(57)【要約】本発明は、ＨＬＡによりディスプレイされるヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）ペプチドに特異的に結合する抗原結合性タンパク質、ならびにこれらの結合性タンパク質を使用する治療方法および診断方法を提供する。ＨＰＶ−６、ＨＰＶ−１１、ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８亜型の主要なカプシドタンパク質であるＨＰＶ  Ｌ１およびＬ２を標的とするワクチンが感染を防止するために開発されているが、そのようなワクチンでは、確立された病変を有する対象を処置することはできないという課題が存在する。本発明は、このような従来技術の課題を解決する手段を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＬＡ−Ａ２により提示されるヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１６Ｅ７ペプチド（ＨＰＶ１６Ｅ７ペプチド）のコンフォメーションエピトープに特異的に結合する単離された抗原結合性タンパク質であって、前記コンフォメーションエピトープが、Ｙ１１、Ｄ１４、Ｌ１５、Ｐ１７およびＥ１８からなる群から選択される配列番号５３７の１つまたは複数のアミノ酸を含む、単離された抗原結合性タンパク質。
【請求項２】
（ａ）２５℃における表面プラズモン共鳴アッセイで測定されると、単量体ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７  １１−１９ペプチドに約２０ｎＭ未満の結合解離平衡定数（ＫＤ）で結合する；
（ｂ）２５℃における表面プラズモン共鳴アッセイで測定されると、単量体ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７  ８２−９０ペプチドに約２５ｎＭ未満の結合解離平衡定数（ＫＤ）で結合する；
（ｃ）発光アッセイによって決定されると、ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７  １１−１９ペプチドを発現する細胞に約６ｎＭ未満のＥＣ５０で結合し、予測されるオフターゲットペプチドを発現する細胞には結合しない；
（ｄ）発光アッセイによって決定されると、ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７  ８２−９０ペプチドを発現する細胞に約１ｎＭ未満のＥＣ５０で結合し、予測されるオフターゲットペプチドを発現する細胞には実質的に結合しない；
（ｅ）フローサイトメトリーアッセイによって決定されると、ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７  １１−１９ペプチドを発現する細胞に約３０ｎＭ未満のＥＣ５０で結合する；および
（ｆ）フローサイトメトリーアッセイによって決定されると、ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７  ８２−９０ペプチドを発現する細胞に約７５ｎＭ未満のＥＣ５０で結合する
からなる群から選択される性質を有する、請求項１に記載の単離された抗原結合性タンパク質。
【請求項３】
前記ＨＰＶ１６Ｅ７ペプチドが、ＹＭＬＤＬＱＰＥＴ（配列番号５３８）のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離された抗原結合性タンパク質。
【請求項４】
全長抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｔ−ボディ構築物、またはＣＡＲである、請求項１から３のいずれか一項に記載の単離された抗原結合性タンパク質。
【請求項５】
ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片である、請求項１から４のいずれか一項に記載の単離された抗原結合性タンパク質。
【請求項６】
表１に列挙されている重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）配列のいずれか１つに含有される３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）；ならびに表１に列挙されている軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）配列のいずれか１つに含有される３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の単離された抗原結合性タンパク質。
【請求項７】
表１に列挙されているＨＣＶＲ配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲを含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の単離された抗原結合性タンパク質。
【請求項８】
表１に列挙されているＬＣＶＲ配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の単離された抗原結合性タンパク質。
【請求項９】
（ａ）表１に列挙されているＨＣＶＲ配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲ；および（ｂ）表１に列挙されているＬＣＶＲ配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の単離された抗原結合性タンパク質。
【請求項１０】
（ａ）配列番号４、２０、３６、５２、６８、８４、１００、１１６、１３２、１４８、１６４、１８０、１９６、２１２、２２０、２３６、２５２、２６８、２８４、３００、３１６、３３２、３４８、３６４、３８０、３９６、４１２、４２８、４４４、４６０、４７６、４９２、５０８、および５２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１ドメイン；
（ｂ）配列番号６、２２、３８、５４、７０、８６、１０２、１１８、１３４、１５０、１６６、１８２、１９８、２１４、２２２、２３８、２５４、２７０、２８６、３０２、３１８、３３４、３５０、３６６、３８２、４１４、４３０、４４６、４６２、４７８、４９４、５１０、および５２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２ドメイン；
（ｃ）配列番号８、２４、４０、５６、７２、８８、１０４、１２０、１３６、１５２、１６８、１８４、２００、２１６、２２４、２４０、２５６、２７２、２８８、３０４、３２０、３３６、３５２、３６８、３８４、４００、４１６、４３２、４４８、４６４、４８０、４９６、５１２、および５２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３ドメイン；
（ｄ）配列番号１２、２８、４４、６０、７６、９２、１０８、１２４、１４０、１５６、１７２、１８８、２０４、２０４、２２８、２４４、２６０、２７６、２９２、３０８、３２４、３４０、３５６、３７２、３８８、４０４、４２０、４３６、４５２、４６８、４８４、５００、５１６、および５３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１ドメイン；
（ｅ）配列番号１４、３０、４６、６２、７８、９４、１１０、１２６、１４２、１５８、１７４、１９０、２０６、２３０、２４６、２６２、２７８、２９４、３１０、３２６、３４２、３５８、３７４、３９０、４０６、４２２、４３８、４５４、４７０、４８６、５０２、５１８、および５３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２ドメイン；ならびに
（ｆ）配列番号１６、３２、４８、６４、８０、９６、１１２、１２８、１４４、１６０、１７６、１９２、２０８、２３２、２４８、２６４、２８０、２９６、３１２、３２８、３４４、３６０、３７６、３９２、４０８、４２４、４４０、４５６、４７２、４８８、５０４、５２０、および５３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３ドメイン
を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の単離された抗原結合性タンパク質。
【請求項１１】
配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／１０６、１１４／１２２、１３０／１３８、１４６／１５４、１６２／１７０、１７８／１８６、１９４／２０２、２１０／２０２、２１８／２２６、２３４／２４２、２５０／２５８、２６６／２７４、２８２／２９０、２９８／３０６、３１４／３２２、３３０／３３８、３４６／３５４、３６２／３７０、３７８／３８６、３９４／４０２、４１０／４１８、４２６／４３４、４４２／４５０、４５８／４６６、４７４／４８２、４９０／４９８、５０６／５１４、および５２２／５３０からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、請求項１０に記載の単離された抗原結合性タンパク質。
【請求項１２】
配列番号２／１０、３４／４２、８２／９０、１９４／２０２、２８２／２９０、および５０６／５１４からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、請求項１１に記載の単離された抗原結合性タンパク質。
【請求項１３】
請求項１１に記載の抗原結合性タンパク質と結合について競合する、単離された抗原結合性タンパク質。
【請求項１４】
請求項１１に記載の抗原結合性タンパク質と同じエピトープに結合する、単離された抗原結合性タンパク質。
【請求項１５】
検出可能部分を含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の単離された抗原結合性タンパク質。
【請求項１６】
請求項１から１５のいずれか一項に記載のＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７に結合する単離された抗原結合性タンパク質および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１から１５のいずれか一項に記載の抗原結合性タンパク質のＨＣＶＲをコードするポリヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１８】
請求項１から１５のいずれか一項に記載の抗原結合性タンパク質のＬＣＶＲをコードするポリヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１９】
請求項１７または１８に記載のポリヌクレオチド分子を含むベクター。
【請求項２０】
請求項１９に記載のベクターを発現する細胞。
【請求項２１】
ＨＰＶ１６Ｅ７に関連する疾患または障害を有する対象を処置する方法であって、前記対象に、請求項１から１５のいずれか一項に記載の抗原結合性タンパク質または請求項１６に記載の医薬組成物を治療有効量で投与するステップを含み、それにより、前記対象を処置する、方法。
【請求項２２】
前記ＨＰＶ１６Ｅ７に関連する疾患または障害が、ＨＰＶ関連がんである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＨＰＶ関連がんが、扁平上皮細胞癌である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＨＰＶ関連がんが、子宮頸がん、肛門生殖器のがん、頭頸部がん、または中咽頭がんである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記抗原結合性タンパク質を第２の治療剤と組み合わせて前記対象に投与する、請求項２１から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記第２の治療剤が、ＰＤ−１阻害剤、ＣＴＬＡ−４阻害剤、腫瘍特異的抗原に対する抗体、ウイルス感染細胞抗原に対する抗体、ＰＤ−Ｌ１阻害剤、ＣＤ２０阻害剤、ＣＤ２０およびＣＤ３に対する二重特異性抗体、抗酸化剤などの栄養補助剤、ＶＥＧＦアンタゴニスト、化学療法剤、細胞傷害性薬剤、外科手術、放射線、ＮＳＡＩＤ、コルチコステロイド、抗ＨＰＶワクチン、および前記疾患または障害に付随する少なくとも１つの症状を好転させるために有用な任意の他の治療からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗原結合性タンパク質を皮下、静脈内、皮内、腹腔内、経口、筋肉内または頭蓋内投与する、請求項２１から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記抗原結合性タンパク質を、前記対象の体重１ｋｇ当たり約０．１ｍｇ〜体重１ｋｇ当たり約１００ｍｇの用量で投与する、請求項２１から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離された核酸分子であって、前記ＣＡＲが、ＨＬＡ−Ａ２により提示されるヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１６Ｅ７ペプチド（ＨＰＶ１６Ｅ７ペプチド）のコンフォメーションエピトープに特異的に結合する細胞外結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含む、単離された核酸分子。
【請求項３０】
前記細胞外結合性ドメインが、抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質である、請求項２９に記載の単離された核酸分子。
【請求項３１】
前記単離された抗原結合性タンパク質が、表１に列挙されている重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）配列のいずれか１つに含有される３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）；ならびに表１に列挙されている軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）配列のいずれか１つに含有される３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）を含む、請求項３０に記載の単離された核酸分子。
【請求項３２】
前記単離された抗原結合性タンパク質が、表１に列挙されているＨＣＶＲ配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲを含む、請求項３０または３１に記載の単離された核酸分子。
【請求項３３】
前記単離された抗原結合性タンパク質が、表１に列挙されているＬＣＶＲ配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む、請求項３０から３２のいずれか一項に記載の単離された核酸分子。
【請求項３４】
前記単離された抗原結合性タンパク質が、（ａ）表１に列挙されているＨＣＶＲ配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲ；および（ｂ）表１に列挙されているＬＣＶＲ配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む、請求項３０から３３のいずれか一項に記載の単離された核酸分子。
【請求項３５】
前記単離された抗原結合性タンパク質が、
（ａ）配列番号４、２０、３６、５２、６８、８４、１００、１１６、１３２、１４８、１６４、１８０、１９６、２１２、２２０、２３６、２５２、２６８、２８４、３００、３１６、３３２、３４８、３６４、３８０、３９６、４１２、４２８、４４４、４６０、４７６、４９２、５０８、および５２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１ドメイン；
（ｂ）配列番号６、２２、３８、５４、７０、８６、１０２、１１８、１３４、１５０、１６６、１８２、１９８、２１４、２２２、２３８、２５４、２７０、２８６、３０２、３１８、３３４、３５０、３６６、３８２、４１４、４３０、４４６、４６２、４７８、４９４、５１０、および５２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２ドメイン；
（ｃ）配列番号８、２４、４０、５６、７２、８８、１０４、１２０、１３６、１５２、１６８、１８４、２００、２１６、２２４、２４０、２５６、２７２、２８８、３０４、３２０、３３６、３５２、３６８、３８４、４００、４１６、４３２、４４８、４６４、４８０、４９６、５１２、および５２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３ドメイン；
（ｄ）配列番号１２、２８、４４、６０、７６、９２、１０８、１２４、１４０、１５６、１７２、１８８、２０４、２０４、２２８、２４４、２６０、２７６、２９２、３０８、３２４、３４０、３５６、３７２、３８８、４０４、４２０、４３６、４５２、４６８、４８４、５００、５１６、および５３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１ドメイン；
（ｅ）配列番号１４、３０、４６、６２、７８、９４、１１０、１２６、１４２、１５８、１７４、１９０、２０６、２３０、２４６、２６２、２７８、２９４、３１０、３２６、３４２、３５８、３７４、３９０、４０６、４２２、４３８、４５４、４７０、４８６、５０２、５１８、および５３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２ドメイン；ならびに
（ｆ）配列番号１６、３２、４８、６４、８０、９６、１１２、１２８、１４４、１６０、１７６、１９２、２０８、２３２、２４８、２６４、２８０、２９６、３１２、３２８、３４４、３６０、３７６、３９２、４０８、４２４、４４０、４５６、４７２、４８８、５０４、５２０、および５３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３ドメイン
を含む、請求項３０から３４のいずれか一項に記載の単離された核酸分子。
【請求項３６】
前記単離された抗原結合性タンパク質が、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／１０６、１１４／１２２、１３０／１３８、１４６／１５４、１６２／１７０、１７８／１８６、１９４／２０２、２１０／２０２、２１８／２２６、２３４／２４２、２５０／２５８、２６６／２７４、２８２／２９０、２９８／３０６、３１４／３２２、３３０／３３８、３４６／３５４、３６２／３７０、３７８／３８６、３９４／４０２、４１０／４１８、４２６／４３４、４４２／４５０、４５８／４６６、４７４／４８２、４９０／４９８、５０６／５１４、および５２２／５３０からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、請求項３０から３５のいずれか一項に記載の単離された核酸分子。
【請求項３７】
前記単離された抗原結合性タンパク質が、配列番号２／１０、３４／４２、８２／９０、１９４／２０２、２８２／２９０、および５０６／５１４からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、請求項３０から３２のいずれか一項に記載の単離された核酸分子。
【請求項３８】
配列番号５４０、５４１、５４２、５４３、５４４、または５４５のいずれか１つを含む、請求項３０から３７のいずれか一項に記載の単離された核酸分子。
【請求項３９】
前記単離された抗原結合性タンパク質が、ｓｃＦｖである、請求項３０から３８のいずれか一項に記載の単離された核酸分子。
【請求項４０】
請求項３０から３９のいずれか一項に記載の単離された核酸分子を含む、ベクター。
【請求項４１】
請求項４０に記載のベクターを含む、単離された免疫エフェクター細胞。
【請求項４２】
Ｔ−ボディである、請求項４１に記載の単離された免疫エフェクター細胞。
【請求項４３】
前記対象に請求項４１または４２に記載の免疫エフェクター細胞を投与するステップを含む、ＨＰＶに関連する疾患または障害を有する対象を処置する方法。
【請求項４４】
前記ＨＰＶに関連する疾患または障害が、ＨＰＶ関連がんである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記ＨＰＶ関連がんが、扁平上皮細胞癌である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記ＨＰＶ関連がんが、子宮頸がん、肛門生殖器のがん、頭頸部がん、または中咽頭がんである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記抗原結合性タンパク質を第２の治療剤と組み合わせて前記対象に投与する、請求項４３から４６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、その内容全体が参照により本明細書に明白に組み込まれる、２０１７年６月２８日に出願された米国仮出願第６２／５２５，９３７号の優先権を主張する。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に出願されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０１８年６月２７日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーの名称は１０３５５ＷＯ０１＿ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔであり、サイズは２５３，６００バイトである。
【０００３】
発明の分野
本発明は、ＨＬＡによりディスプレイされるヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）ペプチドに特異的に結合する抗原結合性タンパク質、ならびにこれらの結合性タンパク質を使用する治療方法および診断方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）は、世界的で極めて一般的である、小さな、エンベロープを有さないＤＮＡウイルスのグループである。ＨＰＶは、主に性的接触によって伝染し、大多数の人が性行為の開始直後にＨＰＶに感染する。
【０００５】
ＨＰＶには１７０種を超える型が存在し、その一部は、疣贅または良性乳頭腫を引き起こす可能性があり、その他の、そのうちの少なくとも１３種は、子宮頸がん、肛門生殖器のがん（肛門、陰茎、膣および外陰部のがん）、頭部／頸部がん、ならびに、喉の奥、舌の根元、および扁桃を含めた中咽頭がんを含めたがんを引き起こす可能性がある（高リスク型ＨＰＶとしても公知）。実際に、ＨＰＶは、全ての頭頸部扁平上皮細胞癌（ＨＮＳＣＣ）の２０〜４０％および子宮頸がんの１００％に存在する。
【０００６】
子宮頸がんは、発展途上地域に暮らす女性において２番目に多いがんであり、２０１２年には新規の症例が４４５，０００件（世界中の新規の症例の８４％）であったと推定される。２０１２年には、およそ２７０，０００名の女性が子宮頸がんにより死亡しており、これらの死亡の８５％よりも多くが、低所得国および中所得国において生じている。
【０００７】
全ての子宮頸がんおよび前がん性子宮頸部病変のおよそ７０％が、２つのＨＰＶ型（１６および１８）により引き起こされる。ＨＰＶ１６または１８などの高リスクＨＰＶ亜型に持続感染した際のがんの発症は、２種のウイルス腫瘍性タンパク質、Ｅ６およびＥ７の発現に主に起因し、これらのタンパク質は、病変において持続的に発現され、ＭＨＣクラスＩによって細胞表面に提示されるが、正常な細胞では発現されない。Ｅ６およびＥ７は、腫瘍抑制因子ｐ５３およびＲｂをプロテアソーム依存的な様式で分解することにより、ゲノムの不安定性および細胞形質転換を促進する。腫瘍は最初の細胞不死化事象の数年後に生じ、形質転換された表現型の維持、ならびに細胞成長停止および／またはアポトーシスの防止にはＥ６およびＥ７の持続的発現が必要とされる（McLaughlin-Drubin  M.E.  &  Miinger  K.,  Virology  (2009)  384:  335-344)。
【０００８】
ＨＰＶ−６、ＨＰＶ−１１、ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８亜型の主要なカプシドタンパク質であるＨＰＶ  Ｌ１およびＬ２を標的とするワクチンが感染を防止するために開発されているが、そのようなワクチンでは、確立された病変を有する対象を処置することはできない。したがって、子宮頸がんを有する対象の処置には、外科手術、照射療法、および化学療法などの高度に侵襲的で不健全な従来の手法が依然として使用されている。さらに、そのような処置では、初期子宮頸がんを有する対象に対しては利益がもたらされるが、進行したまたは再発性子宮頸がんを有する患者には有用性が限られている。
したがって、高い特異性でＨＰＶを標的とするため、ならびにＨＰＶによって引き起こされる子宮頸がんおよび他のがんを処置するための新しい治療戦略について、まだ対処されていない要求が当技術分野において存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】McLaughlin-Drubin  M.E.  &  Miinger  K.,  Virology  (2009)  384:  335-344
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の要旨
本発明は、ＨＬＡによりディスプレイされるヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１６Ｅ７ペプチド（ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７）のコンフォメーションエピトープに特異的に結合する抗原結合性タンパク質を提供する。本発明の抗原結合性タンパク質は、ＨＬＡによりディスプレイされるＨＰＶ１６Ｅ７に高度の特異性で結合し、１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれよりも多くのアミノ酸が異なる、ＨＬＡによりディスプレイされるペプチドには結合しない。本発明の抗原結合性タンパク質により、ＨＰＶ１６Ｅ７を発現しているがん細胞などの、ＨＰＶ１６Ｅ７ペプチド提示細胞（すなわち、ＭＨＣ分子、例えばＨＬＡ−Ａ２と結合したＨＰＶ１６Ｅ７ペプチドをその表面上に提示している細胞）の特異的標的化、および、一部の実施形態では、例えば、そのような細胞のＴ細胞媒介性死滅を刺激するためにＴ細胞活性化を刺激することが可能になる。さらに、検出可能部分と融合させた場合には、本発明の抗原結合性タンパク質により、ＨＰＶ１６Ｅ７陽性疾患または障害を、循環ＨＰＶ１６Ｅ７レベルよりも妥当な疾患進行の尺度であるＨＰＶ１６Ｅ７ペプチド提示細胞の数および分布の変化に対して高感度で診断および予後判定することが可能になる。
【００１１】
本発明の抗原結合性タンパク質は、全長抗体（例えば、ＩｇＧ１抗体またはＩｇＧ４抗体）などの抗体の場合もあり、抗体の抗原結合性部分（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２またはｓｃＦｖ断片）のみを含む場合もあり、また、機能性に影響を及ぼすため、例えば、残留するエフェクター機能を排除するために改変することができる（Reddy  et  al.,  2000,  J.  Immunol.  164:  1925-1933）。一部の実施形態では、本発明の抗原結合性タンパク質は、抗体またはその抗原結合性断片であり得る。ある特定の実施形態では、抗原結合性タンパク質は、二重特異性であり得る。
【００１２】
第１の態様では、本発明は、ＨＰＶ１６Ｅ７のアミノ酸残基１１〜１９または８２〜９０を含む、ＨＬＡによりディスプレイされるペプチドなどの、ＨＬＡによりディスプレイされるヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１６Ｅ７ペプチドのコンフォメーションエピトープに特異的に結合する単離された組換え抗原結合性タンパク質を提供する。ある特定の実施形態では、抗原結合性タンパク質は、抗体である。一部の実施形態では、抗体は、完全ヒト抗体である。
【００１３】
例示的な本発明の抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質が本明細書の表１および２に列挙されている。表１には、例示的な抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗体の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）、重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）、ならびに軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列識別子が記載されている。表２には、例示的な抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗体のＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３の核酸配列識別子が記載されている。
【００１４】
本発明は、表１に列挙されているＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれか、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様な配列から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲを含む抗原結合性タンパク質を提供する。
【００１５】
本発明は、表１に列挙されているＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれか、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様な配列から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲを含む抗原結合性タンパク質も提供する。
【００１６】
本発明は、表１に列挙されているＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかと表１に列挙されているＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかとの対を含むＨＣＶＲおよびＬＣＶＲアミノ酸配列対（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）を含む抗原結合性タンパク質も提供する。ある特定の実施形態によると、本発明は、表１に列挙されている例示的な抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質のいずれかに含有されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む抗原結合性タンパク質を提供する。ある特定の実施形態では、ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対は、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／１０６、１１４／１２２、１３０／１３８、１４６／１５４、１６２／１７０、１７８／１８６、１９４／２０２、２１０／２０２、２１８／２２６、２３４／２４２、２５０／２５８、２６６／２７４、２８２／２９０、２９８／３０６、３１４／３２２、３３０／３３８、３４６／３５４、３６２／３７０、３７８／３８６、３９４／４０２、４１０／４１８、４２６／４３４、４４２／４５０、４５８／４６６、４７４／４８２、４９０／４９８、５０６／５１４、および５２２／５３０からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対は、配列番号２／１０（例えば、Ｈ４ｓＨ１７３６４Ｎ）、３４／４２（例えば、Ｈ４ｓＨ１７６７０Ｐ）、８２／９０（例えば、Ｈ４ｓＨ１７６７５Ｐ）、１９４／２０２（例えば、Ｈ４ｓＨ１７９３０Ｎ２）、２８２／２９０（例えば、Ｈ４ｓＨ２１０６４Ｐ）、および５０６／５１４（例えば、Ｈ４ｓＨ１７３６３Ｎ）のうちの１つから選択される。
【００１７】
ある特定の実施形態では、本発明は、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含む抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質であって、前記ＨＣＶＲが、５つ以下のアミノ酸置換を有する表１に列挙されているアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＶＲが、５つ以下のアミノ酸置換を有する表１に列挙されているアミノ酸配列を含む、抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質を提供する。例えば、本発明は、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含む抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質であって、前記ＨＣＶＲが、５つ以下のアミノ酸置換を有する配列番号１９４のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＶＲが、５つ以下のアミノ酸置換を有する配列番号２０２のアミノ酸配列を含む、抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質を提供する。別の例示的な実施形態では、本発明は、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含む抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質であって、前記ＨＣＶＲが、少なくとも１つのアミノ酸置換を有する配列番号１９４のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＶＲが、少なくとも１つのアミノ酸置換を有する配列番号２０２のアミノ酸配列を含む、抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質を提供する。
【００１８】
本発明は、表１に列挙されているＨＣＤＲ１アミノ酸配列のいずれか、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様な配列から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）を含む抗原結合性タンパク質も提供する。
【００１９】
本発明は、表１に列挙されているＨＣＤＲ２アミノ酸配列のいずれか、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様な配列から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）を含む抗原結合性タンパク質も提供する。
【００２０】
本発明は、表１に列挙されているＨＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれか、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様な配列から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む抗原結合性タンパク質も提供する。
【００２１】
本発明は、表１に列挙されているＬＣＤＲ１アミノ酸配列のいずれか、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様な配列から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）を含む抗原結合性タンパク質も提供する。
【００２２】
本発明は、表１に列挙されているＬＣＤＲ２アミノ酸配列のいずれか、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様な配列から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）を含む抗原結合性タンパク質も提供する。
【００２３】
本発明は、表１に列挙されているＬＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれか、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様な配列から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む抗原結合性タンパク質も提供する。
【００２４】
本発明は、表１に列挙されているＨＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかと表１に列挙されているＬＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかとの対を含むＨＣＤＲ３およびＬＣＤＲ３アミノ酸配列対（ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３）を含む抗原結合性タンパク質も提供する。ある特定の実施形態によると、本発明は、表１に列挙されている例示的な抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質のいずれかに含有されるＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対を含む抗原結合性タンパク質を提供する。ある特定の実施形態では、ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対は、配列番号８／１６（例えば、Ｈ４ｓＨ１７３６４Ｎ）、４０／４８（例えば、Ｈ４ｓＨ１７６７０Ｐ）、８８／９６（例えば、Ｈ４ｓＨ１７６７５Ｐ）、２００／２０８（例えば、Ｈ４ｓＨ１７９３０Ｎ２）、２８８／２９６（例えば、Ｈ４ｓＨ２１０６４Ｐ）、および５１２／５２０（例えば、Ｈ４ｓＨ１７３６３Ｎ）からなる群から選択される。
【００２５】
本発明は、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含む抗原結合性タンパク質であって、前記ＨＣＶＲが、表１に列挙されているアミノ酸配列と１つのアミノ酸が異なるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、表１に列挙されているアミノ酸配列と１つのアミノ酸が異なるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、および表１に列挙されているアミノ酸配列と１つのアミノ酸が異なるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３を含む、抗原結合性タンパク質も提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含む抗原結合性タンパク質であって、前記ＬＣＶＲが、表１に列挙されているアミノ酸配列と１つのアミノ酸が異なるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、表１に列挙されているアミノ酸配列と１つのアミノ酸が異なるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、および表１に列挙されているアミノ酸配列と１つのアミノ酸が異なるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む、抗原結合性タンパク質を提供する。例えば、本発明は、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含む抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質であって、前記ＨＣＶＲが、配列番号１９６のアミノ酸配列または配列番号１９６と１つのアミノ酸が異なるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１９８のアミノ酸配列または配列番号１９８と１つのアミノ酸が異なるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、および配列番号２００のアミノ酸配列または配列番号２００と１つのアミノ酸が異なるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３を含む、抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質を提供する。別の例示的な実施形態では、本発明は、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含む抗原結合性タンパク質であって、前記ＬＣＶＲが、配列番号２０４のアミノ酸配列または配列番号２０４と１つのアミノ酸が異なるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号２０６のアミノ酸配列または配列番号２０６と１つのアミノ酸が異なるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号２０８のアミノ酸配列または配列番号２０８と１つのアミノ酸が異なるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む、抗原結合性タンパク質を提供する。
【００２６】
本発明は、表１に列挙されている例示的な抗原結合性タンパク質のいずれかに含有される６つのＣＤＲのセット（すなわち、ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３）を含む抗原結合性タンパク質も提供する。ある特定の実施形態では、ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３アミノ酸配列セットは、配列番号４−６−８−１２−１４−１６（例えば、Ｈ４ｓＨ１７３６４Ｎ）、３６−３８−４０−４４−４６−４８（例えば、Ｈ４ｓＨ１７６７０Ｐ）、８４−８６−８８−９２−９４−９６（例えば、Ｈ４ｓＨ１７６７５Ｐ）、１９６−１９８−２００−２０４−２０６−２０８（例えば、Ｈ４ｓＨ１７９３０Ｎ２）、２８４−２８６−２８８−２９２−２９４−２９６（例えば、Ｈ４ｓＨ２１０６４Ｐ）、および５０８−５１０−５１２−５１６−５１８−５２０（例えば、Ｈ４ｓＨ１７３６３Ｎ）からなる群から選択される。
【００２７】
関連する実施形態では、本発明は、表１に列挙されている例示的な抗原結合性タンパク質のいずれかによって定義されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対に含有される６つのＣＤＲのセット（すなわち、ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３）を含む抗原結合性タンパク質を提供する。例えば、本発明は、配列番号２／１０（例えば、Ｈ４ｓＨ１７３６４Ｎ）、３４／４２（例えば、Ｈ４ｓＨ１７６７０Ｐ）、８２／９０（例えば、Ｈ４ｓＨ１７６７５Ｐ）、１９４／２０２（例えば、Ｈ４ｓＨ１７９３０Ｎ２）、２８２／２９０（例えば、Ｈ４ｓＨ２１０６４Ｐ）、および５０６／５１４（例えば、Ｈ４ｓＨ１７３６３Ｎ）からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対に含有されるＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３アミノ酸配列セットを含む抗原結合性タンパク質を含む。
【００２８】
ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを同定するための方法および技法は、当技術分野で周知であり、本明細書に開示される指定のＨＣＶＲおよび／またはＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを同定するために使用することができる。ＣＤＲの境界を同定するために使用することができる例示的な慣習としては、例えば、Ｋａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、およびＡｂＭ定義が挙げられる。一般に述べると、Ｋａｂａｔ定義は配列変動性に基づき、Ｃｈｏｔｈｉａ定義は構造的ループ領域の場所に基づき、ＡｂＭ定義はＫａｂａｔ手法とＣｈｏｔｈｉａ手法の折衷である。例えば、Kabat,  "Sequences  of  Proteins  of  Immunological  Interest,"  National  Institutes  of  Health,  Bethesda,  Md.  (1991)；Al-Lazikani  et  al.,  J.  Mol.  Biol.  273:  927-948  (1997)；およびMartin  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  86:  9268-9272  (1989)を参照されたい。公共のデータベースも抗原結合性タンパク質内のＣＤＲ配列を同定するために利用可能である。
【００２９】
本発明は、改変されたグリコシル化パターンを有する抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質を含む。一部の実施形態では、望ましくないグリコシル化部位を除去するための改変、または、例えば抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）機能を増大させるために、オリゴ糖鎖上に存在するフコース部分を欠く抗体が有用であり得る（Shield  et  al.  (2002)  JBC  277:  26733を参照されたい）。他の適用では、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を改変するためにガラクトシル化の改変を行うことができる。
【００３０】
ある特定の実施形態では、本発明の抗原結合性タンパク質は、表１に列挙されているＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかと表１に列挙されているＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかとの対を含むＨＣＶＲおよびＬＣＶＲアミノ酸配列対（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）を含むモノクローナル抗体である。ある特定の実施形態では、モノクローナル抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭからなる群から選択されるアイソタイプのＦｃドメインおよびそのバリアントを含む。
【００３１】
本発明は、表３に列挙されているＨＣアミノ酸配列のいずれか、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様な配列から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む抗原結合性タンパク質またはその抗原結合性断片を提供する。
【００３２】
本発明は、表３に列挙されているＬＣアミノ酸配列のいずれか、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様な配列から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗原結合性タンパク質またはその抗原結合性断片も提供する。
【００３３】
本発明は、表３に列挙されているＨＣアミノ酸配列のいずれかと表３に列挙されているＬＣアミノ酸配列のいずれかとの対を含むＨＣおよびＬＣアミノ酸配列対（ＨＣ／ＬＣ）を含む抗原結合性タンパク質またはその抗原結合性断片も提供する。ある特定の実施形態によると、本発明は、表３に列挙されている例示的な抗ＰＤ−１抗体のいずれかに含有されるＨＣ／ＬＣアミノ酸配列対を含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。ある特定の実施形態では、ＨＣ／ＬＣアミノ酸配列対は、配列番号５７８／５７９、５８０／５８１、５８２／５８３、５８４／５８５、５８６／５８７、５８８／５８９、５９０／５９１、および５９２／５９３からなる群から選択される。
【００３４】
一態様では、本発明は、ＨＬＡ−ペプチド複合体に結合する抗原結合性タンパク質またはその抗原結合性断片であって、ＨＬＡ−ペプチド複合体に含まれるペプチドのアミノ酸残基の少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％と接触する、抗原結合性タンパク質またはその抗原結合性断片を提供する。ある特定の実施形態では、抗原結合性タンパク質またはその抗原結合性断片は、ＨＬＡ−ペプチド複合体に含まれるペプチドのアミノ酸残基の全てに「わたる」またはそれと接触する。ある特定の実施形態では、抗原結合性タンパク質またはその抗原結合性断片は、ＨＬＡ−ペプチド複合体に高い親和性および特異性で結合し、ここで、抗原結合性タンパク質またはその抗原結合性断片は、ディスプレイされたペプチドの全長と接触する。「接触」とは、本明細書で使用される場合、直接または水に媒介される水素結合、電荷−電荷相互作用、または疎水性／ファンデルワールス相互作用を含む。一実施形態では、抗原結合性タンパク質またはその抗原結合性断片は、ＨＬＡ−Ａ２−ＨＰＶ１６Ｅ７  １１−１９ペプチド複合体に結合し、ここで、抗原結合性タンパク質は、ペプチド１１〜１９（配列番号５３８）の１０個のアミノ酸残基のうち少なくとも６個、およびＨＬＡ−Ａ２に結合し、したがって、完全にＨＬＡ−Ａ２−ペプチド複合体にわたる。ある特定の実施形態では、抗原結合性タンパク質またはその抗原結合性断片は、ＨＣＶＲのＣＤＲおよびＬＣＶＲのＣＤＲを含み、ここで、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲはそれぞれ、表１に列挙されているＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ配列から選択されるアミノ酸配列を有する。一実施形態では、抗原結合性タンパク質は、完全ヒト抗原結合性タンパク質である。ある特定の実施形態では、完全ヒト抗原結合性タンパク質は、ファージディスプレイ法および技術を使用することでは得られない。一実施形態では、抗原結合性タンパク質は、ＩＧＫＶ１−３９亜型の軽鎖可変領域を含む。
【００３５】
ある特定の実施形態では、本発明は、ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７  １１−１９ペプチドに結合する抗原結合性タンパク質またはその抗原結合性断片であって、抗原結合性タンパク質が、配列番号５３８の１つまたは複数のアミノ酸に結合する、抗原結合性タンパク質またはその抗原性断片を提供する。一実施形態では、抗原結合性タンパク質は、配列番号５３８の少なくとも６つのアミノ酸に結合する。一実施形態では、抗原結合性タンパク質は、配列番号５３８のＹ１１、Ｄ１４、Ｌ１５、Ｐ１７およびＥ１８からなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸に結合する。
【００３６】
ある特定の実施形態では、本発明は、ＨＬＡ−Ａ２により提示されるヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１６Ｅ７ペプチド（ＨＰＶ１６Ｅ７ペプチド）のコンフォメーションエピトープに特異的に結合する抗原結合性タンパク質であって、コンフォメーションエピトープが、配列番号５３８の１つまたは複数のアミノ酸を含む、抗原結合性タンパク質を提供する。ある特定の実施形態では、コンフォメーションエピトープは、配列番号５３８のＹ１１、Ｄ１４、Ｌ１５、Ｐ１７およびＥ１８からなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸を含む。
【００３７】
本発明は、ＨＣＶＲのＣＤＲおよびＬＣＶＲのＣＤＲを含む抗原結合性タンパク質とＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７との特異的結合について競合する抗原結合性タンパク質であって、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲがそれぞれ、表１に列挙されているＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ配列から選択されるアミノ酸配列を有する、抗原結合性タンパク質も提供する。
【００３８】
本発明は、ＨＣＶＲのＣＤＲおよびＬＣＶＲのＣＤＲを含む参照抗原結合性タンパク質とＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７との結合について交差競合する抗原結合性タンパク質であって、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲがそれぞれ、表１に列挙されているＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ配列から選択されるアミノ酸配列を有する、抗原結合性タンパク質も提供する。
【００３９】
本発明は、ＨＣＶＲのＣＤＲおよびＬＣＶＲのＣＤＲを含む参照抗原結合性タンパク質と同じエピトープに結合する抗原結合性タンパク質であって、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲがそれぞれ、表１に列挙されているＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ配列から選択されるアミノ酸配列を有する、抗原結合性タンパク質も提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ＨＣＶＲのＣＤＲおよびＬＣＶＲのＣＤＲを含む参照抗原結合性タンパク質と同じエピトープに結合する抗原結合性タンパク質であって、ＨＣＶＲが、配列番号２、３４、８２、１９４、２８２および５０４からなる群から選択され、ＬＣＶＲが、配列番号１０、４２、９０、２０２、２９０および５１４からなる群から選択される、抗原結合性タンパク質を提供する。
【００４０】
一実施形態では、本発明は、ＨＬＡ−Ａ２により提示されるヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１６Ｅ７ペプチド（ＨＰＶ１６Ｅ７ペプチド）のコンフォメーションエピトープに特異的に結合する組換え型の単離された抗原結合性タンパク質であって、（ａ）２５℃における表面プラズモン共鳴アッセイで測定されると、単量体ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７  １１−１９ペプチドに約２０ｎＭ未満の結合解離平衡定数（ＫＤ）で結合する；（ｂ）２５℃における表面プラズモン共鳴アッセイで測定されると、単量体ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７  ８２−９０ペプチドに約２５ｎＭ未満の結合解離平衡定数（ＫＤ）で結合する；（ｃ）発光アッセイによって決定されると、ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７  １１−１９ペプチドを発現する細胞に約６ｎＭ未満のＥＣ５０で結合し、予測されるオフターゲットペプチドを発現する細胞には結合しない；（ｄ）発光アッセイによって決定されると、ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７  ８２−９０ペプチドを発現する細胞に約１ｎＭ未満のＥＣ５０で結合し、予測されるオフターゲットペプチドを発現する細胞には実質的に結合しない；（ｅ）フローサイトメトリーアッセイによって決定されると、ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７  １１−１９ペプチドを発現する細胞に約３０ｎＭ未満のＥＣ５０で結合する；（ｆ）フローサイトメトリーアッセイによって決定されると、ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７  ８２−９０ペプチドを発現する細胞に約７５ｎＭ未満のＥＣ５０で結合する；および（ｇ）コンフォメーションエピトープが、配列番号５３８の１つまたは複数のアミノ酸を含む、からなる群から選択される性質を有する、抗原結合性タンパク質を提供する。本明細書の他の箇所で開示されている通り、「オフターゲットペプチド」は、標的ペプチド（例えば、ＨＰＶ１６Ｅ７  １１−１９ペプチド）と１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれよりも多くのアミノ酸が異なるペプチドを指す。
【００４１】
第２の態様では、本発明は、抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質をコードする核酸分子を提供する。例えば、本発明は、表１に列挙されているＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供し、ある特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列挙されているＨＣＶＲ核酸配列のいずれか、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様な配列から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
【００４２】
本発明は、表１に列挙されているＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供し、ある特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列挙されているＬＣＶＲ核酸配列のいずれか、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様な配列から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
【００４３】
本発明は、表１に列挙されているＨＣＤＲ１アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供し、ある特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列挙されているＨＣＤＲ１核酸配列のいずれか、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様な配列から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
【００４４】
本発明は、表１に列挙されているＨＣＤＲ２アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供し、ある特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列挙されているＨＣＤＲ２核酸配列のいずれか、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様な配列から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
【００４５】
本発明は、表１に列挙されているＨＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供し、ある特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列挙されているＨＣＤＲ３核酸配列のいずれか、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様な配列から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
【００４６】
本発明は、表１に列挙されているＬＣＤＲ１アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供し、ある特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列挙されているＬＣＤＲ１核酸配列のいずれか、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様な配列から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
【００４７】
本発明は、表１に列挙されているＬＣＤＲ２アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供し、ある特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列挙されているＬＣＤＲ２核酸配列のいずれか、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様な配列から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
【００４８】
本発明は、表１に列挙されているＬＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供し、ある特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列挙されているＬＣＤＲ３核酸配列のいずれか、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様な配列から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
【００４９】
本発明は、ＨＣＶＲをコードする核酸分子であって、ＨＣＶＲが、３つのＣＤＲのセット（すなわち、ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３）を含み、ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３アミノ酸配列セットが、表１に列挙されている例示的な抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質のいずれかによって定義される、核酸分子も提供する。
【００５０】
本発明は、ＬＣＶＲをコードする核酸分子であって、ＬＣＶＲが、３つのＣＤＲのセット（すなわち、ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３）を含み、ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３アミノ酸配列セットが、表１に列挙されている例示的な抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質のいずれかによって定義される、核酸分子も提供する。
【００５１】
本発明は、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲの両方をコードする核酸分子であって、ＨＣＶＲが、表１に列挙されているＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列を含み、ＬＣＶＲが、表１に列挙されているＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列を含む、核酸分子も提供する。ある特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列挙されているＨＣＶＲ核酸配列のいずれか、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様な配列から選択されるポリヌクレオチド配列、および、表２に列挙されているＬＣＶＲ核酸配列のいずれか、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様な配列から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。本発明のこの態様によるある特定の実施形態では、核酸分子はＨＣＶＲおよびＬＣＶＲをコードし、ここで、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲはどちらも表１に列挙されている同じ抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質に由来する。
【００５２】
本発明は、表３に列挙されている重鎖アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供する。本発明は、表３に列挙されている軽鎖アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供する。
【００５３】
本発明は、重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）の両方をコードする核酸分子であって、ＨＣが、表３に列挙されているＨＣアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列を含み、ＬＣが、表３に列挙されているＬＣアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列を含む、核酸分子も提供する。
【００５４】
関連する態様では、本発明は、ポリペプチドを発現させることができる組換え発現ベクターであって、抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を含む組換え発現ベクターを提供する。例えば、本発明は、上記の核酸分子、すなわち、表１に記載されているＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲ配列のいずれかをコードする核酸分子のいずれかを含む組換え発現ベクターを含む。本発明は、ポリペプチドを発現させることができる組換え発現ベクターであって、抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質の重鎖および／または軽鎖を含む、組換え発現ベクターも提供する。例えば、本発明は、上記の核酸分子、すなわち、表２に記載されている重鎖または軽鎖配列のいずれかをコードする核酸分子のいずれかを含む組換え発現ベクターを含む。そのようなベクターが導入された宿主細胞、ならびに、宿主細胞を抗原結合性タンパク質の産生が可能になる条件下で培養し、そのように産生された抗原結合性タンパク質を回収することによって抗原結合性タンパク質を産生する方法も本発明の範囲内に含まれる。
【００５５】
第３の態様では、本発明は、治療有効量の、ＨＬＡ−Ａ２により提示されるＨＰＶ１６Ｅ７ペプチド（例えば、ＨＰＶ１６Ｅ７のアミノ酸残基１１〜１９または８２〜９０を含むペプチド）のコンフォメーションエピトープに特異的に結合する組換え型の単離された抗原結合性タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。関連する態様では、本発明は、抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質と第２の治療剤の組合せである組成物を特徴とする。一実施形態では、第２の治療剤は、抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質と有利に組み合わせられる任意の作用剤である。抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質と有利に組み合わせることができる例示的な作用剤としては、限定することなく、ＨＰＶに結合し、かつ／もしくはその複製もしくは感染をモジュレートする他の作用剤（他の抗体もしくはその抗原結合性断片などを含む）および／または免疫細胞活性化をモジュレートする作用剤が挙げられる。本発明の抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質と組み合わせて使用することができる追加的な治療薬は本明細書の他の箇所で開示されている。
【００５６】
第４の態様では、本発明は、ＨＰＶ１６Ｅ７陽性がんなどの、ＨＰＶに関連する疾患または障害を有する対象を処置するための方法を提供する。方法は、本発明の抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質または本発明の医薬組成物を、それを必要とする対象に治療有効量で投与することを含む。処置される障害は、本明細書に提示される抗原結合性タンパク質および組成物によって改善される、好転する、阻害されるまたは防止される任意の疾患または状態である。ある特定の実施形態では、本発明の抗原結合性タンパク質（または医薬組成物）を第２の治療剤と組み合わせて、それを必要とする対象に投与する。第２の治療剤は、Ｔ細胞共阻害剤に対する抗体、腫瘍細胞抗原に対する抗体、Ｔ細胞受容体に対する抗体、ウイルス感染細胞上のエピトープに対する抗体、細胞傷害性薬剤、抗がん薬、抗ウイルス薬、抗炎症薬（例えば、コルチコステロイド）、化学療法剤、外科手術、放射線療法、免疫抑制剤および当技術分野で公知の任意の他の薬物または治療からなる群から選択することができる。ある特定の実施形態では、第２の治療剤は、本発明の抗原結合性タンパク質に関連する副作用（複数可）が万一生じた場合には、そのようなあらゆる可能性のある副作用（複数可）を打ち消すまたは低減するのに役立つ作用剤であり得る。
【００５７】
ある特定の実施形態では、本発明は、ＨＰＶ関連がんの成長を抑制するための方法を提供する。例えば、本発明は、対象における原発腫瘍または転移性腫瘍に起因する腫瘍成長を抑制する方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ＨＰＶ関連がんを有する対象の生存（例えば、無増悪生存または全生存）を増強する方法を提供する。がんの例としては、これだけに限定されないが、頭頸部の扁平上皮細胞癌などの扁平上皮細胞癌、子宮頸がん、肛門生殖器のがん、中咽頭がんが挙げられる。
【００５８】
ある特定の実施形態では、本発明は、確立された腫瘍の成長を阻害または抑制するための方法を提供する。方法は、それを必要とする対象に、治療有効量の本発明の抗原結合性タンパク質を含む医薬組成物を投与することを含む。ある特定の実施形態では、抗原結合性タンパク質を第２の治療剤と組み合わせて投与する。
【００５９】
抗原結合性タンパク質、例えば抗体またはその抗原結合性断片は、皮下、静脈内、皮内、腹腔内、経口、筋肉内、または頭蓋内投与することができる。抗原結合性タンパク質、例えば抗体またはその抗原結合性断片は、対象の体重１ｋｇ当たり約０．１ｍｇ〜体重１ｋｇ当たり約１００ｍｇの用量で投与することができる。
【００６０】
第５の態様では、本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離された核酸分子を提供する。ＣＡＲは、ＨＬＡ−Ａ２により提示されるヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１６Ｅ７ペプチド（ＨＰＶ１６Ｅ７ペプチド）のコンフォメーションエピトープ、例えば、ＨＰＶ１６Ｅ７のアミノ酸残基１１〜１９または８２〜９０に特異的に結合する細胞外結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。一実施形態では、細胞外結合性ドメインは、抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質またはその抗原結合性断片である。例示的な本発明の抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質は、本明細書に記載の抗原結合性タンパク質のいずれかである。
【００６１】
例えば、ある特定の実施形態では、本発明のＣＡＲへの使用に適した抗原結合性タンパク質は、表１に列挙されている重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）配列のいずれか１つに含有される３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）；ならびに表１に列挙されている軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）配列のいずれか１つに含有される３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）を含む。
【００６２】
他の実施形態では、本発明のＣＡＲへの使用に適した抗原結合性タンパク質は、表１に列挙されているＨＣＶＲ配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲ；および／または表１に列挙されているＬＣＶＲ配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む。
【００６３】
一部の実施形態では、本発明のＣＡＲへの使用に適した抗原結合性タンパク質は、（ａ）表１に列挙されているＨＣＶＲ配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲ；および（ｂ）表１に列挙されているＬＣＶＲ配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む。
【００６４】
一実施形態では、本発明のＣＡＲへの使用に適した抗原結合性タンパク質は、（ａ）配列番号４、２０、３６、５２、６８、８４、１００、１１６、１３２、１４８、１６４、１８０、１９６、２１２、２２０、２３６、２５２、２６８、２８４、３００、３１６、３３２、３４８、３６４、３８０、３９６、４１２、４２８、４４４、４６０、４７６、４９２、５０８、および５２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１ドメイン；（ｂ）配列番号６、２２、３８、５４、７０、８６、１０２、１１８、１３４、１５０、１６６、１８２、１９８、２１４、２２２、２３８、２５４、２７０、２８６、３０２、３１８、３３４、３５０、３６６、３８２、３９８、４１４、４３０、４４６、４６２、４７８、４９４、５１０、および５２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２ドメイン；（ｃ）配列番号８、２４、４０、５６、７２、８８、１０４、１２０、１３６、１５２、１６８、１８４、２００、２１６、２２４、２４０、２５６、２７２、２８８、３０４、３２０、３３６、３５２、３６８、３８４、４００、４１６、４３２、４４８、４６４、４８０、４９６、５１２、および５２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３ドメイン；（ｄ）配列番号１２、２８、４４、６０、７６、９２、１０８、１２４、１４０、１５６、１７２、１８８、２０４、２２８、２４４、２６０、２７６、２９２、３０８、３２４、３４０、３５６、３７２、３８８、４０４、４２０、４３６、４５２、４６８、４８４、５００、５１６、および５３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１ドメイン；（ｅ）配列番号１４、３０、４６、６２、７８、９４、１１０、１２６、１４２、１５８、１７４、１９０、２０６、２３０、２４６、２６２、２７８、２９４、３１０、３２６、３４２、３５８、３７４、３９０、４０６、４２２、４３８、４５４、４７０、４８６、５０２、５１８、および５３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２ドメイン；ならびに（ｆ）配列番号１６．３２、４８、６４、８０、９６、１１２、１２８、１４４、１６０、１７６、１９２、２０８、２３２、２４８、２６４、２８０、２９６、３１２、３２８、３４４、３６０、３７６、３９２、４０８、４２４、４４０、４５６、４７２、４８８、５０４、５２０、および５３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３ドメインを含む。
【００６５】
さらなる実施形態では、本発明のＣＡＲへの使用に適した抗原結合性タンパク質は、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／１０６、１１４／１２２、１３０／１３８、１４６／１５４、１６２／１７０、１７８／１８６、１９４／２０２、２１０／２０２、２１８／２２６、２３４／２４２、２５０／２５８、２６６／２７４、２８２／２９０、２９８／３０６、３１４／３２２、３３０／３３８、３４６／３５４、３６２／３７０、３７８／３８６、３９４／４０２、４１０／４１８、４２６／４３４、４４２／４５０、４５８／４６６、４７４／４８２、４９０／４９８、５０６／５１４、および５２２／５３０からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対、例えば、配列番号２／１０、３４／４２、８２／９０、１９４／２０２、２８２／２９０、および５０６／５１４からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む。
【００６６】
一部の実施形態では、本発明のＣＡＲに使用するための単離された抗原結合性タンパク質は、ｓｃＦｖである。
【００６７】
他の態様では、本発明は、単離されたＣＡＲ核酸分子を含むベクター；およびそのようなベクターを含む免疫エフェクター細胞を提供する。
【００６８】
本発明のさらに他の態様では、ＨＰＶ１６Ｅ７陽性がん、例えば、扁平上皮細胞癌、例えば、子宮頸がん、頭頸部小細胞癌、肛門生殖器のがん、および中咽頭がんなどのＨＰＶに関連する疾患または障害を有する対象を処置するための方法が提供される。方法は、本発明のＣＡＲを含む免疫エフェクター細胞の集団を対象に投与することを含む。
【００６９】
一部の態様では、本発明は、例えば、対象または対象から得た試料中のＨＰＶ１６Ｅ７陽性細胞を検出するための方法を提供する。方法は、検出可能部分を含む本発明の抗原結合性タンパク質を、対象から得た細胞試料などの細胞と接触させるか、または対象に投与し、検出可能部分の存在を検出することを含む。
【００７０】
他の実施形態は、詳細な説明を精査することにより明らかになろう。
【発明を実施するための形態】
【００７１】
詳細な説明
本方法に関して記載する前に、記載されている特定の方法および実験条件は変動し得るので、本発明はそのような方法および条件に限定されないことが理解されるべきである。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書において使用される用語法は、特定の実施形態を説明する目的のものであり、限定することを意図するものではないことも理解されるべきである。
【００７２】
別段の定義のない限り、本明細書において使用される全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載の方法および材料と類似した、またはそれと等しい任意の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法および材料がここに記載されている。本明細書で言及されている全ての刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００７３】
「ヒトパピローマウイルス」（「ＨＰＶ」）という用語は、皮膚または粘膜細胞に感染する小さな、エンベロープを有さないデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ウイルスを指す。環状の二本鎖ウイルスゲノムはおよそ８ｋｂの長さである。ゲノムは、ウイルスの複製に関与する６つの初期タンパク質、ならびに、ウイルスの構造タンパク質である２つの後期タンパク質、Ｌ１およびＬ２をコードする。１７０種を超えるＨＰＶの型が同定されており、これらは数字で示される。ＨＰＶ−５などの一部のＨＰＶ型は、臨床症状を全く顕在化させることなく個体の寿命にわたって持続する感染を確立し得る。ＨＰＶ１型および２型は、一部の感染個体において疣贅を引き起こす可能性がある。ＨＰＶ６型および１１型は、生殖器疣贅および呼吸器乳頭腫症を引き起こす可能性がある。ＨＰＶ１６型、１８型、３１型、３３型、３５型、３９型、４５型、５１型、５２型、５６型、５８型、５９型、６８型、７３型、および８２型は、発がん性であると考えられる。
【００７４】
「ＨＰＶ１６Ｅ７」という用語は、Ｅ７で示されるＨＰＶ１６型初期遺伝子、および、当該遺伝子から翻訳されるタンパク質を指す。
【００７５】
全長ＨＰＶ１６Ｅ７のアミノ酸配列はＧｅｎＢａｎｋにおいて受託番号ＮＰ＿０４１３２６．１（配列番号５３７）で提供される。「ＨＰＶ１６Ｅ７」という用語は、組換えＨＰＶ１６Ｅ７またはその断片を含む。この用語は、例えば、ヒスチジンタグ、マウスもしくはヒトＦｃ、またはＲＯＲ１などのシグナル配列とカップリングしたＨＰＶ１６Ｅ７またはその断片も包含する。ある特定の実施形態では、この用語は、ＨＬＡ−Ａ２に関しては、ＨＬＡ−Ａ２と連結した、またはＨＬＡ−Ａ２によってディスプレイされるＨＰＶ１６Ｅ７またはその断片を含む。
【００７６】
「ＨＬＡ」という用語は、ヒトにおける主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）タンパク質をコードする遺伝子複合体であるヒト白血球抗原（ＨＬＡ）系または複合体を指す。これらの細胞表面タンパク質は、ヒトにおける免疫系の制御に関与する。ＭＨＣクラスＩ（Ａ、Ｂ、およびＣ）に対応するＨＬＡは、細胞の内側からペプチドを提示する。
【００７７】
「ＨＬＡ−Ａ」という用語は、ＨＬＡ−Ａ遺伝子座によってコードされるヒト白血球抗原（ＨＬＡ）の群を指す。ＨＬＡ−Ａは、ヒトＭＨＣクラスＩ細胞表面受容体の３つの主要な型のうちの１つである。当該受容体は、ヘテロ二量体であり、重鎖α鎖およびより小さなβ鎖で構成される。α鎖はバリアントＨＬＡ−Ａ遺伝子によってコードされ、β鎖（β２−ミクログロブリン）は不変β２ミクログロブリン分子である。
【００７８】
「ＨＬＡ−Ａ２」という用語は、ＨＬＡ−Ａ遺伝子座における１つの特定のクラスＩ主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）対立遺伝子群である；α鎖はＨＬＡ−Ａ＊０２遺伝子によってコードされ、β鎖はβ２−ミクログロブリンまたはＢ２Ｍ遺伝子座によってコードされる。
【００７９】
「抗原結合性タンパク質」、「結合性タンパク質」または「結合性分子」という用語は、本明細書で使用される場合、ＨＬＡ−Ａ２により提示されるヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１６Ｅ７ペプチド（ＨＰＶ１６Ｅ７ペプチド）のコンフォメーションエピトープ、例えば、アミノ酸残基１１〜１９または８２〜９０を含むＨＬＡ−Ａ２によりディスプレイされるペプチドなどの目的の分子に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位を含有する分子を含む。結合性タンパク質は、全長抗体もしくは抗体の抗原結合性断片などの抗体、またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、または任意の他のポリペプチド、例えば、受容体−抗体（Ｒａｂ）タンパク質であり得る。
【００８０】
「ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質」または「ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質」などの用語は、ＨＬＡ−Ａ２によるＨＰＶ１６Ｅ７のペプチド断片、例えば、アミノ酸残基１１〜１９またはアミノ酸残基８２〜９０の提示によってコンフォメーションエピトープに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分などの抗原結合性タンパク質を指す。ある特定の実施形態では、コンフォメーションエピトープは、細胞の表面上にＨＬＡ−Ａ２により提示されるＨＰＶ１６Ｅ７ペプチドによって創出される。
【００８１】
「エピトープ」という用語は、パラトープとして公知の抗原結合性タンパク質の可変領域内の特異的な抗原結合性部位と相互作用する抗原性決定因子を指す。単一の抗原は、１つよりも多くのエピトープを有し得る。したがって、異なる抗原結合性タンパク質は抗原上の異なる領域に結合し得、異なる生物学的影響を有し得る。「エピトープ」という用語は、Ｂ細胞および／またはＴ細胞が応答する抗原上の部位も指す。エピトープは、抗原結合性タンパク質が結合する抗原の領域も指す。エピトープは、構造的または機能的と定義することができる。機能的エピトープは、一般に、構造的エピトープのサブセットであり、相互作用の親和性に直接寄与する残基を有する。エピトープはまた、「コンフォメーション」でもあり得る、すなわち、非直線的アミノ酸で構成される。ある特定の実施形態では、エピトープは、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基、またはスルホニル基などの、分子の化学的に活性な表面の群分けである決定因子を含み得、ある特定の実施形態では、特定の３次元構造特性、および／または特定の電荷特性を有し得る。
【００８２】
本発明の一部の実施形態では、結合性タンパク質は、抗体またはその抗原結合性断片、例えば、全長抗体またはその抗原結合性断片である。
【００８３】
「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、ジスルフィド結合によって相互接続した２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖の４つのポリペプチド鎖で構成される免疫グロブリン分子（すなわち、「全抗体分子」）、ならびにその多量体（例えば、ＩｇＭ）またはその抗原結合性断片を指すものとする。各重鎖は、重鎖可変領域（「ＨＣＶＲ」または「ＶＨ」）および重鎖定常領域（ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３で構成される）で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（「ＬＣＶＲ」または「ＶＬ」）および軽鎖定常領域（ＣＬ）で構成される。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性領域と、その間に散在する、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存された領域にさらに細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲで構成され、アミノ末端からカルボキシ末端まで、以下の順序で配置される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。本発明のある特定の実施形態では、抗体（またはその抗原結合性断片）のＦＲは、ヒト生殖細胞系列配列と同一であってもよく、または天然にもしくは人工的に改変されていてもよい。アミノ酸コンセンサス配列は、２つまたはそれよりも多くのＣＤＲの並列分析に基づいて定義することができる。
【００８４】
１つもしくは複数のＣＤＲ残基の置換または１つもしくは複数のＣＤＲの省略も可能である。１つまたは２つのＣＤＲを結合のために分配することができる、抗体などの抗原結合性タンパク質が科学文献に記載されている。Padlan  et  al.（1995  FASEB  J.  9:  133-139）は、抗体とそれらの抗原の接触領域を公開された結晶構造に基づいて分析し、ＣＤＲ残基の約５分の１〜３分の１のみが抗原と実際に接触すると結論づけた。Padlanは、１つまたは２つのＣＤＲが抗原と接触するアミノ酸を有さない多くの抗体も見いだした（Vajdos  et  al.  2002  J  Mol  Biol  320:  415-428も参照されたい）。
【００８５】
抗原と接触しないＣＤＲ残基は、以前の研究に基づき、Ｃｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲの外側にあるＫａｂａｔ  ＣＤＲの領域から、分子モデリングによって、および／または経験的に同定することができる（例えば、ＣＤＲＨ２の残基Ｈ６０〜Ｈ６５は多くの場合必要でない）。ＣＤＲまたはその残基（複数可）が省略される場合、通常それは別のヒト抗体配列またはそのような配列のコンセンサスにおける対応する位置を占有するアミノ酸で置換される。ＣＤＲ内の置換の位置および置換するアミノ酸も経験的に選択することができる。経験的な置換は、保存的置換または非保存的置換であり得る。
【００８６】
本明細書に開示される抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質、例えば、完全ヒト抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７モノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、またはＣＡＲは、対応する生殖細胞系列配列と比較して、重鎖および軽鎖可変ドメインのフレームワークおよび／またはＣＤＲ領域に１つまたは複数のアミノ酸置換、挿入および／または欠失を含み得る。そのような突然変異は、本明細書に開示されるアミノ酸配列を、例えば公共の抗体配列データベースから入手可能な生殖細胞系列配列と比較することによって容易に確認することができる。本発明は、本明細書に開示されるアミノ酸配列のいずれかに由来する抗原結合性タンパク質、例えば抗体もしくはその抗原結合性断片、またはＣＡＲを含み、ここで、１つまたは複数のフレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内の１つまたは複数のアミノ酸が、抗原結合性タンパク質が由来する生殖細胞系列配列の対応する残基（複数可）、または別のヒト生殖細胞系列配列の対応する残基（複数可）、または対応する生殖細胞系列残基（複数可）の保存的アミノ酸置換（そのような配列変化は、本明細書ではまとめて「生殖細胞系列突然変異」と称される）に突然変異している。当業者は、本明細書に開示される重鎖および軽鎖可変領域配列から開始して、１つまたは複数の個々の生殖細胞系列突然変異またはこれらの組合せを含む多数の抗原結合性タンパク質、例えば抗体もしくはその抗原結合性断片、またはＣＡＲを容易に作製することができる。ある特定の実施形態では、ＶＨドメインおよび／またはＶＬドメイン内のフレームワークおよび／またはＣＤＲ残基の全てが、抗原結合性タンパク質、例えば抗体が由来する元の生殖細胞系列配列において見いだされる残基にまた突然変異して戻っている。他の実施形態では、ある特定の残基のみ、例えば、ＦＲ１の最初の８アミノ酸内もしくはＦＲ４の最後の８アミノ酸内に見いだされる突然変異した残基のみ、またはＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３内に見いだされる突然変異した残基のみが、元の生殖細胞系列配列にまた突然変異して戻っている。他の実施形態では、フレームワークおよび／またはＣＤＲ残基（複数可）の１つまたは複数が、異なる生殖細胞系列配列（すなわち、抗体が元々由来する生殖細胞系列配列とは異なる生殖細胞系列配列）の対応する残基（複数可）に突然変異している。さらに、本発明の抗原結合性タンパク質、例えば抗体もしくはその抗原結合性断片、またはＣＡＲは、フレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内に２つまたはそれよりも多くの生殖細胞系列突然変異の任意の組合せを含有し得、ここで、例えば、ある特定の個々の残基は特定の生殖細胞系列配列の対応する残基に突然変異しており、一方で、元の生殖細胞系列配列とは異なるある特定の他の残基は、維持されているまたは異なる生殖細胞系列配列の対応する残基に突然変異している。１つまたは複数の生殖細胞系列突然変異を含有する抗原結合性タンパク質、例えば抗体および抗原結合性断片が得られたら、例えば、結合特異性の改善、結合親和性の増大、アンタゴニストまたはアゴニスト生物学的性質の改善または増強（場合によっては）、免疫原性の低下などの１つまたは複数の所望の性質について容易に試験することができる。この一般的な様式で得られる抗原結合性タンパク質、例えば抗体もしくはその抗原結合性断片、またはＣＡＲは本発明の範囲内に包含される。
【００８７】
本発明は、１つまたは複数の保存的置換を有する本明細書に開示されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかのバリアントを含む抗原結合性タンパク質、例えば、完全ヒト抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７モノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、またはＣＡＲも含む。例えば、本発明は、例えば、本明細書に開示されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかと比べて１０またはそれ未満、８またはそれ未満、６またはそれ未満、４またはそれ未満などの保存的アミノ酸置換を伴うＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列を有する抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質を含む。
【００８８】
「ヒト抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を含むものとする。本発明のヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、例えば、ＣＤＲ、特にＣＤＲ３に、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるランダム突然変異誘発もしくは部位特異的突然変異誘発によって、またはｉｎ  ｖｉｖｏにおける体細胞突然変異によって導入された突然変異）を含み得る。しかし、「ヒト抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、別の哺乳動物種（例えば、マウス）の生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列がヒトＦＲ配列に移植されたｍＡｂを含むものではない。この用語は、非ヒト哺乳動物において、または非ヒト哺乳動物の細胞において組換えによって作製された抗体を包含する。この用語は、ヒト対象から単離されたまたはヒト対象において生成された抗体を含むものではない。
【００８９】
「組換え」という用語は、本明細書で使用される場合、例えばＤＮＡスプライシングおよびトランスジェニック発現を含む、組換えＤＮＡ技術として当技術分野で公知の技術または方法によって創出されたか、発現されたか、単離されたか、または得られた、本発明の抗原結合性タンパク質、例えば抗体またはその抗原結合性断片を指す。この用語は、例えば、非ヒト哺乳動物（トランスジェニック非ヒト哺乳動物、例えば、トランスジェニックマウスを含む）、もしくは細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）発現系において発現された、または組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗原結合性タンパク質、例えば抗体を指す。
【００９０】
本明細書で使用される場合、「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」という用語は、本明細書では互換的に使用され、抗原（例えば、ＨＬＡ−Ａ２によりディスプレイされるＨＰＶ１６Ｅ７ペプチド、例えば、ＨＰＶ１６Ｅ７のアミノ酸残基１１〜１９または８２〜９０を含むペプチドのコンフォメーションエピトープ）に結合することができる細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含む組換え融合タンパク質を指す。
【００９１】
「免疫エフェクター細胞」は、本明細書で使用される場合、１つまたは複数のエフェクター機能（例えば、細胞傷害性細胞死滅活性、サイトカインの分泌、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣの誘導）を有する免疫系の任意の細胞を指す。一実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲと共に使用される免疫エフェクター細胞は、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ；ＣＤ８＋Ｔ細胞）およびヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ；ＣＤ４＋Ｔ細胞）である。本発明では、他のＴ細胞の集団、例えば、ナイーブＴ細胞およびメモリーＴ細胞も有用である。当業者には理解される通り、他の細胞を本明細書に記載のＣＡＲと共に免疫エフェクター細胞として使用することもできる。具体的には、免疫エフェクター細胞は、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、好中球、およびマクロファージも含む。免疫エフェクター細胞は、エフェクター細胞の前駆体も含み、そのような前駆細胞を、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて免疫エフェクター細胞に分化するように誘導することができる。したがって、この点について、免疫エフェクター細胞は、対象に投与されると成熟免疫エフェクター細胞に分化する、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて成熟免疫エフェクター細胞に分化するように誘導することができる、臍帯血、骨髄または動員末梢血に由来する細胞のＣＤ３４＋集団内に含有される造血幹細胞（ＨＳＣ）などの免疫エフェクター細胞の前駆体を含む。
【００９２】
本明細書に開示される通り、「オフターゲットペプチド」という用語は、標的ペプチド（例えば、ＨＰＶ１６  Ｅ７  １１−１９ペプチド）と１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれよりも多くのアミノ酸が異なるペプチドを指す。ある特定の実施形態では、この用語は、標的ペプチドと３つ未満のアミノ酸または３つのアミノ酸が異なるペプチドを含む。例えば、９−ｍｅｒペプチドに関しては、１つ、２つ、または３つのアミノ酸が標的ペプチドと同一でない場合、「オフターゲット」ペプチドと考えられる。ある特定の実施形態では、アミノ酸同一性は、「類似性の程度」（ＤｏＳ）という用語で表される。９−ｍｅｒペプチド内の６つまたはそれよりも多くのアミノ酸が同一である場合、ＤｏＳは６である。ある特定の実施形態では、ＤｏＳが６以上のペプチドを「オフターゲット」ペプチドとみなす。「オフターゲット」ペプチドという用語は、配列相同性に基づいて標的ペプチドと同様であり、ＨＬＡ−Ａ２に結合することが予測され、必須正常組織において発現されるタンパク質に含まれるペプチドも指す。
【００９３】
「特異的に結合する（specifically  binds）」、または「特異的に結合する（binds  specifically  to）」などという用語は、抗原結合性タンパク質、例えば抗体もしくはその抗原結合性断片、またはＣＡＲが、生理的条件下で比較的安定な抗原と複合体を形成することを意味する。特異的結合は、平衡解離定数が少なくとも約１×１０−８Ｍまたはそれ未満であることによって特徴付けることができる（例えば、ＫＤが小さいほど密接な結合を示す）。２つの分子が特異的に結合するかどうかを決定するための方法は当技術分野で周知であり、それらの例として、例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴などが挙げられる。本明細書に記載の通り、抗原結合性タンパク質、例えば抗体は、表面プラズモン共鳴、例えばＢＩＡＣＯＲＥ（商標）により、ＨＬＡ−Ａ２により提示されるヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１６Ｅ７ペプチド（ＨＰＶ１６Ｅ７ペプチド）のコンフォメーションエピトープ、例えば、ＨＰＶ１６Ｅ７のアミノ酸残基１１〜１９または８２〜９０を含むペプチドに特異的に結合することが同定されている。
【００９４】
「高親和性」抗原結合性タンパク質、例えば抗体という用語は、ＨＬＡ−Ａ２により提示されるＨＰＶ１６Ｅ７ペプチド、例えば、ＨＰＶ１６Ｅ７のアミノ酸残基１１〜１９または８２〜９０を含むペプチドのコンフォメーションエピトープに対して、表面プラズモン共鳴、例えばＢＩＡＣＯＲＥ（商標）、または溶液親和性ＥＬＩＳＡによって測定されるように、少なくとも１０−８Ｍ；好ましくは１０−９Ｍ；より好ましくは１０−１０Ｍ、なおより好ましくは１０−１１Ｍ、なおより好ましくは１０−１２ＭのＫＤで表される結合親和性を有する抗原結合性タンパク質、例えば、ｍＡｂを指す。
【００９５】
「遅い解離速度」、「Ｋｏｆｆ」または「ｋｄ」という用語は、抗原結合性タンパク質がＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７から、表面プラズモン共鳴、例えばＢＩＡＣＯＲＥ（商標）によって決定されると１×１０−３ｓ−１またはそれ未満、好ましくは１×１０−４ｓ−１またはそれ未満の速度定数で解離することを意味する。
【００９６】
抗原結合性タンパク質（例えば、抗体）の「抗原結合性部分」、抗原結合性タンパク質（例えば、抗体）の「抗原結合性断片」などの用語は、本明細書で使用される場合、抗原に特異的に結合して複合体を形成する、天然に存在する、酵素により入手可能な、合成の、または遺伝子操作された任意のポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。抗体の「抗原結合性断片」、または「抗体断片」という用語は、本明細書で使用される場合、ＨＬＡ−Ａ２とカップリングした、ＨＬＡ−Ａ２により提示されるＨＰＶ１６Ｅ７ペプチド、例えば、ＨＰＶ１６Ｅ７のアミノ酸残基１１〜１９または８２〜９０を含むペプチドのコンフォメーションエピトープに結合する能力を保持する抗体の１つまたは複数の断片を指す。
【００９７】
特定の実施形態では、本発明の抗原結合性タンパク質、例えば抗体または抗体断片、またはＣＡＲは、リガンド、検出可能部分、または、ＨＰＶ１６Ｅ７陽性がんなどのＨＰＶに関連する疾患もしくは障害もしくは慢性ＨＰＶ感染を含めたＨＰＶ感染を含めた疾患もしくは状態を処置するために有用な、細胞毒、第２の抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質、腫瘍特異的抗原に対する抗体、抗がん薬、もしくは任意の他の治療用部分などの治療用部分（「免疫コンジュゲート」）などの部分とコンジュゲートすることができる。
【００９８】
「単離された抗原結合性タンパク質」、例えば、単離された抗体は、本明細書で使用される場合、異なる抗原特異性を有する他の抗原結合性タンパク質、例えば抗体（Ａｂ）を実質的に含まない抗原結合性タンパク質、例えば抗体を指すものとする（例えば、ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７またはその断片に特異的に結合する単離された抗体は、ＨＬＡ−Ａ２により提示されるＨＰＶ１６Ｅ７ペプチドのコンフォメーションエピトープ以外の抗原に特異的に結合する抗原結合性タンパク質、例えば抗体を実質的に含まない）。
【００９９】
「表面プラズモン共鳴」という用語は、本明細書で使用される場合、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）システム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、ＳｗｅｄｅｎおよびＰｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）を使用してバイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変更を検出することによるリアルタイム生体分子相互作用の分析を可能にする光学現象を指す。
【０１００】
「ＫＤ」という用語は、本明細書で使用される場合、特定の抗原結合性タンパク質−抗原相互作用の平衡解離定数を指すものとする。
【０１０１】
「交差競合する」という用語は、本明細書で使用される場合、抗原に結合し、別の抗原結合性タンパク質、例えば抗体またはその抗原結合性断片の結合を阻害または遮断する抗原結合性タンパク質、例えば抗体またはその抗原結合性断片を意味する。この用語は、２つの抗原結合性タンパク質、例えば抗体の間の、両方向の競合、すなわち、第１の抗原結合性タンパク質、例えば抗体が結合し、第２の抗原結合性タンパク質、例えば抗体の結合を遮断すること、およびその逆も含む。ある特定の実施形態では、第１の抗原結合性タンパク質、例えば抗体と第２の抗原結合性タンパク質、例えば抗体は、同じエピトープに結合し得る。あるいは、第１のおよび第２の抗原結合性タンパク質、例えば抗体は、異なるが重複するエピトープに結合し得、したがって、一方の抗原結合性タンパク質、例えば抗体が結合することにより、第２の抗原結合性タンパク質、例えば抗体結合が、例えば立体的な障害によって阻害または遮断される。抗原結合性タンパク質、例えば抗体間の交差競合は、当技術分野で公知の方法によって、例えば、リアルタイム、無標識バイオレイヤー干渉アッセイによって測定することができる。２つの抗原結合性タンパク質、例えば抗体の間の交差競合は、第２の抗原結合性タンパク質、例えば抗体の結合が自己結合（第１および第２の抗原結合性タンパク質、例えば抗体が同じ抗原結合性タンパク質、例えば抗体である場合）に起因するバックグラウンドシグナルよりも少ないこととして表すことができる。２つの抗原結合性タンパク質、例えば抗体の間の交差競合は、例えば、第２の抗原結合性タンパク質、例えば抗体の結合の％が、ベースライン自己バックグラウンド結合よりも低いこととして表すことができる（第１および第２の抗原結合性タンパク質、例えば抗体が同じ抗原結合性タンパク質、例えば抗体である場合）。
【０１０２】
「実質的な同一性」または「実質的に同一の」という用語は、核酸またはその断片について言及する場合、以下に考察する通り、別の核酸（またはその相補鎖）と妥当なヌクレオチド挿入または欠失を伴って最適にアラインメントした場合に、任意の周知の配列同一性のアルゴリズムによって測定されるように、ヌクレオチド塩基の少なくとも約９０％、およびより好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％または９９％にヌクレオチド配列同一性があることを示す。参照核酸分子と実質的な同一性を有する核酸分子は、ある特定の例では、参照核酸分子によってコードされるポリペプチドと同じまたは実質的に同様のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし得る。
【０１０３】
配列同一性は、アルゴリズム、例えば、グローバルアラインメントに関してはＮｅｅｄｌｅｍａｎ  Ｗｕｎｓｃｈ  アルゴリズム（Needleman  and  Wunsch  1970,  J.  Mol.  Biol.  48:  443-453）、または局所アラインメントに関してはＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Smith  and  Waterman  1981,  J.  Mol.  Biol.  147:  195-197）を使用して算出することができる。別の好ましいアルゴリズムは、Dufresne  et  al  in  Nature  Biotechnology  in  2002（vol.  20,  pp.  1269-71）により記載されており、ソフトウェアＧｅｎｅＰＡＳＴ（ＧＱ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．  Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）に使用されている。
【０１０４】
ポリペプチドに適用される場合、「実質的な類似性」または「実質的に同様の」という用語は、２つのペプチド配列が、例えばプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴにより、デフォルトのギャップ重みづけを使用して最適にアラインメントした場合に、少なくとも９０％の配列同一性、なおより好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を共有することを意味する。同一でない残基の位置は保存的アミノ酸置換によって異なることが好ましい。「保存的アミノ酸置換」は、同様の化学的性質（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によってアミノ酸残基が置換されたものである。一般に、保存的アミノ酸置換によりタンパク質の機能的性質は実質的に変化しない。２つまたはそれよりも多くのアミノ酸配列が保存的置換によって互いに異なる場合、類似性のパーセントまたは程度を上向きに調整して置換の保存性を補正することができる。この調整を行うための手段は当業者には周知である。例えば、参照により本明細書に組み込まれるPearson  (1994)Methods  Mol.  Biol.  24:  307-331を参照されたい。化学的性質が同様の側鎖を有するアミノ酸の群の例としては、１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン；２）脂肪族ヒドロキシル側鎖：セリンおよびトレオニン；３）アミドを含有する側鎖：アスパラギンおよびグルタミン；４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン；５）塩基性側鎖：リシン、アルギニン、およびヒスチジン；６）酸性側鎖：アスパラギン酸およびグルタミン酸、および７）硫黄含有側鎖：システインおよびメチオニンが挙げられる。好ましい保存的アミノ酸置換基は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、およびアスパラギン−グルタミンである。あるいは、保存的置換えは、参照により本明細書に組み込まれるGonnet  et  al.  (1992)Science  256:  1443  45に開示されているＰＡＭ２５０対数尤度行列が正の値である任意の変化である。「中等度に保存的」置換えは、ＰＡＭ２５０対数尤度行列が負でない値である任意の変化である。
【０１０５】
ポリペプチドについての配列類似性は、一般には、配列解析ソフトウェアを使用して測定される。タンパク質解析ソフトウェアでは、保存的アミノ酸置換を含めた種々の置換、欠失および他の改変に割り当てられる類似性の尺度を使用して同様の配列をマッチさせる。例えば、ＧＣＧソフトウェアは、デフォルトパラメータと共に使用して、異なる種の生物体に由来する相同なポリペプチドなどの密接に関連するポリペプチド間または野生型タンパク質とその突然変異タンパク質の間の配列相同性または配列同一性を決定することができるＧＡＰおよびＢＥＳＴＦＩＴなどのプログラムを含む。例えば、ＧＣＧ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．１を参照されたい。ポリペプチド配列は、ＦＡＳＴＡをデフォルトまたは推奨されるパラメータを用いて使用して比較することもできる；ＧＣＧ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．１．ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３）のプログラムにより、クエリおよび検索配列間の重複が最良の領域のアラインメントおよびパーセント配列同一性がもたらされる（Pearson  (2000)上記）。本発明の配列を異なる生物体に由来する多数の配列を含むデータベースと比較する際の別の好ましいアルゴリズムは、コンピュータプログラムＢＬＡＳＴ、特に、デフォルトパラメータを使用したＢＬＡＳＴＰまたはＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、そのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれるAltschul  et  al.  (1990)  J.  Mol.  Biol.  215:  403-410および  (1997)  Nucleic  Acids  Res.  25:  3389-3402を参照されたい。
【０１０６】
「治療有効量」という句は、それが投与されるものに対して所望の効果をもたらす量を意味する。正確な量は、処置の目的に依存し、当業者が公知の技法を使用して確かめることができる（例えば、Lloyd  (1999)  The  Art,  Science  and  Technology  of  Pharmaceutical  Compoundingを参照されたい）。
【０１０７】
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、ＨＰＶ感染、またはＨＰＶ関連がん（例えば、ＨＰＶ１６Ｅ７陽性がん）などのＨＰＶに関連する疾患もしくは障害などの疾患または障害の好転、防止および／または処置を必要とする動物、好ましくは哺乳動物を指す。この用語は、ＨＰＶ関連がん、転移性ＨＰＶ関連がんなどのＨＰＶに関連する疾患もしくは障害またはＨＰＶ感染を有するまたは有するリスクがあるヒト対象を含む。
【０１０８】
本明細書で使用される場合、「抗がん薬」は、これだけに限定されないが、細胞毒および作用剤、例えば、代謝拮抗薬、アルキル化剤、アントラサイクリン、抗生物質、抗有糸分裂薬、プロカルバジン、ヒドロキシウレア、アスパラギナーゼ、コルチコステロイド、シクロホスファミド、ミトタン（Ｏ，Ｐ’−（ＤＤＤ））、生物製剤（例えば、抗体およびインターフェロン）および放射性薬剤などを含めた、がんを処置するまたは好転させるまたは阻害するために有用な任意の作用剤を意味する。本明細書で使用される場合、「細胞毒または細胞傷害性薬剤」は、化学療法剤も指し、細胞に有害な任意の作用剤を意味する。例としては、Ｔａｘｏｌ（登録商標）（パクリタキセル）、テモゾラミド（temozolamide）、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、シスプラチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド（tenoposide）、ビンクリスチン、ビンブラスチン（vinbiastine）、コルヒチン（coichicin）、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ  ａｎｔｈｒａｃｉｎ  ｄｉｏｎｅ）、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシンおよびその類似体またはホモログが挙げられる。
【０１０９】
本明細書で使用される場合、「抗ウイルス薬」という用語は、宿主対象におけるウイルス感染を処置する、防止する、または好転させるために使用される任意の薬物または治療を指す。「抗ウイルス薬」という用語は、これだけに限定されないが、ジドブジン、ラミブジン、アバカビル、リバビリン、ロピナビル、エファビレンツ、コビシスタット、テノホビル、リルピビリン、鎮痛薬およびコルチコステロイドを含む。
【０１１０】
以下のいずれか１つを含む免疫原を使用して、ＨＬＡ−Ａ２により提示されるＨＰＶ１６Ｅ７ペプチドのコンフォメーションエピトープ、例えば、ＨＬＡ−Ａ２と連結したＨＰＶ１６Ｅ７のアミノ酸残基１１〜１９または残基８２〜９０を含むペプチドに対する抗原結合性タンパク質、例えば抗体を生成することができる。ある特定の実施形態では、本発明の抗原結合性タンパク質、例えば抗体を、全長ネイティブＨＰＶ１６Ｅ７タンパク質（ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿０４１３２６．１参照）（配列番号５３７）を用いて、または、ＨＬＡ−Ａ２と連結したＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０４１３２６．１（配列番号５３７）のアミノ酸残基１１〜１９（ＹＭＬＤＬＱＰＥＴ；配列番号５３８）もしくはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０４１３２６．１（配列番号５３７）のアミノ酸残基８２〜９０（ＬＬＭＧＴＬＧＩＶ；配列番号５３９）を含むペプチドなどの組換えＨＰＶ１６Ｅ７ペプチドを用いて免疫したマウスから得る。
【０１１１】
あるいは、ＨＰＶ１６Ｅ７またはその断片を、標準の生化学的技法を使用して作製し、ＨＬＡ−Ａ２との関連で改変し、免疫原として使用することができる。
【０１１２】
一部の実施形態では、免疫原は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、またはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの任意の他の真核細胞もしくは哺乳動物細胞において発現させた組換えＨＰＶ１６Ｅ７ペプチドであり得る。
【０１１３】
ある特定の実施形態では、ＨＬＡ−Ａ２により提示されるＨＰＶ１６Ｅ７ペプチドのコンフォメーションエピトープに特異的に結合する抗原結合性タンパク質を、上記の領域、または、指定の領域を本明細書に記載の領域のＮ末端またはＣ末端のいずれかまたはその両方から約５〜約２０アミノ酸残基を超えて伸びるペプチドの断片を使用して調製することができる。ある特定の実施形態では、上記の領域またはその断片の任意の組合せをＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７に特異的な抗原結合性タンパク質、例えば抗体の調製に使用することができる。
【０１１４】
ペプチドを、タグ付けのために、またはＫＬＨなどの担体分子とのコンジュゲーションの目的のために、ある特定の残基の付加または置換を含むように改変することができる。例えば、ペプチドのＮ末端もしくはＣ末端のいずれかにシステインを付加することができる、または、リンカー配列を付加して、ペプチドを例えば免疫のためのＫＬＨとのコンジュゲーションのために調製することができる。
【０１１５】
結合活性を測定するための非限定的な、例示的なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイが本明細書の実施例において例示されている。実施例４では、ヒト抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７に特異的な抗原結合性タンパク質、例えば抗体の結合親和性および運動定数を表面プラズモン共鳴によって決定し、測定はＢｉａｃｏｒｅ４０００またはＴ２００機器で行った。実施例６および７には、ＨＰＶ１６Ｅ７の断片を過剰発現する細胞への抗体の結合が記載されている。
【０１１６】
ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７に特異的な抗原結合性タンパク質、例えば抗体は、追加的な標識または部分を含有しない場合もあり、Ｎ末端もしくはＣ末端標識または部分を含有する場合もある。一実施形態では、標識または部分はビオチンである。結合アッセイでは、標識の場所（もしあれば）により、ペプチドが結合する表面に対するペプチドの方向を決定することができる。例えば、表面をアビジンでコーティングした場合、Ｎ末端ビオチンを含有するペプチドは、ペプチドのＣ末端部分が表面に対して遠位になるように配向される。一実施形態では、標識は、放射性核種、蛍光色素またはＭＲＩで検出可能な標識であり得る。ある特定の実施形態では、そのような標識された抗原結合性タンパク質を、イメージングアッセイを含めた診断アッセイに使用することができる。
【０１１７】
抗原結合性タンパク質
本発明は、抗体またはその抗原結合性断片、およびＣＡＲを含む抗原結合性タンパク質（例えば、本発明のＣＡＲをコードする核酸分子）（下記）を提供する。特に他の指示がなければ、「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、２つの免疫グロブリン重鎖および２つの免疫グロブリン軽鎖を含む抗体分子（すなわち、「全抗体分子」）ならびにその抗原結合性断片を包含すると理解されるものとする。抗体の「抗原結合性部分」、抗体の「抗原結合性断片」などの用語は、本明細書で使用される場合、抗原に特異的に結合して複合体を形成する、任意の天然に存在する、酵素により入手可能な、合成の、または遺伝子操作されたポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。抗体の「抗原結合性断片」、または「抗体断片」という用語は、本明細書で使用される場合、ＨＬＡ−Ａ２により提示されるＨＰＶ１６Ｅ７ペプチドのコンフォメーションエピトープに特異的に結合する能力を保持する抗体の１つまたは複数の断片を指す。抗体断片などの抗原結合性タンパク質は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ｄＡｂ断片、ＣＤＲを含有する断片、または単離されたＣＤＲを含み得る。抗体の抗原結合性断片などの抗原結合性タンパク質は、例えば、全抗体分子から、タンパク質消化、または抗体可変ドメインおよび（必要に応じて）定常ドメインをコードするＤＮＡの操作および発現を伴う組換え遺伝子工学技法などの任意の適切な標準技法を使用して得ることができる。そのようなＤＮＡは公知であり、かつ／または、例えば、商業的供給源、ＤＮＡライブラリー（例えば、ファージ抗体ライブラリーを含む）から容易に入手可能である、もしくは合成することができる。ＤＮＡを、配列決定し、例えば、１つもしくは複数の可変ドメインおよび／もしくは定常ドメインを適切な立体配置に配置するため、またはコドンを導入するため、システイン残基を創出するため、アミノ酸を修飾する、付加する、もしくは欠失させるためなどで、化学的にまたは分子生物学技法を使用することによって操作することができる。
【０１１８】
抗体の抗原結合性断片の非限定的な例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）Ｆｄ断片；（ｉｖ）Ｆｖ断片；（ｖ）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子；（ｖｉ）ｄＡｂ断片；および（ｖｉｉ）抗体の超可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位（例えば、ＣＤＲ３ペプチドなどの単離された相補性決定領域（ＣＤＲ））、または制約されたＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４ペプチドが挙げられる。他の操作された分子、例えば、ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲが移植された抗体、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、ナノボディ（例えば、一価ナノボディ、二価ナノボディなど）、小モジュラー免疫薬（ｓｍａｌｌ  ｍｏｄｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）（ＳＭＩＰ）、およびサメ可変ＩｇＮＡＲドメインも、本明細書で使用される「抗原結合性断片」という表現に包含される。
【０１１９】
抗原結合性タンパク質（例えば、抗体）の抗原結合性断片は、一般には、少なくとも１つの可変ドメインを含む。可変ドメインは、任意のサイズまたはアミノ酸組成になり、一般に、１つまたは複数のフレームワーク配列と隣接しているまたはインフレームにある少なくとも１つのＣＤＲを含む。ＶＬドメインと会合したＶＨドメインを有する抗原結合性タンパク質では、ＶＨドメインおよびＶＬドメインを互いに対して任意の適切な配置に位置させることができる。例えば、可変領域は二量体であり得、ＶＨ−ＶＨ、ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＬ二量体を含有する。あるいは、抗体の抗原結合性断片は、単量体ＶＨドメインまたはＶＬドメインを含有し得る。
【０１２０】
ある特定の実施形態では、抗体の抗原結合性断片は、少なくとも１つの定常ドメインと共有結合した少なくとも１つの可変ドメインを含有し得る。本発明の抗原結合性タンパク質の抗原結合性断片内に見いだすことができる可変ドメインおよび定常ドメインの非限定的な、例示的な立体配置としては、（ｉ）ＶＨ−ＣＨ１；（ｉｉ）ＶＨ−ＣＨ２；（ｉｉｉ）ＶＨ−ＣＨ３；（ｉｖ）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２；（ｖ）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；（ｖｉ）ＶＨ−ＣＨ２−ＣＨ３；（ｖｉｉ）ＶＨ−ＣＬ；（ｖｉｉｉ）ＶＬ−ＣＨ１；（ｉｘ）ＶＬ−ＣＨ２；（ｘ）ＶＬ−ＣＨ３；（ｘｉ）ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２；（ｘｉｉ）ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；（ｘｉｉｉ）ＶＬ−ＣＨ２−ＣＨ３；および（ｘｉｖ）ＶＬ−ＣＬが挙げられる。上に列挙されている例示的な立体配置のいずれかを含めた可変ドメインおよび定常ドメインの立体配置のいずれにおいても、可変ドメインと定常ドメインは、互いと直接連結するか、完全なもしくは部分的なヒンジまたはリンカー領域によって連結するかのいずれかでよい。ヒンジ領域は、少なくとも２個（例えば、５個、１０個、１５個、２０個、４０個、６０個またはそれよりも多く）のアミノ酸からなり得、単一のポリペプチド分子内の隣接する可変ドメインおよび／または定常ドメイン間に柔軟なまたは半柔軟な連結をもたらすものである。さらに、本発明の抗体の抗原結合性断片は、上に列挙されている可変ドメインおよび定常ドメイン立体配置のいずれかの、互いとの非共有結合性の会合でのおよび／または１つもしくは複数の単量体ＶＨドメインもしくはＶＬドメインとの（例えば、ジスルフィド結合（複数可）による）ホモ二量体またはヘテロ二量体（または他の多量体）を含み得る。
【０１２１】
全抗体分子と同様に、抗原結合性タンパク質、例えば抗体の抗原結合性断片は、単一特異性または多重特異性（例えば、二重特異性）であり得る。抗体の多重特異性抗原結合性断片は、一般には、少なくとも２つの異なる可変ドメインを含み、各可変ドメインは、別々の抗原、または同じ抗原上の異なるエピトープに特異的に結合することができる。本明細書に開示される例示的な二重特異性抗体形式を含めた任意の多重特異性抗体形式は、当技術分野において利用可能な慣例の技法を使用して本発明の抗体の抗原結合性断片に関連した使用に適応させることができる。
【０１２２】
抗原結合性タンパク質の調製
トランスジェニックマウスにおいてヒト抗体などの抗原結合性タンパク質を生成するための方法は、当技術分野で公知である。任意のそのような公知の方法を本発明に関して使用して、ＨＬＡ−Ａ２により提示されるヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１６Ｅ７ペプチド（ＨＰＶ１６Ｅ７ペプチド）のコンフォメーションエピトープに特異的に結合するヒト抗体を作出することができる。
【０１２３】
ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）技術（例えば、ＵＳ６，５９６，５４１、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）を参照されたい）または抗原結合性タンパク質、例えばモノクローナル抗体を生成するための任意の他の公知の方法を使用し、ＨＬＡ−Ａ２により提示されるＨＰＶ１６Ｅ７ペプチドのコンフォメーションエピトープに対する高親和性抗原結合性タンパク質、例えば、キメラ抗体を、ヒト可変領域およびマウス定常領域を有する状態で最初に単離する。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）技術は、内因性マウス定常領域遺伝子座に作動可能に連結したヒト重鎖および軽鎖可変領域を含むゲノムを有するトランスジェニックマウスの生成を伴い、その結果、マウスが抗原刺激に応答してヒト可変領域およびマウス定常領域を含む抗原結合性タンパク質、例えば抗体を産生する。抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを単離し、ヒト重鎖および軽鎖定常領域をコードするＤＮＡを作動可能に連結する。次いで、完全ヒト抗体を発現することができる細胞において当該ＤＮＡを発現させる。
【０１２４】
一般に、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスを目的の抗原で攻撃し、マウスから抗原結合性タンパク質、例えば抗体を発現するリンパ性細胞（例えば、Ｂ細胞）を回収する。リンパ性細胞を骨髄腫細胞株と融合して不死ハイブリドーマ細胞株を調製し、そのようなハイブリドーマ細胞株をスクリーニングし、選択して、目的の抗原に対する特異的な抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定する。重鎖および軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを単離し、望ましいアイソタイプの重鎖および軽鎖の定常領域に連結することができる。そのような抗原結合性タンパク質をＣＨＯ細胞などの細胞において産生させることができる。あるいは、抗原特異的抗原結合性タンパク質、例えば、キメラ抗体、または軽鎖および重鎖の可変ドメインをコードするＤＮＡを抗原特異的リンパ球から直接単離することができる。
【０１２５】
最初に、高親和性抗原結合性タンパク質、例えば、キメラ抗体をヒト可変領域およびマウス定常領域を有する状態で単離する。以下の実験の節におけるものと同様に、抗原結合性タンパク質を、親和性、選択性、エピトープなどを含めた望ましい特性について特徴付け、選択する。マウス定常領域を所望のヒト定常領域で置き換えて、本発明の抗原結合性タンパク質、例えば完全ヒト抗体、例えば野生型もしくは改変ＩｇＧ１またはＩｇＧ４を生成する。一方、選択される定常領域は、特定の使用、可変領域に存在する高親和性抗原結合性および標的特異性という特性に応じて変動し得る。
【０１２６】
生物学的同等性
本発明の抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質は、記載の抗原結合性タンパク質、例えば抗体のものから変動するアミノ酸配列を有するが、ＨＬＡ−Ａ２により提示されるＨＰＶ１６Ｅ７ペプチドのコンフォメーションエピトープに結合する能力を保持するタンパク質を包含する。そのようなバリアント抗原結合性タンパク質は、親配列と比較した場合に１つまたは複数のアミノ酸の付加、欠失、または置換を含むが、記載の抗原結合性タンパク質のものと本質的に同等の生物活性を示す。同様に、本発明の抗原結合性タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、開示されている配列と比較した場合に１つまたは複数のヌクレオチドの付加、欠失、または置換を含むが、本発明の抗原結合性タンパク質と本質的に生物学的に同等である抗原結合性タンパク質をコードする配列を包含する。
【０１２７】
２つの抗原結合性タンパク質、または抗体は、例えば、同じモル濃度用量で、同様の実験条件下、単回用量または複数用量のいずれかで投与した場合に吸収の速度および程度に有意差が示されない薬学的同等物または薬学的代替物である場合、それらは生物学的に同等であるとみなされる。一部の抗原結合性タンパク質または抗体は、それらの吸収の程度は同等であるがそれらの吸収の速度は同等でなく、それでもなお、そのような吸収の速度の差が意図的なものであり、ラベリングに反映されており、例えば長期にわたる使用での有効な体内薬物濃度の実現のために必須ではなく、試験される特定の薬品に関して医学的に些細であるとみなされることからそれらが生物学的に同等であるとみなすことができる場合、同等物または薬学的代替物とみなされる。
【０１２８】
一実施形態では、２つの抗原結合性タンパク質（または抗体）は、それらの安全性、純度、または効力に臨床的に意味のある差異がない場合、生物学的に同等である。
【０１２９】
一実施形態では、２つの抗原結合性タンパク質（または抗体）は、患者が参照製品と生物学的製剤とを１回または複数回切り換えることができ、そのような切り換えを伴わない継続治療と比較して、免疫原性の臨床的に有意な変化、または効果の減弱を含めた有害作用のリスクの上昇が予想されない場合、生物学的に同等である。
【０１３０】
一実施形態では、２つの抗原結合性タンパク質（または抗体）は、それらがどちらも、使用の条件（複数可）に関して共通の作用機構（複数可）によって作用する場合、そのような機構が公知である限りでは、生物学的に同等である。
【０１３１】
生物学的同等性は、ｉｎ  ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法によって実証することができる。生物学的同等性の尺度としては、例えば、（ａ）血液、血漿、血清、または他の生体液中の抗原結合性タンパク質またはその代謝産物の濃度を時間に応じて測定する、ヒトまたは他の哺乳動物におけるｉｎ  ｖｉｖｏ試験；（ｂ）ヒトｉｎ  ｖｉｖｏ生物学的利用能データと相関し、それを合理的に予測する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験；（ｃ）抗原結合性タンパク質（またはその標的）の妥当な急性薬理学的効果を時間に応じて測定する、ヒトまたは他の哺乳動物におけるｉｎ  ｖｉｖｏ試験；および（ｄ）抗原結合性タンパク質の安全性、有効性、または生物学的利用能もしくは生物学的同等性を確立する管理良好な臨床試験が挙げられる。
【０１３２】
本発明の抗原結合性タンパク質（または抗体）の生物学的に同等であるバリアントは、例えば、残基もしくは配列の種々の置換を行うこと、または生物活性には必要ない末端もしくは内部の残基もしくは配列を欠失させることによって構築することができる。例えば、生物活性のために必須ではないシステイン残基を欠失させるまたは他のアミノ酸で置き換えて、復元時の不必要なまたは不適当な分子内ジスルフィド架橋の形成を防止することができる。他の状況では、生物学的に同等である抗原結合性タンパク質は、抗原結合性タンパク質のグリコシル化特性を改変させるアミノ酸の変化、例えば、グリコシル化を排除または除去する突然変異を含む抗原結合性タンパク質バリアントを含み得る。
【０１３３】
Ｆｃバリアントを含む抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質
本発明のある特定の実施形態によると、例えば、中性ｐＨと比較して酸性ｐＨにおける抗原結合性タンパク質のＦｃＲｎ受容体への結合を増強するまたは減弱させる１つまたは複数の突然変異を含むＦｃドメインを含む抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質、例えば抗体が提供される。例えば、本発明は、ＦｃドメインのＣＨ２領域またはＣＨ３領域に突然変異を含む抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質を含み、ここで、当該突然変異（複数可）は、酸性環境（例えば、ｐＨが約５．５から約６．０までにわたるエンドソームにおける）におけるＦｃドメインのＦｃＲｎに対する親和性を増大させる。そのような突然変異の結果として、動物に投与した際の抗原結合性タンパク質の血清中半減期を増大させることができる。そのようなＦｃ改変の非限定的な例としては、例えば、２５０位（例えば、ＥもしくはＱ）；２５０位および４２８位（例えば、ＬもしくはＦ）；２５２位（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／ＷもしくはＴ）、２５４位（例えば、ＳもしくはＴ）、および２５６位（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤもしくはＴ）における改変；または４２８位および／もしくは４３３位（例えば、Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／ＱもしくはＫ）および／もしくは４３４位（例えば、Ａ、Ｗ、Ｈ、ＦもしくはＹ［Ｎ４３４Ａ、Ｎ４３４Ｗ、Ｎ４３４Ｈ、Ｎ４３４ＦもしくはＮ４３４Ｙ］）における改変；または２５０位および／もしくは４２８位における改変；または３０７位もしくは３０８位（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）、および４３４位における改変が挙げられる。一実施形態では、改変は、４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８Ｌ）および４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）改変；４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２５９Ｉ）、および３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）改変；４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）および４３４（例えば、４３４Ｙ）改変；２５２、２５４、および２５６（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅ）改変；２５０Ｑおよび４２８Ｌ改変（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ４２８Ｌ）；ならびに３０７および／または３０８改変（例えば、３０８Ｆまたは３０８Ｐ）を含む。さらに別の実施形態では、改変は、２６５Ａ（例えば、Ｄ２６５Ａ）および／または２９７Ａ（例えば、Ｎ２９７Ａ）改変を含む。
【０１３４】
例えば、本発明は、２５０Ｑおよび２４８Ｌ（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ２４８Ｌ）；２５２Ｙ、２５４Ｔおよび２５６Ｅ（例えば、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴおよびＴ２５６Ｅ）；４２８Ｌおよび４３４Ｓ（例えば、Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓ）；２５７Ｉおよび３１１Ｉ（例えば、Ｐ２５７ＩおよびＱ３１１Ｉ）；２５７Ｉおよび４３４Ｈ（例えば、Ｐ２５７ＩおよびＮ４３４Ｈ）；３７６Ｖおよび４３４Ｈ（例えば、Ｄ３７６ＶおよびＮ４３４Ｈ）；３０７Ａ、３８０Ａおよび４３４Ａ（例えば、Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０ＡおよびＮ４３４Ａ）；ならびに４３３Ｋおよび４３４Ｆ（例えば、Ｈ４３３ＫおよびＮ４３４Ｆ）からなる群から選択される１つまたは複数の突然変異の対または群を含むＦｃドメインを含む抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質を含む。一実施形態では、本発明は、二量体安定化を促進するために、ＩｇＧ４のヒンジ領域にＳ１０８Ｐ突然変異を含むＦｃドメインを含む抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質を含む。本明細書に開示される抗原結合性タンパク質可変ドメイン内の、前述Ｆｃドメイン突然変異と他の突然変異との可能性のある全ての組合せが本発明の範囲内に入るものとする。
【０１３５】
本発明は、キメラ重鎖定常（ＣＨ）領域を含む抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質も含み、ここで、当該キメラＣＨ領域は、１つよりも多くの免疫グロブリンアイソタイプのＣＨ領域に由来するセグメントを含む。例えば、本発明の抗原結合性タンパク質は、ヒトＩｇＧ１分子、ヒトＩｇＧ２分子またはヒトＩｇＧ４分子に由来するＣＨ２ドメインの一部または全部とヒトＩｇＧ１分子、ヒトＩｇＧ２分子またはヒトＩｇＧ４分子に由来するＣＨ３ドメインの一部または全部との組合せを含むキメラＣＨ領域を含み得る。ある特定の実施形態によると、本発明の抗原結合性タンパク質は、キメラヒンジ領域を有するキメラＣＨ領域を含む。例えば、キメラヒンジは、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２またはヒトＩｇＧ４ヒンジ領域に由来する「上ヒンジ」アミノ酸配列（ＥＵ番号付けに従って２１６位から２２７位までのアミノ酸残基）とヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２またはヒトＩｇＧ４ヒンジ領域に由来する「下ヒンジ」配列（ＥＵ番号付けに従って２２８位から２３６位までのアミノ酸残基）の組合せを含み得る。ある特定の実施形態によると、キメラヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４の上ヒンジに由来するアミノ酸残基とヒトＩｇＧ２の下ヒンジに由来するアミノ酸残基とを含む。本明細書に記載のキメラＣＨ領域を含む抗原結合性タンパク質は、ある特定の実施形態では、抗原結合性タンパク質の治療的性質または薬物動態的性質に悪影響を及ぼすことなく改変されたＦｃエフェクター機能を示す（例えば、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１４０２４３５０４号を参照されたい）。
【０１３６】
抗原結合性タンパク質の生物学的特性
一般に、本発明の抗原結合性タンパク質は、ＨＬＡ−Ａ２により提示されるヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１６Ｅ７ペプチド（ＨＰＶ１６Ｅ７）ペプチドのコンフォメーションエピトープに結合することによって機能する。
【０１３７】
本発明は、ＨＬＡ−Ａ２との関連でＨＰＶ１６Ｅ７ペプチドに高い特異性で結合する抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質を含む。抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質は、ＨＬＡ−Ａ２の不在下ではＨＰＶ１６Ｅ７ペプチドに結合しない。さらに、抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質は、ＨＬＡ−Ａ２との関連でオフターゲットペプチドには結合しない。
【０１３８】
本発明は、単量体ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７  １１−１９ペプチドに高親和性で結合する抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質を含む。例えば、本発明は、単量体ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７  １１−１９ペプチドに（例えば、２５℃でまたは３７℃で）、例えば本明細書の実施例４において定義されているアッセイ形式を使用した表面プラズモン共鳴によって測定されるように、約２０ｎＭ未満のＫＤで結合する抗原結合性タンパク質を含む。ある特定の実施形態では、抗原結合性タンパク質は、例えば本明細書の実施例４において定義されているアッセイ形式を使用した表面プラズモン共鳴、または実質的に同様のアッセイによって測定されるように、単量体ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７  １１−１９ペプチドに、約１５ｎＭ未満、約１２ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約２ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、約０．５ｎＭ未満、約０．１ｎＭ未満、約０．０５ｎＭ未満または約０．０４ｎＭ未満のＫＤで結合する。
【０１３９】
本発明は、例えば本明細書の実施例４において定義されているアッセイ形式を使用した表面プラズモン共鳴、または実質的に同様のアッセイによって測定されるように、単量体ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７  ８２−９０ペプチドに（例えば、２５℃でまたは３７℃で）約２５ｎＭ未満のＫＤで結合する抗原結合性タンパク質を含む。ある特定の実施形態では、抗原結合性タンパク質は、例えば本明細書の実施例４において定義されているアッセイ形式を使用した表面プラズモン共鳴、または実質的に同様のアッセイによって測定されるように、単量体ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７  ８２−９０ペプチドに約２０ｎＭ未満、約１５ｎＭ未満、約１２ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約２ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、約０．５ｎＭ未満、約０．１ｎＭ未満、約０．０５ｎＭ未満または約０．０４ｎＭ未満のＫＤで結合する。
【０１４０】
本発明は、本明細書の実施例６において定義されている発光アッセイまたは実質的に同様のアッセイによって決定されると、ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７  １１−１９ペプチドを発現する細胞に約６ｎＭ未満のＥＣ５０で結合し、予測されるオフターゲットペプチドを発現する細胞には結合しない抗原結合性タンパク質も含む。ある特定の実施形態では、抗原結合性タンパク質は、例えば、本明細書の実施例６のアッセイ形式または実質的に同様のアッセイを使用し、本明細書の実施例６において定義されている発光アッセイまたは実質的に同様のアッセイによって決定されると、ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７  １１−１９ペプチドを発現する細胞に、約６ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約２ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、または約０．５ｎＭ未満のＥＣ５０で結合し、予測されるオフターゲットペプチドを発現する細胞には結合しない。
【０１４１】
本発明は、本明細書の実施例６において定義されている発光アッセイまたは実質的に同様のアッセイによって決定されると、ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７  ８２−９０ペプチドを発現する細胞に約１ｎＭ未満のＥＣ５０で結合し、予測されるオフターゲットペプチドを発現する細胞には結合しない抗原結合性タンパク質も含む。ある特定の実施形態では、抗原結合性タンパク質は、例えば、本明細書の実施例６のアッセイ形式または実質的に同様のアッセイを使用し、本明細書の実施例６において定義されている発光アッセイまたは実質的に同様のアッセイによって決定されると、ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７  ８２−９０ペプチドを発現する細胞に約１ｎＭ未満、約０．５ｎＭ未満、約０．２ｎＭ未満、または約０．０１ｎＭ未満のＥＣ５０で結合し、予測されるオフターゲットペプチドを発現する細胞には結合しない。
【０１４２】
本発明は、本明細書の実施例７において定義されているフローサイトメトリーアッセイまたは実質的に同様のアッセイによって測定されるように、ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７  １１−１９ペプチドを発現する細胞に約３０ｎＭ未満のＥＣ５０で結合する抗原結合性タンパク質も含む。ある特定の実施形態では、抗原結合性タンパク質は、例えば本明細書の実施例７のアッセイ形式を使用したフローサイトメトリーアッセイ、または実質的に同様のアッセイによって測定されるように、ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７  １１−１９ペプチドを発現する細胞に約２５ｎＭ未満、約２０ｎＭ未満、約１５ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約２ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、または約０．５ｎＭ未満のＥＣ５０で結合する。
【０１４３】
本発明は、本明細書の実施例７において定義されているフローサイトメトリーアッセイまたは実質的に同様のアッセイによって測定されるように、ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７  ８２−９０ペプチドを発現する細胞に約７５ｎＭ未満のＥＣ５０で結合する抗原結合性タンパク質も含む。ある特定の実施形態では、抗原結合性タンパク質は、例えば本明細書の実施例７のアッセイ形式を使用したフローサイトメトリーアッセイ、または実質的に同様のアッセイによって測定されるように、ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７  ８２−９０ペプチドを発現する細胞に、約７５ｎＭ未満、約７０ｎＭ未満、約６５ｎＭ未満、約６０ｎＭ未満、約５５ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約４５ｎＭ未満、約４０ｎＭ未満、約３５ｎＭ未満、約３０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、約２０ｎＭ未満、約１５ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約２ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、または約０．５ｎＭ未満のＥＣ５０で結合する。
【０１４４】
ある特定の実施形態では、本発明の抗原結合性タンパク質は、それを必要とする対象に予防的に投与した場合に、腫瘍の成長を阻害することまたはがんの進行を遅延させることにおいて有用であり、対象の生存を増大させることができる。例えば、本発明の抗原結合性タンパク質の投与により、原発腫瘍の縮小を導くことができ、また、転移または二次腫瘍の発生を防止することができる。ある特定の実施形態では、本発明の抗原結合性タンパク質は、それを必要とする対象に治療的に投与した場合に、腫瘍の成長を阻害することにおいて有用であり、対象の生存を増大させることができる。例えば、本発明の抗原結合性タンパク質を対象に治療有効量で投与することにより、対象における確立された腫瘍の縮小および消失を導くことができる。
【０１４５】
一実施形態では、本発明は、ＨＬＡ−Ａ２により提示されるＨＰＶ１６Ｅ７ペプチドのコンフォメーションエピトープに結合する単離された組換え抗原結合性タンパク質であって、以下の特性の１つまたは複数を示す、抗原結合性タンパク質を提供する：（ｉ）配列番号２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１１４、１３０、１４６、１６２、１７８、１９４、２１０、２１８、２３４、２５０、２６６、２８２、２９８、３１４、３３０、３４６、３６２、３７８、３９４、４１０、４２６、４４２、４５８、４７４、４９０、５０６、および５２２、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様な配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲを含む；（ｉｉ）配列番号１０、２６、４２、５８、７４、９０、１０６、１２２、１３８、１５４、１７０、１８６、２０２、２２６、２４２、２５８、２７４、２９０、３０６、３２２、３３８、３５４、３７０、３８６、４０２、４１８、４３４、４５０、４６６、４８２、４９８、５１４、および５３０、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様な配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む；（ｉｉｉ）配列番号８、２４、４０、５６、７２、８８、１０４、１２０、１３６、１５２、１６８、１８４、２００、２１６、２２４、２４０、２５６、２７２、２８８、３０４、３２０、３３６、３５２、３６８、３８４、４００、４１６、４３２、４４８、４６４、４８０、４９６、５１２、および５２８、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様な配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３ドメイン；ならびに配列番号１６、３２、４８、６４、８０、９６、１１２、１２８、１４４、１６０、１７６、１９２、２０８、２３２、２４８、２６４、２８０、２９６、３１２、３２８、３４４、３６０、３７６、３９２、４０８、４２４、４４０、４５６、４７２、４８８、５０４、５２０、および５３６、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様な配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３ドメインを含む；（ｉｖ）配列番号４、２０、３６、５２、６８、８４、１００、１１６、１３２、１４８、１６４、１８０、１９６、２１２、２２０、２３６、２５２、２６８、２８４、３００、３１６、３３２、３４８、３６４、３８０、３９６、４１２、４２８、４４４、４６０、４７６、４９２、５０８、および５２４、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様な配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１ドメイン；配列番号１２、２８、４４、６０、７６、９２、１０８、１２４、１４０、１５６、１７２、１８８、２０４、２２８、２４４、２６０、２７６、２９２、３０８、３２４、３４０、３５６、３７２、３８８、４０４、４２０、４３６、４５２、４６８、４８４、５００、５１６、および５３２、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様な配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１ドメイン；ならびに配列番号１４、３０、４６、６２、７８、９４、１１０、１２６、１４２、１５８、１７４、１９０、２０６、２３０、２４６、２６２、２７８、２９４、３１０、３２６、３４２、３５８、３７４、３９０、４０６、４２２、４３８、４５４、４７０、４８６、５０２、５１８、および５３４、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に同様な配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２ドメインを含む；（ｖ）２５℃における表面プラズモン共鳴アッセイで測定されると、単量体ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７  １１−１９ペプチドに約２０ｎＭ未満の結合解離平衡定数（ＫＤ）で結合する；（ｖｉ）２５℃における表面プラズモン共鳴アッセイで測定されると、単量体ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７  ８２−９０ペプチドに約２５ｎＭ未満の結合解離平衡定数（ＫＤ）で結合する；（ｖｉｉ）発光アッセイによって決定されると、ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７  １１−１９ペプチドを発現する細胞に約６ｎＭ未満のＥＣ５０で結合し、予測されるオフターゲットペプチドを発現する細胞には結合しない；（ｖｉｉｉ）発光アッセイによって決定されると、ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７  ８２−９０ペプチドを発現する細胞に約１ｎＭ未満のＥＣ５０で結合し、予測されるオフターゲットペプチドを発現する細胞には実質的に結合しない；（ｉｘ）フローサイトメトリーアッセイによって決定されると、ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７  １１−１９ペプチドを発現する細胞に約３０ｎＭ未満のＥＣ５０で結合する；（ｘ）フローサイトメトリーアッセイによって決定されると、ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７  ８２−９０ペプチドを発現する細胞に約７５ｎＭ未満のＥＣ５０で結合する；（ｘｉ）配列番号５３８と１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれよりも多くのアミノ酸が異なるＨＬＡ−Ａ２によりディスプレイされるオフターゲットペプチドには結合しない；ならびに（ｘｉｉ）配列番号５３９と１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれよりも多くのアミノ酸が異なるＨＬＡ−Ａ２によりディスプレイされるオフターゲットペプチドには結合しない。
【０１４６】
本発明の抗原結合性タンパク質は、上述の生物学的特性の１つまたは複数、またはこれらの任意の組合せを有し得る。本発明の抗原結合性タンパク質の他の生物学的特性は、本明細書の実施例を含めた本開示の精査から当業者には明らかになろう。
【０１４７】
エピトープマッピングおよび関連する技術
本発明は、ＨＬＡ−Ａ２によりディスプレイされるＨＰＶ１６Ｅ７ペプチドの１つまたは複数のドメイン内に見いだされる１つまたは複数のアミノ酸と相互作用する抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質を含む。エピトープは、上述のＨＰＶ１６Ｅ７分子のドメインのいずれかまたは両方内に位置する複数の連続していないアミノ酸（またはアミノ酸配列）（例えば、コンフォメーションエピトープ）からなり得る。
【０１４８】
抗原結合性タンパク質がポリペプチドまたはタンパク質内の「１つまたは複数のアミノ酸と相互作用する」かどうかを決定するために、当業者に公知の種々の技法を使用することができる。例示的な技法としては、例えば、Antibodies,  Harlow  and  Lane  (Cold  Spring  Harbor  Press,  Cold  Spring  Harbor,  NY)に記載されているものなどの慣例の交差遮断アッセイが挙げられる。他の方法としては、アラニンスキャニング変異性分析、ペプチドブロット分析（Reineke  (2004)  Methods  Mol.  Biol.  248:  443-63）、ペプチド切断分析結晶学的研究およびＮＭＲ分析が挙げられる。さらに、エピトープ切り出し、エピトープ抽出および抗原の化学修飾などの方法を利用することができる（Tomer  (2000)  Prot.  Sci.  9:  487-496）。抗原結合性タンパク質と相互作用するポリペプチド内のアミノ酸を同定するために使用することができる別の方法は、質量分析によって検出される水素／重水素交換である。一般に述べると、水素／重水素交換法は、目的のタンパク質を重水素で標識し、その後、抗原結合性タンパク質を重水素で標識されたタンパク質に結合させることを伴う。次に、タンパク質／抗原結合性タンパク質複合体を水に移し、抗原結合性タンパク質複合体によって保護されているアミノ酸内の交換可能なプロトンが界面の一部ではないアミノ酸内の交換可能なプロトンよりも遅い速度で重水素から水素への逆交換を受ける。結果として、タンパク質／抗原結合性タンパク質界面の一部を形成するアミノ酸は重水素を保持し得、したがって、界面に含まれないアミノ酸と比較して比較的高い質量を示す。抗原結合性タンパク質の解離後、標的タンパク質をプロテアーゼ切断および質量分析法に供し、それにより、抗原結合性タンパク質が相互作用する特定のアミノ酸に対応する重水素で標識された残基を明らかにする。例えば、Ehring  (1999)  Analytical  Biochemistry  267:  252-259;  Engen  and  Smith  (2001)  Anal.  Chem.  73:  256A-265Aを参照されたい。
【０１４９】
「エピトープ」という用語は、Ｂ細胞および／またはＴ細胞が応答する抗原上の部位を指す。Ｂ細胞エピトープは、連続したアミノ酸、またはタンパク質の３次フォールディングによって並置した連続していないアミノ酸の両方で形成されたものであり得る。連続したアミノ酸で形成されたエピトープは、一般には、変性溶媒に曝露しても保持されるが、３次フォールディングによって形成されたエピトープは、一般には、変性溶媒を用いた処理で消失する。エピトープは、一般には、独特の空間コンフォメーション内に少なくとも３つ、より一般的には少なくとも５つまたは８〜１０のアミノ酸を含む。
【０１５０】
抗原構造に基づく抗体プロファイリング（ＡＳＡＰ）としても公知の修飾補助プロファイリング（ＭＡＰ）は、同じ抗原を対象とする多数のモノクローナル抗原結合性タンパク質、例えば抗体（ｍＡｂ）を、化学的にまたは酵素的に修飾された抗原表面への各抗体の結合プロファイルの類似性に従ってカテゴリー分けする方法である（その全体が参照により明確に本明細書に組み込まれるＵＳ２００４／０１０１９２０を参照されたい）。各カテゴリーは、別のカテゴリーによって表されるエピトープとは明確に異なるか、または部分的に重複するかのいずれかの独特のエピトープを反映することができる。この技術により、遺伝的に同一の抗原結合性タンパク質を迅速にフィルタリングすることが可能になり、したがって、特徴付けの焦点を遺伝的に別個の抗原結合性タンパク質に当てることができる。ハイブリドーマスクリーニングに適用する場合、ＭＡＰにより、所望の特性を有する抗原結合性タンパク質を産生する稀なハイブリドーマクローンを同定することが容易になる。ＭＡＰを使用して、本発明の抗原結合性タンパク質を異なるエピトープに結合する抗原結合性タンパク質の群に選別することができる。
【０１５１】
本発明は、本明細書の表１に記載の特定の例示的な抗原結合性タンパク質のいずれか、または表１に記載の例示的な抗原結合性タンパク質のいずれかのＣＤＲ配列を有する抗原結合性タンパク質と同じエピトープまたは当該エピトープの一部に結合する抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質を含む。同様に、本発明は、ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７またはその断片との結合について、本明細書の表１に記載の特定の例示的な抗原結合性タンパク質のいずれか、または表１に記載の例示的な抗原結合性タンパク質のいずれかのＣＤＲ配列を有する抗原結合性タンパク質と競合する抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質も含む。
【０１５２】
抗原結合性タンパク質が、参照抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質と、同じエピトープに結合するかまたは結合について競合するかを、当技術分野で公知の慣例の方法を使用することによって容易に決定することができる。例えば、試験抗原結合性タンパク質が本発明の参照抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質と同じエピトープに結合するかどうかを決定するために、参照抗原結合性タンパク質を、ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７タンパク質またはペプチドに飽和条件下で結合させる。次に、試験抗原結合性タンパク質のＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７分子に結合する能力を評価する。参照抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質との飽和結合後に試験抗原結合性タンパク質がＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７に結合することができれば、試験抗原結合性タンパク質が参照抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質とは異なるエピトープに結合すると結論づけることができる。他方では、参照抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質との飽和結合後に試験抗原結合性タンパク質がＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７タンパク質に結合することができなければ、試験抗原結合性タンパク質は、本発明の参照抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質が結合するエピトープと同じエピトープに結合する可能性がある。
【０１５３】
抗原結合性タンパク質が参照抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質と結合について競合するかどうかを決定するために、上記の結合方法体系を２方向で実施する：第１の方向では、参照抗原結合性タンパク質をＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７タンパク質に飽和条件下で結合させ、その後、試験抗原結合性タンパク質のＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７分子への結合を評価する。第２の方向では、試験抗原結合性タンパク質をＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７分子に飽和条件下で結合させ、その後、参照抗原結合性タンパク質のＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７分子への結合を評価する。どちらの方向でも最初の（飽和）抗原結合性タンパク質のみがＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７分子に結合することができる場合には、試験抗原結合性タンパク質と参照抗原結合性タンパク質がＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７との結合について競合すると結論づけられる。当業者には理解される通り、参照抗原結合性タンパク質と結合について競合する抗原結合性タンパク質は、必ずしも参照抗原結合性タンパク質と同一のエピトープに結合するのではない可能性があり、参照抗原結合性タンパク質の結合が重複するまたは隣接するエピトープへの結合によって立体的に遮断される可能性もある。
【０１５４】
２つの抗原結合性タンパク質は、それぞれが他方の抗原への結合を競合的に阻害する（遮断する）場合、同じまたは重複するエピトープに結合する。すなわち、競合結合アッセイで測定されると、１倍、５倍、１０倍、２０倍または１００倍過剰の一方の抗原結合性タンパク質は他方の結合を少なくとも５０％であるが、好ましくは７５％、９０％またはさらには９９％阻害する（例えば、Junghans  et  al.,  Cancer  Res.  1990  50:  1495-1502を参照されたい）。あるいは、２つの抗原結合性タンパク質は、一方の抗原結合性タンパク質の結合を低減または排除する抗原におけるアミノ酸突然変異の本質的に全てにより他方の結合も低減または排除される場合、同じエピトープを有する。２つの抗原結合性タンパク質は、一方の抗原結合性タンパク質の結合を低減または排除するアミノ酸突然変異の一部により他方の結合も低減または排除される場合、重複するエピトープを有する。
【０１５５】
次いで、追加的な慣例の実験（例えば、ペプチド突然変異および結合分析）を行って、観察される試験抗原結合性タンパク質の結合の欠如が実際に参照抗原結合性タンパク質と同じエピトープへの結合に起因するのか、それとも立体的遮断（または別の現象）が観察される結合の欠如の原因であるのかを確認することができる。この種の実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、表面プラズモン共鳴、フローサイトメトリーまたは当技術分野において利用可能な任意の他の定量的もしくは定性的抗原結合性タンパク質結合アッセイを使用して実施することができる。
【０１５６】
免疫コンジュゲート
本発明は、がんを処置するために細胞毒または化学療法剤などの治療用部分とコンジュゲートした抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質（「免疫コンジュゲート」）を包含する。本明細書で使用される場合、「免疫コンジュゲート」という用語は、細胞毒、放射性薬剤、サイトカイン、インターフェロン、検出可能部分などの標的もしくはレポーター部分、酵素、毒素、ペプチドもしくはタンパク質または治療剤と化学的にまたは生物学的に連結した抗原結合性タンパク質を指す。抗原結合性タンパク質は、その標的と結合することができる限りは、分子に沿って任意の場所で、細胞毒、放射性薬剤、サイトカイン、インターフェロン、標的もしくはレポーター部分、酵素、毒素、ペプチドまたは治療剤と連結することができる。免疫コンジュゲートの例としては、抗原結合性タンパク質−薬物コンジュゲートおよび抗原結合性タンパク質−毒素融合タンパク質が挙げられる。一実施形態では、作用剤は、ＨＰＶ１６Ｅ７またはＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７に対する第２の異なる抗体であり得る。ある特定の実施形態では、抗原結合性タンパク質を、腫瘍細胞またはウイルス感染細胞、すなわち、ＨＰＶ感染細胞に特異的な作用剤とコンジュゲートすることができる。抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質とコンジュゲートすることができる治療用部分の型には、処置される状態および実現される所望の治療効果を考慮に入れる。免疫コンジュゲートを形成するための適切な作用剤の例は、当技術分野で公知である；例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ０５／１０３０８１号を参照されたい。
【０１５７】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）により、Ｔ細胞特異性が、がん細胞の表面上に発現される、抗体に認識される抗原の方へ向け直され、一方、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）により、細胞内腫瘍抗原が含まれるように標的の範囲が広がる。Ｂ細胞分化抗原ＣＤ１９に特異的な、ＣＡＲにより向け直されたＴ細胞は、Ｂ細胞悪性腫瘍の処置における劇的な有効性が示されており、一方、ＴＣＲにより向け直されたＴ細胞は、固形がんに罹患している患者における利点が示されている。Stauss  et  al.は、がんの処置における使用のための治療用ＣＡＲおよびＴＣＲを改変するため、例えば、抗原特異的エフェクター機能を増強し、操作されたＴ細胞の毒性を限定するための戦略を記載している（Current  Opinion  in  Pharmacology  2015,  24:  113-118）。
【０１５８】
本発明の１つの態様は、ＨＬＡ−Ａ２によって腫瘍細胞の表面上にディスプレイされるＨＰＶ１６Ｅ７ペプチド、例えば、ＨＰＶ１６Ｅ７のアミノ酸残基１１〜１９または８２〜９０を含むペプチドなどに特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。本発明の一実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲは、細胞外標的特異的結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ゼータもしくはＦｃＲガンマに由来するシグナル伝達ドメインなど）、および／または、これだけに限定されないが、例えば、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ１３４もしくはＣＤ２７８などの共刺激分子に由来する１つもしくは複数の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。一実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ８アルファヒンジなどの、細胞外結合性ドメインと膜貫通ドメインの間のヒンジまたはスペーサー領域を含む。本発明の別の実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲは、細胞外標的特異的結合性ドメイン、およびＴ細胞受容体定常ドメイン（「Ｔ−ボディ構築物」）を含む。
【０１５９】
本明細書に記載のＣＡＲのいずれかへの使用のために、細胞外標的特異的結合性ドメインは、本発明の抗原結合性タンパク質のＦａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、Ｆｖ、または単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を含み得ることが理解されるべきである。
【０１６０】
本明細書で使用される場合、ＣＡＲの結合性ドメインまたは細胞外ドメインにより、目的の標的抗原に結合する能力を有するＣＡＲがもたらされる。結合性ドメインは、生体分子（例えば、細胞表面受容体または腫瘍タンパク質、またはその構成成分）を特異的に認識し、それに結合する能力を有する任意のタンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、またはペプチドであり得る。結合性ドメインは、任意の天然に存在する、合成の、半合成の、または組換えによって作製された、目的の生体分子に対する結合パートナーを含む。例えばまた、本明細書にさらに記載されている通り、結合性ドメインは、抗体軽鎖および重鎖可変領域であってよい、または軽鎖および重鎖可変領域は単鎖にいずれかの方向で共に接合していてよい（例えば、ＶＬ−ＶＨまたはＶＨ−ＶＬ）。ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、または表面プラズモン共鳴分析（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ分析を使用する）を含めた、特定の標的に特異的に結合する本開示の結合性ドメインを同定するための種々のアッセイが公知であり、また、本明細書に記載されている。標的は、それに対して腫瘍死滅をもたらすエフェクター免疫応答が誘発されることが望ましい、臨床的に興味深い任意の抗原であり得る。一実施形態では、キメラ抗原受容体の結合性ドメインの標的抗原は、腫瘍細胞の表面上にＨＬＡ−Ａ２により提示されるＨＰＶ１６Ｅ７ペプチドのコンフォメーションエピトープ、例えば、ＨＰＶ１６Ｅ７のアミノ酸残基１１〜１９または８２〜９０を含むペプチドなどである。
【０１６１】
例示的な結合性ドメインとしては、ｓｃＦｖなどの抗体の抗原結合性断片、ｓｃＴＣＲ、受容体の細胞外ドメイン、細胞表面分子／受容体のリガンド、またはその受容体結合性ドメイン、および腫瘍結合性タンパク質などの抗原結合性タンパク質が挙げられる。ある特定の実施形態では、本発明のＣＡＲに含められる抗原結合性ドメインは、可変領域（Ｆｖ）、ＣＤＲ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ＶＨ、ＶＬ、ドメイン抗体バリアント（ｄＡｂ）、ラクダ科動物抗体（ＶＨＨ）、フィブロネクチン３ドメインバリアント、アンキリンリピートバリアントおよび他のタンパク質スキャフォールドに由来する他の抗原特異的結合性ドメインであり得る。
【０１６２】
一実施形態では、ＣＡＲの結合性ドメインは、抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７単鎖抗体（ｓｃＦｖ）であり、マウスｓｃＦｖ、ヒトｓｃＦｖまたはヒト化ｓｃＦｖであり得る。単鎖抗体は、所望の標的に特異的なハイブリドーマのＶ領域遺伝子からクローニングすることができる。可変領域重鎖（ＶＨ）および可変領域軽鎖（ＶＬ）のクローニングに使用することができる技法は、例えば、Orlandi  et  al.,  PNAS,  1989;  86:  3833-3837に記載されている。したがって、ある特定の実施形態では、結合性ドメインは、抗体由来の結合性ドメインを含むが、抗体に由来しない結合性ドメインであってもよい。抗体由来の結合性ドメインは、抗体の断片または抗体の１つもしくは複数の断片の遺伝子操作産物であり得、当該断片は、抗原との結合に関与するものである。
【０１６３】
ある特定の実施形態では、本発明のＣＡＲは、分子の妥当な間隔およびコンフォメーションで付加された種々のドメイン間のリンカーを含み得る。例えば、一実施形態では、結合性ドメインＶＨまたはＶＬの間に、１〜１０の間のアミノ酸長であり得るリンカーが存在し得る。他の実施形態では、キメラ抗原受容体のドメインのいずれかの間のリンカーは、１〜２０アミノ酸長または２０アミノ酸長であり得る。この点について、リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０アミノ酸長であり得る。さらなる実施形態では、リンカーは、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０アミノ酸長であり得る。本明細書に記載の数を含めた範囲、例えば、１０〜３０アミノ酸長のリンカーも本明細書に含まれる。
【０１６４】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲへの使用に適したリンカーは、柔軟なリンカーである。適切なリンカーは、容易に選択することができ、４アミノ酸〜１０アミノ酸、５アミノ酸〜９アミノ酸、６アミノ酸〜８アミノ酸、または７アミノ酸〜８アミノ酸を含め、１アミノ酸（例えば、Ｇｌｙ）から２０アミノ酸まで、２アミノ酸から１５アミノ酸まで、３アミノ酸から１２アミノ酸までなどの適切な種々の長さのいずれかであり得、１アミノ酸、２アミノ酸、３アミノ酸、４アミノ酸、５アミノ酸、６アミノ酸、または７アミノ酸であり得る。
【０１６５】
例示的な柔軟なリンカーとしては、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、グリシン−セリンポリマー（ｎは少なくとも１の整数である）、グリシン−アラニンポリマー、アラニン−セリンポリマー、および当技術分野で公知の他の柔軟なリンカーが挙げられる。グリシンポリマーおよびグリシン−セリンポリマーは、比較的構造化されておらず、したがって、本明細書に記載のＣＡＲなどの融合タンパク質のドメイン間の中性つなぎ鎖として機能することができる。グリシンは、ファイ−プサイ空間にアラニンよりも大きく接近し、側鎖がより長い残基よりも制限がはるかに小さい（Scheraga,  Rev.  Computational  Chem.  11173-142  (1992)を参照されたい）。ＣＡＲの設計は、全てまたは部分的に柔軟なリンカーを含み得、したがって、リンカーは、所望のＣＡＲ構造をもたらすために、柔軟なリンカー、ならびに、より柔軟性の低い構造を付与する１つまたは複数の部分を含み得ることが当業者には理解されよう。
【０１６６】
ＣＡＲの結合性ドメインの後には「スペーサー」または「ヒンジ」が続いてよく、これは、妥当な細胞間接触、抗原結合性および活性化を可能にするために抗原結合性ドメインをエフェクター細胞表面から離れるよう動かす領域を指す（Patel  et  al.,  Gene  Therapy,  1999;  6:  412-419）。ＣＡＲ内のヒンジ領域は、一般に、膜貫通（ＴＭ）ドメインと結合性ドメインの間にある。ある特定の実施形態では、ヒンジ領域は、免疫グロブリンヒンジ領域であってよく、野生型免疫グロブリンヒンジ領域であっても、または変更された野生型免疫グロブリンヒンジ領域であってもよい。本明細書に記載のＣＡＲに使用される他の例示的なヒンジ領域としては、ＣＤ８アルファ、ＣＤ４、ＣＤ２８およびＣＤ７などの１型膜タンパク質の細胞外領域に由来するヒンジ領域が挙げられ、これは、これらの分子に由来する野生型ヒンジ領域であってもよく、または変更されたものであってもよい。一実施形態では、ヒンジ領域は、ＣＤ８アルファヒンジを含む。
【０１６７】
「膜貫通」領域またはドメインは、細胞外結合性部分を免疫エフェクター細胞の原形質膜に繋ぎ止め、結合性ドメインの標的抗原への結合を容易にするＣＡＲの部分である。膜貫通ドメインは、ＣＤ３ゼータ膜貫通ドメインであってよいが、ＣＤ８アルファ、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ４５、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、およびＣＤ１５４から得られるものを含む他の膜貫通ドメインも使用することができる。一実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ１３７の膜貫通ドメインである。ある特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、合成されたものであり、その場合、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を主に含む。
【０１６８】
「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、エフェクター細胞機能、例えば、活性化、サイトカイン産生、増殖、および、ＣＡＲが結合した標的細胞への細胞傷害因子の放出を含めた細胞傷害活性、または細胞外ＣＡＲドメインへの抗原結合で引き出される他の細胞応答を引き出すために標的抗原への有効なＣＡＲ結合のメッセージを免疫エフェクター細胞の内部へ伝達することに関与するキメラ抗原受容体タンパク質の部分を指す。「エフェクター機能」という用語は、細胞の特殊化された機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解活性またはサイトカインの分泌を含めた活性の援助であり得る。したがって、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを伝達し、特殊化された機能を果たすように細胞を方向付けるタンパク質の一部を指す。通常、細胞内シグナル伝達ドメイン全体を使用することができるが、多くの場合、ドメイン全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの短縮された部分を使用する限り、そのような短縮された部分によりエフェクター機能シグナルが伝達される限りは、そのような短縮された部分をドメイン全体の代わりに使用することができる。細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを伝達するために十分な、細胞内シグナル伝達ドメインの任意の短縮された部分を含むものとする。細胞内シグナル伝達ドメインは、「シグナルトランスダクションドメイン」としても公知であり、一般には、ヒトＣＤ３またはＦｃＲｙ鎖の一部に由来する。
【０１６９】
Ｔ細胞受容体単独で生成されるシグナルは、Ｔ細胞の完全な活性化には不十分であること、および二次または共刺激シグナルも必要であることが公知である。したがって、Ｔ細胞活性化は、２つの別個のクラスの細胞質内シグナル伝達配列：Ｔ細胞受容体（一次細胞質内シグナル伝達配列）を通じて抗原依存的一次活性化を開始するもの、および抗原非依存的様式で作用して二次または共刺激シグナルをもたらすもの（二次細胞質内シグナル伝達配列）によって媒介されると言うことができる。一次細胞質内シグナル伝達配列により、Ｔ細胞受容体複合体の一次活性化が阻害性に、または阻害性にのいずれかで制御される。共刺激様式で作用する一次細胞質内シグナル伝達配列は、免疫受容活性化チロシンモチーフまたはＩＴＡＭとして公知のシグナル伝達モチーフを含有し得る。
【０１７０】
本発明において特に使用される一次細胞質内シグナル伝達配列を含有するＩＴＡＭの例としては、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂおよびＣＤ６６ｄに由来するものが挙げられる。いくつかの特定の実施形態では、本明細書に記載の抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７  ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータまたはＦｃＲガンマに由来する。
【０１７１】
本明細書で使用される場合、「共刺激シグナル伝達ドメイン」または「共刺激ドメイン」という用語は、共刺激分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲの部分を指す。共刺激分子は、抗原に結合した際のＴリンパ球の効率的な活性化および機能に必要な第２のシグナルをもたらす、抗原受容体またはＦｃ受容体以外の細胞表面分子である。そのような共刺激分子の例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＤ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ２およびＣＤ８３に特異的に結合するリガンドが挙げられる。したがって、本開示は、ＣＤ３ゼータおよび４−１ＢＢに由来する例示的な共刺激ドメインを提供するが、他の共刺激ドメインも本明細書に記載のＣＡＲとの使用が意図されている。１つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインを含めることにより、ＣＡＲ受容体を発現するＴ細胞の有効性および増大を増強することができる。細胞内シグナル伝達および共刺激シグナル伝達ドメインは、膜貫通ドメインのカルボキシル末端と任意の順序でタンデムに連結することができる。
【０１７２】
ＣＤ３またはＦｃＲガンマ由来のシグナル伝達ドメインを含有するように操作されたｓｃＦｖに基づくＣＡＲにより、Ｔ細胞活性化およびエフェクター機能のための強力なシグナルが送達されることが示されているが、これらは、同時の共刺激シグナルの不在下でＴ細胞の生存および増大を促進するシグナルを引き出すためには十分でない。結合性ドメイン、ヒンジ、膜貫通およびＣＤ３ゼータまたはＦｃＲガンマに由来するシグナル伝達ドメインを１つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ１３４およびＣＤ２７８に由来する細胞内共刺激ドメイン）と共に含有する他のＣＡＲにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ならびに動物モデルおよびがん患者において、抗腫瘍活性をより有効に方向付けること、ならびに、サイトカイン分泌、溶解活性、ＣＡＲ発現Ｔ細胞の生存および増殖を増大させることができる（Milone  et  al.,  Molecular  Therapy,  2009;  17:  1453-1464;  Zhong  et  al.,  Molecular  Therapy,  2010;  18:  413-420;  Carpenito  et  al.,  PNAS,  2009;  106:  3360-3365）。
【０１７３】
一実施形態では、本発明のＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７  ＣＡＲは、（ａ）結合性ドメインとして抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７  ｓｃＦｖ（例えば、表１に記載のＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗体の任意の１つまたは複数由来の結合性領域（例えば、ＣＤＲまたは可変ドメイン）を有するｓｃＦｖ）（ｂ）ヒトＣＤ８アルファに由来するヒンジ領域、（ｃ）ヒトＣＤ８アルファ膜貫通ドメイン、ならびに（ｄ）ヒトＴ細胞受容体ＣＤ３ゼータ鎖（ＣＤ３）細胞内シグナル伝達ドメイン、および必要に応じてＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ１３４、およびＣＤ２７８に由来する１つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。一実施形態では、異なるタンパク質ドメインをアミノ末端からカルボキシル末端まで、以下の順序で配置する：結合性ドメイン、ヒンジ領域および膜貫通ドメイン。細胞内シグナル伝達ドメインおよび必要に応じた共刺激シグナル伝達ドメインを膜貫通カルボキシ末端に任意の順序でタンデムに連結して、単鎖キメラポリペプチドを形成する。一実施形態では、ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７  ＣＡＲをコードする核酸構築物は、異なるコード配列、例えば、（５’〜３’）ヒト抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７  ｓｃＦｖのコード配列、ヒトＣＤ８アルファ−ヒンジのコード配列、ヒトＣＤ８アルファ膜貫通ドメインのコード配列、およびＣＤ３ゼータ細胞内シグナル伝達ドメインのコード配列を含む核酸分子を含むキメラ核酸分子である。別の実施形態では、ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７  ＣＡＲをコードする核酸構築物は、異なるコード配列、例えば、（５’〜３’）ヒト抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７  ｓｃＦｖのコード配列、ヒトＣＤ８アルファ−ヒンジのコード配列、ヒトＣＤ８アルファ膜貫通ドメインのコード配列、ＣＤ１３７共刺激ドメインのコード配列、およびＣＤ３ゼータ共刺激ドメインのコード配列を含む核酸分子を含むキメラ核酸分子である。ある特定の実施形態では、ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７  ＣＡＲをコードする核酸構築物は、異なるコード配列、例えば、（５’〜３’）ヒト抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７  ｓｃＦｖのコード配列、ヒトＣＤ８アルファ−ヒンジのコード配列、ヒトＣＤ８アルファ膜貫通ドメインのコード配列、ＣＤ１３７共刺激ドメインのコード配列、およびＣＤ３ゼータ共刺激ドメインのコード配列を含む核酸分子を含むキメラ核酸分子であり、ここで、抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７  ｓｃＦｖは、配列番号２、３４、８２、１９４、２８２、および５０６からなる群から選択されるＶＨ、ならびに配列番号１０、４２、９０、２０２、２９０および５１４からなる群から選択されるＶＬを含む。一部の実施形態では、本発明は、配列番号５４０、５４１、５４２、５４３、５４４および５４５からなる群から選択されるＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７  ＣＡＲをコードする核酸分子を含む。
【０１７４】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲをコードするポリヌクレオチドをベクターに挿入する。「ベクター」という用語は、本明細書で使用される場合、タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、そのタンパク質の発現および／またはポリヌクレオチドのクローニングをもたらすために共有結合により挿入することができるビヒクルを指す。そのようなベクターは「発現ベクター」と称することもできる。単離されたポリヌクレオチドは、当技術分野で公知の任意の適切な方法を使用してベクターに挿入することができ、例えば、これだけに限定することなく、ベクターを、妥当な制限酵素を使用して消化することができ、次いで、マッチする制限末端を有する単離されたポリヌクレオチドとライゲーションすることができる。発現ベクターは、細胞において転写させることができる遺伝子産物の少なくとも一部をコードする異種または改変された核酸配列を組み入れ、発現させる能力を有する。ほとんどの場合、次いで、ＲＮＡ分子をタンパク質に翻訳する。発現ベクターは、種々の調節配列を含有し得、これらは、特定の宿主生物体における作動可能に連結したコード配列の転写、および場合によって翻訳に必要な核酸配列と称される。転写および翻訳を支配する調節配列に加えて、ベクターおよび発現ベクターは、他の機能も果たし、以下で考察する核酸配列を含有し得る。発現ベクターは、追加的なエレメントを含み得、例えば、発現ベクターは、２つの複製系を有し得、したがって、２つの生物体において、例えば、発現のためにヒト細胞において、ならびにクローニングおよび増幅のために原核生物宿主において維持することが可能になる。
【０１７５】
発現ベクターは、そのそれぞれの宿主細胞における効率的な遺伝子の転写および翻訳のための、ＣＭＶ、ＰＧＫおよびＥＦ１アルファプロモーターなどのプロモーター配列、リボソーム認識および結合性ＴＡＴＡボックス、ならびに３’ＵＴＲＡＡＵＡＡＡ転写終結配列などの、必要な５’上流および３’下流制御エレメントを有し得る。他の適切なプロモーターとしては、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ＨＩＶ  ＬＴＲプロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、ＥＢＶ最初期プロモーター、およびラウス肉腫ウイルスプロモーターである構成的プロモーターが挙げられる。これだけに限定されないが、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、およびクレアチンキナーゼプロモーターを含めたヒト遺伝子プロモーターも使用することができる。ある特定の実施形態では、誘導性プロモーターもキメラ抗原受容体を発現するベクターの一部として考えられている。これにより、目的のポリヌクレオチド配列の発現をオンにするまたは発現をオフにすることができる分子スイッチがもたらされる。誘導性プロモーターの例としては、これだけに限定されないが、メタロチオネインプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、またはテトラサイクリンプロモーターが挙げられる。
【０１７６】
発現ベクターは、発現されるＣＡＲに組み入れられる６×−ヒスチジン、ｃ−Ｍｙｃ、およびＦＬＡＧタグなどの追加的な配列を有し得る。したがって、発現ベクターを、発現ベクターで行われる目的の核酸（複数可）の効率的な転写を容易にするまたは増強することができる、時にはエンハンサー配列、プロモーター領域および／またはターミネーター配列として機能し得る５’および３’非翻訳制御配列を含有するように操作することができる。発現ベクターを、特定の細胞型、細胞の場所、または組織型における複製および／または発現機能性（例えば、転写および翻訳）のために操作することもできる。発現ベクターは、宿主またはレシピエント細胞においてベクターを維持するための選択マーカーを含み得る。
【０１７７】
ベクターの例は、プラスミド、自律複製配列、および転移因子である。さらなる例示的なベクターとしては、限定することなく、プラスミド、ファージミド、コスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、またはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）などの人工染色体、ラムダファージまたはＭ１３ファージなどのバクテリオファージ、および動物ウイルスが挙げられる。ベクターとして有用な動物ウイルスのカテゴリーの例としては、限定することなく、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、およびパポーバウイルス（例えば、ＳＶ４０）が挙げられる。発現ベクターの例は、哺乳動物細胞における発現のためのＬｅｎｔｉ−Ｘ（商標）バイシストロン発現系（Ｎｅｏ）ベクター（Ｃｌｏｎｔｒｃｈ）、ｐＣｌｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）；哺乳動物細胞におけるレンチウイルス媒介性遺伝子移入および発現のためのｐＬｅｎｔｉ４／Ｖ５−ＤＥＳＴ（商標）、ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−ＤＥＳＴ（商標）、およびｐＬｅｎｔｉ６．２Ｎ５−ＧＷ／ｌａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。哺乳動物細胞においてキメラタンパク質を発現させるために、本明細書に開示されるＣＡＲのコード配列をそのような発現ベクターにライゲーションすることができる。
【０１７８】
ある特定の実施形態では、本発明のＣＡＲをコードする核酸は、ウイルスベクター内に提供される。ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、または泡沫状ウイルスに由来するものであり得る。本明細書で使用される場合、「ウイルスベクター」という用語は、ウイルス起源のエレメントを少なくとも１つ含み、ウイルスベクター粒子にパッケージングすることが可能な核酸ベクター構築物を指す。ウイルスベクターには、必須ではないウイルス遺伝子の代わりに、本明細書に記載の種々のキメラタンパク質のコード配列を含めることができる。ベクターおよび／または粒子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかにおいてＤＮＡ、ＲＮＡまたは他の核酸を細胞に移入する目的で利用することができる。多数の形態のウイルスベクターが当技術分野で公知である。
【０１７９】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲのコード配列を含有するウイルスベクターは、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである。「レトロウイルスベクター」という用語は、主にレトロウイルスに由来する構造的および機能的遺伝子エレメントを含有するベクターを指す。「レンチウイルスベクター」という用語は、主にレンチウイルスに由来するＬＴＲの外側の構造的および機能的遺伝子エレメントを含有するベクターを指す。
【０１８０】
本明細書において使用するためのレトロウイルスベクターは、任意の公知のレトロウイルス（例えば、Ｃ型レトロウイルス、例えば、モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭｏＭＳＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）、スプーマウイルス、Ｆｒｉｅｎｄ、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ））に由来し得る。本発明のレトロウイルスとしては、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、ＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−２、ならびにレトロウイルスのレンチウイルスファミリー、例えば、ヒト免疫不全ウイルス、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウマ免疫不全ウイルス（ＥＩＶ）、および他のクラスのレトロウイルスなども挙げられる。
【０１８１】
本明細書において使用するためのレンチウイルスベクターは、ゆっくりと発達する疾患を生じさせるレトロウイルスの群（または属）であるレンチウイルスに由来するベクターを指す。この群に含まれるウイルスとしては、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス；ＨＩＶ１型、およびＨＩＶ２型を含む）；ビスナ・マエディ；ヤギ関節炎脳炎ウイルス；ウマ伝染性貧血ウイルス；ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）；ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）；およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられる。組換えレンチウイルスの調製は、Dull  et  al.  and  Zufferey  et  al.  (Dull  et  al.,  J.  Virol.,  1998;  72:  8463-8471  and  Zufferey  et  al.,  J.  Virol.  1998;  72:  9873-9880）による方法を使用して達成することができる。
【０１８２】
本発明において使用するためのレトロウイルスベクター（すなわち、レンチウイルスベクターおよび非レンチウイルスベクターの両方）は、標準のクローニング技法を使用し、所望のＤＮＡ配列を、本明細書に記載の順序および方向で組み合わせることによって形成することができる（Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  Ausubel,  F.  M.  et  al.  (eds.)  Greene  Publishing  Associates,  (1989),  Sections  9.10-9.14およびその他の標準の実験マニュアル;  Eglitis,  et  al.  (1985)  Science  230:  1395-1398;  Danos  and  Mulligan  (1988)  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  85:  6460-6464;  Wilson  et  al.  (1988)  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  85:  3014-3018;  Armentano  et  al.  (1990)  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  87:  6141-6145;  Huber  et  al.  (1991)  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  88:  8039-8043;  Ferry  et  al.  (1991)  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  88:  8377-8381;  Chowdhury  et  al.  (1991)  Science  254:  1802-1805;  van  Beusechem  et  al.  (1992)  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  89:  7640-7644;  Kay  et  al.  (1992)  Human  Gene  Therapy  3:  641-647;  Dai  et  al.  (1992)  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  89:  10892-10895;  Hwu  et  al.  (1993)  J.  Immunol  150:  4104-4115;  米国特許第４，８６８，１１６号；米国特許第４，９８０，２８６号；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０７１３６；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０２４６８；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０５３４５；およびＰＣＴ出願ＷＯ９２／０７５７３）。
【０１８３】
ベクターの形成に使用するためのレトロウイルス配列（すなわち、レンチウイルス配列および非レンチウイルス配列の両方）を得るために適した供給源としては、例えば、Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄを含めた市販の供給源から入手可能なゲノムＲＮＡおよびｃＤＮＡが挙げられる。配列は、化学的に合成することもできる。
【０１８４】
ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７  ＣＡＲを発現させるために、ベクターを宿主細胞に導入して、宿主細胞内でのポリペプチドの発現を可能にすることができる。発現ベクターは、これだけに限定することなく、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択マーカー、およびシグナル配列を含めた、発現を調節するための種々のエレメントを含有し得る。これらのエレメントは、上記の通り、当業者が必要に応じて選択することができる。例えば、プロモーター配列を、ベクター内のポリヌクレオチドの転写が促進されるように選択することができる。適切なプロモーター配列としては、限定することなく、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ベータアクチンプロモーター、ＥＦ１ａプロモーター、ＣＭＶプロモーター、およびＳＶ４０プロモーターが挙げられる。エンハンサー配列を、ポリヌクレオチドの転写が増強されるように選択することができる。選択マーカーを、ベクターが挿入された宿主細胞をベクターを挿入されていない宿主から選択することが可能になるように選択することができ、例えば、選択マーカーは、抗生物質耐性を付与する遺伝子であってよい。シグナル配列は、発現されたポリペプチドの、宿主細胞の外部への輸送が可能になるように選択することができる。
【０１８５】
ポリヌクレオチドのクローニングのために、ベクターを宿主細胞（単離された宿主細胞）に導入して、ベクター自体の複製を可能にし、それにより、ベクターに含有されるポリヌクレオチドのコピーを増幅することができる。クローニングベクターは、一般に、限定することなく、複製開始点、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、および選択マーカーを含む配列構成成分を含有し得る。これらのエレメントは、当業者が必要に応じて選択することができる。例えば、複製開始点は、宿主細胞におけるベクターの自律複製が促進されるように選択することができる。
【０１８６】
ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書に提示されるベクターを含有する単離された宿主細胞を提供する。ベクターを含有する宿主細胞は、ベクターに含有されるポリヌクレオチドの発現またはクローニングにおいて有用であり得る。適切な宿主細胞は、限定することなく、原核細胞、真菌細胞、酵母細胞、または哺乳動物細胞などの高等真核細胞を含み得る。この目的のための適切な原核細胞は、限定することなく、グラム陰性またはグラム陽性生物体などの真正細菌、例えば、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、例えば、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ、およびＳｈｉｇｅｌｌａ、ならびにＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓなどのＢａｃｉｌｌｉ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａなどのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、ならびにＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓを含む。
【０１８７】
本発明のＣＡＲを、当技術分野で公知のトランスフェクションおよび／または形質導入技法を使用して宿主細胞に導入する。本明細書で使用される場合、「トランスフェクション」および「形質導入」という用語は、外因性核酸配列が宿主細胞に導入されるプロセスを指す。核酸は、宿主細胞ＤＮＡに組み込むこともでき、または染色体外で維持することもできる。核酸は、一過性に維持することもでき、または安定に導入することもできる。トランスフェクションは、これだけに限定されないが、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈澱、ＤＥＡＥデキストラン媒介性トランスフェクション、ポリブレン媒介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、微量注射、リポソーム融合、リポフェクション、プロトプラスト融合、レトロウイルス感染、および微粒子銃を含めた当技術分野で公知の種々の手段によって実現することができる。形質導入は、トランスフェクションによるものではなく、ウイルス感染による、ウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターを使用する遺伝子（複数可）の送達を指す。ある特定の実施形態では、レトロウイルスベクターをパッケージングベクターによってビリオンに形質導入した後、細胞と接触させる。例えば、レトロウイルスベクターに保有される抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７  ＣＡＲをコードする核酸を感染およびプロウイルス組込みによって細胞に形質導入することができる。
【０１８８】
本明細書で使用される場合、「遺伝子操作された」または「遺伝子改変された」という用語は、細胞における総遺伝子材料に余分の遺伝子材料をＤＮＡまたはＲＮＡの形態で追加することを指す。「遺伝子改変細胞」、「改変細胞」、および「向け直された細胞」という用語は、互換的に使用される。
【０１８９】
特に、免疫エフェクター細胞の特異性を目的の標的抗原、例えば、ＨＬＡ−Ａ２によりディスプレイされるＨＰＶ１６Ｅ７ペプチド、例えば、アミノ酸残基１１〜１９または８２〜９０のコンフォメーションエピトープに向け直すために、本発明のＣＡＲを免疫エフェクター細胞に導入し、発現させる。
【０１９０】
本発明は、本明細書に記載のＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞を作出するための方法を提供する。一実施形態では、方法は、ＨＰＶ１６Ｅ７に関連する疾患または障害を有する対象などの対象から単離された免疫エフェクター細胞にトランスフェクトまたは形質導入し、したがって、免疫エフェクター細胞に本明細書に記載の１つまたは複数のＣＡＲを発現させることを含む。ある特定の実施形態では、免疫エフェクター細胞を個体から単離し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるさらなる操作を伴わずに遺伝子改変する。次いで、そのような細胞を個体に直接再投与することができる。さらなる実施形態では、免疫エフェクター細胞をまずｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて活性化し、刺激して増殖させた後、ＣＡＲを発現するように遺伝子改変する。この点について、免疫エフェクター細胞を遺伝子改変する（すなわち、本明細書に記載のＣＡＲを発現するように形質導入またはトランスフェクトする）前またはその後に培養することができる。
【０１９１】
本明細書に記載の免疫エフェクター細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける操作または遺伝子改変の前に、対象から細胞の供給源を得ることができる。特に、本明細書に記載のＣＡＲと共に使用するために、免疫エフェクター細胞はＴ細胞を含む。そのような組換えＴ細胞は、本明細書では、「Ｔ−ボディ」と称される。
【０１９２】
本発明の一実施形態では、Ｔ−ボディは、細胞外標的特異的結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ゼータまたはＦｃＲガンマに由来するシグナル伝達ドメインなど）、および／または、例えば、これだけに限定されないが、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ１３４もしくはＣＤ２７８などの共刺激分子に由来する１つもしくは複数の共刺激シグナル伝達ドメインを含む本発明のＣＡＲを含む。本発明の別の実施形態では、Ｔ−ボディは、細胞外標的特異的結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞外結合性ドメインと膜貫通ドメインの間のヒンジまたはスペーサー領域、細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ゼータまたはＦｃＲガンマに由来するシグナル伝達ドメインなど）、および／または共刺激分子に由来する１つもしくは複数の共刺激シグナル伝達ドメインを含む本発明のＣＡＲを含む。本発明のさらに別の実施形態では、Ｔ−ボディは、細胞外標的特異的結合性ドメイン、およびＴ細胞受容体定常ドメインを含むＴ−ボディ構築物ＣＡＲを含む。本明細書に記載のＣＡＲのいずれかを含むＴ−ボディに使用するために適した細胞外標的特異的結合性ドメインは、本発明の抗原結合性タンパク質のＦａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、Ｆｖ、または単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を含み得る。
【０１９３】
Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍を含めたいくつかの供給源から得ることができる。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞は、フィコール分離などの当業者に公知の任意の数の技法を使用して対象から採取された一単位の血液から得ることができる。一実施形態では、個体の循環血液由来の細胞をアフェレーシスによって得る。アフェレーシス産物は、一般には、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球、および血小板を含めたリンパ球を含有する。一実施形態では、アフェレーシスによって採取された細胞を、血漿画分を除去するため、および細胞をその後の処理のために妥当な緩衝剤または培地に入れるために洗浄することができる。本発明の一実施形態では、細胞をＰＢＳで洗浄する。代替の実施形態では、洗浄された溶液は、カルシウムを欠き、また、マグネシウムを欠く可能性がある、または全てではないが多くの二価カチオンを欠く可能性がある。当業者には理解される通り、洗浄ステップは、半自動フロースルー遠心分離機を使用することによるものなどの当業者に公知の方法によって実現することができる。洗浄後、細胞を種々の生体適合性緩衝剤に、または他の生理食塩溶液に緩衝剤を伴ってもしくは伴わずに再懸濁することができる。ある特定の実施形態では、細胞を直接再懸濁させた培養培地中のアフェレーシス試料の望ましくない構成成分を除去することができる。
【０１９４】
ある特定の実施形態では、Ｔ細胞を、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から、赤血球を溶解させ、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配による遠心分離によって単球を枯渇させることによって単離する。ＣＤ２８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞、およびＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞などの特定のＴ細胞の亜集団を正の選択または負の選択技法によってさらに単離することができる。例えば、負に選択された細胞に独特の表面マーカーに方向付けられる抗体の組合せを用いた負の選択によるＴ細胞集団の富化を実現することができる。本明細書において使用するための１つの方法は、負に選択された細胞に存在する細胞表面マーカーに方向付けられるモノクローナル抗体のカクテルを使用する負の磁気免疫粘着反応またはフローサイトメトリーによる細胞選別および／または選択である。例えば、ＣＤ４＋細胞を負の選択によって富化するために、モノクローナル抗体カクテルは、一般には、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ−ＤＲ、およびＣＤ８に対する抗体を含む。フローサイトメトリーおよび細胞選別を使用して、本発明において使用するための目的の細胞集団を単離することもできる。
【０１９５】
本明細書に記載の方法を使用するＣＡＲを用いた遺伝子改変のためにＰＢＭＣを直接使用することができる。ある特定の実施形態では、ＰＢＭＣの単離後、Ｔリンパ球をさらに単離し、ある特定の実施形態では、細胞傷害性Ｔ細胞およびヘルパーＴリンパ球の両方を、遺伝子改変および／または増大の前またはその後のいずれかに、ナイーブＴ細胞亜集団、メモリーＴ細胞亜集団、およびエフェクターＴ細胞亜集団に選別することができる。標準の方法を使用することによってＣＤ８＋細胞を得ることができる。一部の実施形態では、ＣＤ８＋細胞を、これらの型のＣＤ８＋細胞のそれぞれに関連する細胞表面抗原を同定することによってナイーブ細胞、セントラルメモリー細胞、およびエフェクター細胞にさらに選別する。複数の実施形態では、メモリーＴ細胞はＣＤ８＋末梢血リンパ球のＣＤ６２Ｌ＋サブセットおよびＣＤ６２Ｌ−サブセットの両方に存在する。ＰＢＭＣを、抗ＣＤ８抗体および抗ＣＤ６２Ｌ抗体を用いた染色後にＣＤ６２Ｌ−ＣＤ８＋画分およびＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ８＋画分に選別する。一部の実施形態では、セントラルメモリーＴＣＭの表現型マーカーの発現は、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ３、およびＣＤ１２７を含み、グランザイムＢについて陰性である。一部の実施形態では、セントラルメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞、ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。一部の実施形態では、エフェクターＴ細胞は、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、およびＣＤ１２７について陰性であり、グランザイムＢおよびパーフォリンについて陽性である。一部の実施形態では、ナイーブＣＤ８＋Ｔリンパ球は、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ１２７、およびＣＤ４５ＲＡを含めたナイーブＴ細胞の表現型マーカーの発現を特徴とする。
【０１９６】
ある特定の実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞を亜集団にさらに選別する。例えば、ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞を、細胞表面抗原を有する細胞集団を同定することによってナイーブ細胞、セントラルメモリー細胞、およびエフェクター細胞に選別することができる。ＣＤ４＋リンパ球は、標準の方法によって得ることができる。一部の実施形態では、ナイーブＣＤ４＋Ｔリンパ球は、ＣＤ４５ＲＯ−Ｔ細胞、ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞、ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞である。一部の実施形態では、セントラルメモリーＣＤ４＋細胞は、ＣＤ６２Ｌ陽性かつＣＤ４５ＲＯ陽性である。一部の実施形態では、エフェクターＣＤ４＋細胞は、ＣＤ６２ＬおよびＣＤ４５ＲＯ陰性である。
【０１９７】
Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞は、公知の方法を使用して単離した後に遺伝子改変することができる、または、免疫エフェクター細胞は、遺伝子改変する前にｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて活性化し、増大させる（または前駆体の場合では分化させる）ことができる。別の実施形態では、Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞を、本明細書に記載のキメラ抗原受容体を用いて遺伝子改変し（例えば、ＣＡＲをコードする核酸を含むウイルスベクターを用いて形質導入する）、次いで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて活性化し、増大させる。Ｔ細胞を活性化し、増大させるための方法は、当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第６，９０５，８７４号；米国特許第６，８６７，０４１号；米国特許第６，７９７，５１４号；ＷＯ２０１２０７９０００、ＵＳ２０１６／０１７５３５８に記載されている。一般に、そのような方法は、ＰＢＭＣまたは単離されたＴ細胞を、一般にビーズまたは他の表面に付着させた抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体などの刺激性作用剤および共刺激性作用剤と、ＩＬ−２などの妥当なサイトカインを伴う培養培地中で接触させることを含む。同じビーズに付着させた抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体は「代理」抗原提示細胞（ＡＰＣ）として機能する。他の実施形態では、米国特許第６，０４０，１７７号；米国特許第５，８２７，６４２号；およびＷＯ２０１２１２９５１４に記載されているものなどの方法を使用し、フィーダー細胞ならびに妥当な抗体およびサイトカインを用いてＴ細胞を活性化し、刺激して増殖させることができる。
【０１９８】
本発明は、ＨＰＶに関連する疾患または障害、例えば、がんを処置するための改変免疫エフェクター細胞の集団を提供し、改変免疫エフェクター細胞は、本明細書に開示されるＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７  ＣＡＲを含む。
【０１９９】
本明細書に記載の通り調製したＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞は、本開示に基づいて当業者には明らかになる公知の技法またはその変形に従った養子免疫療法のための方法および組成物に利用することができる。例えば、Gruenbergらに対する米国特許出願公開第２００３／０１７０２３８号を参照されたい；Rosenbergに対する米国特許第４，６９０，９１５号も参照されたい。
【０２００】
一部の実施形態では、まず細胞をそれらの培養培地から収集し、次いで、細胞を、投与に適した培地および容器システム（「薬学的に許容される」担体）を用いて洗浄し、処置有効量に濃縮することによって細胞を製剤化する。適切な注入培地は、任意の等張性培地製剤、一般には、通常の生理食塩水、Ｎｏｒｍｏｓｏｌ  Ｒ（Ａｂｂｏｔｔ）またはＰｌａｓｍａ−Ｌｙｔｅ  Ａ（Ｂａｘｔｅｒ）であってよいが、水または乳酸リンゲル液中５％ブドウ糖も利用することができる。注入培地にヒト血清アルブミンを補充することができる。
【０２０１】
組成物中の処置有効量の細胞は、少なくとも２個の細胞（例えば、少なくとも１つのＣＤ８＋セントラルメモリーＴ細胞および少なくとも１つのＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞サブセット）である、または、より一般には、１０２個よりも多くの細胞、および１０６個までおよび１０８個または１０９個の細胞を含み、１０１０個よりも多くの細胞であり得る。細胞の数は、意図される組成物の最終的な使用、同様にそれに含まれる細胞の型に依存する。
【０２０２】
細胞は、治療を受ける患者に対して自己または異種であり得る。所望であれば、処置は、本明細書に記載の通り、免疫応答の誘導を増強するために、マイトジェン（例えば、ＰＨＡ）またはリンフォカイン、サイトカイン、および／またはケモカイン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１８、およびＴＮＦ−β、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、Ｆｌｔ３−Ｌ、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ１αなど）の投与も含み得る。
【０２０３】
本発明のＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞集団は、単独で、または希釈剤および／もしくはＩＬ−２もしくは他のサイトカインもしくは細胞集団などの他の構成成分と組み合わせた医薬組成物としてのいずれかで投与することができる。簡単に述べると、本発明の医薬組成物は、本明細書に記載のＴ細胞などのＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞集団を、１つもしくは複数の薬学的にもしくは生理的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて含み得る。そのような組成物は、例えば中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝食塩水などの緩衝剤；グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールなどの炭水化物；タンパク質；ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸；抗酸化剤；ＥＤＴＡまたはグルタチオンなどのキレート剤；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；および防腐剤を含み得る。本発明の組成物は、静脈内投与用に製剤化されることが好ましい。
【０２０４】
本明細書に記載の方法または当技術分野で公知の他の方法を使用して本明細書に記載のＣＡＲ発現Ｔ細胞を投与することより対象において誘導される抗腫瘍免疫応答は、感染細胞を死滅させることができる細胞傷害性Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞、およびヘルパーＴ細胞応答によって媒介される細胞性免疫応答を含み得る。Ｂ細胞を活性化し、したがって、抗体産生を導くことができるヘルパーＴ細胞によって主に媒介される体液性免疫応答も誘導することができる。本発明の組成物によって誘導される免疫応答の型を分析するために様々な技法を使用することができ、それらは、当技術分野において十分に記載されている；例えば、Current  Protocols  in  Immunology,  Edited  by:  John  E.  Coligan,  Ada  M.  Kruisbeek,  David  H.  Margulies,  Ethan  M.  Shevach,  Warren  Strober  (2001)  John  Wiley  &  Sons,  NY,  N.Y。
【０２０５】
したがって、本発明は、ＨＰＶに関連する疾患または障害、例えば、ＨＰＶ１６Ｅ７陽性がんと診断された、またはそれを有する疑いがある、またはそれが発生するリスクがある個体を処置するための方法であって、個体に本明細書に記載のＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞を治療有効量で投与するステップを含む方法を提供する。
【０２０６】
一実施形態では、本発明は、ＨＰＶ１６Ｅ７陽性がんと診断された対象を処置する方法であって、ＨＰＶ１６Ｅ７陽性がんと診断された対象から免疫エフェクター細胞を取り出すステップと、前記免疫エフェクター細胞を、本発明のキメラ抗原受容体をコードする核酸を含むベクターで遺伝子改変し、それにより、改変免疫エフェクター細胞の集団を作製するステップと、改変免疫エフェクター細胞の集団を同じ対象に投与するステップとを含む方法を提供する。一実施形態では、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞を含む。
【０２０７】
本明細書に記載の細胞組成物を投与するための方法は、対象において本発明のＣＡＲを直接発現するｅｘ  ｖｉｖｏで遺伝子改変された免疫エフェクター細胞の再導入、または対象に導入されるとＣＡＲを発現する成熟免疫エフェクター細胞に分化する遺伝子改変された免疫エフェクター細胞の前駆体の再導入のいずれかをもたらすために有効な任意の方法を含む。１つの方法は、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて末梢血Ｔ細胞に本発明による核酸構築物を用いて形質導入し、形質導入された細胞を対象に戻すことを含む。
【０２０８】
治療的投与および製剤
本発明は、本発明の抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質、例えば抗体またはその抗原結合性断片、またはＣＡＲを含む治療用組成物を提供する。本発明による治療用組成物は、移動、送達、耐性などの改善をもたらすために製剤に組み入れられた適切な担体、賦形剤、および他の作用剤と共に投与される。多数の妥当な製剤は、全ての薬剤師に公知の処方集：Remington's  Pharmaceutical  Sciences,  Mack  Publishing  Company,  Easton,  PAにおいて見いだすことができる。これらの製剤としては、例えば、散剤、ペースト剤、軟膏剤、ゼリー剤、ワックス、油、脂質、脂質（カチオン性または陰イオン性）含有小胞（例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）など）、ＤＮＡコンジュゲート、無水吸収ペースト剤、水中油および油中水エマルション、エマルションカーボワックス（種々の分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、ならびにカーボワックスを含有する半固体混合物が挙げられる。Powell  et  al.  "Compendium  of  excipients  for  parenteral  formulations"  PDA  (1998)  J  Pharm  Sci  Technol  52:  238-311も参照されたい。
【０２０９】
抗原結合性タンパク質、例えば抗体またはその抗原結合性断片の用量は、投与を受ける対象の年齢およびサイズ、標的疾患、状態、投与経路などに応じて変動し得る。本発明の抗原結合性タンパク質を成体患者における疾患もしくは障害を処置するため、またはそのような疾患を防止するために使用する場合、本発明の抗原結合性タンパク質、例えば抗体またはその抗原結合性断片を、通常、体重１ｋｇ当たり約０．１〜約６０ｍｇ、より好ましくは体重１ｋｇ当たり約５〜約６０ｍｇ、約２０〜約５０ｍｇ、約１０〜約５０ｍｇ、約１〜約１０ｍｇ、または約０．８〜約１１ｍｇの単一用量で投与することが有利である。状態の重症度に応じて、処置の頻度および持続時間を調整することができる。ある特定の実施形態では、本発明の抗原結合性タンパク質、例えば抗体またはその抗原結合性断片を少なくとも約０．１ｍｇ〜約８００ｍｇ、約１〜約５００ｍｇ、約５〜約３００ｍｇ、または約１０〜約２００ｍｇ、約１００ｍｇまで、または約５０ｍｇまでの初回用量として投与することができる。ある特定の実施形態では、初回用量の後、第２のまたは複数のその後の用量の抗原結合性タンパク質、例えば抗体またはその抗原結合性断片を、初回用量とほぼ同じまたはそれ未満であり得る量で投与することができ、ここで、その後の用量は、少なくとも１日〜３日；少なくとも１週間、少なくとも２週間；少なくとも３週間；少なくとも４週間；少なくとも５週間；少なくとも６週間；少なくとも７週間；少なくとも８週間；少なくとも９週間；少なくとも１０週間；少なくとも１２週間；または少なくとも１４週間隔てられる。
【０２１０】
種々の送達系、例えば、リポソームへの封入、微小粒子、マイクロカプセル、突然変異体ウイルスを発現することができる組換え細胞、受容体媒介性エンドサイトーシスが公知であり、本発明の医薬組成物を投与するために使用することができる（例えば、Wu  et  al.  (1987)  J.  Biol.  Chem.  262:  4429-4432を参照されたい）。導入の方法としては、これだけに限定されないが、皮内経路、経皮経路、筋肉内経路、腹腔内経路、静脈内経路、皮下経路、鼻腔内経路、硬膜外経路および経口経路が挙げられる。組成物は、任意の都合のよい経路によって、例えば、注入またはボーラス注射によって、上皮または皮膚粘膜の内層（例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜など）を通じた吸収によって投与することができ、また、他の生物活性のある作用剤と一緒に投与することができる。投与は、全身または局所であり得る。医薬組成物は、小胞、特にリポソーム中に入れて送達することもできる（例えば、Langer  (1990)  Science  249:  1527-1533を参照されたい）。
【０２１１】
本発明の抗原結合性タンパク質、例えば抗体またはその抗原結合性断片を送達するためのナノ粒子の使用も本明細書において意図されている。抗原結合性タンパク質とコンジュゲートしたナノ粒子は、治療への適用および診断への適用の両方のために使用することができる。抗原結合性タンパク質とコンジュゲートしたナノ粒子ならびに調製および使用の方法は、参照により本明細書に組み込まれるArruebo,  M.,  et  al.  2009  ("Antibody-conjugated  nanoparticles  for  biomedical  applications"  in  J.  Nanomat.  Volume  2009,  Article  ID  439389,  24  pages,  doi:  10.1155/2009/439389)により詳細に記載されている。腫瘍細胞または自己免疫性組織細胞またはウイルス感染細胞を標的とするために、ナノ粒子を開発し、医薬組成物に含有される抗原結合性タンパク質とコンジュゲートすることができる。薬物送達用のナノ粒子は、例えば、そのそれぞれの全体が本明細書に組み込まれる米国特許第８，２５７，７４０号、または米国特許第８，２４６，９９５号にも記載されている。
【０２１２】
ある特定の状況では、医薬組成物を徐放系で送達することができる。一実施形態では、ポンプを使用することができる。別の実施形態では、ポリマー材料を使用することができる。さらに別の実施形態では、徐放系は、組成物の標的の近傍に置くことができ、したがって、わずかな全身用量しか必要ない。
【０２１３】
注射用調製物は、静脈内注射、皮下注射、皮内注射、頭蓋内注射、腹腔内注射および筋肉内注射、点滴注入などのための剤形を含み得る。これらの注射用調製物は、一般に公知の方法によって調製することができる。例えば、注射用調製物は、例えば、上記の抗原結合性タンパク質またはその塩を注射に慣習的に使用される滅菌水性媒体または油性媒体中に溶解、懸濁、または乳化させることによって調製することができる。注射剤用の水性媒体としては、例えば、生理学的食塩水、グルコースおよび他の補助剤を含有する等張溶液などがあり、これらを、例えば、アルコール（例えば、エタノール）、多価アルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性物質［例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（硬化ヒマシ油のポリオキシエチレン（５０ｍｏｌ）付加生成物）］などの妥当な可溶化剤と組み合わせて使用することができる。油性媒体としては、例えば、ゴマ油、ダイズ油などが使用され、これらを、例えば、安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどの可溶化剤と組み合わせて使用することができる。このように調製された注射剤は、妥当なアンプルに充填されることが好ましい。
【０２１４】
本発明の医薬組成物は、標準の針およびシリンジを用いて皮下または静脈内に送達することができる。さらに、皮下送達に関しては、ペン型送達デバイスが本発明の医薬組成物の送達に容易に適用される。そのようなペン型送達デバイスは、再利用可能なものであっても使い捨てであってもよい。再利用可能なペン型送達デバイスでは、一般に、医薬組成物を含有する交換式カートリッジが利用される。カートリッジ中の医薬組成物が全て投与され、カートリッジが空になったら、空のカートリッジを容易に廃棄し、医薬組成物を含有する新しいカートリッジと交換することができる。次いで、ペン型送達デバイスを再使用することができる。使い捨てペン型送達デバイスでは、交換式カートリッジはない。その代わりに、使い捨てペン型送達デバイスは、デバイス内のリザーバー中に医薬組成物が保持された、予め充填された状態でもたらされる。医薬組成物がなくなり、リザーバーが空になったら、デバイス全体を廃棄する。
【０２１５】
多数の再利用可能なペン型および自動注入送達デバイスが本発明の医薬組成物の皮下送達に適用される。例としては、これらに確実に限定されるものではないが、ほんの数例を挙げると、ＡＵＴＯＰＥＮ（商標）（Ｏｗｅｎ  Ｍｕｍｆｏｒｄ，Ｉｎｃ．、Ｗｏｏｄｓｔｏｃｋ、ＵＫ）、ＤＩＳＥＴＲＯＮＩＣ（商標）ペン（Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｕｒｇｈｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＨＵＭＡＬＯＧ  ＭＩＸ  ７５／２５（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＯＧ（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＩＮ  ７０／３０（商標）ペン（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）、ＮＯＶＯＰＥＮ（商標）Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＮＯＶＯＰＥＮ  ＪＵＮＩＯＲ（商標）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＢＤ（商標）ペン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）、ＯＰＴＩＰＥＮ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ  ＰＲＯ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ  ＳＴＡＲＬＥＴ（商標）、およびＯＰＴＩＣＬＩＫ（商標）（Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）がある。本発明の医薬組成物の皮下送達に適用される使い捨てペン型送達デバイスの例としては、これらに確実に限定されるものではないが、ほんの数例を挙げると、ＳＯＬＯＳＴＡＲ（商標）ペン（Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）、ＦＬＥＸＰＥＮ（商標）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）、およびＫＷＩＫＰＥＮ（商標）（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、ＳＵＲＥＣＬＩＣＫ（商標）Ａｕｔｏｉｎｊｅｃｔｏｒ（Ａｍｇｅｎ、Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ、ＣＡ）、ＰＥＮＬＥＴ（商標）（Ｈａｓｅｌｍｅｉｅｒ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＥＰＩＰＥＮ（Ｄｅｙ、Ｌ．Ｐ．）およびＨＵＭＩＲＡ（商標）ペン（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）がある。
【０２１６】
上記の経口使用または非経口使用のための医薬組成物を、活性成分の用量に合うように適合させた単位用量の剤形に調製することが有利である。そのような単位用量の剤形としては、例えば、錠剤、ピル、カプセル剤、注射（アンプル）、坐剤などが挙げられる。含有される抗原結合性タンパク質の量は、一般に、単位用量の剤形当たり約５〜約５００ｍｇであり、特に、注射の形態では抗原結合性タンパク質が約５〜約１００ｍｇ含有されることが好ましく、他の剤形に関しては約１０〜約２５０ｍｇ含有されることが好ましい。
【０２１７】
抗原結合性タンパク質の治療的使用
本発明の抗体は、とりわけ、ＨＰＶ１６に関連するまたはＨＰＶ１６に媒介される任意の疾患または障害を処置する、防止するおよび／または好転させるために有用である。例えば、本発明は、ＨＰＶ関連がん（例えば、ＨＰＶ１６Ｅ７陽性がん）（腫瘍成長阻害）および／またはＨＰＶ感染などのＨＰＶに関連する疾患または障害を、本明細書に記載の抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質（または抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質を含む医薬組成物）をそのような処置を必要とする患者に投与することによって処置する方法、ならびに、ＨＰＶ関連がん（腫瘍成長阻害）および／またはＨＰＶ感染の処置に使用するための抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質（または抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質を含む医薬組成物）を提供する。本発明の抗原結合性タンパク質は、ＨＰＶ関連がんもしくはＨＰＶ感染などの疾患もしくは障害もしくは状態を処置する、防止する、および／もしくは好転させるため、ならびに／またはそのような疾患、障害もしくは状態に付随する少なくとも１つの症状を好転させるために有用である。本明細書に記載の処置方法に関しては、抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質を単独療法として（すなわち、唯一の治療剤として）投与することもでき、１つまたは複数の追加的な治療剤（その例は、本明細書の他の箇所で記載されている）と組み合わせて投与することもできる。
【０２１８】
本発明の一部の実施形態では、本明細書に記載の抗体は、これだけに限定されないが、ＨＰＶ関連がん、例えば、頭頸部の扁平上皮細胞癌などの扁平上皮細胞癌、子宮頸がん、肛門生殖器のがん、中咽頭がんを含めた原発性がんまたは再発性がんに罹患している対象を処置するために有用である。
【０２１９】
抗原結合性タンパク質を使用して、ＨＰＶ関連がんの初期または後期症状を処置することができる。一実施形態では、本発明の抗体またはその断片を使用して、進行がんまたは転移性がんを処置することができる。抗原結合性タンパク質は、腫瘍成長を低減または阻害または縮小することにおいて有用である。ある特定の実施形態では、本発明の抗原結合性タンパク質を用いた処置により、対象における腫瘍の４０％よりも大きな退縮、５０％よりも大きな退縮、６０％よりも大きな退縮、７０％よりも大きな退縮、８０％よりも大きな退縮または９０％よりも大きな退縮が導かれる。ある特定の実施形態では、抗原結合性タンパク質を使用して、腫瘍の再燃を防止することができる。ある特定の実施形態では、抗原結合性タンパク質は、ＨＰＶ関連がんを有する対象における無増悪生存または全生存を延長することにおいて有用である。一部の実施形態では、抗体は、化学療法または照射療法に起因する毒性を低減すると同時にＨＰＶ関連がんに罹患している患者の長期生存を維持することにおいて有用である。
【０２２０】
ある特定の実施形態では、本発明の抗原結合性タンパク質は、慢性ＨＰＶ感染に罹患している対象を処置するために有用である。一部の実施形態では、本発明の抗原結合性タンパク質は、宿主におけるウイルス力価を低下させることにおいて有用である。
【０２２１】
本発明の１つまたは複数の抗体を投与して、疾患または障害の症状または状態の１つまたは複数を軽減するまたは防止するまたはその重症度を低下させることができる。
【０２２２】
本発明の１つまたは複数の抗体を、ＨＰＶ関連がんなどのＨＰＶに関連する疾患または障害、およびＨＰＶ感染などの疾患または障害が発生するリスクがある患者に対して予防的に使用することも本明細書において意図されている。
【０２２３】
本発明のさらなる実施形態では、本抗体を、ＨＰＶ関連がんなどのＨＰＶに関連する疾患もしくは障害またはＨＰＶ感染に罹患している患者を処置するための医薬組成物を調製するために使用する。本発明の別の実施形態では、本抗体を、ＨＰＶ関連がんまたはＨＰＶ感染を処置するために有用な、当業者に公知の任意の他の作用剤または任意の他の治療と共に、補助療法として使用する。
【０２２４】
併用療法および製剤
併用療法は、本発明のＣＡＲなどの本発明の抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質（例えば、本発明のＣＡＲを含む免疫エフェクター細胞）または本発明の医薬組成物、および、本発明の抗原結合性タンパク質と有利に組み合わせることができる任意の追加的な治療剤を含み得る。本発明の抗原結合性タンパク質は、ＨＰＶ陽性がん、例えば、扁平上皮細胞癌、子宮頸がん、肛門生殖器のがん、頭頸部がん、または中咽頭がんなどのＨＰＶ１６Ｅ７に関連する疾患または障害を処置するまたは阻害するために使用される１つまたは複数の抗がん薬または治療と相乗的に組み合わせることができる。
【０２２５】
本発明の抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質を、腫瘍成長を阻害し、かつ／またはがん患者の生存を増強するための免疫賦活療法および／または免疫支持療法と組み合わせて使用することが本明細書において意図されている。免疫賦活療法は、抑制された免疫細胞に対する「ブレーキを外す」こと、または免疫応答を活性化するために「アクセルを踏む」ことのいずれかによって免疫細胞活性を強化するための直接免疫賦活療法を含む。例としては、他のチェックポイント受容体の標的化、ワクチン接種およびアジュバントが挙げられる。免疫支持モダリティは、免疫原性細胞死、炎症を促進することによって腫瘍の抗原性を増大することができる、または抗腫瘍免疫応答を促進する他の間接的な効果を有するものである。例としては、放射線、化学療法、抗血管新生剤、および外科手術が挙げられる。
【０２２６】
種々の実施形態では、１つまたは複数の本発明の抗原結合性タンパク質を、ＰＤ−１阻害剤（例えば、抗ＰＤ−１抗体、例えば、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ピジリズマブ、ＢＧＢ−Ａ３１７もしくはＲＥＧＮ２８１０など）、ＰＤ−Ｌ１阻害剤（例えば、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、例えば、アベルマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、ＭＤＸ−１１０５、もしくはＲＥＧＮ３５０４など）、ＣＴＬＡ−４阻害剤（例えば、イピリムマブ）、ＴＩＭ３阻害剤、ＢＴＬＡ阻害剤、ＴＩＧＩＴ阻害剤、ＣＤ４７阻害剤、ＧＩＴＲ阻害剤、別のＴ細胞共阻害剤もしくはリガンドのアンタゴニスト（例えば、ＣＤ−２８、２Ｂ４、ＬＹ１０８、ＬＡＩＲ１、ＩＣＯＳ、ＣＤ１６０もしくはＶＩＳＴＡに対する抗体）、インドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）阻害剤、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）アンタゴニスト［例えば、「ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ」、例えば、アフリバーセプトもしくはＵＳ７，０８７，４１１に記載されている他のＶＥＧＦ阻害性融合タンパク質など、もしくは抗ＶＥＧＦ抗体もしくはその抗原結合性断片（例えば、ベバシズマブ、もしくはラニビズマブ）もしくはＶＥＧＦ受容体の小分子キナーゼ阻害剤（例えば、スニチニブ、ソラフェニブ、もしくはパゾパニブ）］、Ａｎｇ２阻害剤（例えば、ネスバクマブ）、形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）阻害剤、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤（例えば、エルロチニブ、セツキシマブ）、ＣＤ２０阻害剤（例えば、抗ＣＤ２０抗体、例えば、リツキシマブなど）、腫瘍特異的抗原に対する抗体［例えば、ＣＡ９、ＣＡ１２５、黒色腫関連抗原３（ＭＡＧＥ３）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ビメンチン、腫瘍−Ｍ２−ＰＫ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ムチン−１、ＭＡＲＴ−１、およびＣＡ１９−９］、ワクチン（例えば、カルメット−ゲラン桿菌、がんワクチン）、抗原提示を増大させるためのアジュバント（例えば、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）、二重特異性抗体（例えば、ＣＤ３×ＣＤ２０二重特異性抗体、もしくはＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体）、細胞毒、化学療法剤（例えば、ダカルバジン、テモゾロミド、シクロホスファミド、ドセタキセル、ドキソルビシン、ダウノルビシン、シスプラチン、カルボプラチン、ゲムシタビン、メトトレキサート、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、およびビンクリスチン）、シクロホスファミド、照射療法、外科手術、ＩＬ−６Ｒ阻害剤（例えば、サリルマブ）、ＩＬ−４Ｒ阻害剤（例えば、デュピルマブ）、ＩＬ−１０阻害剤、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−２１、およびＩＬ−１５などのサイトカイン、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）（例えば、抗ＣＤ１９−ＤＭ４  ＡＤＣ、および抗ＤＳ６−ＤＭ４  ＡＤＣ）、抗炎症薬（例えば、コルチコステロイド、および非ステロイド性抗炎症薬）、抗酸化剤などの栄養補助剤、または、がんを処置するための任意の他の治療ケアと組み合わせて使用することができる。ある特定の実施形態では、本発明の抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質をＨＰＶワクチンと組み合わせて使用することができる。例示的なＨＰＶワクチンとしては、Ｇａｒｄａｓｉｌ、Ｇａｒｄａｓｉｌ９、およびＣ��ｒｖａｒｉｘ、Ｌｍ−ＬＬｏ−Ｅ７（ＡＤＸＳ１１−００１；ＡＤＸＳ−ＨＰＶ；Ａｄｖａｘｉｓ，Ｉｎｃ．）；ＧＬＢＬ１０１ｃ（ＧＥＮＯＬＡＣ  ＢＬ  Ｃｏｒｐ）；ＴＡ−ＨＰＶ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ（ＥＯＲＴＣ））；ＴＧ４００１（Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ／Ｒｏｃｈｅ）；ＭＶＡ  Ｅ２（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｏ  Ｍｅｘｉｃａｎｏ  ｄｅｌ  Ｓｅｇｕｒｏ  Ｓｏｃｉａｌ）；ＨＰＶ１６−ＳＬＰ（ＩＳＡ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；ＧＬ−０８１０（Ｇｌｉｋｎｉｋ  Ｉｎｃ．）；Ｐｅｐｃａｎ＋Ｃａｎｄｉｎ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ａｒｋａｎｓａｓ）；ＧＴＬ００１（ＰｒｏＣｅｒｖｉｘ；Ｇｅｎｔｉｃｅｌ）；ＴＡ−ＣＩＮ（Ｘｅｎｏｖａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）；ＴＡ−ＣＩＮ＋ＴＡ−ＨＰＶ（Ｃｅｌｔｉｃ  Ｐｈａｒｍａ）；ｐＮＧＶＬ４ａ−ｓｉｇ／Ｅ７（ｄｅｔｏｘ）／ＨＳＰ７０＋ＴＡ−ＨＰＶ（Ｓｉｄｎｅｙ  Ｋｉｍｍｅｌ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ）；ｐＮＧＶＬ４ａ−ＣＲＴ／Ｅ７（ｄｅｔｏｘ）（Ｓｉｄｎｅｙ  Ｋｉｍｍｅｌ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ）；ＧＸ−１８８Ｅ（Ｇｅｎｅｘｉｎｅ，Ｉｎｃ）；ＶＧＸ−３１００（Ｉｎｏｖｉｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８  Ｅ７およびキーホールリンペットヘモシアニンでパルスされた樹状細胞（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）；ＨＰＶ＋腫瘍ライセートでパルスされたＤＣ（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＤＢＴ，Ｇｏｖｔ．ｏｆ  Ｉｎｄｉａ））；ＰＤＳ０１０１（ＰＤＳ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐ）；ＰｒｏＣｅｒｖｉｘ（Ｇｅｎｔｉｃｅｌ）；ＧＸ−１８８Ｅ（Ｇｅｎｅｘｉｎｅ，Ｉｎｃ）；ｐＮＧＶＬ４ａ−ＣＲＴ／Ｅ７（ｄｅｔｏｘ）（Ｓｉｄｎｅｙ  Ｋｉｍｍｅｌ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ）；ｐＮＧＶＬ４ａ−ｓｉｇ／Ｅ７（ｄｅｔｏｘ）／ＨＳＰ７０＋ＴＡ−ＨＰＶ（Ｓｉｄｎｅｙ  Ｋｉｍｍｅｌ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ）；ＴＶＧＶ−１＋ＧＰＩ−０１００（ＴＨＥＶＡＸ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｃｏ．）；Ｐｅｐｃａｎ＋Ｃａｎｄｉｎ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ａｒｋａｎｓａｓ）；ＩＳＡ１０１（ＳＬＰ−ＨＰＶ−０１；ＨＰＶ１６−ＳＬＰ；ＩＳＡ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；ＡＤＸＳ１１−００１（Ｌｍ−ＬＬｏ−Ｅ７；Ａｄｖａｘｉｓ，Ｉｎｃ．）；ＩＳＡ１０１（ＳＬＰ−ＨＰＶ−０１；ＨＰＶ１６−ＳＬＰ；ＩＳＡ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；ＤＰＸ−Ｅ７（Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）；ＡＤＸＳ１１−００１（Ｌｍ−ＬＬｏ−Ｅ７；Ａｄｖａｘｉｓ，Ｉｎｃ．）；ＩＮＯ−３１１２（ＶＧＸ−３１００＋ＩＮＯ−９０１２；Ｉｎｏｖｉｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；ＡＤＸＳ１１−００１（Ｌｍ−ＬＬｏ−Ｅ７；Ａｄｖａｘｉｓ，Ｉｎｃ．）；ＩＮＯ−３１１２（ＶＧＸ−３１００＋ＩＮＯ−９０１２；Ｉｎｏｖｉｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；ＩＳＡ１０１（ＳＬＰ−ＨＰＶ−０１；ＨＰＶ１６−ＳＬＰ；ＩＳＡ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；およびＴＡ−ＣＩＮ＋ＧＰＩ−０１００（Ｓｉｄｎｅｙ  Ｋｉｍｍｅｌ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ）が挙げられる。ある特定の実施形態では、本発明の抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質を、抗腫瘍応答を強化するための樹状細胞ワクチン、腫瘍溶解性ウイルス、腫瘍細胞ワクチンなどを含めたがんワクチンと組み合わせて使用することができる。本発明の抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質と組み合わせて使用することができるがんワクチンの例としては、黒色腫および膀胱がんに対するＭＡＧＥ３ワクチン、乳がんに対するＭＵＣ１ワクチン、脳がん（多形神経膠芽腫を含む）に対するＥＧＦＲｖ３（例えば、Ｒｉｎｄｏｐｅｐｉｍｕｔ）、またはＡＬＶＡＣ−ＣＥＡ（ＣＥＡ＋がんに対して）が挙げられる。
【０２２７】
ある特定の実施形態では、本発明の抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質は、がんを有する患者の長期間長持ちする抗腫瘍応答を生成させ、かつ／または生存を増強するための方法において放射線療法と組み合わせて投与することができる。一部の実施形態では、本発明の抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質を、がん患者に放射線療法を施行する前に、それと同時に、またはその後に投与することができる。例えば、放射線療法を１つまたは複数の線量で腫瘍病変に施行し、その後、本発明の抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質を１つまたは複数の用量で投与することができる。一部の実施形態では、患者の腫瘍の局所的な免疫原性を増強するため（アジュバント放射線）および／または腫瘍細胞を死滅させるため（切除放射線）に放射線療法を腫瘍病変に局所的に施行し、その後、本発明の抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質を全身投与することができる。例えば、脳がん（例えば、多形神経膠芽腫）を有する患者に頭蓋内放射線を本発明の抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質の全身投与と組み合わせて施行することができる。ある特定の実施形態では、本発明の抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質を、放射線療法および化学療法剤（例えば、テモゾロミド）またはＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば、アフリバーセプト）と組み合わせて投与することができる。
【０２２８】
ある特定の実施形態では、本発明の抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質を、慢性ＨＰＶ感染を処置するための１つまたは複数の抗ウイルス薬と組み合わせて投与することができる。抗ウイルス薬の例としては、これだけに限定されないが、ジドブジン、ラミブジン、アバカビル、リバビリン、ロピナビル、エファビレンツ、コビシスタット、テノホビル、リルピビリンおよびコルチコステロイドが挙げられる。
【０２２９】
追加的な治療的に活性な作用剤（複数可）／構成成分（複数可）は、本発明の抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質の投与の前に、それと同時に、またはその後に投与することができる。本開示の目的に関して、そのような投与レジメンは、抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質の、第２の治療的に活性な構成成分と「組み合わせた」投与とみなされる。
【０２３０】
追加的な治療的に活性な構成成分（複数可）は、対象に、本発明の抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質の投与の前に投与することができる。例えば、第１の構成成分が第２の構成成分の投与の１週間前、７２時間前、６０時間前、４８時間前、３６時間前、２４時間前、１２時間前、６時間前、５時間前、４時間前、３時間前、２時間前、１時間前、３０分前、１５分前、１０分前、５分前、または１分未満前に投与される場合、第１の構成成分は第２の構成成分の「前に」投与されるとみなすことができる。他の実施形態では、追加的な治療的に活性な構成成分（複数可）を、対象に、本発明の抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質の投与後に投与することができる。例えば、第１の構成成分が第２の構成成分の投与の１分後、５分後、１０分後、１５分後、３０分後、１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、５時間後、６時間後、１２時間後、２４時間後、３６時間後、４８時間後、６０時間後、７２時間後に投与される場合、第１の構成成分は第２の構成成分の「後」に投与されるとみなすことができる。さらに他の実施形態では、追加的な治療的に活性な構成成分（複数可）を対象に本発明の抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質の投与と同時に投与することができる。「同時」投与は、本発明の目的に関しては、例えば、抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質および追加的な治療的に活性な構成成分を対象に単一の剤形で（例えば、共製剤化されて）投与すること、または別々の剤形で対象に互いから約３０分またはそれ未満の間に投与することを含む。別々の剤形で投与する場合、各剤形を同じ経路で投与することができる（例えば、抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質および追加的な治療的に活性な構成成分の両方を静脈内、皮下などに投与することができる）；あるいは、各剤形を異なる経路で投与することができる（例えば、抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質を静脈内に投与することができ、追加的な治療的に活性な構成成分を皮下に投与することができる）。いずれにしても、構成成分を単一の剤形で投与すること、別々の剤形で同じ経路によって投与すること、または別々の剤形で異なる経路によって投与することは全て、本開示の目的に関しては「同時投与」とみなされる。本開示の目的に関して、抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質を追加的な治療的に活性な構成成分の投与の「前に」、「同時に」または「後に」投与すること（これらの用語は、本明細書の上で定義されている通りである）は、抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質と追加的な治療的に活性な構成成分を「組み合わせた」投与とみなされる。
【０２３１】
本発明は、本発明の抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質が本明細書の他の箇所に記載の追加的な治療的に活性な構成成分（複数可）の１つまたは複数と種々の投与量の組合せを使用して共に製剤化された医薬組成物を含む。
【０２３２】
投与レジメン
本発明のある特定の実施形態によると、抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質（または抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質と本明細書で言及されている追加的な治療的に活性な作用剤のいずれかの組合せを含む医薬組成物）の複数用量を対象に定義された時間経過にわたって投与することができる。本発明のこの態様による方法は、対象に多数用量の本発明の抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質を逐次的に投与することを含む。本明細書で使用される場合、「逐次的に投与すること」とは、抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質の各用量を対象に異なる時点で、例えば、所定の間隔（例えば、数時間、数日間、数週間、または数カ月）を隔てた異なる日に投与することを意味する。本発明は、患者に、単一の初回用量の抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質、その後に、１または複数の二次用量の抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質、および必要に応じて、その後に１または複数の三次用量の抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質を逐次的に投与することを含む方法を含む。抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質を対象の体重１ｋｇ当たり０．１ｍｇ〜体重１ｋｇ当たり１００ｍｇの用量で投与することができる。
【０２３３】
「初回用量」、「二次用量」、および「三次用量」という用語は、本発明の抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質の投与の時間的順序を指す。したがって、「初回用量」は、処置レジメンの開始時に投与される用量である（「ベースライン用量」とも称される）；「二次用量」は、初回用量の後に投与される用量であり、「三次用量」は、二次用量の後に投与される用量である。初回用量、二次用量、および三次用量は全て同じ量の抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質を含み得るが、一般に、投与の頻度に関しては互いと異なり得る。しかし、ある特定の実施形態では、初回用量、二次用量および／または三次用量に含有される抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質の量は、処置の過程中、互いに変動する（例えば、必要に応じて上向きまたは下向きに調整される）。ある特定の実施形態では、処置レジメンの開始時に「負荷用量」として２またはそれよりも多く（例えば、２、３、４、または５）の用量を投与し、その後、その後の用量をより低い頻度で投与する（例えば、「維持用量」）。
【０２３４】
ある特定の実施形態では、初回用量、二次用量および／または三次用量に含有される抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質の量は、最適以下または治療量以下である。本明細書で使用される場合、「治療量以下」または「最適以下」という用語は、治療効果をもたらすには低すぎるレベルで、またはがんなどの疾患を処置するために必要なレベルを下回るレベルで投与される抗体の用量を指す。
【０２３５】
本発明のある特定の例示的な実施形態では、二次用量および／または三次用量をそれぞれ、直前の用量の１〜２６週間後（例えば、１週間後、１と１／２週間後、２週間後、２と１／２週間後、３週間後、３と１／２週間後、４週間後、４と１／２週間後、５週間後、５と１／２週間後、６週間後、６と１／２週間後、７週間後、７と１／２週間後、８週間後、８と１／２週間後、９週間後、９と１／２週間後、１０週間後、１０と１／２週間後、１１週間後、１１と１／２週間後、１２週間後、１２と１／２週間後、１３週間後、１３と１／２週間後、１４週間後、１４と１／２週間後、１５週間後、１５と１／２週間後、１６週間後、１６と１／２週間後、１７週間後、１７と１／２週間後、１８週間後、１８と１／２週間後、１９週間後、１９と１／２週間後、２０週間後、２０と１／２週間後、２１週間後、２１と１／２週間後、２２週間後、２２と１／２週間後、２３週間後、２３と１／２週間後、２４週間後、２４と１／２週間後、２５週間後、２５と１／２週間後、２６週間後、２６と１／２週間後、またはそれよりも後）に投与する。「直前の用量」という句は、本明細書で使用される場合、多数回の投与の連続において、連続の中で間に用量を挟まないまさに次の用量の投与前に患者に投与される抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質の用量を意味する。
【０２３６】
本発明のこの態様による方法は、患者に任意の数の抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質の二次用量および／または三次用量を投与することを含み得る。例えば、ある特定の実施形態では、単一の二次用量のみを患者に投与する。他の実施形態では、２またはそれよりも多く（例えば、２、３、４、５、６、７、８、またはそれよりも多く）の二次用量を患者に投与する。同様に、ある特定の実施形態では、単一の三次用量のみを患者に投与する。他の実施形態では、２またはそれよりも多く（例えば、２、３、４、５、６、７、８、またはそれよりも多く）の三次用量を患者に投与する。
【０２３７】
多数の二次用量を伴う実施形態では、各二次用量を他の二次用量と同じ頻度で投与することができる。例えば、各二次用量を患者に直前の用量の１〜２週間後または１〜２カ月後に投与することができる。同様に、多数の三次用量を伴う実施形態では、各三次用量を他の三次用量と同じ頻度で投与することができる。例えば、各三次用量を患者に直前の用量の２〜１２週間後に投与することができる。本発明のある特定の実施形態では、二次用量および／または三次用量を患者に投与する頻度は、処置レジメンの過程にわたって変動し得る。投与の頻度は、処置の過程中に、臨床検査後の個々の患者の必要に応じて医師によって調整される場合もある。
【０２３８】
抗原結合性タンパク質の診断への使用
例えば、診断目的で、本発明の抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質を使用して、試料中のＨＰＶ１６Ｅ７を検出および／または測定することができる。一部の実施形態では、ＨＰＶ１６Ｅ７陽性がんなどのＨＰＶに関連する疾患もしくは障害、またはＨＰＶ感染などの疾患または障害を検出するためのアッセイにおける、１つまたは複数の本発明の抗原結合性タンパク質の使用が意図されている。ＨＰＶ１６Ｅ７についての例示的な診断アッセイは、例えば、対象（例えば、患者）から得た試料を本発明の抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質と接触させることを含み得、ここで、抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質は、検出可能な標識もしくはレポーター分子で標識されている、またはＨＰＶ１６Ｅ７を対象試料から選択的に単離するための捕捉用リガンドとして使用される。あるいは、標識されていない抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質を、診断への適用において、それ自体が検出可能に標識された二次抗原結合性タンパク質、例えば抗体と組み合わせて使用することができる。検出可能な標識またはレポーター分子は、放射性同位元素、例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、もしくは１２５Ｉなど；蛍光もしくは化学発光部分、例えば、フルオレセインイソチオシアネート、もしくはローダミンなど；または、酵素、例えば、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、もしくはルシフェラーゼなどであり得る。試料中のＨＰＶ１６Ｅ７を検出または測定するために使用することができる特定の例示的なアッセイとしては、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）が挙げられる。
【０２３９】
本発明によるＨＰＶ１６Ｅ７診断アッセイに使用することができる試料としては、正常条件または病的条件下にある検出可能な分量のＨＰＶ１６Ｅ７タンパク質またはその断片のいずれかを含有する対象から入手可能な任意の組織または体液試料が挙げられる。一般に、健康な患者（例えば、ＨＰＶ１６Ｅ７に関連する疾患または障害、例えば、ＨＰＶ１６Ｅ７陽性がんを患っていない患者）から得た特定の試料中のＨＰＶ１６Ｅ７のレベルを測定して、ベースラインまたは標準のＨＰＶ１６Ｅ７のレベルを最初に確立する。次いで、このＨＰＶ１６Ｅ７のベースラインレベルを、がんに関連する状態、またはそのような状態に付随する症状を有する疑いがある個体から得た試料において測定されたＨＰＶ１６Ｅ７のレベルと比較する。
【０２４０】
ＨＰＶ１６Ｅ７に特異的な抗原結合性タンパク質は、追加的な標識または部分を含有しない場合もあり、またはＮ末端もしくはＣ末端標識もしくは部分を含有する場合もある。一実施形態では、標識または部分はビオチンである。結合アッセイでは、標識の場所（もしあれば）により、ペプチドが結合する表面に対するペプチドの方向を決定することができる。例えば、表面をアビジンでコーティングした場合、Ｎ末端ビオチンを含有するペプチドは、ペプチドのＣ末端部分が表面に対して遠位になるように配向される。
【０２４１】
本発明の態様は、開示される抗原結合性タンパク質の、患者におけるＨＰＶ１６Ｅ７陽性がんまたはＨＰＶ感染の予後を予測するためのマーカーとしての使用に関する。本発明の抗原結合性タンパク質を診断アッセイにおいて患者におけるがんの予後を評価するためおよび生存を予測するために使用することができる。
【実施例】
【０２４２】
以下の実施例は、本発明の方法および組成物をどのように作出し、使用するかに関する完全な開示および説明を当業者に提供するために提示され、発明者らが自身の発明とみなすものの範囲を限定するものではない。使用される数字（例えば、量、温度など）に関しては正確さを確実にするための試みが行われているが、いくらかの実験的な誤差および偏差が考慮されるべきである。別段の指定のない限り、部分は重量による部分であり、分子量は、平均分子量であり、温度は摂氏度であり、室温は約２５℃であり、および圧力は、大気または大気付近の圧力である。
【０２４３】
（実施例１）
ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７に対するヒト抗体の生成
ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７に対するヒト抗体を、ＨＬＡ−Ａ２とカップリングしたＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０４１３２６．１（配列番号５３７）のアミノ酸１１〜１９（ＹＭＬＤＬＱＰＥＴ；配列番号５３８）またはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０４１３２６．１（配列番号５３７）のアミノ酸残基８２〜９０（ＬＬＭＧＴＬＧＩＶ；配列番号５３９）のいずれかを含むＨＰＶ１６Ｅ７のペプチド断片を使用して生成した。例えば、米国特許第８，５０２，０１８号に記載されている通り、免疫原を、免疫応答を刺激するためのアジュバントと共に、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス（すなわち、ヒト免疫グロブリン重鎖およびカッパ軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを含む、操作されたマウス）に直接投与した。抗体免疫応答をＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７特異的イムノアッセイによってモニターした。所望の免疫応答が達成されたら、脾細胞を収集し、それらの生存能力を保存し、ハイブリドーマ細胞株を形成するために、マウス骨髄腫細胞と融合した。ハイブリドーマ細胞株をスクリーニングし、選択して、ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７特異的抗体を産生する細胞株を同定した。この技法および上記の免疫原を使用し、いくつかの抗ＨＰＶ１６Ｅ７キメラ抗体（すなわち、ヒト可変ドメインおよびマウス定常ドメインを有する抗体）を得た。このように生成した例示的な抗体に以下の通り名前を付けた：Ｈ４ｓＨ１７３６４Ｎ；Ｈ４ｓＨ１７３６８Ｎ２；Ｈ４ｓＨ１７９３０Ｎ；Ｈ４ｓＨ１７９３０Ｎ２；Ｈ４ｓＨ１７３６３ＮおよびＨ４ｓＨ１７３６８Ｎ３。
【０２４４】
抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗体をまた、その全体が参照により明確に本明細書に組み込まれる米国特許第７，５８２，２９８号に記載されている通り、骨髄腫細胞との融合は伴わずに、抗原陽性Ｂ細胞（免疫したマウスのいずれかに由来するもの）からも直接単離した。この方法を使用し、いくつかの完全ヒト抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗体（すなわち、ヒト可変ドメインおよびヒト定常ドメインを有する抗体）を得た。
【０２４５】
前述の方法に従って生成した例示的な抗体に、以下の通り名前を付けた：Ｈ４ｓＨ１７６７０Ｐ；Ｈ４ｓＨ１７６７２Ｐ；Ｈ４ｓＨ１７６７３Ｐ；Ｈ４ｓＨ１７６７５Ｐ；Ｈ４ｓＨ１７６８０Ｐ；Ｈ４ｓＨ１７６９７Ｐ；Ｈ４ｓＨ１７７０７Ｐ；Ｈ４ｓＨ１７７１５Ｐ；Ｈ４ｓＨ１７７２６Ｐ；Ｈ４ｓＨ１７７３０Ｐ；Ｈ４ｓＨ２１０５１Ｐ；Ｈ４ｓＨ２１０５４Ｐ；Ｈ４ｓＨ２１０５５Ｐ；Ｈ４ｓＨ２１０５８Ｐ；Ｈ４ｓＨ２１０６４Ｐ；Ｈ４ｓＨ２１０７３Ｐ；Ｈ４ｓＨ２１０７７Ｐ；Ｈ４ｓＨ２１０７９Ｐ；Ｈ４ｓＨ２１０８０Ｐ；Ｈ４ｓＨ２１０８３Ｐ；Ｈ４ｓＨ２１０８６Ｐ；Ｈ４ｓＨ２１０９０Ｐ；Ｈ４ｓＨ２１０９１Ｐ；Ｈ４ｓＨ２１０９３Ｐ；Ｈ４ｓＨ２１０９９Ｐ；Ｈ４ｓＨ２１１００Ｐ；Ｈ４ｓＨ２１１０３Ｐ；およびＨ４ｓＨ２１１０４Ｐ。
【０２４６】
本実施例の方法に従って生成した例示的な抗体の生物学的性質を下記の実施例に詳しく記載する。
【０２４７】
（実施例２）
重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列
表１に、選択された本発明の抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域およびＣＤＲのアミノ酸配列識別子を記載する。対応する核酸配列識別子を表２に記載する。
【表１−１】
2020529835.tif 000002
【表１−２】
2020529835.tif 000003
【表２−１】
2020529835.tif 000004
【表２−２】
2020529835.tif 000005
【０２４８】
抗体は、本明細書では一般に以下の命名法に従って称される：Ｆｃ接頭辞（例えば、「Ｈ１Ｍ」、「Ｈ４ｓＨ」、「Ｈ４Ｈ」など）、続いて、数値識別子（例えば、表１に示されている通り、「１７６７０」、「１７９３０」など）、続いて、「Ｐ」、「Ｎ」または「Ｎ２」接尾辞。したがって、この命名法に従って、本明細書では、抗体を、例えば、「Ｈ４ｓＨ１７６７０Ｐ」、「Ｈ４ｓＨ１７９３０Ｎ」、「Ｈ４ｓＨ１７３６８Ｎ２」などと称することができる。本明細書で使用される抗体の名称におけるＨ４ｓＨおよびＨ４Ｈ接頭辞は、抗体の特定のＦｃ領域アイソタイプを示す。例えば、「Ｈ４ｓＨ」抗体は、米国特許出願公開第２０１４０２４３５０４号（その全体が本明細書に組み込まれる）に開示されている２つまたはそれよりも多くのアミノ酸変化を有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃを有し、「Ｈ４Ｈ」抗体は、ヒンジ領域におけるセリンからプロリンへの突然変異（Ｓ１０８Ｐ）を有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃを有し、「Ｈ１Ｍ」抗体は、マウスＩｇＧ１  Ｆｃを有し、「Ｈ２Ｍ」抗体は、マウスＩｇＧ２  Ｆｃを有する（抗体の名称の最初の「Ｈ」によって示される通り、全ての可変領域が完全ヒト可変領域である）。当業者には理解される通り、特定のＦｃアイソタイプを有する抗体を、異なるＦｃアイソタイプを有する抗体に変換することができる（例えば、マウスＩｇＧ１  Ｆｃを有する抗体を、ヒトＩｇＧ４を有する抗体に変換することができる、など）が、いずれにしても、可変ドメイン（ＣＤＲを含む）−表１に示されている数値識別子によって示される−は同じままであり、Ｆｃドメインの性質にかかわらず抗原に対する結合特性は同一であるまたは実質的に同様であることが予測される。
【０２４９】
ある特定の実施形態では、マウスＩｇＧ１  Ｆｃを有する選択された抗体をヒトＩｇＧ４  Ｆｃを有する抗体に変換した。ある特定の実施形態では、抗体は、米国特許出願公開第２０１００３３１５２７号（その全体が本明細書に組み込まれる）に開示されている２つまたはそれよりも多くのアミノ酸変化を有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃを含む。一実施形態では、ＩｇＧ４  Ｆｃドメインは、二量体安定化を促進するために、ヒンジ領域におけるセリンからプロリンへの突然変異（Ｓ１０８Ｐ）を含む。
【０２５０】
表３に、本発明の選択された抗体の重鎖配列および軽鎖配列のアミノ酸配列識別子を示す。
【表３】
2020529835.tif 000006
【０２５１】
（実施例３）
可変遺伝子利用分析
産生される抗体の構造を分析するために、抗体可変領域をコードする核酸をクローニングし、配列決定した。抗体の核酸配列および予測されるアミノ酸配列から、各重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）および軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）について遺伝子使用を同定した（表４）。
【表４−１】
2020529835.tif 000007
【表４−２】
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【０２５２】
（実施例４）
ヒトモノクローナル抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７単一特異性抗体の表面プラズモン共鳴により導かれた結合親和性および運動定数
ヒト抗ＨＬＡ−Ａ２／ＨＰＶ１６Ｅ７抗体の結合親和性および運動定数を２５℃でリアルタイム表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ；Ｂｉａｃｏｒｅ４０００またはＢｉａｃｏｒｅＴ−２００、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）によって決定した。抗体を、モノクローナル抗ヒトＦｃ抗体（ＧＥ、＃ＢＲ−１００８−３９）とアミンカップリングすることによって誘導体化したＣＭ５  Ｂｉａｃｏｒｅセンサー表面（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）上に捕捉した。Ｅ７：１１−１９ペプチド（配列番号５３８）またはＥ７：８２−９０ペプチド（配列番号５３９）のいずれかを含有する単量体ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７ペプチド複合体を種々の濃度で抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗体が捕捉された表面にわたって５０μＬ／分（ＢｉａｃｏｒｅＴ−２００）または３０μＬ／分（Ｂｉａｃｏｒｅ４０００）の流速で注射した。抗体−試薬会合を４〜５分間モニタリングし、解離を１０分間モニタリングした。全ての結合試験をＨＢＳ−ＥＴ緩衝剤（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０５％ｖ／ｖ界面活性物質Ｐ２０）中で実施した。
【０２５３】
運動会合（ｋａ）および解離（ｋｄ）速度定数を、Ｓｃｒｕｂｂｅｒ２．０ｃ曲線あてはめソフトウェアを使用してリアルタイムセンサーグラムを１：１結合モデルにあてはめることによって決定した。結合解離平衡定数（ＫＤ）および解離半減期（ｔ１／２）を運動速度定数から以下の通り算出した：
【数１】
2020529835.tif 000009
【０２５４】
単一特異性抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗体についての単量体ＨＬＡ−Ａ２／ＨＰＶ１６Ｅ７ペプチド複合体に対する結合運動パラメータを以下の表５および６に示す。
【表５−１】
2020529835.tif 000010
【表５−２】
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【表６−１】
2020529835.tif 000012
【表６−２】
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【０２５５】
データから、本発明の抗ＨＬＡ−Ａ２／ＨＰＶ１６Ｅ７抗体の大多数が可溶性ＨＬＡ−Ａ２／ＨＰＶ１６Ｅ７ペプチド複合体に選択的に結合し、一部はナノモル以下の親和性を示すことが実証される。しかし、一部の抗体では、ＨＬＡ−Ａ２／ＨＰＶ１６Ｅ７複合体への結合が示されなかった。
【０２５６】
（実施例５）
潜在的なオフターゲットペプチドの予測
標的９−ｍｅｒペプチド−ＨＬＡ−Ａ２複合体を考慮して、関連する潜在的なオフターゲットペプチドを以下の３つの判断基準に基づいて定義する：Ａ）ペプチドは９−ｍｅｒであり、ＨＬＡ−Ａ２に結合することが予測される、Ｂ）ペプチドは、配列相同性に基づいて標的ペプチドと同様である、およびＣ）ペプチドは、必須正常組織において発現される遺伝子に由来する。したがって、ＹＭＬＤＬＱＰＥＴ（ＨＰＶ１６  Ｅ７１１−１９；配列番号５３８）およびＬＬＭＧＴＬＧＩＶ（ＨＰＶ１６  Ｅ７８２−９０；配列番号５３９）に関連する潜在的なオフターゲットペプチドを予測するために、以下の方法体系を使用した（一般に、Dhanik,  Ankur,  et  al.  (2016)  BMC  Bioinformatics  17  (1):  286を参照されたい）。
【０２５７】
第１のステップとして、基準のヒトタンパク質配列をＵｎｉｐｒｏｔＫＢデータベース（２０１４年９月バージョン）（Magrane,  Michele,  and  UniProt  Consortium.  Database  2011  (2011):  bar009）からダウンロードし、全ての９−ｍｅｒを抽出した。これにより、２０，０１４種のタンパク質配列から１１，１１８，０７６種のペプチドがもたらされた。
【０２５８】
次に、ペプチドのＨＬＡ−Ａ２との結合親和性を、ＮｅｔＭＨＣｓｔａｂ  ｗｅｂｓｅｒｖｅｒ（バージョン１．０）を使用してコンピュータ計算した（Jorgensen,  Kasper  W.,  et  al.  (2014)  Immunology  141  (1):  18-26）。親和性値が５００ｎＭ未満であるペプチドをＨＬＡ−Ａ２に結合するものと予測し、残りを棄却し、その結果、３３８，４５２種のペプチドが残った。
【０２５９】
次いで、ペプチド配列を標的ペプチドとの配列相同性について評価した。各ペプチドについて、標的ペプチドに対するその類似性の程度（ＤｏＳ）を算出した。ＤｏＳ値は、２つのペプチド間で同一の位置にある同一のアミノ酸の数を表す。ＤｏＳ値が６未満であるペプチドを退け、その結果、ＨＬＡ−Ａ２／ＨＰＶ１６Ｅ７：１１−１９の場合では２１種のペプチドが残り、ＨＬＡ−Ａ２／ＨＰＶ１６Ｅ７：８２−９０の場合では７８種のペプチドが残った。
【０２６０】
２１種のペプチドに対応する遺伝子の必須正常組織におけるそれらの発現を調べた。発現についての評価を、OmicSoft（Hu,  Jun,  et  al.Bioinformatics  (2012)  28  (14):  1933-1934）から提供されるＧＴＥｘ（Ｇｅｎｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）およびＴＣＧＡ（Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ）データベースに由来する遺伝子発現データを使用して行った。データは、４９７種のＴＣＧＡ隣接正常試料（１５種の必須組織型にわたる）、および２，９２８種のＧＴＥｘ正常試料（２２種の必須組織型にわたる）からＲＰＫＭ（Ｒｅａｄｓ  Ｐｅｒ  Ｋｉｌｏｂａｓｅ  Ｐｅｒ  Ｍｉｌｌｉｏｎ）値として入手可能であった。乳房、子宮頸部、卵管、精巣、子宮、および膣以外の組織を必須とみなした。遺伝子について、ＧＴＥｘデータベースおよびＴＣＧＡデータベースにおいて必須正常組織型それぞれにおける最大で９５パーセンタイル発現が０．５ＲＰＫＭ以上である場合、必須正常組織において発現されるとみなした。ＨＬＡ−Ａ２／ＨＰＶ１６Ｅ７：１１−１９（ＹＭＬＤＬＱＰＥＴ）に関しては、２１種のペプチドのうち、１０種のペプチドが必須正常組織において発現される遺伝子に由来するものであった。ＨＬＡ−Ａ２／ＨＰＶ１６Ｅ７：８２−９０（ＬＬＭＧＴＬＧＩＶ）に関しては、７８種のペプチドのうち、４９種のペプチドが必須正常組織において発現される遺伝子に由来するものであった。
【０２６１】
１０種のペプチドが、標的ＹＭＬＤＬＱＰＥＴ−ＨＬＡ−Ａ２複合体に関連すると予測されるオフターゲットを構成する（表７）。おそらくＬＬＭＧＴＬＧＩＶ−ＨＬＡ−Ａ２複合体に関連するオフターゲットを構成すると予測される４９種の潜在的なペプチドのうち、１３種を実験による検証のためにランダムに選び取り、それらを表８に列挙する。
【表７】
2020529835.tif 000014
【表８−１】
2020529835.tif 000015
【表８−２】
2020529835.tif 000016
【０２６２】
（実施例６）
ＨＬＡ−Ａ２／ＨＰＶ１６Ｅ７  Ｍ特異性を決定するためのＴ２ペプチドパルス
抗ＨＬＡ−Ａ２／ＨＰＶ１６Ｅ７モノクローナル抗体特異性を決定するために、標的またはオフターゲットペプチド（前の実施例で同定された）を負荷された、ペプチドパルスされたＴ２細胞を使用した。実験を以下の通り行った：ＨＰＶ１６Ｅ７標的またはオフターゲットペプチドの外因性負荷のために、Ｔ２細胞をＡＩＭ  Ｖ（登録商標）Ｍｅｄｉｕｍですすぎ、ＣｅｌｌｏｍｅｔｅｒＴＭ  Ａｕｔｏ  Ｔ４  ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて計数した。Ｔ−７５フラスコ当たりおよそ６００万個のＴ２細胞を、１０μｇのヒトｂ２ｍおよび１００μｇのＨＰＶ１６Ｅ７ペプチドまたはオフターゲットペプチドを含有する９ｍＬのＡＩＭ  Ｖ（登録商標）Ｍｅｄｉｕｍ中、２６℃で２４時間培養した（表６および７）。ペプチド負荷されたＴ２細胞をＣａ２＋／Ｍｇ２＋を伴わないＰＢＳで１回洗浄し、計数した。細胞洗浄緩衝剤中１ウェル当たり細胞およそ１０，０００個のペプチド負荷されたＴ２細胞または無処理のＴ２を９６ウェル炭素電極プレート（ＭＵＬＴＩ−ＡＲＲＡＹ  ｈｉｇｈ  ｂｉｎｄ  ｐｌａｔｅ、ＭＳＤ）に播種し、３７℃で１時間インキュベートして、細胞をプレートに接着させた。ＰＢＳ中２％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）を使用し、室温で１時間にわたって非特異的な結合性部位をブロッキングした。プレートに結合した細胞に、１．７ｐＭから１００ｎＭまでにわたる段階希釈物中、抗ＨＬＡ−Ａ２／ＨＰＶ１６Ｅ７：１１−１９、抗ＨＬＡ−Ａ２／ＨＰＶ１６Ｅ７：８２−９０または対照抗体の溶液、ならびに抗体を伴わない溶液を添加した。プレートを室温で１時間インキュベートし、次いで、ＡｑｕａＭａｘ２０００プレート洗浄器（ＭＤＳ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して洗浄して、結合していない抗体を除去した。プレートに結合した抗体を、ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ（商標）とコンジュゲートした、Ｆｃガンマ断片に特異的なヤギポリクローナル抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を用いて室温で１時間にわたって検出した。洗浄後、プレートをＲｅａｄ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＭＳＤ）で製造者の推奨手順に従って展開し、発光シグナルをＳＥＣＴＯＲ  Ｉｍａｇｅｒ６００（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）機器で記録した。相対発光単位（ＲＬＵ）で測定される発光強度を記録して、濃度範囲における各抗体の結合強度を示した。１１ｎＭにおける各抗ＨＬＡ−Ａ２／ＨＰＶ１６Ｅ７抗体についてのアイソタイプ対照と比較した細胞結合シグナルの比を表８および９に報告し、これは、特異性を示すものである。１１ｎＭの濃度では、大多数の抗体が、Ｔ２無処理細胞に対して最小の結合を示した。全ての抗体を全ての対応する関連オフターゲットペプチドで試験したのではない。これらの試験されていないものは「試験されていない（Ｎｏｔ  Ｔｅｓｔｅｄ）」の代わりにＮＴと記されている。結合比が１５よりも大きい抗体は（＋＋＋）と記され、比が１５同等またはそれ未満であるが１０よりも大きいまたは１０と等しいである抗体は（＋＋）と記され、比が１０未満であるが３よりも大きいまたは３と等しい抗体は（＋）と記さ���、結合比が３未満の抗体は非結合体として分類し、（−）で示した。さらに、直接結合シグナル（ＲＬＵ単位）を抗体濃度の関数として分析し、データをＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（商標）を使用してＳ字（４パラメータロジスティック）用量応答モデルにあてはめた。可能であれば各抗体の効力を示すために、細胞において最大の結合シグナルの５０％が検出される抗体の濃度と定義されるＥＣ５０値を決定した。細胞表面ＨＬＡ−Ａ２／ＨＰＶ１６Ｅ７：１１−１９またはＨＬＡ−Ａ２／ＨＰＶ１６Ｅ７：８２−９０のみへの結合についてのＥＣ５０値も表９および１０に報告する。
【０２６３】
本発明の抗ＨＬＡ−Ａ２／ＨＰＶ１６Ｅ７：１１−１９抗体１３種のうち１０種がＴ２細胞表面ＨＬＡ−Ａ２／ペプチド複合体に結合する。これらの１０種の抗体のうち７種（Ｈ４ｓＨ１７６７０Ｐ；Ｈ４ｓＨ１７６７５Ｐ；Ｈ４ｓＨ１７３６３Ｎ；Ｈ４ｓＨ１７３６４Ｎ；Ｈ４ｓＨ１７９３０Ｎ；Ｈ４ｓＨ１７９３０Ｎ２；およびＨ４ｓＨ２１０６４Ｐ）は、ＨＬＡ−Ａ２／ＨＰＶ１６Ｅ７：１１−１９複合体に対して特異的である。３種の抗体（Ｈ４ｓＨ１７６７２Ｐ、Ｈ４ｓＨ２１０７９Ｐ、Ｈ４ｓＨ２１０８０Ｐ）は、より高い効力を示し、ＥＣ５０値は１．１ｎＭを下回った。３種の抗体（Ｈ４ｓＨ１７６７３Ｐ、Ｈ４ｓＨ１７６８０Ｐ、Ｈ４ｓＨ１７６９７Ｐ）は、Ｔ２ペプチド負荷細胞には結合せず、表９の最初の列に（−）で示されている。
【０２６４】
ＨＰＶ１６Ｅ７：８２−９０標的および予測されるオフターゲットペプチドが負荷されたＴ２細胞に関する細胞結合結果を表９に要約する。本発明の抗ＨＬＡ−Ａ２／ＨＰＶ１６Ｅ７：８２−９０  ｍＡｂ２１種のうち１６種がＴ２細胞表面ＨＬＡ−Ａ２／ペプチド複合体に結合した。この群に由来する２種のｍＡｂのみが（Ｈ４ｓＨ１７３６８Ｎ２、Ｈ４ｓＨ２１０８６Ｐ）ＨＬＡ−Ａ２／ＨＰＶ１６Ｅ７  ８２−９０複合体に対する特異性を示した。５種の抗体（Ｈ４ｓＨ１７７３０Ｐ、Ｈ４ｓＨ２１０５１Ｐ、Ｈ４ｓＨ２１０５４Ｐ、Ｈ４ｓＨ２１０５５Ｐ、Ｈ４ｓＨ２１０７７Ｐ）はＴ２ペプチド負荷細胞に結合せず、表１０に（−）で示されている。
【表９】
2020529835.tif 000017
【表１０−１】
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【表１０−２】
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【０２６５】
表９および１０に示されている通り、本発明の抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原結合性タンパク質は、ＨＬＡ−Ａ２によって提示される特異的ＨＰＶペプチド（表９の配列番号５３８、または表１０の配列番号５３９）にのみ高い特異性で結合し、ＨＬＡ−Ａ２によって提示されるいかなるオフターゲットペプチドにも結合しなかった。
【０２６６】
（実施例７）
ペプチドパルスされたＴ２細胞を使用した結合特異性分析およびＦＡＣＳ分析
ＨＰＶ１１−１９ペプチド（３Ｔ３／ＨＬＡ．Ａ２／ｈＢ２Ｍ／ＨＰＶ１６Ｅ７：１１−１９）またはＨＰＶ８２−９０ペプチド（３Ｔ３／ＨＬＡ．Ａ２／ｈＢ２Ｍ／ＨＰＶ１６Ｅ７（８２−９０）のいずれかを提示するＨＬＡ−Ａ２複合体を発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞に対するフローサイトメトリーによってＨＰＶ１６Ｅ７抗体の相対的結合および特異性にアクセスした。ＨＬＡ複合体を発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞を、ヒトＨＬＡ．Ａ２（受託番号Ｐ０１８９２）、ヒトＢ２Ｍ（受託番号ＮＰ＿００４０３９．１）およびＨＰＶ１６Ｅ７のアミノ酸１１〜１９（配列番号５３８）またはアミノ酸８２〜９０（配列番号５３９）（受託番号ＡＫＩ８５２３３）のいずれかを含むユビキチンペプチドカセット（Levy  F.,  et  al.  (1996)  Proceedings  of  the  National  Academy  of  Sciences  of  the  United  States  of  America  93  (10):  4907-4912;  Valmori  D,  et  al.  (1999)  Journal  of  Experimental  Medicine  189  (6):  895-906）をｌｉｐｏｆｅｃｔｏｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ番号１１６６８）を使用してトランスフェクトし、その後、１μｇ／ｍｌのピューロマイシン、５００μｇ／ｍｌのＧ４１８、および１００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンで少なくとも２週間にわたって選択することによって生成した。染色のために、細胞解離緩衝剤（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｃａｔ番号Ｓ−００４−Ｃ）を使用して細胞を収集し、計数した。細胞を、９６ウェルＶ底プレート中、染色緩衝剤（ＰＢＳ、カルシウムおよびマグネシウムを含まない（Ｉｒｖｉｎｇ９２４０）＋２％ＦＢＳ（ＡＴＣＣ３０−２０２０）に１ウェル当たり細胞２００，０００個の密度でプレーティングし、一次抗体の３倍段階希釈物（１．７ｐＭ〜１００ｎＭ）を用いて４℃で３０分にわたって染色した。一次抗体とのインキュベート後、細胞を染色緩衝剤で１回洗浄し、二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｔ番号１０９−６０６−１７０）とコンジュゲートしたＡｌｅｘａ−Ｆｌｏｕｒ６４７を１０μｇ／ｍｌで用いて４℃で３０分にわたって染色した。次いで、染色緩衝剤中に希釈したＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘ（ＢＤ、Ｃａｔ番号５５４６５５）の５０％溶液を用いて細胞を洗浄し、固定した。試料をｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ  ｉＱｕｅフローサイトメーターに流し、分析して、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を算出した。ＭＦＩ値を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍで４パラメータロジスティック方程式を使用して１２点応答曲線にプロットして、ＥＣ５０値を算出した。各用量応答曲線について二次抗体単独（すなわち一次抗体なし）も３倍段階希釈物の続きとして分析に含め、最低用量として表す。ＥＣ５０値（Ｍ）および最大結合倍率（最高用量から最低用量までに変化した倍率）を表１１に示す。いくつかの抗体が３Ｔ３／ＨＬＡ．Ａ２／ｈＢ２Ｍ／ＨＰＶ１６Ｅ７：１１−１９細胞株または３Ｔ３／ＨＬＡ．Ａ２／ｈＢ２Ｍ／ＨＰＶ１６Ｅ７：８２−９０細胞株のいずれかに特異的に結合した。ＥＣ５０値は５〜５００ｎＭにわたり、結合倍率は１．０倍〜４３．８倍にわたった。
【表１１】
2020529835.tif 000020
【０２６７】
６種のＨＰＶ１６Ｅ７：１１−１９抗体の特異性を、ＨＰＶ１６Ｅ７：１１−１９、ＨＰＶ１６Ｅ７：８２−９０または予測されるオフターゲットペプチドをパルスしたＴ２（１７４  ＣＥＭ．Ｔ２）細胞への結合を評価することによってさらに特徴付けた（表７）。パルスのために、Ｔ２（１７４ＣＥＭ．Ｔ２）をＡＩＭ  Ｖ培地に１ｍｌ当たり細胞１×１０６個の密度で再懸濁させた（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ番号３１０３５−０２５）。１０μｇ／ｍｌのｈＢ２Ｍ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃａｔ番号４７５８２８）および１００μｇ／ｍｌの示されているペプチドを添加することによって細胞をパルスした。次いで、Ｔ２細胞を２６℃で終夜インキュベートし、染色緩衝剤で洗浄し、示されている抗体を１０μｇ／ｍｌの濃度で用い、上記のプロトコールに従って染色した。ＭＦＩ値を算出し、染色されなかった細胞に対する倍率変化として示した。６種のＨＰＶ１６Ｅ７：１１−１９抗体のＨＰＶ１６Ｅ７：１１−１９でパルスされたＴ２細胞に対する相対的結合は、染色されなかった細胞の９８６〜１２００倍にわたった。他のペプチドでパルスされたＴ２細胞に対してはアイソタイプ対照を超える有意な結合は観察されなかった（表１２）。
【表１２】
2020529835.tif 000021
【０２６８】
（実施例８）
アラニンスキャニングペプチドを使用したエピトープ分析
アラニンスキャニングを実施して、ＨＰＶ１６Ｅ７：１１−１９ペプチド内のどの残基が抗体結合に重要であるかを決定した。Ｔ２細胞をアラニンスキャニングペプチドでパルスし、ＨＰＶ１６Ｅ７：１１−１９抗体を用いて上記の通り染色した。以下のアラニンスキャニングペプチドを使用した（表１３）。
【表１３】
2020529835.tif 000022
【０２６９】
アスパラギン酸１４のアラニンへの変換（Ｄ１４Ａ）およびグルタミン１６のアラニンへの変換（Ｑ１６Ａ）により、試験した全ての抗体について抗体結合が著しく低減した。チロシン１１のアラニンへの変換（Ｙ１１Ａ）では、Ｈ４ｓＨ１７６７０Ｐ、Ｈ４ｓＨ１７６７５Ｐ、Ｈ４ｓＨ２１０６４Ｐ、およびＨ４ｓＨ１７９３０Ｎ２の結合が低減したが、Ｈ４ｓＨ１７３６３ＮまたはＨ４ｓＨ１７３６４Ｎの結合は低減しなかった。ロイシン１３のアラニンへの変換（Ｌ１３Ａ）およびプロリン１７のアラニンへの変換（Ｐ１７Ａ）では、全体的な抗体結合が低減した（表１４）。
【０２７０】
要約すると、Ｄ１４およびＱ１６が抗体結合のために重要な残基である。
【表１４】
2020529835.tif 000023
【０２７１】
（実施例９）
キメラ抗原受容体に使用するための、ＨＬＡ−Ａ２／ＨＰＶ１６Ｅ７抗体のＳｃＦｖへの再編成
６種のＨＬＡ−Ａ２／ＨＰＶ１６Ｅ７：１１−１９抗体（１７３６３Ｎ、１７３６４Ｎ、１７６７０Ｐ、１７６７５Ｐ、１７９３０Ｎ２および２１０６４Ｐ）をＶＬ−ＶＨ単鎖可変性断片（ＳｃＦｖ）に再編成し、ＣＤ８αヒンジおよび膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζ刺激ドメインを使用したキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）構築物に入れた（配列番号５４０〜５４５）。ＨＬＡ−Ａ２／ＨＰＶ１６Ｅ７：１１−１９特異的ＣＡＲをレンチウイルス発現ベクター（Ｌｅｎｔｉ−Ｘ（商標）バイシストロン発現系（Ｎｅｏ）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｃａｔ番号６３２１８１）にクローニングし、レンチウイルス粒子をＬｅｎｔｉ−Ｘ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｓｈｏｔ（ＶＳＶ−Ｇ）システム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｃａｔ番号６３１２７６）により、製造者のプロトコールに従って生成した。次いで、ＮＦＡＴ−ルシフェラーゼレポーターを発現するように操作されたジャーカット細胞（Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴＬｕｃ  ｃｌ．３Ｃ７）に、６種の異なるＣＡＲ構築物を用い、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）Ｐｒｅ−ｃｏａｔｅｄ  Ｄｉｓｈ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｃａｔ番号Ｔ１１０ａ）を製造者のプロトコールに従って使用して形質導入した。５００μｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ番号１１８１１−０９８）中で少なくとも２週間にわたって選択した後、ＣＡＲ−Ｔ細胞株を生成した。
【０２７２】
ＣＡＲ−Ｔ株の活性をＣＡＲ−Ｔ／抗原提示細胞（ＡＰＣ）バイオアッセイで評価した。
【０２７３】
バイオアッセイを実施するために、Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴＬｕｃ  ｃｌ．３Ｃ７ＣＡＲ−Ｔ細胞５０，０００個をＴｈｅｒｍｏ−Ｎｕｎｃ９６ウェル白色プレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｔ番号１３６１０１）中、アッセイ培地（１０％ＦＢＳおよび１％Ｐ／Ｓ／Ｇを含むＲＰＭＩ培地）５０μｌに添加し、その後、ＡＰＣの３倍段階希釈物（細胞１５０，０００個〜細胞２００個）をアッセイ培地５０μｌに添加した。以下のＡＰＣを利用した：ＣＡＳＫＩ（ＨＬＡ−Ａ２＋／ＨＰＶ１６＋）、１１−１９または８２−９０ペプチドを提示するＨＬＡ−Ａ２の単鎖バージョンを過剰発現するＣＡＳＫＩ細胞、ＨＥＫ２９３（ＨＬＡ−Ａ２＋／ＨＰＶ１６−）、またはＣ３３ａ（ＨＬＡ−Ａ２＋／ＨＰＶ１６−）。細胞混合物を３７℃、５％ＣＯ２、加湿インキュベーター中で５時間インキュベートした。Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｏｎｅ−Ｇｌｏ（Ｃａｔ番号Ｅ６１３０）およびＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーを使用してＮＦＡＴ−ルシフェラーゼ活性を測定した。相対ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）を生成し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍで４パラメータロジスティック方程式を使用して８点応答曲線にプロットして、ＥＣ５０値を算出した。各用量応答曲線についてのゼロＡＰＣ条件も３倍段階希釈物の続きとして含め、最低用量として表す。活性化の最大倍率を、曲線上の最大ＲＬＵと最低ＲＬＵの比をとることによって決定した。６種全てのＨＬＡ−Ａ２／ＨＰＶ１６Ｅ７：１１−１９ＣＡＲ−Ｔ細胞株が、ＨＰＶ１６Ｅ７：１１−１９ペプチドを過剰発現したＣＡＳＫＩ細胞によって活性化され、活性化の最大倍率は２．５〜３２．３倍であった。ＨＰＶ１６Ｅ７：８２−９０ペプチドを過剰発現したＡＰＣまたはＨＥＫ２９３およびＣ３３ａ細胞ではＣＡＲ−Ｔ細胞株は活性化されなかった。興味深いことに、抗体１７６７５Ｐ由来のＳｃＦｖを使用した１つのＣＡＲ−Ｔ細胞株がネイティブなＣＡＳＫＩ細胞によって活性化され、活性化倍率は４．１であり、ＥＣ５０は細胞６８６５４個であった（表１５）。
【表１５】
2020529835.tif 000024
【０２７４】
ＨＰＶ１６Ｅ７：１１−１９ペプチドを提示するＨＬＡ−Ａ２の量を増加させることにより、ＨＬＡ−ＨＰＶ１６Ｅ７：１１−１９ＣＡＲの活性化の増大がもたらされるはずである。インターフェロンガンマにより、プロテアソームが上方制御されるにもかかわらずＭＨＣクラス１分子による抗原提示を増大できることが報告されている（Fruh  K.  and  Yang  Y.  (1999)  Curr  Opin  Immunol.  11  (1):  76-81）。この知見に基づいて、インターフェロンガンマで前処理した野生型ＣＡＳＫＩ細胞またはＨＥＫ２９３細胞によりＣＡＲ−Ｔ細胞株の活性化の増大をもたらすことができるかどうかを決定した。ＣＡＳＫＩ細胞およびＨＥＫ２９３細胞を５００単位／ｍｌの組換えヒトＩＦＮ−γ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ  Ｃａｔ番号３００−０２）を用いて４８時間にわたって前処理し、次いで、上記の通りＣＡＲ−Ｔ／ＡＰＣバイオアッセイに使用した（表１６）。ＩＦＮγで前処理したＣＡＳＫＩ細胞により、６種全てのＨＰＶ１６Ｅ７：１１−１９ＣＡＲ−Ｔ細胞株が活性化され、活性化倍率は２．４〜１０．６にわたった。
【表１６】
2020529835.tif 000025
【０２７５】
ＨＰＶ１６Ｅ７：１１−１９ＣＡＲ−Ｔ株の特異性をルシフェラーゼアッセイでさらに評価するために、Ｔ２細胞をＡＰＣとして使用し、予測されるオフターゲットペプチドでパルスした（表１７）。簡単に述べると、Ｔ２細胞を示されているペプチドの３倍段階希釈物（１．７ｐｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ）でパルスした。パルス後、５０，０００個のＣＡＲ−Ｔ細胞をＴｈｅｒｍｏ−Ｎｕｎｃ９６ウェル白色プレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｔ番号１３６１０１）の５０μＬのアッセイ培地に添加した。次いで、５０，０００個のパルスされたＴ２細胞をプレートのアッセイ培地５０μＬに添加した。細胞混合物を３７℃、５％ＣＯ２、加湿インキュベーター中で５時間インキュベートした。ＮＦＡＴ−ルシフェラーゼ活性を、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｏｎｅ−Ｇｌｏ（商標）（Ｃａｔ番号Ｅ６１３０）およびＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーを使用して決定した。ＲＬＵを、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍで４パラメータロジスティック方程式を使用して１２点応答曲線にプロットして、ＥＣ５０値を算出した。各用量応答曲線についてパルスされていない条件も３倍段階希釈物の続きとして分析に含め、最低用量として表す。活性化の最大倍率を以前に記載されている通り決定した。全てのＣＡＲ−Ｔ細胞株がＨＰＶ１６Ｅ７：１１−１９ペプチドでパルスされたＴ２細胞によって活性化された。抗体１７３６４Ｎ由来のＳｃＦｖを利用するＪｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴＬｕｃ  ＣＡＲＴ株は、Ｅｎｄｏｐｈｉｌｉｎ−Ｂ１（ＳＨ３ＧＬＢ１：２４４−２５２）、コンドロイチン硫酸シンターゼ２（ＣＨＰＦ：４６３：４７１）およびＥ３ユビキチン−タンパク質リガーゼＣＢＬ（ＣＢＬ：８３−９１）でパルスされたＴ２細胞によって非特異的に活性化された。他のＣＡＲ−Ｔ細胞株は全て、いかなるオフターゲットペプチドでも有意には活性化されなかった。
【表１７−１】
2020529835.tif 000026
【表１７−２】
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【０２７６】
（実施例１０）
ＨＬＡ−Ａ２＋ＨＰＶ１６Ｅ７：１１−１９ペプチドへのＦａｂ結合の構造解析
抗体とＨＬＡ−ペプチド複合体の特異的な相互作用をよりよく理解するための取り組みにおいて、ＨＰＶ１６Ｅ７：１１−１９ペプチドをディスプレイするＨＬＡ−Ａ２／ｂ２ｍに結合した抗体Ｆａｂ断片のＸ線結晶構造を決定した。一方の構造は１７６７０Ｐ  Ｆａｂを含有し、他方の構造は１７３６３Ｎ  Ｆａｂを含有する；合わせて、これらの２つの構造が上記の６種の抗体の配列空間にわたる（例えば、表１１および表１２）。ＨＬＡによりディスプレイされるＨＰＶ１６Ｅ７：１１−１９ペプチドの９残基全てが、１７６７０Ｐ構造および１７３６３Ｎ構造のどちらに関しても電子密度マップにおいて明白に目視できる。２．９Å（１７６７０Ｐ構造の分解能）においてさえ、ペプチド残基の位置および同一性は明白であり、残基−残基相互作用を正確に決定することができる。１７３６３Ｐ構造は２．６Åであり、これにより、正確度を改善することが可能である。
【０２７７】
１７６７０Ｐ  Ｆａｂおよび１７３６３Ｎ  Ｆａｂは、ＨＬＡ−ペプチド複合体の上部に、ＴＣＲの結合の仕方と非常に類似した様式で結合する。これらのＦａｂは互いにほぼ等しく位置し、配向されている；どちらもペプチド結合溝の境をなす「レール」にかなり並行に整列し、どちらも結合したペプチドに集中し、重鎖ＣＤＲが、結合したペプチドのＮ末端の半分と接触しており、軽鎖ＣＤＲが、ペプチドのＣ末端の半分と接触している。他の公開された抗体複合体構造（例えば、ＰＤＢコード１Ｗ７２および４ＷＵＵ）から、抗体がＨＬＡによりディスプレイされるペプチド全体にはわたらないことが明らかになる。しかし、部分的なペプチドカバレッジしか有さないこれらの抗体の特異性は乏しく、接触していないペプチドの一部の広範囲にわたる変化を許容し、結合親和性の低下はわずかである。
【０２７８】
これらの構造により、１７６７０Ｐおよび１７３６３Ｎ  Ｆａｂ重鎖はＨＰＶ１６Ｅ７ペプチドの残基１１、１４、１５と接触し、一方、Ｆａｂ軽鎖は残基１５、１７、１８と接触することが示される。残基１２、１３、１６、または１９の側鎖はＨＬＡ分子に向けられるので、これらとＦａｂの接触はなされない。以下の通り、結合したペプチドに元のＨＰＶ１６  Ｅ７タンパク質の残基の位置に従って番号を付す：
【化１】
2020529835.tif 000028
【０２７９】
大多数のＦａｂ接触は骨格とではなくペプチド側鎖となされる。
【０２８０】
１７６７０Ｐによってなされるペプチド接触は、ほぼ排他的にＣＤＲ  ＬＣＤＲ１およびＨＣＤＲ３、特に、ＨＣＤＲ３に集中する。特に、配列番号３４のＦａｂ重鎖残基１００、１０１、１０２、１０５、１０９、１１０および配列番号４２の軽鎖残基３０、３１、３２、５０は結合したペプチドと接触し、一方、配列番号３４のＦａｂ重鎖残基２８、３１、３２、１００、１０２、１０４、１０９、１１０、１１３および配列番号４２の軽鎖残基３１、５０、５２、５３、５４、５５、９２はＨＬＡと接触する。ここでの「接触」は、直接または水に媒介される水素結合、電荷−電荷相互作用、または疎水性／ファンデルワールス相互作用を伴い得る。１７３６３Ｎに関しては、配列番号５０６のＦａｂ重鎖残基１０２、１０３、１０８、１１１、１１２および配列番号５１４の軽鎖残基２８、３０、３２、５０、６８が、結合したペプチドと接触し、一方、配列番号５０６のＦａｂ重鎖残基２８、３２、１００、１０２、１０３、１０７、１１２および配列番号５１４の軽鎖残基３１、４９、５０、５１、５２、５３、５５、９２がＨＬＡ分子と接触する。
【０２８１】
６種の抗ＨＬＡ−Ａ２：ＨＰＶ１６Ｅ７：１１−１９抗体のうち、１７６７５Ｐが、ペプチド結合性を決定するＣＤＲ配列が１７６７０Ｐと最も類似し、２１０６４Ｐと１７９３０Ｎ２もペプチド結合性ＣＤＲ領域に高度の類似性を共有する。１７６７０ＰとＨＬＡ−ペプチド複合体との間の重要な接触は、大部分は１７６７５Ｐ、２１０６４Ｐ、および１７９３０Ｎ２に保存されており、したがって、これらの抗体でなされる結合は１７６７０Ｐの結合と同じである可能性が高い。
【０２８２】
対照的に、１７３６３ＮのＣＤＲ  Ｈ３は１７６７０Ｐ由来のＣＤＲ  Ｈ３と比較して全く異なる配列を有し、この配列の差異はＣＤＲ  Ｈ３の構造的差異に変換され、これにより、この領域におけるＨＬＡ−ペプチド複合体との接触は変更される。例えば、１７６７０Ｐの重鎖Ｔｙｒ１００は結合したペプチドのＴｙｒ１１と接触する。１７３６３Ｎの等価な残基はＴｙｒ１０２であり（この抗体のＣＤＲ  Ｈ３は２残基長い）この残基はペプチドＴｙｒ１１と接触しない。その代わりに、Ｔｙｒ１０２は近くのＨＬＡ分子と接触するように再び配向される。
【０２８３】
リード抗体１７３６４Ｎは、１７３６３Ｎと非常に類似した配列を有し、ＨＬＡ−ペプチド複合体と接触する全ての残基が同一である。この抗体は、１７３６３Ｎと非常に類似し、したがって、１７６７０Ｐ、１７６７５Ｐ、１７９３０Ｎ２、および２１０６４Ｐとは異なる結合形式を有するはずである。
【０２８４】
本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態による範囲に限定されるものではない。実際に、前述の説明および添付図から、本明細書に記載のものに加えて本発明の種々の改変が当業者に明らかになるであろう。そのような改変は、添付の特許請求の範囲の範囲内に入るものとする。
【配列表】
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【国際調査報告】
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2020529835.tif 000031
2020529835.tif 000032
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