(57)【要約】  本発明は、クロストリジウムによる食品の汚染を予防するまたは低減する方法であって、前記対象物を前記クロストリジウムに対して有効な少なくとも１つのエンドライシンを含む組成物と接触させることを含む方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロストリジウムによる食品の汚染を予防するまたは低減する方法であって、前記食品を、前記クロストリジウムに対して活性を有する少なくとも１つのエンドライシンを含む組成物と接触させることを含む方法。
【請求項２】
クロストリジウムによる食品の汚染を予防するまたは低減する方法であって、前記食品を、植物材料またはその抽出物である組成物であって、前記クロストリジウムに対して活性を有する少なくとも１つのエンドライシンを含む前記組成物と接触させることを含み、植物材料が、前記少なくとも１つのエンドライシンを発現している食用植物由来の材料である、前記方法。
【請求項３】
前記組成物が、植物材料もしくはその抽出物であるか、または植物材料もしくはその抽出物を含み、植物材料が、前記少なくとも１つのエンドライシンを発現している植物、好ましくは前記少なくとも１つのエンドライシンを発現している食用植物由来の材料である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記組成物が、前記少なくとも１つのエンドライシンを含有する水溶液であり、または前記組成物が、前記少なくとも１つのエンドライシンを含有する凍結乾燥粉末または乾燥粉末であり、前記粉末が、使用前に水または水溶液に溶解または懸濁されていてもよい、請求項１から３までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１つのエンドライシンを含有する前記水溶液が、５０〜４００ｍＭのＮａＣｌ、好ましくは１４０〜３１０ｍＭのＮａＣｌを含有する緩衝化水溶液であり、スルフヒドリル化合物をさらに含有していてもよい、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記食品が、前記少なくとも１つのエンドライシンを含有する水溶液を吹き付けられる、または前記少なくとも１つのエンドライシンを含有する水溶液中へ浸漬される、請求項１から５までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記食品が食肉である、請求項１から６までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記食肉が、生肉、加熱調理された肉、または肉汁である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記クロストリジウムが、クロストリジウム・パーフリンジェンスである、請求項１から８までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記クロストリジウム・パーフリンジェンスが、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、およびＥ型から選択されるいずれか１つまたは複数、好ましくはエンテロトキシンＣＰＥを含有するＡ型菌株である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも１つのエンドライシンのうちの少なくとも１つが、配列番号１のアミノ酸配列を含むＰｓｍ、配列番号２のアミノ酸配列を含むＺＰ１７３、および配列番号３のアミノ酸配列を含むＺＰ２７８、またはこれらのエンドライシンのいずれかの誘導体から選択され、前記誘導体が、その由来元であるエンドライシンの少なくとも３３％の溶菌活性を有する；または、
前記少なくとも１つのエンドライシンのうちの少なくとも１つが、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＰ２５Ｌ、配列番号５のアミノ酸配列を含むＰｌｙＣＰ２６Ｆ、および配列番号６のアミノ酸配列を含むＰｌｙＣＰ３９Ｏ、またはこれらのエンドライシンのいずれかの誘導体から選択され、前記誘導体が、その由来元であるエンドライシンの少なくとも３３％の溶菌活性を有する、請求項１から１０までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記誘導体またはエンドライシンが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、または配列番号６のいずれか１つのアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも９７％の配列同一性を有する；または、
前記誘導体またはエンドライシンが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、または配列番号６のいずれか１つのアミノ酸配列と比較して、１〜３０個の、好ましくは１〜２０個の、より好ましくは１〜１５個の、さらにより好ましくは１〜１０個のアミノ酸置換、挿入、および／または欠失を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１つのエンドライシンが、ＺＰ２７８もしくはそれらの誘導体、ＣＰ２５Ｌもしくはそれらの誘導体、および／またはＺＰ１７３もしくはそれらの誘導体である、請求項１から１２までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記少なくとも１つのエンドライシンが、ＺＰ２７８またはそれらの誘導体およびＺＰ１７３またはそれらの誘導体であり、または前記少なくとも１つのエンドライシンが、ＺＰ２７８またはそれらの誘導体およびＰｓｍまたはそれらの誘導体である、請求項１から１３までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記少なくとも１つのエンドライシンが、ＺＰ２７８またはそれらの誘導体、およびＺＰ１７３またはそれらの誘導体、およびＣＰ２５Ｌまたはそれらの誘導体である、請求項１から１４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記食品が食肉である、請求項１３、１４、または１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記組成物が、１５０〜７００ｍＭのＮａＣｌ、好ましくは２００〜５５０ｍＭのＮａＣｌを含有する緩衝化水溶液であり、かつ／または前記組成物が、４〜８のｐＨの水溶液、好ましくは４．５〜７のｐＨの水溶液、より好ましくは５．０〜６．５のｐＨの水溶液、さらにより好ましくは５．０〜６．０のｐＨの水溶液である、請求項１３、１４、１５、または１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記少なくとも１つのエンドライシンが、ＺＰ２７８、ＣＰ２５Ｌ、および／もしくはＺＰ１７３、またはそれらの誘導体であり、前記組成物が、１５０〜７００ｍＭのＮａＣｌ、好ましくは２００〜５５０ｍＭのＮａＣｌを含有する、前記ＺＰ２７８、ＣＰ２５Ｌ、および／もしくはＺＰ１７３Ｌ、またはそれらの誘導体の緩衝化水溶液である、請求項１から１２または１３から１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記植物材料が、ホウレンソウ、フダンソウ、ビートの根、ニンジン、テンサイ、ニコチアナ・タバカム、ニコチアナ・ベンサミアナからなる群から選択される植物由来の材料である、かつ／または前記植物材料が、１つまたは複数の葉、根、塊茎、もしくは種子、または前記葉、根、塊茎、もしくは種子の、破砕された、粉砕された、もしくは微粉砕された生成物である、請求項２または３に記載の方法。
【請求項２０】
クロストリジウムに対して活性を有する少なくとも１つのエンドライシンを含む組成物を生成する方法であって、
（ｉ）前記少なくとも１つのエンドライシンを、植物中で、好ましくは食用植物中で発現させるステップ、
（ｉｉ）前記植物から、発現されたエンドライシンを含有する植物材料を収穫するステップ、
（ｉｉｉ）水性バッファーを使用して、前記植物材料から前記少なくとも１つのエンドライシンを抽出して、前記少なくとも１つのエンドライシンを含有する組成物を得るステップ
を含み、
（ｉｖ）前記組成物から望ましくない汚染物質を除去するステップ
を含んでもよい、前記方法。
【請求項２１】
ステップ（ｉｖ）が、疎水性相互作用クロマトグラフィーステップ、脱塩ステップ、およびイオン交換クロマトグラフィーステップをこの順序で含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
クロストリジウムに対して活性を有するエンドライシンを含む組成物。
【請求項２３】
クロストリジウム・ディフィシルまたはクロストリジウム・パーフリンジェンスなどのクロストリジウムによる感染を治療するまたは予防する方法において使用するための、請求項２２に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クロストリジウムによる食品または動物飼料などの対象物の汚染を予防するまたは低減する方法に関する。本発明はさらに、クロストリジウムに対して活性を有する（有効な）少なくとも１つのエンドライシンを含む組成物を生成するプロセスであって、植物中でまたは植物細胞中で前記エンドライシンを発現させることを含むプロセスに関する。本発明はさらに、クロストリジウムに対して活性を有するエンドライシンを含む組成物に関し、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）またはクロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）などのクロストリジウムによる感染を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
嫌気性芽胞形成細菌、クロストリジウム・パーフリンジェンスは、米国および欧州において最も一般的な食品媒介疾病のうちの１つの原因菌である。Ｃ．パーフリンジェンス胃腸炎は、Ｃ．パーフリンジェンスエンテロトキシン（ＣＰＥ）を産生するＡ型菌株（ｐｌｃ遺伝子によってコードされているホスホリパーゼＣとしても既知である、ｃｐａ遺伝子によってコードされているアルファ毒素を産生する）によって引き起こされる（Xiao et al., 2012）。
ＣＰＥが媒介した集団食中毒は、一般に、多数の犠牲者を伴い、温度管理が不適切であった獣肉または鳥肉料理が関係している。ＣＰＥ陽性Ｃ．パーフリンジェンス芽胞に汚染された食品が、ゆっくりと冷やされ、または１０〜５４℃の温度範囲で維持されもしくは提供されると、食中毒の最適条件となり、Ｃ．パーフリンジェンスの発芽および迅速な増殖が可能となる（Li and McClane, 2006, Lindstrom et al., 2011）。この疾患に関連した費用は高額である。オランダでは、クロストリジウム・パーフリンジェンス胃腸炎の平均発生数は、年間１７１，０００例で、食品に関連したＣ．パーフリンジェンス感染事例からの総費用は、２３２０万ユーロに達すると推定されている（Mangen et al., 2015）。
【０００３】
これに関して、Ｃ．パーフリンジェンスによる食品汚染を制御する有効で安全な抗生物質が必要とされる。現在、食品上の細菌の不活性化を標的とする介入法はごくわずかしかない。利用可能な介入法のほとんどは、加熱または有機酸類を必要とし、これらは、製品の味覚や質を悪化させることがある。近年、Schulz et al. (2015)によって、食品中の腸管出血性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を制御する、植物で産生させたコリシンの適用の可能性が説明されている。
細菌の天敵であるバクテリオファージは、２０世紀初頭に、主に抗生物質の発見以前に治療薬として使用されていた。抗生物質耐性病原体の問題の深刻化によって、バクテリオファージ療法や、食品処理を含む細菌汚染が懸念される他の分野での適用において改めて関心がもたれている。Ｉｎｔｒａｌｙｔｉｘによって開発されたファージカクテル（Ｌｉｓｔｅｘ  Ｐ１００、ＳａｌｍｏＦｒｅｓｈ、ＬｉｓｔＳｈｉｅｌｄ）が市販化されている。同社はまた、家禽のクロストリジウム・パーフリンジェンスを制御する、獣医学的適用のためのファージ製品、ＩＮＴ−４０１（商標）を開発し、ライセンスアウトした（Miller et al., 2010）。
【０００４】
発明者らは、バクテリオファージライシンが、バクテリオファージ全体と比べてさらに安全な代替物であり得ると考え、食品添加物として使用したまたは食品加工に使用したバクテリオファージライシンは、クロストリジウム・パーフリンジェンスおよびその他のクロストリジウムを制御する実現可能な解決策となり得ると考えた。大腸菌で産生された、Ｐｌｙ３６２６、ＰｌｙＣＰ２６Ｆ、ＰｌｙＣＰ３９Ｏ、ｐｓｍ、ＰｌｙＣＭ、およびＣＰ２５Ｌなどの幾つかのＣ．パーフリンジェンスライシンの抗菌活性が記述されている（Zimmer et al. 2002; Simmons et al., 2010; Nariya et al., 2011; Schmitz et al., 2011; Gervasi et al., 2014）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従来技術から逸脱して、本発明の目的は、クロストリジウムによる、特にクロストリジウム・パーフリンジェンスによる食品または動物飼料などの対象物の汚染を予防するまたは低減する方法および薬剤を提供することである。別の目的は、クロストリジウムに対して活性を有する少なくとも１つのエンドライシンを含む組成物を生成するプロセスを提供することである。さらなる目的は、クロストリジウムに対して活性を有する組成物と、クロストリジウム・ディフィシルまたはクロストリジウム・パーフリンジェンスなどのクロストリジウムによる感染を治療する方法とを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、以下を提供する：
（１）クロストリジウムによる食品または動物飼料などの対象物の汚染を予防するまたは低減する方法であって、前記対象物を、前記クロストリジウムに対して活性を有する少なくとも１つのエンドライシンを含む組成物と接触させることを含む方法。
（２）前記組成物が、植物材料またはその抽出物であり、または植物材料またはその抽出物を含み、植物材料が、前記少なくとも１つのエンドライシンを発現している植物、好ましくは前記少なくとも１つのエンドライシンを発現している食用植物からの材料である、請求項１に記載の方法。
（３）前記組成物が、前記少なくとも１つのエンドライシンを含有する水溶液である、項目１または２に記載の方法。
（４）前記少なくとも１つのエンドライシンを含有する前記水溶液が、５０〜４００ｍＭのＮａＣｌ、好ましくは１４０〜３１０ｍＭのＮａＣｌ、およびスルフヒドリル化合物を含有する緩衝化水溶液である、項目３に記載の方法。
（５）前記少なくとも１つのエンドライシンの総濃度が、０．００１〜１ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．０１〜０．５ｍｇ／ｍｌである、項目３または４に記載の方法。
（６）前記組成物が、前記少なくとも１つのエンドライシンを含有する凍結乾燥または乾燥粉末であり、前記粉末が、使用前に水または水溶液に溶解または懸濁されていてもよい、項目１または２に記載の方法。
（７）前記対象物が、前記少なくとも１つのエンドライシンを含有する水溶液を吹き付けられる、または前記少なくとも１つのエンドライシンを含有する水溶液中へ浸漬される、項目１から６までのいずれか１項に記載の方法。
（８）前記食品が、生肉、加熱調理された肉、または肉汁などの食肉である、項目１から７までのいずれか１項に記載の方法。
（９）前記クロストリジウムが、クロストリジウム・パーフリンジェンス、好ましくはＡ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、およびＥ型のクロストリジウム・パーフリンジェンスから選択されるいずれか１つまたは複数である、項目１から８までのいずれか１項に記載の方法。
（１０）クロストリジウム・パーフリンジェンスが、エンテロトキシンＣＰＥを含有するＡ型菌株である、項目９に記載の方法。
（１１）前記少なくとも１つのエンドライシンのうちの少なくとも１つが、配列番号１のアミノ酸を含むＰｓｍ、配列番号２のアミノ酸を含むＺＰ１７３、および配列番号３のアミノ酸を含むＺＰ２７８、またはこれらのエンドライシンのいずれかの誘導体から選択され、前記誘導体が、その由来元であるエンドライシンの少なくとも３３％の溶菌活性を有する、項目１から１０までのいずれか１項に記載の方法。
（１２）前記少なくとも１つのエンドライシンのうちの少なくとも１つが、配列番号４のアミノ酸を含むＣＰ２５Ｌ、配列番号５のアミノ酸を含むＰｌｙＣＰ２６Ｆ、および配列番号６のアミノ酸を含むＰｌｙＣＰ３９Ｏ、またはこれらのエンドライシンのいずれかの誘導体から選択され、前記誘導体が、その由来元であるエンドライシンの少なくとも３３％の溶菌活性を有する、項目１から１０までのいずれか１項に記載の方法。
（１３）前記誘導体が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、または配列番号６のいずれか１つのアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも９７％の配列同一性を有する；または、
前記誘導体が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、または配列番号６のいずれか１つのアミノ酸配列と比較して、１〜３０個の、好ましくは１〜２０個の、より好ましくは１〜１５個の、さらにより好ましくは１〜１０個のアミノ酸置換、挿入、および／または欠失を有する、項目１１または１２に記載の方法。
（１４）前記少なくとも１つのエンドライシンが、ＺＰ２７８、ＣＰ２５Ｌ、および／もしくはＺＰ１７３、またはそれらの誘導体であり、前記組成物が、１５０〜７００ｍＭのＮａＣｌ、好ましくは２００〜５５０ｍＭのＮａＣｌを含有する、前記ＺＰ２７８、ＣＰ２５Ｌ、および／もしくはＺＰ１７３Ｌ、またはそれらの誘導体の緩衝化水溶液である、項目１から１３までのいずれか１項に記載の方法。
（１５）前記少なくとも１つのエンドライシンのうちの少なくとも１つが、ＺＰ１７３またはそれらの誘導体であり、前記組成物が、ｐＨ４．５〜８．０のｐＨを有する、好ましくはｐＨ４．７〜６．０のｐＨを有する、前記ＺＰ１７３またはそれらの誘導体の緩衝化水溶液である、項目１から１４までのいずれか１項に記載の方法。
（１６）前記植物材料が、ホウレンソウ、フダンソウ、ビートの根、ニンジン、テンサイ、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）、ニコチアナ・ベンサミアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）からなる群から選択される植物由来の材料である、かつ／または前記植物材料が、１つまたは複数の葉、根、塊茎、もしくは種子、または前記葉、根、塊茎、もしくは種子の、破砕された、粉砕された、もしくは微粉砕された生成物である、項目２に記載の方法。
（１７）クロストリジウムに対して活性を有する少なくとも１つのエンドライシンを含む組成物を生成するプロセスであって、
（ｉ）前記少なくとも１つのエンドライシンを、植物中で、好ましくは食用植物中で発現させるステップ、
（ｉｉ）前記植物体から、発現されたエンドライシンを含有する植物材料を収穫するステップ、
（ｉｉｉ）水性バッファーを使用して、前記植物材料から前記少なくとも１つのエンドライシンを抽出して、前記少なくとも１つのエンドライシンを含有する組成物を得るステップ
を含み、
（ｉｖ）前記組成物から望ましくない汚染物質を除去するステップ
を含んでもよいプロセス。
（１８）ステップ（ｉｉｉ）が、５０〜４００ｍＭのＮａＣｌ、好ましくは１４０〜３１０ｍＭのＮａＣｌ、およびスルフヒドリル化合物を含有する、水性バッファーを使用して行われる、項目１７に記載のプロセス。
（１９）ステップ（ｉｖ）が、疎水性相互作用クロマトグラフィーステップ、脱塩ステップ、およびイオン交換クロマトグラフィーステップをこの順序で含む、項目１７に記載のプロセス。
（２０）前記エンドライシンが、項目１１から１３のいずれか１項に規定の通りである、または項目１１から１３のいずれか１項に規定の誘導体である、項目１７に記載のプロセス。
（２１）クロストリジウムに対して活性を有するエンドライシンを含む組成物。
（２２）クロストリジウム・ディフィシルまたはクロストリジウム・パーフリンジェンスなどのクロストリジウムによる感染を治療するまたは予防する方法において使用される、項目２１に記載の組成物。
（２３）前記エンドライシンが、項目１１から１３のいずれか１項に規定の通りである、または項目１１から１３のいずれか１項に規定の誘導体である、項目２１または２２に記載の組成物。
（２４）クロストリジウム・ディフィシルまたはクロストリジウム・パーフリンジェンスなどのクロストリジウムによる感染を治療する方法であって、クロストリジウムによる感染を患う対象へ、前記クロストリジウムに対して活性を有する少なくとも１つのエンドライシンを含む組成物を投与することを含む方法。
【０００７】
発明者らは、広範囲にわたるＣ．パーフリンジェンス菌株に幅広い溶菌活性を有するライシンを同定した。発明者らは、特に経時的安定性、活性、さらにｐＨ依存性が高いため、クロストリジウムによる食品の汚染の予防に特に好適である、特定のライシンおよび組成物を同定した。とりわけ、ライシンおよび組成物は、クロストリジウムによる食肉の汚染の予防に特に好適であることが確認された。発明者らはさらに、植物ウイルスベースの発現系が、とりわけ、複製するウイルスによって外来ｍＲＮＡを増幅させる場合、葉およびその他の組織中で非常に高いレベルのクロストリジウムに対して活性を有するライシンを産生することができることを見出した。植物ベースの産生系は、ＧＲＡＳ生物によってタンパク質を産生させる場合、大規模な精製を避けることが可能なタンパク質の生成には、明らかに有利である。食品病原体を標的とし、食用植物中で産生されたバクテリオファージライシンは、たとえ部分的でしか純粋でなくとも、食品添加物または加工助剤として安全に使用することができる。
【０００８】
本発明は、はじめてのＣ．パーフリンジェンスライシンの植物発現を提供する。本発明は、植物中での様々なファミリーに属するバクテリオファージライシン（Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼおよびグリコシルヒドロラーゼ２５）の発現がうまくいくことだけでなく、ｐｓｍ、ＺＰ１７３、およびＺＰ２７８、ＣＰ２５Ｌ、ＰｌｙＣＰ２６Ｆ、もしくはＰｌｙＣＰ３９Ｏ、またはそれらの誘導体を含有するタンパク質粗抽出物のような、植物で発現させたライシンを半精製形態で使用する実現性もまた実証し、インビトロおよび加熱調理された肉などの食品における被験Ｃ．パーフリンジェンス菌株に対する溶解活性を実証するものである。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１Ａ】使用したＴＭＶベースプロベクターモジュール（Ａ）のＴ−ＤＮＡ領域、および連結ベクター（Ｂ、Ｃ）の概略図である。ＬＢ  −  Ｔ−ＤＮＡ左境界、ＲＢ  −  Ｔ−ＤＮＡ右境界、Ａｃｔ２およびＨｓｐ８１．１  −  プロモーター、ＲｄＲｐ  −  ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＭＰ  −  ＴＭＶ移行タンパク質、ｉｎｔ  −  イントロン、Ｔ  −  ｎｏｓターミネーター、ｃｔｐ  −  合成葉緑体標的化配列；ＡｔｔＰおよびＡｔｔＢ  −  インテグラーゼ組換え部位、ＰｈｉＣ３１  −  ストレプトマイセスファージＣ３１インテグラーゼ、ＮＬＳ  −  核移行シグナル、ＰｌｙＣＰ２６Ｆ、ＰｌｙＣＰ３９Ｏ、ＣＰ２５Ｌ、ｐｓｍ、ＺＰ１７３、およびＺＰ２７８  −  それぞれ、ＰｌｙＣＰ２６Ｆ、ＰｌｙＣＰ３９Ｏ、ＣＰ２５Ｌ、ｐｓｍ、ＺＰ１７３、およびＺＰ２７８バクテリオファージライシンをコードする配列。
【図１Ｂ】使用したＴＭＶベースプロベクターモジュール（Ａ）のＴ−ＤＮＡ領域、および連結ベクター（Ｂ、Ｃ）の概略図である。ＬＢ  −  Ｔ−ＤＮＡ左境界、ＲＢ  −  Ｔ−ＤＮＡ右境界、Ａｃｔ２およびＨｓｐ８１．１  −  プロモーター、ＲｄＲｐ  −  ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＭＰ  −  ＴＭＶ移行タンパク質、ｉｎｔ  −  イントロン、Ｔ  −  ｎｏｓターミネーター、ｃｔｐ  −  合成葉緑体標的化配列；ＡｔｔＰおよびＡｔｔＢ  −  インテグラーゼ組換え部位、ＰｈｉＣ３１  −  ストレプトマイセスファージＣ３１インテグラーゼ、ＮＬＳ  −  核移行シグナル、ＰｌｙＣＰ２６Ｆ、ＰｌｙＣＰ３９Ｏ、ＣＰ２５Ｌ、ｐｓｍ、ＺＰ１７３、およびＺＰ２７８  −  それぞれ、ＰｌｙＣＰ２６Ｆ、ＰｌｙＣＰ３９Ｏ、ＣＰ２５Ｌ、ｐｓｍ、ＺＰ１７３、およびＺＰ２７８バクテリオファージライシンをコードする配列。
【図１Ｃ】使用したＴＭＶベースプロベクターモジュール（Ａ）のＴ−ＤＮＡ領域、および連結ベクター（Ｂ、Ｃ）の概略図である。ＬＢ  −  Ｔ−ＤＮＡ左境界、ＲＢ  −  Ｔ−ＤＮＡ右境界、Ａｃｔ２およびＨｓｐ８１．１  −  プロモーター、ＲｄＲｐ  −  ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＭＰ  −  ＴＭＶ移行タンパク質、ｉｎｔ  −  イントロン、Ｔ  −  ｎｏｓターミネーター、ｃｔｐ  −  合成葉緑体標的化配列；ＡｔｔＰおよびＡｔｔＢ  −  インテグラーゼ組換え部位、ＰｈｉＣ３１  −  ストレプトマイセスファージＣ３１インテグラーゼ、ＮＬＳ  −  核移行シグナル、ＰｌｙＣＰ２６Ｆ、ＰｌｙＣＰ３９Ｏ、ＣＰ２５Ｌ、ｐｓｍ、ＺＰ１７３、およびＺＰ２７８  −  それぞれ、ＰｌｙＣＰ２６Ｆ、ＰｌｙＣＰ３９Ｏ、ＣＰ２５Ｌ、ｐｓｍ、ＺＰ１７３、およびＺＰ２７８バクテリオファージライシンをコードする配列。
【図２Ａ】植物で産生されたライシン、ＺＰ１７３、ＺＰ２７８、およびＣＰ２５Ｌ（Ａ）の精製を示す図である。ＺＰ１７３  −  レーン１  −  ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ、レーン２  −  抽出されたタンパク質、レーン３  −  ブチルセファロースに載せたタンパク質、レーン４  −  ブチルセファロースフロースルー画分、レーン５  −  ブチルセファロースＩの後、回収されたタンパク質、レーン６  −  ブチルセファロースＩＩの後、回収されたタンパク質、レーン７  −  ＳＰセファロースに載せたタンパク質、レーン８  −  ＳＰセファロースフロースルー画分、レーン９  −  ＳＰセファロースの後、回収されたタンパク質。ＺＰ２７８  −  レーン１  −  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ、レーン２および９  −  抽出されたタンパク質、レーン３  −  ブチルセファロースに載せたタンパク質、レーン４  −  ブチルセファロースフロースルー画分、レーン５  −  ブチルセファロースＩの後、回収されたタンパク質、レーン６  −  ブチルセファロースＩＩの後、回収されたタンパク質、レーン７  −  ブチルセファロースＩＩＩの後、回収されたタンパク質、レーン８  −  ブチルセファロースＩＶの後、回収されたタンパク質、レーン１０  −  ＤＥＡＥセファロースに載せたタンパク質、レーン１１  −  ＤＥＡＥセファロースフロースルー画分、レーン１２  −  ＤＥＡＥセファロースの後、回収されたタンパク質。ＣＰ２５Ｌ  −  レーン１  −  プロテインラダー、レーン２  −  抽出されたタンパク質、レーン３  −  ブチルセファロースに載せたタンパク質、レーン４  −  ブチルセファロースフロースルー画分、レーン５  −  ブチルセファロースＩの後、回収されたタンパク質、レーン６  −  ブチルセファロースＩＩの後、回収されたタンパク質、レーン７  −  ブチルセファロースＩＩＩの後、回収されたタンパク質、レーン８  −  Ｑセファロースに載せたタンパク質、レーン９  −  Ｑセファロースの後、回収されたタンパク質。
【図２Ｂ】植物で産生されたライシン、ＰｌｙＣＰ２６ＦおよびＰｌｙＣＰ３９Ｏ（Ｂ）の精製を示す図である。ＰｌｙＣＰ２６Ｆ  −  レーン１および８  −  プロテインラダー、レーン２  −  抽出されたタンパク質、レーン３  −  ブチルセファロースに載せたタンパク質、レーン４  −  ブチルセファロースフロースルー画分、レーン５  −  ブチルセファロースＩの後、回収されたタンパク質、レーン６  −  ブチルセファロースＩＩの後、回収されたタンパク質、レーン７  −  ブチルセファロースＩＩＩの後、回収されたタンパク質、レーン９  −  ＳＰセファロースに載せたタンパク質、レーン１０  −  ＳＰセファロースフロースルー画分、レーン１１  −  ＳＰセファロースの後、回収されたタンパク質。ＰｌｙＣＰ３９Ｏ  −  レーン１および７  −  プロテインラダー、レーン２  −  抽出されたタンパク質、レーン３  −  ブチルセファロースに載せたタンパク質、レーン４  −  ブチルセファロースフロースルー画分、レーン５  −  ブチルセファロースＩの後、回収されたタンパク質、レーン６  −  ブチルセファロースＩＩの後、回収されたタンパク質、レーン８  −  ＳＰセファロースに載せたタンパク質、レーン９  −  ＳＰセファロースフロースルー画分、レーン１０  −  ＳＰセファロースの後、回収されたタンパク質。Ｐｓｍ  −  レーン１、７、および８  −  プロテインラダー、レーン２  −  抽出されたタンパク質、レーン３  −  ブチルセファロースに載せたタンパク質、レーン４  −  ブチルセファロースフロースルー画分、レーン５  −  ブチルセファロースの後Ｉ、回収されたタンパク質、レーン６  −  ブチルセファロースＩＩの後、回収されたタンパク質、レーン９  −  Ｑセファロースに載せたタンパク質、レーン１０  −  ＱセファロースＩの後、回収されたタンパク質、レーン１１  −  ＱセファロースＩＩの後、回収されたタンパク質。
【図３Ｃ】ｐｓｍ、ＺＰ１７３、およびＺＰ２７８のアラインメント（Ａ）、Ｐｌｙ２６Ｆ、ＰｌｙＣＰ３９Ｏ、およびＣＰ２５Ｌのアラインメント（Ｂ）、ならびに（Ｃ）これらすべてのアミノ酸配列を示す図である。アミノ酸配列のアラインメントは、ＧｅｎｅｉｏｕｓのＣｌｕｓｔａｌ  Ｗを使用し、タンパク質間で共有されている保存された同一残基を表す陰影付けをして、完成させた。
【図４Ａ−４Ｂ】クロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージライシンの発現を示す図である。植物粗抽出物のクマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ。Ａ  −  ６ｄｐｓでアグロスプレーしたニコチアナ・ベンサミアナ（ｐｓｍ葉緑体構築物については１０ｄｐｓ）。Ｂ  −  ６ｄｐｉでシリンジインフィルトレーションしたニコチアナ・ベンサミアナ（ＣＰ２５Ｌについては７ｄｐｉ）。タンパク質粗抽出物は、Ｌａｅｍｍｌｉバッファーを使用して調製した。Ｃｙ  −  細胞質ゾル発現、Ｃｈ  −  葉緑体発現、ＷＴ  −  野生型対照植物体。
【図４Ｃ】クロストリジウム・パーフリンジェンスバクテリオファージライシンの発現を示す図である。植物粗抽出物のクマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ。Ｃ  −  アグロスプレーしたホウレンソウ（Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅｒａｃｅａ）「Ｆｒｕｈｅｓ  Ｒｉｅｓｅｎｂｌａｔｔ」品種（１０ｄｐｓ）。タンパク質粗抽出物は、Ｌａｅｍｍｌｉバッファーを使用して調製した。Ｃｙ  −  細胞質ゾル発現、Ｃｈ  −  葉緑体発現、ＷＴ  −  野生型対照植物体。
【図５Ａ】Ｃ．パーフリンジェンスＮＣＴＣ８２３７に対する、Ｎ．ベンサミアナで発現させたライシン粗抽出物の溶菌活性を示す図である。タンパク質粗抽出物は、アグロインフィルトレーションしたＮ．ベンサミアナ植物体から、抽出バッファー（５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、５ｍＭのＤＴＴ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、（ｐＨ７．５）を使用して調製し、約１μｇ／μＬに希釈した。Ｃ．パーフリンジェンスは、嫌気性条件下で、ＴＳＢ中でＯＤ600＝０．８まで増殖させ、ｐＨ７．３の１×ＰＢＳに再懸濁した。タンパク質抽出物約５０μＬと混合した細菌懸濁液９５０μＬを、ＯＤ600測定およびｃｆｕ計数に使用した。６０分のライシンとの共インキュベーションの後、ｃｆｕ計数のために、ｐＨ７．３の１×ＰＢＳで段階希釈を行った。嫌気性条件下で、３７℃で一晩インキュベートした後、Ｃｆｕを計数した。Ａ  −  ６００ｎｍでの吸光度。
【図５Ｂ】Ｃ．パーフリンジェンスＮＣＴＣ８２３７に対する、Ｎ．ベンサミアナで発現させたライシン粗抽出物の溶菌活性を示す図である。タンパク質粗抽出物は、アグロインフィルトレーションしたＮ．ベンサミアナ植物体から、抽出バッファー（５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、５ｍＭのＤＴＴ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、（ｐＨ７．５）を使用して調製し、約１μｇ／μＬに希釈した。Ｃ．パーフリンジェンスは、嫌気性条件下で、ＴＳＢ中でＯＤ600＝０．８まで増殖させ、ｐＨ７．３の１×ＰＢＳに再懸濁した。タンパク質抽出物約５０μＬと混合した細菌懸濁液９５０μＬを、ＯＤ600測定およびｃｆｕ計数に使用した。６０分のライシンとの共インキュベーションの後、ｃｆｕ計数のために、ｐＨ７．３の１×ＰＢＳで段階希釈を行った。嫌気性条件下で、３７℃で一晩インキュベートした後、Ｃｆｕを計数した。Ｂ  −  ライシンと１時間インキュベートした後のｃｆｕ数。
【図５Ｃ】Ｃ．パーフリンジェンスＮＣＴＣ８２３７に対する、Ｎ．ベンサミアナで発現させたライシン粗抽出物の溶菌活性を示す図である。タンパク質粗抽出物は、アグロインフィルトレーションしたＮ．ベンサミアナ植物体から、抽出バッファー（５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、５ｍＭのＤＴＴ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、（ｐＨ７．５）を使用して調製し、約１μｇ／μＬに希釈した。Ｃ．パーフリンジェンスは、嫌気性条件下で、ＴＳＢ中でＯＤ600＝０．８まで増殖させ、ｐＨ７．３の１×ＰＢＳに再懸濁した。タンパク質抽出物約５０μＬと混合した細菌懸濁液９５０μＬを、ＯＤ600測定およびｃｆｕ計数に使用した。６０分のライシンとの共インキュベーションの後、ｃｆｕ計数のために、ｐＨ７．３の１×ＰＢＳで段階希釈を行った。嫌気性条件下で、３７℃で一晩インキュベートした後、Ｃｆｕを計数した。Ｃ  −  クマシー染色した、実験に使用した植物抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。
【図６Ａ】クロストリジウム・パーフリンジェンス菌株ＮＣＴＣ８２３７（Ａ）、に対する、ホウレンソウで発現させたＺＰ１７３およびＺＰ２７８の溶菌活性を示す図である。タンパク質粗抽出物は、バッファー（５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、３００ｍＭのＮａＣｌ、（ｐＨ４．５）を使用して、アグロスプレーしたホウレンソウ植物体から調製し、約１μｇ／μＬに希釈した。Ｃ．パーフリンジェンスは、嫌気性条件下で、ＴＳＢ中でＯＤ600＝０．７まで増殖させ、ｐＨ７．３の１×ＰＢＳに再懸濁した。タンパク質抽出物５０μＬを混合した細菌懸濁液９５０μＬを、ＯＤ600測定およびｃｆｕ計数に使用した。ライシンと６０分間共インキュベーションした後、ｃｆｕ計数のためにｐＨ７．３の１×ＰＢＳで段階希釈を行った。嫌気性条件下で、３７℃で一晩インキュベートした後、ＴＳＡプレート上でＣＦＵを数えた。Ａ  −  ６００ｎｍでの吸光度。
【図６Ｂ】クロストリジウム・パーフリンジェンス菌株ＮＣＴＣ８２３７（Ｂ）に対する、ホウレンソウで発現させたＺＰ１７３およびＺＰ２７８の溶菌活性を示す図である。タンパク質粗抽出物は、バッファー（５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、３００ｍＭのＮａＣｌ、（ｐＨ４．５）を使用して、アグロスプレーしたホウレンソウ植物体から調製し、約１μｇ／μＬに希釈した。Ｃ．パーフリンジェンスは、嫌気性条件下で、ＴＳＢ中でＯＤ600＝０．７まで増殖させ、ｐＨ７．３の１×ＰＢＳに再懸濁した。タンパク質抽出物５０μＬを混合した細菌懸濁液９５０μＬを、ＯＤ600測定およびｃｆｕ計数に使用した。ライシンと６０分間共インキュベーションした後、ｃｆｕ計数のためにｐＨ７．３の１×ＰＢＳで段階希釈を行った。嫌気性条件下で、３７℃で一晩インキュベートした後、ＴＳＡプレート上でＣＦＵを数えた。Ｂ  −  ライシンと１時間インキュベートした後のｃｆｕ数。
【図６Ｃ】クロストリジウム・パーフリンジェンス菌株ＤＳＭ２９４３（Ｃ）に対する、ホウレンソウで発現させたＺＰ１７３およびＺＰ２７８の溶菌活性を示す図である。タンパク質粗抽出物は、バッファー（５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、３００ｍＭのＮａＣｌ、（ｐＨ４．５）を使用して、アグロスプレーしたホウレンソウ植物体から調製し、約１μｇ／μＬに希釈した。Ｃ．パーフリンジェンスは、嫌気性条件下で、ＴＳＢ中でＯＤ600＝０．７まで増殖させ、ｐＨ７．３の１×ＰＢＳに再懸濁した。タンパク質抽出物５０μＬを混合した細菌懸濁液９５０μＬを、ＯＤ600測定およびｃｆｕ計数に使用した。ライシンと６０分間共インキュベーションした後、ｃｆｕ計数のためにｐＨ７．３の１×ＰＢＳで段階希釈を行った。嫌気性条件下で、３７℃で一晩インキュベートした後、ＴＳＡプレート上でＣＦＵを数えた。Ｃ  −  ６００ｎｍでの吸光度。
【図６Ｄ】クロストリジウム・パーフリンジェンス菌株ＤＳＭ２９４３（Ｄ）に対する、ホウレンソウで発現させたＺＰ１７３およびＺＰ２７８の溶菌活性を示す図である。タンパク質粗抽出物は、バッファー（５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、３００ｍＭのＮａＣｌ、（ｐＨ４．５）を使用して、アグロスプレーしたホウレンソウ植物体から調製し、約１μｇ／μＬに希釈した。Ｃ．パーフリンジェンスは、嫌気性条件下で、ＴＳＢ中でＯＤ600＝０．７まで増殖させ、ｐＨ７．３の１×ＰＢＳに再懸濁した。タンパク質抽出物５０μＬを混合した細菌懸濁液９５０μＬを、ＯＤ600測定およびｃｆｕ計数に使用した。ライシンと６０分間共インキュベーションした後、ｃｆｕ計数のためにｐＨ７．３の１×ＰＢＳで段階希釈を行った。嫌気性条件下で、３７℃で一晩インキュベートした後、ＴＳＡプレート上でＣＦＵを数えた。Ｄ  −  ライシンと１時間インキュベートした後のｃｆｕ数。
【図６Ｅ】クロストリジウム・パーフリンジェンス菌株ＤＳＭ７９８（Ｅ）に対する、ホウレンソウで発現させたＺＰ１７３およびＺＰ２７８の溶菌活性を示す図である。タンパク質粗抽出物は、バッファー（５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、３００ｍＭのＮａＣｌ、（ｐＨ４．５）を使用して、アグロスプレーしたホウレンソウ植物体から調製し、約１μｇ／μＬに希釈した。Ｃ．パーフリンジェンスは、嫌気性条件下で、ＴＳＢ中でＯＤ600＝０．７まで増殖させ、ｐＨ７．３の１×ＰＢＳに再懸濁した。タンパク質抽出物５０μＬを混合した細菌懸濁液９５０μＬを、ＯＤ600測定およびｃｆｕ計数に使用した。ライシンと６０分間共インキュベーションした後、ｃｆｕ計数のためにｐＨ７．３の１×ＰＢＳで段階希釈を行った。嫌気性条件下で、３７℃で一晩インキュベートした後、ＴＳＡプレート上でＣＦＵを数えた。Ｅ  −  ６００ｎｍでの吸光度。
【図６Ｆ】クロストリジウム・パーフリンジェンス菌株ＤＳＭ７９８（Ｆ）に対する、ホウレンソウで発現させたＺＰ１７３およびＺＰ２７８の溶菌活性を示す図である。タンパク質粗抽出物は、バッファー（５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、３００ｍＭのＮａＣｌ、（ｐＨ４．５）を使用して、アグロスプレーしたホウレンソウ植物体から調製し、約１μｇ／μＬに希釈した。Ｃ．パーフリンジェンスは、嫌気性条件下で、ＴＳＢ中でＯＤ600＝０．７まで増殖させ、ｐＨ７．３の１×ＰＢＳに再懸濁した。タンパク質抽出物５０μＬを混合した細菌懸濁液９５０μＬを、ＯＤ600測定およびｃｆｕ計数に使用した。ライシンと６０分間共インキュベーションした後、ｃｆｕ計数のためにｐＨ７．３の１×ＰＢＳで段階希釈を行った。嫌気性条件下で、３７℃で一晩インキュベートした後、ＴＳＡプレート上でＣＦＵを数えた。Ｆ  −  ライシンと１時間インキュベートした後のｃｆｕ数。
【図７Ａ】植物で発現させたライシンの、ＮａＣｌの様々な濃度および様々なｐＨでの活性を示す図である。Ａ  −  Ｃ．パーフリンジェンスＮＣＴ８２３７は、嫌気性条件下で、ＴＳＢ中でＯＤ600＝０．６〜０．７まで増殖させ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、１５０ｍＭ、１５０ｍＭ、２００ｍＭ、３００ｍＭ、および５００ｍＭのＮａＣｌを補充したｐＨ５．５のクエン酸−Ｎａリン酸バッファーに再懸濁した。細菌懸濁液１ｍＬを、３μｇの精製したＺＰ１７３、３４μｇのＺＰ７８、または７．５μｇのＣＰ２５Ｌと混合し、室温で６０分間インキュベートした。被分析試料をｐＨ７．３の１×ＰＢＳで段階希釈し、ＴＳＡプレート上にプレーティングした。嫌気性条件下で、３７℃で一晩インキュベートした後、細菌ｃｆｕ／ｍＬを数えた。
【図７Ｂ】植物で発現させたライシンの、ＮａＣｌの様々な濃度および様々なｐＨでの活性を示す図である。Ｂ  −  Ｃ．パーフリンジェンスＮＣＴ８２３７は、嫌気性条件下で、ＴＳＢ中でＯＤ600＝０．６〜０．７６まで増殖させ、ｐＨ４．５〜８．０のクエン酸−リン酸Ｎａバッファーに再懸濁した。細菌懸濁液１ｍＬを、４μｇのＺＰ１７３、２７μｇのＺＰ２７８、または５μｇのＣＰ２５Ｌと混合し、室温で１時間インキュベートした。被分析試料をｐＨ７．３の１×ＰＢＳで段階希釈し、ＴＳＡプレート上にプレーティングした。嫌気性条件下で、３７℃で一晩インキュベートした後、細菌ｃｆｕ／ｍＬを数えた。
【図８Ａ】様々な温度でインキュベーション後のライシンの残存活性（％）を示す図である。Ａ  −  ライシンを、様々な温度でインキュベートした。Ａ  −  ３７℃〜６０°Ｃの温度でのインキュベーション後のライシン活性。精製したライシンを、分注し、示した温度で３０分間インキュベートした。Ｃ．パーフリンジェンスＮＣＴ８２３７は、嫌気性条件下で、ＴＳＢ中でＯＤ600＝０．８９４まで増殖させ、ｐＨ７．３の１×ＰＢＳに再懸濁した。細菌懸濁液９９８μＬを、２μｇのＺＰ１７３と混合し、室温で１時間インキュベートした。被分析試料をｐＨ７．３の１×ＰＢＳで段階希釈し、ＴＳＡプレート上にプレーティングし、３７℃の嫌気性条件下で一晩インキュベートした後、細菌ｃｆｕを数えた。
【図８Ｂ】様々な温度でインキュベーション後のライシンの残存活性（％）を示す図である。Ｂ  −  ライシンを、室温で、数週間保管した。Ｂ  −  室温での長期貯蔵後のライシン活性。精製したライシンを、分注し、室温で１〜６週間インキュベートした。Ｃ．パーフリンジェンスＮＣＴ８２３７は、嫌気性条件下で、ＴＳＢ中でＯＤ600＝０．８５８まで増殖させ、ｐＨ７．３の１×ＰＢＳに再懸濁した。細菌懸濁液９９８μＬを、２μｇのＺＰ１７３またはＣＰ２５Ｌと混合し、室温で１時間インキュベートした。被分析試料をｐＨ７．３の１×ＰＢＳで段階希釈し、ＴＳＡプレート上にプレーティングし、３７℃の嫌気性条件下で一晩インキュベートした後、細菌ｃｆｕを数えた。
【図８Ｃ】様々な温度でインキュベーション後のライシンの残存活性（％）を示す図である。Ｃ  −  ライシンを、３７℃で、７日までインキュベートした。Ｃ  −  数日間、３７℃でインキュベートした後のライシン活性。精製したライシンを、分注し、３７℃で１〜７日間インキュベートした。Ｃ．パーフリンジェンスＮＣＴ８２３７は、嫌気性条件下で、ＴＳＢ中でＯＤ600＝０，８５８まで増殖させ、ｐＨ７．３の１×ＰＢＳに再懸濁した。細菌懸濁液９９８μＬを、２μｇのＺＰ１７３またはＣＰ２５Ｌと混合し、室温で１時間インキュベートした。被分析試料をｐＨ７．３の１×ＰＢＳで段階希釈し、ＴＳＡプレート上にプレーティングし、３７℃の嫌気性条件下で一晩インキュベートした後、細菌ｃｆｕを数えた。
【図９】様々なＣ．パーフリンジェンス食品菌株に対する、精製したライシンの溶菌活性を示す図である。精製したタンパク質は、約０，３〜０，９μｇ／μＬの濃度に溶解した。Ｃ．パーフリンジェンスは、嫌気的にＴＳＢ中でＯＤ600＝０．８まで増殖させ、遠心分離し、５０ｍＭのＮａＣｌを補充したｐＨ５，５の２０ｍＭクエン酸−リン酸バッファーに再懸濁した。細菌懸濁液９６７μＬを、タンパク質１０μｇと混合し、室温でインキュベートした。１時間、共インキュベーションした後、ＣＦＵ計数のための試料を採取した。被分析試料を再懸濁バッファーで段階希釈し、非希釈、１０、１０2、１０3、１０4、および１０5倍希釈した試料各３０μＬをＴＳＡプレート上にプレーティングした。３７℃の嫌気性条件下で一晩インキュベートした後に得たプレートの画像。
【図１０Ａ】加熱調理された七面鳥（Ａ）挽肉中のＣ．パーフリンジェンスＮＣＴＣ８２３７に対する、ｐｓｍ粗抽出物の活性を示す図である。ｐｓｍ粗抽出物は、標準手法に従って、６ｄｐｉでアグロインフィルトレーションしたＮ．ベンサミアナ植物体を収穫して調製した。タンパク質抽出物は、約０．４４μｇ／μＬの濃度に希釈した。Ｃ．パーフリンジェンスＮＣＴＣ８２３７菌株は、嫌気性条件下で、ＴＳＢ（トリプティックソイブロス）中でＯＤ600＝０．２６５まで増殖させた。細菌１００μＬおよびタンパク質抽出物７００μＬ≒３００μｇを、加熱調理された肉１０ｇに加え、十分にヴォルテックスした。すべての試料の量を等しくするために、７００μＬのｐＨ７．３の１×ＰＢＳを、肉／細菌試料に加えた。試料をすべて、６ウェルプレートに載せ、室温の嫌気性条件下でインキュベートした。被分析試料をｐＨ７．３の１×ＰＢＳで段階希釈し、ＴＳＡプレート上にプレーティングした。３７℃の嫌気性条件下で一晩インキュベートした後、細菌ｃｆｕを数えた。
【図１０Ｂ】加熱調理された牛（Ｂ）挽肉中のＣ．パーフリンジェンスＮＣＴＣ８２３７に対する、ｐｓｍ粗抽出物の活性を示す図である。ｐｓｍ粗抽出物は、標準手法に従って、６ｄｐｉでアグロインフィルトレーションしたＮ．ベンサミアナ植物体を収穫して調製した。タンパク質抽出物は、約０．４４μｇ／μＬの濃度に希釈した。Ｃ．パーフリンジェンスＮＣＴＣ８２３７菌株は、嫌気性条件下で、ＴＳＢ（トリプティックソイブロス）中でＯＤ600＝０．２６５まで増殖させた。細菌１００μＬおよびタンパク質抽出物７００μＬ≒３００μｇを、加熱調理された肉１０ｇに加え、十分にヴォルテックスした。すべての試料の量を等しくするために、７００μＬのｐＨ７．３の１×ＰＢＳを、肉／細菌試料に加えた。試料をすべて、６ウェルプレートに載せ、室温の嫌気性条件下でインキュベートした。被分析試料をｐＨ７．３の１×ＰＢＳで段階希釈し、ＴＳＡプレート上にプレーティングした。３７℃の嫌気性条件下で一晩インキュベートした後、細菌ｃｆｕを数えた。
【図１１】加熱調理された七面鳥挽肉中のＣ．パーフリンジェンスＮＣＴＣ８２３７に対する、精製したＺＰ１７３の活性を示す図である。Ｃ．パーフリンジェンスＮＣＴ８２３７は、嫌気性条件下で、ＴＳＢ中でＯＤ600＝０．２４まで増殖させた。加熱調理された七面鳥胸肉１０ｇと、細菌１００μＬ、２０μｇまたは５０μｇのＺＰ１７３、および無菌水３ｍＬとを合わせ、十分に混合し、６ウェルプレート中で、嫌気的に室温でインキュベートした。ｃｆｕ計数のための試料は、実験の開始直前、ならびに２時間および１８時間共インキュベーションした後、採取した。被分析試料をｐＨ７．３の１×ＰＢＳで段階希釈し、ＴＳＡプレート上にプレーティングし、３７℃の嫌気性条件下で一晩インキュベートした後、細菌ｃｆｕを数えた。
【図１２】Ｎ．ベンサミアナで発現させたライシンによる、Ｃ．パーフリンジェンス食品菌株の死滅を示す図である。各ライシンで別々に処理した、様々なＣ．パーフリンジェンス菌株のＣＦＵ／ｍＬΔｌｏｇ１０。Ｃ．パーフリンジェンス菌株は、嫌気性条件下で、ＴＳＢ中でＯＤ６００約０．８まで増殖させ、ｐＨ５．５の５０ｍＭのＮａＣｌのクエン酸−リン酸バッファーに再懸濁した。ライシンは、細菌懸濁液に１０μｇ／ｍｌの最終濃度で添加した。ｃｆｕ計数のための段階希釈は、６０分のライシンとの共インキュベーション後、ｐＨ７．３のＰＢＳ中で行った。＊  −  プレート上でコロニーは検出されなかった。
【図１３】精製したライシンの、室温でのＣ．パーフリンジェンスで汚染された七面鳥における活性を示す図である。４ｌｏｇ１０ｃｆｕのＣ．パーフリンジェンスＮＣＴＣ８２３７と、ぶつ切りにした加熱調理された七面鳥肉１０ｇ、ＮａＣｌ（１．５％の最終濃度）を補充したｐＨ５．５のクエン酸−リン酸バッファー３ｍｌ、および精製ライシン２．５μｇ／ｍｌまたはナイシン５μｇ／ｍｌとを混合した。０時間  −  ライシンまたはナイシン添加前の試料のｃｆｕ数。２時間、１８時間、および４３時間  −  示した時間、嫌気的に室温でインキュベートした試料のｃｆｕ数。データは、４つの独立した実験の平均±ＳＤである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
バクテリオファージエンドライシン（エンドライシンは、本明細書において「ライシン」とも呼ぶ）は、様々なメカニズムによって、例えば細菌細胞壁成分を加水分解することによって、細菌細胞を殺すことができる。グラム陽性菌に対して活性を有するライシンは、一般に、Ｎ末端の酵素（または触媒）ドメインおよびＣ末端の結合ドメインを有する、長さ２５０〜４００アミノ酸残基のモジュール型単量体タンパク質である。ライシンは、細菌細胞壁構造上で作用するそれらの触媒ドメインの切断部位に基づき、
１）Ｎ−アセチルムラミダーゼ（リゾチーム）が、ＮＡＧ−ＮＡＭ間のβ−１−４−グリコシド結合を切断する、
２）Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ（グルコシダーゼ）が、ＮＡＭ−ＮＡＧ間のβ−１−４−グリコシド結合を切断する、
３）Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼが、糖とペプチドとの間のアミド結合を切断する（ＥＣ３．５．１．２８）、
４）Ｌ−アラノイル−Ｄ−グルタミン酸エンドペプチダーゼおよびペプチド間架橋特異的エンドペプチダーゼが、細胞壁ペプチドグリカンのペプチド部分を切断する
の少なくとも４群がある。
本発明において使用されるライシンは、これらのタイプ１）〜４）のいずれか１つまたは複数であってもよい。
【００１１】
本発明は、クロストリジウム、とりわけ、病原性クロストリジウムに対して有効である１つまたは複数のライシンを使用する。病原性クロストリジウムの例としては、
クロストリジウム・ボツリヌス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）：ボツリヌス毒素を産生する；ボツリヌス中毒の原因となる；
クロストリジウム・ディフィシル：抗生物質療法後の細菌叢異常症；偽膜性大腸炎
クロストリジウム・パーフリンジェンス：食中毒からガス壊疽まで、広範な症状；
クロストリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）：破傷風毒素を産生する；破傷風の原因となる；
クロストリジウム・ソルデリイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｏｒｄｅｌｉｉ）：医学的妊娠中絶後、きわめてまれに、致死的感染の原因となりうる
が挙げられる。
【００１２】
本発明は、クロストリジウムの上記の種のいずれか１つに対して活性を有する１つまたは複数のライシンを使用する。好ましくは、本発明は、クロストリジウム・パーフリンジェンスまたはクロストリジウム・ディフィシルに対して有効である、１つまたは複数のライシンを使用する。好ましくは、その１つまたは複数のライシンは、クロストリジウム・パーフリンジェンスに対して有効である。クロストリジウム・パーフリンジェンスの血清型およびそれらの毒素は、次の通り、毒素（エンテロトキシン）の型：α、β、ε、ι（アルファ、ベータ、イプシロン、およびイオタ毒素）によって、５つの血清型、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥがある。Ｃ．パーフリンジェンスエンテロトキシン（ＣＰＥ）は、多くの重篤な胃腸（ＧＩ）疾患を引き起こす主要な病原性因子である。ＣＰＥは、多くの場合、細胞死をもたらす、細胞膜透過性の崩壊を引き起こす。クロストリジウム・パーフリンジェンスＡ型は、ブタのＧＩ管の常在菌である。最も好ましくは、１つまたは複数のライシンが、クロストリジウム・パーフリンジェンスＡ型に対して有効である。
【００１３】
「クロストリジウムに対して活性を有する」という表現は、ライシンがクロストリジウムに対する溶菌活性を有することを意味する。クロストリジウムに対する溶菌活性は、例えば、実験セクションにおいて用いている濁度アッセイを使用して、または実験セクションに記載されているように、試験されるライシンの存在および非存在下でクロストリジウム試料のコロニー形成単位（ｃｆｕ）を比較することによって、実験的に試験してもよい。
本発明の組成物および方法において、少なくとも１つのライシンが使用される。複数のライシン、例えば２つ、３つ、４つ、またはそれ以上のライシンを、例えば混合物として、本発明の方法、プロセス、または組成物において使用してもよい。２つ以上のライシンを組み合わせる場合、広範囲の抗クロストリジウム活性を獲得するために、かつ／またはクロストリジウムの変異によるライシンに対する抵抗性の発生を回避するために、ライシンの結合ドメインによって決定されるような、異なる標的特異性を有するライシンを組み合わせることが好ましい。別法としてまたは追加的に、２つ以上のライシンは、上記の１）〜４）の４タイプのうちの様々な触媒活性を有する方法または組成物において使用される。例えば、タイプ１）のライシンをタイプ３）のライシンと組み合わせてもよい。
【００１４】
本発明の一実施形態において、前記少なくとも１つのライシンのうちの少なくとも１つは、上記タイプ１）のムラミダーゼ含有ライシンであり、または上記タイプ１）のムラミダーゼ含有ライシンを含む。このようなライシンは、配列番号１のアミノ酸を含むもしくは配列番号１のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するＰｓｍ、配列番号２のアミノ酸を含むもしくは配列番号２のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するＺＰ１７３、および配列番号３のアミノ酸を含むもしくは配列番号３のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するＺＰ２７８、またはこれらのライシンのいずれかの誘導体から選択されてもよい。これらのライシンの受託番号および由来は、実施例において示す。これらのライシンの誘導体は、その由来元であるライシンの少なくとも３３％の溶菌活性を有していてもよく、抗菌活性は、例えば実施例において使用されている濁度アッセイで、実験的に試験してもよい。誘導体は、それと最も高い配列同一性を有するＰｓｍ、ＺＰ１７３、およびＺＰ２７８の中の当該ライシン（親ライシン）の誘導体である。
【００１５】
別の実施形態において、前記少なくとも１つのエンドライシンのうちの少なくとも１つは、Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼ活性を有するライシンであり、またはＮ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼ活性を有するライシンを含む。このようなライシンは、配列番号４のアミノ酸を含むもしくは配列番号４のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するＣＰ２５Ｌ、配列番号５のアミノ酸を含むもしくは配列番号５のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するＰｌｙＣＰ２６Ｆ、および配列番号６のアミノ酸を含むもしくは配列番号６のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するＰｌｙＣＰ３９Ｏ、またはこれらのライシンのいずれかの誘導体から選択されてもよい。これらのライシンの誘導体は、その由来元であるエンドライシンの少なくとも３３％の溶菌活性を有していてよい。誘導体は、この誘導体と最も高い配列同一性を有するＣＰ２５Ｌ、ＰｌｙＣＰ２６Ｆ、およびＰｌｙＣＰ３９Ｏの中の当該ライシン（親ライシン）の誘導体である。
上記に示した配列番号のアミノ酸配列からなるアミノ酸配列を有するＰｓｍ、ＺＰ１７３、およびＺＰ２７８、ＣＰ２５Ｌ、ＰｌｙＣＰ２６Ｆ、およびＰｌｙＣＰ３９Ｏは、本明細書において、親ライシンとも呼ばれる。
【００１６】
（親）ライシンの誘導体は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、または配列番号６のいずれか１つのアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも９７％の配列同一性を有していてもよく、または前記誘導体は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、または配列番号６のいずれか１つのアミノ酸配列と比較して、１〜３０個の、好ましくは１〜２０個の、より好ましくは１〜１５個の、さらにより好ましくは１〜１０個のアミノ酸置換、挿入、および／または欠失を有していてもよい。
【００１７】
したがって、誘導体ライシンのアミノ酸配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、または配列番号６のいずれか１つのアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも９７％の配列同一性を有していてもよく、または誘導体のアミノ酸配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、または配列番号６のいずれか１つのアミノ酸配列と比較して、１〜３０個の、好ましくは１〜２０個の、より好ましくは１〜１５個の、さらにより好ましくは１〜１０個のアミノ酸置換、挿入、および／もしくは欠失を有していてもよい。親ライシンの誘導体もまた、本発明の意味において、ライシンである。
【００１８】
Ｐｓｍ、ＺＰ１７３、およびＺＰ２７８の誘導体の中で、一部のアミノ酸残基は、ライシンの機能性に関連しまたは有用であり、親ライシンと比較して変えるべきではない。代わりに、好ましい実施形態において、対応するアミノ酸残基は、
配列番号１の残基１０は、Ｌｙｓである、
配列番号１の残基１１は、Ｇｌｙである；
配列番号１の残基１２は、Ｉｌｅである；
配列番号１の残基１３は、Ａｓｐである；
配列番号１の残基２１は、ＩｌｅまたはＬｅｕである；
配列番号１の残基２７は、Ｌｙｓである；
配列番号１の残基４１は、Ｇｌｙである；
配列番号１の残基４６は、Ａｓｐである；
配列番号１の残基５２は、Ａｓｎである；
配列番号１の残基６３は、Ｖａｌである；
配列番号１の残基６４は、Ｇｌｙである；
配列番号１の残基６６は、Ｔｙｒである；
配列番号１の残基７９は、Ａｌａである；
配列番号１の残基８６は、ＬｅｕまたはＩｌｅである；
配列番号１の残基１００は、Ｌｅｕ、ＶａｌまたはＩｌｅである；
配列番号１の残基１０１は、ＡｓｐまたはＧｌｕである；
配列番号１の残基１２３は、ＡｓｐまたはＧｌｕである；
配列番号１の残基１２６は、Ａｒｇである；
配列番号１の残基１２９は、Ｇｌｙである；
配列番号１の残基１３５は、Ｔｙｒである；
配列番号１の残基１４３は、Ａｓｎである；
配列番号１の残基１４９は、ＬｅｕまたはＩｌｅである；
配列番号１の残基１５２は、Ｔｙｒである；
配列番号１の残基１５５は、Ｔｒｐである；
配列番号１の残基１５９は、Ｔｙｒである；
配列番号１の残基１６９は、Ｉｌｅである；
配列番号１の残基１７０は、Ｔｒｐである；
配列番号１の残基１７７は、Ｇｌｎである；
配列番号１の残基１７８は、Ｔｙｒである；
配列番号１の残基１７９は、Ｓｅｒである；
配列番号１の残基１８０は、Ｇｌｕである；
配列番号１の残基１８１は、Ａｓｎである；
配列番号１の残基１８２は、Ｇｌｙである；
配列番号１の残基１８９は、Ｇｌｙである；
配列番号１の残基１９２は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、またはＡｓｎ、好ましくはＡｓｐである；
配列番号１の残基１９８は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、またはＡｓｎ、好ましくはＧｌｕである；
配列番号１の残基２１３は、Ｔｈｒである；
配列番号１の残基２２１は、Ｌｅｕである；
配列番号１の残基２２４は、Ａｒｇである；
配列番号１の残基２３５は、Ｇｌｙである；
配列番号１の残基２３７は、Ｉｌｅである；
配列番号１の残基２４０は、Ｇｌｙである；
配列番号１の残基２５１は、Ａｓｐである；
配列番号１の残基２６０は、Ｔｙｒである；
配列番号１の残基２７０は、Ａｓｐである；
配列番号１の残基２８２は、Ａｓｎである；
配列番号１の残基２８３は、Ｖａｌである；
配列番号１の残基２８７は、Ｌｅｕである；
配列番号１の残基２９０は、Ａｒｇである；
配列番号１の残基２９２は、Ｇｌｕである；
配列番号１の残基２９７は、Ｓｅｒである；および／または
配列番号１の残基３０６は、Ｇｌｙである。
【００１９】
ＣＰ２５Ｌ、ＰｌｙＣＰ２６Ｆ、およびＰｌｙＣＰ３９Ｏの誘導体の中で、一部のアミノ酸残基は、ライシンの機能性に関連する場合があり、したがって、親ライシンと比較して変えるべきではない。代わりに、好ましい実施形態において、対応するアミノ酸残基は、
配列番号４の残基１２は、Ｇｌｙである；
配列番号４の残基４５は、Ｇｌｙである；
配列番号４の残基７１は、Ｇｌｙである；
配列番号４の残基７２は、Ａｌａである；
配列番号４の残基１２１は、Ｇｌｙである；
配列番号４の残基１４９は、Ｇｌｙである；
配列番号４の残基１８８は、Ａｓｎである；
配列番号４の残基１８９は、Ａｒｇである；
配列番号４の残基２０９は、Ｉｌｅ、ＬｅｕまたはＶａｌである；
配列番号４の残基２２６は、Ｉｌｅ、ＬｅｕまたはＶａｌである；
配列番号４の残基２６７は、Ａｌａである；
配列番号４の残基２７３は、Ｐｒｏである；
配列番号４の残基２８２は、Ａｒｇである；
配列番号４の残基２８３は、Ｖａｌである；
配列番号４の残基２８７は、Ａｒｇである；
配列番号４の残基３１１は、ＧｌｕまたはＡｓｐ、好ましくはＧｌｕである；
配列番号４の残基３１２は、Ｌｙｓである；
配列番号４の残基３１７は、Ｉｌｅ、ＬｅｕまたはＶａｌである；
配列番号４の残基３２３は、Ｔｙｒである；および／または
配列番号４の残基３３０は、Ｉｌｅ、ＬｅｕまたはＶａｌ、好ましくはＩｌｅである。
【００２０】
配列番号ｙの残基ｙ１に対応するアミノ酸配列ｘ中のアミノ酸残基ｘ１とは、アミノ酸配列ｘと配列番号ｙとが、配列番号ｙの全長にわたって最高度の配列同一性となるよう整列され、配列番号ｙのアミノ酸残基ｙ１に対応する残基ｘ１が、残基ｙ１と整列される当該残基であることを意味する。
【００２１】
本明細書において、アミノ酸配列同一性の決定は、Ａｌｉｇｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴＰ  ２．６．１＋）を使用して行われる（Stephen F. Altschul, Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402.）。
【００２２】
親ライシンの誘導体は、例えば、例えば６つ以上のヒスチジン残基が近接するＨｉｓタグのような精製タグなどの、付加されたＮ末端またはＣ末端のアミノ酸配列の伸長を含んでいてもよい。一実施形態において、誘導体は、好ましくは、Ｎ末端のアミノ酸残基の付加を有さない。
【００２３】
本発明によるライシンまたはそれらの誘導体は、標準的な発現系におけるタンパク質発現の既知の方法によって生産してもよい。ライシンまたは誘導体を生産するために、それをコードするヌクレオチド配列を好適な宿主生物中で発現させてもよい。目的のタンパク質の生産および精製に使用可能な方法は、従来技術において既述されており、任意のこのような方法を使用してもよい。例えば、当技術分野で公知の大腸菌発現系を使用してもよい。真核発現系を使用する場合、１つまたは複数のイントロンを、ライシンをコードする配列中に挿入することができる。
【００２４】
特に効率的な発現方法は、従来技術においてやはり既知である植物発現系である。本発明によるライシンを発現するための植物発現系を、実施例に記述している。植物中で目的のヌクレオチド配列の発現を達成する可能な方法は、ライシンをコードするヌクレオチド配列を含有する自己複製（ウイルス）レプリコンの使用である。植物ウイルス発現系は、多くの公報、例えばＷＯ２０１２０１９６６０、ＷＯ２００８０２８６６１、ＷＯ２００６００３０１８、ＷＯ２００５０７１０９０、ＷＯ２００５０４９８３９、ＷＯ２００６０１２９０６、ＷＯ０２１０１００６、ＷＯ２００７１３７７８８、またはＷＯ０２０６８６６４に既述されており、さらに多くの公報が、これらの文書において引用されている。一過的発現ために、ＤＮＡ分子などの核酸分子を植物または植物部分へ導入する様々な方法が既知である。アグロバクテリアを、例えばアグロインフィルトレーション、またはアグロバクテリア懸濁液を吹き付けることによって、植物体を核酸分子（ベクター）または核酸構築物でトランスフェクトするために使用してもよい。参考文献として、ＷＯ２０１２０１９６６０、ＷＯ２０１４１８７５７１、またはＷＯ２０１３１４９７２６を参照されたい。
【００２５】
目的のタンパク質としてライシンの強力な発現が望まれる実施形態において、ライシンをコードするヌクレオチド配列を含有する核酸構築物は、植物細胞中で複製してウイルスベクターのレプリコンを形成することができるウイルスベクターをコードしていてもよい。複製し続けるために、ウイルスベクターおよびレプリコンは、植物細胞中に存在する核酸ポリメラーゼによって、例えばレプリコンから発現されたウイルスのポリメラーゼによって認識されることが可能な複製開始点を含有していてもよい。ＲＮＡウイルスベクター（「ＲＮＡレプリコン」と呼ぶ）の場合、レプリコンは、ＤＮＡ構築物が植物細胞核中へ導入された後に、ＤＮＡ構築物から、植物細胞中での有効なプロモーターの調節下で転写されて形成されてもよい。ＤＮＡレプリコンの場合、レプリコンは、例えばＷＯ００／１７３６５およびＷＯ９９／２２００３に記載されているように、ＤＮＡ構築物の中で、ウイルスレプリコンをコードする配列に隣接する２つの組換え部位の間の組換えによって形成されてもよい。レプリコンがＤＮＡ構築物によってコードされている場合、ＲＮＡレプリコンが好ましい。ＤＮＡおよびＲＮＡウイルスベクター（ＤＮＡまたはＲＮＡレプリコン）の使用は、長年にわたって文献に広く記載されている。幾つかの例としては、以下の特許公報がある：ＷＯ２００８０２８６６１、ＷＯ２００７１３７７８８、ＷＯ２００６００３０１８、ＷＯ２００５０７１０９０、ＷＯ２００５０４９８３９、ＷＯ０２０９７０８０、ＷＯ０２０８８３６９、ＷＯ０２０６８６６４。ＤＮＡウイルスベクターの例としては、ジェミニウイルスに基づくＤＮＡウイルスベクターがある。本発明のために、植物ＲＮＡウイルスに基づくウイルスベクターまたはレプリコン、とりわけ、プラスセンス一本鎖ＲＮＡウイルスに基づくウイルスベクターまたはレプリコンが使用されることが好ましい場合がある。したがって、ウイルスレプリコンは、プラスセンス一本鎖ＲＮＡレプリコンであってもよい。このようなウイルスベクーの例としては、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）およびジャガイモＸウイルス（ＰＶＸ）に基づくウイルスベクターがある。「に基づく」は、ウイルスベクターが、これらのウイルスの複製に関与するレプリカーゼおよび／またはその他のタンパク質などの複製系を使用することを意味する。ポルテクスウイルスベースのウイルスベクターおよび発現系は、欧州特許第２０６１８９０号またはＷＯ２００８／０２８６６１に記載されている。
【００２６】
ライシンは、多細胞植物またはそれらの一部、とりわけ、高等植物またはそれらの部分において発現させてもよい。単子葉および双子葉（作物）植物の両方を、使用することができる。目的のタンパク質を発現させるために使用可能な一般的な植物には、ニコチアナ・ベンサミアナ、ニコチアナ・タバカム、ホウレンソウ、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）、カラシナ（Ｂ．ｊｕｎｃｅａ）、ビート（サトウダイコン（（Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ））、クレソン、キバナスズシロ、マスタード、イチゴ、イチゴホウレンソウ（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ  ｃａｐｉｔａｔｕｍ）、レタス、ヒマワリ、キュウリ、ハクサイ、キャベツ、ニンジン、ネギ、タマネギ、ラディッシュ、レタス、フィールドピー、カリフラワー、ブロッコリー、ゴボウ、カブ、トマト、ナス、カボチャ、スイカ、プリンスメロン、およびメロンが含まれる。好ましい植物は、ホウレンソウ、フダンソウ、ビートの根、ニンジン、テンサイ、ニコチアナ・タバカム、およびニコチアナ・ベンサミアナである。食用植物中での発現は、植物またはそれから製造した食品のクロストリジウムによる汚染を予防するために用いてもよい。一実施形態において、植物は、Ｎ・タバカムおよびＮ．ベンサミアナなどのニコチアナ種など、ヒトまたは動物の食物連鎖に通常は入ってこない植物が使用される。
【００２７】
一般的に、目的のタンパク質としてのライシンは、植物体または植物部分の細胞の細胞質ゾルにおいて発現される。この場合、目的のタンパク質を特定のコンパートメントへと導くシグナルペプチドは、この酵素に付加されていない。別法として、目的のタンパク質は、植物の葉緑体中で発現させることができ、または植物の葉緑体中へ標的化させることができる。後者の場合、一般に、プラスチドトランジットペプチドまたは葉緑体ターゲティングペプチドと呼ばれるＮ末端のプレ配列が、目的のタンパク質としてのライシンのＮ末端またはＣ末端に、好ましくはＣ末端に付加される。
【００２８】
少なくとも１つのエンドライシンを含む組成物を生成するプロセスにおいて、ライシンを、最初のステップにおいて、食用植物などの植物または植物の細胞中で発現させる。次のステップにおいて、エンドライシンを発現している植物から、発現されたライシンを含有する植物材料を収穫する。植物材料は、例えば、葉、根、塊茎、もしくは種子、または葉、根、塊茎、もしくは種子の、破砕された、粉砕された、もしくは微粉砕された生成物であってもよい。ステップ（ｉｉｉ）において、水性バッファーを使用して、植物材料からライシンを抽出する。このステップには、植物材料をホモジナイズすることを含んでもよく、不溶性の物質を遠心分離またはろ過によって除去してもよい。ライシンを含む可溶性成分は水性バッファー中に抽出されて、水性バッファー中ライシン溶液が生成されることになる。水性バッファーは、無機酸もしくは有機酸またはそれらの塩を含有していてもよく、本発明の組成物としての水溶液のために、下記に定義されているようなｐＨを有してもよい。さらに水性バッファーは、本発明の組成物としての水溶液のために、やはり下記に定義されているような塩および／またはスルフヒドリル化合物を含有してもよい。比較的純粋なライシン組成物が望まれる場合、水性バッファー中ライシン溶液は、タンパク質精製の既知の方法に従って、ステップ（ｉｖ）において望ましくない成分を除去することによって、さらに精製されてもよい。
【００２９】
発明者らは、植物中で発現されたライシンをさらに精製する効率的な方法を見出している。このような精製の方法は、
（ａ）例えば、上記で定義したような水性バッファーを使用して、植物材料から発現されたライシンを抽出するステップ、
（ｂ）抽出物から不溶性材料を除去して、水性バッファー中ライシン溶液を得るステップ、この後、この溶液を濃縮してもよい、
（ｃ）水性バッファー中ライシン溶液を疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）にかけるステップ、この後、脱塩またはバッファー交換をしてもよい
を含んでもよい。
さらなる精製ステップとして、ステップ（ｃ）の後に、イオン交換クロマトグラフィーステップを用いてもよい。イオン交換クロマトグラフィーは、陽イオン交換クロマトグラフィーステップでも陰イオン交換クロマトグラフィーステップでもよい。ライシンＺＰ１７３、ＰｌｙＣＰ２６Ｆ、ＰｌｙＣＰ３９Ｏ、およびそれらの誘導体のためには、陽イオン交換クロマトグラフィーが好ましい。ライシンＺＰ２７８、ＣＰ２５Ｌ、およびｐｓｍ、ならびにそれらの誘導体のためには、陰イオン交換クロマトグラフィーが好ましい。
【００３０】
ライシンを食用植物中で発現させる場合、食用植物からのタンパク質粗抽出物または半精製濃縮物を、クロストリジウムによる食物などの対象物の汚染を予防するまたは低減するために使用してもよい。
本発明のライシンは、クロストリジウムによる食物などの対象物の汚染を予防するまたは低減するために用いてもよい。クロストリジウムによる対象物の汚染とは、対象物へのクロストリジウム生細胞またはそれらの芽胞の付着を意味する。クロストリジウムによる汚染を低減するとは、対象物に付着しているクロストリジウム生細胞の数を低減することを意味する。クロストリジウムによる対象物の汚染を判定することは、一般知識の一部である。例えば、実施例において行われているような、ホモジナイズした食品の溶液もしくは分散液の希釈液のプレーティング、または他の対象物のすすぎ液の希釈液のプレーティングを行い、その後、細菌コロニーを数えてもよい。
【００３１】
本発明の組成物は、植物材料またはその抽出物であってもよい。可能な植物材料は、上述の通りである。植物材料の抽出物は、前記植物材料に存在するまたは前記植物材料で発現される本発明のエンドライシンを含む水溶性タンパク質を含有する水溶液である。抽出物は、好ましくは、除去される植物材料の水不溶性成分を有する。抽出物は、植物材料を水または水溶液（例えば、次の段落で記述しているような、または実験セクションにおいて使用されている抽出バッファー）中でホモジナイズし、好ましくは、例えば遠心分離またはろ過により、植物材料から不溶性成分を除去することによって、植物材料から生成してもよい。得られた生成物は、タンパク質粗抽出物であり、なかんずくクロストリジウムに対して活性を有するライシンを含有する。下記にさらに記述するように抽出物を精製して、抽出物の総タンパク質含量における本発明で使用されるライシンの含量を高めてもよい。抽出物は濃縮してもよい。別法として、抽出物は乾燥してもよい。部分精製の後、生成物を、部分精製または半精製抽出物もしくは濃縮物とみなしてもよい。
【００３２】
組成物は、水性でもよい溶液であってもよく、１つまたは複数のライシンの他にバッファーを含有することがある溶液でもあってもよい。バッファーは、無機もしくは有機酸、またはそれらの塩であってもよい。無機酸の一例としては、リン酸またはそれらの塩がある。有機酸の例としては、ＨＥＰＥＳ、酢酸、コハク酸、酒石酸、リンゴ酸、安息香酸、ケイ皮酸、グリコール酸、乳酸、クエン酸、およびアスコルビン酸がある。好ましい有機酸は、リンゴ酸、乳酸、クエン酸、およびアスコルビン酸である。溶液のｐＨは、一般的に、４〜８、好ましくは５〜８、より好ましくは５．５〜７．５であってもよい。組成物が適用される対象物が食肉である場合、溶液のｐＨは、一般的に、４〜８、好ましくは４．５〜７、より好ましくは５．０〜６．５、さらにより好ましくは５．０〜６．０であってもよい。さらに、溶液は、グリセロールまたは塩化ナトリウムなどの等張剤を含有してもよい。使用されるべき好ましい塩は、塩化ナトリウムである。前記少なくとも１つのエンドライシンを含有する水溶液は、５０〜４００ｍＭのＮａＣｌ、好ましくは１４０〜３１０ｍＭのＮａＣｌを含有する緩衝化水溶液であってもよい。水溶液は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリスリトール、チオエタノール、またはグルタチオンなどのスルフヒドリル化合物、好ましくはＤＴＴを、さらに含有してもよい。水溶液中の全スルフヒドリル化合物の濃度は、１〜５０ｍＭ、好ましくは２〜２０ｍＭ、より好ましくは４〜１０ｍＭであってもよい。本発明の水溶液中の１つまたは複数のライシンの濃度は、０．００１〜１ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．０１〜０．５ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．０５〜０．５ｍｇ／ｍｌであってもよい。クロストリジウムに対して活性を有する複数のライシンが用いられる場合、これらの濃度は、クロストリジウムに対して活性を有するライシンすべての総濃度に関する。
【００３３】
別法として、本発明の組成物は、粉末などの固形物であってもよい。好ましくは、組成物は、前記少なくとも１つのライシンを含有する、凍結乾燥または乾燥粉末である。粉末は、水溶液について上記で触れたような追加の成分を含有してもよい。粉末は、使用前に、水または水溶液に、例えば溶解または懸濁されて、復元されてもよい。
【００３４】
本発明の組成物は、組成物におけるタンパク質の総質量に対して、少なくとも２０質量％の、好ましくは少なくとも３０質量％の、より好ましくは少なくとも５０質量％の、さらにより好ましくは少なくとも７５質量％の本発明のライシンを含有してもよい。組成物中のライシンの含量は、組成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、染色後、得られたゲルを分析することによって、ゲル上のバンドの強さを測定することによって決定してもよい。これによって、ライシンによるバンドの強さは、組成物中のすべてのタンパク質によるバンドの強さと比較して決定することができる。組成物中の全タンパク質含量は、周知のＢｉｏｒａｄタンパク質アッセイを使用して決定してもよい。
【００３５】
本発明の幾つかの好ましい実施形態および本発明において使用される組成物は、以下の通りである。
（ａ）組成物は、ＺＰ２７８もしくはそれらの誘導体、ＣＰ２５Ｌもしくはそれらの誘導体、Ｐｓｍもしくはそれらの誘導体、および／またはＺＰ１７３もしくはそれらの誘導体から選択される少なくとも１つのエンドライシンを含有し、それによって、Ｐｓｍまたはその誘導体、およびＺＰ１７３またはその誘導体は、代替的に存在してもよい；
（ｂ）組成物は、ＺＰ２７８またはそれらの誘導体を含有する；
（ｃ）組成物は、ＺＰ１７３またはそれらの誘導体を含有する；
（ｄ）組成物は、Ｐｓｍまたはそれらの誘導体を含有する；
（ｅ）組成物は、ＣＰ２５Ｌまたはそれらの誘導体を含有する；
（ｆ）組成物は、ＺＰ２７８またはそれらの誘導体およびＺＰ１７３またはそれらの誘導体を含有する；
（ｇ）組成物は、ＺＰ２７８またはそれらの誘導体およびＰｓｍまたはそれらの誘導体を含有する；
（ｈ）組成物は、ＺＰ２７８またはそれらの誘導体およびＺＰ１７３またはそれらの誘導体、ならびにＣＰ２５Ｌまたはそれらの誘導体を含有する；
（ｉ）組成物は、ＺＰ２７８またはそれらの誘導体およびＰｓｍまたはそれらの誘導体、ならびにＣＰ２５Ｌまたはそれらの誘導体を含有する；
（ｊ）組成物は、１５０〜７００ｍＭのＮａＣｌ、好ましくは２００〜５５０ｍＭのＮａＣｌを含有する緩衝化水溶液であり、組成物は、上記の項目（ａ）から（ｉ）のいずれか１項に規定された通りである；
（ｋ）処理されるべき対象物は食品であり、組成物は、上記の項目（ａ）から（ｉ）のいずれか１項に規定された通りである；
（ｌ）処理されるべき対象物は、食肉であり、組成物は、上記の項目（ａ）から（ｊ）のいずれか１項に規定された通りであり、好ましくは、組成物は、４〜８のｐＨの水溶液、好ましくは４．５〜７のｐＨの水溶液、より好ましくは５．０〜６．５のｐＨの水溶液、さらにより好ましくは５．０〜６のｐＨの水溶液である。
【００３６】
これらの実施形態において、ライシンの誘導体についての言及は、上記の規定の通りである。本明細書において開示された他の実施形態は、例えばエンドライシンの濃度またはエンドライシンの組合せに関して、上記の規定の通りであってもよい。
クロストリジウムによる対象物の汚染を予防するまたは低減するために、対象物の表面を、例えば上述のような濃度の、本発明の１つまたは複数のライシンを含有する溶液で濡らしてもよい。例えば、食品などの対象物を、本発明の１つまたは複数のライシンの溶液中に浸しても、本発明の１つまたは複数のライシンの溶液を吹き付けてもよい。濡らした後、濡らした対象物を、さらに処理してもよく、またはそのままにして乾燥させてもよい。食品の場合、濡らした食品は、薄切りにするまたは挽くなどさらに加工されてもよく、かつ／または顧客への輸送用に梱包されても、食するために調理されてもよい。
【００３７】
クロストリジウムによる食品の汚染を予防するまたは低減するために、本発明の組成物は、食品加工助剤として用いられてもよい。この目的のために、本発明の組成物を、食品へ添加したまたは食品と混合した後、あるいはその両方を行った後、さらに食品を加工されてもよい。
ライシンがクロストリジウムによる動物またはヒトの感染を予防するまたは治療するために使用される場合は、ライシンは動物またはヒトに投与される。動物の例としては、家禽およびウシなどの家畜である。一般に、動物またはヒトへの投与のために、ライシンを含有する液体または固体医薬組成物が調製される。液体組成物は、上述のような水溶液であってもよい。固体組成物は、少なくとも１つのライシンを含有する、例えば凍結乾燥形態の粉末、またはこのような粉末から得られた錠剤であってもよい。投与は、経口であってもよい。この場合、医薬調製物は、胃の中の酸性媒体による作用を受けることなく胃を通過できる医薬調製物である。ライシンは、次いで、腸の中で医薬調製物から放出される必要がある。このような医薬調製物は、当技術分野で既知である。例としては、胃の中の酸性媒体に耐性のある錠剤およびカプセル剤である。発現されたライシンを含有する大腸菌または植物材料などの生物学的材料を患者へ経口的に投与することが、さらに可能である。ライシンは、１日当たり１ｍｇ〜１０００ｍｇの量でヒト成人へ、好ましくは１日当たり１０ｍｇ〜２５０ｍｇの量でヒト患者へ投与されてもよい。このような量を、また動物へ投与してもよい。
【００３８】
プロバイオティックな手法において、少なくとも１つのライシンを発現する遺伝子改変された微生物を患者へ投与することによって、患者を治療してもよい。遺伝子改変された微生物は、遺伝子改変された非病原性大腸菌、または一般に乳製品の発酵で用いられるような乳酸産生微生物であってもよい。乳酸産生微生物の例としては、ラクトバチルス・ラクチスなどのラクトバチルス属、およびビフィドバクテリウム・ビフィドゥムまたはビフィドバクテリウム・ブレベなどのビフィドバクテリウム属由来の細菌がある。
別の投与経路としては、クロストリジウムによる感染を予防するための、患者の血流中への注入がある。この目的のために、ライシンを生理食塩水中に溶解してもよく、溶液は滅菌する。
【実施例】
【００３９】
（材料および方法）
（細菌株および増殖条件）
本研究において使用したＡ．ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）菌株は、表１に列記する。大腸菌株ＤＨ５αは、すべてのクローニング手順の受容体として使用した。大腸菌およびＡ．ツメファシエンス細胞は、いずれもＬＢ培地中で、それぞれ３７℃または３０℃で増殖させた。培地はすべて、必要に応じて、１００μｇ／ｍＬアンピシリン、５０μｇ／ｍＬスペクチノマイシン、５０μｇ／ｍＬカナマイシン、および２５μｇ／ｍＬリファンピシンを補充した。クロストリジウム・パーフリンジェンスは、ＡｎａｅｒｏＧｅｎガス発生システム（Ｏｘｏｉｄ）を使用して、嫌気性条件で、ＴＳＢ培地（トリプティックソイブロス）中で、３７℃で増殖させた。本研究で使用したＣ．パーフリンジェンス菌株を、表２に列記する。
【００４０】
【表１】
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【００４１】
【表２】
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2020513847.tif 000004
2020513847.tif 000005
【００４２】
（発現ベクターの構築）
植物中で発現させるエンドライシンを、表３に記載する。植物に最適化させた遺伝子をコードする配列は、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ、Ａｕｓｔｒｉａ（ｐｓｍ、ＰｌｙＣＰ２６Ｆ、ＰｌｙＣＰ３９Ｏ）およびＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、ＵＳＡ（ＣＰ２５Ｌ、ＺＰ１７３、ＺＰ２７８）によって合成した。
【００４３】
【表３】
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【００４４】
配列は、ＢｓａＩ−ＢｓａＩ断片として、ｐＩＣＨ３１０７０ΔｌａｃＺプラスミド（タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）システム３‘プロベクターを分解したＭａｇｎＩＣＯＮ（Marillonnet et al., 2004）の中、ならびに（ＴＭＶベースＭａｇｎＩＣＯＮベクター（Marillonnet et al., 2005）を連結させた）ｐＩＣＨ２９９１２（細胞質ゾル発現用）およびｐＩＣＨ２６２０１（葉緑体での発現用）の中へ挿入した。得られたプラスミドを使用して、Ａ．ツメファシエンスＧＶ３１０１を形質転換した。ストレプトマイセスファージＣ３１インテグラーゼの発現カセットを備えたｐＩＣＨ１４０１を含有するＡ．ツメファシエンス菌株を、５’および３’プロベクターによるコインフィルトレーションに使用した。
得られた３’プロベクターｐＮＭＤＶ５０３（ＰｌｙＣＰ２６Ｆ）およびｐＮＭＤＶ５１６（ＰｌｙＣＰ３９Ｏ）のＴ−ＤＮＡ領域、ならびに連結ベクターｐＮＭＤＶ５０９（細胞質ゾルｐｓｍ）、ｐＮＭＤＶ６００（細胞質ゾルＺＰ１７３）、ｐＮＭＤＶ６０１（細胞質ゾルＺＰ２７８）、ｐＮＭＤＶ５９９（細胞質ゾルＣＰ２５Ｌ）、ｐＮＭＤＶ５０８（葉緑体ｐｓｍ）、ｐＮＭＤＶ６０３（葉緑体ＺＰ＿０２６４０１７３）、ｐＮＭＤＶ６０４（葉緑体ＺＰ２７８）、ｐＮＭＤＶ６０２（葉緑体ＣＰ２５Ｌ）のＴ−ＤＮＡ領域を、図１に示す。Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃからの制限酵素および修飾酵素を、すべてのクローニングステップに使用した。
【００４５】
（例１）
植物におけるライシン発現
Ｎ．ベンサミアナおよびホウレンソウ植物体は、１６時間の明期および８時間の暗期の光周期で、２５℃で、育成チャンバー内で生育させた。４〜６週齢の植物体を、組換えＡ．ツメファシエンスによるインフィルトレーションおよび吹き付けに使用した。
Ａ．ツメファシエンスは、５０ｍｇ／ｌリファンピシンおよびプラスミドの種類に応じたその他の適切な抗生物質（インテグラーゼ、ＴＭＶ３’プロベクター、およびＴＭＶ連結ベクターの選択には５０ｍｇ／ｌカナマイシン；５’ＴＭＶプロベクターの選択には５０ｍｇ／ｌカルベニシリン）を含有するＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地中で、３０℃で、一晩増殖させた。アグロバクテリウムを一晩培養した培養液を、１．５のＯＤ600に調整し、３２２０×ｇで５分間、沈殿させ、同量の水道水に再懸濁した。
【００４６】
（Ｎ．ベンサミアナの葉のシリンジインフィルトレーション）
植物アグロインフィルトレーションは、既述のように実施した（Starkevic at al., 2015）。５’プロベクター、３’プロベクター、およびインテグラーゼプラスミド構築物を含有する、３つのＡ．ツメファシエンス菌株の混合物を、針のないシリンジを使用して、葉の背軸側へインフィルトレートさせた。細胞質ゾル標的化用（ｐＩＣＨ２０１１１）および葉緑体標的化用（ｐＩＣＨ２００３０）のＭａｇｎＩＣＯＮ  ５’プロベクターモジュール、ならびにインテグラーゼ発現ベクターｐＩＣＨ１４０１１は、３’モジュールｐＮＭＤＶ５０３およびｐＮＭＤＶ５１６と一緒に使用した。５’および３’プロベクターモジュールを含有する菌株は１：１００の希釈で、インテグラーゼカセット含有菌株は１：４０の希釈で使用した。植物の葉を観察し、インフィルトレーションの５〜６日後に収集した。ｐＩＣＨ２０１１１（細胞質ゾル発現用の５’プロベクター）、ｐＩＣＨ２００３０（葉緑体発現用の５’プロベクター）、およびｐＩＣＨ１４０１１（インテグラーゼ）構築物は、Kalthoff et al. (2010)に記載されている。
【００４７】
（植物の葉の吹き付け）
連結ベクターを使用した、Ｎ．ベンサミアナおよびホウレンソウ中でのライシン発現のために、Hahn et al. (2014)に記載されているように、連結ベクターを含有するＡ．ツメファシエンス菌株の１：１０００希釈液を植物の葉に吹き付けた。吹き付けは、０．１％（体積／体積）Ｓｉｌｗｅｔ  Ｌ７７（Ｋｕｒｔ  Ｏｂｅｒｍｅｉｅｒ）を含有する水道水に希釈した細菌を用いて実施した。植物の葉を観察し、吹き付けの６〜１０日後に収集した。
【００４８】
（例２）
溶菌活性試験のためのタンパク質粗抽出物の調製
凍結した植物材料を、冷やした乳鉢および乳棒を用いてホモジナイズし、バッファー５ｍｌに対して組織１ｇの比で、抽出バッファー（５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、５ｍＭのＤＴＴ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５と混合した。細胞破片は、４℃で、３２２０ｇで６０分間の遠心分離によって除去した。上清をろ過し、総可溶性タンパク質として得た。
【００４９】
（ライシンの精製）
ライシンの精製は、試料のホモジナイゼーション、清澄化、ＨＩＣクロマトグラフィー、続いて脱塩、およびＣＥＸＣまたはＡＥＸＣカラムという、一般的なスキームに従った（図２）。
ＺＰ１７３．  ５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、２ｍＭのＤＴＴ、０．１％Ｔｗｅｅｎ８０（ｐＨ７．０）を含有するバッファーで抽出したホモジナイズした植物材料を、清澄化し、ブチルセファロースＦＦカラムに載せる。カラムを、５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、２ｍＭのＤＴＴ、１．１Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4、ｐＨ７．０で、１３５〜１４５ｍＳ／ｃｍで洗浄する。ライシンを、５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、２ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ７．０を含有する溶出バッファーの３０％での段階的勾配によって溶出する。濃縮／希釈手順（導電率＜７ｍｓ／ｃｍ）によるバッファー交換後、調製物をＳＰセファロースＦＦカラムに載せる。カラムを、５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、２ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ５．０で洗浄し、５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、２ｍＭのＤＴＴ、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．０の直線勾配（０〜１００％）によって溶出する（図２Ａ）。
【００５０】
ＺＰ２７８．  ５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、５ｍＭのＤＴＴ、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．５）を含有するバッファーで抽出したホモジナイズした植物材料を、清澄化し、ブチルセファロースＦＦカラムに載せる。カラムは、ｐＨ６．５の５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、５ｍＭのＤＴＴ、１．２Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4で、１４５〜１５５ｍＳ／ｃｍで洗浄する。ライシンを、ｐＨ６．５の５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、５ｍＭのＤＴＴを含有する溶出バッファーの３５％での段階的勾配によって溶出する。濃縮／希釈手順（導電率＜７ｍＳ／ｃｍ）によるバッファー交換後、調製物をＤＥＡＥセファロースＦＦカラムに載せる。カラムを、５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、５ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ７．０で洗浄し、溶出バッファー（５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、５ｍＭのＤＴＴ、２５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０（５．５〜６．５ｍＳ／ｃｍ））の直線勾配（０〜１００％）によって溶出する（図２Ａ）。
【００５１】
ＣＰ２５Ｌ．  ５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、２ｍＭのＤＴＴ、１００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．５）を含有するバッファーで抽出したホモジナイズした植物材料を、清澄化し、ブチルセファロースＦＦカラムに載せる。カラムは、５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、２ｍＭのＤＴＴ、０．８５Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4、ｐＨ６．５で、１０８〜１１２ｍＳ／ｃｍで洗浄する。ライシンを、ｐＨ６．５の５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、２ｍＭのＤＴＴを含有する溶出バッファーの２０％での段階的勾配によって溶出する。濃縮／希釈手順（導電率＜５ｍＳ／ｃｍ）によるバッファー交換後、調製物をＱセファロースＦＦカラムに載せる。カラムは、２０ｍＭｎのＮａＨ2ＰＯ4、２ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ８．０で洗浄し、溶出バッファー（２０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、２ｍＭのＤＴＴ、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０）の直線勾配（０〜２５％）によって溶出する（図２Ａ）。
【００５２】
ＰｌｙＣＰ２６Ｆ．  ５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、５ｍＭのＤＴＴ、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．５）を含有するバッファーで抽出したホモジナイズした植物材料を、清澄化し、ブチルセファロースＦＦカラムに載せる。カラムを、５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、５ｍＭのＤＴＴ、１．２Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4（ｐＨ７．０）で、１４５〜１５０ｍＳ／ｃｍで洗浄する。ライシンを、５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、５ｍＭのＤＴＴ（ｐＨ７．０）を含有する溶出バッファーの３０％での段階的勾配によって溶出する。濃縮／希釈手順（導電率＜８ｍＳ／ｃｍ）によるバッファー交換後、調製物をＳＰセファロースＦＦカラムに載せる。カラムは、５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、５ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ６．０（８〜９ｍＳ／ｃｍ）で洗浄し、溶出バッファー（５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、５ｍＭのＤＴＴ、１．０ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０）の２０％での段階的勾配によって溶出する（図２Ｂ）。
【００５３】
ＰｌｙＣＰ３９Ｏ．  ５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、５ｍＭのＤＴＴ、２００ｍＭのＮａＣｌ、（ｐＨ７．５）を含有するバッファーで抽出したホモジナイズした植物材料を、清澄化し、ブチルセファロースＦＦカラムに載せる。カラムを、５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、５ｍＭのＤＴＴ、１．２Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4、ｐＨ７．０で、１４５〜１５０ｍＳ／ｃｍで洗浄する。ライシンを、ｐＨ７．０の５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、５ｍＭのＤＴＴを含有する溶出バッファーの３５％での段階的勾配によって溶出する。濃縮／希釈手順（導電率＜１６ｍＳ／ｃｍ）によるバッファー交換後、調製物をＳＰセファロースＦＦカラムに載せる。カラムを、５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、５ｍＭのＤＴＴ、１２０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０（１５〜１６ｍＳ／ｃｍ）で洗浄し、溶出バッファー（５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、５ｍＭのＤＴＴ、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０）の直線勾配（０〜１００％）によって溶出する（図２Ｂ）。
【００５４】
Ｐｓｍ．  ５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、１５０ｍＭのＮａＣｌ、（ｐＨ５．０）を含有するバッファーで抽出したホモジナイズした植物材料を、清澄化し、ブチルセファロースＦＦカラムに載せる。カラムを、５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、２ｍＭのＤＴＴ、１．２Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4、ｐＨ６．０で、１４０〜１５０ｍＳ／ｃｍで洗浄する。ライシンを、ｐＨ６．０の５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、２ｍＭのＤＴＴを含有する溶出バッファーの３５％での段階的勾配によって溶出する。濃縮／希釈手順（導電率＜６〜７ｍＳ／ｃｍ）によるバッファー交換後、調製物をＱセファロースＦＦカラムに載せる。カラムを、５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、２ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ８．０（６〜７ｍＳ／ｃｍ）で洗浄し、溶出バッファー（５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、２ｍＭのＤＴＴ、２５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０）の直線勾配（０〜１００％）によって溶出する（図２Ｂ）。
【００５５】
（例３）
溶菌活性試験
（濁度低下アッセイおよびｃｆｕ計数）
タンパク質粗抽出物または精製したライシンを、溶菌活性試験で使用した。Ｃ．パーフリンジェンスは、嫌気性条件下で、ＴＳＢ中でＯＤ600約０．７まで増殖させ、遠心分離によって沈殿させ、選択したバッファーに再懸濁した。細菌懸濁液９５０〜９９９μＬを、精製ライシンまたはタンパク質粗抽出物１〜５０μＬと混合し、ＲＴ（室温）でインキュベートした。ＯＤ600測定値は、５〜１０分毎に、分光光度計（Ｇｅｎｅｓｙｓ２０、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって得た。実験は３回同じ方法で実施した。
細菌と植物抽出物との６０分の共インキュベーションの後、ｃｆｕ計数のための段階希釈をｐＨ７．３の１×ＰＢＳで行った。非希釈、１０、１０２、１０３、１０４、および１０５倍に希釈した各試料３０μＬを、ＴＳＡプレート上にプレーティングした。嫌気性条件下で、３７℃で一晩インキュベートした後、ＣＦＵを数えた。
【００５６】
ライシン誘導体が、親ライシンの少なくとも３３％の溶菌活性を有するかどうか判定するために、次の手順を用いる：Ｃ．パーフリンジェンス菌株ＮＣＴＣ８２３７を、嫌気性条件下で、ＴＳＢ中でＯＤ600約０．７まで増殖させ、遠心分離によって沈殿させ、ｐＨ７．３の１×ＰＢＳバッファーに再懸濁する。細菌懸濁液９５０〜９９９μＬに、同じタンパク質濃度の精製した親および誘導体ライシンを１〜５０μＬ等量混合する。細菌とライシンまたはその誘導体との６０分の共インキュベーションの後、ｃｆｕ計数のための段階希釈を、ｐＨ７．３の１×ＰＢＳで行う。非希釈、ｐＨ７．３の１×ＰＢＳバッファーで１０、１０、１０3、１０4、および１０5倍に希釈した各試料３０μＬを、ＴＳＡプレート上にプレーティングする。嫌気性条件下で、３７℃で一晩インキュベートした後、ＣＦＵを数えた。好適な希釈では、親ライシンが存在する場合と比較して誘導体ライシンの存在下で最大３倍のコロニーが形成されれば、誘導体ライシンは、親ライシンの少なくとも３３％の溶菌活性を有すると考えられる。
【００５７】
（例４）
加熱調理された肉におけるライシン粗抽出物の溶菌活性試験
タンパク質粗抽出物は、６ｄｐｉでアグロインフィルトレーションしたＮ．ベンサミアナ植物を収穫して、５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、３００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ５．０）を含有するバッファーを使用して調製した。タンパク質抽出物は、約０．４４〜０．６６μｇ／μＬの濃度に希釈した。Ｃ．パーフリンジェンスＮＣＴＣ８２３７菌株は、嫌気性条件下で、ＴＳＢ中でＯＤ600＝０．２４〜０．２６まで増殖させた。七面鳥胸肉および牛塊肉は、地元の市場から購入した。ぶつ切りにした七面鳥肉は、圧力鍋で３０分間、ぶつ切りにした牛肉は６０分間、加熱調理した。
【００５８】
細菌１００μＬ、およびタンパク質抽出物または精製タンパク質５０〜７００μＬを、加熱調理された肉１０ｇに加え、十分にヴォルテックスした。すべての試料の量を等しくするために、ｐＨ７．３の１×ＰＢＳを肉／細菌試料に１ｍｌに達するまで加えた。試料をすべて６穴マルチウェルプレートの中に入れ、嫌気性条件下で、室温でインキュベートした。
被分析試料の段階希釈は、ｐＨ７．３の１×ＰＢＳで行い、非希釈、１０、１０2、１０3、１０4、および１０5倍の各試料３０μＬを、ＴＳＡプレート上にプレーティングした。嫌気性条件下で、３７℃で一晩インキュベートした後、細菌ｃｆｕ／ｍＬを数えた。
【００５９】
（結果および考察）
（ＺＰ１７３およびＺＰ２７８配列の解析）
ＺＰ＿０２６４０１７３（ＷＰ＿００３４６９３５９）およびＺＰ＿０２６４０２７８（ＷＰ＿００３４６９４４５）（以降、本文および図面中で、それぞれ「ＺＰ１７３」および「ＺＰ２７８」と呼ぶ）のアミノ酸配列のＢｌａｓｔ解析から、両タンパク質においてＧＨ２５ドメインが明らかとなった。いずれのタンパク質も、ＧｅｎＢａｎｋでは細菌細胞壁ヒドロラーゼとして注釈がつけられているが、クロストリジウム・パーフリンジェンスＦ４９６９ゲノム（コンティグＮＺ＿ＡＢＤＸ０１００００２３．１およびＮＺ＿ＡＢＤＸ０１００００２４．１）の詳しい調査からは、ＺＰ１７３およびＺＰ２７８いずれの近傍にも幾つかのファージ遺伝子が存在することがわかる。ＺＰ１７３の右側には、クロストリジウムファージｐｈｉＳＭ１０１のＤＮＡアデニン特異的メチルトランスフェラーゼに近似のＤＮＡアデニン特異的メチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子がある。クロストリジウムファージｐｈｉＳ６３のｇｐ１７に相同のタンパク質、ファージのマイナー構造タンパク質、ファージｔａｉｌ  ｔａｐｅ  ｍｅａｓｕｒｅタンパク質もまた近くに位置する。ＺＰ２７８はまた、ファージ様タンパク質：ファージのマイナー構造タンパク質、ｔａｉｌ  ｔａｐｅ  ｍｅａｓｕｒｅタンパク質、キャプシドタンパク質の近傍に位置する。おそらく、ＺＰ１７３およびＺＰ２７８はいずれも、Ｃ．パーフリンジェンスＦ４９６９ゲノムに取り込まれたプロファージ領域の残遺物中に局在化しており、バクテリオファージ溶菌酵素ファミリーに属する。
【００６０】
ＺＰ１７３と他の記載のＣ．パーフリンジェンスライシンとの配列アラインメントから、ｐｓｍ（およびそのごく近縁のＰｌｙＣＭ）に対する相同性が最も高く、そのカルボキシ末端で同一性の割合が最も高かったが（１７７〜３３５アミノ酸、６４．６％の同一性）、Ｎ末端（１〜１７６アミノ酸）は、ｐｓｍのアミノ末端断片に対して２９．７％のみ同一であることが実証された。ＺＰ２７８と他の記載のＣ．パーフリンジェンスライシンとの配列アラインメントからは、ｐｓｍに対する相同性（触媒ドメインを含むアミノ末端（１〜１７９アミノ酸同一性４７．２％）およびＰｌｙ３６２６に対する相同性（Ｃ末端断片（２１１〜３５１アミノ酸７４．５％の同一性））が、最も高いことが実証された。ＺＰ１７３およびＺＰ２７８と、その最も近い相同体であるＰｌｙＣＭ、ｐｓｍ、およびＰｌｙ３６２６とのアミノ酸配列アラインメントを、図３に示す。
【００６１】
（発現ベクターの構築）
ニコチアナ・ベンサミアナにおけるライシン発現の最適化のために、Marillonet et al. (2004)およびＥＰ１３８５９６８によって既述されている、ｍａｇｎＩＣＯＮプロベクターシステム（Ｉｃｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｈａｌｌｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した。細胞質ゾル発現および葉緑体標的化を運命づけた一連の５’ＴＭＶモジュール（図１Ａ）を使用して、組換えライシンの発現レベルを試験した。植物シリンジインフィルトレーション実験には、プロベクターモジュール（ｐＮＭＤＶ５０３およびｐＮＭＤＶ５１６）を使用した。植物吹き付け実験には、連結ベクター（ｐＮＭＤＶ５０９、ｐＮＭＤＶ５９９、ｐＮＭＤＶ６００、ｐＮＭＤＶ６０１、ｐＮＭＤＶ５０８、ｐＮＭＤＶ６０２、ｐＮＭＤＶ６０３、およびｐＮＭＤＶ６０４）を使用した（図１ＢおよびＣ）。
【００６２】
（植物におけるライシン発現）
３種のＡ．ツメファシエンス菌株（インテグラーゼ、５’プロベクターのどれか、および３’プロベクターのどれか）の組合せをインフィルトレートさせたまたは連結ベクターを有するＡ．ツメファシエンス菌株を吹き付けたＮ．ベンサミアナの葉を、インフィルトレーションの５〜１０日後に収穫し、タンパク質抽出を行った。Ｌａｅｍｍｌｉバッファーによる葉の抽出物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した（図４）。
細胞質ゾル構築物では、ｐｓｍおよびＺＰ１７３ライシンのクマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて、約３８〜３９ｋＤａの予想されたサイズの特異的バンドが検出された。葉緑体標的化ｐｓｍは、細胞質ゾル構築物と同レベルの泳動度であり、これは、シグナルペプチドが完全に切断されていることを示している。しかしながら、葉緑体標的化ＺＰ１７３は、より高い分子量タンパク質として泳動され、これは、葉緑体シグナルペプチドがほとんど切断されていないことを示している。理論的なＺＰ２７８の分子量は４０．２ｋＤａであるが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、このライシンは約２ｋＤａの差がある二重バンドとして泳動され、上方のバンドは理論的なサイズと一致していた。同様の傾向が、葉緑体のＺＰ２７８構築物について観察された（図４Ａ）。
【００６３】
細胞質ゾルで発現したＰｌｙＣＰ２６ＦおよびＰｌｙＣＰ３９Ｏは、予想通り２４．３ｋＤａタンパク質として泳動されたが、葉緑体構築物では、より高い分子量のタンパク質が得られ、ここでも葉緑体トランジットペプチドがほとんど切断されていないことが示されている。細胞質ゾルおよび葉緑体いずれのＣＰ２５Ｌ構築物も、約４３ｋＤａの予想されたサイズのタンパク質バンドが得られた。細胞質ゾル構築物が、Ｎ．ベンサミアナにおいて葉緑体構築物より全般に良好な成績であったため、さらなる実験のためには、細胞質ゾル構築物を選択した（図４Ｂ）。
次に、食用植物における組換えライシン発現レベルを決定した。若いホウレンソウ植物体に、連結したライシン発現ベクターを保有するＡ．ツメファシエンス菌株を吹き付けた。３つの被験ライシン（ｐｓｍ、ＺＰ１７３、およびＺＰ２７８）すべてを、ホウレンソウで発現させた。発現レベルは、葉緑体構築物を使用した場合が勝っていた。ＺＰ１７３は、葉緑体トランジットペプチドの切断は、ホウレンソウではタバコよりはるかに良好であったが、細胞質ゾルＺＰ１７３の発現は、きわめて弱いものであった（図４Ｃ）。
【００６４】
（インビトロにおけるＣ．パーフリンジェンスに対するライシン活性の試験）
Ｃ．パーフリンジェンスファージライシン、ｐｓｍ、ＺＰ１７３、ＺＰ２７８、ＣＰ２５Ｌ、ＰｌｙＣＰ２６Ｆ、およびＰｌｙＣＰ３９Ｏを発現した植物の粗抽出物を、まず、Ｃ．パーフリンジェンス基準株ＮＣＴＣ８２３７（ＡＴＣＣ１３１２４）と試験した（図５）。細菌懸濁液と植物の発現抽出物とのインキュベーションによって、（反応性の順に）ＺＰ１７３、ｐｓｍ、ＺＰ２７８、およびＣＰ２５Ｌの迅速なＯＤの低下がもたらされた。ＰｌｙＣＰ２６ＦおよびＰｌｙＣＰ３９Ｏもまた、細菌懸濁液を清澄化することができたが、よりゆっくりと、比較的低い程度で作用した（図５Ａ）。ライシン抽出物で１時間処理した細菌懸濁液のＣＦＵ数から、被験ライシンはすべて高活性であることが実証された。この実験では、ＣＰ２５Ｌ処理は、Ｃ．パーフリンジェンスｃｆｕ／ｍｌの数値を５．７ｌｏｇ10、ＺＰ１７３処理は４．８ｌｏｇ10低減させ、ｐｓｍ処理は、ｃｆｕ／ｍｌの数値を４ｌｏｇ10、ＰｌｙＣＰ２６Ｆ処理は３．１ｌｏｇ10、ＺＰ２７８処理は２．６ｌｏｇ10、ＰｌｙＣＰ３９Ｏ処理は２ｌｏｇ10低減させた（図５Ｂ）。
【００６５】
次に、同様の一連の実験において、ＺＰ１７３およびＺＰ２７８構築物をアグロスプレーしたホウレンソウの抽出物を試験した。タバコとの比較において、両ライシンは、相対的発現レベルは低かったにもかかわらず、両タンパク質のホウレンソウ抽出物は、３つの被験Ｃ．パーフリンジェンス菌株のすべてに対して有効であった（図６）。細胞質ゾル発現ＺＰ１７３構築物を吹き付けたホウレンソウの抽出物は、Ｃ．パーフリンジェンス菌株に応じて、コロニー形成単位数を１．５〜３．９対数単位、減少させた。葉緑体標的ＺＰ１７３は、ｃｆｕ／ｍｌ数を１．８〜３．６ｌｏｇ10、減少させた。ＺＰ１７３と比較して、細胞質ゾルおよび葉緑体標的化ＺＰ２７８は、いずれも発現のレベルは高かったにもかかわらず、２つの被験菌株に対するこのライシンの抗菌活性は、ＺＰ１７３抽出物の活性より弱かった。
【００６６】
（ライシンは、食品中で一般的にみられる塩分および酸性度条件において有効である）
クロストリジウム・パーフリンジェンスは、加熱調理された肉製品および仕出し食品の摂取による感染の最も一般的な原因である。食品添加物としてライシンをうまく使用するためには、ライシンは、食品中で通常みられるｐＨおよび塩分条件で有効である必要がある。ライシンを食品加工助剤として使用するつもりであれば、ライシンは、食品の調製に用いられる条件下で、それらの活性を発揮できる必要もある。様々な因子：ｐＨ、ＮａＣｌ濃度、温度が、精製したライシンの活性に及ぼす影響を評価した（図７）。
【００６７】
ＮａＣｌ．  調理済み肉製品は、通常、ある程度の量の塩を含有する。塩漬けまたは加熱調理された肉製品（ハム、ソーセージ）では、ＮａＣｌ濃度は、１５０〜３５０ｍＭと高い。５０ｍＭ〜５００ｍＭのＮａＣｌ濃度が植物で産生したライシンの活性に及ぼす影響を試験した（図７Ａ）。３つの被験ライシン、ＺＰ１７３、ＺＰ２７８、およびＣＰ２５Ｌすべての活性は、塩濃度の上昇によって正の影響を受けた。ＺＰ１７３の概ね最大の活性を得るためには、５０ｍＭの低いＮａＣｌで十分であったが、ＺＰ２７８およびＣＰ２５Ｌの活性は、５００ｍＭ（試験した最高濃度）のＮａＣｌに至るまで上昇した。これらの結果は、塩気のある食品環境がライシンの作用に非常によく適していることを実証している。一方、ＺＰ１７３は、ＮａＣｌを含まないバッファー中でも良好な活性を示し、ナトリウムが低い生肉の処理に使用することが可能である（生肉および生魚におけるＮａＣｌ濃度は１０ｍＭの範囲ではあるが、一部の海産物のＮａＣｌ濃度より数倍高い）。
【００６８】
ｐＨ．  ほとんどの肉ベースの食品は、部分的には天然に、部分的にはより良好な保存のために加工製品に有機酸が添加されているために、５．０〜７．０のｐＨ範囲の弱酸性である。ライシン活性を、４．５〜８．０のｐＨ範囲で試験した。ＺＰ１７３活性はｐＨ５．０で最も高く、酸性度がこれより低くなっても高くなっても低下したが、５．０〜８．０のｐＨ範囲では、その活性は高いままであった（図７Ｂ）。ＺＰ２７８は異なる反応を示し、その活性はｐＨ５．５で最も低く、ｐＨ値がこれより低くなっても高くなっても上昇した。しかしながら、様々なｐＨ値におけるこのライシンの活性の差は、有意な差ではなく、ｃｆｕ／ｍｌ数が１．５ｌｏｇ以下の違いであった。ＣＰ２５は、その活性は、試験した最も低いｐＨ値４．５で最も低く、ｐＨ８．０に至るまで常に上昇したように、両ＺＰライシンと比較して異なる反応を示した。このライシンの最低活性と最高活性との間の差は、ｃｆｕ／ｍｌ数で約２．５対数単位であった。生肉および加工肉製品がいずれも７．０未満のｐＨであるという現実を考慮すると、このような条件は、ＺＰ１７３には最適であり、ＺＰ２７８には好適であり、弱アルカリ性媒体で非常に有効であるＣＰ２５Ｌには最適ではない。
【００６９】
（ライシンは、周囲温度での数日間の貯蔵後、高い活性を保持している）
ライシンが機能性をとどめる極端な温度条件を探した。ＺＰ１７３は、３７℃〜４４℃で３０分間のインキュベーション後、その十分な活性を維持していた。５０℃では、ライシン活性は低下し、５５℃ではほぼ完全に消失した（図８Ａ）。
周囲温度および３７℃でのより長い時間のインキュベーションの影響を検討した。ＺＰ１７３は、３７℃で３日まで安定しており（図８Ｃ）、室温での貯蔵６週間後は、５０％の活性を維持した（図８Ｂ）。ＣＰ２５Ｌは、室温ではきわめて安定しており、６週間のインキュベーション後、その活性は実質的に変化していなかった。しかしながら、３７℃では、２日後、その活性は衰えはじめ、３７℃でのインキュベーションの７日後には、ＣＰ２５Ｌは、本来の活性の約２０％を保持したに過ぎなかった（図８ＢおよびＣ）。
【００７０】
４℃で数週間インキュベートしたいずれのライシンの活性も、低下は全く検出されなかった（非表示）。本発明者らは、精製したライシンは、冷蔵条件できわめて安定であり、周囲温度では数日から数週間の貯蔵の後、高い活性を保持すると結論する。
ｈｉｓタグ付けして大腸菌で発現させたＣＰ２５Ｌの熱安定性が、Gervasi et al. (2014)によって評価されている、ここに記載されている研究では、ＣＰ２５Ｌは、４℃で同様に安定であったが、貯蔵の１５日後、室温で活性を失いはじめ、よって、植物で産生されたＣＰ２５Ｌは、細菌で産生されたその同等物より良好な安定性を示す。本発明者らは、精製したＺＰ１７３およびＣＰ２５Ｌライシンは、４℃できわめて安定であり、周囲温度で数日から数週間の貯蔵の後、高い活性を保持し、３７℃では数日後でも有意な機能性を示すと結論する。
【００７１】
（ライシンは様々なＣ．パーフリンジェンス食品分離株に対して有効である。）
植物で発現させたライシン精製物を、さらに、食品から分離した様々なＣ．パーフリンジェンス菌株と試験した（表２）。ライシン処理した食品分離株のＣｆｕ係数実験は、ライシンに対する異なる菌株特異性を実証しているが、被験菌株はすべて、６種のライシンすべてに対して多かれ少なかれ感受性であった（図９）。Ｐｓｍ、ＺＰ１７３、およびＺＰ２７８はｃｆｕ数を非常に強力に低減させ（１〜８Δｌｏｇ10）、ＣＰ２５Ｌはｃｆｕ数を１．５〜４Δｌｏｇ10低減させ、ＰｌｙＣＰ２６ＦおよびＰｌｙＣＰ３９Ｏはそれより低い程度で作用した（１Δｌｏｇ10まで）。本発明者らの実験条件（ｐＨ５．５）が、よりアルカリ性媒体でより良好な活性を有するＣＰ２５Ｌよりも、ＺＰ１７３およびＺＰ２７８、ことによるとｐｓｍにより最適なものであることに注目すべきである。ＰｌｙＣＰ２６ＦおよびＰｌｙＣＰ３９Ｏの最適ｐＨ条件が、それぞれ６．８および８．２であったことも発表されている（Simmons et al., 2010）。本発明者らが選択したｐＨは、食品で非常に一般的にみられる酸性度条件に関連し、Ｐｓｍ、ＺＰ１７３、およびＺＰ２７８が最も有望な候補であるような条件ではあるが、よりアルカリ性の食品と使用する場合には、ＣＰ２５Ｌ、ＰｌｙＣＰ２６Ｆ、およびＰｌｙＣＰ３９Ｏの使用を検討することができる。
【００７２】
抗菌活性の範囲をよりよく特徴づけるために、６つのライシンすべてを、主に食品からまたは食中毒の症例であると文書で証明された後のヒトの糞便から分離した２６種のＣ．パーフリンジェンスＡ型菌株の収集物に対してスクリーニングした。結果を図１２に示す。２６菌株はすべて、用いた濃度（１０μｇ／ｍｌ＝１０ｐｐｍ）で、１つまたは複数のライシンによる処理に対して感受性であった。一般的に、ｐｓｍ、ＣＰ２５Ｌ、ＺＰ１７３、およびＺＰ２７８による処理がｃｆｕ数をきわめて劇的に低減させたのに対し、ＰｌｙＣＰ２６ＦおよびＰｌｙＣＰ３９Ｏではほとんど効果がなかった。ｐｓｍ、ＺＰ１７３、およびＺＰ２７８処理によって、一部の菌株について検出限界未満の細菌の根絶が達成された（図１２、アスタリスクで示した）。ＰｓｍおよびＺＰ１７３は、ｃｆｕ数を最も劇的に低減させ、正味の差は、それぞれ７種および８種の菌株について、４ｌｏｇを超えるに至った。４つのライシン（ｐｓｍ、ＣＰ２５Ｌ、ＺＰ１７３、およびＺＰ２７８）は、１４〜１７種の菌株のｃｆｕ数を、２〜４ｌｏｇ低減させることができた。ＰｌｙＣＰ２６ＦおよびＰｌｙＣＰ３９Ｏについては、最大０．５〜２ｌｏｇの範囲のｃｆｕの低減を達成した。ＰｌｙＣＰ２６Ｆは２０菌株について、ＰｌｙＣＰ３９Ｏは６菌株のみについて、その程度までｃｆｕ数を低減させることができた（図１２）。
【００７３】
Ｃ．パーフリンジェンス食品関連菌株の同じパネルを使用して幾つかのライシンの溶解活性を比較した研究はこれまでにはなかった。本発明者らの結果は、一部の菌株（ＮＣＴＣ８６７９、ＮＣＴＣ８７９８）が、被験ライシンすべてによる処理に対し、他の菌株より不応性であるように思われるものの、菌株間の感受性の違いはあれ、全体として、すべての菌株でライシン活性に対する感受性が高かったことを示唆している。６つの被験ライシンのうち、ｐｓｍとＺＰ１７３だけが非常に似た活性パターンを示したが、これは、おそらくＣ末端細胞壁結合ドメインの両タンパク質の相同性が高いことによる。本発明者らの目的は、食品加工および／または調理環境においてみられる条件に似た条件で、どのようにしてＣ．パーフリンジェンスを根絶させることができるかを検討することであった。したがって、肉などの多くの汚染されやすい食品においてみられる弱酸性のｐＨ値でライシンを評価することが正当であるとした。
【００７４】
これらの結果に基づくと、Ｃ．パーフリンジェンスの根絶は、１つの個別のライシンを用いた処理によるよりも、幾つかのライシンでの（例えば混合物として）同時処理によるほうがうまく達成される。例えば、植物で産生させた３つのライシン（ｐｓｍまたはＺＰ１７３、ＺＰ２７８、およびＣＰ２５Ｌ）を使用すれば、最も広範なスペクトルのＣ．パーフリンジェンス食品関連菌株を制御することが可能である。さらに、これらのライシンは異なるファミリーの酵素であるため、ライシンの組合せを用いることによって、ムラミダーゼとアラニンアミダーゼとの相乗効果を獲得することが可能である。
【００７５】
（食品中のＣ．パーフリンジェンスに対するライシン活性の試験）
インビトロで植物ｐｓｍ、Ｚ１７３、およびＺＰ２７８抽出物の活性を実証した後、ライシン抽出物を使用して、食品中のＣ．パーフリンジェンス栄養細胞の数を減少させることができるかどうかを検討した。不適切に管理された食品の条件をシミュレートするために、細かく刻んだ加熱調理された七面鳥肉および牛肉を室温で使用した。ｐｓｍを発現するＮ．ベンサミアナの全タンパク質抽出物３００μｇを使用して、１０4ｃｆｕ／ｍｌのＣ．パーフリンジェンスが接種された肉１０ｇを処理した。一晩インキュベートした後の両種類の肉において、ｐｓｍを用いた試料では、ｃｆｕ数は変化してなかったのに対し、対照試料では、細菌ｃｆｕ数は４ｌｏｇ増え、１０8ｃｆｕ／ｍｌに達した（図１０）。
【００７６】
別の実験において、別のライシンである、精製したＺＰ１７３を試験した。ライシン２０μｇまたは５０μｇを使用して、細かく刻んだ加熱調理された七面鳥肉１０ｇを処理した。この実験では、ライシンの添加によって、２時間では、Ｃ．パーフリンジェンスの増殖の進行が遅れていたが、一晩インキュベートした後は、細菌数に有意差は認められなかった（図１１）。
このように、植物で発現されたＣ．パーフリンジェンスライシンのタンパク質粗抽出物を使用して、少なくとも幾つかの条件において、食品中のＣ．パーフリンジェンス細菌の栄養増殖を制御することが可能である。
食中毒の原因であるほかに、Ｃ．パーフリンジェンスは、ヒトにおけるより重篤な疾患：ガス壊疽および壊疽性腸炎の病原体である。Ｃ．パーフリンジェンスはまた、重大な家禽疾患である壊死性腸炎の原因物質でもある。壊死性腸炎は、多因子病であり、家禽において疾患への進行をもたらすその素因はまだ完全に理解されていないが、植物で発現させたライシンの飼料または寝わらを補充することが、クロストリジウムの数を制御する一助となる可能性がある。
バクテリオファージライシンは、一般的に安全とみなされており、したがって、食品の処理のために、また、抗生物質に替わるヒトおよび動物の治療薬として使用することができる。
【００７７】
（例５）
加熱調理された肉における溶菌活性
（方法）
Ｃ．パーフリンジェンスＮＣＴＣ８２３７を、モデル病原菌株として使用した。培養物は、嫌気的に、ＴＳＢ中でＯＤ６００約０．３まで増殖させ、次いで、ＯＤ６００＝０．０２５まで希釈した。細かく刻んだ加熱調理された七面鳥肉１０ｇの試料は、８５６ｍＭのＮａＣｌを補充したｐＨ５．５のクエン酸−リン酸バッファー３ｍｌおよび希釈した細菌１００μＬ（４ｌｏｇ  ｃｆｕ／ｍｌ）と混合した。精製ライシン２５μｇまたはナイシン５０μｇを加え、徹底的に混合し、嫌気的に室温でインキュベートした。ナイシン（Ｓｉｇｍａ）は、粉末を０．０２ＮのＨＣｌ中に溶解して、５ｍｇ／ｍｌ保存液を調製した。被分析試料の段階希釈は、２５６ｍＭのＮａＣｌを補充したｐＨ５．５のクエン酸−リン酸バッファーで行い、各試料５０μＬをＴＳＡプレート上にプレーティングした。嫌気性条件下で、３７℃で一晩インキュベートした後、細菌ｃｆｕ／ｍｌ計数を行った。非希釈試料のプレート当たり２５ｃｆｕの数を検出下限（５００ｃｆｕ／ｍｌまたは２．７ｌｏｇ１０ｃｆｕ／ｍｌ）とみなした（Sutton (2011)）。
【００７８】
（結果）
ライシンが、食品基質上のＣ．パーフリンジェンス栄養生細胞の数を減少させることができるかどうかを分析した。不適切に管理された食品の条件をシミュレートするために、１０４ｃｆｕ／ｍｌのＣ．パーフリンジェンス栄養細胞を接種した、細かく刻んだ加熱調理された七面鳥を室温で使用した。現在、ポリペプチドナイシンは、食品防腐剤として承認されている唯一のバクテリオシンであり、食品産業でその常用が増えているのはそれが理由である。ナイシンは、グラム陽性菌に対する抗菌活性、特に芽胞形成種に対する抗菌活性を有しており、栄養細胞、および発芽芽胞からの再増殖の両方を阻害することができる（Gharsallaoui (2016)）。しかしながら、ナイシンは、実験室条件下で、Ｃ．パーフリンジェンスの芽胞からの再増殖および栄養細胞に対する阻害効果を示したにもかかわらず、食肉モデル系において接種したＣ．パーフリンジェンス芽胞へのナイシンの阻害効果は観察されなかった（Udompijitkul (2012)）。このことは、ナイシンが、発芽した芽胞からの再増殖だけを阻止することを示唆している。栄養細胞に対するナイシン作用は、ナイシンの濃度、細菌の濃度、細菌株、生理的状態、および曝露条件によって、殺菌性か静菌性のいずれかでありえ、Garde (2014)によって概説されているように、ほとんどの場合、ナイシンの作用は、殺芽胞性であるよりもむしろ静芽胞性である。
【００７９】
本発明者らの実験条件において、細菌は、５μｇ／ｍｇのナイシン処理の２時間後には検出されず、ナイシンがＣ．パーフリンジェンスに対して有効であることが示された（図１３）。しかしながら、１８時間後、細菌は低い力価で再び現れ、４３時間には細菌力価はほぼ５ｌｏｇ１０ｃｆｕに達した。したがって、ナイシンは、（ナイシンを食品添加物として使用できる概ね最大濃度である）使用した濃度でＣ．パーフリンジェンスの繁殖を阻害したにもかかわらず、ナイシンは細菌を完全に根絶することができなかった。きわだって対照的に、ナイシン（２．５μｇ／ｍｌ）の２分の１（質量対質量）の濃度または１０〜２０分の１のモル濃度で使用した被験ライシンのうち、ｐｓｍおよびＺＰ１７３の２つは細菌を完全に根絶させ、インキュベーションの１８時間後または４３時間後では、コロニーは検出されなかった。ＣＰ２５Ｌもまた非常に有効であり、インキュベーションの４３時間後、細菌力価は、対照と比較して４ｌｏｇ10ｃｆｕ低減した（図１３）。
【００８０】
したがって、使用した実験条件下で、植物で発現させた３つのライシンはすべて、Ｃ．パーフリンジェンスによる腐敗から加熱調理された肉を効率的に保護し、ナイシンより良好な保護を実現した。本発明者らは、食品加工、調理、および提供の筋書きを現実的にモデル化する条件下で評価した場合、植物で発現させたライシンは、Ｃ．パーフリンジェンスに対する候補食品保護抗菌薬としての有用性を示すと結論する。
【００８１】
複製するウイルスよって目的のタンパク質をコードする外来ｍＲＮＡを増幅させる植物ウイルスベースの発現系は、葉およびその他の組織中で非常に高いレベルのタンパク質を産生することができる（Gleba and Giritch, (2011)）。さらに、一般に安全と認められる（Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ  Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ａｓ  Ｓａｆｅ）（ＧＲＡＳ）宿主（食用種）を使用する植物ベースの発現系は、大規模な精製を避ける必要がある可能性のあるタンパク質を産生する場合、明らかな利点を有する。食用植物中で産生されたＣ．パーフリンジェンスバクテリオファージライシンは、たとえ部分的でしか純粋でなくとも、食品添加物または食品加工助剤として安全に使用することができる。したがって、大腸菌でのＣ．パーフリンジェンスバクテリオファージライシンの発現が可能であるものの、ライシンが食品安全上の介入を目的に用いられる場合、植物ベースの発現が好都合である。
【００８２】
（参考文献）
2020513847.tif 000007
2020513847.tif 000008
2020513847.tif 000009
【００８３】
その優先権が本特許出願によって主張されている、２０１７年３月７日に出願した欧州特許出願第１７  １５９  ５９７．８号の内容は、全説明、特許請求の範囲、および図面を含む全体を、参照により本明細書に組み込む。
【図１Ａ】
2020513847.tif 000010
【図１Ｂ】
2020513847.tif 000011
【図１Ｃ】
2020513847.tif 000012
【図２Ａ】
2020513847.tif 000013
【図２Ｂ】
2020513847.tif 000014
【図３Ｃ】
2020513847.tif 000015
【図４Ａ−４Ｂ】
2020513847.tif 000016
【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
2020513847.tif 000018
【図５Ｂ】
2020513847.tif 000019
【図５Ｃ】
2020513847.tif 000020
【図６Ａ】
2020513847.tif 000021
【図６Ｂ】
2020513847.tif 000022
【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
2020513847.tif 000024
【図６Ｅ】
2020513847.tif 000025
【図６Ｆ】
2020513847.tif 000026
【図７Ａ】
2020513847.tif 000027
【図７Ｂ】
2020513847.tif 000028
【図８Ａ】
2020513847.tif 000029
【図８Ｂ】
2020513847.tif 000030
【図８Ｃ】
2020513847.tif 000031
【図９】
2020513847.tif 000032
【図１０Ａ】
2020513847.tif 000033
【図１０Ｂ】
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【図１１】
2020513847.tif 000035
【図１２】
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【図１３】
2020513847.tif 000037
【配列表】
2020513847000001.app
【国際調査報告】
2020513847.tif 000038
2020513847.tif 000039
2020513847.tif 000040