(57)【要約】  Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼを阻害し得る化合物、ならびに、当該化合物を含む組成物及びキット、及び、当該化合物を使用する方法を開示している。【選択図】図１
2020504754.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）の化合物、または、その塩であって、
【化２０】
2020504754.tif 000226
式中、
Ａは、存在せず、任意に置換されたフェニル環、または、任意に置換されたチエニル環であり、
Ｌ1は、存在せず、または、−（ＣＲa1Ｒa2）m1−であり、式中、ｍ１は、１〜１００であり、１つ以上のＣＲa1Ｒa2基は、ヘテロ原子、または、Ｏ、Ｎ（Ｒa3）、Ｓ（＝Ｏ）、及び、Ｓ（＝Ｏ）2からなる群から選択されるヘテロ原子基で置換されてもよく、１つ以上のＣＲa1Ｒa2基は、Ｃ（＝Ｏ）で置換されてもよく、隣接する２つのＣＲa1Ｒa2基が、ＣＲa1＝ＣＲa1を形成してもよく、かつ、１つ以上のＣＲa1Ｒa2基が、−Ｃｙ−基で置換されてもよく、各Ｃｙは、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、及び、複素環からなる群から独立して選択され、式中、Ｒa1、Ｒa2、及びＲa3は、独立して、水素、及びＣ1−Ｃ4−アルキルからなる群から選択され、
Ｚは、Ｃ1−Ｃ10ハロアルキル、脱離基Ｙ、生物活性剤、または、色素であり、前記脱離基Ｙは、ＯＲ4、ハロゲン、ヘテロアリール、及び、ヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ1は、水素、または、Ｃ1−Ｃ8アルキルであり、
Ｒ2は、水素、任意に置換されたＣ1−Ｃ8アルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換されたアリールアルキル、任意に置換されたアルコキシアルキル、及び、任意に置換されたアルコキシアルコキシアルキルからなる群から選択され、
Ｒ3は、水素、または、Ｃ1−Ｃ8アルキルであり、及び
Ｒ4は、任意に置換されたＣ1−Ｃ8アルキル、任意に置換されたＣ3−Ｃ8−シクロアルキル、任意に置換されたＣ3−Ｃ8−シクロアルキルアルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたアリールアルキル、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換されたヘテロアリールアルキル、任意に置換されたヘテロシクリル、及び、任意に置換されたヘテロシクリルアルキルである、
前記化合物、または、その塩。
【請求項２】
Ａが、任意に置換されたフェニル環である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ａが、任意に置換されたチエニル環である、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ1が、水素、Ｃ1−Ｃ8アルキル、ハロ−Ｃ1−Ｃ8−アルキル、アルコキシアルコキシアルキル、及び、アリールアルキルからなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ2が、任意に置換されたアリールである、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ2が、Ｃ1−Ｃ4アルキル、シアノ、アミド、Ｃ1−Ｃ4アルコキシ、Ｃ1−Ｃ4ハロアルキル、及び、ヒドロキシアルキルからなる群から選択される少なくとも１つの置換基で置換されているフェニルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ3が、水素である、請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
式（Ｉａ）を有する化合物であって、
【化２１】
2020504754.tif 000227
式中、
Ａは、存在せず、フェニル環、または、チエニル環であり、
Ｒ2が、少なくとも１つのＣ1−Ｃ4アルキル、または、Ｃ1−Ｃ4ハロアルキルで置換されているフェニルであり、及び
Ｌ2は、存在せず、または、−（ＣＲa1Ｒa2）m2−であり、式中、ｍ２は、１〜９０であり、各ＣＲa1Ｒa2は、請求項１で定義した通りである、
請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
式（Ｉｂ）を有する化合物であって、
【化２２】
2020504754.tif 000228
式中、
Ａは、存在せず、フェニル環、または、チエニル環であり、
Ｒ2が、少なくとも１つのＣ1−Ｃ4アルキル、または、Ｃ1−Ｃ4ハロアルキルで置換されているフェニルであり、及び
Ｒx及びＲyは、各々の存在時に、独立して、水素、または、Ｃ1−Ｃ4アルキルであり、
ｐは、４、５、６、７、８、９、または、１０であり
ｔは、０または１であり、
ｖは、０または１であり、及び
Ｌ3は、存在せず、または、−（ＣＲa1Ｒa2）m3−であり、式中、ｍ３は、１〜８０であり、各ＣＲa1Ｒa2は、請求項１で定義した通りである、
請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｌ3は、−（ＣＲa1Ｒa2）m3−であり、式中、ｍ３は、１〜２０であり、及び、Ｒa1及びＲa2は、各々の存在時に、独立して、水素、または、Ｃ1−Ｃ4アルキルである、請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｌ3が、−Ｑ1−（ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ）k1−Ｑ2−（ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ）k2−Ｑ3−（ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ）k3−であり、
式中、
Ｑ1は、存在せず、Ｏ、または、ＮＨであり、
Ｑ2は、存在せず、
2020504754.tif 000229
、−ＣＯ−ＮＨ−、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＯ−、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＯ、または、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＯ−ＮＨ−であり、
Ｑ3は、存在せず、−ＣＯ−ＮＨ−、または、−ＣＨ2−ＣＨ2−であり、
ｋ１は、１〜１０であり、
ｋ２は、０〜１０であり、及び、
ｋ３は、０〜１０である、
請求項９に記載の化合物。
【請求項１２】
Ｌ3が、
2020504754.tif 000230
2020504754.tif 000231
2020504754.tif 000232
2020504754.tif 000233
2020504754.tif 000234
2020504754.tif 000235
2020504754.tif 000236
2020504754.tif 000237
2020504754.tif 000238
2020504754.tif 000239
2020504754.tif 000240
2020504754.tif 000241
2020504754.tif 000242
及び
2020504754.tif 000243
からなる群から選択される、請求項９に記載の化合物。
【請求項１３】
Ｚが、Ｃ1−Ｃ10ハロアルキルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項１４】
式（Ｉｃ）を有する化合物であって、
【化２３】
2020504754.tif 000244
式中、
Ａは、フェニル環、または、チエニル環であり、
Ｒ2は、１つのメチル、または、エチル基で置換されているフェニルであり、
Ｒx及びＲyは、各々の存在時に、独立して、水素、または、Ｃ1−Ｃ4アルキルであり、
ｐは、４、５、６、７、８、９、または、１０であり、及び
Ｌ3は
2020504754.tif 000245
または
2020504754.tif 000246
である、
請求項１３に記載の化合物。
【請求項１５】
Ｚが、−（ＣＨ2）6−Ｃｌである、請求項１３に記載の化合物。
【請求項１６】
Ｚが、ＯＲ4、ハロゲン、ヘテロアリール、及び、ヘテロシクリルからなる群から選択される脱離基Ｙである、請求項１に記載の化合物。
【請求項１７】
式（Ｉｄ）を有する化合物であって、
【化２４】
2020504754.tif 000247
式中、
Ａは、フェニル環、または、チエニル環であり、
Ｒ2は、メチル、エチル、−ＣＨ2Ｂｒ、及び、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2Ｂｒからなる群から選択される１つの置換基で置換されているフェニルであり、
Ｒx及びＲyは、各々の存在時に、独立して、水素、または、Ｃ1−Ｃ4アルキルであり、
ｐは、４、５、６、７、８、９、または、１０であり
ｔは、０または１であり、
ｖは、０または１であり、及び
Ｌ3は、存在せず、Ｃ1-Ｃ4アルキレン、
2020504754.tif 000248
、
2020504754.tif 000249
、
2020504754.tif 000250
、
2020504754.tif 000251
または
2020504754.tif 000252
である、
請求項１６に記載の化合物。
【請求項１８】
Ｚが、クロロ、ブロモ、ヨード、Ｃ1-Ｃ4アルコキシ、フェノキシ、
2020504754.tif 000253
である、請求項１７に記載の化合物。
【請求項１９】
Ｌ3は、存在せず、
2020504754.tif 000254
、
2020504754.tif 000255
、
2020504754.tif 000256
または
2020504754.tif 000257
であり、及び
Ｚが、Ｃ1-Ｃ4アルコキシ、フェノキシ、
2020504754.tif 000258
である、請求項１７に記載の化合物。
【請求項２０】
Ｌ3が、−ＣＨ2−ＣＨ2−、または、
2020504754.tif 000259
であり、及び、
Ｚが、
2020504754.tif 000260
であり、または
Ｌ3が、Ｃ1−Ｃ4アルキレンであり、及び、Ｚは、クロロ、ブロモ、または、ヨードである、請求項１７に記載の化合物。
【請求項２１】
ｔが、０であり、
ｖが、０であり、
Ｌ3が、存在せず、及び
Ｚが、ブロモ、ヨード、または、
2020504754.tif 000261
である、請求項１７に記載の化合物。
【請求項２２】
Ｚが、酵素阻害剤、受容体阻害剤、及び、タンパク質分解を誘導する部分からなる群から選択される生物活性剤である、請求項１に記載の化合物。
【請求項２３】
Ｚが、キナーゼ阻害剤である、請求項２２に記載の化合物。
【請求項２４】
式（Ｉｅ）を有する化合物であって、
【化２５】
2020504754.tif 000262
式中、
Ａは、存在せず、フェニル環、または、チエニル環であり、
Ｒ2は、１つのメチル、または、エチル基で置換されているフェニルであり、
Ｒx及びＲyは、各々の存在時に、独立して、水素、または、Ｃ1−Ｃ4アルキルであり、
ｐは、４、５、６、７、８、９、または、１０であり、
Ｌ3は、
2020504754.tif 000263
または
2020504754.tif 000264
であり、及び
Ｚは、
2020504754.tif 000265
であり、または
Ｌ3は、
2020504754.tif 000266
または
2020504754.tif 000267
であり、及び
Ｚは、
2020504754.tif 000268
である、
請求項２２に記載の化合物。
【請求項２５】
Ｚが、色素である、請求項１に記載の化合物。
【請求項２６】
式（Ｉｆ’）を有する化合物であって、
【化２６】
2020504754.tif 000269
式中、
Ａは、フェニル環、または、チエニル環であり、
Ｒ2は、１つのメチル、または、エチル基で置換されているフェニルであり、
Ｒx及びＲyは、各々の存在時に、独立して、水素、または、Ｃ1−Ｃ4アルキルであり、
ｐは、４、５、６、７、８、９、または、１０であり、
Ｌ3は、存在せず、
2020504754.tif 000270
、
2020504754.tif 000271
または
2020504754.tif 000272
であり、及び
Ｚは、
2020504754.tif 000273
2020504754.tif 000274
である、請求項２５に記載の化合物。
【請求項２７】
前記化合物が、
１−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ）「３，２−ｂ］ピロール−５−（カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，１０−ジオキソ−１１，１４，１７−トリオキサ−２，９−ジアザノナデカン−１９−イル（２−（２−（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチル）カルバメート、
［（Ｅ）−３０−クロロ−６，１７−ジオキソ−５，１０，１３，１６，２１，２４−ヘキサオキサ−７，１８−ジアザトリアコント−２−エン−１−イル（１−（トランス−４−（４−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，１０−ジオキソ−１１，１４，１７−トリオキサ−２，９−ジアザノナデカン−１９−イル）カルバメート、
［（Ｅ）−３０−クロロ−６，１７−ジオキソ−５，１０，１３，１６，２１，２４−ヘキサオキサ−７，１８−ジアザトリアコント−２−エン−１−イル（１−（トランス−４−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，１０−ジオキソ−１１，１４，１７−トリオキサ−２，９−ジアザノナデカン−１９−イル）カルバメート、
１−（トランス−４−（４−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，１０）−ジオキソ−１１，１４，１７−トリオキサ−２，９−ジアザノナデカン−１９−イル（２−（２−（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチル）カルバメート、
１−（トランス−４−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキシル））−１，１０−ジオキソ−１１，１４，１７−トリオキサ−２，９−ジアザノナデカン−１９−イル（２−（２−（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチル）カルバメート、
２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  １−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−（カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，８−ジオキソ−１２，１５−ジオキサ−２，９−ジアザオクタデカン−１８−オアート、
２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  １−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，８−ジオキソ−１２，１５，１８−トリオキサ−２，９−ジアザヘニコサン−２１−オアート、
２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  １−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，８−ジオキソ−１２，１５，１８，２１−テトラオキサ−２，９−ジアザテトラコサン−２４−オアート、
２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  １−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，１０−ジオキソ−１４，１７−ジオキサ−２，１１−ジアザイコサン−２０−オアート、
２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  １−（（１ｒ，４ｒ）−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル））−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，１０−ジオキソ−１４，１７，２０−トリオキサ−２，１１−ジアザトリコサン−２３−オアート、
２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  １−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，１０−ジオキソ−１４，１７，２０，２３−テトラオキサ−２，１１−ジアザヘキサコサン−２６−オアート、
２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  １−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，８−ジオキソ−１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０，３３−オクタオキサ−２，９−ジアザヘキサトリアコンタン−３６−オアート、
Ｎ−（トランス−４−（（６−（３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）プロパンアミド）ヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド、
Ｎ−（トランス−４−（（１−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−３，１３−ジオキソ−７，１０−ジオキサ−４，１４−ジアザイコサン）−２０−イル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド、
メチル  トランス−４−（４−（２−（（３−（ブロモメチル）フェニル）（エチル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン）−１−カルボキシラート、
メチル  トランス−４−（４−（２−（（３−（３−ブロモプロピル）フェニル）（エチル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン）−１−カルボキシラート、
２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  ８−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）オクタノアート、
メチル  ８−（トランス−４−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）オクタノアート、
メチル  ６−（トランス−４−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキサノアート、
２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  ８−（トランス−４−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）オクタノアート、
２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  ６−（トランス−４−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキサノアート、
フェニル  ８−（トランス−４−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）オクタノアート、
フェニル  ６−（トランス−４−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキサノアート、
１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（（６−ヨードヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド、
Ｎ−（トランス−４−（（６−ブロモヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド、
１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（（８−ヨードオクチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド、
４−フルオロフェニル  ８−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）オクタノアート、
３，５−ジフルオロフェニル  ８−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン）−１−カルボキサミド）オクタノアート、
４−シアノフェニル  ８−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）オクタノアート、
ナトリウム  １−（（８−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）オクタノイル）オキシ）−２，５−ジオキソピロリジン−３−スルホナート、
Ｎ−（トランス−４−（（５−（２−クロロアセトアミド）ペンチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド、
Ｎ−（トランス−４−（（６−（２−クロロアセトアミド）ヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド、
２，３，５，６−テトラフルオロフェニル  ８−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）オクタノアート、
Ｎ−（トランス−４−（（５−（２−ブロモアセトアミド）ペンチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド、
Ｎ−（トランス−４−（（１−（４−（６−（（５−（（２−クロロ−６−メチルフェニル）カルバモイル）チアゾール−２−イル）アミノ）−２−メチルピリミジン−４−イル）ピペラジン−１−イル）−７，１７−ジオキソ−３，１０，１３−トリオキサ−６，１６−ジアザドコサン−２２−イル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ））−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド、
Ｎ−（２−クロロ−６−メチルフェニル）−２−（（６−（４−（１−（トランス−４−（１−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル））−１Ｈ−ピロール−２−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，８，１８−トリオキソ−１２，１５，２２−トリオキサ−２，９，１９−トリアザテトラコサン−２４−イル）ピペラジン−１−イル）−２−メチルピリミジン−４−イル）アミノ）チアゾール−５−カルボキサミド、
Ｎ−（トランス−４−（（１−（４−（６−（（５−（（２−クロロ−６−メチルフェニル）カルバモイル）チアゾール−２−イル）アミノ）−２−メチルピリミジン−４−イル）ピペラジン−１−イル）−７，１７−ジオキソ−３，１０，１３−トリオキサ−６，１６−ジアザドコサン−２２−イル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド、
Ｎ−（２−クロロ−６−メチルフェニル）−２−（（６−（４−（１−（トランス−４−（１−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，８，２４−トリオキソ−１２，１５，１８，２１，２８−ペンタオキサ−２，９，２５−トリアザトリアコンタン−３０−イル）ピペラジン−１−イル）−２−メチルピリミジン−４−イル）アミノ）チアゾール−５−カルボキサミド、
Ｎ−（トランス−４−（（１−（４−（６−（（５−（（２−クロロ−６−メチルフェニル）カルバモイル）チアゾール−２−イル）アミノ）−２−メチルピリミジン−４−イル）ピペラジン−１−イル）−７，２３−ジオキソ−３，１０，１３，１６，１９−ペンタオキサ−６，２２−ジアザオクタコサン−２８−イル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド、
Ｎ−（トランス−４−（（６−（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５−カルボキサミド）ヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド、
５−（（６−（トランス−４−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキシル）カルバモイル）−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−３’，６’−ジイル  ジアセタート、
Ｎ−（トランス−４−（（６−（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５−カルボキサミド）ヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド、
Ｎ−（トランス−４−（（６−（３’，６’ビス（ジメチルアミノ）−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−６−カルボキサミド）ヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド、
Ｎ−（トランス−４−（（６−（３’，６’−ビス（ジメチルアミノ）−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−６−カルボキサミド）ヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド、
Ｎ−（トランス−４−（（６−（３−（５，５−ジフルオロ−７，９−ジメチル−５Ｈ−５ｌ４，６ｌ４−ジピロロ［１，２−ｃ：２’，１’−ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン−３−イル）プロパンアミド）ヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド、
Ｎ−（トランス−４−（（６−（３−（５，５−ジフルオロ−７，９−ジメチル−５Ｈ−５ｌ４，６ｌ４−ジピロロ［１，２−ｃ：２’，１’−ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン−３−イル）プロパンアミド）ヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド、
Ｎ−（トランス−４−（（６−（３’，６’−ジアミノ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５，６−（カルボキサミド）ヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド、
Ｎ−（トランス−４−（（６−（３’，６’−ジアミノ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−６−（カルボキサミド）ヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５，６−カルボキサミド、
Ｎ−（トランス−４−（（８−（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５−カルボキサミド）オクチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド、
Ｎ−（トランス−４−（（８−（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５−カルボキサミド）オクチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド、
Ｎ−（トランス−４−（（８−（３’，６’−ジアミノ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５，６−カルボキサミド）オクチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド、
Ｎ−（トランス−４−（（８−（３’，６’−ジアミノ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５−カルボキサミド）オクチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５，６−カルボキサミド、
Ｎ−（トランス−４−（（８−（３−（５，５−ジフルオロ−７，９−ジメチル−５Ｈ−５λ４，６λ４−ジピロロ［１，２−ｃ：２’，１’−ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン−３−イル）プロパンアミド）オクチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド、
Ｎ−（トランス−４−（（８−（３−（５，５−ジフルオロ−７，９−ジメチル−５Ｈ−５λ４，６λ４−ジピロロ［１，２−ｃ：２’，１’−ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン−３−イル）プロパンアミド）オクチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド、
Ｎ−（トランス−４−（（１−（３’，６’−ビス（ジメチルアミノ）−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−６−イル）−１，１１−ジオキソ−５，８−ジオキサ−２，１２−ジアザオクタデカン−１８−イル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド、
Ｎ−（トランス−４−（（１−（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５，６−イル）−１，１１−ジオキソ−５，８−ジオキサ−２，１２−ジアザイコサン−２０−イル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド、
Ｎ−（トランス−４−（（１−（３’，６’−ビス（ジメチルアミノ）−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−６−イル）−１，１１−ジオキソ−５，８−ジオキサ−２，１２−ジアザイコサン−２０−イル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド、
Ｎ−（トランス−４−（（８−（６−（（Ｚ）−２）−（（Ｅ）−３−（１，１−ジメチル−１，４，５，６−テトラヒドロ−３λ４−ピロロ［３，２，１−ｉｊ］キノリン−２−イル）アリリデン）−１−メチル−１，２，５，６−テトラヒドロ−４Ｈ−ピロロ［３，２，１−ｉｊ］キノリン−１−イル）ヘキサンアミド）オクチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド、
Ｎ−（トランス−４−（（８−（４’，５’−ジクロロ−３’，６’−ジヒドロキシ−２’，７’−ジメトキシ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５，６−カルボキサミド）オクチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド、
Ｎ１−（２−（５，５−ジフルオロ−１，３−ジメチル−５Ｈ−５λ４，６λ４−ジピロロ［１，２−ｃ：２’，１’−ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン−１０−イル）エチル）−Ｎ４−（１−（トランス−４−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，１０−ジオキソ−１３，１６−ジオキサ−２，９−ジアザオクタデカン−１８−イル）スクシンアミド、
Ｎ１−（２−（５，５−ジフルオロ−１，３−ジメチル−５Ｈ−５λ４，６λ４−ジピロロ［１，２−ｃ：２’，１’−ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン−１０−イル）エチル）−Ｎ４−（８−（トランス−４−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）オクチル）スクシンアミド、
Ｎ１−（２−（５，５−ジフルオロ−１，３−ジメチル−５Ｈ−５λ４，６λ４−ジピロロ［１，２−ｃ：２’，１’−ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン−１０−イル）エチル）−Ｎ４−（１−（トランス−４−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，１２−ジオキソ−１５，１８−ジオキサ−２，１１−ジアザイコサン−２０−イル）スクシンアミド、
４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（（８−（（７−ニトロベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール−４−イル）オキシ）オクチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド、
４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（（６−（（７−ニトロベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール−４−イル）オキシ）ヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド、
１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（（８−（（７−ニトロベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール−４−イル）オキシ）オクチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド、
１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（（６−（（７−ニトロベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール−４−イル）オキシ）ヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド、
４−（２−エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（（（Ｒ）−３−（（３Ｓ，４Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−（（４−（４−メチルチアゾール−５−イル）ベンジル）カルバモイル）ピロリジン−１−カルボニル）−２，２−ジメチル−５，１８−ジオキソ−８，１１，１４−トリオキサ−４，１７−ジアザトリコサン−２３−イル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド、
４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（（（Ｒ）−３−（（３Ｓ，４Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−（（４−（４−メチルチアゾール−５−イル）ベンジル）カルバモイル）ピロリジン−１−カルボニル）−２，２−ジメチル−５，２１−ジオキソ−８，１１，１４，１７−テトラオキサ−４，２０−ジアザヘキサコサン−２６−イル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド、
４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（（（Ｒ）−３−（（３Ｓ，４Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−（（４−（４−メチルチアゾール−５−イル）ベンジル）カルバモイル）ピロリジン−１−カルボニル）−２，２−ジメチル−５，１８−ジオキソ−８，１１，１４−トリオキサ−４，１７−ジアザペンタコサン−２５−イル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド、及び
４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（（（Ｒ）−３−（（３Ｓ，４Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−（（４−（４−メチルチアゾール−５−イル）ベンジル）カルバモイル）ピロリジン−１−カルボニル）−２，２−ジメチル−５，２１−ジオキソ−８，１１，１４，１７−テトラオキサ−４，２０−ジアザオクタコサン−２８−イル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド、または、
それらの塩、からなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項２８】
Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼを阻害する方法であって、前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ誘導ルシフェラーゼを、請求項１〜２７のいずれかに記載の化合物と接触させることを含む、前記方法。
【請求項２９】
前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼが、配列番号２のポリペプチド配列を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼを不可逆的に阻害する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
試料中のＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼの発光を調節する方法であって、
（ａ）前記試料を、セレンテラジン基質と請求項１〜３６のいずれかに記載の化合物とに接触させること、及び、
（ｂ）前記試料中における発光を検出すること、
を含み、
請求項１〜２７のいずれかに記載の化合物が、前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼの発光の低減を引き起こすものである、前記方法。
【請求項３２】
試料中の第１のタンパク質と第２のタンパク質との間の相互作用を検出する方法であって、
（ａ）試料を、セレンテラジン基質と請求項１〜２７のいずれか１項に記載の化合物とに接触させ、前記試料が、
（ｉ）第１の融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドであって、前記第１の融合タンパク質が、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼの第１の断片と第１のタンパク質とを含む、前記第１のポリヌクレオチド、及び
（ｉｉ）第２の融合タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドであって、前記第２の融合タンパク質が、前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼの第２の断片と第２のタンパク質とを含む、前記第２のポリヌクレオチドを含み、及び
（ｂ）前記試料中における発光を検出すること、
を含み、
前記発光の検出が、前記第１のタンパク質と前記第２のタンパク質との間の相互作用を示す、前記方法。
【請求項３３】
前記試料を、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の化合物と接触させる前に、前記試料を、前記セレンテラジン基質と接触させることを含む、請求項３１〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
前記第１のタンパク質と前記第２のタンパク質とが相互作用すると、前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼの前記第１の断片と、前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼの前記第２の断片とが、前記セレンテラジン基質を安定に結合することができる全長酵素を再構成する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
試料中の第１のタンパク質と第２のタンパク質との間の相互作用を検出する方法であって、
（ａ）試料を、セレンテラジン基質と請求項１〜２７のいずれか１項に記載の化合物とに接触させ、前記試料が、
（ｉ）第１の融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドであって、前記第１の融合タンパク質が、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼと第１のタンパク質とを含み、前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼは、生物発光ドナーである、前記第１のポリヌクレオチド、及び
（ｉｉ）第２の融合タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドであって、前記第２の融合タンパク質が、蛍光アクセプター分子と第２のタンパク質とを含む、前記第２のポリヌクレオチドを含み、及び
（ｂ）前記試料中の生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）を検出することを含み、これは、前記生物発光ドナーと前記蛍光アクセプターとの相互作用または近接近を示す、前記方法。
【請求項３６】
試料におけるプロテアーゼ活性を検出する方法であって、
（ａ）試料を、セレンテラジン基質と請求項１〜２７のいずれか１項に記載の化合物と接触させることであって、前記試料が、プロテアーゼ感受性Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼ融合タンパク質を含むこと、
（ｂ）発光を測定すること、
（ｃ）プロテアーゼを活性化すること、及び
（ｄ）前記発光の測定を反復すること、
を含み、
工程（ｄ）での発光の増大は、プロテアーゼ活性の増大を示す、前記方法。
【請求項３７】
試料におけるプロテアーゼ活性を検出する方法であって、
（ａ）試料を、セレンテラジン基質と請求項１〜２７のいずれか１項に記載の化合物と接触させることであって、前記試料が、プロテアーゼ感受性Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼ融合タンパク質とエネルギー受容体とを含むこと、
（ｂ）ＢＲＥＴ比を測定すること、
（ｃ）プロテアーゼを活性化すること、及び
（ｄ）前記ＢＲＥＴ比の測定を反復すること、
を含み、
工程（ｄ）でのＢＲＥＴ比の減少は、プロテアーゼ活性の増大を示す、前記方法。
【請求項３８】
試料からＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼ融合タンパク質を単離する方法であって、
（ａ）試料を、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の化合物と接触させることであって、前記試料が、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼ融合タンパク質を含むこと、
（ｂ）前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼ融合タンパク質を捕捉すること、
（ｃ）工程（ｂ）で捕捉した前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼ融合タンパク質を単離すること、
を含む前記方法。
【請求項３９】
前記試料が、細胞を含む、請求項３１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記細胞が、前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記細胞が、前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼを発現する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記セレンテラジン基質が、セレンテラジン、セレンテラジン誘導体、セレンテラジン類似体、プロ−セレンテラジン、または、キノンでマスクしたセレンテラジンである、請求項３１〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）システムであって、第１の標的タンパク質と生物発光ドナー分子とを含む第１の融合タンパク質、第２の標的タンパク質と蛍光アクセプター分子とを含む第２の融合タンパク質、セレンテラジン基質、及び、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の化合物を含み、前記生物発光ドナー分子が、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼである、前記システム。
【請求項４４】
（ａ）請求項１〜２７のいずれか１項に記載の化合物、及び
（ｂ）Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼ、
を含むキット。
【請求項４５】
前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼが、配列番号２のポリペプチド配列を含む、請求項４４に記載のキット。
【請求項４６】
セレンテラジン基質をさらに含む、請求項４４〜４５のいずれかに記載のキット。
【請求項４７】
発光アッセイを実施するための説明書をさらに含む、請求項４４〜４６のいずれかに記載のキット。
【請求項４８】
タンパク質分解を誘導する方法であって、
細胞を、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の化合物と接触させることを含み、前記細胞が、ルシフェラーゼ融合タンパク質及び少なくとも１つのプロテアーゼを含み、
それにより、前記融合タンパク質が、前記プロテアーゼによって分解される、前記方法。
【請求項４９】
標的タンパク質を標識する方法であって、
標的タンパク質を、請求項１に記載の化合物と接触させることを含み、Ｚが、−ＯＲ4であり、Ｒ4が、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、または、任意に置換された複素環であり、
それにより、前記標的タンパク質が、Ｒ4と共有結合を形成する、前記方法。
【請求項５０】
目的とする分子と、試料中の標的タンパク質との間の相互作用を検出する方法であって、
（ａ）試料中の第１の生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）シグナルを検出することであって、前記試料が、
（ｉ）融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、前記融合タンパク質は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼと標的タンパク質とを含み、前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼは、生物発光ドナーである、前記ポリヌクレオチド、
（ｉｉ）セレンテラジン基質、
（ｉｉｉ）請求項１〜２７のいずれか１項に記載の化合物、及び
（ｉｖ）蛍光アクセプター分子と、前記標的タンパク質に結合するリガンドとを含む蛍光トレーサーを含むこと、
（ｂ）前記試料を、目的とする分子と接触させること、及び
（ｃ）前記試料中の第２のＢＲＥＴシグナルを検出すること、
を含み、前記第１のＢＲＥＴシグナルと比較して、前記第２のＢＲＥＴシグナルが減少することは、前記目的とする分子と前記標的タンパク質との間の相互作用を示す、前記方法。
【請求項５１】
前記標的タンパク質が、キナーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、または、ブロモドメイン含有タンパク質を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）システムであって、標的タンパク質と生物発光ドナー分子とを含む融合タンパク質、蛍光アクセプター分子と、前記標的タンパク質に結合するリガンドとを含む蛍光トレーサー、セレンテラジン基質、及び、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の化合物を含み、前記生物発光ドナー分子が、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼである、前記システム。
【請求項５３】
試料中の第１の標的タンパク質と第２の標的タンパク質との間の相互作用を検出する方法であって、
（ａ）試料を、セレンテラジン基質、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の化合物、及び、ＨＡＬＯＴＡＧ（登録商標）リガンドと接触させ、前記ＨＡＬＯＴＡＧ（登録商標）リガンドは、蛍光アクセプター分子を含み、前記試料は、
（ｉ）第１の融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドであって、前記第１の融合タンパク質は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼ、及び、第１の標的タンパク質を含み、前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼは、生物発光ドナーである、前記第１のポリヌクレオチド、
（ｉｉ）第２の融合タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドであって、前記第２の融合タンパク質は、ＨＡＬＯＴＡＧ（登録商標）タンパク質、及び、第２の標的タンパク質を含む、前記第２のポリヌクレオチドを含み、
（ｂ）前記試料中の生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）を検出し、それにより、相互作用を検出する、あるいは、前記第１の標的タンパク質と前記第２の標的タンパク質とが近接近していることを示す、前記方法。
【請求項５４】
生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）システムであって、第１の標的タンパク質と生物発光ドナー分子とを含む第１の融合タンパク質、第２の標的タンパク質とＨＡＬＯＴＡＧ（登録商標）タンパク質とを含む第２の融合タンパク質、蛍光アクセプター分子を含むＨＡＬＯＴＡＧ（登録商標）リガンド、セレンテラジン基質、及び、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の化合物、を含み、前記生物発光ドナー分子が、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼである、前記システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年１２月２８日に出願した米国仮特許出願第６２／４３９，６００号の優先権を主張するものであり、その出願の全内容を、本明細書の一部を構成するものとして援用する。
【０００２】
技術分野
本開示は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼを阻害し得る化合物に関する。
【背景技術】
【０００３】
レポーター分子を、日常的に使用して、生物学、生化学、免疫学、細胞生物学、及び、分子生物学の分野で分子事象をモニターする。深海エビのＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ  ｇｒａｃｉｌｉｒｏｓｔｒｉｓから分泌されるルシフェラーゼに基づいたルシフェラーゼ類は、レポーター分子として使用し得るものであり、また、広範な基質特異性、高活性、及び、高い量子収量を含む有利な特徴を有する、ことが示されている。ある特定の用途では、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼからの発光シグナルを制御する、ことがさらに有利であり得る。選択的ルシフェラーゼ阻害剤は、発光アッセイにおいて有用である。ルシフェラーゼ阻害剤をさらに誘導体化して、酵素活性、及び、細胞プロセスを研究する上で有用な望ましい特性を提供し得る。
【発明の概要】
【０００４】
ある態様では、本開示は、式（Ｉ）の化合物、または、その塩を提供し、
【化１】
2020504754.tif 000003
式中、
Ａは、存在せず、任意に置換されたフェニル環、または、任意に置換されたチエニル環であり、
Ｌ1は、存在せず、または、−（ＣＲa1Ｒa2）m1−であり、式中、ｍ１は、１〜１００であり、任意に、１つ以上のＣＲa1Ｒa2基は、ヘテロ原子、または、Ｏ、Ｎ（Ｒa3）、Ｓ（＝Ｏ）、及び、Ｓ（＝Ｏ）2からなる群から選択されるヘテロ原子基で置換しており、任意に、１つ以上のＣＲa1Ｒa2基は、Ｃ（＝Ｏ）で置換しており、任意の隣接する２つのＣＲa1Ｒa2基が、ＣＲa1＝ＣＲa1を形成し、そして、任意に、１つ以上のＣＲa1Ｒa2基を、−Ｃｙ−基で置換しており、各Ｃｙは、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、及び、複素環からなる群から独立して選択され、式中、Ｒa1、Ｒa2、及びＲa3は、独立して、水素、及び、Ｃ1−Ｃ4−アルキルからなる群から選択され、
Ｚは、Ｃ1−Ｃ10ハロアルキル、脱離基Ｙ、生物活性剤、または、色素であり、当該脱離基Ｙは、ＯＲ4、ハロゲン、ヘテロアリール、及び、ヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ1は、水素、または、Ｃ1−Ｃ8アルキルであり、
Ｒ2は、水素、任意に置換されたＣ1−Ｃ8アルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換されたアリールアルキル、任意に置換されたアルコキシアルキル、及び、任意に置換されたアルコキシアルコキシアルキルからなる群から選択され、
Ｒ3は、水素、または、Ｃ1−Ｃ8アルキルであり、及び
Ｒ4は、任意に置換されたＣ1−Ｃ8アルキル、任意に置換されたＣ3−Ｃ8−シクロアルキル、任意に置換されたＣ3−Ｃ8−シクロアルキルアルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたアリールアルキル、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換されたヘテロアリールアルキル、任意に置換されたヘテロシクリル、及び、任意に置換されたヘテロシクリルアルキルからなる群から選択される。
【０００５】
ある態様では、本開示は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼを阻害する方法を提供し、当該方法は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼを、本明細書に記載の化合物と接触させることを含む。
【０００６】
ある態様では、本開示は、試料に含まれるＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼの発光を調節する方法を提供し、当該方法は、
（ａ）当該試料を、セレンテラジン基質及び本明細書に記載の化合物と接触させ、及び、
（ｂ）当該試料の発光を検出する、ことを含み、
当該化合物は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼからの発光の抑制を招く。
【０００７】
ある態様では、本開示は、試料中の第１のタンパク質と第２のタンパク質との間の相互作用を検出する方法を提供し、当該方法は、
（ａ）試料を、セレンテラジン基質と本明細書に記載の化合物とに接触させ、当該試料が、
（ｉ）第１の融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドであって、当該第１の融合タンパク質が、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼの第１の断片と第１のタンパク質を含む、当該第１のポリヌクレオチド、及び
（ｉｉ）第２の融合タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドであって、当該第２の融合タンパク質が、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼの第２の断片と第２のタンパク質を含む、当該第２のポリヌクレオチドを含み、及び
（ｂ）当該試料での発光を検出する、ことを含み、
当該発光の検出が、第１のタンパク質と第２のタンパク質との間の相互作用を示す。
【０００８】
ある態様では、本開示は、試料に含まれる第１のタンパク質と第２のタンパク質との間の相互作用を検出する方法を提供し、当該方法は、
（ａ）試料を、セレンテラジン基質と本明細書に記載の化合物とに接触させ、当該試料が、
（ｉ）第１の融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドであって、当該第１の融合タンパク質が、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼと第１のタンパク質とを含み、当該Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼは、生物発光ドナーである、当該第１のポリヌクレオチド、及び
（ｉｉ）第２の融合タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドであって、当該第２の融合タンパク質が、蛍光アクセプター分子と第２のタンパク質とを含む、当該第２のポリヌクレオチドを含み、及び
（ｂ）当該試料に含まれる生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）を検出する、ことを含み、このことは、当該生物発光ドナーと蛍光アクセプターとの相互作用、または、近接近を示す。
【０００９】
ある態様では、本開示は、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）システムを提供し、第１の標的タンパク質と生物発光ドナー分子とを含み、当該生物発光ドナー分子が、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼである第１の融合タンパク質、第２の標的タンパク質と蛍光アクセプター分子とを含む第２の融合タンパク質、セレンテラジン基質、及び、本明細書に記載の化合物を含む。
【００１０】
ある態様では、本開示は、
（ａ）本明細書に記載の化合物、及び
（ｂ）Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼ、を含むキットを提供する。
【００１１】
ある態様では、本開示は、タンパク質分解を誘導する方法を提供し、当該方法は、細胞を、本明細書に記載の化合物と接触させることを含み、当該細胞が、ルシフェラーゼ融合タンパク質及び少なくとも１つのプロテアーゼを含み、それにより、当該融合タンパク質が、プロテアーゼによって分解される。
【００１２】
ある態様では、本開示は、標的タンパク質を標識する方法を提供し、当該方法は、標的タンパク質を、本明細書に記載の化合物と接触させることを含み、それにより、当該標的タンパク質が、当該化合物のタンパク質標識部分と共有結合を形成する。
【００１３】
ある態様では、本開示は、試料に含まれる目的とする分子と標的タンパク質との間の相互作用を検出する方法を提供し、当該方法は、
（ａ）試料の第１の生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）シグナルを検出し、当該試料が、
（ｉ）融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、当該融合タンパク質は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼと標的タンパク質とを含み、当該Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼは、生物発光ドナーである、当該ポリヌクレオチド、
（ｉｉ）セレンテラジン基質、
（ｉｉｉ）本明細書に記載の化合物、及び
（ｉｖ）蛍光アクセプター分子と、標的タンパク質に結合するリガンドとを含む蛍光トレーサーを含み、
（ｂ）当該試料を、目的とする分子と接触させ、及び
（ｃ）当該試料に含まれる第２のＢＲＥＴシグナルを検出し、当該第１のＢＲＥＴシグナルと比較して、当該第２のＢＲＥＴシグナルが減少することは、当該目的とする分子と当該標的タンパク質との間の相互作用を示す。
【００１４】
ある態様では、本開示は、標的タンパク質と生物発光ドナー分子とを含み、当該生物発光ドナー分子が、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼである融合タンパク質、蛍光アクセプター分子と当該標的タンパク質に結合するリガンドとを含む蛍光トレーサー、セレンテラジン基質、及び、本明細書に記載の化合物を含む、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）システムを提供する。
【００１５】
ある態様では、本開示は、試料に含まれる第１の標的タンパク質と第２の標的タンパク質との間の相互作用を検出する方法を提供し、当該方法は、
（ａ）当該試料を、セレンテラジン基質、本明細書に記載の化合物、及び、ＨＡＬＯＴＡＧ（登録商標）リガンドと接触させ、当該ＨＡＬＯＴＡＧ（登録商標）リガンドは、蛍光アクセプター分子を含み、当該試料は、
（ｉ）第１の融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドであって、当該第１の融合タンパク質は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼ、及び、第１の標的タンパク質を含み、当該Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼは、生物発光ドナーである当該第１のポリヌクレオチド、
（ｉｉ）第２の融合タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドであって、当該第２の融合タンパク質は、ＨＡＬＯＴＡＧ（登録商標）タンパク質、及び、第２の標的タンパク質を含む当該第２のポリヌクレオチドを含み、
（ｂ）当該試料の生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）を検出し、それにより、相互作用を検出し、あるいは、当該第１の標的タンパク質と当該第２の標的タンパク質とが近接近していることを示す。
【００１６】
ある態様では、本開示は、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）システムを提供し、第１の標的タンパク質と生物発光ドナー分子とを含み、当該生物発光ドナー分子が、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼである第１の融合タンパク質、第２の標的タンパク質とＨＡＬＯＴＡＧ（登録商標）タンパク質とを含む第２の融合タンパク質、蛍光アクセプター分子を含むＨＡＬＯＴＡＧ（登録商標）リガンド、セレンテラジン基質、及び、本明細書に記載の化合物を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ＪＲＷ−０３０８によるＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）（Ｎｌｕｃ）酵素の阻害を示す。Ｎｌｕｃ、Ｎｌｕｃ−Ｈａｌｏ  Ｔａｇ（ＨＴ）、及び、Ｎｌｕｃ−ＨＴ−ＴＭＲを、ＰＢＳ／０．０５％  ＢＳＡで、０．０５ｎＭの最終濃度にまで希釈し、室温で、２時間、指示濃度のＪＲＷ−０３０８と共にインキュベートした。試料を、フリマジン（１０μＭの最終濃度）の添加後に、ＢＭＧ  Ｃｌａｒｉｏｓｔａｒプレートリーダーを用いて、分析をした。
【図２】図２Ａ〜２Ｂは、細胞に含まれるＪＲＷ−０３０８によるＮｌｕｃの阻害を示す。ＨｅＬａ細胞を、ＮｌｕｃまたはＮｌｕｃ−ＨＴ用の発現構築物でリバーストランスフェクトし、プレーティングし（２０，０００細胞／１００μＬ増殖培地）、そして、２４時間、インキュベートした。次いで、増殖培地を、５０μＬのＯｐｔｉＭＥＭ（任意に、５００ｎＭのＮａｎｏＢＲＥＴ（商標）６１８リガンド（Ｎｌｕｃ−ＨＴ−６１８）を含む）と交換し、続いて、３７℃で、３０分間、インキュベートした。次いで、これらの細胞を、ＪＲＷ−０３０８を含む５０μＬのＯｐｔｉＭＥＭの連続希釈物で、３７℃で、２時間、処置した。最終濃度が１９０μＭであるフリマジンを添加した後に、５０μＬのＯｐｔｉＭＥＭが奏するルシフェラーゼ活性を、ＢＭＧ  Ｃｌａｒｉｏｓｔａｒプレートリーダーを用いて測定した。図２Ａは、Ｎｌｕｃ及びＮｌｕｃ−ＨＴの阻害を示す。図２Ｂは、Ｎｌｕｃ−ＨＴ及びＮｌｕｃ−ＨＴ−６１８の阻害を示す。
【図３】同じＮｌｕｃ−ＤＥＶＤ−ＨＴ融合タンパク質を用いて、カスパーゼ活性を測定するための２つの主要な方法を示す。左側の図は、発光強度ベースの方法を示している。カスパーゼ活性の増加は、Ｎｌｕｃ−ＤＥＶＤ−ＨＴ融合タンパク質の開裂をもたらし、そして、結果として、Ｎｌｕｃ阻害剤とＮｌｕｃとの解離をもたらし、それは、次に、発光の増大を招く。右側の図は、ＢＲＥＴが、ＮｌｕｃとＨＴ−色素コンジュゲートとの間に生じるＢＲＥＴベースのセンサーを示す。未開裂の状態であると、このＢＲＥＴシグナルは最大になる。カスパーゼが活性化すると、Ｎｌｕｃ−ＤＥＶＤ−ＨＴ融合物は開裂して、ＢＲＥＴの減少を招く。
【図４】強度をベースにしたアッセイと、図３に記載のＢＲＥＴをベースにしたアッセイとの間の比較を示す。ＨｅＬａ細胞を、Ｎｌｕｃ−ＤＥＶＤ−ＨＴでリバーストランスフェクトし、プレーティングし、そして、一晩、インキュベートした。指示濃度のＪＲＷ−０３０８（緑色で表示）、または、５００ｎＭ  ＮａｎｏＢＲＥＴ（商標）６１８リガンド（赤色で表示）を含むＯｐｔｉＭＥＭで増殖培地を交換し、続いて、３７℃で、９０分間、インキュベートして標識化を行った。段階希釈のスタウロスポリンを含有する５０μＬのＯｐｔｉＭＥＭを添加し、そして、３７℃で、７時間、インキュベートすることで、カスパーゼ活性を誘導した。プレートを、フリマジン（１０μＭ最終濃度）の添加後に、ＢＭＧ  Ｃｌａｒｉｏｓｔａｒプレートリーダーを用いて読み取った。スタウロスポリンについての同様のＥＣ５０値を、双方の方法について計算した。
【図５】図５Ａ〜５Ｃは、タンパク質−タンパク質相互作用をモデル化するための、２つの主要な方法を示す。ＨｅＬａ細胞を、Ｆｒｂ−ＮＬ／ＦＫＢＰ−ＨＴ（１：４のＤＮＡ比）でリバーストランスフェクトし、プレーティングし、そして、一晩、インキュベートした。５００ｎＭのＮａｎｏＢＲＥＴ（商標）６１８リガンド（図５Ａ）、または、指示濃度のＪＲＷ−０３０８（図５Ｂ）を含むＯｐｔｉＭＥＭで増殖培地を交換し、続いて、３７℃で、９０分間、インキュベートして標識化をした。プレートに、ラパマイシン及びフリマジンの連続希釈物（１０μＭ最終濃度）を添加した後に、ＢＭＧ  Ｃｌａｒｉｏｓｔａｒを用いて、１０分間、読み取った。図５Ａは、阻害剤が存在しない条件下でのＢＲＥＴ反応を示す。ＦＫＢＰは、ラパマイシンの存在下でＦＲＢに結合し、Ｎｌｕｃを、ＨＴ−ＮａｎｏＢＲＥＴ（商標）６１８リガンド複合体と接触させて、ＢＲＥＴを可能にする。これらの条件下で、ラパマイシンの濃度が増加するにつれて、当該ＢＲＥＴ比は増加し、６１０ｎｍ：４６０ｎｍの比率の光の放出が増大した。図５Ｂは、ＪＲＷ−０３０８の存在下での同じ会合／解離モデルを示す。低濃度のラパマイシンが存在する条件では、ＦＫＢは、ＦＲＢに結合せず、そして、Ｎｌｕｃは、ＨＴ−ＪＲＷ−０３０８複合体とは結合していないままである。ラパマイシンの添加は、ＦＫＢ／ＦＲＢ結合を誘導し、それは、ＨＴ阻害剤複合体をＮｌｕｃと接触させて、シグナルの減少を招く。図５Ｃは、ラパマイシンが、上記した双方のモデルについて、同様のＥＣ５０となる、ことを示す。
【図６】試験した例示的なコハク酸塩（ＪＲＷ−０５５２、ＪＲＷ−０５４４）、または、臭化物（ＪＲＷ−０５４９）官能化阻害剤によるＮｌｕｃ阻害を示す。阻害剤を、ＯｐｔｉＭＥＭ＋０．１％ＦＢＳで、３ｕＭにまで希釈した。ＮａｎｏＬｕｃを、ＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）緩衝液＋１００μＭフリマジンで、０．４ｎｇ／ｍｌにまで希釈した。５０ｕｌの各阻害剤を、５０ｕｌのＮａｎｏＬｕｃ／フリマジン／ＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）溶液に添加した。試料を、直ちにＧｌｏＭａｘ  Ｍｕｌｔｉ＋セットに仕込み、２分間隔で、動的モードで読み取った。ＪＲＷ−０５５２は、不可逆的な阻害を示した。ＪＲＷ−０２５９を、コントロール（可逆的阻害剤）として使用した。
【図７】例示的なコハク酸塩（ＪＲＷ−０５５２、ＪＲＷ−０６００、ＪＲＷ−０６０４）、エステル（ＪＲＷ−０５９７、ＪＲＷ−０５９８、ＪＲＷ−０６０５、ＪＲＷ−０６０６）、ハロ（ＪＲＷ−０６２２、ＪＲＷ−０６２６）官能化阻害剤によるＮｌｕｃ阻害を示す。１０μＭのＮｌｕｃを、１０μＭ阻害剤を含むＯｐｔｉＭＥＭ＋０．１％ＦＢＳとインキュベートし、そして、室温で、３０分間、インキュベートした。次いで、この混合物を、１０×１０6倍に希釈した（１０ｐＭ  ＮａｎｏＬｕｃ及び阻害剤）。希釈後、５０ｕｌの希釈物を、５０ｕｌのＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）アッセイ緩衝液と混合した。フリマジンの最終濃度は、１０ｕＭであった。Ｃ８リンカーを有するコハク酸塩（ＪＲＷ−０５５２、ＪＲＷ−０６００）だけが、不可逆的な阻害を示し、Ｃ６リンカーを有するコハク酸塩（ＪＲＷ−０６０４）は、この相互作用に対する特異性を示す不可逆的な阻害を示さなかった。その他の官能化阻害剤（臭化物、ヨウ化物、エステル）は、結局、（経時的なＲＬＵの収束が認められて）フリマジンに置換した。
【図８】図８Ａ〜Ｃは、ＥＧＦＲ／セツキシマブ結合アッセイを用いた、コハク酸エステル官能化阻害剤と、強力な可逆的阻害剤との比較を示す。図８Ａは、結合アッセイの概念を説明する概略図である。セツキシマブを、ＨＴ−ＮＬｕｃ融合タンパク質（Ｃｅｔｕｘ−Ｆａｂ−Ｎｌｕｃ）に付加し、そして、ＥＧＦＲプレートに加える。コントロール条件下では、セツキシマブは、ＥＧＦＲに結合し、そして、大きなＮｌｕｃシグナルを示す。阻害剤の添加は、Ｎｌｕｃシグナルを抑制する。図８Ｂは、コハク酸エステル官能化阻害剤（ＪＲＷ−０５５２及びＪＲＷ−０６００）、及び、強力な可逆的阻害剤（ＪＲＷ−０５９７）のＮｌｕｃ阻害活性を示す。ＥＧＦＲ被覆プレートを、３μｇ／ｍｌのＣｅｔｕｘ−Ｆａｂ−Ｎｌｕｃで処理した。このプレートを、指示濃度の阻害剤で処理した。プレートを、フリマジン（１０μＭの最終濃度）の添加後に、ＢＭＧ  Ｃｌａｒｉｏｓｔａｒを用いて読み取った。図８Ｃは、コントロールに対する試験化合物の％阻害を示す。
【図９】図９Ａ〜Ｂは、コハク酸エステル官能化阻害剤ＪＲＷ−０５５２による阻害が不可逆的であることを示す。実験計画の概略図を、図９Ａに示す。Ｃｅｔｕｘ−Ｆａｂ−Ｎｌｕｃは、ＥＧＦＲの結合について、セツキシマブと競合する。フリマジン（１０μＭの最終濃度）の添加後に、ＢＭＧ  Ｃｌａｒｉｏｓｔａｒを用いて、プレートを読み取った。最初の読み取りに続いて、１μＭの阻害剤を、５分間または３０分間、添加する。続いて、これらのプレートを、ＰＢＳで、０、１０、３０、または６０分間、洗浄した。次いで、フリマジン（１０μＭの最終濃度）の添加後に、ＢＭＧ  Ｃｌａｒｉｏｓｔａｒを用いて、２回目のシグナルの読み取りを行う。その結果を、図９Ｂに示す。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｄにおいて、ＨＥＫ２９３細胞を、ＳＲＣキナーゼとＮａｎｏＬｕｃとの融合体をコードするＤＮＡでトランスフェクトした。ＤＮＡ：Ｆｕｇｅｎｅ  ＨＤを１：３の比率にして、細胞をトランスフェクトした。２４時間の発現後、細胞を、５０ｕｇ／ｍＬのジギトニンを含むＯｐｔｉＭＥＭに溶解し、そして、様々な濃度のダサチニブ結合ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）阻害剤（それぞれ、ＪＲＷ−０５７７、−０５８９、−０５９３、−０５９５、図１０Ａ〜１０Ｄ）で処理した。細胞を、段階希釈した未修飾ダサチニブと同時に処理をした。室温で、２時間、インキュベートした後に、フリマジン（１０μＭ）を添加し、そして、発光をＧｌｏＭａｘ（登録商標）ルミノメーターで測定した。ダサチニブの結合は、用量依存的な発光の増加を明示する。
【図１１】ＮａｎｏＬｕｃを、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）特異的阻害剤と共にインキュベートする場合、一方が、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）活性を優先的に遮断し得るが、機能的なＮａｎｏＢｉＴ（商標）酵素系を可能にする条件下での光出力を示す。この図には、３つの条件が示されている。１）ＮａｎｏＬｕｃとＪＲＷ−０５５２、２）ＮａｎｏＬｕｃ及びＨｉＢｉＴとＪＲＷ−０５５２、及び、３）ＮａｎｏＬｕｃ及びＬｇＢｉＴとＪＲＷ−０５５２。５０分の時点で、各条件において、１）フリマジン、２）フリマジン、及び、３）ＬｇＢｉＴ、フリマジン、及び、ＨｉＢｉＴのそれぞれを添加する。実証したように、２つのＮａｎｏＢｉＴ構成が作動可能である間、ＮａｎｏＬｕｃのシグナルは阻害されたままであり、そして、シグナルが大幅に増大する。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
開示した化合物は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼ、例えば、配列番号２のルシフェラーゼ（本明細書では互換可能に「ＮａｎｏＬｕｃ」、「Ｎｌｕｃ」、「Ｎｌｕｃルシフェラーゼ」、及び、「Ｎｌｕｃ酵素」とも称する）を選択的に阻害し得る。それらの安定性、及び、それらが細胞から排泄される可能性があるが故に、ある特定の用途では、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼの発光を抑制する選択的阻害剤を使用することが有利であり得る。例えば、多数の発光システムの時間多重化が関与する用途では、一度に１つの発光シグナルのみを測定、及び／または、検出できるように、システムごとに選択的阻害剤を有することが有益であり得る。さらに、幾つかのプレートベースアッセイでは、一定量のルシフェラーゼが細胞から排泄され得る。細胞外阻害剤化合物は、排泄されたルシフェラーゼからの発光を選択的に抑制することができるため、ある特定のアッセイにおいて、シグナル対ノイズ比の改善に役立ち得る。
【００１９】
これらの化合物は、ルシフェラーゼのセレンテラジン基質の結合と競合し得るものであり、また、改変をして、細胞透過性及び細胞不透過性阻害剤の双方を生成することができる。開示した化合物は、化合物の阻害効力に影響を与えることなく、酵素ポケットから溶媒へと延びる連結官能基を含み得る。これらの開示した化合物は、バイオセンサー分子として使用して、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）自殺型阻害剤を生成する、及び／または、ＮａｎｏＬｕｃベースの細胞選別及び標識のための蛍光タグとして使用する、阻害の緩和アッセイ（例えば、標的接触結合アッセイ、または、標的酵素活性アッセイ）に適用することができる。
【００２０】
１．定義
特に断りのない限り、本明細書で使用するすべての技術用語及び科学用語は、当業者が一般的に理解するものと同じ意味を有する。矛盾がある場合は、定義を含む本明細書が優先する。本明細書に記載のものと類似または同等の方法及び材料を、本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法及び材料は後述する。本明細書で言及した刊行物、特許出願、特許、及び、その他の参考文献は、本明細書の一部を構成するものとして、それらの全内容を援用する。本明細書で開示した材料、方法、及び、実施例は、例示目的のものに過ぎず、限定を意図するものではない。
【００２１】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ（ｓ））」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「することができる（ｃａｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ（ｓ））」、及び、それらの変形は、本明細書で使用する場合、追加の行為または構造の可能性を排除しない、制約を課さない従来の語句、用語、または、単語を意図している。単数形「ａ」、「ａｎｄ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈で特に断りのない限り、複数形の言及を含む。また、本開示は、明示的言及の有無に関係なく、本明細書で提示している実施形態及び要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」、及び「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」、その他の実施形態も企図している。
【００２２】
本明細書で使用する用語「置換基」または「適切な置換基」は、化学的に許容可能な官能基、例えば、本発明の化合物の活性を無効にしない部分を意味する、ことを意図している。適切な置換基の例として、ハロ基、ペルフルオロアルキル基、ペルフルオロアルコキシ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヒドロキシ基、ハロ基、オキソ基、メルカプト基、アルキルチオ基、アルコキシ基、ニトロ基、アジドアルキル基、スルホン酸基、アリールまたはヘテロアリール基、アリールオキシまたはヘテロアリールオキシ基、アラルキルまたはヘテロアラルキル基、アラルコキシまたはヘテロアラルコキシ基、ＨＯ−（Ｃ＝Ｏ）−基、複素環式基、シクロアルキル基、アミノ基、アルキル−、及び、ジアルキル−アミノ基、カルバモイル基、アルキルカルボニル基、アルキルカルボニルオキシ基、アルコキシカルボニル基、アルキルアミノカルボニル基、ジアルキルアミノカルボニル基、アリールカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基などがあるが、これらに限定されない。これらの置換基は、追加の置換基で置換することができる。これらの置換基は、塩形態とすることができる（例えば、スルホン酸基は、スルホネート基の形態とすることができる。
【００２３】
特定の官能基及び化学用語の定義は、以下に、より詳細に記載されている。本開示の目的のために、化学元素は、ｔｈｅ  Ｐｅｒｉｏｄｉｃ  Ｔａｂｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ，  ＣＡＳ  ｖｅｒｓｉｏｎ，  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ，  ７５th  Ｅｄ．，裏表紙に従って同定を行い、また、特定の官能基は、一般的には、そこに記載されたように、定義がされている。加えて、有機化学の一般原理、ならびに、特定の官能部分及び反応性は、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｔｈｏｍａｓ  Ｓｏｒｒｅｌｌ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｏｏｋｓ，  Ｓａｕｓａｌｉｔｏ，  １９９９；Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｍａｒｃｈ  Ｍａｒｃｈ’ｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ５th  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ２００１；Ｌａｒｏｃｋ，  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，  ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８９；Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ，  Ｓｏｍｅ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ３rd  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  １９８７に記載されており、各々の文献の全内容を、本明細書の一部を構成するものとして援用する。
【００２４】
本明細書で使用する用語「アルケニル」とは、２〜１０個の炭素を含み、そして、２つの水素を除去して形成される少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖のことを指す。アルケニルの代表例として、エテニル、２−プロペニル、２−メチル−２−プロペニル、３−ブテニル、４−ペンテニル、５−ヘキセニル、２−ヘプテニル、２−メチル−１−ヘプテニル、及び、３−デセニルがあるが、これらに限定されない。本発明のアルケニル基は、置換しなくともよく、または、先に定義したような、１つ以上の適切な置換基、好ましくは、１〜３個の適切な置換基で置換し得る。
【００２５】
本明細書で使用する用語「アルコキシ」とは、酸素原子を介して親分子部分に付加した、本明細書で定義したようなアルキル基のことを指す。アルコキシの代表例として、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、２−プロポキシ、ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペンチルオキシ、及び、ヘキシルオキシがあるが、これらに限定されない。
【００２６】
本明細書で使用する用語「アルコキシアルコキシ」とは、本明細書で定義したような別のアルコキシ基を介して親分子部分に付加した、本明細書で定義したようなアルコキシ基のことを指す。アルコキシアルコキシの代表例として、ｔｅｒｔ−ブトキシメトキシ、２−エトキシエトキシ、２−メトキシエトキシ、及び、メトキシメトキシがあるが、これらに限定されない。
【００２７】
本明細書で使用する用語「アルコキシアルコキシアルキル」とは、本明細書で定義したようなアルキレン基を介して親分子部分に付加した、本明細書で定義したようなアルコキシアルコキシ基のことを意味する。アルコキシアルコキシアルキルの代表例として、ｔｅｒｔ−ブトキシメトキシメチル、エトキシメトキシメチル、（２−メトキシエトキシ）メチル、及び、２−（２−メトキシエトキシ）エチルがあるが、これらに限定されない。
【００２８】
本明細書で使用する用語「アルコキシアルキル」とは、本明細書で定義したようなアルキル基を介して親分子部分に付加した、本明細書で定義したようなアルコキシ基のことを指す。アルコキシアルキルの代表例として、ｔｅｒｔ−ブトキシメチル、２−エトキシエチル、２−メトキシエチル、及び、メトキシメチルがあるが、これらに限定されない。
【００２９】
本明細書で使用する用語「アルコキシカルボニル」とは、本明細書で定義したようなカルボニル基を介して親分子部分に付加した、本明細書で定義したようなアルコキシ基のことを指す。アルコキシカルボニルの代表例として、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、及び、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルがあるが、これらに限定されない。
【００３０】
本明細書で使用する用語「アルコキシカルボニルアルキル」とは、本明細書で定義したようなアルキレン基を介して親分子部分に付加した、本明細書で定義したようなアルコキシカルボニル基のことを意味する。アルコキシカルボニルアルキルの代表例として、エトキシカルボニルメチル、３−メトキシカルボニルプロピル、４−エトキシカルボニルブチル、及び、２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルエチルがあるが、これらに限定されない。
【００３１】
本明細書で使用する用語「アルキル」とは、適切には、１〜３０個の炭素原子、１〜１２個の炭素原子、１〜１０個の炭素原子、１〜８個の炭素原子、１〜６個の炭素原子、または、１〜４個の炭素原子を有する、直鎖または分枝鎖の炭化水素ラジカルのことを指す。用語「Ｃ1−Ｃ8−アルキル」は、直鎖または分枝鎖の配置で、１、２、３、４、５、６、７、または、８個の炭素を有するアルキル基を含むものと定義する。例えば、「Ｃ1−Ｃ8−アルキル」として、具体的には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル（例えば、ｎ−ペンチル）、ヘキシル（例えば、ｎ−ヘキシル）、ヘプチル（例えば、ｎ−ヘプチル）、及び、オクチル（例えば、ｎ−オクチル）がある。用語「Ｃ1−Ｃ6−アルキル」は、直鎖または分枝鎖の配置で、１、２、３、４、５、または、６個の炭素を有するアルキル基を含むものと定義する。例えば、「Ｃ1−Ｃ6−アルキル」として、具体的には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル（例えば、ｎ−ペンチル）、及び、ヘキシル（例えば、ｎ−ヘキシル）がある。用語「Ｃ1−Ｃ4−アルキル」は、直鎖または分枝鎖の配置で、１、２、３、または、４個の炭素を有するアルキル基を含むものと定義する。例えば、「Ｃ1−Ｃ4−アルキル」として、具体的には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソ−ブチル、及び、ｔｅｒｔ−ブチルがある。本発明のアルキル基は、置換しなくともよく、または、先に定義したような、１つ以上の適切な置換基、好ましくは、１〜３個の適切な置換基で置換し得る。例えば、アルキル基を、１つ以上のハロ置換基で置換して、ハロアルキル基を形成し、または、１つ以上のヒドロキシ置換基で置換して、ヒドロキシアルキル基を形成し、または、１つ以上のアルコキシ基で置換して、アルコキシアルキル基を形成し得る。
【００３２】
本明細書で使用する用語「アルキルアミノ」とは、本明細書で定義したようなアミノ基を介して親分子部分に付加した、本明細書で定義したようなアルキル基のことを指す。アルキルアミノの代表例として、メチルアミノ、エチルアミノ、イソ−プロピルアミノ、ブチル−アミノ、及び、ｓｅｃ−ブチルアミノが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３３】
本明細書で使用する用語「アルキルアミノアルキル」とは、本明細書で定義したようなアミノアルキル基を介して親分子部分に付加した、本明細書で定義したようなアルキル基のことを指す。アルキルアミノアルキル基の代表例として、メチルアミノエチル、及び、メチルアミノ−２−プロピルがあるが、これらに限定されない。
【００３４】
本明細書で使用する用語「アルキルカルボニル」とは、本明細書で定義したようなカルボニル基を介して親分子部分に付加した、本明細書で定義したようなアルキル基のことを指す。アルキルカルボニルの代表例として、アセチル、１−オキソプロピル、２，２−ジメチル−１−オキソプロピル、１−オキソブチル、及び、１−オキソペンチルがあるが、これらに限定されない。
【００３５】
本明細書で使用する用語「アルキルカルボニルアルキル」とは、本明細書で定義したようなアルキル基を介して親分子部分に付加した、本明細書で定義したようなアルキルカルボニル基のことを指す。
【００３６】
本明細書で使用する用語「アルキルカルボニルアルキルアミド」とは、本明細書で定義したようなアルキルアミド基を介して親分子部分に付加した、本明細書で定義したようなアルキルカルボニル基のことを指す。
【００３７】
用語「アルキレン」とは、１〜１０個の炭素原子を有する飽和、直鎖、または、分岐鎖の炭化水素から誘導した二価基のことを意味する。アルキレンの代表例として、−ＣＨ2−、−ＣＨ（ＣＨ3）−、−Ｃ（ＣＨ3）2−、−ＣＨ2ＣＨ2−、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−、−ＣＨ2Ｃ（ＣＨ3）2−、及び、−ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2−があるが、これらに限定されない。
【００３８】
本明細書で使用する用語「アルキニル」とは、２、３、４、５、６、７、８、９、または、１０個の炭素を有し、そして、１つ以上の炭素−炭素三重結合を有する、直鎖または分岐鎖の炭化水素ラジカルのことを指す。本発明のアルキニル基として、エチニル、プロピニル、及び、ブチニルがあるが、これらに限定されない。本発明のアルキニル基は、置換しなくともよく、または、先に定義したような、１つ以上の適切な置換基、好ましくは、１〜３個の適切な置換基で置換し得る。
【００３９】
本明細書で使用する用語「アミド」とは、本明細書で定義したようなカルボニル基（すなわち、−ＣＯＮＨ2）を介して親分子部分に付加したアミノ基のことを指す。本明細書で使用する用語「アルキルアミド」とは、本明細書で定義したようなカルボニル基を介して親分子部分に付加したアルキルアミノ基またはジアルキルアミノ基のことを指す。アルキルアミドの代表例として、メチルアミノカルボニル、ジメチルアミノカルボニル、エチルメチルアミノカルボニル、及び、ｎ−ヘキシルアミノカルボニルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４０】
本明細書で使用する用語「アミノ」とは、−ＮＨ2基のことを指す。
【００４１】
本明細書で使用する用語「アミノアルキル」とは、本明細書で定義したようなアルキル基を介して親分子部分に付加した、本明細書で定義したような、少なくとも１つのアミノ基のことを指す。アミノアルキルの代表例として、アミノメチル、２−アミノエチル、３−アミノプロピル、４−アミノブチル、５−アミノペンチル、及び、６−アミノヘキシルがあるが、これらに限定されない。
【００４２】
本明細書で使用する用語「アミノアルキルアミド」とは、本明細書で定義したようなアルキルアミド基を介して親分子部分に付加した、本明細書で定義したような、少なくとも１つのアミノ基のことを指す。
【００４３】
本明細書で使用する用語「アミノ保護基」とは、保護基が結合する窒素原子上で化学反応が発生することを防ぐ部分のことを指す。また、アミノ保護基は、化学反応によって除去可能でなければならない。そのような基は、当該技術分野で周知であり、そして、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，３rd  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９９に詳細に記載がされており、その全内容を、本明細書の一部を構成するものとして援用する。適切なアミノ保護基として、カルボベンジルオキシ（−ＮＨＣＯ−ＯＣＨ2Ｃ6Ｈ5、または、−ＮＨ−Ｃｂｚ）；ｔ−ブチルオキシカルボニル（−ＮＨＣＯ−ＯＣ（ＣＨ3）3、または、−ＮＨ−Ｂｏｃ）；９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（−ＮＨ−Ｆｍｏｃ）、２，２，２−トリクロロエチルオキシカルボニル（−ＮＨ−Ｔｒｏｃ）、及び、アリルオキシカルボニル（−ＮＨ−Ａｌｌｏｃ）があるが、これらに限定されない。（上記した各々での−ＮＨ−は、保護されているアミノ基に由来する窒素を表している。）
【００４４】
本明細書で使用する用語「アミノルシフェリン」とは、（４Ｓ）−２−（６−アミノ−１，３−ベンゾチアゾール−２−イル）−４，５−ジヒドロチアゾール−４−カルボン酸、または、この分子の置換類似体のことを指す。
【００４５】
本明細書で使用する用語「アリール」とは、単環式、二環式、または、三環式の芳香族ラジカルのことを意味する。アリール基の代表例として、フェニル、ジヒドロインデニル、インデニル、ナフチル、ジヒドロナフタレニル、及び、テトラヒドロナフタレニルがあるが、これらに限定されない。本発明のアリール基は、先に定義したような、１つ以上の適切な置換基、好ましくは、１〜５個の適切な置換基で任意に置換し得る。
【００４６】
本明細書で使用する用語「アリールアルキル」とは、本明細書で定義したようなアルキル基を介して親分子部分に付加した、本明細書で定義したようなアリール基のことを指す。アリールアルキルの代表例として、フェニルメチル（すなわち、ベンジル）、及び、フェニルエチルがあるが、これらに限定されない。
【００４７】
本明細書で使用する用語「アリールカルボニル」とは、本明細書で定義したようなカルボニル基を介して親分子部分に付加した、本明細書で定義したようなアリール基のことを指す。
【００４８】
本明細書で使用する用語「カルボニル」または「（Ｃ＝Ｏ）」（アルキルカルボニル、アルキル−（Ｃ＝Ｏ）−、または、アルコキシカルボニルなどの語句で使用される）とは、アルキル基またはアミノ基（すなわち、アミド基）などの第２の部分への＞Ｃ＝Ｏ部分の結合のことを指す。アルコキシカルボニルアミノ（すなわち、アルコキシ（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−）とは、アルキルカルバメート基のことを指す。また、カルボニル基は、本明細書では（Ｃ＝Ｏ）として同等に定義する。アルキルカルボニルアミノとは、アセトアミドなどの基のことを指す。
【００４９】
本明細書で使用する用語「カルボキシ」とは、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ基のことを指す。
【００５０】
本明細書で使用する用語「カルボキシアルキル」とは、本明細書で定義したようなアルキル基を介して親分子部分に付加した、本明細書で定義したようなカルボキシ基のことを指す。
【００５１】
本明細書で使用する用語「カルボキシアルキルアミド」とは、本明細書で定義したようなアミド基を介して親分子部分に付加した、本明細書で定義したようなカルボキシアルキル基のことを指す。
【００５２】
本明細書で使用する用語「シクロアルキル」とは、単環式、二環式、または、三環式の炭素環ラジカル（例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、ビシクロ［２．２．１］ヘプタニル、ビシクロ［３．２．１］オクタニル、及び、ビシクロ［５．２．０］ノナニルなど）のことを指し、任意に、１または２個の二重結合を含有する。本発明のシクロアルキル基は、置換しなくともよく、または、先に定義したような、１つ以上の適切な置換基、好ましくは、１〜５個の適切な置換基で置換し得る。
【００５３】
本明細書で使用する用語「シクロアルキルアルキル」とは、本明細書で定義したようなアルキル基を介して親分子部分に付加した、本明細書で定義したようなシクロアルキル基のことを指す。シクロアルキルアルキルの代表例として、シクロヘキシルメチルがあるが、これに限定されない。
【００５４】
本明細書で使用する用語「シクロアルキルアミド」とは、本明細書で定義したようなアミド基を介して親分子部分に付加した、本明細書で定義したようなシクロアルキル基のことを指す。
【００５５】
本明細書で使用する用語「ジアルキルアミノ」とは、本明細書で定義したようなアミノ基を介して親分子部分に付加した、本明細書で定義したような、独立して選択をした２つのアルキル基のことを指す。ジアルキルアミノの代表例として、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ、Ｎ−エチル−Ｎ−メチルアミノ、及び、Ｎ−イソプロピル−Ｎ−メチルアミノがあるが、これらに限定されない。
【００５６】
本明細書で使用する用語「ジアルキルアミノアルキル」とは、本明細書で定義したようなアルキル基を介して親分子部分に付加した、本明細書で定義したようなジアルキルアミノ基のことを指す。ジアルキルアミノアルキルの代表例として、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル、及び、Ｎ，Ｎ−メチル（２−プロピル）アミノエチルがあるが、これらに限定されない。
【００５７】
本明細書で使用する用語「ジアルキルアミノアルキルアミド」とは、本明細書で定義したようなアルキルアミド基を介して親分子部分に付加した、本明細書で定義したようなジアルキルアミノ基のことを指す。
【００５８】
本明細書で使用する用語「ハロゲン」または「ハロ」とは、フルオロ、クロロ、ブロモ、または、ヨードのラジカルのことを指す。
【００５９】
本明細書で使用する用語「ハロアルコキシ」とは、１、２、３、または、４個のハロゲン原子で置換した、本明細書で定義したようなアルコキシ基のことを指す。ハロアルコキシの代表例として、クロロメトキシ、２−フルオロエトキシ、トリフルオロメトキシ、及び、ペンタフルオロエトキシがあるが、これらに限定されない。
【００６０】
本明細書で使用する用語「ハロアルキル」とは、１、２、３、または、４個のハロゲン原子で置換した、本明細書で定義したようなアルキル基のことを指す。ハロアルキルの代表例として、クロロメチル、２−フルオロエチル、トリフルオロメチル、ペンタフルオロエチル、２−クロロ−３−フルオロペンチル、及び、４，４，４−トリフルオロブチルがあるが、これらに限定されない。
【００６１】
本明細書で使用する用語「ヘテロアリール」とは、単環式ヘテロアリール、または、二環式ヘテロアリールのことを指す。当該単環式ヘテロアリールは、５員環または６員環である。この５員環は、２つの二重結合を含有する。５員環は、ＯまたはＳから選択される１つのヘテロ原子、または、１、２、３、または、４個の窒素原子、及び、任意に、１つの酸素原子または硫黄原子を含有し得る。６員環は、３つの二重結合と、１、２、３、または、４個の窒素原子とを含有する。単環式ヘテロアリールの代表例として、フラニル、イミダゾリル、イソオキサゾリル、イソチアゾリル、オキサジアゾリル、１，３−オキサゾリル、ピリジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピロリル、テトラゾリル、チアジアゾリル、１，３−チアゾリル、チエニル、トリアゾリル、及び、トリアジニルがあるが、これらに限定されない。当該二環式ヘテロアリールとして、フェニルに融合した単環式ヘテロアリール、または、単環式シクロアルキルに融合した単環式ヘテロアリール、または、単環式シクロアルケニルに融合した単環式ヘテロアリール、または、単環式ヘテロアリールに融合した単環式ヘテロアリール、または、単環式複素環に融合した単環式ヘテロアリールがある。二環式ヘテロアリールの代表例として、ベンゾフラニル、ベンゾチエニル、ベンゾオキサゾリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、６，７−ジヒドロ−１，３−ベンゾチアゾリル、イミダゾ［１，２−ａ］ピリジニル、インダゾリル、インドリル、イソインドリル、イソキノリニル、ナフチリジニル、ピリドイミダゾリル、キナゾリニル、キノリニル、チアゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−２−イル、チアゾロ［５，４−ｄ］ピリミジン−２−イル、及び、５，６，７，８−テトラヒドロキノリン−５−イルがあるが、これらに限定されない。本発明のヘテロアリール基は、置換しなくともよく、または、先に定義したような、１つ以上の適切な置換基、好ましくは、１〜５個の適切な置換基で置換し得る。
【００６２】
本明細書で使用する用語「ヘテロアリールアルキル」とは、本明細書で定義したようなアルキル基を介して親分子部分に付加した、本明細書で定義したようなヘテロアリール基のことを指す。ヘテロアリールアルキルの代表例として、フル−３−イルメチル、１Ｈ−イミダゾール−２−イルメチル、１Ｈ−イミダゾール−４−イルメチル、１−（ピリジン−４−イル）エチル、ピリジン−３−イルメチル、６−クロロピリジン−３−イルメチル、ピリジン−４−イルメチル、（６−（トリフルオロメチル）ピリジン−３−イル）メチル、（６−（シアノ）ピリジン−３−イル）メチル、（２−（シアノ）ピリジン−４−イル）メチル、（５−（シアノ）ピリジン−２−イル）メチル、（２−（クロロ）ピリジン−４−イル）メチル、ピリミジン−５−イルメチル、２−（ピリミジン−２−イル）プロピル、チエン−２−イルメチル、及び、チエン−３−イルメチルがあるが、これらに限定されない。
【００６３】
本明細書で使用する用語「複素環」または「ヘテロシクリル」とは、単環式複素環、二環式複素環、または、三環式複素環のことを指す。当該単環式複素環は、酸素、窒素、リン、及び、硫黄からなる群から独立して選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含有する３、４、５、６、７、または、８員環である。当該３員環または４員環は、０個または１つの二重結合と、酸素、窒素、リン、及び、硫黄からなる群から選択される１つのヘテロ原子とを含有する。当該５員環は、０個または１つの二重結合と、酸素、窒素、リン、及び、硫黄からなる群から選択される１、２、または、３個のヘテロ原子とを含有する。当該６員環は、０、１、または、２個の二重結合と、酸素、窒素、リン、及び、硫黄からなる群から選択される１、２、または、３個のヘテロ原子とを含有する。当該７員環及び８員環は、０、１、２、または、３個の二重結合と、酸素、窒素、リン、及び、硫黄からなる群から選択される１、２、または、３個のヘテロ原子とを含有する。単環式複素環の代表例として、アゼチジニル、アゼパニル、アジリジニル、ジアゼパニル、１，３−ジオキサニル、１，３−ジオキソラニル、１，３−ジチオラニル、１，３−ジチアニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、イソチアゾリニル、イソチアゾリジニル、イソオキサゾリニル、イソオキサゾリジニル、モルフォリニル、オキサジアゾリニル、オキサジアゾリジニル、オキサゾリニル、オキサゾリジニル、ホスフィナン、ピペラジニル、ピペリジニル、ピラニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、ピロリニル、ピロリジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロピリジニル、テトラヒドロピリミジニル、テトラヒドロチエニル、チアジアゾリニル、チアジアゾリジニル、チアゾリニル、チアゾリジニル、チオモルフォリニル、１，１−ジオキシドチオモルフォリニル（チオモルフォリンスルホン）、チオピラニル、トリチアニル、及び、２，５−ジオキソ−ピロリジニルがあるが、これらに限定されない。当該二環式複素環とは、フェニル基に融合した単環式複素環、または、単環式シクロアルキルに融合した単環式複素環、または、単環式シクロアルケニルに融合した単環式複素環、または、単環式複素環に融合した単環式複素環、または、当該環の隣接しない２つの原子を、１、２、３、または、４個の炭素原子のアルキレン架橋、または、２、３、または、４個の炭素原子のアルケニレン架橋で連結した、架橋した単環式複素環系である。二環式複素環の代表例として、ベンゾピラニル、ベンゾチオピラニル、クロマニル、２，３−ジヒドロベンゾフラニル、２，３−ジヒドロベンゾチエニル、アザビシクロ［２．２．１］ヘプチル（２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプト−２−イルを含む）、２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドリル、イソインドリニル、オクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロリル、オクタヒドロピロロピリジニル、９−ホスファビシクロ［３．３．１］ノナン、８−ホスファビシクロ［３．２．１］オクタン、及び、テトラヒドロイソキノリニルがあるが、これらに限定されない。三環式複素環は、フェニル基に融合した二環式複素環、または、単環式シクロアルキルに融合した二環式複素環、または、単環式シクロアルケニルに融合した二環式複素環、または、単環式複素環に融合した二環式複素環、または、当該二環式環の隣接しない２つの原子が、１、２、３、または、４個の炭素原子のアルキレン架橋、または、２、３、または、４個の炭素原子のアルケニレン架橋によって連結した、二環式複素環で例示される。三環式の複素環の例として、オクタヒドロ−２，５−エポキシペンタレン、ヘキサヒドロ−２Ｈ−２，５−メタノシクロペンタ［ｂ］フラン、ヘキサヒドロ−１Ｈ−１，４−メタノシクロペンタ［ｃ］フラン、アザ−アドマンタン（１−アザトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン）、オキサ−アダマンタン（２−オキサトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン）、及び、２，４，６−トリオキサ−８−ホスファトリシクロ［３．３．１．１３，７］デカンがあるが、これらに限定されない。本発明の複素環基は、置換しなくともよく、または、先に定義したような、１つ以上の適切な置換基、好ましくは、１〜３個の適切な置換基で置換し得る。本発明の複素環基は、環に結合した１つ以上のオキソ基（＝Ｏ）、または、チオキソ（＝Ｓ）基を含有し得る。
【００６４】
本明細書で使用する用語「ヘテロシクリルアルキル」とは、本明細書で定義したようなアルキル基を介して親分子部分に付加した、本明細書で定義したようなヘテロシクリル基のことを指す。ヘテロシクリルアルキルの代表例として、ピペリジン−４−イルメチル、ピペラジン−１−イルメチル、３−メチル−１−ピロリジン−１−イルブチル、（１Ｒ）−３−メチル−１−ピロリジン−１−イルブチル、（１Ｓ）−３−メチル−１−ピロリジン−１−イルブチル、及び、３−モルフォリノプロピルがあるが、これらに限定されない。
【００６５】
本明細書で使用する用語「ヘテロシクリルアミド」とは、本明細書で定義したようなアミド基を介して親分子部分に付加した、本明細書で定義したようなヘテロシクリル基のことを指す。
【００６６】
本明細書で使用する用語「ヒドロキシ」とは、−ＯＨ基のことを指す。
【００６７】
本明細書で使用する用語「ヒドロキシアルコキシ」とは、少なくとも１つのヒドロキシ基で置換した、本明細書で定義したようなアルコキシ基のことを指す。ヒドロキシアルコキシの代表例として、ヒドロキシエトキシ、及び、２−ヒドロキシプロポキシがあるが、これらに限定されない。
【００６８】
本明細書で使用する用語「ヒドロキシアルキル」とは、少なくとも１つのヒドロキシ基で置換した、本明細書で定義したようなアルキル基のことを指す。ヒドロキシアルキルの代表例として、ヒドロキシメチル、２−ヒドロキシエチル、３−ヒドロキシプロピル、２，３−ジヒドロキシプロピル、２，３−ジヒドロキシペンチル、４−ヒドロキシブチル、２−エチル−４−ヒドロキシヘプチル、３，４−ジヒドロキシブチル、及び、５−ヒドロキシペンチルがあるが、これらに限定されない。
【００６９】
本明細書で使用する用語「ヒドロキシアルキルアミド」とは、アミド基に結合したヒドロキシアルキル基、例えば、−アミド−アルキル−ＯＨのことを指す。
【００７０】
本明細書で使用する用語「ヒドロキシカルボニル」とは、本明細書で定義したようなカルボニル基を介して親分子部分に付加した、本明細書で定義したようなヒドロキシ基のことを指す。
【００７１】
本明細書で使用する用語「メチレンジオキシ」とは、メチレンジオキシの酸素原子が、隣接する２つの炭素原子を介して親分子部分に連結した−ＯＣＨ2Ｏ−基のことを指す。
【００７２】
本明細書で使用する用語「オキソ」とは、結合相手が炭素原子である二重結合した酸素（＝Ｏ）ラジカルのことを指す。そのようなラジカルは、カルボニル基として考えることもでき
る。
【００７３】
用語「ペプチド」または「ポリペプチド」とは、少なくとも２つのアミノ酸の配列のことを指す。幾つかの実施形態では、ペプチドは、８０個以下のアミノ酸、または、３５個以下のアミノ酸、または、１０個以下のアミノ酸、または、５個以下のアミノ酸を含み得る。
【００７４】
多成分置換基に付けられる接頭辞は、それが先行する最初の成分のみに適用される。例えれば、用語「シクロアルキルアルキル」は、２つの成分、アルキルとシクロアルキルを含有する。したがって、Ｃ1−Ｃ6シクロアルキルアルキルにおけるＣ1−Ｃ6接頭辞は、シクロアルキルアルキルのアルキル成分が、１〜６個の炭素原子を含むことを意味しており、Ｃ1−Ｃ6接頭辞は、シクロアルキル成分を説明するものではない。さらに例示すると、用語「ハロ−Ｃ1−Ｃ6−アルキル」とは、ハロメチル、ハロエチル、ハロプロピル、ハロブチル、ハロペンチル、及び、ハロヘキシルのことを指す。さらに例示すると、ハロアルコキシアルキルにおける接頭辞「ハロ」とは、アルコキシアルキル置換基のアルコキシ成分だけを、１つ以上のハロゲンラジカルで置換することを指す。ハロゲン置換がアルキル成分でのみ生じるものであるのならば、当該置換基は、代わりに「アルコキシハロアルキル」と記載する。
【００７５】
置換基は、それが１つ以上の水素原子に結合している少なくとも１つの炭素原子または窒素原子を含むのであれは、「置換可能」である。したがって、例えば、水素、ハロゲン、及び、シアノは、この定義の範囲内に入らない。加えて、そのような原子を含有するヘテロシクリルにおける硫黄原子は、１つ、または、２つのオキソ置換基で置換可能である。
【００７６】
置換基が「置換されている」と記載されている場合、非水素ラジカルは、置換基の炭素または窒素上の水素ラジカルの位置にある。したがって、例えば、置換したアルキル置換基は、少なくとも１つの非水素ラジカルが、アルキル置換基の水素ラジカルの位置にあるアルキル置換基である。例示すると、モノフルオロアルキルは、フルオロラジカルで置換したアルキルであり、ジフルオロアルキルは、２つのフルオロラジカルで置換したアルキルである。置換基上に複数の置換がある場合、各非水素ラジカルは、同一であってもよいし、異なっていてもよいこと（特に断りのない限り）を認識すべきである。
【００７７】
置換基が「非置換である」と称する場合、または、「置換した」または「任意に置換された」と称する場合、置換基はあらゆる置換基を有さない、ことを意味する。置換基が、「任意に置換している」と称する場合、当該置換基は、（１）置換されていない、または、（２）置換されている、のいずれかである。置換基が特定の数までの非水素ラジカルで任意に置換したと称する場合、当該置換基は、（１）置換されていない、または、（２）非水素ラジカルの特定の数まで、または、当該置換基での置換可能な位置の最大数まで、いずれか少ない数で置換し得る。したがって、例えば、置換基を、３つまでの非水素ラジカルで任意に置換するヘテロアリールと称している場合は、３未満の置換可能な位置を持つヘテロアリールが、そのヘテロアリールが置換可能な位置を有するのと同じ数までの非水素ラジカルで任意に置換することになる。例示すると、テトラゾリル（置換可能な位置を１つしか有していない）は、１つまでの非水素ラジカルで任意に置換することになる。さらに例示すると、アミノ窒素が２までの非水素ラジカルで任意に置換すると称している場合は、１級アミノ窒素は、２までの非水素ラジカルで任意に置換する一方で、２級アミノ窒素は、最大で、わずか１つの非水素ラジカルで任意に置換する。
【００７８】
置換基が、基から「独立して選択される」と称している場合、各置換基は、その他のものから独立して選択される。したがって、各置換基は、その他の置換基（複数可）と同一とし得る、または、相違し得る。
【００７９】
本明細書で使用する用語「生物発光」または「発光」とは、酵素と光を生成する基質との間の反応を受けて生成した光のことを指し得る。そのような酵素（生物発光酵素）の例としては、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ、例えば、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｏｕｓ ｇｒａｃｉｌｉｒｏｓｔｒｉｓ、ホタルルシフェラーゼ、例えば、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ、または、Ｐｈｏｔｕｒｉｓ  ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃａ、コメツキムシルシフェラーゼ、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、ウミホタルルシフェラーゼ、エクオリン発光タンパク質、オベリン発光タンパク質などがある。
【００８０】
本明細書で使用する用語「セレンテラジン基質」とは、ルシフェラーゼ（例えば、海洋ルシフェラーゼ）のような種々の生物発光タンパク質が作用すると発光するレポーター分子のクラスのことを指す。セレンテラジン基質として、セレンテラジン、ならびに、その類似体及び誘導体がある。
【００８１】
用語「エネルギー受容体」または「受容体分子」とは、エネルギー吸収（例えば、共鳴エネルギー移動）に応答して容易に検出可能なシグナルを生じるあらゆる小分子（例えば、発色団）、高分子（例えば、自己蛍光タンパク質、フィコビリタンパク質、ナノ粒子、表面など）、または、分子複合体のことを指す。特定の実施形態では、エネルギー受容体は、フルオロフォア、または、その他の検出可能な発色団である。適切なフルオロフォアとして、キサンテン誘導体（例えば、フルオレセイン、ローダミン、オレゴングリーン、エオシン、テキサスレッドなど）、シアニン誘導体（例えば、シアニン、インドカルボシアニン、オキサカルボシアニン、チアカルボシアニン、メロシアニンなど）、ナフタレン誘導体（例えば、ダンシル、及び、プロダン誘導体）、オキサジアゾール誘導体（例えば、ピリジルオキサゾール、ニトロベンズオキサジアゾール、ベンゾオキサジアゾールなど）、ピレン誘導体（例えば、カスケードブルー）、オキサジン誘導体（例えば、ナイルレッド、ナイルブルー、クレシルバイオレット、オキサジン１７０など）、アクリジン誘導体（例えば、プロフラビン、アクリジンオレンジ、アクリジンイエローなど）、アリールメチン誘導体（例えば、オーラミン、クリスタルバイオレット、マラカイトグリーンなど）、テトラピロール誘導体（例えば、ポルフィン、フタロシアニン、ビリルビンなど）、ＣＦ色素（Ｂｉｏｔｉｕｍ）、ＢＯＤＩＰＹ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＡＬＥＸＡ  ＦＬｕｏＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＤＹＬＩＧＨＴ  ＦＬＵＯＲ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｅｒｃｅ）、ＡＴＴＯ及びＴＲＡＣＹ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＦｌｕｏＰｒｏｂｅｓ（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ）、ＤＹ及びＭＥＧＡＳＴＯＫＥＳ（Ｄｙｏｍｉｃｓ）、ＳＵＬＦＯ  ＣＹ色素（ＣＹＡＮＤＹＥ，ＬＬＣ）、ＳＥＴＡＵ  ＡＮＤ  ＳＱＵＡＲＥ  ＤＹＥＳ（ＳＥＴＡ  ＢｉｏＭｅｄｉｃａｌｓ）、ＱＵＡＳＡＲ及びＣＡＬ  ＦＬＵＯＲ色素（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＳＵＲＥＬＩＧＨＴ  ＤＹＥＳ（ＡＰＣ、ＲＰＥ、ＰｅｒＣＰ、フィコビリソーム（Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＡＰＣ、ＡＰＣＸＬ、ＲＰＥ、ＢＰＥ（Ｐｈｙｃｏ−Ｂｉｏｔｅｃｈ）、自己蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＫａｔｅ）、量子ドットナノクリスタルなどがあるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、フルオロフォアは、ローダミン類似体（例えば、カルボキシローダミン類似体）である。特定の実施形態では、エネルギー受容体として、ＮＣＴなどの小分子蛍光色素、消光剤、量子ドットなどの蛍光粒子、発光金属錯体、及び、その他のあらゆる公知のエネルギー受容体があるが、これらに限定されない。
【００８２】
本明細書で交換可能に使用する用語「発光酵素」、「生物発光酵素」、または、「ルシフェラーゼ」は、生物発光で使用する酸化酵素のクラスのことを指し、当該酵素は、基質を与えられると光を生成し、発光する。当該ルシフェラーゼは、ルシフェラーゼ基質を使用する天然に存在する、組換えの、または、変異体のルシフェラーゼとし得る。当該ルシフェラーゼ基質は、ルシフェリン、ルシフェリン誘導体または類似体、プレルシフェリン誘導体または類似体、セレンテラジン、または、セレンテラジン誘導体または類似体とし得る。当該発光酵素は、天然に存在するものであれば、当業者は生物から容易に取得し得る。当該発光酵素が、天然に存在する、または、組換えの、または、変異体の発光酵素であれば、例えば、天然に存在する発光酵素のルシフェラーゼ−セレンテラジン反応、または、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応において活性を保持するものであれば、それは、発光酵素をコードする核酸を発現するように形質転換した細菌、酵母、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞などの培養物から容易に取得することができる。さらに、当該組換え発光酵素、または、変異体の発光酵素は、ルシフェラーゼをコードする核酸を用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏの無細胞系に由来することができる。適切な発光酵素として、生物発光十脚甲殻類に由来するルシフェラーゼ、例えば、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｏｉｄｅａ（例えば、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来のルシフェラーゼ）、甲虫ルシフェラーゼ（例えば、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ、Ｐｈｏｔｕｒｉｓ  ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃａなど）、海洋生物、例えば、刺胞動物（例えば、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ）、Ａｒｉｓｔｅｉｄａｅ、Ｓｏｌｅｎｏｃｅｒｉｄａｅ、Ｌｕｃｉｆｅｒｉｄａｅ、Ｓｅｒｇｅｓｔｉｄａｅ、Ｐａｓｉｐｈｅｉｄａｅ、及び、Ｔｈａｌａｓｓｏｃａｒｉｄｉｄａｅ十脚甲殻類ファミリーなどに由来するルシフェラーゼ、カイアシ類ルシフェラーゼ、例えば、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼなど、例えば、Ｇａｕｓｓｉａ  ｐｒｉｎｃｅｐｓルシフェラーゼなど、Ｍｅｔｒｉｄｉａルシフェラーゼ、例えば、Ｍｅｔｒｉｄｉａ  ｌｏｎｇａルシフェラーゼ、及び、Ｍｅｔｒｉｄｉａ  ｐａｃｉｆｉｃａルシフェラーゼなど、Ｖａｒｇｕｌａルシフェラーゼ、例えば、Ｖａｒｇｕｌａ  ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆｉｉルシフェラーゼ、Ｐｌｅｕｒｏｍａｍｍａ  ｘｉｐｈｉａｓルシフェラーゼなど、及び、発光タンパク質、例えば、Ａｅｑｕｏｒｉｎなど、及び、これらの変異体、組換え体、及び、突然変異体がある。
【００８３】
「発光反応混合物」は、発光酵素が、光シグナル、すなわち、発光を生成することを可能にする材料を含有する。また、当該混合物は、酵素、例えば、ルシフェラーゼ酵素、または、ルシフェラーゼも含有し得る。発光シグナルの生成に必要とされる材料、及び、特定の濃度及び／または量は、使用する発光酵素ならびに実施するアッセイの種類に応じて変化する。適切なｐＨで反応を維持するための緩衝液、添加剤、例えば、酵素活性の維持に役立つＰＲＩＯＮＥＸまたはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、還元剤、界面活性剤などの他の材料を溶液に添加することがよくある。
【００８４】
本明細書で使用する用語「Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ」及び「Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼ」は、互換可能に使用しており、そして、深海エビのＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ ｇｒａｃｉｌｉｒｏｓｔｒｉｓ（例えば、配列番号１）から分泌されたルシフェラーゼのことを指し、その野生型、変異体、及び、突然変異体を含む。例えば、適切なＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ変異体は、米国特許第８，５５７，９７０号、及び、同第８，６６９，１０３号に記載されており、それらの全内容を、本明細書の一部を構成するものとして援用する。Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼの例として、例えば、配列番号２に記載のもの（本明細書では互換可能に、「ＮａｎｏＬｕｃ」、「Ｎｌｕｃ」、「Ｎｌｕｃルシフェラーゼ」、及び、「Ｎｌｕｃ酵素」とも称する）がある。
【００８５】
本明細書で使用する用語「レポーター部分」とは、好適な条件下で検出可能なシグナルを直接的または間接的に生成する部分のことを意味し得る。レポーター部分の例として、フルオロフォア、発光分子、色素、放射性標識体、及び、ルシフェラーゼなどの酵素のための基質があるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、例えば、レポーター部分が、酵素の基質である場合、当該レポーター部分は、検出可能なシグナルを間接的に生成し得る。そして、当該基質と当該酵素との間で反応が生じて、蛍光または発光などの検出可能なシグナルが生成する。本明細書で使用する用語「生物発光レポーター部分」とは、ルシフェラーゼの基質である部分のことを指し得る。例えば、当該生物発光レポーター部分を、ルシフェリン、ルシフェリン誘導体、例えば、プレ−ルシフェリン、アミノルシフェリン、キノリル−ルシフェリン、ナフチルルシフェリン、フルオロルシフェリン、クロロルシフェリンなど、ルシフェリン誘導体の前駆体、セレンテラジン、または、セレンテラジン誘導体またはフリマジンなどのセレンテラジン類似体とすることができる。生成した発光シグナルは、発光測定器を使用して検出し得る。本明細書で使用する用語「蛍光レポーター部分」とは、蛍光を発する部分のことを意味し得る。例えば、当該蛍光レポーター部分は、フルオロフォア、例えば、クマリン、Ｒ１１０、フルオロセイン、ＤＤＡＯ、レゾルフィン、クレシルバイオレット、シリルキサンテン、または、カルボピロニンなどとし得る。蛍光は、蛍光光度計を使用して検出し得る。
【００８６】
本明細書で使用する用語「生物活性剤」とは、生物学的分子（タンパク質、及び、核酸など）と相互作用することができ、そして、当該生物学的分子の生物学的活性の変化を招くことができる分子、または、分子の機能的成分のことを指し得る。例えば、当該生体分子は、細胞内のシグナル伝達、代謝、及び、その他の生物学的プロセスを調節する酵素、輸送体、または、受容体として機能し得る。当該生物活性剤は、そのような生物学的分子の活性を増強または阻害し得る。当該生物活性剤は、例えば、疾患または障害のための医薬品、酵素阻害剤、または、細胞受容体の阻害剤を含み得る。適切な生物活性剤として、ダサチニブなどのキナーゼ阻害剤を含み得る。また、当該生物活性剤は、生物学的分子と相互作用するタンパク質及び表面を含み得る。例えば、当該生物活性剤は、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）タンパク質などのタンパク質を含み得る。
【００８７】
本明細書での数値範囲の記述では、同程度の精度を有し、その間に介在する各々の数を、明示的に意図している。例えば、６〜９の範囲については、６及び９に加えて、７及び８の数も意図しており、そして、６．０〜７．０の範囲については、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、及び、７．０の数を明示的に意図している。
【００８８】
２．化合物
本明細書では、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼ、及び／または、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼ活性を阻害し得る化合物を提供する。本発明の化合物は、式（Ｉ）の化合物、または、その塩を含み、
【化２】
2020504754.tif 000004
式中、
Ａは、存在せず、任意に置換されたフェニル環、または、任意に置換されたチエニル環であり、
Ｌ1は、存在せず、または、−（ＣＲa1Ｒa2）m1−であり、式中、ｍ１は、１〜１００であり、任意に、１つ以上のＣＲa1Ｒa2基は、ヘテロ原子、または、Ｏ、Ｎ（Ｒa3）、Ｓ（＝Ｏ）、及び、Ｓ（＝Ｏ）2からなる群から選択されるヘテロ原子基で置換しており、任意に、１つ以上のＣＲa1Ｒa2基は、Ｃ（＝Ｏ）で置換しており、任意の隣接する２つのＣＲa1Ｒa2基が、ＣＲa1＝ＣＲa1を形成し、そして、任意に、１つ以上のＣＲa1Ｒa2基を、−Ｃｙ−基で置換しており、各Ｃｙは、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、及び、複素環からなる群から独立して選択され、式中、Ｒa1、Ｒa2、及びＲa3は、独立して、水素、及び、Ｃ1−Ｃ4−アルキルからなる群から選択され、
Ｚは、Ｃ1−Ｃ10ハロアルキル、脱離基Ｙ、生物活性剤、または、色素であり、当該脱離基Ｙは、ＯＲ4、ハロゲン、ヘテロアリール、及び、ヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ1は、水素、または、Ｃ1−Ｃ8アルキルであり、
Ｒ2は、水素、任意に置換されたＣ1−Ｃ8アルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換されたアリールアルキル、任意に置換されたアルコキシアルキル、及び、任意に置換されたアルコキシアルコキシアルキルからなる群から選択され、
Ｒ3は、水素、または、Ｃ1−Ｃ8アルキルであり、及び
Ｒ4は、任意に置換されたＣ1−Ｃ8アルキル、任意に置換されたＣ3−Ｃ8−シクロアルキル、任意に置換されたＣ3−Ｃ8−シクロアルキルアルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたアリールアルキル、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換されたヘテロアリールアルキル、任意に置換されたヘテロシクリル、及び、任意に置換されたヘテロシクリルアルキルからなる群から選択される。
【００８９】
幾つかの実施形態では、Ａは、フェニル環である。幾つかの実施形態では、Ａは、チエニル環である。
【００９０】
幾つかの実施形態では、Ｒ1は、水素、メチル、エチル、ｎ−ヘキシル、２−（２−メトキシエトキシ）エチル、及び、ベンジルからなる群より選択する。幾つかの実施形態では、Ｒ1は、エチルである。
【００９１】
幾つかの実施形態では、Ｒ2は、任意に置換されたアリールである。例えば、幾つかの実施形態では、Ｒ2は、任意に置換されたフェニルである。幾つかの実施形態では、Ｒ2は、それぞれ独立して、Ｃ1-Ｃ4アルキル、シアノ、アミド、Ｃ1-Ｃ4アルコキシ、Ｃ1-Ｃ4ハロアルキル、及び、ヒドロキシアルキルからなる群から選択される、０、１、２、３、４、または、置換基を有するである。幾つかの実施形態では、Ｒ2は、Ｃ1-Ｃ4アルキル、シアノ、アミド、Ｃ1-Ｃ4アルコキシ、Ｃ1-Ｃ4ハロアルキル、及び、ヒドロキシアルキルからなる群から選択される少なくとも１つの置換基で置換したフェニルである。幾つかの実施形態では、Ｒ2は、少なくとも１つのＣ1-Ｃ4アルキル（メチル、または、エチルなど）、または、Ｃ1-Ｃ4ハロアルキル（−ＣＨ2Ｂｒ、または、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2Ｂｒなど）で置換したフェニルである。幾つかの実施形態では、Ｒ2は、１つのＣ1-Ｃ4アルキル、または、Ｃ1-Ｃ4ハロアルキルで置換したフェニルである。幾つかの実施形態では、Ｒ2は、１つのメチル基、１つのエチル基、１つの−ＣＨ2Ｂｒ基、または、１つの−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2Ｂｒで置換したフェニルである。
【００９２】
幾つかの実施形態では、Ｒ1は、Ｃ1-Ｃ4アルキルであり、そして、Ｒ2は、任意に置換されたフェニルである。幾つかの実施形態では、Ｒ1は、エチルであり、及び、Ｒ2は、メチル、エチル、−ＣＨ2Ｂｒ、及び、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2Ｂｒからなる群から選択される１つの置換基で置換したフェニルである。
【００９３】
幾つかの実施形態では、Ｒ3は、水素、または、Ｃ1-Ｃ4アルキルである。幾つかの実施形態では、Ｒ3は、水素である。幾つかの実施形態では、Ｒ4は、任意に置換されたＣ1-Ｃ8アルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、または、任意に置換された複素環である。幾つかの実施形態では、Ｒ4は、Ｃ1-Ｃ4アルキル、または、アルキル、アルコキシ、アミノ、ハロ、ヒドロキシル、及び、シアノからなる群から独立して選択される１、２、３、４または５個の置換基で任意に置換されたフェニルである。
【００９４】
幾つかの実施形態では、当該化合物は、式（Ｉａ）を有する。
【化３】
2020504754.tif 000005
式中、
Ａは、存在せず、フェニル環、または、チエニル環であり、
Ｒ2が、少なくとも１つのＣ1-Ｃ4アルキル、または、Ｃ1-Ｃ4ハロアルキルで置換したフェニルであり、及び
Ｌ2は、存在せず、または、−（ＣＲa1Ｒa2）m2−であり、式中、ｍ２は、１〜９０であり、各ＣＲa1Ｒa2は、先に定義した通りである。
【００９５】
幾つかの実施形態では、当該化合物は、式（Ｉｂ）を有する。
【化４】
2020504754.tif 000006
式中、
Ａは、存在せず、フェニル環、または、チエニル環であり、
Ｒ2が、少なくとも１つのＣ1-Ｃ4アルキル、または、Ｃ1-Ｃ4ハロアルキルで置換したフェニルであり、及び
Ｒx及びＲyは、各々の存在時に、独立して、水素、または、Ｃ1-Ｃ4アルキルであり、
ｐは、４、５、６、７、８、９、または、１０であり
ｔは、０または１であり、
ｖは、０または１であり、及び
Ｌ3は、存在せず、または、−（ＣＲa1Ｒa2）m3−であり、式中、ｍ３は、１〜８０であり、各ＣＲa1Ｒa2は、先に定義した通りである。
【００９６】
幾つかの実施形態では、Ｌ3は、−（ＣＲa1Ｒa2）m3−であり、式中、ｍ３は、１〜２０であり、及び、Ｒa1及びＲa2は、各々の存在時に、独立して、水素、または、Ｃ1-Ｃ4アルキルである。幾つかの実施形態では、Ｌ3は、１つ以上の−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ−単位を含む。例えば、幾つかの実施形態では、Ｌ3は、−Ｑ1−（ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ）k1−Ｑ2−（ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ）k2−Ｑ3−（ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ）k3−であり、
式中、
Ｑ1は、存在せず、Ｏ、または、ＮＨであり、
Ｑ2は、存在せず、
2020504754.tif 000007
、−ＣＯ−ＮＨ−、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＯ−、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＯ、または、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＯ−ＮＨ−であり、
Ｑ３は、存在せず、−ＣＯ−ＮＨ−、または、−ＣＨ2−ＣＨ2−であり、
ｋ１は、１〜１０であり、
ｋ２は、０〜１０であり、及び、
ｋ３は、０〜１０である。
【００９７】
幾つかの実施形態では、ｋ１は、１、２、３、４、５、または、６である。幾つかの実施形態では、ｋ２は、０、１、２、３、または、４である。幾つかの実施形態では、ｋ３は、０、１、２、３、または、４である。幾つかの実施形態では、Ｌ3は、
2020504754.tif 000008
2020504754.tif 000009
2020504754.tif 000010
2020504754.tif 000011
2020504754.tif 000012
2020504754.tif 000013
2020504754.tif 000014
2020504754.tif 000015
及び
2020504754.tif 000016
からなる群から選択される。
【００９８】
幾つかの実施形態では、Ｌ3は、存在しない。幾つかの実施形態では、Ｌ3を、
2020504754.tif 000017
2020504754.tif 000018
2020504754.tif 000019
2020504754.tif 000020
及び
2020504754.tif 000021
からなる群から選択する。
【００９９】
幾つかの実施形態では、Ｌ3は、２０１６年６月３日に出願され、本明細書の一部を構成するものとしてその全内容を援用する、米国特許出願第１５／１７２，８６０号、Ｌｅｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，”ＣＥＬＬ−ＰＥＲＭＥＡＢＬＥ，  ＣＥＬＬ−ＣＯＭＰＡＴＩＢＬＥ，  ＡＮＤ  ＣＬＥＡＶＡＢＬＥ  ＬＩＮＫＥＲＳ  ＦＯＲ  ＣＯＶＡＬＥＮＴ  ＴＥＴＨＥＲＩＮＧ  ＯＦ  ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ  ＥＬＥＭＥＮＴＳ，”に開示されたリンカー基から選択し得る。
【０１００】
幾つかの実施形態では、Ｚは、Ｃ1-Ｃ10ハロアルキル、例えば、Ｃ1-Ｃ10クロロアルキル、Ｃ1-Ｃ10ブロモアルキル、または、Ｃ1-Ｃ10ヨードアルキルなどである。例えば、そのような化合物は、式（Ｉｃ）を有し得る。
【化５】
2020504754.tif 000022
式中、
Ａは、フェニル環、または、チエニル環であり、
Ｒ2は、１つのメチル、または、エチル基で置換したフェニルであり、
Ｒx及びＲyは、各々の存在時に、独立して、水素、または、Ｃ1-Ｃ4アルキルであり、
ｐは、４、５、６、７、８、９、または、１０であり、及び
Ｌ3は、上記した通りである。
【０１０１】
式（Ｉｃ）の化合物の幾つかの実施形態では、Ｌ3は、
2020504754.tif 000023
または
2020504754.tif 000024
である。
【０１０２】
式（Ｉｃ）の化合物の幾つかの実施形態では、Ｚは、−（ＣＨ2）6−Ｃｌである。
【０１０３】
幾つかの実施形態では、Ｚは、脱離基Ｙであり、Ｙを、ＯＲ4、ハロゲン、ヘテロアリール、及び、ヘテロシクリルからなる群から選択する。例えば、そのような化合物は、式（Ｉｄ）を有し得る。
【化６】
2020504754.tif 000025
式中、
Ａは、フェニル環、または、チエニル環であり、
Ｒ2は、メチル、エチル、−ＣＨ2Ｂｒ、及び、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2Ｂｒからなる群から選択される１つの置換基で置換したフェニルであり、
Ｒx及びＲyは、各々の存在時に、独立して、水素、または、Ｃ1-Ｃ4アルキルであり、
ｐは、４、５、６、７、８、９、または、１０であり
ｔは、０または１であり、
ｖは、０または１であり、及び
Ｌ3は、上記した通りである。
【０１０４】
2020504754.tif 000026
である。
【０１０５】
式（Ｉｄ）の化合物の幾つかの実施形態では、Ｚは、ハロゲン、例えば、クロロ、ブロモ、または、ヨードなどである。例えば、式（Ｉｄ）の化合物の幾つかの実施形態では、ｔは、０であり、ｖは、０であり、Ｌ3は、存在せず、及び、Ｚは、ブロモ、または、ヨードである。式（Ｉｄ）の化合物の幾つかの実施形態では、ｔは、１であり、ｖは、１であり、Ｌ3は、Ｃ1-Ｃ4アルキレン（−ＣＨ2−、または、−ＣＨ2−ＣＨ2−など）であり、及び、Ｚは、クロロ、ブロモ、または、ヨードである。
【０１０６】
式（Ｉｄ）の化合物の幾つかの実施形態では、Ｚは、ＯＲ4であり、Ｒ4は、任意に置換されたＣ1-Ｃ8アルキル、任意に置換されたフェニル、または、任意に置換された複素環である。幾つかの実施形態では、Ｒ4は、Ｃ1-Ｃ4アルキル、または、アルキル、アルコキシ、アミノ、ハロ、ヒドロキシル、及び、シアノからなる群から独立して選択される１、２、３、４、または、５個の置換基で任意に置換されたフェニルである。例えば、式（Ｉｄ）の化合物の幾つかの実施形態では、Ｌ3は、存在せず、
2020504754.tif 000027
であり、及び
Ｚは、Ｃ1-Ｃ4アルコキシ、フェノキシ、
2020504754.tif 000028
である。
【０１０７】
式（Ｉｄ）の化合物の幾つかの実施形態では、Ｌ3は、−ＣＨ2−ＣＨ2−、または、
2020504754.tif 000029
であり、及び
Ｚは、
2020504754.tif 000030
である。
【０１０８】
式（Ｉｄ）の化合物の幾つかの実施形態では、Ｚは、−ＯＲ4であり、Ｒ4は、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、または、任意に置換された複素環であり、そして、Ｒ4基は、当該化合物と当該タンパク質との間の反応におけるタンパク質との共有結合を形成することができる。幾つかの実施形態では、Ｒ4は、当該タンパク質と共有結合を形成した後に、タンパク質に、蛍光標識などの標識を形成する。例えば、Ｒ4は、
2020504754.tif 000031
で表される、ニトロベンズオキサジアゾール（ＮＢＤ）色素部分とし得るものであり、このものは、タンパク質においてリシン残基と共有結合を形成し、そして、当該タンパク質に付加した後に、蛍光標識を提供し得る。適切な蛍光標識部分として、その全内容を本明細書の一部を構成するものとして援用する、Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１４，５，１０２１−１０２９に開示したものがある。
【０１０９】
式（Ｉｄ）の化合物の幾つかの実施形態では、ｔは、０であり、ｖは、０であり、Ｌ3は、存在せず、Ｚは、
2020504754.tif 000032
である。
【０１１０】
幾つかの実施形態では、Ｚは、生物活性剤である。例えば、Ｚを、酵素阻害剤、または、受容体阻害剤とし得る。幾つかの実施形態では、Ｚは、医薬品である。幾つかの実施形態では、Ｚは、キナーゼ阻害剤であり、例えば、ダサチニブなどである。幾つかの実施形態では、Ｚは、タンパク質分解を誘導する部分である。例えば、当該化合物は、式（Ｉｅ）を有し得るものであり、
【化７】
2020504754.tif 000033
式中、
Ａは、存在せず、フェニル環、または、チエニル環であり、
Ｒ2は、１つのメチル、または、エチル基で置換したフェニルであり、
Ｒx及びＲyは、各々の存在時に、独立して、水素、または、Ｃ1-Ｃ4アルキルであり、
ｐは、４、５、６、７、８、９、または、１０であり、及び
Ｌ3は、上記した通りである。
【０１１１】
式（Ｉｅ）の化合物の幾つかの実施形態では、Ｚは、
2020504754.tif 000034
である。
【０１１２】
式（Ｉｅ）の化合物の幾つかの実施形態では、Ｚは、タンパク質分解を誘導する部分である。例えば、Ｚは、生体細胞内でタンパク質分解経路を補充する部分とし得る。タンパク質分解を誘導するのに適したＺ部分として、その全内容を本明細書の一部を構成するものとすて援用する、Ｌａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，２０１７，１６，１０１−１１４に開示されているものがある。幾つかの実施形態では、Ｚは、アダマンタンまたはＡｒｇ−Ｂｏｃ3などの疎水性基であり、これらは、疎水性タグ付け（ＨｙＴ）によってタンパク質分解を誘導する。幾つかの実施形態では、Ｚは、ヌトリン−３ａ、ベスタチン、ＶＨＬリガンド、ポマリドマイド、及び、Ｌａｉ  ｅｔ  ａｌ．，（以下に示す）が開示したその他の小分子に由来する部分であり、これらは、タンパク質分解標的キメラ（ＰＲＯＴＡＣ）タグ付けを介してタンパク質分解を誘導する。
2020504754.tif 000035
【０１１３】
幾つかの実施形態では、Ｚは、
2020504754.tif 000036
である。
【０１１４】
式（Ｉｅ）の化合物の幾つかの実施形態では、Ｌ3は、
2020504754.tif 000037
2020504754.tif 000038
2020504754.tif 000039
または
2020504754.tif 000040
である。
【０１１５】
式（Ｉｅ）の化合物の幾つかの実施形態では、Ｌ3は、
2020504754.tif 000041
または
2020504754.tif 000042
であり、及び、
Ｚは、
2020504754.tif 000043
である。
【０１１６】
式（Ｉｅ）の化合物の幾つかの実施形態では、Ｌ3は、
2020504754.tif 000044
または
2020504754.tif 000045
であり、及び
Ｚは、
2020504754.tif 000046
である。
【０１１７】
幾つかの実施形態では、Ｚは、色素であり、例えば、蛍光色素、または、蛍光発生色素などである。幾つかの実施形態では、Ｚは、蛍光色素、または、フルオロフォアである。例えば、当該化合物は、式（Ｉｆ）を有し得るものであり、
【化８】
2020504754.tif 000047
式中、
Ａは、フェニル環、または、チエニル環であり、
Ｒ2は、１つのメチル、または、エチル基で置換したフェニルであり、
Ｒx及びＲyは、各々の存在時に、独立して、水素、または、Ｃ1-Ｃ4アルキルであり、
ｐは、４、５、６、７、８、９、または、１０である。
【０１１８】
式（Ｉｆ）の化合物の幾つかの実施形態では、Ｚは、
2020504754.tif 000048
である。
【０１１９】
幾つかの実施形態では、Ｚは、色素であり、例えば、蛍光色素、または、蛍光発生色素などである。幾つかの実施形態では、Ｚは、蛍光色素、または、フルオロフォアである。例えば、当該化合物は、式（Ｉｆ）を有し得るものであり、
【化９】
2020504754.tif 000049
式中、
Ａは、フェニル環、または、チエニル環であり、
Ｒ2は、１つのメチル、または、エチル基で置換したフェニルであり、
Ｒx及びＲyは、各々の存在時に、独立して、水素、または、Ｃ1-Ｃ4アルキルであり、
ｐは、４、５、６、７、８、９、または、１０であり、
Ｌ3は、上記した通りである。
【０１２０】
式（Ｉｆ）の化合物の幾つかの実施形態では、Ｌ3は、存在せず、
2020504754.tif 000050
、
2020504754.tif 000051
または
2020504754.tif 000052
である。
【０１２１】
式（Ｉｆ’）の化合物の幾つかの実施形態では、Ｚは、
2020504754.tif 000053
である。
【０１２２】
適切な化合物として、以下の化合物、
１−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ）「３，２−ｂ］ピロール−５−（カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，１０−ジオキソ−１１，１４，１７−トリオキサ−２，９−ジアザノナデカン−１９−イル（２−（２−（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチル）カルバメート、
［（Ｅ）−３０−クロロ−６，１７−ジオキソ−５，１０，１３，１６，２１，２４−ヘキサオキサ−７，１８−ジアザトリアコン−２−エン−１−イル（１−（トランス−４）−（４−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，１０−ジオキソ−１１，１４，１７−トリオキサ−２，９−ジアザノナデカン−１９−イル）カルバメート、
［（Ｅ）−３０−クロロ−６，１７−ジオキソ−５，１０，１３，１６，２１，２４−ヘキサオキサ−７，１８−ジアザトリアコン−２−エン−１−イル（１−（トランス−４）−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，１０−ジオキソ−１１，１４，１７−トリオキサ−２，９−ジアザノナデカン１９−イル）カルバメート、
１−（トランス−４−（４−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，１０）−ジオキソ−１１，１４，１７−トリオキサ−２，９−ジアザノナデカン−１９−イル（２−（２−（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチル）カルバメート、
１−（トランス−４−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキシル））−１，１０−ジオキソ−１１，１４，１７−トリオキサ−２，９−ジアザノナデカン−１９−イル（２−（２  −（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチル）カルバメート、
２，５−ジオキソピロリジン−１−イル−１−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，８−ジオキソ−１２，１５−ジオキサ−２，９−ジアザオクタデカン−１８−オアート、
２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  １−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，８−ジオキソ−１２，１５，１８−トリオキサ−２，９−ジアザヘニコサン−２１−オアート、
２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  １−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，８−ジオキソ−１２，１５，１８，２１−テトラオキサ−２，９−ジアザテトラコサン−２４−オアート、
２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  １−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，１０−ジオキソ−１４，１７−ジオキサ−２，１１−ジアザイコサン−２０−オアート、
２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  １−（（１ｒ，４ｒ）−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル））−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，１０−ジオキソ−１４，１７，２０−トリオキサ−２，１１−ジアザトリコサン−２３−オアート、
２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  １−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，１０−ジオキソ−１４，１７，２０，２３−テトラオキサ−２，１１−ジアザヘキサコサン−２６−オアート、
２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  １−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，８−ジオキソ−１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０，３３−オクタオキサ−２，９−ジアザヘキサトリアコンタン−３６−オアート、
Ｎ−（トランス−４−（（６−（３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）プロパンアミド）ヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド、
Ｎ−（トランス−４−（（１−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−３，１３−ジオキソ−７，１０−ジオキサ−４，１４−ジアザイコサン）−２０−イル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド、
メチル  トランス−４−（４−（２−（（３−（ブロモメチル）フェニル）（エチル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン）−１−カルボキシラート、
メチル  トランス−４−（４−（２−（（３−（３−ブロモプロピル）フェニル）（エチル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン）−１−カルボキシラート、
２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  ８−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）オクタノアート、
メチル  ８−（トランス−４−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）オクタノアート、
メチル  ６−（トランス−４−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキサノアート、
２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  ８−（トランス−４−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）オクタノアート、
２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  ６−（トランス−４−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキサノアート、
フェニル  ８−（トランス−４−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）オクタノアート、
フェニル  ６−（トランス−４−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキサノアート、
１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（（６−ヨードヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド、
Ｎ−（トランス−４−（（６−ブロモヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド、
１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（（８−ヨードオクチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド、
４−フルオロフェニル  ８−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）オクタノアート、
３，５−ジフルオロフェニル  ８−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン）−１−カルボキサミド）オクタノアート、
４−シアノフェニル  ８−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）オクタノアート、
ナトリウム  １−（（８−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）オクタノイル）オキシ）−２，５−ジオキソピロリジン−３−スルホナート、
Ｎ−（トランス−４−（（５−（２−クロロアセトアミド）ペンチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド、
Ｎ−（トランス−４−（（６−（２−クロロアセトアミド）ヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド、
２，３，５，６−テトラフルオロフェニル  ８−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）オクタノアート、
Ｎ−（トランス−４−（（５−（２−ブロモアセトアミド）ペンチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド、
Ｎ−（トランス−４−（（１−（４−（６−（（５−（（２−クロロ−６−メチルフェニル）カルバモイル）チアゾール−２−イル）アミノ）−２−メチルピリミジン−４−イル）ピペラジン−１−イル）−７，１７−ジオキソ−３，１０，１３−トリオキサ−６，１６−ジアザドコサン−２２−イル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ））−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド、
Ｎ−（２−クロロ−６−メチルフェニル）−２−（（６−（４−（１−（トランス−４−（１−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル））−１Ｈ−ピロール−２−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，８，１８−トリオキソ−１２，１５，２２−トリオキサ−２，９，１９−トリアザテトラコサン−２４−イル）ピペラジン−１−イル）−２−メチルピリミジン−４−イル）アミノ）チアゾール−５−カルボキサミド、
Ｎ−（トランス−４−（（１−（４−（６−（（５−（（２−クロロ−６−メチルフェニル）カルバモイル）チアゾール−２−イル）アミノ）−２−メチルピリミジン−４−イル）ピペラジン−１−イル）−７，１７−ジオキソ−３，１０，１３−トリオキサ−６，１６−ジアザドコサン−２２−イル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド、
Ｎ−（２−クロロ−６−メチルフェニル）−２−（（６−（４−（１−（トランス−４−（１−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，８，２４−トリオキソ−１２，１５，１８，２１，２８−ペンタオキサ−２，９，２５−トリアザトリアコンタン−３０−イル）ピペラジン−１−イル）−２−メチルピリミジン−４−イル）アミノ）チアゾール−５−カルボキサミド、
Ｎ−（トランス−４−（（１−（４−（６−（（５−（（２−クロロ−６−メチルフェニル）カルバモイル）チアゾール−２−イル）アミノ）−２−メチルピリミジン−４−イル）ピペラジン−１−イル）−７，２３−ジオキソ−３，１０，１３，１６，１９−ペンタオキサ−６，２２−ジアザオクタコサン−２８−イル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド、
Ｎ−（トランス−４−（（６−（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５−カルボキサミド）ヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド、
５−（（６−（トランス−４−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキシル）カルバモイル）−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−３’，６’−ジイル  ジアセタート、
Ｎ−（トランス−４−（（６−（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５−カルボキサミド）ヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド、
Ｎ−（トランス−４−（（６−（３’，６’ビス（ジメチルアミノ）−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−６−カルボキサミド）ヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド、
Ｎ−（トランス−４−（（６−（３’，６’−ビス（ジメチルアミノ）−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン）−６−カルボキサミド）ヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド、
Ｎ−（トランス−４−（（６−（３−（５，５−ジフルオロ−７，９−ジメチル−５Ｈ−５ｌ４，６ｌ４−ジピロロ［１，２−ｃ：２’，１’−ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン−３−イル）プロパンアミド）ヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド、
Ｎ−（トランス−４−（（６−（３−（５，５−ジフルオロ−７，９−ジメチル−５Ｈ−５ｌ４，６ｌ４−ジピロロ［１，２−ｃ：２’，１’−ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン−３−イル）プロパンアミド）ヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド、
Ｎ−（トランス−４−（（６−（３’，６’−ジアミノ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５，６−（カルボキサミド）ヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド、
Ｎ−（トランス−４−（（６−（３’，６’−ジアミノ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−６−（カルボキサミド）ヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５，６−カルボキサミド、
Ｎ−（トランス−４−（（８−（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン）−５−カルボキサミド）オクチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド、
Ｎ−（トランス−４−（（８−（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５−カルボキサミド）オクチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド、
Ｎ−（トランス−４−（（８−（３’，６’−ジアミノ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５，６−カルボキサミド）オクチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド、
Ｎ−（トランス−４−（（８−（３’，６’−ジアミノ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５−カルボキサミド）オクチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５，６−カルボキサミド、
Ｎ−（トランス−４−（（８−（３−（５，５−ジフルオロ−７，９−ジメチル−５Ｈ−５λ４，６λ４−ジピロロ［１，２−ｃ：２’，１’−ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン−３−イル）プロパンアミド）オクチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド、
Ｎ−（トランス−４−（（８−（３−（５，５−ジフルオロ−７，９−ジメチル−５Ｈ−５λ４，６λ４−ジピロロ［１，２−ｃ：２’，１’−ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン−３−イル）プロパンアミド）オクチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド、
Ｎ−（トランス−４−（（１−（３’，６’−ビス（ジメチルアミノ）−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−６−イル）−１，１１−ジオキソ−５，８−ジオキサ−２，１２−ジアザオクタデカン−１８−イル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド、
Ｎ−（トランス−４−（（１−（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５，６−イル）−１，１１−ジオキソ−５，８−ジオキサ−２，１２−ジアザイコサン−２０−イル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド、
Ｎ−（トランス−４−（（１−（３’，６’−ビス（ジメチルアミノ）−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−６−イル）−１，１１−ジオキソ−５，８−ジオキサ−２，１２−ジアザイコサン−２０−イル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド、
Ｎ−（トランス−４−（（８−（６−（（Ｚ）−２）−（Ｅ）−３−（１，１−ジメチル−１，４，５，６−テトラヒドロ−３λ４−ピロロ）［３，２，１−ｉｊ］キノリン−２−イル）アリーリデン）−１−メチル−１，２，５，６−テトラヒドロ−４Ｈ−ピロロ［３，２，１−ｉｊ］キノリン−１−イル）ヘキサンアミド）オクチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド、
Ｎ−（トランス−４−（（８−（４’，５’−ジクロロ−３’，６’−ジヒドロキシ−２’，７’−ジメトキシ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５，６−カルボキサミド）オクチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド、
Ｎ１−（２−（５，５−ジフルオロ−１，３−ジメチル−５Ｈ−５λ４，６λ４−ジピロロ［１，２−ｃ：２’，１’−ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン−１０−イル）エチル）−Ｎ４−（１−（トランス−４−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，１０−ジオキソ−１３，１６−ジオキサ−２，９−ジアザオクタデカン−１８−イル）スクシンアミド、
Ｎ１−（２−（５，５−ジフルオロ−１，３−ジメチル−５Ｈ−５λ４，６λ４−ジピロロ［１，２−ｃ：２’，１’−ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン−１０−イル）エチル）−Ｎ４−（８−（トランス−４−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）オクチル）スクシンアミド、
Ｎ１−（２−（５，５−ジフルオロ−１，３−ジメチル−５Ｈ−５λ４，６λ４−ジピロロ［１，２−ｃ：２’，１’−ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン−１０−イル）エチル）−Ｎ４−（１−（トランス−４−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，１２−ジオキソ−１５，１８−ジオキサ−２，１１−ジアザイコサン−２０−イル）スクシンアミド、
４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（（８−（（７−ニトロベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール−４−イル）オキシ）オクチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド、
４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４  −（（６−（（７−ニトロベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール−４−イル）オキシ）ヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド、
１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（（８−（（７−ニトロベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール−４−イル）オキシ）オクチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド、
１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（（６−（（７−ニトロベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール−４−イル）オキシ）ヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド、
４−（２−エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（（（Ｒ）−３−（（３Ｓ，４Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−（（４−（４−メチルチアゾール−５−イル）ベンジル）カルバモイル）ピロリジン−１−カルボニル）−２，２−ジメチル−５，１８−ジオキソ−８，１１，１４−トリオキサ−４，１７−ジアザトリコサン−２３−イル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド、
４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（（（Ｒ）−３−（（３Ｓ，４Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−（（４−（４−メチルチアゾール−５−イル）ベンジル）カルバモイル）ピロリジン−１−カルボニル）−２，２−ジメチル−５，２１−ジオキソ−８，１１，１４，１７−テトラオキサ−４，２０−ジアザヘキサコサン−２６−イル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド、
４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（（（Ｒ）−３−（（３Ｓ，４Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−（（４−（４−メチルチアゾール−５−イル）ベンジル）カルバモイル）ピロリジン−１−カルボニル）−２，２−ジメチル−５，１８−ジオキソ−８，１１，１４−トリオキサ−４，１７−ジアザペンタコサン−２５−イル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド、及び
４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（（（Ｒ）−３−（（３Ｓ，４Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−（（４−（４−メチルチアゾール−５−イル）ベンジル）カルバモイル）ピロリジン−１−カルボニル）−２，２−ジメチル−５，２１−ジオキソ−８，１１，１４，１７−テトラオキサ−４，２０−ジアザオクタコサン−２８−イル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド、
または、それらの塩がある。
【０１２３】
（１）塩形態
本明細書に記載のチエノピロール化合物は、塩の形態とし得る。化合物の中性形態は、塩を、塩基または酸と接触させて、そして、従来の方法で親化合物を単離することで再生し得る。化合物の親形態は、極性溶媒に対する溶解性など、ある特定の物理的特性において、様々な塩形態とは異なるが、それ以外の点では、当該塩類は、本開示の目的のために、当該化合物の親形態と等価である。
【０１２４】
例えば、当該化合物が、アニオン性であるか、または、アニオン性であり得る官能基（例えば、−ＣＯＯＨは、−ＣＯＯ-であり得る）を有する場合、適切なカチオンを用いて塩を形成し得る。適切な無機カチオンの例として、Ｎａ+及びＫ+などのアルカリ金属イオン、Ｃａ2+及びＭｇ2+などのアルカリ土類カチオン、及び、その他のカチオンなどがあるが、これらに限定されない。適切な有機カチオンの例として、アンモニウムイオン（すなわち、ＮＨ4+）、及び、置換アンモニウムイオン（例えば、ＮＨ3Ｒ1+、ＮＨ2Ｒ2+、ＮＨＲ3+、ＮＲ4+）などがあるが、これらに限定されない。幾つかの適切な置換アンモニウムイオンの例として、エチルアミン、ジエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、トリエチルアミン、ブチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジン、ベンジルアミン、フェニルベンジルアミン、コリン、メグルミン、及び、トロメタミンから誘導されるもの、ならびに、リシン及びアルギニンなどのアミノ酸がある。
【０１２５】
化合物が、カチオン性であるか、または、カチオン性であり得る官能基（例えば、−ＮＨ2は、−ＮＨ3+とし得る）を有する場合、適切なアニオンを用いて塩を形成し得る。適切な無機アニオンの例として、以下の無機酸、すなわち、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、亜硫酸、硝酸、亜硝酸、リン酸、及び、亜リン酸から誘導したものがあるが、これらに限定されない。
【０１２６】
適切な有機アニオンの例として、以下の有機酸、すなわち、２−アセトキシ安息香酸、酢酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、安息香酸、ショウノウスルホン酸、ケイ皮酸、クエン酸、エデト酸、エタンジスルホン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルタミン酸、グリコール酸、ヒドロキシマレイン酸、ヒドロキシナフタレンカルボン酸、イセチオン酸、乳酸、ラクトビオン酸、ラウリン酸、マレイン酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、粘液酸、オレイン酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモ酸、パントテン酸、フェニル酢酸、フェニルスルホン酸、プロピオン酸、ピルビン酸、サリチル酸、ステアリン酸、コハク酸、スルファニル酸、酒石酸、トルエンスルホン酸、及び、吉草酸から誘導されたものがあるが、これらに限定されない。適切な高分子有機アニオンの例として、以下の高分子酸、すなわち、タンニン酸、及び、カルボキシメチルセルロースから誘導したものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２７】
特に断りが無い限り、本明細書における特定のチエノピロール化合物への言及は、その塩形態も含む。
【０１２８】
（２）異性体
ある特定のチエノピロール化合物は、１つ以上の特定の幾何異性体、光学異性体、鏡像異性体、ジアステレオマー、エピマー、アトロピック、立体異性体、互変異性体、配座異性体、または、アノマーの形態で存在し得るものであり、シス形及びトランス形、Ｅ形及びＺ形、ｃ形、ｔ形及びｒ形、エンド形及びエキソ形、Ｒ形、Ｓ形及びメソ形、Ｄ形及びＬ形、ｄ形及びｌ形、（＋）形及び（−）形、ケト形、エノール形及びエノラート形、シン形及びアンチ形、シンクリナル形及びアンチクリナル形、ａ形及びβ形、アキシアル形及びエクアトリアル形、舟形、椅子型、ねじれ形、エンベロープ形、及び、半いす形、ならびに、これらの組合せなどがあるが、それらに限定されず、以下では、「異性体（ｉｓｏｍｅｒ）」（または、「異性体形態（ｉｓｏｍｅｒｉｃ  ｆｏｒｍｓ）」）と総称する。
【０１２９】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載の化合物を、本明細書に記載の立体異性体の鏡像異性的濃縮異性体とし得る。例えば、当該化合物は、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または、９９％の鏡像体過剰率を有し得る。本明細書で使用する鏡像異性体は、分子構造が互いに鏡像の関係をもつ一対の化学化合物のいずれかのことを指す。
【０１３０】
幾つかの実施形態では、本明細書に開示した化合物の調製物は、選択した立体化学、例えば、選択した立体中心に対応するＲまたはＳを有する化合物の異性体について濃縮をしている。例えば、当該化合物は、選択した立体中心の選択した立体化学を有する化合物に応じて、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または、９９％の純度を有する。
【０１３１】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、選択した立体化学、例えば、選択した立体中心にてＲまたはＳを有する１つ以上の構造について濃縮をしている、本明細書に開示した化合物の調製物を含む。本明細書に記載の実施例で示したものを、例示的なＲ／Ｓ配置とすることができる。
【０１３２】
本明細書で使用する「濃縮調製物」は、対象化合物での１つ、２つ、３つ、または、それ以上の選択した立体中心での選択した立体配置について濃縮が行われている。例示的な選択した立体中心、及び、その例示的な立体配置として、本明細書に記載のもの、例えば、本明細書の実施例に記載したものから選択することができる。濃縮するとは、例えば、調製物での化合物の分子の少なくとも６０％が、選択した立体中心の選択した立体化学を有する、ことを意味する。ある実施形態では、それは、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または、９９％である。濃縮したとは、対象分子（複数可）のレベルのことを指し、特定されていない限り、プロセスの限定を意味するものではない。
【０１３３】
本発明の化合物は、立体特異的合成または分割のいずれかによって、ラセミ形態で、または、個々の鏡像異性体またはジアステレオマーとして調製し得る。当該化合物は、例えば、光学活性塩基との塩形成、それに続く、分別結晶化、及び、遊離酸の再生による立体異性体の対の形成などの標準的方法によって、それらの成分の鏡像異性体またはジアステレオマーに分割し得る。また、当該化合物は、立体異性体エステルまたはアミドの形成、それに続く、クロマトグラフィー分離、及び、キラル補助剤の除去によって分割し得る。あるいは、当該化合物は、キラルＨＰＬＣカラムを使用して分割し得る。また、当該鏡像異性体は、リパーゼ酵素を用いた対応するエステルのラセミ体の速度論的分割から取得し得る。
【０１３４】
互変異性形態について後述する場合を除いて、構造（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ）（または構造（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ））異性体（すなわち、単に空間的な原子の位置により異なるのではなく、原子間の結合が異なっている異性体）は、特に、本明細書で使用する用語「異性体」から除外する。例えば、メトキシ基、−ＯＣＨ3への言及は、その構造異性体であるヒドロキシメチル基、−ＣＨ2ＯＨへの言及として解釈すべきではない。同様に、オルト−クロロフェニルへの言及は、その構造異性体であるメタ−クロロフェニルへの言及として解釈すべきではない。しかしながら、構造の群に対する言及は、その群に属する構造的な異性体形態も含み得る（例えば、Ｃ3−アルキルまたはプロピルは、ｎ−プロピル及びイソプロピルを含み、Ｃ4−アルキルまたはブチルは、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−及びｔｅｒｔ−ブチルを含み、メトキシフェニルは、オルト−メトキシフェニル、メタ−メトキシフェニル、及び、パラ−メトキシフェニルを含む）。
【０１３５】
上記した除外は、互変異性体、例えば、ケト形、エノール形、及び、エノラート形、例えば、以下の互変異性体対、すなわち、ケト／エノール、イミン／エナミン、アミド／イミノアルコール、アミジン／アミジン、ニトロソ／オキシム、チオケトン／エンチオール、Ｎ−ニトロソ／ヒドロキシアゾ、及び、ニトロ／アシ−ニトロには適用しない。
【０１３６】
１つ以上の同位体置換を有する化合物が、用語「異性体」に含まれることに、特に留意されたい。例えば、Ｈは、1Ｈ、2Ｈ（Ｄ）、及び、3Ｈ（Ｔ）などのあらゆる同位体形態でも存在し得るものであり、Ｃは、12Ｃ、13Ｃ、及び、14Ｃなどのあらゆる同位体形態でも存在し得るものであり、Ｏは、16Ｏ、及び、18Ｏなどのあらゆる同位体形態でも存在し得るものであり、その他も同様である。
【０１３７】
３．Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ
開示した化合物は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼを阻害するために使用し得る。開示した化合物は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼのルシフェラーゼ活性を阻害し得る。Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼは、野生型Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ、または、配列番号２のルシフェラーゼなどのＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼの変異体とし得る。Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ変異体は、米国特許第８，５５７，９７０号、及び、同第８，６６９，１０３号に記載されており、それら各々の全内容全体を、本明細書の一部を構成するものとして援用する。
【０１３８】
天然に存在する形態のＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ ｇｒａｃｉｌｉｒｏｓｔｒｉｓルシフェラーゼの成熟１９ｋＤａサブユニットのポリペプチド配列を、配列番号１に示す。本明細書に記載の方法で使用することができる合成Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼの例示的なポリペプチド配列を、配列番号２に示す（本明細書では互換可能に「ＮａｎｏＬｕｃ」、「Ｎｌｕｃ」、「Ｎｌｕｃルシフェラーゼ」、及び「Ｎｌｕｃ酵素」とも称する）。
【０１３９】
４．セレンテラジン基質
本発明の開示した化合物を使用して、ルシフェラーゼへの結合を、セレンテラジンまたはセレンテラジン誘導体基質で競合または干渉することで、ルシフェラーゼ活性を阻害し得る。セレンテラジン基質は、ルシフェラーゼ、及び、その他の生物発光タンパク質によって作用を受け次第に、冷光を発するレポーター分子の群である。セレンテラジン基質の例として、ＷＯ２００３／０４０１００、米国特許公開第２００８／０２４８５１１号、及び、米国特許公開第ＵＳ２０１２／０１１７６６７号に開示されたものに加えて、セレンテラジン、セレンテラジン誘導体、及び／または、類似体、例えば、２−フラニルルメチル−デオキシ−セレンテラジン（フリマジン）、セレンテラジン−ｎ、セレンテラジン−ｆ、セレンテラジン−ｈ、セレンテラジン−ｈｃｐ、セレンテラジン−ｃｐ、セレンテラジン−ｃ、セレンテラジン−ｅ、セレンテラジン−ｆｃｐ、ビス−デオキシセレンテラジン（「セレンテラジン−ｈｈ」）、セレンテラジン−ｉ、セレンテラジン−ｉｃｐ、セレンテラジン−ｖ、及び、２−メチル−セレンテラジン、プロセレンテラジン（すなわち、化合物を、ルシフェラーゼのための基質に変換する、非発光酵素のための基質ではない化合物）、キノンマスクされたセレンテラジンなどがあるが、これらに限定されない。セレンテラジン基質のさらなる例は、例えば、米国公報第２０１２／０１０７８４９号、米国公報第２０１３／０１３０２８９号、米国特許出願第１４／６０８，９１０号、及び、米国特許出願第１４／６０９，３７２号に記載されており、それらの各々を本明細書の一部を構成するものとして援用する。
【０１４０】
５．Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ活性を阻害する方法
開示した化合物は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ活性を阻害する方法で使用し得る。この方法は、本明細書に開示した化合物を、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼを発現または含有する細胞と接触させることを含み得るものであって、当該開示した化合物は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼを選択的に阻害し得る。当該方法は、本明細書に開示した化合物を、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼ融合タンパク質での結合パートナーと接触させることを含み得るものであって、当該開示した化合物は、融合タンパク質がインタクトである場合に、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ誘導ルシフェラーゼを阻害する。当該開示した化合物は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼを用いて、酵素の存在、または、活性を検出するために用いるアッセイに使用して、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ由来のシグナルを選択的に阻害し得る。例えば、それらを、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ、及び、セレンテラジンまたはセレンテラジン誘導体基質を利用する生物発光法で使用して、試料、例えば、目的のタンパク質（例えば、酵素、結合パートナー、リガンドなど）、酵素反応のための補因子、酵素基質、酵素阻害剤、酵素活性剤、または、ＯＨラジカル、または、１つ以上の条件、例えば、レドックス条件において、１つ以上の分子を検出し得る。当該セレンテラジン基質は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼの基質として作用するが、当該開示した化合物は、例えば、複数の生物発光システムの時間多重化を伴う用途、または、幾つかのプレートベース発光アッセイにおいて、発光シグナルの抑制が所望され得る実施形態では、ルシフェラーゼを阻害して、当該シグナルを選択的に抑制するように作用し得る。開示した化合物を使用して、細胞内、及び／または、細胞外Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ活性を阻害し得る。
【０１４１】
（１）官能化阻害剤
本明細書に開示した式（Ｉ）の化合物は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼの阻害剤として使用し得る。加えて、当該開示した化合物は、阻害効力に影響を与えることなく、酵素ポケットから溶媒へと延びる官能基を含み得る。当該官能基は、上記したＬ1、Ｌ2、または、Ｌ3基などのリンカーによって、ルシフェラーゼ阻害剤分子に結合し得る。例として、式（Ｉ）の化合物は、Ｃ1-Ｃ10ハロアルキル基（式（Ｉｃ）の化合物など）を有して、ＨａｌｏＴａｇ−ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）融合酵素を阻害し得るものであり、当該化合物は、様々なＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）アッセイ（カスパーゼ検出など）のバイオセンサーとして使用し得るが、これらに限定されない。式（Ｉ）の化合物は、脱離基（式（Ｉｄ）の化合物など）と、イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡなど）においてＮａｎｏＬｕｃ自殺型阻害剤としての機能とを有し得る。式（Ｉ）の化合物は、キナーゼ阻害アッセイにおいて使用し得る、キナーゼ阻害剤部分（式（Ｉｅ）の化合物など）を含み得る。式（Ｉ）の化合物は、蛍光または蛍光発生色素部分（式（Ｉｆ）の化合物など）を含み、これらは、ＮａｎｏＬｕｃベースの細胞選別、及び、標識用途のための蛍光タグとして使用し得る。
【０１４２】
幾つかの実施形態では、開示した化合物は、タンパク質または表面を標識するために使用し得る。例えば、式（Ｉ）の化合物は、適切なリンカーによって化合物に結合している反応性または官能基（ハロゲン、または、阻害剤など）を介して標的タンパク質（酵素、または、受容体など）と相互作用し得る。幾つかの実施形態では、当該開示した化合物は、ＮＬｕｃ融合タンパク質を捕捉し、または、ＮＬｕｃ生物発光を消光し得る表面、樹脂、または、生体分子を作製するために使用し得る。
【０１４３】
（２）細胞不透過性化合物の使用
特定の実施形態では、本明細書に開示した方法は、試料（例えば、細胞）を、細胞透過性セレンテラジン基質と、細胞不透過性に改変した本明細書に記載の化合物との混合物と接触させることを含む。そのような実施形態では、当該開示した化合物及び方法を使用して、ハイスループットスクリーニング操作アッセイフォーマットの初期輝度を構築した後に、細胞から排泄され得るあらゆるルシフェラーゼを選択的に阻害して、細胞の外側に発生し得る発光を選択的に阻害し得る。そのような方法は、細胞内でより選択的なシグナルを提供し得る。
【０１４４】
（３）細胞透過性化合物の使用
特定の実施形態では、本明細書に開示した方法は、試料（例えば、細胞）を、細胞透過性セレンテラジン基質と、細胞透過性である本明細書に記載の化合物との混合物と接触させることを含む。そのような実施形態では、当該開示した化合物は、細胞に侵入し、そして、細胞内でＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼを選択的に阻害することができる。そのような方法は、２つ以上のルシフェラーゼの使用を伴う多重アッセイにおいて有利であり、そして、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼからの発光を阻害して、細胞内の別のルシフェラーゼ由来の発光を選択的に確認できるようにし得る。
【０１４５】
（４）連結化合物の使用
特定の実施形態では、当該開示した化合物は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ融合タンパク質での結合パートナーに連結し得る。これらの実施形態では、当該融合タンパク質がインタクトな場合、連結した化合物は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼの生物発光を阻害し得る。融合タンパク質が開裂すると、当該開示した化合物は、ルシフェラーゼの生物発光が阻害されないように、結合パートナーに連結したままとなる。幾つかの実施形態では、当該開示した連結化合物は、ＨＡＬＯＴＡＧ（登録商標）−、及び、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）−をベースした技術で使用し得る。これらの実施形態では、当該開示した化合物を、クロロアルカンに結合させて、ＨＡＬＯＴＡＧ（登録商標）タンパク質に結合し得る。したがって、そのような実施形態では、当該開示した化合物は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ融合タンパク質における結合パートナーと考えられるＨＡＬＯＴＡＧ（登録商標）タンパク質に連結される。そのような実施形態では、当該開示した化合物は、Ｎｌｕｃ−ＨＴ融合タンパク質がインタクトの場合に、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼの生物発光を阻害する。Ｎｌｕｃ−ＨＴ融合タンパク質が開裂すると、当該開示した化合物は、ＨＴタンパク質に連結されたままであり、そして、Ｎｌｕｃ生物発光は抑制を受ける。
【０１４６】
その他の実施形態では、当該開示した化合物は、Ｎｌｕｃ活性の会合／解離モデルにおいて、結合パートナーに連結し得る。幾つかの実施形態では、当該開示した化合物は、結合パートナー、及び、目的とする第１のタンパク質を含む第１の融合タンパク質での結合パートナーに連結し得る。Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼは、目的とする第２のタンパク質に結合し得る。第１の目的のタンパク質と第２の目的のタンパク質が相互作用しない場合、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼからの生物発光は、ルシフェラーゼ基質の存在下で放出される。目的とする第１のタンパク質と目的とする第２のタンパク質との間に結合が生じると、当該開示した化合物は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼに近接近し、そして、生物発光を阻害する。
【０１４７】
（５）転写レポーターとの併用
当該開示した化合物は、遺伝子転写レポーター系と共に使用し得る。特定の実施形態では、試料に含まれるプロモーターの活性を測定する方法を提供し、当該プロモーターは、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼ、または、その変異体をコードする遺伝子に作動可能に連結される。この方法は、（ａ）試料を、セレンテラジン基質と接触させ、（ｂ）当該試料の発光を測定することによって、プロモーターの活性を決定することを含み、当該試料は、プロモーターを含む。当該方法は、当該試料を、本明細書に記載の化合物と接触させて、発光を選択的に阻害する工程をさらに含み得る。当該プロモーターは、翻訳融合または転写融合を介して、遺伝子に作動可能に連結し得る。目的とする生物学的経路は、例えば、ルシフェラーゼをコードする遺伝子に作動可能に連結されるプロモーターを含む細胞を、当該経路の誘導剤で処理して調べ得る。次いで、このプロモーター活性を測定し、そして、モニターして、プロモーターの活性と目的とする当該経路との間のあらゆる相関を検討し、そして、遺伝子発現に関連する動態測定（例えば、誘導性、抑制、及び、活性化）を行い得る。本明細書に記載の化合物を使用して、発光を選択的に阻害することができる。
【０１４８】
（６）多重化
当該開示した化合物を使用して、その他のルシフェラーゼ及びアッセイを用いる時間的な多重化に適用する際に、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼを阻害し得る。幾つかの実施形態では、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼ、または、その変異体は、異なる波長で発光する別の酵素（例えば、ルシフェラーゼ）、例えば、緑色ホタルルシフェラーゼ、例えば、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ（例えば、Ｌｕｃ２；Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ）、または、赤色コメツキムシルシフェラーゼ（ＣＨＲＯＭＡ−ＬＵＣ（商標）ルシフェラーゼ；Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）を用いて多重化し得る。例えば、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼを、機能的レポーターとして使用する場合には、緑色ホタルルシフェラーゼ、または、赤色ＣＨＲＯＭＡ−ＬＵＣ（商標）ルシフェラーゼを用いて、遺伝子調節に関する非特異的な効果を制御することができ、または、トランスフェクション効率について正規化することができる。幾つかの実施形態では、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼから生成される発光（約４６０ｎｍ）、及び、赤色ＣＨＲＯＭＡ−ＬＵＣから生成される発光（約６１０ｎｍ）は、波長識別フィルターを具備するルミノメーターを用いて容易に分割することができ、同じ試料からの双方のシグナルの測定を可能にする。そのような実施形態では、本明細書に記載の化合物を使用して、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼを選択的に阻害することができ、その結果、その他のルシフェラーゼからのシグナルを、選択的に確認することができる。
【０１４９】
別の例では、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼを、転写レポーターとして使用し、アッセイ試薬に含有される異なる波長で発光するルシフェラーゼと対を形成することができる。別の例では、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼを、１つ以上の追加のルシフェラーゼと共に使用し得るものであり、各ルシフェラーゼの発光は、選択的な酵素阻害剤の使用を介して個別に測定し得る。例えば、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼの発光は、適当な基質と緩衝液の添加の際に測定し得るものであり、それに続く、適当な基質、緩衝液、それに、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼに対して選択的である１つ以上の本明細書に記載の化合物の添加の際に、第２のルシフェラーゼの測定が続き得る。別の例では、アッセイ試薬に含有されるＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼを、細胞生理学の特定の態様、例えば、ＡＴＰを測定するために使用して、細胞の生存率、または、カスパーゼ活性を推定して、細胞のアポトーシスを推定し得る。
【０１５０】
幾つかの実施形態では、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼ、または、その変異体は、同じ波長の光を放射する別の酵素（例えば、ルシフェラーゼ）と多重化し得る。幾つかの実施形態では、ＮＡＮＯＢＩＴ（登録商標）技術（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用し得る。例えば、高親和性ＢｉＴ（ＨｉＢｉＴ、１．３ｋＤａ）に融合している目的のタンパク質を検出及び定量するための手段として、精製ラージＢｉＴ（ＬｇＢｉＴ；１８ｋＤａ）を、フリマジンを含有する検出試薬に添加することができる。ＨｉＢｉＴ及びＬｇＢｉＴは、低ｎＭの親和性を有し、そして、フリマジンの存在下で自発的に相互作用して発光を生じる。
【０１５１】
（７）生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）
当該開示した化合物は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼが、リガンド−タンパク質、及び／または、タンパク質−タンパク質の相互作用を検出するために使用するあらゆる方法で使用し得る。様々な実施形態では、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼを使用して、エネルギーを、エネルギーアクセプターに移動し得る。そのような方法の１つが、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）である。ＢＲＥＴに関して、生物発光ドナーから蛍光アクセプターへのエネルギー移動は、発光のスペクトル分布にてシフトを生じる。このエネルギー移動は、タンパク質−タンパク質、または、リガンド−タンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの相互作用のリアルタイムのモニタリングを可能にする。幾つかの実施形態では、このＢＲＥＴ法は、リガンド−タンパク質、及び／または、タンパク質−タンパク質の相互作用に関する、Ｎｌｕｃが介在する生物発光共鳴エネルギー移動（ＮａｎｏＢＲＥＴなど）アッセイとし得る。ＮＡＮＯＢＲＥＴ（商標）は、２つの異なる方法、すなわち、１）ＨＡＬＯＴＡＧ（登録商標）−、及び、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）−ベースの技術を利用して、シグナルの増大とスペクトルの減退との重複を達成し得る、タンパク質−タンパク質、及び／または、リガンド−タンパク質の相互作用を検出する生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）と、２）目的のタンパク質に融合したＮｌｕｃルシフェラーゼと、蛍光トレーサーを利用して、生体細胞でのリガンド−受容体の相互作用を検出する方法とを含む。
【０１５２】
幾つかの実施形態では、当該開示した化合物は、目的とする分子と試料に含まれる標的タンパク質との間の相互作用を検出するための方法において使用し得る。当該試料は、（ｉ）融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、当該融合タンパク質は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼと、標的タンパク質とを含み、当該Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼが生物発光ドナーである、当該ポリヌクレオチド、（ｉｉ）セレンテラジン基質、（ｉｉｉ）上記した当該開示した化合物、及び、（ｉｖ）蛍光アクセプター分子と、標的タンパク質に結合するリガンドとを含む蛍光トレーサー、を含む。この方法は、（ａ）当該試料に含まれる第１の生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）シグナルを検出し、（ｂ）当該試料を、目的とする分子と接触させ、及び、（ｃ）当該試料に含まれる第２のＢＲＥＴシグナルを検出することを含み、当該第１のＢＲＥＴシグナルと比較して、当該第２のＢＲＥＴシグナルが減少していることは、目的とする分子と標的タンパク質との間の相互作用を示す。幾つかの実施形態では、当該標的タンパク質には、キナーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、または、ブロモドメイン含有タンパク質、例えば、ブロモドメイン、及び、エクストラターミナルドメイン（ＢＥＴ）ファミリーのメンバーなど、を含ませることができる。
【０１５３】
幾つかの実施形態では、当該開示した化合物は、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）システムの一部とし得る。このＢＲＥＴシステムは、標的タンパク質と生物発光ドナー分子とを含み、当該生物発光ドナー分子が、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼである融合タンパク質、蛍光アクセプター分子と、標的タンパク質に結合するリガンドとを含む蛍光トレーサー、セレンテラジン基質、及び、上記した当該開示した化合物を含むことができる。幾つかの実施形態では、当該標的タンパク質には、キナーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、または、ブロモドメイン含有タンパク質、例えば、ブロモドメイン、及び、エクストラターミナルドメイン（ＢＥＴ）ファミリーのメンバーなど、を含ませることができる。
【０１５４】
幾つかの実施形態では、当該開示した化合物は、試料に含まれる第１の標的タンパク質と第２の標的タンパク質との間の相互作用を検出するための方法において使用し得る。当該試料は（ｉ）第１の融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドであって、当該第１の融合タンパク質が、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼと、第１の標的タンパク質とを含み、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼが、生物発光ドナーである当該第１のポリヌクレオチド、及び、（ｉｉ）第２の融合タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドであって、当該第２の融合タンパク質が、ＨＡＬＯＴＡＧ（登録商標）タンパク質と、第２の標的タンパク質とを含む当該第２のポリヌクレオチドを含む。この方法は、（ａ）試料を、セレンテラジン基質、上記した当該開示した化合物、及び、ＨＡＬＯＴＡＧ（登録商標）リガンドと接触させ、当該ＨＡＬＯＴＡＧ（登録商標）リガンドが、蛍光アクセプター分子を含むこと、（ｂ）当該試料に含まれる生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）を検出することを含み、それにより、相互作用を検出し、または、当該第１の標的タンパク質と当該第２の標的タンパク質とが近接近していることを示す。幾つかの実施形態では、ＨＡＬＯＴＡＧ（登録商標）リガンドは、ＮａｎｏＢＲＥＴ（商標）６１８リガンドを含む。幾つかの実施形態では、当該方法は、ＦＫＢＰとＦＲＢとの間の相互作用を検出するために使用し得る。
【０１５５】
幾つかの実施形態では、当該開示した化合物は、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）システムの一部とし得る。このＢＲＥＴシステムは、第１の標的タンパク質と生物発光ドナー分子とを含み、当該生物発光ドナー分子が、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼである第１の融合タンパク質、第２の標的タンパク質と、ＨＡＬＯＴＡＧ（登録商標）タンパク質とを含む第２の融合タンパク質、蛍光アクセプター分子を含むＨＡＬＯＴＡＧ（登録商標）リガンド、セレンテラジン基質、及び、上記した当該開示した化合物を含むことができる。幾つかの実施形態では、当該ＨＡＬＯＴＡＧ（登録商標）リガンドは、ＮａｎｏＢＲＥＴ（商標）６１８リガンドを含む。
【０１５６】
幾つかの実施形態では、ＢＲＥＴ分析で使用した発光酵素（すなわち、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ）を用いて、２つの分子が互いに結合可能であるかどうか、または、細胞において同時に局在可能であるかどうか、を決定することができる。例えば、目的とする分子またはタンパク質と組み合わせる生物発光ドナー分子として発光酵素を使用して、第１の融合タンパク質を生成することができる。様々な実施形態では、当該第１の融合タンパク質は、発光酵素と目的とするタンパク質とを含有する。様々な実施形態では、発光酵素を含有する当該第１の融合タンパク質を、ＢＲＥＴ分析に使用して、系におけるタンパク質／タンパク質の相互作用を検出することができ、当該系として、細胞溶解物、インタクト細胞、及び、生存している動物があるが、これらに限定されない。様々な実施形態では、ＨＡＬＯＴＡＧ（登録商標）タンパク質を、蛍光アクセプター分子として使用できる。幾つかの実施形態では、当該ＨＡＬＯＴＡＧ（登録商標）タンパク質を、目的とする第２のタンパク質または発光酵素に融合することができる。例えば、発光酵素を、ＨＡＬＯＴＡＧ（登録商標）タンパク質に融合し、細胞または動物で発現し、そして、ＨＡＬＯＴＡＧ（登録商標）ＴＭＲリガンドなどの蛍光ＨＡＬＯＴＡＧ（登録商標）リガンドで標識することができる。その後に、細胞透過性発光酵素基質の存在下で、当該融合物を励起して、蛍光を発することができる。幾つかの実施形態では、ＢＲＥＴは、蛍光酵素を蛍光タンパク質と組み合わせて使用して実施し得るものであり、同蛍光タンパク質として、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、または、蛍光標識、幾つかの例を挙げると、フルオレセイン、ローダミン緑、オレゴン緑、もしくは、Ａｌｅｘａ  ４８８などがあるが、これらに限定されない。
【０１５７】
幾つかの実施形態では、Ｎｌｕｃで得たシグナルを消失させると、ＮａｎｏＢＲＥＴ（商標）プレートアッセイを使用した場合に、シグナルとノイズとの比を改善することができる。
【０１５８】
特定の実施形態では、細胞透過性化合物を使用して、細胞内ＢＲＥＴを阻害し得る。特定の実施形態では、細胞不透過性化合物を使用して、細胞外ＢＲＥＴを阻害し得る。特定の実施形態では、細胞不透過性化合物は、標的会合モデルにおいて使用し得る。
【０１５９】
（８）生細胞または溶解フォーマットのためのタンパク質近接アッセイ
幾つかの実施形態では、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼを、循環置換型（ＣＰ）、または、直鎖開裂型（ＳＳ）の発光酵素融合タンパク質において、タンパク質の近接の程度を測定し得る。Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼを、プロテアーゼ基質のアミノ酸配列（例えば、ＴＥＶ）の挿入を介して置換または開裂して、低度の生物発光を生成する。不活性ルシフェラーゼを、（例えば、遺伝子融合を介して）モニタータンパク質に連結する。相互作用する可能性のあるタンパク質は、（例えば、遺伝子融合を介して）プロテアーゼ（例えば、ＴＥＶ）に連結する。２つのモニタータンパク質が、相互作用、または、十分に近接する（例えば、構成的な相互作用、薬剤刺激、または、経路の応答を介して）と、発光酵素が切断されて、高度な生物発光活性を生成する。その例を、細胞または生化学アッセイにおいて、タンパク質近接の測定に適用し得る。
【０１６０】
（９）バイオセンサー機能
幾つかの実施形態では、当該開示した化合物は、バイオセンサーとして、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ融合タンパク質において使用し得る。幾つかの実施形態では、当該開示した化合物は、酵素活性を測定するために、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ融合タンパク質において使用し得る。特定の実施形態では、当該開示した化合物は、プロテアーゼ活性を測定するために、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ融合タンパク質において使用し得る。幾つかの実施形態では、当該プロテアーゼを、カスパーゼタンパク質とし得る。幾つかの実施形態では、目的とする融合タンパク質は、プロテアーゼ感受性リンカーによってタンパク質に結合したＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼを含み得る。例として、Ｎｌｕｃは、ＤＥＶＤリンカー（Ｎｌｕｃ−ＤＥＶＤ−ＨＴ）によって、ＨＡＬＯＴＡＧ（登録商標）タンパク質に結合し得るが、これらに限定されない。これらの実施形態では、当該インタクトなＮｌｕｃ−ＤＥＶＤ−ＨＴ融合タンパク質は、Ｎｌｕｃ基質の存在下で、高レベルの生物発光を発する。これらの実施形態では、当該ＤＥＶＤリンカーは、カスパーゼの活性化がＨＴからのＮｌｕｃの分離をもたらすような、カスパーゼ媒介開裂を受けやすい。幾つかの実施形態では、本明細書に開示した化合物を使用して、Ｎｌｕｃ−ＤＥＶＤ−ＨＴ融合タンパク質からの生物発光を阻害し得る。カスパーゼを活性化すると、ＨＴ阻害剤複合体からＮｌｕｃが分離し、それにより、生物発光が増大する。
【０１６１】
（１０）タンパク質相補アッセイ
幾つかの実施形態では、例えば、タンパク質相補アッセイ（ＰＣＡ）または酵素断片化アッセイなど、リガンド−タンパク質、及び、タンパク質−タンパク質の相互作用、または、近接性を検出するためのその他の方法で、そのようなルシフェラーゼを使用する場合に、当該開示した化合物は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼを阻害するために使用し得る。タンパク質相補アッセイ（ＰＣＡ）は、２つの生体分子、例えば、ポリペプチドの相互作用を検出するための手段を提供する。ＰＣＡは、それらの融合パートナーの結合相互作用を介して互いに極めて接近したときにのみ光を発し、機能的な活性タンパク質に再構成することができる、目的とするポリペプチドに融合した同じタンパク質、例えば、酵素の２つの断片を利用する。幾つかの実施形態では、ＮＡＮＯＢＩＴ（登録商標）技術（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して、酵素の成分またはサブユニットの結合相互作用を介した発光酵素の再構成による分子の近接を検出し得る。ＮａｎｏＢｉＴ（登録商標）システムは、目的とする標的タンパク質への融合として発現される２つのサブユニットを含み得る。当該２つのサブユニットは、ラージＢｉＴ（ＬｇＢｉＴ；１８ｋＤａ）、及び、スモールＢｉＴ（ＳｍＢｉＴ；１．３ｋＤａ）を含み得る。
【０１６２】
例えば、発光酵素は、分離に耐性のある部位（複数可）で２つの断片に分離することができ、そして、分離した発光酵素の各断片を、相互作用があると考えられる一対の目的とするポリペプチドの一方、例えば、ＦＫＢＰ及びＦＲＢに融合することができる。目的とする２つのポリペプチドが実際に相互作用する場合、例えば、発光酵素断片は、機能的に活性な発光酵素を再構成するために、互いに近接するようになる。幾つかの実施形態では、次いで、再構成した発光酵素の活性を検出し、測定することができる。幾つかの実施形態では、ｌａｃ−Ｚ（Ｌａｎｇｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ７２：１２５４−１２５７（１９７５））、または、リボヌクレアーゼＳ（Ｌｅｖｉｔ  ａｎｄ  Ｂｅｒｇｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５１：１３３３−１３３９（１９７６））に類似する、さらに一般的な相補系において、分割発光酵素を使用することができる。幾つかの実施形態では、発光酵素断片（「Ａ」と命名した）、すなわち、別の発光酵素断片（「Ｂ」）と相補性であることが公知の同断片を、標的タンパク質に融合することができ、そして、断片Ｂを含有する細胞または細胞溶解物における発光を介して、得られる融合物をモニターすることができる。幾つかの実施形態では、断片Ｂの供給源を、同一細胞とすることができ（例えば、断片Ｂの遺伝子が、細胞のゲノムに組み込まれ、または、細胞内での別のプラスミドに含有されるのであれば）、または、それは、別の細胞に由来する溶解物または精製タンパク質とすることができる。幾つかの実施形態では、この同一の融合タンパク質（断片Ａ）は、固体支持体への付着が可能なＨＡＬＯＴＡＧ（登録商標）タンパク質などのポリペプチドと断片Ｂとの間での融合を用いて、捕捉または固定化することができる。幾つかの実施形態では、発光を用いて、首尾良く捕捉できることを実証し、または、捕捉した物質の量を定量することができる。
【０１６３】
（１１）二量体化アッセイ
幾つかの実施形態では、当該開示した化合物は、それぞれの結合パートナー、例えば、ＦＲＢ及びＦＫＢＰに融合した完全長の循環置換型発光酵素と共に使用し得るものであり、そして、タンパク質相補型アッセイで使用し得る。本明細書で開示した方法と従来のタンパク質相補性との間での重要な相違点は、相補性は無く、むしろ、２つの全長酵素、例えば、循環置換型発光酵素の二量体化が認められた、ことにある。
【０１６４】
要するに、低活性に対して同様の構成とした循環置換型のレポータータンパク質を、双方の融合タンパク質パートナーに融合させる。例えば、各融合パートナーは、同一構造の置換型レポーターに連結し得る。融合パートナーの相互作用によって、置換型レポーターを最接近させ、それにより、さらに高活性のハイブリッドレポーターの再構成が可能となる。
【０１６５】
（１２）タンパク質単離
幾つかの実施形態では、当該開示した化合物を、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ融合タンパク質を単離するために使用し得る。幾つかの実施形態では、当該開示した化合物を、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）−、及び、ＨＡＬＯＴＡＧ（登録商標）−ベースの技術を使用して、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ融合タンパク質を単離するために使用し得る。幾つかの実施形態では、当該開示した化合物は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ融合タンパク質の単離に使用するための薬物、ヌクレオチド類、糖類、タンパク質、ポリマー、及び、固体表面などの様々な生体分子及び巨大分子に付加し得る。
【０１６６】
（１３）自殺型阻害剤
幾つかの実施形態では、当該開示した化合物を、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼを不可逆的に阻害する自殺型阻害剤として使用し得る。幾つかの実施形態では、当該開示した化合物を、リガンド−受容体結合アッセイに適用される自殺型阻害剤として使用し得る。特定の実施形態では、当該開示した化合物を、ＥＬＩＳＡにおける自殺型阻害剤として適用し得る。
【０１６７】
（１４）細胞取り込みと選別
幾つかの実施形態では、当該開示した化合物を、細胞取り込み、または、細胞の選別及び標識における使用のために、薬物、ヌクレオチド類、糖類、タンパク質、ポリマー、固体表面などの様々な生体分子、及び、巨大分子に付加し得る。例えば、モノクローナル抗体（例えば、Ｎｌｕｃ−トラスツズマブ）を化学的にコンジュゲートさせ、そして、ＳＫＢＲ３細胞の表面に発現したＨＥＲ２レセプターに結合させることができる。細胞不透過性Ｎｌｕｃ阻害剤は、細胞外Ｎｌｕｃ−トラスツズマブを阻害するために適用し得る。セレンテラジン基質を添加すると、シグナル獲得アッセイを使用して、活性／受動的に内在化したトラスツズマブ−Ｎｌｕｃ−ＨＥＲ２受容体を動的に測定することができ、この適用は、その他の抗体、タンパク質、受容体、薬物、薬物担体、ペプチド、糖類、脂肪酸、ナノ粒子、または、Ｎｌｕｃに化学的にコンジュゲートしたその他の生体分子にも及ばせることができる。
【０１６８】
別の例では、Ｎｌｕｃ−ＧＰＣＲ（例えば、Ｎｌｕｃ−Ｂ２ＡＲ）は、哺乳動物細胞において遺伝的に融合し、そして、発現することができる。本明細書に記載した細胞不透過性チエノピロール化合物（阻害剤）は、細胞外または膜結合Ｎｌｕｃ−Ｂ２ＡＲを阻害するために適用することができる。セレンテラジン基質を添加すると、シグナル獲得アッセイを使用して、活性／受動的に内在化または再利用したＮｌｕｃ−ＧＰＣＲを動的に測定することができ、この適用は、その他のタンパク質、または、Ｎｌｕｃに遺伝的に融合した受容体にも及ばせることができる。
【０１６９】
別の例では、当該開示した化合物は、蛍光色素または蛍光発生色素などの色素に対して付加し得る。例えば、当該開示した化合物は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）での使用のための蛍光色素に付加し得る。細胞を、Ｎｌｕｃ−ＨＴ融合タンパク質などのＮｌｕｃ融合タンパク質でトランスフェクトし、そして、阻害剤−色素コンジュゲートに曝露し得る。細胞透過性阻害剤−色素コンジュゲートは、Ｎｌｕｃ融合タンパク質を発現する細胞のＮｌｕｃに結合し、そして、蛍光を発生する。適切なインキュベーションと洗浄工程の後に、当該蛍光細胞を、ＦＡＣＳで選別し、そして、その後の生化学実験に使用し得る。
【０１７０】
（１５）キナーゼ阻害
幾つかの実施形態では、当該開示した化合物は、キナーゼ阻害アッセイでの使用のためにキナーゼ阻害剤に付加し得る。当該開示した化合物を、キナーゼ阻害剤に付加し、そして、細胞シグナリング、細胞の分裂及び増殖、発生、分化、及び、細胞死などのキナーゼによって調節される細胞プロセスをモニターするためのアッセイにおいて使用し得る。
【０１７１】
（１６）誘導タンパク質分解
幾つかの実施形態では、当該開示した化合物は、疎水性タグ付け（ＨｙＴ）、または、タンパク質分解−標的化キメラ（ＰＲＯＴＡＣ）タグ付け（Ｌａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，２０１７，１６，１０１−１１４）のいずれかを通じて、生体細胞内のタンパク質分解経路を動員し得る小分子の部分を含み得る。例えば、当該開示した化合物は、ＨｙＴまたはＰＲＯＴＡＣ部分に付加したルシフェラーゼ阻害剤構造を含み得る。そのような化合物は、ルシフェラーゼ融合タンパク質（ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）融合タンパク質など）に結合し、そして、これらの融合タンパク質を分解のために標的化し得る。したがって、本明細書に開示した化合物は、細胞環境におけるルシフェラーゼ融合タンパク質の薬理学、及び、機能の研究において使用し得る。
【０１７２】
開示したものは、タンパク質分解を誘導する方法であって、当該方法は、細胞を、本明細書に開示した化合物と接触させることを含み、当該細胞は、ルシフェラーゼ融合タンパク質と、少なくとも１つのプロテアーゼとを含み、それにより、当該融合タンパク質を、プロテアーゼで分解する。幾つかの実施形態では、当該融合タンパク質は、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）融合タンパク質などのＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼ融合タンパク質である。
【０１７３】
（１７）タンパク質の標識付け
幾つかの実施形態では、当該開示した化合物は、ニトロベンズオキサジアゾール（ＮＢＤ）色素部分などのタンパク質標識部分を含み得る。標的タンパク質（ルシフェラーゼなど）に結合すると、開示した化合物のタンパク質標識部分は、当該ルシフェラーゼの特定のアミノ酸と反応して、蛍光標識を形成し得る。例えば、幾つかの開示した化合物は、ＮＢＤ基を含んでおり、このものは、ＮａｎｏＬｕｃでのリシン７８などのルシフェラーゼにおけるリシン残基と反応して、ＮａｎｏＬｕｃに蛍光標識を形成し得る。幾つかの実施形態では、当該開示した化合物は、エーテル結合を介して付加したＮＢＤ基を有する蛍光体ではない。しかしながら、当該標的タンパク質に結合した後に、当該エーテル結合は、当該標的タンパク質のリシン残基のアミノ基とＮＢＤ基との間に形成したアミン結合と置換され、そして、得られる標識は蛍光性であり得る（例えば、約４７８ｎｍでの励起、約５３０ｎｍでの発光）。したがって、本明細書に開示した化合物は、蛍光アフィニティー標識用途に順次使用し得る（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１４，５，１０２１−１０２９）。
【０１７４】
開示したものは、標的タンパク質に標識付けする方法であって、当該方法は、標的タンパク質を、標識部分を有する本明細書に開示した化合物と接触させることを含み、それにより、当該標的タンパク質が、タンパク質標識部分と共有結合を形成する。幾つかの実施形態では、タンパク質標識部分を有する当該化合物は、式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、または、（Ｉｄ）の化合物であり、式中、Ｚは、−ＯＲ4であり、Ｒ4は、任意に置換したアリール、任意に置換したヘテロアリール、または、任意に置換した複素環であり、及び、Ｒ4は、当該化合物と当該タンパク質との間の反応において、タンパク質と共有結合を形成することができる。幾つかの実施形態では、当該方法は、式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、または、（Ｉｄ）の化合物を接触させることを含み、式中、Ｚは、
2020504754.tif 000054
で表される、ニトロベンズオキサジアゾール（ＮＢＤ）色素部分を含む。幾つかの実施形態では、当該標的タンパク質は、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）融合タンパク質などの、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼ融合タンパク質である。幾つかの実施形態では、当該タンパク質標識部分は、蛍光色素などの色素である。幾つかの実施形態では、当該共有結合を、当該標的タンパク質のリシン残基のアミノ基と当該タンパク質標識部分との間に形成する。幾つかの実施形態では、当該方法は、当該標的タンパク質のリシン残基のアミノ基と、当該開示した化合物との反応を許容する、ことをさらに含む。幾つかの実施形態では、当該方法は、当該共有結合を形成した後に、当該標的タンパク質の蛍光を検出する、ことをさらに含む。
【０１７５】
６．試料
当該開示した化合物は、生物学的成分を含有する試料と共に使用し得る。当該試料は、細胞を含み得る。当該試料は、成分（インタクトな細胞、細胞抽出物、細胞溶解物、細菌、ウイルス、細胞小器官、エキソソーム、及び、これらの混合物を含む）の異種混合物、または、成分（例えば、天然または合成のアミノ酸、核酸または糖質ポリマー、または、脂質膜複合体）の単一成分、または、同種群を含み得る。当該開示した化合物は、一般的に、使用の濃度内で、生体細胞、及び、その他の生物成分に対して非毒性とし得る。
【０１７６】
当該試料は、動物（例えば、脊椎動物）、植物、真菌、生理学的流体（例えば、血液、血漿、尿、粘液、分泌物など）、細胞、細胞溶解物、細胞上清、または、細胞の精製分画（例えば、細胞亜分画）を含み得る。特定の実施形態では、細胞を、当該試料とし得る。幾つかの実施形態では、生体細胞を、当該試料とし得る。細胞は、真核細胞、例えば、酵母、鳥類、植物、昆虫、または、ヒト、サル、マウス、イヌ、ウシ、ウマ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、または、ブタの細胞など、これらに限定されない、哺乳動物の細胞、または、原核細胞、または、２つ以上の異なる生物に由来する細胞、または、それらの細胞溶解物または上清とし得る。これらの細胞は、組換え技術を介して遺伝子操作されていなくてもよく（非組換え細胞）、または、組換えＤＮＡによって一時的にトランスフェクションされる、及び／または、そのゲノムが組換えＤＮＡによって安定的に増強される、または、遺伝子を撹乱するように、例えば、プロモーター、イントロン、または、オープンリーディングフレームを撹乱するように、または、ＤＮＡ断片の１つを別のもので置き換えるように、ゲノムが修飾されている組換え細胞とし得る。当該組換えＤＮＡまたは置換ＤＮＡの断片は、本発明の方法で検出する分子、検出される当該分子のレベルまたは活性を変化させる部分、及び／または、当該分子のレベルまたは活性を変化させる当該分子または部分に無関係な遺伝子産物をコードし得る。当該細胞は、ルシフェラーゼを発現し、または、発現し得ない。当該細胞は、組換え技術を介して遺伝子操作され得る。
【０１７７】
７．キット
開示したものは、１つ以上の酵素（例えば、ＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓまたはＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ変異体ルシフェラーゼ）の存在または活性を決定するためのキットである。当該キットは、以下の１つ以上を含み得る。ＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓまたはＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ変異体ルシフェラーゼを阻害し得る本発明の化合物または組成物、セレンテラジンまたはセレンテラジン誘導体基質、ＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓまたはＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ変異体ルシフェラーゼ、発光アッセイを実施するための説明書、及び、反応緩衝液（複数可）。当該反応緩衝液は、非ルシフェラーゼ酵素反応、及び、発光酵素反応のための個々の製剤に存在し得るものであり、または、単一工程アッセイのための単一製剤に存在し得る。また、当該キットは、非ルシフェラーゼ酵素（複数可）のためのその他の阻害剤、活性化剤、及び／または、増強剤を含み得る。また、当該キットは、このアッセイのためのポジティブ、及び／または、ネガティブコントロールを含み得る。
【実施例】
【０１７８】
８．実施例
【実施例１】
【０１７９】
ハロアルカン化合物の合成
ハロアルカン基（例えば、クロロアルカン基）を有する式（Ｉ）の化合物は、スキーム１に従って合成することができる。その他の適切な合成方法は、２０１６年６月２４日に出願され、本明細書の一部を構成するものとしてその全内容を援用する、米国特許出願第１５／１９２，４２０号、Ｄｕｅｌｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，”ＴＨＩＥＮＯＰＹＲＲＯＬＥ  ＣＯＭＰＯＵＮＤＳ  ＡＮＤ  ＵＳＥＳ  ＴＨＥＲＥＯＦ，”に開示されている。
【０１８０】
スキーム１．クロロアルカン基を有する式（Ｉ）の化合物の合成。
【化１０】
2020504754.tif 000055
【実施例２】
【０１８１】
１−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，１０−ジオキソ−１１，１４，１７−トリオキサ−２，９−ジアザノナデカン−１９−イル（２−（２−（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチル）カルバメート（ＪＲＷ−０３０８）
2020504754.tif 000056
【０１８２】
Ｎ−（トランス−４−（（６−アミノヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（１０１ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（５ｍＬ）の溶液に対して、２−（２−（２−（（（４−ニトロフェノキシ）カルボニル）オキシ）エトキシ）エトキシ）エチル（２−（２−（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチル）カルバメート（１１２ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）、及び、ジイソプロピルエチルアミン（７０ｍｇ、０．５４ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、室温で、１８時間撹拌した。この混合物を、酢酸エチルで希釈し、そして、水で洗浄した。これらの有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、そして、分取ＨＰＬＣで精製して、所望の生成物（８９ｍｇ、５０％）を、無色のゴムとして得た。1Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ７．９５  −  ７．７９  （ｍ，  １Ｈ），  ７．７０  −  ７．６１  （ｍ，  １Ｈ），  ７．４５  −  ７．３４  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．３４  −  ７．０５  （ｓ，  ７Ｈ），  ４．９７  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．０６  −  ３．９７  （ｍ，  ４Ｈ），  ３．６８  −  ３．２７  （ｍ，  ２１Ｈ），  ３．１３  −  ３．０５  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．０３  −  ２．８８  （ｍ，  ４Ｈ），  ２．３７  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．１２  −  １．９３  （ｍ，  １Ｈ），  １．９０  −  １．６１  （ｍ，  ６Ｈ），  １．５６  −  １．１５  （ｍ，  １８Ｈ），  １．０５  −  ０．９３  （ｍ，  ３Ｈ）；  ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ９９１  ［Ｍ  ＋  Ｈ］＋；  ＨＰＬＣ  ＞９９  ％  （ＡＵＣ），  ＴR  ７．１８  分；  ＵＶ  （ＭｅＯＨ）  λ  ２８９  ｎｍ，  ε  ２５７３１．
【実施例３】
【０１８３】
［（Ｅ）−３０−クロロ−６，１７−ジオキソ−５，１０，１３，１６，２１，２４−ヘキサオキサ−７，１８−ジアザトリアコン−２−エン−１−イル（１−（トランス−４−（４−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，１０−ジオキソ−１１，１４，１７−トリオキサ−２，９−ジアザノナデカン−１９−イル）カルバメート（ＪＲＷ−０４９４）
2020504754.tif 000057
【０１８４】
Ｎ−（トランス−４−（（６−アミノヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（２５ｍｇ、０．０４３ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（２ｍＬ）の溶液に対して、（Ｅ）−１−（４−ニトロフェノキシ）−１，１２−ジオキソ−２，５，８，１３−テトラオキサ−１１−アザヘプタデク−１５−エン−１７−イル（２３−クロロ−１０−オキソ−３，６，９，１４，１７−ペンタオキサ−１１−アザトリコシル）カルバメート（２８ｍｇ、０．０３２ｍｍｏｌ）、及び、ジイソプロピルエチルアミン（１７ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、室温で、１８時間撹拌した。この混合物を、酢酸エチルで希釈し、そして、水で洗浄した。これらの有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（３１ｍｇ、５６％）を、無色の油脂として得た。1Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ6）  δ  ７．９４  −  ７．８０  （ｍ，  １Ｈ），  ７．７３  −  ７．５９  （ｍ，  １Ｈ），  ７．４６  −  ７．０４  （ｍ，  １１Ｈ），  ５．８１  −  ５．７２  （ｍ，  ２Ｈ），  ５．０５  −  ４．８３  （ｍ，  ２Ｈ），  ４．５０  −  ４．３８  （ｓ，  ４Ｈ），  ４．０７  −  ３．９７  （ｍ，  ４Ｈ），  ３．６８  −  ３．４１  （ｍ，  ２２Ｈ），  ３．４０  −  ３．３２  （ｍ，  １０Ｈ），  ３．１６  −  ３．０４  （ｍ，  ６Ｈ），  ３．０４  −  ２．８７  （ｍ，  ４Ｈ），  ２．７４  −  ２．５８  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．１０  −  １．９８  （ｍ，  １Ｈ），  １．８８  −  １．６１  （ｍ，  ６Ｈ），  １．５２  −  １．１８  （ｍ，  １８Ｈ），  １．０７  −  ０．９５  （ｍ，  ３Ｈ）；  ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  １２９３  ［Ｍ  ＋  Ｈ］＋；  ＨＰＬＣ  ９９．２  ％  （ＡＵＣ），  ＴR  ６．０５  分．
【実施例４】
【０１８５】
［（Ｅ）−３０−クロロ−６，１７−ジオキソ−５，１０，１３，１６，２１，２４−ヘキサオキサ−７，１８−ジアザトリアコン−２−エン−１−イル（１−（トランス−４−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，１０−ジオキソ−１１，１４，１７−トリオキサ−２，９−ジアザノナデカン−１９−イル）カルバメート（ＪＲＷ−０４９５）
2020504754.tif 000058
【０１８６】
Ｎ−（トランス−４−（（６−アミノヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド（２３ｍｇ、０．０４０ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（２ｍＬ）の溶液に対して、（Ｅ）−１−（４−ニトロフェノキシ）−１，１２−ジオキソ−２，５，８，１３−テトラオキサ−１１−アザヘプタデク−１５−エン−１７−イル（２３−クロロ−１０−オキソ−３，６，９，１４，１７−ペンタオキサ−１１−アザトリコシル）カルバメート（２５ｍｇ、０．０３０ｍｍｏｌ）、及び、ジイソプロピルエチルアミン（１５ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、室温で、１８時間撹拌した。この混合物を酢酸エチルで希釈し、そして、水で洗浄した。これらの有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（３０ｍｇ、５８％）を、無色の油脂として得た。1Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ6）  δ  ８．２５  −  ８．１６  （ｍ，  １Ｈ），  ７．７１  −  ７．６２  （ｍ，  １Ｈ），  ７．６２  −  ７．５２  （ｍ，  １Ｈ），  ７．４９  −  ７．０１  （ｍ，  １２Ｈ），  ５．８０  −  ５．７２  （ｍ，  ２Ｈ），  ５．１０  −  ４．９２  （ｍ，  ２Ｈ），  ４．５０  −  ４．４０  （ｍ，  ４Ｈ），  ４．０５  −  ３．９６  （ｓ，  ４Ｈ），  ３．６９  −  ３．４１  （ｍ，  ２２Ｈ），  ３．４１  −  ３．３２  （ｍ，  １０Ｈ），  ３．１６  −  ３．０５  （ｍ，  ６Ｈ），  ３．０４  −  ２．８６  （ｍ，  ４Ｈ），  ２．７７  −  ２．６１  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．１２  −  １．９５  （ｍ，  １Ｈ），  １．９２  −  １．６１  （ｍ，  ６Ｈ），  １．５１  −  １．１８  （ｍ，  １８Ｈ），  １．１０  −  ０．９５  （ｍ，  ３Ｈ）；  ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  １２８７  ［Ｍ  ＋  Ｈ］＋；  ＨＰＬＣ  ９７．９  ％  （ＡＵＣ），  ＴR  ６．１７  分．
【実施例５】
【０１８７】
１−（トランス−４−（４−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，１０−ジオキソ−１１，１４，１７−トリオキサ−２，９−ジアザノナデカン−１９−イル（２−（２−（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチル）カルバメート（ＪＲＷ−０４９７）
2020504754.tif 000059
【０１８８】
Ｎ−（トランス−４−（（６−アミノヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（８６ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（３ｍＬ）の溶液に対して、２−（２−（２−（（（４−ニトロフェノキシ）カルボニル）オキシ）エトキシ）エトキシ）エチル（２−（２−（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチル）カルバメート（６２ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）、及び、ジイソプロピルエチルアミン（５７ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、室温で、１８時間撹拌した。この混合物を酢酸エチルで希釈し、そして、水で洗浄した。これらの有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、そして、分取ＨＰＬＣで精製して、所望の生成物（７０ｍｇ、４７％）を、無色の油脂として得た。1Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ6）  δ  ７．９１  −  ７．８３  （ｍ，  １Ｈ），  ７．７０  −  ７．６１  （ｍ，  １Ｈ），  ７．４８  −  ６．９８  （ｍ，  ９Ｈ），  ５．０８  −  ４．７９  （ｍ，  ２Ｈ），  ４．１０  −  ３．９６  （ｍ，  ４Ｈ），  ３．７１  −  ３．２８  （ｓ，  ２１Ｈ），  ３．１５  −  ３．０４  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．０４  −  ２．８７  （ｍ，  ４Ｈ），  ２．７４  −  ２．６１  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．１０  −  １．９８  （ｍ，  １Ｈ），  １．９２  −  １．６２  （ｍ，  ６Ｈ），  １．５６  −  １．１０  （ｍ，  １８Ｈ），  １．１０  −  ０．９３  （ｍ，  ３Ｈ）；  ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  １００５  ［Ｍ  ＋  Ｈ］＋；  ＨＰＬＣ  ＞９９  ％  （ＡＵＣ），  ＴR  ６．１５  分；  ＵＶ  （ＭｅＯＨ）  λ  ２８８  ｎｍ，  ε  １８５１４．
【実施例６】
【０１８９】
１−（トランス−４−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，１０−ジオキソ−１１，１４，１７−トリオキサ−２，９−ジアザノナデカン−１９−イル（２−（２−（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチル）カルバメート（ＪＲＷ−０４９８）
2020504754.tif 000060
【０１９０】
Ｎ−（トランス−４−（（６−アミノヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド（８７ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（３ｍＬ）の溶液に対して、２−（２−（２−（（（４−ニトロフェノキシ）カルボニル）オキシ）エトキシ）エトキシ）エチル（２−（２−（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチル）カルバメート（６４ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）、及び、ジイソプロピルエチルアミン（５８ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、室温で、１８時間撹拌した。この混合物を酢酸エチルで希釈し、そして、水で洗浄した。これらの有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、そして、分取ＨＰＬＣで精製して、所望の生成物（７１ｍｇ、４７％）を、無色の油脂として得た。1Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ6）  δ  ８．２８  −  ８．１０  （ｍ，  １Ｈ），  ７．７１  −  ７．６２  （ｍ，  １Ｈ），  ７．６１  −  ７．５５  （ｍ，  １Ｈ），  ７．５０  −  ７．０２  （ｓ，  １０Ｈ），  ５．０２  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．０５  −  ３．９８  （ｍ，  ４Ｈ），  ３．７０  −  ３．２８  （ｍ，  ２１Ｈ），  ３．１４  −  ３．０５  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．０４  −  ２．８６  （ｓ，  ４Ｈ），  ２．７６  −  ２．６２  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．１２  −  １．９８  （ｍ，  １Ｈ），  １．９０  −  １．６５  （ｍ，  ６Ｈ），  １．５４  −  １．１５  （ｍ，  １８Ｈ），  １．０６  −  ０．９５  （ｓ，  ３Ｈ）；  ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  １０００  ［Ｍ  ＋  ２］＋；  ＨＰＬＣ  ＞９９  ％  （ＡＵＣ），  ＴR  ６．３０  分；  ＵＶ  （ＭｅＯＨ）  λ  ２９１  ｎｍ，  ε  １９２１６．
【実施例７】
【０１９１】
コハク酸エステル及びマレイミド化合物の合成
【０１９２】
コハク酸エステルまたはマレイミド基を有する式（Ｉ）の化合物は、スキーム２に従って合成することができる。
【０１９３】
スキーム２．コハク酸エステルの合成
【化１１】
2020504754.tif 000061
【実施例８】
【０１９４】
２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  １−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，８−ジオキソ−１２，１５−ジオキサ−２，９−ジアザオクタデカン−１８−オアート（ＪＲＷ−０５２０）
2020504754.tif 000062
【０１９５】
工程１．ｔｅｒｔ−ブチル  １−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，８−ジオキソ−１２，１５−ジオキサ−２，９−ジアザオクタデカン−１８−オアート（ＪＲＷ−０５１８）
2020504754.tif 000063
【０１９６】
６−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキサン酸（５２ｍｇ、０．０８９ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（３ｍＬ）の溶液に対して、ＨＯＢＴ（２７ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（３４ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）、ジイソプロピエチルアミン（３４ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）、及び、ｔｅｒｔ−ブチル  ３−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）プロパノアート（３１ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、６０℃で、１時間加熱した。この混合物を、酢酸エチルで希釈し、そして、水で洗浄した。これらの有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（７１ｍｇ、定量的）を、無色の油脂として得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ７９６  ［Ｍ＋１］＋。
【０１９７】
工程２．  １−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，８−ジオキソ−１２，１５−ジオキサ−２，９−ジアザオクタデカン−１８−オイック酸（ＪＲＷ−０５１９）
2020504754.tif 000064
【０１９８】
ｔｅｒｔ−ブチル  １−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，８−ジオキソ−１２，１５−ジオキサ−２，９−ジアザオクタデカン−１８−オアート（７０ｍｇ、０．０８８ｍｍｏｌ）を含むＤＣＭ（５ｍＬ）の溶液に対して、ＴＦＡ（０．５ｍＬ）を加えた。この溶液を、室温で、１８時間撹拌した。この混合物をトルエンで希釈し、濃縮し、トルエンに再懸濁し、そして、濃縮した。これを２回繰り返した。粗生成物を、次工程で使用した。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ７４０  ［Ｍ＋１］＋．
【０１９９】
工程３．  ２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  １−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，８−ジオキソ−１２，１５−ジオキサ−２，９−ジアザオクタデカン−１８−オアート（ＪＲＷ−０５２０）
2020504754.tif 000065
【０２００】
１−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，８−ジオキソ−１２，１５−ジオキサ−２，９−ジアザオクタデカン−１８−オイック酸（０．０８８ｍｍｏｌ）を含むＤＣＭ（５ｍＬ）の溶液に対して、ＴＳＴＵ（３４ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）、及び、ジイソプロピルエチルアミン（３６ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、室温で、２時間撹拌した。この混合物をＤＣＭで希釈し、そして、ＨＣｌ（１Ｍ）で洗浄した。これらの有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（５７ｍｇ、７２％）を、白色の固形物として得た。1Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ6）  δ  ７．９２  −  ７．８４  （ｍ，  １Ｈ），  ７．８２  −  ７．７３  （ｍ，  １Ｈ），  ７．７０  −  ７．６２  （ｍ，  １Ｈ），  ７．４５  −  ７．３３  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．３３  −  ７．１６  （ｍ，  ３Ｈ），  ７．１１  −  ７．０５  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．９６  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．７４  −  ３．５５  （ｍ，  ５Ｈ），  ３．５５  −  ３．４４  （ｍ，  ４Ｈ），  ３．４１  −  ３．３３  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．２０  −  ３．１１  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．０４  −  ２．９４  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．９０  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．０，  ２Ｈ），  ２．７８  （ｓ，  ４Ｈ），  ２．３６  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．１０  −  １．９８  （ｍ，  ３Ｈ），  １．８８  −  １．６８  （ｍ，  ４Ｈ），  １．５３  −  １．１３  （ｍ，  １０Ｈ），  １．０５  −  ０．９５  （ｍ，  ３Ｈ）；  ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ８３７  ［Ｍ  ＋  Ｈ］＋；  ＨＰＬＣ  ９９．４  ％  （ＡＵＣ），  ＴR  ５．５８  分；  ＵＶ  （ＭｅＯＨ）  λ  ２８９  ｎｍ，  ε  ２５４０８．
【実施例９】
【０２０１】
２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  １−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，８−ジオキソ−１２，１５，１８−トリオキサ−２，９−ジアザヘニコサン−２１−オアート（ＪＲＷ−０５２５）
2020504754.tif 000066
【０２０２】
工程１．ｔｅｒｔ−ブチル  １−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，８−ジオキソ−１２，１５，１８−トリオキサ−２，９−ジアザヘニコサン−２１−オアート（ＪＲＷ−０５５２）
2020504754.tif 000067
【０２０３】
６−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン）−１−カルボキサミド）ヘキサン酸（５０ｍｇ、０．０８６ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（３ｍＬ）の溶液に対して、ＨＯＢＴ（２６ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（３３ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（３３ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）、及び、ｔｅｒｔ−ブチル  ３−（２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）エトキシ）プロパノアート（３５ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、６０℃で、２時間加熱した。この混合物を酢酸エチルで希釈し、そして、水で洗浄した。これらの有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（９７ｍｇ、粗製）を、無色の油脂として得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ８４０［Ｍ＋１］＋．
【０２０４】
工程２．  １−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，８−ジオキソ−１２，１５，１８−トリオキサ−２，９−ジアザヘニコサン−２１−オイック酸（ＪＲＷ−０５２４）
2020504754.tif 000068
【０２０５】
ｔｅｒｔ−ブチル  １−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，８−ジオキソ−１２，１５，１８−トリオキサ−２，９−ジアザヘニコサン−２１−オアート（０．０８６ｍｍｏｌ）を含むＤＣＭ（５ｍＬ）の溶液に対して、ＴＦＡ（０．５ｍＬ）を加えた。この溶液を、室温で、１８時間撹拌した。この混合物をトルエンで希釈し、濃縮し、トルエンに再懸濁し、そして、濃縮した。これを２回繰り返した。粗生成物を、次工程で使用した。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ７８４  ［Ｍ ＋ Ｈ］＋．
【０２０６】
工程３．  ２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  １−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，８−ジオキソ−１２，１５，１８−トリオキサ−２，９−ジアザヘニコサン−２１−オアート（ＪＲＷ−０５２５）
2020504754.tif 000069
【０２０７】
１−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，８−ジオキソ−１２，１５，１８−トリオキサ−２，９−ジアザヘニコサン−２１−オイック酸（０．０８６ｍｍｏｌ）を含むＤＣＭ（１０ｍＬ）の溶液に対して、ＴＳＴＵ（３１ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）、及び、ジイソプロピルエチルアミン（３３ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、室温で、１時間撹拌した。この混合物をＤＣＭで希釈し、そして、ＨＣｌ（１Ｍ）で洗浄した。これらの有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（５７ｍｇ、７６％）を、白色の固形物として得た。1Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ6）  δ  ７．８７  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２，  １Ｈ），  ７．８３  −  ７．７５  （ｍ，  １Ｈ），  ７．７０  −  ７．６４  （ｍ，  １Ｈ），  ７．４５  −  ７．３４  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．３２  −  ７．１６  （ｍ，  ３Ｈ），  ７．１１  −  ７．０４  （ｍ，  ２Ｈ），  ４．９６  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．７３  −  ３．５５  （ｍ，  ５Ｈ），  ３．５５  −  ３．４５  （ｍ，  ８Ｈ），  ３．４０  −  ３．３３  （ｔ，  Ｊ  ＝  ５．９，  ２Ｈ），  ３．２０  −  ３．１１  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．０３  −  ２．９４  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．９０  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．０，  ２Ｈ），  ２．７８  （ｓ，  ４Ｈ），  ２．３６  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．０９  −  １．９６  （ｍ，  ３Ｈ），  １．８９  −  １．６８  （ｍ，  ４Ｈ），  １．５２  −  １．１２  （ｍ，  １０Ｈ），  １．０８  −  ０．９３  （ｓ，  ３Ｈ）；  ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ８８１  ［Ｍ  ＋  Ｈ］＋；  ＨＰＬＣ  ９４．９  ％  （ＡＵＣ），  ＴR  ５．５６  分；  ＵＶ  （ＭｅＯＨ）  λ  ２８８  ｎｍ，  ε  ２６３３７．
【実施例１０】
【０２０８】
２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  １−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，８−ジオキソ−１２，１５，１８，２１−テトラオキサ−２，９−ジアザテトラコサン−２４−オアート（ＪＲＷ−０５３３）
2020504754.tif 000070
【０２０９】
工程１．ｔｅｒｔ−ブチル  １−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，８−ジオキソ−１２，１５，１８，２１−テトラオキサ−２，９−ジアザテトラコサン−２４−オアート（ＪＲＷ−０５２９）
2020504754.tif 000071
【０２１０】
６−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキサン酸（７５ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（４ｍＬ）の溶液に対して、ＨＯＢＴ（４０ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（４９ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）、ジイソプロピエチルアミン（５０ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ）、及び、ｔｅｒｔ−ブチル  １−アミノ−３，６，９，１２−テトラオキサペンタデカン−１５−オアート（６２ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、６５℃で、３時間加熱した。この混合物を酢酸エチルで希釈し、そして、水で洗浄した。これらの有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（１３０ｍｇ、粗製）を、無色の油脂として得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ８８４  ［Ｍ＋１］＋．
【０２１１】
工程２．  １−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，８−ジオキソ−１２，１５，１８，２１−テトラオキサ−２，９−ジアザテトラコサン−２４−オイック酸（ＪＲＷ−０５３２）
2020504754.tif 000072
【０２１２】
ｔｅｒｔ−ブチル  １−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，８−ジオキソ−１２，１５，１８，２１−テトラオキサ−２，９−ジアザテトラコサン−２４−オアート（０．１３ｍｍｏｌ）を含むＤＣＭ（５ｍＬ）の溶液に対して、ＴＦＡ（０．５ｍＬ）を加えた。この溶液を、室温で、３時間撹拌した。この混合物をトルエンで希釈し、濃縮し、トルエンに再懸濁し、そして、濃縮した。これを２回繰り返した。粗生成物を、次工程で使用した。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ８２８  ［Ｍ ＋ Ｈ］＋．
【０２１３】
工程３．  ２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  １−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，８−ジオキソ−１２，１５，１８，２１−テトラオキサ−２，９−ジアザテトラコサン−２４−オアート（ＪＲＷ−０５３３）
2020504754.tif 000073
【０２１４】
１−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，８−ジオキソ−１２，１５，１８，２１−テトラオキサ−２，９−ジアザテトラコサン−２４−オイック酸（０．１３ｍｍｏｌ）を含むＤＣＭ（５ｍＬ）の溶液に対して、ＴＳＴＵ（４６ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）、及び、ジイソプロピルエチルアミン（５０ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、室温で、３０分間撹拌した。この混合物をＤＣＭで希釈し、そして、ＨＣｌ（１Ｍ）で洗浄した。これらの有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（８９ｍｇ、７５％）を、白色の泡沫として得た。1Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ6）  δ  ７．８７  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．１，  １Ｈ），  ７．８３  −  ７．７５  （ｍ，  １Ｈ），  ７．６８  −  ７．６２  （ｍ，  １Ｈ），  ７．４３  −  ７．３４  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．３３  −  ７．１６  （ｍ，  ３Ｈ），  ７．１１  −  ７．０５  （ｍ，  ２Ｈ），  ４．９６  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．７３  −  ３．５５  （ｍ，  ５Ｈ），  ３．５５  −  ３．４３  （ｍ，  １２Ｈ），  ３．３７  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．０，  ２Ｈ），  ３．１６  （ｑ，  Ｊ  ＝  ５．８，  ２Ｈ），  ２．９８  （ｑ，  Ｊ  ＝  ５．９，  ２Ｈ），  ２．９０  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．０，  ２Ｈ），  ２．７８  （ｓ，  ４Ｈ），  ２．３６  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．１０  −  １．９７  （ｍ，  ３Ｈ），  １．８８  −  １．６８  （ｓ，  ４Ｈ），  １．５３  −  １．１０  （ｍ，  １０Ｈ），  １．０８  −  ０．９４  （ｓ，  ３Ｈ）；  ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ９２５  ［Ｍ  ＋  Ｈ］＋；  ＨＰＬＣ  ９８．５  ％  （ＡＵＣ），  ＴR  ５．５４  分；  ＵＶ  （ＭｅＯＨ）  λ  ２８８  ｎｍ，  ε  ２６７２６．
【実施例１１】
【０２１５】
２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  １−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，１０−ジオキソ−１４，１７−ジオキサ−２，１１−ジアザイコサン−２０−オアート（ＪＲＷ−０５４４）
2020504754.tif 000074
【０２１６】
工程１．ｔｅｒｔ−ブチル  １−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，１０−ジオキソ−１４，１７−ジオキサ−２，１１−ジアザイコサン−２０−オアート（ＪＲＷ−０５３６）
2020504754.tif 000075
【０２１７】
８−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）オクタン酸（５０ｍｇ、０．０８２ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（３ｍＬ）の溶液に対して、ＨＯＢＴ（２５ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（３１ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）、ジイソプロピエチルアミン（３１ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）、及び、ｔｅｒｔ−ブチル  ３−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）プロパノアート（２９ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、６５℃で、３時間加熱した。この混合物を酢酸エチルで希釈し、そして、水で洗浄した。これらの有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（４０ｍｇ、６０％）を、無色の油脂として得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ８２４  ［Ｍ＋１］＋．
【０２１８】
工程２．  １−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，１０−ジオキソ−１４，１７−ジオキサ−２，１１−ジアザイコサン−２０−オイック酸（ＪＲＷ−０５４０）
2020504754.tif 000076
【０２１９】
ｔｅｒｔ−ブチル  １−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，１０−ジオキソ−１４，１７−ジオキサ−２，１１−ジアザイコサン−２０−オレート（４０ｍｇ、０．０４８ｍｍｏｌ）を含むＤＣＭ（５ｍＬ）の溶液に対して、ＴＦＡ（１ｍＬ）を加えた。この溶液を、室温で、２時間撹拌した。この混合物をトルエンで希釈し、濃縮し、トルエンに再懸濁し、そして、濃縮した。これを２回繰り返した。粗生成物を、次工程で使用した。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ７６８  ［Ｍ ＋ Ｈ］＋．
【０２２０】
工程３．  ２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  １−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，１０−ジオキソ−１４，１７−ジオキサ−２，１１−ジアザイコサン−２０−オアート（ＪＲＷ−０５４４）
2020504754.tif 000077
【０２２１】
１−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，１０−ジオキソ−１４，１７−ジオキサ−２，１１−ジアザイコサン−２０−オイック酸（３９ｍｇ、０．０５１ｍｍｏｌ）を含むＤＣＭ（５ｍＬ）の溶液に対して、ＴＳＴＵ（２３ｍｇ、０．０７６ｍｍｏｌ）、及び、ジイソプロピルエチルアミン（２０ｍｇ，０．１５ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、室温で、１時間撹拌した。この混合物をＤＣＭで希釈し、そして、ＨＣｌ（１Ｍ）で洗浄した。これらの有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（３４ｍｇ、７９％）を、白色の泡沫として得た。1Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ6）  δ  ７．９５  −  ７．８６  （ｍ，  １Ｈ），  ７．８５  −  ７．７６  （ｍ，  １Ｈ），  ７．７４  −  ７．６５  （ｍ，  １Ｈ），  ７．４６  −  ７．３７  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．３４  −  ７．２０  （ｍ，  ３Ｈ），  ７．１４  −  ７．０６  （ｍ，  ２Ｈ），  ４．９９  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．７６  −  ３．５７  （ｍ，  ５Ｈ），  ３．５８  −  ３．４５  （ｍ，  ４Ｈ），  ３．４２  −  ３．３５  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．１８  （ｑ，  Ｊ  ＝  ５．８，  ２Ｈ），  ３．０６  −  ２．９７  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．９２  （ｔ，  Ｊ  ＝  ５．９，  ２Ｈ），  ２．８１  （ｓ，  ４Ｈ），  ２．３９  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．１１  −  １．９９  （ｍ，  ３Ｈ），  １．９１  −  １．７０  （ｍ，  ４Ｈ），  １．５４  −  １．１５  （ｍ，  １４Ｈ），  １．１０  −  ０．９５  （ｍ，  ３Ｈ）；  ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ８６５  ［Ｍ  ＋  Ｈ］＋；  ＨＰＬＣ  ９６．７  ％  （ＡＵＣ），  ＴR  ５．８１  分；  ＵＶ  （ＭｅＯＨ）  λ  ２８８  ｎｍ，  ε  ２３７４２．
【実施例１２】
【０２２２】
２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  １−（（１ｒ，４ｒ）−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，１０−ジオキソ−１４，１７，２０−トリオキサ−２，１１−ジアザトリコサン−２３−オアート（ＪＲＷ−０５４５）
2020504754.tif 000078
【０２２３】
工程１．ｔｅｒｔ−ブチル  １−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，１０−ジオキソ−１４，１７，２０−トリオキサ−２，１１−ジアザトリコサン−２３−オアート（ＪＲＷ−０５３７）
2020504754.tif 000079
【０２２４】
８−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）オクタン酸（５４ｍｇ、０．０８８ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（４ｍＬ）の溶液に対して、ＨＯＢＴ（２７ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（３４ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）、ジイソプロピエチルアミン（２３ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）、及び、ｔｅｒｔ−ブチル  ３−（２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）エトキシ）プロパノアート（３７ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、６０℃で、３時間加熱した。この混合物を酢酸エチルで希釈し、そして、水で洗浄した。これらの有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（５１ｍｇ、６６％）を、白色の泡沫として得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ８６８  ［Ｍ＋１］＋．
【０２２５】
工程２．  １−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，１０−ジオキソ−１４，１７，２０−トリオキサ−２，１１−ジアザトリコサン−２３−オイック酸（ＪＲＷ−０５４１）
2020504754.tif 000080
【０２２６】
ｔｅｒｔ−ブチル  １−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，１０−ジオキソ−１４，１７，２０−トリオキサ−２，１１−ジアザトリコサン−２３−オアート（５１ｍｇ、０．０５８ｍｍｏｌ）を含むＤＣＭ（５ｍＬ）の溶液に対して、ＴＦＡ（１ｍＬ）を加えた。この溶液を、室温で、２時間撹拌した。この混合物をトルエンで希釈し、濃縮し、トルエンに再懸濁し、そして、濃縮した。これを２回繰り返した。粗生成物を、次工程で使用した。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ８１２  ［Ｍ ＋ Ｈ］＋．
【０２２７】
工程３．  ２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  １−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，１０−ジオキソ−１４，１７，２０−トリオキサ−２，１１−ジアゾトリコサン−２３−オアート（ＪＲＷ−０５４５）
2020504754.tif 000081
【０２２８】
１−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，１０−ジオキソ−１４，１７，２０−トリオキサ−２，１１−ジアザトリコサン−２３−オイック酸（５０ｍｇ、０．０６１ｍｍｏｌ）を含むＤＣＭ（５ｍＬ）の溶液に対して、ＴＳＴＵ（２８ｍｇ、０．０９２ｍｍｏｌ）、及び、ジイソプロピルエチルアミン（２３ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、室温で、２時間撹拌した。この混合物をＤＣＭで希釈し、そして、ＨＣｌ（１Ｍ）で洗浄した。これらの有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（４５ｍｇ、８０％）を、白色の泡沫として得た。1Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ6）  δ  ７．９７  −  ７．８７  （ｍ，  １Ｈ），  ７．８７  −  ７．７８  （ｍ，  １Ｈ），  ７．７５  −  ７．６５  （ｍ，  １Ｈ），  ７．４８  −  ７．３７  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．３６  −  ７．２０  （ｍ，  ３Ｈ），  ７．１５  −  ７．０７  （ｍ，  ２Ｈ），  ４．９９  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．７６  −  ３．５８  （ｍ，  ５Ｈ），  ３．５７  −  ３．４５  （ｍ，  ８Ｈ），  ３．４３  −  ３．３５  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．１８  （ｄ，  Ｊ  ＝  ５．８，  ２Ｈ），  ３．０６  −  ２．９７  （ｓ，  ２Ｈ），  ２．９３  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．０，  ２Ｈ），  ２．８１  （ｓ，  ４Ｈ），  ２．３９  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．１１  −  １．９９  （ｓ，  ３Ｈ），  １．９２  −  １．６６  （ｍ，  ４Ｈ），  １．５５  −  １．１３  （ｍ，  １４Ｈ），  １．１０  −  ０．９５  （ｓ，  ３Ｈ）；  ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ９０９  ［Ｍ  ＋  Ｈ］＋；  ＨＰＬＣ  ９６．２  ％  （ＡＵＣ），  ＴR  ５．７８  分；  ＵＶ  （ＭｅＯＨ）  λ  ２８８  ｎｍ，  ε  ２４１９５．
【実施例１３】
【０２２９】
２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  １−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，１０−ジオキソ−１４，１７，２０，２３−テトラオキサ−２，１１−ジアザヘキサコサン−２６−オアート（ＪＲＷ−０５４６）
2020504754.tif 000082
【０２３０】
工程１．ｔｅｒｔ−ブチル  １−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，１０−ジオキソ−１４，１７，２０，２３−テトラオキサ−２，１１−ジアザヘキサコサン−２６−オアート（ＪＲＷ−０５３９）
2020504754.tif 000083
【０２３１】
８−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）オクタン酸（５０ｍｇ、０．０８２ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（３ｍＬ）の溶液に対して、ＨＯＢＴ（２５ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（３１ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（３１ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）、及び、ｔｅｒｔ−ブチル  １−アミノ−３，６，９，１２−テトラオキサペンタデカン−１５−オアート（３９ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、６０℃で、３時間加熱した。この混合物を酢酸エチルで希釈し、そして、水で洗浄した。これらの有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（５０ｍｇ、６６％）を、透明の油脂として得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ９１２  ［Ｍ＋１］＋．
【０２３２】
工程２．  １−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，１０−ジオキソ−１４，１７，２０，２３−テトラオキサ−２，１１−ジアザヘキサコサン−２６−オイック酸（ＪＲＷ−０５４２）
2020504754.tif 000084
【０２３３】
ｔｅｒｔ−ブチル  １−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，１０−ジオキソ−１４，１７，２０，２３−テトラオキサ−２，１１−ジアザヘキサコサン−２６−オアート（５０ｍｇ、０．０５４ｍｍｏｌ）を含むＤＣＭ（５ｍＬ）の溶液に対して、ＴＦＡ（１ｍＬ）を加えた。この溶液を、室温で、２時間撹拌した。この混合物をトルエンで希釈し、濃縮し、トルエンに再懸濁し、そして濃縮した。これを２回繰り返した。粗生成物を、次工程で使用した。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ８５６  ［Ｍ ＋ Ｈ］＋．
【０２３４】
工程３．  ２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  １−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，１０−ジオキソ−１４，１７，２０，２３−テトラオキサ−２，１１−ジアザヘキサコサン−２６−オアート（ＪＲＷ−０５４６）
2020504754.tif 000085
【０２３５】
１−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，１０−ジオキソ−１４，１７，２０，２３−テトラオキサ−２，１１−ジアザヘキサコサン−２６−オイック酸（５０ｍｇ、０．０５８ｍｍｏｌ）を含むＤＣＭ（５ｍＬ）の溶液に対して、ＴＳＴＵ（２６ｍｇ、０．０８７ｍｍｏｌ）、及び、ジイソプロピルエチルアミン（２３ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、室温で、２時間撹拌した。この混合物をＤＣＭで希釈し、そして、ＨＣｌ（１Ｍ）で洗浄した。これらの有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（４２ｍｇ、７６％）を、白色の泡沫として得た。1Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ6）  δ  ７．９５  −  ７．８８  （ｍ，  １Ｈ），  ７．８８  −  ７．７９  （ｍ，  １Ｈ），  ７．７５  −  ７．６７  （ｍ，  １Ｈ），  ７．４７  −  ７．３６  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．３６  −  ７．２１  （ｍ，  ３Ｈ），  ７．１５  −  ７．０７  （ｍ，  ２Ｈ），  ４．９９  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．７６  −  ３．５７  （ｍ，  ５Ｈ），  ３．５６  −  ３．４６  （ｍ，  １２Ｈ），  ３．４２  −  ３．３６  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．１８  （ｑ，  Ｊ  ＝  ５．８，  ２Ｈ），  ３．０７  −  ２．９７  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．９３  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．０，  ２Ｈ），  ２．８１  （ｓ，  ４Ｈ），  ２．３９  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．１１  −  １．９８  （ｍ，  ３Ｈ），  １．９０  −  １．７０  （ｍ，  ４Ｈ），  １．５５  −  １．１４  （ｍ，  １４Ｈ），  １．０８  −  ０．９５  （ｍ，  ３Ｈ）；  ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ９０９  ［Ｍ  ＋  Ｈ］＋；  ＨＰＬＣ  ９６．２  ％  （ＡＵＣ），  ＴR  ５．７８  分；  ＵＶ  （ＭｅＯＨ）  λ  ２８８  ｎｍ，  ε  ２４１９５． 
【実施例１４】
【０２３６】
２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  １−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，８−ジオキソ−１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０，３３−オクタオキサ−２，９−ジアザヘキサトリアコンタン−３６−オアート（ＪＲＷ−０５６１）
2020504754.tif 000086
【０２３７】
工程１．  ｔｅｒｔ−ブチル  １−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，８−ジオキソ−１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０，３３−オクタオキサ−２，９−ジアザヘキサアトリアコンタン−３６−オアート（ＪＲＷ−０５５７）
2020504754.tif 000087
【０２３８】
６−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキサン酸（５０ｍｇ、０．０８６ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（４ｍＬ）の溶液に対して、ＨＯＢＴ（２６ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（３３ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）、ジイソプロピエチルアミン（３３ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）、及び、ｔｅｒｔ−ブチル  １−アミノ−３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４−オクタオキサヘプタコサン−２７−オアート（６４ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、６０℃で、２時間加熱した。この混合物を酢酸エチルで希釈し、そして、水で洗浄した。これらの有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（６６ｍｇ、７２％）を、透明油脂として得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  １０６０  ［Ｍ ＋ Ｈ］＋．
【０２３９】
工程２．  １−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，８−ジオキソ−１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０，３３−オクタオキサ−２，９−ジアザヘキサトリアコンタン−３６−オイック酸（ＪＲＷ−０５６０）
2020504754.tif 000088
【０２４０】
ｔｅｒｔ−ブチル  １−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，８−ジオキソ−１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０，３３−オクタオキサ−２，９−ジアザヘキサトリアコンタン−３６−オアート（６６ｍｇ、０．０６２ｍｍｏｌ）を含むＤＣＭ（５ｍＬ）の溶液に対して、ＴＦＡ（１ｍＬ）を加えた。この溶液を、室温で、２時間撹拌した。この混合物をトルエンで希釈し、濃縮し、トルエンに再懸濁し、そして、濃縮した。これを２回繰り返した。粗生成物を、次工程で使用した。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  １００４  ［Ｍ ＋ Ｈ］＋．
【０２４１】
工程３．  ２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  １−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，８−ジオキソ−１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０，３３−オクタオキサ−２，９−ジアザヘキサトリアコンタン−３６−オアート（ＪＲＷ−０５６１）
2020504754.tif 000089
【０２４２】
１−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，８−ジオキソ−１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０，３３−オクタオキサ−２，９−ジアザヘキサトリアコンタン−３６−オイック酸（６２ｍｇ、０．０６２ｍｍｏｌ）を含むＤＣＭ（１０ｍＬ）の溶液に対して、ＴＳＴＵ（２８ｍｇ、０．０９３ｍｍｏｌ）、及び、ジイソプロピルエチルアミン（２４ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、室温で、２時間撹拌した。この混合物をＤＣＭで希釈し、そして、ＨＣｌ（１Ｍ）で洗浄した。これらの有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（６４ｍｇ、９４％）を、淡橙色のワックスとして得た。1Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ6）  δ  ７．９５  −  ７．８３  （ｍ，  １Ｈ），  ７．８３  −  ７．７３  （ｍ，  １Ｈ），  ７．７０  −  ７．６０  （ｍ，  １Ｈ），  ７．４５  −  ７．３４  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．３３  −  ７．１４  （ｍ，  ３Ｈ），  ７．１１  −  ７．０５  （ｍ，  ２Ｈ），  ４．９６  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．７５  −  ３．５５  （ｓ，  ５Ｈ），  ３．５５  −  ３．４１  （ｍ，  ２４Ｈ），  ３．４０  −  ３．３３  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．２０  −  ３．１２  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．０３  −  ２．９４  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．９２  −  ２．８６  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．７９  （ｓ，  ４Ｈ），  ２．３６  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．０８  −  １．９４  （ｍ，  ３Ｈ），  １．８８  −  １．６８  （ｍ，  ４Ｈ），  １．５１  −  １．１１  （ｍ，  １０Ｈ），  １．０５  −  ０．９５  （ｍ，  ３Ｈ）；  ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  １１０１  ［Ｍ  ＋  Ｈ］＋；  ＨＰＬＣ  ９４．５  ％  （ＡＵＣ），  ＴR  ５．９３  分；  ＵＶ  （ＭｅＯＨ）  λ  ２８８  ｎｍ，  ε  ２６１８６． 
【実施例１５】
【０２４３】
Ｎ−（トランス−４−（（６−（３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）プロパンアミド）ヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（ＪＲＷ−０５５８）
2020504754.tif 000090
【０２４４】
Ｎ−（トランス−４−（（６−アミノヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（５０ｍｇ、０．０８８ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（４ｍＬ）の溶液に対して、ＨＯＢＴ（２７ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（３４ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）、ジイソプロピエチルアミン（３４ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）、及び、３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）プロパン酸（２２ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、６０℃で、１時間加熱した。この混合物を酢酸エチルで希釈し、そして、水で洗浄した。これらの有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（３３ｍｇ、５２％）を、白色の固形物として得た。1Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ6）  δ  ７．９５  −  ７．８４  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．７２  −  ７．６４  （ｍ，  １Ｈ），  ７．４５  −  ７．３４  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．３３  −  ７．１７  （ｍ，  ３Ｈ），  ７．１１  −  ７．０５  （ｍ，  ２Ｈ），  ６．９９  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．９６  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．７４  −  ３．４８  （ｍ，  ５Ｈ），  ３．０５  −  ２．８９  （ｍ，  ４Ｈ），  ２．３６  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．２９  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．２，  ２Ｈ），  ２．１２  −  １．９４  （ｍ，  １Ｈ），  １．８９  −  １．６８  （ｍ，  ４Ｈ），  １．５２  −  １．１５  （ｍ，  １２Ｈ），  １．０８  −  ０．９５  （ｍ，  ３Ｈ）；  ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ７１７  ［Ｍ  ＋  Ｈ］＋；  ＨＰＬＣ  ９８．５  ％  （ＡＵＣ），  ＴR  ５．６３  分；  ＵＶ  （ＭｅＯＨ）  λ  ２８９  ｎｍ，  ε  ２５０００．
【実施例１６】
【０２４５】
Ｎ−（トランス−４−（（１−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−３，１３−ジオキソ−７，１０−ジオキサ−４，１４−ジアザイコサン）−２０−イル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（ＪＲＷ−０５５９）
2020504754.tif 000091
【０２４６】
Ｎ−（トランス−４−（（６−アミノヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（５０ｍｇ、０．０８８ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（４ｍＬ）の溶液に対して、ＨＯＢＴ（２７ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（３４ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）、ジイソプロピエチルアミン（３４ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）、及び、３−（２−（２−（３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）プロパンアミド）エトキシ）エトキシ）プロパン酸（４３ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、６０℃で、１時間加熱した。この混合物を酢酸エチルで希釈し、そして、水で洗浄した。これらの有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（３２ｍｇ、４１％）を、白色の泡沫として得た。1Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ6）  δ  ８．０７  −  ７．９５  （ｍ，  １Ｈ），  ７．９４  −  ７．８４  （ｍ，  １Ｈ），  ７．８４  −  ７．７３  （ｍ，  １Ｈ），  ７．７３  −  ７．６０  （ｍ，  １Ｈ），  ７．４６  −  ７．３５  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．３３  −  ７．１８  （ｍ，  ３Ｈ），  ７．１２  −  ７．０５  （ｍ，  ２Ｈ），  ６．９８  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．９６  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．７０  −  ３．５３  （ｍ，  ７Ｈ），  ３．４７  −  ３．４２  （ｍ，  ４Ｈ），  ３．１２  （ｑ，  Ｊ  ＝  ５．７，  ２Ｈ），  ３．０５  −  ２．９４  （ｍ，  ４Ｈ），  ２．３６  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．３４  −  ２．２３  （ｍ，  ４Ｈ），  ２．１１  −  １．９６  （ｍ，  １Ｈ），  １．９１  −  １．６５  （ｍ，  ４Ｈ），  １．５１  −  １．１５  （ｍ，  １２Ｈ），  １．０５  −  ０．９５  （ｍ，  ３Ｈ）；  ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ８７６  ［Ｍ  ＋  Ｈ］＋；  ＨＰＬＣ  ８７．９  ％  （ＡＵＣ），  ＴR  ５．２３  分；  ＵＶ  （ＭｅＯＨ）  λ  ２８８  ｎｍ，  ε  ２３８４０．
【実施例１７】
【０２４７】
メチル  トランス−４−（４−（２−（（３−（ブロモメチル）フェニル）（エチル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキシラート（ＪＲＷ−０４６６）
2020504754.tif 000092
【０２４８】
標記化合物を、その全内容を本明細書の一部を構成するものとして援用する、米国特許出願第１５／１９２，４２０号に記載された合成方法を用いて調製した。
【実施例１８】
【０２４９】
メチル  トランス−４−（４−（２−（（３−（３−ブロモプロピル）フェニル）（エチル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキシラート（ＪＲＷ−０５４８）
2020504754.tif 000093
【０２５０】
ＪＲＷ−０５４８は、スキーム３に従って合成し得る。
【０２５１】
スキーム．３  ＪＲＷ−０５４８の合成
【化１２】
2020504754.tif 000094
【０２５２】
工程１．  メチル  ３−（３−アミノフェニル）プロパノアート（ＪＲＷ−０５０１）
2020504754.tif 000095
３−（３−アミノフェニル）プロパン酸（３．０ｇ、１８．２ｍｍｏｌ）を含むメタノール（６０ｍＬ）の溶液に対して、クロロトリメチルシラン（２．０ｇ、１８．２ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、室温で、１８時間撹拌した。この混合物を濃縮し、メタノールに再溶解し、そして、再濃縮した（２×）。残渣を、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、目的の生成物（３．５ｇ、粗製）を、褐色の固形物として得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  １８０  ［Ｍ ＋ Ｈ］＋．
【０２５３】
工程２．  メチル  ３−（３−（エチルアミノ）フェニル）プロパノアート（ＪＲＷ−０５１１）
2020504754.tif 000096
【０２５４】
メチル  ３−（３−アミノフェニル）プロパノアート（１．０ｇ、５．６ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（１０ｍＬ）の溶液に対して、ヨウ化エチル（０．６５ｇ、４．２ｍｍｏｌ）、及び、ジイソプロピルアミン（２．１６ｇ、１６．７ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、密閉容器にて、８５℃で、１８時間加熱した。この混合物を酢酸エチルで希釈し、そして、水で洗浄した。これらの有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（０．４８ｇ、４１％）を、無色の油脂として得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ２０８  ［Ｍ ＋ Ｈ］＋．
【０２５５】
工程３．  ３−（３−（エチルアミノ）フェニル）プロパン−１−オール（ＪＲＷ−０５１３）
2020504754.tif 000097
【０２５６】
０℃で、メチル  ３−（３−（エチルアミノ）フェニル）プロパノアート（８５０ｍｇ、４．１０ｍｍｏｌ）を含むメタノール（１０ｍＬ）の溶液に対して、水素化ホウ素ナトリウム（７７５ｍｇ、２０．５ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、室温で、７時間撹拌した。この混合物をＮａＯＨ（１Ｍ）で急冷し、酢酸エチルで希釈し、そして、水で洗浄した。これらの有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮して、所望の生成物（７５０ｍｇ、粗製）を、無色の油脂として得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  １８０  ［Ｍ ＋ Ｈ］＋．
【０２５７】
工程４．  ３−（３−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）プロピル）−Ｎ−エチルアニリン（ＪＲＷ−０５１４）
2020504754.tif 000098
【０２５８】
０℃で、３−（３−（エチルアミノ）フェニル）プロパン−１−オール（７５０ｍｇ、４．２ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（１０ｍＬ）の溶液に対して、クロロ  ｔ−ブチルジメチルシラン（７５６ｍｇ、５．０ｍｍｏｌ）、及び、イミダゾール（５６１ｍｇ、８．４ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、室温で、１８時間撹拌した。この混合物を酢酸エチルで希釈し、そして、水で洗浄した。これらの有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（１．０２ｇ、８３％）を、無色の油脂として得た。1Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ3）  δ  ７．０３  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．４，  １Ｈ），  ６．４９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ７．８，  １Ｈ），  ６．４３  −  ６．３５  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．５８  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．３，  ３Ｈ），  ３．１０  （ｑ，  Ｊ  ＝  ７．０，  ２Ｈ），  ２．５８  −  ２．４９  （ｍ，  ２Ｈ），  １．８２  −  １．７０  （ｍ，  ２Ｈ），  １．２５  −  １．１２  （ｍ，  ４Ｈ），  ０．８６  （ｓ，  ９Ｈ），  ０．００  （ｓ，  ６Ｈ）；  ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ２０８  ［Ｍ ＋ Ｈ］＋．
【０２５９】
工程５．  メチル  ４−（２−（（３−（３−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）プロピル）フェニル）（エチル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキシラート（ＪＲＷ−０５１６）
2020504754.tif 000099
【０２６０】
３−（３−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）プロピル）−Ｎ−エチルアニリン（１３５ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ）、及び、２−（５−（メトキシカルボニル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−４−イル）酢酸（１００ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（５ｍＬ）の溶液に対して、ＨＡＴＵ（３１８ｍｇ、０．８４ｍｍｏｌ）、及び、ジイソプロピルエチルアミン（１６２ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、８５℃で、１時間撹拌した。この混合物を酢酸エチルで希釈し、そして、水で洗浄した。これらの有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（１１９ｍｇ、５５％）を、淡橙色の固形物として得た。1Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ3）  δ  ７．３６  −  ７．２８  （ｍ，  １Ｈ），  ７．２５  −  ７．２２  （ｍ，  １Ｈ），  ７．２０  −  ７．１４  （ｍ，  １Ｈ），  ７．１３  −  ７．０５  （ｍ，  ３Ｈ），  ６．７４  （ｄ，  Ｊ  ＝  ５．４，  １Ｈ），  ４．９１  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．８１  −  ３．５２  （ｍ，  ７Ｈ），  ２．７４  −  ２．６２  （ｍ，  ２Ｈ），  １．８９  −  １．７３  （ｍ，  ２Ｈ），  １．０６  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．１，  ３Ｈ），  ０．８５  （ｓ，  ９Ｈ），  ０．００  （ｓ，  ６Ｈ）；  ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ５１５  ［Ｍ ＋ Ｈ］＋．
【０２６１】
工程６．  ４−（２−（エチル（３−（３−ヒドロキシプロピル）フェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸（ＪＲＷ−０５２３）
2020504754.tif 000100
【０２６２】
メチル  ４−（２−（（３−（３−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）プロピル）フェニル）（エチル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキシラート（１１０ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）を含むジオキサン（５ｍＬ）及び水（１ｍＬ）の溶液に対して、水酸化リチウム（２６ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を８５℃で、５時間撹拌した。この混合物をＨＣｌ（２Ｍ）で酸性化し、酢酸エチルで希釈し、そして、水で洗浄した。これらの有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮して、所望の生成物（１００ｍｇ、粗製）を、淡橙色のガラスとして得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ３８７  ［Ｍ ＋ Ｈ］＋．
【０２６３】
工程７．メチル  トランス−４−（４−（２−（エチル（３−（３−ヒドロキシプロピル）フェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキシラート（ＪＲＷ−０５２６）
2020504754.tif 000101
【０２６４】
４−（２−（エチル（３−（３−ヒドロキシプロピル）フェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボン酸（０．２１ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（５ｍＬ）の溶液に対して、ＨＯＢＴ（６５ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（８２ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）、ジイソプロピエチルアミン（８２ｍｇ、０．６４ｍｍｏｌ）、及び、メチル  トランス−４−アミノシクロヘキサン−１−カルボキシラート（６２ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、６５℃で、１８時間加熱した。この混合物を酢酸エチルで希釈し、そして、水で洗浄した。これらの有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（１１０ｍｇ、定量的）を、褐色の泡沫として得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ５２６  ［Ｍ ＋ Ｈ］＋．
【０２６５】
工程８．  メチル  トランス−４−（４−（２−（（３−（３−ブロモプロピル）フェニル）（エチル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキシラート（ＪＲＷ−０５４８）
2020504754.tif 000102
【０２６６】
メチル  トランス−４−（４−（２−（エチル（３−（３−ヒドロキシプロピル）フェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキシラート（６０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）を含むＤＣＭ（５ｍＬ）の溶液に対して、臭化テトラエチルアンモニウム（３６ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）、及び、２−メチルピリジン（３２ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）、及び、ジエチルアミノ）テトラホウフッ化ジフルオロスルホニウム（３９ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を室温で、２時間撹拌した。この混合物をジクロロメタンで希釈し、やや塩基性の水、やや酸性の水、水、及び、飽和食塩水で洗浄した。これらの有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（２０ｍｇ、３０％）を、白色の固形物として得た。1Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ6）  δ  ７．９９  −  ７．８９  （ｍ，  １Ｈ），  ７．５２  −  ７．２３  （ｍ，  ５Ｈ），  ７．１６  −  ７．０５  （ｍ，  ２Ｈ），  ４．９７  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．７７  −  ３．４８  （ｍ，  ７Ｈ），  ２．８８  −  ２．７５  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．３５  −  ２．１０  （ｍ，  ３Ｈ），  ２．０４  −  １．７８  （ｍ，  ４Ｈ），  １．５５  −  １．１８  （ｓ，  ６Ｈ），  １．１２  −  ０．９５  （ｍ，  ３Ｈ）；  ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ５８８  ［Ｍ  ＋  Ｈ］＋；  ＨＰＬＣ  ９１．７  ％  （ＡＵＣ），  ＴR  ７．６５  分；  ＵＶ  （ＭｅＯＨ）  λ  ２８６  ｎｍ，  ε  １７５６４．
【実施例１９】
【０２６７】
２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  ８−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）オクタノアート（ＪＲＷ−０５５２）
2020504754.tif 000103
【０２６８】
８−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）オクタン酸（８０ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（２ｍＬ）の溶液に対して、ＴＳＴＵ（５９ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）、及び、ジイソプロピルエチルアミン（５１ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、室温で、２時間撹拌した。この混合物をＤＣＭで希釈し、そして、ＨＣｌ（１Ｍ）で洗浄した。これらの有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（６３ｍｇ、６８％）を、白色の泡沫として得た。1Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ6）  δ  ７．９３  −  ７．８４  （ｍ，  １Ｈ），  ７．７２  −  ７．６４  （ｍ，  １Ｈ），  ７．４４  −  ７．３４  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．３３  −  ７．１７  （ｍ，  ３Ｈ），  ７．１２  −  ７．０５  （ｍ，  ２Ｈ），  ４．９６  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．７２  −  ３．５０  （ｍ，  ３Ｈ），  ３．０５  −  ２．９４  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．７９  （ｓ，  ４Ｈ），  ２．６４  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．２，  ２Ｈ），  ２．３６  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．１０  −  １．９７  （ｍ，  １Ｈ），  １．８７  −  １．６７  （ｓ，  ４Ｈ），  １．６５  −  １．５４  （ｍ，  ２Ｈ），  １．５１  −  １．１７  （ｍ，  １２Ｈ），  １．０５  −  ０．９３  （ｍ，  ３Ｈ）；  ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ７０６  ［Ｍ  ＋  Ｈ］＋；  ＨＰＬＣ  ９７．６  ％  （ＡＵＣ），  ＴR  ６．５７  分；  ＵＶ  （ＭｅＯＨ）  λ  ２８８  ｎｍ，  ε  １９６１９．
【実施例２０】
【０２６９】
メチル  ８−（トランス−４−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）オクタノアート（ＪＲＷ−０５９７）
2020504754.tif 000104
【０２７０】
トランス−４−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸（１００ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（３ｍＬ）の溶液に対して、ＨＯＢＴ（６４ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（８０ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（８１ｍｇ、０．６３）、及び、８−アミノオクタン酸メチル−ＨＣｌ（６６ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、６０℃で、１時間加熱した。この混合物を酢酸エチルで希釈し、そして、水で洗浄した。これらの有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（９０ｍｇ、６８％）を、白色の泡沫として得た。1Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ6）  δ  ８．２０  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２，  １Ｈ），  ７．７０  −  ７．６２  （ｍ，  １Ｈ），  ７．５８  （ｄ，  Ｊ  ＝  ７．８，  １Ｈ），  ７．５０  −  ７．１５  （ｍ，  ６Ｈ），  ７．１２  −  ６．９９  （ｍ，  ２Ｈ），  ５．０１  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．７５  −  ３．５０  （ｍ，  ５Ｈ），  ３．００  （ｑ，  Ｊ  ＝  ６．１，  ２Ｈ），  ２．７５  −  ２．６１  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．２７  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．４，  ２Ｈ），  ２．１５  −  １．９５  （ｍ，  １Ｈ），  １．９１  −  １．６８  （ｓ，  ４Ｈ），  １．５７  −  １．１５  （ｍ，  １７Ｈ），  １．０８  −  ０．９６  （ｍ，  ３Ｈ）；  ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ６３１  ［Ｍ  ＋  Ｈ］＋；  ＨＰＬＣ  ９９．４  ％  （ＡＵＣ），  ＴR  ６．３２  分；  ＵＶ  （ＭｅＯＨ）  λ  ２９１  ｎｍ，  ε  １７８５８．
【実施例２１】
【０２７１】
メチル  ６−（トランス−４−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキサノアート（ＪＲＷ−０５９８）
2020504754.tif 000105
【０２７２】
トランス−４−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸（１００ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（３ｍＬ）の溶液に対して、ＨＯＢＴ（６４ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（８０ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）、ジイソプロピエチルアミン（８１ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ）、及び、メチル  ８−アミンヘキサノアート−ＨＣｌ（５７ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、６０℃で、２時間加熱した。この混合物を酢酸エチルで希釈し、そして、水で洗浄した。これらの有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（１２５ｍｇ、定量的）を、白色の固形物として得た。1Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ6）  δ  ８．２０  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．１，  １Ｈ），  ７．７１  −  ７．６３  （ｍ，  １Ｈ），  ７．５８  （ｄ，  Ｊ  ＝  ７．８，  １Ｈ），  ７．５０  −  ７．１４  （ｍ，  ６Ｈ），  ７．１１  −  ７．０２  （ｍ，  ２Ｈ），  ５．０１  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．７５  −  ３．５３  （ｍ，  ５Ｈ），  ３．００  （ｑ，  Ｊ  ＝  ６．０，  ２Ｈ），  ２．７４  −  ２．６１  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．２７  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．４，  ２Ｈ），  ２．１２  −  １．９８  （ｍ，  １Ｈ），  １．９１  −  １．６８  （ｍ，  ４Ｈ），  １．５６  −  １．１９  （ｍ，  １５Ｈ），  １．０８  −  ０．９５  （ｍ，  ３Ｈ）；  ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ６０３  ［Ｍ  ＋  Ｈ］＋；  ＨＰＬＣ  ＞９９  ％  （ＡＵＣ），  ＴR  ５．９１  分；  ＵＶ  （ＭｅＯＨ）  λ  ２９１  ｎｍ，  ε  １６８１６．
【実施例２２】
【０２７３】
２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  ８−（トランス−４−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）オクタノアート（ＪＲＷ−０６００）
2020504754.tif 000106
【０２７４】
８−（トランス−４−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）オクタン酸（４０ｍｇ、０．０６４ｍｍｏｌ）を含むＤＣＭ（５ｍＬ）の溶液に対して、ＴＳＴＵ（２９ｍｇ、０．０９７ｍｍｏｌ）、及び、ジイソプロピルエチルアミン（２５ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、室温で、１時間撹拌した。この混合物をＤＣＭで希釈し、そして、ＨＣｌ（１Ｍ）で洗浄した。これらの有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（４２ｍｇ、９１％）を、白色の固形物として得た。1Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ6）  δ  ８．２８  −  ８．１１  （ｍ，  １Ｈ），  ７．７０  −  ７．６２  （ｍ，  １Ｈ），  ７．６１  −  ７．５５  （ｄ，  Ｊ  ＝  ７．７，  １Ｈ），  ７．５０  −  ７．１５  （ｍ，  ６Ｈ），  ７．１２  −  ７．０２  （ｍ，  ２Ｈ），  ５．０１  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．８９  −  ３．４３  （ｍ，  ３Ｈ），  ３．０５  −  ２．９５  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．７９  （ｓ，  ４Ｈ），  ２．７４  −  ２．５５  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．１２  −  １．９６  （ｍ，  １Ｈ），  １．９２  −  １．６８  （ｍ，  ４Ｈ），  １．６０  （ｓ，  ２Ｈ），  １．５３  −  １．１８  （ｍ，  １５Ｈ），  １．０７  −  ０．９５  （ｍ，  ３Ｈ）；  ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ７１４  ［Ｍ  ＋  Ｈ］＋；  ＨＰＬＣ  ９７．２  ％  （ＡＵＣ），  ＴR  ５．９９  分；  ＵＶ  （ＭｅＯＨ）  λ  ２９１  ｎｍ，  ε  １６８１０．
【実施例２３】
【０２７５】
２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  ６−（トランス−４−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキサノアート（ＪＲＷ−０６０４）
2020504754.tif 000107
【０２７６】
６−（トランス−４−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキサン酸（４５ｍｇ、０．０７６ｍｍｏｌ）を含むＤＣＭ（１０ｍＬ）の溶液に対して、ＴＳＴＵ（３４ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）、及び、ジイソプロピルエチルアミン（２９ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、室温で、４時間撹拌した。この混合物をＤＣＭで希釈し、そして、ＨＣｌ（１Ｍ）で洗浄した。これらの有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（５０ｍｇ、９６％）を、白色の固形物として得た。1Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ6）  δ  ８．２６  −  ８．１３  （ｍ，  １Ｈ），  ７．７２  −  ７．６４  （ｍ，  １Ｈ），  ７．５８  （ｄ，  Ｊ  ＝  ７．９，  １Ｈ），  ７．５０  −  ７．１５  （ｍ，  ６Ｈ），  ７．１２  −  ７．０１  （ｍ，  ２Ｈ），  ５．０２  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．７８  −  ３．４６  （ｍ，  ３Ｈ），  ３．０５  −  ２．９５  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．７９  （ｓ，  ４Ｈ），  ２．７５  −  ２．６０  （ｍ，  ４Ｈ），  ２．１２  −  １．９８  （ｍ，  １Ｈ），  １．９０  −  １．７０  （ｍ，  ４Ｈ），  １．６７  −  １．５５  （ｍ，  ２Ｈ），  １．５４２  −  １．１８  （ｍ，  １３Ｈ），  １．０７  −  ０．９４  （ｍ，  ３Ｈ）；  ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ６８６  ［Ｍ  ＋  Ｈ］＋；  ＨＰＬＣ  ９９．２  ％  （ＡＵＣ），  ＴR  ５．６９  分；  ＵＶ  （ＭｅＯＨ）  λ  ２９１  ｎｍ，  ε  １５５９３．
【実施例２４】
【０２７７】
フェニル  ８−（トランス−４−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）オクタノアート（ＪＲＷ−０６０５）
2020504754.tif 000108
【０２７８】
８−（トランス−４−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）オクタン酸（４５ｍｇ、０．０７３ｍｍｏｌ）を含むＤＣＭ（１０ｍＬ）の溶液に対して、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（２２ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（２ｍｇ、触媒量）、そして、フェノール（１４ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、室温で、１８時間撹拌した。この混合物をＤＣＭで希釈し、そして、ＨＣｌ（１Ｍ）で洗浄した。これらの有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（３８ｍｇ、７６％）を、白色の固形物として得た。1Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ6）  δ  ７．７５  −  ７．６４  （ｍ，  １Ｈ），  ７．６０  −  ７．５１  （ｍ，  １Ｈ），  ７．４６  −  ７．１４  （ｍ，  １０Ｈ），  ７．０７  −  ７．００  （ｍ，  ４Ｈ），  ４．９７  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．８１  −  ３．４６  （ｍ，  ３Ｈ），  ３．０７  −  ２．９５  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．７５  −  ２．５８  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．５７  −  ２．５０  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．１８  −  １．９６  （ｍ，  １Ｈ），  １．９３  −  １．６８  （ｍ，  ４Ｈ），  １．６８  −  １．５４  （ｍ，  ２Ｈ），  １．５５  −  １．１８  （ｍ，  １５Ｈ），  １．０９  −  ０．９４  （ｍ，  ３Ｈ）；  ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ６９３  ［Ｍ  ＋  Ｈ］＋；  ＨＰＬＣ  ＞９９  ％  （ＡＵＣ），  ＴR  ６．６９  分；  ＵＶ  （ＭｅＯＨ）  λ  ２９１  ｎｍ，  ε  ２０９４３．
【実施例２５】
【０２７９】
フェニル  ６−（トランス−４−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキサノアート（ＪＲＷ−０６０６）
2020504754.tif 000109
【０２８０】
６−（トランス−４−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキサン酸（６４ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）を含むＤＣＭ（５ｍＬ）の溶液に対して、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（３３ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（２ｍｇ、触媒量）、及び、フェノール（２０ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、室温で、１８時間撹拌した。この混合物をＤＣＭで希釈し、そして、ＨＣｌ（１Ｍ）で洗浄した。これらの有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（６３ｍｇ、８７％）を、白色の固形物として得た。1Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ6）  δ  ８．２５  −  ８．１３  （ｍ，  １Ｈ），  ７．７９  −  ７．６７  （ｍ，  １Ｈ），  ７．６０  −  ７．５４  （ｍ，  １Ｈ），  ７．４７  −  ７．１４  （ｍ，  １０Ｈ），  ７．１１  −  ７．００  （ｍ，  ４Ｈ），  ４．９９  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．７９  −  ３．５１  （ｍ，  ３Ｈ），  ３．０８  −  ２．９８  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．７３  −  ２．６０  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．５８  −  ２．５０  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．１２  −  １．９８  （ｍ，  １Ｈ），  １．８８  −  １．６９  （ｍ，  ４Ｈ），  １．６８  −  １．５５  （ｍ，  ２Ｈ），  １．５２  −  １．１５  （ｍ，  １３Ｈ），  １．０８  −  ０．９３  （ｍ，  ３Ｈ）；  ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ６６５  ［Ｍ  ＋  Ｈ］＋；  ＨＰＬＣ  ＞９９  ％  （ＡＵＣ），  ＴR  ６．３９  分；  ＵＶ  （ＭｅＯＨ）  λ  ２９１  ｎｍ，  ε  １７０１８．
【実施例２６】
【０２８１】
１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（（６−ヨードヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド（ＪＲＷ−０６２２）
2020504754.tif 000110
【０２８２】
イミダゾール（３５ｍｇ、０．５２ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（１３７ｍｇ、０．５２ｍｍｏｌ）、及び、ヨウ素（１３２ｍｇ、０．５２ｍｍｏｌ）を含むＴＨＦ（１０ｍＬ）の溶液を、室温で１０分間撹拌した。ＴＨＦ（５ｍＬ）に溶解した１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（（６−ヒドロキシヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド（１００ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、室温で、１時間撹拌した。反応物を酢酸エチルで希釈し、そして、１０％Ｎａ2Ｓ2Ｏ3溶液で急冷した。この混合物を酢酸エチル及び水で希釈し、そして、層を分離した。この有機層を、１０％Ｎａ2Ｓ2Ｏ3溶液、及び、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、そして、濃縮した。この残渣を、カラムクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（７７ｍｇ、６４％）を、白色の固形物として得た。1Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ6）  δ  ８．２６  −  ８．１８  （ｍ，  １Ｈ），  ７．７５  −  ７．６５  （ｍ，  １Ｈ），  ７．５８  （ｄ，  Ｊ  ＝  ７．７，  １Ｈ），  ７．５０  −  ７．１５  （ｍ，  ６Ｈ），  ７．１２  −  ７．０３  （ｍ，  ２Ｈ），  ５．０１  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．７５  −  ３．５２  （ｍ，  ３Ｈ），  ３．２５  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．９，  ２Ｈ），  ３．０５  −  ２．９４  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．７５  −  ２．６０  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．１４  −  １．９４  （ｍ，  １Ｈ），  １．９０  −  １．６８  （ｍ，  ６Ｈ），  １．５１  −  １．１６  （ｍ，  １３Ｈ），  １．０８  −  ０．９２  （ｍ，  ３Ｈ）；  ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ６８５  ［Ｍ  ＋  Ｈ］＋；  ＨＰＬＣ  ９７．５  ％  （ＡＵＣ），  ＴR  ６．８４  分；  ＵＶ  （ＭｅＯＨ）  λ  ２９０  ｎｍ，  ε  １６９９０．
【実施例２７】
【０２８３】
Ｎ−（トランス−４−（（６−ブロモヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド（ＪＲＷ−０６２６）
2020504754.tif 000111
【０２８４】
四臭化炭素（２０７ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ）、及び、トリフェニルホスフィン（１６４ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ）を含むＤＣＭ（２ｍＬ）の溶液を、室温で、５分間撹拌した。１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（（６−ヒドロキシヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド（１２０ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）を含むＤＣＭ（２ｍＬ）を加えた。この溶液を、室温で、５時間撹拌した。この混合物を酢酸エチル、及び、水で希釈し、そして、層を分離した。これらの有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（６２ｍｇ、４６％）を、白色の泡沫として得た。1Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ6）  δ  ８．２６  −  ８．１８  （ｍ，  １Ｈ），  ７．８４  −  ７．７６  （ｍ，  １Ｈ），  ７．５６  （ｄ，  Ｊ  ＝  ７．９，  １Ｈ），  ７．４８  −  ７．３５  （ｍ，  １Ｈ），  ７．３５  −  ７．１５  （ｍ，  ５Ｈ），  ７．０９  −  ７．００  （ｍ，  ２Ｈ），  ４．９１  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．７２  −  ３．４８  （ｍ，  ３Ｈ），  ３．４４  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．６，  ２Ｈ），  ３．０４  −  ２．９２  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．７０  −  ２．５６  （ｓ，  ２Ｈ），  ２．１８  −  １．９３  （ｍ，  １Ｈ），  １．８８  −  １．６５  （ｍ，  ６Ｈ），  １．５５  −  １．０５  （ｍ，  １３Ｈ），  １．０３  −  ０．９０  （ｍ，  ３Ｈ）；  ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ６３７  ［Ｍ  ＋  Ｈ］＋；  ＨＰＬＣ  ＞９９  ％  （ＡＵＣ），  ＴR  ６．６７  分；  ＵＶ  （ＭｅＯＨ）  λ  ２９１  ｎｍ，  ε  １６８６６．
【実施例２８】
【０２８５】
１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（（８−ヨードオクチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド（ＪＲＷ−０６６０）
2020504754.tif 000112
【０２８６】
イミダゾール（３８ｍｇ、０．５６ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（１４７ｍｇ、０．５６ｍｍｏｌ）、及び、ヨウ素（１４２ｍｇ、０．５６ｍｍｏｌ）を含むＴＨＦ（１０ｍＬ）の溶液を、室温で、１０分間撹拌した。ＴＨＦ（５ｍＬ）に溶解した１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（（８−ヒドロキシオクチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド（１１３ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、室温で、３０分間撹拌した。反応を、酢酸エチルで希釈し、１０％Ｎａ2Ｓ2Ｏ3溶液で急冷した。この混合物を酢酸エチル、及び、水で希釈し、そして、層を分離した。この有機層を、１０％Ｎａ2Ｓ2Ｏ3溶液、及び、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、そして、濃縮した。この残渣をカラムクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（１０１ｍｇ、７５％）を、白色の固形物として得た。1Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ6）  δ  ８．３３  −  ８．１２  （ｍ，  １Ｈ），  ７．７６  −  ７．５６  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．５６  −  ７．０１  （ｍ，  ８Ｈ），  ５．０４  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．８４  −  ３．４８  （ｍ，  ３Ｈ），  ３．１１  −  ２．９３  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．８４  −  ２．６２  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．１８  −  １．９８  （ｍ，  １Ｈ），  １．９５  −  １．６８  （ｓ，  ６Ｈ），  １．５８−１．１５  （ｍ，  １７Ｈ），  １．１４  −  ０．９１  （ｍ，  ３Ｈ）；  ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ７１３  ［Ｍ  ＋  Ｈ］＋；  ＨＰＬＣ  ＞９９  ％  （ＡＵＣ），  ＴR  ７．００  分；  ＵＶ  （ＭｅＯＨ）  λ  ２９１  ｎｍ，  ε  １８９５８．
【実施例２９】
【０２８７】
４−フルオロフェニル  ８−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）オクタノアート（ＪＲＷ−０８３１）
2020504754.tif 000113
【０２８８】
８−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）オクタン酸（５０ｍｇ、０．０８２ｍｍｏｌ）を含むＤＣＭ（５ｍＬ）の溶液に対して、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（２５ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（２ｍｇ、触媒量）、及び、４−フルオロフェノール（１８ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、室温で、１８時間撹拌した。この混合物をＤＣＭで希釈し、そして、ＨＣｌ（１Ｍ）で洗浄した。これらの有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（６８ｍｇ、粗製）を、白色の固形物として得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ７０３  ［Ｍ ＋ Ｈ］＋．
【実施例３０】
【０２８９】
３，５−ジフルオロフェニル  ８−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）オクタノアート（ＪＲＷ−０８３３）
2020504754.tif 000114
【０２９０】
８−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）オクタン酸（５０ｍｇ、０．０８２ｍｍｏｌ）を含むＤＣＭ（５ｍＬ）の溶液に対して、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（２５ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（２ｍｇ、触媒量）、及び、３，５−ジフルオロフェノール（２１ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、室温で、５時間撹拌した。この混合物をＤＣＭで希釈し、そして、ＨＣｌ（１Ｍ）で洗浄した。これらの有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（４４ｍｇ、７４％）を、白色の固形物として得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ７２１  ［Ｍ ＋ Ｈ］＋．
【実施例３１】
【０２９１】
４−シアノフェニル  ８−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）オクタノアート（ＪＲＷ−０８３４）
2020504754.tif 000115
【０２９２】
８−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）オクタン酸（６６ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）を含むＤＣＭ（５ｍＬ）の溶液に対して、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（３４ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（２ｍｇ、触媒量）、及び、４−ヒドロキシベンゾニトリル（２５ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、室温で、３時間撹拌した。この混合物をＤＣＭで希釈し、そして、ＨＣｌ（１Ｍ）で洗浄した。これらの有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（７０ｍｇ、９０％）を、白色の固形物として得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ７１０  ［Ｍ ＋ Ｈ］＋．
【実施例３２】
【０２９３】
ナトリウム  １−（（８−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）オクタノイル）オキシ）−２，５−ジオキソピロリジン−３−スルホノアート（ＪＲＷ−０８３０）
2020504754.tif 000116
【０２９４】
８−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）オクタン酸（５０ｍｇ、０．０８２ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（１ｍＬ）の溶液に対して、ＨＡＴＵ（４６ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）、ナトリウム  １−ヒドロキシ−２，５−ジオキソピロリジン−３−スルホノアート（２１ｍｇ、０．０９９）、及び、ジイソプロピルエチルアミン（３２ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、８５℃で、２時間撹拌した。この混合物をジクロロメタンで希釈し、セライト上に注ぎ、濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（３０ｍｇ、４５％）を、淡褐色の固形物として得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ７８６  ［Ｍ−Ｎａ＋Ｈ］＋．
【実施例３３】
【０２９５】
Ｎ−（トランス−４−（（５−（２−クロロアセトアミド）ペンチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（ＪＲＷ−０８４４）
2020504754.tif 000117
【０２９６】
Ｎ−（トランス−４−（（５−アミノペンチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（７０ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）を含み、氷浴で冷却した酢酸エチル／水（１０／２ｍＬ）の溶液に対して、塩化２−クロロアセチル（２１ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）、及び、水酸化カリウム（２１ｍｇ、０．３８ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、室温で、１時間撹拌した。この混合物を酢酸エチル、及び、水で希釈した。これらの有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（２２ｍｇ、２７％）を、白色の固形物として得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ６２８  ［Ｍ ＋ Ｈ］＋．
【実施例３４】
【０２９７】
Ｎ−（トランス−４−（（６−（２−クロロアセトアミド）ヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（ＪＲＷ−０８４６）
2020504754.tif 000118
【０２９８】
Ｎ−（トランス−４−（（６−アミノヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（６０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）を含み、氷浴で冷却した酢酸エチル／水（１０／２ｍＬ）の溶液に対して、塩化２−クロロアセチル（１８ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）、及び、水酸化カリウム（１８ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、室温で、１時間撹拌した。この混合物を酢酸エチル、及び、水で希釈した。これらの有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（１８ｍｇ、２６％）を、白色の固形物として得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ６４２  ［Ｍ ＋ Ｈ］＋．
【実施例３５】
【０２９９】
２，３，５，６−テトラフルオロフェニル  ８−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）オクタノアート（ＪＲＷ−０８４７）
2020504754.tif 000119
【０３００】
８−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）オクタン酸（５４ｍｇ、０．０８９ｍｍｏｌ）を含むＤＣＭ（５ｍＬ）の溶液に対して、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（２７ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（２ｍｇ、触媒量）、及び、２，３，５，６−テトラフルオロフェノール（２９ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、室温で、１．５時間撹拌した。この混合物をＤＣＭで希釈し、そして、ＨＣｌ（１Ｍ）で洗浄した。これらの有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（５２ｍｇ、７７％）を、白色の固形物として得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ７５７  ［Ｍ ＋ Ｈ］＋．
【実施例３６】
【０３０１】
Ｎ−（トランス−４−（（５−（２−ブロモアセトアミド）ペンチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（ＪＲＷ−０８７０）
2020504754.tif 000120
【０３０２】
Ｎ−（トランス−４−（（５−アミノペンチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（２２０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）を含み、氷浴で冷却した酢酸エチル／水（１０／２ｍＬ）の溶液に対して、２−ブロモアセチルブロミド（１２０ｍｇ、０．６０ｍｍｏｌ）、及び、水酸化カリウム（６７ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、室温で、６時間撹拌した。この混合物を酢酸エチル、及び、水で希釈した。これらの有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（２０ｍｇ、７％）を、白色の固形物として得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ６７２  ［Ｍ ＋ Ｈ］＋．
【実施例３７】
【０３０３】
Ｎ−（トランス−４−（（１−（４−（６−（（５−（（２−クロロ−６−メチルフェニル）カルバモイル）チアゾール−２−イル）アミノ）−２−メチルピリミジン−４−イル）ピペラジン−１−イル）−７，１７−ジオキソ−３，１０，１３−トリオキサ−６，１６−ジアザドコサン−２２−イル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（ＪＲＷ−０５７７）
2020504754.tif 000121
【０３０４】
２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  １−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，８−ジオキソ−１２，１５−ジオキサ−２，９−ジアザオクタデカン−１８−オアート（５ｍｇ、０．００６０ｍｍｏｌ）を含むＤＣＭ（３ｍＬ）の溶液に対して、２−（（６−（４−（２−（２−アミノエトキシ）エチル）ピペラジン−１−イル）−２−メチルピリミジン−４−イル）アミノ）−Ｎ−（２−クロロ−６−メチルフェニル）チアゾール−５−カルボキサミド（３ｍｇ、０．００６０ｍｍｏｌ）、及び、ジイソプロピルエチルアミン（１滴）を加えた。この溶液を、室温で、３時間撹拌した。この混合物をシリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（５ｍｇ、７０％）を、褐色の固形物として得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  １２５２  ［Ｍ  −Ｎａ  ＋  Ｈ］＋；  ＨＰＬＣ  ９１．０  ％  （ＡＵＣ），  ＴR  ４．３１  分；  ＵＶ  （ＭｅＯＨ）  λ  ３０２  ｎｍ，  ε  ２４１６４．
【実施例３８】
【０３０５】
Ｎ−（２−クロロ−６−メチルフェニル）−２−（（６−（４−（１−（トランス−４−（１−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，８，１８−トリオキソ−１２，１５，２２−トリオキサ−２，９，１９−トリアザテトラコサン−２４−イル）ピペラジン−１−イル）−２−メチルピリミジン−４−イル）アミノ）チアゾール−５−カルボキサミド（ＪＲＷ−０５８８）
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【０３０６】
工程１．  トランス−４−（１−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸（ＪＲＷ−０５７９）
2020504754.tif 000123
【０３０７】
メチル  トランス−４−（１−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキシラート（５００ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）を含むジオキサン（２０ｍＬ）及び水（５ｍＬ）の懸濁液に対して、水酸化リチウム（１４０ｍｇ、５．９ｍｍｏｌ）を加えた。この懸濁液を、６０℃で、１８時間撹拌した。この混合物をＨＣｌ（２Ｍ）で酸性化し、酢酸エチルで希釈し、そして、水で洗浄した。これらの有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮して、所望の生成物（５００ｍｇ、粗製）を、白色の泡沫として得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ４１２  ［Ｍ ＋ Ｈ］＋．
【０３０８】
工程２．  メチル  ６−（トランス−４−（１−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキサノアート（ＪＲＷ−０５８０）
2020504754.tif 000124
【０３０９】
トランス−４−（１−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸（２６０ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（１０ｍＬ）の溶液に対して、ＨＯＢＴ（１９３ｍｇ、１．３ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（２４２ｍｇ、１．３ｍｍｏｌ）、ジイソプロピエチルアミン（２４５ｍｇ、１．９ｍｍｏｌ）、及び、メチル  ６−アミノヘキサノアート塩酸塩（１７２ｍｇ、０．９５ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、６５℃で、１時間加熱した。この混合物を酢酸エチルで希釈し、そして、水で洗浄した。これらの有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（２８２ｍｇ、８３％）を、淡褐色の油脂として得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ５３９  ［Ｍ ＋ Ｈ］＋．
【０３１０】
工程３．  ６−（トランス−４−（１−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキサン酸（ＪＲＷ−０５８２）
2020504754.tif 000125
【０３１１】
メチル  ６−（トランス−４−（１−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキサノアート（２８０ｍｇ、０．５２ｍｍｏｌ）を含む、ジオキサン（１０ｍＬ）、及び、水（２ｍＬ）の懸濁液に対して、水酸化リチウム（６２ｍｇ、２．６ｍｍｏｌ）を加えた。この懸濁液を、６０℃で、２時間撹拌した。この混合物をＨＣｌ（２Ｍ）で酸性化し、酢酸エチルで希釈し、そして、水で洗浄した。これらの有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮して、所望の生成物（２０５ｍｇ、粗製）を、白色の泡沫として得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ５２５  ［Ｍ ＋ Ｈ］＋．
【０３１２】
工程４．  ｔｅｒｔ−ブチル  １−（トランス−４−（１−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，８−ジオキソ−１２，１５−ジオキサ−２，９−ジアザオクタデカン−１８−オアート（ＪＲＷ−０５８３）
2020504754.tif 000126
【０３１３】
６−（トランス−４−（１−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキサン酸（５０ｍｇ、０．０９５ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（３ｍＬ）の溶液に対して、ＨＯＢＴ（２９ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（２６ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）、ジイソプロピエチルアミン（３７ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）、及び、ｔｅｒｔ−ブチル  ３−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）プロパノアート（３３ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、６０℃で、１８時間加熱した。この混合物を酢酸エチルで希釈し、そして、水で洗浄した。これらの有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（８４ｍｇ、粗製）を、白色の固形物として得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ７４０  ［Ｍ ＋ Ｈ］＋．
【０３１４】
工程５．  １−（トランス−４−（１−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，８−ジオキソ−１２，１５−ジオキサ−２，９−ジアザオクタデカン−１８−オイック酸（ＪＲＷ−０５８６）
2020504754.tif 000127
【０３１５】
ｔｅｒｔ−ブチル  １−（トランス−４−（１−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，８−ジオキソ−１２，１５−ジオキサ−２，９−ジアザオクタデカン−１８−オアート（８０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）を含むＤＣＭ（５ｍＬ）の溶液に対して、ＴＦＡ（１ｍＬ）を加えた。この溶液を、室温で、３時間撹拌した。この混合物をトルエンで希釈し、濃縮し、トルエンに再懸濁し、そして、濃縮した。これを２回繰り返した。粗生成物（７５ｍｇ）を、次工程で使用した。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ６８４  ［Ｍ ＋ Ｈ］＋．
【０３１６】
工程６．  Ｎ−（２−クロロ−６−メチルフェニル）−２−（（６−（４−（１−（トランス−４−（１−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，８，１８−トリオキソ−１２，１５，２２−トリオキサ−２，９，１９−トリアザテトラコサン−２４−イル）ピペラジン−１−イル）−２−メチルピリミジン−４−イル）アミノ）チアゾール−５−カルボキサミド（ＪＲＷ−０５８８）
2020504754.tif 000128
【０３１７】
１−（トランス−４−（１−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，８−ジオキソ−１２，１５−ジオキサ−２，９−ジアザオクタデカン−１８−オイック酸（１０ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（２ｍＬ）の溶液に対して、ＨＯＢＴ（４ｍｇ、０．０２９ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（５ｍｇ、０．０２９ｍｍｏｌ）、ジイソプロピエチルアミン（５ｍｇ、０．０４４ｍｍｏｌ）、及び、２−（（６−（４−（２−（２−アミノエトキシ）エチル）ピペラジン−１−イル）−２−メチルピリミジン−４−イル）アミノ）−Ｎ−（２−クロロ−６−メチルフェニル）チアゾール−５−カルボキサミド（１１ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、６０℃で、３時間加熱した。この混合物を酢酸エチルで希釈し、そして、水で洗浄した。これらの有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（１１ｍｇ、６４％）を、淡赤色の固形物として得た。1Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ6）  δ  １１．４４  （ｓ，  １Ｈ），  ９．８４  （ｓ，  １Ｈ），  ８．１９  （ｓ，  １Ｈ），  ７．９２  −  ７．８３  （ｍ，  １Ｈ），  ７．８３  −  ７．７４  （ｍ，  １Ｈ），  ７．６９  −  ７．５６  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．４２  −  ７．３３  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．３０  −  ７．１５  （ｍ，  ５Ｈ），  ６．８０  −  ６．７２  （ｍ，  ２Ｈ），  ６．０３  （ｓ，  １Ｈ），  ５．９６  −  ５．９１  （ｍ，  １Ｈ），  ４．７４  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．６５  −  ３．４３  （ｍ，  １６Ｈ），  ３．３７  （ｑ，  Ｊ  ＝  ５．６，  ４Ｈ），  ３．２４  −  ３．１０  （ｍ，  ４Ｈ），  ３．０４  −  ２．９２  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．３８  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．３４  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．３２  −  ２．２５  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．２２  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．０７  −  １．９９  （ｍ，  ３Ｈ），  １．８４  −  １．６６  （ｍ，  ４Ｈ），  １．５３  −  １．１５  （ｍ，  １０Ｈ），  １．０５  −  ０．９３  （ｍ，  ３Ｈ）；  ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  １１９６  ［Ｍ  ＋  Ｈ］＋；  ＨＰＬＣ  ９７．６  ％  （ＡＵＣ），  ＴR  ４．７３  分；  ＵＶ  （ＭｅＯＨ）  λ  ３２２  ｎｍ，  ε  ２８２８７．
【実施例３９】
【０３１８】
Ｎ−（トランス−４−（（１−（４−（６−（（５−（（２−クロロ−６−メチルフェニル）カルバモイル）チアゾール−２−イル）アミノ）−２−メチルピリミジン−４−イル）ピペラジン−１−イル）−７，１７−ジオキソ−３，１０，１３−トリオキサ−６，１６−ジアザドコサン−２２−イル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（ＪＲＷ−０５８９）
2020504754.tif 000129
【０３１９】
工程１．ｔｅｒｔ−ブチル  １−（トランス−４−（４−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド））シクロヘキシル）−１，８−ジオキソ−１２，１５−ジオキサ−２，９−ジアザオクタデカン−１８−オアート（ＪＲＷ−０５８５）
2020504754.tif 000130
【０３２０】
６−（トランス−４−（４−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン）−１−カルボキサミド）ヘキサン酸（５０ｍｇ、０．０８４ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（３ｍＬ）の溶液に対して、ＨＯＢＴ（２５ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（３２ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）、ジイソプロピエチルアミン（３２ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）、及び、ｔｅｒｔ−ブチル  ３−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）プロパノアート（２９ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、６０℃で、２時間加熱した。この混合物を酢酸エチルで希釈し、そして、水で洗浄した。これらの有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（４５ｍｇ、６６％）を、白色の泡沫として得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ８１０  ［Ｍ ＋ Ｈ］＋．
【０３２１】
工程２．  １−（トランス−４−（４−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，８−ジオキソ−１２，１５−ジオキサ−２，９−ジアザオクタデカン−１８−オイック酸（ＪＲＷ−０５８７）
2020504754.tif 000131
【０３２２】
ｔｅｒｔ−ブチル  １−（トランス−４−（４−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，８−ジオキソ−１２，１５−ジオキサ−２，９−ジアザオクタデカン−１８−オアート（４５ｍｇ、０．０５５ｍｍｏｌ）を含むＤＣＭ（５ｍＬ）の溶液に対して、ＴＦＡ（１ｍＬ）を加えた。この溶液を、室温で、１８時間撹拌した。この混合物をトルエンで希釈し、濃縮し、トルエンに再懸濁し、そして、濃縮した。これを２回繰り返した。粗生成物（４２ｍｇ）を、次工程で使用した。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ７５４  ［Ｍ ＋ Ｈ］＋．
【０３２３】
工程３．  Ｎ−（トランス−４−（（１−（４−（６−（（５−（（２−クロロ−６−メチルフェニル）カルバモイル）チアゾール−２−イル）アミノ）−２−メチルピリミジン−４−イル）ピペラジン−１−イル）−７，１７−ジオキソ−３，１０，１３−トリオキサ−６，１６−ジアザドコサン−２２−イル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（ＪＲＷ−０５８９）
2020504754.tif 000132
【０３２４】
１−（トランス−４−（４−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，８−ジオキソ−１２，１５−ジオキサ−２，９−ジアザオクタデカン−１８−オイック酸（１０ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（２ｍＬ）の溶液に対して、ＨＯＢＴ（４ｍｇ、０．０２６ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（５ｍｇ、０．０２６ｍｍｏｌ）、ジイソプロピエチルアミン（５ｍｇ、０．０４０ｍｍｏｌ）、及び、２−（（６−（４−（２−（２−アミノエトキシ）エチル）ピペラジン−１−イル）−２−メチルピリミジン−４−イル）アミノ）−Ｎ−（２−クロロ−６−メチルフェニル）チアゾール−５−カルボキサミド（１０ｍｇ、０．０２０ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、６０℃で、６時間加熱した。この混合物を酢酸エチルで希釈し、そして、水で洗浄した。これらの有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（１０ｍｇ、６０％）を、白色の固形物として得た。1Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ6）  δ  １１．４３  （ｓ，  １Ｈ），  ９．８４  （ｓ，  １Ｈ），  ８．２０  （ｓ，  １Ｈ），  ７．９３  −  ７．８３  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．８３  −  ７．７３  （ｍ，  １Ｈ），  ７．７１  −  ７．６１  （ｍ，  １Ｈ），  ７．４５  −  ７．１８  （ｍ，  ８Ｈ），  ７．１２  −  ７．０４  （ｍ，  ２Ｈ），  ６．０３  （ｓ，  １Ｈ），  ４．９５  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．７０  −  ３．４２  （ｍ，  １５Ｈ），  ３．３７  （ｑ，  Ｊ  ＝  ４．７，  ５Ｈ），  ３．２３  −  ３．１０  （ｍ，  ４Ｈ），  ３．０４  −  ２．９２  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．７６  −  ２．５９  （ｍ，  ３Ｈ），  ２．３８  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．３３  −  ２．２６  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．２２  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．１０  −  １．９７  （ｍ，  ３Ｈ），  １．９０  −  １．６６  （ｍ，  ４Ｈ），  １．５３  −  １．１３  （ｍ，  １５Ｈ），  １．０７  −  ０．９４  （ｍ，  ３Ｈ）；  ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  １２６６  ［Ｍ  ＋  Ｈ］＋；  ＨＰＬＣ  ９７．２  ％  （ＡＵＣ），  ＴR  ５．３４  分；  ＵＶ  （ＭｅＯＨ）  λ  ３２２  ｎｍ，  ε  ３７０５３．
【実施例４０】
【０３２５】
Ｎ−（２−クロロ−６−メチルフェニル）−２−（（６−（４−（１−（トランス−４−（１−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，８，２４−トリオキソ−１２，１５，１８，２１，２８−ペンタオキサ−２，９，２５−トリアザトリアコンタン−３０−イル）ピペラジン−１−イル）−２−メチルピリミジン−４−イル）アミノ）チアゾール−５−カルボキサミド（ＪＲＷ−０５９３）
2020504754.tif 000133
【０３２６】
工程１．  ｔｅｒｔ−ブチル  １−（トランス−４−（１−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，８−ジオキソ−１２，１５，１８，２１−テトラオキサ−２，９−ジアザテトラコサン−２４−オアート（ＪＲＷ−０５９０）
2020504754.tif 000134
【０３２７】
６−（トランス−４−（１−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキサン酸（５０ｍｇ、０．０９５ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（３ｍＬ）の溶液に対して、ＨＯＢＴ（２９ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（３６ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）、ジイソプロピエチルアミン（３７ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）、及び、ｔｅｒｔ−ブチル  １−アミノ−３，６，９，１２−テトラオキサペンタデカン−１５−オアート（４６ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、６０℃で、２時間加熱した。この混合物を酢酸エチルで希釈し、そして、水で洗浄した。これらの有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（４５ｍｇ、５６％）を、油脂として得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ８２８  ［Ｍ ＋ Ｈ］＋．
【０３２８】
工程２．  １−（トランス−４−（１−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，８−ジオキソ−１２，１５，１８，２１−テトラオキサ−２，９−ジアザテトラコサン−２４−オイック酸（ＪＲＷ−０５９２）
2020504754.tif 000135
【０３２９】
ｔｅｒｔ−ブチル  １−（トランス−４−（１−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，８−ジオキソ−１２，１５，１８，２１−テトラオキサ−２，９−ジアザテトラコサン−２４−オアート（４５ｍｇ、０．０５４ｍｍｏｌ）を含むＤＣＭ（５ｍＬ）の溶液に対して、ＴＦＡ（１ｍＬ）を加えた。この溶液を、室温で、１８時間撹拌した。この混合物をトルエンで希釈し、濃縮し、トルエンに再懸濁し、そして、濃縮した。これを２回繰り返した。粗生成物（４７ｍｇ）を、次工程で使用した。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ７７２  ［Ｍ ＋ Ｈ］＋．
【０３３０】
工程３．  Ｎ−（２−クロロ−６−メチルフェニル）−２−（（６−（４−（１−（トランス−４−（１−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル））−１Ｈ−ピロール−２−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，８，２４−トリオキソ−１２，１５，１８，２１，２８−ペンタオキサ−２，９，２５−トリアザトリアコンタン−３０−イル）ピペラジン−１−イル）−２−メチルピリミジン−４−イル）アミノ）チアゾール−５−カルボキサミド（ＪＲＷ−０５９３）
2020504754.tif 000136
【０３３１】
１−（トランス−４−（１−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボキサミド（シクロヘキシル）−１，８−ジオキソ−１２，１５，１８，２１−テトラオキサ−２，９−ジアザテトラコサン−２４−オイック酸（１２ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（３ｍＬ）の溶液に対して、ＨＯＢＴ（５ｍｇ、０．０３１ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（６ｍｇ、０．０３１ｍｍｏｌ）、ジイソプロピエチルアミン（６ｍｇ、０．０４６ｍｍｏｌ）、及び、２−（（６−（４−（２−（２−アミノエトキシ）エチル）ピペラジン−１−イル）−２−メチルピリミジン−４−イル）アミノ）−Ｎ−（２−クロロ−６−メチルフェニル）チアゾール−５−カルボキサミド（１２ｍｇ、０．０２３ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、６０℃で、１８時間加熱した。この混合物を酢酸エチルで希釈し、そして、水で洗浄した。これらの有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（１０ｍｇ、５０％）を、白色の固形物として得た。1Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ6）  δ  １１．４４  （ｓ，  １Ｈ），  ９．８４  （ｓ，  １Ｈ），  ８．１９  （ｓ，  １Ｈ），  ７．９１  −  ７．８２  （ｍ，  １Ｈ），  ７．８２  −  ７．７５  （ｍ，  １Ｈ），  ７．６９  −  ７．５７  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．４２  −  ７．３３  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．３０  −  ７．１５  （ｍ，  ５Ｈ），  ６．７９  −  ６．７２  （ｓ，  ２Ｈ），  ６．０３  （ｓ，  １Ｈ），  ５．９６  −  ５．９３  （ｍ，  １Ｈ），  ４．７８  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．６６  −  ３．４３  （ｍ，  ２３Ｈ），  ３．４３  −  ３．３４  （ｍ，  ４Ｈ），  ３．２３  −  ３．１２  （ｍ，  ４Ｈ），  ３．０５  −  ２．９２  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．３８  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．３４  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．３３  −  ２．２３  （ｓ，  ２Ｈ），  ２．２２  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．０７  −  １．９７  （ｍ，  ３Ｈ），  １．８７  −  １．６６  （ｍ，  ４Ｈ），  １．５２  −  １．１０  （ｓ，  １４Ｈ），  １．０５  −  ０．９３  （ｍ，  ３Ｈ）；  ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  １２８４  ［Ｍ  ＋  Ｈ］＋；  ＨＰＬＣ  ９９．１  ％  （ＡＵＣ），  ＴR  ３．９４  分；  ＵＶ  （ＭｅＯＨ）  λ  ３２２  ｎｍ，  ε  ３７１６６．
【実施例４１】
【０３３２】
Ｎ−（トランス−４−（（１−（４−（６−（（５−（（２−クロロ−６−メチルフェニル）カルバモイル）チアゾール−２−イル）アミノ）−２−メチルピリミジン−４−イル）ピペラジン−１−イル）−７，２３−ジオキソ−３，１０，１３，１６，１９−ペンタオキサ−６，２２−ジアザオクタコサン−２８−イル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（ＪＲＷ−０５９５）
2020504754.tif 000137
【０３３３】
工程１．  ｔｅｒｔ−ブチル  １−（トランス−４−（４−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，８−ジオキソ−１２，１５，１８，２１−テトラオキサ−２，９−ジアザテトラコサン−２４−オアート（ＪＲＷ−０５９１）
2020504754.tif 000138
【０３３４】
６−（トランス−４−（４−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキサン酸（５０ｍｇ、０．０８４ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（３ｍＬ）の溶液に対して、ＨＯＢＴ（２５ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（３２ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）、ジイソプロピエチルアミン（３３ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）、及び、ｔｅｒｔ−ブチル  １−アミノ−３，６，９，１２−テトラオキサペンタデカン−１５−オアート（４０ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、６０℃で、１８時間加熱した。この混合物を酢酸エチルで希釈し、そして、水で洗浄した。これらの有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（６２ｍｇ、８２％）を、白色の泡沫として得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ８９８  ［Ｍ ＋ Ｈ］＋．
【０３３５】
工程２．  １−（トランス−４−（４−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，８−ジオキソ−１２，１５，１８，２１−テトラオキサ−２，９−ジアザテトラコサン−２４−オイック酸（ＪＲＷ−０５９４）
2020504754.tif 000139
【０３３６】
ｔｅｒｔ−ブチル  １−（トランス−４−（４−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，８−ジオキソ−１２，１５，１８，２１−テトラオキサ−２，９−ジアザテトラコサン−２４−オアート（６２ｍｇ、０．０６９ｍｍｏｌ）を含むＤＣＭ（５ｍＬ）の溶液に対して、ＴＦＡ（１ｍＬ）を加えた。この溶液を、室温で、２時間撹拌した。この混合物をトルエンで希釈し、濃縮し、トルエンに再懸濁し、そして、濃縮した。これを２回繰り返した。粗生成物（６５ｍｇ）を、次工程に使用した。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ８４２  ［Ｍ ＋ Ｈ］＋．
【０３３７】
工程３．  Ｎ−（トランス−４−（（１−（４−（６−（（５−（（２−クロロ−６−メチルフェニル）カルバモイル）チアゾール−２−イル）アミノ）−２−メチルピリミジン−４−イル）ピペラジン−１−イル）−７，２３−ジオキソ−３，１０，１３，１６，１９−ペンタオキサ−６，２２−ジアザオクタコサン−２８−イル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（ＪＲＷ−０５９５）
2020504754.tif 000140
【０３３８】
１−（トランス−４−（４−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，８−ジオキソ−１２，１５，１８，２１−テトラオキサ−２，９−ジアザテトラコサン−２４−オイック酸（１５ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（３ｍＬ）の溶液に対して、ＨＯＢＴ（５ｍｇ、０．０３５ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（７ｍｇ、０．０３５ｍｍｏｌ）、ジイソプロピエチルアミン（７ｍｇ、０．０５３ｍｍｏｌ）、及び、２−（（６−（４−（２−（２−アミノエトキシ）エチル）ピペラジン−１−イル）−２−メチルピリミジン−４−  イル）アミノ）−Ｎ−（２−クロロ−６−メチルフェニル）チアゾール−５−カルボキサミド（１４ｍｇ、０．０２７ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、６０℃で、１８時間加熱した。この混合物を酢酸エチルで希釈し、そして、水で洗浄した。これらの有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（１４ｍｇ、５８％）を、白色の固形物として得た。1Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ6）  δ  １１．４３  （ｓ，  １Ｈ），  ９．８４  （ｍ，  １Ｈ），  ８．１９  （ｓ，  １Ｈ），  ７．９２  −  ７．７５  （ｓ，  ３Ｈ），  ７．７２  −  ７．５８  （ｍ，  １Ｈ），  ７．５０  −  ７．１７  （ｍ，  ７Ｈ），  ７．１２  −  ７．０５  （ｍ，  ２Ｈ），  ６．０３  （ｓ，  １Ｈ），  ４．９５  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．７２  −  ３．４３  （ｍ，  ２２Ｈ），  ３．４１  −  ３．３４  （ｍ，  ４Ｈ），  ３．２３  −  ３．１２  （ｍ，  ４Ｈ），  ３．０３  −  ２．９３  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．７３  −  ２．６０  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．３８  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．３４  −  ２．２６  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．２２  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．１０  −  １．９７  （ｍ，  ３Ｈ），  １．９０  −  １．６７  （ｍ，  ４Ｈ），  １．５１  −  １．１２  （ｍ，  １５Ｈ），  １．０５  −  ０．９５  （ｍ，  ３Ｈ）；  ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  １３５４  ［Ｍ  ＋  Ｈ］＋；  ＨＰＬＣ  ９８．５  ％  （ＡＵＣ），  ＴR  ４．５１  分；  ＵＶ  （ＭｅＯＨ）  λ  ３２２  ｎｍ，  ε  ３７０４８．
【実施例４２】
【０３３９】
Ｎ−（トランス−４−（（６−（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５−カルボキサミド）ヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（ＪＲＷ−０２００）
2020504754.tif 000141
【０３４０】
標記化合物を、その全内容を本明細書の一部を構成するものとして援用する、米国特許出願第１５／１９２，４２０号に記載された合成方法を用いて調製した。
【実施例４３】
【０３４１】
５−（（６−（トランス−４−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキシル）カルバモイル）−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−３’，６’−ジイル  ジアセタート（ＪＲＷ−０６５０）
2020504754.tif 000142
【０３４２】
工程１．  ｔｅｒｔ−ブチル（６−（トランス−４−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキシル）カルバメート（ＪＲＷ−０６４７）
2020504754.tif 000143
【０３４３】
トランス−４−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボン酸（１００ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（３ｍＬ）の溶液に対して、ＨＯＢＴ（６４ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（８０ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）、ジイソプロピエチルアミン（８１ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ）、及び、ｔｅｒｔ−ブチル（６−アミノヘキシル）カルバメート（６８ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、６０℃で、１８時間加熱した。この混合物を酢酸エチルで希釈し、そして、水で洗浄した。これらの有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（１５０ｍｇ、粗製）を、油脂として得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ６７４  ［Ｍ ＋ Ｈ］＋．
【０３４４】
工程２．  Ｎ−（トランス−４−（（６−アミノヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド（ＪＲＷ−０６４８）
2020504754.tif 000144
【０３４５】
ｔｅｒｔ−ブチル（６−（トランス−４−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキシル）カルバメート（１５０ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）を含むＤＣＭ（１０ｍＬ）の溶液に対して、ＴＦＡ（１ｍＬ）を加えた。この溶液を、室温で、２時間撹拌した。この混合物をトルエンで希釈し、濃縮し、トルエンに再懸濁し、そして、濃縮した。これを２回繰り返した。粗生成物（１４０ｍｇ）を、次工程で使用した。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ５７４  ［Ｍ ＋ Ｈ］＋．
【０３４６】
工程３．  ５−（（６−（トランス−４−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキシル）カルバモイル）−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−３’，６’−ジイル  ジアセタート（ＪＲＷ−０６５０）
2020504754.tif 000145
【０３４７】
Ｎ−（トランス−４−（（６−アミノヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド（０．２２ｍｍｏｌ）を含むＤＣＭ（１０ｍＬ）の溶液に対して、５−及び６−（（（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシ）カルボニル）−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−３’，６’−ジイル  ジアセタート（１４８ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）と、ジイソプロピルエチルアミン（１１５ｍｇ、０．８９ｍｍｏｌ）との混合物を加えた。この溶液を、室温で、１時間撹拌した。この混合物をＤＣＭで希釈し、そして、ＨＣｌ（１Ｍ）で洗浄した。これらの有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（１２５ｍｇ、５６％）を、白色の固形物として得た。1Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ6）  δ  ８．８７  −  ８．７３  （ｍ，  １Ｈ，  異性体  Ａ），  ８．７２  −  ８．５８  （ｍ，  １Ｈ，  異性体  Ｂ），  ８．５１  （ｓ，  １Ｈ，  異性体  Ａ），  ８．３０  −  ８．０９  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．７９  （ｓ，  １Ｈ，  異性体  Ｂ），  ７．７４  −  ７．１４  （ｍ，  １０Ｈ），  ７．１２  −  ７．００  （ｍ，  ２Ｈ），  ６．９９  −  ６．８７  （ｍ，  ４Ｈ），  ５．０２  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．８２  −  ３．５０  （ｍ，  ３Ｈ），  ３．２２  −  ３．１３  （ｍ，  １Ｈ），  ３．１０  −  ２．９０  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．７５  −  ２．６２  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．２７  （ｓ，  ６Ｈ），  ２．１２  −  １．９８  （ｍ，  ２Ｈ），  １．９１  −  １．６５  （ｍ，  ４Ｈ），  １．６１  −  １．１８  （ｍ，  １５Ｈ），  １．１０  −  ０．９４  （ｍ，  ３Ｈ）；  ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  １０１６  ［Ｍ  ＋  Ｈ］＋；  ＨＰＬＣ  ８７．８  ％  （ＡＵＣ），  ＴR  ６．５６  分；  ＵＶ  （ＭｅＯＨ）  λ  ２９０  ｎｍ，  ε  ２３３９７．
【実施例４４】
【０３４８】
Ｎ−（トランス−４−（（６−（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５−カルボキサミド）ヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド（ＪＲＷ−０８１８）
2020504754.tif 000146
【０３４９】
５−（（６−（トランス−４−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル））アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキシル）カルバモイル）−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−３’，６’−ジイル  ジアセテート（５０ｍｇ、０．０４９ｍｍｏｌ）を含むメタノール（５ｍＬ）の溶液に対して、炭酸カリウム（３４ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を加えた。この反応を、室温で、３０分間撹拌した。この混合物を酢酸エチルで希釈し、そして、ＨＣｌ（１Ｍ）で洗浄した。これらの有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（４２ｍｇ、９１％）を、橙色の固形物として得た。1Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ6）  δ  １０．１８  （ｓ，  ２Ｈ），  ８．８６  −  ８．７２  （ｍ，  １Ｈ，  異性体  Ａ），  ８．７２  −  ８．５７  （ｍ，  １Ｈ，  異性体  Ｂ），  ８．４５  （ｓ，  １Ｈ，  異性体  Ａ），  ８．２５  −  ８．１３  （ｍ，  ２Ｈ），  ８．１１  −  ８．００  （ｍ，  １Ｈ，  異性体  Ｂ），  ７．７７  −  ７．１５  （ｍ，  ９Ｈ），  ７．１２  −  ７．０２  （ｍ，  ２Ｈ），  ６．６７  （ｓ，  ２Ｈ），  ６．６３  −  ６．４９  （ｍ，  ４Ｈ），  ５．０２  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．８４  −  ３．４６  （ｍ，  ３Ｈ），  ３．２１  −  ３．１３  （ｍ，  １Ｈ），  ３．０９  −  ２．９０  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．７６  −  ２．６０  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．１４  −  １．９６  （ｍ，  １Ｈ），  １．９１  −  １．６８  （ｍ，  ４Ｈ），  １．６２  −  １．１８  （ｍ，  １５Ｈ），  １．０８  −  ０．９５  （ｍ，  ３Ｈ）；  ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ９３０  ［Ｍ  −  Ｈ］−；  ＨＰＬＣ  ＞９９  ％  （ＡＵＣ），  ＴR  ６．４４  分；  ＵＶ  （ＭｅＯＨ）  λ  ２８８  ｎｍ，  ε  ２０３９２． 
【実施例４５】
【０３５０】
Ｎ−（トランス−４−（（６−（３’，６’−ビス（ジメチルアミノ）−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−６−カルボキサミド）ヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド（ＪＲＷ−０８２２）
2020504754.tif 000147
【０３５１】
Ｎ−（トランス−４−（（６−アミノヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド（３５ｍｇ、０．０６１ｍｍｏｌ）を含むＤＣＭ（５ｍＬ）の溶液に対して、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  ３’，６’−ビス（ジメチルアミノ）−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−６−カルボキシラート（３２ｍｇ、０．０６１ｍｍｏｌ）と、ジイソプロピルエチルアミン（３１ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）との混合物を加えた。この溶液を、室温で、２時間撹拌した。この混合物をＤＣＭ、及び、水で希釈した。この水層を、ＣＨＣｌ3／イソプロパノール（３：１）の混合物で抽出し、これらの有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（４１ｍｇ、６８％）を、黒紫色の固形物として得た。1Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ6）  δ  ９．３６  （ｓ，  １Ｈ），  ８．８１  −  ８．７１  （ｍ，  １Ｈ），  ８．２５  −  ８．１８  （ｍ，  ３Ｈ），  ７．８２  （ｓ，  １Ｈ），  ７．７５  −  ７．６５  （ｍ，  １Ｈ），  ７．６２  −  ７．５３  （ｍ，  １Ｈ），  ７．４９  −  ７．００  （ｍ，  ８Ｈ），  ７．００  −  ６．７４  （ｍ，  ５Ｈ），  ５．０１  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．７２  −  ３．５０  （ｍ，  ５Ｈ），  ３．２５  −  ３．０５  （ｓ，  １４Ｈ），  ３．０４  −  ２．９２  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．７６  −  ２．５９  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．１２  −  １．９５  （ｍ，  １Ｈ），  １．８９  −  １．６４  （ｍ，  ４Ｈ），  １．５５  −  １．１８  （ｍ，  １５Ｈ），  １．０５  −  ０．９５  （ｍ，  ３Ｈ）；  ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ９８６  ［Ｍ  ＋  Ｈ］＋；  ＨＰＬＣ  ９５．５  ％  （ＡＵＣ），  ＴR  ５．７８  分；  ＵＶ  （ＭｅＯＨ）  λ  ５４６  ｎｍ，  ε  ８５００５．
【実施例４６】
【０３５２】
Ｎ−（トランス−４−（（６−（３’，６’−ビス（ジメチルアミノ）−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−６−カルボキサミド）ヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（ＪＲＷ−０８２４）
2020504754.tif 000148
【０３５３】
Ｎ−（トランス−４−（（６−アミノヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（３５ｍｇ、０．０６２ｍｍｏｌ）を含むＤＣＭ（５ｍＬ）の溶液に対して、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  ３’，６’−ビス（ジメチルアミノ）−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−６−カルボキシラート（３３ｍｇ、０．０６２ｍｍｏｌ）と、ジイソプロピルエチルアミン（３２ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）との混合物を加えた。この溶液を、室温で、１時間撹拌した。この混合物をメタノールで希釈し、セライトに加え、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（３６ｍｇ、６０％）を、黒紫色の固形物として得た。1Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ6）  δ  ８．６８  −  ８．６０  （ｍ，  １Ｈ），  ８．１６  −  ８．１２  （ｍ，  １Ｈ），  ８．０６  −  ８．０２  （ｍ，  １Ｈ），  ７．９１  −  ７．８５  （ｍ，  １Ｈ），  ７．６８  −  ７．５９  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．４４  −  ７．３３  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．３１  −  ７．１６  （ｍ，  ３Ｈ），  ７．１２  −  ７．０５  （ｍ，  ２Ｈ），  ６．５５  −  ６．４４  （ｍ，  ６Ｈ），  ４．９７  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．７０  −  ３．５４  （ｍ，  ３Ｈ），  ３．２２  −  ３．１５  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．０１  −  ２．８８  （ｍ，  １４Ｈ），  ２．３６  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．０９  −  １．９３  （ｍ，  １Ｈ），  １．８９  −  １．６５  （ｍ，  ４Ｈ），  １．５３  −  １．１８  （ｍ，  １２Ｈ），  １．１０  −  ０．９４  （ｍ，  ３Ｈ）；  ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ９７８  ［Ｍ  ＋  Ｈ］＋；  ＨＰＬＣ  ９１．９  ％  （ＡＵＣ），  ＴR  ５．５２  分．
【実施例４７】
【０３５４】
Ｎ−（トランス−４−（（６−（３−（５，５−ジフルオロ−７，９−ジメチル−５Ｈ−５ｌ４，６ｌ４−ジピロロ）１，２−ｃ：２’，１’−ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン−３−イル）プロパンアミド）ヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド（ＪＲＷ−０８２７）
2020504754.tif 000149
【０３５５】
Ｎ−（トランス−４−（（６−アミノヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド（２０ｍｇ、０．０３５ｍｍｏｌ）を含むＤＣＭ（５ｍＬ）の溶液に対して、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  ３−（５，５−ジフルオロ−７，９−ジメチル−５Ｈ−５ｌ４，６ｌ４−ジピロロ［１，２−ｃ：２’，１’−ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン−３−イル）プロパノアート（１０ｍｇ、０．０２７ｍｍｏｌ）と、ジイソプロピルエチルアミン（２２ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）との混合物を加えた。この溶液を、室温で、１８時間撹拌した。この混合物をＤＣＭで希釈し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（２１ｍｇ、７０％）を、赤色の固形物として得た。1Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ6）  δ  ８．２８  −  ８．１２  （ｍ，  １Ｈ），  ７．９８  −  ７．８０  （ｍ，  １Ｈ），  ７．７２  −  ７．６４  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．６３  −  ７．５３  （ｍ，  １Ｈ），  ７．５０  −  ７．１５  （ｍ，  ６Ｈ），  ７．１３  −  ７．０３  （ｍ，  ３Ｈ），  ６．３６  −  ６．３０  （ｍ，  １Ｈ），  ６．２７  （ｓ，  １Ｈ），  ５．０２  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．７７  −  ３．５２  （ｍ，  ３Ｈ），  ３．１１  −  ２．９５  （ｍ，  ６Ｈ），  ２．７４  −  ２．６０  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．４４  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．２３  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．１３  −  １．９２  （ｍ，  １Ｈ），  １．９２  −  １．６９  （ｍ，  ４Ｈ），  １．５５  −  １．１８  （ｍ，  １５Ｈ），  １．０９  −  ０．９５  （ｍ，  ３Ｈ）；  ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ８４８  ［Ｍ  ＋  Ｈ］＋；  ＨＰＬＣ  ＞９９  ％  （ＡＵＣ），  ＴR  ６．８４  分；  ＵＶ  （ＭｅＯＨ）  λ  ５０４  ｎｍ，  ε  ７９２７５．
【実施例４８】
【０３５６】
Ｎ−（トランス−４−（（６−（３−（５，５−ジフルオロ−７，９−ジメチル−５Ｈ−５ｌ４，６ｌ４−ジピロロ［１，２−ｃ：２’，１’−ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン−３−イル）プロパンアミド）ヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−  ５−カルボキサミド（ＪＲＷ−０８２９）
2020504754.tif 000150
【０３５７】
Ｎ−（トランス−４−（（６−アミノヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（２０ｍｇ、０．０３５ｍｍｏｌ）を含むＤＣＭ（５ｍＬ）の溶液に対して、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  ３−（５，５−ジフルオロ−７，９−ジメチル−５Ｈ−５１４，６１４−ジピロロ［１，２−ｃ：２’，１’−ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン−３−イル）プロパノアート（１１ｍｇ、０．０２８ｍｍｏｌ）と、ジイソプロピルエチルアミン（２２ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）との混合物を加えた。この溶液を、室温で、２時間撹拌した。この混合物をＤＣＭで希釈し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（２０ｍｇ、６７％）を、赤色の固形物として得た。1Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ6）  δ  ７．９１  −  ７．８０  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．７２  −  ７．６２  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．４４  −  ７．３３  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．３２  −  ７．１８  （ｍ，  ３Ｈ），  ７．１２  −  ７．０５  （ｍ，  ３Ｈ），  ６．３３  （ｄ，  Ｊ  ＝  ４．０，  １Ｈ），  ６．２７  （ｓ，  １Ｈ），  ４．９６  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．７２  −  ３．５４  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．１１  −  ２．９５  （ｍ，  ６Ｈ），  ２．４４  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．３６  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．２３  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．１２  −  １．８９  （ｍ，  １Ｈ），  １．９０  −  １．６８  （ｓ，  ４Ｈ），  １．５５  −  １．２０  （ｍ，  １５Ｈ），  １．１０  −  ０．９４  （ｍ，  ３Ｈ）；  ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ８４０  ［Ｍ  ＋  Ｈ］＋；  ＨＰＬＣ  ９９．７  ％  （ＡＵＣ），  ＴR  ６．６３  分；  ＵＶ  （ＭｅＯＨ）  λ  ５０４  ｎｍ，  ε  ８５９０９．
【実施例４９】
【０３５８】
Ｎ−（トランス−４−（（６−（３’，６’−ジアミノ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５，６−カルボキサミド）ヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド（ＪＲＷ−０８５９）
2020504754.tif 000151
【０３５９】
工程１．  Ｎ，Ｎ’−（５，６−（（６−（トランス−４−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキシル）カルバモイル）−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−３’，６’−ジイル）ビス（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）（ＪＲＷ−０８５８）
2020504754.tif 000152
【０３６０】
Ｎ−（トランス−４−（（６−アミノヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド（５０ｍｇ、０．０８７ｍｍｏｌ）を含むＤＣＭ（５ｍＬ）の溶液に対して、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  ３−オキソ−３’，６’−ビス（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５，６−カルボキシラート（１１５ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）と、ジイソプロピルエチルアミン（４５ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）との混合物を加えた。この溶液を、室温で、１８時間撹拌した。この混合物をＤＣＭ及びセライトで希釈し、濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、粗生成物（６５ｍｇ）を、明赤色の固形物として得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  １１２２  ［Ｍ ＋ Ｈ］＋．
【０３６１】
工程２．  Ｎ−（トランス−４−（（６−（３’，６’−ジアミノ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５，６−カルボキサミド）ヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド（ＪＲＷ−０８５９）
2020504754.tif 000153
【０３６２】
Ｎ，Ｎ’−（５，６−（（６−（トランス−４−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキシル）カルバモイル）−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−３’，６’−ジイル）ビス（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）（０．０８７ｍｍｏｌ）を含む、メタノール（５ｍＬ）及び水（０．１ｍＬ）の溶液に対して、炭酸カリウム（２４ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）を加えた。この反応を、室温で、３０分間撹拌した。この混合物を酸性化し（２Ｍ  ＨＣｌ）、ＤＣＭ及びセライトで希釈し、濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（３０ｍｇ、３７％）を、赤色の固形物として得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ９３０  ［Ｍ ＋ Ｈ］＋．
【実施例５０】
【０３６３】
Ｎ−（トランス−４−（（６−（３’，６’−ジアミノ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−６−カルボキサミド）ヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５，６−カルボキサミド）（ＪＲＷ−０８６３）
2020504754.tif 000154
【０３６４】
工程１．  Ｎ，Ｎ’−（５，６−（（６−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキシル）カルバモイル）−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−３’，６’−ジイル）ビス（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）（ＪＲＷ−０８６２）
2020504754.tif 000155
【０３６５】
Ｎ−（トランス−４−（（６−アミノヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（４５ｍｇ、０．０８０ｍｍｏｌ）を含むＤＣＭ（１０ｍＬ）の溶液に対して、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  ３−オキソ−３’，６’−ビス（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５，６−カルボキシラート（５３ｍｇ、０．０８０ｍｍｏｌ）と、ジイソプロピルエチルアミン（３０ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）との混合物を加えた。この溶液を、室温で、１８時間撹拌した。この混合物をＤＣＭ及びセライトで希釈し、濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、粗生成物（８６ｍｇ）を、橙色の油脂として得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  １１１４  ［Ｍ ＋ Ｈ］＋．
【０３６６】
工程２．  Ｎ−（トランス−４−（（６−（３’，６’−ジアミノ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−６−カルボキサミド）ヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５，６−カルボキサミド）（ＪＲＷ−０８６３）
2020504754.tif 000156
【０３６７】
Ｎ，Ｎ’−（５，６−（（６−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキシル）カルバモイル）−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−３’，６’−ジイル）ビス（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）（０．０８０ｍｍｏｌ）を含む、メタノール（５ｍＬ）及び水（０．１ｍＬ）の溶液に対して、炭酸カリウム（３２ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）を加えた。この反応を、室温で、３０分間撹拌した。この混合物を酸性化し（２Ｍ  ＨＣｌ）、ＤＣＭ及びセライトで希釈し、濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（２２ｍｇ、３０％）を、赤色の固形物として得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ９２２  ［Ｍ ＋ Ｈ］＋．
【実施例５１】
【０３６８】
Ｎ−（トランス−４−（（８−（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン）−５−カルボキサミド）オクチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド（ＪＲＷ−０８８２）
2020504754.tif 000157
【０３６９】
Ｎ−（トランス−４−（（８−アミノオクチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド（２００ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（１０ｍＬ）の溶液に対して、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  ３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５−カルボキシラート（４７２ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）、及び、ジイソプロピルエチルアミン（１２９ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、室温で、１８時間撹拌した。この混合物を酢酸エチルで希釈し、そして、水で洗浄した。セライトを有機層に加え、濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（３２ｍｇ、１０％）を、黄色の固形物として得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ９６１  ［Ｍ ＋ Ｈ］＋．
【実施例５２】
【０３７０】
Ｎ−（トランス−４−（（８−（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５−カルボキサミド）オクチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（ＪＲＷ−０８８３）
2020504754.tif 000158
【０３７１】
Ｎ−（トランス−４−（（８−アミノオクチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（１８０ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（１０ｍＬ）の溶液に対して、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  ３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１、９’−キサンテン］−５−カルボキシラート（４３０ｍｇ、０．９１ｍｍｏｌ）、及び、ジイソプロピルエチルアミン（１１８ｍｇ、０．９１ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、室温で、１８時間撹拌した。この混合物を酢酸エチルで希釈し、そして、水で洗浄した。セライトを有機層に加え、濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（４５ｍｇ、１５％）を、黄色の固形物として得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ９５２  ［Ｍ ＋ Ｈ］＋．
【実施例５３】
【０３７２】
Ｎ−（トランス−４−（（８−（３’，６’−ジアミノ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５，６−カルボキサミド）オクチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド（ＪＲＷ−０８８６）
2020504754.tif 000159
【０３７３】
工程１．  Ｎ，Ｎ’−（５，６−（（８−（トランス−４−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）オクチル）カルバモイル）−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−３’，６’−ジイル）ビス（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）（ＪＲＷ−０８８４）
2020504754.tif 000160
【０３７４】
Ｎ−（トランス−４−（（８−アミノオクチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド（７５ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（１０ｍＬ）の溶液に対して、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  ３−オキソ−３’，６’−ビス（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５，６−カルボキシラート（１２４ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）と、ジイソプロピルエチルアミン（４８ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）との混合物を加えた。この溶液を、室温で、１時間撹拌した。この混合物を酢酸エチルで希釈し、そして、水で洗浄した。セライトを有機層に加え、濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、粗生成物（１２０ｍｇ）を、白色の固形物として得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  １１５０  ［Ｍ ＋ Ｈ］＋．
【０３７５】
工程２．  Ｎ−（トランス−４−（（８−（３’，６’−ジアミノ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５，６−カルボキサミド）オクチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド（ＪＲＷ−０８８６）
2020504754.tif 000161
【０３７６】
Ｎ，Ｎ’−（５，６−（（８−（トランス−４−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）オクチル）カルバモイル）−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−３’，６’−ジイル）ビス（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）（０．１２ｍｍｏｌ）を含む、メタノール（５ｍＬ）及び水（１ｍＬ）に対して、炭酸カリウム（４３ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ）に加えた。この反応を、室温で、２時間撹拌した。この混合物を酸性化し（２Ｍ  ＨＣｌ）、ＤＣＭ及びセライトで希釈し、濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（９６ｍｇ、８３％）を、赤色の固形物として得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ９５８  ［Ｍ ＋ Ｈ］＋．
【実施例５４】
【０３７７】
Ｎ−（トランス−４−（（８−（３’，６’−ジアミノ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５−カルボキサミド）オクチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５，６−カルボキサミド（ＪＲＷ−０８８７）
2020504754.tif 000162
【０３７８】
工程１．  Ｎ，Ｎ’−（５，６−（（８−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）オクチル）カルバモイル）−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−３’，６’−ジイル）ビス（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）（ＪＲＷ−０８８５）
2020504754.tif 000163
【０３７９】
Ｎ−（トランス−４−（（８−アミノオクチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（７５ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（１０ｍＬ）の溶液に対して、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  ３−オキソ−３’，６’−ビス（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５，６−カルボキシラート（１２６ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）と、ジイソプロピルエチルアミン（４９ｍｇ、０．３８ｍｍｏｌ）との混合物を加えた。この溶液を、室温で、３時間撹拌した。この混合物を酢酸エチルで希釈し、そして、水で洗浄した。セライトを有機層に加え、濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、粗生成物（１１５ｍｇ）を、白色の固形物として得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  １１４２  ［Ｍ ＋ Ｈ］＋．
【０３８０】
工程２．  Ｎ−（トランス−４−（（８−（３’，６’−ジアミノ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５−カルボキサミド）オクチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５，６−カルボキサミド（ＪＲＷ−０８８７）
2020504754.tif 000164
【０３８１】
Ｎ，Ｎ’−（５，６−（（８−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）オクチル）カルバモイル）−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−３’，６’−ジイル）ビス（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）（０．１３ｍｍｏｌ）を含む、メタノール（５ｍＬ）及び水（１ｍＬ）に対して、炭酸カリウム（４２ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）を加えた。この反応を、室温で、２時間撹拌した。この混合物を酸性化し（２Ｍ  ＨＣｌ）、ＤＣＭ及びセライトで希釈し、濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（１００ｍｇ、８１％）を、赤色の固形物として得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ９５０  ［Ｍ ＋ Ｈ］＋．
【実施例５５】
【０３８２】
Ｎ−（トランス−４−（（８−（３−（５，５−ジフルオロ−７，９−ジメチル−５Ｈ−５λ４、６λ４−ジピロロ［１，２−ｃ：２’，１’−ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン−３−イル）プロパンアミド）オクチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド（ＪＲＷ−０８８８）
2020504754.tif 000165
【０３８３】
Ｎ−（トランス−４−（（８−アミノオクチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド（２０ｍｇ、０．０３３ｍｍｏｌ）を含むＤＣＭ（５ｍＬ）の溶液に対して、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  ３−（５，５−ジフルオロ−７，９−ジメチル−５Ｈ−５λ４，６λ４−ジピロロ［１，２−ｃ：２’，１’−ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン−３−イル）プロパノアート（１０ｍｇ、０．０２６ｍｍｏｌ）、及び、ジイソプロピルエチルアミン（１３ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、室温で、４時間撹拌した。この混合物を濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（２７ｍｇ、９３％）を、赤色の固形物として得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ８７６  ［Ｍ ＋ Ｈ］＋．
【実施例５６】
【０３８４】
Ｎ−（トランス−４−（（８−（３−（５，５−ジフルオロ−７，９−ジメチル−５Ｈ−５λ４、６λ４−ジピロロ［１，２−ｃ：２’，１’−ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン−３−イル）プロパンアミド）オクチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（ＪＲＷ−０８８９）
2020504754.tif 000166
【０３８５】
Ｎ−（トランス−４−（（８−アミノオクチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（２０ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ）を含むＤＣＭ（５ｍＬ）の溶液に対して、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  ３−（５，５−ジフルオロ−７，９−ジメチル−５Ｈ−５λ４、６λ４−ジピロロ［１，２−ｃ：２’，１’−ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン−３−イル）プロパノアート（１１ｍｇ、０．０２７ｍｍｏｌ）、及び、ジイソプロピルエチルアミン（１３ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、室温で、４時間撹拌した。この混合物を濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（２２ｍｇ、７５％）を、赤色の固形物として得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ８６８  ［Ｍ  ＋  Ｈ］＋．
【実施例５７】
【０３８６】
Ｎ−（トランス−４−（（１−（３’，６’−ビス（ジメチルアミノ）−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−６−イル）−１，１１−ジオキソ−５，８−ジオキサ−２，１２−ジアザオクタデカン−１８−イル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド（ＪＲＷ−０９１５）
2020504754.tif 000167
【０３８７】
Ｎ−（トランス−４−（（６−（３−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）プロパンアミド）ヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド（３０ｍｇ、０．０４１ｍｍｏｌ）を含むＤＣＭ（５ｍＬ）の溶液に対して、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  ３’，６’−ビス（ジメチルアミノ）−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−６−カルボキシラート（２４ｍｇ、０．０４５ｍｍｏｌ）、及び、ジイソプロピルエチルアミン（１６ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、室温で、１８時間撹拌した。この混合物を濃縮し、そして、分取ＨＰＬＣで精製して、所望の生成物（３０ｍｇ、６３％）を、黒色の固形物として得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  １１４５  ［Ｍ ＋ Ｈ］＋．
【実施例５８】
【０３８８】
Ｎ−（トランス−４−（（１−（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５，６−イル）−１，１１−ジオキソ）−５，８−ジオキサ−２，１２−ジアザイコサン−２０−イル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド（ＪＲＷ−０９２１）
2020504754.tif 000168
【０３８９】
Ｎ−（トランス−４−（（８−（３−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）プロパンアミド）オクチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド（５０ｍｇ、０．０６６ｍｍｏｌ）を含むＤＣＭ（５ｍＬ）の溶液に対して、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  ３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５，６−カルボキシラート（３７ｍｇ、０．０７９ｍｍｏｌ）、及び、ジイソプロピルエチルアミン（２５ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、室温で、３時間撹拌した。この混合物をセライトで濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（６７ｍｇ、９０％）を、黄色の固形物として得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  １１１９  ［Ｍ ＋ Ｈ］＋．
【実施例５９】
【０３９０】
Ｎ−（トランス−４−（（１−（３’，６’−ビス（ジメチルアミノ）−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−６−イル）−１，１１−ジオキソ−５，８−ジオキサ−２，１２−ジアザイコサン−２０−イル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド（ＪＲＷ−０９２０）
2020504754.tif 000169
【０３９１】
３’，６’−ビス（ジメチルアミノ）−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−６−カルボン酸（２５ｍｇ、０．０５８ｍｍｏｌ）を含むＤＣＭ／ＤＭＦ（３／１ｍＬ）の溶液に対して、ＴＳＴＵ（１９ｍｇ、０．０６４ｍｍｏｌ）、及び、ジイソプロピルエチルアミン（３０ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、１０分間、撹拌し、そして、Ｎ−（トランス−４−（（８−（３−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）プロパンアミド）オクチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド（４４ｍｇ、０．０５８ｍｍｏｌ）を含むＤＣＭ（２ｍＬ）を加えた。この溶液を、室温で、１８時間撹拌した。この混合物をセライトで濃縮し、そして、逆相シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（３４ｍｇ、５０％）を、赤色の固形物として得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  １１７３  ［Ｍ ＋ Ｈ］＋．
【実施例６０】
【０３９２】
Ｎ−（トランス−４−（（８−（６−（（Ｚ）−２−（（Ｅ）−３−（１，１−ジメチル−１，４，５，６−テトラヒドロ−３λ４−ピロロ［３，２，１−ｉｊ］キノリン−２−イル）アリーリデン）−１−メチル−１，２，５，６−テトラヒドロ−４Ｈ−ピロロ［３，２，１−ｉｊ］キノリン−１−イル）ヘキサンアミド）オクチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド（ＪＲＷ−０９５８）
2020504754.tif 000170
【０３９３】
Ｎ−（トランス−４−（（８−アミノオクチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド（７５ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（５ｍＬ）の溶液に対して、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  ６−（（Ｚ）−２−（（Ｅ）−３−（１，１−ジメチル−１，４，５，６−テトラヒドロ−３λ４−ピロロ［３，２，１−ｉｊ］キノリン−２−イル）アリーリデン）−１−メチル−１，２，５，６−テトラヒドロ−４Ｈ−ピロロ［３，２，１−ｉｊ］キノリン−１−イル）ヘキサノアート（７５ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）、及び、ジイソプロピルエチルアミン（４８ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、室温で、３．５時間撹拌した。この混合物を酢酸エチルで希釈し、そして、水で洗浄した。セライトを有機層に加え、濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（３５ｍｇ、２５％）を、赤黒色の固形物として得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  １１９２  ［Ｍ］＋．
【実施例６１】
【０３９４】
Ｎ−（トランス−４−（（８−（４’，５’−ジクロロ−３’，６’−ジヒドロキシ−２’，７’−ジメトキシ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５，６−カルボキサミド）オクチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド（ＪＲＷ−０９６４）
2020504754.tif 000171
【０３９５】
Ｎ−（トランス−４−（（８−アミノオクチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド（５０ｍｇ、０．０８３ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（５ｍＬ）の溶液に対して、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  ４’，５’−ジクロロ−３’，６’−ジヒドロキシ−２’，７’−ジメトキシ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５，６−カルボキシラート（７５ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）、及び、ジイソプロピルエチルアミン（３２ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、室温で、１時間撹拌した。この混合物を酢酸エチルで希釈し、そして、水で洗浄した。この水層を、ＣＨＣｌ3／イソプロパノール（３：１）で抽出した。セライトを有機層に加え、濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（４９ｍｇ、２５％）を、暗赤色の固形物として得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  １０８８  ［Ｍ］＋Ｈ．
【実施例６２】
【０３９６】
Ｎ１−（２−（５，５−ジフルオロ−１，３−ジメチル−５Ｈ−５λ４，６λ４−ジピロロ［１，２−ｃ：２’，１’−ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン−１０−イル）エチル）−Ｎ４−（１−（トランス−４−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，１０−ジオキソ−１３，１６−ジオキサ−２，９−ジアザオクタデカン−１８−イル）スクシンアミド（ＪＲＷ−１０８２）
2020504754.tif 000172
【０３９７】
Ｎ−（トランス−４−（（６−（３−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）プロパンアミド）ヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド（３０ｍｇ、０．０４１ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（３ｍＬ）の溶液に対して、ＨＯＢＴ（１２ｍｇ、０．０８２ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（１６ｍｇ、０．０８２ｍｍｏｌ）、ジイソプロピエチルアミン（１５ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）、及び、４−（（２−（５，５−ジフルオロ−１，３−ジメチル−５Ｈ−５λ４，６λ４−ジピロロ［１，２−ｃ：２’，１’−ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン−１０−イル）エチル）アミノ）−４−オキソブタン酸（２２ｍｇ、０．０６１ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、４０℃で、２時間加熱した。この混合物を酢酸エチルで希釈し、そして、水で洗浄した。これらの有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（２０ｍｇ、４５％）を、褐色の固形物として得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  １０７８  ［Ｍ ＋ Ｈ］＋．
【実施例６３】
【０３９８】
Ｎ１−（２−（５，５−ジフルオロ−１，３−ジメチル−５Ｈ−５λ４，６λ４−ジピロロ［１，２−ｃ：２’，１’−ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン−１０−イル）エチル）−Ｎ４−（８−（トランス−４−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）オクチル）スクシンアミド）（ＪＲＷ−１０８１）
2020504754.tif 000173
【０３９９】
Ｎ−（トランス−４−（（８−アミノオクチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド（３３ｍｇ、０．０５４ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（３ｍＬ）の溶液に対して、ＨＯＢＴ（１７ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（２１ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）、ジイソプロピエチルアミン（２１ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）、及び、４−（（２−（５、５−ジフルオロ−１，３−ジメチル−５Ｈ−５λ，６λ４−ジピロロ［１，２−ｃ：２’，１’−ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン−１０−イル）エチル）アミノ）−４−オキソブタン酸（３０ｍｇ、０．０８２ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、４０℃で、２時間加熱した。この混合物を酢酸エチルで希釈し、そして、水で洗浄した。これらの有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（２３ｍｇ、４４％）を、褐色の固形物として得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ９４７  ［Ｍ ＋ Ｈ］＋．
【実施例６４】
【０４００】
Ｎ１−（２−（５，５−ジフルオロ−１，３−ジメチル−５Ｈ−５λ４，６λ４−ジピロロ［１，２−ｃ：２’，１’−ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン−１０−イル）エチル）−Ｎ４−（１−（トランス−４−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，１２−ジオキソ−１５，１８−ジオキサ−２，１１−ジアザイコサン−２０−イル）スクシンアミド（ＪＲＷ−１０８３）
2020504754.tif 000174
【０４０１】
Ｎ−（トランス−４−（（８−（３−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）プロパンアミド）オクチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド（４２ｍｇ、０．０５５ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（３ｍＬ）の溶液に対して、ＨＯＢＴ（１７ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（２１ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）、ジイソプロピエチルアミン（２１ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）、及び、４−（（２−（５，５−ジフルオロ−１，３−ジメチル−５Ｈ−５λ４，６λ４−ジピロロ［１，２−ｃ：２’，１’−ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン−１０−イル）エチル）アミノ）−４−オキソブタン酸（３０ｍｇ、０．０８２ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、４０℃で、２時間加熱した。この混合物を酢酸エチルで希釈し、そして、水で洗浄した。これらの有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（２７ｍｇ、４４％）を、褐色の固形物として得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  １１０６  ［Ｍ ＋ Ｈ］＋．
【実施例６５】
【０４０２】
４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４  −（（８−（（７−ニトロベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール−４−イル）オキシ）オクチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（ＪＲＷ−１１８１）
2020504754.tif 000175
【０４０３】
４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４  −（（８−ヒドロキシオクチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（５３ｍｇ、０．０８９ｍｍｏｌ）を含むＤＣＭ（５ｍＬ）の溶液に対して、４−フルオロ−７−ニトロベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール（１６ｍｇ、０．０８９ｍｍｏｌ）、及び、ジイソプロピルエチルアミン（２３ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、室温で、１８時間撹拌した。この混合物を濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（３２ｍｇ、４７％）を、緑褐色の固形物として得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ７５８  ［Ｍ］＋  Ｈ．
【実施例６６】
【０４０４】
４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（（６−（（７−ニトロベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール−４−イル）オキシ）ヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（ＪＲＷ−１１８４）
2020504754.tif 000176
【０４０５】
４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（（６−ヒドロキシヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（５５ｍｇ、０．０９７ｍｍｏｌ）を含むＤＣＭ（５ｍＬ）の溶液に対して、４−フルオロ−７−ニトロベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール（２１ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）、及び、ジイソプロピルエチルアミン（２５ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、室温で、２４時間撹拌した。この混合物を濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（５６ｍｇ、８０％）を、緑褐色の固形物として得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ７３０  ［Ｍ］＋Ｈ．
【実施例６７】
【０４０６】
１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（（８−（（７−ニトロベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール−４−イル）オキシ）オクチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド（ＪＲＷ−１１８５）
2020504754.tif 000177
【０４０７】
１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（（トランス−４−（（８−ヒドロキシオクチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド（５３ｍｇ、０．０８８ｍｍｏｌ）を含むＤＣＭ（５ｍＬ）の溶液に対して、４−フルオロ−７−ニトロベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール（１９ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）、及び、ジイソプロピルエチルアミン（３４ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、室温で、１８時間撹拌した。この混合物を濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（１３ｍｇ、１９％）を、暗緑色の固形物として得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ７６６  ［Ｍ］＋Ｈ．
【実施例６８】
【０４０８】
１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（（６−（（７−ニトロベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール−４−イル）オキシ）ヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド（ＪＲＷ−１１８７）
2020504754.tif 000178
【０４０９】
１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（（６−ヒドロキシヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド（５３ｍｇ、０．０９２ｍｍｏｌ）を含むＤＣＭ（５ｍＬ）の溶液に対して、４−フルオロ−７−ニトロベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール（２０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）、及び、ジイソプロピルエチルアミン（３５ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、室温で、１８時間撹拌した。この混合物を濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（４７ｍｇ、６９％）を、褐色の固形物として得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  ７３８  ［Ｍ］＋Ｈ．
【実施例６９】
【０４１０】
４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４  −（（（Ｒ）−３−（（３Ｓ，４Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−（（４−（４−メチルチアゾール−５−イル）ベンジル）カルバモイル）ピロリジン−１−カルボニル）−２，２−ジメチル−５，１８−ジオキソ−８，１１，１４−トリオキサ−４，１７−ジアザトリコサン−２３−イル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（ＪＲＷ−１２１６）
2020504754.tif 000179
【０４１１】
６−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキサン酸（１８ｍｇ、０．０３１ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（３ｍＬ）の溶液に対して、ＨＯＢＴ（９ｍｇ、０．０６２ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（１２ｍｇ、０．０６２ｍｍｏｌ）、ジイソプロピエチルアミン（１２ｍｇ、０．０９３ｍｍｏｌ）、及び、（３Ｒ，４Ｓ）−１−（（Ｒ）−１−アミノ−１４−（ｔｅｒｔ−ブチル）−１２−オキソ−３，６，９−トリオキサ−１３−アザペンタデカン−１５−オイル）−４−ヒドロキシ−Ｎ−（４−（４−メチルチアゾール−５−イル）ベンジル）ピロリジン−３−カルボキサミド（２０ｍｇ、０．０３１ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、６０℃で、１８時間加熱した。この混合物を酢酸エチルで希釈し、そして、水で洗浄した。これらの有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（５ｍｇ、１３％）を、無色の膜として得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  １１９６  ［Ｍ ＋ Ｈ］＋．
【実施例７０】
【０４１２】
４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４  −（（（Ｒ）−３−（（３Ｓ，４Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−（（４−（４−メチルチアゾール−５−イル）ベンジル）カルバモイル）ピロリジン−１−カルボニル）−２，２−ジメチル−５，２１−ジオキソ−８，１１，１４，１７−テトラオキサ−４，２０−ジアザヘキサコサン−２６−イル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（ＪＲＷ−１２１７）
2020504754.tif 000180
【０４１３】
６−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキサン酸（１８ｍｇ、０．０３１ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（３ｍＬ）の溶液に対して、ＨＯＢＴ（９ｍｇ、０．０６２ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（１２ｍｇ、０．０６２ｍｍｏｌ）、ジイソプロピエチルアミン（１２ｍｇ、０．０９３ｍｍｏｌ）、及び、（３Ｒ，４Ｓ）−１−（（Ｒ）−１−アミノ−１７−（ｔｅｒｔ−ブチル）−１５−オキソ−３，６，９，１２−テトラオキサ−１６−アゾオクタデカン−１８−オイル）−４−ヒドロキシ−Ｎ−（４−（４−メチルチアゾール−５−イル）ベンジル）ピロリジン−３−カルボキサミド（２１ｍｇ、０．０３１ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、６０℃で、１８時間加熱した。この混合物を酢酸エチルで希釈し、そして、水で洗浄した。これらの有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（８ｍｇ、２１％）を、無色の膜として得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  １２４０  ［Ｍ ＋ Ｈ］＋．
【実施例７１】
【０４１４】
４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４  −（（（Ｒ）−３−（（３Ｓ，４Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−（（４−（４−メチルチアゾール−５−イル）ベンジル）カルバモイル）ピロリジン−１−カルボニル）−２，２−ジメチル−５，１８−ジオキソ−８，１１，１４−トリオキサ−４，１７−ジアザペンタコサン−２５−イル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−  カルボキサミド（ＪＲＷ−１２１９）
2020504754.tif 000181
【０４１５】
８−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）オクタン酸（２０ｍｇ、０．０３２ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（３ｍＬ）の溶液に対して、ＨＯＢＴ（１０ｍｇ、０．０６６ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（１３ｍｇ、０．０６６ｍｍｏｌ）、ジイソプロピエチルアミン（１３ｍｇ、０．０９８ｍｍｏｌ）、及び、（３Ｒ，４Ｓ）−１−（（Ｒ）−１−アミノ−１４−（ｔｅｒｔ−ブチル）−１２−オキソ−３，６，９−トリオキサ−１３−アザペンタデカン−１５−オイル）−４−ヒドロキシ−Ｎ−（４−（４−メチルチアゾール−５−イル）ベンジル）ピロリジン−３−カルボキサミド（２１ｍｇ、０．０３３ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、６０℃で、３時間加熱した。この混合物を酢酸エチルで希釈し、そして、水で洗浄した。これらの有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（５ｍｇ、１３％）を、無色の膜として得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  １２２４  ［Ｍ ＋ Ｈ］＋．
【実施例７２】
【０４１６】
４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４  −（（（Ｒ）−３−（（３Ｓ，４Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−（（４−（４−メチルチアゾール−５−イル）ベンジル）カルバモイル）ピロリジン−１−カルボニル）−２，２−ジメチル−５，２１−ジオキソ−８，１１，１４，１７−テトラオキサ−４，２０−ジアザオクタコサン−２８−イル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド（ＪＲＷ−１２２０）
2020504754.tif 000182
【０４１７】
８−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）オクタン酸（１８ｍｇ、０．０３０ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（３ｍＬ）の溶液に対して、ＨＯＢＴ（９ｍｇ、０．０６０ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（１１ｍｇ、０．０６０ｍｍｏｌ）、ジイソプロピエチルアミン（１１ｍｇ、０．０８９ｍｍｏｌ）、及び、（３Ｒ，４Ｓ）−１−（（Ｒ）−１−アミノ−１７−（ｔｅｒｔ−ブチル）−１５−オキソ−３，６，９，１２−テトラオキサ−１６−アゾオクタデカン−１８−オイル）−４−ヒドロキシ−Ｎ−（４−（４−メチルチアゾール−５−イル）ベンジル）ピロリジン−３−カルボキサミド（２０ｍｇ、０．０３０ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、６０℃で、４時間加熱した。この混合物を酢酸エチルで希釈し、そして、水で洗浄した。これらの有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、そして、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物（９ｍｇ、２４％）を、無色の膜として得た。ＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ  １２６８  ［Ｍ ＋ Ｈ］＋．
【実施例７３】
【０４１８】
Ｎｌｕｃルシフェラーゼの阻害
以下の実施例は、クロロアルカンに付加して、Ｎｌｕｃ−ＨＴ融合タンパク質を強力に阻害する阻害剤の使用を提供する。Ｎｌｕｃ、Ｎｌｕｃ−ＨａｌｏＴａｇ（ＨＴ）、及び、Ｎｌｕｃ−ＨＴ−ＴＭＲ（ＴＭＲクロロアルカンに結合したＮｌｕｃ−ＨＴ）を、ＰＢＳ／０．０５％ＢＳＡで、０．０５ｎＭの最終濃度にまで希釈し、そして、指示濃度のＪＲＷ−０３０８と共に、室温で、２時間、インキュベートした。ＢＭＧ  Ｃｌａｒｉｏｓｔａｒプレートリーダーを使用して、フリマジン（１０μＭの最終濃度）を添加した後に、試料の分析をした。図１は、ＪＲＷ−０３０８が、Ｎｌｕｃ−ＨＴ融合タンパク質を強力に阻害するのに対して、Ｎｌｕｃだけを阻害、及び、Ｎｌｕｃ−ＨＴ−ＴＭＲを阻害するには、高濃度を要することを実証している。ＴＭＲそれ自体は、クロロアルカン基を含んでおり、このものは、ＨＴへの結合についてＪＲＷ−０３０８のクロロアルカン基と競合する。そのため、Ｎｌｕｃ−ＨＴ−ＴＭＲ融合タンパク質を阻害するためには、より高濃度のＪＲＷ−０３０８が必要となる。
【０４１９】
細胞内のＮｌｕｃルシフェラーゼの阻害
ＨｅＬａ細胞を、Ｎｌｕｃ、または、Ｎｌｕｃ−ＨＴのための発現構築物でリバーストランスフェクトし、プレーティングし（２０，０００細胞／１００μＬの増殖培地）、そして、２４時間、インキュベートした。次いで、増殖培地を、５０μｌのＯｐｔｉＭＥＭ（５００ｎＭのＮａｎｏＢＲＥＴ（商標）６１８リガンド（Ｎｌｕｃ−ＨＴ−６１８）を任意に含む）と交換し、続いて、３７℃で、３０分間、インキュベーションをした。次いで、これらの細胞を、３７℃で、２時間、ＪＲＷ−０３０８の段階希釈物を含む５０μｌのＯｐｔｉＭＥＭで処理した。５０μＬのＯｐｔｉＭＥＭで１９０μＭの最終濃度にしたフリマジンを添加した後に、ＢＭＧ  Ｃｌａｒｉｏｓｔａｒプレートリーダーを用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。図２Ａは、ＪＲＷ−０３０８が、Ｎｌｕｃ−ＨＴ融合タンパク質を強力に阻害するのに対して、Ｎｌｕｃの阻害には高濃度を要する、ことを示している。図２Ｂは、Ｎｌｕｃ−ＨＴ、及び、Ｎｌｕｃ−ＨＴ−６１８の阻害を示す。また、ＮａｎｏＢＲＥＴ（商標）６１８リガンドは、ＨＴへの結合について、ＪＲＷ−０３０８と競合するクロルアルカン基を含む。そのため、Ｎｌｕｃ−ＨＴ−６１８の阻害には、高濃度のＪＲＷ−０３０８を必要とする。
【実施例７４】
【０４２０】
カスパーゼ活性の測定
同じＮｌｕｃ−ＤＥＶＤ−ＨＴ融合タンパク質を使用してカスパーゼ活性を測定するための２つの主要な方法を試験した。これらの方法を、図３に示している。左側の図は、発光強度をベースとした方法を示す。発光強度をベースとした方法は、融合タンパク質がインタクトの場合に、Ｎｌｕｃ生物発光を阻害する。カスパーゼ活性の増大は、当該Ｎｌｕｃ−ＤＥＶＤ−ＨＴ融合タンパク質の開裂、そして、その結果、Ｎｌｕｃ阻害剤とＮｌｕｃとの解離をもたらす。このカスパーゼ活性の増大によって、Ｎｌｕｃの脱抑制を招いて、放出される生物発光を増大させる。右側の図は、ＢＲＥＴをベースとしたセンサーを示しており、ＮｌｕｃとＨＴ−色素コンジュゲートとの間にＢＲＥＴが出現する。カスパーゼが活性化されておらず、かつ、融合タンパク質が開裂されずに存在している場合に、このＢＲＥＴシグナルは最大となる。カスパーゼが活性化すると、当該Ｎｌｕｃ−ＤＥＶＤ−ＨＴ融合物は開裂して、ＢＲＥＴの減少を招く。図４は、当該強度をベースとしたアッセイと、図３に記載の当該ＢＲＥＴをベースとしたアッセイとの間の比較を示す。ＨｅＬａ細胞を、Ｎｌｕｃ−ＤＥＶＤ−ＨＴでリバーストランスフェクトし、プレーティングし、そして、一晩、インキュベートした。指示濃度のＪＲＷ−０３０８（緑色で表示）、または、５００ｎＭ  ＮａｎｏＢＲＥＴ（商標）６１８リガンド（赤色で表示）を含むＯｐｔｉＭＥＭで増殖培地を交換し、続いて、３７℃で、９０分間、インキュベートして標識化を行った。段階希釈のスタウロスポリンを含有する５０μＬのＯｐｔｉＭＥＭを添加し、そして、３７℃で、７時間、インキュベートして、カスパーゼ活性を誘導した。フリマジン（１０μＭの最終濃度）を添加した後に、ＢＭＧ  Ｃｌａｒｉｏｓｔａｒを使用してプレートを読み取った。双方の方法について、スタウロスポリンに関する同様のＥＣ50値を求めた。
【実施例７５】
【０４２１】
タンパク質−タンパク質相互作用のモデリング
タンパク質−タンパク質相互作用を、Ｆｒｂ／ＦＫＢＰ会合／解離モデルを用いて測定した。ＨｅＬａ細胞を、Ｆｒｂ−ＮＬ／ＦＫＢＰ−ＨＴ（１：４のＤＮＡ比）融合のための発現構築物でリバーストランスフェクトし、プレーティングし、そして、一晩、インキュベートした。５００ｎＭのＮａｎｏＢＲＥＴ（商標）６１８リガンド、または、指示濃度のＪＲＷ−０３０８を含むＯｐｔｉＭＥＭで増殖培地を交換し、続いて、３７℃で、９０分間、インキュベートして標識化した。ラパマイシン及びフリマジンの連続希釈物（１０μＭの最終濃度）を添加した後に、ＢＭＧ  Ｃｌａｒｉｏｓｔａｒを用いて、これらのプレートを、１０分間読み取った。図５Ａは、阻害剤が存在しない条件下でのＢＲＥＴをベースとしたＦｒｂ／ＦＫＢＰ相互作用アッセイを示す。ＦＫＢＰ−ＨＴは、ラパマイシンの存在下でＦＲＢ−ＮＬに結合し、Ｎｌｕｃを、ＨＴ−ＮａｎｏＢＲＥＴ（商標）６１８リガンド複合体に近接近させて、ＢＲＥＴを可能にする。これらの条件下で、当該ＢＲＥＴの比は、ラパマイシン濃度の増加に符合して増加し、放出される６１０ｎｍ：４６０ｎｍの光の比を増大させる。図５Ｂは、ＪＲＷ−０３０８の存在下での同じＦｒｂ／ＦＫＢＰ相互作用モデルを示す。低濃度のラパマイシンが存在する条件では、ＦＫＢは、ＦＲＢに結合せず、Ｎｌｕｃは、ＨＴ−ＪＲＷ−０３０８複合体と結合しないままとなる。ラパマイシンを添加すると、ＦＫＢ−ＨＴ／ＦＲＢ−ＨＴ相互作用を誘発し、それにより、ＨＴ阻害剤複合体がＮｌｕｃと接触して、シグナルの減少を招く。図５Ｃは、ラパマイシンが、上記した双方のモデルについて、同様のＥＣ50を示すことを表している。
【実施例７６】
【０４２２】
自殺型阻害剤
例示的なコハク酸または臭化物官能化阻害剤のＮｌｕｃ阻害活性を試験した。阻害剤を、ＯｐｔｉＭＥＭ＋０．１％ＦＢＳで、３ｕＭにまで希釈した。ＮａｎｏＬｕｃを、ＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）緩衝液＋１００ｕＭフリマジンで、０．４ｎｇ／ｍｌにまで希釈した。５０ｕｌの各阻害剤を、５０ｕｌのＮａｎｏＬｕｃ／フリマジン／ＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）溶液に加えた。これらの試料を、直ちに、ＧｌｏＭａｘ（登録商標）Ｍｕｌｔｉ＋セットに入れて、２分間隔で、動的モードで読み取った。図６は、ＮａｎｏＬｕｃ／フリマジン（黒ダイアモンド形）の光出力の動的測定を示す。可逆的阻害剤（ＪＲＷ−０３４７）の存在下では、経時的な阻害は同じままである。臭化アルキル（ＪＲＷ−０５４８）は、定常状態阻害を示す。また、コハク酸エステルＪＲＷ−０５４４も定常状態の結合を示し、一方で、コハク酸エステルＪＲＷ−０５５２は、予想外にも、時間依存性の阻害を示す。このことは、ＪＲＷ−０５５２が、不可逆的な阻害剤である、ことを示す。
【０４２３】
図７は、阻害剤の存在下または非存在下における、ＮａｎｏＬｕｃ／フリマジンの光出力の動的読み取りを示す。この実験は、希釈時に、どの阻害剤が、フリマジンで交換可能か、または、交換可能でないかを示すようにデザインした。１０μＭのＮｌｕｃを、１０μＭの阻害剤を含むＯｐｔｉＭＥＭ＋０．１％ＦＢＳとインキュベートし、そして、室温で、３０分間、インキュベートした。次いで、この混合物を、１０×１０6倍に希釈した（１０ｐＭのＮａｎｏＬｕｃ及び阻害剤）。希釈した後に、５０ｕｌの希釈物を、５０ｕｌのＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）アッセイ緩衝液と混合した。フリマジンの最終濃度は、１０ｕＭであった。ＪＲＷ−０３４７は、フリマジンによる急速な置換を受けており、ＪＲＷ−０５９８、ＪＲＷ−０６０４、ＪＲＷ−０６５０、及び、ＪＲＷ−０６０６での置換は緩慢であり、そして、ＪＲＷ−０５９７、ＪＲＷ−０６２２、及び、ＪＲＷ−０６２６では、フリマジンによる置換がさらに緩慢であった。ＪＲＷ−０５５２、及び、ＪＲＷ−０６００は、フリマジンによる置換を受けておらず、そして、１：１のモル比で、不可逆的にＮａｎｏＬｕｃを阻害した。
【０４２４】
図８Ａ−Ｃは、ＥＧＦＲ／セツキシマブ結合アッセイを用いて、コハク酸エステル官能化阻害剤と、強力な可逆的阻害剤との比較を示す。図８Ａは、当該結合アッセイの概念を説明する概略図である。セツキシマブを、ＨＴ−ＮＬｕｃ融合タンパク質（Ｃｅｔｕｘ−Ｆａｂ−Ｎｌｕｃ）に付加し、そして、ＥＧＦＲプレートに加える。コントロール条件下では、セツキシマブは、ＥＧＦＲに結合し、そして、大きなＮｌｕｃシグナルを示す。阻害剤を添加すると、Ｎｌｕｃシグナルを減退する。図８Ｂは、ＪＲＷ−０５５２、ＪＲＷ−０５９７、及び、ＪＲＷ−０６００のＮｌｕｃ阻害活性を示す。ＥＧＦＲ被覆プレートを、３μｇ／ｍｌのＣｅｔｕｘ−Ｆａｂ−Ｎｌｕｃで処理した。当該プレートを、指示濃度の阻害剤で処理した。フリマジン（１０μＭの最終濃度）を添加した後に、ＢＭＧ  Ｃｌａｒｉｏｓｔａｒを用いて、プレートを読み取った。図８Ｃは、コントロールに対する試験した化合物の％阻害を示す。
【０４２５】
図９Ａ−Ｂは、コハク酸エステル官能化阻害剤ＪＲＷ−０５５２による阻害が不可逆的であることを示す。実験計画の概略図を、図９Ａに示す。Ｃｅｔｕｘ−Ｆａｂ−Ｎｌｕｃは、ＥＧＦＲの結合について、セツキシマブと競合する。フリマジン（１０μＭの最終濃度）を添加した後に、ＢＭＧ  Ｃｌａｒｉｏｓｔａｒを用いて、プレートを読み取った。最初の読み取りに続いて、１μＭの阻害剤を、５分間または３０分間添加する。続いて、これらのプレートを、ＰＢＳで、０、１０、３０、または、６０分間洗浄した。次いで、フリマジン（１０μＭの最終濃度）を添加した後に、ＢＭＧ  Ｃｌａｒｉｏｓｔａｒを用いて、２回目のシグナルの読み取りを行う。上記した実験の結果を、図９Ｂに示す。
【実施例７７】
【０４２６】
阻害剤ＩＣ50の決定
以下の実施例は、本明細書で開示した化合物のＩＣ50値を提供する。結果を、表１に示す。ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）酵素を、ＣＯ2非依存性培地＋１０％ＦＢＳで、０．４ｎｇ／ｍｌにまで希釈して、検出試薬を作製した。次いで、各阻害剤の３倍希釈系列を、当該検出試薬に向けて調製した。「阻害剤なし」のコントロールも、各試料について調製した。各阻害剤希釈物の５０ｕｌを、２０μＭのフリマジンを含有する５０ｕｌのＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）緩衝液（最終フリマジン濃度は１０μＭであり、Ｋｍでもある）と混合し、そして、発光を測定した。各試料を「阻害剤なし」コントロールに対して正規化した。次いで、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ｌｏｇ［阻害剤］対正規化反応）を用いて、ＩＣ50値を決定した。
表１
2020504754.tif 000183
2020504754.tif 000184
【実施例７８】
【０４２７】
ダサチニブ結合ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）阻害剤の結合
ＨＥＫ２９３細胞を、ＳＲＣキナーゼとＮａｎｏＬｕｃとの融合体をコードするＤＮＡでトランスフェクトした。これらの細胞を、ＤＮＡ：Ｆｕｇｅｎｅ  ＨＤを１：３の比率にして、トランスフェクトした。２４時間の発現後、細胞を、５０ｕｇ／ｍＬのジギトニンを含むＯｐｔｉＭＥＭで溶解し、そして、様々な濃度のダサチニブ結合ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）阻害剤（ＪＲＷ−０５７７、−０５８９、−０５９３、−０５９５、結果を、図１０Ａ〜１０Ｄのそれぞれに示す）で処理した。細胞を、段階希釈した未修飾ダサチニブで、同時に処理をした。室温で、２時間、インキュベートした後、フリマジン（１０ｕＭ）を添加し、そして、発光を、ＧｌｏＭａｘ（登録商標）ルミノメーターで測定した。ダサチニブの結合は、用量依存的な発光の増大の証拠である。
【実施例７９】
【０４２８】
同じ波長を有する多重ルシフェラーゼ
以下の溶液を、ＴＢＳ＋２０ｕＭフリマジンで調製した。１）０．４ｎｇ／ｍｌ  ＮａｎｏＬｕｃ、２）０．４ｎｇ／ｍｌ  ＮａｎｏＬｕｃ＋０．２ｎＭ  ＨａｌｏＴａｇ−ＨｉＢｉＴ、３）０．４ｎｇ／ｍｌ  ＮａｎｏＬｕｃ＋２００ｎＭ  ＬｇＢｉＴ。各溶液の５０ｕｌを、ＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）緩衝液で希釈した１００ｕＭのＪＲＷ−０５５２を含有する溶液と三重に合わせた。これらの試料を、直ちに、ＧｌｏＭａｘ（登録商標）+ルミノメーターに仕込み、そして、２分間の間隔で、５０分間、動的モードで読み取った。
【０４２９】
５０分後、１００ｕｌの以下の溶液を、対応する試料に添加した。１）ＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）緩衝液＋５０ｕＭフリマジン、２）ＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）緩衝液＋５０ｕＭフリマジン＋２００ｎＭ  ＬｇＢｉＴ、３）ＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）緩衝液＋５０ｕＭフリマジン＋０．２ｎＭ  ＨａｌｏＴａｇ−ＨｉＢｉＴ。これらの試料を、直ちに、ＧｌｏＭａｘ（登録商標）Ｍｕｌｔｉ＋ルミノメーターに仕込み、そして、２分間の間隔で、５０分間、動的モードで読み取った。図１１に示すように、ＪＲＷ−０５５２は、ＮａｎｏＬｕｃのシグナルを選択的に阻害するのに対して、２つのＮａｎｏＢｉＴ構成は、動作可能なままである。
【０４３０】
Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼの阻害剤の使用のさらなる例は、例えば、米国特許出願第１５／１９２，４２０号に記載されており、その内容は、本明細書の一部を構成するものとして援用する。
【０４３１】
上記した詳細な説明、及び、添付の実施例は、例示目的のものでしかなく、そして、添付の特許請求の範囲、及び、それらの等価物として定義される本発明の範囲を限定するものでない、ことが理解できる。
【０４３２】
本開示の実施形態の様々な変更及び修正は、当業者に自明である。本発明の化学構造、置換基、誘導体、中間体、合成者、組成物、製剤、または、使用の方法に関して、これらに限らず、そのような変更及び修正は、本発明の趣旨及び範囲から逸脱せずに行い得る。
【０４３３】
完全性の理由により、本開示の様々な態様を、以下の番号の条項で示す。
【０４３４】
条項１．式（Ｉ）の化合物、または、その塩であって、
【化１３】
2020504754.tif 000185
式中、
Ａは、存在せず、任意に置換されたフェニル環、または、任意に置換されたチエニル環であり、
Ｌ1は、存在せず、または、−（ＣＲa1Ｒa2）m1−であり、式中、ｍ１は、１〜１００であり、任意に、１つ以上のＣＲa1Ｒa2基は、ヘテロ原子、または、Ｏ、Ｎ（Ｒa3）、Ｓ（＝Ｏ）、及び、Ｓ（＝Ｏ）2からなる群から選択されるヘテロ原子基で置換しており、任意に、１つ以上のＣＲa1Ｒa2基は、Ｃ（＝Ｏ）で置換しており、任意の隣接する２つのＣＲa1Ｒa2基が、ＣＲa1＝ＣＲa1を形成し、そして、任意に、１つ以上のＣＲa1Ｒa2基を、−Ｃｙ−基で置換しており、各Ｃｙは、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、及び、複素環からなる群から独立して選択され、式中、Ｒa1、Ｒa2、及びＲa3は、独立して、水素、及び、Ｃ1−Ｃ4−アルキルからなる群から選択され、
Ｚは、Ｃ1-Ｃ10ハロアルキル、脱離基Ｙ、生物活性剤、または、色素であり、前記脱離基Ｙは、ＯＲ4、ハロゲン、ヘテロアリール、及び、ヘテロシクリルからなる群から選択され、
Ｒ1は、水素、または、Ｃ1-Ｃ8アルキルであり、
Ｒ2は、水素、任意に置換されたＣ1-Ｃ8アルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換されたアリールアルキル、任意に置換されたアルコキシアルキル、及び、任意に置換されたアルコキシアルコキシアルキルからなる群から選択され、
Ｒ3は、水素、または、Ｃ1-Ｃ8アルキルであり、及び
Ｒ4は、任意に置換されたＣ1-Ｃ8アルキル、任意に置換されたＣ3-Ｃ8-シクロアルキル、任意に置換されたＣ3-Ｃ8-シクロアルキルアルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたアリールアルキル、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換されたヘテロアリールアルキル、任意に置換されたヘテロシクリル、及び、任意に置換されたヘテロシクリルアルキルからなる群から選択される、前記化合物、または、その塩。
【０４３５】
条項２．  Ａが、任意に置換されたフェニル環である、条項１に記載の化合物。
【０４３６】
条項３．  Ａが、任意に置換されたチエニル環である、条項１に記載の化合物。
【０４３７】
条項４．  Ｒ1を、水素、Ｃ1-Ｃ8アルキル、ハロ−Ｃ1-Ｃ8−アルキル、アルコキシアルコキシアルキル、及び、アリールアルキルからなる群より選択する、条項１〜３のいずれかに記載の化合物。
【０４３８】
条項５．  Ｒ2が、任意に置換されたアリールである、条項１〜４のいずれかに記載の化合物。
【０４３９】
条項６．  Ｒ2が、Ｃ1-Ｃ4アルキル、シアノ、アミド、Ｃ1-Ｃ4アルコキシ、Ｃ1-Ｃ4ハロアルキル、及び、ヒドロキシアルキルからなる群から選択される少なくとも１つの置換基で置換したフェニルである、条項１〜５のいずれかに記載の化合物。
【０４４０】
条項７．  Ｒ3が、水素である、条項１〜６のいずれかに記載の化合物。
【０４４１】
条項８．式（Ｉａ）を有する化合物であって、
【化１４】
2020504754.tif 000186
式中、
Ａは、存在せず、フェニル環、または、チエニル環であり、
Ｒ2が、少なくとも１つのＣ1-Ｃ4アルキル、または、Ｃ1-Ｃ4ハロアルキルで置換したフェニルであり、及び
Ｌ2は、存在せず、または、−（ＣＲa1Ｒa2）m2−であり、式中、ｍ２は、１〜９０であり、各ＣＲa1Ｒa2は、条項１で定義した通りである、条項１に記載の化合物。
【０４４２】
条項９．式（Ｉｂ）を有する化合物であって、
【化１５】
2020504754.tif 000187
式中、
Ａは、存在せず、フェニル環、または、チエニル環であり、
Ｒ2が、少なくとも１つのＣ1-Ｃ4アルキル、または、Ｃ1-Ｃ4ハロアルキルで置換したフェニルであり、及び
Ｒx及びＲyは、各々の存在時に、独立して、水素、または、Ｃ1-Ｃ4アルキルであり、
ｐは、４、５、６、７、８、９、または、１０であり
ｔは、０または１であり、
ｖは、０または１であり、及び
Ｌ3は、存在せず、または、−（ＣＲa1Ｒa2）m3−であり、式中、ｍ３は、１〜８０であり、各ＣＲa1Ｒa2は、条項１で定義した通りである、条項１に記載の化合物。
【０４４３】
条項１０．  Ｌ3は、−（ＣＲa1Ｒa2）m3−であり、式中、ｍ３は、１〜２０であり、及び、Ｒa1及びＲa2は、各々の存在時に、独立して、水素、または、Ｃ1-Ｃ4アルキルである、条項９に記載の化合物。
【０４４４】
条項１１．  Ｌ3が、−Ｑ1−（ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ）k1−Ｑ2−（ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ）k2−Ｑ3−（ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ）k3−であり、
式中、
Ｑ1は、存在せず、Ｏ、または、ＮＨであり、
Ｑ2は、存在せず、
2020504754.tif 000188
、−ＣＯ−ＮＨ−、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＯ−、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＯ、または、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＯ−ＮＨ−であり、
Ｑ３は、存在せず、−ＣＯ−ＮＨ−、または、−ＣＨ2−ＣＨ2−であり、
ｋ１は、１〜１０であり、
ｋ２は、０〜１０であり、及び、
ｋ３は、０〜１０である、条項９に記載の化合物。
【０４４５】
条項１２．Ｌ3が、
2020504754.tif 000189
2020504754.tif 000190
2020504754.tif 000191
2020504754.tif 000192
2020504754.tif 000193
2020504754.tif 000194
2020504754.tif 000195
2020504754.tif 000196
2020504754.tif 000197
2020504754.tif 000198
2020504754.tif 000199
2020504754.tif 000200
2020504754.tif 000201
及び
2020504754.tif 000202
からなる群から選択される、条項９に記載の化合物。
【０４４６】
条項１３．  Ｚが、Ｃ1-Ｃ10ハロアルキルである、条項１、８、及び、９のいずれかに記載の化合物。
【０４４７】
条項１４．式（Ｉｃ）を有する化合物であって、
【化１６】
2020504754.tif 000203
式中、
Ａは、フェニル環、または、チエニル環であり、
Ｒ2は、１つのメチル、または、エチル基で置換したフェニルであり、
Ｒx及びＲyは、各々の存在時に、独立して、水素、または、Ｃ1-Ｃ4アルキルであり、
ｐは、４、５、６、７、８、９、または、１０であり、及び
Ｌ3は
2020504754.tif 000204
または
2020504754.tif 000205
である、条項１３に記載の化合物。
【０４４８】
条項１５．  Ｚが、−（ＣＨ2）6−Ｃｌである、条項１３〜１４のいずれかに記載の化合物。
【０４４９】
条項１６．  Ｚが、ＯＲ4、ハロゲン、ヘテロアリール、及び、ヘテロシクリルからなる群から選択される脱離基Ｙである、条項１、８、及び、９のいずれかに記載の化合物。
【０４５０】
条項１７．式（Ｉｄ）を有する化合物であって、
【化１７】
2020504754.tif 000206
式中、
Ａは、フェニル環、または、チエニル環であり、
Ｒ2は、メチル、エチル、−ＣＨ2Ｂｒ、及び、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2Ｂｒからなる群から選択される１つの置換基で置換したフェニルであり、
Ｒx及びＲyは、各々の存在時に、独立して、水素、または、Ｃ1-Ｃ4アルキルであり、
ｐは、４、５、６、７、８、９、または、１０であり
ｔは、０または１であり、
ｖは、０または１であり、及び
Ｌ3は、存在せず、Ｃ1-Ｃ4アルキレン、
2020504754.tif 000207
である、条項１６に記載の化合物。
【０４５１】
条項１８．  Ｚが、クロロ、ブロモ、ヨード、Ｃ1-Ｃ4アルコキシ、フェノキシ、
2020504754.tif 000208
または
2020504754.tif 000209
である、条項１６〜１７のいずれかに記載の化合物。
【０４５２】
条項１９．  Ｌ3は、存在せず、
2020504754.tif 000210
であり、及び
Ｚが、Ｃ1-Ｃ4アルコキシ、フェノキシ、
2020504754.tif 000211
である、条項１６〜１７のいずれかに記載の化合物。
【０４５３】
条項２０．  Ｌ3が、−ＣＨ2−ＣＨ2−、または、
2020504754.tif 000212
であり、及び、
Ｚが、
2020504754.tif 000213
であり、または
Ｌ3が、Ｃ1-Ｃ4アルキレンであり、及び、Ｚは、クロロ、ブロモ、または、ヨードである、条項１６〜１７のいずれかに記載の化合物。
【０４５４】
条項２１．ｔが、０であり、
ｖが、０であり、
Ｌ3が、存在せず、及び
Ｚが、ブロモ、ヨード、または、
2020504754.tif 000214
である、請求項１６〜１７のいずれかに記載の化合物。
【０４５５】
条項２２．  Ｚが、酵素阻害剤、受容体阻害剤、及び、タンパク質分解を誘導する部分からなる群から選択される生物活性剤である、条項１、８、及び、９のいずれかに記載の化合物。
【０４５６】
条項２３．  Ｚが、キナーゼ阻害剤である、条項２２の化合物。
【０４５７】
条項２４．式（Ｉｅ）を有する化合物であって、
【化１８】
2020504754.tif 000215
式中、
Ａは、存在せず、フェニル環、または、チエニル環であり、
Ｒ2は、１つのメチル、または、エチル基で置換したフェニルであり、
Ｒx及びＲyは、各々の存在時に、独立して、水素、または、Ｃ1-Ｃ4アルキルであり、
ｐは、４、５、６、７、８、９、または、１０であり、
Ｌ3は、
2020504754.tif 000216
または
2020504754.tif 000217
であり、及び
Ｚは、
2020504754.tif 000218
であり、または
Ｌ3は、
2020504754.tif 000219
または
2020504754.tif 000220
であり、及び
Ｚは、
2020504754.tif 000221
である、請求項２２〜２３のいずれかに記載の化合物。
【０４５８】
条項２５．  Ｚが、色素である、条項１、８、及び９のいずれかに記載の化合物。
【０４５９】
条項２６．式（Ｉｆ’）を有する化合物であって、
【化１９】
2020504754.tif 000222
式中、
Ａは、フェニル環、または、チエニル環であり、
Ｒ2は、１つのメチル、または、エチル基で置換したフェニルであり、
Ｒx及びＲyは、各々の存在時に、独立して、水素、または、Ｃ1-Ｃ4アルキルであり、
ｐは、４、５、６、７、８、９、または、１０であり、
Ｌ3は、存在せず、
2020504754.tif 000223
であり、及び
Ｚは、
2020504754.tif 000224
2020504754.tif 000225
である、条項２５に記載の化合物。
【０４６０】
条項２７．  前記化合物を、
１−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ）「３，２−ｂ］ピロール−５−（カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，１０−ジオキソ−１１，１４，１７−トリオキサ−２，９−ジアザノナデカン−１９−イル（２−（２−（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチル）カルバメート、
［（Ｅ）−３０−クロロ−６，１７−ジオキソ−５，１０，１３，１６，２１，２４−ヘキサオキサ−７，１８−ジアザトリアコン−２−エン−１−イル（１−（トランス−４）−（４−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，１０−ジオキソ−１１，１４，１７−トリオキサ−２，９−ジアザノナデカン−１９−イル）カルバメート、
［（Ｅ）−３０−クロロ−６，１７−ジオキソ−５，１０，１３，１６，２１，２４−ヘキサオキサ−７，１８−ジアザトリアコン−２−エン−１−イル（１−（トランス−４）−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，１０−ジオキソ−１１，１４，１７−トリオキサ−２，９−ジアザノナデカン１９−イル）カルバメート、
１−（トランス−４−（４−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，１０）−ジオキソ−１１，１４，１７−トリオキサ−２，９−ジアザノナデカン−１９−イル（２−（２−（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチル）カルバメート、
１−（トランス−４−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキシル））−１，１０−ジオキソ−１１，１４，１７−トリオキサ−２，９−ジアザノナデカン−１９−イル（２−（２  −（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチル）カルバメート、
２，５−ジオキソピロリジン−１−イル−１−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−（カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，８−ジオキソ−１２，１５−ジオキサ−２，９−ジアザオクタデカン−１８−オアート、
２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  １−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，８−ジオキソ−１２，１５，１８−トリオキサ−２，９−ジアザヘニコサン−２１−オアート、
２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  １−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，８−ジオキソ−１２，１５，１８，２１−テトラオキサ−２，９−ジアザテトラコサン−２４−オアート、
２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  １−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，１０−ジオキソ−１４，１７−ジオキサ−２，１１−ジアザイコサン−２０−オアート、
２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  １−（（１ｒ，４ｒ）−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル））−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，１０−ジオキソ−１４，１７，２０−トリオキサ−２，１１−ジアザトリコサン−２３−オアート、
２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  １−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，１０−ジオキソ−１４，１７，２０，２３−テトラオキサ−２，１１−ジアザヘキサコサン−２６−オアート、
２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  １−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，８−ジオキソ−１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０，３３−オクタオキサ−２，９−ジアザヘキサトリアコンタン−３６−オアート、
Ｎ−（トランス−４−（（６−（３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）プロパンアミド）ヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド、
Ｎ−（トランス−４−（（１−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−３，１３−ジオキソ−７，１０−ジオキサ−４，１４−ジアザイコサン）−２０−イル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド、
メチル  トランス−４−（４−（２−（（３−（ブロモメチル）フェニル）（エチル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン）−１−カルボキシラート、
メチル  トランス−４−（４−（２−（（３−（３−ブロモプロピル）フェニル）（エチル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン）−１−カルボキシラート、
２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  ８−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）オクタノアート、
メチル  ８−（トランス−４−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）オクタノアート、
メチル  ６−（トランス−４−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキサノアート、
２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  ８−（トランス−４−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）オクタノアート、
２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  ６−（トランス−４−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキサノアート、
フェニル  ８−（トランス−４−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）オクタノアート、
フェニル  ６−（トランス−４−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキサノアート、
１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（（６−ヨードヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド、
Ｎ−（トランス−４−（（６−ブロモヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド、
１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（（８−ヨードオクチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド、
４−フルオロフェニル  ８−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）オクタノアート、
３，５−ジフルオロフェニル  ８−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン）−１−カルボキサミド）オクタノアート、
４−シアノフェニル  ８−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）オクタノアート、
ナトリウム  １−（（８−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）オクタノイル）オキシ）−２，５−ジオキソピロリジン−３−スルホナート、
Ｎ−（トランス−４−（（５−（２−クロロアセトアミド）ペンチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド、
Ｎ−（トランス−４−（（６−（２−クロロアセトアミド）ヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド、
２，３，５，６−テトラフルオロフェニル  ８−（トランス−４−（４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）オクタノアート、
Ｎ−（トランス−４−（（５−（２−ブロモアセトアミド）ペンチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド、
Ｎ−（トランス−４−（（１−（４−（６−（（５−（（２−クロロ−６−メチルフェニル）カルバモイル）チアゾール−２−イル）アミノ）−２−メチルピリミジン−４−イル）ピペラジン−１−イル）−７，１７−ジオキソ−３，１０，１３−トリオキサ−６，１６−ジアザドコサン−２２−イル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ））−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド、
Ｎ−（２−クロロ−６−メチルフェニル）−２−（（６−（４−（１−（トランス−４−（１−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル））−１Ｈ−ピロール−２−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，８，１８−トリオキソ−１２，１５，２２−トリオキサ−２，９，１９−トリアザテトラコサン−２４−イル）ピペラジン−１−イル）−２−メチルピリミジン−４−イル）アミノ）チアゾール−５−カルボキサミド、
Ｎ−（トランス−４−（（１−（４−（６−（（５−（（２−クロロ−６−メチルフェニル）カルバモイル）チアゾール−２−イル）アミノ）−２−メチルピリミジン−４−イル）ピペラジン−１−イル）−７，１７−ジオキソ−３，１０，１３−トリオキサ−６，１６−ジアザドコサン−２２−イル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド、
Ｎ−（２−クロロ−６−メチルフェニル）−２−（（６−（４−（１−（トランス−４−（１−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，８，２４−トリオキソ−１２，１５，１８，２１，２８−ペンタオキサ−２，９，２５−トリアザトリアコンタン−３０−イル）ピペラジン−１−イル）−２−メチルピリミジン−４−イル）アミノ）チアゾール−５−カルボキサミド、
Ｎ−（トランス−４−（（１−（４−（６−（（５−（（２−クロロ−６−メチルフェニル）カルバモイル）チアゾール−２−イル）アミノ）−２−メチルピリミジン−４−イル）ピペラジン−１−イル）−７，２３−ジオキソ−３，１０，１３，１６，１９−ペンタオキサ−６，２２−ジアザオクタコサン−２８−イル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド、
Ｎ−（トランス−４−（（６−（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５−カルボキサミド）ヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド、
５−（（６−（トランス−４−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）ヘキシル）カルバモイル）−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−３’，６’−ジイル  ジアセタート、
Ｎ−（トランス−４−（（６−（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５−カルボキサミド）ヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド、
Ｎ−（トランス−４−（（６−（３’，６’ビス（ジメチルアミノ）−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−６−カルボキサミド）ヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド、
Ｎ−（トランス−４−（（６−（３’，６’−ビス（ジメチルアミノ）−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン）−６−カルボキサミド）ヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド、
Ｎ−（トランス−４−（（６−（３−（５，５−ジフルオロ−７，９−ジメチル−５Ｈ−５ｌ４，６ｌ４−ジピロロ［１，２−ｃ：２’，１’−ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン−３−イル）プロパンアミド）ヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド、
Ｎ−（トランス−４−（（６−（３−（５，５−ジフルオロ−７，９−ジメチル−５Ｈ−５ｌ４，６ｌ４−ジピロロ［１，２−ｃ：２’，１’−ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン−３−イル）プロパンアミド）ヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド、
Ｎ−（トランス−４−（（６−（３’，６’−ジアミノ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５，６−（カルボキサミド）ヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド、
Ｎ−（トランス−４−（（６−（３’，６’−ジアミノ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−６−（カルボキサミド）ヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５，６−カルボキサミド、
Ｎ−（トランス−４−（（８−（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン）−５−カルボキサミド）オクチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド、
Ｎ−（トランス−４−（（８−（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５−カルボキサミド）オクチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド、
Ｎ−（トランス−４−（（８−（３’，６’−ジアミノ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５，６−カルボキサミド）オクチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド、
Ｎ−（トランス−４−（（８−（３’，６’−ジアミノ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５−カルボキサミド）オクチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５，６−カルボキサミド、
Ｎ−（トランス−４−（（８−（３−（５，５−ジフルオロ−７，９−ジメチル−５Ｈ−５λ４，６λ４−ジピロロ［１，２−ｃ：２’，１’−ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン−３−イル）プロパンアミド）オクチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド、
Ｎ−（トランス−４−（（８−（３−（５，５−ジフルオロ−７，９−ジメチル−５Ｈ−５λ４，６λ４−ジピロロ［１，２−ｃ：２’，１’−ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン−３−イル）プロパンアミド）オクチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド、
Ｎ−（トランス−４−（（１−（３’，６’−ビス（ジメチルアミノ）−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−６−イル）−１，１１−ジオキソ−５，８−ジオキサ−２，１２−ジアザオクタデカン−１８−イル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド、
Ｎ−（トランス−４−（（１−（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５，６−イル）−１，１１−ジオキソ−５，８−ジオキサ−２，１２−ジアザイコサン−２０−イル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド、
Ｎ−（トランス−４−（（１−（３’，６’−ビス（ジメチルアミノ）−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−６−イル）−１，１１−ジオキソ−５，８−ジオキサ−２，１２−ジアザイコサン−２０−イル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド、
Ｎ−（トランス−４−（（８−（６−（（Ｚ）−２）−（Ｅ）−３−（１，１−ジメチル−１，４，５，６−テトラヒドロ−３λ４−ピロロ）［３，２，１−ｉｊ］キノリン−２−イル）アリーリデン）−１−メチル−１，２，５，６−テトラヒドロ−４Ｈ−ピロロ［３，２，１−ｉｊ］キノリン−１−イル）ヘキサンアミド）オクチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド、
Ｎ−（トランス−４−（（８−（４’，５’−ジクロロ−３’，６’−ジヒドロキシ−２’，７’−ジメトキシ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５，６−カルボキサミド）オクチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド、
Ｎ１−（２−（５，５−ジフルオロ−１，３−ジメチル−５Ｈ−５λ４，６λ４−ジピロロ［１，２−ｃ：２’，１’−ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン−１０−イル）エチル）−Ｎ４−（１−（トランス−４−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，１０−ジオキソ−１３，１６−ジオキサ−２，９−ジアザオクタデカン−１８−イル）スクシンアミド、
Ｎ１−（２−（５，５−ジフルオロ−１，３−ジメチル−５Ｈ−５λ４，６λ４−ジピロロ［１，２−ｃ：２’，１’−ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン−１０−イル）エチル）−Ｎ４−（８−（トランス−４−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキサン−１−カルボキサミド）オクチル）スクシンアミド、
Ｎ１−（２−（５，５−ジフルオロ−１，３−ジメチル−５Ｈ−５λ４，６λ４−ジピロロ［１，２−ｃ：２’，１’−ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン−１０−イル）エチル）−Ｎ４−（１−（トランス−４−（１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド）シクロヘキシル）−１，１２−ジオキソ−１５，１８−ジオキサ−２，１１−ジアザイコサン−２０−イル）スクシンアミド、
４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（（８−（（７−ニトロベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール−４−イル）オキシ）オクチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド、
４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４  −（（６−（（７−ニトロベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール−４−イル）オキシ）ヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド、
１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（（８−（（７−ニトロベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール−４−イル）オキシ）オクチル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド、
１−（２−（エチル（３−エチルフェニル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（（６−（（７−ニトロベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール−４−イル）オキシ）ヘキシル）カルバモイル）シクロヘキシル）−１Ｈ−インドール−２−カルボキサミド、
４−（２−エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（（（Ｒ）−３−（（３Ｓ，４Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−（（４−（４−メチルチアゾール−５−イル）ベンジル）カルバモイル）ピロリジン−１−カルボニル）−２，２−ジメチル−５，１８−ジオキソ−８，１１，１４−トリオキサ−４，１７−ジアザトリコサン−２３−イル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド、
４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（（（Ｒ）−３−（（３Ｓ，４Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−（（４−（４−メチルチアゾール−５−イル）ベンジル）カルバモイル）ピロリジン−１−カルボニル）−２，２−ジメチル−５，２１−ジオキソ−８，１１，１４，１７−テトラオキサ−４，２０−ジアザヘキサコサン−２６−イル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド、
４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（（（Ｒ）−３−（（３Ｓ，４Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−（（４−（４−メチルチアゾール−５−イル）ベンジル）カルバモイル）ピロリジン−１−カルボニル）−２，２−ジメチル−５，１８−ジオキソ−８，１１，１４−トリオキサ−４，１７−ジアザペンタコサン−２５−イル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド、及び
４−（２−（エチル（ｍ−トリル）アミノ）−２−オキソエチル）−Ｎ−（トランス−４−（（（Ｒ）−３−（（３Ｓ，４Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−（（４−（４−メチルチアゾール−５−イル）ベンジル）カルバモイル）ピロリジン−１−カルボニル）−２，２−ジメチル−５，２１−ジオキソ−８，１１，１４，１７−テトラオキサ−４，２０−ジアザオクタコサン−２８−イル）カルバモイル）シクロヘキシル）−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−カルボキサミド、または、
それらの塩、からなる群から選択する、条項１に記載の化合物。
【０４６１】
条項２８．Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ誘導ルシフェラーゼを阻害する方法であって、前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ誘導ルシフェラーゼを、条項１〜２７のいずれかに記載の化合物と接触させる、ことを含む前記方法。
【０４６２】
条項２９．  前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼが、配列番号２のポリペプチド配列を含む、条項２８に記載の方法。
【０４６３】
条項３０．  前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼを不可逆的に阻害する、条項２８に記載の方法。
【０４６４】
条項３１．  試料に含まれるＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼの発光を調節する方法であって、
（ａ）前記試料を、セレンテラジン基質と条項１〜３６のいずれかに記載の化合物とに接触させ、及び、
（ｂ）前記試料でのルシフェラーゼを検出する、ことを含み、
条項１〜２７のいずれかに記載の化合物が、前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼの発光の抑制を招く、前記方法。
【０４６５】
条項３２．  試料に含まれる第１のタンパク質と第２のタンパク質との間の相互作用を検出する方法であって、
（ａ）前記試料を、セレンテラジン基質と条項１〜２７のいずれか１項に記載の化合物とに接触させ、前記試料が、
（ｉ）第１の融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドであって、前記第１の融合タンパク質が、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼの第１の断片と第１のタンパク質を含む、前記第１のポリヌクレオチド、及び
（ｉｉ）第２の融合タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドであって、前記第２の融合タンパク質が、前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼの第２の断片と第２のタンパク質を含む、前記第２のポリヌクレオチドを含み、及び
（ｂ）前記試料での発光を検出する、ことを含み、
前記発光の検出が、前記第１のタンパク質と前記第２のタンパク質との間の相互作用を示す、前記方法。
【０４６６】
条項３３．  前記試料を、条項１〜２７のいずれか１項に記載の化合物と接触させる前に、前記試料を、前記セレンテラジン基質と接触させる、ことを含む、条項３１〜３２のいずれかに記載の方法。
【０４６７】
条項３４．  前記第１のタンパク質と前記第２のタンパク質とが相互作用すると、前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼの前記第１の断片と、前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼの前記第２の断片とが、前記セレンテラジン基質を安定に結合することができる全長酵素を再構成する、請求項３２に記載の方法。
【０４６８】
条項３５．  試料に含まれる第１のタンパク質と第２のタンパク質との間の相互作用を検出する方法であって、
（ａ）前記試料を、セレンテラジン基質と条項１〜２７のいずれか１項に記載の化合物とに接触させ、前記試料が、
（ｉ）第１の融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドであって、前記第１の融合タンパク質が、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼと第１のタンパク質とを含み、前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼは、生物発光ドナーである、前記第１のポリヌクレオチド、及び
（ｉｉ）第２の融合タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドであって、前記第２の融合タンパク質が、蛍光アクセプター分子及び第２のタンパク質を含む、前記第２のポリヌクレオチドを含み、及び
（ｂ）前記試料に含まれる生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）を検出する、ことを含み、このことは、前記生物発光ドナーと前記蛍光アクセプターとの相互作用または近接近を示す、前記方法。
【０４６９】
条項３６．  試料のプロテアーゼ活性を検出する方法であって、
（ａ）前記試料を、セレンテラジン基質と条項１〜２７のいずれか１項に記載の化合物と接触させ、前記試料が、プロテアーゼ感受性Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼ融合タンパク質を含み、
（ｂ）発光を測定し、
（ｃ）プロテアーゼを活性化し、及び
（ｄ）前記発光の測定を反復する、ことを含み、
工程（ｄ）での発光の増大は、プロテアーゼ活性の増大を示す、前記方法。
【０４７０】
条項３７．  試料のプロテアーゼ活性を検出する方法であって、
（ａ）前記試料を、セレンテラジン基質と条項１〜２７のいずれか１項に記載の化合物と接触させ、前記試料が、プロテアーゼ感受性Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼ融合タンパク質とエネルギー受容体とを含み、
（ｂ）前記ＢＲＥＴ比を測定し、
（ｃ）プロテアーゼを活性化し、及び
（ｄ）前記ＢＲＥＴ比の測定を反復する、ことを含み、
工程（ｄ）でのＢＲＥＴ比の減少は、プロテアーゼ活性の増大を示す、前記方法。
【０４７１】
条項３８．  試料からＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼ融合タンパク質を単離する方法であって、
（ａ）前記試料を、条項１〜２７のいずれか１項に記載の化合物と接触させ、前記試料が、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼ融合タンパク質を含み、
（ｂ）前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼ融合タンパク質を捕捉し、
（ｃ）工程（ｂ）で捕捉した前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼ融合タンパク質を単離する、ことを含む前記方法。
【０４７２】
条項３９．  前記試料が、細胞を含む、条項３１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【０４７３】
条項４０．  前記細胞が、前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼを含む、請求項３９に記載の方法。
【０４７４】
条項４１．  前記細胞が、前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼを発現する、条項３９に記載の方法。
【０４７５】
条項４２．  前記セレンテラジン基質が、セレンテラジン、セレンテラジン誘導体、セレンテラジン類似体、プロ−セレンテラジン、または、キノンでマスクしたセレンテラジンである、条項３１〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【０４７６】
条項４３．  生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）システムであって、第１の標的タンパク質と生物発光ドナー分子とを含み、前記生物発光ドナー分子が、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼである第１の融合タンパク質、第２の標的タンパク質と蛍光アクセプター分子とを含む第２の融合タンパク質、セレンテラジン基質、及び、条項１〜２７のいずれか１項に記載の化合物、を含む前記システム。
【０４７７】
条項４４．（ａ）条項１〜２７のいずれか１項に記載の化合物、及び
（ｂ）Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼ、を含むキット。
【０４７８】
条項４５．  前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼが、配列番号２のポリペプチド配列を含む、条項４４に記載のキット。
【０４７９】
条項４６．  セレンテラジン基質をさらに含む、条項４４〜４５のいずれかに記載のキット。
【０４８０】
条項４７．  発光アッセイを実施するための説明書をさらに含む、条項４４〜４６のいずれかに記載のキット。
【０４８１】
条項４８．  タンパク質分解を誘導する方法であって、
細胞を、条項１〜２７のいずれか１項に記載の化合物と接触させることを含み、前記細胞が、ルシフェラーゼ融合タンパク質及び少なくとも１つのプロテアーゼを含み、
それにより、前記融合タンパク質が、前記プロテアーゼによって分解される、前記方法。
【０４８２】
条項４９．  標的タンパク質を標識する方法であって、
標的タンパク質を、条項１に記載の化合物と接触させることを含み、Ｚが、−ＯＲ4であり、Ｒ4が、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、または、任意に置換された複素環であり、
それにより、前記標的タンパク質が、Ｒ4と共有結合を形成する、前記方法。
【０４８３】
条項５０．  試料に含まれる目的とする分子と標的タンパク質との間の相互作用を検出する方法であって、
（ａ）試料の第１の生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）シグナルを検出し、前記試料が、
（ｉ）融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、前記融合タンパク質は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼと標的タンパク質とを含み、前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼは、生物発光ドナーである、前記ポリヌクレオチド、
（ｉｉ）セレンテラジン基質、
（ｉｉｉ）条項１〜２７のいずれか１項に記載の化合物、及び
（ｉｖ）蛍光アクセプター分子と、前記標的タンパク質に結合するリガンドとを含む蛍光トレーサーを含み、
（ｂ）前記試料を、目的とする分子と接触させ、及び
（ｃ）前記試料に含まれる第２のＢＲＥＴシグナルを検出し、前記第１のＢＲＥＴシグナルと比較して、前記第２のＢＲＥＴシグナルが減少することは、前記目的とする分子と前記標的タンパク質との間の相互作用を示す、前記方法。
【０４８４】
条項５１．  前記標的タンパク質が、キナーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、または、ブロモドメイン含有タンパク質を含む、条項５０に記載の方法。
【０４８５】
条項５２．  生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）システムであって、標的タンパク質と生物発光ドナー分子とを含み、前記生物発光ドナー分子が、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼである融合タンパク質、蛍光アクセプター分子と前記標的タンパク質に結合するリガンドとを含む蛍光トレーサー、セレンテラジン基質、及び、条項１〜２７のいずれか１項に記載の化合物、を含む前記システム。
【０４８６】
条項５３．  試料に含まれる第１の標的タンパク質と第２の標的タンパク質との間の相互作用を検出する方法であって、
（ａ）前記試料を、セレンテラジン基質、条項１〜２７のいずれか１項に記載の化合物、及び、ＨＡＬＯＴＡＧ（登録商標）リガンドと接触させ、前記ＨＡＬＯＴＡＧ（登録商標）リガンドは、蛍光アクセプター分子を含み、前記試料は、
（ｉ）第１の融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドであって、前記第１の融合タンパク質は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼ、及び、第１の標的タンパク質を含み、前記Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼは、生物発光ドナーである前記第１のポリヌクレオチド、
（ｉｉ）第２の融合タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドであって、前記第２の融合タンパク質は、ＨＡＬＯＴＡＧ（登録商標）タンパク質、及び、第２の標的タンパク質を含む前記第２のポリヌクレオチドを含み、
（ｂ）前記試料の生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）を検出し、それにより、相互作用を検出し、あるいは、前記第１の標的タンパク質と前記第２の標的タンパク質とが近接近していることを示す、前記方法。
【０４８７】
条項５４．  生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）システムであって、第１の標的タンパク質と生物発光ドナー分子とを含み、前記生物発光ドナー分子が、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ由来ルシフェラーゼである第１の融合タンパク質、第２の標的タンパク質とＨＡＬＯＴＡＧ（登録商標）タンパク質とを含む第２の融合タンパク質、蛍光アクセプター分子を含むＨＡＬＯＴＡＧ（登録商標）リガンド、セレンテラジン基質、及び、条項１〜２７のいずれか１項に記載の化合物、を含む前記システム。
【０４８８】
付録
配列番号１−天然の成熟したＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼアミノ酸配列
ＦＴＬＡＤＦＶＧＤＷＱＱＴＡＧＹＮＱＤＱＶＬＥＱＧＧＬＳＳＬＦＱＡＬＧＶＳＶＴＰＩＱＫＶＶＬＳＧＥＮＧＬＫＡＤＩＨＶＩＩＰＹＥＧＬＳＧＦＱＭＧＬＩＥＭＩＦＫＶＶＹＰＶＤＤＨＨＦＫＩＩＬＨＹＧＴＬＶＩＤＧＶＴＰＮＭＩＤＹＦＧＲＰＹＰＧＩＡＶＦＤＧＫＱＩＴＶＴＧＴＬＷＮＧＮＫＩＹＤＥＲＬＩＮＰＤＧＳＬＬＦＲ−ＶＴＩＮＧＶＴＧＷＲＬＣＥＮＩＬＡ
【０４８９】
配列番号２−Ｎｌｕｃアミノ酸配列
ＭＶＦＴＬＥＤＦＶＧＤＷＲＱＴＡＧＹＮＬＤＱＶＬＥＱＧＧＶＳＳＬＦＱＮＬＧＶＳＶＴＰＩＱＲＩＶＬＳＧＥＮＧＬＫＩＤＩＨＶＩＩＰＹＥＧＬＳＧＤＱＭＧＱＩＥＫＩＦＫＶＶＹＰＶＤＤＨＨＦＫＶＩＬＨＹＧＴＬＶＩＤＧＶＴＰＮＭＩＤＹＦＧＲＰＹＥＧＩＡＶＦＤＧＫＫＩＴＶＴＧＴＬＷＮＧＮＫＩＩＤＥＲＬＩＮＰＤＧＳＬＬＦＲＶＴＩＮＧＶＴＧＷＲＬＣＥＲＩＬＡ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2020504754.tif 000290
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