(57)【要約】【課題】胃癌用のマイクロバイオームマーカーに関する。【解決手段】本発明は、特定の細菌に由来する核酸又は代謝産物の検出により、新生物発生前の良性状態から胃癌を識別するための方法に関する。言及した方法は、前記特定の細菌の核酸又は代謝機能に由来する代謝産物との反応物の検出及び増幅用のプライマーを含む反応組成物を使用する。本発明の別の態様は、前記特定の細菌の核酸に対して高い特異性を示す配列（配列番号１〜配列番号１８として識別される）による上述した方法の実施で使用されるプライマー、及びこのプライマーを含む組成物に関する。本発明はさらに、本発明の方法を実行することにより特定の細菌に由来する核酸又は代謝産物を検出するための上述した組成物を含むキットに関する。本発明の方法、遺伝子配列、組成物及びキットは、生体サンプル中での新生物発生前の良性状態からの胃癌の識別に有利に使用され得、このことは、本発明の方法、遺伝子配列、組成物及びキットの、そのような識別に関する高い感度及び特異性に起因する。従って、本発明を、新生物発生前の良性状態（例えば、慢性胃炎、腸上皮化生及び異形成）を有する患者のモニタリングで適用して、胃癌の発生を検出するか又は予測し得、最終的には、適切な処置設定のための基盤を提供し得る。そのため、本発明は、医学、薬学、分子生物学、生化学、及び細菌関連の遺伝学の技術分野に含まれる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
胃癌と新生物発生前の良性状態との識別のためのヌクレオチド配列のセットであって、配列番号１〜配列番号１８、又は少なくとも配列番号１〜配列番号２及び／又は配列番号３〜４及び／又は配列番号５〜配列番号６及び／又は配列番号７〜配列番号８及び／又は配列番号９〜配列番号１０及び／又は配列番号１１〜配列番号１２及び／又は配列番号１３〜１４及び／又は配列番号１５〜配列番号１６及び／又は配列番号１７〜配列番号１８を含むことを特徴とするセット。
【請求項２】
リアルタイムＰＣＲ定量による胃癌と新生物発生前の良性状態との識別のための反応用の組成物であって、リアルタイムＰＣＲ用の試薬溶液に加えて、請求項１に記載のヌクレオチド配列配列番号１〜配列番号１８、又は少なくとも配列番号１〜配列番号２及び／又は配列番号３〜４及び／又は配列番号５〜配列番号６及び／又は配列番号７〜配列番号８及び／又は配列番号９〜配列番号１０及び／又は配列番号１１〜配列番号１２及び／又は配列番号１３〜１４及び／又は配列番号１５〜配列番号１６及び／又は配列番号１７〜配列番号１８を含むことを特徴とする組成物。
【請求項３】
発色アッセイ、発光アッセイ又は蛍光アッセイによる胃癌と新生物発生前の良性状態との識別のための反応用の組成物であって、代謝産物である硝酸塩及び／又は亜硝酸塩及び／又は酸化窒素及び／又はｐ−クレゾール及び／又はインドール及び／又は３−ヒドロキシアントラニル酸及び／又はデオキシコール酸及び／又はフェノールのうちの少なくとも１つに対する少なくとも１種の反応物、例えば、硫酸鉄、水酸化ナトリウム、ジフェニルアミン、硫酸、オゾン又は他のものを、前記代謝産物の存在下で発色反応、蛍光反応又は発光反応を生じることが知られている他の既知の化学反応物を除外することなく、含むことを特徴とする組成物。
【請求項４】
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）による胃癌と新生物発生前の良性状態との識別のための反応用の組成物であって、代謝産物である硝酸塩及び／又は亜硝酸塩及び／又は酸化窒素及び／又はｐ−クレゾール及び／又はインドール及び／又は３−ヒドロキシアントラニル酸及び／又はデオキシコール酸及び／又はフェノールのうちの少なくとも１つに対する親和性を有する少なくとも１種の抗体を含むことを特徴とする組成物。
【請求項５】
胃癌と新生物発生前の良性状態との識別のための組成物であって、インビトロでの生体サンプルから得られる核酸に加えて、請求項２に記載の少なくとも１種の組成物を含むことを特徴とする組成物。
【請求項６】
胃癌と新生物発生前の良性状態との識別のための組成物であって、インビトロでの生体サンプル中において硝酸レダクターゼ機能及び／又は亜硝酸レダクターゼ機能から得られる化合物に加えて、請求項３又は４に記載の反応用の組成物の少なくとも１種を含むことを特徴とする組成物。
【請求項７】
胃癌と新生物発生前の良性状態との識別のための組成物であって、インビトロでの生体サンプル中においてインビボでの細菌の硝酸レダクターゼ機能及び／又は亜硝酸レダクターゼ機能から得られる化合物に加えて、請求項３又は４に記載の代謝産物反応用の組成物の少なくとも１種を含むことを特徴とする組成物。
【請求項８】
胃癌と新生物発生前の良性状態との識別のためのキットであって、請求項２〜７のいずれか一項に記載の少なくとも１種の組成物を含むことを特徴とするキット。
【請求項９】
請求項８に記載のキットであって、胃癌と新生物発生前の良性状態とを識別する、少なくとも１種の細菌に由来する核酸及び／又は代謝産物を含むコントロールサンプル及び／又はキャリブレーターサンプルをさらに含むことを特徴とするキット。
【請求項１０】
胃癌と新生物発生前の良性状態との識別のためのインビトロでの方法であって、
ａ）請求項２に記載の少なくとも１種の反応組成物の調製、及び、言及した識別のために試験するインビトロの生体サンプルから抽出したＤＮＡと、請求項６に記載の反応組成物との接触の促進の工程、
ｂ）リアルタイムＰＣＲ反応による増幅の工程、
ｃ）蛍光シグナルの定量、並びに陽性結果を得た場合には胃癌の存在に関する陽性に対応する、アクロモバクター（Achromobacter）種及び／又はシトロバクター（Citrobacter）種及び／又はクロストリジウム（Clostridium）種及び／又はロドコッカス（Rhodococcus）種及び／又はラクトバチルス（Lactobacillus）種及び／又はフィロバクテリウム（Phyllobacterium）種に由来する核酸の相対存在量と、ヘリコバクター（Helicobacter）種及び／又はナイセリア（Neisseria）種由来の核酸の相対存在量との比のｌｏｇ１０の算出による、ｂ）で得られた増幅の分析の工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１１】
前記増幅の条件は下記のとおりである、請求項１０に記載の方法：
・  第１ステージ：５０℃で２分及び続いて９５℃で１０分を１サイクル、
・  第２ステージ：シグナルの取得を伴う、９５℃で１５秒及び６０℃で１分を含む４０サイクル、
・  第３ステージ：１５秒にわたり９５℃、１分にわたり６０℃、３０秒にわたり９５℃及び１５秒にわたり６０℃を１サイクル。
【請求項１２】
胃癌と新生物発生前の良性状態との識別のためのインビトロでの方法であって、
ａ）請求項３又は４に記載の少なくとも１種の反応組成物の調製、及び、言及した識別のために試験するインビトロの生体サンプルで得られた硝酸レダクターゼ機能及び／又は亜硝酸レダクターゼ機能に由来する代謝産物と、請求項６又は７に記載の反応組成物との接触の促進の工程、
ｂ）発色反応、発光反応、蛍光反応又はＥＬＩＳＡ反応をインキュベートする工程、
ｃ）正常範囲と比べて値が高い場合には胃癌の存在に関して陽性に対応する吸光度又は発光シグナル若しくは蛍光シグナルの定量により、ｂ）で得られた反応の結果を分析する工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１３】
胃癌と新生物発生前の良性状態との識別のためのインビトロでの方法であって、
ａ）言及した識別のために試験するインビトロの生体サンプル中における硝酸レダクターゼ機能及び／又は亜硝酸レダクターゼ機能に由来する代謝産物を得る工程、
ｂ）前記サンプルを質量分析に供する工程、
ｃ）硝酸塩及び／又は亜硝酸塩及び／又は酸化窒素及び／又はｐ−クレゾール及び／又はインドール及び／又は３−ヒドロキシアントラニル酸及び／又はデオキシコール酸及び／又はフェノールの存在量の定量により、ｂ）で得られた結果を分析する工程であって、正常範囲と比べて値が高い場合には胃癌の存在に関して陽性に対応する、工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１４】
前記（ａ）の生体サンプルは、ヒトの組織、胃洗浄液、血清、血漿、尿、呼気凝縮液又は呼気に由来する、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
アクロモバクター（Achromobacter）種及び／又はシトロバクター（Citrobacter）種及び／又はクロストリジウム（Clostridium）種及び／又はロドコッカス（Rhodococcus）種及び／又はラクトバチルス（Lactobacillus）種及び／又はフィロバクテリウム（Phyllobacterium）種に適した抗生物質を含むことを特徴とする処置用の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の細菌に由来する核酸又は代謝産物の検出により新生物発生前の良性状態から胃癌を識別するための方法、増幅用のプライマー又は特定の細菌機能由来の代謝産物との反応物を含む反応組成物、この細菌の核酸に対して高い特異性を示すように設計された、配列番号１〜配列番号１８と称される配列、及び言及した方法を実施するためのそのような組成物を含むキットに関する。
【０００２】
本発明は、本方法の高い感度、並びに作成した遺伝子配列及び反応する代謝産物の特異性に起因して、生体サンプル中における及びインビトロでの新生物発生前の状態からの胃癌の識別に有利に使用され得、それにより、新生物発生前の状態（例えば、慢性胃炎、腸上皮化生及び異形成）を有する胃癌患者をモニタリングして、胃癌の発生を検出するか又は予測することが可能になり、最終的には、適切な処置設定のための基盤を提供する。
【０００３】
そのため、本発明は、医学、薬学、分子生物学、生化学、及び細菌関連の遺伝学の技術分野に含まれる。
【背景技術】
【０００４】
胃癌は世界的規模の主要な健康問題であり、毎年１００万の新規の症例が推定される［１］。この悪性腫瘍は、世界的規模の癌関連死の５番目に多い且つ３番目の主な原因である［１］。
【０００５】
胃癌は、Ｈ．ピロリ（H. pylori）感染により引き起こされる、長い、多因子性の且つ多段階のプロセスである。
【０００６】
持続性のＨ．ピロリ（H. pylori）感染により、全ての感染者の胃上皮に慢性炎症が誘発されるが、一部の感染者は酸産生腺（acid-producing gland）の数の減少（萎縮）を示し、そのため腸上皮化生が発生しやすく、この腸上皮化生は異形成へと進行する可能性があり、最終的には胃癌へと進行する可能性がある［２］。
【０００７】
感染者の数と、胃癌の発症へと進む感染者の数との間の不均衡は、Ｈ．ピロリ（H. pylori）の病原性、宿主の遺伝的感受性、及び環境因子の差異の影響に起因している［２〜５］。
【０００８】
慢性炎症／胃炎はＨ．ピロリ（H. pylori）により誘発されると考えられており［６，７］、発癌の最終段階ではＨ．ピロリ（H. pylori）のコロニー形成が減少する（及び最終的には喪失する）ことから、胃癌の発症は、ある特定の時点からＨ．ピロリ（H. pylori）に依存しないことが示唆されている［８］。
【０００９】
加えて、Ｈ．ピロリ（H. pylori）の除菌研究により、除菌が成功しても、前癌病変を有する患者での胃癌の発症が完全には予防されないことが分かっている［９〜１１］。この観察は、Ｈ．ピロリ（H. pylori）以外の因子が胃発癌に関与することを示唆する。
【００１０】
近年、Ｈ．ピロリ（H. pylori）により順に引き起こされる炎症及び胃上皮の分解により、悪性転換に寄与する新規の微生物叢の確立が可能である胃発癌のモデルが提案されている［１２］。
【００１１】
このモデルは、以前の研究［１３、１４］、及びＨ．ピロリ（H. pylori）により誘発された胃癌が複雑な胃微生物叢の存在により促進されることを示した高ガストリン血症（hypergastrinaemic）ＩＮＳ−ＧＡＳトランスジェニックマウスモデル（この動物は、Ｈ．ピロリ（H. pylori）に単一感染した無菌マウスと比べて多くの腫瘍を発症した）での研究により支持されている［１５、１６］。
【００１２】
今までのところ、健康及び疾患におけるヒトの胃微生物叢の特徴を明らかにする研究はほんのごくわずかであった。これらの研究の主な発見は、Ｈ．ピロリ（H. pylori）陰性の対象は多様な微生物叢を含んでいるが、Ｈ．ピロリ（H. pylori）感染患者はこの種に支配されており、そのため全体的な多様性が低下していることであった［１７〜２０］。
【００１３】
胃癌に関連して、わずか３件の研究が行なわれており、胃癌に関与していると特定されている胃微生物叢の特定の構成要素は存在しない。
【００１４】
これらの研究の欠点は、最も重要なことに、感度及び特異性の限界であり、そのため、臨床的に有用な試験を作ることが困難である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
そのため、生体サンプル中での胃の発生の検出を可能にするのに十分な感度及び特異性を有する方法を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
胃癌での細菌の相対存在量及びその代謝機能の定性的特性及び定量的特性を考慮して、本発明は、特定の細菌に由来する核酸及び／又は代謝産物の検出による、新生物発生前の状態から胃癌を識別するための方法、組成物、プライマー配列、及びキットに関する。
【００１７】
本発明の概要
本発明は、新生物発生前の良性状態からの胃癌の識別において高度に敏感であり且つ特異的であるアクロモバクター（Achromobacter）種及び／又はシトロバクター（Citrobacter）種及び／又はクロストリジウム（Clostridium）種及び／又はロドコッカス（Rhodococcus）種及び／又はラクトバチルス（Lactobacillus）種及び／又はフィロバクテリウム（Phyllobacterium）種及び／又はヘリコバクター（Helicobacter）種及び／又はナイセリア（Neisseria）種を含む細菌に由来する核酸の特異的検出及び定量のために設計された、請求項１に記載のプライマーセット（配列番号１〜配列番号１８）に関する。
【００１８】
これらのプライマーは、そのような細菌の検出で高い特異性を有することから、新生物発生前の良性状態からの胃癌の識別での高い感度及び特異性のための方法での使用が可能である。
【００１９】
本発明はまた、請求項２に記載のプライマーの言及した配列を含むリアルタイムＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）の技術を使用する、細菌由来のＤＮＡの増幅及び定量のための組成物にも関する。
【００２０】
本発明はまた、請求項３〜４に記載の、硝酸レダクターゼ細菌代謝機能及び／又は亜硝酸レダクターゼ細菌代謝機能に由来する代謝産物による発色アッセイ、発光アッセイ、蛍光アッセイ又は酵素結合免疫吸着アッセイのための反応組成物であって、硝酸塩及び／又は亜硝酸塩及び／又は酸化窒素及び／又はｐ−クレゾール及び／又はインドール及び／又は３−ヒドロキシアントラニル酸及び／又はデオキシコール酸及び／又はフェノールとの反応物（例えば、前記代謝産物と反応することが知られている他の既知の反応物を除外することなく、硫酸鉄、水酸化ナトリウム、ジフェニルアミン、硫酸、オゾン、抗体又は他のもの）を含む反応組成物に関する。
【００２１】
予め調製され得るか又は本発明の方法の実施時に調製され得るこの組成物は、新生物発生前の良性病変からの胃癌の識別に適用可能である。
【００２２】
本発明の別の態様は、新生物発生前の良性病変から胃癌を識別するための組成物であって、この組成物と、試験する生体サンプルとを含む組成物に関する。
【００２３】
この組成物では、この生体サンプルは、特定の細菌に由来する分子（例えば、インビトロで得られる細菌の核酸、及び／又は硝酸レダクターゼ細菌代謝機能により生じる代謝産物（インビトロで若しくはインビボでの細菌代謝により得られる））を含み、且つ請求項５〜７のいずれか一項に記載のインビトロの試験サンプル中に存在する。
【００２４】
本発明の別の態様は、請求項８に記載の、予め調製された、新生物発生前の良性病変から胃癌を識別するためにプライマー及び／又は代謝産物反応組成物を含むキットに関する。
【００２５】
このキットは、前記識別のために試験するサンプルを添加することにより、迅速且つ信頼性のある方法で、新生物発生前の良性病変から胃癌を識別する敏感で且つ特異的な方法を開発するという利点を有する。
【００２６】
本発明の別の態様は、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の、反応が細菌の核酸又は細菌の代謝産物に対して特異的である増幅用のプライマー又は代謝産物用の反応物を含む反応組成物を使用する、新生物発生前の良性状態から胃癌を識別する方法に関する。
【００２７】
この方法を有利に使用して、生体サンプル中において新生物発生前の良性状態から胃癌を識別し得、このことは、この目的のために設計された、遺伝子配列、反応組成物、及び識別のために使用される計算により付与されるこの方法の高い感度及び特異性に起因する。
【００２８】
そのため、本発明を、新生物発生前の良性状態（例えば、慢性胃炎、腸上皮化生及び異形成）を有する患者のモニタリングで適用して、胃癌の発生を検出するか又は予測し得、最終的には、適切な処置設定のための基盤を提供し得る。
【００２９】
そのため、本発明の別の態様は、請求項１５に記載の、前記胃癌に特異的な細菌のうちの少なくとも１種に適した抗生物質が個体で使用される処置用の組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】胃癌生体サンプルと慢性胃炎生体サンプルとの間での特定の細菌の相対存在量の有意差の実証を示す図である。この図は、慢性胃炎と比較して胃癌でのヘリコバクター（Helicobacter）種及びナイセリア（Nisseria）種由来のＤＮＡの有意な減少、並びに慢性胃炎と比較して胃癌でのアクロモバクター（Achromobacter）種、フィロバクテリウム（Phyllobacterium）種、クロストリジウム（Clostridium）種、ロドコッカス（Rhodococcus）種及びラクトバチルス（Lactobacillus）種由来のＤＮＡの有意な富化を実証する。  Ａ−ヘリコバクター（Helicobacter）種  Ｂ−ナイセリア（Nisseria）種  Ｃ−アクロモバクター（Achromobacter）種  Ｄ−フィロバクテリウム（Phyllobacterium）種  Ｅ−クロストリジウム（Clostridium）種  Ｆ−ロドコッカス（Rhodococcus）種  Ｇ−ラクトバチルス（Lactobacillus）種  Ｘ軸：ＣＧ−慢性胃炎；ＧＣ−胃癌  Ｙ軸：相対存在量（特定の細菌由来のＤＮＡの存在量とサンプル中の細菌ＤＮＡの「全」存在量との比の平均のｌｏｇ１０）。
【図２】個々の細菌属に基づく本方法の識別能力の実証を示す図である。この図では、胃癌を検出するために、受信者動作特性（ＲＯＣ）分析を使用して各特定の微生物由来のＤＮＡの相対存在量の識別能力を測定した。アクロモバクター（Achromobacter）種、シトロバクター（Citrobacter）種、ラクトバチルス（Lactobacillus）種、フィロバクテリウム（Phyllobacterium）種、クロストリジウム（Clostridium）種及びロドコッカス（Rhodococcus）種に関して得られた曲線下の面積（ＡＵＣ）はそれぞれ、０．８５（９５％ＣＩ、０．７８〜０．９２）；０．８０（９５％ＣＩ  ０．７１〜０．８８）、０．７４（９５％ＣＩ  ０．６５〜０．８４）；０．６６（９５％ＣＩ  ０．５７〜０．７６）；０．６４（９５％ＣＩ  ０．５４〜０．７３）；及び０．６２（９５％ＣＩ  ０．５２〜０．７２）であった。  Ａ−アクロモバクター（Achromobacter）種  Ｂ−シトロバクター（Citrobacter）種  Ｃ−ラクトバチルス（Lactobacillus）種  Ｄ−フィロバクテリウム（Phyllobacterium）種  Ｅ−クロストリジウム（Clostridium）種  Ｆ−ロドコッカス（Rhodococcus）種  Ｘ軸−１００−特異度（％）  Ｙ軸−感度（％）
【図３】胃癌で富む細菌由来のＤＮＡの相対存在量と、胃癌で枯渇する細菌由来のＤＮＡの相対存在量との比のＬｏｇ１０の算出に基づく、胃癌を検出するための本方法の識別能力の実証を示す図である。この図では、ＲＯＣ分析を使用して、胃癌で富む細菌由来のＤＮＡの相対存在量と、胃癌で枯渇する細菌由来のＤＮＡの相対存在量との比のＬｏｇ１０を使用する胃癌の検出での本方法の識別能力を測定し、いずれの細菌属単独と比べても感度及び特異度が高い０．９１（９５％ＣＩ  ０．８７〜０．９７）のＡＵＣを得た。  Ｘ軸−１００−特異度（％）  Ｙ軸−感度（％）
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明の説明
本発明は、新生物発生前の良性状態から胃癌を識別する方法に関する。言及した反応方法は、増幅及び定量のためのプライマーを含む組成物を使用し、このプライマーの配列（配列番号１〜配列番号１８）は、新生物発生前の良性状態からの胃癌の識別において高度に敏感であり且つ特異的であるアクロモバクター（Achromobacter）種及び／又はシトロバクター（Citrobacter）種及び／又はクロストリジウム（Clostridium）種及び／又はロドコッカス（Rhodococcus）種及び／又はラクトバチルス（Lactobacillus）種及び／又はフィロバクテリウム（Phyllobacterium）種及び／又はヘリコバクター（Helicobacter）種及び／又はナイセリア（Neisseria）種を含む細菌に由来する核酸を検出して定量するように特に設計されている。
【００３２】
そのため、プライマー配列は、前記増幅反応（例えば、ＰＣＲアッセイ、リアルタイム（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイ又はデジタルＰＣＲアッセイ）の基盤を構築するために、増幅及び定量用に作られている。配列表で説明されているように、これらのプライマー用に１８種の配列を設計した。これには、下記の目的のための配列が含まれる：
ａ．アクロモバクター（Achromobacter）種の検出及び定量
・  配列番号１：イニシエータＦ
・  配列番号２：イニシエータＲ
ｂ．シトロバクター（Citrobacter）種の検出及び定量
・  配列番号３：イニシエータＦ
・  配列番号４：イニシエータＲ
ｃ．クロストリジウム（Clostridium）種の検出及び定量
・  配列番号５：イニシエータＦ
・  配列番号６：イニシエータＲ
ｄ．ロドコッカス（Rhodococcus）種の検出及び定量
・  配列番号７：イニシエータＦ
・  配列番号８：イニシエータＲ
ｅ．ラクトバチルス（Lactobacillus）種の検出及び定量
・  配列番号９：イニシエータＦ
・  配列番号１０：イニシエータＲ
ｆ．フィロバクテリウム（Phyllobacterium）種の検出及び定量
・  配列番号１１：イニシエータＦ
・  配列番号１２：イニシエータＲ
ｇ．ヘリコバクター（Helicobacter）種の検出及び定量
・  配列番号１３：イニシエータＦ
・  配列番号１４：イニシエータＲ
ｈ．ナイセリア（Neisseria）種の検出及び定量
・  配列番号１５：イニシエータＦ
・  配列番号１６：イニシエータＲ
ｉ．細菌全体の検出及び定量
・  配列番号１７：イニシエータＦ
・  配列番号１８：イニシエータＲ。
【００３３】
上記配列を、刊行物：Beaucage, SL; Iyer, RP (1992).”Advances in the Synthesis of Oligonucleotides by the Phosphoramidite Approach”. Tetrahedron 48 (12)：2223で説明されている固相ホスホロアミダイトヌクレオシドを使用するヌクレオチド合成法により調製し得る。この合成を、各オリゴヌクレオチドの３’末端の最初の塩基で官能化された固体支持体（制御された細孔ガラス又はポリスチレン）を備えたカラムで実施し得る。各オリゴヌクレオチドの調製は多数の合成サイクルの後に起き、それぞれは複数種の化学反応（典型的には下記の４種の化学反応）からなる：ｉ）放出（脱トリチル化）、ｉｉ）カップリング、ｉｉｉ）保護、及びｉｖ）酸化。各サイクルでは、成長中の鎖の５’末端に、所望される配列に対応するヌクレオチド残基が付加される。
【００３４】
ヌクレオチドは、相補的ヌクレオチドとの塩基対形成によるハイブリダイゼーション能力を有する天然の又は合成の起源のヌクレオチドを指し、このヌクレオチドとして下記が挙げられ得るがこれらに限定されない：ＤＮＡ、ＲＮＡ及びヌクレオチド類似体（例えば、閉じたコンフォメーションの核酸、「ロックド核酸（locked nucleic acid）」（ＬＮＡ）として既知である）、ヌクレオチド間ホスホジエステル型結合を有しないヌクレオチド（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ））、及びチオジエステル結合を有する核酸、又は同一の目的のための同種のもの。
【００３５】
プローブの濃度は、溶液の体積当たりの各プローブのモル数に対応する溶液のモル濃度を指し、マイクロモル（μＭ）は１リットル当たり１×１０−６モルに対応する。
【００３６】
増幅及びＤＮＡハイブリダイゼーション用の組成物（ＰＣＲ組成物）を、市販されているＰＣＲに、様々な組み合わせで配列番号１〜配列番号１８を含む様々なヌクレオチド配列、及び微生物ＤＮＡフリー水（分子生物学グレード、ＤＮＡ汚染を除去するためにフィルタ滅菌されてＵＶ処理されているヌクレアーゼフリー水）と共に反応物溶液を添加することにより調製した。
【００３７】
ＰＣＲ用の反応溶液は、増幅反応の所望されるタイプにより異なる。本発明の実施形態に関するＰＣＲに適した反応物溶液の例は、例えば、リアルタイムＰＣＲによるＤＮＡ増幅及び定量の目的のための溶液「PowerUp SYBR Green Master Mix」（Applied Biosystems社）、又は類似の溶液である。
【００３８】
既に述べたように、プライマー配列は、新生物発生前の良性状態からの胃癌の識別において高度に敏感であり且つ特異的であるアクロモバクター（Achromobacter）種及び／又はシトロバクター（Citrobacter）種及び／又はクロストリジウム（Clostridium）種及び／又はロドコッカス（Rhodococcus）種及び／又はラクトバチルス（Lactobacillus）種及び／又はフィロバクテリウム（Phyllobacterium）種及び／又はヘリコバクター（Helicobacter）種及び／又はナイセリア（Neisseria）種を含む細菌由来の核酸を特異的に検出して定量するように定義される。
【００３９】
同様に、全細菌の検出のためのプライマー（配列番号１７及び配列番号１８）の添加により、比較目的のための組成物を調製する。
【００４０】
配列番号１〜配列番号１８の配列を有する様々なプライマーを含むＰＣＲ用の組成物を調製し、個々の反応は、少なくとも配列番号１及び配列番号２、又は配列番号３及び配列番号４、又は配列番号５及び配列番号６、又は配列番号７及び配列番号８、又は配列番号９及び配列番号１０、又は配列番号１１及び配列番号１２、又は配列番号１３及び配列番号１４、又は配列番号１５及び配列番号１６、又は配列番号１７及び配列番号１８を含む。そのため、ＰＣＲ用の本発明の組成物は、上述したプライマーのうちの１つ又は複数のセットのみを含み得る。
【００４１】
新生物発生前の良性状態から胃癌を識別するための反応混合物の組成物を、ＰＣＲに関して上述した組成物に、試験する生体サンプル由来のＤＮＡを添加することにより調製した。
【００４２】
試験ＤＮＡを、Qiagen社のQIAamp（登録商標）DNA Microbiome Kitで市販されているもの等の当分野で既知の標準的な方法又は類似の方法を使用して、ヒト又は他の生物学的起源の組織、胃洗浄液、呼気凝縮液又は呼気から得ることができる。
【００４３】
ＰＣＲ増幅の条件は下記のとおりであった：
・  第１ステージ：５０℃で２分及び続いて９５℃で１０分を１サイクル、
・  第２ステージ：シグナルの取得を伴う、９５℃で１５秒及び６０℃で１分を含む４０サイクル、
・  第３ステージ：１５秒にわたり９５℃、１分にわたり６０℃、３０秒にわたり９５℃及び１５秒にわたり６０℃を１サイクル。
【００４４】
各細菌に関するプライマーセットの核酸濃度（検量線上で、得られた蛍光レベルを交差させることにより算出される）を、全細菌の検出に関するプライマーセットの核酸濃度（同一の方法で算出される）で割る定量により実施される、各細菌属に由来するＤＮＡの相対存在量の分析により、胃癌と新生物発生前の良性病変との間の有意差が示される（図１）。
【００４５】
アクロモバクター（Achromobacter）種、シトロバクター（Citrobacter）種、クロストリジウム（Clostridium）種、ロドコッカス（Rhodococcus）種、ラクトバチルス（Lactobacillus）種、フィロバクテリウム（Phyllobacterium）種の属のＤＮＡの相対存在量のみが、胃癌の検出において高い識別能力を示す（図２）。アクロモバクター（Achromobacter）種及び／又はシトロバクター（Citrobacter）種及び／又はクロストリジウム（Clostridium）種及び／又はロドコッカス（Rhodococcus）種及び／又はラクトバチルス（Lactobacillus）種及び／又はフィロバクテリウム（Phyllobacterium）種の相対存在量と、ヘリコバクター（Helicobacter）種及び／又はナイセリア（Neisseria）種の存在量との比を算出し、Ｌｏｇ１０変換を実施し、且つ胃癌の存在に関するカットオフとして正の値を考慮することにより、胃癌と慢性胃炎等の新生物発生前の病変との間で、高度に敏感であり且つ特異的な識別が達成される（図３）。
【００４６】
そのため、生体サンプルが添加される、プライマーの様々な組み合わせ（ＰＣＲ組成物で使用される）により、新生物発生前の良性状態からの胃癌の識別において高度に敏感であり且つ特異的である計算が得られる方法を開発することが可能であった。
【００４７】
そのため、本発明の方法は、
ａ）配列番号１〜配列番号１８を含むか、又は少なくとも配列番号１〜配列番号２及び／又は配列番号３〜配列番号４及び／又は配列番号５〜配列番号６及び／又は配列番号７〜配列番号８及び／又は配列番号９〜配列番号１０及び／又は配列番号１１〜配列番号１２及び／又は配列番号１３〜配列番号１４及び／又は配列番号１５〜配列番号１６及び／又は配列番号１７〜配列番号１８を含む少なくとも１種の反応組成物の調製、並びに試験するインビトロの生体サンプルから抽出したＤＮＡと、前記反応組成物との接触の促進の工程、
ｂ）リアルタイムＰＣＲ反応による増幅の工程、
ｃ）蛍光シグナルの定量、並びに陽性結果を得た場合には胃癌の存在に関する陽性に対応する、アクロモバクター（Achromobacter）種及び／又はシトロバクター（Citrobacter）種及び／又はクロストリジウム（Clostridium）種及び／又はロドコッカス（Rhodococcus）種及び／又はラクトバチルス（Lactobacillus）種及び／又はフィロバクテリウム（Phyllobacterium）種に由来する核酸の相対存在量と、ヘリコバクター（Helicobacter）種及び／又はナイセリア（Neisseria）種由来の核酸の相対存在量との比のｌｏｇ１０の算出による、ｂ）で得られた増幅の分析の工程
を含む。
【００４８】
本発明の別の実施形態では、新生物発生前の良性状態から胃癌を識別する方法を、硝酸塩及び／又は亜硝酸塩及び／又は酸化窒素及び／又はｐ−クレゾール及び／又はインドール及び／又は３−ヒドロキシアントラニル酸及び／又はデオキシコール酸及び／又はフェノールを含む、硝酸レダクターゼ細菌機能又は亜硝酸レダクターゼ細菌機能に由来する代謝産物の定量のための発色反応、発光反応、蛍光反応又は免疫反応に基づいて達成し得る。
【００４９】
この実施形態では、この反応方法は、前記代謝産物のうちの少なくとも１つに対する少なくとも１種の反応物（例えば、前記代謝産物の存在下で発色反応、蛍光反応又は発光反応を生じることが知られている他の既知の化学反応物を除外することなく、硫酸鉄、水酸化ナトリウム、ジフェニルアミン、硫酸、オゾン、又は他のもの）を含む組成物を使用する。
【００５０】
前記代謝産物のうちの少なくとも１つに対して親和性を有する少なくとも１種の抗体を含む、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）用の反応組成物も、本発明を達成する形態のうちの１つである。
【００５１】
代謝産物の定量用の反応組成物は、所望される代謝産物及び反応タイプにより異なる。
【００５２】
この実施形態における反応組成物を、インビトロで硝酸レダクターゼ機能及び／又は亜硝酸レダクターゼ機能から得られた化合物を含む生体サンプルの添加により調製する。
【００５３】
別の実施形態では、新生物発生前の良性状態からの胃癌の識別のための反応組成物を、インビボで硝酸レダクターゼ機能及び／又は亜硝酸レダクターゼ機能から得られた化合物を含むインビトロの生体サンプルの添加により調製する。
【００５４】
この試験生体サンプルを、当分野で既知の標準的な方法を使用して、ヒト又は他の生物学的起源の組織、胃洗浄液、血清、血漿、尿、呼気凝縮液又は呼気から得ることができる。
【００５５】
発色反応、発光反応、蛍光反応又はＥＬＩＳＡ反応により、生体サンプル中の代謝産物の量に比例するシグナルが生じ、このシグナルは、正常範囲（新生物発生前の良性状態を有する個体での対応する代謝産物のレベルの平均により算出される）と比べて高い場合には胃癌の存在を示す。
【００５６】
そのため、代謝産物（例えば、硝酸塩及び／又は亜硝酸塩及び／又は酸化窒素及び／又はｐ−クレゾール及び／又はインドール及び／又は３−ヒドロキシアントラニル酸及び／又はデオキシコール酸及び／又はフェノール）との反応用の組成物に、インビトロで生体サンプルを添加し、新生物発生前の良性状態からの胃癌の識別において特異的である定量をもたらす、方法を開発することが可能である。そのため、本実施形態の方法は、
ａ）上記で説明した少なくとも１種の反応組成物の調製、並びに言及した識別のために試験するインビトロの生体サンプル由来の硝酸レダクターゼ機能及び／又は亜硝酸レダクターゼ機能からの代謝産物と、反応組成物との接触の促進の工程、
ｂ）発色反応、発光反応、蛍光反応又はＥＬＩＳＡ反応のインキュベーションの工程、
ｃ）正常範囲と比べて値が高い場合には胃癌の存在に関して陽性に対応する吸光度又は発光シグナル若しくは蛍光シグナルの定量による、ｂ）で得られた反応の結果の分析の工程
を含む。
【００５７】
この方法の代替実施形態では、前記代謝産物を質量分析により定量する。そのため、この代替実施形態では、本発明の方法は、
ａ）言及した識別のために試験するインビトロの生体サンプル由来の硝酸レダクターゼ機能及び／又は亜硝酸レダクターゼ機能からの代謝産物を得る工程、
ｂ）このサンプルを質量分析に供する工程、
ｃ）正常範囲と比べて値が高い場合には胃癌の存在に関して陽性に対応する硝酸塩及び／又は亜硝酸塩及び／又は酸化窒素及び／又はｐ−クレゾール及び／又はインドール及び／又は３−ヒドロキシアントラニル酸及び／又はデオキシコール酸及び／又はフェノールの存在量を定量することにより、ｂ）で得られた結果を分析する工程
を含む。
【００５８】
結論として、本発明の方法は、生体サンプルにおける新生物発生前の良性状態からの胃癌の識別で有用であり、このことは、この目的のために設計された、遺伝子配列、反応組成物、及び識別のために使用される計算により付与されるこの方法の高い感度及び特異性に起因する。この方法の利点は、新生物発生前の状態／病変を有する患者が胃癌へと既に進行しているかどうかを高い識別能力で確認することが可能であるということである。この方法は、胃癌の発生を検出するために又は予測するために、新生物発生前の良性状態（例えば、慢性胃炎、腸上皮化生及び異形成）を有する患者のモニタリングで適用され得、最終的には、抗生物質の組成物を使用して適切な予防処置の基盤を提供する。
【実施例】
【００５９】
実施例
実施例１−プライマーの配列の調製
プライマー配列  配列番号１〜配列番号１８を下記のとおりに調製した：
上記で示した配列を、固相ホスホロアミダイトヌクレオシドを使用するヌクレオチド合成法により調製した。この合成を、各オリゴヌクレオチドの３’末端の最初の塩基で官能化された固体支持体を備えた充填カラムで実施した。各オリゴヌクレオチドの調製は多数の合成サイクルの後に起き、それぞれは下記の４種の化学反応からなった：アンロック（脱トリチル化）；カップリング；保護及び酸化。各サイクルでは、成長中の鎖の５’末端に、所望される配列に対応するヌクレオチド残基が段階的に付加された。
【００６０】
プローブの濃度を、微生物ＤＮＡフリー水（分子生物学グレード、ゲノムＤＮＡ汚染を除去するためにフィルタ滅菌されてＵＶ処理されているヌクレアーゼフリー水）による凍結乾燥調製物の希釈により、２０μＭの値に調整した。
【００６１】
実施例２−ＰＣＲ反応用の組成物の調製
様々な可能な組み合わせで配列番号１〜配列番号１８のヌクレオチドを含むいくつかのＰＣＲ反応組成物を調製した。
【００６２】
２．１．新生物発生前の病変からの胃癌の識別のためのＰＣＲ反応用の本発明の組成物の一例は、
・  濃度１×でのリアルタイムＰＣＲ用の溶液試薬「PowerUp SYBR Green Master Mix」；
・  １μＭの濃度での配列：配列番号１を有するオリゴヌクレオチド；
・  １μＭの濃度での配列：配列番号２を有するオリゴヌクレオチド；
・  微生物ＤＮＡフリー水
である。
【００６３】
２．２．新生物発生前の病変からの胃癌の識別のためのＰＣＲ反応用の本発明の組成物の別の例は、
・  濃度１×でのリアルタイムＰＣＲ用の溶液試薬「PowerUp SYBR Green Master Mix」；
・  １μＭの濃度での配列：配列番号３を有するオリゴヌクレオチド；
・  １μＭの濃度での配列：配列番号４を有するオリゴヌクレオチド；
・  微生物ＤＮＡフリー水
である。
【００６４】
２．３．新生物発生前の病変からの胃癌の識別のためのＰＣＲ反応用の本発明の組成物の別の例は、
・  濃度１×でのリアルタイムＰＣＲ用の溶液試薬「PowerUp SYBR Green Master Mix」；
・  １μＭの濃度での配列：配列番号５を有するオリゴヌクレオチド；
・  １μＭの濃度での配列：配列番号６を有するオリゴヌクレオチド；
・  微生物ＤＮＡフリー水
である。
【００６５】
２．４．新生物発生前の病変からの胃癌の識別のためのＰＣＲ反応用の本発明の組成物の別の例は、
・  濃度１×でのリアルタイムＰＣＲ用の溶液試薬「PowerUp SYBR Green Master Mix」；
・  １μＭの濃度での配列：配列番号７を有するオリゴヌクレオチド；
・  １μＭの濃度での配列：配列番号８を有するオリゴヌクレオチド；
・  微生物ＤＮＡフリー水
である。
【００６６】
２．５．新生物発生前の病変からの胃癌の識別のためのＰＣＲ反応用の本発明の組成物の別の例は、
・  濃度１×でのリアルタイムＰＣＲ用の溶液試薬「PowerUp SYBR Green Master Mix」；
・  １μＭの濃度での配列：配列番号９を有するオリゴヌクレオチド；
・  １μＭの濃度での配列：配列番号１０を有するオリゴヌクレオチド；
・  微生物ＤＮＡフリー水
である。
【００６７】
２．６．新生物発生前の病変からの胃癌の識別のためのＰＣＲ反応用の本発明の組成物の別の例は、
・  濃度１×でのリアルタイムＰＣＲ用の溶液試薬「PowerUp SYBR Green Master Mix」；
・  １μＭの濃度での配列：配列番号１１を有するオリゴヌクレオチド；
・  １μＭの濃度での配列：配列番号１２を有するオリゴヌクレオチド；
・  微生物ＤＮＡフリー水
である。
【００６８】
２．７．新生物発生前の病変からの胃癌の識別のためのＰＣＲ反応用の本発明の組成物の別の例は、
・  濃度１×でのリアルタイムＰＣＲ用の溶液試薬「PowerUp SYBR Green Master Mix」；
・  １μＭの濃度での配列：配列番号１３を有するオリゴヌクレオチド；
・  １μＭの濃度での配列：配列番号１４を有するオリゴヌクレオチド；
・  微生物ＤＮＡフリー水
である。
【００６９】
２．８．新生物発生前の病変からの胃癌の識別のためのＰＣＲ反応用の本発明の組成物の別の例は、
・  濃度１×でのリアルタイムＰＣＲ用の溶液試薬「PowerUp SYBR Green Master Mix」；
・  １μＭの濃度での配列：配列番号１５を有するオリゴヌクレオチド；
・  １μＭの濃度での配列：配列番号１６を有するオリゴヌクレオチド；
・  微生物ＤＮＡフリー水
である。
【００７０】
２．９．新生物発生前の病変からの胃癌の識別のためのＰＣＲ反応用の本発明の組成物の別の例は、
・  濃度１×でのリアルタイムＰＣＲ用の溶液試薬「PowerUp SYBR Green Master Mix」；
・  １μＭの濃度での配列：配列番号１７を有するオリゴヌクレオチド；
・  １μＭの濃度での配列：配列番号１８を有するオリゴヌクレオチド；
・  微生物ＤＮＡフリー水
である。
【００７１】
実施例３−細菌のＤＮＡ又はｃＤＮＡの定量用の組成物の調製
新生物発生前の良性状態からの胃癌の識別のためのＰＣＲ反応混合物の組成物を、上述したＰＣＲ組成物に、インビトロで得た生体サンプル由来のＤＮＡを添加することにより、新生物発生前の良性状態からの胃癌の識別のためのＰＣＲ反応混合物の組成物を調製した。例えばRNeasy Mini Kit（QIAGEN）を使用して抽出したＲＮＡを、前記リアルタイムＰＣＲ反応に使用し得るｃＤＮＡへと変換する逆転写酵素キット（例えば、Superscript IV（Invitrogen））を使用するインビトロでの方法によって、細菌に由来するＲＮＡから得た相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）も使用した。
【００７２】
実施例４−組織中の細菌ＤＮＡの定量の方法
本発明の方法を実行するために、細菌ＤＮＡの定量用の様々な組成物を、先の実施例で説明したように調製した。この実施例では、新鮮な又はホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）のいずれかの組織生検由来のＤＮＡを使用した。
【００７３】
先の実施例からの定量用の組成物を、リアルタイムＰＣＲでの増幅に供した。
【００７４】
この増幅を実行するために、Scientific ThermoFischerから販売されているABI PRISM（登録商標）7500 Fast Real Time PCR装置を使用した。
【００７５】
このＰＣＲ増幅の条件は下記のとおりであった：
・  第１ステージ：５０℃で２分及び続いて９５℃で１０分を１サイクル、
・  第２ステージ：シグナルの取得を伴う、９５℃で１５秒及び６０℃で１分を含む４０サイクル、
・  第３ステージ：１５秒にわたり９５℃、１分にわたり６０℃、３０秒にわたり９５℃及び１５秒にわたり６０℃を１サイクル。
【００７６】
得られた蛍光シグナルの分析と、全細菌濃度により除算された各細菌のＤＮＡ濃度の定量とから、各細菌の相対存在量を得た。アクロモバクター（Achromobacter）種及び／又はシトロバクター（Citrobacter）種及び／又はクロストリジウム（Clostridium）種及び／又はロドコッカス（Rhodococcus）種及び／又はラクトバチルス（Lactobacillus）種及び／又はフィロバクテリウム（Phyllobacterium）種の相対存在量と、ヘリコバクター（Helicobacter）種及び／又はナイセリア（Neisseria）種の存在量との比を算出し、Ｌｏｇ１０変換を実施し、且つ胃癌の存在に関するカットオフとして正の値を考慮することにより、胃癌と慢性胃炎等の新生物発生前の病変との間で、高度に敏感であり且つ特異的な識別が達成される。
【００７７】
この実施例では、利点は、試験の結果を同一サンプルで観測した解剖学的な且つ病理学的な特徴と相関させることが可能であるということである。ＦＦＰＥ組織を使用することも有利であり、なぜならば、長期の臨床経過観察によりアーカイブサンプル（archival sample）から遡及的に試験し得るからである。
【００７８】
実施例５−胃洗浄液中における細菌ＤＮＡの定量の方法
本発明の方法を実行するために、細菌ＤＮＡの定量用のＰＣＲ反応のための様々な組成物を、先の実施例で説明したように調製した。
【００７９】
この実施例では、内視鏡検査により及びQiagen社のQIAamp（登録商標）DNA Microbiome Kitを使用してインビトロでのＤＮＡ抽出を実施することにより得られた胃洗浄液由来のＤＮＡを使用した。
【００８０】
増幅反応及び分析を、先の実施例で述べたように実施した。
【００８１】
この実施例での利点は、特定の解剖学的位置に限定されている生検と比較して、胃細菌内容物のより包括的なサンプリングを表す生体サンプルで決定を行ない得ることである。
【００８２】
実施例６−呼気凝縮液中における細菌ＤＮＡの定量の方法
本発明の方法を実行するために、細菌ＤＮＡの定量用のＰＣＲ反応のための様々な組成物を、先の実施例で説明したように調製した。
【００８３】
この実施例では、QIAamp（登録商標）DNA Microbiome Kitを使用することによりインビトロで得られた呼気凝縮液由来のＤＮＡを使用して、Respiratory Research Inc.のRTube息凝縮液採取器等の採取用の装置又は類似の市販の装置（例えば、EcoScreen（Erich Jaeger GmbH）、ANACON凝縮器（Biostec）、TURBO-DECCS（ItalChill Pharma）及びOncosopro（Infogene,lda））により得られた呼気凝縮液からのＤＮＡ抽出を実施した。
【００８４】
増幅反応及び分析を、先の実施例で述べたように実施した。
【００８５】
この実施例では、利点は、内視鏡検査、生検又は手術に頼る必要なしに、患者にとってより便利であり侵襲性がより低い種類のサンプルから決定を行い得ることである。
【００８６】
実施例７−代謝産物との反応用の組成物の調製
硝酸塩及び／又は亜硝酸塩及び／又は酸化窒素及び／又はｐ−クレゾール及び／又はインドール及び／又は３−ヒドロキシアントラニル酸及び／又はデオキシコール酸及び／又はフェノールとの反応物を含む、硝酸レダクターゼ細菌機能及び／又は亜硝酸レダクターゼ細菌機能に由来する代謝産物との反応用の組成物を調製した。
【００８７】
代謝産物の定量用の反応組成物は、所望される代謝産物及び反応タイプにより異なる。
【００８８】
７．１．硝酸塩の検出及び定量による新生物発生前の状態からの胃癌の識別用の本発明の組成物は、下記の化学反応に従って、反応物として例えば硫酸鉄及び硫酸を含む前記組成物である。
２ＨＮＯ３＋３Ｈ２ＳＯ４＋６ＦｅＳＯ４→３Ｆｅ２（ＳＯ４）３＋２ＮＯ＋４Ｈ２Ｏ
［Ｆｅ（Ｈ２Ｏ）６］ＳＯ４＋ＮＯ＝［Ｆｅ（Ｈ２Ｏ）５（ＮＯ）］ＳＯ４＋Ｈ２Ｏ
【００８９】
７．２．硝酸塩の検出及び定量による新生物発生前の状態からの胃癌の識別用の本発明の組成物の別の例は、下記の化学反応に従って、反応物として例えば水酸化ナトリウム、アルミニウム、及び赤リトマス紙を含む前記組成物である。
３ＮＯ−３＋８Ａｌ＋５ＯＨ−＋１８Ｈ２Ｏ→３ＮＨ３＋８［Ａｌ（ＯＨ）４］−
【００９０】
７．３．硝酸塩の検出及び定量による新生物発生前の状態からの胃癌の識別用の本発明の組成物の別の例は、反応物として例えばジフェニルアミンを含む前記組成物である。
【００９１】
７．４．硝酸塩の検出及び定量による新生物発生前の状態からの胃癌の識別用の本発明の組成物の別の例は、反応物として例えば硫酸及び硫酸中の塩化アンモニウムを含む前記組成物である。
【００９２】
７．５．硝酸塩の検出及び定量による新生物発生前の状態からの胃癌の識別用の本発明の組成物の別の例は、下記の化学反応に従って、反応物として例えば硫酸及び銅を含む前記組成物である。
Ｃｕ＋４ＨＮＯ３→Ｃｕ（ＮＯ３）２＋２ＮＯ２＋２Ｈ２Ｏ
【００９３】
７．６．亜硝酸塩の検出及び定量による新生物発生前の状態からの胃癌の識別用の本発明の組成物の別の例は、反応物として例えば４モル濃度の硫酸及び０．１モル濃度の硫酸鉄（ＩＩ）を含む前記組成物である。
【００９４】
７．７．酸化窒素の検出及び定量による新生物発生前の状態からの胃癌の識別用の本発明の組成物の別の例は、化学発光化合物である二酸化窒素を形成するための反応物として例えばオゾンを含む前記組成物である。
【００９５】
７．８．代謝産物の検出及び定量による新生物発生前の状態からの胃癌の識別用の本発明の組成物の別の例は、例えば前記代謝産物に対する親和性を有する抗体を含む前記組成物である。
【００９６】
実施例８−インビトロでの細菌代謝機能に由来する代謝産物の定量用の組成物の調製
新生物発生前の良性状態からの胃癌の識別用の反応組成物を、先の実施例で述べた反応組成物の、硝酸レダクターゼ細菌代謝機能及び／又は亜硝酸レダクターゼ細菌代謝機能に由来する前記代謝産物を含む、インビトロで得られた生体サンプルへの添加により調製する。インビトロで硝酸レダクターゼ機能由来の及び／又は亜硝酸レダクターゼ機能由来の代謝産物を得るために、基質（例えば硝酸塩）をインビトロで生体サンプルに添加し得る。
【００９７】
試験生体サンプルを、当分野で既知の標準的な方法を使用して、ヒト又は他の生物学的起源の組織、胃洗浄液、血清、血漿、尿、呼気凝縮液又は呼気から得ることができる。
【００９８】
実施例９−インビボでの細菌代謝機能に由来する代謝産物の定量用の組成物の調製
新生物発生前の良性状態からの胃癌の識別用の反応組成物を、先の実施例で述べた反応組成物の、インビボで実施された硝酸レダクターゼ細菌代謝機能及び／又は亜硝酸レダクターゼ細菌代謝機能に由来する前記代謝産物を含む、インビトロで得られた生体サンプルへの添加により調製する。この実施例では、硝酸レダクターゼ機能由来の及び／又は亜硝酸レダクターゼ機能由来の代謝産物を含むインビトロのサンプルを得るために、基質（例えば硝酸塩若しくは亜硝酸塩又は硝酸レダクターゼ代謝機能及び／又は亜硝酸レダクターゼ代謝機能の他の既知の基質）を患者に投与した後に生体サンプルを得る。
【００９９】
試験生体サンプルを、当分野で既知の標準的な方法を使用して、ヒト又は他の生物学的起源の組織、胃洗浄液、血清、血漿、尿、呼気凝縮液又は呼気から得ることができる。
【０１００】
実施例１０−発色反応、発光反応、蛍光反応又は免疫反応を使用する細菌代謝産物の定量の方法
本発明において新生物発生前の良性状態から胃癌を識別する方法を実行するために、先の実施例に従って、インビトロの生体サンプルを添加する、代謝産物との反応用の組成物を調製した。
【０１０１】
発色反応、発光反応、蛍光反応又はＥＬＩＳＡ反応をインキュベートして、この生体サンプル中の代謝産物の量に比例するシグナルを得た。
【０１０２】
正常範囲（新生物発生前の良性状態を有する個体における対応する代謝産物のレベルの平均により算出される）と比べて高い場合には、結果は、サンプルが胃癌に関して陽性であることを示す。
【０１０３】
この実施例では、利点は、実験室で一般的であり且つ重くて高価な機器を必要としないアッセイにより決定を行ない得ることである。
【０１０４】
実施例１１−質量分析を使用する細菌代謝産物の定量の方法
本発明において新生物発生前の良性状態から胃癌を識別する方法を実行するために、インビトロの生体サンプルを先の実施例で述べたように得て、質量分析に直接供した。固体、液体又は気体であり得る生体サンプルはイオン化され、次いで、このイオンは、このイオンを加速させて電場又は磁場に供することにより、このイオンの質量対電荷比に従って分離される。次いで、このイオンは、電子増倍管等の荷電粒子を検出し得るメカニズムにより検出される。結果は、質量対電荷比の関数として、検出されたイオンの相対存在量のスペクトルとして表示される。このようにして、サンプル中の前記代謝産物は、同定した質量に対して既知の質量を相関させることにより同定され、生体サンプル中の代謝産物の量に比例する、対応するピークの強度により定量される。
【０１０５】
正常範囲（新生物発生前の良性状態を有する個体における対応する代謝産物のレベルの平均により算出される）と比べて高い場合には、結果は、サンプルが胃癌に関して陽性であることを示す。
【０１０６】
この実施例では、利点は、同一サンプル中で同時にいくつかの代謝産物の決定を行ない得ることである。
【０１０７】
配列表
配列番号１：
5’-TCGGGCCTTGGTAGCG-3’
配列番号２：
5’-TTCCTTTGAGTTTTAATCTT -3’
配列番号３：
5’-GTAAAGTACTTTCAGCGAG-3’
配列番号４：
5’-GTTTCGGATGCAGTTCCC-3’
配列番号５：
5’-GCTTAACACATGCAAGTCGAGCG-3’
配列番号６：
5’-CCTTTCGGGAGGCTATCC-3’
配列番号７：
5’-GGGTTCCTTCCACGGGAT-3’
配列番号８：
5’-CCTTTGAGTTTTAGCCTTG-3’ 
配列番号９：
5’- GGCAGCAGTAGGGAAT -3’
配列番号１０：
5’- CTATCCTTCTTCACCAAC -3’ 
配列番号１１：
5’-CTGCCTTTGATACTGGTAGT-3’
配列番号１２：
5’-CGGCTAGCTCTCATAGTTTA-3’ 
配列番号１３：
5’-GAAGATAATGACGGTATCTAAC-3’
配列番号１４：
5’-ATTTCACACCTGACTGACTAT-3’ 
配列番号１５：
5’-AACGATGTCAATTAGCTGTT-3’
配列番号１６：
5’-CAATTCCTTTGAGTTTTAATC-3’
配列番号１７：
5’-TAGATACCCTGGTAGTCC-3’ 
配列番号１８：
5’-CTGACGACAGCCATGC-3’
【０１０８】
参考文献：
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【図１Ａ）】
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【図１Ｂ）】
2020513852.tif 000003
【図１Ｃ）】
2020513852.tif 000004
【図１Ｄ）】
2020513852.tif 000005
【図１Ｅ）】
2020513852.tif 000006
【図１Ｆ）】
2020513852.tif 000007
【図１Ｇ）】
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【図２Ａ）】
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【図２Ｂ）】
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【図２Ｃ）】
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【図２Ｄ）】
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【図２Ｅ）】
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【図２Ｆ）】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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