(57)【要約】  CARを用いて、ヒトにおける癌を治療するための組成物及び方法が提供される。本発明は、改変されたCAR(キメラ受容体抗原)及びVEGFRに対する高い親和性を有するそのようなCARを発現する遺伝子修飾された免疫細胞を含む。より具体的には、該細胞は、固形腫瘍上のVEGFR-2を認識するCAR-T細胞、その使用、その組成物、及び作製方法である。本発明は、腫瘍血管新生を標的とするVEGFR-2依存性癌を治療するための治療方法を含む。VEGFR-2、そのエピトープもしくは断片、又はこれらの変異体に結合するキメラ抗原受容体(CAR)。【選択図】図１
2020504623.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
VEGFR-2、そのエピトープもしくは断片、又はこれらの変異体に結合するキメラ抗原受容体(CAR)。
【請求項２】
前記CARがVEGFR-2への結合のための単一ドメイン抗体又はその断片を含む、請求項1記載のCAR。
【請求項３】
前記単一ドメイン抗体又はその断片がラクダ科種のものである、請求項2記載のCAR。
【請求項４】
前記CARがVEGFR-2のエピトープに結合する、請求項1〜3のいずれか一項記載のCAR。
【請求項５】
前記CARが配列番号1に見られるエピトープに結合する、請求項4記載のCAR。
【請求項６】
前記CARが相補性決定領域(CDR) 1; CDR2;及び/又はCDR3を含み、ここで、CDR1、CDR2、及びCDR3のうちの少なくとも1つがVEGFR-2に結合する、請求項1〜5のいずれか一項記載のCAR。
【請求項７】
前記CARが、
【化１】
2020504623.tif 000053
及びVEGFR2に結合するこれらと少なくとも70％同一の配列からなる群から選択される配列を有する少なくとも1つのCDRを含む、請求項1〜6のいずれか一項記載のCAR。
【請求項８】
配列番号78の配列又はそれと少なくとも90％同一の配列を含む、請求項1〜7のいずれか一項記載のCAR。
【請求項９】
スペーサー分子、膜貫通領域、並びにヒトCD8-αタンパク質、ヒトCD28タンパク質、ヒトCD3-ζタンパク質、ヒトFcRyタンパク質、CD27タンパク質、OX40タンパク質、ヒト4-IBBタンパク質、前述のもののいずれかの修飾バージョン、及び前述のものの任意の組合せからなる群から選択される1以上の細胞シグナル伝達ドメインを含む、請求項1〜8のいずれか一項記載のCAR。
【請求項１０】
配列番号2〜30からなる群から選択される配列又はその断片もしくは変異体を含む、請求項1〜9のいずれか一項記載のCAR。
【請求項１１】
配列番号2〜30からなる群から選択される配列、又はそれと少なくとも85％、少なくとも86％、少なくとも87％、少なくとも88％、少なくとも89％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、もしくは少なくとも95％同一の配列、又はそれと実質的に同一の配列を含む、請求項1〜9のいずれか一項記載のCAR。
【請求項１２】
前記配列が配列番号54〜69からなる群から選択されるリンカー配列を含む、請求項10又は11記載のCAR。
【請求項１３】
前記リンカー配列がC-末端システインをさらに含み得る、請求項12記載のCAR。
【請求項１４】
前記リンカー配列が
【化２】
2020504623.tif 000054
又はその変異体を含む、請求項13記載のCAR。
【請求項１５】
請求項1〜14のいずれか一項記載のCARを含む、免疫細胞。
【請求項１６】
前記細胞がT細胞又はサイトカイン誘導性キラー(CIK)細胞である、請求項15記載の免疫細胞。
【請求項１７】
少なくとも第二のCARをさらに含む、請求項15又は16記載の免疫細胞。
【請求項１８】
任意に過剰に活性のあるトランスポゾン/トランスポザーゼシステムをさらに含む、請求項15〜17のいずれか一項記載の免疫細胞。
【請求項１９】
前記トランスポゾン/トランスポザーゼシステムがスリーピングビューティートランスポゾン/トランスポザーゼシステムである、請求項18記載の免疫細胞。
【請求項２０】
前記トランスポゾン/トランスポザーゼシステムがSB100Xトランスポゾン/トランスポザーゼシステムである、請求項18又は19記載の免疫細胞。
【請求項２１】
自殺遺伝子をさらに含む、請求項15〜20のいずれか一項記載の免疫細胞。
【請求項２２】
医薬担体、希釈剤、及び/又は賦形剤を含む組成物へと製剤化される、請求項15〜21のいずれか一項記載の免疫細胞。
【請求項２３】
キメラ抗原受容体(CAR)をコードする核酸分子であって、該CARがVEGFR-2結合部分及び免疫細胞活性化部分を含み、ここで、該VEGFR-2結合部分がVEGFR-2又はその変異体もしくは断片に結合する、前記キメラ抗原受容体(CAR)をコードする核酸分子。
【請求項２４】
前記VEGFR-2結合部分がVEGFR-2又はその変異体もしくは断片に対するモノクローナル抗体又はその抗原結合部分を含む、請求項23記載の核酸分子。
【請求項２５】
前記VEGFR-2結合部分が前記モノクローナル抗体の可変領域を含む、請求項24記載の核酸分子。
【請求項２６】
前記免疫細胞活性化部分が、以下のタンパク質:ヒトCD8-αタンパク質、ヒトCD28タンパク質、ヒトCD3-ζタンパク質、ヒトFcRyタンパク質、CD27タンパク質、OX40タンパク質、ヒト4-IBBタンパク質、及びこれらの変異体又は断片のうちのいずれか1つ又は複数のT-細胞シグナル伝達ドメインを含む、請求項23〜25のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項２７】
配列番号31〜53のうちの少なくとも1つの核酸配列を含む及び/又は配列番号1の配列に結合するポリペプチドをコードする、請求項23〜26のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項２８】
キメラ抗原受容体(CAR)の一方又は両方のポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該CARが、N-末端からC-末端の順に:
i)VEGFR-2に特異的な抗原結合単一ドメイン抗体;
ii)膜貫通ドメイン;
iii)共刺激ポリペプチド(ここで、該共刺激ポリペプチドは、4-1BBポリペプチド及び/又はOX-40ポリペプチドである);並びに
iv)細胞内シグナル伝達ドメイン
を含む、前記核酸分子。
【請求項２９】
第一のポリペプチドが前記単一ドメイン抗体と前記膜貫通ドメインの間に配置されたヒンジ領域を含む、請求項28記載の核酸分子。
【請求項３０】
前記ヒンジ領域が免疫グロブリンIgGヒンジ領域又はCD8に由来するヒンジである、請求項29記載の核酸分子。
【請求項３１】
前記細胞内シグナル伝達ドメインが免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ(ITAM)を含む、請求項28〜30のいずれか一項記載の核酸。
【請求項３２】
ITAMを含む前記細胞内シグナル伝達ドメインがCD3-ζ及びZAP70から選択される、請求項31記載の核酸分子。
【請求項３３】
前記ヌクレオチド配列がT-細胞特異的プロモーターに機能的に連結されている、請求項28〜32のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項３４】
前記ヌクレオチド配列がNK細胞特異的プロモーターに機能的に連結されている、請求項28〜33のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項３５】
配列番号79を含む、請求項34記載の核酸分子。
【請求項３６】
請求項25〜35のいずれか一項記載の核酸配列によってコードされるキメラ抗原受容体(CAR)。
【請求項３７】
配列番号2〜38のいずれか1つのアミノ酸配列を含む、請求項36記載のCAR。
【請求項３９】
請求項25〜35のいずれか一項記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項４０】
請求項25〜35のいずれか一項記載の核酸分子又は請求項28もしくは29記載のCARを発現する宿主細胞。
【請求項４１】
前記宿主細胞が免疫細胞である、請求項40記載の宿主細胞。
【請求項４２】
前記宿主細胞が、T-細胞及びサイトカイン誘導性キラーCIK細胞からなる群から選択される、請求項41記載の宿主細胞。
【請求項４３】
少なくとも第二のCARをさらに含む、請求項40〜42のいずれか一項記載の宿主細胞。
【請求項４４】
任意に過剰に活性のあるトランスポゾン/トランスポザーゼシステムをさらに含む、請求項40〜43のいずれか一項記載の宿主細胞。
【請求項４５】
前記トランスポゾン/トランスポザーゼシステムがスリーピングビューティートランスポゾン/トランスポザーゼシステムである、請求項44記載の宿主細胞。
【請求項４６】
前記トランスポゾン/トランスポザーゼシステムがSB100Xトランスポゾン/トランスポザーゼシステムである、請求項44又は45記載の宿主細胞。
【請求項４７】
自殺遺伝子をさらに含む、請求項40〜46のいずれか一項記載の宿主細胞。
【請求項４８】
請求項40〜47のいずれか一項記載の少なくとも1つの宿主細胞を含む細胞の集団。
【請求項４９】
請求項15〜22のいずれか一項記載の免疫細胞又は請求項40〜47のいずれか一項記載の宿主細胞を含む、医薬組成物。
【請求項５０】
哺乳動物における癌を治療又は予防する方法であって、請求項15〜22のいずれか一項記載の免疫細胞又は請求項40〜47のいずれか一項記載の宿主細胞を、該哺乳動物に、該哺乳動物における癌を治療又は予防するのに有効な量で投与することを含む、前記方法。
【請求項５１】
前記癌がVEGFR-2を発現する癌である、請求項50記載の方法。
【請求項５２】
前記癌が固形腫瘍である、請求項50又は51記載の方法。
【請求項５３】
腫瘍における血管新生を低下させる方法であって、請求項15〜22のいずれか一項記載の免疫細胞又は請求項40〜47のいずれか一項記載の宿主細胞を、該哺乳動物に、血管新生を低下させるのに有効な量で投与することを含む、前記方法。
【請求項５４】
シグナルペプチド-VHH-CD8ヒンジ-CD28-4-1BB-CD3ζ-T2A-EGFRtを含む構造を有し、かつ配列番号79の核酸配列を有する、CARカセット。
【請求項５５】
シグナルペプチド-VHH-CD8ヒンジ-CD28-4-1BB-CD3ζ-T2A-EGFRtを含む構造及び配列番号78のアミノ酸配列を有する、CARカセット。
【請求項５６】
キメラ抗原受容体(CAR)をコードする核酸配列を含むヒトT細胞であって、該CARがVEGFR-2抗原結合ドメインを含み、ここで、該CARが、膜貫通ドメイン、4-1BB共刺激シグナル伝達領域、及びCD3ζシグナル伝達ドメインをさらに含み、ここで、該T細胞が癌を有するヒト由来のものである、前記ヒトT細胞。
【請求項５７】
前記ヒトT細胞が、ヒトが、抗ウイルス剤、化学療法、放射線、免疫抑制剤、及び抗体からなる群から選択されるモダリティで治療される前に、該ヒトから得られる血液試料から単離される、請求項56記載のヒトT細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
(発明の分野)
本発明は、癌免疫療法、より具体的には、ヒトにおける癌を治療するための組成物及び方法に関する。本発明は、改変されたCAR(キメラ受容体抗原)及びVEGFRに対する高い親和性を有するそのようなCARを発現する遺伝子修飾された免疫細胞を含む。より具体的には、該細胞は、固形腫瘍上のVEGFR-2を認識するCAR-T細胞、その使用、その組成物、及び作製方法である。本発明は、腫瘍血管新生を標的とするVEGFR-2依存性癌を治療するための治療方法を含む。
【背景技術】
【０００２】
(発明の背景)
免疫系の調節は、悪性腫瘍の治療において、かなりの有望性を示している。腫瘍微小環境に存在するT細胞を再活性化するチェックポイント阻害剤に加えて、外因性に形質導入されたキメラ抗原受容体(CAR)-T細胞は、白血病の治療のための臨床試験において有望な応答をもたらしている。
【０００３】
血管新生は、新しい血管形成のプロセスであり、腫瘍がある大きさを超えて成長するのに不可欠である。血管新生は、固形腫瘍の成長及び転移を容易にする。腫瘍は、血管内皮成長因子受容体(VEGFR)に結合することによって局所の内皮細胞に作用する血管内皮成長因子(VEGF)という血管新生促進性因子を分泌する。
【０００４】
血管内皮成長因子のVEGFは、内皮細胞特異的有糸分裂促進因子である。これは、内皮細胞の増殖を特異的に促進することにより、血管新生誘導因子として作用するという点で成長因子の間で異なっている。VEGFの生物学的応答は、胚形成時及び腫瘍形成時に内皮細胞上で選択的に発現されるその高親和性受容体を介して媒介される。血管内皮成長因子は、いくつかの受容体に結合することにより、血管発生、血管新生、及びリンパ管新生を調節する。VEGFR-1は、造血幹細胞の動員並びに単球及びマクロファージの遊走に必要とされ、VEGFR-2は、血管内皮機能を調節し、VEGFR-3は、リンパ系内皮細胞機能を調節する。
【０００５】
腫瘍血管新生を標的とする癌を治療又は予防する組成物及び方法が必要とされている。そのような必要性は、所望の臨床活性を有する腫瘍細胞上に発現されたVEGFR-2を認識するCARを用いて、腫瘍関連血管新生の制御を助け、したがって、癌の進行/成長の制限し/減少させることを試みる固形腫瘍の治療を含む。
【発明の概要】
【０００６】
(発明の概要)
VEGFR-2は、種々の腫瘍によって発現される。本明細書においては、VEGFR-2発現腫瘍を標的とするCAR及びCAR-T細胞が記載されている。本明細書に提供される抗VEGFR-2 CAR及びCAR-T細胞は、血管新生を阻害し/減少させ、かつ腫瘍退縮を誘導する用途を有する。
【０００７】
本発明は、固形腫瘍を標的とするように改変されたCARを提供する。一態様において、T細胞を、T細胞が腫瘍細胞上の特異的タンパク質(抗原)を認識するのを可能にするタンパク質を発現するCARを産生するように遺伝子改変する。その後、これらの改変されたCAR-T細胞を実験室で成長させた後、治療に使用する。本明細書に記載されるCARは、VEGFR-2を発現する固形腫瘍に対する高い親和性を有する。ある態様において、本明細書に記載されるCARは、VEGFR-2依存性癌に対する高い親和性を有する。本明細書に記載されるCARの固有の特異性は、改変されたCARのscFvの代わりにsdAb(単一ドメイン抗体)を使用することから生じる。これは、その小さいサイズのために、より高い親和性を提供する。そのような抗体は、容易にリフォールディングする傾向及び生物物理学的な安定性も有する。さらに、該抗体は、従来の抗体には近づきにくいエピトープを認識することができ、かつ改変することができる。
【０００８】
本発明の態様におけるものは、キメラ抗原受容体(CAR)をコードする核酸配列を含むヒトT細胞であり、ここで、該CARは、VEGFR-2結合ドメインを含み、ここで、該CARは、膜貫通ドメイン、4-1BB共刺激シグナル伝達領域、及びCD3ζシグナル伝達ドメインをさらに含み、ここで、該T細胞は、癌を有するヒト由来のものである。ある態様において、VEGFR-2を発現する癌が治療される。
【０００９】
本明細書に記載される態様において、CAR及びCAR-T細胞で使用するためのsdAbは、VEGFR-2に特異的なラクダ科動物単一ドメイン抗体である。ある態様において、該sdAbは、VEGFR-2及びその断片又は変異体に特異的である。
【００１０】
本発明のCAR構築物は、リンカー配列を含むもしくは含まない(ある態様において、該リンカー配列は末端システインを含むことができ、この末端システインは、ある態様において、化学的コンジュゲーションに有用である)配列番号2〜30の配列、又はそれと少なくとも85％、少なくとも86％、少なくとも87％、少なくとも88％、少なくとも89％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、もしくは少なくとも95％同一の配列、又はそれと実質的に同一の配列のうちの1つを含むことができる。
【００１１】
本発明の単一ドメイン抗体に好適なリンカー配列は、配列番号54〜65からなる群から選択されることができる。ある態様において、該リンカー配列は、例えば、配列番号66〜69に見られるような、C-末端システインをさらに含むことができる。これらのリンカー配列と同様の配列を本明細書で使用することができる。
【００１２】
ある態様において、本明細書に記載されるCARを発現する免疫細胞が提供される。該免疫細胞は、典型的には、T細胞又はCIK細胞であるが、ナチュラルキラー(NK)細胞、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、及び調節性T細胞であることもできる。
【００１３】
本明細書に記載される態様において、VEGFR-2に特異的なCAR-Tを作製する方法が提供される。ある態様において、本方法は、ウイルス的であっても、非ウイルス的であってもよい。より具体的には、ある態様における方法は、トランスポゾンを含む非ウイルス的な方法である。
【００１４】
本発明は、キメラ抗原受容体(CAR)をコードする単離された核酸配列を提供し、ここで、該CARは、VEGFR-2並びにその変異体、断片、及び特異的エピトープに結合するsdAbである抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、1以上の共刺激シグナル伝達領域と、CD3ζシグナル伝達ドメインとを含む。一態様において、CARをコードする核酸配列は、配列番号79の核酸配列を含む。この非限定的な例において、CARはAB1(配列番号2)を含む。
【００１５】
一態様において、CAR中の抗原結合ドメインは、抗体又はその抗原結合断片である。典型的には、抗原結合断片は、単一ドメイン抗体又はその断片である。
【００１６】
一態様において、CAR中のsdAbは、VEGFR-2を発現する固形腫瘍に結合する。
【００１７】
一態様において、CAR中の共刺激シグナル伝達領域は、CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83と特異的に結合するリガンド、及びこれらの任意の組合せからなる群から選択される共刺激分子の細胞内ドメインを含む。
【００１８】
本発明は、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激シグナル伝達領域、及びCD3ζシグナル伝達ドメインを含む単離されたCARも提供する。
【００１９】
本発明は、CARをコードする核酸配列を含む細胞も提供し、ここで、該CARは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激シグナル伝達領域、及びCD3ζシグナル伝達ドメインを含む。
【００２０】
一態様において、CARを含む免疫細胞は、T細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、CIK細胞、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、及び調節性T細胞からなる群から選択される。
【００２１】
本発明は、CARをコードする核酸配列を含むベクターも提供し、ここで、該CARは、抗原結合ドメイン、共刺激シグナル伝達領域、及びCD3ζシグナル伝達ドメインを含む。
【００２２】
本発明は、哺乳動物における腫瘍成長を低下させる方法も提供する。一態様において、本方法は、哺乳動物に、CARを発現するように遺伝子修飾された細胞の有効量を投与することを含み、ここで、該CARは、抗原結合ドメイン、共刺激シグナル伝達領域、及びCD3ζシグナル伝達ドメインを含み、ここで、該抗原結合ドメインは、VEGFR-2を特異的に認識するsdAbである。
【００２３】
本発明は、哺乳動物における腫瘍と関連する血管新生を低下させる方法も提供する。一態様において、本方法は、哺乳動物に、CARを発現するように遺伝子修飾された細胞の有効量を投与することを含み、ここで、該CARは、抗原結合ドメイン、共刺激シグナル伝達領域、及びCD3ζシグナル伝達ドメインを含み、ここで、該抗原結合ドメインは、VEGFR-2を特異的に認識するsdAbである。
【００２４】
本発明は、VEGFR-2の発現の上昇と関連する腫瘍を有する哺乳動物を治療する方法も含む。一態様において、本方法は、哺乳動物に、CAR(ここで、該CARは、VEGFR-2に特異的なsdAb、共刺激シグナル伝達領域、及びCD3ζシグナル伝達ドメインを含む)を発現するように遺伝子修飾された細胞の有効量を投与し、それにより、該哺乳動物を治療することを含む。
【００２５】
一態様において、細胞は、自己T細胞である。
【００２６】
別の態様において、細胞は、同種異系T細胞である。
【００２７】
本発明は、癌を有すると診断されたヒトにおいて持続的な遺伝子改変T細胞集団を作製する方法も含む。一態様において、本方法は、ヒトに、CARを発現するように遺伝子改変されたT細胞を投与することを含み、ここで、該CARは、VEGFR-2に特異的な抗原結合ドメイン、共刺激シグナル伝達領域、及びCD3ζシグナル伝達ドメインを含み、ここで、該持続的な遺伝子改変T細胞集団は、投与後少なくとも1カ月間、ヒトで持続する。
【００２８】
一態様において、持続的な遺伝子改変T細胞集団は、ヒトに投与されたT細胞、ヒトに投与されたT細胞の子孫、及びこれらの組合せからなる群から選択される少なくとも1つの細胞を含む。
【００２９】
一態様において、持続的な遺伝子改変T細胞集団は、メモリーT細胞を含む。
【００３０】
一態様において、持続的な遺伝子改変T細胞集団は、投与後少なくとも3カ月間、ヒトで持続する。別の態様において、持続的な遺伝子改変T細胞集団は、投与後少なくとも4カ月間、5カ月間、6カ月間、7カ月間、8カ月間、9カ月間、10カ月間、11カ月間、12カ月間、2年間、又は3年間、ヒトで持続する。
【００３１】
本発明は、癌を有すると診断されたヒトにおいて遺伝子改変T細胞集団を増殖させる方法も提供する。一態様において、本方法は、ヒトに、CARを発現するように遺伝子改変されたT細胞を投与することを含み、ここで、該CARは、VEGFR-2に特異的なsdAb、共刺激シグナル伝達領域、及びCD3ζシグナル伝達ドメインを含み、ここで、該投与された遺伝子改変T細胞は、該ヒトにおける子孫T細胞集団を産生する。
【００３２】
一態様において、ヒトにおける子孫T細胞は、メモリーT細胞を含む。
【００３３】
一態様において、T細胞は、自己T細胞又は同種異系T細胞である。
【００３４】
一態様において、免疫細胞は、自己又は同種異系であり得る、CIK細胞である。
【００３５】
別の態様において、該ヒトは、少なくとも1つの化学療法剤に抵抗性である。
【００３６】
一態様において、癌は、VEGFR-2及びその変異体又はエピトープを発現する任意の癌である。そのような癌としては、膵癌、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、胃癌、卵巣癌、及び膀胱癌が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３７】
一態様において、子孫T細胞集団は、投与後少なくとも3カ月間、ヒトで持続する。別の態様において、子孫T細胞集団は、投与後少なくとも4カ月間、5カ月間、6カ月間、7カ月間、8カ月間、9カ月間、10カ月間、11カ月間、12カ月間、2年間、又は3年間、ヒトで持続する。
【００３８】
本発明の態様におけるものは、VEGFR-2、そのエピトープもしくは断片、又はこれらの変異体に結合するキメラ抗原受容体(CAR)である。さらなる態様におけるものは、それがその一部となっているCARの生物学的活性を保持する本発明のCARの機能的部分である。
【００３９】
ある態様において、CARは、VEGFR-2への結合のための単一ドメイン抗体又はその断片を含む。単一ドメイン抗体は、配列番号2〜30からなる群から選択される配列を含むことができる。
【００４０】
ある態様において、単一ドメイン抗体又はその断片は、ラクダ科種のものである。
【００４１】
ある態様において、CARは、VEGFR-2のエピトープに結合する。例えば、U.S.8,378,071号(その開示は、引用により完全に本明細書中に組み込まれる)に記載されているエピトープに限定されない。
【００４２】
ある態様において、CARは、VEGFR-2に結合するための相補性決定領域(CDR) 1; CDR2;及びCDR3を含む。
【００４３】
ある態様において、CARは、アミノ酸配列:
[シグナルペプチド-VHH-CD8ヒンジ-CD28-4-1BB-CD3ζ-T2A-EGFRt]
を含み、これは、ある態様において、配列番号78又はその変異体もしくは断片、例えば、それと少なくとも90％同一の配列を含むか、或いはこれらからなる。VHH配列は、AB1(配列番号2)を含む。CARをコードする核酸配列は、配列番号79によって表される。
【００４４】
ある態様において、CARは、スペーサー分子、膜貫通領域、並びにヒトCD8-αタンパク質、ヒトCD28タンパク質、ヒトCD3-ζタンパク質、ヒトFcRyタンパク質、CD27タンパク質、OX40タンパク質、ヒト4-IBBタンパク質、前述のもののいずれかの修飾バージョン、及び前述のものの任意の組合せからなる群から選択される1以上の細胞シグナル伝達ドメインを含む。
【００４５】
ある態様におけるものは、本明細書に記載されるCARを含む免疫細胞である。該細胞は、T細胞又はサイトカイン誘導性キラー(CIK)細胞であることができる。ある態様において、該免疫細胞は、少なくとも第二のCARをさらに含むことができる。
【００４６】
ある態様において、免疫細胞は、任意に過剰に活性のあるトランスポゾン/トランスポザーゼシステムを含む。ある態様において、該トランスポゾン/トランスポザーゼシステムは、スリーピングビューティー(Sleeping Beauty)トランスポゾン/トランスポザーゼシステムである。さらなる態様において、該トランスポゾン/トランスポザーゼシステムは、SB100Xトランスポゾン/トランスポザーゼシステムである。
【００４７】
さらなる態様において、CAR免疫細胞は、自殺遺伝子をさらに含むことができる。
【００４８】
さらなる態様において、CAR免疫細胞は、医薬担体、希釈剤、及び/又は賦形剤を含む組成物として提供される。該組成物は、冷蔵し、凍結させ、又は解凍することができる。
【００４９】
本発明の態様におけるものは、キメラ抗原受容体(CAR)をコードする核酸分子であり、ここで、該CARは、VEGFR-2結合部分及び免疫細胞活性化部分を含み、ここで、該VEGFR-2結合部分は、VEGFR-2又はその変異体もしくは断片に結合する。
【００５０】
ある態様において、VEGFR-2結合部分は、VEGFR-2又はその変異体もしくは断片に対する単一ドメインモノクローナル抗体又はその抗原結合部分を含む。ある態様において、VEGFR-2結合部分は、該モノクローナル抗体の可変領域を含む。
【００５１】
ある態様において、免疫細胞活性化部分は、以下のタンパク質:ヒトCD8-αタンパク質、ヒトCD28タンパク質、ヒトCD3-ζタンパク質、ヒトFcRyタンパク質、CD27タンパク質、OX40タンパク質、ヒト4-IBBタンパク質、及びこれらの変異体又は断片のうちのいずれか1つ又は複数のT-細胞シグナル伝達ドメインを含む。
【００５２】
ある態様におけるものは、キメラ抗原受容体(CAR)の一方又は両方のポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であり、ここで、該CARは、N-末端からC-末端の順に:
i)VEGFR-2に特異的な抗原結合単一ドメイン抗体;
ii)膜貫通ドメイン;
iii)共刺激ポリペプチド(ここで、該共刺激ポリペプチドは、4-1BBポリペプチド及び/又はOX-40ポリペプチドである);並びに
iv)細胞内シグナル伝達ドメイン
を含む。
【００５３】
ある態様において、第一のポリペプチドは、単一ドメイン抗体と膜貫通ドメインの間に配置されたヒンジ領域を含む。
【００５４】
ある態様において、該ヒンジ領域は、免疫グロブリンIgGヒンジ領域又はCD8に由来するヒンジである。
【００５５】
ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ(ITAM)を含む。
【００５６】
ある態様において、ITAMを含む細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3-ζ及びZAP70から選択される。
【００５７】
ある態様において、ヌクレオチド配列は、T-細胞特異的プロモーターに機能的に連結されている。
【００５８】
ある態様において、ヌクレオチド配列は、NK細胞特異的プロモーターに機能的に連結されている。
【００５９】
本発明の態様におけるものは、本明細書に開示される核酸配列によってコードされるキメラ抗原受容体(CAR)であり、ある態様において、該CARはVEGFR-2に特異的である。
【００６０】
ある態様において、本発明のCARは、配列番号2〜30のアミノ酸配列を含み、これには、VEGFR-2に結合する活性を保持するその断片又は変異体が含まれる。
【００６１】
ある態様におけるものは、本明細書に記載される核酸分子を含むベクターである。ある態様において、該核酸分子は、配列番号78のポリペプチドをコードする。
【００６２】
ある態様におけるものは、本明細書に記載される核酸分子又はCARを発現する宿主細胞であり、ある態様において、該宿主細胞は免疫細胞である。
【００６３】
ある態様において、宿主細胞は、T-細胞及びサイトカイン誘導性キラーCIK細胞からなる群から選択され、ある態様において、少なくとも第二のCARをさらに含むことができる。
【００６４】
ある態様において、宿主細胞は、任意に過剰に活性のあるトランスポゾン/トランスポザーゼシステムをさらに含むことができ、ある態様において、該トランスポゾン/トランスポザーゼシステムは、スリーピングビューティートランスポゾン/トランスポザーゼシステムである。さらなる態様において、該トランスポゾン/トランスポザーゼシステムは、SB100Xトランスポゾン/トランスポザーゼシステムである。
【００６５】
ある態様において、宿主細胞は、自殺遺伝子をさらに含むことができる。
【００６６】
ある態様におけるものは、本明細書に記載される少なくとも1つの宿主細胞を含む細胞の集団である。
【００６７】
ある態様におけるものは、本明細書に記載される免疫細胞又は宿主細胞を含む医薬組成物である。
【００６８】
ある態様におけるものは、哺乳動物におけるVEGFR-2を発現する癌を治療又は予防する方法であって、本明細書に記載される免疫細胞又は宿主細胞を、該哺乳動物に、該哺乳動物における癌を治療又は予防するのに有効な量で投与することを含む、方法である。ある態様において、腫瘍は、固形腫瘍である。ある態様において、癌は、膵癌、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、胃癌、肝細胞癌、卵巣癌、又は膀胱癌である。
【００６９】
ある態様におけるものは、対象におけるVEGFR-2発現腫瘍の成長を減少させるか、又はそのサイズを低下させる方法であって、VEGFR-2に特異的なCAR-Tを含む組成物を投与することを含む、方法である。
【００７０】
ある態様におけるものは、対象におけるVEGFR-2発現腫瘍の血管新生を減少させる方法であって、VEGFR-2に特異的なCAR-Tを含む組成物を投与することを含む、方法である。
【００７１】
本発明のさらなる態様は、次の通りである。
【００７２】
本発明の態様によるものは、VEGFR-2、そのエピトープもしくは断片、又はこれらの変異体に結合するキメラ抗原受容体(CAR)である。
【００７３】
本発明のさらなる態様によれば、CARは、VEGFR-2への結合のための単一ドメイン抗体又はその断片を含む。
【００７４】
本発明の態様によれば、CARは、ラクダ科種の単一ドメイン抗体又はその断片を含む。
【００７５】
本発明の態様によれば、CARは、VEGFR-2のエピトープに結合する。
【００７６】
本発明の態様によれば、CARは、配列番号1に見られるエピトープに結合する。
【００７７】
本発明の態様によれば、CARは、相補性決定領域(CDR) 1; CDR2;及び/又はCDR3を含み、ここで、CDR1、CDR2、及びCDR3のうちの少なくとも1つは、VEGFR-2に結合する。
【００７８】
本発明の態様によれば、CARは、配列番号78の配列、又はそれと少なくとも90％同一の配列を含む。
【００７９】
本発明の態様によれば、CARは、スペーサー分子、膜貫通領域、並びにヒトCD8-αタンパク質、ヒトCD28タンパク質、ヒトCD3-ζタンパク質、ヒトFcRyタンパク質、CD27タンパク質、OX40タンパク質、ヒト4-IBBタンパク質、前述のもののいずれかの修飾バージョン、及び前述のものの任意の組合せからなる群から選択される1以上の細胞シグナル伝達ドメインをさらに含む。
【００８０】
本発明の態様によれば、本発明のCARは、配列番号2〜30もしくは31〜53及びこれらの変異体及び断片、又は配列番号2〜30もしくは配列番号31〜53のいずれか1つと少なくとも85％、少なくとも86％、少なくとも87％、少なくとも88％、少なくとも89％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、もしくは少なくとも95％同一の配列、又は配列番号2〜30もしくは配列番号31〜53のいずれか1つと実質的に同一の配列からなる群から選択される配列を含む。
【００８１】
本発明の態様によれば、CARは、配列番号54〜65のいずれか1つ及びその変異体からなる群から選択されるリンカー配列をさらに含むことができる。
【００８２】
本発明のCARのある態様において、リンカー配列は、C-末端システインをさらに含むことができ、さらなる態様において、配列番号66〜69から選択される。これらのリンカー配列と同様の配列を本明細書において使用することができる。例えば、KKは、好適なリンカー配列であり、かつ配列番号54〜69の配列のいずれか1つを含むものである。
【００８３】
本発明のある態様において、リンカー配列は、
【化１】
2020504623.tif 000003
及びその変異体を含む。
【００８４】
本発明の態様によるものは、本明細書に記載されるCARを含む免疫細胞である。
【００８５】
本発明の態様によれば、免疫細胞は、T細胞又はサイトカイン誘導性キラー(CIK)細胞である。
【００８６】
本発明のさらなる態様によれば、免疫細胞は、少なくとも第二のCARをさらに含む。
【００８７】
本発明のある態様において、免疫細胞は、任意に過剰に活性のあるトランスポゾン/トランスポザーゼシステムをさらに含む。ある態様において、該トランスポゾン/トランスポザーゼシステムは、スリーピングビューティートランスポゾン/トランスポザーゼシステムである。他の態様において、該トランスポゾン/トランスポザーゼシステムは、SB100Xトランスポゾン/トランスポザーゼシステムである。
【００８８】
本発明のある態様において、免疫細胞は、自殺遺伝子をさらに含む。
【００８９】
本発明のある態様において、本発明のCARを含む免疫細胞は、医薬担体、希釈剤、及び/又は賦形剤を含む組成物へと製剤化される。
【００９０】
本発明の態様によるものは、キメラ抗原受容体(CAR)をコードする核酸分子であり、ここで、該CARは、VEGFR-2結合部分及び免疫細胞活性化部分を含み、ここで、該VEGFR-2結合部分は、VEGFR-2又はその変異体もしくは断片に結合する。
【００９１】
本発明のある態様において、VEGFR-2結合部分は、VEGFR-2又はその変異体もしくは断片に対するモノクローナル抗体又はその抗原結合部分を含む。ある態様において、VEGFR-2結合部分は、該モノクローナル抗体の可変領域を含む。
【００９２】
本発明の態様によれば、免疫細胞活性化部分は、以下のタンパク質:ヒトCD8-αタンパク質、ヒトCD28タンパク質、ヒトCD3-ζタンパク質、ヒトFcRyタンパク質、CD27タンパク質、OX40タンパク質、ヒト4-IBBタンパク質、及びこれらの変異体又は断片のうちのいずれか1つ又は複数のT-細胞シグナル伝達ドメインを含む。
【００９３】
本発明の態様によれば、核酸分子は、配列番号31〜53のうちの少なくとも1つの核酸配列及び/又は配列番号1の配列に結合する核酸配列を含む。
【００９４】
本発明の態様によるものは、キメラ抗原受容体(CAR)の一方又は両方のポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であり、ここで、該CARは、N-末端からC-末端の順に:
i)VEGFR-2に特異的な抗原結合単一ドメイン抗体;
ii)膜貫通ドメイン;
iii)共刺激ポリペプチド(ここで、該共刺激ポリペプチドは、4-1BBポリペプチド及び/又はOX-40ポリペプチドである);並びに
iv)細胞内シグナル伝達ドメイン
を含む。
【００９５】
本発明のある態様において、第一のポリペプチドは、単一ドメイン抗体と膜貫通ドメインの間に配置されたヒンジ領域を含む。
【００９６】
本発明のある態様において、該ヒンジ領域は、免疫グロブリンIgGヒンジ領域又はCD8に由来するヒンジである。
【００９７】
本発明のある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ(ITAM)を含む。
【００９８】
本発明のある態様において、ITAMを含む細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3-ζ及びZAP70から選択される。
【００９９】
本発明のある態様において、ヌクレオチド配列は、T-細胞特異的プロモーターに機能的に連結されている。
【０１００】
本発明のある態様において、ヌクレオチド配列は、NK細胞特異的プロモーターに機能的に連結されている。
【０１０１】
本発明のある態様において、核酸分子は、配列番号79を含む。
【０１０２】
本発明の態様におけるものは、配列番号79の核酸配列によってコードされるキメラ抗原受容体(CAR)である。
【０１０３】
本発明のある態様において、本発明のCARは、配列番号2〜30のうちのいずれか1つのアミノ酸配列並びにその断片及び変異体を含む。
【０１０４】
本発明の態様におけるものは、配列番号31〜53のうちのいずれか1つの核酸分子を含むベクターである。
【０１０５】
本発明の態様によるものは、配列番号79の核酸分子又は配列番号78のCARを発現する宿主細胞である。
【０１０６】
本発明のある態様において、宿主細胞は、免疫細胞である。ある態様において、宿主細胞は、T-細胞及びサイトカイン誘導性キラーCIK細胞からなる群から選択される。
【０１０７】
本発明のある態様において、宿主細胞は、少なくとも第二のCARをさらに含む。
【０１０８】
ある態様において、本発明の宿主細胞は、任意に過剰に活性のあるトランスポゾン/トランスポザーゼシステムをさらに含む。ある態様において、該トランスポゾン/トランスポザーゼシステムは、スリーピングビューティートランスポゾン/トランスポザーゼシステムである。ある態様において、該トランスポゾン/トランスポザーゼシステムは、SB100Xトランスポゾン/トランスポザーゼシステムである。
【０１０９】
本発明のある態様において、本発明の宿主細胞は、自殺遺伝子をさらに含む。
【０１１０】
本発明の態様によるものは、VEGFR-2に対するCARを含む本発明の少なくとも1つの宿主細胞を含む細胞の集団である。
【０１１１】
本発明の態様によるものは、VEGFR-2に対するCARを含む宿主細胞又は免疫細胞を含む医薬組成物である。
【０１１２】
本発明の態様によるものは、哺乳動物における癌を治療又は予防する方法であって、VEGFR-2に対するCARを含む免疫細胞又は宿主細胞を、該哺乳動物に、該哺乳動物における癌を治療又は予防するのに有効な量で投与することを含む、方法である。
【０１１３】
本発明のある態様において、癌は、VEGFR-2を発現する癌である。
【０１１４】
本発明のある態様において、癌は、固形腫瘍である。
【０１１５】
本発明の態様によるものは、腫瘍における血管新生を低下させる方法であって、VEGFR-2に対するCARを含む免疫細胞又は宿主細胞を、該哺乳動物に、血管新生を低下させるのに有効な量で投与することを含む、方法である。
【０１１６】
本発明のさらなる態様によれば、シグナルペプチド-VHH-CD8ヒンジ-CD28-4-1BB-CD3ζ-T2A-EGFRtを含む構造を有し、かつ配列番号79の核酸配列を有するCARカセットである。
【０１１７】
本発明の態様によるものは、シグナルペプチド-VHH-CD8ヒンジ-CD28-4-1BB-CD3ζ-T2A-EGFRtを含む構造及び配列番号78のアミノ酸配列を有するCARカセットである。
【０１１８】
本発明のある態様において、CD8α膜貫通ドメイン、CD8αヒンジドメイン、4-1BB共刺激シグナル伝達領域、及びCD3ζシグナル伝達ドメインは、U.S.9,518,123号(その開示は、引用により完全に本明細書中に組み込まれる)に示されているような核酸配列によってコードされることができる。
【０１１９】
本発明の態様によるものは、キメラ抗原受容体(CAR)をコードする核酸配列を含むヒトT細胞であり、ここで、該CARは、VEGFR-2抗原結合ドメインを含み、ここで、該CARは、膜貫通ドメイン、4-1BB共刺激シグナル伝達領域、及びCD3ζシグナル伝達ドメインをさらに含み、ここで、該T細胞は、癌を有するヒト由来のものである。ある態様において、該ヒトT細胞は、ヒトを抗ウイルス剤、化学療法、放射線、免疫抑制剤、及び抗体からなる群から選択されるモダリティで治療する前に、ヒトから取得された血液試料から単離される。
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
(図面の簡単な説明)
本明細書に記載される典型的な態様の以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むと、より良く理解されるであろう。本発明を例示する目的のために、現在典型的である態様が図面に示されている。しかしながら、本発明は、図面に示された態様の正確な配置及び手段に限定されないことが理解されるべきである。
【図１】図1は、AB1(配列番号2)、AB2(配列番号11)、AB3(配列番号19)、及びAB4(配列番号25)のサイズ排除カラムクロマトグラムを示している。
【図２】図2は、ヒトVEGFR-2/Fcに対するAB1(配列番号2)、AB2(配列番号13)、AB3(配列番号21)、及びAB4(配列番号27)の結合を示している。
【図３】図3は、ヒトVEGFR-2/Fcに対するAB1(配列番号7)結合の結合反応速度を示している。
【図４】図4は、(a)VEGFR-2に対する本発明の単一ドメイン抗VEGFR-2抗体のエピトープマッピング、並びに(b)AB1(配列番号2)、AB2(配列番号13)、AB3(配列番号23)、及びAB4(配列番号27)についてのエピトープの重なり合う結合を示している。
【図５】図5は、VEGFR-1、VEGFR-2、及びVEGFR-3に対するAB1m(配列番号9)、AB2(配列番号13)、AB3m(配列番号23)、及びAB4(配列番号27)の抗体結合及び交差反応性を示している。4つ全ての単一ドメイン抗体を用いて、ウレアーゼ(「DOS47」)コンジュゲートを作製した。これらのコンジュゲートを、抗原VEGFR-2に結合するその能力、そして同じく、VEGFR-1及びVEGFR-3と交差反応するその能力について、ELISAにより試験した。4つ全ての抗体コンジュゲートは、組換えVEGFR2/Fcに結合し、最も強い結合は、リャマ抗体コンジュゲートで認められた(図2で決定されたKD値と一致している)。全ての抗体がVEGFR1/Fcとのある程度の交差反応性を示している。該抗体のいずれかによるVEGFR3/Fcとの検出可能な結合は見られなかった。
【図６】図6は、AB1(配列番号2)、AB2(配列番号13)、AB3(配列番号23)、及びAB4(配列番号27)についてのVEGF競合アッセイの結果を示している。これは、これらの抗体がVEGF結合ポケット付近の領域を認識するかどうかを評価するために行われた。抗体-ウレアーゼコンジュゲートをVEGFと種々の異なるモル比で混合し、その後、ELISAプレート上に捕捉されたVEGFR2/Fcとの結合について試験した。2つのヒト抗体コンジュゲート(AB2-(配列番号13)及びAB3-(配列番号21) DOS47)とVEGFR2との結合はVEGFによって阻害され、これらの抗体とVEGFが重なり合う部位で結合することが示唆された。AB1-DOS47の結合は、VEGFによって最小限にしか影響されず、AB1抗体とVEGFが異なる部位に結合することが示唆された。興味深いことに、AB4-DOS47とVEGFR2との結合は、VEGFの存在によって増強され、AB4抗体がVEGFR2のみよりもVEGF/VEGFR2複合体と良好に結合することが示唆された。
【図７】図7は、4つのカップリングされていない抗体(配列番号7、13、21、及び27)(又は陰性対照としての抗CEACAM6)の各々と種々の異なるモル比で混合され、その後、ELISAプレート上にコーティングされたVEGFR2/Fcとの結合について試験されたAB1(配列番号9)-DOS47(A)及びAB3(配列番号23)-DOS47(B)抗体-ウレアーゼコンジュゲートを示している。各々の抗体-ウレアーゼコンジュゲートの結合は、対応するカップリングされていない抗体によって阻害された。さらに、AB3-ウレアーゼコンジュゲートは、カップリングされていないAB2抗体によって阻害され、これら2つのヒト抗体が少なくとも部分的に重なり合うエピトープを共有することが示唆された。カップリングされていないAB3抗体も、非常に高いモル比でではあったが、AB1-DOS47の結合を部分的に阻害した。
【図８】図8は、抗体及び抗体-ウレアーゼコンジュゲートと293/KDR細胞(これは、VEGFR2(KDR)を安定発現するようにトランスフェクトされたHEK293細胞である)との結合を示している。293/KDR細胞を抗体又は抗体-ウレアーゼコンジュゲートで染色し、結合をフローサイトメトリーによって検出した。抗体AB1(配列番号6)及びAB2(配列番号18)は、293/KDR細胞上に発現されたVEGFR2に結合する。
【図９】図9は、活性化されていない抗体、1つのクロスリンカーによって活性化された抗体、及び2つのクロスリンカーによって活性化された抗体の分布を示す、クロスリンカーによる活性化及びシステインとの連結の後のV21H1(配列番号3)抗体のデコンボリューション処理された質量スペクトルを示している。
【図１０】図10は、様々なリフォールディング時点でのV21H4(配列番号6)試料のRP-HPLCクロマトグラムを示している。青色の線: SPプール画分をリフォールディング緩衝液と混合した直後のリフォールディング時間0の時点の試料。赤色の線:混合後2時間の時点におけるリフォールディング。緑色の線:時間0から4時間後及び1.2mMシスタミンの添加から2時間後のリフォールディング試料。フォールディングされていない抗体は12.513分で溶出し、フォールディングされた抗体は10.958分で溶出する。
【図１１】図11:(A〜C)BiopharmaLynxによるV21H4(配列番号6)試料のインタクトタンパク質質量スペクトルのスクリーンスナップショット。(A)リフォールディング時にジスルフィド結合を形成することによる2分の1のシスタミンのC-末端システインへの結合を示す、V21H4(配列番号6)のデコンボリューション処理されたスペクトル。(B)C-末端半分-シスタミンの脱離を示す、2mM TCEPによる還元後のV21H4のデコンボリューション処理されたスペクトル。(C)C-末端システインがスルフヒドリル活性化クロスリンカーに接近しやすいことを示す、ヨードアセトアミドによるアルキル化後の還元されたV21H4のデコンボリューション処理されたスペクトル。(D)クロスリンカーによる活性化及びシステインとの連結の後のV21H4のデコンボリューション処理された質量スペクトル。BM(PEG)2によって活性化されたV21H4抗体は、単一の活性化種を生成させる。
【図１２】図12:(A)V21H1-(配列番号3) DOS47及びV21H4-(配列番号6) DOS47のSDS-PAGE。赤で標識された1、2、又は3のバンドは、クラスターの番号である。レーン1:分子量ラダー。レーン2: HPU。レーン3及び4: V21H1-DOS47。レーン5及び6: V21H4-DOS47。(B)V21H1、V21H4、高純度ウレアーゼ(HPU)、V21H1-DOS47、及びV21H4-DOS47のサイズ排除クロマトグラム。
【図１３】図13:(A)ビオチン-V21H4(配列番号6)(黒)、V21H1-DOS47(配列番号3)(緑)、及びV21H4-(配列番号6) DOS47(赤)と組換えVEGFR2/Fcとの結合のELISA。示されている結果は、各々の試料について実施された2〜5回の実験を代表しており、3連で試験された試料の平均及びSEとして提示されている。(B)ビオチン-V21H4(黒)及びV21H4-DOS47(赤)と293/KDR細胞によって発現されたVEGFR2との結合。結合は、フローサイトメトリーによって定量された。示されている結果は、各々の試料について実施された2〜3回の実験を代表しており、2連で試験された試料の平均及びSEとして提示されている。(C)様々な抗体/ウレアーゼコンジュゲーション比でのV21H4-DOS47のウレアーゼ酵素活性。点線は、コンジュゲートされていないウレアーゼ活性を表す。(D)組換えVEGFR2/Fcに結合する様々な抗体-ウレアーゼコンジュゲーション比を有するV21H4-DOS47のELISA。示されている結果は、各々の試料について実施された2回の実験を代表しており、2連で試験された試料の平均及びSEとして提示されている。
【図１４】図14: V21H4(配列番号6)、HPU、及びV21H4-(配列番号6) DOS47のウェスタンブロット。ブロットを、(A)抗リャマ抗体又は(B)抗ウレアーゼ抗体でプロービングした。レーンMW:分子量ラダー。レーン1: V21H4。レーン2: HPU。レーン3及び4: V21H4-DOS47。
【図１５】図15:(A)BiopharmaLynxソフトウェアによって処理されたHPウレアーゼ(上)及びV21H4-(配列番号6) DOS47(下)試料のトリプシン消化物の未加工のLC-MS(TIC)クロマトグラムのスクリーンスナップショット。(B)UC824-BM(PEG)2によって修飾されたV21H4ペプチド
【化２】
2020504623.tif 000004
(上)として及びVC136-BM(PEG)2によって修飾されたウレアーゼペプチド
【化３】
2020504623.tif 000005
(下)としてマッピングされたコンジュゲーション部位UC824-VC136のb/yフラグメントプロファイルのスクリーンスナップショット。
【図１６】図16は、挿入された断片(CARカセット)の分子量を検証するエンドヌクレアーゼ消化の結果を示す制限消化マップである。
【図１７】図17は、レンチウイルスの力価を決定するために使用されたqPCR標準曲線を示している。
【図１８】図18は、CAR発現のFACS検出を示している。
【図１９】図19は、肺細胞(NCI-H23)、乳房細胞(ZR-75-30)、及び白血病細胞(HL-60)におけるインビトロでの抗VEGFR-2 CAR-Tの有効性を示す本発明のCAR-Tによる標的腫瘍細胞の溶解のLDHアッセイを示すグラフである。CON-Tは、非形質導入対照T細胞であり、CAR-T細胞は、本発明のVHH-CAR-T細胞である。
【図２０】図20は、IL-2及びIFN-γアッセイの標準曲線を示すグラフである。
【図２１】図21は、対照T細胞及び本発明のCAR-T細胞によって産生されたIL-2のELISA検出を示すグラフである。
【図２２】図22は、対照T細胞及び本発明のCAR-T細胞によって産生されたIFN-γのELISA検出を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０１２１】
(発明の詳細な説明)
本発明は、癌、例えば、固形腫瘍を治療するための組成物及び方法に関する。本発明は、キメラ抗原受容体(CAR)を発現させるために形質導入されるT細胞の養子細胞移入を取り入れている。
【０１２２】
T細胞は、VEGFR-2を標的とする所望のCARを安定に発現するように遺伝子修飾され、本明細書においてCAR T細胞又はCAR修飾T細胞と呼ばれる。該細胞は、VEGFR-2に対する新規の抗原特異性を付与する、本明細書に記載される新規の抗体結合ドメインをその表面に安定に発現するように遺伝子修飾される。
【０１２３】
一実施態様において、本発明のCARは、抗原認識ドメインを有する細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞質ドメインとを含む。一実施態様において、CAR中のドメインのうちの1つと天然に関連している膜貫通ドメインが使用される。別の実施態様において、該膜貫通ドメインは、アミノ酸置換によって選択又は修飾することができる。細胞質ドメインに関して、本発明のCARは、それ自体でCD28及び/もしくは4-1BBシグナル伝達ドメインを含むように設計することができるか、又は本発明のCARとの関連において有用な任意の他の所望の細胞質ドメインと組み合わせることができる。一実施態様において、CARの細胞質ドメインは、CD3-ζのシグナル伝達ドメインをさらに含むように設計することができる。例えば、CARの細胞質ドメインとしては、CD3-ζ、4-1BB、及びCD28シグナル伝達モジュール、並びにこれらの組合せを挙げることができるが、これらに限定されない。したがって、本発明は、VEGFR-2を発現する癌の治療のための養子療法のためのCAR T細胞及びその使用方法を提供する。
【０１２４】
一実施態様において、本発明のCAR T細胞は、所望のCAR、例えば、抗VEGFR-2、CD8αヒンジ、及び膜貫通ドメイン、並びにヒト4-1BB及びCD3ζシグナル伝達ドメインを含むCARを含むレンチウイルスベクターを細胞に導入することにより作製することができる。本発明のCAR T細胞は、インビボで複製し、持続的な腫瘍制御をもたらし得る長期持続性を結果として生じることができる。
【０１２５】
さらに、リンパ球注入を用いる、癌を有するか又は癌を有するリスクのある患者の治療のためのCARを発現する遺伝子修飾されたT細胞。好ましくは、自己リンパ球注入を治療において使用する。自己PBMCを治療を必要としている患者から収集し、T細胞を、本明細書に記載される及び当技術分野で公知の方法を用いて活性化し、増殖させ、その後、該患者に注入して戻す。
【０１２６】
本発明は、CD3-ζと4-1BB共刺激ドメインの両方を含む抗VEGFR-2 CARを発現するT細胞(CART/VEGFR-2 T細胞とも呼ばれる)の使用を含む。本発明のCART/VEGFR-2 T細胞は、頑健なインビボT細胞増殖を経験することができる。
【０１２７】
(定義)
別途説明されない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び化学的用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。分子生物学における一般的な用語の定義は、Benjamin Lewinの文献、遺伝子V(Genes V)、Oxford University Press刊、1994(ISBN 0-19-854287-9); Kendrewら(編)、分子生物学の百科事典(The Encyclopedia of Molecular Biology)、Blackwell Science Ltd.刊、1994(ISBN 0-632-02182-9);及びRobert A. Meyers(編)、分子生物学及びバイオテクノロジー:包括的卓上参考書(Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference)、VCH Publishers社刊、1995(ISBN 1-56081-569-8)に見出すことができる。本明細書に記載されるものと同様又は同等の任意の方法及び材料を本発明の試験の実施において使用することができるが、典型的な材料及び方法が本明細書に記載されている。本発明の説明及び特許請求において、以下の専門用語を使用することにする。
【０１２８】
本明細書で使用される専門用語は、特定の態様を説明することだけを目的とし、限定することを意図するものではないことも理解されるべきである。
【０１２９】
本出願の範囲を理解する上で、冠詞の「a」、「an」、「the」、及び「said」は、要素の1つ又は複数が存在することを意味することが意図される。
【０１３０】
さらに、本明細書で使用される「含む(comprising)」という用語及びその派生語は、記述された特徴、要素、成分、群、整数、及び/又は工程の存在を指定するが、他の記述されていない特徴、要素、成分、群、整数、及び/又は工程の存在を除外しないオープンエンドの用語であることが意図される。上述のことは、同様の意味を有する語、例えば、「含む(including)」、「有する(having)」という用語、及びこれらの派生語にも当てはまる。
【０１３１】
ある成分を「含む」と記載される態様はいずれも、「からなる」又は「から本質的になる」ことができ、ここで、「からなる」は、クローズエンドの又は制限的な意味を有し、「から本質的になる」は、指定された成分を含むが、不純物として存在する材料、該成分を提供するために使用されるプロセスの結果として存在する回避できない材料、及び本発明の技術的効果を達成すること以外の目的のために添加される成分を除く他の成分を除外することを意味する。例えば、「から本質的になる」という語句を用いて定義される組成物は、任意の既知の医薬として許容し得る添加剤、賦形剤、希釈剤、担体などを包含する。典型的には、1セットの成分から本質的になる組成物は、5重量％未満、典型的には3重量％未満、より典型的には1重量％未満の指定されていない成分を含む。
【０１３２】
含まれていると本明細書で定義される成分はいずれも、但し書き又は消極的限定として請求される発明から明示的に除外され得ることが理解される。さらに、本明細書で与えられる全ての範囲は、明示的に記述されているかどうかに関係なく、該範囲の終端、そしてまた、任意の中間範囲点を含む。
【０１３３】
本明細書で使用される「実質的に」、「約(about)」、及び「約(approximately)」などの程度に関する用語は、最終結果が有意には変化しないような修飾された用語の妥当な偏差量を意味する。これらの用語は、例えば、量、期間などの測定可能な値を指すことができ、指定された値からの±20％又は±10％、より典型的には±5％、一層より典型的には±1％、さらにより典型的には±0.1％のばらつきが、開示された方法を実施するのに適しているので、そのようなばらつきを包含することが意図される。
【０１３４】
本明細書で使用される「活性化」は、検出可能な細胞性増殖を誘導するために十分に刺激されている免疫細胞、例えば、CIK細胞又はT細胞の状態を指す。活性化は、サイトカイン産生の誘導、及び検出可能なエフェクター機能とも関連し得る。「活性化T細胞」という用語は、とりわけ、細胞分裂を経ているT細胞を指す。
【０１３５】
核酸又はポリペプチドに対して与えられる、全ての塩基サイズ又はアミノ酸サイズ、及び全ての分子量又は分子質量値は近似値であり、かつ説明のために提供されることがさらに理解される。本明細書に記載されるものと同様又は同等の方法及び材料を本開示の実施又は試験において使用することができるが、好適な方法及び材料が以下で記載されている。「例えば(e.g.)」という略語は、ラテン語の例えば(exempli gratia)に由来し、非限定的な例を示すために本明細書で使用される。したがって、「例えば(e.g.)」という略語は、「例えば(for example)」という用語と同義である。文脈上、別途明確に示されない限り、「又は」という語は、「及び」を含むことが意図される。
【０１３６】
本明細書で使用される、当技術分野で「免疫グロブリン」(Ig)とも呼ばれる、「抗体」という用語は、対になった重ポリペプチド鎖と軽ポリペプチド鎖から構築されるタンパク質を指し; IgA、IgD、IgE、IgG、及びIgMを含む、様々なIgアイソタイプが存在する。抗体が正確にフォールディングされると、各々の鎖は、より線状のポリペプチド配列によって接続されたいくつかの異なる球状ドメインへとフォールディングする。例えば、免疫グロブリン軽鎖は、可変(VL)及び定常(CL)ドメインへとフォールディングし、一方、重鎖は、可変(VH)及び3つの定常(CH、CH2、CH3)ドメインへとフォールディングする。重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメイン(VHとVL)の相互作用は、抗原結合領域(Fv)の形成をもたらす。各々のドメインは、当業者によく知られている十分に確立された構造を有する。
【０１３７】
軽鎖及び重鎖可変領域は標的抗原との結合に関与し、それゆえ、抗体間で顕著な配列多様性を示すことができる。定常領域は、より少ない配列多様性を示し、重要な免疫学的事象を誘発するいくつかの天然タンパク質との結合に関与する。抗体の可変領域は分子の抗原結合決定基を含有し、したがって、その標的抗原に対する抗体の特異性を決定する。配列可変性の大部分は可変重鎖及び軽鎖1つ当たり3つずつの6つの超可変領域で生じ;該超可変領域が組み合わさって、抗原結合部位を形成し、抗原性決定基の結合及び認識に寄与する。その抗原に対する抗体の特異性及び親和性は、超可変領域の構造、並びにそのサイズ、形状、及びそれが抗原に提示する表面の化学的性質によって決定される。超可変領域の同定のための様々なスキームが存在し、2つの最も一般的なものは、KabatのスキームとChothia及びLeskのスキームである。Kabatらの文献(1991a;1991b)は、VH及びVLドメインの抗原結合領域における配列可変性に基づいて「相補性決定領域」(CDR)を定義している。Chothia及びLeskの文献(1987)は、VH及びVLドメイン中の構造ループ領域の位置に基づいて「超可変ループ」(H又はL)を定義している。これらの個々のスキームは、隣接しているか又は重なり合っているCDR及び超可変ループ領域を定義しているので、抗体分野の専門家は、「CDR」及び「超可変ループ」という用語を互換的に使用することが多く、かつこれらの用語は、本明細書でそのように使用することができる。この理由から、抗原結合部位を形成する領域は、VH及びVLドメインを含む抗体の場合、CDR L1、CDR L2、CDR L3、CDR H1、CDR H2、CDR H3と呼ばれ;又は重鎖もしくは軽鎖のいずれかの抗原結合領域の場合、CDR1、CDR2、CDR3と呼ばれる。CDR/ループは、可変ドメインの比較を容易にするために開発されたIMGT付番体系に準拠して、本明細書で言及されている(Lefrancらの文献、2003)。この体系では、保存されたアミノ酸(例えば、Cys23、Trp41、Cys 104、Phe/Trp 118、及び位置89の疎水性残基)は、常に同じ位置を有する。さらに、フレームワーク領域(FR1:位置1〜26; FR2: 39〜55; FR3: 66〜104;及びFR4: 118〜128)並びにCDR(CDR1: 27〜38、CDR2: 56〜65;及びCDR3: 105〜117)の標準化された境界が提供されている。
【０１３８】
本明細書で言及される「抗体断片」は、当技術分野で公知の任意の好適な抗原結合抗体断片を含み得る。抗体断片は、天然に存在する抗体断片であってもよいし、又は天然に存在する抗体の操作によってもしくは組換え法の使用によって得られてもよい。例えば、抗体断片は、Fv、単鎖Fv(scFv;ペプチドリンカーで接続されたVLとVHからなる分子)、Fab、F(ab')2、単一ドメイン抗体(sdAb;単一のVL又はVHから構成される断片)、及びこれらのいずれかの多価提示を挙げることができるが、これらに限定されない。配列番号2〜30のいずれか1つの抗体断片は、VEGFR-2に結合する生物学的活性を保持することが当業者によって理解されるものである。
【０１３９】
本明細書で使用される「合成抗体」という用語は、例えば、本明細書に記載されるバクテリオファージによって発現される抗体などの、組換えDNA技術を用いて作製される抗体を意味する。この用語はまた、抗体をコードするDNA分子の合成によって作製され、かつこのDNA分子が、抗体タンパク質、又は抗体を指定するアミノ酸配列を発現させ、ここで、このDNA配列又はアミノ酸配列が、当技術分野で利用可能でありかつ周知である合成DNA又はアミノ酸配列技術を用いて得られたものである、抗体を意味するものと解釈されるべきである。
【０１４０】
非限定的な例において、抗体断片は、天然に存在する源に由来するsdAbであってもよい。ラクダ科動物起源の重鎖抗体(Hamers-Castermanらの文献、1993)は軽鎖を欠いており、したがって、その抗原結合部位は、VHHと呼ばれる1つのドメインからなる。sdAbは、サメでも認められており、VNARと呼ばれる(Nuttallらの文献、2003)。他のsdAbは、ヒトIg重鎖及び軽鎖配列に基づいて人工的に作製することができる(Jespersらの文献、2004; Toらの文献、2005)。本明細書で使用される場合、「sdAb」という用語は、任意の起源のVH、VHH、VL、又はVNARリザーバーからファージディスプレイ又は他の技術によって直接単離されたsdAb、前述のsdAbから誘導されたsdAb、組換え産生されたsdAb、及びヒト化、親和性成熟、安定化、可溶化、例えば、ラクダ化、又は他の抗体エンジニアリングの方法によるそのようなsdAbのさらなる修飾によって作製されたsdAbを含む。また本発明によって包含されるのは、sdAbの抗原結合機能及び特異性を保持するホモログ、誘導体、又は断片である。
【０１４１】
sdAbは、高い熱安定性、高い洗剤耐性、比較的高いプロテアーゼ耐性(Dumoulinらの文献、2002)、及び高い生産収率(Arbabi-Ghahroudiらの文献、1997)を有し;これは、免疫ライブラリーからの単離によって(Liらの文献、2009)又はインビトロ親和性成熟(Davies及びRiechmannの文献、1996)によって、非常に高い親和性を有するように改変することもできる。
【０１４２】
当業者であれば、単一ドメイン抗体の構造に精通しているであろう(例えば、Protein Data Bankの3DWT、2P42を参照)。sdAbは、免疫グロブリンフォールドを保持する単一の免疫グロブリンドメインを含み;中でも特に、わずか3つのCDRで抗原結合部位を形成する。しかしながら、当業者によって理解されるように、全てのCDRが抗原との結合に必要とされ得るわけではない。例えば、限定することを望むものではないが、CDRのうちの1つ、2つ、又は3つが、本発明のsdAbによる抗原の結合及び認識に寄与し得る。sdAb又は可変ドメインのCDRは、本明細書では、CDR1、CDR2、及びCDR3と呼ばれ、Kabatらの文献(1991b)によって定義されている通りに付番されている。
【０１４３】
エピトープ:抗原決定基。エピトープは、抗原性である、すなわち、特異的な免疫応答を誘発する分子上の特定の化学基又はペプチド配列である。抗体は、例えば、ポリペプチド上の特定の抗原性エピトープに特異的に結合する。エピトープは、隣接するアミノ酸又はタンパク質の三次フォールディングによって並置される隣接していないアミノ酸の両方から形成されることができる。隣接するアミノ酸から形成されるエピトープは、典型的には、変性溶媒に曝露したときに保持されるが、三次フォールディングによって形成されるエピトープは、典型的には、変性溶媒で処理したときに消失する。エピトープは、固有の空間的配座において、典型的には、少なくとも3つ、より普通には、少なくとも5つ、約9つ、又は8〜10のアミノ酸を含む。エピトープの空間的配座を決定する方法としては、例えば、x線結晶構造解析及び2次元核磁気共鳴が挙げられる。例えば、分子生物学の方法(Methods in Molecular Biology)、第66巻、Glenn E. Morris編(1996)所収の「エピトープマッピングプロトコル(Epitope Mapping Protocols)」を参照されたい。一実施態様において、エピトープは、HLA分子又はDR分子などのMHC分子に結合する。これらの分子は、正確なアンカーアミノ酸が約8〜約10アミノ酸、例えば、9アミノ酸だけ隔てられたペプチドに結合する。
【０１４４】
本明細書で使用される「抗原」又は「Ag」という用語は、免疫応答を誘発する分子と定義される。この免疫応答は、抗体産生、もしくは特異的な免疫適格細胞の活性化のいずれか、又はその両方を伴い得る。当業者は、ほとんど全てのタンパク質又はペプチドを含む、任意の高分子が抗原としての役割を果たし得ることを理解するであろう。さらに、抗原は、組換え又はゲノムDNAから得ることができる。当業者は、この用語が本明細書で使用される場合、免疫応答を誘発するタンパク質をコードするヌクレオチド配列又は部分的なヌクレオチド配列を含む任意のDNAが、それゆえ、「抗原」をコードすることを理解するであろう。さらに、当業者は、抗原が遺伝子の全長ヌクレオチド配列によってのみコードされる必要がないことを理解するであろう。本発明が、限定されないが、複数の遺伝子の部分的なヌクレオチド配列の使用を含むこと、及びこれらのヌクレオチド配列が様々な組合せで配置されて、所望の免疫応答を誘発することはすぐに明らかである。さらに、当業者は、抗原が「遺伝子」によってコードされる必要が全くないことを理解するであろう。抗原は、合成することができるか、又は生物学的試料から得ることができることはすぐに明らかである。そのような生物学的試料としては、組織試料、腫瘍試料、細胞、又は生体液を挙げることができるが、これらに限定されない。
【０１４５】
本明細書で使用される「抗腫瘍効果」又は「癌の治療」という用語は、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞数の減少、腫瘍成長速度の減少、転移数の減少、疾患の安定化、平均余命の増加、又は癌性状態と関連する様々な生理的症状の改善によって表すことができる生物学的効果を指す。「抗腫瘍効果」は、第一に腫瘍の発生の予防における本明細書に記載されるペプチド、ポリヌクレオチド、細胞、及び抗体の能力によって表すこともできる。
【０１４６】
「自己抗原」という用語は、本発明によれば、免疫系によって外来のものであると誤って認識される任意の自己抗原を意味する。自己抗原は、細胞タンパク質、リン酸化タンパク質、細胞表面タンパク質、細胞脂質、核酸、細胞表面受容体を含む糖タンパク質を含むが、これらに限定されない。
【０１４７】
本明細書で使用される場合、「自己」という用語は、後に個体に再導入されることになる同じ個体由来の任意の材料を指すことが意図される。
【０１４８】
「同種異系」は、同じ種の異なる動物に由来する移植片を指す。
【０１４９】
「異種」は、異なる種に由来する移植片を指す。
【０１５０】
「同系」は、同一の個体に由来する移植片を指す。
【０１５１】
「共刺激リガンド」は、この用語が本明細書で使用される場合、T細胞上の同族の共刺激分子に特異的に結合し、それにより、例えば、TCR/CD3複合体とペプチドがローディングされたMHC分子との結合によって提供される一次シグナルに加えて、限定されないが、増殖、活性化、分化などを含む、T細胞応答を媒介するシグナルを提供する、抗原提示細胞(例えば、aAPC、樹状細胞、B細胞など)上の分子を含む。共刺激リガンドとしては、CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、誘導性共刺激リガンド(ICOS-L)、細胞内接着分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、リンホトキシンβ受容体、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、Tollリガンド受容体に結合するアゴニスト又は抗体、及びB7-H3と特異的に結合するリガンドを挙げることができるが、これらに限定されない。共刺激リガンドは、とりわけ、T細胞上に存在する共刺激分子、例えば、限定されないが、CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3と特異的に結合する抗体、及びCD83と特異的に結合するリガンドも包含する。
【０１５２】
「共刺激分子」は、共刺激リガンドと特異的に結合し、それにより、限定されないが、増殖などの、T細胞による共刺激応答を媒介するT細胞上の同族の結合パートナーを指す。共刺激分子としては、MHCクラスI分子、BTLA、及びTollリガンド受容体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５３】
本明細書で使用される「共刺激シグナル」は、TCR/CD3ライゲーションなどの一次シグナルとの組合せで、T細胞増殖及び/又は鍵分子の上方調節もしくは下方調節をもたらすシグナルを指す。
【０１５４】
本明細書で使用される「有効量」は、治療的又は予防的利益をもたらす量を意味する。
【０１５５】
「コードする」は、規定のヌクレオチド(例えば、rRNA、tRNA、及びmRNA)配列又は規定のアミノ酸配列のいずれかを有する、生物学的プロセスにおいて他のポリマー及び高分子の合成のための鋳型として機能する、遺伝子、cDNA、又はmRNAなどのポリヌクレオチド中の特定のヌクレオチド配列の固有の特性、並びにそれから生じる生物学的特性を指す。したがって、遺伝子は、その遺伝子に対応するmRNAの転写及び翻訳が細胞又は他の生物学的システムにおいてタンパク質を産生する場合、タンパク質をコードする。そのヌクレオチド配列がmRNA配列と同一であり、かつ通常、配列表に提供されるコード鎖と、遺伝子又はcDNAの転写のための鋳型として使用される非コード鎖の両方を、タンパク質又はその遺伝子又はcDNAの他の産物をコードしていると言うことができる。
【０１５６】
本明細書で使用される場合、「内在性」は、生物、細胞、組織、もしくはシステムの内部に由来するか、又はこれらの内部で産生される任意の材料を指す。
【０１５７】
本明細書で使用される場合、「外因性」という用語は、生物、細胞、組織、もしくはシステムの外部から導入されるか、又はこれらの外部で産生される任意の材料を指す。
【０１５８】
本明細書で使用される「発現」という用語は、そのプロモーターによって駆動される特定のヌクレオチド配列の転写及び/又は翻訳と定義される。
【０１５９】
「発現ベクター」は、発現されることになるヌクレオチド配列と機能的に連結された発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現ための十分なシス作用エレメントを含み;発現のための他のエレメントは、宿主細胞によって又はインビトロ発現系で供給されることができる。発現ベクターとしては、組換えポリヌクレオチドを組み込む、当技術分野で公知の全てのもの、例えば、コスミド、プラスミド(例えば、裸のもの又はリポソームに含まれるもの)、並びにウイルス(例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス)が挙げられる。
【０１６０】
「相同」は、2つのポリペプチド間又は2つの核酸分子間の配列類似性又は配列同一性を指す。2つの比較される配列の両方における位置が同じ塩基又はアミノ酸モノマーサブユニットによって占められている場合、例えば、2つのDNA分子の各々の位置がアデニンによって占められている場合、これらの分子はその位置において相同である。2つの配列間の相同性のパーセントは、この2つの配列によって共有される一致する又は相同な位置の数を比較される位置の数で除したものに100を乗じる関数である。例えば、2つの配列中の10個の位置のうちの6個の位置が一致するか又は相同である場合、この2つの配列は60％相同である。例として、DNA配列
【化４】
2020504623.tif 000006
は50％の相同性を共有する。通常、比較は、2つの配列が最大の相同性を生じるように整列されたときに行われる。
【０１６１】
「単離された」は、天然の状態から改変されたか又は取り出されたことを意味する。例えば、生きている動物中に天然に存在する核酸又はペプチドは、「単離された」ものではないが、その天然の状態の共存する材料から部分的に又は完全に分離された同じ核酸又はペプチドは、「単離された」ものである。単離された核酸又はタンパク質は、実質的に精製された形態で存在することができるか、又は例えば、宿主細胞などの非天然の環境中に存在することができる。
【０１６２】
本発明との関連において、普通に存在する核酸塩基に対する以下の略語が使用される。「A」はアデノシンを指し、「C」はシトシンを指し、「G」はグアノシンを指し、「T」はチミジンを指し、「U」はウリジンを指す。
【０１６３】
別途規定されない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いの縮重バージョンである全てのヌクレオチド配列及び同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列を含む。タンパク質又はRNAをコードするヌクレオチド配列という語句は、該タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、あるバージョンにおいて、イントロンを含有し得る限り、イントロンも含み得る。
【０１６４】
本明細書で使用される「レンチウイルス」は、レトロウイルス科(Retroviridae)ファミリーの属を指す。レンチウイルスは、非分裂細胞に感染することができるという点において、レトロウイルスの間でも独特であり;それは、宿主細胞のDNAにかなりの量の遺伝情報を送達することができるので、遺伝子送達ベクターの最も効率的な方法のうちの1つである。HIV、SIV、及びFIVが、レンチウイルスの全ての例である。レンチウイルスに由来するベクターは、インビボで顕著な遺伝子転移レベルを達成する手段を提供する。
【０１６５】
「トランスポゾン」又は「転移因子」は、ゲノム内でのその位置を変化させ、時に、突然変異を作出し又は復帰させ、かつ細胞のゲノムサイズを変化させることができるDNA配列である。転移は、多くの場合、トランスポゾンの重複をもたらす。2つの異なるタイプのトランスポゾンがあり:クラスIIトランスポゾンは、直接あちこち移動するDNAからなり;クラスIトランスポゾンは、まずDNAをRNAに転写し、その後、逆転写酵素を用いて、該RNAのDNAコピーを作製して、新しい場所に挿入するレトロトランスポゾンである。トランスポゾンは、典型的には、トランスポゾンの移動を媒介するトランスポザーゼと相互作用する。トランスポゾン/トランスポザーゼシステムの非限定的な例としては、スリーピングビューティー、ピギーバック(Piggybac)、フロッグプリンス(Frog Prince)、及びプリンスチャーミング(Prince Charming)が挙げられる。
【０１６６】
本明細書で使用される「調節する」という用語は、治療もしくは化合物の非存在下での対象における応答のレベルと比較した、及び/又はその他の点は同一であるが、治療を受けていない対象における応答のレベルと比較した、対象における応答のレベルの検出可能な増加又は減少を媒介することを意味する。この用語は、天然のシグナルもしくは応答を混乱させ、かつ/又は天然のシグナルもしくは応答に影響を及ぼし、それにより、対象、典型的には、ヒトにおける有益な治療的応答を媒介することを包含する。
【０１６７】
「機能的に連結された」という用語は、異種核酸配列の発現をもたらす調節配列と異種核酸配列の間の機能的な連結を指す。例えば、第一の核酸配列が第二の核酸配列と機能的な関係に置かれているとき、該第一の核酸配列は、該第二の核酸配列と機能的に連結されている。例えば、プロモーターがコード配列の転写又は発現に影響を及ぼす場合、該プロモーターは、該コード配列と機能的に連結されている。通常、機能的に連結されたDNA配列は隣接しており、2つのタンパク質コード領域を繋ぐ必要がある場合、同じリーディングフレーム中にある。
【０１６８】
「過剰発現された」腫瘍抗原又は腫瘍抗原の「過剰発現」という用語は、患者の特定の組織又は器官由来の正常な細胞における発現のレベルと比べた、その組織又は器官内の固形腫瘍のような疾患領域由来の細胞における腫瘍抗原の異常な発現のレベルを示すことが意図される。腫瘍抗原の過剰発現を特徴とする固形腫瘍又は血液悪性腫瘍を有する患者は、当技術分野で公知の標準的なアッセイによって決定することができる。
【０１６９】
免疫原性組成物の「非経口」投与には、例えば、皮下(s.c.)、静脈内(i.v.)、筋肉内(i.m.)、もしくは胸骨内注射、又は点滴法が含まれる。
【０１７０】
本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドの鎖と定義される。さらに、核酸は、ヌクレオチドのポリマーである。したがって、本明細書で使用される核酸及びポリヌクレオチドは互換的なものである。当業者は、核酸がポリヌクレオチドであり、このポリヌクレオチドを加水分解して、モノマーの「ヌクレオチド」にすることができるという一般的な知識を有している。モノマーのヌクレオチドを加水分解して、ヌクレオシドにすることができる。本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドには、限定されないが、組換え手段、すなわち、通常のクローニング技術及びPCRなどを用いる組換えライブラリー又は細胞ゲノムからの核酸配列のクローニング、並びに合成手段によるものを含む、当技術分野で利用可能な任意の手段によって得られる全ての核酸配列が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７１】
本明細書で使用される場合、「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、互換的に使用されており、ペプチド結合によって共有結合したアミノ酸残基から構成される化合物を指す。タンパク質又はペプチドは、少なくとも2つのアミノ酸を含有しなければならず、かつタンパク質又はペプチドの配列を含むことができるアミノ酸の最大数に制限は置かれない。ポリペプチドには、ペプチド結合によって互いに接続された2以上のアミノ酸を含む任意のペプチド又はタンパク質が含まれる。本明細書で使用される場合、この用語は、一般に、当技術分野において、例えば、ペプチド、オリゴペプチド、及びオリゴマーとも呼ばれている短い鎖と、一般に、当技術分野において、多くの種類がある、タンパク質と呼ばれている長い鎖の両方を指す。「ポリペプチド」には、とりわけ、例えば、生物学的に活性のある断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドの変異体、修飾ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質が含まれる。ポリペプチドには、天然ペプチド、組換えペプチド、合成ペプチド、又はこれらの組合せが含まれる。
【０１７２】
本明細書で使用される「プロモーター」という用語は、ポリヌクレオチド配列の特異的な転写を開始するために必要とされる、細胞の合成装置、又は導入された合成装置によって認識されるDNA配列と定義される。
【０１７３】
本明細書で使用される場合、「プロモーター/調節配列」という用語は、プロモーター/調節配列に機能的に連結された遺伝子産物の発現に必要とされる核酸配列を意味する。ある場合には、この配列は、コアプロモーター配列であることができ、他の場合には、この配列は、エンハンサー配列及び遺伝子産物の発現に必要とされる他の調節エレメントを含むこともできる。プロモーター/調節配列は、例えば、遺伝子産物を組織特異的な様式で発現させるものであることができる。
【０１７４】
「構成的」プロモーターは、遺伝子産物をコード又は指定するポリヌクレオチドと機能的に連結された場合、細胞のほとんど又は全ての生理的条件下で、該遺伝子産物を細胞内で産生させるヌクレオチド配列である。
【０１７５】
「誘導性」プロモーターは、遺伝子産物をコード又は指定するポリヌクレオチドと機能的に連結された場合、実質的には、プロモーターに対応する誘導因子が細胞内に存在する場合にのみ、該遺伝子産物を細胞内で産生させるヌクレオチド配列である。
【０１７６】
「組織特異的」プロモーターは、遺伝子によってコード又は指定されるポリヌクレオチドと機能的に連結された場合、実質的には、細胞がプロモーターに対応する組織型の細胞である場合にのみ、該遺伝子産物を細胞内で産生させるヌクレオチド配列である。
【０１７７】
抗体に関して本明細書で使用される「特異的に結合する」という用語は、特異的抗原を認識するが、試料中の他の分子を実質的に認識することも、それに結合することもない抗体を意味する。例えば、1つの種に由来する抗原に特異的に結合する抗体は、1以上の種に由来するその抗原にも結合し得る。しかし、そのような異種間反応性は、特異的とする抗体の分類をそれ自体で変更するものではない。別の例において、抗原に特異的に結合する抗体は、該抗原の異なるアレル形態にも結合し得る。しかしながら、そのような交差反応性は、特異的とする抗体の分類をそれ自体で変更するものではない。場合により、「特異的結合」又は「特異的に結合する」という用語を、抗体、タンパク質、又はペプチドと第二の化学種との相互作用に関して用いて、該相互作用が、化学種上の特定の構造(例えば、抗原性決定基又はエピトープ)の存在に依存し;例えば、抗体が、タンパク質全体ではなく、特異的なタンパク質構造を認識し、それに結合することを意味することができる。抗体がエピトープ「A」に特異的である場合、標識された「A」と抗体とを含有する反応におけるエピトープA(又は遊離の標識されていないA)を含有する分子の存在は、該抗体に結合した標識されたAの量を低下させることになる。
【０１７８】
「エピトープ」という用語は、抗体に特異的に結合することができるタンパク質決定基を意味する。エピトープは、通常、アミノ酸又は糖側鎖などの分子の化学的に活性のある表面基(surface grouping)からなり、かつ通常、特異的な三次元構造特徴、及び特異的な電荷特徴を有する。立体構造エピトープと非立体構造エピトープは、後者に対する結合ではなく、前者に対する結合が変性溶媒の存在下で失われるという点において区別される。
【０１７９】
「刺激」という用語は、刺激分子(例えば、TCR/CD3複合体)とその同族リガンドとの結合によって誘導され、それにより、限定されないが、TCR/CD3複合体を介するシグナル伝達などのシグナル伝達事象を媒介する、一次応答を意味する。刺激は、特定の分子の発現の変化、例えば、TGF-βの下方調節、及び/又は細胞骨格構造の再組織化などを媒介することができる。
【０１８０】
「刺激分子」は、この用語が本明細書で使用される場合、抗原提示細胞上に存在する同族の刺激リガンドと特異的に結合するT細胞上の分子を意味する。
【０１８１】
本明細書で使用される「刺激リガンド」は、抗原提示細胞(例えば、aAPC、樹状細胞、B細胞など)上に存在するとき、T細胞上の同族の結合パートナー(本明細書では「刺激分子」と呼ばれる)と特異的に結合し、それにより、限定されないが、活性化、免疫応答の開始、増殖などを含む、T細胞による一次応答を媒介することができる、リガンドを意味する。刺激リガンドは当技術分野で周知であり、とりわけ、ペプチドをローディングしたMHCクラスI分子、抗CD3抗体、超アゴニスト抗CD28抗体、及び超アゴニスト抗CD2抗体を包含する。
【０１８２】
本明細書で使用される場合、「実質的に純化された」細胞は、他の細胞型を本質的に含まない細胞である。実質的に純化された細胞は、それがその天然に存在する状態で通常関連している他の細胞型から分離されている細胞も指す。いくつかの場合において、実質的に純化された細胞の集団は、均質な細胞集団を指す。他の場合において、この用語は、単に、それがその天然の状態で天然に関連している細胞から分離されている細胞を指す。いくつかの態様において、該細胞は、インビトロで培養される。他の態様において、該細胞は、インビトロで培養されない。
【０１８３】
本明細書で使用される場合、「治療」又は「療法」は、有益な又は所望の臨床結果を得るための手法である。本明細書に記載される目的のために、有益な又は所望の臨床結果には、検出可能か、検出不可能かを問わず、症状の軽減、疾患の度合いの縮小、疾患の安定化した(すなわち、悪化していない)状態、疾患進行の遅延又は減速、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解(部分的であるか、全体的であるかを問わない)が含まれるが、これらに限定されない。「治療」及び「療法」は、治療又は療法を受けていない場合の予想される生存と比較したときの生存の延長を意味することもできる。したがって、「治療」又は「療法」は、障害の病状を変化させる意図を持って行われる介入である。具体的には、治療又は療法は、癌などの疾患もしくは障害の病状を直接予防し、緩徐化し、又はそれ以外の形で減少させることができるか、或いは細胞を他の治療剤による治療又は療法の影響を受けやすい状態にすることができる。
【０１８４】
「治療有効量」、「有効量」、又は「十分量」という用語は、哺乳動物を含む、対象、例えば、ヒトに投与されたとき、所望の結果を達成するのに十分な分量、例えば、癌を治療するのに有効な量を意味する。本明細書に記載される化合物の有効量は、対象の疾患状態、年齢、性別、及び体重などの因子によって異なり得る。当業者によって理解されるように、投薬量又は治療レジメンは、最適な治療応答を提供するように調整することができる。例えば、抗VEGFR-2 sdAbの治療有効量の投与は、ある態様において、腫瘍の進行又は転移と関連する血管の形成を低下させ、阻害し、又は妨害するのに十分である。
【０１８５】
さらに、治療有効量を用いる対象の治療レジメンは、1回の投与からなるか、又はその代わりに、一連の適用を含むことができる。治療期間の長さは、疾患の重症度、対象の年齢、薬剤の濃度、薬剤に対する患者の応答性、又はこれらの組合せなどの、種々の因子によって決まる。治療に使用される薬剤の有効投薬量が特定の治療体制の過程で増減し得ることも理解されるであろう。投薬量の変化が起こり、当技術分野で公知の標準的な診断アッセイによって明らかになり得る。本明細書に記載される抗体は、ある態様において、問題になっている疾患又は障害、例えば、癌に対する従来の療法の前、その間、又はその後に投与することができる。
【０１８６】
本明細書で使用される「トランスフェクトされた」又は「形質転換された」又は「形質導入された」という用語は、外因性核酸が宿主細胞に転移又は導入されるプロセスを指す。「トランスフェクトされた」又は「形質転換された」又は「形質導入された」細胞は、外因性核酸をトランスフェクトされたか、形質転換されたか、又は形質導入された細胞である。該細胞には、初代対象細胞及びその子孫が含まれる。
【０１８７】
本明細書で使用される「転写制御下」又は「機能的に連結された」という語句は、プロモーターが、RNAポリメラーゼによる転写の開始及びポリヌクレオチドの発現を制御するために、ポリヌクレオチドとの関連において正確な場所及び配向にあることを意味する。
【０１８８】
「ベクター」は、単離された核酸を含む物質及び単離された核酸を細胞の内部に送達するために使用することができる物質の組成物である。数々のベクターが当技術分野で公知であり、これには、線状ポリヌクレオチド、イオン性又は両親媒性化合物と関連したポリヌクレオチド、プラスミド、及びウイルスが含まれるが、これらに限定されない。したがって、「ベクター」という用語には、自律複製するプラスミド又はウイルスが含まれる。この用語は、例えば、ポリリジン化合物、リポソームなどの、細胞内への核酸の転移を容易にする非プラスミド及び非ウイルス化合物を含むように解釈されるべきでもある。ウイルスベクターの例としては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８９】
「患者」、「対象」、「個体」などの用語は、本明細書で互換的に使用されており、インビトロのものであるか、又はインサイチュのものであるかを問わず、本明細書に記載される方法に適した、任意の動物、又はその細胞を指す。
【０１９０】
さらに、「患者」、「対象」、及び「個体」という用語は、免疫応答を誘発させることができる生きた生物(例えば、哺乳動物)を含む。ある非限定的な態様において、患者、対象、又は個体は、哺乳動物であり、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、及びこれらのトランスジェニック種を含む。本明細書で使用される「対象」という用語は、動物界の任意のメンバー、典型的には、哺乳動物を指す。「哺乳動物」という用語は、哺乳動物に分類される任意の動物を指し、これには、ヒト、他の高等霊長類、家畜及び農用動物、並びに動物園の動物、スポーツ用動物、又はペット動物、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギなどが含まれる。典型的には、哺乳動物は、ヒトである。
【０１９１】
1以上のさらなる治療剤「と組み合わせた」投与には、同時(並行)投与及び任意の順序での連続した投与が含まれる。
【０１９２】
「医薬として許容し得る」という用語は、化合物又は化合物の組合せが医薬として使用するための製剤の残りの成分と適合すること、及び米国食品医薬品局(United States Food and Drug Administration)によって公布されたものを含む、確立された政府標準に準拠してヒトに投与するのに一般に安全であることを意味する。
【０１９３】
「医薬として許容し得る担体」という用語は、溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤、及び/又は吸収遅延剤などを含むが、これらに限定されない。医薬として許容し得る担体の使用は周知である。
【０１９４】
単離された:「単離された」生物学的成分(例えば、タンパク質)は、該成分が天然に生じる生物の細胞内の他の生物学的成分、すなわち、染色体及び染色体外のDNA及びRNA、他のタンパク質、並びにオルガネラから実質的に分離されているか又は精製されている。「単離された」タンパク質及びペプチドには、標準的な精製法によって精製されたタンパク質及びペプチドが含まれる。この用語は、宿主細胞内での組換え発現によって調製されたタンパク質及びペプチド、並びに化学合成されたタンパク質及びペプチドも含む。
【０１９５】
本明細書に提供される「腫瘍」は、悪性か良性かを問わず、全ての新生物性細胞の成長及び増殖、並びに全ての前癌性及び癌性の細胞及び組織を指す。
【０１９６】
「癌」及び「癌性」という用語は、典型的には、無調節な細胞成長を特徴とする哺乳動物の生理的状態を指し、又は該生理的状態を説明するものである。本明細書で使用される場合、癌又は癌性は、異常な細胞の急速かつ無制御な成長を特徴とする疾患と定義される。癌細胞は、局所的に又は血流及びリンパ系を通って身体の他の部分に広がることができる。様々な癌の例としては、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、皮膚癌、膵癌、結腸直腸癌、腎臓癌、肝臓癌、脳腫瘍、リンパ腫、白血病、肺癌などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９７】
治療されることになる癌は、任意のタイプの悪性腫瘍であってもよく、ある態様において、小細胞肺癌及び非小細胞肺癌(例えば、腺癌)を含む肺癌、膵癌、結腸癌(例えば、結腸直腸癌、例えば、結腸腺癌及び結腸腺腫など)、食道癌、口腔扁平上皮癌、舌癌、胃癌、肝臓癌、鼻咽頭癌、リンパ系の血液腫瘍(例えば、急性リンパ球性白血病、B細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫)、非ホジキンリンパ腫(例えば、マントル細胞リンパ腫)、ホジキン病、骨髄性白血病(例えば、急性骨髄性白血病(AML)もしくは慢性骨髄性白血病(CML))、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病(CLL)、濾胞性甲状腺癌、骨髄異形成症候群(MDS)、間葉起源の腫瘍、軟部組織肉腫、脂肪肉腫、消化管間質肉腫、悪性末梢神経鞘腫(MPNST)、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、間葉性軟骨肉腫、リンパ肉腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、黒色腫、奇形腫、神経芽腫、脳腫瘍、髄芽腫、神経膠腫、皮膚の良性腫瘍(例えば、角化棘細胞腫)、乳癌(例えば、進行性乳癌)、腎臓癌、腎芽腫、卵巣癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、膀胱癌、進行性疾患及びホルモン抵抗性前立腺癌を含む前立腺癌、精巣癌、骨肉腫、頭頸部癌、表皮癌、多発性骨髄腫(例えば、難治性多発性骨髄腫)、又は中皮腫である。一態様において、癌細胞は、固形腫瘍に由来する。典型的には、癌細胞は、乳癌、結腸直腸癌、黒色腫、卵巣癌、膵癌、胃癌、肺癌、又は前立腺癌に由来する。より典型的には、癌細胞は、前立腺癌、肺癌、乳癌、又は黒色腫に由来する。
【０１９８】
「化学療法剤」は、癌の治療において有用な化学的化合物である。化学療法剤の例としては、アルキル化剤、例えば、チオテパ、CYTOXAN(商標)シクロホスファミド;アルキルスルホネート、例えば、ブスルファン、インプロスルファン、及びピポスルファン;アジリジン、例えば、ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、及びウレドーパ;アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド(trietylenephosphoramide)、トリエチレンチオホスホラミド(triethiylenethiophosphoramide)、及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン及びメチラメラミン(methylamelamine);アセトゲニン、例えば、ブラタシン及びブラタシノン;カンプトテシン、例えば、トポテカン;ブリオスタチン;カリスタチン; CC-1065並びにそのアドゼレシン、カルゼレシン、及びビゼレシン合成類似体;クリプトフィシン、例えば、クリプトフィシン1及びクリプトフィシン8;ドラスタチン;デュオカルマイシン、例えば、合成類似体KW-2189及びCB1-TM1;エレウテロビン;パンクラチスタチン;サルコジクチイン;スポンギスタチン;窒素マスタード、例えば、クロラムブシル、クロロナファジン、コロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノブエンビキン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード;ニトロソ尿素、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、及びラニムスチン;抗生物質、例えば、エンジイン抗生物質、例えば、カリケアマイシン、とりわけ、カリケアマイシンγII及びカリケアマイシンωII、ダインマイシンAを含むダインマイシン、ビスホスホネート、例えば、クロドロネート、エスペラマイシン、ネオカルジノスタチン発色団、及び関連色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団;アクラシノマイシン;アクチノマイシン;オースラマイシン;アザセリン;ブレオマイシン;カクチノマイシン;カラビシン;カルミノマイシン;カルジノフィリン;クロモマイシン;ダクチノマイシン;ダウノルビシン;デトルビシン; 6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシン;モルホリノ-ドキソルビシン、シアノモルホリノ-ドキソルビシン、2-ピロリノ-ドキソルビシン、及びデオキシドキソルビシンを含む、ADRIAMYCIN(商標)ドキソルビシン;エピルビシン;エソルビシン;イダルビシン;マルセロマイシン;マイトマイシン、例えば、マイトマイシンC、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、及びゾルビシン;代謝拮抗薬、例えば、メトトレキセート及び5-フルオロウラシル(5-FU);葉酸類似体、例えば、デノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセート;プリン類似体、例えば、フルダラビン、6-メルカプトプリン、チアミプリン、及びチオグアニン;ピリミジン類似体、例えば、アンシタビン、アザシチジン、6-アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、及びフロクスウリジン;アンドロゲン、例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロ���、エピチオスタノール、メピチオスタン、及びテストラクトン;抗副腎薬、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、及びトリロスタン;葉酸補給剤、例えば、フロリン酸(frolinic acid);アセグラトン;アルドホスファミドグリコシド;アミノレブリン酸;エニルウラシル;アムサクリン;ベストラブシル;ビサントレン;エダトラキセート;デホファミン;デメコルシン;ジアジコン;エルフォルニチン(elfornithine);酢酸エリプチニウム;エポチロン;エトグルシド;硝酸ガリウム;ヒドロキシウレア;レンチナン;ロニダイニン;メイタンシノイド、例えば、メイタンシン及びアンサミトシン;ミトグアゾン;ミトキサントロン;モピダンモール(mopidanmol);ニトラエリン;ペントスタチン;フェナメット;ピラルビシン;ロソキサントロン;ポドフィリン酸; 2-エチルヒドラジド;プロカルバジン; PSK(商標)多糖複合体;ラゾキサン;リゾキシン;シゾフィラン;スピロゲルマニウム;テヌアゾン酸;トリアジコン; 2,2',2''-トリクロロトリエチルアミン;トリコテセン、例えば、T-2トキシン、ベラクリンA、ロリジンA、及びアングイジン;ウレタン;ビンデシン;ダカルバジン;マンノムスチン;ミトブロニトール;ミトラクトール;ピポブロマン;ガシトシン;アラビノシド(「Ara-C」);タキソイド、例えば、TAXOL(商標)パクリタキセル、ABRAXANE(商標)パクリタキセルのクレモホール非含有アルブミン操作型ナノ粒子製剤、TAXOTERE(商標)、及びドキセタキセル;クロランブシル(chloranbucil); GEMZAR(商標)ゲムシタビン; 6-チオグアニン;メルカプトプリン;メトトレキセート;白金配位錯体、例えば、シスプラチン、オキサリプラチン、及びカルボプラチン;ビンブラスチン;白金;エトポシド(VP-16);イホスファミド;ビンクリスチン; NAVELBINE(商標)ビノレルビン;ノバントロン;テニポシド;エダトレキセート;ダウノマイシン;アミノプテリン;ゼローダ;イバンドロネート;イリノテカン、例えば、CPT-11;トポイソメラーゼ阻害剤、例えば、RFS 2000;ジフルオロメチルオルニチン(DMFO);レチノイド、例えば、レチノイン酸;カペシタビン;並びに上記のいずれかの医薬として許容し得る塩、酸、又は誘導体が挙げられる。
【０１９９】
またこの定義に含まれるのは、腫瘍に対するホルモン作用を調節もしくは阻害するように作用する抗ホルモン剤、例えば、抗エストロゲン薬及び選択的エストロゲン受容体モジュレーター(SERM)(例えば、タモキシフェン(NOLVADEX(商標)タモキシフェンを含む)、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、4-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケトキシフェン、LY117018、オナプリストン、及びFARESTONトレミフェンを含む);副腎におけるエストロゲン産生を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、例えば、4(5)-イミダゾール、アミノグルテチミド、MEGASE(商標)酢酸メゲストロール、AROMASIN(商標)エキセメスタン、ホルメスタン、ファドロゾール、RIVISOR(商標)ボロゾール、FEMARA(商標)レトロゾール、及びARIMIDEX(商標)アナストロゾールなど;並びに抗アンドロゲン薬、例えば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリン;並びにトロキサシタビン(1,3-ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体);アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に、異常細胞増殖に関係があるシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの、例えば、PKC-α、Ralf、及びH-Rasなど;リボザイム、例えば、VEGF発現阻害剤(例えば、ANGIOZYME(商標)リボザイム)及びHER2発現阻害剤;抗体、例えば、抗VEGF抗体(例えば、AVASTIN(商標)抗体);ワクチン、例えば、遺伝子治療ワクチン、例えば、ALLOVECTIN(商標)ワクチン、LEUVECTIN(商標)ワクチン、及びVAXID(商標)ワクチン; PROLEUKIN(商標) rIL-2; LURTOTECAN(商標)トポイソメラーゼ1阻害剤; ABARELIX(商標) rmRH;並びに上記のいずれかの医薬として許容し得る塩、酸、又は誘導体である。
【０２００】
ある態様において、本明細書に記載される抗体は、他の従来の抗癌治療と相加的に又は相乗的に作用する。
【０２０１】
「変異体」は、比較配列内の1以上のアミノ酸残基の挿入、欠失、修飾、及び/又は置換によって、抗VEGFR-2 sdAbの配列、例えば、配列番号2〜53に記載されているものとは異なるアミノ酸配列を有する生物学的に活性のある抗体又はその断片である。変異体は、通常、比較配列との100％未満の配列同一性を有する。通常、しかしながら、生物学的に活性のある変異体は、比較配列との少なくとも約70％のアミノ酸配列同一性、例えば、少なくとも約71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、又は99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。変異体には、VEGFR-2結合能を保持する少なくとも10アミノ酸のペプチド断片が含まれる。変異体には、1以上のアミノ酸残基が比較配列のN-もしくはC-末端に又は比較配列の内部に付加されているポリペプチドも含まれる。例えば、N-末端の「MQV」は、「MKKQV」と置換することができ、VEGFR-2に対する結合活性を依然として保持する。変異体には、いくつかのアミノ酸残基が欠失し、1以上のアミノ酸残基によって任意に置換されているポリペプチドも含まれる。変異体は、例えば、天然に存在するアミノ酸以外の部分と置換することによるか、又は天然に存在しないアミノ酸を生じるようにアミノ酸残基を修飾することにより、共有結合的に修飾することもできる。
【０２０２】
「パーセントアミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、必要であれば、最大のパーセント配列同一性を達成するためにギャップを導入した後、保存的置換を配列同一性の一部として考慮しないで、対象となる配列、例えば、本発明のポリペプチド中の残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージと本明細書で定義される。候補配列へのN-末端、C-末端、又は内部の伸長、欠失、又は挿入はいずれも、配列同一性又は類似性に影響を及ぼすものとみなされないものとする。アラインメントのための方法及びコンピュータプログラムは、当技術分野で周知であり、例えば、「BLAST」がある。
【０２０３】
本明細書における目的のための「活性のある」又は「活性」は、本明細書に記載されるsdAbの生物学的及び/又は免疫学的活性を指し、ここで、「生物学的」活性は、sdAbに起因する生物学的機能(阻害性又は刺激性のいずれか)を指す。
【０２０４】
したがって、「抗VEGFR-2 sdAb」と併用されるときの「生物学的に活性のある」又は「生物学的活性」は、抗VEGFR-2抗体のエフェクター機能を示すか又は共有する抗VEGFR-2 sdAb又はその断片を意味する。そのような抗体の1つの生物学的活性は、血管形成を少なくとも部分的に阻害するその能力である。
【０２０５】
「阻害する」又は「阻害性」という用語は、VEGFR-2の機能又は活性を減少させる、制限する、遮断する、又は中和することを意味する。これらの用語は、VEGFR-2機能又は活性の完全な又は部分的な阻害を包含する。
【０２０６】
本明細書で使用される場合、「抗VEGFR-2単一ドメイン抗体」は、VEGFR-2に対する特異性を保持する本発明の抗VEGFR-2抗体の修飾を含む。そのような修飾には、限定されないが、エフェクター分子、例えば、化学療法剤(例えば、シスプラチン、タキソール、ドキソルビシン)、又は細胞毒素(例えば、タンパク質もしくは非タンパク質有機化学療法剤)とのコンジュゲーションが含まれる。修飾には、限定されないが、検出可能なレポーター部分とのコンジュゲーションがさらに含まれる。抗体の半減期を延長する修飾(例えば、ペグ化)も含まれる。タンパク質及び非タンパク質剤は、当技術分野で公知である方法によって抗体にコンジュゲートすることができる。コンジュゲーション法は、直接的な連結、共有結合したリンカーによる連結、及び特異的結合対メンバー(例えば、アビジン-ビオチン)を含む。そのような方法には、例えば、ドキソルビシンのコンジュゲーションについての、引用により本明細書中に組み込まれる、Greenfieldらの文献、Cancer Research 50, 6600-6607(1990)に記載されている方法、並びにどちらも引用により本明細書中に組み込まれる、Amonらの文献、Adv. Exp. Med. Biol. 303, 79-90(1991)に記載されている方法及びKiselevaらの文献、MoI. Biol.(USSR)25, 508-514(1991)に記載されている方法が含まれる。
【０２０７】
本発明の抗体又はその断片は、その発現が、限定されないが、乳癌、膵癌、卵巣癌、肺癌、及び結腸癌などの多くの固形腫瘍で上昇しているVEGFR-2に特異的である。
【０２０８】
VEGFR-2(別名、KDR D1〜7、sKDR D1〜7、キナーゼ挿入ドメイン受容体、タンパク質-チロシンキナーゼ受容体Flk-1、CD309、III型受容体チロシンキナーゼ、FLK1)の配列は、限定されないが、配列番号1の配列であってもよい:
【化５】
2020504623.tif 000007
【０２０９】
範囲:本開示の全体を通じて、本明細書に記載される様々な態様は、範囲形式で提示することができる。範囲形式での記載は、単に便宜上及び簡潔性のためのものであり、本明細書に記載される範囲に対する柔軟性のない限定として解釈されるべきではないことが理解されるべきである。したがって、範囲の記載は、全ての可能な部分範囲及びその範囲内の個々の数値を具体的に開示したものとみなされるべきである。例えば、1〜6などの範囲の記載は、例えば、1〜3、1〜4、1〜5、2〜4、2〜6、3〜6などの部分範囲、及びその範囲内の個々の数字、例えば1、2、2.7、3、4、5、5.3、及び6などを具体的に開示したものとみなされるべきである。これは、範囲の幅とは無関係に適用される。
【０２１０】
多くの特許出願、特許、及び刊行物は、記載された態様の理解を助けるために本明細書で参照されている。これらの参考文献の各々は、引用により完全に本明細書中に組み込まれている。
【０２１１】
本発明は、癌、ある態様において、VEGFR-2を発現する固形腫瘍を治療するための組成物及び方法に関する。本発明は、キメラ抗原受容体(CAR)を発現させるために形質導入された免疫細胞の養子細胞移入の戦略に関する。CARは、特異的な抗腫瘍細胞免疫活性を示すキメラタンパク質を作製するために、所望の抗原(例えば、腫瘍抗原)に対する抗体ベースの特異性をT細胞受容体活性化細胞内ドメインと組み合わせている分子である。遺伝子修飾T細胞療法は、キメラ抗原受容体(CAR)をコードする核酸をT細胞に導入すること(ここで、該CARは、腫瘍細胞の表面抗原に対する特異性及びT細胞を活性化する能力を有する)、このようにして得られる遺伝子導入T細胞をエクスビボで成長させること、及びその後、該細胞を患者に輸血することを含む。
【０２１２】
本発明は、全体として、VEGFR-2、その断片及び/又はエピトープ、並びにこれらの変異体を発現する固形腫瘍に特異的なCARを安定に発現するように遺伝子修飾されたそのようなT細胞の使用に関する。CARを発現するT細胞は、本明細書において、CAR-T細胞又はCAR修飾T細胞と呼ばれる。本発明のある態様において、該T細胞は、VEGFR-2に特異的なsdAbの抗原認識ドメインを1以上の細胞内共刺激ドメイン及びシグナル伝達ドメインと組み合わせて、単一のキメラタンパク質にしているCARを安定に発現するように遺伝子修飾される。
【０２１３】
(キメラ抗原受容体(CAR))
本発明のCARは、血管内皮成長因子受容体-2(VEGFR-2)(ヒトではキナーゼドメイン領域(KDR)とも呼ばれ、マウスでは胎仔肝臓キナーゼ-1(Flk-1)とも呼ばれる)に対する特異性を有する。VEGFR-2は、血管内皮成長因子(VEGF)の受容体であり、7つの細胞外ドメインを有し、かつ血管内皮細胞によって選択的に発現される。VEGFR-2は、腫瘍血管内の腫瘍内皮細胞によって過剰発現される。VEGFR-2はさらに、正常、非腫瘍、又は非癌性細胞によって発現されることができる。しかしながら、そのような状況においては、正常、非腫瘍、又は非癌性細胞によるVEGFR-2の発現は、腫瘍又は癌細胞による発現ほど頑強ではない。この点に関して、腫瘍又は癌細胞は、VEGFR-2を過剰発現するか、又は正常細胞、非腫瘍細胞、もしくは非癌性細胞によるVEGFR-2の発現と比較して、顕著により高いレベルでVEGFR-2を発現することができる。VEGFR-2は、腫瘍の血管形成、成長、及び転移を増強する。特定の理論に束縛されるものではないが、VEGFR-2に結合することにより、CAR-Tは、腫瘍血管系のVEGFR-2発現内皮細胞を標的とし、これを破壊し、腫瘍血管系を攻撃し、腫瘍を低下又は消失させ、腫瘍部位への免疫細胞の浸潤を促進し、抗腫瘍応答を増強し/延長させると考えられている。
【０２１４】
抗血管新生腫瘍療法は、多くの利点を提供する。例えば、内皮細胞は遺伝的に安定であるので、薬物抵抗性の可能性が低いと考えられている。さらに、血流が血管内皮への容易なアクセスを提供し、正常組織に対する副作用及び毒性が限定されると考えられている。さらに、腫瘍血液の破壊は、腫瘍細胞死を加速すると考えられている。血管新生性内皮細胞は、抗原、例えば、VEGFR-2の発現を均一に上方調節するとも考えられている。さらに、抗血管新生腫瘍療法は、血管供給を含む固形腫瘍に適用可能である。
【０２１５】
一態様において、改変されたCARが本明細書に記載されている。
【０２１６】
具体的で非限定的な例において、本明細書に記載されるCARは、以下の配列のいずれか1つ、又はそれと少なくとも85％、少なくとも86％、少なくとも87％、少なくとも88％、少なくとも89％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、もしくは少なくとも95％同一の配列、又はそれと実質的に同一の配列を含み得る単一ドメイン抗VEGFR-2抗体を含む(配列は、その配列番号に加えて、その内部記号表示、例えば、AB1、V21などによっても定義されることに留意されたい。これらの記号表示は、本明細書で互換的に使用されているが、どの配列が同定されているかということに関して何らかの疑問がある場合は、配列番号が最優先の定義とみなされるべきである)
【化６】
2020504623.tif 000008
2020504623.tif 000009
2020504623.tif 000010
2020504623.tif 000011
【０２１７】
これらの配列は、当然のことながら、遺伝コードの縮重のために、列挙されたアミノ酸配列を結果として生じる任意の核酸配列によってコードされ得る。上記のアミノ酸配列をコードし得る核酸配列の例としては、以下のもの又はそれらと少なくとも85％、少なくとも86％、少なくとも87％、少なくとも88％、少なくとも89％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、もしくは少なくとも95％同一の配列、又はそれと実質的に同一の配列が挙げられるが、これらに限定されない:
【化７】
2020504623.tif 000012
2020504623.tif 000013
2020504623.tif 000014
2020504623.tif 000015
2020504623.tif 000016
2020504623.tif 000017
。
【０２１８】
本発明の単一ドメイン抗体に好適なリンカー配列は、
【化８】
2020504623.tif 000018
からなる群から選択され得る。ある態様において、リンカー配列は、C-末端システイン、例えば、
【化９】
2020504623.tif 000019
をさらに含み得る。これらのリンカー配列と同様の配列を本明細書で使用することができる。例えば、KKは、好適なリンカー配列であり、かつ配列番号54〜69の配列のいずれか1つを含むものである。
【０２１９】
CARは、VEGFR-2、そのエピトープ、その断片、又は前述のものの変異体に結合するVEGFR-2結合部分を含み、かつ免疫細胞活性化ドメインをさらに含む。免疫細胞によって発現される場合、VEGFR-2結合部分は、細胞外ドメインであるか、又はその一部であり、免疫細胞活性化ドメインは、典型的には、T細胞抗原受容体複合体ζ鎖(例えば、CD3ζ)の細胞内シグナル伝達ドメインであるか、又はその一部である。共刺激シグナル伝達領域も、細胞内ドメインに含めることができ、これは、抗原に対するリンパ球の効率的な応答に必要とされる抗原受容体又はそのリガンド以外の細胞表面分子である。スペーサー部分(ヒンジ部分とも呼ばれる)は、VEGFR-2結合部分がそのエピトープに効率的に結合するのを可能にするために、典型的には、細胞外ドメインに含まれる。細胞内ドメインと細胞外ドメインは、細胞質膜を横断する膜貫通ドメインによって連結される。
【０２２０】
本発明のCARの代表的で非限定的な構造は、腫瘍細胞のVEGFR-2を認識する単一ドメイン抗体と、膜貫通ドメインと、T細胞を活性化するTCR複合体CD3ζの細胞内ドメインとを含む(第一世代のCARと呼ばれる)。ある態様において、該CARは、配列番号78の配列又はその断片もしくは変異体を含む:
【化１０】
2020504623.tif 000020
【０２２１】
そのような単一ドメイン抗体の核酸配列は、当業者によって理解されるような種々の方法によって取得することができる。例えば、該核酸配列は、配列番号79の配列であり得る:
【化１１】
2020504623.tif 000021
。
【０２２２】
CARを発現するT細胞は、腫瘍細胞上の主要組織適合性抗原クラスIの発現とは無関係に、腫瘍細胞の表面抗原を直接認識し、同時に、該T細胞を活性化し、それにより、CAR発現T細胞は、腫瘍細胞を効率的に死滅させることができる。
【０２２３】
第一世代のCARがT細胞を活性化する能力を増強するために、T細胞の共刺激分子であるCD28の細胞内ドメインが第一世代のCAR連結されている、第二世代のCARを作製することができる。(例えば)腫瘍壊死因子(TNF)受容体スーパーファミリーであるCD137(4-1BB)又はCD134(OX40)に由来する細胞内ドメインが第一世代のCARにタンデムに連結されている、第三世代のCARを作製することもできる。したがって、VEGFR-2を標的とする多くのCAR分子が本発明に含まれる。
【０２２４】
本発明のCARは、その機能的部分を含む。CARとの関連において使用される場合の「機能的部分」という用語は、本発明のCARの任意の部分又は断片を指し、この部分又は断片は、それがその一部となっているCAR(もとのCAR)の生物学的活性を保持する。機能的部分は、例えば、もとのCARと同様の程度、同じ程度、又はそれより高い程度に、標的細胞を認識する能力、又は疾患を検出、治療、もしくは予防する能力を保持するCARの部分を包含する。もとのCARとの関連において、機能的部分は、例えば、もとのCARの約10％、25％、30％、50％、68％、80％、90％、95％、又はそれより多くを含むことができる。
【０２２５】
機能的部分は、該部分のアミノもしくはカルボキシ末端、又は両末端にさらなるアミノ酸を含むことができ、このさらなるアミノ酸は、もとのCARのアミノ酸配列中には見られない。望ましくは、さらなるアミノ酸は、例えば、標的細胞を認識する、癌を検出する、癌を治療又は予防するなどの、機能的部分の生物学的機能を妨害しない。より望ましくは、さらなるアミノ酸は、もとのCARの生物学的活性と比較して、生物学的活性を増強する。
【０２２６】
本発明の範囲に含まれるのは、本明細書に記載される本発明のCAR、ポリペプチド、及びタンパク質の機能的変異体である。本明細書で使用される「機能的変異体」という用語は、もとのCAR、ポリペプチド、又はタンパク質との実質的な又は顕著な配列同一性又は類似性を有するCAR、ポリペプチド、又はタンパク質を指し、この機能的変異体は、それがその変異体となっているCAR、ポリペプチド、又はタンパク質の生物学的活性(VEGFR-2に対する結合)を保持する。機能的変異体は、例えば、もとのCAR、ポリペプチド、又はタンパク質と同様の程度、同じ程度、又はそれより高い程度に、標的細胞を認識する能力を保持する、本明細書に記載されるCAR、ポリペプチド、又はタンパク質(もとのCAR、ポリペプチド、又はタンパク質)の変異体を包含する。もとのCAR、ポリペプチド、又はタンパク質との関連において、機能的変異体は、例えば、もとのCAR、ポリペプチド、又はタンパク質とアミノ酸配列が少なくとも約30％、50％、75％、80％、90％、98％、又はそれを超えて同一であることができる。
【０２２７】
機能的変異体は、例えば、もとのCAR、ポリペプチド、又はタンパク質のアミノ酸配列を少なくとも1つの保存的アミノ酸置換とともに含むことができる。その代わりに又はそれに加えて、機能的変異体は、もとのCAR、ポリペプチド、又はタンパク質のアミノ酸配列を少なくとも1つの非保存的アミノ酸置換とともに含むことができる。この場合、非保存的アミノ酸置換が機能的変異体の生物学的活性を妨害しない又は阻害しないのが一般的である。非保存的アミノ酸置換は、機能的変異体の生物学的活性がもとのCAR、ポリペプチド、又はタンパク質と比較して増大するように、該機能的変異体の生物学的活性を増強することができる。
【０２２８】
本発明のCARのアミノ酸置換は、典型的には、保存的アミノ酸置換である。保存的アミノ酸置換は当技術分野で公知であり、特定の物理的及び/又は化学的性質を有するあるアミノ酸が同じ又は同様の化学的又は物理的性質を有する別のアミノ酸に交換されるアミノ酸置換を含む。例えば、保存的アミノ酸置換は、酸性アミノ酸が別の酸性アミノ酸(例えば、Asp又はGlu)に置換されること、非極性側鎖を有するアミノ酸が非極性側鎖を有する別のアミノ酸(例えば、Ala、Gly、Val、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Trp、Valなど)に置換されること、塩基性アミノ酸が別の塩基性アミノ酸(Lys、Argなど)に置換されること、極性側鎖を有するアミノ酸が極性側鎖を有する別のアミノ酸(Asn、Cys、Gln、Ser、Thr、Tyrなど)に置換されることなどであることができる。
【０２２９】
CAR、ポリペプチド、又はタンパク質は、他の成分、例えば、他のアミノ酸が、機能的変異体の生物学的活性を実質的に変化させないように、本明細書に記載される規定のアミノ酸配列(単数又は複数)から本質的になることができる。
【０２３０】
本発明の実施態様のCAR、ポリペプチド、及びタンパク質(機能的部分及び機能的変異体を含む)は、任意の長さのものであることができ、すなわち、任意の数のアミノ酸を含むことができ、但し、該CAR、ポリペプチド、もしくはタンパク質(又はその機能的部分もしくは機能的変異体)は、その生物学的活性、例えば、VEGFR-2に特異的に結合する能力、宿主の疾患を治療又は予防する能力など保持する。例えば、該ポリペプチドは、約50〜約5000アミノ酸の長さ、例えば、50、70、75、100、125、150、175、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、又はそれを上回るアミノ酸長であることができる。この点に関して、本発明のポリペプチドには、オリゴペプチドも含まれる。
【０２３１】
本発明の実施態様のCAR、ポリペプチド、及びタンパク質(本発明の機能的部分及び機能的変異体を含む)は、1以上の天然に存在するアミノ酸の代わりに合成アミノ酸を含むことができる。そのような合成アミノ酸は当技術分野で公知であり、これには、例えば、アミノシクロヘキサンカルボン酸、ノルロイシン、α-アミノ n-デカン酸、ホモセリン、S-アセチルアミノメチル-システイン、trans-3-及びtrans-4-ヒドロキシプロリン、4-アミノフェニルアラニン、4-ニトロフェニルアラニン、4-クロロフェニルアラニン、4-カルボキシフェニルアラニン、β-フェニルセリン β-ヒドロキシフェニルアラニン、フェニルグリシン、α-ナフチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、シクロヘキシルグリシン、インドリン-2-カルボン酸、1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-3-カルボン酸、アミノマロン酸、アミノマロン酸モノアミド、N'-ベンジル-N'-メチル-リジン、N',N'-ジベンジル-リジン、6-ヒドロキシリジン、オルニチン、α-アミノシクロペンタンカルボン酸、α-アミノシクロヘキサンカルボン酸、α-アミノシクロヘプタンカルボン酸、α-(2-アミノ-2-ノルボルナン)-カルボン酸、α,γ-ジアミノ酪酸、α,β-ジアミノプロピオン酸、ホモフェニルアラニン、及びα-tert-ブチルグリシンが含まれる。
【０２３２】
本発明の実施態様のCAR、ポリペプチド、及びタンパク質(機能的部分及び機能的変異体を含む)は、グリコシル化し、アミド化し、カルボキシル化し、リン酸化し、エステル化し、N-アシル化し、例えば、ジスルフィド架橋によって環化し、又は酸付加塩に変換し、及び/或いは任意に二量体化もしくは重合体化し、又は共役させることができる。
【０２３３】
(VEGFR-2結合部分)
典型的な態様において、本明細書に記載されるCARは、VEGFR-2、その断片、そのエピトープ、及び前述のもののいずれかの変異体に特異的である。本発明のVEGFR-2結合部分はとても優れているので、それは、細胞/腫瘍表面上に保有されているVEGFR-2に所望の親和性で結合し、(1)受容体の下方調節を引き起こして、血管新生を減少させ、(2)それが提供される免疫細胞の活性化を引き起こして、細胞傷害活性を誘発し、腫瘍微小環境内のサイトカインを放出し、さらに増殖させる。
【０２３４】
理論によって束縛されることを望むものではないが、この抗体/VEGFR-2エピトープ相互作用は有利なレベルの親和性を有する(高すぎることも低すぎることもない)ので、該抗体は、第一の細胞上のエピトープに結合して、細胞死滅化を活性化し、その後、先に進んで、第二の又はさらなる細胞上のさらなるエピトープに結合して、さらなる細胞死滅化を活性化すると考えられている。
【０２３５】
したがって、また本明細書に記載されるのは、VEGFR-2結合部分内に、相補性決定領域(CDR) 1; CDR2;及びCDR3を含むCARであり、ここで、該抗体又はその断片は、VEGFR-2に特異的である。
【０２３６】
「抗体」及び「抗体断片」(「その断片」)という用語は、上で定義されている通りである。先に述べたように、該抗体又はその断片はsdAbであってもよい。sdAbは、ラクダ科動物起源(例えば、ラクダ科種由来)のものであってもよいし、又はラクダ科動物VHHに由来するものであってもよく、したがって、ラクダ科動物フレームワーク領域に基づいていてもよく;或いは、上記のCDRは、VNAR、VHH、又はVLフレームワーク領域に移植されてもよい。さらに別の選択肢において、上記の超可変ループは、他のタイプの抗体断片(Fv、scFv、Fab)のフレームワーク領域に移植されてもよい。
【０２３７】
本態様は、当技術分野で公知の任意の好適な方法、例えば、限定されないが、CDR移植及びベニアリングを用いて「ヒト化」されている抗体断片をさらに包含する。抗体又は抗体断片のヒト化は、配列中のアミノ酸を、抗原結合能又は特異性を失うことなく、ヒトコンセンサス配列中に見られるそのヒト対応物と置き換えることを含み;この手法は、ヒト対象に導入されたときに、該抗体又はその断片の免疫原性を低下させる。CDR移植のプロセスにおいて、本明細書で定義される重鎖CDRの1つ又は複数をヒト可変領域(VHもしくはVL)又は他のヒト抗体断片フレームワーク領域(Fv、scFv、Fab)に融合又は移植することができる。そのような場合、該1つ又は複数の超可変ループの立体構造は保存され、その標的(すなわち、毒素A及びB)に対するsdAbの親和性及び特異性も保存される。
【０２３８】
CDR移植は、少なくとも以下のもの:米国特許第6,180,370号、米国特許第5,693,761号、米国特許第6,054,297号、米国特許第5,859,205号、及び欧州特許第626390号に記載されている(これらの開示は、引用により完全に本明細書中に組み込まれる)。当技術分野で「可変領域リサーフェシング」とも呼ばれるベニアリングは、溶媒に曝露される抗体又は断片の位置をヒト化することを含み;したがって、CDR立体構造にとって重要であり得る埋め込まれる非ヒト化残基が保存される一方で、溶媒に曝露される領域に対する免疫反応の可能性は最小限に抑えられる。ベニアリングは、少なくとも以下のもの:米国特許第5,869,619号、米国特許第5,766,886号、米国特許第5,821,123号、及び欧州特許第519596号に記載されている(これらの開示は、引用により完全に本明細書中に組み込まれる)。当業者であれば、そのようなヒト化抗体断片を調製する方法に十分精通しているであろう。
【０２３９】
実質的に同一の配列は、1以上の保存的アミノ酸突然変異を含み得る。参照配列に対する1以上の保存的アミノ酸突然変異は、参照配列と比較して、生理的、化学的、又は機能的特性の実質的変化を伴わない突然変異体ペプチドを生じさせることができ;そのような場合、参照配列と突然変異体配列は、「実質的に同一の」ポリペプチドとみなされることが当技術分野で公知である。保存的アミノ酸突然変異には、アミノ酸の付加、欠失、又は置換が含まれてもよく;保存的アミノ酸置換は、本明細書において、類似の化学的特性(例えば、サイズ、電荷、又は極性)を有する別のアミノ酸残基へのアミノ酸残基の置換と定義される。
【０２４０】
非限定的な例において、保存的突然変異は、アミノ酸置換であってもよい。そのような保存的アミノ酸置換は、塩基性、中性、疎水性、又は酸性アミノ酸を同じグループの別のものに置換することができる。「塩基性アミノ酸」という用語は、7よりも大きい側鎖pK値を有する親水性アミノ酸を意味し、これは、典型的には、生理的pHで正電荷を有する。塩基性アミノ酸としては、ヒスチジン(His又はH)、アルギニン(Arg又はR)、及びリジン(Lys又はK)が挙げられる。「中性アミノ酸(「極性アミノ酸」ともいう)という用語は、生理的pHで電荷を有さないが、2つの原子によって共通に共有される電子対が該原子のうちの1つによってより密に保持される少なくとも1つの結合を有する側鎖を有する親水性アミノ酸を意味する。極性アミノ酸としては、セリン(Ser又はS)、トレオニン(Thr又はT)、システイン(Cys又はC)、チロシン(Tyr又はY)、アスパラギン(Asn又はN)、及びグルタミン(Gln又はQ)が挙げられる。「疎水性アミノ酸」(「非極性アミノ酸」ともいう)という用語は、Eisenberg(1984)の標準化されたコンセンサス疎水性度スケールに従って、0よりも大きい疎水性度を示すアミノ酸を含むことが意図される。疎水性アミノ酸としては、プロリン(Pro又はP)、イソロイシン(Ile又はI)、フェニルアラニン(Phe又はF)、バリン(Val又はV)、ロイシン(Leu又はL)、トリプトファン(Trp又はW)、メチオニン(Met又はM)、アラニン(Ala又はA)、及びグリシン(Gly又はG)が挙げられる。
【０２４１】
「酸性アミノ酸」は、典型的には生理的pHで負電荷を有する7未満の側鎖pK値を有する親水性アミノ酸を指す。酸性アミノ酸としては、グルタミン酸(Glu又はE)及びアスパラギン酸(Asp又はD)が挙げられる。
【０２４２】
配列同一性は、2つの配列の類似性を評価するために使用され;それは、残基位置間の最大一致を求めて2つの配列を整列させたときに同じである残基のパーセントを計算することにより決定される。任意の既知の方法を用いて、配列同一性を決定することができ;例えば、配列同一性を計算するために、コンピュータソフトウェアが利用可能である。限定することを望むものではないが、配列同一性は、スイスバイオインフォマティクス研究所(Swiss Institute of Bioinformatics)によって維持されているNCBI BLAST2サービス(及びca.expasy.org/tools/blast/で見られるもの)、BLAST-P、Blast-N、もしくはFASTA-Nなどのソフトウェア、又は当技術分野で公知である任意の他の適当なソフトウェアによって計算することができる。
【０２４３】
本発明の実質的に同一の配列は、少なくとも85％同一であることができ;別の例において、該実質的に同一の配列は、本明細書に記載される配列とアミノ酸レベルで少なくとも70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、もしくは100％(又はこれらの間の任意のパーセンテージ)同一であることができる。具体的な態様において、該実質的に同一の配列は、参照配列の活性及び特異性を保持する。非限定的な例において、配列同一性の違いは、保存的アミノ酸突然変異によるものであることができる。
【０２４４】
本発明の単一ドメイン抗体又はその断片は、組換え抗体又はその断片の発現、検出、又は精製を助けるための追加の配列を含むこともできる。当業者に公知の任意のそのような配列又はタグを使用することができる。例えば、限定することを望むものではないが、該抗体又はその断片は、ターゲッティング又はシグナル配列(例えば、限定されないが、ompA)、検出タグを含むことができ、例示的なタグカセットとしては、Strepタグもしくはその任意のバリアント;例えば、米国特許第7,981,632号を参照、Hisタグ、配列モチーフ
【化１２】
2020504623.tif 000022
を有するFlagタグ、Xpressタグ、Aviタグ、カルモジュリンタグ、ポリグルタミン酸タグ、HAタグ、Mycタグ、Nusタグ、Sタグ、SBPタグ、Softag 1、Softag 3、V5タグ、CREB結合タンパク質(CBP)、グルタチオン S-トランスフェラーゼ(GST)、マルトース結合タンパク質(MBP)、緑色蛍光タンパク質(GFP)、チオレドキシンタグ、もしくはこれらの任意の組合せ;精製タグ(例えば、限定されないが、His5もしくはHis6)、又はこれらの組合せが挙げられる。
【０２４５】
別の例において、追加の配列は、ビオチン認識部位、例えば、CronanらによってWO 95/04069号に又はVogesらによってWO/2004/076670号に記載されているものであることができる。また当業者に知られているように、リンカー配列は、追加の配列又はタグと併用することができる。
【０２４６】
より具体的には、タグカセットは、高い親和性又は結合力で抗体に特異的に結合することができる細胞外成分を含むことができる。単鎖融合タンパク質構造内で、タグカセットは、(a)コネクター領域のすぐアミノ-末端に、(b)リンカーモジュールの間に置いて、それらを接続して、(c)結合ドメインのすぐカルボキシ-末端に、(d)結合ドメイン(例えば、scFv)とエフェクタードメインの間に置いて、それらを接続して、(e)結合ドメインのサブユニットの間に置いて、それらを接続して、又は(f)単鎖融合タンパク質のアミノ-末端に配置することができる。ある実施態様において、1以上の接合アミノ酸をタグカセット間に配置して、それを疎水性部分と接続するか、又はタグカセットとコネクター領域の間において、それらを接続するか、又はタグカセットとリンカーモジュールの間において、それらを接続するか、又はタグカセットと結合ドメインの間において、それらを接続することができる。
【０２４７】
(膜貫通ドメイン)
特定の態様において、CARは、該CARの細胞外ドメイン及び細胞内ドメインに融合される膜貫通ドメインを含む。一態様において、CAR中のドメインのうちの1つと天然に関連している膜貫通ドメインが使用される。いくつかの場合において、該膜貫通ドメインをアミノ酸置換によって選択又は修飾して、そのようなドメインと同じ又は異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインとの結合を回避し、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えることができる。
【０２４８】
膜貫通ドメインは、天然供給源又は合成供給源のいずれかに由来することができる。供給源が天然である場合、該ドメインは、任意の膜結合又は膜貫通タンパク質に由来することができる。本発明における特に有用な膜貫通領域は、T-細胞受容体のα、β、又はζ鎖、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154に由来する(すなわち、これらの少なくとも膜貫通領域を含む)ことができる。典型的には、本明細書に記載されるCAR中の膜貫通ドメインは、CD28の膜貫通ドメインである。
【０２４９】
或いは、膜貫通ドメインは、合成されたものであることができ、その場合、それは、主に、ロイシン及びバリンなどの疎水性残基を含む。典型的には、フェニルアラニン、トリプトファン、及びバリンのトリプレットが合成膜貫通ドメインの各々の末端に見られる。任意に、短いオリゴペプチド又はポリペプチドリンカー、典型的には、長さが2〜10アミノ酸のものは、CARの膜貫通ドメインと細胞質シグナル伝達ドメインの連結を形成することができる。グリシン-セリンダブレットは、特に好適なリンカーを提供する。
【０２５０】
(スペーサードメイン)
CARの細胞外ドメインと膜貫通ドメインの間、又はCARの細胞質ドメインと膜貫通ドメインの間に、ヒンジドメインとも呼ばれるスペーサードメインを組み入れることができる。本明細書で使用される場合、「スペーサードメイン」という用語は、通常、膜貫通ドメインを、ポリペプチド鎖中の細胞外ドメイン又は細胞質ドメインのいずれかに連結し、かつVEGFR-2結合ドメインを細胞表面から高くするように機能する任意のオリゴペプチド又はポリペプチドを意味する。スペーサードメインは、最大300個のアミノ酸、典型的には、10〜100個のアミノ酸、及び最も典型的には、25〜50個のアミノ酸を含むことができる。スペーサーは、以下のもの、例えば:ヒトIgG1 Fcドメイン; IgG1ヒンジ; IgG1ヒンジ-CD8ストーク; CD8ストーク; IgG1ヒンジ-CD28ストーク;及びCD28ストークのうちの1つを含むことができる。
【０２５１】
(細胞質ドメイン)
本明細書に記載されるCARの細胞質ドメイン、又はさもなければ、細胞内シグナル伝達ドメインは、CARが入れられている免疫細胞の正常なエフェクター機能のうちの少なくとも1つの活性化に関与している。「エフェクター機能」という用語は、細胞の特殊化された機能を指す。T細胞のエフェクター機能は、例えば、サイトカインの分泌を含む細胞溶解活性又はヘルパー活性であることができる。したがって、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞が特殊化された機能を果たすように導くタンパク質の部分を指す。通常、細胞内シグナル伝達ドメイン全体を利用することができるが、多くの場合、鎖全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの切断された部分を使用する限り、そのような切断された部分がエフェクター機能シグナルを伝達しさえすれば、それをインタクト鎖の代わりに使用することができる。したがって、細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な細胞内シグナル伝達ドメインの任意の切断された部分を含むことが意図される。
【０２５２】
本明細書に記載されるCARにおいて使用するための細胞内シグナル伝達ドメインの典型例は、抗原受容体エンゲージメント後にシグナル伝達を開始するように協調して作用するT細胞受容体(TCR)及び共受容体の細胞質配列、並びにこれらの配列の任意の誘導体又は変異体及び同じ機能的能力を有する任意の合成配列を含む。
【０２５３】
一次細胞質シグナル伝達配列は、TCR複合体の一次活性化を、刺激性に、又は阻害性に調節する。刺激性に作用する一次細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ又はITAMとしても知られるシグナル伝達モチーフを含有することができる。
【０２５４】
本発明において特に有用である一次細胞質シグナル伝達配列を含有するITAMの例としては、TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、及びCD66dに由来するものが挙げられる。本明細書に記載されるCAR中の細胞質シグナル伝達分子は、CD3ζに由来する細胞質シグナル伝達配列を含むことが特に一般的である。
【０２５５】
典型的な態様において、CARの細胞質ドメインは、それ自体でCD3-ζシグナル伝達ドメインを含むように設計するか、又は本明細書に記載されるCARとの関連において有用な任意の他の所望の細胞質ドメインと組み合わせることができる。例えば、CARの細胞質ドメインは、CD3ζ鎖部分及び1以上の共刺激シグナル伝達領域を含むことができる。共刺激シグナル伝達領域は、共刺激分子の細胞内ドメインを含むCARの部分を指す。共刺激分子は、抗原に対するリンパ球の効率的な応答に必要とされる抗原受容体又はそのリガンド以外の細胞表面分子である。そのような分子の例としては、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、及びCD83と特異的に結合するリガンドなどが挙げられる。
【０２５６】
本明細書に記載されるCARの細胞質シグナル伝達部分内の細胞質シグナル伝達配列は、ランダムに又は特定の順序で互いに連結することができる。任意に、短いオリゴペプチド又はポリペプチドリンカー、典型的には、長さが2〜10アミノ酸のものは、連結を形成することができる。グリシン-セリンダブレットは、特に好適なリンカーを提供することができる。
【０２５７】
一態様において、細胞質ドメインは、CD3-ζのシグナル伝達ドメインとCD28のシグナル伝達ドメインを含むように設計される。別の態様において、細胞質ドメインは、CD3-ζのシグナル伝達ドメインと4-1BBのシグナル伝達ドメインを含むように設計される。さらに別の態様において、細胞質ドメインは、CD3-ζのシグナル伝達ドメインとCD28及び4-1BBのシグナル伝達ドメインを含むように設計される。
【０２５８】
一態様において、本明細書に記載されるCAR中の細胞質ドメインは、CD28のシグナル伝達ドメイン及び/又は4-1BBとCD3-ζのシグナル伝達ドメインを含むように設計される。
【０２５９】
(ベクター)
本明細書に記載されるのは、本発明のDNAが挿入されるベクターである。レンチウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクターは、それが導入遺伝子の長期にわたる安定した組込み及び娘細胞におけるその増殖を可能にするので、長期にわたる遺伝子転移を達成するための好適なツールである。レンチウイルスベクターは、それが肝細胞などの非増殖精細胞に形質導入することができるという点において、マウス白血病ウイルスなどの癌レトロウイルスに由来するベクターと比べて追加の利点を有する。これらは、低い免疫原性という追加の利点も有する。
【０２６０】
簡潔にまとめると、CARをコードする天然又は合成核酸の発現は、典型的には、CARポリペプチド又はその部分をコードする核酸をプロモーターに機能的に連結し、構築物を発現ベクターに組み込むことにより達成される。ベクターは、真核生物での複製及び組込みに好適であることができる。典型的なクローニングベクターは、転写及び翻訳ターミネーター、開始配列、並びに所望の核酸配列の発現の調節に有用なプロモーターを含有する。
【０２６１】
本発明の発現構築物は、標準的な遺伝子送達プロトコルを用いる核酸免疫及び遺伝子治療に使用することもできる。遺伝子送達方法は、当技術分野で公知である。例えば、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、米国特許第5,399,346号、第5,580,859号、第5,589,466号を参照されたい。別の態様において、本発明は、遺伝子治療ベクターを提供する。
【０２６２】
核酸(配列番号31〜53又は80)は、いくつかのタイプのベクターにクローニングすることができる。例えば、核酸は、限定されないが、プラスミド、ファージミド、ファージ派生物、動物ウイルス、及びコスミドを含む、ベクターにクローニングすることができる。特に興味深いベクターとしては、発現ベクター、複製ベクター、プローブ作製ベクター、及びシークエンシングベクターが挙げられる。
【０２６３】
さらに、発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に提供することができる。ウイルスベクター技術は、当技術分野で周知であり、例えば、Sambrookらの文献(2001、分子クローニング:実験室マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)、Cold Spring Harbor Laboratory, New York)、並びに他のウイルス学及び分子生物学のマニュアルに記載されている。ベクターとして有用であるウイルスとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、及びレンチウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。一般に、好適なベクターは、少なくとも1つの生物で機能的な複製起点、プロモーター配列、好都合な制限エンドヌクレアーゼ部位、及び1以上の選択マーカーを含有する(例えば、その開示が、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、WO 01/96584号; WO 01/29058号;及び米国特許第6,326,193号)。
【０２６４】
いくつかのウイルスベースの系が、哺乳類細胞への遺伝子転移用に開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達系のための好都合なプラットフォームを提供する。選択された遺伝子をベクターに挿入し、当技術分野で公知の技法を用いてレトロウイルス粒子にパッケージングすることができる。その後、組換えウイルスを単離し、インビボ又はエクスビボのいずれかで、対象の細胞に送達することができる。いくつかのレトロウイルス系が当技術分野で公知である。いくつかの態様において、アデノウイルスベクターが使用される。いくつかのアデノウイルスベクターが当技術分野で公知である。一態様において、レンチウイルスベクターが使用される。
【０２６５】
さらなるプロモーターエレメント、例えば、エンハンサーは、転写開始の頻度を調節する。典型的には、これらは、開始部位の30〜110bp上流の領域に位置しているが、いくつかのプロモーターは、該開始部位の下流にも同様に機能的エレメントを含有することが示されている。エレメントが互いに対して反転又は移動したときに、プロモーターの機能が保存されるように、プロモーターエレメント間の間隔には柔軟性があることが多い。チミジンキナーゼ(tk)プロモーターにおいては、プロモーターエレメント間の間隔を、活性が低下し始めるまで、50bp離れるまで増大させることができる。プロモーターに応じて、個々のエレメントは、協調的に又は独立に機能して、転写を活性化することができると思われる。
【０２６６】
好適なプロモーターの1つの例は、前初期サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それに機能的に連結された任意のポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動することができる強力な構成的プロモーター配列である。好適なプロモーターの別の例は、伸長成長因子-1α(EF-1α)である。しかしながら、サルウイルス40(SV40)初期プロモーター、マウス乳癌ウイルス(MMTV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)の長い末端反復(LTR)プロモーター、MoMuLVプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン・バーウイルス前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、並びにヒト遺伝子のプロモーター、例えば、限定されないが、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、及びクレアチンキナーゼプロモーターを含むが、これらに限定されない、他の構成的プロモーター配列を使用することもできる。さらに、本発明は、構成的プロモーターの使用に限定されるべきではない。誘導性プロモーターも、本明細書に記載されるものの一部として想定される。誘導性プロモーターの使用は、機能的に連結されているポリヌクレオチド配列が望まれるときに、そのような発現をオンにするか、又は発現が望まれないときに、該発現をオフにすることができる分子スイッチを提供する。誘導性プロモーターの例としては、メタロチオニン(metallothionine)プロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、及びテトラサイクリンプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２６７】
CARポリペプチドポリペプチド又はその部分の発現を評価するために、細胞に導入されることになる発現ベクターは、ウイルスベクターを介してトランスフェクトし又は感染させようとする細胞の集団からの発現細胞の特定及び選択を容易にするための選択マーカー遺伝子もしくはレポーター遺伝子のいずれか又はその両方を含有することもできる。他の態様において、選択マーカーを別々のDNA片上に担持させ、同時トランスフェクション法で使用することができる。選択マーカーとレポーター遺伝子の両方を適切な調節配列と隣接させて、宿主細胞内での発現を可能にすることができる。有用な選択マーカーとしては、例えば、抗生物質耐性遺伝子、例えば、neoなどが挙げられる。
【０２６８】
レポーター遺伝子は、トランスフェクトされた可能性のある細胞を特定するために、及び調節配列の機能を評価するために使用される。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエント生物もしくは組織に存在しないか、又はこれらによって発現されない遺伝子、及びその発現が何らかの容易に検出可能な特性、例えば、酵素活性によって明らかにされるポリペプチドをコードする遺伝子である。レポーター遺伝子の発現は、DNAがレシピエント細胞に導入された後の好適な時点でアッセイされる。好適なレポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子、又は緑色蛍光タンパク質遺伝子を挙げることができる(例えば、Ui-Teiらの文献、2000 FEBS Letters 479: 79-82)。好適な発現系は周知であり、既知の技法を用いて調製するか、又は市販で入手することができる。一般に、レポーター遺伝子の最も高い発現レベルを示す最小の5'隣接領域を有する構築物がプロモーターとして特定される。そのようなプロモーター領域をレポーター遺伝子に連結し、プロモーターによって駆動される転写を調節する能力について薬剤を評価するために使用することができる。
【０２６９】
細胞内に遺伝子を導入し、発現させる方法は、当技術分野で公知である。発現ベクターとの関連において、該ベクターは、宿主細胞、例えば、哺乳動物、細菌、酵母、又は昆虫の細胞に、当技術分野の任意の方法によって容易に導入することができる。例えば、発現ベクターは、物理的、化学的、又は生物学的手段によって宿主細胞に転移することができる。
【０２７０】
宿主細胞内にポリヌクレオチドを導入するための物理的方法としては、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、微粒子銃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどが挙げられる。ベクター及び/又は外因性核酸を含む細胞を産生する方法は、当技術分野で周知である。例えば、Sambrookらの文献(2001、分子クローニング:実験室マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)、Cold Spring Harbor Laboratory, New York)を参照されたい。宿主細胞内へのポリヌクレオチドの導入のための典型的な方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションである。
【０２７１】
対象となるポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入するための生物学的方法は、DNA及びRNAベクターの使用を含む。ウイルスベクター、特に、レトロウイルスベクターは、哺乳動物、例えば、ヒト細胞に遺伝子を挿入するために最も広く使用される方法となっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ型、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルスなどに由来することができる。例えば、米国特許第5,350,674号及び第5,585,362号を参照されたい。
【０２７２】
宿主細胞内にポリヌクレオチドを導入するための化学的手段としては、コロイド分散系、例えば、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、並びに水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、及びリポソームを含む脂質ベースの系が挙げられる。インビトロ及びインビボでの送達ビヒクルとして使用するための例示的なコロイド系は、リポソーム(例えば、人工膜小胞)である。
【０２７３】
非ウイルス送達系が利用される場合、例示的な送達ビヒクルはリポソームである。脂質製剤の使用は、宿主細胞内への核酸の導入(インビトロ、エクスビボ、又はインビボ)が想定される。別の態様において、該核酸は、脂質と関連させることができる。脂質と関連した核酸は、リポソームの水性内部に封入するか、リポソームの脂質二重層内に散在させるか、リポソームとオリゴヌクレオチドの両方と関連している連結分子を介してリポソームに付着させるか、リポソームに閉じ込めるか、リポソームとの複合体を形成させるか、脂質を含有する溶液に分散させるか、脂質と混合するか、脂質と組み合わせるか、脂質中の懸濁物として包含するか、ミセルとともに包含するもしくはミセルとの複合体を形成させるか、又は別の方法で脂質と関連させることができる。脂質、脂質/DNA、又は脂質/発現ベクター関連組成物は、溶液中のいかなる特定の構造にも限定されない。例えば、それらは、二重層構造で、ミセルとして、又は「崩壊した」構造で存在してもよい。それらはまた、単に溶液中に散在していてもよく、サイズも形も均一でない凝集体を形成する可能性がある。脂質は、脂肪性物質であり、これは、天然に存在する脂質でも、合成脂質でもよい。例えば、脂質には、細胞質中に天然に存在する脂肪小滴、並びに長鎖脂肪族炭化水素及びその誘導体、例えば、脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール、及びアルデヒドを含有する化合物のクラスが含まれる。
【０２７４】
使用に好適な脂質は、商業的供給源から入手することができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン(「DMPC」)は、Sigma, St. Louis, Mo.から入手することができ;リン酸ジセチル(「DCP」)は、K & K Laboratories(Plainview, N.Y.)から入手することができ;コレステロール(「Choi」)は、Calbiochem-Behringから入手することができ;ジミリスチルホスファチジルグリセロール(「DMPG」)及び他の脂質は、Avanti Polar Lipids社(Birmingham, Ala.)から入手することができる。クロロホルム又はクロロホルム/メタノール中の脂質の原液は、約-20℃で保存することができる。クロロホルムは、メタノールより容易に蒸発するので、唯一の溶媒として使用される。「リポソーム」は、封入された脂質二重層又は凝集体の生成によって形成される種々の単層又は多層の脂質ビヒクルを包含する総称である。リポソームは、リン脂質二重膜及び内側の水性媒体を備えた小胞構造を有するものと特徴付けることができる。多層リポソームは、水性媒体によって分離された多数の脂質層を有する。それらは、リン脂質を過剰の水性溶液に懸濁したときに自然に形成する。脂質成分は、自己再編成を経た後、閉じた構造を形成し、脂質二重層の間に水及び溶解した溶質を封入する(Ghoshらの文献、1991 Glycobiology 5: 505-10)。しかしながら、通常の小胞構造とは異なる構造を溶液中で有する組成物も包含される。例えば、脂質は、ミセル構造を取ってもよいし、又は単に脂質分子の不均一な凝集体として存在してもよい。リポフェクトアミン-核酸複合体も想定される。
【０２７５】
宿主細胞内に外因性核酸を導入するために、又は別の方法で細胞を本発明の阻害剤に曝露するために使用される方法にかかわらず、宿主細胞内での組換えDNA配列の存在を確認するために、種々のアッセイを実施することができる。そのようなアッセイとしては、例えば、当業者に周知の「分子生物学的」アッセイ、例えば、サザン及びノーザンブロッティング、RT-PCR、及びPCR;「生化学的」アッセイ、例えば、特定のペプチドの有無を、例えば、免疫学的手段(ELISA及びウェスタンブロット)によって、又は本明細書に記載される範囲に含まれる薬剤を同定するための本明細書に記載されるアッセイによって検出することが挙げられる。
【０２７６】
(トランスポゾン/トランスポザーゼシステム)
細胞にDNAを導入するための典型的な方法としては、DNA凝縮試薬、例えば、リン酸カルシウム、ポリエチレングリコールなど、脂質含有試薬、例えば、リポソーム、多層小胞など、及びウイルス媒介戦略が挙げられる。
【０２７７】
しかしながら、これらの方法には全て、その制限がある。例えば、DNA凝縮試薬及びウイルス媒介戦略には、サイズの制約が伴う。さらに、ウイルス戦略では、細胞にトランスフェクトすることができる核酸の量が制限される。全ての方法が送達される核酸の細胞性核酸への挿入を容易にするわけではなく、DNA凝縮法及び脂質含有試薬は調製が比較的容易である一方で、ウイルスベクターへの核酸の挿入には労力がかかることがある。さらに、ウイルス媒介戦略は、細胞型又は組織型特異的である可能性があり、かつウイルス媒介戦略の使用は、インビボで使用する場合、免疫学的問題を生み出す可能性がある。
【０２７８】
こうした問題を克服する1つの好適な方法は、トランスポゾンである。トランスポゾン又は転移因子は、その上流及び下流に末端反復配列を有する(短い)核酸配列を含む。活性型トランスポゾンは、核酸の切り出し及び標的DNA配列への挿入を容易にする酵素をコードする。
【０２７９】
現在、2つのクラスのトランスポゾン、すなわち、クラスIトランスポゾンとクラスIIトランスポゾンが知られている。
【０２８０】
クラスIトランスポゾンは、レトロトランスポゾン又はレトロポゾンとも呼ばれており、これには、レトロウイルス様レトロトランスポゾン及び非レトロウイルス様レトロトランスポゾンが含まれる。クラスIトランスポゾンは、自分自身をコピーし、コピーをゲノムの複数の場所にペーストして戻すことにより作用する。最初、レトロトランスポゾンは自分自身をRNAにコピー(転写)するが、翻訳される代わりに、RNAが逆転写酵素(トランスポゾン自身にコードされていることが多い)によってDNAへとコピーされ、ゲノムに再び挿入される。クラスIトランスポゾンの典型的な代表例としては、例えば、Copia(ショウジョウバエ)、Ty1(酵母)、THE-1(ヒト)、Bs1(トウモロコシ)、F-因子、L1(ヒト)、Cin4(トウモロコシ)が挙げられる。
【０２８１】
第一段階として、クラスIIトランスポゾンは、ウイルス感染などのような標準的な方法を用いて、細胞にトランスフェクトされなければならない。それに続いて、「DNAのみのトランスポゾン」とも呼ばれる、クラスIIトランスポゾンは、コピー＆ペースト機構ではなく、カット＆ペースト機構によって移動し、この機構でトランスポザーゼ酵素を使用する。異なるタイプのトランスポザーゼは、異なる様式で作用することができる。あるトランスポザーゼはDNA分子の任意の部分に結合することができ、標的部位が任意の位置にあり得る一方で、他のトランスポザーゼは特異的な配列に結合する。その場合、該トランスポザーゼは、標的部位を切断して、粘着末端を生じさせ、トランスポゾンを放出し、それを標的部位に連結する。典型的なクラスIIの代表例としては、P因子(ショウジョウバエ)、Ac-Ds(トウモロコシ)、TN3及びIS1(大腸菌)、Tam3(キンギョソウ)などが挙げられる。
【０２８２】
特に、クラスIIトランスポゾンの場合、因子によってコードされたトランスポザーゼは、そのもとの場所からのトランスポゾンの切り出しを触媒し、ゲノムの他の場所へのその挿入を促進する(Plasterkの文献、1996 Curr. Top. Microbiol. Immunol. 204, 125-143)。トランスポゾンファミリーの自律性メンバーは、転移のためのトランス作用性因子である活性型トランスポザーゼを発現することができ、したがって、それら自身で転移することができる。非自律性エレメントは、突然変異したトランスポザーゼ遺伝子を有しているが、シス作用性DNA配列を保持している場合がある。これらのシス作用性DNA配列は逆方向末端反復配列(IR)とも呼ばれる。ある逆方向反復配列は、1以上の直列反復配列を含み得る。これらの配列は、通常、因子の末端逆方向反復配列(IR)に埋め込まれており、この末端逆方向反復配列は、別の因子由来の相補的トランスポザーゼの存在下における移動に必要である。自律性エレメントは、Tol2(下記参照)を除いて、これまで脊椎動物から1つとして単離されておらず;全てのトランスポゾン様配列は、「垂直不活性化」と呼ばれるプロセスの結果として、欠陥があるように見える(Loheらの文献、1995 Mol. Biol. Evol. 12, 62-72)。ある系統発生学的モデル(Hartlらの文献、1997 Trends Genet. 13, 197-201)によれば、真核生物のゲノムにおける自律性エレメントに対する非自律性エレメントの比率は、転移のトランス相補性の結果として増加する。このプロセスによって、ゲノム中のトランスポザーゼを生成する活性型コピーの最終的な消失が避けられない状態が生じる。その結果として、DNAトランスポゾンは、消滅を避けるために、新しい宿主においてそれ自身を定着させる方法を見出さなければならない、ゲノムの一時的な構成要素とみなすことができる。実際、種間の水平遺伝子伝達は、トランスポゾンの進化における重要なプロセスの1つであると考えられている(Loheらの文献、1995 supra and Kidwell, 1992. Curr. Opin. Genet Dev. 2, 868-873)。
【０２８３】
水平遺伝子転移の天然のプロセスを実験室条件下で模倣することができる。植物では、Ac/Dsファミリー及びSpmファミリーのトランスポゾンが異種の種にルーチンにトランスフェクトされている(Osborne及びBakerの文献、1995 Curr. Opin. Cell Biol. 7, 406-413)。しかしながら、動物では、1つの種から別の種への活性型トランスポゾンシステムの転移にとっての大きな障害は、自然宿主によって産生される因子の必要性に起因する転移の種特異性という障害である。
【０２８４】
上で論じられたトランスポゾンシステムは、脊椎動物及び無脊椎動物の系で生じ得る。脊椎動物において、DNA中間体を介して移動する移動因子であるDNAトランスポゾンの発見は、比較的最近のことである(Radice, A. D.らの文献、1994. Mol. Gen. Genet. 244, 606-612)。それ以来、真核生物トランスポゾンのTd/マリナー(mariner)及びhAT(hobo/Ac/Tam)のスーパーファミリーの高度に突然変異した不活性型メンバーが、様々な魚の種、アフリカツメガエル(Xenopus)、及びヒトのゲノムから単離されている(Oosumiらの文献、1995. Nature 378, 873; Iviesらの文献、1995. MoI. Gen. Genet. 247, 312-322; Kogaらの文献、1996. Nature 383, 30; Lamらの文献、1996. J. MoI. Biol. 257, 359-366、及びLam, W. L.らの文献、Proc. Natl. Acad Sci. USA 93, 10870-10875)。
【０２８５】
無脊椎動物トランスポゾンと脊椎動物トランスポゾンはどちらも、モデル生物における遺伝子導入及び挿入突然変異誘発の可能性を有している。特に、同種内での代替トランスポゾンシステムの利用可能性は、遺伝子解析の新しい可能性を開く。例えば、ピギーバックトランスポゾンは、安定に挿入されたP因子の存在下、ショウジョウバエの中で移動することができる(Hackerらの文献(2003), Proc Natl Acad Sci U S A 100, 7720-5.)。P因子に基づくシステムとピギーバックに基づくシステムは、異なる挿入部位優先度を示すので(Spradlingらの文献(1995)、Proc Natl Acad Sci U S A 92, 10824-30、Hackerらの文献(2003)、Proc Natl Acad Sci U S A 100, 7720-5)、トランスポゾンの挿入によって不活性化することができるハエ遺伝子の数を大いに増加させることができる。P因子ベクターは、安定な生殖系列形質転換によってマリナートランスポゾンの構成要素をキイロショウジョウバエ(D.melanogaster)のゲノムに挿入するためにも使用されている。これらの遺伝子導入ハエにおいて、P因子の偶発的な移動がなければ、マリナー転移を研究することができる(Lohe及びHartlの文献(2002)、Genetics 160, 519-26)。
【０２８６】
脊椎動物においては、現在、3つの活性型トランスポゾン:メダカのTol2因子、再構築されたトランスポゾンのスリーピングビューティー(SB)、及びフロッグプリンス(Frog Prince(FP))が知られており、使用されている。脊椎動物におけるさらなる興味深いトランスポゾンシステムは、ピギーバックトランスポゾンシステム(Dingらの文献、Cell, 2005)である。
【０２８７】
Tol2因子は、メダカにおけるhATトランスポゾンファミリーの活性型メンバーである。これは、東アジアの小型淡水魚であるニホンメダカ(ミナミメダカ(Oryzias latipes))のアルビノ表現型の原因となる劣勢突然変異によって発見された。この突然変異は、チロシナーゼ遺伝子の第5エキソンへの4.7kb長のTEの挿入に起因するものであることが分かった。Tol2と命名されたこの因子のDNA配列は、ショウジョウバエのhobo、トウモロコシのAcoi、及びキンギョソウのTam3を含む、hATファミリーのトランスポゾンに類似している。
【０２８８】
スリーピングビューティー(SB)は、魚類由来のTc1/マリナー様因子であり、種々の脊椎動物培養細胞株、胚性幹細胞、及びマウスの体細胞と生殖系列細胞の両方においてインビボで高い転移活性を示す。
【０２８９】
また、フロッグプリンス(FP)は、キタヒョウガエル(ラナ・ピピエンス(Rana pipiens))のゲノムトランスポゾンのコピーから最近再活性化されたTc1/マリナー様因子である。途切れることのないトランスポザーゼコード領域を同定するために、オープンリーディングフレームトラップ法が使用され、これらの配列の多数決合意によって、活性型トランスポザーゼ遺伝子が明らかになった。したがって、SBの「復活」手順とは対照的に、ラナ・ピピエンスにおけるゲノム因子の状態が比較的若いことから、単一種に由来するトランスポゾンコピーを多数決合意の基盤とすることが可能になった。SBトランスポゾンとFPトランスポゾンは明らかに異なっており、それらのトランスポザーゼ配列において〜50％の同一性しか共有していない。
【０２９０】
上記のトランスポゾン、特に、Tol2、SB、及びFP、並びにピギーバック(Dingらの文献、Cell 2005)は相互作用せず、したがって、他のものの存在下での遺伝的ツールとして使用することができ、これにより、これらの因子の有用性がかなり広がる。これらのトランスポゾンが、非コードDNAと比べて、発現遺伝子に挿入される優先度、及び遺伝子内の挿入部位に関する優先度は、大きく異なり得る。そのような場合、これらのトランスポゾンシステムの異なる挿入パターンを相補的な方法において利用することができる。例えば、異なるトランスポゾンシステムを用いれば、既に挿入されている導入遺伝子の偶然かつ不要な移動を伴うことなく、いくつかの導入遺伝子を順次細胞内にトランスフェクトすることができる。さらに、トランスポゾンベクターによって突然変異誘発され得る標的遺伝子座の数は、ゲノム全体でのスクリーニングにおいて異なるトランスポゾンシステムを組み合わせることにより劇的に増加することができる。
【０２９１】
宿主における転移活性のばらつき及び標的部位の特異性の違いに加えて、様々な因子の異なる構造的性質も特定の用途において有利になり得る。例えば、トランスポゾン挿入を、遺伝子を誤発現させるために、及び機能獲得表現型を探すために利用することができる。Rorth, Pの文献(1996、組織特異的表現型を検出するショウジョウバエにおけるモジュール式誤発現スクリーニング(A modular misexpression screen in Drosophila detecting tissue-specific phenotypes.)、Proc Natl Acad Sci U S A 93, 12418-22.)では、改変されたP因子から指令される誘導性プロモーターを担持する改変されたP因子トランスポゾンを用いて、トランスポゾン挿入部位付近の宿主遺伝子の発現が強制され、組織特異的表現型が検出された。そのような実験設定の必要条件は、トランスポゾンIRが該IRにわたって転写/翻訳を読み通すことを可能にすることである。
【０２９２】
上で既に説明したように、DNAトランスポゾンは、脊椎動物モデル生物において、さらに最近では、無脊椎動物においても、遺伝子導入ベクターとして開発されている。また、このDNAトランスポゾンは、ヒト遺伝子治療におけるレトロウイルス系の強力なライバルとなった。先述したように、遺伝子解析のための及び治療的手法のための最も有用な転移因子(TE)は、その実験室での取扱いの容易さ及び制御可能な性質から、「カット＆ペースト」機構を介して宿主ゲノム中を移動するクラスIIのTEである。スリーピングビューティー(以後、「SB」と略記する)は、「カット＆ペースト」トランスポゾンのTc1/マリナーファミリーに属する。これらの可動DNA因子は、単純な編成を有し、逆方向末端反復配列(ITR)が隣接するそのゲノム中にトランスポザーゼタンパク質をコードしている。ITRは、転移に必要なトランスポザーゼ結合部位を保有している。その活性は、トランスポザーゼ源をITRを有する転移性DNAから分離し、それにより、非自律性TEを生成させることにより、容易に制御することができる。そのような2つの構成要素の系において、トランスポゾンは、トランスポザーゼタンパク質をトランスに相補することによってしか移動することができない。実験上の必要性に従って、対象となる配列の事実上全てをITR因子間に配置することができる。転移によって、ベクターDNAからの該因子の切り出しと、その後の新しい配列環境中への単一のコピーの組み込みが生じる。
【０２９３】
一般に、トランスポゾンを介する染色体侵入は、ウイルスによる手法よりも有利であるように思われるが、それは、ウイルス系と比較した場合に、トランスポゾンが、活性遺伝子及び5'調節領域をそれほど好まず、したがって、突然変異誘発の傾向がそれほどない一方で、対象となる遺伝子へのその特殊な染色体侵入機構のために、より生理的に制御されるからである。
【０２９４】
SBは、いくつかの脊椎動物モデル生物における機能的ゲノミクスにとって有用なツールであることが証明されており(Miskey, C、Izsvak, Z.、Kawakami, K.、及びIvies, Z.の文献(2005);脊椎動物の機能的ゲノミクスにおけるDNAトランスポゾン(DNA transposons in vertebrate functional genomics.)、Cell Mol. Life. Sci. 62: 629〜641)、かつヒト遺伝子治療用途に有望である(Ivies, Z.及びIzsvak, Z.の文献(2006)、遺伝子治療用のトランスポゾン(Transposons for gene therapy); Curr. Gene Ther. 6: 593-607)。しかしながら、これらの用途の全てについて、システムの転移活性が有用性及び効率の重要な問題である。今日の時点において一般に知られかつ記載されているように機能的かつ有益であるにもかかわらず、トランスポゾン活性は、SBシステムを未だ限界に至らせる要因の1つである可能性が高い。したがって、転移活性を顕著に改善すれば、両方向で現在の実験的な障壁を破ることができるであろう。
【０２９５】
ある態様において、SB10トランスポザーゼの過剰活性変異体が本明細書に記載される方法において使用される。特定の態様において、該過剰活性変異体は、引用により完全に本明細書中に組み込まれるWO 2009/003671号に記載されているものであってもよい。例えば、以下のK14R、K13D、K13A、K30R、K33A、T83A、I100L、R115H、R143L、R147E、A205K/H207V/K208R/D210E; H207V/K208R/D210E; R214D/K215A/E216V/N217Q; M243H; M243Q; E267D; T314N;及びG317Eから選択される突然変異又は突然変異の群のうちの少なくとも1つを含む配列番号80による天然のSB10トランスポザーゼの配列と1〜20アミノ酸異なるアミノ酸配列を含むSB10トランスポザーゼの変異体から選択されるポリペプチド。
【０２９６】
配列番号80は、次の通りである:
【化１３】
2020504623.tif 000023
【０２９７】
「突然変異(mutation)」又は「突然変異(mutations)」は、既知のアミノ酸配列の1以上のアミノ酸の、それぞれ、1以上の他のアミノ酸配列への交換と本明細書で定義され、具体的に示されている場合、「突然変異の群(group of mutations)」又は「突然変異の群(groups of mutations)」とも定義し得る。「突然変異の群(group of mutations)」又は「突然変異の群(groups of mutations)」は、もとの配列由来のアミノ酸の群、例えば、3つ又は4つのアミノ酸の、それぞれ、指定された位置の3つ又は4つの他のアミノ酸への交換と本明細書で定義される。定義として、以下の記号を用いて、上記の突然変異を特定する。「X数字Z」は、「数字」の位置のもとのアミノ酸配列のアミノ酸「X」がアミノ酸「Z」に交換されていることを意味するが、「X数字Y/X'数字'Z'/X''数字''Z''」は、この変異アミノ酸において、「数字」の位置のアミノ酸「X」、「数字'」の位置のアミノ酸「X'」、及び「数字''」の位置のアミノ酸「X''」が、それぞれ、アミノ酸「Z」、「Z'」、及び「Z''」に同時に交換されていることを意味する。「突然変異の組合せ」が定義される場合、「//」は、この組合せでの「同時突然変異」を区別し、それを示すために使用されるが、他の点では、単一のスラッシュ「/」と同じである。
【０２９８】
別の典型的な態様において、該変異体は、上記の突然変異又は突然変異の群のうちの少なくとも2つ、又は少なくとも1つ〜8つ、典型的には、2つ〜7つ、さらにより典型的には、上記の突然変異又は突然変異の群のうちの少なくとも4つ〜7つが異なる。
【０２９９】
別のものにおいて、SB10トランスポザーゼの変異体は、以下の突然変異の組合せを含む変異体から選択される:
・変異体1: K14R//R214D/K215A/E216V/N217Q;
・変異体2: K33A/R115H//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H;
・変異体3: K14R/K30R//A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H;
・変異体4: K13D/K33Λ/T83A//H207V/K208R/D210E//M243Q;
・変異体5: K13A/K33A//R214D/K215A/E216V/N217Q;
・変異体6: K33A/T83A//R214D/K215A/E216V/N217Q//G317E;
・変異体7: K14R/T83A/M243Q;
・変異体8: K14R/T83A/1100L/M243Q;
・変異体9: K14R/T83A/R143L/M243Q;
・変異体10: K14R/T83A/R147E/M243Q;
・変異体11: K14R/T83A/M243Q/E267D;
・変異体12: K14R/T83A/M243Q/T314N;
・変異体13: K14R/K30R/I100I7/A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H;
・変異体14: K14R/K30R/R143I7/A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H;
・変異体15: K14R/K30R/R147E//A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H;
・変異体16: K14R/K30R//A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H/E267D;
・変異体17: K14R/K30R//A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243 H/T314N;
・変異体18: K14R/K30R//A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H/G317E;
・変異体19: K14R/K33A/R115H//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H;
・変異体20: K14R/K30R/R147E//A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H/T314N;
・変異体21: K14R/K30R/R143L//A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H/E267D;
・変異体22: K14R/K30R/R143L//A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H/T314N;
・変異体23: K14R/K30R/R143L//A205K/H207V/K208R/D210E//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H/G317E;
・変異体24: K14R/K33A/R115H/R143L//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H;
・変異体25: K14R/K33A/R115H/R147E//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H;
・変異体26: K14R/K33A/R115H//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H/E267D;
・変異体27: K14R/K33A/R115H//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H/T314N;
・変異体28: K14R/K33A/R115H//R214D/K215A/E216V/N217Q//M243H/G317E;
・変異体29: K14R/T83A/M243Q/G317E;
・変異体30: K13A/K33A/T83A//R214D/K215A/E216V/N217Q
【０３００】
典型的な態様において、該トランスポザーゼは、上のリストで変異体27と記述されているSB100Xトランスポザーゼである。
【０３０１】
(免疫細胞)
本明細書に記載される免疫細胞の増殖及び遺伝子修飾の前に、免疫細胞の源を対象から取得する。任意の免疫細胞の源を使用してもよく、かつこれらは、自己であっても、同種異系であっても、同系であっても、異種であってもよいことが理解されるであろう。典型的な態様において、該免疫細胞は、自己又は同種異系である。
【０３０２】
例えば、PBMCを任意の既知の方法によって取得し、その後、例えば、引用により完全に組み込まれる、WO 2016/071513号に記載されているように、CIK細胞になるように刺激することができる。その後、CIK細胞をCIK CAR細胞にすることができる。或いは、T細胞を任意の既知の方法によって取得し、その後、それを用いて、CAR-T細胞を産生することができる。
【０３０３】
本明細書に記載されるCARを発現するように免疫細胞を遺伝子修飾する前であるか修飾した後であるかにかかわらず、該免疫細胞は、通常、例えば、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、米国特許第6,352,694号;第6,534,055号;第6,905,680号;第6,692,964号;第5,858,358号;第6,887,466号;第6,905,681号;第7,144,575号;第7,067,318号;第7,172,869号;第7,232,566号;第7,175,843号;第5,883,223号;第6,905,874号;第6,797,514号;第6,867,041号;米国特許出願公開第20060121005号;及びWO 2016/071513号に記載されている方法を用いて、活性化し、増殖させることができる。
【０３０４】
(治療用途)
本明細書に記載されるCAR及び該CARを発現する免疫細胞は、VEGFR-2を遮断し、その活性化能を減少させることができる。結合は、CAR-T細胞又はCIK CAR細胞を活性化し、免疫細胞による癌細胞の死滅化を刺激することもできる。化学療法に使用される薬物に優るこれらの抗体の利点は、それらがVEGFR-2を過剰発現する腫瘍により特異的であるということである。それゆえ、これにより、全体的な細胞毒性及び癌細胞化学耐性の低下がもたらされ得る。さらに、本明細書に記載されるCARは、そのサイズの小ささのために、組織浸透能力を有する。
【０３０５】
本発明は、レンチウイルスベクター(LV)で形質導入された又はトランスポゾンでトランスフェクトされた細胞(例えば、T細胞)を包含する。例えば、LV又はトランスポゾンは、特異的抗体の抗原認識ドメインを、CD3-ζ、CD28、4-1BBの細胞内ドメイン、又はこれらの任意の組合せと組み合わせているCARをコードする。それゆえ、形質導入されたT細胞は、CAR媒介性T-細胞応答を誘発し、したがって、腫瘍成長の低下及び細胞死滅化の誘導を助けることができる。
【０３０６】
本発明は、腫瘍抗原−VEGFR-2に対する初代T細胞の特異性を変更するためのCARの使用を提供する。したがって、本発明は、哺乳動物の標的細胞集団又は組織に対するT細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法であって、該哺乳動物に、CARを発現するT細胞を投与する工程を含み、ここで、該CARが、所定の標的と特異的に相互作用する結合部分、例えば、ヒトCD3ζの細胞内ドメインを含むζ鎖部分、及び共刺激シグナル伝達領域を含む、方法も提供する。
【０３０７】
一態様において、本発明は、T細胞又はCIK細胞を遺伝子修飾して、VEGFR-2に向けられるCARを発現させ、かつCAR-T又はCIK-CAR細胞をそれを必要としているレシピエントに注入する一種の細胞治療を含む。注入される細胞は、レシピエントの腫瘍細胞を死滅させることができる。抗体治療とは異なり、CAR-T及びCIK-CAR細胞は、インビボで複製し、持続的な腫瘍制御をもたらし得る長期持続性を結果として生じることができる。
【０３０８】
一態様において、VEGFR-2を標的とする本明細書に記載されるCAR-T又はCIK-CAR細胞は、頑健なインビボ細胞増殖を経ることができ、かつ長期間にわたって持続することができる。別の態様において、本明細書に記載されるCAR-T細胞は、任意のさらなる腫瘍形成又は成長を阻害するように再活性化することができる特異的メモリーT細胞へと発達する。任意の特定の理論によって束縛されることを望むものではないが、CAR-T細胞は、代替抗原を発現する標的細胞との遭遇及びその後の該細胞の消失時に、セントラルメモリー様状態へとインビボで分化することができる。
【０３０９】
さらに、CAR媒介性T又はCIK細胞によって誘発される抗腫瘍免疫応答は、能動的受動的免疫応答又は受動的免疫応答であり得る。さらに、CAR媒介性免疫応答は、CAR媒介性T細胞がCAR中の抗原結合部分に特異的な免疫応答誘導する養子免疫療法アプローチの一部であり得る。例えば、VEGFR-2特異的なCAR-T又はCIK細胞は、VEGFR-2を発現する細胞に対して特異的な免疫応答を誘発する。
【０３１０】
一態様において、本明細書に記載されるCARの抗原結合部分の一部は、特定の抗原を発現する特定の癌を治療するために設計される。例えば、本明細書に記載されるCARは、典型的には、VEGFR-2に特異的であり、VEGFR-2と関連する癌及び障害、例えば、膵癌、卵巣癌、膀胱癌、乳癌、肺癌、肝細胞癌、及び結腸癌を治療するために使用することができる。
【０３１１】
本明細書に記載されるCAR媒介性T細胞は、哺乳動物におけるエクスビボ免疫及び/又はインビボ治療のための一種のワクチンとして役立つこともできる。典型的には、哺乳動物はヒトである。
【０３１２】
エクスビボ免疫に関して、細胞を哺乳動物に投与する前に、以下のこと: i)細胞の増殖、ii)CARをコードする核酸を該細胞に導入すること、及び/又はiii)該細胞の凍結保存うちの少なくとも1つがインビボで行われる。
【０３１３】
エクスビボ手順は当技術分野で周知であり、以下でより完全に論じられている。簡潔に述べると、細胞を哺乳動物(典型的には、ヒト)から単離し、本明細書に開示されるCARを発現するベクターで遺伝子修飾する(すなわち、インビトロで形質導入又はトランスフェクトする)。CAR修飾細胞を哺乳動物レシピエントに投与して、治療的利益を提供することができる。哺乳動物レシピエントは、ヒトであってもよく、CAR修飾細胞は、レシピエントに対して自己であることができる。或いは、該細胞は、レシピエントに対して、同種異系、同系、又は異種であることができる。
【０３１４】
造血幹細胞及び前駆細胞のエクスビボ増殖のための手順は、引用により本明細書中に組み込まれる米国特許第5,199,942号に記載されており、これを本明細書に記載される細胞に適用することができる。他の好適な方法は当技術分野で公知であり、それゆえ、本発明は、細胞のエクスビボ増殖のいかなる特定の方法にも限定されない。簡潔に述べると、T細胞のエクスビボ培養及び増殖は:(1)哺乳動物由来のCD34+造血幹細胞及び前駆細胞を末梢血採取物又は骨髄外植片から回収すること;並びに(2)そのような細胞をエクスビボで増殖させることを含む。米国特許第5,199,942号に記載されている細胞成長因子の他に、flt3-L、IL-1、IL-3、及びc-kitリガンドなどの他の因子を、細胞の培養及び増殖のために使用することができる。
【０３１５】
エクスビボ免疫に関して細胞ベースのワクチンを使用することに加えて、本発明は、患者における抗原に対する免疫応答を誘発するためのインビボ免疫のための組成物及び方法も提供する。
【０３１６】
特に、本明細書に記載されるCAR修飾T細胞は、VEGFR-2を発現する癌の治療において使用される。ある態様において、本明細書に記載される細胞は、VEGFR-2を発現する癌を発症するリスクのある患者の治療において使用される。したがって、本発明は、VEGFR-2を発現する癌の治療又は予防のための方法であって、それを必要としている対象に、本明細書に記載されるCAR修飾T細胞の治療有効量を投与することを含む、方法を提供する。
【０３１７】
本発明のCAR修飾T細胞は、単独で、或いは希釈剤及び/又はIL-2もしくは他のサイトカインもしくは細胞集団などの他の成分と組み合わせた医薬組成物として投与することができる。簡潔に述べると、本発明の医薬組成物は、本明細書に記載される標的細胞集団を、1以上の複数の医薬として又は生理的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤と組み合わせて含むことができる。そのような組成物は、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水などの緩衝液;グルコース、マンノース、スクロース、又はデキストラン、マンニトールなどの炭水化物;タンパク質;ポリペプチド又はグリシンなどのアミノ酸;抗酸化剤;EDTA又はグルタチオンなどのキレート剤;アジュバント(例えば、水酸化アルミニウム);並びに防腐剤を含有することができる。本発明の組成物は、典型的には、静脈内投与用に製剤される。
【０３１８】
本発明の医薬組成物は、治療(又は予防)されることになる疾患に適した方法で投与することができる。投与の量及び頻度は、患者の状態、並びに患者の疾患の種類及び重症度などの因子によって決定されるが、適切な投薬量は臨床試験によって決定することができる。
【０３１９】
「免疫学的有効量」、「抗腫瘍有効量」、「腫瘍阻害有効量」、又は「治療量」が示されている場合、投与されることになる本発明の組成物の正確な量は、年齢、体重、腫瘍サイズ、感染又は転移の程度、及び患者(対象)の状態の個体差を考慮して、医師により決定されることができる。本明細書に記載されるT細胞を含む医薬組成物は、104〜109細胞/kg体重、典型的には、105〜106細胞/kg体重(これらの範囲内の全ての整数値を含む)の投薬量で投与し得ると一般に述べることができる。T細胞組成物をこれらの投薬量で複数回投与することもできる。該細胞は、免疫療法において一般的に知られている注入法を使用することにより投与することができる(例えば、Rosenbergらの文献、New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988を参照)。特定の患者のための最適な投与量及び治療レジメンは、患者を疾患の徴候についてモニタリングし、それに応じて治療を調整することにより、医療の当業者により容易に決定されることができる。
【０３２０】
ある態様において、活性化されたT細胞を対象に投与し、続いてその後、血液を再び採取して(又はアフェレーシスを行って)、それ由来のT細胞を本発明に従って活性化し、これらの活性化され、増殖したT細胞を患者に再び注入することが望ましい場合がある。このプロセスを数週間毎に複数回実行することができる。ある態様において、T細胞は、10cc〜400ccの採血から活性化することができる。ある態様において、T細胞は、20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc又は100ccの採血から再活性化される。理論によって束縛されるものではないが、この複数回の採血/複数回の再注入プロトコルを使用することは、T細胞のある特定の集団を選別するために役立つ可能性がある。
【０３２１】
本組成物の投与は、エアロゾル吸引、注射、経口摂取、輸血、インプランテーション、又は移植を含む、任意の好都合な方法で実施することができる。本明細書に記載される組成物は、患者に対して、皮下、皮内、腫瘍内、結節内、髄内、筋肉内、静脈内(i.v.)注射により、又は腹腔内に投与することができる。一態様において、本発明のT細胞組成物は、患者に対して、皮内注射又は皮下注射によって投与される。別の態様において、本発明のT細胞組成物は、典型的には、静脈内注射によって投与される。T細胞の組成物は、腫瘍、リンパ節、又は感染部位に直接注射してもよい。
【０３２２】
本発明のある態様において、本明細書に記載される方法、又はT細胞を治療的レベルまで増殖させる当技術分野で公知の他の方法を用いて活性化し、かつ増殖させた細胞は、限定されないが、化学療法、放射線、免疫抑制剤、例えば、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキセート、ミコフェノレート、及びFK506、抗体、又は免疫切除剤、例えば、CAMPATH、抗CD3抗体、もしくは他の抗体療法、サイトキシン、フルダリビン(fludaribine)、シクロスポリン、FK506、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、FR901228、サイトカイン、並びに放射線照射を含む、任意の数の関連する治療モダリティと併せて(例えば、前に、同時に、又は後に)、患者に投与される。これらの薬物は、カルシウム依存性ホスファターゼのカルシニューリンを阻害するか(シクロスポリン及びFK506)、又は成長因子誘導性シグナル伝達に重要であるp70S6キナーゼを阻害する(ラパマイシン)かのいずれかである(Liuらの文献、Cell 66:807-815, 1991; Hendersonらの文献、Immun 73:316-321, 1991; Biererらの文献、Curr. Opin. Immun 5:763-773, 1993)。さらなる態様において、本発明の細胞組成物は、骨髄移植、フルダラビンなどの化学療法剤、外部ビーム照射療法(XRT)、シクロホスファミド、又はOKT3もしくはCAMPATHなどの抗体のいずれかを用いるT細胞切除療法と併せて(例えば、前に、同時に、又は後に)、患者に投与される。別の態様において、本発明の細胞組成物は、CD20と反応する薬剤、例えばリツキサンなどのB細胞切除療法の後に投与される。例えば、一態様において、対象は、高用量の化学療法と、それに続く、末梢血幹細胞移植による標準治療を受けることができる。ある態様において、移植後に、対象は、本明細書に記載される増殖させた免疫細胞の注入を受ける。さらなる態様において、増殖させた細胞は、外科手術の前又は後に投与される。
【０３２３】
患者に投与されることになる上記の治療の投薬量は、治療される状態及び治療のレシピエントの正確な性質によって異なる。ヒトへの投与に関する投薬量の増減は、当技術分野の慣例に従って実施することができる。例えば、CAMPATHの用量は、通常、成人患者について1〜約100mgの範囲であり、普通は、1〜30日の期間にわたって毎日投与される。典型的な日用量は、1日当たり1〜10mgであるが、場合によっては、1日当たり最大40mgのより多くの用量を使用することができる(米国特許第6,120,766号に記載されている)。
【０３２４】
本発明のある態様において、本発明のCAR-Tを含む組成物は、使用するまで冷蔵保存するか、又は使用のために必要となるまで凍結する(その後、解凍する)ことができる。該組成物は、VEGFR-2癌の治療的治療のためのCAR-T細胞の「バンク」として製剤化し、提供することができる。
【０３２５】
本発明の実施態様において、細胞療法に使用されることになる細胞は、キット中に提供され、場合により、該細胞は、本質的には、該キットの唯一の構成要素である。該キットは、所望の細胞を作製するための試薬及び材料を含むことができる。具体的な実施態様において、該試薬及び材料には、所望の配列を増幅させるためのプライマー、ヌクレオチド、好適な緩衝剤又は緩衝試薬、塩などが含まれ、場合により、該試薬には、本明細書に記載されるCAR及び/又はそのための調節エレメントをコードするベクター及び/又はDNAが含まれる。
【０３２６】
特定の実施態様において、個体から1以上の試料を抽出するのに好適な1以上の器具がキット中に存在する。該器具は、注射器、メスなどであることができる。
【０３２７】
本発明のいくつかの場合において、キットは、細胞療法の実施態様に加えて、例えば、化学療法、ホルモン療法、及び/又は免疫療法などの第二の癌療法も含む。キットは、ある個体の特定の癌に合わせて作ることができ、該個体のためのそれぞれの第二の癌療法を含む。キットは、説明書を含むことができる。
【０３２８】
(実験的実施例)
本発明を、以下の実験的実施例を参照して、さらに詳細に説明する。これらの実施例は、別途特定されない限り、例示する目的のためだけに提供されており、限定することを意図するものではない。したがって、本発明は、決して、以下の実施例に限定されるものとみなされるべきではなく、むしろ、本明細書に提供される教示の結果として明白になるありとあらゆるバリエーションを包含するものとみなされるべきである。
【０３２９】
以下の実施例は、従来の方法、例えば、ベクター及びプラスミドの構築、そのようなベクター及びプラスミドへのポリペプチドをコードする遺伝子の挿入、又は宿主細胞へのプラスミドの導入において利用されている方法の詳細な説明を含まない。そのような方法は、当業者に周知であり、引用により本明細書中に組み込まれる、Sambrook, J.、Fritsch, E. F.、及びManiatis, T.の文献(1989)、分子クローニング:実験室マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Pressを含む、多くの刊行物に記載されている。
【０３３０】
これ以上の説明はなくても、当業者は、これまでの説明及び以下の例示的実施例を用いて、本発明の化合物を作製し、利用し、かつ請求された方法を実施することができると考えられる。それゆえ、以下の作業実施例は、本発明の典型的な態様を具体的に指摘するものであり、いかなる方法によっても、本開示の残りの部分を限定するものとみなされるべきではない。
【０３３１】
(発見の概要)
VEGFR-2は、多くのタイプのヒト癌、例えば、乳癌、膵癌、結腸直腸癌、及び非小細胞肺腺癌で過剰発現されている。抗体によるVEGFR-2のターゲッティングは、血管新生を減少させ/予防することにより、特定の動物モデルにおける腫瘍の進行を遅延させることができる。VEGFR-2を標的とする抗体を作製した。AB1は、癌細胞全体で免疫されたリャマライブラリーから単離されたラクダ科動物単一ドメイン抗体である。該抗体は、高い親和性でVEGFR-2に特異的に結合し、VEGFR-2を発現する癌細胞の増殖をインビトロで阻害することができる。
【０３３２】
AB1ラクダ科動物抗体はVEGFR2の細胞外ドメインを標的とする。これは、組換えVEGFR2/Fcによるリャマの免疫によって作製された。ファージディスプレイライブラリーを作製し、スクリーニングして、VEGFR2に対する高い結合親和性を有する抗体を同定した。選択された抗体を大腸菌BL21(DE3) pT7システムで発現させた。精製された抗体を、SEC、LC-MSペプチドマッピング、及びELISAによって特徴解析した。
【０３３３】
CAR-T細胞を改変して、ラクダ科動物抗VEGFR2抗体(AB1)をCD28及び4-1BB共刺激分子並びにCD3ζ鎖との組合せで発現させた。抗VEGFR2 CAR-T細胞とVEGFR-2発現細胞株との共インキュベーションによって、LDH放出によって測定される用量依存的な標的細胞毒性が結果として生じた。さらに、高レベルのIL-2及びIFN-γが細胞培養培地中で検出されたので、T細胞活性が確認された。これらの結果は、抗VEGFR2 CAR-TがVEGFR2発現腫瘍を直接ターゲッティングするのに有用であり得ることを示唆している。
【０３３４】
(実施例1:抗VEGFR-2抗体の作製)
VEGFR-2の細胞外ドメインを標的とするラクダ科動物の単一ドメイン抗体を作製するために、リャマに、組換えVEGFR-2/Fcで免疫した。ファージディスプレイライブラリーを作製し、スクリーニングして、VEGFR-2に対する高い結合親和性を有する単一ドメイン抗体を同定した。
【０３３５】
VEGFR-2の細胞外ドメインを標的とするヒト単一ドメイン抗体を作製するために、ヒトVHライブラリーをスクリーニングして、VEGFR-2に対する高い結合親和性を有する単一ドメイン抗体を同定した。
【０３３６】
融合パートナー配列
【化１４】
2020504623.tif 000024
を配列番号2及び配列番号11(AB1及びAB2)の配列のN-末端に付加して、発現タンパク質を封入体に蓄積させ、かつタンパク質精製及びリフォールディングプロセスを効果的に簡略化することにより、抗体の収率を増大させた。
【０３３７】
4つの抗体を作製し、さらに検討した。選択された抗体を大腸菌BL21(DE3) pT7システムで発現させた。これらの抗体のうちの2つ(AB2(配列番号13)及びAB3(配列番号21))は、ヒト抗体スキャフォールドに基づくものであり、2つの配列番号7及び27(AB1及びAB4)は、リャマ起源のものである。これらの抗体は、特異的なVEGFR-2結合の潜在的候補とみなされるのに十分な品質のものである結合動力学を示した(表1)。
(表1.抗体の特徴解析)
【表１】
2020504623.tif 000025
【０３３８】
(実施例2:ヒトVEGFR-2/Fcバインダー)
ヒト配列番号13(AB2)及び配列番号21(AB3)並びにリャマ配列番号7(AB1)及び配列番号27(AB4)と固定化されたヒト及びマウスVEGFR-2/Fcとの相互作用についての結合動力学をBiacore 3000システムを用いるSPRによって決定した。12,000RUのヒトVEGFR2/Fc(R&D Systems)、14,000RUのマウスVEGFR-2/Fc(R& D Systems)、又は参照タンパク質としての7500RUのBSA(Sigma)を、それぞれ、研究等級のCM5-センサーチップ(Biacore)上に固定化した。固定化を、製造元によって供給されたアミンカップリングキットを用いて、10mM酢酸塩pH 4.5中、50μg/mlタンパク質濃度で実施した。全ての抗体試料をSuperdex 75カラム(GE Healthcare)に通して、Biacore解析に供される単量体形態を分離した。
【０３３９】
どの場合においても、解析は、150mM NaCl、3mM EDTA、及び0.005％界面活性剤P20を含む10mM HEPES、pH 7.4中、25℃で、40μl/分の流速で実施した。3〜8秒の接触時間の10mM HClを用いて、表面を再生した。データをBIAevaluation 4.1ソフトウェアで解析した。4つの抗体は全て、主に単量体のピークを示した。(図1、サイズ排除カラムクロマトグラム)。サイズ排除カラムクロマトグラフィーの条件:機器: AKTA FPLC(GE healthcare); Superdex 75 HR 10/30カラム(Amersham, Cat. No. 17-1047-01, Id No. 9937116);泳動緩衝液: HBS-EP(10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA、pH7.4、0.005％P20);及び4×HBS-Eを4倍希釈し、10％のP20界面活性剤を添加して、最終0.005％にした。試料容量: 200μl。ポンプスピード: 0.5ml/分。
【０３４０】
該抗体はいずれも、150〜200nMの濃度で、固定化されたマウスVEGFR-2/Fcとの結合を示さなかったが、全て、固定化されたヒトVEGFR-2/Fcとの結合を示した(表1及び図2)。これらのデータは、該抗体が種特異的であるということを示している。配列番号7(AB1)は、SPR表面上では解離しにくく、センサーグラムデータ(図2)の標準的な動力学モデルへの直接的な当てはめを複雑にした。それゆえ、配列番号7(AB1)の動力学定数は、図3に示される変換データから推定した。
【０３４１】
(実施例3:ヒト及びリャマ抗体のヒトVEGFR-2/Fcとの結合)
(a)配列番号13(AB2)、(b)配列番号21(AB3)、(c)配列番号7(AB1)、(d)配列番号27(AB4)と、それぞれ、(a)0.1、0.2、0.3、0.5、1、及び2μM、(b)0.2、0.3、0.5、0.75、1、1.5、2、及び3μM、(c)0.15、0.25、0.5、1、2、及び4μM、(d)75、150、225、300、375、525、及び750nMの濃度の固定化されたヒトVEGFR-2/Fcとの結合を示すセンサーグラムオーバーレイが図2に示されている。
【０３４２】
(実施例4:)
(ヒトVEGFR-2/Fcに対するAB1の結合の動力学定数解析)
0.1、0.15、0.25、0.5、0.75、1、2、及び4μMの濃度でのAB1の導出データが図3に示されている。濃度対-ks(1μM未満の濃度を示す切片)のプロット。
【数１】
2020504623.tif 000026
【０３４３】
(実施例5:エピトープマッピング)
2つの異なる抗体を＞4×KDの濃度で次々と同時注入した。結果は、図4A及び図4Bに示されている。はっきりとした重複が、配列番号13(AB2)、配列番号21(AB3)、及び配列番号27(AB4)で見られた。いくらかの重複が配列番号7(AB1)で見られた。
【０３４４】
エピトープ情報は、競合的ELISA実験でも提供された(図7)。AB3(配列番号23)-ウレアーゼコンジュゲートは、カップリングされていないAB2(配列番号13)抗体によって阻害され、2つのヒト抗体が少なくとも一部重なり合うエピトープを共有していることが示唆された。カップリングされていないAB3(配列番号21)抗体も、極めて高いモル比のときのみであったが、AB1(配列番号9)-DOS47の結合を一部阻害した。
【０３４５】
(実施例6: VEGFR-2との結合及びVEGFR-1及びVEGFR-3に対する交差反応性)
4つ全ての単一ドメイン抗体を用いて、ウレアーゼ(「DOS47」)コンジュゲートを作製した。これらのコンジュゲートを、抗原VEGFR-2に結合するその能力、そして同じく、VEGFR-1及びVEGFR-3と交差反応するその能力について試験した(図5)。4つ全てのコンジュゲートは、VEGFR-2を標的とすることができ、VEGFR-1に対するある程度の交差反応性を有していたが、VEGFR-3に対する検出可能な結合は観察されなかった。結果が、配列番号9、配列番号13、配列番号23、及び配列番号27(それぞれ、リンカーを含む、AB1、AB2、AB3、及びAB4)について示されている。
【０３４６】
(実施例7: VEGF競合アッセイ)
ウレアーゼコンジュゲートを、VEGFと競合的に結合するその能力についても試験した。これは、該抗体がVEGF結合ポケット付近の領域を認識するかどうかを評価するために行われた。この解析の例は、図6に提供されている。これにより、2つのヒト抗体-ウレアーゼコンジュゲート(AB2-(配列番号13)及びAB3-(配列番号23) DOS47)とVEGFR-2との結合がVEGFによって競合的に阻害されたということを理解することができる。しかしながら、最大阻害は、AB2-(配列番号13) DOS47については〜40％、及びAB3-(配列番号23) DOS47については〜60％でプラトーに達することが分かった。これにより、AB2及びAB3がVEGF結合ポケット付近にしか結合しないことが示唆された。VEGFは、VEGFR2に対するAB1-(配列番号9) DOS47複合体の結合に対して最小限の効果を有した。したがって、AB1は、VEGF結合ポケットから遠い部位に結合すると思われる。AB4-(配列番号27) DOS47とVEGFR2との結合はVEGFの存在によって強化され、AB4抗体がVEGFR2のみよりもVEGF/VEGFR2複合体と良好に結合することが示唆された。
【０３４７】
(実施例8: 293/KDR細胞上に発現されたVEGFR2に対する抗体結合)
フローサイトメトリー実験を実施して、抗体及び/又は抗体-ウレアーゼコンジュゲートと293/KDR細胞との結合を試験した。293/KDR細胞は、ヒトVEGFR2(別名、KDR)を発現するように安定にトランスフェクトされた293細胞である。図8Aは、ビオチン化AB1抗体(配列番号6)と293/KDR細胞との結合を示している。この結合は、モル濃度過剰の遊離AB1抗体によって阻害されるが、無関係な抗体では阻害されない。図8Bは、AB1-(配列番号6)ウレアーゼコンジュゲート及びAB2-(配列番号18)ウレアーゼコンジュゲートと293/KDR細胞との結合を示している。図8に示された結果により、本明細書に記載されるAB1抗体及びAB2抗体が293/KDR細胞上に発現されるVEGFR2に結合することが確認される。
【０３４８】
(実施例9)
V21-DOS47は、ラクダ科動物単一ドメイン抗VEGFR2抗体(V21)と酵素ウレアーゼ(DOS47)から構成される。該コンジュゲートはVEGFR2に特異的に結合し、ウレアーゼは内在性尿素を腫瘍細胞にとって毒性のあるアンモニアに変換する。以前、本発明者らは、同様の抗体-ウレアーゼコンジュゲートL-DOS47を開発した。これは、現在、非小細胞肺癌に対して臨床試験中である。V21-DOS47はL-DOS47の作製から習得したパラメータから設計されたが、V21-DOS47を産生するために、さらなる作業が必要であった。本研究において、本発明者らは、V21抗体の2つのバージョン: V21H1(配列番号3)及びV21H4(配列番号6)の発現及び精製を記載している。各々を、異なる化学的クロスリンカーを用いて、ウレアーゼにコンジュゲートした。該コンジュゲートを、SDS-PAGE、SEC、ウェスタンブロッティング、及びLC-MSEペプチドマッピングを含む分析手法のパネルによって特徴解析した。結合特徴は、ELISA及びフローサイトメトリーアッセイによって決定した。
【０３４９】
該コンジュゲートの生理的pHでの安定性を改善するために、いくつかのアミノ酸残基をC-末端に付加することにより、V21抗体のpIを調整した。V21H4については、コンジュゲーション化学での使用のために末端システインも付加した。修飾されたV21抗体を大腸菌BL21(DE3) pT7システムで発現させた。抗体のリジン残基を標的とするヘテロ二官能性クロスリンカーのスクシニミジル-[(N-マレイミドプロピオンアミド)-ジエチレングリコール]エステル(SM(PEG)2)を用いて、V21H1をウレアーゼにコンジュゲートした。抗体C-末端に付加されたシステインを標的とするホモ二官能性クロスリンカーの1,8-ビス(マレイミド)ジエチレングリコール(BM(PEG)2)を用いて、V21H4をウレアーゼにコンジュゲートした。V21H4-DOS47は、優れたコンジュゲートであると決定されたが、それは、該抗体が高レベルで容易に産生及び精製され、かつ該コンジュゲートがcGMP生産に容易に移行可能な方法を用いて効率的に作製及び精製することができるからである。さらに、V21H4-DOS47は、天然のリジン残基が未修飾であるので、V21H1-DOS47よりも高い結合活性を保持している。
【０３５０】
本発明者らは、血管新生を抑制するための抗体-薬物コンジュゲート(ADC)アプローチを開発した。VEGFR2の二量体化を遮断することによるか又はキナーゼ活性を阻害することによりキナーゼシグナル伝達カスケードを中断するほとんどの抗血管新生剤とは異なり、本発明者らの抗体-薬物コンジュゲートV21-DOS47は、標的細胞で細胞傷害活性を誘導することにより、VEGFR2発現細胞を死滅させる。本発明者らの以前の抗腫瘍免疫コンジュゲートであるL-DOS47(Tianらの文献、2015)と同様、V21-DOS47は、ラクダ科動物抗体と酵素ウレアーゼ(タチナタマメ、カナウァリア・エンシフォルミス(Canavalia ensiformis)に由来する)から構成されており: V21抗体がVEGFR2に結合し、それにより、複合体をVEGFR2発現細胞にターゲッティングするのに対し、ウレアーゼ酵素は内在性尿素をその場所でアンモニアに変換して、細胞傷害性を誘導する。VEGFR2は、腫瘍血管系で発現されているだけでなく、種々の腫瘍の表面でも確認されているので(Itakuraらの文献、2000; Tannoらの文献、2004; Guoらの文献、2010)、V21-DOS47は、VEGFR2+血管内皮細胞とVEGFR2+腫瘍細胞の両方を標的とする。アンモニアの局所濃度の上昇はまた、本来なら癌細胞成長にとって有利である腫瘍微小血管系の周囲の酸性環境を中和する(Wongらの文献、2005)。ウレアーゼは植物性産物であり、哺乳動物ホモログは知られていないので、それは、免疫原性である可能性が高いが、自己免疫反応は考えられない。L-DOS47は、現在、臨床試験で検討中であり、結果は、抗-ウレアーゼ抗体が形成されるが、既知の重度の免疫毒性は観察されないことを示している。ウレアーゼの免疫原性の完全な影響は、依然として、調査中である。
【０３５１】
ラクダ科動物抗体の1つの利点は、従来の免疫グロブリン(約150kDa)と比較してそのサイズが比較的小さい(約15kDa)ことである。これは、抗体をウレアーゼにカップリングするときに特に重要であるが、それは、ウレアーゼが分子量544kDaの巨大タンパク質であるからである。リャマ抗体を使用することにより、多数の抗体を、分子量全体の増加を比較的小さくして、各々のウレアーゼ分子にカップリングすることができる。これにより、許容し得る生態分布プロファイルを保持する高結合力の治療用試薬の作製が可能になる。ラクダ科動物抗体(De Genstらの文献、2006; Maassらの文献、2007; Harmsen及びDe Haardの文献、2007)の他の利益は、それがクローニングし易く、かつ組換え発現し易く(Arbabi Ghahroudiらの文献、1997; Frenkenらの文献、2000)、一般に、従来のIgGよりも熱的に及び化学的に安定であり(van der Lindenらの文献、1999; Dumoulinらの文献、2002)、かつそれが従来の抗体によって認識されないエピトープに結合することである(Lauwereysらの文献、1998)。さらに、ラクダ科動物抗体は、特に免疫原性であるというわけではないが、それは、ヒトVHドメインとラクダ科動物VHHドメインが約80％の配列同一性を共有し(Muyldermansらの文献、2001)、腎クリアランスが大きい(Cortez-Retamozoらの文献、2002)からである。
【０３５２】
抗体-ウレアーゼコンジュゲートは複合体の巨大タンパク質であり:ウレアーゼ1つ当たりに多数の抗体を含み、該コンジュゲートの分子量は680kDaに達することがある。これは、大規模生産への課題をもたらす。本発明者らの以前の報告において、本発明者らは、これらの課題に対処するために設計されたコンジュゲーション化学及び分離手順を記載した(Tianらの文献、2015)。本研究において、本発明者らは、新規の抗体-ウレアーゼコンジュゲートV21-DOS47を作製するために、さらなる抗体生産及びコンジュゲーション化学法を評価した。
【０３５３】
VEGFR2に対する高親和性抗体を作製するために、リャマに、組換えVEGFR2で免疫し、VHHファージディスプレイライブラリーを作製した。このライブラリーを組換えVEGFR2でパニングすることにより、V21抗体を単離した。複数の目的を果たすために:抗体pIを最適化するために、抗体発現を細菌封入体に向けるために、及び架橋化学反応の固有の標的を提供するために、さらなるアミノ酸残基をV21抗体のC-末端に付加した。この報告において、本発明者らは、V21H1及びV21H4と表記される2つのバージョンのV21抗体、並びに各々の抗体をウレアーゼにコンジュゲートするために使用された様々な方法を記載している。両方の抗体-ウレアーゼコンジュゲートを、サイズ排除クロマトグラフィー(タンパク質純度を評価するため)、SDS-PAGE(ウレアーゼ1つ当たりにコンジュゲートされた抗体の平均数を決定するため)、及びESI質量分析(抗体とウレアーゼの両方におけるコンジュゲーション部位を同定するため)を含む、種々の分析手法で特徴解析した。コンジュゲーション比の効果を検討し、同じコンジュゲーション比を有する2つのコンジュゲートの結合を比較した。細胞表面で発現されるVEGFR2との結合は、フローサイトメトリーによって確認した。
【０３５４】
(材料及び方法)
(高純度ウレアーゼ(HPU)の精製)
粗ウレアーゼ(Cat#U-80、236U/mg)をBioVectra社(Charlottetown, PE Canada)から購入した。コンジュゲーションにおいて使用する前に、粗ウレアーゼを精製して、カナバリン及びコンカナバリンAなどの、タチナタマメのマトリックスタンパク質混入物を除去した。100万単位の粗ウレアーゼを430mlの高純度(HP)水に室温で溶解させた。該溶液を10％(v/v)酢酸でpH 5.15にし、その後、9000rcf及び4℃で40分間遠心分離した。ウレアーゼ含有上清を4℃に冷却し、温度を0〜8℃で維持しながら、冷エタノールを25％(v/v)の最終濃度まで添加することにより分画した。混合物を一晩撹拌し、その後、9000rcf及び4℃で40分間遠心分離した。ペレットを150mlの酢酸塩-EDTA緩衝液(10mM酢酸ナトリウム、1mM EDTA、1mM TCEP、pH 6.5)に再懸濁させ、その後、4℃及び9000rcfで40分間遠心分離した。上清を、Minimate TFFシステム(MWCO 100kDaのMinimate TFFカプセルを備えたMasterflex Model 7518-00)を用いて75mlまで濃縮し、200mlの酢酸塩-EDTA緩衝液で3回透析濾過し、その後、100mlにまで濃縮した。透析濾過したウレアーゼ溶液を回収し、カプセル及びチューブ接続部中の濾過された溶液を50ml酢酸塩-EDTA緩衝液で該システムから放出し、回収された溶液に添加した(総容量〜150ml)。エタノール分画されたウレアーゼ溶液を、Bio-Rad Biologic LPシステムを用いる陰イオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製した。該ウレアーゼ溶液を、150mlのIEC緩衝液A(20mMイミダゾール、1mM TCEP、pH 6.5)で予め平衡化した35ml DEAEカラム(DEAE Sepharose Fast Flow, GE Healthcare, Cat#17-0709-01)に、3.5ml/分の流速で充填した。該カラムを100mlのIEC緩衝液Aで洗浄し、その後、80mlの40％緩衝液B(0.180M NaClを含む緩衝液A)で洗浄した。ウレアーゼを3.5ml/分の流速の100％緩衝液Bで溶出させ、A280＞0.1の画分をプールした。プール画分を、Minimateカプセルを100kDa MWCO膜とともに用いて、6〜8mg/mlの目標タンパク質濃度まで濃縮し、その後、酢酸塩-EDTA緩衝液(20mM酢酸ナトリウム、1mM EDTA、pH 6.5)に対して透析濾過した。高純度のウレアーゼ(HPU)を-80℃で保存した。この精製プロトコルからの収率は、通常、出発活性の＞55％である。
【０３５５】
(V21H1及びV21H4の発現)
両方の抗体を、カナマイシンを選択抗生物質として用いて、大腸菌BL21(DE3) pT7システムで発現させた。BL21(DE3)コンピテント大腸菌細胞(Sigma, B2935-10×50μl)の形質転換は、製造元の指示に準拠した。形質転換プレート由来の1つのコロニーを、50mg/Lカナマイシンが補充された200mlのLBブロス(LB培地EZミックス、Sigma Cat# L76581、20 g/L)に無菌的に植菌した。培養物を200rpm及び37℃でインキュベートした。ひとたび該培養物が0.6を超えるOD600に達したら、50mlの培養物を、50mg/Lカナマイシンを含む1LのLBブロスを各々含有する4つの2Lフラスコに移した。フラスコを、振盪式インキュベーター中、200rpm及び37℃でインキュベートした。ひとたび培養物が0.9〜1.0のOD600に達したら、1mM IPTGの添加と200rpm及び37℃で一晩のインキュベーションとによって、抗体発現を誘導した。細胞を遠心分離によって回収し、2L培養物当たり1つでアリコートにした。
【０３５６】
(V21H1の精製)
V21H1タンパク質の大部分は、封入体中にではなく、大腸菌サイトゾル溶液中に発現された。細胞ペレットのアリコートを、氷水浴中で10分間の超音波処理(Misonix 3000超音波破砕機、先端部品# 4406;各々の超音波処理サイクル: 30秒間超音波処理、4分間冷却、出力8)によって、100mlの溶解緩衝液(50mM Tris、25mM NaCl、pH 6.5)に溶解させた。溶解物を9000rcf及び4℃で30分間遠心分離した。最も存在量の多い細菌マトリックスタンパク質を除去するために、上清を氷冷エタノールと10％(v/v)の最終濃度まで混合し、氷水浴中で、30分間インキュベートし、その後、9000rcf及び4℃で30分間遠心分離した。上清を氷冷エタノールと45％(v/v)の最終濃度まで混合し、氷水浴中で60分間撹拌し、その後、9000rcf及び4℃で30分間遠心分離した。ペレットを200mlの洗浄緩衝液(50mM酢酸塩、0.1％Triton X-100、1mM DTT、25mM NaCl、pH 5.0)に再懸濁させた。9000rcf及び4℃で30分間遠心分離した後、ペレットを、2mM DTTが補充された100mlのSP緩衝液A(50mM酢酸塩、8M尿素、pH 4.0)に再懸濁させ、0.45μmフィルターに通して濾過した。濾過された溶液を、蠕動ポンプを2ml/分で用いて、1ml SP FFカラム(GE Healthcare、カタログ#17-5054-01)に充填し、その後、該カラムをACTA FPLCシステム(Amersham Bioscience, UPC-920)に接続した。該カラムを、10mlのSP緩衝液Aで、1ml/分で洗浄した後、V21H1抗体を、0〜50％のSP緩衝液B(0.7M NaClを含むSP緩衝液A)の勾配によって、30分間かけて、1ml/分の流速で溶出させた。ピーク画分のOD280を決定し、1.967/mg/mlの減衰係数で濃度を計算した。DTTをSPカラムのピーク画分に1mMの最終濃度まで添加し、溶液のpHを2M Tris-塩基で8〜8.5に調整した。pH調整済みのSPピーク画分を1滴ずつリフォールディング緩衝液(100mM Tris、10μM CuSO4、pH 8.8)に添加し、リフォールディングが完了するまで4℃で連続撹拌することにより、抗体のリフォールディングを実施した。リフォールディングプロセスは、インタクトタンパク質LC-MSによってモニタリングした。リフォールディング後、溶液を9000rcf及び4℃で30分間遠心分離した後、1ml QHPカラムに充填した。該カラムをFPLCシステムに接続し、1ml/分の流速の10mlのQ緩衝液A(50mM HEPES、pH 7.0)で洗浄した。抗体を、0〜40％のQ緩衝液B(0.7M NaClを含むQ緩衝液A)の勾配によって、40分で、1ml/分の流速で溶出させた。8Lの細胞培養物からのピーク画分をプールし、2〜4mg/mlまで濃縮し、20mM HEPES、pH 7.1に対して、4℃で一晩(MWCO 5〜8kDa、体積比1:50)、透析した。最終的なV21H1抗体溶液を0.22μmシリンジフィルターに通して濾過し、4℃で保存した。
【０３５７】
(V21H4の精製)
V21H1とは対照的に、V21H4タンパク質の大部分は、大腸菌の封入体中に発現された。各々の2L培養物由来の細胞ペレットを100mlの溶解緩衝液(50mM Tris、25mM NaCl、pH 6.5)に再懸濁させ、リゾチームと0.2mg/mlの最終濃度まで混合した。細胞懸濁液を室温で30分間インキュベートし、その後、氷水浴中、10分間の超音波処理(Misonix 3000超音波破砕機、先端部品# 4406;各々の超音波処理サイクル: 30秒間超音波処理、4分間冷却、出力8)によって溶解した。溶解物を9000rcf及び4℃で30分間遠心分離した。ペレットを、400mlのペレット洗浄緩衝液(50mM Tris、25mM NaCl、pH 6.5、1％ Triton X-100、2mM DTT)で2回及び2mM DTTを含有する50mMの酢酸で1回洗浄した。ペレットを、2mM DTTが補充された100mlのSP緩衝液A(50mM酢酸塩、8M尿素、pH 4.0)に再懸濁させ、9000rcf及び4℃で30分間遠心分離した。得られた上清を0.45μmフィルターに通して濾過し、5ml SP-XLカラム(GE Healthcare、カタログ#17-1152-01)に5ml/分の流速で充填した。該カラムを50mlのSP緩衝液Aで洗浄した後、タンパク質を0〜50％のSP緩衝液B(0.7M NaClを含むSP緩衝液A)の勾配によって、30分間かけて、5ml/分の流速で溶出させた。ピーク画分をA280＞700mUのときに回収した。DTTをプールされたSPピーク画分に1.0mMの最終濃度まで添加し、pHを飽和Tris塩基でpH 8.6〜8.7に調整した。SPピーク画分をリフォールディング緩衝液(50mM Tris、2M尿素、1.0mM DTT pH 8.6〜8.7)と混合することにより、リフォールディングを開始した。室温で2時間撹拌した後、1.2mMシスタミンをリフォールディング混合物に添加した。リフォールディングを室温で継続し、RP-HPLC(Agilent 1100システム; ZORBAX-C3カラム、PN883750-909;溶媒A:水中0.025％(v/v) TFA;溶媒B:アセトニトリル中0.025％TFA;勾配: 0.25ml/分の流速での30分間にわたる20〜60％B)によってモニタリングした。100μlの試料を様々な時点で回収し、1.0μlの未希釈のギ酸をすぐに添加することにより、酸性化した。30μlの各々の試料をカラムに注入して、クロマトグラムを記録した)。得られたリフォールディング混合物を9000rcf及び4℃で30分間遠心分離した後、5ml QHPカラム(GE Healthcare, 17-1154-01)に5ml/分の流速で充填した。該カラムを50mlのQ緩衝液A(50mM HEPES、pH 8.7)で洗浄した後、タンパク質を0〜70％Q緩衝液B(0.7M NaClを含むQ緩衝液A)の勾配によって溶出させた。A280＞700mUのピーク画分をプールした。Qピーク画分をプールし、6〜10mg/mlまで濃縮し、緩衝液を10mM HEPES、pH 7.1と交換した。最終的なV21H4抗体溶液を0.22μmフィルターに通して濾過し、4℃で保存した。
【０３５８】
(V21H1とウレアーゼとのコンジュゲーション)
70.4μlのSM(PEG)2(DMF中、10.0mg/ml)ストック溶液をボルテックス処理しながらV21H1抗体に添加することにより、10mgのV21H1抗体を1:2.4の抗体対クロスリンカーのモル比でクロスリンカーで活性化した。反応溶液を室温で90分間インキュベートした。300mMのTris緩衝液(pH 7.6)を10mMの最終濃度まで添加し、室温で10分間インキュベートすることにより、反応をクエンチした。コンジュゲートされていない、加水分解され、かつクエンチされたクロスリンカーを、50mM NaCl及び1mM EDTA、pH 7.1を含有する50mM Tris緩衝液で予め平衡化した20mlのG25脱塩カラムで除去した。余分なクロスリンカーを除去した後、脱塩カラム画分をプールし、100μl試料をV21H1抗体上の活性化部位を評価するためのインタクトタンパク質マススペクトロメトリー分析及びペプチドマッピング分析用に回収した。プールされた残りの画分を氷水浴中で5分間冷却した。20mgの高純度ウレアーゼ(HPU)を解凍し、別の氷水浴中で5分間インキュベートした。冷却したHPU溶液を撹拌しながら活性化V21H1抗体溶液に注ぎ入れた。氷水浴中で5分間撹拌し続け、その後、反応溶液を室温でベンチに移した。コンジュゲーション反応溶液を室温で90分間インキュベートした後、システイン溶液(300mM Tris、pH 7〜7.5中、200mM)を5mMの最終濃度まで添加して、反応をクエンチした。反応溶液を、15mlの遠心分離フィルター(MWCO 100kDa)中、4℃及び2000 rcfで遠心分離することにより、約4mlにまで濃縮した。得られた濃縮反応溶液を3つのアリコートに分けた後、SEC分離した。分離は、反応溶液の各々のアリコートを、AKATA FPLCシステムに接続されたSuperose 6 100/300 GLカラム(GE)に充填することにより実施した。タンパク質を、0.5ml/分のアイソクラティック流により、SEC緩衝液(50mM NaCl、0.2mM EDTA、pH 7.2)で溶出させ、A280＞200mUの主要なピーク画分をプールした。全3回のSEC分離からのピーク画分をプールし、1Lの製剤化緩衝液(10mMヒスチジン、1％(w/v)スクロース、0.2mM EDTA、pH7.0)に対して透析した。得られたコンジュゲート溶液を0.22μmフィルターに通して濾過し、0.8mlアリコートに分けた。アリコートを-80℃で保存した。
【０３５９】
(V21H4とウレアーゼとのコンジュゲーション)
20mgのV21H4をTCEP(300mM Tris緩衝液、pH 7〜7.5中、100mM)と1.5mMの最終濃度まで混合し、室温で60分間インキュベートした。余分なTCEP及び結果として生じたシステアミンを、Tris-EDTA緩衝液(50mM Tris、1mM EDTA、pH 7.1)を用いて、25mlのG25脱塩カラムにより除去した。得られた脱塩画分を40mlビーカーにプールし、Tris-EDTA緩衝液で30mlの総容量まで希釈した。0.420mlのBM(PEG)2ストック溶液(DMF中、10mg/ml)を撹拌しながらビーカー中のV21H4抗体溶液に素早く分散させることにより、活性化反応を実施した。室温で10分間インキュベートした後、反応溶液を、フィルター膜(MWCO 5kD)を備えた200ml Amicon透析濾過濃縮器に移し、Tris-EDTA緩衝液と100mlまで混合した。透析濾過濃縮器を70psi(483kPa)の窒素源に接続することにより、余分なクロスリンカーを除去し、撹拌しながら20mlまで濃縮した。5サイクルの希釈及び濃縮の後、透析濾過濃縮器を窒素源から取り外し、抗体活性化部位を(インタクトタンパク質マススペクトロメトリー分析及びペプチドマッピング分析を用いて)決定するために、100μlの試料を回収した。Tris-EDTA緩衝液を該濃縮器に添加して、溶液を50mlのマーカーまで希釈した。V21H4活性化抗体を含む濃縮器を撹拌しながら氷水浴中で10分間冷却した。4℃で完全に解凍した後、80mgのHPUを別の氷水浴中で5分間インキュベートし、その後、その氷水浴中で撹拌しながら、該濃縮器中の活性化V21H4抗体溶液中に注ぎ入れた。氷水浴中で5分間撹拌した後、反応溶液を含む濃縮器を実験室のベンチに移し、室温で90分間インキュベートした。システイン(300mM Tris、pH 7〜7.5中、100mM)を5mMの最終濃度まで添加することにより、コンジュゲーション反応をクエンチした。反応を室温で5分間クエンチした後、反応溶液を別の容器に移し、濃縮器を掃除して、新しい濾過膜(MWCO 100kDa)を再び取り付けた。反応溶液を濃縮器に移し戻し、製剤化緩衝液(10mMヒスチジン、1％(w/v)スクロース、及び0.2mM EDTA、pH 7.0)を160mlのマーカーまで添加した。該濃縮器を10psi(69kPa)の窒素源に接続し、撹拌しながら20mlにまで濃縮した。希釈-濃縮サイクルを4回繰り返した後、透析濾過濃縮器を窒素源から取り外し、V21H4-DOS47コンジュゲート溶液を新しい容器に移し、40mlまで希釈した。該コンジュゲート溶液を0.22μmフィルターに通して濾過し、0.8mlのアリコートに分けた。アリコートを-80℃で保存した。
【０３６０】
(サイズ排除クロマトグラフィー(SEC))
996 PADを備えたWaters 2695 HPLCシステムをEmpower 2ソフトウェアとともにデータ取得及び処理のために利用した。クロマトグラムを処理用に抽出された280nmでのシグナルに関して210〜400±4nmにわたって記録した。分離は、Superose 6 100/300 GLカラム(GE)で実施した。タンパク質を10mMリン酸塩、50mM NaCl、0.2mM EDTA、pH 7.2中に溶出させた。分離は、一定容量の未希釈の試料を注入した後、0.5ml/分のアイソクラティック流で実施した。カラム温度を室温で保持し、一方、試料温度を5±2℃で制御した。
【０３６１】
(SDS-PAGE)
Bio-Rad Mini Gel Protein Electrophoresisキット及びBio-RAD Molecular Imager Gel Doc XR+をImageLabソフトウェアとともに利用して、V21-DOS47コンジュゲーション比を解析した。10μgのタンパク質試料を60μlのタンパク質ゲルローディング緩衝液と混合し、混合物を70℃まで10分間加熱した。変性した試料を4〜20％Tris-グリシンゲル(Invitrogen、REF# XP04200)に充填し(10uL/ウェル)、電気泳動を、150Vの定電圧で、＜40mAの電流で、電気泳動の先端がゲル底に到達するまで実施した。洗浄、染色、及び脱染色の後、ゲル画像を解析のためにGel Doc XR+イメージャーでスキャンした。SDS-PAGEを用いて、ウレアーゼ1分子当たりにコンジュゲートした抗体の平均数も計算した。これは、主要クラスター中の5本のバンドの強度を調査することにより決定した(さらなる詳細については、Tianらの文献、2015を参照)。報告されたコンジュゲーション比は全て、平均値である。
【０３６２】
(ELISAアッセイ)
96-ウェルプレートを、100μL/ウェルのヤギ抗ヒトIgG-Fc(Sigma、PBS中、5μg/mL)で、室温で6時間コーティングし、その後、200μL/ウェルの3％BSA/PBSで、2〜8℃で一晩ブロッキングした。T-TBS(0.05％Tween-20を含有する、50mM Tris、0.15M NaCl、pH 7.6)で2回洗浄した後、100μL/ウェルのVEGFR1/Fc、VEGFR2/Fc、又はVEGFR3/Fc(R&D Systems、TB-TBS(0.1％BSA/T-TBS)中、0.25μg/mL)を添加し、プレートを、穏やかに振盪させながら、室温で1時間インキュベートした。T-TBSで3回洗浄した後、100μL/ウェルの抗体-ウレアーゼコンジュゲート又はビオチン化抗体希釈物(TB-TBS中)を添加し、プレートを、穏やかに振盪させながら、室温で2時間インキュベートした。抗体-ウレアーゼコンジュゲートについて、プレートをT-TBSで3回洗浄し、100μL/ウェルのウサギ抗ウレアーゼ(TB-TBS中の1/6,000又は1/10,000倍希釈液、Rockland)を添加し、プレートを、穏やかに振盪させながら、室温で1時間インキュベートした。全ての試料について、プレートをT-TBSで3回洗浄し、100μL/ウェルのヤギ抗ウサギAP(TB-TBS中の1/8,000倍希釈液、Sigma)を添加して、抗体-ウレアーゼコンジュゲートを検出するか、又はストレプトアビジン-アルカリホスファターゼ(TB-TBS中、0.5μg/mL、Sigma)を添加して、ビオチン化抗体を検出し、プレートを、穏やかに振盪させながら、室温で1時間インキュベートした。T-TBSで3回洗浄した後、100μL/ウェルの基質(ジエタノールアミン基質緩衝液(Pierce)中、1mg/mLの4-ニトロフェニルホスフェート二ナトリウム塩六水和物(Fluka))を各々のウェルに添加し、穏やかに振盪させながら、室温で5〜15分間インキュベートした。プレートをUV-Vis分光光度計でスキャンすることにより、各々のウェルの405nmでの吸光度(A405)を取得した。
【０３６３】
(ウレアーゼ活性アッセイ)
ウレアーゼは、尿素からアンモニアへの加水分解を触媒する。1単位のウレアーゼ活性は、25℃、pH 7.3で1分間に1マイクロモルのアンモニアを遊離させる酵素の量と定義される。V21H4-DOS47試料を試料希釈緩衝液(1mM EDTA及び0.1％(w/v) BSAを含有する0.02Mリン酸カリウム、pH 7.3)に希釈した。100μlの希釈試料を2.00mlの0.25M尿素(0.3Mリン酸ナトリウム及び0.5mM EDTAを含有するリン酸緩衝液、pH 7.3中)と混合し、25±0.1℃で5分間インキュベートし、その後、1.00mlの1.0N HClを添加することにより、反応をクエンチした。酵素反応溶液中に生成されるアンモニウムイオンの濃度を決定するために、100μlのクエンチされた反応溶液を2.00mlのフェノール溶液(0.25mMニトロフェリシアン化ナトリウムを含有する0.133Mフェノール)と15ml試験チューブ中で混合した。30秒後、2.50mlのNaOH-NaOCL溶液(0.04％次亜塩素酸ナトリウムを含有する0.14N NaOH)を該試験チューブに添加し、混合し、37℃で15分間インキュベートした。該溶液の吸光度を試薬反応溶液(試料なし)をブランクとして638nmで決定した。ウレアーゼ酵素活性を、以下の方程式: U/ml＝D×(A×Tc×Te)/(5×E×Sc×Se)(式中、A＝638nmでの吸光度、Tc＝呈色反応液の総容量(4.60ml)、Te＝酵素反応液の総容量(3.10ml)、E＝アッセイ条件当たりのインドフェノールブルーのモル減衰係数(20.10mM-1.cm-1)、Sc＝呈色反応の試料容量(0.10ml)、Se＝酵素反応の試料容量(0.10ml)、及びD＝希釈時間)に従って計算した。各々の試料のタンパク質濃度を、製造元の指示に従って、Sigma総タンパク質キット(TP0200)で決定した。ウレアーゼ活性(U/ml)を試験したタンパク質の量(mg/ml)で除することにより、コンジュゲート1mg当たりのウレアーゼ活性を計算した。コンジュゲート1mg当たりの活性をウレアーゼから構成されるコンジュゲートの質量の割合で除することにより、比ウレアーゼ活性を計算した。
【０３６４】
(ウェスタンブロット)
V21H4-DOS47試験試料及び対照をSDS-PAGEゲル電気泳動によって分離し、その後、Bio-Radブロットキットを用いて、ニトロセルロース膜に転写した。対照としての1.2μgのHPU及び4.0μgのV21H4、並びに2.0μgのV21H4-DOS47試料を60.0μlのタンパク質ゲルローディング緩衝液と混合した。得られた試料混合物を、60℃まで10分間加熱することにより変性させ、レーン当たり10μlの各々の試料を充填した。2連のブロットを、ウレアーゼとV21H4抗体のプロービング用に並行して泳動させたゲルから作製した。ウレアーゼ検出のために、ウサギ抗ウレアーゼIgG(Rockland)を使用した。V21H4抗体を検出するために、ウサギ抗リャマIgG(ImmunoReagents社)を使用した。AP(Sigma)にコンジュゲートされたヤギ抗ウサギIgGを二次可視化抗体として使用した。ウェスタンブロットの最終的な顕色は、NBT/BCIPを含有するAP緩衝液を用いて実施した。
【０３６５】
(マススペクトロメトリー)
Waters Xevo G2 QTOFマススペクトロメーター及びAcquity UPLCシステムHクラスを全てのマススペクトロメトリー分析に利用した。785.8426Daのロック質量をリアルタイム2点間質量較正(real time point to point mass calibration)に適用した。LC-MSデータ取得は、Masslynx V4.1ソフトウェアによって制御した。
【０３６６】
(インタクトタンパク質マススペクトロメトリー分析)
クロスリンカーで活性化された抗体試料を5mMシステインと室温で30分間反応させ、0.5〜1mg/mlまで水に希釈し、未希釈のギ酸を1％(v/v)の最終濃度まで添加することにより酸性化した。BEH300 C4(1.7μm、2.1×50 mm)カラムを使用した。カラム温度を60℃に設定し、溶媒A(水中0.025％v/vのTFA)及び溶媒B(アセトニトリル中0.025％のTFA)をUPLC分離に使用した。UPLCを、0.15ml/分の流速で、20〜60％溶媒Bの勾配で30分かけて実施した。LC-MS TIC(総イオンカウント)データ取得は、0.3/秒のスキャン速度、キャピラリー電圧3.0kV、試料コーン電圧40V、抽出コーン電圧4.0kVの分解能モードで、500〜3500DaのM/Z範囲で実施した。イオン源温度は、100℃に設定し、脱溶媒和温度は、350℃に設定した。脱溶媒和ガス流速は、600L/時間とした。リアルタイムロック質量TIC生データセット(スキャン/20秒)を、100fモル/μlのGlu-Fib Bを用いて、6.0μl/分の流速で取得した。マススペクトロメトリーの生データを、BioPharmalynxソフトウェア(v1.2)を用いて、分解能10000のインタクトタンパク質モードで処理した。質量一致許容度を30ppmに設定し、1つのジスルフィド結合を含有する各々の抗体のタンパク質配列をタンパク質一致検索のための一致タンパク質として入力した。
【０３６７】
(V21H1-SM(PEG)2-Cys及びV21H4-BM(PEG)2-Cysのトリプシン消化)
クロスリンカーで活性化された抗体試料を10mMシステインと室温で30分間反応させ、その後、100mM炭酸水素アンモニウムで0.5mg/mlに希釈した。未希釈のアセトニトリルを希釈試料溶液に20％(v/v)の最終濃度まで添加した。トリプシン/Lys-Cミックス(Promega, Ref#V507A)を20:1のタンパク質:プロテアーゼ比で添加し、37℃で16〜20時間消化した。DTTを消化した試料に10mMの最終濃度まで添加し、試料を37℃で30分間インキュベートして、コアジスルフィド結合を還元した。未希釈のギ酸を1％(v/v)まで添加することにより消化を停止させた後、マススペクトロメトリー分析した。
【０３６８】
(V21H4-DOS47のトリプシン消化)
100μgのV21H4-DOS47をDTTと10mMの最終濃度まで混合し、未希釈のアセトニトリルを20％(v/v)の最終濃度まで添加した。ジスルフィド結合を還元し、コンジュゲートされたタンパク質を変性させるために、試料混合物を60℃で30分間加熱した。変性タンパク質沈殿物を室温で5分間の16000rcfでの遠心分離によってペレット化した。5.0μlの0.20Mヨードアセトアミド及び100μlの水をペレットに添加し、その後、ボルテックス処理によって混合した。懸濁液を16000rcfで室温で5分間遠心分離し、上清を廃棄した。得られたペレットを100μlのTris-グアニジン緩衝液(4M塩酸グアニジン、50mM Tris、10mM CaCl2、及び10mMヨードアセトアミド、pH 8.0)に溶解させた。このアルキル化反応を、室温、暗所で、30分間実施した後、反応を5mM DTTでクエンチした。得られた溶液をTris緩衝液(50mM Tris、10mM CaCl2、pH 8.0)で4倍希釈した。トリプシン/LysCミックスを25:1のタンパク質:プロテアーゼ比で希釈試料溶液に添加した。消化を37℃で16〜20時間実施した後、未希釈のギ酸を1％(v/v)の最終濃度まで添加することにより反応を停止させた。
【０３６９】
(V21H1-SM(PEG)2-Cys、V21H4-BM(PEG)2-Cys、及びV21H4-DOS47トリプシン消化物のLC-MSEペプチドマッピング)
BEH300 C18(1.7μm、2.1×150mm)カラムをUPLC分離に使用した。カラム温度を60℃に設定した。溶媒A(水中0.075％v/vのギ酸)及び溶媒B(アセトニトリル中の0.075％ギ酸)をペプチド溶出に使用した。UPLCを0.15mL/分の流速で実施した。50分で0〜30％溶媒Bの勾配をV21H1-SM(PEG)2-Cys及びV21H4-BM(PEG)2-Cys試料のトリプシン消化物の分離に使用した。V21H4-DOS47のトリプシン消化物については、150分で0〜45％溶媒Bの勾配を使用した。LC-MSE TIC(総イオンカウント)データ取得は、0.3/秒のスキャン速度、キャピラリー電圧3.0kV、試料コーン電圧25V、抽出コーン電圧4.0kVの分解能モードで、50〜2000DaのM/Z範囲で実施した。イオン源温度は、100℃に設定し、脱溶媒和温度は、350℃に設定した。脱溶媒和ガス流速は、600L/時間とした。リアルタイムロック質量TIC生データセット(スキャン/20秒)を、100fモル/μLのGlu-Fib Bを用いて、3.0μL/分の流速で取得した。機器設定に関して、2つのインターリーブドスキャン関数がデータ取得に適用される。第一のスキャン関数は、衝突セルにエネルギーを付与しないうちに、試料中のインタクトペプチドイオンのMSスペクトルを取得する。第二のスキャン関数は、同じ質量範囲にわたるデータを取得するが;衝突エネルギーは20から60eVに上昇する。このスキャンは、非選択的タンデムマススペクトロメトリー(MS/MS)スキャンと同等であり、先行するスキャン中のイオンからのMSEフラグメントスペクトルの収集を可能にする。高エネルギー衝突誘導性フラグメンテーションは、ペプチド骨格結合をランダムに切断する。切断された各々のC-Nペプチド骨格結合について、生成したアミノ-末端イオンは「b」イオンと呼ばれ、C-末端イオンは「y」イオンと呼ばれる。表1〜3において、「MS/MS b/y可能性」と題された列は、タンパク質中の全てのペプチド結合が同等に破壊される可能性が高い場合に、各々のペプチドについて生成されることになるb及びyイオンの理論上の最大数を示している。「MS/MS b/y実測値」と題された列は、各々のペプチドについて同定されたb及びyイオンの実際の数を示している。b/yイオンの同定は、ペプチド同一性の明白な確認を提供する。マススペクトルの生データを、BiopharmaLynxソフトウェア(v 1.2)を用いて、分解能20000のペプチドマップモードで処理した。785.8426Daのロック質量をリアルタイム2点間質量較正に適用した。低エネルギーMSイオン強度閾値は、3000カウントに設定し、MSE高エネルギーイオン強度閾値は、300カウントに設定した。質量一致許容度は、MSについては10ppmに及びMSEデータセットについては20ppmに設定した。1つの欠損した切断部位を有するペプチドを質量一致検索に含めた。V21H1、V21H4、及びウレアーゼ(Uniprot P07374)タンパク質配列を、それぞれ、ペプチドマッチング/同定のための配列ライブラリーに入力した。脱アミド化N、脱アミド化スクシンイミドN、酸化M、+K、+Na、及びカルバミドメチルC(アルキル化システインに対するもの)を含む可変修飾因子をペプチドマップ分析に適用した。SM(PEG)2-Cys(429.1206Da)をV21H1コンジュゲーションの活性化部位を同定するための可変修飾因子として設定したのに対し、BM(PEG)2-Cys(431.1362Da)をV21H4コンジュゲーションの活性化部位を同定するための可変修飾因子として入力した。V21H4-DOS47トリプシン消化物については、GGGEEDDGC-BM(PEG)2(配列番号72)(1145.3453Da)をウレアーゼ上のコンジュゲーションを同定するための可変修飾因子として設定した。
【０３７０】
(フローサイトメトリー)
293又は293/KDR細胞を、非酵素的細胞解離緩衝液(Sigma)を用いて、フラスコから剥離した。細胞を300×gで5分間遠心分離し、その後、染色緩衝液に106細胞/mL(Ca2+及びMg2+、0.02％NaN3、2％FBSを含むPBS)で再懸濁させた。100μLの細胞を96-ウェルプレートのウェルに添加した。該プレートを350×gで4分間遠心分離し、緩衝液を除去し、その後、細胞を50μLの抗体-ウレアーゼコンジュゲート又はビオチン化抗体(染色緩衝液に希釈したもの)に再懸濁させ、その後、2〜8℃で1時間インキュベートした。抗体-ウレアーゼコンジュゲートで染色した細胞について、細胞を染色緩衝液で3回洗浄し、その後、(染色緩衝液に希釈した)5.8μg/mLのマウス抗ウレアーゼ(Sigma、cat #U-4879)に再懸濁させ、2〜8℃で30分間インキュベートした。全ての試料について、細胞を染色緩衝液で3回洗浄し、その後、抗体-ウレアーゼ試料については、(染色緩衝液に希釈した)3μg/mLのAF488-抗マウスIgG(Jackson、cat #115-545-164)に再懸濁させ、又はビオチン化抗体については、(染色緩衝液に希釈した)133ng/mLのPE-SA(Biolegend、cat #405204)で染色した。全ての細胞を2〜8℃で暗所で30分間インキュベートし、染色緩衝液で3回洗浄し、その後、(PBSに希釈した)1％パラホルムアルデヒドに再懸濁させた。プレートを室温で15分間インキュベートし、スズ箔で覆った。その後、該プレートを上記のように遠心分離し、パラホルムアルデヒドを除去し、細胞を染色緩衝液に再懸濁させた。該プレートをスズ箔で覆い、Guavaフローサイトメーター及びguavaSoftソフトウェア(Millipore)を用いる解析まで、2〜8℃で保存した。S/N値は、293/KDR細胞に結合しているV21H4-DOS47と293細胞に結合しているV21H4-DOS47の比又は293/KDR細胞に結合しているビオチン-V21H4とビオチン-アイソタイプ対照抗体(抗CEACAM6)の比である。
【０３７１】
(結果)
(V21H1の産生及び精製)
免疫コンジュゲート薬用の単一ドメイン抗体を作製する場合、高純度抗体を、高い収率で、かつ発現、タンパク質リフォールディング、及び精製を含む、制御可能なプロセスで産生しなければならない。他の検討事項としては、以下のものが挙げられる:抗体のpIは、抗体-コンジュゲートが生理的pHで安定かつ可溶性であるようなものであるべきであり、抗体の特性は、コンジュゲーション化学に好適であるべきであり、かつコンジュゲーション反応中の抗体残基の修飾は、その抗原に対する抗体結合の親和性を損なうべきでない。
【０３７２】
V21ラクダ科動物抗体は122個のアミノ酸を有する(配列番号2)。V21H1(配列番号3)を作製するために、11個のアミノ酸をV21抗体のC-末端に付加した。これらのアミノ酸を付加することにより、コンジュゲートの安定性及び可溶性のために必要に応じて、抗体のpIを8.75から5.44へと変化させた。ヘテロ二官能性化学クロスリンカーSM(PEG)2は、アミン及びスルフヒドリル基と反応する。これを、V21H1をウレアーゼにコンジュゲートするのに使用するために選択した:
【化１５】
2020504623.tif 000027
工程1は、SM(PEG)2を用いる抗体の活性化である。工程2は、活性化された抗体をウレアーゼにコンジュゲートする。
【０３７３】
コアV21配列中に5つのリジン残基があり、そのうちの2つ(Lys66及びLys101)は、それぞれ、CDR2及びCDR3配列中に位置する。これらのアミノ酸は、SM(PEG)2により利用されるアミンコンジュゲーション化学によって修飾されることができ、抗体活性を変化させる可能性があるので、この可能性を最小限に抑えるために、2つのさらなるリジン残基を抗体C-末端に付加した。
【０３７４】
V21H1は、主にBL21(DE3)細菌の細胞質ゾル溶液中に発現され、封入体中での発現はほとんどなかった。それゆえ、細胞溶解後、該抗体をエタノール結晶化及び陽イオン交換クロマトグラフィーによって細菌タンパク質から分離した。抗体リフォールディングの後、天然の抗体を陰イオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製した。精製された抗体の分子質量が設計されたタンパク質配列と一致することを確認するために、LC-MSインタクトタンパク質分析を実施した。不純物タンパク質はLC-MS TICクロマトグラムから検出されず、V21H1の検出された分子質量は、そのタンパク質配列から計算される理論値と一致し、質量一致誤差は30ppm以内であった(データは示さない)。しかしながら、精製されたV21H1の収率は、非常に低く(培養物1L当たり4〜6mg)、使用された精製プロセスは、大規模cGMP生産に適していない。
【０３７５】
(V21H1のクロスリンカー活性化)
抗体-ウレアーゼコンジュゲートL-DOS47の産生においてSIABによるAFAIKL2抗体の活性化に最適であることが以前に分かった条件を用いて、V21H1をSM(PEG)2によりpH 7.0で活性化した。NHS-エステル反応はSIABとSM(PEG)2について同じであり、LC-MSスペクトルはAFAIKL2反応産物とV21H1反応産物について同様であるので(データは示さない)、これらの条件は、SM(PEG)2によるV21H1の活性化にも最適であるはずであった。
【０３７６】
SM(PEG)2のNHS-エステル基だけがV21H1と反応することができる。V21H1抗体中の2つのシステイン残基はジスルフィド結合を形成し、そのため、クロスリンカーのマレイミド末端との反応に利用することができない。抗体N-末端由来の一級アミン及びタンパク質配列由来のリジン残基は全て潜在的にクロスリンカーのNHS-エステルと反応することができる。その場合、抗体-担持クロスリンカーのマレイミド末端は、ウレアーゼ分子の表面上のシステインと反応する。各々のアミンが活性化される可能性は、その周囲の天然構造に起因するその接近可能性によって決まる。ウレアーゼの二量体及び重合体が第二の反応工程で形成するのを避けるために、抗体1つ当たり1つのアミンのみがNHS-エステルによって活性化されることが理想的である。しかしながら、多数の一級アミンが各々の抗体中に存在するので、一部のV21H1抗体が複数のクロスリンカー分子によって活性化されることは統計学的に避けられない。複数のクロスリンカーによって活性化される抗体の割合を最小化すると同時に、活性化された抗体の総量を最大化する、最適な活性化条件を選択した。活性化分布を評価するために、SM(PEG)2活性化V21H1を過剰のシステインと反応させ、インタクトマススペクトロメトリー分析によって評価した。マススペクトルは、図9に示されている。V21H1の約50％がSM(PEG)2によって活性化され、活性化された抗体のうち、約30％が2つのクロスリンカーによって活性化された。したがって、V21H1抗体のわずか35％が、ウレアーゼとの架橋のために最適に活性化される。
【０３７７】
V21H1のどのリジンがSM(PEG)2によって標的とされるのかを決定するために、V21H1-SM(PEG)2-Cysをトリプシン消化に供し、その後、LC-MSE分析した。トリプシンは、アルギニン及びリジン残基のC-末端側でペプチド骨格結合を切断する(プロリンがK又はRのすぐC-末端にある場合を除く)。リジンがSM(PEG)2によって活性化される場合、該リジンの極性及び側鎖構造は変化し、空間的に遮断される。したがって、このトリプシン消化部位は、プロテアーゼにとって、もはや接近可能ではない。例えば、V21H1のK66がSM(PEG)2によって活性化される場合、それは-SM(PEG)2-Cysに連結され、もはやトリプシン消化に利用することができず;それゆえ、2862.3018(2431.1656＋431.1362)Daの分子質量を有するピークが観察されるはずであり、このピークは、-SM(PEG)2-Cysが中間のリジンと連結したペプチド、
【化１６】
2020504623.tif 000028
に相当する。LC-MSEペプチドマッピング分析において、-SM(PEG)2-Cys(431.1362Da)を可変修飾因子として、全てのリジン担持ペプチド及びN-末端ペプチドを検索することにより、可能性のある全ての活性化部位を同定することができる。検出されたトリプシン消化ペプチドは、コンジュゲーション部位と一緒に、表2に掲載されている。
表2:同定されたペプチド及びV21H1-(PEG)2-Cysの活性化部位のリスト。トリプシン消化ペプチドのセットの周囲の太い囲み(青の網掛けもされている)は、各々の活性化部位についての活性化の％を計算するために使用された関連ペプチド群を示している。nd＝未検出。
【表２】
2020504623.tif 000029
【０３７８】
トリプシン消化ペプチドは全て、5ppm未満の質量一致誤差で検出され、アミノ酸配列回収は100％であった。ESI感度が修飾因子の連結によって影響を受けないと仮定して、クロスリンカー修飾ペプチドの強度を全ての関連ペプチドの合計強度と比較することにより、活性化パーセンテージを評価した。使用した活性化条件下で、CDR2中のリジン残基K66は、クロスリンカーによって相当に(活性化されたV21H1抗体全体の〜25％)活性化されたが; CDR3中のK101は、クロスリンカー活性化の間に修飾されなかった。驚くべきことに、コンジュゲーション化学の目的で意図的に付加された2つのC-末端リジン残基は、クロスリンカーによって修飾されなかった。
【０３７９】
(V21H4の産生及び精製)
抗体V21H4を、V21H1の産生、精製、及びクロスリンカー活性化において確認された問題について改善するように設計した。V21H4抗体のアミノ酸配列は、配列番号6に示されている。V21H1に関しては、いくつかのアミノ酸残基をV21抗体C-末端に付加し(G123〜C136)、該抗体のpIを8.75から5.43に調整した。V21H1の場合、抗体CDR2領域中のSM(PEG)2クロスリンカー活性化K66の存在が抗体の結合親和性を損ない得るので、これは懸案事項であった。したがって、異なるクロスリンカーBM(PEG)2を用いるスルフヒドリルとスルフヒドリルの架橋のために、システイン残基(C136)をV21H4に付加した:
【化１７】
2020504623.tif 000030
工程1は、BM(PEG)2を用いる抗体の活性化である。工程2は、活性化された抗体をウレアーゼにコンジュゲートする。
【０３８０】
C-末端システインの包含は、抗体が細菌封入体中に発現されることも可能にした。V21抗体の2つのコアシステイン残基はジスルフィド結合を形成し、化学的コンジュゲーションに利用することができないので、追加のC-末端システイン残基が、標的とされるコンジュゲーションのための固有の活性化部位を提供する。
【０３８１】
V21H4は、高レベルで封入体に発現された。細胞溶解後、抗体を遠心分離によって細菌マトリックスタンパク質から分離した。変性した抗体を陽イオン交換クロマトグラフィーによって精製して、核酸及び他のタンパク質を除去した。V21H4抗体のリフォールディングを容易に制御可能な方法で実施し、HPLCによってモニタリングした(図10)。
【０３８２】
陽イオン交換カラムのピーク画分をリフォールディング緩衝液と混合することにより、リフォールディングプロセスを開始した。フォールディングプロセスは、シスタミンなしでは非常に遅いが、シスタミンを1.2mMの最終濃度まで添加した後、フォールディングは、室温で2時間のうちに完了した。陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて、適切にフォールディングしたタンパク質を単離し、80％を超える収率が概ね観察された。精製されたV21H4の典型的な収率は、培養物1L当たり20〜40mgであり、これは、V21H1の収率よりもかなり高い。さらに、V21H4を産生及び精製するために使用された方法は、スケールアップ及びcGMP生産に適している。
【０３８３】
(V21H4のクロスリンカー活性化)
V21H4のC-末端システインは、ウレアーゼとのコンジュゲーションに必要である。しかしながら、シスタミンがV21H4リフォールディング緩衝液中に含まれていたので、半シスタミン(システアミン-H)とのジスルフィド結合を形成することにより、C-末端システインが修飾された。これは、LC-MSインタクトタンパク質分析によって確認された(図11A)。したがって、この半シスタミンを除去しなければならず、かつその後、システインはクロスリンカーによる活性化に利用可能とならなければならない。さらに、この除去は、コンジュゲーション目的のために使用される天然条件下での制御可能な穏やかな還元を用いて行われなければならず、かつそれは、抗体の内部ジスルフィド結合を還元してはいけない。図11Bに示されているように、V21H4を、2mM TCEPを用いてpH 7.1で、室温で1時間還元した後、検出された抗体分子質量は14667.94Daであり、保護的半シスタミンが除去されたことが示唆された。脱保護されたシステイン残基が架橋試薬に対して活性があることを確認するために、10mMヨードアセトアミドを脱保護されたV21H4抗体に添加した。pH 7.5〜8.0で、室温で30分後、得られた検出された分子質量は14724.83Daに増加しており(図11C)、カルボキシメチル基(57.05Da)がシステイン残基に対してアルキル化されたことが示唆された。まとめると、C-末端の半シスタミンを除去することができ、得られる脱保護されたシステインは、化学的コンジュゲーションに利用可能である。また、アルキル化された抗体をトリプシンで消化して、LC-MSEペプチドマッピングによって評価した。LC-MSEペプチドマップ(データは示さない)はアミノ酸配列の100％を網羅し、かつC-末端システインは特異的かつ効果的にアルキル化され、標的としたスルフヒドリル架橋化学における脱保護還元反応の特異性及びC-末端システインの好適性が確認された。
【０３８４】
V21H4抗体をクロスリンカーBM(PEG)2によって活性化した。BM(PEG)2はホモ二官能性クロスリンカーであるので、BM(PEG)2の両方のマレイミド基が反応し、2つのV21H4分子を連結し、ウレアーゼにコンジュゲートすることができない抗体二量体の生成をもたらし得ることが可能である。生成する抗体二量体の頻度は、反応物のモル比、システイン残基の天然の疎水性度環境、及び反応溶液中の分子の相対移動度によって決まる。この反応を10:1のクロスリンカー対抗体のモル比で実施した。さらに、クロスリンカーの分子量は308.29Daであり、これは、抗体の分子量よりも約50倍小さい。活性化されたV21H4抗体を評価するために、100μlの活性化された抗体溶液を過剰のシステインと反応させ、インタクトマススペクトロメトリー分析によって評価した(図11D)。使用された実験条件の下で、99％超のV21H4が単一のクロスリンカーにカップリングし、クロスリンカーの他のマレイミド基がその後のウレアーゼとの反応に利用可能な状態になった。
【０３８５】
C-末端システインがBM(PEG)2の唯一の標的であることを確認するために、V21H4-BM(PEG)2-Cysをトリプシン消化に供し、その後、LC-MSE分析した。C-末端システインがクロスリンカーによって活性化された場合、クロスリンカー活性化ペプチド
【化１８】
2020504623.tif 000031
に相当する1266.3652Daの質量を有するピークが検出されるはずである。コアジスルフィド結合がクロスリンカー活性化の前にTCEPによって還元された場合、2つのピーク−ペプチド
【化１９】
2020504623.tif 000032
に相当する一方と
【化２０】
2020504623.tif 000033
に相当するもう一方が同定されるはずである。検出されたトリプシン消化ペプチドは、クロスリンカー活性化部位一緒に、表3に掲載されている。
表3:同定されたペプチド及びV21H4-(PEG)2-Cysの活性化部位のリスト。トリプシン消化ペプチドのセットの周囲の太い囲み(青の網掛けもされている)は、各々の活性化部位についての活性化の％を計算するために使用された関連ペプチド群を示している。nd＝未検出。
【表３】
2020504623.tif 000034
【０３８６】
トリプシン消化ペプチドは全て、5ppm未満の質量一致誤差で検出され、アミノ酸配列回収は100％であった。予想された通り、C-末端システインの90％超がクロスリンカーによって活性化され、ごく微量のクロスリンカー活性化コアシステイン残基(Cys23及びCys97)が検出された。これは、CDR2中のものを含む、多数のリジンが標的とされるV21H1及びSM(PEG)2で観察される状況よりもはるかに望ましい状況である。
【０３８７】
(V21H1及びV21H4とウレアーゼとのコンジュゲーション及び初期特徴解析)
タチナタマメウレアーゼは、各々のサブユニットが約91kDaであるホモ六量体酵素である。サブユニット当たり15個の未結合のシステイン残基のうち、5個は天然構造の表面にあり、マレイミドクロスリンカーを介する単一ドメイン抗体との連結に利用可能である(Takishimaらの文献、1998)。様々なコンジュゲーション化学がタンパク質コンジュゲーションに広く使用されている。銅を含まないクリック化学は、タンパク質標識及びタンパク質-薬物コンジュゲーションにおいて優先的に使用されており(Thirumuruganらの文献、2013)、本発明者らの抗体とウレアーゼとのコンジュゲーションにおける潜在的な選択肢であった。しかしながら、クリック化学を実施する前に、NHS-エステル活性化工程又はマレイミド活性化工程のいずれかが必要となる。したがって、従来の架橋化学がより簡便であり、この特定の事例に適している。
【０３８８】
V21H1及びV21H4を架橋した後、それらをウレアーゼにコンジュゲートして、それぞれ、V21H1-DOS47及びV21H4-DOS47を作製した。どちらの場合も、スルフヒドリル化学を用いて、抗体-リンカーをウレアーゼにコンジュゲートした。SDS-PAGEを実施して、両方のコンジュゲートを評価した(図12A)。
【０３８９】
コンジュゲーションの間に、6つの単量体ウレアーゼサブユニットの各々を潜在的に最大5つの抗体分子と架橋することができ;それゆえ、変性SDS-PAGE条件下で、V21H1-DOS47とV21H4-DOS47はどちらも、〜90から180kDaの範囲の6つの別々のバンドのパターンを生じると予想された。しかしながら、5つの別々のバンドしか観察されないので、ウレアーゼ1つ当たり最大で4つの抗体がコンジュゲートされるようである(図12A、クラスター1)。これにより、ウレアーゼの表面にある5つのシステイン残基のうちの1つは、マレイミドと反応する能力がほとんど又は全くないことが示唆される。
【０３９０】
予想された5つの別々のバンドに加えて、さらなるバンドのクラスターがV21H1-DOS47とV21H4-DOS47の両方について観察される。V21H1-DOS47については、2つのさらなるクラスターが見える。クラスター2(有効MWは〜200から250Da)及びクラスター3(有効MWは＞300Da)は、多数のSM(PEG)2クロスリンカーを担持するV21H1種によって生成されたウレアーゼ二量体及び重合体である可能性が高い。これらの高分子量種は多数の天然ウレアーゼ分子から構成され得るが、サイズ排除クロマトグラフィーによって観察される低レベル(5％未満)の二量体及び重合体ピーク(図12B)は、これらの種の大部分が、分子間連結ではなく、単一の天然ウレアーゼ分子のサブユニット間連結から構成されることを示唆している。
【０３９１】
V21H4-DOS47については、C-末端システインだけがBM(PEG)2によって活性化されるので、理論上、1つのバンドクラスターしか存在しないはずである。しかしながら、レーン5及び6に示されているように、さらなるクラスターがV21H4-DOS47レーンに観察される(MW≧150kDa)。第二のクラスターは、コンジュゲートされたサブユニットがゲル中を移動するときに形成する非共有結合的二量体から構成され得る。これは、SDS-PAGEキャピラリー電気泳動によって確認され(図示せず)、このSDS-PAGEキャピラリー電気泳動では、二量体クラスターが観察されなかった。それゆえ、V21H4-DOS47は、架橋されたウレアーゼ二量体も重合体も含有しない。
【０３９２】
SDS-PAGEを用いて、各々の天然ウレアーゼ六量体-抗体コンジュゲートについての抗体:ウレアーゼコンジュゲーション比も決定した。クラスター1のバンド強度(図12A)は、様々な数の抗体分子に連結されたウレアーゼ単量体の相対存在量によって決まる。ImageLabソフトウェアを用いて、バンド強度に対応するヒストグラムを作成し、各々のヒストグラムのピーク面積を積分した。天然のウレアーゼ六量体のコンジュゲーション比(CR)を、次のように計算した:
CR=6*(PK1*0+PK2*1+PK3*2+PK4*3+PK5*4)/(PK1+PK2+PK3+PK4+PK5)
(ここで、PKi(i＝1〜5)は、i-1抗体分子と連結したウレアーゼ単量体のピーク面積である)。
【０３９３】
各々のウレアーゼ単量体にコンジュゲートされる抗体の数は変動するものの、該単量体がランダムにクラスター化して、六量体を形成するので、ウレアーゼ六量体1つ当たりの抗体の数の変動は小さいと予測されるであろう。これは、天然V21H4-DOS47のSECによって確認され、該SECでは、コンジュゲートが明瞭なピークとして移動することが観察される(図12B)。V21H4-DOS47コンジュゲーション法は、コンジュゲートを再現性良く産生し、ウレアーゼ1つ当たり抗体は8.7〜9.2であった(3回のバッチに基づく)。
【０３９４】
該抗体、HPウレアーゼ、及びコンジュゲートの純度及び有効分子量を、天然条件下でのサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によって評価した(図12B)。
【０３９５】
V21H1抗体とV21H4抗体は、同程度の時間(35.9分)で溶出する。遊離のHPウレアーゼは、26分で溶出する。V21H1-DOS47とV21H4-DOS47の両方について、抗体分子がウレアーゼ分子に連結されており、コンジュゲートが遊離のウレアーゼよりも大きくなるので、該コンジュゲートは遊離のウレアーゼよりも早く溶出する。しかしながら、V21H1-DOS47がV21H4-DOS47よりも1分早く溶出する(22.80分と23.80分)ことは興味深い。両方のコンジュゲートは、ほぼ同一のコンジュゲーション比を有する(V21H1-DOS47については、8.8抗体/ウレアーゼ及びV21H4-DOS47については、8.7抗体/ウレアーゼ)。V21H4抗体は、V21H1よりも3つ多くのアミノ酸を有する(159.20Da);しかしながら、理論上、より大きいV21H4-DOS47コンジュゲートは、その対応物のV21H1-DOS47よりもSECでの有効分子サイズが小さいように見える。これは、V21H4-DOS47が天然条件下でV21H1-DOS47よりもコンパクトであることを示唆している。
【０３９６】
各々の種の大部分は単量体形態のものであり、わずかな二量体ピークが各々の単量体形態の前に現れる。特筆すべきは、V21H1-DOS47コンジュゲーション手順は、高純度(96％)を達成するために、SEC工程を必要とすることである。SEC工程は、2つのクロスリンカーによって活性化されたV21H1抗体によって生成されるウレアーゼ重合体を除去する。しかしながら、V21H4抗体は1つのクロスリンカーのみによって活性化されるので、SEC工程はV21H4-DOS47を産生するのには必要ではない。V21H4-DOS47について、97％を超える純度は、通常、未結合のV21H4抗体を除去するための透析濾過のみを用いて達成される。SEC法は大規模GMPプロセスへと容易には移行されないので、臨床的使用のためのV21H1-DOS47を生産することは技術的により難しくかつ費用がかかるであろう。
【０３９７】
(V21H1-DOS47及びV21H4-DOS47の活性)
ELISAアッセイを実施して、V21H1-DOS47(9.2抗体/ウレアーゼ)、V21H4-DOS47(8.8抗体/ウレアーゼ)、及びビオチン-V21H4と組換えVEGFR2/Fcとの結合を評価した(図13A)。V21H4-DOS47(EC50＝44pM)は、V21H1-DOS47(EC50＝226pM)が結合するよりも約5倍大きい親和性でVEGFR2/Fcに結合する。相当な量のV21H1がCDR2中に存在するリジンを介してウレアーゼにコンジュゲートされたので、これは驚くべきことではない。V21H4-DOS47はまた、V21H4抗体のみ(EC50＝1.8nM)が結合するよりも約40倍大きい親和性でVEGFR2/Fcに結合する。これは、該コンジュゲートの多価性によるものである可能性が最も高い。V21H4-DOS47が優れたコンジュゲートであったので、後続の特徴解析をV21H4-DOS47についてのみ実施した。
【０３９８】
V21H4抗体及びV21H4-DOS47コンジュゲートがVEGFR2(293/KDR)を発現する細胞に結合する能力をフローサイトメトリーによって評価した(図13B)。ビオチン-V21H4(EC50＝1.6nM)は、組換えVEGFR/Fcに対するのと同様の親和性で293/KDR細胞に結合する(EC50＝1.8nM、図13A)。これは、VEGFR2抗体エピトープがELISAアッセイにおける及び293/KDR細胞の細胞表面における組換えVEGFR2/Fc中で同等に接近可能であることを示唆している。興味深いことに、V21H4-DOS47と293/KDR細胞との結合(EC50＝1.2nM)は、ビオチン-V21H4抗体とこれらの細胞との結合(EC50＝1.6nM)と非常によく似ている。VEGFR2/Fcを用いるELISAアッセイにおいて、V21H4抗体と比較したV21H4-DOS47について、親和性の改善が観察されたが、これは、細胞結合については観察されなかった。これは、293/KDR細胞の表面に発現されるVEGFR2の密度がELISAプレートのウェル中よりも低いことを示唆している。
【０３９９】
いくつかの要因が理想的な抗体/ウレアーゼコンジュゲーション比の決定に寄与する。コンジュゲーション反応の間に、ウレアーゼ分子はV21抗体との連結によって変化する;それゆえ、コンジュゲーション比に応じて、ウレアーゼ酵素活性は影響を受ける可能性がある。他方、抗体-ウレアーゼ複合体の結合力は、より多くの抗体がウレアーゼとカップリングされるにつれて増大する。ウレアーゼ酵素活性と結合活性の両方に対するコンジュゲーション比の効果を評価するために、様々なコンジュゲーション比(1.4〜9.4 V21H4/ウレアーゼ)を有するV21H4-DOS47コンジュゲートを、V21H4/HPUモル比を調整することにより産生した。
【０４００】
未修飾のウレアーゼの活性は約4500U/mgである。抗体をウレアーゼにコンジュゲートすると、活性の約40％が失われる(図13C)。しかしながら、ウレアーゼ酵素活性は、活性が試験した全てのコンジュゲーション比で一定のままであるので、コンジュゲートされる抗体の数とは無関係である。組換えVEGFR2/Fcを用いるELISAアッセイを実施して、ウレアーゼ1つ当たりの抗体の数が異なるコンジュゲートの結合を評価した(図13D)。1.4抗体/ウレアーゼから2.3抗体/ウレアーゼに増加させると、226pMから93pMへのEC50値の減少によって示されるように、コンジュゲートとVEGFR2/Fcとの結合は改善する。さらにもう1つの抗体の追加(3.3抗体/ウレアーゼ)によって、EC50がさらに58pMまで低下する。しかしながら、その後の抗体/ウレアーゼの追加には、限られた効果しかなく: 9.4抗体/ウレアーゼの場合、EC50は31pMである。したがって、3.3超の抗体/ウレアーゼが存在するとき、親和性の改善はごくわずかである。したがって、最適なウレアーゼ活性及びコンジュゲート結合には、3.3抗体/ウレアーゼのコンジュゲーション比で十分である。
【０４０１】
(V21H4-DOS47のさらなる特徴解析)
V21H4-DOS47のデュアルパネルウェスタンブロッティング(図14)を実施して、SDS-PAGEによって見られるバンドパターンを確認した。ウェスタンブロッティングにおいて、ゲル中で形成される二量体及び重合体クラスターは、SDS-PAGEで現れたものよりも顕著である(図12A)。抗ウレアーゼ抗体でプロービングすると、ウレアーゼバンドは、分子量〜85kDaで可視化され、1〜4個の抗体に結合したウレアーゼサブユニットのバンドは、SDS-PAGEによって見られるパターンと一致する。抗リャマ抗体でプロービングすると、遊離のウレアーゼサブユニットバンドは観察されず、抗体-ウレアーゼコンジュゲートバンドは、抗ウレアーゼ抗体でプロービングしたときと同じパターンで見られる。V21H4-DOS47が抗リャマ抗体と抗ウレアーゼ抗体の両方によって可視化されることができることは、該コンジュゲート中に両方の種が存在することを示している。
【０４０２】
V21H4及びウレアーゼの同一性を確認するために、並びにV21H4-DOS47のコンジュゲーション部位を同定するために、ESI-LC-MSEペプチドマッピング分析を利用した。V21H4-DOS47及びHPUのLC-MS(TIC)クロマトグラムは、図15Aに示されている。
【０４０３】
同定されたペプチドは、V21H4及びウレアーゼタンパク質配列の100％を網羅しており、質量一致誤差は4ppm未満であった。3残基を超える同定されたペプチドは全て、高エネルギーMS/MSによって確認され、b/yイオンの少なくとも半分が同定された。V21H4のC-末端
【化２１】
2020504623.tif 000035
だけがウレアーゼの様々なシステイン担持ペプチドに連結されるので、コンジュゲーション部位(UCx-VC136と表記され、ここで、xは、ウレアーゼタンパク質配列中のアミノ酸である)は、
【化２２】
2020504623.tif 000036
によって修飾されたウレアーゼペプチドである。その共有結合的コンジュゲーション部位を同定するために、V21H4-DOS47試料由来のトリプシン消化物のESI LC-MSE生データをBiopharmaLynxによって処理し、1145.3453Daの可変修飾因子を全15個のウレアーゼシステイン残基に適用して、ウレアーゼタンパク質配列に対して検索した。各々のコンジュゲーション部位の相対頻度を評価するために、コンジュゲートされたペプチドUCx-VC136のペプチド強度をUCxに関連する全てのペプチドの合計強度と比較して、コンジュゲーションの％を得た(表4)。
表4: ESI LC-MSEペプチドマッピング分析。V21H4-(PEG)2-Cysによって修飾されたウレアーゼシステイン残基の同定。na＝該当なし。
【表４】
2020504623.tif 000037
【０４０４】
各々のウレアーゼサブユニットの15個のシステイン残基のうち、4個だけがコンジュゲートされた(SDS-PAGEによって観察されたバンドと一致する、図12A)。最も接近しやすいシステインはC824(26.7％)であり、以下、順に、C663(4.2％)、C59(2.6％)、及びC207(0.6％)である。ウレアーゼ酵素活性にとって不可欠であるシステイン残基C592とのコンジュゲーションは検出されなかった。これは、ウレアーゼ活性が全てのコンジュゲーション比で同程度であるという観察と一致している(図13B)。
【０４０５】
コンジュゲーション部位も、-UCxによって修飾されたV21H4ペプチド(UCx＋308.1008Da)として同定された。これは、V21H4抗体タンパク質配列を、V21H4のC-末端システインに対する可変修飾因子としての-UCxに対して検索することにより行われた(表3)。同定されたトリプシン消化ペプチドのうち、これらの0.4％が未修飾であった(T:012)。この微量のペプチドは、コア配列のC23及びC97を介してクロスリンカーによって活性化されたV21H4の部分であり得る。或いは、このペプチドは、TCEP還元工程で脱保護されなかったC-末端の半シスタミンに結合した微量のV21H4であり得る。これらの結果は、-VC136によって修飾されたウレアーゼペプチドで観察された結果と一致している。V21H4 C-末端システインのほとんどは、C824を介してウレアーゼにコンジュゲートされ(59％)、C663(27％)、C59(12％)、及びC207(1.2％)でのコンジュゲーションは少なかった。
【０４０６】
コンジュゲーション部位の同一性を、ウレアーゼ及びV21H4ペプチドのb/yイオンマッピングを用いて確認した。16個のあり得るV21H4 b/yイオンのうち、ごく少数(4〜7個)が3つの主要なウレアーゼコンジュゲーション部位から同定された。これは、イオン化環境において陽電荷中心の欠如を引き起こす、
【化２３】
2020504623.tif 000038
残基のESIイオン化特性の結果であり得る。しかしながら、MS/MS b/yフラグメントプロファイル(図15B)は、V21H4とウレアーゼタンパク質の両方を見ることにより評価することができる。一例として、その配列が
【化２４】
2020504623.tif 000039
であり、かつ2633.1472のペプチド質量を有するコンジュゲートされたペプチドUC663-VC133は、それを
【化２５】
2020504623.tif 000040
として、V21H4側からの
【化２６】
2020504623.tif 000041
で修飾されたウレアーゼペプチドを修飾因子として検索することにより、2.1ppmの質量一致誤差で同定された。また、同じペプチドは、それを
【化２７】
2020504623.tif 000042
として、ウレアーゼ側からの
【化２８】
2020504623.tif 000043
で修飾されたV21H4 C-末端ペプチドを修飾因子として検索することにより、2.1ppmの質量一致誤差で同定された。このコンジュゲートされたペプチドのMSE衝突誘導MS/MSスペクトルは、それをV21H4側からの修飾因子で修飾されたウレアーゼペプチドとして検索することにより、ウレアーゼ側からの13個のb/yフラグメントイオンを用いてマッピングされた。また、同じスペクトルは、それをウレアーゼ側からの修飾因子を有するV21H4ペプチドとして検索することにより、V21H4側からの7個のb/yイオンを用いてマッピングされた。
【０４０７】
(考察)
抗体薬物コンジュゲートは、有望なクラスの抗癌薬として浮上している。薬物を標的部位に直接送達することにより、非特異的な副作用が軽減される。本発明者らは、酵素ウレアーゼと抗CEACAM6抗体から構成されるADCであるL-DOS47の産生及び特徴解析を以前に記載した(Tianらの文献、2015)。L-DOS47は、現在、非小細胞肺癌の治療のための第I/II相試験の段階である。本研究において、VEGFR2を標的とするコンジュゲートV21H4-DOS47を作製し、特徴解析した。L-DOS47とV21H4-DOS47は両方とも、ウレアーゼをリャマ抗体にコンジュゲートすることにより作製されたが、良好なV21H4-DOS47コンジュゲートを産生するためには、相当な研究が必要であった。例えば、L-DOS47に見られるのと同じリンカーであるSIABを用いて作製された初期のV21-DOS47コンジュゲートは、比較的長くかつ柔軟性があるPEG2クラスのリンカーを使用するときほどの成功は収めなかったが(SIABは短くてかつ硬いリンカーである)、現在、該コンジュゲートの結合活性がかなり改善されたことが本明細書に示されている。
【０４０８】
本研究において、本発明者らは、大規模なcGMP生産に好適であるV21-DOS47免疫コンジュゲートをコンジュゲートし、精製するための手順を開発した。単一ドメインラクダ科動物抗体は、抗体-酵素コンジュゲートの作製において使用するために理想的である。その小さい分子サイズのために、それを廉価で大量に生産することが可能になっている。重要なことに、それは、ここでは、短いアミノ酸タグをC-末端に付加することにより修飾された。タグは、抗体pIの修飾、標的とされる抗体発現の促進、及び特異的反応部位の付加を含む、いくつかの目的を果たしている。ウレアーゼのpIは4.8〜5.1の範囲内であるので、未修飾のコア抗体を用いて作製される抗体-ウレアーゼコンジュゲートは、約7のpIを有するコンジュゲートを生じさせることになる。このpIでは、該コンジュゲートは不安定であり、コンジュゲーション中及びその後に沈殿を形成する。短いC-末端ペプチドタグの付加は、抗体のpIを8.75から5.43へと調整し、コンジュゲーション及び精製中に安定であるpIが4.8〜5.5のコンジュゲートを生じさせる。C-末端タグは、発現を細菌封入体にターゲッティングすることにより、抗体産生の収率も改善する。これにより、イオン交換クロマトグラフィーのみを使用することによる抗体精製が可能になった。V21配列は、それぞれ、CDR2及びCDR3配列中に、2つのリジン残基を含有するので、リジンとスルフヒドリルの架橋化学がこれらのリジン残基を修飾し、該コンジュゲートとその標的抗原との結合親和性を損なう可能性がある。この理由から、C-末端システイン残基を、スルフヒドリルとスルフヒドリルの架橋反応において使用するために、V21H4のC-末端タグに含めた。LC-MSE特徴解析により、リジンとスルフヒドリルの架橋化学によるCDR2リジン残基の修飾が確認され、ELISA結合アッセイにより、スルフヒドリルとスルフヒドリルの架橋化学によって産生されたV21H4-DOS47の親和性が、リジンとスルフヒドリルの架橋化学によって産生されたV21H1-DOS47コンジュゲートの親和性よりも約6倍強いことが確認された。
【０４０９】
C-末端システイン残基の付加は、V21H4-DOS47のコンジュゲーションにおいて極めて有用であることがわかったが、他のリャマ抗体を用いて作業する場合、この戦略を使用することができるかどうかを決定する前に、コアシステイン残基の状況を評価する必要があり得ることが理解されるであろう。これは、コアシステイン残基がジスルフィド結合中で接続され、したがって、修飾に利用することができないので、スルフヒドリルとスルフヒドリルの化学作用がC-末端システインを一意的に標的とするからである。
【０４１０】
タンパク質リフォールディングは、緩徐でかつ再現不可能なプロセスであり得る。典型的には、リフォールディングは、希釈又は透析によって行われ、そのプロセスは、数日かかることがある。さらに、収率は、一般に低い(Yamaguchi及びMiyazakiの文献、2014)。DTT/シスタミンレドックス対の導入は、高収率の活性のあるV21H4抗体を生成する短くかつ再現可能なリフォールディングプロセスをもたらし、該リフォールディングプロセスは、大規模生産に有用である。
【０４１１】
抗体をウレアーゼにコンジュゲートする1つの利点は、抗体のみと比較して、コンジュゲートの親和性が明らかに増大することである。複合体の相対解離速度が遊離の抗体の場合よりも遅いので、ウレアーゼ1つ当たりに多数の抗体をクラスター化することにより、結合力が増大する。しかしながら、抗体結合力の改善は、ウレアーゼ活性の減損及びコンジュゲートの免疫原性の増加を含む、抗体をウレアーゼに付加することの潜在的な有害効果とのバランスを保たなければならない。さらに、高いコンジュゲーション比は、生産の費用及び複雑性を増大させる。標的抗原の利用可能性が異なり、かつウレアーゼ表面に提示される抗体の配向及び活性が異なるコンジュゲーション化学とともに変化するので、各々の抗体-ウレアーゼコンジュゲートは異なる理想的コンジュゲーション比を有し得る。本研究において、本発明者らは、3.3を超えるコンジュゲーション比では抗原結合の改善がほとんどないことを観察した。これは、ウレアーゼ1つ当たり8つの抗体がコンジュゲートされるまで結合が増大したL-DOS47と対照的である。抗体が標的抗原に接近しやすい可能性があるので、L-DOS47と比較して、V21H4-DOS47を作製するためのより柔軟性のあるリンカーの使用は、この違いを一部説明することができる。しかしながら、2つのコンジュゲート間の違いは、L-DOS47の抗体成分であるAFAIKL2が、VEGFR2の場合にV21が有するよりもはるかに低いその標的抗原に対する親和性を有するという事実によるものである可能性が最も高い(データは示さない)。したがって、抗体の多量体化は、V21の場合よりもAFAIKL2の場合により顕著な効果を有する。
(参考文献)
【化２９】
2020504623.tif 000044
【０４１２】
(実施例10)
V21細胞外ドメインを発現させるために、CAR-Tベクターを構築した。その後、このベクターを、VEGFR-2を発現する腫瘍細胞に対する活性について試験した。細胞傷害性をLDH-放出アッセイを用いて測定し、T-細胞活性を周囲の組織培養培地中に分泌されるIL-2及びIFN-γサイトカインレベルを測定することにより評価した。
【０４１３】
(プロトコル1. CARベクターの構築)
全長キメラ抗原受容体を合成し、レンチウイルスベクターにサブクローニングした。挿入物をサンガーシークエンシングによって確認した。キメラ抗原受容体の構造を下に示す:
【化３０】
2020504623.tif 000045
【０４１４】
(プロトコル2.レンチウイルスの調製)
1. 15cmの培養皿を用意し、培養皿当たり5×106個の細胞を接種し; 25mLの完全培養培地(DMEM高グルコース、10％FBS、ペニシリン-ストレプトマイシン)を添加し、該皿を37℃、5％CO2のインキュベーターに一晩置いた。
2. 100μM PEI及びレンチウイルスパッケージングシステム(Lenti-EF1a-VHH-3rd-CAR、pGP、pVSVG)を室温で解凍し、上下にピペッティングすることにより完全に混合し; 2mLのPBSを6-ウェルプレートの1つのウェルに添加し、それぞれ、10μgのLenti-EF1a-VHH-3rd-CAR、4μgのpGP、2μgのpVSVGを添加し;その後、18μLの100μM PEIを添加し、十分に混合した後、室温で10分間静置して、DNA/PEI複合体を形成させた。
3. DNA/PEI複合体を15cm培養皿に滴加し、該皿を前後に揺すって、十分に混合し;培養皿を37℃、5％CO2のインキュベーターに6〜8時間置き;その後、培養培地を交換した。
4. 48時間後、レンチウイルス粒子を含有する培養培地を回収し、上清を0.45μm膜で濾過し;その後、4℃で2時間、50000×gで遠心分離し;遠心分離後、上清をバイオキャビネット中で除去し、500μLのPBS緩衝液を添加して、ペレットを再懸濁させ;ウイルスを分注し、-80℃で保存する。
【０４１５】
(プロトコル3.レンチウイルス力価測定)
1. HT1080細胞を液体窒素から回復させ、該細胞を対数期に至るまで調整する。
2. HT1080細胞を新しい24-ウェルプレートに50000細胞/ウェルで播く。培地を500μLの最終容量まで添加し、その後、プレートを、5％CO2、37℃インキュベーター中で、一晩静置する。
3. 10μLの濃縮レンチウイルスをウェルに添加し、同時に、ポリブレンを6μg/mLの濃度まで添加する。
4.プレートを、5％CO2、37℃インキュベーター中で96時間静置する。
5.細胞をPBSで洗浄する。ゲノムDNAをゲノムDNA精製キット(Lifetech，CAT#K0512)で抽出する。抽出したゲノムDNAの濃度をNanoDrop2000によって決定した。
6. PUCWPRE及びPUCALBプラスミドを10倍希釈する。標準試料を蛍光定量PCR用に調製する。
7.下の表に従って、PCR反応用のプレミックス溶液を調製する。
【表５】
2020504623.tif 000046
PCRのプライマーの情報
【表６】
2020504623.tif 000047
8. 5μL/ウェルの標準又はゲノムDNA試料を96-ウェルプレートに添加する。15μL/ウェルのプレミックス溶液をプレートに添加する。プレートをパラフィルムで密閉し、1分間遠心分離する。
9.以下の手順に従って、PCR反応を実施する。
【表７】
2020504623.tif 000048
【０４１６】
(プロトコル4.初代T細胞の単離)
1.端から端までひっくり返すことにより、Lymphoprep試薬を混合する。
2. 15mLのLymphoprepを50mLチューブに添加する。
3.血液試料をPBS＋2％FBSで1:1に希釈する。
4.希釈した試料を注意深くかつゆっくりとLymphoprep試薬上に重層する。
5. 800×gで20℃で20分間遠心分離する。
6.遠心分離後、白血球(white cell)の層を吸引して新しいチューブに入れ、細胞をPBSで1回洗浄する。
7.細胞密度を1*108細胞/mL(2.5mL以内の総容量)に調整し、細胞を丸底の5mLチューブに入れる。
8. 100μl/mLのカクテルをチューブに添加し、室温で15分間インキュベートする。
9.ビーズを混合し、1mL当たり50μlのビーズを試料に添加し、室温で10分間インキュベートする。
10.容量が最大2.5mLに達するまで完全培地を添加し、チューブをマグネットの中に入れ、室温で5分間静置する。
11.インキュベーション後、チューブをマグネットの中で保持し、液体を注ぐ。
12.細胞をX-vivo 15培地で懸濁させ、10％ヒトAB血清、300U/mLのIL-2、5ng/mLのIL-15、及び10ng/mLのIL-7を添加する。
【０４１７】
(プロトコル5.レンチウイルスによるT細胞への形質導入)
1.細胞密度を1*106細胞/mLに調整し、サイトカイン及び抗体を添加して、初代T細胞を48時間活性化する。サイトカイン及び抗体は、300U/mLのIL-2、10ng/mLのIL-7、5ng/mLのIL-15、1μg/mLの抗CD3(OKT3)、及び2μg/mLの抗CD28からなる。
2. MOIを20に設定し、形質導入用のレンチウイルスの容量を計算する。
ウイルス容量(mL)＝(MOI*細胞数)/ウイルス力価
3.レンチウイルスを37℃の水浴中で素速く解凍し; 6μg/mLのポリブレンとウイルスとを添加し、完全に混合し;プレートをパラフィルムで密閉し、800×gで1時間遠心分離する。
4.遠心分離後、パラフィルムを剥がし、プレートを37℃、5％CO2インキュベーターに24時間置く。
5. 250×gで10分間の遠心分離の後、上清を除去し、その後、細胞ペレットを新鮮な培地で再懸濁させ、細胞をさらに3〜6日間、連続的に培養する。
【０４１８】
(プロトコル6. CAR発現の検証)
1. 2×10-6個のCAR-T細胞を収集し、細胞を、各々1×10-6個のCAR-T細胞を含む2本のチューブに分ける。細胞を100μLのPBSに再懸濁させる。
2. 10μLの抗EGFR抗体を一方のチューブに添加し、室温で30分間インキュベートする。
3. 800×gで5分間遠心分離し、上清を除去し、細胞を1mLのPBSで3回洗浄する。
4. 10μLのAPC-抗ヒトIgGを両方のチューブに添加し、暗所、室温で30分間インキュベートする。
5. 800×gで5分間遠心分離し、上清を除去し、細胞を1mLのPBSで3回洗浄する。
6.細胞を500μLのPBSに再懸濁させ、T細胞の表面上のCARをFACSよって検出する。
【０４１９】
(プロトコル7. CAR-Tによる標的腫瘍細胞の溶解)
10.標的細胞を対数期に至るまで調整する。通常、細胞をアッセイ前に2回継代する。
11.接着細胞をトリプシンで浮かせ、細胞密度を5×105細胞/mLに調整し; 100μLの細胞懸濁液を96-ウェルプレートの各々のウェルに播種する。100μLの滅菌水を全ての未使用のウェルに添加して、アッセイウェルの蒸発を最小限に抑える。プレートを5％CO2、37℃インキュベーター中に一晩静置する。
12.工程2で調製されるCAR-T細胞を遠心分離によって回収し、細胞ペレットをFBSを含まないRPMI1640培地で再懸濁させ;標的腫瘍細胞を含有する96-ウェルプレートを取り出し、培養液を完全に吸引し、細胞を滅菌PBSで洗浄し;CAR-T細胞をE/T比に従って各々のウェルに添加し、最終容量を100μL/ウェルまで補充し;一方、標的細胞を含有し、T細胞を含まない4つのウェルを、それぞれ、最大溶解及び最小溶解として取っておく。プレートを5％CO2、37℃インキュベーター中に6時間置く。
13.培養後、プレートを取り出し、細胞溶解緩衝液を最大溶解ウェルに添加し;プレートを1200×gで5分間遠心分離し、50μLの上清を新しいプレートに移し、LDH検出試薬を添加する。最後に、Multiscan SpectrumでOD値を記録する。
14.標的細胞溶解のパーセンテージを計算する定式化:
【数２】
2020504623.tif 000049
。
【０４２０】
(プロトコル8. ELISAアッセイによるサイトカインの検出)
1.標的細胞を対数期に至るまで調整する。通常、細胞をアッセイ前に2回継代する。
2.接着細胞をトリプシンで浮かせ、細胞密度を5×105細胞/mLに調整し; 100μLの細胞懸濁液を96-ウェルプレートの各々のウェルに接種する。100μLの滅菌水を全ての未使用のウェルに添加して、アッセイウェルの蒸発を最小限に抑える。プレートを5％CO2、37℃インキュベーター中に一晩静置する。
3. CAR-T細胞を遠心分離によって回収し、細胞ペレットをFBSを含まない1640培地で再懸濁させ;標的腫瘍細胞を含有する96-ウェルプレートを取り出し、培養液を完全に吸引し、細胞を滅菌PBSで洗浄し;CAR-T細胞をE/T比に従って各々のウェルに添加し、最終容量を100μL/ウェルまで補充する。プレートを5％CO2、37℃インキュベーター中に6時間に置く。
4.培養後、プレートを、1200×gで、室温で5分間遠心分離する。50μLの上清を、ELISAアッセイキットを用いるIL-2及びIFN-γの検出用に移す。
5. GraphPad Prism 6.0でデータを解析する。
【０４２１】
(CAR及びCAR-Tの結果)
VHHのタンパク質配列は、配列番号2のタンパク質配列であった。
【０４２２】
(CAR構築の検証)
組換えレンチウイルスベクターをEcoRI-BamHIで消化し、約1500bpの断片を生成させた(推定される断片は約1518bpであった)。エンドヌクレアーゼ消化の結果は、挿入された断片の分子量が設計と一致することを示した(図16)。
【０４２３】
(CARシークエンシングの検証)
組換えベクターをさらにシークエンシングし、構築されたプラスミドの配列が設計と一致することが分かった。
【０４２４】
(レンチウイルスの力価測定)
表1.ウイルスのCt値
【表８】
2020504623.tif 000050
【０４２５】
ウイルス力価計算の式:
【数３】
2020504623.tif 000051
表2.レンチウイルス力価
【表９】
2020504623.tif 000052
【０４２６】
レンチウイルスの力価測定の結果は、レンチウイルスベクターが高力価で調製されることを示した。使用したqPCR標準曲線は、図17に示されている。
【０４２７】
(CAR発現の検証)
レンチウイルスベクターにおいて、切断型EGFR(ドメインIII及びIV)は、ペプチドを介してVHH-CARに連結されており、このEGFRtの発現は、同じプロモーターによって駆動される。それゆえ、EGFRtの検出は、CAR発現の情報を反映する。FACSの結果は、レンチウイルスの形質導入が成功し、形質導入効率(68.5％)が満足のいくものであることを示した(図18)。注意: 2ラウンドのレンチウイルス感染の後、40％〜60％の形質導入効率がOKとみなされる。
【０４２８】
(CAR-Tによる標的腫瘍細胞の溶解)
NCI-H23細胞、HL-60細胞、及びZR-75-30細胞をそれぞれ標的細胞として採用し、図19に示されているような様々なE/T比で、形質導入されていない対照T細胞及びCAR-T細胞と共培養した。共培養の後、LDHアッセイキットを使用することにより、上清をLDHの検出用に回収した(図19)。溶解アッセイの結果は、VEGFR-2を標的とするCAR-T細胞が標的細胞を「用量依存的」様式で死滅させることができることを示した。形質導入されていないT細胞も若干の細胞溶解効果を示した。これは、活性化T細胞の非特異的な殺傷効果によるものである。
【０４２９】
(ELISAアッセイによるサイトカインの検出)
NCI-H23細胞、HL-60細胞、及びZR-75-30細胞をそれぞれ標的細胞として採用し、下の図に示されているような様々なE/T比で、形質導入されていない対照T細胞及びCAR-T細胞と共培養した。IL-2及びIFN-γの分泌レベルをELISAアッセイによって検出した(図21及び図22)。使用した標準曲線は図20に示されている。サイトカイン放出アッセイの結果は、標的細胞との共インキュベーションの後、CAR-T細胞が形質導入されていないT細胞よりも多くのサイトカインを分泌したことを示した。これは、標的細胞の認識及びCAR-T細胞の活性化を示している。
【０４３０】
上述の説明及び実施例は、単に本発明を例示するために記載されており、限定するものであることが意図されない。本発明の開示された態様及び実施態様の各々を、個々に又は本発明の他の態様、実施態様、及びバリエーションと組み合わせて考慮することができる。さらに、別途規定されない限り、本発明の方法の工程はいずれも、任意の特定の実施順序に限定されない。本発明の精神及び物質を組み込んでいる開示された実施態様の修飾が当業者の心に浮かんでもよく、そのような修飾は本発明の範囲内にある。さらに、本明細書に引用された参考文献は全て、引用により完全に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2020504623.tif 000069
【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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2020504623.tif 000078
2020504623.tif 000079
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