(57)【要約】１つ以上の徴候の処置におけるインターロイキン（ＩＬ）抱合体（例えば、ＩＬ−２抱合体）およびその使用が本明細書に開示される。さらに、インターロイキン抱合体（例えば、ＩＬ−２抱合体）の１つ以上を含む医薬組成物とキットが本明細書に記載される。【選択図】図４Ａ
2020529976.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離および修飾されたインターロイキン２（ＩＬ−２）ポリペプチドであって、前記インターロイキン２（ＩＬ−２）ポリペプチドは、インターロイキン２受容体βγ（ＩＬ−２Ｒβγ）に対する受容体シグナル伝達能力を減少させるか、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒβ複合体へのＩＬ−２Ｒγサブユニットの動員を減少させるが、インターロイキン２αβγ受容体（ＩＬ−２Ｒαβγ）の有意な活性化を維持するある位置における少なくとも１つの非天然アミノ酸を含み、減少した受容体シグナル伝達能力は、野生型のＩＬ−２ポリペプチドとＩＬ−２Ｒβγとの間の受容体シグナル伝達能力と比較され、および、動員は野生型のＩＬ−２ポリペプチドによるＩＬ−２Ｒγサブユニットの動員と比較される、単離および修飾されたインターロイキン２（ＩＬ−２）ポリペプチド。
【請求項２】
単離および修飾されたインターロイキン２（ＩＬ−２）ポリペプチドであって、前記インターロイキン２（ＩＬ−２）ポリペプチドは、インターロイキン２αβγ受容体（ＩＬ−２Ｒαβγ）の活性化に結びつく、ＩＬ−２ポリペプチドに対するＩＬ−２Ｒαサブユニットの動員を増加させるある位置における少なくとも１つの非天然アミノ酸を含み、および、動員の増加は、野生型のＩＬ−２ポリペプチドによるＩＬ−２Ｒαサブユニットの動員と比較される、単離および修飾されたインターロイキン２（ＩＬ−２）ポリペプチド。
【請求項３】
少なくとも１つの非天然アミノ酸の位置は、Ｐ２、Ｔ３、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６、Ｔ７、Ｋ８、Ｋ９、Ｑ１１、Ｌ１２、Ｅ１５、Ｈ１６、Ｌ１８、Ｌ１９、Ｄ２０、Ｑ２２、Ｍ２３、Ｎ２６、Ｇ２７、Ｎ２９、Ｎ３０、Ｙ３１、Ｋ３２、Ｋ３５、Ｔ３７、Ｍ４６、Ｋ４７、Ｋ４８、Ａ５０、Ｔ５１、Ｅ５２、Ｋ５３、Ｈ５５、Ｑ５７、Ｅ６０、Ｅ６７、Ｎ７１、Ｑ７４、Ｓ７５、Ｋ７６、Ｎ７７、Ｆ７８、Ｈ７９、Ｒ８１、Ｐ８２、Ｒ８３、Ｄ８４、Ｓ８７、Ｎ８８、Ｎ８９、Ｖ９１、Ｉ９２、Ｌ９４、Ｅ９５、Ｋ９７、Ｇ９８、Ｓ９９、Ｅ１００、Ｔ１０１、Ｔ１０２、Ｆ１０３、Ｍ１０４、Ｃ１０５、Ｅ１０６、Ｙ１０７、Ａ１０８、Ｄ１０９、Ｅ１１０、Ｔ１１１、Ａ１１２、Ｔ１１３、Ｅ１１６、Ｎ１１９、Ｒ１２０、Ｔ１２３、Ａ１２５、Ｑ１２６、Ｓ１２７、Ｓ１３０、Ｔ１３１、Ｌ１３２、および、Ｔ１３３から選択され、アミノ酸残基の番号はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対応する、請求項１または２に記載の単離および修飾されたＩＬ−２ポリペプチド。
【請求項４】
少なくとも１つの非天然アミノ酸の位置は、Ｋ８、Ｋ９、Ｑ１１、Ｌ１２、Ｅ１５、Ｈ１６、Ｌ１８、Ｌ１９、Ｄ２０、Ｑ２２、Ｍ２３、Ｎ２６、Ｒ８１、Ｄ８４、Ｓ８７、Ｎ８８、Ｖ９１、Ｉ９２、Ｌ９４、Ｅ９５、Ｅ１１６、Ｎ１１９、Ｒ１２０、Ｔ１２３、Ａ１２５、Ｑ１２６、Ｓ１２７、Ｓ１３０、Ｔ１３１、Ｌ１３２、および、Ｔ１３３から選択され、アミノ酸残基の番号はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対応する、請求項１または２に記載の単離および修飾されたＩＬ−２ポリペプチド。
【請求項５】
少なくとも１つの非天然アミノ酸の位置は、Ｐ２、Ｔ３、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６、Ｔ７、Ｇ２７、Ｎ２９、Ｎ３０、Ｙ３１、Ｋ３２、Ｋ３５、Ｔ３７、Ｍ４６、Ｋ４７、Ｋ４８、Ａ５０、Ｔ５１、Ｅ５２、Ｋ５３、Ｈ５５、Ｑ５７、Ｅ６０、Ｅ６７、Ｎ７１、Ｑ７４、Ｓ７５、Ｋ７６、Ｎ７７、Ｆ７８、Ｈ７９、Ｐ８２、Ｒ８３、Ｎ８９、Ｋ９７、Ｇ９８、Ｓ９９、Ｅ１００、Ｔ１０１、Ｔ１０２、Ｆ１０３、Ｍ１０４、Ｃ１０５、Ｅ１０６、Ｙ１０７、Ａ１０８、Ｄ１０９、Ｅ１１０、Ｔ１１１、Ａ１１２、および、Ｔ１１３から選択され、アミノ酸残基の番号はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対応する、請求項１または２に記載の単離および修飾されたＩＬ−２ポリペプチド。
【請求項６】
少なくとも１つの非天然アミノ酸の位置は、Ｋ８、Ｋ９、Ｌ１２、Ｅ１５、Ｈ１６、Ｌ１９、Ｄ２０、Ｑ２２、Ｍ２３、Ｎ２６、Ｄ８４、Ｎ８８、Ｅ９５、および、Ｑ１２６から選択され、アミノ酸残基の番号はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対応する、請求項１または２に記載の単離および修飾されたＩＬ−２ポリペプチド。
【請求項７】
少なくとも１つの非天然アミノ酸の位置は、Ｋ８、Ｋ９、およびＨ１６から選択され、アミノ酸残基の番号はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対応する、請求項１または２に記載の単離および修飾されたＩＬ−２ポリペプチド。
【請求項８】
少なくとも１つの非天然アミノ酸の位置は、Ｑ２２、Ｎ２６、Ｎ８８、およびＱ１２６から選択され、アミノ酸残基の番号はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対応する、請求項１または２に記載の単離および修飾されたＩＬ−２ポリペプチド。
【請求項９】
少なくとも１つの非天然アミノ酸の位置は、Ｅ１５、Ｄ２０、Ｄ８４、およびＥ９５から選択され、アミノ酸残基の番号はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対応する、請求項１または２に記載の単離および修飾されたＩＬ−２ポリペプチド。
【請求項１０】
少なくとも１つの非天然アミノ酸の位置は、Ｌ１２、Ｌ１９、およびＭ２３から選択され、アミノ酸残基の番号はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対応する、請求項１または２に記載の単離および修飾されたＩＬ−２ポリペプチド。
【請求項１１】
少なくとも１つの非天然アミノ酸の位置は、Ｑ２２とＮ２６から選択され、アミノ酸残基の番号はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対応する、請求項１または２に記載の単離および修飾されたＩＬ−２ポリペプチド。
【請求項１２】
少なくとも１つの非天然アミノ酸は：
リジンアナログであり；
システインアナログあるいはヒスチジンアナログであり；
芳香族側鎖を含み；
アジド基を含み；
アルキン基を含み；あるいは、
アルデヒド基またはケトン基を含む、請求項１または２に記載の単離および修飾されたＩＬ−２ポリペプチド。
【請求項１３】
少なくとも１つの非天然アミノ酸は芳香族側鎖を含まない、請求項１または２に記載の単離および修飾されたＩＬ−２ポリペプチド。
【請求項１４】
少なくとも１つの非天然アミノ酸は、Ｎ６−アジドエトキシ−Ｌ−リジン（ＡｚＫ）、Ｎ６−プロパルギルエトキシ−Ｌ−リジン（ＰｒａＫ）、ＢＣＮ−Ｌ−リジン、ノルボルネンリジン、ＴＣＯリジン、メチルテトラジンリジン、アリルオキシカルボニルリジン、２−アミノ−８−オキソノナン酸、２−アミノ−８−オキソオクタン酸、ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジドメチル−Ｌ−フェニルアラニン（ｐＡＭＦ）、ｐ−ヨード−Ｌ−フェニルアラニン、ｍ−アセチルフェニルアラニン、２−アミノ−８−オキソノナン酸、ｐ−プロパギルオキシフェニルアラニン、ｐ−プロパルギル−フェニルアラニン、３−メチル−フェニルアラニン、Ｌ−ドパ、フッ素処理したフェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−アリルチロシン、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、ホスホノチロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃｐ−セリン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、２−アミノ−３−（（２−（（３−（ベンジルオキシ）−３−オキソプロピル）アミノ）エチル）セラニル）プロパン酸、２−アミノ−３−（フェニルセラニル）プロパン、または、セレノシステインを含む、請求項１または２に記載の単離および修飾されたＩＬ−２ポリペプチド。
【請求項１５】
少なくとも１つの非天然アミノ酸は、直交ｔＲＮＡ合成酵素／ｔＲＮＡ対によって、修飾されたＩＬ−２ポリペプチドに組み込まれる、請求項１または２に記載の単離および修飾されたＩＬ−２ポリペプチド。
【請求項１６】
直交合成酵素／ｔＲＮＡ対の直交のｔＲＮＡは、少なくとも１つの非天然核酸塩基を含む、請求項１５に記載の単離および修飾されたＩＬ−２ポリペプチド。
【請求項１７】
修飾されたＩＬ−２ポリペプチドは、少なくとも１つの非天然アミノ酸を介して抱合部分に共有結合される、請求項１または２に記載の単離および修飾されたＩＬ−２ポリペプチド。
【請求項１８】
抱合部分は水溶性ポリマー、脂質、タンパク質、あるいはペプチドを含む、請求項１７に記載の単離および修飾されたＩＬ−２ポリペプチド。
【請求項１９】
水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（プロピレングリコール）（ＰＰＧ）、エチレングリコールとプロピレングリコールのコポリマー、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィンアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリルアミド）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリラート）、ポリ（サッカライド）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）、あるいはこれらの組み合わせを含む、請求項１８に記載の単離および修飾されたＩＬ−２ポリペプチド。
【請求項２０】
水溶性ポリマーはＰＥＧ分子を含む、請求項１８に記載の単離および修飾されたＩＬ−２ポリペプチド。
【請求項２１】
ＰＥＧ分子は線形ＰＥＧである、請求項２０に記載の単離および修飾されたＩＬ−２ポリペプチド。
【請求項２２】
ＰＥＧ分子は分岐ＰＥＧである、請求項２０に記載の単離および修飾されたＩＬ−２ポリペプチド。
【請求項２３】
水溶性ポリマーは多糖類を含む、請求項１８に記載の単離および修飾されたＩＬ−２ポリペプチド。
【請求項２４】
多糖類はデキストラン、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ヒアルロン酸（ＨＡ）、アミロース、ヘパリン、ヘパラン硫酸（ＨＳ）、デキストリン、あるいはヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）を含む、請求項２３に記載の単離および修飾されたＩＬ−２ポリペプチド。
【請求項２５】
脂質は脂肪酸を含む、請求項１８に記載の単離および修飾されたＩＬ−２ポリペプチド。
【請求項２６】
脂肪酸は、約６から約２６の炭素原子、約６から約２４の炭素原子、約６から約２２の炭素原子、約６から約２０の炭素原子、約６から約１８の炭素原子、約２０から約２６の炭素原子、約１２から約２６の炭素原子、約１２から約２４の炭素原子、約１２から約２２の炭素原子、約１２から約２０の炭素原子、あるいは、約１２から約１８の炭素原子を含む、請求項２５に記載の単離および修飾されたＩＬ−２ポリペプチド。
【請求項２７】
脂肪酸は飽和脂肪酸である、請求項２５に記載の単離および修飾されたＩＬ−２ポリペプチド。
【請求項２８】
タンパク質は、アルブミン、トランスフェリン、あるいはトランスサイレチンを含む、請求項１８に記載の単離および修飾されたＩＬ−２ポリペプチド。
【請求項２９】
タンパク質は、抗体またはその結合フラグメントを含む、請求項１８に記載の単離および修飾されたＩＬ−２ポリペプチド。
【請求項３０】
抗体あるいはその結合フラグメントは、抗体のＦｃ部分を含む、請求項２９に記載の単離および修飾されたＩＬ−２ポリペプチド。
【請求項３１】
ペプチドは、ＸＴＥＮペプチド、グリシンに富んだホモアミノ酸ポリマー（ＨＡＰ）、ＰＡＳポリペプチド、エラスチン様ポリペプチド（ＥＬＰ）、ＣＴＰペプチド、あるいはゼラチン様タンパク質（ＧＬＫ）ポリマーを含む、請求項１８に記載の単離および修飾されたＩＬ−２ポリペプチド。
【請求項３２】
抱合部分は、リンカーを介して修飾されたＩＬ−２の少なくとも１つの非天然アミノ酸に間接的に結合する、請求項１７に記載の単離および修飾されたＩＬ−２ポリペプチド。
【請求項３３】
リンカーは、ホモ二機能性リンカー、ヘテロ二機能性リンカー、ゼロ長リンカー、切断あるいは非切断ジペプチドリンカー、マレイミド基、スペーサー、あるいはこれらの組み合わせを含む、請求項３２に記載の単離および修飾されたＩＬ−２ポリペプチド。
【請求項３４】
単離および修飾されたＩＬ−２ポリペプチドは、ＩＬ−２Ｒβγに対する受容体シグナル伝達能力が減少しており、受容体シグナル伝達能力の減少は、野生型のＩＬ−２Ｒβγと比較して、約１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、３０倍、５０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、１０００倍、またはそれ以上である、請求項１に記載の単離および修飾されたＩＬ−２ポリペプチド。
【請求項３５】
修飾されたＩＬ−２ポリペプチドは：
完全長のＩＬ−２ポリペプチドの機能的に活性なフラグメント；
組み換えＩＬ−２ポリペプチド；あるいは、
組み換えヒトＩＬ−２ポリペプチドである、請求項１または２に記載の単離および修飾されたＩＬ−２ポリペプチド。
【請求項３６】
修飾されたＩＬ−２ポリペプチドは、Ｎ末端欠失、Ｃ末端欠失、あるいはこれらの組み合わせを含む、請求項１または２に記載の単離および修飾されたＩＬ−２ポリペプチド。
【請求項３７】
Ｎ末端欠失は、Ｎ末端から最初の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、あるいは３０の残基の欠失を含み、ここで、残基位置は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置を基準にしている、請求項１または２に記載の単離および修飾されたＩＬ−２ポリペプチド。
【請求項３８】
Ｃ末端欠失は、Ｃ末端から最後の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、あるいはそれ以上の残基の欠失を含み、ここで、残基位置は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置を基準にしている、請求項１または２に記載の単離および修飾されたＩＬ−２ポリペプチド。
【請求項３９】
機能的に活性なフラグメントは、ＩＬ−２領域１０−１３３、２０−１３３、３０−１３３、１０−１３０、２０−１３０、３０−１３０、１０−１２５、２０−１２５、３０−１２５、１−１３０、あるいは１−１２５を含み、ここで、残基位置は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置を基準にしている、請求項３５に記載の単離および修飾されたＩＬ−２ポリペプチド。
【請求項４０】
修飾されたＩＬ−２ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、あるいは９９％の配列同一性を含む、請求項１または２に記載の単離および修飾されたＩＬ−２ポリペプチド。
【請求項４１】
ＩＬ−２Ｒβγに対する受容体シグナル伝達能力が減少した修飾されたＩＬ−２ポリペプチドは、ＣＤ４＋Ｔ制御性（Ｔｒｅｇ）細胞を拡張することができる、請求項１または２に記載の単離および修飾されたＩＬ−２ポリペプチド。
【請求項４２】
抱合部分は、ＩＬ−２Ｒβγを用いてＩＬ−２の受容体シグナル伝達能力を損なうか遮断し、あるいはＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒβ複合体へのＩＬ−２Ｒγサブユニットの動員を減少させる、請求項１７に記載の単離および修飾されたＩＬ−２ポリペプチド。
【請求項４３】
修飾されたＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒαβγ複合体によるＣＤ４＋  Ｔｒｅｇ細胞増殖は、野生型のＩＬ−２ポリペプチドの４＋  Ｔｒｅｇ細胞増殖と同等以上である、請求項１または２に記載の単離および修飾されたＩＬ−２ポリペプチド。
【請求項４４】
修飾されたＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒαβγ複合体は、動物モデルにおいて疾患経過を調節するのに十分な集団に対するＣＤ４＋  Ｔｒｅｇ細胞の増殖を引き起こす、請求項１または２に記載の単離および修飾されたＩＬ−２ポリペプチド。
【請求項４５】
修飾されたＩＬ−２ポリペプチドは、ＩＬ−２Ｒβγに対する第１の受容体シグナル伝達能力を示し、ＩＬ−２Ｒαβγに対する第２の受容体シグナル伝達能力を示し、ここで、第１の受容体シグナル伝達能力は、第２の受容体シグナル伝達能力よりも、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍以下である、請求項１または２に記載の単離および修飾されたＩＬ−２ポリペプチド。
【請求項４６】
修飾されたＩＬ−１ポリペプチドの第１の受容体シグナル伝達能力は、ＩＬ−２Ｒβγに対する野生型のＩＬ−２ポリペプチドの受容体シグナル伝達能力よりも低い、請求項４５に記載の単離および修飾されたＩＬ−２ポリペプチド。
【請求項４７】
修飾されたＩＬ−２ポリペプチドの第２の受容体シグナル伝達能力は、ＩＬ−２Ｒαβγに対する野生型のＩＬ−２ポリペプチドの受容体シグナル伝達能力よりも低い、請求項４５に記載の単離および修飾されたＩＬ−２ポリペプチド。
【請求項４８】
修飾されたＩＬ−２ポリペプチドはさらに、インターロイキン２αβγ受容体（ＩＬ−２Ｒαβγ）の活性化に結びつくＩＬ−２ポリペプチドへのＩＬ−２Ｒαサブユニットの動員の増加をもたらし、および、動員の増加は、野生型のＩＬ−２ポリペプチドによるＩＬ−２Ｒαサブユニットの動員と比較される、請求項１に記載の単離および修飾されたＩＬ−２ポリペプチド。
【請求項４９】
修飾されたＩＬ−２ポリペプチドはさらに、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒβ複合体へのＩＬ−２Ｒγサブユニットの動員の減少をもたらし、減少した動員は、野生型のＩＬ−２ＲポリペプチドによるＩＬ−２Ｒβサブユニットおよび／またはＩＬ−２Ｒγサブユニットの動員と比較される、請求項２に記載の単離および修飾されたＩＬ−２ポリペプチド。
【請求項５０】
インターロイキン２αβγ受容体（ＩＬ−２Ｒαβγ）結合タンパク質であって、ここで、前記結合タンパク質のインターロイキン２βγ受容体（ＩＬ−２Ｒβγ）の受容体シグナル伝達能力は、野生型のヒトＩＬ−２（ｈＩＬ−２）の受容体シグナル伝達能力未満であり、および、前記結合タンパク質は、少なくとも１つの非天然アミノ酸を含む、インターロイキン２αβγ受容体（ＩＬ−２Ｒαβγ）結合タンパク質。
【請求項５１】
インターロイキン２αβγ受容体（ＩＬ−２Ｒαβγ）結合タンパク質であって、前記結合タンパク質によるＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒβ複合体へのＩＬ−２Ｒγサブユニットの動員は、野生型ヒトＩＬ−２（ｈＩＬ−２）の動員未満であり、および、前記結合タンパク質は、少なくとも１つの非天然アミノ酸を含む、インターロイキン２αβγ受容体（ＩＬ−２Ｒαβγ）結合タンパク質。
【請求項５２】
前記結合タンパク質は、修飾されたＩＬ−２ポリペプチドあるいはその機能的に活性なフラグメントであり、修飾されたＩＬ−２ポリペプチドは、少なくとも１つの非天然アミノ酸を含む、請求項５０または５１に記載のＩＬ−２Ｒαβγ結合タンパク質。
【請求項５３】
非天然アミノ酸とＩＬ−２Ｒαβγを含む修飾されたＩＬ−２ポリペプチドを含むＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒαβγ複合体であって、ここで、修飾されたＩＬ−２ポリペプチドは、ＩＬ−２Ｒβγへの減少した受容体シグナル伝達能力を有し、および、減少した受容体シグナル伝達能力は、野生型のＩＬ−２ポリペプチドとＩＬ−２Ｒβγとの間の結合親和性と比較される、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒαβγ複合体。
【請求項５４】
非天然アミノ酸とＩＬ−２Ｒαβγを含む修飾されたＩＬ−２ポリペプチドを含むＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒαβγ複合体であって、前記修飾されたＩＬ−２ポリペプチドによるＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒβ複合体へのＩＬ−２Ｒγサブユニットの動員は、野生型のＩＬ−２ポリペプチドの動員未満である、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒαβγ複合体。
【請求項５５】
前記修飾されたＩＬ−２ポリペプチドは、非天然アミノ酸に共有結合された抱合部分をさらに含む、請求項５３または５４に記載のＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒαβγ複合体。
【請求項５６】
細胞集団においてＣＤ４＋  Ｔｒｅｇ細胞を選択的に拡張するＣＤ４＋  Ｔｒｅｇ細胞アクチベーターであって、ここで、前記アクチベーターは、少なくとも１つの非天然アミノ酸を含む修飾されたＩＬ−２ポリペプチドを含む、ＣＤ４＋  Ｔｒｅｇ細胞アクチベーター。
【請求項５７】
野生型のＩＬ−２ポリペプチドと接触したＣＤ３＋細胞集団におけるＣＤ８＋エフェクターＴ細胞および／またはナチュラルキラー細胞の拡張と比較して、前記アクチベーターが前記ＣＤ３＋細胞集団に接しているとき、前記アクチベーターは、ＣＤ３＋細胞集団において２０％、１５％、１０％、５％、１％、あるいは０．１％未満、ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞および／またはナチュラルキラー細胞を拡張する、請求項５６に記載のＣＤ４＋  Ｔｒｅｇ細胞アクチベーター。
【請求項５８】
前記アクチベーターは、ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞および／またはナチュラルキラー細胞を拡張しない、請求項５６に記載のＣＤ４＋  Ｔｒｅｇ細胞アクチベーター。
【請求項５９】
前記細胞集団はインビボの細胞集団である、請求項５６に記載のＣＤ４＋  Ｔｒｅｇ細胞アクチベーター。
【請求項６０】
前記細胞集団はインビトロの細胞集団である、請求項５６に記載のＣＤ４＋  Ｔｒｅｇ細胞アクチベーター。
【請求項６１】
前記細胞集団はエクスビボの細胞集団である、請求項５６に記載のＣＤ４＋  Ｔｒｅｇ細胞アクチベーター。
【請求項６２】
医薬組成物であって、請求項１−４９の単離および修飾されたＩＬ−２ポリペプチド、請求項５０−５２のＩＬ−２Ｒαβγ結合タンパク質、あるいは請求項５６−６１のＣＤ４＋  Ｔｒｅｇ細胞；および、薬学的に許容可能な賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項６３】
前記医薬組成物は全身送達のために製剤化される、請求項６２に記載の医薬組成物。
【請求項６４】
前記医薬組成物は非経口投与のために製剤化される、請求項６２に記載の医薬組成物。
【請求項６５】
被験体の自己免疫疾患あるいは障害を処置する方法であって、治療上有効な量の、請求項１または２の単離および修飾されたＩＬ−２ポリペプチド、請求項５０または５１のＩＬ−２Ｒαβγ結合タンパク質、請求項５６のＣＤ４＋  Ｔｒｅｇ細胞、あるいは請求項６２の医薬組成物を、被験体に投与する工程を含む、方法。
【請求項６６】
自己免疫疾患または障害は、円形脱毛症、自己免疫溶血性貧血、自己免疫性肝炎、皮膚筋炎、１型糖尿病、若年性特発性関節炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、特発性血小板減少性紫斑病、重症筋無力症、多発性硬化症、天疱瘡／類天疱瘡、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、関節リウマチ、強皮症、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、甲状腺炎、ブドウ膜炎、白斑、あるいはヴェーゲナー肉芽腫症を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
追加の治療剤を投与する工程をさらに含む、請求項６５または６６に記載の方法。
【請求項６８】
ＩＬ−２抱合体と追加の治療剤は同時に投与される、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
ＩＬ−２抱合体と追加の治療剤は順次投与される、請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
ＩＬ−２抱合体は追加の治療剤の前に投与される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
ＩＬ−２抱合体は追加の治療剤の投与後に投与される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
被験体はヒトである、請求項６５−７１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７３】
ＣＤ４＋制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞集団を拡張する方法であって、ＩＬ−２Ｒαβγを有する複合体の形成を誘導するのに十分な時間にわたって、請求項１または２の単離および修飾されたＩＬ−２ポリペプチド、請求項５０または５１のＩＬ−２Ｒαβγ結合タンパク質、請求項５６のＣＤ４＋  Ｔｒｅｇ細胞、あるいは請求項６２の医薬組成物に、細胞を接触させる工程であって、それによって、Ｔｒｅｇ細胞集団の拡張を刺激する、工程を含む、方法。
【請求項７４】
前記方法はインビボの方法である、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記方法はインビトロの方法である、請求項７３に記載の方法。
【請求項７６】
前記方法はエクスビボの方法である、請求項７３に記載の方法。
【請求項７７】
請求項１−４９の単離および修飾されたＩＬ−２ポリペプチド、請求項５０−５２のＩＬ−２Ｒαβγ結合タンパク質、請求項５６−６１のＣＤ４＋  Ｔｒｅｇ細胞、あるいは請求項６２−６４の医薬組成物を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、２０１７年８月３日に出願された米国仮特許出願第６２／５４０，７８１号の利益を主張し、その全体は引用によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は配列表を包含しており、これは、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、その全体を引用することで本明細書に組み込まれる。２０１８年８月３日に作成された上記ＡＳＣＩＩのコピーは、４６０８５−７１０＿６０２＿ＳＬ．ｔｘｔのファイル名であり、３，７０３バイトのサイズである。
【背景技術】
【０００３】
Ｔ細胞の特徴的な集団は、免疫の恒常性と耐性を維持するために免疫系を調節する。例えば、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞は、病的な自己反応性を予防することによって免疫系による不適切な反応を防ぎ、その一方で、細胞傷害性Ｔ細胞は感染細胞および／または癌細胞を標的とする。いくつかの例では、Ｔ細胞の異なる集団の調節は、疾患または徴候の処置に関するオプションを提供する。
【発明の概要】
【０００４】
ある実施形態では、サイトカイン抱合体および１つ以上の兆候の処置におけるその使用が本明細書に開示される。いくつかの実施形態において、インターロイキン２（ＩＬ−２）抱合体と１つ以上の兆候の処置におけるその使用も本明細書に記載される。いくつかの例において、１以上の徴候は自己免疫疾患を含む。場合によっては、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）集団を特異的に刺激または拡張するために、ＩＬ−２とＩＬ−２受容体との間の相互作用を調節するためのＩＬ−２抱合体が本明細書に記載される。場合によっては、延長されたインビボ半減期、減少した毒性、および／または拡大された治療濃度域を有する、ＩＬ−２抱合体が本明細書に記載される。さらなる場合において、本明細書に記載される１つ以上のインターロイキン抱合体（例えば、ＩＬ−２抱合体）を含む医薬組成物およびキットも本明細書に記載される。
【０００５】
ある実施形態では、単離および修飾されたインターロイキン２（ＩＬ−２）ポリペプチドが本明細書に開示され、上記インターロイキン２（ＩＬ−２）ポリペプチドは、インターロイキン２受容体βγ（ＩＬ−２Ｒβγ）に対する受容体シグナル伝達能力を減少させるか、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒβ複合体へのＩＬ−２Ｒγサブユニットの動員を減少させるが、インターロイキン２αβγ受容体（ＩＬ−２Ｒαβγ）の有意な活性化を維持するある位置における少なくとも１つの非天然アミノ酸を含み、減少した受容体シグナル伝達能力は、野生型のＩＬ−２ポリペプチドとＩＬ−２Ｒβγとの間の受容体シグナル伝達能力と比較され、および、動員は野生型のＩＬ−２ポリペプチドによるＩＬ−２Ｒγサブユニットの動員と比較される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの非天然アミノ酸の位置は、Ｐ２、Ｔ３、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６、Ｔ７、Ｋ８、Ｋ９、Ｑ１１、Ｌ１２、Ｅ１５、Ｈ１６、Ｌ１８、Ｌ１９、Ｄ２０、Ｑ２２、Ｍ２３、Ｎ２６、Ｇ２７、Ｎ２９、Ｎ３０、Ｙ３１、Ｋ３２、Ｋ３５、Ｔ３７、Ｍ４６、Ｋ４７、Ｋ４８、Ａ５０、Ｔ５１、Ｅ５２、Ｋ５３、Ｈ５５、Ｑ５７、Ｅ６０、Ｅ６７、Ｎ７１、Ｑ７４、Ｓ７５、Ｋ７６、Ｎ７７、Ｆ７８、Ｈ７９、Ｒ８１、Ｐ８２、Ｒ８３、Ｄ８４、Ｓ８７、Ｎ８８、Ｎ８９、Ｖ９１、Ｉ９２、Ｌ９４、Ｅ９５、Ｋ９７、Ｇ９８、Ｓ９９、Ｅ１００、Ｔ１０１、Ｔ１０２、Ｆ１０３、Ｍ１０４、Ｃ１０５、Ｅ１０６、Ｙ１０７、Ａ１０８、Ｄ１０９、Ｅ１１０、Ｔ１１１、Ａ１１２、Ｔ１１３、Ｅ１１６、Ｎ１１９、Ｒ１２０、Ｔ１２３、Ａ１２５、Ｑ１２６、Ｓ１２７、Ｓ１３０、Ｔ１３１、Ｌ１３２、および、Ｔ１３３から選択され、アミノ酸残基の番号はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対応する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの非天然アミノ酸の位置は、Ｋ８、Ｋ９、Ｑ１１、Ｌ１２、Ｅ１５、Ｈ１６、Ｌ１８、Ｌ１９、Ｄ２０、Ｑ２２、Ｍ２３、Ｎ２６、Ｒ８１、Ｄ８４、Ｓ８７、Ｎ８８、Ｖ９１、Ｉ９２、Ｌ９４、Ｅ９５、Ｅ１１６、Ｎ１１９、Ｒ１２０、Ｔ１２３、Ａ１２５、Ｑ１２６、Ｓ１２７、Ｓ１３０、Ｔ１３１、Ｌ１３２、および、Ｔ１３３から選択され、アミノ酸残基の番号はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対応する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの非天然アミノ酸の位置は、Ｐ２、Ｔ３、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６、Ｔ７、Ｇ２７、Ｎ２９、Ｎ３０、Ｙ３１、Ｋ３２、Ｋ３５、Ｔ３７、Ｍ４６、Ｋ４７、Ｋ４８、Ａ５０、Ｔ５１、Ｅ５２、Ｋ５３、Ｈ５５、Ｑ５７、Ｅ６０、Ｅ６７、Ｎ７１、Ｑ７４、Ｓ７５、Ｋ７６、Ｎ７７、Ｆ７８、Ｈ７９、Ｐ８２、Ｒ８３、Ｎ８９、Ｋ９７、Ｇ９８、Ｓ９９、Ｅ１００、Ｔ１０１、Ｔ１０２、Ｆ１０３、Ｍ１０４、Ｃ１０５、Ｅ１０６、Ｙ１０７、Ａ１０８、Ｄ１０９、Ｅ１１０、Ｔ１１１、Ａ１１２、および、Ｔ１１３から選択され、アミノ酸残基の番号はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対応する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの非天然アミノ酸の位置は、Ｋ８、Ｋ９、Ｌ１２、Ｅ１５、Ｈ１６、Ｌ１９、Ｄ２０、Ｑ２２、Ｍ２３、Ｎ２６、Ｄ８４、Ｎ８８、Ｅ９５、ａｎｄ  Ｑ１２６から選択され、アミノ酸残基の番号はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対応する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの非天然アミノ酸の位置は、Ｋ８、Ｋ９、およびＨ１６から選択され、アミノ酸残基の番号はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対応する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの非天然アミノ酸の位置は、Ｑ２２、Ｎ２６、Ｎ８８、およびＱ１２６から選択され、アミノ酸残基の番号はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対応する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの非天然アミノ酸の位置は、Ｅ１５、Ｄ２０、Ｄ８４、およびＥ９５から選択され、アミノ酸残基の番号はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対応する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの非天然アミノ酸の位置は、Ｌ１２、Ｌ１９、およびＭ２３から選択され、アミノ酸残基の番号はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対応する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの非天然アミノ酸の位置は、Ｑ２２とＮ２６から選択され、アミノ酸残基の番号はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対応する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの非天然アミノ酸は：リジンアナログであり；システインアナログあるいはヒスチジンアナログであり；芳香族側鎖を含み；アジド基を含み；アルキン基を含み；あるいは、アルデヒドまたはケトン基を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの非天然アミノ酸は芳香族側鎖を含まない。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの非天然アミノ酸は、Ｎ６−アジドエトキシ−Ｌ−リジン（ＡｚＫ）、Ｎ６−プロパルギルエトキシ−Ｌ−リジン（ＰｒａＫ）、ＢＣＮ−Ｌ−リジン、ノルボルネンリジン、ＴＣＯリジン、メチルテトラジンリジン、アリルオキシカルボニルリジン、２−アミノ−８−オキソノナン酸、２−アミノ−８−オキソオクタン酸、ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジドメチル−Ｌ−フェニルアラニン（ｐＡＭＦ）、ｐ−ヨード−Ｌ−フェニルアラニン、ｍ−アセチルフェニルアラニン、２−アミノ−８−オキソノナン酸、ｐ−プロパギルオキシフェニルアラニン、ｐ−プロパルギル−フェニルアラニン、３−メチル−フェニルアラニン、Ｌ−ドパ、フッ素処理したフェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−アリルチロシン、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、ホスホノチロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃｐ−セリン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、２−アミノ−３−（（２−（（３−（ベンジルオキシ）−３−オキソプロピル）アミノ）エチル）セラニル）プロパン酸、２−アミノ−３−（フェニルセラニル）プロパン、または、セレノシステインを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの非天然アミノ酸は、直交ｔＲＮＡ合成酵素／ｔＲＮＡ対によって、修飾されたＩＬ−２ポリペプチドに組み込まれる。いくつかの実施形態において、直交合成酵素／ｔＲＮＡ対の直交のｔＲＮＡは、少なくとも１つの非天然核酸塩基を含む。いくつかの実施形態において、修飾されたＩＬ−２���リペプチドは、少なくとも１つの非天然アミノ酸を介して抱合部分に共有結合される。いくつかの実施形態において、抱合部分は水溶性ポリマー、脂質、タンパク質、あるいはペプチドを含む。いくつかの実施形態において、水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（プロピレングリコール）（ＰＰＧ）、エチレングリコールとプロピレングリコールのコポリマー、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィンアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリルアミド）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリラート）、ポリ（サッカライド）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）、あるいはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、水溶性ポリマーはＰＥＧ分子を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子は線形ＰＥＧである。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子は分岐ＰＥＧである。いくつかの実施形態において、水溶性ポリマーは多糖類を含む。いくつかの実施形態において、多糖類はデキストラン、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ヒアルロン酸（ＨＡ）、アミロース、ヘパリン、ヘパラン硫酸（ＨＳ）、デキストリン、あるいはヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）を含む。いくつかの実施形態では、脂質は脂肪酸を含む。いくつかの実施形態において、脂肪酸は、約６から約２６の炭素原子、約６から約２４の炭素原子、約６から約２２の炭素原子、約６から約２０の炭素原子、約６から約１８の炭素原子、約２０から約２６の炭素原子、約１２から約２６の炭素原子、約１２から約２４の炭素原子、約１２から約２２の炭素原子、約１２から約２０の炭素原子、あるいは、約１２から約１８の炭素原子を含む。いくつかの実施形態では、脂肪酸は飽和脂肪酸である。いくつかの実施形態において、タンパク質は、アルブミン、トランスフェリン、あるいはトランスサイレチンを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、抗体またはその結合フラグメントを含む。いくつかの実施形態において、抗体あるいはその結合フラグメントは、抗体のＦｃ部分を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、ＸＴＥＮペプチド、グリシンに富んだホモアミノ酸ポリマー（ＨＡＰ）、ＰＡＳポリペプチド、エラスチン様ポリペプチド（ＥＬＰ）、ＣＴＰペプチド、あるいはゼラチン様タンパク質（ＧＬＫ）ポリマーを含む。いくつかの実施形態において、抱合部分は、リンカーを介して修飾されたＩＬ−２の少なくとも１つの非天然アミノ酸に間接的に結合する。いくつかの実施形態において、リンカーは、ホモ二機能性リンカー、ヘテロ二機能性リンカー、ゼロ長リンカー、切断あるいは非切断ジペプチドリンカー、マレイミド基、スペーサー、あるいはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、単離および修飾されたＩＬ−２ポリペプチドは、ＩＬ−２Ｒβγに対する受容体シグナル伝達能力が減少しており、受容体シグナル伝達能力の減少は、野生型のＩＬ−２Ｒβγと比較して、約１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、３０倍、５０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、１０００倍、またはそれ以上である。いくつかの実施形態において、修飾されたＩＬ−２ポリペプチドは：完全長のＩＬ−２ポリペプチドの機能的に活性なフラグメント；組み換えＩＬ−２ポリペプチド；あるいは、組み換えヒトＩＬ−２ポリペプチドである。いくつかの実施形態において、修飾されたＩＬ−２ポリペプチドは、Ｎ末端欠失、Ｃ末端欠失、あるいはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、Ｎ末端欠失は、Ｎ末端から最初の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、あるいは３０の残基の欠失を含み、ここで、残基位置は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置を基準にしている。いくつかの実施形態において、Ｃ末端欠失は、Ｃ末端から最後の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、あるいはそれ以上の残基の欠失を含み、ここで、残基位置は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置を基準にしている。いくつかの実施形態において、機能的に活性なフラグメントは、ＩＬ−２領域１０−１３３、２０−１３３、３０−１３３、１０−１３０、２０−１３０、３０−１３０、１０−１２５、２０−１２５、３０−１２５、１−１３０、あるいは１−１２５を含み、ここで、残基位置は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置を基準にしている。いくつかの実施形態では、修飾されたＩＬ−２ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、あるいは９９％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２Ｒβγに対する受容体シグナル伝達能力が減少した修飾されたＩＬ−２ポリペプチドは、ＣＤ４＋Ｔ制御性（Ｔｒｅｇ）細胞を拡張することができる。いくつかの実施形態において、抱合部分は、ＩＬ−２Ｒβγを用いてＩＬ−２の受容体シグナル伝達能力を損なうか遮断し、あるいはＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒγ複合体へのＩＬ−２Ｒγサブユニットの動員を減少させる。いくつかの実施形態において、修飾されたＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒαβγ複合体によるＣＤ４＋  Ｔｒｅｇ細胞増殖は、野生型のＩＬ−２ポリペプチドの４＋  Ｔｒｅｇ細胞増殖と同等以上である。いくつかの実施形態において、修飾されたＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒαβγ複合体は、動物モデルにおいて疾患経過を調節するのに十分な集団に対するＣＤ４＋  Ｔ
ｒｅｇ細胞の増殖を引き起こす。いくつかの実施形態において、修飾されたＩＬ−２ポリペプチドは、ＩＬ−２Ｒβγに対する第１の受容体シグナル伝達能力を示し、ＩＬ−２Ｒαβγに対する第２の受容体シグナル伝達能力を示し、ここで、第１の受容体シグナル伝達能力は、第２の受容体シグナル伝達能力よりも、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍以下である。いくつかの実施形態において、修飾されたＩＬ−２ポリペプチドの第１の受容体シグナル伝達能力は、ＩＬ−２Ｒβγに対する野生型のＩＬ−２ポリペプチドの受容体シグナル伝達能力よりも低い。いくつかの実施形態において、修飾されたＩＬ−２ポリペプチドの第２の受容体シグナル伝達能力は、ＩＬ−２Ｒαβγに対する野生型のＩＬ−２ポリペプチドの受容体シグナル伝達能力よりも低い。いくつかの実施形態において、修飾されたＩＬ−２ポリペプチドはさらに、インターロイキン２αβγ受容体（ＩＬ−２Ｒαβγ）の活性化に結びつくＩＬ−２ポリペプチドへのＩＬ−２Ｒαサブユニットの動員の増加をもたらし、および、動員の増加は、野生型のＩＬ−２ポリペプチドによるＩＬ−２Ｒαサブユニットの動員と比較される。いくつかの実施形態において、修飾されたＩＬ−２ポリペプチドはさらに、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒβ複合体へのＩＬ−２Ｒγサブユニットの動員の減少をもたらし、減少した動員は、野生型のＩＬ−２ＲポリペプチドによるＩＬ−２Ｒβサブユニットおよび／またはＩＬ−２Ｒγサブユニットの動員と比較される。
【０００６】
ある実施形態では、単離および修飾されたインターロイキン２（ＩＬ−２）ポリペプチドが本明細書に開示され、上記インターロイキン２（ＩＬ−２）ポリペプチドは、インターロイキン２αβγ受容体（ＩＬ−２Ｒαβγ）の活性化に結びつく、ＩＬ−２ポリペプチドに対するＩＬ−２Ｒαサブユニットの動員を増加させる位置の少なくとも１つの非天然アミノ酸を含み、および、動員の増加は、野生型のＩＬ−２ポリペプチドによるＩＬ−２Ｒαサブユニットの動員と比較される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの非天然アミノ酸の位置は、Ｐ２、Ｔ３、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６、Ｔ７、Ｋ８、Ｋ９、Ｑ１１、Ｌ１２、Ｅ１５、Ｈ１６、Ｌ１８、Ｌ１９、Ｄ２０、Ｑ２２、Ｍ２３、Ｎ２６、Ｇ２７、Ｎ２９、Ｎ３０、Ｙ３１、Ｋ３２、Ｋ３５、Ｔ３７、Ｍ４６、Ｋ４７、Ｋ４８、Ａ５０、Ｔ５１、Ｅ５２、Ｋ５３、Ｈ５５、Ｑ５７、Ｅ６０、Ｅ６７、Ｎ７１、Ｑ７４、Ｓ７５、Ｋ７６、Ｎ７７、Ｆ７８、Ｈ７９、Ｒ８１、Ｐ８２、Ｒ８３、Ｄ８４、Ｓ８７、Ｎ８８、Ｎ８９、Ｖ９１、Ｉ９２、Ｌ９４、Ｅ９５、Ｋ９７、Ｇ９８、Ｓ９９、Ｅ１００、Ｔ１０１、Ｔ１０２、Ｆ１０３、Ｍ１０４、Ｃ１０５、Ｅ１０６、Ｙ１０７、Ａ１０８、Ｄ１０９、Ｅ１１０、Ｔ１１１、Ａ１１２、Ｔ１１３、Ｅ１１６、Ｎ１１９、Ｒ１２０、Ｔ１２３、Ａ１２５、Ｑ１２６、Ｓ１２７、Ｓ１３０、Ｔ１３１、Ｌ１３２、および、Ｔ１３３から選択され、アミノ酸残基の番号はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対応する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの非天然アミノ酸の位置は、Ｋ８、Ｋ９、Ｑ１１、Ｌ１２、Ｅ１５、Ｈ１６、Ｌ１８、Ｌ１９、Ｄ２０、Ｑ２２、Ｍ２３、Ｎ２６、Ｒ８１、Ｄ８４、Ｓ８７、Ｎ８８、Ｖ９１、Ｉ９２、Ｌ９４、Ｅ９５、Ｅ１１６、Ｎ１１９、Ｒ１２０、Ｔ１２３、Ａ１２５、Ｑ１２６、Ｓ１２７、Ｓ１３０、Ｔ１３１、Ｌ１３２、および、Ｔ１３３から選択され、アミノ酸残基の番号はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対応する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの非天然アミノ酸の位置は、Ｐ２、Ｔ３、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６、Ｔ７、Ｇ２７、Ｎ２９、Ｎ３０、Ｙ３１、Ｋ３２、Ｋ３５、Ｔ３７、Ｍ４６、Ｋ４７、Ｋ４８、Ａ５０、Ｔ５１、Ｅ５２、Ｋ５３、Ｈ５５、Ｑ５７、Ｅ６０、Ｅ６７、Ｎ７１、Ｑ７４、Ｓ７５、Ｋ７６、Ｎ７７、Ｆ７８、Ｈ７９、Ｐ８２、Ｒ８３、Ｎ８９、Ｋ９７、Ｇ９８、Ｓ９９、Ｅ１００、Ｔ１０１、Ｔ１０２、Ｆ１０３、Ｍ１０４、Ｃ１０５、Ｅ１０６、Ｙ１０７、Ａ１０８、Ｄ１０９、Ｅ１１０、Ｔ１１１、Ａ１１２、および、Ｔ１１３から選択され、アミノ酸残基の番号はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対応する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの非天然アミノ酸の位置は、Ｋ８、Ｋ９、Ｌ１２、Ｅ１５、Ｈ１６、Ｌ１９、Ｄ２０、Ｑ２２、Ｍ２３、Ｎ２６、Ｄ８４、Ｎ８８、Ｅ９５、および、Ｑ１２６から選択され、アミノ酸残基の番号はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対応する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの非天然アミノ酸の位置は、Ｋ８、Ｋ９、およびＨ１６から選択され、アミノ酸残基の番号はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対応する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの非天然アミノ酸の位置は、Ｑ２２、Ｎ２６、Ｎ８８、およびＱ１２６から選択され、アミノ酸残基の番号はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対応する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの非天然アミノ酸の位置は、Ｅ１５、Ｄ２０、Ｄ８４、およびＥ９５から選択され、アミノ酸残基の番号はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対応する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの非天然アミノ酸の位置は、Ｌ１２、Ｌ１９、およびＭ２３から選択され、アミノ酸残基の番号はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対応する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの非天然アミノ酸の位置は、Ｑ２２とＮ２６から選択され、アミノ酸残基の番号はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対応する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの非天然アミノ酸は：リジンアナログであり；システインアナログあるいはヒスチジンアナログであり；芳香族側鎖を含み；アジド基を含み；アルキン基を含み；あるいは、アルデヒドまたはケトン基を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの非天然アミノ酸は芳香族側鎖を含まない。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの非天然アミノ酸は、Ｎ６−アジドエトキシ−Ｌ−リジン（ＡｚＫ）、Ｎ６−プロパルギルエトキシ−Ｌ−リジン（ＰｒａＫ）、ＢＣＮ−Ｌ−リジン、ノルボルネンリジン、ＴＣＯリジン、メチルテトラジンリジン、アリルオキシカルボニルリジン、２−アミノ−８−オキソノナン酸、２−アミノ−８−オキソオクタン酸、ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジドメチル−Ｌ−フェニルアラニン（ｐＡＭＦ）、ｐ−ヨード−Ｌ−フェニルアラニン、ｍ−アセチルフェニルアラニン、２−アミノ−８−オキソノナン酸、ｐ−プロパギルオキシフェニルアラニン、ｐ−プロパルギル−フェニルアラニン、３−メチル−フェニルアラニン、Ｌ−ドパ、フッ素処理したフェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−アリルチロシン、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、ホスホノチロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃｐ−セリン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、２−アミノ−３−（（２−（（３−（ベンジルオキシ）−３−オキソプロピル）アミノ）エチル）セラニル）プロパン酸、２−アミノ−３−（フェニルセラニル）プロパン、または、セレノシステインを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの非天然アミノ酸は、直交ｔＲＮＡ合成酵素／ｔＲＮＡ対によって、修飾されたＩＬ−２ポリペプチドに組み込まれる。いくつかの実施形態において、直交合成酵素／ｔＲＮＡ対の直交のｔＲＮＡは、少なくとも１つの非天然核酸塩基を含む。いくつかの実施形態において、修飾されたＩＬ−２ポリペプチドは、少なくとも１つの非天然アミノ酸を介して抱合部分に共有結合される。いくつかの実施形態において、抱合部分は水溶性ポリマー、脂質、タンパク質、あるいはペプチドを含む。いくつかの実施形態において、水溶性ポリマーは��ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（プロピレングリコール）（ＰＰＧ）、エチレングリコールとプロピレングリコールのコポリマー、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィンアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリルアミド）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリラート）、ポリ（サッカライド）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）、あるいはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、水溶性ポリマーはＰＥＧ分子を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子は線形ＰＥＧである。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子は分岐ＰＥＧである。いくつかの実施形態において、水溶性ポリマーは多糖類を含む。いくつかの実施形態において、多糖類はデキストラン、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ヒアルロン酸（ＨＡ）、アミロース、ヘパリン、ヘパラン硫酸（ＨＳ）、デキストリン、あるいはヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）を含む。いくつかの実施形態では、脂質は脂肪酸を含む。いくつかの実施形態において、脂肪酸は、約６から約２６の炭素原子、約６から約２４の炭素原子、約６から約２２の炭素原子、約６から約２０の炭素原子、約６から約１８の炭素原子、約２０から約２６の炭素原子、約１２から約２６の炭素原子、約１２から約２４の炭素原子、約１２から約２２の炭素原子、約１２から約２０の炭素原子、あるいは、約１２から約１８の炭素原子を含む。いくつかの実施形態では、脂肪酸は飽和脂肪酸である。いくつかの実施形態において、タンパク質は、アルブミン、トランスフェリン、あるいはトランスサイレチンを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、抗体またはその結合フラグメントを含む。いくつかの実施形態において、抗体あるいはその結合フラグメントは、抗体のＦｃ部分を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、ＸＴＥＮペプチド、グリシンに富んだホモアミノ酸ポリマー（ＨＡＰ）、ＰＡＳポリペプチド、エラスチン様ポリペプチド（ＥＬＰ）、ＣＴＰペプチド、あるいはゼラチン様タンパク質（ＧＬＫ）ポリマーを含む。いくつかの実施形態において、抱合部分は、リンカーを介して修飾されたＩＬ−２の少なくとも１つの非天然アミノ酸に間接的に結合する。いくつかの実施形態において、リンカーは、ホモ二機能性リンカー、ヘテロ二機能性リンカー、ゼロ長リンカー、切断あるいは非切断ジペプチドリンカー、マレイミド基、スペーサー、あるいはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、単離および修飾されたＩＬ−２ポリペプチドは、ＩＬ−２Ｒβγに対する受容体シグナル伝達能力が減少しており、受容体シグナル伝達能力の減少は、野生型のＩＬ−２Ｒβγと比較して、約１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、３０倍、５０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、１０００倍、またはそれ以上である。いくつかの実施形態において、修飾されたＩＬ−２ポリペプチドは：完全長のＩＬ−２ポリペプチドの機能的に活性なフラグメント；組み換えＩＬ−２ポリペプチド；あるいは、組み換えヒト���Ｌ−２ポリペプチドである。いくつかの実施形態において、修飾されたＩＬ−２ポリペプチドは、Ｎ末端欠失、Ｃ末端欠失、あるいはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、Ｎ末端欠失は、Ｎ末端から最初の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、あるいは３０の残基の欠失を含み、ここで、残基位置は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置を基準にしている。いくつかの実施形態において、Ｃ末端欠失は、Ｃ末端から最後の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、あるいはそれ以上の残基の欠失を含み、ここで、残基位置は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置を基準にしている。いくつかの実施形態において、機能的に活性なフラグメントは、ＩＬ−２領域１０−１３３、２０−１３３、３０−１３３、１０−１３０、２０−１３０、３０−１３０、１０−１２５、２０−１２５、３０−１２５、１−１３０、あるいは１−１２５を含み、ここで、残基位置は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置を基準にしている。いくつかの実施形態では、修飾されたＩＬ−２ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、あるいは９９％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２Ｒβγに対する受容体シグナル伝達能力が減少した修飾されたＩＬ−２ポリペプチドは、ＣＤ４＋Ｔ制御性（Ｔｒｅｇ）細胞を拡張することができる。いくつかの実施形態において、抱合部分は、ＩＬ−２Ｒβγを用いてＩＬ−２の受容体シグナル伝達能力を損なうか遮断し、あるいはＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒγ複合体へのＩＬ−２Ｒγサブユニットの動員を減少させる。いくつかの実施形態において、修飾されたＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒαβγ複合体によるＣＤ４＋  Ｔｒｅｇ細胞増殖は、野生型のＩＬ−２ポリペプチドの４＋  Ｔｒｅｇ細胞増殖と同等以上である。いくつかの実施形態において、修飾されたＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒαβγ複合体は、動物モデルにおいて疾患経過を調節するのに十分な集団に対するＣＤ４＋  Ｔｒｅｇ細胞の増殖を引き起こす。いくつかの実施形態において、修飾されたＩＬ−２ポリペプチドは、ＩＬ−２Ｒβγに対する第１の受容体シグナル伝達能力を示し、ＩＬ−２Ｒαβγに対する第２の受容体シグナル伝達能力を示し、ここで、第１の受
容体シグナル伝達能力は、第２の受容体シグナル伝達能力よりも、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍以下である。いくつかの実施形態において、修飾されたＩＬ−２ポリペプチドの第１の受容体シグナル伝達能力は、ＩＬ−２Ｒβγに対する野生型のＩＬ−２ポリペプチドの受容体シグナル伝達能力よりも低い。いくつかの実施形態において、修飾されたＩＬ−２ポリペプチドの第２の受容体シグナル伝達能力は、ＩＬ−２Ｒαβγに対する野生型のＩＬ−２ポリペプチドの受容体シグナル伝達能力よりも低い。いくつかの実施形態において、修飾されたＩＬ−２ポリペプチドはさらに、インターロイキン２αβγ受容体（ＩＬ−２Ｒαβγ）の活性化に結びつくＩＬ−２ポリペプチドへのＩＬ−２Ｒαサブユニットの動員の増加をもたらし、および、動員の増加は、野生型のＩＬ−２ポリペプチドによるＩＬ−２Ｒαサブユニットの動員と比較される。いくつかの実施形態において、修飾されたＩＬ−２ポリペプチドはさらに、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒβ複合体へのＩＬ−２Ｒγサブユニットの動員の減少をもたらし、減少した動員は、野生型のＩＬ−２ＲポリペプチドによるＩＬ−２Ｒβサブユニットおよび／またはＩＬ−２Ｒγサブユニットの動員と比較される。
【０００７】
ある実施形態では、単離および修飾されたインターロイキン２（ＩＬ−２）ポリペプチドが本明細書に開示され、上記インターロイキン２（ＩＬ−２）ポリペプチドは、ＩＬ−２Ｒポリペプチドとインターロイキン２受容体βγ（ＩＬ−２Ｒβγ）との間の結合を減少させるか、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒβ複合体へのＩＬ−２Ｒγサブユニットの動員を減少させるが、インターロイキン２αβγ受容体（ＩＬ−２Ｒαβγ）の活性化を損なわないある位置における少なくとも１つの非天然アミノ酸を含み、減少した結合は、野生型のＩＬ−２ポリペプチドとＩＬ−２Ｒβγとの間の結合と比較され、および、減少した動員は野生型のＩＬ−２ポリペプチドによるＩＬ−２Ｒγサブユニットの動員と比較される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの非天然アミノ酸の位置は、Ｐ２、Ｔ３、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６、Ｔ７、Ｋ８、Ｋ９、Ｑ１１、Ｌ１２、Ｅ１５、Ｈ１６、Ｌ１８、Ｌ１９、Ｄ２０、Ｑ２２、Ｍ２３、Ｎ２６、Ｇ２７、Ｎ２９、Ｎ３０、Ｙ３１、Ｋ３２、Ｋ３５、Ｔ３７、Ｍ４６、Ｋ４７、Ｋ４８、Ａ５０、Ｔ５１、Ｅ５２、Ｋ５３、Ｈ５５、Ｑ５７、Ｅ６０、Ｅ６７、Ｎ７１、Ｑ７４、Ｓ７５、Ｋ７６、Ｎ７７、Ｆ７８、Ｈ７９、Ｒ８１、Ｐ８２、Ｒ８３、Ｄ８４、Ｓ８７、Ｎ８８、Ｎ８９、Ｖ９１、Ｉ９２、Ｌ９４、Ｅ９５、Ｋ９７、Ｇ９８、Ｓ９９、Ｅ１００、Ｔ１０１、Ｔ１０２、Ｆ１０３、Ｍ１０４、Ｃ１０５、Ｅ１０６、Ｙ１０７、Ａ１０８、Ｄ１０９、Ｅ１１０、Ｔ１１１、Ａ１１２、Ｔ１１３、Ｅ１１６、Ｎ１１９、Ｒ１２０、Ｔ１２３、Ａ１２５、Ｑ１２６、Ｓ１２７、Ｓ１３０、Ｔ１３１、Ｌ１３２、および、Ｔ１３３から選択され、アミノ酸残基の番号はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対応する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの非天然アミノ酸の位置は、Ｋ８、Ｋ９、Ｑ１１、Ｌ１２、Ｅ１５、Ｈ１６、Ｌ１８、Ｌ１９、Ｄ２０、Ｑ２２、Ｍ２３、Ｎ２６、Ｒ８１、Ｄ８４、Ｓ８７、Ｎ８８、Ｖ９１、Ｉ９２、Ｌ９４、Ｅ９５、Ｅ１１６、Ｎ１１９、Ｒ１２０、Ｔ１２３、Ａ１２５、Ｑ１２６、Ｓ１２７、Ｓ１３０、Ｔ１３１、Ｌ１３２、および、Ｔ１３３から選択され、アミノ酸残基の番号はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対応する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの非天然アミノ酸の位置は、Ｐ２、Ｔ３、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６、Ｔ７、Ｇ２７、Ｎ２９、Ｎ３０、Ｙ３１、Ｋ３２、Ｋ３５、Ｔ３７、Ｍ４６、Ｋ４７、Ｋ４８、Ａ５０、Ｔ５１、Ｅ５２、Ｋ５３、Ｈ５５、Ｑ５７、Ｅ６０、Ｅ６７、Ｎ７１、Ｑ７４、Ｓ７５、Ｋ７６、Ｎ７７、Ｆ７８、Ｈ７９、Ｐ８２、Ｒ８３、Ｎ８９、Ｋ９７、Ｇ９８、Ｓ９９、Ｅ１００、Ｔ１０１、Ｔ１０２、Ｆ１０３、Ｍ１０４、Ｃ１０５、Ｅ１０６、Ｙ１０７、Ａ１０８、Ｄ１０９、Ｅ１１０、Ｔ１１１、Ａ１１２、および、Ｔ１１３から選択され、アミノ酸残基の番号はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対応する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの非天然アミノ酸の位置は、Ｋ８、Ｋ９、Ｌ１２、Ｅ１５、Ｈ１６、Ｌ１９、Ｄ２０、Ｑ２２、Ｍ２３、Ｎ２６、Ｄ８４、Ｎ８８、Ｅ９５、および、Ｑ１２６から選択され、アミノ酸残基の番号はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対応する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの非天然��ミノ酸の位置は、Ｋ８、Ｋ９、およびＨ１６から選択され、アミノ酸残基の番号はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対応する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの非天然アミノ酸の位置は、Ｑ２２、Ｎ２６、Ｎ８８、およびＱ１２６から選択され、アミノ酸残基の番号はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対応する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの非天然アミノ酸の位置は、Ｅ１５、Ｄ２０、Ｄ８４、およびＥ９５から選択され、アミノ酸残基の番号はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対応する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの非天然アミノ酸の位置は、Ｌ１２、Ｌ１９、およびＭ２３から選択され、アミノ酸残基の番号はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対応する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの非天然アミノ酸の位置は、Ｑ２２とＮ２６から選択され、アミノ酸残基の番号はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対応する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの非天然アミノ酸の位置は、Ｑ２２であり、アミノ酸残基の番号はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対応する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの非天然アミノ酸の位置は、Ｎ２６であり、アミノ酸残基の番号はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対応する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの非天然アミノ酸は：リジンアナログであり；システインアナログあるいはヒスチジンアナログであり；芳香族側鎖を含み；アジド基を含み；あるいは、アルデヒドまたはケトン基を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの非天然アミノ酸は芳香族側鎖を含まない。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの非天然アミノ酸は、Ｎ６−アジドエトキシ−Ｌ−リジン（ＡｚＫ）、Ｎ６−プロパルギルエトキシ−Ｌ−リジン（ＰｒａＫ）、ＢＣＮ−Ｌ−リジン、ノルボルネンリジン、ＴＣＯリジン、メチルテトラジンリジン、アリルオキシカルボニルリジン、２−アミノ−８−オキソノナン酸、２−アミノ−８−オキソオクタン酸、ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジドメチル−Ｌ−フェニルアラニン（ｐＡＭＦ）、ｐ−ヨード−Ｌ−フェニルアラニン、ｍ−アセチルフェニルアラニン、２−アミノ−８−オキソノナン酸、ｐ−プロパギルオキシフェニルアラニン、ｐ−プロパルギル−フェニルアラニン、３−メチル−フェニルアラニン、Ｌ−ドパ、フッ素処理したフェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−アリルチロシン、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、ホスホノチロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃｐ−セリン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、２−アミノ−３−（（２−（（３−（ベンジルオキシ）−３−オキソプロピル）アミノ）エチル）セラニル）プロパン酸、２−アミノ−３−（フェニルセラニル）プロパン、または、セレノシステインを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの非天然アミノ酸は、直交ｔＲＮＡ合成酵���／ｔＲＮＡ対によって、修飾されたＩＬ−２ポリペプチドに組み込まれる。いくつかの実施形態において、直交合成酵素／ｔＲＮＡ対の直交のｔＲＮＡは、少なくとも１つの非天然核酸塩基を含む。いくつかの実施形態において、修飾されたＩＬ−２ポリペプチドは、少なくとも１つの非天然アミノ酸を介して抱合部分に共有結合される。いくつかの実施形態において、抱合部分は水溶性ポリマー、脂質、タンパク質、あるいはペプチドを含む。いくつかの実施形態において、水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（プロピレングリコール）（ＰＰＧ）、エチレングリコールとプロピレングリコールのコポリマー、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィンアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリルアミド）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリラート）、ポリ（サッカライド）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）、あるいはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、水溶性ポリマーはＰＥＧ分子を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子は線形ＰＥＧである。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子は分岐ＰＥＧである。いくつかの実施形態において、水溶性ポリマーは多糖類を含む。いくつかの実施形態において、多糖類はデキストラン、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ヒアルロン酸（ＨＡ）、アミロース、ヘパリン、ヘパラン硫酸（ＨＳ）、デキストリン、あるいはヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）を含む。いくつかの実施形態では、脂質は脂肪酸を含む。いくつかの実施形態において、脂肪酸は、約６から約２６の炭素原子、約６から約２４の炭素原子、約６から約２２の炭素原子、約６から約２０の炭素原子、約６から約１８の炭素原子、約２０から約２６の炭素原子、約１２から約２６の炭素原子、約１２から約２４の炭素原子、約１２から約２２の炭素原子、約１２から約２０の炭素原子、あるいは、約１２から約１８の炭素原子を含む。いくつかの実施形態では、脂肪酸は飽和脂肪酸である。いくつかの実施形態において、タンパク質は、アルブミン、トランスフェリン、あるいはトランスサイレチンを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、抗体またはその結合フラグメントを含む。いくつかの実施形態において、抗体あるいはその結合フラグメントは、抗体のＦｃ部分を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、ＸＴＥＮペプチド、グリシンに富んだホモアミノ酸ポリマー（ＨＡＰ）、ＰＡＳポリペプチド、エラスチン様ポリペプチド（ＥＬＰ）、ＣＴＰペプチド、あるいはゼラチン様タンパク質（ＧＬＫ）ポリマーを含む。いくつかの実施形態において、抱合部分は、リンカーを介して修飾されたＩＬ−２の少なくとも１つの非天然アミノ酸に間接的に結合する。いくつかの実施形態において、リンカーは、ホモ二機能性リンカー、ヘテロ二機能性リンカー、ゼロ長リンカー、切断あるいは非切断ジペプチドリンカー、マレイミド基、スペーサー、あるいはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、結合の減少は、野生型ＩＬ−２ポリペプチドと比較して、ＩＬ��２Ｒβγに対する結合の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、あるいはそれ以上の減少である。いくつかの実施形態において、結合の減少は、野生型ＩＬ−２ポリペプチドと比較して、ＩＬ−２Ｒβγに対して、約１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、３０倍、５０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、１０００倍、またはそれ以上である。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２Ｒγサブユニット動員の減少は、野生型ＩＬ−２ポリペプチドと比較して、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、あるいはそれ以上の減少である。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２Ｒγサブユニット動員の減少は、野生型のＩＬ−２ポリペプチドと比較して、約１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、３０倍、５０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、１０００倍、あるいはそれ以上である。いくつかの実施形態において、修飾されたＩＬ−２ポリペプチドは：完全長のＩＬ−２ポリペプチドの機能的に活性なフラグメント；組み換えＩＬ−２ポリペプチド；あるいは、組み換えヒトＩＬ−２ポリペプチドである。いくつかの実施形態において、修飾されたＩＬ−２ポリペプチドは、Ｎ末端欠失、Ｃ末端欠失、あるいはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、Ｎ末端欠失は、Ｎ末端から最初の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、あるいは３０の残基の欠失を含み、ここで、残基位置は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置を基準にしている。いくつかの実施形態において、Ｃ末端欠失は、Ｃ末端から最後の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、あるいはそれ以上の残基の欠失を含み、ここで、残基位置は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置を基準にしている。いくつかの実施形態において、機能的に活性なフラグメントは、ＩＬ−２領域１０−１３３、２０−１３３、３０−１３３、１０−１３０、２０−１３０、３０−１３０、１０−１２５、２０−１２５、３０−１２５、１−１３０、あるいは１−１２５を含み、ここで、残基位置は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置を基準にしている。いくつかの実施形態で
は、修飾されたＩＬ−２ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、あるいは９９％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２Ｒβγに対する結合親和性が減少した修飾されたＩＬ−２ポリペプチドは、ＣＤ４＋Ｔ制御性（Ｔｒｅｇ）細胞を拡張することができる。いくつかの実施形態において、抱合部分は、ＩＬ−２のＩＬ−２Ｒβγとの結合を損なうか遮断し、あるいはＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒβ複合体へのＩＬ−２Ｒγサブユニットの動員を減少させる。いくつかの実施形態において、修飾されたＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒαβγ複合体によるＣＤ４＋  Ｔｒｅｇ細胞増殖は、野生型のＩＬ−２ポリペプチドの４＋  Ｔｒｅｇ細胞増殖と同等以上である。
【０００８】
ある実施形態では、インターロイキン２（ＩＬ−２）抱合体が本明細書で開示され、上記インターロイキン２（ＩＬ−２）抱合体は：単離および精製されたＩＬ−２ポリペプチド；および、Ｐ２、Ｔ３、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６、Ｔ７、Ｋ８、Ｋ９、Ｑ１１、Ｌ１２、Ｅ１５、Ｈ１６、Ｌ１８、Ｌ１９、Ｄ２０、Ｑ２２、Ｍ２３、Ｎ２６、Ｇ２７、Ｎ２９、Ｎ３０、Ｙ３１、Ｋ３２、Ｋ３５、Ｔ３７、Ｍ４６、Ｋ４７、Ｋ４８、Ａ５０、Ｔ５１、Ｅ５２、Ｋ５３、Ｈ５５、Ｑ５７、Ｅ６０、Ｅ６７、Ｎ７１、Ｑ７４、Ｓ７５、Ｋ７６、Ｎ７７、Ｆ７８、Ｈ７９、Ｒ８１、Ｐ８２、Ｒ８３、Ｄ８４、Ｓ８７、Ｎ８８、Ｎ８９、Ｖ９１、Ｉ９２、Ｌ９４、Ｅ９５、Ｋ９７、Ｇ９８、Ｓ９９、Ｅ１００、Ｔ１０１、Ｔ１０２、Ｆ１０３、Ｍ１０４、Ｃ１０５、Ｅ１０６、Ｙ１０７、Ａ１０８、Ｄ１０９、Ｅ１１０、Ｔ１１１、Ａ１１２、Ｔ１１３、Ｅ１１６、Ｎ１１９、Ｒ１２０、Ｔ１２３、Ａ１２５、Ｑ１２６、Ｓ１２７、Ｓ１３０、Ｔ１３１、Ｌ１３２、およびＴ１３３から選択されたアミノ酸残基において単離および精製されたＩＬ−２ポリペプチドに結合する抱合部分を含み、アミノ酸残基の番号はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対応する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの非天然アミノ酸の位置は、Ｋ８、Ｋ９、Ｑ１１、Ｌ１２、Ｅ１５、Ｈ１６、Ｌ１８、Ｌ１９、Ｄ２０、Ｑ２２、Ｍ２３、Ｎ２６、Ｒ８１、Ｄ８４、Ｓ８７、Ｎ８８、Ｖ９１、Ｉ９２、Ｌ９４、Ｅ９５、Ｅ１１６、Ｎ１１９、Ｒ１２０、Ｔ１２３、Ａ１２５、Ｑ１２６、Ｓ１２７、Ｓ１３０、Ｔ１３１、Ｌ１３２、および、Ｔ１３３から選択され、アミノ酸残基の番号はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対応する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの非天然アミノ酸の位置は、Ｐ２、Ｔ３、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６、Ｔ７、Ｇ２７、Ｎ２９、Ｎ３０、Ｙ３１、Ｋ３２、Ｋ３５、Ｔ３７、Ｍ４６、Ｋ４７、Ｋ４８、Ａ５０、Ｔ５１、Ｅ５２、Ｋ５３、Ｈ５５、Ｑ５７、Ｅ６０、Ｅ６７、Ｎ７１、Ｑ７４、Ｓ７５、Ｋ７６、Ｎ７７、Ｆ７８、Ｈ７９、Ｐ８２、Ｒ８３、Ｎ８９、Ｋ９７、Ｇ９８、Ｓ９９、Ｅ１００、Ｔ１０１、Ｔ１０２、Ｆ１０３、Ｍ１０４、Ｃ１０５、Ｅ１０６、Ｙ１０７、Ａ１０８、Ｄ１０９、Ｅ１１０、Ｔ１１１、Ａ１１２、および、Ｔ１１３から選択され、アミノ酸残基の番号はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対応する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの非天然アミノ酸の位置は、Ｋ８、Ｋ９、Ｌ１２、Ｅ１５、Ｈ１６、Ｌ１９、Ｄ２０、Ｑ２２、Ｍ２３、Ｎ２６、Ｄ８４、Ｎ８８、Ｅ９５、および、Ｑ１２６から選択され、アミノ酸残基の番号はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対応する。いくつかの実施形態において、アミノ酸位置はＫ８、Ｋ９、およびＨ１６から選択される。いくつかの実施形態において、アミノ酸位置はＱ２２、Ｎ２６、Ｎ８８、およびＱ１２６から選択される。いくつかの実施形態において、アミノ酸位置はＥ１５、Ｄ２０、Ｄ８４、およびＥ９５から選択される。いくつかの実施形態において、アミノ酸位置はＬ１２、Ｌ１９、Ｍ２３、およびＦ７８から選択される。いくつかの実施形態において、アミノ酸位置はＱ２２とＮ２６から選択される。いくつかの実施形態において、アミノ酸位置はＱ２２であ��。いくつかの実施形態において、アミノ酸位置はＮ２６である。いくつかの実施形態において、Ｋ８、Ｋ９、Ｌ１２、Ｅ１５、Ｈ１６、Ｌ１９、Ｄ２０、Ｑ２２、Ｍ２３、Ｎ２６、Ｆ７８、Ｄ８４、Ｎ８８、Ｅ９５、およびＱ１２６から選択されたアミノ酸残基は、リジン、システイン、あるいはヒスチジンにさらに変異する。いくつかの実施形態において、アミノ酸残基はシステインに変異する。いくつかの実施形態において、アミノ酸残基はリジンに変異する。いくつかの実施形態において、Ｋ８、Ｋ９、Ｌ１２、Ｅ１５、Ｈ１６、Ｌ１９、Ｄ２０、Ｑ２２、Ｍ２３、Ｎ２６、Ｆ７８、Ｄ８４、Ｎ８８、Ｅ９５、およびＱ１２６から選択されたアミノ酸残基は、非天然アミノ酸にさらに変異する。いくつかの実施形態において、非天然アミノ酸は、ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジドメチル−Ｌ−フェニルアラニン（ｐＡＭＦ）、ｐ−ヨード−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、ｐ−プロパギルオキシフェニルアラニン、ｐ−プロパルギル−フェニルアラニン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチル−フェニルアラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃｐ−セリン、Ｌ−ドパ、フッ素処理したフェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、あるいは、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニンを含む。いくつかの実施形態において、追加の変異したアミノ酸残基は、さらなる抱合部分に結合する。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２抱合体は、野生型のＩＬ−２ポリペプチドと比較して、ＩＬ−２受容体β（ＩＬ−２Ｒβ）サブユニット、ＩＬ−２受容体γ（ＩＬ−２Ｒγ）サブユニット、あるいはこれらの組み合わせに対する減少した親和性を有する。いくつかの実施形態において、減少した親和性は、野生型のＩＬ−２ポリペプチドと比較して、ＩＬ−２Ｒβ、ＩＬ−２Ｒγ、あるいはこれらの組み合わせに対する結合親和性の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、あるいは６０％の減少である。いくつかの実施形態において、結合した親和性は、野生型のＩＬ−２ポリペプチドと比較して、約１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、あるいはそれ以上である。いくつかの実施形態において、抱合部分は、ＩＬ−２のＩＬ−２Ｒβ、ＩＬ−２Ｒγ、あるいはこれらの組み合わせとの結合を損なうか、遮断する。いくつかの実施形態において、抱合部分は、形成されたＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒβ鎖複合体に対するＩＬ−Ｒγの動員をダウンレギュレートする。いくつかの実施形態において、抱合部分は、ＩＬ−２受容体のα、β、およびγ鎖へのその親和性に影響を与えることなくポリペプチドの全身半減期を延長する。いくつかの実施形態において、抱合部分は水溶性ポリマーを含む。いくつかの実施形態において、追加の抱合部分は水溶性ポリマーを含む。いくつかの実施形態において、水溶性ポリマーの各々は独立して、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（プロピレングリコール）（ＰＰＧ）、エチレングリコールとプロピレングリコールのコポリマー、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィンアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリルアミド）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリラート）、ポリ（サッカライド）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）、あるいはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、水溶性ポリマーの各々は独立してＰＥＧを含む。いくつかの実施形態において、ＰＥＧは線形ＰＥＧあるいは分岐ＰＥＧである。いくつかの実施形態において、水溶性ポリマーの各々は独立して多糖類を含む。いくつかの実施形態において、多糖類はデキストラン、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ヒアルロン酸（ＨＡ）、アミロース、ヘパリン、ヘパラン硫酸（ＨＳ）、デキストリン、あるいはヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）を含む。いくつかの実施形態において、水溶性ポリマーの各々は独立してグリカンを含む。いくつかの実施形態において、水溶性ポリマーの各々は独立してポリアミンを含む。いくつかの実施形態において、抱合部分はタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、追加の抱合部分は、タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、タンパク質の各々は独立して、アルブミン、トランスフェリン、あるいはトランスサイレチンを含む。いくつかの実施形態において、タンパク質の各々は独立して、Ｆｃ部分を含む。いくつかの実施形態において、タンパク質の各々は独立して、ＩｇＧのＦｃ部分を含む。いくつかの実施形態において、抱合部分は、ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、追加の抱合部分はポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドの各々は独立して、ＸＴＥＮペプチド、グリシンに富んだホモアミノ酸ポリマー（ＨＡＰ）、ＰＡＳポリペプチド、エラスチン様ポリペプチド（ＥＬＰ）、ＣＴＰペプチド、あるいはゼラチン様タンパク質（ＧＬＫ）ポリマーを含む。いくつかの実施形態において、単離および精製されたＩＬ−２ポリペプチドは、グルタルミル化によって修飾される。いくつかの実施形態において、抱合部分は、単離および精製されたＩＬ−２ポリペプチドに直接結合する。いくつかの実施形態において、抱合部分は、リンカーによって単離および精製されたＩＬ−２ポリペプチドに間接的に結合する。いくつかの実施形態では、リンカーはホモ二機能性リンカーを含む。いくつかの実施形態では、ホモ二機能性リンカーは、Ｌｏｍａｎｔの試薬ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）ＤＳＰ、３’３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロプリオネート）（ＤＴＳＳＰ）、ジスクシンイミジルスベリン酸塩（ＤＳＳ）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベリン酸塩（ＢＳ）、ジスクシンイミジル酒石酸塩（ＤＳＴ）、ジスルホスクシンイミジル酒石酸塩（スルホＤＳＴ）、エチレングリコビス（スクシンイミジルスクシネート）（ＥＧＳ）、ジスクシンイミジルグルタル酸塩（ＤＳＧ）、Ｎ、Ｎ’−ジスクシンイミジル炭酸塩（ＤＳ���）、アジプイミド酸ジメチル（ＤＭＡ）、ジメチルピメリミデートピメリミデート（ＤＭＰ）、ジメチルスベリミデート（ＤＭＳ）、ジメチル−３，３’−ジチオビスプロピオンイミデート（ＤＴＢＰ）、１，４−ジ−（３’−（２’−ピリジルジチオ）プロピオンアミド）ブタン（ＤＰＤＰＢ）、ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）、例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン、１，３−ジフルオロ−４，６−ジニトロベンゼンなどのハロゲン化アリール含有化合物（ＤＦＤＮＢ）、４、４’−ジフルオロ−３、３’−ジニトロフェニルスルホン（ＤＦＤＮＰＳ）、ビス−［β−（４−アジドサリチルアミド）エチル］ジスルフィド（ＢＡＳＥＤ）、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、１，４−ブタンジオール・ジグリシジルエーテル、アジピン酸ジヒドラジド、カルボヒドラジド、ｏ−トルイジン、３、３’−ジメチルベンジジン、ベンジジン、α，α’−ｐ−ジアミノジフェニル、ジヨード−ｐ−キシレン・スルホン酸、Ｎ，Ｎ’−エチレン−ビス（ヨードアセトアミド）、あるいは、Ｎ，Ｎ’−ヘキサメチレン−ビス（ヨードアセトアミド）を含む。いくつかの実施形態では、リンカーはヘテロ二機能性リンカーを含む。いくつかの実施形態において、ヘテロ二機能性リンカーは、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸塩（ｓＰＤＰ）、長鎖Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸塩（ＬＣ−ｓＰＤＰ）、水溶性の長鎖Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸塩（スルホ−ＬＣ−ｓＰＤＰ）、スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルエン（ｓＭＰＴ）、スルホスクシンイミジル−６−［α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルアミド］ヘキサン酸塩（スルホ−ＬＣ−ｓＭＰＴ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸塩（ｓＭＣＣ）、スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸塩（スルホ−ｓＭＣＣ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢｓ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＭＢ）、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノ安息香酸塩（ｓＩＡＢ）、スルホスクシンイミジル（４−ヨードアセチル
）アミノ安息香酸塩（スルホ−ｓＩＡＢ）、スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）酪酸塩（ｓＭＰＢ）、スルホスクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）酪酸塩（スルホ−ｓＭＰＢ）、Ｎ−（γ−マレイミドブチルオキシ）スクシンイミドエステル（ＧＭＢｓ）、Ｎ−（γ−マレイミドブチルオキシ）スルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＧＭＢｓ）、スクシンイミジル６−（（ヨードアセチル）アミノ）ヘキサン酸塩（ｓＩＡＸ）、スクシンイミジル６−［６−（（ヨードアセチル）アミノ）ヘキサノイル）アミノ］ヘキサン酸塩（ｓＩＡＸＸ）、スクシンイミジル−４−（（ヨードアセチル）アミノ）メチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸塩（ｓＩＡＣ）、スクシンイミジル６−（（（（（４−ヨードアセチル）アミノ）メチル）シクロヘキサン−１−カルボニル）アミノ）ヘキサン酸塩（ｓＩＡＣＸ）、ｐ−ニトロフェニルヨード酢酸（ＮＰＩＡ）、カルボニル反応性およびスルフヒドリル反応性の架橋剤、例えば、４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド（ＭＰＢＨ）、４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシル−ヒドラジド−８（Ｍ２Ｃ２Ｈ）、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニルヒドラジド（ＰＤＰＨ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−４−アジドサリチル酸（ＮＨ−ＡｓＡ）、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル−４−アジドサリチル酸（スルホ−ＮＨ−ＡｓＡ）、スルホスクシンイミジル−（４−アジドサリチルアミド）ヘキサン酸塩（スルホ−ＮＨ−ＬＣ−ＡｓＡ）、スルホスクシンイミジル−２−（ρ−アジドサリチルアミド）エチル−１，３’−ジチオプロピオン酸塩（ｓＡｓＤ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−４−アジド安息香酸塩（ＨｓＡＢ）、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル−４−アジド安息香酸塩（スルホ−ＨｓＡＢ）、Ｎ−スクシンイミジル−６−（４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ）ヘキサン酸塩（ｓＡＮＰＡＨ）、スルホスクシンイミジル−６−（４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ）ヘキサン酸塩（スルホ−ｓＡＮＰＡＨ）、Ｎ−５−アジド−２−ニトロベンゾイルオキシスクシンイミド（ＡＮＢ−ＮＯｓ）、スルホスクシンイミジル−２−（ｍ−アジド−ｏ−ニトロベンズアミド）−エチル−１，３’−ジチオプロピオン酸塩（ｓＡＮＤ）、Ｎ−スクシンイミジル−４（４−アジドフェニル）１，３’−ジチオプロピオン酸塩（ｓＡＤＰ）、Ｎ−スルホスクシンイミジル（４−アジドフェニル）−１，３’−ジチオプロピオン酸塩（スルホ−ｓＡＤＰ）、スルホスクシンイミジル  ４−（ρ−アジドフェニル）酪酸塩（スルホ−ｓＡＰＢ）、スルホスクシンイミジル  ２−（７−アジド−４−メチルクマリン−３−アセトアミド）エチル−１，３’−ジチオプロピオン酸塩（ｓＡＥＤ）、スルホスクシンイミジル  ７−アジド−４−メチルクマリン−３−酢酸塩（スルホ−ｓＡＭＣＡ）、ρ−ニトロフェニルジアゾピルバート（ρＮＰＤＰ）、ρ−ニトロフェニル−２−ジアゾ−３，３，３−トリフルオロプロピオン酸塩（ＰＮＰ−ＤＴＰ）、１−（ρ−アジドサリチルアミド）−４−（ヨードアセトアミド）ブタン（ＡｓＩＢ）、Ｎ−［４−（ρ−アジドサリチルアミド）ブチル］−３’−（２’−ピリジルジチオ）プロピオンアミド（ＡＰＤＰ）、ベンゾフェノン−４−ヨードアセトアミド、ρ−アジドベンゾイルヒドラジド（ＡＢＨ）、４−（ρ−アジドサリチルアミド）ブチルアミン（ＡｓＢＡ）、あるいはρ−アジドフェニルグリオキサール（ＡＰＧ）を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、ジペプチドリンカーを随意に含む切断リンカーを含む。いくつかの実施形態において、ジペプチドリンカーは、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ−Ａｌａ、あるいはＶａｌ−Ｌｙｓを含む。いくつかの実施形態において、リンカーは非切断可能なリンカーを含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、マレイミドカプロイル（ｍｃ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート（ｓＭＣＣ）、あるいはスルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート（スルホ−ｓＭＣＣ）を随意に含む、マレイミドメチル基を含む。いくつかの実施形態において、リンカーはさらにスペーサーを含む。いくつかの実施形態において、スペーサーは、ｐ−アミノベンジルアルコール（ＰＡＢ）、ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ＰＡＢＣ）、誘導体、またはそれらのアナログを含む。いくつかの実施形態において、抱合部分は、ＩＬ−２抱合体の血清半減期を拡張することができる。いくつかの実施形態において、追加の抱合部分は、ＩＬ−２抱合体の血清半減期を拡張することができる。
【０００９】
ある実施形態では、インターロイキン２（ＩＬ−２）抱合体が本明細書で開示され、上記インターロイキン２（ＩＬ−２）抱合体は：単離および精製されたＩＬ−２ポリペプチド；および、抱合部分を含み；ここで、ＩＬ−２抱合体は、野生型のＩＬ−２ポリペプチドと比較して、ＩＬ−２受容体β（ＩＬ−２Ｒβ）サブユニット、ＩＬ−２受容体γ（ＩＬ−２Ｒγ）サブユニット、あるいはこれらの組み合わせに対する減少した親和性を有する。いくつかの実施形態において、抱合部分は、ＩＬ−２ＲβあるいはＩＬ−２Ｒγと相互作用するアミノ酸残基に結合する。いくつかの実施形態において、抱合部分は、Ｋ８、Ｋ９、Ｑ１１、Ｌ１２、Ｅ１５、Ｈ１６、Ｌ１８、Ｌ１９、Ｄ２０、Ｑ２２、Ｍ２３、Ｎ２６、Ｒ８１、Ｄ８４、Ｓ８７、Ｎ８８、Ｖ９１、Ｉ９２、Ｌ９４、Ｅ９５、Ｅ１１６、Ｎ１１９、Ｒ１２０、Ｔ１２３、Ａ１２５、Ｑ１２６、Ｓ１２７、Ｓ１３０、Ｔ１３１、Ｌ１３２、および、Ｔ１３３から選択されたアミノ酸残基に結合し、アミノ酸残基の番号はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対応する。いくつかの実施形態において、抱合部分は水溶性ポリマーを含む。いくつかの実施形態において、追加の抱合部分は水溶性ポリマーを含む。いくつかの実施形態において、水溶性ポリマーの各々は独立して、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（プロピレングリコール）（ＰＰＧ）、エチレングリコールとプロピレングリコールのコポリマー、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィンアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリルアミド）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリラート）、ポリ（サッカライド）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）、あるいはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、水溶性ポリマーの各々は独立してＰＥＧを含む。いくつかの実施形態において、ＰＥＧは線形ＰＥＧあるいは分岐ＰＥＧである。いくつかの実施形態において、水溶性ポリマーの各々は独立して多糖類を含む。いくつかの実施形態において、多糖類はデキストラン、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ヒアルロン酸（ＨＡ）、アミロース、ヘパリン、ヘパラン硫酸（ＨＳ）、デキストリン、あるいはヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）を含む。いくつかの実施形態において、水溶性ポリマーの各々は独立してグリカンを含む。いくつかの実施形態において、水溶性ポリマーの各々は独立してポリアミンを含む。いくつかの実施形態において、抱合部分はタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、追加の抱合部分は、タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、タンパク質の各々は独立して、アルブミン、トランスフェリン、あるいはトランスサイレチンを含む。いくつかの実施形態において、タンパク質の各々は独立して、Ｆｃ部分を含む。いくつかの実施形態において、タンパク質の各々は独立して、ＩｇＧのＦｃ部分を含む。いくつかの実施形態において、抱合部分は、ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、追加の抱合部分はポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドの各々は独立して、ＸＴＥＮペプチド、グリシンに富んだホモアミノ酸ポリマー（ＨＡＰ）、ＰＡＳポリペプチド、エラスチン様ポリペプチド（ＥＬＰ）、ＣＴＰペプチド、あるいはゼラチン様タンパク質（ＧＬＫ）ポリマーを含む。いくつかの実施形態において、単離および精製されたＩＬ−２ポリペプチドは、グルタルミル化によって修飾される。いくつかの実施形態において、抱合部分は、単離および精製されたＩＬ−２ポリペプチドに直接結合する。いくつかの実施形態において、抱合部分は、リンカーによって単離および精製されたＩＬ−２ポリペプチドに間接的に結合する。いくつかの実施形態では、リンカーはホモ二機能性リンカーを含む。いくつかの実施形態では、ホモ二機能性リンカーは、Ｌｏｍａｎｔの試薬ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）ＤＳＰ、３’３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロプリオネート）（ＤＴＳＳＰ）、ジスクシンイミジルスベリン酸塩（ＤＳＳ）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベリン酸塩（ＢＳ）、ジスクシンイミジル酒石酸塩（ＤＳＴ）、ジスルホスクシンイミジル酒石酸塩（スルホＤＳＴ）、エチレングリコビス（スクシンイミジルスクシネート）（ＥＧＳ）、ジスクシンイミジルグルタル酸塩（ＤＳＧ）、Ｎ、Ｎ’−ジスクシンイミジル炭酸塩（ＤＳＣ）、アジプイミド酸ジメチル（ＤＭＡ）、ジメチルピメリミデートピメリミデート（ＤＭＰ）、ジメチルスベリミデート（ＤＭＳ）、ジメチル−３，３’−ジチオビスプロピオンイミデート（ＤＴＢＰ）、１，４−ジ−（３’−（２’−ピリジルジチオ）プロピオンアミド）ブタン（ＤＰＤＰＢ）、ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）、例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン、１，３−ジフルオロ−４，６−ジニトロベンゼンなどのハロゲン化アリール含有化合物（ＤＦＤＮＢ）、４、４’−ジフルオロ−３、３’−ジニトロフェニルスルホン（ＤＦＤＮＰＳ）、ビス−［β−（４−アジドサリチルアミド）エチル］ジスルフィド（ＢＡＳＥＤ）、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、１，４−ブタンジオール・ジグリシジルエーテル、アジピン酸ジヒドラジド、カルボヒドラジド、ｏ−トルイジン、３、３’−ジメチルベンジジン、ベンジジン、α，α’−ｐ−ジアミノジフェニル、ジヨード−ｐ−キシレン・スルホン酸、Ｎ，Ｎ’−エチレン−ビス（ヨードアセトアミド）、あるいは、Ｎ，Ｎ’−ヘキサメチレン−ビス（ヨードアセトアミド）を含む。いくつかの実施形態では、リンカーはヘテロ二機能性リンカーを含む。いくつかの実施形態において、ヘテロ二機能性リンカーは、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸塩（ｓＰＤＰ）、長鎖Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸塩（ＬＣ−ｓＰＤＰ）、水溶性の長鎖Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸塩（スルホ−ＬＣ−ｓＰＤＰ）、スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルエン（ｓＭＰＴ）、スルホスクシンイミジル−６−［α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルアミド］ヘキサン酸塩（スルホ−ＬＣ−ｓＭＰＴ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン���塩（ｓＭＣＣ）、スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸塩（スルホ−ｓＭＣＣ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢｓ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＭＢ）、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノ安息香酸塩（ｓＩＡＢ）、スルホスクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノ安息香酸塩（スルホ−ｓＩＡＢ）、スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）酪酸塩（ｓＭＰＢ）、スルホスクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）酪酸塩（スルホ−ｓＭＰＢ）、Ｎ−（γ−マレイミドブチルオキシ）スクシンイミドエステル（ＧＭＢｓ）、Ｎ−（γ−マレイミドブチルオキシ）スルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＧＭＢｓ）、スクシンイミジル６−（（ヨードアセチル）アミノ）ヘキサン酸塩（ｓＩＡＸ）、スクシンイミジル６−［６−（（ヨードアセチル）アミノ）ヘキサノイル）アミノ］ヘキサン酸塩（ｓＩＡＸＸ）、スクシンイミジル−４−（（ヨードアセチル）アミノ）メチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸塩（ｓＩＡＣ）、スクシンイミジル６−（（（（（４−ヨードアセチル）アミノ）メチル）シクロヘキサン−１−カルボニル）アミノ）ヘキサン酸塩（ｓＩＡＣＸ）、ｐ−ニトロフェニルヨード酢酸（ＮＰＩＡ）、カルボニル反応性およびスルフヒドリル反応性の架橋剤、例えば、４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド（ＭＰＢＨ）、４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシル−ヒドラジド−８（Ｍ２Ｃ２Ｈ）、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニルヒドラジド（ＰＤＰＨ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−４−アジドサリチル酸（ＮＨ−ＡｓＡ）、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル−４−アジドサリチル酸（スルホ−ＮＨ−ＡｓＡ）、スルホスクシンイミジル−（４−アジドサリチルアミド）ヘキサン酸塩（スルホ−ＮＨ−ＬＣ−ＡｓＡ）、スルホスクシンイミジル−２−（ρ−アジドサリチルアミド）エチル−１，３’−ジチオプロピオン酸塩（ｓＡｓＤ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−４−アジド安息香酸塩（ＨｓＡＢ）、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル−４−アジド安息香酸塩（スルホ−ＨｓＡＢ）、Ｎ−スクシンイミジル−６−（４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ）ヘキサン酸塩（ｓＡＮＰＡＨ）、スルホスクシンイミジル−６−（４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ）ヘキサン酸塩（スルホ−ｓＡＮＰＡＨ）、Ｎ−５−アジド−２−ニトロベンゾイルオキシスクシンイミド（ＡＮＢ−ＮＯｓ）、スルホスクシンイミジル−２−（ｍ−アジド−ｏ−ニトロベンズアミド）−エチル−１，３’−ジチオプロピオン酸塩（ｓＡＮＤ）、Ｎ−スクシンイミジル−４（４−アジドフェニル）１，３’−ジチオプロピオン酸塩（ｓＡＤＰ）、Ｎ−スルホスクシンイミジル（４−アジドフェニル）−１，３’−ジチオプロピオン酸塩（スルホ−ｓＡＤＰ）、スルホスクシンイミジル  ４−（ρ−アジドフェニル）酪酸塩（スルホ−ｓＡＰＢ）、スルホスクシンイミジル  ２−（７−アジド−４−メチルクマリン−３−アセトアミド���エチル−１，３’−ジチオプロピオン酸塩（ｓＡＥＤ）、スルホスクシンイミジル  ７−アジド−４−メチルクマリン−３−酢酸塩（スルホ−ｓＡＭＣＡ）、ρ−ニトロフェニルジアゾピルバート（ρＮＰＤＰ）、ρ−ニトロフェニル−２−ジアゾ−３，３，３−トリフルオロプロピオン酸塩（ＰＮＰ−ＤＴＰ）、１−（ρ−アジドサリチルアミド）−４−（ヨードアセトアミド）ブタン（ＡｓＩＢ）、Ｎ−［４−（ρ−アジドサリチルアミド）ブチル］−３’−（２’−ピリジルジチオ）プロピオンアミド（ＡＰＤＰ）、ベンゾフェノン−４−ヨードアセトアミド、ρ−アジドベンゾイルヒドラジド（ＡＢＨ）、４−（ρ−アジドサリチルアミド）ブチルアミン（ＡｓＢＡ）、あるいはρ−アジドフェニルグリオキサール（ＡＰＧ）を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、ジペプチドリンカーを随意に含む切断リンカーを含む。いくつかの実施形態において、ジペプチドリンカーは、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ−Ａｌａ、あるいはＶａｌ−Ｌｙｓを含む。いくつかの実施形態において、リンカーは非切断可能なリンカーを含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、マレイミドカプロイル（ｍｃ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート（ｓＭＣＣ）、あるいはスルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート（スルホ−ｓＭＣＣ）を随意に含む、マレイミドメチル基を含む。いくつかの実施形態において、リンカーはさらにスペーサーを含む。いくつかの実施形態において、スペーサーは、ｐ−アミノベンジルアルコール（ＰＡＢ）、ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ＰＡＢＣ）、誘導体、またはそれらのアナログを含む。いくつかの実施形態において、抱合部分は、ＩＬ−２抱合体の血清半減期を拡張することができる。いくつかの実施形態において、追加の抱合部分は、ＩＬ−２抱合体の血清半減期を拡張することができる。
【００１０】
ある実施形態において、医薬組成物が本明細書に開示され、上記医薬組成物は、上記のＩＬ−２抱合体；および、薬学的に許容可能な賦形剤を含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は非経口投与用に製剤化される。
【００１１】
ある実施形態では、被験体の自己免疫疾患または障害を処置する方法が本明細書に開示され、上記方法は、治療上有効な量の上記のＩＬ−２抱合体を被験体に投与する工程を含む。いくつかの実施形態において、自己免疫疾患または障害は、円形脱毛症、自己免疫溶血性貧血、自己免疫性肝炎、皮膚筋炎、１型糖尿病、若年性特発性関節炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、特発性血小板減少性紫斑病、重症筋無力症、多発性硬化症、天疱瘡／類天疱瘡、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、関節リウマチ、強皮症、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、甲状腺炎、ブドウ膜炎、白斑、あるいはヴェーゲナー肉芽腫症を含む。いくつかの実施形態では、方法はさらに、追加の治療薬を投与する工程を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２抱合体と追加の治療剤は同時に投与される。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２抱合体と追加の治療剤は順次投与される。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２抱合体は追加の治療剤の前に投与される。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２抱合体は追加の治療剤の投与後に投与される。いくつかの実施形態では、被験体はヒトである。
【００１２】
ある実施形態では、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞集団を拡張する方法が本明細書に開示され、上記方法は：（ａ）細胞を上記ＩＬ−２抱合体に接触させる工程；および、（ｂ）ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒβγ複合体を形成するために、ＩＬ−２抱合体をＩＬ−２Ｒα、ＩＬ−２Ｒβ、およびＩＬ−２Ｒγのサブユニットと相互作用させる工程を含み；ここで、ＩＬ−２抱合体は、ＩＬ−２Ｒβおよび／またはＩＬ−２Ｒγサブユニットに対する減少した親和性を有するか、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒβ複合体へのＩＬ−２Ｒγサブユニットの動員をダウンレギュレートするか、ＩＬ−２と同様の効力を、そのα、β、およびγ受容体サブユニットにおいて保持するが、その半減期を延長させ、および、ここで、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒαβγ複合体は、Ｔｒｅｇ細胞の拡張を、同様に、あるいは未変性のＩＬ−２よりも強力に刺激する。
【００１３】
ある実施形態では、上記のＩＬ−２抱合体を含むキット；あるいは、上記のＩＬ−２抱合体を含む医薬組成物が本明細書に開示される。いくつかの実施形態において、上記のＩＬ−２ポリペプチドをコードするポリ核酸分子を含むキットも本明細書に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
本発明の新規な特徴はとりわけ添付の請求項で説明される。本発明の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理が用いられる例示的実施形態を説明する以下の詳細な説明と、以下の添付図面とを引用することによって得られるであろう。
【図１】典型的な非天然アミノ酸を示す。この図はＹｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｂｅｙｏｎｄ  ｔｈｅ  ｃａｎｏｎｉｃａｌ  ２０  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ：  ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｌｅｘｉｃｏｎ，”  Ｊ．  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８５（１５）：  １１０３９−１１０４４  （２０１０）の図２を変更したものである。
【図２Ａ】典型的な非天然アミノ酸を例証する。図２Ａは典型的なリジン誘導体を例証する。
【図２Ｂ】典型的な非天然アミノ酸を例証する。図２Ｂは典型的なフェニルアラニン誘導体を例証する。
【図３Ａ】典型的な非天然アミノ酸を例証する。これらの非天然アミノ酸（ＵＡＡ）は、タンパク質（図３Ａ−ＵＡＡ番号１−４２；図３Ｂ−ＵＡＡ番号４３−８９；図３Ｃ−ＵＡＡ番号９０−１２８；図３Ｄ−ＵＡＡ番号１２９−１６７）中で遺伝学的にコードされた。図３Ａ〜図３Ｄは、Ｄｕｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１５，  ６，  ５０−６９の表１から採用される。
【図３Ｂ】典型的な非天然アミノ酸を例証する。これらの非天然アミノ酸（ＵＡＡ）は、タンパク質（図３Ａ−ＵＡＡ番号１−４２；図３Ｂ−ＵＡＡ番号４３−８９；図３Ｃ−ＵＡＡ番号９０−１２８；図３Ｄ−ＵＡＡ番号１２９−１６７）中で遺伝学的にコードされた。図３Ａ〜図３Ｄは、Ｄｕｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１５，  ６，  ５０−６９の表１から採用される。
【図３Ｃ】典型的な非天然アミノ酸を例証する。これらの非天然アミノ酸（ＵＡＡ）は、タンパク質（図３Ａ−ＵＡＡ番号１−４２；図３Ｂ−ＵＡＡ番号４３−８９；図３Ｃ−ＵＡＡ番号９０−１２８；図３Ｄ−ＵＡＡ番号１２９−１６７）中で遺伝学的にコードされた。図３Ａ〜図３Ｄは、Ｄｕｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１５，  ６，  ５０−６９の表１から採用される。
【図３Ｄ】典型的な非天然アミノ酸を例証する。これらの非天然アミノ酸（ＵＡＡ）は、タンパク質（図３Ａ−ＵＡＡ番号１−４２；図３Ｂ−ＵＡＡ番号４３−８９；図３Ｃ−ＵＡＡ番号９０−１２８；図３Ｄ−ＵＡＡ番号１２９−１６７）中で遺伝学的にコードされた。図３Ａ〜図３Ｄは、Ｄｕｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１５，  ６，  ５０−６９の表１から採用される。
【図４Ａ】ヒトＬＲＳ初代細胞におけるｐＳＴＡＴ５シグナル伝達（図４Ａ）に関する例示的なＩＬ−２変異体とマウスＣＴＬＬ−２集団における増殖反応（図４Ｂ）の用量反応曲線を示す。
【図４Ｂ】ヒトＬＲＳ初代細胞におけるｐＳＴＡＴ５シグナル伝達（図４Ａ）に関する例示的なＩＬ−２変異体とマウスＣＴＬＬ−２集団における増殖反応（図４Ｂ）の用量反応曲線を示す。
【図５】２つの異なる濃度の例示的なＩＬ−２分子Ｋ３５＿３０ｋＤの増強されたＰＫプロファイルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
サイトカインは、細胞シグナル伝達タンパク質のファミリー、例えば、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホカイン、腫瘍壊死因子、および、先天性ならびに適応性の免疫細胞ホメオスタシスにおいて複数の役割を果たす他の成長因子を含む。サイトカインは、免疫細胞、例えば、マクロファージ、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、および、マスト細胞、内皮細胞、線維芽細胞、ならびに様々な間質細胞によって産生される。いくつかの例では、サイトカインは、体液性応答と細胞ベースの免疫応答との間の平衡を調節する。
【００１６】
インターロイキンは、Ｔリンパ球とＢリンパ球の発達と分化、単球血統の細胞、好中球、好塩基性細胞、好酸球、巨核球、および造血細胞を調節するシグナル伝達タンパク質である。インターロイキンは、ヘルパーＣＤ４  ＴおよびＢリンパ球、単球、マクロファージ、内皮細胞、ならびに他の組織常在物（ｔｉｓｓｕｅ  ｒｅｓｉｄｅｎｔｓ）によって産生される。場合によっては、約１５のインターロイキン、インターロイキン１−１３、インターロイキン１５、およびインターロイキン１７がある。
【００１７】
インターロイキン２（ＩＬ−２）は、その構造が１５．５ｋＤａの４つのα−ヘリックスバンドルを含む多面発現性の１型サイトカインである。ＩＬ−２の前駆体形態は、長さが１５３アミノ酸残基であり、最初の２０のアミノ酸がシグナルペプチドを形成し、残基２１−１５３が成熟した形態を形成する。ＩＬ−２は主として抗原刺激後にＣＤ４＋  Ｔ細胞によって産生され、程度は少ないが、ＣＤ８＋細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、およびＮＫＴ（ＮＫＴ）細胞、活性化樹状細胞（ＤＣ）、ならびにマスト細胞によって産生される。ＩＬ−２シグナル伝達は、ＩＬ−２受容体（ＩＬ−２Ｒ）サブユニットの特定の組み合わせ、ＩＬ−２Ｒα（ＣＤ２５としても知られている）、ＩＬ−２Ｒβ（ＣＤ１２２としても知られている）、およびＩＬ−２Ｒγ（ＣＤ１３２としても知られている）との相互作用によって生じる。ＩＬ−２のＩＬ−２Ｒαとの相互作用は、約１０−８ＭのＫｄの「低親和性」のＩＬ−２受容体複合体を形成する。ＩＬ−２のＩＬ−２ＲβおよびＩＬ−２Ｒγとの相互作用は、約１０−９ＭのＫｄの「中程度親和性」のＩＬ−２受容体複合体を形成する。ＩＬ−２の３つすべてのサブユニット、ＩＬ−２Ｒα、ＩＬ−２Ｒβ、およびＩＬ−２Ｒγとの相互作用は、約１０−１１Ｍよりも大きなＫｄの「高親和性」のＩＬ−２受容体複合体を形成する。
【００１８】
いくつかの例では、「高親和性」ＩＬ−２Ｒαβγ複合体を介するＩＬ−２シグナル伝達は、制御性Ｔ細胞の活性化と増殖を調節する。制御性Ｔ細胞あるいはＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞は、エフェクター細胞、例えば、ＣＤ８＋  Ｔ細胞、ヘルパー細胞、例えば、ＣＤ４＋  Ｔｈ１、Ｔｈ２、および、Ｔｈ１７細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ならびにＮＫＴ細胞の抑制による免疫ホメオスタシスの維持を媒介する。いくつかの例では、Ｔｒｅｇ細胞は、胸腺から生成される（ｔＴｒｅｇ細胞）か、あるいは、末梢のナイーブＴ細胞から誘発される（ｐＴｒｅｇ細胞）。場合によっては、Ｔｒｅｇ細胞は、末梢性寛容のメディエーターとみなされる。実際に、ある研究では、ＣＤ２５枯渇末梢性ＣＤ４＋  Ｔ細胞の移動は、ヌードマウスにおいて様々な自己免疫疾患を引き起こし、その一方で、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋  Ｔ細胞の同時移動は、自己免疫の発達を抑制した（Ｓａｋａｇｕｃｈｉ，  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ｓｅｌｆ−ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｍａｉｎｔａｉｎｅｄ  ｂｙ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ＩＬ−２  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｌｐｈａ−ｃｈａｉｎｓ  （ＣＤ２５），”Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５（３）：１１５１−１１６４  （１９９５））。Ｔｒｅｇ細胞集団の増強は、エフェクターＴ細胞増殖をダウンレギュレートし、自己免疫とＴ細胞の非腫瘍性反応を抑える。
【００１９】
ある実施形態では、サイトカイン／サイトカイン受容体シグナル伝達を介するリンパ球（例えば、制御性Ｔ細胞）の特徴的な集団を選択的にアップレギュレートする方法が本明細書に開示される。いくつかの例では、サイトカインはインターロイキンを含む。場合によっては、サイトカインは、サイトカイン抱合体、例えば、インターロイキン抱合体、インターフェロン抱合体、腫瘍壊死因子抱合体である。さらなる場合において、本明細書に記載される１つ以上のサイトカイン抱合体を含む医薬組成物とキットが本明細書に記載される。
【００２０】
いくつかの実施形態において、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒシグナル伝達を介してＴｒｅｇ集団を選択的にアップレギュレートする方法も本明細書に記載される。いくつかの例では、ＩＬ−２はＩＬ−２抱合体であり、野生型のＩＬ−２に対してＩＬ−２Ｒαβγ複合体内でＩＬ−２ＲβとＩＬ−２Ｒγの弱体化した相互作用を有するか、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒβ複合体へのＩＬ−２Ｒγサブユニットの動員をダウンレギュレートするか、ＩＬ−２と同様の効力を、そのα、β、およびγ受容体サブユニットにおいて保持するが、その半減期を延長させる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＩＬ−２抱合体の使用によって自己免疫疾患を処置する方法が本明細書に記載される。さらなる実施形態において、本明細書に記載される１つ以上のＩＬ−２抱合体を含む医薬組成物とキットが本明細書に記載される。
【００２１】
サイトカイン抱合体
いくつかの実施形態において、サイトカイン抱合体が本明細書に記載される。いくつかの例では、サイトカインは、インターロイキン、腫瘍壊死因子、インターフェロン、ケモカイン、あるいはリンホカインを含む。いくつかの例では、サイトカインは、インターロイキンである。場合によっては、サイトカインはインターフェロンである。さらなる場合において、サイトカインは腫瘍壊死因子である。
【００２２】
いくつかの実施形態において、インターロイキン抱合体が本明細書に記載される。典型的なインターロイキンとしては、限定されないが、インターロイキン１β（ＩＬ−１β）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン７（ＩＬ−７）、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン１８（ＩＬ−１８）、およびインターロイキン２１（ＩＬ−２１）が挙げられる。いくつかの例では、インターロイキンがＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、およびＩＬ−２１から選択されるインターロイキン抱合体が本明細書に記載される。
【００２３】
ＩＬ−２抱合体
いくつかの実施形態において、アミノ酸位置で修飾されたＩＬ−２抱合体が本明細書に記載される。いくつかの例では、ＩＬ−２ポリペプチドは、単離および精製されたＩＬ−２ポリペプチドである。いくつかの例では、ＩＬ−２ポリペプチドは、哺乳動物ＩＬ−２、例えば、げっ歯類ＩＬ−２タンパク質あるいはヒトＩＬ−２タンパク質である。場合によっては、ＩＬ−２ポリペプチドはヒトＩＬ−２タンパク質である。場合によっては、ＩＬ−２ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、あるいは９９％の配列同一性を含む。場合によっては、ＩＬ−２ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の配列を含む。場合によっては、ＩＬ−２ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の配列からなる。さらなる場合には、ＩＬ−２ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、あるいは９９％の配列同一性を含む。さらなる場合には、ＩＬ−２ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の配列を含む。さらなる場合には、ＩＬ−２ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の配列からなる。
【００２４】
いくつかの例では、ＩＬ−２ポリペプチドは切断された変異体である。いくつかの例では、切断はＮ末端欠失である。他の例では、切断はＣ末端欠失である。さらなる例では、切断はＮ末端とＣ末端欠失の両方を含む。例えば、切断は、Ｎ末端あるいはＣ末端のいずれか、または、Ｎ末端とＣ末端の両方からの少なくともあるいは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、あるいはそれ以上の残基の欠失であり得る。場合によっては、ＩＬ−２ポリペプチドは、少なくともあるいは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、あるいはそれ以上の残基のＮ末端欠失を含む。場合によっては、ＩＬ−２ポリペプチドは、少なくともあるいは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、あるいは１０の残基のＮ末端欠失を含む。場合によっては、ＩＬ−２ポリペプチドは、少なくともあるいは約２の残基のＮ末端欠失を含む。場合によっては、ＩＬ−２ポリペプチドは、少なくともあるいは約３の残基のＮ末端欠失を含む。場合によっては、ＩＬ−２ポリペプチドは、少なくともあるいは約４の残基のＮ末端欠失を含む。場合によっては、ＩＬ−２ポリペプチドは、少なくともあるいは約５の残基のＮ末端欠失を含む。場合によっては、ＩＬ−２ポリペプチドは、少なくともあるいは約６の残基のＮ末端欠失を含む。場合によっては、ＩＬ−２ポリペプチドは、少なくともあるいは約７の残基のＮ末端欠失を含む。場合によっては、ＩＬ−２ポリペプチドは、少なくともあるいは約８の残基のＮ末端欠失を含む。場合によっては、ＩＬ−２ポリペプチドは、少なくともあるいは約９の残基のＮ末端欠失を含む。場合によっては、ＩＬ−２ポリペプチドは、少なくともあるいは約１０の残基のＮ末端欠失を含む。
【００２５】
いくつかの実施形態において、ＩＬ−２ポリペプチドは機能的に活性なフラグメントである。場合によっては、機能的に活性なフラグメントは、ＩＬ−２領域１０−１３３、２０−１３３、３０−１３３、１０−１３０、２０−１３０、３０−１３０、１０−１２５、２０−１２５、３０−１２５、１−１３０、あるいは１−１２５を含み、ここで、残基位置は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置を基準にしている。場合によっては、機能的に活性なフラグメントはＩＬ−２領域１０−１３３を含み、ここで、残基位置は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置を基準にしている。場合によっては、機能的に活性なフラグメントはＩＬ−２領域２０−１３３を含み、ここで、残基位置は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置を基準にしている。場合によっては、機能的に活性なフラグメントはＩＬ−２領域３０−１３３を含み、ここで、残基位置は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置を基準にしている。場合によっては、機能的に活性なフラグメントはＩＬ−２領域１０−１２５を含み、ここで、残基位置は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置を基準にしている。場合によっては、機能的に活性なフラグメントはＩＬ−２領域２０−１２５を含み、ここで、残基位置は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置を基準にしている。場合によっては、機能的に活性なフラグメントはＩＬ−２領域１−１３０を含み、ここで、残基位置は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置を基準にしている。場合によっては、機能的に活性なフラグメントはＩＬ−２領域１−１２５を含み、ここで、残基位置は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置を基準にしている。
【００２６】
いくつかの実施形態において、単離および精製されたＩＬ−２ポリペプチドと抱合部分を含む上記のＩＬ−２抱合体は、野生型のＩＬ−２ポリペプチドと比較して、ＩＬ−２受容体β（ＩＬ−２Ｒβ）サブユニット、ＩＬ−２受容体γ（ＩＬ−２Ｒγ）サブユニット、あるいはこれらの組み合わせに対する減少した親和性を有する。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２抱合体は、野生型のＩＬ−２ポリペプチドと比較して、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒβ複合体に対して減少したＩＬ−２Ｒγサブユニット動員を有する。場合によっては、抱合部分は、ＩＬ−２Ｒγ（例えば、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒβ界面で）と、ＩＬ−２Ｒβ（例えば、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒβ界面で）と、あるいはこれらの組み合わせと相互作用するアミノ酸残基に結合する。場合によっては、抱合部分は、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒβ界面、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒβ界面、あるいはＩＬ−２Ｒβγ界面に近接するアミノ酸残基に結合する。場合によっては、アミノ酸残基は、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒβ界面、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒβ界面、あるいはＩＬ−２Ｒβγ界面から、約５Å、約１０Å、あるいは約２０Å離れている。本明細書で使用されるように、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒβ界面、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒβ界面、あるいはＩＬ−２Ｒβγ界面に含まれるＩＬ−２の残基は、ＩＬ−２Ｒβサブユニット、ＩＬ−２Ｒγサブユニットからの残基と、あるいはＩＬ−２Ｒβγ界面の残基と、疎水的相互作用、水素結合、あるいはイオン相互作用を形成する。
【００２７】
いくつかの例では、抱合部分は、アミノ酸位置Ｐ２、Ｔ３、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６、Ｔ７、Ｋ８、Ｋ９、Ｑ１１、Ｌ１２、Ｅ１５、Ｈ１６、Ｌ１８、Ｌ１９、Ｄ２０、Ｑ２２、Ｍ２３、Ｎ２６、Ｇ２７、Ｎ２９、Ｎ３０、Ｙ３１、Ｋ３２、Ｋ３５、Ｔ３７、Ｍ４６、Ｋ４７、Ｋ４８、Ａ５０、Ｔ５１、Ｅ５２、Ｋ５３、Ｈ５５、Ｑ５７、Ｅ６０、Ｅ６７、Ｎ７１、Ｑ７４、Ｓ７５、Ｋ７６、Ｎ７７、Ｆ７８、Ｈ７９、Ｒ８１、Ｐ８２、Ｒ８３、Ｄ８４、Ｓ８７、Ｎ８８、Ｎ８９、Ｖ９１、Ｉ９２、Ｌ９４、Ｅ９５、Ｋ９７、Ｇ９８、Ｓ９９、Ｅ１００、Ｔ１０１、Ｔ１０２、Ｆ１０３、Ｍ１０４、Ｃ１０５、Ｅ１０６、Ｙ１０７、Ａ１０８、Ｄ１０９、Ｅ１１０、Ｔ１１１、Ａ１１２、Ｔ１１３、Ｅ１１６、Ｎ１１９、Ｒ１２０、Ｔ１２３、Ａ１２５、Ｑ１２６、Ｓ１２７、Ｓ１３０、Ｔ１３１、Ｌ１３２、およびＴ１３３から選択されたアミノ酸残基に結合し、アミノ酸残基の番号はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対応する。いくつかの実施形態において、アミノ酸位置は、Ｋ８、Ｋ９、Ｑ１１、Ｌ１２、Ｅ１５、Ｈ１６、Ｌ１８、Ｌ１９、Ｄ２０、Ｑ２２、Ｍ２３、Ｎ２６、Ｒ８１、Ｄ８４、Ｓ８７、Ｎ８８、Ｖ９１、Ｉ９２、Ｌ９４、Ｅ９５、Ｅ１１６、Ｎ１１９、Ｒ１２０、Ｔ１２３、Ａ１２５、Ｑ１２６、Ｓ１２７、Ｓ１３０、Ｔ１３１、Ｌ１３２、および、Ｔ１３３から選択される。いくつかの例では、アミノ酸位置は、Ｐ２、Ｔ３、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６、Ｔ７、Ｇ２７、Ｎ２９、Ｎ３０、Ｙ３１、Ｋ３２、Ｋ３５、Ｔ３７、Ｍ４６、Ｋ４７、Ｋ４８、Ａ５０、Ｔ５１、Ｅ５２、Ｋ５３、Ｈ５５、Ｑ５７、Ｅ６０、Ｅ６７、Ｎ７１、Ｑ７４、Ｓ７５、Ｋ７６、Ｎ７７、Ｆ７８、Ｈ７９、Ｐ８２、Ｒ８３、Ｎ８９、Ｋ９７、Ｇ９８、Ｓ９９、Ｅ１００、Ｔ１０１、Ｔ１０２、Ｆ１０３、Ｍ１０４、Ｃ１０５、Ｅ１０６、Ｙ１０７、Ａ１０８、Ｄ１０９、Ｅ１１０、Ｔ１１１、Ａ１１２、および、Ｔ１１３から選択される。いくつかの実施形態において、アミノ酸位置は、Ｋ８、Ｋ９、Ｌ１２、Ｅ１５、Ｈ１６、Ｌ１９、Ｄ２０、Ｑ２２、Ｍ２３、Ｎ２６、Ｄ８４、Ｎ８８、Ｅ９５、および、Ｑ１２６から選択される。いくつかの例では、アミノ酸位置はＫ８、Ｋ９、およびＨ１６から選択される。いくつかの例では、アミノ酸位置はＱ２２、Ｎ２６、Ｎ８８、およびＱ１２６から選択される。いくつかの例では、アミノ酸位置はＥ１５、Ｄ２０、Ｄ８４、およびＥ９５から選択される。いくつかの例では、アミノ酸位置はＬ１２、Ｌ１９、およびＭ２３から選択される。いくつかの例では、アミノ酸位置はＱ２２とＮ２６から選択される。場合によっては、アミノ酸位置はＫ８である。場合によっては、アミノ酸位置はＫ９である。場合によっては、アミノ酸位置はＱ１１である。場合によっては、アミノ酸位置はＬ１２である。場合によっては、アミノ酸位置はＥ１５である。場合によっては、アミノ酸位置はＨ１６である。場合によっては、アミノ酸位置はＬ１８である。場合によっては、アミノ酸位置はＬ１９である。場合によっては、アミノ酸位置はＤ２０である。場合によっては、アミノ酸位置はＱ２２である。場合によっては、アミノ酸位置はＭ２３である。場合によっては、アミノ酸位置はＮ２６である。場合によって��、アミノ酸位置はＲ８１である。場合によっては、アミノ酸位置はＤ８４である。場合によっては、アミノ酸位置はＳ８７である。場合によっては、アミノ酸位置はＮ８８である。場合によっては、アミノ酸位置はＶ９１である。場合によっては、アミノ酸位置はＩ９２である。場合によっては、アミノ酸位置はＬ９４である。場合によっては、アミノ酸位置はＥ９５である。場合によっては、アミノ酸位置はＥ１１６である。場合によっては、アミノ酸位置はＮ１１９である。場合によっては、アミノ酸位置はＲ１２０である。場合によっては、アミノ酸位置はＴ１２３である。場合によっては、アミノ酸位置はＡ１２５である。場合によっては、アミノ酸位置はＱ１２６である。場合によっては、アミノ酸位置はＳ１２７である。場合によっては、アミノ酸位置はＳ１３０である。場合によっては、アミノ酸位置はＴ１３１である。場合によっては、アミノ酸位置はＬ１３２である。場合によっては、アミノ酸位置はＴ１３３である。
【００２８】
いくつかの例では、ＩＬ−２抱合体はさらに追加の突然変異を含む。そのような場合、アミノ酸は、血清の半減期、安定性、あるいはこれらの組み合わせの増加のために、追加の抱合部分に抱合する。代替的に、アミノ酸は、追加の抱合部分に結合する前に、リジン、システイン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、あるいはチロシンなどの天然アミノ酸；あるいは、非天然アミノ酸にまず変異する。
【００２９】
いくつかの実施形態において、ＩＬ−２抱合体は、野生型のＩＬ−２ポリペプチドと比較して、ＩＬ−２受容体β（ＩＬ−２Ｒβ）サブユニット、ＩＬ−２受容体γ（ＩＬ−２Ｒγ）サブユニット、あるいはこれらの組み合わせに対する減少した結合親和性を有する。いくつかの例では、野生型のＩＬ−２ポリペプチドと比較して、ＩＬ−２受容体β（ＩＬ−２Ｒβ）サブユニット、ＩＬ−２受容体γ（ＩＬ−２Ｒγ）サブユニット、あるいはこれらの組み合わせに対するＩＬ−２抱合体の減少した親和性は、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、あるいは９９％よりも大きい。場合によっては、減少した結合親和性は約１０％である。場合によっては、減少した結合親和性は約２０％である。場合によっては、減少した結合親和性は約４０％である。場合によっては、減少した結合親和性は約５０％である。場合によっては、減少した結合親和性は約６０％である。場合によっては、減少した結合親和性は約８０％である。場合によっては、減少した結合親和性は約９０％である。場合によっては、減少した結合親和性は約９９％である。場合によっては、減少した結合親和性は約９９％よりも大きい。場合によっては、減少した結合親和性は約８０％である。場合によっては、減少した結合親和性は約１００％である。
【００３０】
いくつかの実施形態において、野生型のＩＬ−２ポリペプチドと比較して、ＩＬ−２受容体β（ＩＬ−２Ｒβ）サブユニット、ＩＬ−２受容体γ（ＩＬ−２Ｒγ）サブユニット、あるいはこれらの組み合わせに対するＩＬ−２抱合体の減少した親和性は、約１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、３０倍、５０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、１０００倍、あるいはそれ以上である。場合によっては、減少した結合親和性は約１倍である。場合によっては、減少した結合親和性は約２倍である。場合によっては、減少した結合親和性は約４倍である。場合によっては、減少した結合親和性は約５倍である。場合によっては、減少した結合親和性は約６倍である。場合によっては、減少した結合親和性は約８倍である。場合によっては、減少した結合親和性は約１０倍である。場合によっては、減少した結合親和性は約３０倍である。場合によっては、減少した結合親和性は約５０倍である。場合によっては、減少した結合親和性は約１００倍である。場合によっては、減少した結合親和性は約３００倍である。場合によっては、減少した結合親和性は約５００倍である。場合によっては、減少した結合親和性は約１０００倍である。場合によっては、減少した結合親和性は１０００倍を超える。
【００３１】
いくつかの実施形態において、ＩＬ−２抱合体は、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒβ複合体に対する減少したＩＬ−２Ｒγサブユニットの動員を有する。場合によっては、減少した動員は、非天然アミノ酸（例えば、野生型のＩＬ−２ポリペプチド）のない同等なＩＬ−２ポリペプチドによるＩＬ−２Ｒγサブユニット動員と比較される。場合によっては、ＩＬ−２Ｒγサブユニット動員の減少は、非天然アミノ酸修飾のない同等のＩＬ−２ポリペプチドと比較して、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、あるいは９９％を超える減少である。場合によっては、ＩＬ−２Ｒγサブユニット動員の減少は約１０％である。場合によっては、ＩＬ−２Ｒγサブユニット動員の減少は約２０％である。場合によっては、ＩＬ−２Ｒγサブユニット動員の減少は約４０％である。場合によっては、ＩＬ−２Ｒγサブユニット動員の減少は約５０％である。場合によっては、ＩＬ−２Ｒγサブユニット動員の減少は約６０％である。場合によっては、ＩＬ−２Ｒγサブユニット動員の減少は約７０％である。場合によっては、ＩＬ−２Ｒγサブユニット動員の減少は約８０％である。場合によっては、ＩＬ−２Ｒγサブユニット動員の減少は約９０％である。場合によっては、ＩＬ−２Ｒγサブユニット動員の減少は約９９％である。場合によっては、ＩＬ−２Ｒγサブユニット動員の減少は９９％よりも大きい。場合によっては、ＩＬ−２Ｒγサブユニット動員の減少は約１００％である。いくつかの例では、ＩＬ−２抱合体はＩＬ−２Ｒαサブユニット動員の増大をさらに有する。
【００３２】
いくつかの実施形態において、ＩＬ−２Ｒγサブユニット動員の減少は、非天然アミノ酸修飾のない同等のＩＬ−２ポリペプチド（野生型のＩＬ−２ポリペプチド）と比較して、約１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、３０倍、５０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、１０００倍、あるいはそれ以上である。場合によっては、ＩＬ−２Ｒγサブユニット動員の減少は約１倍である。場合によっては、ＩＬ−２Ｒγサブユニット動員の減少は約２倍である。場合によっては、ＩＬ−２Ｒγサブユニット動員の減少は約４倍である。場合によっては、ＩＬ−２Ｒγサブユニット動員の減少は約５倍である。場合によっては、ＩＬ−２Ｒγサブユニット動員の減少は約６倍である。場合によっては、ＩＬ−２Ｒγサブユニット動員の減少は約８倍である。場合によっては、ＩＬ−２Ｒγサブユニット動員の減少は約１０倍である。場合によっては、ＩＬ−２Ｒγサブユニット動員の減少は約３０倍である。場合によっては、ＩＬ−２Ｒγサブユニット動員の減少は約５０倍である。場合によっては、ＩＬ−２Ｒγサブユニット動員の減少は約１００倍である。場合によっては、ＩＬ−２Ｒγサブユニット動員の減少は約３００倍である。場合によっては、ＩＬ−２Ｒγサブユニット動員の減少は約５００倍である。場合によっては、ＩＬ−２Ｒγサブユニット動員の減少は約１０００倍である。場合によっては、ＩＬ−２Ｒγサブユニット動員の減少は１０００倍よりも大きい。いくつかの例では、ＩＬ−２抱合体はＩＬ−２Ｒαサブユニット動員の増大をさらに有する。
【００３３】
いくつかの実施形態において、ＩＬ−２抱合体は、ＩＬ−２ポリペプチドに対するＩＬ−２Ｒαサブユニット動員の増加を有する。場合によっては、減少した動員は、非天然アミノ酸のない同等のＩＬ−２ポリペプチドによる（例えば、野生型のＩＬ−２ポリペプチド）ＩＬ−２Ｒαサブユニット動員と比較される。場合によっては、ＩＬ−２Ｒαサブユニット動員の増加は、非天然アミノ酸修飾のない同等のＩＬ−２ポリペプチドと比較して、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、あるいは９９％を超える増加である。場合によっては、ＩＬ−２Ｒαサブユニット動員の増加は約１０％である。場合によっては、ＩＬ−２Ｒαサブユニット動員の増加は約２０％である。場合によっては、ＩＬ−２Ｒαサブユニット動員の増加は約４０％である。場合によっては、ＩＬ−２Ｒαサブユニット動員の増加は約５０％である。場合によっては、ＩＬ−２Ｒαサブユニット動員の増加は約６０％である。場合によっては、ＩＬ−２Ｒαサブユニット動員の増加は約７０％である。場合によっては、ＩＬ−２Ｒαサブユニット動員の増加は約８０％である。場合によっては、ＩＬ−２Ｒαサブユニット動員の増加は約９０％である。場合によっては、ＩＬ−２Ｒαサブユニット動員の増加は約９９％である。場合によっては、ＩＬ−２Ｒαサブユニット動員の増加は９９％を超える。場合によっては、ＩＬ−２Ｒαサブユニット動員の増加は約１００％である。いくつかの例では、ＩＬ−２抱合体はさらに、ＩＬ−２Ｒβサブユニットおよび／またはＩＬ−２Ｒαサブユニットの動員が減少している。
【００３４】
いくつかの実施形態において、ＩＬ−２Ｒαサブユニット動員の増加は、非天然アミノ酸修飾のない同等のＩＬ−２ポリペプチド（野生型のＩＬ−２ポリペプチド）と比較して、約１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、３０倍、５０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、１０００倍、あるいはそれ以上である。場合によっては、ＩＬ−２Ｒαサブユニット動員の増加は約１倍である。場合によっては、ＩＬ−２Ｒαサブユニット動員の増加は約２倍である。場合によっては、ＩＬ−２Ｒαサブユニット動員の増加は約４倍である。場合によっては、ＩＬ−２Ｒαサブユニット動員の増加は約５倍である。場合によっては、ＩＬ−２Ｒαサブユニット動員の増加は約６倍である。場合によっては、ＩＬ−２Ｒαサブユニット動員の増加は約８倍である。場合によっては、ＩＬ−２Ｒαサブユニット動員の増加は約１０倍である。場合によっては、ＩＬ−２Ｒαサブユニット動員の増加は約３０倍である。場合によっては、ＩＬ−２Ｒαサブユニット動員の増加は約５０倍である。場合によっては、ＩＬ−２Ｒαサブユニット動員の増加は約１００倍である。場合によっては、ＩＬ−２Ｒαサブユニット動員の増加は約３００倍である。場合によっては、ＩＬ−２Ｒαサブユニット動員の増加は約５００倍である。場合によっては、ＩＬ−２Ｒαサブユニット動員の増加は約１０００倍である。場合によっては、ＩＬ−２Ｒαサブユニット動員の増加は１０００倍を超える。いくつかの例では、ＩＬ−２抱合体はさらに、ＩＬ−２Ｒβサブユニットおよび／またはＩＬ−２Ｒαサブユニットの動員が減少している。
【００３５】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたＩＬ−２ポリペプチドは、ＩＬ−２Ｒβγに対する受容体シグナル伝達能力が減少している。いくつかの例では、受容体シグナル伝達能力の減少は、野生型ＩＬ−２ポリペプチドと比較して、ＩＬ−２Ｒβγに対して、約１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、３０倍、５０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、１０００倍、またはそれ以上である。場合によっては、受容体シグナル伝達能力の減少は約２倍である。場合によっては、受容体シグナル伝達能力の減少は約５倍である。場合によっては、受容体シグナル伝達能力の減少は約１０倍である。場合によっては、受容体シグナル伝達能力の減少は約２０倍である。場合によっては、受容体シグナル伝達能力の減少は約３０倍である。場合によっては、受容体シグナル伝達能力の減少は約４０倍である。場合によっては、受容体シグナル伝達能力の減少は約５０倍である。場合によっては、受容体シグナル伝達能力の減少は約１００倍である。場合によっては、受容体シグナル伝達能力の減少は約２００倍である。場合によっては、受容体シグナル伝達能力の減少は約３００倍である。場合によっては、受容体シグナル伝達能力の減少は約４００倍である。場合によっては、受容体シグナル伝達能力の減少は約５００倍である。場合によっては、受容体シグナル伝達能力の減少は約１０００倍である。
【００３６】
いくつかの例では、受容体シグナル伝達能力はＥＣ５０値によって測定される。場合によっては、受容体シグナル伝達能力の減少はＥＣ５０値の増加である。いくつかの例では、ＥＣ５０値の増加は、野生型のＩＬ−２ポリペプチドと比較して、約１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、３０倍、５０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、１０００倍、またはそれ以上である。
【００３７】
いくつかの例では、受容体シグナル伝達能力はＥＤ５０値によって測定される。場合によっては、受容体シグナル伝達能力の減少はＥＤ５０値の増加である。いくつかの例では、ＥＤ５０値の増加は、野生型のＩＬ−２ポリペプチドと比較して、約１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、３０倍、５０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、１０００倍、またはそれ以上である。
【００３８】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたＩＬ−２ポリペプチドは、野生型のＩＬ−２ポリペプチドの治療濃度域と比較して、拡張した治療濃度域を有する。いくつかの例では、拡張した治療濃度域は、ＩＬ−２ポリペプチドとインターロイキン２受容体βγ（ＩＬ−２Ｒβγ）との間の結合の減少、ＩＬ−２Ｒβγに対する受容体シグナル伝達能力の減少、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒβ複合体へのＩＬ−２Ｒγサブユニットの動員の減少、あるいは、ＩＬ−２ポリペプチドへのＩＬ−２Ｒαサブユニットの動員の増加によるものである。いくつかの例では、ＩＬ−２ポリペプチドは、インターロイキン２αβγ受容体（ＩＬ−２Ｒαβγ）の活性化が損なわれていない。
【００３９】
いくつかの実施形態では、修飾されたＩＬ−２ポリペプチドは、ＩＬ−２βγシグナル伝達複合体に対する第１の受容体シグナル伝達能力と、ＩＬ−２αβγシグナル伝達複合体に対する第２の受容体シグナル伝達能力を示し、ここで、第１の受容体シグナル伝達能力と第２の受容体シグナル伝達能力との間の差は、少なくとも１倍である。いくつかの例では、差は少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、あるいは１０００倍以上である。いくつかの例では、第１の受容体シグナル伝達能力は、第２の受容体シグナル伝達能力未満である。いくつかの例では、第１の受容体シグナル伝達能力は、第２の受容体シグナル伝達能力よりも、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、あるいはそれ未満である。場合によっては、修飾されたＩＬ−２ポリペプチドは、ＩＬ−２αβγシグナル伝達複合体に対する第２の受容体シグナル伝達能力よりも低い、ＩＬ−２βγシグナル伝達複合体に対する受容体シグナル伝達能力を有する。場合によっては、修飾されたＩＬ−２ポリペプチドの第１の受容体シグナル伝達能力は、野生型のＩＬ−２ポリペプチドの受容体シグナル伝達能力よりも少なくとも１倍低い。場合によっては、修飾されたＩＬ−２ポリペプチドの第１の受容体シグナル伝達能力は、野生型のＩＬ−２ポリペプチドの受容体シグナル伝達能力よりも、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、あるいは５００倍低い。場合によっては、第１の受容体シグナル伝達能力と第２の受容体シグナル伝達能力は両方とも野生型のＩＬ−２ポリペプチドのそれぞれの能力よりも低いが、第１の受容体シグナル伝達能力は第２の受容体シグナル伝達能力よりも低い。場合によっては、第１の受容体シグナル伝達能力と第２の受容体シグナル伝達能力との間の差は、修飾されたＩＬ−２ポリペプチドの治療濃度域を増大させる。
【００４０】
いくつかの実施形態において、抱合部分は、直接的に、あるいは、リンカーペプチドを介して間接的に、ＩＬ−２ポリペプチドのＮ末端あるいはＣ末端に結合される。場合によっては、抱合部分（例えば、ポリマー、タンパク質、あるいはペプチド）は、ＩＬ−２のＮ末端あるいはＣ末端において、直接的に、あるいは、リンカーペプチドを介して間接的に、ＩＬ−２に遺伝的に融合される。いくつかの例では、抱合部分は、Ｎ末端あるいはＣ末端のアミノ酸残基に結合する。いくつかの例では、抱合部分は、Ｎ末端またはＣ末端のアミノ酸残基に結合する反応基に結合する。
【００４１】
いくつかの実施形態において、ＩＬ−２抱合体は、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１２時間、１８時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、あるいはそれよりも長い血漿半減期を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２抱合体は、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、あるいはそれ以上よりも長い血漿半減期を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２抱合体は、１時間よりも長い血漿半減期を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２抱合体は、２時間よりも長い血漿半減期を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２抱合体は、３時間よりも長い血漿半減期を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２抱合体は、４時間よりも長い血漿半減期を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２抱合体は、５時間よりも長い血漿半減期を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２抱合体は、６時間よりも長い血漿半減期を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２抱合体は、７時間よりも長い血漿半減期を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２抱合体は、８時間よりも長い血漿半減期を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２抱合体は、９時間よりも長い血漿半減期を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２抱合体は、１０時間よりも長い血漿半減期を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２抱合体は、１２時間よりも長い血漿半減期を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２抱合体は、１８時間よりも長い血漿半減期を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２抱合体は、２４時間よりも長い血漿半減期を含む。
【００４２】
いくつかの実施形態において、ＩＬ−２抱合体は、少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１２時間、１５時間、１８時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、あるいはそれ以上の血漿半減期を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２抱合体は、少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１２時間、１５時間、１８時間、２４時間、あるいはそれ以上の血漿半減期を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２抱合体は、少なくとも１時間の血漿半減期を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２抱合体は、少なくとも２時間の血漿半減期を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２抱合体は、少なくとも３時間の血漿半減期を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２抱合体は、少なくとも４時間の血漿半減期を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２抱合体は、少なくとも５時間の血漿半減期を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２抱合体は、少なくとも６時間の血漿半減期を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２抱合体は、少なくとも７時間の血漿半減期を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２抱合体は、少なくとも８時間の血漿半減期を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２抱合体は、少なくとも９時間の血漿半減期を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２抱合体は、少なくとも１０時間の血漿半減期を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２抱合体は、少なくとも１２時間の血漿半減期を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２抱合体は、少なくとも１８時間の血漿半減期を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２抱合体は、少なくとも２４時間の血漿半減期を含む。
【００４３】
いくつかの実施形態において、ＩＬ−２抱合体は、約１時間から約７日間、約１２時間から約７日間、約１８時間から約７日間、約２４時間から約７日間、約１時間から約５日間、約１２時間から約５日間、約２４時間から約５日間、約２日間から約５日間、あるいは、約２日間から約３日間の血漿半減期を含む。
【００４４】
いくつかの実施形態において、ＩＬ−２抱合体は、約１時間から約１８時間、約１時間から約１２時間、約２時間から約１０時間、約２時間から約８時間、約４時間から約１８時間、約４時間から約１２時間、約４時間から約１０時間、約４時間から約８時間、約６時間から約１８時間、約６時間から約１２時間、約６時間から約１０時間、約６時間から約８時間、約８時間から約１８時間、約８時間から約１２時間、あるいは、約８時間から約１０時間の血漿半減期を含む。
【００４５】
いくつかの実施形態において、ＩＬ−２抱合体は、Ｔｒｅｇ細胞を増殖および／または拡張することができるが、アポトーシスなどの有害な作用を及ぼさない血漿半減期を含む。
【００４６】
いくつかの実施形態において、ＩＬ−２抱合体は、野生型のＩＬ−２と比較して、例えば、少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１２時間、１５時間、１８時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、あるいはそれ以上、延長された血漿半減期を含む。
【００４７】
いくつかの実施形態において、ＩＬ−２抱合体は、野生型のＩＬ−２と比較して、例えば、約１時間から約１８時間、約１時間から約１２時間、約２時間から約１０時間、約２時間から約８時間、約４時間から約１８時間、約４時間から約１２時間、約４時間から約１０時間、約４時間から約８時間、約６時間から約１８時間、約６時間から約１２時間、約６時間から約１０時間、約６時間から約８時間、約８時間から約１８時間、約８時間から約１２時間、あるいは、約８時間から約１０時間の、延長された血漿半減期を含む。
【００４８】
いくつかの実施形態において、ＩＬ−２抱合体は、毒性の減少した延長された血漿半減期を含む。いくつかの例では、ＩＬ−２抱合体は、毒性の減少した、少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１２時間、１５時間、１８時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、あるいはそれ以上延長された血漿半減期を含む。いくつかの例では、ＩＬ−２抱合体は、毒性の減少した、少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１２時間、１５時間、１８時間、２４時間、あるいはそれ以上延長された血漿半減期を含む。いくつかの例では、ＩＬ−２抱合体は、毒性の減少した、約１時間から約１８時間、約１時間から約１２時間、約２時間から約１０時間、約２時間から約８時間、約４時間から約１８時間、約４時間から約１２時間、約４時間から約１０時間、約４時間から約８時間、約６時間から約１８時間、約６時間から約１２時間、約６時間から約１０時間、約６時間から約８時間、約８時間から約１８時間、約８時間から約１２時間、あるいは、約８時間から約１０時間延長された血漿半減期を含む。場合によっては、減少した毒性は、野生型のＩＬ−２と比較して、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、５０倍、１００倍、あるいはそれ以上減少する。場合によっては、減少した毒性は、野生型のＩＬ−２と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、あるいはそれ以上減少する。
【００４９】
いくつかの実施形態において、ＩＬ−２抱合体は、抱合部分のサイズ（例えば、体積あるいは長さ）が血漿安定性を向上させるが効力を減少させない抱合部分を含む。いくつかの例では、抱合部分のサイズは、少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１２時間、１５時間、１８時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、あるいはそれ以上、血漿半減期を延長させる。いくつかの例では、抱合部分のサイズは、少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１２時間、１５時間、１８時間、２４時間、あるいはそれ以上、血漿半減期を延長させる。いくつかの例では、抱合部分のサイズは、約１時間から約１８時間、約１時間から約１２時間、約２時間から約１０時間、約２時間から約８時間、約４時間から約１８時間、約４時間から約１２時間、約４時間から約１０時間、約４時間から約８時間、約６時間から約１８時間、約６時間から約１２時間、約６時間から約１０時間、約６時間から約８時間、約８時間から約１８時間、約８時間から約１２時間、あるいは、約８時間から約１０時間、血漿半減期を延長させる。いくつかの例では、抱合部分のサイズは、野生型のＩＬ−２と比較して、５％、４％、３％、２％、１％、あるいはそれ以下、効力を減少させる。
【００５０】
いくつかの実施形態において、ＩＬ−２抱合体は、抱合部分のサイズ（例えば、体積あるいは長さ）が血漿安定性と効力を向上させる抱合部分を含む。いくつかの例では、抱合部分のサイズは、少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１２時間、１５時間、１８時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、あるいはそれ以上、血漿半減期を延長させる。いくつかの例では、抱合部分のサイズは、少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１２時間、１５時間、１８時間、２４時間、あるいはそれ以上、血漿半減期を延長させる。いくつかの例では、抱合部分のサイズは、約１時間から約１８時間、約１時間から約１２時間、約２時間から約１０時間、約２時間から約８時間、約４時間から約１８時間、約４時間から約１２時間、約４時間から約１０時間、約４時間から約８時間、約６時間から約１８時間、約６時間から約１２時間、約６時間から約１０時間、約６時間から約８時間、約８時間から約１８時間、約８時間から約１２時間、あるいは、約８時間から約１０時間、血漿半減期を延長させる。いくつかの例では、抱合部分のサイズはさらに、野生型のＩＬ−２と比較して、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、あるいはそれ以上、効力を増強する。
【００５１】
いくつかの例では、抱合部分は、ＩＬ−２ＲβγとＩＬ−２の受容体シグナル伝達能力を損なうか、妨害し、あるいは、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒβ複合体へのＩＬ−２Ｒγサブユニットの動員を減少させる。
【００５２】
いくつかの例では、ＩＬ−２Ｒβγに対する減少した受容体シグナル伝達能力を有する修飾されたＩＬ−２ポリペプチドは、ＣＤ４＋Ｔ調節（Ｔｒｅｇ）細胞を拡張することができる。
【００５３】
いくつかの実施形態において、修飾されたＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒαβγ複合体によるＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞の増殖は、野生型のＩＬ−２ポリペプチドのそれと同等であるか、あるいはそれより大きい。
【００５４】
いくつかの実施形態において、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒαβγ複合体は、動物モデルにおける疾患経過を調節するのに十分な、集団へのＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞の増殖を誘導する。
【００５５】
いくつかの実施形態において、インターロイキン２αβγ受容体（ＩＬ−２Ｒαβγ）結合タンパク質が本明細書に記載され、ここで、上記結合タンパク質のインターロイキン２βγ受容体（ＩＬ−２Ｒβγ）のための受容体シグナル伝達能力は、野生型ヒトＩＬ−２（ｈＩＬ−２）のそれ未満であり、および上記結合タンパク質は、少なくとも１つの非天然アミノ酸を含む。場合によっては、上記結合タンパク質は、修飾されたＩＬ−２ポリペプチドあるいはその機能的に活性なフラグメントであり、ここで、修飾されたＩＬ−２ポリペプチドは、少なくとも１つの非天然アミノ酸を含む。
【００５６】
いくつかの実施形態において、インターロイキン２αβγ受容体（ＩＬ−２Ｒαβγ）結合タンパク質が本明細書に記載され、ここで、上記結合タンパク質によるＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒβ複合体へのＩＬ−２Ｒγサブユニットの動員は、野生型ヒトＩＬ−２（ｈＩＬ−２）のそれ未満であり、および、上記結合タンパク質は、少なくとも１つの非天然アミノ酸を含む。場合によっては、上記結合タンパク質は、修飾されたＩＬ−２ポリペプチドあるいはその機能的に活性なフラグメントであり、ここで、修飾されたＩＬ−２ポリペプチドは少なくとも１つの非天然アミノ酸を含む。
【００５７】
いくつかの実施形態において、インターロイキン２αβγ受容体（ＩＬ−２Ｒαβγ）結合タンパク質が本明細書に記載され、ここで、上記結合タンパク質のインターロイキン２βγ受容体（ＩＬ−２Ｒβγ）の結合親和性は、野生型ヒトＩＬ−２（ｈＩＬ−２）のそれ未満であり、および、上記結合タンパク質は少なくとも１つの非天然アミノ酸を含む。そのような場合、上記結合タンパク質は、修飾されたＩＬ−２ポリペプチドあるいはその機能的に活性なフラグメントであり、ここで、修飾されたＩＬ−２ポリペプチドは少なくとも１つの非天然アミノ酸を含む。
【００５８】
いくつかの実施形態において、非天然アミノ酸およびＩＬ−２Ｒαβγを含む、修飾されたＩＬ−２ポリペプチドを含むＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒαβγ複合体が本明細書に記載され、ここで、修飾されたＩＬ−２ポリペプチドは、ＩＬ−２Ｒβγに対する減少した受容体シグナル伝達能力を有し、および、減少した受容体シグナル伝達能力が、野生型のＩＬ−２ポリペプチドとＩＬ−２Ｒβγとの間の結合親和性と比較される。場合によっては、修飾されたＩＬ−２ポリペプチドは、非天然アミノ酸に共有結合された抱合部分をさらに含む。
【００５９】
いくつかの実施形態において、非天然アミノ酸およびＩＬ−２Ｒαβγを含む、修飾されたＩＬ−２ポリペプチドを含むＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒαβγ複合体が本明細書に記載され、ここで、上記修正されたＩＬ−２ポリペプチドによるＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒβ複合体へのＩＬ−２Ｒγサブユニットの動員は、野生型のＩＬ−２ポリペプチドのそれ未満である。場合によっては、修飾されたＩＬ−２ポリペプチドは、非天然アミノ酸に共有結合された抱合部分をさらに含む。
【００６０】
いくつかの実施形態において、非天然アミノ酸およびＩＬ−２Ｒαβγを含む、修飾されたＩＬ−２ポリペプチドを含むＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒαβγ複合体が本明細書に記載され、ここで、修飾されたＩＬ−２ポリペプチドは、ＩＬ−２Ｒβγに対する減少した結合親和性を有し、および、減少した結合親和性が、野生型のＩＬ−２ポリペプチドとＩＬ−２Ｒβγとの間の結合親和性と比較される。いくつかの実施形態において、非天然アミノ酸およびＩＬ−２Ｒαβγを含む、修飾されたＩＬ−２ポリペプチドを含むＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒαβγ複合体が本明細書に記載され、ここで、上記修飾されたＩＬ−２ポリペプチドによるＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒβ複合体へのＩＬ−２Ｒγサブユニットの動員は、野生型のＩＬ−２ポリペプチドのそれ未満である。いくつかの例では、修飾されたＩＬ−２ポリペプチドは、非天然アミノ酸に共有結合された抱合部分をさらに含む。
【００６１】
いくつかの実施形態において、細胞集団のＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞を選択的に拡張するＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞アクチベーターが本明細書に記載され、ここで、上記アクチベーターは、少なくとも１つの非天然アミノ酸を含む修飾されたＩＬ−２ポリペプチドを含む。いくつかの例では、上記アクチベーターが上記ＣＤ３＋細胞集団に接している場合、上記アクチベーターは、野生型のＩＬ−２ポリペプチドによって接触されるＣＤ３＋細胞集団中のＣＤ８＋エフェクターＴ細胞および／またはナチュラルキラー細胞の拡張と比較して、ＣＤ３＋細胞集団中のＣＤ８＋エフェクターＴ細胞および／またはナチュラルキラー細胞を２０％、１５％、１０％、５％、１％、または０．１％未満拡張する。いくつかの例では、上記細胞集団はインビボの細胞集団である。いくつかの例では、上記細胞集団はインビトロの細胞集団である。いくつかの例では、上記細胞集団はエクスビボ細胞集団である。
【００６２】
ＩＬ−１０抱合体
いくつかの実施形態において、アミノ酸位置で修飾されたＩＬ−１０抱合体が本明細書に記載される。ＩＬ−１０（ヒトサイトカイン合成抑制因子またはＣＳＩＦとしても知られている）は、病原体に対する炎症反応を制限する免疫修飾性のサイトカインであるが、それはＣＤ８  Ｔ細胞におけるその免疫賦活作用ゆえに、抗腫瘍性サイトカインとしても同定された。ＩＬ−１０は、マクロファージ上のＴｈ１サイトカイン、ＭＨＣクラスＩＩ抗原、および共刺激分子の発現をダウンレギュレートし、Ｂ細胞生存、増殖、ならびに抗体生成をさらに増強する。加えて、ＩＬ−１０は、胸腺細胞の増殖およびＣＤ８  Ｔ細胞の細胞毒性を刺激することができる。いくつかの例では、ＩＬ−１０抱合体は、単離および精製されたＩＬ−１０ポリペプチドと抱合部分を含む。いくつかの例では、ＩＬ−１０抱合体は、野生型ＩＬ−１０ポリペプチドと比較して、ＩＬ−１０受容体に対する減少した親和性を有する。場合によっては、抱合部分は、（例えば、ＩＬ−１０／ＩＬ−１０Ｒα界面で）ＩＬ−１０受容体と相互作用するアミノ酸残基に結合する。場合によっては、抱合部分は、（例えば、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα界面から約５Å、約１０Å、約１５Å、あるいは約２０Å離れて）ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα界面の近位にあるアミノ酸残基に結合する。本明細書で使用されるように、ＩＬ−１０／ＩＬ−１０Ｒα界面に含まれる残基は、ＩＬ−１０からの残基と疎水的相互作用、水素結合、あるいはイオン相互作用を形成する、ＩＬ−１０残基を含む。場合によっては、抱合部分は、直接的に、あるいは、リンカーペプチドを介して間接的に、サイトカインのＮ末端あるいはＣ末端に結合される。さらなる場合において、抱合部分は、ＩＬ−１０とＩＬ−１０Ｒとの間の相互作用を調節して、その免疫抑制活性を強化し、その免疫賦活作用を低減する。いくつかの例では、ＩＬ−１０抱合体は、ＩＬ−１０／ＩＬ−１０Ｒシグナル伝達を介してリンパ球の別個の集団をアップレギュレートする。いくつかの例では、ＩＬ−１０抱合体は免疫活性を調節する。
【００６３】
追加のサイトカイン抱合体
いくつかの実施形態において、アミノ酸位置で修飾された１つ以上の追加のサイトカイン抱合体が本明細書に記載される。典型的なサイトカインとしては、限定されないが、ＩＬ−１β、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、およびＩＬ−２１を含む。いくつかの例では、サイトカイン抱合体は、単離および精製されたサイトカインポリペプチドと抱合部分を含む。いくつかの例では、サイトカイン抱合体は、その野生型のサイトカインと比較して、そのそれぞれの受容体に対する減少した親和性を有する。場合によっては、抱合部分は、受容体界面の近位にある（例えば、受容体界面から約５Å、約１０Å、約１５Å、あるいは約２０Å離れて）アミノ酸残基に結合する。場合によっては、抱合部分は、直接的に、あるいは、リンカーペプチドを介して間接的に、サイトカインペプチドのＮ末端あるいはＣ末端に結合される。さらなる場合において、抱合部分は、サイトカインとその受容体との間の相互作用を調節して、その免疫抑制活性を強化し、その免疫賦活作用を低減する。いくつかの例では、サイトカイン抱合体は、その受容体シグナル伝達を介してリンパ球の別個の集団をアップレギュレートする。いくつかの例では、サイトカイン抱合体は免疫活性を調節する。
【００６４】
サイトカイン抱合体前駆体
突然変異体サイトカイン（ＩＬ−２など）を含むサイトカイン抱合体前駆体が本明細書に記載され、ここで、１つ以上のアミノ酸が野生型アミノ酸から変異している。そのような前駆体は、しばしば、疾患または疾病の処置のために本明細書に記載される方法と共に使用される。いくつかの実施形態において、サイトカイン前駆体は抱合しない。そのような突然変異は、様々な付加、欠失、または置換を含む。いくつかの実施形態において、突然変異は、異なる天然アミノ酸の置換を含む。いくつかの例では、突然変異体サイトカインは、アミノ酸位置Ｐ２、Ｔ３、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６、Ｔ７、Ｋ８、Ｋ９、Ｑ１１、Ｌ１２、Ｅ１５、Ｈ１６、Ｌ１８、Ｌ１９、Ｄ２０、Ｑ２２、Ｍ２３、Ｎ２６、Ｇ２７、Ｎ２９、Ｎ３０、Ｙ３１、Ｋ３２、Ｋ３５、Ｔ３７、Ｍ４６、Ｋ４７、Ｋ４８、Ａ５０、Ｔ５１、Ｅ５２、Ｋ５３、Ｈ５５、Ｑ５７、Ｅ６０、Ｅ６７、Ｎ７１、Ｑ７４、Ｓ７５、Ｋ７６、Ｎ７７、Ｆ７８、Ｈ７９、Ｒ８１、Ｐ８２、Ｒ８３、Ｄ８４、Ｓ８７、Ｎ８８、Ｎ８９、Ｖ９１、Ｉ９２、Ｌ９４、Ｅ９５、Ｋ９７、Ｇ９８、Ｓ９９、Ｅ１００、Ｔ１０１、Ｔ１０２、Ｆ１０３、Ｍ１０４、Ｃ１０５、Ｅ１０６、Ｙ１０７、Ａ１０８、Ｄ１０９、Ｅ１１０、Ｔ１１１、Ａ１１２、Ｔ１１３、Ｅ１１６、Ｎ１１９、Ｒ１２０、Ｔ１２３、Ａ１２５、Ｑ１２６、Ｓ１２７、Ｓ１３０、Ｔ１３１、Ｌ１３２、およびＴ１３３に突然変異を含み、ここで、アミノ酸残基の番号付けはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対応する。いくつかの例では、アミノ酸位置は、Ｋ８、Ｋ９、Ｑ１１、Ｌ１２、Ｅ１５、Ｈ１６、Ｌ１８、Ｌ１９、Ｄ２０、Ｑ２２、Ｍ２３、Ｎ２６、Ｒ８１、Ｄ８４、Ｓ８７、Ｎ８８、Ｖ９１、Ｉ９２、Ｌ９４、Ｅ９５、Ｅ１１６、Ｎ１１９、Ｒ１２０、Ｔ１２３、Ａ１２５、Ｑ１２６、Ｓ１２７、Ｌ１３２、およびＴ１３３から選択される。いくつかの例では、アミノ酸位置は、Ｐ２、Ｔ３、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６、Ｔ７、Ｇ２７、Ｎ２９、Ｎ３０、Ｙ３１、Ｋ３２、Ｋ３５、Ｔ３７、Ｍ４６、Ｋ４７、Ｋ４８、Ａ５０、Ｔ５１、Ｅ５２、Ｋ５３、Ｈ５５、Ｑ５７、Ｅ６０、Ｅ６７、Ｎ７１、Ｑ７４、Ｓ７５、Ｋ７６、Ｎ７７、Ｆ７８、Ｈ７９、Ｐ８２、Ｒ８３、Ｎ８９、Ｋ９７、Ｇ９８、Ｓ９９、Ｅ１００、Ｔ１０１、Ｔ１０２、Ｆ１０３、Ｍ１０４、Ｃ１０５、Ｅ１０６、Ｙ１０７、Ａ１０８、Ｄ１０９、Ｅ１１０、Ｔ１１１、Ａ１１２、およびＴ１１３から選択される。いくつかの例では、アミノ酸位置は、Ｋ８、Ｋ９、Ｌ１２、Ｅ１５、Ｈ１６、Ｌ１９、Ｄ２０、Ｑ２２、Ｍ２３、Ｎ２６、Ｄ８４、Ｎ８８、Ｅ９５、およびＱ１２６から選択される。いくつかの例では、アミノ酸位置は、Ｋ８、Ｋ９、およびＨ１６から選択される。いくつかの例では、アミノ酸位置は、Ｑ２２、Ｎ２６、Ｎ８８、およびＱ１２６から選択される。いくつかの例では、アミノ酸位置は、Ｅ１５、Ｄ２０、Ｄ８４、およびＥ９５から選択される。いくつかの例では、アミノ酸位置は、Ｌ１２、Ｌ１９、およびＭ２３から選択される。いくつかの例では、アミノ酸位置は、Ｑ２２およびＮ２６から選択される。いくつかの実施形態において、サイトカイン突然変異体は抱合部分を含み、ここで、抱合部分は突然変異体サイトカインにおける変異��位に結合される。
【００６５】
タンパク質またはペプチドの融合
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるサイトカイン抱合体は、ペプチドまたはタンパク質に融合されるサイトカイン（例えば、ＩＬ−２、あるいは他のサイトカイン）を含む（融合）。いくつかの実施形態において、ペプチドまたはタンパク質は抗体または抗体フラグメントである。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるサイトカイン抱合体は、抗体に融合されるサイトカイン（例えば、ＩＬ−２、あるいは他のサイトカイン）、またはその結合フラグメントを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるサイトカインは、複数のタンパク質またはペプチドに融合される。いくつかの実施形態において、サイトカイン結合体は、タンパク質またはペプチドへのサイトカイン融合および少なくとも抱合部分を含む。いくつかの例では、抗体またはその結合フラグメントは、ヒト化抗体またはその結合フラグメント、マウス抗体またはその結合フラグメント、キメラ抗体またはその結合フラグメント、モノクローナル抗体またはその結合フラグメント、一価のＦａｂ’、二価のＦａｂ２、Ｆ（ａｂ）’３フラグメント、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ビス−ｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ）２、ダイアボディ、ミニボディ、ナノボディ、トリアボディ、テトラボディ、ヒューマボディ、ジスルフィド安定Ｆｖタンパク質（ｄｓＦｖ）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、Ｉｇ  ＮＡＲ、ｃａｍｅｌｉｄ抗体またはその結合フラグメント、二重特異性抗体またはその結合フラグメント、あるいはその化学修飾された誘導体を含む。いくつかの例において、そのような融合タンパク質は、翻訳を介して直接生成される。いくつかの実施形態において、融合は化学的あるいは他の酵素的なライゲーション方法を使用して生成される。いくつかの実施形態において、サイトカイン結合体は、リンカーによって結合される融合ペプチドまたはタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、リンカーはヘペプチドである。いくつかの実施形態において、サイトカイン結合体はＮ末端ペプチドまたはタンパク質の融合を含む。いくつかの実施形態において、サイトカイン結合体はＣ末端ペプチドまたはタンパク質の融合を含む。場合によっては、ペプチドまたはタンパク質に融合されるサイトカインは、以下に記載される１つ以上の抱合部分にさらに抱合される。
【００６６】
いくつかの例では、サイトカイン抱合体は、ｓｃＦｖ、ビス−ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ｄｓＦｖ、またはｓｄＡｂ融合への融合を含む。場合によっては、融合はｓｃＦｖを含む。場合によっては、サイトカイン抱合体は、ビス−ｓｃＦｖへの融合を含む。場合によっては、サイトカイン抱合体は、（ｓｃＦｖ）２への融合を含む。場合によっては、サイトカイン抱合体は、ｄｓＦｖへの融合を含む。場合によっては、サイトカイン抱合体は、ｓｄＡｂへの融合を含む。場合によっては、ｓｃＦｖ、ビス−ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ｄｓＦｖ、またはｓｄＡｂに融合されるサイトカインは、以下に記載される１つ以上の抱合部分にさらに抱合される。
【００６７】
いくつかの例では、サイトカイン抱合体は、抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、またはＩｇＤ）のＦｃ部分への融合を含む。いくつかの例では、サイトカイン抱合体は、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）のＦｃ部分への融合を含む。場合によっては、Ｆｃ部分に融合するサイトカインは、以下に記載される１つ以上の抱合部分にさらに抱合される。
【００６８】
場合によっては、サイトカイン（例えば、インターロイキン、ＩＦＮ、またはＴＮＦ）のポリペプチドは、抗体、またはその結合フラグメントに融合される。場合によっては、サイトカインポリペプチドは、ヒト化抗体またはその結合フラグメント、マウス抗体またはその結合フラグメント、キメラ抗体またはその結合フラグメント、モノクローナル抗体またはその結合フラグメント、一価のＦａｂ’、二価のＦａｂ２、Ｆ（ａｂ）’３、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ビス−ｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ）２、ダイアボディ、ミニボディ、ナノボディ、トリアボディ、テトラボディ、ヒューマボディ、ジスルフィド安定Ｆｖタンパク質（ｄｓＦｖ）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、Ｉｇ  ＮＡＲ、ｃａｍｅｌｉｄ抗体またはその結合フラグメント、二重特異性抗体またはその結合フラグメント、あるいはその化学修飾された誘導体に融合される。さらなる場合において、サイトカインポリペプチドは抗体のＦｃ部分に融合される。さらなる場合において、サイトカインポリペプチドは、ＩｇＧ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）のＦｃ部分に融合される。場合によっては、抗体に融合されるサイトカイン、またはその結合フラグメントは、以下に記載される１つ以上の抱合部分に抱合される。
【００６９】
場合によっては、ＩＬ−２ポリペプチドは抗体、またはその結合フラグメントに融合される。いくつかの例では、ＩＬ−２は、ヒト化抗体またはその結合フラグメント、マウス抗体またはその結合フラグメント、キメラ抗体またはその結合フラグメント、モノクローナル抗体またはその結合フラグメント、一価のＦａｂ’、二価のＦａｂ２、Ｆ（ａｂ）’３フラグメント、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ビス−ｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ）２、ダイアボディ、ミニボディ、ナノボディ、トリアボディ、テトラボディ、ヒューマボディ、ジスルフィド安定Ｆｖタンパク質（ｄｓＦｖ）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、Ｉｇ  ＮＡＲ、ｃａｍｅｌｉｄ抗体またはその結合フラグメント、二重特異性抗体またはその結合フラグメント、あるいはその化学修飾された誘導体に融合される。さらなる場合において、ＩＬ−２ポリペプチドは抗体のＦｃ部分に融合される。さらなる場合において、ＩＬ−２ポリペプチドは、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）のＦｃ部分に融合される。場合によっては、抗体またはＩＬ−２ポリペプチドに融合されるその結合フラグメントは、ＩＬ−２ＲβγとＩＬ−２ポリペプチドとの結合を妨害しないだろう。場合によっては、抗体またはＩＬ−２ポリペプチドに融合されるその結合フラグメントは、ＩＬ−２ＲβγとのＩＬ−２ポリペプチドの結合を部分的に遮断する。場合によっては、抗体またはその結合フラグメントに融合されるＩＬ−２ポリペプチドは、以下に述べられる１つ以上の抱合部分に抱合される。
【００７０】
天然アミノ酸および非天然アミノ酸
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるアミノ酸残基（例えば、ＩＬ−２などのサイトカイン内）は、抱合部分に結合する（または、抱合部分と反応する）前に、リジン、システイン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、またはチロシンに変異する。例えば、リジン、システイン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、またはチロシンの側鎖は、本明細書に記載される抱合部分に結合することができる。いくつかの例では、アミノ酸残基はシステイン、リジン、またはヒスチジンに変異する。場合によっては、アミノ酸残基はシステインに変異する。場合によっては、アミノ酸残基はリジンに変異する。場合によっては、アミノ酸残基はヒスチジンに変異する。場合によっては、アミノ酸残基はチロシンに変異する。場合によっては、アミノ酸残基はトリプトファンに変異する。いくつかの実施形態において、非天然アミノ酸は抱合部分と抱合しない。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるサイトカインは非天然アミノ酸を含み、ここで、サイトカインはタンパク質に抱合され、結合点は非天然アミノ酸でない。
【００７１】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるアミノ酸残基（例えば、ＩＬ−２などのサイトカイン内）は、抱合部分に結合する前に、非天然アミノ酸に変異する。場合によっては、非天然アミノ酸の突然変異は、免疫系の自己抗原反応を防ぐか、あるいは最小化する。本明細書で使用されるように、用語「非天然アミノ酸」は、タンパク質において自然に生じる２０のアミノ酸以外のアミノ酸を指す。非天然アミノ酸の非限定的な例は、以下を含む：ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ヨード−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−メトキシフェニルアラニン、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニン、ｐ−プロパルギル−フェニルアラニン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチル−フェニルアラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃｐ−セリン、Ｌ−Ｄｏｐａ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ボロノフェニルアラニン、Ｏ−プロパルギルチロシン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、セレノシステイン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、アジドリジン（ＡｚＫ）、チロシンアミノ酸の非天然アナログ；グルタミンアミノ酸の非天然アナログ；フェニルアラニンアミノ酸の非天然アナログ；セリンアミノ酸の非天然アナログ；トレオニンアミノ酸の非天然アナログ；アルキル、アリール、アシル、アジド、シアノ、ハロ、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシル、アルケニル、アルキニル（ａｌｋｙｎｌ）、エーテル、チオール、スルホニル、セレノ、エステル、チオ酸、ホウ酸塩、ボロン酸  、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環式、エノン、イミン、アルデヒド、ヒドロキシルアミン、ケト、またはアミノ置換アミノ酸、あるいはそれらの組み合わせ；光活性化可能なクロスリンカーを有するアミノ酸；スピン標識アミノ酸；蛍光性アミノ酸；アミノ酸結合金属；金属含有アミノ酸；放射性アミノ酸；光ケージ化（ｐｈｏｔｏｃａｇｅｄ）アミノ酸および／または光異性化可能なアミノ酸；ビオチンまたはビオチンアナログ含有アミノ酸；ケト含有アミノ酸；ポリエチレングリコールまたはポリエーテルを含むアミノ酸；重原子置換アミノ酸；化学的に切断可能または光切断可能なアミノ酸；細長い側鎖を有するアミノ酸；毒性基含有アミノ酸；糖置換アミノ酸；炭素に結合された糖を含有するアミノ酸；酸化還元活性アミノ酸；ヒドロキシ含有酸；アミノチオ酸；α、α二置換アミノ酸；β−アミノ酸；プロリンまたはヒスチジン以外の環状アミノ酸、およびフェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファン以外の芳香族アミノ酸。
【００７２】
いくつかの実施形態において、非天然アミノ酸は、選択的反応基、または標的ポリペプチドの部位選択的標識化のための反応基を含む。いくつかの例では、化学は生体直交型反応（ｂｉｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）（例えば、生体適合性および選択的反応）である。場合によっては、化学は、Ｃｕ（Ｉ）−触媒化または「銅を含まない」アルキン−アジド  トリアゾール−生成反応、シュタウディンガー・ライゲーション、逆電子要請型Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ（ＩＥＤＤＡ）反応、「光クリック（ｐｈｏｔｏ−ｃｌｉｃｋ）」ケミストリー、またはオレフィンメタセシス、および鈴木・宮浦クロスカップリングあるいは薗頭カップリングなどの金属媒介プロセスである。
【００７３】
いくつかの実施形態において、非天然アミノ酸は、例えば、ＵＶでの照射の際に架橋する光反応基を含む。
【００７４】
いくつかの実施形態において、非天然アミノ酸は光ケージ化アミノ酸を含む。
【００７５】
いくつかの例では、非天然アミノ酸は、パラ置換、メタ置換、またはオルト置換のアミノ酸誘導体である。
【００７６】
いくつかの例では、非天然アミノ酸は、ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ヨード−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、ｐ−メトキシフェニルアラニン、ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニン、ｐ−プロパルギル−フェニルアラニン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチル−フェニルアラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃｐ−セリン、Ｌ−Ｄｏｐａ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、またはイソプロピル−Ｌ−フェニルアラニンを含む。
【００７７】
場合によっては、非天然アミノ酸は、３−アミノチロシン、３−ニトロチロシン、３，４−ジヒドロキシ−フェニルアラニン、または３−ヨードチロシンである。
【００７８】
場合によっては、非天然アミノ酸はフェニルセレノシステインである。
【００７９】
いくつかの例では、非天然アミノ酸は、ベンゾフェノン、ケトン、ヨウ化物、メトキシ、アセチル、ベンゾイル、またはアジド含有フェニルアラニン誘導体である。
【００８０】
いくつかの例では、非天然アミノ酸は、ベンゾフェノン、ケトン、ヨウ化物、メトキシ、アセチル、ベンゾイル、またはアジド含有リジン誘導体である。
【００８１】
いくつかの例では、非天然アミノ酸は芳香族側鎖を含む。
【００８２】
いくつかの例では、非天然アミノ酸は芳香族側鎖を含まない。
【００８３】
いくつかの例では、非天然アミノ酸はアジド基を含む。
【００８４】
いくつかの例では、非天然アミノ酸はマイケルアクセプター基を含む。いくつかの例では、マイケルアクセプター基は、１、２−付加反応を介して共有結合を形成することができる不飽和部分を含む。いくつかの例では、マイケルアクセプター基は、電子不足アルケンまたはアルキンを含む。いくつかの例では、マイケルアクセプター基は、限定されないが、α、β不飽和の：ケトン、アルデヒド、スルホキシド、スルホン、ニトリル、イミン、または芳香族化合物を含む。
【００８５】
いくつかの例では、非天然アミノ酸はデヒドロアラニンである。
【００８６】
いくつかの例では、非天然アミノ酸はアルデヒドまたはケトン基を含む。
【００８７】
いくつかの例では、非天然アミノ酸はアルデヒドまたはケトン基を含むリジン誘導体である。
【００８８】
いくつかの例では、非天然アミノ酸は、β、γ、またはδ位に１つ以上のＯ、Ｎ、Ｓｅ、またはＳ原子を含むリジン誘導体である。いくつかの例では、非天然アミノ酸は、γ位にＯ、Ｎ、Ｓｅ、またはＳ原子を含むリジン誘導体である。
【００８９】
いくつかの例では、非天然アミノ酸は、イプシロン  Ｎ原子が酸素原子と取り替えられるリジン誘導体である。
【００９０】
いくつかの例では、非天然アミノ酸は、自然発生の翻訳後に修飾されるリジンではないリジン誘導体である。
【００９１】
いくつかの例では、非天然アミノ酸は側鎖を含むアミノ酸であり、α位から６番目の原子はカルボニル基を含む。いくつかの例では、非天然アミノ酸は側鎖を含むアミノ酸であり、ここで、α位から６番目の原子は、カルボニル基を含み、および、α位からの５番目の原子は窒素である。いくつかの例では、非天然アミノ酸は側鎖を含むアミノ酸であり、α位から７番目の原子は酸素原子である。
【００９２】
いくつかの例では、非天然アミノ酸はセリンを含むセリン誘導体である。いくつかの例では、非天然アミノ酸は、セレノセリン（ｓｅｌｅｎｏｓｅｒｉｎｅ）（２−アミノ−３−ヒドロセレノプロパン酸である。いくつかの例では、非天然アミノ酸は、２−アミノ−３−（（２−（（３−（ベンジルオキシ）−３−オキソプロピル）アミノ）エチル）セラニル）プロパン酸である。いくつかの例では、非天然アミノ酸は、２−アミノ−３−（フェニルセラニル）プロパン酸である。いくつかの例では、非天然アミノ酸はセレニウムを含み、ここで、セレニウムの酸化は、アルケンを含む非天然アミノ酸の形成を結果としてもたらす。
【００９３】
いくつかの例では、非天然アミノ酸はシクロオクチニル基を含む。
【００９４】
いくつかの例では、非天然アミノ酸は、トランスシクロテニル（ｔｒａｎｓｃｙｃｌｏｃｔｅｎｙｌ）基を含む。
【００９５】
いくつかの例では、非天然アミノ酸はノルボルネニル基を含む。
【００９６】
いくつかの例では、非天然アミノ酸はシクロプロペニル基を含む。
【００９７】
いくつかの例では、非天然アミノ酸はジアジリン基を含む。
【００９８】
いくつかの例では、非天然アミノ酸はテトラジン基を含む。
【００９９】
いくつかの例では、非天然アミノ酸はリジン誘導体であり、側鎖窒素はカルバミル化される。いくつかの例では、非天然アミノ酸はリジン誘導体であり、側鎖窒素はアシル化される。いくつかの例では、非天然アミノ酸は、２−アミノ−６−｛［（ｔｅｒｔ−ブトキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸である。いくつかの例では、非天然アミノ酸は、２−アミノ−６−｛［（ｔｅｒｔ−ブトキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸である。いくつかの例では、非天然アミノ酸は、Ｎ６−Ｂｏｃ−Ｎ６−メチルリシンである。いくつかの例では、非天然アミノ酸は、Ｎ６−アセチルリジンである。いくつかの例では、非天然アミノ酸は、ピロリシンである。いくつかの例では、非天然アミノ酸は、Ｎ６−トリフルオロアセチルリジン（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｙｌｌｙｓｉｎｅ）である。いくつかの例では、非天然アミノ酸は、２−アミノ−６−｛［（ベンジルオキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸である。いくつかの例では、非天然アミノ酸は、２−アミノ−６−｛［（ｐ−ヨードベンジルオキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸である。いくつかの例では、非天然アミノ酸は、２−アミノ−６−｛［（ｐ−ニトロベンジルオキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸である。いくつかの例では、非天然アミノ酸は、Ｎ６−プロリルリジン（ｐｒｏｌｙｌｌｙｓｉｎｅ）である。いくつかの例では、非天然アミノ酸は、２−アミノ−６−｛［（シクロペンチロキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸である。いくつかの例では、非天然アミノ酸は、Ｎ６−（シクロペンタンカルボニル）リジンである。いくつかの例では、非天然アミノ酸は、Ｎ６−（テトラヒドロフラン−２−カルボニル）リジンである。いくつかの例では、非天然アミノ酸は、Ｎ６−（３−エチニルテトラヒドロフラン−２−カルボニル）リジンである。いくつかの例では、非天然アミノ酸は、Ｎ６−（（プロプ−２−イン−１−イルオキシ）カルボニル）リジンである。いくつかの例では、非天然アミノ酸は、２−アミノ−６−｛［（２−アジドシクロペンチルオキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸である。いくつかの例では、非天然アミノ酸は、Ｎ６−（（２−アジドエトキシ）カルボニル）リジンである。いくつかの例では、非天然アミノ酸は、２−アミノ−６−｛［（２−ニトロベンジルオキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸である。いくつかの例では、非天然アミノ酸は２−アミノ−６−｛［（２−シクロオクチニルオキシ）カルボニル］アミノ｝ヘキサン酸である。いくつかの例では、非天然アミノ酸は、Ｎ６−（２−アミノブト−３−イノイル）リジンである。いくつかの例では、非天然アミノ酸は、２−アミノ−６−（（２−アミノブト−３−イノイル）オキシ）ヘキサン酸である。いくつかの例では、非天然アミノ酸は、Ｎ６−（アリルオキシカルボニル）リジンである。いくつかの例では、非天然アミノ酸は、Ｎ６−（ブテニル−４−オキシカルボニル）リジンである。いくつかの例では、非天然アミノ酸は、Ｎ６−（ペンテニル−５−オキシカルボニル）リジンである。いくつかの例では、非天然アミノ酸は、Ｎ６−（（ブト−３−イン−１−イルオキシ）カルボニル）−リジンである。いくつかの例では、非天然アミノ酸は、Ｎ６−（（ペンタ−４−イン−１−イルオキシ）カルボニル）−リジンである。いくつかの例では、非天然アミノ酸は、Ｎ６−（チアゾリジン−４−カルボニル）リジンである。いくつかの例では、非天然アミノ酸は、２−アミノ−８−オキソノナン酸である。いくつかの例では、非天然アミノ酸は、２−アミノ−８−オキソオクタン酸である。いくつかの例では、非天然アミノ酸は、Ｎ６−（２−オキソアセチル）リジンである。
【０１００】
いくつかの例では、非天然アミノ酸はＮ６−プロピオニルリジン（ｐｒｏｐｉｏｎｙｌｌｙｓｉｎｅ）である。いくつかの例では、非天然アミノ酸はＮ６−ブチリルリジン（ｂｕｔｙｒｙｌｌｙｓｉｎｅ）である。いくつかの例では、非天然アミノ酸はＮ６−（ブト−２−エノイル）リジンである。いくつかの例では、非天然アミノ酸はＮ６−（（ビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−２−イルオキシ）カルボニル）リジンである。いくつかの例では、非天然アミノ酸は、Ｎ６−（（スピロ［２．３］ヘキサ（ｈｅｘ）−１−エン−５−イルメトキシ）カルボニル）リジンである。いくつかの例では、非天然アミノ酸は、Ｎ６−（（（４―（１−（トリフルオロメチル）シクロプロパ−２−エン−１−イル）ベンジル）オキシ）カルボニル）リジンである。いくつかの例では、非天然アミノ酸は、Ｎ６−（（ビシクロ［２．２．１］ヘプト−５−エン−２−イルメトキシ）カルボニル）リジンである。いくつかの例では、非天然アミノ酸は、システイニルリジン（ｃｙｓｔｅｉｎｙｌｌｙｓｉｎｅ）である。いくつかの例では、非天然アミノ酸は、Ｎ６−（（１−（６−ニトロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）エトキシ）カルボニル）リジンである。いくつかの例では、非天然アミノ酸は、Ｎ６−（（２−（３−メチル−３Ｈ−ジアジリン−３−イル）エトキシ）カルボニル）リジンである。いくつかの例では、非天然アミノ酸は、Ｎ６−（（３−（３−メチル−３Ｈ−ジアジリン−３−イル）プロポキシ）カルボニル）リジンである。いくつかの例では、非天然アミノ酸は、Ｎ６−（メタ  ニトロベニルオキシ（ｎｉｔｒｏｂｅｎｙｌｏｘｙ））Ｎ６−メチルカルボニル）リジン）である。いくつかの例では、非天然アミノ酸は、Ｎ６−（（ビシクロ［６．１．０］ノン−４−イン−９−イルメトキシ）カルボニル）−リジンである。いくつかの例では、非天然アミノ酸は、Ｎ６−（（シクロヘプト−３−エン−１−イルオキシ）カルボニル）−Ｌ−リジンである。
【０１０１】
いくつかの例では、非天然アミノ酸は、２−アミノ−３−（（（（（ベンジルオキシ）カルボニル）アミノ）メチル）セラニル）プロパン酸である。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、非天然アミノ酸は、再目的化された（ｒｅｐｕｒｐｏｓｅｄ）アンバー、オパール、またはオーカー停止コドンによってサイトカイン（例えば、ＩＬ  ポリペプチド）に組み込まれる。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、非天然アミノ酸は、４塩基コドンによってサイトカイン（例えば、ＩＬ  ポリペプチド）に組み込まれる。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、非天然アミノ酸は、再目的化された希少センスコドンによってサイトカイン（例えば、ＩＬ  ポリペプチド）に組み込まれる。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、非天然アミノ酸は、非天然核酸を含む合成コドンによってサイトカイン（例えば、ＩＬ  ポリペプチド）に組み込まれる。いくつかの例では、非天然アミノ酸は、直交する改変シンテターゼ／ｔＲＮＡ対によってサイトカインに組み込まれる。そのような直交対は非天然シンテターゼを含み、非天然シンテターゼは、非天然アミノ酸で非天然ｔＲＮＡをチャージする（ｃｈａｒｇｉｎｇ）ことができるが、ａ）非天然ｔＲＮＡへの他の内因性アミノ酸のチャージ、およびｂ）他の内因性ｔＲＮＡへの非天然アミノ酸のチャージを最小化する。そのような直交対はｔＲＮＡを含み、ｔＲＮＡは、非天然シンテターゼによってチャージされ得るが、内因性シンテターゼによって、ａ）他の内因性アミノ酸でチャージされるのを回避する。いくつかの実施形態において、そのような対は、細菌、酵母菌、古細菌、またはヒトソースなどの様々な有機体から同定される。いくつかの実施形態において、直交シンテターゼ／ｔＲＮＡ対は単一の有機体からの構成要素を含む。いくつかの実施形態において、直交シンテターゼ／ｔＲＮＡ対は、２つの異なる有機体からの構成要素を含む。いくつかの実施形態において、直交シンテターゼ／ｔＲＮＡ対は、修飾前に２つの異なるアミノ酸の翻訳を促進する構成要素を含む。いくつかの実施形態において、直交シンテターゼは改変アラニンシンテターゼである。いくつかの実施形態において、直交シンテターゼは改変アルギニンシンテターゼである。いくつかの実施形態において、直交シンテターゼは改変アスパラギンシンテターゼである。いくつかの実施形態において、直交シンテターゼは改変アスパラギン酸シンテターゼである。いくつかの実施形態において、直交シンテターゼは改変システインシンテターゼである。いくつかの実施形態において、直交シンテターゼは改変グルタミンシンセターゼである。いくつかの実施形態において、直交シンテターゼは改変グルタミン酸シンテターゼである。いくつかの実施形態において、直交シンテターゼは改変アラニングリシンである。いくつかの実施形態において、直交シンテターゼは改変ヒスチジンシンテターゼである。いくつかの実施形態において、直交シンテターゼは改変ロイシンシンテターゼである。いくつかの実施形態において、直交シンテターゼは改変イソロイシンシンテターゼである。いくつかの実施形態において、直交シンテターゼは改変リジンシンテターゼである。いくつかの実施形態において、直交シンテターゼは改変メチオニンシンテターゼである。いくつかの実施形態において、直交シンテターゼは改変フェニルアラニンシンテターゼである。いくつかの実施形態において、直交シンテターゼは改変プロリンシンテターゼである。いくつかの実施形態において、直交シンテターゼは改変セリンシンテターゼである。いくつかの実施形態において、直交シンテターゼは改変トレオニンシンテターゼである。いくつかの実施形態において、直交シンテターゼは改変トリプトファンシンセターゼである。いくつかの実施形態において、直交シンテターゼは改変チロシンシンテターゼである。いくつかの実施形態において、直交シンテターゼは改変バリンシンテターゼである。いくつかの実施形態にお���て、直交シンテターゼは改変ホスホセリンシンテターゼである。いくつかの実施形態において、直交ｔＲＮＡは改変アラニンｔＲＮＡである。いくつかの実施形態において、直交ｔＲＮＡは改変アルギニンｔＲＮＡである。いくつかの実施形態において、直交ｔＲＮＡは改変アスパラギンｔＲＮＡである。いくつかの実施形態において、直交ｔＲＮＡは改変アスパラギン酸ｔＲＮＡである。いくつかの実施形態において、直交ｔＲＮＡは改変システインｔＲＮＡである。いくつかの実施形態において、直交ｔＲＮＡは改変グルタミンｔＲＮＡである。いくつかの実施形態において、直交ｔＲＮＡは改変グルタミン酸ｔＲＮＡである。いくつかの実施形態において、直交ｔＲＮＡは改変アラニングリシンである。いくつかの実施形態において、直交ｔＲＮＡは改変ヒスチジンｔＲＮＡである。いくつかの実施形態において、直交ｔＲＮＡは改変ロイシンｔＲＮＡである。いくつかの実施形態において、直交ｔＲＮＡは改変イソロイシンｔＲＮＡである。いくつかの実施形態において、直交ｔＲＮＡは改変リジンｔＲＮＡである。いくつかの実施形態において、直交ｔＲＮＡは改変メチオニンｔＲＮＡである。いくつかの実施形態において、直交ｔＲＮＡは改変フェニルアラニンｔＲＮＡである。いくつかの実施形態において、直交ｔＲＮＡは改変プロリンｔＲＮＡである。いくつかの実施形態において、直交ｔＲＮＡは改変セリンｔＲＮＡである。いくつかの実施形態において、直交ｔＲＮＡは改変トレオニンｔＲＮＡである。いくつかの実施形態において、直交ｔＲＮＡは改変トリプトファンｔＲＮＡである。いくつかの実施形態において、直交ｔＲＮＡは改変チロシンｔＲＮＡである。いくつかの実施形態において、直交ｔＲＮＡは改変バリンｔＲＮＡである。いくつかの実施形態において、直交ｔＲＮＡは改変ホスホセリンｔＲＮＡである。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、非天然アミノ酸は、アミノアシル（ａａＲＳまたはＲＳ）−ｔＲＮＡシンセターゼ−ｔＲＮＡ対によってサイトカイン（例えば、ＩＬ  ポリペプチド）に組み込まれる。典型的なａａＲＳ−ｔＲＮＡ対としては、限定されないが、メタノカルドコックス・ヤンナスキイ（Ｍｊ−Ｔｙｒ）ａａＲＳ／ｔＲＮＡ対、大腸菌ＴｙｒＲＳ（Ｅｃ−Ｔｙｒ）／バチルス・ステアロサーモフィルス  ｔＲＮＡＣＵＡ対、大腸菌ＬｅｕＲＳ（Ｅｃ−Ｌｅｕ）／バチルス・ステアロサーモフィルス ｔＲＮＡＣＵＡ対、およびピロリジル−ｔＲＮＡ対が挙げられる。いくつかの例では、非天然アミノ酸は、Ｍｊ−ＴｙｒＲＳ／ｔＲＮＡ対によってサイトカイン（例えば、ＩＬ  ポリペプチド）に組み込まれる。Ｍｊ−ＴｙｒＲＳ／ｔＲＮＡ対によって組み込まれ得る典型的なＵＡＡとしては、限定されないが、ｐ−アミノフェニルアラニンおよびｐ−メチルフェニルアラニンなどのパラ置換フェニルアラニン誘導体；３−アミノチロシン、３−ニトロチロシン、３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン、および３−ヨードチロシンなどのメタ置換チロシン誘導体；フェニルセレノシステイン（ｐｈｅｎｙｌｓｅｌｅｎｏｃｙｓｔｅｉｎｅ）；ｐ−ブロノフェイルアラニン（ｂｏｒｏｎｏｐｈｅｙｌａｌａｎｉｎｅ）；およびｏ−ニトロベンジルチロシンが挙げられる。
【０１０７】
いくつかの例では、非天然アミノ酸は、Ｅｃ−ティール／ｔＲＮＡＣＵＡまたはＥｃ−Ｌｅｕ／ｔＲＮＡＣＵＡ対によってサイトカイン（例えば、ＩＬポリペプチド）に組み込まれる。Ｅｃ−Ｔｙｒ／ｔＲＮＡＣＵＡまたはＥｃ−Ｌｅｕ／ｔＲＮＡＣＵＡ対によって組み込まれ得る典型的なＵＡＡとしては、限定されないが、ベンゾフェノ、ケトン、ヨウ化物、またはアジド置換基を含むフェニルアラニン誘導体；Ｏ−プロパルギルチロシン；α−アミノカプリル酸、Ｏメチルチロシン、Ｏ−ニトロベンジルシステイン；および、３−（ナフタレン−２−イルアミノ）−２−アミノ−プロパン酸が挙げられる。
【０１０８】
いくつかの例では、非天然アミノ酸は、ピロリジル−ｔＲＮＡ対によってサイトカイン（例えば、ＩＬ  ポリペプチド）に組み込まれる。場合によっては、ＰｙｌＲＳは、古細菌から（例えば、メタン生成古細菌から）得られる。場合によっては、ＰｙｌＲＳは、メタノサルシナ・バーケリ、メタノサルシナ・マゼイ、またはメタノサルシナ・アセチボランスから得られる。ピロリジル−ｔＲＮＡ対によって組み込まれ得る典型的なＵＡＡとしては、限定されないが、２−アミノ−６−（（Ｒ）−テトラヒドロフラン−２−カルボキシアミド）ヘキサン酸、Ｎ−ε−Ｄ−プロリル−Ｌ−リジン、およびＮ−ε−シクロペンチロキシカルボニル−Ｌ−リジンなどのアミドおよびカルバマート置換リジン；Ｎ−ε−アクリロイル  −Ｌ−リジン；Ｎ−ε−［（１−（６−ニトロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソ−ル（ｄｉｏｘｏｌ）−５−イル）エトキシ）カルボニル］−Ｌ−リジン；ならびに、Ｎ−ε−（１−メチルシクロプロ−２−エネカルボキシアミド（ｅｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ））リジンが挙げられる。
【０１０９】
いくつかの例では、非天然アミノ酸は、米国特許第９，９８８，６１９号および米国特許第９，９３８，５１６号において開示されたシンテターゼによって、本明細書に記載されるサイトカイン（例えば、ＩＬ  ポリペプチド）に組み込まれる。そのようなシンテターゼによって組み込まれ得る典型的なＵＡＡとしては、パラ−メチルアジド−Ｌ−フェニルアラニン、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロアラルキル非天然アミノ酸、あるいは他のものが挙げられる。いくつかの実施形態において、そのようなＵＡＡは、ピリジル、ピラジニル、ピラゾリル、トリアゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、チオフェニル、または他の複素環を含む。いくつかの実施形態において、そのようなアミノ酸は、アジド、テトラジン、または水溶性部分などの結合パートナーに抱合することができる他の化学基を含む。いくつかの実施形態において、そのようなシンテターゼは発現され、インビボでサイトカインにＵＡＡを組み込むために使用される。いくつかの実施形態において、そのようなシンテターゼは、無細胞翻訳系を使用して、サイトカインにＵＡＡを組み込むために使用される。
【０１１０】
いくつかの例では、非天然アミノ酸は、自然発生のシンテターゼによって、本明細書に記載されるサイトカイン（例えば、ＩＬ  ポリペプチド）に組み込まれる。いくつかの実施形態において、非天然アミノ酸は、１つ以上のアミノ酸に対して栄養要求性の有機体によってサイトカインに組み込まれる。いくつかの実施形態において、栄養要求性アミノ酸に対応するシンテターゼは、非天然アミノ酸で対応するｔＲＮＡをチャージすることができる。いくつかの実施形態において、非天然アミノ酸は、セレノシステインまたはその誘導体である。いくつかの実施形態において、非天然アミノ酸は、セレノメチオニンまたはその誘導体である。いくつかの実施形態において、非天然アミノ酸は、ヨウ化物などのハロゲン化アリールを含む芳香族アミノ酸である。実施形態において、非天然アミノ酸は、栄養要求性アミノ酸に構造的に類似する。
【０１１１】
いくつかの例では、非天然アミノ酸は、図１において例証される非天然アミノ酸を含む。
【０１１２】
いくつかの例では、非天然アミノ酸は、リジンまたはフェニルアラニンの誘導体またはアナログを含む。いくつかの例では、非天然アミノ酸は、リジン誘導体またはリジンアナログを含む。いくつかの例では、非天然アミノ酸は、ピロリジン（Ｐｙｌ）を含む。いくつかの例では、非天然アミノ酸は、フェニルアラニン誘導体またはフェニルアラニンアナログを含む。いくつかの例では、非天然アミノ酸は、Ｗａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｐｙｒｒｏｌｙｓｙｌ−ｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ：  ａｎ  ｏｒｄｉｎａｒｙ  ｅｎｚｙｍｅ  ｂｕｔ  ａｎ  ｏｕｔｓｔａｎｄｉｎｇ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｔｏｏｌ，”  Ｂｉｏｃｈｅｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｅｔａ  １８４４（６）：  １０５９−４０７０  （２０１４）に記載される非天然アミノ酸である。いくつかの例では、非天然アミノ酸は、図２（例えば、図２Ａおよび図２Ｂ）において例証される非天然アミノ酸を含む。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、非天然アミノ酸は、図３Ａ−図３Ｄにおいて例証される非天然アミノ酸を含む（Ｄｕｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１５，  ６，  ５０−６９の表１から採用される）。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるサイトカイン（例えば、ＩＬ  ポリペプチド）に組み込まれる非天然アミノ酸は、ＵＳ９，８４０，４９３；ＵＳ９，６８２，９３４；ＵＳ２０１７／０２６０１３７；ＵＳ９，９３８，５１６；または、ＵＳ２０１８／００８６７３４に開示される。そのようなシンテターゼによって組み込まれ得る典型的なＵＡＡは、パラ−メチルアジド−Ｌ−フェニルアラニン、アラルキル、ヘテロシクリル、およびヘテロアラルキル、およびリジン誘導体の非天然アミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、そのようなＵＡＡは、ピリジル、ピラジニル、ピラゾリル、トリアゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、チオフェニル、または他の複素環を含む。いくつかの実施形態において、そのようなアミノ酸は、アジド、テトラジン、または水溶性部分などの結合パートナーに抱合することができる他の化学基を含む。いくつかの実施形態において、ＵＡＡは、アルキルリンカーを介して芳香族部分に結合されるアジドを含む。いくつかの実施形態において、アルキルリンカーは、Ｃ１−Ｃ１０リンカーである。いくつかの実施形態において、ＵＡＡは、アルキルリンカーを介して芳香族部分に結合されるテトラジンを含む。いくつかの実施形態において、ＵＡＡは、アミノ基を介して芳香族部分に結合されるテトラジンを含む。いくつかの実施形態において、ＵＡＡは、アルキルアミノ基を介して芳香族部分に結合されるテトラジンを含む。いくつかの実施形態において、ＵＡＡは、アルキル鎖を介してアミノ酸側鎖の末端窒素（例えば、リジン誘導体のＮ６、短いアルキル側鎖を含む誘導体のＮ５、Ｎ４、又Ｎ３）に結合されるアジドを含む。いくつかの実施形態において、ＵＡＡは、アルキル鎖を介してアミノ酸側鎖の末端窒素に結合されるテトラジンを含む。いくつかの実施形態において、ＵＡＡは、アルキル基のリンカーを介してアミドに結合されるアジドまたはテトラジンを含む。いくつかの実施形態において、ＵＡＡは、アジドまたはテトラジン含有カルバマート、あるいは３−アミノアラニン、セリン、リジン、またはその誘導体のアミドである。いくつかの実施形態において、そのようなＵＡＡは、インビボでサイトカインに組み込まれる。いくつかの実施形態において、そのようなＵＡＡは、無細胞系におけるサイトカインに組み込まれる。
【０１１５】
抱合部分
特定の実施形態において、上に記載される１つ以上のサイトカイン（例えば、インターロイキン、ＩＦＮ、またはＴＮＦ）に結合される抱合部分が本明細書に開示される。いくつかの例では、抱合部分は、サイトカインとその受容体の相互作用を乱す分子である。いくつかの例では、抱合部分は、サイトカインに結合される場合、サイトカイン抱合を可能にして、免疫応答を調節することができる任意の分子である。いくつかの例では、抱合部分は水溶性高分子を含む。他の例では、抱合部分はタンパク質またはその結合フラグメントを含む。さらなる場合において、抱合部分はペプチドを含む。さらなる場合において、抱合部分は核酸を含む。さらなる場合において、抱合部分は小分子を含む。場合によっては、抱合部分は、血清半減期を増加させ、および／または安定性を改善する。場合によっては、抱合部分は、１つ以上のサイトカイン受容体ドメインまたはサブユニットとのサイトカイン相互作用を減少させる。さらなる場合において、抱合部分は、１つ以上のサイトカインドメインまたはその同族受容体へのサブユニットとサイトカインとの相互作用を遮断する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるサイトカイン抱合は、複数の複合部分を含む。いくつかの実施形態において、抱合部分は、サイトカインペプチドにおける非天然または天然アミノ酸に結合される。いくつかの実施形態において、サイトカイン抱合体は、天然アミノ酸に結合される抱合部分を含む。いくつかの実施形態において、サイトカイン抱合体は、サイトカインペプチドにおける非天然アミノ酸に結合される。いくつかの実施形態において、抱合部分は、サイトカインペプチドのＮ末端またはＣ末端アミノ酸に結合される。様々な組み合わせ部位が本明細書に開示され、例えば、第１の抱合部分は、サイトカインペプチドにおける非天然または天然アミノ酸に結合され、第２の抱合部分は、サイトカインペプチドのＮ末端またはＣ末端アミノ酸に結合される。いくつかの実施形態において、単一の抱合部分は、サイトカインペプチド（例えば、ステープル）の複数の残基に結合される。いくつかの実施形態において、抱合部分は、サイトカインペプチドのＮ末端およびＣ末端アミノ酸の両方に結合される。
【０１１６】
水溶性ポリマー
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抱合部分は水溶性高分子である。いくつかの例では、水溶性高分子は、非ペプチド性、無毒、および生体適合性である。本明細書で使用されるように、生体組織（例えば、患者の投与）に関する物質のみの使用、あるいは他の物質（例えば、サイトカイン部分などの活性薬剤）との使用に関連する有益な効果が、臨床医（例えば、医師、毒物学者、臨床開発専門家）によって評価されるような任意の有害な影響より上回る場合、物質は生体適合性であるとみなされる。いくつかの例では、水溶性高分子はさらに非免疫原性である。いくつかの例では、インビボでの物質の意図された使用が望ましくない免疫応答（例えば、抗体の形成）をもたらさない場合、あるいは、臨床医（例えば、医師、毒物学者、臨床開発専門家）によって評価されるような、臨床的に有意または重要であると認められない免疫応答が生じる場合、物質は非免疫原であるとみなされる。
【０１１７】
いくつかの例では、水溶性高分子は、約２〜約３００の終端を有するとして特徴付けられる。典型的な水溶性のポリマーとしては、限定されないが、ポリ（アルキレングリコール）、例えば、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）、ポリ（プロピレングリコール）（「ＰＰＧ」）、エチレングリコールおよびプロピレングリコールのコポリマーなど、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィンアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリルアミド）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリラート）、ポリ（サッカライド）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリアクリルアミド（ＰＡＡｍ）、ポリ（Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド）（ＰＨＰＭＡ）、ポリジメチルアクリルアミド（ＰＤＡＡｍ）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン（「ＰＯＺ」）（国際公開第２００８／１０６１８６号に記載される）、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン、および前述のもののいずれかの組み合わせが挙げられる。
【０１１８】
場合によっては、水溶性高分子は特定の構造に限定されない。場合によっては、水溶性高分子は、直鎖状（例えば、エンドキャップされた、例えば、アルコキシＰＥＧ、二官能性のＰＥＧ）、分枝状または多アームの（例えば、ポリオールコアに結合される分岐したＰＥＧまたはＰＥＧ）、樹枝状の（または、星状体）構造であり、各々は、１つ以上の分解性結合を有するか、あるいは有しない。さらに、水溶性高分子の内部構造は、任意の数の異なる反復パターンで構築することができ、ならびに、ホモポリマー、交互共重合体、ランダム共重合体、ブロック共重合体、交互トリポリマー（ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ  ｔｒｉｐｏｌｙｍｅｒ）、ランダムトリポリマー（ｒａｎｄｏｍ  ｔｒｉｐｏｌｙｍｅｒ）、ブロックトリポリマー（ｂｌｏｃｋ  ｔｒｉｐｏｌｙｍｅｒ）からなる群から選択することができる。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、ＩＬ−２抱合体における水溶性高分子の重量平均分子量は、約１００ダルトン〜約１５０，０００ダルトンである。典型的な範囲は、例えば、５，０００ダルトン以上〜約１００，０００ダルトンの範囲、約６，０００ダルトン〜約９０，０００ダルトンの範囲、約８５，０００ダルトン〜約１０，０００ダルトンの範囲、１０，０００ダルトン以上〜約８５，０００ダルトンの範囲、約２０，０００ダルトン〜約８５，０００ダルトンの範囲、約５３，０００ダルトン〜約８５，０００ダルトンの範囲、約２５，０００ダルトン〜約１２０，０００ダルトンの範囲、約２９，０００ダルトン〜約１２０，０００ダルトンの範囲、約３５，０００ダルトン〜約１２０，０００ダルトンの範囲、および約４０，０００ダルトン〜約１２０，０００ダルトンの範囲の重量平均分子量を含む。
【０１２０】
水溶性高分子の典型的な重量平均分子量は、約１００ダルトン、約２００ダルトン、約３００ダルトン、４００ダルトン、約５００ダルトン、約６００ダルトン、約７００ダルトン、約７５０ダルトン、約８００ダルトン、約９００ダルトン、約１，０００ダルトン、約１，５００ダルトン、約２，０００ダルトン、約２，２００ダルトン、約２，５００ダルトン、約３，０００ダルトン、約４，０００ダルトン、約４，４００ダルトン、約４，５００ダルトン、約５，０００ダルトン、約５，５００ダルトン、約６，０００ダルトン、約７，０００ダルトン、約７，５００ダルトン、約８，０００ダルトン、約９，０００ダルトン、約１０，０００ダルトン、約１１，０００ダルトン、約１２，０００ダルトン、約１３，０００、約１４，０００ダルトン、約１５，０００ダルトン、約２０，０００ダルトン、約２２，５００ダルトン、約２５，０００ダルトン、約３０，０００ダルトン、約３５，０００ダルトン、約４０，０００ダルトン、約４５，０００ダルトン、約５０，０００ダルトン、約５５，０００ダルトン、約６０，０００ダルトン、約６５，０００ダルトン、約７０，０００ダルトン、および約７５，０００ダルトンを含む。前述のいずれかの総分子量を有する分枝状バージョンの水溶性高分子（例えば、２つの２０，０００ダルトンのポリマーから構成される分枝状の４０，０００ダルトンの水溶性高分子）も使用することができる。１つ以上の実施形態において、抱合体は、約６，０００ダルトン未満の重量平均分子量を有するＰＥＧに、直接または間接的に結合されるＰＥＧ部分を有しないだろう。
【０１２１】
ＰＥＧは典型的に、多数の（ＯＣＨ２ＣＨ２）単量体［または、ＰＥＧがどのように定義されるかに応じて（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）単量体］を含むだろう。本明細書で使用されるように、反復単位の数は「（（ＯＣＨ２ＣＨ２））ｎ」中の添字「ｎ」によって識別される。したがって、（ｎ）の値は、典型的には以下の範囲の１つ以上に該当する：約２〜約３４００、約１００〜約２３００、約１００〜約２２７０、約１３６〜約２０５０、約２２５〜約１９３０、約４５０〜約１９３０、約１２００〜約１９３０、約５６８〜約２７２７、約６６０〜約２７３０、約７９５〜約２７３０、約７９５〜約２７３０、約９０９〜約２７３０、および約１，２００〜約１，９００。分子量が既知の所定のポリマーに関しては、反復単量体の分子量でポリマーの全重量平均分子量を割ることにより、反復単位（すなわち「ｎ」）の数を決定することが可能である。
【０１２２】
いくつかの例では、水溶性高分子は、エンドキャップされたポリマー、すなわち、より低いＣ１−６アルコキシ基、またはヒドロキシル基などの比較的不活性な基によりキャップされる少なくとも１つの終端を有するポリマーである。ポリマーがＰＥＧである場合、例えば、直鎖状のＰＥＧであるメトキシ−ＰＥＧ（一般的にｍＰＥＧと呼ばれる）が使用されてもよく、ここで、ポリマーの１つの終端はメトキシ（−−ＯＣＨ３）基であり、もう一方の終端は随意に化学的に改変されるヒドロキシルまたは他の官能基である。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、典型的な水溶性高分子としては、限定されないが、Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ，  Ｌｔｄの直鎖または分枝状の個々のＰＥＧ（ｄＰＥＧ）；Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓの分枝状、直鎖状、あるいは分岐状のＰＥＧ；および、ＪｅｎＫｅｍ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙのＹ状のＰＥＧ誘導体が挙げられる。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるサイトカイン（例えば、インターロイキン、ＩＦＮ、またはＴＮＦ）ポリペプチドは、ポリ（アルキレングリコール）、例えば、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）、ポリ（プロピレングリコール）（「ＰＰＧ」）、エチレングリコールおよびプロピレングリコールなどのコポリマー、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィンアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリルアミド）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリラート）、ポリ（サッカライド）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリアクリルアミド（ＰＡＡｍ）、ポリジメチルアクリルアミド（ＰＤＡＡｍ）、ポリ（Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド）（ＰＨＰＭＡ）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン（「ＰＯＺ」）、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）、およびそれらの組み合わせから選択される水溶性高分子に抱合される。いくつかの例では、サイトカインポリペプチドはＰＥＧ（例えば、ペグ化された）に抱合される。いくつかの例では、サイトカインポリペプチドはＰＰＧに抱合される。いくつかの例では、サイトカインポリペプチドはＰＯＺに抱合される。いくつかの例では、サイトカインポリペプチドはＰＶＰに抱合される。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＩＬ−２は、ポリ（アルキレングリコール）、例えば、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）、ポリ（プロピレングリコール）（「ＰＰＧ」）、エチレングリコールおよびプロピレングリコールなどのコポリマー、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィンアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリルアミド）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリラート）、ポリ（サッカライド）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリアクリルアミド（ＰＡＡｍ）、ポリジメチルアクリルアミド（ＰＤＡＡｍ）、ポリ（Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド）（ＰＨＰＭＡ）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン（「ＰＯＺ」）、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）、およびそれらの組み合わせから選択される水溶性高分子に抱合される。いくつかの例では、ＩＬ−２ポリペプチドはＰＥＧ（例えば、ペグ化された）に抱合される。いくつかの例では、ＩＬ−２ポリペプチドはＰＰＧに抱合される。いくつかの例では、ＩＬ−２ポリペプチドはＰＯＺに抱合される。いくつかの例では、ＩＬ−２ポリペプチドはＰＶＰに抱合される。
【０１２６】
いくつかの例では、水溶性高分子はポリグリセロール（ＰＧ）を含む。場合によっては、ポリグリセロールは、高分岐ＰＧ（ＨＰＧ）（例えば、Ｉｍｒａｎ，  ｅｔ  ａｌ．  ”Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｈｉｇｈ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｌｉｎｅａｒ  ａｎｄ  ｂｒａｎｃｈｅｄ  ｐｏｌｙｇｌｙｃｅｒｏｌｓ  ｏｎ  ｔｈｅｉｒ  ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ，”  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ３３：９１３５−９１４７  （２０１２）によって記載されるような）である。その他の場合において、ポリグリセロールは直鎖状ＰＧ（ＬＰＧ）である。さらなる場合において、ポリグリセロールは、中官能性ＰＧ、直鎖状のブロック高分岐ＰＧ（例えば、Ｗｕｒｍ  ｅｔ．  Ａｌ．  ，  ”Ｓｑｕａｒｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  ｌｉｎｅａｒ  ａｎｄ  ｈｙｐｅｒｂｒａｎｃｈｅｄ  ｐｏｌｙ（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，”  Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  １３：１１６１−１１７１  （２０１２））によって記載される）、または側鎖状の官能性ＰＧ（例えば、Ｌｉ，  ｅｔ．  ａｌ．，  ”Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｌｉｎｅａｒ  ｐｏｌｙｅｔｈｅｒ  ｐｏｌｙｏｌ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｓ  ｎｅｗ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ，”  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  ２０：７８０−７８９  （２００９）によって記載される）である。
【０１２７】
いくつかの例では、本明細書に記載されるサイトカイン（例えば、インターロイキン、ＩＦＮ、またはＴＮＦ）ポリペプチドは、ＰＧ、例えば、ＨＰＧ、ＬＰＧ、中官能性ＰＧ、直鎖状のブロック高分岐ＰＧ、側鎖の官能性ＰＧに抱合される。いくつかの例では、サイトカインはＩＬ−２ポリペプチドである。場合によっては、ＩＬ−２ポリペプチドは、ＰＧ、中官能性ＰＧ、直鎖状のブロック高分岐ＰＧに抱合される。
【０１２８】
いくつかの実施形態において、水溶性高分子は分解性合成ＰＥＧ代替物である。典型的な分解性合成ＰＥＧ代替物としては、限定されないが、ポリ［オリゴ（エチレングリコール）メタクリル酸メチル］（ＰＯＥＧＭＡ）；テレキーレック、あるいは両末端が官能基化されたＰＥＧベースのマクロモノマー重合によって生成された、骨格を修飾したＰＥＧ誘導体；分解性結合、例えば、ポリ［（エチレンオキシエ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｏｘｉｅ））−ｃｏ−（メチレンエチレンオキシド］［Ｐ（ＥＯ−ｃｏ−ＭＥＯ）、環状ケテンアセタール、例えば、５，６−ベンゾ−２−メチレン−１，３−ジオキセパン（ＢＭＤＯ）などの、２−メチレン−１，３−ジオキセパン（ＭＤＯ）、およびＯＥＧＭＡにより共重合された２−メチレン−４−フェニル−１，３−ジオキソラン（ＭＰＤＬ）を含む、コモノマーを含むＰＥＧ誘導体；または、ポリ（ε−カプロラクトン）−グラフト（ｇｒａｆｔ）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＣＬｇ−ＰＥＯ）が挙げられる。
【０１２９】
いくつかの例では、本明細書に記載されるサイトカイン（例えば、インターロイキン、ＩＦＮ、またはＴＮＦ）ポリペプチドは、分解性合成ＰＥＧ代替物、例えば、ＰＯＥＧＭ；テレキーレック、あるいは両末端が官能基化されたＰＥＧベースのマクロモノマー重合によって生成された、骨格を修飾したＰＥＧ誘導体；Ｐ（ＥＯ−ｃｏ−ＭＥＯ）；ＯＥＧＭＡにより共重合されたＢＭＤＯ、ＭＤＯ、およびＭＰＤＬなどの環状のケテンアセタール；または、ＰＣＬ−ｇ−ＰＥＯなどに抱合される。いくつかの例では、サイトカインはＩＬ−２ポリペプチドである。場合によっては、ＩＬ−２ポリペプチドは、分解性合成ＰＥＧ代替物、例えば、ＰＯＥＧＭ；テレキーレック、あるいは両末端が官能基化されたＰＥＧベースのマクロモノマー重合によって生成された、骨格を修飾したＰＥＧ誘導体；Ｐ（ＥＯ−ｃｏ−ＭＥＯ）；ＯＥＧＭＡにより共重合されたＢＭＤＯ、ＭＤＯ、およびＭＰＤＬなどの環状のケテンアセタール；または、ＰＣＬ−ｇ−ＰＥＯなどに抱合される。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、水溶性高分子はポリ（双性イオン）を含む。典型的なポリ（双性イオン）としては、限定されないが、ポリ（スルホベタインメタクリレート）（ＰＳＢＭＡ）、ポリ（カルボキシベタインメタクリレート）（ＰＣＢＭＡ）、およびポリ（２−メタクリロイルオキシエチル（ｍｅｔｈｙａｃｒｙｌｏｙｌｏｘｙｅｔｈｙｌ）ホスホリルコリン）（ＰＭＰＣ）が挙げられる。いくつかの例では、本明細書に記載されるサイトカイン（例えば、インターロイキン、ＩＦＮ、またはＴＮＦ）ポリペプチドは、ポリ（双性イオン）、例えば、ＰＳＢＭＡ、ＰＣＢＭＡ、またはＰＭＰＣに抱合される。場合によっては、サイトカインはＩＬ−２ポリペプチドである。場合によっては、ＩＬ−２ポリペプチドは、ポリ（双性イオン）、例えば、ＰＳＢＭＡ、ＰＣＢＭＡ、またはＰＭＰＣに抱合される。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、水溶性高分子はポリカーボネートを含む。典型的なポリカーボネートとしては、限定されないが、ペンタフルオロフェニル５−メチル−２−オキソ−１，３−ジオキサン−５−カルボン酸塩（ＭＴＣ−ＯＣ６Ｆ５）が挙げられる。いくつかの例では、本明細書に記載されるサイトカイン（例えば、インターロイキン、ＩＦＮ、またはＴＮＦ）ポリペプチドは、ポリカーボネート、例えば、ＭＴＣ−ＯＣ６Ｆ５に抱合される。場合によっては、サイトカインはＩＬ−２ポリペプチドである。場合によっては、ＩＬ−２ポリペプチドはポリカーボネート、例えば、ＭＴＣ−ＯＣ６Ｆ５に抱合される。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、水溶性高分子は、ポリマーハイブリッド、例えば、ポリカーボネート／ＰＥＧポリマーハイブリッド、ペプチド／タンパク質ポリマー抱合体、またはヒドロキシル基を含むおよび／または両性イオンの誘導体化されたポリマー（例えば、ヒドロキシル基を含むおよび／または両性イオンの誘導体化されたＰＥＧポリマー）などを含む。いくつかの例では、本明細書に記載されるサイトカイン（例えば、インターロイキン、ＩＦＮ、またはＴＮＦ）ポリペプチドは、ポリマーハイブリッド、例えば、ポリカーボネート／ＰＥＧポリマーハイブリッド、ペプチド／タンパク質ポリマー抱合体、またはヒドロキシル基を含むおよび／または両性イオンの誘導体化されたポリマー（例えば、ヒドロキシル基を含むおよび／または両性イオンの誘導体化されたＰＥＧポリマー）に抱合される。場合によっては、サイトカインはＩＬ−２ポリペプチドである。場合によっては、ＩＬ−２ポリペプチドは、ポリマーハイブリッド、例えば、ポリカーボネート／ＰＥＧポリマーハイブリッド、ペプチド／タンパク質ポリマー抱合体、またはヒドロキシル基を含むおよび／又両性イオンの誘導体化されたポリマー（例えば、ヒドロキシル基を含むおよび／または両性イオンの誘導体化されたＰＥＧポリマー）に抱合される。
【０１３３】
いくつかの例では、水溶性高分子は多糖を含む。典型的な多糖としては、限定されないが、デキストラン、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ヒアルロン酸（ＨＡ）、アミロース、ヘパリン、ヘパラン硫酸（ＨＳ）、デキストリン、またはヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）が挙げられる。場合によっては、サイトカイン（例えば、インターロイキン、ＩＦＮ、またはＴＮＦ）ポリペプチドは多糖に抱合される。場合によっては、ＩＬ−２ポリペプチドはデキストランに抱合される。場合によっては、ＩＬ−２ポリペプチドはＰＳＡに抱合される。場合によっては、ＩＬ−２ポリペプチドはＨＡに抱合される。場合によっては、ＩＬ−２ポリペプチドはアミロースに抱合される。場合によっては、ＩＬ−２ポリペプチドはヘパリンに抱合される。場合によっては、ＩＬ−２ポリペプチドはＨＳに抱合される。場合によっては、ＩＬ−２ポリペプチドはデキストリンに抱合される。場合によっては、ＩＬ−２ポリペプチドはＨＥＳに抱合される。
【０１３４】
場合によっては、水溶性高分子はグリカンを含む。グリカンの典型的なクラスは、Ｎ結合型グリカン、Ｏ結合型グリカン、糖脂質、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ、およびグリコサミノグリカンを含む。場合によっては、サイトカイン（例えば、インターロイキン、ＩＦＮ、またはＴＮＦ）ポリペプチドは、グリカンに抱合される。場合によっては、ＩＬ−２ポリペプチドはＮ結合型グリカンに抱合される。場合によっては、ＩＬ−２ポリペプチドはＯ結合型グリカンに抱合される。場合によっては、ＩＬ−２ポリペプチドは糖脂質に抱合される。場合によっては、ＩＬ−２ポリペプチドはＯ−ＧｌｃＮＡｃに抱合される。場合によっては、ＩＬ−２ポリペプチドはグリコサミノグリカンに抱合される。
【０１３５】
いくつかの実施形態において、水溶性高分子はポリオキサゾリンポリマーを含む。ポリオキサゾリンポリマーは線状合成ポリマーであり、およびＰＥＧと類似し、低い多分散を含む。いくつかの例では、ポリオキサゾリンポリマーは、平均分子体重により特徴づけられる、多分散のポリオキサゾリンポリマーである。場合によっては、ポリオキサゾリンポリマーの平均分子体重は、例えば、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、１０，０００、１２，０００、２０，０００、３５，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００または５００，０００Ｄａを含む。いくつかの例では、ポリオキサゾリンポリマーは、ポリ（２−メチル２−オキサゾリン）（ＰＭＯＺ）、ポリ（２−エチル２−オキサゾリン）（ＰＥＯＺ）、ポリ（２−プロピル２−オキサゾリン）（ＰＰＯＺ）を含む。場合によっては、サイトカイン（例えば、インターロイキン、ＩＦＮ、またはＴＮＦ）ポリペプチドは、ポリオキサゾリンポリマーに抱合される。場合によっては、ＩＬ−２ポリペプチドはポリオキサゾリンポリマーに抱合される。場合によっては、ＩＬ−２ポリペプチドはＰＭＯＺに抱合される。場合によっては、ＩＬ−２ポリペプチドはＰＥＯＺに抱合される。場合によっては、ＩＬ−２ポリペプチドはＰＰＯＺに抱合される。
【０１３６】
いくつかの例では、水溶性高分子はポリアクリル酸ポリマーを含む。場合によっては、サイトカイン（例えば、インターロイキン、ＩＦＮ、またはＴＮＦ）ポリペプチドは、ポリアクリル酸ポリマーに抱合される。場合によっては、ＩＬ−２ポリペプチドはポリアクリル酸ポリマーに抱合される。
【０１３７】
いくつかの例では、水溶性高分子はポリアミンを含む。ポリアミンは、２つ以上の一級アミノ基を含む有機ポリマーである。いくつかの実施形態において、ポリアミンは、分岐ポリアミン、直鎖状ポリアミン、または環状ポリアミンを含む。場合によっては、ポリアミンは低分子量の直鎖状ポリアミンである。典型的なポリアミンは、プトレッシン、カダベリン、スペルミジン、スペルミン、エチレンジアミン、１、３−ジアミノプロパン、ヘキサメチレンジアミン、テトラエチルメチレンジアミン、およびピペラジンを含む。場合によっては、サイトカイン（例えば、インターロイキン、ＩＦＮ、またはＴＮＦ）ポリペプチドは、ポリアミンに抱合される。場合によっては、ＩＬ−２ポリペプチドはポリアミンに抱合される。場合によっては、ＩＬ−２ポリペプチドは、プトレッシン、カダベリン、スペルミジン、スペルミン、エチレンジアミン、１、３−ジアミノプロパン、ヘキサメチレンジアミン、テトラエチルメチレンジアミン、またはピペラジンに抱合される。
【０１３８】
いくつかの例では、水溶性高分子は、米国特許第７，７４４，８６１号、第８，２７３，８３３号、および第７，８０３，７７７号に記載されている。いくつかの例では、サイトカイン（例えば、インターロイキン、ＩＦＮ、またはＴＮＦ）ポリペプチドは、米国特許第７，７４４，８６１号、第８，２７３，８３３号、または第７，８０３，７７７号に記載されるリンカーに抱合される。場合によっては、ＩＬ−２ポリペプチドは、米国特許第７，７４４，８６１号、第８，２７３，８３３号、または第７，８０３，７７７号に記載されるリンカーに抱合される。
【０１３９】
タンパク質
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抱合部分は、タンパク質またはその結合フラグメントである。典型的なタンパク質は、アルブミン、トランスフェリン、またはトランスサイレチンを含む。いくつかの例では、タンパク質またはその結合フラグメントは、抗体、またはその結合フラグメントを含む。場合によっては、サイトカイン抱合体は、タンパク質またはその結合フラグメントを含む。場合によっては、タンパク質またはその結合フラグメントを含むＩＬ−２抱合体は、増加した血清半減期、および／または安定性を有する。場合によっては、タンパク質またはその結合フラグメントを含むＩＬ−２抱合体は、１つ以上のＩＬ−２Ｒサブユニットと減少したＩＬ−２の相互作用を有する。さらなる場合では、タンパク質あるいはその結合フラグメントは、１つ以上のＩＬ−２ＲサブユニットとＩＬ−２の相互作用を遮断するか、あるいはＩＬ−２Ｒβγシグナル伝達複合体のアセンブリに影響する。
【０１４０】
いくつかの実施形態において、抱合部分はアルブミンである。アルブミンは、水溶性の球状たんぱくのファミリーである。それは、一般に血漿において見られ、全血漿たんぱく質の約５５−６０％を構成する。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は、三次構造３つのドメイン、つまり、ドメインＩ（アミノ酸残基１−１９５）、ドメインＩＩ（アミノ酸残基１９６−３８３）およびドメインＩＩＩ（アミノ酸残基３８４−５８５）へと三次構造が分割される、５８５のアミノ酸ポリペプチドである。各ドメインは、内在性リガンド、例えば、長鎖脂肪酸および中鎖脂肪酸、ビリルビン、またはヘミン、あるいは、外因性化合物、例えば、複素環化合物または芳香族化合物と、可逆的にまたは不可逆的に相互作用することができる結合部位を含む。
【０１４１】
場合によっては、サイトカイン（例えば、インターロイキン、ＩＦＮ、またはＴＮＦ）ポリペプチドは、アルブミンに抱合される。場合によっては、サイトカインポリペプチドは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に抱合される。さらなる場合において、サイトカインポリペプチドは、アルブミンの官能性フラグメントに抱合される。
【０１４２】
いくつかの例では、ＩＬ−２ポリペプチドはアルブミンに抱合される。場合によっては、ＩＬ−２ポリペプチドはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に抱合される。さらなる場合において、ＩＬ−２ポリペプチドはアルブミンの官能性フラグメントに抱合される。
【０１４３】
いくつかの実施形態において、抱合部分はトランスフェリンである。トランスフェリンは、約８０ｋＤａのサイズであり、２つのＦｅ３＋結合部位を含む（Ｎ末端ドメインに１つと、Ｃ末端ドメインに１つ）、６７９のアミノ酸ポリペプチドである。いくつかの例では、ヒトトランスフェリンは、約７−１２日の半減期を有する。
【０１４４】
いくつかの例では、サイトカイン（例えば、インターロイキン、ＩＦＮ、またはＴＮＦ）ポリペプチドは、トランスフェリンに抱合される。場合によっては、サイトカインポリペプチドは、ヒトトランスフェリンに抱合される。さらなる場合において、サイトカインポリペプチドは、トランスフェリンの官能性フラグメントに抱合される。
【０１４５】
いくつかの例では、ＩＬ−２ポリペプチドはトランスフェリンに抱合される。場合によっては、ＩＬ−２ポリペプチドはヒトトランスフェリンに抱合される。さらなる場合において、ＩＬ−２ポリペプチドは、トランスフェリンの官能性フラグメントに抱合される。
【０１４６】
いくつかの実施形態において、抱合部分はトランスサイレチン（ＴＴＲ）である。トランスサイレチンは、レチノールに結合された甲状腺ホルモンチロキシン（Ｔ４）およびレチノール結合タンパク質を運ぶ血清および脳脊髄液に存在する輸送タンパク質である。
【０１４７】
いくつかの例では、サイトカイン（例えば、インターロイキン、ＩＦＮ、またはＴＮＦ）ポリペプチドは、トランスサイレチンに抱合される（その終端の１つ、または内部ヒンジ領域を介して）。場合によっては、サイトカインポリペプチドは、トランスサイレチンの機能性フラグメントに抱合される。
【０１４８】
いくつかの例では、ＩＬ−２ポリペプチドは、トランスサイレチン（その終端の１つ、または内部ヒンジ領域を介して）に抱合される。場合によっては、ＩＬ−２ポリペプチドは、トランスサイレチンの機能性フラグメントに抱合される。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、抱合部分は、抗体またはその結合フラグメントである。いくつかの例では、抗体またはその結合フラグメントは、ヒト化抗体またはその結合フラグメント、マウス抗体またはその結合フラグメント、キメラ抗体またはその結合フラグメント、モノクローナル抗体またはその結合フラグメント、一価のＦａｂ’、二価のＦａｂ２、Ｆ（ａｂ）’３フラグメント、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ビス−ｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ）２、ダイアボディ、ミニボディ、ナノボディ、トリアボディ、テトラボディ、ヒューマボディ、ジスルフィド安定Ｆｖタンパク質（ｄｓＦｖ）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、Ｉｇ  ＮＡＲ、ｃａｍｅｌｉｄ抗体またはその結合フラグメント、二重特異性抗体またはその結合フラグメント、あるいはその化学修飾された誘導体を含む。
【０１５０】
いくつかの例では、抱合部分は、ｓｃＦｖ、ビス−ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ｄｓＦｖ、またはｓｄＡｂを含む。場合によっては、抱合部分はｓｃＦｖを含む。場合によっては、抱合部分はビス−ｓｃＦｖを含む。場合によっては、抱合部分は（ｓｃＦｖ）２を含む。場合によっては、抱合部分はｄｓＦｖを含む。場合によっては、抱合部分はｓｄＡｂを含む。
【０１５１】
いくつかの例では、抱合部分は、抗体、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、またはＩｇＤのＦｃ部分を含む。いくつかの例では、上記部分は、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）のＦｃ部分を含む。
【０１５２】
場合によっては、サイトカイン（例えば、インターロイキン、ＩＦＮ、またはＴＮＦ）ポリペプチドは、抗体、またはその結合フラグメントに抱合される。いくつかの例では、サイトカインポリペプチドは、ヒト化抗体またはその結合フラグメント、マウス抗体またはその結合フラグメント、キメラ抗体またはその結合フラグメント、モノクローナル抗体またはその結合フラグメント、一価のＦａｂ’、二価のＦａｂ２、Ｆ（ａｂ）’３、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ビス−ｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ）２、ダイアボディ、ミニボディ、ナノボディ、トリアボディ、テトラボディ、ヒューマボディ、ジスルフィド安定Ｆｖタンパク質（ｄｓＦｖ）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、Ｉｇ  ＮＡＲ、ｃａｍｅｌｉｄ抗体またはその結合フラグメント、二重特異性抗体またはその結合フラグメント、あるいはその化学修飾された誘導体に抱合される。さらなる場合において、サイトカインポリペプチドは抗体のＦｃ部分に抱合される。さらなる場合において、サイトカインポリペプチドは、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）のＦｃ部分に抱合される。
【０１５３】
場合によっては、ＩＬ−２ポリペプチドは、抗体、またはその結合フラグメントに抱合される。いくつかの例では、ＩＬ−２ポリペプチドは、ヒト化抗体またはその結合フラグメント、マウス抗体またはその結合フラグメント、キメラ抗体またはその結合フラグメント、モノクローナル抗体またはその結合フラグメント、一価のＦａｂ’、二価のＦａｂ２、Ｆ（ａｂ）’３フラグメント、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ビス−ｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ）２、ダイアボディ、ミニボディ、ナノボディ、トリアボディ、テトラボディ、ヒューマボディ、ジスルフィド安定Ｆｖタンパク質（ｄｓＦｖ）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、Ｉｇ  ＮＡＲ、ｃａｍｅｌｉｄ抗体またはその結合フラグメント、二重特異性抗体またはその結合フラグメント、あるいはその化学修飾された誘導体に抱合される。さらなる場合において、ＩＬ−２ポリペプチドは抗体のＦｃ部分に抱合される。さらなる場合において、ＩＬ−２ポリペプチドは、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）のＦｃ部分に抱合される。
【０１５４】
いくつかの実施形態において、ＩＬ−２ポリペプチドは、水溶性高分子（例えば、ＰＥＧ）、抗体またはその結合フラグメントに抱合される。場合によっては、抗体またはその結合フラグメントは、ヒト化抗体またはその結合フラグメント、マウス抗体またはその結合フラグメント、キメラ抗体またはその結合フラグメント、モノクローナル抗体またはその結合フラグメント、一価のＦａｂ’、二価のＦａｂ２、Ｆ（ａｂ）’３フラグメント、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ビス−ｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ）２、ダイアボディ、ミニボディ、ナノボディ、トリアボディ、テトラボディ、ヒューマボディ、ジスルフィド安定Ｆｖタンパク質（ｄｓＦｖ）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、Ｉｇ  ＮＡＲ、ｃａｍｅｌｉｄ抗体またはその結合フラグメント、二重特異性抗体またはその結合フラグメント、あるいはその化学修飾された誘導体を含む。場合によっては、抗体またはその結合フラグメントは、ｓｃＦｖ、ビス−ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ｄｓＦｖ、またはｓｄＡｂを含む。場合によっては、抗体またはその結合フラグメントはｓｃＦｖを含む。場合によっては、抗体またはその結合フラグメントはＩＬ−２抱合体を対象の標的細胞へと導き、および水溶性高分子は安定性および／または血清半減期を増加させる。
【０１５５】
いくつかの例では、１つ以上のＩＬ−２ポリペプチド−水溶性高分子（例えば、ＰＥＧ）抱合体は、抗体またはその結合フラグメントにさらに結合される。いくつかの例では、ＩＬ−２抱合体対抗体の比率は、約１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、または１２：１である。場合によっては、ＩＬ−２抱合体対抗体の比率は約１：１である。その他の場合において、ＩＬ−２抱合体対抗体の比率は、約２：１、３：１、または４：１である。さらなる場合において、ＩＬ−２抱合体対抗体の比率は約６：１以上である。
【０１５６】
いくつかの実施形態において、１つ以上のＩＬ−２ポリペプチド−水溶性高分子（例えば、ＰＥＧ）抱合体は、抗体またはその結合フラグメントに直接結合される。他の例では、ＩＬ−２抱合体は、リンカーにより抗体または結合そのフラグメントに間接的に結合される。典型的なリンカーは、ホモ二官能性リンカー、ヘテロ官能性リンカー、マレイミドベースのリンカー、ゼロトレースのリンカー、自壊性リンカー、スペーサー等を含む。
【０１５７】
いくつかの実施形態において、抗体またはその結合フラグメントは、ＩＬ−２ポリペプチド−水溶性高分子（例えば、ＰＥＧ）抱合体のＩＬ−２ポリペプチド部分に直接あるいは間接的に結合される。そのような場合、ＩＬ−２ポリペプチドに対する抗体の抱合部位は、ＩＬ−２ＲβγとＩＬ−２ポリペプチドとの結合を妨害しない部位である。さらなる場合において、ＩＬ−２ポリペプチドに対する抗体の抱合部位は、ＩＬ−２ＲβγとＩＬ−２ポリペプチドとの結合を部分的に遮断する部位である。他の実施形態では、抗体またはその結合フラグメントは、ＩＬ−２ポリペプチド−水溶性高分子（例えば、ＰＥＧ）抱合体の水溶性高分子部分に直接または間接的に結合される。
【０１５８】
ペプチド
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抱合部分はペプチドである。いくつかの例では、ペプチドは非構造化ペプチドである。場合によっては、サイトカイン（例えば、インターロイキン、ＩＦＮ、またはＴＮＦ）ポリペプチドは、ペプチドに抱合される。場合によっては、ペプチドを含むＩＬ−２抱合体は、増加した血清半減期、および／または安定性を有する。場合によっては、ペプチドを含むＩＬ−２抱合体は、１つ以上のＩＬ−２Ｒサブユニットと減少したＩＬ−２の相互作用を有する。さらなる場合において、ペプチドは、１つ以上のＩＬ−２ＲサブユニットとＩＬ−２の相互作用を遮断する。
【０１５９】
いくつかの例では、抱合部分は、ＸＴＥＮ（商標）ペプチド（Ａｍｕｎｉｘ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｉｎｃ．）であり、その修飾はＸＴＥＮｙｌａｔｉｏｎと呼ばれる。ＸＴＥＮｙｌａｔｉｏｎは、ＸＴＥＮ（商標）ペプチド（Ａｍｕｎｉｘ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｉｎｃ．）、すなわち、６つのアミノ酸（Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、およびＴｈｒ）の異なるパーセンテージを含む長い非構造化親水性ペプチドをコードする核酸と、対象のポリペプチドをコードする核酸との遺伝学的な融合である。いくつかの例では、ＸＴＥＮ（商標）ペプチドは、発現、遺伝子安定性、溶解度、凝集抵抗、半減期の増加、効力の増強、および／または、対象のポリペプチドと組み合わせたインビトロの活性の増大などの特性に基づいて選択されている。場合によっては、サイトカイン（例えば、インターロイキン、ＩＦＮ、またはＴＮＦ）ポリペプチドは、ＸＴＥＮペプチドに抱合される。場合によっては、ＩＬ−２ポリペプチドはＸＴＥＮペプチドに抱合される。
【０１６０】
いくつかの例では、抱合部分は、グリシンに富むホモアミノ酸ポリマー（ＨＡＰ）であり、その修飾はＨＡＰｙｌａｔｉｏｎと呼ばれる。ＨＡＰｙｌａｔｉｏｎは、グリシンに富むホモアミノ酸ポリマー（ＨＡＰ）をコードする核酸と、対象のポリペプチドをコードする核酸との遺伝学的な融合である。いくつかの例では、ＨＡＰポリマーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ反復モチーフ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）を含み、時に、約５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、またはそれ以上の長さの残基である。場合によっては、サイトカイン（例えば、インターロイキン、ＩＦＮ、またはＴＮＦ）ポリペプチドはＨＡＰに抱合される。場合によっては、ＩＬ−２ポリペプチドはＨＡＰに抱合される。
【０１６１】
いくつかの実施形態において、抱合部分はＰＡＳポリペプチドであり、その修飾はＰＡＳｙｌａｔｉｏｎと呼ばれる。ＰＡＳｙｌａｔｉｏｎは、ＰＡＳポリペプチドをコードする核酸と、対象のポリペプチドをコードする核酸との遺伝学的な融合である。ＰＡＳポリペプチドは、Ｐｒｏ、Ａｌａ、およびＳｅｒ残基から成る親水性の非荷電ポリペプチドである。いくつかの例では、ＰＡＳポリペプチドの長さは、少なくとも約１００、２００、３００、４００、５００、または６００のアミノ酸である。場合によっては、サイトカイン（例えば、インターロイキン、ＩＦＮ、またはＴＮＦ）ポリペプチドは、ＰＡＳポリペプチドに抱合される。場合によっては、ＩＬ−２ポリペプチドはＰＡＳポリペプチドに抱合される。
【０１６２】
いくつかの実施形態において、抱合部分はエラスチン様ポリペプチド（ＥＬＰ）であり、その修飾はＥＬＰｙｌａｔｉｏｎと呼ばれる。ＥＬＰｙｌａｔｉｏｎは、エラスチン様ポリペプチド（ＥＬＰ）をコードする核酸と、対象のポリペプチドをコードする核酸との遺伝学的な融合である。ＥＬＰはＶＰＧｘＧ反復モチーフ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）を含み、ここで、ｘがプロリン以外の任意のアミノ酸である。場合によっては、サイトカイン（例えば、インターロイキン、ＩＦＮ、またはＴＮＦ）ポリペプチドは、ＥＬＰに抱合される。場合によっては、ＩＬ−２ポリペプチドはＥＬＰに抱合される。
【０１６３】
いくつかの実施形態において、抱合部分はＣＴＰペプチドである。ＣＴＰペプチドは、３１のアミノ酸残基ペプチドＦＱＳＳＳＳ＊ＫＡＰＰＰＳ＊ＬＰＳＰＳ＊ＲＬＰＧＰＳ＊ＤＴＰＩＬＰＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）を含み、ここで、Ｓ＊がＯ糖鎖付加部位（ＯＰＫＯ）を意味する。いくつかの例では、ＣＴＰペプチドは、サイトカインポリペプチド（例えば、ＩＬ−２ポリペプチド）に遺伝学的に融合される。場合によっては、サイトカインポリペプチド（例えば、ＩＬ−２ポリペプチド）は、ＣＴＰペプチドに抱合される。
【０１６４】
いくつかの実施形態において、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２ポリペプチド）は、グルタミル化（ｇｌｕｔａｍｙｌａｔｉｏｎ）によって修飾される。グルタミル化（または、ポリグルタミル化）は、グルタミン酸の可逆的な翻訳後修飾であり、ここで、遊離グルタミン酸のアミノ基とのペプチド様結合を形成し、グルタミン酸のγ−カルボキシ基はα−カルボキシ基がポリグルタミン酸鎖へと伸長する。
【０１６５】
いくつかの実施形態において、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２ポリペプチド）は、ゼラチン様タンパク質（ＧＬＫ）ポリマーによって修飾される。いくつかの例では、ＧＬＫポリマーはＧｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａの複数の反復を含み、ここで、ＸａａおよびＹａａは主にプロリンおよび４−ヒドロキシプロリンをそれぞれ含む。場合によっては、ＧＬＫポリマーは、アミノ酸残基Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ｑｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、およびＬｙｓをさらに含む。場合によっては、ＧＬＫポリマーの長さは、約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１５０残基またはそれ以上である。
【０１６６】
付加的な抱合部分
いくつかの例では、抱合部分は細胞外のバイオマーカーを含む。いくつかの例では、細胞外のバイオマーカーは腫瘍抗原である。いくつかの例では、典型的な細胞外のバイオマーカーは、ＣＤ１９、ＰＳＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＤ７０、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐｈＡ３、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ＦＡＰ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＲＯＲ１、ＴＡＧ７２、ＶＥＧＦＲ２、ＣＤ１１、Ｇｒ−１、ＣＤ２０４、ＣＤ１６、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４、ＣＤ８、およびＢ２２０を含む。いくつかの例では、抱合部分はサイトカイン（例えばＩＬ−２）に結合されるか、あるいは抱合される。場合によっては、抱合部分は、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２）の、例えば、Ｎ末端またはＣ末端で、遺伝学的に融合される。
【０１６７】
いくつかの例では、抱合部分は、翻訳後修飾からの分子を含む。いくつかの例では、翻訳後修飾の例は、ミリストイル化、パルミトイル化、イソプレニル化（またはプレニル化）（例えばファルネシル化またはゲラニルゲラニル化）、グリピエーション、アシル化（例えば、Ｏアシル化、Ｎ−アシル化、Ｓアシル化）、アルキル化（例えば、メチルまたはエチル基などのアルキル基の付加的な）、アミド化、グリコシル化、ヒドロキシル化、ヨウ素化、ヌクレオチド付加、酸化、リン酸化、サクシニル化、硫酸化、糖化、カルバミル化、グルタミル化、または脱アミドを含む。いくつかの例では、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２）は、翻訳後修飾、例えば、ミリストイル化、パルミトイル化、イソプレニル化（または、プレニル化）（例えば、ファルネシル化あるいはゲラニルゲラニル化）、グリピエーション、アシル化（例えば、Ｏアシル化、Ｎ−アシル化、Ｓアシル化）、アルキル化（例えば、メチルまたはエチル基などのアルキル基の付加的な）、アミド化、グリコシル化、ヒドロキシル化、ヨウ素化、ヌクレオチド付加、酸化、リン酸化、サクシニル化、硫酸化、糖化、カルバミル化、グルタミル化、または脱アミドによって修飾される。
【０１６８】
抱合
リンカー
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるサイトカインポリペプチド（例えば、ＩＬ−２ポリペプチド）の抱合部分に抱合するか、あるいは結合するための有用な官能性反応基は、例えば、０または高次のリンカーを含む。いくつかの例では、本明細書に記載されるインターロイキンに組み込まれる非天然アミノ酸は、官能性反応基を含む。いくつかの例では、リンカーは、本明細書に記載されるインターロイキンに組み込まれる非天然アミノ酸と反応する官能性反応基を含む。いくつかの例では、抱合部分は、本明細書に記載されるインターロイキンに組み込まれる非天然アミノ酸と反応する官能性反応基を含む。いくつかの例では、抱合部分は、本明細書に記載されるリンカー（随意に、サイトカインペプチドにあらかじめ結合される）と反応する官能性反応基を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、本明細書に記載されるサイトカインペプチド中の天然アミノ酸と反応する反応基を含む。場合によっては、高次のリンカーは、ホモ二官能性リンカーまたはヘテロ官能性リンカーなどの官能性リンカーを含む。典型的なモ二官能性リンカーとしては、限定されないが、Ｌｏｍａｎｔ試薬ジチオビス（サクシニミヂルプロピオネート  ＤＳＰおよび３’３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジル  プロピオン酸塩（ＤＴＳＳＰ）、ジスクシンイミジル  スベリン酸（ＤＳＳ）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベリン酸塩（ＢＳ）、ジスクシンイミジルタルトレート（ＤＳＴ）、ジスルホスクシンイミジルタルトレート（ｓｕｌｆｏ  ＤＳＴ）、エチレングリコビス（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｂｉｓ）（スクシンイミジルスクシナート（ＥＧＳ）、ジスクシニミジルグルタラート（ＤＳＧ）、Ｎ、Ｎ’−ジスクシンイミジルカルボネート（ＤＳＣ）、ジメチルアジピミデート（ＤＭＡ）、ジメチルピメリミダート（ＤＭＰ）、ジメチルスベルイミデート（ＤＭＳ）、ジメチル−３、３’−ジチオビスプロピオンイミデート（ＤＴＢＰ）、１、４−ジ−３’−（２’−ピリジルジチオ）プロピオンアミド）ブタン（ＤＰＤＰＢ）、ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）、ハロゲン化アリール含有化合物（ＤＦＤＮＢ）、例えば、例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン、あるいは１，３−ジフルオロ−４，６−ジニトロベンゼン、４，４’−ジフルオロ−３，３’−ジニトロフェニルスルホン（ＤＦＤＮＰＳ）、ビス−［β−（４−アジドサリチルアミド）エチル］ジスルフィド（ＢＡＳＥＤ）、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル、アジピン酸ジヒドラジド、カルボヒドラジド、ｏ−トルイジン、３，３’−ジメチルベンジジン、ベンジジン、α，α’−ｐ−ジアミノジフェニル、ジヨード−ｐ−キシレンスルホン酸、Ｎ，Ｎ’−エチレン−ビス（ヨードアセトアミドまたはＮ，Ｎ’−ヘキサメチレン−ビス（ヨードアセトアミド）を含む。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、二官能性リンカーはヘテロ官能性リンカーを含む。典型的なヘテロ官能性リンカーとしては、限定されないが、アミン反応性クロスリンカーおよびスルフヒドリルクロスリンカー、例えば、Ｎ−サクシニミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸塩（ｓＰＤＰ）、長鎖Ｎ−サクシニミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸塩（ＬＣ−ｓＰＤＰ）、水溶性の長鎖Ｎ−サクシニミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸塩（スルホ  ＬＣ−ｓＰＤＰ）、クシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルエン（ｓＭＰＴ）、スルホスクシンイミジル−６−［α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルアミド］ヘキサン酸塩（スルホＬＣ−ｓＭＰＴ）、サクシニミジル−４―（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸塩（ｓＭＣＣ）、スルホスクシンイミジル−４ー（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸塩（スルホ−ｓＭＣＣ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢｓ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＭＢｓ）、Ｎ−サクシニミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾアート（ｓＩＡＢ）、スルホスクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（スルホ−ｓＩＡＢ）、スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ｓＭＰＢ）、スルホスクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（スルホ−ｓＭＰＢ）、Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミドエステル（ＧＭＢｓ）、Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）スルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＧＭＢｓ）、サクシニミジル６−（（ヨードアセチル）アミノ）ヘキサン酸塩（ｓＩＡＸ）、サクシニミジル６−［６−（（（ヨードアセチル）アミノ）ヘキサノイル）アミノ］ヘキサン酸塩（ｓＩＡＸＸ）、サクシニミジル４−（（（ヨードアセチル）アミノ）メチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸塩（ｓＩＡＣ）、サクシニミジル６−（（（（４−ヨードアセチル）アミノ）メチル）シクロヘキサン−１−カルボニル）アミノ）ヘキサン酸塩（ｓＩＡＣＸ）、ｐ−ニトロフェニルヨード酢酸（ＮＰＩＡ）、カルボニル反応性クロスリンカーおよびスルフヒドリル反応性のクロスリンカー、例えば、４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド（ＭＰＢＨ）、４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシル−ヒドラジド−８（Ｍ２Ｃ２Ｈ）、３−（２−ピリジルジチオ）プロビオニルヒドラジド（ＰＤＰＨ）、アミン反応性クロスリンカーおよび光反応性クロスリンカー、例えば、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル−４−アジドサリチル酸（ＮＨ−ＡｓＡ）、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル−４−アジドサリチル酸（スルホ−ＮＨ−ＡｓＡ）、スルホスクシンイミジル−（４−アジドサリチルアミド）ヘキサノエート（スルホ−ＮＨ−ＬＣ−ＡｓＡ）、スルホスクシンイミジル−２−（ρ−アジドサリチルアミド）エチル−１，３’−ジチオプロピオネート（ｓＡｓＤ）、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル−４−アジド安息香酸（ＨｓＡＢ）、��−ヒドロキシスルホスクシンイミジル−４−アジド安息香酸（スルホ−ＨｓＡＢ）、Ｎ−サクシニミジル−６−（４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ）ヘキサン酸塩（ｓＡＮＰＡＨ）、スルホスクシンイミジル−６−（４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ）ヘキサン酸塩（スルホ−ｓＡＮＰＡＨ）、Ｎ−５−アジド−２−ニトロベンゾイルオキシスクシンイミド（ＡＮＢ−ＮＯｓ）、スルホスクシンイミジル−２−（ｍ−アジド−ｏ−ニトロベンズアミド）−エチル−１，３’−ジチオプロピオナート（ｓＡＮＤ）、Ｎ−サクシニミジル−４（４−アジドフェニル）１，３’−ジチオプロピオナート（ｓＡＤＰ）、Ｎ−スルホスクシンイミジル（４−アジドフェニル）−１，３’−ジチオプロピオナート（スルホ−ｓＡＤＰ）、スルホスクシンイミジル  ４−（ρ−アジドフェニル）酪酸塩（スルホ−ｓＡＰＢ）、スルホスクシンイミジル  ２−（７−アジド−４−メチルクマリン−３−アセトアミド）エチル−１，３’−ジチオプロピオナート（ｓＡＥＤ）、スルホスクシンイミジル  ７−アジド−４−メチルクマイン−３−酢酸塩（スルホ−ｓＡＭＣＡ）、ρ−ニトロフェニルジアゾピルバート（ρＮＰＤＰ）、ρ−ニトロフェニル−２−ジアゾ−３，３，３−トリフルオロプロピオネート（ＰＮＰ−ＤＴＰ）、スルフヒドリル反応性クロスリンカーおよび光反応性クロスリンカー、例えば１−（ρ−アジドサリチルアミド）−４−（ヨードアセトアミド）ブタン（ＡｓＩＢ）、Ｎ−［４−（ρ−アジドサリチルアミド）ブチル］−３’−（２’−ピリジルジチオ）プロピオンアミド（ＡＰＤＰ）、ベンゾフェノン−４−ヨードアセトアミド、ベンゾフェノン−４−マレイミド、カルボニル反応性クロスリンカーおよび光反応性クロスリンカー、例えばρ−アジドベンゾイルヒドラジド（ＡＢＨ）、カルボキシラート反応性クロスリンカーおよび光反応性クロスリンカー、例えば、４−（ρ−アジドサリチルアミド）ブチルアミン（ＡｓＢＡ）、およびアルギニン反応性クロスリンカーおよび光反応性クロスリンカー、例えば、ρ−アジドフェニルグリオキサール（ＡＰＧ）を含む。
【０１７０】
いくつかの例では、反応性官能基は、結合部分（例えば、抱合部分、またはＩＬ−２）上で存在する求電子基に反応する求核基を含む。典型的な求電子基は、カルボニル基、例えば、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、エステル、アミド、エノン、酸ハロゲン化物、または酸無水物を含む。いくつかの実施形態において、反応性官能基はアルデヒドである。典型的な求核基は、ヒドラジド、オキシム、アミノ、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、カルボン酸ヒドラジン、およびアリールヒドラジドを含む。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、リンカーは切断可能なリンカーである。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーはジペプチドリンカーである。いくつかの実施形態において、ジペプチドリンカーは、バリン−シトルリン（Ｖａｌ−Ｃｉｔ）、フェニルアラニン−リジン（Ｐｈｅ−Ｌｙｓ）、バリン−アラニン（Ｖａｌ−Ａｌａ）、およびバリン−リジン（Ｖａｌ−Ｌｙｓ）である。いくつかの実施形態において、ジペプチド−リンカーはバリン−シトルリンである。
【０１７２】
いくつかの実施形態において、リンカーは、例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、またはそれより多くのアミノ酸を含むペプチド−リンカーである。いくつかの例では、ペプチド−リンカーは、最大で、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、またはそれより少ないアミノ酸を含む。場合によっては、ペプチドリンカーは、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、あるいは５０のアミノ酸を含む。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、リンカーは自壊性リンカー部分を含む。いくつかの実施形態において、自壊性リンカー部分は、それらのｐ−アミノベンジルアルコール（ＰＡＢ）、ｐ−アミノベンジオキシカルボニル（ＰＡＢＣ）、または誘導体あるいはそのアナログを含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、ジペプチドリンカー部分および自壊性リンカー部分を含む。いくつかの実施形態において、自壊性リンカー部分は、米国特許第９０８９６１４号およびＷＯ２０１５０３８４２６に記載されるものなどである。
【０１７４】
いくつかの実施形態において、切断可能なリンカーはグルクロニドである。いくつかの実施形態において、切断可能なリンカーは酸切断可能なリンカーである。いくつかの実施形態において、酸切断可能なリンカーはヒドラジンである。いくつかの実施形態において、切断可能なリンカーは還元可能なリンカーである。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、リンカーマレイミド基を含む。いくつかの例において、マレイミド基はマレイミドスペーサーとも呼ばれる。いくつかの例において、マレイミド基は、マレイミドカプロイル（ｍｃ）を形成するカプロン酸を含む。場合によっては、リンカーはマレイミドカプロイル（ｍｃ）を含む。場合によっては、リンカーはマレイミドカプロイル（ｍｃ）である。他の例において、マレイミド基は、上述のスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート（ｓＭＣＣ）またはスルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート（スルホ−ｓＭＣＣ）などのマレイミドメチル基を含む。
【０１７６】
いくつかの実施形態において、マレイミド基は自己安定化マレイミドである。いくつかの例において、自己安定化マレイミドは、チオスクシンイミド環加水分解の分子内の触媒作用を提供するべくマレイミドに隣接する塩基性アミノ基を組み込むジアミノプロピオン酸（ＤＰＲ）を利用し、それにより、マレイミドがレトロマイケル反応を介して脱離反応を受けることを排除する。いくつかの例において、自己安定化マレイミドは、Ｌｙｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｓｅｌｆ−ｈｙｄｒｏｌｙｚｉｎｇ  ｍａｌｅｉｍｉｄｅｓ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ｔｈｅ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，”  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ３２（１０）：１０５９−１０６２  （２０１４）．に記載されるマレイミド基である。いくつかの例において、リンカーは自己安定化マレイミドを含む。いくつかの例において、リンカーは自己安定化マレイミドである。
【０１７７】
抱合化学
様々な抱合反応は、リンカー、抱合部分、および本明細書に記載されるサイトカインペプチドに組み込まれる非天然アミノ酸を抱合するために使用される。そのような抱合反応はしばしば、「生体直交型」反応などの水性条件に適合する。いくつかの実施形態において、抱合反応は、化学試薬、例えば、リンカー、抱合部分、または非天然アミノ酸上で発見される触媒、光、または反応性化学基によって媒介される。いくつかの実施形態において、抱合反応は酵素によって媒介される。いくつかの実施形態において、本明細書に使用される抱合反応は、Ｇｏｎｇ，  Ｙ．，  Ｐａｎ，  Ｌ．  Ｔｅｔｔ．  Ｌｅｔｔ．  ２０１５，  ５６，  ２１２３に記載される。いくつかの実施形態において、本明細書で使用される抱合反応は、Ｃｈｅｎ，  Ｘ．；  Ｗｕ．  Ｙ−Ｗ．  Ｏｒｇ．  Ｂｉｏｍｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２０１６，  １４，  ５４１７に記載される。
【０１７８】
本明細書に記載されるいくつかの実施形態において、抱合反応は、求核分子とケトンまたはアルデヒドとの反応を含む。いくつかの実施形態において、抱合反応は、オキシムを形成するために、アミノキシ基とケトンとの反応を含む。いくつかの実施形態において、抱合反応は、イミンを形成するために、アリールまたはヘテロアリールとアミン基とのケトンの反応を含む。いくつかの実施形態において、抱合反応は、イミンを形成するために、アリールまたはヘテロアリールとアミン基とのアルデヒドの反応を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抱合反応は、オキシムを介して結合されるリンカーまたは抱合の部分を含むサイトカインペプチドを結果としてもたらす。いくつかの実施形態において、抱合反応は、トリプタミン求核分子とのアルデヒドまたはケトンのピクテ・スペングラー反応を含む。いくつかの実施形態において、抱合反応はヒドラジノ・ピクテ・スペングラー反応を含む。いくつかの実施形態において、抱合反応はピクテ・スペングラー・ライゲーションを含む。
【０１７９】
本明細書に記載されるいくつかの実施形態において、本明細書に記載される抱合反応は、アジドおよびホスフィンの反応を含む（シュタウディンガー・ライゲーション）。いくつかの実施形態において、ホスフィンはアリールホスフィンである。いくつかの実施形態において、アリールホスフィンはオルトエステル基を含む。いくつかの実施形態において、ホスフィンは、メチル２−（ジフェニルホスファニル）安息香酸塩の構造を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抱合反応は、アリルアミドを介して結合されるリンカーまたは抱合部分を含むサイトカインペプチドを結果としてもたらす。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抱合反応は、アミドを介して結合されるリンカーまたは抱合部分を含むサイトカインペプチドを結果としてもたらす。
【０１８０】
本明細書に記載されるいくつかの実施形態において、本明細書に記載される抱合反応は、１，３−双極子付加環化反応を含む。いくつかの実施形態において、１，３−双極子付加環化反応は、アジドおよびホスフィンの反応を含む（「クリック」反応）。いくつかの実施形態において、抱合反応は銅によって触媒される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抱合反応は、トリアゾールを介して結合されるリンカーまたは抱合部分を含むサイトカインペプチドを結果としてもたらす。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抱合反応は、歪みオレフィンとのアジドの反応を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抱合反応は、歪みアルキンとのアジドの反応を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抱合反応は、シクロアルキン、例えば、ＯＣＴ、ＤＩＦＯ、ＤＩＦＢＯ、ＤＩＢＯ、ＢＡＲＡＣ、ＴＭＴＨ、または他の歪みシクロアルキンとのアジドの反応を含み、それらの構造はＧｏｎｇ，  Ｙ．，  Ｐａｎ，  Ｌ．  Ｔｅｔｔ．  Ｌｅｔｔ．  ２０１５，  ５６，  ２１２３において示される。いくつかの実施形態において、１，３−双極子付加環化反応は、光によって触媒される（「光クリック」）。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抱合反応は、テトラゾールおよび光と末端アリル基との反応を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抱合反応は、テトラゾールおよび光と末端アルキニル基との反応を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抱合反応は、テトラジンおよび光とＯ−アリルアミノ酸との反応を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抱合反応は、テトラジンおよび光とＯ−アリル・チロシンとの反応を含む。
【０１８１】
本明細書に記載されるいくつかの実施形態において、本明細書に記載される抱合反応は、ジエンおよび求ジエン体を含む逆電子要請型付加環化反応を含む。いくつかの実施形態において、ジエンはテトラジンを含む。いくつかの実施形態において、求ジエン体はアルケンを含む。いくつかの実施形態において、求ジエン体はアルキンを含む。いくつかの実施形態において、アルキンは歪みアルキンである。いくつかの実施形態において、アルケンは歪みジエンである。いくつかの実施形態において、アルキンはｔｒａｎｓ−シクロオクテンである。いくつかの実施形態において、アルキンはシクロオクテンである。いくつかの実施形態において、アルケンは、シクロプロペンである。いくつかの実施形態において、アルケンは、フルオロシクロプロペンである。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抱合反応は、環内に２つの窒素原子を含む６−員環の複素環を介してリンカーまたは抱合部分に結合されるサイトカインペプチドの形成を結果としてもたらす。
【０１８２】
本明細書に記載されるいくつかの実施形態において、本明細書に記載される抱合反応は、オレフィン病部転位反応を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抱合反応は、ルテニウム触媒とアルケンおよびアルキンとの反応を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抱合反応は、ルテニウム触媒と２つのアルケンとの反応を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抱合反応は、ルテニウム触媒と２つのアルキンとの反応を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抱合反応は、ルテニウム触媒およびアリル基を含むアミノ酸とのアルケンまたはアルキンの反応を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抱合反応は、ルテニウム触媒および硫化アリルまたはセレン化物を含むアミノ酸とのアルケンまたはアルキンの反応を含む。いくつかの実施形態において、ルテニウム触媒は第２世代Ｈｏｖｅｄａ−Ｇｒｕｂｂｓ触媒である。いくつかの実施形態において、オレフィンメタセシス反応は、１つ以上の歪みアルケンまたはアルキンの反応を含む。
【０１８３】
本明細書に記載されるいくつかの実施形態において、本明細書に記載される抱合反応は、クロスカップリング反応を含む。いくつかの実施形態において、クロスカップリング反応は、イリジウム、金、ルテニウム、ロジウム、パラジウム、ニッケル、白金または他の遷移金属触媒および１つ以上のリガンドなどの遷移金属触媒を含む。いくつかの実施形態において、遷移金属触媒は水溶性である。本明細書に記載されるいくつかの実施形態において、本明細書に記載される抱合反応は、鈴木・宮浦クロスカップリング反応を含む。本明細書に記載されるいくつかの実施形態において、本明細書に記載される抱合反応は、ハロゲン化アリール（あるいはトリフラート、またはトシラート）、アリールまたはアルケニルボロン酸、およびパラジウム触媒の反応を含む。本明細書に記載されるいくつかの実施形態において、本明細書に記載される抱合反応は、薗頭カップリング反応を含む。本明細書に記載されるいくつかの実施形態において、本明細書に記載される抱合反応は、ハロゲン化アリール（あるいはトリフラート、またはトシラート）、アルキン、およびパラジウム触媒の反応を含む。いくつかの実施形態において、クロスカップリング反応は、炭素−炭素結合を介してサイトカインペプチドへのリンカーまたは抱合部分の結合を結果としてもたらす。
【０１８４】
本明細書に記載されるいくつかの実施形態において、本明細書に記載される抱合反応は、抱合前の反応基の脱保護または「アンケージング（ｕｎｃａｇｉｎｇ）」反応を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抱合反応は、光との反応基のアンケージング、その後の抱合反応を含む。いくつかの実施形態において、反応基は、１つ以上のニトロ基を含むアラルキル部分により保護される。いくつかの実施形態において、反応基のアンケージングは、遊離アミン、硫化物、または他の反応基を結果としてもたらす。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抱合反応は、遷移金属触媒を用いた反応基のアンケージング、その後の抱合反応を含む。いくつかの実施形態において、遷移金属触媒はパラジウムおよび１つ以上のリガンドを含む。いくつかの実施形態において、反応基はアリル部分により保護される。いくつかの実施形態において、反応基はアリルカルバマートにより保護される。いくつかの実施形態において、反応基はプロパルギル部分により保護される。いくつかの実施形態において、反応基はプロパルギルカルバマートにより保護される。いくつかの実施形態において、反応基は求ジエン体により保護され、ここで、ジエン（テトラジンなどの）への曝露は、反応基の脱保護を結果としてもたらす。
【０１８５】
本明細書に記載されるいくつかの実施形態において、本明細書に記載される抱合反応はリガンド指向反応を含み、ここで、反応基に（随意に）結合されたリガンドは、反応基とサイトカインペプチドとの間の抱合の部位を促進する。いくつかの実施形態において、リガンドは、反応基とのサイトカインペプチドの反応中、またはその反応後に切断される。いくつかの実施形態において、サイトカインペプチドの抱合部位は天然アミノ酸である。いくつかの実施形態において、サイトカインペプチドの抱合部位は、リジン、システイン、またはセリンである。いくつかの実施形態において、サイトカインペプチドの抱合部位は、本明細書に記載される非天然アミノ酸である。いくつかの実施形態において、反応基は、電子不足アリールまたはヘテロアリール基などの脱離基を含む。いくつかの実施形態において、反応基は、サイトカインペプチドによって置換される電子不足アルキル基などの、脱離基を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抱合反応は、ラジカル種とのラジカル捕捉剤の反応を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抱合反応は、酸化的ラジカル付加反応を含む。いくつかの実施形態において、ラジカル捕捉剤はアリールアミンである。いくつかの実施形態において、ラジカル種はチロシルラジカルである。いくつかの実施形態において、ラジカル種は、ルテニウム触媒（［Ｒｕ（ｂｐｙ）３］などの）および光によって生成される。
【０１８６】
酵素反応は、本明細書に記載される抱合反応に随意に使用される。典型的な酵素的な抱合は、ＳｏｒｔＡ媒介抱合、ＴＧ媒介抱合、またはＦＧＥ媒介抱合を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抱合反応は、アミド結合を形成するためのチオエステルを有する末端１−アミノ−２−チオ基の未変性タンパク質ライゲーション（ＮＰＬ）を含む。
【０１８７】
サイトカインペプチドとリンカーまたは抱合部分とを反応させるための様々な抱合反応が本明細書に記載され、ここで、上記反応は、サイトカインペプチド中の天然（「基準」）アミノ酸により起こる。いくつかの実施形態において、抱合位置で見られる天然アミノ酸は、野生型配列において見られるか、または代替的に、その位置が変異されている。いくつかの実施形態において、抱合反応は、システイン残基でのジスルフィド結合の形成を含む。いくつかの実施形態において、抱合反応は、システインまたはリジンの１，４マイケル付加反応を含む。いくつかの実施形態において、抱合反応は、システインのシアノベンゾチアゾールライゲーションを含む。いくつかの実施形態において、抱合反応は１，３−ジクロロ−２−プロピオン酸などのアセトン部分により架橋することを含む。いくつかの実施形態において、抱合反応は、Ｏ−メシチレンスルホニルヒドロキシルアミンとシステインとの反応によって形成される、デヒドロアラニンの１，４マイケル付加を含む。いくつかの実施形態において、抱合反応は、トリアゾリンジオン（ＴＡＤ）とチロシン、またはＴＡＤ誘導体との反応を含む。いくつかの実施形態において、抱合反応は、ロジウムカルベノイドとトリプトファンとの反応を含む。
【０１８８】
使用の方法
自己免疫疾患または障害
いくつかの実施形態において、被験体における自己免疫疾患または障害を処置する方法も本明細書に記載され、該方法は、本明細書に記載される治療上有効な量のサイトカイン抱合体（例えば、ＩＬ−２抱合体）を被験体に投与する工程を含む。いくつかの例において、ＩＬ−２抱合体は、単離および精製されたＩＬ−２ポリペプチドおよび抱合部分を含み、ここで、ＩＬ−２抱合体は、野生型ＩＬ−２ポリペプチドと比較してＩＬ−２受容体β（ＩＬ−２Ｒβ）サブユニット、ＩＬ−２受容体γ（ＩＬ−２Ｒγ）サブユニット、またはそれらの組み合わせに対する減少した親和性を有する。いくつかの例において、ＩＬ−２抱合体は、単離および精製されたＩＬ−２ポリペプチド；および抱合部分を含み、該抱合部分は、Ｐ２、Ｔ３、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６、Ｔ７、Ｋ８、Ｋ９、Ｑ１１、Ｌ１２、Ｅ１５、Ｈ１６、Ｌ１８、Ｌ１９、Ｄ２０、Ｑ２２、Ｍ２３、Ｎ２６、Ｇ２７、Ｎ２９、Ｎ３０、Ｙ３１、Ｋ３２、Ｋ３５、Ｔ３７、Ｍ４６、Ｋ４７、Ｋ４８、Ａ５０、Ｔ５１、Ｅ５２、Ｋ５３、Ｈ５５、Ｑ５７、Ｅ６０、Ｅ６７、Ｎ７１、Ｑ７４、Ｓ７５、Ｋ７６、Ｎ７７、Ｆ７８、Ｈ７９、Ｒ８１、Ｐ８２、Ｒ８３、Ｄ８４、Ｓ８７、Ｎ８８、Ｎ８９、Ｖ９１、Ｉ９２、Ｌ９４、Ｅ９５、Ｋ９７、Ｇ９８、Ｓ９９、Ｅ１００、Ｔ１０１、Ｔ１０２、Ｆ１０３、Ｍ１０４、Ｃ１０５、Ｅ１０６、Ｙ１０７、Ａ１０８、Ｄ１０９、Ｅ１１０、Ｔ１１１、Ａ１１２、Ｔ１１３、Ｅ１１６、Ｎ１１９、Ｒ１２０、Ｔ１２３、Ａ１２５、Ｑ１２６、Ｓ１２７、Ｓ１３０、Ｔ１３１、Ｌ１３２、およびＴ１３３から選択されるアミノ酸残基にて単離且つ精製されたＩＬ−２ポリペプチドに結合し、ここでアミノ酸残基の番号はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に相当する。いくつかの例において、アミノ酸残基は、Ｋ８、Ｋ９、Ｑ１１、Ｌ１２、Ｅ１５、Ｈ１６、Ｌ１８、Ｌ１９、Ｄ２０、Ｑ２２、Ｍ２３、Ｎ２６、Ｒ８１、Ｄ８４、Ｓ８７、Ｎ８８、Ｖ９１、Ｉ９２、Ｌ９４、Ｅ９５、Ｅ１１６、Ｎ１１９、Ｒ１２０、Ｔ１２３、Ａ１２５、Ｑ１２６、Ｓ１２７、Ｌ１３２、およびＴ１３３から選択される。いくつかの例において、アミノ酸残基は、Ｋ８、Ｋ９、Ｌ１２、Ｅ１５、Ｈ１６、Ｌ１９、Ｄ２０、Ｑ２２、Ｍ２３、Ｎ２６、Ｄ８４、Ｎ８８、Ｅ９５、およびＱ１２６から選択される。場合によっては、ＩＬ−２抱合体はＩＬ−２Ｒαβγ複合体と相互作用するが、ＩＬ−２ＲβおよびＩＬ−２Ｒγサブユニットに対する親和性は減少しており、あるいは、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒβ複合体へのＩＬ−２Ｒγサブユニットの動員を減少させる。場合によっては、修飾されたＩＬ−２ポリペプチドは、野生型ＩＬ−２ポリペプチドに比べてＩＬ−２Ｒαに対する結合親和性を維持する。この場合、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒαβγ複合体は、ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞の拡張を刺激または増強する。更なる場合、修飾されたＩＬ−２ポリペプチドは、ＩＬ−２Ｒβγ複合体を介してＴｅｆｆ細胞および／またはＮＫ細胞の活性化に必要な投与量を増大させ、それにより、ＩＬ−２Ｒαβγ複合体を介してＴｒｅｇ細胞の活性化のための投与量範囲を拡張させる（またはＩＬ−２Ｒαβγ複合体を介してＴｒｅｇ細胞の活性化のためのＩＬ−２の治療濃度域を拡張させる）。
【０１８９】
いくつかの例において、自己免疫疾患または障害には、円形脱毛症、自己免疫溶血性貧血、自己免疫性肝炎、皮膚筋炎、１型糖尿病、若年性特発性関節炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン‐バレー症候群、特発性血小板減少性紫斑病、重症筋無力症、多発性硬化症、天疱瘡／類天疱瘡、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、関節リウマチ、強皮症、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、甲状腺炎、ブドウ膜炎、白斑、またはヴェーゲナー肉芽腫症が挙げられる。
【０１９０】
場合によっては、サイトカイン（例えばインターロイキン、ＩＦＮ、またはＴＮＦ）抱合体は、円形脱毛症、自己免疫溶血性貧血、自己免疫性肝炎、皮膚筋炎、１型糖尿病、若年性特発性関節炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン‐バレー症候群、特発性血小板減少性紫斑病、重症筋無力症、多発性硬化症、天疱瘡／類天疱瘡、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、関節リウマチ、強皮症、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、甲状腺炎、ブドウ膜炎、白斑、またはヴェーゲナー肉芽腫症を抱える被験体に投与される。
【０１９１】
場合によっては、ＩＬ−２抱合体は、円形脱毛症、自己免疫溶血性貧血、自己免疫性肝炎、皮膚筋炎、１型糖尿病、若年性特発性関節炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン‐バレー症候群、特発性血小板減少性紫斑病、重症筋無力症、多発性硬化症、天疱瘡／類天疱瘡、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、関節リウマチ、強皮症、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、甲状腺炎、ブドウ膜炎、白斑、またはヴェーゲナー肉芽腫症を抱える被験体に投与される。場合によっては、ＩＬ−２抱合体は１型糖尿病を抱える被験体に投与される。場合によっては、ＩＬ−２抱合体はグレーブス病を抱える被験体に投与される。場合によっては、ＩＬ−２抱合体は多発性硬化症を抱える被験体に投与される。場合によっては、ＩＬ−２抱合体は乾癬を抱える被験体に投与される。場合によっては、ＩＬ−２抱合体は関節リウマチを抱える被験体に投与される。場合によっては、ＩＬ−２抱合体はシェーグレン症候群を抱える被験体に投与される。場合によっては、ＩＬ−２抱合体は全身性エリテマトーデスを抱える被験体に投与される。場合によっては、ＩＬ−２抱合体はブドウ膜炎を抱える被験体に投与される。場合によっては、ＩＬ−２抱合体はヴェーゲナー肉芽腫症を抱える被験体に投与される。
【０１９２】
場合によっては、サイトカイン抱合体（例えばＩＬ−２抱合体）は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の処置のために被験体に投与される。
【０１９３】
いくつかの実施形態において、追加の治療剤が更に、被験体に投与される。場合によっては、追加の治療剤は、サイトカイン抱合体（例えば、ＩＬ−２抱合体）と同時に投与される。他の場合、追加の治療剤およびサイトカイン抱合体（例えば、ＩＬ−２抱合体）は連続して投与され、例えば、サイトカイン抱合体（例えば、ＩＬ−２抱合体）は追加の治療剤の前に投与され、あるいは、サイトカイン抱合体（例えば、ＩＬ−２抱合体）は追加の治療剤の投与後に投与される。
【０１９４】
自己免疫疾患または障害の処置のための典型的な追加の治療剤は、限定されないが、プレドニゾン、ブデソニド、またはプレドニゾロンなどのコルチコステロイド；シクロスポリンまたはタクロリムスなどのカルシニューリン阻害剤；シロリムスまたはエベロリムスなどのｍＴＯＲ阻害剤；アザチオプリン、レフルノミド、またはミコフェノール酸塩などのＩＭＤＨ阻害剤；アバタセプト、アダリムマブ、アナキンラ、セルトリズマブ、エタネルセプト、ゴリムマブ、インフリキシマブ、イキセキズマブ、ナタリズマブ、リツキシマブ、セクキヌマブ、トシリズマブ、ウステキヌマブ、またはベドリズマブなどの生物製剤；およびバシリキシマブ、ダクリズマブ、またはムロモナブなどのモノクローナル抗体を含む。
【０１９５】
場合によっては、サイトカイン抱合体（例えばＩＬ−２抱合体）は、以下から選択される追加の治療剤と共に投与される：プレドニゾン、ブデソニド、またはプレドニゾロンなどのコルチコステロイド；シクロスポリンまたはタクロリムスなどのカルシニューリン阻害剤；シロリムスまたはエベロリムスなどのｍＴＯＲ阻害剤；アザチオプリン、レフルノミド、またはミコフェノール酸塩などのＩＭＤＨ阻害剤；アバタセプト、アダリムマブ、アナキンラ、セルトリズマブ、エタネルセプト、ゴリムマブ、インフリキシマブ、イキセキズマブ、ナタリズマブ、リツキシマブ、セクキヌマブ、トシリズマブ、ウステキヌマブ、またはベドリズマブなどの生物製剤；およびバシリキシマブ、ダクリズマブ、またはムロモナブなどのモノクローナル抗体。
【０１９６】
細胞集団拡張の方法
いくつかの実施形態において、本明細書にはさらに、Ｔｒｅｇ細胞集団を拡張する方法が記載される。いくつかの例において、前記方法は、細胞を本明細書に記載されるサイトカイン抱合体と接触させる工程、および複合体を形成するためにサイトカインをサイトカイン受容体と相互作用させる工程を含み、ここで、前記複合体は別個のリンパ球集団の拡張を刺激する。
【０１９７】
いくつかの実施形態において、ＣＤ４＋制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞集団を拡張する方法は、ＩＬ−２Ｒαβγとの複合体の形成を誘導するのに十分な時間にわたり上述の単離および修飾されたＩＬ−２ポリペプチドに細胞を接触させる工程を含み、これにより、Ｔｒｅｇ細胞集団の拡張を刺激する。いくつかの実施形態において、ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞集団を拡張する方法は、（ａ）細胞を本明細書に記載されるＩＬ−２抱合体と接触させる工程；および（ｂ）ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒαβγ複合体を形成するためにＩＬ−２抱合体をＩＬ−２Ｒα、ＩＬ−２Ｒβ、およびＩＬ−２Ｒγと相互作用させる工程を含み；ここで、ＩＬ−２抱合体には、ＩＬ−２ＲβおよびＩＬ−２Ｒγサブユニットへの親和性が減少しており、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒβ複合体へのＩＬ−２Ｒγサブユニットの動員を減少させ、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒαβγ複合体はＴｒｅｇ細胞の拡張を刺激する。いくつかの例において、ＩＬ−２抱合体は、単離および精製されたＩＬ−２ポリペプチド；および抱合部分を含み、該抱合部分は、Ｐ２、Ｔ３、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６、Ｔ７、Ｋ８、Ｋ９、Ｑ１１、Ｌ１２、Ｅ１５、Ｈ１６、Ｌ１８、Ｌ１９、Ｄ２０、Ｑ２２、Ｍ２３、Ｎ２６、Ｇ２７、Ｎ２９、Ｎ３０、Ｙ３１、Ｋ３２、Ｋ３５、Ｔ３７、Ｍ４６、Ｋ４７、Ｋ４８、Ａ５０、Ｔ５１、Ｅ５２、Ｋ５３、Ｈ５５、Ｑ５７、Ｅ６０、Ｅ６７、Ｎ７１、Ｑ７４、Ｓ７５、Ｋ７６、Ｎ７７、Ｆ７８、Ｈ７９、Ｒ８１、Ｐ８２、Ｒ８３、Ｄ８４、Ｓ８７、Ｎ８８、Ｎ８９、Ｖ９１、Ｉ９２、Ｌ９４、Ｅ９５、Ｋ９７、Ｇ９８、Ｓ９９、Ｅ１００、Ｔ１０１、Ｔ１０２、Ｆ１０３、Ｍ１０４、Ｃ１０５、Ｅ１０６、Ｙ１０７、Ａ１０８、Ｄ１０９、Ｅ１１０、Ｔ１１１、Ａ１１２、Ｔ１１３、Ｅ１１６、Ｎ１１９、Ｒ１２０、Ｔ１２３、Ａ１２５、Ｑ１２６、Ｓ１２７、Ｓ１３０、Ｔ１３１、Ｌ１３２、およびＴ１３３から選択されるアミノ酸残基にて単離且つ精製されたＩＬ−２ポリペプチドに結合し、ここでアミノ酸残基の番号はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に相当する。いくつかの例において、アミノ酸残基は、Ｋ８、Ｋ９、Ｑ１１、Ｌ１２、Ｅ１５、Ｈ１６、Ｌ１８、Ｌ１９、Ｄ２０、Ｑ２２、Ｍ２３、Ｎ２６、Ｒ８１、Ｄ８４、Ｓ８７、Ｎ８８、Ｖ９１、Ｉ９２、Ｌ９４、Ｅ９５、Ｅ１１６、Ｎ１１９、Ｒ１２０、Ｔ１２３、Ａ１２５、Ｑ１２６、Ｓ１２７、Ｌ１３２、およびＴ１３３から選択される。いくつかの例において、アミノ酸残基は、Ｐ２、Ｔ３、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６、Ｔ７、Ｇ２７、Ｎ２９、Ｎ３０、Ｙ３１、Ｋ３２、Ｋ３５、Ｔ３７、Ｍ４６、Ｋ４７、Ｋ４８、Ａ５０、Ｔ５１、Ｅ５２、Ｋ５３、Ｈ５５、Ｑ５７、Ｅ６０、Ｅ６７、Ｎ７１、Ｑ７４、Ｓ７５、Ｋ７６、Ｎ７７、Ｆ７８、Ｈ７９、Ｐ８２、Ｒ８３、Ｎ８９、Ｋ９７、Ｇ９８、Ｓ９９、Ｅ１００、Ｔ１０１、Ｔ１０２、Ｆ１０３、Ｍ１０４、Ｃ１０５、Ｅ１０６、Ｙ１０７、Ａ１０８、Ｄ１０９、Ｅ１１０、Ｔ１１１、Ａ１１２、およびＴ１１３から選択される。いくつかの例において、アミノ酸位置は、Ｋ８、Ｋ９、Ｌ１２、Ｅ１５、Ｈ１６、Ｌ１９、Ｄ２０、Ｑ２２、Ｍ２３、Ｎ２６、Ｄ８４、Ｎ８８、Ｅ９５、およびＱ１２６から選択される。いくつかの例において、アミノ酸位置はＫ８、Ｋ９、およびＨ１６から選択される。いくつかの例において、アミノ酸位置はＱ２２、Ｎ２６、Ｎ８８、およびＱ１２６から選択される。いくつかの例において、アミノ酸位置はＥ１５、Ｄ２０、Ｄ８４、およびＥ９５から選択される。いくつかの例において、アミノ酸位置はＬ１２、Ｌ１９、Ｍ２３、およびＦ７８から選択される。いくつかの例において、アミノ酸位置はＱ２２およびＮ２６から選択される。
【０１９８】
いくつかの例において、ＩＬ−２抱合体は、ＣＤ４＋Ｔ制御性（Ｔｒｅｇ）細胞を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、またはそれ以上拡張させる。いくつかの例において、ＩＬ−２抱合体は、ＣＤ４＋Ｔ制御性（Ｔｒｅｇ）細胞を約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、またはそれ以上拡張させる。
【０１９９】
場合によっては、ＩＬ−２抱合体は、ＣＤ４＋Ｔ制御性（Ｔｒｅｇ）細胞を少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、１０００倍、またはそれ以上拡張させる。場合によっては、ＩＬ−２抱合体は、ＣＤ４＋Ｔ制御性（Ｔｒｅｇ）細胞を約１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、１０００倍、またはそれ以上拡張させる。
【０２００】
いくつかの例において、ＩＬ−２Ｒαβγとの複合体の形成を誘導するのに十分な時間は、少なくとも５分、１０分、１５分、２０分、３０分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、８時間、１０時間、１２時間、１８時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、または７日である。いくつかの例において、ＩＬ−２Ｒαβγとの複合体の形成を誘導するのに十分な時間は、約５分、１０分、１５分、２０分、３０分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、８時間、１０時間、１２時間、１８時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、または７日である。
【０２０１】
いくつかの実施形態において、前記方法はインビボの方法である。
【０２０２】
他の実施形態において、前記方法はインビトロの方法である。
【０２０３】
更なる実施形態において、前記方法はエキソビボの方法である。
【０２０４】
サイトカインポリペプチド産生
いくつかの例において、本明細書に記載されるサイトカイン（例えば、インターロイキン、ＩＦＮ、またはＴＮＦ）ポリペプチドは、天然アミノ酸突然変異または非天然アミノ酸突然変異の何れかを含んで、組み換えにより作成されるか、あるいは化学合成される。いくつかの例において、本明細書に記載されるサイトカイン（例えばＩＬ−２）ポリペプチドは、組み換えにより、例えば、宿主細胞系により、あるいは無細胞系において生成される。
【０２０５】
いくつかの例において、サイトカイン（例えばＩＬ−２）ポリペプチドは、宿主細胞系を介して組み換えにより生成される。場合によっては、宿主細胞は、真核細胞（例えば、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、または植物細胞）あるいは原核細胞（例えば、グラム陽性菌またはグラム陰性菌）である。場合によっては、真核宿主細胞は、哺乳動物宿主細胞である。場合によっては、哺乳動物宿主細胞は、安定した細胞株、あるいは、対象の遺伝物質をそれ自体のゲノムに組み込み、且つ細胞分裂の多くの世代後に遺伝物質の生成物を発現する能力を有している細胞株である。他の場合、哺乳動物宿主細胞は、一過性の細胞株、あるいは、対象の遺伝物質をそれ自体のゲノムに組み込まず、且つ細胞分裂の多くの世代後に遺伝物質の生成物を発現する能力を有していない細胞株である。
【０２０６】
典型的な哺乳動物宿主細胞には、限定されないが、２９３Ｔ細胞株、２９３Ａ細胞株、２９３ＦＴ細胞株、２９３Ｆ細胞、２９３Ｈ細胞、Ａ５４９細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣＨＯ  ＤＧ４４細胞、ＣＨＯ−Ｓ細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞、Ｆｌｐ−Ｉｎ（商標）Ｔ−ＲＥｘ（商標）２９３細胞株、Ｆｌｐ−Ｉｎ（商標）−２９３細胞株、Ｆｌｐ−Ｉｎ（商標）３Ｔ３細胞株、Ｆｌｐ−Ｉｎ（商標）−ＢＨＫ細胞株、Ｆｌｐ−Ｉｎ（商標）−ＣＨＯ細胞株、Ｆｌｐ−Ｉｎ（商標）−ＣＶ−１細胞株、Ｆｌｐ−Ｉｎ（商標）−Ｊｕｒｋａｔ細胞株、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３Ｆ細胞、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＣＨＯ−Ｓ細胞、ＧｒｉｐＴｉｔｅ（商標）２９３ＭＳＲ細胞株、ＧＳ−ＣＨＯ細胞株、ＨｅｐａＲＧ（商標）細胞、Ｔ−ＲＥｘ（商標）Ｊｕｒｋａｔ細胞株、Ｐｅｒ．Ｃ６細胞、Ｔ−ＲＥｘ（商標）−２９３細胞株、Ｔ−ＲＥｘ（商標）−ＣＨＯ細胞株、およびＴ−ＲＥｘ（商標）−ＨｅＬａ細胞株が挙げられる。
【０２０７】
いくつかの実施形態において、真核宿主細胞は昆虫宿主細胞である。典型的な昆虫宿主細胞は、ショウジョウバエＳ２細胞  Ｓ２細胞、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ（商標）細胞、およびｅｘｐｒｅｓＳＦ＋（登録商標）細胞を含む。
【０２０８】
いくつかの実施形態において、真核宿主細胞は酵母宿主細胞である。典型的な酵母宿主細胞は、ＧＳ１１５、ＫＭ７１Ｈ、ＳＭＤ１１６８、ＳＭＤ１１６８Ｈ、およびＸ−３３などのピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）酵母菌株、並びにＩＮＶＳｃ１などのサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）酵母菌株を含む。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、真核宿主細胞は、植物宿主細胞である。いくつかの例において、植物細胞は藻類由来の細胞を含む。典型的な植物細胞株は、コナミドリムシ１３７ｃ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  １３７ｃ）、またはＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＰＣ  ７９４２を含む。
【０２１０】
いくつかの実施形態において、宿主細胞は原核宿主細胞である。典型的な原核生物の宿主細胞には、ＢＬ２１、Ｍａｃｈ１（商標）、ＤＨ１０Ｂ（商標）、ＴＯＰ１０、ＤＨ５α、ＤＨ１０Ｂａｃ（商標）、ＯｍｎｉＭａｘ（商標）、ＭｅｇａＸ（商標）、ＤＨ１２Ｓ（商標）、ＩＮＶ１１０、ＴＯＰ１０Ｆ’、ＩＮＶαＦ、ＴＯＰ１０／Ｐ３、ｃｃｄＢ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ、ＰＩＲ１、ＰＩＲ２、Ｓｔｂｌ２（商標）、Ｓｔｂｌ３（商標）、またはＳｔｂｌ４（商標）が挙げられる。
【０２１１】
いくつかの例において、本明細書に記載されるＩＬ−２ポリペプチドの産生に適切なポリ核酸分子またはベクターは、真核生物または原核生物のソースに由来する適切なベクターを含む。典型的なポリ核酸分子またはベクターは、細菌（例えばＥ．ｃｏｌｉ）、昆虫、酵母（例えばピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ））、藻類、または哺乳動物に由来するベクターを含む。細菌ベクターには、例えば、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＳＫ７５、ｐＢＡＤ配列ベクター系、ｐＢＡＤＭ配列ベクター系、ｐＥＴ配列ベクター系、ｐＥＴＭ配列ベクター系、ｐＧＥＸ配列ベクター系、ｐＨＡＴ、ｐＨＡＴ２、ｐＭａｌ−ｃ２、ｐＭａｌ−ｐ２、ｐＱＥ配列ベクター系、ｐＲＳＥＴ  Ａ、ｐＲＳＥＴ  Ｂ、ｐＲＳＥＴ  Ｃ、ｐＴｒｃＨｉｓ２系、ｐＺＡ３１−Ｌｕｃ、ｐＺＥ２１−ＭＣＳ−１、ｐＦＬＡＧ  ＡＴＳ、ｐＦＬＡＧ  ＣＴＳ、ｐＦＬＡＧ  ＭＡＣ、ｐＦＬＡＧ  Ｓｈｉｆｔ−１２ｃ、ｐＴＡＣ−ＭＡＴ−１、ｐＦＬＡＧ  ＣＴＣ、またはｐＴＡＣ−ＭＡＴ−２が挙げられる。
【０２１２】
媒介昆虫には、例えば、ｐＦａｓｔＢａｃ１、ｐＦａｓｔＢａｃ  ＤＵＡＬ、ｐＦａｓｔＢａｃ  ＥＴ、ｐＦａｓｔＢａｃ  ＨＴａ、ｐＦａｓｔＢａｃ  ＨＴｂ、ｐＦａｓｔＢａｃ  ＨＴｃ、ｐＦａｓｔＢａｃ  Ｍ３０ａ、ｐＦａｓｔＢａｃｔ  Ｍ３０ｂ、ｐＦａｓｔＢａｃ、Ｍ３０ｃ、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＶＬ１３９３  Ｍ１０、ｐＶＬ１３９３  Ｍ１１、ｐＶＬ１３９３  Ｍ１２、ｐＰｏｌｈ−ＦＬＡＧ１またはｐＰｏｌｈ−ＭＡＴ２などのＦＬＡＧベクター、あるいはｐＰｏｌｈ−ＭＡＴ１またはｐＰｏｌｈ−ＭＡＴ２などのＭＡＴベクターが挙げられる。
【０２１３】
酵母ベクターには、例えば、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ｐＤＥＳＴ（商標）１４ベクター、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ｐＤＥＳＴ（商標）１５ベクター、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ｐＤＥＳＴ（商標）１７ベクター、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ｐＤＥＳＴ（商標）２４ベクター、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ｐＹＥＳ−ＤＥＳＴ５２ベクター、ｐＢＡＤ−ＤＥＳＴ４９  Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）デスティネーションベクター、ｐＡＯ８１５ピキアベクター、ｐＦＬＤ１ピキ・パストリスベクター、ｐＧＡＰＺＡ、Ｂ、およびＣのピキア・パストリスベクター、ｐＰＩＣ３．５Ｋピキアベクター、ｐＰＩＣ６  Ａ、Ｂ、およびＣのピキアベクター、ｐＰＩＣ９Ｋピキアベクター、ｐＴＥＦ１／Ｚｅｏ、ｐＹＥＳ２酵母ベクター、ｐＹＥＳ２／ＣＴ酵母ベクター、ｐＹＥＳ２／ＮＴ  Ａ、Ｂ、およびＣの酵母ベクター、あるいはｐＹＥＳ３／ＣＴ酵母ベクターが挙げられる。
【０２１４】
藻類ベクターには例えば、ｐＣｈｌａｍｙ−４ベクターまたはＭＣＳベクターが挙げられる。
【０２１５】
哺乳動物ベクターには例えば、一過性発現ベクターまたは安定した発現ベクターが挙げられる。典型的な哺乳動物の一過性発現ベクターには、ｐ３ｘＦＬＡＧ−ＣＭＶ８、ｐＦＬＡＧ−Ｍｙｃ−ＣＭＶ１９、ｐＦＬＡＧ−Ｍｙｃ−ＣＭＶ２３、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ２、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ６ａ，ｂ，ｃ、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ５．１、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ５ａ，ｂ，ｃ、ｐ３ｘＦＬＡＧ−ＣＭＶ７．１、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ２０、ｐ３ｘＦＬＡＧ−Ｍｙｃ−ＣＭＶ２４、ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ−ＭＡＴ１、ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ−ＭＡＴ２、ｐＢＩＣＥＰ−ＣＭＶ３、またはｐＢＩＣＥＰ−ＣＭＶ４が挙げられる。典型的な哺乳動物の安定した発現ベクターには、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ３、ｐ３ｘＦＬＡＧ−ＣＭＶ９、ｐ３ｘＦＬＡＧ−ＣＭＶ１３、ｐＦＬＡＧ−Ｍｙｃ−ＣＭＶ２１、ｐ３ｘＦＬＡＧ−Ｍｙｃ−ＣＭＶ２５、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ４、ｐ３ｘＦＬＡＧ−ＣＭＶ１０、ｐ３ｘＦＬＡＧ−ＣＭＶ１４、ｐＦＬＡＧ−Ｍｙｃ−ＣＭＶ２２、ｐ３ｘＦＬＡＧ−Ｍｙｃ−ＣＭＶ２６、ｐＢＩＣＥＰ−ＣＭＶ１、またはｐＢＩＣＥＰ−ＣＭＶ２が挙げられる。
【０２１６】
いくつかの例において、無細胞系は、本明細書に記載されるサイトカイン（例えばＩＬ−２）ポリペプチドの産生のために使用される。場合によっては、無細胞系は、細胞からの細胞質成分および／または核成分の混合物を含み、インビトロでの核酸合成に適している。いくつかの例において、無細胞系は原核細胞成分を利用する。他の例において、無細胞系は真核細胞成分を利用する。核酸合成は、例えば、ショウジョウバエ細胞（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｃｅｌｌ）、ツメガエル卵子（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｅｇｇ）、古細菌、あるいはＨｅＬａ細胞に基づいて無細胞系において得られる。典型的な無細胞系には、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｓ３０  Ｅｘｔｒａｃｔ系、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｔ７  Ｓ３０系、またはＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標）、ＸｐｒｅｓｓＣＦ、およびＸｐｒｅｓｓＣＦ＋が挙げられる。
【０２１７】
無細胞翻訳系は多様に、構成成分、例えばプラスミド、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｔＲＮＡ、シンテターゼ、遊離因子、リボソーム、シャペロンタンパク質、翻訳開始因子および伸長因子、天然アミノ酸および／または非天然アミノ酸、および／または、タンパク質発現のために使用される他の構成成分を含む。そのような構成成分は随意に修飾されることで、収率を改善し、合成速度を増大させ、タンパク質生成物の忠実度を増大させ、または非天然アミノ酸を組み込む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるサイトカインは、次のものに記載される無細胞翻訳系を使用して合成される：ＵＳ８，７７８，６３１；ＵＳ２０１７／０２８３４６９；ＵＳ２０１８／００５１０６５；ＵＳ２０１４／０３１５２４５；またはＵＳ８，７７８，６３１。いくつかの実施形態において、無細胞翻訳系は、修飾された遊離因子、あるいは更に系からの１つ以上の遊離因子の除去を含む。いくつかの実施形態において、無細胞翻訳系は、減少されたプロテアーゼ濃度を含む。いくつかの実施形態において、無細胞翻訳系は、非天然アミノ酸をコードするために使用される再配置されたコドンを含む、修飾されたｔＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるシンテターゼは、非天然アミノ酸の取り込みのために、無細胞翻訳系において使用される。いくつかの実施形態において、ｔＲＮＡは、無細胞翻訳系に加える前に酵素的方法または化学的方法を使用して非天然アミノ酸を予め充填される。いくつかの実施形態において、無細胞翻訳系の構成成分は、修飾された有機体、例えば修飾された細菌、酵母菌、または他の有機体などから得られる。
【０２１８】
いくつかの実施形態において、サイトカイン（例えばＩＬ−２）ポリペプチドは、環状に順列された形態として、発現宿主系を介してまたは無細胞系を通じて生成される。
【０２１９】
非天然アミノ酸を含むサイトカインポリペプチドの産生
直交のまたは拡張された遺伝子コードは本開示において使用することができ、そこでは、サイトカイン（例えばＩＬ−２）ポリペプチドの核酸配列に存在する１つ以上の特定のコドンが割り当てられることで、非天然アミノ酸がコードされ、その結果、非天然アミノ酸が、直交ｔＲＮＡ合成酵素／ｔＲＮＡ対の使用によりサイトカイン（例えばＩＬ−２）へと遺伝学的に組み込まれ得る。直交ｔＲＮＡ合成酵素／ｔＲＮＡ対は、ｔＲＮＡに非天然アミノ酸を充填することができ、且つコドンに応じてその非天然アミノ酸をポリペプチド鎖に組み込むことができる。
【０２２０】
いくつかの例において、コドンは、コドンアンバー、オーカー、オパール、またはクアドルプレットコドン（ｑｕａｄｒｕｐｌｅｔ  ｃｏｄｏｎ）である。場合によっては、コドンは、非天然アミノ酸を運ぶために使用される直交ｔＲＮＡに相当する。場合によっては、コドンはアンバーである。他の場合、コドンは直交コドンである。
【０２２１】
いくつかの例において、コドンはクアドルプレットコドンであり、直交リボソームｒｉｂｏ−Ｑ１によりデコードされ得る。場合によっては、クアドルプレットコドンは、Ｎｅｕｍａｎｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｖｉａ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｑｕａｄｒｕｐｌｅｔ−ｄｅｃｏｄｉｎｇ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ，”  Ｎａｔｕｒｅ，  ４６４（７２８７）：  ４４１−４４４  （２０１０）に説明される通りのものである。
【０２２２】
いくつかの例において、本開示において使用されるコドンは、再コードされたコドン、例えば、代替的なコドンと置き換えられる同義コドンまたはレアコドンである。場合によっては、再コードされたコドンは、Ｎａｐｏｌｉｔａｎｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｅｍｅｒｇｅｎｔ  ｒｕｌｅｓ  ｆｏｒ  ｃｏｄｏｎ  ｃｈｏｉｃｅ  ｅｌｕｃｉｄａｔｅｄ  ｂｙ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｒａｒｅ  ａｒｇｉｎｅ  ｃｏｄｏｎｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，”  ＰＮＡＳ，  １１３（３８）：  Ｅ５５８８−５５９７  （２０１６）に記載される通りのものである。場合によっては、再コードされたコドンは、Ｏｓｔｒｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｄｅｓｉｇｎ，  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ａｎｄ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｔｏｗａｒｄ  ａ  ５７−ｃｏｄｏｎ  ｇｅｎｏｍｅ，”  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３５３（６３０１）：  ８１９−８２２  （２０１６）に記載される通りのものである。
【０２２３】
いくつかの例において、非天然核酸は、サイトカイン（例えばＩＬ−２）への１つ以上の非天然アミノ酸の組み込みをもたらすために利用される。典型的な非天然核酸には、限定されないが次のものが挙げられる：ウラシル−５−イル、ヒポキサンチン−９−イル（Ｉ）、２−アミノアデニン−９−イル、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−２）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン、および２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン、並びに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニン。特定の非天然核酸、例えば５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、およびＮ−２置換プリンなど、Ｎ−６置換プリン、Ｏ−６置換プリン、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、５−プロピニルシトシン、５−メチルシトシン、二重形成の安定性を増大させるもの、普遍的な核酸、疎水性核酸、乱雑な核酸、サイズ拡張された核酸、フッ素処理した核酸、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジンおよびＮ−２、Ｎ−６、並びに０−６の置換プリンには、以下が挙げられる：２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、および５−プロピニルシトシン、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチル、アデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシル、５−ハロシトシン、５−プロピニル（−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ３）ウラシル、５−プロピニルシトシン、ピリミジン核酸の他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、６−アゾシトシン、６−アゾチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニン、５−ハロ、特に５−ブロも、５−トリフルオロメチル、他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニン、７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニン、８−アザアデニン、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、３−デアザグアニン、３−デアザアデニン、三環式ピリミジン、フェノキサジンシチジン（［５，４−ｂ］［１，４］ベンズオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、Ｇ−クランプ、フェノキサジンシチジン（例えば９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンズオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）、プリン塩基またはピリミジン塩基が他の複素環式化合物により置換されるもの、７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジン、２−ピリドン、アザシトシン、５−ブロモシトシン、ブロモウラシル、５−クロロシトシン、塩素化シトシン、シクロシトシン、シトシンアラビノサイド、５−フルオロピリミジン、フルオロピリミジン、フルオロウラシル、５，６−ジヒドロシトシン、５−ヨードシトシン、ヒドロキシ尿素、ヨードウラシル、５−ニトロシトシン、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−フルオロウラシル、および５−ヨードウラシル、２−アミノ−アデニン、６−チオ−グアニン、２−チオ−チミン、４−チオ−チミン、５−プロピニル−ウラシル、４−チオ−ウラシル、Ｎ４−エチルシトシン、７−デアザグアニン、７−デアザ−８−アザグアニン、５−ヒドロキシシトシン、２’−デオキシウリジン、２−アミノ−２’−デオキシアデノシン、および、米国特許第３，６８７，８０８号；４，８４５，２０５号；４，９１０，３００号；４，９４８，８８２号；５，０９３，２３２号；５，１３０，３０２号；５，１３４，０６６号；５，１７５，２７３号；５，３６７，０６６号；５，４３２，２７２号；５，４５７，１８７号；５，４５９，２５５号；５，４８４，９０８号；５，５０２，１７７号；５，５２５，７１１号；５，５５２，５４０号；５，５８７，４６９号；５，５９４，１２１号；５，５９６，０９１号；５，６１４，６１７号；５，６４５，９８５号；５，６８１，９４１号；５，７５０，６９２号；５，７６３，５８８号；５，８３０，６５３号および６，００５，０９６号；ＷＯ２００８／１１６０６４；Ｋａｎｄｉｍａｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００１）  Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ９：８０７−８１３；Ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，  Ｊ．Ｉ．，  Ｅｄ．，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  １９９０，  ８５８−  ８５９；Ｅｎｇｌｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  １９９１，  ３０，  ６１３；およびＳａｎｇｈｖｉ，  Ｃｈａｐｔｅｒ  １５，  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｃｒｏｏｋｅａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ  Ｅｄｓ．，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９３，  ２７３−２８８に記載されるもの。追加の塩基修飾は、例えば米国特許第３，６８７，８０８号；Ｅｎｇｌｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  １９９１，  ３０，  ６１３；およびＳａｎｇｈｖｉ，  Ｃｈａｐｔｅｒ  １５，  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  ｐａｇｅｓ  ２８９−３０２，  Ｃｒｏｏｋｅ  ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ  ｅｄ．，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９３に見出すことができる。
【０２２４】
様々な複素環式の塩基および様々な糖部分（および糖アナログ）を含有する非天然核酸が当技術分野において利用可能であり、核酸は場合によっては、自然発生の核酸の主要な５つの塩基成分とは別の１つ以上の複素環式塩基を含む。例えば、複素環式塩基は場合によっては、ウラシル−５−イル、シトシン−５−イル、アデニン−７−イル、アデニン−８−イル、グアニン−７−イル、グアニン−８−イル、４−アミノピロロ［２．３−ｄ］ピリミジン−５−イル、２−アミノ−４−オキソピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル、２−アミノ−４−オキソピロロ［２．３−ｄ］ピリミジン−３−イル基を含み、ここで、プリンは９位置を介して核酸の糖部分に、１位置を介してピリミジンに、７位置を介してピロロピリミジンに、および１位置を介してピラゾロピリミジンに結合する。
【０２２５】
いくつかの実施形態において、ヌクレオチドアナログもリン酸塩部分にて修飾される。修飾されたリン酸塩部分は、限定されないが、２つのヌクレオチド間の結合にて修飾を有するものを含み、および、例えばホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよび他のアルキルホスホン酸塩、例えば３’−アルキレンホスホン酸塩およびキラルホスホン酸塩など、ホスフィネート、ホスホラミデート、例えば３’−アミノホスホラミデートおよびアミノアルキルホスホラミデートなど、チオホスホラミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、およびボラノホスフェートを含有する。２つのヌクレオチド間のこれらリン酸塩または修飾されたリン酸塩結合は、３’−５’結合または２’−５’結合を経由し、結合は、逆転した極性、例えば３’−５’〜５’−３’、または２’−５’〜５’−２’などを含むことを理解されたい。様々な塩、混合塩、および遊離酸形態も含まれている。多数の米国特許は、修飾されたリン酸塩を含有するヌクレオチドを作成且つ使用する方法を教示しており限定されないが以下が挙げられる：米国特許第３，６８７，８０８号；４，４６９，８６３号；４，４７６，３０１号；５，０２３，２４３号；５，１７７，１９６号；５，１８８，８９７号；５，２６４，４２３号；５，２７６，０１９号；５，２７８，３０２号；５，２８６，７１７号；５，３２１，１３１号；５，３９９，６７６号；５，４０５，９３９号；５，４５３，４９６号；５，４５５，２３３号；５，４６６，６７７号；５，４７６，９２５号；５，５１９，１２６号；５，５３６，８２１号；５，５４１，３０６号；５，５５０，１１１号；５，５６３，２５３号；５，５７１，７９９号；５，５８７，３６１号；および５，６２５，０５０号。
【０２２６】
いくつかの実施形態において、非天然核酸は、２’，３’−ジデオキシ−２’，３’−ジデヒドロ−ヌクレオシド（ＰＣＴ／ＵＳ２００２／００６４６０）、５’−置換ＤＮＡおよびＲＮＡの誘導体（ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３３９６１；Ｓａｈａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｏｒｇ  Ｃｈｅｍ．，  １９９５，  ６０，  ７８８−７８９；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  １９９９，  ９，  ８８５−８９０；およびＭｉｋｈａｉｌｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，  １９９１，  １０（１−３），  ３３９−３４３；Ｌｅｏｎｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５，  １４（３−５），  ９０１−９０５；およびＥｐｐａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ，  ２００４，  ８７，  ３００４−３０２０；ＰＣＴ／ＪＰ２０００／００４７２０；ＰＣＴ／ＪＰ２００３／００２３４２；ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１３２１６；ＰＣＴ／ＪＰ２００５／０２０４３５；ＰＣＴ／ＪＰ２００６／３１５４７９；ＰＣＴ／ＪＰ２００６／３２４４８４；ＰＣＴ／ＪＰ２００９／０５６７１８；ＰＣＴ／ＪＰ２０１０／０６７５６０）、または修飾塩基と共に一リン酸塩として作成された５’−置換単量体（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，  ２００４，  ２３  （１  ＆  ２），  ３１７−３３７）を含む。
【０２２７】
いくつかの実施形態において、非天然核酸は、修飾を糖骨格環の５’−位置および２’−位置に含み（ＰＣＴ／ＵＳ９４／０２９９３）、例えば、５’−ＣＨ２−置換２’−Ｏ−保護ヌクレオシド（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ，  ２０００，  ８３，  １１２７−１１４３  ａｎｄ  Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  １９９９，  １０，  ９２１−９２４）などを含む。場合によっては、非天然核酸は、アミド結合ヌクレオシド二量体を含んで、オリゴヌクレオチドへの組み込みのために調製され、ここで、二量体（５〜３’）における３’結合ヌクレオシドは２’−ＯＣＨ３および５’−（Ｓ）−ＣＨ３を含む（Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｙｎｌｅｔｔ，  １９９７，  １２８７−１２９０）。非天然核酸は、２’−置換５’−ＣＨ２（またはＯ）修飾ヌクレオシドを含み得る（ＰＣＴ／ＵＳ９２／０１０２０）。非天然核酸は、５’−メチレンホスホナートＤＮＡおよびＲＮＡ単量体、および二量体を含み得る（Ｂｏｈｒｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｅｔ．  Ｌｅｔｔ．，  １９９３，  ３４，  ２７２３−２７２６；  Ｃｏｌｌｉｎｇｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｙｎｌｅｔｔ，  １９９５，  ７，  ７０３−７０５；  ａｎｄ  Ｈｕｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ，  ２００２，  ８５，  ２７７７−２８０６）。非天然核酸は、２’−置換を有する５’−ホスホン酸塩単量体（ＵＳ２００６／００７４０３５）、および他の修飾５’−ホスホン酸塩単量体（ＷＯ１９９７／３５８６９）を含み得る。非天然核酸は、５’−修飾メチレンホスホナート単量体を含み得る（ＥＰ６１４９０７およびＥＰ６２９６３３）。非天然核酸は、５’および／または６’位置にてヒドロキシル基を含有する５’または６’ホスホネートリボヌクレオシドのアナログを含み得る（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ，  Ｓｕｌｆｕｒ  ａｎｄ  Ｓｉｌｉｃｏｎ，  ２００２，  ７７７，  １７８３−１７８６；  Ｊｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．，  ２０００，  ８，  ２５０１−２５０９；  Ｇａｌｌｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．，  ２００７，  ９２５−９３３；  ａｎｄ  Ｈａｍｐｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．，  １９７６，  １９（８），  １０２９−１０３３）。非天然核酸は、５’−ホスホネートデオキシリボヌクレオシド単量体、および５’−リン酸基を有する二量体を含み得る（Ｎａｗｒｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，  ２００６，  １６（１），  ６８−８２）。非天然核酸は、６’−ホスホネート基を有するヌクレオシドを含み、ここで、５’および／または６’位置は、置換されない、あるいはチオ−ｔｅｒｔ−ブチル基（ＳＣ（ＣＨ３）３）（およびそのアナログ）；メチレンアミノ基（ＣＨ２ＮＨ２）（およびそのアナログ）、またはシアノ基（ＣＮ）（およびそのアナログ）により置換される（Ｆａｉｒｈｕｒｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｙｎｌｅｔｔ，  ２００１，  ４，  ４６７−４７２；Ｋａｐｐｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．，  １９８６，  ２９，  １０３���−１０３８；Ｋａｐｐｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．，  １９８２，  ２５，  １１７９−１１８４；Ｖｒｕｄｈｕｌａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．，  １９８７，  ３０，  ８８８−８９４；Ｈａｍｐｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．，  １９７６，  １９，  １３７１−１３７７；Ｇｅｚｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ，  １９８３，  １０５（２６），  ７６３８−７６４０；およびＨａｍｐｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ，  １９７３，  ９５（１３），  ４４０４−４４１４）。
【０２２８】
いくつかの実施形態において、非天然核酸は糖部の修飾も含む。場合によっては、核酸は、糖群が修飾された１つ以上のヌクレオシドを含む。そのような糖が修飾されたヌクレオシドは、ヌクレアーゼ安定性の増強、結合親和性の増加、または他のいくつかの有益な生物学的特性を与える場合がある。特定の実施形態において、核酸は化学修飾されたリボフラノース環部分を含む。化学修飾されたリボフラノース環の例には、限定されないが、置換基の付加（５’および／または２’置換基；二環式核酸（ＢＮＡ）を形成するための２つの環原子の架橋；リボシル環酸素原子のＳ、Ｎ（Ｒ）、またはＣ（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ＝Ｈ、Ｃ１−Ｃ１２アルキルまたは保護基）への置換を含む）；およびこれらの組み合わせが挙げられる。化学修飾された糖の例は、ＷＯ２００８／１０１１５７、ＵＳ２００５／０１３０９２３、およびＷＯ２００７／１３４１８１に見出すことができる。
【０２２９】
いくつかの例において、修飾された核酸は修飾された糖または糖アナログを含む。故に、リボースおよびデオキシリボースに加えて、糖部分は、ペントース基、デオキシペントース基、ヘキソース基、デオキシヘキソース基、グルコース基、アラビノース基、キシロース基、リキソース基、または糖「アナログ」シクロペンチル基であり得る。糖はピラノシルまたはフラノシルの形態であってもよい。糖部分は、リボース、デオキシリボース、アラビノース、または２’−Ｏ−アルキルリボースのフラノシドであり、糖は、［α］または［β］アノマー配置の何れかの各複素環式塩基に結合され得る。糖修飾には、限定されないが、２’−アルコキシ−ＲＮＡアナログ、２’−アミノ−ＲＮＡアナログ、２’−フルオロ−ＤＮＡ、および２’−アルコキシまたはアミノ−ＲＮＡ／ＤＮＡキメラが挙げられる。例えば、糖修飾は２’−Ｏ−メチル−ウリジンまたは２’−Ｏ−メチル−シチジンを含み得る。糖修飾は２’−Ｏ−アルキル−置換デオキシリボヌクレオシドおよび２’−Ｏ−エチレングリコール様のリボヌクレオシドを含む。これら糖または糖アナログの調製物、およびそのような糖またはアナログが複素環式塩基（核酸塩基）に結合される各「ヌクレオシド」は、既知である。糖修飾はまた、他の修飾により行われ、且つそれと組み合わせられ得る。
【０２３０】
糖部分の修飾は、非天然修飾と共にリボースおよびデオキシリボースの天然修飾も含む。糖修飾は、限定されないが、２’位置に以下の修飾を含む：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、またはＮ−アルキル；Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、またはＮ−アルケニル；Ｏ−アルキニル、Ｓ−アルキニル、またはＮ−アルキニル；あるいはまたはＯ−アルキル−Ｏ−アルキル、ここで、アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換または非置換のＣ１〜Ｃ１０アルキル、あるいはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであり得る。２’糖修飾はまた、限定されないが、−Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］２を含み、ここでｎおよびｍは１から約１０である。
【０２３１】
２’位置の他の修飾は、限定されないが以下を含む：Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリル、Ｏ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２  ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレータ、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善するための基、および同様の特性を有する他の置換基。同様の修飾はまた、糖の上の他の位置、具体的には３’末端ヌクレオチドまたは２’−５’結合オリゴヌクレオチドにおける糖の３’位置、および５’末端ヌクレオチドの５’位置に作られ得る。修飾された糖はまた、ＣＨ２およびＳなどの架橋環酸素に修飾を含むものを含む。ヌクレオチド糖アナログはまた、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣物を有し得る。そのような修飾された糖構造の調製を教示し、且つ塩基修飾の範囲を詳述および説明する、多数の米国特許が存在し、例えば、米国特許第４，９８１，９５７号；５，１１８，８００号；５，３１９，０８０号；５，３５９，０４４号；５，３９３，８７８号；５，４４６，１３７号；５，４６６，７８６号；５，５１４，７８５号；５，５１９，１３４号；５，５６７，８１１号；５，５７６，４２７号；５，５９１，７２２号；５，５９７，９０９号；５，６１０，３００号；５，６２７，０５３号；５，６３９，８７３号；５，６４６，２６５号；５，６５８，８７３号；５，６７０，６３３号；４，８４５，２０５号；５，１３０，３０２号；５，１３４，０６６号；５，１７５，２７３号；５，３６７，０６６号；５，４３２，２７２号；５，４５７，１８７号；５，４５９，２５５号；５，４８４，９０８号；５，５０２，１７７号；５，５２５，７１１号；５，５５２，５４０号；５，５８７，４６９号；５，５９４，１２１号；５，５９６，０９１号；５，６１４，６１７号；５，６８１，９４１号；および５，７００，９２０号などであり、これら各々は全体の参照によって本明細書に組み込まれる。
【０２３２】
修飾された糖部分を有する核酸の例は、限定されないが、５’−ビニル、５’−メチル（ＲまたはＳ）、４’−Ｓ、２’−Ｆ、２’−ＯＣＨ３、および２’−Ｏ（ＣＨ２）２ＯＣＨ３の置換基を含有する核酸を含む。２’位置における置換基はまた、アリル、アミノ、アジド、チオ、Ｏ−アリル、Ｏ−（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）、ＯＣＦ３、Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）２−ＯＮ（Ｒｍ）（Ｒｎ）、およびＯ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）から選択することができ、各ＲｍおよびＲｎは独立して、Ｈあるいは置換または非置換のＣ１−Ｃ１０アルキルである。
【０２３３】
特定の実施形態において、本明細書に記載される核酸は１つ以上の二環式核酸を含む。そのような特定の実施形態において、二環式核酸は、４’リボシル環原子と２’リボシル環原子との間の架橋を含む。特定の実施形態において、本明細書で提供される核酸は１つ以上の二環式核酸を含み、ここで架橋は４’〜２’の二環式核酸を含む。そのような４’〜２’の二環式核酸の例は、限定されないが、以下の式の１つを含む：４’−（ＣＨ２）−Ｏ−２’（ＬＮＡ）；４’−（ＣＨ２）−Ｓ−２’；４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’（ＥＮＡ）；４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’および４’−ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ３）−Ｏ−２’、およびそれらのアナログ（米国特許第７，３９９，８４５号参照）；４’−Ｃ（ＣＨ３）（ＣＨ３）−Ｏ−２’およびそのアナログ（ＷＯ２００９／００６４７８、ＷＯ２００８／１５０７２９、ＵＳ２００４／０１７１５７０、米国特許第７，４２７，６７２号、Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．，  ２０９，  ７４，  １１８−１３４、およびＷＯ２００８／１５４４０１）。更に、例えばＳｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｅｍ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  １９９８，  ４，  ４５５−４５６；Ｋｏｓｈｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，  １９９８，  ５４，  ３６０７−３６３０；Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．  Ｓ．  Ａ．，  ２０００，  ９７，  ５６３３−５６３８；Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．，  １９９８，  ８，  ２２１９−２２２２；Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．，  １９９８，  ６３，  １００３５−１００３９；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  ２００７，  １２９（２６）  ８３６２−８３７９；Ｅｌａｙａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｉｎｖｅｎｓ．  Ｄｒｕｇｓ，  ２００１，  ２，  ５５８−５６１；Ｂｒａａｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ，  ２００１，  ８，  １−７；Ｏｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．，  ２００１，  ３，  ２３９−２４３；米国特許第４，８４９，５１３号；５，０１５，７３３号；５，１１８，８００号；５，１１８，８０２号；７，０５３，２０７号；６，２６８，４９０号；６，７７０，７４８号；６，７９４，４９９号；７，０３４，１３３号；６，５２５，１９１号；６，６７０，４６１号；および７，３９９，８４５号；国際公開番号ＷＯ２００４／１０６３５６、ＷＯ１９９４／１４２２６、ＷＯ２００５／０２１５７０、ＷＯ２００７／０９００７１、およびＷＯ２００７／１３４１８１；米国特許公開番号ＵＳ２００４／０１７１５７０、ＵＳ２００７／０２８７８３１、およびＵＳ２００８／００３９６１８；米国仮特許出願第６０／９８９，５７４号、６１／０２６，９９５号、６１／０２６，９９８号、６１／０５６，５６４号、６１／０８６，２３１号、６１／０９７，７８７号、および６１／０９９，８４４号；並びに国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６４５９１、ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６６１５４、ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６８９２２、およびＰＣＴ／ＤＫ９８／００３９３号を参照。
【０２３４】
特定の実施形態において、核酸は結合された核酸を含む。核酸は、任意の相互核酸結合を使用して共に結合され得る。相互核酸結合基の２つの主なクラスは、リン原子の有無によって定められる。代表的なリン含有相互核酸結合は、限定されないが、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、ホスホラミデート、およびホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）を含む。代表的な非リン含有相互核酸結合は、限定されないが、メチレンメチルイミノ（−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−）、チオジエステル（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｓ−）、チオカルバメート（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）（ＮＨ）−Ｓ−）；シロキサン（−Ｏ−Ｓｉ（Ｈ）２−Ｏ−）；およびＮ，Ｎ＊−ジメチルヒドラジン（−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３））。特定の実施形態において、キラル原子を有する相互核酸結合は、ラセミ混合物、別個のエナンチオマー、例えばアルキルホスホネートおよびホスホロチオエートとして調製され得る。非天然核酸は単一の修飾を含み得る。非天然核酸は、部分の１つの内に、または異なる部分間に複数の修飾を含み得る。
【０２３５】
核酸への骨格リン酸塩修飾は、限定されないが、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホラミデート（架橋または非架橋）、ホスホトリエステル、ホスホロジチオエート、ホスホジチオエート、およびボラノホスフェートを含み、および、任意の組み合わせにおいて使用されてもよい。他の非リン酸塩結合も使用されてもよい。
【０２３６】
いくつかの実施形態において、骨格修飾（例えばメチルホスホナート、ホスホロチオエート、ホスホラミデート、およびホスホロジチオエートのヌクレオチド間結合）は、修飾された核酸に免疫修飾物質活性を付与し、および／またはインビボでそれらの安定性を増強することができる。
【０２３７】
いくつかの例において、リン誘導体（または修飾されたリン酸基）は、糖または糖アナログ部分に結合され、および、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、アルキルホスホナート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホラミデートなどであり得る。修飾されたリン酸塩結合または非リン酸塩結合を含んでいる典型的なポリヌクレオチドは、以下に見出すことができる：Ｐｅｙｒｏｔｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２４：  １８４１−１８４８；Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２４：２３１８−２３２３；およびＳｃｈｕｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９６）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２４：２９６６−２９７３；Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ，  １９９７，  “Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｓ：  ａｎ  Ｏｖｅｒｖｉｅｗ”  ｉｎ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ，  （Ｃｈａｄｗｉｃｋ  ａｎｄ  Ｃａｒｄｅｗ，  ｅｄ．）  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ；Ｚｏｎ，  １９９３，  ”Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅｓ”  ｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ，  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  ｐｐ．  １６５−１９０；Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７１，  ＪＡＣＳ  ９３：６６５７−６６６５；Ｊａｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２７：７２４７−７２４６；Ｎｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  ＪＯＣ  ６２：７２７８−７２８７；米国特許第５，４５３，４９６号；およびＭｉｃｋｌｅｆｉｅｌｄ，  ２００１，  Ｃｕｒｒ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ８：  １１５７−１１７９。
【０２３８】
場合によっては、骨格修飾は、ホスホジエステル結合を代替的な部分、例えば陰イオン基、中性基、または陽イオン基に置換することを含む。そのような修飾の例には以下が挙げられる：陰イオン性ヌクレオシド間結合；Ｎ３’〜Ｐ５’のホスホラミデート修飾；ボラノホスフェートＤＮＡ；プロオリゴヌクレオチド；メチルホスホネートなどの中性ヌクレオシド間結合；アミド結合ＤＮＡ；メチレン（メチルイミノ）結合；ホルムアセタール（ｆｏｒｍａｃｅｔａｌ）およびチオホルムアセタール（ｔｈｉｏｆｏｒｍａｃｅｔａｌ）結合；スルホニル基を含有する骨格；モルホリノオリゴ；ペプチド核酸（ＰＮＡ）；および正に荷電したデオキシリボ核グアニジン（ＤＮＧ）オリゴ（Ｍｉｃｋｌｅｆｉｅｌｄ，  ２００１，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ８：  １１５７−１１７９）。修飾された核酸は、１つ以上の修飾、例えばホスホジエステルおよびホスホロチオエートの結合の組み合わせなどのリン酸塩結合の組み合わせを含むキメラ骨格または混合骨格を含み得る。
【０２３９】
リン酸塩の置換基は、例えば、短鎖アルキルまたはシクロアルキルのヌクレオシド間結合、混合されたヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルのヌクレオシド間結合、あるいは１つ以上の短鎖ヘテロ原子または複素環式のヌクレオシド間結合を含む。これらは、（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される）モルホリノ結合を有するもの；シロキサン骨格；硫化物、スルホキシド、およびスルホン骨格；ホルムアセチル骨格およびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチル骨格およびメチレンチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノ骨格およびメチレンヒドラジノ骨格；スルホネート骨格およびスルホンアミド骨格；アミド骨格；および混合されたＮ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２成分の部分を有する他のものを含み得る。多数の米国特許は、これらのタイプのリン酸塩置換を作成且つ使用する方法を開示しており、限定されないが、米国特許第５，０３４，５０６号；５，１６６，３１５号；５，１８５，４４４号；５，２１４，１３４号；５，２１６，１４１号；５，２３５，０３３号；５，２６４，５６２号；５，２６４，５６４号；５，４０５，９３８号；５，４３４，２５７号；５，４６６，６７７号；５，４７０，９６７号；５，４８９，６７７号；５，５４１，３０７号；５，５６１，２２５号；５，５９６，０８６号；５，６０２，２４０号；５，６１０，２８９号；５，６０２，２４０号；５，６０８，０４６号；５，６１０，２８９号；５，６１８，７０４号；５，６２３，０７０号；５，６６３，３１２号；５，６３３，３６０号；５，６７７，４３７号；および５，６７７，４３９号が挙げられる。ヌクレオチドの糖およびリン酸塩両方の部分が、例えばアミド型結合（アミノエチルグリシン）（ＰＮＡ）により置換され得ることも、ヌクレオチド置換基において理解される。米国特許第５，５３９，０８２号；５，７１４，３３１号；および５，７１９，２６２号は、ＰＮＡ分子を作成且つ使用する方法を教示しており、その各々は参照により本明細書に組み込まれる。また、Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １９９１，  ２５４，  １４９７−１５００を参照。更に、他のタイプの分子（抱合体）をヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログに結合して、例えば細胞取込みを増強することも可能である。抱合体は、ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログに化学結合され得る。そのような抱合体は、限定されないが、脂質部分、例えばコレステロール部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  １９８９，  ８６，  ６５５３−６５５６）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔ．  ，  １９９４，  ４，  １０５３−１０６０）、チオエテール、例えばヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．  ＫＹ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  １９９２，  ６６０，  ３０６−３０９；  Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔ．，  １９９３，  ３，  ２７６５−２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕ��ｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １９９２，  ２０，  ５３３−５３８）、脂肪族鎖、例えばドデカンジオールまたはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭ５ＯＪ，  １９９１，  １０，  １１１１−１１１８；  Ｋａｂａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，  １９９０，  ２５９，  ３２７−３３０；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，  １９９３，  ７５，  ４９−５４）、リン脂質、例えばジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−Ｓ−Ｈ−ホスホン酸塩（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．  ，  １９９５，  ３６，  ３６５１−３６５４；  Ｓｈｅａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １９９０，  １８，  ３７７７−３７８３）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，  １９９５，  １４，  ９６９−９７３）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，  １９９５，  ３６，  ３６５１−３６５４）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，  １９９５，  １２６４，  ２２９−２３７）、またはオクタデシルアミンあるいはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｅｘｐ．  Ｔｈｅｒ．，  １９９６，  ２７７，  ９２３−９３７）を含む。多数の米国特許は、そのような抱合体の調製を教示し、限定されないが、以下が挙げられる：米国特許第４，８２８，９７９号；４，９４８，８８２号；５，２１８，１０５号；５，５２５，４６５号；５，５４１，３１３号；５，５４５，７３０号；５，５５２，５３８号；５，５７８，７１７号；５，５８０，７３１号；５，５８０，７３１号；５，５９１，５８４号；５，１０９，１２４号；５，１１８，８０２号；５，１３８，０４５号；５，４１４，０７７号；５，４８６，６０３号；５，５１２，４３９号；５，５７８，７１８号；５，６０８，０４６号；４，５８７，０４４号；４，６０５，７３５号；４，６６７，０２５号；４，７６２，７７９号；４，７８９，７３７号；４，８２４，９４１号；４，８３５，２６３号；４，８７６，３３５号；４，９０４，５８２号；４，９５８，０１３号；５，０８２，８３０号；５，１１２，９６３号；５，２１４，１３６号；５，０８２，８３０号；５，１１２，９６３号；５，２１４，１３６号；５，２４５，０２２号；５，２５４，４６９号；５，２５８，５０６号；５，２６２，５３６号；５，２７２，２５０号；５，２９２，８７３号；５，３１７，０９８号；５，３７１，２４１号；５，３９１，７２３号；５，４１６，２０３号；５，４５１，４６３号；５，５１０，４７５号；５，５１２，６６７号；５，５１４，７８５号；５，５６５，５５２号；５，５６７，８１０号；５，５７４，１４２号；５，５８５，４８１号；５，５８７，３７１号；５，５９５，７２６号；５，５９７，６９６号；５，５���９，９２３号；５，５９９，９２８号；および５，６８８，９４１号。
【０２４０】
場合によっては、非天然核酸は更に非天然塩基対を形成する。インビボ条件下で非天然ＤＮＡまたはＲＮＡ塩基対（ＵＢＰ）を形成可能な典型的な不自然なヌクレオチドは、限定されないが、５ＳＩＣＳ、ｄ５ＳＩＣＳ、ＮＡＭ、ｄＮａＭ、およびそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、非天然ヌクレオチドは以下を含む：
【０２４１】
【化１】
2020529976.tif 000003
【０２４２】
いくつかの実施形態において、非天然塩基対は、Ｄｕｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ  ｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｄｏｎ  ｒｅａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ−Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｉｎ  ｂｉｏｌｏｇｙ，”  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ６：  ５０−６９  （２０１５）に記載される非天然アミノ酸を生成する。
【０２４３】
ｔＲＮＡ、ｔＲＮＡ合成酵素、および目的のタンパク質が産生されるように、本明細書に開示される構築物またはベクターが導入される宿主細胞が、適切な媒体において培養または維持される。目的のタンパク質が非天然アミノ酸を組み込むように、媒体は更に非天然アミノ酸を含む。
【０２４４】
直交ｔＲＮＡ合成酵素／ｔＲＮＡ対は非天然アミノ酸によりｔＲＮＡをチャージし、且つコドンに応じて非天然アミノ酸をポリペプチド鎖に組み込むことができる。典型的なａａＲＳ−ｔＲＮＡは、限定されないが、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（Ｍｊ−Ｔｙｒ）ａａＲＳ／ｔＲＮＡ対、Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＴｙｒＲＳ（Ｅｃ−Ｔｙｒ）／Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｔＲＮＡＣＵＡ対、Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＬｅｕＲＳ（Ｅｃ−Ｌｅｕ）／Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｔＲＮＡＣＵＡ対、およびピロリジル（ｐｙｒｒｏｌｙｓｙｌ）−ｔＲＮＡ対を含む。
【０２４５】
非天然アミノ酸を含むサイトカイン（例えばＩＬ−２）ポリペプチドは、ｔＲＮＡおよびｔＲＮＡ合成酵素を含み、且つ１つ以上のインフレーム直交（停止）コドンにより目的の核酸配列を含む、本明細書に記載される核酸構築物の宿主細胞への導入により調製される。宿主細胞は、非天然アミノ酸を含む生理溶液に晒され、宿主細胞はその後、対象のコード配列のタンパク質の発現を可能にする条件下で維持される。非天然アミノ酸はコドンに応じてポリペプチド鎖へと組み込まれる。例えば、１つ以上の非天然アミノ酸はサイトカイン（例えばＩＬ−２）ポリペプチドへと組み込まれる。代替的に、２つ以上の非天然アミノ酸は、タンパク質中の２つ以上の部位にてサイトカイン（例えばＩＬ−２）ポリペプチドへと組み込まれ得る。
【０２４６】
複数の非天然アミノ酸がサイトカイン（例えばＩＬ−２）ポリペプチドへと組み込まれることになっている場合、ｔＲＮＡ合成酵素／ｔＲＮＡ対がコドンに応じて非天然アミノ酸の組み込みを導くことができるように、複数のコドンは所望の位置にてコード核酸配列へと組み込まれる必要がある。核酸をコードする少なくとも１、２、３、または４つ以上のコドンは、目的の核酸配列へと組み込まれ得る。
【０２４７】
１より多くのタイプの非天然アミノ酸を目的のタンパク質へと組み込み単一のタンパク質とすることが望まれるとき、第２のまたは更なる直交ｔＲＮＡ−ｔＲＮＡ合成酵素対は、第２のまたは更なる非天然アミノ酸を組み込むために使用され；適切な場合、第２のまたは更なる直交ｔＲＮＡ−ｔＲＮＡ合成酵素対は、２つ以上の非天然アミノ酸が単一生産工程においてタンパク質中の異なる定義された部位へと特異的に組み込まれ得るように、目的のタンパク質をコードする核酸において異なるコドンを認識する。特定の実施形態において、２つ以上の直交ｔＲＮＡ−ｔＲＮＡ合成酵素対が故に使用されてもよい。
【０２４８】
一旦非天然アミノ酸を組み込むサイトカイン（例えばＩＬ−２）ポリペプチドが宿主細胞中で産生されると、それは、当該技術分野で既知の様々な技術、例えば、酵素溶解、化学溶解、および／または浸透圧溶解、並びに物理的破壊などにより、そこから抽出され得る。サイトカイン（例えばＩＬ−２）ポリペプチドは、当該技術分野で既知の標準技術、例えば分取クロマトグラフィー、親和性精製、または他のあらゆる適切な技術などによって精製され得る。
【０２４９】
適切な宿主細胞は、細菌細胞（例えば大腸菌）を含むが、最も適切な場合、宿主細胞は、真核細胞（例えば昆虫細胞（例えばキイロショウジョウバエなどのショウジョウバエ）、酵母菌、線虫（例えばシー・エレガンス（Ｃｅｌｅｇａｎｓ））、マウス（例えばハツカネズミ）、または哺乳動物細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞、ヒト２９３Ｔ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞、およびマウス赤白血症（ＭＥＬ）細胞など）、あるいはヒト細胞または他の真核細胞である。他の適切な宿主細胞は当業者に知られている。適切な場合、宿主細胞は、ヒト細胞または昆虫細胞などの哺乳動物細胞である。
【０２５０】
本発明の実施形態において一般的に使用され得る他の適切な宿主細胞は、実施例のセクション中に記載されるものである。ベクターＤＮＡは従来の形質転換または形質移入技術を介して宿主細胞へと導入され得る。本明細書に使用されるように、用語「形質転換」および「形質移入」は、宿主細胞へと外来性核酸分子（例えばＤＮＡ）を導入するための様々な十分に認識された技術、例えばリン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥデキストラン媒介性形質移入、リポフェクション、またはエレクトロポレーションなどを指すように意図される。宿主細胞を形質転換または形質移入するのに適した方法は当該技術分野で周知である。
【０２５１】
細胞株を作成する場合、通常は安定した細胞株が調製されることが好ましい。哺乳動物細胞の安定した形質移入に関しては、例えば、使用される発現ベクターおよび形質移入技術に応じて、細胞の小さな画分のみが外来性ＤＮＡをゲノムに統合できることが知られている。これらの成分を同定および選択するために、選択マーカー（例えば、抗生物質耐性のための）をコードする遺伝子は一般に、対象の遺伝子と共に宿主細胞へと導入される。好ましい選択可能なマーカーは、Ｇ４１８、ヒグロマイシン、またはメトトレキサートなどの、薬物に対する耐性を与えるものを含む。選択マーカーをコード化する核酸分子は、同じベクター上の宿主細胞へと導入され得るか、または別々のベクター上で導入され得る。導入された核酸分子によって安定して形質移入された細胞は、薬物選択によって同定され得る（例えば、選択マーカー遺伝子を組み込んだ細胞は残存するが、一方で他の細胞は死滅する）。
【０２５２】
一実施形態において、本明細書に記載される構築物は、宿主細胞のゲノムへと統合される。安定した統合の利点は、個別の細胞またはクローン間の均一性が達成されるということである。他の利点は、最良の生産者の選択が実行され得るということである。従って、安定した細胞株を作成することが望ましい。別の実施形態において、本明細書に記載される構築物は、宿主細胞へと形質移入される。宿主細胞へと構築物を形質移入するという利点は、タンパク質収率が最大化され得るということである。一態様において、本明細書に記載される核酸構築物またはベクターを含む細胞が記載される。
【０２５３】
医薬組成物と製剤
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される医薬組成物および製剤は、複数の投与経路、限定されないが、非経口（例えば、静脈内、皮下、筋肉内）、脳内、経口、鼻腔内、頬側、局所、直腸、舌下、または経皮の投与経路などによって被験体に投与される。
【０２５４】
いくつかの実施形態において、医薬製剤は、水性液体分散、自己乳化分散、固溶体、リポソーム分散液、エアロゾル、固形剤形、粉末剤、即時放出製剤、制御放出製剤、速溶製剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、遅延放出製剤、拡張放出製剤、パルス放出製剤、多重微粒子製剤（例えばナノ粒子製剤）、および即時混合且つ制御放出の製剤を含むが、これらに限定されない。
【０２５５】
いくつかの実施形態において、医薬製剤は、本明細書に開示される組成物との適合性並びに所望の剤形の放出プロファイル特性に基づいて選択された、担体または担体材料を含む。典型的な担体材料としては、例えば、結合剤、懸濁化剤、崩壊剤、充填剤、界面活性剤、可溶化剤、安定剤、潤滑剤、湿潤剤、希釈剤などが挙げられる。薬学的に適合性のある担体材料は、限定されないが、アラビアゴム、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、グリセロリン酸カルシウム、乳酸カルシウム、マルトデキストリン、グリセリン、ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、コレステロール、コレステロールエステル、カゼイン酸ナトリウム、大豆レシチン、タウロコール酸、ホスファチジルコリン（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、塩化ナトリウム、リン酸三カルシウム、リン酸二カリウム、セルロースおよびセルロース抱合体、糖ナトリウム・ステアロイルラクチラート塩（ｓｕｇａｒｓ  ｓｏｄｉｕｍ  ｓｔｅａｒｏｙｌ  ｌａｃｔｙｌａｔｅ）、カラギーナン、モノグリセリド、ジグリセリド、α化デンプンなどを含む。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  Ｎｉｎｅｔｅｅｎｔｈ  Ｅｄ  （Ｅａｓｔｏｎ，  Ｐａ．：  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  １９９５），  Ｈｏｏｖｅｒ，  Ｊｏｈｎ  Ｅ．，  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ  １９７５，  Ｌｉｂｅｒｍａｎ，  Ｈ．Ａ．  ａｎｄ  Ｌａｃｈｍａｎ，  Ｌ．，  Ｅｄｓ．，  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｃｋｅｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．，  １９８０，  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｅｄ．  （Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ１９９９）を参照。
【０２５６】
場合によっては、医薬組成物は免疫リポソームとして製剤され、これは、リポソームの脂質二重層に直接または間接的に結合された複数のＩＬ−２抱合体を含む。典型的な脂質は、限定されないが、脂肪酸；リン脂質；コレステロールなどのステロール；スフィンゴミエリンなどのスフィンゴ脂質；ガングリオシド、グロボシド、およびセレブロシドなどのグリコスフィンゴ脂質；ステアリル、オレイル、およびリノレイルアミンなどの界面活性アミンを含む。いくつかの例において、脂質は陽イオン性脂質を含む。いくつかの例において、脂質はリン脂質を含む。典型的なリン脂質には、限定されないが以下が挙げられる：ホスファチジン酸（「ＰＡ」）、ホスファチジルコリン（「ＰＣ」）、ホスファチジルグリセロール（「ＰＧ」）、ホスファチジルエタノールアミン（「ＰＥ」）、ホスファチジルイノシトール（「ＰＩ」）、およびホスファチジルセリン（「ＰＳ」）、スフィンゴミエリン（脳スフィンゴミエリンを含む）、レシチン、リソレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、セレブロシド、ジアラキドイルホスファチジルコリン（「ＤＡＰＣ」）、ジデカノイル−Ｌ−α−ホスファチジルコリン（「ＤＤＰＣ」）、ジエライドイルホスファチジルコリン（「ＤＥＰＣ」）、ジラウロイルホスファチジルコリン（「ＤＬＰＣ」）、ジリノレオイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）、ジオレオイルホスファチジルコリン（「ＤＯＰＣ」）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（「ＤＰＰＣ」）、ジステアロイルホスファチジルコリン（「ＤＳＰＣ」）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルコリン（「ＰＯＰＣ」）、ジアラキドイルホスファチジルグリセロール（「ＤＡＰＧ」）、ジデカノイル−Ｌ−α−ホスファチジルグリセロール（「ＤＤＰＧ」）、ジエライドイルホスファチジルグリセロール（「ＤＥＰＧ」）、ジラウロイルホスファチジルグリセロール（「ＤＬＰＧ」）、ジリノレオイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（「ＤＯＰＧ」）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（「ＤＰＰＧ」）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（「ＤＳＰＧ」）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルグリセロール（「ＰＯＰＧ」）、ジアラキドイルホスファチジルエタノールアミン（「ＤＡＰＥ」）、ジデカノイル−Ｌ−α−ホスファチジルエタノール（「ＤＤＰＥ」）、ジエライドイルホスファチジルエタノールアミン（「ＤＥＰＥ」）、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン（「ＤＬＰＥ」）、ジリノレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（「ＤＭＰＥ」）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（「ＤＯＰＥ」）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（「ＤＰＰＥ」）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（「ＤＳＰＥ」）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（「ＰＯＰＥ」）、ジアラキドイルホスファチジルイノシトール（「ＤＡＰＩ」）、ジデカノイル−Ｌ−α−���スファチジルイノシトール（「ＤＤＰＩ」）、ジエライドイルホスファチジルイノシトール（「ＤＥＰＩ」）、ジラウロイルホスファチジルイノシトール（「ＤＬＰＩ」）、ジリノレオイルホスファチジルイノシトール、ジミリストイルホスファチジルイノシトール（「ＤＭＰＩ」）、ジオレオイルホスファチジルイノシトール（「ＤＯＰＩ」）、ジパルミトイルホスファチジルイノシトール（「ＤＰＰＩ」）、ジステアロイルホスファチジルイノシトール（「ＤＳＰＩ」）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルイノシトール（「ＰＯＰＩ」）、ジアラキドイルホスファチジルセリン（「ＤＡＰＳ」）、ジデカノイル−Ｌ−α−ホスファチジルセリン（「ＤＤＰＳ」）、ジエライドイルホスファチジルセリン（「ＤＥＰＳ」）、ジラウロイルホスファチジルセリン（「ＤＬＰＳ」）、ジリノレオイルホスファチジルセリン、ジミリストイルホスファチジルセリン（「ＤＭＰＳ」）、ジオレオイルホスファチジルセリン（「ＤＯＰＳ」）、ジパルミトイルホスファチジルセリン（「ＤＰＰＳ」）、ジステアロイルホスファチジルセリン（「ＤＳＰＳ」）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルセリン（「ＰＯＰＳ」）、ジアラキドイルスフィンゴミエリン、ジデカノイルスフィンゴミエリン、ジエライドイルスフィンゴミエリン、ジラウロイルスフィンゴミエリン、ジリノレオイルスフィンゴミエリン、ジミリストイルスフィンゴミエリン、スフィンゴミエリン、ジオレオイルスフィンゴミエリン、ジパルミトイルスフィンゴミエリン、ジステアロイルスフィンゴミエリン、および１−パルミトイル−２−オレオイル−スフィンゴミエリン。
【０２５７】
いくつかの例において、医薬組成物は更に、酢酸、ホウ酸、クエン酸、乳酸、リン酸、および塩酸などの酸、水酸化ナトリウム、リン酸塩ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、およびトリス−ヒドロキシメチルアミノメタンなどの塩基、クエン酸塩／デキストロース、重炭酸ナトリウム、および塩化アンモニウムなどの緩衝液を含む、ｐＨ調整剤を含む。このような酸、塩基、および緩衝剤は、組成物のｐＨを許容可能な範囲で維持することを必要とする量で含まれる。
【０２５８】
いくつかの例において、医薬製剤は、組成物の浸透圧を許容可能な範囲にするのに必要な量の１つ以上の塩を含む。このような塩は、ナトリウム、カリウム、またはアンモニウムのカチオンおよび塩化物、クエン酸塩、アスコルビン酸塩、ホウ酸塩、リン酸塩、炭酸水素塩、硫酸塩、チオ硫酸塩、または亜硫酸水素塩を有する塩を含み、適切な塩としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、チオ硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、および硫酸アンモニウムが挙げられる。
【０２５９】
いくつかの実施形態において、医薬製剤は、限定されないが、トレハロース、スクロース、マンニトール、マルトース、グルコースのような糖、あるいは、リン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、硫酸アンモニウムのような塩、および／または、ポリペプチドの溶解度およびインビボの安定性を増大させるヘパリンなどの他の薬剤を含む。
【０２６０】
いくつかの例において、医薬組成物は更に、より安定した環境を提供することができることから、化合物を安定化させるために使用される希釈剤を含む。緩衝液（ｐＨの制御または維持をもたらすこともできる）の中で溶解された塩は、当技術分野で希釈剤として利用され、例えばリン酸緩衝生理食塩溶液が挙げられるがこれに限定されない。特定の例において、希釈剤は組成物のかさ（ｂｕｌｋ）を増やして圧縮を促すか、またはカプセル充填のための均質混合のために十分なかさを作り出す。そのような化合物は、例えばラクトース、デンプン、マンニトール、ソルビトール、デキストロース、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）などの微結晶性セルロース、リン酸水素カルシウム、リン酸カルシウム二水和物、リン酸三カルシウム、リン酸カルシウム、無水ラクトース、噴霧乾燥ラクトース、α化デンプン、Ｄｉ−Ｐａｃ（登録商標）（Ａｍｓｔａｒ）などの圧縮可能な糖、マンニトール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートステアレート、スクロースベースの希釈剤、粉砂糖、一塩基性硫酸カルシウム一水和物、硫酸カルシウム二水和物、乳酸カルシウム三水和物、デキストラート、加水分解シリアル固形物、アミロース、粉末セルロース、炭酸カルシウム、グリシン、カオリン、マンニトール、塩化ナトリウム、イノシトール、ベントナイトなどを含み得る。
【０２６１】
場合によっては、医薬製剤は、物質の分解または崩壊を促進するために崩壊剤または分解剤を含む。用語「分解する」は、胃腸液と接触した際の剤形の溶解と分散の両方を含む。崩壊剤の例は、デンプン、例えば、トウモロコシデンプンまたはジャガイモデンプンなどの天然のデンプン、Ｎａｔｉｏｎａｌ１５５１またはＡｍｉｊｅｌ（登録商標）などのα化デンプン、あるいはＰｒｏｍｏｇｅｌ（登録商標）またはＥｘｐｌｏｔａｂ（登録商標）などのデンプングリコール酸ナトリウム、木材生成物などのセルロース、メチル結晶性セルロース（例えば、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）ＰＨ１０１、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）ＰＨ１０２、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）ＰＨ１０５、Ｅｌｃｅｍａ（登録商標）Ｐ１００、Ｅｍｃｏｃｅｌ（登録商標）、Ｖｉｖａｃｅｌ（登録商標）、Ｍｉｎｇ  Ｔｉａ（登録商標）、およびＳｏｌｋａ−Ｆｌｏｃ（登録商標）、メチルセルロース、クロスカルメロース、または、架橋セルロース、例えば、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム（Ａｃ−Ｄｉ−Ｓｏｌ（登録商標））、架橋カルボキシメチルセルロース、または架橋クロスカルメロース、架橋デンプン、例えば、デンプングリコール酸ナトリウムなど、架橋ポリマー、例えば、クロスポビドンなど、架橋ポリビニルピロリドン、アルギン酸塩、例えば、アルギン酸またはアルギン酸ナトリウムの塩など、Ｖｅｅｇｕｍ（登録商標）ＨＶ（ケイ酸アルミニウムマグネシウム）などの粘土、ゴム、例えば、寒天、グアー、イナゴマメ、カラヤ、ペクチン、またはトラガント、デンプングリコール酸ナトリウム、ベントナイト、天然のスポンジ、界面活性剤、陽イオン交換樹脂などの樹脂、柑橘類の果肉、ラウリル硫酸ナトリウム、デンプンと組み合わせたラウリル硫酸ナトリウムなどを含む。
【０２６２】
いくつかの例において、医薬製剤は、充填剤、例えばラクトース、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、硫酸カルシウム、微結晶性セルロース、セルロース粉末、デキストロース、デキストラート、デキストラン、デンプン、α化デンプン、スクロース、キシリトール、ラクチトール、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウム、ポリエチレングリコールなどを含む。
【０２６３】
潤滑剤および滑剤も、物質の接着または摩擦を予防するか、減少するか、阻害するための本明細書に記載された医薬製剤において随意に含まれている。典型的な潤滑剤は、例えば、ステアリン酸、水酸化カルシウム、タルク、フマル酸ステアリルナトリウム、鉱油などの炭化水素、あるいは、例えば水素化大豆油（Ｓｔｅｒｏｔｅｘ（登録商標））などの硬化植物油、高脂肪酸、およびそのアルカリ金属とアルカリ土類金属塩、例えばアルミニウム、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、ステアリン酸、ステアリン酸ナトリウム、グリセロール、タルク、ワックス、Ｓｔｅａｒｏｗｅｔ（登録商標）、ホウ酸、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ロイシン、ポリエチレングリコール（例えばＰＥＧ−４０００）またはＣａｒｂｏｗａｘ（商標）などのメトキシポリエチレングリコール、オレイン酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム、ベへン酸グリセリル、ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸マグネシウムまたはラウリル硫酸ナトリウム、Ｓｙｌｏｉｄ（商標）などのコロイダルシリカ、Ｃａｂ−Ｏ−Ｓｉｌ（登録商標）、トウモロコシデンプンなどのデンプン、シリコーン油、界面活性剤などを含む。
【０２６４】
可塑剤は、マイクロカプセル化材料またはフィルムコーティングを軟化することでそれらの脆さを抑えるために使用される化合物を含む。適切な可塑剤は、例えばＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１４５０、ＰＥＧ３３５０、およびＰＥＧ８００などのポリエチレングリコール、ステアリン酸、プロピレングリコール、オレイン酸、トリエチルセルロース、およびトリアセチンを含む。可塑剤はまた、分散剤または湿潤剤としても機能することができる。
【０２６５】
可溶化剤は、トリアセチン、クエン酸トリエチル、オレイン酸エチル、カプリル酸エチル、ラウリル硫酸ナトリウム、ドクサートナトリウム、ビタミンＥ  ＴＰＧＳ、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン、Ｎ−ヒドロキシエチルピロリドン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルシクロデキストリン、エタノール、ｎ−ブタノール、イソプロピルアルコール、コレステロール、胆汁塩、ポリエチレングリコール２００−６００、グリコフロール、トランスクトール、プロピレングリコール、およびジメチルイソソルビドなどの化合物を含む。
【０２６６】
安定化剤は、任意の抗酸化剤、緩衝液、酸、防腐剤などの化合物を含む。典型的な安定化剤は、塩酸Ｌ−アルギニン、トロメタミン、アルブミン（ヒト）、クエン酸、ベンジルアルコール、フェノール、リン酸水素二ナトリウム無水物、プロピレングリコール、メタクレゾールまたは、ｍ−クレゾール、酢酸亜鉛、ポリソルベート−２０またはＴｗｅｅｎ（登録商標）２０、またはトロメタモールを含む。
【０２６７】
懸濁化剤は、化合物、例えば、ポリビニルピロリドン、例えばポリビニルピロリドンＫ１２、ポリビニルピロリドンＫ１７、ポリビニルピロリドンＫ２５、またはポリビニルピロリドンＫ３０、ビニルピロリドン／酢酸ビニルコポリマー（Ｓ６３０）、ポリエチレングリコール（例えば、ポリエチレングリコールは約３００〜約６０００、約３３５０〜約４０００、または約７０００〜約５４００の分子量を有する）、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロースアセテートステアレート、ポリソルベート８０、ヒドロキシエチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ゴム、例えばトラガカントゴム、アカシアゴム、グアーゴム、キサンタンゴムを含むキサンタン、糖、セルロース系のもの、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリソルベート８０、アルギン酸ナトリウム、ポリエトキシレートソルビタンモノラウリン酸、ポリエトキシレートソルビタンモノラウリン酸、ポビドンなどを含む。
【０２６８】
界面活性剤は、ラウリル硫酸ナトリウム、ドクサートナトリウム、Ｔｗｅｅｎ６０または８０、トリアセチン、ビタミンＥ  ＴＰＧＳ、モノオレイン酸ソルビタン、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、ポリソルベート、ポロクサマー（ｐｏｌａｘｏｍｅｒ）、胆汁塩、モノステアリン酸グリセリル、エチレンオキシドおよびプロピレンオキシドのコポリマー、例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）（ＢＡＳＦ）などの化合物を含む。追加の界面活性剤は、ポリオキシエチレン脂肪酸グリセリド、および植物油、例えばポリオキシエチレン（６０）水素化ヒマシ油、およびポリオキシエチレンアルキルエーテルとアルキルフェニルエーテル、例えばオクトキシノール１０、オクトキシノール４０を含む。時に、界面活性剤は、物理的安定性を高めるために、または他の目的のために含まれる。
【０２６９】
粘度増強剤は、例えば、メチルセルロース、キサンタンゴム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートステアラート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタラート、カルボマー、ポリビニルアルコール、アルギン酸塩、アカシア、キトサン、およびそれらの組み合わせを含む。
【０２７０】
湿潤剤は、オレイン酸、モノステアリン酸グリセリル、モノオレイン酸ソルビタン、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミン、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、ナトリウムドクセート、オレイン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ナトリウムドクセート、トリアセチン、Ｔｗｅｅｎ８０、ビタミンＥ  ＴＰＧＳ、アンモニウム塩などの化合物を含む。
【０２７１】
治療レジメン
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される医薬組成物は治療用途のために投与される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は１日１回、１日２回、１日３回、またはそれ以上投与される。医薬組成物は、毎日、１日おき、週５日、週１日、１週おき、１か月に２週、１か月に３週、月１回、月２回、１か月に３回、またはそれ以上投与される。医薬組成物は、少なくとも１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、１８か月、２年、３年、またはそれ以上の間投与される。
【０２７２】
患者の状態が改善する場合、医師の判断に基づいて、組成物の投与は連続的に与えられてもよく、代替的に、投与される組成物の投与量は、一時的に減少するか、一定時間（即ち「休薬期間」）にわたり一時的に停止される。いくつかの例において、休薬期間の長さは２日から１年の間で変動し、ほんの一例として、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、１２日、１５日、２０日、２８日、３５日、５０日、７０日、１００日、１２０日、１５０日、１８０日、２００日、２５０日、２８０日、３００日、３２０日、３５０日、または３６５日が挙げられる。休薬日中の投与量の減少は１０％−１００％であり、ほんの一例として、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％が挙げられる。
【０２７３】
一旦、患者の疾病の改善が生じると、必要ならば維持量が投与される。その後、用量または投与頻度、あるいはその両方は、症状に応じて、疾患、障害、または疾病の改善が保持されるレベルにまで減少可能である。
【０２７４】
いくつかの実施形態において、そのような量に相当する与えられた薬剤の量は、特定の化合物、疾患の重症度、処置を必要とする被験体または宿主の同一性（例えば重量）などの要因に依存して変動するが、それにも関わらず、症例を取り囲む特定の状況、例えば投与される特定の薬剤、投与経路、および処置されている被験体または宿主などに従い当該技術分野で既知の方法で慣例的に決定される。いくつかの例において、所望の投与量は一回量において、あるいは、同時に（または短時間にわたり）または適切な間隔を置いて、例えば１日に２、３、または４以上の下位用量として投与された分割量として都合よく提示される。
【０２７５】
個々の処置レジメンに関する変数の数が大きいため、前述の範囲は単なる示唆的なものに過ぎず、これらの推奨値からかなり逸脱することは珍しいことではない。こうした投与量は、多くの変数、限定されないが、使用される化合物の活性、治療される疾患または疾病、投与の形態、個々の被験体の要件、処置されている疾患または疾病の重症度、および医師の判断に依存して変更される。
【０２７６】
いくつかの実施形態において、こうした治療レジメンの毒性と治療の有効性は、限定されないが、ＬＤ５０（母集団の５０％までの致死投与量）と、ＥＤ５０（母集団の５０％に治療上有効な投与量）の決定を含む、細胞培養または実験動物における標準的な製薬手順によって決定される。毒性と治療効果との間の用量比は治療指数であり、これはＬＤ５０とＥＤ５０との間の比率として表される。高い治療指数を示す化合物が好ましい。細胞培養アッセイと動物研究から得られたデータは、ヒトで使用される一連の投与量を製剤するのに使用される。そのような化合物の用量は、好ましくは毒性が最小限のＥＤ５０を含む、血中濃度の範囲内にある。投与量は、使用された剤形と利用される投与経路に応じてこの範囲内で変動する。
【０２７７】
キット／製品
本明細書には、特定の実施形態において、本明細書に記載される１つ以上の方法および組成物を使用するためのキットおよび製品が開示される。このようなキットは、バイアルやチューブなどの１以上の容器を収容するために仕切られた運搬装置、パッケージ、または容器を含み、容器の各々は本明細書に記載される方法において使用される別個の要素の１つを備えている。適切な容器として、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、および試験管が挙げられる。他の実施形態において、容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成される。
【０２７８】
本明細書で提供される製品は、包装材料を含む。製薬用包装材料の例としては、限定されないが、ブリスターパック、ボトル、チューブ、バッグ、容器、ボトル、および、選択された製剤と投与および処置の意図した形態に適切な任意の包装材料が挙げられる。
【０２７９】
例えば、容器は、本明細書に開示されるサイトカイン（例えばＩＬ−２）ポリペプチドまたはサイトカイン（例えばＩＬ−２）抱合体の１つ以上、および随意に、サイトカイン（例えばＩＬ−２）ポリペプチドまたはサイトカイン（例えばＩＬ−２）抱合体の送達を促進するために本明細書に記載される１つ以上の医薬賦形剤を含有する。そのようなキットは更に、識別用の記載またはラベル、あるいは本明細書に記載される方法における使用に関する説明書を随意に含む。
【０２８０】
キットは典型的に、内容物を列挙するラベルおよび／または使用説明書と、使用説明書を備えた添付文書とを含んでいる。１セットの説明書も典型的に含まれる。
【０２８１】
１つの実施形態において、ラベルは容器上にあるか容器に付随される。一実施形態において、ラベルを形成する文字、数、あるいは他の特徴が容器自体に取り付けられるか、成型されるか、またはエッチングされるとき、ラベルは容器上にあり、ラベルが例えば添付文書として容器を保持するレセプタクルまたは運搬装置内に存在する場合、ラベルは容器に関連付けられる。一実施形態において、ラベルは、内容物が特定の治療用途に用いられるべきものであるということを示すために用いられる。ラベルはまた、例えば本明細書に記載の方法などにおける内容物の使用に関する指示を示す。
【０２８２】
特定の実施形態において、医薬組成物は、本明細書で提供される化合物を含む１以上の単位剤形を含むパックまたはディスペンサーデバイスにおいて提供される。パックは、例えば、ブリスターパックなどの金属またはプラスチックホイルを含む。一実施形態において、パックまたはディスペンサーデバイスには、投与の説明書が付随する。別の実施形態において、パックまたはディスペンサーには、医薬品の製造、使用、または販売を制御する政府機関によって規定された形態の容器に付属の通知書が添付してあり、この通知書は、ヒトまたは動物の投与のための薬物の形態に関する政府機関の承認を反映するものである。このような通知書は、例えば、薬物または承認された製品の挿入物に関して、米国食品医薬品局により承認されたラベルである。１つの実施形態において、適合可能な医薬担体において製剤される、本明細書に提供される化合物を含有する組成物も調製され、適切な容器に入れられ、および示された疾病の処置についてラベル付けされる。
【０２８３】
特定の用語
別段の定めのない限り、本明細書で使用される技術用語と科学用語は全て、主張される主題が属する当該技術分野の当業者により一般に理解されるのと同じ意味を持っている。詳細な記載は典型的且つ説明的なものに過ぎず、主張される主題を制限するものではないことを理解されたい。本出願において、単数形の使用は、特に別記しない限り複数を含む。本明細書で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明確にそうではないと定めていない限り、複数の指示対象を含む。本出願において、「または」の使用は、特に明記しない限り、「および／または」を意味する。更に、用語「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」といった他の形態と同じく、制限はない。
【０２８４】
本発明の様々な特徴は単一の実施形態の文脈において記載され得るが、それらの特徴はまた、個別にまたは任意の適切な組み合わせで提供され得る。反対に、本発明は明確性のために別個の実施形態の観点から本明細書に記載され得るが、本発明は単一の実施形態でも実施され得る。
【０２８５】
本明細書における「いくつかの実施形態」、「実施形態」、「一実施形態」、または「他の実施形態」への言及は、実施形態と関連して記載される特定の特徴、構造、または特性が、本発明の少なくともいくつかの実施形態に含まれるが、必ずしも全ての実施形態には含まれていないことを意味するものである。
【０２８６】
本明細書で使用されるように、範囲および量は、「およその（ａｂｏｕｔ）」特定の値または範囲として表現可能である。「約」は正確な量も含んでいる。従って、「約５μＬ」は、「約５μＬ」と「５μＬ」も意味する。一般に、用語「約」は、実験誤差の範囲内、例えば、１５％、１０％、または５％以内であると予想される量を含む。
【０２８７】
本明細書に使用されるセクションの見出しは、単に構成上の目的のためであり、記載される主題を制限すると解釈されるものではない。
【０２８８】
本明細書で使用されるように、用語「個体」、「被験体」、および「患者」は任意の哺乳動物を意味する。いくつかの実施形態において、哺乳動物はヒトである。いくつかの実施形態では、哺乳動物はヒトではない。いかなる用語も、保健従事者（例えば、医師、正看護師、臨床看護師、医師助手、看護助手、またはホスピスの職員）の監督（例えば、常時または断続的）を特徴とする状況には制限されない。
【０２８９】
本明細書に使用されるように、用語「有意な」または「有意に」は、結合親和性に関して、標的受容体へのサイトカイン（例えばＩＬ−２ポリペプチド）の結合に影響を及ぼすのに十分なサイトカイン（例えばＩＬ−２ポリペプチド）の結合親和性における変化を意味する。いくつかの例において、この用語は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上の変化を指す。いくつかの例において、前記用語は、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、またはそれ以上の変化を指す。
【０２９０】
いくつかの例において、用語「有意な」または「有意に」は、サイトカインシグナル伝達複合体を介した１つ以上の細胞集団の活性化に関して、細胞集団を活性化するのに十分な変化を意味する。場合によっては、細胞集団を活性化する変化は受容体シグナル伝達能力として測定される。この場合、ＥＣ５０値が提供され得る。他の場合、ＥＤ５０値が提供され得る。更なる場合、サイトカインの濃度または用量が提供され得る。
【０２９１】
本明細書に使用されるように、用語「効力」は、標的効果をもたらすことを求められるサイトカイン（例えばＩＬ−２ポリペプチド）の量を指す。いくつかの例において、用語「効力」は、標的サイトカイン受容体（例えばＩＬ−２受容体）を活性化することを求められるサイトカイン（例えばＩＬ−２ポリペプチド）の量を指す。他の例において、用語「効力」は、標的細胞集団を活性化することを求められるサイトカイン（例えばＩＬ−２ポリペプチド）の量を指す。場合によっては、効力は、ＥＤ５０（５０％有効量）、または最大効果の５０％をもたらすことを求められる投与量として測定される。他の場合、効力は、ＥＣ５０（５０％有効濃度）、または集団の５０％において標的効果をもたらすことを求められる投与量として測定される。
【実施例】
【０２９２】
これら実施例は例示目的のためだけに提供され、本明細書に提供される請求の範囲を制限するものではない。
【０２９３】
実施例１
キナーゼ受容体およびサイトカイン受容体の二量化アッセイ
【０２９４】
細胞の取り扱い
【０２９５】
ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ細胞株を、冷凍装置ストックから標準手順に従い拡張させた。細胞を、２０μＬの総容量において、白色の壁付きの３８４ウェルマイクロプレートの中に蒔いて、試験前に適切な時間にわたり培養した。
【０２９６】
アゴニストフォーマット
【０２９７】
アゴニスト判定のために、細胞をサンプルと共にインキュベートして反応を誘導した。サンプルストックの中間希釈を行い、５Ｘサンプルをアッセイ緩衝液中に生成した。約５μＬの５Ｘサンプルを細胞に添加し、３７℃で６〜１６時間、アッセイに応じてインキュベートした。ビヒクル濃度は１％であった。
【０２９８】
シグナル検出
【０２９９】
アッセイシグナルを、アゴニストアッセイおよびアンタゴニストアッセイそれぞれに対する１２．５または１５μＬ（５０％ｖ／ｖ）のＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ検出試薬カクテルの添加一回を介して生成し、その後に１時間のインキュベーションを室温で行った。いくつかのアッセイに関して、活性を、高感度性検出試薬（ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ  Ｆｌａｓｈキット）を使用して検出し、アッセイパフォーマンスを改善した。これらアッセイにおいて、等容量の検出試薬（２５または３０ｕＬ）をウェルに添加し、その後に１時間のインキュベーションを室温で行った。マイクロプレートを、化学発光シグナル検出のためにＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（商標）器機を用いるシグナル生成に従って、読み取った。
【０３００】
データ分析
【０３０１】
化合物活性を、ＣＢＩＳデータ分析スイート（ＣｈｅｍＩｎｎｏｖａｔｉｏｎ、ＣＡ）を使用して分析した。アゴニストモードアッセイに関して、パーセンテージ活性を、以下の式を使用して算出した：
％活性＝１００％×（試験サンプル−の平均ＲＬＵ−ビヒクル対照の平均ＲＬＵ）／（平均ＭＡＸ  ＲＬＵ対照リガンド−ビヒクル対照の平均ＲＬＵ）。
【０３０２】
アンタゴニストモードアッセイに関して、パーセンテージ阻害を、以下の式を使用して算出した：
％阻害＝１００％×（１−／（試験サンプルの平均ＲＬＵ−ビヒクル対照の平均ＲＬＵ）／（ＥＣ８０対照の平均ＲＬＵ−ビヒクル対照の平均ＲＬＵ）。
【０３０３】
実施例２
主要なヒト白血球減少系（ＬＲＳ）由来のＰＢＭＣサンプルにおける典型的なＩＬ−２化合物のエクスビボでの免疫応答プロファイリング
【０３０４】
典型的なＩＬ−２化合物の差次的な受容体特異性が主要な免疫細胞部分母集団の活性化にどのように影響を及ぼすのかを判定するために、ヒトのＬＲＳ由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）サンプルにおけるリンパ球活性化の濃縮反応プロファイリングを、多色フローサイトメトリーを用いて行った。これらの研究をＰｒｉｍｉｔｙＢｉｏ  ＬＬＣ（Ｆｒｅｍｏｎｔ，  ＣＡ）において行った。ヒトＬＲＳサンプルに由来する主要なリンパ球を、典型的なＩＬ−２化合物の系列希釈により処置し、表１に示されるパネルを使用して各リンパ球型におけるｐＳＴＡＴ５シグナル伝達に基づいて定量を行った。
【０３０５】
【表１】
2020529976.tif 000004
【０３０６】
フローサイトメトリーデータを、濃度反応モードにおける様々なＴ細胞およびＮＫ細胞の部分集合の活性化に対して分析し、典型的なＩＬ−２変異体Ｋ９＿３０ｋＤによる処置後のｐＳＴＡＴ５蓄積を読み取った。
【０３０７】
図４Ａ−図４Ｂは、ヒトＬＲＳ初代細胞におけるｐＳＴＡＴ５シグナル伝達（図４Ａ）およびマウスＣＴＬＬ−２集団における増殖反応（図４Ｂ）に関する用量反応曲線を示す。
【０３０８】
表２は、示されたＩＬ−２変異体により処置されたヒトＬＲＳサンプルまたはＣＴＬＬ−２増殖におけるｐＳＴＡＴ５シグナル伝達（ＥＣ５０）に対する用量応答ＥＣ５０を示す。
【０３０９】
【表２】
2020529976.tif 000005
【０３１０】
ＥＣ５０値（ｐｇ／ｍＬ）を、ＭＦＩプロットから作成した用量反応曲線から算出した。
【０３１１】
＊Ｔｒｅｇ効力変化を天然ＩＬ−２（野生型ＩＬ−２）と比較して、個々の実験において実行した（ｒｕｎ）。
【０３１２】
実施例３
担癌Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＰＫ研究
【０３１３】
実験の詳細を表３に要約する。
【０３１４】
【表３】
2020529976.tif 000006
【０３１５】
２つの投与量レベルでの典型的なペグ化ＩＬ−２化合物Ｋ３５＿３０ｋＤの薬物動態特性を評価した。凍結乾燥した被験物質をＰＢＳにおいて再構成し、９匹のオスのＣ５７ＢＬ／６マウスに０．３および３ｍｇ／ｋｇを、静脈内尾静脈注射を介して各投薬群に対して投与した（下記の採取の詳細を参照）。血液サンプルを投与後０．０８、０．２５、０．５、１、２、４、８、１２、および２４時間にて採取した。天然マウスＩＬ−２と交差反応しない、Ａｂｃａｍ（ａｂ１００５６６）からのｈＩＬ−２  ＥＬＩＳＡキットを、被験物質の検出および定量のために使用した。天然およびペグ化化合物のキット検出の感度におけるＥＬＩＳＡに特異的な差異を調節するために、天然ＩＬ−２およびＫ３５＿３０ｋＤ被験物質の標準曲線を被験物質希釈緩衝液を用いて作成し、データを各標準曲線に対して分析した。プロットされたデータは、上述のような３つの個体サンプル（生物学的複製物）の平均およびＳＥＭを表わし、Ｋ３５＿３０ｋＤ被験物質のＰＫパラメータを抽出して表４に要約した。
【０３１６】
【表４】
2020529976.tif 000007
【０３１７】
図５は、２つの異なる濃度でのＫ３５＿３０ｋＤのＰＫプロファイルの向上を示す。それらのＰＫプロファイルは野生型ＩＬ−２に匹敵する。
【０３１８】
実施例４
表５は、本明細書に記載されるＩＬ−２配列を説明する。
【０３１９】
【表５】
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【０３２０】
本発明の好ましい実施形態が本明細書中で示され且つ記載されてきたが、このような実施形態はほんの一例として提供されるものであることは、当業者に明らかであろう。多数の変形、変更、および置き換えは、本発明から逸脱することなく、当業者によって現在想到されるものである。本明細書に記載される本発明の実施形態の様々な代案が、本発明の実施において利用されるかもしれないことを理解されたい。以下の特許請求の範囲は本発明の範囲を定義するものであり、この特許請求の範囲およびその同等物の範囲内の方法および構造は、それにより包含されることが、意図されている。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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