こされうる副作用のない安全な医薬品、医薬部外品、皮膚外用剤などに用いられることを確認した。
【００４３】
また、ｈｚＶＳＦ_ｗｔ変異体を用い、Ｔ細胞の分析を介してＴ細胞の増殖に大きく影響を与えないことを確認し（表８）、臨床に用いる時に免疫源として作用して副作用を引き起こす可能性が低いことを確認した。
【００４４】
本発明では、前記皮膚疾患はバラ色粃糠疹（pityriasis rosea）、帯状疱疹、慢性単純苔癬、単純疱疹、貨幣状湿疹、湿疹、水いぼ、乾癬、いぼ、アトピー性皮膚炎または接触性皮膚炎であってもよく、具体的には、慢性単純苔癬、乾癬、貨幣状湿疹、湿疹、アトピー性皮膚炎または接触性皮膚炎であってもよい。ただし、本発明の前記皮膚疾患は皮膚組織または皮膚細胞のＶＲが発現されるものであれば、制限なく含まれてもよい。
【００４５】
本発明の具体的な一実施例では、様々な皮膚疾患が発生した皮膚組織では配列番号１のビメンチン由来のペプチドが発現されるが、正常細胞では発現されないことを確認した（図１７）。また、本発明の配列番号１のペプチドに特異的に結合する物質が、実際的に乾癬、慢性単純苔癬、貨幣状湿疹、湿疹、アトピー性皮膚炎または接触性皮膚炎を発症した患者に対しても、皮膚疾患に対する優れた治療効能を示すことを検証して（図２１〜図２８）、原因が明らかにされていない様々な皮膚疾患の予防及び治療用薬学組成物として用いられることを確認した。
【００４６】
前記薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含んでもよい。
本発明において、用語、「薬学的に許容可能な担体」とは、生物体を刺激せずに投与化合物の生物学的活性及び特性を阻害しない担体または希釈剤をいう。液状溶液に製剤化される組成物において許容される薬学的担体としては、滅菌及び生体に適したものであり、生理食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、アルブミン注射溶液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール及びこれらの成分のうち１成分以上を混合して用いてもよく、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など他の通常の添加剤を添加してもよい。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び潤滑剤を付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などの注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化してもよい。
【００４７】
前記薬学的組成物は経口または非経口の様々な剤形であってもよい。製剤化する場合には、通常使用される充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使用して調剤される。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれており、これらの固形製剤は１つ以上の化合物に少なくとも１つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロース（sucrose）またはラクトース（lactose）、ゼラチンなどを混ぜて調剤される。また、単純な賦形剤以外にステアリン酸マグネシウム、タルクなどの潤滑剤も使用される。経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当するが、よく使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外にさまざまな賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれてもよい。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁溶剤としては、プロピレングリコール（propylene glycol）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどが用いられてもよい。坐剤の基剤は、ウィテプソル（witepsol）、マクロゴール、ツイン（tween）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが用いられてもよい。
【００４８】
前記薬学的組成物は、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤及び坐剤からなる群から選択されるいずれか１つの剤形を有してもよい。
【００４９】
前記本発明の組成物は薬学的に有効な量で投与する。
本発明において、用語、「薬学的に有効な量」は、医学的治療に適用可能な合理的な恩恵／リスク比で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効用量の水準は個体の種類及び重症度、年齢、性別、疾患の種類、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路、及び排出比率、治療期間、同時に使用される薬物を含む要素及びその他の医学分野でよく知られている要素に応じて決定されうる。本発明の組成物は個別治療剤として投与するか、他の治療剤と併用して投与してもよく、従来の治療剤とは順次的または同時に投与してもよい。そして、単一または多重投与されてもよい。前記要素をすべて考慮して副作用のない最小限の量で最大の効果を得ることができる量を投与することが重要であり、当業者によって容易に決定されうる。前記他の治療剤はインターフェロンであってもよいが、これに制限されない。
【００５０】
本発明において、用語、「予防」とは、前記組成物の投与により疾患の発症を抑制するか、遅延させる全ての行為を意味してもよく、前記「治療」とは、前記組成物の投与により疾患の症状が好転したり有利に変更されるすべての行為を意味してもよい。
【００５１】
本発明の他の一つの様態は、配列番号１のペプチドに特異的に結合する物質を有効成分として含む、皮膚疾患の予防または改善用化粧料組成物を提供する。
より具体的には、本発明は配列番号１のペプチドに特異的に結合する抗体または前記ペプチドの結合断片を有効成分として含む、皮膚疾患の予防または改善用化粧料組成物を提供する。
【００５２】
前記配列番号１のペプチドに特異的に結合する物質、配列番号１のペプチド、抗体、ペプチド結合断片、皮膚疾患、予防については、前記説明した通りである。
本発明の具体的な一実施例では、本発明の配列番号１のペプチドに特異的に結合する物質が、実際的に、乾癬、慢性単純苔癬、貨幣状湿疹、湿疹、アトピー性皮膚炎または接触性皮膚炎を発症した患者に対しても優れた治療効果を示すことを検証し（図２１〜図２８）、原因が明らかにされていない様々な皮膚疾患の予防及び改善用化粧料組成物として用いられることを確認した。
【００５３】
本発明に係る化粧料組成物は、溶液、外用軟膏、クリーム、フォーム、栄養化粧水、柔軟化粧水、パック、柔軟水、乳液、メイクアップベース、エッセンス、石鹸、液体洗浄料、入浴剤、日焼け止めクリーム、日焼け止めオイル、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、ローション、パウダー、石鹸、界面活性剤含有クレンジング、オイル、粉末ファンデーション、乳濁液ファンデーション、ワックスファンデーション、パッチ及びスプレーで構成された群から選択される剤形で製造してもよいが、これに制限されるものではない。
【００５４】
また、本発明の化粧料組成物は、一般的な皮膚化粧料に配合される化粧品学的に許容可能な担体を１種以上さらに含んでもよく、通常の成分として、例えば、油分、水、界面活性剤、保湿剤、低級アルコール、増粘剤、キレート剤、色素、防腐剤、香料などを適切に配合してもよいが、これに制限されるものではない。
【００５５】
本発明の化粧料組成物に含まれる化粧品学的に許容可能な担体は、剤型に応じて様々である。
本発明の剤形が軟膏、ペースト、クリームまたはゲルである場合には、担体成分として動物性油、植物性油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、シリカ、タルク、酸化亜鉛またはこれらの混合物が用いられてもよい。
【００５６】
本発明の剤形がパウダーまたはスプレーである場合には、担体成分としてラクトース、タルク、シリカ、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム、ポリアミドパウダーまたはこれらの混合物が用いられてもよく、特にスプレーである場合には、クロロフルオロヒドロカーボン、プロパン／ブタンまたはジメチルエーテルのような推進剤をさらに含んでもよい。
【００５７】
本発明の剤形が溶液または乳濁液である場合には、担体成分として溶媒、溶解化剤または乳濁化剤が用いられ、例えば、水、エタノール、イソプロパノール、エチルカーボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、１，３−ブチルグリコールオイルが用いられてもよく、特に、綿実油、ピーナッツ油、トウモロコシ種子油、オリーブオイル、ヒマシ油及びごま油、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコールまたはソルビタンの脂肪酸エステルが用いられてもよい。
【００５８】
本発明の剤形が懸濁液である場合には、担体成分として、水、エタノールまたはプロピレングリコールのような液状の希釈剤、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステル及びポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁剤、微小結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、アガーまたはトラカントなどが用いられてもよい。
【００５９】
本発明の剤形が石鹸である場合には、担体成分として脂肪酸のアルカリ金属塩、脂肪酸ヘミエステル塩、脂肪酸タンパク質加水分解物、イセチオネート、ラノリン誘導体、脂肪族アルコール、植物油、グリセロール、糖などが用いられてもよい。
【００６０】
本発明のもう一つの様態は、配列番号１のペプチドに特異的に結合する物質を有効成分として含む、皮膚疾患の予防または改善用医薬部外品組成物を提供する。
具体的には、本発明は、配列番号１のペプチドに特異的に結合する抗体または前記ペプチドの結合断片を有効成分として含む、皮膚疾患の予防または改善用医薬部外品組成物を提供する。
【００６１】
前記配列番号１のペプチドに特異的に結合する物質、配列番号１のペプチド、抗体、ペプチド結合断片、皮膚疾患、予防については、前記説明した通りである。
本発明の医薬部外品組成物には、前記成分の他に必要に応じて薬学的に許容可能な担体、賦形剤または希釈剤をさらに含んでもよい。前記薬学的に許容可能な担体、賦形剤または希釈剤は、本発明の効果を害しない限り制限されず、例えば、充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤、潤滑剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などを含んでもよい。
【００６２】
本発明の医薬部外品組成物は、消毒ウォッシュ、シャワーフォーム、軟膏液、ウェットティッシュ、コーティング剤などを例示してもよいが、これに制限されるものではなく、医薬部外品の製剤化方法、用量、利用方法、構成成分などは技術分野に公知された通常の技術から適宜選択してもよい。
【００６３】
本発明のもう一つの様態は、配列番号１のペプチドに特異的に結合する物質を有効成分として含む、皮膚疾患の予防または改善用皮膚外用剤を提供する。
具体的には、本発明は配列番号１のペプチドに特異的に結合する抗体または前記ペプチドの結合断片を有効成分として含む、皮膚疾患の予防または改善用皮膚外用剤を提供する。
【００６４】
前記配列番号１のペプチドに特異的に結合する物質、配列番号１のペプチド、抗体、ペプチド結合断片、皮膚疾患、予防については、前記説明した通りである。
本発明の用語、「皮膚外用剤」は、一般的に皮膚外用に使用する物質全般を含む包括的な概念であって、前記薬学組成物を含む剤形の非限定的な例としては、絆創膏（PLASTERS）、ローション剤（LOTIONS）、リニメント剤（LINIMENTS）、液剤（LIQUIDS AND SOLUTIONS）、エアロゾル剤（AEROSOLS）、エキス剤（EXTRACTS）、軟膏剤（OINTMENTS）、流動エキス剤（FLUIDEXTRACTS）、乳剤（EMULSIONS）、懸濁剤（SUSPESIONS）、カプセル剤（CAPSULES）、クリーム剤（CREAMS）、軟質、硬質ゼラチンカプセル、貼付剤、または徐放化製剤がある。
【００６５】
本発明に係る皮膚外用剤は、一般的な無機または有機の担体、賦形剤及び希釈剤を加えて、固体、半固体または液状の形態で製剤化された非経口投与剤であってもよい。前記非経口投与のための製剤としては、点滴剤、軟膏、ローション、ゲル、クリーム、パッチ、スプレー、懸濁剤及び乳剤からなる群から選択される経皮投与型剤形であってもよいが、これに制限されない。
【００６６】
前記外用剤に含まれてもよい担体、賦形剤及び希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、オリゴ糖、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱物油が挙げられる。
【００６７】
各剤形による皮膚外用剤組成物において、前記した本発明の組成物以外の他の成分を他の皮膚外用剤の剤形または使用目的等に応じて当業者が困難なく、適当に選定し配合してもよく、この場合、他の原料と同時に適用する場合は相乗効果が起こることがある。
【００６８】
本発明のもう一つの様態は、配列番号１のペプチドに特異的に結合する物質を有効成分として含む組成物を、それを必要とする個体に塗布する段階を含む、皮膚疾患の予防または治療方法を提供する。
【００６９】
具体的には、本発明は配列番号１のペプチドに特異的に結合する抗体または前記ペプチドの結合断片を有効成分として含む組成物を、これを必要とする個体に塗布する段階を含む、皮膚疾患の予防または治療方法を提供する。
【００７０】
前記皮膚疾患を治療する方法は、抗体及び薬学的に許容可能な担体をさらに含む薬学的組成物を、前記皮膚疾患が発症したり、発症の疑いのある個体に投与する段階を含む方法であってもよく、前記薬学的に許容可能な担体は前記で説明した通りである。
【００７１】
前記個体は、牛、豚、羊、鶏、犬、人間などを含む哺乳動物、鳥類などを含み、本発明の組成物の投与により皮膚疾患が治療される個体は、制限なく含む。
このとき、前記組成物は薬学的に有効な量で、単一または多重投与されてもよい。このとき、組成物は液剤、散剤、エアロゾル、カプセル剤、腸溶性錠剤またはカプセル剤または坐剤の形態で投与してもよい。投与経路は、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下内投与、内皮投与、経口投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与、直腸内投与などを含むが、これに制限されない。しかし、経口投与時、ペプチドは消化されるため、経口用組成物は活性薬剤をコーティングしたり、胃での分解から保護されるように剤形化されるべきである。また、製薬組成物は活性物質が標的細胞に移動することができる任意の装置によって投与されてもよい。
【００７２】
本発明のもう一つの様態は、配列番号１のペプチドに特異的に結合する物質を有効成分として含む組成物の、皮膚疾患の予防または治療用途を提供する。
本発明のもう一つの様態は、皮膚疾患を予防または治療する医薬を製造するための、配列番号１のペプチドに特異的に結合する物質を有効成分として含む組成物の用途を提供する。
【００７３】
本発明のもう一つの様態は、皮膚疾患を改善する化粧料、医薬部外品、または皮膚外用剤を製造するための、配列番号１のペプチドに特異的に結合する物質を有効成分として含む組成物の用途を提供する。
【００７４】
以下、本出願の実施例により、より詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、本出願を例示的に説明するためのものであり、本出願の範囲がこれらの実施例により制限されるものではない。
【００７５】
実施例１：ＶＳＦ（Virus suppressing factor）の製造
実施例１−１：ｃｈＶＳＦ（キメラＶＳＦ）の製造
マウスＶＳＦ（ｍＶＳＦ）の主な機能的部分が単細胞群の抗体であることを仮定し、これとヒト免疫グロブリンとを遺伝子操作法で交雑（chimerization）してマウス／ヒト交雑抗体（ｃｈＡｂ）を作った。
【００７６】
具体的には、交雑抗体を作るために、マウスＶＳＦの軽鎖及び重鎖の不変領域（constant region）をヒト免疫抗体（κ、γ２またはγ４）の不変領域に置き換えた。ｃｈＶＳＦはｐＣＡＧＧＳベクターを鋳型にして発現ベクターを作った（図１）。ｍＶＳＦの可変重鎖（ｍＶＨ）（配列番号９）はＳａｃＩとＫｐｎＩ制限酵素部位を含んでＰＣＲで増幅した。可変軽鎖（ｍＶＬ）（配列番号８）は、ＣｌａＩとＸｈｏＩ制限酵素部位を含んでＰＣＲ法で増幅した。ＰＣＲに用いられたプライマーは表１に記載されたプライマーを用い、ＰＣＲ条件は９４℃で４５秒、６０℃で４５秒、７２℃で４５秒に３５サイクルを行い、７２℃で１０分間行った。
【００７７】
【表１】
2020532518.tif 000003
【００７８】
人間の重鎖（配列番号１１）は、ＫｐｎＩとＳｐｈＩ制限酵素部位を用い、軽鎖（配列番号１３）は、ＸｈｏＩとＢｇｌＩ制限酵素を用いてクローニングを行った。軽鎖と重鎖を同時に発現させるためにＩＲＥＳ（internal ribosome entry site）をＳｐｈＩとＣｌａＩ制限酵素部位を用いて軽鎖と重鎖の間にクローニングした。選別マーカーは、ＳａｌＩ制限酵素部位に挿入した。このような方法で、図２の模式図に開示されたようなｃｈＶＳＦを製造した。
【００７９】
実施例１−２：ｔｗｏｖｅｃｔｏｒ発現システムを用いたｃｈＶＳＦの発現
１ｍｇ／ｍｌのＰＥＩ（Polyethyleneimine）を用いて１５μｇのｐＣＡＧＧＳ−ＧＦＰをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションし、トランスフェクションの程度及び発現レベルを確認した。同様の方法で前記実施例１−１のｃｈＶＳＦをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスファクションした後、６時間後に培地を２％ＦＢＳを含む培地に交替した。３日ごとに細胞培養液を集めて０．４５μｍのフィルタを利用して不純物を除去した。タンパク質Ａセファロースビーズ（nProtein A sepharose bead）を用いてｃｈＶＳＦを精製した。ｃｈＶＳＦは０．２Ｍグリシン／塩酸バッファー（Glycine／HCl）（ｐＨ２．５）で溶出し、中和バッファーとしては１ＭＴｒｉｓ−Ｃｌバッファー（ｐＨ９．０）を用いた。具体的には、１ＭＴｒｉｓ−Ｃｌバッファー（ｐＨ８．０）をレジンボリュームの１０倍を使用してレジンを均質化させた後、ＶＳＦ培養液をカラムに通過させた。０．１ＭＴｒｉｓ−Ｃｌバッファー（ｐＨ８．０）をカラムボリュームの５倍以上に流して洗浄した。溶出は０．２Ｍグリシン／塩酸バッファー（ｐＨ２．５）をレジンボリュームの５倍に流して、中和バッファーをあらかじめ入れておいたチューブに精製されたＶＳＦを収得した。この後、精製されたＶＳＦをＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した。
【００８０】
その結果、図３に示すように、ｃｈＶＳＦは免疫グロブリンの特性を有した５０ｋＤａの重鎖と２５ｋＤａの軽鎖で構成されている構造であることを確認できた。
実施例２：ｓｃＦｖ（single-chain variable Fragment）の製造
ＶＳＦの可変領域を用いてｓｃＦｖを製造した。ｓｃＦｖは配列番号１５０のＤＮＡ配列を有し、前記ＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターであるｐＥＴ−２２ｂ（＋）にクローニングしてｓｃＦｖを製造した（図４及び図５）。
【００８１】
具体的には、ｍＶＳＦのＶＨとＶＬをリンカーに連結してｓｃＦｖを作製し、バクテリア発現ベクターであるｐＥＴ２２ｂ（＋）に挿入した後、ＩＰＴＧを添加して発現を誘導した後、Ｎｉ−ＮＴＡカラムを用いて精製した（図６）。
【００８２】
実施例３：ヒト化抗体であるＶＳＦの製造
前記実施例１に基づいてｃｈＶＳＦを用い、ヒト化抗体であるｈｚＶＳＦ（Humanized VSF）を製造した。
【００８３】
真核細胞を用いて２種類の組換えタンパク質を発現させようとするときに使用する発現システムの１つであるｔｗｏ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒに該当するｐｄＣＭＶ−ｄｈＦＲ−ｖｅｃｔｏｒ（図７）を用いた。前記ベクターは２種類の遺伝子を１つのベクター内で異なる転写ユニット（transcription unit）で構成しそれぞれの独自のプロモーターとｐｏｌｙＡシグナルを使用して発現するもので、強力な哺乳類の発現プロモーターであるＣＭＶ（cytomegalovirus）プロモーターを利用するベクターシステムである。これを用いて図８の模式図のようなｈｚＶＳＦを製造した。
【００８４】
そこで、前記ｈｚＶＳＦの重鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号１０に、重鎖領域を配列番号１１に、軽鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号１２に、軽鎖領域を配列番号１３に示した。
【００８５】
１ｍｇ／ｍｌのＰＥＩ（Polyethyleneimine）を用いて１５μｇのｐＣＡＧＧＳ−ＧＦＰをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションし、トランスフェクション程度及び発現レベルを確認した。同様の方法で前記ｃｈＶＳＦ及びｈｚＶＳＦをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスファクションした後、６時間後に培地を２％ＦＢＳを含む培地に交替した。３日ごとに細胞培養液を集めて０．４５μｍのフィルタを利用して不純物を除去した。タンパク質Ａセファロースビーズ（nProtein A sepharose bead）を用いてｃｈＶＳＦ及びｈｚＶＳＦを精製した。ｃｈＶＳＦ及びｈｚＶＳＦは０．２Ｍグリシン／塩酸バッファー（Glycine／HCl）（ｐＨ２．５）で溶出し、中和バッファーとしては１Ｍトリス−Ｃｌバッファー（ｐＨ９．０）を用いた。具体的には、１ＭＴｒｉｓ−Ｃｌバッファー（ｐＨ８．０）をレジンボリュームの１０倍を使用してレジンを均質化させた後、ＶＳＦ培養液をカラムに通過させた。０．１ＭＴｒｉｓ−Ｃｌバッファー（ｐＨ８．０）をカラムボリュームの５倍以上に流して洗浄した。溶出は０．２Ｍグリシン／塩酸バッファー（ｐＨ２．５）をレジンボリュームの５倍に流して、中和バッファーをあらかじめ入れておいたチューブに精製されたＶＳＦを収得した。この後、精製されたＶＳＦをＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認し、活性はＭＶＩＴアッセイを介して確認した。
【００８６】
実験に用いられたＶＳＦを示すと、以下の表２の通りである。
【００８７】
【表２】
2020532518.tif 000004
【００８８】
その結果、図９で確認できるように、ｃｈＶＳＦγ２及びｃｈＶＳＦγ４、ｈｚＶＳＦγ２及びｈｚＶＳＦγ４は免疫グロブリンの特性を有した５０ｋＤａの重鎖と２５ｋＤａの軽鎖で構成されていることを確認した。
【００８９】
実施例４：ヒト化抗体であるＶＳＦの物性確認
前記実施例３で製造したｈｚＶＳＦの物性を次のように確認した。
実施例４−１：基本的な分子量のパターン及び純度の確認
還元及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分子量のパターン及び純度を確認した。具体的には、ｈｚＶＳＦ_ｖ１３をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分子量に応じてクマシー染色法（Coomassie Staining）で染色し、ｈｚＶＳＦ_ｖ１３の分子量及び純度を確認した。
【００９０】
その結果、図１０に示すように、１レーンは非還元ゲルであって、ＩｇＧ抗体（1５０ｋＤａ）で予想される位置に主なバンドが観察され、２レーンは還元ゲルであって、ＩｇＧ抗体の重鎖（約５０ｋＤａ）と軽鎖（約２５ｋＤａ）で該当する位置にバンドが観察され、ｈｚＶＳＦ_ｖ１３が一般的なＩｇＧ抗体のパターンを示すことが確認できた。
【００９１】
実施例４−２：分子量、糖パターン及びサイズの変化などの確認
ｈｚＶＳＦ_ｖ１３の分子量、糖パターン、サイズの変化などを確認するために、液体クロマトグラフィー／質量分析（Liquid Chromtography/Mass Spectrometry）を行った。少量のｈｚＶＳＦ_ｖ１３をＨＰＬＣに注入して、ピークを観察した。
【００９２】
その結果、ｈｚＶＳＦ_ｖ１３は免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の特性を示すことを確認した（図１１）。ＩｎｔａｃｔＭａｓｓでは全体分子量（約１４０ｋＤａ）が観察され、Ｇ０／Ｇ０、Ｇ０Ｆ／Ｇ１、Ｇ１／Ｇ１などの一般的な糖化されたＩｇＧで該当するピークのパターンが観察された。また、糖除去後の重鎖（約４９ｋＤａ）及び軽鎖（約２３ｋＤａ）が観察された。ＰＮＧａｓｅＦ処理で糖鎖が除去された重鎖とＰＮＧａｓｅＦを処理しない重鎖の分子量を総合すると、一般的なＩｇＧのグリカン（glycan）パターンが確認できた（Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ、Ｇ２Ｆ）。
【００９３】
実施例４−３：純度及び凝集度の確認
ｈｚＶＳＦ_ｖ１３の純度と凝集度を確認するために、ＳＥＣ−ＨＰＬＣを用いた。
ＳＥＣ−ＨＰＬＣの条件は以下の通りである。
【００９４】
-  ＨＰＬＣシステム：ＤｉｏｎｅｘＵｌｔｉｍａｔｅ３０００
-  カラム：ＴｏｓｏｈＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷｘｌ
-  移動相：リン酸バッファー、０．５ｍｌ／ｍｉｎ
-  注入量：１０μｌ
その結果、典型的なＩｇＧ抗体の単量体に該当する位置（渋滞時間約１６分）で９２．４４％の主要ピークが観察され、二量体の位置（渋滞時間約１３分）で約６．８４％のピークが観察された（図１２）。
【００９５】
実施例４−４：ｐＩ及び電荷の不均一性（charge heterogeneity）の確認
ｈｚＶＳＦ_ｖ１３の等電荷点を調べるために、ｐＨ３からｐＨ１０まで勾配を示すゲルでランニングをした。
【００９６】
その結果、図１３に示すように、ｈｚＶＳＦ_ｖ１３のｐＩは７．７で分析され、主要バンド以外に酸性及び塩基性アイソフォーム（acidic/basic isoform）も観察された。これは、ＩｇＧ抗体で一般的に観察される異性体[isomer（例えば、Ｃ末端領域の脱アミノ化（deamination））]に該当する。
【００９７】
前記のような結果は、本発明のヒト化抗体であるｈｚＶＳＦ_ｖ１３がＩｇＧ抗体と同様の物性を示すことを裏付ける。
実施例５：免疫原性が減少したヒト化抗体であるｈｚＶＳＦの変異体の製造
実施例５−１：ｈｚＶＳＦオルタナティブ（alternative）の製造
前記実施例３で製造したｈｚＶＳＦに基づいて、３つのオルタナティブを製造した。各オルタナティブの活性は野生型（wild-type）の活性と同様または減少した（０．５≦１Ｕ＜１ｍｇ／ｍｌ）を（表３及び表４）。それぞれのオルタナティブのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列を表３に、それぞれの変異体のＦＲ１〜ＦＲ４のアミノ酸配列を表４に記載した。
【００９８】
【表３】
2020532518.tif 000005
【００９９】
【表４】
2020532518.tif 000006
【０１００】
実施例５−２：ｈｚＶＳＦ変異体の製造
前記実施例３で製造したｈｚＶＳＦに基づいて、実際に生体内で活用するための免疫原性の減少及び親和性成熟（affinity maturation）を介したｈｚＶＳＦ変異体を製造した。その結果、１３個の変異体を製造した（表５及び表６）。それぞれの変異体のＣＤＲ１〜ＣＤＲ３のアミノ酸配列を表５に、それぞれの変異体のＦＲ１〜ＦＲ４のアミノ酸配列を表６に記載した。
【０１０１】
【表５】
2020532518.tif 000007
【０１０２】
【表６−１】
2020532518.tif 000008
【０１０３】
【表６−２】
2020532518.tif 000009
【０１０４】
前記で製造した１３個の変異体は、野生型に比べて免疫原性が減少したことが確認できた。
実施例５−３：ｈｚＶＳＦ野生型及びその変異体のエピトープカウント（epitope count）の確認
ｈｚＶＳＦ野生型とその免疫原性を減少させた前記変異体のうち、代表的な変異体であるｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１２及びｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３のエピトープカウントと現在抗体医薬品における医薬品市場でのブロックバスター医薬品である４種のエピトープカウントを比較した結果、表７に示すように各ＨＬＡｃｌａｓｓＩＩでの相対的な免疫原性の可能性が確認できた。
【０１０５】
【表７】
2020532518.tif 000010
【０１０６】
前記表７でｔｏｔａｌ値が高いほど世界全体人口のＨＬＡｃｌａｓｓＩＩによる副作用の可能性が高いことを意味する。前記の結果を介して免疫原性が減少した本発明のｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１２及びｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３のエピトープカウントが全世界的に市販されている４種の医薬品の中で免疫原性が最も低いＨｕｍｉｒａと似ていることが確認でき、このような結果は本発明のヒト化抗体が引き起こしうる大きい副作用が非常に低いことを示唆するもので、安全な医薬品としての安定性を裏付ける。
【０１０７】
実施例５−４：ｈｚＶＳＦ変異体のＴ細胞分析の確認
ｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１２及びｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３の免疫原性を評価するために、５１人の健康なドナーの血液を用いて、Ｌｏｎｚａのｉｎｖｉｔｒｏ Ｔ細胞分析で本物質がＴ細胞の増殖に影響を与えるかを確認した。各ドナーの全体末梢血液単核球（Peripheral Blood Mononuclear Cell； ＰＢＭＣ）にｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１２、ｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３またはＫＬＨ（Keyhole limpet hemocyanin）を処理した後、７日間培養した。ＫＬＨは酸素を運搬する機能を担う金属タンパク質（metalloprotein）であって、抗体生産時のキャリアタンパク質として利用され、効果的に免疫反応を起こすため陽性対照群として使用した。この後、ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｅｄｕ＋で染色されたＴ細胞の割合（％）を測定した。その結果、ＫＬＨは４５人の血液ドナーからＴ細胞の増殖が起こり、８８％が反応したが、ｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１２またはｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３に反応してＴ細胞の増殖を誘導した個体はそれぞれ３個体であり、５．８％だけが本物質に反応した（図１４）。
【０１０８】
一方、対照群として７日間培養したＰＢＭＣを用いてＫＬＨ、ｈｚＶＳＦ_ｖ１２またはｈｚＶＳＦ_ｖ１３によって誘導されたＴ細胞の増殖の刺激指数（stimulation index；ＳＩ）を計算した。ＳＩ値が２よりも大きいと、人間に適用したときに免疫原性が大きいと予想されるし、ＳＩ値が０．５よりも小さいと、むしろＴ細胞の増殖を抑制することが予想される。その結果、ｈｚＶＳＦ_ｖ１２及びｈｚＶＳＦ_ｖ１３は１．１２及び１．０３の低い値のＳＩ値であって、ほとんどの個体で０．６以上２以下のＳＩ値を示すことを確認した。一方、陽性対照群として用いられたＫＬＨは３．９１の高いＳＩ値を示した（図１５、図１６、及び表８）。
【０１０９】
【表８】
2020532518.tif 000011
【０１１０】
これらの結果から、ｈｚＶＳＦ_ｖ１２及びｈｚＶＳＦ_ｖ１３は実際に皮膚疾患にかかった患者に投与時の免疫原性が少ないと見られ、これに伴う副作用が低いと予想される。
実施例６：ヒトの正常組織とＶＳＦ間の反応性の調査
以下では、前記実施例１〜５で製造及び確認したｈｚＶＳＦ（以下、ＶＳＦ）の皮膚疾患に対する治療効果を多方面で確認した。
【０１１１】
まず、ヒトの正常組織とＶＳＦ間の反応性を調査するために、ヒトの主要な臓器に対する正常組織が配列されているスライドである組織マイクロアレイ（tissue microarray、ＴＭＡ）を用いてｍＶＳＦで免疫組織化学染色を行った。
【０１１２】
その結果、正常組織ではｍＶＳＦによる染色が全く行われていなかった（図１７）。したがって、正常組織ではＶＳＦの受容体であるＶＲが発現されず、ＶＳＦは実質的に皮膚疾患が発生した皮膚細胞のみに作用することがわかる。また、ＶＳＦは正常組織に影響を与えず、薬学組成物などに用いられても副作用が低く、薬理効果に優れることがわかる。
【０１１３】
実施例７：様々な皮膚疾患でのＶＲ発現確認
前記実施例６では、正常組織（正常細胞）ではＶＲが発現されていないことを確認したところ、皮膚疾患が発生した皮膚組織ではＶＲが発現されるかどうかを確認した。
【０１１４】
まず、様々な皮膚疾患者の皮膚組織が固定されたスライドを用いてｍＶＳＦで免疫組織化学染色を行った。各段階の具体的な実験方法は以下の通りである。
実施例７−１：パラフィン包埋
皮膚疾患者由来組織の皮膚片を１０％ＮＢＦ（Neutral buffered formalin）に４８時間固定した。固定された皮膚片から固定液（１０％ＮＢＦ）を除去した後、１×ＰＢＳで３０分間攪拌機を用いて水洗した。１×ＰＢＳを除去した後、７０％、９０％、１００％アルコールに１時間ずつ撹拌機で脱水化過程を行った。キシレン（Xylene）：１００％アルコール（１：１）の溶液で１時間透明化過程の前処理を行った。その後、キシレンを１時間ずつ３回の透明化過程を進行し、６０℃で溶かしたパラフィンを用いて１時間に２回の浸透過程を行った。その後、６０℃のオーブンに溶かしたパラフィンを１２時間皮膚片に処理して浸透過程を行った。パラフィン切片の製造機械を利用して、６０℃で溶かしたパラフィンをモールドに５０％のみ満たし、皮膚片を入れた後、溶かしたパラフィンを５０％追加した。その後、コールドパッドの上で１時間、実験テーブルの上で６時間パラフィンモールドを乾燥した。
【０１１５】
乾燥が終わった後、モールドを除去してパラフィンブロックを収得し、これを冷蔵保管（４℃）した。具体的には、アイスボックスに氷を８０％満たした後、適量の水道水を入れて冷たい状態にした後、冷蔵保管されたパラフィンブロックを試験片がある方向にしてアイスボックスに入れておいた。これは、ブロックの状態が冷えていない場合は組織が分かれて正しい組織を得ることができないからである。
【０１１６】
その後、組織薄切機を利用して４μｍで組織を薄切し、これを５０％アルコールに浸した後、４３℃の恒温水槽に入れた。スライドを用いて薄切された皮膚組織をスライドに付した。スライドを４３℃に温められたヒーティングパッドの上に置いて１時間乾燥した後、冷蔵保管（４℃）した。
【０１１７】
実施例７−２：ヘマトキシリン−エオシン染色（H＆E staining）
キシレンに皮膚片のスライドを１０分間静置した。新しいキシレンを満たし、スライドを１０分間静置した後、キシレン：１００％アルコール（１：１）に３分間静置した。次に、１００％、９５％、９０％、７０％、５０％のアルコールにそれぞれ３分間静置して脱パラフィン過程を行った。これを流れる水道水に１０分間水和させた後、ハリスヘマトキシリン（Harris Hematoxylin）を３分間静置して、まず核を染色した。その後、流れる水道水で５分間水和過程を行った。
【０１１８】
染色されたヘマトキシリンを除去するために１％塩酸（数滴）を添加して脱色し、エオシン（Eosin）を３分間静置して周囲の組織を染色し、流れる水道水で３分間水和過程を行った。次に、７０％、９０％、９５％、１００％のアルコールで３分間静置させてキシレンで５分間静置した後、有機溶媒の封入剤で封入した。フードでスライドをキシレンの臭いがなくなるまで乾燥した後、顕微鏡を用いて組織を観察した。
【０１１９】
実施例７−３：免疫組織化学染色（Immunohistochemistry、ＩＨＣ）
キシレンに皮膚片のスライドを１０分間静置した。新しいキシレンを満たし、スライドを１０分間静置した後、キシレン：１００％アルコール（１：１）に３分間静置した。次に、１００％、９５％、９０％、７０％、５０％のアルコールにそれぞれ３分間静置して脱パラフィン過程を行った。これを流れる水道水に１０分間水和させた後、３％過酸化水素に５分間静置してＰＢＳで３分間２回水洗した。Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  ｂｕｆｆｅｒにスライドを入れた後、電子レンジ（９５℃）で１０分間沸し（組織が乾かないようにバッファーが沸騰したら、不足したバッファーを満たした）、室温で３０分間バッファーを冷やした。これをＰＢＳで３分間２回水洗した。１％ＢＳＡ（Bovine Serum Albumin）を１×ＴＢＳＴ（５０ｍＭＴｒｉｓ、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０）を用いて作成した後、室温で１時間静置した。ｍＶＳＦ（１：５０）と一緒に４℃の恒湿チャンバーで一晩培養した。１×ＴＢＳＴで１０分ずつ３回水洗した。ＨＲＰ（horseradish peroxidase）が結合された抗マウスＩｇＧ抗体（１：２０００）と一緒に３０分間常温で培養した。１×ＴＢＳＴで１０分ずつ３回水洗した。その後、ＤＡＢ（Diaminobenzidine）：過酸化水素（１：２０）溶液に５分間静置して色原体（chromogen）を検出し、ハリスヘマトキシリン（Harris Hematoxylin）を３０秒間静置して核を染色し、流れる水道水で水和過程を行った。最後に、水溶性封入剤を用いて封入した。
【０１２０】
実施例７−４：皮膚疾患の患者の皮膚組織からのＶＲ発現の確認結果
前記のような方法で、さまざまな皮膚疾患者の皮膚組織でＶＳＦの受容体でありながら、皮膚疾患が発生した皮膚細胞でのみ発現されるバイオマーカーであるＶＲの発現を免疫組織化学染色を介して確認した。
【０１２１】
具体的には、皮膚疾患の患者の皮膚組織にパンチ生検を行い、前記方法でパラフィンブロックを作成し、これにＨ＆Ｅ染色を行い、ｍＶＳＦで免疫組織化学染色を実行してＶＲ発現を確認した。
【０１２２】
その結果、図１８〜図２０に示すように、１０人のバラ色粃糠疹（pityriasis rosea）患者のすべての皮膚組織からＶＲが発現されており、その他の帯状疱疹、慢性単純苔癬、単純疱疹患者の皮膚組織では、ＶＲが９０％以上発現された。また、円形湿疹、水いぼ、乾癬、いぼ、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎患者の皮膚組織でも６７％以上のＶＲ発現率を見せ、最終的には合計１１０件の皮膚疾患者の皮膚組織から８８件、すなわち８０％の発現率でＶＲが発現されることを確認した。
【０１２３】
したがって、現在まで具体的かつ正確な発症の原因が明らかにされていない皮膚疾患であるバラ色粃糠疹（pityriasis rosea）、慢性単純苔癬、貨幣状湿疹、乾癬、アトピー性皮膚炎などの皮膚組織では、前記ＶＳＦと結合しうるＶＲが発現されるため、ＶＳＦを処理して前記皮膚疾患に対する治療効果が期待できることがわかった。
【０１２４】
そこで、皮膚疾患の患者に対するＶＳＦの治療効果をより具体的に確認した。
実施例８：皮膚疾患の患者でＶＳＦの治療効能の評価
実際の皮膚疾患の患者を対象にＶＳＦの治療効果を確認した。
【０１２５】
本評価はより客観的な効能を評価するため、皮膚科専門医の主導下に行われ、ｈｚＶＳＦの塗布を自発的に要求した患者に適用した。
ｈｚＶＳＦの効能評価は、１回塗布時のＰＢＳに溶解した５ｍｇ／ｍｌのｈｚＶＳＦを５０μｌずつ使用し、皮膚科専門医が肉眼で治療効果を評価した。
【０１２６】
実施例８−１：乾癬患者に対するＶＳＦの治療効能の確認
対象になる１番乾癬患者は右足に乾癬があり、初診（２０１６年８月１７日）で膝側の病変部位にｈｚＶＳＦを塗布し、２０１６年８月２９日、２０１６年９月７日にさらに塗布した。
【０１２７】
その結果、２０１６年９月１５日の観察時、他の部位に比べてｈｚＶＳＦを塗布した膝部位で顕著な治療効果が確認され、２０１６年９月１５日の４回目の塗布後約１ヶ月後の２０１６年１０月２０日に病変部位を観察した結果、塗布部位の病変部位が９０％以上減少することを確認した（図２１）。
【０１２８】
したがって、前記実施例５で製造したｈｚＶＳＦは乾癬のようにＶＲを発現する皮膚疾患に対して優れた治療効果があることが分かった。
一方、２番の乾癬患者は背に乾癬があり、初診（２０１６年８月１９日）時に生検をしてｈｚＶＳＦの受容体であるＶＲの発現を組織免疫染色で確認してＶＲ発現程度を確認し、初診時に背の病変部位にｈｚＶＳＦを塗布して５日後の８月２４日観察した時に角質生成程度と発赤の程度が５０％以上減少した（図２２）。したがって、２番の患者の場合でも、優れた治療効果を確認した。
【０１２９】
実施例８−２：慢性単純苔癬患者に対するＶＳＦの治療効能の確認
１番の慢性単純苔癬患者は右足に病変部位があり、初診（２０１６年８月７日）時にすね側の病変部位にｈｚＶＳＦを塗布し、５日ごとに１回塗布して３回塗布後の２０１６年８月２２日に観察した結果、角質生成程度及び発赤の程度が７０％以上抑制されることを確認した（図２３）。
【０１３０】
その後、足首側の病変部位にも塗布した。具体的には、すね部位は２０１６年９月２日まで計６回塗布して１ヶ月後の２０１６年１０月２日に観察した結果、疾患が再発せずに治療効果が維持されることを確認した。足首の方は２０１６年９月２日までに計３回投与して１ヶ月後の２０１６年１０月２日に観察した結果、病変部位が５０％以上減少したことを確認した（図２３）。
【０１３１】
２番の慢性単純苔癬患者は両方の足の足首に病変部位があり、初診（２０１６年８月７日）時に病変部位にｈｚＶＳＦを塗布した。２０１６年８月１９日に２回目を塗布し、約６週後である２０１６年９月３０日に観察した結果、ほぼ完治に近い治療効果を示した。特に、ｈｚＶＳＦを塗布することにより角質生成部位がほとんどなくなり、病変部位が９０％以上減少する治療効果が明らかになった（図２４）。
【０１３２】
３番の慢性単純苔癬患者は右足のすねに病変部位があり、初診（２０１６年９月１７日）時にｈｚＶＳＦを１回塗布して２日後の２０１６年９月１９日の観察時に病変部位が５０％以上減少したことを確認して、同様にｈｚＶＳＦの優れた治療効果を確認した（図２５）。
【０１３３】
実施例８−３：貨幣状湿疹患者に対するＶＳＦの治療効能の確認
貨幣状湿疹患者は、右ふくらはぎに病変部位があり、初診（２０１８年２月９日）時からｈｚＶＳＦを病変部位に毎日２回塗布し、２０１８年２月２３日、２０１８年３月２６日に観察した結果、肉眼的に病変部位が改善されたことを確認できた。また、湿疹の疾患程度を紅斑、浮腫／結節／丘疹、擦傷及び苔癬化を点数化したＥＡＳＩｓｃｏｒｅが初診に比べて３次訪問時（４５日後）のＥＡＳＩｓｃｏｒｅが１１から４に改善されたことを確認し、かゆみ感の改善度も３次の訪問時に１０から５に改善されて治療効果を確認した（図２６）。
【０１３４】
実施例８−４：皮膚疾患の患者に対するＶＳＦの治療効能の定量的測定
慢性単純苔癬、貨幣状湿疹、湿疹、アトピー性皮膚炎、及び乾癬が発症した患者では初診時からｈｚＶＳＦを病変部位に毎日２回塗布し、２次及び３次の訪問時に観察した。慢性単純苔癬の場合、初診時から３次訪問時まで平均４０日間進行しており、ＥＡＳＩｓｃｏｒｅは平均８．５から４に改善され、かゆみ感も６．５から２．５に改善された。貨幣状湿疹は、初診時から３次訪問時まで平均３６日間進行しており、ＥＡＳＩｓｃｏｒｅは平均８．３から３に改善され、かゆみ感も８から３に改善された。湿疹は、初診時から３次訪問時まで３５日間進行しており、ＥＡＳＩｓｃｏｒｅは５から１に改善され、かゆみ感も５から２に改善された。アトピー性皮膚炎は、初診時から３次訪問時まで４２日間進行されており、ＥＡＳＩｓｃｏｒｅは１０から４に改善され、かゆみ感も６から２に改善された。皮膚炎は、初診時から３次訪問時まで３５日間進行されており、ＥＡＳＩｓｃｏｒｅは６から３に改善され、かゆみ感も５から４に改善された。乾癬は、初診時から３次訪問時まで平均２６日間進行されており、ＰＡＳＩｓｃｏｒｅは平均８から３．６に改善され、かゆみ感も６．３から２．６に改善された。これらの結果から、肉眼的に病変部位が改善されたことを確認することができ、湿疹の疾患程度を紅斑、浮腫／結節／丘疹、擦傷及び苔癬化を点数化したＥＡＳＩｓｃｏｒｅ及び乾癬疾患の程度を紅斑、厚さ、鱗屑を点数化したＰＡＳＩｓｃｏｒｅが初診に比べて３次訪問時にすべての皮膚炎の疾患で改善されたことを確認し、かゆみ感の改善度も３次訪問時にすべて改善されて治療効果を確認した（図２７及び２８）。
【０１３５】
これを総合すると、本発明のＶＳＦ、すなわち実施例５及び実施例８で製造したｈｚＶＳＦは、乾癬、慢性単純苔癬、バラ色粃糠疹（pityriasis rosea）、単純疱疹、貨幣状湿疹、水いぼ、いぼ、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎のように、ＶＲを発現する皮膚疾患に適用される場合、優れた治療効果を示すことができ、ＶＲを発現する皮膚疾患に対する予防及び治療用組成物などに有効に活用されうることがわかった。
【０１３６】
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者は、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更せず、他の具体的な形態で実施されうることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はすべての面で例示的なものであり、限定的なものではないものと理解しなければならない。本発明の範囲は、前記詳細な説明より、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導き出されるすべての変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年2月27日(2020.2.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のペプチドに特異的に結合する物質を有効成分として含む、皮膚疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項２】
配列番号１のペプチドに特異的に結合する物質が、配列番号１のペプチドに特異的に結合する抗体または前記ペプチドの結合断片、化合物、ペプチド、またはアプタマーである、請求項１に記載の薬学組成物。
【請求項３】
前記抗体が、マウス抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体である、請求項２に記載の薬学組成物。
【請求項４】
前記ペプチドの結合断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、これらの二量体、ミニボディ（minibodies）、ダイアボディ（diabodies）及び多量体（multimer）または二重特異性抗体断片である、請求項２に記載の薬学組成物。
【請求項５】
前記皮膚疾患が、バラ色粃糠疹（pityriasis rosea）、帯状疱疹、慢性単純苔癬、単純疱疹、貨幣状湿疹、湿疹、水いぼ、乾癬、いぼ、アトピー性皮膚炎または接触性皮膚炎である、請求項１に記載の薬学組成物。
【請求項６】
前記皮膚疾患が、慢性単純苔癬、乾癬、貨幣状湿疹、湿疹、アトピー性皮膚炎または接触性皮膚炎である、請求項１に記載の薬学組成物。
【請求項７】
配列番号１のペプチドに特異的に結合する物質を有効成分として含む、皮膚疾患の予防または改善用化粧料組成物。
【請求項８】
前記配列番号１のペプチドに特異的に結合する物質が、配列番号１のペプチドに特異的に結合する抗体または前記ペプチドの結合断片、化合物、ペプチド、またはアプタマーである、請求項７に記載の化粧料組成物。
【請求項９】
配列番号１のペプチドに特異的に結合する物質を有効成分として含む、皮膚疾患の予防または改善用医薬部外品組成物。
【請求項１０】
前記配列番号１のペプチドに特異的に結合する物質が、配列番号１のペプチドに特異的に結合する抗体または前記ペプチドの結合断片、化合物、ペプチド、またはアプタマーである、請求項９に記載の医薬部外品組成物。
【請求項１１】
配列番号１のペプチドに特異的に結合する物質を有効成分として含む、皮膚疾患の予防または改善用皮膚外用剤。
【請求項１２】
前記配列番号１のペプチドに特異的に結合する物質が、配列番号１のペプチドに特異的に結合する抗体または前記ペプチドの結合断片、化合物、ペプチド、またはアプタマーである、請求項１１に記載の皮膚外用剤。
【請求項１３】
皮膚疾患を予防または治療する医薬を製造するための、配列番号１のペプチドに特異的に結合する物質を有効成分として含む組成物の用途。
【請求項１４】
皮膚疾患を改善する化粧料、医薬部外品、または皮膚外用剤を製造するための、配列番号１のペプチドに特異的に結合する物質を有効成分として含む組成物の用途。
【国際調査報告】
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