(57)【要約】  本開示は、免疫腫瘍学のための、ゲノム編集系、試薬、および方法を対象とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｔｒａｃｒとｃｒＲＮＡとを含むｇＲＮＡ分子であって、前記ｃｒＲＮＡが、ＴＥＴ２イントロンおよびＴＥＴ２イントロン−エクソン接合部から選択される標的配列と相補的なターゲティングドメインを含む、ｇＲＮＡ分子。
【請求項２】
前記ターゲティングドメインが、ｃｈｒ４：１０５１４６９８０−１０５１９０３５９；ｃｈｒ４：１０５１９０５０６−１０５２３３８９６；ｃｈｒ４：１０５２３７３５２−１０５２４１３３８；ｃｈｒ４：１０５２４１４３０−１０５２４２８３３；ｃｈｒ４：１０５２４２９２８−１０５２４３５６９；ｃｈｒ４：１０５２４３７７９−１０５２５９６１８；ｃｈｒ４：１０５２５９７７０−１０５２６１７５８；ｃｈｒ４：１０５２６１８４９−１０５２６９６０９；ｃｈｒ４：１０５２６９７４８−１０５２７２５６３；およびｃｈｒ４：１０５２７２９１９−１０５２７５０４７から選択されるゲノム領域内の配列と相補的であり、前記ゲノム領域が、ヒト基準ゲノムであるｈｇ３８に従う、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項３】
前記ゲノム領域が、ｃｈｒ４：１０５２６９７４８−１０５２７２５６３である、請求項２に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項４】
前記ターゲティングドメインが、ｃｈｒ４：１０５２７０６２４−１０５２７０６４３；ｃｈｒ４：１０５２７０６３０−１０５２７０６４９；ｃｈｒ４：１０５２７１８６３−１０５２７１８８３；ｃｈｒ４：１０５２７１３４０−１０５２７１３６０；ｃｈｒ４：１０５２７１２０４−１０５２７１２２３；ｃｈｒ４：１０５２７１５２６−１０５２７１５４６；ｃｈｒ４：１０５２７０３５０−１０５２７０３７０；ｃｈｒ４：１０５２７０２６８−１０５２７０２８８；ｃｈｒ４：１０５２７２１８２−１０５２７２２０２；ｃｈｒ４：１０５２７２４６５−１０５２７２４８５；ｃｈｒ４：１０５２７１３８７−１０５２７１４０７；ｃｈｒ４：１０５２７２４３６−１０５２７２４５６；ｃｈｒ４：１０５２７１９２４−１０５２７１９４４；ｃｈｒ４：１０５２７２３２３−１０５２７２３４３；ｃｈｒ４：１０５２７２０５７−１０５２７２０７７；ｃｈｒ４：１０５２７２３０９−１０５２７２３２９；ｃｈｒ４：１０５２７２３２４−１０５２７２３４４；ｃｈｒ４：１０５２７２３２４−１０５２７２３４４；ｃｈｒ４：１０５２７１１８４−１０５２７１２０４；ｃｈｒ４：１０５２７１１９０−１０５２７１２１０；ｃｈｒ４：１０５２７１２９５−１０５２７１３１５；ｃｈｒ４：１０５２７１２９２−１０５２７１３１２；ｃｈｒ４：１０５２７１４５８−１０５２７１４７８；ｃｈｒ４：１０５２７０６３５−１０５２７０６５５；ｃｈｒ４：１０５２７１１７３−１０５２７１１９２；ｃｈｒ４：１０５２７１２３２−１０５２７１２５２；ｃｈｒ４：１０５２７１８４５−１０５２７１８６５；ｃｈｒ４：１０５２７１８４９−１０５２７１８６９；およびｃｈｒ４：１０５２７１０５６−１０５２７１０７６から選択されるゲノム領域内の配列と相補的である、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項５】
前記ターゲティングドメインが、ｃｈｒ４：１０５２７０６２４−１０５２７０６４３；ｃｈｒ４：１０５２７０６３０−１０５２７０６４９；ｃｈｒ４：１０５２７１３８７−１０５２７１４０７；ｃｈｒ４：１０５２７１９２４−１０５２７１９４４；ｃｈｒ４：１０５２７２３２３−１０５２７２３４３；ｃｈｒ４：１０５２７２０５７−１０５２７２０７７；ｃｈｒ４：１０５２７２３０９−１０５２７２３２９；ｃｈｒ４：１０５２７２３２４−１０５２７２３４４；ｃｈｒ４：１０５２７２３２４−１０５２７２３４４；ｃｈｒ４：１０５２７１１８４−１０５２７１２０４；ｃｈｒ４：１０５２７１１９０−１０５２７１２１０；ｃｈｒ４：１０５２７１２９５−１０５２７１３１５；ｃｈｒ４：１０５２７１２９２−１０５２７１３１２；ｃｈｒ４：１０５２７１４５８−１０５２７１４７８；ｃｈｒ４：１０５２７０６３５−１０５２７０６５５；ｃｈｒ４：１０５２７１１７３−１０５２７１１９２；ｃｈｒ４：１０５２７１２３２−１０５２７１２５２；およびｃｈｒ４：１０５２７１０５６−１０５２７１０７６から選択されるゲノム領域内の配列と相補的である、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項６】
前記ターゲティングドメインが、ｃｈｒ４：１０５２７１８６３−１０５２７１８８３；ｃｈｒ４：１０５２７１３４０−１０５２７１３６０；ｃｈｒ４：１０５２７１２０４−１０５２７１２２３；ｃｈｒ４：１０５２７１５２６−１０５２７１５４６；ｃｈｒ４：１０５２７０３５０−１０５２７０３７０；ｃｈｒ４：１０５２７０２６８−１０５２７０２８８；ｃｈｒ４：１０５２７２１８２−１０５２７２２０２；およびｃｈｒ４：１０５２７２４６５−１０５２７２４８５から選択されるゲノム領域内の配列と相補的である、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項７】
前記ターゲティングドメインが、ｃｈｒ４：１０５２７１３４０−１０５２７１３６０；ｃｈｒ４：１０５２７１５２６−１０５２７１５４６；ｃｈｒ４：１０５２７０３５０−１０５２７０３７０；ｃｈｒ４：１０５２７０２６８−１０５２７０２８８；ｃｈｒ４：１０５２７２１８２−１０５２７２２０２；およびｃｈｒ４：１０５２７２４６５−１０５２７２４８５から選択されるゲノム領域内の配列と相補的である、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項８】
前記ターゲティングドメインが、ｃｈｒ４：１０５２７０６２４〜１０５２７０６４３；ｃｈｒ４：１０５２７０６３０〜１０５２７０６４９；およびｃｈｒ４：１０５２７１８６３〜１０５２７１８８３から選択されるゲノム領域内の配列と相補的である、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項９】
前記ターゲティングドメインが、例えば、表１または表２の、配列番号１０００〜配列番号１０５１４のうちのいずれか１つ、またはこの断片を含むか、またはこれらからなる、請求項１から２のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項１０】
前記ターゲティングドメインが、配列番号１０１０２〜配列番号１０３２４のうちのいずれか１つ、またはこれらの断片を含む、請求項１から８のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項１１】
前記ターゲティングドメインが、表２に列挙されたターゲティングドメイン配列、またはこれらの断片を含む、請求項１から９のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項１２】
前記ターゲティングドメインが、配列番号１０１４８、配列番号１０１８４、配列番号１０１８５、配列番号１０１８８、配列番号１０２０９、配列番号１０２１２、配列番号１０３１７、配列番号１０３１８、配列番号１０１８７、配列番号１０２２４、配列番号１０２９２、配列番号１０１４９、配列番号１０１７７、配列番号１０１５１、配列番号１０２２５または配列番号１０５０９のうちのいずれか１つを含む、請求項１から１１のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項１３】
前記ターゲティングドメインが、配列番号１０１４８、１０１４９、１０２０６、１０１９１、１０５１５、１０２０３、１０２５９、１０１３６、１０３１４、１０２３４、１０２９０、１０２３３、１０２０９、１０２２４、１０２１２、１０３１７、１０３１８、１０２２５、１０１８４、１０１８５、１０１８８、１０１８７、１０２９２、１０１５１、１０５０９、１０２８１、１０２９９、１０３０１、または１０１７７のうちのいずれか１つを含む、請求項１から１１のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項１４】
前記ターゲティングドメインが、配列番号１０１４８、１０１４９、１０２９０、１０２０９、１０２２４、１０２１２、１０３１７、１０３１８、１０２２５、１０１８４、１０１８５、１０１８８、１０１８７、１０２９２、１０１５１、１０５０９、１０２８１、または１０１７７のうちのいずれか１つを含む、請求項１から１１のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項１５】
前記ターゲティングドメインが、配列番号１０２０６、１０１９１、１０５１５、１０２０３、１０２５９、１０１３６、１０３１４、または１０２３４のうちのいずれか１つを含む、請求項１から１１のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項１６】
前記ターゲティングドメインが、配列番号１０１９１、１０２０３、１０２５９、１０１３６、１０３１４、または１０２３４のうちのいずれか１つを含む、請求項１から１１のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項１７】
前記ターゲティングドメインが、配列番号１０１４８、１０１４９、および１０２０６のうちのいずれか１つを含む、請求項１から１１のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項１８】
前記ターゲティングドメインが、列挙されたターゲティングドメイン配列のうちのいずれか１つの、１７、１８、１９、または２０の連続核酸を含む、請求項１から１７のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項１９】
前記ターゲティングドメインが、列挙されたターゲティングドメイン配列のうちのいずれか１つの、１７、１８、１９、または２０の連続核酸からなる、請求項１から１７のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項２０】
前記列挙されたターゲティングドメイン配列のうちのいずれか１つの、１７、１８、１９、または２０の連続核酸が、列挙されたターゲティングドメイン配列の３’末端部に配置された、１７、１８、１９、または２０の連続核酸である、請求項１８または１９に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項２１】
前記列挙されたターゲティングドメイン配列のうちのいずれか１つの、１７、１８、１９、または２０の連続核酸が、列挙されたターゲティングドメイン配列の５’末端部に配置された、１７、１８、１９、または２０の連続核酸である、請求項１８または９９に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項２２】
前記列挙されたターゲティングドメイン配列のうちのいずれか１つの、１７、１８、１９、または２０の連続核酸が、列挙されたターゲティングドメイン配列の５’または３’核酸を含まない、請求項１８または１９に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項２３】
前記ターゲティングドメインが、列挙されたターゲティングドメイン配列からなる、請求項１から１７のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項２４】
前記ｃｒＲＮＡの部分と、前記ｔｒａｃｒの部分とが、ハイブリダイズして、配列番号５０または配列番号５１を含むフラッグポールを形成する、先行する請求項のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項２５】
前記フラッグポールが、前記フラッグポールの前記ｃｒＲＮＡ部分に対して３’側に位置する、第１のフラッグポール伸長部をさらに含み、前記第１のフラッグポール伸長部が、配列番号５５を含む、請求項２４に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項２６】
前記フラッグポールが、前記フラッグポールの前記ｃｒＲＮＡ部分と、存在する場合、前記第１のフラッグポール伸長部とに対して３’側に位置する、第２のフラッグポール伸長部をさらに含み、前記第２のフラッグポール伸長部が、配列番号５７を含む、請求項２４または２５に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項２７】
前記ｔｒａｃｒが、
（ａ）任意選択で、３’末端部において、さらなる１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、もしくは７つのウラシル（Ｕ）ヌクレオチドをさらに含む配列番号７８２０；
（ｂ）配列番号６５；または
（ｃ）配列番号８４
を含む、請求項１から２６のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項２８】
前記フラッグポールの前記ｃｒＲＮＡ部分が、配列番号７９または配列番号８０を含む、請求項２７に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項２９】
前記ｔｒａｃｒが、配列番号５３または配列番号５４と、任意選択で、第１のフラッグポール伸長部が存在する場合、配列番号５３または配列番号５４に対して５’側に配置された、第１のｔｒａｃｒ伸長部とを含み、前記第１のｔｒａｃｒ伸長部が、配列番号５６を含む、請求項１から２６のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項３０】
前記ターゲティングドメインと、前記ｔｒａｃｒとが、別個の核酸分子上に配置された、請求項１９から２０のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項３１】
前記ｃｒＲＮＡが、５’から３’へと、［ターゲティングドメイン］−：
（ａ）配列番号５０；
（ｂ）配列番号５１；
（ｃ）配列番号７７；
（ｄ）配列番号７８；
（ｅ）配列番号７９；
（ｆ）配列番号８０；または
（ｇ）配列番号８１
を含む、請求項１から２３のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項３２】
前記ｔｒａｃｒが、５’から３’へと：
（ａ）配列番号５３；
（ｂ）配列番号５４；
（ｃ）配列番号８２；
（ｄ）配列番号８３；
（ｅ）配列番号６５；
（ｆ）配列番号８４；
（ｇ）配列番号８７；
（ｈ）配列番号７６；
（ｉ）配列番号８５；
（ｊ）配列番号８６；
（ｋ）３’末端部において、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、もしくは７つのウラシル（Ｕ）ヌクレオチド、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、もしくは７つのウラシル（Ｕ）ヌクレオチドをさらに含む、上記のａ）〜ｊ）のうちのいずれか；
（ｌ）３’末端部において、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、もしくは７つのアデニン（Ａ）ヌクレオチド、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、もしくは７つのアデニン（Ａ）ヌクレオチドをさらに含む、上記のａ）〜ｋ）のうちのいずれか；または
（ｍ）５’末端部（例えば、５’末端）において、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、もしくは７つのアデニン（Ａ）ヌクレオチド、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、もしくは７つのアデニン（Ａ）ヌクレオチドをさらに含む、上記のa）〜l）のうちのいずれか
を含む、請求項１から２３または３１のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項３３】
前記ターゲティングドメインと、前記ｔｒａｃｒとが、別個の核酸分子上に配置され、前記ターゲティングドメインを含む前記核酸分子が、任意選択で、前記ターゲティングドメインに対してすぐ３’側に配置された配列番号７９を含み、前記ｔｒａｃｒを含む前記核酸分子が、配列番号６５を含む、請求項１から２３のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項３４】
前記ターゲティングドメインと、前記ｔｒａｃｒとが、単一の核酸分子上に配置され、前記ｔｒａｃｒが、前記ターゲティングドメインに対して３’側に配置された、請求項２７から２８のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項３５】
前記ターゲティングドメインに対して３’側に配置され、かつ、前記ｔｒａｃｒに対して５’側に配置されたループをさらに含む、請求項３４に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項３６】
前記ループが、配列番号５２を含む、請求項３５に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項３７】
５’から３’へと、［ターゲティングドメイン］−：
（ａ）配列番号７１；
（ｂ）配列番号７２；
（ｃ）配列番号７３；
（ｄ）配列番号７４；
（ｅ）配列番号７５；または
（ｆ）３’末端部において、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、もしくは７つのウラシル（Ｕ）ヌクレオチドをさらに含む、上記の(ａ）〜（ｅ）のうちのいずれか
を含む、請求項１から３３のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項３８】
前記ターゲティングドメインと、前記ｔｒａｃｒとが、単一の核酸分子上に配置され、前記核酸分子が、前記ターゲティングドメインと、任意選択で、前記ターゲティングドメインに対してすぐ３’側に配置された配列番号７１とを含む、請求項１から２３のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項３９】
前記ターゲティングドメインと、前記ｔｒａｃｒとが、単一の核酸分子上に配置され、前記核酸分子が、前記ターゲティングドメインと、任意選択で、前記ターゲティングドメインに対してすぐ３’側に配置された配列番号７５とを含む、請求項１から２３のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項４０】
前記ｇＲＮＡ分子を含む前記核酸分子のうちの、１つの核酸分子、または、任意選択で、１つを超える核酸分子が、
（ａ）前記１つまたは複数の核酸分子の３’末端部における、ある、例えば３つのホスホロチオエート修飾；
（ｂ）前記１つまたは複数の核酸分子の５’末端部における、ある、例えば３つのホスホロチオエート修飾；
（ｃ）前記１つまたは複数の核酸分子の３’末端部における、ある、例えば３つの２’−Ｏ−メチル修飾；
（ｄ）前記１つまたは複数の核酸分子の５’末端部における、ある、例えば３つの２’−Ｏ−メチル修飾；
（ｅ）前記１つまたは複数の核酸分子の、末端に対して４つ目、末端に対して３つ目、および末端に対して２つ目の３’残基の各々における２’−Ｏ−メチル修飾；または
（ｆ）これらの任意の組合せ
を含む、請求項１から３９のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項４１】
前記ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ系（例えば、本明細書で記載されるＲＮＰ）を、細胞へと導入すると、前記ｇＲＮＡ分子の前記ターゲティングドメインと相補的な前記標的配列において、またはこの近傍において、インデルが形成される、請求項１から４０のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項４２】
前記インデルが、１０ヌクレオチドを超える欠失、例えば、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５ヌクレオチドの欠失を含む、請求項４１に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項４３】
前記ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ系（例えば、本明細書で記載されるＲＮＰ）を、細胞集団へと導入すると、前記集団の前記細胞のうちの少なくとも約４０％、例えば、少なくとも約５０％、例えば、少なくとも約６０％、例えば、少なくとも約７０％、例えば、少なくとも約８０％、例えば、少なくとも約９０％、例えば、少なくとも約９５％、例えば、少なくとも約９６％、例えば、少なくとも約９７％、例えば、少なくとも約９８％、例えば、少なくとも約９９％の中の、前記ｇＲＮＡ分子の前記ターゲティングドメインと相補的な前記標的配列において、またはこの近傍において、インデルが形成される、請求項１から４２のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項４４】
１０ヌクレオチドを超える欠失、例えば、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５ヌクレオチドの欠失を含む前記インデルが、前記集団の前記細胞のうちの少なくとも約５％、例えば、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％またはこれを超える細胞内で検出される、請求項４２に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項４５】
前記インデルが、表２２中のインデルから選択される、請求項４１に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項４６】
前記インデルが、表２３中のインデル頻度から選択されるインデル頻度で形成される、請求項４１に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項４７】
前記インデルが、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）により測定されるものである、請求項４１から４６のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項４８】
前記ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ系（例えば、本明細書で記載されるＲＮＰ）を、細胞へと導入すると、ＴＥＴ２の少なくとも１つのアイソフォームの発現が、前記細胞内で低減または消失する、請求項１から４７のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項４９】
前記ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ系（例えば、本明細書で記載されるＲＮＰ）を、細胞へと導入すると、ＴＥＴ２の機能、例えば、触媒機能が、前記細胞内で低減または消失する、請求項１から４８のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項５０】
前記細胞内で、ＴＥＴ２の前記機能、例えば、前記触媒機能が、例えば、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％低減されるが、前記機能、例えば、前記触媒機能が、約８０％を超えて低減されない、例えば、消失しない、請求項４９に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項５１】
前記ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ系（例えば、本明細書で記載されるＲＮＰ）を、細胞へと導入すると、ＴＥＴ２の発現、例えば、少なくとも１つのＴＥＴ２アイソフォームの発現、および／または少なくとも１つのＴＥＴ２の機能が、同じ種類であるが、前記ＣＲＩＳＰＲ系を導入していない細胞（例えば、同じ種類の非変更細胞）内の発現および／または機能のレベルと比べて変更されない、請求項１から５１のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項５２】
前記ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ系（例えば、本明細書で記載されるＲＮＰ）を、細胞へと導入すると、前記細胞内で、例えば、次世代シーケンシングおよび／またはヌクレオチド挿入アッセイにより検出可能なオフターゲットインデルが形成されない、請求項４３から５１のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項５３】
前記ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ系（例えば、本明細書で記載されるＲＮＰ）を、細胞集団へと導入すると、例えば、次世代シーケンシングおよび／またはヌクレオチド挿入アッセイにより検出可能なオフターゲットインデルが、前記細胞集団の前記細胞のうちの約５％以下、例えば、約１％以下、例えば、約０．１％以下、例えば、約０．０１％以下の中で検出される、請求項４３から５１のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項５４】
請求項１から５３のいずれかに記載の第１のｇＲＮＡ分子を含む組成物。
【請求項５５】
Ｃａｓ９分子をさらに含む、請求項５４に記載の組成物。
【請求項５６】
前記Ｃａｓ９分子が、配列番号９０、配列番号１１１〜配列番号１２１または配列番号１２３のうちのいずれか１つを含む、請求項５５に記載の組成物。
【請求項５７】
前記Ｃａｓ９分子が、活性または不活性の化膿連鎖球菌（S. pyogenes）Ｃａｓ９である、請求項５５に記載の組成物。
【請求項５８】
前記第１のｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子が、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）内に存在する、請求項５５から５７のいずれかに記載の組成物。
【請求項５９】
鋳型核酸をさらに含む、請求項５４から５８のいずれかに記載の組成物。
【請求項６０】
前記鋳型核酸が、二本鎖または一本鎖である、請求項５９に記載の組成物。
【請求項６１】
前記鋳型核酸が、ベクターであるか、またはこの中に含まれる、請求項５９から６０のいずれかに記載の組成物。
【請求項６２】
前記ベクターが、レンチウイルスベクター、ＡＡＶベクター、アデノウイルスベクター、プラスミド、ミニサークル、またはナノプラスミドである、請求項６１に記載の組成物。
【請求項６３】
前記ベクターが、ＡＡＶベクターである、請求項６２に記載の組成物。
【請求項６４】
前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ６ベクターである、請求項６３に記載の組成物。
【請求項６５】
前記鋳型核酸が、少なくとも１つの（例えば、少なくとも５’または少なくとも３’）相同性アームを含み、前記相同性アームが、ＴＥＴ２イントロンの配列と相同な配列を含む、請求項５９から８４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６６】
前記鋳型核酸が、５’および３’相同性アームの両方を含み、前記相同性アームのうちの少なくとも１つが、ＴＥＴ２イントロンの配列と相同な配列を含む、請求項６５に記載の組成物。
【請求項６７】
前記鋳型核酸が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含む、請求項５９から６６のいずれかに記載の組成物。
【請求項６８】
前記ＣＡＲが、
（ａ）例えば、本明細書で記載されるＣＤ１９  ＣＡＲ；または
（ｂ）例えば、本明細書で記載されるＢＣＭＡ  ＣＡＲ
である、請求項６７に記載の組成物。
【請求項６９】
前記ＣＡＲが、配列番号１６０〜配列番号１７２または配列番号１７５のうちのいずれか１つを含む抗原結合性ドメインを含むＣＤ１９  ＣＡＲである、請求項６８に記載の組成物。
【請求項７０】
前記ＣＡＲが、ＣＤ１９  ＣＡＲであり、配列番号１８５〜配列番号１９７のうちのいずれか１つを含む、請求項６８から６９のいずれかに記載の組成物。
【請求項７１】
前記ＣＡＲが、配列番号２３９〜配列番号４１２のうちのいずれか１つを含む抗原結合性ドメインを含むＢＣＭＡ  ＣＡＲである、請求項６８に記載の組成物。
【請求項７２】
前記ＣＡＲが、ＢＣＭＡ  ＣＡＲであり、配列番号８４９〜配列番号８６３または配列番号８７９〜配列番号８９９のうちのいずれか１つを含む、例えば、配列番号８５９を含む、請求項６８および７１のいずれかに記載の組成物。
【請求項７３】
前記鋳型核酸が、前記ＣＡＲをコードする核酸配列に作動可能に連結したプロモーター、例えば、ＥＦ１アルファプロモーターを含む、請求項６７から７２のいずれかに記載の組成物。
【請求項７４】
前記鋳型核酸配列が、ＣＤ１９  ＣＡＲ、ＢＣＭＡ  ＣＡＲ、およびＣＤ２２  ＣＡＲから選択されるＣＡＲをコードする核酸配列を含み；前記鋳型核酸配列が、配列番号１２４を含む第１の相同性アームと、配列番号１２５を含む第２の相同性アームとをさらに含み；前記ｇＲＮＡ分子が、ｃｈｒ４：１０５２６９７４８〜１０５２７２５６３、ｃｈｒ４：１０５２７０６２４〜１０５２７０６４３、ｃｈｒ４：１０５２７０６３０〜１０５２７０６４９、またはｃｈｒ４：１０５２７１８６３〜１０５２７１８８３のゲノム領域（ｈｇ３８に従う）内の配列と相補的なターゲティングドメインを含むｇＲＮＡである、請求項５９から７３のいずれかに記載の組成物。
【請求項７５】
前記鋳型核酸配列が、配列番号１２４を含む第１の相同性アームと、配列番号１２５を含む第２の相同性アームとを含み；前記ｇＲＮＡ分子が、ｃｈｒ４：１０５２６９７４８〜１０５２７２５６３、ｃｈｒ４：１０５２７０６２４〜１０５２７０６４３、ｃｈｒ４：１０５２７０６３０〜１０５２７０６４９、またはｃｈｒ４：１０５２７１８６３〜１０５２７１８８３のゲノム領域（ｈｇ３８に従う）内の配列と相補的なターゲティングドメインを含むｇＲＮＡである、請求項５９から７３のいずれかに記載の組成物。
【請求項７６】
前記鋳型核酸配列が、ＣＤ１９  ＣＡＲ、ＢＣＭＡ  ＣＡＲ、およびＣＤ２２  ＣＡＲから選択されるＣＡＲをコードする核酸配列を含み；前記ｇＲＮＡ分子が、ｃｈｒ４：１０５２６９７４８〜１０５２７２５６３、ｃｈｒ４：１０５２７０６２４〜１０５２７０６４３、ｃｈｒ４：１０５２７０６３０〜１０５２７０６４９、またはｃｈｒ４：１０５２７１８６３〜１０５２７１８８３のゲノム領域（ｈｇ３８に従う）内の配列と相補的なターゲティングドメインを含むｇＲＮＡである、請求項５９から７３のいずれかに記載の組成物。
【請求項７７】
前記鋳型核酸配列が、ＡＡＶ６ベクター内にあり；前記鋳型核酸配列が、ＣＤ１９  ＣＡＲ、ＢＣＭＡ  ＣＡＲ、およびＣＤ２２  ＣＡＲから選択されるＣＡＲをコードする核酸配列を含み；前記鋳型核酸配列が、配列番号１２４を含む第１の相同性アームと、配列番号１２５を含む第２の相同性アームとをさらに含み；前記ｇＲＮＡ分子が、ｃｈｒ４：１０５２６９７４８〜１０５２７２５６３、ｃｈｒ４：１０５２７０６２４〜１０５２７０６４３、ｃｈｒ４：１０５２７０６３０〜１０５２７０６４９、またはｃｈｒ４：１０５２７１８６３〜１０５２７１８８３のゲノム領域（ｈｇ３８に従う）内の配列と相補的なターゲティングドメインを含むｇＲＮＡである、請求項５９から７３のいずれかに記載の組成物。
【請求項７８】
前記鋳型核酸配列が、ＡＡＶ６ベクター上に提供され；前記鋳型核酸配列が、配列番号１２４を含む第１の相同性アームと、配列番号１２５を含む第２の相同性アームとを含み；前記ｇＲＮＡ分子が、ｃｈｒ４：１０５２６９７４８〜１０５２７２５６３、ｃｈｒ４：１０５２７０６２４〜１０５２７０６４３、ｃｈｒ４：１０５２７０６３０〜１０５２７０６４９、またはｃｈｒ４：１０５２７１８６３〜１０５２７１８８３のゲノム領域（ｈｇ３８に従う）内の配列と相補的なターゲティングドメインを含むｇＲＮＡである、請求項５９から７３のいずれかに記載の組成物。
【請求項７９】
前記鋳型核酸配列が、ＡＡＶ６ベクター上に提供され；前記鋳型核酸配列が、ＣＤ１９  ＣＡＲ、ＢＣＭＡ  ＣＡＲ、およびＣＤ２２  ＣＡＲから選択されるＣＡＲをコードする核酸配列を含み；前記ｇＲＮＡ分子が、ｃｈｒ４：１０５２６９７４８〜１０５２７２５６３、ｃｈｒ４：１０５２７０６２４〜１０５２７０６４３、ｃｈｒ４：１０５２７０６３０〜１０５２７０６４９、ｃｈｒ４：１０５２７１８６３〜１０５２７１８８３のゲノム領域（ｈｇ３８に従う）内の配列と相補的なターゲティングドメインを含むｇＲＮＡから選択される、請求項５９から７３のいずれかに記載の組成物。
【請求項８０】
前記鋳型核酸配列が、ＡＡＶ６ベクター上に提供され；前記ｇＲＮＡ分子が、ｃｈｒ４：１０５２６９７４８〜１０５２７２５６３、ｃｈｒ４：１０５２７０６２４〜１０５２７０６４３、ｃｈｒ４：１０５２７０６３０〜１０５２７０６４９、またはｃｈｒ４：１０５２７１８６３〜１０５２７１８８３のゲノム領域（ｈｇ３８に従う）内の配列と相補的なターゲティングドメインを含むｇＲＮＡである、請求項５９から７３のいずれかに記載の組成物。
【請求項８１】
前記鋳型核酸配列が、ＣＤ１９  ＣＡＲ、ＢＣＭＡ  ＣＡＲ、およびＣＤ２２  ＣＡＲから選択されるＣＡＲをコードする核酸配列を含み；前記鋳型核酸配列が、配列番号１２４を含む第１の相同性アームと、配列番号１２５を含む第２の相同性アームとをさらに含み；前記ｇＲＮＡ分子が、表１中または表２中の配列、配列番号１０１４８、配列番号１０１４９、または配列番号１０２０６のうちのいずれかのターゲティングドメインを含むｇＲＮＡから選択される、請求項５９から７３のいずれかに記載の組成物。
【請求項８２】
前記鋳型核酸配列が、配列番号１２４を含む第１の相同性アームと、配列番号１２５を含む第２の相同性アームとを含み；前記ｇＲＮＡ分子が、表１中または表２中の配列、配列番号１０１４８、配列番号１０１４９、または配列番号１０２０６のうちのいずれかのターゲティングドメインを含むｇＲＮＡである、請求項５９から７３のいずれかに記載の組成物。
【請求項８３】
前記鋳型核酸配列が、ＣＤ１９  ＣＡＲ、ＢＣＭＡ  ＣＡＲ、およびＣＤ２２  ＣＡＲから選択されるＣＡＲをコードする核酸配列を含み；前記ｇＲＮＡ分子が、表１中または表２中の配列、配列番号１０１４８、配列番号１０１４９、または配列番号１０２０６のうちのいずれかのターゲティングドメインを含むｇＲＮＡである、請求項５９から７３のいずれかに記載の組成物。
【請求項８４】
前記鋳型核酸配列が、ＡＡＶ６ベクター上に提供され；前記鋳型核酸配列が、ＣＤ１９  ＣＡＲ、ＢＣＭＡ  ＣＡＲ、およびＣＤ２２  ＣＡＲから選択されるＣＡＲをコードする核酸配列を含み；前記鋳型核酸配列が、配列番号１２４を含む第１の相同性アームと、配列番号１２５を含む第２の相同性アームとをさらに含み；前記ｇＲＮＡ分子が、表１中または表２中の配列、配列番号１０１４８、配列番号１０１４９、または配列番号１０２０６のうちのいずれかのターゲティングドメインを含むｇＲＮＡである、請求項５９から７３のいずれかに記載の組成物。
【請求項８５】
前記鋳型核酸配列が、ＡＡＶ６ベクター上に提供され；前記鋳型核酸配列が、配列番号１２４を含む第１の相同性アームと、配列番号１２５を含む第２の相同性アームとを含み；前記ｇＲＮＡ分子が、表１中または表２中の配列、配列番号１０１４８、配列番号１０１４９、または配列番号１０２０６のうちのいずれかのターゲティングドメインを含むｇＲＮＡである、請求項５９から７３のいずれかに記載の組成物。
【請求項８６】
前記鋳型核酸配列が、ＡＡＶ６ベクター上に提供され；前記鋳型核酸配列が、ＣＤ１９  ＣＡＲ、ＢＣＭＡ  ＣＡＲ、およびＣＤ２２  ＣＡＲから選択されるＣＡＲをコードする核酸配列を含み；前記ｇＲＮＡ分子が、表１中または表２中の配列、配列番号１０１４８、配列番号１０１４９、または配列番号１０２０６のうちのいずれかのターゲティングドメインを含むｇＲＮＡである、請求項５９から７３のいずれかに記載の組成物。
【請求項８７】
前記鋳型核酸配列が、ＡＡＶ６ベクター上に提供され；前記ｇＲＮＡ分子が、表１中または表２中の配列、配列番号１０１４８、配列番号１０１４９、または配列番号１０２０６のうちのいずれかのターゲティングドメインを含むｇＲＮＡである、請求項５９から７３のいずれかに記載の組成物。
【請求項８８】
少なくとも１つのさらなるｇＲＮＡ分子をさらに含み、前記組成物の各ｇＲＮＡ分子が、異なる標的配列と相補的である、請求項５４から８７のいずれかに記載の組成物。
【請求項８９】
前記第１のｇＲＮＡ分子と、前記少なくとも１つのさらなるｇＲＮＡ分子とが、同じＴＥＴ２イントロン内の標的配列と相補的である、請求項８８に記載の組成物。
【請求項９０】
前記第１のｇＲＮＡ分子と、前記少なくとも１つのさらなるｇＲＮＡ分子とが、異なる遺伝子内の標的配列と相補的である、請求項８８に記載の組成物。
【請求項９１】
前記第１のｇＲＮＡ分子が、請求項１から５３のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子であり、前記さらなるｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、阻害性分子（例えば、ＰＤＣＤ１）、Ｔ細胞受容体の構成要素（例えば、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ）、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ−ＤＭ、ＨＬＡ−ＤＯ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、ＲＦＸ１、ＲＦＸ５、ＮＦ−ＹＡ、ＮＦ−ＹＢ、ＮＦ−ＹＣ、Ｘ２ＢＰ、ＯＣＡＢ、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＮＬＲＣ５、ＣＤ２４７、ＣＤ３、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＤＣＫ、ＣＤ５２、ＦＫＢＰ１Ａ、またはＮＲ３Ｃ１の標的配列と相補的なターゲティングドメインを含む、請求項９０に記載の組成物。
【請求項９２】
電気穿孔に適する培地中で製剤化された、請求項５４から９１のいずれかに記載の組成物。
【請求項９３】
前記ｇＲＮＡ分子の各々が、本明細書で記載されるＣａｓ９分子と共に、ＲＮＰ複合体内にあり、前記ＲＮＰ複合体の各々が、約１０ｕＭ未満、例えば、約３ｕＭ未満、例えば、約１ｕＭ未満、例えば、約０．５ｕＭ未満、例えば、約０．３ｕＭ未満、例えば、約０．１ｕＭ未満の濃度である、請求項５４から９２のいずれかに記載の組成物。
【請求項９４】
請求項１から５４のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子、または請求項５５から９３のいずれかに記載の組成物のある、例えば全ての構成要素をコードする核酸配列。
【請求項９５】
請求項９４に記載の核酸を含むベクター。
【請求項９６】
レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、プラスミド、ミニサークル、ナノプラスミド、およびＲＮＡベクターからなる群から選択される、請求項９５に記載のベクター。
【請求項９７】
細胞の標的配列を変更する、例えば、その構造、例えば配列を変更する方法であって、前記細胞を、
（ａ）請求項１から５４のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子、例えば、１つを超えるｇＲＮＡ分子、およびＣａｓ９分子；
（ｂ）請求項１から５４のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子、例えば、１つを超えるｇＲＮＡ分子、およびＣａｓ９分子をコードする核酸；
（ｃ）請求項１から５４のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子、例えば、１つを超えるｇＲＮＡ分子をコードする核酸、およびＣａｓ９分子；
（ｄ）請求項１から５４のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子、例えば、１つを超えるｇＲＮＡ分子をコードする核酸、およびＣａｓ９分子をコードする核酸；
（ｅ）上記のａ）〜ｄ）のうちのいずれか、および鋳型核酸、例えば、請求項６０から８７のいずれかに記載の鋳型核酸；
（ｆ）請求項５５から９３のいずれかに記載の組成物；または
（ｇ）請求項９５から９６のいずれかに記載のベクター
と接触させるステップを含む方法。
【請求項９８】
請求項１から５４のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子、または請求項１から５４のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子をコードする核酸と、前記Ｃａｓ９分子または前記Ｃａｓ９分子をコードする核酸とを、単一の組成物中に製剤化する、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
前記組成物が、鋳型核酸、例えば、請求項６０から８７のいずれかに記載の鋳型核酸を含み、前記鋳型核酸を、請求項１から５４のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子、または請求項１から５４のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子をコードする核酸と、前記Ｃａｓ９分子または前記Ｃａｓ９分子をコードする核酸とは別個の組成物中に製剤化する、請求項９７または９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記１つを超える組成物を、逐次的に送達する、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記１つを超える組成物を、同時に送達する、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０２】
前記鋳型核酸の少なくとも一部の、請求項１から５４のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子の標的配列における、またはこの近傍における挿入を結果としてもたらす、請求項９７から１０１のいずれかに記載の方法。
【請求項１０３】
前記挿入が、１つの対立遺伝子だけで生じる、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
前記挿入が、両方の対立遺伝子で生じる、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０５】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように細胞を操作する方法であって、
（ａ）前記細胞へと、請求項１から５４のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子、または請求項５５から５８のいずれかに記載の組成物を含むＣＲＩＳＰＲ系を導入するステップと；
（ｂ）前記細胞へと、ＣＡＲをコードする核酸配列を含む鋳型核酸を導入するステップと
を含み、ＣＡＲをコードする前記核酸配列を、ゲノムへと、例えば、任意選択で、前記ｇＲＮＡ分子の標的配列における、またはこの近傍における、ゲノムの単一の対立遺伝子だけに組み込む、方法。
【請求項１０６】
前記細胞へと、阻害性分子、Ｔ細胞受容体の構成要素、Ｂ２Ｍ、および／またはＣＩＩＴＡの標的配列と相補的な１または複数のｇＲＮＡ分子を含む、１または複数のＣＲＩＳＰＲ系を導入するステップをさらに含む、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
前記細胞が、動物細胞である、請求項９７から１０６のいずれかに記載の方法。
【請求項１０８】
前記細胞が、哺乳動物、霊長類、またはヒト細胞である、請求項９７から１０７のいずれかに記載の方法。
【請求項１０９】
前記細胞が、免疫エフェクター細胞（例えば、免疫エフェクター細胞の集団）である、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
前記免疫エフェクター細胞が、Ｔ細胞またはＮＫ細胞、例えば、Ｔ細胞、例えば、ＣＤ４＋  Ｔ細胞、ＣＤ８＋  Ｔ細胞、またはこれらの組合せである、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
前記ＣＡＲが、
（ａ）例えば、本明細書で記載されるＣＤ１９  ＣＡＲ；または
（ｂ）例えば、本明細書で記載されるＢＣＭＡ  ＣＡＲ
である、請求項１０５から１０６のいずれかに記載の方法。
【請求項１１２】
前記ＣＡＲが、配列番号１６０〜配列番号１７２または配列番号１７５のうちのいずれか１つを含む抗原結合性ドメインを含むＣＤ１９  ＣＡＲである、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
前記ＣＡＲが、ＣＤ１９  ＣＡＲであり、配列番号１８５〜配列番号１９７のうちのいずれか１つを含む、請求項１１１から１１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１１４】
前記ＣＡＲが、配列番号２３９〜配列番号４１２のうちのいずれか１つを含む抗原結合性ドメインを含むＢＣＭＡ  ＣＡＲである、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１５】
前記ＣＡＲが、ＢＣＭＡ  ＣＡＲであり、配列番号８４９〜配列番号８６３または配列番号８７９〜配列番号８９９のうちのいずれか１つを含み、例えば、配列番号８５９を含む、請求項１１１および１１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１１６】
前記細胞が、前記細胞を投与される患者に関して自家または同種異系である、請求項９７から１１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１１７】
請求項９７から１１６のいずれかに記載の方法により変更された細胞。
【請求項１１８】
請求項１から５４のいずれかに記載の第１のｇＲＮＡ分子、または請求項５５から９３のいずれかに記載の組成物、請求項９４に記載の核酸、または請求項９５から９６のいずれかに記載のベクターを含む細胞。
【請求項１１９】
動物細胞、例えば、哺乳動物、霊長類、またはヒト細胞である、請求項１１７から１１８のいずれかに記載の細胞。
【請求項１２０】
免疫エフェクター細胞（例えば、免疫エフェクター細胞の集団）、例えば、Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞、例えば、Ｔ細胞、例えば、ＣＤ４＋  Ｔ細胞、ＣＤ８＋  Ｔ細胞、またはこれらの組合せである、請求項１１９に記載の細胞。
【請求項１２１】
阻害性分子、Ｔ細胞受容体の構成要素（例えば、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｄ、またはＣＤ３Ｇ）、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、またはこれらの組合せの発現が、例えば、同じ種類の非改変細胞と比べて低減または消失している、請求項１１７から１２０のいずれかに記載の細胞。
【請求項１２２】
ゲノムへと、ＴＥＴ２のイントロンまたはイントロン−エクソン接合部に組み込まれた、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を含む、請求項１１７から１２１のいずれかに記載の細胞。
【請求項１２３】
ゲノムへと、ＴＥＴ２のイントロン９〜１０、またはエクソン９およびイントロン９〜１０におけるイントロン−エクソン接合部、またはエクソン１０およびイントロン９〜１０におけるイントロン−エクソン接合部に組み込まれた、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を含む、請求項１１７から１２２のいずれかに記載の細胞。
【請求項１２４】
同じ細胞型の非変更細胞の発現および／または機能のレベルと比べて、低減もしくは消失したＴＥＴ２の発現、例えば、少なくとも１つのＴＥＴ２アイソフォームの発現、および／または低減もしくは消失したＴＥＴ２の機能、例えば、ＴＥＴ２の少なくとも１つの機能、例えば、ＴＥＴ２の触媒機能を含む、請求項１１７から１２３のいずれかに記載の細胞。
【請求項１２５】
Ｔ細胞であり、類似の種類の非変更細胞と比べて、
（ａ）増強された増殖能；
（ｂ）増強された細胞傷害作用；
（ｃ）低枯渇性表現型（例えば、阻害性分子、例えば、ＰＤ１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＰＤ−Ｌ１、またはこれらの組合せの発現の低減）；または
（ｄ）Ｔｓｃｍの表現型（例えば、ＣＤ４５ＲＡ＋  ＣＤ６２Ｌ＋  ＣＤ２７＋  ＣＤ９５＋である）
を呈示する、請求項１１７から１２４のいずれかに記載の細胞。
【請求項１２６】
前記細胞を投与される患者に関して自家である、請求項１１７から１２５のいずれかに記載の細胞。
【請求項１２７】
前記細胞を投与される患者に関して同種異系である、請求項１１７から１２５のいずれかに記載の細胞。
【請求項１２８】
ＴＥＴ２の発現および／または機能が、低減または消失しており、ＴＥＴ２イントロン内の部位に組み込まれた、異種核酸配列（例えば、キメラ抗原受容体をコードする核酸配列）を含む、改変細胞。
【請求項１２９】
ＴＥＴ２イントロン内の前記部位が、ｃｈｒ４：１０５１４６９８０−１０５１９０３５９；ｃｈｒ４：１０５１９０５０６−１０５２３３８９６；ｃｈｒ４：１０５２３７３５２−１０５２４１３３８；ｃｈｒ４：１０５２４１４３０−１０５２４２８３３；ｃｈｒ４：１０５２４２９２８−１０５２４３５６９；ｃｈｒ４：１０５２４３７７９−１０５２５９６１８；ｃｈｒ４：１０５２５９７７０−１０５２６１７５８；ｃｈｒ４：１０５２６１８４９−１０５２６９６０９；ｃｈｒ４：１０５２６９７４８−１０５２７２５６３；およびｃｈｒ４：１０５２７２９１９−１０５２７５０４７のうちのいずれか１つから選択され、前記ゲノム領域が、ヒト基準ゲノムであるｈｇ３８に従う、請求項１２８に記載の改変細胞。
【請求項１３０】
前記異種核酸配列が、ｃｈｒ４：１０５２６９７４８〜１０５２７２５６３から選択されるＴＥＴ２イントロン内の部位に組み込まれる、請求項１２８または１２９に記載の改変細胞。
【請求項１３１】
前記異種核酸配列が、ｃｈｒ４：１０５２７０６２４−１０５２７０６４３；ｃｈｒ４：１０５２７０６３０−１０５２７０６４９；ｃｈｒ４：１０５２７１８６３−１０５２７１８８３；ｃｈｒ４：１０５２７１３４０−１０５２７１３６０；ｃｈｒ４：１０５２７１２０４−１０５２７１２２３；ｃｈｒ４：１０５２７１５２６−１０５２７１５４６；ｃｈｒ４：１０５２７０３５０−１０５２７０３７０；ｃｈｒ４：１０５２７０２６８−１０５２７０２８８；ｃｈｒ４：１０５２７２１８２−１０５２７２２０２；ｃｈｒ４：１０５２７２４６５−１０５２７２４８５；ｃｈｒ４：１０５２７１３８７−１０５２７１４０７；ｃｈｒ４：１０５２７２４３６−１０５２７２４５６；ｃｈｒ４：１０５２７１９２４−１０５２７１９４４；ｃｈｒ４：１０５２７２３２３−１０５２７２３４３；ｃｈｒ４：１０５２７２０５７−１０５２７２０７７；ｃｈｒ４：１０５２７２３０９−１０５２７２３２９；ｃｈｒ４：１０５２７２３２４−１０５２７２３４４；ｃｈｒ４：１０５２７２３２４−１０５２７２３４４；ｃｈｒ４：１０５２７１１８４−１０５２７１２０４；ｃｈｒ４：１０５２７１１９０−１０５２７１２１０；ｃｈｒ４：１０５２７１２９５−１０５２７１３１５；ｃｈｒ４：１０５２７１２９２−１０５２７１３１２；ｃｈｒ４：１０５２７１４５８−１０５２７１４７８；ｃｈｒ４：１０５２７０６３５−１０５２７０６５５；ｃｈｒ４：１０５２７１１７３−１０５２７１１９２；ｃｈｒ４：１０５２７１２３２−１０５２７１２５２；ｃｈｒ４：１０５２７１８４５−１０５２７１８６５；ｃｈｒ４：１０５２７１８４９−１０５２７１８６９；およびｃｈｒ４：１０５２７１０５６−１０５２７１０７６から選択されるＴＥＴ２イントロン内の部位に組み込まれる、請求項１２８または１２９に記載の改変細胞。
【請求項１３２】
前記異種核酸配列が、ｃｈｒ４：１０５２７０６２４−１０５２７０６４３；ｃｈｒ４：１０５２７０６３０−１０５２７０６４９；ｃｈｒ４：１０５２７１３８７−１０５２７１４０７；ｃｈｒ４：１０５２７１９２４−１０５２７１９４４；ｃｈｒ４：１０５２７２３２３−１０５２７２３４３；ｃｈｒ４：１０５２７２０５７−１０５２７２０７７；ｃｈｒ４：１０５２７２３０９−１０５２７２３２９；ｃｈｒ４：１０５２７２３２４−１０５２７２３４４；ｃｈｒ４：１０５２７２３２４−１０５２７２３４４；ｃｈｒ４：１０５２７１１８４−１０５２７１２０４；ｃｈｒ４：１０５２７１１９０−１０５２７１２１０；ｃｈｒ４：１０５２７１２９５−１０５２７１３１５；ｃｈｒ４：１０５２７１２９２−１０５２７１３１２；ｃｈｒ４：１０５２７１４５８−１０５２７１４７８；ｃｈｒ４：１０５２７０６３５−１０５２７０６５５；ｃｈｒ４：１０５２７１１７３−１０５２７１１９２；ｃｈｒ４：１０５２７１２３２−１０５２７１２５２；およびｃｈｒ４：１０５２７１０５６−１０５２７１０７６から選択されるＴＥＴ２イントロン内の部位に組み込まれる、請求項１２８または１２９に記載の改変細胞。
【請求項１３３】
前記異種核酸配列が、ｃｈｒ４：１０５２７１８６３−１０５２７１８８３；ｃｈｒ４：１０５２７１３４０−１０５２７１３６０；ｃｈｒ４：１０５２７１２０４−１０５２７１２２３；ｃｈｒ４：１０５２７１５２６−１０５２７１５４６；ｃｈｒ４：１０５２７０３５０−１０５２７０３７０；ｃｈｒ４：１０５２７０２６８−１０５２７０２８８；ｃｈｒ４：１０５２７２１８２−１０５２７２２０２；およびｃｈｒ４：１０５２７２４６５−１０５２７２４８５から選択されるＴＥＴ２イントロン内の部位に組み込まれる、請求項１２８または１２９に記載の改変細胞。
【請求項１３４】
前記異種核酸配列が、ｃｈｒ４：１０５２７１３４０−１０５２７１３６０；ｃｈｒ４：１０５２７１５２６−１０５２７１５４６；ｃｈｒ４：１０５２７０３５０−１０５２７０３７０；ｃｈｒ４：１０５２７０２６８−１０５２７０２８８；ｃｈｒ４：１０５２７２１８２−１０５２７２２０２；およびｃｈｒ４：１０５２７２４６５−１０５２７２４８５から選択されるＴＥＴ２イントロン内の部位に組み込まれる、請求項１２８または１２９に記載の改変細胞。
【請求項１３５】
前記異種核酸配列が、ｃｈｒ４：１０５２７０６２４〜１０５２７０６４３；ｃｈｒ４：１０５２７０６３０〜１０５２７０６４９；およびｃｈｒ４：１０５２７１８６３〜１０５２７１８８３から選択されるＴＥＴ２イントロン内の部位に組み込まれる、請求項１２８または１２９に記載の改変細胞。
【請求項１３６】
Ｔ細胞受容体の構成要素、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、またはこれらの組合せの発現および／または機能が、同じ種類の非改変細胞と比べて低減または消失している、請求項１２８から１３５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１３７】
対象において抗腫瘍免疫をもたらす方法であって、前記対象へと、有効量の、請求項１１７から１３６のいずれかに記載の細胞を投与するステップを含む方法。
【請求項１３８】
腫瘍抗原の発現と関連する疾患、例えば、増殖性疾患、前がん性状態、がん、および前記腫瘍抗原の発現と関連する非がん関連適応症を有する対象を処置する方法であって、前記対象へと、有効量の、請求項１１７から１３６のいずれかに記載の細胞を投与するステップを含む方法。
【請求項１３９】
前記腫瘍抗原の発現と関連する疾患が、がんまたは非がん関連適応症である、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４０】
前記疾患が、結腸がん、直腸がん、腎細胞癌、肝臓がん、肺非小細胞癌、小腸がん、食道がん、黒色腫、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頚部がん、皮膚または眼内悪性黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域がん、胃がん、精巣がん、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頚癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、小児充実性腫瘍、膀胱がん、腎または尿管がん、腎盂癌、中枢神経系（ＣＮＳ）新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮がん、扁平上皮がん、Ｔ細胞リンパ腫、環境誘導性がん、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性白血病、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、小児急性リンパ性白血病、Ｂ細胞性急性リンパ性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、Ｔ細胞性急性リンパ性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、毛様細胞白血病、小細胞または大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成および骨髄異形成症候群、ホジキンリンパ腫、形質芽細胞性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、ワルデンシュトロームマクログロブリン血症、および前白血病、前記がんの組合せ、および前記がんの転移性病変から選択されるがんである、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４１】
前記がんが、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）である、請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４２】
前記がんが、小児ＡＬＬである、請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４３】
前記がんが、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫である、請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４４】
前記がんが、慢性リンパ球性白血病である、請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４５】
前記がんが、濾胞性リンパ腫である、請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４６】
前記がんが、ホジキンリンパ腫である、請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４７】
前記がんが、非ホジキンリンパ腫である、請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４８】
化学療法剤を投与するステップをさらに含む、請求項１３６から１４７のいずれかに記載の方法。
【請求項１４９】
前記化学療法剤が、シクロホスファミド、フルダラビン、またはシクロホスファミドおよびフルダラビンである、請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５０】
前記対象へと、有効量の、請求項１１７から１３６のいずれかに記載の細胞を投与するステップの前に、リンパ球枯渇剤または免疫抑制薬を投与するステップを含む、請求項１３６から１４９のいずれかに記載の方法。
【請求項１５１】
請求項１１７から１３６のいずれかに記載の細胞を含む細胞集団であって、前記細胞のうちの少なくとも約３０％、例えば、前記細胞のうちの少なくとも約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％が、請求項１１７から１３６のいずれかに記載の細胞である、細胞集団。
【請求項１５２】
ＴＥＴ２のイントロンまたはイントロン−エクソン接合部の配列に結合する遺伝子編集系。
【請求項１５３】
ＴＥＴ２のイントロンまたはイントロン−エクソン接合部の前記配列が、ｃｈｒ４：１０５１４６９８０−１０５１９０３５９；ｃｈｒ４：１０５１９０５０６−１０５２３３８９６；ｃｈｒ４：１０５２３７３５２−１０５２４１３３８；ｃｈｒ４：１０５２４１４３０−１０５２４２８３３；ｃｈｒ４：１０５２４２９２８−１０５２４３５６９；ｃｈｒ４：１０５２４３７７９−１０５２５９６１８；ｃｈｒ４：１０５２５９７７０−１０５２６１７５８；ｃｈｒ４：１０５２６１８４９−１０５２６９６０９；ｃｈｒ４：１０５２６９７４８−１０５２７２５６３；およびｃｈｒ４：１０５２７２９１９−１０５２７５０４７のうちのいずれか１つから選択されるゲノム領域内の配列であり、前記ゲノム領域が、ヒト基準ゲノムであるｈｇ３８に従う、請求項１５２に記載の遺伝子編集系。
【請求項１５４】
前記ゲノム領域が、ｃｈｒ４：１０５２６９７４８〜１０５２７２５６３である、請求項１５３に記載の遺伝子編集系。
【請求項１５５】
ＴＥＴ２のイントロンまたはイントロン−エクソン接合部の前記配列が、ｃｈｒ４：１０５２７０６２４−１０５２７０６４３；ｃｈｒ４：１０５２７０６３０−１０５２７０６４９；ｃｈｒ４：１０５２７１８６３−１０５２７１８８３；ｃｈｒ４：１０５２７１３４０−１０５２７１３６０；ｃｈｒ４：１０５２７１２０４−１０５２７１２２３；ｃｈｒ４：１０５２７１５２６−１０５２７１５４６；ｃｈｒ４：１０５２７０３５０−１０５２７０３７０；ｃｈｒ４：１０５２７０２６８−１０５２７０２８８；ｃｈｒ４：１０５２７２１８２−１０５２７２２０２；ｃｈｒ４：１０５２７２４６５−１０５２７２４８５；ｃｈｒ４：１０５２７１３８７−１０５２７１４０７；ｃｈｒ４：１０５２７２４３６−１０５２７２４５６；ｃｈｒ４：１０５２７１９２４−１０５２７１９４４；ｃｈｒ４：１０５２７２３２３−１０５２７２３４３；ｃｈｒ４：１０５２７２０５７−１０５２７２０７７；ｃｈｒ４：１０５２７２３０９−１０５２７２３２９；ｃｈｒ４：１０５２７２３２４−１０５２７２３４４；ｃｈｒ４：１０５２７２３２４−１０５２７２３４４；ｃｈｒ４：１０５２７１１８４−１０５２７１２０４；ｃｈｒ４：１０５２７１１９０−１０５２７１２１０；ｃｈｒ４：１０５２７１２９５−１０５２７１３１５；ｃｈｒ４：１０５２７１２９２−１０５２７１３１２；ｃｈｒ４：１０５２７１４５８−１０５２７１４７８；ｃｈｒ４：１０５２７０６３５−１０５２７０６５５；ｃｈｒ４：１０５２７１１７３−１０５２７１１９２；ｃｈｒ４：１０５２７１２３２−１０５２７１２５２；ｃｈｒ４：１０５２７１８４５−１０５２７１８６５；ｃｈｒ４：１０５２７１８４９−１０５２７１８６９；およびｃｈｒ４：１０５２７１０５６−１０５２７１０７６から選択されるゲノム領域内の配列である、請求項１５２または１５３に記載の遺伝子編集系。
【請求項１５６】
ＴＥＴ２のイントロンまたはイントロン−エクソン接合部の前記配列が、ｃｈｒ４：１０５２７０６２４−１０５２７０６４３；ｃｈｒ４：１０５２７０６３０−１０５２７０６４９；ｃｈｒ４：１０５２７１３８７−１０５２７１４０７；ｃｈｒ４：１０５２７１９２４−１０５２７１９４４；ｃｈｒ４：１０５２７２３２３−１０５２７２３４３；ｃｈｒ４：１０５２７２０５７−１０５２７２０７７；ｃｈｒ４：１０５２７２３０９−１０５２７２３２９；ｃｈｒ４：１０５２７２３２４−１０５２７２３４４；ｃｈｒ４：１０５２７２３２４−１０５２７２３４４；ｃｈｒ４：１０５２７１１８４−１０５２７１２０４；ｃｈｒ４：１０５２７１１９０−１０５２７１２１０；ｃｈｒ４：１０５２７１２９５−１０５２７１３１５；ｃｈｒ４：１０５２７１２９２−１０５２７１３１２；ｃｈｒ４：１０５２７１４５８−１０５２７１４７８；ｃｈｒ４：１０５２７０６３５−１０５２７０６５５；ｃｈｒ４：１０５２７１１７３−１０５２７１１９２；ｃｈｒ４：１０５２７１２３２−１０５２７１２５２；およびｃｈｒ４：１０５２７１０５６−１０５２７１０７６から選択されるゲノム領域内の配列である、請求項１５２または１５３に記載の遺伝子編集系。
【請求項１５７】
ＴＥＴ２のイントロンまたはイントロン−エクソン接合部の前記配列が、ｃｈｒ４：１０５２７１８６３−１０５２７１８８３；ｃｈｒ４：１０５２７１３４０−１０５２７１３６０；ｃｈｒ４：１０５２７１２０４−１０５２７１２２３；ｃｈｒ４：１０５２７１５２６−１０５２７１５４６；ｃｈｒ４：１０５２７０３５０−１０５２７０３７０；ｃｈｒ４：１０５２７０２６８−１０５２７０２８８；ｃｈｒ４：１０５２７２１８２−１０５２７２２０２；およびｃｈｒ４：１０５２７２４６５−１０５２７２４８５から選択されるゲノム領域内の配列である、請求項１５２または１５３に記載の遺伝子編集系。
【請求項１５８】
ＴＥＴ２のイントロンまたはイントロン−エクソン接合部の前記配列が、ｃｈｒ４：１０５２７１３４０−１０５２７１３６０；ｃｈｒ４：１０５２７１５２６−１０５２７１５４６；ｃｈｒ４：１０５２７０３５０−１０５２７０３７０；ｃｈｒ４：１０５２７０２６８−１０５２７０２８８；ｃｈｒ４：１０５２７２１８２−１０５２７２２０２；およびｃｈｒ４：１０５２７２４６５−１０５２７２４８５から選択されるゲノム領域内の配列である、請求項１５２または１５３に記載の遺伝子編集系。
【請求項１５９】
ＴＥＴ２のイントロンまたはイントロン−エクソン接合部の前記配列が、ｃｈｒ４：１０５２７０６２４〜１０５２７０６４３；ｃｈｒ４：１０５２７０６３０〜１０５２７０６４９；およびｃｈｒ４：１０５２７１８６３〜１０５２７１８８３から選択されるゲノム領域内の配列である、請求項１５２または１５３に記載の遺伝子編集系。
【請求項１６０】
前記遺伝子編集系が、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）遺伝子編集系、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集系、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集系、またはメガヌクレアーゼ遺伝子編集系である、請求項１５２から１５９のいずれかに記載の遺伝子編集系。
【請求項１６１】
前記遺伝子編集系が、鋳型核酸をさらに含む、請求項１５２から１６０のいずれかに記載の遺伝子編集系。
【請求項１６２】
前記鋳型核酸が、ＣＡＲをコードする核酸配列を含む、請求項１６１に記載の遺伝子編集系。
【請求項１６３】
前記遺伝子編集系（および／または前記遺伝子編集系の、１または複数の構成要素をコードする核酸配列）を、細胞へと導入すると、前記ＣＡＲをコードする前記核酸配列が、前記細胞のゲノムへと、前記ゲノム編集系が結合するＴＥＴ２のイントロンまたはイントロン−エクソン接合部の前記配列において、またはこの近傍において組み込まれる、請求項１６２に記載の遺伝子編集系。
【請求項１６４】
請求項１５２から１６３のいずれかに記載の遺伝子編集系により改変された細胞。
【請求項１６５】
請求項１５２から１６３のいずれかに記載の遺伝子編集系を含む細胞。
【請求項１６６】
医薬としての使用のための、請求項１から５４のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子、請求項５５から９３のいずれかに記載の組成物、請求項９４に記載の核酸、請求項９５から９６のいずれかに記載のベクター、請求項１１７から１３６、１５１、もしくは１６４から１６５のいずれかに記載の細胞（または細胞集団）、または請求項１５２から１６３のいずれかに記載の遺伝子編集系。
【請求項１６７】
医薬の製造における使用のための、請求項１から５４のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子、請求項５５から９３のいずれかに記載の組成物、請求項９４に記載の核酸、請求項９５から９６のいずれかに記載のベクター、請求項１１７から１３６、１５１、もしくは１６４から１６５のいずれかに記載の細胞（または細胞集団）、または請求項１５２から１６３のいずれかに記載の遺伝子編集系。
【請求項１６８】
疾患の処置における使用のための、請求項１から５４のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子、請求項５５から９３のいずれかに記載の組成物、請求項９４に記載の核酸、請求項９５から９６のいずれかに記載のベクター、請求項１１７から１３６、１５１、もしくは１６４から１６５のいずれかに記載の細胞（または細胞集団）、または請求項１５２から１６３のいずれかに記載の遺伝子編集系。
【請求項１６９】
腫瘍抗原の発現と関連する疾患、例えば、増殖性疾患、前がん性状態、がん、および腫瘍抗原の発現と関連する非がん関連適応症である疾患の処置における使用のための、請求項１から５４のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子、請求項５５から９３のいずれかに記載の組成物、請求項９４に記載の核酸、請求項９５から９６のいずれかに記載のベクター、請求項１１７から１３６、１５１、もしくは１６４から１６５のいずれかに記載の細胞（または細胞集団）、または請求項１５２から１６３のいずれかに記載の遺伝子編集系。
【請求項１７０】
慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性白血病、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、小児急性リンパ性白血病、Ｂ細胞性急性リンパ性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、Ｔ細胞性急性リンパ性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、毛様細胞白血病、小細胞または大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成および骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、形質芽細胞性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、ワルデンシュトロームマクログロブリン血症、および前白血病からなる群から選択される血液がんであるがんの処置における使用のための、請求項１から５４のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子、請求項５５から９３のいずれかに記載の組成物、請求項９４に記載の核酸、請求項９５から９６のいずれかに記載のベクター、請求項１１７から１３６、１５１、もしくは１６４から１６５のいずれかに記載の細胞（または細胞集団）、または請求項１５２から１６３のいずれかに記載の遺伝子編集系。
【請求項１７１】
疾患が、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）である、請求項１７０に記載の使用のためのｇＲＮＡ分子、組成物、核酸、ベクター、細胞（または細胞集団）、または遺伝子編集系。
【請求項１７２】
疾患が、小児ＡＬＬである、請求項１７０に記載の使用のためのｇＲＮＡ分子、組成物、核酸、ベクター、細胞（または細胞集団）、または遺伝子編集系。
【請求項１７３】
疾患が、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫である、請求項１７０に記載の使用のためのｇＲＮＡ分子、組成物、核酸、ベクター、細胞（または細胞集団）、または遺伝子編集系。
【請求項１７４】
疾患が、慢性リンパ球性白血病である、請求項１７０に記載の使用のためのｇＲＮＡ分子、組成物、核酸、ベクター、細胞（または細胞集団）、または遺伝子編集系。
【請求項１７５】
疾患が、濾胞性リンパ腫である、請求項１７０に記載の使用のためのｇＲＮＡ分子、組成物、核酸、ベクター、細胞（または細胞集団）、または遺伝子編集系。
【請求項１７６】
疾患が、ホジキンリンパ腫である、請求項１７０に記載の使用のためのｇＲＮＡ分子、組成物、核酸、ベクター、細胞（または細胞集団）、または遺伝子編集系。
【請求項１７７】
疾患が、非ホジキンリンパ腫である、請求項１７０に記載の使用のためのｇＲＮＡ分子、組成物、核酸、ベクター、細胞（または細胞集団）、または遺伝子編集系。
【請求項１７８】
がんが、中皮腫、腺癌、神経膠芽腫、結腸がん、直腸がん、腎細胞癌、肝臓がん、肺非小細胞癌、小腸がん、食道がん、黒色腫、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頚部がん、皮膚または眼内悪性黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域がん、胃がん、精巣がん、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頚癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、小児充実性腫瘍、膀胱がん、腎または尿管がん、腎盂癌、中枢神経系（ＣＮＳ）新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮がん、扁平上皮がん、Ｔ細胞リンパ腫、環境誘導性がん、前記がんの組合せ、および前記がんの転移性病変からなる群から選択されるがんの処置における使用のための、請求項１から５４のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子、請求項５５から９３のいずれかに記載の組成物、請求項９４に記載の核酸、請求項９５から９６のいずれかに記載のベクター、請求項１１７から１３６、１５１、もしくは１６４から１６５のいずれかに記載の細胞（または細胞集団）、または請求項１５２から１６３のいずれかに記載の遺伝子編集系。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１７年３月２２日に出願された、米国特許仮出願第６２／４７５０２４号明細書に対する優先権を主張する。この出願の内容の全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットにおいて電子的に提出され、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる配列表を含有する。２０１８年３月１５日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、ＰＡＴ０５７６６２−ＷＯ−ＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられ、３，４６０，１４１バイトのサイズである。
【背景技術】
【０００３】
ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ）は、細菌内で、ウイルスの攻撃に対して防御する養子免疫系として進化した。ウイルスへの曝露時に、ウイルスＤＮＡの短いセグメントが、細菌ゲノムのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座へと組み込まれる。ＲＮＡは、ウイルス配列を含むＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の部分から転写される。ウイルスゲノムに相補的な配列を含む、このＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質の、ウイルスゲノム内の配列へのターゲティングを媒介する。Ｃａｓ９タンパク質は、ウイルス標的を切断し、これにより、ウイルス標的をサイレンシングする。
【０００４】
近年、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、真核細胞内のゲノム編集に適合している。部位特異的一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）の導入は、例えば、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同性指向修復（ＨＤＲ）を介して、標的配列の変更を可能とする。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
ある態様では、本開示は、ｔｒａｃｒとｃｒＲＮＡとを含むｇＲＮＡ分子であって、ｃｒＲＮＡが、ＴＥＴ２イントロン、またはＴＥＴ２イントロン−エクソン接合部の、標的配列と相補的なターゲティングドメインを含む、ｇＲＮＡ分子を提供する。
【０００６】
ある態様では、本開示は、ターゲティングドメインが、ａ）ｃｈｒ４：１０５１４６９８０−１０５１９０３５９；ｂ）ｃｈｒ４：１０５１９０５０６−１０５２３３８９６；ｃ）ｃｈｒ４：１０５２３７３５２−１０５２４１３３８；ｄ）ｃｈｒ４：１０５２４１４３０−１０５２４２８３３；ｅ）ｃｈｒ４：１０５２４２９２８−１０５２４３５６９；ｆ）ｃｈｒ４：１０５２４３７７９−１０５２５９６１８；ｇ）ｃｈｒ４：１０５２５９７７０−１０５２６１７５８；ｈ）ｃｈｒ４：１０５２６１８４９−１０５２６９６０９；ｉ）ｃｈｒ４：１０５２６９７４８−１０５２７２５６３；およびｊ）ｃｈｒ４：１０５２７２９１９−１０５２７５０４７から選択されるゲノム領域内の配列と相補的であり、ゲノム領域が、ヒト基準ゲノムであるｈｇ３８に従い、例えば、ゲノム領域が、ｃｈｒ４：１０５２６９７４８−１０５２７２５６３（ＴＥＴ２の、エクソン９とエクソン１０との間のイントロン）である、ｇＲＮＡ分子を提供する。
【０００７】
ある態様では、本開示は、ターゲティングドメインが、ｃｈｒ４：１０５２７０６２４−１０５２７０６４３；ｃｈｒ４：１０５２７０６３０−１０５２７０６４９；ｃｈｒ４：１０５２７１８６３−１０５２７１８８３；ｃｈｒ４：１０５２７１３４０−１０５２７１３６０；ｃｈｒ４：１０５２７１２０４−１０５２７１２２３；ｃｈｒ４：１０５２７１５２６−１０５２７１５４６；ｃｈｒ４：１０５２７０３５０−１０５２７０３７０；ｃｈｒ４：１０５２７０２６８−１０５２７０２８８；ｃｈｒ４：１０５２７２１８２−１０５２７２２０２；ｃｈｒ４：１０５２７２４６５−１０５２７２４８５；ｃｈｒ４：１０５２７１３８７−１０５２７１４０７；ｃｈｒ４：１０５２７２４３６−１０５２７２４５６；ｃｈｒ４：１０５２７１９２４−１０５２７１９４４；ｃｈｒ４：１０５２７２３２３−１０５２７２３４３；ｃｈｒ４：１０５２７２０５７−１０５２７２０７７；ｃｈｒ４：１０５２７２３０９−１０５２７２３２９；ｃｈｒ４：１０５２７２３２４−１０５２７２３４４；ｃｈｒ４：１０５２７２３２４−１０５２７２３４４；ｃｈｒ４：１０５２７１１８４−１０５２７１２０４；ｃｈｒ４：１０５２７１１９０−１０５２７１２１０；ｃｈｒ４：１０５２７１２９５−１０５２７１３１５；ｃｈｒ４：１０５２７１２９２−１０５２７１３１２；ｃｈｒ４：１０５２７１４５８−１０５２７１４７８；ｃｈｒ４：１０５２７０６３５−１０５２７０６５５；ｃｈｒ４：１０５２７１１７３−１０５２７１１９２；ｃｈｒ４：１０５２７１２３２−１０５２７１２５２；ｃｈｒ４：１０５２７１８４５−１０５２７１８６５；ｃｈｒ４：１０５２７１８４９−１０５２７１８６９；およびｃｈｒ４：１０５２７１０５６−１０５２７１０７６から選択されるゲノム領域内の配列と相補的である、ｇＲＮＡ分子を提供する。
【０００８】
ある態様では、本開示は、ターゲティングドメインが、ｃｈｒ４：１０５２７０６２４−１０５２７０６４３；ｃｈｒ４：１０５２７０６３０−１０５２７０６４９；ｃｈｒ４：１０５２７１３８７−１０５２７１４０７；ｃｈｒ４：１０５２７１９２４−１０５２７１９４４；ｃｈｒ４：１０５２７２３２３−１０５２７２３４３；ｃｈｒ４：１０５２７２０５７−１０５２７２０７７；ｃｈｒ４：１０５２７２３０９−１０５２７２３２９；ｃｈｒ４：１０５２７２３２４−１０５２７２３４４；ｃｈｒ４：１０５２７２３２４−１０５２７２３４４；ｃｈｒ４：１０５２７１１８４−１０５２７１２０４；ｃｈｒ４：１０５２７１１９０−１０５２７１２１０；ｃｈｒ４：１０５２７１２９５−１０５２７１３１５；ｃｈｒ４：１０５２７１２９２−１０５２７１３１２；ｃｈｒ４：１０５２７１４５８−１０５２７１４７８；ｃｈｒ４：１０５２７０６３５−１０５２７０６５５；ｃｈｒ４：１０５２７１１７３−１０５２７１１９２；ｃｈｒ４：１０５２７１２３２−１０５２７１２５２；およびｃｈｒ４：１０５２７１０５６−１０５２７１０７６から選択されるゲノム領域内の配列と相補的である、ｇＲＮＡ分子を提供する。
【０００９】
ある態様では、本開示は、ターゲティングドメインが、ｃｈｒ４：１０５２７１８６３−１０５２７１８８３；ｃｈｒ４：１０５２７１３４０−１０５２７１３６０；ｃｈｒ４：１０５２７１２０４−１０５２７１２２３；ｃｈｒ４：１０５２７１５２６−１０５２７１５４６；ｃｈｒ４：１０５２７０３５０−１０５２７０３７０；ｃｈｒ４：１０５２７０２６８−１０５２７０２８８；ｃｈｒ４：１０５２７２１８２−１０５２７２２０２；およびｃｈｒ４：１０５２７２４６５−１０５２７２４８５から選択されるゲノム領域内の配列と相補的である、ｇＲＮＡ分子を提供する。一部の実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、表２２に記載された編集修復パターン、および／または表２３に記載された、＞７５％のインデル頻度を発生させることが可能である。
【００１０】
ある態様では、本開示は、ターゲティングドメインが、ｃｈｒ４：１０５２７１３４０−１０５２７１３６０；ｃｈｒ４：１０５２７１５２６−１０５２７１５４６；ｃｈｒ４：１０５２７０３５０−１０５２７０３７０；ｃｈｒ４：１０５２７０２６８−１０５２７０２８８；ｃｈｒ４：１０５２７２１８２−１０５２７２２０２；およびｃｈｒ４：１０５２７２４６５−１０５２７２４８５から選択されるゲノム領域内の配列と相補的である、ｇＲＮＡ分子を提供する。一部の実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、表２２に記載された編集修復パターン、および／または表２３に記載された、＞８０％のインデル頻度を発生させることが可能である。
【００１１】
ある態様では、本開示は、ターゲティングドメインが、ｃｈｒ４：１０５２７０６２４〜１０５２７０６４３、ｃｈｒ４：１０５２７０６３０〜１０５２７０６４９、およびｃｈｒ４：１０５２７１８６３〜１０５２７１８８３から選択されるゲノム領域内の配列と相補的である、ｇＲＮＡ分子を提供する。前述の複数の態様のうちのいずれかを含む、ある態様では、本開示のｇＲＮＡ分子は、例えば、表１または表２の、配列番号１０００〜配列番号１０５１４のうちのいずれか１つを含む、例えば、これらからなる、例えば、配列番号１０１０２〜配列番号１０３２４のうちのいずれか１つを含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。
【００１２】
ｇＲＮＡ分子についての態様であって、前述の複数の態様のうちのいずれかを含む態様では、本開示のｇＲＮＡ分子は、例えば、表２に列挙されたターゲティングドメイン配列を含むか、またはこれらからなる、例えば、配列番号１０１４８、配列番号１０１８４、配列番号１０１８５、配列番号１０１８８、配列番号１０２０９、配列番号１０２１２、配列番号１０３１７、配列番号１０３１８、配列番号１０１８７、配列番号１０２２４、配列番号１０２９２、配列番号１０１４９、配列番号１０１７７、配列番号１０１５１、配列番号１０２２５または配列番号１０５０９のうちのいずれか１つを含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む。
【００１３】
ｇＲＮＡについての態様であって、前述の複数の態様のうちのいずれかを含む態様では、本開示のｇＲＮＡ分子は、配列番号１０１４８、１０１４９、１０２０６、１０１９１、１０５１５、１０２０３、１０２５９、１０１３６、１０３１４、１０２３４、１０２９０、１０２３３、１０２０９、１０２２４、１０２１２、１０３１７、１０３１８、１０２２５、１０１８４、１０１８５、１０１８８、１０１８７、１０２９２、１０１５１、１０５０９、１０２８１、１０２９９、１０３０１、もしくは１０１７７；またはこれらの断片を含むか、またはこれらからなるターゲティングドメインを含む。
【００１４】
ｇＲＮＡについての態様であって、前述の複数の態様のうちのいずれかを含む態様では、本開示のｇＲＮＡ分子は、配列番号１０１４８、１０１４９、１０２９０、１０２０９、１０２２４、１０２１２、１０３１７、１０３１８、１０２２５、１０１８４、１０１８５、１０１８８、１０１８７、１０２９２、１０１５１、１０５０９、１０２８１、もしくは１０１７７；またはこれらの断片を含むか、またはこれらからなるターゲティングドメインを含む。
【００１５】
ｇＲＮＡについての態様であって、前述の複数の態様のうちのいずれかを含む態様では、本開示のｇＲＮＡ分子は、配列番号１０２０６、１０１９１、１０５１５、１０２０３、１０２５９、１０１３６、１０３１４、もしくは１０２３４；またはこれらの断片を含むか、またはこれらからなるターゲティングドメインを含む。
【００１６】
ｇＲＮＡについての態様であって、前述の複数の態様のうちのいずれかを含む態様では、本開示のｇＲＮＡ分子は、配列番号１０１９１、１０２０３、１０２５９、１０１３６、１０３１４、もしくは１０２３４；またはこれらの断片を含むか、またはこれらからなるターゲティングドメインを含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、表２２に記載された編集修復パターン、および／または表２３に記載された、＞７５％のインデル頻度を発生させることが可能である。
【００１７】
ｇＲＮＡについての態様であって、前述の複数の態様のうちのいずれかを含む態様では、本開示のｇＲＮＡ分子は、配列番号１０１４８、配列番号１０１４９、もしくは配列番号１０２０６；またはこれらの断片を含むか、またはこれらからなるターゲティングドメインを含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、表２２に記載された編集修復パターン、および／または表２３に記載された、＞８０％のインデル頻度を発生させることが可能である。
【００１８】
一部の実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、表２２に記載された編集修復パターン、および／または表２３に記載されたインデル頻度を発生させることが可能である。ｇＲＮＡ分子についての態様であって、前述の複数の態様のうちのいずれかを含む態様では、ターゲティングドメインは、列挙されたターゲティングドメイン配列のうちのいずれか１つの、１７、１８、１９、または２０の連続核酸を含む。ある態様であって、前述の複数の態様のうちのいずれかを含む態様では、ターゲティングドメインは、列挙されたターゲティングドメイン配列のうちのいずれか１つの、１７、１８、１９、または２０の連続核酸からなる。ある態様では、列挙されたターゲティングドメイン配列のうちのいずれか１つの、１７、１８、１９、または２０の連続核酸は、列挙されたターゲティングドメイン配列の３’末端部に配置された、１７、１８、１９、または２０の連続核酸である。別の態様では、列挙されたターゲティングドメイン配列のうちのいずれか１つの、１７、１８、１９、２０の連続核酸は、列挙されたターゲティングドメイン配列の５’末端部に配置された、１７、１８、１９、または２０の連続核酸である。別の態様では、列挙されたターゲティングドメイン配列のうちのいずれか１つの、１７、１８、１９、または２０の連続核酸は、列挙されたターゲティングドメイン配列の５’または３’核酸を含まない。
【００１９】
ｇＲＮＡ分子についての態様であって、前述の複数の態様のうちのいずれかを含む態様では、ターゲティングドメインは、列挙されたターゲティングドメイン配列からなる。
【００２０】
ｇＲＮＡ分子についての態様であって、前述の複数の態様のうちのいずれかを含む態様では、ｃｒＲＮＡの部分と、ｔｒａｃｒの部分とは、ハイブリダイズして、配列番号５０または配列番号５１を含むフラッグポールを形成する。ｇＲＮＡ分子についての態様であって、前述の複数の態様のうちのいずれかを含む態様では、フラッグポールは、フラッグポールのｃｒＲＮＡ部分に対して３’側に位置する、第１のフラッグポール伸長部をさらに含み、前記第１のフラッグポール伸長部は、配列番号５５を含む。ｇＲＮＡ分子についての態様であって、前述の複数の態様のうちのいずれかを含む態様では、フラッグポールは、フラッグポールのｃｒＲＮＡ部分に対して３’側に位置する、第２のフラッグポール伸長部と、存在する場合、第１のフラッグポール伸長部とをさらに含み、前記第２のフラッグポール伸長部は、配列番号５７を含む。
【００２１】
ｇＲＮＡ分子についての態様であって、前述の複数の態様のうちのいずれかを含む態様では、ｔｒａｃｒは、（ａ）任意選択で、３’末端部において、さらなる１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、もしくは７つのウラシル（Ｕ）ヌクレオチドをさらに含む配列番号８７；（ｂ）配列番号６５；または（ｃ）配列番号８４を含む。
【００２２】
ｇＲＮＡ分子についての態様であって、前述の複数の態様のうちのいずれかを含む態様では、フラッグポールのｃｒＲＮＡ部分は、配列番号７９または配列番号８０を含む。
【００２３】
ｇＲＮＡ分子についての態様であって、前述の複数の態様のうちのいずれかを含む態様では、ｔｒａｃｒは、配列番号５３または配列番号５４と、任意選択で、第１のフラッグポール伸長部が存在する場合、配列番号５３または配列番号５４に対して５’側に配置された、第１のｔｒａｃｒ伸長部とを含み、前記第１のｔｒａｃｒ伸長部は、配列番号５６９１を含む。
【００２４】
ｇＲＮＡ分子についての態様であって、前述の複数の態様のうちのいずれかを含む態様では、ターゲティングドメインと、ｔｒａｃｒとは、別個の核酸分子上に配置される。
【００２５】
ｇＲＮＡ分子についての態様であって、前述の複数の態様のうちのいずれかを含む態様では、ｃｒＲＮＡは、５’から３’へと、［ターゲティングドメイン］−：ａ）配列番号５０；ｂ）配列番号５１；ｃ）配列番号７７；ｄ）配列番号７８；ｅ）配列番号７９；ｆ）配列番号８０；またはｇ）配列番号８１を含む。
【００２６】
ｇＲＮＡ分子についての複数の態様であって、前述の複数の態様のうちのいずれかを含む態様では、ｔｒａｃｒは、５’から３’へと；ａ）配列番号５３；ｂ）配列番号５４；ｃ）配列番号８２；ｄ）配列番号８３；ｅ）配列番号６５；ｆ）配列番号８４；ｇ）配列番号８７；ｈ）配列番号７６；ｉ）配列番号８５；ｊ）配列番号８６９；ｋ）３’末端部において、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、もしくは７つのウラシル（Ｕ）ヌクレオチド、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、もしくは７つのウラシル（Ｕ）ヌクレオチドをさらに含む、上記のａ）〜ｊ）のうちのいずれか；ｌ）３’末端部において、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、もしくは７つのアデニン（Ａ）ヌクレオチド、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、もしくは７つのアデニン（Ａ）ヌクレオチドをさらに含む、上記のａ）〜ｋ）のうちのいずれか；またはｍ）５’末端部（end）（例えば、５’末端（terminus））において、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、もしくは７つのアデニン（Ａ）ヌクレオチド、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、もしくは７つのアデニン（Ａ）ヌクレオチドをさらに含む、上記のａ）〜ｌ）のうちのいずれかを含む。
【００２７】
ｇＲＮＡ分子についての態様であって、前述の複数の態様のうちのいずれかを含む態様では、ターゲティングドメインと、ｔｒａｃｒとは、別個の核酸分子上に配置され、ターゲティングドメインを含む核酸分子は、任意選択で、ターゲティングドメインに対してすぐ３’側に配置された配列番号７９を含み、例えば、ｔｒａｃｒを含む核酸分子は、配列番号６５を含む。
【００２８】
ｇＲＮＡ分子についての態様であって、前述の複数の態様のうちのいずれかを含む態様では、ターゲティングドメインと、ｔｒａｃｒとは、単一の核酸分子上に配置され、ｔｒａｃｒは、ターゲティングドメインに対して３’側に配置されている。ｇＲＮＡ分子についての態様であって、ｓｇＲＮＡを伴う、前述の複数の態様のうちのいずれかを含む態様では、ｇＲＮＡ分子は、ターゲティングドメインに対して３’側に配置され、かつ、ｔｒａｃｒに対して５’側に配置されたループ、例えば、配列番号５２を含むループをさらに含む。
【００２９】
ｇＲＮＡ分子についての態様であって、前述の複数の態様のうちのいずれかを含む態様では、ｇＲＮＡ分子は、５’から３’へと、［ターゲティングドメイン］−：ａ）配列番号７１；ｂ）配列番号７２；ｃ）配列番号７３；ｄ）配列番号７４；ｅ）配列番号７５；ｆ）３’末端部において、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、もしくは７つのウラシル（Ｕ）ヌクレオチドをさらに含む、上記の（ａ）〜（ｅ）のうちのいずれかを含む。
【００３０】
ｇＲＮＡ分子についての態様であって、前述の複数の態様のうちのいずれかを含む態様では、ターゲティングドメインと、ｔｒａｃｒとは、単一の核酸分子上に配置され、前記核酸分子は、前記ターゲティングドメインと、任意選択で、前記ターゲティングドメインに対してすぐ３’側に配置された配列番号７１とを含む、例えば、これらからなる。
【００３１】
ｇＲＮＡ分子についての態様であって、前述の複数の態様のうちのいずれかを含む態様では、ターゲティングドメインと、ｔｒａｃｒとは、単一の核酸分子上に配置され、前記核酸分子は、前記ターゲティングドメインと、任意選択で、前記ターゲティングドメインに対してすぐ３’側に配置された配列番号７５とを含む、例えば、これらからなる。
【００３２】
ｇＲＮＡ分子についての態様であって、前述の複数の態様のうちのいずれかを含む態様では、ｇＲＮＡ分子を含む核酸分子のうちの１つ、または、任意選択で、１つを超えるものは、ａ）前記１または複数の核酸分子の３’末端部における、ある、例えば、３つのホスホロチオエート修飾；ｂ）前記１または複数の核酸分子の５’末端部における、ある、例えば、３つのホスホロチオエート修飾；ｃ）前記１または複数の核酸分子の３’末端部における、ある、例えば、３つの２’−Ｏ−メチル修飾；ｄ）前記１または複数の核酸分子の５’末端部における、ある、例えば、３つの２’−Ｏ−メチル修飾；ｅ）前記１または複数の核酸分子の、末端に対して４つ目、末端に対して３つ目、および末端に対して２つ目の３’残基の各々における２’−Ｏ−メチル修飾；またはｆ）これらの任意の組合せを含む。
【００３３】
ｇＲＮＡ分子についての態様であって、前述の複数の態様のうちのいずれかを含む態様では、ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ系（例えば、本明細書で記載されるＲＮＰ）を、細胞へと導入すると、インデル、例えば、１０ヌクレオチドを超える欠失、例えば、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５ヌクレオチドの欠失を含むインデルは、ｇＲＮＡ分子のターゲティングドメインと相補的な標的配列において、またはこの近傍において、形成される。
【００３４】
ｇＲＮＡ分子についての態様であって、前述の複数の態様のうちのいずれかを含む態様では、ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ系（例えば、本明細書で記載されるＲＮＰ）を、細胞集団へと導入すると、例えば、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）により測定される通りに、細胞集団うちの、少なくとも約４０％、例えば、少なくとも約５０％、例えば、少なくとも約６０％、例えば、少なくとも約７０％、例えば、少なくとも約８０％、例えば、少なくとも約９０％、例えば、少なくとも約９５％、例えば、少なくとも約９６％、例えば、少なくとも約９７％、例えば、少なくとも９８％、例えば、少なくとも約９９％の中の、ｇＲＮＡ分子のターゲティングドメインに相補的な標的配列またはこの近傍において、インデルが形成される。ｇＲＮＡ分子についての態様であって、前述の複数の態様のうちのいずれかを含む態様では、１０ヌクレオチドを超える欠失、例えば、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５ヌクレオチドの欠失を含むインデルは、例えば、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）により測定される通りに、集団の細胞のうちの少なくとも約５％、例えば、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％またはこれを超える細胞内で検出される。
【００３５】
ｇＲＮＡ分子についての態様であって、前述の複数の態様のうちのいずれかを含む態様では、ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ系（例えば、本明細書で記載されるＲＮＰ）を、細胞へと導入すると、ＴＥＴ２、例えば、ＴＥＴ２の少なくとも１つのアイソフォームの発現は、前記細胞内で低減または消失する。
【００３６】
ｇＲＮＡ分子についての態様であって、前述の複数の態様のうちのいずれかを含む態様では、ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ系（例えば、本明細書で記載されるＲＮＰ）を、細胞へと導入すると、ＴＥＴ２の機能、例えば、触媒機能は、前記細胞内で低減または消失する。
【００３７】
ｇＲＮＡ分子についての態様であって、前述の複数の態様のうちのいずれかを含む態様では、前記細胞内で、ＴＥＴ２の機能、例えば、触媒機能は、例えば、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％低減されるが、前記機能、例えば、前記触媒機能は、約８０％を超えて低減されない、例えば、消失しない。
【００３８】
ｇＲＮＡ分子についての態様であって、前述の複数の態様のうちのいずれかを含む態様では、ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ系（例えば、本明細書で記載されるＲＮＰ）を、細胞へと導入すると、ＴＥＴ２の発現、例えば、少なくとも１つのＴＥＴ２アイソフォームの発現、および／または少なくとも１つのＴＥＴ２の機能は、同じ種類であるが、前記ＣＲＩＳＰＲ系を導入していない細胞（例えば、同じ種類の非変更細胞）内の発現および／または機能のレベルと比べて変更されない。
【００３９】
ｇＲＮＡ分子についての態様であって、前述の複数の態様のうちのいずれかを含む態様では、ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ系（例えば、本明細書で記載されるＲＮＰ）を、細胞へと導入すると、前記細胞内で、例えば、次世代シーケンシングおよび／またはヌクレオチド挿入アッセイにより検出可能なオフターゲットインデルが形成されない。ｇＲＮＡ分子についての態様であって、前述の複数の態様のうちのいずれかを含む態様では、ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ系（例えば、本明細書で記載されるＲＮＰ）を、細胞集団へと導入すると、オフターゲットインデルは、細胞集団の細胞、例えば、次世代シーケンシングおよび／またはヌクレオチド挿入アッセイにより検出可能なのうちの、約５％以下、例えば、約１％以下、例えば、約０．１％以下、例えば、約０．０１％以下において検出される。
【００４０】
一部の実施形態では、ｇＲＮＡ分子（例えば、本明細書で記載される）を含むＣＲＩＳＰＲ系（例えば、本明細書で記載されるＲＮＰ）を、細胞、例えば、Ｔ細胞へと導入すると、本明細書で記載されるｇＲＮＡの標的配列において、またはこの近傍において、非自然発生のインデルが形成される、例えば、表２２に記載された、非自然発生のインデルを含むインデルが形成される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡ分子（例えば、本明細書で記載される）を含むＣＲＩＳＰＲ系（例えば、本明細書で記載されるＲＮＰ）を、細胞の集団、例えば、Ｔ細胞の集団へと導入すると、集団の細胞のうちの少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％は、本明細書で記載されるｇＲＮＡの標的配列において、またはこの近傍において、１または複数の、非自然発生のインデルを含む、例えば、表２２に記載されたインデルから選択される、１または複数の、非自然発生のインデル（例えば、ＲＮＡのターゲティングドメイン配列と関連する、表２に記載されたインデル）を含む。
【００４１】
一部の実施形態では、ｇＲＮＡ分子（例えば、本明細書で記載される）と、鋳型核酸分子（例えば、本明細書で記載される）とを含むＣＲＩＳＰＲ系（例えば、本明細書で記載されるＲＮＰ）を、細胞、例えば、Ｔ細胞へと導入すると、ｇＲＮＡの標的配列に、またはこの近傍に挿入された異種配列を含む細胞が形成される。一部の実施形態では、異種配列は、例えば、本明細書で記載されるＣＡＲをコードする配列を含む。一部の実施形態では、異種配列は、例えば、本明細書で記載されるＣＡＲをコードする配列であって、例えば、本明細書で記載される、プロモーター、例えば、ＥＦ１アルファプロモーターをコードする配列に作動可能に連結した配列を含む。ある態様では、本開示は、前出のｇＲＮＡについての複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかの、第１のｇＲＮＡ分子を含む組成物を提供する。ある態様では、組成物は、Ｃａｓ９分子、例えば、配列番号９０または配列番号１１１〜配列番号１２１または配列番号１２３のうちのいずれか１つを含む、例えば、これらからなるＣａｓ９分子、または、例えば、活性または不活性の化膿連鎖球菌（S. pyogenes）Ｃａｓ９をさらに含む。
【００４２】
組成物についての態様であって、前述の複数の組成物態様のうちのいずれかを含む態様では、第１のｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子は、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）内に存在する。
【００４３】
組成物についての態様であって、前述の複数の組成物態様のうちのいずれかを含む態様では、組成物は、鋳型核酸、例えば、二本鎖もしくは一本鎖である鋳型核酸をさらに含み、例えば、鋳型核酸は、ベクター、例えば、レンチウイルスベクター、およびＡＡＶベクター、アデノウイルスベクター、プラスミド、ミニサークル、もしくはナノプラスミドであるか、またはこの中に含まれる。組成物についての態様であって、前述の複数の組成物態様のうちのいずれかを含む態様では、鋳型核酸は、少なくとも１つの（例えば、少なくとも５’または少なくとも３’）相同性アームを含み、相同性アームは、ＴＥＴ２イントロンの配列と相同な配列を含む。組成物についての態様であって、前述の複数の組成物態様のうちのいずれかを含む態様では、鋳型核酸は、５’および３’相同性アームの両方を含み、相同性アームのうちの少なくとも１つは、ＴＥＴ２イントロンの配列と相同な配列を含む。組成物についての態様であって、前述の複数の組成物態様のうちのいずれかを含む態様では、組成物鋳型核酸は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸、例えば、本明細書で記載されるＣＡＲを含む。ある態様では、ＣＡＲは、（ａ）例えば、本明細書で記載されるＣＤ１９  ＣＡＲ；または（ｂ）例えば、本明細書で記載されるＢＣＭＡ  ＣＡＲである。ある態様では、ＣＡＲは、配列番号１６０〜配列番号１７２または配列番号１７５のうちのいずれか１つを含む抗原結合性ドメインを含むＣＤ１９  ＣＡＲである。ある態様では、ＣＡＲは、ＣＤ１９  ＣＡＲであり、配列番号１８５〜配列番号１９７のうちのいずれか１つを含む。他の態様では、ＣＡＲは、配列番号２３９〜配列番号４１２のうちのいずれか１つを含む抗原結合性ドメインを含むＢＣＭＡ  ＣＡＲである。ある態様では、ＣＡＲは、ＢＣＭＡ  ＣＡＲであり、配列番号８４９〜配列番号８６３または配列番号８７９〜配列番号８９９のうちのいずれか１つを含み、例えば、配列番号８５９を含む。組成物についての態様であって、前述の複数の組成物態様のうちのいずれかを含む態様では、組成物は、ＣＡＲをコードする核酸配列に作動可能に連結したプロモーター、例えば、ＥＦ１アルファプロモーターを含む鋳型核酸を含む。
【００４４】
組成物についての態様であって、前述の複数の組成物態様のうちのいずれかを含む態様では、組成物は、少なくとも１つのさらなるｇＲＮＡ分子（例えば、第２のｇＲＮＡ分子；第２のｇＲＮＡ分子および第３のｇＲＮＡ分子；または第２のｇＲＮＡ分子、第３のｇＲＮＡ分子、および第４のｇＲＮＡ分子）をさらに含み、組成物の各ｇＲＮＡ分子は、異なる標的配列と相補的である。ある態様では、少なくとも１つのさらなるｇＲＮＡ分子、例えば、第２のｇＲＮＡ分子、第３のｇＲＮＡ分子（存在する場合）、および第４のｇＲＮＡ分子（存在する場合）は、同じＴＥＴ２イントロン内の標的配列と相補的である。別の態様では、第１のｇＲＮＡ分子、第２のｇＲＮＡ分子、第３のｇＲＮＡ分子（存在する場合）、および第４のｇＲＮＡ分子（存在する場合）は、異なる遺伝子内の標的配列と相補的である、例えば、第１のｇＲＮＡ分子は、前述のｇＲＮＡについての複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかの（例えば、本明細書で記載される）ｇＲＮＡ分子であり、第２のｇＲＮＡ分子は、阻害性分子（例えば、ＰＤＣＤ１）、Ｔ細胞受容体の構成要素（例えば、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ）、Ｂ２Ｍ、またはＣＩＩＴＡの標的配列と相補的なターゲティングドメインを含む。
【００４５】
組成物についての態様であって、前述の複数の組成物態様のうちのいずれかを含む態様では、組成物を、電気穿孔に適する培地中で製剤化するが、この場合、例えば、前記ｇＲＮＡ分子の各々は、本明細書で記載されるＣａｓ９分子と共に、ＲＮＰ内にあり、前記ＲＮＰ複合体の各々は、約１０ｕＭ未満、例えば、約３ｕＭ未満、例えば、約１ｕＭ未満、例えば、約０．５ｕＭ未満、例えば、約０．３ｕＭ未満、例えば、約０．１ｕＭ未満の濃度である。
【００４６】
ある態様では、本開示は、前出のｇＲＮＡについての態様および実施形態のうちのいずれかによるｇＲＮＡ分子、または前出の組成物についての複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかの組成物の、ある構成要素、例えば、全ての構成要素をコードする核酸配列を提供する。
【００４７】
ある態様では、本開示は、前出の核酸についての複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかの核酸を含むベクターであって、例えば、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、プラスミド、ミニサークル、ナノプラスミド、およびＲＮＡベクターからなる群から選択されるベクターを提供する。
【００４８】
ある態様では、本開示は、細胞の標的配列を変更する、例えば、その構造、例えば、配列を変更する方法であって、前記細胞を、ａ）前出のｇＲＮＡ分子についての、複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかのｇＲＮＡ分子、例えば、１つを超えるｇＲＮＡ分子、ならびにＣａｓ９分子；ｂ）前出のｇＲＮＡ分子についての、複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかのｇＲＮＡ分子、例えば、１つを超えるｇＲＮＡ分子、ならびにＣａｓ９分子をコードする核酸；ｃ）前出のｇＲＮＡ分子についての、複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかのｇＲＮＡ分子、例えば、１つを超えるｇＲＮＡ分子をコードする核酸、ならびにＣａｓ９分子；ｄ）前出のｇＲＮＡ分子についての、複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかのｇＲＮＡ分子、例えば、１つを超えるｇＲＮＡ分子をコードする核酸、ならびＣａｓ９分子をコードする核酸；ｅ）上記のａ）〜ｄ）のうちのいずれか、および鋳型核酸；ｆ）上記のａ）〜ｄ）のうちのいずれか、および鋳型核酸、例えば、前出の複数の態様および実施形態のうちのいずれかで記載される鋳型核酸、例えば、本明細書で記載される鋳型核酸；ｇ）前出の組成物についての、複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかの組成物；またはｈ）前出のベクターについての、複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかのベクターと接触させるステップを含む方法を提供する。
【００４９】
方法についての態様であって、前述の複数の方法態様のうちのいずれかを含む態様では、前出のｇＲＮＡについての複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかのｇＲＮＡ分子（または前出のｇＲＮＡについての複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかのｇＲＮＡ分子をコードする核酸）と、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９分子をコードする核酸とを、単一の組成物中に製剤化する。
【００５０】
方法についての態様であって、前述の複数の方法態様のうちのいずれかを含む態様では、組成物が、鋳型核酸、例えば、前出の複数の態様および実施形態のうちのいずれかで記載される（例えば、本明細書で記載される）鋳型核酸を含む場合、鋳型核酸を、前出のｇＲＮＡについての複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかのｇＲＮＡ分子（または前出のｇＲＮＡについての複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかのｇＲＮＡ分子をコードする核酸）と、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９分子をコードする核酸とは別個の組成物中に製剤化する。ある態様では、１つを超える組成物を、（細胞へと）逐次的に送達する。
【００５１】
方法についての態様であって、前述の複数の方法態様のうちのいずれかを含む態様では、方法は、鋳型核酸の少なくとも一部の、前出のｇＲＮＡについての複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかのｇＲＮＡ分子の標的配列における、またはこの近傍における挿入を結果としてもたらす。ある態様では、挿入は、１つの対立遺伝子だけで生じる。
【００５２】
ある態様では、本開示は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように細胞を操作する方法であって、（ａ）前記細胞へと、前出のｇＲＮＡ分子についての複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかのｇＲＮＡ分子、または前出の組成物についての複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかの組成物を含むＣＲＩＳＰＲ系を導入するステップと；（ｂ）前記細胞へと、ＣＡＲをコードする核酸配列を含む鋳型核酸を導入するステップとを含み、ＣＡＲをコードする前記核酸配列を、ゲノムへと、例えば、任意選択で、前記ｇＲＮＡ分子の標的配列における、またはこの近傍における、ゲノムの単一の対立遺伝子だけに組み込む、方法を提供する。ある態様では、方法は、前記細胞へと阻害性分子、Ｔ細胞受容体の構成要素、Ｂ２Ｍ、および／またはＣＩＩＴＡの標的配列と相補的な１または複数のｇＲＮＡ分子を含む、１または複数のＣＲＩＳＰＲ系を導入するステップをさらに含む。
【００５３】
方法についての態様であって、前述の複数の方法態様のうちのいずれかを含む態様では、細胞は、動物細胞、例えば、哺乳動物、霊長類、またはヒト細胞、例えば、免疫エフェクター細胞（例えば、免疫エフェクター細胞の集団）、例えば、Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞、例えば、Ｔ細胞、例えば、ＣＤ４＋  Ｔ細胞、ＣＤ８＋  Ｔ細胞、またはこれらの組合せである。
【００５４】
方法についての態様であって、前述の複数の方法態様のうちのいずれかを含む態様では、ＣＡＲは、例えば、本明細書で記載されるＣＡＲ：（ａ）例えば、本明細書で記載されるＣＤ１９  ＣＡＲ；または（ｂ）例えば、本明細書で記載されるＢＣＭＡ  ＣＡＲである。ある態様では、ＣＡＲは、（ａ）例えば、本明細書で記載されるＣＤ１９  ＣＡＲ；または（ｂ）例えば、本明細書で記載されるＢＣＭＡ  ＣＡＲである。ある態様では、ＣＡＲは、配列番号１６０〜配列番号１７２または配列番号１７５のうちのいずれか１つを含む抗原結合性ドメインを含むＣＤ１９  ＣＡＲである。ある態様では、ＣＡＲは、ＣＤ１９  ＣＡＲであり、配列番号１８５〜配列番号１９７のうちのいずれか１つを含む。他の態様では、ＣＡＲは、配列番号２３９〜配列番号４１２のうちのいずれか１つを含む抗原結合性ドメインを含むＢＣＭＡ  ＣＡＲである。ある態様では、ＣＡＲは、ＢＣＭＡ  ＣＡＲであり、配列番号８４９〜配列番号８６３または配列番号８７９〜配列番号８９９のうちのいずれか１つを含み、例えば、配列番号８５９を含む。
【００５５】
方法についての態様であって、前述の複数の方法態様のうちのいずれかを含む態様では、細胞は、前記細胞を投与される患者に関して自家または同種異系である。
【００５６】
ある態様では、本開示は、本明細書で記載される細胞、例えば、本明細書における方法についての複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかの方法により（例えば、本明細書で記載される方法により）変更された細胞を提供する。ある態様では、細胞は、前出のｇＲＮＡ分子についての複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかの（例えば、本明細書で記載される）第１のｇＲＮＡ分子、または前出の組成物についての複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかの（例えば、本明細書で記載される）組成物、例えば、本明細書で記載される核酸、または前出のベクターについての複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかのベクターを含む。ある態様では、細胞は、動物細胞、例えば、哺乳動物、霊長類、またはヒト細胞である。ある態様では、細胞は、免疫エフェクター細胞（例えば、免疫エフェクター細胞の集団）、例えば、Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞、例えば、Ｔ細胞、例えば、ＣＤ４＋  Ｔ細胞、ＣＤ８＋  Ｔ細胞、またはこれらの組合せである。
【００５７】
細胞についての態様であって、前述の複数の細胞態様のうちのいずれかを含む態様では、細胞は、阻害性分子、Ｔ細胞受容体の構成要素（例えば、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｄ、またはＣＤ３Ｇ）、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、またはこれらの組合せの発現が、例えば、同じ種類の非改変細胞と比べて低減または消失している。
【００５８】
細胞についての態様であって、前述の複数の細胞態様のうちのいずれかを含む態様では、細胞は、ゲノムへと、ＴＥＴ２のイントロンまたはイントロン−エクソン接合部に組み込まれた、例えば、単一の対立遺伝子だけに組み込まれた、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）（例えば、本明細書で記載されるＣＡＲ）をコードする核酸配列を含む。
【００５９】
細胞についての態様であって、前述の複数の細胞態様のうちのいずれかを含む態様では、細胞は、同じ細胞型の非変更細胞の発現および／または機能のレベルと比べて、低減もしくは消失したＴＥＴ２の発現、例えば、少なくとも１つのＴＥＴ２アイソフォームの発現、および／または低減もしくは消失したＴＥＴ２の機能、例えば、ＴＥＴ２の少なくとも１つの機能、例えば、ＴＥＴ２の触媒機能を含む。
【００６０】
細胞についての態様であって、前述の複数の細胞態様のうちのいずれかを含む態様では、細胞は、Ｔ細胞であり、類似の種類の非変更細胞と比べて、（ａ）増強された増殖能；（ｂ）増強された細胞傷害作用；（ｃ）低枯渇性表現型（例えば、阻害性分子、例えば、ＰＤ１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＰＤ−Ｌ１、またはこれらの組合せの発現の低減）；または（ｄ）Ｔｓｃｍの表現型（例えば、ＣＤ４５ＲＡ＋  ＣＤ６２Ｌ＋  ＣＤ２７＋  ＣＤ９５＋である）を呈示する。
【００６１】
細胞についての態様であって、前述の複数の細胞態様のうちのいずれかを含む態様では、細胞は、前記細胞を投与される患者に関して自家である。前述の細胞態様のうちのいずれかを含む、細胞についての他の複数の態様では、細胞は、前記細胞を投与される患者に関して同種異系である。
【００６２】
ある態様では、本開示は、ＴＥＴ２の発現および／または機能が、低減または消失しており、ＴＥＴ２イントロン内の部位に組み込まれた、異種核酸配列（例えば、例えば、本明細書で記載されるキメラ抗原受容体をコードする核酸配列）を含み、ＴＥＴ２イントロン内の前記部位が、ａ）ｃｈｒ４：１０５１４６９８０−１０５１９０３５９；ｂ）ｃｈｒ４：１０５１９０５０６−１０５２３３８９６；ｃ）ｃｈｒ４：１０５２３７３５２−１０５２４１３３８；ｄ）ｃｈｒ４：１０５２４１４３０−１０５２４２８３３；ｅ）ｃｈｒ４：１０５２４２９２８−１０５２４３５６９；ｆ）ｃｈｒ４：１０５２４３７７９−１０５２５９６１８；ｇ）ｃｈｒ４：１０５２５９７７０−１０５２６１７５８；ｈ）ｃｈｒ４：１０５２６１８４９−１０５２６９６０９；ｉ）ｃｈｒ４：１０５２６９７４８−１０５２７２５６３；およびｊ）ｃｈｒ４：１０５２７２９１９−１０５２７５０４７から選択され、上記の座標が、ｈｇ３８に従う、改変細胞を提供する。
【００６３】
細胞についての態様であって、前述の複数の細胞態様のうちのいずれかを含む態様では、細胞は、Ｔ細胞受容体の構成要素、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、またはこれらの組合せの発現および／または機能が、同じ種類の非改変細胞と比べて低減または消失している。
【００６４】
細胞についての前述の複数の態様および実施形態のうちのいずれかを含む、一部の実施形態では、細胞、例えば、Ｔ細胞は、本明細書で記載されるｇＲＮＡの標的配列において、またはこの近傍において、非自然発生のインデルを含み、例えば、表２２に記載された、非自然発生のインデルを含むインデルを含む。細胞についての前述の複数の態様および実施形態のうちのいずれかを含む、一部の実施形態では、本開示は、細胞集団、例えば、Ｔ細胞の集団を提供し、集団の細胞のうちの少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％は、本明細書で記載されるｇＲＮＡの標的配列において、またはこの近傍において、１または複数の、非自然発生のインデルを含む、例えば、表２２に記載されたインデルから選択される、１または複数の、非自然発生のインデル（例えば、ｇＲＮＡのターゲティングドメイン配列と関連する、表２に記載されたインデル）を含む。
【００６５】
一部の実施形態では、本開示は、ｇＲＮＡの標的配列に、またはこの近傍に挿入された異種配列を含む細胞、例えば、本明細書で記載されるｇＲＮＡを提供する。一部の実施形態では、異種配列は、例えば、本明細書で記載されるＣＡＲをコードする配列を含む。一部の実施形態では、異種配列は、例えば、本明細書で記載されるＣＡＲをコードする配列であって、例えば、本明細書で記載される、プロモーター、例えば、ＥＦ１アルファプロモーターをコードする配列に作動可能に連結した配列を含む。好ましい実施形態では、ＣＡＲを、前記細胞内で発現させる。
【００６６】
ある態様では、本開示は、対象において、抗腫瘍免疫をもたらす方法であって、対象へと、有効量の、前出の細胞についての複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかの（例えば、本明細書で記載される）細胞を投与するステップを含む方法を提供する。
【００６７】
ある態様では、本開示は、腫瘍抗原の発現と関連する疾患、例えば、増殖性疾患、前がん性状態、がん、および腫瘍抗原の発現と関連する非がん関連適応症を有する対象を処置する方法であって、対象へと、有効量の、前出の細胞についての複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかの（例えば、本明細書で記載される）細胞を投与するステップを含む方法を提供するが、この場合、例えば、腫瘍抗原の発現と関連する疾患は、がんまたは非がん関連適応症であり、例えば、疾患は、がん、例えば、結腸がん、直腸がん、腎細胞癌、肝臓がん、肺非小細胞癌、小腸がん、食道がん、黒色腫、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頚部がん、皮膚または眼内悪性黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域がん、胃がん、精巣がん、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頚癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、小児充実性腫瘍、膀胱がん、腎または尿管がん、腎盂癌、中枢神経系（ＣＮＳ）新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮がん、扁平上皮がん、Ｔ細胞リンパ腫、環境誘導性がん、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性白血病、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ細胞性急性リンパ性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、Ｔ細胞性急性リンパ性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、毛様細胞白血病、小細胞または大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成および骨髄異形成症候群、ホジキンリンパ腫、形質芽細胞性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、ワルデンシュトロームマクログロブリン血症、および前白血病、前記がんの組合せ、および前記がんの転移性病変から選択されるがんである。
【００６８】
方法についての態様であって、前述の複数の方法態様のうちのいずれかを含む態様では、方法は、化学療法剤、例えば、シクロホスファミド、フルダラビン、またはシクロホスファミドおよびフルダラビンを投与するステップをさらに含む。
【００６９】
方法についての態様であって、前述の複数の方法態様のうちのいずれかを含む態様では、方法は、対象へと、有効量の、前出の細胞についての複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかの（例えば、本明細書で記載される）細胞を投与するステップの前に、リンパ球枯渇剤または免疫抑制薬を投与するステップを含む。
【００７０】
ある態様では、本開示は、前述の細胞についての複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかの（例えば、本明細書で記載される）細胞を含む細胞集団であって、細胞のうちの少なくとも約３０％、例えば、細胞のうちの少なくとも約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％が、前出の細胞についての複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかの（例えば、本明細書で記載される）細胞である、細胞集団を提供する。
【００７１】
ある態様では、本開示は、ＴＥＴ２のイントロンまたはイントロン−エクソン接合部の配列に結合する遺伝子編集系であって、例えば、ＴＥＴ２のイントロンまたはイントロン−エクソン接合部の配列が、ａ）ｃｈｒ４：１０５１４６９８０−１０５１９０３５９；ｂ）ｃｈｒ４：１０５１９０５０６−１０５２３３８９６；ｃ）ｃｈｒ４：１０５２３７３５２−１０５２４１３３８；ｄ）ｃｈｒ４：１０５２４１４３０−１０５２４２８３３；ｅ）ｃｈｒ４：１０５２４２９２８−１０５２４３５６９；ｆ）ｃｈｒ４：１０５２４３７７９−１０５２５９６１８；ｇ）ｃｈｒ４：１０５２５９７７０−１０５２６１７５８；ｈ）ｃｈｒ４：１０５２６１８４９−１０５２６９６０９；ｉ）ｃｈｒ４：１０５２６９７４８−１０５２７２５６３；およびｊ）ｃｈｒ４：１０５２７２９１９−１０５２７５０４７から選択されるゲノム領域内の配列であり、前記ゲノム領域が、ｈｇ３８に従い、例えば、ゲノム領域が、ｃｈｒ４：１０５２６９７４８〜１０５２７２５６３である、遺伝子編集系を提供する。ある態様では、遺伝子編集系は、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）遺伝子編集系、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集系、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集系、またはメガヌクレアーゼ遺伝子編集系である。ある態様では、遺伝子編集系は、鋳型核酸（例えば、本明細書で記載される）、例えば、ＣＡＲをコードする核酸配列（例えば、本明細書で記載される）を含む鋳型核酸をさらに含む。遺伝子編集系についての態様であって、前述の複数の遺伝子編集系態様のうちのいずれかを含む態様では、前記遺伝子編集系（および／または遺伝子編集系の、１または複数の構成要素をコードする核酸配列）を、細胞へと導入すると、ＣＡＲをコードする核酸配列は、前記細胞のゲノムへと、前記ゲノム編集系が結合するＴＥＴ２のイントロンまたはイントロン−エクソン接合部の配列において、またはこの近傍において組み込まれる。
【００７２】
ある態様では、本開示は、前出の遺伝子編集系についての複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかの（例えば、本明細書で記載される）遺伝子編集系により改変された細胞を提供する。
【００７３】
ある態様では、本開示は、前出の遺伝子編集系についての複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかの（例えば、本明細書で記載される）遺伝子編集系を含む細胞を提供する。
【００７４】
ある態様では、本開示は、医薬としての使用のための、前出のｇＲＮＡ分子についての複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかの（例えば、本明細書で記載される）ｇＲＮＡ分子、前出の組成物についての複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかの（例えば、本明細書で記載される）組成物、前出の核酸についての複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかの（例えば、本明細書で記載される）核酸、前出のベクターについての複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかの（例えば、本明細書で記載される）ベクター、前出の細胞についての複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかの（例えば、本明細書で記載される）細胞（または細胞集団）、または前出の遺伝子編集系についての複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかの（例えば、本明細書で記載される）遺伝子編集系を提供する。
【００７５】
ある態様では、本開示は、医薬の製造における使用のための、前出のｇＲＮＡ分子についての複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかの（例えば、本明細書で記載される）ｇＲＮＡ分子、前出の組成物についての複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかの（例えば、本明細書で記載される）組成物、前出の核酸についての複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかの（例えば、本明細書で記載される）核酸、前出のベクターについての複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかの（例えば、本明細書で記載される）ベクター、前出の細胞についての複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかの（例えば、本明細書で記載される）細胞（または細胞集団）、または前出の遺伝子編集系についての複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかの（例えば、本明細書で記載される）遺伝子編集系を提供する。
【００７６】
ある態様では、本開示は、疾患の処置における使用のための、前出のｇＲＮＡ分子についての複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかの（例えば、本明細書で記載される）ｇＲＮＡ分子、前出の組成物についての複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかの（例えば、本明細書で記載される）組成物、前出の核酸についての複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかの（例えば、本明細書で記載される）核酸、前出のベクターについての複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかの（例えば、本明細書で記載される）ベクター、前出の細胞についての複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかの（例えば、本明細書で記載される）細胞（または細胞集団）、または前出の遺伝子編集系についての複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかの（例えば、本明細書で記載される）遺伝子編集系を提供する。
【００７７】
ある態様では、本開示は、腫瘍抗原の発現と関連する疾患、例えば、増殖性疾患、前がん性状態、がん、および腫瘍抗原の発現と関連する非がん関連適応症である、疾患の処置における使用のための、前出のｇＲＮＡ分子についての複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかの（例えば、本明細書で記載される）ｇＲＮＡ分子、前出の組成物についての複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかの（例えば、本明細書で記載される）組成物、前出の核酸についての複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかの（例えば、本明細書で記載される）核酸、前出のベクターについての複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかの（例えば、本明細書で記載される）ベクター、前出の細胞についての複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかの（例えば、本明細書で記載される）細胞（または細胞集団）、または前出の遺伝子編集系についての複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかの（例えば、本明細書で記載される）遺伝子編集系を提供する。
【００７８】
ある態様では、本開示は、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性白血病、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ細胞性急性リンパ性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、Ｔ細胞性急性リンパ性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、毛様細胞白血病、小細胞または大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成および骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、形質芽細胞性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、ワルデンシュトロームマクログロブリン血症、および前白血病からなる群から選択される血液がんである、がんの処置における使用のための、前出のｇＲＮＡ分子についての複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかの（例えば、本明細書で記載される）ｇＲＮＡ分子、前出の組成物についての複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかの（例えば、本明細書で記載される）組成物、前出の核酸についての複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかの（例えば、本明細書で記載される）核酸、前出のベクターについての複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかの（例えば、本明細書で記載される）ベクター、前出の細胞についての複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかの（例えば、本明細書で記載される）細胞（または細胞集団）、または前出の遺伝子編集系についての複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかの（例えば、本明細書で記載される）遺伝子編集系を提供する。
【００７９】
ある態様では、本開示は、中皮腫、腺癌、神経膠芽腫、結腸がん、直腸がん、腎細胞癌、肝臓がん、肺非小細胞癌、小腸がん、食道がん、黒色腫、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頚部がん、皮膚または眼内悪性黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域がん、胃がん、精巣がん、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頚癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、小児充実性腫瘍、膀胱がん、腎または尿管がん、腎盂癌、中枢神経系（ＣＮＳ）新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮がん、扁平上皮がん、Ｔ細胞リンパ腫、環境誘導性がん、前記がんの組合せ、および前記がんの転移性病変からなる群から選択される、がんの処置における使用のための、前出のｇＲＮＡ分子についての複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかの（例えば、本明細書で記載される）ｇＲＮＡ分子、前出の組成物についての複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかの（例えば、本明細書で記載される）組成物、前出の核酸についての複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかの（例えば、本明細書で記載される）核酸、前出のベクターについての複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかの（例えば、本明細書で記載される）ベクター、前出の細胞についての複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかの（例えば、本明細書で記載される）細胞（または細胞集団）、または前出の遺伝子編集系についての複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかの（例えば、本明細書で記載される）遺伝子編集系を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】ＣＤ３４＋造血幹細胞内の、異なるＣａｓ９変異体によりターゲティングされたＢ２Ｍ遺伝子座における編集効率であって、ＮＧＳおよびフローサイトメトリーにより査定される編集効率を示す図である。ＮＬＳ＝ＳＶ４０  ＮＬＳであり；Ｈｉｓ６（配列番号１０８）またはＨｉｓ８（配列番号１０９）とは、それぞれ、６つまたは８つのヒスチジン残基を指し；ＴＥＶ＝タバコエッチウイルスの切断部位であり；Ｃａｓ９＝野生型化膿連鎖球菌（S. pyogenes）のＣａｓ９である（突然変異または変異体は、示された通りである）。
【図２】初代ヒトＴ細胞内の、異なるＣａｓ９変異体によりターゲティングされたＢ２Ｍ遺伝子座における編集効率および濃度範囲であって、フローサイトメトリーにより測定される編集効率および濃度範囲を示す図である。
【図３】Ｂ２Ｍ（左パネル）またはＴＲＡＣ（右パネル）をターゲティングする、２つの異なるｇＲＮＡを使用する、初代ヒトＴ細胞内の、多様な濃度の、２つの異なるＣａｓ９変異体の編集効率を示す図である。編集効率（編集％）は、フローサイトメトリーによって、Ｂ２Ｍ（左パネル）またはＴＣＲ（右パネル）の細胞表面発現の喪失を測定することにより測定した。
【図４】ｈＴＥＴ２のイントロン９〜１０（エクソン９とエクソン１０との間のイントロン）をターゲティングする、ｇＲＮＡのデザインについての概略図である。
【図５】ＡＡＶによるターゲティング構築物についての概略図（縮尺通りの描図ではない）である。
【図６】７日目における、ｇ１−ＲＮＡを使用するＦＡＣＳ染色により、ＣＤ３＋細胞のうちの１１．４％が、ＢＣＭＡ１０＿ＣＡＲ＋であり、ｇ４５−ＲＮＡを使用するＦＡＣＳ染色により、１３．５％が、ＢＣＭＡ１０＿ＣＡＲ＋であったことを示す図である。ＢＣＭＡ１０＿ＣＡＲ＋細胞の百分率は、経時的に増大した。
【図７】ｇ４５、および図６で使用されたドナーと異なるドナーを使用するＦＡＣＳ染色により、ＢＣＭＡ１０＿ＣＡＲ＋であったＣＤ３＋細胞を示す図である。ＢＣＭＡ１０＿ＣＡＲ＋細胞の百分率は、経時的に増大した。
【図８】全細胞の倍数変化を、ＲＮＰ−ＡＡＶ処置群、ＲＮＰ処置群、およびビーズ除去だけの群について示す図である。ＢＣＭＡ−ＣＡＲ＋細胞の、７日目〜１０日目における拡大は、全集団より、わずかに速かった（４．３対２．７倍）。
【図９】５’側部位および３’側部位の両方における、適正な組込みを確認するために、ＢＣＭＡ１０＿ＣＡＲインサートとの相同性領域の外側から増幅するようにデザインされたＰＣＲプライマー（それぞれ、出現の順に、配列番号１０５５７〜１０５５８、１０５５７〜１０５５８、１０５５９〜１０５６０、および１０５５９〜１０５６０）についての概略図である。
【図１０】図１０Ａ、および、図１０Ｂは、例示的なガイドを、ＣＤ３＋  Ｔ細胞内で査定したことを示す図である。各標的部位について、各遺伝子座を増幅するように、２セットのプライマーをデザインした。ＮＧＳを使用して、各標的配列における、全編集パーセント、挿入パーセント、および欠失パーセントを決定した。
【図１１】オリゴインサートベースのアッセイ（例えば、Tsai et al., Nature Biotechnology. 33, 187-197; 2015を参照されたい）を使用して、ＴＥＴ２をターゲティングするＣａｓ９により切断された、潜在的なオフターゲットのゲノム部位を決定したことを示す図である。ＴＥＴ２をターゲティングする例示的なｇＲＮＡと、対照ガイドとを、Ｃａｓ９発現ＨＥＫ２９３細胞内でスクリーニングした。予期された標的配列における高効率編集が検出され、ガイドのうちの一部については、潜在的なオフターゲットも検出されたが、ガイドのうちの３つについては、オフターゲットが検出されなかった。
【発明を実施するための形態】
【００８１】
定義
「遺伝子編集系」または「ゲノム編集系」という用語は、ヌクレアーゼ（またはヌクレアーゼドメイン）による、標的配列における、核酸の修飾（例えば、一本鎖切断または二本鎖切断）を方向付け、実行するのに、必要かつ十分な、少なくともヌクレアーゼ（またはヌクレアーゼドメイン）と、プログラム可能なヌクレオチド結合性ドメインとを含む、１または複数の分子による系を指す。複数の実施形態では、遺伝子編集系は、ＣＲＩＳＰＲ系である。複数の実施形態では、遺伝子編集系は、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ系（ＺＦＮ）である。複数の実施形態では、遺伝子編集系は、ＴＡＬＥＮ系である。複数の実施形態では、遺伝子編集系は、メガヌクレアーゼ系である。複数の実施形態では、遺伝子編集系は、ＴＥＴ２イントロン内の部位を修飾する。複数の実施形態では、遺伝子編集系は、鋳型核酸、例えば、例えば、本明細書で記載されるキメラ抗原受容体をコードする配列を含む鋳型核酸をさらに含む。複数の実施形態では、遺伝子編集系の構成要素のうちの１または複数を、細胞へと、前記１または複数の構成要素をコードする核酸として導入することができる。理論に束縛されずに、前記１または複数の構成要素が発現すると、遺伝子編集系は、例えば、細胞内で構成される。
【００８２】
「ＣＲＩＳＰＲ系」、「Ｃａｓ系」、または「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系」という用語は、ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼまたは他のエフェクター分子と、ガイドＲＮＡ分子とを含む分子のセットであって、併せて、ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼまたは他のエフェクター分子による、標的配列における核酸の修飾を方向付け、実行するのに必要かつ十分なセットを指す。一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ系は、ガイドＲＮＡと、Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９タンパク質とを含む。本明細書では、Ｃａｓ９または修飾Ｃａｓ９分子を含む、このような系を、「Ｃａｓ９系」または「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系」と称する。１つの例では、ガイドＲＮＡ分子と、Ｃａｓ分子とは、複合体化して、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する。
【００８３】
「ガイドＲＮＡ」、「ガイドＲＮＡ分子」、「ｇＲＮＡ分子」、または「ｇＲＮＡ」という用語は、互換的に使用され、ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼまたは他のエフェクター分子（典型的に、ｇＲＮＡ分子と複合体化させた）の、標的配列への特異的な方向付けを促進する核酸分子のセットを指す。一部の実施形態では、前記方向付けは、ｇＲＮＡの部分の、ＤＮＡへのハイブリダイゼーション（例えば、ｇＲＮＡのターゲティングドメインを介する）を介して、かつ、ｇＲＮＡ分子の部分の、ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼまたは他のエフェクター分子への結合（例えば、少なくともｇＲＮＡのｔｒａｃｒを介する）により達せられる。複数の実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、本明細書では、「単一ガイドＲＮＡ」、「ｓｇＲＮＡ」、または「単一分子ＤＮＡターゲティングＲＮＡ」などと称する、単一の連続ポリヌクレオチド分子からなる。他の実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、複数のポリヌクレオチド分子、通例、２つのポリヌクレオチド分子であって、それら自体、通例、ハイブリダイゼーションを介して、会合が可能であり、本明細書では、「二重ガイドＲＮＡ」または「ｄｇＲＮＡ」または「二重分子ＤＮＡターゲティングＲＮＡ」などと称するポリヌクレオチド分子からなる。ｇＲＮＡ分子は、下記でより詳細に記載されるが、一般に、ターゲティングドメインとｔｒａｃｒとを含む。複数の実施形態では、ターゲティングドメインとｔｒａｃｒとを、単一のポリヌクレオチド上に配置する。他の実施形態では、ターゲティングドメインとｔｒａｃｒとを、別個のポリヌクレオチド上に配置する。
【００８４】
本明細書において、ｇＲＮＡとの関連で使用される「ターゲティングドメイン」という用語は、標的配列、例えば、細胞の核酸内、例えば、遺伝子内の標的配列を認識する、例えば、これに相補的である、ｇＲＮＡ分子の部分である。
【００８５】
本明細書において、ｇＲＮＡ分子との関連で使用される「ｃｒＲＮＡ」という用語は、ターゲティングドメインと、ｔｒａｃｒと相互作用して、フラッグポール領域を形成する領域とを含む、ｇＲＮＡ分子の部分である。
【００８６】
「標的配列」という用語は、ｇＲＮＡのターゲティングドメインに相補的、例えば、完全に相補的な核酸の配列を指す。複数の実施形態では、標的配列は、ゲノムＤＮＡ上に配置される。ある実施形態では、標的配列は、（ＤＮＡの同じ鎖上または相補的な鎖上で）ヌクレアーゼ活性または他のエフェクター活性を有するタンパク質により認識されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列、例えば、Ｃａｓ９により認識されるＰＡＭ配列に隣接する。ＰＡＭの配列および長さは、使用されるＣａｓ９タンパク質に依存しうる。ＰＡＭ配列の非限定的な例は、５’−ＮＧＧ−３’、５’−ＮＧＧＮＧ−３’、５’−ＮＧ−３’、５’−ＮＡＡＡＡＮ−３’、５’−ＮＮＡＡＡＡＷ−３’、５’−ＮＮＮＮＡＣＡ−３’、５’−ＧＮＮＮＣＮＮＡ−３’、および５’−ＮＮＮＮＧＡＴＴ−３’［配列中、Ｎは、任意のヌクレオチドを表し、Ｗは、ＡまたはＴを表す］を含む。
【００８７】
複数の実施形態では、標的配列は、同種異系Ｔ細胞標的の標的配列である。複数の実施形態では、標的配列は、阻害性分子の標的配列である。複数の実施形態では、標的配列は、阻害性分子の下流のエフェクターの標的配列である。
【００８８】
本明細書において、ｇＲＮＡ分子との関連で使用される「フラッグポール」という用語は、ｃｒＲＮＡと、ｔｒａｃｒとが、互いに結合するか、または互いにハイブリダイズする、ｇＲＮＡの部分を指す。
【００８９】
本明細書において、ｇＲＮＡ分子との関連で使用される「ｔｒａｃｒ」または「ｔｒａｃｒＲＮＡ」という用語は、ヌクレアーゼまたは他のエフェクター分子に結合するｇＲＮＡの部分を指す。複数の実施形態では、ｔｒａｃｒは、Ｃａｓ９に特異的に結合する核酸配列を含む。複数の実施形態では、ｔｒａｃｒは、フラッグポールの一部を形成する核酸配列を含む。
【００９０】
「Ｃａｓ」という用語は、ガイドＲＮＡ分子と併せて、標的配列における、核酸の修飾を方向付け、実行するのに、必要かつ十分なＣＲＩＳＰＲ系の、ＲＮＡにガイドされるヌクレアーゼを指す。非限定的な例は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系に由来するＣａｓ分子、例えば、Ｃａｓ９分子である。別の非限定的な例は、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ系に由来するＣａｓ分子、例えば、Ｃｐｆ１分子である。
【００９１】
「Ｃａｓ９」および「Ｃａｓ９分子」という用語は、ＤＮＡ切断の一因となる、細菌性ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に由来する酵素を指す。複数の実施形態では、Ｃａｓ９はまた、非触媒性タンパク質およびその機能的断片を含む、野生型タンパク質、突然変異体タンパク質、変異体タンパク質も含む。当技術分野では、Ｃａｓ９配列の非限定的な例が公知であり、本明細書でも提供される。一部の実施形態では、Ｃａｓ９とは、当技術分野で公知であるか、または本明細書で開示される、任意のＣａｓ９配列、例えば、野生型、突然変異体、変異体、非触媒性、またはその機能的断片との、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の相同性を含むか；これらと比較した場合に、アミノ酸残基のうちの、１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、もしくは４０％以下において異なるか；少なくとも１、２、５、１０、もしくは２０アミノ酸だけ異なるが、１００、８０、７０、６０、５０、４０、もしくは３０アミノ酸を超えては異ならないか；またはこれらと同一であるＣａｓ９配列を指す。
【００９２】
「Ｃｐｆ１」および「Ｃｐｆ１分子」という用語は、ＤＮＡ切断の一因となる、細菌性Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に由来する酵素を指す。複数の実施形態では、Ｃｐｆ１はまた、非触媒性タンパク質およびその機能的断片を含む、野生型タンパク質、突然変異体タンパク質、変異体タンパク質も含む。当技術分野では、Ｃｐｆ１配列の非限定的な例が公知である。一部の実施形態では、Ｃｐｆ１とは、当技術分野で公知である、任意のＣｐｆ１配列、例えば、野生型、突然変異体、変異体、非触媒性、またはその機能的断片との、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の相同性を含むか；これらと比較した場合に、アミノ酸残基のうちの、１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、もしくは４０％以下において異なるか；少なくとも１、２、５、１０、もしくは２０アミノ酸だけ異なるが、１００、８０、７０、６０、５０、４０、もしくは３０アミノ酸を超えては異ならないか；またはこれらと同一であるＣｐｆ１配列を指す。
【００９３】
核酸との関連で使用される「相補的」という用語は、塩基の対合、Ａの、ＴまたはＵとの対合、およびＧの、Ｃとの対合を指す。相補的という用語は、完全に相補的な核酸分子、すなわち、基準配列の全体にわたり、Ａ−Ｔ対またはＡ−Ｕ対、およびＧ−Ｃ対を形成する核酸分子のほか、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９９％相補的な分子も指す場合がある。
【００９４】
本明細書で使用された、「鋳型核酸」とは、例えば、相同性指向修復または相同組換えにおいて、核酸配列を、標的配列に、またはこの近傍に挿入するのに、遺伝子編集系、例えば、ＣＲＩＳＰＲ系と共に使用されうる核酸配列を指す。複数の実施形態では、鋳型核酸配列の一部を、標的配列に、またはこの近傍に挿入する。複数の実施形態では、鋳型核酸配列の全てまたは実質的に全てを、標的配列に、またはこの近傍に挿入する。鋳型核酸は、一本鎖または二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡでありうる。複数の実施形態では、鋳型核酸は、ベクターであるか、またはベクター内、例えば、ＡＡＶベクター内、プラスミドＤＮＡ内、ミニサークル内、またはナノプラスミド内に含まれる。複数の態様では、鋳型核酸は、例えば、本明細書で記載されるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を含む。複数の態様では、鋳型核酸は、例えば、本明細書で記載されるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を含むベクターを含むか、またはこの中に含まれる。複数の実施形態では、鋳型核酸は、標的配列における、またはこの近傍における核酸配列と相補的な核酸配列を含む。
【００９５】
本明細書で使用される用語しての「インデル」とは、ｇＲＮＡ分子、例えば、ＣＲＩＳＰＲ系を含む組成物へと曝露されることから生じる、非修飾の基準核酸と比べて、１もしくは複数のヌクレオチドの挿入、１もしくは複数のヌクレオチドの欠失、またはヌクレオチドの挿入と欠失との組合せを含む核酸を指す。一部の実施形態では、インデルは、標的配列の外部のヌクレオチドを含む。インデルは、ｇＲＮＡ分子を含む組成物組成物へと曝露された後で、例えば、ＮＧＳにより核酸をシーケンシングすることにより決定することができる。インデル部位に関して、それが、基準部位から、約１０、９、８、７、６、５、４、３、２、もしくは１ヌクレオチド以内に、少なくとも１つの挿入もしくは欠失を含むか、または前記基準部位の一部もしくは全部と重複する（例えば、少なくとも１つの挿入または欠失であって、ｇＲＮＡ分子、例えば、本明細書で記載されるｇＲＮＡ分子のターゲティングドメインに相補的な部位と重複する挿入もしくは欠失、またはこれから、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、もしくは１ヌクレオチド以内の挿入もしくは欠失を含む）場合、インデルは基準部位（例えば、ｇＲＮＡ分子のターゲティングドメインに相補的な部位）「に、またはこの近傍に」あるという。複数の実施形態では、インデルは、非自然発生であり、例えば、例えば、標的細胞内の、任意の自然発生の遺伝子の突然変異（例えば、挿入、欠失、またはこれらの組合せ）に対応しない。
【００９６】
本明細書で使用される用語しての「インデルパターン」とは、遺伝子編集系、例えば、ＣＲＩＳＰＲ系、またはｇＲＮＡ分子を含む組成物への曝露の後で生じる、インデルのセットを指す。ある実施形態では、インデルパターンは、出現の頻度による、上位３つのインデルを含むか、またはこれらからなる。ある実施形態では、インデルパターンは、出現の頻度による、上位５つのインデルを含むか、またはこれらからなる。ある実施形態では、インデルパターンは、全シーケンシングリードと比べて、約５％を超える頻度で存在するインデルを含むか、またはこれらからなる。ある実施形態では、インデルパターンは、インデルシーケンシングリード（すなわち、非修飾の基準核酸配列からならないリード）の総数と比べて、約１０％を超える頻度で存在するインデルを含むか、またはこれらからなる。ある実施形態では、インデルパターンは、最も高頻度で観察される、上位５つのインデルのうちの任意の３つを含む。インデルパターンは、例えば、遺伝子編集系、例えば、ＣＲＩＳＰＲ系、本明細書で記載されるｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ系へと曝露された細胞集団の細胞をシーケンシングすることにより決定することができる。
【００９７】
本明細書で使用される用語としての「オフターゲットインデル」とは、ｇＲＮＡ分子のターゲティングドメインの標的配列以外の部位におけるインデル、またはその近傍におけるインデルを指す。このような部位は、例えば、ｇＲＮＡのターゲティングドメインと相補的な配列と比べて、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはこれを超えるミスマッチヌクレオチドを含みうる。例示的な複数の実施形態では、このような部位を、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで予測されるオフターゲット部位のターゲティングされたシーケンシングを使用して、または当技術分野で公知の挿入法により検出する。
【００９８】
「阻害性分子」という用語は、活性化させると、細胞の生存、活性化、増殖、および／または機能の阻害を引き起こすか、またはこれに寄与する分子を指す。用語はまた、前記分子をコードする遺伝子、およびその関連する調節エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサーなども指す。複数の実施形態では、阻害性分子は、免疫エフェクター細胞上、例えば、Ｔ細胞上で発現する分子である。阻害性分子の非限定的な例は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３、および／またはＣＥＡＣＡＭ−５）、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ１０７）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬ９、アデノシン、およびＴＧＦベータである。阻害性分子という用語は、標的配列またはｇＲＮＡ分子との関連で使用される場合、阻害性分子のタンパク質をコードする遺伝子（およびその関連する調節エレメント）を指す場合があると理解されるであろう。一部の実施形態では、阻害性分子の配列に対するターゲティングドメインを含む、１または複数のｇＲＮＡ分子を含む遺伝子編集系、例えば、ＣＲＩＳＰＲ系を、本明細書で開示される他の特色（例えば、ＴＥＴ２イントロンに対するＣＲＩＳＰＲ系）と共に使用する。
【００９９】
本明細書では、「同種異系Ｔ細胞（Ｔ  ｃｅｌｌ）標的」および「同種異系Ｔ細胞（Ｔ−ｃｅｌｌ）標的」という用語は、互換的に使用され、宿主対移植片応答を媒介するか、もしくはこれに寄与するか、移植片対宿主応答を媒介するか、もしくはこれに寄与するか、または免疫抑制薬の標的であるタンパク質と；前記分子をコードする遺伝子、およびその関連する調節エレメント、例えば、プロモーターとを指す。同種異系Ｔ細胞標的という用語は、標的配列またはｇＲＮＡ分子との関連で使用される場合、同種異系Ｔ細胞の標的タンパク質をコードする遺伝子（およびその関連する調節エレメント）を指すと理解されるであろう。理論に束縛されずに、例えば、このような標的に対する、遺伝子編集系、例えば、ＣＲＩＳＰＲ系の使用による、１または複数の同種異系Ｔ細胞標的の阻害または消失は、例えば、望ましくない免疫原性（宿主対移植片応答または移植片対宿主応答など）を低減または消失させることにより、同種異系細胞、例えば、同種異系Ｔ細胞の、有効性、生存、機能、および／または生存率を改善しうる。同種異系Ｔ細胞標的はまた、指定された標的の機能的断片、スプライス変異体、またはドメインも指す場合がある。
【０１００】
一部の実施形態では、免疫原性とは、体液媒介性免疫応答または細胞媒介性免疫応答の惹起を指す。ある特定の実施形態では、所望されない免疫原性は、例えば、同種異系移植の後で、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）または移植片対宿主応答から生じる場合があり、この場合、ドナー／移植細胞または組織は、ドニー／宿主細胞または組織を、外来物として攻撃する。他の実施形態では、所望されない免疫原性は、例えば、同種異系移植の後で、宿主対移植片病（ＨｖＧＤ）から生じる場合があり、この場合、ドニー／宿主細胞または組織は、ドナー／移植細胞または組織を、外来物として攻撃する。
【０１０１】
非限定的な例では、移植片対宿主応答または宿主対移植片応答を媒介するか、もしくはこれに寄与するタンパク質は、１または複数のＴ細胞受容体の構成要素である。ある実施形態では、Ｔ細胞受容体の構成要素は、Ｔ細胞受容体アルファ、例えば、ＴＣＲアルファの定常ドメインである。ある実施形態では、Ｔ細胞受容体の構成要素は、Ｔ細胞受容体のベータ鎖、例えば、ＴＣＲベータの定常ドメイン１または定常ドメイン２である。ある実施形態では、Ｔ細胞受容体の構成要素は、Ｔ細胞受容体のデルタ鎖である。ある実施形態では、Ｔ細胞受容体の構成要素は、Ｔ細胞受容体のイプシロン鎖である。ある実施形態では、Ｔ細胞受容体の構成要素は、Ｔ細胞受容体のゼータ鎖である。ある実施形態では、Ｔ細胞受容体の構成要素は、Ｔ細胞受容体のガンマ鎖である。したがって、同種異系Ｔ細胞標的によりコードされるタンパク質が、ＴＣＲの構成要素である、複数の実施形態では、同種異系Ｔ細胞標的をコードする遺伝子は、例えば、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、またはＣＤ２４７、およびこれらの組合せでありうる。
【０１０２】
非限定的な例では、移植片対宿主応答または宿主対移植片応答を媒介するか、もしくはこれに寄与するタンパク質は、ＨＬＡタンパク質またはＢ２Ｍである。ＨＬＡタンパク質の例は、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、およびＨＬＡ−Ｃを含む。したがって、同種異系Ｔ細胞の標的タンパク質が、ＨＬＡまたはＢ２Ｍのタンパク質である、複数の実施形態では、同種異系Ｔ細胞標的をコードする遺伝子は、例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、またはＢ２Ｍ、およびこれらの組合せでありうる。他の実施形態では、同種異系Ｔ細胞の標的タンパク質は、ＮＬＲＣ５であり、同種異系Ｔ細胞標的をコードする遺伝子は、例えば、ＮＬＲＣ５でありうる。
【０１０３】
一部の実施形態では、移植片対宿主応答または宿主対移植片応答を媒介するか、またはこれらに寄与するタンパク質は、ＨＬＡ−ＤＭ、ＨＬＡ−ＤＯ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、ＲＦＸ１、ＲＦＸ５、ＮＦ−ＹＡ、ＮＦ−ＹＢ、ＮＦ−ＹＣ、Ｘ２ＢＰ、ＯＣＡＢ、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、Ｂ２Ｍ、ＮＬＲＣ５、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ２４７、ＣＤ３、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＤＣＫ、ＣＤ５２、ＦＫＢＰ１Ａ、およびＮＲ３Ｃ１から選択される。非限定的な例では、移植片対宿主応答または宿主対移植片応答を媒介するか、もしくはこれに寄与するタンパク質は、主要組織適合性複合体クラスＩＩ（ＭＨＣ  ＩＩ）分子（例えば、ＨＬＡ−Ｄｘ（名称中、ｘは、ＭＨＣ  ＩＩタンパク質、例えば、ＨＬＡ−ＤＭ、ＨＬＡ−ＤＯ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、および／またはＨＬＡ−ＤＰの文字を指す））、またはＭＨＣ  ＩＩの発現のための調節因子、およびこれらの組合せである。非限定的な例は、ＣＩＩＴＡ（本明細書ではまた、Ｃ２ＴＡとも言及される）である。したがって、同種異系Ｔ細胞の標的タンパク質が、ＣＩＩＴＡである、複数の実施形態では、同種異系Ｔ細胞標的をコードする遺伝子は、例えば、ＣＩＩＴＡでありうる。別の非限定的な例では、移植片対宿主応答または宿主対移植片応答を媒介するか、もしくはこれに寄与するタンパク質は、ＲＦＸＡＮＫである。別の非限定的な例では、移植片対宿主応答または宿主対移植片応答を媒介するか、もしくはこれに寄与するタンパク質は、ＲＦＸＡＰである。別の非限定的な例では、移植片対宿主応答または宿主対移植片応答を媒介するか、もしくはこれに寄与するタンパク質は、ＲＦＸ５である。別の非限定的な例において、移植片対宿主応答または宿主対移植片応答を媒介するか、またはこれらに寄与するタンパク質は、ＲＦＸ１である。
【０１０４】
一部の実施形態では、同種異系Ｔ細胞標的の配列に対するターゲティングドメインを含む、１または複数のｇＲＮＡ分子を含む遺伝子編集系、例えば、ＣＲＩＳＰＲ系を、単独で、または本明細書で開示される他の特色（例えば、ＴＥＴ２イントロンに対するＣＲＩＳＰＲ系）と共に使用する。複数の実施形態では、ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ、および／またはＣＩＩＴＡをターゲティングするＣＲＩＳＰＲ系を、本明細書で開示される他の特色（例えば、ＴＥＴ２イントロンに対するＣＲＩＳＰＲ系）と共に使用する。
【０１０５】
本明細書で使用される「免疫抑制薬の標的」という用語は、免疫抑制剤の分子標的、例えば、受容体または他のタンパク質（本明細書では、薬剤または薬剤の標的との関連で、「免疫抑制薬（immunosuppressant）」および「免疫抑制薬（immunosuppressive）」という用語を、互換的に使用する）を指す。免疫抑制剤とは、１つまたは複数の作用機構により、免疫機能を抑制する薬剤である。言い換えると、免疫抑制剤とは、化合物により果たされる役割であって、免疫応答の程度および／または貪食を減殺する能力により呈示される役割である。免疫抑制剤により呈示される活性の種類の１つの例は、Ｔ細胞、例えば、活性化Ｔ細胞の消失である。免疫抑制剤により呈示される活性の種類の別の例は、Ｔ細胞の活性または活性化レベルの低減である。
【０１０６】
非限定的な例として、免疫抑制剤は、カルシニューリン阻害剤、ラパマイシンの標的、インターロイキン２  ａ鎖ブロッカー、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼの阻害剤、ジヒドロ葉酸レダクターゼの阻害剤、コルチコステロイド、シクロスポリン、または免疫抑制性代謝拮抗剤でありうる。古典的な細胞傷害性免疫抑制薬は、ＤＮＡ合成を阻害することにより作用する。他の細胞傷害性免疫抑制薬は、Ｔ細胞の活性化を介して、またはヘルパー細胞の活性化を阻害することにより作用する。非限定的な例として、免疫抑制剤の標的は、デオキシシチジンキナーゼ、ＣＤ５２、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）、ＦＫＢＰファミリー遺伝子メンバー、例えば、ＦＫＢＰ１２、およびシクロフィリンファミリー遺伝子のメンバーなど、免疫抑制剤の受容体でありうる。ある実施形態では、免疫抑制薬の標的は、デオキシシチジンキナーゼ（ＤＣＫ）であり、免疫抑制薬は、シタラビン（シトシンアラビノシド）またはゲムシタビンなど、ヌクレオシド類似体ベースの薬物である。ある実施形態では、免疫抑制薬の標的は、ＧＲであり、免疫抑制薬は、デキサメタゾンなどのコルチコステロイドである。ある実施形態では、免疫抑制薬の標的は、ＣＤ５２であり、免疫抑制薬は、アレムツズマブ（ＣＡＭＰＡＴＨ（登録商標））などの抗ＣＤ５２抗体またはその抗原結合性断片である。ある実施形態では、免疫抑制薬の標的は、ＦＫＢＰ１２であり、免疫抑制薬は、ＦＫ５０６（またはその類似体もしくはそのＦＫＢＰ１２結合性断片）、シクロスポリン、ラパマイシンもしくはラパログ、またはＲＡＤ００１などのｍＴｏｒ阻害剤である。したがって、同種異系Ｔ細胞標的が、免疫抑制薬の標的タンパク質である、複数の実施形態では、同種異系Ｔ細胞標的をコードする遺伝子は、例えば、ＮＲ３Ｃ１、ＦＫＢＰ１Ａ、ＣＤ５２、またはＤＣＫ、およびこれらの組合せでありうる。一部の実施形態では、同種異系Ｔ細胞標的の配列に対するターゲティングドメインを含む、１または複数のｇＲＮＡ分子を含む遺伝子編集系、例えば、ＣＲＩＳＰＲ系を、本明細書で開示される他の特色（例えば、ＴＥＴ２イントロンに対するＣＲＩＳＰＲ系）と共に使用する。複数の実施形態では、ＴＲＡＣおよびＦＫＢＰ１ＡをターゲティングするＣＲＩＳＰＲ系を、本明細書で開示される他の特色（例えば、ＴＥＴ２イントロンに対するＣＲＩＳＰＲ系）と共に使用する。
【０１０７】
本明細書で使用される「Ｔｅｔ」という用語は、（１０；１１）転座メチルシトシンジオキシゲナーゼファミリーのうちの、遺伝子のファミリーと、前記遺伝子によりコードされるタンパク質とを指す。Ｔｅｔは、例えば、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２、およびＴｅｔ３を含む。
【０１０８】
本明細書で使用される用語としての「Ｔｅｔ２」は、遺伝子である、Ｔｅｔメチルシトシンジオキシゲナーゼ２と、前記遺伝子によりコードされるタンパク質であり、メチルシトシンの、５−ヒドロキシメチルシトシンへの転換を触媒する、ＴＥＴ２メチルシトシンジオキシゲナーゼとを指す。Ｔｅｔ２はまた、場合によって、「ＫＩＡＡ１５４６」、「ＦＬＪ２００３２」、および「Ｔｅｔがん遺伝子ファミリーメンバー２」とも称する。コードされたタンパク質は、骨髄造血に関与し、この遺伝子の欠損は、いくつかの骨髄増殖障害と関連する。ヒトゲノム内で、ＴＥＴ２は、４ｑ２４染色体上に位置する。Ｔｅｔ２遺伝子は、関連遺伝子のイントロンおよびエクソンの両方を含む。現在のところ、６つのＴＥＴ２アイソフォームが記載されており、それらのＧｅｎｅｂａｎｋ番号は、ＮＭ＿００１１２７２０８．２；ＸＭ＿００５２６３０８２．１；ＸＭ＿００６７１４２４２．２；ＮＭ＿０１７６２８．４；ＸＭ＿０１１５３２０４４．１；およびＸＭ＿０１１５３２０４３．１である。
【０１０９】
ヒトＴｅｔ２のタンパク質配列の例を、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ６Ｎ０２１：
【０１１０】
【化１−１】
2020513832.tif 000002
【０１１１】
【化１−２】
2020513832.tif 000003
として提示する。
【０１１２】
ＴＥＴ２遺伝子は、第４染色体の、ＧＲＣｈ３８．ｐ２位（ＧＣＦ＿０００００１４０５．２８）（ＮＣ＿０００００４．１２（１０５１４５８７５〜１０５２７９８０３）；Ｇｅｎｅ  ＩＤ５４７９０に位置する。
【０１１３】
Ｔｅｔ２をコードする核酸配列の例を、下記に提示する。ヒトＴｅｔ２の、６つのアイソフォームが同定されている。ｍＲＮＡ配列を、下記に（複数の実施形態では、各配列中、Ｔは、Ｕで置きかえることができる）提示する。複数の実施形態では、Ｔｅｔ２は、下記の配列の各々によりコードされるタンパク質を含む。
【０１１４】
【表１−１】
2020513832.tif 000004
【０１１５】
【表１−２】
2020513832.tif 000005
【０１１６】
【表１−３】
2020513832.tif 000006
【０１１７】
【表１−４】
2020513832.tif 000007
【０１１８】
【表１−５】
2020513832.tif 000008
【０１１９】
【表１−６】
2020513832.tif 000009
【０１２０】
【表１−７】
2020513832.tif 000010
【０１２１】
【表１−８】
2020513832.tif 000011
【０１２２】
【表１−９】
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【０１２３】
【表１−１０】
2020513832.tif 000013
【０１２４】
【表１−１１】
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【０１２５】
【表１−１２】
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【０１２６】
【表１−１３】
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【０１２７】
【表１−１４】
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【０１２８】
【表１−１５】
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【０１２９】
【表１−１６】
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【０１３０】
【表１−１７】
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【０１３１】
【表１−１８】
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【０１３２】
【表１−１９】
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【０１３３】
【表１−２０】
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【０１３４】
【表１−２１】
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【０１３５】
【表１−２２】
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【０１３６】
【表１−２３】
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【０１３７】
【表１−２４】
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【０１３８】
【表１−２５】
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【０１３９】
【表１−２６】
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【０１４０】
「遺伝子」または「遺伝子配列」という用語は、遺伝子配列、例えば、核酸配列を指すことを意図する。「遺伝子」という用語は、完全な遺伝子配列または部分的な遺伝子配列を包摂することを意図する。「遺伝子」という用語は、タンパク質もしくはポリペプチドをコードする配列、またはタンパク質もしくはポリペプチドをコードしない配列、例えば、調節的配列、リーダー配列、シグナル配列、イントロン、または他のタンパク質をコードしない配列を指す。
【０１４１】
「イントロン」という用語は、遺伝子から発現するタンパク質をコードしない、前記遺伝子内の核酸配列を指す。イントロン配列は、ＤＮＡから、ＲＮＡへと転写されうるが、タンパク質が発現する前に除去されうる。
【０１４２】
「エクソン」という用語は、遺伝子から発現するタンパク質をコードする、遺伝子内の核酸配列を指す。
【０１４３】
遺伝子編集系またはｇＲＮＡ分子との関連で使用される場合の、「イントロン−エクソン接合部」という用語は、エクソンのヌクレオチドと、イントロンのヌクレオチドとを含む配列を指す。例示的な実施形態では、イントロン−エクソン接合部は、イントロン−エクソン接合部の標的配列と相補的なターゲティングドメインを含むｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ系により認識されると、それによって、前記ＣＲＩＳＰＲ系は、修飾する、例えば、イントロンの２つのヌクレオチドの間の標的配列における、またはこの近傍における切断をもたらす、ｇＲＮＡの標的配列である。他の例示的な実施形態では、イントロン−エクソン接合部は、イントロン−エクソン接合部の標的配列と相補的なターゲティングドメインを含むｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ系により認識されると、それによって、前記ＣＲＩＳＰＲ系は、修飾する、例えば、エクソンの２つのヌクレオチドの間の標的配列における、またはこの近傍における切断をもたらす、ｇＲＮＡの標的配列である。他の例示的な実施形態では、イントロン−エクソン接合部は、イントロン−エクソン接合部の標的配列と相補的なターゲティングドメインを含むｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ系により認識されると、それによって、前記ＣＲＩＳＰＲ系は、修飾する、例えば、エクソンのヌクレオチドと、イントロンのヌクレオチドとの間の標的配列における、またはこの近傍における切断をもたらす、ｇＲＮＡの標的配列である。
【０１４４】
「ある（ａ）」「ある（ａｎ）」という用語は、冠詞の文法上の目的語が１つであるか、または１つを超えることを指す。用語は「１つ」、「１つまたは複数」、「少なくとも１つ」または「１つまたは１つを超える」を意味する。例を目的として、「ある要素」とは、１つの要素または１つを超える要素を意味する。「または」という用語は、そうでないことが言明されない限りにおいて、「および／または」を意味する。「〜を含むこと」または「〜を含有すること」という用語は、限定的ではない。
【０１４５】
「約」という用語は、量、時間的な持続など、測定可能な値を指す場合、そのような変動は、開示される方法を実施するのに適切であるので、指定された値から、±２０％、または、一部の場合、±１０％、または、一部の場合、±５％、または、一部の場合、±１％または、一部の場合、±０．１％の変動を包摂することを意図する。
【０１４６】
「キメラ抗原受容体」または代替的に「ＣＡＲ」という用語は、典型的に、最も単純な複数の実施形態では、２つのポリペプチドのセットであって、免疫エフェクター細胞内にある場合、細胞に、標的細胞、典型的に、がん細胞に対する特異性と、細胞内シグナルの発生とをもたらすセットを指す。一部の実施形態では、ＣＡＲは、下記で規定される、刺激性分子および／または共刺激性分子から導出される機能的シグナル伝達ドメインを含む、少なくとも、細胞外抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質シグナル伝達ドメイン（本明細書ではまた、「細胞内シグナル伝達ドメイン」とも称する）を含む。一部の態様では、ポリペプチドのセットは、互いと連続する。一部の実施形態では、ポリペプチドのセットは、二量体化分子の存在時に、ポリペプチドを、互いにカップリングさせうる、例えば、抗原結合性ドメインを、細胞内シグナル伝達ドメインにカップリングさせうる二量体化スイッチを含む。一態様では、刺激性分子は、Ｔ細胞受容体複合体と会合するゼータ鎖である。一態様では、細胞質シグナル伝達ドメインは、下記で規定される、少なくとも１つの共刺激性分子から導出される、１または複数の機能的シグナル伝達ドメインをさらに含む。一態様では、共刺激性分子は、本明細書で記載される共刺激性分子、例えば、４  １ＢＢ（すなわち、ＣＤ１３７）、ＣＤ２７、および／またはＣＤ２８から選択される。一態様では、ＣＡＲは、刺激性分子から導出される、機能的シグナル伝達ドメインを含む、細胞外抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。一態様では、ＣＡＲは、共刺激性分子から導出される、機能的シグナル伝達ドメインと、刺激性分子から導出される、機能的シグナル伝達ドメインとを含む、細胞外抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。一態様では、ＣＡＲは、１または複数の共刺激性分子から導出される、２つの機能的シグナル伝達ドメインと、刺激性分子から導出される、機能的シグナル伝達ドメインとを含む、細胞外抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。一態様では、ＣＡＲは、１または複数の共刺激性分子から導出される、少なくとも２つの機能的シグナル伝達ドメインと、刺激性分子から導出される、機能的シグナル伝達ドメインとを含む、細胞外抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。一態様では、ＣＡＲは、ＣＡＲ融合タンパク質のアミノ末端（Ｎ−ｔｅｒ）における、任意選択のリーダー配列を含む。一態様では、ＣＡＲは、細胞外抗原結合性ドメインのＮ末端におけるリーダー配列をさらに含み、この場合、リーダー配列は、任意選択で、細胞内プロセシング時、および細胞膜へのＣＡＲの局在化時に、抗原結合性ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）から切断される。
【０１４７】
本明細書で記載される腫瘍マーカーなどの特異的腫瘍マーカーＸをターゲティングする抗原結合性ドメイン（例えば、ｓｃＦｖまたはＴＣＲ）を含むＣＡＲはまた、Ｘ  ＣＡＲとも称する。例えば、ＣＤ１９をターゲティングする抗原結合性ドメインを含むＣＡＲを、ＣＤ１９  ＣＡＲと称する。別の例として、ＢＣＭＡをターゲティングする抗原結合性ドメインを含むＣＡＲを、ＢＣＭＡ  ＣＡＲと称する。
【０１４８】
「シグナル伝達ドメイン」という用語は、例えば、第２のメッセンジャーを発生させることにより、規定されたシグナル伝達経路を介して、細胞の活性を調節するように、細胞内の情報を伝達することにより、またはこのようなメッセンジャーに応答することを介して、エフェクターとして機能することにより作用する、タンパク質から導出される機能的部分を指す。複数の実施形態では、シグナル伝達ドメインとは、自然発生のシグナル伝達ドメインの変異体または相同体、例えば、機能的な変異体または相同体、例えば、自然発生のシグナル伝達ドメインに対する、少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する、シグナル伝達ドメインの変異体を指す。
【０１４９】
本明細書で使用される「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子から導出される、１または複数のタンパク質またはポリペプチドの配列であって、抗原に特異的に結合する配列を指す。抗体は、ポリクローナル抗体の場合もあり、モノクローナル抗体の場合もあり、多重鎖の場合もあり、単鎖の場合もあり、機能的断片（例えば、Ｆａｂ断片またはｓｃＦｖ）の場合もあり、完全免疫グロブリンの場合もあり、天然供給源から導出される場合もあり、組換え供給源から導出される場合もある。抗体は、免疫グロブリン分子の二量体の場合もあり、四量体の場合もある。抗体は、任意の種に由来する場合もあり、ヒト抗体またはヒト化抗体を含む、キメラ抗体の場合もある。
【０１５０】
「抗体断片」という用語は、抗原のエピトープと、特異的に相互作用する（例えば、結合、立体障害、安定化／脱安定化、空間的分布により）能力を保持する、抗体の少なくとも１つの部分を指す。一部の実施形態では、抗体断片は、完全免疫グロブリンのアフィニティーと、広範にわたり同等な、抗原のエピトープに対するアフィニティーを保持する。例えば、抗体断片は、例えば、ＥＬＩＳＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他の適切なアッセイにより測定される通り、完全免疫グロブリンに関して見られるアフィニティーのうちの、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％またはこれを超えるアフィニティーを保持しうる。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ抗体断片、ジスルフィド連結されたＦｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＨドメインとＣＨ１ドメインとからなるＦｄ断片、直鎖状抗体、ｓｄＡｂ（ＶＬまたはＶＨ）などの単一ドメイン抗体、ラクダ科動物のＶＨＨドメイン、抗体断片から形成された多特異性抗体など、ヒンジ領域において、ジスルフィド架橋により連結された、２つのＦａｂ断片を含む二価断片、および単離ＣＤＲ、または他の抗体のエピトープ結合性断片を含むがこれらに限定されない。抗原結合性断片はまた、単一ドメイン抗体、マキシボディー、ミニボディー、ナノボディー、イントラボディー、ダイアボディー、トリアボディー、テトラボディー、ｖ−ＮＡＲ、およびビスｓｃＦｖにも組み込むことができる（例えば、Hollinger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005を参照されたい）。抗原結合断片はまた、ＩＩＩ型フィブロネクチン（Ｆｎ３）などのポリペプチドに基づく足場へとグラフトすることもできる（フィブロネクチンポリペプチドミニボディーについて記載する、米国特許第６，７０３，１９９号明細書を参照されたい）。
【０１５１】
「ｓｃＦｖ」という用語は、軽鎖の可変領域を含む、少なくとも１つの抗体断片と、重鎖の可変領域を含む、少なくとも１つの抗体断片とを含む融合タンパク質であって、軽鎖可変領域と、重鎖可変領域とが、例えば、直接、または合成リンカー、例えば、短い可撓性のポリペプチドリンカーを介して、連続的に連結され、単鎖ポリペプチドとして発現することが可能な融合タンパク質を指し、ｓｃＦｖは、それが導出される完全抗体の特異性を保持する。本明細書で使用されるｓｃＦｖが、例えば、ポリペプチドのＮ末端およびＣ末端に関して、いずれの順序でＶＬ可変領域およびＶＨ可変領域を有しうるのかが指定されない限りにおいて、ｓｃＦｖは、ＶＬ−リンカー−ＶＨを含む場合もあり、ＶＨ−リンカー−ＶＬを含む場合もある。
【０１５２】
抗体またはその抗体断片を含む、ＣＡＲの部分は、抗原結合性ドメインを、例えば、単一ドメイン抗体断片（ｓｄＡｂ）、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ヒト化抗体、または二特異性抗体を含む連続ポリペプチド鎖の一部として発現させた、様々な形態で存在しうる（Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies:  A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies:  A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426）。一態様では、ＣＡＲ組成物の抗原結合性ドメインは、抗体断片を含む。さらなる態様では、ＣＡＲは、ｓｃＦｖを含む抗体断片を含む。別の態様では、ＣＡＲは、Ｆｃ領域を含む完全抗体を含む。
【０１５３】
完全抗体を含むＣＡＲの部分は、任意の種類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）、または任意のサブクラスのものでありうる。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ型の定常領域である。ある特定の実施形態では、完全抗体のＦｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、およびＩｇＹ、またはこれらの断片に由来するＦｃ領域を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１である。Ｆｃ領域は、天然配列のＦｃ領域の場合もあり、変異体のＦｃ領域の場合もある。一実施形態では、Ｆｃ領域は、ヒトＦｃ領域である。
【０１５４】
抗体またはその抗体断片を含むＣＡＲの部分は、ヒトまたは他の抗体フレームワーク配列とカップリングさせた、抗体のＣＤＲ配列を含みうる。フレームワーク配列は、出発抗体内のフレームワーク配列と同じ場合もあり、異なる場合もある。所与のＣＤＲの正確なアミノ酸配列の境界は、Kabat et al. (1991), “Sequences of Proteins of Immunological Interest,” 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD（「Ｋａｂａｔ」番号付けスキーム）、Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948（「Ｃｈｏｔｈｉａ」番号付けスキーム）により記載されているスキームを含む、周知の多数のスキームのうちのいずれか、またはこれらの組合せを使用して決定することができる。本明細書で使用される「結合性ドメイン」または「抗体分子」という用語は、タンパク質、例えば、少なくとも１つの免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む、免疫グロブリン鎖またはその断片を指す。「結合性ドメイン」または「抗体分子」という用語は、抗体および抗体断片のほか、多特異性結合性構築物を包摂する。ある実施形態では、抗体分子は、多特異性抗体分子である、例えば、抗体分子は、抗原の異なるエピトープに対する抗原結合性部位を形成する、複数の免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、この場合、複数の免疫グロブリン可変ドメイン配列のうちの、第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列は、第１のエピトープに対する結合特異性を有し、複数の免疫グロブリン可変ドメイン配列のうちの、第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列は、第２のエピトープに対する結合特異性を有する。ある実施形態では、多特異性抗体分子は、二特異性抗体分子である。二特異性抗体は、２つ以下の抗原に対する特異性を有する。二特異性抗体分子は、第１のエピトープに対する結合特異性を有する、第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列と、第２のエピトープに対する結合特異性を有する、第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列とを特徴とする。他の実施形態では、「結合性ドメイン」または「抗体分子」は、多価抗体分子を包摂し、例えば、「結合性ドメイン」または「抗体分子」は、抗原の同じエピトープに対する、２つまたはこれを超える抗原結合性部位を形成する、複数の免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む。
【０１５５】
「抗体重鎖」という用語は、それらの自然発生のコンフォメーションで、抗体分子内に存在するポリペプチド鎖の２つの種類のうちの大きい方の鎖を指し、通常は、この鎖が、抗体が属するクラスを決定する。
【０１５６】
「抗体軽鎖」という用語は、それらの自然発生のコンフォメーションで、抗体分子内に存在するポリペプチド鎖の２つの種類のうちの小さい方の鎖を指す。カッパ（κ）軽鎖およびラムダ（λ）軽鎖は、２つの主要な抗体軽鎖アイソタイプを指す。
【０１５７】
「組換え抗体」という用語は、例えば、バクテリオファージ発現系または酵母発現系により、または他の任意の宿主細胞内で発現させる抗体など、組換えＤＮＡ技術を使用して作出される抗体を指す。用語はまた、抗体をコードするＤＮＡ分子の合成により作出された抗体を含み、このＤＮＡ分子は、抗体タンパク質、または抗体を指定するアミノ酸配列を発現するが、この場合、ＤＮＡ配列またはアミノ酸配列は、入手可能であり、当技術分野でも周知の組換えＤＮＡ技術またはアミノ酸配列技術を使用して得られている。
【０１５８】
「抗原」または「Ａｇ」という用語は、免疫応答を惹起する分子を指す。この免疫応答は、抗体の産生もしくは特異的な免疫コンピテント細胞の活性化、またはこれらの両方を伴いうる。用語はまた、抗体またはその抗体断片が結合する、任意のペプチドも指す。当業者は、事実上全てのタンパク質またはペプチドを含む、任意の高分子が、抗原として機能しうると理解するであろう。さらに、抗原は、組換えＤＮＡから導出される場合もあり、ゲノムＤＮＡから導出される場合もある。当業者は、したがって、免疫応答を誘発するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分的なヌクレオチド配列を含む、任意のＤＮＡが、この用語を本明細書で使用する場合の「抗原」をコードすると理解するであろう。さらに、当業者は、抗原が、遺伝子の全長ヌクレオチド配列だけによりコードされる必要はないと理解するであろう。本開示が、１つを超える遺伝子の部分的なヌクレオチド配列の使用を含むがこれらに限定されず、これらのヌクレオチド配列が、所望の免疫応答を誘発するポリペプチドをコードするように、多様な組合せで配置されることは、たやすく明らかである。さらに、当業者は、抗原が、「遺伝子」によりコードされる必要は全くないと理解するであろう。抗原は、合成により作出される場合もあり、生物学的試料から導出される場合もあり、ポリペプチドのほか、高分子の場合もありうることは、たやすく明らかである。このような生物学的試料は、他の生物学的構成要素を伴う、組織試料、腫瘍試料、細胞、または体液を含みうるがこれらに限定されない。
【０１５９】
「抗がん効果」という用語は、多様な手段により顕在化しうる生物学的効果であって、例えば、腫瘍容量の減少、がん細胞数の減少、転移数の減少、平均余命の延長、がん細胞増殖の減少、がん細胞生存の減少、またはがん性状態に関連する、多様な生理学的症状の軽快を含むがこれらに限定されない生物学的効果を指す。「抗がん効果」はまた、第一に、がんの発症の防止における、ペプチド、ポリヌクレオチド、細胞、および抗体の能力によっても顕示されうる。「抗腫瘍効果」という用語は、多様な手段により顕在化しうる生物学的効果であって、例えば、腫瘍容量の減少、腫瘍細胞数の減少、腫瘍細胞増殖の減少、または腫瘍細胞生存の減少を含むがこれらに限定されない生物学的効果を指す。
【０１６０】
「自家」という用語は、同じ個体から導出され、その個体へと導入される、任意の材料を指す。
【０１６１】
「同種異系」という用語は、材料が導入される個体と同じ種の、異なる動物から導出される、任意の材料を指す。１または複数の遺伝子座における遺伝子が、同一でない場合、２つまたはこれを超える個体は、互いと同種異系であるという。一部の態様では、同じ種の個体に由来する同種異系材料は、抗原として相互作用するのに十分に、遺伝子的に非同一でありうる。
【０１６２】
「異種」という用語は、異なる種の動物から導出される移植片を指す。
【０１６３】
「がん」という用語は、異常な細胞の、制御不能な成長を特徴とする疾患を指す。がん細胞は、局所的に拡散する場合もあり、血流およびリンパ系を介して、体内の他の部分へと拡散する場合もある。本明細書では、多様ながんの例が記載されており、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、皮膚がん、膵臓がん、結腸直腸がん、腎臓がん、肝臓がん、脳腫瘍、リンパ腫、白血病、肺がんなどを含むがこれらに限定されない。本明細書では、「腫瘍」および「がん」という用語が互換的に使用され、例えば、いずれの用語も、充実性腫瘍および液性腫瘍、例えば、びまん性腫瘍または循環性腫瘍を包摂する。本明細書で使用される「がん」または「腫瘍」という用語は、前悪性がんおよび前悪性腫瘍のほか、悪性がんおよび悪性腫瘍も含む。
【０１６４】
本明細書でこの用語を使用する場合の「〜から導出される」とは、第１の分子と、第２の分子との間の関係を指し示す。「〜から導出される」とは一般に、第１の分子と、第２の分子との構造的類似性を指すものであり、第２の分子から導出される第１の分子に対する、工程または供給源についての限定を含意したり、これらを含んだりするものではない。例えば、ＣＤ３ゼータ分子から導出される細胞内シグナル伝達ドメインの場合、細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞内シグナル伝達ドメインが、要求される機能、すなわち、適切な条件下で、シグナルを発生させる能力を有するように、十分なＣＤ３ゼータ構造を保持する。「ＣＤ３ゼータ分子から導出される」は、細胞内シグナル伝達ドメインを産生する特定の工程に対する限定を含意したり、これらを含んだりするものではなく、例えば、「ＣＤ３ゼータ分子から導出される」とは、細胞内シグナル伝達ドメインをもたらすために、ＣＤ３ゼータ配列から始め、望ましくない配列を欠失させるか、または突然変異を付与して、細胞内シグナル伝達ドメインに到達しなければならないことを意味するわけではない。
【０１６５】
「本明細書で記載される腫瘍抗原の発現と関連する疾患」という語句は、本明細書で記載される、腫瘍抗原の発現と関連する疾患、または本明細書で記載される腫瘍抗原を発現する細胞と関連する状態であって、例えば、がんもしくは悪性腫瘍、または骨髄異形成、骨髄異形成症候群、もしくは前白血病などの前がん性状態などの増殖性疾患；あるいは本明細書で記載される腫瘍抗原を発現する細胞と関連する非がん関連適応症を含む疾患または状態を含むがこれらに限定されない。一態様では、本明細書で記載される腫瘍抗原の発現と関連するがんは、血液がんである。一態様では、本明細書で記載される腫瘍抗原の発現と関連するがんは、固形がんである。本明細書で記載される腫瘍抗原の発現と関連するさらなる疾患は、例えば、本明細書で記載される腫瘍抗原の発現と関連する非定型がんおよび／もしくは非古典がん、悪性腫瘍、前がん性状態、または増殖性疾患を含むがこれらに限定されない。本明細書で記載される腫瘍抗原の発現と関連する非がん関連適応症は、例えば、自己免疫疾患（例えば、ループス）、炎症性障害（アレルギーおよび喘息）、および移植を含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、腫瘍抗原を発現する細胞は、腫瘍抗原をコードするｍＲＮＡを発現するか、または、任意の時点において、これを発現した。ある実施形態では、腫瘍抗原を発現する細胞は、腫瘍抗原タンパク質（例えば、野生型または突然変異体）を産生し、腫瘍抗原タンパク質は、正常レベルまたは低減レベルで存在しうる。ある実施形態では、腫瘍抗原を発現する細胞は、検出可能レベルの腫瘍抗原タンパク質を、１つの時点において産生したが、その後、検出可能な腫瘍抗原タンパク質を、実質的に産生しなかった。
【０１６６】
「保存的配列修飾」という用語は、アミノ酸配列を含有する抗体または抗体断片の結合特徴に著明な影響を及ぼしたりこれを著明に変更したりしないアミノ酸修飾を指す。このような保存的修飾は、アミノ酸の置換、付加、および欠失を含む。修飾は、部位指向突然変異誘発およびＰＣＲ媒介突然変異誘発など、当技術分野で公知の標準的な技法により、本明細書で記載される抗体または抗体断片へと導入することができる。保存的アミノ酸置換とは、アミノ酸残基を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置きかえたアミノ酸置換である。当技術分野では、類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが規定されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非帯電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ−分枝型側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を伴うアミノ酸を含む。したがって、本開示のＣＡＲ内の、１または複数のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーに由来する他のアミノ酸残基で置きかえることができ、変更されたＣＡＲは、本明細書で記載される機能アッセイを使用して調べることができる。
【０１６７】
「刺激」という用語は、刺激性分子（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体またはＣＡＲ）の、その同族リガンド（またはＣＡＲの場合、腫瘍抗原）との結合により誘導され、これにより、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介するシグナル伝達、または適切なＮＫ受容体もしくはＣＡＲのシグナル伝達ドメインを介するシグナル伝達などであるがこれらに限定されないシグナル伝達イベントを媒介する一次応答を指す。刺激は、ある特定の分子の発現の変更を媒介しうる。
【０１６８】
「刺激性分子」という用語は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞）が発現する分子であって、免疫細胞シグナル伝達経路の少なくとも一部の側面では、免疫細胞の活性化を刺激性に調節する細胞質シグナル伝達配列をもたらす分子を指す。一態様では、シグナルは、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体の、ペプチドをロードされたＭＨＣ分子との結合により誘発され、増殖、活性化、分化などを含むがこれらに限定されないＴ細胞応答の媒介をもたらす一次シグナルである。刺激的な様態で作用する細胞質一次シグナル伝達配列（「一次シグナル伝達ドメイン」ともまた称する）は、免疫受容体のチロシンベースの活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして公知のシグナル伝達モチーフを含有しうる。使用に特に有用な、細胞質シグナル伝達配列を含有するＩＴＡＭの例は、ＣＤ３ゼータ、一般的なＦｃＲガンマ（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃガンマＲＩＩａ、ＦｃＲベータ（ＦｃイプシロンＲ１ｂ）、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＤＡＰ１０、およびＤＡＰ１２から導出されるＩＴＡＭを含むがこれらに限定されない。具体的ＣＡＲの実施形態では、本開示の、任意の、１または複数のＣＡＲ内の細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータの、細胞内シグナル伝達配列、例えば、一次シグナル伝達配列を含む。本開示の具体的ＣＡＲでは、ＣＤ３ゼータの一次シグナル伝達配列は、配列番号２１として提供される配列、または非ヒト種、例えば、マウス、齧歯動物、サル、類人猿などに由来する同等な残基である。本開示の具体的ＣＡＲでは、ＣＤ３ゼータの一次シグナル伝達配列は、配列番号２４に提供される配列、または非ヒト種、例えば、マウス、齧歯動物、サル、類人猿などに由来する同等な残基である。
【０１６９】
「抗原提示細胞」または「ＡＰＣ」という用語は、その表面上で、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）と複合体化させた外来抗原を提示するアクセサリー細胞（例えば、Ｂ細胞、樹状細胞など）などの免疫系細胞を指す。Ｔ細胞は、それらのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を使用して、これらの複合体を認識しうる。ＡＰＣは、抗原を、プロセシングし、それらを、Ｔ細胞へと提示する。
【０１７０】
本明細書で使用される用語としての「細胞内シグナル伝達ドメイン」とは、分子、例えば、刺激性分子または共刺激性分子から導出される細胞内部分を指す。細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲ含有細胞、例えば、ＣＡＲＴ細胞の免疫エフェクター機能を促進するシグナルを発生させる。例えば、ＣＡＲＴ細胞における、免疫エフェクター機能の例は、細胞溶解活性と、サイトカインの分泌を含むヘルパー活性とを含む。
【０１７１】
ある実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞内一次シグナル伝達ドメインを含みうる。例示的な細胞内一次シグナル伝達ドメインは、一次刺激または抗原依存性刺激の一因となる分子から導出される、細胞内一次シグナル伝達ドメインを含む。ある実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激性細胞内ドメインを含みうる。例示的な共刺激性細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激性シグナルまたは抗原非依存性刺激の一因となる分子から導出される、共刺激性細胞内シグナル伝達ドメインを含む。例えば、ＣＡＲＴの場合、細胞内一次シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞受容体の細胞質配列を含むことが可能であり、共刺激性細胞内シグナル伝達ドメインは、共受容体または共刺激性分子に由来する細胞質配列を含みうる。
【０１７２】
細胞内一次シグナル伝達ドメインは、免疫受容体のチロシンベースの活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして公知のシグナル伝達モチーフを含みうる。細胞質一次シグナル伝達配列を含有するＩＴＡＭの例は、ＣＤ３ゼータ、一般的なＦｃＲガンマ（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃガンマＲＩＩａ、ＦｃＲベータ（ＦｃイプシロンＲ１ｂ）、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＤＡＰ１０、およびＤＡＰ１２から導出されるＩＴＡＭを含むがこれらに限定されない。
【０１７３】
「ゼータ」、または、代替的に、「ゼータ鎖」、「ＣＤ３ゼータ」、もしくは「ＴＣＲゼータ」という用語は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＡＧ３６６６４．１として提供されるタンパク質、または非ヒト種、例えば、マウス、齧歯動物、サル、類人猿などに由来する同等な残基として規定され、「ゼータ刺激性ドメイン」、または、代替的に、「ＣＤ３ゼータ刺激性ドメイン」もしくは「ＴＣＲゼータ刺激性ドメイン」は、ゼータ鎖、またはＴ細胞の活性化に必要な初期シグナルを機能的に伝達するのに十分な、その機能的な誘導体の細胞質ドメインに由来するアミノ酸残基と規定される。一態様では、ゼータの細胞質ドメインは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＡＧ３６６６４．１の残基５２〜１６４、または非ヒト種、例えば、マウス、齧歯動物、サル、類人猿などに由来する同等な残基であって、その機能的なオーソログである残基を含む。一態様では、「ゼータ刺激性ドメイン」または「ＣＤ３ゼータ刺激性ドメイン」は、配列番号２１として提供される配列である。一態様では、「ゼータ刺激性ドメイン」または「ＣＤ３ゼータ刺激性ドメイン」は、配列番号２４として提供される配列である。
【０１７４】
「共刺激性分子」という用語は、Ｔ細胞上の同族結合パートナーであって、共刺激リガンドと特異的に結合し、これにより、増殖などであるがこれらに限定されない、Ｔ細胞による共刺激応答を媒介する結合パートナーを指す。共刺激性分子とは、抗原受容体またはそれらのリガンド以外の細胞表面分子であって、効率的な免疫応答に寄与する細胞表面分子である。共刺激性分子は、ＭＨＣクラスＩ分子、ＢＴＬＡ、およびＴｏｌｌリガンド受容体のほか、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、および４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）を含むがこれらに限定されない。このような共刺激性分子のさらなる例は、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ、およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドを含む。
【０１７５】
共刺激性細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激性分子の細胞内部分でありうる。共刺激性分子は、以下のタンパク質ファミリー：ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、および活性化ＮＫ細胞受容体で代表されうる。このような分子の例は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＡＭ−１、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤＳ、ＣＤ７、ＣＤ２８７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、Ｂ７−Ｈ３、およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなどを含む。
【０１７６】
細胞内シグナル伝達ドメインは、それが導出される分子の、細胞内部分の全体、または天然の細胞内シグナル伝達ドメインの全体、またはこれらの機能的断片もしくは誘導体を含みうる。
【０１７７】
「４−１ＢＢ」という用語は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ６２４７８．２、または非ヒト種、例えば、マウス、齧歯動物、サル、類人猿などに由来する同等な残基として提供されるアミノ酸配列を伴うＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーを指し、「４−１ＢＢ共刺激性ドメイン」は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ６２４７８．２のアミノ酸残基２１４〜２５５、または非ヒト種、例えば、マウス、齧歯動物、サル、類人猿などに由来する同等な残基として規定される。一態様では、「４−１ＢＢ共刺激性ドメイン」とは、配列番号１６として提供される配列、または非ヒト種、例えば、マウス、齧歯動物、サル、類人猿などに由来する同等な残基である。
【０１７８】
本明細書でこの用語を使用する場合の「免疫エフェクター細胞」とは、免疫応答、例えば、免疫エフェクター応答の促進に関与する細胞を指す。免疫エフェクター細胞の例は、Ｔ細胞、例えば、アルファ／ベータＴ細胞およびガンマ／デルタＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、マスト細胞、および骨髄球由来の食細胞を含む。
【０１７９】
本明細書でこの用語を使用する場合の「免疫エフェクター機能または免疫エフェクター応答」とは、例えば、標的細胞の免疫攻撃を増強または促進する免疫エフェクター細胞の機能または応答を指す。例えば、免疫エフェクター機能または応答とは、標的細胞の殺滅、または成長もしくは増殖の阻害を促進する、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の特性を指す。Ｔ細胞の場合、一次刺激および共刺激は、免疫エフェクター機能または免疫エフェクター応答の例である。
【０１８０】
「〜をコードすること」という用語は、生物学的過程において、規定されたヌクレオチド（例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、およびｍＲＮＡ）の配列、または規定されたアミノ酸の配列を有する、他のポリマーおよび高分子の合成のための鋳型として用いられる、遺伝子、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド内の、ヌクレオチドの特異的配列の固有の特性、およびそれから生じる生物学的特性を指す。したがって、細胞内または他の生物学的系内で、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳が、タンパク質を産生する場合、遺伝子、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡは、タンパク質をコードする。そのヌクレオチド配列が、ｍＲＮＡの配列と同一であり、通例、配列表に提供されるコード鎖、および遺伝子またはｃＤＮＡの転写のための鋳型として使用される非コード鎖の両方を、タンパク質、またはその遺伝子もしくはｃＤＮＡの他の産物をコードする鎖と称することができる。
【０１８１】
そうでないことが指定されない限りにおいて、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いの縮重形であり、同じアミノ酸配列をコードする、全てのヌクレオチド配列を含む。タンパク質またはＲＮＡをコードするヌクレオチド配列という語句はまた、タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、一部の変化形では、イントロンも含有する程度において、イントロンも含みうる。
【０１８２】
本明細書では、「有効量」または「治療有効量」という用語は、互換的に使用され、本明細書で記載される化合物、製剤、材料、または組成物の量であって、特定の生物学的結果を達成するのに有効な量を指す。
【０１８３】
「内因性」という用語は、生物、細胞、組織、または系の内部に由来するか、またはこれらから産生される、任意の材料を指す。
【０１８４】
「外因性」という用語は、生物、細胞、組織、または系の外部から導入されるか、またはこれらから産生される、任意の材料を指す。
【０１８５】
「発現」という用語は、プロモーターにより駆動される、特定のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳を指す。
【０１８６】
「移入ベクター」という用語は、単離核酸を含み、単離核酸を、細胞の内部へと送達するのに使用しうる組成物を指す。当技術分野では、直鎖状ポリヌクレオチド、イオン性化合物または両親媒性化合物と会合させたポリヌクレオチド、プラスミド、およびウイルスを含むがこれらに限定されない、多数のベクターが公知である。したがって、「移入ベクター」という用語は、自己複製プラスミドまたはウイルスを含む。用語はまた、例えば、ポリリシン化合物、リポソームなど、核酸の細胞への移入を容易とする、非プラスミド化合物および非ウイルス化合物をさらに含むようにも解釈されるものとする。ウイルス性移入ベクターの例は、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどを含むがこれらに限定されない。
【０１８７】
「発現ベクター」という用語は、発現させるヌクレオチド配列に作動的に連結した発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現に十分なシス作用型エレメントを含み；発現のための他のエレメントは、宿主細胞により、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現系内で供給することができる。発現ベクターは、組換えポリヌクレオチドを組み込む、当技術分野で公知の、全ての発現ベクターであって、コスミド、プラスミド（例えば、ネイキッドのプラスミドまたはリポソーム内に含有されたプラスミド）、およびウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）を含む発現ベクターを含む。
【０１８８】
「相同な」または「同一性」という用語は、２つのポリマー分子の間、例えば、２つのＤＮＡ分子もしくは２つのＲＮＡ分子など、２つの核酸分子の間、または２つのポリペプチド分子の間の、サブユニットの配列同一性を指す。２つの分子の両方におけるサブユニット位置を、同じ単量体サブユニットが占める場合、例えば、２つのＤＮＡ分子の各々における位置を、アデニンが占める場合、それらは、その位置において相同なまたは同一である。２つの配列の間の相同性とは、マッチする位置または相同な位置の数の直接的な関数であり；例えば、２つの配列内の位置のうちの半分（例えば、１０サブユニットの長さのポリマー内の５つの位置）が相同である場合、２つの配列は、５０％相同であり；９０％の位置（例えば、１０のうち９つ）がマッチするかまたは相同である場合、２つの配列は、９０％相同である。
【０１８９】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンから導出される最小限の配列を含有する、キメラ免疫グロブリン、キメラ免疫グロブリン鎖、またはこれらの断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または抗体の他の抗原結合性部分配列など）である。大部分において、ヒト化抗体およびそれらの断片は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）の１つまたは複数、例えば６つ全てが、マウス、ラット、またはウサギなど、非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲであって、所望の特異性、アフィニティー、および能力を有するＣＤＲに由来する残基により置きかえられた、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体または抗体断片）である。一部の場合、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）の残基を、対応する非ヒト残基により置きかえる。さらに、ヒト化抗体／抗体断片は、同じ抗原特異性を保持する限りにおいて、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲ配列またはフレームワーク配列にも見出されない残基を含みうる。これらの修飾をさらに精緻化し、抗体または抗体断片の効能を最適化することもできる。一般に、ヒト化抗体またはその抗体断片は、少なくとも１つの可変ドメインであり、典型的に、２つの可変ドメインであって、ＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリン配列のＣＤＲ領域に対応し、ＦＲ領域の全てまたは著明な部分が、ヒト免疫グロブリン配列のＦＲ領域である可変ドメインの実質的に全てを含むであろう。ヒト化抗体または抗体断片はまた、免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）のうちの少なくとも一部、典型的に、ヒト免疫グロブリンのＦｃのうちの少なくとも一部も含みうる。さらなる詳細については、Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986; Reichmann et al., Nature, 332: 323-329, 1988; Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596, 1992を参照されたい。
【０１９０】
「完全ヒト」とは、抗体または抗体断片などの免疫グロブリンであって、全分子が、ヒト由来であるか、または抗体もしくは免疫グロブリンのヒト形態と同一なアミノ酸配列からなる免疫グロブリンを指す。
【０１９１】
「単離された」という用語は、天然状態から変更または除去されていることを意味する。例えば、生存する動物において天然で存在する核酸またはペプチドは、「単離」されていないが、その天然状態の材料から、部分的または完全に分離された、同じ核酸またはペプチドは、「単離」されている。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在する場合もあり、例えば、宿主細胞など、非天然環境内に存在する場合もある。
【０１９２】
「作動可能に連結された」または「転写の制御」という用語は、調節的配列と、異種核酸配列との機能的連結であって、後者の発現を結果としてもたらす機能的連結を指す。例えば、第１の核酸配列は、第２の核酸配列と機能的な関係に置かれたとき、第２の核酸配列と、作動可能に連結されている。例えば、プロモーターは、コード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結されている。プロモーター配列または調節配列は、シス作用型エレメントの場合もあり、トランス作用型エレメントの場合もある。作動可能に連結されたＤＮＡ配列は、互いと連続する場合があり、例えば、２つのタンパク質のコード領域を接続することが必要な場合、同じリーディングフレーム内にある。
【０１９３】
免疫原性組成物の「非経口」投与という用語は、例えば、皮下（ｓ．ｃ．）投与、静脈内（ｉ．ｖ．）投与、筋内（ｉ．ｍ．）投与、または胸骨下注射投与、腫瘍内投与、または注入投与法を含む。
【０１９４】
「核酸」または「ポリヌクレオチド」という用語は、一本鎖形態または二本鎖形態の、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）、およびこれらのポリマーを指す。具体的に限定されない限りにおいて、用語は、天然ヌクレオチドの公知の類似体であって、基準核酸と同様の結合特性を有し、自然発生のヌクレオチドと同様の様態で代謝される類似体を含有する核酸を包摂する。そうでないことが指し示されない限りにおいて、特定の核酸配列はまた暗黙に、保存的に修飾されたその変異体（例えば、縮重コドン置換）、対立遺伝子、オーソログ、ＳＮＰ、および相補性配列のほか、明示的に指し示される配列も包摂する。具体的に、縮重コドン置換は、１つまたは複数の選択された（または全ての）コドンの第３の位置を、混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換した配列を作出することにより、達成することができる（Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); and Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)）。
【０１９５】
「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語は、互換的に使用され、ペプチド結合により共有結合的に連結されたアミノ酸残基から構成される化合物を指す。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含有しなければならず、タンパク質またはペプチドの配列を含みうるアミノ酸の最大数には、限定を設けない。ポリペプチドは、ペプチド結合により互いと接続された、２つ以上のアミノ酸を含む、任意のペプチドまたはタンパク質を含む。本明細書で使用される用語は、当技術分野ではまた一般に、例えば、ペプチド、オリゴペプチド、およびオリゴマーとも称する短鎖、ならびに、当技術分野では一般に、タンパク質と称し、多くの種類が存在する長鎖の両方を指す。「ポリペプチド」は、例えば、中でも、生物学的に活性の断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドの変異体、修飾ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質を含む。ポリペプチドは、天然ペプチド、組換えペプチド、またはこれらの組合せを含む。
【０１９６】
「プロモーター」という用語は、細胞の合成機構、または導入された合成機構により認識されるＤＮＡ配列であって、ポリヌクレオチド配列の特異的転写を誘発するのに要求されるＤＮＡ配列を指す。
【０１９７】
「プロモーター／調節配列」という用語は、プロモーター／調節配列に作動可能に連結した遺伝子産物の発現に要求される核酸配列を指す。一部の場合では、この配列は、コアプロモーター配列であることが可能であり、他の場合では、この配列はまた、エンハンサー配列、および遺伝子産物の発現に要求される、他の調節エレメントも含みうる。プロモーター／調節配列は、例えば、組織特異的な様態で、遺伝子産物を発現させる配列でありうる。
【０１９８】
「構成的」プロモーターは、遺伝子産物をコードするか、または指定するポリヌクレオチドと作動可能に連結されると、細胞の大半の生理学的状態下、または全ての生理学的状態下で、細胞内で遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列を指す。
【０１９９】
「誘導的」プロモーターは、遺伝子産物をコードするか、または指定するポリヌクレオチドと作動可能に連結されると、実質的に、プロモーターに対応するインデューサーが細胞内に存在する場合に限り、細胞内で遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列を指す。
【０２００】
「組織特異的」プロモーターは、遺伝子によりコードまたは指定されるポリヌクレオチドと作動可能に連結されると、実質的に、プロモーターに対応する組織型の細胞である場合に限り、細胞内で遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列を指す。
【０２０１】
「がん関連抗原」または「腫瘍抗原」という用語は互換的に、がん細胞の表面上で、全体的に、または断片（例えば、ＭＨＣもしくはペプチドの断片）として発現し、薬理学的薬剤を、がん細胞へと、優先的にターゲティングするのに有用である分子（典型的に、タンパク質、炭水化物、または脂質）を指す。一部の実施形態では、腫瘍抗原は、正常細胞およびがん細胞の両方が発現するマーカー、例えば、系統マーカー、例えば、Ｂ細胞上のＣＤ１９である。一部の実施形態では、腫瘍抗原は、がん細胞内で、正常細胞と比較して過剰発現する、例えば、正常細胞と比較して、１倍過剰発現する、２倍過剰発現する、３倍過剰発現するか、またはこれを超えて過剰発現する細胞表面分子である。一部の実施形態では、腫瘍抗原は、がん細胞内で、正常細胞と比較して過小発現する、例えば、正常細胞と比較して、１分の１過小発現する、２分の１過小発現する、３分の１過小発現するか、またはこれ未満に過小発現する細胞表面分子である。一部の実施形態では、腫瘍抗原は、がん細胞内で不適切に合成される細胞表面分子、例えば、正常細胞上で発現する分子と比較して、欠失、付加、または突然変異を含有する分子である。
【０２０２】
一部の実施形態では、腫瘍抗原はもっぱら、がん細胞の細胞表面上で、全体的に、または断片（例えば、ＭＨＣまたはペプチド断片）として発現し、正常細胞の表面上では、合成されたり、発現したりしないであろう。一部の実施形態では、本開示のＣＡＲは、腫瘍抗原または断片、例えば、ＭＨＣにより提示されたペプチドに結合する抗原結合性ドメイン（例えば、抗体または抗体断片）を含むＣＡＲを含む。
【０２０３】
通常、内因性タンパク質から導出されるペプチドは、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子のポケットを充填し、ＣＤ８＋  Ｔリンパ球上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）により認識される。ＭＨＣクラスＩ複合体は、全ての有核細胞が構成的に発現する。がんでは、ウイルス特異的ペプチド／ＭＨＣ複合体、および／または腫瘍特異的ペプチド／ＭＨＣ複合体は、免疫療法のための細胞表面標的の固有のクラスを表す。ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）−Ａ１またはＨＬＡ−Ａ２の文脈における、ウイルス抗原または腫瘍抗原から導出されるペプチドをターゲティングするＴＣＲ様抗体については、記載されている（例えば、Sastry et al., J Virol. 2011 85(5):1935-1942; Sergeeva et al., Blood, 2011 117(16):4262-4272; Verma et al., J Immunol 2010 184(4):2156-2165; Willemsen et al., Gene Ther 2001 8(21) :1601-1608; Dao et al., Sci Transl Med 2013 5(176) :176ra33 ; Tassev et al., Cancer Gene Ther 2012 19(2):84-100を参照されたい）。例えば、ＴＣＲ様抗体は、ヒトｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーなどのライブラリーをスクリーニングすることから同定することができる。
【０２０４】
「腫瘍支持抗原」または「がん支持抗原」という用語は互換的に、それ自体はがん性ではないが、例えば、それらの成長または生存、例えば、免疫細胞に対する耐性を促進することにより、がん細胞を支持する細胞の表面上で発現する分子（典型的に、タンパク質、炭水化物、または脂質）を指す。この種類の例示的な細胞は、間質細胞および骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を含む。腫瘍支持抗原自体は、抗原が、がん細胞を支持する細胞上に存在する限りにおいて、腫瘍細胞の支持において役割を果たす必要がない。
【０２０５】
ｓｃＦｖの文脈で使用される「可撓性のポリペプチドリンカー」または「リンカー」という用語は、単独または組合せで、可変重鎖領域および可変軽鎖領域を一体に連結するのに使用される、グリシン残基および／またはセリン残基などのアミノ酸からなるペプチドリンカーを指す。一実施形態では、可撓性のポリペプチドリンカーは、Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカーであり、アミノ酸配列（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎ［配列中、ｎは、１と等しいかまたはこれを超える、正の整数である］を含む。例えば、ｎ＝１、ｎ＝２、ｎ＝３、ｎ＝４、ｎ＝５、ならびにｎ＝６、ｎ＝７、ｎ＝８、ｎ＝９、およびｎ＝１０である（配列番号３２）。一実施形態では、可撓性のポリペプチドリンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４（配列番号３４）または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号３５）を含むがこれらに限定されない。別の実施形態では、リンカーは、（Ｇｌｙ２Ｓｅｒ）、（ＧｌｙＳｅｒ）、または（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）（配列番号３６）の複数のリピートを含む。また、参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１２／１３８４７５号パンフレットに記載されているリンカーも、本開示の範囲内に含まれる。
【０２０６】
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）との関連で、本明細書で使用される、５’キャップ（また、ＲＮＡキャップ、ＲＮＡ  ７−メチルグアノシンキャップ、またはＲＮＡ  ｍ７Ｇキャップとも称する）とは、転写開始の直後の、真核メッセンジャーＲＮＡの「フロント」または５’末端部へと付加された、修飾グアニンヌクレオチドである。５’キャップは、最初の転写ヌクレオチドへと連結される末端基からなる。その存在は、リボソームによる認識、およびＲＮアーゼからの保護に極めて重要である。キャップの付加は、転写とカップリングしており、各々が、互いに影響を及ぼしあうように、共転写的に生じる。転写開始直後に、ＲＮＡポリメラーゼと会合するキャップ合成複合体が、合成されつつあるｍＲＮＡの５’末端部に結合する。この酵素複合体が、ｍＲＮＡのキャッピングに要求される化学的反応を触媒する。合成は、多段階の生化学反応として進行する。キャッピング部分は、その安定性または翻訳の効率など、ｍＲＮＡの機能性をモジュレートするように改変することができる。
【０２０７】
本明細書で使用される「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写されたＲＮＡ」とは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成されたＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡを指す。一般に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写されたＲＮＡは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ベクターから作出される。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ベクターは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写されたＲＮＡを作出するのに使用される鋳型を含む。
【０２０８】
本明細書で使用される「ポリ（Ａ）」とは、ポリアデニル化により、ｍＲＮＡへと接合させたアデノシンの連鎖である。一過性発現のための構築物についての、好ましい実施形態では、ポリＡは、５０〜５０００（配列番号１０５１７）の間であるか、好ましくは６４を超えるか、より好ましくは１００を超えるか、最も好ましくは３００を超えるか、または４００である。ポリ（Ａ）配列は、局在化、安定性、または翻訳の効率など、ｍＲＮＡの機能性をモジュレートするように、化学的または酵素的に修飾することができる。
【０２０９】
本明細書で使用される「ポリアデニル化」とは、ポリアデニルイル部分、またはその修飾変異体の、メッセンジャーＲＮＡ分子への共有結合的連結を指す。真核生物では、大半のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子は、３’末端部においてポリアデニル化されている。３’ポリ（Ａ）テールとは、酵素であるポリアデニル酸ポリメラーゼの作用を介して、プレｍＲＮＡへと付加された、アデニンヌクレオチド（数百であることが多い）の、長い配列である。高等真核生物では、ポリ（Ａ）テールは、特異的配列である、ポリアデニル化シグナルを含有する転写物へと付加されている。ポリ（Ａ）テールと、それに結合したタンパク質は、ｍＲＮＡを、エキソヌクレアーゼによる分解から保護する一助となる。ポリアデニル化はまた、転写の終結、ｍＲＮＡの、核からの移出、および翻訳にも重要である。ポリアデニル化は、ＤＮＡの、ＲＮＡへの転写の直後に、核内で生じるが、加えてまた、その後、細胞質内でも生じる。転写が終結した後、ｍＲＮＡ鎖は、ＲＮＡポリメラーゼと会合するエンドヌクレアーゼ複合体の作用を介して切断される。切断部位は通例、切断部位の近傍における、塩基配列ＡＡＵＡＡＡの存在を特徴とする。ｍＲＮＡが切断された後で、アデノシン残基が、切断部位の遊離３’末端部へと付加される。
【０２１０】
本明細書で使用される「一過性」とは、組み込まれていないトランス遺伝子の、数時間、数日間、または数週間の期間にわたる発現を指し、この場合、発現期間は、宿主細胞内で、ゲノムへと組み込まれるか、または安定的なプラスミドレプリコン内に含有される場合における、遺伝子の発現のための期間未満である。
【０２１１】
本明細書で使用される「〜を処置する」、「処置」、および「〜を処置すること」という用語は、１もしくは複数の療法（例えば、本開示のＣＡＲなど、１または複数の治療剤）の投与から生じる、増殖性障害の進行、重症度、および／もしくは持続期間の部分的なもしくは完全な低減もしくは軽快、または増殖性障害の、１もしくは複数の症状（好ましくは、１または複数の識別可能な症状）の軽快を指す。具体的な実施形態では、「〜を処置する」、「処置」、および「〜を処置すること」という用語は、腫瘍の成長など、増殖性障害についての、少なくとも１つの測定可能な物理的パラメータのほか、患者により必ずしも識別可能ではないパラメータの軽快を指す。他の実施形態では、「〜を処置する」、「処置」、および「〜を処置すること」という用語は、腫瘍サイズの安定化など、増殖性障害の進行の阻害であって、物理的な阻害、例えば、識別可能な症状の安定化による阻害、生理学的な阻害、例えば、物理的パラメータの安定化による阻害、またはこれらの両方による阻害を指す。他の実施形態では、「〜を処置する」、「処置」、および「〜を処置すること」という用語は、腫瘍サイズまたはがん性細胞カウントの低減または安定化を指す。
【０２１２】
「シグナル伝達経路」は、細胞の１つの部分から、細胞の別の部分へまたは別の細胞への、シグナルの伝達において役割を果たす、２つまたはこれを超えるシグナル伝達分子の間の生化学的関係を指す。「細胞表面受容体」という語句は、シグナルを受け取り、細胞の膜を隔ててシグナルを伝達することが可能な、分子および分子の複合体を含む。
【０２１３】
「対象」は、免疫応答が誘発されうる生物（例えば、ヒトなどの哺乳動物）を含むように意図される。
【０２１４】
「実質的な精製」細胞は、他の細胞型を本質的に含まない細胞を指す。実質的な精製細胞はまた、その自然発生の状態では、通常、それが会合する他の細胞型から分離された細胞も指す。一部の場合では、実質的な精製細胞の集団とは、均一の細胞集団を指す。他の場合には、この用語は単に、それらの天然の状態では、それらが自然に会合する細胞から分離された細胞を指す。一部の態様では、細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養されている。他の複数の態様では、細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養されていない。
【０２１５】
本明細書で使用される「治療的」という用語は、処置を意味する。治療効果は、疾患状態または症状の、部分的または完全な低減、抑制、寛解、または根絶により得られる。
【０２１６】
本明細書で使用される「予防」という用語は、疾患または疾患状態の、部分的または完全な防止、またはこれらのための防御的処置を意味する。
【０２１７】
本開示の文脈では、「腫瘍抗原」または「高増殖性障害抗原」または「高増殖性障害と関連する抗原」とは、具体的な高増殖性障害に一般的な抗原を指す。ある特定の態様では、本開示の高増殖性障害抗原は、原発性または転移性の、黒色腫、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺がん、肝臓がん、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、子宮がん、子宮頸がん、膀胱がん、腎臓がん、および乳がん、前立腺がん、卵巣がん、膵臓がんなどの腺癌を含むがこれらに限定されないがんから導出される。
【０２１８】
「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」という用語は、外因性核酸を、宿主細胞へと移入または導入する工程を指す。「トランスフェクト」または「形質転換」または「形質導入」された細胞とは、外因性核酸を、トランスフェクト、形質転換、または形質導入された細胞である。細胞は、初代対象細胞、およびその子孫細胞を含む。
【０２１９】
「〜に特異的に結合する」という用語は、試料中に存在する他の分子に対して、結合パートナー（例えば、タンパク質または核酸）を、優先的に認識し、これに結合する分子を指す。
【０２２０】
本明細書でこの用語を使用する場合の「膜アンカー」または「膜テザリングドメイン」とは、細胞外ドメインまたは細胞内ドメインを、細胞膜へとアンカリングするのに十分なポリペプチドまたは部分、例えば、ミリストイル基を指す。
【０２２１】
「生体同等」という用語は、基準化合物（例えば、ＲＡＤ００１）以外の薬剤の量であって、基準用量または基準量の基準化合物（例えば、ＲＡＤ００１）によりもたらされる効果と同等な効果をもたらすのに要求される量を指す。ある実施形態では、効果は、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて査定される、例えば、本明細書で記載されるアッセイ、例えば、ブーレーアッセイにより測定される、例えば、Ｐ７０  Ｓ６キナーゼ阻害により測定される、ｍＴＯＲ阻害のレベルである。ある実施形態では、効果は、細胞選別により測定される、ＰＤ−１陽性Ｔ細胞／ＰＤ−１陰性Ｔ細胞比の変更である。ある実施形態では、ｍＴＯＲ阻害剤の生体同等量または用量とは、基準用量または基準量の基準化合物がもたらすのと同じレベルのＰ７０  Ｓ６キナーゼ阻害を達成する量または用量である。ある実施形態では、ｍＴＯＲ阻害剤の生体同等量または用量とは、基準用量または基準量の基準化合物がもたらすのと同じレベルの、ＰＤ−１陽性Ｔ細胞／ＰＤ−１陰性Ｔ細胞比の変更を達成する量または用量である。
【０２２２】
ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１またはラパマイシン、または触媒性ｍＴＯＲ阻害剤と共に使用される場合の、「低免疫増強用量」という用語は、完全にではないが、部分的に、ｍＴＯＲ活性を阻害するｍＴＯＲ阻害剤の用量であって、例えば、Ｐ７０  Ｓ６キナーゼ活性の阻害により測定される用量を指す。本明細書では、例えば、Ｐ７０  Ｓ６キナーゼ阻害により、ｍＴＯＲ活性を査定するための方法について論じる。用量は、完全な免疫抑制を結果としてもたらすには不十分であるが、免疫応答を増強するには十分である。ある実施形態では、低免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤は、ＰＤ−１陽性Ｔ細胞数の減少および／もしくはＰＤ−１陰性Ｔ細胞数の増大、またはＰＤ−１陰性Ｔ細胞／ＰＤ−１陽性Ｔ細胞比の増大を結果としてもたらす。ある実施形態では、低免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤は、ナイーブＴ細胞数の増大を結果としてもたらす。ある実施形態では、低免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤は、以下：
例えば、メモリーＴ細胞上、例えば、メモリーＴ細胞前駆体上の、以下のマーカー：ＣＤ６２Ｌｈｉｇｈ、ＣＤ１２７ｈｉｇｈ、ＣＤ２７＋、およびＢＣＬ２のうちの１または複数の発現の増大；
例えば、メモリーＴ細胞上、例えば、メモリーＴ細胞の前駆細胞上の、ＫＬＲＧ１の発現の減少；ならびに
メモリーＴ細胞の前駆細胞、例えば、以下の特徴：ＣＤ６２Ｌｈｉｇｈの増大、ＣＤ１２７ｈｉｇｈの増大、ＣＤ２７＋の増大、ＫＬＲＧ１の減少、およびＢＣＬ２の増大のうちのいずれか１つまたは組合せを伴う細胞の数の増大；
のうちの１または複数を結果としてもたらし、
この場合、上記で記載した変化のうちのいずれかが、例えば、非処置対象と比較して、例えば、少なくとも一過性に生じる。
【０２２３】
本明細書で使用される「不応性」とは、処置に応答しない疾患、例えば、がんを指す。複数の実施形態では、不応性がんは、処置の前または処置の開始時において、処置に対して耐性でありうる。他の実施形態では、不応性がんは、処置中に耐性となりうる。不応性がんはまた、耐性がんとも呼ばれる。
【０２２４】
本明細書で使用される「再発した」とは、改善期間の後、例えば、治療、例えば、がん治療の既往の処置の後における、疾患（例えば、がん）、またはがんなどの疾患の徴候および症状の再来を指す。
【０２２５】
範囲：本開示を通して、本開示の多様な態様は、範囲のフォーマットで提示される場合がある。範囲のフォーマットにおける記載は、単に簡便さおよび簡潔さのためであり、本開示の範囲に対する、柔軟性のない限定として解釈すべきではないと理解されたい。したがって、範囲についての記載は、全ての可能な部分範囲、加えてその範囲内の個々の数値を具体的に開示していると考えるものとする。例えば、１から６などの範囲についての記載は、例えば、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６など、具体的に開示される部分範囲のほか、その範囲内の個々の数値、例えば、１、２、２．７、３、４、５、５．３、および６を有すると考えるものとする。別の例として、９５〜９９％の同一性などの範囲は、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を伴うあるものを含み、さらに、９６〜９９％、９６〜９８％、９６〜９７％、９７〜９９％、９７〜９８％、および９８〜９９％の同一性などの部分範囲を含む。これは、範囲の幅に関わらず適用される。そうでないことが言明されない限りにおいて、全ての指定された範囲はまた、端点も含む。
【０２２６】
詳細な説明
本明細書で記載されるｇＲＮＡ分子、組成物、および方法は、例えば、本明細書で記載されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、例えば、Ｃａｓ９系を、例えば、使用する、真核細胞内の、特に、Ｔｅｔ遺伝子のイントロンまたはイントロン−エクソン接合部、例えば、ＴＥＴ２のイントロンまたはイントロン−エクソン接合部におけるゲノム編集、例えば、遺伝子編集に関する。特定の実施形態では、本明細書で記載されるｇＲＮＡ分子、組成物、および方法は、ＣＲＩＳＰＲ系の、Ｔｅｔ遺伝子、例えば、ＴＥＴ２遺伝子の、イントロンまたはイントロン−エクソン接合部の標的配列へのターゲティングをもたらす。さらなる態様では、本開示は、Ｔｅｔ遺伝子、例えば、ＴＥＴ２遺伝子の、イントロンまたはイントロン−エクソン接合部の標的配列の修飾（例えば、挿入または欠失）を提供する。さらなる態様では、本開示は、異種タンパク質、例えば、本明細書で記載される、例えば、ＣＡＲ分子をコードする核酸配列の、例えば、Ｔｅｔ遺伝子、例えば、ＴＥＴ２遺伝子の、イントロンまたはイントロン−エクソン接合部の、遺伝子編集系が結合する標的配列、例えば、本明細書で記載されるｇＲＮＡ分子が結合する標的配列における、またはこの近傍における挿入を提供する。異種タンパク質をコードする、このような核酸配列は、細胞へと、例えば、相同性アームを含む、本明細書で記載される鋳型核酸として、またはベクターの一部として、個別に導入することもでき、遺伝子編集系として、同時に導入することもできる。
【０２２７】
ＴＥＴ２遺伝子内のミスセンス、ナンセンス、およびフレームシフト突然変異（すなわち、機能喪失突然変異）は、多様ながん、例えば、血液がんと関連する。例えば、Pan et al., IUBMB Life 67(6): 438-45 (June 2015)を参照されたい。しかしながら、理論に束縛されずに、本開示は、部分的に、ＣＡＲ遺伝子の、ＴＥＴ２遺伝子への挿入であり、特に、ＴＥＴ２遺伝子のイントロン、例えば、エクソン９とエクソン１０との間のイントロンへの挿入が、特性が改善されたＣＡＲ発現Ｔ細胞を結果としてもたらすという知見に基づく。例えば、一部の実施形態では、ＴＥＴ２遺伝子、例えば、ＴＥＴ２遺伝子のイントロンの、１または複数のコピーへと挿入されたＣＡＲ遺伝子を含むＣＡＲＴ細胞は、ＴＥＴ２の発現および／または機能を破壊することが可能である。一部の実施形態では、結果として得られる、ＴＥＴ２の機能喪失を伴うＣＡＲＴ細胞は、驚くべきことに、制御不能の増殖を回避することが可能であり、がん、例えば、血液がんの処置に有用である。
【０２２８】
理論に束縛されずに、ＣＡＲ遺伝子の、ＴＥＴ２遺伝子、例えば、ＴＥＴ２遺伝子のイントロンの、１または複数の対立遺伝子への挿入は、ＴＥＴ２の全長形態を、部分的に、または完全に破壊することが可能な、ＴＥＴ２切断形態および／またはドミナントネガティブ形態を作製することが可能でありうる。
【０２２９】
本開示はさらに、ＴＥＴ２の機能および／または発現の、部分的な（部分的であり、完全ではない）阻害が、免疫エフェクター細胞の機能に有益でありうるという発見にも部分的に基づく。一部の実施形態では、ＣＡＲ遺伝子の、ＴＥＴ２遺伝子、例えば、ＴＥＴ２遺伝子のイントロンへの挿入は、ＴＥＴ２遺伝子の、１つの対立遺伝子を破壊し、ＴＥＴ２の機能および／または発現の、部分的な阻害を結果としてもたらす。一部の実施形態では、ＣＡＲ遺伝子の、ＴＥＴ２遺伝子、例えば、ＴＥＴ２遺伝子のイントロンへの挿入は、ＴＥＴ２遺伝子の、両方の対立遺伝子を破壊し、ＴＥＴ２の機能および／または発現の、完全な阻害を結果としてもたらす。本開示はまた、異種タンパク質、例えば、本明細書で記載される、例えば、ＣＡＲ分子をコードする核酸の、細胞、例えば、免疫エフェクター細胞のゲノムへの、例えば、具体的に、Ｔｅｔ遺伝子のイントロン、例えば、ＴＥＴ２遺伝子のイントロン、例えば、ＴＥＴ２の、エクソン９とエクソン１０との間のイントロンにおける、ターゲティングされた挿入に対する必要の認識にも部分的に基づく。したがって、ある態様では、本開示は、異種タンパク質、例えば、本明細書で記載される、例えば、ＣＡＲ分子をコードする核酸配列の、細胞、例えば、本明細書で記載される、例えば、免疫エフェクター細胞の、ＴＥＴ２遺伝子のイントロン内の挿入に有用な、遺伝子編集系、ｇＲＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲ系、および方法を提供する。
【０２３０】
本開示はさらに、イントロン、例えば、ＴＥＴ２の、エクソン９とエクソン１０との間のイントロンのターゲティングが、いくつかの利点をもたらしうるという発見にも部分的に基づく。第一に、例えば、本開示は、標的配列において、またはこの近傍において、１または２ヌクレオチドの欠失インデルを、驚くべき高頻度で含むインデルを創出することが可能なｇＲＮＡを提供し、特に、これらのｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ系を、鋳型核酸、例えば、ＣＡＲをコードする鋳型核酸（例えば、本明細書で記載される）と組み合わせることは、予測外に、驚くべきことに、鋳型核酸の配列の、ｇＲＮＡ分子によりターゲティングされる部位における、またはこの近傍における、高頻度の組込みを結果としてもたらす。これらのインデルおよび挿入（例えば、鋳型核酸の配列の挿入）は、エクソン内で創出されると、フレームシフト突然変異をもたらすことが可能であり、遺伝子によりコードされるタンパク質の発現の著明な（例えば、全面的な）阻害をもたらしうる。これらのｇＲＮＡにより、高頻度のインデル形成のために、このようなフレームシフトは、高百分率の細胞内の遺伝子の、両方の対立遺伝子で生じうる。理論に束縛されずに、したがって、本明細書で開示されるＣＲＩＳＰＲ系による、特に、異種タンパク質をコードする核酸（例えば、鋳型核酸の配列）の挿入のための部位としての、イントロン配列のターゲティングは、例えば、イントロン領域内の、５０ｎｔ、１００ｎｔ、または１５０ｎｔ未満のインデルは、遺伝子の両方の対立遺伝子で生じる場合であってもなお、機能的なタンパク質の発現を破壊することが予期されないため、標的遺伝子の機能および／または発現の、消失でなくとも、低減が所望される場合に有益でありうる。挿入は、比較的低頻度のイベントでありうるため、異種タンパク質（例えば、本明細書で記載されるＣＡＲ分子）をコードする核酸の挿入は、大半の細胞内の、ＣＲＩＳＰＲ系によりターゲティングされる遺伝子のうちの、１つの対立遺伝子だけで生じる。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ系による、イントロンのターゲティングは、例えば、挿入された核酸配列を含まない対立遺伝子を介して、遺伝子の発現および／または機能の少なくとも一部を保存しながら、異種配列（例えば、例えば、本明細書で記載されるＣＡＲ分子）をコードする核酸の、ターゲティングされた挿入を可能とする。代替的な実施形態では、例えば、鋳型核酸の配列の、驚くべき高比率の組込みを結果としてもたらす、本明細書で記載されるｇＲＮＡ分子を使用する、ＣＲＩＳＰＲ系（例えば、本明細書で記載される）による、イントロンのターゲティングは、遺伝子の、両方の対立遺伝子の発現および／または機能を破壊しながら、異種配列（例えば、例えば、本明細書で記載されるＣＡＲ分子）をコードする核酸の、ターゲティングされた挿入を可能とする。ある態様では、細胞は、免疫エフェクター細胞、例えば、ＮＫ細胞またはＴ細胞である。ある態様では、細胞は、自家細胞である。
【０２３１】
したがって、ある態様では、本開示は、細胞、例えば、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔｅｔ遺伝子のイントロン内、例えば、Ｔｅｔ２遺伝子のイントロン内の標的配列において、またはこの近傍において、インデルを含むＣＡＲ分子を含む免疫エフェクター細胞を提供する。ある態様では、本開示は、細胞、例えば、免疫エフェクター細胞、例えば、ｇＲＮＡ分子の、Ｔｅｔイントロン配列、例えば、Ｔｅｔ２イントロン配列に対するターゲティングドメインと相補的、例えば、本明細書で記載されるｇＲＮＡ分子のターゲティングドメインと相補的な標的配列において、またはこの近傍において、インデルを含むＣＡＲ分子を含む免疫エフェクター細胞を提供する。ある態様では、本開示は、細胞、例えば、免疫エフェクター細胞、例えば、前記細胞のゲノムへと、ｇＲＮＡ分子の、Ｔｅｔイントロン配列、例えば、Ｔｅｔ２イントロン配列またはイントロン−エクソン接合部配列に対するターゲティングドメインと相補的、例えば、本明細書で記載されるｇＲＮＡ分子のターゲティングドメインと相補的な標的配列において、またはこの近傍において組み込まれた異種タンパク質（例えば、例えば、本明細書で記載されるＣＡＲ分子）をコードする核酸配列を含むＣＡＲ分子を含む免疫エフェクター細胞を提供する。本開示は、前記細胞との関連で有用な方法および組成物をさらに提供する。
【０２３２】
前述の複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかにおいて、細胞は、自家細胞である。代替的に、前述の複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかにおいて、細胞は、同種異系細胞である。同種異系細胞の例は、例えば、前記遺伝子へとターゲティングされたゲノム編集系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ系）を使用して、Ｔ細胞受容体鎖、例えば、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣの発現および／または機能が低減または消失した同種異系細胞を含む。細胞は、１または複数のさらなる遺伝子、例えば、Ｂ２Ｍおよび／またはＣＩＩＴＡの発現の低減または消失をさらに含みうる。前述の複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかにおいて、細胞は、例えば、本明細書で記載されるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように操作される、または将来において操作される。前述の複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかにおいて、細胞は、Ｔ細胞である。
【０２３３】
本開示の遺伝子編集系、ｇＲＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲ系、Ｃａｓ９分子、細胞、ＣＡＲ分子、方法、および他の態様のさらなる特色については、下記で詳細に記載する。
【０２３４】
遺伝子編集系
ある態様では、本開示は、ＴＥＴ、例えば、ＴＥＴ２の、イントロン配列、例えば、表３に列挙された配列から選択された配列をターゲティングする遺伝子編集系を提供する。多様な遺伝子編集系については、下記でより完全に記載する。
【０２３５】
一部の実施形態では、本開示は、ＣＡＲが発現し、かつ／またはＴＥＴ、例えば、ＴＥＴ２が破壊されるように、ＣＡＲをコードし、ＣＡＲの核酸配列を組み込むことが可能な鋳型核酸を含む遺伝子編集系を提供する。一部の実施形態では、ＴＥＴ、例えば、ＴＥＴ２は、部分的に破壊される。一部の実施形態では、ＴＥＴ、例えば、ＴＥＴ２は、完全に破壊される。一部の実施形態では、ＴＥＴ、例えば、ＴＥＴ２の１つの対立遺伝子だけが修飾される。一部の実施形態では、ＴＥＴ、例えば、ＴＥＴ２の両方の対立遺伝子が修飾される。
【０２３６】
ＴＡＬＥＮ遺伝子編集系
ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインを、ＤＮＡ切断ドメインに融合させることにより、人工的に作製される。転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）は、ＴＥＴ２イントロンの配列、例えば、表３の配列内の配列を含む、任意の所望のＤＮＡ配列に結合するように操作することができる。操作されたＴＡＬＥを、ＤＮＡ切断ドメインと組み合わせることにより、ＴＥＴ２イントロンを含む、任意の所望のＤＮＡ配列に特異的な制限酵素を作製することができる。次いで、これらを、細胞へと導入し、そこで、これらを、ゲノム編集のために使用することができる（Boch (2011) Nature Biotech. 29: 135-6；およびBoch et al. (2009) Science 326: 1509-12; Moscou et al. (2009) Science 326: 3501）。
【０２３７】
ＴＡＬＥとは、キサントモナス属（Xanthomonas）菌により分泌されるタンパク質である。ＤＮＡ結合ドメインは、１２番目のアミノ酸および１３番目のアミノ酸を除き、反復的であり、高度に保存的な３３〜３４アミノ酸の配列を含有する。これらの２つの位置は、高度に可変性であり、特異的なヌクレオチド認識との強い相関を示す。したがって、これらを、所望のＤＮＡ配列に結合するように操作することができる。
【０２３８】
ＴＡＬＥＮを作製するために、ＴＡＬＥタンパク質を、例えば、野生型ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼまたは突然変異型ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼである、ヌクレアーゼ（Ｎ）へと融合させる。ＴＡＬＥＮにおけるその使用のために、ＦｏｋＩに対するいくつかの突然変異が施されており、これらは、例えば、切断特異性または切断活性を改善する（Cermak et al. (2011) Nucl. Acids Res. 39: e82; Miller et al. (2011) Nature Biotech. 29: 143-8; Hockemeyer et al. (2011) Nature Biotech. 29: 731-734; Wood et al. (2011) Science 333: 307; Doyon et al. (2010) Nature Methods 8: 74-79; Szczepek et al. (2007) Nature Biotech. 25: 786-793；およびGuo et al. (2010) J. Mol. Biol. 200: 96）。
【０２３９】
ＦｏｋＩドメインは、二量体として機能し、標的ゲノム内の部位に対する固有のＤＮＡ結合ドメインであって、適正な配向性および間隔を有するＤＮＡ結合ドメインを伴う、２つのコンストラクトを要求する。ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインとＦｏｋＩ切断ドメインとの間のアミノ酸残基の数、および２つの個別のＴＡＬＥＮ結合性部位の間の塩基の数のいずれもが、高レベルの活性を達成するための重要なパラメータであると考えられる（Miller et al. (2011) Nature Biotech. 29: 143-8）。
【０２４０】
ＴＥＴ２イントロン配列、例えば、表３に列挙された配列に対するＴＡＬＥＮを、細胞内で使用して、二本鎖切断（ＤＳＢ）を創出することができる。修復機構による、非相同な末端接合を介する切断の修復が適正でない場合は、切断部位に突然変異を導入することができる。例えば、不適正な修復は、フレームシフト突然変異を導入する場合がある。代替的に、例えば、本明細書で記載される鋳型核酸、例えば、本明細書で記載される、例えば、ＣＡＲをコードする鋳型核酸を、ＴＡＬＥＮと共に、細胞へと導入することもでき、鋳型核酸の配列および染色体配列に応じて、この過程を使用して、ＴＡＬＥＮによりターゲティングされる部位に、またはこの近傍に、異種核酸配列、例えば、本明細書で記載される、例えば、ＣＡＲをコードする配列を組み込むこともできる。理論に束縛されずに、このような組込みは、ＣＡＲの発現のほか、破壊、例えば、部分的な破壊、例えば、１または複数の機能の破壊、例えば、ＴＥＴ２の、１つの対立遺伝子だけの破壊をもたらしうる。一部の実施形態では、ＴＥＴ、例えば、ＴＥＴ２の両方の対立遺伝子を破壊する。
【０２４１】
モジュール構成要素を使用する、多様なスキームを含む、当技術分野で公知である、任意の方法を使用して、ＴＥＴ２イントロン内の配列に特異的なＴＡＬＥＮを構築することができる（それらの内容が、参照によりそれらの全体において組み込まれる、Zhang et al. (2011) Nature Biotech. 29: 149-53; Geibler et al. (2011) PLoS ONE 6: e19509；米国特許第８，４２０，７８２号明細書；米国特許第８，４７０，９７３号明細書）。
【０２４２】
ＴＥＴ２イントロンに対する、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（「ＺＦＮ」）による遺伝子編集系
「ＺＦＮ」または「亜鉛フィンガーヌクレアーゼ」とは、所望の核酸配列、例えば、ＴＥＴ２イントロン、例えば、表３に列挙された配列の、１または複数の核酸を修飾する、例えば、欠失させるのに使用しうる人工ヌクレアーゼを指す。突然変異体および変異体のＺＦＮもまた、包摂される。
【０２４３】
ＴＡＬＥＮと同様に、ＺＦＮも、ＤＮＡ結合ドメインへと融合させたＦｏｋＩヌクレアーゼドメイン（またはその誘導体）を含む。ＺＦＮの場合、ＤＮＡ結合性ドメインは、１または複数の亜鉛フィンガーを含む（Carroll et al. (2011) Genetics Society of America 188: 773-782；およびKim et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1156-1160）。
【０２４４】
亜鉛フィンガーとは、１または複数の亜鉛イオンにより安定化する、低分子タンパク質の構造モチーフである。亜鉛フィンガーは、例えば、Ｃｙｓ２Ｈｉｓ２を含むことが可能であり、約３ｂｐの配列を認識しうる。特異性が公知である、多様な亜鉛フィンガーを組み合わせて、約６、９、１２、１５、または１８ｂｐの配列を認識する、マルチフィンガーポリペプチドを作製することができる。亜鉛フィンガー（およびこれらの組合せ）を作出するのに、特異的な配列を認識する、多様な選択法およびモジュールアセンブリー技術であって、ファージディスプレイ、酵母ワンハイブリッド系、細菌ワンハイブリッド系および細菌ツーハイブリッド系、ならびに哺乳動物細胞を含む選択法およびモジュールアセンブリー技術が利用可能である。
【０２４５】
ＴＡＬＥＮと同様に、ＺＦＮも、ＤＮＡを切断するのに二量体化しなければならない。したがって、非パリンドロミックのＤＮＡ部位をターゲティングするには、ＺＦＮの対が要求される。２つの個別のＺＦＮは、それらのヌクレアーゼが適正な間隔で隔てられた状態で、ＤＮＡ逆鎖に結合しなければならない（Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10570-5）。
【０２４６】
ＴＡＬＥＮと同様に、ＺＦＮも、ＤＮＡにおいて二本鎖切断を創出することが可能であり、修復が適正でない場合は、これにより、フレームシフト突然変異を創出し、細胞内の、例えば、１つの対立遺伝子からの、ＴＥＴ２の発現および／または機能、例えば、１または複数の機能の減少をもたらす。ＺＦＮはまた、ＴＥＴ２イントロンを突然変異させるか、または、例えば、ＣＡＲをコードする核酸を、標的配列の部位に、またはこの近傍に誘導するように、相同組換えと共に使用することもできる。上記で論じた通り、ＣＡＲをコードする核酸を、鋳型核酸の一部として導入することができる。複数の実施形態では、鋳型核酸は、１または複数の目的の分子または分子をコードする（例えば、本明細書で記載されるＣＡＲをコードする）鋳型核酸の核酸に対して、５’側、３’側、または５’側および３’側の両方における相同性アームであって、標的配列を挟むゲノムＤＮＡ配列と相補的な相同性アームをさらに含む。
【０２４７】
当技術分野で公知である、任意の方法を使用して、ＴＥＴ２イントロン内の配列、例えば、表３の配列に特異的なＺＦＮを構築することができる。例えば、それらの内容が、参照によりそれらの全体において組み込まれる、Provasi (2011) Nature Med. 18: 807-815; Torikai (2013) Blood 122: 1341-1349; Cathomen et al. (2008) Mol. Ther. 16: 1200-7；およびGuo et al. (2010) J. Mol. Biol. 400: 96；米国特許出願公開第２０１１／０１５８９５７号明細書；および米国特許出願公開第２０１２／００６０２３０号明細書を参照されたい。複数の実施形態では、ＺＦＮ遺伝子編集系はまた、ＺＦＮ遺伝子編集系、例えば、ＴＥＴ２イントロン、例えば、表３に列挙された配列へとターゲティングされるＺＦＮ遺伝子編集系の、１または複数の構成要素をコードする核酸も含みうる。
【０２４８】
好ましい態様では、遺伝子編集系は、ＣＲＩＳＰＲ系である。本開示のｇＲＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲ系、Ｃａｓ９分子、細胞、ＣＡＲ分子、方法、および他の態様のさらなる特色については、下記で詳細に記載する。
【０２４９】
Ｉ．ｇＲＮＡ分子
ｇＲＮＡ分子は、下記でより完全に記載される、いくつかのドメインを有しうるが、ｇＲＮＡ分子は少なくとも、ｃｒＲＮＡドメイン（ターゲティングドメインを含む）と、ｔｒａｃｒとを含むことが典型的である。複数の実施形態では、ｃｒＲＮＡと、ｔｒａｃｒとが、単一の連続的ポリヌクレオチド分子上に提供される。他の実施形態では、ｃｒＲＮＡと、ｔｒａｃｒとが、別個のポリヌクレオチド分子上に提供されるが、これら自体、例えば、非共有結合的ハイブリダイゼーションを介する会合が可能である。ＣＲＩＳＰＲ系の構成要素として使用されるｇＲＮＡ分子は、標的部位において、またはこの近傍において、ＤＮＡを修飾する（例えば、配列を修飾する）ために有用である。このような修飾は、例えば、標的部位を含む遺伝子の機能的産物の、発現の低減または消失を結果としてもたらす、欠失および／または挿入を含む。このような修飾はまた、異種核酸配列、例えば、前記細胞へと、本明細書で記載される鋳型核酸として施されうる、異種タンパク質（例えば、例えば、本明細書で記載されるＣＡＲ分子）をコードする核酸配列の挿入も含みうる。一部の実施形態では、挿入された異種核酸はまた、標的部位を含む遺伝子の機能的産物の発現を消失させる役割も果たす。一部の実施形態では、別個のｇＲＮＡ分子およびＣＲＩＳＰＲ系を、使用して、異種核酸の挿入の前に、これと同時に、またはこの後で、標的部位を含む遺伝子の機能的産物の発現を消失させる。これらの使用、およびさらなる使用については、下記でより完全に記載する。
【０２５０】
ある実施形態では、単分子のまたはｓｇＲＮＡは、好ましくは、５’から３’へと、ｃｒＲＮＡ（標的配列に相補的なターゲティングドメインと、フラッグポールの一部（すなわち、ｃｒＲＮＡのフラッグポール領域）を形成する領域とを含む）；ループ；およびｔｒａｃｒ（ｃｒＲＮＡのフラッグポール領域に相補的なドメインと、加えて、ヌクレアーゼまたは他のエフェクター分子、例えば、Ｃａｓ分子、例えば、Ｃａｓ９分子にも結合するドメインとを含む）を含み、以下のフォーマット（５’から３’へと）：
［ターゲティングドメイン］−［ｃｒＲＮＡのフラッグポール領域］−［任意選択の、第１のフラッグポール伸長部］−［ループ］−［任意選択の、第１のｔｒａｃｒ伸長部］−［ｔｒａｃｒのフラッグポール領域］−［ｔｒａｃｒのヌクレアーゼ結合性ドメイン］
をとりうる。
【０２５１】
複数の実施形態では、ｔｒａｃｒのヌクレアーゼ結合性ドメインは、Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９タンパク質に結合する。
【０２５２】
ある実施形態では、二分子のまたはｄｇＲＮＡは、２つのポリヌクレオチド；好ましくは、５’から３’へと、第１のｃｒＲＮＡ（標的配列に相補的なターゲティングドメインと、フラッグポールの一部を形成する領域とを含有する）；および好ましくは、５’から３’へと、第２のｔｒａｃｒ（ｃｒＲＮＡのフラッグポール領域に相補的なドメインと、加えて、ヌクレアーゼまたは他のエフェクター分子、例えば、Ｃａｓ分子、例えば、Ｃａｓ９分子にも結合するドメインとを含有する）を含み、以下のフォーマット（５’から３’へと）：
ポリヌクレオチド１（ｃｒＲＮＡ）：［ターゲティングドメイン］−［ｃｒＲＮＡのフラッグポール領域］−［任意選択の、第１のフラッグポール伸長部］−［任意選択の、第２のフラッグポール伸長部］
ポリヌクレオチド２（ｔｒａｃｒ）：［任意選択の、第１のｔｒａｃｒ伸長部］−［ｔｒａｃｒのフラッグポール領域］−［ｔｒａｃｒのヌクレアーゼ結合性ドメイン］
をとりうる。
【０２５３】
複数の実施形態では、ｔｒａｃｒのヌクレアーゼ結合性ドメインは、Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９タンパク質に結合する。
【０２５４】
一部の態様では、ターゲティングドメインは、本明細書で記載されるターゲティングドメイン配列、例えば、表１に記載されたターゲティングドメイン、もしくは、好ましくは、表２に記載されたターゲティングドメイン、または表１または表２に記載されたターゲティングドメイン配列のうちの、１７、１８、１９、もしくは２０（好ましくは２０）の連続ヌクレオチドを含むか、もしくはこれらからなるターゲティングドメインを含むか、あるいはこれらからなる。
【０２５５】
一部の態様では、フラッグポール、例えば、ｃｒＲＮＡのフラッグポール領域は、５’から３’へと、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ（配列番号５０）を含む。
【０２５６】
一部の態様では、フラッグポール、例えば、ｃｒＲＮＡのフラッグポール領域は、５’から３’へと、ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡ（配列番号５１）を含む。
【０２５７】
一部の態様では ループは、５’から３’へと、ＧＡＡＡ（配列番号５２）を含む。
【０２５８】
一部の態様ではｔｒａｃｒは、５’から３’へと、ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号５３）を含み、好ましくは、配列番号５０を含むｇＲＮＡ分子内で使用される。
【０２５９】
一部の態様では ｔｒａｃｒは、５’から３’へと、ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号５４）を含み、好ましくは、配列番号５１を含むｇＲＮＡ分子内で使用される。
【０２６０】
一部の態様では、ｇＲＮＡはまた、３’末端部に、さらなるＵ核酸も含みうる。例えば、ｇＲＮＡは、３’末端部に、さらなる１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０のＵ核酸を含みうる（配列番号５８）。ある実施形態では、ｇＲＮＡは、３’末端部に、さらなる４つのＵ核酸を含む。ｄｇＲＮＡの場合、ｄｇＲＮＡのポリヌクレオチド（例えば、ターゲティングドメインを含むポリヌクレオチド、およびｔｒａｃｒを含むポリヌクレオチド）のうちの１または複数は、３’末端部に、さらなるＵ核酸を含みうる。例えば、ｄｇＲＮＡの場合、ｄｇＲＮＡのポリヌクレオチド（例えば、ターゲティングドメインを含むポリヌクレオチド、およびｔｒａｃｒを含むポリヌクレオチド）のうちの１または複数は、３’末端部に、さらなる１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０のＵ核酸を含みうる（配列番号５８）。ある実施形態では、ｄｇＲＮＡの場合、ｄｇＲＮＡのポリヌクレオチド（例えば、ターゲティングドメインを含むポリヌクレオチド、およびｔｒａｃｒを含むポリヌクレオチド）のうちの１または複数は、３’末端部に、さらなる４つのＵ核酸を含む。ｄｇＲＮＡについてのある実施形態では、ｔｒａｃｒを含むポリヌクレオチドだけが、さらなるＵ核酸、例えば、４つのＵ核酸を含む。ｄｇＲＮＡについてのある実施形態では、ターゲティングドメインを含むポリヌクレオチドだけが、さらなるＵ核酸を含む。ｄｇＲＮＡについてのある実施形態では、ターゲティングドメインを含むポリヌクレオチド、およびｔｒａｃｒを含むポリヌクレオチドのいずれもが、さらなるＵ核酸、例えば、４つのＵ核酸を含む。
【０２６１】
一部の態様では、ｇＲＮＡはまた、３’末端部に、さらなるＡ核酸も含みうる。例えば、ｇＲＮＡは、３’末端部に、さらなる１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０のＡ核酸を含みうる（配列番号５９）。ある実施形態では、ｇＲＮＡは、３’末端部に、さらなる４つのＡ核酸を含む。ｄｇＲＮＡの場合、ｄｇＲＮＡのポリヌクレオチド（例えば、ターゲティングドメインを含むポリヌクレオチド、およびｔｒａｃｒを含むポリヌクレオチド）のうちの１または複数は、３’末端部に、さらなるＡ核酸を含みうる。例えば、ｄｇＲＮＡの場合、ｄｇＲＮＡのポリヌクレオチド（例えば、ターゲティングドメインを含むポリヌクレオチド、およびｔｒａｃｒを含むポリヌクレオチド）のうちの１または複数は、３’末端部に、さらなる１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０のＡ核酸を含みうる（配列番号５９）。ある実施形態では、ｄｇＲＮＡの場合、ｄｇＲＮＡのポリヌクレオチド（例えば、ターゲティングドメインを含むポリヌクレオチド、およびｔｒａｃｒを含むポリヌクレオチド）のうちの１または複数は、３’末端部に、さらなる４つのＡ核酸を含む。ｄｇＲＮＡについてのある実施形態では、ｔｒａｃｒを含むポリヌクレオチドだけが、さらなるＡ核酸、例えば、４つのＡ核酸を含む。ｄｇＲＮＡについてのある実施形態では、ターゲティングドメインを含むポリヌクレオチドだけが、さらなるＡ核酸を含む。ｄｇＲＮＡについてのある実施形態では、ターゲティングドメインを含むポリヌクレオチド、およびｔｒａｃｒを含むポリヌクレオチドのいずれもが、さらなるＵ核酸、例えば、４つのＡ核酸を含む。
【０２６２】
複数の実施形態では、ｇＲＮＡのポリヌクレオチドのうちの１または複数は、５’末端部に、キャップを含みうる。
【０２６３】
ある実施形態では、単分子のまたはｓｇＲＮＡは、好ましくは、５’から３’へと、ｃｒＲＮＡ（標的配列に相補的なターゲティングドメインと、ｃｒＲＮＡのフラッグポール領域と、第１のフラッグポール伸長部とを含有する）；ループ；第１のｔｒａｃｒ伸長部（第１のフラッグポール伸長部の少なくとも一部に相補的なドメインを含有する）；およびｔｒａｃｒ（ｃｒＲＮＡのフラッグポール領域に相補的なドメインと、加えて、Ｃａｓ９分子にも結合するドメインとを含有する）を含む。一部の態様では、ターゲティングドメインは、本明細書で記載されるターゲティングドメイン配列、例えば、表１もしくは表２に記載されるターゲティングドメイン、または表１もしくは表２に記載されるターゲティングドメイン配列の、１７、１８、１９、２０（好ましくは２０）の連続ヌクレオチドを含むか、またはこれからなるターゲティングドメイン、例えば、表１または表２に記載されるターゲティングドメイン配列の、３’側の１７、１８、１９、または２０（好ましくは２０）の連続ヌクレオチドを含む。
【０２６４】
第１のフラッグポール伸長部および／または第１のｔｒａｃｒ伸長部を含む、複数の態様では、フラッグポール、ループ、およびｔｒａｃｒ配列は、上記で記載した通りでありうる。一般に、それらが相補的であるという条件で、任意の第１のフラッグポール伸長部と、第１のｔｒａｃｒ伸長部とを援用することができる。複数の実施形態では、第１のフラッグポール伸長部、および第１のｔｒａｃｒ伸長部は、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、またはこれを超える相補的なヌクレオチドからなる。
【０２６５】
一部の態様では、第１のフラッグポール伸長部は、５’から３’へと、ＵＧＣＵＧ（配列番号５５）を含む。一部の態様では、第１のフラッグポール伸長部は、配列番号５５からなる。
【０２６６】
一部の態様では、第１のｔｒａｃｒ伸長部は、５’から３’へと、ＣＡＧＣＡ（配列番号５６）を含む。一部の態様では、第１のｔｒａｃｒ伸長部は、配列番号５６からなる。
【０２６７】
ある実施形態では、ｄｇＲＮＡは、２つの核酸分子を含む。一部の態様では、ｄｇＲＮＡは、好ましくは、５’から３’へと、標的配列に相補的なターゲティングドメイン；ｃｒＲＮＡのフラッグポール領域；任意選択で、第１のフラッグポール伸長部；および、任意選択で、第２のフラッグポール伸長部を含有する第１の核酸と；第２の核酸（本明細書では、ｔｒａｃｒと称しうる）とを含み、好ましくは、５’から３’へと、任意選択で、第１のｔｒａｃｒ伸長部；およびｔｒａｃｒ（ｃｒＲＮＡのフラッグポール領域に相補的なドメインと、加えて、Ｃａｓ分子、例えば、Ｃａｓ９分子にも結合するドメインとを含有する）を含む、少なくとも１つのドメイン（Ｃａｓ分子、例えば、Ｃａｓ９分子に結合する）を含む。第２の核酸は加えて、３’末端部に（例えば、ｔｒａｃｒに対して３’側に）、さらなるＵ核酸も含みうる。例えば、ｔｒａｃｒは、３’末端部に（例えば、ｔｒａｃｒに対して３’側に）、さらなる１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０のＵ核酸を含みうる（配列番号５８）。第２の核酸は加えて、または代替的に、３’末端部に（例えば、ｔｒａｃｒに対して３’側に）、さらなるＡ核酸も含みうる。例えば、ｔｒａｃｒは、３’末端部に（例えば、ｔｒａｃｒに対して３’側に）、さらなる１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０のＡ核酸を含みうる（配列番号５９）。一部の態様では、ターゲティングドメインは、本明細書で記載されるターゲティングドメイン配列、例えば、表１もしくは表２に記載されるターゲティングドメイン、または表１もしくは表２に記載されるターゲティングドメイン配列の、１７、１８、１９、もしくは２０（好ましくは２０）の連続ヌクレオチドを含むか、またはこれからなるターゲティングドメインを含む。
【０２６８】
ｄｇＲＮＡを伴う複数の態様では、ｃｒＲＮＡのフラッグポール領域、任意選択の、第１のフラッグポール伸長部、任意選択の、第１のｔｒａｃｒ伸長部、およびｔｒａｃｒ配列は、上記で記載した通りでありうる。
【０２６９】
一部の態様では、任意選択の、第２のフラッグポール伸長部は、５’から３’へと、ＵＵＵＵＧ（配列番号５７）を含む。
【０２７０】
複数の実施形態では、ｇＲＮＡ分子の（ならびに、ｄｇＲＮＡ分子の場合、ターゲティングドメインを含むポリヌクレオチド、および／またはｔｒａｃｒを含むポリヌクレオチドの）、３’側の１つ、２つ、３つ、４つ、もしくは５つのヌクレオチド、５’側の１つ、２つ、３つ、４つ、もしくは５つのヌクレオチド、または３’側および５’側の１つ、２つ、３つ、４つ、もしくは５つのヌクレオチドの両方は、下記のＸＩＩＩ節で、より完全に記載される修飾核酸である。
【０２７１】
ドメインについては、下記で簡略に論じる。
【０２７２】
１）ターゲティングドメイン：
ターゲティングドメインの選択についての指針は、例えば、Fu Y el al. NAT BIOTECHNOL 2014 (doi: 10.1038/nbt.2808)およびSternberg SH el al. NATURE 2014 (doi: 10.1038/naturel3011)において見出すことができる。
【０２７３】
ターゲティングドメインは、標的核酸上の標的配列に相補的、例えば、少なくとも８０、８５、９０、９５、もしくは９９％相補的、または例えば、完全に相補的であるヌクレオチド配列を含む。ターゲティングドメインは、ＲＮＡ分子の一部であり、したがって、ウラシル（Ｕ）塩基を含むが、ｇＲＮＡ分子をコードする任意のＤＮＡは、チミン（Ｔ）塩基を含むであろう。理論に束縛されることを望まないが、ターゲティングドメインの、標的配列との相補性は、ｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子複合体の、標的核酸との相互作用の特異性に寄与すると考えられる。ターゲティングドメインと、標的配列との対では、ターゲティングドメイン内のウラシル塩基は、標的配列内のアデニン塩基と対合すると理解される。
【０２７４】
ある実施形態では、ターゲティングドメインは、５〜５０、例えば、１０〜４０、例えば、１０〜３０、例えば、１５〜３０、例えば、１５〜２５ヌクレオチドの長さである。ある実施形態では、ターゲティングドメインは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチドの長さである。ある実施形態では、ターゲティングドメインは、１６ヌクレオチドの長さである。ある実施形態では、ターゲティングドメインは、１７ヌクレオチドの長さである。ある実施形態では、ターゲティングドメインは、１８ヌクレオチドの長さである。ある実施形態では、ターゲティングドメインは、１９ヌクレオチドの長さである。ある実施形態では、ターゲティングドメインは、２０ヌクレオチドの長さである。ある実施形態では、ターゲティングドメインは、２１ヌクレオチドの長さである。ある実施形態では、ターゲティングドメインは、２２ヌクレオチドの長さである。ある実施形態では、ターゲティングドメインは、２３ヌクレオチドの長さである。ある実施形態では、ターゲティングドメインは、２４ヌクレオチドの長さである。ある実施形態では、ターゲティングドメインは、２５ヌクレオチドの長さである。複数の実施形態では、前述の１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチドは、表１または表２に記載されるターゲティングドメインに由来する、５’側の１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチドを含む。複数の実施形態では、前述の１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチドは、表１または表２に記載されるターゲティングドメインに由来する、３’側の１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチドを含む。複数の実施形態では、前述の１６、１７、１８、１９、または２０のヌクレオチドは、表１または表２に記載されたターゲティングドメインに由来する、３’側の１６、１７、１８、１９、または２０のヌクレオチドからなる。複数の実施形態では、ターゲティングドメインは、表１または表２に記載されたターゲティングドメインからなる。
【０２７５】
理論に束縛されずに、ターゲティングドメインの３’末端部に配置される、ターゲティングドメインの、８つ、９つ、または１０の核酸は、標的配列をターゲティングするために重要な場合があり、したがって、ターゲティングドメインの「コア」領域と称しうると考えられる。ある実施形態では、コアドメインは、標的配列と完全に相補的である。
【０２７６】
本明細書では、ターゲティングドメインが相補的な標的核酸の鎖を、標的配列と称する。一部の態様では、標的配列は、染色体上に配置され、例えば、遺伝子内の標的である。一部の態様では標的配列は、遺伝子のエクソン内に配置される。一部の態様では標的配列は、遺伝子のイントロン内に配置される。一部の態様では、標的配列は、目的の遺伝子の調節エレメントの結合性部位、例えば、プロモーターの結合性部位、または転写因子結合性部位を含むか、またはこれらに対して近位（例えば、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、または１０００核酸以内）である。ターゲティングドメインのヌクレオチドの一部または全部は、修飾、例えば、本明細書のＸＩＩＩ節で見出される修飾を有しうる。
【０２７７】
２）ｃｒＲＮＡのフラッグポール領域：
フラッグポールは、ｃｒＲＮＡと、ｔｒａｃｒとが、互いに結合するか、または互いにハイブリダイズする、ｇＲＮＡの部分を含む。ｃｒＲＮＡのフラッグポール領域は、ｔｒａｃｒの部分と相補的であり、ある実施形態では、ｔｒａｃｒの部分に対して、少なくとも一部の生理学的条件下、例えば、正常な生理学的条件下で、二重鎖領域を形成するのに十分な相補性を有する。ある実施形態では、ｃｒＲＮＡのフラッグポール領域は、５〜３０ヌクレオチドの長さである。ある実施形態では、ｃｒＲＮＡのフラッグポール領域は、５〜２５ヌクレオチドの長さである。ｃｒＲＮＡのフラッグポール領域は、細菌のＣＲＩＳＰＲ系に由来する、自然発生のリピート配列部分との相同性を共有しうるか、またはこれらから導出されうる。ある実施形態では、ｃｒＲＮＡのフラッグポール領域は、本明細書で開示される、ｃｒＲＮＡのフラッグポール領域、例えば、化膿連鎖球菌（S. pyogenes）またはストレプトコッカス・サーモフィルス（S. thermophilus）のｃｒＲＮＡのフラッグポール領域と、少なくとも５０％の相同性を有する。
【０２７８】
ある実施形態では、フラッグポール、例えば、ｃｒＲＮＡフラッグポール領域は、配列番号５０を含む。ある実施形態では、フラッグポール、例えば、ｃｒＲＮＡフラッグポール領域は、配列番号５０からなる。ある実施形態では、フラッグポール、例えば、ｃｒＲＮＡフラッグポール領域は、配列番号５０との、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の相同性を有する配列を含む。ある実施形態では、フラッグポール、例えば、ｃｒＲＮＡフラッグポール領域は、配列番号５０のうちの少なくとも５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、または１１のヌクレオチドを含む。ある実施形態では、フラッグポール、例えば、ｃｒＲＮＡフラッグポール領域は、配列番号５１を含む。ある実施形態では、フラッグポール、例えば、ｃｒＲＮＡフラッグポール領域は、配列番号５１からなる。ある実施形態では、フラッグポールは、配列番号５１との、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の相同性を有する配列を含む。ある実施形態では、フラッグポール、例えば、ｃｒＲＮＡフラッグポール領域は、配列番号５１のうちの少なくとも５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、または１１のヌクレオチドを含む。
【０２７９】
ドメインのヌクレオチドの一部または全部は、修飾、例えば、本明細書のＸＩＩＩ節で記載される修飾を有しうる。
【０２８０】
３）第１のフラッグポール伸長部
第１のｔｒａｃｒ伸長部を含むｔｒａｃｒを使用する場合、ｃｒＲＮＡは、第１のフラッグポール伸長部を含みうる。一般に、それらが相補的であるという条件で、任意の第１のフラッグポール伸長部と、第１のｔｒａｃｒ伸長部とを援用することができる。複数の実施形態では、第１のフラッグポール伸長部、および第１のｔｒａｃｒ伸長部は、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、またはこれを超える相補的なヌクレオチドからなる。
【０２８１】
第１のフラッグポール伸長部は、第１のｔｒａｃｒ伸長部のヌクレオチドと相補的、例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％、例えば、完全に相補的であるヌクレオチドを含みうる。一部の態様では、第１のｔｒａｃｒ伸長部の相補的なヌクレオチドとハイブリダイズする、第１のフラッグポール伸長部のヌクレオチドは、連続である。一部の態様では、第１のｔｒａｃｒ伸長部の相補的なヌクレオチドとハイブリダイズする、第１のフラッグポール伸長部のヌクレオチドは、不連続であり、例えば、第１のｔｒａｃｒ伸長部のヌクレオチドと塩基対合しないヌクレオチドにより隔てられた、２つまたはこれを超えるハイブリダイゼーション領域を含む。一部の態様では、第１のフラッグポール伸長部は、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはこれを超えるヌクレオチドを含む。一部の態様では、第１のフラッグポール伸長部は、５’から３’へと：ＵＧＣＵＧ（配列番号５５）を含む。一部の態様では、第１のフラッグポール伸長部は、５’から３’へと：ＵＧＣＵＧ（配列番号５５）からなる。一部の態様では、第１のフラッグポール伸長部は、配列番号５５からなる。一部の態様では 第１のフラッグポール伸長部は、配列番号５５に対する、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の相同性を有する核酸を含む。
【０２８２】
第１のｔｒａｃｒ伸長部のヌクレオチドの一部または全部は、修飾、例えば、本明細書のＸＩＩＩ節で見出される修飾を有しうる。
【０２８３】
３）ループ
ループは、ｃｒＲＮＡのフラッグポール領域（または、存在する場合、任意選択で、第１のフラッグポール伸長部）を、ｓｇＲＮＡのｔｒａｃｒ（または、存在する場合、任意選択で、第１のｔｒａｃｒ伸長部）と連結するのに用いられる。ループは、ｃｒＲＮＡのフラッグポール領域と、ｔｒａｃｒとを、共有結合的に連結する場合もあり、非共有結合的に連結する場合もある。ある実施形態では、連結は、共有結合的である。ある実施形態では、ループは、ｃｒＲＮＡのフラッグポール領域と、ｔｒａｃｒとを共有結合的にカップリングさせる。ある実施形態では、ループは、第１のフラッグポール伸長部と、第１のｔｒａｃｒ伸長部とを共有結合的にカップリングさせる。ある実施形態では、ループは、ｃｒＲＮＡのフラッグポール領域と、ｃｒＲＮＡのフラッグポール領域にハイブリダイズする、ｔｒａｃｒのドメインとの間に挿入される共有結合であるか、またはこれを含む。典型的に、ループは、１つまたは複数の、例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０のヌクレオチドを含む。
【０２８４】
ｄｇＲＮＡ分子内では、ｃｒＲＮＡの少なくとも一部分（例えば、ｃｒＲＮＡのフラッグポール領域）と、ｔｒａｃｒの少なくとも一部分（例えば、ｃｒＲＮＡのフラッグポール領域に相補的な、ｔｒａｃｒのドメイン）との間のハイブリダイゼーションを介して、２つの分子が会合しうる。
【０２８５】
多種多様なループは、ｓｇＲＮＡにおける使用に適する。ループは、共有結合からなる場合もあり、１または数ヌクレオチド、例えば、１、２、３、４、または５ヌクレオチドの長さほどの短いものでもありうる。ある実施形態では、ループは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、もしくは２５ヌクレオチド、またはこれを超えるヌクレオチドの長さである。ある実施形態では、ループは、２〜５０、２〜４０、２〜３０、２〜２０、２〜１０、または２〜５ヌクレオチドの長さである。ある実施形態では、ループは、自然発生の配列との相同性を共有するか、またはこれから導出される。ある実施形態では、ループは、本明細書で開示されるループと、少なくとも５０％の相同性を有する。ある実施形態では、ループは、配列番号５２を含む。ある実施形態では、ループは、配列番号５２からなる。
【０２８６】
ドメインのヌクレオチドの一部または全部は、修飾、例えば、本明細書のＸＩＩＩ節で記載される修飾を有しうる。
【０２８７】
４）第２のフラッグポール伸長部
ある実施形態では、ｄｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡのフラッグポール領域、または、存在する場合、第１のフラッグポール伸長部に対して３’側のさらなる配列であって、本明細書では、第２のフラッグポール伸長部と称する配列を含みうる。ある実施形態では、第２のフラッグポール伸長部は、２〜１０、２〜９、２〜８、２〜７、２〜６、２〜５、または２〜４ヌクレオチドの長さである。ある実施形態では、第２のフラッグポール伸長部は、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０ヌクレオチド、またはこれを超えるヌクレオチドの長さである。ある実施形態では、第２のフラッグポール伸長部は、配列番号５７を含む。ある実施形態では、第２のフラッグポール伸長部は、配列番号５７からなる。
【０２８８】
５）ｔｒａｃｒ：
ｔｒａｃｒとは、ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９の結合に施しうる核酸配列である。理論に束縛されずに、各Ｃａｓ９分子種は、特定のｔｒａｃｒ配列と関連すると考えられる。ｔｒａｃｒ配列は、ｓｇＲＮＡ系およびｄｇＲＮＡ系のいずれにおいても活用される。表１および表２に提示された、例示的なｇＲＮＡターゲティングドメイン配列は、ｓｇＲＮＡ系およびｄｇＲＮＡ系のいずれにおいても活用することができる。
【０２８９】
ある実施形態では、ｔｒａｃｒは、化膿連鎖球菌（S. pyogenes）のｔｒａｃｒに由来するか、またはこれから導出された配列を含む。Jinek et al. (2012)を参照されたい。一部の態様では、ｔｒａｃｒは、ｃｒＲＮＡのフラッグポール部分にハイブリダイズする部分を有する、例えば、ｃｒＲＮＡのフラッグポール領域に対して、少なくとも一部の生理学的条件下で、二重鎖領域を形成するのに十分な相補性を有する（本明細書では、場合によって、ｔｒａｃｒのフラッグポール領域、またはｃｒＲＮＡのフラッグポール領域に相補的なｔｒａｃｒドメインと称する）。複数の実施形態では、ｃｒＲＮＡのフラッグポール領域とハイブリダイズする、ｔｒａｃｒのドメインは、ｃｒＲＮＡのフラッグポール領域の相補的なヌクレオチドとハイブリダイズする、少なくとも５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０のヌクレオチドを含む。一部の態様では、ｃｒＲＮＡのフラッグポール領域の相補的なヌクレオチドとハイブリダイズする、ｔｒａｃｒのヌクレオチドは、連続である。一部の態様では、ｃｒＲＮＡのフラッグポール領域の相補的なヌクレオチドとハイブリダイズする、ｔｒａｃｒのヌクレオチドは、不連続であり、例えば、ｃｒＲＮＡのフラッグポール領域のヌクレオチドと塩基対合しないヌクレオチドにより隔てられた、２つまたはこれを超えるハイブリダイゼーション領域を含む。一部の態様では、ｃｒＲＮＡのフラッグポール領域にハイブリダイズする、ｔｒａｃｒの部分は、５’から３’へと、ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡ（配列番号６１）を含む。一部の態様では、ｃｒＲＮＡのフラッグポール領域にハイブリダイズする、ｔｒａｃｒの部分は、５’から３’へと、ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡ（配列番号６２）を含む。複数の実施形態では、ｃｒＲＮＡのフラッグポール領域とハイブリダイズする配列は、ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ分子、例えば、Ｃａｓ９分子にも加えて結合するｔｒａｃｒの配列に対して５’側の、ｔｒａｃｒ上に配置される。
【０２９０】
ｔｒａｃｒは、ヌクレアーゼ、例えば、加えて、Ｃａｓ分子、例えば、Ｃａｓ９分子にも結合するドメインをさらに含む。理論に束縛されずに、異なる種に由来するＣａｓ９は、異なるｔｒａｃｒ配列に結合すると考えられる。一部の態様では、ｔｒａｃｒは、化膿連鎖球菌（S. pyogenes）のＣａｓ９分子に結合する配列を含む。Jinek et al. (2012)を参照されたい。一部の態様では、ｔｒａｃｒは、本明細書で開示されるＣａｓ９分子に結合する配列を含む。一部の態様では、Ｃａｓ９分子にも加えて結合するドメインは、５’から３’へと、ＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号６３）を含む。一部の態様では Ｃａｓ９分子にも加えて結合するドメインは、５’から３’へと、ＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（配列番号６４）を含む。
【０２９１】
一部の実施形態では、ｔｒａｃｒは、配列番号５３を含む。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒは、配列番号５４を含む。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒは、配列番号５３からなる。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒは、配列番号５４からなる。
【０２９２】
ｔｒａｃｒのヌクレオチドの一部または全部は、修飾、例えば、本明細書の第ＸＩＩＩ節に見出される修飾を有しうる。
【０２９３】
複数の実施形態では、上記で記載した、ｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ構成要素のうちのいずれかは、５’末端部、３’末端部、または５’末端部および３’末端部の両方における、逆位非塩基性残基（例えば、ｓｇＲＮＡ内またはｄｇＲＮＡのｔｒａｃｒ内および／もしくはｃｒＲＮＡ内の）を含む。複数の実施形態では、上記で記載した、ｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ構成要素のうちのいずれかは、１または複数のホスホロチオエート結合を含む。例えば、１または複数のホスホロチオエート結合は、ポリヌクレオチドの５’末端部における残基の間の、１または複数のホスホロチオエート結合、例えば、最初の２つの５’残基の間、最初の３つの５’残基の各々の間、最初の４つの５’残基の各々の間、または最初の５つの５’残基の各々の間のホスホロチオエート結合（例えば、ｓｇＲＮＡ内またはｄｇＲＮＡのｔｒａｃｒ内および／もしくはｃｒＲＮＡ内の）でありうる。複数の実施形態では、ｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ構成要素は、代替的に、または加えて、ポリヌクレオチドの３’末端部における残基の間の、１または複数のホスホロチオエート結合、例えば、最初の２つの３’残基の間、最初の３つの３’残基の各々の間、最初の４つの３’残基の各々の間、または最初の５つの３’残基の各々の間のホスホロチオエート（phosphrothioate）結合も含みうる。ある実施形態では、上記で記載したｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ構成要素は、最初の４つの５’残基の各々の間のホスホロチオエート結合（例えば、５’末端部における、３つのホスホロチオエート結合を含む、または、これからなる）、および最初の４つの３’残基の各々の間のホスホロチオエート結合（例えば、３’末端部における、３つのホスホロチオエート結合を含む、または、これからなる）を含む。ある実施形態では、上記で記載したホスホロチオエート修飾のうちのいずれかを、ポリヌクレオチドの、５’末端部、３’末端部、または５’末端部および３’末端部の両方における、逆位非塩基性残基と組み合わせることができる。このような実施形態では、逆位非塩基性ヌクレオチドを、リン酸結合またはホスホロチオエート結合により、５’ヌクレオチドおよび／または３’ヌクレオチドと連結することができる。
【０２９４】
複数の実施形態では、上記で記載したｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ構成要素は、２’−Ｏ−メチル修飾を含む、１または複数のヌクレオチドを含む。複数の実施形態では、５’残基のうちの、最初の１つ、２つ、３つ、またはこれを超えるものの各々は、２’−Ｏ−メチル修飾を含む。複数の実施形態では、３’残基のうちの、最初の１つ、２つ、３つ、またはこれを超えるものの各々は、２’−Ｏ−メチル修飾を含む。複数の実施形態では、末端に対して４つ目、末端に対して３つ目、および末端に対して２つ目の３’残基は、２’−Ｏ−メチル修飾を含む。複数の実施形態では、５’残基のうちの、最初の１つ、２つ、３つ、またはこれを超えるものの各々は、２’−Ｏ−メチル修飾を含み、３’残基のうちの、最初の１つ、２つ、３つ、またはこれを超えるものの各々は、２’−Ｏ−メチル修飾を含む。ある実施形態では、５’残基のうちの、最初の３つの各々は、２’−Ｏ−メチル修飾を含み、３’残基のうちの、最初の３つの各々は、２’−Ｏ−メチル修飾を含む。複数の実施形態では、５’残基のうちの、最初の３つの各々は、２’−Ｏ−メチル修飾を含み、末端に対して４つ目、末端に対して３つ目、および末端に対して２つ目の３’残基は、２’−Ｏ−メチル修飾を含む。複数の実施形態では、例えば、上記で記載した２’−Ｏ−メチル修飾のうちのいずれかを、例えば、上記で記載した、１もしくは複数のホスホロチオエート修飾、および／または、例えば、上記で記載した、１もしくは複数の逆位非塩基性修飾と組み合わせることができる。
【０２９５】
ある実施形態では、上記で記載したｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ構成要素は、最初の４つの５’残基の各々の間のホスホロチオエート結合（例えば、ポリヌクレオチドの５’末端部における、３つのホスホロチオエート結合を含む、または、これからなる）、最初の４つの３’残基の各々の間のホスホロチオエート結合（例えば、ポリヌクレオチドの５’末端部における、３つのホスホロチオエート結合を含む、または、これからなる）、最初の３つの５’残基の各々における２’−Ｏ−メチル修飾、および最初の３つの３’残基の各々における２’−Ｏ−メチル修飾を含む、または、これからなる。
【０２９６】
ある実施形態では、上記で記載した、ｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ構成要素は、最初の４つの５’残基の各々の間のホスホロチオエート結合（例えば、ポリヌクレオチドの５’末端部における、３つのホスホロチオエート結合を含むか、またはこれらからなる）、最初の４つの３’残基の各々の間のホスホロチオエート結合（例えば、ポリヌクレオチドの５’末端部における、３つのホスホロチオエート結合を含むか、またはこれらからなる）、最初の３つの５’残基の各々における２’−Ｏ−メチル修飾、ならびに末端に対して４つ目、末端に対して３つ目、および末端に対して２つ目の３’残基の各々における２’−Ｏ−メチル修飾を含むか、またはこれらからなる。
【０２９７】
ある実施形態では、上記で記載した、ｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ構成要素は、最初の４つの５’残基の各々の間のホスホロチオエート結合（例えば、ポリヌクレオチドの５’末端部における、３つのホスホロチオエート結合を含むか、またはこれらからなる）、最初の４つの３’残基の各々の間のホスホロチオエート結合（例えば、ポリヌクレオチドの５’末端部における、３つのホスホロチオエート結合を含むか、またはこれらからなる）、最初の３つの５’残基の各々における２’−Ｏ−メチル修飾、最初の３つの３’残基の各々における２’−Ｏ−メチル修飾、および５’末端部および３’末端部の各々における、さらなる逆位非塩基性残基を含むか、またはこれらからなる。
【０２９８】
ある実施形態では、上記で記載したｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ構成要素は、最初の４つの５’残基の各々の間のホスホロチオエート結合（例えば、ポリヌクレオチドの５’末端部における、３つのホスホロチオエート結合を含む、または、これからなる）、最初の４つの３’残基の各々の間のホスホロチオエート結合（例えば、ポリヌクレオチドの５’末端部における、３つのホスホロチオエート結合を含む、または、これからなる）、最初の３つの５’残基の各々における２’−Ｏ−メチル修飾、ならびに末端に対して４つ目、末端に対して３つ目、および末端に対して２つ目の３’残基の各々における２’−Ｏ−メチル修飾、ならびに５’末端部および３’末端部の各々における、さらなる逆位非塩基性残基を含む、または、これからなる。
【０２９９】
ｇＲＮＡ分子の具体的な実施形態については、下記で詳細に記載する。各々は、ターゲティングドメインのうちの２０の核酸残基（下記の各配列中のＮ’）を伴うことが示されるが、ターゲティングドメインは、５つ〜５０の残基、例えば、１５〜３０の残基、例えば、１５〜２５の残基、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５の残基を含みうるか、またはこれらからなりうることが理解されるであろう。複数の実施形態では、ｇＲＮＡは、ｄｇＲＮＡであり、以下を含むか、またはこれらからなる：
ｃｒＲＮＡ：
【０３００】
ｍＮ＊ｍＮ＊ｍＮ＊ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵ＊ｍＧ＊ｍＣ＊ｍＵ（配列番号６６）［配列中、ｍは、２’−Ｏ−メチル修飾を伴う塩基を指し示し、＊は、ホスホロチオエート結合を指し示し、Ｎは、例えば、本明細書で記載されるターゲティングドメインの残基を指し示す］（任意選択で、５’末端および／または３’末端において、逆位非塩基性残基を伴う）；および
ｔｒａｃｒ：
【０３０１】
ＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号６５）（任意選択で、５’末端および／または３’末端において、逆位非塩基性残基を伴う）
を含む、または、これからなる。
【０３０２】
複数の実施形態では、ｇＲＮＡは、ｄｇＲＮＡであり、
ｃｒＲＮＡ：
ｍＮ＊ｍＮ＊ｍＮ＊ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵ＊ｍＧ＊ｍＣ＊ｍＵ（配列番号６６）［配列中、ｍは、２’−Ｏ−メチル修飾を伴う塩基を指し示し、＊は、ホスホロチオエート結合を指し示し、Ｎは、例えば、本明細書で記載されるターゲティングドメインの残基を指し示す］（任意選択で、５’末端および／または３’末端において、逆位非塩基性残基を伴う）；および
ｔｒａｃｒ：
ｍＡ＊ｍＡ＊ｍＣ＊ＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ＊ｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ（配列番号６７［配列中、ｍは、２’−Ｏ−メチル修飾を伴う塩基を指し示し、＊は、ホスホロチオエート結合を指し示し、Ｎは、ターゲティングドメインの残基を指し示す］（任意選択で、５’末端および／または３’末端において、逆位非塩基性残基を伴う）
を含む、または、これからなる。
【０３０３】
複数の実施形態では、ｇＲＮＡは、ｄｇＲＮＡであり、
ｃｒＲＮＡ：
ｍＮ＊ｍＮ＊ｍＮ＊ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵ＊ｍＵ＊ｍＵ＊ｍＧ（配列番号６８）［配列中、ｍは、２’−Ｏ−メチル修飾を伴う塩基を指し示し、＊は、ホスホロチオエート結合を指し示し、Ｎは、例えば、本明細書で記載されるターゲティングドメインの残基を指し示す］（任意選択で、５’末端および／または３’末端において、逆位非塩基性残基を伴う）；および
ｔｒａｃｒ：
ＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号６５）（任意選択で、５’末端および／または３’末端において、逆位非塩基性残基を伴う）
を含む、または、これからなる。
【０３０４】
複数の実施形態では、ｇＲＮＡは、ｄｇＲＮＡであり、
ｃｒＲＮＡ：
ｍＮ＊ｍＮ＊ｍＮ＊ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵ＊ｍＵ＊ｍＵ＊ｍＧ（配列番号６８）［配列中、ｍは、２’−Ｏ−メチル修飾を伴う塩基を指し示し、＊は、ホスホロチオエート結合を指し示し、Ｎは、例えば、本明細書で記載されるターゲティングドメインの残基を指し示す］（任意選択で、５’末端および／または３’末端において、逆位非塩基性残基を伴う）；および
ｔｒａｃｒ：
ｍＡ＊ｍＡ＊ｍＣ＊ＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ＊ｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ（配列番号６７）［配列中、ｍは、２’−Ｏ−メチル修飾を伴う塩基を指し示し、＊は、ホスホロチオエート結合を指し示す］（任意選択で、５’末端および／または３’末端において、逆位非塩基性残基を伴う）
を含む、または、これからなる。
【０３０５】
複数の実施形態では、ｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡであり、
ｍＮ＊ｍＮ＊ｍＮ＊ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵ＊ｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ（配列番号６９）［配列中、ｍは、２’−Ｏ−メチル修飾を伴う塩基を指し示し、＊は、ホスホロチオエート結合を指し示し、Ｎは、例えば、本明細書で記載されるターゲティングドメインの残基を指し示す］（任意選択で、５’末端および／または３’末端において、逆位非塩基性残基を伴う）
を含む、または、これからなる。
【０３０６】
複数の実施形態では、ｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡであり、
ｍＮ＊ｍＮ＊ｍＮ＊ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ＊Ｕ（配列番号７０）［配列中、ｍは、２’−Ｏ−メチル修飾を伴う塩基を指し示し、＊は、ホスホロチオエート結合を指し示し、Ｎは、例えば、本明細書で記載されるターゲティングドメインの残基を指し示す］（任意選択で、５’末端および／または３’末端において、逆位非塩基性残基を伴う）
を含む、または、これからなる。
【０３０７】
６）第１のｔｒａｃｒ伸長部
ｇＲＮＡが、第１のフラッグポール伸長部を含む場合、ｔｒａｃｒは、第１のｔｒａｃｒ伸長部を含みうる。第１のｔｒａｃｒ伸長部は、第１のフラッグポール伸長部のヌクレオチドに相補的、例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％、例えば、完全に相補的であるヌクレオチドを含みうる。一部の態様では、第１のフラッグポール伸長部の相補的なヌクレオチドとハイブリダイズする、第１のｔｒａｃｒ伸長部のヌクレオチドは、連続である。一部の態様では、第１のフラッグポール伸長部の相補的なヌクレオチドとハイブリダイズする、第１のｔｒａｃｒ伸長部のヌクレオチドは、不連続であり、例えば、第１のフラッグポール伸長部のヌクレオチドと塩基対合しないヌクレオチドにより隔てられた、２つまたはこれを超えるハイブリダイゼーション領域を含む。一部の態様では、第１のｔｒａｃｒ伸長部は、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはこれを超えるヌクレオチドを含む。一部の態様では、第１のｔｒａｃｒ伸長部は、配列番号５６を含む。一部の態様では 第１のｔｒａｃｒ伸長部は、配列番号５６に対する、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の相同性を有する核酸を含む。
【０３０８】
第１のｔｒａｃｒ伸長部のヌクレオチドの一部または全部は、修飾、例えば、本明細書のＸＩＩＩ節で見出される修飾を有しうる。
【０３０９】
一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ターゲティングドメインに対して３’側に配置されて、５’から３’へと：
ａ）
ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号７１）；
ｂ）
ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号７２）；
ｃ）
ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号７３）；
ｄ）
ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号７４）；
ｅ）３’末端部において、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、もしくは７つのウラシル（Ｕ）ヌクレオチド、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、もしくは７つのウラシル（Ｕ）ヌクレオチドをさらに含む、上記のａ）〜ｄ）のうちのいずれか；
ｆ）３’末端部において、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、もしくは７つのアデニン（Ａ）ヌクレオチド、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、もしくは７つのアデニン（Ａ）ヌクレオチドをさらに含む、上記のａ）〜ｄ）のうちのいずれか；または
ｇ）５’末端部において（例えば、５’末端において、例えば、ターゲティングドメインに対して５’側において）、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、もしくは７つのアデニン（Ａ）ヌクレオチド、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、もしくは７つのアデニン（Ａ）ヌクレオチドをさらに含む、上記のａ）〜ｆ）のうちのいずれか
を含みうる。
【０３１０】
ある実施形態では、本開示のｓｇＲＮＡは、５’から３’へと：［ターゲティングドメイン］−
ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（配列番号７５）を含む、または、これからなる。
【０３１１】
ある実施形態では、本開示のｓｇＲＮＡは、５’から３’へと：［ターゲティングドメイン］−
ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（配列番号７６）を含む、または、これからなる。
【０３１２】
複数の実施形態では、上記のａ）〜ｇ）のうちのいずれかを、ターゲティングドメインに対して、すぐ３’側に配置する。
【０３１３】
一部の実施形態では、ｄｇＲＮＡは、
好ましくは、ターゲティングドメインに対して、すぐ３’側に配置されて、５’から３’へと、
ａ）  ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ（配列番号５０）；
ｂ）  ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡ（配列番号５１）；
ｃ）  ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧ（配列番号７７）；
ｄ）  ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧ（配列番号７８）；
ｅ）  ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ（配列番号７９）；
ｆ）  ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ（配列番号８０）；または
ｇ）  ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵ（配列番号８１）：
を含むｃｒＲＮＡと、
５’から３’へと、
ａ）  ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号５３）；
ｂ）  ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号５４）；
ｃ）  ＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号８２）；
ｄ）  ＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号８３）；
ｅ）  ＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号６５）；
ｆ）  ＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号８４）；
ｇ）  ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（配列番号７６）；
ｈ）  ＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵ（配列番号８５）；
ｉ）  ＧＵＵＧＧＡＡＣＣＡＵＵＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵ（配列番号８６）；
ｊ）  ＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号８７）；
ｋ）３’末端部において、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、もしくは７つのウラシル（Ｕ）ヌクレオチド、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、もしくは７つのウラシル（Ｕ）ヌクレオチドをさらに含む、上記のａ）〜ｊ）のうちのいずれか；
ｌ）３’末端部において、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、もしくは７つのアデニン（Ａ）ヌクレオチド、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、もしくは７つのアデニン（Ａ）ヌクレオチドをさらに含む、上記のａ）〜ｊ）のうちのいずれか；または
ｍ）５’末端部（例えば、５’末端）において、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、もしくは７つのアデニン（Ａ）ヌクレオチド、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、もしくは７つのアデニン（Ａ）ヌクレオチドをさらに含む、上記のa）〜l）のうちのいずれか
を含むｔｒａｃｒと
を含みうる。
【０３１４】
ある実施形態では、例えば、転写のために、Ｕ６プロモーターを使用する場合、上記のｋ）の配列は、３’配列であるＵＵＵＵＵＵを含む。ある実施形態では、例えば、転写のために、ＨＩプロモーターを使用する場合、上記のｋ）の配列は、３’配列であるＵＵＵＵを含む。ある実施形態では、上記のｋ）の配列は、例えば、使用されるｐｏｌ−ＩＩＩプロモーターの終結シグナルに応じて、可変数の３’Ｕを含む。ある実施形態では、Ｔ７プロモーターを使用する場合、上記のｋ）の配列は、ＤＮＡ鋳型に由来する可変３’配列を含む。ある実施形態では、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を使用して、ＲＮＡ分子を作出する場合、上記のｋ）の配列は、ＤＮＡ鋳型に由来する可変３’配列を含む。ある実施形態では、例えば、ｐｏｌ−ＩＩプロモーターを使用して、転写を駆動する場合、上記のｋ）の配列は、ＤＮＡ鋳型に由来する可変３’配列を含む。
【０３１５】
ある実施形態では、ｃｒＲＮＡは、配列番号７９を含み、ｔｒａｃｒは、ＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号６５）を含む、または、これからなる。
【０３１６】
ある実施形態では、ｃｒＲＮＡは、配列番号８０を含み、ｔｒａｃｒは、ＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号８４）を含む、または、これからなる。
【０３１７】
ある実施形態では、ｃｒＲＮＡは、ターゲティングドメインと、ターゲティングドメインに対して、３’側に配置され（例えば、ターゲティングドメインに対して、すぐ３’側に配置され）、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵ（配列番号８１）を含む、または、これらからなる配列とを含み、例えば、これからなり、ｔｒａｃｒは、ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（配列番号７６）を含む、または、これからなる。
【０３１８】
ある実施形態では、ｃｒＲＮＡは、ターゲティングドメインと、ターゲティングドメインに対して、３’側に配置され（例えば、ターゲティングドメインに対して、すぐ３’側に配置され）、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵ（配列番号８１）を含む、または、これらからなる配列とを含み、例えば、これからなり、ｔｒａｃｒは、ＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵ（配列番号８５）を含む、または、これからなる。
【０３１９】
ある実施形態では、ｃｒＲＮＡは、ターゲティングドメインと、ターゲティングドメインに対して、３’側に配置され（例えば、ターゲティングドメインに対して、すぐ３’側に配置され）、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ（配列番号７９）を含む、例えば、これらからなる配列とを含み、または、これからなり、ｔｒａｃｒは、ＧＵＵＧＧＡＡＣＣＡＵＵＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵ（配列番号８６）を含む、または、これからなる。
【０３２０】
本開示のｇＲＮＡ分子および他の態様に有用なターゲティングドメイン。
下記の表に、本開示のＣＲＩＳＰＲ系、細胞、組成物、および方法における、例えば、ＴＥＴ２の発現および／もしくは機能の低減もしくは消失、ならびに／またはＴＥＴ２、例えば、ＴＥＴ２のイントロンまたはイントロン−エクソン接合部の標的配列における、またはこの近傍における、異種核酸配列（例えば、例えば、本明細書で記載される、ＣＡＲをコードする核酸配列）の挿入における使用のための、ｇＲＮＡ分子のためのターゲティングドメインを提示する。
【０３２１】
【表２−１】
2020513832.tif 000030
【０３２２】
【表２−２】
2020513832.tif 000031
【０３２３】
【表２−３】
2020513832.tif 000032
【０３２４】
【表２−４】
2020513832.tif 000033
【０３２５】
【表２−５】
2020513832.tif 000034
【０３２６】
【表２−６】
2020513832.tif 000035
【０３２７】
【表２−７】
2020513832.tif 000036
【０３２８】
【表２−８】
2020513832.tif 000037
【０３２９】
【表２−９】
2020513832.tif 000038
【０３３０】
【表２−１０】
2020513832.tif 000039
【０３３１】
【表２−１１】
2020513832.tif 000040
【０３３２】
【表２−１２】
2020513832.tif 000041
【０３３３】
【表２−１３】
2020513832.tif 000042
【０３３４】
【表２−１４】
2020513832.tif 000043
【０３３５】
【表２−１５】
2020513832.tif 000044
【０３３６】
【表２−１６】
2020513832.tif 000045
【０３３７】
【表２−１７】
2020513832.tif 000046
【０３３８】
【表２−１８】
2020513832.tif 000047
【０３３９】
【表２−１９】
2020513832.tif 000048
【０３４０】
【表２−２０】
2020513832.tif 000049
【０３４１】
【表２−２１】
2020513832.tif 000050
【０３４２】
【表２−２２】
2020513832.tif 000051
【０３４３】
【表２−２３】
2020513832.tif 000052
【０３４４】
【表２−２４】
2020513832.tif 000053
【０３４５】
【表２−２５】
2020513832.tif 000054
【０３４６】
【表２−２６】
2020513832.tif 000055
【０３４７】
【表２−２７】
2020513832.tif 000056
【０３４８】
【表２−２８】
2020513832.tif 000057
【０３４９】
【表２−２９】
2020513832.tif 000058
【０３５０】
【表２−３０】
2020513832.tif 000059
【０３５１】
【表２−３１】
2020513832.tif 000060
【０３５２】
【表２−３２】
2020513832.tif 000061
【０３５３】
【表２−３３】
2020513832.tif 000062
【０３５４】
【表２−３４】
2020513832.tif 000063
【０３５５】
【表２−３５】
2020513832.tif 000064
【０３５６】
【表２−３６】
2020513832.tif 000065
【０３５７】
【表２−３７】
2020513832.tif 000066
【０３５８】
【表２−３８】
2020513832.tif 000067
【０３５９】
【表２−３９】
2020513832.tif 000068
【０３６０】
【表２−４０】
2020513832.tif 000069
【０３６１】
【表２−４１】
2020513832.tif 000070
【０３６２】
【表２−４２】
2020513832.tif 000071
【０３６３】
【表２−４３】
2020513832.tif 000072
【０３６４】
【表２−４４】
2020513832.tif 000073
【０３６５】
【表２−４５】
2020513832.tif 000074
【０３６６】
【表２−４６】
2020513832.tif 000075
【０３６７】
【表２−４７】
2020513832.tif 000076
【０３６８】
【表２−４８】
2020513832.tif 000077
【０３６９】
【表２−４９】
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【０４０１】
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【０４１０】
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【０４２０】
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【０４２５】
【表２−１０５】
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【０４２７】
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【０４２８】
【表２−１０８】
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【０４２９】
【表２−１０９】
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【０４３０】
【表２−１１０】
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【０４３１】
【表２−１１１】
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【０４３２】
【表２−１１２】
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【０４３３】
【表２−１１３】
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【０４３４】
【表２−１１４】
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【０４３５】
【表２−１１５】
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【０４３６】
【表２−１１６】
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【０４３７】
【表２−１１７】
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【０４３８】
【表２−１１８】
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【０４３９】
【表２−１１９】
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【０４４０】
【表２−１２０】
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【０４４１】
【表２−１２１】
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【０４４２】
【表２−１２２】
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【０４４３】
【表２−１２３】
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【０４４４】
【表２−１２４】
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【０４４５】
【表２−１２５】
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【０４４６】
【表２−１２６】
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【０４４７】
【表２−１２７】
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【０４４８】
【表２−１２８】
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【０４４９】
【表２−１２９】
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【０４５０】
【表２−１３０】
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【０４５１】
【表２−１３１】
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【０４５２】
【表２−１３２】
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【０４５３】
【表２−１３３】
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【０４５４】
【表２−１３４】
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【０４５５】
【表２−１３５】
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【０４５６】
【表２−１３６】
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【０４５７】
【表２−１３７】
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【０４５８】
【表２−１３８】
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【０４５９】
【表２−１３９】
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【０４６０】
【表２−１４０】
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【０４６１】
【表２−１４１】
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【０４６２】
【表２−１４２】
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【０４６３】
【表２−１４３】
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【０４６４】
【表２−１４４】
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【０４６５】
【表２−１４５】
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【０４６６】
【表２−１４６】
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【０４６７】
【表２−１４７】
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【０４６８】
【表２−１４８】
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【０４６９】
【表２−１４９】
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【０４７０】
【表２−１５０】
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【０４７１】
【表２−１５１】
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【０４７２】
【表２−１５２】
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【０４７３】
【表２−１５３】
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【０４７４】
【表２−１５４】
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【０４７５】
【表２−１５５】
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【０４７６】
【表２−１５６】
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【０４７７】
【表２−１５７】
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【０４７８】
【表２−１５８】
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【０４７９】
【表２−１５９】
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【０４８０】
【表２−１６０】
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【０４８１】
【表２−１６１】
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【０４８２】
【表２−１６２】
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【０４８３】
【表２−１６３】
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【０４８４】
【表２−１６４】
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【０４８５】
【表２−１６５】
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【０４８６】
【表２−１６６】
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【０４８７】
【表２−１６７】
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【０４８８】
【表２−１６８】
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【０４８９】
【表２−１６９】
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【０４９０】
【表２−１７０】
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【０４９１】
【表２−１７１】
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【０４９２】
【表２−１７２】
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【０４９３】
【表２−１７３】
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【０４９４】
【表２−１７４】
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【０４９５】
【表２−１７５】
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【０４９６】
【表２−１７６】
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【０４９７】
【表２−１７７】
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【０４９８】
【表２−１７８】
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【０４９９】
【表２−１７９】
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【０５００】
【表２−１８０】
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【０５０１】
【表２−１８１】
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【０５０２】
【表２−１８２】
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【０５０３】
【表２−１８３】
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【０５０４】
【表２−１８４】
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【０５０５】
【表２−１８５】
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【０５０６】
【表２−１８６】
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【０５０７】
【表２−１８７】
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【０５０８】
【表２−１８８】
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【０５０９】
【表２−１８９】
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【０５１０】
【表２−１９０】
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【０５１１】
【表２−１９１】
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【０５１２】
【表２−１９２】
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【０５１３】
【表２−１９３】
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【０５１４】
【表２−１９４】
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【０５１５】
【表２−１９５】
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【０５１６】
【表２−１９６】
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【０５１７】
【表２−１９７】
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【０５１８】
【表２−１９８】
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【０５１９】
好ましい実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、エクソン９とエクソン１０との間のイントロン内の配列をターゲティングするか、または前記イントロンのＤＮＡ内の切断を誘導する、イントロン−エクソン接合部をターゲティングする。このようなｇＲＮＡ分子の例は、配列番号１０１０２〜配列番号１０３２４のうちのいずれか１つのターゲティングドメインを含む、例えば、これらからなるｇＲＮＡ分子である。特に好ましいｇＲＮＡ分子は、表２に示されたターゲティングドメインを含む、例えば、これらからなるｇＲＮＡ分子である。
【０５２０】
【表３−１】
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【０５２１】
【表３−２】
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【０５２２】
特に好ましいｇＲＮＡ分子は、配列番号１０１４８、配列番号１０１８４、配列番号１０１８５、配列番号１０１８８、配列番号１０２０９、配列番号１０２１２、配列番号１０３１７、配列番号１０３１８、配列番号１０１８７、配列番号１０２２４、配列番号１０２９２、配列番号１０１４９、配列番号１０１７７、配列番号１０１５１、配列番号１０２２５または配列番号１０５０９のうちのいずれか１つのターゲティングドメイン配列を含む、例えば、これらからなるｇＲＮＡ分子である。
【０５２３】
一部の実施形態では、好ましいｇＲＮＡ分子は、配列番号１０１４８、１０１４９、１０２０６、１０１９１、１０５１５、１０２０３、１０２５９、１０１３６、１０３１４、１０２３４、１０２９０、１０２３３、１０２０９、１０２２４、１０２１２、１０３１７、１０３１８、１０２２５、１０１８４、１０１８５、１０１８８、１０１８７、１０２９２、１０１５１、１０５０９、１０２８１、１０２９９、１０３０１、または１０１７７のターゲティングドメイン配列を含むか、またはこれらからなるｇＲＮＡ分子である。
【０５２４】
一部の実施形態では、好ましいｇＲＮＡ分子は、配列番号１０１４８、１０１４９、１０２９０、１０２０９、１０２２４、１０２１２、１０３１７、１０３１８、１０２２５、１０１８４、１０１８５、１０１８８、１０１８７、１０２９２、１０１５１、１０５０９、１０２８１、または１０１７７のターゲティングドメイン配列を含むか、またはこれらからなるｇＲＮＡ分子である。
【０５２５】
一部の実施形態では、好ましいｇＲＮＡ分子は、配列番号１０２０６、１０１９１、１０５１５、１０２０３、１０２５９、１０１３６、１０３１４、または１０２３４のターゲティングドメイン配列を含むか、またはこれらからなるｇＲＮＡ分子である。
【０５２６】
一部の実施形態では、好ましいｇＲＮＡ分子は、配列番号１０１９１、１０２０３、１０２５９、１０１３６、１０３１４、または１０２３４のターゲティングドメイン配列を含むか、またはこれらからなるｇＲＮＡ分子である。
【０５２７】
一部の実施形態では、好ましいｇＲＮＡ分子は、配列番号１０１４８、１０１４９、または１０２０６のターゲティングドメイン配列を含むか、またはこれらからなるｇＲＮＡ分子である。一部の実施形態では、好ましいｇＲＮＡ分子は、配列番号１０１４８のターゲティングドメイン配列を含むか、またはこれらからなるｇＲＮＡ分子である。一部の実施形態では、好ましいｇＲＮＡ分子は、配列番号１０１４９のターゲティングドメイン配列を含むか、またはこれらからなるｇＲＮＡ分子である。一部の実施形態では、好ましいｇＲＮＡ分子は、配列番号１０２０６のターゲティングドメイン配列を含むか、またはこれらからなるｇＲＮＡ分子である。
【０５２８】
ある態様では、本開示は、遺伝子編集系、例えば、ＣＲＩＳＰＲ系、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ系、ＴＡＬＥＮ系、またはメガヌクレアーゼ系を、ＴＥＴ２イントロン、またはＴＥＴ２イントロン−エクソン接合部の標的配列へと方向付けるために有用な組成物をさらに提供する。複数の実施形態では、遺伝子編集系は、例えば、異種核酸配列（例えば、例えば、本明細書で記載されるＣＡＲをコードする配列）の、標的遺伝子座における、またはこの近傍における挿入のための鋳型核酸をさらに含む。ある態様では、遺伝子編集系は、ＴＥＴ２イントロン、またはＴＥＴ２イントロン−エクソン接合部の標的配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含むｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ系である。ＣＲＩＳＰＲ系を伴う、複数の実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、ＣＲＩＳＰＲ系のＣａｓ分子（例えば、Ｃａｓ９分子）の、ＰＡＭ認識配列と隣接する標的配列と相補的なターゲティングドメイン配列を含む。表３は、ｈｇ３８に従う、ヒトＴＥＴ２イントロンのゲノム位置を提示する。ある態様では、遺伝子編集系、例えば、ＣＲＩＳＰＲ系は、表３に列挙されたイントロンの、始点ヌクレオチドから終点ヌクレオチドの間の配列（例えば、２つのヌクレオチドの間の配列）において、切断（例えば、一本鎖切断または二本鎖切断）を創出する。好ましい一態様では、遺伝子編集系、例えば、ＣＲＩＳＰＲ系は、表３の、エクソン９とエクソン１０との間のイントロンの、始点ヌクレオチドから終点ヌクレオチドの間の配列（例えば、２つのヌクレオチドの間の配列）において（例えば、ｈｇ３８に従う、ｃｈ４：１０５２６９７４８〜ｃｈ４：１０５２７２５６３の間の位置において）、切断（例えば、一本鎖切断または二本鎖切断）を創出する。
【０５２９】
【表４】
2020513832.tif 000230
【０５３０】
ＩＩＩ．ｇＲＮＡをデザインするための方法
本明細書では、ｇＲＮＡをデザインするための方法であって、標的配列を選択し、デザインし、検証するための方法を含む方法が記載される。本明細書ではまた、例示的なターゲティングドメインも提供される。本明細書で論じられるターゲティングドメインを、本明細書で記載されるｇＲＮＡへと組み込むことができる。
【０５３１】
標的配列を選択および検証するための方法、ならびにオフターゲット解析のための方法については、例えば、Mali el al. , 2013 SCIENCE 339(6121): 823-826; Hsu et al , 2013 NAT BIOTECHNOL, 31 (9): 827-32; Fu et al , 2014 NAT BIOTECHNOL, doi: 10.1038/nbt.2808. PubMed PM ID: 24463574; Heigwer et al, 2014 NAT METHODS ll (2): 122-3. doi: 10.1038/nmeth.2812. PubMed PMID: 24481216; Bae el al , 2014 BIOINFORMATICS PubMed PMID: 24463181 ; Xiao A el al , 2014 BIOINFORMATICS PubMed PMID: 24389662において記載されている。
【０５３２】
例えば、ソフトウェアツールを使用して、使用者の標的配列内のｇＲＮＡの選択を最適化する、例えば、ゲノムにわたる、全オフターゲット活性を最小化することができる。オフターゲット活性は、切断以外の活性でもありうる。例えば、化膿連鎖球菌（（S. pyogenes）のＣａｓ９を使用する、可能な各ｇＲＮＡの選択のために、ツールは、ゲノムにわたり、ある特定の数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）までのミスマッチ塩基対を含有する、全てのオフターゲット配列（例えば、ＮＡＧ  ＰＡＭまたはＮＧＧ  ＰＡＭに先行する）を同定しうる。各オフターゲット配列における切断効率は、例えば、実験由来の重みづけスキームを使用して予測することができる。次いで、可能な各ｇＲＮＡを、予測されるその全オフターゲット切断に従いランク付けすると、上位にランク付けされたｇＲＮＡは、最多のオンターゲット切断と、最少のオフターゲット切断とを有する可能性が高いｇＲＮＡを表す。ツールにはまた、他の機能、例えば、ＣＲＩＳＰＲ構築のための自動式の試薬デザイン、オンターゲットについてのＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイのためのプライマーデザイン、および次世代シーケンシングを介する、オフターゲット切断のハイスループットの検出および定量化のためのプライマーデザインも含まれうる。候補ｇＲＮＡ分子は、当技術分野で公知の方法、または本明細書で記載される方法により査定することができる。
【０５３３】
ソフトウェアアルゴリズムを使用して、潜在的なｇＲＮＡ分子の初期リストを作成しうるが、切断の効率および特異性は、必ずしも、予測値を反映するものではなく、ｇＲＮＡ分子は典型的に、例えば、切断効率、インデル形成、切断特異性、および、所望される表現型の変化を決定するのに、具体的な細胞系、例えば、一次ヒト細胞系、例えば、一次ヒト免疫エフェクター細胞、例えば、初代ヒトＴ細胞におけるスクリーニングを要求する。これらの特性は、本明細書で記載される方法によりアッセイすることができる。
【０５３４】
ＩＶ．Ｃａｓ分子
一部の実施形態では、Ｃａｓ分子は、クラス１  Ｃａｓヌクレアーゼである。一部の実施形態では、Ｃａｓ分子は、クラス２  Ｃａｓヌクレアーゼである。例えば、Makarova et al. (2015), Nat Rev Microbiol, 13(11): 722-36; Shmakov et al. (2015), Molecular Cell, 60:385-397を参照されたい。クラス２  Ｃａｓ分子は、単一タンパク質のエンドヌクレアーゼでありうる。一部の実施形態では、クラス２  Ｃａｓ分子は、ＩＩ、Ｖ、またはＶＩ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に由来し、単一タンパク質のエンドヌクレアーゼでありうる。クラス２  Ｃａｓ分子の非限定的な例は、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、およびＣ２ｃ３のタンパク質を含む。例えば、Yang et al. (2016), Cell, 167(7): 1814-28; Zetsche et al. (2015), Cell, 163: 1-13を参照されたい。一部の実施形態では、Ｃａｓ分子は、Ｃｐｆ１分子である。Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９と相同であることが可能であり、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを含有する。例えば、そのＣｐｆ１配列が、参照によりそれらの全体において組み込まれる、Zetsche et al. (2015)を参照されたい。
【０５３５】
Ｃａｓ９分子
一部の実施形態では、Ｃａｓ分子は、Ｃａｓ９分子またはその断片もしくは変異体、例えば、触媒性または非触媒性の変異体である。本明細書で記載される方法および組成物では、様々な種のＣａｓ９分子を、使用することができる。化膿連鎖球菌（S. pyogenes）のＣａｓ９分子が、本明細書における本開示の大半の対象であるが、本明細書で列挙される他の種のＣａｓ９タンパク質のＣａｓ９分子、これらから導出されるＣａｓ９分子、またはこれらに基づくＣａｓ９分子もまた、使用することができる。言い換えると、他のＣａｓ９分子、例えば、ストレプトコッカス・サーモフィルス（S. thermophilus）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、および／または髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）のＣａｓ９分子も、本明細書で記載される系、方法、および組成物において使用することができる。
【０５３６】
一部の実施形態では、Ｃａｓ９分子は、非特異的ＤＮＡ接触を低減するようにデザインされた変更を保有する、高忠実度変異体である。例えば、Kleinstiver et al. (2016), Nature 529(7587): 490-95; Slaymaker et al. (2016), Science, 351(6268): 84-88; Tsai et al. (2014), Nat. Biotech. 32:569-577を参照されたい。一部の実施形態では、高忠実度Ｃａｓ９は、野生型Ｃａｓ９と同等なオンターゲット活性を保持する。一部の実施形態では、高忠実度Ｃａｓ９は、例えば、ゲノムワイドの切断捕捉法およびターゲティングされたシーケンシング法により測定される通り、オフターゲット活性を、野生型Ｃａｓ９と比較して、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％低減する。一部の実施形態では、高忠実度Ｃａｓ９は、例えば、ゲノムワイドの切断捕捉法およびターゲティングされたシーケンシング法により測定される通り、オフターゲット活性を、検出不能とする。一部の実施形態では、高忠実度Ｃａｓ９は、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１（Kleinstiver 2016）またはＡｌｔ−Ｒ（登録商標）Ｓ．ｐ．  ＨｉＦｉ  Ｃａｓ９  Ｎｕｃｌｅａｓｅ  ３ＮＬＳ（ＩＤＴ）である。
【０５３７】
さらなるＣａｓ９分子種は、スイカ果実汚斑細菌病菌（Acidovorax avenae）、アクチノバチルス・プルロニューモニエ（Actinobacillus pleuropneumoniae）、アクチノバチルス・スクシノゲネス（Actinobacillus succinogenes）、アクチノバチルス・スイス（Actinobacillus suis）、口腔細菌（Actinomyces）属種、アリシクリフィルス・デニトリフィカンス（cycliphilus denitrificans（Alicycliphilus denitrificans））、アミノモナス・パウシボランス（Aminomonas paucivorans）、セレウス菌（Bacillus cereus）、バチルス・スミシー（Bacillus smithii）、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）、バクテロイデス（Bacteroides）属種、ブラストピレルラ・マリーナ（Blastopirellula marina）、ブラジリゾビウム（Bradyrhiz’ obium（Bradyrhizobium））属種、ブレビバチルス・ラテロスポルス（Brevibacillus latemsporus（Brevibacillus laterosporus））、カンピロバクター・コリー（Campylobacter coli）、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）、カンピロバクター・ラッド（Campylobacter lad）、カンジダタス・プニセイスピリルム（Candidatus Puniceispirillum）属、クロストリジウム・セルロリティクム（Clostridiu cellulolyticum（Clostridium cellulolyticum））、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）、コリネバクテリウム・アクコレンス（Corynebacterium accolens）、ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheria（Corynebacterium diphtheriae））、コリネバクテリウム・マツルショティイ（Corynebacterium matruchotii）、ディノロセオバクター・シバエ（Dinoroseobacter sliibae（Dinoroseobacter shibae））、ユウバクテリウム・ドリクム（Eubacterium dolichum）、ガンマプロテオバクテリア（gamma proteobacterium（Gammaproteobacterium））綱、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス（Gluconacetobacler diazotrophicus（Gluconacetobacter diazotrophicus））、ヘモフィルス・パラインフルエンゼ（Haemophilus parainfluenzae）、ヘモフィルス・スプトルム（Haemophilus sputorum）、ヘリコバクター・カナデンシス（Helicobacter canadensis）、ヘリコバクター・シネディ（Helicobacter cinaedi）、ヘリコバクター・ムステレ（Helicobacter mustelae）、イリオバクター・ポリトロプス（Ilyobacler polytropus（（Ilyobacter polytropus））、キンゲラ・キンゲ（Kingella kingae）、ラクトバチルス・クリスパツス（Lactobacillus crispatus）、リステリア・イバノビ（Listeria ivanovii）、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）、リステリア（Listeriaceae）科細菌、メチロシスティス（Methylocystis）属種、メチロシヌス・トリコスポリウム（Methylosinus trichosporium）、モビルンカス・ムリエリス（Mobiluncus mulieris）、ナイセリア・バシリフォルミス（Neisseria bacilliformis）、ナイセリア・シネレア（Neisseria cinerea）、ナイセリア・フラベセンス（Neisseria flavescens）、ナイセリア・ラクタミカ（Neisseria lactamica）、ナイセリア（Neisseria）属種、ナイセリア・ワズワーシー（Neisseria wadsworthii）、ニトロソモナス（Nitrosomonas）属種、パルビバクラム・ラバメンティボランス（Parvibaculum lavamentivorans）、パスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）、ファスコラークトバクテリウム・スクシナテュテンス（Phascolarctobacterium succinatutens）、ラルストニア・シジジー（Ralstonia syzygii）、ロドシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）、ロドブラム（Rhodovulum）属種、シモンシエラ・ムエレリ（Simonsiella muelleri）、スフィンゴモナス（Sphingomonas）属種、スポロラクトバチルス・ビネエ（Sporolactobacillus vineae）、スタフィロコッカス・ルグヅネンシス（Staphylococcus lugdunensis）、スタフィロコッカス（Staphylococcus）属種、スブドリグラヌラム（Subdoligranulum）属種、チストレラ・モビリス（Tislrella mobilis）（Tistrella mobilis）、トレポネーマ（Treponema）属種、またはベルミネフロバクター・エイセニエ（Verminephrobacter eiseniae）を含む。
【０５３８】
本明細書でこの用語を使用する場合のＣａｓ９分子とは、ｇＲＮＡ分子（例えば、ｔｒａｃｒドメインの配列）と相互作用し、ｇＲＮＡ分子と協同して、標的配列およびＰＡＭ配列を含む部位へと局在化する（例えば、ターゲティングまたはホーミングする）分子を指す。
【０５３９】
ある実施形態では、Ｃａｓ９分子は、標的核酸分子を切断することが可能であり、本明細書では、これを、活性Ｃａｓ９分子と称することがある。ある実施形態では、活性Ｃａｓ９分子は、以下の活性：ニッカーゼ活性、すなわち、核酸分子の単一の鎖、例えば、非相補鎖または相補鎖を切断する能力；二本鎖ヌクレアーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸の両方の鎖を切断し、二本鎖切断を創出する能力であって、ある実施形態では、２つのニッカーゼ活性の存在である能力；エンドヌクレアーゼ活性；エキソヌクレアーゼ活性；およびヘリカーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸のヘリックス構造をほどく能力のうちの１または複数を含む。
【０５４０】
ある実施形態では、酵素的に活性のＣａｓ９分子は、両方のＤＮＡ鎖を切断する結果として、二本鎖切断をもたらす。ある実施形態では、Ｃａｓ９分子は、１つの鎖、例えば、ｇＲＮＡがハイブリダイズする鎖、またはｇＲＮＡがハイブリダイズする鎖と相補的な鎖だけを切断する。ある実施形態では、活性Ｃａｓ９分子は、ＨＮＨ様ドメインと関連する切断活性を含む。ある実施形態では、活性Ｃａｓ９分子は、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインと関連する切断活性を含む。ある実施形態では、活性Ｃａｓ９分子は、ＨＮＨ様ドメインと関連する切断活性と、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインと関連する切断活性とを含む。ある実施形態では、活性Ｃａｓ９分子は、活性ＨＮＨ様ドメイン、または切断コンピテントのＨＮＨ様ドメインと、不活性Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメイン、または切断インコンピテントのＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインとを含む。ある実施形態では、活性Ｃａｓ９分子は、不活性ＨＮＨ様ドメイン、または切断インコンピテントのＨＮＨ様ドメインと、活性Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメイン、または切断コンピテントのＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインとを含む。
【０５４１】
ある実施形態では、標的核酸と相互作用し、これを切断する、活性Ｃａｓ９分子の能力は、ＰＡＭ配列依存的である。ＰＡＭ配列は、標的核酸内の配列である。ある実施形態では、標的核酸の切断は、ＰＡＭ配列から上流で生じる。異なる細菌種に由来する活性Ｃａｓ９分子は、異なる配列モチーフ（例えば、ＰＡＭ配列）を認識しうる。ある実施形態では、化膿連鎖球菌（S. pyogenes）の活性Ｃａｓ９分子は、配列モチーフＮＧＧを認識し、この配列から、１〜１０、例えば、３〜５塩基対上流の標的核酸配列の切断を方向付ける。例えば、Mali el ai, SCIENCE 2013; 339(6121): 823- 826を参照されたい。ある実施形態では、ストレプトコッカス・サーモフィルス（S. thermophilus）の活性Ｃａｓ９分子は、配列モチーフＮＧＧＮＧおよびＮＮＡＧＡＡＷ（Ｗ＝ＡまたはＴ）を認識し、これらの配列から、１〜１０、例えば、３〜５塩基対上流の、コア標的核酸配列の切断を方向付ける。例えば、Horvath et al., SCIENCE 2010; 327(5962): 167- 170, and Deveau et al , J BACTERIOL 2008; 190(4): 1390- 1400を参照されたい。ある実施形態では、ストレプトコッカス・ミュータンス（S. mutans）の活性Ｃａｓ９分子は、配列モチーフＮＧＧまたはＮＡＡＲ（Ｒ−ＡまたはＧ）を認識し、この配列から、１〜１０、例えば、３〜５塩基対上流の、コア標的核酸配列の切断を方向付ける。例えば、Deveau et al , J BACTERIOL 2008; 190(4): 1390- 1400を参照されたい。
【０５４２】
ある実施形態では、黄色ブドウ球菌（S. aureus）の活性Ｃａｓ９分子は、配列モチーフＮＮＧＲＲ（Ｒ＝ＡまたはＧ）を認識し、この配列から、１〜１０、例えば、３〜５塩基対上流の標的核酸配列の切断を方向付ける。例えば、Ran F. et al., NATURE, vol. 520, 2015, pp. 186-191を参照されたい。ある実施形態では、髄膜炎菌（N. meningitidis）の活性Ｃａｓ９分子は、配列モチーフＮＮＮＮＧＡＴＴを認識し、この配列から、１〜１０、例えば、３〜５塩基対上流の標的核酸配列の切断を方向付ける。例えば、Hou et al., 110(39): 15644-49 (2013)を参照されたい。Ｃａｓ９分子が、ＰＡＭ配列を認識する能力は、例えば、Jinek et al, SCIENCE 2012, 337:816において記載されている形質転換アッセイを使用して決定することができる。
【０５４３】
一部のＣａｓ９分子は、ｇＲＮＡ分子と相互作用し、ｇＲＮＡ分子と共に、コア標的ドメインへと結合する（例えば、これをターゲティングするか、またはこれに局在化する）能力を有するが、標的核酸を切断することが不可能であるか、または効率的な比率での切断が不可能である。本明細書では、切断活性を有さないか、または実質的な切断活性を有さないＣａｓ９分子を、不活性Ｃａｓ９（酵素的に不活性のＣａｓ９）、ｄｅａｄ  Ｃａｓ９分子またはｄＣａｓ９分子と称することができる。例えば、Gilbert et al. (2013), Cell, 154(2): 442-51を参照されたい。例えば、不活性のＣａｓ９分子は、本明細書で記載されるアッセイにより測定される通り、切断活性を欠くか、または基準Ｃａｓ９分子の切断活性より、実質的に小さい切断活性、例えば、基準Ｃａｓ９分子の切断活性の２０、１０、５、１もしくは０．１％未満の切断活性を有しうる。
【０５４４】
他のＣａｓ分子、例えば、Ｃｐｆ１もまた、ｇＲＮＡ分子と相互作用し、ｇＲＮＡ分子と共に、コア標的ドメインに結合する（例えば、これをターゲティングするか、またはこれに局在化する）能力を有しうるが、標的核酸を切断することが不可能な場合もあり、効果的な速度で切断することが不可能な場合もある。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１６／２０５７１１号パンフレットを参照されたい。本明細書では、切断活性を有さないか、または実質的に有さないＣｐｆ１分子を、不活性Ｃｐｆ１（酵素的に不活性のＣｐｆ１分子）、ｄｅａｄ  Ｃｐｆ１分子、ｄＣｐｆ１分子、ＤＮアーゼｄｅａｄ  Ｃｐｆ１分子、またはｄｄＣｐｆ１分子と称する場合がある。例えば、Zhang et al. (2017), Cell Discov. 3:17018を参照されたい。例えば、ｄｄＣｐｆ１分子は、本明細書で記載されるアッセイにより測定される通り、切断活性であるＤＮアーゼ活性を欠くか、または基準Ｃｐｆ１分子の切断活性より、実質的に小さい、例えば、基準Ｃｐｆ１分子の切断活性の２０、１０、５、１もしくは０．１％未満の切断活性を有しうる。
【０５４５】
本明細書で記載される方法と共に使用されうる、例示的な、自然発生のＣａｓ９分子については、Chylinski et al , RNA Biology 2013; 10:5, 727-737において記載されている。このようなＣａｓ９分子は、クラスター１細菌ファミリー、クラスター２細菌ファミリー、クラスター３細菌ファミリー、クラスター４細菌ファミリー、クラスター５細菌ファミリー、クラスター６細菌ファミリー、クラスター７細菌ファミリー、クラスター８細菌ファミリー、クラスター９細菌ファミリー、クラスター１０細菌ファミリー、クラスター１１細菌ファミリー、クラスター１２細菌ファミリー、クラスター１３細菌ファミリー、クラスター１４細菌ファミリー、クラスター１細菌ファミリー、クラスター１６細菌ファミリー、クラスター１７細菌ファミリー、クラスター１８細菌ファミリー、クラスター１９細菌ファミリー、クラスター２０細菌ファミリー、クラスター２１細菌ファミリー、クラスター２２細菌ファミリー、クラスター２３細菌ファミリー、クラスター２４細菌ファミリー、クラスター２５細菌ファミリー、クラスター２６細菌ファミリー、クラスター２７細菌ファミリー、クラスター２８細菌ファミリー、クラスター２９細菌ファミリー、クラスター３０細菌ファミリー、クラスター３１細菌ファミリー、クラスター３２細菌ファミリー、クラスター３３細菌ファミリー、クラスター３４細菌ファミリー、クラスター３５細菌ファミリー、クラスター３６細菌ファミリー、クラスター３７細菌ファミリー、クラスター３８細菌ファミリー、クラスター３９細菌ファミリー、クラスター４０細菌ファミリー、クラスター４１細菌ファミリー、クラスター４２細菌ファミリー、クラスター４３細菌ファミリー、クラスター４４細菌ファミリー、クラスター４５細菌ファミリー、クラスター４６細菌ファミリー、クラスター４７細菌ファミリー、クラスター４８細菌ファミリー、クラスター４９細菌ファミリー、クラスター５０細菌ファミリー、クラスター５１細菌ファミリー、クラスター５２細菌ファミリー、クラスター５３細菌ファミリー、クラスター５４細菌ファミリー、クラスター５５細菌ファミリー、クラスター５６細菌ファミリー、クラスター５７細菌ファミリー、クラスター５８細菌ファミリー、クラスター５９細菌ファミリー、クラスター６０細菌ファミリー、クラスター６１細菌ファミリー、クラスター６２細菌ファミリー、クラスター６３細菌ファミリー、クラスター６４細菌ファミリー、クラスター６５細菌ファミリー、クラスター６６細菌ファミリー、クラスター６７細菌ファミリー、クラスター６８細菌ファミリー、クラスター６９細菌ファミリー、クラスター７０細菌ファミリー、クラスター７１細菌ファミリー、クラスター７２細菌ファミリー、クラスター７３細菌ファミリー、クラスター７４細菌ファミリー、クラスター７５細菌ファミリー、クラスター７６細菌ファミリー、クラスター７７細菌ファミリー、またはクラスター７８細菌ファミリーのＣａｓ９分子を含む。
【０５４６】
例示的な、自然発生のＣａｓ９分子は、クラスター１細菌ファミリーのＣａｓ９分子を含む。例は、化膿連鎖球菌（S. pyogenes）（例えば、ＳＦ３７０株、ＭＧＡＳ１０２７０株、ＭＧＡＳ１０７５０株、ＭＧＡＳ２０９６株、ＭＧＡＳ３１５株、ＭＧＡＳ５００５株、ＭＧＡＳ６１８０株、ＭＧＡＳ９４２９株、ＮＺ１３１株、およびＳＳＩ−１株）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（S. thermophilus）（例えば、ＬＭＤ−９株）、ストレプトコッカス・シュードポルシヌス（S. pseudoporcinus）（例えば、ＳＰＩＮ２００２６株）、ストレプトコッカス・ミュータンス（S. mutans）（例えば、ＵＡ１５９株、ＮＮ２０２５株）、ストレプトコッカス・マカケ（S. macacae）（例えば、ＮＣＴＣ１１５５８株）、ウシ連鎖球菌（S. gallolylicus）（例えば、ＵＣＮ３４株、ＡＴＣＣＢＡＡ−２０６９株）、ストレプトコッカス・エクイヌス（S. equinus（S. equines））（例えば、ＡＴＣＣ９８１２株、ＭＧＣＳ１２４株）、ストレプトコッカス・ディスガラクティエ（S, dysgalactiae（S. dysdalactiae））（例えば、ＧＧＳ１２４株）、ウシ連鎖球菌（S. bovis）（例えば、ＡＴＣＣ７００３３８株）、ストレプトコッカス・アンギノサス（S. anginosus）（例えば、Ｆ０２１１株）、アガラクチア菌（S. agalactiae（S. agalactia））（例えば、ＮＥＭ３１６株、Ａ９０９株）、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）（例えば、Ｆ６８５４株）、リステリア・イノクア（Listeria innocua）（L. innocua、例えば、Ｃｌｉｐ１１２６２株）、エンテロコッカス・イタリクス（Enterococcus italicus（EtUerococcus italicus））（例えば、ＤＳＭ１５９５２株）、またはエンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）（例えば、１，２３１，４０８株）のＣａｓ９分子を含む。さらなる例示的なＣａｓ９分子は、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）のＣａｓ９分子（Hou et al. 110(39): 15644-49 (2013)）、および黄色ブドウ球菌（S. aureus）のＣａｓ９分子である。
【０５４７】
ある実施形態では、Ｃａｓ９分子、例えば、活性のＣａｓ９分子または不活性のＣａｓ９分子は、本明細書で記載される、任意のＣａｓ９分子配列、または自然発生のＣａｓ９分子配列、例えば、本明細書で列挙されるか、またはChylinski et al, RNA Biology 2013, 10:5, I2I-Τ,1; Hou et al. 110(39): 15644-49 (2013)において記載されている種に由来するＣａｓ９分子との、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性を有するか；これらと比較した場合に、１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、または４０％以下のアミノ酸残基において異なるか；少なくとも１、２、５、１０、または２０アミノ酸だけ異なるが、１００、８０、７０、６０、５０、４０、または３０アミノ酸を超えては異ならないか；またはこれらと同一であるアミノ酸配列を含む。
【０５４８】
ある実施形態では、Ｃａｓ９分子は、以下の化膿連鎖球菌（S. pyogenes）のＣａｓ９との、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性を有するか；これらと比較した場合に、１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、または４０％以下のアミノ酸残基において異なるか；少なくとも１、２、５、１０、または２０アミノ酸だけ異なるが、１００、８０、７０、６０、５０、４０、または３０アミノ酸を超えては異ならないか；またはこれらと同一であるアミノ酸配列を含む。
【０５４９】
【化２−１】
2020513832.tif 000231
【０５５０】
【化２−２】
2020513832.tif 000232
【０５５１】
【化２−３】
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【０５５２】
【化２−４】
2020513832.tif 000234
【０５５３】
【化２−５】
2020513832.tif 000235
【０５５４】
複数の実施形態では、Ｃａｓ９分子は、正に帯電したアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、またはヒスチジン）への、１または複数の突然変異であって、前記位置において、非帯電または非極性のアミノ酸、例えば、アラニンを導入する突然変異を含む、配列番号９０の、化膿連鎖球菌（S. pyogenes）のＣａｓ９変異体である。複数の実施形態では、突然変異は、Ｃａｓ９のｎｔグルーブ内の、１または複数の正に帯電したアミノ酸へのものである。複数の実施形態では、Ｃａｓ９分子は、配列番号９０の、化膿連鎖球菌（S. pyogenes）のＣａｓ９変異体であって、配列番号９０の８５５位における突然変異、例えば、配列番号９０の８５５位における、非帯電アミノ酸、例えば、アラニンへの突然変異を含むＣａｓ９変異体である。複数の実施形態では、Ｃａｓ９分子は、配列番号９０の、８５５位だけにおいて、配列番号９０と比べた突然変異、例えば、非帯電アミノ酸、例えば、アラニンへの突然変異を有する。複数の実施形態では、Ｃａｓ９分子は、配列番号９０の、化膿連鎖球菌（S. pyogenes）のＣａｓ９変異体であって、配列番号９０の、８１０位における突然変異、１００３位における突然変異、および／または１０６０位における突然変異、例えば、配列番号９０の、８１０位、１００３位、および／または１０６０位における、アラニンへの突然変異を含むＣａｓ９変異体である。複数の実施形態では、Ｃａｓ９分子は、配列番号９０の、８１０位、１００３位、および１０６０位だけにおいて、配列番号９０と比べた突然変異を有し、例えば、この場合、各突然変異は、非帯電アミノ酸、例えば、アラニンへのものである。複数の実施形態では、Ｃａｓ９分子は、配列番号９０の、化膿連鎖球菌（S. pyogenes）のＣａｓ９変異体であって、配列番号９０の、８４８位における突然変異、１００３位における突然変異、および／または１０６０位における突然変異、例えば、配列番号９０の、８４８位、１００３位、および／または１０６０位における、アラニンへの突然変異を含むＣａｓ９変異体である。複数の実施形態では、Ｃａｓ９分子は、配列番号９０の、８４８位、１００３位、および１０６０位だけにおいて、配列番号９０と比べた突然変異を有し、例えば、この場合、各突然変異は、非帯電アミノ酸、例えば、アラニンへのものである。複数の実施形態では、Ｃａｓ９分子は、Science DOI: 10.1126/science.aad5227においてオンラインで入手可能であるSlaymaker et al., Science Express, December 1, 2015に記載されているＣａｓ９分子である。
【０５５５】
複数の実施形態では、Ｃａｓ９分子は、１または複数の突然変異を含む、配列番号９０の、化膿連鎖球菌（S. pyogenes）のＣａｓ９変異体である。複数の実施形態では、Ｃａｓ９変異体は、配列番号９０の８０位における突然変異を含む、例えば、配列番号９０の８０位におけるロイシンを含む（すなわち、Ｃ８０Ｌ突然変異を伴う配列番号９０を含む、または、これからなる）。複数の実施形態では、Ｃａｓ９変異体は、配列番号９０の５７４位における突然変異を含む、例えば、配列番号９０の５７４位におけるグルタミン酸を含む（すなわち、Ｃ５７４Ｅ突然変異を伴う配列番号９０を含む、または、これからなる）。複数の実施形態では、Ｃａｓ９変異体は、配列番号９０の、８０位における突然変異と、５７４位における突然変異とを含む、例えば、配列番号９０の８０位におけるロイシンと、配列番号９０の５７４位におけるグルタミン酸とを含む（すなわち、Ｃ８０Ｌ突然変異およびＣ５７４Ｅ突然変異を伴う配列番号９０を含む、または、これからなる）。理論に束縛されずに、このような突然変異は、Ｃａｓ９分子の溶解特性を改善すると考えられる。
【０５５６】
複数の実施形態では、Ｃａｓ９分子は、１または複数の突然変異を含む、配列番号９０の、化膿連鎖球菌（S. pyogenes）のＣａｓ９変異体である。複数の実施形態では、Ｃａｓ９変異体は、配列番号９０の１４７位における突然変異を含む、例えば、配列番号９０の１４７位におけるチロシンを含む（すなわち、Ｄ１４７Ｙ突然変異を伴う配列番号９０を含む、または、これからなる）。複数の実施形態では、Ｃａｓ９変異体は、配列番号９０の４１１位における突然変異を含む、例えば、配列番号９０の４１１位におけるトレオニンを含む（すなわち、Ｐ４１１Ｔ突然変異を伴う配列番号９０を含む、または、これからなる）。複数の実施形態では、Ｃａｓ９変異体は、配列番号９０の、１４７位における突然変異と、４１１位における突然変異とを含む、例えば、配列番号９０の１４７位におけるチロシンと、配列番号９０の４１１位におけるトレオニンとを含む（すなわち、Ｄ１４７Ｙ突然変異およびＰ４１１Ｔ突然変異を伴う配列番号９０を含む、または、これからなる）。理論に束縛されずに、このような突然変異は、例えば、酵母内の、Ｃａｓ９分子のターゲティング効率を改善すると考えられる。
【０５５７】
複数の実施形態では、Ｃａｓ９分子は、１または複数の突然変異を含む、配列番号９０の、化膿連鎖球菌（S. pyogenes）のＣａｓ９変異体である。複数の実施形態では、Ｃａｓ９変異体は、配列番号９０の１１３５位における突然変異を含む、例えば、配列番号９０の１１３５位におけるグルタミン酸を含む（すなわち、Ｄ１１３５Ｅ突然変異を伴う配列番号９０を含む、または、これからなる）。理論に束縛されずに、このような突然変異は、Ｃａｓ９分子の、ＮＡＧ  ＰＡＭ配列と対比した、ＮＧＧ  ＰＡＭ配列に対する選択性を改善すると考えられる。
【０５５８】
複数の実施形態では、Ｃａｓ９分子は、ある特定の位置に、非帯電または非極性のアミノ酸、例えば、アラニンを導入する、１または複数の突然変異を含む、配列番号９０の、化膿連鎖球菌（S. pyogenes）のＣａｓ９変異体である。複数の実施形態では、Ｃａｓ９分子は、配列番号９０の、化膿連鎖球菌（S. pyogenes）のＣａｓ９変異体であって、配列番号９０の、４９７位における突然変異、６６１位における突然変異、６９５位における突然変異、および／または９２６位における突然変異、例えば、配列番号９０の、４９７位、６６１位、６９５位、および／または９２６位におけるアラニンへの突然変異を含むＣａｓ９変異体である。複数の実施形態では、Ｃａｓ９分子は、配列番号９０の、４９７位、６６１位、６９５位、および９２６位だけにおいて、配列番号９０と比べた突然変異を有し、例えば、この場合、各突然変異は、非帯電アミノ酸、例えば、アラニンへのものである。理論に束縛されずに、このような突然変異は、オフターゲット部位における、Ｃａｓ９分子による切断を低減すると考えられる。
【０５５９】
本明細書で記載される、Ｃａｓ９分子に対する突然変異を組み合わせることができ、本明細書で記載される融合または他の修飾のうちのいずれかと組み合わせることができ、Ｃａｓ９分子を、本明細書で記載されるアッセイのいずれかにおいて調べうると理解されるであろう。
【０５６０】
多様な種類のＣａｓ分子を本明細書で使用することができる。一部の実施形態では、ＩＩ型Ｃａｓ系のＣａｓ分子を使用する。他の実施形態では、他のＣａｓ系のＣａｓ分子を使用する。例えば、Ｉ型またはＩＩＩ型のＣａｓ分子を使用することができる。例示的なＣａｓ分子（およびＣａｓ系）については、例えば、いずれの参考文献の内容も、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、Haft et al., PLoS COMPUTATIONAL BIOLOGY 2005, 1(6): e60 and Makarova et al., NATURE REVIEW MICROBIOLOGY 2011, 9:467-477において記載されている。
【０５６１】
ある実施形態では、本明細書で開示される方法において使用されるＣａｓまたはＣａｓ９分子は、以下の活性：ニッカーゼ活性；二本鎖切断活性（例えば、エンドヌクレアーゼ活性および／またはエキソヌクレアーゼ活性）；ヘリカーゼ活性；またはｇＲＮＡ分子と一体となって、標的核酸へと局在化する能力のうちの１または複数を含む。
【０５６２】
変更Ｃａｓ９分子
自然発生のＣａｓ９分子は、ニッカーゼ活性、ヌクレアーゼ活性（例えば、エンドヌクレアーゼ活性および／またはエキソヌクレアーゼ活性）；ヘリカーゼ活性；ｇＲＮＡ分子と、機能的に会合する能力；および核酸上の部位をターゲティングする（またはこれに局在化する）能力（例えば、ＰＡＭの認識およびＰＡＭ特異性）を含む多数の特性を有しうる。ある実施形態では、本明細書で記載される方法と共に使用されるＣａｓ９分子は、これらの特性の全てまたはサブセットを含みうる。典型的な複数の実施形態では、Ｃａｓ９分子は、ｇＲＮＡ分子と相互作用し、ｇＲＮＡ分子と協同して、核酸内の部位へと局在化する能力を有する。他の活性、例えば、ＰＡＭ特異性、切断活性、またはヘリカーゼ活性は、Ｃａｓ９分子内で、より広範に変動しうる。
【０５６３】
所望の特性を伴うＣａｓ９分子は、多数の形で、例えば、所望の特性を有する変更Ｃａｓ９分子をもたらす、親、例えば、自然発生のＣａｓ９分子の変更により作製することができる。例えば、親Ｃａｓ９分子と比べた、１または複数の突然変異または差違を導入することができる。このような突然変異および差違は、置換（例えば、非必須アミノ酸の保存的置換または置換）；挿入；または欠失を含みうる。ある実施形態では、Ｃａｓ９分子は、基準Ｃａｓ９分子と比べて、１または複数の突然変異または差違、例えば、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、１０、１５、２０、３０、４０、または５０の突然変異であるが、２００、１００、または８０未満の突然変異を含みうる一方で、基準Ｃａｓ９分子の、１または複数の活性を保持または増強する。
【０５６４】
ある実施形態では、１または複数の突然変異は、Ｃａｓ９活性、例えば、本明細書で記載されるＣａｓ９活性に対して、実質的な影響を及ぼさない。ある実施形態では、１または複数の突然変異は、Ｃａｓ９活性、例えば、本明細書で記載されるＣａｓ９活性に対して、実質的な影響を及ぼす。ある実施形態では、例示的な活性は、ＰＡＭ特異性、切断活性、およびヘリカーゼ活性のうちの１または複数を含む。突然変異は、例えば、１または複数のＲｕｖＣ様ドメイン内、例えば、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメイン内；ＨＮＨ様ドメイン内；ＲｕｖＣ様ドメインおよびＨＮＨ様ドメインの外部の領域内に存在しうる。一部の実施形態では、突然変異は、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメイン内に存在する。一部の実施形態では、突然変異は、ＨＮＨ様ドメイン内に存在する。一部の実施形態では、突然変異は、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメイン内およびＨＮＨ様ドメイン内の両方に存在する。
【０５６５】
特定の配列、例えば、置換が、ターゲティング活性、切断活性など、１または複数の活性に影響を及ぼしうるのかどうかは、例えば、突然変異が保存的であるのかどうかを査定することにより、査定または予測することもでき、ＩＩＩ節で記載した方法により査定または予測することもできる。ある実施形態では、Ｃａｓ９分子の文脈で使用される「非必須」アミノ酸残基が、Ｃａｓ９活性（例えば、切断活性）を消滅させたり、より好ましくは、これを実質的に変更したりせずに、Ｃａｓ９分子、例えば、自然発生のＣａｓ９分子、例えば、活性Ｃａｓ９分子の野生型配列から変更しうる残基であるのに対し、「必須」アミノ酸残基の変化は、活性（例えば、切断活性）の実質的な損失を結果としてもたらす。
【０５６６】
ＰＡＭ認識を変更したＣａｓ９分子、またはＰＡＭ認識を変更していないＣａｓ９分子
自然発生のＣａｓ９分子は、特異的ＰＡＭ配列、例えば、化膿連鎖球菌（S. pyogenes）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（S. thermophilus）、ストレプトコッカス・ミュータンス（S. mutans）、黄色ブドウ球菌（S. aureus）、および髄膜炎菌（N. meningitidis）について上記で記載したＰＡＭ認識配列を認識しうる。
【０５６７】
ある実施形態では、Ｃａｓ９分子は、自然発生のＣａｓ９分子と同じＰＡＭ特異性を有する。他の実施形態では、Ｃａｓ９分子は、自然発生のＣａｓ９分子と関連しないＰＡＭ特異性、またはそれが緊密な配列相同性を有する、自然発生のＣａｓ９分子と関連しないＰＡＭ特異性を有する。例えば、自然発生のＣａｓ９分子を変更して、例えば、ＰＡＭ認識を変更する、例えば、Ｃａｓ９分子が認識するＰＡＭ配列を変更して、オフターゲット部位を減少させ、かつ／または特異性を改善することもでき；ＰＡＭ認識の要求を消失させることもできる。ある実施形態では、Ｃａｓ９分子を変更して、例えば、ＰＡＭ認識配列の長さを増大させ、かつ／またはＣａｓ９特異性を、高レベルの同一性へと改善して、オフターゲット部位を減少させ、特異性を増大させることができる。ある実施形態では、ＰＡＭ認識配列の長さは、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、または１５アミノ酸の長さである。異なるＰＡＭ配列を認識し、かつ／またはオフターゲット活性を低減したＣａｓ９分子は、指向性進化を使用して作出することができる。Ｃａｓ９分子の指向性進化のために使用しうる、例示的な方法およびシステムについては、例えば、Esvelt el al , Nature 2011, 472(7344): 499-503において記載されている。候補Ｃａｓ９分子は、例えば、本明細書で記載される方法により査定することができる。
【０５６８】
非切断型Ｃａｓ９分子および切断修飾型Ｃａｓ９分子
ある実施形態では、Ｃａｓ９分子は、自然発生のＣａｓ９分子と異なる、例えば、緊密な相同性を有する自然発生のＣａｓ９分子と異なる切断特性を含む。例えば、Ｃａｓ９分子は、自然発生のＣａｓ９分子、例えば、化膿連鎖球菌（S. pyogenes）のＣａｓ９分子と、以下の通りに異なりうる：例えば、二本鎖切断（エンドヌクレアーゼ活性および／またはエキソヌクレアーゼ活性）の減少もしくは増大であって、例えば、自然発生のＣａｓ９分子（例えば、化膿連鎖球菌（S. pyogenes）のＣａｓ９分子）と比較した減少もしくは増大をモジュレートするその能力；例えば、核酸の一本鎖、例えば、核酸分子の非相補鎖または核酸分子の相補鎖の切断（ニッカーゼ活性）の減少もしくは増大であって、例えば、自然発生のＣａｓ９分子（例えば、化膿連鎖球菌（S. pyogenes）のＣａｓ９分子）と比較した減少もしくは増大をモジュレートするその能力；または核酸分子、例えば、二本鎖核酸分子または一本鎖核酸分子を切断する能力を消失させることができる能力。
【０５６９】
切断活性修飾型Ｃａｓ９分子
ある実施形態では、活性Ｃａｓ９分子は、以下の活性：Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインと関連する切断活性；ＨＮＨ様ドメインと関連する切断活性；ＨＮＨドメインと関連する切断活性およびＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインと関連する切断活性のうちの１または複数を含む。
【０５７０】
ある実施形態では、Ｃａｓ９分子は、Ｃａｓ９ニッカーゼであり、例えば、ＤＮＡの一本鎖だけを切断する。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ニッカーゼは、切断が可能なＲｕｖＣ様ドメインと、切断能が低減されているか、または切断が不可能なＨＮＨ様ドメインとを含む。代替的な実施形態では、Ｃａｓ９ニッカーゼは、切断が可能なＨＮＨ様ドメインと、切断能が低減されているか、または切断が不可能なＲｕｖＣ様ドメインとを含む。ある実施形態では、Ｃａｓ９ニッカーゼは、配列番号９０の、１０位における突然変異および／または８４０位における突然変異を含む、例えば、配列番号９０に対するＤ１０Ａ突然変異および／またはＨ８４０Ａ突然変異を含む。
【０５７１】
非切断型不活性Ｃａｓ９分子
ある実施形態では、変更Ｃａｓ９分子は、核酸分子（二本鎖核酸分子または一本鎖核酸分子）を切断しないか、または著明に低い効率、例えば、本明細書で記載されるアッセイにより測定される通り、基準Ｃａｓ９分子の切断活性の、例えば、２０、１０、５、１、もしくは０．１％未満の効率で、核酸分子を切断する、不活性Ｃａｓ９分子である。基準Ｃａｓ９分子は、自然発生の非修飾Ｃａｓ９分子、例えば、化膿連鎖球菌（S. pyogenes）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（S. thermophilus）、黄色ブドウ球菌（S. aureus）、または髄膜炎菌（N. meningitidis）のＣａｓ９分子など、自然発生のＣａｓ９分子でありうる。ある実施形態では、基準Ｃａｓ９分子は、緊密な配列同一性または相同性を有する、自然発生のＣａｓ９分子である。ある実施形態では、不活性Ｃａｓ９分子は、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインと関連する実質的な切断活性と、ＨＮＨ様ドメインと関連する実質的な切断活性とを欠く。
【０５７２】
ある実施形態では、Ｃａｓ９分子は、ｄＣａｓ９である。例えば、Tsai et al. (2014), Nat. Biotech. 32:569-577を参照されたい。
【０５７３】
触媒的に不活性のＣａｓ９分子を、転写リプレッサーと融合させることができる。不活性のＣａｓ９融合タンパク質は、ｇＲＮＡと複合体化し、ｇＲＮＡのターゲティングドメインにより指定されるＤＮＡ配列へと局在化するが、活性Ｃａｓ９と異なり、標的ＤＮＡを切断しないであろう。転写抑制ドメインなどのエフェクタードメインの、不活性Ｃａｓ９への融合は、エフェクターの、ｇＲＮＡにより指定される、任意のＤＮＡ部位への動員を可能とする。Ｃａｓ９融合タンパク質の、遺伝子のプロモーター領域への部位特異的ターゲティングは、転写の活性化を増大させるか、または阻害するように、ポリメラーゼの、プロモーター領域への結合、例えば、Ｃａｓ９の、転写因子（例えば、転写活性化因子）との融合、および／または転写エンハンサーの、核酸への結合をブロックするか、またはこれに影響を及ぼしうる。代替的に、Ｃａｓ９の、転写リプレッサーへの融合体の、遺伝子のプロモーター領域への部位特異的ターゲティングを使用して、転写の活性化を減少させることができる。
【０５７４】
不活性Ｃａｓ９分子に融合させうる転写リプレッサーまたは転写リプレッサードメインはＫｒｕｅｐｐｅｌ結合ボックス（ＫＲＡＢまたはＳＫＤ）、Ｍａｄ  ｍＳＩＮ３相互作用ドメイン（ＳＩＤ）、またはＥＲＦリプレッサードメイン（ＥＲＤ）を含みうる。
【０５７５】
別の実施形態では、不活性Ｃａｓ９分子を、クロマチンを修飾するタンパク質と融合させることができる。例えば、不活性Ｃａｓ９分子を、ヘテロクロマチン  タンパク質  １  （ＨＰ１）、ヒストンリシンメチルトランスフェラーゼ（例えば、ＳＵＶ３９Ｈ  １、ＳＵＶ３９Ｈ２、Ｇ９Ａ、ＥＳＥＴ／ＳＥＴＤＢ  １、Ｐｒ−ＳＥＴ７／８、ＳＵＶ４−２０Ｈ  １，ＲＩＺ１）、ヒストンリシンデメチラーゼ（例えば、ＬＳＤ１／ＢＨＣ１１０、ＳｐＬｓｄ１／Ｓｗ１／Ｓａｆ１１０、Ｓｕ（ｖａｒ）３−３、ＪＭＪＤ２Ａ／ＪＨＤＭ３Ａ、ＪＭＪＤ２Ｂ、ＪＭＪＤ２Ｃ／ＧＡＳＣ１、ＪＭＪＤ２Ｄ、Ｒｐｈ  １、ＪＡＲＩＤ  １  Ａ／ＲＢＰ２、ＪＡＲＩ  ＤＩＢ／ＰＬＵ−Ｉ、ＪＡＲ１Ｄ  １Ｃ／ＳＭＣＸ、ＪＡＲＩＤ１  Ｄ／ＳＭＣＹ、Ｌｉｄ、Ｊｈｎ２、Ｊｍｊ２）、ヒストンリシンデアセチラーゼ（例えば、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ８、Ｒｐｄ３、Ｈｏｓ  ｌ、Ｃｉｒ６、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ９、Ｈｄａｌ、Ｃｉｒ３、ＳＩＲＴ  １、ＳＩＲＴ２、Ｓｉｒ２、Ｈｓｔ  １、Ｈｓｔ２、Ｈｓｔ３、Ｈｓｔ４、ＨＤＡＣ  １１）、およびＤＮＡメチラーゼ（ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ２ａ／ＤＭＮＴ３ｂ、ＭＥＴ１）に融合させることができる。不活性Ｃａｓ９−クロマチン修飾分子融合タンパク質を使用して、標的遺伝子の発現を低減するように、クロマチン状態を変更することができる。
【０５７６】
異種配列（例えば、転写リプレッサードメイン）を、不活性Ｃａｓ９タンパク質のＮ末端またはＣ末端に融合させることができる。代替的な実施形態では、異種配列（例えば、転写リプレッサードメイン）を、不活性Ｃａｓ９タンパク質の内部部分（すなわち、Ｎ末端またはＣ末端以外の部分）に融合させることができる。
【０５７７】
Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が、標的核酸に結合し、これを切断する能力は、例えば、本明細書のＩＩＩ節で記載した方法により査定することができる。単独の、またはｇＲＮＡ分子と複合体化させた、Ｃａｓ９分子、例えば、活性Ｃａｓ９または不活性Ｃａｓ９の活性はまた、当技術分野で周知の方法であって、遺伝子発現アッセイ、ならびにクロマチンベースのアッセイ、例えば、クロマチン免疫沈降（ＣｈｉＰ）、およびクロマチンｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ（ＣｉＡ）を含む方法により査定することもできる。
【０５７８】
他の分子
複数の実施形態では、Ｃａｓ分子、例えば、化膿連鎖球菌（S. pyogenes）のＣａｓ９は、さらなる活性を付与する、１または複数のアミノ酸配列を含みうる。非限定的な例は、核局在化シグナルまたは核局在化配列、ミトコンドリア局在化シグナル、葉緑体局在化シグナル、小胞体（ＥＲ）保持シグナル、タグもしくはマーカー（例えば、ヒスチジンタグまたは蛍光タンパク質）、または大型のポリペプチド、例えば、酵素、転写因子、あるいはこれらの機能的部分のうちの１または複数を含む（例えば、Maeder et al., 2013; Perez-Piniera et al., 2013; Gilbert et al., 2013; Guilinger et al., 2014を参照されたい）。
【０５７９】
一部の態様では、Ｃａｓ９分子は、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、またはこれを超えるＮＬＳなど、１または複数の核局在化配列（ＮＬＳ）を含みうる。一部の実施形態では、Ｃａｓ９分子は、アミノ末端における、もしくはこの近傍における、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、もしくはこれを超えるＮＬＳ、カルボキシ末端における、もしくはこの近傍における、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、もしくはこれを超えるＮＬＳ、またはこれらの組合せ（例えば、アミノ末端における、１または複数のＮＬＳ、およびカルボキシ末端における、１または複数のＮＬＳ）を含む。１つを超えるＮＬＳが存在する場合、各ＮＬＳは、単一のＮＬＳが、１つを超えるコピー内に存在することも可能であり、かつ／または１もしくは複数のコピー内に存在する、１もしくは複数の他のＮＬＳと組み合わせて存在することも可能であるように、他のＮＬＳと独立に選択することができる。一部の実施形態では、ＮＬＳの最も近傍のアミノ酸が、ポリペプチド鎖に沿って、Ｎ末端またはＣ末端から約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、またはこれを超えるアミノ酸以内である場合に、ＮＬＳは、Ｎ末端またはＣ末端の近傍にあると考えられる。典型的に、ＮＬＳは、正に帯電したリシンまたはアルギニンの、１または複数の短い配列であって、タンパク質表面に露出した配列からなるが、他の種類のＮＬＳも公知である。ＮＬＳの非限定的な例は、アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号９１）を有する、ＳＶ４０ウイルス大型Ｔ抗原のＮＬＳ；ヌクレオプラスミンに由来するＮＬＳ（例えば、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号９２）を伴う、ヌクレオプラスミン二分ＮＬＳ）；アミノ酸配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号９３）またはＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰ（配列番号９４）を有するｃ−ｍｙｃ  ＮＬＳ；配列ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（配列番号９５）を有するｈＲＮＰＡ１  Ｍ９  ＮＬＳ；インポルチンアルファに由来するＩＢＢドメインの配列である、ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ（配列番号９６）；筋腫Ｔタンパク質の配列である、ＶＳＲＫＲＰＲＰ（配列番号９７）およびＰＰＫＫＡＲＥＤ（配列番号９８）；ヒトｐ５３の配列である、ＰＱＰＫＫＫＰＬ（配列番号９９）；マウスｃ−ａｂ１  ＩＶの配列である、ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ（配列番号１００）；インフルエンザウイルスＮＳ１の配列である、ＤＲＬＲＲ（配列番号１０１）およびＰＫＱＫＫＲＫ（配列番号１０２）；肝炎ウイルスデルタ抗原の配列である、ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ（配列番号１０３）；マウスＭｘ１タンパク質の配列である、ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（配列番号１０４）；ヒトポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼの配列である、ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ（配列番号１０５）；およびステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイドの配列である、ＲＫＣLＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ（配列番号１０６）を含むかまたはこれらから導出されるＮＬＳ配列を含む。当技術分野では、他の適するＮＬＳ配列も公知である（例えば、Sorokin, Biochemistry (Moscow) (2007) 72:13, 1439-1457; Lange J Biol Chem. (2007) 282:8, 5101-5）。
【０５８０】
一部の態様では、Ｃａｓ９分子は、Ｃａｓ９分子を特異的に認識することを可能とする、１または複数のアミノ酸配列、例えば、タグを含みうる。一実施形態では、タグは、ヒスチジンタグ、例えば、少なくとも３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、またはこれを超えるヒスチジンアミノ酸（配列番号１０７）を含むヒスチジンタグである。複数の実施形態では、ヒスチジンタグは、Ｈｉｓ６タグ（６ヒスチジン）（配列番号１０８）である。他の実施形態では、ヒスチジンタグは、Ｈｉｓ８タグ（８ヒスチジン）（配列番号１０９）である。複数の実施形態では、ヒスチジンタグは、リンカーにより、Ｃａｓ９分子の、１または複数の他の部分から隔てることができる。複数の実施形態では、リンカーは、ＧＧＳまたは２つまたはこれを超えるＧＧＳ配列のリピートである。このような融合体の例は、Ｃａｓ９分子である、ｉＰｒｏｔ１０６５２０である。
【０５８１】
一部の態様では、Ｃａｓ９分子は、プロテアーゼ（例えば、プロテアーゼ切断部位を含む）により認識される、１または複数のアミノ酸配列を含みうる。複数の実施形態では、切断部位は、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）切断部位であり、例えば、配列ＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号１１０）を含む。一部の態様では、プロテアーゼ切断部位、例えば、ＴＥＶ切断部位は、タグ、例えば、Ｈｉｓタグ、例えば、Ｈｉｓ６（配列番号１０８）またはＨｉｓ８タグ（配列番号１０９）と、Ｃａｓ９分子の残余部分との間に配置される。理論に束縛されずに、このような導入は、例えば、Ｃａｓ９分子の精製のためのタグの使用、次いで、後続の切断を可能とするので、タグは、Ｃａｓ９分子の機能に干渉しないと考えられる。
【０５８２】
複数の実施形態では、Ｃａｓ９分子（例えば、本明細書で記載されるＣａｓ９分子）は、Ｎ末端のＮＬＳおよびＣ末端のＮＬＳ（例えば、Ｎ末端から、Ｃ末端へと、ＮＬＳ−Ｃａｓ９−ＮＬＳを含む）を含み、例えば、配列中、各ＮＬＳは、ＳＶ４０  ＮＬＳ（ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号９１））である。複数の実施形態では、Ｃａｓ９分子（例えば、本明細書で記載されるＣａｓ９分子）は、Ｎ末端のＮＬＳ、Ｃ末端のＮＬＳ、およびＣ末端のＨｉｓ６タグ（配列番号１０８）（例えば、Ｎ末端から、Ｃ末端へと、ＮＬＳ−Ｃａｓ９−ＮＬＳ−Ｈｉｓタグを含む）を含み、例えば、配列中、各ＮＬＳは、ＳＶ４０  ＮＬＳ（ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号９１））である。複数の実施形態では、Ｃａｓ９分子（例えば、本明細書で記載されるＣａｓ９分子）は、Ｎ末端のＨｉｓタグ（例えば、Ｈｉｓ６タグ（配列番号１０８））、Ｎ末端のＮＬＳ、およびＣ末端のＮＬＳ（例えば、Ｎ末端から、Ｃ末端へと、Ｈｉｓタグ−ＮＬＳ−Ｃａｓ９−ＮＬＳを含む）を含み、例えば、配列中、各ＮＬＳは、ＳＶ４０  ＮＬＳ（ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号９１））である。複数の実施形態では、Ｃａｓ９分子（例えば、本明細書で記載されるＣａｓ９分子）は、Ｎ末端のＮＬＳおよびＣ末端のＨｉｓタグ（例えば、Ｈｉｓ６タグ（配列番号１０８））（例えば、Ｎ末端から、Ｃ末端へと、Ｈｉｓタグ−Ｃａｓ９−ＮＬＳを含む）を含み、例えば、配列中、ＮＬＳは、ＳＶ４０  ＮＬＳ（ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号９１））である。複数の実施形態では、Ｃａｓ９分子（例えば、本明細書で記載されるＣａｓ９分子）は、Ｎ末端のＨｉｓタグ（例えば、Ｈｉｓ６タグ（配列番号１０８））およびＣ末端のＮＬＳ（例えば、Ｎ末端から、Ｃ末端へと、ＮＬＳ−Ｃａｓ９−Ｈｉｓタグを含む）を含み、例えば、配列中、ＮＬＳは、ＳＶ４０  ＮＬＳ（ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号９１））である。複数の実施形態では、Ｃａｓ９分子（例えば、本明細書で記載されるＣａｓ９分子）は、Ｎ末端のＨｉｓタグ（例えば、Ｈｉｓ８タグ（配列番号１０９））、Ｎ末端の切断ドメイン（例えば、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）切断ドメイン（例えば、配列ＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号１１０）を含む））、Ｎ末端のＮＬＳ（例えば、ＳＶ４０  ＮＬＳ；配列番号９１）、およびＣ末端のＮＬＳ（例えば、ＳＶ４０  ＮＬＳ；配列番号９１）を含む（例えば、Ｎ末端から、Ｃ末端へと、Ｈｉｓタグ−ＴＥＶ−ＮＬＳ−Ｃａｓ９−ＮＬＳを含む）。前述の複数の実施形態のうちのいずれかでは、Ｃａｓ９は、配列番号９０の配列を有する。代替的に、前述の複数の実施形態のうちのいずれかでは、Ｃａｓ９は、例えば、本明細書で記載される、配列番号９０のＣａｓ９変異体の配列を有する。前述の複数の実施形態のうちのいずれかでは、Ｃａｓ９分子は、Ｈｉｓタグと、分子の別の部分との間のリンカー、例えば、ＧＧＳリンカーを含む。上記で記載した、例示的なＣａｓ９分子のアミノ酸配列を、下記に提供する。一部の実施形態では、Ｃａｓ９分子は、本明細書、例えば、配列番号９０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、���列番号１２１、または配列番号１２３に提示されたＣａｓ９配列との、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性を有するか；これらと比較した場合に、アミノ酸残基のうちの、１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、または４０％以下において異なるか；少なくとも１、２、５、１０、または２０アミノ酸だけ異なるが、１００、８０、７０、６０、５０、４０、または３０アミノ酸を超えては異ならないか；またはこれらと同一であるアミノ酸配列を含む。「ｉＰｒｏｔ」識別子は、図１の識別子と合致する。
【０５８３】
ｉＰｒｏｔ１０５０２６（タンパク質の調製に応じてまた、ｉＰｒｏｔ１０６１５４、ｉＰｒｏｔ１０６３３１、ｉＰｒｏｔ１０６５４５、およびＰＩＤ４２６３０３とも称する）（配列番号１１１）：
【０５８４】
【化３】
2020513832.tif 000236
【０５８５】
ｉＰｒｏｔ１０６５１８（配列番号１１２）：
【０５８６】
【化４】
2020513832.tif 000237
【０５８７】
ｉＰｒｏｔ１０６５１９（配列番号１１３）：
【０５８８】
【化５】
2020513832.tif 000238
【０５８９】
ｉＰｒｏｔ１０６５２０（配列番号１１４）：
【０５９０】
【化６】
2020513832.tif 000239
【０５９１】
ｉＰｒｏｔ１０６５２１（配列番号１１５）：
【０５９２】
【化７】
2020513832.tif 000240
【０５９３】
ｉＰｒｏｔ１０６５２２（配列番号１１６）：
【０５９４】
【化８】
2020513832.tif 000241
【０５９５】
ｉＰｒｏｔ１０６６５８（配列番号１１７）：
【０５９６】
【化９】
2020513832.tif 000242
【０５９７】
ｉＰｒｏｔ１０６７４５（配列番号１１８）：
【０５９８】
【化１０】
2020513832.tif 000243
【０５９９】
ｉＰｒｏｔ１０６７４６（配列番号１１９）：
【０６００】
【化１１】
2020513832.tif 000244
【０６０１】
ｉＰｒｏｔ１０６７４７（配列番号１２０）：
【０６０２】
【化１２】
2020513832.tif 000245
【０６０３】
ｉＰｒｏｔ１０６８８４（配列番号１２１）：
【０６０４】
【化１３】
2020513832.tif 000246
【０６０５】
ｉＰＲＯＴ１０９４９６（配列番号１２３）：
【０６０６】
【化１４】
2020513832.tif 000247
【０６０７】
Ｃａｓ９分子をコードする核酸
本明細書では、上記に論じたＣａｓ９分子、例えば、活性のＣａｓ９分子または不活性のＣａｓ９分子をコードする核酸が提示される。
【０６０８】
例示的なＣａｓ９分子をコードする核酸については、Cong et al , SCIENCE 2013, 399(6121):819-823; Wang et al , CELL 2013, 153(4):910-918; Mali et al. , SCIENCE 2013, 399(6121):823-826; Jinek et al, SCIENCE 2012, 337(6096):816-821において記載されている。
【０６０９】
ある実施形態では、Ｃａｓ９分子をコードする核酸は、合成核酸配列でありうる。例えば、合成核酸分子は、例えば、ＸＩＩＩ節に記載する通り、化学修飾することができる。ある実施形態では、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡは、以下の特性：キャッピング、ポリアデニル化、５−メチルシチジンおよび／またはシュードウリジンによる置換のうちの１または複数、例えば、全てを有する。
【０６１０】
加えて、または代替的に、合成核酸配列は、コドン最適化する、例えば、少なくとも１つの非一般的コドンまたはそれほど一般的でないコドンを、一般的コドンにより置きかえることができる。例えば、合成核酸は、最適化されたメッセンジャーｍＲＮＡ、例えば、例えば、本明細書で記載される、哺乳動物の発現系内の発現のために最適化されたメッセンジャーｍＲＮＡの合成を方向付けうる。
【０６１１】
下記には、化膿連鎖球菌（S. pyogenes）のＣａｓ９分子をコードする、例示的なコドン最適化核酸配列を提供する。
【０６１２】
【化１５−１】
2020513832.tif 000248
【０６１３】
【化１５−２】
2020513832.tif 000249
【０６１４】
【化１５−３】
2020513832.tif 000250
【０６１５】
Ｃａｓ９配列、例えば、上記で列挙された配列を、Ｃ末端において、ペプチドまたはポリペプチドと融合させる（例えば、不活性のＣａｓ９を、Ｃ末端において、転写リプレッサーと融合させる）場合、終止コドンは、除去されることが理解される。
【０６１６】
Ｖ．キメラ抗原受容体
本明細書では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞、またはキメラＴＣＲを形質導入された免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞が開示される。特に、本明細書では、Ｔｅｔ遺伝子のイントロンまたはイントロン−エクソン接合部、例えば、ＴＥＴ２のイントロンまたはイントロン−エクソン接合部、例えば、ＴＥＴ２のエクソン９とエクソン１０との間のイントロンにおいて改変された、ＣＡＲ免疫エフェクター細胞の改善が開示される。本明細書の一部の実施形態では、ＴＥＴ２の機能および／または発現の、部分的な（部分的であり、完全ではない）阻害を呈示して、免疫エフェクター細胞機能を増強するように改変された、ＣＡＲ免疫エフェクター細胞が開示される。本明細書の一部の実施形態では、ＴＥＴ２の機能および／または発現の、完全な阻害を呈示して、免疫エフェクター細胞機能を増強するように改変された、ＣＡＲ免疫エフェクター細胞が開示される。一部の実施形態では、ＴＥＴ２機能を、特異的に破壊し、かつ／または異種タンパク質を、この位置に、特異的に挿入するように、ＣＡＲ免疫エフェクター細胞を、Ｔｅｔ遺伝子のイントロンまたはイントロン−エクソン接合部、例えば、ＴＥＴ２のイントロンまたはイントロン−エクソン接合部において改変する。一部の実施形態では、本開示は、これらの養子免疫療法および試薬との関連で、ＣＡＲ免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞、またはキメラＴＣＲを形質導入された免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞を作製する使用のためのｇＲＮＡ分子およびＣＲＩＳＰＲ系を提供する。本開示のｇＲＮＡ分子およびＣＲＩＳＰＲ系を使用して、有効性および安全性など、特性が改善された、養子免疫療法のための細胞および組成物を創出することができる。本節は、一部の実施形態では、本開示のｇＲＮＡ分子およびＣＲＩＳＰＲ系と共に、ＣＡＲ技術について記載し、改善されたＣＡＲ試薬、例えば、細胞および組成物、ならびに方法について記載する。キメラ抗原受容体を、免疫エフェクター細胞へと挿入するための他の方法であって、本明細書で記載されるか、または、そうでなければ、当業者に公知の方法を含む方法もまた、援用することができる。
【０６１７】
一般に、本開示の複数の態様は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離核酸分子であって、ＣＡＲが、本明細書で記載される腫瘍抗原に結合する抗原結合性ドメイン（例えば、抗体または抗体断片、ＴＣＲまたはＴＣＲ断片）、膜貫通ドメイン（例えば、本明細書で記載される膜貫通ドメイン）、および細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書で記載される細胞内シグナル伝達ドメイン）を含む、単離核酸分子に関するか、またはこれを含む。多様な実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激性ドメイン（例えば、本明細書で記載される共刺激性ドメイン）および／または一次シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書で記載される一次シグナル伝達ドメイン）を含む。
【０６１８】
他の複数の態様では、本開示は、上記の核酸と、このような核酸分子によりコードされる単離タンパク質とを含有する宿主細胞を含む。本明細書では、ＣＡＲ核酸構築物、コードされるタンパク質、ＣＡＲ核酸構築物を含有するベクター、宿主細胞、医薬組成物、ならびに投与法および処置法が開示される。それらの調製および使用についての、さらなる詳細は、参照によりその全体において組み込まれる、国際特許出願公開第２０１５１４２６７５号パンフレットにおいて提示されている。
【０６１９】
一態様では、本開示は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および／またはＣＡＲをコードする単離核酸分子であって、ＣＡＲが、腫瘍支持抗原（例えば、本明細書で記載される腫瘍支持抗原）に結合する抗原結合性ドメイン（例えば、抗体または抗体断片、ＴＣＲまたはＴＣＲ断片）、膜貫通ドメイン（例えば、本明細書で記載される膜貫通ドメイン）、および細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書で記載される細胞内シグナル伝達ドメイン）を含む、ＣＡＲおよび／またはＣＡＲをコードする単離核酸分子に関する。一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激性ドメイン（例えば、共刺激性ドメイン（本明細書で記載される共刺激性ドメイン）および／または一次シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書で記載される一次シグナル伝達ドメイン）を含む、細胞内シグナル伝達ドメイン）を含む。一部の実施形態では、腫瘍支持抗原は、間質細胞上または骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）上に存在する抗原である。他の複数の態様では、本開示は、このような核酸によりコードされるポリペプチドと、このような核酸および／またはポリペプチドを含有する宿主細胞とを特色とする。
【０６２０】
代替的に、本開示の複数の態様は、本明細書で記載されるがん抗原に対する特異性を伴う、ＴＣＲアルファ可変ドメインおよび／またはＴＣＲベータ可変ドメインを含む、キメラＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする単離核酸に関する。例えば、それらの内容が、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、Dembic et al., Nature, 320, 232-238 (1986), Schumacher, Nat. Rev. Immunol., 2, 512-519 (2002), Kershaw et al., Nat. Rev. Immunol., 5, 928-940 (2005), Xue et al., Clin. Exp. Immunol., 139, 167-172 (2005), Rossig et al., Mol. Ther., 10, 5-18 (2004), and Murphy et al., Immunity, 22, 403-414 (2005); (Morgan et al. J. Immunol., 171, 3287-3295 (2003), Hughes et al., Hum. Gene Ther., 16, 1-16 (2005), Zhao et al., J. Immunol., 174, 4415-4423 (2005), Roszkowski et al., Cancer Res., 65, 1570-1576 (2005), and Engels et al., Hum. Gene Ther., 16, 799-810 (2005)；米国特許出願公開第２００９／０３０４６５５７号明細書を参照されたい。このようなキメラＴＣＲは、例えば、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ−１００、ｐ５３、およびＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥＡ３／Ａ６、ＭＡＧＥＡ３、ＳＳＸ２、ＨＰＶ−１６Ｅ６、またはＨＰＶ−１６Ｅ７などのがん抗原を認識しうる。他の複数の態様では、本開示は、このような核酸によりコードされるポリペプチドと、このような核酸および／またはポリペプチドを含有する宿主細胞とを特色とする。
【０６２１】
標的
本開示は、本明細書で記載されるｇＲＮＡ分子またはＣＲＩＳＰＲ系であって、免疫エフェクター細胞を、所望されない細胞（例えば、がん細胞）へと方向付ける、１または複数のＣＡＲを含有するように、さらに操作されたｇＲＮＡ分子またはＣＲＩＳＰＲ系を含むか、または、任意の時点において、これを含んだ細胞、例えば、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を提供する。これは、がん関連抗原に特異的なＣＡＲ上の抗原結合性ドメインを介して達成される。本開示のＣＡＲによりターゲティングされうるがん関連抗原（腫瘍抗原）には、２つのクラス：（１）がん細胞の表面上で発現するがん関連抗原と；（２）それ自体は、細胞内にあるが、このような抗原（ペプチド）の断片は、ＭＨＣ（主要組織適合性複合体）により、がん細胞の表面上に提示されているがん関連抗原とがある。
【０６２２】
一部の実施形態では、腫瘍抗原は、ＣＤ１９；ＣＤ１２３；ＣＤ２２；ＣＤ３０；ＣＤ１７１；ＣＳ−１（ＣＤ２サブセット１、ＣＲＡＣＣ、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ３１９、および１９Ａ２４ともまた称する）；Ｃ型レクチン様分子１（ＣＬＬ−１またはＣＬＥＣＬ１）；ＣＤ３３；表皮成長因子受容体変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）；ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）；ガングリオシドＧＤ３（ａＮｅｕ５Ａｃ（２−８）ａＮｅｕ５Ａｃ（２−３）ｂＤＧａｌｐ（１−４）ｂＤＧｌｃｐ（１−１）Ｃｅｒ）；ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーであるＢ細胞成熟（ＢＣＭＡ）；Ｔｎ抗原（（ＴｎＡｇ）または（ＧａｌＮＡｃα−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ））；前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）；受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）；Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）；腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）；ＣＤ３８；ＣＤ４４ｖ６；癌胎児性抗原（ＣＥＡ）；上皮細胞接着分子（ＥＰＣＡＭ）；Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６）；ＫＩＴ（ＣＤ１１７）；インターロイキン１３受容体サブユニットアルファ−２（ＩＬ−１３Ｒａ２またはＣＤ２１３Ａ２）；メソテリン；インターロイキン１１受容体アルファ（ＩＬ−１１Ｒａ）；前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）；プロテアーゼセリン２１（テスチシンまたはＰＲＳＳ２１）；血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）；Ｌｅｗｉｓ（Ｙ）抗原；ＣＤ２４；血小板由来成長因子受容体ベータ（ＰＤＧＦＲベータ）；発生段階特異的胎児性抗原４（ＳＳＥＡ−４）；ＣＤ２０；葉酸受容体アルファ；受容体型プロテインチロシンキナーゼＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）；細胞表面関連ムチン１（ＭＵＣ１）；表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）；神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）；プロスターゼ；前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）；突然変異型伸長因子２（ＥＬＦ２Ｍ）；エフリンＢ２；線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰ）；インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ−１受容体）；炭酸脱水素酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）；ベータ９型プロテアソーム（プロソーム、マクロペイン）サブユニット（ＬＭＰ２）；糖タンパク質１００（ｇｐ１００）；切断点クラスター領域（ＢＣＲ）およびＡｂｅｌｓｏｎマウス白血病ウイルスがん遺伝子相同体１（Ａｂｌ）からなるがん遺伝子融合タンパク質（ｂｃｒ−ａｂｌ）；チロシナーゼ；Ａ型エフリン受容体２（ＥｐｈＡ２）；フコシルＧＭ１；シアリルＬｅｗｉｓ接着分子（ｓＬｅ）；ガングリオシドＧＭ３（ａＮｅｕ５Ａｃ（２−３）ｂＤＧａｌｐ（１−４）ｂＤＧｌｃｐ（１−１）Ｃｅｒ）；トランスグルタミナーゼ５（ＴＧＳ５）；高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷＭＡＡ）；ｏ−アセチル−ＧＤ２ガングリオシド（ＯＡｃＧＤ２）；葉酸受容体ベータ；腫瘍内皮マーカー１（ＴＥＭ１／ＣＤ２４８）；腫瘍内皮マーカー７関連（ＴＥＭ７Ｒ）；ｃｌａｕｄｉｎ６（ＣＬＤＮ６）；甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）；Ｇタンパク質共役受容体クラスＣ群５メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）；Ｘ染色体オープンリーディングフレーム６１（ＣＸＯＲＦ６１）；ＣＤ９７；ＣＤ１７９ａ；未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）；ポリシアル酸；胎盤特異的１（ＰＬＡＣ１）；ｇｌｏｂｏＨ糖セラミドの六糖部���（ＧｌｏｂｏＨ）；乳腺分化抗原（ＮＹ−ＢＲ−１）；ウロプラキン２（ＵＰＫ２）；Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体１（ＨＡＶＣＲ１）；アドレナリン受容体ベータ３（ＡＤＲＢ３）；パネキシン３（ＰＡＮＸ３）；Ｇタンパク質共役受容体２０（ＧＰＲ２０）；リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｋ９（ＬＹ６Ｋ）；嗅覚受容体５１Ｅ２（ＯＲ５１Ｅ２）；ＴＣＲガンマ代替的リーディングフレームタンパク質（ＴＡＲＰ）；ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）；がん／精巣抗原１（ＮＹ−ＥＳＯ−１）；がん／精巣抗原２（ＬＡＧＥ−１ａ）；黒色腫関連抗原１（ＭＡＧＥ−Ａ１）；染色体１２ｐに位置するＥＴＳ転座変異体遺伝子６（ＥＴＶ６−ＡＭＬ）；精子タンパク質１７（ＳＰＡ１７）；Ｘ抗原ファミリー、メンバー１Ａ（ＸＡＧＥ１）；アンジオポエチン結合性細胞表面受容体２（Ｔｉｅ  ２）；黒色腫がん精巣抗原１（ＭＡＤ−ＣＴ−１）；黒色腫がん精巣抗原２（ＭＡＤ−ＣＴ−２）；Ｆｏｓ関連抗原１；腫瘍タンパク質ｐ５３（ｐ５３）；ｐ５３突然変異体；プロステイン；サバイビン；テロメラーゼ；前立腺癌腫瘍抗原１（ＰＣＴＡ−１またはガレクチン８）；Ｔ細胞により認識される黒色腫抗原１（ＭｅｌａｎＡまたはＭＡＲＴ１）；ラット肉腫（Ｒａｓ）突然変異体；ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）；肉腫転座切断点；黒色腫アポトーシス阻害剤（ＭＬ−ＩＡＰ）；ＥＲＧ（膜貫通セリンプロテアーゼ２（ＴＭＰＲＳＳ２）ＥＴＳ融合遺伝子）；Ｎ−アセチルグルコサミニル−トランスフェラーゼＶ（ＮＡ１７）；ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ−３（ＰＡＸ３）；アンドロゲン受容体；ＣｙｃｌｉｎＢ１；ｖ−ｍｙｃトリ骨髄細胞腫症ウイルスがん遺伝子神経芽細胞腫由来相同体（ＭＹＣＮ）；Ｒａｓ相同体ファミリーメンバーＣ（ＲｈｏＣ）；チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ−２）；チトクロームＰ４５０１Ｂ１（ＣＹＰ１Ｂ１）；ＣＣＣＴＣ結合性因子（亜鉛フィンガータンパク質）様（ＢＯＲＩＳまたはＢｒｏｔｈｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  Ｉｍｐｒｉｎｔｅｄ  Ｓｉｔｅｓ）；Ｓｑｕａｍｏｕｓ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｂｙ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ  ３（ＳＡＲＴ３）；ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ−５（ＰＡＸ５）；プロアクロシン結合タンパク質ｓｐ３２（ＯＹ−ＴＥＳ１）；リンパ球特異的プロテインチロシンキナーゼ（ＬＣＫ）；Ａキナーゼアンカータンパク質４（ＡＫＡＰ−４）；滑膜肉腫Ｘ切断点２（ＳＳＸ２）；終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ−１）；腎ユビキタス１（ＲＵ１）；腎ユビキタス２（ＲＵ２）；レグマイン；ヒトパピローマウイルスＥ６（ＨＰＶＥ６）；ヒトパピローマウイルスＥ７（ＨＰＶＥ７）；腸カルボキシルエステラーゼ；突然変異型熱ショックタンパク質７０−２（ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２）；ＣＤ７９ａ；ＣＤ７９ｂ；ＣＤ７２；白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）；ＩｇＡ受容体のＦｃ断片（ＦＣＡＲまたはＣＤ８９）；白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＡメンバー２（ＬＩＬＲＡ２）；ＣＤ３００分子様ファミリーメンバーｆ（ＣＤ３００ＬＦ）；Ｃ型レクチンドメインファミリー１２メンバーＡ（ＣＬＥＣ１２Ａ）；��髄間質細胞抗原２（ＢＳＴ２）；ＥＧＦ様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様２（ＥＭＲ２）；リンパ球抗原７５（ＬＹ７５）；グリピカン３（ＧＰＣ３）；Ｆｃ受容体様５（ＦＣＲＬ５）；および免疫グロブリンラムダ様ポリペプチド１（ＩＧＬＬ１）のうちの１または複数から選択される。
【０６２３】
本明細書で記載されるＣＡＲは、腫瘍支持抗原（例えば、本明細書で記載される腫瘍支持抗原）に結合する抗原結合性ドメイン（例えば、抗体または抗体断片、ＴＣＲまたはＴＣＲ断片）を含みうる。一部の実施形態では、腫瘍支持抗原は、間質細胞上または骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）上に存在する抗原である。間質細胞は、マイクロ環境内の細胞分裂を促進する成長因子を分泌しうる。ＭＤＳＣ細胞は、Ｔ細胞の増殖および活性化を阻害しうる。理論に束縛されることを望まずに、一部の実施形態では、ＣＡＲ発現細胞は、腫瘍支持細胞を破壊し、これにより、腫瘍の成長または生存を間接的に阻害する。
【０６２４】
複数の実施形態では、間質細胞抗原は、骨髄間質細胞抗原２（ＢＳＴ２）、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、およびテネイシンのうちの１または複数から選択される。ある実施形態では、ＦＡＰ特異的抗体は、結合について、シブロツズマブと競合するか、またはこれと同じＣＤＲを有する。複数の実施形態では、ＭＤＳＣ抗原は、ＣＤ３３、ＣＤ１１ｂ、Ｃ１４、ＣＤ１５、およびＣＤ６６ｂのうちの１または複数から選択される。したがって、一部の実施形態では、腫瘍支持抗原は、骨髄間質細胞抗原２（ＢＳＴ２）、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、またはテネイシン、ＣＤ３３、ＣＤ１１ｂ、Ｃ１４、ＣＤ１５、およびＣＤ６６ｂのうちの１または複数から選択される。
【０６２５】
一部の実施形態では、１つを超えるＣＡＲ遺伝子を、ＴＥＴ２遺伝子のイントロン（またはイントロン−エクソン接合部）へと挿入する、例えば、第１のＣＡＲをコードする配列と、第２のＣＡＲをコードする配列とを、ＴＥＴ２遺伝子のイントロン（またはイントロン−エクソン接合部）へと挿入する。複数の実施形態では、第１のＣＡＲをコードする配列と、第２のＣＡＲをコードする配列とを、本明細書で記載される、２Ａ部位の配列により隔てる。複数の実施形態では、第１のＣＡＲは、ＣＤ１９  ＣＡＲであり、第２のＣＡＲは、ＣＤ２０  ＣＡＲまたはＣＤ２２  ＣＡＲである。
【０６２６】
一部の実施形態では、ＴＥＴ２遺伝子のイントロンへと挿入されるＣＡＲ遺伝子は、２つまたはこれを超える抗原結合性ドメイン、例えば、異なる抗原をターゲティングする、２つまたはこれを超える抗原結合性ドメインを含むＣＡＲをコードする。２つまたはこれを超える抗原結合性ドメインを含むＣＡＲの例については、例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１６／１６４７３１号パンフレットにおいて記載されている。複数の実施形態では、第１の抗原結合性ドメインは、ＣＤ１９に結合し、第２の抗原結合性ドメインは、ＣＤ２０またはＣＤ２２に結合する。
【０６２７】
一部の実施形態では、ＴＥＴ２遺伝子のイントロンへと挿入されるＣＡＲ遺伝子は、調節性ＣＡＲ遺伝子系をコードする。例示的な調節性ＣＡＲ系については、例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１７／１８１１１９号パンフレットにおいて記載されている。
【０６２８】
一部の実施形態では、ＴＥＴ２遺伝子のイントロンへと挿入されるＣＡＲ遺伝子は、ＣＤ１９  ＣＡＲ遺伝子である。一部の実施形態では、ＴＥＴ２遺伝子のイントロンへと挿入されるＣＡＲ遺伝子は、ＢＣＭＡ  ＣＡＲ遺伝子である。一部の実施形態では、ＴＥＴ２遺伝子のイントロンへと挿入されるＣＡＲ遺伝子は、ＣＤ２２  ＣＡＲ遺伝子である。
【０６２９】
一部の実施形態では、ＴＥＴ２遺伝子のエクソン９とエクソン１０との間のイントロンへと挿入されるＣＡＲ遺伝子は、ＣＤ１９  ＣＡＲ遺伝子である。一部の実施形態では、ＴＥＴ２遺伝子のエクソン９とエクソン１０との間のイントロンへと挿入されるＣＡＲ遺伝子は、ＢＣＭＡ  ＣＡＲ遺伝子である。一部の実施形態では、ＴＥＴ２遺伝子のエクソン９とエクソン１０との間のイントロンへと挿入されるＣＡＲ遺伝子は、ＣＤ２２  ＣＡＲ遺伝子である。
【０６３０】
抗原結合性ドメインの構造
一部の実施形態では、コードされるＣＡＲ分子の抗原結合性ドメインは、抗体、抗体断片、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、単一ドメイン抗体（ＳＤＡＢ）、ＶＨドメインおよび／またはＶＬドメイン、ラクダ科動物ＶＨＨドメイン、二官能性（例えば、二特異性）、また多特異性ハイブリッド抗体を含む（例えば、Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987)）。
【０６３１】
一部の場合では、ｓｃＦｖは、当技術分野で公知の方法（例えば、Bird et al., (1988) Science 242:423-426およびHuston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883を参照されたい）に従い調製することができる。ＳｃＦｖ分子は、可撓性のポリペプチドリンカーを使用して、ＶＨ領域と、ＶＬ領域とを、一体に連結することにより産生することができる。ｓｃＦｖ分子は、長さおよび／またはアミノ酸組成を最適化したリンカー（例えば、Ｓｅｒ−Ｇｌｙリンカー）を含むことができる。リンカーの長さは、ｓｃＦｖの可変領域が、どのようにしてフォールディングし、相互作用するのかに、多大な影響を及ぼしうる。実際、短いポリペプチドリンカー（例えば、５〜１０アミノ酸の間の）を援用する場合、鎖内フォールディングが妨げられる。鎖内フォールディングはまた、２つの可変領域を一体として、機能的なエピトープ結合性部位を形成するのにも要求される。リンカーの配向性およびサイズについては、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Hollinger et al. 1993 Proc Natl Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448；米国特許出願公開第２００５／０１００５４３号明細書、同第２００５／０１７５６０６号明細書、同第２００７／００１４７９４号明細書、ならびにＰＣＴ国際公開第２００６／０２０２５８号パンフレットおよび国際公開第２００７／０２４７１５号パンフレットを参照されたい。
【０６３２】
ｓｃＦｖは、そのＶＬ領域と、ＶＨ領域との間に、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、またはこれを超えるアミノ酸残基のリンカーを含みうる。リンカー配列は、任意の自然発生のアミノ酸を含みうる。一部の実施形態では、リンカー配列は、アミノ酸である、グリシンおよびセリンを含む。別の実施形態では、リンカー配列は、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎなど、グリシンおよびセリンのリピートのセット［配列中、ｎは、１と等しいか、またはこれを超える、正の整数である］（配列番号２６）を含む。一実施形態では、リンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４（配列番号３４）または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号３５）でありうる。リンカーの長さの変動は、活性を保持または増強することが可能であり、活性研究において、優れた有効性をもたらす。
【０６３３】
別の態様では、抗原結合性ドメインは、Ｔ細胞受容体（「ＴＣＲ」）、またはその断片、例えば、単鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ）である。当技術分野では、このようなＴＣＲを作製する方法が公知である。例えば、Willemsen RA et al, Gene Therapy 7: 1369-1377 (2000); Zhang T et al, Cancer Gene Ther 11: 487-496 (2004); Aggen et al, Gene Ther. 19(4):365-74 (2012)（参考文献は、それらの全体において本明細書に組み込まれる）を参照されたい。例えば、リンカー（例えば、可撓性のペプチド）により連結されたＴ細胞クローンに由来するＶα遺伝子およびＶβ遺伝子を含有する、ｓｃＴＣＲを操作することができる。この手法は、それ自体は細胞内にあるが、このような抗原（ペプチド）の断片は、ＭＨＣにより、がん細胞の表面上に提示される、がん関連標的に対して極めて有用である。
【０６３４】
ある特定の実施形態では、コードされる抗原結合性ドメインは、１０−４Ｍ〜１０−８Ｍの結合アフィニティーであるＫＤを有する。
【０６３５】
一実施形態では、コードされるＣＡＲ分子は、標的抗原に対して、１０−４Ｍ〜１０−８Ｍ、例えば、１０−５Ｍ〜１０−７Ｍ、例えば、１０−６Ｍまたは１０−７Ｍの結合アフィニティーであるＫＤを有する抗原結合性ドメインを含む。一実施形態では、抗原結合性ドメインは、基準抗体、例えば、本明細書で記載される抗体の、少なくとも５分の１、１０分の１、２０分の１、３０分の１、５０分の１、１００分の１、または１，０００分の１である結合アフィニティーを有する。一実施形態では、コードされる抗原結合性ドメインは、基準抗体（例えば、抗原結合性ドメインが導出される抗体）の、少なくとも５分の１の結合アフィニティーを有する。一態様では、このような抗体断片は、それらが、当業者により理解される生物学的応答であって、免疫応答の活性化、その標的抗原からの、シグナル伝達の発生の阻害、キナーゼ活性の阻害などを含むがこれらに限定されない生物学的応答をもたらすという意味で機能的である。
【０６３６】
一態様では、ＣＡＲの抗原結合性ドメインは、それが導出されるｓｃＦｖのマウス配列と比較してヒト化されたｓｃＦｖ抗体断片である。
【０６３７】
一態様では、本開示のＣＡＲの抗原結合性ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、その配列が、哺乳動物細胞内の発現についてコドン最適化された核酸分子によりコードされる。一態様では、本開示のＣＡＲ構築物の全体は、その配列の全体が、哺乳動物細胞内の発現についてコドン最適化された核酸分子によりコードされる。コドン最適化とは、異なる種では、コードＤＮＡ内の同義コドン（すなわち、同じアミノ酸をコードするコドン）の発生頻度にバイアスがかかるという発見を指す。このようなコドンの縮重は、同一のポリペプチドが、様々なヌクレオチド配列によりコードされることを可能とする。当技術分野では、様々なコドン最適化法が公知であり、例えば、少なくとも米国特許第５，７８６，４６４号明細書および同第６，１１４，１４８号明細書において開示されている方法を含む。
【０６３８】
抗原結合性ドメイン（および標的抗原）
一実施形態では、ＣＤ１９に対する抗原結合性ドメインは、ＰＣＴ国際公開第２０１２／０７９０００号パンフレット；ＰＣＴ国際公開第２０１４／１５３２７０号パンフレット；Kochenderfer, J.N. et al., J. Immunother. 32 (7), 689-702 (2009)；Kochenderfer, J.N., et al., Blood, 116 (20), 4099-4102 (2010)；ＰＣＴ国際公開第２０１４／０３１６８７号パンフレット；Bejcek, Cancer Research, 55, 2346-2351, 1995；または米国特許第７，４４６，１９０号明細書において記載されている、ＣＡＲ、抗体または、これらの抗原結合性断片の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０６３９】
一実施形態では、メソテリンに対する抗原結合性ドメインは、例えば、ＰＣＴ国際公開第２０１５／０９０２３０号パンフレットにおいて記載されている、抗体、抗原結合性断片、またはＣＡＲの、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。一実施形態では、メソテリンに対する抗原結合性ドメインは、例えば、ＰＣＴ国際公開第１９９７／０２５０６８号パンフレット、国際公開第１９９９／０２８４７１号パンフレット、国際公開第２００５／０１４６５２号パンフレット、国際公開第２００６／０９９１４１号パンフレット、国際公開第２００９／０４５９５７号パンフレット、国際公開第２００９／０６８２０４号パンフレット、国際公開第２０１３／１４２０３４号パンフレット、国際公開第２０１３／０４０５５７号パンフレット、または国際公開第２０１３／０６３４１９号パンフレットにおいて記載されている、抗体、抗原結合性断片、またはＣＡＲの、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。一実施形態では、メソテリンに対する抗原結合性ドメインは、国際公開第２０１５／０９０２３０号パンフレットにおいて記載されている、抗体、抗原結合性断片、またはＣＡＲの、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０６４０】
一実施形態では、ＣＤ１２３に対する抗原結合性ドメインは、例えば、ＰＣＴ国際公開第２０１４／１３０６３５号パンフレットにおいて記載されている、抗体、抗原結合性断片、またはＣＡＲの、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。一実施形態では、ＣＤ１２３に対する抗原結合性ドメインは、例えば、ＰＣＴ国際公開第２０１４／１３８８０５号パンフレット、国際公開第２０１４／１３８８１９号パンフレット、国際公開第２０１３／１７３８２０号パンフレット、国際公開第２０１４／１４４６２２号パンフレット、国際公開第２００１／６６１３９号パンフレット、国際公開第２０１０／１２６０６６号パンフレット、国際公開第２０１４／１４４６２２号パンフレット、または米国特許出願公開第２００９／０２５２７４２号明細書において記載されている、抗体、抗原結合性断片、またはＣＡＲの、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。一実施形態では、ＣＤ１２３に対する抗原結合性ドメインは、国際公開第２０１６／０２８８９６号パンフレットにおいて記載されている、抗体、抗原結合性断片、またはＣＡＲの、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０６４１】
例は、以下の抗原結合性ドメイン、またはＶＬおよびＶＨ（（Ｇ４Ｓ）３リンカー（配列番号３５）により隔てられた下記の配列内の）を含むＣＡＲ分子を含む。
【０６４２】
ＣＤ１２３−１：
【０６４３】
【化１６】
2020513832.tif 000251
【０６４４】
ＣＤ１２３−２：
【０６４５】
【化１７】
2020513832.tif 000252
【０６４６】
ＣＤ１２３−３：
【０６４７】
【化１８】
2020513832.tif 000253
【０６４８】
ＣＤ１２３−４：
【０６４９】
【化１９】
2020513832.tif 000254
【０６５０】
前記抗ＣＤ１２３結合性ドメインを含むＣＡＲは、例えば、以下のアミノ酸配列を含みうる。
【０６５１】
ＣＡＲ１２３−２：
【０６５２】
【化２０】
2020513832.tif 000255
【０６５３】
ＣＡＲ１２３−３：
【０６５４】
【化２１】
2020513832.tif 000256
【０６５５】
ＣＡＲ１２３−４：
【０６５６】
【化２２】
2020513832.tif 000257
【０６５７】
ＣＡＲ１２３−１：
【０６５８】
【化２３】
2020513832.tif 000258
【０６５９】
各場合に、ＣＡＲは、任意選択で、上記の配列の各々に含まれるリーダー配列（ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ；配列番号２）を含む場合もあり、含まない場合もある。
【０６６０】
一実施形態では、ＥＧＦＲｖＩＩＩに対する抗原結合性ドメインは、例えば、国際公開第２０１４／１３０６５７号パンフレットにおいて記載されている、抗体、抗原結合性断片、またはＣＡＲの、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０６６１】
一実施形態では、ＣＤ２２に対する抗原結合性ドメインは、例えば、Haso et al., Blood, 121(7): 1165-1174 (2013); Wayne et al., Clin Cancer Res 16(6): 1894-1903 (2010); Kato et al., Leuk Res 37(1):83-88 (2013); Creative BioMart (creativebiomart.net): MOM-18047-S(P)において記載されている抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０６６２】
一実施形態では、ＣＳ−１に対する抗原結合性ドメインは、エロツズマブ（ＢＭＳ）の抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである（例えば、Tai et al., 2008, Blood 112(4):1329-37; Tai et al., 2007, Blood. 110(5):1656-63を参照されたい）。
【０６６３】
一実施形態では、ＣＬＬ−１に対する抗原結合性ドメインは、Ｒ＆Ｄ、ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｂｃａｍから市販されている抗体であって、例えば、ＰＥ−ＣＬＬ１−ｈｕ；型番３５３６０４（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）；およびＰＥ−ＣＬＬ１（ＣＬＥＣ１２Ａ）型番５６２５６６（ＢＤ）である抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。一実施形態では、ＣＬＬ−１に対する抗原結合性ドメインは、国際公開第２０１６／０１４５３５号パンフレットにおいて記載されている、抗体、抗原結合性断片、またはＣＡＲの、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０６６４】
一実施形態では、ＣＤ３３に対する抗原結合性ドメインは、例えば、Bross et al., Clin Cancer Res 7(6):1490-1496 (2001) (Gemtuzumab Ozogamicin, hP67.6), Caron et al., Cancer Res 52(24):6761-6767 (1992) (Lintuzumab, HuM195)；Lapusan et al., Invest New Drugs 30(3):1121-1131 (2012) (AVE9633), Aigner et al., Leukemia 27(5): 1107-1115 (2013) (AMG330, CD33 BiTE)；Dutour et al., Adv hematol 2012:683065 (2012),およびPizzitola et al., Leukemia doi:10.1038/Lue.2014.62 (2014)において記載されている抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。一実施形態では、ＣＤ３３に対する抗原結合性ドメインは、国際公開第２０１６／０１４５７６号パンフレットにおいて記載されている、抗体、抗原結合性断片、またはＣＡＲの、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０６６５】
一実施形態では、ＧＤ２に対する抗原結合性ドメインは、例えば、Mujoo et al., Cancer Res. 47(4):1098-1104 (1987); Cheung et al., Cancer Res 45(6):2642-2649 (1985), Cheung et al., J Clin Oncol 5(9):1430-1440 (1987), Cheung et al., J Clin Oncol 16(9):3053-3060 (1998), Handgretinger et al., Cancer Immunol Immunother 35(3):199-204 (1992)において記載されている抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。一部の実施形態では、ＧＤ２に対する抗原結合性ドメインは、ｍＡｂ１４．１８、１４Ｇ２ａ、ｃｈ１４．１８、ｈｕ１４．１８、３Ｆ８、ｈｕ３Ｆ８、３Ｇ６、８Ｂ６、６０Ｃ３、１０Ｂ８、ＭＥ３６．１、および８Ｈ９から選択される抗体の抗原結合性部分である（例えば、国際公開第２０１２０３３８８５号パンフレット、国際公開第２０１３０４０３７１号パンフレット、国際公開第２０１３１９２２９４号パンフレット、国際公開第２０１３０６１２７３号パンフレット、国際公開第２０１３１２３０６１号パンフレット、国際公開第２０１３０７４９１６号パンフレット、および国際公開第２０１３８５５５２号パンフレットを参照されたい）。一部の実施形態では、ＧＤ２に対する抗原結合性ドメインは、米国特許出願公開第２０１００１５０９１０号明細書またはＰＣＴ国際公開第２０１１１６０１１９号パンフレットにおいて記載されている抗体の抗原結合性部分である。
【０６６６】
一実施形態では、ＢＣＭＡに対する抗原結合性ドメインは、例えば、国際公開第２０１２１６３８０５号パンフレット、国際公開第２００１１２８１２号パンフレット、および国際公開第２００３０６２４０１号パンフレットにおいて記載されている抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。一実施形態では、ＢＣＭＡに対する抗原結合性ドメインは、国際公開第２０１６／０１４５６５号パンフレットにおいて記載されている、抗体、抗原結合性断片、またはＣＡＲの、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０６６７】
一実施形態では、Ｔｎ抗原に対する抗原結合性ドメインは、例えば、米国特許第８，４４０，７９８号明細書；Brooks et al., PNAS 107(22):10056-10061 (2010)；およびStone et al., OncoImmunology 1(6):863-873(2012)において記載されている抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０６６８】
一実施形態では、ＰＳＭＡに対する抗原結合性ドメインは、例えば、Parker et al., Protein Expr Purif 89(2):136-145 (2013)；米国特許出願公開第２０１１０２６８６５６号明細書（Ｊ５９１  ＳｃＦｖ）；Frigerio et al, European J Cancer 49(9):2223-2232 (2013)（ｓｃＦｖ  Ｄ２Ｂ）；国際公開第２００６１２５４８１号パンフレット（ｍＡｂ  ３／Ａ１２、ｍＡｂ  ３／Ｅ７、およびｍＡｂ  ３／Ｆ１１）において記載されている抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲ、および単鎖抗体断片（ｓｃＦｖ  Ａ５およびｓｃＦｖ  Ｄ７）である。
【０６６９】
一実施形態では、ＲＯＲ１に対する抗原結合性ドメインは、例えば、Hudecek et al., Clin Cancer Res 19(12):3153-3164 (2013)；国際公開第２０１１１５９８４７号パンフレット；および米国特許出願公開第２０１３０１０１６０７号明細書において記載されている抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０６７０】
一実施形態では、ＦＬＴ３に対する抗原結合性ドメインは、例えば、国際公開第２０１１０７６９２２号パンフレット、米国特許第５７７７０８４号明細書、欧州特許第０７５４２３０号明細書、米国特許出願公開第２００９０２９７５２９号明細書において記載されている抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲ、およびいくつかの市販のカタログ抗体（Ｒ＆Ｄ、ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｂｃａｍ）である。
【０６７１】
一実施形態では、ＴＡＧ７２に対する抗原結合性ドメインは、例えば、Hombach et al., Gastroenterology 113(4):1163-1170 (1997)において記載されている抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲ；およびＡｂｃａｍ  ａｂ６９１である。
【０６７２】
一実施形態では、ＦＡＰに対する抗原結合性ドメインは、例えば、Ostermann et al., Clinical Cancer Research 14:4584-4592 (2008)（ＦＡＰ５）、米国特許出願公開第２００９／０３０４７１８号明細書において記載されている抗体；シブロツズマブ(例えば、Hofheinz et al., Oncology Research and Treatment 26(1), 2003を参照されたい）；およびTran et al., J Exp Med 210(6):1125-1135 (2013)において記載されている抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０６７３】
一実施形態では、ＣＤ３８に対する抗原結合性ドメインは、ダラツムマブ（例えば、Groen et al., Blood 116(21):1261-1262 (2010)を参照されたい）；ＭＯＲ２０２（例えば、米国特許第８，２６３，７４６号明細書を参照されたい）；または米国特許第８，３６２，２１１号明細書において記載されている抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０６７４】
一実施形態では、ＣＤ４４ｖ６に対する抗原結合性ドメインは、例えば、Casucci et al., Blood 122(20):3461-3472 (2013)において記載されている抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０６７５】
一実施形態では、ＣＥＡに対する抗原結合性ドメインは、例えば、Chmielewski et al., Gastoenterology 143(4):1095-1107 (2012)において記載されている抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０６７６】
一実施形態では、ＥＰＣＡＭに対する抗原結合性ドメインは、ＭＴ１１０、ＥｐＣＡＭ−ＣＤ３二特異的Ａｂ（例えば、clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00635596を参照されたい）；エドレコロマブ；３６２２Ｗ９４；ＩＮＧ−１；およびアデカツムマブ（ＭＴ２０１）から選択される抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲＳである。
【０６７７】
一実施形態では、ＰＲＳＳ２１に対する抗原結合性ドメインは、米国特許第８，０８０，６５０号明細書において記載されている抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０６７８】
一実施形態では、Ｂ７Ｈ３に対する抗原結合性ドメインは、抗体ＭＧＡ２７１（Ｍａｃｒｏｇｅｎｉｃｓ）の抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０６７９】
一実施形態では、ＫＩＴに対する抗原結合性ドメインは、例えば、米国特許第７９１５３９１号明細書、米国特許出願公開第２０１２０２８８５０６号明細書、およびいくつかの市販のカタログ抗体において記載されている抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０６８０】
一実施形態では、ＩＬ−１３Ｒａ２に対する抗原結合性ドメインは、例えば、国際公開第２００８／１４６９１１号パンフレット、国際公開第２００４０８７７５８号パンフレット、国際公開第２００４０８７７５８号パンフレットにおいて記載されている抗体、およびいくつかの市販のカタログ抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０６８１】
一実施形態では、ＣＤ３０に対する抗原結合性ドメインは、例えば、米国特許第７０９０８４３号明細書および欧州特許第０８０５８７１号明細書において記載されている抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０６８２】
一実施形態では、ＧＤ３に対する抗原結合性ドメインは、例えば、米国特許第７２５３２６３号明細書；米国特許第８，２０７，３０８号明細書；米国特許出願公開第２０１２０２７６０４６号明細書；欧州特許第１０１３７６１号明細書；国際公開第２００５０３５５７７号パンフレット；および米国特許第６４３７０９８号明細書において記載されている抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０６８３】
一実施形態では、ＣＤ１７１に対する抗原結合性ドメインは、例えば、Hong et al., J Immunother 37(2):93-104 (2014)において記載されている抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０６８４】
一実施形態では、ＩＬ−１１Ｒａに対する抗原結合性ドメインは、Ａｂｃａｍ（型番ａｂ５５２６２）またはＮｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（型番ＥＰＲ５４４６）から入手可能な抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。別の実施形態では、ＩＬ−１１Ｒａに対する抗原結合性ドメインは、ペプチドである（例えば、Huang et al., Cancer Res 72(1):271-281 (2012)を参照されたい）。
【０６８５】
一実施形態では、ＰＳＣＡに対する抗原結合性ドメインは、例えば、Morgenroth et al., Prostate 67(10):1121-1131 (2007)（ｓｃＦｖ  ７Ｆ５）；Nejatollahi et al., J of Oncology 2013(2013), article ID 839831（ｓｃＦｖ  Ｃ５−ＩＩ）；および米国特許出願公開第２００９０３１１１８１号明細書において記載されている抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０６８６】
一実施形態では、ＶＥＧＦＲ２に対する抗原結合性ドメインは、例えば、Chinnasamy et al., J Clin Invest 120(11):3953-3968 (2010)において記載されている抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０６８７】
一実施形態では、ＬｅｗｉｓＹに対する抗原結合性ドメインは、例えば、Kelly et al., Cancer Biother Radiopharm 23(4):411-423 (2008)（ｈｕ３Ｓ１９３  Ａｂ（ｓｃＦｖ））；Dolezal et al., Protein Engineering 16(1):47-56 (2003)（ＮＣ１０  ｓｃＦｖ）において記載されている抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０６８８】
一実施形態では、ＣＤ２４に対する抗原結合性ドメインは、例えば、Maliar et al., Gastroenterology 143(5):1375-1384 (2012)において記載されている抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０６８９】
一実施形態では、ＰＤＧＦＲベータに対する抗原結合性ドメインは、抗体であるＡｂｃａｍ  ａｂ３２５７０の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０６９０】
一実施形態では、ＳＳＥＡ−４に対する抗原結合性ドメインは、抗体であるＭＣ８１３（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、または他の市販されている抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０６９１】
一実施形態では、ＣＤ２０に対する抗原結合性ドメインは、抗体である、リツキシマブ、オファツムマブ、オクレリズマブ、ベルツズマブ、またはＧＡ１０１の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０６９２】
一実施形態では、葉酸受容体アルファに対する抗原結合性ドメインは、抗体であるＩＭＧＮ８５３、または米国特許出願公開第２０１２０００９１８１号明細書；米国特許第４８５１３３２号明細書において記載されている抗体、ＬＫ２６（米国特許第５９５２４８４号明細書）の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０６９３】
一実施形態では、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）に対する抗原結合性ドメインは、抗体であるトラスツズマブまたはペルツズマブの、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０６９４】
一実施形態では、ＭＵＣ１に対する抗原結合性ドメインは、抗体であるＳＡＲ５６６６５８の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０６９５】
一実施形態では、ＥＧＦＲに対する抗原結合性ドメインは、抗体である、セツキシマブ、パニツムマブ、ザルツムマブ、ニモツズマブ、またはマツズマブの、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０６９６】
一実施形態では、ＮＣＡＭに対する抗原結合性ドメインは、抗体クローンである２−２Ｂ：ＭＡＢ５３２４（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０６９７】
一実施形態では、エフリンＢ２に対する抗原結合性ドメインは、例えば、Abengozar et al., Blood 119(19):4565-4576 (2012)において記載されている抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０６９８】
一実施形態では、ＩＧＦ−１受容体に対する抗原結合性ドメインは、例えば、米国特許第８３４４１１２号明細書；欧州特許出願公開第２３２２５５０号明細書；国際公開第２００６／１３８３１５号パンフレット、またはＰＣＴ／米国特許出願公開第２００６／０２２９９５号明細書において記載されている抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０６９９】
一実施形態では、ＣＡＩＸに対する抗原結合性ドメインは、抗体クローンである３０３１２３（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０７００】
一実施形態では、ＬＭＰ２に対する抗原結合性ドメインは、例えば、米国特許第７，４１０，６４０号明細書、または米国特許出願公開第２００５０１２９７０１号明細書において記載されている抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０７０１】
一実施形態では、ｇｐ１００に対する抗原結合性ドメインは、抗体である、ＨＭＢ４５、ＮＫＩベータＢ、または国際公開第２０１３１６５９４０号パンフレット、もしくは米国特許出願公開第２０１３０２９５００７号明細書において記載されている抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０７０２】
一実施形態では、チロシナーゼに対する抗原結合性ドメインは、例えば、米国特許第５８４３６７４号明細書；または米国特許出願公開第１９９５０５０４０４８号明細書において記載されている抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０７０３】
一実施形態では、ＥｐｈＡ２に対する抗原結合性ドメインは、例えば、Yu et al., Mol Ther 22(1):102-111 (2014)において記載されている抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０７０４】
一実施形態では、ＧＤ３に対する抗原結合性ドメインは、例えば、米国特許第７２５３２６３号明細書；米国特許第８，２０７，３０８号明細書；米国特許出願公開第２０１２０２７６０４６号明細書；欧州特許出願公開第１０１３７６１号明細書；米国特許出願公開第２０１２０２７６０４６号明細書；国際公開第２００５０３５５７７号パンフレット；または米国特許第６４３７０９８号明細書において記載されている抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０７０５】
一実施形態では、フコシルＧＭ１に対する抗原結合性ドメインは、例えば、米国特許出願公開第２０１００２９７１３８号明細書；または国際公開第２００７／０６７９９２号パンフレットにおいて記載されている抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０７０６】
一実施形態では、ｓＬｅに対する抗原結合性ドメインは、抗体であるＧ１９３（ｌｅｗｉｓＹに対する抗体）（Scott AM et al, Cancer Res 60: 3254-61 (2000)を参照されたい；また、Neeson et al, J Immunol May 2013 190 (Meeting Abstract Supplement) 177.10においても記載されている）の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０７０７】
一実施形態では、ＧＭ３に対する抗原結合性ドメインは、抗体であるＣＡ  ２５２３４４９（ｍＡｂ  １４Ｆ７）の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０７０８】
一実施形態では、ＨＭＷＭＡＡに対する抗原結合性ドメインは、例えば、Kmiecik et al., Oncoimmunology 3(1):e27185 (2014) (PMID: 24575382) (mAb9.2.27)；米国特許第６５２８４８１号明細書；国際公開第２０１００３３８６６号パンフレット；または米国特許出願公開第２０１４０００４１２４号明細書において記載されている抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０７０９】
一実施形態では、ｏ−アセチル−ＧＤ２に対する抗原結合性ドメインは、抗体である８Ｂ６の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０７１０】
一実施形態では、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８に対する抗原結合性ドメインは、例えば、Marty et al., Cancer Lett 235(2):298-308 (2006); Zhao et al., J Immunol Methods 363(2):221-232 (2011)において記載されている抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０７１１】
一実施形態では、ＣＬＤＮ６に対する抗原結合性ドメインは、抗体であるＩＭＡＢ０２７（Ｇａｎｙｍｅｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）（例えば、clinicaltrial.gov/show/NCT02054351を参照されたい）の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０７１２】
一実施形態では、ＴＳＨＲに対する抗原結合性ドメインは、例えば、米国特許第８，６０３，４６６号明細書；米国特許第８，５０１，４１５号明細書；または米国特許第８，３０９，６９３号明細書において記載されている抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０７１３】
一実施形態では、ＧＰＲＣ５Ｄに対する抗原結合性ドメインは、抗体である、ＦＡＢ６３００Ａ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）；またはＬＳ−Ａ４１８０（Ｌｉｆｅｓｐａｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０７１４】
一実施形態では、ＣＤ９７に対する抗原結合性ドメインは、例えば、米国特許第６，８４６，９１１号明細書；de Groot et al., J Immunol 183(6):4127-4134 (2009)において記載されている抗体；またはＲ＆Ｄ製の抗体：ＭＡＢ３７３４の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０７１５】
一実施形態では、ＡＬＫに対する抗原結合性ドメインは、例えば、Mino-Kenudson et al., Clin Cancer Res 16(5):1561-1571 (2010)において記載されている抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０７１６】
一実施形態では、ポリシアル酸に対する抗原結合性ドメインは、例えば、Nagae et al., J Biol Chem 288(47):33784-33796 (2013)において記載されている抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０７１７】
一実施形態では、ＰＬＡＣ１に対する抗原結合性ドメインは、例えば、Ghods et al., Biotechnol Appl Biochem 2013 doi:10.1002/bab.1177において記載されている抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０７１８】
一実施形態では、ＧｌｏｂｏＨに対する抗原結合性ドメインは、抗体であるＶＫ９；または、例えば、Kudryashov V et al, Glycoconj J.15(3):243-9 (1998), Lou et al., Proc Natl Acad Sci USA 111(7):2482-2487 (2014)において記載されている抗体；ＭＢｒ１（Bremer E-G et al. J Biol Chem 259:14773-14777 (1984)）の抗原結合性部分である。
【０７１９】
一実施形態では、ＮＹ−ＢＲ−１に対する抗原結合性ドメインは、例えば、Jager et al., Appl Immunohistochem Mol Morphol 15(1):77-83 (2007)において記載されている抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０７２０】
一実施形態では、ＷＴ−１に対する抗原結合性ドメインは、例えば、Dao et al., Sci Transl Med 5(176):176ra33 (2013)；または国際公開第２０１２／１３５８５４号パンフレットにおいて記載されている抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０７２１】
一実施形態では、ＭＡＧＥ−Ａ１に対する抗原結合性ドメインは、例えば、Willemsen et al., J Immunol 174(12):7853-7858 (2005)において記載されている抗体（ＴＣＲ様ｓｃＦｖ）の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０７２２】
一実施形態では、精子タンパク質１７に対する抗原結合性ドメインは、例えば、Song et al., Target Oncol 2013 Aug 14 (PMID: 23943313); Song et al., Med Oncol 29(4):2923-2931 (2012)において記載されている抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０７２３】
一実施形態では、Ｔｉｅ  ２に対する抗原結合性ドメインは、抗体であるＡＢ３３（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０７２４】
一実施形態では、ＭＡＤ−ＣＴ−２に対する抗原結合性ドメインは、例えば、PMID: 2450952；米国特許第７６３５７５３号明細書において記載されている抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０７２５】
一実施形態では、Ｆｏｓ関連抗原１に対する抗原結合性ドメインは、抗体である１２Ｆ９（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０７２６】
一実施形態では、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１に対する抗原結合性ドメインは、欧州特許出願公開第２５１４７６６号明細書；または米国特許第７，７４９，７１９号明細書において記載されている抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０７２７】
一実施形態では、肉腫転座切断点に対する抗原結合性ドメインは、例えば、Luo et al, EMBO Mol. Med. 4(6):453-461 (2012)において記載されている抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０７２８】
一実施形態では、ＴＲＰ−２に対する抗原結合性ドメインは、例えば、Wang et al, J Exp Med. 184(6):2207-16 (1996)において記載されている抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０７２９】
一実施形態では、ＣＹＰ１Ｂ１に対する抗原結合性ドメインは、例えば、Maecker et al, Blood 102 (9): 3287-3294 (2003)において記載されている抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０７３０】
一実施形態では、ＲＡＧＥ−１に対する抗原結合性ドメインは、抗体であるＭＡＢ５３２８（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０７３１】
一実施形態では、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素に対する抗原結合性ドメインは、抗体である型番ＬＳ−Ｂ９５−１００（Ｌｉｆｅｓｐａｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０７３２】
一実施形態では、腸カルボキシルエステラーゼに対する抗原結合性ドメインは、抗体である４Ｆ１２：型番ＬＳ−Ｂ６１９０−５０（Ｌｉｆｅｓｐａｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０７３３】
一実施形態では、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２に対する抗原結合性ドメインは、抗体である、Ｌｉｆｅｓｐａｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ：ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ：型番ＬＳ−Ｃ１３３２６１−１００（Ｌｉｆｅｓｐａｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０７３４】
一実施形態では、ＣＤ７９aに対する抗原結合性ドメインは、Ａｂｃａｍから入手可能な抗体である、Ａｎｔｉ−ＣＤ７９ａ  ａｎｔｉｂｏｄｙ［ＨＭ４７／Ａ９］（ａｂ３１２１）；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手可能な抗体である、ＣＤ７９Ａ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＃３３５１；またはウサギにおいて産生され、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能な抗体である、ＨＰＡ０１７７４８（Ａｎｔｉ−ＣＤ７９Ａ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０７３５】
一実施形態では、ＣＤ７９ｂに対する抗原結合性ドメインは、Dornan et al., “Therapeutic potential of an anti-CD79b antibody-drug conjugate, anti-CD79b-vc-MMAE, for the treatment of non-Hodgkin lymphoma” Blood. 2009 Sep 24;114(13):2721-9. doi: 10.1182/blood-2009-02-205500. Epub 2009 Jul 24において記載されている抗ＣＤ７９ｂ抗体であるポラツズマブベドチン、または“4507 Pre-Clinical Characterization of T Cell-Dependent Bispecific Antibody Anti-CD79b/CD3 As a Potential Therapy for B Cell Malignancies” Abstracts of 56th ASH Annual Meeting and Exposition, San Francisco, CA December 6-9 2014において記載されている二特異性抗体である、Ａｎｔｉ−ＣＤ７９ｂ／ＣＤ３の抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０７３６】
一実施形態では、ＣＤ７２に対する抗原結合性ドメインは、Myers, and Uckun, “An anti-CD72 immunotoxin against therapy-refractory B-lineage acute lymphoblastic leukemia.” Leuk Lymphoma. 1995 Jun;18(1-2):119-22において記載されている抗体であるＪ３−１０９、またはPolson et al., “Antibody-Drug Conjugates for the Treatment of Non-Hodgkin’s Lymphoma: Target and Linker-Drug Selection” Cancer Res March 15, 2009 69; 2358において記載されている抗ＣＤ７２（１０Ｄ６．８．１；ｍＩｇＧ１）の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０７３７】
一実施形態では、ＬＡＩＲ１に対する抗原結合性ドメインは、ＰｒｏＳｐｅｃから入手可能な抗体である、ＡＮＴ−３０１ＬＡＩＲ１抗体；またはＢｉｏＬｅｇｅｎｄから入手可能な抗ヒトＣＤ３０５（ＬＡＩＲ１）抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０７３８】
一実施形態では、ＦＣＡＲに対する抗原結合性ドメインは、Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃから入手可能な抗体である、ＣＤ８９／ＦＣＡＲＡｎｔｉｂｏｄｙ（型番１０４１４−Ｈ０８Ｈ）の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０７３９】
一実施形態では、ＬＩＬＲＡ２に対する抗原結合性ドメインは、Ａｂｎｏｖａから入手可能な抗体である、ＬＩＬＲＡ２モノクローナル抗体（Ｍ１７）のクローン３Ｃ７、またはＬｉｆｅｓｐａｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能な、Ｍｏｕｓｅ  Ａｎｔｉ−ＬＩＬＲＡ２  ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ（２Ｄ７）の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０７４０】
一実施形態では、ＣＤ３００ＬＦに対する抗原結合性ドメインは、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから入手可能な抗体である、Ｍｏｕｓｅ  Ａｎｔｉ−ＣＭＲＦ３５−ｌｉｋｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  １  ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ［ＵＰ−Ｄ２］、またはＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから入手可能な、Ｒａｔ  Ａｎｔｉ−ＣＭＲＦ３５−ｌｉｋｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  １  ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ［２３４９０３］の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０７４１】
一実施形態では、ＣＬＥＣ１２Ａに対する抗原結合性ドメインは、Noordhuis et al., “Targeting of CLEC12A In Acute Myeloid Leukemia by Antibody-Drug-Conjugates and Bispecific CLL-1xCD3 BiTE Antibody” 53rd ASH Annual Meeting and Exposition, December 10-13, 2011において記載されている抗体である、二特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）ｓｃＦｖ抗体およびＡＤＣ、およびＭＣＬＡ−１１７（Ｍｅｒｕｓ）の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０７４２】
一実施形態では、ＢＳＴ２（ＣＤ３１７ともまた呼ばれる）に対する抗原結合性ドメインは、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ｏｎｌｉｎｅから入手可能な抗体である、Ｍｏｕｓｅ  Ａｎｔｉ−ＣＤ３１７  ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ［３Ｈ４］、またはＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから入手可能な、Ｍｏｕｓｅ  Ａｎｔｉ−ＣＤ３１７  ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ［６９６７３９］の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０７４３】
一実施形態では、ＥＭＲ２（ＣＤ３１２ともまた呼ばれる）に対する抗原結合性ドメインは、Ｌｉｆｅｓｐａｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能な抗体である、Ｍｏｕｓｅ  Ａｎｔｉ−ＣＤ３１２  ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ［ＬＳ−Ｂ８０３３］、またはＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから入手可能な、Ｍｏｕｓｅ  Ａｎｔｉ−ＣＤ３１２  ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ［４９４０２５］の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０７４４】
一実施形態では、ＬＹ７５に対する抗原結合性ドメインは、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから入手可能な抗体である、Ｍｏｕｓｅ  Ａｎｔｉ−Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ７５  ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ［ＨＤ３０］、またはＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能な、Ｍｏｕｓｅ  Ａｎｔｉ−Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ７５  ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ［Ａ１５７９７］の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０７４５】
一実施形態では、ＧＰＣ３に対する抗原結合性ドメインは、Nakano K, Ishiguro T, Konishi H, et al. Generation of a humanized anti-glypican 3 antibody by CDR grafting and stability optimization. Anticancer Drugs. 2010 Nov;21(10):907-916において記載されている抗体であるｈＧＣ３３、またはそれらの３つ全てが、Feng et al., “Glypican-3 antibodies: a new therapeutic target for liver cancer.” FEBS Lett. 2014 Jan 21;588(2):377-82において記載されている、ＭＤＸ−１４１４、ＨＮ３、もしくはＹＰ７の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０７４６】
一実施形態では、ＦＣＲＬ５に対する抗原結合性ドメインは、Elkins et al., “FcRL5 as a target of antibody-drug conjugates for the treatment of multiple myeloma” Mol Cancer Ther. 2012 Oct;11(10):2222-32において記載されている抗ＦｃＲＬ５抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。一実施形態では、ＦＣＲＬ５に対する抗原結合性ドメインは、例えば、国際公開第２００１／０３８４９０号パンフレット、国際公開第２００５／１１７９８６号パンフレット、国際公開第２００６／０３９２３８号パンフレット、国際公開第２００６／０７６６９１号パンフレット、国際公開第２０１０／１１４９４０号パンフレット、国際公開第２０１０／１２０５６１号パンフレット、または国際公開第２０１４／２１００６４号パンフレットにおいて記載されている抗ＦｃＲＬ５抗体の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０７４７】
一実施形態では、ＩＧＬＬ１に対する抗原結合性ドメインは、Ｌｉｆｅｓｐａｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから市販されている、Ｍｏｕｓｅ  Ａｎｔｉ−Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｌａｍｂｄａ−ｌｉｋｅ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  １  ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ［ＡＴ１Ｇ４］、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから市販されている、Ｍｏｕｓｅ  Ａｎｔｉ−Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｌａｍｂｄａ−ｌｉｋｅ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  １  ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ［ＨＳＬ１１］の、抗原結合性部分、例えば、ＣＤＲである。
【０７４８】
一実施形態では、抗原結合性ドメインは、上記で列挙した抗体に由来する、１つ、２つ、または３つの（例えば、３つ全ての）重鎖ＣＤＲである、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２、およびＨＣ  ＣＤＲ３、ならびに／または上記で列挙した抗体に由来する、１つ、２つ、または３つの（例えば、３つ全ての）軽鎖ＣＤＲである、ＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２、およびＬＣ  ＣＤＲ３を含む。一実施形態では、抗原結合性ドメインは、上記で列挙した抗体の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、本明細書で記載される抗原結合性ドメインと、Ｆｃ領域とを含む。
【０７４９】
別の態様では、抗原結合性ドメインは、ヒト化抗体または抗体断片を含む。一部の態様では、非ヒト抗体は、ヒト化されており、この場合、ヒトにおいて天然で産生される抗体またはその断片との類似性を増大させるように、抗体の特異的配列または特異的領域を修飾する。一態様では、抗原結合性ドメインをヒト化する。一部の実施形態では、非ヒト抗体または断片をヒト化させ、復帰突然変異させて、ヒト化抗体の抗原結合アフィニティーを、元の非ヒト抗体または断片の抗原結合アフィニティーに近づける。
【０７５０】
ある実施形態では、ＣＡＲ、例えば、細胞が発現するＣＡＲの抗原結合性ドメインは、ＣＤ１９に結合する。ＣＤ１９は、プロ／プレＢ細胞段階から、終末分化段階である形質細胞段階を経る分化系列全体にわたり、Ｂ細胞上で見出されている。ある実施形態では、抗原結合性ドメインは、ヒトＣＤ１９に結合するマウスｓｃＦｖドメイン、例えば、ＣＴＬ０１９の抗原結合性ドメイン（例えば、配列番号１６０）を含む。ある実施形態では、抗原結合性ドメインは、ヒト化抗体またはヒト化抗体断片、例えば、マウスＣＴＬ０１９  ｓｃＦｖから導出されるｓｃＦｖドメインを含む。ある実施形態では、抗原結合性ドメインは、ヒトＣＤ１９に結合するヒト抗体またはヒト抗体断片である。ＣＤ１９に結合する、例示的なｓｃＦｖドメイン（およびそれらの配列、例えば、ＣＤＲ、ＶＬ、およびＶＨの配列）を、表４に提供する。表４に提供されるｓｃＦｖドメイン配列は、軽鎖可変領域（ＶＬ）および重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。ＶＬとＶＨとは、配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３５）を含むリンカーにより、例えば、以下の配向性：ＶＬ−リンカー−ＶＨで接合させる。
【０７５１】
【表５−１】
2020513832.tif 000259
【０７５２】
【表５−２】
2020513832.tif 000260
【０７５３】
表４に提供されるＣＤ１９抗原結合性ドメインのｓｃＦｖドメインのＣＤＲ配列の配列を、重鎖可変ドメインについては表５に示し、軽鎖可変ドメインについては、表６に示す。「ＩＤ」とは、各ＣＤＲの、それぞれの配列番号を表す。
【０７５４】
【表６】
2020513832.tif 000261
【０７５５】
【表７】
2020513832.tif 000262
【０７５６】
ある実施形態では、抗原結合性ドメインは、抗ＣＤ１９抗体、またはその断片、例えば、ｓｃＦｖを含む。例えば、抗原結合性ドメインは、表７に列挙される可変重鎖および／または可変軽鎖を含む。可変重鎖と、可変軽鎖とを結合するリンカー配列は、本明細書で記載されるリンカー配列のうちのいずれかの場合もあり、代替的に、ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号３８）の場合もある。ｓｃＦｖの軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、例えば、以下の配向性：軽鎖可変領域−リンカー−重鎖可変領域、または重鎖可変領域−リンカー−軽鎖可変領域のうちのいずれかにありうる。
【０７５７】
【表８】
2020513832.tif 000263
【０７５８】
一実施形態では、ＣＤ１９結合性ドメインは、本明細書で記載される、例えば、表４もしくは５に提供されるＣＤ１９結合性ドメインの、１もしくは複数の（例えば、３つ全ての）軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ  ＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ  ＣＤＲ２）、および軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ  ＣＤＲ３）、および／または本明細書で記載される、例えば、表４もしくは５に提供されるＣＤ１９結合性ドメインの、１もしくは複数の（例えば、３つ全ての）重鎖相補性決定領域１（ＨＣ  ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ  ＣＤＲ２）、および重鎖相補性決定領域３（ＨＣ  ＣＤＲ３）を含む。一実施形態では、ＣＤ１９結合性ドメインは、参照により本明細書に組み込まれる、表６に提供される、任意のアミノ酸配列の、ＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２、およびＬＣ  ＣＤＲ３のうちの、１つ、２つ、または全てと；表５に提供される、任意のアミノ酸配列の、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２、およびＨＣ  ＣＤＲ３のうちの、１つ、２つ、または全てとを含む。
【０７５９】
一実施形態では、ＣＤ１９の抗原結合性ドメインは、
（ｉ）（ａ）配列番号１８２のＬＣ  ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１８３のＬＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号１８４のＬＣ  ＣＤＲ３アミノ酸配列；ならびに
（ｂ）配列番号１７６のＨＣ  ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１７７のＨＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号１８１のＨＣ  ＣＤＲ３アミノ酸配列
（ｉｉ）（ａ）配列番号１８２のＬＣ  ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１８３のＬＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号１８４のＬＣ  ＣＤＲ３アミノ酸配列；ならびに
（ｂ）配列番号１７６のＨＣ  ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１７８のＨＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号１８１のＨＣ  ＣＤＲ３アミノ酸配列；
（ｉｉｉ）（ａ）配列番号１８２のＬＣ  ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１８３のＬＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号１８４のＬＣ  ＣＤＲ３アミノ酸配列；ならびに
（ｂ）配列番号１７６のＨＣ  ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１７９のＨＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号１８１のＨＣ  ＣＤＲ３アミノ酸配列；または
（ｉｖ）（ａ）配列番号１８２のＬＣ  ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１８３のＬＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号１８４のＬＣ  ＣＤＲ３アミノ酸配列；ならびに
（ｂ）配列番号１７６のＨＣ  ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１８０のＨＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号１８１のＨＣ  ＣＤＲ３アミノ酸配列
を含む。
【０７６０】
一実施形態では、ＣＤ１９結合性ドメインは、本明細書で記載される（例えば、表４または７に）軽鎖可変領域、および／または本明細書で記載される（例えば、表４または７に）重鎖可変領域を含む。一実施形態では、ＣＤ１９結合性ドメインは、表４または７に列挙されるアミノ酸配列の軽鎖および重鎖を含むｓｃＦｖである。ある実施形態では、ＣＤ１９結合性ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、表４もしくは７に提供される軽鎖可変領域のアミノ酸配列の、少なくとも１つ、２つ、もしくは３つの修飾（例えば、置換、例えば、保存的置換）を有するが、３０、２０、もしくは１０を超える修飾（例えば、置換、例えば、保存的置換）は有さないアミノ酸配列、または表４もしくは７に提供されるアミノ酸配列との、９５〜９９％の同一性を伴う配列を含む軽鎖可変領域；および／あるいは表４もしくは７に提供される重鎖可変領域のアミノ酸配列の、少なくとも１つ、２つ、もしくは３つの修飾（例えば、置換、例えば、保存的置換）を有するが、３０、２０、もしくは１０を超える修飾（例えば、置換、例えば、保存的置換）は有さないアミノ酸配列、または表４もしくは７に提供されるアミノ酸配列に対する、９５〜９９％の同一性を伴う配列を含む重鎖可変領域を含む。
【０７６１】
一実施形態では、ＣＤ１９結合性ドメインは、配列番号１６１；配列番号１６２、配列番号１６３；配列番号１６４；配列番号１６５；配列番号１６６；配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１６０、および配列番号１７５；からなる群から選択されるアミノ酸配列；または前記配列のうちのいずれかに対する、少なくとも１つ、２つ、もしくは３つの修飾（例えば、置換、例えば、保存的置換）を有するが、３０、２０、もしくは１０を超える修飾（例えば、置換、例えば、保存的置換）は有さないアミノ酸配列；または前記配列のうちのいずれかに対する、９５〜９９％の同一性を伴う配列を含む。一実施形態では、ＣＤ１９結合性ドメインは、ｓｃＦｖであり、本明細書で記載されるアミノ酸配列であって、例えば、表４または７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を、本明細書で記載されるアミノ酸配列であって、例えば、表４または７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域へと、リンカー、例えば、本明細書で記載されるリンカーを介して接合させる。一実施形態では、ＣＤ１９結合性ドメインは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカー［配列中、ｎは、１、２、３、４、５、または６（配列番号１０５６１）、好ましくは３である］（配列番号３５）を含む。ｓｃＦｖの軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、例えば、以下の配向性：軽鎖可変領域−リンカー−重鎖可変領域、または重鎖可変領域−リンカー−軽鎖可変領域のうちのいずれかにありうる。
【０７６２】
当技術分野で公知である、任意のＣＤ１９  ＣＡＲ、例えば、当技術分野で公知である、任意のＣＤ１９  ＣＡＲのＣＤ１９抗原結合性ドメインを、本開示に従い使用して、ＣＡＲを構築することができる。例えば、米国特許第８，３９９，６４５号明細書；米国特許第７，４４６，１９０号明細書；Xu et al., Leuk Lymphoma. 2013 54(2):255-260(2012); Cruz et al., Blood 122(17):2965-2973 (2013); Brentjens et al., Blood, 118(18):4817-4828 (2011); Kochenderfer et al., Blood 116(20):4099-102 (2010); Kochenderfer et al., Blood 122 (25):4129-39(2013); and 16th Annu Meet Am Soc Gen Cell Ther (ASGCT) (May 15-18, Salt Lake City) 2013, Abst 10において記載されているＣＤ１９  ＣＡＲである、ＬＧ−７４０である。一実施形態では、ＣＤ１９に対する抗原結合性ドメインは、抗原結合性部分、例えば、ＰＣＴ国際公開第２０１２／０７９０００号パンフレット；ＰＣＴ国際公開第２０１４／１５３２７０号パンフレット；Kochenderfer, J.N. et al., J. Immunother. 32 (7), 689-702 (2009); Kochenderfer, J.N., et al., Blood, 116 (20), 4099-4102 (2010)；ＰＣＴ国際公開第２０１４／０３１６８７号パンフレット；Bejcek, Cancer Research, 55, 2346-2351, 1995；または米国特許第７，４４６，１９０号明細書において記載されているＣＡＲ、抗体、またはその抗原結合性断片のＣＤＲを含む。
【０７６３】
ある実施形態では、ＣＡＲ、例えば、本開示の細胞が発現するＣＡＲの抗原結合性ドメインは、ＢＣＭＡに結合する。ＢＣＭＡは、成熟Ｂリンパ球内で優先的に発現することが見出されている。ある実施形態では、抗原結合性ドメインは、ヒトＢＣＭＡに結合するマウスｓｃＦｖドメインである。ある実施形態では、抗原結合性ドメインは、ヒトＢＣＭＡに結合する、ヒト化および復帰突然変異した抗体または抗体断片、例えば、ｓｃＦｖドメインである。ある実施形態では、抗原結合性ドメインは、ヒトＢＣＭＡに結合するヒト化抗体またはヒト化抗体断片、例えば、ｓｃＦｖドメインである。ある実施形態では、抗原結合性ドメインは、ヒトＢＣＭＡに結合するヒト抗体またはヒト抗体断片である。ＢＣＭＡに結合する、例示的なｓｃＦｖドメイン（およびそれらの配列、例えば、ＣＤＲ、ＶＬ、およびＶＨの配列）を、表８、表９、表１０、および表１１に提供する。表８および表９に提供されるｓｃＦｖドメイン配列は、軽鎖可変領域（ＶＬ）および重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。ＶＬとＶＨとは、リンカーにより、例えば、以下の配向性：ＶＨ−リンカー−ＶＬで接合させる。
【０７６４】
【表９−１】
2020513832.tif 000264
【０７６５】
【表９−２】
2020513832.tif 000265
【０７６６】
【表９−３】
2020513832.tif 000266
【０７６７】
【表９−４】
2020513832.tif 000267
【０７６８】
【表９−５】
2020513832.tif 000268
【０７６９】
【表９−６】
2020513832.tif 000269
【０７７０】
【表９−７】
2020513832.tif 000270
【０７７１】
【表９−８】
2020513832.tif 000271
【０７７２】
【表９−９】
2020513832.tif 000272
【０７７３】
【表９−１０】
2020513832.tif 000273
【０７７４】
【表９−１１】
2020513832.tif 000274
【０７７５】
【表９−１２】
2020513832.tif 000275
【０７７６】
【表９−１３】
2020513832.tif 000276
【０７７７】
【表９−１４】
2020513832.tif 000277
【０７７８】
【表９−１５】
2020513832.tif 000278
【０７７９】
【表９−１６】
2020513832.tif 000279
【０７８０】
【表９−１７】
2020513832.tif 000280
【０７８１】
【表９−１８】
2020513832.tif 000281
【０７８２】
【表９−１９】
2020513832.tif 000282
【０７８３】
【表９−２０】
2020513832.tif 000283
【０７８４】
【表９−２１】
2020513832.tif 000284
【０７８５】
【表９−２２】
2020513832.tif 000285
【０７８６】
複数の実施形態では、ＰＣＴ国際公開第２０１２／０１６３８０５号パンフレット（その内容が、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる）によるＣＤＲならびに／またはＶＨ配列およびＶＬ配列を使用して、さらなる例示的なＢＣＭＡ  ＣＡＲ構築物を作出する。複数の実施形態では、ＰＣＴ国際公開第２０１６／０１４５６５号パンフレット（その内容が、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる）によるＣＤＲならびに／またはＶＨ配列およびＶＬ配列を使用して、さらなる例示的なＢＣＭＡ  ＣＡＲ構築物を作出する。複数の実施形態では、ＰＣＴ国際公開第２０１４／１２２１４４号パンフレット（その内容が、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる）によるＣＤＲならびに／またはＶＨ配列およびＶＬ配列を使用して、さらなる例示的なＢＣＭＡ  ＣＡＲ構築物を作出する。複数の実施形態では、ＰＣＴ国際公開第２０１６／０１４７８９号パンフレット（その内容が、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる）によるＣＡＲ分子、ならびに／またはＶＨ配列およびＶＬ配列を使用して、さらなる例示的なＢＣＭＡ  ＣＡＲ構築物を作出する。複数の実施形態では、ＰＣＴ国際公開第２０１４／０８９３３５号パンフレット（その内容が、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる）によるＣＡＲ分子、ならびに／またはＶＨ配列およびＶＬ配列を使用して、さらなる例示的なＢＣＭＡ  ＣＡＲ構築物を作出する。複数の実施形態では、ＰＣＴ国際公開第２０１４／１４０２４８号パンフレット（その内容が、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる）によるＣＡＲ分子、ならびに／またはＶＨ配列およびＶＬ配列を使用して、さらなる例示的なＢＣＭＡ  ＣＡＲ構築物を作出する。
【０７８７】
複数の実施形態では、また、表９に見出されるＶＨ配列およびＶＬ配列を使用して、さらなる例示的なＢＣＭＡ  ＣＡＲ構築物も作出することができる。表９には、ＶＨドメインおよびＶＬドメインと、リンカー配列と、全長ＣＡＲとを含む、例示的なｓｃＦｖドメインのアミノ酸配列を示す。
【０７８８】
【表１０】
2020513832.tif 000286
【０７８９】
ｓｃＦｖドメインのヒトＣＤＲ配列の配列を、重鎖可変ドメインについては、表１０に示し、軽鎖可変ドメインについては、表１１に示す。「ＩＤ」とは、各ＣＤＲの、それぞれの配列番号を表す。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔによる定義に従い示されるが、他の慣例法、例えば、Ｃｈｏｔｈｉａによる定義またはＫａｂａｔ／Ｃｈｏｔｈｉａによる定義の組合せ下におけるＣＤＲも、上記のＶＨ配列およびＶＬ配列に基づき、たやすく推定することができる。
【０７９０】
【表１１−１】
2020513832.tif 000287
【０７９１】
【表１１−２】
2020513832.tif 000288
【０７９２】
【表１１−３】
2020513832.tif 000289
【０７９３】
【表１２−１】
2020513832.tif 000290
【０７９４】
【表１２−２】
2020513832.tif 000291
【０７９５】
【表１２−３】
2020513832.tif 000292
【０７９６】
一実施形態では、ＢＣＭＡ結合性ドメインは、本明細書で記載される、例えば、表８、９、もしくは１１に提供されるＢＣＭＡ結合性ドメインの、１もしくは複数の（例えば、３つ全ての）軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ  ＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ  ＣＤＲ２）、および軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ  ＣＤＲ３）、および／または本明細書で記載される、例えば、表８、９、もしくは１０に提供されるＢＣＭＡ結合性ドメインの、１もしくは複数の（例えば、３つ全ての）重鎖相補性決定領域１（ＨＣ  ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ  ＣＤＲ２）、および重鎖相補性決定領域３（ＨＣ  ＣＤＲ３）を含む。一実施形態では、ＢＣＭＡ結合性ドメインは、表８に提供される、任意のアミノ酸配列の、ＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２、およびＬＣ  ＣＤＲ３のうちの、１つ、２つ、または全てと；表８に提供される、任意のアミノ酸配列の、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２、およびＨＣ  ＣＤＲ３のうちの、１つ、２つ、または全てとを含む。
【０７９７】
一実施形態では、ＢＣＭＡ抗原結合性ドメインは、
（ｉ）（ａ）配列番号７１４のＬＣ  ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号７５４のＬＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号７９４のＬＣ  ＣＤＲ３アミノ酸配列；ならびに
（ｂ）配列番号５９４のＨＣ  ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号６３４のＨＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号６７４のＨＣ  ＣＤＲ３アミノ酸配列
（ｉｉ）（ａ）配列番号７０４のＬＣ  ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号７４４のＬＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号７８４のＬＣ  ＣＤＲ３アミノ酸配列；ならびに
（ｂ）配列番号５８４のＨＣ  ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号６２４のＨＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号６６４のＨＣ  ＣＤＲ３アミノ酸配列
（ｉｉｉ）（ａ）配列番号７０５のＬＣ  ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号７４５のＬＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号７８５のＬＣ  ＣＤＲ３アミノ酸配列；ならびに
（ｂ）配列番号５８５のＨＣ  ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号６２５のＨＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号６６５のＨＣ  ＣＤＲ３アミノ酸配列
（ｉｖ）（ａ）配列番号７０６のＬＣ  ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号７４６のＬＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号７８６のＬＣ  ＣＤＲ３アミノ酸配列；ならびに
（ｂ）配列番号５８６のＨＣ  ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号６２６のＨＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号６６６のＨＣ  ＣＤＲ３アミノ酸配列
（ｖ）（ａ）配列番号７０７のＬＣ  ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号７４７のＬＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号７８７のＬＣ  ＣＤＲ３アミノ酸配列；ならびに
（ｂ）配列番号５８７のＨＣ  ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号６２７のＨＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号６６７のＨＣ  ＣＤＲ３アミノ酸配列
（ｖｉ）（ａ）配列番号７０８のＬＣ  ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号７４８のＬＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号７８８のＬＣ  ＣＤＲ３アミノ酸配列；ならびに
（ｂ）配列番号５８８のＨＣ  ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号６２８のＨＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号６６８のＨＣ  ＣＤＲ３アミノ酸配列
（ｖｉｉ）（ａ）配列番号７０９のＬＣ  ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号７４９のＬＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号７８９のＬＣ  ＣＤＲ３アミノ酸配列；ならびに
（ｂ）配列番号５８９のＨＣ  ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号６２９のＨＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号６６９のＨＣ  ＣＤＲ３アミノ酸配列
（ｖｉｉｉ）（ａ）配列番号７１０のＬＣ  ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号７５０のＬＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号７９０のＬＣ  ＣＤＲ３アミノ酸配列；ならびに
（ｂ）配列番号５９０のＨＣ  ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号６３０のＨＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号６７０のＨＣ  ＣＤＲ３アミノ酸配列
（ｉｘ）（ａ）配列番号７１１のＬＣ  ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号７５１のＬＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号７９１のＬＣ  ＣＤＲ３アミノ酸配列；ならびに
（ｂ）配列番号５９１のＨＣ  ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号６３１のＨＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号６７１のＨＣ  ＣＤＲ３アミノ酸配列
（ｘ）（ａ）配列番号７１２のＬＣ  ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号７５２のＬＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号７９２のＬＣ  ＣＤＲ３アミノ酸配列；ならびに
（ｂ）配列番号５９２のＨＣ  ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号６３２のＨＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号６７２のＨＣ  ＣＤＲ３アミノ酸配列
（ｘｉ）（ａ）配列番号７１３のＬＣ  ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号７５３のＬＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号７９３のＬＣ  ＣＤＲ３アミノ酸配列；ならびに
（ｂ）配列番号５９３のＨＣ  ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号６３３のＨＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号６７３のＨＣ  ＣＤＲ３アミノ酸配列
（ｘｉｉ）（ａ）配列番号７１５のＬＣ  ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号７５５のＬＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号７９５のＬＣ  ＣＤＲ３アミノ酸配列；ならびに
（ｂ）配列番号５９５のＨＣ  ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号６３５のＨＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号６７５のＨＣ  ＣＤＲ３アミノ酸配列
（ｘｉｉｉ）（ａ）配列番号７１６のＬＣ  ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号７５６のＬＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号７９６のＬＣ  ＣＤＲ３アミノ酸配列；ならびに
（ｂ）配列番号５９６のＨＣ  ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号６３６のＨＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号６７６のＨＣ  ＣＤＲ３アミノ酸配列
（ｘｉｖ）（ａ）配列番号７１７のＬＣ  ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号７５７のＬＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号７９７のＬＣ  ＣＤＲ３アミノ酸配列；ならびに
（ｂ）配列番号５９７のＨＣ  ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号６３７のＨＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号６７７のＨＣ  ＣＤＲ３アミノ酸配列
（ｘｖ）（ａ）配列番号７１８のＬＣ  ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号７５８のＬＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号７９８のＬＣ  ＣＤＲ３アミノ酸配列；ならびに
（ｂ）配列番号５９８のＨＣ  ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号６３８のＨＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号６７８のＨＣ  ＣＤＲ３アミノ酸配列
（ｘｖｉ）（ａ）配列番号７１９のＬＣ  ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号７５９のＬＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号７９９のＬＣ  ＣＤＲ３アミノ酸配列；ならびに
（ｂ）配列番号５９９のＨＣ  ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号６３９のＨＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号６７９のＨＣ  ＣＤＲ３アミノ酸配列
（ｘｖｉｉ）（ａ）配列番号７２０のＬＣ  ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号７６０のＬＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号８００のＬＣ  ＣＤＲ３アミノ酸配列；ならびに
（ｂ）配列番号６００のＨＣ  ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号６４０のＨＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号６８０のＨＣ  ＣＤＲ３アミノ酸配列
（ｘｖｉｉｉ）（ａ）配列番号７２１のＬＣ  ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号７６１のＬＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号８０１のＬＣ  ＣＤＲ３アミノ酸配列；ならびに
（ｂ）配列番号６０１のＨＣ  ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号６４１のＨＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号６８１のＨＣ  ＣＤＲ３アミノ酸配列
（ｘｉｘ）（ａ）配列番号７２２のＬＣ  ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号７６２のＬＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号８０２のＬＣ  ＣＤＲ３アミノ酸配列；ならびに
（ｂ）配列番号６０２のＨＣ  ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号６４２のＨＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号６８２のＨＣ  ＣＤＲ３アミノ酸配列
（ｘｘ）（ａ）配列番号７２３のＬＣ  ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号７６３のＬＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号８０３のＬＣ  ＣＤＲ３アミノ酸配列；ならびに
（ｂ）配列番号６０３のＨＣ  ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号６４３のＨＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号６８３のＨＣ  ＣＤＲ３アミノ酸配列
（ｘｘｉ）（ａ）配列番号７２４のＬＣ  ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号７６４のＬＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号８０４のＬＣ  ＣＤＲ３アミノ酸配列；ならびに
（ｂ）配列番号６０４のＨＣ  ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号６４４のＨＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号６８４のＨＣ  ＣＤＲ３アミノ酸配列
（ｘｘｉｉ）（ａ）配列番号７２５のＬＣ  ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号７６５のＬＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号８０５のＬＣ  ＣＤＲ３アミノ酸配列；ならびに
（ｂ）配列番号６０５のＨＣ  ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号６４５のＨＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号６８５のＨＣ  ＣＤＲ３アミノ酸配列または
（ｘｘｉｉｉ）（ａ）配列番号７２６のＬＣ  ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号７６６のＬＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号８０６のＬＣ  ＣＤＲ３アミノ酸配列；ならびに
（ｂ）配列番号６０６のＨＣ  ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号６４６のＨＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号６８６のＨＣ  ＣＤＲ３アミノ酸配列
を含む。
【０７９８】
一実施形態では、ＢＣＭＡ結合性ドメインは、本明細書で記載される（例えば、表８または９に）軽鎖可変領域、および／または本明細書で記載される（例えば、表８または９に）重鎖可変領域を含む。一実施形態では、ＢＣＭＡ結合性ドメインは、表８または９に列挙されるアミノ酸配列の軽鎖および重鎖を含むｓｃＦｖである。ある実施形態では、ＢＣＭＡ結合性ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、表８もしくは９に提供される軽鎖可変領域のアミノ酸配列の、少なくとも１つ、２つ、もしくは３つの修飾（例えば、置換、例えば、保存的置換）を有するが、３０、２０、もしくは１０を超える修飾（例えば、置換、例えば、保存的置換）は有さないアミノ酸配列、または表８もしくは９に提供されるアミノ酸配列との、９５〜９９％の同一性を伴う配列を含む軽鎖可変領域；および／あるいは表８もしくは９に提供される重鎖可変領域のアミノ酸配列の、少なくとも１つ、２つ、もしくは３つの修飾（例えば、置換、例えば、保存的置換）を有するが、３０、２０、もしくは１０を超える修飾（例えば、置換、例えば、保存的置換）は有さないアミノ酸配列、または表８もしくは９に提供されるアミノ酸配列に対する、９５〜９９％の同一性を伴う配列を含む重鎖可変領域を含む。
【０７９９】
一実施形態では、ＢＣＭＡ結合性ドメインは、配列番号２４９；配列番号２３９、配列番号２４０；配列番号２４１；配列番号２４２；配列番号２４３；配列番号２４４、配列番号２４５、配列番号２４６、配列番号２４７、配列番号２４８、配列番号２５０、配列番号２５１、配列番号２５２、配列番号２５３、配列番号３２９、配列番号３３０、配列番号３３１、配列番号３３２、配列番号３３３、配列番号３３４、配列番号３３５、配列番号３３６、配列番号３３７、配列番号３３８、配列番号３３９、配列番号３４０、配列番号３４１、配列番号３４２、配列番号３４３、配列番号３４４、配列番号３４５、配列番号３４６、配列番号３４７、配列番号３４８、配列番号３４９、配列番号４６３、配列番号４６４、配列番号４６５および配列番号４６６からなる群から選択されるアミノ酸配列；または前記配列のうちのいずれかに対する、少なくとも１つ、２つ、もしくは３つの修飾（例えば、置換、例えば、保存的置換）を有するが、３０、２０、もしくは１０を超える修飾（例えば、置換、例えば、保存的置換）は有さないアミノ酸配列；または前記配列のうちのいずれかに対する、９５〜９９％の同一性を伴う配列を含む。一実施形態では、ＢＣＭＡ結合性ドメインは、ｓｃＦｖであり、本明細書で記載されるアミノ酸配列であって、例えば、表８または９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を、本明細書で記載されるアミノ酸配列であって、例えば、表８または９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域へと、リンカー、例えば、本明細書で記載されるリンカーを介して接合させる。一実施形態では、ＢＣＭＡ結合性ドメインは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカー［配列中、ｎは、１、２、３、４、５、または６（配列番号１０５６１）、好ましくは３である］（配列番号３５）を含む。ｓｃＦｖの軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、例えば、以下の配向性：軽鎖可変領域−リンカー−重鎖可変領域、または重鎖可変領域−リンカー−軽鎖可変領域のうちのいずれかにありうる。
【０８００】
当技術分野で公知である、任意のＢＣＭＡ  ＣＡＲ、例えば、当技術分野で公知である、任意のＢＣＭＡ  ＣＡＲのＢＣＭＡ抗原結合性ドメインを、本開示に従い使用することができる。例えば、本明細書で記載されているＢＣＭＡ抗原結合性ドメインである。
【０８０１】
例示的なＣＡＲ分子
一態様では、ＣＡＲ、例えば、本明細書で開示される細胞が発現するＣＡＲは、例えば、ＣＤ１９またはＢＣＭＡなど、本明細書で記載されるＢ細胞抗原に結合する抗原結合性ドメインを含むＣＡＲ分子を含む。
【０８０２】
一実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ１９抗原結合性ドメイン（例えば、ＣＤ１９に特異的に結合する、マウス抗体もしくはマウス抗体断片、ヒト抗体もしくはヒト抗体断片、またはヒト化抗体もしくはヒト化抗体断片）、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、共刺激性ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメイン）を含むＣＡＲ分子を含む。
【０８０３】
本明細書で記載される、例示的なＣＡＲ分子を、表１２に提供する。表１２のＣＡＲ分子は、ＣＤ１９抗原結合性ドメイン、例えば、表４に提供される、任意のＣＤ１９抗原結合性ドメインのアミノ酸配列を含む。下記で列挙される、例示的なＣＡＲ分子のうちのいずれか、またはこれらの組合せを、本明細書で開示される細胞および方法と共に使用することができる。
【０８０４】
【表１３−１】
2020513832.tif 000293
【０８０５】
【表１３−２】
2020513832.tif 000294
【０８０６】
【表１３−３】
2020513832.tif 000295
【０８０７】
【表１３−４】
2020513832.tif 000296
【０８０８】
一実施形態では、ＣＡＲ分子は、表１２または参照により本明細書に組み込まれる、２０１４年３月１５日に出願された、国際公開第２０１４／１５３２７０号パンフレットの表３に提供されるアミノ酸配列を含む（または、これらからなる）。一実施形態では、ＣＡＲ分子は、配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号１８７、配列番号１８８、配列番号１８９、配列番号１９０、配列番号１９１、配列番号１９２、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９６、または配列番号１９７；のアミノ酸配列；または配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号１８７、配列番号１８８、配列番号１８９、配列番号１９０、配列番号１９１、配列番号１９２、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９６、または配列番号１９７；のアミノ酸配列の、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、１０、１５、２０、または３０の修飾（例えば、置換、例えば、保存的置換）は有するが、６０、５０、または４０を超える修飾（例えば、置換、例えば、保存的置換）は有さないアミノ酸配列；または配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号１８７、配列番号１８８、配列番号１８９、配列番号１９０、配列番号１９１、配列番号１９２、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９６、または配列番号１９７のアミノ酸配列に対して、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む（または、これらからなる）。
【０８０９】
一態様では、ＣＡＲ、例えば、本明細書で開示される細胞が発現するＣＡＲは、ＢＣＭＡに結合する抗原結合性ドメインを含むＣＡＲ分子を含む、例えば、ＢＣＭＡ抗原結合性ドメイン（例えば、ＢＣＭＡ、例えば、ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する、マウス抗体もしくはマウス抗体断片、ヒト抗体もしくはヒト抗体断片、またはヒト化抗体もしくはヒト化抗体断片）、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、共刺激性ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメイン）を含む。
【０８１０】
例示的なＣＡＲ分子は、表１３もしくは国際公開第２０１６／０１４５６５号パンフレットの表１に提供されているか、または、そうでなければ、本明細書で記載される通りである。表１３におけるＣＡＲ分子は、ＢＣＭＡ抗原結合性ドメイン、例えば、表８または９に提示された、任意のＢＣＭＡ抗原結合性ドメインのアミノ酸配列を含む。下記で列挙される、例示的なＣＡＲ分子のうちのいずれか、またはこれらの組合せを、本明細書で開示される細胞および方法と共に使用することができる。
【０８１１】
【表１４−１】
2020513832.tif 000297
【０８１２】
【表１４−２】
2020513832.tif 000298
【０８１３】
【表１４−３】
2020513832.tif 000299
【０８１４】
【表１４−４】
2020513832.tif 000300
【０８１５】
【表１４−５】
2020513832.tif 000301
【０８１６】
【表１４−６】
2020513832.tif 000302
【０８１７】
【表１４−７】
2020513832.tif 000303
【０８１８】
【表１４−８】
2020513832.tif 000304
【０８１９】
【表１４−９】
2020513832.tif 000305
【０８２０】
【表１４−１０】
2020513832.tif 000306
【０８２１】
【表１４−１１】
2020513832.tif 000307
【０８２２】
【表１４−１２】
2020513832.tif 000308
【０８２３】
【表１４−１３】
2020513832.tif 000309
【０８２４】
【表１４−１４】
2020513832.tif 000310
【０８２５】
【表１４−１５】
2020513832.tif 000311
【０８２６】
【表１４−１６】
2020513832.tif 000312
【０８２７】
【表１４−１７】
2020513832.tif 000313
【０８２８】
【表１４−１８】
2020513832.tif 000314
【０８２９】
【表１４−１９】
2020513832.tif 000315
【０８３０】
【表１４−２０】
2020513832.tif 000316
【０８３１】
【表１４−２１】
2020513832.tif 000317
【０８３２】
【表１４−２２】
2020513832.tif 000318
【０８３３】
【表１４−２３】
2020513832.tif 000319
【０８３４】
【表１４−２４】
2020513832.tif 000320
【０８３５】
【表１４−２５】
2020513832.tif 000321
【０８３６】
【表１４−２６】
2020513832.tif 000322
【０８３７】
【表１４−２７】
2020513832.tif 000323
【０８３８】
【表１４−２８】
2020513832.tif 000324
【０８３９】
【表１４−２９】
2020513832.tif 000325
【０８４０】
一実施形態では、ＣＡＲ分子は、表１３もしくは国際公開第２０１６／０１４５６５号パンフレットの表１に提供されているか、または、そうでなければ、本明細書で記載される通りであるアミノ酸配列を含む（または、これらからなる）。一実施形態では、ＣＡＲ分子は、配列番号８４９、配列番号８５０、配列番号８５１、配列番号８５２、配列番号８５３、配列番号８５４、配列番号８５５、配列番号８５６、配列番号８５７、配列番号８５８、配列番号８５９、配列番号８６０、配列番号８６１、配列番号８６２、配列番号８６３、配列番号８７９、配列番号８８０、配列番号８８１、配列番号８８２、配列番号８８３、配列番号８８４、配列番号８８５、配列番号８８６、配列番号８８７、配列番号８８８、配列番号８８９、配列番号８９０、配列番号８９１、配列番号８９２、配列番号８９３、配列番号８９４、配列番号８９５、配列番号８９６、配列番号８９７、配列番号８９８、または配列番号８９９；のアミノ酸配列、または配列番号８４９、配列番号８５０、配列番号８５１、配列番号８５２、配列番号８５３、配列番号８５４、配列番号８５５、配列番号８５６、配列番号８５７、配列番号８５８、配列番号８５９、配列番号８６０、配列番号８６１、配列番号８６２、配列番号８６３、配列番号８７９、配列番号８８０、配列番号８８１、配列番号８８２、配列番号８８３、配列番号８８４、配列番号８８５、配列番号８８６、配列番号８８７、配列番号８８８、配列番号８８９、配列番号８９０、配列番号８９１、配列番号８９２、配列番号８９３、配列番号８９４、配列番号８９５、配列番号８９６、配列番号８９７、配列番号８９８、または配列番号８９９；のアミノ酸配列の、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、１０、１５、２０、もしくは３０の修飾（例えば、置換、例えば、保存的置換）を有するが、６０、５０、もしくは４０を超える修飾（例えば、置換、例えば、保存的置換）は有さないアミノ酸配列、または配列番号８４９、配列番号８５０、配列番号８５１、配列番号８５２、配列番号８５３、配列番号８５４、配列番号８５５、配列番号８５６、配列番号８５７、配列番号８５８、配列番号８５９、配列番号８６０、配列番号８６１、配列番号８６２、配列番号８６３、配列番号８７９、配列番号８８０、配列番号８８１、配列番号８８２、配列番号８８３、配列番号８８４、配列番号８８５、配列番号８８６、配列番号８８７、配列番号８８８、配列番号８８９、配列番号８９０、配列番号８９１、配列番号８９２、配列番号８９３、配列番号８９４、配列番号８９５、配列番号８９６、配列番号８９７、配列番号８９８、または配列番号８９９のアミノ酸配列と、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む（または、これらからなる）。
【０８４１】
膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインに関する、多様な実施形態では、ＣＡＲは、ＣＡＲの細胞外ドメインへと接合させた、例えば、上記で列挙された抗原結合性ドメインのうちのいずれかへと接合させた膜貫通ドメインを含むようにデザインすることができる。一部の実施形態では、膜貫通ドメインはまた、ＣＡＲの細胞内ドメイン（例えば、共刺激性および／または一次シグナル伝達ドメイン）へも接合させることができる。膜貫通ドメインは、膜貫通領域と隣接する、１または複数のさらなるアミノ酸、例えば、膜貫通部が導出されたタンパク質の細胞外領域と関連する、１もしくは複数のアミノ酸（例えば、細胞外領域の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０〜１５までのアミノ酸）、および／または膜貫通タンパク質が導出されるタンパク質の細胞内領域と関連する、１もしくは複数のさらなるアミノ酸（例えば、細胞内領域の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０〜１５までのアミノ酸）を含みうる。一態様では、膜貫通ドメインは、ＣＡＲの他のドメインのうちの１つと関連する膜貫通ドメインである、例えば、一実施形態では、膜貫通ドメインは、シグナル伝達ドメイン、共刺激性ドメイン、またはヒンジドメインが導出される、同じタンパク質に由来しうる。別の態様では、膜貫通ドメインは、ＣＡＲの他の任意のドメインが導出される、同じタンパク質から導出されない。一部の場合では、膜貫通ドメインは、表面膜タンパク質が同じであるかまたは異なる膜貫通ドメインへの、このようなドメインの結合を回避するように、例えば、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小化するように、アミノ酸置換により選択または修飾することができる。一態様では、膜貫通ドメインは、ＣＡＲ発現細胞の細胞表面上の、別のＣＡＲとのホモ二量体化が可能である。異なる態様では、膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、同じＣＡＲ発現細胞内に存在する、天然の結合パートナーの結合性ドメインとの相互作用を最小化するように修飾または置換することができる。
【０８４２】
膜貫通ドメインは、天然供給源から導出される場合もあり、組換え供給源から導出される場合もある。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合性タンパク質または膜貫通タンパク質から導出されうる。一態様では、膜貫通ドメインは、ＣＡＲが標的に結合した場合はいつでも、細胞内ドメインへとシグナル伝達することが可能である。本開示において特に有用な膜貫通ドメインは、例えば、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖、またはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４のうちの、少なくとも膜貫通領域を含みうる。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、例えば、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒ  α、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、またはこれらの任意のタンパク質から導出される膜貫通ドメインのうちの少なくとも膜貫通領域を含みうる。
【０８４３】
一部の場合には、膜貫通ドメインを、ヒンジ、例えば、ヒトタンパク質に由来するヒンジを介して、ＣＡＲ、例えば、ＣＡＲの抗原結合性ドメインの細胞外領域へと接合させることができる。例えば、一実施形態では、ヒンジは、ヒトＩｇ（免疫グロブリン）ヒンジ（例えば、ＩｇＧ４のヒンジ、ＩｇＤのヒンジ）の場合もあり、ＧＳリンカー（例えば、本明細書で記載されるＧＳリンカー）の場合もあり、ＫＩＲ２ＤＳ２ヒンジの場合もあり、ＣＤ８ａヒンジの場合もある。一実施形態では、ヒンジまたはスペーサーは、配列番号５のアミノ酸配列を含む（または、これからなる）。一態様では、膜貫通ドメインは、配列番号１３の膜貫通ドメインを含む（または、これからなる）。
【０８４４】
ある特定の実施形態では、コードされる膜貫通ドメインは、配列番号１３のアミノ酸配列の、少なくとも１つ、２つ、もしくは３つの修飾を有するが、２０、１０、もしくは５を超える修飾は有さない、ＣＤ８膜貫通ドメインのアミノ酸配列、または配列番号１３のアミノ酸配列に対する、９５〜９９％の同一性を伴う配列を含む。一実施形態では、コードされる膜貫通ドメインは、配列番号１３の配列を含む。
【０８４５】
他の実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸分子は、ＣＤ８膜貫通ドメインのヌクレオチド配列であって、例えば、配列番号１４の配列、またはこれに対して９５〜９９％の同一性を伴う配列を含むヌクレオチド配列を含む。
【０８４６】
ある特定の実施形態では、コードされる抗原結合性ドメインを、ヒンジ領域によって、膜貫通ドメインに接続させる。一実施形態では、コードされるヒンジ領域は、ＣＤ８ヒンジのアミノ酸配列、例えば、配列番号５；もしくはＩｇＧ４ヒンジのアミノ酸配列、例えば、配列番号７、または配列番号５もしくは７に対して９５〜９９％の同一性を伴う配列を含む。他の実施形態では、ヒンジ領域をコードする核酸配列は、それぞれ、ＣＤ８ヒンジもしくはＩｇＧ４ヒンジに対応する、配列番号６もしくは配列番号８の配列、または配列番号６もしくは８に対して９５〜９９％の同一性を伴う配列を含む。
【０８４７】
一態様では、ヒンジまたはスペーサーは、ＩｇＧ４のヒンジを含む。例えば、一実施形態では、ヒンジまたはスペーサーは、アミノ酸配列
【０８４８】
【化２４】
2020513832.tif 000326
のヒンジを含む。一部の実施形態では、ヒンジまたはスペーサーは、
【０８４９】
【化２５】
2020513832.tif 000327
のヌクレオチド配列によりコードされるヒンジを含む。
【０８５０】
一態様では、ヒンジまたはスペーサーは、ＩｇＤのヒンジを含む。例えば、一実施形態では、ヒンジまたはスペーサーは、アミノ酸配列
【０８５１】
【化２６】
2020513832.tif 000328
のヒンジを含む。一部の実施形態では、ヒンジまたはスペーサーは、
【０８５２】
【化２７】
2020513832.tif 000329
のヌクレオチド配列によりコードされるヒンジを含む。
【０８５３】
一態様では、膜貫通ドメインは、組換えであることが可能であり、この場合、膜貫通ドメインは、ロイシンおよびバリンなど、主に、疎水性残基を含むであろう。一態様では、フェニルアラニン、トリプトファン、およびバリンのトリプレットを、組換え膜貫通ドメインの各末端部において見出すことができる。
【０８５４】
任意選択で、短鎖オリゴペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカー、２〜１０アミノ酸の間の長さは、ＣＡＲの膜貫通ドメインと、細胞質領域との間の連結を形成しうる。グリシン−セリンダブレットは特に、適するリンカーをもたらす。例えば、一態様では、リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１１）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、リンカーは、ＧＧＴＧＧＣＧＧＡＧＧＴＴＣＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＴＴＣＣ（配列番号１２）のヌクレオチド配列によりコードされる。
【０８５５】
一態様では、ヒンジまたはスペーサーは、ＫＩＲ２ＤＳ２ヒンジを含む。
【０８５６】
シグナル伝達ドメイン
細胞内シグナル伝達ドメインを有する複数の実施形態では、このようなドメインは、例えば、一次シグナル伝達ドメイン、および／または共刺激性シグナル伝達ドメインのうちの１または複数を含有しうる。一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメインをコードする配列を含む。一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激性シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメインと、共刺激性シグナル伝達ドメインとを含む。
【０８５７】
ＣＡＲの細胞質部分内の細胞内シグナル伝達配列は、互いに、ランダムな順序で連結することもでき、指定された順序で連結することもできる。任意選択で、例えば、２〜１０アミノ酸の間（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸）の長さの、短鎖オリゴペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカーは、細胞内シグナル伝達配列の間の連結を形成しうる。一実施形態では、グリシン−セリンダブレットを、適するリンカーとして使用することができる。一実施形態では、単一のアミノ酸、例えば、アラニン、グリシンを、適するリンカーとして使用することができる。
【０８５８】
一態様では、細胞内シグナル伝達ドメインを、２つまたはこれを超える、例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、またはこれを超える共刺激性シグナル伝達ドメインを含むようにデザインする。ある実施形態では、２つまたはこれを超える、例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、またはこれを超える共刺激性シグナル伝達ドメインを、リンカー分子、例えば、本明細書で記載されるリンカー分子で隔てる。一実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、２つの共刺激性シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、リンカー分子は、グリシン残基である。一部の実施形態では、リンカーは、アラニン残基である。
【０８５９】
一次シグナル伝達ドメイン
一次シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲ複合体の一次活性化を、刺激的または阻害的な形で調節する。刺激的な様態で作用する細胞内一次シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして公知のシグナル伝達モチーフを含有しうる。
【０８６０】
本開示で特に有用な、ＩＴＡＭを含有する細胞内一次シグナル伝達ドメインの例は、ＣＤ３ゼータ、一般的ＦｃＲガンマ（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃガンマＲＩＩａ、ＦｃＲベータ（ＦｃイプシロンＲ１ｂ）、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＤＡＰ１０、およびＤＡＰ１２の細胞内一次シグナル伝達ドメインを含む。一実施形態では、本開示のＣＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータの一次シグナル伝達ドメインを含む。
【０８６１】
一実施形態では、コードされる一次シグナル伝達ドメインは、機能的なＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む。コードされるＣＤ３ゼータ一次シグナル伝達ドメインは、配列番号２１、または配列番号２４のアミノ酸配列の、少なくとも１つ、２つ、もしくは３つの修飾を有するが、２０、１０もしくは５を超える修飾は有さないアミノ酸配列、または配列番号２１、または配列番号２４のアミノ酸配列に対する、９５〜９９％の同一性を伴う配列を含みうる。一部の実施形態では、コードされる一次シグナル伝達ドメインは、配列番号２１または配列番号２４の配列を含む。他の実施形態では、一次シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列は、配列番号２２または配列番号２５の配列、またはこれに対して９５〜９９％の同一性を伴う配列を含む。
【０８６２】
共刺激性シグナル伝達ドメイン
一部の実施形態では、コードされる細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激性シグナル伝達ドメインを含む。例えば、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメインと、共刺激性シグナル伝達ドメインとを含みうる。一部の実施形態では、コードされる共刺激性シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、またはＮＫＧ２Ｄのうちの１または複数から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含む。
【０８６３】
ある特定の実施形態では、コードされる共刺激性シグナル伝達ドメインは、配列番号１６、または配列番号１９のアミノ酸配列の、少なくとも１つ、２つ、もしくは３つの修飾を有するが、２０、１０、もしくは５を超える修飾は有さないアミノ酸配列、または配列番号１６、または配列番号１９のアミノ酸配列に対する、９５〜９９％の同一性を伴う配列を含む。一実施形態では、コードされる共刺激性シグナル伝達ドメインは、配列番号１６、または配列番号１９の配列を含む。他の実施形態では、共刺激性シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列は、配列番号１７、または配列番号２０の配列、またはこれに対して９５〜９９％の同一性を伴う配列を含む。
【０８６４】
他の実施形態では、コードされる細胞内ドメインは、配列番号１６または配列番号１９の配列、および配列番号２１または配列番号２４の配列を含み、この場合、細胞内シグナル伝達ドメインを含む配列は、単一のポリペプチド鎖と同じフレーム内で発現する。
【０８６５】
ある特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列は、配列番号１７もしくは配列番号２０の配列、またはこれに対して９５〜９９％の同一性を伴う配列と、配列番号２２もしくは配列番号２５の配列、またはこれに対して９５〜９９％の同一性を伴う配列とを含む。
【０８６６】
一部の実施形態では、核酸分子は、リーダー配列をさらにコードする。一実施形態では、リーダー配列は、配列番号２の配列を含む。
【０８６７】
一態様では、細胞内シグナル伝達ドメインを、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインと、ＣＤ２８のシグナル伝達ドメインとを含むようにデザインする。一態様では、細胞内シグナル伝達ドメインを、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインと、４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインとを含むようにデザインする。一態様では、４−１ＢＢシグナル伝達ドメインは、配列番号１６のシグナル伝達ドメインである。一態様では、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインは、配列番号２１のシグナル伝達ドメインである。
【０８６８】
一態様では、細胞内シグナル伝達ドメインを、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインと、ＣＤ２７のシグナル伝達ドメインとを含むようにデザインする。一態様では、ＣＤ２７のシグナル伝達ドメインは、ＱＲＲＫＹＲＳＮＫＧＥＳＰＶＥＰＡＥＰＣＲＹＳＣＰＲＥＥＥＧＳＴＩＰＩＱＥＤＹＲＫＰＥＰＡＣＳＰ（配列番号１９）のアミノ酸配列を含む。一態様では、ＣＤ２７のシグナル伝達ドメインは、ＡＧＧＡＧＴＡＡＧＡＧＧＡＧＣＡＧＧＣＴＣＣＴＧＣＡＣＡＧＴＧＡＣＴＡＣＡＴＧＡＡＣＡＴＧＡＣＴＣＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＧＧＧＣＣＣＡＣＣＣＧＣＡＡＧＣＡＴＴＡＣＣＡＧＣＣＣＴＡＴＧＣＣＣＣＡＣＣＡＣＧＣＧＡＣＴＴＣＧＣＡＧＣＣＴＡＴＣＧＣＴＣＣ（配列番号２０）の核酸配列によりコードされる。
【０８６９】
ベクター
別の態様では、本開示は、本明細書で記載される、ＣＡＲをコードする核酸配列を含むベクターに関する。一実施形態では、ベクターは、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターから選択される。一実施形態では、ベクターは、レンチウイルスベクターである。とりわけ、これらのベクターまたはそれらの部分を使用して、本明細書で記載されるＣＲＩＳＰＲ系を伴う使用のための、本明細書で記載される鋳型核酸を創出することができる。代替的に、ベクターを使用して、核酸を、ＣＲＩＳＰＲ系と独立に、細胞、例えば、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞、例えば、同種異系Ｔ細胞へと直接送達することもできる。
【０８７０】
本開示はまた、本明細書で記載されるＤＮＡを挿入したベクターも提供する。レンチウイルスなどのレトロウイルスから導出されるベクターは、トランス遺伝子の、長期にわたる、安定的な組込みと、娘細胞内のその繁殖を可能とするので、長期にわたる遺伝子移入を達成するのに適するツールである。レンチウイルスベクターは、それらが、肝細胞などの非増殖性細胞に形質導入しうるという点で、マウス白血病ウイルスなどの腫瘍レトロウイルスから導出されるベクターを上回る、さらなる利点も有する。それらはまた、低免疫原性という、さらなる利点も有する。レトロウイルスベクターはまた、例えば、ガンマレトロウイルスベクターでもありうる。ガンマレトロウイルスベクターは、例えば、プロモーター、パッケージングシグナル（ψ）、プライマー結合性部位（ＰＢＳ）、１または複数の（例えば、２つの）長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）、および目的のトランス遺伝子、例えば、ＣＡＲをコードする遺伝子を含みうる。ガンマレトロウイルスベクターは、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖなど、ウイルスの構造遺伝子を欠く場合がある。例示的なガンマレトロウイルスベクターは、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、脾臓フォーカス形成ウイルス（ＳＦＦＶ）、および骨髄増殖性肉腫ウイルス（ＭＰＳＶ）、ならびにこれらから導出されるベクターを含む。他のガンマレトロウイルスベクターについては、例えば、Tobias Maetzig et al., “Gammaretroviral Vectors: Biology, Technology and Application” Viruses. 2011 Jun; 3(6): 677-713において記載されている。
【０８７１】
別の実施形態では、所望される本開示のＣＡＲをコードする核酸を含むベクターは、アデノウイルスベクター（Ａ５／３５）である。別の実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸の発現は、スリーピングビューティー、ＣＲＩＳＰＲ、ＣＡＳ９、および亜鉛フィンガーヌクレアーゼなどのトランスポゾンを使用して達することができる。参照により本明細書に組み込まれる、下記June et al. 2009Nature Reviews Immunology 9.10: 704-716を参照されたい。
【０８７２】
核酸は、多数種類のベクターへとクローニングすることができる。例えば、核酸は、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス、およびコスミドを含むがこれらに限定されないベクターへとクローニングすることができる。特に目的のベクターは、発現ベクター、複製ベクター、プローブ作出ベクター、およびシーケンシングベクターを含む。
【０８７３】
本明細書では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写されたＲＮＡ  ＣＡＲを産生するための方法が開示される。本開示はまた、ＣＡＲをコードするＲＮＡ構築物であって、細胞へと直接トランスフェクトされうるＲＮＡ構築物も含む。トランスフェクションにおける使用のためのｍＲＮＡを作出するための方法は、３’非翻訳配列および５’非翻訳配列（「ＵＴＲ」）、５’キャップおよび／または内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、発現させる核酸、およびポリＡテールを含有する構築物であって、典型的に、５０〜２０００塩基の長さ（配列番号１０５５５）の構築物を産生するように、特別にデザインされたプライマー鋳型のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）に続くポリＡ付加を伴いうる。このようにして産生されたＲＮＡは、異なる種類の細胞に、効率的にトランスフェクトしうる。一態様では、鋳型は、ＣＡＲの配列を含む。
【０８７４】
ウイルス以外の送達法
一部の態様では、ウイルス以外の方法を使用して、本明細書で記載される、ＣＡＲをコードする核酸を、細胞または組織または対象へと送達することができる。
【０８７５】
一部の実施形態では、ウイルス以外の方法は、トランスポゾン（また、転移性エレメントとも呼ばれる）の使用を含む。一部の実施形態では、トランスポゾンは、自身を、ゲノム内の位置へと挿入しうるＤＮＡの小片、例えば、自己複製およびそのコピーの、ゲノムへの挿入が可能な、ＤＮＡの小片、または長い核酸からスプライシングし、ゲノム内の別の場所へと挿入しうる、ＤＮＡの小片である。例えば、トランスポゾンは、転移のための遺伝子を挟む逆位リピートから作製されるＤＮＡ配列を含む。
【０８７６】
一部の実施形態では、ＳＢＴＳを使用する遺伝子挿入と、ヌクレアーゼ（例えば、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、または操作メガヌクレアーゼ再操作ホーミングエンドヌクレアーゼ）を使用する遺伝子編集との組合せを使用することにより、細胞、例えば、本明細書で記載されるＣＡＲを発現するＴ細胞またはＮＫ細胞を作出する。具体的な実施形態では、遺伝子編集系の使用は、ＣＡＲをコードする核酸配列を、例えば、ＴＥＴ２イントロン内、例えば、表３に列挙された配列内の、規定された遺伝子座に挿入する。
【０８７７】
一部の実施形態では、本明細書で開示される改変細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞、例えば、本明細書で記載される、例えば、自家Ｔ細胞または同種異系Ｔ細胞（例えば、本明細書で記載されるＣＡＲを発現する）は、細胞を、（ａ）例えば、本明細書で記載される、１または複数のｇＲＮＡ分子と、例えば、本明細書で記載される、１または複数のＣａｓ分子、例えば、Ｃａｓ９分子とを含む組成物、および（ｂ）例えば、本明細書で記載されるＣＡＲをコードする配列を含む核酸（本明細書で記載される鋳型核酸分子など）と接触させることにより作出する。理論に束縛されずに、前記の（ａ）の組成物は、ｇＲＮＡ分子のターゲティングドメインによりターゲティングされるゲノムＤＮＡにおける、またはこの近傍における切断を誘導し、（ｂ）の核酸は、例えば、組み込まれると、コードされたＣＡＲ分子は、発現するように、ゲノムへと、前記切断部において、またはこの近傍において、部分的に、または完全に組み込まれるであろう。一部の実施形態では、核酸配列の組込み％は、適切な方法、例えば、ＰＣＲ、シーケンシング、単一細胞遺伝子型解析、ｄｄＰＣＲ遺伝子型解析、サザンブロット、および／または細胞表面染色により測定される通り、細胞を接触させた後の時点において、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、または７０％である。一部の実施形態では、核酸配列が、例えば、集団の細胞のうちの少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％において組み込まれた細胞集団を、例えば、後続の選択ステップの後でもたらす。
【０８７８】
複数の実施形態では、ＣＡＲの発現は、ゲノムに対して内因性のプロモーターまたは他の調節エレメント（例えば、（ｂ）の核酸が挿入された遺伝子からの発現を制御するプロモーター）により制御する。他の実施形態では、（ｂ）の核酸は、組み込まれたら、ＣＡＲの発現が、このプロモーター、および／または他の調節エレメントにより制御されるように、ＣＡＲをコードする配列に作動可能に連結した、例えば、本明細書で記載されるプロモーター、および／または他の調節エレメント、例えば、ＥＦ１アルファプロモーターをさらに含む。例えば、本明細書で記載されるＣＡＲをコードする核酸配列の組込みを方向付ける、例えば、本明細書で記載されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系の使用に関する、本開示のさらなる特色については、本出願の別の箇所、例えば、遺伝子挿入および相同組換えに関する節において記載されている。複数の実施形態では、上記のａ）の組成物は、１または複数のｇＲＮＡ分子を含むＲＮＰを含む組成物である。複数の実施形態では、固有の標的配列をターゲティングするｇＲＮＡを含むＲＮＰを、細胞へと、同時に、例えば、１または複数のｇＲＮＡを含むＲＮＰの混合物として導入する。複数の実施形態では、固有の標的配列をターゲティングするｇＲＮＡを含むＲＮＰを、細胞へと、逐次的に導入する。
【０８７９】
一部の実施形態では、改変細胞は、細胞を、（ａ）例えば、本明細書で記載される、１または複数のｇＲＮＡ分子と、例えば、本明細書で記載される、１または複数のＣａｓ分子、例えば、Ｃａｓ９分子とを含む組成物、および（ｂ）ＴＥＴ２の発現を破壊することが可能な核酸と接触させることにより作出する。理論に束縛されずに、上記の（ａ）の前記組成物は、ｇＲＮＡ分子のターゲティングドメインによりターゲティングされるゲノムＤＮＡにおける、またはこの近傍における切断を誘導し、（ｂ）の核酸は、例えば、組み込まれると、少なくとも１つのＴＥＴ２アイソフォームの発現が低減されるように、ゲノムへと、前記切断部において、またはこの近傍において、部分的に、または完全に組み込まれるであろう。
【０８８０】
一部の実施形態では、改変細胞は、細胞を、（ａ）例えば、本明細書で記載される、１または複数のｇＲＮＡ分子と、例えば、本明細書で記載される、１または複数のＣａｓ分子、例えば、Ｃａｓ９分子とを含む組成物、および（ｂ）ＣＡＲをコードする配列を含む核酸と接触させることにより作出する。理論に束縛されずに、上記の（ａ）の前記組成物は、ｇＲＮＡ分子のターゲティングドメインによりターゲティングされるゲノムＤＮＡにおける、またはこの近傍における切断を誘導し、（ｂ）の、ＣＡＲをコードする配列を含む核酸は、例えば、組み込まれると、少なくとも１つのＴＥＴ２アイソフォームの発現が低減されるように、ゲノムへと、前記切断部において、またはこの近傍において、部分的に、または完全に組み込まれるであろう。
【０８８１】
一部の実施形態では、ウイルス以外の送達法の使用は、細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の再プログラム化と、細胞の、対象への直接的な注入とを可能とする。非ウイルスベクターの利点は、患者集団に見合うのに要求される、十分な量を産生することの容易さおよび比較的低廉な費用、保存時の安定性、ならびに免疫原性の欠如を含むがこれらに限定されない。
【０８８２】
阻害性ドメイン
ある実施形態では、ベクターは、ＣＡＲ、例えば、本明細書で記載されるＣＡＲをコードする核酸配列と、ｉｎｈＫＩＲの細胞質ドメイン；膜貫通ドメイン、例えば、ＫＩＲ膜貫通ドメイン；および阻害性細胞質ドメイン、例えば、ＩＴＩＭドメイン、例えば、ｉｎｈＫＩＲＩＴＩＭドメインを含む阻害性分子をコードする核酸配列とを含む。ある実施形態では、阻害性分子は、自然発生のｉｎｈＫＩＲ、または自然発生のｉｎｈＫＩＲとの、少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、または９９％の相同性を共有するか、もしくはこれと１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、または２０以下の残基だけ異なる配列である。
【０８８３】
ある実施形態では、阻害性分子をコードする核酸配列は、ＳＬＡＭファミリーの細胞質ドメイン；膜貫通ドメイン、例えば、ＳＬＡＭファミリーの膜貫通ドメイン；および阻害性細胞質ドメイン、例えば、ＳＬＡＭファミリードメイン、例えば、ＳＬＡＭファミリーＩＴＩＭドメインを含む。ある実施形態では、阻害性分子は、自然発生のＳＬＡＭファミリーメンバー、または自然発生のＳＬＡＭファミリーメンバーとの、少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、または９９％の相同性を共有するか、もしくはこれと１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、または２０以下の残基だけ異なる配列である。
【０８８４】
一実施形態では、ベクターは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ベクター、例えば、本明細書で記載される核酸分子のＲＮＡを転写するベクターである。一実施形態では、ベクター内の核酸配列は、ポリ（Ａ）テール、例えば、ポリＡテールをさらに含む。一実施形態では、ベクター内の核酸配列は、３’ＵＴＲ、例えば、ヒトベータ−グロブリンから導出される３’ＵＴＲの、少なくとも１つのリピートを含む、例えば、本明細書で記載される３’ＵＴＲをさらに含む。一実施形態では、ベクター内の核酸配列は、プロモーター、例えば、Ｔ２Ａプロモーターをさらに含む。
【０８８５】
プロモーター
一実施形態では、ベクターは、プロモーターをさらに含む。一部の実施形態では、プロモーターは、ＥＦ−１プロモーター、ＣＭＶ  ＩＥ遺伝子プロモーター、ＥＦ−１αプロモーター、ユビキチンＣプロモーター、またはホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターから選択される。一実施形態では、プロモーターは、ＥＦ−１プロモーターである。一実施形態では、ＥＦ−１プロモーターは、配列番号１の配列を含む。
【０８８６】
ＣＡＲを発現するための宿主細胞
上記で言及した通り、一部の態様では、本開示は、本明細書で記載される核酸分子（例えば、鋳型核酸分子）、ＣＡＲポリペプチド分子、またはベクターを含む細胞、例えば、免疫エフェクター細胞（例えば、細胞集団、例えば、免疫エフェクター細胞の集団）に関する。
【０８８７】
本開示のある特定の態様では、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）分離法など、当業者に公知の、任意の数の技法を使用して対象から回収された、単位量の血液から得ることができる。好ましい一態様では、個体の循環血液に由来する細胞を、アフェレーシスにより得る。アフェレーシス産物は典型的に、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球、および血小板を含むリンパ球を含有する。一態様では、アフェレーシスにより回収された細胞を洗浄して、血漿画分を除去し、任意選択で、細胞を、その後の加工ステップに適切な緩衝液中または培地中に入れることができる。一実施形態では、細胞を、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄する。代替的な実施形態では、洗浄液は、カルシウムを欠き、マグネシウムを欠く場合もあり、全てではないにせよ、多くの二価カチオンを欠く場合もある。
【０８８８】
カルシウムの非存在下における初期の活性化ステップは、活性化の拡大をもたらしうる。当業者がたやすく察知する通り、洗浄ステップは、製造元の指示書に従い、半自動式「フロースルー」型遠心分離機（例えば、Ｃｏｂｅ  ２９９１  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ；Ｂａｘｔｅｒ  ＣｙｔｏＭａｔｅ；またはＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｅｌｌ  Ｓａｖｅｒ  ５）を使用することによるなど、当業者に公知の方法により達することができる。洗浄後、細胞を、例えば、Ｃａ非含有ＰＢＳ、Ｍｇ非含有ＰＢＳ、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ  Ａ、または緩衝液を伴うかもしくは伴わない、他の生理食塩液溶液など、様々な生体適合性緩衝液中に再懸濁させることができる。代替的に、アフェレーシス試料の、所望されない成分を除去し、細胞を、培養培地中に直接再懸濁させることもできる。
【０８８９】
本出願の方法は、５％またはこれ未満、例えば、２％のヒトＡＢ血清を含む培養培地条件を活用することが可能であり、公知の培養培地条件および培養組成物、例えば、Smith et al., “Ex vivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement” Clinical & Translational Immunology (2015) 4, e31; doi:10.1038/cti.2014.31において記載されている、培養培地条件および培養組成物を援用しうることが認識される。
【０８９０】
一態様では、赤血球を溶解させ、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配を介する遠心分離、または対向流遠心溶出法により、単球を枯渇させることにより、Ｔ細胞を、末梢血リンパ球から単離する。
【０８９１】
本明細書で記載される方法は、例えば、免疫エフェクター細胞、例えば、本明細書で記載される、例えば、陰性選択法を使用して、例えば、Ｔ調節性細胞枯渇集団であるＴ細胞の、ＣＤ２５＋枯渇細胞の特異的亜集団の選択を含みうる。Ｔ調節性枯渇細胞集団は、３０％未満、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％のＣＤ２５＋細胞を含有することが好ましい。
【０８９２】
一実施形態では、抗ＣＤ２５抗体もしくはその断片、またはＣＤ２５結合性リガンドであるＩＬ−２を使用して、Ｔ調節性細胞、例えば、ＣＤ２５＋  Ｔ細胞を、集団から除去する。一実施形態では、抗ＣＤ２５抗体もしくはその断片、またはＣＤ２５結合性リガンドを、基質、例えば、ビーズへとコンジュゲートさせるか、または、他の点では、基質、例えば、ビーズ上にコーティングする。一実施形態では、抗ＣＤ２５抗体またはその断片を、本明細書で記載される基質へとコンジュゲートさせる。
【０８９３】
一実施形態では、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ（商標）製のＣＤ２５枯渇試薬を使用して、Ｔ調節性細胞、例えば、ＣＤ２５＋  Ｔ細胞を、集団から除去する。一実施形態では、細胞の、ＣＤ２５枯渇試薬に対する比は、細胞１×１０７個対２０ｕＬ、または細胞１×１０７個対１５ｕＬ、または細胞１×１０７個対１０ｕＬ、または細胞１×１０７個対５ｕＬ、または細胞１×１０７個対２．５ｕＬ、または細胞１×１０７個対１．２５ｕＬである。一実施形態では、例えば、Ｔ調節性細胞には、例えば、１ｍｌ当たりの細胞５億個を超えるＣＤ２５＋枯渇を使用する。さらなる態様では、１ｍｌ当たりの細胞６億、７億、８億、または９億個の濃度を使用する。
【０８９４】
一実施形態では、枯渇させる免疫エフェクター細胞の集団は、約６×１０９個のＣＤ２５＋  Ｔ細胞を含む。他の複数の態様では、枯渇させる免疫エフェクター細胞の集団は、約１×１０９〜１×１０１０個、およびこれらの間の任意の整数値のＣＤ２５＋  Ｔ細胞を含む。一実施形態では、結果として得られるＴ調節性枯渇細胞集団は、２×１０９個またはこれ未満のＴ調節性細胞、例えば、ＣＤ２５＋細胞（例えば、１×１０９、５×１０８、１×１０８、５×１０７、１×１０７、またはこれ未満のＣＤ２５＋細胞）を有する。
【０８９５】
一実施形態では、ＣｌｉｎｉＭＡＣ  ｓｙｓｔｅｍを、例えば、チュービング１６２−０１などの枯渇チュービングセットと共に使用して、Ｔ調節性細胞、例えば、ＣＤ２５＋細胞を、集団から除去する。一実施形態では、ＣｌｉｎｉＭＡＣ  ｓｙｓｔｅｍを、例えば、ＤＥＰＬＥＴＩＯＮ２．１など、枯渇設定で作動させる。
【０８９６】
特定の理論に束縛されることを望まないが、対象におけるアフェレーシスの前、またはＣＡＲ発現細胞製品の製造時において、免疫細胞の負の調節因子のレベルを減少させること（例えば、望ましくない免疫細胞、例えば、ＴＲＥＧ細胞の数を減少させること）は、対象の再発の危険性を低減しうる。例えば、当技術分野では、ＴＲＥＧ細胞を枯渇させる方法が公知である。ＴＲＥＧ細胞を減少させる方法は、シクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体（本明細書で記載される抗ＧＩＴＲ抗体）、ＣＤ２５の枯渇、およびこれらの組合せを含むがこれらに限定されない。
【０８９７】
一部の実施形態では、製造法は、ＣＡＲ発現細胞を製造する前に、ＴＲＥＧ細胞の数を低減すること（例えば、ＴＲＥＧ細胞を枯渇させること）を含む。例えば、製造法は、ＣＡＲ発現細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）製品を製造する前に、試料、例えば、アフェレーシス試料を、例えば、抗ＧＩＴＲ抗体および／または抗ＣＤ２５抗体（もしくはその断片、またはＣＤ２５結合性リガンド）と接触させて、ＴＲＥＧ細胞を枯渇させるステップを含む。
【０８９８】
ある実施形態では、ＣＡＲ発現細胞製品を製造するための細胞を回収する前に、ＴＲＥＧ細胞を低減する、１または複数の療法で、対象を前処置し、これにより、ＣＡＲ発現細胞による処置に対する対象の再発の危険性を低減する。ある実施形態では、ＴＲＥＧ細胞を減少させる方法は、対象への、シクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体、ＣＤ２５の枯渇、またはこれらの組合せのうちの１または複数の投与を含むがこれらに限定されない。シクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体、ＣＤ２５の枯渇、またはこれらの組合せのうちの１または複数の投与は、ＣＡＲ発現細胞製品の注入前、注入時、または注入後に行うことができる。
【０８９９】
ある実施形態では、ＣＡＲ発現細胞製品を製造するための細胞を回収する前にＴＲＥＧ細胞を減少するために、シクロホスファミドで、対象を前処置し、これにより、ＣＡＲ発現細胞による処置に対する対象の再発の危険性を低減する。ある実施形態では、ＣＡＲ発現細胞製品を製造するための細胞を回収する前に、抗ＧＩＴＲ抗体で、対象を前処置し、これにより、ＣＡＲ発現細胞による処置に対する対象の再発の危険性を低減する。
【０９００】
一実施形態では、除去される細胞集団は、調節性Ｔ細胞でも、腫瘍細胞でもなく、他の形で、ＣＡＲＴ細胞の拡大および／または機能に負の影響を及ぼす細胞、例えば、ＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ１５、または潜在的な免疫抑制性細胞が発現する他のマーカーを発現する細胞である。一実施形態では、このような細胞は、調節性Ｔ細胞および／または腫瘍細胞と共時的に、もしくは前記枯渇の後に、または別の順序で除去することが想定される。
【０９０１】
本明細書で記載される方法は、１つを超える選択ステップ、例えば、１つを超える枯渇ステップを含みうる。陰性選択によるＴ細胞集団の濃縮は、例えば、陰性選択される細胞に固有の表面マーカーを指向する抗体の組合せにより達することができる。１つの方法は、負磁気による免疫接着、または陰性選択される細胞上に存在する細胞表面マーカーを指向するモノクローナル抗体のカクテルを使用するフローサイトメトリーを介する、細胞の選別および／または選択である。例えば、陰性選択によりＣＤ４＋細胞を濃縮するには、モノクローナル抗体カクテルは、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ−ＤＲ、およびＣＤ８に対する抗体を含みうる。
【０９０２】
本明細書で記載される方法は、腫瘍抗原、例えば、ＣＤ２５を含まない腫瘍抗原、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ２０、ＣＤ１４、またはＣＤ１１ｂを発現する集団から細胞を除去し、これにより、ＣＡＲ、例えば、本明細書で記載されるＣＡＲの発現に適する、Ｔ調節性細胞枯渇集団、例えば、ＣＤ２５＋細胞枯渇集団、および腫瘍抗原枯渇細胞をもたらすステップをさらに含みうる。一実施形態では、腫瘍抗原を発現する細胞を、Ｔ調節性細胞、例えば、ＣＤ２５＋細胞と同時に除去する。例えば、抗ＣＤ２５抗体またはその断片と、抗腫瘍抗原抗体またはその断片とを、細胞または抗ＣＤ２５抗体もしくはその断片を除去するのに使用しうる、同じ基質、例えば、ビーズへと接合させることもでき、抗腫瘍抗原抗体またはその断片を、別個のビーズへと接合させ、これらの混合物を使用して、細胞を除去することもできる。他の実施形態では、Ｔ調節性細胞、例えば、ＣＤ２５＋細胞の除去と、腫瘍抗原を発現する細胞の除去とは、逐次的であり、例えば、いずれの順序でも行うことができる。
【０９０３】
また、チェックポイント阻害剤、例えば、本明細書で記載されるチェックポイント阻害剤を発現する集団から細胞、例えば、ＰＤ１＋細胞、ＬＡＧ３＋細胞、およびＴＩＭ３＋細胞のうちの１または複数を除去し、これにより、Ｔ調節性細胞枯渇集団、例えば、ＣＤ２５＋枯渇細胞、およびチェックポイント阻害剤枯渇細胞、例えば、ＰＤ１＋、ＬＡＧ３＋、および／またはＴＩＭ３＋枯渇細胞をもたらすステップを含む方法も提供される。例示的なチェックポイント阻害剤は、Ｂ７−Ｈ１、Ｂ７−１、ＣＤ１６０、Ｐ１Ｈ、２Ｂ４、ＰＤ１、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３、および／またはＣＥＡＣＡＭ−５）、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、およびＬＡＩＲ１を含む。一実施形態では、チェックポイント阻害剤を発現する細胞を、Ｔ調節性細胞、例えば、ＣＤ２５＋細胞と同時に除去する。例えば、抗ＣＤ２５抗体またはその断片と、抗チェックポイント阻害剤抗体またはその断片とを、細胞または抗ＣＤ２５抗体もしくはその断片を除去するのに使用しうる、同じビーズへと接合させることもでき、抗チェックポイント阻害剤抗体またはその断片を、別個のビーズへと接合させ、これらの混合物を使用して、細胞を除去することもできる。他の実施形態では、Ｔ調節性細胞、例えば、ＣＤ２５＋細胞の除去と、チェックポイント阻害剤を発現する細胞の除去とは、逐次的であり、例えば、いずれの順序でも行うことができる。
【０９０４】
本明細書で記載される方法は、陽性選択ステップを含みうる。例えば、Ｔ細胞は、所望されるＴ細胞の陽性選択に十分な時間にわたる、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ−４５０  ＣＤ３／ＣＤ２８Ｔなどの抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（例えば、３×２８）コンジュゲートビーズを伴うインキュベーションにより単離することができる。一実施形態では、時間は、約３０分間である。さらなる実施形態では、時間は、３０分間〜３６時間またはこれより長い時間、およびこの間の全ての整数値の範囲である。さらなる実施形態では、時間は、少なくとも１、２、３、４、５、または６時間である。さらに別の実施形態では、時間は、１０〜２４時間、例えば、２４時間である。長いインキュベーション時間を使用して、他の細胞型と比較して、Ｔ細胞が少数である任意の状況であって、腫瘍組織または免疫障害個体から腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を単離する場合などの状況において、Ｔ細胞を単離することができる。さらに、長いインキュベーション時間の使用は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞の捕捉効率も増大させうる。したがって、単に時間を短縮もしくは延長することにより、Ｔ細胞を、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズに結合させることもでき、かつ／またはビーズのＴ細胞に対する比を増大もしくは減少させる（本明細書でさらに記載される通り）ことにより、培養開始時または工程の他の時点において、Ｔ細胞の亜集団を、正または負に、優先的に選択することもできる。加えて、ビーズ上または他の表面上の、抗ＣＤ３抗体および／または抗ＣＤ２８抗体の比を増大または減少させることにより、培養開始時または所望の他の時点において、Ｔ細胞の亜集団を、正または負に、優先的に選択することもできる。
【０９０５】
一実施形態では、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、グランザイムＢ、およびペルフォリン、または他の適切な分子、例えば、他のサイトカインのうちの１または複数を発現するＴ細胞集団を選択することができる。細胞の発現についてスクリーニングするための方法は、例えば、ＰＣＴ国際公開第２０１３／１２６７１２号パンフレットにおいて記載されている方法により決定することができる。
【０９０６】
陽性選択または陰性選択により、所望される細胞集団を単離するために、細胞の濃度および表面（例えば、ビーズなどの粒子）を変化させることができる。ある特定の態様では、細胞とビーズとの最大の接触を確保するように、ビーズと細胞とを併せて混合する容量を、著明に減少させる（例えば、細胞の濃度を増大させる）ことが望ましい。例えば、一態様では、１ｍｌ当たりの細胞１００億個、１ｍｌ当たり９０億個、１ｍｌ当たり８０億個、１ｍｌ当たり７０億個、１ｍｌ当たり６０億個、または１ｍｌ当たり５０億個の濃度を使用する。一態様では、１ｍｌ当たりの細胞１０億個の濃度を使用する。さらなる１つの態様では、１ｍｌ当たりの細胞７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万、または１億個からの細胞の濃度を使用する。さらなる複数の態様では、１ｍｌ当たりの細胞１億２５００万または１億５０００万個の濃度を使用することができる。
【０９０７】
高濃度の使用は、細胞収量の増大、細胞の活性化、および細胞の拡大を結果としてもたらしうる。さらに、高細胞濃度の使用は、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞など、目的の標的抗原の発現が弱い場合がある細胞、または多くの腫瘍細胞が存在する試料（例えば、白血病性血液、腫瘍組織など）に由来する細胞の効率的な捕捉を可能とする。このような細胞集団は、治療的価値を有する可能性があり、得ることが望ましいであろう。例えば、高濃度の細胞の使用は、正常ではＣＤ２８の発現がより弱いＣＤ８＋Ｔ細胞の、より効率的な選択を可能とする。
【０９０８】
関連する態様では、低濃度の細胞を使用することが望ましい場合がある。Ｔ細胞と、表面（例えば、ビーズなどの粒子）との混合物を著明に希釈することにより、粒子と細胞との相互作用を最小化する。これにより、粒子に結合する所望の抗原を、高量で発現する細胞を選択する。例えば、ＣＤ４＋  Ｔ細胞は、高レベルのＣＤ２８を発現し、希釈濃度でも、ＣＤ８＋  Ｔ細胞より効率的に捕捉される。一態様では、使用される細胞の濃度は、５×１０６／ｍｌである。他の複数の態様では、使用される濃度は、約１×１０５／ｍｌ〜１×１０６／ｍｌ、およびこの間の任意の整数値でありうる。
【０９０９】
他の複数の態様では、細胞は、２〜１０℃または室温のロテーター上、様々な速度で、様々な長さの時間にわたりインキュベートすることができる。
【０９１０】
刺激のためのＴ細胞はまた、洗浄ステップの後で凍結させることもできる。理論に束縛されることを望まないが、凍結ステップと、その後における解凍ステップとは、細胞集団内の顆粒球と、ある程度、単球とを除去することにより、より均一の製品をもたらす。血漿および血小板を除去する洗浄ステップの後で、細胞を、凍結溶液中に懸濁させることができる。当技術分野では、多くの凍結溶液および凍結パラメータが公知であり、この文脈でも有用であるが、１つの方法は、２０％のＤＭＳＯおよび８％のヒト血清アルブミンを含有するＰＢＳ、または１０％のデキストラン４０および５％のデキストロース、２０％のヒト血清アルブミン、ならびに７．５％のＤＭＳＯ、もしくは３１．２５％のＰｌａｓｍａｌｙｔｅ−Ａ、３１．２５％のデキストロース５％、０．４５％のＮａＣｌ、１０％のデキストラン４０および５％のデキストロース、２０％のヒト血清アルブミン、ならびに７．５％のＤＭＳＯを含有する培養物培地、あるいは、例えば、ＨｅｓｐａｎおよびＰｌａｓｍａＬｙｔｅ  Ａを含有する、他の適する細胞凍結培地を使用することを伴い、次いで、細胞を、１分間当たり１°の速度で、−８０℃まで凍結させ、液体窒素式保存タンクの蒸気相内で保管する。他の制御凍結法のほか、−２０℃または液体窒素中の瞬時非制御凍結も使用することができる。
【０９１１】
ある特定の態様では、低温保存された細胞は、本明細書で記載される通りに解凍し、洗浄し、室温で１時間にわたり休眠させてから、本開示の方法を使用して活性化させる。
【０９１２】
本開示の文脈ではまた、本明細書で記載される拡大細胞が必要とされうる前の時点における、対象からの血液試料またはアフェレーシス産物の回収も想定される。したがって、拡大される細胞の供給源は、必要な任意の時点において回収することができ、Ｔ細胞など、所望の細胞を、本明細書で記載される免疫エフェクター細胞療法などの免疫エフェクター細胞療法から利益を得る、任意の数の疾患または状態のための免疫エフェクター細胞療法におけるその後の使用のために、単離し、凍結させることができる。一態様では、血液試料またはアフェレーシスは一般に、健常対象から採取する。ある特定の態様では、血液試料またはアフェレーシスは一般に、疾患を発症する危険性があるが、いまだ疾患を発症していない健常対象から採取し、目的の細胞を、その後の使用のために、単離し、凍結させる。ある特定の態様では、Ｔ細胞を拡大し、凍結させ、その後の時点において、使用することができる。ある特定の態様では、試料を、本明細書で記載される特定の疾患についての診断の直後であるが、任意の処置の前に、患者から回収する。さらなる態様では、細胞を、任意の数の、関与性の処置モダリティーであって、ナタリズマブ、エファリズマブ、抗ウイルス剤、化学療法、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、マイコフェノール酸、およびＦＫ５０６などの免疫抑制剤、ＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体、キトサン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８など、抗体または他の免疫除去剤、および照射などの薬剤による処置を含むがこれらに限定されない処置モダリティーの前に、対象に由来する血液試料またはアフェレーシスから単離する。
【０９１３】
本開示のさらなる態様では、Ｔ細胞を、対象を、機能的Ｔ細胞下に置く処置の直後における患者から得る。この点で、ある特定のがん処置、特に、免疫系を損なう薬物による処置後の、患者が通常、処置から回復する期間中である、処置の直後には、得られるＴ細胞の品質は、ｅｘ  ｖｉｖｏで拡大されるそれらの能力が最適となりうるか、または改善されうることが観察されている。同様に、本明細書で記載される方法を使用する、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける操作後においても、これらの細胞は、生着の増強およびｉｎ  ｖｉｖｏにおける拡大に好ましい状態にありうる。したがって、本開示の文脈内では、Ｔ細胞、樹状細胞、または他の造血系細胞を含む血液細胞を、この回復期の間に回収することが想定される。さらに、ある特定の態様では、動員（例えば、ＧＭ−ＣＳＦによる動員）レジメンおよびコンディショニングレジメンを使用して、とりわけ、治療後の規定された時間ウィンドウ内の対象において、特定の細胞型の再増殖、再循環、再生、および／または拡大が好適となる状態を創出することができる。例示的な細胞型は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、および免疫系の他の細胞を含む。
【０９１４】
一実施形態では、ＣＡＲ分子、例えば、本明細書で記載されるＣＡＲ分子を発現する免疫エフェクター細胞を、低免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤を施された対象から得る。ある実施形態では、免疫エフェクター細胞の集団、例えば、ＣＡＲを発現するように操作されるＴ細胞を、対象におけるＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞のレベル、もしくはＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の比、または対象から採取されたこれらが、少なくとも一過性に、増大しているように、十分な時間の後で、または低免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の十分な投与の後で採取する。
【０９１５】
他の実施形態では、免疫エフェクター細胞の集団、例えば、ＣＡＲを発現するように操作されているか、または操作されることになるＴ細胞を、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の数を増大させるか、またはＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の比を増大させる量のｍＴＯＲ阻害剤と接触させることにより、ｅｘ  ｖｉｖｏで処置することができる。
【０９１６】
一実施形態では、Ｔ細胞集団は、ジアシルグリセロール（diaglycerol）キナーゼ（ＤＧＫ）を欠損する。ＤＧＫ欠損細胞は、ＤＧＫのＲＮＡもしくはタンパク質を発現しないか、またはＤＧＫ活性を低減もしくは阻害した細胞を含む。ＤＧＫ欠損細胞は、遺伝子法、例えば、ＤＧＫの発現を低減または防止する、ＲＮＡ干渉薬剤、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡを投与することにより作出することができる。代替的に、ＤＧＫ欠損細胞は、本明細書で記載されるＤＧＫ阻害剤を伴う処置により作出することができる。
【０９１７】
一実施形態では、Ｔ細胞集団は、Ｉｋａｒｏｓを欠損する。Ｉｋａｒｏｓ欠損細胞は、ＩｋａｒｏｓのＲＮＡもしくはタンパク質を発現しないか、またはＩｋａｒｏｓ活性を低減もしくは阻害した細胞を含み、Ｉｋａｒｏｓ欠損細胞は、遺伝子法、例えば、Ｉｋａｒｏｓの発現を低減または防止する、ＲＮＡ干渉薬剤、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡを投与することにより作出することができる。代替的に、Ｉｋａｒｏｓ欠損細胞は、Ｉｋａｒｏｓ阻害剤、例えば、レナリドマイドを伴う処置により作出することができる。
【０９１８】
複数の実施形態では、Ｔ細胞集団は、ＤＧＫを欠損し、かつ、Ｉｋａｒｏｓを欠損する、例えば、ＤＧＫおよびＩｋａｒｏｓを発現しないか、またはＤＧＫおよびＩｋａｒｏｓの活性を低減もしくは阻害している。このようなＤＧＫおよびＩｋａｒｏｓ欠損細胞は、本明細書で記載される方法のうちのいずれかにより作出することができる。
【０９１９】
ある実施形態では、ＮＫ細胞を、対象から得る。別の実施形態では、ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞系、例えば、ＮＫ−９２細胞系（Ｃｏｎｋｗｅｓｔ）である。
【０９２０】
一部の態様では、本開示の細胞（例えば、本開示の免疫エフェクター細胞、例えば、本発明のＣＡＲ発現細胞）は、人工多能性幹細胞（「ｉＰＳＣ」）もしくは胚性幹細胞（ＥＳＣ）であるか、または前記ｉＰＳＣおよび／またはＥＳＣから発生させた（例えば、これらから分化させた）Ｔ細胞である。ｉＰＳＣは、例えば、当技術分野で公知の方法により、末梢血Ｔリンパ球、例えば、健常ボランティアから単離された末梢血Ｔリンパ球から発生させることができる。同様に、このような細胞は、当技術分野で公知の方法により、Ｔ細胞へと分化させることもできる。例えば、それらの各々の内容が、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Themeli M. et al., Nat. Biotechnol., 31, pp. 928-933 (2013); doi:10.1038/nbt.2678;国際公開第２０１４／１６５７０７号パンフレットを参照されたい。
【０９２１】
発現されるさらなる薬剤
複数の実施形態では、本明細書で記載される、ＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞は、例えば、国際公開第２０１７／１８１１１９号パンフレットにおいて記載されている条件的発現ドメインを含むＣＡＲ、または国際公開第２０１７／０２４３１８号パンフレットにおいて記載されている分解ドメインを含むＣＡＲを発現しうる。一部の実施形態では、条件的発現ドメインは、単一のＣＡＲ（例えば、１つの抗原結合性ドメインを含む単一のＣＡＲ、または２つまたはこれを超える抗原結合性ドメインを含む単一のＣＡＲ）と共に使用することもでき、複数のＣＡＲと共に使用することもできる。
【０９２２】
別の実施形態では、本明細書で記載される、ＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞は、別の薬剤、例えば、ＣＡＲを発現する細胞の活性を増強する薬剤もさらに発現しうる。このような、発現したさらなる薬剤は、ＣＡＲと併せて、例えば、同じベクター内または鋳型核酸内に導入することもでき、または別個のベクター内に導入することもできる。
【０９２３】
例えば、一実施形態では、薬剤は、阻害性分子を阻害する薬剤でありうる。阻害性分子の例は、例えば、本明細書で記載される、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３、および／またはＣＥＡＣＡＭ−５）、ＬＡＧ−３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、およびＴＧＦベータを含む。一実施形態では、阻害性分子を阻害する薬剤は、細胞、例えば、本明細書で記載される細胞内シグナル伝達ドメインへと、正のシグナルをもたらす第２のポリペプチドと関連する、第１のポリペプチド、例えば、阻害性分子を含む。一実施形態では、薬剤は、例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３、および／またはＣＥＡＣＡＭ−５）、ＬＡＧ−３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、もしくはＴＧＦベータなどの阻害性分子、またはこれらのうちのいずれかの断片の、第１のポリペプチドと、本明細書で記載される細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば共刺激性ドメイン（例えば、本明細書で記載される、例えば、４１ＢＢ、ＣＤ２７、またはＣＤ２８）、および／または一次シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書で記載される、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン）を含む）である、第２のポリペプチドとを含む。一実施形態では、薬剤は、ＰＤ−１またはその断片の、第１のポリペプチドと、本明細書で記載される細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書で記載される、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ４０、もしくは４−１ＢＢのシグナル伝達ドメイン、および／または本明細書で記載されるＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン）の、第２のポリペプチドとを含む。複数の実施形態では、薬剤は、阻害性分子の細胞外ドメインの、第１のポリペプチドと、本明細書で記載される共刺激性分子または本明細書で記載される一次シグナル伝達分子の細胞内シグナル伝達ドメインの、第２のポリペプチドとを含む。阻害性分子（例えば、阻害性分子のドメイン）が、正のシグナルをもたらす分子（例えば、共刺激性分子または一次シグナル伝達分子のドメイン）と関連する、このような分子については、例えば、国際公開第２０１３／０１９６１５号パンフレットにおいてさらに記載されている。
【０９２４】
一実施形態では、本明細書で記載される、ＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞は、第２のＣＡＲ、例えば、同じ標的（例えば、上記で記載した標的）または異なる標的上の異なるエピトープに対する、異なる抗原結合性ドメインを含む、例えば、第２のＣＡＲをさらに含みうる。一実施形態では、第２のＣＡＲは、第１のＣＡＲの標的と同じがん細胞型上で発現する標的に対する抗原結合性ドメインを含む。一実施形態では、ＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞は、第１の抗原をターゲティングし、共刺激性シグナル伝達ドメインを有するが、一次シグナル伝達ドメインは有さない細胞内シグナル伝達ドメインを含む第１のＣＡＲと、第２の、異なる抗原をターゲティングし、一次シグナル伝達ドメインを有するが、共刺激性シグナル伝達ドメインを有さない細胞内シグナル伝達ドメインを含む第２のＣＡＲとを含む。
【０９２５】
理論に束縛されることを望まないが、共刺激性シグナル伝達ドメイン、例えば、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、またはＯＸ−４０を、第１のＣＡＲへと配置し、一次シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータを、第２のＣＡＲへと配置することにより、ＣＡＲの活性を、両方の標的が発現する細胞へと限定することができる。一実施形態では、ＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞は、例えば、上記で記載した標的をターゲティングする抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、および共刺激性ドメインを含む、第１のＣＡＲと、第１のＣＡＲによりターゲティングされる抗原（例えば、第１の標的と同じがん細胞型上で発現する抗原）以外の抗原をターゲティングし、抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、および一次シグナル伝達ドメインを含む、第２のＣＡＲとを含む。別の実施形態では、ＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞は、例えば、上記で記載した標的をターゲティングする抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、および一次シグナル伝達ドメインを含む、第１のＣＡＲと、第１のＣＡＲによりターゲティングされる抗原（例えば、第１の標的と同じがん細胞型上で発現する抗原）以外の抗原をターゲティングし、抗原に対する抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、および共刺激性シグナル伝達ドメインを含む、第２のＣＡＲとを含む。
【０９２６】
一実施形態では、ＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞は、本明細書で記載されるＣＡＲ、例えば、上記で記載した標的に対するＣＡＲと、阻害性ＣＡＲとを含む。一実施形態では、阻害性ＣＡＲは、正常細胞、例えば、標的もまた発現する正常細胞上で見出されるが、がん細胞上では見出されない抗原に結合する抗原結合性ドメインを含む。一実施形態では、阻害性ＣＡＲは、阻害性分子の、抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含む。例えば、阻害性ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３、および／またはＣＥＡＣＡＭ−５）、ＬＡＧ−３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、またはＴＧＦベータの細胞内ドメインでありうる。
【０９２７】
一実施形態では、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）は、本明細書で記載される腫瘍抗原に結合する抗原結合性ドメインを含む第１のＣＡＲと、ＰＤ１の細胞外ドメインまたはその断片を含む第２のＣＡＲとを含む。
【０９２８】
一実施形態では、細胞は、上記で記載した阻害性分子をさらに含む。阻害性分子の非限定的な例は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５）、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ１０７）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬ９、アデノシン、およびＴＧＦベータを含む。
【０９２９】
一実施形態では、細胞内の第２のＣＡＲは、阻害性ＣＡＲであり、この場合、阻害性ＣＡＲは、阻害性分子の抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含む。阻害性分子は、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＴＧＦベータ、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３、およびＣＥＡＣＡＭ−５のうちの１または複数から選択することができる。一実施形態では、第２のＣＡＲ分子は、ＰＤ１またはその断片の細胞外ドメインを含む。
【０９３０】
複数の実施形態では、細胞内の第２のＣＡＲ分子は、一次シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメイン、および／または細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含む。
【０９３１】
他の実施形態では、細胞内の細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータの機能的ドメインを含む一次シグナル伝達ドメインと、４−１ＢＢの機能的ドメインを含む共刺激性シグナル伝達ドメインとを含む。
【０９３２】
一実施形態では、細胞内の第２のＣＡＲ分子は、配列番号３０のアミノ酸配列を含む。
【０９３３】
ある特定の実施形態では、第１のＣＡＲ分子の抗原結合性ドメインは、ｓｃＦｖを含み、第２のＣＡＲ分子の抗原結合性ドメインは、ｓｃＦｖを含まない。例えば、第１のＣＡＲ分子の抗原結合性ドメインは、ｓｃＦｖを含み、第２のＣＡＲ分子の抗原結合性ドメインは、ラクダ科動物のＶＨＨドメインを含む。
【０９３４】
他の複数の態様および複数の実施形態では、本開示の細胞、例えば、ＣＡＲを発現するように操作された細胞はまた、適切な場合（例えば、Ｔ細胞が抗腫瘍機能を達した後、またはＴ細胞が致死性の副作用を引き起こしつつある場合）、細胞、例えば、ＣＡＲ  Ｔ細胞の枯渇を媒介する分子（または分子のセット）など、安全性のための分子を発現するようにも操作することができる。１つの例示的な態様では、安全性のための分子とは、細胞の機能に影響を及ぼさないが、別の薬剤、例えば、前記分子をターゲティングする抗体またはＡＤＣ分子によりターゲティングされうる分子である。このような分子についての、１つの例示的な実施形態は、トランケート型受容体、例えば、受容体の細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインは含むが、受容体の細胞内ドメインの全て、または実質的な部分は欠く受容体である。例は、例えば、国際公開第２０１１／０５６８９４号パンフレットにおいて記載されている、トランケート型ＥＧＦＲ受容体である。理論に束縛されずに、前記トランケート型ＥＧＦＲ受容体の、抗ＥＧＦＲ抗体、例えば、セツキシマブによるターゲティングは、トランケート型ＥＧＦＲ受容体を発現する細胞を枯渇させるであろう。第２の例は、ｉＣａｓｐ９スイッチポリペプチド、例えば、二量体化ドメイン、任意選択のリンカー、およびカスパーゼドメインを有するポリペプチドであって、哺乳動物の宿主細胞内、二量体化化合物の存在下で発現させると、ｉＣａｓｐ９スイッチポリペプチドが、ホモ二量体化し、宿主細胞のアポトーシスを結果としてもたらすように方向付けられたポリペプチドである。複数の実施形態では、二量体化ドメインは、ＦＫＢＰベースの二量体化ドメインであり、例えば、配列は、二量体化化合物として作用しうる分子である、ＡＰ１９０３、およびＡＰ１９０３と構造的に関連するリガンド（ＡＰ２０１８７など）の、空隙への相補的なはめ込みをもたらす突然変異（Ｆ３７Ｖ）を保有する。このようなｉＣａｓｐ９スイッチポリペプチド（および関連する二量体化化合物）については、例えば、国際公開第１９９７／０３１８９９号パンフレット、米国特許出願公開第２０１１／２８６９８０号明細書、国際公開第２０１４／１６４３４８号パンフレット、国際公開第２０１３／０４０３７１号パンフレット、米国特許出願公開第２０１３／０７１４１４号明細書、国際公開第２０１４／２５５３６０号パンフレット；およびN Engl J Med. 2011 Nov 3;365(18):1673-83において記載されている。第３のこのような分子の例は、抗ＣＤ２０抗体によりターゲティングされる分子であり、この場合、例えば、抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）を投与することにより、前記細胞を枯渇させる。抗ＣＤ２０抗体によりターゲティングされる分子の例は、ＣＤ２０、およびそのトランケート形（例えば、抗ＣＤ２０抗体により認識可能な細胞外ドメイン、膜貫通ドメインを含むが、細胞内ドメインのうちの少なくとも一部を欠く分子）を含む。
【０９３５】
スプリットＣＡＲ
一部の実施形態では、ＣＡＲ発現細胞は、スプリットＣＡＲを使用する。スプリットＣＡＲ法については、国際公開第２０１４／０５５４４２号パンフレットおよび国際公開第２０１４／０５５６５７号パンフレットにおいてより詳細に記載されている。略述すると、スプリットＣＡＲ系は、第１の抗原結合性ドメインと、共刺激性ドメイン（例えば、４１ＢＢ）とを有する、第１のＣＡＲを発現する細胞を含み、細胞はまた、第２の抗原結合性ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ゼータ）とを有する、第２のＣＡＲも発現する。細胞が、第１の抗原に遭遇すると、共刺激性ドメインが活性化し、細胞が増殖する。細胞が、第２の抗原に遭遇すると、細胞内シグナル伝達ドメインが活性化し、細胞殺滅活性が始動する。したがって、ＣＡＲ発現細胞は、両方の抗原の存在下に限り、完全に活性化する。
【０９３６】
複数のＣＡＲの発現
一態様では、本明細書で記載されるＣＡＲ発現細胞は、第２のＣＡＲ（例えば、上記の発現したさらなる薬剤を参照されたい）、例えば、同じ標的または異なる標的（例えば、本明細書で記載されるがん関連抗原以外の標的、または本明細書で記載される、異なるがん関連抗原）に対する、例えば、異なる抗原結合性ドメインを含む、第２のＣＡＲをさらに含みうる。一実施形態では、第２のＣＡＲは、第１のＣＡＲによりターゲティングされるがん関連抗原と同じがん細胞型が発現する標的に対する抗原結合性ドメインを含む。一実施形態では、ＣＡＲ発現細胞は、第１の抗原をターゲティングし、共刺激性シグナル伝達ドメインを有するが、一次シグナル伝達ドメインは有さない細胞内シグナル伝達ドメインを含む第１のＣＡＲと、第２の、異なる抗原をターゲティングし、一次シグナル伝達ドメインを有するが、共刺激性シグナル伝達ドメインを有さない細胞内シグナル伝達ドメインを含む第２のＣＡＲとを含む。理論に束縛されることを望まないが、共刺激性シグナル伝達ドメイン、例えば、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、またはＯＸ−４０を、第１のＣＡＲへと配置し、一次シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータを、第２のＣＡＲへと配置することにより、ＣＡＲの活性を、両方の標的が発現される細胞へと限定することができる。一実施形態では、ＣＡＲを発現する細胞は、本明細書で記載される標的抗原に結合する抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、および共刺激性ドメインを含む、第１のがん関連抗原のＣＡＲと、異なる標的抗原（例えば、第１の標的抗原と同じがん細胞型上で発現する抗原）をターゲティングし、抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、および一次シグナル伝達ドメインを含む、第２のＣＡＲとを含む。別の実施形態では、ＣＡＲを発現する細胞は、本明細書で記載される標的抗原に結合する抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、および一次シグナル伝達ドメインを含む、第１のＣＡＲと、第１の標的抗原（例えば、第１の標的抗原と同じがん細胞型上で発現する抗原）以外の抗原をターゲティングし、抗原に対する抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、および共刺激性シグナル伝達ドメインを含む、第２のＣＡＲとを含む。
【０９３７】
一部の実施形態では、ＣＡＲを発現する細胞は、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲを含み、前記第１のＣＡＲおよび前記第２のＣＡＲのうちの１つの抗原結合性ドメインは、可変軽ドメインおよび可変重ドメインを含まない。一部の実施形態では、前記第１のＣＡＲおよび前記第２のＣＡＲのうちの１つの抗原結合性ドメインは、ｓｃＦｖであり、他の抗原結合性ドメインは、ｓｃＦｖではない。一部の実施形態では、前記第１のＣＡＲおよび前記第２のＣＡＲのうちの１つの抗原結合性ドメインは、単一ＶＨドメイン、例えば、ラクダ科動物、サメ、もしくはヤツメウナギの単一ＶＨドメイン、またはヒト配列もしくはマウス配列から導出される単一ＶＨドメインを含む。一部の実施形態では、前記第１のＣＡＲおよび前記第２のＣＡＲのうちの１つの抗原結合性ドメインは、ナノボディーを含む。一部の実施形態では、前記第１のＣＡＲおよび前記第２のＣＡＲのうちの１つの抗原結合性ドメインは、ラクダ科動物のＶＨＨドメインを含む。
【０９３８】
テロメラーゼの発現
いかなる特定の理論によっても束縛されることを望まないが、一部の実施形態では、治療用Ｔ細胞は、Ｔ細胞内のテロメアの短縮に起因して、患者において、短期の残留性を有し、したがって、テロメラーゼ遺伝子のトランスフェクションは、Ｔ細胞のテロメアを延長し、患者におけるＴ細胞の残留性を改善しうる。Carl June, “Adoptive T cell therapy for cancer in the clinic”, Journal of Clinical Investigation, 117:1466-1476 (2007)を参照されたい。したがって、ある実施形態では、本明細書で開示される免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞は、細胞外において発現するテロメラーゼサブユニット、例えば、テロメラーゼの触媒性サブユニット、例えば、ＴＥＲＴ、例えば、ｈＴＥＲＴをさらに含みうる。一部の態様では、本開示は、患者において、より長く存続するＣＡＲ発現細胞を作製する方法であって、細胞を、テロメラーゼサブユニット、例えば、テロメラーゼの触媒性サブユニット、例えば、ＴＥＲＴ、例えば、ｈＴＥＲＴをコードする核酸と接触させるステップを含む方法を提供する。細胞は、ＣＡＲをコードする構築物と接触させる前に、これと同時に、またはこの後で、核酸と接触させることができる。
【０９３９】
１つを超える分子を発現するように細胞を操作する、複数の実施形態では、前記分子の各々をコードする配列（例えば、ＣＡＲをコードする配列およびＮＫ阻害性分子をコードする配列）を、同じ核酸分子（例えば、同じ鋳型核酸）、例えば、同じプラスミドまたはベクター、例えば、ウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクター上に配置することができる。ある実施形態では、（ｉ）本明細書で記載される、ＣＡＲをコードする配列と、（ｉｉ）本明細書で記載される、ＮＫ阻害性分子をコードする配列とは、同じ核酸上、例えば、ベクター上に存在しうる。対応するタンパク質の産生は、例えば、個別のプロモーターの使用により達成することもでき、バイシストロニックの転写産物の使用により達成することもできる（単一の翻訳産物の切断により、または２つの個別のタンパク質産物の翻訳により、２つのタンパク質の産生を結果としてもたらしうる）。ある実施形態では、切断型ペプチドをコードする配列、例えば、Ｐ２Ａ配列、Ｔ２Ａ配列、またはＦ２Ａ配列を、（ｉ）と（ｉｉ）との間に配置する。ある実施形態では、ＩＲＥＳ、例えば、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳまたはＥＶ７１  ＩＲＥＳをコードする配列を、（ｉ）と（ｉｉ）との間に配置する。これらの複数の実施形態では、（ｉ）と（ｉｉ）とは、単一のＲＮＡとして転写される。他の複数の態様では、各分子を、異なるプロモーターから発現させることもできる。ある実施形態では、（ｉ）と（ｉｉ）とが、個別のＲＮＡとして転写されるように、第１のプロモーターを、（ｉ）に作動可能に連結し、第２のプロモーターを、（ｉｉ）に作動可能に連結する。
【０９４０】
代替的に、１つを超える分子をコードする配列を、異なる核酸分子（例えば、異なる鋳型核酸分子）上、例えば、異なるプラスミド上またはベクター上、例えば、ウイルスベクター上、例えば、レンチウイルスベクター上に配置することができる。例えば、（ｉ）本明細書で記載される、ＣＡＲをコードする配列は、第１の核酸上、例えば、第１のベクター上に存在することが可能であり、（ｉｉ）ＮＫ阻害性分子をコードする配列は、第２の核酸上、例えば、第２のベクター上に存在しうる。多様な実施形態では、下記の配列を使用することができる。
【０９４１】
【表１５−１】
2020513832.tif 000330
【０９４２】
【表１５−２】
2020513832.tif 000331
【０９４３】
【表１５−３】
2020513832.tif 000332
【０９４４】
【表１５−４】
2020513832.tif 000333
【０９４５】
ＶＩ．細胞
本明細書の多様な実施形態では、細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞、例えば、自家Ｔ細胞または同種異系Ｔ細胞が提供される。一部の実施形態では、細胞は、少なくとも１つの、本明細書で記載されるＣＡＲを発現する。一部の実施形態では、少なくとも１つのＣＡＲは、ＢＣＭＡである。一部の実施形態では、少なくとも１つのＣＡＲは、ＣＤ１９である。一部の実施形態では、ＣＡＲは、細胞内のＴＥＴ２遺伝子における、またはこの近傍における、例えば、イントロンまたはイントロン−エクソン接合部、例えば、ＴＥＴ２のエクソン９とエクソン１０との間のイントロンにおける、またはこの近傍における、ゲノムへの挿入からコードされ、発現する。一部の実施形態では、細胞は、少なくとも１つのＣＡＲを発現し、発現ＭＨＣ  Ｉの発現を調節する少なくとも１つの遺伝子、例えば、ＭＨＣ  Ｉ  ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、Ｂ２Ｍ、ＮＬＲＣ５、および／またはＭＨＣ  ＩＩ例えば、ＭＨＣ  ＩＩ  ＨＬＡ−ＤＭ、ＨＬＡ−ＤＯ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、ＲＦＸ１、ＲＦＸ５、ＮＦ−ＹＡ、ＮＦ−ＹＢ、ＮＦ−ＹＣ、Ｘ２ＢＰ、ＯＣＡＢの発現が低減し、破壊され、または消失している。一部の実施形態では、細胞は、本明細書で記載されるＣＲＩＳＰＲ系を使用して作出する。前記細胞を作出するための他の方法もまた、使用することができる。
【０９４６】
ある態様では、本開示は、本明細書で記載される遺伝子編集系、例えば、ＣＲＩＳＰＲ系を含む細胞を提供する。ある態様では、本開示は、本明細書で記載される遺伝子編集系、例えば、ＣＲＩＳＰＲ系により改変された細胞を提供する。
【０９４７】
別の態様では、本開示は、本明細書で記載されるｇＲＮＡ分子、例えば、１もしくは複数のｇＲＮＡ分子、または本明細書で記載されるＣＲＩＳＰＲ系を含むか、あるいは任意の時点においてこれを含んだ細胞を提供する。ある実施形態では、例えば、例えば、本明細書で記載される方法により変更された、本明細書で記載されるｇＲＮＡ分子（または前記ｇＲＮＡ分子をコードする核酸）、または本明細書で記載されるＣＲＩＳＰＲ系（または前記ＣＲＩＳＰＲ系の、１もしくは複数の構成要素をコードする核酸）の導入により、インデルを創出するように、細胞は変更されている、例えば、ｇＲＮＡ分子によりターゲティングされる標的配列は変更されている。ある実施形態では、変更は、標的部位を含む遺伝子の、機能的な（例えば、野生型の）遺伝子産物の転写または翻訳の変化を結果としてもたらす。ある実施形態では、変更は、標的部位を含む遺伝子の、機能的な（例えば、野生型の）遺伝子産物の発現の低減または消失を結果としてもたらす。複数の実施形態では、変更は、例えば鋳型核酸（例えば、本明細書で記載される）、例えば、ＣＡＲをコードする配列（例えば、本明細書で記載される）に由来する異種核酸配列の挿入である。複数の実施形態では、変更は、標的部位を含む遺伝子の、機能的な（例えば、野生型の）遺伝子産物の発現の低減または消失、および、例えば、鋳型核酸に由来する異種核酸配列の、同じ標的部位における挿入を結果としてもたらす。複数の実施形態では、変更は、標的部位を含む遺伝子の、機能的な（例えば、野生型の）遺伝子産物の発現の低減または消失、および、例えば、鋳型核酸に由来する異種核酸配列の、異なる標的部位における挿入を結果としてもたらす。
【０９４８】
一態様では、細胞は、動物細胞である。複数の実施形態では、細胞は、哺乳動物、霊長類、またはヒト細胞である。複数の実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。複数の実施形態では、細胞は、免疫エフェクター細胞（例えば、免疫エフェクター細胞の集団）、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞である。複数の実施形態では、Ｔ細胞（例えば、Ｔ細胞の集団）は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞、ＣＤ８＋  Ｔ細胞、またはこれらの組合せであるか、またはこれらを含む。複数の実施形態では、細胞は、自家である。複数の実施形態では、細胞は、同種異系である。
【０９４９】
好ましい実施形態では、細胞（または、細胞集団）は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、例えば、Ｖ節で記載したＣＡＲを発現するように操作されているか、または操作されることになる。複数の実施形態では、細胞は、例えば、本明細書で記載されるＢＣＭＡ  ＣＡＲを発現するように操作される。複数の実施形態では、ＣＡＲ操作細胞は、同種異系である。複数の実施形態では、ＣＡＲ操作細胞は、自家である。複数の実施形態では、ＣＡＲをコードする配列を、ＴＥＴ２イントロン内の細胞ゲノムへと、例えば、本明細書で記載されるｇＲＮＡ分子の標的配列に、またはこの近傍に、安定的に組み込む。複数の実施形態では、前記部位へと組み込まれた核酸配列は、レンチウイルスベクターの配列を含まない（例えば、ｃＰＰＴエレメントまたはＣＰＴエレメントを含まない）。
【０９５０】
別の態様では、本開示は、本明細書で記載される、第２のｇＲＮＡ分子、例えば、第１のｇＲＮＡ分子のターゲティングドメインと異なるターゲティングドメインを伴う、第２のｇＲＮＡ分子を含むか、任意の時点においてこれを含んだか、またはこれを将来において含む、上記で記載した細胞などの細胞を提供する。複数の実施形態では、２つのｇＲＮＡ分子は、同じＴＥＴ２イントロン内の標的部位と相補的である。他の実施形態では、２つまたはこれを超えるｇＲＮＡ分子は、異なる遺伝子内の標的配列と相補的である。複数の実施形態では、前記ｇＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、例えば、本明細書で記載される、ＴＥＴ２イントロン配列と相補的なターゲティングドメインを含む。複数の実施形態では、１または複数の他のｇＲＮＡ分子は、阻害性分子の遺伝子（例えば、ＰＤＣＤ１）内、同種異系Ｔ細胞の標的（例えば、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、ＲＦＸ１、ＲＦＸ５、またはＴ細胞受容体の構成要素、例えば、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｄ、もしくはＣＤ３Ｇ、あるいはこれらの組合せ）内の配列をターゲティングする。
【０９５１】
異なる遺伝子（または、例えば、ＴＥＴ２イントロン、Ｔ細胞受容体の構成要素、およびＢ２Ｍをターゲティングする場合における、異なる分子複合体）の、２つまたはこれを超える標的部位をターゲティングする、開示される複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかでは、異なる遺伝子（または分子複合体）標的のうちのいずれか、または全てのために、前記異なる遺伝子または異なる分子複合体のうちの１または複数に関する、２つまたはこれを超えるｇＲＮＡを援用しうることが理解されるであろう。
【０９５２】
加えて、または代替的に、１つを超える遺伝子をターゲティングするｇＲＮＡ分子を援用する場合、異なる手段のために援用することができる。例えば、ＴＥＴ２イントロンに対するｇＲＮＡ分子を、鋳型核酸と共に活用して、ＴＥＴ２イントロン内の標的配列において、またはこの近傍において、異種核酸配列を挿入することができる。同時に、さらに、１または複数のさらなる標的、例えば、Ｔ細胞受容体の構成要素（例えば、ＴＲＡＣ）、Ｂ２Ｍ、および／またはＣＩＩＴＡに対する、１または複数のさらなるｇＲＮＡ分子を活用して、前記１または複数の遺伝子の発現および／または機能を低減または消失させることもできる。これらのさらなるｇＲＮＡ分子は、第１のｇＲＮＡ分子と同時に活用することもでき、これに後続して活用することもでき、この前に活用することもできる。
【０９５３】
一部の実施形態では、２つまたはこれを超える、例えば、２つのｇＲＮＡ分子は、異なる遺伝子内の標的部位と相補的である。このような細胞は、１つを超える遺伝子の機能的な遺伝子産物の発現が低減または消失するように、各標的部位において、またはこの近傍において、変更、例えば、インデルを含みうる。上記で論じた通り、このような実施形態では、各異なる遺伝子へとターゲティングされた、１つを超えるｇＲＮＡ分子を援用することができる。
【０９５４】
複数の実施形態では、細胞は、ＴＥＴ２のイントロンまたはイントロン−エクソン接合部の標的配列（例えば、表１または２に記載されたターゲティングドメイン）と相補的なターゲティングドメインを含む、第１のｇＲＮＡ分子を含むか、これを含んだか、または将来においてこれを含む。細胞はまた、阻害性分子の標的配列と相補的なターゲティングドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子、および／またはＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ２４７、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、もしくはＣＤ３Ｇの標的配列と相補的なターゲティングドメインを含む第３のｇＲＮＡ分子、および／またはＢ２Ｍ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、もしくはＨＬＡ−Ｃの標的配列と相補的なターゲティングドメインを含む第４のｇＲＮＡ分子、および／またはＣＩＩＴＡの標的配列と相補的なターゲティングドメインを含む第５のｇＲＮＡ分子を含む場合もあり、任意の時点においてこれを含んだか、または将来においてこれを含む。複数の実施形態では、細胞は、例えば、異種核酸配列、例えば、ＴＥＴ２に対するｇＲＮＡ分子によりターゲティングされる部位に、またはこの近傍に組み込まれた、本明細書で記載されるＣＡＲをコードする配列を含み、任意選択で、１または複数の遺伝子、例えば、第２のｇＲＮＡ分子、第３のｇＲＮＡ分子、第４のｇＲＮＡ分子、および／または第５のｇＲＮＡ分子によりターゲティングされる、１または複数の遺伝子の発現が低減または消失している。
【０９５５】
複数の実施形態では、細胞、例えば、本明細書で記載されるＣＡＲ発現細胞は、ＴＥＴ２のイントロンに対する、１もしくは複数の修飾（例えば、異種核酸配列の挿入、またはヌクレオチドの挿入もしくは欠失）；Ｔ細胞受容体の構成要素（例えば、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ）をコードする内因性遺伝子に対する、１または複数の修飾（例えば、ヌクレオチドの挿入または欠失）；内因性Ｂ２Ｍ遺伝子に対する、１または複数の修飾（例えば、ヌクレオチドの挿入または欠失）；および／または内因性ＣＩＩＴＡ遺伝子に対する、１もしくは複数の修飾（例えば、ヌクレオチドの挿入または欠失）を含みうる。複数の実施形態では、前記修飾のうちの１または複数は、前記遺伝子の発現を低減または消失させる。複数の実施形態では、本開示は、さらに、ＴＣＲ−（例えば、ＦＡＣＳ、例えば、抗ＣＤ３抗体を使用するＦＡＣＳにより検出される通り、同じ種類の非改変細胞の発現レベルより、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を超えて低いＴＣＲの発現レベルを有する）、Ｂ２Ｍ−（例えば、ＦＡＣＳ、例えば、抗Ｂ２Ｍ抗体を使用するＦＡＣＳにより検出される通り、同じ種類の非改変細胞の発現レベルより、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を超えて低い、Ｂ２Ｍおよび／または１もしくは複数のＭＨＣクラスＩタンパク質の発現レベルを有する）、および／またはＣＩＩＴＡ−（例えば、ＦＡＣＳ、例えば、抗ＣＩＩＴＡ抗体を使用するＦＡＣＳにより検出される通り、同じ種類の非改変細胞の発現レベルより、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を超えて低い、ＣＩＩＴＡおよび／またはＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現レベルを有する）である、ＴＥＴ２イントロンに対する修飾を伴う細胞、例えば、本明細書で記載される、例えば、ＣＡＲ発現細胞を提供する。ある実施形態では、細胞を、例えば、本明細書で記載されるＣＡＲ分子を発現するように操作する。複数の実施形態では、ＣＡＲは、例えば、本明細書で記載されるＣＤ１９  ＣＡＲである。他の実施形態では、ＣＡＲは、例えば、本明細書で記載されるＢＣＭＡ  ＣＡＲである。他の実施形態では、ＣＡＲは、例えば、本明細書で記載されるＣＤ１２３  ＣＡＲである。
【０９５６】
ある態様では、本開示の細胞は、
（ａ）ＣＡＲをコードする核酸配列、例えば、例えば、本明細書で記載されるＣＡＲをコードする配列を含む鋳型核酸であって、例えば、ＣＡＲをコードする前記核酸配列が、ゲノムへと、本明細書で記載される、ＴＥＴ２イントロンのｇＲＮＡ分子（例えば、表１または表２のターゲティングドメインを含むｇＲＮＡ分子）の標的配列における部位、またはこの近傍における部位に組み込まれる（またはそのようになる）鋳型核酸
を含み（または細胞集団は、これらを含む、１または複数の細胞を含み）；
細胞は、ＣＡＲを発現する（または細胞集団が、これらを発現する１または複数の細胞を含む）。複数の実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸配列は、標的配列の１つの対立遺伝子だけに組み込まれる。複数の実施形態では、ＴＥＴ２の１または複数の機能は、前記細胞内で低減または消失する。複数の実施形態では、ＴＥＴ２の１または複数の機能は、低減される、例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％またはこれを超えて低減されるが、消失しない。
【０９５７】
ある態様では、本開示の細胞は、
（ｂ）ＣＡＲをコードする核酸配列、例えば、例えば、本明細書で記載されるＣＡＲをコードする配列を含む鋳型核酸であって、例えば、ＣＡＲをコードする前記核酸配列が、ゲノムへと、本明細書で記載される、ＴＥＴ２イントロンのｇＲＮＡ分子（例えば、表１または表２のターゲティングドメインを含むｇＲＮＡ分子）の標的配列における部位、またはこの近傍における部位に組み込まれる（またはそのようになる）鋳型核酸；
（ｃ）ＴＣＲの構成要素（例えば、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、またはＴＲＢＣ２、例えば、ＴＲＡＣ）またはその調節エレメントをコードする遺伝子の配列における、またはこの近傍におけるインデル、例えば、ＴＣＲの構成要素（例えば、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、またはＴＲＢＣ２、例えば、ＴＲＡＣ）に対するターゲティングドメインを含む、ｇＲＮＡの標的配列における、またはこの近傍におけるインデル；
（ｄ）Ｂ２Ｍまたはその調節エレメントをコードする遺伝子の配列における、またはこの近傍におけるインデル、例えば、Ｂ２Ｍに対するターゲティングドメインを含む、ｇＲＮＡの標的配列における、またはこの近傍におけるインデル；および
任意選択で、ＣＩＩＴＡまたはその調節エレメントをコードする遺伝子の配列における、またはこの近傍におけるインデル、例えば、ＣＩＩＴＡに対するターゲティングドメインを含む、ｇＲＮＡの標的配列における、またはこの近傍におけるインデル
を含み（例えば、本開示の細胞集団は、これらを含む、１または複数の細胞を含み）；細胞は、ＣＡＲを発現し（または細胞集団が、これらを発現する１または複数の細胞を含み）、ｉ）ＴＣＲの構成要素（例えば、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、またはＴＲＢＣ２、例えば、ＴＲＡＣ）、ｉｉ）Ｂ２Ｍ、および／またはｉｉｉ）ＣＩＩＴＡのうちの１または複数の発現および／または機能の、低減または消失を呈示する。
【０９５８】
前述の複数の実施形態および複数の態様のうちのいずれかでは細胞は、例えば、本明細書で記載される、１または複数のＣＲＩＳＰＲ系であって、示されたｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ系を含む。複数の実施形態では、細胞は、各々が、例えば、本明細書で記載されるＣａｓ９分子と、例えば、本明細書で記載される、示されたターゲティングドメインを含むｇＲＮＡ分子とを含む、１または複数のリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を含む。本明細書で記載される方法のうちのいずれかを含む、複数の実施形態であって、１つを超える標的配列に対するｇＲＮＡを援用する実施形態では、ｇＲＮＡ（および前記ｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ系）を、細胞へと同時に導入することができる。本明細書で記載される方法のうちのいずれかを含む、他の実施形態であって、１つを超える標的配列に対するｇＲＮＡを援用する実施形態では、ｇＲＮＡ（および前記ｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ系）を、細胞へと逐次的に導入することができる。
【０９５９】
前述の複数の実施形態または複数の態様のうちのいずれかを伴う態様では、細胞集団は、ＴＥＴ２のイントロンまたはイントロン−エクソン接合部をターゲティングするｇＲＮＡの標的配列（本明細書で記載される）における、またはこの近傍における、ＣＡＲをコードする核酸配列の挿入を含む、例えば、１つの対立遺伝子だけの、ＴＥＴ２のイントロンまたはイントロン−エクソン接合部をターゲティングするｇＲＮＡの標的配列（本明細書で記載される）における、またはこの近傍における、ＣＡＲをコードする核酸配列の挿入を含む細胞のうちの少なくとも２０％、例えば、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％を含む。前述の複数の実施形態または複数の態様のうちのいずれかを伴う態様では、細胞集団は、ｇＲＮＡ分子の各々によりターゲティングされる標的配列の各々において、またはその近傍において、インデルを含む細胞のうちの、少なくとも２０％、例えば、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％を含む。前記集団は、例えば、高効率のｇＲＮＡ分子（例えば、前記ｇＲＮＡ分子へと曝露された前記細胞のうちの＞８５％において、インデルを引き起こすｇＲＮＡ分子）を活用することにより得ることもでき、集団を、所望の細胞について濃縮することにより、例えば、アフィニティークロマトグラフィーまたは細胞選別によって、例えば、所望の細胞集団について選択することにより得ることもできる。
【０９６０】
ＶＩＩ．鋳型核酸（核酸配列を修飾するための）
ある態様では、本開示は、核酸配列、例えば、鋳型核酸に由来する核酸配列の、ＣＲＩＳＰＲ系、例えば、ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ系により認識される標的配列における、またはこの近傍における、例えば、本明細書で記載されるＴＥＴ２イントロン、例えば、ＴＥＴ２遺伝子のエクソン９とエクソン１０との間のイントロンへの挿入を提供する。ある実施形態では、標的配列における、またはこの近傍における核酸配列を、典型的に、切断部位において、またはこの近傍において、鋳型核酸の配列の一部または全部を有するように修飾する。ある実施形態では、鋳型核酸は、一本鎖である。代替的な実施形態では、鋳型核酸は、二本鎖である。ある実施形態では、鋳型核酸は、ＤＮＡ、例えば、二本鎖ＤＮＡである。代替的な実施形態では、鋳型核酸は、一本鎖ＤＮＡである。
【０９６１】
複数の実施形態では、鋳型核酸は、第１の異種タンパク質、例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、例えば、上記の第Ｖ節で記載したＣＡＲをコードする配列を含む。一部の実施形態では、鋳型核酸は、第２の異種タンパク質をコードする、別の核酸配列をさらに含む。一部の実施形態では、第１の異種タンパク質をコードする配列と、第２の異種タンパク質をコードする配列とは、単一の転写物として転写される。複数の実施形態では、２つの（またはこれを超える）目的のタンパク質を、互いから、２Ａ切断部位など、介在切断部位の組入れにより隔てることができる。他の実施形態では、２つの（またはこれを超える）タンパク質が、同じｍＲＮＡに由来する、個別のタンパク質として作製されるように、鋳型核酸は、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含む。本明細書で記載される通りに使用されうる２Ａ切断部位の例を、下記：
２Ａペプチド：アミノ酸配列＊
Ｔ２Ａ：（ＧＳＧ）ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１３０）
Ｐ２Ａ：（ＧＳＧ）ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１３１）
Ｅ２Ａ：（ＧＳＧ）ＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号１３２）
Ｆ２Ａ：（ＧＳＧ）ＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号１３３）
に示す。
【０９６２】
（ＧＳＧ）配列は、任意選択であり、文脈によっては、切断を改善するように、２Ａ配列の５’端へと付加することができる。
【０９６３】
ある実施形態では、鋳型核酸は、挿入イベント、例えば、相同性指向修復イベントに参与することにより、標的位置の構造を変更する。ある実施形態では、鋳型核酸は、例えば、標的配列における、またはこの近傍における、鋳型核酸配列の一部または全ての挿入により、標的位置の配列を変更する。ある実施形態では、鋳型核酸は、修飾塩基または非自然発生の塩基の、標的配列における、またはこの近傍における組込みを結果としてもたらす。
【０９６４】
本明細書で記載される遺伝子内または経路内の突然変異は、本明細書で論じられる手法のうちの１つを使用して補正することができる。ある実施形態では、鋳型核酸を使用して、相同性指向修復（ＨＤＲ）により、本明細書で記載される遺伝子内または経路内の突然変異を補正する。ある実施形態では、鋳型核酸を使用して、相同組換え（ＨＲ）により、本明細書で記載される遺伝子内または経路内の突然変異を補正する。ある実施形態では、鋳型核酸を使用して、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）による修復により、本明細書で記載される遺伝子内または経路内の突然変異を補正する。他の実施形態では、目的の分子をコードする核酸を、本開示のＣＲＩＳＰＲ系により修飾された部位において、またはその近傍において挿入することができる。ある実施形態では、挿入される核酸は、本明細書で記載されるキメラ抗原受容体をコードする。複数の実施形態では、鋳型核酸は、目的の分子、例えば、本明細書で記載される、例えば、キメラ抗原受容体をコードする核酸配列に作動可能に連結した調節エレメント、例えば、１または複数のプロモーターおよび／またはエンハンサーを含む。
【０９６５】
ＨＤＲによる修復および／または挿入ならびに鋳型核酸
本明細書で記載されるヌクレアーゼ誘導型相同性指向修復（ＨＤＲ）を使用して、標的配列を変更し（例えば、異種核酸を挿入する、例えば、異種タンパク質をコードする核酸を挿入し）、かつ／またはゲノム内の突然変異を補正する（例えば、修復または編集する）ことができる。理論に束縛されることを望まないが、標的配列の変更は、ドナー鋳型または鋳型核酸による相同性指向修復（ＨＤＲ）を介して生じると考えられる。例えば、ドナー鋳型または鋳型核酸は、標的配列の変更をもたらす。プラスミドドナーを、相同組換えのための鋳型として使用しうると想定される。ベクターは、鋳型核酸として使用する場合もあり、鋳型核酸を、目的の細胞へと施す場合もあると想定される。例示的なベクターは、レンチウイルスベクター、ｍＲＮＡ、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）、ミニサークル、およびナノプラスミドを含む。ある実施形態では、鋳型核酸を、組換えＡＡＶにより送達する。一部の実施形態では、ＡＡＶは、そのゲノムを、例えば、本明細書で記載される宿主細胞、例えば、標的細胞、例えば、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞のゲノムへと組み込まない。一部の実施形態では、ＡＡＶは、そのゲノムを、宿主細胞のゲノムへと組み込みうる。一部の実施形態では、ＡＡＶは、自己相補性アデノ随伴ウイルス（ｓｃＡＡＶ）、例えば、一体にアニーリングして、二本鎖ＤＮＡを形成する、両方の鎖をパッケージングするｓｃＡＡＶである。ある実施形態では、本明細書で記載される方法において使用されうるＡＡＶカプシドは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ  ｒｈ３２／３３、ＡＡＶ．ｒｈ４３、ＡＡＶ．ｒｈ６４Ｒ１、またはＡＡＶ７ｍ８に由来するカプシド配列である。ある実施形態では、鋳型核酸を、例えば、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ３２／３３、ＡＡＶ．ｒｈ４３、またはＡＡＶ．ｒｈ６４Ｒ１に由来するカプシド配列との、５０％またはこれを超える、例えば、６０％またはこれを超える、７０％またはこれを超える、８０％またはこれを超える、９０％またはこれを超える、または９５％またはこれを超える配列相同性を伴う、再操作されたＡＡＶカプシドにより送達する。ある実施形態では、鋳型核酸を、キメラＡＡＶカプシドにより送達する。例示的なキメラＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ９ｉ１、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ−ＤＪ、ＡＡＶ２Ｇ９、ＡＡＶ２ｉ８Ｇ９、またはＡＡＶ８Ｇ９を含むがこれらに限定されない。好ましい実施形態では、ベクターは、ＡＡＶ６ベクターまたは再操作されたＡＡＶ６ベクターである。さらに、一本鎖ドナー鋳型を、標的配列と、鋳型核酸との間の、相同性指向修復の代替法（例えば、一本鎖アニーリング）による、標的配列の変更のための鋳型として使用しうるとも想定される。鋳型核酸によりなされる標的配列の変更は、Ｃａｓ９分子による切断に依存する。Ｃａｓ９による切断は、二本鎖切断または２つの一本鎖切断を含みうる。
【０９６６】
ある実施形態では、単一の二本鎖切断、または２つの一本鎖切断により突然変異を補正するまたは核酸配列を挿入することができる。ある実施形態では、（１）単一の二本鎖切断、（２）２つの一本鎖切断、（３）切断が標的配列の各側で生じる、２つの二本鎖切断、（４）二本鎖切断および２つの一本鎖切断が、標的配列の各側で生じる、１つの二本鎖切断および２つの一本鎖切断、または（５）一本鎖切断の対が、標的配列の各側で生じる、４つの一本鎖切断により突然変異を補正するまたは核酸配列を挿入することができる。
【０９６７】
二本鎖切断媒介型補正または挿入
ある実施形態では、二本鎖切断は、例えば、ＨＮＨ様ドメインと関連する切断活性と、ＲｕｖＣ様ドメイン、例えば、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインと関連する切断活性とを有する、両方のＤＮＡを切断する能力を有するＣａｓ９分子、例えば、野生型Ｃａｓ９によりなされる。このような複数の実施形態は、単一のｇＲＮＡだけを要求する。
【０９６８】
一本鎖切断媒介型補正または挿入
他の実施形態では、２つの一本鎖切断、またはニックは、ニッカーゼ活性、例えば、ＨＮＨ様ドメインと関連する切断活性、またはＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインと関連する切断活性を有するＣａｓ９分子によりなされる。このような複数の実施形態は、各一本鎖切断の配置につき１つずつの、２つのｇＲＮＡを要求する。ある実施形態では、ニッカーゼ活性を有するＣａｓ９分子は、ｇＲＮＡがハイブリダイズする鎖は切断するが、ｇＲＮＡがハイブリダイズする鎖に相補的な鎖は切断しない。ある実施形態では、ニッカーゼ活性を有するＣａｓ９分子は、ｇＲＮＡがハイブリダイズする鎖は切断しないが、ｇＲＮＡがハイブリダイズする鎖に相補的な鎖は切断する。
【０９６９】
ある実施形態では、ニッカーゼは、ＨＮＨ活性、例えば、ＲｕｖＣ活性を不活化させたＣａｓ９分子、例えば、Ｄ１０における突然変異、例えば、Ｄ１０Ａ突然変異を有するＣａｓ９分子を有する。Ｄ１０Ａは、ＲｕｖＣを不活化させ、したがって、Ｃａｓ９ニッカーゼは、ＨＮＨ活性（だけ）を有し、ｇＲＮＡがハイブリダイズする鎖（例えば、その上に、ＮＧＧ  ＰＡＭを有さない相補鎖）上で切断する。他の実施形態では、Ｈ８４０における突然変異、例えば、Ｈ８４０Ａ突然変異を有するＣａｓ９分子を、ニッカーゼとして使用することができる。Ｈ８４０Ａは、ＨＮＨを不活化させ、したがって、Ｃａｓ９ニッカーゼは、ＲｕｖＣ活性（だけ）を有し、非相補鎖（例えば、ＮＧＧ  ＰＡＭを有し、その配列が、ｇＲＮＡと同一である鎖）上で切断する。
【０９７０】
ニッカーゼと、２つのｇＲＮＡとを使用して、２つの一本鎖ニックを配置する実施形態では、１つのニックは、標的核酸の＋鎖上にあり、１つのニックは、−鎖上にある。ＰＡＭは、外側を向いている。ｇＲＮＡは、約０〜５０、０〜１００、または０〜２００ヌクレオチド隔てられるように選択することができる。ある実施形態では、２つのｇＲＮＡのターゲティングドメインに相補的な標的配列の間に、重複が見られない。ある実施形態では、ｇＲＮＡは重複せず、最大で、５０、１００、または２００ヌクレオチド隔てられる。ある実施形態では、２つのｇＲＮＡの使用は、例えば、オフターゲット結合を減少させることにより、特異性を増大させることができる（Ran el al., CELL 2013）。
【０９７１】
ある実施形態では、単一のニックを使用して、ＨＤＲを誘導することができる。本明細書では、単一のニックを使用して、所与の切断部位における、ＨＤＲ、ＨＲ、またはＮＨＥＪの比を増大させうることが想定される。
【０９７２】
標的位置と比べた、二本鎖切断または一本鎖切断の配置
鎖のうちの１つにおける二本鎖切断または一本鎖切断は、補正または挿入が、前記標的位置において、またはこの近傍において生じるように、標的位置に十分に近接するものとする。ある実施形態では、距離は、５０、１００、２００、３００、３５０、または４００ヌクレオチド以下である。理論に束縛されることを望まないが、切断が、末端切除時に、エキソヌクレアーゼ媒介型除去下に置かれる領域内にあるように、切断は、標的位置に十分に近接するべきであると考えられる。標的位置と切断との距離が大きすぎる場合、突然変異は、末端切除部に含まれず、ドナー配列は、末端切除領域内の配列を補正するためにだけ使用されうるので、したがって、突然変異は補正されない場合がある。挿入のためにもまた、標的位置（すなわち、異種配列を挿入することが所望される位置）と切断との距離は、十分に近接するものとする。
【０９７３】
ｇＲＮＡ（またはｓｇＲＮＡもしくはｄｇＲＮＡ）と、Ｃａｓ９ヌクレアーゼとが、ＨＤＲ媒介型補正もしくはＨＲ媒介型補正または挿入の誘導を目的として、二本鎖切断を誘導する実施形態では、切断部位は、標的位置から、０〜２００ｂｐ（例えば、０〜１７５、０〜１５０、０〜１２５、０〜１００、０〜７５、０〜５０、０〜２５、２５〜２００、２５〜１７５、２５〜１５０、２５〜１２５、２５〜１００、２５〜７５、２５〜５０、５０〜２００、５０〜１７５、５０〜１５０、５０〜１２５、５０〜１００、５０〜７５、７５〜２００、７５〜１７５、７５〜１５０、７５〜１２５、７５〜１００ｂｐ）の間離れている。ある実施形態では、切断部位は、標的位置から、０〜１００ｂｐ（例えば、０〜７５、０〜５０、０〜２５、２５〜１００、２５〜７５、２５〜５０、５０〜１００、５０〜７５、または７５〜１００ｂｐ）の間離れている。
【０９７４】
Ｃａｓ９ニッカーゼと複合体化する、２つのｇＲＮＡ（独立に、単分子（またはキメラ）ｇＲＮＡまたはモジュラーｇＲＮＡ）が、ＨＤＲ媒介型補正または挿入の誘導を目的として、２つの一本鎖切断を誘導する実施形態では、近い方のニックは、標的位置から、０〜２００ｂｐ（例えば、０〜１７５、０〜１５０、０〜１２５、０〜１００、０〜７５、０〜５０、０〜２５、２５〜２００、２５〜１７５、２５〜１５０、２５〜１２５、２５〜１００、２５〜７５、２５〜５０、５０〜２００、５０〜１７５、５０〜１５０、５０〜１２５、５０〜１００、５０〜７５、７５〜２００、７５〜１７５、７５〜１５０、７５〜１２５、７５〜１００ｂｐ）の間離れており、２つのニックは、理想的には、互いから、２５〜５５ｂｐ以内（例えば、２５〜５０、２５〜４５、２５〜４０、２５〜３５、２５〜３０、３０〜５５、３０〜５０、３０〜４５、３０〜４０、３０〜３５、３５〜５５、３５〜５０、３５〜４５、３５〜４０、４０〜５５、４０〜５０、４０〜４５ｂｐ）にあり、互いから、１００ｂｐを超えて離れない（例えば、互いから、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、または５ｂｐを超えて離れない）であろう。ある実施形態では、切断部位は、標的位置から、０〜１００ｂｐ（例えば、０〜７５、０〜５０、０〜２５、２５〜１００、２５〜７５、２５〜５０、５０〜１００、５０〜７５、または７５〜１００ｂｐ）の間離れている。
【０９７５】
一実施形態では、２つのｇＲＮＡ、例えば、独立に、単分子（またはキメラ）ｇＲＮＡまたはモジュラーｇＲＮＡを、標的位置の両側に二本鎖切断を配置するように構成する。代替的な実施形態では、３つのｇＲＮＡ、例えば、独立に、単分子（またはキメラ）ｇＲＮＡまたはモジュラーｇＲＮＡを、標的位置の片側に、二本鎖切断（すなわち、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを伴う１つのｇＲＮＡ複合体）と、２つの一本鎖切断または対をなした一本鎖切断（すなわち、Ｃａｓ９ニッカーゼを伴う、２つのｇＲＮＡ複合体）とを配置する（例えば、第１のｇＲＮＡを使用して、標的位置の上流（すなわち、５’側）をターゲティングし、第２のｇＲＮＡを使用して、標的位置の下流（すなわち、３’側）をターゲティングする）ように構成する。別の実施形態では、４つのｇＲＮＡ、例えば、独立に、単分子（またはキメラ）ｇＲＮＡまたはモジュラーｇＲＮＡを、標的位置の片側に、一本鎖切断の２つの対（すなわち、Ｃａｓ９ニッカーゼを伴う、２つのｇＲＮＡ複合体の２つの対）を作出する（例えば、第１のｇＲＮＡを使用して、標的位置の上流（すなわち、５’側）をターゲティングし、第２のｇＲＮＡを使用して、標的位置の下流（すなわち、３’側）をターゲティングする）ように構成する。二本鎖切断、または対内の、２つの一本鎖ニックのうちの近い方は、理想的に、標的位置から０〜５００ｂｐ以内（例えば、標的位置から、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、５０、または２５ｂｐ以下）であろう。ニッカーゼを使用する場合、対内の２つのニックは、互いから２５〜５５ｂｐ以内（例えば、２５〜５０、２５〜４５、２５〜４０、２５〜３５、２５〜３０、５０〜５５、４５〜５５、４０〜５５、３５〜５５、３０〜５５、３０〜５０、３５〜５０、４０〜５０、４５〜５０、３５〜４５、または４０〜４５ｂｐの間の）にあり、互いから、１００ｂｐを超えて離れない（例えば、互いから、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、または１０ｂｐを超えて離れない）。
【０９７６】
一実施形態では、２つのｇＲＮＡ、例えば、独立に、単分子（またはキメラ）ｇＲＮＡまたはモジュラーｇＲＮＡを、標的位置の両側に二本鎖切断を配置するように構成する。代替的な実施形態では、３つのｇＲＮＡ、例えば、独立に、単分子（またはキメラ）ｇＲＮＡまたはモジュラーｇＲＮＡを、挿入部位の、２つの標的配列上に、二本鎖切断（すなわち、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを伴う１つのｇＲＮＡ複合体）と、２つの一本鎖切断または対をなした一本鎖切断（すなわち、Ｃａｓ９ニッカーゼを伴う、２つのｇＲＮＡ複合体）とを配置する（例えば、第１のｇＲＮＡを使用して、標的配列の上流（すなわち、５’側）をターゲティングし、第２のｇＲＮＡを使用して、標的配列の下流（すなわち、３’側）をターゲティングする）ように構成する。別の実施形態では、４つのｇＲＮＡ、例えば、独立に、単分子（またはキメラ）ｇＲＮＡまたはモジュラーｇＲＮＡを、挿入部位の片側に、一本鎖切断の２つの対（すなわち、Ｃａｓ９ニッカーゼを伴う、２つのｇＲＮＡ複合体の２つの対）を作出する（例えば、第１のｇＲＮＡを使用して、本明細書で記載される標的配列の上流（すなわち、５’側）をターゲティングし、第２のｇＲＮＡを使用して、本明細書で記載される標的配列の下流（すなわち、３’側）をターゲティングする）ように構成する。二本鎖切断、または対内の、２つの一本鎖ニックのうちの近い方は、理想的に、標的位置から０〜５００ｂｐ以内（例えば、標的位置から、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、５０、または２５ｂｐ以下）であろう。ニッカーゼを使用する場合、対内の２つのニックは、互いから２５〜５５ｂｐ以内（例えば、２５〜５０、２５〜４５、２５〜４０、２５〜３５、２５〜３０、５０〜５５、４５〜５５、４０〜５５、３５〜５５、３０〜５５、３０〜５０、３５〜５０、４０〜５０、４５〜５０、３５〜４５、または４０〜４５ｂｐの間の）にあり、互いから、１００ｂｐを超えて離れない（例えば、互いから、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、または１０ｂｐを超えて離れない）。
【０９７７】
相同性アームの長さ
複数の実施形態では、異種配列の組込みは、鋳型核酸内に、１または複数の、例えば、２つの（例えば、５’側および３’側の）相同性アームであって、標的配列または二本鎖切断における、またはこの近傍における、例えば、これと隣接する配列に対する相同性を有する相同性アーム、例えば、ＴＥＴ２イントロン内の配列、またはＴＥＴ２イントロン内の配列を含む配列に対する相同性を有する相同性アームを含むことにより容易とすることができる。相同性アームは、例えば、切除された一本鎖突出が、ドナー鋳型内の相補的な領域を見出すことを可能とするために、少なくとも、末端切除が生じうる領域まで伸長するものとする。全体の長さは、プラスミドサイズまたはウイルスのパッケージング限界などのパラメータにより制限されうるであろう。ある実施形態では、相同性アームは、反復エレメント、例えば、ＡＬＵリピート、ＬＩＮＥリピートへと伸長しない。鋳型は、同じ長さまたは異なる長さの、２つの相同性アームを有しうる。
【０９７８】
一実施形態では、相同性アームは、下記の配列（配列番号１２４）：
【０９７９】
【化２８】
2020513832.tif 000334
を含む、例えば、これからなる。
【０９８０】
一実施形態では、相同性アームは、下記の配列（配列番号１２５）：
【０９８１】
【化２９】
2020513832.tif 000335
を含む、例えば、これからなる。
【０９８２】
一実施形態では、第１の相同性アームは、配列番号１２４を含み、第２の相同性アームは、配列番号１２５を含む。複数の実施形態では、配列番号１２４および／または配列番号１２５を含む相同性アームを含む鋳型核酸を、配列番号１０１４８、１０１４９、または１０２０６を含むｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ系と共に使用する。複数の実施形態では、配列番号１２４および／または配列番号１２５を含む相同性アームを含む鋳型核酸を、配列番号１０１４８または１０１４９を含むｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ系と共に使用する。複数の実施形態では、鋳型核酸は、ＡＡＶベクター、例えば、ＡＡＶ６ベクター内に含まれる。
【０９８３】
例示的な相同性アーム長は、少なくとも約２５、５０、１００、２００、２５０、５００、７５０、１０００、または１５００ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、例えば、そうでなければ、より長い相同性アームによりターゲティングされる、相同性のゲノム領域内に、リピート領域が存在する場合、約２００ヌクレオチドまたはこれ未満の相同性アーム長を使用することができる。本明細書で使用される「標的位置」とは、Ｃａｓ９分子依存型工程により修飾された標的核酸（例えば、染色体）上の部位を指す。例えば、標的位置は、修飾Ｃａｓ９分子による標的核酸の切断、および標的位置の鋳型核酸指向性修飾、例えば、鋳型核酸指向性補正または挿入でありうる。ある実施形態では、標的位置は、１または複数のヌクレオチドが付加される標的核酸上の、２つのヌクレオチド、例えば、隣接ヌクレオチドの間の部位でありうる。標的位置は、鋳型核酸により変更される、例えば、補正される、１または複数のヌクレオチドを含みうる。ある実施形態では、標的位置は、標的配列（例えば、ｇＲＮＡが結合する配列）内にある。ある実施形態では、標的位置は、標的配列（例えば、ｇＲＮＡが結合する配列）の上流または下流にある。
【０９８４】
典型的に、鋳型配列は、切断に媒介または触媒される、標的配列との組換えを経る。ある実施形態では、鋳型核酸は、Ｃａｓ９により媒介される切断イベントにより切断される、標的配列上の部位に対応する配列を含む。ある実施形態では、鋳型核酸は、第１のＣａｓ９により媒介されるイベントにより切断される、標的配列上の第１の部位、および第２のＣａｓ９により媒介されるイベントにより切断される、標的配列上の第２の部位の両方に対応する配列を含む。
【０９８５】
ある実施形態では、鋳型核酸は、翻訳される配列のコード配列内の変更を結果としてもたらす配列、例えば、タンパク質産物内の、１つのアミノ酸の、別のアミノ酸への置換、例えば、突然変異体対立遺伝子の、野生型対立遺伝子への形質転換、野生型対立遺伝子の、突然変異体対立遺伝子への形質転換、および／または終止コドンの導入、アミノ酸残基の挿入、アミノ酸残基の欠失、もしくはナンセンス突然変異を結果としてもたらす配列を含みうる。
【０９８６】
他の実施形態では、鋳型核酸は、コード配列内、例えば、エクソン内の変更、または非コード配列内、例えば、イントロン内、または５’側もしくは３’側の非翻訳領域内もしくは非転写領域内の変更を結果としてもたらす配列を含みうる。このような変更は、制御エレメント内、例えば、プロモーター内、エンハンサー内の変更、およびシス作用型制御エレメント内またはトランス作用型制御エレメント内の変更を含む。一部の実施形態では、変更は、標的配列、例えば、本明細書で記載されるｇＲＮＡ分子により認識される標的配列における、またはこの近傍における、核酸配列、例えば、異種タンパク質、例えば、本明細書で記載される、例えば、ＣＡＲをコードする核酸配列の挿入を含む。
【０９８７】
鋳型核酸は、組み込まれると、
正の制御エレメントの活性の減少；
正の制御エレメントの活性の増大；
負の制御エレメントの活性の減少；
負の制御エレメントの活性の増大；
遺伝子の発現の減少；
遺伝子の発現の増大；
障害または疾患に対する耐性の増大；
ウイルスの侵入に対する耐性の増大；
突然変異の補正または望ましくないアミノ酸残基の変更；
例えば、酵素の酵素活性を増大させるか、または遺伝子産物が、別の分子と相互作用する能力を増大させることにより、遺伝子産物の生物学的特性を付与するか、増大させるか、消滅させるか、または減少させること
を結果としてもたらす配列を含みうる。
【０９８８】
鋳型核酸は、
標的配列のうちの、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、またはこれを超えるヌクレオチドの配列の変化
を結果としてもたらす配列を含みうる。
【０９８９】
ある実施形態では、鋳型核酸は、２０＋／−１０、３０＋／−１０、４０＋／−１０、５０＋／−１０、６０＋／−１０、７０＋／−１０、８０＋／−１０、９０＋／−１０、１００＋／−１０、１１０＋／−１０、１２０＋／−１０、１３０＋／−１０、１４０＋／−１０、１５０＋／−１０、１６０＋／−１０、１７０＋／−１０、１８０＋／−１０、１９０＋／−１０、２００＋／−１０、２１０＋／−１０、２２０＋／−１０、２００〜３００、３００〜４００、４００〜５００、５００〜６００、６００〜７００、７００〜８００、８００〜９００、９００〜１０００、１０００〜２０００、２０００〜３０００、または３０００を超えるヌクレオチドの長さである。
【０９９０】
鋳型核酸は、以下の構成要素：
［５’相同性アーム］−［挿入配列］−［３’相同性アーム］を含む。
【０９９１】
相同性アームは、所望されないエレメント、例えば、突然変異または署名を、置きかえ配列で置きかえる場合もあり、所望の配列を挿入する場合もある、染色体への組換えをもたらす。ある実施形態では、相同性アームは、最も遠位の切断部位を挟む。
【０９９２】
ある実施形態では、５’相同性アームの３’末端部は、置きかえ配列の５’末端部の隣の位置にある。ある実施形態では、５’相同性アームは、置きかえ配列の５’末端部から、５’側に、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１５０、１８０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、または２０００ヌクレオチド伸長しうる。
【０９９３】
ある実施形態では、３’相同性アームの５’末端部は、置きかえ配列の３’末端部の隣の位置にある。ある実施形態では、３’相同性アームは、置きかえ配列の３’末端部から、３’側に、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１５０、１８０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、または２０００ヌクレオチド伸長しうる。
【０９９４】
本明細書では、相同性アームの一方または両方を短縮して、ある特定の配列リピートエレメント、例えば、Ａｌｕリピート、ＬＩＮＥエレメントを含むことを回避しうることが想定される。例えば、５’側相同性アームを短縮して、配列リピートエレメントを回避することができる。他の実施形態では、３’側相同性アームを短縮して、配列リピートエレメントを回避することができる。一部の実施形態では、５’側相同性アームおよび３’側相同性アームの両方を短縮して、ある特定の配列リピートエレメントの組入れを回避することができる。
【０９９５】
本明細書では、突然変異を補正するための鋳型核酸を、一本鎖オリゴヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）としての使用のためにデザインしうることが想定される。ｓｓＯＤＮを使用する場合、５’側相同性アームおよび３’側相同性アームは、最長で約２００塩基対（ｂｐ）の長さ、例えば、少なくとも２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、または２００ｂｐの長さの範囲でありうる。オリゴヌクレオチド合成の改善を継続するときは、ｓｓＯＤＮのために、より長い相同性アームもまた想定される。
【０９９６】
一態様では、挿入配列は、例えば、本明細書で記載されるキメラ抗原受容体をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、挿入配列は、キメラ抗原受容体をコードする核酸配列に作動可能に連結したプロモーター、例えば、ＥＦ−１アルファプロモーターをさらに含む。一態様では、挿入配列は、例えば、本明細書で記載されるキメラ抗原受容体またはその部分をコードするベクターを含む。
【０９９７】
遺伝子ターゲティングのためのＮＨＥＪ法
本明細書で記載される通り、ヌクレアーゼ誘導型非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を使用して、遺伝子特異的ノックアウトをターゲティングすることができる。ヌクレアーゼ誘導型ＮＨＥＪはまた、目的の遺伝子内の配列を除去する（例えば、これを欠失させる）のにも使用することができる。
【０９９８】
理論に束縛されることを望まないが、ある実施形態では、本明細書で記載される方法と関連するゲノムの変更は、ヌクレアーゼ誘導型ＮＨＥＪと、ＮＨＥＪ修復経路のエラー誘起的性質とに依拠すると考えられる。ＮＨＥＪは、２つの末端部を一体に接続することにより、ＤＮＡ内の二本鎖切断を修復するが、一般に、元の配列は、それらが二本鎖切断により形成されたときのままの、２つの適合性の末端部が、完全にライゲーションされる場合に限り回復される。二本鎖切断のＤＮＡ末端部が、高頻度で酵素によるプロセシング下に置かれる結果として、末端部を再接続する前に、鎖の一方または両方における、ヌクレオチドの付加または除去がもたらされる。この結果として、ＮＨＥＪ修復部位のＤＮＡ配列内に、挿入および／または欠失（インデル）突然変異の存在がもたらされる。これらの突然変異のうちの３分の２は、リーディングフレームを変更し、したがって、非機能的タンパク質をもたらす。加えて、リーディングフレームは維持するが、著明量の配列を挿入するか、または欠失させる突然変異は、タンパク質の機能性を破壊しうる。極めて重要な機能的ドメイン内の突然変異は、タンパク質の、それほど重要でない領域内の突然変異より、許容度が小さい可能性が高いので、これは、遺伝子座依存性である。
【０９９９】
ＮＨＥＪにより発生するインデル突然変異は、予測不可能な性質であるが、所与の切断部位では、ある特定のインデル配列が好適とされ、集団内で過剰代表される。欠失の長さは、大きく変動する場合があり、最も一般には、１〜５０ｂｐの範囲であるが、容易に、１００〜２００ｂｐを超える範囲に到達しうる。挿入は、短くなる傾向があり、切断部位のすぐ周囲に、短い配列の重複を含むことが多い。しかし、大型の挿入を得る可能性があり、これらの場合、挿入された配列は、細胞内に存在するゲノムＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡの他の領域に由来していることが多い。
【１０００】
ＮＨＥＪは、突然変異原性の工程であるため、特異的な最終配列の作出が要求されない限りにおいて、小型の配列モチーフを欠失させるのにもまた使用することができる。二本鎖切断が、短い標的配列の近傍へとターゲティングされる場合、ＮＨＥＪ修復により引き起こされる欠失突然変異は、望ましくないヌクレオチドに及び、したがって、これを除去することが多い。大型のＤＮＡセグメントを欠失させるためには、配列の各側に１つずつの、２つの二本鎖切断を導入する結果として、末端部の間にＮＨＥＪをもたらし、介在配列の全体を除去することができる。これらの手法の両方を使用して、特異的ＤＮＡ配列を欠失させうるが、ＮＨＥＪのエラー誘起的性質はやはり、修復部位において、インデル突然変異をもたらしうる。
【１００１】
本明細書で記載される方法および組成物では、ＮＨＥＪ媒介型インデルを作出するのに、二本鎖切断型Ｃａｓ９分子、および一本鎖Ｃａｓ９分子またはニッカーゼＣａｓ９分子のいずれも使用することができる。遺伝子、例えば、目的の遺伝子のコード領域、例えば、早期コード領域へとターゲティングされたＮＨＥＪ媒介型インデルを使用して、目的の遺伝子をノックアウトする（すなわち、目的の遺伝子の発現を消失させる）ことができる。例えば、目的の遺伝子の早期コード領域は、コード配列の第１のエクソン内の、転写開始部位のすぐ後の配列、または転写開始部位から５００ｂｐ以内（例えば、５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、または５０ｂｐ未満）の配列を含む。
【１００２】
標的位置と比べた、二本鎖切断または一本鎖切断の配置
ＮＨＥＪ媒介型インデルを誘導する目的で、ｇＲＮＡおよびＣａｓ９ヌクレアーゼにより、二重鎖切断を作出する実施形態では、ｇＲＮＡ、例えば、単分子（またはキメラ）ｇＲＮＡ分子またはモジュラーｇＲＮＡ分子を、標的位置のヌクレオチドと近接して、１つの二本鎖切断を配置するように構成する。ある実施形態では、切断部位は、標的位置から、０〜５００ｂｐの間（例えば、標的位置から、５００、４００、３００、２００、１００、５０、４０、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１ｂｐ未満）離れている。
【１００３】
ＮＨＥＪ媒介型インデルを誘導する目的で、Ｃａｓ９ニッカーゼと複合体化する、２つのｇＲＮＡにより、２つの一本鎖切断を誘導する実施形態では、２つのｇＲＮＡ、例えば、独立に、単分子（またはキメラ）ｇＲＮＡまたはモジュラーｇＲＮＡを、ＮＨＥＪ修復に標的位置のヌクレオチドをもたらすように、２つの一本鎖切断を配置するように構成する。ある実施形態では、異なる鎖上で、同じ位置、または互いから数ヌクレオチド以内に切断を配置し、二本鎖切断を本質的に模倣するように、ｇＲＮＡを構成する。ある実施形態では、近い方のニックは、標的位置から、０〜３０ｂｐの間（例えば、標的位置から、３０、２５、２０、１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１ｂｐ未満）離れており、２つのニックは、互いから２５〜５５ｂｐ以内（例えば、２５〜５０、２５〜４５、２５〜４０、２５〜３５、２５〜３０、５０〜５５、４５〜５５、４０〜５５、３５〜５５、３０〜５５、３０〜５０、３５〜５０、４０〜５０、４５〜５０、３５〜４５、または４０〜４５ｂｐの間の）であり、互いから１００ｂｐを超えて離れない（例えば、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、または１０ｂｐを超えて離れない）。ある実施形態では、標的位置のヌクレオチドの片側に一本鎖切断を配置するように、ｇＲＮＡを構成する。
【１００４】
本明細書で記載される方法および組成物では、標的位置の両側に切断を作出するのに、二本鎖切断型Ｃａｓ９分子、および一本鎖Ｃａｓ９分子またはニッカーゼＣａｓ９分子のいずれも使用することができる。２つの切断の間の核酸配列を除去する（例えば、２つの切断の間の領域を欠失させる）ように、標的位置の両側に、二本鎖切断または対をなした一本鎖切断を作出する。一実施形態では、２つのｇＲＮＡ、例えば、独立に、単分子（またはキメラ）ｇＲＮＡまたはモジュラーｇＲＮＡを、標的位置の両側に二本鎖切断を配置する（例えば、第１のｇＲＮＡを使用して、本明細書で記載される遺伝子内または経路内の突然変異の上流（すなわち、５’側）をターゲティングし、第２のｇＲＮＡを使用して、本明細書で記載される遺伝子内または経路内の突然変異の下流（すなわち、３’側）をターゲティングする）ように構成する。代替的な実施形態では、３つのｇＲＮＡ、例えば、独立に、単分子（またはキメラ）ｇＲＮＡまたはモジュラーｇＲＮＡを、標的位置の片側に、二本鎖切断（すなわち、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを伴う１つのｇＲＮＡ複合体）と、２つの一本鎖切断または対をなした一本鎖切断（すなわち、Ｃａｓ９ニッカーゼを伴う、２つのｇＲＮＡ複合体）とを配置する（例えば、第１のｇＲＮＡを使用して、本明細書で記載される遺伝子内または経路内の突然変異の上流（すなわち、５’側）をターゲティングし、第２のｇＲＮＡを使用して、本明細書で記載される遺伝子内または経路内の突然変異の下流（すなわち、３’側）をターゲティングする）ように構成する。別の実施形態では、４つのｇＲＮＡ、例えば、独立に、単分子（またはキメラ）ｇＲＮＡまたはモジュラーｇＲＮＡを、標的位置の片側に、一本鎖切断の２つの対（すなわち、Ｃａｓ９ニッカーゼを伴う、２つのｇＲＮＡ複合体の２つの対）を作出する（例えば、第１のｇＲＮＡを使用して、本明細書で記載される遺伝子内または経路内の突然変異の上流（すなわち、５’側）をターゲティングし、第２のｇＲＮＡを使用して、本明細書で記載される遺伝子内または経路内の突然変異の下流（すなわち、３’側）をターゲティングする）ように構成する。二本鎖切断、または対内の、２つの一本鎖ニックのうちの近い方は、理想的には、標的位置から０〜５００ｂｐ以内（例えば、標的位置から、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、５０、または２５ｂｐ以下）であろう。ニッカーゼを使用する場合、対内の２つのニックは、互いから２５〜５５ｂｐ以内（例えば、２５〜５０、２５〜４５、２５〜４０、２５〜３５、２５〜３０、５０〜５５、４５〜５５、４０〜５５、３５〜５５、３０〜５５、３０〜５０、３５〜５０、４０〜５０、４５〜５０、３５〜４５、または４０〜４５ｂｐの間の）にあり、互いから、１００ｂｐを超えて離れない（例えば、互いから、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、または１０ｂｐを超えて離れない）。
【１００５】
したがって、具体的な実施形態では、本開示は、養子免疫療法のために、例えば、本明細書で記載される細胞、例えば、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞を製造する方法であって、
ａ）前記細胞へと、１）本明細書で記載されるｇＲＮＡ分子（例えば、前記ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ系）、例えば、Ｔｅｔのイントロンまたはイントロン−エクソン接合部、例えば、ＴＥＴ２のイントロンまたはイントロン−エクソン接合部に対するｇＲＮＡ分子、例えば、表１中または表２中のターゲティングドメインを含むｇＲＮＡ分子、および２）鋳型核酸、例えば、ＣＡＲをコードする核酸配列（例えば、本明細書で記載される）を含む鋳型核酸を導入するステップ
を含み、
鋳型核酸（例えば、ＣＡＲをコードする核酸配列）のうちの少なくとも一部が、前記細胞のゲノムへと、Ｔｅｔ、例えば、ＴＥＴ２イントロン（例えば、Ｔｅｔ、例えば、ＴＥＴ２のｇＲＮＡ分子の標的配列に、またはこの近傍に）内に組み込まれる
、方法を提供する。
【１００６】
一部の実施形態では、ＴＥＴ２のイントロンまたはイントロン−エクソン接合部をターゲティングするための鋳型核酸配列は、ＣＤ１９  ＣＡＲ、ＢＣＭＡ  ＣＡＲ、およびＣＤ２２  ＣＡＲから選択されるＣＡＲをコードする核酸配列（例えば、本明細書で記載される）を含み；鋳型核酸配列は、配列番号１２４を含む第１の相同性アームと、配列番号１２５を含む第２の相同性アームとをさらに含み；ｇＲＮＡ分子は、ｃｈｒ４：１０５２６９７４８〜１０５２７２５６３、例えば、ｃｈｒ４：１０５２７０６２４〜１０５２７０６４３、ｃｈｒ４：１０５２７０６３０〜１０５２７０６４９、ｃｈｒ４：１０５２７１８６３〜１０５２７１８８３のゲノム領域（ｈｇ３８に従う）内の配列と相補的なターゲティングドメインを含むｇＲＮＡから選択される。
【１００７】
一部の実施形態では、ＴＥＴ２のイントロンまたはイントロン−エクソン接合部をターゲティングするための鋳型核酸配列は、配列番号１２４を含む第１の相同性アームと、配列番号１２５を含む第２の相同性アームとを含み；ｇＲＮＡ分子は、ｃｈｒ４：１０５２６９７４８〜１０５２７２５６３、例えば、ｃｈｒ４：１０５２７０６２４〜１０５２７０６４３、ｃｈｒ４：１０５２７０６３０〜１０５２７０６４９、ｃｈｒ４：１０５２７１８６３〜１０５２７１８８３のゲノム領域（ｈｇ３８に従う）内の配列と相補的なターゲティングドメインを含むｇＲＮＡから選択される。
【１００８】
一部の実施形態では、ＴＥＴ２のイントロンまたはイントロン−エクソン接合部をターゲティングするための鋳型核酸配列は、ＣＤ１９  ＣＡＲ、ＢＣＭＡ  ＣＡＲ、およびＣＤ２２  ＣＡＲから選択されるＣＡＲをコードする核酸配列（例えば、本明細書で記載される）を含み；ｇＲＮＡ分子は、ｃｈｒ４：１０５２６９７４８〜１０５２７２５６３、例えば、ｃｈｒ４：１０５２７０６２４〜１０５２７０６４３、ｃｈｒ４：１０５２７０６３０〜１０５２７０６４９、ｃｈｒ４：１０５２７１８６３〜１０５２７１８８３のゲノム領域（ｈｇ３８に従う）内の配列と相補的なターゲティングドメインを含むｇＲＮＡから選択される。
【１００９】
一部の実施形態では、ＴＥＴ２のイントロンまたはイントロン−エクソン接合部をターゲティングするための鋳型核酸配列は、ＡＡＶ６ベクター上に提供され；鋳型核酸配列は、ＣＤ１９  ＣＡＲ、ＢＣＭＡ  ＣＡＲ、およびＣＤ２２  ＣＡＲから選択されるＣＡＲをコードする核酸配列を含み；鋳型核酸配列は、配列番号１２４を含む第１の相同性アームと、配列番号１２５を含む第２の相同性アームとをさらに含み；ｇＲＮＡ分子は、ｃｈｒ４：１０５２６９７４８〜１０５２７２５６３、例えば、ｃｈｒ４：１０５２７０６２４〜１０５２７０６４３、ｃｈｒ４：１０５２７０６３０〜１０５２７０６４９、ｃｈｒ４：１０５２７１８６３〜１０５２７１８８３のゲノム領域（ｈｇ３８に従う）内の配列と相補的なターゲティングドメインを含むｇＲＮＡから選択される。
【１０１０】
一部の実施形態では、ＴＥＴ２のイントロンまたはイントロン−エクソン接合部をターゲティングするための鋳型核酸配列は、ＡＡＶ６ベクター上に提供され；鋳型核酸配列は、配列番号１２４を含む第１の相同性アームと、配列番号１２５を含む第２の相同性アームとを含み；ｇＲＮＡ分子は、ｃｈｒ４：１０５２６９７４８〜１０５２７２５６３、例えば、ｃｈｒ４：１０５２７０６２４〜１０５２７０６４３、ｃｈｒ４：１０５２７０６３０〜１０５２７０６４９、ｃｈｒ４：１０５２７１８６３〜１０５２７１８８３のゲノム領域（ｈｇ３８に従う）内の配列と相補的なターゲティングドメインを含むｇＲＮＡから選択される。
【１０１１】
一部の実施形態では、ＴＥＴ２のイントロンまたはイントロン−エクソン接合部をターゲティングするための鋳型核酸配列は、ＡＡＶ６ベクター上に提供され；鋳型核酸配列は、ＣＤ１９  ＣＡＲ、ＢＣＭＡ  ＣＡＲ、およびＣＤ２２  ＣＡＲから選択されるＣＡＲをコードする核酸配列（例えば、本明細書で記載される）を含み；ｇＲＮＡ分子は、ｃｈｒ４：１０５２６９７４８〜１０５２７２５６３、例えば、ｃｈｒ４：１０５２７０６２４〜１０５２７０６４３、ｃｈｒ４：１０５２７０６３０〜１０５２７０６４９、ｃｈｒ４：１０５２７１８６３〜１０５２７１８８３のゲノム領域（ｈｇ３８に従う）内の配列と相補的なターゲティングドメインを含むｇＲＮＡから選択される。
【１０１２】
一部の実施形態では、ＴＥＴ２のイントロンまたはイントロン−エクソン接合部をターゲティングするための鋳型核酸配列は、ＡＡＶ６ベクター上に提供され；ｇＲＮＡ分子は、ｃｈｒ４：１０５２６９７４８〜１０５２７２５６３、例えば、ｃｈｒ４：１０５２７０６２４〜１０５２７０６４３、ｃｈｒ４：１０５２７０６３０〜１０５２７０６４９、ｃｈｒ４：１０５２７１８６３〜１０５２７１８８３のゲノム領域（ｈｇ３８に従う）内の配列と相補的なターゲティングドメインを含むｇＲＮＡから選択される。
【１０１３】
一部の実施形態では、ＴＥＴ２のイントロンまたはイントロン−エクソン接合部をターゲティングするための鋳型核酸配列は、ＣＤ１９  ＣＡＲ、ＢＣＭＡ  ＣＡＲ、およびＣＤ２２  ＣＡＲから選択されるＣＡＲをコードする核酸配列（例えば、本明細書で記載される）を含み；鋳型核酸配列は、配列番号１２４を含む第１の相同性アームと、配列番号１２５を含む第２の相同性アームとをさらに含み；ｇＲＮＡ分子は、表１中または表２中の配列、例えば、配列番号１０１４８、配列番号１０１４９、配列番号１０２０６、例えば、配列番号１０１４８または配列番号１０１４９のうちのいずれかのターゲティングドメインを含むｇＲＮＡから選択される。
【１０１４】
一部の実施形態では、ＴＥＴ２のイントロンまたはイントロン−エクソン接合部をターゲティングするための鋳型核酸配列は、配列番号１２４を含む第１の相同性アームと、配列番号１２５を含む第２の相同性アームとを含み；ｇＲＮＡ分子は、表１中または表２中の配列、例えば、配列番号１０１４８、配列番号１０１４９、配列番号１０２０６のうちのいずれかのターゲティングドメインを含むｇＲＮＡから選択される。
【１０１５】
一部の実施形態では、ＴＥＴ２のイントロンまたはイントロン−エクソン接合部をターゲティングするための鋳型核酸配列は、ＣＤ１９  ＣＡＲ、ＢＣＭＡ  ＣＡＲ、およびＣＤ２２  ＣＡＲから選択されるＣＡＲをコードする核酸配列（例えば、本明細書で記載される）を含み；ｇＲＮＡ分子は、表１中または表２中の配列のうちのいずれかのターゲティングドメインを含むｇＲＮＡから選択される。
【１０１６】
一部の実施形態では、ＴＥＴ２のイントロンまたはイントロン−エクソン接合部をターゲティングするための鋳型核酸配列は、ＡＡＶ６ベクター上に提供され；鋳型核酸配列は、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、およびＣＤ２２から選択されるＣＡＲをコードする核酸配列を含み；鋳型核酸配列は、配列番号１２４を含む第１の相同性アームと、配列番号１２５を含む第２の相同性アームとをさらに含み；ｇＲＮＡ分子は、表１中または表２中の配列、例えば、配列番号１０１４８、配列番号１０１４９、配列番号１０２０６のうちのいずれかのターゲティングドメインを含むｇＲＮＡから選択される。
【１０１７】
一部の実施形態では、ＴＥＴ２のイントロンまたはイントロン−エクソン接合部をターゲティングするための鋳型核酸配列は、ＡＡＶ６ベクター上に提供され；鋳型核酸配列は、配列番号１２４を含む第１の相同性アームと、配列番号１２５を含む第２の相同性アームとを含み；ｇＲＮＡ分子は、表１中または表２中の配列、例えば、配列番号１０１４８、配列番号１０１４９、配列番号１０２０６のうちのいずれかのターゲティングドメインを含むｇＲＮＡから選択される。
【１０１８】
一部の実施形態では、ＴＥＴ２のイントロンまたはイントロン−エクソン接合部をターゲティングするための鋳型核酸配列は、ＡＡＶ６ベクター上に提供され；鋳型核酸配列は、ＣＤ１９  ＣＡＲ、ＢＣＭＡ  ＣＡＲ、およびＣＤ２２  ＣＡＲから選択されるＣＡＲをコードする核酸配列（例えば、本明細書で記載される）を含み；ｇＲＮＡ分子は、表１中または表２中の配列、例えば、配列番号１０１４８、配列番号１０１４９、配列番号１０２０６のうちのいずれかのターゲティングドメインを含むｇＲＮＡから選択される。
【１０１９】
一部の実施形態では、ＴＥＴ２のイントロンまたはイントロン−エクソン接合部をターゲティングするための鋳型核酸配列は、ＡＡＶ６ベクター上に提供され；ｇＲＮＡ分子は、表１中または表２中の配列、例えば、配列番号１０１４８、配列番号１０１４９、配列番号１０２０６のうちのいずれかのターゲティングドメインを含むｇＲＮＡから選択される。
【１０２０】
一部の実施形態では、鋳型核酸は、配列番号１２６を含む。一部の実施形態では、鋳型核酸は、配列番号１２６を含み、ＡＡＶベクター、例えば、ＡＡＶ６ベクター上に提供される。一部の実施形態では、鋳型核酸は、配列番号１２６を含み、ＡＡＶベクター、例えば、ＡＡＶ６ベクター上に提供され、ｇＲＮＡ分子は、表１中または表２中の配列、例えば、配列番号１０１４８、配列番号１０１４９、配列番号１０２０６、例えば、配列番号１０１４８および配列番号１０１４９から選択される配列のうちのいずれかのターゲティングドメインを含むｇＲＮＡから選択される。
【１０２１】
一部の実施形態では、本明細書で記載されるｇＲＮＡ分子と、本明細書で記載されるＣａｓ９分子とを混合して、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を形成し、次に、ＲＮＰを、本明細書で記載される細胞へと導入し、次いで、細胞を、本明細書で記載されるベクター、例えば、ＡＡＶ６へと導入する。
【１０２２】
一部の実施形態では、本明細書で開示されるｇＲＮＡ分子は、表２２に記載された編集修復パターン、および／または表２３に記載されたインデル頻度を発生させることが可能である。
【１０２３】
本開示はまた、１または複数の本明細書で開示されるｇＲＮＡ分子を含むか、またはかつてこれを含み、表２２に記載された編集修復パターン、および／または表２３に記載されたインデル頻度を呈示するか、またはかつてこれを呈示した細胞も提供する。
【１０２４】
ＶＩＩＩ．１つを超えるｇＲＮＡ分子を含む系
理論に束縛されることを意図しないが、連続核酸上に近接して位置する、２つの標的配列のターゲティング（例えば、各々が、それらのそれぞれの標的配列において、またはその近傍において、一本鎖切断または二本鎖切断を誘導する、２つのｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子複合体による）は、２つの標的配列の間に位置する核酸配列（または、核酸配列のうちの、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の切出し（例えば、欠失）を誘導する。一部の態様では、本開示は、連続核酸、例えば、染色体、例えば、そのイントロン、エクソン、および調節エレメントを含む、遺伝子上または遺伝子座上で近接する標的配列をターゲティングするターゲティングドメインを含む、２つまたはこれを超えるｇＲＮＡ分子の使用をもたらす。使用は、例えば、２つまたはこれを超えるｇＲＮＡ分子の、１または複数のＣａｓ９分子と併せた（あるいは２つもしくはこれを超えるｇＲＮＡ分子、および／または１もしくは複数のＣａｓ９分子をコードする核酸の）、細胞への導入によるものでありうる。このような系を、使用して、例えば、異種核酸配列、例えば、鋳型核酸、例えば、ＣＡＲをコードする配列（例えば、本明細書で記載される）から、切出し部位へと、配列を挿入することができる。
【１０２５】
一部の態様では、２つまたはこれを超えるｇＲＮＡ分子の標的配列は、連続核酸上で、少なくとも５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、または７００００ヌクレオチド隔てて位置するが、連続核酸上で、１００００ヌクレオチドを超えては隔てずに位置する。ある実施形態では、標的配列は、約４０００ヌクレオチド隔てて位置する。ある実施形態では、標的配列は、約６０００ヌクレオチド隔てて位置する。
【１０２６】
一部の態様では、複数のｇＲＮＡ分子は、各標的配列を、同じ遺伝子内、または遺伝子遺伝子座内に有する。別の態様では、複数のｇＲＮＡ分子は、各標的配列を、２つまたはこれを超える、異なる遺伝子内に有する。
【１０２７】
一部の態様では、本開示は、複数、例えば、２つまたはこれを超える、例えば、２つの、本開示のｇＲＮＡ分子を含む組成物および細胞であって、複数のｇＲＮＡ分子が、標的配列を、１０，０００ヌクレオチド未満、９，０００ヌクレオチド未満、８，０００ヌクレオチド未満、７，０００ヌクレオチド未満、６，０００ヌクレオチド未満、５，０００ヌクレオチド未満、４，０００ヌクレオチド未満、３，０００ヌクレオチド未満、２，０００ヌクレオチド未満、１，０００ヌクレオチド未満、９００ヌクレオチド未満、８００ヌクレオチド未満、７００ヌクレオチド未満、６００ヌクレオチド未満、５００ヌクレオチド未満、４００ヌクレオチド未満、３００ヌクレオチド未満、２００ヌクレオチド未満、１００ヌクレオチド未満、９０ヌクレオチド未満、８０ヌクレオチド未満、７０ヌクレオチド未満、６０ヌクレオチド未満、５０ヌクレオチド未満、４０ヌクレオチド未満、または３０ヌクレオチド未満隔てて有する、組成物および細胞を提供する。ある実施形態では、標的配列は、二重鎖核酸の同じ鎖上にある。ある実施形態では、標的配列は、二重鎖核酸の異なる鎖上にある。
【１０２８】
一実施形態では、本開示は、二重鎖核酸の同じ鎖上または異なる鎖上で、１０，０００ヌクレオチド未満、９，０００ヌクレオチド未満、８，０００ヌクレオチド未満、７，０００ヌクレオチド未満、６，０００ヌクレオチド未満、５，０００ヌクレオチド未満、４，０００ヌクレオチド未満、３，０００ヌクレオチド未満、２，０００ヌクレオチド未満、１，０００ヌクレオチド未満、９００ヌクレオチド未満、８００ヌクレオチド未満、７００ヌクレオチド未満、６００ヌクレオチド未満、５００ヌクレオチド未満、４００ヌクレオチド未満、３００ヌクレオチド未満、２００ヌクレオチド未満、１００ヌクレオチド未満、９０ヌクレオチド未満、８０ヌクレオチド未満、７０ヌクレオチド未満、６０ヌクレオチド未満、５０ヌクレオチド未満、４０ヌクレオチド未満、または３０ヌクレオチド未満隔てて配置された、２つのｇＲＮＡ結合性部位の間に位置する核酸を切り出す（例えば、これを欠失させる）ための方法を提供する。ある実施形態では、方法は、各ｇＲＮＡ結合性部位と関連するＰＡＭ部位の間に位置するヌクレオチドのうちの、５０％を超える、６０％を超える、７０％を超える、８０％を超える、８５％を超える、８６％を超える、８７％を超える、８８％を超える、８９％を超える、９０％を超える、９１％を超える、９２％を超える、９３％を超える、９４％を超える、９５％を超える、９６％を超える、９７％を超える、９８％を超える、９９％を超える、または１００％の欠失をもたらす。複数の実施形態では、欠失は、各ｇＲＮＡ結合性部位と関連するＰＡＭ部位のうちの１または複数の中の、１または複数のヌクレオチドをさらに含む。複数の実施形態では、欠失はまた、各ｇＲＮＡ結合性部位と関連するＰＡＭ部位の間の領域の外部の、１または複数のヌクレオチドも含む。
【１０２９】
一態様では、２つまたはこれを超えるｇＲＮＡ分子は、介在配列（または介在配列の部分）の切出しが、目的の遺伝子の上方調節または下方調節を引き起こすように、遺伝子調節エレメント、例えば、プロモーター結合性部位、エンハンサー領域、またはリプレッサー領域を挟む標的配列をターゲティングするターゲティングドメインを含む。
【１０３０】
ある実施形態では、２つまたはこれを超えるｇＲＮＡ分子は、表１または表２のｇＲＮＡ分子から選択される。ある態様では、２つまたはこれを超えるｇＲＮＡ分子は、同じ遺伝子内、例えば、同じ領域内、例えば、同じイントロン内の配列と相補的なターゲティングドメインを含む。
【１０３１】
本明細書で記載されるｇＲＮＡ分子、例えば、Ｔｅｔのイントロンまたはイントロン−エクソン接合部、例えば、ＴＥＴ２のイントロンまたはイントロン−エクソン接合部に対するｇＲＮＡ分子に加えて、本開示のＣＲＩＳＰＲ系、細胞、方法、および他の複数の実施形態は、１または複数のさらなるｇＲＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲ系、または、例えば、細胞の場合、例えば、ＣＲＩＳＰＲ系により実行される、他の遺伝子内の、１または複数の変更をさらに含みうる。
【１０３２】
本明細書で記載される通り、１つを超えるｇＲＮＡ分子（または１つを超えるｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ系、例えば、第１のｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ系および第２のｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ系、例えば、各ｇＲＮＡ分子を、Ｃａｓ分子、例えば、本明細書で記載される、例えば、Ｃａｓ９分子と複合体化させたＣＲＩＳＰＲ系）を活用する場合、１つを超えるｇＲＮＡ分子を、細胞へと、例えば、単一の導入ステップ、例えば、単回の電気穿孔ステップで、同時に導入することができる。代替的に、１つを超えるｇＲＮＡ分子（または前記ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ系）を、細胞へと、１つを超えるステップ、例えば、１回を超える電気穿孔により導入することもできる。複数の導入ステップを活用する場合、ステップは、数時間、数日間、または数週間にわたる期間、例えば、１時間、２時間、５時間、１０時間、１５時間、２０時間、２４時間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、またはこれを超える期間隔てることができる。
【１０３３】
１つを超えるｇＲＮＡ分子を活用する系または方法において、鋳型核酸を活用し、ｇＲＮＡ分子のうちの１つの標的配列だけに核酸配列を挿入することが所望される、複数の実施形態では、目的の細胞の変更を、段階的に達することができる。例えば、第１のステップでは、挿入が所望される標的配列に結合するｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ系を、例えば、本明細書で記載される鋳型核酸と併せて、細胞へと導入する。第２のステップでは、例えば、前記細胞内に、鋳型核酸が、もはや存在しない時点において、さらなる標的配列（例えば、遺伝子内の標的配列であって、前記１または複数の遺伝子の機能または発現が低減または消失していることが所望される、遺伝子内の標的配列）に対する、１または複数のｇＲＮＡ分子を含む、１または複数のＣＲＩＳＰＲ系を導入する。複数の実施形態では、第１のステップと、第２のステップとは、順序を逆にすることができる。複数の実施形態では、第２のステップは、各々が、単一のＣＲＩＳＰＲ系／ｇＲＮＡ分子を伴う、複数のステップを含みうる。
【１０３４】
具体的な実施形態では、本開示は、養子免疫療法のために、例えば、本明細書で記載される細胞、例えば、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞を製造する方法であって、
ａ）前記細胞へと、１）本明細書で記載されるｇＲＮＡ分子（例えば、前記ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ系）、例えば、Ｔｅｔのイントロンまたはイントロン−エクソン接合部、例えば、ＴＥＴ２のイントロンまたはイントロン−エクソン接合部に対するｇＲＮＡ分子、例えば、表１中または表２中のターゲティングドメインを含むｇＲＮＡ分子、および２）鋳型核酸、例えば、ＣＡＲをコードする核酸配列（例えば、本明細書で記載される）を含む鋳型核酸を導入するステップと；
ｂ）前記細胞へと、Ｔ細胞受容体の構成要素（例えば、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｄ、またはＣＤ３Ｇ）の標的配列に特異的なターゲティングドメインを含むｇＲＮＡ分子（例えば、前記ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ系）を導入し、かつ／または前記細胞へと、Ｂ２Ｍの標的配列に特異的なターゲティングドメインを含むｇＲＮＡ分子（例えば、前記ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ系）を導入し、かつ／または前記細胞へと、ＣＩＩＴＡの標的配列に特異的なターゲティングドメインを含むｇＲＮＡ分子（例えば、前記ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ系）を導入するステップと
を含み、
鋳型核酸（例えば、ＣＡＲをコードする核酸配列）のうちの少なくとも一部が、前記細胞のゲノムへと、Ｔｅｔ、例えば、ＴＥＴ２イントロン（例えば、Ｔｅｔ、例えば、ＴＥＴ２のｇＲＮＡ分子の標的配列に、またはこの近傍に）内に組み込まれ、前記細胞は、Ｔ細胞の構成要素、Ｂ２Ｍ、および／またはＣＩＩＴＡの発現が低減または消失している、
方法を提供する。
【１０３５】
具体的な実施形態では、本開示は、養子免疫療法のために、例えば、本明細書で記載される細胞、例えば、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞を製造する方法であって、
ａ）前記細胞へと、１）本明細書で記載されるｇＲＮＡ分子（例えば、前記ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ系）、例えば、Ｔｅｔのイントロンまたはイントロン−エクソン接合部、例えば、ＴＥＴ２のイントロンまたはイントロン−エクソン接合部に対するｇＲＮＡ分子、例えば、表１中または表２中のターゲティングドメインを含むｇＲＮＡ分子、および２）鋳型核酸、例えば、ＣＡＲをコードする核酸配列（例えば、本明細書で記載される）を含む鋳型核酸を導入するステップと；
ｂ）前記細胞へと、Ｔ細胞受容体の構成要素（例えば、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｄ、またはＣＤ３Ｇ）の標的配列に特異的なターゲティングドメインを含むｇＲＮＡ分子（例えば、前記ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ系）を導入し、かつ／または前記細胞へと、免疫抑制剤の標的に特異的なターゲティングドメインを含むｇＲＮＡ分子（例えば、前記ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ系）を導入するステップと
を含み、
鋳型核酸（例えば、ＣＡＲをコードする核酸配列）のうちの少なくとも一部が、前記細胞のゲノムへと、Ｔｅｔ、例えば、ＴＥＴ２イントロン（例えば、Ｔｅｔ、例えば、ＴＥＴ２のｇＲＮＡ分子の標的配列に、またはこの近傍に）内に組み込まれ、前記細胞は、免疫抑制剤の標的の発現が低減または消失している、
方法を提供する。免疫抑制剤の例示的な標的は、ＦＫＢＰ１ＡまたはＣＤ５２を含む。
【１０３６】
ＩＸ．ｇＲＮＡの特性
理論に束縛されることを意図しないが、複数の実験を通して、同じ細胞型内で、同じ系を使用する場合、ｇＲＮＡ分子および前記ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ系は、類似であるか、または同一なインデルパターンをもたらす。理論に束縛されずに、あるインデルパターンは、他のインデルパターンより有利でありうると考えられる。例えば、「フレームシフト突然変異」を結果としてもたらす挿入および／または欠失（例えば、１塩基対もしくは２塩基対の挿入もしくは欠失、または任意の挿入もしくは欠失であって、ｎ／３（式中、ｎ＝挿入内または欠失内のヌクレオチドの数）が整数ではない、挿入もしくは欠失）を主に含むインデルは、機能的なタンパク質の発現を低減または消失させるのに有益でありうる。同様に、「大型の欠失」（１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、または３０ヌクレオチドを超える欠失）を主に含むインデルもまた、例えば、プロモーター結合性部位など、極めて重要な調節配列を除去するのに有益な場合があり、これは同様に、機能的なタンパク質発現に対する効果の改善をもたらしうる。本明細書で記載される通り、所与のｇＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲ系により誘導されるインデルパターンは、驚くべきことに、細胞型を越えて、一貫して再現されることが見出されているのであれば、ｇＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲ系の導入時に、所与の細胞内では、１つのインデル構造ももたらされないことは必然であろう。複数の実施形態では、特異的ｇＲＮＡ、Ｃａｓ分子、細胞型、足場などは、ＣＲＩＳＰＲ系により誘導されるインデルパターンに影響を及ぼすように選択することができる。
【１０３７】
したがって、本開示は、有益なインデルのパターンまたは構造を創出するｇＲＮＡ分子、例えば、フレームシフト突然変異および／または大規模な欠失から主に構成されるインデルのパターンまたは構造を有するｇＲＮＡ分子を提供する。このようなｇＲＮＡ分子は、被験細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞または目的の細胞、例えば、Ｔ細胞）内で、候補ｇＲＮＡ分子により創出される、インデルのパターンまたは構造を、本明細書で記載される通り、ＮＧＳにより評価することにより選択することができる。実施例で示す通り、所望の細胞集団へと導入されると、標的遺伝子内にフレームシフト突然変異を有する、著明な割合の細胞を含む細胞集団を結果としてもたらすｇＲＮＡ分子が発見された。場合によって、フレームシフト突然変異率は、７５％、８０％、８５％、９０％またはこれを超える高い効率である。したがって、本開示は、本明細書で記載されるｇＲＮＡ分子の標的部位において、またはこれらの近傍において、例えば、本明細書で記載されるフレームシフト突然変異を有する、少なくとも約４０％（例えば、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％）の細胞を含む細胞集団を提供する。本開示はまた、本明細書で記載されるｇＲＮＡ分子の標的部位において、またはこれらの近傍において、例えば、本明細書で記載されるフレームシフト突然変異を有する、少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％）の細胞を含む細胞集団も提供する。
【１０３８】
したがって、本開示は、本開示の治療法における使用のためのｇＲＮＡ分子を選択する方法であって、１）目的の標的に対する、複数のｇＲＮＡ分子を用意するステップと、２）前記ｇＲＮＡ分子の使用により創出される、インデルパターンまたは構造を評価するステップと、３）フレームシフト突然変異、大型の欠失、またはこれらの組合せから主に構成される、インデルパターンまたは構造を形成するｇＲＮＡ分子を選択するステップと、４）前記選択されたｇＲＮＡを、本開示の方法において使用するステップとを含む方法を提供する。
【１０３９】
本開示は、細胞を変更する方法と、変更された細胞とをさらに提供し、この細胞型内の、所与のｇＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲ系により、特定のインデルパターンが、一貫して作製される。
【１０４０】
また、標的細胞型のゲノム内のオフターゲット配列に、インデルを創出しないか、またはオフターゲット部位にインデルをもたらすが、標的部位におけるインデル創出の頻度と比べて、極めて低頻度（例えば、集団内の細胞のうちの＜５％）であるｇＲＮＡ分子を活用することも有益でありうる。したがって、本開示は、標的細胞型内で、オフターゲットインデルの形成を呈示しないか、またはオフターゲットインデルの形成頻度を＜５％とする、ｇＲＮＡ分子およびＣＲＩＳＰＲ系を提供する。複数の実施形態では、本開示は、標的細胞型内で、いかなるオフターゲットインデルの形成も呈示しないｇＲＮＡ分子およびＣＲＩＳＰＲ系を提供する。したがって、本開示はさらに、本明細書で記載されるｇＲＮＡ分子の標的部位におけるインデル、またはこれらの近傍におけるインデル（例えば、例えば、本明細書で記載される、所与のｇＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲ系によりもたらされる、フレームシフトインデル、または上位５つのインデルのうちのいずれか１つ）は含むが、ｇＲＮＡ分子の任意のオフターゲット部位におけるインデルは含まない、細胞、例えば、細胞集団、例えば、免疫エフェクター細胞、例えば、本明細書で記載される、例えば、ＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞も提供する。他の実施形態では、本開示はさらに、本明細書で記載されるｇＲＮＡ分子の標的部位におけるインデル、またはこれらの近傍におけるインデル（例えば、例えば、本明細書で記載される、所与のｇＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲ系によりもたらされる、フレームシフトインデル、または上位５つのインデルのうちのいずれか１つ）を有する細胞のうちの＞５０％は含むが、ｇＲＮＡ分子の任意のオフターゲット部位におけるインデルを含む細胞のうちの、５％未満、例えば、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満を含む、細胞集団、例えば、免疫エフェクター細胞、例えば、本明細書で記載される、例えば、ＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞も提供する。
【１０４１】
Ｘ．送達／構築物
構成要素、例えば、Ｃａｓ９分子、ｇＲＮＡ分子、および／もしくは鋳型核酸、またはこれらの組合せは、様々な形態で、送達するか、製剤化するか、または投与することができる。非限定的な例として述べると、ｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子は、製剤化する（１または複数の組成物中に）こともでき、ゲノム編集イベントが所望される細胞へと直接送達または投与することもできる。代替的に、１または複数の構成要素、例えば、Ｃａｓ９分子もしくはｇＲＮＡ分子、またはこれらの両方をコードする核酸は、製剤化する（１または複数の組成物中に）こともでき、送達または投与することもできる。一態様では、ｇＲＮＡ分子は、ｇＲＮＡ分子をコードするＤＮＡとして提供することができ、Ｃａｓ９分子は、Ｃａｓ９分子をコードするＤＮＡとして提供することができる。一実施形態では、ｇＲＮＡ分子とＣａｓ９分子とは、個別の核酸分子上でコードされる。一実施形態では、ｇＲＮＡ分子とＣａｓ９分子とは、同じ核酸分子上でコードされる。一態様では、ｇＲＮＡ分子は、ＲＮＡとして提供することができ、Ｃａｓ９分子は、Ｃａｓ９分子をコードするＤＮＡとして提供することができる。一実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、例えば、本明細書で記載される、１または複数の修飾と共に提供される。一態様では、ｇＲＮＡ分子は、ＲＮＡとして提供され、Ｃａｓ９分子は、Ｃａｓ９分子をコードするｍＲＮＡとして提供される。一態様では、ｇＲＮＡ分子は、ＲＮＡとして提供され、Ｃａｓ９分子は、タンパク質として提供される。一実施形態では、ｇＲＮＡおよびＣａｓ９分子は、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）として提供される。一態様では、ｇＲＮＡ分子は、ｇＲＮＡ分子をコードするＤＮＡとして提供され、Ｃａｓ９分子は、タンパク質として提供される。前述の実施形態のうちのいずれかでは、組成物は、鋳型核酸をさらに含みうる。
【１０４２】
送達は、例えば、電気穿孔（例えば、当技術分野で公知の）または細胞膜を、核酸および／もしくはポリペプチド分子に対して透過性とする他の方法により達することができる。当技術分野では、膜を透過性とするためのさらなる技法が公知であり、例えば、細胞スクイージング（例えば、それらの内容が、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１５／０２３９８２号パンフレットおよび国際公開第２０１３／０５９３４３号パンフレットにおいて記載されている）、ナノニードル（例えば、それらの内容が、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、Chiappini et al., Nat. Mat., 14; 532-39、または米国特許出願公開第２０１４／０２９５５５８号明細書において記載されている）、およびナノストロー（例えば、それらの内容が、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、Xie, ACS Nano, 7(5); 4351-58において記載されている）を含む。
【１０４３】
ＤＮＡにコードされる構成要素を、送達する場合、ＤＮＡは典型的に、制御領域、例えば、発現を実行するためのプロモーターを含む制御領域を含むであろう。Ｃａｓ９分子の配列に有用なプロモーターは、ＣＭＶ、ＥＦ−１アルファ、ＭＳＣＶ、ＰＧＫ、ＣＡＧ制御プロモーターを含む。ｇＲＮＡに有用なプロモーターは、Ｈ１、ＥＦ−１ａ、およびＵ６プロモーターを含む。構成要素の発現を微調整するように、強度の類似するプロモーターを選択することもでき、強度の類似しないプロモーターを選択することもできる。Ｃａｓ９分子をコードする配列は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、例えば、ＳＶ４０  ＮＬＳを含みうる。ある実施形態では、Ｃａｓ９分子またはｇＲＮＡ分子のプロモーターは、独立に、誘導的プロモーターの場合もあり、組織特異的の場合もあり、細胞特異的の場合もある。
【１０４４】
Ｃａｓ９分子および／またはｇＲＮＡ分子の、ＤＮＡベースの送達
Ｃａｓ９分子および／またはｇＲＮＡ分子をコードするＤＮＡは、対象へと投与することもでき、当技術分野で公知の方法、または本明細書で記載される方法により、細胞へと送達することもできる。例えば、Ｃａｓ９をコードするＤＮＡ、および／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、例えば、ベクター（例えば、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクター）により送達することもでき、非ベクターベースの方法（例えば、ネイキッドＤＮＡまたはＤＮＡ複合体を使用する）により送達することもでき、これらの組合せにより送達することもできる。
【１０４５】
一部の実施形態では、Ｃａｓ９をコードするＤＮＡ、および／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡを、ベクター（例えば、ウイルスベクター／ウイルス、プラスミド、ミニサークル、またはナノプラスミド）により送達する。一部の実施形態では、Ｃａｓ９をコードするＤＮＡ、および／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡを、少なくとも１つのベクターにより送達する。例えば、Ｃａｓ９を、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡを送達するベクターと異なるベクターにより送達する。
【１０４６】
ベクターは、Ｃａｓ９分子および／またはｇＲＮＡ分子をコードする配列を含みうる。ベクターはまた、シグナルペプチド（例えば、核局在化、核小体局在化、ミトコンドリア局在化のための）をコードする配列であって、例えば、Ｃａｓ９分子配列へと融合させた配列も含みうる。例えば、ベクターは、１または複数の核局在化配列（例えば、ＳＶ４０に由来する）であって、Ｃａｓ９分子をコードする配列へと融合させた配列を含みうる。
【１０４７】
１または複数の調節／制御エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリアデニル化シグナル、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、２Ａ配列、およびスプライスアクセプターまたはスプライスドナーを、ベクター内に組み入れることができる。一部の実施形態では、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（例えば、ＣＭＶプロモーター）により認識される。他の実施形態では、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（例えば、Ｕ６プロモーター）により認識される。一部の実施形態では、プロモーターは、調節的プロモーター（例えば、誘導的プロモーター）である。他の実施形態では、プロモーターは、構成的プロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、組織特異的プロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、ウイルスプロモーターである。他の実施形態では、プロモーターは、非ウイルスプロモーターである。
【１０４８】
一部の実施形態では、ベクターまたは送達媒体は、ミニサークルである。一部の実施形態では、ベクターまたは送達媒体は、ナノプラスミドである。
【１０４９】
一部の実施形態では、ベクターまたは送達媒体は、ウイルスベクター（例えば、組換えウイルスを作出するための）である。一部の実施形態では、ウイルスは、ＤＮＡウイルス（例えば、ｄｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡウイルス）である。他の実施形態では、ウイルスは、ＲＮＡウイルス（例えば、ｓｓＲＮＡウイルス）である。
【１０５０】
例示的なウイルスベクター／ウイルスは、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、および単純ヘルペスウイルスを含む。ウイルスベクター技術は、当技術分野で周知であり、例えば、Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1 -4, Cold Spring Harbor Press, NY、ならびに他のウイルス学マニュアルおよび分子生物学マニュアルにおいて記載されている。
【１０５１】
一部の実施形態では、ウイルスは、分裂細胞に感染する。他の実施形態では、ウイルスは、非分裂細胞に感染する。一部の実施形態では、ウイルスは、分裂細胞および非分裂細胞の両方に感染する。一部の実施形態では、ウイルスは、宿主ゲノムへと組み込まれうる。一部の実施形態では、ウイルスを、例えば、ヒトにおける免疫が低減されるように操作する。一部の実施形態では、ウイルスは、複製コンピテントである。他の実施形態では、ウイルスは、複製欠損である、例えば、ビリオンの複製および／またはパッケージングのさらなるラウンドに必要な遺伝子の、１または複数のコード領域を、他の遺伝子で置きかえているか、または欠失させている。一部の実施形態では、ウイルスは、Ｃａｓ９分子および／またはｇＲＮＡ分子の一過性発現を引き起こす。他の実施形態では、ウイルスは、Ｃａｓ９分子および／またはｇＲＮＡ分子の、長期にわたり持続する、例えば、少なくとも１週間、２週間、１カ月間、２カ月間、３カ月間、６カ月間、９カ月間、１年間、２年間にわたる、または永続的な発現を引き起こす。ウイルスのパッケージング能力は、例えば、少なくとも約４ｋｂ〜少なくとも約３０ｋｂ、例えば、少なくとも約５ｋｂ、１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、３０ｋｂ、３５ｋｂ、４０ｋｂ、４５ｋｂ、または５０ｋｂで変動しうる。
【１０５２】
一部の実施形態では、Ｃａｓ９をコードするＤＮＡ、および／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡを、組換えレトロウイルスにより送達する。一部の実施形態では、レトロウイルス（例えば、モロニーマウス白血病ウイルス）は、例えば、宿主ゲノムへの組込みを可能とする逆転写酵素を含む。一部の実施形態では、レトロウイルスは、複製コンピテントである。他の実施形態では、レトロウイルスは、複製欠損である、例えば、ビリオンの複製およびパッケージングのさらなるラウンドに必要な遺伝子の、１または複数のコード領域を、他の遺伝子で置きかえているか、または欠失させている。
【１０５３】
一部の実施形態では、Ｃａｓ９をコードするＤＮＡ、および／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡを、組換えレンチウイルスにより送達する。例えば、レンチウイルスは、複製欠損であり、例えば、ウイルスの複製に要求される、１または複数の遺伝子を含まない。
【１０５４】
一部の実施形態では、Ｃａｓ９をコードするＤＮＡ、および／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡを、組換えアデノウイルスにより送達する。一部の実施形態では、アデノウイルスは、ヒトにおける免疫を低減しているように操作されている。
【１０５５】
一部の実施形態では、Ｃａｓ９をコードするＤＮＡ、および／もしくはｇＲＮＡをコードするＤＮＡならびに／または鋳型核酸を、組換えＡＡＶにより送達する。一部の実施形態では、ＡＡＶは、宿主細胞、例えば、本明細書で記載される標的細胞のゲノムへと、そのゲノムを組み込みうる。一部の実施形態では、ＡＡＶは、自己相補性アデノ随伴ウイルス（ｓｃＡＡＶ）、例えば、二本鎖ＤＮＡを一体に形成するようにアニールする鎖の両方をパッケージングするｓｃＡＡＶである。開示される方法において使用されうるＡＡＶ血清型は、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、改変ＡＡＶ２（例えば、Ｙ４４４Ｆ、Ｙ５００Ｆ、Ｙ７３０Ｆ、および／またはＳ６６２Ｖにおける修飾）、ＡＡＶ３、改変ＡＡＶ３（例えば、Ｙ７０５Ｆ、Ｙ７３１Ｆ、および／またはＴ４９２Ｖにおける修飾）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、改変ＡＡＶ６（例えば、Ｓ６６３Ｖおよび／またはＴ４９２Ｖにおける修飾）、ＡＡＶ８を含む。ＡＡＶ８．２、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、ならびにＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５、およびＡＡＶ２／６などの偽型ＡＡＶもまた、開示される方法において使用することができる。一部の実施形態では、組換えＡＡＶは、ＡＡＶ６である。
【１０５６】
一部の実施形態では、Ｃａｓ９をコードするＤＮＡ、および／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡを、ハイブリッドウイルス、例えば、本明細書で記載されるウイルスのうちの１または複数のハイブリッド体により送達する。
【１０５７】
パッケージング細胞を使用して、宿主細胞または標的細胞に感染することが可能なウイルス粒子を形成することができる。このような細胞は、アデノウイルスをパッケージングしうる２９３細胞と、レトロウイルスをパッケージングしうる、ψ２細胞またはＰＡ３１７細胞とを含む。遺伝子治療において使用されるウイルスベクターは通例、核酸ベクターを、ウイルス粒子へとパッケージングする、プロデューサー細胞系により作出される。ベクターは典型的に、パッケージングと、その後における、宿主細胞または標的細胞（該当する場合）への組込みとに要求される、最小限のウイルス配列を、発現させるタンパク質をコードする発現カセットにより置きかえられる、他のウイルス配列と共に含有する。例えば、遺伝子治療において使用されるＡＡＶベクターは典型的に、ＡＡＶゲノムに由来する逆位末端リピート（ＩＴＲ）配列であって、パッケージングと、宿主細胞内または標的細胞内の遺伝子発現とに要求されるＩＴＲだけを保有する。逸失するウイルスの機能は、パッケージング細胞系により、トランスで供給される。よって、ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子、すなわちｒｅｐおよびｃａｐはコードするが、ＩＴＲ配列は欠く、ヘルパープラスミドを含有する細胞系内でパッケージングされる。細胞系にはまた、ヘルパーとしてのアデノウイルスも感染させる。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製と、ヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現とを促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列の欠如のために、著明量ではパッケージングされない。アデノウイルスによる汚染は、例えば、アデノウイルスが、ＡＡＶより感受性である熱処理により低減することができる。
【１０５８】
ある実施形態では、ウイルスベクターは、細胞型および／または組織型を認識する能力を有する。例えば、ウイルスベクターは、ウイルスエンベロープの、異なる／代替的な糖タンパク質を伴う偽型の場合もあり、細胞型特異的受容体で操作（例えば、ウイルスエンベロープの糖タンパク質の遺伝子改変であって、ペプチドリガンド、単鎖抗体、成長因子などのターゲティングリガンドを組み込む遺伝子改変）される場合もあり、かつ／または１つの末端部が、ウイルスの糖タンパク質を認識し、他の末端部が標的細胞表面の部分を認識する、二重の特異性を伴う分子架橋（例えば、リガンド−受容体、モノクローナル抗体、アビジン−ビオチン、および化学的コンジュゲーション）を有するように操作される場合もある。
【１０５９】
ある実施形態では、ウイルスベクターは、細胞型特異的発現を達成する。例えば、トランス遺伝子（Ｃａｓ９およびｇＲＮＡ）の発現を、標的細胞内だけに限定するように、組織特異的プロモーターを構築することができる。ベクターの特異性はまた、トランス遺伝子発現の、マイクロＲＮＡ依存型制御によっても媒介されうる。ある実施形態では、ウイルスベクターは、ウイルスベクターと、標的細胞膜との融合の効率を増大させている。例えば、ウイルスの細胞への取込みを増大させるように、融合コンピテントヘマグルチニン（hemagglutin）（ＨＡ）などの融合タンパク質を組み込むことができる。ある実施形態では、ウイルスベクターは、核局在化能を有する。例えば、細胞壁の破壊（細胞分裂時の）を要求し、したがって、非分裂細胞には感染しないウイルスは、ウイルスのマトリックスタンパク質内に、核局在化ペプチドを組み込み、これにより、非増殖細胞への形質導入を可能とするように変更することができる。
【１０６０】
一部の実施形態では、Ｃａｓ９をコードするＤＮＡ、および／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡを、非ベクターベースの方法（例えば、ネイキッドＤＮＡまたはＤＮＡ複合体を使用する）により送達する。例えば、ＤＮＡを、例えば、有機修飾されたシリカまたはケイ酸塩（Ｏｒｍｏｓｉｌ）、電気穿孔、遺伝子銃、超音波穿孔、マグネトフェクション、脂質媒介型トランスフェクション、デンドリマー、無機ナノ粒子、リン酸カルシウム、またはこれらの組合せにより送達することができる。
【１０６１】
一部の実施形態では、Ｃａｓ９をコードするＤＮＡ、および／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡを、ベクターベースの方法と、非ベクターベースの方法との組合せにより送達する。例えば、ウィロソームは、不活化ウイルス（例えば、ＨＩＶまたはインフルエンザウイルス）と組み合わせたリポソームであって、例えば、呼吸器上皮細胞内で、ウイルス法単独またはリポソーム法単独より効率的な遺伝子移入を結果としてもたらしうるリポソームを含む。
【１０６２】
ある実施形態では、送達媒体は、非ウイルスベクターである。ある実施形態では、非ウイルスベクターは、無機ナノ粒子（例えば、ナノ粒子の表面へと、ペイロードを接合させた）である。例示的な無機ナノ粒子は、例えば、磁気ナノ粒子（例えば、Ｆｅ、ＭｎＯ２）またはシリカを含む。ナノ粒子の表面は、正に帯電したポリマー（例えば、ポリエチレンイミン、ポリリシン、ポリセリン）とコンジュゲートさせることができるが、これは、ペイロードの接合（例えば、コンジュゲーションまたはエントラップメント）を可能とする。ある実施形態では、非ウイルスベクターは、有機ナノ粒子（例えば、ペイロードの、ナノ粒子の内部へのエントラップメント）である。例示的な有機ナノ粒子は、例えば、カチオン性脂質を、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびプロタミンでコーティングされた中性ヘルパー脂質、ならびに脂質コーティングでコーティングされた核酸複合体と併せて含有するＳＮＡＬＰリポソームを含む。
【１０６３】
ＣＲＩＳＰＲ系、またはＣＲＩＳＰＲ系もしくはその構成要素をコードする核酸、例えば、ベクターを移入するための、例示的な脂質および／またはポリマーは、例えば、国際公開第２０１１／０７６８０７号パンフレット、国際公開第２０１４／１３６０８６号パンフレット、国際公開第２００５／０６０６９７号パンフレット、国際公開第２０１４／１４０２１１号パンフレット、国際公開第２０１２／０３１０４６号パンフレット、国際公開第２０１３／１０３４６７号パンフレット、国際公開第２０１３／００６８２５号パンフレット、国際公開第２０１２／００６３７８号パンフレット、国際公開第２０１５／０９５３４０号パンフレット、および国際公開第２０１５／０９５３４６号パンフレットにおいて記載されている脂質および／またはポリマーを含む、前出の各々の内容は、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる。ある実施形態では、媒体は、標的細胞による、ナノ粒子およびリポソームの取込みを増大させるように、ターゲティングの修飾、例えば、細胞特異的抗原、モノクローナル抗体、単鎖抗体、アプタマー、ポリマー、糖、および細胞透過性ペプチドを有する。ある実施形態では、媒体は、融合性ペプチド／ポリマーおよびエンドソーム不安定化ペプチド／ポリマーを使用する。ある実施形態では、媒体は、酸誘発性コンフォメーション変化（例えば、カーゴのエンドソームからの脱出を加速化させる）を経る。ある実施形態では、例えば、細胞内コンパートメント内の放出のために、刺激切断型ポリマーを使用する。例えば、細胞内の還元性環境内で切断される、ジスルフィドベースのカチオン性ポリマーを使用することができる。
【１０６４】
ある実施形態では、送達媒体は、非ウイルス性の生物学的送達媒体である。ある実施形態では、媒体は、弱毒化細菌（例えば、天然弱毒化細菌、または侵入性ではあるが、病原性を防止するように弱毒化され、かつ、トランス遺伝子を発現するように人工的に操作された弱毒化細菌（例えば、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）、ある特定のサルモネラ（Salmonella）属株、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）、および改変大腸菌（Escherichia coli））、標的特異的組織に対する、栄養的および組織特異的向性を有する細菌、標的組織特異性を変更するように、修飾表面タンパク質を有する細菌）である。ある実施形態では、媒体は、遺伝子改変されたバクテリオファージ（例えば、大きなパッケージング能力、低い免疫原性を有し、哺乳動物プラスミド維持配列を含有し、ターゲティングリガンドを組み込んだ操作ファージ）である。ある実施形態では、媒体は、哺乳動物ウイルス様粒子である。例えば、改変ウイルス粒子を作出することができる（例えば、「空」粒子の精製に続く、所望のカーゴを伴うウイルスの、ｅｘ  ｖｉｖｏにおけるアセンブリーにより）。媒体はまた、ターゲティングリガンドを組み込んで、標的組織特異性を変更するように操作することもできる。ある実施形態では、媒体は、生物学的リポソームである。例えば、生物学的リポソームは、ヒト細胞から導出されるリン脂質ベースの粒子（例えば、対象から導出される赤血球であって、球状構造へと破壊された赤血球である、赤血球ゴースト（例えば、組織ターゲティングは、多様な組織特異的リガンドまたは細胞特異的リガンドの接合により達成することができる））、または分泌性エクソソーム（対象（すなわち、患者）由来の、細胞内由来の膜結合性ナノ小胞（３０〜１００ｎｍ）（例えば、多様な細胞型から産生することができ、したがって、ターゲティングリガンドを必要とせずに、細胞に取り込まれうる））である。
【１０６５】
ある実施形態では、Ｃａｓ系の構成要素、例えば、本明細書で記載される、Ｃａｓ９分子の構成要素および／またはｇＲＮＡ分子の構成要素以外の、１または複数の核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子）を送達する。ある実施形態では、核酸分子を、Ｃａｓ系の構成要素のうちの１または複数を送達するのと同時に送達する。ある実施形態では、核酸分子を、Ｃａｓ９系の構成要素のうちの１または複数を送達する前に、または送達した後で（例えば、約３０分、１時間、２時間、３時間、６時間、９時間、１２時間、１日、２日間、３日間、１週間、２週間、または４週間以内に）送達する。ある実施形態では、核酸分子を、Ｃａｓ９系の構成要素、例えば、Ｃａｓ９分子の構成要素および／またはｇＲＮＡ分子の構成要素のうちの１または複数を送達する手段と異なる手段により送達する。核酸分子を、本明細書で記載される送達法のうちのいずれかにより送達することができる。例えば、核酸分子は、ウイルスベクター、例えば、組込み欠損レンチウイルスにより送達することができ、Ｃａｓ９分子の構成要素および／またはｇＲＮＡ分子の構成要素を、例えば、核酸（例えば、ＤＮＡ）により引き起こされる毒性を低減しうるように、電気穿孔により送達することができる。ある実施形態では、核酸分子は、治療用タンパク質、例えば、本明細書で記載されるタンパク質をコードする。ある実施形態では、核酸分子は、ＲＮＡ分子、例えば、本明細書で記載されるＲＮＡ分子をコードする。
【１０６６】
Ｃａｓ９分子をコードするＲＮＡの送達
Ｃａｓ９分子（例えば、活性のＣａｓ９分子、不活性のＣａｓ９分子、または不活性のＣａｓ９融合タンパク質）および／またはｇＲＮＡ分子をコードするＲＮＡを、当技術分野で公知の方法、または本明細書で記載される方法により、細胞、例えば、本明細書で記載される標的細胞へと送達することができる。例えば、Ｃａｓ９をコードするＲＮＡおよび／またはｇＲＮＡをコードするＲＮＡを、例えば、マイクロインジェクション、電気穿孔、脂質媒介型トランスフェクション、ペプチド媒介型送達、またはこれらの組合せにより送達することができる。
【１０６７】
Ｃａｓ９分子の、タンパク質としての送達
Ｃａｓ９分子（例えば、活性のＣａｓ９分子、不活性のＣａｓ９分子、または不活性のＣａｓ９融合タンパク質）を、当技術分野で公知の方法、または本明細書で記載される方法により、細胞へと送達することができる。例えば、Ｃａｓ９タンパク質分子を、例えば、マイクロインジェクション、電気穿孔、脂質媒介型トランスフェクション、ペプチド媒介型送達、細胞スクイージングもしくは細胞アブレーション（例えば、ナノニードルによる）、またはこれらの組合せにより送達することができる。送達は、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡにより達することもでき、ｇＲＮＡにより達することもできる。
【１０６８】
ある実施形態では、例えば、本明細書で記載されるＣａｓ９分子を、タンパク質として送達し、ｇＲＮＡ分子を、１または複数のＲＮＡ（例えば、本明細書で記載されるｄｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ）として送達する。複数の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質を、例えば、本明細書で記載される細胞への送達の前に、リボ核タンパク質複合体（「ＲＮＰ」）として、ｇＲＮＡ分子と複合体化させる。複数の実施形態では、ＲＮＰを、例えば、本明細書で記載される細胞へと、当技術分野で公知の任意の方法、例えば、電気穿孔により送達することができる。本明細書で記載される通り、かつ、理論に束縛されずに、細胞へと送達されるＲＮＰの濃度が低減される場合であってもなお、例えば、本明細書で記載される標的細胞内の、標的配列において、高編集％（例えば、＞８５％、＞９０％、＞９５％、＞９８％、または＞９９％）を結果としてもたらすｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子を使用することが好ましい場合がある。ここでもまた、理論に束縛されずに、標的細胞内の標的配列において、高編集％（低ＲＮＰ濃度における高編集％を含む）をもたらすｇＲＮＡ分子を含む、低減濃度または低濃度のＲＮＰを送達することは、オフターゲットの編集イベントの頻度および数を低減しうるため、有益でありうる。低濃度または低減濃度のＲＮＰを使用する一態様では、以下の手順：
１．Ｃａｓ９分子およびｔｒａｃｒを、溶液中、高濃度（例えば、細胞へと送達される最終ＲＮＰ濃度より高濃度）で用意し、２つの構成要素を平衡化させる手順；
２．ｃｒＲＮＡ分子を用意し、構成要素を平衡化させる（これにより、ＲＮＰの高濃度溶液を形成する）手順；
３．ＲＮＰ溶液を、所望の濃度まで希釈する手順；
４．前記所望の濃度の、前記ＲＮＰを、標的細胞へと、例えば、電気穿孔により送達する手順
を使用して、ＲＮＰを作出することができる。
【１０６９】
ｓｇＲＮＡ分子を伴う使用では、上記のステップ２を省略し、ステップ１において、Ｃａｓ９分子およびｓｇＲＮＡ分子を、溶液中、高濃度で用意し、構成要素を平衡化させることにより、上記の手順を改変することができる。複数の実施形態では、Ｃａｓ９分子および各ｇＲＮＡ構成要素を、溶液中、１：２比（Ｃａｓ９：ｇＲＮＡ）で、例えば、Ｃａｓ９：ｇＲＮＡ分子のモル比を１：２として用意する。ｄｇＲＮＡ分子を使用する場合、比、例えば、モル比は、１：２：２（Ｃａｓ９：ｔｒａｃｒ：ｃｒＲＮＡ）である。複数の実施形態では、ＲＮＰを、２０ｕＭまたはこれを超える濃度、例えば、約２０ｕＭ〜約５０ｕＭの濃度で形成する。複数の実施形態では、ＲＮＰを、１０ｕＭまたはこれを超える濃度、例えば、約１０ｕＭ〜約３０ｕＭの濃度で形成する。複数の実施形態では、ＲＮＰを、前記標的細胞への送達のために、標的細胞（例えば、本明細書で記載される）を含む溶液中に、１０ｕＭまたはこれ未満（例えば、濃度約０．０１ｕＭ〜約１０ｕＭ）の最終濃度まで希釈する。複数の実施形態では、ＲＮＰを、前記標的細胞への送達のために、標的細胞（例えば、本明細書で記載される）を含む溶液中に、３ｕＭまたはこれ未満（例えば、濃度約０．０１ｕＭ〜約３ｕＭ）の最終濃度まで希釈する。複数の実施形態では、ＲＮＰを、前記標的細胞への送達のために、標的細胞（例えば、本明細書で記載される）を含む溶液中に、１ｕＭまたはこれ未満（例えば、濃度約０．０１ｕＭ〜約１ｕＭ）の最終濃度まで希釈する。複数の実施形態では、ＲＮＰを、前記標的細胞への送達のために、標的細胞（例えば、本明細書で記載される）を含む溶液中に、０．３ｕＭまたはこれ未満（例えば、濃度約０．０１ｕＭ〜約０．３ｕＭ）の最終濃度まで希釈する。複数の実施形態では、ＲＮＰを、前記標的細胞への送達のために、標的細胞（例えば、本明細書で記載される）を含む溶液中に、約３ｕＭの最終濃度で用意する。複数の実施形態では、ＲＮＰを、前記標的細胞への送達のために、標的細胞（例えば、本明細書で記載される）を含む溶液中に、約１ｕＭの最終濃度で用意する。複数の実施形態では、ＲＮＰを、前記標的細胞への送達のために、標的細胞（例えば、本明細書で記載される）を含む溶液中に、約０．３ｕＭの最終濃度で用意する。複数の実施形態では、ＲＮＰを、前記標的細胞への送達のために、標的細胞（例えば、本明細書で記載される）を含む溶液中に、約０．１ｕＭの最終濃度で用意する。複数の実施形態では、ＲＮＰを、前記標的細胞への送達のために、標的細胞（例えば、本明細書で記載される）を含む溶液中に、約０．０５ｕＭの最終濃度で用意する。複数の実施形態では、ＲＮＰを、前記標的細胞への送達のために、標的細胞（例えば、本明細書で記載される）を含む溶液中に、約０．０３ｕＭの最終濃度で用意する。複数の実施形態では、ＲＮＰを、前記標的細胞への送達のために、標的細胞（例えば、本明細書で記載される）を含む溶液中に、約０．０１ｕＭの最終濃度で用意する。
【１０７０】
ＸＩ．処置法
Ｃａｓ系、例えば、本明細書で記載される、１または複数のｇＲＮＡ分子、および１または複数のＣａｓ分子（例えば、Ｃａｓ９分子）は、哺乳動物、例えば、ヒトにおける疾患の処置に有用である。「〜を処置する」、「処置された」、「〜を処置すること」、および「処置」という用語は、Ｃａｓ系、例えば、１または複数のｇＲＮＡ分子、および１または複数のＣａｓ９分子の、細胞への投与であって、疾患の症状、合併症、または生化学的徴候の発症を防止するか、または遅延させ、疾患、状態、または障害の症状を緩和するか、またはこれらを停止させるか、またはこれらのさらなる発生を阻害する投与を含む。処置は、予防的（疾患の発症を防止するか、もしくは遅延させるか、またはその臨床症状または潜在症状の顕在化を防止する）な場合もあり、疾患が顕在化した後における、症状の、治療的抑制または緩和の場合もある。処置は、本明細書で記載される治療的尺度により測定することができる。本開示の「処置」法は、Ｃａｓ系（例えば、１または複数のｇＲＮＡ分子、および１または複数のＣａｓ分子）の細胞への導入により変更された前記細胞の、対象への投与であって、疾患または状態を治癒させるか、これらの重症度を遅らせるか、逆にするか、低減するか、またはこれらの１もしくは複数の症状を軽快させるための投与、対象の健康または生存を、このような処置の非存在下で予測される健康または生存を超えて延長するための投与を含む。例えば、「処置」は、対象における、疾患の症状の、少なくとも５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％の、またはこれを超える緩和を含む。
【１０７１】
処置法／組合せ療法
多様な実施形態では、例えば、本明細書で記載される細胞（例えば、ＣＡＲを発現し、かつ／または本明細書で記載される、ＴＥＴ２イントロンもしくはＴＥＴ２イントロン−エクソンにおいて修飾された細胞）、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞、例えば、自家Ｔ細胞または同種異系Ｔ細胞を、対象へと投与する方法が提供される。一部の実施形態では、細胞は、本明細書で開示されるＣＲＩＳＰＲ法を使用して作出する。細胞を作出するための他の方法もまた、使用することができる。
【１０７２】
一実施形態では、方法は、本明細書で記載されるｇＲＮＡ分子を含むか、または任意の時点においてこれを含んだ細胞を、対象へと投与するステップを含む。複数の実施形態では、細胞は、この遺伝子の機能的産物の発現を、非改変細胞と比べて低減するか、または消失させるよう、ｇＲＮＡ分子のターゲティングドメインに相補的な配列を含む遺伝子を変更するように、ｇＲＮＡ分子の導入により変更されている。複数の実施形態では、細胞は、例えば、本明細書で記載されるＣＡＲを発現するように、さらに操作される。複数の実施形態では、細胞は、免疫エフェクター細胞、例えば、ＮＫ細胞またはＴ細胞である。複数の実施形態では、細胞は、同種異系である。複数の実施形態では、細胞は、自家である。
【１０７３】
別の態様では、本開示は、ｇＲＮＡ分子、例えば、本明細書で記載されるｇＲＮＡ分子、またはｇＲＮＡ分子、例えば、本明細書で記載されるｇＲＮＡ分子を含むか、もしくは、任意の時点においてこれを含んだ細胞を、それを必要とする対象へと投与するステップを含む方法を提供する。一実施形態では、対象は、本明細書で記載される障害を有する、例えば、対象は、がんを有する、例えば、対象は、本明細書で記載される標的抗原を発現するがんを有する。一実施形態では、対象は、ヒトである。
【１０７４】
別の態様では、本開示は、本明細書で記載されるがん関連抗原の発現と関連する疾患を有する対象を処置する方法であって、対象へと、有効量のｇＲＮＡ分子、例えば、本明細書で記載されるｇＲＮＡ分子、またはｇＲＮＡ分子、例えば、本明細書で記載されるｇＲＮＡ分子を含むか、もしくは、任意の時点においてこれを含んだ細胞を投与するステップを含む方法に関する。
【１０７５】
さらに別の態様では、本開示は、腫瘍抗原（例えば、本明細書で記載される抗原）の発現と関連する疾患を有する対象を処置する方法であって、対象へと、有効量のｇＲＮＡ分子、例えば、本明細書で記載されるｇＲＮＡ分子、またはｇＲＮＡ分子、例えば、本明細書で記載されるｇＲＮＡ分子を含むか、もしくは、任意の時点においてこれを含んだ細胞、例えば、免疫エフェクター細胞（例えば、免疫エフェクター細胞の集団）を投与するステップを含み、抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含むＣＡＲ分子をさらに含み、前記細胞内ドメインが、共刺激性ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメインを含み、前記抗原結合性ドメインが、疾患と関連する腫瘍抗原、例えば、本明細書で記載される腫瘍抗原に結合する、方法を特色とする。
【１０７６】
関連する態様では、本開示は、腫瘍抗原の発現と関連する疾患を有する対象を処置する方法を特色とする。方法は、対象へと、有効量の、ｇＲＮＡ分子、例えば、本明細書で記載されるｇＲＮＡ分子、またはｇＲＮＡ分子、例えば、本明細書で記載されるｇＲＮＡ分子を含むか、もしくは、任意の時点においてこれを含んだ細胞を、細胞の有効性を増大させる薬剤と組み合わせて投与するステップを含み、この場合、
免疫細胞の有効性を増大させる薬剤は、
プロテインホスファターゼ阻害剤；
キナーゼ阻害剤；
サイトカイン；
免疫阻害性分子の阻害剤；または
ＴＲＥＧ細胞のレベルもしくは活性を低下させる薬剤
のうちの１または複数から選択される。
【１０７７】
別の態様では、本開示は、腫瘍抗原の発現と関連する疾患、例えば、本明細書で記載される障害を有する対象の処置における使用のための、ｇＲＮＡ分子、例えば、本明細書で記載されるｇＲＮＡ分子を含むか、または、任意の時点においてこれを含んだ、免疫エフェクター細胞（例えば、免疫エフェクター細胞の集団）を含む組成物を特色とする。
【１０７８】
前記方法または使用のうちのいずれかについての、ある特定の実施形態では、本明細書で記載されるｇＲＮＡを含むか、または、任意の時点においてこれを含んだ細胞は、ｇＲＮＡターゲティングドメインに相補的な標的配列を含む遺伝子の、機能的な遺伝子産物の発現を、低減するか、または消滅させるように変更されている。ある実施形態では、ｇＲＮＡのターゲティングドメインに相補的な標的配列を含む遺伝子の、機能的な遺伝子産物の発現を消滅させている。複数の実施形態では、細胞はさらに、例えば、本明細書で記載されるＣＡＲも発現する。複数の実施形態では、細胞は、同種異系である。複数の実施形態では、細胞は、自家である。
【１０７９】
前記方法または使用のうちのいずれかについての、ある特定の実施形態では、腫瘍抗原、例えば、本明細書で記載される腫瘍抗原と関連する疾患は、がんもしくは悪性腫瘍、または骨髄異形成、骨髄異形成症候群、もしくは前白血病などの前がん性状態などの増殖性疾患から選択されるか、あるいは、本明細書で記載される腫瘍抗原の発現と関連する非がん関連適応症である。一実施形態では、疾患は、本明細書で記載されるがん、例えば、本明細書で記載される標的と関連するものとして本明細書で記載されるがんである。一実施形態では、疾患は、血液がんである。一実施形態では、血液がんは、白血病である。一実施形態では、がんは、Ｂ細胞性急性リンパ性白血病（「ＢＡＬＬ」）、Ｔ細胞性急性リンパ性白血病（「ＴＡＬＬ」）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、小児急性リンパ性白血病を含むがこれらに限定されない、１または複数の急性白血病；慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）を含むがこれらに限定されない、１または複数の慢性白血病；Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、毛様細胞白血病、小細胞または大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成および骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、形質芽細胞性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、ワルデンシュトロームマクログロブリン血症、および骨髄系血液細胞の無効な産生（または異形成）により統一される血液学的状態の多様なコレクションである「前白血病」を含むがこれらに限定されない、さらなる血液がんまたは血液学的状態からなる群から選択され、本明細書で記載される腫瘍抗原の発現と関連する疾患は、本明細書で記載される腫瘍抗原を発現する、非定型がんおよび／もしくは非古典がん、悪性腫瘍、前がん性状態、または増殖性疾患；ならびにこれらの任意の組合せを含むがこれらに限定されない。一実施形態では、がんは、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）である。一実施形態では、がんは、小児ＡＬＬである。一実施形態では、がんは、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫である。一実施形態では、がんは、慢性リンパ球性白血病である。一実施形態では、がんは、濾胞性リンパ腫である。一実施形態では、がんは、ホジキンリンパ腫である。一実施形態では、がんは、非ホジキンリンパ腫である。別の実施形態では、本明細書で記載される腫瘍抗原と関連する疾患は、充実性腫瘍である。
【１０８０】
ある特定の実施形態では、方法または使用を、免疫エフェクター細胞の有効性を増大させる薬剤、例えば、本明細書で記載される薬剤と組み合わせて実行する。
【１０８１】
前記方法または使用のうちのいずれかでは、腫瘍抗原の発現と関連する疾患は、増殖性疾患、前がん性状態、がん、および腫瘍抗原の発現と関連する非がん関連適応症からなる群から選択される。
【１０８２】
がんは、血液がん、例えば、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性白血病、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ細胞性急性リンパ性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、Ｔ細胞性急性リンパ性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、毛様細胞白血病、小細胞または大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成および骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、形質芽細胞性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、ワルデンシュトロームマクログロブリン血症、または前白血病のうちの１または複数から選択されるがんでありうる。
【１０８３】
がんはまた、結腸がん、直腸がん、腎細胞癌、肝臓がん、肺非小細胞癌、小腸がん、食道がん、黒色腫、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頚部がん、皮膚または眼内悪性黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域がん、胃がん、精巣がん、子宮がん、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頚癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、小児充実性腫瘍、膀胱がん、腎または尿管がん、腎盂癌、中枢神経系（ＣＮＳ）新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮がん、扁平上皮がん、Ｔ細胞リンパ腫、環境誘導性がん、前記がんの組合せ、および前記がんの転移性病変からも選択することができる。
【１０８４】
本明細書で記載される方法または使用についての、ある特定の実施形態では、細胞を、免疫エフェクター細胞の有効性を増大させる薬剤、例えば、プロテインホスファターゼ阻害剤、キナーゼ阻害剤、サイトカイン、免疫阻害性分子の阻害剤、またはＴＲＥＧ細胞のレベルもしくは活性を低下させる薬剤のうちの１または複数と組み合わせて投与する。
【１０８５】
本明細書で記載される方法または使用についての、ある特定の実施形態では、プロテインホスファターゼ阻害剤は、ＳＨＰ−１阻害剤および／またはＳＨＰ−２阻害剤である。
【１０８６】
本明細書で記載される方法または使用についての、他の実施形態では、キナーゼ阻害剤は、ＣＤＫ４阻害剤、ＣＤＫ４／６阻害剤（例えば、パルボシクリブ）、ＢＴＫ阻害剤（例えば、イブルチニブまたはＲＮ−４８６）、ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシンまたはエベロリムス（ＲＡＤ００１））、ＭＮＫ阻害剤、またはＰ１３Ｋ／ｍＴＯＲ二重阻害剤のうちの１または複数から選択される。一実施形態では、ＢＴＫ阻害剤は、インターロイキン２誘導性キナーゼ（ＩＴＫ）のキナーゼ活性を低減しないか、またはこれを阻害しない。
【１０８７】
本明細書で記載される方法または使用についての、他の実施形態では、ＴＲＥＧ細胞のレベルまたは活性を低下させる薬剤は、シクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体、ＣＤ２５枯渇、またはこれらの組合せから選択される。
【１０８８】
他の実施形態では、阻害性分子を阻害する薬剤は、阻害性分子またはその断片を含む第１のポリペプチドと、細胞へと正のシグナルをもたらす第２のポリペプチドとを含み、この場合、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、ＣＡＲ含有免疫細胞上で発現し、ここで、（ｉ）第１のポリペプチドは、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＴＧＦベータ、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３、およびＣＥＡＣＡＭ−５、もしくはこれらの断片を含み；かつ／または（ｉｉ）第２のポリペプチドは、一次シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインおよび／もしくは共刺激性シグナル伝達ドメインを含む。一実施形態では、一次シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータの機能的ドメインを含み；かつ／または共刺激性シグナル伝達ドメインは、４１ＢＢ、ＣＤ２７、およびＣＤ２８から選択されるタンパク質の機能的ドメインを含む。
【１０８９】
他の実施形態では、サイトカインは、ＩＬ−７；ＩＬ−１５；インターロイキン１５（ＩＬ−１５）ポリペプチド、インターロイキン１５受容体アルファ（ＩＬ−１５Ｒａ）ポリペプチド、もしくはＩＬ−１５ポリペプチドおよびＩＬ−１５Ｒａポリペプチドの両方の組合せ、例えば、ｈｅｔＩＬ−１５；ＩＬ−１８；ＩＬ−２１、またはこれらの組合せを含む組成物から選択される。例示的なｈｅｔＩＬ−１５は、ＩＬ−１５と、ＩＬ−１５Ｒａとの、ヘテロ二量体による非共有結合的複合体（Ａｄｍｕｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ＬＬＣ）である。このようなｈｅｔＩＬ−１５については、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，１２４，０８４号明細書、米国特許出願公開第２０１２／０１７７５９８号明細書、米国特許出願公開第２００９／００８２２９９号明細書、米国特許出願公開第２０１２／０１４１４１３号明細書、および米国特許出願公開第２０１１／００８１３１１号明細書において記載されている。ｈｅｔＩＬ−１５については、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，１２４，０８４号明細書、米国特許出願公開第２０１２／０１７７５９８号明細書、米国特許出願公開第２００９／００８２２９９号明細書、米国特許出願公開第２０１２／０１４１４１３号明細書、および米国特許出願公開第２０１１／００８１３１１号明細書において記載されている。ｈｅｔＩＬ−１５についての、他の例示的な複数の実施形態は、ＩＬ−１５ポリペプチドと、ＩＬ−１５Ｒ（例えば、ＩＬ−１５Ｒａ）ポリペプチドとの間の共有結合的複合体である。
【１０９０】
他の実施形態では、細胞と、第２の薬剤、例えば、本明細書で開示される組合せ療法のうちのいずれか（例えば、細胞の有効性を増大させる薬剤）とを、実質的に同時に、または逐次的に投与する。
【１０９１】
他の実施形態では、細胞を、ＧＩＴＲをターゲティングし、かつ／またはＧＩＴＲ機能をモジュレートする分子と組み合わせて投与する。ある特定の実施形態では、ＧＩＴＲをターゲティングし、かつ／またはＧＩＴＲ機能をモジュレートする分子を、ＣＡＲを発現する細胞もしくは細胞集団の前、またはアフェレーシスの前に投与する。
【１０９２】
一実施形態では、リンパ球の注入、例えば、同種異系リンパ球の注入を、がんの処置において使用するが、この場合、リンパ球の注入は、少なくとも１つの細胞、例えば、本開示のＣＡＲ発現細胞を含む。一実施形態では、自家リンパ球の注入を、がんの処置において使用するが、この場合、自家リンパ球の注入は、少なくとも１つの細胞、例えば、本明細書で記載されるＣＡＲ発現細胞を含む。
【１０９３】
一実施形態では、細胞は、Ｔ細胞であり、Ｔ細胞は、ジアシルグリセロールキナーゼ（ＤＧＫ）欠損性である。一実施形態では、細胞は、Ｔ細胞であり、Ｔ細胞は、Ｉｋａｒｏｓ欠損性である。一実施形態では、細胞は、Ｔ細胞であり、Ｔ細胞は、ＤＧＫ欠損性およびＩｋａｒｏｓ欠損性の両方である。
【１０９４】
一実施形態では、方法は、本明細書で記載される、本開示の細胞を、細胞の活性を増強する薬剤と組み合わせて投与するステップを含み、この場合、薬剤は、例えば、ＩＬ−７；ＩＬ−１５；インターロイキン１５（ＩＬ−１５）ポリペプチド、インターロイキン１５受容体アルファ（ＩＬ−１５Ｒａ）ポリペプチド、もしくはＩＬ−１５ポリペプチドおよびＩＬ−１５Ｒａポリペプチドの両方の組合せ、例えば、ｈｅｔＩＬ−１５；ＩＬ−１８；ＩＬ−２１；またはこれらの組合せを含む組成物などのサイトカインである。サイトカインを、細胞の投与と組み合わせて、例えば、細胞の投与と同時に、またはこの短期間の後に送達することができる。代替的に、サイトカインを、細胞の投与の長期間の後に、例えば、細胞に対する対象の応答についての評価の後に送達することができる。一実施形態では、サイトカインを、対象へと、請求項６１から８０のいずれかに記載の細胞または細胞集団の投与と同時に投与する（例えば、同じ日に投与する）か、またはこの短期間の後に投与する（例えば、投与の、１日、２日、３日、４日、５日、６日、または７日後に投与する）。他の実施形態では、サイトカインを、対象へと、請求項６１から８０のいずれかに記載の細胞または細胞集団の投与の長期間（例えば、少なくとも２週間、３週間、４週間、６週間、８週間、１０週間、またはこれを超える）の後に、または細胞に対する対象の応答についての評価の後に投与する。
【１０９５】
他の実施形態では、ＣＡＲを発現するようにさらに操作された、本開示の細胞を、ＣＡＲ分子を発現する細胞の投与と関連する、１または複数の副作用を軽快させる薬剤と組み合わせて投与する。ＣＡＲ発現細胞と関連する副作用は、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）または血球貪食性リンパ組織球症（ＨＬＨ）から選択することができる。
【１０９６】
前記方法または使用のうちのいずれかについての、複数の実施形態では、ＣＡＲ分子を発現する細胞を、腫瘍抗原の発現と関連する疾患を処置する薬剤、例えば、本明細書で開示される第２の療法または第３の療法のうちのいずれかと組み合わせて投与する。さらなる例示的な組合せは、以下のうちの１または複数を含む。
【１０９７】
別の実施形態では、例えば、本明細書で記載される細胞は、別の薬剤、例えば、本明細書で記載される、キナーゼ阻害剤および／またはチェックポイント阻害剤と組み合わせて投与することができる。ある実施形態では、本開示の細胞は、別の薬剤、例えば、細胞の活性を増強する薬剤をさらに発現しうる。
【１０９８】
例えば、一実施形態では、細胞の活性を増強する薬剤は、阻害性分子を阻害する薬剤でありうる。
【１０９９】
一実施形態では、阻害性分子を阻害する薬剤は、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡである阻害性核酸である。
【１１００】
別の実施形態では、阻害性分子を阻害する薬剤は、例えば、本明細書で記載される分子、例えば、細胞、例えば、本明細書で記載される細胞内シグナル伝達ドメインへと、正のシグナルをもたらす第２のポリペプチドと関連する、第１のポリペプチド、例えば、阻害性分子を含む薬剤である。一実施形態では、薬剤は、例えば、阻害性分子またはその断片（例えば、これらのうちのいずれかの細胞外ドメインの少なくとも一部）の、第１のポリペプチドと、本明細書で記載される細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば共刺激性ドメイン（例えば、本明細書で記載される、例えば、４１ＢＢ、ＣＤ２７、またはＣＤ２８）、および／または一次シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書で記載される、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン）を含む）である、第２のポリペプチドとを含む。一実施形態では、薬剤は、ＰＤ１またはその断片（例えば、ＰＤ１の細胞外ドメインの少なくとも一部）の、第１のポリペプチドと、本明細書で記載される細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書で記載されるＣＤ２８シグナル伝達ドメイン、および／または本明細書で記載されるＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン）の、第２のポリペプチドとを含む。
【１１０１】
一実施形態では、本開示の細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を、前出の幹細胞移植、例えば、自家幹細胞移植を施された対象へと投与する。
【１１０２】
一実施形態では、本開示の細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を、前出の用量のメルファランを施された対象へと投与する。
【１１０３】
一実施形態では、本開示の細胞を、細胞の有効性を増大させる薬剤、例えば、本明細書で記載される薬剤と組み合わせて投与する。
【１１０４】
一実施形態では、本開示の細胞を、低免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤と組み合わせて投与する。理論に束縛されることを望まないが、低免疫増強用量（例えば、免疫系を完全に抑制するには不十分であるが、免疫機能を改善するには十分な用量）による処置は、ＰＤ−１陽性Ｔ細胞の減少、またはＰＤ−１陰性細胞の増大を伴うと考えられる。ＰＤ−１陽性Ｔ細胞は、ＰＤ−１リガンド、例えば、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２を発現する細胞との係合により消尽させることができるが、ＰＤ−１陰性Ｔ細胞は、これらにより消尽させることができない。
【１１０５】
ある実施形態では、この手法を使用して、対象における、本明細書で記載される細胞の効能を最適化することができる。理論に束縛されずに、ある実施形態では、内因性の、非修飾の免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の効能が改善されると考えられる。理論に束縛されることを望まないが、ある実施形態では、ＣＡＲ発現細胞の効能が改善されると考えられる。他の実施形態では、本開示のｇＲＮＡ分子を含むか、または含むように操作されることになる細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の数を増大させるか、またはＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の比を増大させる量のｍＴＯＲ阻害剤と接触させることにより、ｅｘ  ｖｉｖｏで処置することができる。
【１１０６】
ある実施形態では、低免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１、または触媒性阻害剤の投与を、本明細書で記載される、ＣＡＲを発現する細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の投与の前に開始する。ある実施形態では、細胞を、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞のレベル、またはＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の比が、少なくとも一過性に、増大しているように、十分な時間の後で、またはｍＴＯＲ阻害剤の十分な投与の後で投与する。
【１１０７】
ある実施形態では、本開示のｇＲＮＡを含むように操作される細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を、対象におけるＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞のレベル、もしくはＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の比、または対象から採取されたこれらが、少なくとも一過性に、増大しているように、十分な時間の後で、または低免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の十分な投与の後で採取する。
【１１０８】
一実施形態では、本開示の細胞を、細胞の投与と関連する、１または複数の副作用を軽快させる薬剤、例えば、本明細書で記載される薬剤と組み合わせて投与する。
【１１０９】
一実施形態では、細胞を、本明細書で記載されるがん関連抗原と関連する疾患を処置する薬剤、例えば、本明細書で記載される薬剤と組み合わせて投与する。
【１１１０】
一実施形態では、細胞を、本明細書で記載される用量および／または投与スケジュールで投与する。
【１１１１】
一実施形態では、対象（例えば、ヒト）に、本開示の細胞の初回投与を施し、本開示の細胞の、後続の１回または複数回の投与を施すが、この場合、後続の１回または複数回の投与を、前回の投与の１５日未満後、例えば、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、または２日後に投与する。一実施形態では、本開示の細胞の、対象（例えば、ヒト）への、毎週１回を超える投与を行う、例えば、ＣＡＲ分子を含む細胞の、毎週２、３、または４回の投与を行う。一実施形態では、対象（例えば、ヒト対象）に、本開示の細胞の、毎週１回を超える投与（例えば、毎週２、３、または４回の投与）（本明細書ではまた、サイクルとも称する）を施すのに続く週では、本開示の細胞の投与を行わず、次いで、本開示の細胞の、１回または複数回のさらなる投与（例えば、本開示の細胞の、毎週１回を超える投与）を、対象へと投与する。別の実施形態では、対象（例えば、ヒト対象）に、本開示の細胞の、１つを超えるサイクルを施し、各サイクルの間の時間は、１０、９、８、７、６、５、４、または３日間未満である。一実施形態では、本開示の細胞を、毎週３回の投与のために、隔日で投与する。一実施形態では、本開示の細胞を、少なくとも２、３、４、５、６、７、８週間、またはこれを超える期間にわたり投与する。
【１１１２】
一実施形態では、本開示の細胞を、疾患、例えば、がん、例えば、本明細書で記載されるがんのための、第１選択処置として投与する。別の実施形態では、本開示の細胞を、疾患、例えば、がん、例えば、本明細書で記載されるがんのための、第２選択処置、第３選択処置、第４選択処置として投与する。
【１１１３】
一実施形態では、本明細書で記載される細胞集団を、投与する。
【１１１４】
別の態様では、本開示は、医薬としての使用のための、本開示のｇＲＮＡをコードする単離核酸分子、本開示のｇＲＮＡ分子、および／または本開示のｇＲＮＡを含むか、もしくは、任意の時点においてこれを含んだ細胞に関する。複数の実施形態では、本開示のｇＲＮＡを含むか、または、任意の時点においてこれを含んだ細胞は、ｇＲＮＡのターゲティングドメインに相補的な配列を含む遺伝子の機能的産物の発現を、低減するか、または消滅させるように、変更されるか、または変更されることになる。
【１１１５】
別の態様では、本開示は、本明細書で記載されるがん関連抗原を発現する疾患の処置における使用のための、本開示のｇＲＮＡをコードする単離核酸分子、本開示のｇＲＮＡ分子、および／または本開示のｇＲＮＡを含むか、もしくは、任意の時点においてこれを含んだ細胞に関する。複数の実施形態では、本開示のｇＲＮＡを含むか、または、任意の時点においてこれを含んだ細胞は、ｇＲＮＡのターゲティングドメインに相補的な配列を含む遺伝子の機能的産物の発現を、低減するか、または消滅させるように、変更されるか、または変更されることになる。
【１１１６】
別の態様では、本開示は、本明細書で記載されるサイトカイン、例えば、ＩＬ−７；ＩＬ−１５；インターロイキン１５（ＩＬ−１５）ポリペプチド、インターロイキン１５受容体アルファ（ＩＬ−１５Ｒａ）ポリペプチド、もしくはＩＬ−１５ポリペプチドおよびＩＬ−１５Ｒａポリペプチドの両方の組合せ、例えば、ｈｅｔＩＬ−１５；ＩＬ−１８；ならびに／またはＩＬ−２１；ならびに／またはこれらの組合せを含む組成物と組み合わせた、医薬としての使用のための、本開示のｇＲＮＡをコードする単離核酸分子、本開示のｇＲＮＡ分子、および／または本開示のｇＲＮＡを含むか、もしくは、任意の時点においてこれを含んだ細胞に関する。別の態様では、本開示は、医薬としての使用のための、本明細書で記載されるサイトカインであって、本明細書で記載される細胞と組み合わせたサイトカインに関する。複数の実施形態では、ｇＲＮＡターゲティングドメインと相補的な配列を含む遺伝子の機能的産物の発現が低減または失効化するように、本開示のｇＲＮＡを含むか、または任意の時点でこれを含んだ細胞を、変更するか、または将来においてこれを変更する。別の態様では、本開示は、サイトカイン、例えば、ＩＬ−７；ＩＬ−１５；インターロイキン１５（ＩＬ−１５）ポリペプチド、インターロイキン１５受容体アルファ（ＩＬ−１５Ｒａ）ポリペプチド、もしくはＩＬ−１５ポリペプチドおよびＩＬ−１５Ｒａポリペプチド両方の組合せ、例えば、ｈｅｔＩＬ−１５を含む組成物；ＩＬ−１８；および／またはＩＬ−２１；および／または本明細書で記載されるこれらの組合せと組み合わせた、ｇＲＮＡをコードする単離核酸分子、ｇＲＮＡ分子、および／または医薬としての使用のためのｇＲＮＡを含むか、または任意の時点でこれを含んだ細胞に関する。別の態様では、本開示は、本明細書で記載される細胞と組み合わせた、医薬としての使用のための、本明細書で記載されるサイトカインに関する。複数の実施形態では、ｇＲＮＡターゲティングドメインと相補的な配列を含む遺伝子の機能的産物の発現が低減または失効化するように、ｇＲＮＡを含むか、または任意の時点でこれを含んだ細胞を、変更するか、または将来においてこれを変更する。
【１１１７】
別の態様では、本開示は、本明細書で記載されるキナーゼ阻害剤および／またはチェックポイント阻害剤と組み合わせた、医薬としての使用のための、本開示のｇＲＮＡをコードする単離核酸分子、本開示のｇＲＮＡ分子、および／または本開示のｇＲＮＡを含むか、もしくは、任意の時点においてこれを含んだ細胞に関する。別の態様では、本開示は、本開示のｇＲＮＡを含むか、または、任意の時点においてこれを含んだ細胞と組み合わせた、医薬としての使用のための、本明細書で記載される、キナーゼ阻害剤および／またはチェックポイント阻害剤に関する。
【１１１８】
別の態様では、本開示は、腫瘍支持抗原の発現と関連する疾患、例えば、本明細書で記載される障害を有する対象の処置における使用のための、本開示の細胞を含む組成物を特色とする。
【１１１９】
前記方法または使用のうちのいずれかでは、腫瘍支持抗原の発現と関連する疾患は、増殖性疾患、前がん性状態、がん、および腫瘍支持抗原の発現と関連する非がん関連適応症からなる群から選択される。ある実施形態では、本明細書で記載される腫瘍支持抗原と関連する疾患は、充実性腫瘍である。
【１１２０】
本明細書で記載される方法または使用についての一実施形態では、本開示の細胞を、別の薬剤と組み合わせて投与する。一実施形態では、薬剤は、キナーゼ阻害剤、例えば、ＣＤＫ４／６阻害剤、ＢＴＫ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、ＭＮＫ阻害剤、またはＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ二重阻害剤、およびこれらの組合せでありうる。一実施形態では、キナーゼ阻害剤は、ＣＤＫ４阻害剤、例えば、本明細書で記載されるＣＤＫ４阻害剤、例えば、６−アセチル−８−シクロペンチル−５−メチル−２−（５−ピペラジン−１−イル−ピリジン−２−イルアミノ）−８Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−オン、ヒドロクロリド（パルボシクリブまたはＰＤ０３３２９９１ともまた称する）など、例えば、ＣＤ４／６阻害剤である。一実施形態では、キナーゼ阻害剤は、ＢＴＫ阻害剤、例えば、イブルチニブなど、例えば、本明細書で記載されるＢＴＫ阻害剤である。一実施形態では、キナーゼ阻害剤は、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシン、ラパマイシン類似体、ＯＳＩ−０２７など、例えば、本明細書で記載されるｍＴＯＲ阻害剤である。ｍＴＯＲ阻害剤は、例えば、ｍＴＯＲＣ１阻害剤および／またはｍＴＯＲＣ２阻害剤、例えば、本明細書で記載されるｍＴＯＲＣ１阻害剤および／またはｍＴＯＲＣ２阻害剤でありうる。一実施形態では、キナーゼ阻害剤は、ＭＮＫ阻害剤、例えば、４−アミノ−５−（４−フルオロアニリノ）−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンなど、例えば、本明細書で記載されるＭＮＫ阻害剤である。ＭＮＫ阻害剤は、例えば、ＭＮＫ１ａ阻害剤、ＭＮＫ１ｂ阻害剤、ＭＮＫ２ａ阻害剤、および／またはＭＮＫ２ｂ阻害剤でありうる。ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ二重阻害剤は、例えば、ＰＦ−０４６９５１０２でありうる。
【１１２１】
本明細書で記載される方法または使用についての一実施形態では、キナーゼ阻害剤は、アロイシンＡ；フラボピリドールまたはＨＭＲ−１２７５、２−（２−クロロフェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−［（３Ｓ，４Ｒ）−３−ヒドロキシ−１−メチル−４−ピペリジニル］−４−クロメノン；クリゾチニブ（ＰＦ−０２３４１０６６；２−（２−クロロフェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−［（２Ｒ，３Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）−１−メチル−３−ピロリジニル］−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン、ヒドロクロリド（Ｐ２７６−００）；１−メチル−５−［［２−［５−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−４−ピリジニル］オキシ］−Ｎ−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−アミン（ＲＡＦ２６５）；インジスラム（Ｅ７０７０）；ロスコビチン（ＣＹＣ２０２）；パルボシクリブ（ＰＤ０３３２９９１）；ジナシクリブ（ＳＣＨ７２７９６５）；Ｎ−［５−［［（５−ｔｅｒｔ−ブチルオキサゾール−２−イル）メチル］チオ］チアゾール−２−イル］ピペリジン−４−カルボキサミド（ＢＭＳ３８７０３２）；４−［［９−クロロ−７−（２，６−ジフルオロフェニル）−５Ｈ−ピリミド［５，４−ｄ］［２］ベンザゼピン−２−イル］アミノ］−安息香酸（ＭＬＮ８０５４）；５−［３−（４，６−ジフルオロ−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イル］−Ｎ−エチル−４−メチル−３−ピリジンメタンアミン（ＡＧ−０２４３２２）；４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸Ｎ−（ピペリジン−４−イル）アミド（ＡＴ７５１９）；４−［２−メチル−１−（１−メチルエチル）−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］−Ｎ−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−２−ピリミジンアミン（ＡＺＤ５４３８）；およびＸＬ２８１（ＢＭＳ９０８６６２）から選択されるＣＤＫ４阻害剤である。
【１１２２】
本明細書で記載される方法または使用についての一実施形態では、キナーゼ阻害剤は、ＣＤＫ４阻害剤、例えば、パルボシクリブ（ＰＤ０３３２９９１）であり、パルボシクリブは、約５０ｍｇ、６０ｍｇ、７０ｍｇ、７５ｍｇ、８０ｍｇ、９０ｍｇ、１００ｍｇ、１０５ｍｇ、１１０ｍｇ、１１５ｍｇ、１２０ｍｇ、１２５ｍｇ、１３０ｍｇ、１３５ｍｇ（例えば、７５ｍｇ、１００ｍｇ、または１２５ｍｇ）の用量で、ある期間にわたり毎日、例えば、２８日間のサイクルの、１４〜２１日間にわたり毎日、または２１日間のサイクルの、７〜１２日間にわたり毎日投与される。一実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、またはこれを超えるサイクルのパルボシクリブを投与する。
【１１２３】
本明細書で記載される方法または使用についての一実施形態では、キナーゼ阻害剤は、イブルチニブ（ＰＣＩ−３２７６５）；ＧＤＣ−０８３４；ＲＮ−４８６；ＣＧＩ−５６０；ＣＧＩ−１７６４；ＨＭ−７１２２４；ＣＣ−２９２；ＯＮＯ−４０５９；ＣＮＸ−７７４；およびＬＦＭ−Ａ１３から選択されるＢＴＫ阻害剤である。一実施形態では、ＢＴＫ阻害剤は、インターロイキン２誘導性キナーゼ（ＩＴＫ）のキナーゼ活性を低減しないか、またはこれを阻害せず、ＧＤＣ−０８３４；ＲＮ−４８６；ＣＧＩ−５６０；ＣＧＩ−１７６４；ＨＭ−７１２２４；ＣＣ−２９２；ＯＮＯ−４０５９；ＣＮＸ−７７４；およびＬＦＭ−Ａ１３から選択される。
【１１２４】
本明細書で記載される方法または使用についての一実施形態では、キナーゼ阻害剤は、ＢＴＫ阻害剤、例えば、イブルチニブ（ＰＣＩ−３２７６５）であり、イブルチニブは、約２５０ｍｇ、３００ｍｇ、３５０ｍｇ、４００ｍｇ、４２０ｍｇ、４４０ｍｇ、４６０ｍｇ、４８０ｍｇ、５００ｍｇ、５２０ｍｇ、５４０ｍｇ、５６０ｍｇ、５８０ｍｇ、６００ｍｇ（例えば、２５０ｍｇ、４２０ｍｇ、または５６０ｍｇ）の用量で、ある期間にわたり毎日、例えば、２１日間のサイクルにわたり毎日、または２８日間のサイクルにわたり毎日投与される。一実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、またはこれを超えるサイクルのイブルチニブを投与する。
【１１２５】
本明細書で記載される方法または使用についての一実施形態では、キナーゼ阻害剤は、ＩＴＫのキナーゼ活性を阻害しないＢＴＫ阻害剤、例えば、ＲＮ−４８６であり、ＲＮ−４８６は、約１００ｍｇ、１１０ｍｇ、１２０ｍｇ、１３０ｍｇ、１４０ｍｇ、１５０ｍｇ、１６０ｍｇ、１７０ｍｇ、１８０ｍｇ、１９０ｍｇ、２００ｍｇ、２１０ｍｇ、２２０ｍｇ、２３０ｍｇ、２４０ｍｇ、２５０ｍｇ（例えば、１５０ｍｇ、２００ｍｇ、または２５０ｍｇ）の用量で、ある期間にわたり毎日、例えば、２８日間のサイクルにわたり毎日投与される。一実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、またはこれを超えるサイクルのＲＮ−４８６を投与する。
【１１２６】
本明細書で記載される方法または使用についての一実施形態では、キナーゼ阻害剤は、テムシロリムス；ＡＰ２３５７３およびＭＫ８６６９としてもまた公知のリダホロリムス（１Ｒ，２Ｒ，４Ｓ）−４−［（２Ｒ）−２［（１Ｒ，９Ｓ，１２Ｓ，１５Ｒ，１６Ｅ，１８Ｒ，１９Ｒ，２１Ｒ、２３Ｓ，２４Ｅ，２６Ｅ，２８Ｚ，３０Ｓ，３２Ｓ，３５Ｒ）−１，１８−ジヒドロキシ−１９，３０−ジメトキシ−１５，１７，２１，２３、２９，３５−ヘキサメチル−２，３，１０，１４，２０−ペンタオキソ−１１，３６−ジオキサ−４−アザトリシクロ［３０．３．１．０４，９］ヘキサトリアコンタ−１６，２４，２６，２８−テトラエン−１２−イル］プロピル］−２−メトキシシクロヘキシルジメチルホスフィネート；エベロリムス（ＲＡＤ００１）；ラパマイシン（ＡＹ２２９８９）；シマピモド；（５−｛２，４−ビス［（３Ｓ）−３−メチルモルホリン−４−イル］ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル｝−２−メトキシフェニル）メタノール（ＡＺＤ８０５５）；２−アミノ−８−［ｔｒａｎｓ−４−（２−ヒドロキシエトキシ）シクロヘキシル］−６−（６−メトキシ−３−ピリジニル）−４−メチル−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−オン（ＰＦ０４６９１５０２）；およびＮ２−［１，４−ジオキソ−４−［［４−（４−オキソ−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−２−イル）モルホリニウム−４−イル］メトキシ］ブチル］−Ｌ−アルギニルグリシル−Ｌ−α−アスパルチル−Ｌ−セリン（配列番号１０５５６）、内塩（ＳＦ１１２６）；およびＸＬ７６５から選択されるｍＴＯＲ阻害剤である。
【１１２７】
本明細書で記載される方法または使用についての一実施形態では、キナーゼ阻害剤は、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンであり、ラパマイシンは、約３ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、６ｍｇ、７ｍｇ、８ｍｇ、９ｍｇ、１０ｍｇ（例えば、６ｍｇ）の用量で、ある期間にわたり毎日、例えば、２１日間のサイクルにわたり毎日、または２８日間のサイクルにわたり毎日投与される。一実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、またはこれを超えるサイクルのラパマイシンを投与する。一実施形態では、キナーゼ阻害剤は、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、エベロリムスであり、エベロリムスは、約２ｍｇ、２．５ｍｇ、３ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、６ｍｇ、７ｍｇ、８ｍｇ、９ｍｇ、１０ｍｇ、１１ｍｇ、１２ｍｇ、１３ｍｇ、１４ｍｇ、１５ｍｇ（例えば、１０ｍｇ）の用量で、ある期間にわたり毎日、例えば、２８日間のサイクルにわたり毎日投与される。一実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、またはこれを超えるサイクルのエベロリムスを投与する。
【１１２８】
本明細書で記載される方法または使用についての一実施形態では、キナーゼ阻害剤は、ＣＧＰ０５２０８８；４−アミノ−３−（ｐ−フルオロフェニルアミノ）−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン（ＣＧＰ５７３８０）；セロコスポラミド；ＥＴＣ−１７８０４４５−２；および４−アミノ−５−（４−フルオロアニリノ）−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンから選択されるＭＮＫ阻害剤である。
【１１２９】
本明細書で記載される方法または使用についての一実施形態では、キナーゼ阻害剤は、２−アミノ−８−［ｔｒａｎｓ−４−（２−ヒドロキシエトキシ）シクロヘキシル］−６−（６−メトキシ−３−ピリジニル）−４−メチル−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−オン（ＰＦ−０４６９１５０２）；Ｎ−［４−［［４−（ジメチルアミノ）−１−ピペリジニル］カルボニル］フェニル］−Ｎ’−［４−（４，６−ジ−４−モルホリニル−１，３，５−トリアジン−２−イル）フェニル］尿素（ＰＦ−０５２１２３８４ＰＫＩ−５８７）；２−メチル−２−｛４−［３−メチル−２−オキソ−８−（キノリン−３−イル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］フェニル｝プロパンニトリル（ＢＥＺ−２３５）；アピトリシブ（ＧＤＣ−０９８０、ＲＧ７４２２）；２，４−ジフルオロ−Ｎ−｛２−（メチルオキシ）−５−［４−（４−ピリダジニル）−６−キノリニル］−３−ピリジニル｝ベンゼンスルホンアミド（ＧＳＫ２１２６４５８）；８−（６−メトキシピリジン−３−イル）−３−メチル−１−（４−（ピペラジン−１−イル）−３−（トリフルオロメチル）フェニル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２（３Ｈ）−オン  マレイン酸塩（ＮＶＰ−ＢＧＴ２２６）；３−［４−（４−モルホリニルピリド［３’，２’：４，５］フロ［３，２−ｄ］ピリミジン−２−イル］フェノール（ＰＩ−１０３）；５−（９−イソプロピル−８−メチル−２−モルホリノ−９Ｈ−プリン−６−イル）ピリミジン−２−アミン（ＶＳ−５５８４、ＳＢ２３４３）；およびＮ−［２−［（３，５−ジメトキシフェニル）アミノ］キノキサリン−３−イル］−４−［（４−メチル−３−メトキシフェニル）カルボニル］アミノフェニルスルホンアミド（ＸＬ７６５）から選択される、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）／ｍＴＯＲ二重阻害剤である。
【１１３０】
本明細書で記載される方法または使用についての一実施形態では、本明細書で記載される、ＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞を、対象へと、プロテインチロシンホスファターゼ阻害剤、例えば、本明細書で記載される、プロテインチロシンホスファターゼ阻害剤と組み合わせて投与する。一実施形態では、プロテインチロシンホスファターゼ阻害剤は、ＳＨＰ−１阻害剤、例えば、スチボグルコン酸ナトリウムなど、例えば、本明細書で記載されるＳＨＰ−１阻害剤である。一実施形態では、プロテインチロシンホスファターゼ阻害剤は、ＳＨＰ−２阻害剤である。
【１１３１】
本明細書で記載される方法または使用についての一実施形態では、本開示の細胞を、別の薬剤と組み合わせて投与し、薬剤は、サイトカインである。サイトカインは、例えば、ＩＬ−７；ＩＬ−１５；インターロイキン１５（ＩＬ−１５）ポリペプチド、インターロイキン１５受容体アルファ（ＩＬ−１５Ｒａ）ポリペプチド、もしくはＩＬ−１５ポリペプチドおよびＩＬ−１５Ｒａポリペプチドの両方の組合せ、例えば、ｈｅｔＩＬ−１５；ＩＬ−１８；ＩＬ−２１；またはこれらの組合せを含む組成物でありうる。別の実施形態では、本開示の細胞を、チェックポイント阻害剤、例えば、本明細書で記載されるチェックポイント阻害剤と組み合わせて投与する。例えば、一実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３、および／またはＣＥＡＣＡＭ−５）、ＬＡＧ−３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、およびＴＧＦベータから選択される阻害性分子を阻害する。
【１１３２】
一態様では、本開示は、対象、例えば、本明細書で記載された状態を有する対象を、例えば、本明細書で記載される細胞、例えば、例えば、ゲノムへと、本明細書で記載されるｇＲＮＡ分子、例えば、表１または表２に列挙されたターゲティングドメインを含むｇＲＮＡ分子の標的配列における、またはこの近傍における部位に、安定的に組み込まれるＣＡＲ（例えば、本明細書で記載される）をコードする異種核酸配列を有する細胞で処置する方法を提供する。
【１１３３】
前述の複数の態様および複数の実施形態のうちのいずれかを含む、本開示の複数の実施形態および複数の態様のうちのいずれかでは、細胞集団を、例えば、製造時に、特定のサブセットまたは亜集団、例えば、Ｔ細胞、例えば、ステムセルメモリー様Ｔ細胞について濃縮することができる。
【１１３４】
別の態様では、対象を処置する方法、例えば、対象における過剰増殖性状態または過剰増殖性障害（例えば、がん）、例えば、充実性腫瘍、軟部組織腫瘍、または転移性病変を低減するか、または軽快させる方法が提供される。本明細書で使用される「がん」という用語は、組織病理学型または浸潤性の段階に関わらず、全ての種類のがん性成長または発がん性過程、転移性組織または悪性形質転換された細胞、組織、もしくは臓器を含むことを意図する。充実性腫瘍の例は、肝臓、肺、乳腺、リンパ系、消化管（例えば、結腸）、非尿生殖路（例えば、腎細胞、尿路上皮細胞）、前立腺、および咽頭に影響を及ぼす悪性腫瘍など、多様な臓器系の悪性腫瘍、例えば、肉腫、腺癌、および癌腫を含む。腺癌は、大半の結腸がん、直腸がん、腎細胞癌、肝臓がん、肺非小細胞癌、小腸がん、および食道がんなどの悪性腫瘍を含む。一実施形態では、がんは、黒色腫、例えば、進行期黒色腫である。本開示の方法および組成物を使用して、前述のがんの転移性病変もまた、処置または防止することができる。処置されうる他のがんの例は、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頚部がん、皮膚または眼内悪性黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域がん、胃がん、精巣がん、子宮がん、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頚癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道がん、小腸がん、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病を含む、慢性白血病または急性白血病、小児性充実性腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱がん、腎または尿管がん、腎盂癌、中枢神経系（ＣＮＳ）新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮がん、扁平上皮がん、Ｔ細胞リンパ腫、アスベストにより誘導される環境誘導性がんを含む環境誘導性がん、および前記がんの組合せを含む。転移性がん、例えば、ＰＤ−Ｌ１を発現する転移性がんの処置（Iwai et al. (2005) Int. Immunol. 17:133-144）も、本明細書で記載される抗体分子を使用して行うことができる。
【１１３５】
それらの成長が阻害されうる例示的ながんは、典型的に、免疫療法に対して応答性のがんを含む。処置のためのがんの非限定的な例は、黒色腫（例えば、転移性悪性黒色腫）、腎臓がん（例えば、明細胞癌）、前立腺がん（例えば、ホルモン不応性前立腺癌）、乳がん、結腸がん、および肺がん（例えば、非小型細胞肺がん）を含む。加えて、不応性悪性腫瘍または再発性悪性腫瘍も、本明細書で記載される分子を使用して処置することができる。
【１１３６】
一態様では、本開示は、対象におけるがんを処置する方法に関する。一態様では、本明細書で記載されるがん関連抗原の発現と関連するがんは、血液がんである。一態様では、血液がんは、白血病またはリンパ腫である。一態様では、本明細書で記載されるがん関連抗原の発現と関連するがんは、例えば、Ｂ細胞性急性リンパ性白血病（「ＢＡＬＬ」）、Ｔ細胞性急性リンパ性白血病（「ＴＡＬＬ」）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）を含むがこれらに限定されない、例えば、１または複数の急性白血病；例えば、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を含むがこれらに限定されない、１または複数の慢性白血病を含むがこれらに限定されない、がんおよび悪性腫瘍を含む。本明細書で記載されるがん関連抗原の発現と関連する、さらなるがんまたは血液学的状態は、例えば、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、有毛細胞白血病、小細胞または大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成および骨髄異形成性症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽細胞リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、ワルデンシュトロームマクログロブリン血症、ならびに骨髄系血液細胞の無効な産生（または異形成）により統一される血液学的状態の多様なコレクションである「前白血病」などを含むがこれらに限定されない。さらに、本明細書で記載されるがん関連抗原の発現と関連する、疾患は、例えば、本明細書で記載されるがん関連抗原の発現と関連する、非定型がんおよび／もしくは非古典がん、悪性腫瘍、前がん性状態、または増殖性疾患を含むがこれらに限定されない。
【１１３７】
一部の実施形態では、処置されうるがんは、多発性骨髄腫である。一般に、骨髄腫細胞は、フローサイトメトリーにより、本明細書で記載されるがん関連抗原の発現について陰性であると考えられる。したがって、一部の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲ、例えば、本明細書で記載されるＣＤ１９  ＣＡＲまたはＢＣＭＡ  ＣＡＲを発現するように、さらに操作された細胞を使用して、骨髄腫細胞をターゲティングすることができる。一部の実施形態では、本開示のＣＡＲ療法を、１または複数のさらなる療法、例えば、レナリドマイド処置と組み合わせて使用することができる。
【１１３８】
多様な態様では、患者へと投与された、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）、またはそれらの子孫細胞は、患者へのＴ細胞またはＮＫ細胞の投与の後、少なくとも４カ月間、５カ月間、６カ月間、７カ月間、８カ月間、９カ月間、１０カ月間、１１カ月間、１２カ月間、１３カ月間、１４カ月間、１５カ月間、１６カ月間、１７カ月間、１８カ月間、１９カ月間、２０カ月間、２１カ月間、２２カ月間、２３カ月間、２年間、３年間、４年間、または５年間にわたり、患者に残留する。
【１１３９】
本開示はまた、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写されたＲＮＡによりさらに修飾して、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を一過性に発現させ、ＣＡＲ  Ｔ細胞またはＮＫ細胞を、それを必要とするレシピエントへと注入する種類の細胞療法も含む。注入された細胞は、レシピエント内の腫瘍細胞を殺滅させることが可能である。したがって、多様な態様では、患者へと投与された免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を、患者へと投与した後で、１カ月間未満、例えば、３週間、２週間、１週間にわたり存在する。
【１１４０】
いかなる特定の理論にも束縛されることを望まずに、ＣＡＲ改変免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）により誘発される抗腫瘍免疫応答は、能動的免疫応答の場合もあり、受動的免疫応答の場合もあり、代替的に、間接的免疫応答対直接的免疫応答に起因する場合もある。一態様では、ＣＡＲを形質導入された免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）は、本明細書で記載されるがん関連抗原を発現するヒトがん細胞に応答して、特異的な炎症促進性サイトカインの分泌および強力な細胞溶解活性を呈示し、可溶性の、本明細書で記載されるがん関連抗原による阻害に抵抗し、バイスタンダー殺滅を媒介し、確立されたヒト腫瘍の退縮を媒介する。例えば、本明細書で記載されるがん関連抗原を発現する腫瘍の不均質場内の無抗原腫瘍細胞は、本明細書で記載されるがん関連抗原によりリダイレクトされた免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）であって、隣接する抗原陽性がん細胞に対して既に反応している免疫エフェクター細胞による間接的破壊（例えば、前駆細胞の破壊）を受けやすい場合がある。
【１１４１】
当技術分野では、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける手順が周知であり、下記でより完全に論じられる。略述すると、細胞を、哺乳動物（例えば、ヒト）から単離し、本開示のｇＲＮＡ分子と、任意選択で、本明細書で開示されるＣＡＲを発現するベクターとで遺伝子改変する（すなわち、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、形質導入またはトランスフェクトする）。改変細胞は、治療的有益性をもたらすように、哺乳動物レシピエントへと投与することができる。哺乳動物レシピエントは、ヒトであることが可能であり、細胞は、レシピエントに対して自家でありうる。代替的に、細胞は、レシピエントに対して同種異系でもありうる。
【１１４２】
造血幹細胞および造血始原細胞の、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける拡大のための手順については、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，１９９，９４２号明細書において記載されており、本開示の細胞にも適用することができる。当技術分野では、他の適する方法も公知であり、したがって、本開示は、いかなる特定のｅｘ  ｖｉｖｏ細胞拡大法にも限定されない。略述すると、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）の、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける培養および拡大は、（１）哺乳動物に由来するＣＤ３４＋造血幹細胞および造血始原細胞を、末梢血採取物または骨髄外植体から回収することと；（２）このような細胞を、ｅｘ  ｖｉｖｏで拡大することとを含む。細胞を培養および拡大するためには、米国特許第５，１９９，９４２号明細書に記載されている細胞成長因子に加えて、ｆｌｔ３−Ｌ、ＩＬ−１、ＩＬ−３、およびｃ−ｋｉｔのリガンドなど、他の因子も使用することができる。
【１１４３】
免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞を、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて拡大するための手順については、例えば、それらの内容が、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１５／１４２６７５号パンフレットにおいて記載されている。このような手順は、本明細書で記載される方法と共に使用する場合に有用である。
【１１４４】
ｅｘ  ｖｉｖｏにおける免疫化との関係で、細胞ベースのワクチンを使用することに加えて、本開示はまた、患者における抗原に対して方向付けられた免疫応答を誘発する、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける免疫化のための組成物および方法も提供する。
【１１４５】
一般に、本明細書で記載される通りに活性化させ、拡大した細胞は、免疫障害性の個体において生じる疾患の処置および防止において活用することができる。特に、本開示のＣＡＲ改変免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を、本明細書で記載されるがん関連抗原の発現と関連する疾患、障害、および状態の処置に使用する。ある特定の態様では、本開示の細胞を、本明細書で記載されるがん関連抗原の発現と関連する疾患、障害、および状態を発症する危険性がある患者の処置に使用する。したがって、本開示は、本明細書で記載されるがん関連抗原の発現と関連する疾患、障害、および状態を処置または防止するための方法であって、それを必要とする対象へと、治療有効量の、本開示のＣＡＲ改変免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を投与するステップを含む方法を提供する。
【１１４６】
一態様では、ＣＡＲを発現するようにさらに操作された細胞を含む、本開示の細胞を使用して、がんもしくは悪性腫瘍、または骨髄異形成、骨髄異形成症候群、または前白血病などの前がん性状態などの増殖性疾患を処置することができる。本明細書で記載されるがん関連抗原の発現と関連する、さらなる疾患は、例えば、本明細書で記載されるがん関連抗原を発現する、非定型がんおよび／もしくは非古典がん、悪性腫瘍、前がん性状態、または増殖性疾患を含むがこれらに限定されない。本明細書で記載されるがん関連抗原の発現と関連する非がん関連適応症は、例えば、自己免疫疾患（例えば、ループス）、炎症性障害（アレルギーおよび喘息）、および移植を含むがこれらに限定されない。
【１１４７】
本発明の細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）は、単独で投与することもでき、希釈剤および／あるいはＩＬ−２もしくは他のサイトカイン、または細胞集団など、他の成分と組み合わせた医薬組成物として投与することもできる。
【１１４８】
血液がん
血液がん状態とは、血液、骨髄、およびリンパ系に影響を及ぼす、白血病、リンパ腫、および悪性リンパ増殖性状態などの種類のがんである。
【１１４９】
白血病は、急性白血病および慢性白血病として分類することができる。急性白血病は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）として、さらに分類することができる。慢性白血病は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）および慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を含む。他の類縁の状態は、骨髄系血液細胞の無効な産生（または異形成）と、ＡＭＬへと形質転換する危険性とにより統一される、血液学的状態の多様なコレクションである骨髄異形成症候群（ＭＤＳ；「前白血病」の旧称で公知であった）を含む。
【１１５０】
リンパ腫とは、リンパ球から発生する血液細胞腫瘍の群である。例示的なリンパ腫は、非ホジキンリンパ腫およびホジキンリンパ腫を含む。
【１１５１】
本開示はまた、本明細書で記載されるがん関連抗原を発現する細胞集団の増殖を阻害または低減するための方法であって、本明細書で記載されるがん関連抗原を発現する細胞を含む細胞集団を、本明細書で記載されるがん関連抗原を発現する細胞に結合するＣＡＲを発現するようにさらに操作された、本開示の細胞（例えば、ＮＫ細胞またはＴ細胞）と接触させるステップを含む方法も提供する。具体的な態様では、本開示は、本明細書で記載されるがん関連抗原を発現する、がん細胞の集団の増殖を阻害または低減するための方法であって、本明細書で記載されるがん関連抗原を発現するがん細胞集団を、本明細書で記載されるがん関連抗原を発現する細胞に結合するＣＡＲを発現するようにさらに操作された、本開示のＴ細胞またはＮＫ細胞と接触させるステップを含む方法を提供する。一態様では、本開示は、本明細書で記載されるがん関連抗原を発現するがん細胞の増殖を阻害するか、またはこれらの集団を低減する方法であって、本明細書で記載されるがん関連抗原を発現するがん細胞集団を、本明細書で記載されるがん関連抗原を発現する細胞に結合するＣＡＲを発現するようにさらに操作された、本開示のＴ細胞またはＮＫ細胞と接触させるステップを含む方法を提供する。ある特定の態様では、本開示のＴ細胞またはＮＫ細胞は、骨髄性白血病、または本明細書で記載されるがん関連抗原を発現する細胞と関連する別のがんを伴う対象、またはこれらについての動物モデルにおいて、細胞および／またはがん細胞の、数量、数、量、または百分率を、陰性対照と比べて、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６５％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％低減する。一態様では、対象は、ヒトである。
【１１５２】
本開示はまた、本明細書で記載されるがん関連抗原を発現する細胞と関連する疾患（例えば、本明細書で記載されるがん関連抗原を発現する、血液がんまたは非定型がん）を防止、処置、および／または管理するための方法であって、それを必要とする対象へと、本明細書で記載されるがん関連抗原を発現する細胞に結合するＣＡＲを発現するようにさらに操作されたＴ細胞またはＮＫ細胞を含む、本開示のＴ細胞またはＮＫ細胞を投与するステップを含む方法も提供する。一態様では、対象は、ヒトである。本明細書で記載されるがん関連抗原を発現する細胞と関連する障害の非限定的な例は、自己免疫障害（ループスなど）、炎症性障害（アレルギーおよび喘息など）、およびがん（本明細書で記載されるがん関連抗原を発現する血液がんまたは非定型がんなど）を含む。
【１１５３】
本開示はまた、本明細書で記載されるがん関連抗原を発現する細胞と関連する疾患を防止、処置、および／または管理するための方法であって、それを必要とする対象へと、本明細書で記載されるがん関連抗原を発現する細胞に結合するＣＡＲを発現するようにさらに操作されたＴ細胞またはＮＫ細胞を含む、本開示のＴ細胞またはＮＫ細胞を投与するステップを含む方法も提供する。一態様では、対象は、ヒトである。
【１１５４】
本発明は、本明細書で記載されるがん関連抗原を発現する細胞と関連するがんの再発を防止するための方法であって、それを必要とする対象へと、本明細書で記載されるがん関連抗原を発現する細胞に結合するＣＡＲを発現するようにさらに操作されたＴ細胞またはＮＫ細胞を含む、本発明のＴ細胞またはＮＫ細胞を投与するステップを含む方法を提供する。一態様では、方法は、有効量の別の治療と組み合わせた細胞を投与するステップを含む。
【１１５５】
医薬組成物および処置
本明細書で開示される医薬組成物は、１または複数の、薬学的または生理学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせた細胞、例えば、本明細書で記載される複数の細胞を含みうる。このような組成物は、中性緩衝生理食塩液、リン酸緩衝生理食塩液などの緩衝液；グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールなどの炭水化物；タンパク質；ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸；抗酸化剤；ＥＤＴＡまたはグルタチオンなどのキレート剤；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；および保存剤を含みうる。一態様では、本開示の組成物を、静脈内投与のために製剤化する。
【１１５６】
本明細書で開示される医薬組成物は、１または複数の、薬学的または生理学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせた、本明細書で開示される核酸、例えば、ｇＲＮＡまたはベクターを含みうる。
【１１５７】
本開示の医薬組成物は、処置される（または防止される）疾患に適切な様態で投与することができる。投与の数量および頻度は、患者の状態、ならびに患者の疾患の種類および重症度などの因子により決定されるが、適切な投与量は、臨床試験により決定することができる。
【１１５８】
一実施形態では、医薬組成物は、例えば、内毒素、マイコプラズマ、複製コンピテントのレンチウイルス（ＲＣＬ）、ｐ２４、ＶＳＶ−Ｇ核酸、ＨＩＶ  ｇａｇ、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８コーティングビーズの残留物、マウス抗体、プールされたヒト血清、ウシ血清アルブミン、ウシ血清、培養培地の成分、ベクターパッケージング細胞またはプラスミドの構成要素、細菌、および真菌からなる群から選択される、検出可能レベルの汚染物質を実質的に含まない、例えば、これらが存在しない。一実施形態では、細菌は、アルカリゲネス・フェカリス（Alcaligenes faecalis）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、大腸菌（Escherichia coli）、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae（Haemophilus influenza））、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis（Neisseria meningitides））、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae（Streptococcus pneumonia））、およびＡ群溶血連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）からなる群から選択される、少なくとも１つである。
【１１５９】
「免疫有効量」、「抗腫瘍有効量」、「腫瘍阻害有効量」、または「治療量」を表示する場合、投与される本開示の組成物の正確な量は、医師が、患者（対象）の年齢、体重、腫瘍サイズ、感染または転移の広がり、および状態の個別の差違を考慮することにより決定することができる。一般に、本明細書で記載される免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を含む医薬組成物は、体重１ｋｇ当たりの細胞１０４〜１０９個、一部の場合、体重１ｋｇ当たりの細胞１０５〜１０６個の投与量であって、これらの範囲内の全ての整数値を含む投与量で投与しうると言明することができる。Ｔ細胞組成物はまた、これらの投与量で、複数回にわたり投与することもできる。細胞は、免疫療法において一般に公知の注入法を使用することにより投与することができる（例えば、Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988を参照されたい）。
【１１６０】
ある特定の態様では、活性化免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を、対象へと投与し、次いで、その後、血液を再採取し（またはアフェレーシスを実施し）、これに由来する免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を、本開示に従い活性化させ、活性化させ、拡大したこれらの免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を、患者に再注入することが所望されうる。この工程は、数週間ごとに、複数回にわたり実行することができる。ある特定の態様では、１０ｃｃ〜４００ｃｃの血液採取物に由来する免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を活性化させることができる。ある特定の態様では、２０ｃｃ、３０ｃｃ、４０ｃｃ、５０ｃｃ、６０ｃｃ、７０ｃｃ、８０ｃｃ、９０ｃｃ、または１００ｃｃの血液採取物に由来する免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を活性化させる。
【１１６１】
対象組成物の投与は、エアゾール吸入、注射、内服、輸液、植込み、または移植を含む、任意の簡便な様態で実行することができる。本明細書で記載される組成物は、患者へと、経動脈投与、皮下投与、皮内投与、腫瘍内投与、リンパ節内投与、髄内投与、筋内投与、静脈内（ｉ．ｖ．）注射、または腹腔内投与することができる。一態様では、本開示のＴ細胞組成物を、患者へと、皮内注射または皮下注射により投与する。一態様では、本開示のＴ細胞組成物を、ｉ．ｖ．注射により投与する。免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）の組成物は、腫瘍、リンパ節、または感染部位へと、直接注射することができる。
【１１６２】
特定の例示的な態様では、対象は、目的の細胞、例えば、Ｔ細胞を、選択および／または単離するように、白血球を、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、回収するか、濃縮するか、または枯渇させる白血球アフェレーシスを経ることができる。これらのＴ細胞単離物を、当技術分野で公知の方法により拡大し、本明細書で記載される通りに処置し、これにより、本開示のＴ細胞を創出することができる。その後、それを必要とする対象は、高用量化学療法に続く、末梢血幹細胞移植による標準的な処置を経ることができる。ある特定の態様では、移植の後、またはこれと共時的に、対象に、拡大された本開示のＴ細胞の注入を施す。さらなる態様では、拡大された細胞は、手術の前に、またはこの後で投与する。
【１１６３】
患者へと投与される上記の処置の投与量は、処置される状態および処置のレシピエントの正確な性質と共に変動するであろう。ヒト投与のための投与量のスケーリングは、当技術分野で許容される慣例に従い実施することができる。ＣＡＭＰＡＴＨの用量は、例えば、一般に、成人患者で、１〜約１００ｍｇの範囲内となり、通例、１〜３０日間の間の期間にわたり毎日投与されるであろう。好ましい１日の用量は、毎日１〜１０ｍｇであるが、一部の場合では、毎日４０ｍｇまでのより高い用量も使用することができる（米国特許第６，１２０，７６６号明細書において記載されている）。
【１１６４】
一態様では、レンチウイルスなどのレンチウイルスウイルスベクターを使用して、本開示のＣＡＲ発現細胞を作出する。このようにして作出された細胞、例えば、ＣＡＲＴは、ＣＡＲを、安定的に発現するであろう。
【１１６５】
一態様では、ガンマレトロウイルスベクター、例えば、本明細書で記載されるガンマレトロウイルスベクターなどのウイルスベクターを使用して、ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲＴを作出する。これらのベクターを使用して作出されたＣＡＲＴは、ＣＡＲを、安定的に発現することができる。
【１１６６】
一態様では、ＣＡＲＴは、形質導入後４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５日間にわたり、ＣＡＲベクターを一過性に発現する。ＣＡＲの一過性発現は、ＲＮＡ  ＣＡＲベクターの送達により行うことができる。一態様では、ＣＡＲ  ＲＮＡを、Ｔ細胞へと、電気穿孔により形質導入する。
【１１６７】
ＣＡＲを一過性に発現する免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）（特に、ＣＡＲＴを保有するマウスｓｃＦｖを伴う）を使用して処置される患者において生じうる潜在的な問題は、複数回にわたる処置後におけるアナフィラキシーである。
【１１６８】
この理論に束縛されずに、このようなアナフィラキシー応答は、体液性抗ＣＡＲ応答、すなわち、抗ＩｇＥアイソタイプを有する抗ＣＡＲ抗体を発生させる患者により引き起こされうると考えられる。患者の抗体産生細胞は、抗原への曝露に、１０〜１４日間にわたる間断が生じると、ＩｇＧアイソタイプ（アナフィラキシーを引き起こさない）から、ＩｇＥアイソタイプへのクラススイッチを経ると考えられる。
【１１６９】
患者が、一過性ＣＡＲ療法の過程において、抗ＣＡＲ抗体応答（ＲＮＡの形質導入などにより発生する抗ＣＡＲ抗体応答など）を発生させる危険性が高い場合、ＣＡＲＴ注入の間断は、１０〜１４日間を超えて持続しないものとする。
【１１７０】
修飾ＣＡＲ発現細胞を作製する方法
ある実施形態では、本開示は、細胞（例えば、免疫エフェクター細胞またはその集団）を作製する方法であって、細胞へと、ＴＥＴ２イントロンに対する（例えば、表３の配列内の配列に対する）ｇＲＮＡ分子、例えば、表１または表２に列挙されたターゲティングドメインを含むｇＲＮＡ分子を導入するステップ（例えば、形質導入するステップ）と、前記細胞へと、ＣＡＲ（例えば、本明細書で記載される）をコードする配列を含む鋳型核酸を導入するステップとを含む方法に関する。複数の実施形態では、ＣＡＲをコードする配列は、ゲノムへと、ｇＲＮＡ分子の標的配列に、またはこの近傍に組み込まれる。複数の実施形態では、前記部位に、またはこの近傍に組み込まれた異種核酸配列は、レンチウイルスベクターのエレメントを含まない（例えば、ｃＰＰＴエレメントまたはＣＰＴエレメントを含まない）。
【１１７１】
別の態様では、本開示は、細胞（例えば、免疫エフェクター細胞またはその集団）を作製する方法であって、細胞、例えば、本明細書で記載されるＴ細胞またはＮＫ細胞へと、例えば、本明細書で記載されるＣＡＲをコードする核酸を含むベクター；またはＣＡＲ分子、例えば、本明細書で記載されるＣＡＲをコードする核酸を導入するステップ（例えば、形質導入するステップ）を含む方法に関する。
【１１７２】
方法における細胞は、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞、またはこれらの組合せ）である。一部の実施形態では、方法における細胞は、ジアシルグリセロールキナーゼ（ＤＧＫ）および／またはＩｋａｒｏｓを欠損するものである。
【１１７３】
一部の実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸分子を導入するステップは、ＣＡＲをコードする核酸分子を含むベクターを形質導入すること、またはＣＡＲをコードする核酸分子をトランスフェクトすることを含み、この場合、核酸分子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写されたＲＮＡである。
【１１７４】
一部の実施形態では、方法は、
免疫エフェクター細胞の集団（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）を用意するステップと；
Ｔ調節性細胞を、集団から除去し、これにより、Ｔ調節性枯渇細胞集団を用意するステップと；
をさらに含み、
この場合、ステップａ）およびｂ）は、ＣＡＲをコードする核酸および／またはＣＲＩＳＰＲ系を集団に導入する前に実施される。
【１１７５】
方法についての複数の実施形態では、Ｔ調節性細胞は、ＣＤ２５＋  Ｔ細胞を含み、抗ＣＤ２５抗体またはその断片を使用して、細胞集団から除去される。抗ＣＤ２５抗体またはその断片は、基質、例えば、ビーズへとコンジュゲートさせることができる。
【１１７６】
他の実施形態では、ステップ（ｂ）により用意されるＴ調節性枯渇細胞集団は、ＣＤ２５＋細胞のうちの、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満を含有する。
【１１７７】
さらに他の実施形態では、方法は、ＣＡＲをコードする核酸を、集団へと導入する前に、ＣＤ２５を含まない腫瘍抗原を発現する集団から細胞を除去して、Ｔ調節性枯渇および腫瘍抗原枯渇細胞集団を用意するステップをさらに含む。腫瘍抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ２０、ＣＤ１４、もしくはＣＤ１１ｂ、またはこれらの組合せから選択することができる。
【１１７８】
他の実施形態では、方法は、ＣＡＲをコードする核酸またはＣＲＩＳＰＲ系を、集団へと導入する前に、チェックポイント阻害剤を発現する集団から、細胞を除去して、Ｔ調節性枯渇および阻害性分子枯渇細胞集団を用意するステップをさらに含む。チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ３、Ｂ７−Ｈ１、ＣＤ１６０、Ｐ１Ｈ、２Ｂ４、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３、および／またはＣＥＡＣＡＭ−５）、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、およびＬＡＩＲ１から選択することができる。
【１１７９】
本明細書で開示される、さらなる複数の実施形態は、免疫エフェクター細胞の集団を用意するステップを包摂する。用意される免疫エフェクター細胞の集団は、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＡ、および／またはＣＤ４５ＲＯのうちの１または複数の発現に基づき選択することができる。ある特定の実施形態では、用意される免疫エフェクター細胞の集団は、ＣＤ３＋および／またはＣＤ２８＋である。
【１１８０】
方法についてのある特定の実施形態では、方法は、ＣＡＲをコードする核酸分子を導入した後で、細胞集団を拡大するステップをさらに含む。
【１１８１】
複数の実施形態では、細胞集団を、８日間またはこれ未満の期間にわたり拡大する。
【１１８２】
ある特定の実施形態では、細胞集団は、培養物中で、５日間にわたり拡大され、結果として得られる細胞は、同じ培養条件下の培養物中で９日間にわたり拡大された同じ細胞より強力である。
【１１８３】
他の実施形態では、細胞集団は、培養物中で、５日間にわたり拡大され、抗原刺激時において、同じ培養条件下の培養物中で９日間にわたり拡大された同じ細胞と比較して、少なくとも１、２、３、または４倍の、細胞倍加の増大を示す。
【１１８４】
さらに他の実施形態では、細胞集団は、培養物中で、５日間にわたり拡大され、結果として得られる細胞は、同じ培養条件下の培養物中で９日間にわたり拡大された同じ細胞と比較して高レベルの、炎症促進性ＩＦＮ−γおよび／またはＧＭ−ＣＳＦを呈示する。
【１１８５】
他の実施形態では、細胞集団を、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体と関連するシグナルを刺激する薬剤、および／または細胞表面上の共刺激性分子を刺激するリガンドの存在下で細胞を培養することにより拡大する。薬剤は、抗ＣＤ３抗体もしくはその断片、および／または抗ＣＤ２８抗体もしくはその断片とコンジュゲートさせたビーズでありうる。
【１１８６】
他の実施形態では、細胞集団を、フローサイトメトリーにより測定される通り、細胞の、少なくとも２００倍、２５０倍、３００倍、または３５０倍の増大を結果としてもたらす、１または複数のインターロイキンを含む、適切な培地中で、１４日間の拡大期間にわたり拡大する。
【１１８７】
他の実施形態では、細胞集団を、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−７の存在下で拡大する。
【１１８８】
ある特定の実施形態では、方法は、適切な拡大期間の後で、細胞集団を低温保存するステップをさらに含む。
【１１８９】
さらに他の実施形態では、本明細書で開示される作製法は、免疫エフェクター細胞の集団を、テロメラーゼサブユニット、例えば、ｈＴＥＲＴをコードする核酸と接触させるステップをさらに含む。テロメラーゼサブユニットをコードする核酸は、ＤＮＡでありうる。
【１１９０】
本開示はまた、外因性ＲＮＡを一過性に発現するＲＮＡ操作細胞、例えば、本明細書で記載される細胞、例えば、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）の集団を作出する方法も提供する。方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写されたＲＮＡまたは合成ＲＮＡを、細胞へと導入するステップを含み、この場合、ＲＮＡは、本明細書で記載されるＣＡＲをコードする核酸を含む。
【１１９１】
別の態様では、本開示は、対象において抗腫瘍免疫をもたらす方法であって、対象へと、有効量の、ＣＡＲ分子を含む細胞、例えば、本明細書で記載されるＣＡＲ分子を発現する細胞を投与するステップを含む方法に関する。一実施形態では、細胞は、自家Ｔ細胞または自家ＮＫ細胞である。一実施形態では、細胞は、同種異系Ｔ細胞または同種異系ＮＫ細胞である。一実施形態では、対象は、ヒトである。
【１１９２】
一態様では、本開示は、例えば、本明細書で記載される、ＣＡＲ分子をコードする核酸分子を含むベクターをトランスフェクトするかまたは形質導入した自家細胞の集団を含む。一実施形態では、ベクターは、レトロウイルスベクターである。一実施形態では、ベクターは、本明細書の別の箇所で記載される、自己不活化レンチウイルスベクターである。一実施形態では、ベクターを、細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞へと送達する（例えば、トランスフェクトまたは電気穿孔することにより）が、この場合、ベクターは、本明細書で記載される、本開示のＣＡＲをコードする核酸分子であって、ｍＲＮＡ分子として転写される核酸分子を含み、ＲＮＡ分子から、本開示のＣＡＲが翻訳され、細胞表面上で発現する。
【１１９３】
別の態様では、本開示は、ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）の集団を提供する。一部の実施形態では、ＣＡＲ発現細胞の集団は、異なるＣＡＲを発現する細胞の混合物を含む。例えば、一実施形態では、ＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）の集団は、本明細書で記載される第１の腫瘍抗原に結合する、抗原結合性ドメインを有するＣＡＲを発現する、第１の細胞と、本明細書で記載される第２の腫瘍抗原に結合する、異なる抗原結合性ドメインを有するＣＡＲを発現する、第２の細胞とを含みうる。別の例として、ＣＡＲ発現細胞の集団は、本明細書で記載される腫瘍抗原に結合する抗原結合性ドメインを含むＣＡＲを発現する、第１の細胞と、本明細書で記載される腫瘍抗原以外の標的に対する抗原結合性ドメインを含むＣＡＲを発現する、第２の細胞とを含みうる。一実施形態では、ＣＡＲ発現細胞の集団は、例えば、細胞内一次シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを発現する、第１の細胞と、二次シグナル伝達ドメイン、例えば、共刺激性シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを発現する、第２の細胞とを含む。
【１１９４】
別の態様では、本開示は、集団内の、少なくとも１つの細胞が、本明細書で記載される腫瘍抗原に結合する抗原結合性ドメインを有するＣＡＲを発現し、第２の細胞が、別の薬剤、例えば、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤を発現する細胞集団を提供する。例えば、一実施形態では、薬剤は、阻害性分子を阻害する薬剤でありうる。阻害性分子の例は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３、および／またはＣＥＡＣＡＭ−５）、ＬＡＧ−３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、およびＴＧＦベータを含む。一実施形態では、阻害性分子を阻害する薬剤は、例えば、本明細書で記載される分子、例えば、細胞、例えば、本明細書で記載される細胞内シグナル伝達ドメインへと、正のシグナルをもたらす第２のポリペプチドと関連する、第１のポリペプチド、例えば、阻害性分子を含む薬剤である。一実施形態では、薬剤は、例えば、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ１６０、ＢＴＬＡ、ＬＡＩＲ１、ＴＩＭ−３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３、および／またはＣＥＡＣＡＭ−５）、２Ｂ４、ならびにＴＩＧＩＴなどの阻害性分子、またはこれらのうちのいずれかの断片の、第１のポリペプチドと、本明細書で記載される細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば共刺激性ドメイン（例えば、本明細書で記載される、例えば、４１ＢＢ、ＣＤ２７、またはＣＤ２８）、および／または一次シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書で記載される、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン）を含む）である、第２のポリペプチドとを含む。一実施形態では、薬剤は、ＰＤ−１またはその断片の、第１のポリペプチドと、本明細書で記載される細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書で記載される、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ４０、もしくは４−１ＢＢのシグナル伝達ドメイン、および／または本明細書で記載されるＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン）の、第２のポリペプチドとを含む。
【１１９５】
一実施形態では、例えば、本明細書で記載される、本開示のＣＡＲ分子をコードする核酸分子は、ｍＲＮＡ分子として発現する。一実施形態では、本開示のＣＡＲを発現する遺伝子改変細胞、例えば、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）は、所望のＣＡＲをコードするＲＮＡ分子を、細胞へとトランスフェクトまたは電気穿孔する（例えば、ベクター配列を伴わずに）ことにより作出することができる。一実施形態では、本開示のＣＡＲ分子は、組み込まれると、ｍＲＮＡ分子から翻訳され、組換え細胞の表面上で発現する。
【１１９６】
トランスフェクションにおける使用のためのｍＲＮＡを作出するための方法は、３’非翻訳配列および５’非翻訳配列（「ＵＴＲ」）（例えば、本明細書で記載される３’ＵＴＲおよび／または５’ＵＴＲ）、５’キャップ（例えば、本明細書で記載される５’キャップ）および／または内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）（例えば、本明細書で記載されるＩＲＥＳ）、発現させる核酸、およびポリＡテールを含有する構築物であって、典型的に、５０〜２０００塩基の長さ（配列番号１０５５５）の構築物を産生するように、特別にデザインされたプライマー鋳型のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）に続くポリＡ付加を伴う。このようにして産生されたＲＮＡは、異なる種類の細胞に、効率的にトランスフェクトすることができる。一実施形態では、鋳型は、ＣＡＲの配列を含む。ある実施形態では、ＲＮＡ  ＣＡＲベクターを、細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞へと、電気穿孔により形質導入する。
【１１９７】
ＸＩＩ．製造法
本開示は、細胞、例えば、Ｔ細胞、例えば、同種異系Ｔ細胞、例えば、本明細書で記載されるｇＲＮＡ分子で修飾されているか、または修飾されるＣＡＲ操作細胞を製造する方法を提示する。
【１１９８】
ＣＲＩＳＰＲ系の導入
本開示は、本明細書で記載される、１または複数のｇＲＮＡ分子を含むか、またはかつてこれらを含んだ細胞、例えば、免疫エフェクター細胞、例えば、同種異系細胞または自家細胞を含む。本明細書で記載されるＣＲＩＳＰＲ系を、本明細書で記載される方法のうちのいずれかにより、細胞へと導入することができる。細胞は、本明細書で記載されるＣＡＲを発現するように、さらに操作することができる。
【１１９９】
一態様では、本開示は、細胞を作製する方法であって、
ａ）例えば、本明細書で記載されるｇＲＮＡ分子、または前記ｇＲＮＡ分子をコードする核酸（例えば、表３で指定された領域内の標的配列と相補的な配列を含むターゲティングドメインを含むか、または、例えば、表１または表２に列挙されたターゲティングドメインを含む）を、前記細胞へと導入するステップと；
ｂ）本明細書で記載されるＣａｓ９分子、または前記Ｃａｓ９分子をコードする核酸、を、前記細胞へと導入するステップと；
ｃ）ＣＡＲをコードする核酸（例えば、ＣＡＲをコードする配列を含む鋳型核酸）を、前記細胞へと導入するステップと；
ｄ）細胞を拡大し、活性化させるステップとを含む方法を提供する。
【１２００】
複数の実施形態では、ステップａ）、ｂ）、およびｃ）は、併せて行われる（例えば、１つのステップで実施する、例えば、ｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９タンパク質を、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体として導入し鋳型核酸を、例えば、電気穿孔により、併せて、導入する）。複数の実施形態では、ａ）およびｂ）の導入（例えば、ＲＮＰの電気穿孔による）が、ステップｃ）（例えば、トランスフェクションを介する）およびｄ）の前に行われる。複数の実施形態では、ｃ）の導入（例えば、トランスフェクションを介する）が、ａ）およびｂ）の導入（例えば、ＲＮＰの電気穿孔による）の前に行われる。複数の実施形態では、ｃ）の導入と、ｄ）の、拡大し、活性化させるステップとが、ａ）およびｂ）の導入の前に行われる。複数の実施形態では、方法は、ｅ）ＣＡＲを発現する細胞を選択するステップをさらに含む。複数の実施形態では、方法は、ｆ）ステップａ）のｇＲＮＡ分子によりターゲティングされる遺伝子の機能または発現が低減または消失している細胞を選択するステップをさらに含む。例えば、ｇＲＮＡ分子が、ＴＥＴ２のイントロン内、またはイントロン−エクソン接合部内の標的配列と相補的なターゲティングドメインを含む（例えば、表１または表２に列挙された配列を含む、例えば、これらからなるターゲティングドメインを含む）場合、ＣＡＲをコードする核酸配列の挿入は、ステップａ）のｇＲＮＡ分子の標的配列において、またはこの近傍において生じる可能性があり、細胞は、ＴＥＴ２の機能、例えば、触媒機能を低減している可能性がある。
【１２０１】
細胞の拡大および活性化
一般に、例えば、それぞれが参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第６，３５２，６９４号明細書；同第６，５３４，０５５号明細書；同第６，９０５，６８０号明細書；同第６，６９２，９６４号明細書；同第５，８５８，３５８号明細書；同第６，８８７，４６６号明細書；同第６，９０５，６８１号明細書；同第７，１４４，５７５号明細書；同第７，０６７，３１８号明細書；同第７，１７２，８６９号明細書；同第７，２３２，５６６号明細書；同第７，１７５，８４３号明細書；同第５，８８３，２２３号明細書；同第６，９０５，８７４号明細書；同第６，７９７，５１４号明細書；同第６，８６７，０４１号明細書；および米国特許出願公開第２００６０１２１００５号明細書において記載されている方法を使用して、Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞を活性化させ、拡大することができる。
【１２０２】
一般に、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ調節性細胞枯渇細胞の集団は、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体と関連するシグナルを刺激する薬剤、およびＴ細胞の表面上の共刺激性分子を刺激するリガンドをそれへと接合させた表面と接触させることにより、拡大することができる。特に、Ｔ細胞集団は、表面上に固定化させた、抗ＣＤ３抗体もしくはその抗原結合性断片、または抗ＣＤ２抗体との接触、あるいはカルシウムイオノフォアと共に、プロテインキナーゼＣ活性化因子（例えば、ブリオスタチン）との接触によるなど、本明細書で記載される通りに刺激することができる。Ｔ細胞表面のアクセサリー分子の共刺激のためには、アクセサリー分子に結合するリガンドを使用する。例えば、Ｔ細胞の集団を、Ｔ細胞を増殖させる刺激に適切な条件下で、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体と接触させることができる。ＣＤ４＋  Ｔ細胞またはＣＤ８＋  Ｔ細胞の増殖を刺激するためには、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を使用することができる。抗ＣＤ２８抗体の例は、９．３、Ｂ−Ｔ３、ＸＲ−ＣＤ２８（Ｄｉａｃｌｏｎｅ、Ｂｅｓａｎｃｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）を含み、当技術分野で一般に公知の他の方法と同様に使用することができる（Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999; Garland et al., J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, 1999）。
【１２０３】
細胞の、ＴＣＲの構成要素の発現レベルまたはレベルを、低減するか、または非存在とした、複数の実施形態では、活性化は、ＣＤ３との相互作用以外の手段を介して達成することができる。ＣＡＲをさらに発現する細胞では、活性化は、前記細胞を、ＣＡＲの抗原結合性ドメイン、またはＣＡＲに結合することが可能なその断片が結合する抗原と接触させることにより達成することができる。このような抗原またはその断片は、例えば、抗体足場上、細胞（例えば、抗原提示細胞、例えば、前記抗原を天然で発現する細胞、またはその細胞表面上で、前記抗原を発現するように人工的に操作された細胞）上、またはビーズもしくは膜などの固体支持体上に存在しうる。
【１２０４】
ある特定の態様では、Ｔ細胞に対する一次刺激シグナルおよび共刺激シグナルを、異なるプロトコールによりもたらすこともできる。例えば、各シグナルをもたらす薬剤を、溶液中とすることもでき、表面にカップリングさせることもできる。表面にカップリングさせる場合、薬剤は、同じ表面に（すなわち、「シス」形態で）カップリングさせることもでき、別個の表面に（すなわち、「トランス」形態で）カップリングさせることもできる。代替的に、１つの薬剤を、表面にカップリングさせ、他の薬剤を、溶液中の薬剤とすることもできる。一態様では、共刺激シグナルをもたらす薬剤を、細胞表面に結合させ、一次活性化シグナルをもたらす薬剤を、溶液中とするか、または表面にカップリングさせる。ある特定の態様では、いずれの薬剤も、溶液中とすることができる。一態様では、薬剤は、可溶性形態であることが可能であり、次いで、Ｆｃ受容体もしくは抗体、または薬剤に結合する他の結合剤を発現する細胞などの表面へと架橋することができる。この点で、本開示の、Ｔ細胞の活性化および拡大における使用に想定される人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）については、例えば、米国特許出願公開第２００４０１０１５１９号明細書および同第２００６００３４８１０号明細書を参照されたい。
【１２０５】
一態様では、２つの薬剤を、同じビーズ上、すなわち、「シス」、または個別のビーズ上、すなわち、「トランス」である、ビーズ上に固定化させる。例を目的として、一次活性化シグナルをもたらす薬剤は、抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合性断片であり、共刺激シグナルをもたらす薬剤は、抗ＣＤ２８抗体またはその抗原結合性断片であり；両方の薬剤を、等分子量で、同じビーズ上に共固定化させる。一態様では、ＣＤ４＋  Ｔ細胞の拡大およびＴ細胞の成長のために、ビーズに結合させる各抗体の比１：１を使用する。本開示のある特定の態様では、ビーズに結合させる抗ＣＤ３抗体：抗ＣＤ２８抗体の比を、１：１の比を使用して観察される拡大と比較した、Ｔ細胞拡大の増大が観察されるように使用する。特定の一態様では、１：１の比を使用して観察される拡大と比較して、約１〜約３倍の増大が観察される。一態様では、ビーズに結合させるＣＤ３抗体：ＣＤ２８抗体の比は、１００：１〜１：１００、およびこの間の全ての整数値の範囲である。一態様では、抗ＣＤ３抗体より多くの抗ＣＤ２８抗体を、粒子に結合させる、すなわち、ＣＤ３：ＣＤ２８の比を１未満とする。ある特定の態様では、ビーズに結合させる抗ＣＤ２８抗体：抗ＣＤ３抗体の比は、２：１を超える。特定の一態様では、ビーズに結合させるＣＤ３抗体：ＣＤ２８抗体の比として１：１００を使用する。一態様では、ビーズに結合させるＣＤ３抗体：ＣＤ２８抗体の比として１：７５を使用する。さらなる態様では、ビーズに結合させるＣＤ３抗体：ＣＤ２８抗体の比として１：５０を使用する。一態様では、ビーズに結合させるＣＤ３抗体：ＣＤ２８抗体の比として１：３０を使用する。好ましい一態様では、ビーズに結合させるＣＤ３抗体：ＣＤ２８抗体の比として１：１０を使用する。一態様では、ビーズに結合させるＣＤ３抗体：ＣＤ２８抗体の比として１：３を使用する。さらなる１つの態様では、ビーズに結合させるＣＤ３抗体：ＣＤ２８抗体の比として３：１を使用する。
【１２０６】
１：５００〜５００：１、およびこれらの間の任意の整数値である粒子対細胞比を使用して、Ｔ細胞または他の標的細胞を刺激することができる。当業者がたやすく察知しうる通り、粒子対細胞比は、標的細胞と比べた粒子サイズに依存しうる。例えば、小型サイズのビーズは、少数の細胞に結合しうるのみであるが、大型のビーズは、多数の細胞に結合しうるであろう。ある特定の態様では、細胞対粒子比は、１：１００〜１００：１、およびこれらの間の任意の整数値の範囲であり、さらに複数の態様では、比は、１：９〜９：１、およびこれらの間の任意の整数値を含み、これらもまた、Ｔ細胞を刺激するのに使用することができる。抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８とカップリングさせた粒子の、Ｔ細胞に対する比であって、Ｔ細胞の刺激を結果としてもたらす比は、上記で言及した通り、変動しうるが、ある特定の好ましい値は、１：１００、１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、および１５：１を含み、１つの好ましい比は、少なくとも１：１の粒子対Ｔ細胞比である。一態様では、１：１またはこれ未満の粒子対細胞比を使用する。特定の一態様では、好ましい粒子：細胞比は、１：５である。さらなる複数の態様では、粒子対細胞比は、刺激日に応じて変動しうる。例えば、一態様では、粒子対細胞比は、１日目には、１：１〜１０：１であり、その後、さらなる粒子を、細胞へと、毎日または隔日で、最大１０日間にわたり、最終比を、１：１〜１：１０（添加日における細胞カウントに基づく）として添加する。特定の一態様では、粒子対細胞比は、刺激の１日目には、１：１であり、刺激の３および５日目には、１：５へと調整される。一態様では、粒子は、毎日ベースまたは隔日ベースで、刺激の１日目における１：１、および３および５日目における１：５の最終比まで添加する。一態様では、粒子対細胞比は、刺激の１日目には、２：１であり、刺激の３および５日目には、１：１０へと調整される。一態様では、粒子は、毎日ベースまたは隔日ベースで、１日目における刺激の１：１、および３および５日目における１：１０の最終比まで添加する。当業者は、他の様々な比も、本開示における使用に適しうることを察知するであろう。特に、比は、粒子サイズならびに細胞サイズおよび細胞型に応じて変動するであろう。一態様では、使用のための最も典型的な比は、１日目において、１：１、２：１、および３：１の近傍である。
【１２０７】
さらなる複数の態様では、Ｔ細胞などの細胞を、薬剤コーティングビーズと組み合わせ、その後、ビーズと細胞とを分離し、次いで、細胞を培養する。代替的な態様では、培養の前に、薬剤コーティングビーズと細胞とを、分離せず、併せて培養する。さらなる態様では、ビーズおよび細胞を、磁力などの力を適用することによりまず濃縮する結果として、細胞表面マーカーへのライゲーションの増大をもたらし、これにより、細胞刺激を誘導する。
【１２０８】
例を目的として、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８を接合させた常磁性ビーズ（３×２８ビーズ）を、Ｔ細胞に接触させることにより、細胞表面タンパク質をライゲーションすることができる。一態様では、細胞（例えば、Ｔ細胞１０４〜１０９個）と、ビーズ（例えば、比を１：１とする、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ−４５０  ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｔ常磁性ビーズ）とを、緩衝液中、例えば、ＰＢＳ（カルシウムおよびマグネシウムなどの二価カチオンを伴わない）中で組み合わせる。ここでもまた、当業者は、任意の細胞濃度を使用しうることを、たやすく察知しうる。例えば、標的細胞は、試料中で極めて希少であり、試料のうちの０．０１％を含むに過ぎない場合もあり、試料の全体（すなわち、１００％）が、目的の標的細胞を含む場合もある。したがって、任意の細胞数が、本開示の文脈内にある。ある特定の態様では、細胞と粒子との最大の接触を確保するように、粒子と細胞とを併せて混合する容量を、著明に減少させる（すなわち、細胞の濃度を増大させる）ことが望ましい場合がある。例えば、一態様では、約１ｍｌ当たりの細胞１００億個、１ｍｌ当たり９０億個、１ｍｌ当たり８０億個、１ｍｌ当たり７０億個、１ｍｌ当たり６０億個、１ｍｌ当たり５０億個、または１ｍｌ当たりの細胞２０億個の濃度を使用する。一態様では、１ｍｌ当たり１億個を超える細胞を使用する。さらなる態様では、１ｍｌ当たりの細胞１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０００万個の細胞の濃度を使用する。さらなる１つの態様では、１ｍｌ当たりの細胞７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万、または１億個の細胞の濃度を使用する。さらなる複数の態様では、１ｍｌ当たりの細胞１億２５００万または１億５０００万個の濃度を使用することができる。高濃度の使用は、細胞収量の増大、細胞の活性化、および細胞の拡大を結果としてもたらしうる。さらに、高細胞濃度の使用は、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞など、目的の標的抗原の発現が弱い場合がある細胞のより効率的な捕捉を可能とする。ある特定の態様では、このような細胞集団は、治療的価値を有する可能性があり、得ることが望ましいであろう。例えば、高濃度の細胞の使用は、正常ではＣＤ２８の発現が弱いＣＤ８＋Ｔ細胞の、より効率的な選択を可能とする。
【１２０９】
一実施形態では、本開示の細胞、例えば、本明細書で記載されるｇＲＮＡ分子を含むか、または、任意の時点においてこれを含んだか、またはこれを含むことになる細胞、例えば、ＣＡＲ、例えば、本明細書で記載されるＣＡＲをコードする核酸を形質導入された前記細胞を、例えば、本明細書で記載される方法により拡大する。一実施形態では、細胞を、培養物中で、数時間（例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、１８、２１時間）〜約１４日間（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４日間）の期間にわたり拡大する。一実施形態では、細胞を、４〜９日間の期間にわたり拡大する。一実施形態では、細胞を、８日間またはこれ未満、例えば、７、６、または５日間の期間にわたり拡大する。一実施形態では、細胞は、培養物中で、５日間にわたり拡大され、結果として得られる細胞は、同じ培養条件下の培養物中で９日間にわたり拡大された同じ細胞より強力である。効力は、例えば、多様なＴ細胞機能、例えば、増殖、標的細胞の殺滅、サイトカインの産生、活性化、遊走、またはこれらの組合せにより規定することができる。一実施形態では、細胞は、５日間にわたり拡大され、抗原刺激時において、同じ培養条件下の培養物中で９日間にわたり拡大された同じ細胞と比較して、少なくとも１、２、３、または４倍の、細胞倍加の増大を示す。一実施形態では、細胞は、培養物中で、５日間にわたり拡大され、結果として得られる細胞は、同じ培養条件下の培養物中で９日間にわたり拡大された同じ細胞と比較して高い炎症促進性サイトカインの産生、例えば、高レベルのＩＦＮ−γおよび／またはＧＭ−ＣＳＦを呈示する。一実施形態では、５日間にわたり拡大された細胞は、同じ培養条件下の培養物中で９日間にわたり拡大された同じ細胞と比較して、１ｍｌ当たりのｐｇ単位で、少なくとも１、２、３、４、５、１０倍、またはこれを超える、炎症促進性サイトカインの産生の増大、例えば、ＩＦＮ−γおよび／またはＧＭ−ＣＳＦのレベルの上昇を示す。
【１２１０】
Ｔ細胞の培養時間が、６０日間またはこれを超えうるように、数サイクルにわたる刺激もまた、所望されうる。Ｔ細胞の培養に適切な条件は、増殖および生存に必要な因子であって、血清（例えば、ウシ胎仔血清またはヒト血清）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＴＧＦβ、およびＴＮＦ−α、または当業者に公知の、細胞を成長させるための他の任意の添加剤を含む因子を含有しうる、適切な培地（例えば、最少必須培地またはＲＰＭＩ培地１６４０またはＸ−ｖｉｖｏ１５（Ｌｏｎｚａ））を含む。細胞を成長させるための他の添加剤は、界面活性剤、プラズマネート、およびＮ−アセチルシステインおよび２−メルカプトエタノールなどの還元剤を含むがこれらに限定されない。培地は、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、およびビタミンを添加し、血清非含有であるか、あるいはＴ細胞の成長および拡大に十分な適量の血清（または血漿）または規定されたホルモンのセット、および／もしくは規定量のサイトカインを補充した、ＲＰＭＩ  １６４０、ＡＩＭ−Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、α−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｘ−Ｖｉｖｏ１５、およびＸ−Ｖｉｖｏ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒを含みうる。抗生剤、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシンは、実験培養物中だけに組み入れ、対象へと注入される細胞培養物中には組み入れない。標的細胞は、成長を支援するのに必要な条件、例えば、適切な温度（例えば、３７℃）および雰囲気（例えば、５％のＣＯ２を加えた空気）下で維持する。
【１２１１】
一実施形態では、細胞を、１または複数のインターロイキンを含む適切な培地（例えば、本明細書で記載される培地）であって、例えば、フローサイトメトリーなど、本明細書で記載される方法により測定される通り、１４日間の拡大期間にわたり、細胞の、少なくとも２００倍（例えば、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍）の増大を結果としてもたらす培地中で拡大する。一実施形態では、細胞を、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−７（例えば、ＩＬ−１５およびＩＬ−７）の存在下で拡大する。
【１２１２】
複数の実施形態では、本明細書で記載される方法であって、本開示の細胞、例えば、本明細書で記載されるｇＲＮＡ分子を含むか、または、任意の時点においてこれを含んだか、またはこれを含むことになる細胞、例えば、ＣＡＲを発現する前記細胞のための製造法は、例えば、抗ＣＤ２５抗体もしくはその断片、またはＣＤ２５結合性リガンドであるＩＬ−２を使用して、Ｔ調節性細胞、例えば、ＣＤ２５＋  Ｔ細胞を、細胞集団から除去するステップを含む。本明細書では、Ｔ調節性細胞、例えば、ＣＤ２５＋  Ｔ細胞を、細胞集団から除去する方法が記載される。複数の実施形態では、方法、例えば、製造法は、細胞集団（例えば、ＣＤ２５＋  Ｔ細胞などのＴ調節性細胞を枯渇させた細胞集団；または抗ＣＤ２５抗体、その断片、もしくはＣＤ２５結合性リガンドに既に接触した細胞集団）を、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−７と接触させるステップをさらに含む。例えば、細胞集団（例えば、抗ＣＤ２５抗体、その断片、またはＣＤ２５結合性リガンドに既に接触した細胞集団）を、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−７の存在下で拡大する。
【１２１３】
一部の実施形態では、例えば、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける、ＣＡＲ発現細胞の製造時に、本開示の細胞、例えば、本明細書で記載されるｇＲＮＡ分子を含むか、または、任意の時点においてこれを含んだか、またはこれを含むことになる細胞、例えば、本明細書で記載されるＣＡＲを発現する前記細胞を、インターロイキン１５（ＩＬ−１５）ポリペプチド、インターロイキン１５受容体アルファ（ＩＬ−１５Ｒａ）ポリペプチド、またはＩＬ−１５ポリペプチドおよびＩＬ−１５Ｒａポリペプチドの両方の組合せ、例えば、ｈｅｔＩＬ−１５を含む組成物と接触させる。複数の実施形態では、例えば、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける、細胞の製造時に、本明細書で記載される細胞を、ＩＬ−１５ポリペプチドを含む組成物と接触させる。複数の実施形態では、例えば、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける、ＣＡＲ発現細胞の製造時に、本明細書で記載される細胞を、ＩＬ−１５ポリペプチドおよびＩＬ−１５Ｒａポリペプチドの両方の組合せを含む組成物と接触させる。複数の実施形態では、例えば、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける、ＣＡＲ発現細胞の製造時に、本明細書で記載される細胞を、ｈｅｔＩＬ−１５を含む組成物と接触させる。
【１２１４】
一実施形態では、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける拡大時に、本開示の細胞、例えば、本明細書で記載されるｇＲＮＡ分子を含むか、または、任意の時点においてこれを含んだか、またはこれを含むことになる細胞、例えば、本明細書で記載されるＣＡＲを発現する前記細胞を、ｈｅｔＩＬ−１５を含む組成物と接触させる。ある実施形態では、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける拡大時に、本明細書で記載される細胞を、ＩＬ−１５ポリペプチドを含む組成物と接触させる。ある実施形態では、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける拡大時に、本明細書で記載されるＣＡＲ発現細胞を、ＩＬ−１５ポリペプチドおよびＩＬ−１５Ｒａポリペプチドの両方を含む組成物と接触させる。一実施形態では、接触させることは、リンパ球亜集団、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞の生存および増殖を結果としてもたらす。
【１２１５】
回数を変動させる刺激へと曝露されたＴ細胞は、異なる特徴を呈示しうる。例えば、典型的な血液生成物またはアフェレーシスにかけられた末梢血単核細胞生成物は、細胞傷害性またはサプレッサーＴ細胞集団（ＴＣ、ＣＤ８＋）より多くの、ヘルパーＴ細胞集団（ＴＨ、ＣＤ４＋）を有する。ＣＤ３受容体およびＣＤ２８受容体を刺激することによる、ｅｘ  ｖｉｖｏにおけるＴ細胞の拡大は、約８〜９日目以前には、主にＴＨ細胞からなるＴ細胞集団をもたらすが、約８〜９日目以後には、Ｔ細胞集団は、ますます多くのＴＣ細胞集団を含む。したがって、処置の目的に応じて、対象に、主にＴＨ細胞を含むＴ細胞集団を注入することも有利でありうる。同様に、ＴＣ細胞の抗原特異的サブセットを単離した場合は、このサブセットを、より高度に拡大することも有益でありうる。
【１２１６】
さらに、ＣＤ４マーカーおよびＣＤ８マーカーに加えて、他の表現型マーカーも、細胞拡大工程の過程において、著明ではあるが、大部分は、再現可能な形で変動する。したがって、このような再現可能性は、活性化Ｔ細胞産物を、具体的な目的に向けてテーラーメイド化する能力を可能とする。
【１２１７】
本明細書で記載されるＣＡＲを発現するように操作された、本開示の細胞を構築したら、多様なアッセイを使用して、抗原による刺激後にＴ細胞を拡大する能力、再刺激の非存在下で、Ｔ細胞の拡大を維持する能力、ならびに適切なｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルおよび動物モデルにおける抗がん活性などであるがこれらに限定されない、分子の活性について査定することができる。ＣＡＲおよび／またはＣＡＲを発現する細胞の効果を査定するアッセイについては、下記でさらに詳細に記載する。
【１２１８】
初代Ｔ細胞内のＣＡＲ発現についてのウェスタンブロット解析を使用して、単量体および二量体の存在を検出することができる。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)を参照されたい。ごく簡単に略述すると、ＣＡＲを発現するＴ細胞（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の１：１混合物）を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、１０日間を超えて拡大するのに続いて、溶解させ、還元条件下で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。全長ＴＣＲ−ζ細胞質ドメインと、内因性ＴＣＲ−ζ鎖とを含有するＣＡＲを、ＴＣＲ−ζ鎖に対する抗体を使用するウェスタンブロット法により検出する。同じＴ細胞のサブセットを、非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析のために使用して、共有結合による二量体の形成についての査定を可能とした。
【１２１９】
抗原刺激後のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける、ＣＡＲ＋Ｔ細胞の拡大は、フローサイトメトリーにより測定することができる。例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞と、ＣＤ８＋Ｔ細胞との混合物を、αＣＤ３／αＣＤ２８  ａＡＰＣで刺激するのに続き、プロモーターの制御下でＧＦＰを発現するレンチウイルスベクターを形質導入して、解析する。例示的なプロモーターは、ＣＭＶ  ＩＥ遺伝子プロモーター、ＥＦ−１αプロモーター、ユビキチンＣプロモーター、またはホスホグリセロキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターを含む。ＧＦＰ蛍光は、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞サブセット内における培養の６日目に、フローサイトメトリーによりにより査定する。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)を参照されたい。代替的に、ＣＤ４＋Ｔ細胞と、ＣＤ８＋Ｔ細胞との混合物を、０日目に、αＣＤ３／αＣＤ２８でコーティングされた磁気ビーズで刺激し、１日目に、２Ａリボソームスキッピング配列を使用して、ｅＧＦＰと共に、ＣＡＲを発現する、バイシストロニックのレンチウイルスベクターを使用して、ＣＡＲを形質導入する。洗浄後において、培養物を、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体（Ｋ５６２−ＢＢＬ−３／２８）の存在下において、本明細書で記載されるがん関連抗原＋Ｋ５６２細胞（本明細書で記載されるがん関連抗原を発現するＫ５６２）、野生型Ｋ５６２細胞（Ｋ５６２野生型）、またはｈＣＤ３２および４−１ＢＢＬを発現するＫ５６２細胞で再刺激する。外因性ＩＬ−２を、隔日、１００ＩＵ／ｍｌで、培養物へと添加する。ＧＦＰ＋Ｔ細胞は、ビーズベースのカウンティングを使用して、フローサイトメトリーにより数え上げる。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)を参照されたい。
【１２２０】
また、再刺激の非存在下における、持続的なＣＡＲ＋Ｔ細胞の拡大についても、測定することができる。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)を参照されたい。略述すると、０日目の、αＣＤ３／αＣＤ２８でコーティングされた磁気ビーズによる刺激、および１日目の、示されたＣＡＲの形質導入後である、培養の８日目において、Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ  ＩＩＩ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｃｏｕｎｔｅｒ、Ｎｅｘｃｅｌｏｍ  Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ  Ｖｉｓｉｏｎ、またはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｓｃｅｐｔｅｒを使用して、平均Ｔ細胞容量（ｆｌ）を測定する。
【１２２１】
ＣＡＲＴ活性を測定するのに、動物モデルもまた使用することができる。例えば、免疫欠損マウスにおいて、本明細書で記載されるがん関連抗原に特異的なヒトＣＡＲ＋Ｔ細胞を使用して、原発性ヒトｐｒｅ−Ｂ  ＡＬＬを処置する、異種移植片モデルを使用することができる。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)を参照されたい。ごく簡単に略述すると、ＡＬＬを確立した後で、マウスを、処置群へと無作為化する。異なる数の、がん関連抗原特異的ＣＡＲで操作されたＴ細胞を、１：１の比で、Ｂ−ＡＬＬを保有するＮＯＤ−ＳＣＩＤ−γ−／−マウスへと共注射する。マウスに由来する脾臓ＤＮＡ内の、がん関連抗原特異的ＣＡＲベクターのコピー数を、Ｔ細胞注射後の、多様な時点において査定する。動物を、毎週の間隔で、白血病について評価する。末梢血の、本明細書で記載されるがん関連抗原＋Ｂ−ＡＬＬ芽球カウントを、本明細書で記載されるがん関連抗原ζＣＡＲ＋Ｔ細胞またはモック形質導入Ｔ細胞を注射されたマウスにおいて測定する。ログランク検定を使用して、群ごとの生存曲線を比較する。加えて、ＮＯＤ−ＳＣＩＤ−γ−／−マウスにおけるＴ細胞注射の４週間後における、絶対末梢血ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞のカウントについてもまた解析することができる。マウスに白血病性細胞を注射し、３週間後、ｅＧＦＰへと連結されたＣＡＲをコードするバイシストロニックのレンチウイルスベクターにより、ＣＡＲを発現するように操作されたＴ細胞を注射した。注射の前に、Ｔ細胞を、モック形質導入細胞と混合することにより、インプットＧＦＰ＋Ｔ細胞の４５〜５０％へと標準化し、フローサイトメトリーにより確認する。動物を、１週間の間隔で、白血病について評価する。ログランク検定を使用して、ＣＡＲ＋Ｔ細胞群についての生存曲線を比較する。
【１２２２】
用量依存性のＣＡＲ処置応答について査定することができる。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)を参照されたい。例えば、２１日目に、ＣＡＲ  Ｔ細胞を注射されたマウス、同等数のモック形質導入Ｔ細胞を注射されたマウス、またはＴ細胞を注射されなかったマウスにおいて、白血病を確立した３５〜７０日後に、末梢血を得る。末梢血の、本明細書で記載されるがん関連抗原＋ＡＬＬ芽球カウントを決定するために、各群に由来するマウスからランダムに採血し、次いで、３５および４９日目に死なせた。残りの動物は、５７および７０日目に査定した。
【１２２３】
細胞増殖およびサイトカイン産生の評価については、例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)において、既に記載されている。略述すると、マイクロ滴定プレート内で、洗浄されたＴ細胞を、本明細書で記載されるがん関連抗原を発現するＫ５６２細胞（Ｋ１９）またはＣＤ３２およびＣＤ１３７を発現するＫ５６２細胞（ＫＴ３２−ＢＢＬ）と、最終Ｔ細胞：Ｋ５６２比を２：１として混合することにより、ＣＡＲ媒介型増殖についての評価を実施する。Ｋ５６２細胞は、使用の前に、ガンマ放射線で照射した。これらのシグナルは、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、ＣＤ８＋Ｔ細胞の拡大を、長期にわたり支援するので、抗ＣＤ３（クローンＯＫＴ３）および抗ＣＤ２８（クローン９．３）モノクローナル抗体を、ＫＴ３２−ＢＢＬ細胞を伴う培養物へと添加して、Ｔ細胞増殖の刺激についての陽性対照として用いる。製造元により記載される通りに、ＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ（商標）ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）およびフローサイトメトリーを使用して、培養物中のＴ細胞を数え上げる。ｅＧＦＰ−２Ａと連結された、ＣＡＲを発現するレンチウイルスベクターで操作されたＴ細胞を使用して、ＣＡＲ＋Ｔ細胞を、ＧＦＰの発現により同定する。ＧＦＰを発現しないＣＡＲ＋Ｔ細胞については、ＣＡＲ＋Ｔ細胞を、ビオチニル化された、組換えの、本明細書で記載されるがん関連抗原タンパク質、および二次アビジン−ＰＥコンジュゲートにより検出する。また、Ｔ細胞上のＣＤ４＋およびＣＤ８＋の発現も、特異的モノクローナル抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により、同時に検出する。サイトカインの測定は、製造元の指示書に従い、ヒトＴＨ１／ＴＨ２サイトカインサイトメトリービーズアレイキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して、再刺激の２４時間後において回収された上清について実施した。蛍光は、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターを使用して評価し、データは、製造元の指示書に従い解析する。
【１２２４】
細胞傷害作用は、標準的な５１Ｃｒ放出アッセイにより評価することができる。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)を参照されたい。略述すると、標的細胞（Ｋ５６２系および原発性ｐｒｏ−Ｂ−ＡＬＬ細胞）に、５１Ｃｒ（ＮａＣｒＯ４としての、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）を、３７℃で、頻繁に攪拌しながら、２時間にわたりロードし、完全ＲＰＭＩ中で、２回にわたり洗浄し、マイクロ滴定プレートへと播種した。エフェクターＴ細胞を、標的細胞と、ウェル内で、完全ＲＰＭＩ中、多様なエフェクター細胞：標的細胞（Ｅ：Ｔ）比で混合する。また、培地だけ（自発放出；ＳＲ）または１％のｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００洗浄剤溶液（全放出：ＴＲ）を含有する、さらなるウェルも調製する。３７℃で４時間にわたるインキュベーションの後、上清を、各ウェルから採取する。次いで、ガンマ粒子カウンター（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して、放出された５１Ｃｒを測定する。各条件を、少なくとも三連で実施し、式：溶解％＝（ＥＲ−ＳＲ）／（ＴＲ−ＳＲ）［式中、ＥＲは、各実験条件で放出される平均５１Ｃｒを表す］を使用して、溶解百分率を計算する。
【１２２５】
イメージング技術を使用して、腫瘍保有動物モデルにおける、ＣＡＲの特異的トラフィッキングおよび増殖について査定することができる。このようなアッセイについては、例えば、Barrett et al., Human Gene Therapy 22:1575-1586 (2011)において記載されている。略述すると、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃ−／−（ＮＳＧ）マウスに、Ｎａｌｍ−６細胞をＩＶ注射し、７日後、ＣＡＲ構築物を電気穿孔した４時間後に、Ｔ細胞をＩＶ注射する。Ｔ細胞に、レンチウイルス構築物を安定的にトランスフェクトして、ホタルルシフェラーゼを発現させ、マウスを、生物発光についてイメージングする。代替的に、Ｎａｌｍ−６異種移植片モデルにおける、単回のＣＡＲ＋Ｔ細胞の注射の治療有効性および特異性は、以下の通りに測定することもできる。ＮＳＧマウスに、ホタルルシフェラーゼを安定的に発現するように形質導入されたＮａｌｍ−６を注射し、７日後に、ＣＡＲを電気穿孔されたＴ細胞の、単回の尾静脈注射が続く。注射後の多様な時点において、動物をイメージングする。例えば、５日目（処置の２日前）および８日目（ＣＡＲ＋ＰＢＬの２４時間後）の代表的マウスにおいて、ホタルルシフェラーゼ陽性白血病についての光子密度ヒートマップを作成することができる。
【１２２６】
本明細書の実施例節に記載されるアッセイのほか、当技術分野で公知のアッセイも含む、他のアッセイもまた、本明細書で記載される細胞およびＣＡＲを発現する細胞について査定するのに使用することができる。
【１２２７】
送達のタイミング
ある実施形態では、Ｃａｓ系の構成要素、例えば、本明細書で記載される、Ｃａｓ９分子の構成要素および／またはｇＲＮＡ分子の構成要素以外の、１または複数の核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子）を送達する。ある実施形態では、核酸分子を、Ｃａｓ系の構成要素のうちの１または複数を送達するのと同時に送達する。ある実施形態では、核酸分子を、Ｃａｓ系の構成要素のうちの１または複数を送達する前に、または送達した後で（例えば、約３０分、１時間、２時間、３時間、６時間、９時間、１２時間、１日、２日間、３日間、１週間、２週間、または４週間以内に）送達する。ある実施形態では、核酸分子を、Ｃａｓ系の構成要素、例えば、Ｃａｓ９分子の構成要素および／またはｇＲＮＡ分子の構成要素のうちの１または複数を送達する手段と異なる手段により送達する。核酸分子を、本明細書で記載される送達法のうちのいずれかにより送達することができる。例えば、核酸分子は、ウイルスベクター、例えば、組込み欠損レンチウイルスにより送達することができ、Ｃａｓ９分子の構成要素および／またはｇＲＮＡ分子の構成要素を、例えば、核酸（例えば、ＤＮＡ）により引き起こされる毒性を低減しうるように、電気穿孔により送達することができる。ある実施形態では、核酸分子は、治療用タンパク質、例えば、本明細書で記載されるタンパク質をコードする。ある実施形態では、核酸分子は、ＲＮＡ分子、例えば、本明細書で記載されるＲＮＡ分子をコードする。
【１２２８】
構成要素の、バイモーダル送達または示差的送達
Ｃａｓ系の構成要素、例えば、Ｃａｓ９分子の構成要素、およびｇＲＮＡ分子の構成要素の個別の送達であり、より特定すると、示差的方式による構成要素の送達は、例えば、組織特異性および安全性を改善することにより、効能を増強しうる。ある実施形態では、Ｃａｓ９分子とｇＲＮＡ分子とを、場合によって、本明細書では、示差的方式と称する、異なる方式により送達する。本明細書で使用される、異なる方式または示差的方式とは、対象の構成要素分子、例えば、Ｃａｓ９分子、ｇＲＮＡ分子、鋳型核酸、またはペイロードに対して、異なる薬力学特性または薬物動態特性を付与する送達方式を指す。例えば、送達方式は、例えば、選択されたコンパートメント内、組織内、または臓器内で、異なる組織分布、異なる半減期、または異なる時間的分布を結果としてもたらしうる。
【１２２９】
一部の送達方式、例えば、細胞内または細胞の子孫細胞内に残留する核酸ベクターによる送達、例えば、自己複製または細胞内の核酸への挿入による送達は、残留性の大きな構成要素の発現および存在を結果としてもたらす。例は、ウイルスによる送達、例えば、アデノ随伴ウイルスによる送達、またはレンチウイルスによる送達を含む。
【１２３０】
例を目的として、構成要素、例えば、Ｃａｓ９分子およびｇＲＮＡ分子を、結果として得られる、送達された構成要素の、体内、または特定のコンパートメント内、組織内、もしくは臓器内における半減期または残留性との関係で、異なる方式により送達することができる。ある実施形態では、ｇＲＮＡ分子を、このような方式により送達することができる。Ｃａｓ９分子構成要素を、その身体、または特定のコンパートメント、組織、もしくは臓器への、低い残留性またはより少ない曝露を結果としてもたらす方式により送達することができる。
【１２３１】
より一般に、ある実施形態では、第１の送達方式を使用して、第１の構成要素を送達し、第２の送達方式を使用して、第２の構成要素を送達する。第１の送達方式は、第１の薬力学特性または薬物動態特性を付与する。第１の薬力学特性は、例えば、体内、コンパートメント内、組織内、または臓器内の、構成要素、または構成要素をコードする核酸の、分布、残留性、または曝露でありうる。第２の送達方式は、第２の薬力学特性または薬物動態特性を付与する。第２の薬力学特性は、例えば、体内、コンパートメント内、組織内、または臓器内の、構成要素、または構成要素をコードする核酸の、分布、残留性、または曝露でありうる。
【１２３２】
ある実施形態では、第１の薬力学特性または薬物動態特性、例えば、分布、残留性、または曝露を、第２の薬力学特性または薬物動態特性より、大きく制限する。
【１２３３】
ある実施形態では、第１の送達方式を選択して、薬力学特性または薬物動態特性、例えば、分布、残留性、または曝露を最適化する、例えば、これらを最小化する。
【１２３４】
ある実施形態では、第２の送達方式を選択して、薬力学特性または薬物動態特性、例えば、分布、残留性、または曝露を最適化する、例えば、これらを最大化する。
【１２３５】
ある実施形態では、第１の送達方式は、比較的残留性のエレメント、例えば、核酸、例えば、プラスミドまたはウイルスベクター、例えば、ＡＡＶまたはレンチウイルスの使用を含む。このようなベクターは、比較的残留性であるので、それらから転写される産物も、比較的残留性となるであろう。
【１２３６】
ある実施形態では、第２の送達方式は、比較的一過性のエレメント、例えば、ＲＮＡまたはタンパク質を含む。
【１２３７】
ある実施形態では、第１の構成要素は、ｇＲＮＡを含み、送達方式は、比較的残留性である、例えば、ｇＲＮＡは、プラスミドまたはウイルスベクター、例えば、ＡＡＶまたはレンチウイルスから転写される。遺伝子は、タンパク質産物をコードせず、ｇＲＮＡは、孤立して作用することは不可能であるため、これらの遺伝子の転写は、生理学的帰結をそれほど有しないであろう。第２の構成要素であるＣａｓ９分子は、例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質として、一過性で送達され、完全なＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が、短時間に限り存在し、活性となることを確保する。
【１２３８】
さらに、構成要素は、安全性および組織特異性を増強するように、互いを補完し合う、異なる分子形態で送達することもでき、異なる送達ベクターにより送達することもできる。
【１２３９】
示差的送達方式の使用は、効能、安全性、および有効性を増強しうる。例えば、最終的なオフターゲット修飾の可能性を低減することができる。細菌由来のＣａｓ酵素に由来するペプチドは、ＭＨＣ分子により、細胞の表面上に表示されるので、低残留性方式による、免疫原性構成要素、例えば、Ｃａｓ９分子の送達は、免疫原性を低減しうる。二元送達系は、これらの欠点を緩和しうる。
【１２４０】
示差的送達方式を使用して、構成要素を、異なるが、重複する標的領域へと送達することができる。標的領域の重複部の外側では、活性複合体の形成を最小化する。したがって、ある実施形態では、第１の構成要素、例えば、ｇＲＮＡ分子を、第１の空間、例えば、組織への分布を結果としてもたらす、第１の送達方式により送達する。第２の構成要素、例えば、Ｃａｓ９分子を、第２の空間、例えば、組織への分布を結果としてもたらす、第２の送達方式により送達する。ある実施形態では、第１の方式は、リポソーム、ナノ粒子、例えば、ポリマー性ナノ粒子、および核酸、例えば、ウイルスベクターから選択される第１のエレメントを含む。第２の方式は、これらの群から選択される第２のエレメントを含む。ある実施形態では、第１の送達方式は、第１のターゲティングエレメント、例えば、細胞特異的受容体または抗体を含み、第２の送達方式は、このエレメントを含まない。ある実施形態では、第２の送達方式は、第２のターゲティングエレメント、例えば、第２の細胞特異的受容体または第２の抗体を含む。
【１２４１】
Ｃａｓ９分子を、ウイルス送達ベクター、リポソーム、またはポリマー性ナノ粒子により送達する場合、単一の組織だけをターゲティングすることが望ましい場合に、複数の組織への送達がなされ、これらにおける治療活性がもたらされる潜在的可能性がある。二元送達系は、この課題を解決し、組織特異性を増強する。ｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子を、顕著に異なるが、組織向性が重複する、個別の送達媒体内にパッケージングする場合、両方のベクターによりターゲティングされる組織内に限り、完全に機能的な複合体が形成される。
【１２４２】
一態様では、送達を、ｅｘ  ｖｉｖｏで達する。
【１２４３】
ＸＩＩＩ．修飾ヌクレオシド、ヌクレオチド、および核酸
修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは、核酸内、例えば、特に、ｇＲＮＡ内に存在しうるが、また、ＲＮＡの他の形態、例えば、ｍＲＮＡ内、ＲＮＡｉ内、またはｓｉＲＮＡ内にも存在しうる。本明細書で記載される「ヌクレオシド」とは、五炭糖分子（ペントースまたはリボース）もしくはその誘導体、および有機塩基、プリンもしくはピリミジン、またはこれらの誘導体を含有する化合物と規定される。本明細書で記載される「ヌクレオチド」とは、リン酸基をさらに含むヌクレオシドとして規定される。
【１２４４】
修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは、
（ｉ）ホスホジエステル骨格連結内の、非連結型リン酸酸素の一方もしくは両方、および／または連結型リン酸酸素のうちの１もしくは複数の変更、例えば、置きかえ；
（ｉｉ）リボース糖上のリボース糖の構成要素、例えば、２’ヒドロキシルの変更、例えば、置きかえ；
（ｉｉｉ）リン酸部分の、「脱リン酸化」リンカーでの、完全な置きかえ；
（ｉｖ）自然発生のヌクレオ塩基の修飾または置きかえであって、非カノニカルのヌクレオ塩基での修飾または置きかえを含む修飾または置きかえ；
（ｖ）リボース−リン酸骨格の置きかえまたは修飾；
（ｖｉ）オリゴヌクレオチドの３’末端部または５’末端部の修飾、例えば、末端リン酸基の除去、修飾、もしくは置きかえ、または部分、キャップ、もしくはリンカーのコンジュゲーション；ならびに
（ｖｉｉ）糖の修飾または置きかえ
のうちの１または複数を含みうる。
【１２４５】
上記で列挙した修飾を組み合わせて、２つ、３つ、４つ、またはこれを超える修飾を有しうる、修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドをもたらすことができる。例えば、修飾ヌクレオシドまたは修飾ヌクレオチドは、修飾糖および修飾ヌクレオ塩基を有しうる。ある実施形態では、ｇＲＮＡのどの塩基も、修飾されている、例えば、全ての塩基は、修飾リン酸基を有する、例えば、全ての修飾リン酸基は、ホスホロチオエート基である。ある実施形態では、単分子ｇＲＮＡ分子またはモジュラーｇＲＮＡ分子のリン酸基の全てまたは実質的に全ては、ホスホロチオエート基で置きかえられている。
【１２４６】
ある実施形態では、修飾ヌクレオチド、例えば、本明細書で記載される修飾を有するヌクレオチドを、核酸、例えば、「修飾核酸」へと組み込むことができる。一部の実施形態では、修飾核酸は、１つ、２つ、３つ、またはこれを超える修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、修飾核酸内の位置のうちの、少なくとも５％（例えば、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％）は、修飾ヌクレオチドである。
【１２４７】
非修飾核酸は、例えば、細胞内のヌクレアーゼによる分解を受けやすい場合がある。例えば、ヌクレアーゼは、核酸のホスホジエステル結合を加水分解しうる。したがって、一態様では、本明細書で記載される修飾核酸は、例えば、ヌクレアーゼに対する安定性を導入するように、１または複数の修飾ヌクレオシドまたは修飾ヌクレオチドを含有しうる。
【１２４８】
一部の実施形態では、修飾ヌクレオシド、修飾ヌクレオチド、および本明細書で記載される修飾核酸は、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏのいずれにおいても、細胞集団へと導入されると、生得的免疫応答の低減を呈示しうる。「生得的免疫応答」という用語は、一般に、ウイルス由来または細菌由来の一本鎖核酸を含む外因性核酸に対する細胞の応答であって、サイトカイン、特に、インターフェロンの発現および放出、ならびに細胞死の誘導を伴う応答を含む。一部の実施形態では、修飾ヌクレオシド、修飾ヌクレオチド、および本明細書で記載される修飾核酸は、パートナーと相互作用する主溝の、核酸との結合を破壊しうる。一部の実施形態では、修飾ヌクレオシド、修飾ヌクレオチド、および本明細書で記載される修飾核酸は、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏのいずれにおいても、細胞集団へと導入されると、生得的免疫応答の低減を呈示することが可能であり、また、パートナーと相互作用する主溝の、核酸との結合も破壊する。
【１２４９】
化学基の定義
本明細書で使用される「アルキル」とは、直鎖状または分枝状である、飽和炭化水素基を指すことを意図する。アルキル基の例は、メチル（Ｍｅ）、エチル（Ｅｔ）、プロピル（例えば、ｎ−プロピルおよびイソプロピル）、ブチル（例えば、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル）、ペンチル（例えば、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル）などを含む。アルキル基は、１〜約２０、２〜約２０、１〜約１２、１〜約８、１〜約６、１〜約４、または１〜約３個の炭素原子を含有しうる。
【１２５０】
本明細書で使用される「アリール」とは、例えば、フェニル、ナフチル、アントラセニル、フェナントレニル、インダニル、インデニルなど、単環式または多環式の（例えば、２つ、３つ、または４つの融合環を有する）芳香族炭化水素を指す。一部の実施形態では、アリール基は、６〜約２０個の炭素原子を有する。
【１２５１】
本明細書で使用される「アルケニル」とは、少なくとも１つの二重結合を含有する脂肪族基を指す。本明細書で使用される「アルキニル」とは、２〜１２個の炭素原子を含有する、直鎖状または分枝状の炭化水素鎖を指し、１または複数の三重結合を有することを特徴とする。アルキニル基の例は、エチニル、プロパルギル、および３−ヘキシニルを含むがこれらに限定されない。
【１２５２】
本明細書で使用される「アリールアルキル」または「アラルキル」とは、アルキルの水素原子が、アリール基により置きかえられたアルキル部分を指す。アラルキルは、１つを超える水素が、アリール基により置きかえられた基を含む。「アリールアルキル」または「アラルキル」の例は、ベンジル基、２−フェニルエチル基、３−フェニルプロピル基、９−フルオレニル基、ベンズヒドリル基、およびトリチル基を含む。
【１２５３】
本明細書で使用される「シクロアルキル」とは、３〜１２個の炭素を有する、環式、二環式、三環式、または多環式の、非芳香族炭化水素基を指す。シクロアルキル部分の例は、シクロプロピル、シクロペンチル、およびシクロヘキシルを含むがこれらに限定されない。
【１２５４】
本明細書で使用される「ヘテロシクリル」とは、複素環系の一価ラジカルを指す。代表的なヘテロシクリルは、限定せずに、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、ピロリジニル、ピロリドニル、ピペリジニル、ピロリニル、ピペラジニル、ジオキサニル、ジオキソラニル、ジアゼピニル、オキサゼピニル、ジアゼピニル、およびモルホリニルを含む。
【１２５５】
本明細書で使用される「ヘテロアリール」とは、ヘテロ芳香族環系の一価ラジカルを指す。ヘテロアリール部分の例は、イミダゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、トリアゾリル、ピロリル、フラニル、インドリル、チオフェニルピラゾリル、ピリジニル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、インドリジニル、プリニル、ナフチリジニル、キノリル、およびプテリジニルを含むがこれらに限定されない。
【１２５６】
リン酸骨格修飾
リン酸基
一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドのリン酸基は、酸素のうちの１または複数を、異なる置換基で置きかえることにより修飾することができる。さらに、修飾ヌクレオチド、例えば、修飾核酸内に存在する修飾ヌクレオチドは、非修飾リン酸部分の、本明細書で記載される修飾リン酸による、完全な置きかえを含みうる。一部の実施形態では、リン酸骨格の修飾は、非対称的な電荷分布を伴う、非帯電リンカーまたは帯電リンカーを結果としてもたらす変更を含みうる。
【１２５７】
修飾リン酸基の例は、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート（phosphoroselenate）、ボラノホスフェート（boranophosphate（borano phosphate））、ボラノホスフェート（boranophosphate（borano phosphate））エステル、ホスホン酸水素、ホスホルアミデート（phosphoramidate（phosphoroamidate））、ホスホン酸アルキルまたはホスホン酸アリール、およびホスホトリエステルを含む。一部の実施形態では、リン酸骨格部分内の、非架橋リン酸酸素原子のうちの１つを、以下の基：硫黄（Ｓ）、セレニウム（Ｓｅ）、ＢＲ３（式中、Ｒは、例えば、水素、アルキル、またはアリールでありうる）、Ｃ（例えば、アルキル基、アリール基など）、Ｈ、ＮＲ２（式中、Ｒは、例えば、水素、アルキル、またはアリールでありうる）、またはＯＲ（式中、Ｒは、例えば、アルキルまたはアリールでありうる）のうちのいずれかにより置きかえることができる。非修飾リン酸基内のリン原子は、アキラルである。しかし、非架橋酸素のうちの１つの、上記の原子または原子群のうちの１つでの置きかえは、リン原子をキラルとしうる、すなわち、このようにして修飾されたリン酸基内のリン原子は、立体中心である。ステレオジェニックのリン原子は、「Ｒ」立体配置（本明細書では、Ｒｐ）または「Ｓ」立体配置（本明細書では、Ｓｐ）を有しうる。
【１２５８】
ホスホロジチオエート（phosphorodithioate）は、非架橋酸素の両方が、硫黄により置きかえられている。ホスホロジチオエート（phosphorodithioate）内のリン中心は、アキラルであり、これは、オリゴリボヌクレオチドジアステレオマーの形成を除外する。一部の実施形態では、非架橋酸素の一方または両方に対する修飾はまた、非架橋酸素の、Ｓ、Ｓｅ、Ｂ、Ｃ、Ｈ、Ｎ、およびＯＲ（Ｒは、例えば、アルキルまたはアリールでありうる）から独立に選択される基での置きかえも含みうる。
【１２５９】
また、リン酸リンカーも、架橋酸素（すなわち、リン酸をヌクレオシドへと連結する酸素）の、窒素（架橋ホスホルアミデート（phosphoramidate（phosphoroamidate）））、硫黄（架橋ホスホロチオエート）、および炭素（架橋ホスホン酸メチレン）での置きかえにより修飾することができる。置きかえは、連結酸素の一方または両方において生じうる。
【１２６０】
リン酸基の置きかえ
リン酸基は、非リン含有コネクターにより置きかえることができる。一部の実施形態では、リン酸基の電荷を、中性部分により置きかえることができる。
【１２６１】
リン酸基を置きかえうる部分の例は、限定せずに、例えば、ホスホン酸メチル、ヒドロキシルアミノ、シロキサン、カーボネート（carbonate）、カルボキシメチル、カルバメート（carbamate）、アミド、チオエーテル、エチレンオキシドリンカー、スルホネート（sulfonate）、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、およびメチレンオキシメチルイミノを含みうる。
【１２６２】
リボリン酸骨格の置きかえ
また、核酸を模倣しうる足場であって、リン酸リンカーおよびリボース糖を、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシドまたはヌクレオチドサロゲートにより置きかえた足場も、構築することができる。一部の実施形態では、ヌクレオ塩基を、サロゲート骨格でテザリングすることができる。例は、限定せずに、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジン、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）によるヌクレオシドサロゲートを含みうる。
【１２６３】
糖修飾
修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは、糖基に対する、１または複数の修飾を含みうる。例えば、２’ヒドロキシル基（ＯＨ）は、多数の異なる「オキシ」または「デオキシ」置換基で、修飾するか、または置きかえることができる。一部の実施形態では、２’ヒドロキシル基に対する修飾は、ヒドロキシルが脱プロトン化されて、２’−アルコキシドイオンを形成することがもはやできなくなるので、核酸の安定性を増強しうる。２’−アルコキシドは、リンカーリン原子に対する、分子内の求核攻撃による分解を触媒しうる。
【１２６４】
「オキシ」−２’ヒドロキシル基修飾の例は、アルコキシまたはアリールオキシ（ＯＲ［式中、「Ｒ」は、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖でありうる］）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲ［式中、Ｒは、例えば、Ｈ、または、任意選択で、置換アルキルであることが可能であり、ｎは、０〜２０（例えば、０〜４、０〜８、０〜１０、０〜１６、１〜４、１〜８、１〜１０、１〜１６、１〜２０、２〜４、２〜８、２〜１０、２〜１６、２〜２０、４〜８、４〜１０、４〜１６、および４〜２０）の整数でありうる］を含みうる。一部の実施形態では、「オキシ」−２’ヒドロキシル基修飾は、２’ヒドロキシルを、例えば、Ｃ１〜６アルキレンまたはＣ１〜６ヘテロアルキレン架橋により、同じリボース糖の４’炭素へと接続した「ロックト」核酸（ＬＮＡ）であって、例示的な架橋がメチレン架橋、プロピレン架橋、エーテル架橋、またはアミノ架橋；Ｏ−アミノ（式中、アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、またはポリアミノでありうる）；およびアミノアルコキシ、Ｏ（ＣＨ２）ｎ−アミノ（式中、アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、またはポリアミノでありうる）を含みうる、ＬＮＡを含みうる。一部の実施形態では、「オキシ」−２’ヒドロキシル基修飾は、メトキシエチル基（ＭＯＥ）（ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３；例えば、ＰＥＧ誘導体）を含みうる。
【１２６５】
「デオキシ」修飾は、水素（すなわち、デオキシリボース糖、例えば、部分的にｄｓであるＲＮＡの突出部分における）；ハロ（例えば、ブロモ、クロロ、フルオロ、またはヨード）；アミノ（式中、アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸でありうる）；ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎＣＨ２ＣＨ２−アミノ（式中、アミノは、例えば、本明細書で記載される通りでありうる）、−ＮＨＣ（０）Ｒ（式中、Ｒは、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、または糖でありうる）、シアノ；メルカプト；アルキルチオアルキル；チオアルコキシ；ならびに任意選択で、例えば、本明細書で記載されるアミノで置換されうる、アルキル、シクロアルキル、アリール、アルケニルおよびアルキニルを含みうる。
【１２６６】
糖基はまた、リボース内の対応する炭素の立体化学配置とは逆の立体化学配置を有する、１または複数の炭素も含有しうる。したがって、修飾核酸は、例えば、アラビノースを糖として含有するヌクレオチドを含みうる。ヌクレオチド「単量体」は、糖上のΓ位、例えば、アルファ−ヌクレオシドにおいて、アルファ連結を有しうる。修飾核酸はまた、Ｃ−において、ヌクレオ塩基を欠く、「非塩基性」糖も含みうる。これらの非塩基性糖はまた、構成糖原子のうちの１または複数においても、さらに修飾されうる。修飾核酸はまた、Ｌ形態、例えば、Ｌ−ヌクレオシド内の１または複数の糖も含みうる。
【１２６７】
一般に、ＲＮＡは、酸素を有する５員環の糖基である、リボースを含む。例示的な修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは、限定せずに、リボースの酸素の置きかえ（例えば、硫黄（Ｓ）、セレニウム（Ｓｅ）、または例えば、メチレンもしくはエチレンなどのアルキレンによる）；二重結合の付加（例えば、リボースを、シクロペンテニルまたはシクロヘキセニルで置きかえる）；リボースの環縮小（例えば、シクロブタンまたはオキセタンの４員環を形成する）；リボースの環拡大（例えば、アンヒドロヘキシトール、アルトリトール、マンニトール、シクロヘキサニル、シクロヘキセニル、およびホスホルアミデート（phosphoramidate）骨格もまた有するモルホリノなど、さらなる炭素またはヘテロ原子を有する、例えば、６員環または７員環を形成する）を含みうる。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、多環形態（例えば、トリシクロ）；およびグリコール核酸（ＧＮＡ）（例えば、リボースを、ホスホジエステル結合へと接合させたグリコール単位により置きかえた、Ｒ−ＧＮＡまたはＳ−ＧＮＡ）、トレロース核酸（リボースを、ａ−Ｌ−トレオフラノシル−（３’−→２’）で置きかえたＴＮＡ）などの「非ロックト」形態を含みうる。
【１２６８】
ヌクレオ塩基に対する修飾
修飾核酸へと組み込みうる、本明細書で記載される、修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは、修飾ヌクレオ塩基を含みうる。ヌクレオ塩基の例は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）を含むがこれらに限定されない。これらのヌクレオ塩基は、修飾核酸へと組み込みうる、修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドをもたらすように、修飾するか、または完全に置きかえることができる。ヌクレオチドのヌクレオ塩基は、プリン、ピリミジン、プリン、またはピリミジン類似体から独立に選択することができる。一部の実施形態では、ヌクレオ塩基は、例えば、自然発生の塩基および塩基の合成誘導体を含みうる。
【１２６９】
ウラシル
一部の実施形態では、修飾ヌクレオ塩基は、修飾ウラシルである。修飾ウラシルを有する、例示的なヌクレオ塩基およびヌクレオシドは、限定せずに、シュードウリジン（ψ）、ピリジン−４−オン  リボヌクレオシド、５−アザ−ウリジン、６−アザ−ウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオ−ウリジン（ｓ２Ｕ）、４−チオ−ウリジン（ｓ４Ｕ）、４−チオ−プソイドウリジン、２−チオ−プソイドウリジン、５−ヒドロキシ−ウリジン（ｈｏ５Ｕ）、５−アミノアリル−ウリジン、５−ハロ−ウリジン（例えば、５−ヨード−ウリジンまたは５−ブロモ−ウリジン）、３−メチル−ウリジン（ｍ３Ｕ）、５−メトキシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、ウリジン５−オキシ酢酸（ｃｍｏ５Ｕ）、ウリジン５−オキシ酢酸メチルエステル（ｍｃｍｏ＾Ｕ）、５−カルボキシメチル−ウリジン（ｃｍｓＵ）、１−カルボキシメチル−プソイドウリジン、５−カルボキシヒドロキシメチル−ウリジン（ｃｈｍ５Ｕ）、５−カルボキシヒドロキシメチル−ウリジンメチルエステル（ｍｃｈｍ５Ｕ）、５−メトキシカルボニルメチル−ウリジン（ｍｃｍ５Ｕ）、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオ−ウリジン（ｍｃｍ５ｓ２Ｕ）、５−アミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−メチルアミノメチル−ウリジン（ｍｎｍ５Ｕ）、５−メチルアミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−メチルアミノメチル−２−セレノ−ウリジン（ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ）、５−カルバモイルメチル−ウリジン（ｎｃｍ５Ｕ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｃｍｎｍ＼ｓ２Ｕ）、５−プロピニル−ウリジン、１−プロピニル−プソイドウリジン、５−タウリノメチル−ウリジン（ｘｃｍ５Ｕ）、１−タウリノメチル−プソイドウリジン、５−タウリノメチル−２−チオ−ウリジン（Ｔｒｎ５ｓ２Ｕ）、１−タウリノメチル−４−チオ−プソイドウリジン、５−メチルウリジン（ｍ５Ｕ、すなわち、ヌクレオ塩基であるデオキシチミンを有する）、１−メチル−プソイドウリジン（ιτι’ψ）、５−メチル−２−チオ−ウリジン（ｍ５ｓ２Ｕ）、１−メチル−４−チオ−プソイドウリジン（ｍ’ｓ＼｜／）、４−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、３−メチル−プソイドウリジン（ｍ’Ｖ）、２−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、ジヒドロウンジン（Ｄ）、ジヒドロプソイドウンジン、５，６−ジヒドロウリジン、５−メチル−ジヒドロウリジン（ｍ５Ｄ）、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−ジヒドロプソイドウリジン、２−メトキシ−ウリジン、２−メトキシ−４−チオ−ウリジン、４−メトキシ−プソイドウリジン、４−メトキシ−２−チオ−プソイドウリジン、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン（ａｃｐ３Ｕ）、１−メチル−３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピルプソイドウリジン５−（イソペンテニルアミノメチル）ウリジン（ｉｎｍ５Ｕ）、５−（イソペンテニルアミノメチ］）−２−チオ−ウリジン（ｉｎｍ５ｓ２Ｕ）、ａ−チオ−ウリジン、２’−０−メチル−ウリジン（Ｕｒｎ）、５，２’−０−ジメチル−ウリジン（ｍ５Ｕｍ）、２’−０−メチル−プソイドウリジン（ψπι）、２−チオ−２’−０−メチル−ウリジン（ｓ２Ｕｍ）、５−メトキシカルボニルメチル−２’−０−メチル−ウリジン（ｍｃｍ５Ｕｍ）、５−カルバモイルメチル−２’−０−メチル−ウリジン（ｎｃｍ５Ｕｍ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−２’−０−メチル−ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕｍ）、３，２’−０−ジメチル−ウリジン（ｍ３Ｕｍ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）−２’−０−メチル−ウリジン（ｉｎｍ５Ｕｍ）、ｌ−チオ−ウリジン、デオキシチミジン、２’−Ｆ−ａｒａ−ウリジン、２’−Ｆ−ウリジン、２’−ＯＨ−ａｒａ−ウリジン、５−（２−カルボメトキシビニル）ウリジン、５−［３−（１−Ｅ−プロペニルアミノ）ウリジン、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジネス、キサンチン、およびヒポキサンチンを含む。
【１２７０】
シトシン
一部の実施形態では、修飾ヌクレオ塩基は、修飾シトシンである。修飾シトシンを有する、例示的なヌクレオ塩基およびヌクレオシドは、限定せずに、５−アザ−シチジン、６−アザ−シチジン、プソイドイソシチジン、３−メチル−シチジン（ｍ３Ｃ）、Ｎ４−アセチル−シチジン（ａｃｔ）、５−ホルミル−シチジン（ｆ５Ｃ）、Ｎ４−メチル−シチジン（ｍ４Ｃ）、５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）、５−ハロ−シチジン（例えば、５−ヨード−シチジン）、５−ヒドロキシメチル−シチジン（ｈｍ５Ｃ）、１−メチル−プソイドイソシチジン、ピロロ−シチジン、ピロロ−プソイドイソシチジン、２−チオ−シチジン（ｓ２Ｃ）、２−チオ−５−メチル−シチジン、４−チオ−プソイドイソシチジン、４−チオ−１−メチル−プソイドイソシチジン、４−チオ−１−メチル−１−デアザ−プソイドイソシチジン、１−メチル−１−デアザ−プソイドイソシチジン、ゼブラリン、５−アザ−ゼブラリン、５−メチル−ゼブラリン、５−アザ−２−チオ−ゼブラリン、２−チオ−ゼブラリン、２−メトキシ−シチジン、２−メトキシ−５−メチル−シチジン、４−メトキシ−プソイドイソシチジン、４−メトキシ−１−メチル−プソイドイソシチジン、リシジン（ｋ２Ｃ）、ａ−チオ−シチジン、２’−０−メチル−シチジン（Ｃｍ）、５，２’−０−ジメチル−シチジン（ｍ５Ｃｍ）、Ｎ４−アセチル−２’−０−メチル−シチジン（ａｃ４Ｃｍ）、Ｎ４，２’−０−ジメチル−シチジン（ｍ４Ｃｍ）、５−ホルミル−２’−０−メチル−シチジン（ｆ５Ｃｍ）、Ｎ４，Ｎ４，２’−０−トリメチル−シチジン（ｍ４２Ｃｍ）、１−チオ−シチジン、２’−Ｆ−ａｒａ−シチジン、２’−Ｆ−シチジン、および２’−ＯＨ−ａｒａ−シチジンを含む。
【１２７１】
アデニン
一部の実施形態では、修飾ヌクレオ塩基は、修飾アデニンである。修飾アデニンを有する、例示的なヌクレオ塩基およびヌクレオシドは、限定せずに、２−アミノ−プリン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノ−６−ハロ−プリン（例えば、２−アミノ−６−クロロ−プリン）、６−ハロ−プリン（例えば、６−クロロ−プリン）、２−アミノ−６−メチル−プリン、８−アジド−アデノシン、７−デアザ−アデニン、７−デアザ−８−アザ−アデニン、７−デアザ−２−アミノ−プリン、７−デアザ−８−アザ−２−アミノ−プリン、７−デアザ−２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノプリン、１−メチル−アデノシン（ｍ’Ａ）、２−メチル−アデニン（ｍ  Ａ）、Ｎ６−メチル−アデノシン（ｍ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−メチル−アデノシン（ｍｓ２ｍ６Ａ）、Ｎ６−イソペンテニル−アデノシン（ｉ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニル−アデノシン（ｍｓ２ｉ６Ａ）、Ｎ６−（ｃｉｓ−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン（ｉｏ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−（ｃｉｓ−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン（ｍｓ２ｉｏ６Ａ）、Ｎ６−グリシニルカルバモイル−アデノシン（ｇ６Ａ）、Ｎ６−トレオニルカルバモイル−アデノシン（ｔ６Ａ）、Ｎ６−メチル−Ｎ６−トレオニルカルバモイル−アデノシン（ｍ６ｔ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−トレオニルカルバモイル−アデノシン（ｍｓ２ｇ６Ａ）、Ｎ６，Ｎ６−ジメチル−アデノシン（ｍ６２Ａ）、Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイル−アデノシン（ｈｎ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイル−アデノシン（ｍｓ２ｈｎ６Ａ）、Ｎ６−アセチル−アデノシン（ａｃ６Ａ）、７−メチル−アデニン、２−メチルチオ−アデニン、２−メトキシ−アデニン、ａ−チオ−アデノシン、２’−０−メチル−アデノシン（Ａｍ）、Ｎ６，２’−０−ジメチル−アデノシン（ｍ５Ａｍ）、Ｎ６−メチル−２’−デオキシアデノシン、Ｎ６，Ｎ６，２’−０−トリメチル−アデノシン（ｍ６２Ａｍ）、１，２’−０−ジメチル−アデノシン（ｍ’Ａｍ）、２’−Ｏ−リボシルアデノシン（リン酸）（Ａｒ（ｐ））、２−アミノ−Ｎ６−メチルプリン、１−チオアデノシン、８−アジドアデノシン、２’−Ｆ−アラアデノシン、２’−Ｆ−アデノシン、２’−ＯＨ−アラアデノシン、およびＮ６−（１９−アミノ−ペンタオキサノンアデシル）−アデノシンを含む。
【１２７２】
グアニン
一部の実施形態では、修飾ヌクレオ塩基は、修飾グアニンである。修飾グアニンを有する、例示的なヌクレオ塩基およびヌクレオシドは、限定せずに、イノシン（Ｉ）、１−メチルイノシン（ｍ１Ｉ）、ワイオシン（ｉｍＧ）、メチルワイオシン（ｍｉｍＧ）、４−デメチルワイオシン（ｉｍＧ−１４）、イソワイオシン（ｉｍＧ２）、ワイブトシン（ｙＷ）、ペルオキシワイブトシン（ｏ２ｙＷ）、ヒドロキシワイブトシン（ＯHｙＷ）、非修飾ヒドロキシワイブトシン（ＯHｙＷ＊）、７−デアザグアノシン、クエオシン（Ｑ）、エポキシクエオシン（ｏＱ）、ガラクトシルクエオシン（ｇａｌＱ）、マンノシルクエオシン（ｍａｎＱ）、７−シアノ−７−デアザグアノシン（ｐｒｅＱ０）、７−アミノメチル−７−デアザグアノシン（ｐｒｅＱ１）、アルカエオシン（Ｇ＋）、７−デアザ−８−アザグアノシン、６−チオグアノシン、６−チオ−７−デアザグアノシン、６−チオ−７−デアザ−８−アザグアノシン、７−メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）、６−チオ−７−メチルグアノシン、７−メチルイノシン、６−メトキシグアノシン、１−メチルグアノシン（ｍ１Ｇ）、Ｎ２−メチルグアノシン（ｍ２Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２−ジメチルグアノシン（ｍ２２Ｇ）、Ｎ２，７−ジメチルグアノシン（ｍ２，７Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２，７−ジメチルグアノシン（ｍ２，２，７Ｇ）、８−オキソグアノシン、７−メチル−８−オキソグアノシン、１−メチル−６−チオグアノシン、Ｎ２−メチル−６−チオグアノシン、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−６−チオグアノシン、ａ−チオグアノシン、２’−Ｏ−メチルグアノシン（Ｇｍ）、Ｎ２−メチル−２’−Ｏ−メチルグアノシン（ｍ２Ｇｍ）、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−２’−Ｏ−メチルグアノシン（ｍ２２Ｇｍ）、１−メチル−２’−Ｏ−メチルグアノシン（ｍ１Ｇｍ）、Ｎ２，７−ジメチル−２’−Ｏ−メチルグアノシン（ｍ２，７Ｇｍ）、２’−Ｏ−メチルイノシン（Ｉｍ）、１，２’−Ｏ−ジメチルイノシン（ｍ１Ｉｍ）、０６−フェニル−２’−デオキシイノシン、２’−Ｏ−リボシルグアノシン（リン酸）（Ｇｒ（ｐ））、１−チオグアノシン、Ｏ６−メチルグアノシン、０６−メチル−２’−デオキシグアノシン、２’−Ｆ−アラグアノシン、および２’−Ｆ−グアノシンを含む。
【１２７３】
修飾ｇＲＮＡ
一部の実施形態では、修飾核酸は、修飾ｇＲＮＡでありうる。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、３’末端部において修飾することができる。この実施形態では、ｇＲＮＡは、Ｕリボースの３’末端部において修飾することができる。例えば、Ｕリボースの２つの末端のヒドロキシル基を、アルデヒド基へと酸化させ、かつ、これと共時的に、リボース環を開裂させて、修飾ヌクレオシドをもたらすことができるが、この場合、Ｕは、非修飾ウリジンの場合もあり、修飾ウリジンの場合もある。
【１２７４】
別の実施形態では、３’末端のＵを、２’３’環状リン酸エステルで修飾することができ、この場合、Ｕは、非修飾ウリジンの場合もあり、修飾ウリジンの場合もある。一部の実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、例えば、本明細書で記載される修飾ヌクレオチドのうちの１または複数を組み込むことにより、分解に対して安定化させうる３’ヌクレオチドを含有しうる。この実施形態では、例えば、ウリジンを、修飾ウリジン、例えば、５−（２−アミノ）プロピルウリジン、および５−ブロモウリジン、または本明細書で記載される修飾ウリジンのうちのいずれかで置きかえることができ、アデノシンおよびグアノシンを、修飾アデノシンおよび修飾グアノシン、例えば、８位における修飾、例えば、８−ブロモグアノシン、または本明細書で記載される修飾アデノシンもしくは修飾グアノシンのうちのいずれかで置きかえることができる。一部の実施形態では、デアザヌクレオチド、例えば、７−デアザ−アデノシンを、ｇＲＮＡへと組み込むことができる。一部の実施形態では、Ｏ−アルキル化ヌクレオチドおよびＮ−アルキル化ヌクレオチド、例えば、Ｎ６−メチルアデノシンを、ｇＲＮＡへと組み込むことができる。一部の実施形態では、例えば、２’ＯＨ基を、Ｈ、−ＯＲ、−Ｒ（式中、Ｒは、例えば、メチル、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、または糖でありうる）、ハロ、−ＳＨ、−ＳＲ（式中、Ｒは、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、または糖でありうる）、アミノ（式中、アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸でありうる）；またはシアノ（−ＣＮ）から選択される群により置きかえた、糖修飾リボヌクレオチドを組み込むことができる。一部の実施形態では、リン酸骨格は、本明細書で記載される通り、例えば、ホスホロチオエート（phosphorothioate（phosphothioate））基で修飾することができる。一部の実施形態では、ｇＲＮＡの突出領域内のヌクレオチドは、各々独立に、２−Ｆ  ２’−Ｏ−メチルチミジン（Ｔ）、２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン（Ｔｅｏ）、２’−Ｏ−メトキシエチルアデノシン（Ａｅｏ）、２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルシチジン（ｍ５Ｃｅｏ）、およびこれらの任意の組合せなどの２’−糖修飾ヌクレオチドを含むがこれらに限定されない、修飾ヌクレオチドまたは非修飾ヌクレオチドでありうる。
【１２７５】
ある実施形態では、ＲＮＡ分子、例えば、ｇＲＮＡ分子の一本鎖突出内のヌクレオチドの１もしくは複数または全ては、デオキシヌクレオチドである。
【１２７６】
候補Ｃａｓ分子、例えば、Ｃａｓ９分子、候補ｇＲＮＡ分子、候補Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体、および候補ＣＲＩＳＰＲ系は、当技術分野で公知の方法、または本明細書で記載される方法により査定することができる。例えば、Ｃａｓ９分子エンドヌクレアーゼ活性を査定するための例示的な方法については、例えば、Jinek el al., SCIENCE 2012; 337(6096):8 16-821において記載されている。
【実施例】
【１２７７】
[実施例１]
アッセイ
ガイド選択
初期のガイド選択は、目的の領域内のＰＡＭを同定するために、ヒト基準ゲノムと、使用者により規定される目的のゲノム領域（例えば、遺伝子、遺伝子のエクソン、遺伝子のイントロン、非コード調節領域など）とを使用して、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで実施した。同定された各ＰＡＭについて、解析を実施し、統計を報告した。ｇＲＮＡ分子をさらに選択し、当技術分野で公知の多数の基準に基づきランク付けした。次いで、ｇＲＮＡ分子を、本明細書で記載される切断効率と、インデル形成とについて、本明細書で記載される通り調べた。
【１２７８】
ＣＲＩＳＰＲ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の作出
単離し、凍結させた汎Ｔ細胞を、０日目に、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（ＣＤ３／ＣＤ２８  ＣＴＳ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）４３２０５Ｄ）により、解凍および活性化させた。活性化Ｔ細胞を、３日目まで培養し、次いで、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を、あらかじめ複合体化させたｇＲＮＡ／Ｃａｓ９リボ核タンパク質（「ＲＮＰ」）の形態に誘導するように電気穿孔した。ＲＮＰを形成するために、全てのＲＮＡ試料を、９５℃で加熱した。化膿連鎖球菌（S. pyogenes）ＣＡＳ９タンパク質（ＮＬＳ  ＣＡＳ９  ｉＰＲＯＴ１０６１５４、３７μＭ）を、緩衝液中で希釈してから、ｔｒａｃｒＲＮＡ（配列：ＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵ（配列番号８５）を有する；ＩＤＴ）を、これへと添加した。ＣＡＳ９タンパク質を、ｔｒａｃｒＲＮＡと混合した後で、ｃｒＲＮＡを添加した（各場合に、各ｃｒＲＮＡは、配列ｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎ  ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵ（配列番号１０５６２）［配列中、ｎ残基は、表示のターゲティングドメイン配列の、２０のリボ核酸残基を表す］を含んだ；ＩＤＴ）。単一のｇＲＮＡ分子を使用する場合、そうでないことが指し示されない限りにおいて、ｇＲＮＡ分子の配列は、ｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（配列番号１０５６３）［配列中、ｎ残基は、表示のターゲティングドメイン配列の、２０のリボ核酸残基を表す］であった。次いで、あらかじめ複合体化させたＲＮＰを、合計２０万個の細胞へと添加したところ、ＲＮＰ濃度は、１．１μＭであった。電気穿孔は、Ｎｅｏｎ（登録商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  １００μＬ  Ｋｉｔ（ＭＰＫ１００９６）を、１６００Ｖ、１０ミリ秒間、３つのパルスで使用する、ｎｅｏｎ電気穿孔機により実施した。細胞を、５％のＣＯ２を伴う３７℃で、Ｔ細胞完全培地を使用することにより、さらに７日間にわたり、培養物中に保った。
【１２７９】
一次ガイドスクリーニングのための、ＨＥＫ−２９３＿Ｃａｓ９ＧＦＰ細胞のトランスフェクション
Ｃａｓ９ＧＦＰを発現するＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ−２９３＿Ｃａｓ９ＧＦＰ）のトランスフェクションを、標的特異的ｃｒＲＮＡの一次スクリーニングのために使用しうる。本実施例では、例えば、本明細書で記載される、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏオフターゲットの検出を含む、規定された基準を使用して、標的特異的ｃｒＲＮＡをデザインし、一次スクリーニングのために選択する。選択されたｃｒＲＮＡを化学合成し、９６ウェルフォーマットで送達する。ＨＥＫ−２９３−Ｃａｓ９ＧＦＰ細胞に、配列番号７９のフラッグポール領域を、配列番号６５のストックｔｒＲＮＡと、１：１の比で含む標的ｃｒＲＮＡを形質導入する。トランスフェクションは、製造元のプロトコール（ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ  Ｄｕｏ、ＧＥ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ；またはＲＮＡｉＭａｘ、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従うリポフェクション技術を使用して媒介する。トランスフェクト細胞は、リポフェクションの２４時間後に溶解させ、Ｔ７Ｅ１アッセイおよび／または次世代シーケンシング（ＮＧＳ；下記）により、溶解物内の編集（例えば、切断）を検出する。
【１２８０】
Ｔ７Ｅ１アッセイ
Ｔ７Ｅ１アッセイを、Ｃａｓ９によるＤＮＡ切断後において、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を介して創出された挿入、欠失、および置換など、ゲノムＤＮＡ内の突然変異イベントを検出するのに使用する（Cho et al., Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease. Nature Biotechnology. 2013; 31, 230-232を参照されたい）。
【１２８１】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９による切断のためにターゲティングされたゲノムＤＮＡ領域を、ＰＣＲにより増幅し、９５℃で１０分間にわたり変性させ、次いで、１秒間当たり０．５℃で、９５℃から、２５℃へと低下させることにより、再アニールさせた。増幅される領域内に突然変異が存在する場合は、ＤＮＡは、組み合わされて、ヘテロ二重鎖を形成する。次いで、再アニールさせたヘテロ二重鎖を、Ｔ７Ｅ１（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で、３７℃、１時間にわたり消化する。Ｔ７Ｅ１エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡミスマッチ、ヘテロ二重鎖を認識し、二本鎖ＤＮＡにニックを形成し、これらの部位において、二本鎖切断を発生させる。Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して、結果として得られるＤＮＡ断片を解析し、定量化して、切断効率を決定する。
【１２８２】
オンターゲット切断効率およびインデルの形成についての、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）および解析
ゲノム内の編集（例えば、切断）標的位置の効率を決定するために、ディープシーケンシングを活用して、非相同末端結合により導入された挿入および欠失の存在を同定する。
【１２８３】
まず、ＰＣＲプライマーを、標的部位の近傍においてデザインし、目的のゲノム領域を、ＰＣＲで増幅する。製造元のプロトコール（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）に従い、さらなるＰＣＲを実施して、シーケンシングに必要な化学反応を追加する。次いで、単位複製配列を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ装置上でシーケンシングする。次いで、品質スコアが低いリードを消失させた後で、リードを、ヒト基準ゲノム（例えば、ｈｇ３８）に対してアライメントする。結果として得られる、基準ゲノムへとマップされたリードを含有するファイル（ＢＡＭファイル）から、目的の標的領域と重複するリードを選択し、挿入または欠失を含有するリードの数と対比した野生型リードの数を計算する。次いで、編集百分率を、野生型を含むリードの総数に対する、挿入または欠失を伴うリードの総数として規定する。編集から生じる挿入および／または欠失のパターンを決定するために、インデルを伴う、アライメントされたリードを選択し、所与のインデルを伴うリードの数を合計する。次いで、この情報を、リストとして表示するほか、各インデルの頻度を表すヒストグラムの形態でも視覚化する。
【１２８４】
ＲＮＰの作出
ｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡ（ｄｇＲＮＡの場合）、またはキメラｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡの場合）の、Ｃａｓ９タンパク質への付加は、ｃｒＲＮＡにより指定される標的領域への結合と、標的ゲノムＤＮＡの特異的切断とを媒介する、活性のＣａｓ９リボヌクレオタンパク質複合体（ＲＮＰ）の形成を結果としてもたらす。この複合体は、ｔｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡの、Ｃａｓ９へのロードであって、Ｃａｓ９に対して、ｄｓＤＮＡに結合し、これを切断することを可能とするコンフォメーション変化を引き起こすと考えられるロードにより形成する。
【１２８５】
ｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡを、９５℃で２分間にわたり、個別に変性させ、室温へと至らせる。Ｃａｓ９タンパク質（１０ｍｇ／ｍｌ）を、５×のＣＣＥ緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、５％グリセロール）へと添加し、これに、ｔｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡを、添加し（別個の反応）、３７℃で１０分間にわたりインキュベートし、これにより、活性のＲＮＰ複合体を形成する。複合体を、電気穿孔および他の方法により、ＨＥＫ−２９３細胞およびＣＤ３＋  Ｔ細胞を含む、多種多様な細胞へと送達する。
【１２８６】
Ｔ細胞へのＲＮＰの送達
ＣＤ３＋Ｔ細胞は、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞およびＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞を含む、複数のＴ細胞集団から構成される。これらの細胞は、全血液から単離することもでき、白血球アファレーシス試料から単離することもできる。Ｃａｓ９媒介型編集を使用して、患者のＴ細胞を操作することにより、がん性細胞を特異的にターゲティングし、免疫原性を低下させるように、Ｔ細胞を改変することができる。本実施例では、Ｃａｓ９  ＲＮＰ、例えば、ＴＥＴ２イントロンをターゲティングするＣａｓ９  ＲＮＰを、Ｔ細胞内に送達するのに使用される基礎的方法について記載する。このプロトコールを、異なるＴ細胞標的（例えば、本明細書で提供されるＴ細胞標的のうちのいずれか）に適応させるには、ＲＮＰ内のターゲティングｃｒＲＮＡを変化させさえすればよいであろう。
【１２８７】
まず、Ｔ細胞を、市販のキット（例えば、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）Ｈｕｍａｎ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して、Ｌｅｕｋｏｐａｋから濃縮する。濃縮されたＴ細胞を、アリコート分割し、その後の使用のために凍結する（バイアル１つ当たり１０×１０６個で）。その後、必要に応じて、バイアルを解凍し、Ｔ細胞培地（ＲＰＭＩ  １６４０、ＦＢＳ、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳ緩衝液、２−メルカプトエタノール、および、任意選択のＩＬ２）中に、３：１の比のＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加することにより、またはＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ  Ｈｕｍａｎ  ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して活性化させる。本明細書で記載される通りに、ＲＮＰを作出し、Ｐ３緩衝液中に再懸濁させた、約５０，０００〜１００，０００個のＣＤ３＋  Ｔ細胞へと添加し、ＡｍａｘａヌクレオフェクションプログラムＥＯ−１１５を使用してヌクレオフェクトする。ヌクレオフェクション直後に、Ｔ細胞培地を、細胞へと添加し、２４時間にわたり、またはこれを超えて培養する。
【１２８８】
当技術分野では、結果として得られるＣＡＲ  Ｔ細胞集団の機能についてアッセイするためのアッセイを含む、さらなるアッセイ、例えば、サイトカイン産生アッセイ、Ｔ細胞増殖アッセイが公知であり、本明細書でも記載される。例えば、参照によりその全体において組み込まれる、国際公開第２０１７０４９１６６号パンフレットを参照されたい。
【１２８９】
[実施例２]
Ｃａｓ９変異体の査定
ＣＤ３４＋造血幹細胞内の査定
本発明者らは、初代ヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）内で、ベータ−２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子をノックアウトするそれらの効率を測定することにより、１４の精製化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）Ｃａｓ９（ＳＰｙＣａｓ９）タンパク質について査定した。これらのタンパク質を、３つの群へと分けた。第１の群は、選択性が改善されたＳＰｙＣａｓ９変異体からなった（Slaymaker et al. 2015, Science 351: 84（ｅ１．０、ｅ１．１、およびＫ８５５Ａ）；Kleinstiver et al. 2016, Nature 529: 490（ＨＦ））。第２の群は、異なる数および／または位置のＳＶ４０核局在化シグナル（ＮＬＳ）と、切断型ＴＥＶ部位を伴うかまたは伴わない、６×ヒスチジン（Ｈｉｓ６）タグ（配列番号１０８）または８×ヒスチジン（Ｈｉｓ８）タグ（配列番号１０９）とを伴う野生型ＳＰｙＣａｓ９、ならびに構造研究（Nishimasu et al. 2014, Cell 156:935）で、Ｃａｓ９を安定化させることが報告されている、２つのシステイン置換（Ｃ８０Ｌ、Ｃ５７４Ｅ）を伴うＳＰｙＣａｓ９タンパク質からなった。第３の群は、異なる工程により産生された、同じ組換えＳＰｙＣａｓ９（図１）からなった。Ｂ２Ｍノックアウトは、ＦＡＣＳおよび次世代シーケンシング（ＮＧＳ）により決定した。
【１２９０】
方法
材料
１．Ｎｅｏｎ電気穿孔装置（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＭＰＫ５０００）
２．Ｎｅｏｎ電気穿孔キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＭＰＫ１０２５）
３．ｃｒＲＮＡ（配列番号７９へと融合させた、Ｂ２Ｍのターゲティングドメインを含む）
４．ｔｒａｃｒＲＮＡ（配列番号６５）
５．Ｃａｓ９保存緩衝液：２０ｍＭのトリス−Ｃｌ、ｐＨ８．０、２００ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２
６．骨髄由来ＣＤ３４＋  ＨＳＣ（Ｌｏｎｚａ；２Ｍ−１０１Ｃ）
７．細胞培養培地（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＳｔｅｍＳｐａｍ  ＳＦＥＭ  ＩＩおよびＳｔｅｍＳｐａｍ  ＣＣ−１００）
８．ＦＡＣＳ洗浄緩衝液：ＰＢＳに２％のＦＣＳ
９．ＦＡＣＳブロック緩衝液：ＰＢＳ  １ｍＬ当たり０．５ｕｇのマウスＩｇＧ、１５０ｕｇのＦｃブロック、２０ｕＬのＦＣＳを添加する
１０．Ｃｈｅｌｅｘ懸濁液：Ｈ２Ｏ中に１０％のＣｈｅｌｅｘ  １００（ＢｉｏＲａｄ、型番１４２−１２５３）
１１．抗Ｂ２Ｍ抗体：Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、型番３１６３０４
【１２９１】
工程
Ｌｏｎｚａの推奨に従い、細胞を解凍し、成長させ、２〜３日ごとに培地を添加する。５日目に、細胞を、２００×ｇで、１５分間にわたりペレット化させ、ＰＢＳで１回洗浄し、細胞を、ＮＥＯＮキットによるＴ緩衝液により、１ｕＬ当たり２×１０４個で再懸濁させ、氷上に置く。Ｃａｓ９タンパク質を、Ｃａｓ９保存緩衝液で、５ｍｇ／ｍｌまで希釈する。ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを、Ｈ２Ｏで、１００ｕＭへと再構成する。ＣＡＳ９タンパク質、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの各々０．８ｕＬずつを、０．６ｕＬのＣａｓ９保存緩衝液と混合することにより、リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体を作製し、室温で１０分間にわたりインキュベートする。７ｕＬのＨＳＣを、ＲＮＰ複合体と、２分間にわたり混合し、１０ｕＬの全体を、Ｎｅｏｎピペットチップへと移し、１７００Ｖ、２０ミリ秒、および１パルスで電気穿孔する。電気穿孔の後、細胞を、５％のＣＯ２、３７℃であらかじめ較正した１ｍｌの培地を含有する２４ウェルプレートのウェルへと速やかに移す。電気穿孔の７２時間後、ＦＡＣＳ解析およびＮＧＳ解析のために、細胞を採取する。
【１２９２】
ＦＡＣＳ：２５０ｕＬの細胞を、２４ウェルプレートの各ウェルから、９６ウェルＵ字底プレートのウェルへと取り込み、細胞をペレット化する。２％のＦＣＳ（ウシ胎仔血清）−ＰＢＳで１回洗浄する。５０ｕＬのＦＡＣＳブロック緩衝液を、細胞へと添加し、氷上で１０分間にわたりインキュベートし、１ｕＬのＦＩＴＣ標識Ｂ２Ｍ抗体を添加し、３０分間にわたりインキュベートする。１５０ｕＬのＦＡＣＳ洗浄緩衝液で１回洗浄するのに続き、２００ｕＬのＦＡＣＳ洗浄緩衝液で、さらに１回洗浄する。細胞を、ＦＡＣＳ解析のために、２００ｕＬのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させた。
【１２９３】
ＮＧＳ試料の調製：２５０ｕＬの細胞懸濁液を、２４ウェルプレートの各ウェルから、１．５ｍｌのエッペンドルフ管へと移し、１ｍＬのＰＢＳを添加し、細胞をペレット化させる。１００ｕＬのＣｈｅｌｅｘ懸濁液を添加し、９９℃で８分間にわたりインキュベートし、１０秒間にわたりボルテックスするのに続き、９９℃で８分間にわたりインキュベートし、１０秒間にわたりボルテックスする。１０，０００×ｇで３分間にわたり遠心分離することにより、樹脂の下方にペレット化させ、上清溶解物を、ＰＣＲのために使用する。４ｕＬの溶解物を採取し、Ｔｉｔａｎｉｕｍ  ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ；型番６３９２０８）を使用して、Ｂ２Ｍ  ｇＲＮＡの標的配列を挟むプライマーによるＰＣＲ反応を行い、製造元の指示書に従う。以下のＰＣＲ条件：９８℃で５分間の１サイクル；９５℃で１５秒間、６２℃で１５秒間、および７２℃で１分間の３０サイクル；ならびに、最後に、７２℃で３分間の１サイクルを使用する。ＰＣＲ産物を、ＮＧＳのために使用した。
【１２９４】
統計学的解析：ＦＡＣＳによるＢ２Ｍ  ＫＯ細胞の百分率、およびＮＧＳによるインデルの百分率を使用して、ＣＡＳ９切断効率について査定する。Ｃａｓ９を固定効果として、実験をデザインした。各実験を、ネスト化ランダム効果として、ドナー内でネスト化させる。こうして、ＦＡＣＳデータおよびＮＧＳデータを解析するために、混合線形モデルを適用した。
【１２９５】
結果
実験およびドナー変動を標準化するために、本発明者らは、野生型ＳＰｙＣａｓ９を挟む、２つのＳＶ４０  ＮＬＳと、タンパク質のＣ末端におけるＨｉｓ６タグ（配列番号１０８）とを伴う、元のデザインであるｉＰｒｏｔ１０５０２６に対して、各タンパク質の相対活性をグラフ化した（図１）。統計学的解析は、基準Ｃａｓ９タンパク質と比較して、ｉＰｒｏｔ１０５０２６、ｉＰｒｏｔ１０６３３１、ｉＰｒｏｔ１０６５１８、ｉＰｒｏｔ１０６５２０、およびｉＰｒｏｔ１０６５２１が、ＨＳＣ内のＢ２Ｍのノックアウトにおいて、それほど異ならないのに対し、他の被験変異体（ＰＩＤ４２６３０３、ｉＰｒｏｔ１０６５１９、ｉＰｒｏｔ１０６５２２、ｉＰｒｏｔ１０６５４５、ｉＰｒｏｔ１０６６５８、ｉＰｒｏｔ１０６７４５、ｉＰｒｏｔ１０６７４６、ｉＰｒｏｔ１０６７４７、ｉＰｒｏｔ１０６８８４）は、ＨＳＣ内のＢ２Ｍのノックアウトにおいて、基準ｉＰｒｏｔ１０５０２６と、非常に著明に異なることを示す。本発明者らは、Ｈｉｓ６タグ（配列番号１０８）の、Ｃ末端から、Ｎ末端への移動（ｉＰｒｏｔ１０６５２０）が、タンパク質の活性に影響を及ぼさないことを見出した（図１）。１つのＮＬＳは、タンパク質のＣ末端に置かれた場合に限り、活性を維持するのに十分であった（ｉＰｒｏｔ１０６５２１対ｉＰｒｏｔ１０６５２２；図１）。工程１により精製されたタンパク質は、工程２および３によるタンパク質より、一貫して高いノックアウト効率を有した（ｉＰｒｏｔ１０６３３１対ｉＰｒｏｔ１０６５４５およびＰＩＤ４２６３０３；図１）。一般に、選択性の改善が報告されたＳＰｙＣａｓ９変異体は、野生型ＳＰｙＣａｓ９ほど活性ではなかった（ｉＰｒｏｔ１０６７４５、ｉＰｒｏｔ１０６７４６、およびｉＰｒｏｔ１０６７４７；図１）。興味深いことに、ｉＰｒｏｔ１０６８８４は、ターゲティング部位を切断しなかった。これは、この変異体が、哺乳動物細胞内の正規のターゲティング部位のうちの最大で２０％を切断できなかったという、Kleinstiver et alによる報告と符合する（Kleinstiver et al. 2016, Nature 529: 490）。最後に、２つのシステイン置換を伴うＣａｓ９変異体（ｉＰｒｏｔ１０６５１８）は、高レベルの酵素活性を維持した（図１）。
【１２９６】
Ｔ細胞内の査定
方法
これらの実験では、表１４に示される、異なる化膿連鎖球菌（S. Pyogenes）Ｃａｓ９変異体を使用した。また、構造も、図１に示す。
【１２９７】
【表１６】
2020513832.tif 000336
【１２９８】
ＰＢＭＣは、Ｆｉｃｏｌｌを使用する遠心分離法を使用することにより、ヒト血液（Ｈｅｍａｃａｒｅ／ＡＬＬ  Ｃｅｌｌｓから得られる）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  型番１７−１４４０−０３）から単離した。全Ｔ細胞は、ｈｕｍａｎ  Ｐａｎ  Ｔ  ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  型番１３０−０９６−５３５）を使用して、これらのＰＢＭＣから単離した。これらの細胞をアリコート分割し、ＣＲＹＯＳＴＯＲ  ＣＳ１０培地（Ｂｉｏｌｉｆｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ−２１０１０２）を使用して凍結させ、液体窒素中に保管した。次いで、これらの凍結させた細胞アリコートを、摂氏３７度の水浴中で、２０秒間にわたり解凍し、次いで、１０ｍｌの、あらかじめ温められたＴ細胞培地中の５０ｍｌのコニカルチューブへと移し、摂氏２４度、３００ｒｐｍで、５〜１０分間にわたり遠心分離して、凍結培地を除去し、あらかじめ温めたＴ細胞培地と共に再懸濁させた。次いで、これらを、ビーズ対細胞比を３：１とする、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（ＤｙｎａＢｅａｄｓ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  型番１１１．４１Ｄ）を使用し、１ｍｌ当たり５０万個の細胞濃度を保つことにより活性化させた。
【１２９９】
ビーズによる活性化後３日目に、細胞２００，０００個を、電気穿孔のために使用する。Ｔ細胞のゲノム編集のために使用されるＲＮＰ複合体は、Ｃａｓ９タンパク質対ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃＲＮＡ）の１：２のモル比を使用して形成した。１００μＭのｃｒＲＮＡ（［ターゲティングドメイン］−［配列番号７９］）、および１００μＭのｔｒａｃｒＲＮＡ（配列番号６５）を、個別に、９５℃で２分間にわたり変性させ、室温へと冷却した。５μＬの最終容量中、濃度を５．９μｇ／μＬとするＣａｓ９タンパク質１．４μＬを、１．６μＬの反応緩衝液（２０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０；２００ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２）と混合し、１００μＭのｔｒａｃｒＲＮＡ  １μＬと、室温で混合した。次に、１００μＭのｃｒＲＮＡ  １μＬを、添加し、混合し、３７℃で、１０分間にわたりインキュベートした。ＴＲＡＣおよびＢ２Ｍをターゲティングする、高効率ｇＲＮＡを使用した。これらの高濃度のＲＮＰを使用して、ＲＮＰ系列希釈液の試料を作出した。次いで、これらのＲＮＰ希釈液を使用して、１０ｕｌのＴ緩衝液（Ｎｅｏｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  １０ｕｌ  Ｋｉｔ）中の細胞２００，０００個と共に混合した。電気穿孔は、Ｎｅｏｎ（登録商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  １０μＬ  Ｋｉｔ（ＭＰＫ１０９６）を、１６００Ｖ、１０ミリ秒間、３つのパルスで使用する、Ｎｅｏｎ電気穿孔機により実施した。細胞は、抗生剤を伴わないＴ細胞培地中で培養した。細胞を各試料から採取し、それらを、ビーズから解離させるようにピペッティングし、９６ウェルプレート用磁石を使用することにより、ビーズを除去し、０．５％のＢＳＡ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ−型番１３０−０９１−３７６）を伴う、１００ｕｌのＦＡＣＳ緩衝液（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＭＡＣＳ緩衝液；型番１３０−０９２−９８７）と共に遠心分離して、細胞を洗浄した。次いで、細胞を、氷上、１００ｕｌのＦＡＣＳ緩衝液中で希釈された、異なる抗体と共に、３０分間にわたりインキュベートした。次いで、細胞を、２００ｕｌのＦＡＣＳ緩衝液で、２回にわたり洗浄した。次いで、細胞を、１５０ｕｌのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させ、ＢＤ  ５  ｌｅｓｅｒ  Ｆｏｒｔｅｓｓａにかけた。ＴＣＲの発現は、抗ＣＤ３−ＰｅｒｃｐＣｙ５．５（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；４５−００３７−４２）を使用することにより検出し、Ｂ２Ｍの発現は、抗Ｂ２Ｍ−ＡＰＣ（３１６３１２  Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用することにより検出した。フローサイトメトリーデータは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して解析した。
【１３００】
結果
低濃度のＲＮＰの作出と、最高の編集効率とは、ＲＮＰを、高濃度で作出し、次いで、所望の濃度へと希釈する場合に、良好になされた。６つの異なるＣａｓ９タンパク質を、初代Ｔ細胞内のＢ２Ｍガイドを使用する編集効率について調べた。編集効率は、フローサイトメトリーによる、Ｂ２Ｍタンパク質の、細胞表面における検出を使用して測定し、結果を、ＲＮＰによる電気穿孔の３日後において、ＲＮＰを示された濃度（Ｘ軸）とするときの、図２（Ｙ軸；Ｂ２Ｍの編集％）に示す。異なる被験Ｃａｓ９タンパク質を、それらの「ｉｐｒｏｔ」ＩＤにより表示する（図１および表１４を参照されたい）。結果を、図２に示す。これらのデータは、これらのＣａｓ９変異体の全ては、活性であるが、Ｃａｓ９タンパク質１０６５２１、１０６５１８、および１０６１５４（また、１０５０２６とも称する）は、ＲＮＰを低濃度とするときの、それらの高活性により証拠立てられる通り、Ｔ細胞内でも高活性を示すことを指し示す。次に、Ｘ軸上に表示される、ＲＮＰの異なる濃度を使用することにより、Ｂ２ＭターゲティングガイドであるＲＮＡ（図３、左パネル）またはＴＲＡＣターゲティングガイド（図３、右パネル）を使用して、示された２つの異なるＣａｓ９タンパク質である、１０６８８４または１０６１５４（また、１０５０２６とも称する）を、編集効率について調べた。編集効率（編集％）は、フローサイトメトリーにより、Ｂ２Ｍ（図３、左パネル）、またはＣＤ３イプシロン抗体を使用するＴＣＲ（図３、右パネル）の、細胞表面発現の喪失を測定することにより測定した。
【１３０１】
[実施例３]
初代ヒトＴ細胞内の、ＴＥＴ２のイントロン９〜１０における、ＥＦ１α−ＢＣＭＡ１０−ＣＡＲのターゲティング
ｇＲＮＡのデザイン
ＴＥＴ２のイントロン９〜１０をターゲティングする、ＳＰｙＣａｓ９のためのｇＲＮＡをデザインした（例えば、表１、表２を参照されたい）。一部の実施形態では、これらの配列を、ｄｇＲＮＡとして合成することができる。一部の実施形態では、これらの配列を、ｓｇＲＮＡとして合成することができる。
【１３０２】
配列番号１０１４８、１０１４９、１０２９０、１０２０９、１０２２４、１０２１２、１０３１７、１０３１８、１０２２５、１０１８４、１０１８５、１０１８８、１０１８７、１０２９２、１０１５１、１０５０９、１０２８１、または１０１７７を含むターゲティングドメインを含むｇＲＮＡ分子を、初代ヒトＴ細胞内の切断効率をスクリーニングするために、二重ｇＲＮＡフォーマット（ｃｒＲＮＡ）で合成した。これらのｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡのターゲティング部位の５’末端部および３’末端部から、２００ｂｐ以内に存在する、３０ｂｐを超える長さのリピート配列を含有しなかった。例えば、図４を参照されたい。
【１３０３】
ｇＲＮＡのスクリーニング
ｃｒＲＮＡを合成し、１００ｕＭのｄｄＨ２Ｏ中で再構成した。ＴｒａｃｒＲＮＡ（ＧＥ／Ｄｈａｍａｒｃｏｎ、型番Ｕ−００２００５−２０）を、１００ｕＭのｄｄＨ２Ｏ中で再構成した。低温保存された、初代正常ヒト末梢血ＣＤ３＋Ｔリンパ球５×１０６個（ＡｌｌＣｅｌｌｓ、型番ＰＢ００９−１Ｆ）を、０日目に解凍し、２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ２（型番２００−０２−５０ｕｇ、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）および２ｍＭのＧｌｕｔａＭａｘ（３５０５０−０６１、Ｇｉｂｃｏ）を補充したＸ−ＶＩＶＯ１５培地（Ｌｏｎｚａ、型番０４−７４４Ｑ）を伴う６ウェルプレート内、１ｍｌ当たり１×１０６個で播種した。細胞を、ビーズ／細胞比を３：１とするＤｙｎａｂｅａｄｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｔ−ｅｘｐａｎｄｅｒ  ＣＤ３／ＣＤ２８（型番１１１４１Ｄ、Ｇｉｂｃｏ）により、３日間にわたり活性化させた。
【１３０４】
３日目に、細胞を洗浄し、Ｔ緩衝液（Ｎｅｏｎ電気穿孔緩衝液）中、１ｍｌ当たりの細胞２．５×１０７個で再懸濁させた。１ｕＬのＮＬＳ−Ｓｐｙ（ｗｔ）Ｃａｓ９−ＮＬＳ−Ｈｉｓ６（配列番号１１１）（配列番号１０８として開示された「Ｈｉｓ６」）（６．２ｍｇ／ｍｌ、ｉＰｒｏｔ１０６３３１）、１ｕＬのｃｒＲＮＡ（１００ｕＭ）、および１ｕＬのＴｒａｃｒＲＮＡ（１００ｕＭ）を混合し、室温で、５分間にわたりインキュベートすることにより、ＲＮＰの形成を実施した。１０ｕＬの細胞を、５ｕＬのＲＮＰと混合し、室温で、２〜３分間にわたりインキュベートした。
【１３０５】
電気穿孔は、Ｎｅｏｎ（登録商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  １００μＬ  Ｋｉｔ（ＭＰＫ１００９６）を、１６００Ｖ、１０ミリ秒間、３つのパルスで使用する、Ｎｅｏｎ電気穿孔機により実施した。細胞を、９６ウェルプレート内、２００μＬ当たりの細胞１．６×１０５個で播種し、５％のＣＯ２を伴い、３７℃で培養した。
【１３０６】
電気穿孔の７２時間後、磁石により、細胞からビーズを除去した。細胞約１０万〜１５万個をスピンダウンし、プロテイナーゼＫ（１００ｎｇ／ｍｌ）を伴う、約５０μＬの溶解緩衝液（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、０．０５％のＳＤＳ）を使用して、細胞溶解物を抽出した。プライマーおよびＴｉｔａｎｉｕｍ  Ｔａｑポリメラーゼ（型番６３９２４２、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を介して、標的配列を増幅するのに、２μＬの細胞溶解抽出物を使用し、次いで、本明細書で記載される通り、ＮＧＳにより解析した。編集％およびインデルパターン解析については、下記の表２２におよび表２３に記載する。
【１３０７】
結果
スクリーニングされたｇＲＮＡの中で、ｇ１、ｇ４５、およびｇ５９が、最高の切断効率を有した。しかし、ｇ５９により創出される突然変異体対立遺伝子のうちでは、１ｎｔのインデルが、３０％を超えたのに対し、ｇ１により創出される対立遺伝子のうちでは、１ｎｔのインデルは、２０％未満であり、ｇ４５により創出される対立遺伝子のうちでは、１ｎｔのインデルは、５％未満であった。本発明者らは、かつての観察に基づき、１ｎｔより大きなインデルパターンが、相同性指向修復（ＨＤＲ）を促進すると仮定した。したがって、本発明者らは、ＢＣＭＡ１０  ＣＡＲ構築物をターゲティングするために、ｇ１およびｇ４５を選択した。
【１３０８】
[実施例４]
ＡＡＶによるターゲティングベクター
ＡＡＶ６ベースのターゲティングベクターをデザインした。例えば、図５を参照されたい。ノックイン（ＫＩ）構築物の配列を、下記（配列番号１２６）に示し、５’側および３’側の相同性配列に下線を付す。
【１３０９】
【化３０−１】
2020513832.tif 000337
【１３１０】
【化３０−２】
2020513832.tif 000338
【１３１１】
ＡＡＶ６ウイルスを、１ｍｌ当たり１．１２×１０１３ＶＧの力価で作出した（ロット番号１９３５）。低温保存された、初代正常ヒト末梢血ＣＤ３＋Ｔリンパ球５×１０６個（ＡｌｌＣｅｌｌｓ、型番ＰＢ００９−１Ｆ）を、０日目に解凍し、熱不活化され、プールされた、５％のヒトＭａｌｅ  ＡＢ血清（ＩＰＬＡ＿ＳＥＲＡＢ、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、２ｍＭのＧｌｕｔａＭａｘ（型番３５０５０−０６１、Ｇｉｂｃｏ）、および５ｎｇ／ｍｌのＩＬ２（型番２００−０２−５０ｕｇ  ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）を補充した、Ｘ−ＶＩＶＯ１５培地（Ｌｏｎｚａ、型番０４−７４４Ｑ）を伴う６ウェルプレート内、１ｍｌ当たり０．５×１０６個で播種した。細胞を、上記で説明した通り、ビーズ／細胞比を１：１とするＤｙｎａｂｅａｄｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｔ−ｅｘｐａｎｄｅｒ  ＣＤ３／ＣＤ２８（型番１１１４１Ｄ、Ｇｉｂｃｏ）により、３日間にわたり活性化させた。
【１３１２】
３日目に、磁石により、細胞からビーズを除去し、１×のＰＢＳで、１回洗浄し、Ｔ緩衝液（Ｎｅｏｎ電気穿孔緩衝液）中、１ｍｌ当たりの細胞２．５×１０７個で再懸濁させた。
【１３１３】
１００マーの全長のｓｇＲＮＡ−ｇ１およびｓｇＲＮＡ−ｇ４５を合成した。０．３２５ｕＬのＮＬＳ−Ｓｐｙ（ｗｔ）Ｃａｓ９−ＮＬＳ−Ｈｉｓ６（配列番号１１１）（配列番号１０８として開示された「Ｈｉｓ６」）（５．９ｍｇ／ｍｌ、ｉＰｒｏｔ１０９２９６）、０．２５ｕＬのｓｇＲＮＡ（１００ｕＭ）、４．４μＬの緩衝液（２０ｍＭのトリス−Ｃｌ  ｐＨ８．０、２００ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２）を混合し、室温で、５〜１０分間にわたりインキュベートすることにより、ＲＮＰの形成を実施した。１０ｕＬの細胞を、５ｕＬのＲＮＰと混合し、室温で、２〜３分間にわたりインキュベートした。
【１３１４】
電気穿孔は、Ｎｅｏｎ（登録商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  １００μＬ  Ｋｉｔ（ＭＰＫ１００９６）を、１６００Ｖ、１０ミリ秒間、３つのパルスで使用する、Ｎｅｏｎ電気穿孔機により実施した。
【１３１５】
細胞を、９６ウェルプレート内、１６０ｕｌの培養培地と共に、５％のＣＯ２を伴い、３０℃で、１時間にわたり静置した。ＡＡＶ６ウイルスを、細胞１個当たり２．７×１０６ウイルスゲノム（ｖｇ）のＭＯＩで添加し、３０℃で、２４時間にわたりインキュベートし、次いで、５％のＣＯ２を伴い、３７℃でインキュベートした。
【１３１６】
新鮮な培養培地を、２〜３日ごとに補充して、１ｍｌ当たり＜５０万〜１００万個の細胞密度を維持した。
【１３１７】
細胞約１０万〜１５万個を、ＦＡＣＳ染色のために、７、１０、および１５日目に採取し、ＦＡＣＳ解析を、表１５に列挙された試薬を使用して、Ｆｏｒｔｅｓｓａ−Ｉ１０５１３上で実施した。
【１３１８】
【表１７】
2020513832.tif 000339
【１３１９】
結果
７日目に、ｇ１−ＲＮＡを使用したところ、ＣＤ３＋細胞のうちの１１．４％が、ＢＣＭＡ１０＿ＣＡＲ＋であり、ｇ４５−ＲＮＡを使用したところ、１３．５％が、ＢＣＭＡ１０＿ＣＡＲ＋であった。図６に示される通り、ＢＣＭＡ１０＿ＣＡＲ＋細胞の百分率は、経時的に増大した。
【１３２０】
ｇ４５を使用して、異なるドナーによるＴ細胞実験を繰り返した。図７に示される通り、ＢＣＭＡ１０＿ＣＡＲ＋細胞の百分率は、経時的に増大した。
【１３２１】
細胞拡大の倍数変化を、７日目〜１０日目において測定した。ＲＮＰ−ＡＡＶ処置群、ＲＮＰ処置群、およびビーズ除去だけの群についての、全細胞の拡大倍数は、それぞれ、２．７、２．７、および３．０であった。群間で、劇的な差違は見られなかった。ＢＣＭＡ−ＣＡＲ＋細胞の、７日目〜１０日目における拡大は、全集団より、わずかに速かった（４．３対２．７倍）（図８）。
【１３２２】
ＰＣＲプライマー
図９に示される通り、５’側部位および３’側部位の両方における、適正な組込みを確認するために、ＰＣＲプライマーを、ＢＣＭＡ１０＿ＣＡＲインサートとの相同性領域の外側から増幅するようにデザインした。プライマーの配列を、表１６に列挙する。
【１３２３】
【表１８】
2020513832.tif 000340
【１３２４】
細胞を、１０日目に採取し、プロテイナーゼＫ（１００ｎｇ／ｍｌ）を伴う、５０〜１００ｕｌの細胞溶解物緩衝液（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ  ＰＨ＝８．０、０．０５％のＳＤＳ）中に溶解させた。Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲキット（型番Ｆ５５３Ｌ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、ＰＣＲを実施した。ＰＣＲ条件を、下記の表１７および表１８に示す。
【１３２５】
【表１９】
2020513832.tif 000341
【１３２６】
【表２０】
2020513832.tif 000342
【１３２７】
７μＬのＰＣＲ産物を、２％のＥ−ｇｅｌ上で泳動させて、予期されるＰＣＲバンドの存在を確認した。未精製のＰＣＲ産物を、両方のプライマーによりシーケンシングした。
【１３２８】
[実施例５]
ヒトＣＤ３＋  Ｔ細胞内のガイドスクリーニング
まず、市販のキット（例えば、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）Ｈｕｍａｎ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｌｏｎｏｌｏｇｙ）を使用して、Ｔ細胞を、ｌｅｕｋｏｐａｋから濃縮した。濃縮されたＴ細胞は、将来の使用のために、アリコート分割し、凍結させた（バイアル１本当たり１０×１０６個で）。その後、バイアルを、必要に応じて解凍し、Ｔ細胞培地（ＲＰＭＩ  １６４０、ＦＢＳ、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳ緩衝液、２−メルカプトエタノール、および、任意選択で、ＩＬ２）中に、３：１の比のＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、型番１１１．４１Ｄ）を添加することにより活性化させた。ビーズによる活性化後３日目に、ＲＮＰを伴う電気穿孔のために、細胞を培養物から除去した。ＲＮＰは、本明細書で記載される通りに作出し、Ｐ３緩衝液中に再懸濁させたＣＤ３＋  Ｔ細胞約５０，０００〜１００，０００個へと添加し、ＡｍａｘａヌクレオフェクションプログラムＥＯ−１１５を使用してヌクレオフェクトした。Ｔ細胞培地を、ヌクレオフェクションの直後に、細胞へと添加し、ＮＧＳ解析のために、細胞溶解の前に、４８時間にわたり培養する。
【１３２９】
Ｔ細胞のゲノム編集のために使用されるＲＮＰ複合体は、Ｃａｓ９タンパク質対ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃＲＮＡ）の１：２のモル比を使用して形成した。１００μＭのｃｒＲＮＡおよび１００μＭのｔｒａｃｒＲＮＡを、個別に、９５℃で２分間にわたり変性させ、室温へと冷却した。５μＬの最終容量中、濃度を５．９μｇ／μＬとするＳｐｙ  Ｃａｓ９タンパク質１．４μＬを、１．６μＬのＣａｓ９緩衝液（２０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０；２００ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２）と混合し、１００μＭのｔｒａｃｒＲＮＡ  １μＬと、室温で混合した。次に、１００μＭのｃｒＲＮＡ  １μＬを、添加し、混合し、３７℃で、１０分間にわたりインキュベートした。次いで、アセンブルされたＲＮＰを、２０ｕｌのＰ３緩衝液中の細胞１００，０００個と共に混合し、ＡｍａｘａヌクレオフェクションプログラムＥＯ−１１５を使用してヌクレオフェクトした。Ｔ細胞培地を、ヌクレオフェクションの直後に、細胞へと添加し、ＮＧＳ解析のために、細胞溶解の前に、４８時間にわたり培養する。各ガイドについて、試行１回当たり二連の生物学的レプリケートを、少なくとも三連の技法的レプリケートと共に実施した。
【１３３０】
編集頻度について査定するため、ゲノムＤＮＡを単離し、実施例１で記載したシーケンシングにかけた。４つの陽性対照ガイドを、実験に組み入れた。結果を、下記の表１９に提示する。
【１３３１】
【表２１−１】
2020513832.tif 000343
【１３３２】
【表２１−２】
2020513832.tif 000344
【１３３３】
【表２１−３】
2020513832.tif 000345
【１３３４】
【表２１−４】
2020513832.tif 000346
【１３３５】
【表２１−５】
2020513832.tif 000347
【１３３６】
【表２１−６】
2020513832.tif 000348
【１３３７】
初期スクリーンの後、本実施例で記載される通り、表１９のガイドのサブセットを、ＣＤ３＋  Ｔ細胞内で、再度査定した。この解析では、ＮＧＳを使用して、各標的配列における、全編集パーセントに加えて、挿入パーセントおよび欠失パーセントも決定した。各標的部位について、各遺伝子座を増幅するように、２セットのプライマーをデザインした。結果を、図１０Ａおよび図１０Ｂにプロットする。
【１３３８】
[実施例６]
ガイドによる挿入百分率および欠失百分率についての検証スクリーン
オリゴインサートベースのアッセイ（例えば、Tsai et al., Nature Biotechnology. 33, 187-197; 2015を参照されたい）を使用して、ＴＥＴ２をターゲティングするＣａｓ９により切断された、潜在的なオフターゲットのゲノム部位を決定した。ＴＥＴ２をターゲティングする、合計１５のガイドＲＮＡ（表示のターゲティングドメインを含む二重ガイドＲＮＡ）と、６つの対照ガイドとを、上記の実施例１で記載したＣａｓ９発現ＨＥＫ２９３細胞内でスクリーニングし、結果を、図１１にプロットする。アッセイは、予期された標的配列における高効率編集を検出し、ガイドのうちの一部については、潜在的なオフターゲットも検出したが、ガイドのうちの３つについては、オフターゲットを検出しなかった。
【１３３９】
挿入解析の後、同定された、潜在的なオフターゲット部位を、ＮＧＳを使用して、Ｃａｓ９発現ＨＥＫ２９３細胞内で、さらに査定した。この実験では、細胞に、標的ｃｒＲＮＡを、原液のｔｒＲＮＡとの１：１の比で、トランスフェクトした。トランスフェクションは、製造元のプロトコール（ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ  Ｄｕｏ、ＧＥ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ；またはＲＮＡｉＭａｘ、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従うリポフェクション技術を使用して媒介した。トランスフェクトされた細胞を、リポフェクション後４８時間にわたり溶解させ、次世代シーケンシングにより、溶解物中の編集（例えば、切断）を検出した。プライマーの２つのセットを、各部位についてデザインし、結果として得られる単位複製配列を、例えば、実施例１で記載した通りにシーケンシングした。結果を、下記の表２０に提示する。
【１３４０】
【表２２−１】
2020513832.tif 000349
【１３４１】
【表２２−２】
2020513832.tif 000350
【１３４２】
【表２２−３】
2020513832.tif 000351
【１３４３】
【表２２−４】
2020513832.tif 000352
【１３４４】
【表２２−５】
2020513832.tif 000353
【１３４５】
【表２２−６】
2020513832.tif 000354
【１３４６】
【表２２−７】
2020513832.tif 000355
【１３４７】
[実施例７]
ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏにおけるオフターゲット解析
Ｃａｓ−ＯＦＦｉｎｄｅｒアルゴリズム（Bae et al 2014, PMID: 24463181）を使用して、ＣＲ００７６２６（ｇ１）、ＣＲ００７７１０（ｇ４５）、ＣＲ００７６３３、ＣＲ００７６６５、ＣＲ００７６７７、ＣＲ００７７０３、ＣＲ００７６７１、ＣＲ００７６７５、ＣＲ００７６８４、ＣＲ００７６９１、ｇ５９、ＣＲ００７６３２（ｇ１０）、ＣＲ００７６４８（ｇ２０）、ＣＲ００７７０９（ｇ３４）、ｇ２１、ｇ２２、ｇ２３、ｇ５５、ＣＲ００７６２７（ｇ２）、ｇ４、ｇ１７、ｇ２５、ｇ４２、ｇ５４、ｇ５８、ｇ６０、ＴＩ−７（６９００）、およびＴＩ−８（７６００）のターゲティングドメインを含む、ＴＥＴ２  ｇＲＮＡについての、潜在的なオフターゲット遺伝子座を同定した。各ｇＲＮＡについて、２０ヌクレオチドのｇＲＮＡターゲティングドメイン配列を、ヒトゲノム基準配列（ビルドＧＲＣｈ３８）に対して解析することにより、カノニカルのＣａｓ９  ５’−ＮＧＧ−３’ＰＡＭ配列の５’側に隣接する、最大で５ヌクレオチドのミスマッチを伴う全ての部位（すなわち、５’−オフターゲット遺伝子座−ＰＡＭ−３’）を同定した。５つのミスマッチを伴う同定された部位に、エクソンとして注釈された遺伝子座だけを含有するように、ＲｅｆＳｅｑ遺伝子アノテーションに対して、さらにフィルターをかけた（Pruitt et al, 2014, PMID: 24259432）。ＴＥＴ２  ｇＲＮＡについて同定された、潜在的なオフターゲット遺伝子座のカウントを、表２１に示す。
【１３４８】
【表２３−１】
2020513832.tif 000356
【１３４９】
【表２３−２】
2020513832.tif 000357
【１３５０】
潜在的なオフターゲット部位は、ターゲティングされたＮＧＳ解析を使用する、ゲノム編集されたＴ細胞内の検証を要求するであろう。
【１３５１】
ＴＥＴ２  ｇＲＮＡのための、上位のインデル
初代ヒトＴ細胞を、実施例３で記載した通りに調製し、インデル頻度（表２３）およびインデルパターン（表２２）を、記載される通りに評価した。
【１３５２】
【表２４−１】
2020513832.tif 000358
【１３５３】
【表２４−２】
2020513832.tif 000359
【１３５４】
【表２４−３】
2020513832.tif 000360
【１３５５】
【表２４−４】
2020513832.tif 000361
【１３５６】
【表２４−５】
2020513832.tif 000362
【１３５７】
【表２４−６】
2020513832.tif 000363
【１３５８】
【表２４−７】
2020513832.tif 000364
【１３５９】
【表２４−８】
2020513832.tif 000365
【１３６０】
【表２４−９】
2020513832.tif 000366
【１３６１】
【表２５−１】
2020513832.tif 000367
【１３６２】
【表２５−２】
2020513832.tif 000368
【１３６３】
オンターゲット解析のための方法
ＮＧＳライブラリーの調製および単位複製配列のシーケンシング
製造元の推奨に従い、１．８×のＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡｍｐｕｒｅＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、ＰＣＲ単位複製配列を精製した。製造元の推奨に従い、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ  ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡアッセイ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、単位複製配列を定量化した。製造元の推奨に従い、Ｎｅｘｔｅｒａ  ＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用するが、以下の改変を伴い、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングライブラリーを作出した。Ｗａｎｇら(PMID: 24071908)により、既に記載されている、５ｎｇの精製ＰＣＲ産物、０．１５ｕｌのＮｅｘｔｅｒａタグメント酵素、およびタグメント化（tagmentation）緩衝液を使用して、５ｕｌの最終的な容量中で、タグメント化を実施した。次いで、最終濃度を０．２ｍＭとするｄＮＴＰ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、０．２ｕＭのＩｌｌｕｍｉｎａインデックスＰＣＲプライマー（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１×のＰｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、および１ＵのＰｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、タグメント化された単位複製配列を、５０ｕｌの最終容量中で、ＰＣＲ増幅した。使用されるＰＣＲサイクリング条件は、以下の通り：７２℃で３分間、９８℃で２分間、ならびに９８℃で１０秒間、６３℃で３０秒間、および７２℃で３分間の１５サイクルであった。次いで、製造元の推奨に従い、１．０×のＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡｍｐｕｒｅＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、シーケンシングライブラリーを精製した。製造元の推奨に従い、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ  ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡアッセイ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、シーケンシングライブラリーを定量化し、シーケンシングのために、等モルのライブラリーをプールした。製造元の推奨（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）に従い、シーケンシングライブラリーを、ＭｉＳｅｑシーケンサー上の、１５０塩基のペアドエンドリードによりシーケンシングした。最小で、単位複製配列当たり１０００倍のシーケンシングカバレッジを生成した。
【１３６４】
ＮＧＳシーケンシングデータについてのＱＣ解析および変異体解析
デフォルトパラメータを使用して、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ解析ソフトウェア（ＭｉＳｅｑ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ；ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．６．２、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して、単位複製配列特異的な、ＦＡＳＴＱシーケンシングデータファイル（Cock et al, Nucleic Acids Res. 2010, 38(6):1767-71, PMID: 20015970）を作出した。次いで、標準的なＰｅｒｌスクリプトラッパーを使用して合体させた、一連のパブリックドメインのソフトウェアパッケージからなる、社内開発の変異体解析パイプラインを介して、ＦＡＳＴＱファイルを加工した。使用されるワークフローを、５段階に分けた。
【１３６５】
段階１、ＰＣＲプライマー、ならびにオンターゲット配列およびオフターゲット配列についてのＱＣ：ＢＬＡＳＴ検索（ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．２.２９＋、Altschul et al, J Mol Biol., 1990, 215(3):403-10, PMID: 2231712）を使用して、ＰＡＭ配列および標的特異的ＰＣＲプライマー配列に加えた、２０ヌクレオチドのｇＲＮＡターゲットドメイン配列を、ヒトゲノム基準配列（ビルドＧＲＣｈ３８）に対してアライメントした。複数のゲノム位置を伴う配列を、フラッグ付けした。
【１３６６】
段階２、シーケンサーファイルの解凍：ｇｚｉｐスクリプト（ｖｅｒｓｉｏｎ  １．３．１２）を使用して、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンサーにより生成されたＦＡＳＴＱ．ＧＺファイルを、ＦＡＳＴＱファイルへと解凍し、ファイル１つ当たりのリード数を計算した。リードを伴わないファイルは、さらなる解析から除外した。
【１３６７】
段階３、配列リードアライメントおよび品質トリミング：Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列のリードの３’末端部と、低品質塩基とをトリミングする「ハードクリッピング」を使用するＢＷＡ−ＭＥＭアライナー（ｖｅｒｓｉｏｎ  ０．７.４-r３８５；Li and Durbin, Bioinformatics, 2009, 25(14):1754-60, PMID: 19451168）を使用して、ＦＡＳＴＱファイル内のシーケンシングリードを、ヒトゲノム基準配列（ビルドＧＲＣｈ３８）に対してアライメントした。ＳＡＭｔｏｏｌｓスクリプト（ｖｅｒｓｉｏｎ  ０．１.１９-４４４２８ｃd；Li et al, Bioinformatics, 2009 25(16):2078-9, PMID: 19505943）を使用して、結果として得られる、ＢＡＭファイルフォーマット（Li et al, Bioinformatics, 2009 25(16):2078-9, PMID: 19505943）のアライメントリードを、ＦＡＳＴＱファイルへと転換した。次いで、今回は「ハードクリッピング」を伴わずに、ＢＷＡ−ＭＥＭアライナーを使用して、ＦＡＳＴＱファイルを、ヒトゲノム基準配列（ビルドＧＲＣｈ３８）に対して、再度アライメントした。
【１３６８】
段階４、変異体（ＳＮＰおよびインデル）解析：変異体（ＳＮＰおよびインデル）を同定する、対立遺伝子頻度検出限界を、＞＝０．０００１に設定した、ＶａｒＤｉｃｔ  ｖａｒｉａｎｔ  ｃａｌｌｅｒ（開発者であるＺｈｏｎｇ  Ｗｕ  Ｌａｉにより改変された、ｖｅｒｓｉｏｎ  １．０の「Ｃａｓ９  ａｗａｒｅ」、Lai et al, Nucleic Acids Res., 2016, 44(11):e108, PMID: 27060149）を使用して、アライメントリードのＢＡＭファイルを加工した。Ｃａｓ９  ａｗａｒｅ  ＶａｒＤｉｃｔ  ｃａｌｌｅｒは、パブリックドメインパッケージに基づくが、変異体イベントのアライメント領域内の反復配列に起因して生成された、両義的な変異体コールを、ＰＡＭ配列の５’側から３塩基に位置する、ｇＲＮＡのターゲットドメイン配列内の、潜在的なＣａｓ９ヌクレアーゼ切断部位へと移動させることが可能である。ＳＡＭｔｏｏｌｓスクリプトを使用して、試料である単位複製配列１つ当たりのリードカバレッジを計算して、ターゲット部位が、＞１０００倍の配列カバレッジでカバーされたのかどうかを決定した。配列カバレッジが＜１０００倍である部位には、再処理のためにフラッグ付けした。
【１３６９】
段階５、ｄｂＳＮＰのフィルタリングおよび処置／非処置についての示差的解析：同定された変異体に、ｄｂＳＮＰ内で見出される、公知の変異体（ＳＮＰおよびインデル）（ビルド１４２、Shery et al, Nucleic Acids Res. 2001, 29(1):308-11, PMID: 11125122）についてフィルターをかけた。処置試料中の変異体に、さらにフィルターをかけて、１）未編集のモック対照試料で同定される変異体；２）ＶａｒＤｉｃｔによる鎖バイアスが２：１である変異体（この場合、基準配列を裏付ける、フォワードリードカウントと、リバースリードカウントとは、均衡するが、非基準変異体判定については、均衡しない）；３）潜在的なＣａｓ９切断部位のいずれかの側の、＞５ｂｐに位置する変異体；４）単一のヌクレオチド変異体；５）各処置群についての、技術的なＰＣＲレプリケートのいずれにおいても見られない変異体を除外した。
【１３７０】
例示される複数の実施形態は、本開示のある特定の態様だけを例示することを意図するものであり、機能的に同等な任意の構築物も、本開示の範囲内にあるので、本開示の範囲は、例示される構築物により限定されるものではない。当業者には、前出の記載から、本明細書で示され、記載される改変に加えて、本開示の多様な改変が明らかであり、これらも、付属の特許請求の範囲内に収まるであろう。
【１３７１】
本開示の教示の、具体的問題または状況への適用は、本明細書に含有される教示に照らして、当業者の能力の範囲内にあると理解される。
【１３７２】
本明細書内の各引用およびあらゆる引用の開示は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【１３７３】
配列表と、本明細書内で列挙される任意の配列との間に、齟齬が見られる範囲においては、本明細書内で列挙される配列が正確な配列とみなされるものとする。そうでないことが指し示されない限りにおいて、全てのゲノム位置は、ｈｇ３８に従う。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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