(57)【要約】レジメンにおける、がん細胞の処置のための方法であって、がん細胞を、任意選択により直接的プロテアソーム阻害剤と組み合わせて、ＮＧｌｙ１に対する阻害剤に接触させることを含む方法が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
がんを処置する方法であって、
がん細胞を、がん細胞プロテアソームの発現を低減するのに有効な用量のＮＧｌｙ１阻害剤に接触させることを含み、生存可能ながん細胞の数が低減される、前記方法。
【請求項２】
有効用量の直接的プロテアソーム阻害剤の同時投与をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記直接的プロテアソーム阻害剤が、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、イキサゾミブ、デランゾミブ、オプロゾミブ、マリゾミブ、ＩＰＳＩ−００１、ＯＮＸ−０９１４、及びＰＲ−９２４のうちの１つ以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記組合せが、単一薬剤としてのいずれかの薬剤の投与に比べて相乗効果をもたらす、請求項２または請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記直接的プロテアソーム阻害剤の有効用量が、前記ＮＧｌｙ１阻害剤の不在下における有効用量よりも低い、請求項２〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記直接的プロテアソーム阻害剤が有効である時間期間が、前記ＮＧｌｙ１阻害剤の不在下で前記直接的プロテアソーム阻害剤が有効である時間期間よりも長い、請求項２〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記がんが血液癌である、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記血液癌が多発性骨髄腫である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＮＧｌｙ１阻害剤がカスパーゼ活性を阻害しない、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記ＮＧｌｙ１阻害剤が、標的タンパク質のアスパラギン側鎖とＮ連結オリゴ糖との間のアミド連結におけるシステイン残基の求核性攻撃を阻害することにより、ＮＧｌｙ１を機構的に阻害する、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記ＮＧｌｙ１阻害剤が式Ｉの構造を有する、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法であって、
【化１】
2020505470.tif 000012
式中、Ｒ１は、Ｈ、低級アルキル、分枝状アルキル、置換アルキルを含めたアルキル、アリール、アルカリル、置換アリール、置換アルカリルであり、
Ｒ２は、Ｈ、低級アルキル、分枝状アルキル、置換アルキルを含めたアルキル、アリール、アルカリル、置換アリール、置換アルカリルであり、
Ｒ３は、Ｈ、低級アルキル、分枝状アルキル、置換アルキルを含めたアルキル、アリール、アルカリル、置換アリール、置換アルカリル、電子求引性置換基、または電子供与性基である、前記方法。
【請求項１２】
前記ＮＧｌｙ１阻害剤が式ＩＩの構造を有する、請求項１１に記載の方法であって、
【化２】
2020505470.tif 000013
式中、Ｘは、クロロ、ブロモ、フルオロ、またはヨード置換基である、前記方法。
【請求項１３】
前記ＮＧｌｙ１阻害剤が式ＩＩＩの構造を有する、請求項１１に記載の方法であり、
【化３】
2020505470.tif 000014
Ｒ４は、低級アルキル、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピルを含めたアルキル基であり、
Ｒ５は、以下に限定されないが、アルキニル、アルケニル、モルホリノ、アミノ、アミド、スルフヒドリルを含めた極性または非極性基である、前記方法。
【請求項１４】
前記ＮＧｌｙ１阻害剤が式ＩＶの構造を有する、請求項１１に記載の方法であって、
【化４】
2020505470.tif 000015
Ｒ６は、前記アリール環上の任意の位置（オルト、メタ、またはパラ）における任意選択の置換基であり、前記置換基は、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノアシル、アミノアシルオキシ、オキシアミノアシル、アジド、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシル、オキソ、チオケト、カルボキシル、カルボキシアルキル、チオアリールオキシ、チオヘテロアリールオキシ、チオヘテロシクロオキシ、チオール、チオアルコキシ、置換チオアルコキシ、アリール、アリールオキシ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリル、ヘテロシクロオキシ、ヒドロキシアミノ、アルコキシアミノ、ニトロ、−ＳＯ−アルキル、−ＳＯ−置換アルキル、−ＳＯ−アリール、−ＳＯ−ヘテロアリール、−ＳＯ２−アルキル、−ＳＯ２−置換アルキル、−ＳＯ２−アリール、−ＳＯ２−ヘテロアリール、または融合複素環であってもよく、
Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３はいずれも、任意選択により、窒素、酸素、硫黄、リン、またはケイ素から選択されるヘテロ原子である、前記方法。
【請求項１５】
前記ＮＧｌｙ１阻害剤が、
【化５】
2020505470.tif 000016
である、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記ＮＧｌｙ１阻害剤が式Ｖのエポキシケトンである、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法であって、
【化６】
2020505470.tif 000017
式中、Ｒ７は、アミン、置換アミン、アミド、置換アミド、低級アルキル、分枝状アルキル、置換アルキルを含めたアルキル、アリール、アルカリル、置換アリール、置換アルカリル等である、前記方法。
【請求項１７】
有効用量のＮＧｌｙ１阻害剤と、薬学的に許容される担体とを含む、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法で使用するための、組成物。
【請求項１８】
有効用量の直接的プロテアソーム阻害剤をさらに含む、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
薬学的に許容される担体中の有効用量のＮＧｌｙ１阻害剤と、使用説明書とを含む、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法で使用するための、キット。
【請求項２０】
有効用量の直接的プロテアソーム阻害剤をさらに含む、請求項１９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年１月３１日に出願された米国特許出願第６２／４５２，８０８号の優先権を主張し、その各々の内容が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
ユビキチン−プロテアソーム経路は、細胞周期進行、アポトーシス、及びＤＮＡ修復をコントロールする制御タンパク質を含めた真核細胞内のタンパク質の分解を担うことから、正常な細胞ホメオスタシスの維持において不可欠な役割を有する。プロテアソーム活性を途絶させることで、適合しない制御タンパク質の迅速な蓄積がもたらされ、この蓄積により、成長を捕捉し最終的には細胞死を導くアポトーシスカスケードが誘発される。がん細胞は、概して、正常細胞よりも高レベルのプロテアソーム活性を有し、プロテアソーム阻害のアポトーシス促進効果に対しより高い感受性を示すため、プロテアソームはオンコロジーにおける強力な標的となっている。
【０００３】
タンパク質の合成及び分解のバランスは、健康な正常細胞内で緊密に制御されている。ほとんどの細胞内タンパク質はユビキチン−プロテアソームシステム（ＵＰＳ）を介して分解され、このＵＰＳでタンパク質はユビキチンによりタグ付けされ、次に２６Ｓプロテアソーム複合体がこれを認識して小ペプチドに分解する。ＵＰＳは、８０〜９０％の細胞内タンパク質の分解を担っている。プロテアソーム分解の標的とされたタンパク質は、ユビキチン活性化酵素Ｅ１、ユビキチン結合酵素Ｅ２、及びユビキチンＥ３リガーゼを含めた一連の酵素によりユビキチン化され、これにより、標的化されたタンパク質が、２６Ｓプロテアソーム（分子量２，４００ｋＤａ）、２０Ｓ触媒コアで構成されたマルチサブユニットプロテアーゼ複合体（分子量７００ｋＤａ）、及び１つまたは２つの１９Ｓ制御粒子（分子量７００ｋＤａ）により認識されるようになる。２０Ｓコアは、２セットの同一なαリング及び２セットの同一なβリングにより形成されており、これらのリングは、外側のαリングが内側のβリングを囲む対称的な様式で積み重なっている（αββα）。それぞれのαリングまたはβリングは、α１〜α７またはβ１〜β７という名の７つの異なるサブユニットを含有し、この中で主にβ１、β２、及びβ５がタンパク質分解活性を所持する。β１サブユニットは、酸性残基（例えば、アスパラギン酸及びグルタミン酸）の後で優先的に切断するカスパーゼ様（またはペプチジル−グルタミルペプチド加水分解様／ＰＧＰＨ様）活性を担い、β２サブユニットは、塩基性残基（例えば、アルギニン及びリジン）の後で優先的に切断するトリプシン様活性を有し、β５サブユニットは、疎水性残基（例えば、チロシン及びフェニルアラニン）の後で優先的に切断するキモトリプシン様活性を有する。１９Ｓ制御粒子は「蓋部」及び「基底部」から構成され、２０Ｓコアプロテアソームの両端に結合する。１９Ｓプロテアソーム蓋部は９個以上の非ＡＴＰアーゼサブユニットを含有し、これらのサブユニットは、ポリユビキチン化タンパク質を認識し、それに結合し、脱ユビキチン化と呼ばれるプロセスにより、基質タンパク質からポリユビキチン鎖を除去する。一方、１９Ｓ基底部は、６個のＡＴＰアーゼサブユニット及び４個の非ＡＴＰアーゼサブユニットを含有し、これらは基質タンパク質のアンフォールディングと、基質タンパク質の２０Ｓプロテアソームへの進入の促進とを担っている。
【０００４】
タンパク質分解の調節不全は、ヒトのがんの細胞成長、発生、及び生存において不可欠な役割を果たしている。様々な悪性のヒト造血細胞株におけるプロテアソームｍＲＮＡレベルは、健康な成人からの末梢リンパ球及び単球と比べて、一貫して著明に増加する。また、プロテアソーム活性の増加は、悪性疾患（結腸、前立腺、及び白血病のものを含む）と関連する。腫瘍形成細胞は、プロテアソーム活性に対する依存性がより高いため、そのブロックに対する感受性もより高い。実際に、複数の研究者が、多くのタイプの活発に増殖する腫瘍細胞が非腫瘍形成細胞よりもプロテアソーム阻害剤に対する感受性が高いことを見いだした。プロテアソームの薬理学的阻害は、腫瘍抑制タンパク質の蓄積を含めたアポトーシス促進性及び抗アポトーシス性タンパク質におけるバランスのシフトをもたらし、細胞周期抑止及びアポトーシスがもたらされる。一部の腫瘍細胞タイプにおいて、プロテアソーム阻害剤は、標準的な細胞傷害性薬剤に比べて、より有効なアポトーシス誘導能力を示す。プロテアソーム阻害は、化学的感作及び耐性克服に有効な戦略であることが見いだされている。
【０００５】
特に、多発性骨髄腫のような血液悪性腫瘍の処置は、プロテアソーム阻害剤の使用によって顕著に進歩した。ボルテゾミブは、２０Ｓプロテアソームのβ５サブユニットのキモトリプシン様活性部位を可逆的に標的化するジペプチジルボロン酸誘導体であり、最初にＦＤＡ承認されたがん（例えば、多発性骨髄腫（ＭＭ）及びマントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ））処置向けのプロテアソーム阻害剤であった。ボルテゾミブによるプロテアソーム阻害は、腫瘍細胞の成長抑制及びアポトーシスをもたらし、細胞及び腫瘍微小環境におけるＮＦ−κＢの活性化を阻害し、ＩＬ−６の産生及び細胞内シグナリングをブロックし、血管新生促進性メディエーターの産生及び発現を停止し、Ｂｃｌ−２のようなアポトーシス制御物質の欠点を克服し、ｐ５３誘導性アポトーシスを作動させる。
【０００６】
ボルテゾミブは、ＭＭの再発時間を改善することができたが、末梢神経障害及び胃腸系の苦痛のような副作用を伴う。加えて、ボルテゾミブに対する内在的及び後天的な耐性が増加したことから、エポキシケトンであるカルフィルゾミブのような第２世代プロテアソーム阻害剤の開発が促された。ボルテゾミブに比べると、カルフィルゾミブは、キモトリプシン様活性部位をより高い選択性で不可逆的に阻害し、トリプシン様及びカスパーゼ様プロテアーゼに対しより低い親和性を示し、セリンプロテアーゼのようなオフターゲット酵素に対し最小限の活性を有する。加えて、カルフィルゾミブは、ボルテゾミブ耐性の細胞株及び初代ＭＭ細胞に対する活性を示している。
【０００７】
プロテアソーム阻害剤はＭＭの処置を進歩させたが、耐性が発生していることや応答期間が短いことから、新たな治療の道が必要とされている。
【発明の概要】
【０００８】
プロテアソーム発現に関与する転写因子経路を阻害することによる、がん処置のための組成物及び方法が提供される。詳細には、Ｎ−グリカナーゼ１（ＮＧｌｙ１）の阻害のための組成物及びその使用方法が提供される。ＮＧｌｙ１の阻害は、プロテアソーム発現を低減する。ＮＧｌｙ１阻害剤は、単一薬剤として、またはプロテアソーム活性を直接的に阻害する薬剤と組み合わせて使用することができる。薬剤の組合せにより、がんの処置を受けている個体の全生存期間の増加がもたらされ得る。薬剤の組合せは、単一薬剤としての投与に比べて、がん細胞の殺滅における相乗的利益をもたらし得る。
【０００９】
一部の実施形態において、ＮＧｌｙ１阻害剤の化合物及びその製剤が提供される。一部の実施形態において、化合物はＮＧｌｙ１を阻害し、カスパーゼ活性を阻害しない。一部の実施形態において、阻害剤は、標的タンパク質のアスパラギン側鎖とＮ連結オリゴ糖との間のアミド連結におけるシステイン残基の求核性攻撃を阻害することにより、Ｎｇｌｙ１を機構的に阻害する。一部の実施形態において、ＮＧｌｙ１阻害剤及び薬学的に許容される賦形剤の薬学的製剤が提供される。一部の実施形態において、製剤は、標的細胞内のプロテアソーム発現を低減するのに有効な用量をもたらす単位用量製剤で提供される。一部の実施形態において、製剤はさらに、有効用量の、プロテアソーム活性を直接的に阻害する薬物を含む。
【００１０】
一部の実施形態において、ＮＧｌｙ１阻害剤は、式Ｉの構造：
【化１】
2020505470.tif 000002
を有し、
式中、Ｒ１は、Ｈ、低級アルキル、分枝状アルキル、置換アルキルを含めたアルキル、アリール、アルカリル、置換アリール、置換アルカリル等であり、
Ｒ２は、Ｈ、低級アルキル、分枝状アルキル、置換アルキルを含めたアルキル、アリール、アルカリル、置換アリール、置換アルカリル等であり、
Ｒ３は、Ｈ、低級アルキル、分枝状アルキル、置換アルキルを含めたアルキル、アリール、アルカリル、置換アリール、置換アルカリル、電子求引性置換基、または電子供与性基である。一部の実施形態において、候補ＮＧｌｙ１阻害剤は、Ｎ−グリコシル化部位を含むポリペプチド基質の脱グリコシル化を阻害することに基づいて、活性を試験される。一部のこのような実施形態において、アッセイは、蛍光アッセイである。
【００１１】
他の実施形態において、がんを処置するための方法が提供され、このがんには、以下に限定されないが、血液癌、例えば、白血病、リンパ腫、骨髄腫等；固形腫瘍（以下に限定されないが、腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腎細胞癌のような癌腫が含まれる）；神経膠腫；肉腫；黒色腫が含まれる。一部の実施形態において、がんは、多発性骨髄腫である。本発明の方法において、がん細胞は、有効用量のＮＧｌｙ１阻害剤に接触され、この用量は、標的細胞内のプロテアソーム発現を低減するのに有効である。一部の実施形態において、がん細胞は、有効用量の直接的プロテアソーム阻害剤にも接触され、この阻害剤としては、以下に限定されないが、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、イキサゾミブ、デランゾミブ、オプロゾミブ、マリゾミブ、ＩＰＳＩ−００１、ＯＮＸ−０９１４、ＰＲ−９２４等が挙げられ得る。
【００１２】
一部の実施形態において、がんを処置するために、有効用量の、（ｉ）ＮＧｌｙ１阻害剤と（ｉｉ）直接的プロテアソーム阻害剤との薬剤の組合せが投与される。組合せ内の薬剤は同時に投与することができ、すなわち、各薬剤は、組み合わせ内の他の薬剤（複数可）に対し、約４５日、３０日、１５日、７日、３日、２日、１日以内、または実質的に同時に投与される。本発明の利益は、例えば、副作用（例えば、末梢神経障害）の低減をもたらすための、単剤療法として必要とされる用量に比べて低下した用量のプロテアソーム阻害剤の使用であり得る。投与は、がん細胞集団の枯渇の必要に応じて繰り返され得る。１つの利益は、投与が長い時間期間にわたり有効となるような、プロテアソーム阻害剤に対する耐性の低減であり得る。
【００１３】
がん細胞の接触は、（例えば、治療目的のために）ｉｎ  ｖｉｖｏで、及び（例えば、スクリーニングアッセイなどのために）ｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施され得る。組合せ療法は、単一薬剤の使用に比べて腫瘍細胞の排除を強化することにおいて相乗的であり得る。さらに、組合せにより、処置を受ける個体の全生存期間の増加がもたらされ得る。
【００１４】
本発明は、添付の図面と併用して以下の詳細な説明を参照することで、十分に理解される。慣例に従い、図面の様々な特徴が縮尺通りではないことを強調する。別の見地から、様々な特徴の寸法は、分かりやすくするため任意に拡大または縮小されている。以下の図が図面に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ＮＧｌｙ１は、Ｎｒｆ１の正しい処理に必要である。図１Ａは、プロテアソームバウンスバックのための脱Ｎ−グリコシル化依存的Ｎｒｆ１活性化における提唱経路である。図１Ｂは、カルフィゾミブ（プロテアソーム阻害剤）；Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ（パン−カスパーゼ阻害剤としても機能するＮＧｌｙ１阻害剤）；Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ（ＮＧｌｙ１を阻害しないパン−カスパーゼ阻害剤）の化学構造である。図１Ｃでは、ＮＧｌｙ１−／−  ＭＥＦ細胞が、プロテアソーム阻害剤カルフィルゾミブの存在下で異常なＮｒｆ１処理を示している。図１Ｄでは、Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋによるＮＧｌｙ１阻害により、Ｎｒｆ１がＮｒｆ１過剰発現ＨＥＫ細胞内で不正に処理されている。カスパーゼ阻害剤Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈは、未処置細胞に対し同様の処理を示している。
【図２】ＮＧｌｙ１は、Ｎｒｆ１の活性化及び正しい細胞内局在化に必要である。図２Ａでは、Ｎｒｆ１依存的ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて、ＮＧｌｙ１−／−  ＭＥＦがプロテアソーム阻害に対し、野生型ＭＥＦよりも低い応答を示した。図２Ｂでは、ＮＧｌｙ１−／−  ＭＥＦにおけるＮｒｆ１の局在化が、野生型に比べて変化している：ｉ）未処置野生型；ｉｉ）２０ｎＭカルフィルゾミブの存在下での野生型；ｉｉｉ）未処置ＮＧｌｙ１−／−；ｉｖ）２０ｎＭカルフィルゾミブの存在下でのＮＧｌｙ１−／−。図２Ｃでは、Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋで処置したＮｒｆ１過剰発現ＨＥＫ細胞におけるＮｒｆ１の局在化が変化している：ｉ）未処置；ｉｉ）１０ｎＭカルフィルゾミブで処置；ｉｉｉ）１００μＭ  Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋで処置；ｉｖ）１００μＭ  Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ及び１０ｎＭカルフィルゾミブで処置；ｖ）５０ｎＭ  Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈで処置；ｖｉ）５０ｎＭ  Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ及び１０ｎＭカルフィルゾミブで処置。
【図３】ＮＧｌｙ１−／−またはＮＧｌｙ１ノックダウンは、プロテアソーム阻害剤に対する細胞の感受性を増加させる。図３Ａでは、ＭＥＦ  ＮＧｌｙ１−／−の生存率が、プロテアソーム阻害剤カルフィルゾミブとの２４時間のインキュベート後、ＭＥＦ野生型よりも顕著に低下している。図３Ｂでは、Ｋ５６２におけるｄＣａｓ９−ｓｇＲＮＡによるＮＧｌｙ１またはＮｒｆ１のノックダウンにより、プロテアソーム阻害剤による処置中の生存が低減している。図３Ｃでは、Ｋ５６２細胞におけるカルフィゾミブのＬＤ５０が、Ｎｒｆ１またはＮＧｌｙ１ノックダウンにより約２倍減少している。
【図４−１】システインプロテアーゼ阻害剤様化合物の標的化スクリーニングは、新規のＮＧｌｙ１阻害剤ＷＲＲ１３９の発見につながった。図４Ａは、ＮＧｌｙ１阻害検出のためのＣｒｅｓｓｗｅｌｌアッセイの概略図である。図４Ｂは、高スループットスクリーニングから得られた６つのヒットを示している。
【図４−２】システインプロテアーゼ阻害剤様化合物の標的化スクリーニングは、新規のＮＧｌｙ１阻害剤ＷＲＲ１３９の発見につながった。図４Ｃは、Ｃｒｅｓｓｗｅｌｌアッセイにおけるヒットの検証を示している。ＷＲＲ１３９のみが、用量依存的様式でＮＧｌｙ１を阻害することが見いだされた。図４Ｄは、漸増量のＷＲＲ１３９の存在下でのカスパーゼ３／７の活性を示している。図４Ｅでは、ＷＲＲ１３９の存在下で、ＲＮＡアーゼＢは組換えＮＧｌｙ１により脱グリコシル化されない。
【図５】ＮＧｌｙ１の阻害は、プロテアソーム阻害による多発性骨髄腫の処置を増強する。図５Ａでは、ＷＲＲ１３９の存在下のＵ２６６細胞において、生存が顕著に低減している。図５Ｂでは、ＷＲＲ１３９の存在下でのＨ９２９細胞において、生存が顕著に低減している。図５Ｃでは、Ｕ２６６及びＨ９２９において、カルフィルゾミブ処置のＬＤ５０がそれぞれ２．６倍及び２倍低減している。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
対象におけるがん細胞の枯渇のための方法であって、がん細胞が、任意選択により直接的プロテアソーム阻害剤と組み合わせて、有効用量のＮＧｌｙ１阻害剤に接触される、方法が提供される。また、追加の化学療法薬が提供されてもよい。がんとしては、以下に限定されないが、血液がん、例えば、多発性骨髄腫、マスト細胞リンパ腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症（ＷＭ）；非ホジキンリンパ腫、例えば、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫等；急性白血病、例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病；慢性白血病、例えば、慢性骨髄性白血病及び慢性リンパ性白血病；等が挙げられる。
【００１７】
本発明の理解を容易にするために、複数の用語を以下に定義する。
【００１８】
本発明の活性薬剤及び方法について説明する前に、本発明が、記載されている特定の方法論、装置、及び因子に限定されるものではないため、方法、装置、及び製剤が当然ながら様々であり得るということを理解されたい。また、本明細書で使用する用語が、特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、また本発明の範囲を限定するようには意図されていないこと、そして本発明の範囲が付属の請求項によってのみ限定されることも理解されたい。
【００１９】
本明細書及び付属の請求項で使用する単数形「ａ」及び「ｔｈｅ」は、文脈による別段の明確な定めがない限り、複数の指示対象を含むことに注意しなければならない。したがって、例えば、「１つの薬物候補」という言及は１つのまたは混合のこのような候補を指し、「当該方法」という言及には、当業者に公知の等価的なステップ及び方法への言及が含まれる、などとなる。
【００２０】
別途定義されない限り、本明細書で使用する全ての技術的用語及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書で挙げられた全ての刊行物は、その刊行物で説明されており、目下説明している発明と共に使用される可能性があるデバイス、製剤、及び方法論を説明及び開示する目的において、参照により本明細書に組み入れられる。
【００２１】
値の範囲が示されている場合、その間に存在する各値（その範囲の上限と下限との間において、文脈による別段の指示が明確にない限り、下限の１０分の１の単位まで）、及びその記述された値または間に存在する値は、本発明に含まれることを理解されたい。これらのより小さな範囲における上限及び下限は、独立してその小さな範囲に含めることができ、これらは本発明にも含まれ、記述範囲における任意の特定的に除外された制限を受ける。記載範囲が上限下限の一方または両方を含む場合、この含まれた上限下限の一方、両方を除外する範囲も、本発明に含まれる。
【００２２】
以下の記載において、本発明のより十分な理解をもたらすために、多数の具体的な詳細が述べられる。しかし、当業者には、本発明がこれらの具体的な詳細の１つ以上を伴うことなく実施され得ることは明らかであろう。その他の場合において、当業者に周知されている周知の特徴及び手順は、本発明を不明瞭にすることを回避するため、記載されていない。
【００２３】
概して、本発明では、タンパク質合成、組換え細胞培養、及びタンパク質単離の従来的な方法、ならびに当業者の技量の範囲内の組換えＤＮＡ技法が用いられる。このような技法は文献で十分に説明されており、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＆  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８２）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｒｕｓｓｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２００１）；Ｈａｒｌｏｗ，Ｌａｎｅ  ａｎｄ  Ｈａｒｌｏｗ，Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：Ｐｏｒｔａｂｌｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  Ｎｏ．Ｉ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９９８）；及びＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；（１９８８）を参照されたい。
【００２４】
定義
ＮＧｌｙ１阻害剤。本明細書ではある特定のＮＧｌｙ１阻害剤が開示され、その他の阻害剤（以下に限定されないが、Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ（カルボベンズオキシ−バリル−アラニル−アスパルチル−［Ｏ−メチル］−フルオロメチルケトン）を含む）は当技術分野において公知であるか、または本明細書の実施例に記載されているようなスクリーニングアッセイにより決定され得る。一部の実施形態において、化合物はＮＧｌｙ１を阻害し、カスパーゼ活性を阻害しない。一部の実施形態において、阻害剤は、標的タンパク質のアスパラギン側鎖とＮ連結オリゴ糖との間のアミド連結におけるシステイン残基の求核性攻撃を阻害することにより、Ｎｇｌｙ１を機構的に阻害する。一部の実施形態において、候補ＮＧｌｙ１阻害剤は、Ｎ−グリコシル化部位を含むポリペプチド基質の脱グリコシル化を阻害することに基づいて、活性を試験される。一部のこのような実施形態において、アッセイは、蛍光アッセイである。
【００２５】
一部の実施形態において、ＮＧｌｙ１阻害剤は、式Ｉの構造：
【化２】
2020505470.tif 000003
を有し、
式中、Ｒ１は、Ｈであり、
Ｒ２は、Ｈ、低級アルキル、分枝状アルキル、置換アルキルを含めたアルキル、アリール、アルカリル、置換アリール、置換アルカリル等であり、
Ｒ３は、Ｈ、低級アルキル、分枝状アルキル、置換アルキルを含めたアルキル、アリール、アルカリル、置換アリール、置換アルカリル、電子求引性置換基、または電子供与性基である。
【００２６】
一部のこのような実施形態において、Ｒ３はハロゲンであり、下記の構造ＩＩにおけるＸとして図示され、
【化３】
2020505470.tif 000004
式中、Ｘは、クロロ、ブロモ、フルオロ、またはヨード置換基である。
【００２７】
一部の実施形態において、ＮＧｌｙ１阻害剤は式ＩＩＩの構造を有し、式中、Ｒ１及びＲ２は上記の通りであり、
【化４】
2020505470.tif 000005
Ｒ４は、低級アルキル、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル等を含めたアルキル基であり、
Ｒ５は、以下に限定されないが、アルキニル、アルケニル、モルホリノ、アミノ、アミド、スルフヒドリル等を含めた極性または非極性基である。
【００２８】
一部の実施形態において、ＮＧｌｙ１阻害剤は式ＩＶの構造を有し、式中、Ｒ４及びＲ５は上記の通りであり、
【化５】
2020505470.tif 000006
Ｒ６は、アリール環上の任意の位置（オルト、メタ、またはパラ）における任意選択の置換基であり、前記置換基は、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノアシル、アミノアシルオキシ、オキシアミノアシル、アジド、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシル、オキソ、チオケト、カルボキシル、カルボキシアルキル、チオアリールオキシ、チオヘテロアリールオキシ、チオヘテロシクロオキシ、チオール、チオアルコキシ、置換チオアルコキシ、アリール、アリールオキシ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリル、ヘテロシクロオキシ、ヒドロキシアミノ、アルコキシアミノ、ニトロ、−ＳＯ−アルキル、−ＳＯ−置換アルキル、−ＳＯ−アリール、−ＳＯ−ヘテロアリール、−ＳＯ２−アルキル、−ＳＯ２−置換アルキル、−ＳＯ２−アリール、−ＳＯ２−ヘテロアリール、または融合複素環であり、
Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３はいずれも、任意選択により、窒素、酸素、硫黄、リン、またはケイ素から選択されるヘテロ原子、典型的には窒素、酸素、または硫黄である。
【００２９】
一部の実施形態において、ＮＧｌｙ１阻害剤は、式Ｖのエポキシケトンであり、
【化６】
2020505470.tif 000007
式中、Ｒ７は、アミン、置換アミン、アミド、置換アミド、低級アルキルを含めたアルキル、分枝状アルキル、置換アルキル、アリール、アルカリル、置換アリール、置換アルカリル等である。
【００３０】
薬物スクリーニングは、阻害剤の同定のためにｉｎ  ｖｉｔｒｏモデル、遺伝子改変細胞もしくは遺伝子改変動物、または精製ＮＧｌｙ１タンパク質を用いて実行され得る。この目的のために、標識ｉｎ  ｖｉｔｒｏタンパク質間結合アッセイ、電気泳動移動度シフトアッセイ、タンパク質結合についてのイムノアッセイなどを含めた幅広い種類のアッセイが使用され得る。本明細書で使用する「薬剤」という用語は、ＮＧｌｙ１の生理的機能を阻害する能力を有する任意の分子（例えば、タンパク質または医薬品）を言い表すものである。概して、異なる薬剤濃度を用いて複数の混合アッセイが実行されて、様々な濃度に対する異なる応答が得られる。典型的には、これらの濃度の１つは陰性対照として、すなわちゼロ濃度または検出レベル未満で働く。
【００３１】
候補薬剤は多数の化学クラスを包含するが、典型的には有機分子であり、好ましくは、５０ダルトン超約２，５００ダルトン未満の分子量を有する低分子の有機化合物である。候補薬剤は、タンパク質との構造的な相互作用、特に水素結合に必要な官能基を含み、典型的には、少なくとも１つのアミン基、カルボニル基、ヒドロキシル基、またはカルボキシル基、好ましくはこれらの官能化学基のうちの少なくとも２つを含む。候補薬剤は、多くの場合、上記の官能基のうちの１つ以上で置換された、環状炭素もしくは複素環構造、及び／または芳香族もしくはポリ芳香族構造を含む。また、候補薬剤は、ペプチド、サッカライド、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造的アナログ、またはこれらの組合せを含めた生体分子からも見いだされる。
【００３２】
候補薬剤は、合成または天然の化合物のライブラリーを含めた幅広い種類の供給源から得られる。例えば、幅広い種類の有機化合物及び生体分子をランダム及び指向的に合成するために、ランダム化されたオリゴヌクレオチド及びオリゴペプチドの発現を含めた多数の手段が利用可能である。代替的に、細菌、真菌、植物、及び動物の抽出物の形態の天然化合物のライブラリーが利用可能であり、またはこれらは容易に産生される。加えて、天然または合成産生のライブラリー及び化合物は、従来的な化学的、物理的、及び生化学的手段を介して容易に修飾され、組合せライブラリーを産生するのに使用することができる。公知の薬理学的薬剤を指向的またはランダムな化学修飾、例えば、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化等に供して、構造的アナログを産生することができる。
【００３３】
スクリーニングアッセイが結合アッセイまたは活性アッセイである場合、１つ以上の分子を標識に連結させてもよく、このとき標識は、直接的または間接的に検出可能なシグナルをもたらす。様々な標識としては、ラジオアイソトープ、蛍光剤、化学発光剤、酵素、特異的結合分子、粒子（例えば、磁性粒子）などが挙げられる。特異的結合分子としては、ビオチン及びストレプトアビジン、ジゴキシン及びアンチジゴキシンのような対が挙げられる。特異的結合メンバーについては、通常は、補完的なメンバーが、公知の手順に従い、検出をもたらす分子で標識されると考えられる。
【００３４】
好適なアッセイの一例として、検出可能な表現型を有するタンパク質（蛍光タンパク質を含むがこれに限定されない）が変異して、ミスフォールドしＮ−グリコシル化部位を含有する。次に、タンパク質は、ＮＧｌｙ１による脱グリコシル化の際に専ら適切にフォールドする。このようにして、ＮＧｌｙ１の阻害は、検出可能な表現型の欠如をもたらす。一実施形態において、ミスフォールドタンパク質は、ｄｄＶｅｎｕｓのような蛍光タンパク質である。
【００３５】
プロテアソーム阻害剤。直接的プロテアソーム阻害剤は、プロテアソームの一構成要素に結合し、可逆的または非可逆的に酵素活性をブロックする。このような阻害剤は、当技術分野において公知であり、臨床的に使用されているか、または臨床試験で試験されているプロセスにある。当業者には、薬剤のクラスは使用が知られていること、及び以下に記載する特定のメンバーは例示的であり限定的なものではないことが理解されよう。
【００３６】
直接的プロテアソーム阻害剤としては、ボルテゾミブ（ＢＴＺ；［３−メチル−１−（３−フェニル−２−ピラジン−２−イルカルボニルアミノ−プロパノイル）アミノ−ブチル］ボロン酸）が挙げられる。ボルテゾミブは、その構造内にピラジン酸、フェニルアラニン、及びロイシンをボロン酸と共に含有するジペプチドボロン酸誘導体である。
ＢＴＺは、２０Ｓプロテアソームの可逆的阻害剤である。ＢＴＺのボロン酸基は、β５サブユニット内のスレオニンヒドロキシル基の活性部位に結合して複合体を形成し、プロテアソームのキモトリプシン様活性をブロックする。また、ボロン酸基はβ１サブユニットにもより低い親和性で結合し、そのＰＧＰＨ様活性を阻害する。薬物力学研究から、ＢＴＺは、０．１３〜２．０ｍｇ／ｍ２の範囲の静脈内用量でプロテアソーム活性を用量依存的に阻害し、ピーク阻害は投与から１時間以内に生じることが示された。現時点で承認されている適応症には多発性骨髄腫及びマスト細胞リンパ腫が含まれ、ＢＴＺは、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症（ＷＭ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、及び急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）に対する活性も示している。
【００３７】
ＢＴＺは、アルキル化剤、アンスラサイクリン、及び免疫調節薬を含めた血液悪性腫瘍の処置で使用されるいくつかの他のクラスの薬物と組み合わせてもよく、例えば、ＢＴＺ＋ＤＥＸ；ＢＴＺ＋メルファラン＋ＤＥＸ；ＢＴＺ＋ＤＥＸ＋ペグ化ドキソルビシン；ＰＡＤ；ＶＤＤ；ＶＴＤ；ＶＭＰ；ＣｙＢｏｒＤ、ＲＶＤ；ＶＴＤ−ＰＡＣＥ等が挙げられる。
【００３８】
カルフィルゾミブ（ＣＦＺ、別称ＰＲ−１７１、商品名Ｋｙｐｒｏｌｉｓ（登録商標））は、非可逆的ペプチドエポキシケトンクラスのプロテアソーム阻害剤である。α，β−エポキシケトン部分は、プロテアソームの触媒的βサブユニット内のヒドロキシル基及び遊離α−アミノ基の両方と相互作用し、非可逆的様式でのモルホリノ付加物の形成を導く。プロテアソーム活性の復旧には新たなサブユニット合成及びプロテアソームアセンブリーを要するため、エポキシケトン系プロテアソーム阻害剤による非可逆的結合は、活性としてはＢＴＺに比べてより高い持続性をもたらす。血液及びＰＢＭＣにおけるプロテアソーム活性は、用量依存的様式でＣＦＺにより阻害され、最初の用量の後には１５ｍｇ／ｍ２にて＞７５％阻害、５回用量の後には＞９０％阻害となった。組合せとしては、例えば、ＣＦＺ、レナリドミド、及びＤＥＸが挙げられる。
【００３９】
イキサゾミブ（ＭＬＮ−９７０８）は、経口的に生体利用可能なボロン酸エステルプロドラッグであり可逆的なプロテアソーム阻害剤である。現在、イキサゾミブは、過去に処置されていないＭＭ、再発性ＭＭ、進行期の固形腫瘍、リンパ芽球性白血病、非ホジキンリンパ腫、及びＡＬアミロイド症を含めた広範囲の臨床的徴候において、多くの臨床試験で試験されている。デランゾミブ（ＤＬＺ）は、もう１つの可逆的に結合するボロン酸系第２世代プロテアソーム阻害剤であり、経口及び静脈内両方における生体利用能を有する。ＤＬＺは、血液腫瘍及び固形腫瘍の細胞株において、ならびに多発性骨髄腫患者からの初代細胞において、ＢＴＺと同様のプロテアソーム阻害活性を示している。オプロゾミブ（ＯＰＺ）は、細胞傷害性アッセイでＣＦＺと同様の効力を示した、経口的に生体利用可能なペプチドエポキシケトン系の非可逆的プロテアソーム阻害剤である。マリゾミブは、βラクトン骨格を有する非可逆的プロテアソーム阻害剤である。βラクトンのカルボニル基は、触媒的βサブユニット内のＴｈｒｌのヒドロキシル基と相互作用し、アシルエステル付加物の形成をもたらし得る。このプロセスは可逆的であるが、共有結合的付加物は専ら非常に遅い速度で解離する。アシル−エステル結合に加えて、マリゾミブはプロテアソームと共に環式テトラヒドロフラン環も形成し、反応を非可逆的にする。
【００４０】
イムノプロテアソーム特異的阻害剤−００１（ＩＰＳＩ−００１）は、好ましくは、（主にβ１ｉサブユニットに結合することにより）構成的な２０Ｓプロテアソームを制して活性イムノプロテアソーム２０Ｓｉ活性を阻害し、ＭＭ細胞株及び患者試料において強力に増殖を抑制しアポトーシスを誘導する。ＯＮＸ−０９１４及びＰＲ−９２４は、ペプチドエポキシケトン系のイムノプロテアソーム阻害剤であり、これらの両方が選択的かつ非可逆的にβ５ｉサブユニットを阻害することができる。ＯＮＸ−０９１４は、β５及びβ１ｉサブユニットの双方よりも２０〜４０倍β５ｉに対し選択的である。
【００４１】
一部の実施形態において、ＮＧｌｙ１阻害剤と組み合わせた場合に、直接的プロテアソーム阻害剤の用量は、望ましくない副作用を最小化するレベルに低減され、例えば、現時点で承認されている用量の約９０％までの用量にて、従来的な用量の約８０％まで、約７０％まで、約６０％まで、約５０％まで、約４０％まで、約３０％まで、約２０％まで、約１０％まで、約５％までに低減される。一部の実施形態において、ＮＧｌｙ１阻害剤と組み合わせた場合に、用量の回数は低減される。一部の患者に対し、プロテアソーム阻害剤は毒性の末梢神経障害を引き起こす。末梢神経障害は、このような処置の制限的な副作用の１つであり、よってその潜在的な有効性を縮小する。例えば、ボルテゾミブにより誘導される神経障害の発生率は、およそ３０〜６０％である。神経毒性機構は完全には理解されていないが、諸研究からは、アグリソーム形成、小胞体ストレス、ミトコンドリア毒性（ｍｉｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）、炎症応答、及びＤＮＡ損傷がこの神経毒性に寄与することが示唆されている。一部の実施形態において、ＮＧｌｙ１を阻害する薬剤及び直接的プロテアソーム阻害剤の組合せを用いてがんを処置する方法であって、組合せにおける薬剤の投与が、ＮＧｌｙ１阻害剤の不在下で直接的プロテアソーム阻害剤に必要な投与と比べて、臨床的に有意義な神経性有害事象の低減を伴ってがんの処置をもたらす、方法が提供される。
【００４２】
一部の実施形態において、個体は、過去に直接的プロテアソーム阻害剤を用いて処置され、その直接的プロテアソーム阻害剤に耐性を有するようになった場合、ＮＧｌｙ１阻害剤及び直接的プロテアソーム阻害剤の組合せによる処置を選択される。
【００４３】
本発明の目的における「患者」には、ヒト及び他の動物、特に哺乳類（ペット動物及び実験動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ等を含む）が含まれる。したがって、当該方法は、ヒトの治療及び獣医学用途の両方に適用可能である。一実施形態において、患者は哺乳類であり、好ましくは霊長類である。他の実施形態において、患者はヒトである。
【００４４】
「対象」、「個体」、及び「患者」という用語は、本明細書では互換的に使用され、処置の評価を受けている及び／または処置を受けている哺乳類を指す。一実施形態において、哺乳類はヒトである。「対象」、「個体」、及び「患者」という用語は、以下に限定されないが、がんを有する個体を包含する。対象はヒトであり得るが、他の哺乳類、特にヒトの疾患向けの実験モデルに有用な哺乳類（例えば、マウス、ラット等）も含み得る。
【００４５】
「がん」、「新生物」、及び「腫瘍」という用語は、本明細書では互換的に使用され、自律的な制御されない成長を示し、その結果、細胞増殖に対するコントロールの顕著な喪失が特徴の異常な成長表現型を示す細胞を指す。本出願における検出、解析、または処置の目的細胞としては、前がん性（例えば、良性）、悪性、前転移性、転移性、及び非転移性の細胞が挙げられる。事実上あらゆる組織のがんが知られている。「がん負荷（ｃａｎｃｅｒ  ｂｕｒｄｅｎ）」という表現は、対象におけるがん細胞の量またはがんの体積を指す。したがって、がん負荷の低減とは、対象におけるがん細胞数またはがんの体積の低減を指す。本明細書で使用する「がん細胞」という用語は、がん細胞である、またはがん細胞に由来する（例えば、がん細胞のクローン）任意の細胞を指す。
【００４６】
多くのタイプのがんが当業者に公知であり、これには、癌腫、肉腫、黒色腫、リンパ腫、骨髄腫等のような固形腫瘍、及び白血病のような循環性のがんが含まれる。がんの例としては、以下に限定されないが、卵巣癌、乳癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌、肝細胞癌、胃癌、膵臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿路癌、甲状腺癌、腎臓癌、癌腫、黒色腫、頭頸部癌、及び脳癌が挙げられる。
【００４７】
血液癌、すなわち血液起源の細胞のがん、例えば、白血病、リンパ腫、及び骨髄腫は、特に関心対象である。急性白血病は急速に進行する白血病であり、正常な骨髄が、造血細胞の悪性転換から生じるクローンの芽細胞によって置き換えられることを特徴とする。急性白血病には、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）及び急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）が含まれる。ＡＬＬはしばしば中枢神経系に影響し、一方、急性単芽球性白血病は歯肉に影響し、ＡＭＬは任意の部位における局在化された集合物（顆粒球肉腫または緑色腫）に影響する。
【００４８】
真性多血症（ＰＶ）は、Ｈｂ濃度及びＲＢＣ質量の増加（赤血球増加）を特徴とする特発性慢性骨髄増殖性障害である。ＰＶは、年当たり約２．３／１００，０００人に生じ、男性により高い頻度で生じる（約１．４：１）。骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）は、一群の症候群（前白血病、難治性貧血、Ｐｈ陰性慢性骨髄球性白血病、慢性骨髄単球性白血病、骨髄化生）であり、より高齢の患者において一般的に見られる。発がん物質への曝露が関与する可能性がある。ＭＤＳは、赤血球系、骨髄系、及び巨核球系の形態を含めた造血細胞のクローン増殖を特徴とする。ＭＤＳクローンは不安定であり、ＡＭＬに進行する傾向がある。
【００４９】
非ホジキンリンパ腫は不均質な群の障害であり、リンパ節、骨髄、脾臓、及び消化管を含めたリンパ細網部位におけるリンパ系細胞の悪性モノクローナル増殖を伴う。ホジキンリンパ腫に比べると、診断時に播種性である可能性がより高い。ほとんど（８０〜８５％）のＮＨＬはＢ細胞から生じ、残りはＴ細胞またはナチュラルキラー細胞から生じる。前駆細胞または成熟細胞のいずれもが関係し得る。白血病及びＮＨＬは共にリンパ球またはその前駆体の増殖を伴うため、白血病とＮＨＬとの間には重複が存在する。以下のものがこの群内のリンパ腫に含まれる：前駆Ｂリンパ芽球性白血病／リンパ腫；Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病／小リンパ球性リンパ腫；Ｂ細胞性前リンパ球性白血病；リンパ形質細胞性リンパ腫；脾辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（±絨毛状リンパ球）；有毛細胞白血病；形質細胞性骨髄腫／形質細胞腫；ＭＡＬＴ型の節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫；節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（±単球様Ｂ細胞）；濾胞性リンパ腫；マントル細胞リンパ腫；びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫；バーキットリンパ腫；前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫／白血病；Ｔ細胞性前リンパ球性白血病；Ｔ細胞性顆粒リンパ球性白血病；アグレッシブＮＫ細胞白血病；成人Ｔ細胞性リンパ腫／白血病（ＨＴＬＶ１−陽性）；節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、鼻型；腸症型Ｔ細胞リンパ腫；肝脾γ−δ  Ｔ細胞リンパ腫；皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫；菌状息肉症／セザリー症候群；未分化大細胞リンパ腫、Ｔ／ヌル細胞、原発性皮膚型；未分化大細胞リンパ腫、Ｔ／ヌル細胞、原発性全身型；末梢性Ｔ細胞リンパ腫、非特定型；血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫。
【００５０】
通常、慢性白血病は、他の点では無症状の人において、血球減少を伴うまたは伴わない異常な白血球増加として現れる。慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）と慢性骨髄球性白血病（ＣＭＬ）とでは、知見及び管理が顕著に相違する。西洋で最も一般的なタイプの白血病であるＣＬＬは、寿命が異常に長い一見成熟した不完全な腫瘍性リンパ球（ほとんど常にＢ細胞）を伴う。末梢血、骨髄、脾臓、及びリンパ節が白血病性浸潤を経る。
【００５１】
多発性骨髄腫は、モノクローナルな免疫グロブリンを産生し、隣接する骨組織を浸潤し破壊する形質細胞のがんである。一般的な所見としては、骨の痛み、腎臓の機能不全、高カルシウム血、貧血、及び再発性感染が挙げられる。診断には、Ｍタンパク質（尿中に存在することがあり、血清中には存在しない）の実証と、溶解性の骨病変、軽鎖タンパク尿、または過剰な骨髄形質細胞のいずれかの実証とが必要である。通常は骨髄の生検が必要である。現時点の処置としては、従来的な化学療法にボルテゾミブ、レナリドマイド、サリドマイド、コルチコステロイドを追加したもの、及び高用量のメルファランの後の自家末梢血幹細胞移植が挙げられる。
【００５２】
がんの「病態」は、患者の健康を弱める全ての現象を含む。この病態には、以下に限定されないが、異常なまたはコントロール不能な細胞成長、転位、近隣細胞の正常な機能の妨害、サイトカインまたは他の分泌産物の異常なレベルでの放出、炎症性応答または免疫応答の抑制または悪化、新生物、前悪性、悪性腫瘍、周囲または遠位の組織または臓器（例えば、リンパ節等）への浸潤が含まれる。
【００５３】
本明細書で使用する「がん再発」及び「腫瘍再発」という用語、ならびにこれらの文法的変形は、がんの診断後の新生物性細胞またはがん細胞のさらなる成長を指す。特に、再発は、がん性組織内にさらなるがん性細胞成長が生じる場合に生じ得る。同様に、「腫瘍拡散」も、腫瘍の細胞が局所または遠位の組織及び臓器に広がる場合に生じ得る。そのため、腫瘍拡散は腫瘍転移を包含する。「腫瘍浸潤」は、腫瘍成長が局在的に広がって、正常な臓器機能の圧迫、破壊、または妨害により、関係する組織の機能を弱める場合に生じる。
【００５４】
本明細書で使用する「転移」という用語は、元のがん性腫瘍の臓器に直接接続していない臓器または身体部分におけるがん性腫瘍の成長を指す。転移は、元のがん性腫瘍の臓器に直接接続していない臓器または身体部分における検出不能な量のがん性細胞の存在である、微小転移を含むように理解される。転移は、あるプロセス（例えば、元の腫瘍部位からのがん細胞の離脱、ならびにがん細胞の他の身体部分への移動及び／または浸潤）におけるいくつかのステップとしても定義され得る。
【００５５】
患者に対する「試料」という用語は、血液及び生体起源の他の液体試料、固体組織試料、例えば、生検標本または組織培養物もしくはそれに由来する細胞及びその後代を含む。また、この定義は、試料の調達後に、例えば、試薬による処理、洗浄、またはある特定の細胞集団（例えば、がん細胞）の濃縮により、任意の方法で操作された試料も含む。また、この定義は、特定のタイプの分子（例えば、核酸、ポリペプチド等）を濃縮した試料も含む。「生体試料」という用語は臨床的試料を含み、また外科的切除により得られる組織、生検により得られる組織、培養下の細胞、細胞上清、細胞ライセート、組織試料、臓器、骨髄、血液、血漿、血清なども含む。「生体試料」としては、患者のがん細胞から得られた試料、例えば、患者のがん細胞から得られたポリヌクレオチド及び／またはポリペプチドを含む試料（例えば、細胞ライセートまたはポリヌクレオチド及び／またはポリペプチドを含む他の細胞抽出物）、ならびに患者からのがん細胞を含む試料が挙げられる。患者からのがん細胞を含む生体試料は、非がん性細胞も含み得る。
【００５６】
「診断」という用語は、分子的もしくは病理学的状態、疾患、または状態の同定（例えば、乳癌、前立腺癌、または他のタイプのがんの分子的サブタイプの同定）を指すように本明細書で使用される。
【００５７】
「予後」という用語は、新生物性疾患（例えば、卵巣癌）における、がんに起因する死亡または進行（再発、転移性拡散、及び薬物耐性）の可能性の予測を指すように本明細書で使用される。「予測」という用語は、観察、経験、または科学的推論に基づいた予想または推定の行為を指すように本明細書で使用される。一例では、医師は、原発性腫瘍の外科的除去及び／または化学療法の後に、患者ががん再発を伴うことなくある特定の時間期間の間生存する可能性を予測し得る。
【００５８】
本明細書で使用する「処置」、「処置すること」などの用語は、ある効果を得る目的で薬剤を投与すること、またはある手順を実行することを指す。効果は、疾患もしくはその症状を完全もしくは部分的に防止するという観点で予防的であってもよく、及び／または、疾患または疾患の症状に部分的もしくは完全な治癒をもたらすという観点で治療的であってもよい。本明細書で使用する「処置」は、哺乳類における、特にヒトにおける腫瘍の処置を含み、また、（ａ）疾患にかかりやすい可能性があるがまだそれを有すると診断されていない対象において疾患または疾患の症状が生じるのを防止すること（例えば、原発性疾患に関連し得るまたはそれにより引き起こされ得る疾患を含む）、（ｂ）疾患を阻害すること、すなわちその発生を抑止すること、及び（ｃ）疾患を緩和すること、すなわち、疾患の後退を引き起こすことを含む。がんの処置に有効な用量は、アポトーシスまたは他の形態の細胞死の誘導における薬剤の活性に起因した、生存可能ながん細胞の枯渇または低減を含む。
【００５９】
処置するとは、がんの処置または寛解または防止における任意の成功の徴候を指すことができ、このような徴候には、任意の客観的または主観的パラメーター、例えば、軽減；軽快；症状の漸減、もしくは患者に対する疾患状態の認容性を高めること；変性もしくは減退の低速化；または、変性最終点の衰弱性を緩和することが含まれる。症状の処置または回復は、医師による身体検査の結果を含めた客観的または主観的パラメーターに基づき得る。したがって、「処置する」という用語は、がんまたは他の疾患に関連する症状または状態の発生を防止もしくは遅延、緩和、または抑止もしくは阻害するために、本発明の化合物または薬剤を投与することを含む。「治療効果」という用語は、対象における疾患、疾患の症状、または疾患の副作用の低減、消去、または防止を指す。
【００６０】
「〜と組み合わせて」、「組合せ療法」、及び「組合せ産物」とは、ある特定の実施形態において、患者に、本明細書で使用されるような第１の治療薬及び化合物を同時発生的に投与することを指す。組み合わせて投与される場合、各構成要素は、同時に投与される場合もあれば、異なる時点における任意の順序で経時的に投与される場合もある。したがって、各構成要素は、別々に、ただし所望の治療効果をもたらすように時間を十分に近接させて投与され得る。
【００６１】
１つ以上のがん治療薬物（複数可）及び本発明の薬学的組成物の「同時投与」とは、両方の薬剤が治療効果を有するような時間に薬剤を投与することを意味する。このような同時投与は、本発明の化合物の投与に対する同時発生的（すなわち、同時に）、事前、または事後の薬剤の投与を伴い得る。当業者であれば、特定の薬物及び本発明の組成物に関し、何ら困難なく適切なタイミング、順序、及び薬用量を決定するであろう。
【００６２】
本明細書で使用するがん処置のエンドポイントは、当技術分野で公知であるような、かつ食品医薬品局により使用されているような意味が与えられる。
【００６３】
全生存期間は、ランダム化から任意の原因による死亡までの時間として定義され、治療企図集団において測定される。生存期間は、最も信頼できるがんのエンドポイントとみなされており、妥当に生存期間評価するように試験を行うことができれば通常は好ましいエンドポイントとなる。このエンドポイントは正確であり、測定が容易であり、死亡日まで記録される。バイアスは、エンドポイント測定における因子ではない。生存期間の改善は、臨床的利益を評価するためのリスク−利益解析として解析されるべきである。全生存期間は、ランダム化対照試験において評価され得る。全生存期間における統計的に有意な改善が実証されることは、毒性プロファイルが許容される場合、臨床的に意義のあるものとみなされ得、しばしば新薬承認を支持するものとなっている。本発明の方法の利益には、患者の全生存期間の増加が含まれ得る。
【００６４】
腫瘍評価に基づいたエンドポイントとしては、ＤＦＳ、ＯＲＲ、ＴＴＰ、ＰＦＳ、及び治療成功期間（ＴＴＦ）が挙げられる。このような時間依存的エンドポイントにおけるデータの収集及び解析は、間接的な評価、計算、及び推定（例えば、腫瘍の測定値）に基づいている。無病生存期間（ＤＦＳ）は、ランダム化から任意の原因による腫瘍再発または死亡までの時間として定義される。このエンドポイントが最も頻繁に使用されるのは、根治的な手術または放射線療法の後のアジュバント設定においてである。また、ＤＦＳは、高いパーセンテージの患者が化学療法に対する完全な応答を達成する場合における重要なエンドポイントでもあり得る。
【００６５】
客観的奏効率。ＯＲＲは、予め定義された量の腫瘍サイズ低減を最小限の時間期間の間伴う患者の割合として定義される。応答期間は、通常、最初の応答の時間から記録された腫瘍進行までを測定する。概して、ＦＤＡは、ＯＲＲを部分奏効及び完全奏効の和として定義している。このようにして定義される場合、ＯＲＲは薬物の抗腫瘍活性の直接的測定値であり、これはシングルアーム試験で評価され得る。
【００６６】
無進行期間及び無憎悪生存期間。ＴＴＰ及びＰＦＳは、薬物承認のプライマリーエンドポイントとして働いている。ＴＴＰは、ランダム化から客観的な腫瘍進行までの時間として定義され、ＴＴＰは死亡を含まない。ＰＦＳは、ランダム化から客観的な腫瘍進行または死亡までの時間として定義される。
【００６７】
本明細書で使用する「相関する」または「〜と相関する」という用語及び類似する用語は、２つの事象の実例間の統計的な関連性を指し、事象としては数字、データセットなどが挙げられる。例えば、事象が数字を伴う場合、正の相関（本明細書では「直接的相関」とも呼ばれる）とは、一方が増加するにつれて他方も増加することを意味する。負の相関（本明細書では「逆相関」とも呼ばれる）とは、一方が増加するにつれて他方は減少することを意味する。
【００６８】
「薬用量単位」または「単位用量」とは、特定の個体が処置を受けるためのまとまった薬用量として適している物理的に別々の単位を指す。各単位は、必要とされる薬学的担体と共に所望の治療効果（複数可）もたらすように計算された、所定の量の活性化合物（複数可）を含有し得る。薬用量単位形態の仕様は、（ａ）活性化合物（複数可）の特有の特性及び達成されるべき特定の治療効果（複数可）と、（ｂ）このような活性化合物（複数可）を配合する技術分野に固有の制限とにより規定され得る。
【００６９】
「薬学的に許容される賦形剤」とは、概して安全で、無毒性で、望ましい薬学的組成物を調製するのに有用な賦形剤を意味し、これには、ヒトの医薬使用に加えて獣医学的使用にも許容される賦形剤が含まれる。このような賦形剤は、固体、液体、半固体、またはエアロゾル組成物の場合には気体であり得る。
【００７０】
「薬学的に許容される塩及びエステル」とは、薬学的に許容され、所望の薬理学的特性を有する塩及びエステルを意味する。このような塩としては、化合物中に存在する酸性プロトンが無機塩基または有機塩基と反応可能な場合に形成され得る塩が挙げられる。好適な無機塩としては、アルカリ金属（例えば、ナトリウム及びカリウム）、マグネシウム、カルシウム、及びアルミニウムと共に形成される塩が挙げられる。好適な有機塩としては、有機塩基、例えば、アミン塩基、例えば、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、Ｎメチルグルカミンなどと共に形成される塩が挙げられる。また、このような塩としては、無機酸（例えば、塩酸及び臭化水素酸）ならびに有機酸（例えば、酢酸、クエン酸、マレイン酸、ならびにアルカン及びアレーンスルホン酸、例えば、メタンスルホン酸及びベンゼンスルホン酸）と共に形成される酸付加塩も挙げられる。薬学的に許容されるエステルとしては、化合物中に存在するカルボキシ基、スルホニルオキシ基、及びホスホノオキシ基から形成されるエステル（例えば、Ｃ１−６アルキルエステル）が挙げられる。２つの酸性基が存在する場合、薬学的に許容される塩またはエステルは、モノ−酸−モノ−塩もしくはエステル、またはジ−塩もしくはエステルであり得る。同様に、３つ以上の酸性基が存在する場合、このような基の一部または全てが塩化またはエステル化され得る。本発明で命名されている化合物は、非塩化または非エステル化形態で存在しても、塩化及び／またはエステル化形態で存在してもよく、このような化合物の呼称は、元の（非塩化及び非エステル化）化合物ならびにその薬学的に許容される塩及びエステルの両方を含むように意図されている。また、本発明で命名されているある特定の化合物は、２つ以上の立体異性体形態で存在する可能性があり、このような化合物の呼称は、全ての個別の立体異性体及びこのような立体異性体の全ての混合物（ラセミでもそれ以外でも）を含むように意図されている。
【００７１】
「薬学的に許容される」、「生理的に認容される」という用語及びこれらの文法的変形は、それらが組成物、担体、希釈剤、及び試薬を指す場合、互換的に使用され、材料が、組成物の投与を妨げる程度に望ましくない生理的影響をもたらすことなく、ヒトに対しまたはヒトにおいて投与可能であるということを表す。
【００７２】
「治療有効量」とは、疾患の処置のために対象に投与する場合に、その疾患に対する処置をもたらすのに十分な量を意味する。
【００７３】
がん患者は、プロテアソーム阻害剤に加えて、手術、放射線療法、及び化学療法を含めた追加の処置モダリティーを用いて処置されてもよい。化学療法剤としては、以下に限定されないが、アルキル化剤、アントラサイクリン、免疫調節薬、コルチコステロイド、ビンカアルカロイド、タキサン、エピポドフィロトキシン、アントラサイクリン、アクチノマイシン等が挙げられる。アントラサイクリンとしては、ダウノルビシン塩酸塩（ダウノマイシン、ルビドマイシン、セルビジン）、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、及びミトキサントロンが挙げられる。ビンカアルカロイドは、元はＶｉｎｃａ植物に由来する薬物のクラスであり、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビンがこれに含まれる。タキサンはジテルペンであり、パクリタキセル及びドセタキセルがこれに含まれる。エピポドフィロトキシンは天然存在のアルカロイド及びその誘導体である。現在がんの処置で使用されているエピポドフィロトキシン誘導体としては、エトポシド、テニポシドが挙げられる。キノリンアルカロイドとしては、カンプトテシン、ＳＮ−３８、ＤＸ−８９５１ｆ、トポテカン、９−アミノカンプトテシン、ＢＮ  ８０９１５、イリノテカン、ＤＢ  ６７、ＢＮＰ  １３５０、エキサテカン、ルルトテカン、ＳＴ  １４８１、及びＣＫＤ  ６０２が挙げられる。他の天然産物としては、アザチオプリン；ブレキナル；フェノキシゾンビスシクロペプチド、例えば、ダクチノマイシン；塩基性グリコペプチド、例えば、ブレオマイシン；アントラキノングリコシド、例えば、プリカマイシン（ミトラマイシン）；アントラセンジオン、例えば、ミトキサントロン；アジリノピロロインドールジオン、例えば、ミトマイシン；大環状免疫抑制剤、例えば、シクロスポリン、ＦＫ−５０６（タクロリムス、プログラフ）、ラパマイシン等；などが挙げられる。他の化学療法剤としては、金属錯体、例えば、シスプラチン（シス−ＤＤＰ）、カルボプラチン等；ウレア、例えば、ヒドロキシウレア；及びヒドラジン、例えば、Ｎ−メチルヒドラジンが挙げられる。レチノイド、例えば、ビタミンＡ、シス−レチノイン酸、トランス−レチノイン酸、イソトレチノイン等；カロテノイド、例えば、ベータカロテン、ビタミンＤ等。
【００７４】
他の組合せ療法としては、細胞特異的抗体または免疫制御抗体、例えば、チェックポイント阻害剤、例えば、腫瘍細胞マーカーに対し選択的な抗体、放射線、手術、及び／またはホルモン遮断（Ｋｗｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．，９６：１５０７４−９，１９９９）が挙げられる。複数の抗体が、現在、がんの処置向けに臨床使用されており、他の抗体は臨床開発の様々な段階にある。例えば、抗ＣＤ２０（リツキシマブ）；抗ＣＤ５２（アレムツズマブ）；抗ＣＤ２２等。アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ）は、慢性リンパ球性白血病の処置で使用されており、ゲムツズマブ（Ｍｙｌｏｔａｒｇ）は、急性骨髄性白血病の処置で使用されており、イブリツモマブ（Ｚｅｖａｌｉｎ）は、非ホジキンリンパ腫の処置で使用されており、パニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ）は、結腸癌の処置で使用されている。固形腫瘍で使用されてきたモノクローナル抗体としては、以下に限定されないが、エドレコロマブ及びトラスツズマブ（ハーセプチン）が挙げられる。エドレコロマブは、結腸直腸癌に見られる１７−１Ａ抗原を標的化する。トラスツズマブは、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ抗原を標的化する。セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ）はＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）に結合し、癌腫の処置で使用されてきた。
【００７５】
本明細書で使用する「式を有する」または「構造を有する」という表現は、限定的であるようには意図されておらず、「含む」という用語が一般的に使用されているのと同じように使用される。「〜から独立的に選択される」という用語は、挙げられた要素（例えば、Ｒ基など）が同一であっても異なっていてもよいことを示すように本明細書で使用される。
【００７６】
本明細書で使用する「〜してもよい」、「任意選択の」、「任意選択により」、または「任意選択により〜してもよい」という用語は、次に記述される状況が生じても生じなくてもよいことを意味し、その結果、この記述はそのような状況が生じる場合及び生じない場合を含む。例えば、「任意選択により置換された」という表現は、非水素置換基が所与の原子上に存在しても存在しなくてもよいことを意味し、したがって、この記述は、非水素置換基が存在する構造及び非水素置換基が存在しない構造を含む。
【００７７】
本明細書で使用する「アルキル」という用語は、典型的には、ただし常にそうとは限らないが１〜約２４個の炭素原子を含有する、分枝状または非分枝状の飽和炭化水素基（すなわち、モノラジカル）、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、オクチル、デシルなど、さらにシクロアルキル、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどを指す。概して、ただし常にそうとは限らないが、本明細書におけるアルキル基は１〜約１８個の炭素原子を含有し得、このような基は１〜約１２個の炭素原子を含有し得る。「低級アルキル」という用語は、１〜６個の炭素原子のアルキル基を意図する。「置換アルキル」とは、１つ以上の置換基で置換されたアルキルを指し、これには、アルキル置換基内の同じ炭素原子からの２個の水素原子が置き換えられる場合（例えば、カルボニル基の場合）も含まれる（すなわち、置換アルキル基は−Ｃ（＝Ｏ）−部分を含んでもよい）。「ヘテロ原子含有アルキル」及び「ヘテロアルキル」という用語は、以下でさらに詳細に説明されるように、少なくとも１個の炭素原子がヘテロ原子で置き換えられているアルキル置換基を指す。別途指示されない場合、「アルキル」及び「低級アルキル」という用語は、それぞれ、直鎖状、分枝状、環式、非置換、置換、及び／またはヘテロ原子含有のアルキルまたは低級アルキルを含む。
【００７８】
本明細書で使用する「アルケニル」という用語は、少なくとも１つの二重結合を含有する２〜約２４個の炭素原子の直鎖状、分枝状、または環式の炭化水素基、例えば、エテニル、ｎ−プロペニル、イソプロペニル、ｎ−ブテニル、イソブテニル、オクテニル、デセニル、テトラデセニル、ヘキサデセニル、エイコセニル、テトラコセニルなどを指す。概して、ただし、またしても常にそうとは限らないが、本明細書におけるアルケニル基は２〜約１８個の炭素原子を含有し得、例えば、２〜１２個の炭素原子を含有し得る。「低級アルケニル」という用語は、２〜６個の炭素原子のアルケニル基を意図する。「置換アルケニル」という用語は、１つ以上の置換基で置換されたアルケニルを指し、「ヘテロ原子含有アルケニル」及び「ヘテロアルケニル」という用語は、少なくとも１個の炭素原子がヘテロ原子で置き換えられているアルケニルを指す。別途指示されない場合、「アルケニル」及び「低級アルケニル」という用語は、それぞれ、直鎖状、分枝状、環式、非置換、置換、及び／またはヘテロ原子含有のアルケニルまたは低級アルケニルを含む。
【００７９】
本明細書で使用する「アルキニル」という用語は、少なくとも１つの三重結合を含有する２〜２４個の炭素原子の直鎖状または分枝状の炭化水素基、例えば、エチニル、ｎ−プロピニルなどを指す。概して、ただし、またしても常にそうとは限らないが、本明細書におけるアルキニル基は２〜約１８個の炭素原子を含有し得、このような基はさらに、２〜１２個の炭素原子を含有し得る。「低級アルキニル」という用語は、２〜６個の炭素原子のアルキニル基を意図する。「置換アルキニル」という用語は、１つ以上の置換基で置換されたアルキニルを指し、「ヘテロ原子含有アルキニル」及び「ヘテロアルキニル」という用語は、少なくとも１個の炭素原子がヘテロ原子で置き換えられているアルキニルを指す。別途指示されない場合、「アルキニル」及び「低級アルキニル」という用語は、それぞれ、直鎖状、分枝状、非置換、置換、及び／またはヘテロ原子含有のアルキニルまたは低級アルキニルを含む。
【００８０】
本明細書で使用する「アルコキシ」という用語は、単一の末端のエーテル連結を介し結合したアルキル基を意図しており、すなわち「アルコキシ」基は、−Ｏ−アルキル（アルキルは、上記で定義されている通りである）として表現することができる。「低級アルコキシ」基は、１〜６個の炭素原子を含有するアルコキシ基を意図しており、これには、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｔ−ブチルオキシ等が含まれる。本明細書で「Ｃ１−Ｃ６アルコキシ」または「低級アルコキシ」として識別される置換基は、例えば、１〜３個の炭素原子を含有し得、さらなる例としては、このような置換基は１個または２個の炭素原子を含有し得る（すなわち、メトキシ及びエトキシ）。
【００８１】
本明細書で使用する「アリール」という用語は、別段の指定がない限り、概して、ただし常にそうとは限らないが、５〜３０個の炭素原子を含有し、単一の芳香族環、または一緒に融合した、直接連結した、もしくは（異なる芳香環がメチレンもしくはエチレン部分のような共通の基に結合するように）間接的に連結した複数の芳香族環を含有する、芳香族置換基を指す。アリール基は、例えば、５〜２０個の炭素原子を含有し得、さらなる例としては、アリール基は５〜１２個の炭素原子を含有し得る。例えば、アリール基は、１つの芳香族環、または２つ以上の融合もしくは連結した芳香族環（例えば、ビアリール、アリール−置換アリール等）を含有することができる。例としては、フェニル、ナフチル、ビフェニル、ジフェニルエーテル、ジフェニルアミン、ベンゾフェノンなどが挙げられる。「置換アリール」とは、１つ以上の置換基で置換されたアリール部分を指し、「ヘテロ原子含有アリール」及び「ヘテロアリール」という用語は、以下でさらに詳細に説明されるように、少なくとも１個の炭素原子がヘテロ原子で置き換えられているアリール置換基を指す。アリールは、安定した環式、複素環式、多環式、及び多複素環式の不飽和Ｃ３−Ｃ１４部分であり、例示としては、以下に限定されないが、フェニル、ビフェニル、ナフチル、ピリジル、フリル、チオフェニル、イミダゾリル、ピリミジニル、及びオキサゾリルが挙げられ、これらはさらに、Ｃ１−Ｃ８アルコキシ、Ｃ１−Ｃ８分枝状または直鎖状アルキル、アシルオキシ、カルバモイル、アミノ、Ｎ−アシルアミノ、ニトロ、ハロゲン、トリフルオロメチル、シアノ、及びカルボキシルからなる群より選択される１〜５つのメンバーで置換されていてもよい（例えば、Ｋａｔｒｉｔｚｋｙ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙを参照）。別途指示されない場合、「アリール」という用語は、非置換、置換、及び／またはヘテロ原子含有の芳香族置換基を含む。
【００８２】
「アラルキル」という用語は、アリール置換基を有するアルキル基を指し、「アルカリル」という用語は、アルキル置換基を有するアリール基を指し、「アルキル」及び「アリール」は上記で定義されている通りである。概して、本明細書におけるアラルキル基及びアルカリル基は、６〜３０個の炭素原子を含有する。アラルキル基及びアルカリル基は、例えば、６〜２０個の炭素原子を含有し得、さらなる例としては、このような基は６〜１２個の炭素原子を含有し得る。
【００８３】
本明細書で使用する「アルキレン」という用語は、ジラジカルアルキル基を指す。別段の指示がない限り、このような基は、１〜２４個の炭素原子を含有する飽和炭化水素鎖を含み、これは置換されていても置換されていなくてもよく、１つ以上の脂環式基を含有してもよく、ヘテロ原子含有であってもよい。「低級アルキレン」とは、１〜６個の炭素原子を含有するアルキレン連結を指す。例としては、メチレン（−−ＣＨ２−−）、エチレン（−−ＣＨ２ＣＨ２−−）、プロピレン（−−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−−）、２−メチルプロピレン（−−ＣＨ２−−ＣＨ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−）、ヘキシレン（−−（ＣＨ２）６−−）などが挙げられる。
【００８４】
同様に、本明細書で使用する「アルケニレン」、「アルキニレン」、「アリーレン」、「アラルキレン」、及び「アルカリレン」という用語は、それぞれジラジカルのアルケニル基、アルキニル基、アリール基、アラルキル基、及びアルカリル基を指す。
【００８５】
「アミノ」という用語は、基−ＮＲＲ′を指すように本明細書で使用されており、式中、Ｒ及びＲ′は独立的に水素または非水素置換基であり、非水素置換基としては、例えば、アルキル、アリール、アルケニル、アラルキル、ならびにこれらの置換及び／またはヘテロ原子含有バリアントが挙げられる。
【００８６】
「ハロ」及び「ハロゲン」という用語は、従来的な意味において、クロロ、ブロモ、フルオロ、またはヨード置換基を指すように使用されている。
【００８７】
「ヘテロ原子含有アルキル基」（「ヘテロアルキル」基とも称される）または「ヘテロ原子含有アリール基」（「ヘテロアリール」基とも称される）におけるような、「ヘテロ原子含有」という用語は、１個以上の炭素原子が炭素以外の原子（例えば、窒素、酸素、硫黄、リン、またはケイ素、典型的には窒素、酸素、または硫黄）で置き換えられた分子、連結、または置換基を指す。同様に、「ヘテロアルキル」という用語は、ヘテロ原子含有であるアルキル置換基を指し、「複素環式」または「複素環」という用語は、ヘテロ原子含有である環式の置換基を指し、「ヘテロアリール」及び「複素環式芳香族」という用語は、それぞれヘテロ原子含有である「アリール」及び「芳香族」置換基を指す、などとなる。ヘテロアルキル基の例としては、アルコキシアリール、アルキルスルファニル置換アルキル、Ｎ−アルキル化アミノアルキルなどが挙げられる。ヘテロアリール置換基の例としては、ピロリル、ピロリジニル、ピリジニル、キノリニル、インドリル、フリル、ピリミジニル、イミダゾリル、１，２，４−トリアゾリル、テトラゾリル等が挙げられ、ヘテロ原子含有脂環式基の例としては、ピロリジノ、モルホリノ、ピペリジノ、テトラヒドロフラニル等が挙げられる。
【００８８】
本明細書で使用する「複素環」、「複素環式」、「ヘテロシクロアルキル」、及び「ヘテロシクリル」という用語は、単環または複数の縮合環（融合架橋環系及びスピロ環系を含む）を有し、３〜１５個の環原子（１〜４個のヘテロ原子を含む）を有する飽和基または不飽和基を指す。このような環原子は、窒素、硫黄、または酸素からなる群から選択され、融合環系においては、付着点が非芳香族環を介していることを条件に、環のうちの１つ以上は、シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり得る。ある特定の実施形態において、複素環式基の窒素及び／または硫黄原子（複数可）は、任意選択により酸化されてＮ−オキシド、−Ｓ（Ｏ）−、または−ＳＯ２−部分をもたらす。
【００８９】
複素環及びヘテロアリールの例としては、以下に限定されないが、アゼチジン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インドリジン、イソインドール、インドール、ジヒドロインドール、インダゾール、プリン、キノリジン、イソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチルピリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、プテリジン、カルバゾール、カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、フェナントロリン、イソチアゾール、フェナジン、イソキサゾール、フェノキサジン、フェノチアジン、イミダゾリジン、イミダゾリン、ピペリジン、ピペラジン、インドリン、フタルイミド、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン、４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン、チアゾール、チアゾリジン、チオフェン、ベンゾ［ｂ］チオフェン、モルホリニル、チオモルホリニル（チアモルホリニルとも呼ばれる）、１，１−ジオキソチオモルホリニル、ピペリジニル、ピロリジン、テトラヒドロフラニルなどが挙げられる。
【００９０】
複素環式置換基の定義により別途制約されない限り、このような複素環式基は、任意選択により、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノアシル、アミノアシルオキシ、オキシアミノアシル、アジド、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシル、オキソ、チオケト、カルボキシル、カルボキシアルキル、チオアリールオキシ、チオヘテロアリールオキシ、チオヘテロシクロオキシ、チオール、チオアルコキシ、置換チオアルコキシ、アリール、アリールオキシ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリル、ヘテロシクロオキシ、ヒドロキシアミノ、アルコキシアミノ、ニトロ、−ＳＯ−アルキル、−ＳＯ−置換アルキル、−ＳＯ−アリール、−ＳＯ−ヘテロアリール、−ＳＯ２−アルキル、−ＳＯ２−置換アルキル、−ＳＯ２−アリール、−ＳＯ２−ヘテロアリール、及び融合複素環から選択される１〜５個または１〜３個の置換基で置換されていてもよい。
【００９１】
「ヒドロカルビル」とは、１〜約３０個の炭素原子（１〜約２４個の炭素原子を含む、さらに１〜約１８個の炭素原子を含む、さらに約１〜１２個の炭素原子を含む）を含有し、直鎖状、分枝状、環式、飽和、及び不飽和の種を含む一価のヒドロカルビルラジカル、例えば、アルキル基、アルケニル基、アリール基などを指す。ヒドロカルビルは、１つ以上の置換基で置換されていてもよい。「ヘテロ原子含有ヒドロカルビル」という用語は、少なくとも１個の炭素原子がヘテロ原子で置き換えられているヒドロカルビルを指す。    別段の指示がない限り、「ヒドロカルビル」という用語は、置換及び／またはヘテロ原子含有ヒドロカルビル部分を含むように解釈されるものとする。
【００９２】
「置換ヒドロカルビル」、「置換アルキル」、「置換アリール」などにおけるような「置換」は、上述の定義のいくつかで言及されているように、ヒドロカルビル、アルキル、アリール、または他の部分において、炭素（または他の）原子に結合している少なくとも１個の水素原子が、１つ以上の非水素置換基で置き換えられていることを意味する。このような置換基の例としては、以下に限定されないが、官能基、ならびにヒドロカルビル部分Ｃ１−Ｃ２４アルキル（Ｃ１−Ｃ１８アルキルを含み、Ｃ１−Ｃ１２アルキルをさらに含み、Ｃ１−Ｃ６アルキルをさらに含む）、Ｃ２−Ｃ２４アルケニル（Ｃ２−Ｃ１８アルケニルを含み、Ｃ２−Ｃ１２アルケニルをさらに含み、Ｃ２−Ｃ６アルケニルをさらに含む）、Ｃ２−Ｃ２４アルキニル（Ｃ２−Ｃ１８アルキニルを含み、Ｃ２−Ｃ１２アルキニルをさらに含み、Ｃ２−Ｃ６アルキニルをさらに含む）、Ｃ５−Ｃ３０アリール（Ｃ５−Ｃ２０アリールを含み、Ｃ５−Ｃ１２アリールをさらに含む）、及びＣ６−Ｃ３０アラルキル（Ｃ６−Ｃ２０アラルキルを含み、Ｃ６−Ｃ１２アラルキルをさらに含む）が挙げられる。上述のヒドロカルビル部分は、具体的に挙げられたもののような１つ以上の官能基または追加のヒドロカルビル部分でさらに置換されていてもよい。別段の指示がない限り、本明細書に記載されているいずれの基も、非置換基に加えて置換及び／またはヘテロ原子含有部分も含むように解釈されるものとする。
【００９３】
「官能基」という用語は、ハロ、ヒドロキシル、スルフヒドリル、Ｃ１−Ｃ２４アルコキシ、Ｃ２−Ｃ２４アルケニルオキシ、Ｃ２−Ｃ２４アルキニルオキシ、Ｃ５−Ｃ２０アリールオキシ、アシル（Ｃ２−Ｃ２４アルキルカルボニル（−ＣＯ−アルキル）及びＣ６−Ｃ２０アリールカルボニル（−ＣＯ−アリール）を含む）、アシルオキシ（−Ｏ−アシル）、Ｃ２−Ｃ２４アルコキシカルボニル（−（ＣＯ）−Ｏ−アルキル）、Ｃ６−Ｃ２０アリールオキシカルボニル（−（ＣＯ）−Ｏ−アリール）、ハロカルボニル（−ＣＯ）−Ｘ（式中、Ｘはハロである））、Ｃ２−Ｃ２４アルキルカルボナト（−Ｏ−（ＣＯ）−Ｏ−アルキル）、Ｃ６−Ｃ２０アリールカルボナト（−Ｏ−（ＣＯ）−Ｏ−アリール）、カルボキシ（−ＣＯＯＨ）、カルボキシラト（−ＣＯＯ−）、カルバモイル（−（ＣＯ）−ＮＨ２）、モノ−置換Ｃ１−Ｃ２４アルキルカルバモイル（−（ＣＯ）−ＮＨ（Ｃ１−Ｃ２４アルキル））、ジ−置換アルキルカルバモイル（−（ＣＯ）−Ｎ（Ｃ１−Ｃ２４アルキル）２）、モノ−置換アリールカルバモイル（−（ＣＯ）−ＮＨ−アリール）、チオカルバモイル（−（ＣＳ）−ＮＨ２）、カルバミド（−ＮＨ−（ＣＯ）−ＮＨ２）、シアノ（−Ｃ≡Ｎ）、イソシアノ（−Ｎ＋≡Ｃ−）、シアナト（−Ｏ−Ｃ≡Ｎ）、イソシアナト（−Ｏ−Ｎ＋≡Ｃ−）、イソチオシアナト（−Ｓ−Ｃ≡Ｎ）、アジド（−Ｎ＝Ｎ＋＝Ｎ−）、ホルミル（−（ＣＯ）−Ｈ）、チオホルミル（−（ＣＳ）−Ｈ）、アミノ（−ＮＨ２）、モノ−及びジ−（Ｃ１−Ｃ２４アルキル）−置換アミノ、モノ−及びジ−（Ｃ５−Ｃ２０アリール）−置換アミノ、Ｃ２−Ｃ２４アルキルアミド（−ＮＨ−（ＣＯ）−アルキル）、Ｃ５−Ｃ２０アリールアミド（−ＮＨ−（ＣＯ）−アリール）、イミノ（−ＣＲ＝ＮＨ（Ｒ＝水素、Ｃ１−Ｃ２４アルキル、Ｃ５−Ｃ２０アリール、Ｃ６−Ｃ２０アルカリル、Ｃ６−Ｃ２０アラルキル等））、アルキルイミノ（−ＣＲ＝Ｎ（アルキル）（Ｒ＝水素、アルキル、アリール、アルカリル等））、アリールイミノ（−ＣＲ＝Ｎ（アリール）（Ｒ＝水素、アルキル、アリール、アルカリル等））、ニトロ（−ＮＯ２）、ニトロソ（−ＮＯ）、スルホ（−ＳＯ２−ＯＨ）、スルホナト（−ＳＯ２−Ｏ−）、Ｃ１−Ｃ２４アルキルスルファニル（−Ｓ−アルキル；「アルキルチオ」とも称される）、アリールスルファニル（−Ｓ−アリール；「アリールチオ」とも称される）、Ｃ１−Ｃ２４アルキルスルフィニル（−（ＳＯ）−アルキル）、Ｃ５−Ｃ２０アリールスルフィニル（−（ＳＯ）−アリール）、Ｃ１−Ｃ２４アルキルスルホニル（−ＳＯ２−アルキル）、Ｃ５−Ｃ２０アリールスルホニル（−ＳＯ２−アリール）、ホスホノ（−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２）、ホスホナト（−Ｐ（Ｏ）（Ｏ−）２）、ホスフィナト（−Ｐ（Ｏ）（Ｏ−））、ホスホ（−ＰＯ２）、及びホスフィノ（−ＰＨ２）、モノ−及びジ−（Ｃ１−Ｃ２４アルキル）−置換ホスフィノ、モノ−及びジ−（Ｃ５−Ｃ２０アリール）−置換ホスフィンのような化学基を意味する。加えて、上述の官能基は、特定の基が許容する場合、上記で具体的に挙げられたもののような１つ以上の追加の官能基または１つ以上のヒドロカルビル部分でさらに置換されていてもよい。
【００９４】
「連結基」、「リンカー部分」等におけるような「連結する」または「リンカー」は、共有結合を介して２つの基を接続する二価のラジカル部分を意味する。このような連結基としては、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アリーレン、アルカリレン、アラルキレン、及びアミド官能基を含有する連結部分（以下に限定されないが、アミド（−ＮＨ−ＣＯ−）、ウレイレン（−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−）、イミド（−ＣＯ−ＮＨ−ＣＯ−）、エポキシ（−Ｏ−）、エピチオ（−Ｓ−）、エピジオキシ（−Ｏ−Ｏ−）、カルボニルジオキシ（−Ｏ−ＣＯ−Ｏ−）、アルキルジオキシ（−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−）、エポキシイミノ（−Ｏ−ＮＨ−）、エピミノ（−ＮＨ−）、カルボニル（−ＣＯ−）等を含む）が挙げられる。連結対象の基に対するリンカーの任意の好都合な配向及び／または接続が使用され得る。
【００９５】
「置換」という用語が、可能な置換対象基のリストの前にある場合、この用語がその基のあらゆるメンバーに適用されることが意図されている。例えば、「置換アルキル及びアリール」という表現は、「置換アルキル及び置換アリール」として解釈されるものとする。
【００９６】
ある特定の実施形態において、置換基は、化合物の光学異性及び／または立体異性に寄与し得る。化合物の塩、溶媒和物、水和物、及びプロドラッグ形態も対象となる。全てのこのような形態は、本開示に包含される。したがって、本明細書に記載の化合物には、その塩、溶媒和物、水和物、プロドラッグ、及び異性体形態（その薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、プロドラッグ、及び異性体を含む）が含まれる。ある特定の実施形態において、化合物は、薬学的に活性の誘導体に代謝され得る。
【００９７】
別段の指定がない限り、原子に対する言及は、その原子の同位体を含むことが意図されている。例えば、Ｈに対する言及は、１Ｈ、２Ｈ（すなわち、Ｄ）、及び３Ｈ（すなわち、Ｔ）を含むことが意図され、Ｃに対する言及は、１２Ｃ及び全ての炭素の同位体（例えば、１３Ｃ）を含むことが意図される。
【００９８】
使用方法
プロテアソーム発現に関与する転写因子経路の阻害により、原発性または転移性のがんを処置または低減するための方法が提供される。詳細には、Ｎ−グリカナーゼ１（ＮＧｌｙ１）の阻害のための組成物及びその使用方法が提供される。ＮＧｌｙ１の阻害は、プロテアソーム発現を低減する。ＮＧｌｙ１阻害剤は、単一薬剤として、またはプロテアソーム活性を直接的に阻害する薬剤と組み合わせて使用することができる。薬剤の組合せにより、がんの処置を受けている個体の全生存期間の増加がもたらされ得る。薬剤の組合せは、単一薬剤としての投与に比べて、がん細胞の殺滅における相乗的利益をもたらし得る。このような方法は、処置を必要としている対象に、化学療法薬、放射線療法等との追加の組合せを投与することを含む。
【００９９】
一部の実施形態において、ＮＧｌｙ１阻害剤は、本明細書に記載されているように、式Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩの構造を有する。：  一部の実施形態において、化合物はＮＧｌｙ１を阻害し、カスパーゼ活性を阻害しない。一部の実施形態において、阻害剤は、標的タンパク質のアスパラギン側鎖とＮ連結オリゴ糖との間のアミド連結におけるシステイン残基の求核性攻撃を阻害することにより、Ｎｇｌｙ１を機構的に阻害する。一部の実施形態において、ＮＧｌｙ１阻害剤及び薬学的に許容される賦形剤の薬学的製剤が提供される。一部の実施形態において、製剤は、標的細胞内のプロテアソーム発現を低減するのに有効な用量をもたらす単位用量製剤で提供される。
【０１００】
組成物
単体での、または有効用量の直接的プロテアソーム阻害剤と組み合わせたがんの処置向けのＮＧｌｙ１阻害剤の有効用量は、投与手段、標的部位、患者の生理的状態、患者がヒトであるか動物であるか、投与される他の薬剤、及び処置が予防的であるか治療的であるかを含めた多くの異なる因子に応じて変動する。通常、患者はヒトであるが、非ヒト哺乳類、例えば、イヌ、ネコ、ウマ等のような伴侶動物、ウサギ、マウス、ラット等のような実験動物なども処置され得る。処置の薬用量は、安全性及び効力を最適化するように滴定され得る。
【０１０１】
一部の実施形態において、各薬剤の治療薬用量は、約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．００１、約０．０１、約０．１ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇまで、約５０ｍｇ／ｋｇまで、約２５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇまでを範囲とすることができる。例示的な処置レジームは、１日に１回、２日に１回、３日に１回、１週間に１回、１ヵ月に２回、１ヵ月に１回等、さらにこれらの中間の回数の投与を提供し得る。本発明の治療的実体は、通常、複数の機会に投与される。単一の薬用量間の間隔は、約１日、１週間、１ヵ月、または１年であり得る。間隔は、患者における治療的実体の血中レベルの測定により指示されるように不規則であってもよい。代替的に、本発明の治療的実体は、持続放出製剤として投与されてもよく、この場合には、より低頻度の投与が必要である。薬用量及び頻度は、患者における薬剤の半減期に応じて変動する。
【０１０２】
予防的用途においては、比較的低い薬用量が、比較的低頻度の間隔にて長い時間期間にわたり投与され得る。一部の患者は、一生にわたり処置を受け続ける。他の治療用途においては、疾患の進行が低減または終止するまで、好ましくは、患者が疾患の症状の部分的または完全な寛解を示すまで、比較的高い薬用量が比較的短い間隔で必要となることがある。その後、患者は予防的レジームを投与され得る。
【０１０３】
さらに他の実施形態において、本発明の方法は、腫瘍の再成長、腫瘍の転移、またはがんの腫瘍浸潤を処置、低減、または防止することを含む。予防的用途に関しては、薬学的組成物または医薬は、疾患に対し感受性を有する、または別の点で疾患のリスクがある患者に、疾患（疾患の生化学的、組織学的、及び／または挙動的症状、疾患の発生中に提示される合併症及び介在する病理学的表現型を含む）のリスクを消去もしくは低減する、重症度を軽減する、または発症を遅延させるのに十分な量で投与される。
【０１０４】
がん処置のための組成物は、非経口的、局所的、静脈内、腫瘍内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、腹腔内、鼻腔内、または筋肉内の手段により投与され得る。典型的な投与経路は静脈内または腫瘍内であるが、他の経路も同様に有効であり得る。
【０１０５】
組成物は、溶液または懸濁液としての注射用液として調製することができ、注射前に液体ビヒクルに溶解または懸濁するのに適した固体形態も調製することができる。また、調製物は、上で論じたように、ポリラクチド、ポリグリコシド、またはアジュバント効果強化のためのコポリマーなどのリポソームまたは微粒子に乳化させることもカプセル化することもできる。Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７，１９９０  ａｎｄ  Ｈａｎｅｓ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２８：９７−１１９，１９９７。本発明の薬剤は、デポー注射またはインプラント調製物の形態で投与することができ、これらは活性成分の持続放出または拍動放出を可能にするような方法で製剤化され得る。概して医薬組成物は、無菌、実質的に等張で、米国食品医薬品局の全てのＧｏｏｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（ＧＭＰ）規定を完全に遵守するように製剤化される。
【０１０６】
「単離された」という用語は、材料が、材料の元の環境（例えば、材料が天然に存在する場合は自然環境）から取り出されることを意味する。例えば、生きている動物内に存在する天然存在のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、自然系内に共存する材料の一部または全てから分離した同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されている。このようなポリヌクレオチドはベクターの一部になり得、及び／またはこのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の一部になり得るが、このようなベクターまたは組成物がその自然環境の一部でないという点から、依然として単離されている。
【０１０７】
「薬学的に許容される賦形剤」とは、概して安全で、無毒性で、望ましい薬学的組成物を調製するのに有用な賦形剤を意味し、これには、ヒトの医薬使用に加えて獣医学的使用にも許容される賦形剤が含まれる。このような賦形剤は、固体、液体、半固体、またはエアロゾル組成物の場合には気体であり得る。
【０１０８】
「薬学的に許容される塩及びエステル」とは、薬学的に許容され、所望の薬理学的特性を有する塩及びエステルを意味する。このような塩としては、化合物中に存在する酸性プロトンが無機塩基または有機塩基と反応可能な場合に形成され得る塩が挙げられる。好適な無機塩としては、アルカリ金属（例えば、ナトリウム及びカリウム）、マグネシウム、カルシウム、及びアルミニウムと共に形成される塩が挙げられる。好適な有機塩としては、有機塩基、例えば、アミン塩基、例えば、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、Ｎメチルグルカミンなどと共に形成される塩が挙げられる。また、このような塩としては、無機酸（例えば、塩酸及び臭化水素酸）ならびに有機酸（例えば、酢酸、クエン酸、マレイン酸、ならびにアルカン及びアレーンスルホン酸、例えば、メタンスルホン酸及びベンゼンスルホン酸）と共に形成される酸付加塩も挙げられる。薬学的に許容されるエステルとしては、化合物中に存在するカルボキシ基、スルホニルオキシ基、及びホスホノオキシ基から形成されるエステル（例えば、Ｃ１−６アルキルエステル）が挙げられる。２つの酸性基が存在する場合、薬学的に許容される塩またはエステルは、モノ−酸−モノ−塩もしくはエステル、またはジ−塩もしくはエステルであり得る。同様に、３つ以上の酸性基が存在する場合、このような基の一部または全てが塩化またはエステル化され得る。本発明で命名されている化合物は、非塩化または非エステル化形態で存在しても、塩化及び／またはエステル化形態で存在してもよく、このような化合物の呼称は、元の（非塩化及び非エステル化）化合物ならびにその薬学的に許容される塩及びエステルの両方を含むように意図されている。また、本発明で命名されているある特定の化合物は、２つ以上の立体異性体形態で存在する可能性があり、このような化合物の呼称は、全ての個別の立体異性体及びこのような立体異性体の全ての混合物（ラセミでもそれ以外でも）を含むように意図されている。
【０１０９】
「薬学的に許容される」、「生理的に認容される」という用語及びこれらの文法的変形は、それらが組成物、担体、希釈剤、及び試薬を指す場合、互換的に使用され、材料が、組成物の投与を妨げる程度に望ましくない生理的影響をもたらすことなく、ヒトに対しまたはヒトにおいて投与可能であるということを表す。
【０１１０】
本明細書に記載の組み合わせた薬剤の毒性は、細胞培養または実験動物における標準的医薬手順、例えばＬＤ５０（個体群の５０％に対する致死用量）の測定またはＬＤ１００（個体群の１００％に対する致死用量）の測定によって決定することができる。毒性と治療効果との用量比率が治療指数である。この細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデータは、ヒトでの使用に毒性ではない薬用量範囲を製剤化するのに使用することができる。本明細書に記載のタンパク質の薬用量は、毒性がわずかであるか全くない有効用量を含む血中濃度の範囲内であることが好ましい。薬用量は、用いる剤形及び利用する投与経路に応じてこの範囲内で変動し得る。的確な製剤化、投与経路、及び投与量は、個々の医師が患者の状態を考慮して選択することができる。
【０１１１】
薬学的組成物は、投与方法に応じて様々な単位剤形で投与され得る。例えば、経口投与に好適な単位剤形としては、以下に限定されないが、粉末、錠剤、ピル、カプセル、及びロゼンジが挙げられる。本発明の組成物は、経口投与された場合、消化から保護されるべきであることが認識される。これは、典型的には、分子を組成物と複合化して酸性及び酵素的加水分解に対する耐性を持たせることにより、または適切な耐性を有する担体（例えば、リポソームまたは保護バリア）に分子をパッケージ化することにより遂行される。薬剤を消化から保護する手段は、当技術分野で周知されている。
【０１１２】
投与のための組成物は、共通して、薬学的に許容される担体、好ましくは水性担体に溶解した抗体または他の切除薬剤を含むことになる。様々な水性担体、例えば、緩衝食塩水などが使用され得る。これらの溶液は無菌であり、概して望ましくない物質を含まない。このような組成物は、従来的な周知の滅菌技法により滅菌され得る。組成物は、必要に応じて生理的条件に近づけるための薬学的に許容される補助物質、例えば、ｐＨ調整剤及び緩衝剤など、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどを含有してもよい。このような製剤における活性薬剤の濃度は幅広く変動する可能性があり、主に液体体積、粘度、体重などに基づいて、選択された特定の投与様式及び患者のニーズに従い選択されることになる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１５ｔｈ  ｅｄ．，１９８０）及びＧｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｌｍａｎ，Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｈａｒｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９６））。
【０１１３】
ＮＧｌｙ１阻害剤及び使用説明書を含むキットも、本発明の範囲内である。ＮＧｌｙ１阻害剤は、薬学的に許容される担体を含む単位用量製剤で提供され得る。キットはさらに、少なくとも１つの追加の試薬、例えば、有効用量の直接的プロテアソーム阻害剤等を含み得る。キットは、典型的には、キットの内容物の意図された使用を指示するラベルを含む。ラベルという用語は、キット上にもしくはキットと共に供給される、または別の形でキットに付随する、任意の記述または記録資料を含む。
【０１１４】
組成物は、治療的処置向けに投与され得る。組成物は、患者に対し、上記のように標的細胞を実質的に切除するのに十分な量で投与される。これを達成するのに妥当な量は「治療有効用量」として定義され、これは全生存率の改善をもたらし得る。組成物の単回または複数回投与は、患者が必要としかつ認容する薬用量及び頻度に応じて投与され得る。処置に必要な特定の用量は、哺乳類の医学的状態及び履歴、ならびに他の因子（例えば、年齢、体重、性別、投与経路、効率等）に依存することになる。
【実施例】
【０１１５】
実験
実施例１
プロテアソーム阻害剤の有効性における潜在的な制限が、転写因子である核因子赤血球系２様１（Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｆａｃｔｏｒ，Ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ  ２  Ｌｉｋｅ  １）（ＮＦＥ２Ｌ１、Ｎｒｆ１とも呼ばれる）の作用様式に見いだされている。Ｎｒｆ１は、「ｃａｐ’ｎ’ｃｏｌｌａｒ」ｂＺＩＰ転写因子ファミリーのメンバーであり、多くの重要な代謝経路（例えば、脂質及びアミノ酸代謝、抗酸化酵素のトランス活性化、骨形成、及びタンパク質恒常性の維持）における主要な制御物質である。重要なことには、Ｎｒｆ１は、プロテアソームサブユニット遺伝子発現の唯一の制御物質である。したがって、Ｎｒｆ１は、生存率及び細胞生存にとって不可欠である。
【０１１６】
Ｎｒｆ１に特有の特徴は、それ自体の複雑な制御である。転写因子には珍しく、Ｎｒｆ１は複数のＮ−グリコシル化部位を含有し、その活性化は、小胞体関連分解（ＥＲＡＤ）経路を介して進行する。ＥＲ内でミスフォールド及びＮ−グリコシル化されたタンパク質としてその一生を開始したＮｒｆ１は、ＥＲからサイトゾルにレトロ転座し、そこで、アスパルチルプロテアーゼＤＮＡ損傷誘導性１ホモログ２（ＤＤＩ２）により脱Ｎ−グリコシル化され部分的にタンパク質分解処理される。もはや活性ｐ１１０形態のＮｒｆ１は、核に転座しプロテアソームサブユニット遺伝子発現を活性化することができる。
【０１１７】
正常なタンパク質恒常性条件下では、Ｎｒｆ１は、ＶＣＰ／ｐ９７複合体を介したレトロ転座によって継続的にプロテアソーム分解の標的とされる。これによって、このタンパク質は基本条件下では低いレベルに維持される。しかし、プロテアソーム阻害剤による処置のようなプロテアソームが弱められた条件下では、脱Ｎ−グリコシル化されたＮｒｆ１が蓄積し、プロテアソームサブユニット遺伝子のトランス活性化を含めた核機能を発揮する。このようにして、Ｎｒｆ１は、タンパク質恒常性を維持するレベルにプロテアソームを保持する「バウンスバック」応答を媒介すると考えられている。この作用様式は、がん療法における小分子の有効なプロテアソーム阻害を打ち消す可能性がある。Ｎｒｆ１阻害は、小分子プロテアソーム阻害剤の有効性を顕著に改善すると考えられる。Ｎｒｆ１自体は、その複雑な処理及び定常的な分解のため、阻害剤にとって実行可能な標的ではない。しかし、Ｎｒｆ１の活性化経路の妨害は、がん処置向けにプロテアソーム阻害を増強するための有望なアプローチをもたらす。
【０１１８】
Ｎｒｆ１の脱Ｎ−グリコシル化は、その機能にとって重要である可能性がある。タンパク質配列の解析からは、両側が酸性ドメイン（ＡＤ１及び２）と隣接している、７つの潜在的Ｎ−グリコサイトを有するＮ−グリコシル化「ＮＳＴ」ドメインを含む複雑なドメインアーキテクチャーが示される。Ａｓｎから酸性Ａｓｐ残基への転換を同時に伴うＮＳＴドメインの脱グリコシル化は、転写活性化に必要な機能的なトランス活性化ドメイン（ＴＡＤ）を創出すると推測されている。実際に、Ｎｒｆ１の潜在的Ｎ−グリコサイトのＡｓｎからＡｓｐへの変異は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子コンストラクトを用いてその転写活性化能力を強化した。
【０１１９】
プロテアソーム阻害の際、Ｎｒｆ１活性化が１２０ＭＷ種から脱グリコシル化１１０ＭＷ種への処理を伴うという知見と合わせると、この所見からは、脱Ｎ−グリコシル化活性が最適なＮｒｆ１機能に必要であることが示唆される。
【０１２０】
サイトゾル内でＮ−グリカン除去を担う酵素は、Ｎ−グリカナーゼ１（ＮＧｌｙ１）である。本明細書では、ＮＧｌｙ１が、Ｎｒｆ１の処理に関与し、詳細にはＮｒｆ１の活性化にとって重要であることが示されている。ＮＧｌｙ１は小分子阻害剤にとっての強力な標的であり、小分子阻害剤は、Ｎｒｆ１のプロテアソームバウンスバック経路を分断することにより、Ｎｒｆ１の活性化を防止し、それによってプロテアソーム阻害剤に基づいたがん療法を増強することができる。ＮＧｌｙ１阻害剤及びプロテアソーム阻害剤の組合せにより、プロテアソーム阻害剤単体よりも有効な戦略ががん処置にもたらされる。
【０１２１】
結果及び考察：
発明者らは、ＮＧｌｙ１が、転写因子Ｎｒｆ１の処理及び活性化に中心的役割を果たしていることを提唱する。図１Ａは、酵素ＮＧｌｙ１による脱Ｎ−グリコシル化という必要なステップを含めた、提唱されるＮｒｆ１活性化経路を図示している。ＮＧｌｙ１の存在下及び不在下でＮｒｆ１を調べた。ＮＧｌｙ１−／−マウス（Ｔａｄａｓｈｉ  Ｓｕｚｕｋｉ，Ｒｉｋｅｎ，Ｊａｐａｎ）に由来するマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）をプロテアソーム阻害剤カルフィルゾミブ（図１Ｂ）で処置し、同等の条件下で処置した野生型ＭＥＦと比較した。免疫ブロット解析からは、カルフィルゾミブによる処置後に、ＮＧｌｙ１−／−細胞におけるＮｒｆ１の異常な処理が明らかになった（図１Ｃ）。
【０１２２】
第２の試みでは、Ｎｒｆ１過剰発現ＨＥＫ細胞を使用し、細胞をカルフィルゾミブで処置する前に小分子Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ（図１Ｂ）を適用してＮＧｌｙ１を阻害した。Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋはカスパーゼも阻害することが示されたため、対照分子として、ＮＧｌｙ１に作用しない強力なパンーカスパーゼ阻害剤Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈを使用した。Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋで処置した細胞は、特にカルフィルゾミブの存在下で、Ｎｒｆ１の異常な処理を示した。ｐ１２０バンドの存在量がより高いことは、Ｎ−グリコシル化形態のＮｒｆ１が、Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋで処置した細胞における主な種として存在することを示している。これに対し、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈで処置した細胞は、未処置細胞と比べて同様のＮｒｆ１の処理を示し、カルフィルゾミブとのインキュベート後の支配的な種は脱Ｎ−グリコシル化Ｎｒｆ１（ｐ１１０バンド）であった（図１Ｃ）。したがって、Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋで処置した細胞において観察されたＮｒｆ１の不正な処理は、ＮＧｌｙ１阻害から生じたものであり、カスパーゼ阻害から生じたものではない。両方の実験は、機能的なＮＧｌｙ１が、脱Ｎ−グリコシル化にとって、つまりＮｒｆ１の正しい処理にとって必要であることを明らかにするものである。
【０１２３】
ＮＧｌｙ１がＮｒｆ１の処理に関与することが分かった上で、脱Ｎ−グリコシル化が、転写因子の活性化にとって、つまりプロテアソームサブユニットの産生にとって必要であるかどうかを決定した。理論に従えば、核に転座しプロテアソーム遺伝子を活性化する活性形態（ｐ１１０）のＮｒｆ１は、Ｎ−グリカンが除去されると産生される。発明者らは、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイ（内部トランスフェクト対照としてウミシイタケルシフェラーゼ発現プラスミドを使用した）におけるホタルルシフェラーゼの発現を駆動するＳＶ４０プロモーターの上流に、ヒトＰＳＭＡ４遺伝子における３コピーの抗酸化剤応答配列（ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  ｒｅｓｐｏｎｄ  ｅｌｅｍｅｎｔ）（ＡＲＥ）が挿入されたコンストラクトを用いて、カルフィルゾミブによる処置後のＮＧｌｙ１−／−  ＭＥＦ及び野生型ＭＥＦにおけるレポーター活性を比較した。野生型細胞は、１２時間のカルフィルゾミブとのインキュベート後にＰＳＭ活性の増加を示したが、一方ＮＧｌｙ１−／−細胞は、プロテアソーム阻害剤処置に対する応答を示さなかった（図２Ａ）。
【０１２４】
発明者らは、ＮＧｌｙ１−／−細胞は活性形態のＮｒｆ１が欠如しており、従ってプロテアソーム阻害に対するバウンスバック反応に応答することができないと結論づけた。同じ実験を、カルフィルゾミブとのインキュベート前にＮＧｌｙ１をＺ−ＶＡＤ−ｆｍｋで阻害したＮｒｆ１過剰発現ＨＥＫ細胞において実施した。観察される効果がカスパーゼ阻害から生じることを除外するため、カスパーゼ阻害剤ＱＶＤ−ＯＰｈを対照として用いた。Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋと共にインキュベートした細胞のみがレポーター活性増加を示さなかった。これは、ＮＧｌｙが阻害されたため、これらの細胞内で活性Ｎｒｆ１が欠如していたことを示している（図２Ｂ）。
【０１２５】
発明者らは、さらに共焦点顕微鏡を使用して、カルフィルゾミブによる処置前及び処置後のＭＥＦ及びＮｒｆ１過剰発現ＨＥＫ細胞におけるＮｒｆ１の局在化を可視化した（図２Ｂ及びＣ）。カルフィルゾミブの不在下では、野生型及びＮＧｌｙ１−／−  ＭＥＦは、Ｎｒｆ１（白）を低存在量で、主にサイトゾル内で示した（図２Ｂ）。細胞をカルフィルゾミブで処置してから数時間後、野生型ＭＥＦは核内にＮｒｆ１を示したが、一方ＮＧｌｙ１−／−  ＭＥＦはより高い存在量のＮｒｆ１をサイトゾル内に示すのみである。Ｎｒｆ１過剰発現ＨＥＫ細胞においても同じ効果が観察された（図２Ｃ）が、これらの細胞におけるＮｒｆ１がより高存在量であったため、さらにより著しく観察された。未処置細胞は、主にＥＲ周辺のサイトゾル内でＮｒｆ１を示した。カルフィルゾミブとのインキュベート後は、Ｎｒｆ１の大部分が核内で観察された。カルフィルゾミブとのインキュベート前にＺ−ＶＡＤ−ｆｍｋで処置した細胞は、サイトゾル内に高存在量のＮｒｆ１を示した。対照分子ＱＶＤ−ＯＰｈとのインキュベートは、未処置細胞に同様の結果をもたらした。このことは、Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋで処置した細胞で観察された効果が、カスパーゼ阻害の結果ではなくＮＧｌｙ阻害の結果であることを確証するものである。これらの結果は、明らかにＮＧｌｙ１とＮｒｆ１との間の関連を示している。発明者らは、全ての結果を検討した上で、機能的ＮＧｌｙ１がＮｒｆ１の活性化に必要であることを結論づける。
【０１２６】
発明者らは、非機能的ＮＧｌｙ１を用いるとＮｒｆ１が不正に処理されるというエビデンスを伴い、ＮＧｌｙ１とプロテアソームとの関連を決定するように努めた。ＮＧｌｙ１の欠如が、プロテアソームサブユニット産生の主な制御物質である機能的Ｎｒｆ１が欠如するためにプロテアソーム阻害に対する感受性を増加させることを確証するため、漸増量のカルフィゾミブを用いてＭＥＦ  ＮＧｌｙ１−／−細胞をＭＥＦ野生型と比較した。２４時間のインキュベート後、ＮＧｌｙ１−／−細胞は、５〜１００ｎＭの範囲の用量のカルフィゾミブによる処置に対し、感受性が２倍以上となることが見いだされた。同じ効果を４時間時にも観察することができたが、程度はより小さいものであった。プロテアソームサブユニットバウンスバックの活性化のためのラグ時間は、およそ８時間かかることが示されており、より早い時点におけるＮＧｌｙ１  ＫＯの効果減少を説明するものと考えられる。
【０１２７】
少量のＮＧｌｙ１が正常な量と同じように細胞内で機能的である可能性を説明するため、Ｋ５６２細胞をｄＣＡＳ９と、Ｎｒｆ１、ＮＧｌｙ１、または対照配列に対応するｓｇＲＮＡとで処置し、次に漸増濃度のカルフィゾミブの存在下で生存を測定した（図３ｂ）。ｓｇＲＮＡなしまたは対照ｓｇＲＮＡでは、カルフィゾミブのＬＤ５０は４０ｎＭであることが見いだされた（図３ｃ）。Ｎｒｆ１またはＮＧｌｙ１のｄＣＡＳ９ノックダウン（ｓｇＮｒｆ１−Ａ、ｓｇＮｒｆ１−Ｂ、及びｓｇＮＧｌｙ１）においては、ＬＤ５０は各場合について約２倍〜２０ｎＭに有効に低くシフトした。このことは、ＮＧｌｙ１のノックダウンがＮｒｆ１のノックダウンと非常に類似する効果を有すること、及びこれらのタンパク質の正常な量が不足している細胞はプロテアソーム阻害に対しさらに弱いことを意味する。
【０１２８】
発明者らは、プロテアソーム阻害剤強化に対するＮＧｌｙ１  ＫＯまたはノックダウンの効果を考慮し、ＮＧｌｙ１の小分子阻害剤の使用を通じて同じ効果を見いだすことを期待した。Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋを使用して、多発性骨髄腫細胞株においてプロテアソーム阻害を強化する試みは不成功であった。これは、Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋの強力なパン−カスパーゼ阻害剤としての活性に起因する可能性がある。
【０１２９】
発明者らは、この問題に対応するため、新規のＮＧｌｙ１阻害剤を見いだすことに着手した。ＮＧｌｙ１の機構は、標的タンパク質のアスパラギン側鎖とＮ連結オリゴ糖との間のアミド連結におけるシステイン残基の求核性攻撃である。この機構は、カスパーゼのシステインプロテアーゼ特性と同様に、カスパーゼとＮＧｌｙ１との間のＺ−ＶＡＤ−ｆｍｋの求電子性フルオロメチルケトン基の交差反応性を説明する。発明者らは、この求核性の硫黄ベース機構が、システインプロテアーゼと反応するように設計された化合物の小さなライブラリーの標的化スクリーニングを実施するのに利用され得ると仮定した。
【０１３０】
使用したアッセイは、２０１１年にＣｒｅｓｓｗｅｌｌ  ｌａｂにより最初に説明された蛍光定量アッセイの修正バージョンであった。Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ  ｌａｂにより調製された、安定的にトランスフェクトされたＫ５６２細胞株を使用した。ミスフォールドしＮ−グリコシル化用部位を含有するように変異させた発現ｄｄＶｅｎｕｓは、ＮＧｌｙ１による脱グリコシル化及びグリコシル化アスパラギン残基からアスパラギン酸への同時転換が行われると、専ら適切にフォールドし、よって蛍光発光した（図４Ａ）。したがって、このアッセイにおいてＮＧｌｙ１の阻害は蛍光を活性化しなかった。この方法を用いて、約６００種のシステイン−プロテアーゼ阻害剤様化合物のライブラリーをスクリーニングした。６つのヒットが見いだされ、これらの全ては、ビニルスルホンまたはエポキシケトンからなる求電子性の弾頭（ｗａｒｈｅａｄ）を有するペプチド由来構造であった（図４Ｂ）。これらの化合物のストックを使用してＣｒｅｓｓｗｅｌｌアッセイでこれらの効力を検証したところ、化合物ＷＲＲ１３９が、蛍光を有効に低減することが見いだされる唯一の化合物であった（５．５μＭのＩＣ５０）（図４Ｃ）。比較のため、Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋは同じアッセイで４．４μＭのＩＣ５０を有することが見いだされた。
【０１３１】
ＷＲＲ１３９によるＮＧｌｙ１の直接的阻害を検出するため、組換えＮＧｌｙ１に曝露したＲＮＡアーゼＢの質量シフトをゲル電気泳動により観察した。ＮＧｌｙ１の存在下で、ＲＮＡアーゼＢは、ｐＸＸＸにおけるそのグリコシル化バンドをｐＸＸＸにおける脱グリコシル化タンパク質に完全に転換した（図４Ｅ）。Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋまたはＷＲＲ１３９の存在下では、元のバンドのみが残存し、脱グリコシル化形態への転換はなかった。
【０１３２】
発明者らはさらに、この分子が、既知のＮＧｌｙ１阻害剤Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋと同様にカスパーゼもヒットするかどうか確認することに関心を寄せた。ＷＲＲ１３９が、ＮＧｌｙ１を阻害する範囲においてカスパーゼ３／７も阻害しないことを確証するため、一連の濃度において、カスパーゼ３／７に対する阻害を試験した（図４ｄ）。カスパーゼ３／７の阻害は、約１０μＭの濃度に達するまで観察されなかった。加えて、相対的活性は、誘導アポトーシスにより観察された範囲を下回って低下しなかった。
【０１３３】
アポトーシスを阻害しなかった手元のＮＧｌｙ１阻害剤を用いて、小分子のＮＧｌｙ１阻害がＭＭ細胞株におけるプロテアソーム阻害を増強し得るかを試験した。Ｕ２６６及びＨ９２９細胞株において、ＷＲＲ１３９及びカルフィゾミブによる同時阻害は、カルフィゾミブ単体に比べて、２４時間後の細胞生存を顕著に減少させた（図５ａ及び５ｂ）。この生存の低減は、Ｕ２６６及びＨ９２９における殺滅の、それぞれ２．６倍及び２倍の増加に相当する（図５ｃ）。これらの結果は、ＮＧｌｙ１の阻害を介したＮｒｆ１不活性化がプロテアソーム阻害剤の有効性を増強することを実証するものである。興味深いことには、Ｕ２６６細胞株は、Ｈ９２９のような他のＭＭ株に比べて、プロテアソーム阻害に対し耐性を有する細胞株であると考えられている。プロテアソーム阻害に対し耐性を有すると考えられている細胞において組合せ処置の効力がより大きく増大すれば、有用な組合せ療法がもたらされる。
【０１３４】
要約すると、発明者らは、現在、ある特定のがんタイプ（例えば、多発性骨髄腫）の処置に適用されているプロテアソーム阻害剤の有効性を増強するための新たな道を検討した。発明者らは、プロテアソームサブユニットの主な制御物質、転写因子Ｎｒｆ１の不活性化が、小分子プロテアソーム阻害剤の効力を高め得ることを示した。Ｎｒｆ１自体は阻害剤の標的には不十分であるため、発明者らはＮｒｆ１の処理に関与する酵素、すなわちＮＧｌｙ１を阻害した。
【０１３５】
最初の実験では、Ｎｒｆ１の処理、活性化、及び局在化を検討し、発明者らは、ＮＧｌｙ１とＮｒｆ１との間のつながりを証明することができた。そして、発明者らは、この酵素の脱Ｎ−グリコシル化が活性形態のＮｒｆ１の産生に必要であることを示した。ＮＧｌｙ１が欠如した細胞が、プロテアソーム阻害剤に対し高い感受性を有すること、及び野生型細胞に比べてプロテアソーム遺伝子の活性化が低減されていることから、ＮＧｌｙ１とプロテアソームとの間のつながりと、それに応じた細胞における非機能的ＮＧｌｙ１とのバウンスバック反応低減とが明らかになった。これらの知見に基づき、発明者らは、ＮＧｌｙ１を阻害する分子を見いだすため、脱グリコシル化に対する活性を示すｄｄＶｅｎｕｓ蛍光アッセイを用いて、システイン−プロテアーゼ阻害剤様化合物のライブラリーをスキャンした。ビニルスルホンまたはエポキシケトンからなる求電子性の弾頭を有する６つのペプチド由来構造をヒット化合物として同定し、さらに検討を進めた。ＷＲＲ１３９は、Ｋ５６２細胞におけるＮＧｌｙ１阻害で最も高い効率を示し、ＩＣ５０は、既存のＮＧｌｙ１阻害剤Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ（さらにカスパーゼも阻害する）よりも高かった。ＷＲＲ１３９の存在下または不在下で精製組換え酵素に曝露したＲＮＡアーゼＢを用いたゲルシフトアッセイにより、ＮＧｌｙ１の阻害をさらに検証した。加えて、発明者らは、カスパーゼ３／７が、ＮＧｌｙ１の有効な阻害に必要なＷＲＲ１３９の濃度範囲内で阻害されないことを見いだした。カスパーゼは、顕著に高い濃度でヒットした。カスパーゼ阻害が細胞のアポトーシスを回避することを考慮すると、この結果は、Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋに比べてのＷＲＲ１３９の利益を明らかに示すものである。
【０１３６】
最後に、発明者らは、２つの多発性骨髄腫細胞株を使用して、発明者らのＮＧｌｙ１阻害剤ＷＲＲ１３９及びプロテアソーム阻害剤カルフィルゾミブの組合せが、プロテアソーム阻害単体に比べて有効性を増強し得るかどうか試験した。予備結果は、両方の化合物の同時阻害について、カルフィルゾミブ単体に比べて顕著に低減した細胞生存を示しており、発明者らの最初の理論を確証するものであった。興味深いことには、この戦略は、プロテアソーム阻害に対し耐性を有するＭＭ細胞株における成功も示した。発明者らは、発明者らのアプローチ及びここで論じた知見が、再発性の多発性骨髄腫及び他のがんタイプの処置に対する大きな潜在可能性を擁していると考えている。
【０１３７】
材料及び方法
細胞培養。ノックアウト動物に由来する、ＳＶ４０（Ｔａｄａｓｈｉ  Ｓｕｚｕｋｉ，ＲＩＫＥＮ，Ｊａｐａｎからの厚意ある寄贈）を用いて不死化した初代ＭＥＦを、１０％ウシ胎児血清（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ペニシリン、及びストレプトマイシン（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を追加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、５％  ＣＯ２中３７℃にて成長させた。
【０１３８】
Ｎｒｆ−３ｘＦｌａｇ過剰発現ＨＥＫ細胞（ＲＤＢ−２８６７；Ｓｅｎｔｈｉｌ  Ｒａｄｈａｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ  Ｃｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙからの厚意ある寄贈）は、ヒトＮｒｆ１コード領域をＣ末端３ｘＦｌａｇ配列と共にｐｃＤＮＡ３．１＋（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングすることにより得られた。細胞を、１０％ウシ胎児血清（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ペニシリン、及びストレプトマイシン（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を追加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、５％  ＣＯ２中３７℃にて成長させた。
【０１３９】
Ｋ５６２細胞を、１０％ウシ胎児血清（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ペニシリン、及びストレプトマイシン（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を追加したイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）中で、５％  ＣＯ２中３７℃にて成長させた。
【０１４０】
Ｕ２６６細胞を、１５％ウシ胎児血清（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ペニシリン、及びストレプトマイシン（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を追加したＲＰＭＩ−１６４０中で、５％  ＣＯ２中３７℃にて成長させた。
【０１４１】
Ｈ９２９細胞を、１０％ウシ胎児血清（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ペニシリン、及びストレプトマイシン（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、及び５０ｍＭのＢＭＥベータ−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）を追加したＲＰＭＩ−１６４０中で、５％  ＣＯ２中３７℃にて成長させた。
【０１４２】
免疫ブロット解析。細胞を、プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｐｉｅｒｃｅ）を追加したＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭトリス［ｐＨ７．４］、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  ＮＰ４０、１％  Ｎａ、デオキシコレート、０．１％  ＳＤＳ、及び１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に溶解した。Ｎｒｆ１検出のため、Ｎ末端に対し産生させたウサギモノクローナル抗体（Ｄ５Ｂ１０、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を使用した。他の免疫ブロットは、Ｆｌａｇタグに特異的な抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及びβアクチンに特異的な抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を用いて実施した。
【０１４３】
ルシフェラーゼアッセイ。コンストラクト３ｘＰＳＭＡ４−ＡＲＥ−Ｌｕｃ（ＲＤＢ−２４１５；Ｓｅｎｔｈｉｌ  Ｒａｄｈａｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ  Ｃｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙからの厚意ある寄贈）は、以前に説明されている。簡潔に述べると、ヒトＰＳＭＡ４遺伝子の第１のイントロンに由来する３コピーの推定ＡＲＥ（大文字で示されている）を含有するオリゴ（５’−ｃｇａｇｃｃｇｔｇｇｇｃａｃｇａ  ＴＧＡＣＴＣＴＧＣＡ  ｃｃｇｃｃｔｃｃｔｃｔｇａｇｃｃｇｔｇｇｇｃａｃｇａ  ＴＧＡＣＴＣＴＧＣＡ  ｃｃｇｃｃｔｃｃｔｃｔｇａｇｃｃｇｔｇｇｇｃａｃｇａ  ＴＧＡＣＴＣＴＧＣＡ  ｃｃｇｃｃｔｃｃｔｃｔｇ−３’）を、対応する逆相補オリゴにアニーリングし、ｐＧＬ３−プロモーターベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングした。このコンストラクトを、ホタルルシフェラーゼの発現を駆動する最小ＳＶ４０プロモーターの上流に挿入することにより、プロモーターレポーターを生成した。
【０１４４】
細胞に、ホタル（プロモーターレポーター）及びウミシイタケルシフェラーゼ（ｐＲＬ−ＴＫ；Ｐｒｏｍｅｇａ）コンストラクトを、必要に応じてエフェクタープラスミドと共に一過的にトランスフェクトした。細胞を化合物またはビヒクルコントロールで１２時間処置した。その後、細胞を溶解し、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（Ｅ１９１０；Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、製造業者の指示に従いルシフェラーゼアッセイを実施した。全ての実験について、ホタルルシフェラーゼ活性は、ウミシイタケルシフェラーゼ活性を基準に正規化した。
【０１４５】
細胞生存率アッセイ。細胞を、９６ウェルプレート内において、１〜１００μｇ／ｍｌの範囲の濃度におけるプロテアソーム阻害剤を用いて、それぞれ４時間または２４時間処置した。ＷＳＴ−１試薬をＲｏｃｈｅ（Ｇｅｒｍａｒｙ）から取得し、製造業者の指示に従い使用した。Ｓｐｅｃｔｒａ  ｍａｘ（登録商標）ｉ３ｘ（ＶＷＲ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）プレートリーダーを用いて、４５０ｎｍにおける吸光度を測定することにより、リードアウトを実施した。
【０１４６】
免疫蛍光法及びその後の共焦点イメージング。ＭＥＦ及びＮｒｆ−３ｘＦｌａｇ過剰発現ＨＥＫ細胞をカバーガラス上で８０％コンフルエンシーに成長させた。細胞を、示されるようにＮＧＬｙ１阻害剤、カスパーゼ阻害剤、及びプロテアソーム阻害剤で処置し、新鮮培地中で１時間回復させてから、１００％氷冷メタノールを用いて細胞を固定した。細胞を、Ｎｒｆ１のＮ末端に対し産生させた一次ウサギモノクローナル抗体（Ｄ５Ｂ１０、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）及び二次ポリクローナルＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７  ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆａｂ断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で処置した。ＰＢＳで洗浄後、カバーガラスを、核ＤＮＡ染色のために４９，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を含有するＰｒｏＬｏｎｇ（登録商標）Ｄｉａｍｏｎｄ  Ａｎｔｉｆａｄｅ  Ｍｏｕｎｔａｎｔ（Ｐ３６９７，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ）で処置し、スライドガラス上に置いて一晩乾燥した。その後、Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｔｉ及び６０ｘ拡大率を用いた共焦点イメージングにより、Ｎｒｆ１の細胞内位置（遠赤色チャネル）を調べた。Ｉｍａｒｉｓ解析ソフトウェア（バージョン）を用いて画像を解析した。Ｂａｒ＝１０ｍｍ。
【０１４７】
Ｃｒｅｓｓｗｅｌｌアッセイによる約６００種化合物のスクリーニング。透明Ｖ底９６ウェルプレートでスクリーニングを実施した。プレートを、陰性対照２μＬ  ＤＭＳＯ（Ａ１）及び陽性対照１μＬ  ＤＭＳＯ＋１μＬ  ＤＭＳＯ＋１μＬ  １０ｍＭ  Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ（最終濃度１００ｕＭ  Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ；Ａ１２〜Ｈ１２）で調製した。ウェルＡ２〜Ａ１１は１μＬ  ＤＭＳＯを含有し、残りのウェルはライブラリーからの化合物の１ｍＭストックを１μＬ含有した。
【０１４８】
１００μＬの懸濁Ｋ５６２  ｄｄＶｅｎｕｓ細胞を１ｘ１０＾６細胞／ｍＬにてプレートに添加した。ウェルＡ１〜Ａ１２は、成長培地中の細胞を含有した。残りのウェルは、１００ｕＭカルフィゾミブを追加した成長培地中の細胞を含有した。
【０１４９】
プレートを３７℃、５％  ＣＯ２にて６時間インキュベートし、次に（装置詳細）を用いた自動化フローサイトメトリーにより、５０ｕＬにおけるカットオフ及び５０，０００事象で解析した。ＦＬ１における蛍光の平均値を各ウェルについてプロットした。
【０１５０】
陽性対照（最大の蛍光）を３標準偏差下回る蛍光減少を示したウェルをヒットと同定した。アッセイのＺ因子は０．３８〜０．８５の範囲であった。
【０１５１】
プロテアソーム阻害剤による細胞生存。Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  ２．０アッセイを用いた細胞生存アッセイを、乳白色平底９６ウェルプレートにおいて実施した。細胞（１００μＬ新鮮培地中１．０〜２．０×１０４個）を所望の条件下で処置し、１００μＬアッセイ試薬を添加する前に２４または４８時間インキュベートした。ビヒクル処置細胞と比べたシグナルパーセントとして生存率を計算した。回帰分析及びＩＣ５０計算をＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ７．０を用いて実施した。
【０１５２】
Ｕ２６６及びＨ９２９：Ｕ２６６及びＨ９２９細胞を、１０万細胞／ｍＬの密度でＲＰＭＩ培地（ウェル当たり１００μＬ）に播種した。翌日、カルフィゾミブ、ＤＭＳＯ、またはＷＲＲ１３９をＤＭＳＯに添加して、１％  ＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）の最大最終濃度に対し示される最終濃度にした。３７℃、５％  ＣＯ２における４８時間のインキュベート後、プレートを回収し、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  ２．０アッセイで処置した。１０分のインキュベート後、Ｓｐｅｃｔｒａ  ｍａｘ（登録商標）ｉ３ｘ（ＶＷＲ，  Ａｕｓｔｒａｌｉａ）プレートリーダーを用いて蛍光を測定することにより、プレートを解析した。
【０１５３】
Ｋ５６２：Ｋ５６２細胞（野生型またはＮＧＬＹ１−／−）を、２０万細胞／ｍＬの密度でＲＰＭＩ培地（ウェル当たり１００μＬ）に播種した。翌日、カルフィゾミブまたはＤＭＳＯを添加して、０．２％  ＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）の最大最終濃度に対し示される最終濃度にした。３７℃、５％  ＣＯ２における２４時間のインキュベート後、プレートを回収し、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  ２．０アッセイで処置した。１０分のインキュベート後、Ｓｐｅｃｔｒａ  ｍａｘ（登録商標）ｉ３ｘ（ＶＷＲ，  Ａｕｓｔｒａｌｉａ）プレートリーダーを用いて蛍光を測定することにより、プレートを解析した。
【０１５４】
カスパーゼ３／７阻害アッセイ。１００万個のＵ２６６細胞を１０ｍＬ  ＲＰＭＩ  １５％  ＢＳＡ＋ＰＳに懸濁させ、平底白壁９６ウェルプレート（ウェル当たり１００μＬ）にプレーティングした。プレートを３７℃にて一晩インキュベートした。翌日、細胞を、スタウロスポリン（アポトーシス誘導物質、最終濃度１μＭ）、ＷＲＲ１３９もしくはＺ−ＶＡＤ−ｆｍｋ（示されている最終濃度）、ＤＭＳＯを２％  ＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）の最終濃度にしたもので、それぞれ処置した。プレートを３７℃にて８時間インキュベートした。Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏキット試薬（会社詳細）を製造業者の指示に従って調製し、２３℃に平衡化した後、１００ｍｌの試薬を各ウェルに添加した。プレートを室温にて６０分間インキュベートし、その次にＳｐｅｃｔｒａ  ｍａｘ（登録商標）ｉ３ｘ（ＶＷＲ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）プレートリーダーを用いて蛍光を測定することにより、プレートを解析した。バックグラウンド（細胞を含有しない培地からのシグナル）を差し引き、アポトーシス誘導を伴った細胞（スタウロスポリンのみ）からのシグナルと比較することにより、カスパーゼ阻害を計算した。
【０１５５】
ＣＲＩＳＰＲｉ媒介ノックダウンｋ５６２細胞株の生成：ｄＣａｓ９−ＫＲＡＢ１を安定的に発現するＣＲＩＳＰＲｉ  Ｋ５６２細胞株及び第３世代レンチウイルスシステムをＪｏｎａｔｈａｎ  Ｗｅｉｓｓｍａｎ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）のグループから取得した。ＣＲＩＳＰＲｉベースのノックダウンｋ５６２細胞株の生成を、公表されている手順に従って実行した。最初に、Ｈｏｒｌｂｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．により報告された最も高い予測ＣＲＩＳＰＲｉ活性スコアを有するプロトスペーサー配列を、以前説明されたｓｇＲＮＡ発現レンチウイルストランスファープラスミドにクローニングした。酵母ＧＡＬ４−ＵＡＳを標的とするｓｇＲＮＡコンストラクトを、以前説明されたように陰性対照として使用した。第３世代レンチウイルスプラスミドシステムを用いて、レンチウイルスをＨＥＫ２９３Ｔ細胞内で生成した。
【０１５６】
レンチウイルス感染については、最初にＫ５６２細胞を１０万／ｍｌの密度で２４ウェルプレートに播種し一晩置いた。翌日、個別のｓｇＲＮＡベクターを保有するレンチウイルスを各ウェルに添加した。プレートを１，０００ｘｇ及び３３℃にて３０分間遠心処理し、次に正常な細胞培養インキュベート条件に戻した。感染から２日後、ピューロマイシンを添加して１．２５μｇ／ｍｌの最終濃度にし、セレクションを４日間継続した。次に、ｓｇＲＮＡ形質導入細胞に対し実施される全ての実験を、ピューロマイシンセレクションから１０継代以下で実行した。
【０１５７】
遺伝子ノックダウンのレベルを決定するため、各Ｋ５６２細胞株から２０万個の細胞を収集し、Ｑｕｉｃｋ−ＲＮＡ（商標）ＭｉｃｒｏＰｒｅｐキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＣＡ，ＵＳＡ）により製造業者の指示に従いＲＮＡを抽出した。Ｏｌｉｇｏ  ｄ（Ｔ）２３  ＶＮプライマーを追加したＰｒｏｔｏＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ第１ストランドｃＤＮＡ合成キット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて、製造業者の指示に従い、２００ｎｇの抽出ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写させた。ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、製造業者の指示に従い、定量的ＰＣＲ反応物を調製した。ＣＦＸ９６  Ｔｏｕｃｈ（商標）リアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）でＰＣＲ反応を実行した。
【０１５８】
各ｓｇＲＮＡコンストラクトのプロトスペーサー配列：
ＮＦＥ２Ｌ１（Ｎｒｆ１）：５’−ＧＡＡＧＣＴＣＣＧＧＣＧＣＣＧＡＧＡＧＴ−３’（配列番号１）
ＮＧＬＹ１：５’−ＧＴＧＡＧＧＣＧＣＣＴＧＣＴＣＡＧＴＧＴ−３’（配列番号２）
ＧＡＬ４−４：５’−ＧＡＡＣＧＡＣＴＡＧＴＴＡＧＧＣＧＴＧＴＡ−３’（配列番号３）
定量的ＰＣＲのプライマー配列：
ＧＡＰＤＨ：
ＦＷ：５’−ＧＧＴＧＧＴＣＴＣＣＴＣＴＧＡＣＴＴＣＡＡＣＡ−３’（配列番号４）
ＲＶ：５’−ＧＴＴＧＣＴＧＴＡＧＣＣＡＡＡＴＴＣＧＴＴＧＴ３’（配列番号５）
ＮＦＥ２Ｌ１：
ＦＷ：５’−ＡＧＴＧＧＣＡＡＧＡＴＣＴＣＡＴＧＴＣＣ−３’（配列番号６）
ＲＶ：５’−ＧＣＴＧＡＡＧＡＧＴＡＡＧＡＡＧＴＣＣＴＧＧ−３’（配列番号７）
ＮＧＬＹ１：
ＦＷ：５’−ＡＡＴＡＴＣＴＧＧＧＴＣＡＧＴＧＧＣＴＴＧ−３’（配列番号８）
ＲＶ：５’−ＣＡＴＴＴＴＣＣＡＣＡＣＧＣＣＡＴＴＣＴＣ−３’（配列番号９）
【０１５９】
ＣＲＩＳＰＲｉノックダウンｋ５６２細胞株のカルフィゾミブ感受性。１０ｍＭの濃度でＤＭＳＯに溶解したカルフィルゾミブを、新たに、または−８０℃にて凍結融解サイクルの反復なしで１ヵ月以下の間保管したものを使用した。Ｋ５６２細胞を、処置の１８時間前に、２０万細胞／ｍｌの密度で、９６ウェルプレートの各ウェル内の１００μｌのＲＰＭＩ培地に播種した。翌日、各ウェルにおいて０．１％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯの最終濃度で、系列希釈したカルフィルゾミブまたはＤＭＳＯを細胞に添加した。３７℃における４８時間のインキュベート後、プレートを回収し、製造業者の指示に従い、カルセインベースのＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）生存率／細胞毒性キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色した。次に、Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６サイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）上で細胞を計数した。合計１０，０００イベントを各ウェルについて収集した。生存率は、各カルフィルゾミブ処置試料におけるカルセイン陽性細胞のパーセントとして計算し、ＤＭＳＯ処置ビヒクル対照のものを基準に正規化した。
【０１６０】
合成
化合物２：
【化７】
2020505470.tif 000008
実験：Ｂｏｃ−ホモフェニルアラニン１（５００ｍｇ、１．７８ｍｍｏｌ）を８ｍＬ  ＤＭＦに溶解した。この溶液に、ＨＡＴＵ（７４１ｍｇ、３．５６ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（９２９μＬ、５．３４ｍｍｏｌ）を連続して添加した。得られた混合物を３０分間撹拌し、その後にイソペンチルアミン（４１２μＬ、３．５６ｍｍｏｌ）を添加した。溶液はすぐに黄色に変わった。混合物を１４時間撹拌した。混合物をＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ）で希釈し、水（２ｘ２０ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ３（２ｘ２０ｍＬ）、及びブライン（２０ｍＬ）で洗浄した。有機層を収集し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過した。透明な黄色の溶液を減圧下で濃縮し、黄色の残渣をカラムクロマトグラフィー（２：１  ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）により精製した。生成物２を、透明な無色の泡沫として単離した（３６５ｍｇ、５８％収率）。１Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， クロロホルム−ｄ） δ ７．３０ − ７．１２ （ｍ， ６Ｈ）， ６．７８ （ｓ， １Ｈ）， ５．５９ （ｄ， Ｊ ＝ ７．９ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．２６ − ４．１４ （ｍ， １Ｈ）， ３．２２ （ｓ， ２Ｈ）， ２．７４ − ２．６２ （ｍ， ２Ｈ）， ２．０１ − １．９０ （ｍ， １Ｈ）， １．６２ （ｄｔ， Ｊ ＝ １３．２， ６．７ Ｈｚ， １Ｈ）， １．４７ （ｓ， １４Ｈ）， １．１２ （ｓ， １Ｈ）， ０．９１ （ｄ， Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ， ６Ｈ）． １３Ｃ ＮＭＲ （１２６ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ １７２．１８， １５６．１０， １４１．３６， １２８．７０， １２８．６２， １２６．２９， ８０．１０， ７７．６３， ７７．３７， ７７．１２， ５４．４２， ３８．６１， ３８．０１， ３４．６７， ３２．１８， ２８．６１， ２６．０２， ２２．７２， ２２．６７． ＨＲＭＳ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ： 計算値．Ｒｆ： ０．４７ （２：１ ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）．
【０１６１】
化合物３：
【化８】
2020505470.tif 000009
実験：化合物２（３６０ｍｇ、１．０３ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１０ｍＬ）に撹拌しながら溶解し、ＴＦＡ（１０ｍＬ）を溶液に添加した。ＴＬＣ（２：１  ヘキサン／ＥｔＯＡｃ、約２０分）により出発材料が完全に消失するまで混合物を撹拌した。減圧下で溶媒を除去し、残渣をＤＣＭ（２０ｍＬ）に溶解し、飽和ＮａＨＣＯ３（３ｘ１５ｍＬ）で洗浄した。合わせた水層をＤＣＭ（２ｘ２０ｍＬ）で逆抽出した。合わせた有機層をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。得られた黄色の油を化合物３とし、さらなる精製なしにこれを使用した（２４７．９ｍｇ、９７％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， クロロホルム−ｄ） δ ７．２９ （ｄ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．２４ − ７．１３ （ｍ， ４Ｈ）， ３．３７ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．４， ３．９ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．２７ （ｑ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．７８ − ２．６７ （ｍ， ２Ｈ）， ２．２６ − ２．１３ （ｍ， １Ｈ）， １．８８ − １．７５ （ｍ， １Ｈ）， １．６０ （ｓ， ４Ｈ）， １．４０ （ｑ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， ０．９２ （ｄ， Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ， ６Ｈ）．
【０１６２】
化合物４：
【化９】
2020505470.tif 000010
実験：化合物３（５０ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２．０ｍＬ）に溶解し、これにアクリル酸（１３．７μＬ、０．２０ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（１０４μＬ、０．６０ｍｍｏｌ）を撹拌しながら添加した。混合物を０℃に冷却し、ＣＯＭＵ（８６ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）を添加した。フラスコをＮ２でバックフィルし、１時間撹拌した。この時点で混合物を室温に温め、さらに３時間撹拌した。混合物をＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）で希釈し、１Ｎ  ＨＣｌ（１０ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ３（２ｘ１０ｍＬ）、及びブライン（１０ｍＬ）で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、溶媒を減圧下で除去した。黄色の残渣をカラムクロマトグラフィー（２：１→３：２→１：１  ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）により精製した。生成物４を、白色の粉末として単離した（３４．３ｍｇ、５７％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， クロロホルム−ｄ） δ ７．２３ （ｄｄ， Ｊ ＝ １３．５， ６．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．１４ （ｄｄ， Ｊ ＝ １９．９， ６．８ Ｈｚ， ４Ｈ）， ６．８５ （ｄ， Ｊ ＝ ４．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．３２ − ６．１１ （ｍ， ２Ｈ）， ５．６４ （ｄ， Ｊ ＝ ９．９ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．６３ （ｑ， Ｊ ＝ ７．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．３４ − ３．２６ （ｍ， １Ｈ）， ３．１９ （ｄｔ， Ｊ ＝ １３．１， ６．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．６７ （ｔ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．１６ （ｄｑ， Ｊ ＝ １４．６， ８．１ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．０４ （ｄｔ， Ｊ ＝ １３．９， ７．２ Ｈｚ， １Ｈ）， １．６０ （ｄｔ， Ｊ ＝ １３．２， ６．８ Ｈｚ， １Ｈ）， １．３９ （ｑ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ０．８９ （ｄ， Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ， ５Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ （１０１ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ １７１．７３， １６５．７５， １４１．２０， １３０．７８， １２８．７０， １２８．５８， １２７．１１， １２６．３０， ７７．５９， ７７．２７， ７６．９５， ５３．２９， ３８．４８， ３８．１６， ３４．６０， ３２．１１， ２６．０５， ２２．７０， ２２．６１．ＨＲＭＳ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ： 計算値．Ｒｆ： ０．４ （１：１ ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）．
【０１６３】
ＷＲＲ１３９：
【化１０】
2020505470.tif 000011
実験：
添加：Ｎ−クロロスクシンイミド（３２．３ｍｇ、０．２４２ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（３ｍＬ）に溶解し、ｐ−メチルベンゼンチオール（２８．６ｍｇ、０．２３１ｍｍｏｌ）を撹拌しながらゆっくり添加した。溶液はオレンジ色になり、沈殿物が形成された。混合物を３０分間撹拌した。化合物４を別途ＤＣＭ（０．２５ｍＬ）に溶解し、ゆっくり添加した。反応混合物を１４時間撹拌し、次にＤＣＭ（１０ｍＬ）で希釈し、水（１０ｍＬ）で、そして最後にブライン（１０ｍＬ）で洗浄した。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。この粗製残渣を、さらなる精製なしに次のステップで使用した。
【０１６４】
酸化：添加から得られた粗製残渣をＤＣＭ（４ｍＬ）に溶解し、溶液を０℃に冷却した。ｍＣＰＢＡ（１１３ｍｇ、０．５０８ｍｍｏｌ）をゆっくり添加し、反応物を室温に温め撹拌した。反応をＴＬＣによりモニターし（この変換中、中間体のスルホキシドが非常に極性で見られ得る）、１時間後、転換が不完全だったため第２の等価物のｍＣＰＢＡ（１１３ｍｇ、０．５０８ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を１時間撹拌した後に、飽和チオ硫酸ナトリウム（５ｍＬ）でクエンチした。混合物をＤＣＭ（１０ｍＬ）で希釈し、有機層を分離し、飽和ＮａＨＣＯ３（１０ｍＬ）及びブライン（１０ｍＬ）で洗浄した。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。高真空下で十分に乾燥した後、チャンク状の白色の残渣を精製なしに次のステップで使用した。
【０１６５】
脱離：酸化からの粗製残渣をＤＣＭ（３．２ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却した。この溶液にＤＢＵ（５０μＬ、０．３３ｍｍｏｌ）を滴下添加し、混合物を室温に温めた。１５分間撹拌した後、混合物をＤＣＭ（１０ｍＬ）で希釈し、１Ｎ  ＨＣｌ（１０ｍＬ）、水（１０ｍＬ）、及び最後にブライン（１０ｍＬ）で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。得られた粗製材料をＢｉｏｔａｇｅ  Ｉｓｏｌｅｒａ  Ｐｒｉｍｅを用いて２つのカラムで精製した（ＳｉＯ２、１０−８０％  ヘキサン中ＥｔＯＡｃ、次に０−８％  ＤＣＭ中ＭｅＯＨ）。白色の残渣（８．９ｍｇ、３ステップかけて８．４％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， クロロホルム−ｄ） δ ７．７７ （ｄｔ， Ｊ ＝ ８．３， １．９ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．６１ − ７．４８ （ｍ， １Ｈ）， ７．３７ − ７．２８ （ｍ， ３Ｈ）， ７．２８ − ７．２０ （ｍ， ２Ｈ）， ７．１７ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．１， ４．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．１０ （ｄ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．０２ （ｄｔ， Ｊ ＝ １４．７， ２．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．１５ （ｄ， Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．５０ （ｑ， Ｊ ＝ ７．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．２７ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ ４０．４， １３．６， ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．６４ （ｓ， ２Ｈ）， ２．４３ （ｓ， ３Ｈ）， ２．１５ （ｄｄ， Ｊ ＝ １４．２， ７．１ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．００ （ｄｑ， Ｊ ＝ １４．７， ７．４ Ｈｚ， １Ｈ）， １．５７ （ｄｑ， Ｊ ＝ １３．５， ６．７ Ｈｚ， １Ｈ）， １．４３ − １．３２ （ｍ， ２Ｈ）， ０．８８ （ｄｄ， Ｊ ＝ ６．５， １．８ Ｈｚ， ６Ｈ）． １３Ｃ ＮＭＲ （１２６ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ １７１．１６， １６２．５１， １４５．５４， １４１．０５， １４０．６５， １３６．０３， １３３．６７， １３３．１８， １３０．３７， １３０．０６， １２８．８３， １２８．６９， １２８．５７， １２８．５５， １２６．５２， ７７．５４， ７７．２８， ７７．０３， ５３．６１， ３８．４０， ３８．３４， ３４．４３， ３２．０２， ２６．０３， ２２．６８， ２２．６１， ２１．９６． ＨＲＭＳ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ： 計算値．Ｒｆ ０．３２ （ＤＣＭ中３％ ＭｅＯＨ）．
参考文献：
（１）Ｊｅｍａｌ，Ａ．，Ｓｉｅｇｅｌ，Ｒ．，Ｗａｒｄ，Ｅ．，Ｍｕｒｒａｙ，Ｔ．，Ｘｕ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｔｈｕｎ，Ｍ．Ｊ．（２００７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，２００７．ＣＡ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．Ｃｌｉｎ．５７，４３−６６．
（２）Ｏｂｅｎｇ，Ｅ．Ａ．，Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｌ．Ｍ．，Ｇｕｔｍａｎ，Ｄ．Ｍ．，Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ｗ．Ｊ．，Ｌｅｅ，Ｋ．Ｐ．，ａｎｄ  Ｂｏｉｓｅ，Ｌ．Ｈ．（２００６）Ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｉｎｄｕｃｅ  ａ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｕｎｆｏｌｄｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ  １０７，４９０７−４９１６．
（３）Ｋｕｍａｒ，Ｓ．Ｋ．，Ｒａｊｋｕｍａｒ，Ｓ．Ｖ．，Ｄｉｓｐｅｎｚｉｅｒｉ，Ａ．，Ｌａｃｙ，Ｍ．Ｑ．，Ｈａｙｍａｎ，Ｓ．Ｒ．，Ｂｕａｄｉ，Ｆ．Ｋ．，Ｚｅｌｄｅｎｒｕｓｔ，Ｓ．Ｒ．，Ｄｉｎｇｌｉ，Ｄ．，Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｓ．Ｊ．，Ｌｕｓｔ，Ｊ．Ａ．，Ｇｒｅｉｐｐ，Ｐ．Ｒ．，Ｋｙｌｅ，Ｒ．Ａ．，ａｎｄ  Ｇｅｒｔｚ，Ｍ．Ａ．（２００８）Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ．Ｂｌｏｏｄ  １１１，２５１６  ＬＰ−２５２０．
（４）Ｍｏｒｅａｕ，Ｐ．，Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｐ．Ｇ．，Ｃａｖｏ，Ｍ．，Ｏｒｌｏｗｓｋｉ，Ｒ．Ｚ．，Ｓａｎ  Ｍｉｇｕｅｌ，Ｊ．Ｆ．，Ｐａｌｕｍｂｏ，Ａ．，ａｎｄ  Ｈａｒｏｕｓｓｅａｕ，Ｊ．−Ｌ．（２０１２）Ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ：  １０  ｙｅａｒｓ  ｌａｔｅｒ．Ｂｌｏｏｄ  １２０，９４７  ＬＰ−９５９．
（５）Ｃｉｅｃｈａｎｏｖｅｒ，Ａ．（１９９４）Ｔｈｅ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｐａｔｈｗａｙ．Ｃｅｌｌ  ７９，１３−２１．
（６）Ａｄａｍｓ，Ｊ．（２００３）Ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ：  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ．Ｒｅｖ．２９，３−９．
（７）Ｃｉｅｃｈａｎｏｖｅｒ，Ａ．（１９９８）Ｔｈｅ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  ｐａｔｈｗａｙ：  ｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｅａｔｈ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｌｉｆｅ．ＥＭＢＯ  Ｊ．１７，７１５１  ＬＰ−７１６０．
（８）Ｄｏｕ，Ｑ．Ｐ．，ａｎｄ  Ｌｉ，Ｂ．（２０１６）Ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ａｓ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｎｏｖｅｌ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ａｇｅｎｔｓ．Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔ．Ｕｐｄａｔ．２，２１５−２２３．
（９）Ａｄａｍｓ，Ｊ．（２００４）Ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ：  ａ  ｓｕｉｔａｂｌｅ  ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ４，３４９−３６０．
（１０）Ｄｏｕ，Ｑ．Ｐ．，ａｎｄ  Ｚｏｎｄｅｒ，Ｊ．Ａ．（２０１４）Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−Ｂａｓｅｄ  Ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ：  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｏｎ  Ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ  ａｎｄ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｖｅｒｓｕｓ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−Ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ．Ｃｕｒｒ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  １４，５１７−５３６．
（１１）Ｈｉｄｅｓｈｉｍａ，Ｔ．，Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｐ．，Ｃｈａｕｈａｎ，Ｄ．，Ｐａｌｏｍｂｅｌｌａ，Ｖ．Ｊ．，Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｐ．Ｊ．，Ａｄａｍｓ，Ｊ．，ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｋ．Ｃ．（２００１）Ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＰＳ−３４１  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｇｒｏｗｔｈ，ｉｎｄｕｃｅｓ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，ａｎｄ  ｏｖｅｒｃｏｍｅｓ  ｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ  ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６１．
（１２）Ｈｉｄｅｓｈｉｍａ，Ｔ．，Ｃｈａｕｈａｎ，Ｄ．，Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｐ．，Ｍｉｔｓｉａｄｅｓ，Ｃ．，Ｍｉｔｓｉａｄｅｓ，Ｎ．，Ｈａｙａｓｈｉ，Ｔ．，Ｍｕｎｓｈｉ，Ｎ．，Ｄａｎｇ，Ｌ．，Ｃａｓｔｒｏ，Ａ．，Ｐａｌｏｍｂｅｌｌａ，Ｖ．，Ａｄａｍｓ，Ｊ．，ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｋ．Ｃ．（２００２）ＮＦ−ｋａｐｐａ  Ｂ  ａｓ  ａ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７．
（１３）Ｈｉｄｅｓｈｉｍａ，Ｔ．，Ｃｈａｕｈａｎ，Ｄ．，Ｈａｙａｓｈｉ，Ｔ．，Ａｋｉｙａｍａ，Ｍ．，Ｍｉｔｓｉａｄｅｓ，Ｎ．，Ｍｉｔｓｉａｄｅｓ，Ｃ．，Ｐｏｄａｒ，Ｋ．，Ｍｕｎｓｈｉ，Ｎ．Ｃ．，Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｐ．Ｇ．，ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｋ．Ｃ．（２００３）Ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＰＳ−３４１  ａｂｒｏｇａｔｅｓ  ＩＬ−６  ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｃａｓｃａｄｅｓ  ｖｉａ  ｃａｓｐａｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｐ１３０  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２２．
（１４）Ｂｏｃｃａｄｏｒｏ，Ｍ．，Ｍｏｒｇａｎ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｃａｖｅｎａｇｈ，Ｊ．（２００５）Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｔ．５，１８．
（１５）Ｒｅｄｄｙ，Ｎ．，ａｎｄ  Ｃｚｕｃｚｍａｎ，Ｍ．Ｓ．（２０１０）Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｏｖｅｒｃｏｍｉｎｇ  ｃｈｅｍｏｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ：  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ  ｓｔｕｄｉｅｓ．Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．２１，１７５６−１７６４．
（１６）Ｑｉｎ，Ｊ．−Ｚ．，Ｚｉｆｆｒａ，Ｊ．，Ｓｔｅｎｎｅｔｔ，Ｌ．，Ｂｏｄｎｅｒ，Ｂ．，Ｂｏｎｉｓｈ，Ｂ．Ｋ．，Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉ，Ｖ．，Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｆ．，Ｐｏｌｌｏｃｋ，Ｐ．Ｍ．，Ｔｒｅｎｔ，Ｊ．Ｍ．，Ｈｅｎｄｒｉｘ，Ｍ．Ｊ．Ｃ．，Ｒｉｚｚｏ，Ｐ．，Ｍｉｅｌｅ，Ｌ．，ａｎｄ  Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ，Ｂ．Ｊ．（２００５）Ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  Ｔｒｉｇｇｅｒ  ＮＯＸＡ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｅｌａｎｏｍａ  ａｎｄ  Ｍｙｅｌｏｍａ  Ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６５，６２８２  ＬＰ−６２９３．
（１７）Ｏｄａ，Ｅ．，Ｏｈｋｉ，Ｒ．，Ｍｕｒａｓａｗａ，Ｈ．，Ｎｅｍｏｔｏ，Ｊ．，Ｓｈｉｂｕｅ，Ｔ．，Ｙａｍａｓｈｉｔａ，Ｔ．，Ｔｏｋｉｎｏ，Ｔ．，Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｔａｎａｋａ，†  Ｎｏｂｕｙｕｋｉ．（２０００）Ｎｏｘａ，ａ  ＢＨ３−Ｏｎｌｙ  Ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂｃｌ−２  Ｆａｍｉｌｙ  ａｎｄ  Ｃａｎｄｉｄａｔｅ  Ｍｅｄｉａｔｏｒ  ｏｆ  ｐ５３−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（８０−．）．２８８，１０５３  ＬＰ−１０５８．
（１８）Ｌｕ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｗａｎｇ，Ｊ．（２０１３）Ｔｈｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ．Ｂｉｏｍａｒｋ．Ｒｅｓ．１，１３．
（１９）Ｊａｉｎ，Ｓ．，Ｄｉｅｆｅｎｂａｃｈ，Ｃ．，Ｚａｉｎ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｏ．Ａ．（２０１１）Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｃａｒｆｉｌｚｏｍｉｂ  ｉｎ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｒｅｌａｐｓｅｄ  ａｎｄ  ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｎｅｏｐｌａｓｍｓ  ａｎｄ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ．Ｃｏｒｅ  Ｅｖｉｄ．６，４３−５７．
（２０）Ａｒａｓｔｕ−Ｋａｐｕｒ，Ｓ．，Ａｎｄｅｒｌ，Ｊ．Ｌ．，Ｋｒａｕｓ，Ｍ．，Ｐａｒｌａｔｉ，Ｆ．，Ｓｈｅｎｋ，Ｋ．Ｄ．，Ｌｅｅ，Ｓ．Ｊ．，Ｍｕｃｈａｍｕｅｌ，Ｔ．，Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｍ．Ｋ．，Ｄｒｉｅｓｓｅｎ，Ｃ．，Ｂａｌｌ，Ａ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｋｉｒｋ，Ｃ．Ｊ．（２０１１）Ｎｏｎｐｒｏｔｅａｓｏｍａｌ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  Ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ  ａｎｄ  Ｃａｒｆｉｌｚｏｍｉｂ：  ａ  Ｌｉｎｋ  ｔｏ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｄｖｅｒｓｅ  Ｅｖｅｎｔｓ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１７，２７３４  ＬＰ−２７４３．
（２１）Ｋｕｈｎ，Ｄ．Ｊ．，Ｃｈｅｎ，Ｑ．，Ｖｏｏｒｈｅｅｓ，Ｐ．Ｍ．，Ｓｔｒａｄｅｒ，Ｊ．Ｓ．，Ｓｈｅｎｋ，Ｋ．Ｄ．，Ｓｕｎ，Ｃ．Ｍ．，Ｄｅｍｏ，Ｓ．Ｄ．，Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｍ．Ｋ．，ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎ，Ｆ．Ｗ．Ｂ．，Ｃｈａｎａｎ−Ｋｈａｎ，Ａ．Ａ．，ａｎｄ  Ｏｒｌｏｗｓｋｉ，Ｒ．Ｚ．（２００７）Ｐｏｔｅｎｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｃａｒｆｉｌｚｏｍｉｂ，ａ  ｎｏｖｅｌ，ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  ｐａｔｈｗａｙ，ａｇａｉｎｓｔ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ．Ｂｌｏｏｄ  １１０，３２８１  ＬＰ−３２９０．
（２２）Ｋｉｍ，Ｈ．Ｍ．，Ｈａｎ，Ｊ．Ｗ．，ａｎｄ  Ｃｈａｎ，Ｊ．Ｙ．（２０１６）Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ−２  Ｌｉｋｅ  １（ＮＦＥ２Ｌ１）：  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｇｅｎｅ  ５８４，１７−２５．
（２３）Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，ａｎｄ  Ｘｉａｎｇ，Ｙ．（２０１６）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｕｎｉｑｕｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｇ  ｏｆ  Ｎｒｆ１，ａｎ  ｉｎｄｉｓｐｅｎｓａｂｌｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｈｏｍｏｅｏｓｔａｓｉｓ  ａｎｄ  ｏｒｇａｎ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．４７３，９６１  ＬＰ−１０００．
（２４）Ｓｈａ，Ｚ．，ａｎｄ  Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ａ．Ｌ．（２０１４）Ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  Ｎｒｆ１  Ｉｓ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｌ  Ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  Ｓｕｂｕｎｉｔｓ  ａｎｄ  ｐ９７．Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．２４，１５７３−１５８３．
（２５）Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，Ｌｕｃｏｃｑ，Ｊ．Ｍ．，Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｈａｙｅｓ，Ｊ．Ｄ．（２００７）Ｔｈｅ  ＮＨＢ１（Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｂｏｘ  １）ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｎｒｆ１  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｔｏ  ａｎｃｈｏｒ  ｉｔ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  ａｎｄ  ａｌｓｏ  ｔｏ  ｅｎａｂｌｅ  ｉｔｓ  ａｓｐａｒａｇｉｎｅ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．４０８，１６１−１７２．
（２６）Ｌｅｈｒｂａｃｈ，Ｎ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｒｕｖｋｕｎ，Ｇ．（２０１６）Ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｔｒｉｇｇｅｒｓ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳＫＮ−１Ａ／Ｎｒｆ１  ｂｙ  ｔｈｅ  ａｓｐａｒｔｉｃ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ＤＤＩ−１．ｂｉｏＲｘｉｖ．
（２７）Ｋｏｉｚｕｍｉ，Ｓ．，Ｉｒｉｅ，Ｔ．，Ｈｉｒａｙａｍａ，Ｓ．，Ｓａｋｕｒａｉ，Ｙ．，Ｙａｓｈｉｒｏｄａ，Ｈ．，Ｎａｇｕｒｏ，Ｉ．，Ｉｃｈｉｊｏ，Ｈ．，Ｈａｍａｚａｋｉ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｍｕｒａｔａ，Ｓ．（２０１６）Ｔｈｅ  ａｓｐａｒｔｙｌ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ＤＤＩ２  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  Ｎｒｆ１  ｔｏ  ｃｏｍｐｅｎｓａｔｅ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｅｌｉｆｅ（Ｄｉｋｉｃ，Ｉ．，Ｅｄ．）５，ｅ１８３５７．
（２８）Ｒａｄｈａｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｓ．Ｋ．，ｄｅｎ  Ｂｅｓｔｅｎ，Ｗ．，ａｎｄ  Ｄｅｓｈａｉｅｓ，Ｒ．Ｊ．（２０１４）ｐ９７−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｇｏｖｅｒｎ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｔｉｖｅ  Ｎｒｆ１  ｕｐｏｎ  ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ．Ｅｌｉｆｅ（Ｂｒｏｗｎ，Ｍ．Ｓ．，Ｅｄ．）３，ｅ０１８５６．
（２９）Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，Ｑｉｕ，Ｌ．，Ｌｉ，Ｓ．，Ｘｉａｎｇ，Ｙ．，Ｃｈｅｎ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｒｅｎ，Ｙ．（２０１４）Ｔｈｅ  Ｃ−Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  Ｎｒｆ１  Ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ  Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｔｈｅ  Ｆｕｌｌ−Ｌｅｎｇｔｈ  ＣＮＣ−ｂＺＩＰ  Ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ｓｈｏｒｔｅｒ  Ｉｓｏｆｏｒｍ  ＬＣＲ−Ｆ１／Ｎｒｆ１β；Ｂｏｔｈ  Ａｒｅ  Ａｌｓｏ  Ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｓｍａｌｌ  Ｄｏｍｉｎａｎｔ−Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｎｒｆ１γ／δ  Ｉｓｏｆｏｒｍｓ  ｔｈａｔ  Ｄｏｗｎ−Ｒｅｇｕｌａｔｅ  ＡＲＥ−Ｂａｔｔｅｒｙ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ９，ｅ１０９１５９．
（３０）Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，Ｒｅｎ，Ｙ．，Ｌｉ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｈａｙｅｓ，Ｊ．Ｄ．（２０１４）Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｎｒｆ１  Ｉｓ  Ｔｏｐｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  Ｒｅｐａｒｔｉｔｉｏｎｅｄ  ａｃｒｏｓｓ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  ｔｏ  Ｅｎａｂｌｅ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｉｔｓ  Ａｃｉｄｉｃ  Ｇｌｕｃｏｓｅ−Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｄｏｍａｉｎｓ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ９，ｅ９３４５８．
（３１）Ｒａｄｈａｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｓ．Ｋ．，Ｌｅｅ，Ｃ．Ｓ．，Ｙｏｕｎｇ，Ｐ．，Ｂｅｓｋｏｗ，Ａ．，Ｃｈａｎ，Ｊ．Ｙ．，ａｎｄ  Ｄｅｓｈａｉｅｓ，Ｒ．Ｊ．（２０１０）Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｎｒｆ１  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｆｔｅｒ  ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  ３８，１７−２８．
（３２）Ｈｉｒｓｃｈ，Ｃ．，Ｂｌｏｍ，Ｄ．，ａｎｄ  Ｐｌｏｅｇｈ，Ｈ．Ｌ．（２００３）Ａ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  Ｎ−ｇｌｙｃａｎａｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ  ｔｕｒｎｏｖｅｒ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．ＥＭＢＯ  Ｊ．２２，１０３６  ＬＰ−１０４６．
（３３）Ｓｕｚｕｋｉ，Ｔ．，Ｓｅｋｏ，Ａ．，Ｋｉｔａｊｉｍａ，Ｋ．，Ｉｎｏｕｅ，Ｙ．，ａｎｄ  Ｉｎｏｕｅ，Ｓ．（１９９３）Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ：Ｎ−Ｇｌｙｃａｎａｓｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｃｕｌｔｕｒｅｄ  Ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９４，１１２４−１１３０．
（３４）Ｓｕｚｕｋｉ，Ｔ．，Ｐａｒｋ，Ｈ．，Ｈｏｌｌｉｎｇｓｗｏｒｔｈ，Ｎ．Ｍ．，Ｓｔｅｒｎｇｌａｎｚ，Ｒ．，ａｎｄ  Ｌｅｎｎａｒｚ，Ｗ．Ｊ．（２０００）ＰＮＧ１，ａ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅ  Ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａ  Ｈｉｇｈｌｙ  Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ：Ｎ−Ｇｌｙｃａｎａｓｅ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１４９，１０３９  ＬＰ−１０５２．
Ｒａｄｈａｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｓ．Ｋ．，Ｌｅｅ，Ｃ．Ｓ．，Ｙｏｕｎｇ，Ｐ．，Ｂｅｓｋｏｗ，Ａ．，Ｃｈａｎ，Ｊ．Ｙ．，ａｎｄ  Ｄｅｓｈａｉｅｓ，Ｒ．Ｊ．（２０１０）Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｎｒｆ１  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｆｔｅｒ  ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  ３８，１７−２８．
Ｒａｄｈａｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｓ．Ｋ．，ｄｅｎ  Ｂｅｓｔｅｎ，Ｗ．，ａｎｄ  Ｄｅｓｈａｉｅｓ，Ｒ．Ｊ．（２０１４）ｐ９７−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｇｏｖｅｒｎ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｔｉｖｅ  Ｎｒｆ１  ｕｐｏｎ  ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ．Ｅｌｉｆｅ（Ｂｒｏｗｎ，Ｍ．Ｓ．，Ｅｄ．）３，ｅ０１８５６．
Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｌ．Ａ．；Ｈｏｒｌｂｅｃｋ，Ｍ．Ａ．；Ａｄａｍｓｏｎ，Ｂ．；Ｖｉｌｌａｌｔａ，Ｊ．Ｅ．；Ｃｈｅｎ，Ｙ．；Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ，Ｅ．Ｈ．；Ｇｕｉｍａｒａｅｓ，Ｃ．；Ｐａｎｎｉｎｇ，Ｂ．；Ｐｌｏｅｇｈ，Ｈ．Ｌ．；Ｂａｓｓｉｋ，Ｍ．Ｃ．；Ｑｉ，Ｌ．Ｓ．；Ｋａｍｐｍａｎｎ，Ｍ．；Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｊ．Ｓ．Ｃｅｌｌ  ２０１４，１５９（３），６４７−６６１．
Ｈｏｒｌｂｅｃｋ，Ｍ．Ａ．；Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｌ．Ａ．；Ｖｉｌｌａｌｔａ，Ｊ．Ｅ．；Ａｄａｍｓｏｎ，Ｂ．；Ｐａｋ，Ｒ．Ａ．；Ｃｈｅｎ，Ｙ．；Ｆｉｅｌｄｓ，Ａ．Ｐ．；Ｐａｒｋ，Ｃ．Ｙ．；Ｃｏｒｎ，Ｊ．Ｅ．；Ｋａｍｐｍａｎｎ，Ｍ．；Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｊ．Ｓ．ｅＬｉｆｅ  ２０１６，５，ｅ１９７６０．
Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｌ．Ａ．；Ｌａｒｓｏｎ，Ｍ．Ｈ．；Ｍｏｒｓｕｔ，Ｌ．；Ｌｉｕ，Ｚ．；Ｂｒａｒ，Ｇ．Ａ．；Ｔｏｒｒｅｓ，Ｓ．Ｅ．；Ｓｔｅｒｎ−Ｇｉｎｏｓｓａｒ，Ｎ．；Ｂｒａｎｄｍａｎ，Ｏ．；Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ，Ｅ．Ｈ．；Ｄｏｕｄｎａ，Ｊ．Ａ．；Ｌｉｍ，Ｗ．Ａ．；Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｊ．Ｓ．；Ｑｉ，Ｌ．Ｓ．Ｃｅｌｌ  ２０１３，１５４（２），４４２−４５１．
【０１６６】
本出願で引用されている各刊行物は、あらゆる目的において参照により本明細書に組み入れられる。
【０１６７】
本発明は、本明細書に記載されている特定の方法論、プロトコル、細胞株、動物の種または属、及び試薬に限定されず、そのため変動し得ることが理解されるべきである。また、本明細書で使用する用語が、特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、また本発明の範囲を限定するようには意図されていないこと、そして本発明の範囲が付属の請求項によってのみ限定されることも理解されたい。
【０１６８】
本明細書で使用する単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈による明確な別段の定めがない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「１つの細胞」という言及には複数のこのような細胞が含まれ、「当該培養物」という言及には、１つ以上の培養物及び当業者に公知のその等価物への言及が含まれる、などとなる。本明細書で使用する全ての技術的用語及び科学的用語は、別段の指示がない限り、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。
【図１】
2020505470.tif 000018
【図２】
2020505470.tif 000019
【図３】
2020505470.tif 000020
【図４−１】
2020505470.tif 000021
【図４−２】
2020505470.tif 000022
【図５】
2020505470.tif 000023
【配列表】
2020505470000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年1月10日(2020.1.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
がん細胞プロテアソームの発現を低減するのに有効な用量のＮＧｌｙ１阻害剤を含む、がんを処置するための組成物であって、生存可能ながん細胞の数が低減される、組成物。
【請求項２】
有効用量の直接的プロテアソーム阻害剤と同時投与される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
有効用量の直接的プロテアソーム阻害剤をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記直接的プロテアソーム阻害剤が、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、イキサゾミブ、デランゾミブ、オプロゾミブ、マリゾミブ、ＩＰＳＩ−００１、ＯＮＸ−０９１４、及びＰＲ−９２４のうちの１つ以上である、請求項２または３に記載の組成物。
【請求項５】
前記組合せが、単一薬剤としてのいずれかの薬剤の投与に比べて相乗効果をもたらす、請求項２〜４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
前記直接的プロテアソーム阻害剤の有効用量が、前記ＮＧｌｙ１阻害剤の不在下における有効用量よりも低い、請求項２〜５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
前記直接的プロテアソーム阻害剤が有効である時間期間が、前記ＮＧｌｙ１阻害剤の不在下で前記直接的プロテアソーム阻害剤が有効である時間期間よりも長い、請求項２〜６のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
前記がんが血液癌である、請求項１〜７のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
前記血液癌が多発性骨髄腫である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ＮＧｌｙ１阻害剤がカスパーゼ活性を阻害しない、請求項１〜９のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】
前記ＮＧｌｙ１阻害剤が、標的タンパク質のアスパラギン側鎖とＮ連結オリゴ糖との間のアミド連結におけるシステイン残基の求核性攻撃を阻害することにより、ＮＧｌｙ１を機構的に阻害する、請求項１〜１０のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２】
前記ＮＧｌｙ１阻害剤が式Ｉの構造を有する、請求項１〜１１のいずれかに記載の組成物であって、
【化１】
2020505470.tif 000024
式中、Ｒ１は、Ｈ、低級アルキル、分枝状アルキル、置換アルキルを含めたアルキル、アリール、アルカリル、置換アリール、置換アルカリルであり、
Ｒ２は、Ｈ、低級アルキル、分枝状アルキル、置換アルキルを含めたアルキル、アリール、アルカリル、置換アリール、置換アルカリルであり、
Ｒ３は、低級アルキル、分枝状アルキル、置換アルキルを含めたアルキル、アリール、アルカリル、置換アリール、置換アルカリル、電子求引性置換基、または電子供与性基である、前記組成物。
【請求項１３】
前記ＮＧｌｙ１阻害剤が式ＩＩの構造を有する、請求項１２に記載の組成物であって、
【化２】
2020505470.tif 000025
式中、Ｘは、クロロ、ブロモ、フルオロ、またはヨード置換基である、前記組成物。
【請求項１４】
前記ＮＧｌｙ１阻害剤が式ＩＩＩの構造を有する、請求項１２に記載の組成物であり、
【化３】
2020505470.tif 000026
Ｒ４は、低級アルキル、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピルを含めたアルキル基であり、
Ｒ５は、以下に限定されないが、アルキニル、アルケニル、モルホリノ、アミノ、アミド、スルフヒドリルを含めた極性または非極性基である、前記組成物。
【請求項１５】
前記ＮＧｌｙ１阻害剤が式ＩＶの構造を有する、請求項１２に記載の組成物であって、
【化４】
2020505470.tif 000027
Ｒ６は、前記アリール環上の任意の位置（オルト、メタ、またはパラ）における任意選択の置換基であり、前記置換基は、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノアシル、アミノアシルオキシ、オキシアミノアシル、アジド、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシル、オキソ、チオケト、カルボキシル、カルボキシアルキル、チオアリールオキシ、チオヘテロアリールオキシ、チオヘテロシクロオキシ、チオール、チオアルコキシ、置換チオアルコキシ、アリール、アリールオキシ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリル、ヘテロシクロオキシ、ヒドロキシアミノ、アルコキシアミノ、ニトロ、−ＳＯ−アルキル、−ＳＯ−置換アルキル、−ＳＯ−アリール、−ＳＯ−ヘテロアリール、−ＳＯ２−アルキル、−ＳＯ２−置換アルキル、−ＳＯ２−アリール、−ＳＯ２−ヘテロアリール、または融合複素環であってもよく、
Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３はいずれも、任意選択により、窒素、酸素、硫黄、リン、またはケイ素から選択されるヘテロ原子である、前記組成物。
【請求項１６】
前記ＮＧｌｙ１阻害剤が、
【化５】
2020505470.tif 000028
である、請求項１〜１４のいずれかに記載の組成物。
【請求項１７】
前記ＮＧｌｙ１阻害剤が式Ｖのエポキシケトンである、請求項１〜１１のいずれかに記載の組成物であって、
【化６】
2020505470.tif 000029
式中、Ｒ７は、アミン、置換アミン、アミド、置換アミド、低級アルキル、分枝状アルキル、置換アルキルを含めたアルキル、アリール、アルカリル、置換アリール、置換アルカリル等である、前記組成物。
【請求項１８】
薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項１〜１７のいずれかに記載の組成物。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれかに記載の組成物と、使用説明書とを含む、キット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
一部の実施形態において、ＮＧｌｙ１阻害剤は、式Ｉの構造：
【化１】
2020505470.tif 000030
を有し、
式中、Ｒ１は、Ｈ、低級アルキル、分枝状アルキル、置換アルキルを含めたアルキル、アリール、アルカリル、置換アリール、置換アルカリル等であり、
Ｒ２は、Ｈ、低級アルキル、分枝状アルキル、置換アルキルを含めたアルキル、アリール、アルカリル、置換アリール、置換アルカリル等であり、
Ｒ３は、低級アルキル、分枝状アルキル、置換アルキルを含めたアルキル、アリール、アルカリル、置換アリール、置換アルカリル、電子求引性置換基、または電子供与性基である。一部の実施形態において、候補ＮＧｌｙ１阻害剤は、Ｎ−グリコシル化部位を含むポリペプチド基質の脱グリコシル化を阻害することに基づいて、活性を試験される。一部のこのような実施形態において、アッセイは、蛍光アッセイである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
一部の実施形態において、ＮＧｌｙ１阻害剤は、式Ｉの構造：
【化２】
2020505470.tif 000031
を有し、
式中、Ｒ１は、Ｈであり、
Ｒ２は、Ｈ、低級アルキル、分枝状アルキル、置換アルキルを含めたアルキル、アリール、アルカリル、置換アリール、置換アルカリル等であり、
Ｒ３は、低級アルキル、分枝状アルキル、置換アルキルを含めたアルキル、アリール、アルカリル、置換アリール、置換アルカリル、電子求引性置換基、または電子供与性基である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６８】
本明細書で使用する単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈による明確な別段の定めがない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「１つの細胞」という言及には複数のこのような細胞が含まれ、「当該培養物」という言及には、１つ以上の培養物及び当業者に公知のその等価物への言及が含まれる、などとなる。本明細書で使用する全ての技術的用語及び科学的用語は、別段の指示がない限り、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。
以下は、本発明の実施形態の一つである。
（１）がんを処置する方法であって、
がん細胞を、がん細胞プロテアソームの発現を低減するのに有効な用量のＮＧｌｙ１阻害剤に接触させることを含み、生存可能ながん細胞の数が低減される、前記方法。
（２）有効用量の直接的プロテアソーム阻害剤の同時投与をさらに含む、（１）に記載の方法。
（３）前記直接的プロテアソーム阻害剤が、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、イキサゾミブ、デランゾミブ、オプロゾミブ、マリゾミブ、ＩＰＳＩ−００１、ＯＮＸ−０９１４、及びＰＲ−９２４のうちの１つ以上である、（１）に記載の方法。
（４）前記組合せが、単一薬剤としてのいずれかの薬剤の投与に比べて相乗効果をもたらす、（２）または（３）に記載の方法。
（５）前記直接的プロテアソーム阻害剤の有効用量が、前記ＮＧｌｙ１阻害剤の不在下における有効用量よりも低い、（２）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）前記直接的プロテアソーム阻害剤が有効である時間期間が、前記ＮＧｌｙ１阻害剤の不在下で前記直接的プロテアソーム阻害剤が有効である時間期間よりも長い、（２）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）前記がんが血液癌である、（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）前記血液癌が多発性骨髄腫である、（７）に記載の方法。
（９）前記ＮＧｌｙ１阻害剤がカスパーゼ活性を阻害しない、（１）〜（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）前記ＮＧｌｙ１阻害剤が、標的タンパク質のアスパラギン側鎖とＮ連結オリゴ糖との間のアミド連結におけるシステイン残基の求核性攻撃を阻害することにより、ＮＧｌｙ１を機構的に阻害する、（１）〜（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）前記ＮＧｌｙ１阻害剤が式Ｉの構造を有する、（１）〜（１０）のいずれかに記載の方法であって、
【化１１】
2020505470.tif 000032
式中、Ｒ１は、Ｈ、低級アルキル、分枝状アルキル、置換アルキルを含めたアルキル、アリール、アルカリル、置換アリール、置換アルカリルであり、
Ｒ２は、Ｈ、低級アルキル、分枝状アルキル、置換アルキルを含めたアルキル、アリール、アルカリル、置換アリール、置換アルカリルであり、
Ｒ３は、低級アルキル、分枝状アルキル、置換アルキルを含めたアルキル、アリール、アルカリル、置換アリール、置換アルカリル、電子求引性置換基、または電子供与性基である、前記方法。
（１２）前記ＮＧｌｙ１阻害剤が式ＩＩの構造を有する、（１１）に記載の方法であって、
【化１２】
2020505470.tif 000033
式中、Ｘは、クロロ、ブロモ、フルオロ、またはヨード置換基である、前記方法。
（１３）前記ＮＧｌｙ１阻害剤が式ＩＩＩの構造を有する、（１１）に記載の方法であり、
【化１３】
2020505470.tif 000034
Ｒ４は、低級アルキル、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピルを含めたアルキル基であり、
Ｒ５は、以下に限定されないが、アルキニル、アルケニル、モルホリノ、アミノ、アミド、スルフヒドリルを含めた極性または非極性基である、前記方法。
（１４）前記ＮＧｌｙ１阻害剤が式ＩＶの構造を有する、（１１）に記載の方法であって、
【化１４】
2020505470.tif 000035
Ｒ６は、前記アリール環上の任意の位置（オルト、メタ、またはパラ）における任意選択の置換基であり、前記置換基は、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノアシル、アミノアシルオキシ、オキシアミノアシル、アジド、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシル、オキソ、チオケト、カルボキシル、カルボキシアルキル、チオアリールオキシ、チオヘテロアリールオキシ、チオヘテロシクロオキシ、チオール、チオアルコキシ、置換チオアルコキシ、アリール、アリールオキシ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリル、ヘテロシクロオキシ、ヒドロキシアミノ、アルコキシアミノ、ニトロ、−ＳＯ−アルキル、−ＳＯ−置換アルキル、−ＳＯ−アリール、−ＳＯ−ヘテロアリール、−ＳＯ２−アルキル、−ＳＯ２−置換アルキル、−ＳＯ２−アリール、−ＳＯ２−ヘテロアリール、または融合複素環であってもよく、
Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３はいずれも、任意選択により、窒素、酸素、硫黄、リン、またはケイ素から選択されるヘテロ原子である、前記方法。
（１５）前記ＮＧｌｙ１阻害剤が、
【化１５】
2020505470.tif 000036
である、（１）〜（１３）のいずれかに記載の方法。
（１６）前記ＮＧｌｙ１阻害剤が式Ｖのエポキシケトンである、（１）〜（１０）のいずれかに記載の方法であって、
【化１６】
2020505470.tif 000037
式中、Ｒ７は、アミン、置換アミン、アミド、置換アミド、低級アルキル、分枝状アルキル、置換アルキルを含めたアルキル、アリール、アルカリル、置換アリール、置換アルカリル等である、前記方法。
（１７）有効用量のＮＧｌｙ１阻害剤と、薬学的に許容される担体とを含む、（１）〜（１６）のいずれかに記載の方法で使用するための、組成物。
（１８）有効用量の直接的プロテアソーム阻害剤をさらに含む、（１７）に記載の組成物。
（１９）薬学的に許容される担体中の有効用量のＮＧｌｙ１阻害剤と、使用説明書とを含む、（１）〜（１６）のいずれかに記載の方法で使用するための、キット。
（２０）有効用量の直接的プロテアソーム阻害剤をさらに含む、（１９）に記載のキット。
【国際調査報告】
2020505470.tif 000038
2020505470.tif 000039
2020505470.tif 000040