(57)【要約】ある特定の態様では、本開示は、心不全または心不全の１つもしくは複数の合併症を処置する、予防する、およびその重症度または進行を低減させる方法に関する。例えば、本開示は、心不全または心不全の１つもしくは複数の合併症を処置する、予防する、およびその重症度または進行を低減させるための種々のＢＭＰアンタゴニスト、例えば、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ＢＭＰＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ１ポリペプチド、エンドグリンポリペプチド、ＢＭＰ１０プロペプチドタンパク質およびそれらのＦｃ融合タンパク質、ならびに抗ＢＭＰ９抗体を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
心不全を有する患者の死亡および／または入院のリスクを低減させる方法であって、それを必要とする患者に、有効量のＢＭＰアンタゴニストを投与するステップを含む、方法。
【請求項２】
前記患者の死亡が、任意の原因による、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記患者の死亡が、心血管事象による、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記心血管事象が、心筋梗塞、脳卒中、狭心症、不整脈、体液貯留、および心不全の進行からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記患者の入院が、任意の原因による、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記患者の入院が、心血管事象による、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記心血管事象が、心筋梗塞、脳卒中、狭心症、不整脈、体液貯留、心不全の進行からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
患者において心不全の進行を低減させる方法であって、それを必要とする患者に、有効量のＢＭＰアンタゴニストを投与するステップを含む、方法。
【請求項９】
患者において心血管事象の発生率を低減させる方法であって、それを必要とする患者に、有効量のＢＭＰアンタゴニストを投与するステップを含む、方法。
【請求項１０】
前記心血管事象が、心筋梗塞、脳卒中、狭心症、不整脈、体液貯留、心不全の進行からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記心血管事象が、患者の入院を生じることになる、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
患者において心線維症を処置する、予防する、またはその重症度を低減させる方法であって、それを必要とする患者に、有効量のＢＭＰアンタゴニストを投与するステップを含む、方法。
【請求項１３】
患者において心肥大を処置する、予防する、またはその重症度を低減させる方法であって、それを必要とする患者に、有効量のＢＭＰアンタゴニストを投与するステップを含む、方法。
【請求項１４】
心筋肥大が、求心性および／または遠心性肥大である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
患者において心リモデリングを処置する、予防する、またはその重症度を低減させる方法であって、それを必要とする患者に、有効量のＢＭＰアンタゴニストを投与するステップを含む、方法。
【請求項１６】
前記心リモデリングが心室リモデリングである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記心リモデリングが心室拡張である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
心室中隔拡張終期を減少させる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
後壁拡張終期を減少させる、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
患者において心機能不全を処置する、予防する、またはその重症度を低減させる方法であって、それを必要とする患者に、有効量のＢＭＰアンタゴニストを投与するステップを含む、方法。
【請求項２１】
心駆出率を増加させる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
心駆出率を、少なくとも５％（例えば、少なくとも５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％、６５％またはそれよりも多く）増加させる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
等容弛緩時間を減少させる、請求項２０から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
等容弛緩時間を、少なくとも２ｍｓ（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０ｍｓまたはそれよりも多く）減少させる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
短縮率を増加させる、請求項２０から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
短縮率を、少なくとも５％（例えば、少なくとも５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％またはそれよりも多く）増加させる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
患者において高血圧を処置する、予防する、またはその重症度を低減させる方法であって、それを必要とする患者に、有効量のＢＭＰアンタゴニストを投与するステップを含む、方法。
【請求項２８】
前記患者の血圧を低減させる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
収縮期血圧を低減させる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
収縮期血圧を、少なくとも４ｍｍＨｇ（例えば、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０ｍｍＨｇまたはそれよりも多く）低減させる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
拡張期血圧を低減させる、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
拡張期血圧を、少なくとも２ｍｍＨｇ（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０ｍｍＨｇまたはそれよりも多く）低減させる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記血圧が、安静時血圧として測定される、請求項２８から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記血圧が、自由行動下血圧として測定される、請求項２８から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
心臓疾患または心臓疾患の１つもしくは複数の合併症を処置する、予防する、またはその重症度を低減させる方法であって、それを必要とする患者に、有効量のＢＭＰアンタゴニストを投与するステップを含む、方法。
【請求項３６】
心臓疾患の前記１つまたは複数の合併症が、呼吸困難（息切れ）、起座呼吸、発作性夜間呼吸困難、および疲労（これは、運動耐容能を制限し得る）、体液貯留（これは、例えば、肺うっ血および末梢性浮腫をもたらし得る）、狭心症、高血圧、不整脈、心室性不整脈、心筋症、心肥大、心臓喘息、夜間多尿症、腹水貯留、うっ血性肝障害、凝固障害、腎血流低減、腎機能不全、心筋梗塞、および脳卒中からなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＢＭＰアンタゴニストが、心筋梗塞後に前記患者に投与される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記患者が、左心室収縮期機能不全を有する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記患者が、≦４０％の駆出率を有する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記患者が、≦３５％の駆出率を有する、請求項１から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記駆出率が、放射性核種心室造影法、放射性核種血管造影法、心エコー法または心室コントラスト血管造影法（ventricular contrast angiography）のうち１つまたは複数によって測定される、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記患者が、左心室機能不全に起因する心不全、正常駆出率心不全、大動脈弁狭窄症心不全、急性心不全、慢性心不全、うっ血性心不全、先天性心不全、代償性心不全、非代償性心不全、拡張期心不全、収縮期心不全、右心（室）不全、左心（室）不全、前方心不全、後方心不全、高拍出性心不全、低拍出性心不全および心筋浮腫からなる群から選択される１つまたは複数の型の心不全を有する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記患者が、呼吸困難、起座呼吸、大動脈弁狭窄症、発作性夜間呼吸困難、疲労、体液貯留、肺うっ血、浮腫、末梢性浮腫、狭心症、高血圧、不整脈、心室性不整脈、心筋症、心肥大、腎血流低減、腎機能不全、心筋梗塞症、心リモデリング、心線維症、心高血圧、心壁ストレス、心炎症、心圧負荷、心容量負荷、脳卒中、心腔拡張、心室真球度の増加、間質性線維症、血管周囲線維症、心筋細胞肥大、心臓喘息、夜間多尿症、腹水貯留、うっ血性肝障害、凝固障害、急性虚血傷害、再灌流傷害、左心室機能の機能障害、および右心室機能の機能障害からなる群から選択される１つまたは複数の合併症を有する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
呼吸困難、起座呼吸、発作性夜間呼吸困難、疲労、体液貯留、肺うっ血、浮腫、末梢性浮腫、狭心症、高血圧、不整脈、心室性不整脈、心筋症、心肥大、腎血流低減、大動脈弁狭窄症、腎機能不全、心筋梗塞症、心リモデリング、心線維症、心高血圧、心壁ストレス、心炎症、心圧負荷、心容量負荷、脳卒中、心腔拡張、心室真球度の増加、間質性線維症、血管周囲線維症、心筋細胞肥大、心臓喘息、夜間多尿症、腹水貯留、うっ血性肝障害、凝固障害、急性虚血傷害、再灌流傷害、左心室機能の機能障害、および右心室機能の機能障害からなる群から選択される１つまたは複数の合併症を処置する、予防する、またはその重症度を低減させる、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記患者が、体高血圧、肺高血圧、糖尿病、腎臓（腎）不全（例えば、急性または慢性腎不全）、冠動脈疾患、高血圧、左心室機能不全、心臓弁疾患、先天性心臓欠損、急性虚血傷害、再灌流傷害、心リモデリング心膜障害、心筋障害、大血管障害および心内膜障害からなる群から選択される１つまたは複数の状態を有する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記患者が、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＮＹＨＡ）機能分類に従うと少なくともクラスＩの心不全を有する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記患者が、ＮＹＨＡ機能分類に従うとクラスＩＩ、クラスＩＩＩまたはクラスＩＶの心不全を有する、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記患者が、ＮＹＨＡ機能分類に従うとクラスＩＩまたはクラスＩＩＩの心不全を有する、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記患者が、ＮＹＨＡ機能分類に従うとクラスＩＩＩまたはクラスＩＶの心不全を有する、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
前記患者が、ＮＹＨＡ機能分類に従うとクラスＩＶの心不全を有する、請求項４６に記載の方法。
【請求項５１】
前記患者の、ＮＹＨＡ機能分類システムに従う心不全スコアを、少なくとも１クラス改善する（例えば、クラスＩＶの心不全からクラスＩＩＩの心不全への、クラスＩＶの心不全からクラスＩＩの心不全への、クラスＩＶの心不全からクラスＩの心不全への、ステージＩＩＩの心不全からステージＩＩの心不全への、ステージＩＩＩの心不全からステージＩの心不全への、またはクラスＩＩの心不全からクラスＩの心不全への改善）、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記患者の、ＮＹＨＡ機能分類システムに従う心不全スコアの進行を、少なくとも１クラス分、予防するまたは遅延させる（例えば、クラスＩの心不全からクラスＩＩの心不全への進行を遅延させる、クラスＩの心不全からクラスＩＩＩの心不全への進行を遅延させる、クラスＩの心不全からクラスＩＶの心不全への進行を遅延させる、クラスＩＩの心不全からクラスＩＩＩの心不全への進行を遅延させる、クラスＩＩの心不全からクラスＩＶの心不全への進行を遅延させる、またはクラスＩＩＩの心不全からクラスＩＶの心不全への進行を遅延させる）、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記患者が、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ／Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎワーキンググループ（ＡＡＣ）機能分類に従うと少なくともステージＡの心不全を有する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記患者が、ＡＣＣ機能分類に従うとステージＢ、ステージＣまたはステージＤの心不全を有する、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記患者の、ＡＣＣ機能分類システムに従う心不全スコアを、少なくとも１ステージ改善する（例えば、ステージＤの心不全からステージＣの心不全への、ステージＤの心不全からステージＢの心不全への、ステージＤの心不全からステージＡの心不全への、ステージＣの心不全からステージＢの心不全への、ステージＣの心不全からステージＡの心不全への、またはステージＢの心不全からステージＡの心不全への改善）、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記患者の、ＡＣＣ機能分類システムに従う心不全スコアの進行を、少なくとも１ステージ分、予防するまたは遅延させる（例えば、ステージＡの心不全からステージＢの心不全への進行を予防するもしくは遅延させる、ステージＡの心不全からステージＣの心不全への進行を遅延させる、ステージＡの心不全からステージＤの心不全への進行を遅延させる、ステージＢの心不全からステージＣの心不全への進行を遅延させる、ステージＢの心不全からステージＤの心不全への進行を遅延させる、またはステージＣの心不全からステージＤの心不全への進行を遅延させる）、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
心線維症を処置する、予防する、またはその重症度を低減させる、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
心肥大を処置する、予防する、またはその重症度を低減させる、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記心筋肥大が、求心性および／または遠心性肥大である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
患者において心リモデリングを処置する、予防する、またはその重症度を低減させる方法であって、それを必要とする患者に、有効量のＢＭＰアンタゴニストを投与するステップを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記心リモデリングが、心室リモデリングおよび／または心室拡張である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
心室中隔拡張終期および／または後壁拡張終期を減少させる、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
患者において心機能不全を処置する、予防する、またはその重症度を低減させる、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
心駆出率を増加させる、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
心駆出率を、少なくとも５％（例えば、少なくとも５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％、６５％またはそれよりも多く）増加させる、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
等容弛緩時間を減少させる、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
等容弛緩時間を、少なくとも２ｍｓ（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０ｍｓまたはそれよりも多く）減少させる、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
短縮率を増加させる、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
短縮率を、少なくとも５％（例えば、少なくとも５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％またはそれよりも多く）増加させる、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
患者において高血圧を処置する、予防する、またはその重症度を低減させる、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
前記患者の血圧を低減させる、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
収縮期血圧を低減させる、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
収縮期血圧を、少なくとも４ｍｍＨｇ（例えば、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０ｍｍＨｇまたはそれよりも多く）低減させる、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
拡張期血圧を低減させる、請求項７０に記載の方法。
【請求項７５】
拡張期血圧を、少なくとも２ｍｍＨｇ（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０ｍｍＨｇまたはそれよりも多く）低減させる、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記ＢＭＰアンタゴニストがＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドが、
ａ．配列番号１０のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｂ．配列番号１１のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド；および
ｃ．配列番号９のアミノ酸３０〜１１０の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群から選択される、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記ＢＭＰアンタゴニストがＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドである、請求項１から７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
前記ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、
ａ．配列番号１のアミノ酸２９〜１０９に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｂ．配列番号１のアミノ酸２５〜１３１に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｃ．配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｄ．配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｅ．配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｆ．配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｇ．配列番号６５のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド；および
ｈ．配列番号１３３のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群から選択される、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記ポリペプチドが、配列番号１に関して７９位に酸性アミノ酸を含まない、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記ポリペプチドが、配列番号１に関して７９位にＤもＥも含まない、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記ＢＭＰアンタゴニストがＢＭＰＲＩＩポリペプチドである、請求項１から７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
前記ＢＭＰＲＩＩポリペプチドが、
ａ．配列番号１４のアミノ酸２７〜１５０に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｂ．配列番号１４のアミノ酸３４〜１２３に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド；および
ｃ．配列番号１５のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群から選択される、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記ＢＭＰアンタゴニストがＡＬＫ１ポリペプチドである、請求項１から７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
前記ＡＬＫ１ポリペプチドが、
ａ．配列番号２０のアミノ酸２２〜１１８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｂ．配列番号２０のアミノ酸３４〜９５に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド；および
ｃ．配列番号２１のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群から選択される、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記ＢＭＰアンタゴニストがエンドグリンポリペプチドである、請求項１から７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
前記エンドグリンポリペプチドが、
ａ．配列番号２４のアミノ酸２６〜３７８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｂ．配列番号２４のアミノ酸４２〜３３３に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｃ．配列番号２４のアミノ酸２６〜３４６に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｄ．配列番号２４のアミノ酸２７〜３５８１に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド；および
ｅ．配列番号２４のアミノ酸２６〜３５９に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群から選択される、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記エンドグリンポリペプチドが、配列番号２４のアミノ酸３７９〜４３０からなる配列を含まない、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記エンドグリンポリペプチドが、配列番号２４のアミノ酸３７９〜５８６からなる配列由来の５０よりも多く連続するアミノ酸を含まない、請求項８７に記載の方法。
【請求項９０】
前記ＢＭＰアンタゴニストがＢＭＰ１０プロペプチドポリペプチドである、請求項１から７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
前記ＢＭＰ１０プロペプチドポリペプチドが、
ａ．配列番号３４のアミノ酸１〜６のいずれか１つに対応する位置において始まり、配列番号３４のアミノ酸２９２〜２９６のいずれか１つに対応する位置において終わる配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｂ．配列番号３４のアミノ酸１〜６のいずれか１つに対応する位置において始まり、配列番号３４のアミノ酸２９２〜２９５のいずれか１つに対応する位置において終わる配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、アミノ酸ＲＩＲＲの配列を含まないポリペプチド；
ｃ．配列番号３４のアミノ酸１〜２９２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｄ．配列番号３４のアミノ酸１〜２９２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、アミノ酸ＲＩＲＲの配列を含まないポリペプチド；
ｅ．配列番号３４のアミノ酸１〜２９５に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｆ．配列番号３４のアミノ酸１〜２９５に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、アミノ酸ＲＩＲＲの配列を含まないポリペプチド；
ｇ．配列番号３４のアミノ酸１〜６のいずれか１つに対応する位置において始まり、配列番号３４のアミノ酸２９２〜２９５のいずれか１つに対応する位置において終わる配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、前記ポリペプチドのＣ末端が、配列番号３４のＲ２９６ではない、ポリペプチド；
ｈ．配列番号３４のアミノ酸１〜６のいずれか１つに対応する位置において始まり、配列番号３４のアミノ酸２９２〜２９５のいずれか１つに対応する位置において終わる配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、前記ポリペプチドのＣ末端が、配列番号３４のＲ２９６ではない、ポリペプチド；
ｉ．配列番号３４のアミノ酸１〜２９２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、前記ポリペプチドのＣ末端が、配列番号３４のＲ２９６ではない、ポリペプチド；および
ｊ．配列番号３４のアミノ酸１〜２９５に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、前記ポリペプチドのＣ末端が、配列番号３４のＲ２９６ではない、ポリペプチド
からなる群から選択される、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ１、エンドグリンまたはＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドが、免疫グロブリンＦｃドメインを含む融合タンパク質である、請求項７６から９１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９３】
前記免疫グロブリンＦｃドメインが、ＩｇＧ１  Ｆｃ免疫グロブリンドメインである、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記融合タンパク質が、前記ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ１、エンドグリンまたはＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドドメインと前記Ｆｃ免疫グロブリンドメインとの間に位置するリンカードメインを含む、請求項９２または９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記リンカーが、ＧＧＧ（配列番号４１）、ＧＧＧＧ（配列番号４２）、ＴＧＧＧＧ（配列番号４３）、ＳＧＧＧＧ（配列番号４４）、ＴＧＧＧ（配列番号４５）、ＳＧＧＧ（配列番号４６）またはＧＧＧＧＳ（配列番号４７）からなる群から選択される、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合タンパク質が、
ａ．配列番号５０のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｂ．配列番号５４のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド；および
ｃ．配列番号５７のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群から選択される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９７】
前記融合タンパク質が、
ａ．配列番号５８のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｂ．配列番号６０のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｃ．配列番号６３のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｄ．配列番号６４のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｅ．配列番号６６のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｆ．配列番号１２３のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｇ．配列番号１３１のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド；および
ｈ．配列番号１３２のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群から選択されるＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９８】
前記ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号１に関して７９位に酸性アミノ酸を含むＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドドメインを含まない、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
前記ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドドメインが、配列番号１に関して７９位にＤもＥも含まない、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質が、
ａ．配列番号６９のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド；および
ｂ．配列番号７１のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群から選択される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０１】
前記ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質が、
ａ．配列番号７４のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド；および
ｂ．配列番号７６のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群から選択される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０２】
前記エンドグリン−Ｆｃ融合タンパク質が、
ａ．配列番号７８のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｂ．配列番号８０のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｃ．配列番号２８のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｄ．配列番号２９のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド
ｅ．配列番号３０のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド；および
ｆ．配列番号３１のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群から選択される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０３】
前記ＢＭＰ１０プロペプチド−Ｆｃ融合タンパク質が、
ａ．配列番号８２のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｂ．配列番号８４のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｃ．配列番号８５のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド；および
ｄ．配列番号８７のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群から選択される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０４】
前記ポリペプチドまたは融合タンパク質が、グリコシル化されたアミノ酸、ＰＥＧ化されたアミノ酸、ファルネシル化されたアミノ酸、アセチル化されたアミノ酸、ビオチン化されたアミノ酸、および脂質部分にコンジュゲートされたアミノ酸からなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸改変を含む、請求項７６から１０３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０５】
前記ポリペプチドまたは融合タンパク質が、チャイニーズハムスター卵巣細胞株から取得可能なグリコシル化パターンを有する、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
前記ポリペプチドまたは融合タンパク質が、ＢＭＰ１０および／またはＢＭＰ９に結合する、請求項７６から１０４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０７】
前記ポリペプチドまたは融合タンパク質が、ＢＭＰ６、ＢＭＰ３ｂおよびＢＭＰ５からなる群から選択される１種または複数種のリガンドにさらに結合する、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
前記ポリペプチドまたは融合タンパク質が、ＢＭＰ１０および／またはＢＭＰ９を阻害する、請求項７６から１０７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０９】
前記ポリペプチドまたは融合タンパク質が、細胞ベースのアッセイにおいてＢＭＰ１０および／またはＢＭＰ９活性を阻害する、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
前記ポリペプチドまたは融合タンパク質が、ＢＭＰ６、ＢＭＰ３ｂおよびＢＭＰ５からなる群から選択される１種または複数種のリガンドをさらに阻害する、請求項１０８または１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
前記ポリペプチドまたは融合タンパク質が、細胞ベースのアッセイにおいてＢＭＰ６、ＢＭＰ３ｂおよびＢＭＰ５のうち１種または複数種の活性を阻害する、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
前記融合タンパク質がホモダイマーである、請求項９２から１１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１３】
前記ＢＭＰアンタゴニストが、抗体または抗体の組合せである、請求項１から７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１４】
前記抗体または抗体の組合せが、ＢＭＰ１０および／またはＢＭＰ９に結合する、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
前記抗体または抗体の組合せが、ＢＭＰ６、ＢＭＰ３ｂおよびＢＭＰ５からなる群から選択される１種または複数種のリガンドにさらに結合する、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
前記抗体または抗体の組合せが、ＢＭＰ１０および／またはＢＭＰ９活性を阻害する、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１７】
前記抗体または抗体の組合せが、ＢＭＰ６、ＢＭＰ３ｂおよびＢＭＰ５からなる群から選択される１種または複数種のリガンドの活性をさらに阻害する、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１８】
前記抗体または抗体の組合せが、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ３ｂ、ＢＭＰ５、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１およびエンドグリンからなる群から選択される１種または複数種のポリペプチドに結合する、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１９】
前記抗体または抗体の組合せが、少なくとも成熟ＢＭＰ１０に結合し、かつＢＭＰ１０プロペプチドと競合的に結合する、請求項１１３から１１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２０】
前記抗体または抗体の組合せが、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ３ｂおよびＢＭＰ５のうち１種または複数種に結合し、かつＢＭＰ１０プロペプチドと競合的に結合する、請求項１１３から１１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２１】
前記ＢＭＰアンタゴニストが小分子である、請求項１から７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２２】
前記小分子が、ＢＭＰ９および／またはＢＭＰ１０の活性を阻害する、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２３】
前記小分子が、ＢＭＰ６、ＢＭＰ３ｂおよびＢＭＰ５からなる群から選択される１種または複数種のリガンドの活性をさらに阻害する、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２４】
前記小分子が、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ３ｂ、ＢＭＰ５、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１、エンドグリン、および１種または複数種のＳｍａｄ（例えば、Ｓｍａｄ２および／または３）からなる群から選択される１種または複数種の薬剤の活性を阻害する、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２５】
前記ＢＭＰアンタゴニストがヌクレオチドである、請求項１から７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２６】
前記ヌクレオチドが、ＢＭＰ９および／またはＢＭＰ１０の活性を阻害する、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２７】
前記ヌクレオチドが、ＢＭＰ６、ＢＭＰ３ｂおよびＢＭＰ５からなる群から選択される１種または複数種のリガンドの活性をさらに阻害する、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
前記ヌクレオチドが、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ３ｂ、ＢＭＰ５、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１、エンドグリン、および１種または複数種のＳｍａｄ（例えば、Ｓｍａｄ２および／または３）からなる群から選択される１種または複数種の薬剤の活性を阻害する、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２９】
前記患者に、心不全または心不全の１つもしくは複数の合併症を処置する、予防する、またはその重症度を低減させるためのさらなる活性薬剤または他の支持療法が投与される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３０】
心不全または心不全の１つもしくは複数の合併症を処置する、予防する、またはその重症度を低減させるための前記さらなる活性薬剤または他の支持療法が、ペースメーカー、インプラント可能な心除細動器、心収縮力モジュレーション、心再同期治療、補助循環装置、両心室再同期治療、心臓移植、アドレナリンブロッカー（アルファ−ブロッカーおよびベータ−ブロッカー）、中枢作用性アルファ−アゴニスト、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、アンギオテンシン受容体ブロッカー、カルシウムチャネルブロッカー、陽性変力物質、血管拡張薬、ベンゾジアゼピン、レニン阻害剤、抗血栓剤、複数の型の利尿薬、カプトプリル、エナラプリル、リシノプリル、ベナゼプリル、ラミプリル、ゾフェノプリル、キナプリル、ペリンドプリル、リシノプリル、ベナゼプリル、イミダプリル、トランドラプリル、シラザプリルおよびホシノプリル、ロサルタン、カンデサルタン、バルサルタン、イルベサルタン、テルミサルタン、エプロサルタン、オルメサルタン、アジルサルタン、フィマサルタン、プロプラノロール、ブシンドロール、カルテオロール、カルベジロール、ラベタロール、ナドロール、オクスプレノロール、ペンブトロール、ピンドロール、ソタロール、チモロール、アセブトロール、アテノロール、ベタキソロール、ビソプロロール、セリプロロール、エスモロール、メトプロロール、ネビボロール、ブタザミン、ＩＣＩ−１１８，５５１、ＳＲ  ５９２３０Ａ、フェノキシベンザミン、フェントラミン、トラゾリン、トラゾドン、アルフゾシン、メシル酸ドキサゾシン（ＣａｒｄｕｒａおよびＣａｒｄｕｒａｎ）、プラゾシン、タムスロシン、テラゾシン、シロドシン、アチパメゾール（例えば、Ａｎｔｉｓｅｄａｎ）、イダゾキサン、ミルタザピン、ヨヒンビン、酸性化塩（例えば、ＣａＣｌ２およびＮＨ４ＣＬ）、アルギニンバソプレシン受容体２アンタゴニスト、選択的バソプレシンＶ２アンタゴニスト、Ｎａ−Ｈ交換体アンタゴニスト、炭酸脱水酵素阻害剤、ループ利尿薬、浸透圧利尿薬、カリウム保持性利尿薬、チアジド、キサンチン、ジヒドロピリジン、アムロジピン、アラニジピン、アゼルニジピン、バルニジピン、ベニジピン、シルニジピン、クレビジピン、イスラジピン、エホニジピン、フェロジピン、ラシジピン、レルカニジピン、マニジピン、ニカルジピン、ニフェジピン、ニルバジピン、ニモジピン、ニソルジピン、ニトレンジピン、プラニジピン、フェニルアルキルアミンカルシウムチャネルブロッカー、ベラパミル、ガロパミル、フェンジリン、ベンゾチアゼピンカルシウムチャネルブロッカー、ジルチアゼム、ミベフラジル、ベプリジル、フルナリジン、フルスピリレン、フェンジリン、ガバペンチノイド、ジコノチド、ジゴキシン、アミオダロン、ベルベリン、レボシメンダン、オメカムチブ、カテコラミン、エイコサノイド、ホスホジエステラーゼ阻害剤、エノキシモン、ミルリノン、アムリノン、テオフィリン、グルカゴン、インスリン、ニトロプルシドナトリウム、ヒドララジン、二硝酸イソソルビドおよび一硝酸イソソルビド、ニトログリセリン、ベンゾジアゼピン、レニン阻害剤、クロニジン、グアナベンズ、グアンファシン、メチルドパおよびモクソニジ���、ミノキシジル、グアネチジン、メカミラミン、レセルピン、不可逆的シクロオキシゲナーゼ阻害剤、アデノシン二リン酸受容体阻害剤、クロピドグレル、プラスグレル、チカグレロルおよびチクロピジン、ホスホジエステラーゼ阻害剤、シロスタゾール、プロテアーゼ活性化受容体−１アンタゴニスト、ボラパクサール、糖タンパク質ＩＩＢ／ＩＩＩＡ阻害剤、アブシキシマブ、エプチフィバチド、チロフィバン、アデノシン再取り込み阻害剤、ジピリダモール、トロンボキサン阻害剤、トロンボキサンシンターゼ阻害剤およびトロンボキサン受容体アンタゴニスト、組織プラスミノーゲンアクチベーター、アルテプラーゼ、レテプラーゼ、テネクテプラーゼ、アニストレプラーゼ、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、ダビガトラン、リバーロキサバン、アピキサバン、クマリン、ヘパリンおよびその誘導体、第Ｘａ因子阻害剤、リバーロキサバン、アピキサバン、エドキサバン、ベトリキサバン、レタキサバン、エリバキサバン、ヒルジン、レピルジン、ビバリルジン、アルガトロバン、ダビガトラン、キシメラガトラン、アンチトロンビンタンパク質、バトロキソビン、ヘメンチン、ならびにビタミンＥからなる群から選択される、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３１】
配列番号３４のアミノ酸１〜６のいずれか１つに対応する位置において始まり、配列番号３４のアミノ酸２９２〜２９５のいずれか１つに対応する位置において終わる配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むＢＭＰ１０プロペプチド（ＢＭＰ１０ｐｒｏ）ポリペプチドであって、アミノ酸ＲＩＲＲの配列を含まないＢＭＰ１０プロペプチド（ＢＭＰ１０ｐｒｏ）ポリペプチド。
【請求項１３２】
配列番号３４のアミノ酸１〜２９２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１３１に記載のＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチド。
【請求項１３３】
配列番号３４のアミノ酸１〜２９５に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１３１に記載のＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチド。
【請求項１３４】
配列番号３４のアミノ酸１〜６のいずれか１つに対応する位置において始まり、配列番号３４のアミノ酸２９２〜２９５のいずれか１つに対応する位置において終わる配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むＢＭＰプロペプチド（ＢＭＰ１０ｐｒｏ）ポリペプチドであって、前記ポリペプチドのＣ末端が、配列番号３４のＲ２９６ではない、ＢＭＰプロペプチド（ＢＭＰ１０ｐｒｏ）ポリペプチド。
【請求項１３５】
配列番号３４のアミノ酸１〜２９２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１３４に記載のＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチド。
【請求項１３６】
配列番号３４のアミノ酸１〜２９５に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１３４に記載のＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチド。
【請求項１３７】
免疫グロブリンＦｃドメインを含む融合タンパク質である、請求項１３１から１３６のいずれか一項に記載のＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチド。
【請求項１３８】
前記免疫グロブリンＦｃドメインが、ＩｇＧ１  Ｆｃ免疫グロブリンドメインである、請求項１３７に記載のＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチド。
【請求項１３９】
ＢＭＰ１０ｐｒｏドメインおよびＦｃ免疫グロブリンドメインを含むＢＭＰ１０ｐｒｏ−Ｆｃ融合タンパク質であって、前記ＢＭＰ１０ｐｒｏドメインが、配列番号３４のアミノ酸１〜６のいずれか１つに対応する位置において始まり、配列番号３４のアミノ酸２９２〜２９５のいずれか１つに対応する位置において終わる配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列からなる、ＢＭＰ１０ｐｒｏ−Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項１４０】
前記ＢＭＰ１０ｐｒｏドメインが、配列番号３４のアミノ酸１〜２９２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列からなる、請求項１３９に記載のＢＭＰ１０ｐｒｏ−Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項１４１】
前記ＢＭＰ１０ｐｒｏドメインが、配列番号３４のアミノ酸１〜２９５に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列からなる、請求項１３９に記載のＢＭＰ１０ｐｒｏ−Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項１４２】
前記ＢＭＰ１０ｐｒｏドメインが、アミノ酸ＲＩＲＲの配列を含まない、請求項１３９から１４１のいずれか一項に記載のＢＭＰ１０ｐｒｏ−Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項１４３】
ポリペプチドのＣ末端が、配列番号３４のＲ２９６ではない、請求項１３９から１４１のいずれか一項に記載のＢＭＰ１０ｐｒｏ−Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項１４４】
ＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドドメインと前記Ｆｃ免疫グロブリンドメインとの間に位置するリンカードメインを含む、請求項１３７から１４３のいずれか一項に記載のＢＭＰ１０ｐｒｏ−Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項１４５】
前記リンカーが、ＧＧＧ（配列番号４１）、ＧＧＧＧ（配列番号４２）、ＴＧＧＧＧ（配列番号４３）、ＳＧＧＧＧ（配列番号４４）、ＴＧＧＧ（配列番号４５）、ＳＧＧＧ（配列番号４６）またはＧＧＧＧＳ（配列番号４７）からなる群から選択される、請求項１４４に記載のＢＭＰ１０ｐｒｏ−Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項１４６】
ａ．配列番号８２のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｂ．配列番号８４のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｃ．配列番号８５のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド；および
ｄ．配列番号８７のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群から選択される、請求項１３１に記載のＢＭＰ１０ｐｒｏ−Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項１４７】
前記ポリペプチドまたは融合タンパク質が、グリコシル化されたアミノ酸、ＰＥＧ化されたアミノ酸、ファルネシル化されたアミノ酸、アセチル化されたアミノ酸、ビオチン化されたアミノ酸、および脂質部分にコンジュゲートされたアミノ酸からなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸改変を含む、請求項１３１から１４６のいずれか一項に記載のＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチド。
【請求項１４８】
前記ポリペプチドまたは融合タンパク質が、チャイニーズハムスター卵巣細胞株から取得可能なグリコシル化パターンを有する、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１４９】
ＢＭＰ１０および／またはＢＭＰ９に結合する、請求項１３１から１４８のいずれか一項に記載のＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドまたはＢＭＰ１０ｐｒｏ−Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項１５０】
ＢＭＰ６、ＢＭＰ３ｂおよびＢＭＰ５からなる群から選択される１種または複数種のリガンドにさらに結合する、請求項１４９に記載のＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドまたはＢＭＰ１０ｐｒｏ−Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項１５１】
ＢＭＰ１０および／またはＢＭＰ９の活性を阻害する、請求項１３１から１５０のいずれか一項に記載のＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドまたはＢＭＰ１０ｐｒｏ−Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項１５２】
ＢＭＰ６、ＢＭＰ３ｂおよびＢＭＰ５からなる群から選択される１種または複数種のリガンドの活性をさらに阻害する、請求項１５１に記載のＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドまたはＢＭＰ１０ｐｒｏ−Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項１５３】
細胞ベースのアッセイにおいてＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ３ｂおよびＢＭＰ５のうち１種または複数種の活性を阻害する、請求項１５１または１５２に記載のＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドまたはＢＭＰ１０ｐｒｏ−Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項１５４】
請求項１３１から１５３のいずれか一項に記載のＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドまたはＢＭＰ１０ｐｒｏ−Ｆｃ融合タンパク質および薬学的に許容される担体を含む医薬調製物。
【請求項１５５】
発熱物質を実質的に含まない、請求項１５４に記載の医薬調製物。
【請求項１５６】
請求項１３１から１５３のいずれか一項に記載のＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドまたはＢＭＰ１０ｐｒｏ−Ｆｃ融合タンパク質のコード配列を含む、単離されたおよび／または組換えポリヌクレオチド。
【請求項１５７】
からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項１５６に記載の単離されたおよび／または組換えポリヌクレオチド。
【請求項１５８】
請求項１５６または１５７に記載のポリヌクレオチドに作動可能に連結したプロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチド。
【請求項１５９】
請求項１５６から１５８のいずれか一項に記載の単離されたおよび／または組換えポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１６０】
請求項１５６から１５９のいずれか一項に記載の単離されたおよび／もしくは組換えポリヌクレオチドまたはベクターを含む細胞。
【請求項１６１】
哺乳動物細胞である、請求項１６０に記載の細胞。
【請求項１６２】
ＣＨＯ細胞である、請求項１６１に記載の細胞。
【請求項１６３】
ＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドを作製する方法であって、前記ＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドの発現に適した条件下で細胞を培養するステップを含み、前記細胞が、請求項１５６から１５９のいずれか一項に記載の単離されたおよび／もしくは組換えポリヌクレオチドまたはベクターを含む、方法。
【請求項１６４】
前記発現されたＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドを回収するステップをさらに含む、請求項１６３に記載の方法。
【請求項１６５】
前記細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１６３または１６４に記載の方法。
【請求項１６６】
前記ＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドが、組織プラスミノーゲンアクチベーターシグナル配列を使用して発現される、請求項１６３から１６５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１７年２月６日に出願された米国仮出願番号第６２／４５５，２６６号からの優先権の利益を主張している。前述の出願の明細書は、その全体が参考として本明細書中に援用される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
米国単独で、５百万人を超える人々が、心不全に罹患していると推定されている。Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎからの統計も、毎年約５５０，０００人の割合で心不全の新たな症例が診断されていることを示唆している。新たに診断された患者のうち、５０パーセントは、最初の診断から５年以内に死亡する可能性が高い。もちろん、これらの数は、同じく心不全に罹患している他国の患者数を数に入れていない。これらの数を考慮すると、心不全がヒトにとっての顕著な危機であることは明らかである。
【０００３】
心不全は、心臓が血液を体中に循環させる能力の低減によって一部特徴付けられる状態である。典型的には、根底にある疾患、例えば、高血圧症（例えば、高血圧）、動脈の詰まり（例えば、冠動脈疾患）、心臓欠損（例えば、心筋症または心臓弁膜症）またはいくつかの他の問題（例えば、糖尿病、甲状腺機能亢進症またはアルコール乱用）が、時間と共に、循環の減少をもたらすことになる。心臓があまり効率的に働かないので、心臓が血液を循環させる能力が減少し、身体の酸素要求が満たされない。効率の減少を補償するために時間と共に心臓がより激しく働くので、心筋が肥大する傾向がある。
【０００４】
処置は、典型的には、例えば、アンギオテンシン変換（ＡＣＥ）酵素阻害剤、利尿薬、ベータ−ブロッカーを含むいくつかの異なる医薬品、および外科的手順の使用を含む。これらの処置は、心不全と関連するいくつかの症状を改善できるが、多くが種々の副作用と関連し、心不全の複数の所見を処置するには有効性が限定的であるので、不完全である。心不全に対する唯一の永続的な処置は、心臓移植である。結果的に、心不全の処置のためのさらなる治療薬が必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の要旨
一部、本明細書に提示されるデータは、ＢＭＰアンタゴニスト（阻害剤）が心不全を処置するために使用できることを実証する。例えば、可溶性ＢＭＰ１０プロペプチド（ＢＭＰ１０ｐｒｏ）ポリペプチドは、心肥大、心リモデリングおよび心線維症を予防するため、またはその重症度を低減させるため、ならびに横行大動脈縮窄術（ＴＡＣ）心不全モデルにおいて心機能を改善するために使用できることが示された。さらに、ＢＭＰ１０ｐｒｏ処置は、心不全患者の生存時間を増加させた。さらなる研究では、ＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドは、心筋梗塞（ＭＩ）心不全モデルにおいて心肥大、心リモデリングおよび心線維症を予防すること、またはその重症度を低減させること、ならびにこれらの患者において生存時間を増加させることが示された。結合研究は、ＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドが高い親和性を有し、ＢＭＰ１０の活性をアンタゴナイズできることを実証した。さらに、本開示のデータは、ＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドが、高い親和性でＢＭＰ９、ＢＭＰ６およびＢＭＰ３ｂに結合し、より低い程度でＢＭＰ５に結合することを示している。さらに、本明細書に記載される実験は、可溶性エンドグリンポリペプチドが心不全を処置するために使用され得ることを実証している。例えば、エンドグリンポリペプチドによる処置は、ＴＡＣ心不全モデルにおいて、心肥大の重症度を低減させ、心機能および心線維症を低減させ、ならびにＭＩ心不全モデルにおいて、心肥大、心リモデリングの重症度を低減させ、心機能および心線維症を低減させた。さらに、エンドグリンポリペプチドによる処置は、ＴＡＣおよびＭＩの両方の心不全モデルにおいて、患者の生存時間を増加させた。さらに、本開示のデータは、エンドグリンポリペプチドが、高い親和性でＢＭＰ９およびＢＭＰ１０に結合することを示している。したがって、本開示は、ＢＭＰシグナル伝達（例えば、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ３ｂおよびＢＭＰ５のうち１種または複数種種によるシグナル伝達）のアンタゴニストが、心不全を処置するために使用され得ることを証明する。ＢＭＰ１０ｐｒｏおよびエンドグリンポリペプチドは、ＢＭＰアンタゴニズム以外の機構を介して心不全に影響を与える可能性があるが、それにもかかわらず、本開示は、望ましい治療剤が、ＢＭＰシグナル伝達アンタゴニズム活性に基づいて選択され得ることを実証している。したがって、一部の実施形態では、本開示は、例えば、１種または複数種種のＢＭＰリガンド、特に、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ３ｂおよびＢＭＰ５のうち１種または複数種種を阻害するアンタゴニスト；１種または複数種種のＢＭＰ相互作用性Ｉ型受容体、ＩＩ型受容体または共受容体（例えば、ＡＬＫ１、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＢＭＰＲＩＩおよびエンドグリン）を阻害するアンタゴニスト；ならびに１種または複数種種の下流シグナル伝達成分（例えば、Ｓｍａｄタンパク質、例えば、Ｓｍａｄ２および３）を阻害するアンタゴニストを含む、心不全を処置するための種々のＢＭＰシグナル伝達アンタゴニストを使用するための方法を提供する。本明細書で使用する場合、かかるシグナル伝達アンタゴニストは、「ＢＭＰアンタゴニスト」または「ＢＭＰ阻害剤」と集合的に呼ばれる。したがって、本開示は、一部、心不全を処置するため、特に、心不全の１つまたは複数の合併症（例えば、肥大、心リモデリング、線維症、低減された心機能）を予防するため、またはその重症度を低減させるため、ならびに１種または複数種種の心合併症（事象）による死亡のリスクを低減させるための、ＢＭＰアンタゴニスト組成物および方法を提供する。本開示の方法および使用に従って使用されるＢＭＰアンタゴニストには、例えば、リガンドトラップ（例えば、可溶性ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ１およびエンドグリンポリペプチド）、抗体アンタゴニスト、小分子アンタゴニストおよびヌクレオチドアンタゴニストが含まれる。必要に応じて、ＢＭＰアンタゴニストは、心不全を処置するための１種または複数種種の支持療法および／またはさらなる活性薬剤と組み合わせて使用され得る。
【０００６】
ある特定の態様では、本開示は、心不全を有する患者の死亡のリスクを低減させる（生存を増加させる）方法であって、それを必要とする患者に、有効量のＢＭＰアンタゴニストを投与するステップを含む方法に関する。一部の実施形態では、患者の死亡のリスクは、任意の原因による（総死亡率）。一部の実施形態では、患者の死亡のリスクは、心血管事象（合併症）による。一部の実施形態では、心血管事象は、心筋梗塞、脳卒中、狭心症、不整脈、体液貯留、および心不全の進行のうち１つまたは複数［例えば、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＮＹＨＡ）によって分類されるクラス進行、またはＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ／Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎワーキンググループ（ＡＡＣ）によって分類されるステージ進行］を含む。一部の実施形態では、ＢＭＰアンタゴニストは、心筋梗塞後に患者に投与される。一部の実施形態では、患者は、左心室収縮期機能不全を有する。一部の実施形態では、本開示は、心不全を有する患者の死亡のリスクを低減させる方法であって、それを必要とする患者に、有効量のＢＭＰアンタゴニストを投与するステップを含み、ＢＭＰアンタゴニストが、心筋梗塞後に投与される、方法に関する。一部の実施形態では、本開示は、心不全を有する患者の死亡のリスクを低減させる方法であって、それを必要とする患者に、有効量のＢＭＰアンタゴニストを投与するステップを含み、ＢＭＰアンタゴニストが、心筋梗塞後に投与され、患者が、左心室収縮期機能不全を有する、方法に関する。一部の実施形態では、患者は、≦４０％の駆出率を有する。一部の実施形態では、患者は、≦３５％の駆出率を有する。一部の実施形態では、本開示は、心不全を有する患者の死亡のリスクを低減させる方法であって、それを必要とする患者に、有効量のＢＭＰアンタゴニストを投与するステップを含み、ＢＭＰアンタゴニストが、心筋梗塞後に投与され、患者が、≦４０％の駆出率（例えば、≦３５％の駆出率）で、左心室収縮期機能不全を有する、方法に関する。一部の実施形態では、患者は、左心室機能不全に起因する心不全、正常駆出率心不全、急性心不全、慢性心不全、うっ血性心不全、先天性心不全、代償性心不全、非代償性心不全、拡張期心不全、収縮期心不全、右心（室）不全、左心（室）不全、前方心不全、後方心不全、高拍出性心不全、低拍出性心不全および心筋浮腫からなる群から選択される１つまたは複数の型の心不全を有する。一部の実施形態では、患者は、体高血圧、肺高血圧、糖尿病、腎臓（腎）不全（例えば、急性または慢性腎不全）、冠動脈疾患、高血圧、左心室機能不全、心臓弁疾患、先天性心臓欠損、急性虚血傷害、再灌流傷害、心リモデリング心膜障害、心筋障害、大血管障害および心内膜障害からなる群から選択される１つまたは複数の状態を有する。一部の実施形態では、患者は、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＮＹＨＡ）機能分類に従うと少なくともクラスＩの心不全（クラスＩ、クラスＩＩ、クラスＩＩＩまたはクラスＩＶ）を有する。一部の実施形態では、患者は、ＡＡＣ機能分類に従うと少なくともステージＡの心不全（ステージ��、ステージＢ、ステージＣまたはステージＤ）を有する。一部の実施形態では、患者に、心不全または心不全の１つもしくは複数の合併症を処置する、予防する、またはその重症度を低減させるための１種または複数種種のさらなる活性薬剤または支持療法［例えば、アドレナリンブロッカー（アルファ−ブロッカーおよびベータ−ブロッカー）、中枢作用性アルファ−アゴニスト、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、アンギオテンシン受容体ブロッカー、カルシウムチャネルブロッカー、陽性変力物質（positive inotrope）、血管拡張薬、ベンゾジアゼピン、レニン阻害剤、抗血栓剤、利尿薬、ペースメーカー、インプラント可能な心除細動器、心収縮力モジュレーション、心再同期治療、補助循環装置、両心室再同期治療および心臓移植］がさらに投与される。
【０００７】
ある特定の態様では、本開示は、心不全を有する患者の入院のリスクを低減させる方法であって、それを必要とする患者に、有効量のＢＭＰアンタゴニストを投与するステップを含む方法に関する。一部の実施形態では、患者の入院のリスクは、任意の原因による（総死亡率）。一部の実施形態では、患者の死亡の入院は、心血管事象（合併症）による。一部の実施形態では、心血管事象は、心筋梗塞、脳卒中、狭心症、不整脈、体液貯留、および心不全の進行のうち１つまたは複数［例えば、ＮＹＨＡによって分類されるクラス進行またはＡＡＣによって分類されるステージ進行］を含む。一部の実施形態では、ＢＭＰアンタゴニストは、心筋梗塞後に患者に投与される。一部の実施形態では、患者は、左心室収縮期機能不全を有する。一部の実施形態では、本開示は、心不全を有する患者の入院のリスクを低減させる方法であって、それを必要とする患者に、有効量のＢＭＰアンタゴニストを投与するステップを含み、ＢＭＰアンタゴニストが、心筋梗塞後に投与される、方法に関する。一部の実施形態では、本開示は、心不全を有する患者の入院のリスクを低減させる方法であって、それを必要とする患者に、有効量のＢＭＰアンタゴニストを投与するステップを含み、ＢＭＰアンタゴニストが、心筋梗塞後に投与され、患者が、左心室収縮期機能不全を有する、方法に関する。一部の実施形態では、患者は、≦４０％の駆出率を有する。一部の実施形態では、患者は、≦３５％の駆出率を有する。一部の実施形態では、本開示は、心不全を有する患者の入院のリスクを低減させる方法であって、それを必要とする患者に、有効量のＢＭＰアンタゴニストを投与するステップを含み、ＢＭＰアンタゴニストが、心筋梗塞後に投与され、患者が、≦４０％の駆出率（例えば、≦３５％の駆出率）で、左心室収縮期機能不全を有する、方法に関する。一部の実施形態では、患者は、左心室機能不全に起因する心不全、正常駆出率心不全、急性心不全、慢性心不全、うっ血性心不全、先天性心不全、代償性心不全、非代償性心不全、拡張期心不全、収縮期心不全、右心（室）不全、左心（室）不全、前方心不全、後方心不全、高拍出性心不全、低拍出性心不全および心筋浮腫からなる群から選択される１つまたは複数の型の心不全を有する。一部の実施形態では、患者は、体高血圧、肺高血圧、糖尿病、腎臓（腎）不全（例えば、急性または慢性腎不全）、冠動脈疾患、高血圧、左心室機能不全、心臓弁疾患、先天性心臓欠損、急性虚血傷害、再灌流傷害、心リモデリング心膜障害、心筋障害、大血管障害および心内膜障害からなる群から選択される１つまたは複数の状態を有する。一部の実施形態では、患者は、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＮＹＨＡ）機能分類に従うとクラスＩの心不全を有する。一部の実施形態では、患者は、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＮＹＨＡ）機能分類に従うと少なくともクラスＩの心不全（クラスＩ、クラスＩＩ、クラスＩＩＩまたはクラスＩＶ）を有する。一部の実施形態では、患者は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ／Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎワーキンググループ（ＡＡＣ）��能分類に従うと少なくともステージＡの心不全（ステージＡ、ステージＢ、ステージＣまたはステージＤ）を有する。一部の実施形態では、患者に、心不全または心不全の１つもしくは複数の合併症を処置する、予防する、またはその重症度を低減させるための１種または複数種種のさらなる活性薬剤または支持療法［例えば、アドレナリンブロッカー（アルファ−ブロッカーおよびベータ−ブロッカー）、中枢作用性アルファ−アゴニスト、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、アンギオテンシン受容体ブロッカー、カルシウムチャネルブロッカー、陽性変力物質、血管拡張薬、ベンゾジアゼピン、レニン阻害剤、抗血栓剤、利尿薬、ペースメーカー、インプラント可能な心除細動器、心収縮力モジュレーション、心再同期治療、補助循環装置、両心室再同期治療および心臓移植］がさらに投与される。
【０００８】
ある特定の態様では、本開示は、患者において心不全を改善する、またはその進行を低減させる（遅延させる）方法であって、それを必要とする患者に、有効量のＢＭＰアンタゴニストを投与するステップを含む方法に関する。一部の実施形態では、患者は、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＮＹＨＡ）機能分類に従うとクラスＩの心不全を有する。一部の実施形態では、患者は、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＮＹＨＡ）機能分類に従うとクラスＩＩの心不全を有する。一部の実施形態では、患者は、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＮＹＨＡ）機能分類に従うとクラスＩＩＩの心不全を有する。一部の実施形態では、患者は、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＮＹＨＡ）機能分類に従うとクラスＩＶの心不全を有する。一部の実施形態では、患者は、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＮＹＨＡ）機能分類に従うとクラスＩＩまたはＩＩＩの心不全を有する。一部の実施形態では、患者は、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＮＹＨＡ）機能分類に従うとクラスＩＩＩまたはＩＶの心不全を有する。一部の実施形態では、患者は、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＮＹＨＡ）機能分類に従うとクラスＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶの心不全を有する。一部の実施形態では、この方法は、患者の、ＮＹＨＡ機能分類システムに従う心不全スコアを、少なくとも１クラス改善する（例えば、クラスＩＶの心不全からクラスＩＩＩの心不全への、クラスＩＶの心不全からクラスＩＩの心不全への、クラスＩＶの心不全からクラスＩの心不全への、ステージＩＩＩの心不全からステージＩＩの心不全への、ステージＩＩＩの心不全からステージＩの心不全への、またはクラスＩＩの心不全からクラスＩの心不全への改善）。一部の実施形態では、この方法は、患者の、ＮＹＨＡ機能分類システムに従う心不全スコアの進行を、少なくとも１クラス分、低減させる（例えば、クラスＩの心不全からクラスＩＩの心不全への進行を予防するもしくは遅延させる、クラスＩの心不全からクラスＩＩＩの心不全への進行を遅延させる、クラスＩの心不全からクラスＩＶの心不全への進行を遅延させる、クラスＩＩの心不全からクラスＩＩＩの心不全への進行を遅延させる、クラスＩＩの心不全からクラスＩＶの心不全への進行を遅延させる、またはクラスＩＩＩの心不全からクラスＩＶの心不全への進行を遅延させる）。一部の実施形態では、患者は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ／Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎワーキンググループ（ＡＡＣ）機能分類に従うとステージＡの心不全を有する。一部の実施形態では、患者は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ／Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎワーキンググループ（ＡＡＣ）機能分類に従うとステージＢの心不全を有する。一部の実施形態では、患者は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ／Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎワーキンググループ（ＡＡＣ）機能分類に従うとステージＣの心不全を有する。一部の実施形態では、患者は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ／Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎワーキンググループ（ＡＡＣ）機能分類に従うとステージＤの心不全を有する。一部の実施形態では、患者は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ／Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎワーキンググループ（ＡＡＣ）機能分類に従うとステージＢまたはＣの心不全を有する。一部の実施形態では、患者は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ／Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎワーキンググループ（ＡＡＣ）機能分類に従うとステージＣまたはＤの心不全を有する。一部の実施形態では、患者は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ／Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎワーキンググループ（ＡＡＣ）機能分類に従うとステージＢ、ＣまたはＤの心不全を有する。一部の実施形態では、この方法は、患者の、ＡＣＣ機能分類システムに従う心不全スコアを、少なくとも１ステージ改善する（例えば、ステージＤの心不全からステージＣの心不全への、ステージＤの心不全からステージＢの心不全への、ステージＤの心不全からステージＡの心不全への、ステージＣの心不全からステージＢの心不全への、ステージＣの心不全からステージＡの心不全への、またはステージＢの心不全からステージＡの心不全への改善）。一部の実施形態では、この方法は、患者の、ＡＣＣ機能分類システムに従う心不全スコアの進行を、少なくとも１ステージ分、低減させる（例えば、ステージＡの心不全からステージＢの心不全への進行を予防するもしくは遅延させる、ステージＡの心不全からステージＣの心不全への進行を遅延させる、ステージＡの心不全からステージＤの心不全への進行を遅延させる、ステージＢの心不全からステージＣの心不全への進行を遅延させる、ステージＢの心不全からステージＤの心不全への進行を遅延させる、またはステージＣの心不全からステージＤの心不全への進行を遅延させる）。一部の実施形態では、患者は、以前に心筋梗塞を有した。一部の実施形態では、患者は、左心室収縮期機能不全を有する。一部の実施形態では、患者は、≦４０％の駆出率を有する。一部の実施形態では、患者は、≦３５％の駆出率を有する。一部の実施形態では、患者は、左心室機能不全に起因する心不全、正常駆出率心不全、急性心不全、慢性心不全、うっ血性心不全、先天性心不全、代償性心不全、非代償性心不全、拡張期心不全、収縮期心不全、右心（室）不全、左心（室）不全、前方心不全、後方心不全、高拍出性心不全、低拍出性心不全および心筋浮腫からなる群から選択される１つまたは複数の型の心不全を有する。一部の実施形態では、患者は、体高血圧、肺高血圧、糖尿病、腎臓（腎）不全（例えば、急性または慢性腎不全）、冠動脈疾患、高血圧、左心室機能不全、心臓弁疾患、先天性心臓欠損、急性虚血傷害、再灌流傷害、心リモデリング心膜障害、心筋障害、大血管障害および心内膜障害からなる群から選択される１つまたは複数の状態を有する。一部の実��形態では、患者に、心不全または心不全の１つもしくは複数の合併症を処置する、予防する、またはその重症度を低減させるための１種または複数種種のさらなる活性薬剤または支持療法［例えば、アドレナリンブロッカー（アルファ−ブロッカーおよびベータ−ブロッカー）、中枢作用性アルファ−アゴニスト、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、アンギオテンシン受容体ブロッカー、カルシウムチャネルブロッカー、陽性変力物質、血管拡張薬、ベンゾジアゼピン、レニン阻害剤、抗血栓剤、利尿薬、ペースメーカー、インプラント可能な心除細動器、心収縮力モジュレーション、心再同期治療、補助循環装置、両心室再同期治療および心臓移植］がさらに投与される。
【０００９】
一部の実施形態では、本開示は、患者において心血管事象（合併症）の発生率を低減させる方法であって、それを必要とする患者に、有効量のＢＭＰアンタゴニストを投与するステップを含む方法に関する。一部の実施形態では、心血管事象は、心筋梗塞、脳卒中、狭心症、不整脈、体液貯留、心不全の進行のうち１つまたは複数である。一部の実施形態では、心血管事象は、呼吸困難、起座呼吸、発作性夜間呼吸困難、疲労、体液貯留、肺うっ血、浮腫、末梢性浮腫、狭心症、高血圧、不整脈、心室性不整脈、心筋症、心肥大、腎血流低減、腎機能不全、心筋梗塞症、心リモデリング、心線維症、心高血圧、心壁ストレス（cardiac wall stress）、心炎症、心圧負荷、心容量負荷、脳卒中、心腔拡張、心室真球度（ventricular sphericity）の増加、間質性線維症、血管周囲線維症、心筋細胞肥大、心臓喘息、夜間多尿症、腹水貯留（ascities）、うっ血性肝障害、凝固障害、急性虚血傷害、再灌流傷害、左心室機能の機能障害、および右心室機能の機能障害のうち１つまたは複数である。一部の実施形態では、心血管事象は、患者の入院を生じることになる。患者が心血管事象に起因して入院すべきかどうかの決定は、当業者（例えば、医師、特に救急医および心臓病専門医）によって決定され得る。一部の実施形態では、患者は、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＮＹＨＡ）機能分類に従うと少なくともクラスＩの心不全（クラスＩ、クラスＩＩ、クラスＩＩＩまたはクラスＩＶ）を有する。一部の実施形態では、患者は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ／Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎワーキンググループ（ＡＡＣ）機能分類に従うと少なくともステージＡの心不全（ステージＡ、ステージＢ、ステージＣまたはステージＤ）を有する。一部の実施形態では、患者は、心線維症を有する。一部の実施形態では、患者は、心肥大を有する。一部の実施形態では、患者は、心リモデリングを有する。一部の実施形態では、患者は、心機能不全（例えば、≦４０％または≦３５％の駆出率）を有する。一部の実施形態では、患者は高血圧である。一部の実施形態では、患者に、心不全または心不全の１つもしくは複数の合併症を処置する、予防する、またはその重症度を低減させるための１種または複数種種のさらなる活性薬剤または支持療法［例えば、アドレナリンブロッカー（アルファ−ブロッカーおよびベータ−ブロッカー）、中枢作用性アルファ−アゴニスト、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、アンギオテンシン受容体ブロッカー、カルシウムチャネルブロッカー、陽性変力物質、血管拡張薬、ベンゾジアゼピン、レニン阻害剤、抗血栓剤、利尿薬、ペースメーカー、インプラント可能な心除細動器、心収縮力モジュレーション、心再同期治療、補助循環装置、両心室再同期治療および心臓移植］がさらに投与される。
【００１０】
一部の実施形態では、本開示は、患者において心線維症を処置する、予防する、またはその重症度を低減させる方法であって、それを必要とする患者に、有効量のＢＭＰアンタゴニストを投与するステップを含む方法に関する。一部の実施形態では、患者は、心不全を有する。一部の実施形態では、患者は、左心室機能不全に起因する心不全、正常駆出率心不全、急性心不全、慢性心不全、うっ血性心不全、先天性心不全、代償性心不全、非代償性心不全、拡張期心不全、収縮期心不全、右心（室）不全、左心（室）不全、前方心不全、後方心不全、高拍出性心不全、低拍出性心不全および心筋浮腫からなる群から選択される１つまたは複数の型の心不全を有する。一部の実施形態では、患者は、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＮＹＨＡ）機能分類に従うと少なくともクラスＩの心不全（クラスＩ、クラスＩＩ、クラスＩＩＩまたはクラスＩＶ）を有する。一部の実施形態では、患者は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ／Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎワーキンググループ（ＡＡＣ）機能分類に従うと少なくともステージＡの心不全（ステージＡ、ステージＢ、ステージＣまたはステージＤ）を有する。一部の実施形態では、患者は、以前に心筋梗塞を有した。一部の実施形態では、患者は、左心室収縮期機能不全を有する。一部の実施形態では、患者は、以前に心筋梗塞を有した。一部の実施形態では、患者は、左心室収縮期機能不全を有する。一部の実施形態では、患者は、≦４０％の駆出率を有する。一部の実施形態では、患者は、≦３５％の駆出率を有する。一部の実施形態では、患者に、心不全または心不全の１つもしくは複数の合併症を処置する、予防する、またはその重症度を低減させるための１種または複数種種のさらなる活性薬剤または支持療法［例えば、アドレナリンブロッカー（アルファ−ブロッカーおよびベータ−ブロッカー）、中枢作用性アルファ−アゴニスト、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、アンギオテンシン受容体ブロッカー、カルシウムチャネルブロッカー、陽性変力物質、血管拡張薬、ベンゾジアゼピン、レニン阻害剤、抗血栓剤、利尿薬、ペースメーカー、インプラント可能な心除細動器、心収縮力モジュレーション、心再同期治療、補助循環装置、両心室再同期治療および心臓移植］がさらに投与される。
【００１１】
一部の実施形態では、本開示は、患者において心肥大を処置する、予防する、またはその重症度を低減させる方法であって、それを必要とする患者に、有効量のＢＭＰアンタゴニストを投与するステップを含む方法に関する。一部の実施形態では、心肥大は求心性肥大である。一部の実施形態では、心肥大は遠心性肥大である。一部の実施形態では、患者は、求心性肥大および遠心性肥大の両方を有する。一部の実施形態では、患者は、心不全を有する。一部の実施形態では、患者は、左心室機能不全に起因する心不全、正常駆出率心不全、急性心不全、慢性心不全、うっ血性心不全、先天性心不全、代償性心不全、非代償性心不全、拡張期心不全、収縮期心不全、右心（室）不全、左心（室）不全、前方心不全、後方心不全、高拍出性心不全、低拍出性心不全および心筋浮腫からなる群から選択される１つまたは複数の型の心不全を有する。一部の実施形態では、患者は、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＮＹＨＡ）機能分類に従うと少なくともクラスＩの心不全（クラスＩ、クラスＩＩ、クラスＩＩＩまたはクラスＩＶ）を有する。一部の実施形態では、患者は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ／Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎワーキンググループ（ＡＡＣ）機能分類に従うと少なくともステージＡの心不全（ステージＡ、ステージＢ、ステージＣまたはステージＤ）を有する。一部の実施形態では、患者は、以前に心筋梗塞を有した。一部の実施形態では、患者は、左心室収縮期機能不全を有する。一部の実施形態では、患者は、以前に心筋梗塞を有した。一部の実施形態では、患者は、左心室収縮期機能不全を有する。一部の実施形態では、患者は、≦４０％の駆出率を有する。一部の実施形態では、患者は、≦３５％の駆出率を有する。一部の実施形態では、患者に、心不全または心不全の１つもしくは複数の合併症を処置する、予防する、またはその重症度を低減させるための１種または複数種種のさらなる活性薬剤または支持療法［例えば、アドレナリンブロッカー（アルファ−ブロッカーおよびベータ−ブロッカー）、中枢作用性アルファ−アゴニスト、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、アンギオテンシン受容体ブロッカー、カルシウムチャネルブロッカー、陽性変力物質、血管拡張薬、ベンゾジアゼピン、レニン阻害剤、抗血栓剤、利尿薬、ペースメーカー、インプラント可能な心除細動器、心収縮力モジュレーション、心再同期治療、補助循環装置、両心室再同期治療および心臓移植］がさらに投与される。
【００１２】
一部の実施形態では、本開示は、患者において心リモデリングを処置する、予防する、またはその重症度を低減させる方法であって、それを必要とする患者に、有効量のＢＭＰアンタゴニストを投与するステップを含む方法に関する。一部の実施形態では、心リモデリングは心室リモデリングである。一部の実施形態では、心リモデリングは心室拡張である。一部の実施形態では、この方法は、心室中隔リモデリングを減少させる。一部の実施形態では、この方法は、心室中隔拡張終期を減少させる。一部の実施形態では、この方法は、後壁リモデリングを減少させる。一部の実施形態では、この方法は、後壁拡張終期を減少させる。一部の実施形態では、患者は、心不全を有する。一部の実施形態では、患者は、左心室機能不全に起因する心不全、正常駆出率心不全、急性心不全、慢性心不全、うっ血性心不全、先天性心不全、代償性心不全、非代償性心不全、拡張期心不全、収縮期心不全、右心（室）不全、左心（室）不全、前方心不全、後方心不全、高拍出性心不全、低拍出性心不全および心筋浮腫からなる群から選択される１つまたは複数の型の心不全を有する。一部の実施形態では、患者は、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＮＹＨＡ）機能分類に従うと少なくともクラスＩの心不全（クラスＩ、クラスＩＩ、クラスＩＩＩまたはクラスＩＶ）を有する。一部の実施形態では、患者は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ／Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎワーキンググループ（ＡＡＣ）機能分類に従うと少なくともステージＡの心不全（ステージＡ、ステージＢ、ステージＣまたはステージＤ）を有する。一部の実施形態では、患者は、以前に心筋梗塞を有した。一部の実施形態では、患者は、左心室収縮期機能不全を有する。一部の実施形態では、患者は、以前に心筋梗塞を有した。一部の実施形態では、患者は、左心室収縮期機能不全を有する。一部の実施形態では、患者は、≦４０％の駆出率を有する。一部の実施形態では、患者は、≦３５％の駆出率を有する。一部の実施形態では、患者に、心不全または心不全の１つもしくは複数の合併症を処置する、予防する、またはその重症度を低減させるための１種または複数種種のさらなる活性薬剤または支持療法［例えば、アドレナリンブロッカー（アルファ−ブロッカーおよびベータ−ブロッカー）、中枢作用性アルファ−アゴニスト、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、アンギオテンシン受容体ブロッカー、カルシウムチャネルブロッカー、陽性変力物質、血管拡張薬、ベンゾジアゼピン、レニン阻害剤、抗血栓剤、利尿薬、ペースメーカー、インプラント可能な心除細動器、心収縮力モジュレーション、心再同期治療、補助循環装置、両心室再同期治療および心臓移植］がさらに投与される。
【００１３】
一部の実施形態では、本開示は、患者において心機能不全を処置する、予防する、またはその重症度を低減させる方法であって、それを必要とする患者に、有効量のＢＭＰアンタゴニストを投与するステップを含む方法に関する。一部の実施形態では、この方法は、心駆出率を増加させる。一部の実施形態では、患者は、≦４０％の駆出率を有する。一部の実施形態では、患者は、≦３５％の駆出率を有する。一部の実施形態では、この方法は、心駆出率を、少なくとも５％（例えば、少なくとも５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％、６５％またはそれよりも多く）増加させる。一部の実施形態では、この方法は、等容弛緩時間を減少させる。一部の実施形態では、この方法は、等容弛緩時間を、少なくとも２ｍｓ（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０ｍｓまたはそれよりも多く）減少させる。一部の実施形態では、この方法は、短縮率（fractional shorting）を増加させる。一部の実施形態では、この方法は、短縮率を、少なくとも５％（例えば、少なくとも５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％またはそれよりも多く）増加させる。一部の実施形態では、患者は、心不全を有する。一部の実施形態では、患者は、左心室機能不全に起因する心不全、正常駆出率心不全、急性心不全、慢性心不全、うっ血性心不全、先天性心不全、代償性心不全、非代償性心不全、拡張期心不全、収縮期心不全、右心（室）不全、左心（室）不全、前方心不全、後方心不全、高拍出性心不全、低拍出性心不全および心筋浮腫からなる群から選択される１つまたは複数の型の心不全を有する。一部の実施形態では、患者は、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＮＹＨＡ）機能分類に従うと少なくともクラスＩの心不全（クラスＩ、クラスＩＩ、クラスＩＩＩまたはクラスＩＶ）を有する。一部の実施形態では、患者は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ／Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎワーキンググループ（ＡＡＣ）機能分類に従うと少なくともステージＡの心不全（ステージＡ、ステージＢ、ステージＣまたはステージＤ）を有する。一部の実施形態では、患者は、以前に心筋梗塞を有した。一部の実施形態では、患者は、左心室収縮期機能不全を有する。一部の実施形態では、患者は、以前に心筋梗塞を有した。一部の実施形態では、患者は、左心室収縮期機能不全を有する。一部の実施形態では、患者に、心不全または心不全の１つもしくは複数の合併症を処置する、予防する、またはその重症度を低減させるための１種または複数種種のさらなる活性薬剤または支持療法［例えば、アドレナリンブロッカー（アルファ−ブロッカーおよびベータ−ブロッカー）、中枢作用性アルファ−アゴニスト、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、アンギオテンシン受容体ブロッカー、カルシウムチャネルブロッカー、陽性変力物質、血管拡張薬、ベンゾジアゼピン、レニン阻害剤、抗血栓剤、利尿薬、ペースメーカー、インプラント可能な心���細動器、心収縮力モジュレーション、心再同期治療、補助循環装置、両心室再同期治療および心臓移植］がさらに投与される。
【００１４】
一部の実施形態では、本開示は、患者において高血圧を処置する、予防する、またはその重症度を低減させる方法であって、それを必要とする患者に、有効量のＢＭＰアンタゴニストを投与するステップを含む方法に関する。一部の実施形態では、この方法は、患者の血圧を低減させる。一部の実施形態では、この方法は、収縮期血圧を低減させる。一部の実施形態では、この方法は、収縮期血圧を、少なくとも４ｍｍＨｇ（例えば、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０ｍｍＨｇまたはそれよりも多く）低減させる。一部の実施形態では、この方法は、拡張期血圧を低減させる。一部の実施形態では、この方法は、拡張期血圧を、少なくとも２ｍｍＨｇ（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０ｍｍＨｇまたはそれよりも多く）低減させる。一部の実施形態では、血圧は、安静時血圧として測定される。一部の実施形態では、血圧は、自由行動下血圧として測定される。一部の実施形態では、患者は、心不全を有する。一部の実施形態では、患者は、左心室機能不全に起因する心不全、正常駆出率心不全、急性心不全、慢性心不全、うっ血性心不全、先天性心不全、代償性心不全、非代償性心不全、拡張期心不全、収縮期心不全、右心（室）不全、左心（室）不全、前方心不全、後方心不全、高拍出性心不全、低拍出性心不全および心筋浮腫からなる群から選択される１つまたは複数の型の心不全を有する。一部の実施形態では、患者は、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＮＹＨＡ）機能分類に従うと少なくともクラスＩの心不全（クラスＩ、クラスＩＩ、クラスＩＩＩまたはクラスＩＶ）を有する。一部の実施形態では、患者は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ／Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎワーキンググループ（ＡＡＣ）機能分類に従うと少なくともステージＡの心不全（ステージＡ、ステージＢ、ステージＣまたはステージＤ）を有する。一部の実施形態では、患者は、以前に心筋梗塞を有した。一部の実施形態では、患者は、左心室収縮期機能不全を有する。一部の実施形態では、患者は、以前に心筋梗塞を有した。一部の実施形態では、患者は、左心室収縮期機能不全を有する。一部の実施形態では、患者に、心不全または心不全の１つもしくは複数の合併症を処置する、予防する、またはその重症度を低減させるための１種または複数種種のさらなる活性薬剤または支持療法［例えば、アドレナリンブロッカー（アルファ−ブロッカーおよびベータ−ブロッカー）、中枢作用性アルファ−アゴニスト、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、アンギオテンシン受容体ブロッカー、カルシウムチャネルブロッカー、陽性変力物質、血管拡張薬、ベンゾジアゼピン、レニン阻害剤、抗血栓剤、利尿薬、ペースメーカー、インプラント可能な心除細動器、心収縮力モジュレーション、心再同期治療、補助循環装置、両心室再同期治療および心臓移植］がさらに投与される。
【００１５】
一部の実施形態では、本開示は、心臓疾患または心臓疾患の１つもしくは複数の合併症を処置する、予防する、またはその重症度を低減させる方法であって、それを必要とする患者に、有効量のＢＭＰアンタゴニストを投与するステップを含む方法に関する。一部の実施形態では、心臓疾患の１つまたは複数の合併症は、呼吸困難、起座呼吸、発作性夜間呼吸困難、疲労、体液貯留、肺うっ血、浮腫、末梢性浮腫、狭心症、高血圧、不整脈、心室性不整脈、心筋症、心肥大、腎血流低減、腎機能不全、心筋梗塞症、心リモデリング、心線維症、心高血圧、心壁ストレス、心炎症、心圧負荷、心容量負荷、脳卒中、心腔拡張、心室真球度の増加、間質性線維症、血管周囲線維症、心筋細胞肥大、心臓喘息、夜間多尿症、腹水貯留、うっ血性肝障害、凝固障害、急性虚血傷害、再灌流傷害、左心室機能の機能障害、および右心室機能の機能障害のうち１つまたは複数である。一部の実施形態では、合併症は心線維症である。一部の実施形態では、合併症は心肥大である。一部の実施形態では、合併症は心リモデリングである。一部の実施形態では、合併症は心機能不全（例えば、≦４０％または≦３５％の駆出率）である。一部の実施形態では、合併症は高血圧である。一部の実施形態では、患者は、左心室機能不全に起因する心不全、正常駆出率心不全、急性心不全、慢性心不全、うっ血性心不全、先天性心不全、代償性心不全、非代償性心不全、拡張期心不全、収縮期心不全、右心（室）不全、左心（室）不全、前方心不全、後方心不全、高拍出性心不全、低拍出性心不全および心筋浮腫からなる群から選択される１つまたは複数の型の心不全を有する。一部の実施形態では、患者は、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＮＹＨＡ）機能分類に従うと少なくともクラスＩの心不全（クラスＩ、クラスＩＩ、クラスＩＩＩまたはクラスＩＶ）を有する。一部の実施形態では、患者は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ／Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎワーキンググループ（ＡＡＣ）機能分類に従うと少なくともステージＡの心不全（ステージＡ、ステージＢ、ステージＣまたはステージＤ）を有する。一部の実施形態では、患者は、以前に心筋梗塞を有した。一部の実施形態では、患者は、左心室収縮期機能不全を有する。一部の実施形態では、患者は、以前に心筋梗塞を有した。一部の実施形態では、患者は、左心室収縮期機能不全を有する。一部の実施形態では、患者は、≦４０％の駆出率を有する。一部の実施形態では、患者は、≦３５％の駆出率を有する。一部の実施形態では、患者に、心不全または心不全の１つもしくは複数の合併症を処置する、予防する、またはその重症度を低減させるための１種または複数種種のさらなる活性薬剤または支持療法［例えば、アドレナリンブロッカー（アルファ−ブロッカーおよびベータ−ブロッカー）、中枢作用性アルファ−アゴニスト、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、アンギオテンシン受容体ブロッカー、カルシウムチャネルブロッカー、陽性変力物質、血管拡張薬、ベンゾジアゼピン、レニン阻害剤、抗血栓剤、利尿薬、ペースメーカー、インプラント可能な心除細動器、心収縮力モジ��レーション、心再同期治療、補助循環装置、両心室再同期治療および心臓移植］がさらに投与される。
【００１６】
ある特定の態様では、本明細書に記載される方法および使用に従って使用されるＢＭＰアンタゴニストは、ＢＭＰ１０を阻害する薬剤（ＢＭＰ１０アンタゴニスト）である。ＢＭＰ１０阻害に対する影響は、例えば、本明細書に記載されるもの（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達レポーターアッセイ）を含む細胞ベースのアッセイを使用して決定され得る。かかる細胞ベースのアッセイは、本明細書に記載されるものを含む他のＢＭＰアンタゴニストの阻害効果を決定するために使用され得る。したがって、一部の実施形態では、ＢＭＰ１０アンタゴニストは、ＢＭＰ１０に結合し得る。リガンド結合活性は、例えば、本明細書に記載されるものなどを含む結合親和性アッセイを使用して決定され得る。かかるリガンド結合アッセイは、本明細書に記載されるものを含む他のＢＭＰアンタゴニストの結合親和性を決定するために使用され得る。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０アンタゴニストは、少なくとも１×１０−８Ｍ（例えば、少なくとも少なくとも１×１０−９Ｍ、少なくとも１×１０−１０Ｍ、少なくとも１×１０−１１Ｍまたは少なくとも１×１０−１２Ｍ）のＫＤで、ＢＭＰ１０に結合する。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０アンタゴニストは、ＢＭＰ９の活性をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０アンタゴニストは、ＢＭＰ６、ＢＭＰ３ｂおよびＢＭＰ５のうち１種または複数種種をさらに阻害する。したがって、一部の実施形態では、ＢＭＰ１０アンタゴニストは、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ３ｂおよびＢＭＰ５のうち１種または複数種種に結合し得る。ＢＭＰ１０アンタゴニストの例は、本明細書に記載され、これには、例えば、リガンドトラップ（例えば、ＴＧＦβ受容体スーパーファミリーのＩ型受容体、ＩＩ型受容体または共受容体の可溶性リガンド結合ドメイン）、抗体、小分子およびポリヌクレオチドが含まれる。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０アンタゴニストは、ＴＧＦβスーパーファミリーの１種もしくは複数のＩ型受容体、ＩＩ型受容体もしくは共受容体および／またはシグナル伝達メディエーター（例えば、Ｓｍａｄ）をさらに阻害し得る。
【００１７】
ある特定の態様では、本明細書に記載される方法および使用に従って使用されるＢＭＰアンタゴニストは、ＢＭＰ９を阻害する薬剤（ＢＭＰ９アンタゴニスト）である。したがって、一部の実施形態では、ＢＭＰ９アンタゴニストは、ＢＭＰ９に結合し得る。一部の実施形態では、ＢＭＰ９アンタゴニストは、少なくとも１×１０−８Ｍ（例えば、少なくとも少なくとも１×１０−９Ｍ、少なくとも１×１０−１０Ｍ、少なくとも１×１０−１１Ｍまたは少なくとも１×１０−１２Ｍ）のＫＤで、ＢＭＰ９に結合する。一部の実施形態では、ＢＭＰ９アンタゴニストは、ＢＭＰ１０の活性をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＢＭＰ９アンタゴニストは、ＢＭＰ６、ＢＭＰ３ｂおよびＢＭＰ５のうち１種または複数種種をさらに阻害する。したがって、一部の実施形態では、ＢＭＰ９アンタゴニストは、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ６、ＢＭＰ３ｂおよびＢＭＰ５のうち１種または複数種種に結合し得る。ＢＭＰ９アンタゴニストの例は、本明細書に記載され、これには、例えば、リガンドトラップ（例えば、ＴＧＦβ受容体スーパーファミリーのＩ型受容体、ＩＩ型受容体または共受容体の可溶性リガンド結合ドメイン）、抗体、小分子およびポリヌクレオチドが含まれる。一部の実施形態では、ＢＭＰ９アンタゴニストは、ＴＧＦβスーパーファミリーの１種もしくは複数のＩ型受容体、ＩＩ型受容体もしくは共受容体および／またはシグナル伝達メディエーター（例えば、Ｓｍａｄ）をさらに阻害し得る。
【００１８】
ある特定の態様では、本明細書に記載される方法および使用に従って使用されるＢＭＰアンタゴニストは、ＢＭＰ６を阻害する薬剤（ＢＭＰ６アンタゴニスト）である。したがって、一部の実施形態では、ＢＭＰ６アンタゴニストは、ＢＭＰ６に結合し得る。一部の実施形態では、ＢＭＰ６アンタゴニストは、少なくとも１×１０−８Ｍ（例えば、少なくとも少なくとも１×１０−９Ｍ、少なくとも１×１０−１０Ｍ、少なくとも１×１０−１１Ｍまたは少なくとも１×１０−１２Ｍ）のＫＤで、ＢＭＰ６に結合する。一部の実施形態では、ＢＭＰ６アンタゴニストは、ＢＭＰ１０および／またはＢＭＰ９の活性をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＢＭＰ６アンタゴニストは、ＢＭＰ３ｂおよび／またはＢＭＰ５をさらに阻害する。したがって、一部の実施形態では、ＢＭＰ６アンタゴニストは、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ３ｂおよびＢＭＰ５のうち１種または複数種種に結合し得る。ＢＭＰ６アンタゴニストの例は、本明細書に記載され、これには、例えば、リガンドトラップ（例えば、ＴＧＦβ受容体スーパーファミリーのＩ型受容体、ＩＩ型受容体または共受容体の可溶性リガンド結合ドメイン）、抗体、小分子およびポリヌクレオチドが含まれる。一部の実施形態では、ＢＭＰ６アンタゴニストは、ＴＧＦβスーパーファミリーの１種もしくは複数のＩ型受容体、ＩＩ型受容体もしくは共受容体および／またはシグナル伝達メディエーター（例えば、Ｓｍａｄ）をさらに阻害し得る。
【００１９】
ある特定の態様では、本明細書に記載される方法および使用に従って使用されるＢＭＰアンタゴニストは、ＢＭＰ３ｂを阻害する薬剤（ＢＭＰ３ｂアンタゴニスト）である。したがって、一部の実施形態では、ＢＭＰ３ｂアンタゴニストは、ＢＭＰ３ｂに結合し得る。一部の実施形態では、ＢＭＰ３ｂアンタゴニストは、少なくとも１×１０−８Ｍ（例えば、少なくとも少なくとも１×１０−９Ｍ、少なくとも１×１０−１０Ｍ、少なくとも１×１０−１１Ｍまたは少なくとも１×１０−１２Ｍ）のＫＤで、ＢＭＰ３ｂに結合する。一部の実施形態では、ＢＭＰ３ｂアンタゴニストは、ＢＭＰ１０および／またはＢＭＰ９の活性をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＢＭＰ３ｂアンタゴニストは、ＢＭＰ６および／またはＢＭＰ５をさらに阻害する。したがって、一部の実施形態では、ＢＭＰ３ｂアンタゴニストは、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６およびＢＭＰ５のうち１種または複数種種に結合し得る。ＢＭＰ３ｂアンタゴニストの例は、本明細書に記載され、これには、例えば、リガンドトラップ（例えば、ＴＧＦβ受容体スーパーファミリーのＩ型受容体、ＩＩ型受容体または共受容体の可溶性リガンド結合ドメイン）、抗体、小分子およびポリヌクレオチドが含まれる。一部の実施形態では、ＢＭＰ３ｂアンタゴニストは、ＴＧＦβスーパーファミリーの１種もしくは複数のＩ型受容体、ＩＩ型受容体もしくは共受容体および／またはシグナル伝達メディエーター（例えば、Ｓｍａｄ）をさらに阻害し得る。
【００２０】
ある特定の態様では、本明細書に記載される方法および使用に従って使用されるＢＭＰアンタゴニストは、ＢＭＰ５を阻害する薬剤（ＢＭＰ５アンタゴニスト）である。したがって、一部の実施形態では、ＢＭＰ５アンタゴニストは、ＢＭＰ５に結合し得る。一部の実施形態では、ＢＭＰ５アンタゴニストは、少なくとも１×１０−８Ｍ（例えば、少なくとも少なくとも１×１０−９Ｍ、少なくとも１×１０−１０Ｍ、少なくとも１×１０−１１Ｍまたは少なくとも１×１０−１２Ｍ）のＫＤで、ＢＭＰ５に結合する。一部の実施形態では、ＢＭＰ５アンタゴニストは、ＢＭＰ１０および／またはＢＭＰ９の活性をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＢＭＰ５アンタゴニストは、ＢＭＰ６および／またはＢＭＰ５をさらに阻害する。したがって、一部の実施形態では、ＢＭＰ５アンタゴニストは、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６およびＢＭＰ３ｂのうち１種または複数種に結合し得る。ＢＭＰ５アンタゴニストの例は、本明細書に記載され、これには、例えば、リガンドトラップ（例えば、ＴＧＦβ受容体スーパーファミリーのＩ型受容体、ＩＩ型受容体または共受容体の可溶性リガンド結合ドメイン）、抗体、小分子およびポリヌクレオチドが含まれる。一部の実施形態では、ＢＭＰ５アンタゴニストは、ＴＧＦβスーパーファミリーの１種もしくは複数のＩ型受容体、ＩＩ型受容体もしくは共受容体および／またはシグナル伝達メディエーター（例えば、Ｓｍａｄ）をさらに阻害し得る。
【００２１】
ある特定の態様では、本明細書に記載される方法および使用に従って使用されるＢＭＰアンタゴニストは、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ３ｂおよびＢＭＰ５のうち１種または複数種の、１種または複数種の受容体またはシグナル伝達メディエーターを阻害する薬剤である。例えば、一部の実施形態では、ＢＭＰアンタゴニストは、ＡｃｔＲＩＩＡを阻害し得る。一部の実施形態では、ＢＭＰアンタゴニストは、ＡｃｔＲＩＩＢを阻害し得る。一部の実施形態では、ＢＭＰアンタゴニストは、ＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢを阻害し得る。一部の実施形態では、ＢＭＰアンタゴニストは、ＢＭＰＲＩＩを阻害し得る。一部の実施形態では、ＢＭＰアンタゴニストは、ＡＬＫ１を阻害し得る。一部の実施形態では、ＢＭＰアンタゴニストは、エンドグリンを阻害し得る。一部の実施形態では、ＢＭＰアンタゴニストは、１種または複数種のＳｍａｄタンパク質（例えば、Ｓｍａｄ２および／または３）を阻害し得る。したがって、一部の実施形態では、ＢＭＰアンタゴニストは、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＢＭＰＲＩＩ、エンドグリンおよびＳｍａｄタンパク質のうち１種または複数種に結合し得る。一部の実施形態では、ＢＭＰアンタゴニストは、少なくとも１×１０−８Ｍ（例えば、少なくとも少なくとも１×１０−９Ｍ、少なくとも１×１０−１０Ｍ、少なくとも１×１０−１１Ｍまたは少なくとも１×１０−１２Ｍ）のＫＤで、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＢＭＰＲＩＩ、エンドグリンおよびＳｍａｄタンパク質のうち１種または複数種に結合する。ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＢＭＰＲＩＩ、エンドグリンおよびＳｍａｄタンパク質アンタゴニストの例は、本明細書に記載され、これには、例えば、抗体、小分子およびポリヌクレオチドが含まれる。
【００２２】
ある特定の態様では、本開示のＢＭＰアンタゴニストは、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドである。用語「ＡｃｔＲＩＩポリペプチド」は、本明細書に記載されるものなどの、天然に存在するＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドならびにそれらのトランケーションおよびバリアントを集合的に指す。好ましくは、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドまたはその改変（バリアント）形態のリガンド結合ドメインを含む。例えば、一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩＡの細胞外ドメインを含み得る。同様に、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメインを含み得る。好ましくは、本明細書に記載される方法および使用に従って使用されるＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、可溶性ポリペプチドである。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号１０のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号１１のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸３０〜１１０の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号５０のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号５４のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号５７のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸２９〜１０９に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸２５〜１３１に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号６５のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１３３のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号５８のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号６０のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号６３のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号６４のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号６６のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１２３のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１３１のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１３２のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１に関して７９位に酸性アミノ酸（例えば、人工的に酸性のアミノ酸または天然に存在する酸性アミノ酸、例えば、ＤもしくはＥ）を含まない。
【００２３】
ある特定の態様では、本開示のＢＭＰアンタゴニストは、ＢＭＰＲＩＩポリペプチドである。用語ＢＭＰＲＩＩポリペプチドは、本明細書に記載されるものなどの、天然に存在するポリペプチドならびにそれらのトランケーションおよびバリアントを集合的に指す。好ましくは、ＢＭＰＲＩＩポリペプチドは、ＢＭＰＲＩＩポリペプチドまたはその改変（バリアント）形態のリガンド結合ドメインを含む。例えば、一部の実施形態では、ＢＭＰＲＩＩポリペプチドは、ＢＭＰＲＩＩの細胞外ドメインを含み得る。好ましくは、本明細書に記載される方法および使用に従って使用されるＢＭＰＲＩＩポリペプチドは、可溶性ポリペプチドである。一部の実施形態では、ＢＭＰＲＩＩポリペプチドは、配列番号１４のアミノ酸２７〜１５０に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、ＢＭＰＲＩＩポリペプチドは、配列番号１４のアミノ酸３４〜１２３に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、ＢＭＰＲＩＩポリペプチドは、配列番号１５のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、ＢＭＰＲＩＩポリペプチドは、配列番号６９のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、ＢＭＰＲＩＩポリペプチドは、配列番号７１のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み得る。
【００２４】
ある特定の態様では、本開示のＢＭＰアンタゴニストは、ＡＬＫ１ポリペプチドである。用語ＡＬＫ１ポリペプチドは、本明細書に記載されるものなどの、天然に存在するポリペプチドならびにそれらのトランケーションおよびバリアントを集合的に指す。好ましくは、ＡＬＫ１ポリペプチドは、ＡＬＫ１ポリペプチドまたはその改変（バリアント）形態のリガンド結合ドメインを含む。例えば、一部の実施形態では、ＡＬＫ１ポリペプチドは、ＡＬＫ１の細胞外ドメインを含み得る。好ましくは、本明細書に記載される方法および使用に従って使用されるＡＬＫ１ポリペプチドは、可溶性ポリペプチドである。一部の実施形態では、ＡＬＫ１ポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸２２〜１１８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、ＡＬＫ１ポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸３４〜９５に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、ＡＬＫ１ポリペプチドは、配列番号２１のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、ＡＬＫ１ポリペプチドは、配列番号７４のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、ＡＬＫ１ポリペプチドは、配列番号７６のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み得る。
【００２５】
ある特定の態様では、本開示のＢＭＰアンタゴニストは、エンドグリンポリペプチドである。用語エンドグリンポリペプチドは、本明細書に記載されるものなどの、天然に存在するポリペプチドならびにそれらのトランケーションおよびバリアントを集合的に指す。好ましくは、エンドグリンポリペプチドは、エンドグリンポリペプチドまたはその改変（バリアント）形態のリガンド結合ドメインを含む。例えば、一部の実施形態では、エンドグリンポリペプチドは、エンドグリンの細胞外ドメインを含み得る。好ましくは、本明細書に記載される方法および使用に従って使用されるエンドグリンポリペプチドは、可溶性ポリペプチドである。一部の実施形態では、エンドグリンポリペプチドは、配列番号２４のアミノ酸２６〜３７８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、エンドグリンポリペプチドは、配列番号２４のアミノ酸４２〜３３３に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、エンドグリンポリペプチドは、配列番号２４のアミノ酸２６〜３４６に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、エンドグリンポリペプチドは、配列番号２４のアミノ酸２７〜５８１に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、エンドグリンポリペプチドは、配列番号２４のアミノ酸２６〜３５９に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、エンドグリンポリペプチドは、配列番号７８のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、エンドグリンポリペプチドは、配列番号８０のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、エンドグリンポリペプチドは、配列番号２８のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、エンドグリンポリペプチドは、配列番号２９のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、エンドグリンポリペプチドは、配列番号３０のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、エンドグリンポリペプチドは、配列番号３１のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、エンドグリンポリペプチドは、配列番号２４のアミノ酸３７９〜４３０からなる配列を含まない。一部の実施形態では、エンドグリンポリペプチドは、配列番号２４のアミノ酸３７９〜５８６からなる配列由来の５０よりも多く連続するアミノ酸を含まない。
【００２６】
ある特定の態様では、本開示のＢＭＰアンタゴニストは、ＢＭＰ１０プロペプチド（ＢＭＰ１０ｐｒｏ）ポリペプチドである。用語ＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドは、本明細書に記載されるものなどの、天然に存在するプロペプチドポリペプチドならびにそれらのトランケーションおよびバリアントを集合的に指す。好ましくは、ＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドは、ＢＭＰ１０プロペプチドポリペプチドまたはその改変（バリアント）形態のリガンド結合ドメインを含む。好ましくは、本明細書に記載される方法および使用に従って使用されるＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドは、可溶性ポリペプチドである。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドは、配列番号３４のアミノ酸１〜６のいずれか１つに対応する位置において始まり、配列番号３４のアミノ酸２９１〜２９５のいずれか１つに対応する位置において終わる配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドは、配列番号３４のアミノ酸１〜６のいずれか１つに対応する位置において始まり、配列番号３４のアミノ酸２９１〜２９４のいずれか１つに対応する位置において終わる配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み得、このポリペプチドは、アミノ酸ＲＩＲＲの配列を含まない。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドは、配列番号３４のアミノ酸１〜２９１に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドは、配列番号３４のアミノ酸１〜２９１に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み得、このポリペプチドは、アミノ酸ＲＩＲＲの配列を含まない。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドは、配列番号３４のアミノ酸１〜２９４に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドは、配列番号３４のアミノ酸１〜２９４に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み得、このポリペプチドは、アミノ酸ＲＩＲＲの配列を含まない。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドは、配列番号３４のアミノ酸１〜６のいずれか１つに対応する位置において始まり、配列番号３４のアミノ酸２９１〜２９１のいずれか１つに対応する位置において終わる配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み得、このポリペプチドのＣ末端は、配列番号３４のＲ２９５ではない。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドは、配列番号３４のアミノ酸１〜６のいずれか１つに対応する位置において始まり、配列番号３４のアミノ酸２９１〜２９４のいずれか１つに対応する位置において終わる配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み得、このポリペプチドのＣ末端は、配列番号３４のＲ２９５ではない。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドは、配列番号３４のアミノ酸１〜２９１に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み得、このポリペプチドのＣ末端は、配列番号３４のＲ２９５ではない。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドは、配列番号３４のアミノ酸１〜２９４に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み得、このポリペプチドのＣ末端は、配列番号３４のＲ２９５ではない。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドは、配列番号８２のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドは、配列番号８４のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドは、配列番号８５のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドは、配列番号８７のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み得る。
【００２７】
ある特定の態様では、それらのバリアントを含む、ＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＢＭＰＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ１ポリペプチドおよびエンドグリンポリペプチドは、融合タンパク質であり得る。例えば、一部の実施形態では、ＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＢＭＰＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ１ポリペプチドまたはエンドグリンポリペプチドは、ＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＢＭＰＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ１ポリペプチドまたはエンドグリンポリペプチドドメインおよび１つまたは複数の異種（非ＢＭＰ１０ｐｒｏ、非ＡｃｔＲＩＩ、非ＢＭＰＲＩＩ、非ＡＬＫ１または非エンドグリン）ポリペプチドドメインを含む融合タンパク質であり得る。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＢＭＰＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ１ポリペプチドまたはエンドグリンポリペプチドは、１つのドメインとして、ＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＢＭＰＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ１ポリペプチドまたはエンドグリンポリペプチド（例えば、ＢＭＰプロペプチド、ＡｃｔＲＩＩ受容体、ＢＭＰＲＩＩ受容体、ＡＬＫ１受容体もしくはエンドグリン受容体またはそれらのバリアントのリガンド結合ドメイン）に由来するアミノ酸配列を有し、望ましい特性、例えば、改善された薬物動態、より容易な精製、特定の組織への標的化などを提供する１つまたは複数の異種ドメインを有する、融合タンパク質であり得る。例えば、融合タンパク質のドメインは、ｉｎ  ｖｉｖｏ安定性、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期、取り込み／投与、組織局在化もしくは分布、タンパク質複合体の形成、融合タンパク質のマルチマー化、および／または精製のうち１つまたは複数を増強し得る。必要に応じて、融合タンパク質のＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＢＭＰＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ１ポリペプチドまたはエンドグリンポリペプチドドメインは、１つもしくは複数の異種ポリペプチドドメインに直接接続（融合）され、またはリンカーなどの介在配列が、ＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＢＭＰＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ１ポリペプチドまたはエンドグリンポリペプチドのアミノ酸配列と１つまたは複数の異種ドメインのアミノ酸配列との間に位置し得る。ある特定の実施形態では、ＢＭＰ１０ｐｒｏ、ＡｃｔＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１またはエンドグリンポリペプチド融合物は、異種ドメインとＢＭＰ１０ｐｒｏドメイン、ＡｃｔＲＩＩドメイン、ＢＭＰＲＩＩドメイン、ＡＬＫ１ドメインまたはエンドグリンドメインとの間に位置するリンカーを含む。リンカーは、ＢＭＰ１０ｐｒｏドメイン、ＡｃｔＲＩＩドメイン、ＢＭＰＲＩＩドメイン、ＡＬＫ１ドメインもしくはエンドグリンドメインのＣ末端のおおよそ４〜１５アミノ酸の非構造領域に対応し得、または比較的二次構造をとらない、３アミノ酸と１５、２０、３０、５０またはそれよりも多くのアミノ酸との間の人工配列であり得る。リンカーは、グリシンおよびプロリン残基がリッチであり得、例えば、スレオニン／セリンおよびグリシンの反復配列を��み得る。リンカーの例には、配列ＴＧＧＧ（配列番号４５）、ＳＧＧＧ（配列番号４６）、ＴＧＧＧＧ（配列番号４３）、ＳＧＧＧＧ（配列番号４４）、ＧＧＧＧＳ（配列番号４７）、ＧＧＧＧ（配列番号４２）およびＧＧＧ（配列番号４１）が含まれるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０ｐｒｏ、ＡｃｔＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１およびエンドグリン融合タンパク質は、例えば、免疫グロブリンのＦｃ部分を含む、免疫グロブリンの定常ドメインを含み得る。例えば、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１またはＩｇＡ２）、ＩｇＥまたはＩｇＭ免疫グロブリンのＦｃドメインに由来するアミノ酸配列。例えば、免疫グロブリンドメインのＦｃ部分は、配列番号３６〜４０のいずれか１つに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み得、本質的にそれからなり得、またはそれからなり得る。かかる免疫グロブリンドメインは、変更されたＦｃ活性、例えば、１つまたは複数のＦｃエフェクター機能の減少を付与する、１つまたは複数のアミノ酸改変（例えば、欠失、付加および／または置換）を含み得る。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０ｐｒｏ、ＡｃｔＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１またはエンドグリン融合タンパク質は、式Ａ−Ｂ−Ｃで示されるアミノ酸配列を含む。例えば、Ｂ部分は、本明細書に記載される、Ｎ末端およびＣ末端がトランケートされたＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドである。ＡおよびＣ部分は、独立して、ゼロ、１つ、または１つよりも多いアミノ酸であり得、ＡおよびＣ部分は共に、Ｂに対して異種である。Ａおよび／またはＣ部分は、リンカー配列を介してＢ部分に付加され得る。ある特定の実施形態では、ＢＭＰ１０ｐｒｏ、ＡｃｔＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１またはエンドグリン融合タンパク質は、リーダー配列を含む。リーダー配列は、ネイティブのＢＭＰ１０ｐｒｏ、ＡｃｔＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１もしくはエンドグリンのリーダー配列、または異種リーダー配列であり得る。ある特定の実施形態では、リーダー配列は、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）リーダー配列である。
【００２８】
そのバリアントを含む、ＢＭＰ１０ｐｒｏ、ＡｃｔＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１またはエンドグリンポリペプチドは、精製部分配列、例えば、エピトープタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジン配列およびＧＳＴ融合物を含み得る。必要に応じて、ＢＭＰ１０ｐｒｏ、ＡｃｔＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１またはエンドグリンポリペプチドは、グリコシル化されたアミノ酸、ＰＥＧ化されたアミノ酸、ファルネシル化されたアミノ酸、アセチル化されたアミノ酸、ビオチン化されたアミノ酸、脂質部分にコンジュゲートされたアミノ酸、および有機誘導体化剤にコンジュゲートされたアミノ酸から選択される１つまたは複数の改変されたアミノ酸残基を含む。ＢＭＰ１０ｐｒｏ、ＡｃｔＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１およびエンドグリンポリペプチドは、少なくとも１つのＮ結合型糖を含み得、２つ、３つまたはそれよりも多くのＮ結合型糖を含み得る。かかるポリペプチドは、Ｏ結合型糖もまた含み得る。一般に、ＢＭＰ１０ｐｒｏ、ＡｃｔＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１およびエンドグリンポリペプチドは、患者における好ましくない免疫応答の可能性を減弱するために、ポリペプチドの天然のグリコシル化を適切に媒介する哺乳動物細胞株において発現させることが好ましい。ＢＭＰ１０ｐｒｏ、ＡｃｔＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１およびエンドグリンポリペプチドは、操作された昆虫または酵母細胞、ならびに哺乳動物細胞、例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞およびＮＳＯ細胞を含む、患者での使用に適した様式でタンパク質をグリコシル化する種々の細胞株において産生され得る。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０ｐｒｏ、ＡｃｔＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１またはエンドグリンポリペプチドは、グリコシル化され、チャイニーズハムスター卵巣細胞株から取得可能なグリコシル化パターンを有する。一部の実施形態では、本開示のＢＭＰ１０ｐｒｏ、ＡｃｔＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１およびエンドグリンポリペプチドは、哺乳動物（例えば、マウスまたはヒト）において、少なくとも４、６、１２、２４、３６、４８または７２時間の血清半減期を示す。必要に応じて、ＢＭＰ１０ｐｒｏ、ＡｃｔＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１およびエンドグリンポリペプチドは、哺乳動物（例えば、マウスまたはヒト）において、少なくとも６、８、１０、１２、１４、２０、２５または３０日間の血清半減期を示し得る。
【００２９】
ある特定の態様では、本開示の教示に従って使用されるＢＭＰアンタゴニストは、抗体または抗体の組合せである。一部の実施形態では、抗体または抗体の組合せは、少なくともＢＭＰ１０に結合する。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０に結合する抗体または抗体の組合せは、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ３ｂ、ＢＭＰ５、ＡｃｔＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１およびエンドグリンのうち１種または複数種にさらに結合する。一部の実施形態では、抗体または抗体の組合せは、少なくともＢＭＰ９に結合する。一部の実施形態では、ＢＭＰ９に結合する抗体または抗体の組合せは、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ６、ＢＭＰ３ｂ、ＢＭＰ５、ＡｃｔＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１およびエンドグリンのうち１種または複数種にさらに結合する。一部の実施形態では、抗体または抗体の組合せは、少なくともＢＭＰ６に結合する。一部の実施形態では、ＢＭＰ６に結合する抗体または抗体の組合せは、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ３ｂ、ＢＭＰ５、ＡｃｔＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１およびエンドグリンのうち１種または複数種にさらに結合する。一部の実施形態では、抗体または抗体の組合せは、少なくともＢＭＰ３ｂに結合する。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０に結合する抗体または抗体の組合せは、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ５、ＡｃｔＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１およびエンドグリンのうち１種または複数種にさらに結合する。一部の実施形態では、抗体または抗体の組合せは、少なくともＢＭＰ５に結合する。一部の実施形態では、ＢＭＰ５に結合する抗体または抗体の組合せは、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ３ｂ、ＢＭＰ１０、ＡｃｔＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１およびエンドグリンのうち１種または複数種にさらに結合する。一部の実施形態では、抗体または抗体の組合せは、少なくともＡｃｔＲＩＩに結合する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩに結合する抗体または抗体の組合せは、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ３ｂ、ＢＭＰ５、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１およびエンドグリンのうち１種または複数種にさらに結合する。一部の実施形態では、抗体または抗体の組合せは、少なくともＢＭＰＲＩＩに結合する。一部の実施形態では、ＢＭＰＲＩＩに結合する抗体または抗体の組合せは、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ３ｂ、ＢＭＰ５、ＡｃｔＲＩＩ、ＡＬＫ１およびエンドグリンのうち１種または複数種にさらに結合する。一部の実施形態では、抗体または抗体の組合せは、少なくともＡＬＫ１に結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ１に結合する抗体または抗体の組合せは、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ３ｂ、ＢＭＰ５、ＡｃｔＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩおよびエンドグリンのうち１種または複数種にさらに結合する。一部の実施形態では、抗体または抗体の組合せは、少なくともエンドグリンに結合する。一部の実施形態では、エンドグリンに結合する抗体または抗体の組合せは、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ３ｂ、ＢＭＰ５、ＡｃｔＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩおよびＡＬＫ１のうち１種または複数種にさらに結合する。一部の実施形態では、抗体または抗体の組合せは、少なくともＢＭＰ１０およびＢＭＰ９に結合する。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０およびＢＭＰ９に結合する抗体または抗体の組合せは、ＢＭＰ６、ＢＭＰ３ｂ、ＢＭＰ５、ＡｃｔＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１およびエンドグリンのうち１種または複数種にさらに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、本明細書に開示される抗体または抗体の組合せは、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ３ｂ、ＢＭＰ５、ＡｃｔＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１およびエンドグリンのうち１種または複数種の活性を阻害する。ある特定の好ましい実施形態では、ＢＭＰ１０抗体は、成熟ＢＭＰ１０タンパク質に結合する。ある特定の好ましい実施形態では、ＢＭＰ１０抗体は、成熟ＢＭＰ１０タンパク質に、ＢＭＰ１０プロペプチドと競合的に結合する。
【００３０】
ある特定の態様では、本開示の教示に従って使用されるＢＭＰアンタゴニストは、小分子または小分子の組合せである。一部の実施形態では、小分子または小分子の組合せは、少なくともＢＭＰ１０活性を阻害する。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０活性を阻害する小分子または小分子の組合せは、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ３ｂ、ＢＭＰ５、ＡｃｔＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１、エンドグリンおよびＳｍａｄタンパク質（例えば、Ｓｍａｄ２および／または３）のうち１種または複数種の活性をさらに阻害する。一部の実施形態では、小分子または小分子の組合せは、少なくともＢＭＰ９活性を阻害する。一部の実施形態では、ＢＭＰ９活性を阻害する小分子または小分子の組合せは、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ６、ＢＭＰ３ｂ、ＢＭＰ５、ＡｃｔＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１、エンドグリンおよびＳｍａｄタンパク質（例えば、Ｓｍａｄ２および／または３）のうち１種または複数種の活性をさらに阻害する。一部の実施形態では、小分子または小分子の組合せは、少なくともＢＭＰ６活性を阻害する。一部の実施形態では、ＢＭＰ６活性を阻害する小分子または小分子の組合せは、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ３ｂ、ＢＭＰ５、ＡｃｔＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１、エンドグリンおよびＳｍａｄタンパク質（例えば、Ｓｍａｄ２および／または３）のうち１種または複数種の活性をさらに阻害する。一部の実施形態では、小分子または小分子の組合せは、少なくともＢＭＰ３ｂ活性を阻害する。一部の実施形態では、ＢＭＰ３ｂ活性を阻害する小分子または小分子の組合せは、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ５、ＡｃｔＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１、エンドグリンおよびＳｍａｄタンパク質（例えば、Ｓｍａｄ２および／または３）のうち１種または複数種の活性をさらに阻害する。一部の実施形態では、小分子または小分子の組合せは、少なくともＢＭＰ５活性を阻害する。一部の実施形態では、ＢＭＰ５活性を阻害する小分子または小分子の組合せは、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ３ｂ、ＡｃｔＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１、エンドグリンおよびＳｍａｄタンパク質（例えば、Ｓｍａｄ２および／または３）のうち１種または複数種の活性をさらに阻害する。一部の実施形態では、小分子または小分子の組合せは、少なくともＡｃｔＲＩＩ活性を阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩ活性を阻害する小分子または小分子の組合せは、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ３ｂ、ＢＭＰ５、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１、エンドグリンおよびＳｍａｄタンパク質（例えば、Ｓｍａｄ２および／または３）のうち１種または複数種の活性をさらに阻害する。一部の実施形態では、小分子または小分子の組合せは、少なくともＢＭＰＲＩＩ活性を阻害する。一部の実施形態では、ＢＭＰＲＩＩ活性を阻害する小分子または小分子の組合せは、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ３ｂ、ＢＭＰ５、ＡｃｔＲＩＩ、ＡＬＫ１、エンドグリンおよびＳｍａｄタンパク質（例えば、Ｓｍａｄ２および／または３）のうち１種または複数種の活性をさらに阻害する。一部の実施形態では、小分子または小分子の組合せは、少なくともＡＬＫ１活性を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ１活性を阻害する小分子または小分子の組合せは、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ３ｂ、ＢＭＰ５、ＡｃｔＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、エンドグリンおよびＳｍａｄタンパク質（例えば、Ｓｍａｄ２および／または３）のうち１種または複数種の活性をさらに阻害する。一部の実施形態では、小分子または小分子の組合せは、少なくともエンドグリン活性を阻害する。一部の実施形態では、エンドグリン活性を阻害する小分子または小分子の組合せは、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ３ｂ、ＢＭＰ５、ＡｃｔＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１およびＳｍａｄタンパク質（例えば、Ｓｍａｄ２および／または３）のうち１種または複数種の活性をさらに阻害する。一部の実施形態では、小分子または小分子の組合せは、少なくとも１種または複数種のＳｍａｄ（例えば、Ｓｍａｄ２および／または３）の活性を阻害する。一部の実施形態では、１種または複数種のＳｍａｄの活性を阻害する小分子または小分子の組合せは、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ３ｂ、ＢＭＰ５、ＡｃｔＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１およびエンドグリンのうち１種または複数種の活性をさらに阻害する。一部の実施形態では、小分子または小分子の組合せは、少なくともＢＭＰ１０およびＢＭＰ９の活性を阻害する。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０およびＢＭＰ９の活性を阻害する小分子または小分子の組合せは、ＢＭＰ６、ＢＭＰ３ｂ、ＢＭＰ５、ＡｃｔＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１、エンドグリンおよびＳｍａｄタンパク質（例えば、Ｓｍａｄ２および／または３）のうち１種または複数種の活性をさらに阻害する。
【００３１】
ある特定の態様では、本開示の教示に従って使用されるＢＭＰアンタゴニストは、ヌクレオチドまたはヌクレオチドの組合せである。一部の実施形態では、ヌクレオチドまたはヌクレオチドの組合せは、少なくともＢＭＰ１０活性を阻害する。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０活性を阻害するヌクレオチドまたはヌクレオチドの組合せは、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ３ｂ、ＢＭＰ５、ＡｃｔＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１、エンドグリンおよびＳｍａｄタンパク質（例えば、Ｓｍａｄ２および／または３）のうち１種または複数種の活性をさらに阻害する。一部の実施形態では、ヌクレオチドまたはヌクレオチドの組合せは、少なくともＢＭＰ９活性を阻害する。一部の実施形態では、ＢＭＰ９活性を阻害するヌクレオチドまたはヌクレオチドの組合せは、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ６、ＢＭＰ３ｂ、ＢＭＰ５、ＡｃｔＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１、エンドグリンおよびＳｍａｄタンパク質（例えば、Ｓｍａｄ２および／または３）のうち１種または複数種の活性をさらに阻害する。一部の実施形態では、ヌクレオチドまたはヌクレオチドの組合せは、少なくともＢＭＰ６活性を阻害する。一部の実施形態では、ＢＭＰ６活性を阻害するヌクレオチドまたはヌクレオチドの組合せは、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ３ｂ、ＢＭＰ５、ＡｃｔＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１、エンドグリンおよびＳｍａｄタンパク質（例えば、Ｓｍａｄ２および／または３）のうち１種または複数種の活性をさらに阻害する。一部の実施形態では、ヌクレオチドまたはヌクレオチドの組合せは、少なくともＢＭＰ３ｂ活性を阻害する。一部の実施形態では、ＢＭＰ３ｂ活性を阻害するヌクレオチドまたはヌクレオチドの組合せは、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ５、ＡｃｔＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１、エンドグリンおよびＳｍａｄタンパク質（例えば、Ｓｍａｄ２および／または３）のうち１種または複数種の活性をさらに阻害する。一部の実施形態では、ヌクレオチドまたはヌクレオチドの組合せは、少なくともＢＭＰ５活性を阻害する。一部の実施形態では、ＢＭＰ５活性を阻害するヌクレオチドまたはヌクレオチドの組合せは、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ３ｂ、ＡｃｔＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１、エンドグリンおよびＳｍａｄタンパク質（例えば、Ｓｍａｄ２および／または３）のうち１種または複数種の活性をさらに阻害する。一部の実施形態では、ヌクレオチドまたはヌクレオチドの組合せは、少なくともＡｃｔＲＩＩ活性を阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩ活性を阻害するヌクレオチドまたはヌクレオチドの組合せは、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ３ｂ、ＢＭＰ５、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１、エンドグリンおよびＳｍａｄタンパク質（例えば、Ｓｍａｄ２および／または３）のうち１種または複数種の活性をさらに阻害する。一部の実施形態では、ヌクレオチドまたはヌクレオチドの組合せは、少なくともＢＭＰＲＩＩ活性を阻害する。一部の実施形態では、ＢＭＰＲＩＩ活性を阻害するヌクレオチドまたはヌクレオチドの組合せは、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ３ｂ、ＢＭＰ５、ＡｃｔＲＩＩ、ＡＬＫ１、エンドグリンおよびＳｍａｄタンパク質（例えば、Ｓｍａｄ２および／または３）のうち１種または複数種の活性をさらに阻害する。一部の実施形態では、ヌクレオチドまたはヌクレオチドの組合せは、少なくともＡＬＫ１活性を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ１活性を阻害するヌクレオチドまたはヌクレオチドの組合せは、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ３ｂ、ＢＭＰ５、ＡｃｔＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、エンドグリンおよびＳｍａｄタンパク質（例えば、Ｓｍａｄ２および／または３）のうち１種または複数種の活性をさらに阻害する。一部の実施形態では、ヌクレオチドまたはヌクレオチドの組合せは、少なくともエンドグリン活性を阻害する。一部の実施形態では、エンドグリン活性を阻害するヌクレオチドまたはヌクレオチドの組合せは、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ３ｂ、ＢＭＰ５、ＡｃｔＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１およびＳｍａｄタンパク質（例えば、Ｓｍａｄ２および／または３）のうち１種または複数種の活性をさらに阻害する。一部の実施形態では、ヌクレオチドまたはヌクレオチドの組合せは、少なくとも１種または複数種のＳｍａｄ（例えば、Ｓｍａｄ２および／または３）の活性を阻害する。一部の実施形態では、１種または複数種のＳｍａｄの活性を阻害するヌクレオチドまたはヌクレオチドの組合せは、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ３ｂ、ＢＭＰ５、ＡｃｔＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１およびエンドグリンのうち１種または複数種の活性をさらに阻害する。一部の実施形態では、ヌクレオチドまたはヌクレオチドの組合せは、少なくともＢＭＰ１０およびＢＭＰ９の活性を阻害する。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０およびＢＭＰ９の活性を阻害するヌクレオチドまたはヌクレオチドの組合せは、ＢＭＰ６、ＢＭＰ３ｂ、ＢＭＰ５、ＡｃｔＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１、エンドグリンおよびＳｍａｄタンパク質（例えば、Ｓｍａｄ２および／または３）のうち１種または複数種の活性をさらに阻害する。
【００３２】
ある特定の態様では、本開示は、ＢＭＰ１０プロペプチドを提供する。本明細書の実施例によって示されるように、成熟ＢＭＰ１０ポリペプチドに結合し、その活性をアンタゴナイズするＢＭＰ１０プロペプチドが生成された。これらのＢＭＰ１０プロペプチドは、他のＢＭＰタンパク質に、特にＢＭＰ９、ＢＭＰ６およびＢＭＰ３ｂに結合し、より低い程度でＢＭＰ５に結合することが、さらに発見された。したがって、ＢＭＰプロペプチドは、ＢＭＰファミリーの他のメンバーをアンタゴナイズし得、したがって、これらの他のＢＭＰタンパク質と関連するさらなる障害または状態（例えば、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ３ｂおよびＢＭＰ６関連障害または状態）の処置において有用であり得る。さらに、プロペプチドドメインの４つのＣ末端アミノ酸を欠く、Ｃ末端がトランケートされたＢＭＰ１０プロペプチドバリアントは、驚くべきことに、より長い長さのＢＭＰ１０プロペプチドバリアントと比較して増加したＢＭＰ１０アンタゴナイズ活性を有することが見出された。したがって、ＢＭＰ１０プロペプチドは、ＢＭＰ１０アンタゴナイズ活性を喪失することなしに、１、２、３または４アミノ酸のＣ末端トランケーションを許容し得る。さらに、４つのＣ末端アミノ酸を欠くＢＭＰ１０プロペプチドバリアントは、増加したＢＭＰ１０アンタゴナイズ活性を有し得、したがって、かかる増加したＢＭＰ１０アンタゴニズムが望ましいある特定の実験状況および臨床状況において有用であり得る。本開示は、ＢＭＰ１０プロペプチドをコードする核酸配列、ＢＭＰ１０プロペプチドを含む医薬組成物およびキット、ならびにＢＭＰ１０プロペプチドを製造する方法をさらに提供する。
【００３３】
ある特定の態様では、本開示は、配列番号３４のアミノ酸１〜６のいずれか１つに対応する位置において始まり、配列番号３４のアミノ酸２９２〜２９５のいずれか１つに対応する位置において終わる配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むＢＭＰ１０プロペプチド（ＢＭＰ１０ｐｒｏ）ポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドは、アミノ酸ＲＩＲＲの配列を含まない。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドのＣ末端は、配列番号３４のＲ２９６ではない。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドは、配列番号３４のアミノ酸１〜２９２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドは、配列番号３４のアミノ酸１〜２９２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み、このポリペプチドは、アミノ酸ＲＩＲＲの配列を含まない。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドは、配列番号３４のアミノ酸１〜２９２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み、このポリペプチドのＣ末端は、配列番号３４のＲ２９６ではない。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドは、配列番号３４のアミノ酸１〜２９５に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドは、配列番号３４のアミノ酸１〜２９５に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み、このポリペプチドは、アミノ酸ＲＩＲＲの配列を含まない。
【００３４】
一部の実施形態では、ＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドは、配列番号３４のアミノ酸１〜２９５に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み、このポリペプチドのＣ末端は、配列番号３４のＲ２９６ではない。
【００３５】
以前に論じたように、本開示は、ＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドドメインおよび１つまたは複数の異種（非ＢＭＰ１０ｐｒｏ）ポリペプチドドメインを含む融合タンパク質であるＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドを提供する。例えば、ＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドは、ＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドドメインおよび免疫グロブリンＦｃドメインを含むＦｃ融合タンパク質である。必要に応じて、融合タンパク質のＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドドメインは、１つもしくは複数の異種ポリペプチドドメインに直接接続（融合）され、またはリンカーなどの介在配列が、ＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドのアミノ酸配列と１つもしくは複数の異種ドメインのアミノ酸配列との間に位置し得る。ある特定の実施形態では、ＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチド融合物は、異種ドメインとＢＭＰ１０ｐｒｏドメインとの間に位置するリンカーを含む。リンカーは、ＢＭＰ１０ｐｒｏドメインのＣ末端のおおよそ４〜１５アミノ酸の非構造領域に対応し得、または比較的二次構造をとらない、３アミノ酸と１５、２０、３０、５０またはそれよりも多くのアミノ酸との間の人工配列であり得る。リンカーは、グリシンおよびプロリン残基がリッチであり得、例えば、スレオニン／セリンおよびグリシンの反復配列を含み得る。リンカーの例には、配列ＴＧＧＧ（配列番号４５）、ＳＧＧＧ（配列番号４６）、ＴＧＧＧＧ（配列番号４３）、ＳＧＧＧＧ（配列番号４４）、ＧＧＧＧＳ（配列番号４７）、ＧＧＧＧ（配列番号４２）およびＧＧＧ（配列番号４１）が含まれるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０ｐｒｏエンドグリン融合タンパク質は、例えば、免疫グロブリンのＦｃ部分を含む、免疫グロブリンの定常ドメインを含み得る。例えば、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１またはＩｇＡ２）、ＩｇＥまたはＩｇＭ免疫グロブリンのＦｃドメインに由来するアミノ酸配列。例えば、免疫グロブリンドメインのＦｃ部分は、配列番号３６〜４０のいずれか１つに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列からなり得る。かかる免疫グロブリンドメインは、変更されたＦｃ活性、例えば、１つまたは複数のＦｃエフェクター機能の減少を付与する、１つまたは複数のアミノ酸改変（例えば、欠失、付加および／または置換）を含み得る。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０ｐｒｏ融合タンパク質は、式Ａ−Ｂ−Ｃで示されるアミノ酸配列を含む。例えば、Ｂ部分は、本明細書に記載される、Ｎ末端およびＣ末端がトランケートされたＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドである。ＡおよびＣ部分は、独立して、ゼロ、１つ、または１つよりも多いアミノ酸であり得、ＡおよびＣ部分は共に、Ｂに対して異種である。Ａおよび／またはＣ部分は、リンカー配列を介してＢ部分に付加され得る。ある特定の実施形態では、ＢＭＰ１０ｐｒｏ融合タンパク質は、リーダー配列を含む。リーダー配列は、ネイティブのＢＭＰ１０ｐｒｏリーダー配列または異種リーダー配列であり得る。ある特定の実施形態では、リーダー配列は、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）リーダー配列である。
【００３６】
ある特定の態様では、本開示は、ＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドドメインおよび免疫グロブリンＦｃドメインを含むＦｃ融合タンパク質であるＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドを提供する。ある特定の態様では、本開示は、配列番号３４のアミノ酸１〜６のいずれか１つに対応する位置において始まり、配列番号３４のアミノ酸２９２〜２９５のいずれか１つに対応する位置において終わる配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むＢＭＰ１０ｐｒｏ−Ｆｃ融合タンパク質を提供する。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０ｐｒｏ−Ｆｃ融合タンパク質は、アミノ酸ＲＩＲＲの配列を含まない。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０ｐｒｏ−Ｆｃ融合タンパク質のＢＭＰ１０ｐｒｏドメインのＣ末端は、配列番号３４のＲ２９６ではない。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０ｐｒｏ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号３４のアミノ酸１〜２９２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０ｐｒｏ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号３４のアミノ酸１〜２９２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み、このポリペプチドは、アミノ酸ＲＩＲＲの配列を含まない。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０ｐｒｏ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号３４のアミノ酸１〜２９２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み、ＢＭＰ１０ｐｒｏドメインのＣ末端は、配列番号３４のＲ２９６ではない。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０ｐｒｏ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号３４のアミノ酸１〜２９５に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０ｐｒｏ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号３４のアミノ酸１〜２９５に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み、ＢＭＰ１０ｐｒｏドメインは、アミノ酸ＲＩＲＲの配列を含まない。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０ｐｒｏ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号３４のアミノ酸１〜２９５に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み、ＢＭＰ１０ｐｒｏドメインのＣ末端は、配列番号３４のＲ２９６ではない。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０ｐｒｏ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号８２のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０ｐｒｏ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号８２のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み、この融合タンパク質は、アミノ酸ＲＩＲＲの配列を含まない。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０ｐｒｏ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号８２のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み、ＢＭＰ１０ｐｒｏドメインのＣ末端は、配列番号３４のＲ２９６ではない。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０ｐｒｏ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号８７のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０ｐｒｏ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号８７のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み、この融合タンパク質は、アミノ酸ＲＩＲＲの配列を含まない。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０ｐｒｏ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号８７のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み、ＢＭＰ１０ｐｒｏドメインのＣ末端は、配列番号３４のＲ２９６ではない。
【００３７】
そのバリアントを含むＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドは、精製部分配列、例えば、エピトープタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジン配列およびＧＳＴ融合物を含み得る。必要に応じて、ＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドは、グリコシル化されたアミノ酸、ＰＥＧ化されたアミノ酸、ファルネシル化されたアミノ酸、アセチル化されたアミノ酸、ビオチン化されたアミノ酸、脂質部分にコンジュゲートされたアミノ酸、および有機誘導体化剤にコンジュゲートされたアミノ酸から選択される１つまたは複数の改変されたアミノ酸残基を含む。ＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドは、少なくとも１つのＮ結合型糖を含み得、２つ、３つまたはそれよりも多くのＮ結合型糖を含み得る。かかるポリペプチドは、Ｏ結合型糖もまた含み得る。一般に、ＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドは、患者における好ましくない免疫応答の可能性を減弱するために、ポリペプチドの天然のグリコシル化を適切に媒介する哺乳動物細胞株において発現させることが好ましい。ＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドは、操作された昆虫または酵母細胞、ならびに哺乳動物細胞、例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞およびＮＳＯ細胞を含む、患者での使用に適した様式でタンパク質をグリコシル化する種々の細胞株において産生され得る。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドは、グリコシル化され、チャイニーズハムスター卵巣細胞株から取得可能なグリコシル化パターンを有する。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドは、哺乳動物（例えば、マウスまたはヒト）において、少なくとも４、６、１２、２４、３６、４８または７２時間の血清半減期を示す。必要に応じて、ＢＭＰ１０ｐｒｏは、哺乳動物（例えば、マウスまたはヒト）において、少なくとも６、８、１０、１２、１４、２０、２５または３０日間の血清半減期を示し得る。
【００３８】
ある特定の態様では、本開示は、ＢＭＰ１０の完全な翻訳可能な成熟部分をコードしない、ＢＭＰ１０プロペプチドをコードする核酸を提供する。単離されたおよび／または組換えポリヌクレオチドは、例えば上記のような、ＢＭＰ１０プロペプチドのコード配列を含み得る。単離された核酸には、ＢＭＰ１０プロペプチドをコードする配列、および成熟部分内に位置するまたはプロペプチドと成熟部分との間に位置する終止コドンを別にして成熟部分の一部または全てをコードする配列が含まれ得る。一部の実施形態では、本開示は、配列番号８３の核酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一な核酸配列を提供する。一部の実施形態では、本開示は、配列番号８６の核酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一な核酸配列を提供する。本明細書に開示される核酸は、発現のためのプロモーターに作動可能に連結し得、本開示は、かかるポリヌクレオチドを含むベクター、ならびにかかるポリヌクレオチドで形質転換された細胞を提供する。好ましくは、細胞は、ＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞である。
【００３９】
ある特定の態様では、本開示は、ＢＭＰ１０プロペプチドを作製するための方法を提供する。かかる方法は、本明細書に開示されるプロペプチドコード核酸のいずれかを、適切な細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において発現させるステップを含み得る。かかる方法は、プロペプチドの発現に適した条件下で細胞を培養するステップを含み得、この細胞は、ＢＭＰ１０プロペプチド発現構築物を含む。この方法は、プロペプチド発現されたＢＭＰ１０プロペプチドを回収するステップをさらに含み得る。ＢＭＰ１０プロペプチドは、細胞培養物からタンパク質を取得するための周知の技術のいずれかを使用して、粗製画分、部分的に精製された画分、または高度に精製された画分として回収され得る。
【００４０】
ある特定の態様では、本開示は、心不全または心不全の１つもしくは複数の合併症を予防する、処置する、またはその重症度を低減させるための医薬を作製するため、ならびに本明細書に記載される他の心関連の使用のためのＢＭＰ１０プロペプチドの使用を提供する。ある特定の態様では、本開示は、心不全または心不全の１つもしくは複数の合併症を予防する、処置する、またはその重症度を低減させる使用のため、ならびに本明細書に記載される他の心関連の使用のためのＢＭＰ１０プロペプチドを提供する。
【００４１】
ある特定の態様では、本開示は、心不全または心不全の１つもしくは複数の合併症を処置するために使用され得る薬剤を同定するための方法を提供する。方法は、ａ）成熟ＢＭＰ１０ポリペプチドに、ＢＭＰ１０プロペプチドと競合的に結合する試験薬剤を同定するステップ；およびｂ）心臓障害に対するその薬剤の効果を評価するステップを含み得る。試験薬剤は、例えば、バリアントＢＭＰ１０プロペプチド、抗体または小分子であり得る。
【００４２】
ある特定の態様では、本開示は、ＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む医薬調製物（組成物）を提供する。ＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドを含む医薬調製物は、１種または複数種のさらなる活性薬剤、例えば、本明細書に記載される障害または状態［例えば、心不全または心不全の１つもしくは複数の合併症］を処置または予防するために使用される化合物もまた含み得る。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドを含む医薬調製物は、発熱物質を含まない（例えば、治療的使用のための製品の品質を管理する規制によって要求される程度まで、発熱物質を含まない）。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１は、複数のＡｃｔＲＩＩＢ結晶構造およびＡｃｔＲＩＩＡ結晶構造の複合解析に基づき、本明細書においてリガンドと直接接触すると推定された残基を四角で表示した、ヒトＡｃｔＲＩＩＢおよびヒトＡｃｔＲＩＩＡの細胞外ドメインのアライメントを示す。
【００４４】
【図２】図２は、種々の脊椎動物ＡｃｔＲＩＩＢタンパク質（配列番号１００〜１０５）およびヒトＡｃｔＲＩＩＡ（配列番号１２２）の複数の配列アライメントならびにこのアライメントから得られたコンセンサスＡｃｔＲＩＩ配列（配列番号１０６）を示す。
【００４５】
【図３】図３は、種々の脊椎動物ＡｃｔＲＩＩＡタンパク質およびヒトＡｃｔＲＩＩＡ（配列番号１０７〜１１４）の複数の配列アライメントを示す。
【００４６】
【図４】図４は、Ｃｌｕｓｔａｌ  ２．１を使用するヒトＩｇＧアイソタイプからのＦｃドメインの複数の配列アライメントを示す。ヒンジ領域を点線の下線により表示する。二重下線は、非対称性鎖対形成を促進するためにＩｇＧ１  Ｆｃ中に操作された位置ならびに他のアイソタイプＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４に関する対応する位置の例を示す。
【００４７】
【図５】図５は、ＡｃｔＲＩＩＢ（２５−１３１）−ｈＦｃについての完全な、プロセシングされていないアミノ酸配列（配列番号１２３）を示す。ＴＰＡリーダー（残基１〜２２）および二重トランケーション型ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（残基２４〜１３１、配列番号１のネイティブな配列に基づく番号付けを使用）にそれぞれ下線を付ける。配列番号１に関して２５位の、成熟融合タンパク質のＮ末端アミノ酸であると配列決定により明らかになったグルタミン酸を強調表示する。
【００４８】
【図６−１】図６は、ＡｃｔＲＩＩＢ（２５−１３１）−ｈＦｃをコードするヌクレオチド配列を示す（コード鎖、配列番号１２４を上に示し、相補鎖、配列番号１２５を下に３’から５’に示す）。ＴＰＡリーダー（ヌクレオチド１〜６６）およびＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（ヌクレオチド７３〜３９６）をコードする配列に下線を付ける。ＡｃｔＲＩＩＢ（２５−１３１）についての対応するアミノ酸配列も示す。
【図６−２】図６は、ＡｃｔＲＩＩＢ（２５−１３１）−ｈＦｃをコードするヌクレオチド配列を示す（コード鎖、配列番号１２４を上に示し、相補鎖、配列番号１２５を下に３’から５’に示す）。ＴＰＡリーダー（ヌクレオチド１〜６６）およびＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（ヌクレオチド７３〜３９６）をコードする配列に下線を付ける。ＡｃｔＲＩＩＢ（２５−１３１）についての対応するアミノ酸配列も示す。
【００４９】
【図７−１】図７は、ＡｃｔＲＩＩＢ（２５−１３１）−ｈＦｃをコードする代替的なヌクレオチド配列を示す（コード鎖、配列番号１２６を上に示し、相補鎖、配列番号１２７を下に３’から５’に示す）。この配列は、より大きいレベルのタンパク質発現を最初の形質転換体に付与し、細胞株の発生をより迅速なプロセスにする。ＴＰＡリーダー（ヌクレオチド１〜６６）およびＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（ヌクレオチド７３〜３９６）をコードする配列に下線を付け、ＥＣＤの野生型ヌクレオチド配列（図６参照）中の置換を強調表示する。ＡｃｔＲＩＩＢ（２５−１３１）についての対応するアミノ酸配列も示す。
【図７−２】図７は、ＡｃｔＲＩＩＢ（２５−１３１）−ｈＦｃをコードする代替的なヌクレオチド配列を示す（コード鎖、配列番号１２６を上に示し、相補鎖、配列番号１２７を下に３’から５’に示す）。この配列は、より大きいレベルのタンパク質発現を最初の形質転換体に付与し、細胞株の発生をより迅速なプロセスにする。ＴＰＡリーダー（ヌクレオチド１〜６６）およびＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（ヌクレオチド７３〜３９６）をコードする配列に下線を付け、ＥＣＤの野生型ヌクレオチド配列（図６参照）中の置換を強調表示する。ＡｃｔＲＩＩＢ（２５−１３１）についての対応するアミノ酸配列も示す。
【００５０】
【図８】図８は、ＴＰＡリーダー（二重下線）、トランケーション型ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（配列番号１における残基２５〜１３１；一重下線）、およびｈＦｃドメインを含むトランケーション型ＧＤＦトラップＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５−１３１）−ｈＦｃ（配列番号１３１）についての完全アミノ酸配列を示す。ネイティブな配列中の７９位で置換されたアスパラギン酸に二重下線を付け、強調表示し、配列決定により成熟融合タンパク質中のＮ末端残基であることが明らかになったグルタミン酸も同様である。
【００５１】
【図９】図９は、リーダーを有さないトランケーション型ＧＤＦトラップＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５−１３１）ｈＦｃについてのアミノ酸配列（配列番号１３２）を示す。トランケーション型ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（配列番号１における残基２５〜１３１）に下線を付ける。ネイティブな配列中の７９位で置換されたアスパラギン酸に二重下線を付け、強調表示し、配列決定により成熟融合タンパク質中のＮ末端残基であることが明らかになったグルタミン酸も同様である。
【００５２】
【図１０】図１０は、リーダー、ｈＦｃドメイン、およびリンカーを有さないトランケーション型ＧＤＦトラップＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５−１３１）についてのアミノ酸配列（配列番号１３３）を示す。ネイティブな配列中の７９位で置換されたアスパラギン酸に下線を付け、強調表示し、配列決定により成熟融合タンパク質中のＮ末端残基であることが明らかになったグルタミン酸も同様である。
【００５３】
【図１１−１】図１１は、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５−１３１）−ｈＦｃをコードするヌクレオチド配列を示す。配列番号１３４は、センス鎖に対応し、配列番号１３５は、アンチセンス鎖に対応する。ＴＰＡリーダー（ヌクレオチド１〜６６）に二重下線を付け、トランケーション型ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（ヌクレオチド７６〜３９６）に一重下線を付ける。ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（配列番号１における残基２５〜１３１）についてのアミノ酸配列も示す。
【図１１−２】図１１は、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５−１３１）−ｈＦｃをコードするヌクレオチド配列を示す。配列番号１３４は、センス鎖に対応し、配列番号１３５は、アンチセンス鎖に対応する。ＴＰＡリーダー（ヌクレオチド１〜６６）に二重下線を付け、トランケーション型ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（ヌクレオチド７６〜３９６）に一重下線を付ける。ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（配列番号１における残基２５〜１３１）についてのアミノ酸配列も示す。
【００５４】
【図１２−１】図１２は、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５−１３１）−ｈＦｃをコードする代替的なヌクレオチド配列を示す。配列番号１３６は、センス鎖に対応し、配列番号１３７は、アンチセンス鎖に対応する。ＴＰＡリーダー（ヌクレオチド１〜６６）に二重下線を付け、トランケーション型ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（ヌクレオチド７６〜３９６）に下線を付け、細胞外ドメインの野生型ヌクレオチド配列中の置換に二重下線を付け、強調表示する。ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（配列番号１における残基２５〜１３１）についてのアミノ酸配列も示す。
【図１２−２】図１２は、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５−１３１）−ｈＦｃをコードする代替的なヌクレオチド配列を示す。配列番号１３６は、センス鎖に対応し、配列番号１３７は、アンチセンス鎖に対応する。ＴＰＡリーダー（ヌクレオチド１〜６６）に二重下線を付け、トランケーション型ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（ヌクレオチド７６〜３９６）に下線を付け、細胞外ドメインの野生型ヌクレオチド配列中の置換に二重下線を付け、強調表示する。ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（配列番号１における残基２５〜１３１）についてのアミノ酸配列も示す。
【００５５】
【図１３】図１３は、ｈＥＮＧ−Ｆｃ融合構築物のドメイン構造を示す。完全長ＥＮＧ細胞外ドメイン（一番上の構造の残基２６〜５８６）は、オーファンドメインならびにＮ末端およびＣ末端透明帯（ＺＰ）ドメインからなる。選択されたトランケーション型バリアントの構造を下に示し、ＳＰＲベースのアッセイにおいてそれらがＢＭＰ−９およびＢＭＰ−１０と高親和性結合を示すかどうか（＋／−）を示す。
【００５６】
【図１４】図１４は、マウスＴＡＣモデルにおける心肥大に及ぼすＢＭＰ１０ｐｒｏ（２２−３１２）−Ｆｃの効果を示す。偽処置動物、ＴＡＣ−ＰＢＳ（ビヒクル対照）処置動物、およびＴＡＣ−ＢＭＰ１０ｐｒｏ（２２−３１２）−Ｆｃ処置動物からの体重あたりの心重量（ＨＷ／ＢＷ；ｍｇ／ｇ）を比較した。ＴＡＣ−ＰＢＳ対照動物は、偽手術動物と比較して有意な心肥大を示した。ＢＭＰ１０ｐｒｏ（２２−３１２）−Ｆｃ処置は、心不全のこのＴＡＣモデルにおいて心肥大を阻害した。（＊）は、一元配置ＡＮＯＶＡに続くチューキーを意味する。
【００５７】
【図１５】図１５は、マウスＴＡＣモデルにおける拡張終期での心室中隔厚に及ぼすＢＭＰ１０ｐｒｏ（２２−３１２）−Ｆｃの効果を示す。偽処置動物、ＴＡＣ−ＰＢＳ（ビヒクル対照）処置動物、およびＴＡＣ−ＢＭＰ１０ｐｒｏ（２２−３１２）−Ｆｃ処置動物における拡張終期での心室中隔厚を測定するためにＭモード心エコーを取得した。ＴＡＣ−ＰＢＳマウスは、偽手術動物と比較して増加した心室中隔拡張終期（ＬＶＳｄ  ｍｍ）を示した。ＢＭＰ１０ｐｒｏ（２２−３１２）−Ｆｃ処置は、心不全のこのＴＡＣモデルにおいて心室中隔拡張終期を有意に減少させた。（＊）および（＃）は、一元配置ＡＮＯＶＡに続くチューキーを意味する。
【００５８】
【図１６】図１６は、マウスＴＡＣモデルにおける拡張終期での左心室後壁厚に及ぼすＢＭＰ１０ｐｒｏ（２２−３１２）−Ｆｃの効果を示す。Ｍモード心エコーを取得して、偽処置動物、ＴＡＣ−ＰＢＳ（ビヒクル対照）処置動物、およびＴＡＣ−ＢＭＰ１０ｐｒｏ（２２−３１２）−Ｆｃ処置動物における拡張終期での左心室後壁厚を測定した。ＴＡＣ−ＰＢＳマウスは、偽手術動物と比較して増加した左心室後壁拡張終期（ＬＶＰＴｄ  ｍｍ）を示した。ＢＭＰ１０ｐｒｏ（２２−３１２）−Ｆｃ処置は、心不全のこのＴＡＣモデルにおいて左心室後壁拡張終期を有意に減少させた。（＊）および（＃）は、一元配置ＡＮＯＶＡに続くチューキーを意味する。
【００５９】
【図１７】図１７は、マウスＴＡＣモデルにおける短縮率に及ぼすＢＭＰ１０ｐｒｏ（２２−３１２）−Ｆｃの効果を示す。Ｍモード心エコーを取得して、偽処置動物、ＴＡＣ−ＰＢＳ（ビヒクル対照）処置動物、およびＴＡＣ−ＢＭＰ１０ｐｒｏ（２２−３１２）−Ｆｃ処置動物における左心室拡張終期径および左心室収縮終期径を測定した。次式を使用して、拡張終期径（ＥＤＤ）および収縮終期径（ＥＳＤ）から短縮率（ＦＳ）を計算した：ＦＳ＝１００％×［（ＥＤＤ−ＥＳＤ）／ＥＤＤ］。ＴＡＣ−ＰＢＳマウスは、偽手術動物と比較して約２０％減少した短縮率を示した。ＢＭＰ１０ｐｒｏ（２２−３１２）−Ｆｃ処置は、心不全のこのＴＡＣモデルにおいて短縮率拡張を有意に増加させた。（＊）は、一元配置ＡＮＯＶＡに続くチューキーを意味する。
【００６０】
【図１８】図１８は、マウスＴＡＣモデルにおける駆出率に及ぼすＢＭＰ１０ｐｒｏ（２２−３１２）−Ｆｃの効果を示す。Ｍモード心エコーを取得して、偽処置動物、ＴＡＣ−ＰＢＳ（ビヒクル対照）処置動物、およびＴＡＣ−ＢＭＰ１０ｐｒｏ（２２−３１２）−Ｆｃ処置動物における拡張終期容積（ＥＤＤ）および収縮終期容積（ＥＳＤ）を測定した。次式を使用して駆出率（ＥＦ）を計算した：ＥＦ％＝（ＥＤＶ−ＥＳＶ）／ＥＤＶ。ＴＡＣ−ＰＢＳマウスは、偽手術動物と比較して減少した駆出率を示した。ＢＭＰ１０ｐｒｏ（２２−３１２）−Ｆｃ処置は、心不全のこのＴＡＣモデルにおいて駆出率を有意に増加させた。（＊）は、一元配置ＡＮＯＶＡに続くチューキーを意味する。
【００６１】
【図１９】図１９は、マウスＴＡＣモデルにおける等容性弛緩時間に及ぼすＢＭＰ１０ｐｒｏ（２２−３１２）−Ｆｃの効果を示す。Ｍモード心エコーを取得して、偽処置動物、ＴＡＣ−ＰＢＳ（ビヒクル対照）処置動物、およびＴＡＣ−ＢＭＰ１０ｐｒｏ（２２−３１２）−Ｆｃ処置動物における等容性弛緩時間（ＩＶＲＴ  ｍｓ）を測定した。ＴＡＣ＋ＰＢＳマウスは、偽手術動物と比較して増加したＩＶＲＴを示した。ＢＭＰ１０ｐｒｏ（２２−３１２）−Ｆｃ処置は、心不全のこのＴＡＣモデルにおいてＩＶＲＴを有意に減少させた。（＊）および（＃）は、一元配置ＡＮＯＶＡに続くチューキーを意味する。
【００６２】
【図２０】図２０は、マウスＴＡＣモデルにおける心線維症に及ぼすＢＭＰ１０ｐｒｏ（２２−３１２）−Ｆｃの効果を示す。偽処置動物、ＴＡＣ−ＰＢＳ（ビヒクル対照）処置動物、およびＴＡＣ−ＢＭＰ１０ｐｒｏ（２２−３１２）−Ｆｃ処置動物から心臓を取り出し、１０％ホルマリン中で固定し、次いでマッソン三色染色のために薄片を作製して、線維症を評価した。ＴＡＣ−ＰＢＳマウスは、偽手術動物と比較して増加した心線維症を示した。ＢＭＰ１０ｐｒｏ（２２−３１２）−Ｆｃ処置は、心不全のこのＴＡＣモデルにおいて心線維症を有意に減少させた。（＊）および（＃）は、一元配置ＡＮＯＶＡに続くチューキーを意味する。
【００６３】
【図２１】図２１は、配列番号３３と名付けられるヒトＢＭＰ１０前駆タンパク質をコードする核酸配列を示す。
【００６４】
【図２２】図２２は、配列番号３５と名付けられるヒトＢＭＰ１０プロペプチドドメインタンパク質をコードする核酸配列を示す。
【００６５】
【図２３】図２３は、マウスＴＡＣモデルにおける心肥大に及ぼすｈＥＮＧ（２７−５８１）−ｍＦｃの効果を示す。偽処置動物、ＴＡＣ−ＰＢＳ（ビヒクル対照）処置動物、およびＴＡＣ−ｈＥＮＧ（２７−５８１）−ｍＦｃ処置動物からの体重あたりの心重量（ＨＷ／ＢＷ；ｍｇ／ｇ）を比較した。ＴＡＣ−ＰＢＳ対照動物は、偽手術動物と比較して有意な心肥大を示した。ｈＥＮＧ（２７−５８１）−ｍＦｃ処置は、心不全のこのＴＡＣモデルにおいて心肥大を阻害した。（＊）は、一元配置ＡＮＯＶＡに続くチューキーを意味する。
【００６６】
【図２４】図２４は、マウスＴＡＣモデルにおける短縮率に及ぼすｈＥＮＧ（２７−５８１）−ｍＦｃの効果を示す。Ｍモード心エコーを取得して、偽処置動物、ＴＡＣ−ＰＢＳ（ビヒクル対照）処置動物、およびＴＡＣ−ｈＥＮＧ（２６−５８６１）−ｍＦｃ処置動物における左心室拡張終期径および左心室収縮終期径を測定した。次式を使用して拡張終期径（ＥＤＤ）および収縮終期径（ＥＳＤ）から短縮率（ＦＳ）を計算した：ＦＳ＝１００％×［（ＥＤＤ−ＥＳＤ）／ＥＤＤ］。ＴＡＣ−ＰＢＳマウスは、偽手術動物と比較して約２０％減少した短縮率を示した。ｈＥＮＧ（２６７−５８１）−ｍＦｃ処置は、心不全のこのＴＡＣモデルにおいて短縮率拡張を有意に増加させた。（＊）は、一元配置ＡＮＯＶＡに続くチューキーを意味する。
【００６７】
【図２５】図２５は、マウスＴＡＣモデルにおける駆出率に及ぼすｈＥＮＧ（２７−５８１）−ｍＦｃの効果を示す。Ｍモード心エコーを取得して、偽処置動物、ＴＡＣ−ＰＢＳ（ビヒクル対照）、およびＴＡＣ−ｈＥＮＧ（２７−５８１）−ｍＦｃ処置動物における拡張終期容積（ＥＤＤ）および収縮終期容積（ＥＳＤ）を測定した。次式を使用して駆出率（ＥＦ）を計算した：ＥＦ％＝（ＥＤＶ−ＥＳＶ）／ＥＤＶ。ＴＡＣ−ＰＢＳマウスは、偽手術動物と比較して減少した駆出率を示した。ｈＥＮＧ（２７−５８１）−ｍＦｃ処置は、心不全のこのＴＡＣモデルにおける駆出率を有意に増加させた。（＊）は、一元配置ＡＮＯＶＡに続くチューキーを意味する。
【００６８】
【図２６】図２６は、マウスＴＡＣモデルにおける心線維症に及ぼすｈＥＮＧ（２７−５８１）−ｍＦｃの効果を示す。偽処置動物、ＴＡＣ−ＰＢＳ（ビヒクル対照）処置動物、およびＴＡＣ−ｈＥＮＧ（２７−５８１）−ｍＦｃ処置動物から心臓を取り出し、１０％ホルマリン中で固定し、次いでマッソン三色染色のために薄片を作製して、線維症を評価した。ＴＡＣ−ＰＢＳマウスは、偽手術動物と比較して増加した心線維症を示した。ｈＥＮＧ（２７−５８１）−ｍＦｃ処置は、心不全のこのＴＡＣモデルにおいて心線維症を有意に減少させた。（＊）は、一元配置ＡＮＯＶＡに続くチューキーを意味する。
【００６９】
【図２７】図２７は、マウスＭＩモデルにおける心肥大に及ぼすＢＭＰ１０ｐｒｏ（２２−３１２）−ＦｃまたはｈＥＮＧ（２６−５８６１）−ｍＦｃの効果を示す。体重あたりの心重量（ＨＷ／ＢＷ；ｍｇ／ｇ）をＭＩ−ＰＢＳ（ビヒクル対照）処置動物、ＭＩ−ＢＭＰ１０ｐｒｏ（２２−３１２）−Ｆｃ処置動物およびＴＡＣ−ｈＥＮＧ（２７−５８１）−ｍＦｃ処置動物と比較した。ＭＩ−ＰＢＳ対照動物は、偽手術動物と比較して有意な心肥大を示した。ｈＥＮＧ（２７−５８１）−ｍＦｃまたはＢＭＰ１０ｐｒｏ（２２−３１２）−Ｆｃ処置は、心不全のこのＭＩモデルにおいて心肥大を阻害した。（＊）は、一元配置ＡＮＯＶＡに続くチューキーを意味する。
【００７０】
【図２８】図２８は、マウスＭＩモデルにおける収縮終期での左心室拡張に及ぼすＢＭＰ１０ｐｒｏ（２２−３１２）−ＦｃまたはｈＥＮＧ（２７−５８１）−ｍＦｃの効果を示す。Ｍモード心エコーを取得して、偽処置動物、ＭＩ−ＰＢＳ（ビヒクル対照）処置動物、ＭＩ−ｈＥＮＧ（２７−５８１）−ｍＦｃ処置動物およびＭＩ−ＢＭＰ１０ｐｒｏ（２２−３１２）−Ｆｃ処置動物における収縮終期での左心室拡張を測定した。ＭＩ−ＰＢＳマウスは、偽手術動物と比較して増加した左心室収縮終期径（ＬＶＥＳＤ  ｍｍ）を示した。ＢＭＰ１０ｐｒｏ（２２−３１２）−ＦｃまたはｈＥＮＧ（２７−５８１）−ｍＦｃ処置は、心不全のこのＭＩモデルにおいて左心室収縮終期径を有意に減少させた。（＊）は、一元配置ＡＮＯＶＡに続くチューキーを意味する。
【００７１】
【図２９】図２９は、マウスＭＩモデルにおける拡張終期での左心室拡張に及ぼすＢＭＰ１０ｐｒｏ（２２−３１２）−ＦｃまたはｈＥＮＧ（２７−５８１）−ｍＦｃの効果を示す。Ｍモード心エコーを取得して、偽処置動物、ＭＩ−ＰＢＳ（ビヒクル対照）処置動物、ＭＩ−ｈＥＮＧ（２７−５８１）−ｍＦｃ処置動物およびＭＩ−ＢＭ１０Ｐｐｒｏ（２２−３１２）−Ｆｃ処置動物における拡張終期での左心室拡張を測定した。ＭＩ−ＰＢＳマウスは、偽手術動物と比較して増加した左心室拡張終期径（ＬＶＥＤＤ  ｍｍ）を示した。ＢＭＰ１０ｐｒｏ（２２−３１２）−ＦｃまたはｈＥＮＧ（２７−５８１）−ｍＦｃ処置は、心不全のこのＭＩモデルにおいて左心室拡張終期径を有意に減少させた。（＊）は、一元配置ＡＮＯＶＡに続くチューキーを意味する。
【００７２】
【図３０】図３０は、マウスＭＩモデルにおける心線維症に及ぼすＢＭＰ１０ｐｒｏ（２２−３１２）−ＦｃまたはｈＥＮＧ（２７−５８１）−ｍＦｃの効果を示す。ＭＩ−ＰＢＳ（ビヒクル対照）処置動物、ＭＩ−ＢＭＰ１０ｐｒｏ（２２−３１２）−Ｆｃ処置動物およびＭＩ−ｈＥＮＧ（２７−５８１）−ｍＦｃ処置動物から心臓を取り出し、１０％ホルマリン中で固定し、次いでマッソン三色染色のために薄片を作製して、線維症を評価した。ＭＩ−ＰＢＳマウスは、偽手術動物と比較して増加した心線維症を示した。ＢＭＰ１０ｐｒｏ（２２−３１２）−ＦｃまたはｈＥＮＧ（２７−５８１）−ｍＦｃ処置は、心不全のこのＭＩモデルにおいて心線維症を有意に減少させた。（＊）は、一元配置ＡＮＯＶＡに続くチューキーを意味する。
【００７３】
【図３１】図３１は、マウスＭＩモデルにおける短縮率に及ぼすＢＭＰ１０ｐｒｏ（２２−３１２）−ＦｃまたはｈＥＮＧ（２７−５８１）−ｍＦｃの効果を示す。Ｍモード心エコーを取得して、偽処置動物、ＭＩ−ＰＢＳ（ビヒクル対照）処置動物、ＭＩ−ＢＭＰ１０ｐｒｏ（２２−３１２）−Ｆｃまたは／およびＭＩ−ｈＥＮＧ（２７−５８１）−ｍＦｃ処置動物における左心室拡張終期径および左心室収縮終期径を測定した。次式を使用して拡張終期径（ＥＤＤ）および収縮終期径（ＥＳＤ）から短縮率（ＦＳ）を計算した：ＦＳ＝１００％×［（ＥＤＤ−ＥＳＤ）／ＥＤＤ］。ＴＡＣ−ＰＢＳマウスは、偽手術動物と比較して約２０％減少した短縮率を示した。ｈＥＮＧ（２７−５８１）−ｍＦｃ処置は、心不全のこのＭＩモデルにおいて短縮率拡張を有意に増加させた。（＊）は、一元配置ＡＮＯＶＡに続くチューキーを意味する。
【００７４】
【図３２】図３２は、マウスＭＩモデルにおける駆出率に及ぼすＢＭＰ１０ｐｒｏ（２２−３１２）−ＦｃまたはｈＥＮＧ（２７−５８１）−ｍＦｃの効果を示す。Ｍモード心エコーを取得して、偽処置動物、ＭＩ−ＰＢＳ（ビヒクル対照）処置動物、ＭＩ−ＢＭＰ１０ｐｒｏ（２２−３１２）−Ｆｃ処置動物およびＭＩ−ｈＥＮＧ（２７−５８１）−ｍＦｃ処置動物における拡張終期容積（ＥＤＤ）および収縮終期容積（ＥＳＤ）を測定した。次式を使用して駆出率（ＥＦ）を計算した：ＥＦ％＝（ＥＤＶ−ＥＳＶ）／ＥＤＶ。ＭＩ−ＰＢＳマウスは、偽手術動物と比較して減少した駆出率を示した。ｈＥＮＧ（２７−５８１）−ｍＦｃ処置は、心不全のこのＭＩモデルにおいて駆出率を有意に増加させた。（＊）は、一元配置ＡＮＯＶＡに続くチューキーを意味する。
【発明を実施するための形態】
【００７５】
発明の詳細な説明
１．概観
ＴＧＦβスーパーファミリーは、ＴＧＦβ、アクチビン、ノダル、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、増殖および分化因子（ＧＤＦ）、ならびに抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）を含む、３０種を超える分泌型因子から構成される［Weissら（２０１３年）Developmental Biology、２巻（１号）：４７〜６３頁］。脊椎動物および無脊椎動物の両方において見出されるスーパーファミリーのメンバーは、多様な組織において遍在的に発現され、動物の寿命を通じた発生の最も初期の段階の間に機能する。実際、ＴＧＦβスーパーファミリータンパク質は、幹細胞自己再生、原腸陥入、分化、臓器形態形成および成体組織恒常性の重要なメディエーターである。この遍在的な活性と一致して、異常なＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達は、広範なヒト病理と関連する。
【００７６】
ＴＧＦβスーパーファミリーのリガンドは、一方のモノマーの中央の３−１／２ターンのらせんが、他方のモノマーのベータ鎖によって形成される凹面表面に対してパッキングされた、同じダイマー構造を共有する。ＴＧＦβファミリーメンバーの大部分は、分子間ジスルフィド結合によってさらに安定化される。このジスルフィド結合は、２つの他のジスルフィド結合によって形成される環をくぐり抜け、「システインノット」モチーフと呼ばれるものを生成する［Linら（２００６年）Reproduction １３２巻：１７９〜１９０頁；およびHinckら（２０１２年）FEBS Letters ５８６巻：１８６０〜１８７０頁］。
【００７７】
ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達は、リガンド刺激の際に下流のＳＭＡＤタンパク質（例えば、ＳＭＡＤタンパク質１、２、３、５および８）をリン酸化および活性化するＩ型およびＩＩ型セリン／スレオニンキナーゼ受容体のヘテロマー複合体によって媒介される［Massague（２０００年）Nat. Rev. Mol. Cell Biol. １巻：１６９〜１７８頁］。これらのＩ型およびＩＩ型受容体は、システインリッチ領域を有するリガンド結合性細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および予測されたセリン／スレオニンキナーゼ特異性を有する細胞質ドメインから構成される膜貫通タンパク質である。一般に、Ｉ型受容体は細胞内シグナル伝達を媒介し、ＩＩ型受容体は、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドに結合するために必要である。Ｉ型およびＩＩ型受容体は、リガンド結合後に安定な複合体を形成し、ＩＩ型受容体によるＩ型受容体のリン酸化を生じる。
【００７８】
ＴＧＦβファミリーは、それらが結合するＩ型受容体およびそれらが活性化するＳｍａｄタンパク質に基づいて、２つの系統学的分岐へと分割され得る。一方は、より最近進化した分岐であり、例えば、Ｓｍａｄ２および３を活性化するＩ型受容体を介してシグナル伝達するＴＧＦβ、アクチビン、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ３およびノダルを含む［Hinck（２０１２年）FEBS Letters ５８６巻：１８６０〜１８７０頁］。他方の分岐は、このスーパーファミリーのより遠縁のタンパク質を含み、例えば、Ｓｍａｄ１、５および８を介してシグナル伝達するＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ１、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６およびＧＤＦ７を含む。
【００７９】
アクチビンは、ＴＧＦβスーパーファミリーのメンバーであり、卵胞刺激ホルモンの分泌の調節因子として当初発見されたが、引き続いて、種々の生殖性および非生殖性の役割が特徴付けられている。２つの密接に関連したβサブユニットのホモ／ヘテロダイマー（それぞれ、βＡβＡ、βＢβＢおよびβＡβＢ）である３つの主要なアクチビン形態（Ａ、ＢおよびＡＢ）が存在する。ヒトゲノムもまた、アクチビンＣおよびアクチビンＥをコードし、これらは、肝臓で主に発現され、βＣまたはβＥを含むヘテロダイマー形態もまた公知である。ＴＧＦ−ベータスーパーファミリー中で、アクチビンは、卵巣および胎盤細胞におけるホルモン産生を刺激でき、神経細胞の生存を支持でき、細胞型に依存して細胞周期の進行に正または負の影響を与えることができ、少なくとも両生類の胚において中胚葉分化を誘導できる、独自の多機能性因子である［DePaoloら（１９９１年）Proc Soc Ep Biol Med. １９８巻：５００〜５１２頁；Dysonら（１９９７年）Curr Biol. ７巻：８１〜８４頁；およびWoodruff（１９９８年）Biochem Pharmacol. ５５巻：９５３〜９６３頁］。いくつかの組織では、アクチビンシグナル伝達は、その関連のヘテロダイマーであるインヒビンによってアンタゴナイズされる。例えば、下垂体からの卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）分泌の調節において、アクチビンは、ＦＳＨの合成および分泌を促進するが、インヒビンは、ＦＳＨの合成および分泌を低減させる。アクチビン生理活性を調節し得る、および／またはアクチビンに結合し得る他のタンパク質には、フォリスタチン（ＦＳ）、フォリスタチン関連タンパク質（ＦＬＲＧまたはＦＳＴＬ３としても公知のＦＳＲＰ）およびα２−マクログロブリンが含まれる。
【００８０】
ＢＭＰおよびＧＤＦは一緒になって、ＴＧＦβスーパーファミリーの特徴的フォールディングを共有するシステイン−ノットサイトカインのファミリーを形成する［Riderら（２０１０年）Biochem J.、４２９巻（１号）：１〜１２頁］。このファミリーは、例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ２ａ、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３ｂ（ＧＤＦ１０としても公知）、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９（ＧＤＦ２としても公知）、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ１１（ＧＤＦ１１としても公知）、ＢＭＰ１２（ＧＤＦ７としても公知）、ＢＭＰ１３（ＧＤＦ６としても公知）、ＢＭＰ１４（ＧＤＦ５としても公知）、ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１、ＧＤＦ３（ＶＧＲ２としても公知）、ＧＤＦ８（ミオスタチンとしても公知）、ＧＤＦ９、ＧＤＦ１５およびデカペンタプレジックを含む。ＢＭＰという名称を与えた骨形成を誘導する能力に加えて、ＢＭＰ／ＧＤＦは、広範な組織の発生において形態形成活性を示す。ＢＭＰ／ＧＤＦホモダイマーおよびヘテロダイマーは、Ｉ型およびＩＩ型受容体ダイマーの組合せと相互作用して、複数の可能なシグナル伝達複合体を産生し、２つの競合するセットのＳＭＡＤ転写因子のうち一方の活性化をもたらす。ＢＭＰ／ＧＤＦは、高度に特異的な局在化した機能を有する。これらは、ＢＭＰ／ＧＤＦ発現の発生的制限、および高い親和性でサイトカインに結合するいくつかの特異的ＢＭＰアンタゴニストタンパク質の分泌を介することを含めたいくつかの方法で調節される。不思議なことに、いくつかのこれらのアンタゴニストは、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンドと似ている。
【００８１】
本明細書で示されるように、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ３ｂおよびＢＭＰ５を含む種々のＢＭＰタンパク質に結合する可溶性ＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドは、心肥大、心リモデリングおよび心線維症の重症度を低減させること、ならびに横行大動脈縮窄術（ＴＡＣ）心不全モデルにおいて心機能を改善することにおいて有効である。さらに、ＢＭＰ１０ｐｒｏ処置は、この研究において心不全患者の生存時間を増加させた。ＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドは、心筋梗塞（ＭＩ）心不全モデルにおいても同様の有利な効果を有した。さらに、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０に結合する可溶性エンドグリンポリペプチドは、ＴＡＣおよびＭＩの両方の心不全モデルにおいて種々の有利な効果を有することが示された。いずれの特定の機構にも束縛されることは望まないが、ＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドおよびエンドグリンポリペプチドの効果は、特にＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ３ｂおよびＢＭＰ５のうち１種または複数種のＢＭＰシグナル伝達アンタゴニスト効果によって主に引き起こされると予測される。機構にかかわらず、本明細書に提示されるデータから、ＢＭＰシグナル伝達アンタゴニストが、心肥大の重症度を低減させ、心リモデリングを減少させ、心線維症を減少させ、心不全を処置するにあたり他の正の効果を有することが明らかである。血圧、肥大、心リモデリングおよび線維症はダイナミックであり、変化は、血圧、肥大、心リモデリングおよび線維症を増加させる因子と血圧、肥大、心リモデリングおよび線維症を減少させる因子とのバランスに依存することに留意すべきである。血圧、肥大、心リモデリングおよび線維症は、血圧、肥大、心リモデリングおよび線維症を低減させる因子を増加させること；血圧、肥大、心リモデリングおよび線維症を促進する因子を減少させること；またはそれら両方によって、減少され得る。血圧、肥大、心リモデリングおよび線維症を減少させる（低減させる）という用語は、血圧、肥大、心リモデリングおよび線維症における観察可能な物理的変化を指し、変化が生じる機構に関して中立であることが意図される。
【００８２】
本明細書に記載される研究において使用した心臓についての動物モデルは、ヒトにおける有効性を予測するとみなされ、したがって、本開示は、ヒトにおいて心不全を処置するため、特に、心不全の１つまたは複数の合併症を処置する、予防する、またはその重症度もしくは持続時間を低減させるためにＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチド、エンドグリンポリペプチドおよび他のＢＭＰアンタゴニストを使用するための方法を提供する。本明細書に開示される場合、用語ＢＭＰアンタゴニストは、例えば、１種または複数種のＢＭＰリガンド［例えば、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ３ｂおよびＢＭＰ５］を阻害するアンタゴニスト；１種または複数種のＢＭＰ相互作用性Ｉ型受容体、ＩＩ型受容体または共受容体（例えば、ＡＬＫ１、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＢＭＰＲＩＩおよびエンドグリン）を阻害するアンタゴニスト；および１種または複数種の下流シグナル伝達成分（例えば、Ｓｍａｄタンパク質、例えば、Ｓｍａｄ２および３）を阻害するアンタゴニストを含む、ＢＭＰシグナル伝達をアンタゴナイズするために使用され得る種々の薬剤を指す。本開示の方法および使用に従って使用されるＢＭＰアンタゴニストには、種々の形態、例えば、リガンドトラップ（例えば、可溶性ＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ＡＬＫ１ポリペプチドおよびエンドグリンポリペプチド）、抗体アンタゴニスト（例えば、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ３ｂ、ＢＭＰ５、ＡＬＫ１、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＢＭＰＲＩＩおよびエンドグリンのうち１種または複数種を阻害する抗体）、小分子アンタゴニスト［例えば、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ３ｂ、ＢＭＰ５、ＡＬＫ１、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＢＭＰＲＩＩ、エンドグリンおよび１種もしくは複数のＳｍａｄタンパク質（例えば、Ｓｍａｄ２および３）のうち１種または複数種を阻害する小分子］、およびヌクレオチドアンタゴニスト［例えば、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ３ｂ、ＢＭＰ５、ＡＬＫ１、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＢＭＰＲＩＩ、エンドグリンおよび１種もしくは複数のＳｍａｄタンパク質（例えば、Ｓｍａｄ２および３）のうち１つまたは複数を阻害するヌクレオチド配列］が含まれる。
【００８３】
本明細書で使用される用語は一般に、本開示の文脈の範囲内および各用語が使用される具体的な文脈において、当技術分野におけるその通常の意味を有する。ある特定の用語は、本開示の組成物および方法、ならびにそれらをどのように作製し使用するかを記述する際のさらなるガイダンスを実施者に提供するために、本明細書の以下および他の箇所で論じられる。用語の任意の使用の範囲または意味は、それが使用される具体的な文脈から明らかである。
【００８４】
「相同な」は、その全ての文法的形態およびつづりのバリエーションで、同じ種の生物中のスーパーファミリーからのタンパク質、ならびに異なる種の生物からの相同なタンパク質を含む、「共通の進化的起源」を有する２つのタンパク質間の関係性を指す。かかるタンパク質（およびそれらをコードする核酸）は、パーセント同一性に関してであれ、特定の残基またはモチーフおよび保存された位置の存在によってであれ、それらの配列類似性によって反映される配列相同性を有する。しかし、一般的な用法および本出願では、用語「相同な」は、「高度に」などの副詞を用いて修飾される場合、配列類似性を指し得、共通の進化的起源に関連してもしなくてもよい。
【００８５】
用語「配列類似性」は、その全ての文法的形態で、共通の進化的起源を共有してもしなくてもよい核酸またはアミノ酸配列間での同一性または対応の程度を指す。
【００８６】
「パーセント（％）配列同一性」は、参照ポリペプチド（またはヌクレオチド）配列に関して、配列をアラインし、必要に応じてギャップを導入して、いずれの保存的置換も配列同一性の一部とみなさずに、最大のパーセント配列同一性を達成した後の、参照ポリペプチド（ヌクレオチド）配列中のアミノ酸残基（または核酸）に対して同一な、候補配列中のアミノ酸残基（または核酸）の百分率として定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定することを目的としたアラインメントは、例えば、公に入手可能なコンピューターソフトウェア、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを使用して、当技術分野の技術範囲内の種々の方法で達成され得る。当業者は、比較されている配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列をアラインするための適切なパラメーターを決定することができる。しかし、本明細書の目的のために、％アミノ酸（核酸）配列同一性値は、配列比較コンピュータープログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータープログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．の著作であり、ソースコードは、米国著作権局、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．、２０５５９においてユーザー文書と共に提出されており、米国著作権登録第ＴＸＵ５１００８７号の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆ．から公に入手可能であり、またはソースコードからコンパイルされ得る。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ（登録商標）  Ｖ４．０Ｄを含むＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステムでの使用のためにコンパイルすべきである。全ての配列比較パラメーターは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され、変動しない。
【００８７】
「アゴナイズする」は、その全ての文法的形態で、タンパク質および／もしくは遺伝子を活性化するプロセス（例えば、そのタンパク質の遺伝子発現を活性化もしくは増幅することによる、または不活性タンパク質を活性状態に入るように誘導することによる）またはタンパク質の活性および／もしくは遺伝子の活性を増加させるプロセスを指す。
【００８８】
「アンタゴナイズする」は、その全ての文法的形態で、タンパク質および／もしくは遺伝子を阻害するプロセス（例えば、そのタンパク質の遺伝子発現を阻害もしくは減少させることによる、または活性タンパク質を不活性状態に入るように誘導することによる）またはタンパク質の活性および／もしくは遺伝子の活性を減少させるプロセスを指す。
【００８９】
用語「約」および「およそ」は、本明細書および特許請求の範囲を通じて数値に関連して使用される場合、当業者が精通し許容できる正確さの区間を示す。一般に、かかる正確さの区間は、±１０％である。あるいは、特に生物学的系では、用語「約」および「およそ」は、所与の値の、あるオーダーの大きさ以内、好ましくは≦５倍、より好ましくは≦２倍以内である値を意味し得る。
【００９０】
本明細書に開示される数値範囲は、その範囲を規定する数字を含む。
【００９１】
用語「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、その用語が使用される文脈が明らかに他を示さない限り、複数形の指示対象を含む。用語「１つの（ａ）」（または「１つの（ａｎ）」）、ならびに用語「１つまたは複数の」および「少なくとも１つの」は、本明細書で相互交換可能に使用され得る。さらに、「および／または」は、本明細書で使用する場合、残りのものを伴うまたは伴わない、２つまたはそれよりも多くの特定された特色または成分の各々の具体的な開示と解釈すべきである。したがって、用語「および／または」は、本明細書で「Ａおよび／またはＢ」などの語句において使用する場合、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）および「Ｂ」（単独）を含むことが意図される。同様に、用語「および／または」は、「Ａ、Ｂおよび／またはＣ」などの語句において使用する場合、以下の態様の各々を包含することが意図される：Ａ、ＢおよびＣ；Ａ、ＢまたはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；ならびにＣ（単独）。
【００９２】
２．ＢＭＰ１０プロペプチド、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ１ポリペプチド、ＢＭＰＲＩＩポリペプチドおよびエンドグリンポリペプチド
ある特定の態様では、本開示は、ＢＭＰ１０プロペプチド（ＢＭＰ１０ｐｒｏ）ポリペプチドおよびその使用（例えば、心不全または心不全の合併症を処置する）に関する。本明細書で使用する場合、用語「ＢＭＰ１０ポリペプチド」は、任意の種に由来する１０型の骨形成タンパク質のファミリーを指す。用語「ＢＭＰ１０ポリペプチド」は、天然に存在するＢＭＰ１０ポリペプチドならびに有用な活性を保持するその任意のバリアント（変異体、断片、融合物およびペプチド模倣形態を含む）のいずれかを含む。天然に存在するＢＭＰ１０タンパク質は、一般に、そのＮ末端のシグナル配列、その後の二塩基性アミノ酸切断部位およびプロペプチド、その後の別の二塩基性アミノ酸切断部位および成熟ドメインを典型的には含む、より大きい前駆体としてコードされる。ヒトＢＭＰ１０前駆体配列（ＮＣＢＩ  ＮＰ＿０５５２９７）は、以下に示される：
【化１】
2020506944.tif 000002
シグナルペプチド（アミノ酸１〜２１）には下線が付される；成熟タンパク質（アミノ酸３１７〜４２４）には二重下線が付される；潜在的Ｎ結合型グリコシル化部位は四角で囲まれる。図２１は、配列番号３２のＢＭＰ１０前駆体タンパク質をコードする核酸配列を示す（この核酸は、配列番号３３と称される）。
【００９３】
用語「ＢＭＰ１０プロペプチド」または「ＢＭＰ１０ｐｒｏ」は、ＢＭＰ１０ファミリーメンバーの任意の天然に存在するプロペプチドならびに有用な活性を保持するその任意のバリアント（変異体、断片およびペプチド模倣形態を含む）を含むポリペプチドを指すために使用される。ＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドの有用な活性の例には、ＢＭＰ１０タンパク質の成熟部分への結合、および成熟ＢＭＰ１０の活性のアンタゴニストとしての作用が含まれる。本明細書で示されるように、ＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドは、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ３ｂおよびＢＭＰ５のうち１種または複数種にも結合し得る。したがって、一部の実施形態では、ＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドは、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ３ｂおよびＢＭＰ５のうち１種または複数種のアンタゴニストとしてさらに使用され得る。ＢＭＰ１０プロペプチドの機能的バリアントは、例えば、成熟ＢＭＰ１０タンパク質への結合、ならびに／またはＩＩ型受容体、例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＢＭＰＲＩＩ；Ｉ型受容体、例えばＡＬＫ１；および／もしくは共受容体、例えばエンドグリンへのＢＭＰ１０の結合を競合的に阻害する能力によって特徴付けられ得る。
【００９４】
ヒトＢＭＰ１０プロペプチド配列は、以下に示される：
【化２−１】
2020506944.tif 000003
【化２−２】
2020506944.tif 000004
図２２は、配列番号３４に対応するＢＭＰ１０プロペプチドをコードする核酸配列を示す（この核酸は、配列番号３５と称される）。
【００９５】
ＢＭＰ１０プロペプチドは、脊椎動物において保存されている。したがって、当技術分野で周知のおよび本明細書に記載される技術を使用して異なる脊椎動物由来のＢＭＰ１０プロペプチド配列のアラインメントを生成でき、これらのアラインメントを使用して、成熟ＢＭＰ１０結合活性にとって重要なプロペプチドドメイン内の重要なアミノ酸位置を予測できるだけでなく、成熟ＢＭＰ１０結合活性を顕著に変更することなしに置換に対して許容性がある可能性が高いアミノ酸位置を予測できる。したがって、本明細書で開示された方法に従って有用な活性なヒトＢＭＰ１０ｐｒｏバリアントポリペプチドは、別の脊椎動物ＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドの配列由来の対応する位置に１つもしくは複数のアミノ酸を含み得、または、ヒトもしくは他の脊椎動物配列中の残基と類似の残基を含み得る。
【００９６】
本明細書で示されるように、プロペプチド配列のＣ末端アルギニンの欠失（配列番号３４の２９６位のアミノ酸の欠失）を有するＢＭＰ１０ｐｒｏドメインを含むバリアントＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドは、ＢＭＰ１０に対する高い親和性を保持し、ＢＭＰ１０アンタゴニストとして使用され得る。プロペプチド配列のＣ末端に４アミノ酸の欠失（配列番号３４の２９３〜２９６位のアミノ酸の欠失）を有するＢＭＰ１０ｐｒｏドメインを含む別のバリアントＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドを生成した。驚くべきことに、プロペプチド配列のＣ末端から４アミノ酸が欠失されたバリアントＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドは、Ｃ末端アルギニンのみの欠失を有するＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドよりも強力な、ＢＭＰ１０活性のアンタゴニストであった。したがって、配列番号３４に関してアミノ酸２９２、２９３、２９４、２９５および２９６のうちいずれか１つにおいて停止するＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドドメインは全て、活性であると予測されたが、２９２において停止する構築物が最も活性であり得る。これらの形態のいずれかが、臨床設定または実験設定によっては、使用するのに望ましい可能性がある。
【００９７】
ＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドは、Ｎ末端に種々のリーダー配列のいずれかをさらに含み得る。かかる配列は、真核生物の系においてペプチドが発現され、分泌経路に標的化されるのを可能にする。例えば、Ｅｒｎｓｔら、米国特許第５，０８２，７８３号（１９９２年）を参照のこと。あるいは、ネイティブのＢＭＰ１０シグナル配列が、細胞からの突出をもたらすために使用され得る。可能なリーダー配列には、本明細書に開示される、ミツバチメリチン、ＴＰＡおよびネイティブのリーダーが含まれる。ＴＰＡリーダー配列を取り込んでいるＢＭＰ１０ｐｒｏ−Ｆｃ融合タンパク質の例には、配列番号８２および８５が含まれる。シグナルペプチドのプロセシングは、数ある変量のうち、選択されるリーダー配列、使用される細胞型、および培養条件に依存して変動し得、したがって、成熟ＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドの実際のＮ末端開始部位は、Ｎ末端方向に１、２、３、４または５アミノ酸シフトし得る。したがって、ＢＭＰ１０ｐｒｏのＮ末端において、配列番号３４に関してアミノ酸１、２、３、４、５または６のいずれか１つにおいて始まるタンパク質は全て、活性であると予測されることが予測される。
【００９８】
合わせて考えると、ＢＭＰ１０ｐｒｏの活性部分（例えば、成熟ＢＭＰ１０結合部分）の一般式は、配列番号３４のアミノ酸６〜２９２を含む。したがって、ＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドは、例えば、配列番号３４のアミノ酸１〜６のいずれか１つに対応する残基において始まり（例えば、アミノ酸１、２、３、４、５または６のいずれか１つにおいて始まる）、配列番号３４のアミノ酸２９２〜２９６のいずれか１つに対応する位置において終わる（例えば、アミノ酸２９２、２９３、２９４、２９５または２９６のいずれか１つにおいて終わる）ＢＭＰ１０ｐｒｏの部分に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み得、本質的にそれからなり得、またはそれからなり得る。例えば、一部の実施形態では、本開示のＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドは、配列番号３４のアミノ酸１〜２９６に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み得、それからなり得、または本質的にそれからなり得る。一部の実施形態では、本開示のＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドは、配列番号３４のアミノ酸１〜２９５に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み得、それからなり得、または本質的にそれからなり得る。一部の実施形態では、本開示のＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドは、配列番号３４のアミノ酸１〜２９４に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み得、それからなり得、または本質的にそれからなり得る。一部の実施形態では、本開示のＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドは、配列番号３４のアミノ酸１〜２９３に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み得、それからなり得、または本質的にそれからなり得る。一部の実施形態では、本開示のＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドは、配列番号３４のアミノ酸１〜２９２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み得、それからなり得、または本質的にそれからなり得る。一部の実施形態では、本開示のＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドは、配列番号３４のアミノ酸２〜２９５に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み得、それからなり得、または本質的にそれからなり得る。一部の実施形態では、本開示のＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドは、配列番号３４のアミノ酸２〜２９２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み得、それからなり得、または本質的にそれからなり得る。一部の実施形態では、本開示のＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドは、配列番号３４のアミノ酸３〜２９５に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み得、それからなり得、または本質的にそれからなり得る。一部の実施形態では、本開示のＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドは、配列番号３４のアミノ酸３〜２９４に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み得、それからなり得、または本質的にそれからなり得る。一部の実施形態では、本開示のＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドは、配列番号３４のアミノ酸３〜２９２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み得、それからなり得、または本質的にそれからなり得る。一部の実施形態では、本開示のＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドは、配列番号３４のアミノ酸４〜２９２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み得、それからなり得、または本質的にそれからなり得る。一部の実施形態では、本開示のＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドは、配列番号３４のアミノ酸５〜２９２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み得、それからなり得、または本質的にそれからなり得る。一部の実施形態では、本開示のＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドは、配列番号３４のアミノ酸６〜２９２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み得、それからなり得、または本質的にそれからなり得る。好ましくは、ＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドは、可溶性である。上記ＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドは、成熟ＢＭＰ１０結合およびアンタゴナイズ活性を保持すると予測される。一部の実施形態では、かかるＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドは、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ３ｂおよびＢＭＰ５のうち１種または複数種にさらに結合し得る。
【００９９】
ある特定の態様では、本開示は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドおよびその使用（例えば、心不全または心不全の合併症を処置する）に関する。本明細書で使用する場合、用語「ＡｃｔＲＩＩ」は、ＩＩ型アクチビン受容体のファミリーを指す。このファミリーは、アクチビン受容体ＩＩＡ型（ＡｃｔＲＩＩＡ）およびアクチビン受容体ＩＩＢ型（ＡｃｔＲＩＩＢ）を含む。
【０１００】
本明細書で使用する場合、用語「ＡｃｔＲＩＩＢ」は、任意の種由来のアクチビン受容体ＩＩＢ型（ＡｃｔＲＩＩＢ）タンパク質のファミリー、および変異誘発または他の改変によってかかるＡｃｔＲＩＩＢタンパク質から誘導されたバリアントを指す。ＡｃｔＲＩＩＢに対する本明細書の言及は、現在同定されている形態のいずれか１つに対する言及であると理解される。ＡｃｔＲＩＩＢファミリーのメンバーは、一般に、システインリッチ領域を含むリガンド結合性細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および予測されたセリン／スレオニンキナーゼ活性を有する細胞質ドメインから構成される膜貫通タンパク質である。
【０１０１】
用語「ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド」は、ＡｃｔＲＩＩＢファミリーメンバーの任意の天然に存在するポリペプチドならびに有用な活性を保持するその任意のバリアント（変異体、断片、融合物およびペプチド模倣形態を含む）を含むポリペプチドを含む。かかるバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの例は、本開示を通じて、ならびにその全体が参照によって本明細書に組み込まれる国際特許出願公開番号ＷＯ２００６／０１２６２７、ＷＯ２００８／０９７５４１およびＷＯ２０１０／１５１４２６に提供される。本明細書に記載される全てのＡｃｔＲＩＩＢ関連ポリペプチドについてのアミノ酸の番号付けは、他が具体的に示されない限り、以下に提供されるヒトＡｃｔＲＩＩＢ前駆体タンパク質配列（配列番号１）の番号付けに基づく。
【０１０２】
ヒトＡｃｔＲＩＩＢ前駆体タンパク質配列は、以下の通りである：
【化３】
2020506944.tif 000005
【０１０３】
シグナルペプチドは、一重下線で示される；細胞外ドメインは、太字で示される；潜在的な内因性Ｎ結合型グリコシル化部位は、二重下線で示される。
【０１０４】
プロセシングされた細胞外ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド配列は、以下の通りである：
【化４】
2020506944.tif 000006
【０１０５】
一部の実施形態では、このタンパク質は、Ｎ末端に「ＳＧＲ…」配列を伴って産生され得る。細胞外ドメインのＣ末端「テイル」は、一重下線によって示される。「テイル」が欠失した配列（Δ１５配列）は、以下の通りである：
【化５】
2020506944.tif 000007
【０１０６】
配列番号１の６４位にアラニン（Ａ６４）を有するＡｃｔＲＩＩＢの形態もまた、文献中で報告されている。例えば、Hildenら（１９９４年）Blood、８３巻（８号）：２１６３〜２１７０頁を参照のこと。Ａ６４置換を有するＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメインを含むＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質は、アクチビンおよびＧＤＦ１１に対する比較的低い親和性を有することが確認されている。対照的に、６４位にアルギニン（Ｒ６４）を有する同じＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質は、低ナノモル濃度から高ピコモル濃度の範囲の、アクチビンおよびＧＤＦ１１に対する親和性を有する。したがって、Ｒ６４を有する配列は、本開示では、ヒトＡｃｔＲＩＩＢについての「野生型」参照配列として使用される。
【０１０７】
６４位にアラニンを有するＡｃｔＲＩＩＢの形態は、以下の通りである：
【化６】
2020506944.tif 000008
【０１０８】
シグナルペプチドは、一重下線によって示され、細胞外ドメインは、太字によって示される。
【０１０９】
代替的Ａ６４形態のプロセシングされた細胞外ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド配列は、以下の通りである：
【化７】
2020506944.tif 000009
【０１１０】
一部の実施形態では、このタンパク質は、Ｎ末端に「ＳＧＲ…」配列を伴って産生され得る。細胞外ドメインのＣ末端「テイル」は、一重下線によって示される。「テイル」が欠失した配列（Δ１５配列）は、以下の通りである：
【化８】
2020506944.tif 000010
【０１１１】
ヒトＡｃｔＲＩＩＢ前駆体タンパク質をコードする核酸配列は、以下に示され（配列番号７）、これは、ＡｃｔＲＩＩＢ前駆体のアミノ酸１〜５１３をコードするＧｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿００１１０６．３のヌクレオチド２５〜１５６０を示す。示される配列は、６４位にアルギニンを提供し、代わりにアラニンを提供するように改変され得る。シグナル配列には下線が付される。
【化９−１】
2020506944.tif 000011
【化９−２】
2020506944.tif 000012
【０１１２】
プロセシングされた細胞外ヒトＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードする核酸配列は、以下の通りである（配列番号８）。示される配列は、６４位にアルギニンを提供し、代わりにアラニンを提供するように改変され得る。
【化１０】
2020506944.tif 000013
【０１１３】
ヒトＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインおよびヒトＡｃｔＲＩＩＡ細胞外ドメインのアミノ酸配列のアラインメントは、図１に示される。このアラインメントは、ＡｃｔＲＩＩリガンドと直接接触すると考えられている、両方の受容体内のアミノ酸残基を示す。例えば、複合ＡｃｔＲＩＩ構造は、ＡｃｔＲＩＩＢ−リガンド結合ポケットが、残基Ｙ３１、Ｎ３３、Ｎ３５、Ｌ３８〜Ｔ４１、Ｅ４７、Ｅ５０、Ｑ５３〜Ｋ５５、Ｌ５７、Ｈ５８、Ｙ６０、Ｓ６２、Ｋ７４、Ｗ７８〜Ｎ８３、Ｙ８５、Ｒ８７、Ａ９２、およびＥ９４〜Ｆ１０１によって一部規定されることを示した。これらの位置では、保存的変異が許容されると予測される。
【０１１４】
さらに、ＡｃｔＲＩＩＢは、脊椎動物において十分に保存されており、細胞外ドメインの大きいストレッチは完全に保存されている。例えば、図２は、種々のＡｃｔＲＩＩＢオルソログと比較した、ヒトＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインの多配列アラインメントを示す。ＡｃｔＲＩＩＢに結合するリガンドの多くもまた、高度に保存されている。したがって、これらのアラインメントから、正常なＡｃｔＲＩＩＢ−リガンド結合活性にとって重要なリガンド結合ドメイン内の重要なアミノ酸位置を予測できるだけでなく、正常なＡｃｔＲＩＩＢ−リガンド結合活性を顕著に変更することなしに置換に対して許容性がある可能性が高いアミノ酸位置を予測できる。したがって、本明細書で開示された方法に従って有用な活性なヒトＡｃｔＲＩＩＢバリアントポリペプチドは、別の脊椎動物ＡｃｔＲＩＩＢの配列由来の対応する位置に１つもしくは複数のアミノ酸を含み得、または、ヒトもしくは他の脊椎動物配列中の残基と類似の残基を含み得る。限定を意味しないが、以下の例は、活性ＡｃｔＲＩＩＢバリアントを定義するためのこのアプローチを示す。ヒト細胞外ドメイン（配列番号１０３）中のＬ４６は、Ｘｅｎｏｐｕｓ  ＡｃｔＲＩＩＢ（配列番号１０５）ではバリンであり、したがって、この位置は変更され得、必要に応じて、別の疎水性残基、例えば、Ｖ、ＩもしくはＦ、または非極性残基、例えばＡに変更され得る。ヒト細胞外ドメイン中のＥ５２は、ＸｅｎｏｐｕｓではＫであり、このことは、この部位が、極性残基、例えば、Ｅ、Ｄ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｓ、Ｔ、Ｐ、Ｇ、ＹおよびおそらくはＡを含む広範な種々の変化に対して許容性があり得ることを示している。ヒト細胞外ドメイン中のＴ９３は、ＸｅｎｏｐｕｓではＫであり、このことは、好ましい極性残基、例えば、Ｓ、Ｋ、Ｒ、Ｅ、Ｄ、Ｈ、Ｇ、Ｐ、ＧおよびＹによる広い構造的バリエーションが、この位置において許容されることを示している。ヒト細胞外ドメイン中のＦ１０８は、ＸｅｎｏｐｕｓではＹであり、したがって、Ｙまたは他の疎水性基、例えば、Ｉ、ＶもしくはＬが許容されるはずである。ヒト細胞外ドメイン中のＥ１１１は、ＸｅｎｏｐｕｓではＫであり、このことは、Ｄ、Ｒ、ＫおよびＨ、ならびにＱおよびＮを含む荷電残基が、この位置において許容されることを示している。ヒト細胞外ドメイン中のＲ１１２は、ＸｅｎｏｐｕｓではＫであり、このことは、ＲおよびＨを含む塩基性残基が、この位置において許容されることを示している。ヒト細胞外ドメイン中の１１９位は、比較的あまり保存されておらず、げっ歯類ではＰとして現れ、ＸｅｎｏｐｕｓではＶとして現れ、したがって、本質的に任意のアミノ酸がこの位置において許容されるはずである。
【０１１５】
さらに、ＡｃｔＲＩＩタンパク質は、構造的および機能的特徴に関して、特にリガンド結合に関して、当技術分野で特徴付けられている［Attisanoら（１９９２年）Cell ６８巻（１号）：９７〜１０８頁；Greenwaldら（１９９９年）Nature Structural Biology ６巻（１号）：１８〜２２頁；Allendorphら（２００６年）PNAS １０３巻（２０号）：７６４３〜７６４８頁；Thompsonら（２００３年）The EMBO Journal ２２巻（７号）：１５５５〜１５６６頁；ならびに米国特許第７，７０９，６０５号、同第７，６１２，０４１号および同第７，８４２，６６３号］。本明細書の教示に加えて、これらの参考文献は、１つまたは複数の正常な活性（例えば、リガンド結合活性）を保持するＡｃｔＲＩＩＢバリアントを生成するための方法についてのガイダンスを十分に提供している。
【０１１６】
例えば、スリーフィンガー毒素フォールディング（three-finger toxinfold）として公知の特徴的構造モチーフは、Ｉ型およびＩＩ型受容体によるリガンド結合にとって重要であり、各モノマー受容体の細胞外ドメイン内の変動する位置に位置する保存されたシステイン残基によって形成される［Greenwaldら（１９９９年）Nat Struct Biol ６巻：１８〜２２頁；およびHinck（２０１２年）FEBS Lett ５８６巻：１８６０〜１８７０頁］。したがって、これらの保存されたシステインのうち最も外側のシステインが境界となる、ヒトＡｃｔＲＩＩＢのコアリガンド結合ドメインは、配列番号１（ＡｃｔＲＩＩＢ前駆体）の２９〜１０９位に対応する。これらの、システインが境界となるコア配列に隣接する構造的にあまり秩序だっていないアミノ酸は、リガンド結合を必ずしも変更せずに、Ｎ末端において１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７もしくは２８残基、および／またはＣ末端において１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４もしくは２５残基、トランケートされ得る。Ｎ末端および／またはＣ末端トランケーションのための例示的なＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインには、配列番号２、３、５および６が含まれる。
【０１１７】
Ａｔｔｉｓａｎｏらは、ＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメインのＣ末端におけるプロリンノットの欠失が、アクチビンに対する受容体の親和性を低減させたことを示した。本配列番号１のアミノ酸２０〜１１９を含むＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質「ＡｃｔＲＩＩＢ（２０−１１９）−Ｆｃ」は、プロリンノット領域および完全な膜近傍ドメインを含むＡｃｔＲＩＩＢ（２０−１３４）−Ｆｃと比較して、ＧＤＦ１１およびアクチビンへの結合を低減させた（例えば、米国特許第７，８４２，６６３号を参照のこと）。しかし、ＡｃｔＲＩＩＢ（２０−１２９）−Ｆｃタンパク質は、プロリンノット領域が破壊されていても、野生型と比較して類似ではあるが幾分低減された活性を保持する。
【０１１８】
したがって、（配列番号１に関して）アミノ酸１３４、１３３、１３２、１３１、１３０および１２９において停止するＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインは全て、活性であると予測されるが、１３４または１３３において停止する構築物が最も活性であり得る。同様に、（配列番号１に関して）残基１２９〜１３４のいずれかにおける変異は、リガンド結合親和性を大幅には変更しないと予測される。このことの支持として、（配列番号１に関して）Ｐ１２９およびＰ１３０の変異は、リガンド結合を実質的に減少させないことが、当技術分野で公知である。したがって、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、アミノ酸１０９（最後のシステイン）ほどの早期に終わり得るが、１０９および１１９または１０９と１１９との間（例えば、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８または１１９）において終わる形態は、低減されたリガンド結合を有すると予測される。（本配列番号１に関して）アミノ酸１１９は、あまり保存されておらず、したがって、容易に変更またはトランケートされる。ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、および（配列番号１に関して）１２８またはそれ以降において終わるＡｃｔＲＩＩＢベースのＧＤＦトラップは、リガンド結合活性を保持するはずである。ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、および配列番号１に関して１１９および１２７または１１９と１２７との間（例えば、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６または１２７）において終わるＡｃｔＲＩＩＢベースのＧＤＦトラップは、中間の結合能を有する。これらの形態のいずれかが、臨床設定または実験設定によっては、使用するのに望ましい可能性がある。
【０１１９】
ＡｃｔＲＩＩＢのＮ末端において、（配列番号１に関して）アミノ酸２９またはその前において始まるタンパク質は、リガンド結合活性を保持すると予測される。アミノ酸２９は、最初のシステインを示す。（配列番号１に関して）２４位におけるアラニンからアスパラギンへの変異は、リガンド結合に実質的に影響を与えることなしに、Ｎ結合型グリコシル化配列を導入する［米国特許第７，８４２，６６３号］。このことは、アミノ酸２０〜２９に対応する、シグナル切断ペプチドとシステイン架橋された領域との間の領域中の変異が十分に許容されることを確認する。特に、（配列番号１に関して）２０、２１、２２、２３および２４位において始まるＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、一般的なリガンド結合活性を保持するはずであり、（配列番号１に関して）２５、２６、２７、２８および２９位において始まるＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドもまた、リガンド結合活性を保持すると予測される。驚くべきことに、２２、２３、２４または２５において始まるＡｃｔＲＩＩＢ構築物が最も高い活性を有することが、例えば、米国特許第７，８４２，６６３号において実証されている。
【０１２０】
合わせて考えると、ＡｃｔＲＩＩＢの活性部分（例えば、リガンド結合部分）の一般式は、配列番号１のアミノ酸２９〜１０９を含む。したがって、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、例えば、配列番号１のアミノ酸２０〜２９のいずれか１つに対応する残基において始まり（例えば、アミノ酸２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または２９のいずれか１つにおいて始まる）、配列番号１のアミノ酸１０９〜１３４のいずれか１つに対応する位置において終わる（例えば、アミノ酸１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３または１３４のいずれか１つにおいて終わる）ＡｃｔＲＩＩＢの部分に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み得、本質的にそれからなり得、またはそれからなり得る。他の例には、配列番号１の２０〜２９（例えば、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または２９位のいずれか１つ）または２１〜２９（例えば、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または２９位のいずれか１つ）の位置において始まり、配列番号１の１１９〜１３４（例えば、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３または１３４位のいずれか１つ）、１１９〜１３３（例えば、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２または１３３位のいずれか１つ）、１２９〜１３４（例えば、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３または１３４位のいずれか１つ）または１２９〜１３３（例えば、１２９、１３０、１３１、１３２または１３３位のいずれか１つ）の位置において終わるポリペプチドが含まれる。他の例には、配列番号１の２０〜２４（例えば、２０、２１、２２、２３または２４位のいずれか１つ）、２１〜２４（例えば、２１、２２、２３または２４位のいずれか１つ）または２２〜２５（例えば、２２、２２、２３または２５位のいずれか１つ）の位置において始まり、配列番号１の１０９〜１３４（例えば、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３または１３４位のいずれか１つ）、１１９〜１３４（例えば、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３または１３４位のいずれか１つ）または１２９〜１３４（例えば、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３または１３４位のいずれか１つ）の位置において終わる構築物が含まれる。これらの範囲内のバリアント、特に、配列番号１の対応する部分に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるものもまた企図される。
【０１２１】
本明細書に記載されるバリエーションは、種々の方法で組み合わされ得る。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢバリアントは、リガンド結合ポケット中に１、２、５、６、７、８、９、１０または１５個以下の保存的アミノ酸変化を含み、必要に応じて、リガンド結合ポケット中の４０、５３、５５、７４、７９および／または８２位に、ゼロ、１つまたは複数の非保存的変更を含む。可変性が特に十分に許容され得る結合ポケットの外側の部位は、細胞外ドメインのアミノ末端およびカルボキシ末端（上述の通り）、ならびに（配列番号１に関して）４２〜４６および６５〜７３位を含む。６５位におけるアスパラギンからアラニンへの変更（Ｎ６５Ａ）は、Ｒ６４背景でのリガンド結合を減少させないようである［米国特許第７，８４２，６６３号］。この変化は、おそらくは、Ａ６４背景でのＮ６５におけるグリコシル化を排除し、したがって、この領域中では顕著な変化が許容される可能性が高いことを実証している。Ｒ６４Ａ変化はあまり許容されないが、Ｒ６４Ｋは十分に許容され、したがって、別の塩基性残基、例えばＨが、６４位において許容され得る［米国特許第７，８４２，６６３号］。さらに、当技術分野で記載された変異誘発プログラムの結果は、保存するのが有益な場合が多いＡｃｔＲＩＩＢ中のアミノ酸位置が存在することを示している。配列番号１に関して、これらには、８０位（酸性または疎水性アミノ酸）、７８位（疎水性、特に、トリプトファン）、３７位（酸性、特に、アスパラギン酸またはグルタミン酸）、５６位（塩基性アミノ酸）、６０位（疎水性アミノ酸、特に、フェニルアラニンまたはチロシン）が含まれる。したがって、本開示は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド中の保存され得るアミノ酸のフレームワークを提供する。保存するのが望ましい可能性がある他の位置は、全て配列番号１に関して、以下の通りである：５２位（酸性アミノ酸）、５５位（塩基性アミノ酸）、８１位（酸性）、９８（極性または荷電、特に、Ｅ、Ｄ、ＲまたはＫ）。
【０１２２】
ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン中へのさらなるＮ結合型グリコシル化部位（Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ）の付加は、十分に許容されることが以前に実証されている（例えば、米国特許第７，８４２，６６３号を参照のこと）。したがって、Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列は、一般に、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド中の、例えば図１で規定されたリガンド結合ポケットの外側の位置において導入され得る。非内因性Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列の導入に特に適した部位には、（配列番号１に関して）アミノ酸２０〜２９、２０〜２４、２２〜２５、１０９〜１３４、１２０〜１３４または１２９〜１３４が含まれる。Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列はまた、ＡｃｔＲＩＩＢ配列とＦｃドメインまたは他の融合成分との間のリンカー中に、ならびに必要に応じて融合成分自体の中に導入され得る。かかる部位は、既存のＳもしくはＴに関して正確な位置にＮを導入すること、または既存のＮに対応する位置にＳもしくはＴを導入することによって、最小限の労力で導入され得る。したがって、Ｎ結合型グリコシル化部位を創出する望ましい変更は、（配列番号１に関して）Ａ２４Ｎ、Ｒ６４Ｎ、Ｓ６７Ｎ（おそらくはＮ６５Ａ変更と組み合わせて）、Ｅ１０５Ｎ、Ｒ１１２Ｎ、Ｇ１２０Ｎ、Ｅ１２３Ｎ、Ｐ１２９Ｎ、Ａ１３２Ｎ、Ｒ１１２ＳおよびＲ１１２Ｔである。グリコシル化されると予測される任意のＳは、グリコシル化によって得られる保護に起因して、免疫原性部位を創出することなくＴに変更され得る。同様に、グリコシル化されると予測される任意のＴは、Ｓに変更され得る。したがって、（配列番号１に関して）変更Ｓ６７ＴおよびＳ４４Ｔが企図される。同様に、Ａ２４Ｎバリアントでは、Ｓ２６Ｔ変更が使用され得る。したがって、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、上記１つまたは複数のさらなる非内因性Ｎ結合型グリコシル化コンセンサス配列を有するバリアントであり得る。
【０１２３】
ある特定の実施形態では、本開示は、その断片、機能的バリアントおよび改変形態を含むＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ならびにその使用（例えば、心不全または心不全の合併症を処置する）に関する。好ましくは、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、可溶性である（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメイン）。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、１種または複数種のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ）、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１０および／またはＢＭＰ９］の活性（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）をアンタゴナイズする。したがって、一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、１種または複数種のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ）、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１０および／またはＢＭＰ９］に結合する。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸２０〜２９に対応する残基において始まり（例えば、アミノ酸２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または２９のいずれか１つにおいて始まる）、配列番号１のアミノ酸１０９〜１３４に対応する位置において終わる（例えば、アミノ酸１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３または１３４のいずれか１つにおいて終わる）ＡｃｔＲＩＩＢの部分に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸２９〜１０９に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み、それからなり、または本質的にそれからなる。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸２９〜１０９に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み、それからなり、または本質的にそれからなり、ここで、配列番号１のＬ７９に対応する位置は、酸性アミノ酸（天然に存在する酸性アミノ酸ＤおよびＥ、または人工酸性アミノ酸）である。ある特定の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸２５〜１３１に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み、それからなり、または本質的にそれからなる。ある特定の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸２５〜１３１に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み、それからなり、または本質的にそれからなり、ここで、配列番号１のＬ７９に対応する位置は、酸性アミノ酸である。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、５８、５９、６０、６３、６４、６５、６６、１２３、１３１、１３２および１３３のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み、それからなり、または本質的にそれからなる。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、５８、５９、６０、６３、６４、６５、６６、１２３、１３１、１３２および１３３のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み、それからなり、または本質的にそれからなり、ここで、配列番号１のＬ７９に対応する位置は、酸性アミノ酸である。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含み、それからなり、または本質的にそれからなり、ここで、配列番号１のＬ７９に対応する位置は、酸性アミノ酸ではない（即ち、天然に存在する酸性アミノ酸ＤでもＥでもなく、人工酸性アミノ酸残基でもない）。
【０１２４】
ある特定の実施形態では、本開示は、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドに関する。本明細書で使用する場合、用語「ＡｃｔＲＩＩＡ」は、任意の種由来のアクチビン受容体ＩＩＡ型（ＡｃｔＲＩＩＡ）タンパク質のファミリー、および変異誘発または他の改変によってかかるＡｃｔＲＩＩＡタンパク質から誘導されたバリアントを指す。ＡｃｔＲＩＩＡに対する本明細書の言及は、現在同定されている形態のいずれか１つに対する言及であると理解される。ＡｃｔＲＩＩＡファミリーのメンバーは、一般に、システインリッチ領域を含むリガンド結合性細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および予測されたセリン／スレオニンキナーゼ活性を有する細胞質ドメインから構成される膜貫通タンパク質である。
【０１２５】
用語「ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド」は、ＡｃｔＲＩＩＡファミリーメンバーの任意の天然に存在するポリペプチドならびに有用な活性を保持するその任意のバリアント（変異体、断片、融合物およびペプチド模倣形態を含む）を含むポリペプチドを含む。かかるバリアントＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドの例は、本開示を通じて、ならびにその全体が参照によって本明細書に組み込まれる国際特許出願公開番号ＷＯ２００６／０１２６２７およびＷＯ２００７／０６２１８８に提供される。本明細書に記載される全てのＡｃｔＲＩＩＡ関連ポリペプチドについてのアミノ酸の番号付けは、他が具体的に示されない限り、以下に提供されるヒトＡｃｔＲＩＩＡ前駆体タンパク質配列（配列番号９）の番号付けに基づく。
【０１２６】
ヒトＡｃｔＲＩＩＡ前駆体タンパク質配列は、以下の通りである：
【化１１】
2020506944.tif 000014
【０１２７】
シグナルペプチドは、一重下線によって示される；細胞外ドメインは、太字で示される；潜在的な内因性Ｎ結合型グリコシル化部位は、二重下線によって示される。
【０１２８】
プロセシングされた細胞外ヒトＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド配列は、以下の通りである：
【化１２】
2020506944.tif 000015
【０１２９】
細胞外ドメインのＣ末端「テイル」は、一重下線によって示される。「テイル」が欠失した配列（Δ１５配列）は、以下の通りである：
【化１３】
2020506944.tif 000016
【０１３０】
ヒトＡｃｔＲＩＩＡ前駆体タンパク質をコードする核酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿００１６１６．４のヌクレオチド１５９〜１７００として、以下に示される（配列番号１２）。シグナル配列には下線が付される。
【化１４−１】
2020506944.tif 000017
【化１４−２】
2020506944.tif 000018
【０１３１】
プロセシングされたヒトＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドをコードする核酸配列は、以下の通りである：
【化１５】
2020506944.tif 000019
【０１３２】
ＡｃｔＲＩＩＡは、脊椎動物において十分に保存されており、細胞外ドメインの大きいストレッチは完全に保存されている。例えば、図３は、種々のＡｃｔＲＩＩＡオルソログと比較した、ヒトＡｃｔＲＩＩＡ細胞外ドメインの多配列アラインメントを示す。ＡｃｔＲＩＩＡに結合するリガンドの多くもまた、高度に保存されている。したがって、これらのアラインメントから、正常なＡｃｔＲＩＩＡ−リガンド結合活性にとって重要なリガンド結合ドメイン内の重要なアミノ酸位置を予測できるだけでなく、正常なＡｃｔＲＩＩＡ−リガンド結合活性を顕著に変更することなしに置換に対して許容性がある可能性が高いアミノ酸位置を予測できる。したがって、本明細書で開示された方法に従って有用な活性なヒトＡｃｔＲＩＩＡバリアントポリペプチドは、別の脊椎動物ＡｃｔＲＩＩＡの配列由来の対応する位置に１つもしくは複数のアミノ酸を含み得、または、ヒトもしくは他の脊椎動物配列中の残基と類似の残基を含み得る。
【０１３３】
限定を意味しないが、以下の例は、活性ＡｃｔＲＩＩＡバリアントを定義するためのこのアプローチを示す。図３に示されるように、ヒト細胞外ドメイン中のＦ１３は、Ｏｖｉｓ  ａｒｉｅｓ（配列番号１０８）、Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ（配列番号１１１）、Ｂｏｓ  Ｔａｕｒｕｓ（配列番号１１２）、Ｔｙｔｏ  ａｌｂａ（配列番号１１３）およびＭｙｏｔｉｓ  ｄａｖｉｄｉｉ（配列番号１１４）のＡｃｔＲＩＩＡではＹであり、このことは、Ｆ、ＷおよびＹを含む芳香族残基が、この位置において許容されることを示している。ヒト細胞外ドメイン中のＱ２４は、Ｂｏｓ  ＴａｕｒｕｓのＡｃｔＲＩＩＡではＲであり、このことは、Ｄ、Ｒ、Ｋ、ＨおよびＥを含む荷電残基が、この位置において許容されることを示している。ヒト細胞外ドメイン中のＳ９５は、Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓおよびＴｙｔｏ  ａｌｂａのＡｃｔＲＩＩＡではＦであり、このことは、この部位が、極性残基、例えば、Ｅ、Ｄ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｓ、Ｔ、Ｐ、Ｇ、Ｙ、およびおそらくは疎水性残基、例えば、Ｌ、ＩまたはＦを含む広範な種々の変化に対して許容性があり得ることを示している。ヒト細胞外ドメイン中のＥ５２は、Ｏｖｉｓ  ａｒｉｅｓのＡｃｔＲＩＩＡではＤであり、このことは、ＤおよびＥを含む酸性残基が、この位置において許容されることを示している。ヒト細胞外ドメイン中のＰ２９は、比較的あまり保存されておらず、Ｏｖｉｓ  ａｒｉｅｓのＡｃｔＲＩＩＡではＳとして現れ、Ｍｙｏｔｉｓ  ｄａｖｉｄｉｉのＡｃｔＲＩＩＡではＬとして現れ、したがって、本質的に任意のアミノ酸がこの位置において許容されるはずである。
【０１３４】
さらに、上で論じたように、ＡｃｔＲＩＩタンパク質は、構造的／機能的特徴に関して、特にリガンド結合に関して、当技術分野で特徴付けられている［Attisanoら（１９９２年）Cell ６８巻（１号）：９７〜１０８頁；Greenwaldら（１９９９年）Nature Structural Biology ６巻（１号）：１８〜２２頁；Allendorphら（２００６年）PNAS １０３巻（２０号）：７６４３〜７６４８頁；Thompsonら（２００３年）The EMBO Journal ２２巻（７号）：１５５５〜１５６６頁；ならびに米国特許第７，７０９，６０５号、同第７，６１２，０４１号および同第７，８４２，６６３号］。本明細書の教示に加えて、これらの参考文献は、１つまたは複数の所望の活性（例えば、リガンド結合活性）を保持するＡｃｔＲＩＩＡバリアントを生成するための方法についてのガイダンスを十分に提供している。
【０１３５】
例えば、スリーフィンガー毒素フォールディングとして公知の特徴的構造モチーフは、Ｉ型およびＩＩ型受容体によるリガンド結合にとって重要であり、各モノマー受容体の細胞外ドメイン内の変動する位置に位置する保存されたシステイン残基によって形成される［Greenwaldら（１９９９年）Nat Struct Biol ６巻：１８〜２２頁；およびHinck（２０１２年）FEBS Lett ５８６巻：１８６０〜１８７０頁］。したがって、これらの保存されたシステインのうち最も外側のシステインが境界となる、ヒトＡｃｔＲＩＩＡのコアリガンド結合ドメインは、配列番号９（ＡｃｔＲＩＩＡ前駆体）の３０〜１１０位に対応する。したがって、これらの、システインが境界となるコア配列に隣接する構造的にあまり秩序だっていないアミノ酸は、リガンド結合を必ずしも変更せずに、Ｎ末端において約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または２９残基、およびＣ末端において約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５残基、トランケートされ得る。例示的なＡｃｔＲＩＩＡ細胞外ドメイントランケーションには、配列番号１０および１１が含まれる。
【０１３６】
したがって、ＡｃｔＲＩＩＡの活性部分（例えば、リガンド結合）の一般式は、配列番号９のアミノ酸３０〜１１０を含む、それから本質的になる、またはそれからなるポリペプチドである。したがって、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、例えば、配列番号９のアミノ酸２１〜３０のいずれか１つに対応する残基において始まり（例えば、アミノ酸２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０のいずれか１つにおいて始まる）、配列番号９のアミノ酸１１０〜１３５のいずれか１つに対応する位置において終わる（例えば、アミノ酸１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３または１３５のいずれか１つにおいて終わる）ＡｃｔＲＩＩＡの部分に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み得、本質的にそれからなり得、またはそれからなり得る。他の例には、配列番号９の２１〜３０（例えば、アミノ酸２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０のいずれか１つにおいて始まる）、２２〜３０（例えば、アミノ酸２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０のいずれか１つにおいて始まる）、２３〜３０（例えば、アミノ酸２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０のいずれか１つにおいて始まる）、２４〜３０（例えば、アミノ酸２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０のいずれか１つにおいて始まる）から選択される位置において始まり、配列番号９の１１１〜１３５（例えば、アミノ酸１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４または１３５のいずれか１つにおいて終わる）、１１２〜１３５（例えば、アミノ酸１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４または１３５のいずれか１つにおいて終わる）、１１３〜１３５（例えば、アミノ酸１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４または１３５のいずれか１つにおいて終わる）、１２０〜１３５（例えば、アミノ酸１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４または１３５のいずれか１つにおいて終わる）、１３０〜１３５（例えば、アミノ酸１３０、１３１、１３２、１３３、１３４または１３５のいずれか１つにおいて終わる）、１１１〜１３４（例えば、アミノ酸１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３または１３４のいずれか１つにおいて終わる）、１１１〜１３３（例えば、アミノ酸１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２または１３３のいずれか１つにおいて終わる）、１１１〜１３２（例えば、アミノ酸１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１または１３２のいずれか１つにおいて終わる）または１１１〜１３１（例えば、アミノ酸１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０または１３１のいずれか１つにおいて終わる）から選択される位置において終わる構築物が含まれる。これらの範囲内のバリアント、特に、配列番号９の対応する部分に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるものもまた企図される。したがって、一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸３０〜１１０に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なポリペプチドを含み得る、それから本質的になり得る、またはそれからなり得る。必要に応じて、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸３０〜１１０に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であり、リガンド結合ポケット中に１、２、５、１０または１５個以下の保存的アミノ酸変化を含むポリペプチドを含む。
【０１３７】
ある特定の実施形態では、本開示は、その断片、機能的バリアントおよび改変形態を含むＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ならびにその使用（例えば、それを必要とする患者において免疫応答を増加させる、およびがんを処置する）に関する。好ましくは、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、可溶性である（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡの細胞外ドメイン）。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、１種または複数種のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ）、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１０および／またはＢＭＰ９］の（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、１種または複数種のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ）、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１０および／またはＢＭＰ９］に結合する。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸２１〜３０に対応する残基において始まり（例えば、アミノ酸２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０のいずれか１つにおいて始まる）、配列番号９のアミノ酸１１０〜１３５のいずれか１つに対応する位置において終わる（例えば、アミノ酸１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３または１３５のいずれか１つにおいて終わる）ＡｃｔＲＩＩＡの部分に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸３０〜１１０に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み、それからなり、または本質的にそれからなる。ある特定の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸２１〜１３５に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み、それからなり、または本質的にそれからなる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号９、１０、１１、５０、５４および５７のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み、それからなり、または本質的にそれからなる。
【０１３８】
ある特定の態様では、本開示は、ＧＤＦトラップポリペプチド（「ＧＤＦトラップ」とも呼ばれる）に関する。一部の実施形態では、バリアントＡｃｔＲＩＩポリペプチドが、対応する野生型ＡｃｔＲＩＩポリペプチドと比較して変更された１つまたは複数のリガンド結合活性を有するように、本開示のＧＤＦトラップは、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド（例えば、「野生型」または未改変のＡｃｔＲＩＩポリペプチド）の細胞外ドメイン（リガンド結合ドメインとも呼ばれる）中に１つまたは複数の変異（例えば、アミノ酸付加、欠失、置換、およびそれらの組合せ）を含むバリアントＡｃｔＲＩＩポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）である。好ましい実施形態では、本開示のＧＤＦトラップポリペプチドは、対応する野生型ＡｃｔＲＩＩポリペプチドと類似の少なくとも１つの活性を保持する。例えば、好ましいＧＤＦトラップは、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８に結合し、その機能を阻害する（例えば、アンタゴナイズする）。一部の実施形態では、本開示のＧＤＦトラップはさらに、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーのリガンドのうち１種または複数種に結合し、それを阻害する。したがって、本開示は、１種または複数種のＡｃｔＲＩＩリガンドに対する変更された結合特異性を有するＧＤＦトラップポリペプチドを提供する。
【０１３９】
説明するために、１種または複数種のＡｃｔＲＩＩ結合リガンド、例えば、アクチビン（アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣおよび／またはアクチビンＥ）、特に、アクチビンＡを超えて、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８に対する変更されたリガンド結合ドメインの選択性を増加させる、１つまたは複数の変異が選択され得る。必要に応じて、変更されたリガンド結合ドメインは、野生型リガンド結合ドメインについての比と比較して、少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍またはさらには１０００倍大きい、アクチビン結合についてのＫｄの、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８結合についてのＫｄに対する比を有する。必要に応じて、変更されたリガンド結合ドメインは、野生型リガンド結合ドメインと比較して、少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍またはさらには１０００倍大きい、アクチビンを阻害する際のＩＣ５０の、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８を阻害する際のＩＣ５０に対する比を有する。必要に応じて、変更されたリガンド結合ドメインは、アクチビンを阻害する際のＩＣ５０と比較して少なくとも２分の１、５分の１、１０分の１、２０分の１、５０分の１、１００分の１またはさらには１０００分の１のＩＣ５０で、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８を阻害する。
【０１４０】
ある特定の好ましい実施形態では、本開示のＧＤＦトラップは、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８（ミオスタチンとしても公知）に優先的に結合するように設計される。必要に応じて、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８結合トラップは、アクチビンＢにさらに結合し得る。必要に応じて、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８結合トラップは、ＢＭＰ６にさらに結合し得る。必要に応じて、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８結合トラップは、ＢＭＰ１０にさらに結合し得る。必要に応じて、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８結合トラップは、アクチビンＢおよびＢＭＰ６にさらに結合し得る。ある特定の実施形態では、本開示のＧＤＦトラップは、例えば、野生型ＡｃｔＲＩＩポリペプチドと比較して、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＡ／Ｂ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ）に対する減弱された結合親和性を有する。ある特定の好ましい実施形態では、本開示のＧＤＦトラップポリペプチドは、アクチビンＡに対する減弱された結合親和性を有する。
【０１４１】
ＡｃｔＲＩＩＢタンパク質のアミノ酸残基（例えば、配列番号１に関してＥ３９、Ｋ５５、Ｙ６０、Ｋ７４、Ｗ７８、Ｌ７９、Ｄ８０およびＦ１０１）は、ＡｃｔＲＩＩＢリガンド結合ポケット中にあり、例えば、アクチビンＡ、ＧＤＦ１１およびＧＤＦ８を含むそのリガンドへの結合の媒介を助ける。したがって、本開示は、これらのアミノ酸残基において１つまたは複数の変異を含むＡｃｔＲＩＩＢ受容体の変更されたリガンド結合ドメイン（例えば、ＧＤＦ８／ＧＤＦ１１結合ドメイン）を含むＧＤＦトラップポリペプチドを提供する。
【０１４２】
具体的な例として、ＡｃｔＲＩＩＢのリガンド結合ドメインの正に荷電したアミノ酸残基Ａｓｐ（Ｄ８０）は、ＧＤＦ８に優先的に結合するがアクチビンには結合しないＧＤＦトラップポリペプチドを産生するために、異なるアミノ酸残基へと変異され得る。好ましくは、配列番号１に関してＤ８０残基は、非荷電アミノ酸残基、陰性アミノ酸残基および疎水性アミノ酸残基からなる群から選択されるアミノ酸残基に変化される。さらなる具体的な例として、配列番号１の疎水性残基Ｌ７９は、変更されたアクチビン−ＧＤＦ１１／ＧＤＦ８結合特性を付与するために変更され得る。例えば、Ｌ７９Ｐ置換は、アクチビン結合よりも高い程度まで、ＧＤＦ１１結合を低減させる。対照的に、酸性アミノ酸［アスパラギン酸またはグルタミン酸］によるＬ７９の置き換え［Ｌ７９ＤまたはＬ７９Ｅ置換］は、ＧＤＦ１１結合親和性を保持しつつ、アクチビンＡ結合親和性を大きく低減させる。例示的な実施形態では、本明細書に記載される方法は、１つまたは複数のさらなるアミノ酸置換、付加または欠失と必要に応じて組み合わせて配列番号１の７９位に対応する位置に酸性アミノ酸（例えば、ＤまたはＥ）を含むバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドであるＧＤＦトラップポリペプチドを利用する。
【０１４３】
用語「ＢＭＰＲＩＩポリペプチド」は、ＢＭＰＲＩＩファミリーメンバーの任意の天然に存在するポリペプチドならびに有用な活性を保持するその任意のバリアント（変異体、断片、融合物およびペプチド模倣形態を含む）を含むポリペプチドを含む。本明細書に記載されるタンパク質は、特記しない限り、ヒト形態である。本明細書に記載される全てのＢＭＰＲＩＩ関連ポリペプチドについてのアミノ酸の番号付けは、他が具体的に示されない限り、以下に提供されるヒトＢＭＰＲＩＩ前駆体タンパク質配列（配列番号１４）の番号付けに基づく。
【０１４４】
ヒトＢＭＰＲＩＩ前駆体のプロセシングされていないカノニカルアイソフォームのアミノ酸配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１１９５．２）は、以下の通りである：
【化１６】
2020506944.tif 000020
【０１４５】
シグナルペプチドには下線が付され、細胞外ドメインは太字で示される。
【０１４６】
プロセシングされた細胞外ＢＭＰＲＩＩポリペプチドの配列（配列番号１５）は、以下の通りである：
【化１７】
2020506944.tif 000021
【０１４７】
配列中のシステイン残基の位置に基づいて、ＢＭＰＲＩＩポリペプチドは、配列番号１５のアミノ酸１、２、３、４、５、６、７または８において始まり、配列番号１５のアミノ酸９７〜１２４のいずれかにおいて終わるアミノ酸配列を含み得る。カノニカルヒトＢＭＰＲＩＩ前駆体タンパク質をコードする核酸配列は、以下に示され（配列番号１６）、これは、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００１２０４．６のヌクレオチド１１４９〜４２６２に対応する。シグナル配列には下線が付される。
【化１８−１】
2020506944.tif 000022
【化１８−２】
2020506944.tif 000023
【０１４８】
プロセシングされた細胞外ＢＭＰＲＩＩポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号１７）は、以下の通りである：
【化１９】
2020506944.tif 000024
【０１４９】
ヒトＢＭＰＲＩＩ前駆体のより短いアイソフォーム（アイソフォームＡ）が報告されており、これは、上記カノニカルＢＭＰＲＩＩ前駆体と同じ細胞外ドメイン配列を含む。ヒトＢＭＰＲＩＩ前駆体アイソフォームＡのアミノ酸配列（ＮＣＢＩ受託番号ＡＡＡ８６５１９．１）は、以下の通りである：
【化２０−１】
2020506944.tif 000025
【化２０−２】
2020506944.tif 000026
【０１５０】
シグナルペプチドには下線が付され、細胞外ドメインは太字で示される。
【０１５１】
ヒトＢＭＰＲＩＩ前駆体タンパク質のアイソフォームＡをコードする核酸配列は、以下に示され（配列番号１９）、これは、ＮＣＢＩ受託番号Ｕ２５１１０．１のヌクレオチド１６３〜１７５２に対応する。シグナル配列には下線が付される。
【化２１】
2020506944.tif 000027
【０１５２】
スリーフィンガー毒素フォールディングとして公知の特徴的構造モチーフは、ＴＧＦベータスーパーファミリーＩ型およびＩＩ型受容体によるリガンド結合にとって重要であり、各モノマー受容体の細胞外ドメイン内の変動する位置に位置する１０、１２または１４個の保存されたシステイン残基によって形成される。例えば、Greenwaldら（１９９９年）Nat Struct Biol ６巻：１８〜２２頁；Galat（２０１１年）Cell Mol Life Sci ６８巻：３４３７〜３４５１頁；Hinck（２０１２年）FEBS Lett ５８６巻：１８６０〜１８７０頁を参照のこと。これらの保存されたシステインのうち最も外側のシステインが境界となる、ＢＭＰＲＩＩ受容体のコアリガンド結合ドメインは、配列番号１４の３４〜１２３位を含む。配列番号１４のアミノ酸３４（ＥＣＤの最初のシステイン）またはそれよりも前において始まり、配列番号１４のアミノ酸１２３（ＥＣＤの最後のシステイン）またはそれよりも後において終わるＢＭＰＲＩＩポリペプチドは、リガンド結合活性を保持すると予測される。したがって、リガンド結合性ＢＭＰＲＩＩポリペプチドの例には、例えば、配列番号１４のアミノ酸２７〜３４のいずれか１つ（２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３または３４）において始まり、配列番号１４のアミノ酸１２３〜１５０のいずれか１つ（１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９または１５０）において終わるアミノ酸配列を含むポリペプチドが含まれる。一部の実施形態では、本開示のＢＭＰＲＩＩポリペプチドは、配列番号１４のアミノ酸３４〜１２３に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のＢＭＰＲＩＩポリペプチドは、配列番号１４のアミノ酸２７〜１５０に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のＢＭＰＲＩＩポリペプチドは、配列番号１４の２７〜１２３に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のＢＭＰＲＩＩポリペプチドは、配列番号１４の３４〜１５０に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＢＭＰＲＩＩポリペプチドは、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ１５および／またはアクチビンＢに結合し、ＢＭＰＲＩＩポリペプチドは、カノニカルＢＭＰ、例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６および／またはＢＭＰ７への実質的な結合を示さない。結合は、例えば、精製されたタンパク質を使用して、溶液中で、または表面プラズモン共鳴システム、例えばＢｉａｃｏｒｅ（商標）システムにおいて、評価され得る。
【０１５３】
用語「ＡＬＫ１ポリペプチド」は、ＡＬＫ１ファミリーメンバーの任意の天然に存在するポリペプチドならびに有用な活性を保持するその任意のバリアント（変異体、断片、融合物およびペプチド模倣形態を含む）を含むポリペプチドを含む。
【０１５４】
ヒトＡＬＫ１前駆体タンパク質配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００００１１．２）は、以下の通りである：
【化２２】
2020506944.tif 000028
【０１５５】
シグナルペプチドは、一重下線によって示され、細胞外ドメインは、太字で示される。
【０１５６】
プロセシングされた細胞外ＡＬＫ１ポリペプチド配列は、以下の通りである：
【化２３】
2020506944.tif 000029
【０１５７】
ヒトＡＬＫ１前駆体タンパク質をコードする核酸配列は、以下に示され（配列番号２２）、これは、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿００００２０．２のヌクレオチド２８４〜１７９２に対応する。シグナル配列には下線が付される。
【化２４−１】
2020506944.tif 000030
【化２４−２】
2020506944.tif 000031
【０１５８】
プロセシングされた細胞外ＡＬＫ１ポリペプチドをコードする核酸配列は、以下の通りである：
【化２５】
2020506944.tif 000032
【０１５９】
上で論じたように、スリーフィンガー毒素フォールディングとして公知の特徴的構造モチーフは、ＴＧＦベータスーパーファミリーＩ型およびＩＩ型受容体によるリガンド結合にとって重要であり、各モノマー受容体の細胞外ドメイン内の変動する位置に位置する１０、１２または１４個の保存されたシステイン残基によって形成される。これらの保存されたシステインのうち最も外側のシステインが境界となる、ＡＬＫ１受容体のコアリガンド結合ドメインは、配列番号２０の３４〜９５位を含む。配列番号２０のアミノ酸３４（ＥＣＤの最初のシステイン）またはそれよりも前において始まり、配列番号２０のアミノ酸９５（ＥＣＤの最後のシステイン）またはそれよりも後において終わるＡＬＫ１ポリペプチドは、リガンド結合活性を保持すると予測される。したがって、リガンド結合性ＡＬＫ１ポリペプチドの例には、例えば、配列番号２０のアミノ酸２２〜３４のいずれか１つ（２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３または３４）において始まり、配列番号２０のアミノ酸９５〜１１８のいずれか１つ（９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７または１１８）において終わるアミノ酸配列を含むポリペプチドが含まれる。一部の実施形態では、本開示のＡＬＫ１ポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸３４〜９５に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のＡＬＫ１ポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸２２〜１１８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のＡＬＫ１ポリペプチドは、配列番号２０の２２〜９５に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示のＡＬＫ１ポリペプチドは、配列番号２０の３４〜９５に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＬＫ１ポリペプチドは、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０に結合する。結合は、例えば、精製されたタンパク質を使用して、溶液中で、または表面プラズモン共鳴システム、例えばＢｉａｃｏｒｅ（商標）システムにおいて、評価され得る。
【０１６０】
用語「エンドグリンポリペプチド」は、エンドグリンファミリーメンバーの任意の天然に存在するポリペプチドならびに有用な活性を保持するその任意のバリアント（変異体、断片、融合物およびペプチド模倣形態を含む）を含むポリペプチドを含む。
【０１６１】
ヒトエンドグリンアイソフォーム１前駆体タンパク質配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ＿００１１１４７５３）は、以下の通りである：
【化２６】
2020506944.tif 000033
【０１６２】
リーダー配列および予測された膜貫通ドメインは各々、一重下線によって示される。
【０１６３】
ヒトエンドグリンアイソフォーム１前駆体タンパク質をコードする核酸配列は、以下に示される（配列番号２５；Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿００１１１４７５３）。リーダー配列および予測された膜貫通ドメインは各々、一重下線によって示される。
【化２７−１】
2020506944.tif 000034
【化２７−２】
2020506944.tif 000035
【０１６４】
ヒトエンドグリンアイソフォーム２前駆体タンパク質配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ＿００１１１４７５３）は、以下の通りである：
【化２８】
2020506944.tif 000036
【０１６５】
リーダー配列および予測された膜貫通ドメインは各々、一重下線によって示される。
【０１６６】
ヒトＡＬＫ１アイソフォーム２前駆体タンパク質をコードする核酸配列は、以下に示される（配列番号２７；Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿００１１１４７５３）。リーダー配列および予測された膜貫通ドメインは各々、一重下線によって示される。
【化２９−１】
2020506944.tif 000037
【化２９−２】
2020506944.tif 000038
【０１６７】
本出願人は、より短い、Ｃ末端がトランケートされたＥＮＧポリペプチドのバリアントを含むＦｃ融合タンパク質が、ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β３への感知できる結合を示さないが、その代わり、ＥＮＧ（２６−４３７）−Ｆｃ、または全長ＥＮＧ  ＥＣＤを含むＦｃ融合タンパク質のいずれかと比較して顕著により緩徐な解離速度で、ＢＭＰ９へのより高い親和性の結合を示すことを以前に実証している（例えば、その教示の全体が参照によって本明細書に組み込まれるＵＳ２０１５／０３０７５８８を参照のこと）。具体的には、配列番号２４のアミノ酸３７８、３５９および３４６において終わるＣ末端がトランケートされたバリアントは全て、ＥＮＧ（２６−４３７）またはＥＮＧ（２６−５８６）と比較して、実質的により高い親和性でＢＭＰ９に結合する（および、減弱されていない親和性でＢＭＰ１０に結合する）ことが見出された。しかし、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０への結合は、アミノ酸３３２、３２９または２５７までのより広範なＣ末端トランケーションによって完全に破壊された。したがって、アミノ酸３３３とアミノ酸３７８との間で終結するＥＮＧポリペプチドは全て、活性であると予測されるが、アミノ酸３４６および３５９において、またはアミノ酸３４６と３５９との間において終わる構築物が、最も活性であり得る。アミノ酸３６０および３７８において、またはアミノ酸３６０と３７８との間において終わる形態は、ＥＮＧ（２６−３７８）によって示される中間のリガンド結合親和性に向かう傾向があると予測される。他の重要なパラメーターの改善は、全長ＥＮＧ  ＥＣＤを含む融合タンパク質と比較した、ＥＮＧ（２６−３４６）−Ｆｃを用いて観察されたタンパク質発現および排出半減期の改善に基づいて、アミノ酸３３３および３７８において、またはアミノ酸３３３と３７８との間において終わるある特定の構築物を用いた場合に予測される（例えば、ＵＳ２０１５／０３０７５８８を参照のこと）。これらのトランケートされたバリアント形態のいずれかが、臨床設定または実験設定によっては、使用するのに望ましい可能性がある。
【０１６８】
Ｎ末端において、配列番号２４のアミノ酸２６（最初のグルタミン酸）またはその前において始まるＥＮＧポリペプチドは、リガンド結合活性を保持すると予測される。本明細書およびＵＳ２０１５／０３０７５８８に記載されるように、配列番号２４のアミノ酸６１までのＮ末端トランケーションは、より広範なＮ末端トランケーションと同様、リガンド結合を消失させる。しかし、本明細書にも開示されるように、ＥＮＧ一次配列のコンセンサスモデル化は、配列番号２４のアミノ酸２６〜６０によって規定される領域内の秩序だった二次構造が、配列番号２４の４２〜４５位において高い信頼度で予測される４残基ベータ鎖、および配列番号２４の２８〜２９位において非常に低い信頼度で予測される２残基ベータ鎖に限定されることを示している。したがって、活性ＥＮＧポリペプチドは、配列番号２４のアミノ酸２６において（またはその前において）優先的に、またはアミノ酸２７〜４２のいずれかにおいて始まることになる。
【０１６９】
合わせて考えると、ＥＮＧポリペプチドの活性部分は、配列番号２４のアミノ酸２７〜４２のいずれか１つ（例えば、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１または４２）において始まり、配列番号２４のアミノ酸３３３〜３７８のいずれか１つ（３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、２７７または３７８）において終わるアミノ酸配列、ならびに配列番号２４の対応する部分に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する配列を含み得る。例えば、活性ＥＮＧポリペプチドは、配列番号２４のアミノ酸配列２６〜３３３、２６〜３３４、２６〜３３５、２６〜３３６、２６〜３３７、２６〜３３８、２６〜３３９、２６〜３４０、２６〜３４１、２６〜３４２、２６〜３４３、２６〜３４４、２６〜３４５または２６〜３４６、ならびに配列番号２４のアミノ酸２７〜４２のいずれかにおいて始まるこれらの配列のバリアントを含み得る。例示的なＥＮＧポリペプチドは、配列番号２４のアミノ酸配列２６〜３４６、２６〜３５９および２６〜３７８を含む。これらの範囲内のバリアント、特に、配列番号２４の対応する部分に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するものもまた企図される。ＥＮＧポリペプチドは、配列番号２４のアミノ酸３７９〜４３０からなる配列を含まなくてもよい。ある特定の実施形態では、ＥＮＧポリペプチドは、ＢＭＰ−９およびＢＭＰ−１０に結合し、ＥＮＧポリペプチドは、ＴＧＦ−β１に対してもＴＧＦ−β３に対しても実質的な結合を示さない。結合は、精製されたタンパク質を使用して、溶液中で、または表面プラズモン共鳴システム、例えばＢｉａｃｏｒｅ（商標）システムにおいて、評価され得る。
【０１７０】
ＥＮＧポリペプチドは、Ｎ末端に種々のリーダー配列のいずれかをさらに含み得る。かかる配列は、真核生物の系においてペプチドが発現され、分泌経路に標的化されるのを可能にする。例えば、Ernstら、米国特許第５，０８２，７８３号（１９９２年）を参照のこと。あるいは、ネイティブのＥＮＧシグナル配列が、細胞からの突出をもたらすために使用され得る。可能なリーダー配列には、ミツバチメリチン、ＴＰＡおよびネイティブのリーダーが含まれる。シグナルペプチドのプロセシングは、数ある変量のうち、選択されるリーダー配列、使用される細胞型、および培養条件に依存して変動し得、したがって、成熟ＥＮＧポリペプチドの実際のＮ末端開始部位は、Ｎ末端またはＣ末端のいずれかの方向に、１、２、３、４または５アミノ酸シフトし得る。成熟ＥＮＧ−Ｆｃ融合タンパク質の例には、下線を付したＥＮＧポリペプチド部分を伴って以下に示される配列番号２８〜３１が含まれる。
【０１７１】
ヒトＥＮＧ（２６−３７８）−ｈＦｃ（トランケートされたＦｃ）
【化３０】
2020506944.tif 000039
【０１７２】
ヒトＥＮＧ（２６−３５９）−ｈＦｃ
【化３１−１】
2020506944.tif 000040
【化３１−２】
2020506944.tif 000041
【０１７３】
ヒトＥＮＧ（２６−３５９）−ｈＦｃ（トランケートされたＦｃ）
【化３２】
2020506944.tif 000042
【０１７４】
ヒトＥＮＧ（２６−３４６）−ｈＦｃ（トランケートされたＦｃ）
【化３３】
2020506944.tif 000043
【０１７５】
一部の実施形態では、本開示は、治療有効性または安定性（例えば、有効期間、およびｉｎ  ｖｉｖｏでのタンパク質分解性分解に対する耐性）を増強するなどの目的のために、ＢＭＰ１０プロペプチドポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＢＭＰＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ１ポリペプチドおよび／またはエンドグリンポリペプチドの構造を改変することによって機能的バリアントを作製することを企図する。バリアントは、アミノ酸置換、欠失、付加、またはそれらの組合せによって産生され得る。例えば、イソロイシンまたはバリンによるロイシンの、グルタミン酸によるアスパラギン酸の、セリンによるスレオニンの単独の置き換え、または構造的に関連するアミノ酸によるあるアミノ酸の類似の置き換え（例えば、保存的変異）が、得られた分子の生物学的活性に対して主要な影響を有さないと予測することは、合理的である。保存的置き換えは、側鎖において関連があるアミノ酸のファミリー内で起こる置き換えである。本開示のポリペプチドのアミノ酸配列における変化が機能的ホモログを生じるかどうかは、バリアントポリペプチドが、野生型ポリペプチドと類似の様式で細胞における応答を生じる能力、またはバリアントポリペプチドが、例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ２／７、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ４／７、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６／ＢＭＰ１３、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９ｂ／ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１１／ＢＭＰ１１、ＧＤＦ１５／ＭＩＣ１、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、ノダル、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アルテミン（artemin）、パーセフィン、ＭＩＳおよびＬｅｆｔｙを含む１種もしくは複数のＴＧＦ−ベータリガンドに結合する能力を評価することによって、容易に決定され得る。
【０１７６】
ある特定の実施形態では、本開示は、ポリペプチドのグリコシル化を変更するための、ＢＭＰ１０プロペプチドポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＢＭＰＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ１ポリペプチドおよび／またはエンドグリンポリペプチドの具体的な変異を企図する。かかる変異は、１つまたは複数のグリコシル化部位、例えば、Ｏ結合型またはＮ結合型グリコシル化部位を導入または排除するために選択され得る。アスパラギン連結型グリコシル化認識部位は、一般に、適切な細胞性グリコシル化酵素によって特異的に認識されるトリペプチド配列であるアスパラギン−Ｘ−スレオニンまたはアスパラギン−Ｘ−セリン（式中、「Ｘ」は任意のアミノ酸である）を含む。変更は、ポリペプチドの配列への１つもしくは複数のセリンもしくはスレオニン残基の付加、または１つもしくは複数のセリンもしくはスレオニン残基による置換によっても行われ得る（Ｏ結合型グリコシル化部位について）。グリコシル化認識部位の第１または第３のアミノ酸位置の一方または両方における種々のアミノ酸置換または欠失（および／または第２の位置におけるアミノ酸欠失）は、改変されたトリペプチド配列における非グリコシル化を生じる。ポリペプチド上の炭水化物部分の数を増加させる別の手段は、ポリペプチドへのグリコシドの化学的または酵素的カップリングによる。使用されるカップリング様式に依存して、糖（複数可）が、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン；（ｂ）遊離カルボキシル基；（ｃ）遊離スルフヒドリル基、例えば、システインのもの；（ｄ）遊離ヒドロキシル基、例えば、セリン、スレオニンもしくはヒドロキシプロリンのもの；（ｅ）芳香族残基、例えば、フェニルアラニン、チロシンもしくはトリプトファンのもの；または（ｆ）グルタミンのアミド基に付加され得る。ポリペプチド上に存在する１つまたは複数の炭水化物部分の除去は、化学的におよび／または酵素的に達成され得る。化学的脱グリコシル化には、例えば、化合物トリフルオロメタンスルホン酸または等価な化合物へのポリペプチドの曝露が関与し得る。この処理は、アミノ酸配列をインタクトなままにしながら、連結糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）を除くほとんどまたは全ての糖の切断を生じる。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakuraら［Meth. Enzymol.（１９８７年）１３８巻：３５０頁］によって記載されるように、種々のエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼの使用によって達成され得る。哺乳動物、酵母、昆虫および植物細胞は全て、ペプチドのアミノ酸配列によって影響され得る異なるグリコシル化パターンを導入し得るので、ポリペプチドの配列は、使用される発現系の型に依存して、必要に応じて調整され得る。一般に、ヒトにおける使用のための本開示のＢＭＰ１０プロペプチドポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＢＭＰＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ１ポリペプチドおよび／またはエンドグリンポリペプチドは、適切なグリコシル化を提供する哺乳動物細胞株、例えば、ＨＥＫ２９３またはＣＨＯ細胞株において発現され得るが、他の哺乳動物発現細胞株も同様に有用であると予測される。
【０１７７】
本開示は、変異体、特に、ＢＭＰ１０プロペプチドポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＢＭＰＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ１ポリペプチドおよび／またはエンドグリンポリペプチドのコンビナトリアル変異体、ならびにトランケーション変異体のセットを生成する方法をさらに企図する。コンビナトリアル変異体のプールは、機能的に活性な（例えば、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンド結合性）ＡｃｔＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１、エンドグリンおよび／またはＢＭＰ１０プロペプチド配列を同定するために特に有用である。かかるコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングする目的は、例えば、変更された薬物動態または変更されたリガンド結合などの変更された特性を有するポリペプチドバリアントを生成することであり得る。種々のスクリーニングアッセイが以下に提供され、かかるアッセイは、バリアントを評価するために使用され得る。例えば、ＢＭＰ１０プロペプチドポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＢＭＰＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ１ポリペプチドおよび／またはエンドグリンポリペプチドバリアントは、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリー受容体へのＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドの結合を防止するため、および／またはＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドによって引き起こされるシグナル伝達を妨害するために、１種または複数種のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンド（例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ２／７、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ４／７、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６／ＢＭＰ１３、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９ｂ／ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１１／ＢＭＰ１１、ＧＤＦ１５／ＭＩＣ１、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、ノダル、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アルテミン、パーセフィン、ＭＩＳおよびＬｅｆｔｙ）に結合する能力についてスクリーニングされ得る。
【０１７８】
ＢＭＰ１０プロペプチドポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＢＭＰＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ１ポリペプチドおよび／またはエンドグリンポリペプチドの活性はまた、細胞ベースのアッセイでまたはｉｎ  ｖｉｖｏで試験され得る。例えば、筋肉細胞における筋肉産生に関与する遺伝子の発現に対するＢＭＰ１０プロペプチドポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＢＭＰＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ１ポリペプチドおよび／またはエンドグリンポリペプチドの影響が評価され得る。これは、必要に応じて、１種または複数種の組換えＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドタンパク質（例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ２／７、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ４／７、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６／ＢＭＰ１３、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９ｂ／ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１１／ＢＭＰ１１、ＧＤＦ１５／ＭＩＣ１、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、ノダル、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アルテミン、パーセフィン、ＭＩＳおよびＬｅｆｔｙ）の存在下で実施され得、細胞は、ＢＭＰ１０プロペプチドポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＢＭＰＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ１ポリペプチドおよび／またはエンドグリンポリペプチド、ならびに必要に応じてＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドを産生するためにトランスフェクトされ得る。同様に、ＢＭＰ１０プロペプチドポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＢＭＰＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ１ポリペプチドおよび／またはエンドグリンポリペプチドは、マウスまたは他の動物に投与され得、１つまたは複数の測定値、例えば、筋肉の形成および強度が、当技術分野で認識された方法を使用して評価され得る。同様に、ＢＭＰ１０プロペプチドポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＢＭＰＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ１ポリペプチドおよび／もしくはエンドグリンポリペプチド、またはそれらのバリアントの活性は、例えば、本明細書に記載されるアッセイおよび当技術分野では常識のアッセイによって、がん細胞の成長に対する任意の影響について、これらの細胞において試験され得る。ＳＭＡＤ応答性レポーター遺伝子が、下流のシグナル伝達に対する影響をモニタリングするために、かかる細胞株において使用され得る。
【０１７９】
参照ＢＭＰ１０プロペプチドポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＢＭＰＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ１ポリペプチドおよび／またはエンドグリンポリペプチドと比較して増加した選択性、または一般には、増加した効力を有するコンビナトリアル由来のバリアントが生成され得る。かかるバリアントは、組換えＤＮＡ構築物から発現される場合、遺伝子治療プロトコールにおいて使用され得る。同様に、変異誘発が、対応する未改変のＢＭＰ１０プロペプチドポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＢＭＰＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ１ポリペプチドおよび／またはエンドグリンポリペプチドとは劇的に異なる細胞内半減期を有するバリアントを生じ得る。例えば、変更されたタンパク質は、未改変のポリペプチドの破壊を生じるタンパク質分解性分解もしくは他の細胞性プロセス、または他の方法によるその不活性化に対してより安定に、またはあまり安定でなくなるようにされ得る。かかるバリアント、およびそれをコードする遺伝子は、ポリペプチドの半減期をモジュレートすることによって、ポリペプチド複合体レベルを変更するために利用され得る。例えば、短い半減期は、より一過的な生物学的効果を生じ得、誘導性の発現系の一部である場合、細胞内での組換えポリペプチド複合体レベルのより緊密な制御を可能にし得る。Ｆｃ融合タンパク質では、変異は、ＢＭＰ１０プロペプチドポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＢＭＰＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ１ポリペプチドおよび／またはエンドグリンポリペプチドの半減期を変更するために、リンカー（存在する場合）および／またはＦｃ部分において行われ得る。
【０１８０】
コンビナトリアルライブラリーは、潜在的ＡｃｔＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１、エンドグリンおよび／またはＢＭＰ１０プロペプチド配列の少なくとも一部分を各々が含むポリペプチドのライブラリーをコードする遺伝子の縮重ライブラリーによって産生され得る。例えば、潜在的ＡｃｔＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１、エンドグリンおよび／またはＢＭＰ１０プロペプチドをコードするヌクレオチド配列の縮重セットが、個々のポリペプチドとして発現可能であるように、またはあるいは、より大きい融合タンパク質のセットとして発現可能であるように（例えば、ファージディスプレイのため）、合成オリゴヌクレオチドの混合物が、遺伝子配列へと酵素的にライゲーションされ得る。
【０１８１】
潜在的ホモログのライブラリーが縮重オリゴヌクレオチド配列から生成され得る多くの方法が存在する。縮重遺伝子配列の化学的合成は、自動ＤＮＡ合成機で実施され得、次いで、合成遺伝子が、発現に適したベクター中にライゲーションされ得る。縮重オリゴヌクレオチドの合成は、当技術分野で周知である［Narang, SA（１９８３年）Tetrahedron ３９巻：３頁；Itakuraら（１９８１年）Recombinant DNA、Proc. 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules、AGWalton編、Amsterdam: Elsevier ２７３〜２８９頁；Itakuraら（１９８４年）Annu. Rev. Biochem. ５３巻：３２３頁；Itakuraら（１９８４年）Science １９８巻：１０５６頁；およびIkeら（１９８３年）Nucleic Acid Res. １１巻：４７７頁］。かかる技術は、他のタンパク質の定向進化において使用されてきた［Scottら（１９９０年）Science ２４９巻：３８６〜３９０頁；Robertsら（１９９２年）PNAS USA ８９巻：２４２９〜２４３３頁；Devlinら（１９９０年）Science ２４９巻：４０４〜４０６頁；Cwirlaら（１９９０年）PNAS USA ８７巻：６３７８〜６３８２頁；ならびに米国特許第５，２２３，４０９号、同第５，１９８，３４６号および同第５，０９６，８１５号］。
【０１８２】
あるいは、他の形態の変異誘発が、コンビナトリアルライブラリーを生成するために利用され得る。例えば、本開示のＢＭＰ１０プロペプチドポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＢＭＰＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ１ポリペプチドおよび／またはエンドグリンポリペプチドは、例えば、アラニンスキャニング変異誘発を使用するスクリーニングによって［Rufら（１９９４年）Biochemistry ３３巻：１５６５〜１５７２頁；Wangら（１９９４年）J. Biol. Chem. ２６９巻：３０９５〜３０９９頁；Balintら（１９９３年）Gene １３７巻：１０９〜１１８頁；Grodbergら（１９９３年）Eur. J. Biochem. ２１８巻：５９７〜６０１頁；Nagashimaら（１９９３年）J. Biol. Chem. ２６８巻：２８８８〜２８９２頁；Lowmanら（１９９１年）Biochemistry ３０巻：１０８３２〜１０８３８頁；およびCunninghamら（１９８９年）Science ２４４巻：１０８１〜１０８５頁］、リンカースキャニング変異誘発によって［Gustinら（１９９３年）Virology １９３巻：６５３〜６６０頁；およびBrownら（１９９２年）Mol. Cell Biol. １２巻：２６４４〜２６５２頁；McKnightら（１９８２年）Science ２３２巻：３１６頁］、飽和変異誘発によって［Meyersら（１９８６年）Science ２３２巻：６１３頁］；ＰＣＲ変異誘発によって［Leungら（１９８９年）Method Cell Mol Biol １巻：１１〜１９頁］；または化学的変異誘発を含むランダム変異誘発によって［Millerら（１９９２年）A Short Course in BacterialGenetics、CSHL Press、Cold SpringHarbor、NY；およびGreenerら（１９９４年）Strategies in Mol Biol ７巻：３２〜３４頁］、生成され得、ライブラリーから単離され得る。特にコンビナトリアル設定でのリンカースキャニング変異誘発は、ＢＭＰ１０プロペプチドポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＢＭＰＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ１ポリペプチドおよび／またはエンドグリンポリペプチドのトランケートされた（生理活性な）形態を同定するための代替的方法である。
【０１８３】
点変異およびトランケーションによって作製されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするため、もっと言えばある特定の特性を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための広範な技術が、当技術分野で公知である。かかる技術は、一般に、ＢＭＰ１０プロペプチドポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＢＭＰＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ１ポリペプチドおよび／またはエンドグリンポリペプチドのコンビナトリアル変異誘発によって生成された遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングのために適応可能である。大きい遺伝子ライブラリーをスクリーニングするために最も広く使用される技術は、典型的には、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクター中にクローニングするステップ、ベクターの得られたライブラリーで適切な細胞を形質転換するステップ、およびその産物が検出された遺伝子をコードするベクターの比較的容易な単離を、所望の活性の検出が促進する条件下で、コンビナトリアル遺伝子を発現させるステップを含む。好ましいアッセイには、ＴＧＦ−ベータリガンド（例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ２／７、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ４／７、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６／ＢＭＰ１３、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９ｂ／ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１１／ＢＭＰ１１、ＧＤＦ１５／ＭＩＣ１、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、ノダル、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アルテミン、パーセフィン、ＭＩＳおよびＬｅｆｔｙ）結合アッセイおよび／またはＴＧＦ−ベータリガンド媒介性細胞シグナル伝達アッセイが含まれる。
【０１８４】
ある特定の実施形態では、ＢＭＰ１０プロペプチドポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＢＭＰＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ１ポリペプチドおよび／またはエンドグリンポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１、エンドグリンおよび／またはＢＭＰ１０プロペプチドポリペプチド中に天然に存在する任意の改変に加えて、翻訳後修飾をさらに含み得る。かかる修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化およびアシル化が含まれるがこれらに限定されない。結果として、ＢＭＰ１０プロペプチドポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＢＭＰＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ１ポリペプチドおよび／またはエンドグリンポリペプチドは、非アミノ酸要素、例えば、ポリエチレングリコール、脂質、多糖または単糖、およびリン酸を含み得る。ＢＭＰ１０プロペプチドポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＢＭＰＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ１ポリペプチドおよび／またはエンドグリンポリペプチドの機能性に対するかかる非アミノ酸要素の影響は、他のバリアントについて本明細書に記載されるように試験され得る。本開示のポリペプチドが、新生形態のポリペプチドを切断することによって細胞において産生される場合、翻訳後プロセシングもまた、タンパク質の正確なフォールディングおよび／または機能のために重要であり得る。異なる細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８、ＮＩＨ−３Ｔ３またはＨＥＫ２９３）は、かかる翻訳後活性のための特定の細胞マシナリーおよび特徴的機構を有し、ＡｃｔＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１、エンドグリンまたはＢＭＰ１０プロペプチドポリペプチドの正確な修飾およびプロセシングを確実にするために選択され得る。
【０１８５】
ある特定の態様では、本開示のＢＭＰ１０プロペプチドポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＢＭＰＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ１ポリペプチドおよび／またはエンドグリンポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡまたはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１、エンドグリンまたはＢＭＰ１０プロペプチドポリペプチドの少なくとも一部分（ドメイン）および１つまたは複数の異種部分（ドメイン）を含む融合タンパク質である。かかる融合ドメインの周知の例には、ポリヒスチジン、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、プロテインＡ、プロテインＧ、免疫グロブリン重鎖定常領域（Ｆｃ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）またはヒト血清アルブミンが含まれるがこれらに限定されない。融合ドメインは、所望の特性を付与するために選択され得る。例えば、一部の融合ドメインは、アフィニティクロマトグラフィーによる融合タンパク質の単離に特に有用である。親和性精製を目的として、アフィニティクロマトグラフィー、例えば、グルタチオン、アミラーゼ、およびニッケルまたはコバルトコンジュゲートした樹脂のための適切なマトリックスが使用される。かかるマトリックスの多くは、「キット」形態、例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＧＳＴ精製システム、および（ＨＩＳ６）融合パートナーを用いて有用なＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ（商標）システム（Ｑｉａｇｅｎ）で入手可能である。別の例として、融合ドメインは、ＢＭＰ１０プロペプチドポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＢＭＰＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ１ポリペプチドおよび／またはエンドグリンポリペプチドの検出を促進するために選択され得る。かかる検出ドメインの例には、通常はそれに対する特異的抗体が入手可能な短いペプチド配列である種々の蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）ならびに「エピトープタグ」が含まれる。それに対する特異的モノクローナル抗体が容易に入手可能な周知のエピトープタグには、ＦＬＡＧ、インフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）およびｃ−ｍｙｃタグが含まれる。一部の場合には、融合ドメインは、適切なプロテアーゼに融合タンパク質を部分的に消化させ、それによって組換えタンパク質をそれから遊離させる、例えば、第Ｘａ因子またはトロンビンのためのプロテアーゼ切断部位を有する。次いで、遊離されたタンパク質は、引き続くクロマトグラフィー分離によって、融合ドメインから単離され得る。選択され得る他の型の融合ドメインには、例えば、免疫グロブリン由来の定常ドメイン（例えば、Ｆｃドメイン）を含む、マルチマー化（例えば、ダイマー化、テトラマー化）するドメインおよび機能的ドメイン（これは、さらなる生物学的機能を付与する）が含まれる。
【０１８６】
ある特定の態様では、本開示のＢＭＰ１０プロペプチドポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＢＭＰＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ１ポリペプチドおよび／またはエンドグリンポリペプチドは、ポリペプチドを「安定化する」ことが可能な１つまたは複数の改変を含む。「安定化する」は、減少した破壊、腎臓による減少したクリアランス、または薬剤の他の薬物動態効果にこれが起因するかどうかにかかわらず、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ半減期、血清半減期を増加させる一切のことを意味する。例えば、かかる改変は、ポリペプチドの有効期間を増強し、ポリペプチドの循環半減期を増強し、および／またはポリペプチドのタンパク質分解性分解を低減させる。かかる安定化性の改変には、融合タンパク質（例えば、ＢＭＰ１０プロペプチドポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＢＭＰＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ１ポリペプチドおよび／またはエンドグリンポリペプチドドメインならびに安定剤ドメインを含む融合タンパク質を含む）、グリコシル化部位の改変（例えば、本開示のポリペプチドへのグリコシル化部位の付加を含む）、および炭水化物部分の改変（例えば、本開示のポリペプチドからの炭水化物部分の除去を含む）が含まれるがこれらに限定されない。本明細書で使用する場合、用語「安定剤ドメイン」は、融合タンパク質の場合の融合ドメイン（例えば、免疫グロブリンＦｃドメイン）を指すだけでなく、非タンパク質性改変、例えば炭水化物部分、または非タンパク質性部分、例えばポリエチレングリコールもまた含む。ある特定の好ましい実施形態では、ＢＭＰ１０プロペプチドポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＢＭＰＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ１ポリペプチドおよび／またはエンドグリンポリペプチドは、ポリペプチドを安定化する異種ドメイン（「安定剤」ドメイン）、好ましくは、ポリペプチドの安定性をｉｎ  ｖｉｖｏで増加させる異種ドメインと融合される。免疫グロブリンの定常ドメイン（例えば、Ｆｃドメイン）との融合は、望ましい薬物動態特性を広範なタンパク質に付与することが公知である。同様に、ヒト血清アルブミンへの融合は、望ましい安定化特性を付与し得る。
【０１８７】
一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１、エンドグリンおよび／またはＢＭＰ１０プロペプチドポリペプチドは、Ｆｃ融合タンパク質である。ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分（Ｇ１Ｆｃ）として使用され得るネイティブのアミノ酸配列の例は、以下に示される（配列番号３６）。点線の下線は、ヒンジ領域を示し、実線の下線は、天然に存在するバリアントがある位置を示す。一部、本開示は、配列番号３６に対して７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドを提供する。Ｇ１Ｆｃにおいて天然に存在するバリアントは、配列番号３６において使用される番号付けシステムに従うとＥ１３４ＤおよびＭ１３６Ｌを含むであろう（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０１８５７を参照のこと）。
【化３４】
2020506944.tif 000044
【０１８８】
必要に応じて、ＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、Ａｓｐ−２６５、リシン３２２およびＡｓｎ−４３４などの残基において、１つまたは複数の変異を有する。ある特定の場合には、これらの変異のうち１つまたは複数（例えば、Ａｓｐ−２６５変異）を有する変異体ＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、野生型Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃγ受容体に結合する低減された能力を有する。他の場合には、これらの変異のうち１つまたは複数（例えば、Ａｓｎ−４３４変異）を有する変異体Ｆｃドメインは、野生型ＩｇＧ１  Ｆｃドメインと比較して、ＭＨＣクラスＩ関連Ｆｃ受容体（ＦｃＲＮ）に結合する増加された能力を有する。
【０１８９】
ヒトＩｇＧ２のＦｃ部分（Ｇ２Ｆｃ）として使用され得るネイティブのアミノ酸配列の例は、以下に示される（配列番号３７）。点線の下線は、ヒンジ領域を示し、二重下線は、配列中にデータベースの矛盾が存在する位置を示す（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ０１８５９に従う）。一部、本開示は、配列番号３７に対して７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドを提供する。
【化３５】
2020506944.tif 000045
【０１９０】
ヒトＩｇＧ３のＦｃ部分（Ｇ３Ｆｃ）として使用され得るアミノ酸配列の２つの例は、以下に示される。Ｇ３Ｆｃ中のヒンジ領域は、他のＦｃ鎖中のヒンジ領域の最大で４倍の長さであり得、類似の１７残基セグメントが先行する３つの同一な１５残基セグメントを含む。以下に示される最初のＧ３Ｆｃ配列（配列番号３８）は、単一の１５残基セグメントからなる短いヒンジ領域を含むが、２番目のＧ３Ｆｃ配列（配列番号３９）は、全長ヒンジ領域を含む。各場合において、点線の下線は、ヒンジ領域を示し、実線の下線は、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ０１８５９に従う天然に存在するバリアントがある位置を示す。一部、本開示は、配列番号３８または３９に対して７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドを提供する。
【化３６】
2020506944.tif 000046
【０１９１】
Ｇ３Ｆｃにおいて天然に存在するバリアント（例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０１８６０を参照のこと）は、配列番号３８において使用される番号付けシステムに変換した場合、Ｅ６８Ｑ、Ｐ７６Ｌ、Ｅ７９Ｑ、Ｙ８１Ｆ、Ｄ９７Ｎ、Ｎ１００Ｄ、Ｔ１２４Ａ、Ｓ１６９Ｎ、Ｓ１６９ｄｅｌ、Ｆ２２１Ｙを含み、本開示は、これらのバリエーションのうち１つまたは複数を含むＧ３Ｆｃドメインを含む融合タンパク質を提供する。さらに、ヒト免疫グロブリンＩｇＧ３遺伝子（ＩＧＨＧ３）は、異なるヒンジ長さを特徴とする構造的多型を示す［Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０１８５９を参照のこと］。具体的には、バリアントＷＩＳは、Ｖ領域のほとんどおよびＣＨ１領域の全てを欠いている。これは、ヒンジ領域中に通常存在する１１位に加えて、７位に余分の鎖間ジスルフィド結合を有する。バリアントＺＵＣは、Ｖ領域のほとんど、ＣＨ１領域の全て、およびヒンジの一部を欠く。バリアントＯＭＭは、対立遺伝子形態または別のガンマ鎖サブクラスを示し得る。本開示は、これらのバリアントのうち１つまたは複数を含むＧ３Ｆｃドメインを含むさらなる融合タンパク質を提供する。
【０１９２】
ヒトＩｇＧ４のＦｃ部分（Ｇ４Ｆｃ）として使用され得るネイティブのアミノ酸配列の例は、以下に示される（配列番号４０）。点線の下線は、ヒンジ領域を示す。一部、本開示は、配列番号４０に対して７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるポリペプチドを提供する。
【化３７】
2020506944.tif 000047
【０１９３】
Ｆｃドメイン中の種々の操作された変異は、Ｇ１Ｆｃ配列（配列番号３６）に関して本明細書で示され、Ｇ２Ｆｃ、Ｇ３ＦｃおよびＧ４Ｆｃにおける類似の変異は、図４中のそれらとＧ１Ｆｃとのアラインメントから誘導され得る。不等なヒンジ長さに起因して、アイソタイプアラインメント（図４）に基づく類似のＦｃ位置は、配列番号３６、３７、３８、３９および４０において異なるアミノ酸番号を有する。ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域からなる免疫グロブリン配列（例えば、配列番号３６、３７、３８、３９および４０）中の所与のアミノ酸位置は、番号付けがＩｇＧ１重鎖定常ドメイン全体（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域からなる）を包含する場合、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース中の同じ位置とは異なる番号によって同定されることもまた理解され得る。
【０１９４】
本出願は、操作されたまたはバリアントＦｃ領域を有する抗体およびＦｃ融合タンパク質をさらに提供する。かかる抗体およびＦｃ融合タンパク質は、例えば、エフェクター機能、例えば、抗原依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）をモジュレートする際に有用であり得る。さらに、改変が、抗体およびＦｃ融合タンパク質の安定性を改善し得る。抗体およびＦｃ融合タンパク質のアミノ酸配列バリアントは、適切なヌクレオチド変化をＤＮＡ中に導入することによって、またはペプチド合成によって調製される。かかるバリアントは、例えば、本明細書に開示される抗体およびＦｃ融合タンパク質のアミノ酸配列からの欠失、および／またはかかるアミノ酸配列中への挿入、および／またはかかるアミノ酸配列内の残基の置換を含む。欠失、挿入および置換の任意の組合せが、最終構築物が所望の特徴を有することを条件として、最終構築物に到達するために行われる。アミノ酸変化はまた、抗体およびＦｃ融合タンパク質の翻訳後プロセスを変更し得、例えば、グリコシル化部位の数または位置を変化させる。
【０１９５】
低減されたエフェクター機能を有する抗体およびＦｃ融合タンパク質は、Bluestoneら（ＷＯ９４／２８０２７およびＷＯ９８／４７５３１を参照のこと；Xuら、２０００年、Cell Immunol ２００巻；１６〜２６頁もまた参照のこと）によって記載されるＡｌａ−Ａｌａ変異が含まれるがこれに限定されない変化をアミノ酸配列中に導入することによって産生され得る。したがって、ある特定の実施形態では、定常領域内にＡｌａ−Ａｌａ変異を含む変異を有する本開示の抗体およびＦｃ融合タンパク質は、エフェクター機能を低減または消失させるために使用され得る。これらの実施形態によれば、抗体およびＦｃ融合タンパク質は、２３４位におけるアラニンへの変異もしくは２３５位におけるアラニンへの変異、またはそれらの組合せを含み得る。一実施形態では、抗体またはＦｃ融合タンパク質は、ＩｇＧ４フレームワークを含み、Ａｌａ−Ａｌａ変異は、２３４位におけるフェニルアラニンからアラニンへの変異および／または２３５位におけるロイシンからアラニンへの変異を記述する。別の実施形態では、抗体またはＦｃ融合タンパク質は、ＩｇＧ１フレームワークを含み、Ａｌａ−Ａｌａ変異は、２３４位におけるロイシンからアラニンへの変異および／または２３５位におけるロイシンからアラニンへの変異を記述する。抗体またはＦｃ融合タンパク質は、あるいはまたはさらに、ＣＨ２ドメイン中の点変異Ｋ３２２Ａを含む他の変異を保有し得る（Hezarehら、２００１年、J Virol. ７５巻：１２１６１〜８頁）。
【０１９６】
一部の実施形態では、抗体またはＦｃ融合タンパク質は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を増強または阻害するために改変され得る。モジュレートされたＣＤＣ活性は、Ｆｃ領域中に１つまたは複数のアミノ酸置換、挿入または欠失を導入することによって達成され得る（例えば、米国特許第６，１９４，５５１号を参照のこと）。あるいはまたはさらに、システイン残基（複数可）がＦｃ領域中に導入され得、それによって、この領域における鎖間ジスルフィド結合の形成を可能にする。こうして生成されたホモダイマー抗体では、内部移行能が改善もしくは低減されていることがあり、および／または補体媒介性細胞死滅が増加もしくは減少していることがある。Caronら、J. Exp Med. １７６巻：１１９１〜１１９５頁（１９９２年）ならびにShopes, B. J. Immunol. １４８巻：２９１８〜２９２２頁（１９９２年）、ＷＯ９９／５１６４２、DuncanおよびWinter Nature ３２２巻：７３８〜４０頁（１９８８年）；米国特許第５，６４８，２６０号；米国特許第５，６２４，８２１号；ならびにＷＯ９４／２９３５１を参照のこと。
【０１９７】
融合タンパク質（例えば、免疫グロブリンＦｃ融合タンパク質）の異なる要素は、所望の機能性と一致する任意の様式で整列され得ることが理解される。例えば、ＢＭＰ１０プロペプチドポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＢＭＰＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ１ポリペプチドおよび／またはエンドグリンポリペプチドドメインは、異種ドメインに対してＣ末端側に配置され得、またはあるいは、異種ドメインは、ＢＭＰ１０プロペプチドポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＢＭＰＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ１ポリペプチドおよび／またはエンドグリンポリペプチドドメインに対してＣ末端側に配置され得る。ＢＭＰ１０プロペプチドポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＢＭＰＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ１ポリペプチドおよび／またはエンドグリンポリペプチドドメインならびに異種ドメインは、融合タンパク質中で隣接している必要はなく、さらなるドメインまたはアミノ酸配列が、いずれかのドメインに対してＣ末端側もしくはＮ末端側に、またはドメイン間に含まれ得る。
【０１９８】
例えば、ＢＭＰ１０プロペプチド（ＡｃｔＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１またはエンドグリン）融合タンパク質は、式Ａ−Ｂ−Ｃで示されるアミノ酸配列を含み得る。Ｂ部分は、ＢＭＰ１０プロペプチド（ＡｃｔＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１またはエンドグリン）ポリペプチドドメインに対応する。ＡおよびＣ部分は、独立して、ゼロ、１つ、または１つよりも多いアミノ酸であり得、ＡおよびＣ部分は共に、存在する場合には、Ｂに対して異種である。Ａおよび／またはＣ部分は、リンカー配列を介してＢ部分に付加され得る。リンカーは、グリシン（例えば、２〜１０、２〜５、２〜４、２〜３個のグリシン残基）またはグリシンおよびプロリン残基がリッチであり得、例えば、スレオニン／セリンおよびグリシンの単一配列またはスレオニン／セリンおよび／もしくはグリシンの反復配列、例えば、ＧＧＧ（配列番号４１）、ＧＧＧＧ（配列番号４２）、ＴＧＧＧＧ（配列番号４３）、ＳＧＧＧＧ（配列番号４４）、ＴＧＧＧ（配列番号４５）、ＳＧＧＧ（配列番号４６）またはＧＧＧＧＳ（配列番号４７）シングレットまたはリピートを含み得る。ある特定の実施形態では、ＢＭＰ１０プロペプチド（ＡｃｔＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１またはエンドグリン）融合タンパク質は、式Ａ−Ｂ−Ｃで示されるアミノ酸配列を含み、式中、Ａはリーダー（シグナル）配列であり、Ｂは、ＢＭＰ１０プロペプチド（ＡｃｔＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１またはエンドグリン）ポリペプチドドメインからなり、Ｃは、ｉｎ  ｖｉｖｏ安定性、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期、取り込み／投与、組織局在化もしくは分布、タンパク質複合体の形成、および／または精製のうち１つまたは複数を増強するポリペプチド部分である。ある特定の実施形態では、ＢＭＰ１０プロペプチド（ＡｃｔＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１またはエンドグリン）融合タンパク質は、式Ａ−Ｂ−Ｃで示されるアミノ酸配列を含み、式中、ＡはＴＰＡリーダー配列であり、Ｂは、ＢＭＰ１０プロペプチド（ＡｃｔＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１またはエンドグリン）受容体ポリペプチドドメインからなり、Ｃは免疫グロブリンＦｃドメインである。好ましい融合タンパク質は、配列番号２８、２９、３０、３１、５０、５４、５７、５８、６０、６３、６４、６６、６９、７１、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８５、８７、１２３、１３１および１３２のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む。
【０１９９】
ある特定の好ましい実施形態では、本明細書に記載される方法に従って使用されるＢＭＰ１０プロペプチドポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＢＭＰＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ１ポリペプチドおよび／またはエンドグリンポリペプチドは、単離された複合体である。本明細書で使用する場合、単離されたタンパク質（もしくはタンパク質複合体）またはポリペプチド（もしくはポリペプチド複合体）は、その天然の環境の成分から分離されたものである。一部の実施形態では、本開示のポリペプチドは、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフィー（例えば、イオン交換または逆相ＨＰＬＣ）によって決定した場合、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％よりも高い純度まで精製される。抗体純度の評価のための方法は、当技術分野で周知である［Flatmanら（２００７年）J. Chromatogr. B ８４８巻：７９〜８７頁］。
【０２００】
ある特定の実施形態では、本開示のＢＭＰ１０プロペプチドポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＢＭＰＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ１ポリペプチドおよび／またはエンドグリンポリペプチドは、当技術分野で公知の種々の技術によって産生され得る。例えば、本開示のポリペプチドは、Bodansky, M. Principles of Peptide Synthesis、Springer Verlag、Berlin（１９９３年）およびGrant G. A.（編）、Synthetic Peptides: A User'sGuide、W. H. Freeman and Company、New York（１９９２年）に記載されるものなどの標準的なタンパク質化学技術を使用して合成され得る。さらに、自動ペプチド合成機が市販されている（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ  Ｍｏｄｅｌ  ３９６；Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  ９６００）。あるいは、その断片またはバリアントを含む本開示のポリペプチドおよび複合体は、当技術分野で周知の種々の発現系［Ｅ．ｃｏｌｉ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ細胞、バキュロウイルス］を使用して組換え産生され得る。さらなる実施形態では、改変されたまたは未改変の本開示のポリペプチドは、例えば、プロテアーゼ、例えば、トリプシン、サーモリシン、キモトリプシン、ペプシンまたは塩基性アミノ酸対変換酵素（paired basic amino acid converting enzyme）（ＰＡＣＥ）を使用した、組換え産生された全長ＢＭＰ１０プロペプチドポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＢＭＰＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ１ポリペプチドおよび／またはエンドグリンポリペプチドの消化によって産生され得る。コンピューター分析（市販のソフトウェア、例えば、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ、Ｏｍｅｇａ、ＰＣＧｅｎｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．を使用する）が、タンパク質分解性切断部位を同定するために使用され得る。
【０２０１】
３．ＢＭＰ１０プロペプチド、ＡｃｔＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１およびエンドグリンポリペプチドをコードする核酸
ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書に開示されるＡｃｔＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１、エンドグリンおよび／またはＢＭＰ１０プロペプチドポリペプチド（その断片、機能的バリアントおよび融合タンパク質を含む）をコードする単離されたおよび／または組換え核酸を提供する。例えば、配列番号１６は、天然に存在するヒトＢＭＰＲＩＩ前駆体ポリペプチドをコードし、配列番号１７は、ＢＭＰＲＩＩのプロセシングされた細胞外ドメインをコードする。対象核酸は、一本鎖または二本鎖であり得る。かかる核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子であり得る。これらの核酸は、例えば、本明細書に記載されるＡｃｔＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１、エンドグリンおよび／またはＢＭＰ１０プロペプチドポリペプチドを作製するための方法において使用され得る。
【０２０２】
本明細書で使用する場合、単離された核酸（複数可）は、その天然の環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、その核酸分子を通常含む細胞中に含まれた核酸分子を含むが、この核酸分子は、染色体外に存在する、またはその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。
【０２０３】
ある特定の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１、エンドグリンおよび／またはＢＭＰ１０プロペプチドポリペプチドをコードする核酸は、配列番号７、８、１２、１３、１６、１７、１９、２２、２３、２５、２７、３３、３５、５５、６１、６７、７０、７２、７９、８３、８６、１２４、１２５、１２６、１２７、１３４、１３５、１３６および１３７のいずれか１つ、ならびにそれらのバリアントを含むことが理解される。バリアントヌクレオチド配列は、対立遺伝子バリアントを含む、１つまたは複数のヌクレオチド置換、付加または欠失により異なる配列を含み、したがって、配列番号７、８、１２、１３、１６、１７、１９、２２、２３、２５、２７、３３、３５、５５、６１、６７、７０、７２、７９、８３、８６、１２４、１２５、１２６、１２７、１３４、１３５、１３６および１３７のいずれか１つで指定されたヌクレオチド配列とは異なるコード配列を含む。
【０２０４】
ある特定の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１、エンドグリンおよび／またはＢＭＰ１０プロペプチドポリペプチドは、配列番号７、８、１２、１３、１６、１７、１９、２２、２３、２５、２７、３３、３５、５５、６１、６７、７０、７２、７５、７９、８３、８６、１２４、１２５、１２６、１２７、１３４、１３５、１３６および１３７に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一な配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる単離されたまたは組換え核酸配列によってコードされる。当業者は、配列番号７、８、１２、１３、１６、１７、１９、２２、２３、２５、２７、３３、３５、５５、６１、６７、７０、７２、７９、８３、８６、１２４、１２５、１２６、１２７、１３４、１３５、１３６および１３７に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一な配列に対して相補的な配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる核酸配列もまた、本開示の範囲内であることを理解する。さらなる実施形態では、本開示の核酸配列は、単離され得、組換えであり得、および／もしくは異種ヌクレオチド配列と融合され得、またはＤＮＡライブラリー中にあり得る。
【０２０５】
他の実施形態では、本開示の核酸は、配列番号７、８、１２、１３、１６、１７、１９、２２、２３、２５、２７、３３、３５、５５、６１、６７、７０、７２、７９、８３、８６、１２４、１２５、１２６、１２７、１３４、１３５、１３６および１３７で指定されるヌクレオチド配列、またはその断片に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列もまた含む。当業者は、ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシーの条件が変動され得ることを容易に理解する。例えば、約４５℃で６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）におけるハイブリダイゼーションとその後の５０℃で２．０×ＳＳＣの洗浄を実施することができる。例えば、洗浄ステップにおける塩濃度は、５０℃で約２．０×ＳＳＣの低いストリンジェンシーから５０℃で約０．２×ＳＳＣの高いストリンジェンシーまでから選択され得る。さらに、洗浄ステップにおける温度は、室温、約２２℃における低いストリンジェンシーの条件から約６５℃における高いストリンジェンシーの条件まで増加され得る。温度および塩は共に変動され得、または温度もしくは塩濃度は、他の変量が変化されていても一定に維持され得る。一実施形態では、本開示は、室温で６×ＳＳＣの低いストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズし、その後室温で２×ＳＳＣで洗浄される核酸を提供する。
【０２０６】
配列番号７、８、１２、１３、１６、１７、１９、２２、２３、２５、２７、３３、３５、５５、６１、６７、７０、７２、７９、８３、８６、１２４、１２５、１２６、１２７、１３４、１３５、１３６および１３７で示される核酸とは、遺伝コードにおける縮重まで異なる単離された核酸もまた、本開示の範囲内である。例えば、いくつかのアミノ酸は、１つよりも多いトリプレットによって指定される。同じアミノ酸または同義語（例えば、ＣＡＵおよびＣＡＣは、ヒスチジンについて同義語である）を特定するコドンは、タンパク質のアミノ酸配列に影響しない「サイレント」変異を生じ得る。しかし、対象タンパク質のアミノ酸配列中に変化をもたらすＤＮＡ配列多型が哺乳動物細胞において存在すると予測される。当業者は、特定のタンパク質をコードする核酸の１つまたは複数のヌクレオチド（ヌクレオチドの最大で約３〜５％）におけるこれらのバリエーションが、天然の対立遺伝子バリエーションに起因して所与の種の個体において存在し得ることを理解する。ありとあらゆるかかるヌクレオチドバリエーションおよび得られたアミノ酸多型は、本開示の範囲内である。
【０２０７】
ある特定の実施形態では、本開示の組換え核酸は、発現構築物中の１つまたは複数の調節ヌクレオチド配列に作動可能に連結し得る。調節ヌクレオチド配列は一般に、発現のために使用される宿主細胞にとって適切である。多数の型の適切な発現ベクターおよび適切な調節配列が、種々の宿主細胞について当技術分野で公知である。典型的には、前記１つまたは複数の調節ヌクレオチド配列には、プロモーター配列、リーダーまたはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始および終結配列、翻訳開始および終結配列、ならびにエンハンサーまたはアクチベーター配列が含まれ得るがこれらに限定されない。当技術分野で公知の構成的または誘導性プロモーターが、本開示によって企図される。プロモーターは、天然に存在するプロモーター、または１つよりも多いプロモーターのエレメントを組み合わせるハイブリッドプロモーターのいずれかであり得る。発現構築物は、細胞中で、プラスミドなどのエピソーム上に存在し得、または発現構築物は、染色体中に挿入され得る。一部の実施形態では、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を可能にする選択可能なマーカー遺伝子を含む。選択可能なマーカー遺伝子は、当技術分野で周知であり、使用される宿主細胞によって変動することになる。
【０２０８】
本開示のある特定の態様では、対象核酸は、ＡｃｔＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１、エンドグリンおよび／またはＢＭＰ１０プロペプチドポリペプチドをコードし、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結したヌクレオチド配列を含む発現ベクター中で提供される。調節配列は、当技術分野で認識され、ＡｃｔＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１、エンドグリンおよび／またはＢＭＰ１０プロペプチドポリペプチドの発現を指示するために選択される。したがって、用語調節配列は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメントを含む。例示的な調節配列は、Goeddel；Gene Expression Technology：Methods in Enzymology、Academic Press、San Diego、CA（１９９０年）に記載されている。例えば、それに作動可能に連結したＤＮＡ配列の発現を制御する広範な種々の発現制御配列のいずれかが、ＡｃｔＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１、エンドグリンおよび／またはＢＭＰ１０プロペプチドポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現するために、これらのベクターにおいて使用され得る。かかる有用な発現制御配列には、例えば、ＳＶ４０の初期および後期プロモーター、ｔｅｔプロモーター、アデノウイルスまたはサイトメガロウイルス最初期プロモーター、ＲＳＶプロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣまたはＴＲＣ系、その発現がＴ７  ＲＮＡポリメラーゼによって指示されるＴ７プロモーター、ファージラムダの主要オペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖酵素のプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター、例えば、Ｐｈｏ５、酵母α−接合因子のプロモーター、バキュロウイルス系の多面体プロモーター、および原核もしくは真核細胞またはそれらのウイルスの遺伝子の発現を制御することが公知の他の配列、ならびにそれらの種々の組合せが含まれる。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞および／または発現されることが所望されるタンパク質の型の選択などの因子に依存し得ることを理解すべきである。さらに、ベクターのコピー数、そのコピー数を制御する能力、およびベクターによってコードされる任意の他のタンパク質、例えば抗生物質マーカーの発現もまた考慮すべきである。
【０２０９】
本開示の組換え核酸は、クローニングされた遺伝子またはその一部分を、原核細胞、真核細胞（酵母、トリ、昆虫または哺乳動物）、またはその両方のいずれかにおける発現に適したベクター中にライゲーションすることによって産生され得る。組換えＡｃｔＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１、エンドグリンおよび／またはＢＭＰ１０プロペプチドポリペプチドの産生のための発現ビヒクルには、プラスミドおよび他のベクターが含まれる。例えば、適切なベクターには、以下の型のプラスミドが含まれる：Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核細胞における発現のための、ｐＢＲ３２２由来プラスミド、ｐＥＭＢＬ由来プラスミド、ｐＥＸ由来プラスミド、ｐＢＴａｃ由来プラスミドおよびｐＵＣ由来プラスミド。
【０２１０】
一部の哺乳動物発現ベクターは、細菌中でのベクターの拡大増殖を促進するための原核生物配列、および真核細胞において発現される１つまたは複数の真核生物転写単位の両方を含む。ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＴｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ−ｎｅｏおよびｐＨｙｇ由来ベクターは、真核細胞のトランスフェクションに適した哺乳動物発現ベクターの例である。これらのベクターの一部は、原核細胞および真核細胞の両方における複製および薬物耐性選択を促進するために、ｐＢＲ３２２などの細菌プラスミド由来の配列で改変される。あるいは、ウイルス、例えば、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ−１）またはエプスタイン・バーウイルス（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ由来およびｐ２０５）の誘導体は、真核細胞におけるタンパク質の一過的発現のために使用され得る。他のウイルス（レトロウイルスを含む）発現系の例は、遺伝子治療送達系の説明において以下に見出され得る。プラスミドの調製および宿主生物の形質転換において使用される種々の方法は、当技術分野で周知である。原核細胞および真核細胞の両方に適した他の発現系、ならびに一般的組換え手順について［Molecular Cloning A Laboratory Manual、第３版、Sambrook、FritschおよびManiatis編、ColdSpring Harbor Laboratory Press、２００１年］。一部の場合には、バキュロウイルス発現系の使用によって組換えポリペプチドを発現させることが望ましい場合がある。かかるバキュロウイルス発現系の例には、ｐＶＬ由来ベクター（例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３およびｐＶＬ９４１）、ｐＡｃＵＷ由来ベクター（例えば、ｐＡｃＵＷ１）およびｐＢｌｕｅＢａｃ由来ベクター（例えば、β−ｇａｌ含有ｐＢｌｕｅＢａｃ  ＩＩＩ）が含まれる。
【０２１１】
好ましい実施形態では、Ｐｃｍｖ−Ｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）、ｐｃＤＮＡ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）およびｐＣＩ−ｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃ．）などのベクターは、ＣＨＯ細胞における対象ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩポリペプチドの産生のために設計される。明らかなように、対象遺伝子構築物は、精製のために、例えば、融合タンパク質またはバリアントタンパク質を含むタンパク質を産生するために、培養物中で拡大増殖した細胞において対象ＡｃｔＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１、エンドグリンおよび／またはＢＭＰ１０プロペプチドポリペプチドの発現を引き起こすために使用され得る。
【０２１２】
本開示は、対象ＡｃｔＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１、エンドグリンおよび／またはＢＭＰ１０プロペプチドポリペプチドのうち１種または複数種のコード配列を含む組換え遺伝子をトランスフェクトした宿主細胞にも関する。宿主細胞は、任意の原核細胞または真核細胞であり得る。例えば、ＡｃｔＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１、エンドグリンおよび／またはＢＭＰ１０プロペプチドポリペプチドは、細菌細胞、例えばＥ．ｃｏｌｉ、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現系を使用する）、酵母または哺乳動物細胞［例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株］において発現され得る。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。
【０２１３】
したがって、本開示は、対象ＡｃｔＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１、エンドグリンおよび／またはＢＭＰ１０プロペプチドポリペプチドを産生する方法にさらに関する。例えば、ＡｃｔＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１、エンドグリンおよび／またはＢＭＰ１０プロペプチドポリペプチドをコードする発現ベクターをトランスフェクトした宿主細胞は、ＡｃｔＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１、エンドグリンおよび／またはＢＭＰ１０プロペプチドポリペプチドの発現を生じさせるのに適した条件下で培養され得る。ポリペプチドは、分泌され得、細胞とこのポリペプチドを含む培地との混合物から単離され得る。あるいは、ＡｃｔＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１、エンドグリンおよび／またはＢＭＰ１０プロペプチドポリペプチドは、回収および溶解された細胞から取得された細胞質画分または膜画分から単離され得る。細胞培養物は、宿主細胞、培地および他の副産物を含む。細胞培養に適した培地は、当技術分野で周知である。対象ポリペプチドは、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動、ＡｃｔＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１、エンドグリンおよび／またはＢＭＰ１０プロペプチドポリペプチドの特定のエピトープに特異的な抗体を用いた免疫親和性精製、ならびにＡｃｔＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１、エンドグリンおよび／またはＢＭＰ１０プロペプチドポリペプチドに融合したドメインに結合する薬剤を用いた親和性精製（例えば、プロテインＡカラムは、ＡｃｔＲＩＩ−Ｆｃ、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ、ＡＬＫ１−Ｆｃ、エンドグリン−Ｆｃおよび／またはＢＭＰ１０プロペプチド−Ｆｃ融合タンパク質を精製するために使用され得る）を含む、タンパク質を精製するための当技術分野で公知の技術を使用して、細胞培養培地、宿主細胞、またはその両方から単離され得る。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１、エンドグリンおよび／またはＢＭＰ１０プロペプチドポリペプチドは、その精製を促進するドメインを含む融合タンパク質である。
【０２１４】
一部の実施形態では、精製は、例えば、以下：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよびカチオン交換クロマトグラフィーのうち３つまたはそれよりも多くを任意の順序で含む、一連のカラムクロマトグラフィーステップによって達成される。精製は、ウイルス濾過および緩衝液交換で完了され得る。ＡｃｔＲＩＩ−Ｆｃ、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ、ＡＬＫ１−Ｆｃ、エンドグリン−Ｆｃおよび／またはＢＭＰ１０プロペプチド−Ｆｃ融合タンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィーによって決定した場合には＞９０％、＞９５％、＞９６％、＞９８％または＞９９％の純度まで、ＳＤＳ  ＰＡＧＥによって決定した場合には＞９０％、＞９５％、＞９６％、＞９８％または＞９９％の純度まで精製され得る。純度の標的レベルは、哺乳動物系、特に、非ヒト霊長類、げっ歯類（マウス）およびヒトにおいて望ましい結果を達成するのに十分なレベルであるべきである。
【０２１５】
別の実施形態では、組換えＡｃｔＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１、エンドグリンおよび／またはＢＭＰ１０プロペプチドポリペプチドの所望の部分のＮ末端において精製リーダー配列、例えば、ポリ−（Ｈｉｓ）／エンテロキナーゼ切断部位配列をコードする融合遺伝子は、Ｎｉ２＋金属樹脂を使用するアフィニティクロマトグラフィーによる、発現された融合タンパク質の精製を可能にし得る。次いで、精製リーダー配列は引き続いて、精製されたＡｃｔＲＩＩ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１、エンドグリンおよび／またはＢＭＰ１０プロペプチドポリペプチドを提供するために、エンテロキナーゼによる処理によって除去され得る［Hochuliら（１９８７年）J. Chromatography ４１１巻：１７７頁；およびJanknechtら（１９９１年）PNAS USA ８８巻：８９７２頁］。
【０２１６】
融合遺伝子を作製するための技術は、周知である。本質的には、異なるポリペプチド配列をコードする種々のＤＮＡ断片の接続は、ライゲーションのための平滑末端または付着末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化、必要に応じた粘着末端の平滑化（filling-in）、望ましくない接続を回避するためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的ライゲーションを使用して、従来技術に従って実施される。別の実施形態では、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成機を含む従来技術によって合成され得る。あるいは、遺伝子断片のＰＣＲ増幅は、キメラ遺伝子配列を生成するために引き続いてアニーリングされ得る２つの連続する遺伝子断片間の相補的オーバーハングを生じるアンカープライマーを使用して実施され得る。例えば、Current Protocols in Molecular Biology、Ausubelら編、John Wiley & Sons：１９９２年を参照のこと。
【０２１７】
４．抗体アンタゴニスト
他の態様では、本開示は、抗体または抗体の組合せであるＢＭＰアンタゴニスト（阻害剤）に関する。ＢＭＰアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、例えば、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ５および／もしくはＢＭＰ３ｂまたは１種もしくは複数のＢＭＰ相互作用性受容体［例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＢＭＰＲＩＩおよびエンドグリン］に結合し得る。特に、本開示は、それを必要とする対象において所望の効果を達成する（例えば、心不全または心不全の１つもしくは複数の合併症を処置する）ために、ＢＭＰアンタゴニスト抗体またはＢＭＰアンタゴニスト抗体の組合せを、単独でまたは１種もしくは複数のさらなる支持療法および／もしくは活性薬剤と組み合わせて使用する方法を提供する。
【０２１８】
ある特定の態様では、本開示のＢＭＰアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＢＭＰ１０を阻害する抗体である。したがって、一部の実施形態では、ＢＭＰアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＢＭＰ１０に結合する。本明細書で使用する場合、ＢＭＰ１０抗体（抗ＢＭＰ１０抗体）は一般に、その抗体が、ＢＭＰ１０の標的化に際して診断剤および／または治療剤として有用であるように、十分な親和性でＢＭＰ１０に結合する抗体を指す。ある特定の実施形態では、無関係の非ＢＭＰ１０タンパク質への抗ＢＭＰ１０抗体の結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質−タンパク質相互作用もしくは結合親和性アッセイによって測定した場合、ＢＭＰ１０へのその抗体の結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ＢＭＰ１０抗体は、異なる種由来のＢＭＰ１０間で保存されたＢＭＰ１０のエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ＢＭＰ１０抗体は、ヒトＢＭＰ１０に結合する。他の好ましい実施形態では、抗ＢＭＰ１０抗体は、ＢＭＰ１０が同族Ｉ型受容体、ＩＩ型受容体または共受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１およびエンドグリン）に結合するのを阻害し得、したがって、これらの受容体を介したＢＭＰ１０媒介性シグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害し得る。ＢＭＰ１０は、ＢＭＰ９に対していくらかの配列相同性を有し、したがって、ＢＭＰ１０に結合する抗体はまた、一部の場合には、ＢＭＰ９に結合し得るおよび／またはＢＭＰ９を阻害し得ることに留意すべきである。一部の実施形態では、抗ＢＭＰ１０抗体は、１種もしくは複数のさらなるリガンド（例えば、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ５およびＢＭＰ３ｂ）に結合するならびに／または１種もしくは複数のＩ型受容体、ＩＩ型受容体および／もしくは共受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１およびエンドグリン）に結合する多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）である。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０抗体は、ＢＭＰ９にさらに結合する。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組合せ、ならびにその使用に関し、抗体のこの組合せは、抗ＢＭＰ１０抗体、ならびに例えば、異なるリガンド（例えば、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ５およびＢＭＰ３ｂ）に結合するならびに／または１種もしくは複数のＩ型受容体、ＩＩ型受容体および／もしくは共受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１およびエンドグリン）に結合する１種または複数種のさらなる抗体を含む。一部の実施形態では、抗ＢＭＰ１０抗体を含む組合せ抗体は、抗ＢＭＰ９抗体をさらに含む。好ましくは、ＢＭＰ１０抗体は、成熟ＢＭＰ１０ドメインに、ＢＭＰ１０プロペプチドと競合的に結合する。
【０２１９】
ある特定の態様では、本開示のＢＭＰアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＢＭＰ９を阻害する抗体である。したがって、一部の実施形態では、ＢＭＰアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＢＭＰ９に結合する。本明細書で使用する場合、ＢＭＰ９抗体（抗ＢＭＰ９抗体）は一般に、その抗体が、ＢＭＰ９の標的化に際して診断剤および／または治療剤として有用であるように、十分な親和性でＢＭＰ９に結合する抗体を指す。ある特定の実施形態では、無関係の非ＢＭＰ９タンパク質への抗ＢＭＰ９抗体の結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質−タンパク質相互作用もしくは結合親和性アッセイによって測定した場合、ＢＭＰ９へのその抗体の結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ＢＭＰ９抗体は、異なる種由来のＢＭＰ９間で保存されたＢＭＰ９のエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ＢＭＰ９抗体は、ヒトＢＭＰ９に結合する。他の好ましい実施形態では、抗ＢＭＰ９抗体は、ＢＭＰ９が同族Ｉ型受容体、ＩＩ型受容体または共受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１およびエンドグリン）に結合するのを阻害し得、したがって、これらの受容体を介したＢＭＰ９媒介性シグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害し得る。ＢＭＰ９は、ＢＭＰ１０に対していくらかの配列相同性を有し、したがって、ＢＭＰ９に結合する抗体はまた、一部の場合には、ＢＭＰ１０に結合し得るおよび／またはＢＭＰ１０を阻害し得ることに留意すべきである。一部の実施形態では、抗ＢＭＰ９抗体は、１種もしくは複数のさらなるリガンド［例えば、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ６、ＢＭＰ５およびＢＭＰ３ｂ］に結合するならびに／または１種もしくは複数のＩ型受容体、ＩＩ型受容体および／もしくは共受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１およびエンドグリン）に結合する多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）である。一部の実施形態では、ＢＭＰ９抗体は、ＢＭＰ１０にさらに結合する。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組合せ、ならびにその使用に関し、抗体のこの組合せは、抗ＢＭＰ９抗体、ならびに例えば、異なるリガンド（例えば、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ６、ＢＭＰ５およびＢＭＰ３ｂ）に結合するならびに／または１種もしくは複数のＩ型受容体、ＩＩ型受容体および／もしくは共受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１およびエンドグリン）に結合する１種または複数種のさらなる抗体を含む。一部の実施形態では、抗ＢＭＰ９抗体を含む組合せ抗体は、抗ＢＭＰ１０抗体をさらに含む。
【０２２０】
ある特定の態様では、本開示のＢＭＰアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＢＭＰ６を阻害する抗体である。したがって、一部の実施形態では、ＢＭＰアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＢＭＰ６に結合する。本明細書で使用する場合、ＢＭＰ６抗体（抗ＢＭＰ６抗体）は一般に、その抗体が、ＢＭＰ６の標的化に際して診断剤および／または治療剤として有用であるように、十分な親和性でＢＭＰ６に結合する抗体を指す。ある特定の実施形態では、無関係の非ＢＭＰ６タンパク質への抗ＢＭＰ６抗体の結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質−タンパク質相互作用もしくは結合親和性アッセイによって測定した場合、ＢＭＰ６へのその抗体の結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ＢＭＰ６抗体は、異なる種由来のＢＭＰ６間で保存されたＢＭＰ６のエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ＢＭＰ６抗体は、ヒトＢＭＰ６に結合する。他の好ましい実施形態では、抗ＢＭＰ６抗体は、ＢＭＰ６が同族Ｉ型受容体、ＩＩ型受容体または共受容体に結合するのを阻害し得、したがって、これらの受容体を介したＢＭＰ６媒介性シグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害し得る。一部の実施形態では、抗ＢＭＰ６抗体は、１種もしくは複数のさらなるリガンド（例えば、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ５およびＢＭＰ３ｂ）に結合するならびに／または１種もしくは複数のＩ型受容体、ＩＩ型受容体および／もしくは共受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１およびエンドグリン）に結合する多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）である。一部の実施形態では、ＢＭＰ６抗体は、ＢＭＰ９および／またはＢＭＰ１０にさらに結合する。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組合せ、ならびにその使用に関し、抗体のこの組合せは、抗ＢＭＰ６抗体、ならびに例えば、異なるリガンド（例えば、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ５およびＢＭＰ３ｂ）に結合するならびに／または１種もしくは複数のＩ型受容体、ＩＩ型受容体および／もしくは共受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１およびエンドグリン）に結合する１種または複数種のさらなる抗体を含む。一部の実施形態では、抗ＢＭＰ６抗体を含む組合せ抗体は、抗ＢＭＰ１０および／またはＢＭＰ９抗体をさらに含む。
【０２２１】
ある特定の態様では、本開示のＢＭＰアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＢＭＰ５を阻害する抗体である。したがって、一部の実施形態では、ＢＭＰアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＢＭＰ５に結合する。本明細書で使用する場合、ＢＭＰ５抗体（抗ＢＭＰ５抗体）は一般に、その抗体が、ＢＭＰ５の標的化に際して診断剤および／または治療剤として有用であるように、十分な親和性でＢＭＰ５に結合する抗体を指す。ある特定の実施形態では、無関係の非ＢＭＰ５タンパク質への抗ＢＭＰ５抗体の結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質−タンパク質相互作用もしくは結合親和性アッセイによって測定した場合、ＢＭＰ５へのその抗体の結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ＢＭＰ５抗体は、異なる種由来のＢＭＰ５間で保存されたＢＭＰ５のエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ＢＭＰ５抗体は、ヒトＢＭＰ５に結合する。他の好ましい実施形態では、抗ＢＭＰ５抗体は、ＢＭＰ５が同族Ｉ型受容体、ＩＩ型受容体または共受容体に結合するのを阻害し得、したがって、これらの受容体を介したＢＭＰ５媒介性シグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害し得る。一部の実施形態では、抗ＢＭＰ５抗体は、１種もしくは複数のさらなるリガンド（例えば、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６およびＢＭＰ３ｂ）に結合するならびに／または１種もしくは複数のＩ型受容体、ＩＩ型受容体および／もしくは共受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１およびエンドグリン）に結合する多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）である。一部の実施形態では、ＢＭＰ５抗体は、ＢＭＰ９および／またはＢＭＰ１０にさらに結合する。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組合せ、ならびにその使用に関し、抗体のこの組合せは、抗ＢＭＰ５抗体、ならびに例えば、異なるリガンド（例えば、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６およびＢＭＰ３ｂ）に結合するならびに／または１種もしくは複数のＩ型受容体、ＩＩ型受容体および／もしくは共受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１およびエンドグリン）に結合する１種または複数種のさらなる抗体を含む。一部の実施形態では、抗ＢＭＰ５抗体を含む組合せ抗体は、抗ＢＭＰ１０および／またはＢＭＰ９抗体をさらに含む。
【０２２２】
ある特定の態様では、本開示のＢＭＰアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＢＭＰ３ｂを阻害する抗体である。したがって、一部の実施形態では、ＢＭＰアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＢＭＰ３ｂに結合する。本明細書で使用する場合、ＢＭＰ３ｂ抗体（抗ＢＭＰ３ｂ抗体）は一般に、その抗体が、ＢＭＰ３ｂの標的化に際して診断剤および／または治療剤として有用であるように、十分な親和性でＢＭＰ３ｂに結合する抗体を指す。ある特定の実施形態では、無関係の非ＢＭＰ３ｂタンパク質への抗ＢＭＰ３ｂ抗体の結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質−タンパク質相互作用もしくは結合親和性アッセイによって測定した場合、ＢＭＰ３ｂへのその抗体の結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ＢＭＰ３ｂ抗体は、異なる種由来のＢＭＰ３ｂ間で保存されたＢＭＰ３ｂのエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ＢＭＰ３ｂ抗体は、ヒトＢＭＰ５に結合する。他の好ましい実施形態では、抗ＢＭＰ３ｂ抗体は、ＢＭＰ３ｂが同族Ｉ型受容体、ＩＩ型受容体または共受容体に結合するのを阻害し得、したがって、これらの受容体を介したＢＭＰ３ｂ媒介性シグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害し得る。一部の実施形態では、抗ＢＭＰ３ｂ抗体は、１種もしくは複数のさらなるリガンド（例えば、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６およびＢＭＰ５）に結合するならびに／または１種もしくは複数のＩ型受容体、ＩＩ型受容体および／もしくは共受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１およびエンドグリン）に結合する多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）である。一部の実施形態では、ＢＭＰ３ｂ抗体は、ＢＭＰ９および／またはＢＭＰ１０にさらに結合する。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組合せ、ならびにその使用に関し、抗体のこの組合せは、抗ＢＭＰ３ｂ抗体、ならびに例えば、異なるリガンド（例えば、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６およびＢＭＰ５）に結合するならびに／または１種もしくは複数のＩ型受容体、ＩＩ型受容体および／もしくは共受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１およびエンドグリン）に結合する１種または複数種のさらなる抗体を含む。一部の実施形態では、抗ＢＭＰ３ｂ抗体を含む組合せ抗体は、抗ＢＭＰ１０および／またはＢＭＰ９抗体をさらに含む。
【０２２３】
他の態様では、本開示のＢＭＰアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＡｃｔＲＩＩ受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）を阻害する抗体である。したがって、一部の実施形態では、ＢＭＰアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＡｃｔＲＩＩＡに結合するが、ＡｃｔＲＩＩＢには結合しないまたは実質的に結合しない（例えば、１×１０−７Ｍよりも大きいＫＤでＡｃｔＲＩＩＢに結合する、または比較的中程度の結合、例えば、約１×１０−８Ｍもしくは約１×１０−９Ｍを有する）。他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＡｃｔＲＩＩＢに結合するが、ＡｃｔＲＩＩＡには結合しないまたは実質的に結合しない（例えば、１×１０−７Ｍよりも大きいＫＤでＡｃｔＲＩＩＡに結合する、または比較的中程度の結合、例えば、約１×１０−８Ｍもしくは約１×１０−９Ｍを有する）。なお他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢに結合する。本明細書で使用する場合、ＡｃｔＲＩＩ抗体（抗ＡｃｔＲＩＩ抗体）は一般に、その抗体が、ＡｃｔＲＩＩの標的化に際して診断剤および／または治療剤として有用であるように、十分な親和性でＡｃｔＲＩＩ（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）に結合する抗体を指す。ある特定の実施形態では、無関係の非ＡｃｔＲＩＩタンパク質への抗ＡｃｔＲＩＩ抗体の結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質−タンパク質相互作用もしくは結合親和性アッセイによって測定した場合、ＡｃｔＲＩＩへのその抗体の結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ＡｃｔＲＩＩ抗体は、異なる種由来のＡｃｔＲＩＩ間で保存されたＡｃｔＲＩＩ（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）のエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ＡｃｔＲＩＩ抗体は、ヒトＡｃｔＲＩＩ（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）に結合する。他の好ましい実施形態では、抗ＡｃｔＲＩＩ抗体は、１種または複数種のリガンド（例えば、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６およびＢＭＰ５）がＡｃｔＲＩＩ（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）に結合するのを阻害し得る。ＡｃｔＲＩＩＡは、ＡｃｔＲＩＩＢに対して配列相同性を有し、したがって、ＡｃｔＲＩＩＡに結合する抗体はまた、一部の場合には、ＡｃｔＲＩＩＢに結合し得るおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢを阻害し得、逆もまたあてはまることに留意すべきである。一部の実施形態では、抗ＡｃｔＲＩＩ抗体は、ＡｃｔＲＩＩ（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）および１種または複数種のリガンド（例えば、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ５およびＢＭＰ３ｂ）に結合する多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）である。一部の実施形態では、抗ＡｃｔＲＩＩ抗体は、ＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢに結合する多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）である。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組合せ、ならびにその使用に関し、抗体のこの組合せは、少なくとも抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体および少なくともＡｃｔＲＩＩＢ抗体を含む。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組合せ、ならびにその使用に関し、抗体のこの組合せは、抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体、ならびに例えば、１種または複数種のリガンド（例えば、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６およびＢＭＰ５）、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１および／またはエンドグリンに結合する１種または複数種のさらなる抗体を含む。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組合せ、ならびにその使用に関し、抗体のこの組合せは、抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体、ならびに例えば、１種または複数種のリガンド（例えば、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６およびＢＭＰ５）、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１および／またはエンドグリンに結合する１種または複数種のさらなる抗体を含む。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組合せ、ならびにその使用に関し、抗体のこの組合せは、抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体、抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体、ならびに例えば、１種または複数種のリガンド（例えば、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６およびＢＭＰ５）、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１および／またはエンドグリンに結合する少なくとも１種または複数種のさらなる抗体を含む。
【０２２４】
他の態様では、本開示のＢＭＰアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＡＬＫ１を阻害する抗体である。したがって、一部の実施形態では、ＢＭＰアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＡＬＫ１に結合する。本明細書で使用する場合、ＡＬＫ１抗体（抗ＡＬＫ１抗体）は一般に、その抗体が、ＡＬＫ１の標的化に際して診断剤および／または治療剤として有用であるように、十分な親和性でＡＬＫ１に結合する抗体を指す。ある特定の実施形態では、無関係の非ＡＬＫ１タンパク質への抗ＡＬＫ１抗体の結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質−タンパク質相互作用もしくは結合親和性アッセイによって測定した場合、ＡＬＫ１へのその抗体の結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ＡＬＫ１抗体は、異なる種由来のＡＬＫ１間で保存されたＡＬＫ１のエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ＡＬＫ１抗体は、ヒトＡＬＫ１に結合する。他の好ましい実施形態では、抗ＡＬＫ１抗体は、１種または複数種のリガンド（例えば、ＢＭＰ１０およびＢＭＰ９）がＡＬＫ１に結合するのを阻害し得る。一部の実施形態では、抗ＡＬＫ１抗体は、ＡＬＫ１および１種または複数種のリガンド（例えば、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０）、ＢＭＰＲＩＩ、ＡｃｔＲＩＩ（ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）および／またはエンドグリンに結合する多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）である。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組合せ、ならびにその使用に関し、抗体のこの組合せは、抗ＡＬＫ１抗体、ならびに例えば、１種または複数種のリガンド（例えば、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０）、ＢＭＰＲＩＩ、ＡｃｔＲＩＩ（ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）および／またはエンドグリンに結合する１種または複数種のさらなる抗体を含む。
【０２２５】
他の態様では、本開示のＢＭＰアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＢＭＰＲＩＩを阻害する抗体である。したがって、一部の実施形態では、ＢＭＰアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＢＭＰＲＩＩに結合する。本明細書で使用する場合、ＢＭＰＲＩＩ抗体（抗ＢＭＰＲＩＩ抗体）は一般に、その抗体が、ＢＭＰＲＩＩの標的化に際して診断剤および／または治療剤として有用であるように、十分な親和性でＢＭＰＲＩＩに結合する抗体を指す。ある特定の実施形態では、無関係の非ＢＭＰＲＩＩタンパク質への抗ＢＭＰＲＩＩ抗体の結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質−タンパク質相互作用もしくは結合親和性アッセイによって測定した場合、ＢＭＰＲＩＩへのその抗体の結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ＢＭＰＲＩＩ抗体は、異なる種由来のＢＭＰＲＩＩ間で保存されたＢＭＰＲＩＩのエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ＢＭＰＲＩＩ抗体は、ヒトＢＭＰＲＩＩに結合する。他の好ましい実施形態では、抗ＢＭＰＲＩＩ抗体は、１種または複数種のリガンド（例えば、ＢＭＰ１０およびＢＭＰ９）がＢＭＰＲＩＩに結合するのを阻害し得る。一部の実施形態では、抗ＢＭＰＲＩＩ抗体は、ＢＭＰＲＩＩおよび１種または複数種のリガンド（例えば、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０）、ＡＬＫ１、ＡｃｔＲＩＩ（ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）および／またはエンドグリンに結合する多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）である。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組合せ、ならびにその使用に関し、抗体のこの組合せは、抗ＢＭＰＲＩＩ抗体、ならびに例えば、１種または複数種のリガンド（例えば、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０）、ＡＬＫ１、ＡｃｔＲＩＩ（ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）および／またはエンドグリンに結合する１種または複数種のさらなる抗体を含む。
【０２２６】
他の態様では、本開示のＢＭＰアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともエンドグリンを阻害する抗体である。したがって、一部の実施形態では、ＢＭＰアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともエンドグリンに結合する。本明細書で使用する場合、エンドグリン抗体（抗エンドグリン抗体）は一般に、その抗体が、エンドグリンの標的化に際して診断剤および／または治療剤として有用であるように、十分な親和性でエンドグリンに結合する抗体を指す。ある特定の実施形態では、無関係の非エンドグリンタンパク質への抗エンドグリン抗体の結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質−タンパク質相互作用もしくは結合親和性アッセイによって測定した場合、エンドグリンへのその抗体の結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満である。ある特定の実施形態では、抗エンドグリン抗体は、異なる種由来のエンドグリン間で保存されたエンドグリンのエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗エンドグリン抗体は、ヒトエンドグリンに結合する。他の好ましい実施形態では、抗エンドグリン抗体は、１種または複数種のリガンド（例えば、ＢＭＰ１０およびＢＭＰ９）がエンドグリンに結合するのを阻害し得る。一部の実施形態では、抗エンドグリン抗体は、エンドグリンおよび１種または複数種のリガンド（例えば、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０）、ＡＬＫ１、ＡｃｔＲＩＩ（ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）および／またはＢＭＰＲＩＩに結合する多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）である。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組合せ、ならびにその使用に関し、抗体のこの組合せは、抗エンドグリン抗体、ならびに例えば、１種または複数種のリガンド（例えば、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０）、ＡＬＫ１、ＡｃｔＲＩＩ（ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）および／またはＢＭＰＲＩＩに結合する１種または複数種のさらなる抗体を含む。
【０２２７】
用語抗体は、最も広い意味で本明細書で使用され、それらが所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）および抗体断片が含まれるがこれらに限定されない種々の抗体構造を包含する。抗体断片は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の部分を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ディアボディ（diabody）；直鎖抗体；単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；および抗体断片から形成される多特異性抗体が含まれるがこれらに限定されない。例えば、Hudsonら（２００３年）Nat. Med. ９巻：１２９〜１３４頁；Pluckthun、The Pharmacology of MonoclonalAntibodies、１１３巻、RosenburgおよびMoore編（Springer-Verlag、New York）、２６９〜３１５頁（１９９４年）；ＷＯ９３／１６１８５；ならびに米国特許第５，５７１，８９４号、同第５，５８７，４５８号および同第５，８６９，０４６号を参照のこと。本明細書に開示される抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。ある特定の実施形態では、本開示の抗体は、それに付加された、検出することができる標識を含む（例えば、標識は、放射性同位体、蛍光化合物、酵素または酵素補因子であり得る）。好ましい実施形態では、本開示の抗体は、単離された抗体である。
【０２２８】
ディアボディは、二価または二重特異性であり得る、２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ１９９３／０１１６１；Hudsonら（２００３年）Nat. Med. ９巻：１２９〜１３４頁（２００３年）；およびHollingerら（１９９３年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９０巻：６４４４〜６４４８頁を参照のこと。トリアボディ（triabody）およびテトラボディ（tetrabody）もまた、Hudsonら（２００３年）Nat. Med. ９巻：１２９〜１３４頁に記載されている。
【０２２９】
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全てもしくは一部分または軽鎖可変ドメインの全てもしくは一部分を含む抗体断片である。ある特定の実施形態では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である。例えば、米国特許第６，２４８，５１６号を参照のこと。
【０２３０】
抗体断片は、本明細書に記載されるような、インタクトな抗体のタンパク質分解性消化ならびに組換え宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたはファージ）による産生が含まれるがこれらに限定されない種々の技術によって作製され得る。
【０２３１】
本明細書の抗体は、任意のクラスのものであり得る。抗体のクラスは、その重鎖が有する定常ドメインまたは定常領域の型を指す。抗体には、５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭが存在し、これらのうちいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２へとさらに分割され得る。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマおよびミューと呼ばれる。
【０２３２】
一般に、本明細書に開示される方法における使用のための抗体は、好ましくは高い結合親和性で、その標的抗原に特異的に結合する。親和性は、ＫＤ値として表され得、（例えば、最小限の結合活性効果（avidity effect）を伴った）固有の結合親和性を反映する。典型的には、結合親和性は、無細胞設定であれ細胞関連設定であれ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定される。例えば、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）アッセイ）、放射能標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）およびＥＬＩＳＡを含む、本明細書に開示されるものを含む当技術分野で公知のいくつかのアッセイのいずれかが、結合親和性測定値を取得するために使用され得る。一部の実施形態では、本開示の抗体は、少なくとも、１×１０−７もしくはそれよりも強い、１×１０−８もしくはそれよりも強い、１×１０−９もしくはそれよりも強い、１×１０−１０もしくはそれよりも強い、１×１０−１１もしくはそれよりも強い、１×１０−１２もしくはそれよりも強い、１×１０−１３もしくはそれよりも強い、または１×１０−１４もしくはそれよりも強いＫＤで、それらの標的抗原［例えば、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ５、ＢＭＰ３ｂ、ＡｃｔＲＩＩ（ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１およびエンドグリン］に結合する。
【０２３３】
ある特定の実施形態では、ＫＤは、以下のアッセイによって記載されるように、Ｆａｂバージョンの目的の抗体およびその標的抗原を用いて実施されるＲＩＡによって測定される。抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性は、未標識の抗原の滴定シリーズの存在下で、Ｆａｂを最小濃度の放射能標識抗原（例えば、１２５Ｉ標識されたもの）で平衡化し、次いで、結合した抗原を抗Ｆａｂ抗体コートされたプレートで捕捉することによって測定される［例えば、Chenら（１９９９年）J. Mol. Biol. ２９３巻：８６５〜８８１頁を参照のこと］。アッセイのための条件を確立するために、マルチウェルプレート（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ（登録商標））は、捕捉性抗Ｆａｂ抗体（例えば、Ｃａｐｐｅｌ  Ｌａｂｓのもの）で（例えば、一晩）コートされ、引き続いて、好ましくは室温（例えば、およそ２３℃）で、ウシ血清アルブミンでブロッキングされる。非吸着プレートにおいて、放射能標識抗原は、目的のＦａｂの段階希釈と混合される［例えば、Prestaら（１９９７年）Cancer Res. ５７巻：４５９３〜４５９９頁における抗ＶＥＧＦ抗体Ｆａｂ−１２の評価と一致して］。次いで、目的のＦａｂは、好ましくは一晩インキュベートされるが、このインキュベーションは、平衡状態に達したことを確実にするために、より長い期間（例えば、約６５時間）にわたって継続し得る。その後、混合物は、好ましくは室温で約１時間のインキュベーションのために、捕捉プレートに移される。次いで、溶液が除去され、プレートは、好ましくはポリソルベート２０およびＰＢＳ混合物で、数回洗浄される。プレートが乾燥したところで、シンチラント（例えば、ＰａｃｋａｒｄのＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ（登録商標））が添加され、プレートは、ガンマカウンター（例えば、ＰａｃｋａｒｄのＴＯＰＣＯＵＮＴ（登録商標））でカウントされる。
【０２３４】
別の実施形態によれば、ＫＤは、例えば、約１０応答単位（ＲＵ）で固定化された抗原ＣＭ５チップを用いて、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）２０００またはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）３０００（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）を使用する表面プラズモン共鳴アッセイを使用して測定される。簡潔に述べると、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）が、供給業者の指示に従ってＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を用いて活性化される。例えば、抗原は、およそ１０応答単位（ＲＵ）のカップリングされたタンパク質を達成するために、５μｌ／分の流速での注入の前に、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８で５μｇ／ｍｌ（約０．２μＭ）に希釈され得る。抗原の注入後、１Ｍエタノールアミンを注入して、未反応の基をブロックする。速度論測定のために、Ｆａｂの２倍段階希釈（０．７８ｎＭ〜５００ｎＭ）が、およそ２５μｌ／分の流速で、０．０５％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標））界面活性剤を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中で注入される。会合速度（ｋｏｎ）および解離速度（ｋｏｆｆ）は、例えば、会合センサーグラムおよび解離センサーグラムを同時にフィッティングすることによって、単純一対一ラングミュア結合モデル（simple one-to-one Langmuir binding model）（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．２）を使用して計算される。平衡解離定数（ＫＤ）は、比ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算される［例えば、Chenら（１９９９年）J. Mol. Biol. ２９３巻：８６５〜８８１頁を参照のこと］。オンレート（on-rate）が、例えば、上記表面プラズモン共鳴アッセイによって１０６Ｍ−１ｓ−１を超える場合、オンレートは、分光計、例えば、ストップフローを備えた分光光度計（stop-flow equipped spectrophometer）（Ａｖｉｖ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）または撹拌キュベットを備えた８０００シリーズＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯ（登録商標）分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）で測定した場合の、漸増濃度の抗原の存在下で、ＰＢＳ中２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ形態）の蛍光発光強度（例えば、励起＝２９５ｎｍ；発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍバンドパス）の増加または減少を測定する蛍光クエンチ技術を使用することによって決定され得る。
【０２３５】
ヒトＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ５、ＢＭＰ３ｂ、ＡｃｔＲＩＩ（ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１およびエンドグリンの核酸およびアミノ酸配列は、当技術分野で周知であり、したがって、本開示に従う使用のための抗体アンタゴニストは、当技術分野の知識および本明細書で提供される教示に基づいて、当業者によって慣用的に作製され得る。
【０２３６】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、キメラ抗体である。キメラ抗体は、重鎖および／または軽鎖の一部分が特定の供給源または種に由来するが、重鎖および／または軽鎖の残部が異なる供給源または種に由来する、抗体を指す。ある特定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；およびMorrisonら（１９８４年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA、８１巻：６８５１〜６８５５頁に記載されている。一部の実施形態では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギまたは非ヒト霊長類、例えばサルに由来する可変領域）およびヒト定常領域を含む。一部の実施形態では、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のものから変化している、「クラススイッチされた」抗体である。一般に、キメラ抗体には、その抗原結合性断片が含まれる。
【０２３７】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるキメラ抗体は、ヒト化抗体である。ヒト化抗体は、非ヒト超可変領域（ＨＶＲ）由来のアミノ酸残基およびヒトフレームワーク領域（ＦＲ）由来のアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。ある特定の実施形態では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ここで、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全てまたは実質的に全ては、非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲの全てまたは実質的に全ては、ヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、必要に応じて、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部分を含み得る。抗体、例えば非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を受けた抗体を指す。
【０２３８】
ヒト化抗体およびそれを作製する方法は、例えば、AlmagroおよびFransson（２００８年）Front. Biosci. １３巻：１６１９〜１６３３頁で概説されており、例えば、Riechmannら（１９８８年）Nature ３３２巻：３２３〜３２９頁；Queenら（１９８９年）Proc. Nat'l Acad. Sci. USA ８６巻：１００２９〜１００３３頁；米国特許第５，８２１，３３７号、同第７，５２７，７９１号、同第６，９８２，３２１号および同第７，０８７，４０９号；Kashmiriら（２００５年）Methods ３６巻：２５〜３４頁［ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）移植を記載している］；Padlan、Mol. Immunol.（１９９１年）２８巻：４８９〜４９８頁（「表面再処理（resurfacing）」を記載している）；Dall'Acquaら（２００５年）Methods ３６巻：４３〜６０頁（「ＦＲシャッフリング」を記載している）；Osbournら（２００５年）Methods ３６巻：６１〜６８頁；ならびにKlimkaら、Br. J. Cancer（２０００年）８３巻：２５２〜２６０頁（ＦＲシャッフリングへの「ガイド選択（guided selection）」アプローチを記載している）にさらに記載されている。
【０２３９】
ヒト化のために使用され得るヒトフレームワーク領域には、「ベストフィット」法を使用して選択されるフレームワーク領域［例えば、Simsら（１９９３年）J. Immunol. １５１巻：２２９６頁を参照のこと］；軽鎖または重鎖可変領域の特定の下位群のヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域［例えば、Carterら（１９９２年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA、８９巻：４２８５頁；およびPrestaら（１９９３年）J. Immunol.、１５１巻：２６２３頁を参照のこと］；ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域またはヒト生殖系列フレームワーク領域［例えば、AlmagroおよびFransson（２００８年）Front. Biosci. １３巻：１６１９〜１６３３頁を参照のこと］；およびＦＲライブラリーをスクリーニングすることから誘導されたフレームワーク領域［例えば、Bacaら（１９９７年）J. Biol. Chem. ２７２巻：１０６７８〜１０６８４頁；およびRosokら（１９９６年）J. Biol. Chem. ２７１巻：２２６１１〜２２６１８頁を参照のこと］が含まれるがこれらに限定されない。
【０２４０】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野で公知の種々の技術を使用して産生され得る。ヒト抗体は、van Dijkおよびvan de Winkel（２００１年）Curr. Opin. Pharmacol. ５巻：３６８〜７４頁ならびにLonberg（２００８年）Curr. Opin. Immunol. ２０巻：４５０〜４５９頁に一般に記載されている。
【０２４１】
ヒト抗体は、免疫原［例えば、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ５、ＢＭＰ３ｂ、ＡｃｔＲＩＩ（ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１およびエンドグリン］を、抗原チャレンジに応答してインタクトなヒト抗体またはヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に投与することによって調製され得る。かかる動物は、典型的には、内因性免疫グロブリン遺伝子座を置き換える、または染色体外に存在するもしくは動物の染色体中にランダムに組み込まれる、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部分を含む。かかるトランスジェニック動物では、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、一般に、不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を取得するための方法の概説については、例えば、Lonberg（２００５年）Nat. Biotechnol. ２３巻：１１１７〜１１２５頁；米国特許第６，０７５，１８１号および同第６，１５０，５８４号（ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）テクノロジーを記載している）；米国特許第５，７７０，４２９号（ＨｕＭａｂ（登録商標）テクノロジーを記載している）；米国特許第７，０４１，８７０号（Ｋ−Ｍ  ＭＯＵＳＥ（登録商標）テクノロジーを記載している）；ならびに米国特許出願公開第２００７／００６１９００号（ＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）テクノロジーを記載している）を参照のこと。かかる動物によって生成されたインタクトな抗体由来のヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることによって、さらに改変され得る。
【０２４２】
本明細書で提供されるヒト抗体は、ハイブリドーマベースの方法によっても作製され得る。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株は、記載されている［例えば、Kozbor J. Immunol.（１９８４年）１３３巻：３００１頁；Brodeurら（１９８７年）Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications、５１〜６３頁、Marcel Dekker, Inc.、New York；およびBoernerら（１９９１年）J. Immunol.、１４７巻：８６頁を参照のこと］。ヒトＢ細胞ハイブリドーマテクノロジーを介して生成されるヒト抗体はまた、Liら（２００６年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA、１０３巻：３５５７〜３５６２頁に記載されている。さらなる方法には、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を記載している）およびNi、Xiandai Mianyixue（２００６年）２６巻（４号）：２６５〜２６８頁（２００６年）（ヒト−ヒトハイブリドーマを記載している）に記載されるものが含まれる。ヒトハイブリドーマテクノロジー（トリオーマ（Trioma）テクノロジー）はまた、VollmersおよびBrandlein（２００５年）Histol. Histopathol.、２０巻（３号）：９２７〜９３７頁（２００５年）ならびにVollmersおよびBrandlein（２００５年）Methods Find Exp. Clin. Pharmacol.、２７巻（３号）：１８５〜９１頁に記載されている。
【０２４３】
本明細書で提供されるヒト抗体は、ヒト由来ファージディスプレイライブラリーから選択されるＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによっても生成され得る。次いで、かかる可変ドメイン配列は、所望のヒト定常ドメインと組み合わされ得る。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択するための技術は、本明細書に記載されている。
【０２４４】
例えば、本開示の抗体は、所望の活性（単数または複数）を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離され得る。ファージディスプレイライブラリーを生成し、所望の結合特徴を有する抗体についてかかるライブラリーをスクリーニングするための種々の方法が、当技術分野で公知である。かかる方法は、例えば、Hoogenboomら（２００１年）、Methods in MolecularBiology １７８巻：１〜３７頁、O'Brienら編、HumanPress、Totowa、N.J.で概説されており、例えば、McCaffertyら（１９９１年）Nature ３４８巻：５５２〜５５４頁；Clacksonら（１９９１年）Nature ３５２巻：６２４〜６２８頁；Marksら（１９９２年）J. Mol. Biol. ２２２巻：５８１〜５９７頁；MarksおよびBradbury（２００３年）、Methods in Molecular Biology ２４８巻：１６１〜１７５頁、Lo編、Human Press、Totowa、N.J.；Sidhuら（２００４年）J. Mol. Biol. ３３８巻（２号）：２９９〜３１０頁；Leeら（２００４年）J. Mol. Biol. ３４０巻（５号）：１０７３〜１０９３頁；Fellouse（２００４年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA １０１巻（３４号）：１２４６７〜１２４７２頁；およびLeeら（２００４年）J. Immunol. Methods ２８４巻（１〜２号）：１１９〜１３２頁にさらに記載されている。
【０２４５】
ある特定のファージディスプレイ法では、ＶＨおよびＶＬ遺伝子のレパートリーは、Winterら（１９９４年）Ann. Rev. Immunol.、１２巻：４３３〜４５５頁に記載されるように、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって別々にクローニングされ、ファージライブラリー中でランダムに組換えられ、このライブラリーは次いで、抗原結合ファージについてスクリーニングされ得る。ファージは、典型的には、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片またはＦａｂ断片のいずれかとして、抗体断片をディスプレイする。免疫化された供給源由来のライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要なしに、免疫原［例えば、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ５、ＢＭＰ３ｂ、ＡｃｔＲＩＩ（ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１およびエンドグリン］に対する高親和性抗体を提供する。あるいは、ナイーブなレパートリーが、Griffithsら（１９９３年）EMBO J、１２巻：７２５〜７３４頁により記載されるように、いずれの免疫化もなしに、広範な非自己抗原およびまた自己抗原に対する抗体の単一の供給源を提供するために、（例えば、ヒトから）クローニングされ得る。最後に、ナイーブなライブラリーはまた、HoogenboomおよびWinter（１９９２年）J. Mol. Biol.、２２７巻：３８１〜３８８頁により記載されるように、再編成されていないＶ遺伝子セグメントを幹細胞からクローニングすること、および高度に可変性のＣＤＲ３領域をコードし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの再編成を達成するためのランダム配列を含むＰＣＲプライマーを使用することによって、合成により作製され得る。ヒト抗体ファージライブラリーを記載している特許公報には、例えば、米国特許第５，７５０，３７３号ならびに米国特許公開第２００５／００７９５７４号、同第２００５／０１１９４５５号、同第２００５／０２６６０００号、同第２００７／０１１７１２６号、同第２００７／０１６０５９８号、同第２００７／０２３７７６４号、同第２００７／０２９２９３６号および同第２００９／０００２３６０号が含まれる。
【０２４６】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、多特異性抗体、例えば、二重特異性抗体である。多特異性抗体（典型的にはモノクローナル抗体）は、１種または複数種の（例えば、２、３、４、５、６つまたはそれよりも多くの）抗原上の少なくとも２つの（例えば、２、３、４、５もしくは６つまたはそれよりも多くの）異なるエピトープに対する結合特異性を有する。
【０２４７】
「オクトパス抗体」を含む、３つまたはそれよりも多くの機能的抗原結合部位を有する操作された抗体もまた、本明細書に含まれる（例えば、ＵＳ２００６／００２５５７６Ａ１を参照のこと）。
【０２４８】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗体は、モノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、実質的に均一な抗体の集団から取得される抗体を指し、即ち、その集団を構成する個々の抗体は、例えば、天然に存在する変異を含むまたはモノクローナル抗体調製物の産生の間に生じる可能なバリアント抗体を除いて、同一でありおよび／または同じエピトープに結合し、かかるバリアントは、一般に、微量で存在する。異なるエピトープに対する異なる抗体を典型的には含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、ある抗原上の単一のエピトープに対するものである。したがって、修飾語「モノクローナル」は、抗体の特徴を、抗体の実質的に均一な集団から取得されるものとして示し、任意の特定の方法による抗体の産生を要求すると解釈すべきでない。例えば、本方法に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法が含まれるがこれらに限定されない種々の技術によって作製され得、かかる方法およびモノクローナル抗体を作製するための他の例示的な方法は、本明細書に記載されている。
【０２４９】
例えば、ＢＭＰ１０に由来する免疫原を使用することによって、抗タンパク質／抗ペプチド抗血清またはモノクローナル抗体は、標準的なプロトコールによって作製され得る［例えば、Antibodies: A Laboratory Manual（１９８８年）、HarlowおよびLane編、Cold Spring Harbor Pressを参照のこと］。哺乳動物、例えば、マウス、ハムスターまたはウサギは、免疫原性形態のＢＭＰ１０ポリペプチド、抗体応答を惹起することが可能な抗原性断片、または融合タンパク質で免疫化され得る。タンパク質またはペプチドに免疫原性を付与するための技術には、担体へのコンジュゲーションまたは当技術分野で周知の他の技術が含まれる。ＢＭＰ１０ポリペプチドの免疫原性部分は、アジュバントの存在下で投与され得る。免疫化の進行は、血漿または血清中の抗体力価の検出によってモニタリングされ得る。標準的なＥＬＩＳＡまたは他のイムノアッセイが、抗体産生のレベルおよび／または結合親和性のレベルを評価するために、抗原としての免疫原と共に使用され得る。
【０２５０】
ＢＭＰ１０の抗原性調製物による動物の免疫化後、抗血清が取得され得、必要に応じて、ポリクローナル抗体が、血清から単離され得る。モノクローナル抗体を産生するために、抗体産生細胞（リンパ球）が、免疫化された動物から回収され得、骨髄腫細胞などの不死化細胞と、標準的な体細胞融合手順によって融合されて、ハイブリドーマ細胞を生じ得る。かかる技術は、当技術分野で周知であり、これには、例えば、ハイブリドーマ技術［例えば、KohlerおよびMilstein（１９７５年）Nature、２５６巻：４９５〜４９７頁を参照のこと］、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術［例えば、Kozbarら（１９８３年）Immunology Today、４巻：７２頁を参照のこと］、およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術［Coleら（１９８５年）Monoclonal Antibodies and CancerTherapy、Alan R. Liss, Inc. ７７〜９６頁］が含まれる。ハイブリドーマ細胞は、ＢＭＰ１０ポリペプチドと特異的に反応性である抗体、およびかかるハイブリドーマ細胞を含む培養物から単離されたモノクローナル抗体の産生のために、免疫化学的にスクリーニングされ得る。
【０２５１】
ある特定の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸改変が、本明細書で提供される抗体のＦｃ領域中に導入され得、それによって、Ｆｃ領域バリアントを生成する。Ｆｃ領域バリアントは、１つまたは複数のアミノ酸位置にアミノ酸改変（例えば、置換、欠失および／または付加）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４Ｆｃ領域）を含み得る。
【０２５２】
例えば、本開示は、全てではないが一部のエフェクター機能を有する抗体バリアントを企図し、それによってその抗体バリアントは、抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期は重要であるが、ある特定のエフェクター機能［例えば、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）および抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）］が不要であるかまたは有害である適用のための望ましい候補になる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏ細胞毒性アッセイが、ＣＤＣおよび／またはＡＤＣＣ活性の低減／枯渇を確認するために実施され得る。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイは、抗体がＦｃγＲ結合を欠く（したがって、ＡＤＣＣ活性を欠いている可能性が高い）が、ＦｃＲｎ結合能を保持することを確実にするために実施され得る。ＡＤＣＣを媒介する主要な細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上でのＦｃＲ発現は、例えば、RavetchおよびKinet（１９９１年）Annu. Rev. Immunol. ９巻：４５７〜４９２頁にまとめられている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号；Hellstrom, I.ら（１９８６年）Proc. Nat'l Acad. Sci.USA ８３巻：７０５９〜７０６３頁；Hellstrom, Iら（１９８５年）Proc. Nat'l Acad. Sci. USA ８２巻：１４９９〜１５０２頁；米国特許第５，８２１，３３７号；およびBruggemann, M.ら（１９８７年）J. Exp. Med. １６６巻：１３５１〜１３６１頁に記載されている。あるいは、非放射活性アッセイ法が使用され得る（例えば、ＡＣＴＩ（商標）、フローサイトメトリーのための非放射活性細胞毒性アッセイ；ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆ．；およびＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）非放射活性細胞毒性アッセイ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）。かかるアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは、またはさらに、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Clynesら（１９９８年）Proc. Nat'l Acad. Sci. USA ９５巻：６５２〜６５６頁に開示されるものなどの動物モデルにおいて、ｉｎ  ｖｉｖｏで評価され得る。Ｃ１ｑ結合アッセイもまた、抗体がＣ１ｑに結合できず、したがってＣＤＣ活性を欠くことを確認するために実施され得る［例えば、ＷＯ２００６／０２９８７９およびＷＯ２００５／１００４０２中のＣ１ｑおよびＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照のこと］。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイが実施され得る［例えば、Gazzano-Santoroら（１９９６年）J. Immunol. Methods ２０２巻：１６３頁；Cragg, M. S.ら（２００３年）Blood １０１巻：１０４５〜１０５２頁；ならびにCragg, M. SおよびM. J. Glennie（２００４年）Blood １０３巻：２７３８〜２７４３頁を参照のこと］。ＦｃＲｎ結合およびｉｎ  ｖｉｖｏクリアランス／半減期の決定は、当技術分野で公知の方法を使用して実施することもできる［例えば、Petkova, S. B.ら（２００６年）Int. Immunol. １８巻（１２号）：１７５９〜１７６９頁を参照のこと］。
【０２５３】
低減されたエフェクター機能を有する本開示の抗体には、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７および３２９のうち１つまたは複数の置換を有する抗体が含まれる（米国特許第６，７３７，０５６号）。かかるＦｃ変異体には、残基２６５および２９７のアラニンへの置換を有するいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７および３２７のうち２つまたはそれよりも多くに置換を有するＦｃ変異体が含まれる（米国特許第７，３３２，５８１号）。
【０２５４】
ある特定の実施形態では、システイン操作された抗体、例えば、抗体の１つまたは複数の残基がシステイン残基で置換された「チオＭＡｂ」を創出することが望まれ得る。特定の実施形態では、置換された残基は、抗体のアクセス可能な部位に存在する。これらの残基をシステインで置換することによって、反応性チオール基を、抗体のアクセス可能な部位に位置させ、本明細書にさらに記載されるイムノコンジュゲートを創出するために、抗体を他の部分、例えば、薬物部分またはリンカー−薬物部分にコンジュゲートするために使用し得る。ある特定の実施形態では、以下の残基のうちいずれか１つまたは複数が、システインで置換され得る：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔ番号付け）；重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）；および重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。システイン操作された抗体は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号に記載されるように生成され得る。
【０２５５】
さらに、望ましい抗体を同定するために抗体をスクリーニングするために使用される技術は、取得された抗体の特性に影響し得る。例えば、抗体が溶液中の抗原を結合するために使用される場合、溶液結合を試験することが望まれ得る。特に望ましい抗体を同定するために抗体と抗原との間の相互作用を試験するために、種々の異なる技術が利用可能である。かかる技術には、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴結合アッセイ（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）結合アッセイ、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）、サンドイッチアッセイ（例えば、ＩＧＥＮ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍａｒｙｌａｎｄの常磁性ビーズシステム）、ウエスタンブロット、免疫沈降アッセイおよび免疫組織化学が含まれる。
【０２５６】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体および／または結合ポリペプチドのアミノ酸配列バリアントが企図される。例えば、抗体および／または結合ポリペプチドの結合親和性および／または他の生物学的特性を改善することが望まれ得る。抗体および／または結合ポリペプチドのアミノ酸配列バリアントは、その抗体および／もしくは結合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列中に適切な改変を導入することによって、またはペプチド合成によって調製され得る。かかる改変には、例えば、抗体および／または結合ポリペプチドのアミノ酸配列からの欠失、および／またはかかるアミノ酸配列中への挿入、および／またはかかるアミノ酸配列内の残基の置換が含まれる。欠失、挿入および置換の任意の組合せが、最終構築物が所望の特徴、例えば、標的結合（ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ５、ＢＭＰ３ｂ、ＡｃｔＲＩＩ（ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１およびエンドグリン結合）を有することを条件として、最終構築物に到達するために行われ得る。
【０２５７】
変更（例えば、置換）は、例えば、抗体親和性を改善するために、ＨＶＲにおいて行われ得る。かかる変更は、ＨＶＲ「ホットスポット」、即ち、体細胞成熟化プロセスの間に高い頻度で変異を受けるコドンによってコードされる残基（例えば、Chowdhury（２００８年）Methods Mol. Biol. ２０７巻：１７９〜１９６頁（２００８年）を参照のこと）、および／またはＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）において行われ得、得られたバリアントＶＨまたはＶＬは、結合親和性について試験される。二次ライブラリーを構築しそこから再選択することによる親和性成熟化は、当技術分野で記載されている［例えば、Hoogenboomら、Methods in Molecular Biology １７８巻：１〜３７頁、O'Brienら編、Human Press、Totowa、N.J.（２００１年）を参照のこと］。親和性成熟化の一部の実施形態では、多様性は、種々の方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャッフリングまたはオリゴヌクレオチド指定変異誘発）のいずれかによって、成熟化のために選択された可変遺伝子中に導入される。次いで、二次ライブラリーが創出される。次いで、ライブラリーは、所望の親和性を有する任意の抗体バリアントを同定するためにスクリーニングされる。多様性を導入するための別の方法は、いくつかのＨＶＲ残基（例えば、一度に４〜６残基）がランダム化されるＨＶＲ指向性アプローチを含む。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えば、アラニンスキャニング変異誘発またはモデル化を使用して具体的に同定され得る。特に、ＣＤＲ−Ｈ３およびＣＤＲ−Ｌ３が標的化される場合が多い。
【０２５８】
ある特定の実施形態では、置換、挿入または欠失は、かかる変更が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低減させない限り、１つまたは複数のＨＶＲ内に存在し得る。例えば、結合親和性を実質的に低減させない保存的変更（例えば、本明細書で提供される保存的置換）が、ＨＶＲにおいて行われ得る。かかる変更は、ＨＶＲ「ホットスポット」またはＳＤＲの外側にあり得る。上で提供されたバリアントＶＨおよびＶＬ配列のある特定の実施形態では、各ＨＶＲは、未変更であるか、または１、２もしくは３つ以下のアミノ酸置換を含むのいずれかである。
【０２５９】
変異誘発のために標的化され得る抗体および／または結合ポリペプチドの残基または領域の同定のための有用な方法は、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれ、CunninghamおよびWells（１９８９年）Science、２４４巻：１０８１〜１０８５頁に記載されている。この方法では、残基または標的残基の群（例えば、荷電残基、例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓおよびｇｌｕ）が同定され、抗体または結合ポリペプチドと抗原との相互作用が影響を受けるかどうかを決定するために、中性または負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニンまたはポリアラニン）によって置き換えられる。さらなる置換が、最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸位置において導入され得る。あるいは、またはさらに、抗原−抗体複合体の結晶構造が、抗体と抗原との間の接触点を同定するために使用され得る。かかる接触残基および隣接残基は、置換のための候補として標的化または排除され得る。バリアントは、所望の特性を含むかどうかを決定するためにスクリーニングされ得る。
【０２６０】
アミノ酸配列挿入には、１残基から１００またはそれよりも多くの残基を含むポリペプチドまでの長さ範囲のアミノ末端および／またはカルボキシル末端融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入バリアントには、酵素（例えば、ＡＤＥＰＴのため）または抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドへの、抗体のＮ末端またはＣ末端の融合が含まれる。
【０２６１】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体および／または結合ポリペプチドは、当技術分野で公知であり容易に利用可能なさらなる非タンパク質性部分を含むようにさらに改変され得る。抗体および／または結合ポリペプチドの誘導体化に適した部分には、水溶性ポリマーが含まれるがこれに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的な例には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、およびデキストランまたはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール（propropylene glycol）ホモポリマー、ポリプロピレンオキシド（prolypropyleneoxide）／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、ならびにそれらの混合物が含まれるがこれらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性に起因して、製造における利点を有し得る。ポリマーは、任意の分子量のものであり得、分枝していても分枝していなくてもよい。抗体および／または結合ポリペプチドに付加されるポリマーの数は、変動し得、１つよりも多いポリマーが付加される場合、これらは、同じまたは異なる分子であり得る。一般に、誘導体化のために使用されるポリマーの数および／または型は、改善される抗体および／または結合ポリペプチドの特定の特性または機能、抗体誘導体および／または結合ポリペプチド誘導体が規定された条件下で治療において使用されるかどうかが含まれるがこれらに限定されない検討事項に基づいて決定され得る。
【０２６２】
５．小分子アンタゴニスト
他の態様では、本開示は、小分子または小分子の組合せであるＢＭＰアンタゴニスト（阻害剤）に関する。ＢＭＰアンタゴニスト小分子は、１種もしくは複数のリガンド［例えば、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ５、およびＢＭＰ３ｂ］ならびに／または１種もしくは複数のＩ型受容体、ＩＩ型受容体、および／もしくは共受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１、およびエンドグリン）、ならびに／または１種もしくは複数の下流シグナル伝達成分（例えば、Ｓｍａｄ２および／もしくは３）を阻害し得る。特に、本開示は、それを必要とする対象において所望の効果を達成する（例えば、心不全または心不全の１つもしくは複数の合併症を処置する）ために、ＢＭＰアンタゴニスト小分子またはＢＭＰアンタゴニスト小分子の組合せを、単独で、または１種もしくは複数のさらなる支持療法および／もしくは活性薬剤と組み合わせて使用する方法を提供する。
【０２６３】
一部の実施形態では、ＢＭＰアンタゴニストは、少なくともＢＭＰ１０を阻害する小分子アンタゴニストまたは小分子アンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０を阻害する小分子アンタゴニストまたは小分子アンタゴニストの組合せは、１種もしくは複数のリガンド［例えば、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ５およびＢＭＰ３ｂ］、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１、エンドグリン、および／または１種もしくは複数のＳｍａｄ（例えば、Ｓｍａｄ２および３）をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＢＭＰアンタゴニストは、少なくともＢＭＰ９を阻害する小分子アンタゴニストまたは小分子アンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、ＢＭＰ９を阻害する小分子アンタゴニストまたは小分子アンタゴニストの組合せは、１種もしくは複数のリガンド［例えば、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ６、ＢＭＰ５およびＢＭＰ３ｂ］、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１、エンドグリン、ならびに／または１種もしくは複数のＳｍａｄ（例えば、Ｓｍａｄ２および３）をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＢＭＰアンタゴニストは、少なくともＢＭＰ６を阻害する小分子アンタゴニストまたは小分子アンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、ＢＭＰ６を阻害する小分子アンタゴニストまたは小分子アンタゴニストの組合せは、１種もしくは複数のリガンド［例えば、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ５およびＢＭＰ３ｂ］、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１、エンドグリン、ならびに／または１種もしくは複数のＳｍａｄ（例えば、Ｓｍａｄ２および３）をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＢＭＰアンタゴニストは、少なくともＢＭＰ５を阻害する小分子アンタゴニストまたは小分子アンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、ＢＭＰ５を阻害する小分子アンタゴニストまたは小分子アンタゴニストの組合せは、１種もしくは複数のリガンド［例えば、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ５およびＢＭＰ３ｂ］、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１、エンドグリン、ならびに／または１種もしくは複数のＳｍａｄ（例えば、Ｓｍａｄ２および３）をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＢＭＰアンタゴニストは、少なくともＢＭＰ３ｂを阻害する小分子アンタゴニストまたは小分子アンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、ＢＭＰ３ｂを阻害する小分子アンタゴニストまたは小分子アンタゴニストの組合せは、１種もしくは複数のリガンド［例えば、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、およびＢＭＰ５］、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１、エンドグリン、ならびに／または１種もしくは複数のＳｍａｄ（例えば、Ｓｍａｄ２および３）をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＢＭＰアンタゴニストは、少なくともＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢを阻害する小分子アンタゴニストまたは小分子アンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢを阻害する小分子アンタゴニストまたは小分子アンタゴニストの組合せは、１種もしくは複数のリガンド［例えば、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ５およびＢＭＰ３ｂ］、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１、エンドグリン、ならびに／または１種もしくは複数のＳｍａｄ（例えば、Ｓｍａｄ２および３）をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＢＭＰアンタゴニストは、少なくともＢＭＰＲＩＩを阻害する小分子アンタゴニスト、または小分子アンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、ＢＭＰＲＩＩを阻害する小分子アンタゴニストまたは小分子アンタゴニストの組合せは、１種もしくは複数のリガンド［例えば、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ５およびＢＭＰ３ｂ］、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ１、エンドグリン、および／または１種もしくは複数のＳｍａｄ（例えば、Ｓｍａｄ２および３）をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＢＭＰアンタゴニストは、少なくともＡＬＫ１を阻害する小分子アンタゴニストまたは小分子アンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、ＡＬＫ１を阻害する小分子アンタゴニストまたは小分子アンタゴニストの組合せは、１種もしくは複数のリガンド［例えば、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ５およびＢＭＰ３ｂ］、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＢＭＰＲＩＩ、エンドグリン、ならびに／または１種もしくは複数のＳｍａｄ（例えば、Ｓｍａｄ２および３）をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＢＭＰアンタゴニストは、少なくともエンドグリンを阻害する小分子アンタゴニストまたは小分子アンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、エンドグリンを阻害する小分子アンタゴニストまたは小分子アンタゴニストの組合せは、１種もしくは複数のリガンド［例えば、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ５およびＢＭＰ３ｂ］、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１、ならびに／または１種もしくは複数のＳｍａｄ（例えば、Ｓｍａｄ２および３）をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＢＭＰアンタゴニストは、少なくとも１種または複数種のＳｍａｄ（例えば、Ｓｍａｄ２および／または３）を阻害する小分子アンタゴニストまたは小分子アンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、Ｓｍａｄを阻害する小分子アンタゴニストまたは小分子アンタゴニストの組合せは、１種もしくは複数のリガンド［例えば、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ５およびＢＭＰ３ｂ］、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１、ならびに／またはエンドグリンをさらに阻害する。
【０２６４】
小分子アンタゴニストは、直接または間接阻害剤であり得る。例えば、間接小分子アンタゴニストまたは小分子アンタゴニストの組合せは、少なくとも１種もしくは複数のリガンド［例えば、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ５およびＢＭＰ３ｂ］、１種もしくは複数のＩ型受容体、ＩＩ型受容体および／もしくは共受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＢＭＰＲＩＩ、およびＡＬＫ）、１種もしくは複数の共受容体（エンドグリン）、ならびに／または１種もしくは複数の下流シグナル伝達成分（例えば、Ｓｍａｄ２および／もしくは３）の発現（例えば、転写、翻訳、細胞分泌、またはそれらの組合せ）を阻害し得る。あるいは、直接小分子ＢＭＰアンタゴニストまたは小分子アンタゴニストの組合せは、例えば、１種もしくは複数のリガンド［例えば、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ５およびＢＭＰ３ｂ］、１種もしくは複数のＩ型受容体、ＩＩ型受容体および／もしくは共受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＢＭＰＲＩＩ、およびＡＬＫ）、１種もしくは複数の共受容体（エンドグリン）、ならびに／または１種もしくは複数の下流シグナル伝達成分（例えば、Ｓｍａｄ２および／もしくは３）のうち１種または複数種と直接結合し得る。１種または複数種の間接小分子アンタゴニストと、１種または複数種の直接小分子アンタゴニストとの組合せが、本明細書において開示された方法に従って使用される場合がある。
【０２６５】
本開示の結合性有機小分子アンタゴニストは、公知の方法論（例えば、ＰＣＴ公報番号ＷＯ００／００８２３およびＷＯ００／３９５８５を参照されたい）を使用して同定および化学合成され得る。一般に、本開示の小分子アンタゴニストは、通常、サイズが約２０００ダルトン未満、あるいはサイズが約１５００、７５０、５００、２５０または２００ダルトン未満であり、ここで、かかる有機小分子は、本明細書に記載のポリペプチドと、好ましくは特異的に結合することが可能である。かかる小分子アンタゴニストは、過度の実験なしに周知の技術を使用して同定され得る。これについて、ポリペプチド標的と結合することが可能な分子について有機小分子ライブラリーをスクリーニングするための技術が当技術分野において周知であることが、留意される（例えば、国際特許公報番号ＷＯ００／００８２３およびＷＯ００／３９５８５を参照されたい）。
【０２６６】
本開示の結合性有機小分子は、例えば、アルデヒド、ケトン、オキシム、ヒドラゾン、セミカルバゾン、カルバジド、一級アミン、二級アミン、三級アミン、Ｎ置換ヒドラジン、ヒドラジド、アルコール、エーテル、チオール、チオエーテル、ジスルフィド、カルボン酸、エステル、アミド、尿素、カルバメート、カルボネート、ケタール、チオケタール、アセタール、チオアセタール、アリールハライド、アリールスルホネート、アルキルハライド、アルキルスルホネート、芳香族化合物、複素環化合物、アニリン、アルケン、アルキン、ジオール、アミノアルコール、オキサゾリジン、オキサゾリン、チアゾリジン、チアゾリン、エナミン、スルホンアミド、エポキシド、アジリジン、イソシアネート、スルホニルクロリド、ジアゾ化合物、および酸塩化物であり得る。
【０２６７】
６．ヌクレオチドアンタゴニスト
他の態様では、本開示は、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組合せであるＢＭＰアンタゴニスト（阻害剤）に関する。ＢＭＰアンタゴニストポリヌクレオチドは、１種もしくは複数のリガンド［例えば、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ５、およびＢＭＰ３ｂ］、１種もしくは複数のＩ型受容体、ＩＩ型受容体および／もしくは共受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１、およびエンドグリン）、ならびに／または１種もしくは複数の下流シグナル伝達成分（例えば、Ｓｍａｄ２および／もしくは３）を阻害し得る。特に、本開示は、それを必要とする対象において所望の効果を達成する（例えば、心不全または心不全の１つもしくは複数の合併症を処置するために、ＢＭＰアンタゴニストポリヌクレオチドまたはＢＭＰアンタゴニストポリヌクレオチドの組合せを、単独で、または１種もしくは複数のさらなる支持療法および／もしくは活性薬剤と組み合わせて使用する方法を提供する。
【０２６８】
一部の実施形態では、ＢＭＰアンタゴニストは、少なくともＢＭＰ１０を阻害するポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０を阻害するポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せは、１種もしくは複数のリガンド［例えば、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ５、およびＢＭＰ３ｂ］、１種もしくは複数のＩ型受容体、ＩＩ型受容体および／もしくは共受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１、およびエンドグリン）、ならびに／または１種もしくは複数の下流シグナル伝達成分（例えば、Ｓｍａｄ２および／もしくは３）をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＢＭＰアンタゴニストは、少なくともＢＭＰ９を阻害するポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、ＢＭＰ９を阻害するポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せは、１種もしくは複数のリガンド［例えば、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ６、ＢＭＰ５、およびＢＭＰ３ｂ］、１種もしくは複数のＩ型受容体、ＩＩ型受容体および／もしくは共受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１、およびエンドグリン）、ならびに／または１種もしくは複数の下流シグナル伝達成分（例えば、Ｓｍａｄ２および／もしくは３）をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＢＭＰアンタゴニストは、少なくともＢＭＰ６を阻害するポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、ＢＭＰ６を阻害するポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せは、１種もしくは複数のリガンド［例えば、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ５、およびＢＭＰ３ｂ］、１種もしくは複数のＩ型受容体、ＩＩ型受容体および／もしくは共受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１、およびエンドグリン）、ならびに／または１種もしくは複数の下流シグナル伝達成分（例えば、Ｓｍａｄ２および／もしくは３）をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＢＭＰアンタゴニストは、少なくともＢＭＰ５を阻害するポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、ＢＭＰ５を阻害するポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せは、１種もしくは複数のリガンド［例えば、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、およびＢＭＰ３ｂ］、１種もしくは複数のＩ型受容体、ＩＩ型受容体および／もしくは共受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１、およびエンドグリン）、ならびに／または１種もしくは複数の下流シグナル伝達成分（例えば、Ｓｍａｄ２および／もしくは３）をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＢＭＰアンタゴニストは、少なくともＢＭＰ３ｂを阻害するポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、ＢＭＰ３ｂを阻害するポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せは、１種もしくは複数のリガンド［例えば、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、およびＢＭＰ５］、１種もしくは複数のＩ型受容体、ＩＩ型受容体および／もしくは共受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１、およびエンドグリン）、ならびに／または１種もしくは複数の下流シグナル伝達成分（例えば、Ｓｍａｄ２および／もしくは３）をさらに阻害する。一部の実施形態では、少なくともＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢを阻害するＢＭＰアンタゴニストは、ポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢを阻害するポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せは、１種もしくは複数のリガンド［例えば、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ５、およびＢＭＰ３ｂ］、１種もしくは複数のＩ型受容体、ＩＩ型受容体および／もしくは共受容体（例えば、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１、およびエンドグリン）、ならびに／または１種もしくは複数の下流シグナル伝達成分（例えば、Ｓｍａｄ２および／もしくは３）をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＢＭＰアンタゴニストは、少なくともＢＭＰＲＩＩを阻害するポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、ＢＭＰＲＩＩを阻害するポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せは、１種もしくは複数のリガンド［例えば、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ５、およびＢＭＰ３ｂ］、１種もしくは複数のＩ型受容体、ＩＩ型受容体および／もしくは共受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ１、およびエンドグリン）、ならびに／または１種もしくは複数の下流シグナル伝達成分（例えば、Ｓｍａｄ２および／もしくは３）をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＢＭＰアンタゴニストは、少なくともＡＬＫ１を阻害するポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、ＡＬＫ１を阻害するポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せは、１種もしくは複数のリガンド［例えば、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ５、およびＢＭＰ３ｂ］、１種もしくは複数のＩ型受容体、ＩＩ型受容体および／もしくは共受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＢＭＰＲＩＩ、およびエンドグリン）、ならびに／または１種もしくは複数の下流シグナル伝達成分（例えば、Ｓｍａｄ２および／もしくは３）をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＢＭＰアンタゴニストは、少なくともエンドグリンを阻害するポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、エンドグリンを阻害するポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せは、１種もしくは複数のリガンド［例えば、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ５、およびＢＭＰ３ｂ］、１種もしくは複数のＩ型受容体、ＩＩ型受容体および／もしくは共受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＢＭＰＲＩＩ、およびＡＬＫ１）、ならびに／または１種もしくは複数の下流シグナル伝達成分（例えば、Ｓｍａｄ２および／もしくは３）をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＢＭＰアンタゴニストは、少なくとも１種または複数種のＳｍａｄ（例えば、Ｓｍａｄ２および／もしくは３を阻害するポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、１種または複数種のＳｍａｄを阻害するポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せは、１種もしくは複数のリガンド［例えば、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ５、およびＢＭＰ３ｂ］ならびに／または１種もしくは複数のＩ型受容体、ＩＩ型受容体および／もしくは共受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１、およびエンドグリン）をさらに阻害する。
【０２６９】
本開示のポリヌクレオチドアンタゴニストは、アンチセンス核酸、ＲＮＡｉ分子［例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）］、アプタマーおよび／またはリボザイムであり得る。ヒトＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ５、ＢＭＰ３ｂ、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１、エンドグリン、およびＳｍａｄ（例えば、Ｓｍａｄ２および３）の核酸配列およびアミノ酸配列は、当技術分野において公知であり、したがって、本開示の方法に従う使用のためのポリヌクレオチドアンタゴニストは、当技術分野における知識および本明細書において提供される教示に基づき当業者によって日常的に作製され得る。
【０２７０】
例えば、アンチセンス技術を使用して、アンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡにより、または三重らせん形成により遺伝子発現を制御することができる。アンチセンス技術は、例えば、Okano（１９９１年）J.Neurochem.５６巻：５６０頁；Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression、CRC Press、Boca Raton、Fla.（１９８８年）に論じられている。三重らせん形成は、例えば、Cooneyら（１９８８年）Science  ２４１巻：４５６頁；およびDervanら、（１９９１年）Science  ２５１巻：１３００頁に論じられている。これらの方法は、ポリヌクレオチドの相補性ＤＮＡまたはＲＮＡへの結合に基づく。一部の実施形態では、アンチセンス核酸は、所望の遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部分と相補的な一本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ配列を含む。しかし、絶対相補性は、好ましいものの、必要なわけではない。
【０２７１】
本明細書において言及される「ＲＮＡの少なくとも一部分に相補的な」配列は、ＲＮＡとハイブリダイズして安定な二重鎖を形成することができるために十分な相補性を有する配列を意味する。したがって、本明細書開示の遺伝子の二本鎖アンチセンス核酸の場合、二重鎖ＤＮＡの単一の鎖が試験される場合があり、または三重鎖形成がアッセイされる場合がある。ハイブリダイズする能力は、相補性の程度およびアンチセンス核酸の長さの両方に依存する。一般的に、ハイブリダイズする核酸が長いほど、それは、ＲＮＡとより多くの塩基ミスマッチを含有し、それでも安定な二重鎖（または場合によっては三重鎖）を形成する場合がある。当業者は、標準的な手順の使用によりミスマッチの許容度を確認して、ハイブリダイズした複合体の融点を決定することができる。
【０２７２】
メッセージの５’末端、例えば、ＡＵＧ開始コドンまでおよびそれを含む５’非翻訳配列と相補的なポリヌクレオチドは、翻訳を阻害するのに最も効率的に働くはずである。しかし、ｍＲＮＡの３’非翻訳配列と相補的な配列も、同様に、ｍＲＮＡの翻訳を阻害するのに有効であることが示されている［例えば、Wagner, R.、（１９９４年）Nature  ３７２巻：３３３〜３３５頁を参照されたい］。したがって、本開示の遺伝子の５’または３’のいずれかの非翻訳非コード領域に相補的なオリゴヌクレオチドをアンチセンスアプローチに使用して、内因性ｍＲＮＡの翻訳を阻害することができよう。ｍＲＮＡの５’非翻訳領域と相補的なポリヌクレオチドは、ＡＵＧ開始コドンの相補体を含むはずである。ｍＲＮＡコード領域と相補的なアンチセンスポリヌクレオチドは、翻訳のあまり効率的でない阻害物質であるが、本開示の方法に従って使用できよう。本開示のｍＲＮＡの５’非翻訳領域、３’非翻訳領域、またはコード領域のいずれにハイブリダイズするように設計されようと、アンチセンス核酸は、少なくとも６ヌクレオチド長であるべきであり、好ましくは６〜約５０ヌクレオチド長の範囲のオリゴヌクレオチドである。具体的な態様では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１７ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド、または少なくとも５０ヌクレオチドである。
【０２７３】
一実施形態では、本開示のアンチセンス核酸は、外因性配列からの転写により細胞内で生成される。例えば、ベクターまたはその一部分は、転写され、本開示の遺伝子のアンチセンス核酸（ＲＮＡ）を生成する。かかるベクターは、所望のアンチセンス核酸をコードする配列を含有する。かかるベクターは、それが転写されて所望のアンチセンスＲＮＡを生成できる限り、エピソーマルのままである、または染色体に組み込まれる場合がある。かかるベクターは、当技術分野において標準的な組換えＤＮＡ技術により構築することができる。ベクターは、脊椎動物細胞における複製および発現のために使用される、プラスミド、ウイルス、または当技術分野において公知のその他であり得る。本開示の所望の遺伝子をコードする配列またはその断片の発現は、当技術分野において脊椎動物、好ましくはヒト細胞において作用することが公知の任意のプロモーターによることができる。このようなプロモーターは、誘導性または構成的であり得る。かかるプロモーターには、ＳＶ４０初期プロモーター領域［例えば、BenoistおよびChambon（１９８１年）Nature  ２９巻：３０４〜３１０頁を参照されたい］、ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復配列中に含有されるプロモーター［例えば、Yamamotoら（１９８０年）Cell  ２２巻：７８７〜７９７頁を参照されたい］、ヘルペスチミジンプロモーター［例えば、Wagnerら（１９８１年）Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.７８巻：１４４１〜１４４５頁を参照されたい］、およびメタロチオネイン遺伝子の調節配列［例えば、Brinsterら（１９８２年）Nature  ２９６巻：３９〜４２頁を参照されたい］が含まれるが、これに限定されない。
【０２７４】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドアンタゴニストは、１種または複数種の遺伝子の発現を標的化する干渉性ＲＮＡまたはＲＮＡｉ分子である。ＲＮＡｉは、標的化ｍＲＮＡの発現を干渉するＲＮＡの発現を指す。具体的には、ＲＮＡｉは、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）を経由して特異的ｍＲＮＡを干渉することにより標的化遺伝子をサイレンシングする。次いで、ｄｓＲＮＡ複合体が、細胞による分解の標的にされる。ｓｉＲＮＡ分子は、１０〜５０ヌクレオチド長の二本鎖ＲＮＡ二重鎖であり、十分に相補的な（例えば遺伝子に対して少なくとも８０％の同一性の）標的遺伝子の発現を干渉する。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、標的遺伝子のヌクレオチド配列に対して少なくとも８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一なヌクレオチド配列を含む。
【０２７５】
さらなるＲＮＡｉ分子には、低分子干渉性ヘアピンとも呼ばれる低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）およびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が含まれる。ｓｈＲＮＡ分子は、標的遺伝子からのセンス配列とアンチセンス配列とがループにより接続されたものを含有する。ｓｈＲＮＡは、核から細胞質中に輸送され、ｍＲＮＡと共に分解される。Ｐｏｌ  ＩＩＩまたはＵ６プロモーターを使用して、ＲＮＡｉのためのＲＮＡを発現させることができる。Paddisonら［Genes & Dev.（２００２年）１６巻：９４８〜９５８頁、２００２年］は、ＲＮＡｉを引き起こすための手段としてヘアピンに折り畳まれた小ＲＮＡ分子を使用している。したがって、かかる低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子も、本明細書に記載の方法に有利に使用される。機能的ｓｈＲＮＡのステムおよびループの長さは様々であり、サイレンシング活性に影響せずに、ステムの長さは、約２５〜約３０ｎｔの任意の長さの範囲である場合があり、ループのサイズは、４〜約２５ｎｔの間の範囲である場合がある。任意の特定の理論に縛られることを望むわけではないが、これらのｓｈＲＮＡは、ＤＩＣＥＲ  ＲＮアーゼの二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）生成物に類似しており、いずれにせよ、特定の遺伝子の発現を阻害する同じ能力を有すると考えられる。ｓｈＲＮＡは、レンチウイルスベクターから発現し得る。ｍｉＲＮＡは、「ステム−ループ」構造によって特徴付けられるプレｍｉＲＮＡとして最初に転写され、その後ＲＩＳＣを経由するさらなるプロセシング後に成熟ｍｉＲＮＡにプロセシングされる、約１０〜７０ヌクレオチド長の一本鎖ＲＮＡである。
【０２７６】
ＲＮＡｉを媒介する、ｓｉＲＮＡを含むがこれに限定されない分子は、化学合成（Hohjoh、FEBS Lett ５２１巻：１９５〜１９９頁、２００２年）、ｄｓＲＮＡの加水分解（Yangら、Proc Natl Acad Sci USA ９９巻：９９４２〜９９４７頁、２００２年）により、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（Donzeetら、Nucleic Acids Res  ３０巻：ｅ４６頁、２００２年；Yuら、Proc Natl Acad Sci USA  ９９巻：６０４７〜６０５２頁、２００２年）、およびＥ．ｃｏｌｉ  ＲＮアーゼＩＩＩなどのヌクレアーゼを使用する二本鎖ＲＮＡの加水分解（Yangら、Proc Natl Acad Sci USA  ９９巻：９９４２〜９９４７頁、２００２年）により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成することができる。
【０２７７】
別の態様に従って、本開示は、デコイＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、複合ＤＮＡ、封入ＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、裸のＲＮＡ、封入ＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ＲＮＡ干渉を発生することが可能な分子、またはその組合せを含むがこれに限定されない、ポリヌクレオチドアンタゴニストを提供する。
【０２７８】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドアンタゴニストは、アプタマーである。アプタマーは、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ５、ＢＭＰ３ｂ、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ１、エンドグリン、およびＳｍａｄ（例えば、Ｓｍａｄ２および３）などの標的分子と結合し、これらの標的分子と特異的に結合する三次構造を形成する、二本鎖ＤＮＡ分子および一本鎖ＲＮＡ分子を含む核酸分子である。アプタマーの発生およびその治療的使用は、当技術分野において十分に確立されている。例えば、米国特許第５，４７５，０９６号を参照されたい。アプタマーに関するさらなる情報は、米国特許出願公開第２００６０１４８７４８号に見出すことができる。核酸アプタマーは、当技術分野において公知の方法を使用して、例えば試験管内進化（ＳＥＬＥＸ）プロセスを介して選択される。ＳＥＬＥＸは、例えば、米国特許第５，４７５，０９６号、同第５，５８０，７３７号、同第５，５６７，５８８号、同第５，７０７，７９６号、同第５，７６３，１７７号、同第６，０１１，５７７号、および同第６，６９９，８４３号に記載の、標的分子と高度に特異的な結合性を有する核酸分子のｉｎ  ｖｉｔｒｏ進化のための方法である。アプタマーを同定するための別のスクリーニング方法は、米国特許第５，２７０，１６３号に記載されている。ＳＥＬＥＸプロセスは、核酸が多様な二次元および三次元構造を形成する能力、ならびにモノマーであろうとポリマーであろうと、他の核酸分子およびポリペプチドを含む事実上任意の化学化合物に対してリガンドとして作用する（特異的結合対を形成する）ためにヌクレオチドモノマー内で利用可能な化学的多用途性に基づく。任意のサイズまたは組成の分子が標的として役立ち得る。ＳＥＬＥＸ法は、所望の結合親和性および選択性を獲得するために同じ一般的選択スキームを使用する、候補オリゴヌクレオチドの混合物からの選択ならびに結合、分割および増幅のステップ的な反復を伴う。ランダム配列のセグメントを含み得る核酸混合物から開始して、ＳＥＬＥＸ法は、結合に好都合な条件下で混合物を標的と接触させるステップ；標的分子と特異的に結合した核酸から未結合の核酸を分割するステップ；核酸−標的複合体を解離させるステップ；核酸−標的複合体から解離した核酸を増幅して、リガンドが富化された核酸混合物を産出するステップを含む。結合させるステップ、分割するステップ、解離させるステップおよび増幅するステップは、標的分子に対して高度に特異的な高親和性の核酸リガンドを産出するために、望むだけ多くのサイクルを経由して繰り返される。
【０２７９】
概して、かかる結合分子は、動物に別々に投与される［例えば、O'Connor（１９９１年）J. Neurochem.５６巻：５６０頁を参照されたい］が、かかる結合分子は、宿主細胞により取り込まれたポリヌクレオチドからｉｎ  ｖｉｖｏで発現されることも、ｉｎ  ｖｉｖｏで発現されることもできる［例えば、Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression、CRC Press、Boca Raton、Fla.（１９８８年）を参照されたい］。
【０２８０】
７．スクリーニングアッセイ
ある特定の態様では、本開示は、ＢＭＰアンタゴニストである化合物（薬剤）を同定するためのＢＭＰ１０プロペプチドの使用に関する。このスクリーニングにより同定された化合物を試験して、それらが心臓組織をモジュレートする能力を評価すること、およびそれらが組織変化をｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでモジュレートする能力を評価することができる。これらの化合物は、例えば動物モデルにおいて試験することができる。
【０２８１】
ＴＧＦβスーパーファミリーリガンドシグナル伝達（例えば、ＳＭＡＤシグナル伝達）を標的化することにより組織の成長をモジュレートするための治療剤についてスクリーニングするために、数多くのアプローチがある。ある特定の実施形態では、選択された細胞株に対するＴＧＦβスーパーファミリー受容体媒介効果を撹乱する薬剤を同定するために化合物の高スループットスクリーニングを実施することができる。ある特定の実施形態では、例えば、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ５、およびＢＭＰ３ｂを含む結合パートナーへのＢＭＰ１０プロペプチドの結合を特異的に阻害または低減する化合物をスクリーニングおよび同定するためにアッセイが実施される。あるいは、リガンドなどの結合パートナーへのＢＭＰ１０プロペプチドの結合を増強する化合物を同定するためにアッセイを使用することができる。さらなる実施形態では、化合物は、それらがＢＭＰ１０プロペプチドと相互作用する能力により同定することができる。
【０２８２】
多様なアッセイ形式が十分であり、本開示に照らして、本明細書に明白に記載されない形式が、それでも当業者により理解されるであろう。本明細書に記載されるように、本発明の試験化合物（薬剤）は、任意のコンビナトリアルケミストリー法により創出され得る。あるいは、対象化合物は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成される、天然に存在する生体分子であり得る。組織の成長のモジュレーターとして作用する能力について試験されるべき化合物（薬剤）は、例えば、細菌、酵母、植物または他の生物により生成される（例えば、天然生成物）、化学的に生成される（例えば、ペプチド模倣薬を含む小分子）、または組換え生成される場合がある。本発明により考えられる試験化合物には、非ペプチド有機分子、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣薬、糖、ホルモン、および核酸分子が含まれる。ある特定の実施形態では、試験薬剤は、約２，０００ダルトン未満の分子量を有する小有機分子である。
【０２８３】
本開示の試験化合物は、単一の別個の実体として提供される、またはコンビナトリアルケミストリーにより作製されるような、より大きい複雑さのライブラリーとして提供される場合がある。これらのライブラリーは、例えば、アルコール、アルキルハライド、アミン、アミド、エステル、アルデヒド、エーテルおよび他のクラスの有機化合物を含み得る。試験システムへの試験化合物の提示は、単離された形態で、または特に最初のスクリーニングステップでは化合物の混合物としてのいずれかであり得る。必要に応じて、化合物は、必要に応じて他の化合物を用いて誘導体化される場合があり、化合物の単離を容易にする誘導体化基を有する場合がある。誘導体化基の非限定的な例には、ビオチン、フルオレセイン、ジゴキシゲニン、緑色蛍光タンパク質、同位体、ポリヒスチジン、磁気ビーズ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、光活性化可能な架橋剤またはそれらの任意の組合せが含まれる。
【０２８４】
化合物および天然抽出物のライブラリーを試験する多くの薬物スクリーニングプログラムにおいて、所与の期間に調査される化合物の数を最大化するために、高スループットアッセイが望ましい。例えば精製または半精製タンパク質を用いて得られる場合があるような、無細胞システムで行われるアッセイは、試験化合物により媒介される分子標的における変化の迅速な進展および比較的容易な検出を可能にするために産生できるという点で、「一次」スクリーニングと称されることが多い。そのうえ、試験化合物の細胞毒性またはバイオアベイラビリティーの効果は、一般的に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏシステムでは無視することができ、その代わりに、アッセイは、ＢＭＰ１０プロペプチドと、例えば、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ５、およびＢＭＰ３ｂを含む結合パートナーとの間の結合親和性の変化に現れ得る、主として分子標的に及ぼす薬物の効果に焦点が当てられる。
【０２８５】
単に例証すると、本開示の例示的なスクリーニングアッセイにおいて、目的の化合物は、アッセイの目的のために必要に応じて、通常、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーリガンドと結合することが可能な単離および精製されたＢＭＰ１０プロペプチドと接触される。次いで、化合物とＢＭＰ１０プロペプチドとの混合物が、適切なリガンド（例えば、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ５、およびＢＭＰ３ｂ）を含有する組成物に添加される。ＢＭＰ１０プロペプチド−スーパーファミリーリガンド複合体の検出および定量は、ＢＭＰ１０プロペプチドとその結合タンパク質との間の複合体形成を阻害（または強化）することへの化合物の効力を決定するための手段を提供する。化合物の効力は、種々の濃度の試験化合物を使用して得られたデータから用量反応曲線を作製することにより評価することができる。そのうえ、対照アッセイも行って、比較のためのベースラインを提供することができる。例えば、対照アッセイでは、単離および精製されたリガンドが、ＢＭＰ１０プロペプチドを含有する組成物に添加され、ＢＭＰ１０プロペプチド−リガンド複合体の形成が、試験化合物の非存在下で定量される。一般に、反応物が混和され得る順序は様々である可能性があり、同時に混和できることが理解されるであろう。そのうえ、精製タンパク質の代わりに、細胞抽出物および溶解物を使用して適切な無細胞アッセイシステムにされる場合がある。
【０２８６】
ＢＭＰ１０プロペプチドの別のタンパク質との結合は、種々の技術により検出され得る。例えば、複合体形成のモジュレーションは、例えば放射性標識（例えば、３２Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃもしくは３Ｈ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ）、もしくは酵素標識ＢＭＰ１０プロペプチドなどの検出可能に標識されたタンパク質および／または結合タンパク質を使用して、イムノアッセイまたはクロマトグラフィー検出により定量することができる。
【０２８７】
ある特定の実施形態では、本開示は、ＢＭＰ１０プロペプチドと結合タンパク質との間の相互作用の程度を直接的または間接的のいずれかで測定することへの、蛍光偏光アッセイおよび蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）アッセイの使用を考えている。さらに、他の検出様式、例えば光導波路（ＰＣＴ公報ＷＯ９６／２６４３２および米国特許第５，６７７，１９６号）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、表面電荷センサー、および表面力センサーに基づくものが、本開示の多くの実施形態と適合する。
【０２８８】
そのうえ、本開示は、ＢＭＰ１０プロペプチドと結合パートナーとの間の相互作用を破壊または強化する薬剤を同定するために、「ツーハイブリッドアッセイ」としても公知の相互作用トラップアッセイの使用を考えている。例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；Zervosら（１９９３年）Cell  ７２巻：２２３〜２３２頁；Maduraら（１９９３年）J Biol Chem  ２６８巻：１２０４６〜１２０５４頁；Bartelら（１９９３年）Biotechniques  １４巻：９２０〜９２４頁；およびIwabuchiら（１９９３年）Oncogene  ８巻：１６９３〜１６９６頁）を参照されたい。具体的な実施形態では、本開示は、ＢＭＰ１０プロペプチドと結合タンパク質との間の相互作用を解離させる化合物（例えば、小分子またはペプチド）を同定するために逆ツーハイブリッドシステムの使用を考えている［VidalおよびLegrain、（１９９９年）Nucleic Acids Res  ２７巻：９１９〜２９頁；VidalおよびLegrain、（１９９９年）Trends Biotechnol  １７巻：３７４〜８１頁；ならびに米国特許第５，５２５，４９０号；同第５，９５５，２８０号；および同第５，９６５，３６８号］。
【０２８９】
ある特定の実施形態では、対象化合物は、それらがＢＭＰ１０プロペプチドと相互作用する能力により同定される。化合物とＢＭＰ１０プロペプチドとの間の相互作用は、共有結合的または非共有結合的であり得る。例えば、かかる相互作用は、光架橋、放射性リガンド結合、およびアフィニティークロマトグラフィーを含むｉｎ  ｖｉｔｒｏ生化学法を使用してタンパク質レベルで同定することができる［Jakoby WBら（１９７４年）Methods in Enzymology  ４６巻：１頁］。ある特定の場合、化合物は、ＢＭＰ１０プロペプチドと結合する化合物を検出するためのアッセイなどの、メカニズムベースのアッセイでスクリーニングされる場合がある。これは、固相または液相結合事象を含み得る。あるいは、レポーターシステム（例えば、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、または緑色蛍光タンパク質）を用いて、ＢＭＰ１０プロペプチドをコードする遺伝子を細胞中にトランスフェクトし、好ましくは高スループットスクリーニングによりライブラリーに対して、またはライブラリーの個別のメンバーを用いてスクリーニングすることができる。他のメカニズムベースの結合アッセイ、例えば、自由エネルギーの変化を検出する結合アッセイが使用される場合がある。結合アッセイは、ウェル、ビーズもしくはチップに固定された標的を用いて行う、または固定化抗体により捕捉する、またはキャピラリー電気泳動により分割することができる。結合した化合物は、通常、比色エンドポイントまたは蛍光または表面プラズモン共鳴を使用して検出され得る。
【０２９０】
８．例示的な治療的使用
本明細書に記載されるように、ＢＭＰアンタゴニストが心不全の種々の編集物の処置および予防に対して驚くべき効果を有することが発見されている。例えば、可溶性ＢＭＰ１０プロペプチド（ＢＭＰ１０ｐｒｏ）ポリペプチドは、心肥大、心リモデリング、および心線維症を予防するため、またはその重症度を低減させるため、ならびに横行大動脈縮窄術（ＴＡＣ）心不全モデルにおいて心機能を改善するために使用できることが示された。そのうえ、ＢＭＰ１０ｐｒｏ処置は、心不全患者の生存期間を増加させた。ＢＭＰ１０ｐｒｏ処置の類似の有益効果は、心筋梗塞症（ＭＩ）心臓疾患モデルで観察された。そのうえ、ＢＭＰ１０およびＢＭＰ９と結合する可溶性エンドグリンポリペプチドも、ＴＡＣおよびＭＩ心不全モデルの両方でプラス効果を示した。したがって、本開示は、一部では、心不全を処置、予防、またはその重症度を低減させる、特に心不全（例えば、心肥大、心リモデリング、および心線維症）の１種または複数種の合併症を処置、予防、またはその重症度を低減させる、ならびに心不全患者の心機能を改善し、生存期間を増加させるために、ＢＭＰアンタゴニストを単独でまたは１種もしくは複数のさらなる支持療法および／もしくはさらなる活性薬剤と組み合わせて使用する方法を提供する。
【０２９１】
本明細書で使用される、障害または状態を「予防する」治療薬は、統計試料において未処置対照試料と比べて処置試料における障害もしくは状態の発生率を低減させる、または未処置対照試料と比べて障害または状態の発生を遅延させる化合物を指す。本明細書で使用される、「処置する」という用語は、状態が確立した後のその回復または消失を含む。いずれの場合も、予防または処置は、医師または他の医療提供者により提供される診断および治療剤の投与の意図される結果で識別され得る。
【０２９２】
一般に、本開示に記載されるような疾患または状態の処置または予防は、１種または複数種のＢＭＰアンタゴニストを有効量で投与することにより達成される。薬剤の有効量は、所望の治療結果または予防結果を達成するために必要な投薬量および期間で有効な量を指す。本開示の薬剤の治療有効量は、個体の病状、年齢、性別、および体重、ならびに薬剤が個体において所望の応答を誘発する能力などの要因に応じて様々であり得る。予防有効量は、所望の予防結果を達成するために必要な投薬量および期間で有効な量を指す。
【０２９３】
心不全は、心臓のある特定の構造または機能的異常に起因する典型的な症状および徴候により定義される臨床症候群である（ESC Guidelines for the diagnosis and treatment of acute and chronicheart failure.  McMurray J Jら、EuropeanHeart Journal  ２０１２年、１４巻（８号）：８０３〜６９頁；2013 ACCF/AHAGuideline for the Management of Heart Failure、Yanzy C Wら、Circulation  ２０１３年、１２８巻、ｅ２４０〜ｅ３２７頁）。例えば、心臓の異常は、血液を充満もしくは駆出する能力の機能障害をもたらし、かつ／または充満圧が正常であっても代謝を行っている組織の要求に見合う十分な酸素を送達できない、もしくは充満圧を増加させることと引き換えにしか送達できないこととなる場合がある。本明細書で使用される、心不全という用語は、左心室機能不全による心不全、正常な駆出率を有する心不全、大動脈狭窄による心不全、急性心不全、慢性心不全、うっ血性心不全、先天性心不全、代償性心不全、非代償性心不全、拡張期心不全、収縮期心不全、右心（室）不全、左心（室）不全、両室心不全、前方心不全、後方心不全、高拍出性心不全、低拍出性心不全が含まれるがこれに限定されない、多様な心血管状態を包含する。心不全には、心筋浮腫などの心臓における体液蓄積に関する心臓の状態も含まれる。
【０２９４】
一般に、心不全の臨床症状発現には、例えば、呼吸困難（息切れ）、起座呼吸、発作性夜間呼吸困難、および疲労（運動耐容能を制限し得る）、体液貯留（これは、例えば、肺うっ血および末梢浮腫をもたらし得る）、狭心症、高血圧、不整脈、心室性不整脈、心筋症、心肥大、心臓喘息、夜間多尿症、腹水貯留、うっ血性肝障害、凝固障害、腎血流低減、腎機能不全、心筋梗塞、および脳卒中が含まれる。
【０２９５】
「うっ血性心不全」という語句は、上記の種類を含む全ての種類の心不全を記載するために使用されることが多いものの、うっ血性心不全は、肺での肺うっ血または体液蓄積に関係する心不全の症状をより的確に描写している。このうっ血は、収縮期および左心不全のより一般的な症状である。肺系統の効率が低下するにつれ、心臓のインプット側近くの血液体積増加が、肺毛細血管と肺の肺胞腔との間の界面である肺胞−動脈界面の圧を変化させる。この界面での圧変化は、血漿を肺内の肺胞腔中に押し出す。呼吸困難および全身疲労は、うっ血性心不全の典型的な知覚される症状発現である。
【０２９６】
心不全を分類するために多数の異なる方法がある。例えば、心不全は、該当する心臓の側（左心不全に対して右心不全）に基づき特徴付けられる場合がある。右心不全は、肺への肺血流を損なう。左心不全は、身体および脳への大動脈血流を損なう。混ざった症状（mixed presentation）が一般的であり；左心不全は、しばしば、より長期で右心不全をもたらす。心不全は、また、異常が収縮不十分（収縮機能不全；収縮期心不全）、または心臓の弛緩不十分（拡張機能不全；拡張期心不全）、またはその両方が原因であるかどうかで分類される場合がある。加えて、心不全は、問題が、主として静脈の後方圧増加（前負荷）、または十分な動脈灌流を供給できないこと（後負荷）であるかで分類される場合がある。心不全は、異常が高い全身血管抵抗を有する低い心拍出量または低い血管抵抗を有する高い心拍出量（低拍出量心不全に対する高拍出量心不全）が原因であるかどうかで分類され得る。また、心不全は、共存する病気、例えば、心不全／全身性高血圧、心不全／肺高血圧、心不全／糖尿病、および心不全／腎不全症の程度に基づき分類され得る。
【０２９７】
さらに、心不全は、心臓異常により付与される機能障害の程度に基づき分類され得る。機能分類は、一般的にＮｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＮＹＨＡ）機能分類に依拠する。クラス（Ｉ〜ＩＶ）は、以下の通りである：クラスＩ：いかなる活動にも制限はない；通常の活動で症状を生じない；クラスＩＩ：活動のわずかな軽度の制限；患者は安静時または軽度の労作で無症状；クラスＩＩＩ：任意の活動で顕著な制限；患者は安静時にのみ無症状；およびクラスＩＶ：いかなる身体活動も不快感を起こさせ、安静時にも症状が起こる。このスコアは、症状の重症度を記述し、処置に対する応答を評価するために使用することができる。
【０２９８】
Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ／Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＡＣＣ）ワーキンググループは、その２００１年ガイドラインにおいて心不全の４つのステージを導入した［例えば、Hunt, S.、「ACC/AHA 2005 Guideline Update forthe Diagnosis and Management of Chronic Heart Failure in the Adult: A Report ofthe American College of Cardiology/American Heart Association Task Force onPractice Guidelines (Writing Committee to Update the 2001 Guidelines for theEvaluation and Management of Heart Failure)」、J. Am,Coll. Cardiol、４６巻：ｅ１〜ｅ８２頁（２００５年を参照されたい］。第１ステージであるステージＡは、心不全の高いリスクがあるが、器質的心臓疾患も心不全の症状もない対象である（例えばこれらは、高血圧、動脈硬化性疾患、糖尿病、肥満、メタボリックシンドロームを有する患者または心臓毒を使用している患者である）。第２ステージであるステージＢは、器質的心臓疾患を有するが、心不全の徴候も症状もない対象である（例えば、これらは、以前に心筋梗塞を経験したことがあり、肥大および低駆出率を含む心リモデリングを示す患者、ならびに無症候性弁膜症のある患者である）。第３ステージであるステージＣは、器質的心臓疾患を有し、心不全の以前または現在の症状がある対象である（例えば、これらは、器質的心臓疾患を有することが分かっており、息切れおよび疲労を示し、運動耐容能が低減した患者である）。第４最終ステージであるステージＤは、専門的な介入を要する治療抵抗性心不全である（例えば、最大限の医学治療にもかかわらず安静時に顕著な症状を有する患者（すなわち、入院を繰り返す、または専門的な介入なしに病院から安全に退院できない患者）。ＡＣＣステージ分類システムは、ステージＡが「心不全前」（処置による介入が明らかな症状への進行をおそらく予防できるステージ）を包含する点で有用である。ＡＣＣのステージＡは、対応するＮＹＨＡクラスを有さない。ＡＣＣのステージＢは、ＮＹＨＡのクラスＩに対応するであろう。ＡＣＣのステージＣは、ＮＹＨＡのクラスＩＩおよびＩＩＩに対応するのに対し、ＡＣＣのステージＤは、ＮＹＨＡのクラスＩＶと一部重複する。
【０２９９】
通常、心不全の臨床徴候に先行する心リモデリングは、一般的に心臓負荷または心傷害に起因して、心臓のサイズ、形状および機能の変化として臨床的に現れる、分子、細胞および／または間質の変化を指す（Cohn J Nら、JACC  ２０００年．３５巻（３号）：５６９〜８２頁）。心リモデリングのトリガーには、例えば、心筋梗塞、高血圧、壁ストレス、炎症、圧負荷、および容量負荷が含まれる。心筋構造の変更が、傷害の数時間以内と急速に起こる可能性があり、数ヶ月および数年にわたり進行する場合がある。これらの変化は、最初は有益であるものの、時間と共に（数ヶ月〜数年で）、慢性難治性心不全のポイントまで心筋機能の機能障害をもたらす可能性がある。心リモデリングの特徴には、例えば、心腔拡張、心室真球度における増加、ならびに間質および血管周囲線維症の発生が含まれる。増加した真球度は、僧帽弁逆流と正の関連性がある。心室拡張は、主に心筋細胞の肥大および伸長、ならびに程度は少ないものの心室質量における増加に起因する。
【０３００】
一部の実施形態では、本開示のＢＭＰアンタゴニストは、心リモデリングを処置、予防、またはその進行を低減させるために使用される場合がある。例えば、ＢＭＰアンタゴニストは、対象における心臓の心筋構造を維持するまたは心筋構造の変更を減少させるために使用される場合がある。心リモデリングの進行は、第１の群（処置群）が本発明の方法により処置され、第２の群（プラセボ群）が、本発明の方法による処置と置き換えてまたはその代わりにプラセボを使用することにより処置される２群の対象の間で、ある期間にわたり心臓の心筋構造における変更を比較することにより評価することができる。処置群の対象における心臓の心筋構造の変更が、プラセボ群の対象における心臓の心筋構造の変更よりも小さいならば、心リモデリングの進行が低減したという判定が下される。心リモデリングなどの疾患の進行または発生を判定するための方法は、例えば、身体検査、ドップラーフロー併用二次元心エコー試験、超音波、ＭＲＩ、コンピューター断層撮影、心カテーテル、放射性核種イメージング（放射性核種心室造影など）およびそれらの任意の組合せを含む、周知の方法を使用して評価することができる。
【０３０１】
一般に、心リモデリングおよび心不全は、心仕事負荷または心傷害に持続的増加を引き起こす障害および状態に起因する。心不全をもたらす障害および状態には、例えば、心筋梗塞後の生存可能な心筋の喪失、冠動脈疾患、高血圧、心筋症（例えば、拡張型心筋症、感染症またはアルコール／薬物乱用からの心筋症など）、例えば、大動脈弁疾患（例えば、大動脈弁閉鎖不全、大動脈弁逆流、および大動脈狭窄（大動脈弁狭窄））を含む心臓弁疾患および機能不全、肺障害（例えば、肺高血圧）、先天性心臓欠損、急性虚血傷害、再灌流傷害、心膜障害および異常、心筋障害、大血管障害、心内膜障害、心房細動、左心室心筋機能障害、右心室心筋機能障害、心不整脈、甲状腺疾患、腎疾患、糖尿病、心筋が十分な血液を送出できないままにする心筋の衰弱、甲状腺疾患、神経ホルモン不均衡、ウイルス感染、ならびに貧血が含まれる。かかる障害および状態は、心リモデリングおよび／または心不全をもたらすおそれがあるので、これらの状態のうち１つまたは複数を有するまたは有する疑いのある対象は、本発明に従って心リモデリングおよび／または心不全を処置するための１種または複数種のさらなる活性薬剤または支持療法と必要に応じて組み合わせた、１種または複数種のＢＭＰアンタゴニストを用いた処置に好ましい対象である。一部の実施形態では、たとえ基礎となる病因を検出できない場合であっても、心リモデリング（例えば、心筋肥大および心室拡張）の徴候または明白な心不全を有する対象も、本開示に従う処置に適している。さらなる心リモデリングを予防するまたは既存の心リモデリングを処置するまたは心リモデリングを低減させることがこれらの対象において有益であるからである。一部の実施形態では、心リモデリングおよび／または心不全の発生についてのリスク因子を有する対象（例えば、本明細書に記載の心リモデリングおよび／または慢性心不全をもたらすおそれがある状態を有する対象）も、本開示に従う処置に適している。
【０３０２】
一般に、高血圧または高血圧症は、例えば血圧計で測定されるとき、１２０ｍｍＨｇ（収縮期）／８０ｍｍＨｇ（拡張期）よりも高い安静時血圧を指す。１２１〜１３９／８１〜８９の間の血圧は、高血圧前症と見なされ、このレベルを超える（１４０／９０ｍｍＨｇまたはそれよりも高い）と、高い（高血圧）と見なされる。特に示さない限り、高血圧前症および高血圧の両方の血圧が、本明細書に使用される「高血圧」の意味に含まれる。例えば、安静時血圧１３５ｍｍＨｇ／８７または１４０ｍｍＨｇ／９０ｍｍＨｇは、１３５／８７が一般的に高血圧前症の範疇に入ると見なされるにしても、「高血圧」という用語の範囲内に入ることが意図される。血圧１４５ｍｍＨｇ／９０ｍｍＨｇ、１４０ｍｍＨｇ／９５ｍｍＨｇ、および１４２ｍｍＨｇ／９３ｍｍＨｇは、高血圧症のさらなる例である。血圧は、通常、１日を通して変動することが認識されている。血圧は、心拍毎にさえ、わずかに変動し得る。通常、血圧は活動の間に増加し、安静時に減少する。血圧は、寒い天候の方が高いことが多く、ストレス下で上昇する可能性がある。外部要因の影響を最小限にするために、血圧の読取りを毎日同じ時間に行う、血圧を毎日モニタリングすることにより、より正確な血圧の読取りを得ることができる。血圧が高いかどうかを判定するために、経時的ないくつかの読取りが必要な場合がある。一般に、慢性高血圧は、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも２ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも１年、少なくとも２年、少なくとも３年、少なくとも４年、少なくとも５年、少なくとも１０年などであるが、これに限定されない長期間、連続的または断続的のいずれかで高血圧を示す対象を指す。
【０３０３】
一般に、心不整脈は、心臓の筋収縮が不規則になる状態を指す。異常に速い調律（例えば、１分間に１００回よりも多い）は、頻脈と呼ばれる。異常に遅い調律（例えば、１分間に６０回よりも少ない）は、徐脈と呼ばれる。
【０３０４】
一般に、心肥大は、心臓および個別の心筋細胞、特に心室筋細胞のサイズの増加、ならびに心腔の空洞内部のサイズの増加によって特徴付けられる状態である心拡大を指す。
【０３０５】
駆出率は、心拍の度に左心室から送出される血液のパーセンテージである。駆出率は、例えば心エコーの間に測定される場合がある。駆出率は、心臓がどれだけ十分に送出しているかの重要な測定値であり、心不全を分類し、処置をガイドするために使用することができる。心不全は、駆出率が保たれた心不全（拡張期心不全とも称される）または駆出率が低減した心不全（収縮期心不全とも称される）として分類することができる。最近の研究により、駆出率が保たれた心不全の有病率は、１５年間にわたり増加し、死亡率に顕著な改善がなかったことが実証された。これらの傾向が続くならば、駆出率が保たれた心不全が、最もよく見られる形態の心不全になり得、ますます増大する公衆衛生上の問題であることを実証している（Owanら、２００６年、N Engl J Med；３５５巻（３号）：２５１〜９頁）。
【０３０６】
一部の実施形態では、本開示のＢＭＰアンタゴニストは、非致死性または致死性心血管イベント（例えば、心筋梗塞、脳卒中、狭心症、不整脈、体液貯留、および心不全の進行）の発生率を低減させるために使用される場合がある。本明細書に使用される、心血管イベントの発生率を低減させることは、ある期間の経過の間または経過にわたり対象によって経験される心血管イベントの数を維持または低減させることを指す。心血管イベントの発生率における低減は、第１の群（処置群）が本発明の方法により処置され、第２の群（プラセボ群）が、本発明の方法による処置と置き換えてまたはその代わりにプラセボ（すなわち偽薬）を使用することにより処置される２群の対象の間で、期間の経過にわたるまたは経過の間の心血管イベントの発生率を比較することにより評価または決定することができる。処置群についての心血管イベント数が、プラセボ群についての心血管イベント数よりも少ないならば、心血管イベントの発生率に減少があった、またはそれが減少しているという判定がなされる。あるいは、心血管イベントの発生率の低減は、第１の期間での対象集団についての心血管イベントのベースラインの数を決定すること、および次いで第２のその後の期間での対象集団についての心血管イベントの数を測定することにより、評価または決定することができる。第２のその後の期間での対象集団についての心血管イベントの数が、第１の期間での対象集団についての心血管イベントの数と同じまたはそれよりも少ないならば、前記対象集団について心血管イベントの発生率が低減しているという判定がなされる。
【０３０７】
一部の実施形態では、本開示のＢＭＰアンタゴニストは、心不全についての入院の発生率を低減させるために使用される場合がある。本明細書で使用される、心不全についての入院の発生率を低減させることは、ある期間の経過の間または経過にわたり対象により経験される心不全についての入院数を維持または低減させることを指す。心不全についての入院の発生率の低減は、第１の群（処置群）が本発明の方法により処置され、第２の群（プラセボ群）が、本発明の方法による処置と置き換えてまたはその代わりにプラセボ（すなわち偽薬）を使用することにより処置される２群の対象の間で、ある期間の経過にわたりまたは経過の間の心不全についての入院の発生率を比較することにより評価または決定することができる。処置群についての心不全の入院数がプラセボ群についての心不全の入院数よりも少ないならば、心不全についての入院の発生率が低減したまたは低減しているという判定がなされる。あるいは、心不全についての入院の発生率の低減は、第１の期間での対象集団についての心不全のベースラインの入院数を決定すること、および次いで第２のその後の期間での対象集団についての心不全についての入院数を測定することにより評価または決定することができる。第２のその後の期間での対象集団についての心不全についての入院数が、第１の期間での対象集団についての心不全についての入院数と同じまたはそれよりも小さいならば、前記対象集団についての心不全についての入院の発生率が低減しているという判定がなされる。
【０３０８】
一部の実施形態では、本開示のＢＭＰアンタゴニストは、心不全患者の生存率を改善するために使用される場合がある。本明細書で使用される、心不全患者の生存率を改善することは、ある期間の経過の間または経過にわたり対象集団により経験される致死性心血管イベントの数を維持または低減させることを指す。心不全患者の生存率における改善は、第１の群（処置群）が本発明の方法により処置され、第２の群（プラセボ群）が、本発明の方法による処置と置き換えてまたはその代わりにプラセボ（すなわち偽薬）を使用することにより処置される２群の対象の間で、ある期間の経過にわたりまたは経過の間の致死性心血管イベントの発生率を比較することにより評価または決定することができる。処置群についての致死性心血管イベントの数が、プラセボ群についての致死性心血管イベントの数よりも少ないならば、心不全患者の生存率に改善があったまたは改善しているという判定がなされる。あるいは、致死性心血管イベントの発生率における低減は、第１の期間での対象集団についての致死性心血管イベントのベースラインの数を決定することおよび次いで第２のその後の期間での対象集団についての致死性心血管イベントの数を測定することにより評価または決定することができる。第２のその後の期間での対象集団についての致死性心血管イベントの数が、第１の期間での対象集団についての致死性心血管イベントの数と同じまたはそれよりも少ないならば、前記対象集団についての心不全患者の生存率が改善しているという判定がなされる。
【０３０９】
一部の実施形態では、本開示のＢＭＰアンタゴニストは、心不全患者における心血管死のリスクを低減させるために使用される場合がある。本明細書で使用される、心不全患者の心血管死のリスクを低減させることは、ある期間の経過の間または経過にわたり対象集団により経験される致死性心血管イベントの数を維持または低減させること指す。心不全患者における心血管死の低減は、第１の群（処置群）が本発明の方法により処置され、第２の群（プラセボ群）が、本発明の方法による処置と置き換えてまたはその代わりにプラセボ（すなわち偽薬）を使用することにより処置される２群の対象の間で、ある期間の経過にわたりまたは経過の間の致死性心血管イベントの発生率を比較することにより評価または決定することができる。処置群についての致死性心血管イベントの数がプラセボ群についての致死性心血管イベントの数よりも少ないならば、心不全患者において心血管死が低減したまたは低減しているという判定がなされる。あるいは、心不全患者における心血管死の低減は、第１の期間での対象集団についての致死性心血管イベントのベースラインの数を決定すること、および次いで第２のその後の期間での対象集団についての致死性心血管イベントの数を測定することにより評価または決定することができる。第２のその後の期間での対象集団についての致死性心血管イベントの数が、第１の期間での対象集団についての致死性心血管イベントの数と同じまたはそれよりも少ないならば、前記対象集団についての心不全患者における心血管死が低減しているという判定がなされる。
【０３１０】
心不全を有する患者ならびに心不全のリスクがある患者（例えば、高血圧、脂質障害、糖尿病、および血管障害を有する患者）を管理するために、多種多様な承認薬および支持療法が現在使用されている。かかる薬物には、例えば、アドレナリンブロッカー（アルファ−ブロッカーおよびベータ−ブロッカー）、中枢作用性アルファ−アゴニスト、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、アンギオテンシン受容体ブロッカー、カルシウムチャネルブロッカー、陽性変力物質、血管拡張薬、ベンゾジアゼピン、レニン阻害剤、抗血栓剤、および複数の型の利尿薬（例えば、ループ、カリウム保持性、チアジドおよびチアジド様）が含まれる。心不全を処置または予防するための外科手技には、例えば、狭窄した動脈の内部サイズをバルーン血管形成またはステント留置により増加させようとする物理的操作が含まれる。一部の実施形態では、本開示は、心不全または心不全の１つもしくは複数の合併症を処置する方法であって、心不全を処置、予防またはその進行を低減させるためのさらなる活性薬剤または支持療法（例えば、アドレナリンブロッカー、中枢作用性アルファ−アゴニスト、ＡＣＥ阻害剤、アンギオテンシンＩＩ受容体ブロッカー、カルシウムチャネルブロッカー、陽性変力物質、利尿薬、および種々の外科手技）と組み合わせたＢＭＰアンタゴニストの投与を含む方法を提供する。
【０３１１】
ＡＣＥ阻害剤は、長年、高血圧の処置のために使用されている。ＡＣＥ阻害剤は、特に心不全患者において心臓および循環に対して有害作用を有するホルモンであるアンギオテンシンＩＩの形成を遮断する。これらの薬物の副作用には、例えば、空咳、低血圧、悪化する腎機能および電解質不均衡、ならびに時にアレルギー反応が含まれる。ＡＣＥ阻害剤の例には、カプトプリル（例えば、カポテン（Capoten））、エナラプリル（例えば、バソテック（Vasotec）、レニテック（Renitec）、およびエナカード（Enacard））、リシノプリル（ゼストリル（Zestril）およびプリニビル（Prinivil））、ベナゼプリル（ロテンシン（Lotensin））、ラミプリル（例えば、アルテース（Altace）、プリレース（Prilace）、ラメース（Ramace）、ラミウィン（Ramiwin）、トリアテック（Triatec）、およびトリテース（Tritace））、ゾフェノプリル、キナプリル（例えば、アキュプリル（Accupril））、ペリンドプリル（perinodopril）（例えば、コバシル（Coversyl）、アセオン（Aceon）、およびペリンド（Perindo））、リシノプリル（例えば、リストリル（Listril）、ロプリル（Lopril）、ノバテック（Novatec）、プリニビル（Prinivil）、およびゼストリル（Zestril））、ベナゼプリル（例えば、ロテンシン（Lotensin））、イミダプリル（例えば、タナトリル）、トランドラプリル（例えば、マビク（Mavik）、オドリック（Odrik）、およびゴプテン（Gopten））、シラザプリル（例えば、インヒベース（Inhibace））、およびホシノプリル（例えば、ホシテン（Fositen）およびモノプリル（Monopril））が含まれる。
【０３１２】
一般に、ＡＣＥ阻害剤に不耐性の患者は、アンギオテンシン受容体ブロッカーで処置される。これらの薬物は、ＡＣＥ阻害剤と同じホルモン経路に作用するが、それよりもむしろアンギオテンシンＩＩの作用をその受容体部位で直接遮断する。これらの薬物の副作用は、ＡＣＥ阻害剤と関連する副作用と類似しているが、空咳はあまり見られない。本開示に従って使用され得るアンギオテンシン受容体ブロッカーには、例えば、ロサルタン（例えば、コザール（Cozaar））、カンデサルタン（例えば、アタカンド（Atacand））、バルサルタン（例えば、ディオバン（Diovan））、イルベサルタン（例えば、アバプロ（Avapro））、テルミサルタン（例えば、ミカルディス（Micardis））、エプロサルタン（例えば、テベテン（Teveten））、オルメサルタン（例えば、ベニカル（Benicar）およびオルメテック（Olmetec））、アジルサルタン（イダービ（Edarbi））、およびフィマサルタン（例えば、カナーブ（Kanarb））が含まれる。
【０３１３】
アドレナリンブロッカーは、エピネフリン（アドレナリン）、ノルエピネフリン、および種々の身体組織のベータ受容体に作用する他の類似のホルモンなどのある特定の刺激ホルモンの作用を遮断する薬物である。心臓のアドレナリン受容体に対するこれらのホルモンの自然効果は、心筋のより力強い収縮である。これらのホルモンの刺激効果は、最初は心機能の維持に有用であるとはいえ、時間が経つと心筋に有害作用を有するように見える。ベータ−ブロッカー（例えば、非特異的、β１選択的、β２選択的、およびβ３選択的ブロッカー）は、これらの刺激ホルモンのベータ受容体に対する作用を遮断する薬剤である。アルファ−ブロッカー（例えば、非特異的、α１選択的、およびα２選択的）は、これらの刺激ホルモンのアルファ受容体に対する作用を遮断する薬剤である。一般的に、慢性心臓患者がアドレナリンブロッカーの投与を受ける場合、アドレナリンブロッカーは、最初に非常に低用量で与えられ、次いで用量は徐々に増加される。副作用には、例えば、体液貯留、低血圧、低脈拍数、ならびに全身疲労および立ちくらみが含まれる。アドレナリンブロッカーは、また、気道疾患（例えば、喘息および肺気腫）または非常に低い安静時心拍数を有する人々に使用すべきでない。本開示に従って使用され得るアドレナリンブロッカーには、例えば、プロプラノロール、ブシンドロール、カルテオロール（例えば、カルトロール（Cartrol）、オクプレス（Ocupress）、テオプティック（Teoptic）、アルテオロール（Arteolol）、アルテオプティック（Arteoptic）、カルテ（Calte）、カルテアバク（Carteabak）、カルテオール（Carteol）、カルテオール（Carteol）、カルトロール（Cartrol）、エレブロク（Elebloc）、エンダク（Endak）、グラウテオロール（Glauteolol）、ミケラン（Mikelan）、ポエングラウコール（Poenglaucol）、およびシングラウク（Singlauc））、カルベジロール（例えば、コレグ（Coreg））、ラベタロール（例えば、ノルモダイン（Normodyne）およびトランデート（Trandate））、ナドロール（例えば、コルガード（Corgard））、オクスプレノロール（例えば、トラサコール（Trasacor）、トラシコール（Trasicor）、コレタール（Coretal）、ララコール（Laracor）、スロープレン（Slow-Pren）、カプトール（Captol）、コルベトン（Corbeton）、スロートラシコール（Slow-Trasicor）、テバコール（Tevacor）、トラシテンシン（Trasitensin）、トラシデクス（Trasidex））、ペンブトロール（例えば、レバトール（Levatol）、レバトロール（Levatolol）、ロベータ（Lobeta）、パギノール（Paginol）、ホスタブロック（Hostabloc）、ベータプレシン（Betapressin））、ピンドロール（例えば、ビスケン（Visken））、ソタロール（例えば、ベタペース（Betapace）、ベタペースＡＦ、ソタレックス（Sotalex）、ソタコール（Sotacor）、およびソチライズ（Sotylize））、チモロール（例えば、ベチモール（betimol））、アセブトロール（例えば、セクトラール（Sectral）およびプレント（Prent））、アテノロール（例えば、テノーミン（tenormin））、ベタキソロール（例えば、ベトプティック（Betoptic）、ベトプティックＳ、ロクレン（Lokren）、およびケルロン（Kerlone））、ビソプロロール（例えば、ゼベータ（Zebeta）およびコンコール（Concor））、セリプロロール（例えば、カーデム（Cardem）、セレクトール（Selectol）、セリプレス（Celipres）、セリプロ（Celipro）、セロール（Celol）、コルディアックス（Cordiax）、ディラノーム（Dilanorm））、エスモロール（例えば、ブレビブロック（brevibloc））、メトプロロール（例えば、ロプレソール（Lopressor）およびメトラー（Metolar）ＸＲ）、ネビボロール（例えば、ネビレット（Nebilet）およびバイストリック（Bystolic））、ブタザミン（butazamine）、ＩＣＩ−１１８，５５１、ＳＲ５９２３０Ａ、フェノキシベンザミン（例えば、ジベンジリン（Dibenzyline））、フェントラミン（例えば、レジチン（Regitine））、トラゾリン、トラゾドン、アルフゾシン（例えば、ウロキサトラール（uroxatral）、キサト（Xat）、キサトラール（Xatral）、プロステトロール（Prostetrol）およびアルフラール（Alfural））、メシル酸ドキサゾシン（カルデュラ（Cardura）およびカルデュラン（Carduran））、プラゾシン（例えば、ミニプレス（Minipress）、バソフレックス（Vasoflex）、レントプレス（Lentopres）およびヒポベース（Hypovase））、タムスロシン（フロマックス（Flomax））、テラゾシン（例えば、ハイトリン（Hytrin）およびザヤセル（Zayasel））、シロドシン（例えば、ラパフロ（Rapaflo）、シロジクス（Silodyx）、ラピリフ（Rapilif）、シロダール（Silodal）、ユリーフ（Urief）、スルーパス（Thrupas）、およびウロレック（Urorec））、アチパメゾール（atipanmezole）（例えば、アンチセダン（Antisedan））、イダゾキサン、ミルタザピン（例えば、レメロン（Remeron））、およびヨヒンビンが含まれる。
【０３１４】
利尿薬は、体液貯留の症状を予防または緩和するために、しばしば心不全患者の処置に使用される。これらの薬物は、腎臓を通過する体液の流れを促進することにより、体液が肺および他の組織内に蓄積しないようにすることを助ける。これらの薬物は、息切れおよび脚のむくみなどの症状を軽減するのに有効であるものの、長期生存率によい影響を及ぼすことは実証されていない。利尿薬の副作用には、脱水、電解質異常、特に低カリウムレベル、聴覚の乱れ、および低血圧が含まれる。電解質不均衡により患者は重度の心調律の乱れを被りやすくなり得るので、一部の患者では、患者にサプリメントを提供することにより低カリウムレベルを予防することが重要である。利尿薬の種々のクラスの例には、酸性化塩（例えば、ＣａＣｌ２およびＮＨ４ＣＬ）、アルギニンバソプレシン受容体２アンタゴニスト（例えば、アンホテリシンＢおよびクエン酸リチウム）、選択的バソプレシンＶ２アンタゴニスト（例えば、トルバプタン（tolvapatan）およびコニバプタン）、Ｎａ−Ｈ交換体アンタゴニスト（例えば、ドーパミン）、炭酸脱水酵素阻害剤（例えば、アセタゾラミドおよびドルゾラミド）、ループ利尿薬（例えば、ブメタニド、エタクリン酸、フロセミド、およびトルセミド）、浸透圧利尿薬（例えば、グルコースおよびマンニトール）、カリウム保持性利尿薬（例えば、アミロライド、スピロノラクトン、エプレレノン、トリアムテレン、およびカンレノ酸カリウム）、チアジド（例えば、ベンドロフルメチアジド、ヒドロクロロチアジド、およびメトラゾン）、キサンチン（例えば、テオフィリンおよびテオブロミン）が含まれる。
【０３１５】
カルシウムチャネルブロッカーは、カルシウムチャネルを通過するカルシウムの移動を妨害し、しばしば降圧薬として使用される。カルシウムチャネルブロッカーは、高齢患者における上昇した収縮期血圧のよく見られる原因の１つである大血管の硬化を処置するのに特に有効である。カルシウムチャネルブロッカーは、心拍数を変化させるため、脳血管攣縮を予防するため、および狭心症により引き起こされる胸痛を低減させるためにも、しばしば使用される。カルシウムチャネルブロッカーの副作用には、例えば、めまい、頭痛、浮腫、変更された心拍数、および便秘が含まれる。カルシウムチャネルブロッカーの種々のクラスの例には、ジヒドロピリジンカルシウムチャネルブロッカー［例えば、アムロジピン（例えば、ノルバスク（Norvasc））、アラニジピン（例えば、サプレスタ（Sapresta））、アゼルニジピン（例えば、カルブロック（Calblock））、バルニジピン（例えば、ハイポカ（HypoCa））、ベニジピン（例えば、コニール（Coniel））、シルニジピン（例えば、アテレック（Atelec）、シナロング（Cinalong）、およびシスカード（Siscard））、クレビジピン（例えば、クレビプレクス（Cleviprex））、イスラジピン（例えば、ダイナサーク（DynaCirc）およびプレスカール（Prescal））、エホニジピン（例えば、ランデル（Landel））、フェロジピン（例えば、プレンディル（Plendil））、ラシジピン（例えば、モテンス（Motens）、ラシピル（Lacipil））、レルカニジピン（例えば、ザニディプ（Zanidip））、マニジピン（例えば、カルスロット（Calslot）およびマジピン（Madipine））、ニカルジピン（例えば、カルデン（Cardene）およびカルデンＳＲ）、ニフェジピン（例えば、プロカルディア（Procardia）およびアダラート（Adalat））、ニルバジピン（例えば、ニバジール（Nivadil））、ニモジピン（例えば、ニモトップ（Nimotop））、ニソルジピン（例えば、バイミカード（Baymycard）、スラー（Sular）、およびシスコール（Syscor））、ニトレンジピン（例えば、カーディフ（Cardif）、ニトレピン（Nitrepin）、およびバイロテンシン（Baylotensin））、およびプラニジピン（例えば、アカラス（Acalas））］、フェニルアルキルアミンカルシウムチャネルブロッカー［例えば、ベラパミル（例えば、カラン（Calan）およびイソプチン（Isoptin））、ガロパミル、およびフェンジリン］、ベンゾチアゼピンカルシウムチャネルブロッカー（例えば、ジルチアゼム）、ミベフラジル、ベプリジル、フルナリジン、フルスピリレン、フェンジリン、ガバペンチノイド（例えば、ガバペンチンおよびプレガバリン）、およびジコノチドが含まれる。
【０３１６】
変力物質は、筋収縮の力またはエネルギーを変更する薬剤である。細胞内カルシウム濃度を増加させることまたはカルシウムに対する受容体タンパク質の感受性を増加させることにより、陽性変力剤は、心筋の収縮性を増加させることができる。陽性変力剤の例には、ジゴキシン、アミオダロン、ベルベリン、カルシウム、レボシメンダン、オメカムチブ、カテコラミン（例えば、ドーパミン、ドブタミン、ドペキサミン、エピネフリン、イソプレナリン、およびノルエピネフリン）、アンギオテンシンＩＩ、エイコサノイド（例えば、プロスタグランジン）、ホスホジエステラーゼ阻害剤（例えば、エノキシモン、ミルリノン、アムリノン、およびテオフィリン）、グルカゴン、およびインスリンが含まれる。
【０３１７】
血管拡張薬は、動脈の平滑筋に直接作用して、血液が動脈を通過してより容易に移動できるように動脈壁を弛緩させる。一般に、血管拡張薬は、高血圧緊急時に、または他の薬物が失敗したときにだけ使用され、単独で与えられることはまれである。心不全を処置するために使用される主な血管拡張薬には、ニトレートおよびヒドララジンならびにそれらの誘導体が含まれる。本開示に従って使用され得る血管拡張薬には、例えば、ニトロプルシドナトリウム、ヒドララジン（例えば、アペソリン（Apesoline）およびバイディル（BiDil））、二硝酸イソソルビド（ジラトレート（Dilatrate）およびイソルディル（Isordil））、および一硝酸イソソルビド（例えば、ＩＳＭＯ）、ニトログリセリン（例えば、ニトロデュール（Nitro-Dur）、ニトロリンギュアル（Nitrolingual）、およびニトロスタット（Nitrostat））が含まれる。
【０３１８】
議論の余地があるものの、ベンゾジアゼピンは、血圧を低下するのに役割を果たし得る。ベンゾジアゼピンは、脳内でＧＡＢＡ−ａ受容体のアゴニストとして働くことで、神経伝達を減速させ、血管を拡張する。ＧＡＢＡは、他（グリシン、アデニンなど）にもある中で、抑制性神経伝達物質である。ＧＡＢＡ−ａ受容体は、ベンゾジアゼピンについての主な標的であるイオンチャネルである。アゴニストがこの受容体部位に結合すると、タンパク質チャネルが開口し、塩化物陰イオンをチャネルに進入させ、電位依存性イオン部位に透過させる。したがって、神経伝達に負のフィードバックを与え、上昇した血圧と関連し得る、患者におけるストレス、不安、緊張を軽減する。ＧＡＢＡに加えて、ベンゾジアゼピンは、上記の阻害性化学物質として役立つ、アデノシンと呼ばれるヌクレオシド化学物質の再取り込みを阻害する。ベンゾジアゼピンは、冠血管拡張薬としても役立ち、心筋を弛緩させ、心臓動脈を拡張させる。しかし、ベンゾジアゼピンの長期使用は、依存性および耐性と関連し、それは、ＧＡＢＡ−ａ受容体のダウンレギュレーションの結果の可能性が高い。したがって、健康な個体であっても、離脱症状は高血圧を含む。
【０３１９】
レニンは、レニン−アンギオテンシンシステムにおいてアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）よりも一段上である。したがって、レニン阻害剤は、高血圧を効果的に低減させることができる。アリスキレンは、高血圧の処置のために承認されているレニン阻害剤である。
【０３２０】
中枢性アルファアゴニストは、末梢動脈を開き血流を容易にする脳内のアルファ−受容体を刺激することにより血圧を低下させる。これらのアルファ２受容体は、神経伝達（この場合、アドレナリンの血管収縮効果）に負のフィードバックを提供する自己受容体として公知である。中枢性アルファアゴニストは、通常、全ての他の降圧医薬が失敗したときに処方される。高血圧を処置するために、これらの薬物は、通常、利尿薬と組み合わせて投与される。このクラスの薬物の有害作用には、鎮静、鼻粘膜の渇きおよびリバウンド高血圧が含まれる。本開示に従って使用され得る中枢性アルファアゴニストには、例えば、クロニジン（例えば、カタプレス（Catapres）、カプベイ（Kapvay）、ネキシクロン（Nexiclon）、およびクロフェリン（Clophelin））、グアナベンズ（例えば、ウイテンシン（Wytensin））、グアンファシン（例えば、エスタリック（Estulic）、テネックス（Tenex）、およびインツニブ（Intuniv））、メチルドパ（例えば、アルドメット（Aldomet）、アルドリル（Aldoril）、およびドパメット（Dopamet））、およびモクソニジン（フィジオテンス（Physiotens））、ミノキシジル（例えば、ロニテン（Loniten））、グアネチジン（例えば、ミクロメデックス（Micromedex））、メカミラミン（例えば、インバーシン（Inversine）およびベカミル（Vecamyl））、およびレセルピン（例えば、ラウディクシン（Raudixin）、セルパラン（Serpalan）、およびセルパシル（Serpasil））が含まれる。
【０３２１】
一般に、抗血栓剤は、血餅（血栓）の形成を低減させる薬物である。抗血栓薬は、危険な血餅（急性血栓）の予防（一次予防、二次予防）または処置のために治療的に使用することができる。異なる抗血栓薬は、異なる血液凝固プロセスに影響する。抗血小板薬は、血小板の遊走または凝集を制限する。抗凝固薬は血液が凝固する能力を制限する。血栓溶解薬は、形成した後の血餅を溶解するように作用する。本開示に従って使用され得る抗血栓剤には、例えば、不可逆的シクロオキシゲナーゼ阻害剤［例えば、アスピリンおよびトリフルサル（例えば、ジスグレン（Disgren））］、アデノシン二リン酸受容体阻害剤［例えば、クロピドグレル（例えば、プラビックス（Plavix））、プラスグレル（prasugrel）（例えば、エフィエント（Effient））、チカグレロル（例えば、ブリリンタ（Brilinta））、およびチクロピジン（例えば、チクリド（Ticlid））］、ホスホジエステラーゼ阻害剤［例えば、シロスタゾール（例えば、プレタール（Pletal））］、プロテアーゼ活性化受容体−１アンタゴニスト［例えば、ボラパクサール（例えば、ゾンティビティー（Zontivity））］、糖タンパク質ＩＩＢ／ＩＩＩＡ阻害剤［例えば、アブシキシマブ（例えば、レオプロ（ReoPro））、エプチフィバチド（例えば、インテグリリン（Integrilin））、チロフィバン（例えば、アグラスタット（Aggrastat））］、アデノシン再取り込み阻害剤［例えば、ジピリダモール（例えば、ペルサンチン（Persantine））］、トロンボキサン阻害剤［例えば、トロンボキサンシンターゼ阻害剤およびトロンボキサン受容体アンタゴニスト（例えば、テルトロバン（Terutroban））］、組織プラスミノーゲンアクチベーター［例えば、アルテプラーゼ（例えば、アクチバーゼ（Activase））、レテプラーゼ（例えば、レタバーゼ（Retavase））、テネクテプラーゼ（例えば、ＴＮＫアーゼ（TNKase））］、アニストレプラーゼ（例えば、エミナーゼ（Eminase））、ストレプトキナーゼ（例えば、カビキナーゼ（Kabikinase）およびストレプターゼ（Streptase））、ウロキナーゼ（例えば、アボキナーゼ（Abbokinase））、ダビガトラン、リバーロキサバン、アピキサバン、クマリン（例えば、ワルファリン、ブロディファコウム、およびジフェナコウム（difenacoum））、ヘパリンおよびその誘導体、第Ｘａ因子阻害剤（例えば、フォンダパリヌクスおよびイドラパリヌクス）、リバーロキサバン、アピキサバン、エドキサバン、ベトリキサバン（betrixaban）、レタキサバン（letaxaban）、エリバキサバン（eribaxaban）、ヒルジン、レピルジン、ビバリルジン、アルガトロバン、ダビガトラン、キシメラガトラン（例えば、エキサンタ（Exanta））、アンチトロンビンタンパク質（例えば、アトリン（Atryn））、バトロキソビン、ヘメンチン（hementin）、およびビタミンＥが含まれる。
【０３２２】
心不全のための薬理処置に加えて、例えば、外科手技および医療装置を含む、心不全または心不全の１つもしくは複数の合併症を処置するための多種多様な支持療法がある。
【０３２３】
最も一般的な心不全医療装置の１つは、ペースメーカーである。ペースメーカーは、一般的に、患者の胸部または腹部に留置されて異常な心調律の制御を助ける小型装置である。これらの装置は、低エネルギーパルスを使用して、正常な速さで拍動するよう心臓に促す（例えば不整脈を処置する）。異なる種類の不整脈のための処置を提供する、異なる種類のペースメーカー装置がある。
【０３２４】
重症の心筋症（例えば、３５％を下回る左心室駆出率）を有する人々または再発心室頻脈もしくは悪性不整脈を有する人々では、重症の命に関わる不整脈のリスクを低減させるために、インプラント可能な自動心除細動器を用いた処置が適応される。インプラント可能な自動心除細動器は、悪性不整脈の症状を改善せず、その発生率も低減させないが、しばしば抗不整脈医薬と一緒になって、それらの不整脈による死亡率を低減させる。３５％を下回る左心室駆出を有する人々では、心室頻脈または心突然死の発生率は、ＡＩＣＤ留置を正当化するために足るほど高い。
【０３２５】
心収縮力モジュレーション（ＣＣＭ）は、心室収縮の強度および心臓のポンプ能力の両方を増強する、中等度から重症の左心室収縮期心不全（ＮＹＨＡクラスＩＩ〜ＩＶ）を有する人々のための処置である。ＣＣＭのメカニズムは、ペースメーカー様装置により送達される、非興奮性電気シグナルによる心筋の刺激に基づく。ＣＣＭは、正常なＱＲＳ複合時間長（１２０ｍｓまたはそれよりも短い）を有する心不全の処置に特に適しており、症状、生活の質および運動耐容能を改善することが実証されている。
【０３２６】
３５％を下回る左心室駆出率を有する人々の約３分の１は、心室への顕著に変更された伝導を有し、右心室および左心室の同期不全脱分極を招く。これは、左脚ブロック（心臓の基部に起始し、左心室に脱分極興奮を運ぶ２つの一次伝導線維束のうち１つの遮断）を有する人々において特に問題である。特別なペーシングアルゴリズムを使用して、両心室再同期（ＣＲＴ）は、心室脱分極の正常なシーケンスを開始することができる。３５％を下回る左心室駆出率および心電図でのＱＲＳ持続時間延長（１５０ｍｓまたはそれよりも長いＬＢＢＢまたはＱＲＳ）を有する人々では、ＣＲＴが標準的な医学治療に追加されるときに症状および死亡率の改善がある。
【０３２７】
最も重症の心不全を有する人々は、補助循環装置（ＶＡＤ）についての候補であり得る。ＶＡＤは、心臓移植への橋渡しとして一般に使用されているが、さらに最近では進行性心不全のための心臓移植代替処置（destination treatment）として使用されている。選ばれた症例では、心臓移植を考慮することができる。これが心不全に関連する問題を解決する場合がある一方で、その人物は、拒絶を予防するために一般的に免疫抑制レジメンを受け続けなければならず、それは、それ自体で顕著な欠点を有する。この処置選択肢の大きな限界は、移植に利用可能な心臓が不足していることである。
【０３２８】
９．医薬組成物
ある特定の態様では、本開示のＢＭＰアンタゴニストまたはかかるアンタゴニストの組合せは、単独で、または医薬製剤（治療用組成物または医薬組成物とも称される）の成分として投与することができる。医薬形成物は、その中に含有される活性成分（例えば、本開示の薬剤）の生物学的活性を有効にさせる形態の調製物であって、製剤が投与される対象に許容されない毒性のさらなる成分を含有しない調製物を指す。対象化合物は、ヒトまたは動物薬での使用のために任意の好都合な方法での投与用に製剤化される場合がある。例えば、本開示の１種または複数種の薬剤は、薬学的に許容される担体と一緒に製剤化される場合がある。薬学的に許容される担体は、一般的に対象に無毒である、活性成分以外の医薬製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体には、緩衝剤、賦形剤、安定化剤、および／または保存剤が含まれるが、これに限定されない。一般に、本開示における使用のための医薬製剤は、対象に投与される場合に発熱物質不含の生理的に許容される形態である。必要に応じて上記の製剤に含まれる場合がある、本明細書に記載の薬剤以外の治療的に有用な薬剤は、本開示の方法において対象薬剤と一緒に投与される場合がある。
【０３２９】
ある特定の実施形態では、組成物は、非経口的に［例えば、静脈内（Ｉ．Ｖ．）注射、動脈内注射、骨内注射、筋肉内注射、髄腔内注射、皮下注射、または皮内注射により］投与される。非経口投与に適した医薬組成物は、本開示の１種または複数種の薬剤を、１種もしくは複数の薬学的に許容される無菌で等張性の水性もしくは非水性の液剤、分散剤、懸濁剤もしくはエマルション、または無菌散剤と一緒に含む場合があり、この散剤は、使用直前に無菌注射液または分散剤に復元され得る。注射液または分散剤は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌薬、懸濁化剤、粘稠化剤、または製剤を目的のレシピエントの血液と等張にする溶質を含有する場合がある。本開示の医薬製剤に採用され得る適切な水性および非水性担体の例には、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、植物油（例えば、オリーブ油）、注射用有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）、およびそれらの適切な混合物が含まれる。妥当な流動性は、例えば、コーティング物質（例えばレシチン）の使用により、分散剤の場合は所要の粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により維持することができる。
【０３３０】
一部の実施形態では、化合物は、例えば、心臓内投与、心膜内投与、またはインプラントもしくは装置などにより、心臓に投与される。例えば、囲心腔へのアクセスは、心嚢にアクセスしてそれを切断または貫通するために胸部または剣状突起下切開を行うことにより体外から達成され得る。カニューレまたはカテーテル型装置を胸壁に通すこと、およびその後にカニューレもしくはカテーテルまたはさらなる器具を、心膜を経由して囲心腔内に通すことによって達成される、体外から囲心腔へのアクセスは、例えば、米国特許第５，３３６，２５２号、同第５，８２７，２１６号、同第５，９００，４３３号、同第５，９７２，０１３号、同第６，１６２，１９５号、同第６，２０６，００４号、および同第６，５９２，５５２号に開示されている。ある特定の場合では、心嚢は、例えば、米国特許第５，９３１，８１０号、同第６，１５６，００９号、および同第６，２３１，５１８号に開示されるように、切断器具により切断される場合がある。
【０３３１】
一部の実施形態では、本開示の治療法は、インプラントまたは装置から医薬組成物を全身的または局所的に投与することを含む。さらに、医薬組成物は、標的組織部位（例えば、骨髄または筋肉）への送達のための形態に封入または注射される場合がある。ある特定の実施形態では、本開示の組成物は、本開示の薬剤のうち１種または複数種を標的組織部位（例えば、骨髄または筋肉）に送達し、発達中の組織に構造を与えることが可能なマトリックスであって、最適には体内に再吸収可能なマトリックスを含み得る。例えば、マトリックスは、本開示の１種または複数種の薬剤の徐放を提供し得る。かかるマトリックスは、他のインプラント型医学的適用のために現在使用されている材料から形成されている場合がある。
【０３３２】
マトリックス材料の選択は、生体適合性、生分解性、機械的特性、美容的外観、および界面特性のうち１つまたは複数に基づき得る。対象組成物の特定の適用が、適切な製剤を規定する。組成物のための潜在的マトリックスは、生分解性で、化学的に規定された、硫酸カルシウム、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸、およびポリ無水物であり得る。例えば、骨または真皮コラーゲンを含む、他の潜在的材料は、生分解性であり、生物学的に明確に規定されている。さらなるマトリックスは、純粋なタンパク質または細胞外マトリックス成分から構成される。例えば、焼結ヒドロキシアパタイト、バイオガラス、アルミン酸塩、または他のセラミックスを含む他の潜在的マトリックスは、非生分解性であり、化学的に規定されている。マトリックスは、例えば、ポリ乳酸およびヒドロキシアパタイト、またはコラーゲンおよびリン酸三カルシウムを含む、上記の型の材料のうちいずれかの組合せから構成され得る。バイオセラミックスは、組成（例えば、カルシウム−アルミン酸塩−リン酸塩）が変更される場合があり、加工して孔径、粒子径、粒子形状、および生分解性のうち１つまたは複数が変更される場合がある。
【０３３３】
ある特定の実施形態では、本開示の医薬組成物は、局所投与することができる。「局所適用」または「局所に」は、医薬組成物の、例えば、皮膚、創傷部位、および粘膜を含む体表面との接触を意味する。局所医薬組成物は、種々の適用形態を有することができ、典型的には、組成物を局所投与するときに組織近くまたは組織と直接接触して配置されることに適合する薬物含有層を含む。局所投与に適した医薬組成物は、液体、ゲル、クリーム、ローション、軟膏、泡、ペースト、パテ、半固形物、または固形物として製剤化された配合物中に１種または複数種の本開示のＢＭＰアンタゴニストを含み得る。液体、ゲル、クリーム、ローション、軟膏、泡、ペースト、またはパテ形態の組成物は、組成物を標的組織上に延展、噴霧、塗抹、塗布またはロールすることにより適用することができる。組成物は、無菌ドレッシング材、経皮パッチ、硬膏剤、および包帯に含浸される場合もある。パテ、半固形または固形形態の組成物は、変形可能な場合がある。それらは、弾性または非弾性（例えば、柔軟または剛性）の場合がある。ある特定の態様では、組成物は、複合物の部分を形成し、同じまたは異なる組成を有する繊維、微粒子、または多層を含み得る。
【０３３４】
液体形態の局所組成物には、薬学的に許容される液剤、エマルション、マイクロエマルション、および懸濁剤が含まれ得る。活性成分に加えて、液体剤形は、例えば、水または他の溶媒、可溶化剤および／または乳化剤［例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、もしくは１，３−ブチレングリコール、油（例えば、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール、ソルビタン脂肪酸エステル、およびそれらの混合物］を含む、当技術分野において一般に使用されている不活性希釈剤を含有する場合がある。
【０３３５】
局所ゲル、クリーム、ローション、軟膏、半固形または固形組成物は、多糖、合成ポリマーまたはタンパク質ベースのポリマーなどの１種または複数種の粘稠化剤を含み得る。本発明の一実施形態では、本明細書におけるゲル化剤は、しかるべく無毒であり、所望の粘度を与えるゲル化剤である。粘稠化剤は、ビニルピロリドン、メタクリルアミド、アクリルアミド、Ｎ−ビニルイミダゾール、カルボキシビニル、ビニルエステル、ビニルエーテル、シリコーン、ポリエチレンオキシド、ポリエチレングリコール、ビニルアルコール、アクリル酸ナトリウム、アクリレート、マレイン酸、ＮＮ−ジメチルアクリルアミド、ジアセトンアクリルアミド、アクリルアミド、アクリロイルモルホリン、プルロニック、コラーゲン、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリビニレン、ポリビニルシリケート、糖（例えば、スクロース、グルコース、グルコサミン、ガラクトース、トレハロース、マンノース、またはラクトース）で置換されたポリアクリレート、アシルアミドプロパンスルホン酸、テトラメトキシオルトシリケート、メチルトリメトキシオルトシリケート、テトラアルコキシオルトシリケート、トリアルコキシオルトシリケート、グリコール、プロピレングリコール、グリセリン、多糖、アルギネート、デキストラン、シクロデキストリン、セルロース、加工セルロース、酸化セルロース、キトサン、キチン、グアー、カラゲナン、ヒアルロン酸、イヌリン、デンプン、加工デンプン、アガロース、メチルセルロース、植物ガム、ヒアルロナン（hylaronan）、ヒドロゲル、ゼラチン、グリコサミノグリカン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ペクチン、低メトキシペクチン、架橋デキストラン、デンプン−アクリロニトリルグラフトコポリマー、ポリアクリル酸ナトリウムデンプン、ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシエチルアクリレート、ポリビニレン、ポリエチルビニルエーテル、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレン、ポリウレタン、ポリアルカノエート、ポリ乳酸、ポリラクテート、ポリ（３−ヒドロキシブチレート）、スルホン化ヒドロゲル、ＡＭＰＳ（２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸）、ＳＥＭ（スルホエチルメタクリレート）、ＳＰＭ（スルホプロピルメタクリレート）、ＳＰＡ（スルホプロピルアクリレート）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−メタクリルオキシエチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アンモニウムベタイン、メタクリル酸アミドプロピル−ジメチルアンモニウムスルホベタイン、ＳＰＩ（イタコン酸−ビス（１−プロピルスルホン酸（sulfonizacid）−３）エステル二カリウム塩）、イタコン酸、ＡＭＢＣ（３−アクリルアミド−３−メチルブタン酸）、ベータ−カルボキシエチルアクリレート（アクリル酸ダイマー）、および無水マレイン酸−メチルビニルエーテルポリマー、それらの誘導体、それらの塩、それらの酸、およびそれらの組合せのポリマー、コポリマー、およびモノマーを含み得る。ある特定の実施形態では、本開示の医薬組成物は、各々が、本開示の化合物の所定量と、必要に応じて１つまたは複数の他の活性成分とを含有する、例えば、カプセル剤、カシェ剤、丸剤、錠剤、トローチ剤（スクロースおよびアカシアまたはトラガカントなどの香味基剤を使用する）、散剤、顆粒剤、水性もしくは非水性液体としての液剤もしくは懸濁剤、水中油もしくは油中水型液体エマルション、またはエリキシル剤もしくはシロップ剤、または香錠（ゼラチンおよびグリセリン、もしくはスクロースおよびアカシアなどの不活性基剤を使用する）、ならびに／またはマウスウォッシュの形態で経口投与することもできる。本開示の化合物と、必要に応じて１種または複数種の他の活性成分とは、ボーラス、舐剤、またはペースト剤としても投与され得る。
【０３３６】
経口投与のための固形剤形（例えば、カプセル剤、錠剤、丸剤、糖剤、散剤、および顆粒剤）において、本開示の１種または複数種の化合物は、例えば、クエン酸ナトリウム、リン酸二カルシウム、充填剤または増量剤（例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトールおよびケイ酸）、結合剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース、およびアカシア）、保水剤（例えば、グリセロール）、崩壊剤（例えば、アガー−アガー、炭酸カルシウム、バレイショデンプンもしくはタピオカデンプン、アルギン酸、シリケート、および炭酸ナトリウム）、溶解遅延剤（例えば、パラフィン）、吸収加速剤（例えば、四級アンモニウム化合物）、湿潤剤（例えば、セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロール）、吸収剤（例えば、カオリンおよびベントナイトクレイ）、潤滑剤（例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム）、着色剤およびそれらの混合物を含む、１種または複数種の薬学的に許容される担体と共に混合され得る。カプセル剤、錠剤、および丸剤の場合、医薬製剤（組成物）は、緩衝化剤も含み得る。また、同様の種類の固形組成物も、例えば、ラクトースまたは乳糖に加えて、高分子量ポリエチレングリコールを含む、１種または複数種の賦形剤を使用して、軟充填ゼラチンカプセル中および硬充填ゼラチンカプセル中の充填剤として採用される場合がある。
【０３３７】
医薬組成物の経口投与のための液体剤形には、薬学的に許容されるエマルション、マイクロエマルション、液剤、懸濁剤、シロップ剤およびエリキシル剤が含まれ得る。活性成分に加えて、液体剤形は、例えば、水または他の溶媒を含む、当技術分野で一般に使用される不活性希釈剤、可溶化剤および／または乳化剤［例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、もしくは１，３−ブチレングリコール、油（例えば、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール、ソルビタンの脂肪酸エステル、およびこれらの混合物］を含有し得る。不活性希釈剤に加えて、経口製剤は、また、例えば、加湿剤、乳化剤および懸濁化剤、甘味剤、香味剤、着色剤、芳香剤、保存剤およびそれらの組合せを含む佐剤も含み得る。
【０３３８】
懸濁剤は、活性化合物に加えて、例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール、ソルビタンエステル、結晶セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、アガー−アガー、トラガカント、およびそれらの組合せを含む、懸濁化剤を含有し得る。
【０３３９】
微生物の作用および／または成長の防止は、例えば、パラベン、クロロブタノール、およびソルビン酸フェノールを含む、種々の抗細菌剤および抗真菌剤の包含により保証され得る。
【０３４０】
ある特定の実施形態では、例えば、糖、または塩化ナトリウムを含む等張化剤を組成物中に含めることが、望ましい場合がある。加えて、注射可能な医薬形態の長期吸収は、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含む、吸収を遅延させる薬剤の包含により、もたらされ得る。
【０３４１】
投薬レジメンは、本開示の１種または複数種の薬剤の作用を改変する種々の要因を考慮して、担当医師により決定されると理解される。赤血球の形成を促進するＢＭＰアンタゴニストの場合、種々の要因には、患者の赤血球数、ヘモグロビンレベル、所望の標的赤血球数、患者の年齢、患者の性別、患者の食餌、赤血球レベルの低下に寄与し得る任意の疾患の重症度、投与時間、および他の臨床的要因が含まれ得るが、これに限定されない。他の公知の活性薬剤の最終組成物への添加もまた、投与量に影響を及ぼし得る。進行は、赤血球レベル、ヘモグロビンレベル、網状赤血球レベル、および造血プロセスの他の指標のうち１つまたは複数の定期的な評価によりモニタリングすることができる。
【０３４２】
ある特定の実施形態では、本開示はまた、本開示の１種または複数種の薬剤のｉｎ  ｖｉｖｏ産生のための遺伝子治療を提供する。かかる治療は、上に列挙したような障害のうち１つまたは複数を有する細胞または組織中に薬剤の配列を導入することによりその治療効果を達成する。薬剤の配列の送達は、例えば、キメラウイルスのような組換え発現ベクターまたはコロイド分散システムを使用することにより達成することができる。本開示の１つまたは複数の薬剤の配列の好ましい治療的送達は、標的化リポソームの使用である。
【０３４３】
本明細書において教示されるような遺伝子治療に利用することができる種々のウイルスベクターには、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニア、またはＲＮＡウイルス（例えば、レトロウイルス）が含まれる。レトロウイルスベクターは、マウスレトロウイルスまたはトリレトロウイルスの派生物であり得る。単一の外来遺伝子を挿入できるレトロウイルスベクターの例には、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベーマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳がんウイルス（ＭｕＭＴＶ）、およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）が含まれるが、これに限定されない。いくつかのさらなるレトロウイルスベクターにも、複数の遺伝子を組み込むことができる。これらのベクターの全てに、形質導入された細胞が同定および産生され得るように、選択マーカーについての遺伝子を移入または組み込むことができる。レトロウイルスベクターは、例えば、糖、糖脂質またはタンパク質を付加することによって、標的特異的にすることができる。好ましい標的化は、抗体を使用することにより達成される。当業者は、本開示の１種または複数種の薬剤を含有するレトロウイルスベクターの標的特異的な送達を可能にするために、特定のポリヌクレオチド配列をレトロウイルスゲノム中に挿入すること、またはウイルスエンベロープに付加することができることを認識する。
【０３４４】
あるいは、従来のリン酸カルシウムトランスフェクションにより、レトロウイルスの構造遺伝子（ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ）をコードするプラスミドを組織培養細胞に直接トランスフェクトすることができる。次いで、目的の遺伝子を含有するベクタープラスミドがこれらの細胞にトランスフェクトされる。結果として生じた細胞は、培養培地中にレトロウイルスベクターを放出する。
【０３４５】
本開示の１種または複数種の薬剤のための別の標的化送達システムは、コロイド分散システムである。コロイド分散システムには、例えば、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、および脂質ベースのシステム（水中油型エマルション、ミセル、混合型ミセルおよびリポソームを含む）が含まれる。ある特定の実施形態では、本開示の好ましいコロイドシステムは、リポソームである。リポソームは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで送達ビヒクルとして有用な人工の膜小胞である。ＲＮＡ、ＤＮＡおよび無傷のビリオンが、水性の内部に封入され得、生物学的に活性な形態で細胞に送達され得る［Fraleyら（１９８１年）Trends Biochem. Sci.、６巻：７７頁］。リポソームビヒクルを使用する効率的な遺伝子移入方法は、当技術分野において公知である［Manninoら（１９８８年）Biotechniques、６巻：６８２頁、１９８８年］。
【０３４６】
リポソームの組成物は、通常、ステロイド（例えば、コレステロール）を含み得るリン脂質の組合せである。リポソームの物理的特徴は、ｐＨ、イオン強度、および二価陽イオンの存在に依存する。例えば、ホスファチジル化合物（例えば、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシド、およびガングリオシド）、卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、およびジステアロイルホスファチジルコリンを含む、他のリン脂質または他の脂質も使用され得る。例えば、器官特異性、細胞特異性、およびオルガネラ特異性に基づくリポソームの標的化もまた可能であり、当技術分野で公知である。
【実施例】
【０３４７】
本発明は、今や一般的に説明されているが、以下の実施例を参照するとより容易に理解され、実施例は、単にある特定の実施形態および本発明の実施形態を例示する目的のために炭に含められるものであり、本発明を限定することは意図されない。
【０３４８】
（実施例１）
ＡｃｔＲＩＩａ−Ｆｃ融合タンパク質
間にリンカーをはさんでヒトＡｃｔＲＩＩＡの細胞外ドメインをヒトまたはマウスＦｃドメインと融合させたＡｃｔＲＩＩＡ融合タンパク質を産生した。この構築物をそれぞれＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃと名付ける。
【０３４９】
ＣＨＯ細胞株から精製されたようなＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃを下に示す（配列番号５０）：
【化３８】
2020506944.tif 000048
【０３５０】
ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃタンパク質をＣＨＯ細胞株に発現させた。３つの異なるリーダー配列を検討した：
（ｉ）ミツバチメリチン（ＨＢＭＬ）：ＭＫＦＬＶＮＶＡＬＶＦＭＶＶＹＩＳＹＩＹＡ（配列番号５１）
（ｉｉ）組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）：ＭＤＡＭＫＲＧＬＣＣＶＬＬＬＣＧＡＶＦＶＳＰ（配列番号５２）
（ｉｉｉ）ネイティブ：ＭＧＡＡＡＫＬＡＦＡＶＦＬＩＳＣＳＳＧＡ（配列番号５３）。
【０３５１】
選択された形態は、ＴＰＡリーダーを採用し、以下のプロセシングされていないアミノ酸配列：
【化３９】
2020506944.tif 000049
を有する。
【０３５２】
このポリペプチドは、以下の核酸配列によりコードされる：
【化４０−１】
2020506944.tif 000050
【化４０−２】
2020506944.tif 000051
【０３５３】
ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃの両方は、組換え発現が顕著に容易であった。タンパク質を明確な単一ピークのタンパク質として精製した。Ｎ末端配列決定により、−ＩＬＧＲＳＥＴＱＥ（配列番号５６）の単一配列であることが明らかとなった。精製は、例えば、以下：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、および陽イオン交換クロマトグラフィーのうち３つまたはそれよりも多くを任意の順序で含む、一連のカラムクロマトグラフィーステップにより達成することができた。精製は、ウイルス濾過および緩衝液交換を用いて完了することができた。ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃタンパク質を、サイズ排除クロマトグラフィーにより決定されたとき＞９８％およびＳＤＳ  ＰＡＧＥにより決定されたとき＞９５％の純度まで精製した。
【０３５４】
ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃは、種々のリガンドに対して高い親和性を示した。標準的なアミンカップリング手順を使用して、リガンドをＢｉａｃｏｒｅ（商標）ＣＭ５チップ上に固定化した。ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃタンパク質をシステム上にロードし、結合を測定した。ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃは、例えば、３．３３×１０−１０Ｍの解離定数（ＫＤ）でＢＭＰ１０、１．０４×１０−８ＭのＫＤでＢＭＰ９、５．５６×１０−１０ＭのＫＤでＢＭＰ６、および１．１４×１０−９ＭのＫＤでＢＭＰ５を含む、種々のリガンドと結合した。ＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃは、同じように挙動した。
【０３５５】
本明細書に記載の方法に従って使用され得る多様なＡｃｔＲＩＩＡバリアントは、その全体が参照により本明細書に組み込まれているＷＯ２００６／０１２６２７およびＷＯ２００７／０６２１８８として公開された国際特許出願に記載されている。代替的な構築物は、ＡｃｔＲＩＩＡのＣ末端尾部（細胞外ドメインの最終の１５アミノ酸の欠失を有し得る。かかる構築物についての配列を、下に提示する（Ｆｃ部分に下線）（配列番号５７）：
【化４１】
2020506944.tif 000052
【０３５６】
（実施例２）
ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質の産生
間にリンカーをはさんでヒトＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメインをヒトまたはマウスＦｃドメインと融合させたＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質を構築した。この構築物をそれぞれＡｃｔＲＩＩＢ−ｈＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃと名付ける。
【０３５７】
ＣＨＯ細胞株から精製されたようなＡｃｔＲＩＩＢ−ｈＦｃを下に示す（配列番号５８）：
【化４２】
2020506944.tif 000053
【０３５８】
ＡｃｔＲＩＩＢ−ｈＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃタンパク質をＣＨＯ細胞株に発現させた。３つの異なるリーダー配列を検討した：（ｉ）ミツバチメリチン（ＨＢＭＬ）、ｉｉ）組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）、および（ｉｉｉ）ネイティブ：ＭＧＡＡＡＫＬＡＦＡＶＦＬＩＳＣＳＳＧＡ（配列番号５９）。
【０３５９】
選択された形態は、ＴＰＡリーダーを採用し、以下のプロセシングされていないアミノ酸配列（配列番号６０）：
【化４３】
2020506944.tif 000054
を有する。
【０３６０】
このポリペプチドは、以下の核酸配列（配列番号６１）：
【化４４】
2020506944.tif 000055
によりコードされる。
【０３６１】
ＣＨＯ細胞生成物質のＮ末端配列決定により、−ＧＲＧＥＡＥ（配列番号６２）という主要な配列が明らかとなった。特に、文献に報告された他の構築物は、−ＳＧＲ…配列で開始する。
【０３６２】
精製は、例えば、以下：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、および陽イオン交換クロマトグラフィーのうち３つまたはそれよりも多くを任意の順序で含む、一連のカラムクロマトグラフィーステップにより達成することができた。精製は、ウイルス濾過および緩衝液交換で完了することができた。
【０３６３】
ＡｃｔＲＩＩＢ−ｈＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃは、種々のリガンドに対して高い親和性を示した。標準的なアミンカップリング手順を使用してリガンドをＢｉａｃｏｒｅ（商標）ＣＭ５チップ上に固定化した。ＡｃｔＲＩＩＢ−ｈＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃタンパク質をシステム上にロードし、結合を測定した。ＡｃｔＲＩＩＢ−ｈＦｃは、例えば、１．７３×１０−１１Ｍの解離定数（ＫＤ）でＢＭＰ１０、３．３５×１０−１１ＭのＫＤでＢＭＰ９、１．６４×１０−１０ＭのＫＤでＢＭＰ６、および２．９２×１０−９ＭのＫＤでＢＭＰ５を含む、種々のリガンドと結合した。ＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃは、同じように挙動した。
【０３６４】
ＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメイン中に一連の変異を産生し、これらの変異型タンパク質を、ＡｃｔＲＩＩＢのバリアント細胞外ドメインとＦｃドメインとの間の可溶性融合タンパク質として生成した。バックグラウンドのＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合物は、配列番号５８の配列を有する。Ｎ末端トランケーションおよびＣ末端トランケーションを含む種々の変異をバックグラウンドＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃタンパク質に導入した。本明細書に提示されたデータに基づき、これらの構築物は、ＴＰＡリーダーと共に発現された場合、Ｎ末端セリンを欠如すると予想される。ＰＣＲ変異誘発によりＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン中に変異を産生した。ＰＣＲの後に、Ｑｉａｇｅｎカラムを通して断片を精製し、ＳｆｏＩおよびＡｇｅＩで消化し、ゲル精製した。ライゲーションによりヒトＩｇＧ１と融合キメラを創出するように、これらの断片を発現ベクターｐＡＩＤ４中にライゲートした（ＷＯ２００６／０１２６２７参照）。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５アルファ中に形質転換後、コロニーをピックし、ＤＮＡを単離した。マウス構築物（ｍＦｃ）について、ヒトＩｇＧ１をマウスＩｇＧ２ａに代用した。全ての変異体の配列を検証した。変異体の全てを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において一過性トランスフェクションにより生成した。要約すると、５００ｍｌスピナー中で、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を体積２５０ｍｌのＦｒｅｅｓｔｙｌｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）培地中に細胞６×１０５個／ｍｌで準備し、一晩成長させた。翌日、これらの細胞をＤＮＡの終濃度０．５ｕｇ／ｍｌのＤＮＡ：ＰＥＩ（１：１）複合体で処理した。４時間後、培地２５０ｍｌを添加し、細胞を７日間成長させた。細胞を遠心沈殿することにより馴化培地を回収し、濃縮した。例えば、プロテインＡカラムを含む多様な技術を使用して変異体を精製し、低ｐＨ（３．０）グリシン緩衝液で溶出した。中和後、これらをＰＢＳに対して透析した。同様の方法論によりＣＨＯ細胞からも変異体を生成した。参照により本明細書に組み込まれているＷＯ２００８／０９７５４１およびＷＯ２００６／０１２６２７に記載された結合アッセイ／またはバイオアッセイで変異体を試験した。場合によっては、精製タンパク質ではなく馴化培地を用いてアッセイを行った。ＡｃｔＲＩＩＢのさらなる変種は、米国特許第７，８４２，６６３号に記載されている。
【０３６５】
Ｎ末端トランケーションおよびＣ末端トランケーションを有するヒトＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（ネイティブなタンパク質、配列番号１の残基２５〜１３１）を含むＡｃｔＲＩＩＢ（２５−１３１）−ｈＦｃ融合タンパク質を、Ｎ末端でネイティブなＡｃｔＲＩＩＢリーダーの代わりにＴＰＡリーダー配列と融合し、Ｃ末端でリンカーを介してヒトＦｃドメインと融合した（図５；配列番号１２３）。この融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を図６に示す（配列番号１２４はコード鎖、配列番号１２５は相補鎖）。コドンを改変し、ＡｃｔＲＩＩＢ（２５−１３１）−ｈＦｃタンパク質をコードするバリアント核酸が見出されたが、これは、融合タンパク質の発現レベルに実質的な改善を与えた（図７；配列番号１２６はコード鎖、配列番号１２７は相補鎖）。
【０３６６】
成熟タンパク質は、以下のアミノ酸配列（Ｎ末端をＮ末端配列決定により確認）（配列番号６３）：
【化４５】
2020506944.tif 000056
を有する。アミノ酸１〜１０７は、ＡｃｔＲＩＩＢ由来である。
【０３６７】
例えば、以下：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、および陽イオン交換クロマトグラフィーのうち３つまたはそれよりも多くを任意の順序で含む、一連のカラムクロマトグラフィーステップを使用して、発現された分子を精製することができる。ウイルス濾過および緩衝液交換で精製を完了することができる。
【０３６８】
いくつかのリガンドのＡｃｔＲＩＩＢ（２５−１３１）−ｈＦｃに対する親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）器具を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価した。標準的なアミンカップリング手順を使用してＢｉａｃｏｒｅ（商標）ＣＭ５チップ上にリガンドを固定化した。ＡｃｔＲＩＩＢ（２５−１３１）−ｈＦｃをシステム上にロードし、結合を測定した。ＡｃｔＲＩＩＢ（２５−１３１）−ｈＦｃは、例えば、５．５×１０−１１Ｍの解離定数（ＫＤ）でＢＭＰ１０、３．２×１０−１０ＭのＫＤでＢＭＰ９、１．４６×１０−１０ＭのＫＤでＢＭＰ６、および２．１９×１０−８ＭのＫＤでＢＭＰ５を含む、種々のリガンドと結合した。
【０３６９】
配列番号１の７９位にロイシンからアスパラギン酸への置換を有するＡｃｔＲＩＩＢ（２０−１３４）のバリアントを、間にリンカーをはさんでＦｃドメインと融合させた。この構築物をＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２０−１３４）−ｈＦｃと名付ける。７９位のアスパラギン酸に代えてグルタミン酸を有する代替形態（Ｌ７９Ｅ）は、結合アッセイにおいて同様の性能を発揮した。下記の配列番号６４に関して２２６位のバリンに代えてアラニンを有する代替形態も産生したが、これらは、試験したあらゆる点で同等の性能を発揮した。７９位（配列番号１に関して、または配列番号６４に関して６０位）のアスパラギン酸を下に二重下線を付けて表示する。配列番号６４に関する２２６位のバリンも、下に二重下線を付けて表示する。
【０３７０】
ＣＨＯ細胞株から精製されたようなＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２０−１３４）−ｈＦｃを下に示す（配列番号６４）：
【化４６】
2020506944.tif 000057
【０３７１】
ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２０−１３４）−ｈＦｃのＡｃｔＲＩＩＢ由来部分は、下に示されるアミノ酸配列（配列番号６５）を有し、その部分は、モノマーとして、またはモノマー、ダイマー、もしくはより高い次元の複合体としての非Ｆｃ融合タンパク質として使用できた。
【化４７】
2020506944.tif 000058
【０３７２】
ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２０−１３４）−ｈＦｃ融合タンパク質をＣＨＯ細胞株から発現させた。３つの異なるリーダー配列を検討した：
（ｉ）ミツバチメリチン（ＨＢＭＬ）、（ｉｉ）組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）、および（ｉｉｉ）ネイティブ。
【０３７３】
選択された形態は、ＴＰＡリーダーを採用し、以下のプロセシングされていないアミノ酸配列：
【化４８】
2020506944.tif 000059
を有する。
【０３７４】
このポリペプチドは、以下の核酸配列（配列番号６７）：
【化４９】
2020506944.tif 000060
によりコードされる。
【０３７５】
例えば、以下：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、および陽イオン交換クロマトグラフィーのうち３つまたはそれよりも多くを任意の順序で含む、一連のカラムクロマトグラフィーステップにより精製を達成することができた。精製は、ウイルス濾過および緩衝液交換で完了することができた。精製スキームの一例では、細胞培養培地にプロテインＡカラムを通過させ、１５０ｍＭトリス／ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）中で洗い、次いで５０ｍＭトリス／ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）中で洗い、０．１Ｍグリシン（ｐＨ３．０）で溶出した。ウイルス浄化ステップとして低ｐＨの溶出液を室温で３０分間保った。次いで溶出液を中和し、Ｑ−セファロースイオン交換カラムを通過させ、５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ  ＮａＣｌ中で洗い、ＮａＣｌ濃度が１５０ｍＭ〜３００ｍＭの間の５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）中に溶出した。次いで溶出液を５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）、１．１Ｍ硫酸アンモニウムに交換し、フェニルセファロースカラムを通過させ、洗浄し、１５０〜３００ｍＭの間の硫酸アンモニウムを有する５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）中に溶出した。溶出液を透析し、使用のために濾過した。
【０３７６】
配列番号１の７９位でロイシンからアスパラギン酸への置換を有するＡｃｔＲＩＩＢ（２５−１３１）バリアントを、その間にリンカーをはさんでＦｃドメインと融合させた。ＴＰＡリーダー配列を含む構築物を図８（配列番号１３１）に示す。ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５−１３１）−ｈＦｃの細胞精製形態の配列を図９（配列番号１３２）に提示し、リーダー、リンカーまたはＦｃドメインを有さない成熟細胞外ドメインを図１０（配列番号１３３）に提示する。この融合タンパク質をコードする１つのヌクレオチド配列（配列番号１３４）を、その相補配列（配列番号１３５）と共に図１１に示し、まったく同じ融合タンパク質をコードする代替的なヌクレオチド配列（配列番号１３６）およびその相補的配列（配列番号１３７）を図１２に示す。
【０３７７】
いくつかのリガンドのＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５−１３１）−ｈＦｃに対する親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）器具を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価した。標準的なアミンカップリング手順を使用してリガンドをＢｉａｃｏｒｅ（商標）ＣＭ５チップ上に固定化した。ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５−１３１）−ｈＦｃをシステム上にロードし、結合を測定した。ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５−１３１）−ｈＦｃは、例えば、１．５６×１０−１０Ｍの解離定数（ＫＤ）でＢＭＰ１０および１．７９×１０−１０ＭのＫＤでＢＭＰ６を含む種々のリガンドと結合した。ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５−１３１）−ｈＦｃは、ＢＭＰ９に対して一過性の親和性だけを有し、ＢＭＰ５に対して検出可能な結合親和性を有さなかった。ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５−１３１）−ｍＦｃは同じように挙動した。
【０３７８】
（実施例３）
ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質の産生
ヒトＢＭＰＲＩＩの細胞外ドメインをヒト免疫グロブリンＧ１  Ｆｃドメインと、リンカーを用いて融合したものを含むホモダイマー性ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質を産生した。ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合ポリペプチドで使用するためのリーダー配列には、ネイティブなヒトＢＭＰＲＩＩ前駆体リーダー、ＭＴＳＳＬＱＲＰＷＲＶＰＷＬＰＷＴＩＬＬＶＳＴＡＡＡ（配列番号６８）、および組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）リーダーが含まれる。
【０３７９】
ＴＰＡリーダーを有するヒトＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃポリペプチド配列（配列番号６９）を下に示す：
【化５０】
2020506944.tif 000061
【０３８０】
リーダー配列およびリンカーに下線を付ける。配列番号６９のアミノ酸配列は、必要に応じて、Ｃ末端から除去されたリシンを備える場合がある。
【０３８１】
このＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質は、以下の核酸配列（配列番号７０）：
【化５１】
2020506944.tif 000062
によりコードされる。
【０３８２】
プロセシングされたＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号７１）は、以下の通りであり、必要に応じて、Ｃ末端から除去されたリシンを備える場合がある。
【化５２】
2020506944.tif 000063
【０３８３】
このＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質は、以下の核酸配列（配列番号７２）：
【化５３】
2020506944.tif 000064
によりコードされる。
【０３８４】
配列番号７１のＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合ポリペプチドは、ＣＨＯ細胞株から発現および精製されて、ホモダイマー性ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質複合体を生じる場合がある。
【０３８５】
種々のＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ複合体の精製は、例えば、以下：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、および陽イオン交換クロマトグラフィーのうち３つまたはそれよりも多くを任意の順序で含む、一連のカラムクロマトグラフィーステップにより達成することができた。精製は、ウイルス濾過および緩衝液交換で完了することができた。
【０３８６】
Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）ベースの結合アッセイを使用して、上記のＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃタンパク質複合体のリガンド結合選択性を決定した。抗Ｆｃ抗体を使用してＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃホモダイマーをシステム上に捕捉し、リガンドを注入し、捕捉した受容体タンパク質上に流した。結果を下の表にまとめる。
【表１】
2020506944.tif 000065
【０３８７】
これらのリガンド結合データは、ホモダイマー性ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質がＢＭＰ１０とピコモル濃度の高い親和性で結合し、ＢＭＰ９と約１０分の１の親和性で結合することを実証している。リガンドトラップとして、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃポリペプチドは、好ましくは低速のリガンド解離を示すべきであるので、特にＢＭＰ１０について観察されるオフレートが望ましい。驚くべきことに、ＢＭＰＲＩＩが、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６またはＢＭＰ７などの古典的ＢＭＰタンパク質に対する主なＩＩ型受容体として作用することを示唆している文献にもかかわらず、ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質は、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６またはＢＭＰ７のいずれとも実質的な結合を示さない。したがって、ホモダイマー性ＢＭＰＲＩＩ−Ｆｃは、ＢＭＰ１０およびＢＭＰ９のアンタゴニズムが有利なある特定の治療適用に有用であろう。
【０３８８】
（実施例４）
ＡＬＫ１−Ｆｃ融合タンパク質
間にリンカーをはさんでヒトＡＬＫ１の細胞外ドメインをヒトＦｃドメインと融合させた、またはマウスＡＬＫ１の細胞外ドメインをマウスＦｃドメインと融合させたＡＬＫ１融合タンパク質を産生した。この構築物を、それぞれＡＬＫ１−ｈＦｃおよびｍＡＬＫ１−ｍＦｃと名付ける。
【０３８９】
特に、ヒトＡＬＫ１タンパク質の細胞外ドメインの従来のＣ末端が、配列番号２０のアミノ酸１１８であるのに対し、本発明者らは、グルタミン残基で終わるドメインを有することを回避することが理想的であると判定した。したがって、ヒトＡＬＫ１から得られる配列番号７６の部分には、Ｑ１１８のＣ末端側にロイシンおよびアラニンの２つの残基が組み込まれている。したがって、本開示は、Ｑ１１８の１〜５アミノ酸上流（配列番号２０に関して１１３〜１１７）または下流（１１９〜１２３）のどこかである、ＡＬＫ１由来配列のＣ末端を有するＡＬＫ１  ＥＣＤポリペプチド（Ｆｃ融合タンパク質を含む）を提供する。
【０３９０】
ＡＬＫ１−ｈＦｃおよびＡＬＫ１−ｍＦｃタンパク質をＣＨＯ細胞株において発現させた。３つの異なるリーダー配列：（ｉ）ミツバチメリチン（ＨＢＭＬ）、（ｉｉ）組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）、およびネイティブ：ＭＴＬＧＳＰＲＫＧＬＬＭＬＬＭＡＬＶＴＱＧ（配列番号７３）を検討した。
【０３９１】
選択されたＡＬＫ１−ｈＦｃ形態は、ＴＰＡリーダーを使用し、下に示されるプロセシングされていないアミノ酸配列：
【化５４】
2020506944.tif 000066
を有する。
【０３９２】
ＡＬＫ１の細胞外ドメインに下線を付ける。
【０３９３】
ＣＨＯ細胞株から精製されたようなＡＬＫ１−ｈＦｃを下に示す：
【化５５】
2020506944.tif 000067
【０３９４】
精製は、例えば、以下：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、および陽イオン交換クロマトグラフィーのうち３つまたはそれよりも多くを任意の順序で含む、一連のカラムクロマトグラフィーステップにより達成することができる。精製は、ウイルス濾過および緩衝液交換で完了することができる。サイズ排除クロマトグラフィーにより決定されるとき＞９８％およびＳＤＳ  ＰＡＧＥにより決定されるとき＞９５％の純度にＡＬＫ１−ｈＦｃタンパク質を精製した。
【０３９５】
Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）器具を用いていくつかのリガンドのＡＬＫ１−ｈＦｃに対する親和性をｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価した。標準的なアミンカップリング手順を使用してＢｉａｃｏｒｅ（商標）ＣＭ５チップ上に種々のリガンドを固定化した。ＡＬＫ１−ｈＦｃをシステム上にロードし、結合を測定した。ＡＬＫ１−ｈＦｃは、１．４９×１０−１１Ｍの解離定数（ＫＤ）でＢＭＰ１０、および３．１４×１０−１１ＭのＫＤでＢＭＰ９と結合した。ＡＬＫ１−ｈＦｃは、ＢＭＰ５またはＢＭＰ６に対して検出可能な結合親和性を有さなかった。ＡＬＫ１−ｍＦｃは同じように挙動した。
【０３９６】
（実施例５）
ＥＮＧ−Ｆｃ融合タンパク質の産生
ヒトＥＮＧ完全長細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（配列番号２４のアミノ酸２６〜５８６）がヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインに、これらのドメインの間にリンカーをはさんで付加されたエンドグリン（ＥＮＧ）融合タンパク質［ｈＥＮＧ（２６−５８６）−ｈＦｃ］。
【０３９７】
３つの異なるリーダー配列：（ｉ）ミツバチメリチン（ＨＢＭＬ）、（ｉｉ）組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）、および（ｉｉｉ）ネイティブなヒトＥＮＧ：ＭＤＲＧＴＬＰＬＡＶＡＬＬＬＡＳＣＳＬＳＰＴＳＬＡ（配列番号７７）を検討した。
【０３９８】
ｈＥＮＧ（２６−５８６）−ｈＦｃの選択された形態は、ＴＰＡリーダーを使用し、下に示されるプロセシングされていないアミノ酸配列：
【化５６−１】
2020506944.tif 000068
【化５６−２】
2020506944.tif 000069
を有する。
【０３９９】
ＥＮＧ細胞外ドメインを、一重下線を付けて表示し；ＴＰＡリーダーを、二重下線を付けて表示する。
【０４００】
上記のｈＥＮＧ（２６−５８６）−ｈＦｃは、下に示されるヌクレオチド配列：
【化５７−１】
2020506944.tif 000070
【化５７−２】
2020506944.tif 000071
によりコードされる。
【０４０１】
ＥＮＧ細胞外ドメインを、一重下線を付けて表示し；ＴＰＡリーダーを、二重下線を付けて表示する。
【０４０２】
Ｎ末端トランケーション型ｈＦｃドメインがＴリンカーによりｈＥＮＧ（２６−５８６）に付加されたものを含む、ＴＰＡリーダーを有する代替的なｈＥＮＧ（２６−５８６）−ｈＦｃ配列も構想した：
【化５８】
2020506944.tif 000072
【０４０３】
例えば、馴化培地の濾過、それに続くプロテインＡクロマトグラフィー、低ｐＨ（３．０）グリシン緩衝液を用いた溶出、試料の中和、およびＰＢＳに対する透析を含む、多様な技術を使用して精製を達成した。分析用サイズ排除クロマトグラフィー、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、銀染色、およびウエスタンブロットにより試料の純度を評価した。成熟タンパク質の分析により、予想されたＮ末端配列を確認した。
【０４０４】
検討した共受容体であるＥＮＧは、Ｉ型受容体およびＩＩ型受容体の多タンパク質複合体とのＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β３の結合を容易にすることにより機能すると広く考えられている。単離されたＥＮＧによる直接リガンド結合の可能性を検討するために、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）方法論（Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）器具）を使用して、多様な可溶性ヒトＴＧＦ−βファミリーリガンドに対する、ＥＮＧの完全長細胞外ドメインを含む捕捉されたタンパク質の結合についてスクリーニングした。
【表２】
2020506944.tif 000073
【０４０５】
この表に示すように、低リガンド濃度で評価された場合、ｈＥＮＧ（２６−５８６）−ｈＦｃに対する結合親和性は、ｈＢＭＰ９およびｈＢＭＰ１０について高かった（＋＋＋＋、ＫＤ＜１ｎＭ）。４０倍高い濃度であっても、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、アクチビンＡ、ＢＭＰ２、およびＢＭＰ７のｈＥＮＧ（２６−５８６）−ｈＦｃへの結合は、検出不能（−）であった。この後者の群のリガンドについて、単離されたＥＮＧ融合タンパク質との直接結合の欠如は、注目に値する。それは、Ｉ型およびＩＩ型受容体の多タンパク質複合体が、ＥＮＧの非存在下よりもその存在下でそれらの大部分とより良好に結合することが示されていたからである。上の表に同じく示されるように、Ｆｃドメインを有さないヒトバリアントである固定化ｈＥＮＧ（２６−５８６）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号１０９７−ＥＮ）とリガンドが結合する能力についてリガンドをスクリーニングしたときに類似の結果が得られた。ＳＰＲによる特徴付けにより、捕捉されたｈＥＮＧ（２６−５８６）−ｈＦｃが可溶性ＢＭＰ９と２９ｐＭのＫＤで、および可溶性ＢＭＰ１０と４００ｐＭのＫＤで結合すると決定された。したがって、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０の選択的高親和性結合は、ＥＮＧ細胞外ドメインのこれまでに認識されていない特性である。
【０４０６】
間にリンカーをはさんでヒトＥＮＧ  ＥＣＤのトランケーション型バリアントがヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインと融合されたＥＮＧ融合タンパク質も産生した。これらのバリアントを下に挙げ、選択されたバリアントの構造を図１３に概略的に示す。
【表３】
2020506944.tif 000074
【０４０７】
示したように、ＨＥＫ２９３細胞またはＣＯＳ細胞における一過性トランスフェクションによりこれらのバリアントを発現させた。
【０４０８】
ＳＰＲ方法論を使用して、ヒトＢＭＰ９およびＢＭＰ１０との高親和性結合についてこれらのｈＥＮＧ−ｈＦｃタンパク質バリアントをスクリーニングした。これらの実験では、捕捉されたｈＥＮＧ−ｈＦｃタンパク質をそれぞれ１００ｎＭで可溶性ＢＭＰ９またはＢＭＰ１０に曝露した。
【表４】
2020506944.tif 000075
【０４０９】
上の表に示されるように、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０との高親和性結合は、完全長構築物およびｈＥＮＧ（２６−３４６）−ｈＦｃのように短いＣ末端トランケーション型バリアントについてのみ観察された。試験した６１アミノ酸よりも長い全てのＮ末端トランケーションについて、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０との高親和性結合は失われた。
【０４１０】
Ｃ末端トランケーション型バリアントｈＥＮＧ（２６−３４６）−ｈＦｃ、ｈＥＮＧ（２６−３５９）−ｈＦｃ、およびｈＥＮＧ（２６−４３７）−ｈＦｃとの潜在的結合についてリガンドのパネルをスクリーニングした。これらの３種のタンパク質の高親和性結合は、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０に選択的であった。ｈＥＮＧ（２６−３４６）−ｈＦｃ、ｈＥＮＧ（２６−３５９）−ｈＦｃ、およびｈＥＮＧ（２６−４３７）−ｈＦｃのいずれも、高いリガンド濃度であってもＢＭＰ２、ＢＭＰ７、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、またはアクチビンＡと検出可能な結合を示さなかった。
【表５】
2020506944.tif 000076
【０４１１】
ＳＰＲ方法論は、５種の構築物：ｈＥＮＧ（２６−５８６）−ｈＦｃ、ｈＥＮＧ（２６−４３７）−ｈＦｃ、ｈＥＮＧ（２６−３７８）−ｈＦｃ、ｈＥＮＧ（２６−３５９）−ｈＦｃ、およびｈＥＮＧ（２６−３４６）−ｈＦｃによるＢＭＰ９の結合動態を比較することであった。ヒトＢＭＰ−９のｈＥＮＧ（２６−３５９）−ｈＦｃまたはｈＥＮＧ（２６−３４６）−ｈＦｃに対する親和性（低ピコモル濃度範囲のＫＤを有する）は、完全長構築物に対する親和性よりもほぼ１桁大きかった。ＥＮＧ−Ｆｃなどのリガンドトラップが比較的低速のリガンド解離を示すことが大いに望ましいので、完全長構築物と比較してｈＥＮＧ（２６−３４６）−ｈＦｃに対するＢＭＰ９の解離速度における１０倍の改善（減少）は、特に注目すべきである。
【表６】
2020506944.tif 000077
【０４１２】
下に示すように、完全長構築物と比較してトランケーション型バリアントのそれぞれは、ＢＭＰ１０とも高い親和性で、より良好な動態で結合した。たとえそうであっても、トランケーション型バリアントは、ＢＭＰ１０と比べてＢＭＰ９に対する選好度が異なり（ＫＤ比に基づく）、ｈＥＮＧ（２６−３４６）−ｈＦｃが最大の差を、ｈＥＮＧ（２６−４３７）−ｈＦＣが最小の差を示した。トランケーション型バリアントの間のリガンド選好度のこの差異は、ことによると、それらのｉｎ  ｖｉｖｏ活性における意味のある差異につながる可能性があろう。
【表７】
2020506944.tif 000078
【０４１３】
前述の結果は、ｈＥＮＧ  ＥＣＤのある特定のＣ末端トランケーション型バリアントを含む融合タンパク質が、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０と高親和性結合を示すが、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３を含む多様な他のＴＧＦ−βファミリーリガンドと高親和性結合を示さないことを示している。特に、トランケーション型バリアントｈＥＮＧ（２６−３５９）−ｈＦｃ、ｈＥＮＧ（２６−３４６）−ｈＦｃ、およびｈＥＮＧ（２６−３７８）−ｈＦｃは、完全長構築物ｈＥＮＧ（２６−５８６）−ｈＦｃおよびトランケーション型バリアントｈＥＮＧ（２６−４３７）−ｈＦｃの両方と比較して、ＢＭＰ−９に対して平衡時に高い結合親和性および改善された速度論特性を示す。
【０４１４】
上に開示されたように、３６アミノ酸のように短いＮ末端トランケーション（ｈＥＮＧ（６１−３４６）−ｈＦｃ）は、ＥＮＧポリペプチドとのリガンド結合を打ち消すことが見出された。リガンド結合に対するいっそう短いＮ末端トランケーションの効果を予想するために、修正Ｐｓｉｐｒｅｄバージョン３（Jones、１９９９年、J Mol Biol  ２９２巻：１９５〜２０２頁）を用いてヒトエンドグリンオーファンドメインについての二次構造をコンピューター予測した。この解析により、配列番号２４のアミノ酸２６〜６０によって規定されるＥＮＧポリペプチド領域内の秩序だった二次構造が、配列番号２４の４２〜４５位において高い信頼度で予測される４残基ベータ鎖、および配列番号２４の２８〜２９位において非常に低い信頼度で予測される２残基ベータ鎖に限定されることが示されている。したがって、配列番号２４のアミノ酸２７または２８で開始するＥＮＧポリペプチドバリアントおよび必要に応じてアミノ酸２９〜４２のいずれかで開始するＥＮＧポリペプチドバリアントは、重要な構造エレメントおよびリガンド結合を保持する可能性が高い。
【０４１５】
下記のマウス研究について、ヒトエンドグリンの細胞外ドメインのトランケーション型部分（すなわち、アミノ酸２７〜５８１）をマウスＩｇＧ１のＦｃドメインと、その２つのドメインの間に位置する最小リンカー（ＴＧＧＧ）を用いて融合することによりＥＮＧ−Ｆｃ融合タンパク質を構築した。この構築物は、ｈＥＮＧ（２７−５８１）−ｍＦｃと名付けられ、ｈＥＮＧ（２６−５８１）−ｈＦｃについて上に記載されたものと類似の結合親和性を示した。
【０４１６】
（実施例６）
ＢＭＰ１０プロペプチド融合タンパク質
Ｃ末端トランケーション型ヒトＢＭＰ１０プロペプチドドメイン（配列番号３２のアミノ酸２２〜３１５をヒト免疫グロブリンＧ１  Ｆｃドメインと、オプショナルなリンカーを用いて融合したものを含むＢＭＰ１０プロペプチド−Ｆｃ融合タンパク質を産生した。この融合タンパク質をＢＭＰ１０ｐｒｏ（２２−３１５）−ｈＦｃと名付けた。マウス免疫グロブリンＧ１  Ｆｃドメインを使用して類似の融合タンパク質を産生し、これをＢＭＰ１０ｐｒｏ（２２−３１５）−ｍＦｃと名付ける。検討した、ＢＭＰ１０プロペプチド−Ｆｃ融合タンパク質で使用するためのシグナル配列は、例えば、ネイティブなヒトＢＭＰ１０前駆体リーダー、ＭＧＳＬＶＬＴＬＣＡＬＦＣＬＡＡＹＬＶＳＧ（配列番号８１）、ミツバチメリチン、および組織型ＴＰＡリーダーを含む。
【０４１７】
ＴＰＡリーダーを有するヒトＢＭＰ１０ｐｒｏ（２２−３１５）−ｈＦｃポリペプチド配列（配列番号８２）を下に示す：
【化５９】
2020506944.tif 000079
【０４１８】
ＢＭＰプロペプチドドメインに下線を付ける。配列番号８２のアミノ酸配列は、必要に応じて、Ｃ末端から除去されたリシンを備える場合がある。
【０４１９】
このＢＭＰ１０ｐｒｏ（２２−３１５）−ｈＦｃ融合タンパク質は、以下の核酸配列（配列番号８３）によりコードされる：
【化６０−１】
2020506944.tif 000080
【化６０−２】
2020506944.tif 000081
【０４２０】
プロセシングされたＢＭＰ１０ｐｒｏ（２２−３１５）−ｈＦｃ融合タンパク質（配列番号８４）は、以下の通りであり、必要に応じて、Ｃ末端から除去されたリシンを備える場合がある。
【化６１】
2020506944.tif 000082
【０４２１】
ＢＭＰプロペプチドドメインに下線を付ける。
【０４２２】
ヒトＢＭＰ１０プロペプチドドメインのより長いＣ末端トランケーション（配列番号３２のアミノ酸２２〜３１２）をヒト免疫グロブリンＧ１  Ｆｃドメインと、オプショナルなリンカーを用いて融合したものを含む、別のＢＭＰ１０プロペプチド−Ｆｃ融合タンパク質を産生した。この融合タンパク質をＢＭＰ１０ｐｒｏ（２２−３１２）−ｈＦｃと名付けた。マウス免疫グロブリンＧ１  Ｆｃドメインを使用して類似の融合タンパク質を産生し、これをＢＭＰ１０ｐｒｏ（２２−３１２）−ｍＦｃと名付ける。検討した、ＢＭＰ１０ｐｒｏ（２２−３１２）−Ｆｃ融合タンパク質で使用するためのシグナル配列には、例えば、ネイティブなヒトＢＭＰ１０前駆体リーダー、ミツバチメリチン、およびＴＰＡリーダーが含まれる。
【０４２３】
ＴＰＡリーダーを有するヒトＢＭＰ１０ｐｒｏ（２２−３１２）−ｈＦｃポリペプチド配列（配列番号８５）を下に示す：
【化６２】
2020506944.tif 000083
【０４２４】
ＢＭＰプロペプチドドメインに下線を付ける。配列番号８５のアミノ酸配列は、必要に応じて、Ｃ末端から除去されたリシンを備える場合がある。
【０４２５】
このＢＭＰ１０ｐｒｏ（２２−３１２）−ｈＦｃ融合タンパク質は、以下の核酸配列（配列番号８６）によりコードされる：
【化６３−１】
2020506944.tif 000084
【化６３−２】
2020506944.tif 000085
【０４２６】
プロセシングされたＢＭＰ１０ｐｒｏ（２２−３１２）−ｈＦｃ融合タンパク質（配列番号８７）は、以下の通りであり、必要に応じて、Ｃ末端から除去されたリシンを備える場合がある。
【化６４】
2020506944.tif 000086
【０４２７】
ＢＭＰプロペプチドドメインに下線を付ける。
【０４２８】
上記のＢＭＰ１０ｐｒｏ−Ｆｃ融合タンパク質は、ＣＯＳまたはＣＨＯ細胞株から発現および精製されて、ホモダイマー性ＢＭＰ１０ｐｒｏ−Ｆｃ融合タンパク質複合体を生じる場合がある。
【０４２９】
種々のＢＭＰ１０ｐｒｏ−Ｆｃ融合タンパク質複合体の精製は、例えば、以下：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、および陽イオン交換クロマトグラフィーのうち３つまたはそれよりも多くを任意の順序で含む、一連のカラムクロマトグラフィーステップにより達成することができる。精製は、ウイルス濾過および緩衝液交換で完了した。
【０４３０】
Ｃ末端トランケーション型バリアントＢＭＰ１０ｐｒｏ（２２−３１５）−ｈＦｃおよびＢＭＰ１０ｐｒｏ（２２−３１２）−ｈＦｃ、ならびに対応するマウス融合タンパク質に対する潜在的結合について、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）ベースの結合アッセイを使用してリガンドのパネルをスクリーニングした。抗Ｆｃ抗体を使用してＢＭＰ１０ｐｒｏ−Ｆｃタンパク質を別々にシステム上に捕捉し、リガンドを注入し、捕捉された受容体タンパク質上に流した。ＢＭＰ１０ｐｒｏ（２２−３１５）−ｈＦｃおよびＢＭＰ１０ｐｒｏ（２２−３１２）−ｈＦｃは、両方ともＢＭＰ１０およびＢＭＰ９に対して高親和性を示した。両方の構築物は、ＢＭＰ６およびＢＭＰ５に対しても高度〜中等度の親和性を示した。マウスＦｃ等価構築物も同じように挙動した。ＢＭＰ１０ｐｒｏ（２２−３１２）−ｈＦｃもＢＭＰ３ｂに対して高い親和性を示した。ＢＭＰ３ｂに対するＢＭＰ１０ｐｒｏ（２２−３１５）−ｈＦｃの親和性は、評価しなかった。
【０４３１】
Ｓｍａｄ１／４／８媒介シグナル伝達に応答性の４つの順次的なコンセンサスＳＢＥ部位（ＳＢＥ４−ｌｕｃ）の制御下でルシフェラーゼレポーター構築物を使用して、ＢＭＰ１０ｐｒｏ（２２−３１５）−ｈＦｃおよびＢＭＰ１０ｐｒｏ（２２−３１２）−ｈＦｃの個別の存在下および非存在下における成熟ＢＭＰ１０媒介活性を、ＨＭＶＥＣ細胞において測定した。結果を下の表に示す。
【表８】
2020506944.tif 000087
【０４３２】
このデータは、ＢＭＰ１０プロペプチドはＢＭＰ１０のアンタゴナイズ活性を喪失することなしに、１、２、３、または４アミノ酸のＣ末端トランケーションを許容し得ることを示している。そのうえ、両方の融合タンパク質がＢＭＰ１０活性の強力な阻害剤であることが示されたのに対し、ＢＭＰ１０ｐｒｏ（２２−３１２）−ｈＦｃ融合タンパク質は、ＢＭＰ１０活性をＢＭＰ１０ｐｒｏ（２２−３１５）−ｈＦｃの３倍またはそれよりも大きくアンタゴナイズすると決定された。ＢＭＰ１０ｐｒｏ（２２−３１２）−ｈＦｃはＢＭＰ１０ｐｒｏ（２２−３１５）−ｈＦｃよりも大きいＣ末端トランケーションを有することを考えると、ＢＭＰ１０ｐｒｏ（２２−３１２）−ｈＦｃの増加した活性は、驚くべきことである。したがって、ＢＭＰ１０阻害を最大化することが望ましいある特定の使用では、配列番号３２に関して残基３１２で終わるＢＭＰ１０ｐｒｏドメインを含むポリペプチドは、配列番号３２に関して残基３１３〜３１５のうちの任意の１つで終わるＢＭＰ１０ｐｒｏドメインよりも好ましい場合がある。より大きい活性を有することに加えて、より短いＢＭＰ１０ｐｒｏドメインは、ＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドに対する免疫反応のリスクを下げることが望ましいある特定の治療適用において好ましい場合があり、すなわち、より少ないアミノ酸が、患者の免疫システムにより認識され得る潜在エピトープの数を減少させる。
【０４３３】
（実施例７）
心不全モデルにおけるＢＭＰ１０プロペプチド処置の効果
心不全の進行に対するＢＭＰ１０ｐｒｏ（２２−３１２）−Ｆｃの効果を、大動脈狭窄を模倣するマウス横行大動脈縮窄（ＴＡＣ）モデルを使用して検討した。例えば、Nakamuraら（２００１年）Am J Physiol Heart CircPhysiol.２８１巻：Ｈ１１０４〜Ｈ１１１２頁を参照されたい。
【０４３４】
１０週齢Ｃ５７／Ｂ６雄性マウス３０匹に０日目にＴＡＣ手術を受けさせ、齢適合動物１０匹に、ＴＡＣを除く同じ外科手技を受けさせた（偽マウス）。手術から覚醒後、ＴＡＣマウスを無作為化して２群に分けた。３日毎に２１日間、マウス１５匹の１つの群にＢＭＰ１０ｐｒｏ（２２−３１２）−ｍＦｃを用量１０ｍｇ／ｋｇで皮下注射し（ＴＡＣ−ＢＭＰ１０ｐｒｏマウス）、マウス１５匹の第２の群にリン酸緩衝生理食塩水を皮下注射した（ビヒクル対照マウス；ＴＡＣ−ＰＢＳマウス）。試験の終わりに、心エコーを行って、左心室機能およびリモデリングを測定し、その後、心臓採取のために動物を安楽死させた。それぞれの心臓を撮影し、１０％ホルマリン中で固定し、マッソン三色染色のために薄片を作製して、線維症を評価した。
【０４３５】
意識のあるマウスにおいて経胸壁心エコー（Ａｃｕｓｏｎ  Ｐ３００、１８ＭＨｚトランスデューサー；Ｓｉｅｍｅｎｓ）によりｉｎ  ｖｉｖｏ心機能を評価した。左心室短軸像から、Ｍモード心エコーを取得して、拡張終期の心室中隔厚、拡張終期の左心室後壁厚、左心室拡張終期径、および左心室収縮終期径を測定した。次式を使用して拡張終期径（ＥＤＤ）および収縮終期径（ＥＳＤ）から短縮率（ＦＳ）を計算した：ＦＳ＝１００％×［（ＥＤＤ−ＥＳＤ）／ＥＤＤ］。組織ドップラー画像から僧帽弁レベルで内側壁または中隔壁から拡張早期の充満ピーク速度（Ｅ）、終期の充満ピーク速度（Ａ）、および等容性弛緩時間（ＩＶＲＴ）を測定した。Ｅ／Ａ比およびＩＶＲＴを測定することにより左心室拡張機能を評価した。各マウスの測定について３〜５拍を平均した。全体の２１日死亡率も計算した。
【０４３６】
本研究では、ＢＭＰ１０ｐｒｏ（２２−３１２）−Ｆｃを用いたマウスの処置は、有意に、心肥大を阻害し（図１４参照）、心リモデリングを抑制し（図１５および１６参照）、心機能を改善し（図１７〜１９参照）、組織学的データにより、心線維症の阻害が確認された（図２０参照）。さらに、この心不全モデルにおいて、ＢＭＰ１０ｐｒｏ（２２−３１２）−Ｆｃ処置は、動物の生存期間を増加させた。まとめると、これらのデータは、ＢＭＰ１０プロペプチド処置が心不全を処置するのに有効であり、心不全の多数の別個の合併症を処置するのに驚くほど有効であることを実証している。これは、ＢＭＰ１０プロペプチドが心不全の１つまたは少数の合併症だけを処置する現行の標準治癒処置よりも心不全の処置に利点を有し得ることを示している。さらに、ＢＭＰ１０プロペプチドが選択的ＢＭＰ結合プロファイル（特にＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、およびＢＭＰ３ｂと高親和性で結合し、ＢＭＰ５とより少ない程度で結合する）を有するので、本明細書において提示されたデータは、類似の結合特性を有する他のＢＭＰアンタゴニストが、心不全の処置に、特に心不全の種々の合併症の予防に、またはその重症度を低減させるのに類似の有益効果を有し得ることを示唆している。
【０４３７】
（実施例８）
心不全モデルにおけるＥｎｄｏ−Ｆｃ処置の効果
心不全の進行に対するｈＥＮＧ（２７−５８１）−ｍＦｃの効果を、大動脈狭窄を模倣するマウス横行大動脈縮窄（ＴＡＣ）モデルを使用して検討した。例えば、Nakamuraら（２００１年）Am J Physiol Heart CircPhysiol.２８１巻：Ｈ１１０４〜Ｈ１１１２頁を参照されたい。
【０４３８】
０日目に１０週齢Ｃ５７／Ｂ６雄性マウス３０匹にＴＡＣ手術を受けさせ、齢適合動物１０匹に、ＴＡＣを除く同じ外科手技を受けさせた（偽マウス）。手術から覚醒後、ＴＡＣマウスを無作為化して２群に分けた。３日毎に２１日間、マウス１５匹の１つの群にｈＥＮＧ（２７−５８１）−ｍＦｃを用量１０ｍｇ／ｋｇで皮下注射し（ＴＡＣ−Ｅｎｄｏ）、マウス１５匹の第２の群にリン酸緩衝生理食塩水を皮下注射した（ビヒクル対照マウス；ＴＡＣ−ＰＢＳマウス）。試験の終わりに、心エコーを行って、左心室機能およびリモデリングを測定し、その後、心臓採取のために動物を安楽死させた。それぞれの心臓を撮影し、１０％ホルマリン中で固定し、マッソン三色染色のために薄片を作製して、線維症を評価した。
【０４３９】
意識のあるマウスにおいて経胸壁心エコー（Ａｃｕｓｏｎ  Ｐ３００、１８ＭＨｚトランスデューサー；Ｓｉｅｍｅｎｓ）によりｉｎ  ｖｉｖｏ心機能を評価した。左心室短軸像から、Ｍモード心エコーを取得して、拡張終期の心室中隔厚、拡張終期の左心室後壁厚、左心室拡張終期径、および左心室収縮終期径を測定した。次式を使用して拡張終期径（ＥＤＤ）および収縮終期径（ＥＳＤ）から短縮率（ＦＳ）を計算した：ＦＳ＝１００％×［（ＥＤＤ−ＥＳＤ）／ＥＤＤ］。組織ドップラー画像から僧帽弁レベルで内側壁または中隔壁から拡張早期の充満ピーク速度（Ｅ）、終期の充満ピーク速度（Ａ）、および等容性弛緩時間（ＩＶＲＴ）を測定した。Ｅ／Ａ比およびＩＶＲＴを測定することにより左心室拡張機能を評価した。各マウスの測定について３〜５拍を平均した。全体の２１日死亡率も計算した。
【０４４０】
本研究では、ｈＥＮＧ（２７−５８１）−ｍＦｃを用いたマウスの処置は、有意に、心肥大を阻害し（図２３参照）、心機能を改善し（図２４および２５参照）、組織学的データにより、心線維症の阻害が確認された（図２６参照）。さらに、この心不全モデルにおいて、ｈＥＮＧ（２７−５８１）−ｍＦｃ処置は、動物の生存期間を増加させた。まとめると、これらのデータは、エンドグリンポリペプチド処置が心不全を処置するのに有効であり、心不全の多数の別個の合併症を処置するのに驚くほど有効であることを実証している。これは、エンドグリンポリペプチドが心不全の１つまたは少数の合併症だけを処置する現行の標準治癒処置よりも心不全の処置に利点を有し得ることを示している。
【０４４１】
（実施例９）
心筋梗塞モデルにおけるＢＭＰ１０プロペプチドおよびＥｎｄｏ−Ｆｃ処置の効果
心不全の進行に対するＢＭＰ１０ｐｒｏ（２２−３１２）−ＦｃおよびｈＥＮＧ（２７−５８１）−ｍＦｃの効果を、マウス心筋梗塞（ＭＩ）モデルを使用して検討した。例えば、Patten R. D.ら（１９９８年）Am J Physiol.２７４巻：Ｈ１８１２〜１８２０頁を参照されたい。
【０４４２】
０日目に１０週齢Ｃ５７／Ｂ６雄性マウス３０匹にＬＡＤ手術を受けさせて心筋梗塞を誘導し（ＭＩマウス）、齢適合動物１０匹に、ＬＡＤを除く同じ外科手技を受けさせた（偽マウス）。手術から覚醒後、ＭＩマウスを無作為化して３群に分けた。３日毎に２８日間、マウス１５匹の１つの群にＢＭＰ１０ｐｒｏ（２２−３１２）−Ｆｃを用量１０ｍｇ／ｋｇで皮下注射し（ＭＩ−ＢＭＰ１０ｐｒｏ）、マウス１５匹の第２の群にｈＥＮＧ（２７−５８１）−ｍＦｃを用量１０ｍｇ／ｋｇで皮下注射し（ＭＩ−Ｅｎｄｏ）、マウス１５匹の第３の群にリン酸緩衝生理食塩水を皮下注射した（ビヒクル対照マウス；ＭＩ−ＰＢＳマウス）。試験の終わりに、心エコーを行って、左心室機能およびリモデリングを測定し、その後、心臓採取のために動物を安楽死させた。それぞれの心臓を撮影し、１０％ホルマリン中で固定し、マッソン三色染色のために薄片を作製して、線維症を評価した。
【０４４３】
意識のあるマウスにおいて経胸壁心エコー（Ａｃｕｓｏｎ  Ｐ３００、１８ＭＨｚトランスデューサー；Ｓｉｅｍｅｎｓ）によりｉｎ  ｖｉｖｏ心機能を評価した。左心室短軸像から、Ｍモード心エコーを取得して、拡張終期の心室中隔厚、拡張終期の左心室後壁厚、左心室拡張終期径、および左心室収縮終期径を測定した。次式を使用して拡張終期径（ＥＤＤ）および収縮終期径（ＥＳＤ）から短縮率（ＦＳ）を計算した：ＦＳ＝１００％×［（ＥＤＤ−ＥＳＤ）／ＥＤＤ］。組織ドップラー画像から僧帽弁レベルで内側壁または中隔壁から拡張早期の充満ピーク速度（Ｅ）、終期の充満ピーク速度（Ａ）、および等容性弛緩時間（ＩＶＲＴ）を測定した。Ｅ／Ａ比およびＩＶＲＴを測定することにより左心室拡張機能を評価した。各マウスの測定について３〜５拍を平均した。全体の２８日死亡率も計算した。
【０４４４】
本研究では、ＢＭＰ１０ｐｒｏ（２２−３１２）−ＦｃまたはｈＥＮＧ（２７−５８１）−ｍＦｃを用いたマウスの処置は、有意に、心肥大を阻害し（図２７参照）、心リモデリングを抑制し（図２８および２９参照）、心線維症を阻害した（図３０参照）。ｈＥＮＧ（２７−５８１）−ｍＦｃを用いた処置は、心機能をさらに改善した（図３１および３２参照）。さらに、この心不全モデルにおいて、ｈＥＮＧ（２７−５８１）−ｍＦｃまたはＢＭＰ１０ｐｒｏ（２２−３１２）−Ｆｃ処置は、動物の生存期間を増加させた。まとめると、これらのデータは、エンドグリンポリペプチドＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチド処置が心筋梗塞に続く心不全を処置するのに有効であり、心不全の多数の別個の合併症を処置するのに驚くほど有効であることを実証している。これは、エンドグリンポリペプチドおよびＢＭＰ１０ｐｒｏポリペプチドが、心不全の１つまたは少数の合併症だけを処置する現行の標準治癒処置よりも心不全の処置に利点を有し得ることを示している。
【０４４５】
参照による組込み
本明細書において言及された全ての刊行物および特許は、各個別の刊行物または特許が参照により組み込まれていると具体的かつ個別に示されたかの如く、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０４４６】
主題の具体的な実施形態が論じられているものの、上記の明細書は、例証的であって限定するものではない。本明細書および下記の特許請求の範囲を調査すると多数の変形が当業者に明白になるであろう。本発明の全範囲は、均等物の全範囲に加えて特許請求の範囲、およびかかる変形に加えて明細書への参照により決定されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2020506944.tif 000099
【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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