(57)【要約】  本明細書では、動物の健康に有用である、例えば宿主昆虫（例えば、節足動物、例えば昆虫、例えば病原体ベクター）に常在する１つ以上の微生物のレベル、活動又は代謝を変化させるための薬剤、組成物及び方法であって、この変化は、宿主の適応度の低下をもたらす、薬剤、組成物及び方法が提供される。本発明は、宿主の微生物叢を宿主にとって有害な方法で変化させることができる薬剤（例えば、ファージ、ペプチド、小分子、抗生物質又はこれらの組み合わせ）を含む組成物を特徴とする。微生物レベル、微生物活動、微生物代謝又は微生物多様性を破綻させることにより、本明細書に記載される薬剤は、動物において疾患を引き起こすベクター媒介性病原体を保有する種々の昆虫の適応度を低下させるために使用され得る。【選択図】図２Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物病原体のベクターの適応度を低下させる方法であって、
以下：セクロピン（配列番号８２）、メリチン、コプシン、ドロソマイシン（配列番号９３）、ダームシジン（配列番号８１）、アンドロピン（配列番号８３）、モリシン（配列番号８４）、セラトトキシン（配列番号８５）、アバエシン（配列番号８６）、アピダエシン（配列番号８７）、プロフェニン（配列番号８８）、インドリシジン（配列番号８９）、プロテグリン（配列番号９０）、タキプレシン（配列番号９１）又はデフェンシン（配列番号９２）の１つ以上と少なくとも９０％の配列同一性を有する抗微生物ペプチドを前記ベクターに送達すること
を含む方法。
【請求項２】
前記送達は、前記ベクターが成長、生活、繁殖、摂餌又は寄生する少なくとも１つの生息場所に前記抗微生物ペプチドを送達することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗微生物ペプチドは、前記ベクターによる摂取のための、昆虫が摂食可能な組成物で送達される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記抗微生物ペプチドは、液体、固体、エアロゾル、ペースト、ゲル又は気体組成物として製剤化される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
昆虫は、カ、小昆虫類、シラミ、スナバエ、マダニ、サシガメ、ツェツェバエ又はノミの少なくとも１つである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
動物病原体のベクター内の微生物を標的とするように製剤化される、以下：セクロピン、メリチン、コプシン、ドロソマイシン、ダームシジン、アンドロピン、モリシン、セラトトキシン、アバエシン、アピダエシン、プロフェニン、インドリシジン、プロテグリン、タキプレシン又はデフェンシンの１つ以上と少なくとも９０％の配列同一性を有する抗微生物ペプチドを含む組成物。
【請求項７】
前記抗微生物ペプチドは、前記組成物中において約０．１ｎｇ／ｇ〜約１００ｍｇ／ｇの濃度である、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記抗微生物ペプチドは、ターゲティングドメインを更に含む、請求項６又は７に記載の組成物。
【請求項９】
前記抗微生物ペプチドは、細胞透過性ペプチドを更に含む、請求項６〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１７年１月２４日に出願された米国仮特許出願第６２／４５０，０３２号明細書及び２０１７年１１月９日に出願された米国仮特許出願第６２／５８３，９２５号明細書に対する優先権を主張し、これらの仮特許出願の内容は、本明細書によって全体として参照により本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
昆虫は、デング熱、トリパノソーマ症及びマラリアなど、ヒト及び動物に重篤な疾患を引き起こす病原体のベクターとして機能する。家畜などの動物に感染するベクター媒介性疾患は、世界的に公衆衛生上の大きい負担となっている。従って、当該技術分野では、ベクター媒介性疾患を保有する昆虫の防除方法及び組成物が必要とされている。
【発明の概要】
【０００３】
本明細書では、動物におけるベクター媒介性疾患の蔓延を防除するために昆虫の適応度を調節する組成物及び方法が開示される。本組成物は、宿主に常在する１つ以上の微生物のレベル、活動又は代謝を変化させる薬剤であって、この変化は、宿主の適応度の調節をもたらす、薬剤を含む。
【０００４】
一態様において、本明細書では、動物病原体のベクター（例えば、ベクター昆虫）の適応度を低下させる方法であって、以下：セクロピン（配列番号８２）、メリチン、コプシン、ドロソマイシン（配列番号９３）、ダームシジン（配列番号８１）、アンドロピン（配列番号８３）、モリシン（配列番号８４）、セラトトキシン（配列番号８５）、アバエシン（配列番号８６）、アピダエシン（配列番号８７）、プロフェニン（配列番号８８）、インドリシジン（配列番号８９）、プロテグリン（配列番号９０）、タキプレシン（配列番号９１）又はデフェンシン（配列番号９２）の１つ以上と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％又は１００％の配列同一性）を有する抗微生物ペプチドをベクターに送達することを含む方法が提供される。
【０００５】
一部の実施形態において、送達は、ベクターが成長、生活、繁殖、摂餌又は寄生する少なくとも１つの生息場所に抗微生物ペプチドを送達することを含む。
【０００６】
一部の実施形態において、抗微生物ペプチドは、ベクターによる摂取のための、昆虫が摂食可能な組成物で送達され得る。
【０００７】
一部の実施形態において、抗微生物ペプチドは、液体、固体、エアロゾル、ペースト、ゲル又は気体組成物として製剤化され得る。
【０００８】
一部の実施形態において、昆虫は、カ、小昆虫類（ｍｉｄｇｅ）、シラミ、スナバエ、マダニ、サシガメ、ツェツェバエ又はノミの少なくとも１つであり得る。
【０００９】
別の態様において、本明細書では、動物病原体のベクター（例えば、ベクター昆虫）内の微生物を標的とするように製剤化される、以下：セクロピン（配列番号８２）、メリチン、コプシン、ドロソマイシン（配列番号９３）、ダームシジン（配列番号８１）、アンドロピン（配列番号８３）、モリシン（配列番号８４）、セラトトキシン（配列番号８５）、アバエシン（配列番号８６）、アピダエシン（配列番号８７）、プロフェニン（配列番号８８）、インドリシジン（配列番号８９）、プロテグリン（配列番号９０）、タキプレシン（配列番号９１）又はデフェンシン（配列番号９２）の１つ以上と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％又は１００％の配列同一性）を有する抗微生物ペプチドを含む組成物が提供される。
【００１０】
第２の態様の一部の実施形態において、抗微生物ペプチドは、組成物中において約０．１ｎｇ／ｇ〜約１００ｍｇ／ｇ（約０．１ｎｇ／ｇ〜約１ｎｇ／ｇ、約１ｎｇ／ｇ〜約１０ｎｇ／ｇ、約１０ｎｇ／ｇ〜約１００ｎｇ／ｇ、約１００ｎｇ／ｇ〜約１０００ｎｇ／ｇ、約１ｍｇ／ｇ〜約１０ｍｇ／ｇ、約１０ｍｇ／ｇ〜約１００ｍｇ／ｇ）又は約０．１ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬ（約０．１ｎｇ／ｍＬ〜約１ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ〜約１０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ〜約１０００ｎｇ／ｍＬ、約１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬ）の濃度であり得る。
【００１１】
第２の態様の一部の実施形態において、抗微生物ペプチドは、ターゲティングドメインを更に含み得る。
【００１２】
第２の態様の一部の実施形態において、抗微生物ペプチドは、細胞透過性ペプチドを更に含み得る。
【００１３】
更に別の態様において、本組成物は、昆虫宿主に常在する１つ以上の微生物のレベル、活動又は代謝を変化させる薬剤であって、この変化は、昆虫宿主の適応度の低下をもたらす、薬剤を含む。
【００１４】
上記の任意の組成物の一部の実施形態において、１つ以上の微生物は、宿主に常在する細菌又は真菌であり得る。一部の実施形態において、宿主に常在する細菌は、カンディダトゥス属種（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  ｓｐｐ）、ブフネラ属種（Ｂｕｃｈｅｎｅｒａ  ｓｐｐ）、ブラッタバクテリウム属種（Ｂｌａｔｔａｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ）、バウマンニア属種（Ｂａｕｍａｎｉａ  ｓｐｐ）、ウィグルスウォーチア属種（Ｗｉｇｇｌｅｓｗｏｒｔｈｉａ  ｓｐｐ）、ボルバキア属種（Ｗｏｌｂａｃｈｉａ  ｓｐｐ）、リケッチア属種（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｓｐｐ）、オリエンティア属種（Ｏｒｉｅｎｔｉａ  ｓｐｐ）、ソーダリス属種（Ｓｏｄａｌｉｓ  ｓｐｐ）、バークホルデリア属種（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐｐ）、カプリアビダス属種（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｓｐｐ）、フランキア属種（Ｆｒａｎｋｉａ  ｓｐｐ）、シノリゾビウム属種（Ｓｎｉｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐｐ）、ストレプトコッカス属種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ）、ウォリネラ属種（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ  ｓｐｐ）、キシレラ属種（Ｘｙｌｅｌｌａ  ｓｐｐ）、エルウィニア属種（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｓｐｐ）、アグロバクテリウム属種（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ）、バチルス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ）、パエニバチルス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ）、ストレプトミセス属種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ）、ミクロコッカス属種（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ）、コリネバクテリウム属種（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ）、アセトバクター属種（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ）、シアノバクテリア属種（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｓｐｐ）、サルモネラ属種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ）、ロドコッカス属種（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ）、シュードモナス属種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ）、ラクトバチルス属種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ）、エンテロコッカス属種（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ）、アルカリゲネス属種（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐｐ）、クレブシエラ属種（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ）、パエニバチルス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ）、アルスロバクター属種（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ）、コリネバクテリウム属種（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ）、ブレビバクテリウム属種（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ）、サーマス属種（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｐｐ）、シュードモナス属種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ）、クロストリジウム属種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ）及び大腸菌属種（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｓｐｐ）からなる群から選択される少なくとも１つである。一部の実施形態において、宿主に常在する真菌は、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、メチニコウイア属（Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ）、デバロマイセス属（Ｄｅｂａｒｏｍｙｃｅｓ）、スターメレラ属（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードジマ属（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）、シンビオタフリナ・ブフネリ（Ｓｙｍｂｉｏｔａｐｈｒｉｎａ  ｂｕｃｎｅｒｉ）、シンビオタフリナ・コッホイ（��ｙｍｂｉｏｔａｐｈｒｉｎａ  ｋｏｃｈｉｉ）、シェフェルソマイセス・シェハテ（Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓｏｍｙｃｅｓ  ｓｈｅｈａｔａｅ）、シェフェルソマイセス・スティピティス（Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓｏｍｙｃｅｓ  ｓｔｉｐｉｔｅｓ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、アミロステレウム・アレオラツム（Ａｍｙｌｏｓｔｅｒｅｕｍ  ａｒｅｏｌａｔｕｍ）、エピクロエ属種（Ｅｐｉｃｈｌｏｅ  ｓｐｐ）、ピキア・ピヌス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｎｕｓ）、ハンゼヌラ・カプスラタ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｃａｐｓｕｌａｔｅ）、ダルディニア・デシピエンス（Ｄａｌｄｉｎｉａ  ｄｅｃｉｐｉｅｎ）、セラトシスチス属種（Ｃｅｒａｔｏｃｙｔｉｓ  ｓｐｐ）、オフィオストマ属種（Ｏｐｈｉｏｓｔｏｍａ  ｓｐｐ）及びアッタマイセス・ブロマティフィカス（Ａｔｔａｍｙｃｅｓ  ｂｒｏｍａｔｉｆｉｃｕｓ）からなる群から選択される少なくとも１つである。特定の実施形態において、細菌は、（例えば、カ宿主における）ボルバキア属種（Ｗｏｌｂａｃｈｉａ  ｓｐｐ．）である。特定の実施形態において、細菌は、（例えば、ダニ宿主における）リケッチア属種（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｓｐｐ．）である。
【００１５】
上記の任意の組成物において、薬剤（以下では調節薬剤とも称され得る）は、宿主に常在する微生物の成長、分裂、生存能、代謝及び／又は寿命を変化させることができる。任意の上記実施形態において、調節薬剤は、宿主に常在する１つ以上の微生物の生存能を低下させることができる。一部の実施形態において、調節薬剤は、宿主に常在する１つ以上の微生物の成長又は生存能を増加させる。
【００１６】
任意の上記実施形態において、調節薬剤は、ファージ、ポリペプチド、小分子、抗生物質、細菌又はこれらの任意の組み合わせである。
【００１７】
一部の実施形態において、ファージは、宿主に常在する細菌上の細胞表面タンパク質に結合する。一部の実施形態において、ファージは、宿主に常在する細菌に対してビルレントである。一部の実施形態において、ファージは、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）、サイフォウイルス科（Ｓｉｐｈｏｖｉｒｉｄａｅ）、ポドウイルス科（Ｐｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、リポスリクスウイルス科（Ｌｉｐｏｔｈｒｉｘｖｉｒｉｄａｅ）、ルディウイルス科（Ｒｕｄｉｖｉｒｉｄａｅ）、アンピュラウイルス科（Ａｍｐｕｌｌａｖｉｒｉｄａｅ）、ビカウダウイルス科（Ｂｉｃａｕｄａｖｉｒｉｄａｅ）、クラバウイルス科（Ｃｌａｖａｖｉｒｉｄａｅ）、コルチコウイルス科（Ｃｏｒｔｉｃｏｖｉｒｉｄａｅ）、シストウイルス科（Ｃｙｓｔｏｖｉｒｉｄａｅ）、フセロウイルス科（Ｆｕｓｅｌｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、グロブロウイルス科（Ｇｌｕｂｏｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、グッタウイルス科（Ｇｕｔｔａｖｉｒｉｄａｅ）、イノウイルス科（Ｉｎｏｖｉｒｉｄａｅ）、レビウイルス科（Ｌｅｖｉｖｉｒｉｄａｅ）、ミクロウイルス科（Ｍｉｃｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、プラズマウイルス科（Ｐｌａｓｍａｖｉｒｉｄａｅ）及びテクティウイルス科（Ｔｅｃｔｉｖｉｒｉｄａｅ）からなる群から選択される少なくとも１つである。
【００１８】
一部の実施形態において、ポリペプチドは、バクテリオシン、Ｒ型バクテリオシン、根粒Ｃリッチペプチド、抗微生物ペプチド、溶解素又はバクテリオサイト調節性ペプチドの少なくとも１つである。
【００１９】
一部の実施形態において、小分子は、代謝産物である。
【００２０】
一部の実施形態において、抗生物質は、広域抗生物質である。
【００２１】
一部の実施形態において、調節薬剤は、天然に存在する細菌である。一部の実施形態において、細菌は、バルトネラ・アピス（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  ａｐｉｓ）、パラサッカリバクター・アピウム（Ｐａｒａｓａｃｃｈａｒｉｂａｃｔｅｒ  ａｐｉｕｍ）、フリシェラ・ペララ（Ｆｒｉｓｃｈｅｌｌａ  ｐｅｒｒａｒａ）、スノッドグラセラ・アルビ（Ｓｎｏｄｇｒａｓｓｅｌｌａ  ａｌｖｉ）、ギリアメラ・アピコラ（Ｇｉｌｌｉａｍｅｌａ  ａｐｉｃｏｌａ）、ビフィドバクテリウム属種（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ）及びラクトバチルス属種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ）からなる群から選択される少なくとも１つである。一部の実施形態において、細菌は、カンディダトゥス属種（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  ｓｐｐ）、ブフネラ属種（Ｂｕｃｈｅｎｅｒａ  ｓｐｐ）、ブラッタバクテリウム属種（Ｂｌａｔｔａｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ）、バウマンニア属種（Ｂａｕｍａｎｉａ  ｓｐｐ）、ウィグルスウォーチア属種（Ｗｉｇｇｌｅｓｗｏｒｔｈｉａ  ｓｐｐ）、ボルバキア属種（Ｗｏｌｂａｃｈｉａ  ｓｐｐ）、リケッチア属種（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｓｐｐ）、オリエンティア属種（Ｏｒｉｅｎｔｉａ  ｓｐｐ）、ソーダリス属種（Ｓｏｄａｌｉｓ  ｓｐｐ）、バークホルデリア属種（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐｐ）、カプリアビダス属種（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｓｐｐ）、フランキア属種（Ｆｒａｎｋｉａ  ｓｐｐ）、シノリゾビウム属種（Ｓｎｉｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐｐ）、ストレプトコッカス属種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ）、ウォリネラ属種（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ  ｓｐｐ）、キシレラ属種（Ｘｙｌｅｌｌａ  ｓｐｐ）、エルウィニア属種（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｓｐｐ）、アグロバクテリウム属種（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ）、バチルス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ）、パエニバチルス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ）、ストレプトミセス属種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ）、ミクロコッカス属種（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ）、コリネバクテリウム属種（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ）、アセトバクター属種（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ）、シアノバクテリア属種（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｓｐｐ）、サルモネラ属種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ）、ロドコッカス属種（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ）、シュードモナス属種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ）、ラクトバチルス属種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ）、エンテロコッカス属種（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ）、アルカリゲネス属種（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐｐ）、クレブシエラ属種（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ）、パエニバチルス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ）、アルスロバクター属種（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ）、コリネバクテリウム属種（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ）、ブレビバクテリウム属種（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ）、サーマス属種（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｐｐ）、シュードモナス属種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ）、クロストリジウム属種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ）及び大腸菌属種（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｓｐｐ）か��なる群から選択される少なくとも１つである。
【００２２】
任意の上記組成物において、宿主適応度は、宿主の生存、繁殖又は代謝によって測定され得る。任意の上記実施形態において、調節薬剤は、宿主の農薬感受性（例えば、表１２に挙げられる農薬に対する感受性）を増加させることにより宿主の適応度を調節し得る。一部の実施形態において、調節薬剤は、宿主の農薬感受性を増加させることにより宿主の適応度を調節する。一部の実施形態において、農薬感受性は、殺菌剤又は殺真菌剤感受性である。一部の実施形態において、農薬感受性は、殺虫剤感受性である。
【００２３】
上記の任意の組成物において、本組成物は、複数の異なる調節薬剤を含み得る。一部の実施形態において、本組成物は、調節薬剤と農薬用薬剤（例えば、表１２に挙げられる農薬）とを含む。一部の実施形態において、農薬用薬剤は、殺菌性又は殺真菌性薬剤である。一部の実施形態において、農薬用薬剤は、殺虫性薬剤である。
【００２４】
上記の任意の組成物において、調節薬剤は、第２の部分に連結され得る。一部の実施形態において、第２の部分は、調節薬剤である。
【００２５】
上記の任意の組成物において、調節薬剤は、ターゲティングドメインに連結され得る。一部の実施形態において、ターゲティングドメインは、調節薬剤を宿主の標的部位に標的化させる。一部の実施形態において、ターゲティングドメインは、調節薬剤を宿主に常在する１つ以上の微生物に標的化させる。
【００２６】
上記の任意の組成物において、調節薬剤は、プレ配列又はプロ配列を不活性化し、それにより前駆調節薬剤を形成することを含み得る。一部の実施形態において、前駆調節薬剤は、宿主体内で活性型に変換される。
【００２７】
上記の任意の組成物において、調節薬剤は、リンカーを含み得る。一部の実施形態において、リンカーは、切断可能リンカーである。
【００２８】
上記の任意の組成物において、本組成物は、担体を更に含み得る。一部の例では、担体は、農業的に許容可能な担体であり得る。
【００２９】
上記の任意の組成物において、本組成物は、宿主用ベイト、粘着性薬剤又はこれらの組み合わせを更に含み得る。一部の実施形態において、宿主用ベイトは、摂食可能な薬剤及び／又は化学誘引剤である。
【００３０】
上記の任意の組成物において、本組成物は、宿主適応度を調節するのに有効な用量であり得る。
【００３１】
上記の任意の組成物において、本組成物は、宿主の腸に生息する微生物への送達のために製剤化され得る。上記の任意の組成物において、本組成物は、宿主のバクテリオサイト及び／又は宿主の腸に生息する微生物への送達のために製剤化され得る。一部の実施形態において、本組成物は、植物への送達のために製剤化され得る。一部の実施形態において、本組成物は、宿主の餌場での使用向けに製剤化され得る。
【００３２】
上記の任意の組成物において、本組成物は、液体、粉末、顆粒又はナノ粒子として製剤化され得る。一部の実施形態において、本組成物は、リポソーム、ポリマー、細菌分泌ペプチド及び合成ナノカプセルからなる群から選択されるものとして製剤化される。一部の実施形態において、合成ナノカプセルは、宿主の標的部位に本組成物を送達する。一部の実施形態において、標的部位は、宿主の腸である。一部の実施形態において、標的部位は、宿主のバクテリオサイトである。
【００３３】
更なる態様において、本明細書では、上記の任意の組成物を含む宿主も提供される。一部の実施形態において、宿主は、昆虫である。一部の実施形態において、昆虫は、カ、小昆虫類、シラミ、スナバエ、マダニ、サシガメ、ツェツェバエ又はノミである。特定の実施形態において、昆虫は、カである。特定の実施形態において、昆虫は、マダニである。特定の実施形態において、昆虫は、コダニである。特定の実施形態において、昆虫は、シラミである。
【００３４】
本明細書では、宿主の適応度に必要な微生物を標的とする調節薬剤を含む宿主の適応度の調節システムも提供され、ここで、このシステムは、宿主の適応度を調節するのに有効であり、宿主は、昆虫である。調節薬剤は、本明細書に記載される組成物のいずれを含むこともできる。一部の実施形態において、調節薬剤は、粉末として製剤化される。一部の実施形態において、調節薬剤は、溶媒として製剤化される。一部の実施形態において、調節薬剤は、濃縮物として製剤化される。一部の実施形態において、調節薬剤は、希釈剤として製剤化される。一部の実施形態において、調節薬剤は、前出の任意の組成物を担体と組み合わせることにより送達のために調製される。
【００３５】
なおも更なる態様において、本明細書では、本明細書に記載される任意の組成物を使用した昆虫の適応度の調節方法も提供される。１つの例では、昆虫宿主の適応度を調節する方法は、前出の請求項のいずれか１つの組成物を宿主に送達することを含み、ここで、調節薬剤は、宿主に常在する１つ以上の微生物を標的とし、それにより宿主の適応度を調節する。別の例では、昆虫宿主の微生物多様性を調節する方法は、前出の請求項のいずれか１つの組成物を宿主に送達することを含み、ここで、調節薬剤は、宿主に常在する１つ以上の微生物を標的とし、それにより宿主の微生物多様性を調節する。
【００３６】
上記の任意の方法の一部の実施形態において、調節薬剤は、宿主に常在する１つ以上の微生物のレベルを変化させることができる。上記の任意の方法の一部の実施形態において、調節薬剤は、宿主に常在する１つ以上の微生物の機能を変化させることができる。一部の実施形態において、１つ以上の微生物は、細菌及び／又は真菌であり得る。一部の実施形態において、１つ以上の微生物は、宿主適応に必要である。一部の実施形態において、１つ以上の微生物は、宿主生存に必要である。
【００３７】
上記の任意の方法の一部の実施形態において、送達するステップは、１つ以上の微生物に影響を及ぼし、それにより宿主の微生物多様性を調節するのに十分な用量及び時間で調節薬剤を提供することを含み得る。一部の実施形態において、送達するステップは、植物への前出の任意の組成物の局所施用を含む。一部の実施形態において、送達するステップは、遺伝子操作された植物を介して調節薬剤を提供することを含む。一部の実施形態において、送達するステップは、宿主に調節薬剤を摂食可能物として提供することを含む。一部の実施形態において、送達するステップは、調節薬剤を保有している宿主を提供することを含む。一部の実施形態において、調節薬剤を保有している宿主は、調節薬剤を１つ以上の別の宿主に伝播させることができる。
【００３８】
任意の上記方法の一部の実施形態において、本組成物は、農薬用薬剤（例えば、表１２に挙げられる農薬）に対する宿主の感度を増加させるのに有効であり得る。一部の実施形態において、宿主は、調節薬剤の送達前に農薬用薬剤に対して抵抗性である。一部の実施形態において、農薬用薬剤は、アレロケミカル薬剤である。一部の実施形態において、アレロケミカル薬剤は、カフェイン、大豆シスタチンＮ、モノテルペン類、ジテルペン酸又はフェノール化合物である。一部の実施形態において、本組成物は、宿主を選択的に死滅させるのに有効である。一部の実施形態において、本組成物は、宿主適応度を低下させるのに有効である。一部の実施形態において、本組成物は、宿主における必須アミノ酸及び／又はビタミンの生産を低下させるのに有効である。
【００３９】
任意の上記方法の一部の実施形態において、宿主は、昆虫である。一部の実施形態において、宿主は、動物病原体のベクターである。一部の実施形態において、ベクターは、カ、小昆虫類、シラミ、スナバエ、マダニ、サシガメ、ツェツェバエ又はノミである。特定の実施形態において、ベクターは、カである。特定の実施形態において、ベクターは、マダニである。特定の実施形態において、ベクターは、コダニである。特定の実施形態において、ベクターは、シラミである。一部の実施形態において、動物病原体は、ウイルス、原虫、細菌、原生生物又は線虫である。一部の実施形態において、ウイルスは、トガウイルス科（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）、フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）、ブニヤウイルス科（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ）、ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）又はオルビウイルス科（Ｏｒｂｉｖｉｒｉｄａｅ）の群に属するものである。一部の実施形態において、細菌は、エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、オリエンティア属（Ｏｒｉｅｎｔｉａ）又はボレリア属（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）に属するものである。一部の実施形態において、原虫は、プラスモジウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）、トリパノソーマ属（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）、リーシュマニア又はバベシア属（Ｂａｂｅｓｉａ）に属するものである。一部の実施形態において、線虫は、ブルギア属（Ｂｒｕｇｉａ）に属するものである。一部の実施形態において、本組成物は、動物への病原体の伝播を予防するか又は低下させるのに有効である。一部の実施形態において、本組成物は、宿主間での病原体の水平又は垂直伝播を予防するか又は低下させるのに有効である。一部の実施形態において、本組成物は、宿主適応度、宿主発育又は媒介能力を低下させるのに有効である。
【００４０】
別の態様において、本明細書では、宿主の適応度を調節する調節薬剤を同定するスクリーニングアッセイも提供される。１つの例では、宿主の適応度を調節する調節薬剤を同定するスクリーニングアッセイは、（ａ）宿主に常在することができる微生物を１つ以上の候補調節薬剤に曝露するステップと、（ｂ）宿主の適応度を低下させる調節薬剤を同定するステップとを含む。
【００４１】
本スクリーニングアッセイの一部の実施形態において、調節薬剤は、宿主に常在する微生物である。一部の実施形態において、微生物は、細菌である。一部の実施形態において、細菌は、宿主に常在するとき宿主適応度を低下させる。本スクリーニングアッセイの一部の実施形態において、調節薬剤は、アレロケミカル分解微生物に影響を及ぼす。一部の実施形態において、調節薬剤は、ファージ、抗生物質又は試験化合物である。一部の実施形態において、抗生物質は、チメンチン又はアジスロマイシンである。
【００４２】
本スクリーニングアッセイの一部の実施形態において、宿主は、無脊椎動物であり得る。一部の実施形態において、無脊椎動物は、昆虫である。一部の実施形態において、昆虫は、カである。一部の実施形態において、昆虫は、マダニである。特定の実施形態において、昆虫は、コダニである。特定の実施形態において、昆虫は、シラミである。
【００４３】
本スクリーニングアッセイの任意の上記実施形態において、宿主適応度は、宿主微生物叢を調節することにより調節され得る。
【００４４】
定義
本明細書で使用されるとき、用語「動物」は、家畜又は農業動物及び他の哺乳類獣医学的動物を指す。
【００４５】
本明細書で使用されるとき、用語「バクテリオシン」は、抗微生物特性を備えたペプチド又はポリペプチドを指す。天然に存在するバクテリオシンは、ある種の原核生物によって生産されるものであり、その生産株に関連する生物に対抗して作用するが、生産株自体に対抗しない。本明細書で企図されるバクテリオシンとしては、限定はされないが、天然に存在するバクテリオシン、例えば細菌によって生産されるバクテリオシン及びその誘導体、例えば改変バクテリオシン、組換え発現バクテリオシン及び化学合成バクテリオシンが挙げられる。一部の例では、バクテリオシンは、本明細書に記載されるバクテリオシンの機能的に活性な変異体である。一部の例では、バクテリオシンの変異体は、例えば、特定の領域にわたり又は配列全体にわたり、本明細書に記載されるバクテリオシン又は天然に存在するバクテリオシンの配列と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する。
【００４６】
本明細書で使用されるとき、用語「バクテリオサイト」は、共生細菌特性を備えた細胞内細菌が常在するある種の昆虫に見られる特殊化した細胞を指す。
【００４７】
本明細書で使用されるとき、用語「有効量」は、記載される結果を生じさせるのに十分である、例えば宿主生物（例えば、昆虫、例えばカ、マダニ、コダニ、シラミ）の適応度を減少させるか又は低減するのに十分である、標的宿主の内部で目標レベル（例えば、所定又は閾値レベル）の調節薬剤濃度に達するのに十分である、標的宿主の腸の内部で目標レベル（例えば、所定又は閾値レベル）の調節薬剤濃度に達するのに十分である、標的宿主のバクテリオサイトの内部で目標レベル（例えば、所定又は閾値レベル）の調節薬剤濃度に達するのに十分である、標的宿主の１つ以上の微生物（例えば、内部共生体）のレベル又は活動を調節するのに十分である調節薬剤（例えば、ファージ、溶解素、バクテリオシン、小分子又は抗生物質）又は前記薬剤を含む組成物の量を指す。
【００４８】
本明細書で使用されるとき、用語「適応度」は、宿主生物が生存する能力及び／又は生存能力のある子孫を生産する能力を指す。生物の適応度は、限定はされないが、寿命、繁殖率、移動性、体重及び代謝率を含めた１つ以上のパラメータによって測定され得る。適応度は、活動（例えば、刺咬動物）又は疾患伝播（例えば、ベクター間伝播又はベクター−動物間伝播）の尺度に基づいて更に測定され得る。
【００４９】
本明細書で使用されるとき、用語「腸」は、宿主の前腸、中腸又は後腸を含めた宿主の腸の任意の一部分を指す。
【００５０】
本明細書で使用されるとき、用語「宿主」は、常在性微生物（例えば、内因性微生物、内部共生微生物（例えば、一次又は二次内部共生体）、片利共生生物及び／又は病原性微生物）を保有する生物（例えば、昆虫、例えば蚊、シラミ、コダニ又はマダニ）を指す。
【００５１】
本明細書で使用されるとき、「宿主適応度の低下」又は「宿主適応度の低下」は、限定はされないが、以下の所望の効果：（１）宿主の個体群の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、１００％又はそれを超える低下；（２）宿主（例えば、昆虫、例えば蚊、マダニ、コダニ、シラミ）の繁殖率の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、１００％又はそれを超える低下；（３）宿主（例えば、昆虫、例えば蚊、マダニ、コダニ、シラミ）の移動性の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、１００％又はそれを超えてる低下；（４）宿主（例えば、昆虫、例えば蚊、マダニ、コダニ、シラミ）の体重の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、１００％又はそれを超える低下；（５）宿主（例えば、昆虫、例えば蚊、マダニ、コダニ、シラミ）の代謝率又は活動の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、１００％又はそれを超える増加；（６）宿主（例えば、昆虫、例えば蚊、マダニ、コダニ、シラミ）によるベクター間病原体伝播（例えば、ある昆虫から別の昆虫への病原体の垂直又は水平伝播）の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、１００％又はそれを超える低下；（７）ベクター−動物間病原体伝播（例えば、昆虫、例えば蚊、マダニ、コダニ、シラミ）の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、１００％又はそれを超える低下；（８）宿主（例えば、昆虫、例えば蚊、マダニ、コダニ、シラミ）寿命の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、１００％又はそれを超える低下；（９）宿主（例えば、昆虫、例えば蚊、マダニ、コダニ、シラミ）の農薬（例えば、殺虫剤）に対する感受性の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、１００％又はそれを超える増加；又は（１０）宿主（例えば、昆虫、例えば蚊、マダニ、コダニ、シラミ）による媒介能力の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、１００％又はそれを超える低下のいずれか１つ以上を含め、調節薬剤の投与がもたらす結果としての宿主生理学又は前記宿主によって行われる任意の活動の任意の破綻を指す。宿主適応度の低下は、調節薬剤を投与されていない宿主生物と比較して決定することができる。
【００５２】
用語「昆虫」には、任意の発育段階にある、即ち幼虫及び成虫の、節足動物門（Ａｒｔｈｒｏｐｏｄａ）及び昆虫綱（Ｉｎｓｅｃｔａ）又は蛛形綱（Ａｒａｃｈｎｉｄａ）に属する任意の生物が含まれる。
【００５３】
本明細書で使用されるとき、エンドリシン、自己溶解素、ムレイン加水分解酵素、ペプチドグリカン加水分解酵素又は細胞壁加水分解酵素としても知られる「溶解素」は、細菌の細胞壁のペプチドグリカンを切断することにより細菌を溶解させることができる加水分解酵素を指す。本明細書で企図される溶解素としては、限定はされないが、天然に存在する溶解素、例えばファージによって生産される溶解素、細菌によって生産される溶解素及びその誘導体、例えば改変溶解素、組換え発現溶解素及び化学合成溶解素が挙げられる。バクテリオシンの機能的に活性な変異体は、例えば、特定の領域にわたり又は配列全体にわたり、本明細書に記載されるいずれかを含め、合成、組換え又は天然由来のバクテリオシンの配列と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有し得る。
【００５４】
本明細書で使用されるとき、用語「微生物」は、細菌又は真菌を指す。微生物は、調節薬剤としての役割を果たし得るものを含め、宿主生物に常在する微生物（例えば、内因性微生物、内部共生微生物（例えば、一次又は二次内部共生体））又は宿主にとって外因性の微生物を指し得る。本明細書で使用されるとき、用語「標的微生物」は、宿主に常在し、且つ直接又は間接的のいずれかで調節薬剤の影響を受ける微生物を指す。
【００５５】
本明細書で使用されるとき、用語「薬剤」又は「調節薬剤」は、宿主生物（例えば、昆虫、例えばカ、マダニ、コダニ、シラミ）に常在する微生物のレベル及び／又は機能を変化させ、それにより宿主生物（例えば、昆虫、例えばカ、マダニ、コダニ、シラミ）の適応度を調節する（例えば、減少させる）能力を有する薬剤を指す。
【００５６】
本明細書で使用されるとき、用語「農薬」又は「農薬用薬剤」は、農業、環境又は家庭／住居の病害虫、例えば昆虫、真菌、細菌又はウイルスの防除に使用することができる物質を指す。用語「農薬」は、天然に存在する又は合成の殺虫剤（幼虫駆除剤又は成虫駆除剤）、昆虫成長調節物質、殺ダニ剤（ダニ駆除剤）、殺線虫剤、外部寄生生物撲滅薬、殺菌剤、殺真菌剤又は除草剤（農業において植物成長を制御又は変更するために使用することができる物質）を包含するものと理解される。農薬又は農薬用薬剤の更なる例は、表１２に挙げられる。一部の例では、農薬は、アレロケミカルである。本明細書で使用されるとき、「アレロケミカル」又は「アレロケミカル薬剤」は、別の生物（例えば、宿主昆虫）の生理学的機能（例えば、発芽、成長、生存又は繁殖）に影響を及ぼすことができる生物によって生産される物質である。
【００５７】
本明細書で使用されるとき、用語「ペプチド」、「タンパク質」又は「ポリペプチド」は、長さ（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、４０、５０、１００アミノ酸又はそれを超える）、翻訳後修飾（例えば、グリコシル化又はリン酸化）の有無又は例えばペプチドに共有結合的に連結した１つ以上の非アミノアシル基（例えば、糖、脂質等）の存在に関わらず、天然に存在する又は天然に存在しないアミノ酸鎖（Ｄ−アミノ酸又はＬ−アミノ酸のいずれも）を包含し、例えば天然タンパク質、合成若しくは組換えのポリペプチド及びペプチド、ハイブリッド分子、ペプトイド及びペプチドミメティクスが含まれる。
【００５８】
本明細書で使用されるとき、２つの配列間の「パーセント同一性」は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０に記載されるＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムによって決定される。ＢＬＡＳＴ解析の実行用ソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を通じて公的に利用可能である。
【００５９】
本明細書で使用されるとき、用語「「バクテリオファージ」又はファージ」は、細菌に感染して複製するウイルスを指す。バクテリオファージは、細菌内でそのゲノムを細胞質に注入した後に複製し、これは、細菌細胞溶解をもたらす溶菌サイクル又は細菌細胞をインタクトなまま残す溶原（非溶菌）サイクルのいずれかを用いて行われる。ファージは、天然に存在するファージ分離株であるか、又は部分的なファージゲノム（例えば、宿主細菌の内部でファージのライフサイクルを行うのに必要な全ての必須遺伝子を少なくとも含む）若しくは完全なファージゲノムのいずれかをコードするベクター若しくは核酸を含めた改変ファージであり得る。
【００６０】
本明細書で使用されるとき、用語「植物」は、全植物、植物器官、植物組織、種子、植物細胞、種子及びその子孫を指す。植物細胞には、限定なしに、種子、浮遊培養物、胚、分裂組織領域、カルス組織、葉、根、シュート、配偶体、胞子体、花粉及び小胞子の細胞が含まれる。植物部位には、限定はされないが、以下：根、茎、シュート、葉、花粉、種子、腫瘍組織並びに様々な形態の細胞及び培養物（例えば、単一細胞、プロトプラスト、胚及びカルス組織）を含めた、分化した及び未分化の組織が含まれる。植物組織は、植物のものであるか、又は植物器官、組織若しくは細胞培養物のものであり得る。加えて、植物は、例えば、本明細書に記載される方法又は組成物における任意の調節薬剤の異種タンパク質又はＲＮＡを産生するように遺伝子操作され得る。
【００６１】
本明細書で使用されるとき、用語「ベクター」は、動物病原体を保有するか又はそれをリザーバから動物に伝播させることができる昆虫を指す。例示的ベクターとしては、半翅目（Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ）、及び一部の膜翅目（Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ）、及び双翅目（Ｄｉｐｔｅｒａ）、例えばカ、ミツバチ、スズメバチ、小昆虫類、シラミ、ツェツェバエ、ノミ及びアリなど、並びに蛛形綱（Ａｒａｃｈｎｉｄａ）のメンバー、例えばマダニ及びコダニに見られるとおりの刺し−吸い型口器を備えたものなどの昆虫が挙げられる。
【００６２】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
【００６３】
図は、本発明の１つ以上の特徴、態様又は実施形態を例示することを目的とし、限定することを意図するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１Ａ−１Ｇ】種々の抗生物質送達システムの画像を示す。初齢ＬＳＲ−１アブラムシを種々の治療溶液で経植物送達（図１Ａ）、葉面塗布（図１Ｂ）、マイクロインジェクション（図１Ｃ）及び局所送達（図１Ｄ）によって処理した。
【図２Ａ】３つの異なる条件：必須アミノ酸不含の人工食（ＡＤのみ）、１００μｇ／ｍｌリファンピシンを含有する必須アミノ酸不含の人工食（ＡＤ＋Ｒｉｆ）及び１００μｇ／ｍｌリファンピシン及び必須アミノ酸を含有する人工食（ＡＤ＋Ｒｉｆ＋ＥＡＡ）で経植物送達によって処理した初齢ＬＳＲ−１アブラムシにおけるリファンピシン処理時のアブラムシの発育遅延を示す。図２Ａは、各発育段階における生存アブラムシの割合を示す一連のグラフである（標本サイズ＝３３匹のアブラムシ／群）。
【図２Ｂ−２Ｃ】３つの異なる条件：必須アミノ酸不含の人工食（ＡＤのみ）、１００μｇ／ｍｌリファンピシンを含有する必須アミノ酸不含の人工食（ＡＤ＋Ｒｉｆ）及び１００μｇ／ｍｌリファンピシン及び必須アミノ酸を含有する人工食（ＡＤ＋Ｒｉｆ＋ＥＡＡ）で経植物送達によって処理した初齢ＬＳＲ−１アブラムシにおけるリファンピシン処理時のアブラムシの発育遅延を示す。図２Ｂは、１２日の時点で撮影した各処理の代表的な画像を示す。スケールバー２．５ｍｍ。図２Ｃは、リファンピシン処理の劇的効果を示すアブラムシの体表面積測定値を示す。必須アミノ酸のアドバックにより、発育不足が部分的にレスキューされる。
【図３】リファンピシン処理によってアブラムシの死亡が引き起こされたことを示す。必須アミノ酸不含の人工食（ＡＤのみ）、１００ｕｇ／ｍｌリファンピシンを含有する必須アミノ酸不含の人工食（ＡＤ＋Ｒｉｆ）並びに１００ｕｇ／ｍｌリファンピシン及びを含有する人工食（ＡＤ＋Ｒｉｆ＋ＥＡＡ）で経植物送達によって処理したＬＳＲ−１アブラムシについて、生存を毎日モニタした。括弧内の数字は、各群のアブラムシの数を表す。統計的有意性は、ログ・ランク検定によって決定し、以下の統計的有意差が決定された：ＡＤのみ対ＡＤ＋Ｒｉｆ、ｐ＜０．０００１及びＡＤ＋Ｒｉｆ対ＡＤ＋Ｒｉｆ＋ＥＡＡ、ｐ＝０．０１７。
【図４】リファンピシン処理によってアブラムシの繁殖の消失が引き起こされたことを示すグラフである。初齢ＬＳＲ−１アブラムシを必須アミノ酸不含の人工食（ＡＤのみ）、１００ｕｇ／ｍｌリファンピシンを含有する必須アミノ酸不含の人工食（ＡＤ＋Ｒｉｆ）並びに１００ｕｇ／ｍｌリファンピシン及びを含有する人工食（ＡＤ＋Ｒｉｆ＋ＥＡＡ）で経植物送達によって処理し、アブラムシが成虫期に達した後の各日に産生される子孫の数を測定した。アブラムシが成虫期に達した後、１日当たりに産生される子孫の数の平均値±Ｓ．Ｄ．を示す。
【図５】リファンピシン処理によって内部共生体ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）が除去されたことを示すグラフである。処理後７日に種々の条件について共生体力価を決定した。アブラムシからＤＮＡを抽出し、ｑＰＣＲを実施して、アブラムシＤＮＡに対するブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）ＤＮＡの比を決定した。各群３匹のアブラムシのアブラムシＤＮＡに対するブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）ＤＮＡの比の平均値±ＳＤを示す。統計的有意差は、一元配置ＡＮＯＶＡ、続くチューキーの事後検定を用いて決定した；＊、ｐ＜０．０５。
【図６Ａ】リファンピシン処理を葉面塗布によって送達すると、アブラムシの発育が遅延したことを示す。１００μｌの２つの異なる溶液：溶媒対照（０．０２５％Ｓｉｌｗｅｔ  Ｌ−７７）及び５０μｇ／ｍｌリファンピシンを葉に塗布することにより、初齢ｅＮＡＳＣＯアブラムシを処理した。図６Ａは、各条件についての時間の経過に伴う発育段階を示す一連のグラフである。各発育段階における生存アブラムシの割合を示す（標本サイズ＝２０匹のアブラムシ／群）。
【図６Ｂ】リファンピシン処理を葉面塗布によって送達すると、アブラムシの発育が遅延したことを示す。１００μｌの２つの異なる溶液：溶媒対照（０．０２５％Ｓｉｌｗｅｔ  Ｌ−７７）及び５０μｇ／ｍｌリファンピシンを葉に塗布することにより、初齢ｅＮＡＳＣＯアブラムシを処理した。図６Ｂは、アブラムシの体表面積測定値を示すグラフであり、リファンピシンを塗布した葉がアブラムシのサイズに及ぼす劇的効果が示される。統計的有意差は、一元配置ＡＮＯＶＡ、続くチューキーの事後検定を用いて決定した；＊、ｐ＜０．０５。
【図７】リファンピシン処理を葉面塗布によって送達すると、アブラムシの死亡が引き起こされたことを示す。１００μｌの２つの異なる溶液：溶媒対照（Ｓｉｌｗｅｔ  Ｌ−７７）及び５０μｇ／ｍｌリファンピシンを葉に塗布することにより処理したｅＮＡＳＣＯアブラムシについて、生存を毎日モニタした。処理は、アブラムシの生存率に影響を与える。
【図８】リファンピシン処理を葉面塗布によって送達すると、内部共生体ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）が除去されたことを示す。処理後６日に２つの条件について共生体力価を決定した。アブラムシからＤＮＡを抽出し、ｑＰＣＲを実施して、アブラムシＤＮＡに対するブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）ＤＮＡの比を決定した。アブラムシＤＮＡに対するブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）ＤＮＡの比の平均値±ＳＤを示す。統計的有意差は、一元配置ＡＮＯＶＡ、続くチューキーの事後検定を用いて決定した；＊、ｐ＜０．０５。
【図９】マイクロインジェクションによるリファンピシン処理によって内部共生体ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）が除去されたことを示すグラフである。指示される条件での注入後４日の共生体力価を決定した。対照サンプルは、前述の溶媒、０．０２５％Ｓｉｌｗｅｔ  Ｌ−７７である。アブラムシからＤＮＡを抽出し、ｑＰＣＲを実施して、アブラムシＤＮＡに対するブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）ＤＮＡの比を決定した。アブラムシＤＮＡに対するブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）ＤＮＡの比の平均値±ＳＤを示す。統計的有意差は、一元配置ＡＮＯＶＡ、続くチューキーの事後検定を用いて決定した；＊、ｐ＜０．０５。
【図１０】リファンピシン処理を局所処理によって送達すると、内部共生体ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）が除去されたことを示すグラフである。溶媒（ｓｉｌｗｅｔ  Ｌ−７７）又は溶媒に希釈したリファンピシン溶液の噴霧後３日における共生体力価を決定した。アブラムシからＤＮＡを抽出し、ｑＰＣＲを実施して、アブラムシＤＮＡに対するブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）ＤＮＡの比を決定した。アブラムシＤＮＡに対するブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）ＤＮＡの比の平均値±ＳＤを示す。統計的有意差は、一元配置ＡＮＯＶＡ、続くチューキーの事後検定を用いて決定した；＊、ｐ＜０．０５。
【図１１】１齢及び２齢ＬＳＲ−１アブラムシが、水＋食品着色料又は水＋食品着色料中５０μｇ／ｍｌリファンピシンで灌流した葉上に置かれたことを実証するグラフのパネルを示す。各条件について時間の経過に伴う発育段階を測定した。各発育段階における生存アブラムシの割合を示す（標本サイズ＝７４〜８１匹のアブラムシ／群）。
【図１２】水＋食品着色料又は水＋食品着色料中５０μｇ／ｍｌリファンピシンで灌流した葉上に置いた１齢及び２齢ＬＳＲ−１アブラムシの生存を実証するグラフを示す。括弧内の数字は、各群のアブラムシの数を表す。統計的有意性は、ログ・ランク検定によって決定した。
【図１３】水及び食品着色料又はリファンピシン＋水及び食品着色料で灌流した葉による処理後８日で決定した共生体力価を実証するグラフを示す。アブラムシからＤＮＡを抽出し、ｑＰＣＲを実施して、アブラムシＤＮＡに対するブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）ＤＮＡの比を決定した。アブラムシＤＮＡに対するブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）ＤＮＡの比の平均値±ＳＤを示す。囲み枠内の数字は、実験群の中央値を示す。
【図１４】水＋食品着色料又は水＋食品着色料中１００μｇ／ｍｌリファンピシンで葉への注入及び経植物によって処理した１齢及び２齢ＬＳＲ−１アブラムシを実証するグラフのパネルを示す。各条件について時間の経過に伴う発育段階を測定した。各発育段階における生存アブラムシの割合を示す（標本サイズ＝４９〜５０匹のアブラムシ／群）。
【図１５】水＋食品着色料又は水＋食品着色料中１００μｇ／ｍｌリファンピシンで灌流した葉上に置き及びそれで処理した１齢及び２齢ＬＳＲ−１アブラムシの生存を実証するグラフである。括弧内の数字は、各群のアブラムシの数を表す。ログ・ランク検定を実施し、群間に統計的有意差がないことが決定された。
【図１６Ａ−１６Ｂ】水及び食品着色料又はリファンピシン＋水及び食品着色料で灌流した葉を給餌し且つそれで処理したアブラムシにおける処理後６日（図１６Ａ）及び８日（図１６Ｂ）で決定した共生体力価を示すグラフである。アブラムシからＤＮＡを抽出し、ｑＰＣＲを実施して、アブラムシＤＮＡに対するブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）ＤＮＡの比を決定した。アブラムシＤＮＡに対するブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）ＤＮＡの比の平均値±ＳＤを示す。囲み枠内の数字は、実験群の中央値を示す。
【図１７】１齢及び２齢ＬＳＲ−１アブラムシを対照溶液（水及びＳｉｌｗｅｔ  Ｌ−７７）又は１００μｇ／ｍｌリファンピシンによる処理の併用で処理したことを示すグラフのパネルである。各条件について時間の経過に伴う発育段階を測定した。各発育段階における生存アブラムシの割合を示す（標本サイズ＝７６〜８０匹のアブラムシ／群）。
【図１８】１齢及び２齢ＬＳＲ−１アブラムシを、リファンピシンを含む処理の併用の対照溶液で処理したことを示すグラフである。括弧内の数字は、各群のアブラムシの数を表す。ログ・ランク検定を実施し、群間に統計的有意差がないことが決定された。
【図１９】対照又はリファンピシン溶液による処理後７日で決定した共生体力価を示すグラフである。アブラムシからＤＮＡを抽出し、ｑＰＣＲを実施して、アブラムシＤＮＡに対するブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）ＤＮＡの比を決定した。アブラムシＤＮＡに対するブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）ＤＮＡの比の平均値±ＳＤを示す。囲み枠内の数字は、実験群の中央値を示す。統計的有意差は、ｔ検定によって決定した。
【図２０】キトサン送達システムを示す画像である。Ａ．ピスム（Ａ．ｐｉｓｕｍ）アブラムシを図示されるとおり葉の灌流及び経植物による送達によって治療溶液で処理した。
【図２１】キトサン処理によってアブラムシの発育遅延が引き起こされたことを示すグラフのパネルである。１齢及び２齢Ａ．ピスム（Ａ．ｐｉｓｕｍ）アブラムシを対照溶液（水）及び水中３００ｕｇ／ｍｌキトサンの経植物送達及び葉の灌流によって処理した。実験全体を通じて発育段階をモニタした。処理群毎の各発育段階（１齢、２齢、３齢、４齢、５齢又は繁殖する５齢を表す５Ｒ）にあるアブラムシの割合を示す。
【図２２】キトサンで処理したときに昆虫生存率の低下があったことを示すグラフである。１齢及び２齢Ａ．ピスム（Ａ．ｐｉｓｕｍ）アブラムシを水のみ又はキトサン溶液で経植物送達及び葉の灌流によって処理し、実験の経過にわたって生存を毎日モニタした。括弧内の数字は、処理群中のアブラムシの総数を表す。
【図２３】キトサンで処理すると、内部共生体ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）が減少したことを示すグラフである。１齢及び２齢Ａ．ピスム（Ａ．ｐｉｓｕｍ）アブラムシを水又は水中３００ｕｇ／ｍｌキトサンで経植物送達及び葉の灌流によって処理した。処理後８日でアブラムシからＤＮＡを抽出し、ｑＰＣＲを実施して、アブラムシＤＮＡに対するブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）ＤＮＡの比を決定した。６匹のアブラムシ／群のアブラムシＤＮＡに対するブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）ＤＮＡの比の平均値±ＳＤを示す。各群の中央値を囲み枠内に示す。
【図２４】ナイシンで処理すると、アブラムシの発育遅延が引き起こされたことを示すグラフのパネルである。１齢及び２齢ＬＳＲ−２  Ａ．ピスム（Ａ．ｐｉｓｕｍ）アブラムシを葉への注入及び経植物による送達を用いて水（対照）又は１．６又は７ｍｇ／ｍｌナイシンで処理し、時間の経過に伴う発育を測定した。指示される時点において各ライフステージ（１齢、２齢、３齢、４齢、５齢及び５Ｒ（繁殖する５齢））にあるアブラムシの割合を示す。Ｎ＝５６〜５９匹のアブラムシ／群。
【図２５】ナイシンで処理したときに昆虫生存率の用量依存的低下があったことを示すグラフである。１齢及び２齢ＬＳＲ−１  Ａ．ピスム（Ａ．ｐｉｓｕｍ）アブラムシを葉への注入及び経植物による送達を用いて水（対照）又は１．６又は７ｍｇ／ｍｌナイシンで処理し、時間の経過に伴う生存をモニタした。括弧内の数字は、アブラムシの数／群を示す。統計的有意差は、ログ・ランク（マンテル・コックス）検定によって決定した。
【図２６】ナイシンで処理すると、内部共生体ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）が減少したことを示すグラフである。１齢及び２齢ＬＳＲ−１  Ａ．ピスム（Ａ．ｐｉｓｕｍ）アブラムシを葉への注入及び経植物による送達を用いて水（対照）又は１．６ｍｇ／ｍｌナイシンで処理し、処理後８日で選択のアブラムシからＤＮＡを抽出し、それをｑＰＣＲに使用してブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）コピー数を決定した。各処理についてのブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）／アブラムシ比の平均値±ＳＥＭを示す。各実験群の上にある囲み枠内の数字は、その群の中央値を示す。各データ点が単一のアブラムシを表す。
【図２７】レブリン酸で処理すると、アブラムシの発育遅延が引き起こされたことを示すグラフのパネルである。１齢及び２齢ｅＮＡＳＣＯ  Ａ．ピスム（Ａ．ｐｉｓｕｍ）アブラムシを葉への注入及び経植物による送達を用いて水（対照）又は０．０３若しくは０．３％レブリン酸で処理し、時間の経過に伴う発育を測定した。指示される時点において各ライフステージ（１齢、２齢、３齢、４齢及び５齢）にあるアブラムシの割合を示す。Ｎ＝５７〜５９匹のアブラムシ／群。
【図２８】レブリン酸で処理したときに昆虫生存率の低下があったことを示すグラフである。１齢及び２齢ｅＮＡＳＣＯ  Ａ．ピスム（Ａ．ｐｉｓｕｍ）アブラムシを葉への注入及び経植物による送達を用いて水（対照）又は０．０３若しくは０．３％レブリン酸で処理し、時間の経過に伴う生存をモニタした。Ｎ＝５７〜５９匹のアブラムシ／群。統計的有意差は、ログ・ランク（マンテル・コックス）検定によって決定した；＊＊、ｐ＜０．０１。
【図２９】レブリン酸で処理すると、内部共生体ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）が減少したことを示すグラフのパネルである。１齢及び２齢ｅＮＡＳＣＯ  Ａ．ピスム（Ａ．ｐｉｓｕｍ）アブラムシを葉への注入及び経植物による送達を用いて水（対照）又は０．０３若しくは０．３％レブリン酸で処理し、処理後７及び１１日で選択のアブラムシからＤＮＡを抽出し、それをｑＰＣＲに使用してブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅａｒ）コピー数を決定した。各処理についてのブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）／アブラムシ比の平均値±ＳＥＭを示す。統計的有意差は、一元配置ＡＮＯＶＡ及びダネットの多重比較検定によって決定した；＊、ｐ＜０．０５。各データ点が単一のアブラムシを表す。
【図３０Ａ】ゴシポール処理によってアブラムシの発育遅延が引き起こされたことを実証するグラフを示す。１齢及び２齢Ａ．ピスム（Ａ．ｐｉｓｕｍ）アブラムシを必須アミノ酸不含の人工食（ＡＤのみ）及び種々の濃度のゴシポール（０．０５％、０．２５％及び０．５％）を含有する必須アミノ酸不含の人工食で経植物送達によって処理した。実験全体を通じて発育段階をモニタした。図３０Ａは、処理群毎の各発育段階（１齢、２齢、３齢、４齢、５齢又は繁殖する５齢を表す５Ｒ）にあるアブラムシの数の平均値を示す一連のグラフである。指示される時点でＩｍａｇｅ  Ｊを使用してアブラムシをイメージングし、そのサイズを決定した。
【図３０Ｂ】ゴシポール処理によってアブラムシの発育遅延が引き起こされたことを実証するグラフを示す。１齢及び２齢Ａ．ピスム（Ａ．ｐｉｓｕｍ）アブラムシを必須アミノ酸不含の人工食（ＡＤのみ）及び種々の濃度のゴシポール（０．０５％、０．２５％及び０．５％）を含有する必須アミノ酸不含の人工食で経植物送達によって処理した。実験全体を通じて発育段階をモニタした。図３０Ｂは、人工食処理（対照）又はゴシポール処理したアブラムシのアブラムシ面積平均値±ＳＤを示すグラフである。統計的有意性は、一元配置ＡＮＯＶＡ、続くチューキーの事後検定を用いて決定した。＊、ｐ＜０．０５。＊＊、ｐ＜０．０１。
【図３１】アレロケミカルゴシポールで処理したときのアブラムシの生存の用量依存的低下を示すグラフである。１齢及び２齢Ａ．ピスム（Ａ．ｐｉｓｕｍ）アブラムシを必須アミノ酸不含の人工食（ＥＡＡ不含ＡＤ）、０．５％ゴシポール酢酸を含有する必須アミノ酸不含の人工食（０．５％ゴシポール）、０．２５％ゴシポール酢酸を含有する必須アミノ酸不含の人工食（０．２５％ゴシポール）並びに必須アミノ酸不含の人工食及び０．０５％ゴシポール酢酸（０．０５％ゴシポール）で経植物送達によって処理し、実験の経過にわたって生存を毎日モニタした。括弧内の数字は、必須アミノ酸、各群のアブラムシの数を表す。統計的有意差は、ログ・ランク検定によって決定したものであり、ＥＡＡ不含ＡＤと０．５％ゴシポールと有意に異なる、ｐ＝０．０００２。
【図３２Ａ−３２Ｂ】０．２５％ゴシポールで処理すると、繁殖力の低下が引き起こされたことを示す２つのグラフである。１齢及び２齢Ａ．ピスム（Ａ．ｐｉｓｕｍ）アブラムシを必須アミノ酸不含の人工食（ＥＡＡ不含ＡＤ５−２）又は０．２５％ゴシポール酢酸を含有する必須アミノ酸不含の人工食（ＥＡＡ不含ＡＤ５−２＋０．２５％ゴシポール）で経植物送達によって処理し、実験の時間経過全体にわたって繁殖力を決定した。図３２Ａは、アブラムシが子孫を産生し始めた平均日数±ＳＤを測定し、ゴシポール処理によって子孫の産生遅延が引き起こされることを示す。図３２Ｂは、アブラムシが繁殖成虫になり始めた後に産生される子孫の数の平均値±ＳＤを示し且つそれを測定したものであり、ゴシポール処理によって産生される子孫の数の低下が引き起こされる。各データ点が１匹のアブラムシを表す。
【図３３】種々の濃度のゴシポールで処理すると、内部共生体ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）が減少したことを示すグラフである。１齢及び２齢Ａ．ピスム（Ａ．ｐｉｓｕｍ）アブラムシを必須アミノ酸不含の人工食（対照））又は０．５％、０．２５％若しくは０．０５％ゴシポールを含有する必須アミノ酸不含の人工食で経植物送達によって処理した。処理後５又は１３日でアブラムシからＤＮＡを抽出し、ｑＰＣＲを実施して、アブラムシＤＮＡに対するブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）ＤＮＡの比を決定した。２〜６匹のアブラムシ／群のアブラムシＤＮＡに対するブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）ＤＮＡの比の平均値±ＳＤを示す。統計的有意差は、対応のないｔ検定によって決定した；＊、ｐ＜０．０５。
【図３４】ゴシポールのマイクロインジェクションによってアブラムシ内のブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）レベルが低下したことを示すグラフである。Ａ．ピスム（Ａ．ｐｉｓｕｍ）ＬＳＲ−１アブラムシ＜３齢期（若虫）に２０ｎｌの必須アミノ酸不含の人工食（ＡＤ）又は０．０５％ゴシポールを含有する必須アミノ酸不含の人工食（ゴシポール（０．０５％））を注入した。注入から３日後、アブラムシからＤＮＡを抽出し、ｑＰＣＲによってブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）レベルを評価した。ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）／アブラムシＤＮＡ比の平均値±ＳＤを示す。各データ点が１匹のアブラムシを表す。
【図３５】ｔｒａｎｓ−シンナムアルデヒド処理によってアブラムシの発育遅延が引き起こされたことを示すグラフのパネルである。１齢及び２齢Ａ．ピスム（Ａ．ｐｉｓｕｍ）アブラムシを水及び種々の濃度のｔｒａｎｓ−シンナムアルデヒドを含有する水（ＴＣ、０．０５％、０．５％及び５％）で経植物送達によって処理した。実験全体を通じて発育段階をモニタした。処理群毎の各発育段階（１齢、２齢、３齢、４齢、５齢又は繁殖する５齢を表す５Ｒ）にあるアブラムシの数の平均値を示す。Ｎ＝４０〜４９匹のアブラムシ／実験群。
【図３６】天然抗微生物性ｔｒａｎｓ−シンナムアルデヒドで処理したときに生存の用量依存的低下があったことを示すグラフである。１齢及び２齢Ａ．ピスム（Ａ．ｐｉｓｕｍ）アブラムシを水及び種々の濃度のｔｒａｎｓ−シンナムアルデヒドを含有する水（ＴＣ、０．０５％、０．５％及び５％）で経植物送達によって処理した。処理の経過全体を通じて生存をモニタした。統計的有意差は、ログ・ランク検定によって決定した。Ｎ＝４０〜４９匹のアブラムシ／群。
【図３７】種々の濃度のｔｒａｎｓ−シンナムアルデヒドで処理すると、内部共生体ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）が減少したことを示すグラフである。１齢及び２齢Ａ．ピスム（Ａ．ｐｉｓｕｍ）アブラムシを水及び種々の濃度のｔｒａｎｓ−シンナムアルデヒドを含有する水（０．０５％、０．５％及び５％）で経植物送達によって処理した。処理後３日でアブラムシからＤＮＡを抽出し、ｑＰＣＲを実施して、アブラムシＤＮＡに対するブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）ＤＮＡの比を決定した。２〜１１匹のアブラムシ／群のアブラムシＤＮＡに対するブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）ＤＮＡの比の平均値±ＳＤを示す。各処理群の中央値をデータ点の上の囲み枠内に示す。統計的有意差は、対応のないｔ検定によって決定した；＊、ｐ＜０．０５。水対照と０．５％ｔｒａｎｓ−シンナムアルデヒド群との間に統計的有意差があった。
【図３８】サソリペプチドＵｙ１９２で処理すると、アブラムシの発育遅延が引き起こされたことを示すグラフのパネルである。１齢及び２齢Ａ．ピスム（Ａ．ｐｉｓｕｍ）アブラムシを対照溶液（水）及び水中１００ｕｇ／ｍｌ  Ｕｙ１９２による経植物送達及び葉の灌流によって処理した。ａ）実験全体を通じて発育段階をモニタした。処理群毎の各発育段階（１齢、２齢、３齢、４齢、５齢又は繁殖する５齢を表す５Ｒ）にあるアブラムシの割合を示す。
【図３９】サソリＡＭＰ  Ｕｙ１９２で処理したときに昆虫生存率の低下があったことを示すグラフである。１齢及び２齢Ａ．ピスム（Ａ．ｐｉｓｕｍ）アブラムシを水のみ又はＵｙ１９２溶液で経植物送達及び葉の灌流によって処理し、実験の経過にわたって生存を毎日モニタした。括弧内の数字は、処理群中のアブラムシの総数を表す。
【図４０】Ｕｙ１９２で処理すると、内部共生体ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）が減少したことを示すグラフである。１齢及び２齢Ａ．ピスム（Ａ．ｐｉｓｕｍ）アブラムシを水又は水中１００ｕｇ／ｍｌ  Ｕｙ１９２で経植物送達及び葉の灌流によって処理し、処理後８日でアブラムシからＤＮＡを抽出し、ｑＰＣＲを実施して、アブラムシＤＮＡに対するブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）ＤＮＡの比を決定した。２〜６匹のアブラムシ／群のアブラムシＤＮＡに対するブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）ＤＮＡの比の平均値±ＳＤを示す。各群の中央値を囲み枠内に示す。
【図４１】サソリペプチドＤ１０及びＤ３をマイクロインジェクションしたアブラムシの生存の低下を示すグラフである。ＬＳＲ−１  Ａ．ピスム（Ａ．ｐｉｓｕｍ）アブラムシに水（対照）又は１００ｎｇのサソリペプチドＤ３若しくはＤ１０のいずれかをマイクロインジェクションした。注入後、アブラムシをソラマメの葉に放し、実験の経過全体を通じて生存をモニタした。括弧内の数字は、各実験処理群のアブラムシの数を示す。
【図４２】サソリペプチドＤ３及びＤ１０を注入したときの内部共生体力価の低下を示すグラフである。ＬＳＲ−１  Ａ．ピスム（Ａ．ｐｉｓｕｍ）アブラムシに水（対照）又は１００ｎｇのサソリペプチドＤ３若しくはＤ１０のいずれかをマイクロインジェクションした。注入後、アブラムシをソラマメの葉に放し、処理後５日で残りの生存アブラムシからＤＮＡを抽出し、ｑＰＣＲを実施してブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）／アブラムシＤＮＡ比を決定した。各処理群の平均値±ＳＤを示す。Ｎ＝２〜９匹のアブラムシ／群。各処理群の上にある囲み枠内の数字は、データセットの中央値を表す。
【図４３】サソリＡＭＰのカクテルで処理したときの昆虫生存率の低下を示すグラフである。１齢及び２齢ｅＮＡＳＣＯアブラムシをサソリペプチドのカクテル（各４０μｇ／ｍｌのＵｙ１７、Ｄ３、ＵｙＣｔ３及びＤ１０）で葉の灌流及び経植物による送達によって処理し、実験の経過にわたって生存をモニタした。括弧内の数字は、各処理群のアブラムシの数を表す。
【図４４】細胞透過性ペプチドに融合したサソリペプチドで処理すると、アブラムシの発育遅延が引き起こされたことを示すグラフのパネルである。初齢ＬＳＲ−２  Ａ．ピスム（Ａ．ｐｉｓｕｍ）アブラムシを水（対照）又は１００μｇ／ｍｌ  Ｕｙ１９２＋ＣＰＰ＋ＦＡＭで葉への注入及び経植物による送達を用いて処理し、時間の経過に伴う発育を測定した。指示される時点において各ライフステージ（１齢、２齢、３齢、４齢、５齢及び５Ｒ（繁殖する５齢））にあるアブラムシの割合を示す。Ｎ＝９０匹のアブラムシ／群。
【図４５】細胞透過性ペプチドに融合したサソリペプチドでアブラムシを処理すると、死亡率が増加したことを示すグラフである。初齢ＬＳＲ−１  Ａ．ピスム（Ａ．ｐｉｓｕｍ）アブラムシを葉への注入及び経植物によって送達した水又は水中１００μｇ／ｍｌ  ＵＹ１９２＋ＣＰＰ＋ＦＡＭ（ペプチド）で処理した。時間の経過に伴う生存をモニタした。括弧内の数字は、アブラムシの数／群を示す。統計的有意差は、ログ・ランク（マンテル・コックス）検定によって決定したものであり、２つの実験群間に有意差がある（ｐ＝０．００３６）。
【図４６】Ｕｙ１９２＋ＣＰＰ＋ＦＡＭで処理すると、内部共生体ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）が減少したことを示すグラフである。初齢ＬＳＲ−１  Ａ．ピスム（Ａ．ｐｉｓｕｍ）アブラムシを葉への注入及び経植物によって送達した水又は水中１００μｇ／ｍｌ  Ｕｙ１９２＋ＣＰＰ＋ＦＡＭ（ペプチド）で処理した。処理後５日で選択のアブラムシからＤＮＡを抽出し、それをｑＰＣＲに使用してブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）コピー数を決定した。各処理についてのブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）／アブラムシ比の平均値±ＳＥＭを示す。各実験群の上にある囲み枠内の数字は、その群の中央値を示す。各データ点が単一のアブラムシを表す。統計的有意差は、スチューデントｔ検定によって決定した；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１。
【図４７】Ｕｙ１９２＋ＣＰＰ＋ＦＡＭがバクテリオサイト膜を透過したことを示す画像のパネルである。アブラムシからバクテリオサイトを解離し、２５０ｕｇ／ｍｌのＵｙ１９２＋ＣＰＰ＋ＦＡＭペプチドと共に３０分間インキュベートした。洗浄及びイメージングすると、バクテリオサイト内部に多量のＵｙ１９２＋ＣＰＰ＋ＦＡＭを見ることができる。
【図４８Ａ−４８Ｂ】パントテノール処理によってアブラムシの発育が遅延したことを示すグラフのパネルである。初齢及び第２のｅＮＡＳＣＯアブラムシを３つの異なる条件：必須アミノ酸不含の人工食（ＥＡＡ不含ＡＤ）、１０ｕＭパントテノールを含有する必須アミノ酸不含の人工食（１０ｕＭパントテノール）及び１００ｕＭパントテノールを含有する必須アミノ酸不含の人工食（１００ｕＭパントテノール）、１００ｕＭパントテノールを含有する必須アミノ酸不含の人工食並びに１０ｕＭパントテノールを含有する必須アミノ酸不含の人工食で経植物送達によって処理した。図４８Ａは、各条件について時間の経過に伴いモニタした発育段階を示す。図４８Ｂは、アブラムシの相対体表面積測定値を示し、パントテノール処理の劇的効果が示される。
【図４９】パントテノールで処理すると、アブラムシ死亡率が増加したことを示すグラフである。必須アミノ酸不含の人工食又は１０若しくは１００ｕＭパントテノールを含有する必須アミノ酸不含の人工食で経植物送達によって処理したｅＮＡＳＣＯアブラムシについて生存を毎日モニタした。括弧内の数字は、各群のアブラムシの数を表す。
【図５０Ａ−５０Ｃ】パントテノール処理によって繁殖の消失が引き起こされたことを示すグラフのパネルである。１齢及び２齢ｅＮＡＳＣＯアブラムシを必須アミノ酸不含の人工食又は１０若しくは１００ｕＭパントテノールを含有する必須アミノ酸不含の人工食で経植物送達によって処理した。図５０Ａは、成虫まで生き延びて繁殖するアブラムシの比率を示す。図５０Ｂは、各群のアブラムシが繁殖し始めた平均日数を示す。アブラムシが繁殖し始めた平均日数±ＳＤを示す。図５０Ｃは、アブラムシが繁殖し始めた後に１日当たりに産生される子孫の数の平均値を示す。子孫の数の平均値／日±ＳＤを示す。
【図５１】パントテノール処理が内部共生体ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）に影響を与えなかったことを示すグラフである。処理後８日で種々の条件について共生体力価を決定した。アブラムシからＤＮＡを抽出し、ｑＰＣＲを実施して、アブラムシＤＮＡに対するブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）ＤＮＡの比を決定した。各群６匹のアブラムシのアブラムシＤＮＡに対するブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）ＤＮＡの比の平均値±ＳＤを示す。
【図５２】経植物送達したパントテノール処理がアブラムシの発育に影響を与えなかったことを示すグラフのパネルである。１００μｌの２つの異なる溶液：溶媒対照（０．０２５％Ｓｉｌｗｅｔ  Ｌ−７７）及び１０ｕＭパントテノールを葉に塗布することにより初齢ｅＮＡＳＣＯアブラムシを処理し、各条件について時間の経過に伴う発育段階を測定した。各発育段階における生存アブラムシの割合を示す（標本サイズ＝２０匹のアブラムシ／群）。
【図５３】パントテノール処理を葉面塗布によって送達すると、アブラムシの死亡が引き起こされたことを示すグラフである。１００μｌの２つの異なる溶液：溶媒対照（Ｓｉｌｗｅｔ  Ｌ−７７）及び１０ｕＭパントテノールを葉に塗布することにより処理したｅＮＡＳＣＯアブラムシについて、生存を毎日モニタした。処理は、アブラムシの生存率に影響を与える。標本サイズ＝２０匹のアブラムシ／群。ログ・ランク・マンテル・コックス検定を用いて群間に統計的有意差があるかどうかを決定し、これらの２群が有意に異なることを同定した（ｐ＝０．００１９）。
【図５４Ａ−５４Ｂ】アミノ酸類似体のカクテルで処理すると、アブラムシの発育が遅延したことを示すグラフのパネルである。初齢ＬＳＲ−１アブラムシを水又は水中のアミノ酸類似体のカクテル（ＡＡカクテル）で葉の灌流及び経植物による送達によって処理した。図５４Ａは、各条件について時間の経過に伴い測定した発育段階を示す。各発育段階における生存アブラムシの割合を示す。図５４Ｂは、アブラムシの体表面積測定値を示し、アミノ酸類似体カクテル（ＡＡカクテル）による処理の劇的効果が示される。統計的有意差は、スチューデントｔ検定を用いて決定した；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１。
【図５５】アミノ酸類似体のカクテルで処理すると、内部共生体ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）が除去されたことを示すグラフである。処理後６日で種々の条件について共生体力価を決定した。アブラムシからＤＮＡを抽出し、ｑＰＣＲを実施して、アブラムシＤＮＡに対するブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）ＤＮＡの比を決定した。各群１９〜２０匹のアブラムシのアブラムシＤＮＡに対するブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）ＤＮＡの比の平均値±ＳＤを示す。各データ点が個々のアブラムシを表す。統計的有意差は、スチューデントｔ検定を用いて決定した；＊、ｐ＜０．０５。
【図５６Ａ−５６Ｂ】３つの薬剤の併用で処理すると、アブラムシの発育が遅延したことを示すグラフのパネルである。初齢ＬＳＲ−１アブラムシを水又は水中３つの薬剤の併用（Ｐｅｐ−Ｒｉｆ−キトサン）で葉の灌流及び経植物による送達によって処理した。図５６Ａは、各条件について時間の経過に伴い測定した発育段階を示す。各発育段階における生存アブラムシの割合を示す。図５６Ｂは、アブラムシの体表面積測定値を示し、３つの治療の併用（Ｐｅｐ−Ｒｉｆ−キトサン）による処理の劇的効果が示される。統計的有意差は、スチューデントｔ検定を用いて決定した；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１。
【図５７】ペプチド、抗生物質及び天然抗微生物剤の併用で処理すると、アブラムシ死亡率が増加したことを示すグラフである。ＬＳＲ−１アブラムシを水又は３つの処理の併用（Ｐｅｐ−Ｒｉｆ−キトサン）で処理し、処理後の生存を毎日モニタした。
【図５８】ペプチド、抗生物質及び天然抗微生物剤の併用で処理すると、内部共生体ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）が除去されたことを示すグラフである。処理後６日で種々の条件の共生体力価を決定した。アブラムシからＤＮＡを抽出し、ｑＰＣＲを実施して、アブラムシＤＮＡに対するブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）ＤＮＡの比を決定した。各群２０〜２１匹のアブラムシのアブラムシＤＮＡに対するブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）ＤＮＡの比の平均値±ＳＤを示す。各データ点が個々のアブラムシを表す。
【図５９Ａ−５９Ｂ】シプロフロキサシンを塗布して浸透させたトウモロコシカーネルを示す画像のパネルである。トウモロコシカーネルを水（抗生物質なし）又は水中の指示濃度のシプロフロキサシンに浸漬し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５αの成長を阻害することができるかどうかを見るためにホールカーネル又はカーネルを試験した。図５９Ａは、抗生物質を含まない水に浸漬したトウモロコシカーネルの存在下での細菌の成長を示し、図５９Ｂは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を広げたプレートに、抗生物質に浸漬したホール又はハーフトウモロコシカーネルを置いたときの細菌成長の阻害を示す。
【図６０】成虫Ｓ．ゼアマイス（Ｓ．ｚｅａｍａｉｓ）ゾウムシをシプロフロキサシン（２５０ｕｇ／ｍｌ又は２．５ｍｇ／ｍｌ）で処理するか、又は水でモック処理したことを示すグラフである。１８日間の処理後、ゾウムシからゲノムＤＮＡを単離し、ｑＰＣＲによってコクゾウムシ属（Ｓｉｔｏｐｈｉｌｕｓ）一次内部共生体の量を決定した。各群の平均値±ＳＥＭを示す。各データ点が１匹のゾウムシを表す。各群の中央値をデータセットの上に掲載する。
【図６１Ａ−６１Ｂ】シプロフロキサシンで処理した後のゾウムシの発育を示すグラフである。図６１Ａは、水（対照）又はシプロフロキサシン（２５０ｕｇ／ｍｌ又は２．５ｍｇ／ｍｌ）に浸漬した／それを塗布した当初のトウモロコシカーネルの各１つのレプリケートから成虫を取り除いた２５日後に個々のトウモロコシカーネルを切り開き、幼虫、蛹又はほぼ完全に発育した（成虫）ゾウムシの存在に関して調べたことを示す。各処理群のカーネルに見られた各ライフステージの割合を示す。各処理群のカーネルに見られた子孫の総数を各データセットの上に表示する。図６１Ｂは、対照（水）及び２．５ｍｇ／ｍｌシプロフロキサシン処理群のトウモロコシカーネルから解離された子孫から単離されたゲノムＤＮＡを示し、ｑＰＣＲを行ってコクゾウムシ属（Ｓｉｔｏｐｈｉｌｕｓ）一次内部共生体の存在量を測定した。各群の平均値±ＳＤを示す。統計的有意差は、対応のないｔ検定によって決定した；＊＊＊、ｐ≦０．００１。
【図６２Ａ−６２Ｂ】交配対を取り除いた後（処理の７日後）に子孫の羽化に関してモニタした、モック処理（水）するか、又は２５０ｕｇ／ｍｌ若しくは２．５ｍｇ／ｍｌシプロフロキサシンで処理したトウモロコシカーネルの２つの残りのレプリケートを示すグラフである。図６２Ａは、各処理群についての時間の経過に伴うゾウムシの新規羽化数の平均値±ＳＤを示す。図６２Ｂは、交配対を取り除いた後４３日の時点における各処理群についてのゾウムシの羽化数の平均値±ＳＥＭを示す。
【図６３】リファンピシン及びドキシサイクリン処理によってダニの死亡が引き起こされたことを示すグラフのパネルである。未処理のナミハダニ並びに０．０２５％Ｓｉｌｗｅｔ  Ｌ−７７中２５０μｇ／ｍｌリファンピシン及び５００μｇ／ｍｌドキシサイクリンで処理したダニについて、生存を毎日モニタした。
【図６４】細菌の呼吸に関するＳｅａｈｏｒｓｅフラックスアッセイの結果を示すグラフのパネルである。方法に記載されるとおり、細菌を対数期まで成長させ、Ｓｅａｈｏｒｓｅ  ＸＦｅ９６プレートにロードして酸素消費速度（ＯＣＲ）及び細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）を経時的に測定した。約２０分後にウェルに処理剤を注入し、細菌をモニタして成長の変化を検出した。リファンピシン＝１００μｇ／ｍＬ；クロラムフェニコール＝２５μｇ／ｍＬ；ファージ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）についてＴ７及びＳ．マルセセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）についてΦＳｍＶＬ−Ｃ１）は、ＳＭ緩衝液中１：２希釈又は１：１００希釈のいずれかのライセートであった。各線上のマーカーは、単に各線の対応する条件を表示するものとして提供され、データ点を表しているわけではない。
【図６５】Ｓ．マルセセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）に対するファージがハエの死亡率を低下させたことを示すグラフである。Ｓ．マルセセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）を穿刺したハエは、全て１日以内に死亡した一方、Ｓ．マルセセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）及びファージの両方を穿刺したハエは、かなりの割合が処置後５日間生存した。いかなる処置も行わなかった対照ハエのほぼ全てが実験終了まで生存した。統計的有意性について、ログ・ランク検定を用いて曲線を比較した。アスタリスクは、ｐ＜０．０００１を表す。
【発明を実施するための形態】
【００６５】
本明細書では、動物の健康に有用である、例えば宿主昆虫（例えば、節足動物、例えば昆虫、例えば動物病原体ベクター、例えばカ、コダニ、シラミ又はマダニ）に常在する１つ以上の微生物のレベル、活動又は代謝を変化させるための方法及び組成物であって、この変化は、宿主の適応度の低下をもたらす、方法及び組成物が提供される。本発明は、宿主にとって有害な方法で宿主の微生物叢を変化させることができる調節薬剤（例えば、ファージ、ペプチド、小分子、抗生物質又はこれらの組み合わせ）を含む組成物を特徴とする。微生物レベル、微生物活動、微生物代謝又は微生物多様性を破綻させることにより、本明細書に記載される調節薬剤は、動物において疾患を引き起こすベクター媒介性病原体を保有する種々の昆虫の適応度を低下させるために使用され得る。
【００６６】
本明細書に記載される方法及び組成物は、一部には、どのように調節薬剤、例えば抗生物質（例えば、オキシテトラサイクリン、ドキシサイクリン又はこれらの組み合わせ）を使用すれば、宿主の共生微生物（例えば、動物病原体のベクター昆虫における内部共生体、例えばカにおける内部共生体ボルバキア属（Ｗｏｌｂａｃｈｉａ）又はマダニにおけるリケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ））を標的にして、宿主体内での微生物のレベル、活動又は代謝を変化させることにより宿主の適応度を低下させることができるかを例示する、本明細書に提供される例に基づく。オキシテトラサイクリン及びドキシサイクリンは、本目的上有用な抗生物質の代表例である。これを踏まえ、本開示は、宿主（例えば、動物病原体のベクター、例えばカ、コダニ、シラミ又はマダニ）に常在する１つ以上の微生物のレベル、活動又は代謝を変化させる薬剤の使用に関する種々の異なる手法を記載し、この変化は、宿主の適応度の低下をもたらす。
【００６７】
Ｉ．宿主
ｉ．宿主
本明細書に提供される方法及び組成物は、動物に疾患を引き起こす能力を有する病原体のベクターと考えられる任意の昆虫宿主で用いられ得る。
【００６８】
例えば、昆虫宿主には、限定はされないが、半翅目（Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ）、及び一部の膜翅目（Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ）、及び双翅目（Ｄｉｐｔｅｒａ）に見られるとおりの刺し−吸い型口器を備えるもの、例えばカ、ミツバチ、スズメバチ、小昆虫類、シラミ、ツェツェバエ、ノミ及びアリ並びにマダニ及びコダニなどの蛛形綱（Ａｒａｃｈｎｉｄａ）のメンバー；ダニ目（Ａｃａｒｉｎａ）の目、綱又は科（マダニ及びコダニ）、例えばヒメダニ科（Ａｒｇａｓｉｄａｅ）、ワクモ科（Ｄｅｒｍａｎｙｓｓｉｄａｅ）、マダニ科（Ｉｘｏｄｉｄａｅ）、キュウセンダニ科（Ｐｓｏｒｏｐｔｉｄａｅ）又はヒゼンダニ科（Ｓａｒｃｏｐｔｉｄａｅ）を代表するもの、及びキララマダニ属種（Ａｍｂｌｙｏｍｍａ  ｓｐｐ．）、アノセントン属種（Ａｎｏｃｅｎｔｏｎ  ｓｐｐ．）、ナガヒメダニ属種（Ａｒｇａｓ  ｓｐｐ．）、ウシマダニ属種（Ｂｏｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｐｐ．）、ツメダニ属種（Ｃｈｅｙｌｅｔｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、ショクヒヒゼンダニ属種（Ｃｈｏｒｉｏｐｔｅｓ  ｓｐｐ．）、ニキビダニ属種（Ｄｅｍｏｄｅｘ  ｓｐｐ．）、カクマダニ属種（Ｄｅｒｍａｃｅｎｔｏｒ  ｓｐｐ．）、ワクモ属種（Ｄｅｎｍａｎｙｓｓｕｓ  ｓｐｐ．）、チマダニ属種（Ｈａｅｍｏｐｈｙｓａｌｉｓ  ｓｐｐ．）、イボマダニ属種（Ｈｙａｌｏｍｍａ  ｓｐｐ．）、マダニ属種（Ｉｘｏｄｅｓ  ｓｐｐ．）、リンクサカルス属種（Ｌｙｎｘａｃａｒｕｓ  ｓｐｐ．）、トゲダニ亜目種（Ｍｅｓｏｓｔｉｇｍａｔａ  ｓｐｐ．）、ショウセンコウヒゼンダニ属（Ｎｏｔｏｅｄｎｅｓ  ｓｐｐ．）、カズキダニ属種（Ｏｒｎｉｔｈｏｄｏｒｏｓ  ｓｐｐ．）、イエダニ属種（Ｏｒｎｉｔｈｏｎｙｓｓｕｓ  ｓｐｐ．）、オトビウス属種（Ｏｔｏｂｉｕｓ  ｓｐｐ．）、ミミヒゼンダニ属種（ｏｔｏｄｅｃｔｅｓ  ｓｐｐ．）、ニューモニサス属種（Ｐｎｅｕｍｏｎｙｓｓｕｓ  ｓｐｐ．）、キュウセンヒゼンダニ属種（Ｐｓｏｒｏｐｔｅｓ  ｓｐｐ．）、コイタマダニ属種（Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ  ｓｐｐ．）、ヒゼンダニ属種（Ｓａｎｃｏｐｔｅｓ  ｓｐｐ．）又はツツガムシ属種（Ｔｒｏｍｂｉｃｕｌａ  ｓｐｐ．）を代表するもの；シラミ目（Ａｎｏｐｌｕｒａ）（吸血・刺咬性シラミ）、例えばボビコーラ属種（Ｂｏｖｉｃｏｌａ  ｓｐｐ．）、ケモノジラミ属種（Ｈａｅｍａｔｏｐｉｎｕｓ  ｓｐｐ．）、ケモノホソジラミ属種（Ｌｉｎｏｇｎａｔｈｕｓ  ｓｐｐ．）、タンカクハジラミ属種（Ｍｅｎｏｐｏｎ  ｓｐｐ．）、ヒトジラミ属種（Ｐｅｄｉｃｕｌｕｓ  ｓｐｐ．）、タマワタムシ属種（Ｐｅｍｐｈｉｇｕｓ  ｓｐｐ．）、ネアブラムシ属種（Ｐｈｙｌｌｏｘｅｒａ  ｓｐｐ．）又はソレノポテス属種（Ｓｏｌｅｎｏｐｏｔｅｓ  ｓｐｐ．）を代表するもの；双翅目（Ｄｉｐｔｅｒａ）（ハエ）、例えばヤブカ属種（Ａｅｄｅｓ  ｓｐｐ．）、ハマダラカ属種（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｓｐｐ．）、オオクロバエ属種（Ｃａｌｌｉｐｈｏｒａ  ｓｐｐ．）、オビキンバエ属種（Ｃｈｒｙｓｏｍｙｉａ  ｓｐｐ．）、メクラアブ属種（Ｃｈｒｙｓｏｐｓ  ｓｐｐ．）、コクリオミイア属種（Ｃｏｃｈｌｉｏｍｙｉａ  ｓｐｐ．）、イエカ属種（Ｃｗ／ｅｘ  ｓｐｐ．）、サシバエ属種（Ｃｕｌｉｃｏｉｄｅｓ  ｓｐｐ．）、ウサ���ヒフバエ属種（Ｃｕｔｅｒｅｂｒａ  ｓｐｐ．）、ヒフバエ属種（Ｄｅｒｍａｔｏｂｉａ  ｓｐｐ．）、ウマバエ属種（Ｇａｓｔｒｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｐｐ．）、ツェツェバエ属種（Ｇｌｏｓｓｉｎａ  ｓｐｐ．）、ノサシバエ属種（Ｈａｅｍａｔｏｂｉａ  ｓｐｐ．）、ゴマフアブ属種（Ｈａｅｍａｔｏｐｏｔａ  ｓｐｐ．）、ウマシラミバエ属種（Ｈｉｐｐｏｂｏｓｃａ  ｓｐｐ．）、ウシバエ属種（Ｈｙｐｏｄｅｒｍａ  ｓｐｐ．）、キンバエ属種（Ｌｕｃｉｌｉａ  ｓｐｐ．）、リペロシア属種（Ｌｙｐｅｒｏｓｉａ  ｓｐｐ．）、ヒツジシラミバエ属種（Ｍｅｌｏｐｈａｇｕｓ  ｓｐｐ．）、ヒツジバエ属種（Ｏｅｓｔｒｕｓ  ｓｐｐ．）、フェニシア属種（Ｐｈａｅｎｉｃｉａ  ｓｐｐ．）、サシチョウバエ属種（Ｐｈｌｅｂｏｔｏｍｕｓ  ｓｐｐ．）、クロキンバエ属種（Ｐｈｏｒｍｉａ  ｓｐｐ．）を代表するもの、ダニ目（Ａｃａｒｉ）（疥癬）、例えばヒゼンダニ科種（Ｓａｒｃｏｐｔｉｄａｅ  ｓｐｐ．）、ニクバエ属種（Ｓａｒｃｏｐｈａｇａ  ｓｐｐ．）、ブユ属種（Ｓｉｍｕｌｉｕｍ  ｓｐｐ．）、サシバエ属種（Ｓｔｏｍｏｘｙｓ  ｓｐｐ．）、アブ属種（Ｔａｂａｎｕｓ  ｓｐｐ．）、タンニア属種（Ｔａｎｎｉａ  ｓｐｐ．）又はズズプラルファ属種（Ｚｚｐｕ／ａｌｐｈａ  ｓｐｐ．）；ハジラミ目（Ｍａｌｌｏｐｈａｇａ）（ハジラミ）、例えばダマリニア属種（Ｄａｍａｌｉｎａ  ｓｐｐ．）、フェリコラ属種（Ｆｅｌｉｃｏｌａ  ｓｐｐ．）、ヘテロドクサス属種（Ｈｅｔｅｒｏｄｏｘｕｓ  ｓｐｐ．）又はケモノハジラミ属種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｃｔｅｓ  ｓｐｐ．）を代表するもの；又はノミ目（Ｓｉｐｈｏｎａｐｔｅｒａ）（無翅昆虫）、例えばナガノミ属種（Ｃｅｒａｔｏｐｈｙｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）、ネズミノミ属種（Ｘｅｎｏｐｓｙｌｌａ  ｓｐｐ）を代表するもの；トコジラミ科（Ｃｉｍｉｃｉｄａｅ）（半翅類昆虫）、例えばトコジラミ属種（Ｃｉｍｅｘ  ｓｐｐ．）、オオサシガメ亜科種（Ｔｒｉｔｏｍｉｎａｅ  ｓｐｐ．）、ロドニウス属種（Ｒｈｏｄｉｎｉｕｓ  ｓｐｐ．）又はサシガメ属種（Ｔｒｉａｔｏｍａ  ｓｐｐ．）を代表するものが含まれ得る。
【００６９】
一部の例では、昆虫は、双翅目（Ｄｉｐｔｅｒａ）（例えば、カ亜目（Ｎｅｍａｔｏｃｅｒａ）、例えばカ科（Ｃｏｌｉｃｉｄａｅ））の吸血昆虫である。一部の例では、昆虫は、イエカ亜科（Ｃｕｌｉｃｉｎａｅ）、コレトリナエ（Ｃｏｒｅｔｈｒｉｎａｅ）、ヌカカ科（Ｃｅｒａｔｏｐｏｇｏｎｉｄａｅ）又はブユ科（Ｓｉｍｕｌｉｉｄａｅ）のものである。一部の例では、昆虫は、イエカ属種（Ｃｕｌｅｘ  ｓｐｐ．）、テオバルディア属種（Ｔｈｅｏｂａｌｄｉａ  ｓｐｐ．）、ヤブカ属種（Ａｅｄｅｓ  ｓｐｐ．）、ハマダラカ属種（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｓｐｐ．）、ヤブカ属種（Ａｅｄｅｓ  ｓｐｐ．）、ホルシポミア属種（Ｆｏｒｃｉｐｏｎｉｙｉａ  ｓｐｐ．）、サシバエ属種（Ｃｕｌｉｃｏｉｄｅｓ  ｓｐｐ．）又はヘレア属種（Ｈｅｌｅａ  ｓｐｐ．）のものである。
【００７０】
特定の例では、昆虫は、カである。特定の例では、昆虫は、マダニである。特定の例では、昆虫は、コダニである。特定の例では、昆虫は、ハジラミである。
【００７１】
ｉｉ．宿主適応度
本明細書に提供される方法及び組成物を使用して、本明細書に記載される任意の宿主の適応度を低下させることができる。適応度の低下は、宿主に常在する微生物の任意の変化によって生じ得、ここで、変化は、調節薬剤の投与がもたらす結果であり、宿主に有害な効果を有し得る。
【００７２】
一部の例では、宿主適応度の低下は、調節薬剤の投与がもたらす結果としての宿主の生理の増悪又は悪化（例えば、健康又は生存の低下）として現れ得る。一部の例では、生物の適応度は、限定はされないが、繁殖率、寿命、移動性、繁殖力、体重、代謝率又は活動又は生存を含めた１つ以上のパラメータにより、調節薬剤を投与されていない宿主生物との比較で測定され得る。例えば、本明細書に提供される方法又は組成物は、宿主の全般的な健康を低下させるか又は宿主の全生存を低下させるのに有効であり得る。一部の例では、宿主の生存の減少は、参照レベル（例えば、調節薬剤の投与を受けない宿主で見られるレベル）と比べて約２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超大きい。一部の例では、本方法及び組成物は、調節薬剤を投与されていない宿主生物と比較して宿主の繁殖（例えば、繁殖率）を減少させるのに有効である。一部の例では、本方法及び組成物は、移動性、体重、寿命、生殖能力又は代謝率などの他の生理学的パラメータを参照レベル（例えば、調節薬剤の投与を受けない宿主で見られるレベル）と比べて約２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超減少させるのに有効である。
【００７３】
一部の例では、宿主適応度の低下は、宿主における１つ以上の栄養素（例えば、ビタミン、炭水化物、アミノ酸又はポリペプチド）の生産の低下として現れ得る。一部の例では、本明細書に提供される方法又は組成物は、宿主における栄養素（例えば、ビタミン、炭水化物、アミノ酸又はポリペプチド）の生産量を参照レベル（例えば、調節薬剤の投与を受けない宿主で見られるレベル）と比べて約２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超低下させるのに有効であり得る。一部の例では、本明細書に提供される方法又は組成物は、調節薬剤を投与されていない宿主生物と比較して、宿主の１つ以上の微生物（例えば、内部共生体）による栄養素の生産を低下させることにより、宿主の栄養素を低下させることができる。
【００７４】
一部の例では、宿主適応度の減少は、調節薬剤を投与されていない宿主生物と比較した、農薬用薬剤（例えば、表１２に挙げられる農薬）に対する宿主の感度の上昇及び／又は農薬用薬剤（例えば、表１２に挙げられる農薬）に対する宿主の抵抗性の減少として現れ得る。一部の例では、本明細書に提供される方法又は組成物は、農薬用薬剤（例えば、表１２に挙げられる農薬）に対する宿主の感度を参照レベル（例えば、調節薬剤の投与を受けない宿主で見られるレベル）と比べて約２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超上昇させるのに有効であり得る。農薬用薬剤は、殺虫性薬剤を含めた、当該技術分野において公知の任意の農薬用薬剤であり得る。一部の例では、本明細書に提供される方法又は組成物は、調節薬剤を投与されていない宿主生物と比較して、農薬用薬剤を利用可能な基質に代謝又は分解する宿主の能力を低下させることにより、農薬用薬剤（例えば、表１２に挙げられる農薬）に対する宿主の感度を増加させることができる。
【００７５】
一部の例では、宿主適応度の低下は、調節薬剤を投与されていない宿主生物と比較した、アレロケミカル薬剤に対する宿主の感度の増加及び／又はアレロケミカル薬剤に対する宿主の抵抗性の低下として現れ得る。一部の例では、本明細書に提供される方法又は組成物は、アレロケミカル薬剤に対する宿主の抵抗性を参照レベル（例えば、調節薬剤の投与を受けない宿主で見られるレベル）と比べて約２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超低下させるのに有効であり得る。一部の例では、アレロケミカル薬剤は、カフェイン、大豆シスタチンＮ、モノテルペン類、ジテルペン酸又はフェノール化合物である。一部の例では、本明細書に提供される方法又は組成物は、調節薬剤を投与されていない宿主生物と比較して、宿主のアレロケミカル薬剤を利用可能な基質に代謝又は分解する能力を低下させることにより、アレロケミカル薬剤に対する宿主の感度を増加させることができる。
【００７６】
一部の例では、本明細書に提供される方法又は組成物は、調節薬剤を投与されていない宿主生物と比較して、寄生虫又は病原体（例えば、真菌性、細菌性又はウイルス性病原体又は寄生虫）に対する宿主の抵抗性を低下させるのに有効であり得る。一部の例では、本明細書に提供される方法又は組成物は、病原体又は寄生虫（例えば、真菌性、細菌性又はウイルス性病原体；又は寄生ダニ）に対する宿主の抵抗性を参照レベル（例えば、調節薬剤の投与を受けない宿主で見られるレベル）と比べて約２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超低下させるのに有効であり得る。
【００７７】
一部の例では、宿主適応度の減少は、調節薬剤を投与されていない宿主生物と比較した、ある種の環境因子に対する耐性（例えば、高温又は低温耐性）の低下、ある種の生息場所で生き延びる能力の低下又はある種の食餌を持続させる能力の低下など、他の適応上の不利点として現れ得る。一部の例では、本明細書に提供される方法又は組成物は、本明細書に記載される任意の複数の方法で宿主適応度を減少させるのに有効であり得る。更に、調節薬剤は、任意の数の宿主綱、目、科、属又は種（例えば、１つの宿主種、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２００、２５０、５００又はそれを超える宿主種）における宿主適応度を減少させることができる。一部の例では、調節薬剤は、単一の宿主綱、目、科、属又は種に作用する。
【００７８】
宿主適応度は、当該技術分野における任意の標準方法を用いて判定され得る。一部の例では、宿主適応度は、個々の宿主を評価することにより判定され得る。或いは、宿主適応度は、宿主個体群を評価することにより判定され得る。例えば、宿主適応度の減少は、他の昆虫との競合の成功の減少として現れ、それが宿主個体群サイズの減少につながり得る。
【００７９】
ｉｉｉ．疾患伝播における宿主昆虫
本明細書に提供される調節薬剤は、動物病原体を保有する宿主昆虫の適応度を低下させることにより、ベクター媒介性疾患の蔓延を低減するのに有効である。調節薬剤は、本明細書に記載される任意の製剤及び送達方法を用いて、疾患の伝播を低減する、例えばベクター間の垂直又は水平伝播を低減する及び／又は動物への伝播を低減するのに有効な量で且つ有効な持続期間にわたって昆虫に送達され得る。例えば、本明細書に記載される調節薬剤は、調節薬剤を投与されていない宿主生物と比較して、ベクター媒介性病原体の垂直又は水平伝播を約２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又はそれを超えて低減することができる。別の例として、本明細書に記載される調節薬剤は、調節薬剤を投与されていない宿主生物と比較して、ベクター昆虫の媒介能力を約２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又はそれを超えて低減することができる。
【００８０】
本明細書に提供される組成物及び方法によって防除し得る疾患の非限定的な例としては、トガウイルス科（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）ウイルスによって引き起こされる疾患（例えば、チクングニア熱、ロスリバー熱、マヤロ熱、オニョンニョン熱、シンドビス熱、東部ウマ脳脊髄炎、西部ウマ脳脊髄炎、ベネズエラウマ脳脊髄炎又はバーマ森林熱）；フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｄａｅ）ウイルスによって引き起こされる疾患（例えば、デング熱、黄熱、キャサヌール森林病、オムスク出血熱、日本脳炎、マレー渓谷脳炎、ロシオ脳炎、セントルイス脳炎、西ナイル脳炎又はダニ媒介脳炎）；ブニヤウイルス科（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ）ウイルスによって引き起こされる疾患（例えば、サシチョウバエ熱、リフトバレー熱、ラクロス脳炎、カリフォルニア脳炎、クリミア・コンゴ出血熱又はオロプーシェ熱）；ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）ウイルスによって引き起こされる疾患（例えば、水疱性口内炎）；オルビウイルス科（Ｏｒｂｉｖｉｒｉｄａｅ）によって引き起こされる疾患（例えば、ブルータング）；細菌によって引き起こされる疾患（例えば、ペスト、野兎病、Ｑ熱、ロッキー山紅斑熱、ネズミチフス、ボタン熱、クイーンズランドマダニチフス、シベリアマダニチフス、ツツガムシ病、回帰熱又はライム病）；又は原虫によって引き起こされる疾患（例えば、マラリア、アフリカトリパノソーマ症、ナガナ、シャーガス病、リーシュマニア症、ピロプラズマ症、バンクロフト糸状虫症又はブルギア糸状虫症）が挙げられる。
【００８１】
ＩＩ．標的微生物
本明細書に記載される調節薬剤の標的となる微生物には、限定はされないが、本明細書に記載される任意の細菌及び／又は真菌を含め、宿主内又は宿主上に常在する任意の微生物が含まれ得る。宿主に常在する微生物には、例えば、共生微生物（例えば、宿主に有益な栄養素又は酵素を提供する内部共生微生物）、片利共生微生物、病原性微生物又は寄生性微生物が含まれ得る。内部共生微生物は、一次内部共生体又は二次内部共生体であり得る。共生微生物（例えば、細菌又は真菌）は、宿主の偏性共生体又は宿主の通性共生体であり得る。宿主に常在する微生物は、垂直伝播、水平伝播又は複数の伝播起源を含め、任意の伝播様式によって獲得され得る。
【００８２】
ｉ．細菌
本明細書に提供される方法及び組成物において標的となり得る例示的細菌としては、限定はされないが、ゼノラブダス属種（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ  ｓｐｐ）、フォトラブダス属種（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ  ｓｐｐ）、カンディダトゥス属種（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  ｓｐｐ）、ブフネラ属種（Ｂｕｃｈｎｅｒａ  ｓｐｐ）、ブラッタバクテリウム属種（Ｂｌａｔｔａｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ）、バウマンニア属種（Ｂａｕｍａｎｉａ  ｓｐｐ）、ウィグルスウォーチア属種（Ｗｉｇｇｌｅｓｗｏｒｔｈｉａ  ｓｐｐ）、ボルバキア属種（Ｗｏｌｂａｃｈｉａ  ｓｐｐ）、リケッチア属種（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｓｐｐ）、オリエンティア属種（Ｏｒｉｅｎｔｉａ  ｓｐｐ）、ソーダリス属種（Ｓｏｄａｌｉｓ  ｓｐｐ）、バークホルデリア属種（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐｐ）、カプリアビダス属種（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｓｐｐ）、フランキア属種（Ｆｒａｎｋｉａ  ｓｐｐ）、シノリゾビウム属種（Ｓｎｉｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐｐ）、ストレプトコッカス属種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ）、ウォリネラ属種（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ  ｓｐｐ）、キシレラ属種（Ｘｙｌｅｌｌａ  ｓｐｐ）、エルウィニア属種（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｓｐｐ）、アグロバクテリウム属種（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ）、バチルス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ）、パエニバチルス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ）、ストレプトミセス属種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ）、ミクロコッカス属種（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ）、コリネバクテリウム属種（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ）、アセトバクター属種（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ）、シアノバクテリア属種（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｓｐｐ）、サルモネラ属種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ）、ロドコッカス属種（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ）、シュードモナス属種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ）、ラクトバチルス属種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ）、エンテロコッカス属種（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ）、アルカリゲネス属種（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐｐ）、クレブシエラ属種（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ）、パエニバチルス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ）、アルスロバクター属種（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ）、コリネバクテリウム属種（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ）、ブレビバクテリウム属種（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ）、サーマス属種（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｐｐ）、シュードモナス属種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ）、クロストリジウム属種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ）及び大腸菌属種（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｓｐｐ）が挙げられる。本明細書に提供される方法及び組成物による標的となり得る細菌の非限定的な例を表１に示す。一部の例では、調節薬剤が標的とする細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列は、表１に挙げる配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、９９．９％又は１００％の同一性を有する。
【００８３】
【表１】
2020506960.tif 000003
【００８４】
【表２】
2020506960.tif 000004
【００８５】
【表３】
2020506960.tif 000005
【００８６】
【表４】
2020506960.tif 000006
【００８７】
【表５】
2020506960.tif 000007
【００８８】
【表６】
2020506960.tif 000008
【００８９】
【表７】
2020506960.tif 000009
【００９０】
【表８】
2020506960.tif 000010
【００９１】
【表９】
2020506960.tif 000011
【００９２】
【表１０】
2020506960.tif 000012
【００９３】
【表１１】
2020506960.tif 000013
【００９４】
【表１２】
2020506960.tif 000014
【００９５】
【表１３】
2020506960.tif 000015
【００９６】
【表１４】
2020506960.tif 000016
【００９７】
【表１５】
2020506960.tif 000017
【００９８】
【表１６】
2020506960.tif 000018
【００９９】
【表１７】
2020506960.tif 000019
【０１００】
【表１８】
2020506960.tif 000020
【０１０１】
【表１９】
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【０１０２】
【表２０】
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【０１０３】
【表２１】
2020506960.tif 000023
【０１０４】
【表２２】
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【０１０５】
【表２３】
2020506960.tif 000025
【０１０６】
【表２４】
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【０１０７】
【表２５】
2020506960.tif 000027
【０１０８】
【表２６】
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【０１０９】
【表２７】
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【０１１０】
【表２８】
2020506960.tif 000030
【０１１１】
【表２９】
2020506960.tif 000031
【０１１２】
【表３０】
2020506960.tif 000032
【０１１３】
【表３１】
2020506960.tif 000033
【０１１４】
【表３２】
2020506960.tif 000034
【０１１５】
【表３３】
2020506960.tif 000035
【０１１６】
【表３４】
2020506960.tif 000036
【０１１７】
【表３５】
2020506960.tif 000037
【０１１８】
【表３６】
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【０１１９】
【表３７】
2020506960.tif 000039
【０１２０】
【表３８】
2020506960.tif 000040
【０１２１】
【表３９】
2020506960.tif 000041
【０１２２】
【表４０】
2020506960.tif 000042
【０１２３】
【表４１】
2020506960.tif 000043
【０１２４】
【表４２】
2020506960.tif 000044
【０１２５】
【表４３】
2020506960.tif 000045
【０１２６】
【表４４】
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【０１２７】
【表４５】
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【０１２８】
【表４６】
2020506960.tif 000048
【０１２９】
【表４７】
2020506960.tif 000049
【０１３０】
【表４８】
2020506960.tif 000050
【０１３１】
【表４９】
2020506960.tif 000051
【０１３２】
【表５０】
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【０１３３】
【表５１】
2020506960.tif 000053
【０１３４】
【表５２】
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【０１３５】
【表５３】
2020506960.tif 000055
【０１３６】
【表５４】
2020506960.tif 000056
【０１３７】
【表５５】
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【０１３８】
【表５６】
2020506960.tif 000058
【０１３９】
【表５７】
2020506960.tif 000059
【０１４０】
【表５８】
2020506960.tif 000060
【０１４１】
【表５９】
2020506960.tif 000061
【０１４２】
【表６０】
2020506960.tif 000062
【０１４３】
【表６１】
2020506960.tif 000063
【０１４４】
【表６２】
2020506960.tif 000064
【０１４５】
【表６３】
2020506960.tif 000065
【０１４６】
【表６４】
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【０１４７】
【表６５】
2020506960.tif 000067
【０１４８】
【表６６】
2020506960.tif 000068
【０１４９】
例えば、カ（例えば、ヤブカ属種（Ａｅｄｅｓ  ｓｐｐ．）又はハマダラカ属種（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｓｐｐ．））は、カの免疫応答を調節し、且つ病原体に対する媒介能力に影響を及ぼす共生細菌を抱えている。本明細書に記載される調節薬剤は、限定はされないが、ＥｓｐＺ、セラチア属種（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｓｐｐ）（例えば、セラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ））、腸内細菌科種（Ｅｎｔｅｒｂａｃｔｅｒｉｏａｃｅａｅ  ｓｐｐ．）、エンテロバクター属種（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．）（例えば、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）、エンテロバクター・アムニゲナス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｍｎｉｇｅｎｕｓ）、エンテロバクター・ルドウィギイ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｌｕｄｗｉｇｉｉ））、プロテウス属種（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｓｐｐ．）、アシネトバクター属種（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．）、ウィグルスウォーチア属種（Ｗｉｇｇｌｅｓｗｏｒｔｈｉａ  ｓｐｐ．）（ウィグルスウォーチア・グロシニディア（Ｗｉｇｇｌｅｓｗｏｒｔｈｉａ  ｇｌｏｏｓｉｎｉｄｉａ））、キサントモナス属種（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．）（例えば、キサントモナス・マルトフィリア（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ））、シュードモナス属種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．）（例えば、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・スツッツェリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｕｔｚｅｒｉ）、シュードモナス・ロデシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｒｈｏｄｅｓｉａｅ））、大腸菌属種（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．）（例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｃｈｉａ  ｃｏｌｉ））、セデセア属種（Ｃｅｄｅｃｅａ  ｓｐｐ．）（例えば、セデセア・ラパゲイ（Ｃｅｄｅｃｅａ  ｌａｐａｇｅｉ））、エウィンゲラ属種（Ｅｗｉｎｇｅｌｌａ  ｓｐｐ．）（例えば、エウィンゲラ・アメリカナ（Ｅｗｉｎｇｅｌｌａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ））、バチルス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）（例えば、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ））、コマモナス属種（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．）、又はバゴコッカス属種（Ｖａｇｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）（例えば、バゴコッカス・サルモニナルム（Ｖａｇｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｍｏｎｉｎａｒｉｕｍ））、又はボルバキア属種（Ｗｏｌｂａｃｈｉａ  ｓｐｐ．）（例えば、ボルバキア属（Ｗｏｌｂａｃｈｉａ）−ｗＭｅｌ、ボルバキア属（Ｗｏｌｂａｃｈｉａ）−ｗＡｌｂＢ、ボルバキア属（Ｗｏｌｂａｃｈｉａ）−ｗＭｅｌＰｏｐ、ボルバキア属（Ｗｏｌｂａｃｈｉａ）−ｗＭｅｌＰｏｐ−ＣＬＡ）を含め、カに常在する細菌を標的にする際に有用であり得る。
【０１５０】
任意の数の細菌種は、本明細書に記載される組成物又は方法の標的となり得る。例えば、一部の例では、調節薬剤は、単一の細菌種を標的とし得る。一部の例では、調節薬剤は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、５００又はそれを超えるもののいずれかの異なる細菌種を標的とし得る。一部の例では、調節薬剤は、約１〜約５、約５〜約１０、約１０〜約２０、約２０〜約５０、約５０〜約１００、約１００〜約２００、約２００〜約５００、約１０〜約５０、約５〜約２０又は約１０〜約１００のいずれか１つの異なる細菌種を標的とし得る。一部の例では、調節薬剤は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００又はそれを超えるもののいずれかの細菌門、綱、目、科又は属を標的とし得る。
【０１５１】
一部の例では、調節薬剤は、調節薬剤を投与されていない宿主生物と比較して、宿主における１つ以上の細菌（例えば、病原性細菌、毒素生産細菌）の個体群を少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれを超えるもののいずれかだけ増加させることができる。一部の例では、調節薬剤は、調節薬剤を投与されていない宿主生物と比較して、宿主における１つ以上の細菌（例えば、共生細菌、農薬分解細菌、例えば表１２に挙げられる農薬のいずれか１つを分解する細菌）の個体群を少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれを超えるもののいずれかだけ低減することができる。一部の例では、調節薬剤は、宿主における細菌（例えば、共生細菌、農薬分解細菌、例えば表１２に挙げられる農薬のいずれか１つを分解する細菌）の個体群を根絶し得る。一部の例では、調節薬剤は、調節薬剤を投与されていない宿主生物と比較して、宿主における１つ以上の病原性細菌のレベルを少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれを超えるもののいずれかだけ増加させる及び／又は宿主における１つ以上の共生細菌のレベルを少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれを超えるもののいずれかだけ低下させることができる。
【０１５２】
一部の例では、調節薬剤は、宿主の細菌多様性及び／又は細菌組成を変化させることができる。一部の例では、調節薬剤は、調節薬剤を投与されていない宿主生物と比較して、宿主における出発時の多様性と比べた細菌多様性を少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれを超えるもののいずれかだけ増加させることができる。一部の例では、調節薬剤は、調節薬剤を投与されていない宿主生物と比較して、宿主における出発時の多様性と比べた細菌多様性を少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれを超えるもののいずれかだけ低下させることができる。
【０１５３】
一部の例では、調節薬剤は、１つ以上の細菌細胞の機能、活動、成長及び／又は分裂を変化させることができる。例えば、調節薬剤は、細菌の１つ又は遺伝子の発現を変化させることができる。一部の例では、調節薬剤は、細菌の１つ以上のタンパク質の機能を変化させることができる。一部の例では、調節薬剤は、細菌の１つ以上の細胞構造（例えば、細胞壁、外膜又は内膜）の機能を変化させることができる。一部の例では、調節薬剤は、細菌を死滅（例えば、溶解）させることができる。
【０１５４】
標的細菌は、昆虫の１つ以上の部位に常在し得る。更に、標的細菌は、細胞内又は細胞外であり得る。一部の例では、細菌は、例えば、前腸、中腸及び／又は後腸を含め、宿主の腸の１つ以上の部位内又は部位上に常在する。一部の例では、細菌は、宿主昆虫の細胞内に細胞内細菌として常在する。一部の例では、細菌は、宿主昆虫のバクテリオサイトに常在する。
【０１５５】
宿主における細菌の個体群の変化は、マイクロアレイ、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ、フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡法、透過電子顕微鏡法、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（例えば、ＦＩＳＨ）、分光測定法、マトリックス支援レーザー脱離イオン化−質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）及びＤＮＡシーケンシングなど、当該技術分野において公知の任意の方法によって決定され得る。一部の例では、調節薬剤で処理した宿主のサンプルがシーケンシング（例えば、１６Ｓ  ｒＲＮＡ又はｒＤＮＡのメタゲノミクスシーケンシングにより）され、調節薬剤の送達又は投与後の宿主のマイクロバイオームが決定される。一部の例では、調節薬剤の投与を受けなかった宿主のサンプルもシーケンシングされ、参照が提供される。
【０１５６】
ｉｉ．真菌
本明細書に提供される方法及び組成物において標的となり得る例示的真菌としては、限定はされないが、アミロステレウム・アレオラツム（Ａｍｙｌｏｓｔｅｒｅｕｍ  ａｒｅｏｌａｔｕｍ）、エピクロエ属種（Ｅｐｉｃｈｌｏｅ  ｓｐｐ）、ピキア・ピヌス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｎｕｓ）、ハンゼヌラ・カプスラタ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｃａｐｓｕｌａｔｅ）、ダルディニア・デシピエンス（Ｄａｌｄｉｎｉａ  ｄｅｃｉｐｉｅｎ）、セラトシスチス属種（Ｃｅｒａｔｏｃｙｔｉｓ  ｓｐｐ）、オフィオストマ属種（Ｏｐｈｉｏｓｔｏｍａ  ｓｐｐ）及びアッタマイセス・ブロマティフィカス（Ａｔｔａｍｙｃｅｓ  ｂｒｏｍａｔｉｆｉｃｕｓ）が挙げられる。昆虫に見られる酵母及び酵母様共生体の非限定的な例としては、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、メチニコウイア属（Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ）、デバロマイセス属（Ｄｅｂａｒｏｍｙｃｅｓ）、シェフェルソマイセス・シェハテ（Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓｏｍｙｃｅｓ  ｓｈｅｈａｔａｅ）及びシェフェルソマイセス・スティピティス（Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓｏｍｙｃｅｓ  ｓｔｉｐｉｔｅｓ）、スターメレラ属（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードジマ属（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）及びチャワンタケ亜門（Ｐｅｚｉｚｏｍｙｃｏｔｉｎａ）からの酵母様共生者（例えば、シンビオタフリナ・ブクネリ（Ｓｙｍｂｉｏｔａｐｈｒｉｎａ  ｂｕｃｎｅｒｉ）及びシンビオタフリナ・コッホイ（Ｓｙｍｂｉｏｔａｐｈｒｉｎａ  ｋｏｃｈｉｉ））が挙げられる。本明細書の方法及び組成物による標的となり得る酵母の非限定的な例を表２に挙げる。
【０１５７】
【表６７】
2020506960.tif 000069
【０１５８】
【表６８】
2020506960.tif 000070
【０１５９】
【表６９】
2020506960.tif 000071
【０１６０】
【表７０】
2020506960.tif 000072
【０１６１】
【表７１】
2020506960.tif 000073
【０１６２】
【表７２】
2020506960.tif 000074
【０１６３】
【表７３】
2020506960.tif 000075
【０１６４】
任意の数の真菌種は、本明細書に記載される組成物又は方法の標的となり得る。例えば、一部の例では、調節薬剤は、単一の真菌種を標的とし得る。一部の例では、調節薬剤は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、５００又はそれを超えるもののいずれかの異なる真菌種を標的とし得る。一部の例では、調節薬剤は、約１〜約５、約５〜約１０、約１０〜約２０、約２０〜約５０、約５０〜約１００、約１００〜約２００、約２００〜約５００、約１０〜約５０、約５〜約２０又は約１０〜約１００のいずれか１つの異なる真菌種を標的とし得る。一部の例では、調節薬剤は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００又はそれを超えるもののいずれかの真菌門、綱、目、科又は属を標的とし得る。
【０１６５】
一部の例では、調節薬剤は、調節薬剤を投与されていない宿主生物と比較して、宿主における１つ以上の真菌（例えば、病原性又は寄生性真菌）の個体群を少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれを超えるもののいずれかだけ増加させることができる。一部の例では、調節薬剤は、調節薬剤を投与されていない宿主生物と比較して、宿主における１つ以上の真菌（例えば、共生真菌）の個体群を少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれを超えるもののいずれかの割合だけ低減することができる。一部の例では、調節薬剤は、宿主における真菌（例えば、共生真菌）の個体群を根絶することができる。一部の例では、調節薬剤は、調節薬剤を投与されていない宿主生物と比較して、宿主における１つ以上の共生真菌のレベルを少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれを超えるもののいずれかだけ増加させることができ、及び／又は宿主における１つ以上の共生真菌のレベルを少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれを超えるもののいずれかだけ低下させることができる。
【０１６６】
一部の例では、調節薬剤は、宿主の真菌多様性及び／又は真菌組成を変化させることができる。一部の例では、調節薬剤は、調節薬剤を投与されていない宿主生物と比較して、宿主における出発時の多様性と比べた真菌多様性を少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれを超えるもののいずれかだけ増加させることができる。一部の例では、調節薬剤は、調節薬剤を投与されていない宿主生物と比較して、宿主における出発時の多様性と比べた真菌多様性を少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれを超えるもののいずれかだけ低下させることができる。
【０１６７】
一部の例では、調節薬剤は、１つ以上の真菌の機能、活動、成長及び／又は分裂を変化させることができる。例えば、調節薬剤は、真菌の１つ以上の遺伝子の発現を変化させることができる。一部の例では、調節薬剤は、真菌の１つ以上のタンパク質の機能を変化させることができる。一部の例では、調節薬剤は、真菌の１つ以上の細胞成分の機能を変化させることができる。一部の例では、調節薬剤は真菌を死滅させることができる。
【０１６８】
更に、標的真菌は、昆虫の１つ以上の部位に常在し得る。一部の例では、真菌は、例えば、前腸、中腸及び／又は後腸を含め、昆虫の腸の１つ以上の部位内又は部位上に常在する。一部の例では、真菌は、細胞外で血リンパ、脂肪体において、又は宿主の特殊化した構造において生活する。
【０１６９】
宿主における真菌の個体群の変化は、マイクロアレイ、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ、フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡法、透過電子顕微鏡法、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（例えば、ＦＩＳＨ）、分光測定法、マトリックス支援レーザー脱離イオン化−質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）及びＤＮＡシーケンシングなど、当該技術分野において公知の任意の方法によって決定され得る。一部の例では、調節薬剤で処理した宿主のサンプルがシーケンシング（例えば、メタゲノミクスシーケンシングにより）され、調節薬剤の送達又は投与後の宿主のマイクロバイオームが決定される。一部の例では、調節薬剤の投与を受けなかった宿主のサンプルもシーケンシングされ、参照が提供される。
【０１７０】
ＩＩＩ．調節薬剤
本明細書に提供される方法及び組成物の調節薬剤には、ファージ、ポリペプチド、小分子、抗生物質、二次代謝産物、細菌若しくは真菌又はこれらの任意の組み合わせが含まれ得る。
【０１７１】
ｉ．ファージ
本明細書に記載される調節薬剤は、ファージ（例えば、溶菌性ファージ又は非溶菌性ファージ）を含み得る。一部の例では、本明細書に記載される任意のファージの有効濃度は、本明細書に記載される宿主（例えば、動物病原体のベクター、例えばカ、コダニ、ハジラミ又はマダニ）に常在する１つ以上の微生物（本明細書に記載されるとおり）のレベル、活動又は代謝を変化させることができ、この調節は、宿主の適応度（例えば、本明細書に概説されるとおりの）の低下をもたらし得る。一部の例では、調節薬剤には、テクティウイルス科（Ｔｅｃｔｉｖｉｒｉｄａｅ）、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）、サイフォウイルス科（Ｓｉｐｈｏｖｉｒｉｄａｅ）、ポドウイルス科（Ｐｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、カウドウイルス目（Ｃａｕｄｏｖｉｒａｌｅｓ）、リポスリクスウイルス科（Ｌｉｐｏｔｈｒｉｘｖｉｒｉｄａｅ）、ルディウイルス科（Ｒｕｄｉｖｉｒｉｄａｅ）又はリガメンウイルス目（Ｌｉｇａｍｅｎｖｉｒａｌｅｓ）の目から選択される少なくとも１つのファージが含まれる。一部の例では、本組成物は、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）、サイフォウイルス科（Ｓｉｐｈｏｖｉｒｉｄａｅ）、ポドウイルス科（Ｐｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、リポスリクスウイルス科（Ｌｉｐｏｔｈｒｉｘｖｉｒｉｄａｅ）、ルディウイルス科（Ｒｕｄｉｖｉｒｉｄａｅ）、アンピュラウイルス科（Ａｍｐｕｌｌａｖｉｒｉｄａｅ）、ビカウダウイルス科（Ｂｉｃａｕｄａｖｉｒｉｄａｅ）、クラバウイルス科（Ｃｌａｖａｖｉｒｉｄａｅ）、コルチコウイルス科（Ｃｏｒｔｉｃｏｖｉｒｉｄａｅ）、シストウイルス科（Ｃｙｓｔｏｖｉｒｉｄａｅ）、フセロウイルス科（Ｆｕｓｅｌｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、グロブロウイルス科（Ｇｌｕｂｏｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、グッタウイルス科（Ｇｕｔｔａｖｉｒｉｄａｅ）、イノウイルス科（Ｉｎｏｖｉｒｉｄａｅ）、レビウイルス科（Ｌｅｖｉｖｉｒｉｄａｅ）、ミクロウイルス科（Ｍｉｃｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、プラズマウイルス科（Ｐｌａｓｍａｖｉｒｉｄａｅ）及びテクティウイルス科（Ｔｅｃｔｉｖｉｒｉｄａｅ）から選択される少なくとも１つのファージを含む。本方法及び組成物において有用なファージの更なる非限定的な例を表３に挙げる。
【０１７２】
【表７４】
2020506960.tif 000076
【０１７３】
【表７５】
2020506960.tif 000077
【０１７４】
一部の例では、調節薬剤は、溶菌性ファージを含む。従って、宿主に常在する細菌細胞への溶菌性ファージの送達後、ファージは、標的細菌細胞に溶解を引き起こす。一部の例では、溶菌性ファージが宿主昆虫に常在する細菌を標的にして死滅させることにより、宿主の適応度が減少する。代わりに又は加えて、調節薬剤のファージは、非溶菌性ファージ（溶原性又はテンペレートファージとも称される）であり得る。従って、宿主に常在する細菌細胞への非溶菌性ファージの送達後、細菌細胞は、生存可能なままであり、ファージゲノムにおいてコードされる遺伝子の発現を安定に維持することが可能である。一部の例では、非溶菌性ファージを使用して宿主昆虫に常在する細菌の遺伝子発現を変化させることにより、宿主の適応度を減少させる。一部の例では、調節薬剤は、溶菌性ファージと非溶菌性ファージとの混合物を含む。
【０１７５】
特定の例では、ファージは、天然に存在するファージである。例えば、天然に存在するファージは、異なるファージの混合物を含む環境サンプルから分離され得る。天然に存在するファージは、特定の微生物（例えば、昆虫宿主の内部共生細菌）を標的とするファージを分離、精製及び同定する当該技術分野において公知の方法を用いて分離され得る。或いは、特定の例では、ファージは、天然に存在するファージをベースとして改変され得る。
【０１７６】
本明細書に記載される調節薬剤は、狭域又は広域のいずれかの細菌標的域を有するファージを含み得る。一部の例では、ファージは、狭域の細菌標的域を有する。一部の例では、ファージは、大きい細菌標的域を有する無差別的なファージである。例えば、無差別的なファージは、少なくとも約５、１０、２０、３０、４０、５０又はそれを超えるもののいずれかの宿主常在細菌を標的とし得る。狭域の細菌標的域を有するファージは、宿主における他の細菌、例えば非標的細菌には影響を与えることなく、宿主の特定の細菌株を標的とし得る。例えば、ファージは、約５０、４０、３０、２０、１０、８、６、４、２又は１のいずれか以下の宿主常在細菌を標的とし得る。例えば、本明細書に記載されるファージは、限定はされないが、ＥｓｐＺ、セラチア属種（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｓｐｐ）（例えば、セラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ））、腸内細菌科種（Ｅｎｔｅｒｂａｃｔｅｒｉｏａｃｅａｅ  ｓｐｐ．）、エンテロバクター属種（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．）（例えば、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）、エンテロバクター・アムニゲナス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｍｎｉｇｅｎｕｓ）、エンテロバクター・ルドウィギイ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｌｕｄｗｉｇｉｉ））、プロテウス属種（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｓｐｐ．）、アシネトバクター属種（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．）、ウィグルスウォーチア属種（Ｗｉｇｇｌｅｓｗｏｒｔｈｉａ  ｓｐｐ．）（ウィグルスウォーチア・グロシニディア（Ｗｉｇｇｌｅｓｗｏｒｔｈｉａ  ｇｌｏｏｓｉｎｉｄｉａ））、キサントモナス属種（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．）（例えば、キサントモナス・マルトフィリア（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ））、シュードモナス属種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．）（例えば、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・スツッツェリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｕｔｚｅｒｉ）、シュードモナス・ロデシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｒｈｏｄｅｓｉａｅ））、大腸菌属種（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．）（例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｃｈｉａ  ｃｏｌｉ））、セデセア属種（Ｃｅｄｅｃｅａ  ｓｐｐ．）（例えば、セデセア・ラパゲイ（Ｃｅｄｅｃｅａ  ｌａｐａｇｅｉ））、エウィンゲラ属種（Ｅｗｉｎｇｅｌｌａ  ｓｐｐ．）（例えば、エウィンゲラ・アメリカナ（Ｅｗｉｎｇｅｌｌａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ））、バチルス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）（例えば、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ））、コマモナス属種（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．）、又はバゴコッカス属種（Ｖａｇｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）（例えば、バゴコッカス・サルモニナルム（Ｖａｇｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｍｏｎｉｎａｒｉｕｍ））、又はボルバキア属種（Ｗｏｌｂａｃｈｉａ  ｓｐｐ．）（例えば、ボルバキア属（Ｗｏｌｂａｃｈｉａ）−ｗＭｅｌ、ボルバキア属（Ｗｏｌｂａｃｈｉａ）−ｗＡｌｂＢ、ボルバキア属（Ｗｏｌｂａｃｈｉａ）−ｗＭｅｌＰｏｐ、ボルバキア属（Ｗｏｌｂａｃｈｉａ）−ｗＭｅｌＰｏｐ−ＣＬＡ）��含め、カに常在する１つ以上の細菌を標的とするのに有用であり得る。
【０１７７】
本明細書に記載される組成物は、少なくとも約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、１００又はそれを超えるもののいずれか１つのファージなど、任意の数のファージを含み得る。一部の例では、本組成物は、１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれを超えるファージ）の科、１つ以上の目（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれを超えるファージ）又は１つ以上の種（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、１００又はそれを超えるファージ）からのファージを含む。１つ以上のファージを含む組成物は、本明細書では「ファージカクテル」とも称される。ファージカクテルは、より広域の宿主域の細菌を標的とすることが可能になるために有用である。更に、ファージカクテルによれば、各細菌株（即ち亜種）を複数の直交性のファージによって標的化することが可能であり、それにより抵抗性の発生が防止されるか又は大幅に遅延する。一部の例では、カクテルは、１つの細菌種を標的とする複数のファージを含む。一部の例では、カクテルは、複数の細菌種を標的とする複数のファージを含む。一部の例では、１ファージ「カクテル」は、種内の多くの株を標的とする単一の無差別的なファージ（即ち大きい宿主域のファージ）を含む。
【０１７８】
本明細書に記載される調節薬剤中のファージの好適な濃度は、ファージの有効性、生存率、感染力、組成物中にある異なるファージの数並びに／又は溶解素の種類、製剤及び組成物の施用方法などの要因に依存する。一部の例では、ファージは、液体又は固体製剤中にある。一部の例では、本明細書に記載される任意の組成物中の各ファージの濃度は、少なくとも約１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０ｐｆｕ／ｍｌ又はそれを超えるもののいずれかである。一部の例では、本明細書に記載される任意の組成物中の各ファージの濃度は、約１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９ｐｆｕ／ｍｌのいずれか以下である。一部の例では、本組成物中の各ファージの濃度は、約１０２〜約１０３、約１０３〜約１０４、約１０４〜約１０５、約１０５〜約１０６、約１０７〜約１０８、約１０８〜約１０９、約１０２〜約１０４、約１０４〜約１０６、約１０６〜約１０９又は約１０３〜約１０８ｐｆｕ／ｍｌのいずれかである。一部の例では、ここで、本組成物は、少なくとも２種類のファージを含み、ファージの各種類の濃度は、同じであるか又は異なり得る。例えば、一部の例では、カクテル中の１つのファージの濃度が約１０８ｐｆｕ／ｍｌであり、カクテル中の第２のファージの濃度が約１０６ｐｆｕ／ｍｌである。
【０１７９】
本明細書に記載されるとおりのファージを含む調節薬剤は、（ａ）標的宿主の内部で目標レベル（例えば、所定又は閾値レベル）のファージ濃度に達する；（ｂ）標的宿主の腸の内部で目標レベル（例えば、所定又は閾値レベル）のファージ濃度に達する；（ｃ）標的宿主のバクテリオサイトの内部で目標レベル（例えば、所定又は閾値レベル）のファージ濃度に達する；（ｄ）標的宿主の１つ以上の微生物（例えば、内部共生体）のレベル又は活動を調節する；又は／及び（ｅ）標的宿主の適応度を調節するのに十分な量で且つ十分な時間にわたって標的宿主と接触させることができる。
【０１８０】
実施例５〜７及び２８によって示されるとおり、ファージ（例えば、１つ以上の天然に存在するファージ）を、昆虫宿主の内部共生細菌を標的とする調節薬剤として使用して、宿主の適応度（例えば、本明細書に概説されるとおりの）を低下させることができる。
【０１８１】
ｉｉ．ポリペプチド
本明細書に記載される組成物及び方法では、多くのポリペプチド（例えば、バクテリオシン、Ｒ型バクテリオシン、根粒Ｃリッチペプチド、抗微生物ペプチド、溶解素又はバクテリオサイト調節性ペプチド）を使用し得る。一部の例では、本明細書に記載される任意のペプチド又はポリペプチドの有効濃度は、宿主（例えば、動物病原体のベクター、例えばカ、コダニ、ハジラミ又はマダニ）に常在する１つ以上の微生物（本明細書に記載されるとおりの、例えばボルバキア属種（Ｗｏｌｂａｃｈｉａ  ｓｐｐ．）又はリケッチア属種（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｓｐｐ．））のレベル、活動又は代謝を変化させることができ、この調節は、宿主の適応度（例えば、本明細書に概説されるとおりの）の低下をもたらし得る。本明細書に含まれるポリペプチドには、天然に存在するポリペプチド又は組換え産生された変異体が含まれ得る。例えば、ポリペプチドは、例えば、特定の領域にわたり又は配列全体にわたり、本明細書に記載されるポリペプチド又は天然に存在するポリペプチドの配列と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する本明細書に記載される任意のポリペプチドの機能的に活性な変異体であり得る。
【０１８２】
本明細書に記載されるとおりのポリペプチドを含む調節薬剤は、（ａ）標的宿主の内部で目標レベル（例えば、所定又は閾値レベル）の濃度に達する；（ｂ）標的宿主の腸の内部で目標レベル（例えば、所定又は閾値レベル）の濃度に達する；（ｃ）標的宿主のバクテリオサイトの内部で目標レベル（例えば、所定又は閾値レベル）の濃度に達する；（ｄ）標的宿主の１つ以上の微生物（例えば、内部共生体）のレベル又は活動を調節する；又は／及び（ｅ）標的宿主の適応度を調節するのに十分な量で且つ十分な時間にわたって標的宿主と接触させることができる。
【０１８３】
宿主昆虫（例えば、動物病原体のベクター、例えばカ、コダニ、ハジラミ又はマダニ）の適応度を低下させるため、以下で考察するポリペプチド調節薬剤、即ちバクテリオシン、溶解素、抗微生物ペプチド、根粒Ｃリッチペプチド及びバクテリオサイト調節性ペプチドを使用して、本節に示されるとおりの標的微生物（例えば、リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）又はボルバキア属（Ｗｏｌｂｏｃｈｉａ））のレベル、活動又は代謝を変化させることができる。
【０１８４】
（ａ）バクテリオシン
本明細書に記載される調節薬剤は、バクテリオシンを含み得る。一部の例では、バクテリオシンは、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）又は乳酸菌（ＬＡＢ、例えばラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ））などのグラム陽性細菌によって天然に生産される。一部の例では、バクテリオシンは、ハフニア・アルベイ（Ｈａｆｎｉａ  ａｌｖｅｉ）、シトロバクター・フロインディ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）、セラチア・プリミチクム（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｐｌｙｍｉｔｈｉｃｕｍ）、キサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）、エルウィニア・カロトボラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）、ラルストニア・ソラナケアルム（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）又は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）などのグラム陰性細菌によって天然に生産される。例示的バクテリオシンとしては、限定はされないが、クラスＩ〜ＩＶ  ＬＡＢ抗生物質（ランチビオティックなど）、コリシン、ミクロシン及びピオシンが挙げられる。バクテリオシンの非限定的な例を表４に挙げる。
【０１８５】
【表７６】
2020506960.tif 000078
【０１８６】
【表７７】
2020506960.tif 000079
【０１８７】
【表７８】
2020506960.tif 000080
【０１８８】
一部の例では、バクテリオシンは、グラム陰性細菌によって生産されるコリシン、ピオシン又はミクロシンである。一部の例では、バクテリオシンは、コリシンである。コリシンは、Ａ群コリシン（例えば、Ｔｏｌ系を使用して標的細菌の外膜に侵入する）又はＢ群コリシン（例えば、Ｔｏｎ系を使用して標的細菌の外膜に侵入する）であり得る。一部の例では、バクテリオシンは、ミクロシンである。ミクロシンは、クラスＩミクロシン（例えば、＜５ｋＤａ、翻訳後修飾を有する）又はクラスＩＩミクロシン（例えば、５〜１０ｋＤａ、翻訳後修飾有り又は無し）であり得る。一部の例では、クラスＩＩミクロシンは、クラスＩＩａミクロシン（例えば、機能性ペプチドの合成及びアセンブリに２つ以上の遺伝子を必要とする）又はクラスＩＩｂミクロシン（例えば、Ｃ末端の翻訳後修飾有り又は無しの線状ペプチド）である。一部の例では、バクテリオシンは、ピオシンである。一部の例では、ピオシンは、Ｒ−ピオシン、Ｆ−ピオシン又はＳ−ピオシンである。
【０１８９】
一部の例では、バクテリオシンは、グラム陽性細菌によって生産されるクラスＩ、クラスＩＩ、クラスＩＩＩ又はクラスＩＶバクテリオシンである。一部の例では、調節薬剤は、クラスＩバクテリオシン（例えば、グラム陽性細菌によって生産されるランチオニン含有抗生物質（ランチビオティック））を含む。クラスＩバクテリオシン又はランチビオティックは、低分子量ペプチド（例えば、約５ｋＤａ未満）であり得、翻訳後修飾されたアミノ酸残基（例えば、ランチオニン、β−メチルランチオニン又は脱水アミノ酸）を有し得る。
【０１９０】
一部の例では、バクテリオシンは、クラスＩＩバクテリオシン（例えば、グラム陽性細菌によって生産される非ランチビオティック）である。多くは、正電荷の非ランチオニン含有ペプチドであり、これは、ランチビオティックと異なり、大規模な翻訳後修飾を受けない。クラスＩＩバクテリオシンは、以下のサブクラスの１つに属し得る：「ペディオシン様」バクテリオシン（例えば、ペディオシンＰＡ−１及びカルノバクテリオシンＸ（クラスＩＩａ））；２ペプチドバクテリオシン（例えば、ラクタシンＦ及びＡＢＰ−１１８（クラスＩＩｂ））；環状バクテリオシン（例えば、カルノシクリンＡ（ｃａｒｎｏｃｙｃｌｉｎ  Ａ）及びエンテロシンＡＳ−４８（クラスＩＩｃ））；又は修飾されていない線状の非ペディオシン様バクテリオシン（例えば、エピデルミシンＮＩ０１及びラクトコッシンＡ（クラスＩＩｄ））。
【０１９１】
一部の例では、バクテリオシンは、クラスＩＩＩバクテリオシン（例えば、グラム陽性細菌によって生産される）である。クラスＩＩＩバクテリオシンは、１０ｋＤａより大きい分子量を有し得、熱不安定性タンパク質であり得る。クラスＩＩＩバクテリオシンは、ＩＩＩＡ群及びＩＩＩＢ群バクテリオシンに更に細分される。ＩＩＩＡ群バクテリオシンは、エンテロリシンＡなど、敏感な株を細胞の溶解によって十分に死滅させる細菌溶解酵素を含む。ＩＩＩＢ群バクテリオシンは、カゼイシン８０、ヘルベティシンＪ及びラクタシンＢなど、非溶菌性タンパク質を含む。
【０１９２】
一部の例では、バクテリオシンは、クラスＩＶバクテリオシン（例えば、グラム陽性細菌によって生産されるもの）である。クラスＩＶバクテリオシンは、活性に必要と見られる他の脂質又は炭水化物部分と会合した一群の複合タンパク質である。これは、比較的疎水性が高く、熱安定性である。クラスＩＶバクテリオシンの例は、ロイコノシンＳ、ラクトシン２７及びラクトシンＳである。
【０１９３】
一部の例では、バクテリオシンは、Ｒ型バクテリオシンである。Ｒ型バクテリオシンは、収縮性殺菌性タンパク質複合体である。一部のＲ型バクテリオシンは、収縮性ファージ尾部様構造を有する。ファージ尾繊維タンパク質のＣ末端領域は、標的結合特異性を決定する。これは、受容体結合タンパク質、例えば尾繊維を介して標的細胞に付着し得る。付着に続いて鞘が収縮し、標的細菌のエンベロープを通ってコアが入り込む。コアが侵入すると、細胞膜電位の急速な脱分極が起こり、細胞死が促進される。単一のＲ型バクテリオシン粒子との接触で細胞死が起こり得る。Ｒ型バクテリオシンは、例えば、易熱性、耐弱酸性、トリプシン耐性、遠心によって沈降可能、電子顕微鏡法によって解像可能又はこれらの組み合わせであり得る。他のＲ型バクテリオシンは、複数のタンパク質、ポリペプチド又はサブユニットを含む複合分子であり得、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）のバクテリオファージの尾部構造に類似したものであり得る。天然に存在するＲ型バクテリオシンでは、サブユニット構造は、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）又は緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）などの細菌ゲノムによってコードされ、Ｒ型バクテリオシンを形成して他の細菌に対する天然の防御としての役割を果たし得る。一部の例では、Ｒ型バクテリオシンは、ピオシンである。一部の例では、ピオシンは、Ｒ−ピオシン、Ｆ−ピオシン又はＳ−ピオシンである。
【０１９４】
一部の例では、バクテリオシンは、本明細書に記載されるバクテリオシンの機能的に活性な変異体である。一部の例では、バクテリオシンの変異体は、例えば、特定の領域にわたり又は配列全体にわたり、本明細書に記載されるバクテリオシン又は天然に存在するバクテリオシンの配列と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する。
【０１９５】
一部の例では、バクテリオシンは、標準方法に従って生物工学的に操作され得、その生物活性を調節し、例えば増加若しくは低下させるか、又は調整するか、又はその標的微生物を指定し得る。他の例では、バクテリオシンは、微生物細胞の翻訳機構（例えば、リボソーム等）によって産生される。一部の例では、バクテリオシンは、化学的に合成される。一部のバクテリオシンは、ポリペプチド前駆体に由来することができる。ポリペプチド前駆体は、切断（例えば、プロテアーゼによるプロセシング）を受けると、バクテリオシン自体のポリペプチドを生じさせることができる。このように、一部の例では、バクテリオシンは、前駆体ポリペプチドから産生される。他の一部の例では、バクテリオシンは、翻訳後修飾、例えば切断又は１つ以上の官能基の付加を受けたポリペプチドを含む。
【０１９６】
本明細書に記載されるバクテリオシンは、本明細書に記載される任意の使用のために組成物に製剤化され得る。本明細書に開示される組成物は、少なくとも約１つのバクテリオシン、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、１００又はそれを超えるバクテリオシンのいずれか１つなど、任意の数又は種類（例えば、クラス）のバクテリオシンを含み得る。本明細書に記載される組成物中の各バクテリオシンの好適な濃度は、バクテリオシンの有効性、安定性、組成物中にある異なるバクテリオシン種類の数、製剤及び組成物の施用方法などの要因に依存する。一部の例では、液体組成物中の各バクテリオシンは、約０．０１ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍＬである。一部の例では、固体組成物中の各バクテリオシンは、約０．０１ｎｇ／ｇ〜約１００ｍｇ／ｇである。一部の例では、ここで、本組成物は、少なくとも２種類のバクテリオシンを含み、各種類のバクテリオシンの濃度は、同じであるか又は異なり得る。一部の例では、バクテリオシンは、バクテリオシンを分泌する細菌細胞を含む組成物で提供される。一部の例では、バクテリオシンは、ポリペプチド（例えば、細菌細胞から単離されたポリペプチド）を含む組成物で提供される。
【０１９７】
バクテリオシンは、その細菌細胞にクローン的に関連する細胞及び他の微生物細胞を含め、そのポリペプチドを作る個別の細菌細胞以外の少なくとも１つの微生物を中和し得る（例えば、死滅させ得る）。このように、細菌細胞は、バクテリオシンを分泌することにより複数の微生物に細胞傷害効果又は成長阻害効果を及ぼし得る。一部の例では、バクテリオシンは、細胞膜孔形成、細胞壁干渉（例えば、ペプチドグリカナーゼ（ｐｅｐｔｉｄｏｇｌｙｃａｎａｓｅ）活性）又はヌクレアーゼ活性（例えば、ＤＮアーゼ活性、１６Ｓ  ｒＲＮアーゼ活性若しくはｔＲＮアーゼ活性）によって１つ以上の宿主常在細菌種を標的とし、それを死滅させる。
【０１９８】
一部の例では、バクテリオシンは、中和活性を有する。バクテリオシンの中和活性としては、限定はされないが、微生物生殖の停止又は細胞傷害性を挙げることができる。一部のバクテリオシンは、細胞傷害活性を有し、従って微生物、例えば細菌、酵母、藻類などを死滅させることができる。一部のバクテリオシンは、微生物、例えば細菌、酵母、藻類などの生殖を例えば細胞周期の停止によって阻害することができる。
【０１９９】
一部の例では、バクテリオシンは、殺傷活性を有する。バクテリオシンの殺傷機構は、各バクテリオシン群に特異的である。一部の例では、バクテリオシンは、狭域スペクトル生物活性を有する。バクテリオシンは、その標的株に対するその極めて高い効力で知られる。一部のバクテリオシン活性は、バクテリオシン生産株に近縁の株に限定されている（狭域スペクトル生物活性）。一部の例では、バクテリオシンは、幅広い属に対して広域スペクトル生物活性を有する。
【０２００】
一部の例では、バクテリオシンは、標的細菌細胞膜上の受容体分子又はドッキング分子と相互作用する。例えば、ナイシンは、その標的細菌株に対して極めて効力が強く、１桁のナノモル濃度でも抗微生物活性を示す。ナイシン分子は、ペプチドグリカンサブユニットを細胞質から細胞壁に運ぶ主要なトランスポーターであるリピドＩＩに結合することが示されている。
【０２０１】
一部の例では、バクテリオシンは、抗真菌活性を有する。抗酵母又は抗真菌活性を有する幾つものバクテリオシンが同定されている。例えば、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）のバクテリオシンは、一部の酵母株に対して中和活性を有することが示されている（例えば、Ａｄｅｔｕｎｊｉ  ａｎｄ  Ｏｌａｏｙｅ，Ｍａｌａｙｓｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ９：１３０−１３，２０１３を参照されたい）。別の例では、フェカリス菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）ペプチドは、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）種に対して中和活性を有することが示されている（例えば、Ｓｈｅｋｈ  ａｎｄ  Ｒｏｙ，ＢＭＣ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １２：１３２，２０１２を参照されたい）。別の例では、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）のバクテリオシンは、クルブラリア・ルナータ（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｌｕｎａｔａ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種、ヘルミントスポリウム属（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ）種及びビポラリス属（Ｂｉｏｐｏｌａｒｉｓ）種などの真菌に対して中和活性を有することが示されている（例えば、Ｓｈａｌａｎｉ  ａｎｄ  Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎｅｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌｕｍｅ  ５  Ｎｕｍｂｅｒ  ２，２００８を参照されたい）。別の例では、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のボトリシジン（ｂｏｔｒｙｃｉｄｉｎ）ＡＪ１３１６及びアリリンＢ１は、抗真菌活性を有することが示されている。
【０２０２】
本明細書に記載されるとおりのバクテリオシンを含む調節薬剤は、（ａ）標的宿主の内部で目標レベル（例えば、所定又は閾値レベル）のバクテリオシン濃度に達する；（ｂ）標的宿主の腸の内部で目標レベル（例えば、所定又は閾値レベル）のバクテリオシン濃度に達する；（ｃ）標的宿主のバクテリオサイトの内部で目標レベル（例えば、所定又は閾値レベル）のバクテリオシン濃度に達する；（ｄ）標的宿主における１つ以上の微生物（例えば、内部共生体）のレベル又は活動を調節する；又は／及び（ｅ）標的宿主の適応度を調節するのに十分な量で且つ十分な時間にわたって標的宿主と接触させることができる。
【０２０３】
実施例８、９又は１６によって示されるとおり、バクテリオシン（例えば、ｃｏｌＡ又はナイシン）を、昆虫宿主の内部共生細菌を標的とする調節薬剤として使用して、宿主の適応度（例えば、本明細書に概説されるとおりの）を低下させることができる。
【０２０４】
（ｂ）溶解素
本明細書に記載される調節薬剤は、溶解素（例えば、ムレイン加水分解酵素又はペプチドグリカン自己溶解素としても知られる）を含み得る。宿主に常在する細菌の阻害に好適な任意の溶解素を使用し得る。一部の例では、溶解素は、細菌細胞によって天然に生産され得るものである。一部の例では、溶解素は、バクテリオファージによって天然に生産され得るものである。一部の例では、溶解素は、宿主に常在する細菌を阻害するファージから入手される。一部の例では、溶解素は、天然に存在する溶解素をベースとして改変される。一部の例では、溶解素は、例えば、溶解素にシグナルペプチドを導入することにより、宿主細菌によって分泌されるように改変される。一部の例では、溶解素は、ファージホリンとの組み合わせで使用される。一部の例では、溶解素は、溶解素に敏感でない組換え細菌宿主によって発現される。一部の例では、溶解素を使用して、宿主に常在するグラム陽性又はグラム陰性細菌が阻害される。
【０２０５】
溶解素は、任意のクラスの溶解素であり得、１つ以上の基質特異性を有し得る。例えば、溶解素は、グリコシダーゼ、エンドペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ又はこれらの組み合わせであり得る。一部の例では、溶解素は、細胞壁の糖部分のβ−１−４グリコシド結合、細菌細胞壁の糖及びペプチド部分をつなぐアミド結合及び／又は細胞壁のペプチド部分間のペプチド結合を切断する。溶解素は、ペプチドグリカン内での切断部位に応じて１つ以上の特定の溶解素群に属し得る。一部の例では、溶解素は、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−ムラミダーゼ（例えば、リゾチーム）、溶解性トランスグリコシラーゼ、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニンアミダーゼ、Ｌ，Ｄ−エンドペプチダーゼ、Ｄ，Ｄ−エンドペプチダーゼ、Ｄ，Ｄ−カルボキシペプチダーゼ、Ｌ，Ｄ−カルボキシペプチダーゼ又はＬ，Ｄ−トランスペプチダーゼである。溶解素及びその活性の非限定的な例を表５に挙げる。
【０２０６】
【表７９】
2020506960.tif 000081
【０２０７】
【表８０】
2020506960.tif 000082
【０２０８】
【表８１】
2020506960.tif 000083
【０２０９】
【表８２】
2020506960.tif 000084
【０２１０】
【表８３】
2020506960.tif 000085
【０２１１】
【表８４】
2020506960.tif 000086
【０２１２】
【表８５】
2020506960.tif 000087
【０２１３】
【表８６】
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【０２１４】
【表８７】
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【０２１５】
【表８８】
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【０２１６】
【表８９】
2020506960.tif 000091
【０２１７】
【表９０】
2020506960.tif 000092
【０２１８】
【表９１】
2020506960.tif 000093
【０２１９】
【表９２】
2020506960.tif 000094
【０２２０】
【表９３】
2020506960.tif 000095
【０２２１】
【表９４】
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【０２２２】
【表９５】
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【０２２３】
【表９６】
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【０２２４】
【表９７】
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【０２２５】
【表９８】
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【０２２６】
【表９９】
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【０２２７】
【表１００】
2020506960.tif 000102
【０２２８】
一部の例では、溶解素は、本明細書に記載される溶解素の機能的に活性な変異体である。一部の例では、溶解素の変異体は、例えば、特定の領域にわたり又は配列全体にわたり、本明細書に記載される溶解素又は天然に存在する溶解素の配列と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する。
【０２２９】
一部の例では、溶解素は得生物工学的に操作され得、その生物活性を調節し、例えば増加若しくは低下させるか、又は調整するか、又は標的微生物を指定し得る。一部の例では、溶解素は、微生物細胞の翻訳機構（例えば、リボソーム等）によって産生される。一部の例では、溶解素は、化学的に合成される。一部の例では、溶解素は、ポリペプチド前駆体に由来する。ポリペプチド前駆体は、切断（例えば、プロテアーゼによるプロセシング）を受けると、溶解素自体のポリペプチドを生じさせることができる。このように、一部の例では、溶解素は、前駆体ポリペプチドから産生される。一部の例では、溶解素は、翻訳後修飾、例えば切断又は１つ以上の官能基の付加を受けたポリペプチドを含む。
【０２３０】
本明細書に記載される溶解素は、本明細書に記載される任意の使用のために組成物に製剤化され得る。本明細書に開示される組成物は、少なくとも約１つの溶解素、２、３、４、５、１０、１５、２０又はそれを超える溶解素のいずれか１つなど、任意の数又は種類（例えば、クラス）の溶解素を含み得る。組成物中の各溶解素の好適な濃度は、溶解素の有効性、安定性、異なる溶解素の数、製剤及び組成物の施用方法などの要因に依存する。一部の例では、液体組成物中の各溶解素は、約０．１ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬである。一部の例では、固体組成物中の各溶解素は、約０．１ｎｇ／ｇ〜約１００ｍｇ／ｇである。一部の例では、ここで、本組成物は、少なくとも２種類の溶解素を含み、溶解素の各種類の濃度は、同じであるか又は異なり得る。
【０２３１】
本明細書に記載されるとおりの溶解素を含む調節薬剤は、（ａ）標的宿主の内部で目標レベル（例えば、所定又は閾値レベル）の溶解素濃度に達する；（ｂ）標的宿主の腸の内部で目標レベル（例えば、所定又は閾値レベル）の溶解素濃度に達する；（ｃ）標的宿主のバクテリオサイトの内部で目標レベル（例えば、所定又は閾値レベル）の溶解素濃度に達する；（ｄ）標的宿主の１つ以上の微生物（例えば、内部共生体）のレベル又は活動を調節する；又は／及び（ｅ）標的宿主の適応度を調節するのに十分な量で且つ十分な時間にわたって標的宿主と接触させることができる。
【０２３２】
（ｃ）抗微生物ペプチド
本明細書に記載される調節薬剤は、抗微生物ペプチド（ＡＭＰ）を含み得る。宿主に常在する微生物を阻害するのに好適な任意のＡＭＰを使用し得る。ＡＭＰは、多様な分子の群であり、そのアミノ酸組成及び構造に基づいてサブ群に分けられる。ＡＭＰは、植物（例えば、コプシン）、昆虫（例えば、ドロソシン、サソリペプチド（例えば、Ｕｙ１９２、ＵｙＣＴ３、Ｄ３、Ｄ１０、Ｕｙ１７、Ｕｙ１９２）、マストパラン、ポネラトキシン、セクロピン、モリシン、メリチン）、カエル（例えば、マガイニン、ダーマセプチン、オーレイン）及び哺乳類（例えば、カテリシジン類、デフェンシン類及びプロテグリン類）に由来するＡＭＰを含め、天然でＡＭＰを生産する任意の生物に由来するか又はそれから生産され得る。例えば、ＡＭＰは、Ｕｙ１９２（５’−ＦＬＳＴＩＷＮＧＩＫＧＬＬ−３’；配列番号２２７）、ＵｙＣＴ３（５’−ＬＳＡＩＷＳＧＩＫＳＬＦ−３；配列番号２２８）、Ｄ３（５’−ＬＷＧＫＬＷＥＧＶＫＳＬＩ−３’；配列番号２２９）及びＤ１０（５’−ＦＰＦＬＫＬＳＬＫＩＰＫＳＡＩＫＳＡＩＫＲＬ−３’；配列番号２３０）、Ｕｙ１７（５’−ＩＬＳＡＩＷＳＧＩＫＧＬＬ−３’；配列番号２３１）又はこれらの組み合わせなどのサソリペプチドであり得る。一部の例では、抗微生物ペプチドは、動物病原体のベクターに対する、以下：セクロピン（配列番号８２）、メリチン、コプシン、ドロソマイシン（配列番号９３）、ダームシジン（配列番号８１）、アンドロピン（配列番号８３）、モリシン（配列番号８４）、セラトトキシン（配列番号８５）、アバエシン（配列番号８６）、アピダエシン（配列番号８７）、プロフェニン（配列番号８８）、インドリシジン（配列番号８９）、プロテグリン（配列番号９０）、タキプレシン（配列番号９１）又はデフェンシン（配列番号９２）の１つ以上と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％又は１００％の配列同一性）を有するものであり得る。ＡＭＰの非限定的な例を表６に挙げる。
【０２３３】
【表１０１】
2020506960.tif 000103
【０２３４】
【表１０２】
2020506960.tif 000104
【０２３５】
【表１０３】
2020506960.tif 000105
【０２３６】
ＡＭＰは、任意の数の標的微生物に対して活性があり得る。一部の例では、ＡＭＰは、抗細菌及び／又は抗真菌活性を有し得る。一部の例では、ＡＭＰは、狭域スペクトル生物活性又は広域スペクトル生物活性を有し得る。例えば、一部のＡＭＰは、少数の細菌種又は真菌種のみを標的としてそれを死滅させるが、別のＡＭＰは、グラム陰性及びグラム陽性の両方の細菌並びに真菌に対する活性がある。
【０２３７】
更に、ＡＭＰは、幾つもの既知の作用機構で機能し得る。例えば、細胞膜は、ＡＭＰの高頻度標的であるが、ＡＭＰは、ＤＮＡ及びタンパク質合成、タンパク質フォールディング及び細胞壁合成にも干渉し得る。一部の例では、正味カチオン荷電の、両親媒性の性質を有するＡＭＰは、細菌膜を破壊して細胞溶解をもたらす。一部の例では、ＡＭＰは、細胞に侵入して細胞内標的と相互作用することにより、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質又は細胞壁合成に干渉し得る。微生物を死滅させることに加えて、ＡＭＰは、宿主遺伝子発現を変化させ、ケモカインとして役割を果たし且つ／又はケモカイン産生を誘導し、リポ多糖誘発性炎症誘発性サイトカイン産生を阻害し、創傷治癒を促進し、及び樹状細胞及び適応免疫応答細胞の応答を調節する能力を含め、感染のクリアランスに関わる幾つもの免疫調節機能を実証している。
【０２３８】
一部の例では、ＡＭＰは、本明細書に記載されるＡＭＰの機能的に活性な変異体である。一部の例では、ＡＭＰの変異体は、例えば、特定の領域にわたり又は配列全体にわたり、本明細書に記載されるＡＭＰ又は天然由来のＡＭＰの配列と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する。
【０２３９】
一部の例では、ＡＭＰは、生物工学的に操作され得、その生物活性を調節し、例えば増加若しくは低下させるか、又は調整するか、又は標的微生物を指定し得る。一部の例では、ＡＭＰは、細胞の翻訳機構（例えば、リボソーム等）によって産生される。一部の例では、ＡＭＰは、化学的に合成される。一部の例では、ＡＭＰは、ポリペプチド前駆体に由来する。ポリペプチド前駆体は、切断（例えば、プロテアーゼによるプロセシング）を受けると、ＡＭＰ自体のポリペプチドを生じさせることができる。このように、一部の例では、ＡＭＰは、前駆体ポリペプチドから産生される。一部の例では、ＡＭＰは、翻訳後修飾、例えば切断又は１つ以上の官能基の付加を受けたポリペプチドを含む。
【０２４０】
本明細書に記載されるＡＭＰは、本明細書に記載される任意の使用のために組成物に製剤化され得る。本明細書に開示される組成物は、少なくとも約１つのＡＭＰ、２、３、４、５、１０、１５、２０又はそれを超えるＡＭＰのいずれか１つなど、任意の数又は種類（例えば、クラス）のＡＭＰを含み得る。例えば、本組成物は、ＡＭＰのカクテル（例えば、サソリペプチド、例えばＵｙＣＴ３、Ｄ３、Ｄ１０及びＵｙ１７のカクテル）を含み得る。組成物中の各ＡＭＰの好適な濃度は、ＡＭＰの有効性、安定性、組成物中にある異なるＡＭＰの数、製剤及び組成物の施用方法などの要因に依存する。一部の例では、液体組成物中の各ＡＭＰは、約０．１ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬ（約０．１ｎｇ／ｍＬ〜約１ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ〜約１０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ〜約１０００ｎｇ／ｍＬ、約１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬ）である。一部の例では、固体組成物中の各ＡＭＰは、約０．１ｎｇ／ｇ〜約１００ｍｇ／ｇ（約０．１ｎｇ／ｇ〜約１ｎｇ／ｇ、約１ｎｇ／ｇ〜約１０ｎｇ／ｇ、約１０ｎｇ／ｇ〜約１００ｎｇ／ｇ、約１００ｎｇ／ｇ〜約１０００ｎｇ／ｇ、約１ｍｇ／ｇ〜約１０ｍｇ／ｇ、約１０ｍｇ／ｇ〜約１００ｍｇ／ｇ）である。一部の例では、ここで、本組成物は、少なくとも２種類のＡＭＰを含み、ＡＭＰの各種類の濃度は、同じであるか又は異なり得る。
【０２４１】
本明細書に記載されるとおりのＡＭＰを含む調節薬剤は、（ａ）標的宿主の内部で目標レベル（例えば、所定又は閾値レベル）のＡＭＰ濃度に達する；（ｂ）標的宿主の腸の内部で目標レベル（例えば、所定又は閾値レベル）のＡＭＰ濃度に達する；（ｃ）標的宿主のバクテリオサイトの内部で目標レベル（例えば、所定又は閾値レベル）のＡＭＰ濃度に達する；（ｄ）標的宿主の１つ以上の微生物（例えば、内部共生体）のレベル又は活動を調節する；又は／及び（ｅ）標的宿主の適応度を調節するのに十分な量で且つ十分な時間にわたって標的宿主と接触させることができる。
【０２４２】
実施例１６及び２０〜２２によって示されるとおり、サソリペプチドなどのＡＭＰを、昆虫宿主の内部共生細菌を標的とする調節薬剤として使用して、宿主の適応度（例えば、本明細書に概説されるとおりの）を低下させることができる。
【０２４３】
（ｄ）根粒Ｃリッチペプチド
本明細書に記載される調節薬剤は、根粒Ｃリッチペプチド（ＮＣＲペプチド）を含み得る。ＮＣＲペプチドは、ある種のマメ科植物で生産され、植物細胞が何千もの細胞内内部共生体を含有する根粒の形成をもたらすリゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）の細菌（根粒菌）との植物の相利共生的窒素固定共生において重要な役割を果たす。ＮＣＲペプチドは、細菌の不可逆的な最終分化過程を指図する抗微生物特性を備え、それにより例えば細菌膜を透過処理し、細胞分裂を破綻させるか又はタンパク質合成を阻害する。例えば、アルファルファ根粒菌（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）に感染したメディカゴ・トルンカトゥラ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）根粒細胞では、高い倍数性の窒素固定バクテロイドへの細菌の不可逆的な分化を指図する何百ものＮＣＲペプチドが生産される）。ＮＣＲペプチドの非限定的な例を表７に挙げる。
【０２４４】
【表１０４】
2020506960.tif 000106
【０２４５】
【表１０５】
2020506960.tif 000107
【０２４６】
【表１０６】
2020506960.tif 000108
【０２４７】
【表１０７】
2020506960.tif 000109
【０２４８】
【表１０８】
2020506960.tif 000110
【０２４９】
【表１０９】
2020506960.tif 000111
【０２５０】
【表１１０】
2020506960.tif 000112
【０２５１】
【表１１１】
2020506960.tif 000113
【０２５２】
【表１１２】
2020506960.tif 000114
【０２５３】
【表１１３】
2020506960.tif 000115
【０２５４】
【表１１４】
2020506960.tif 000116
【０２５５】
【表１１５】
2020506960.tif 000117
【０２５６】
【表１１６】
2020506960.tif 000118
【０２５７】
【表１１７】
2020506960.tif 000119
【０２５８】
当該技術分野において公知の任意のＮＣＲペプチドは、本明細書に記載される方法又は組成物における使用に好適である。ＮＣＲペプチド生産植物としては、限定はされないが、ピスム・サティブム（Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ）（エンドウマメ）、アストラガルス・シニクス（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ  ｓｉｎｉｃｕｓ）（ＩＲＬＣマメ科植物）、ファセオルス・ブルガリス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）（インゲンマメ）、ビグナ・ウンギクラタ（Ｖｉｇｎａ  ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔａ）（ササゲ）、メディカゴ・トルンカトゥラ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）（タルウマゴヤシ）及びロトゥス・ジャポニクス（Ｌｏｔｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）が挙げられる。例えば、Ｍ．トルンカトゥラ（Ｍ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）のゲノム配列から６００を超える候補ＮＣＲペプチドが予測され、根粒から分離された細胞において約１５０の異なるＮＣＲペプチドが質量分析法によって検出されている。
【０２５９】
本明細書に記載されるＮＣＲペプチドは、成熟又は未成熟ＮＣＲペプチドであり得る。未成熟ＮＣＲペプチドは、小胞体への移行に必要であり且つ移行後に切断されるＣ末端シグナルペプチドを有する。ＮＣＲペプチドのＮ末端は、分泌経路への標的化のためのシグナルペプチドを含み、これは、切断可能であり得る。ＮＣＲペプチドは、概して、その構造を安定化させるジスルフィド架橋を有する小さいペプチドである。成熟ＮＣＲペプチドは、約２０〜約６０アミノ酸、約２５〜約５５アミノ酸、約３０〜約５０アミノ酸、約３５〜約４５アミノ酸の範囲又はその間にある任意の範囲の長さを有する。ＮＣＲペプチドは、システイン残基の保存配列を含み、残りのペプチド配列は、極め可変的であり得る。ＮＣＲペプチドは、概して約４つ又は８つのシステインを有する。
【０２６０】
ＮＣＲペプチドは、アニオン性、中性又はカチオン性であり得る。一部の例では、約８より高いｐＩを有する合成カチオン性ＮＣＲペプチドが抗微生物活性を有する。例えば、ＮＣＲ２４７（ｐＩ＝１０．１５）（ＲＮＧＣＩＶＤＰＲＣＰＹＱＱＣＲＲＰＬＹＣＲＲＲ；配列番号１９８）及びＮＣＲ３３５（ｐＩ＝１１．２２）（ＭＡＱＦＬＬＦＶＹＳＬＩＩＦＬＳＬＦＦＧＥＡＡＦＥＲＴＥＴＲＭＬＴＩＰＣＴＳＤＤＮＣＰＫＶＩＳＰＣＨＴＫＣＦＤＧＦＣＧＷＹＩＥＧＳＹＥＧＰ；配列番号１９９）は、両方ともグラム陰性及びグラム陽性細菌並びに真菌に対して有効である。一部の例では、ＮＣＲ００１など、中性及び／又はアニオン性ＮＣＲペプチドは、約８より大きいｐＩで抗微生物活性を有しない。
【０２６１】
一部の例では、ＮＣＲペプチドは細菌を死滅させるのに有効である。一部の例では、ＮＣＲペプチドは、アルファルファ根粒菌（Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ）、ゼノラブダス属種（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ  ｓｐｐ）、フォトラブダス属種（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ  ｓｐｐ）、カンディダトゥス属種（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  ｓｐｐ）、ブフネラ属種（Ｂｕｃｈｎｅｒａ  ｓｐｐ）、ブラッタバクテリウム属種（Ｂｌａｔｔａｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ）、バウマンニア属種（Ｂａｕｍａｎｉａ  ｓｐｐ）、ウィグルスウォーチア属種（Ｗｉｇｇｌｅｓｗｏｒｔｈｉａ  ｓｐｐ）、ボルバキア属種（Ｗｏｌｂａｃｈｉａ  ｓｐｐ）、リケッチア属種（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｓｐｐ）、オリエンティア属種（Ｏｒｉｅｎｔｉａ  ｓｐｐ）、ソーダリス属種（Ｓｏｄａｌｉｓ  ｓｐｐ）、バークホルデリア属種（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐｐ）、カプリアビダス属種（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｓｐｐ）、フランキア属種（Ｆｒａｎｋｉａ  ｓｐｐ）、シノリゾビウム属種（Ｓｎｉｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐｐ）、ストレプトコッカス属種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ）、ウォリネラ属種（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ  ｓｐｐ）、キシレラ属種（Ｘｙｌｅｌｌａ  ｓｐｐ）、エルウィニア属種（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｓｐｐ）、アグロバクテリウム属種（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ）、バチルス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ）、パエニバチルス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ）、ストレプトミセス属種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ）、ミクロコッカス属種（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ）、コリネバクテリウム属種（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ）、アセトバクター属種（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ）、シアノバクテリア属種（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｓｐｐ）、サルモネラ属種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ）、ロドコッカス属種（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ）、シュードモナス属種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ）、ラクトバチルス属種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ）、エンテロコッカス属種（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ）、アルカリゲネス属種（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐｐ）、クレブシエラ属種（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ）、パエニバチルス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ）、アルスロバクター属種（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ）、コリネバクテリウム属種（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ）、ブレビバクテリウム属種（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ）、サーマス属種（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｐｐ）、シュードモナス属種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ）、クロストリジウム属種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ）又は大腸菌属種（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｓｐｐ）を死滅させるのに有効である。
【０２６２】
一部の例では、ＮＣＲペプチドは、本明細書に記載されるＮＣＲペプチドの機能的に活性な変異体である。一部の例では、ＮＣＲペプチドの変異体は、例えば、特定の領域にわたり又は配列全体にわたり、本明細書に記載されるＮＣＲペプチド又は天然由来のＮＣＲペプチドの配列と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する。
【０２６３】
一部の例では、ＮＣＲペプチドは、生物工学的に操作され得、その生物活性を調節し、例えば増加若しくは低下させるか、又は調整するか、又は標的微生物を指定し得る。一部の例では、ＮＣＲペプチドは、細胞の翻訳機構（例えば、リボソーム等）によって産生される。一部の例では、ＮＣＲペプチドは、化学的に合成される。一部の例では、ＮＣＲペプチドは、ポリペプチド前駆体に由来する。ポリペプチド前駆体は、切断（例えば、プロテアーゼによるプロセシング）を受けると、ＮＣＲペプチド自体を生じさせることができる。このように、一部の例では、ＮＣＲペプチドは、前駆体ポリペプチドから産生される。一部の例では、ＮＣＲペプチドは、翻訳後修飾、例えば切断又は１つ以上の官能基の付加を受けたポリペプチドを含む。
【０２６４】
本明細書に記載されるＮＣＲペプチドは、本明細書に記載される任意の使用のために組成物に製剤化され得る。本明細書に開示される組成物は、少なくとも約１つのＮＣＲペプチド、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、１００又はそれを超えるＮＣＲペプチドのいずれか１つなど、任意の数又は種類のＮＣＲペプチドを含み得る。組成物中の各ＮＣＲペプチドの好適な濃度は、ＮＣＲペプチドの有効性、安定性、異なるＮＣＲペプチドの数、製剤及び組成物の施用方法などの要因に依存する。一部の例では、液体組成物中の各ＮＣＲペプチドは、約０．１ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬである。一部の例では、固体組成物中の各ＮＣＲペプチドは、約０．１ｎｇ／ｇ〜約１００ｍｇ／ｇである。一部の例では、ここで、本組成物は、少なくとも２種類のＮＣＲペプチドを含み、ＮＣＲペプチドの各種類の濃度は、同じであるか又は異なり得る。
【０２６５】
本明細書に記載されるとおりのＮＣＲペプチドを含む調節薬剤は、（ａ）標的宿主の内部で目標レベル（例えば、所定又は閾値レベル）のＮＣＲペプチド濃度に達する；（ｂ）標的宿主の腸の内部で目標レベル（例えば、所定又は閾値レベル）のＮＣＲペプチド濃度に達する；（ｃ）標的宿主のバクテリオサイトの内部で目標レベル（例えば、所定又は閾値レベル）のＮＣＲペプチド濃度に達する；（ｄ）標的宿主の１つ以上の微生物（例えば、内部共生体）のレベル又は活動を調節する；又は／及び（ｅ）標的宿主の適応度を調節するのに十分な量で且つ十分な時間にわたって標的宿主と接触させることができる。
【０２６６】
（ｅ）バクテリオサイト調節性ペプチド
本明細書に記載される調節薬剤は、バクテリオサイト調節性ペプチド（ＢＲＰ）を含み得る。ＢＲＰは、昆虫のバクテリオサイトに発現するペプチドである。この遺伝子は、初めに発育時点で共生体の取り込みと同時に発現し、そのバクテリオサイト特異的発現が昆虫の生涯にわたって維持される。一部の例では、ＢＲＰは、疎水性アミノ末端ドメインを有し、これは、シグナルペプチドであると予想されている。加えて、一部のＢＲＰは、システインリッチドメインを有する。一部の例では、バクテリオサイト調節性ペプチドは、バクテリオサイト特異的システインリッチ（ＢＣＲ）タンパク質である。バクテリオサイト調節性ペプチドは、長さが約４０〜１５０アミノ酸である。一部の例では、バクテリオサイト調節性ペプチドは、長さが約４５〜約１４５、約５０〜約１４０、約５５〜約１３５、約６０〜約１３０、約６５〜約１２５、約７０〜約１２０、約７５〜約１１５、約８０〜約１１０、約８５〜約１０５の範囲又はその間にある任意の範囲である。ＢＲＰ及びその活性の非限定的な例を表８に挙げる。
【０２６７】
【表１１８】
2020506960.tif 000120
【０２６８】
【表１１９】
2020506960.tif 000121
【０２６９】
一部の例では、ＢＲＰは、宿主のバクテリオサイトに常在する１つ以上の細菌の成長及び／又は活動を変化させる。一部の例では、ＢＲＰは、生物工学的に操作され得、その生物活性を調節するか（例えば、増加させるか、低下させるか、若しくは調整し）、又は標的微生物を指定し得る。一部の例では、ＢＲＰは、細胞の翻訳機構（例えば、リボソーム等）によって産生される。一部の例では、ＢＲＰは、化学的に合成される。一部の例では、ＢＲＰは、ポリペプチド前駆体に由来する。ポリペプチド前駆体は、切断（例えば、プロテアーゼによるプロセシング）を受けると、ＢＲＰ自体のポリペプチドを生じさせることができる。このように、一部の例では、ＢＲＰは、前駆体ポリペプチドから産生される。一部の例では、ＢＲＰは、翻訳後修飾、例えば切断又は１つ以上の官能基の付加を受けたポリペプチドを含む。
【０２７０】
本明細書に記載されるとおりのＢＲＰの機能的に活性な変異体も、本明細書に記載される組成物及び方法において有用である。一部の例では、ＢＲＰの変異体は、例えば、特定の領域にわたり又は配列全体にわたり、本明細書に記載されるＢＲＰ又は天然由来のＢＲＰの配列と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する。
【０２７１】
本明細書に記載されるＢＲＰは、本明細書に記載される任意の使用のために組成物に製剤化され得る。本明細書に開示される組成物は、少なくとも約１つのＢＲＰ、２、３、４、５、１０、１５、２０又はそれを超えるＢＲＰのいずれか１つなど、任意の数又は種類（例えば、クラス）のＢＲＰを含み得る。組成物中の各ＢＲＰの好適な濃度は、ＢＲＰの有効性、安定性、異なるＢＲＰの数、製剤及び組成物の施用方法などの要因に依存する。一部の例では、液体組成物中の各ＢＲＰは、約０．１ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬである。一部の例では、固体組成物中の各ＢＲＰは、約０．１ｎｇ／ｇ〜約１００ｍｇ／ｇである。一部の例では、ここで、本組成物は、少なくとも２種類のＢＲＰを含み、ＢＲＰの各種類の濃度は、同じであるか又は異なり得る。
【０２７２】
本明細書に記載されるとおりのＢＲＰを含む調節薬剤は、（ａ）標的宿主の内部で目標レベル（例えば、所定又は閾値レベル）のＢＲＰ濃度に達する；（ｂ）標的宿主の腸の内部で目標レベル（例えば、所定又は閾値レベル）のＢＲＰ濃度に達する；（ｃ）標的宿主のバクテリオサイトの内部で目標レベル（例えば、所定又は閾値レベル）のＢＲＰ濃度に達する；（ｄ）標的宿主の１つ以上の微生物（例えば、内部共生体）のレベル又は活動を調節する；又は／及び（ｅ）標的宿主の適応度を調節するのに十分な量で且つ十分な時間にわたって標的宿主と接触させることができる。
【０２７３】
ｉｉｉ．小分子
多くの小分子（例えば、抗生物質又は代謝産物）を、本明細書に記載される組成物及び方法において使用し得る。一部の例では、本明細書に記載される小分子の有効濃度は、宿主に常在する１つ以上の微生物（本明細書に記載されるとおり）のレベル、活動又は代謝を変化させることができ、この変化が宿主の適応度の減少をもたらし得る。
【０２７４】
本明細書に記載されるとおりの小分子を含む調節薬剤は、（ａ）標的宿主の内部で目標レベル（例えば、所定又は閾値レベル）の小分子濃度に達する；（ｂ）標的宿主の腸の内部で目標レベル（例えば、所定又は閾値レベル）の小分子濃度に達する；（ｃ）標的宿主のバクテリオサイトの内部で目標レベル（例えば、所定又は閾値レベル）の小分子濃度に達する；（ｄ）標的宿主の１つ以上の微生物（例えば、内部共生体）のレベル又は活動を調節する；又は／及び（ｅ）標的宿主の適応度を調節するのに十分な量で且つ十分な時間にわたって標的宿主と接触させることができる。
【０２７５】
カ、コダニ、シラミ又はマダニなどの宿主昆虫（例えば、動物病原体のベクター）の適応度を低下させるため、以下で考察する小分子、即ち抗生物質及び二次代謝産物を使用して、本節に示されるとおりの標的微生物のレベル、活動又は代謝を変化させることができる。
【０２７６】
（ａ）抗生物質
本明細書に記載される調節薬剤は、抗生物質を含み得る。当該技術分野において公知の任意の抗生物質を使用し得る。抗生物質は、通常、その作用機構、化学構造又は活性スペクトルに基づいて分類される。
【０２７７】
本明細書に記載される抗生物質は、任意の細菌機能又は成長過程を標的とし得、静菌性（例えば、細菌成長を遅らせ又は妨げる）又は殺菌性（例えば、細菌を死滅させる）のいずれであり得る。一部の例では、抗生物質は、殺菌性抗生物質である。一部の例では、殺菌性抗生物質は、細菌細胞壁を標的とするもの（例えば、ペニシリン系及びセファロスポリン系）；細胞膜を標的とするもの（例えば、ポリミキシン系）；又は必須細菌酵素を阻害するもの（例えば、リファマイシン系、リピアルマイシン系、キノロン系及びスルホンアミド系）である。一部の例では、殺菌性抗生物質は、アミノグリコシドである。一部の例では、抗生物質は、静菌性抗生物質である。一部の例では、静菌性抗生物質は、タンパク質合成を標的とする（例えば、マクロライド系、リンコサミド系及びテトラサイクリン系）。本明細書で使用し得る更なる抗生物質クラスとしては、環状リポペプチド系（ダプトマイシンなど）、グリシルサイクリン系（チゲサイクリンなど）、オキサゾリジノン系（リネゾリドなど）又はリピアルマイシン系（フィダキソマイシンなど）が挙げられる。抗生物質の例としては、オキシテトラサイクリン、ドキシサイクリン、リファンピシン、シプロフロキサシン、アンピシリン及びポリミキシンＢが挙げられる。他の抗生物質の非限定的な例を表９に掲載する。
【０２７８】
【表１２０】
2020506960.tif 000122
【０２７９】
本明細書に記載される抗生物質は、任意のレベルの標的特異性を有し得る（例えば、狭域又は広域スペクトル）。一部の例では、抗生物質は、狭域スペクトル抗生物質であり、従ってグラム陰性又はグラム陽性細菌などの特異的なタイプの細菌を標的とする。或いは、抗生物質は、広範囲の細菌を標的とする広域スペクトル抗生物質であり得る。
【０２８０】
本明細書に記載される抗生物質は、本明細書に記載される任意の使用のために組成物に製剤化され得る。本明細書に開示される組成物は、少なくとも約１つの抗生物質、２、３、４、５、１０、１５、２０又はそれを超える抗生物質（例えば、リファンピシンとドキシサイクリンとの併用又はアンピシリンとリファンピシンとの併用）のいずれか１つなど、任意の数又は種類（例えば、クラス）の抗生物質を含み得る。組成物中の各抗生物質の好適な濃度は、抗生物質の有効性、安定性、異なる抗生物質の数、製剤及び組成物の施用方法などの要因に依存する。一部の例では、ここで、本組成物は、少なくとも２種類の抗生物質を含み、抗生物質の各種類の濃度は、同じであるか又は異なり得る。
【０２８１】
本明細書に記載されるとおりの抗生物質を含む調節薬剤は、（ａ）標的宿主の内部で目標レベル（例えば、所定又は閾値レベル）の抗生物質濃度に達する；（ｂ）標的宿主の腸の内部で目標レベル（例えば、所定又は閾値レベル）の抗生物質濃度に達する；（ｃ）標的宿主のバクテリオサイトの内部で目標レベル（例えば、所定又は閾値レベル）の抗生物質濃度に達する；（ｄ）標的宿主の１つ以上の微生物（例えば、内部共生体）のレベル又は活動を調節する；又は／及び（ｅ）標的宿主の適応度を調節するのに十分な量で且つ十分な時間にわたって標的宿主と接触させることができる。
【０２８２】
実施例１〜４、１４、２６及び２７によって示されるとおり、抗生物質（例えば、ドキシサイクリン、オキシテトラサイクリン、アジスロマイシン、シプロフロキサシン又はリファンピシン）を、カ又はコダニ又はマダニ又はハジラミなど、昆虫宿主（例えば、動物病原体のベクター昆虫）におけるボルバキア属種（Ｗｏｌｂａｃｈｉａ  ｓｐｐ．）などの内部共生細菌を標的とする調節薬剤として使用して、宿主の適応度（例えば、本明細書に概説されるとおりの）を低下させることができる。実施例３によって示されるとおり、オキシテトラサイクリンなどの抗生物質を、ダニなどの昆虫宿主におけるリケッチア属種（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｓｐｐ．）などの内部共生細菌を標的とする調節薬剤として使用して、宿主の適応度（例えば、本明細書に概説されるとおりの）を低下させることができる。
【０２８３】
（ｂ）二次代謝産物
一部の例では、本明細書に記載される組成物及び方法の調節薬剤は、二次代謝産物を含む。二次代謝産物は、生物によって生産される有機分子に由来する。二次代謝産物は、（ｉ）細菌、真菌、アメーバ、植物、昆虫及び大型動物に対して使用される競合薬剤；（ｉｉ）金属運搬薬剤；（ｉｉｉ）微生物と植物、昆虫及び高等動物との間の共生薬剤；（ｉｖ）性ホルモン；及び（ｖ）分化エフェクターとして作用し得る。二次代謝産物の非限定的な例を表１０に掲載する。
【０２８４】
【表１２１】
2020506960.tif 000123
【０２８５】
本明細書で使用される二次代謝産物には、任意の公知の二次代謝産物群からの代謝産物が含まれ得る。例えば、二次代謝産物は、以下の群に分類することができる：アルカロイド類、テルペノイド類、フラボノイド類、グリコシド類、天然フェノール類（例えば、ゴシポール酢酸）、エナール類（例えば、ｔｒａｎｓ−シンナムアルデヒド）、フェナジン類、ビフェノール類及びジベンゾフラン類、ポリケチド類、脂肪酸シンターゼペプチド、非リボソーム性ペプチド、リボソーム合成ペプチド及び翻訳後修飾ペプチド、ポリフェノール類、多糖類（例えば、キトサン）及びバイオポリマー類。二次代謝産物の詳細なレビューについては、例えば、Ｖｉｎｉｎｇ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４４：３９５−４２７，１９９０を参照されたい。
【０２８６】
本明細書に記載される組成物及び方法に有用な二次代謝産物としては、内部共生体（例えば、一次又は二次内部共生体）、バクテリオサイト又は細胞外共生体の天然の機能を変化させるものが挙げられる。一部の例では、本明細書に記載される１つ以上の二次代謝産物は、抗微生物化合物に関するハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）から分離される。例えば、ＨＴＳスクリーニングにより、１つの特定領域の多様な生態系で成長する生物からの３９，０００を超える粗抽出物からグラム陽性及びグラム陰性細菌に対する特異性を有する４９の抗細菌性抽出物が同定された。一部の例では、二次代謝産物は、バクテリオサイト内で輸送される。
【０２８７】
一部の例では、小分子は、ビタミン合成の阻害薬である。一部の例では、ビタミン合成阻害薬は、ビタミン前駆類似体である。特定の例では、ビタミン前駆類似体は、パントテノールである。
【０２８８】
一部の例では、小分子は、アミノ酸類似体である。特定の例では、アミノ酸類似体は、Ｌ−カナバニン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−バリン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−スレオニン、Ｄ−ロイシン、Ｌ−ＮＧ−ニトロアルギニン又はこれらの組み合わせである。
【０２８９】
一部の例では、小分子は、プロピオン酸、レブリン酸、ｔｒａｎｓ−シンナムアルデヒド、ナイシン又は低分子量キトサンなどの天然抗微生物化合物である。本明細書に記載される二次代謝産物は、本明細書に記載される任意の使用のために組成物に製剤化され得る。本明細書に開示される組成物は、少なくとも約１つの二次代謝産物、２、３、４、５、１０、１５、２０又はそれを超える二次代謝産物のいずれか１つなど、任意の数又は種類（例えば、クラス）の二次代謝産物を含み得る。組成物中の各二次代謝産物の好適な濃度は、二次代謝産物の有効性、安定性、異なる二次代謝産物の数、製剤及び組成物の施用方法などの要因に依存する。一部の例では、ここで、本組成物は、少なくとも２種類の二次代謝産物を含み、二次代謝産物の各種類の濃度は、同じであるか又は異なり得る。
【０２９０】
本明細書に記載されるとおりの二次代謝産物を含む調節薬剤は、（ａ）標的宿主の内部で目標レベル（例えば、所定又は閾値レベル）の二次代謝産物濃度に達する；（ｂ）標的宿主の腸の内部で目標レベル（例えば、所定又は閾値レベル）の二次代謝産物濃度に達する；（ｃ）標的宿主のバクテリオサイトの内部で目標レベル（例えば、所定又は閾値レベル）の二次代謝産物濃度に達する；（ｄ）標的宿主の１つ以上の微生物（例えば、内部共生体）のレベル又は活動を調節する；又は／及び（ｅ）標的宿主の適応度を調節するのに十分な量で且つ十分な時間にわたって標的宿主と接触させることができる。
【０２９１】
実施例１５によって示されるとおり、二次代謝産物（例えば、ゴシポール）を、昆虫宿主の内部共生細菌を標的とする調節薬剤として使用して、宿主の適応度（例えば、本明細書に概説されるとおりの）を低下させることができる。実施例１１〜１３、１５〜１９、２３及び２４によって更に例示されるとおり、ｔｒａｎｓ−シンナムアルデヒド、レブリン酸、キトサン、ビタミン類似体又はアミノ酸輸送阻害薬などの小分子を、昆虫宿主の内部共生細菌を標的とする調節薬剤として使用して、宿主の適応度（例えば、本明細書に概説されるとおりの）を低下させることができる。
【０２９２】
ｉｖ．調節薬剤としての細菌
一部の例では、本明細書に記載される調節薬剤は、１つ以上の細菌を含む。多くの細菌は、本明細書に記載される組成物及び方法に有用である。一部の例では、薬剤は、宿主に内因的に見られる細菌種である。一部の例では、細菌性調節薬剤は、内部共生細菌種である。調節薬剤として使用し得る細菌の非限定的な例としては、本明細書で詳細な説明の第ＩＩ節に記載されるあらゆる細菌種及び表１に挙げられるものが含まれる。例えば、調節薬剤は、ガンマプロテオバクテリア綱（Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、アルファプロテオバクテリア（Ａｌｐｈａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、ベータプロテオバクテリア（Ｂｅｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）、フィルミクテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）（例えば、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）及びバチルス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．））、クロストリジウム綱（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）、放線菌類（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）、スピロヘータ門（Ｓｐｉｒｏｃｈｅｔｅｓ）、ウェルコミクロビウム門（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ）及び放線菌門（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）を含め、昆虫の腸に存在する任意の細菌門からの細菌種であり得る。
【０２９３】
一部の例では、調節薬剤は、微生物多様性を破壊するか又は別様に宿主の微生物叢を宿主にとって有害な方法で変化させる細菌である。１つの例では、細菌はカの微生物叢を破壊するように提供され得る。例えば、細菌性調節薬剤は、カの共生細菌と競合し、それを排除し、且つ／又はその個体群を低減し得る。
【０２９４】
別の例では、細菌は、コダニの微生物叢を破壊するように提供され得る。例えば、細菌性調節薬剤は、コダニの共生細菌と競合し、それを排除し、且つ／又はその個体群を低減し得る。
【０２９５】
別の例では、細菌は、ハジラミの微生物叢を破壊するように提供され得る。例えば、細菌性調節薬剤は、ハジラミの共生細菌と競合し、それを排除し、且つ／又はその個体群を低減し得る。
【０２９６】
別の例では、細菌は、マダニの微生物叢を破壊するように提供され得る。例えば、細菌性調節薬剤は、マダニの共生細菌と競合し、それを排除し、且つ／又はその個体群を低減し得る。
【０２９７】
カ、コダニ、ハジラミ又はマダニなどの宿主昆虫（例えば、動物病原体のベクター）の適応度を低下させるため、本明細書で考察される細菌性調節薬剤を使用して、本節に示されるとおりの標的微生物のレベル、活動又は代謝を変化させることができる。
【０２９８】
ｖ．調節薬剤に対する修飾
（ａ）融合
本明細書に記載される調節薬剤のいずれも追加的な部分に融合又は連結し得る。一部の例では、調節薬剤には、１つ以上の追加的な部分（例えば、１つの追加的な部分、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれを超える追加的な部分）の融合物が含まれる。一部の例では、追加的な部分は、本明細書に記載される調節薬剤（例えば、ペプチド、ポリペプチド、小分子又は抗生物質）のいずれか１つである。或いは、追加的な部分は、調節薬剤自体として作用しなくてもよく、代わりに二次的機能を果たし得る。例えば、追加的な部分は、宿主の標的部位（例えば、宿主の腸又は宿主バクテリオサイト）において又は宿主（例えば、動物病原体のベクター、例えばカ、コダニ、ハジラミ又はマダニ）に常在する標的微生物において調節薬剤が到達するか、結合するか、又は活性化された状態になることを促進し得る。
【０２９９】
一部の例では、追加的な部分は、調節薬剤が標的宿主細胞又は宿主に常在する標的微生物に侵入することを促進し得る。例えば、追加的な部分には、細胞透過性ペプチドが含まれ得る。細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）は、タンパク質に由来する天然配列；２つの天然配列の融合によって形成されるキメラペプチド；又は構造−活性研究に基づいて合成的に設計された配列である合成ＣＰＰであり得る。一部の例では、ＣＰＰは、限られた毒性で細胞膜（例えば、原核及び真核細胞膜）を遍在的に通過する能力を有する。更に、ＣＰＰは、特定の受容体によるキラル認識の必要なしに、エネルギー依存性及び／又は非依存性機構によって細胞膜を通過する能力を有し得る。ＣＰＰは、本明細書に記載される任意の調節薬剤に結合させることができる。例えば、ＣＰＰは、細胞透過性ペプチドに融合した抗微生物ペプチド（ＡＭＰ）、例えばサソリペプチド、例えばＵＹ１９２（例えば、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＦＬＳＴＩＷＮＧＩＫＧＬＬＦＡＭ；配列番号２３２）に結合させることができる。ＣＰＰの非限定的な例を表１１に挙げる。
【０３００】
【表１２２】
2020506960.tif 000124
【０３０１】
他の例では、追加的な部分は、調節薬剤が宿主に常在する標的微生物（例えば、真菌又は細菌）に結合することを促進する。追加的な部分は、１つ以上のターゲティングドメインを含み得る。一部の例では、ターゲティングドメインは、調節薬剤を宿主の腸に常在する１つ以上の微生物（例えば、細菌又は真菌）に標的化し得る。一部の例では、ターゲティングドメインは、調節薬剤を宿主の特定の領域（例えば、宿主の腸又はバクテリオサイト）に標的化することにより、概して宿主の前記領域に存在する微生物に到達し得る。例えば、ターゲティングドメインは、調節薬剤を宿主の前腸、中腸又は後腸に標的化し得る。他の例では、ターゲティングドメインは、調節薬剤を宿主のバクテリオサイト及び／又は宿主バクテリオサイトに常在する１つ以上の特定の細菌に標的化し得る。例えば、ターゲティングドメインは、本明細書に記載される調節薬剤、例えばＡＭＰ、例えばサソリペプチド、例えばＵｙ１９２に結合したスノードロップ（Ｇａｌａｎｔｈｕｓ  ｎｉｖａｌｉｓ）レクチン又は凝集素（ＧＮＡ）であり得る。
【０３０２】
（ｂ）プレ又はプロドメイン
一部の例では、調節薬剤は、プレ又はプロアミノ酸配列を含み得る。例えば、調節薬剤は、プレ配列又はプロ配列の切断又は翻訳後修飾によって活性化され得る不活性なタンパク質又はペプチドであり得る。一部の例では、調節薬剤は、不活性化プレ配列又はプロ配列によって操作される。例えば、プレ配列又はプロ配列は、調節薬剤上の活性化部位、例えば受容体結合部位を隠し得るか又は調節薬剤のコンホメーション変化を誘導し得る。従って、プレ配列又はプロ配列の切断を受けると、調節薬剤が活性化される。
【０３０３】
或いは、調節薬剤は、プレ又はプロ小分子、例えば抗生物質を含み得る。調節薬剤は、宿主内部の標的環境で活性化され得る不活性な本明細書に記載される小分子であり得る。例えば、小分子は、宿主腸内が特定のｐＨに達したときに活性化され得る。
【０３０４】
（ｃ）リンカー
調節薬剤が追加的な部分に結び付いている例では、調節薬剤は、リンカーを更に含み得る。例えば、リンカーは、化学結合、例えば１つ以上の共有結合又は非共有結合であり得る。一部の例では、リンカーは、ペプチドリンカー（例えば、２、３、４、５、６、８、１０、１２、１４、１６、２０、２５、３０、３５、４０アミノ酸又はそれを超えて長い）であり得る。リンカーには、本明細書に記載される任意のフレキシブルリンカー、リジッドリンカー又は切断可能リンカーが含まれ得る。
【０３０５】
フレキシブルペプチドリンカーには、主にＧｌｙ及びＳｅｒ残基を有する配列を有するリンカー（「ＧＳ」リンカー）を含め、当該技術分野で一般的に使用されるもののいずれが含まれ得る。フレキシブルリンカーは、ある程度の動き又は相互作用を必要とするドメインをつなぎ合わせるのに有用となることもあり、小型の非極性（例えば、Ｇｌｙ）又は極性（例えば、Ｓｅｒ又はＴｈｒ）アミノ酸を含み得る。
【０３０６】
或いは、ペプチドリンカーは、リジッドリンカーであり得る。リジッドリンカーは、部分間を固定的な距離に保ってその独立した機能を維持するのに有用である。リジッドリンカーは、融合物中の１つ以上の構成成分の安定性又は生物活性を確保するためにドメインの空間的隔離が決定的に重要な場合にも有用であり得る。リジッドリンカーは、例えば、αヘリックス構造又はＰｒｏリッチ配列（ＸＰ）ｎ（ここで、Ｘは、任意のアミノ酸、好ましくはＡｌａ、Ｌｙｓ又はＧｌｕを意味する）を有し得る。
【０３０７】
更に他の例では、ペプチドリンカーは、切断可能リンカーであり得る。一部の例では、リンカーは、還元試薬又はプロテアーゼの存在下など、特定の条件下で切断され得る。インビボ切断可能リンカーは、ジスルフィド結合の可逆的な性質を利用し得る。一例としては、２つのＣｙｓ残基間におけるトロンビン感受性配列（例えば、ＰＲＳ）が挙げられる。インビトロでＣＰＲＳＣをトロンビン処理すると、トロンビン感受性配列の切断が起こる一方、可逆的ジスルフィド結合がインタクトなまま残る。かかるリンカーは、公知であり、例えばＣｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．６５（１０）：１３５７−１３６９，２０１３に記載されている。融合物中のリンカーの切断は、宿主の特定の細胞若しくは組織又は宿主に常在する微生物における条件下においてインビボで発現するプロテアーゼでも行われ得る。一部の例では、標的部位又は細胞への到達時、リンカーが切断されると、遊離した機能性の調節薬剤が放出され得る。
【０３０８】
本明細書に記載される融合物は、或いは、疎水性リンカー、例えば負電荷スルホン酸基；脂質、例えばポリ（−ＣＨ２−）炭化水素鎖、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基、その不飽和変種、そのアミド化された又は他にＮを含有する変種、非炭素リンカー；炭水化物リンカー；リン酸ジエステルリンカー又はその他、２つ以上の分子、例えば２つの調節薬剤を共有結合的に連結する能力を有する分子を含めた連結分子によって連結され得る。ロイシン、イソロイシン、バリン又は場合によりアラニン、フェニルアラニン又は更にはチロシン、メチオニン、グリシン又は他の疎水性残基がリッチな一連の残基など、調節薬剤の疎水性領域又は調節薬剤の疎水性伸長部を例えば介して調節薬剤が連結される疎水性脂質小球など、非共有結合リンカーも使用し得る。調節薬剤は、調節薬剤の正電荷部分が別の調節薬剤又は追加的な部分の負電荷に連結されるなど、電荷に基づいた化学を用いて連結され得る。
【０３０９】
ＩＶ．製剤及び組成物
本明細書に記載される組成物は、純粋な形態で製剤化されるか（例えば、組成物は調節薬剤のみを含む）、又は組成物の施用若しくは送達を促進するため１つ以上の追加的な薬剤（賦形剤、送達媒体、担体、希釈剤、安定剤など）と共に製剤化され得る。好適な賦形剤及び希釈剤の例としては、限定はされないが、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、生理食塩水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル及びプロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱油が挙げられる。
【０３１０】
一部の例では、本組成物は、送達媒体又は担体を含む。一部の例では、送達媒体は、賦形剤を含む。例示的賦形剤としては、限定はされないが、固体又は液体担体材料、溶媒、安定剤、徐放賦形剤、着色料及び界面活性物質（サーファクタント）が挙げられる。一部の例では、送達媒体は、安定化媒体である。一部の例では、安定化媒体は、安定化賦形剤を含む。例示的安定化賦形剤としては、限定はされないが、エポキシ化植物油、消泡剤、例えばシリコーン油、保存剤、粘性調節剤、結合剤及び粘着付与剤が挙げられる。一部の例では、安定化媒体は、調節薬剤に好適な緩衝液である。一部の例では、本組成物は、ポリマービーズ送達媒体にマイクロカプセル化される。一部の例では、安定化媒体は、調節薬剤をＵＶ及び／又は酸性条件から保護する。一部の例では、送達媒体は、ｐＨ緩衝液を含有する。一部の例では、本組成物は、例えば、５．０〜約８．０、約６．５〜約７．５又は約６．５〜約７．０のいずれか１つのｐＨ範囲を含め、約４．５〜約９．０の範囲のｐＨを有するように製剤化される。
【０３１１】
意図される目的及び優勢な状況に応じて、本組成物は、乳化性濃縮物、懸濁濃縮物、直接噴霧可能又は希釈可能な溶液、塗布可能なペースト、希釈エマルション、噴霧粉末、可溶性粉末、分散性粉末、水和性粉末、ダスト、顆粒、ポリマー物質にカプセル化されたもの、マイクロカプセル、泡、エアロゾル、二酸化炭素ガス調製物、錠剤、樹脂調製物、紙調製物、不織布調製物又は編物若しくは織物調製物に製剤化され得る。一部の例では、本組成物は、液体である。一部の例では、本組成物は、固体である。一部の例では、本組成物は、加圧エアロゾル缶などに入ったエアロゾルである。一部の例では、本組成物は、病害虫の廃棄物（糞便など）に存在する。一部の例では、本組成物は、生きている病害虫の体内又は体上に存在する。
【０３１２】
一部の例では、送達媒体は、宿主の飼料又は水である。他の例では、送達媒体は、宿主の飼料供給源である。一部の例では、送達媒体は、宿主のベイト飼料である。一部の例では、本組成物は、宿主によって摂取される摂食可能な薬剤である。一部の例では、本組成物は、宿主によって第２の宿主に送達され、第２の宿主によって摂取される。一部の例では、本組成物は、宿主又は第２の宿主によって摂取され、本組成物は、宿主又は第２の宿主の廃棄物（糞便など）を介して宿主又は第２の宿主の周囲に放出される。一部の例では、調節薬剤は、宿主が摂取するか、又はそのコロニーに持ち帰ることが意図されるベイト飼料中に含まれる。
【０３１３】
一部の例では、送達媒体は、細菌ベクターである。調節薬剤は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９に記載されるなどの当該技術分野において公知の任意の好適なクローニング方法及び試薬を使用して細菌ベクターに導入することができる。「細菌ベクター」は、本明細書で使用されるとき、細菌細胞の内部で複製する能力を有し、且つ細胞間で遺伝子を移行させる能力を有する、プラスミド、バクテリオファージベクター、トランスポゾン、コスミド及び染色体などの任意の遺伝要素を指す。例示的細菌ベクターとしては、限定はされないが、λベクター系ｇｔｌ  １、ｇｔ  ＷＥＳ．ｔＢ、シャロン４及びプラスミドベクター、例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＬＧ３３９、ｐＲ２９０、ｐＫＣ３７、ｐＫＣｌＯｌ、ＳＶ  ４０、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ±又はＫＳ±（“Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ”Ｃａｔａｌｏｇ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，１９９３を参照されたい）、ｐＱＥ、ｐＩＨ８２１、ｐＧＥＸ、ｐＥＴシリーズ（Ｓｔｕｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｔ７  ＲＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｔｏ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｌｏｎｅｄ  Ｇｅｎｅｓ”，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１８５，１９９０を参照されたい）及びその任意の誘導体が挙げられる。
【０３１４】
各細菌ベクターが１つ以上の調節薬剤をコードし得る。一部の例では、細菌ベクターは、標的共生細菌で発現し、そこにパッケージングされるファージゲノムを含む。一部の例では、細菌ベクターは、標的共生細菌又は宿主細菌で発現する溶解素をコードする核酸分子を含む。一部の例では、溶解素は、ホリンと共発現するか、又は溶解素は、宿主細菌からの分泌のためのシグナルペプチドを有するように改変される。一部の例では、細菌ベクターは、標的共生細菌で発現するバクテリオシンをコードする核酸分子を含む。一部の例では、細菌ベクターは、プロモーター、終結シグナル並びに転写及び翻訳エレメントなど、１つ以上の調節エレメントを更に含む。一部の例では、これらの調節配列は、標的共生細菌で発現する遺伝子（バクテリオシン、溶解素又は他のポリペプチドなど）をコードする核酸に作動可能に連結される。
【０３１５】
一部の例では、細菌ベクターは、宿主又は宿主のコロニー内のメンバーが摂食する細菌に導入される。一部の例では、細菌は、標的共生細菌である。一部の例では、細菌は、宿主の腸の天然に存在する細菌又はその遺伝子修飾された誘導体であり、これは、摂取を通じて宿主に容易に導入することができる。細菌ベクターを運ぶために使用される例示的細菌としては、限定はされないが、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）を含むプロテオバクター（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒ）；プロピオニバクテリウム属（Ｐｒｉｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）及びコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を含むアクチノバクター（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒ）；マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）の任意の種を含むフィルミクテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）；フィブロバクター門（Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒｅｓ）；トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）及びボレリア属（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）を含むスピロヘータ門（Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ）；バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）及びフラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を含むバクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）が挙げられる。また、限定はされないが、Ｓ．マルセセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、Ｓ．エントモフィラ（Ｓ．ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ）、Ｓ．プロテアマクランス（Ｓ．ｐｒｏｔｅａｍａｃｕｌａｎｓ）、Ｓ．マルセッセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｎｓｃｅｓ）を含めたセラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）を含む腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）の任意の細菌；限定はされないが、Ｅ．クロアカ（Ｅ．ｃｌｏａｃａｅ）、Ｅ．アムニゲナス（Ｅ．ａｍｎｉｇｅｎｕｓ）、Ｅ．エロゲネス（Ｅ．ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、Ｅ．ディソルベンス（Ｅ．ｄｉｓｓｏｌｖｅｎｓ）、Ｅ．アグロメランス（Ｅ．ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、Ｅ．ハフニア（Ｅ．ｈａｆｉｉｉａｅ）を含めたエンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）の任意の種；及び以下の属：シトロバクター属（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、クライベラ属（Ｋｌｕｙｖｅｒａ）、パンテア属（Ｐａｎｏｔｅａ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ゼノラブダス属（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ）及びヨケネラ属（Ｙｏｋｅｎｅｌｌａ）に属する任意の種も好適である。
【０３１６】
一部の例では、調節薬剤は、約０．０１％〜約１００％、約１％〜約９９．９％、約０．１％〜約１０％、約１％〜約２５％、約１０％〜約５０％、約５０％〜約９９％又は約０．１％〜約９０％のいずれか１つの活性成分（ファージ、溶解素又はバクテリオシンなど）など、組成物の約０．１％〜約１００％を占め得る。一部の例では、本組成物は、少なくとも０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又はそれを超えるもののいずれかの活性成分（ファージ、溶解素又はバクテリオシンなど）を含む。一部の例では、市販品として濃縮薬剤が好ましく、最終使用者は、通常、活性成分の濃度が実質的に低い希釈した薬剤を使用する。
【０３１７】
本明細書に記載される製剤のいずれも、ベイト、コイル、電気マット、燻煙製剤、燻蒸剤又はシートの形態で使用され得る。
【０３１８】
ｉ．液体製剤
本明細書に提供される組成物は、液体製剤であり得る。液体製剤は、概して水と混合されるが、一部の例では、担体としての作物油、ディーゼル燃料、灯油又は他の軽油と共に使用され得る。活性成分の量は、多くの場合に約０．５〜約８０重量パーセントの範囲である。
【０３１９】
乳化性濃縮製剤は、液体活性成分と、１つ以上の石油系溶媒と、製剤を水と混合してエマルションを形成することを可能にする薬剤とを含有し得る。かかる濃縮物は、農業、観賞植物及び芝生、林業、構造物、食品加工、家畜及び公衆衛生のための農薬製剤中に使用され得る。これは、小型の可搬式散布器から油圧散布器、少量地上散布器、ミストブロワ及び少量空中散布器に至る施用機器と適合性があり得る。一部の活性成分は、液体担体に易溶解性である。活性成分は、担体と混合すると、沈降又は分離しない溶液、例えば均一溶液を形成する。この種の製剤は、活性成分と、担体と、１つ以上の他の成分とを含み得る。溶液は、屋内及び屋外においていかなる種類の散布器でも使用され得る。
【０３２０】
一部の例では、本組成物は、逆エマルションとして製剤化され得る。逆エマルションは、水溶性活性成分が油担体中に分散したものである。逆エマルションは、活性成分を多量の石油系担体、通常、燃料油と混合可能にする乳化剤が必要である。逆エマルションは、ドリフトの低減に役立つ。他の製剤では、水滴が目標表面に達する前に蒸発し始めると、結果として極めて小さく軽い液滴となり、何らかの散布ドリフトが起こる。油は、水よりも蒸発が遅いため、逆エマルションの液滴は、縮小が小さく、より多くの活性成分が標的に到達する。油は、更に流亡を低減し、耐降雨性を向上させることを促進する。油は、更に表面被覆及び吸収の向上により粘着剤−展着剤としての役割を果たす。液滴は、比較的大きく重いため、葉の裏面への被覆を通じて染み込ませることは難しい。逆エマルションは、影響を受け易い標的外の場所へのドリフトが問題となり得る沿道で最も一般的に用いられる。
【０３２１】
流動性体又は液体製剤は、乳化性濃縮物及び水和性粉末の特徴の多くを合わせ持つ。製造者は、活性成分が水にも油にも溶解しない固体である場合にこれらの製剤を使用する。粘土などの物質に含浸させた活性成分を粉砕して微細粉末にする。次に、この粉末を少量の液体に懸濁する。得られる液体産物は、かなり濃厚である。流動性体及び液体は、乳化性濃縮物の特徴の多くを共有し、これらは、同様の欠点を有する。これらは、懸濁液中に保つのに適度の撹拌が必要であり、水和性粉末と同様に目に見える残渣が残る。
【０３２２】
流動性体／液体は、取り扱い及び散布が容易である。これらは、液体であるため、こぼれたり、跳ね返ったりしがちである。これらは、固体粒子を含有し、そのため、ノズル及びポンプの摩損の一因となる。流動性体及び液体懸濁物は、その容器内で沈降する。流動性体及び液体製剤は、沈降する傾向があるため、５ガロン以下の容器に詰めると混合し直し易くなる。
【０３２３】
エアロゾル製剤は、１つ以上の活性成分と溶媒とを含有する。ほとんどのエアロゾルが低率の活性成分を含有する。２つのタイプのエアロゾル製剤−加圧密閉容器に入って市販されている即時使用型と、製剤を煙又は霧として放出する電動式又はガソリン動力式エアロゾル発生器で使用される製品とがある。
【０３２４】
即時使用型エアロゾル製剤は、通常、ノズル弁の作動時に製剤を放出する小さい内蔵型ユニットである。圧力下の不活性ガスによって製剤が微細な開口部に押し通され、微細液滴を作り出す。こうした製品は、温室、建物内の狭い場所又は局所的な屋外場所に使用される。５〜５ポンドの活性成分を保持する市販のモデルは、通常、詰め替え可能である。
【０３２５】
煙又は霧エアロゾル製剤は、圧力下にない。これは、急激に回転するディスク又は加熱された表面を使用して液体製剤を微細なミスト又は霧（エアロゾル）に細かくする機械で使用される。
【０３２６】
ｉｉ．乾燥又は固体製剤
乾燥製剤は、２つのタイプ：即時使用型及び散布剤として施用するために水と混合しなければならない濃縮物に分けることができる。ほとんどのダスト製剤は、即時使用型であり、低率の活性成分（約１０重量パーセント未満）と、加えてタルク、チョーク、粘土、堅果の殻又は火山灰で作られた超微細な乾燥不活性担体とを含有する。個々のダスト粒子のサイズは、様々である。少数のダスト製剤は、濃縮物であり、高率の活性成分を含有する。これらを施用前に乾燥不活性担体と混合する。ダストは、常に乾燥して使用され、標的外の部位にドリフトし易い。
【０３２７】
ｉｉｉ．顆粒又はペレット製剤
一部の例では、本組成物は、顆粒として製剤化される。顆粒状製剤は、ダスト製剤と同様であり、但し顆粒状粒子の方が大きくて重い。粗粒子は、粘土、トウモロコシの穂軸又はクルミ殻などの材料から作られ得る。活性成分は、顆粒の外面を被覆するか、又はその中に吸収されるかのいずれかである。活性成分の量は、比較的少ないことができ、通常、約０．５〜約１５重量パーセントの範囲である。顆粒状製剤は、ほとんどの場合、土壌、土壌中で生活する昆虫への施用に使用されるか、又は根から植物中に吸収される。顆粒状製剤は、時に、ドリフトを最小限に抑えるか、又は高密度の植生に浸透させるため、飛行機又はヘリコプターによって施用される。施用後、顆粒は、活性成分を徐々に放出し得る。一部の顆粒は、活性成分の放出に土壌水分を必要とする。顆粒状製剤は、幼虫のカ及び他の水生病害虫の防除にも使用される。顆粒は、農業、構造物、鑑賞植物、芝生、水生、道路用地及び公衆衛生（刺咬昆虫）のための病害虫防除活動において使用される。
【０３２８】
一部の例では、本組成物は、ペレットとして製剤化される。ほとんどのペレット製剤が顆粒状製剤と極めて良く類似しており、これらの用語は、同義的に使用される。しかしながら、ペレット製剤では、全ての粒子が同じ重量及び形状である。粒子が均一であるため、精密な施用機器で使用することが可能である。
【０３２９】
ｉｖ．粉末
一部の例では、本組成物は、粉末として製剤化される。一部の例では、本組成物は、水和性粉末として製剤化される。水和性粉末は、ダストに類似した微粉砕された乾燥製剤である。これは、通常、散布剤として施用するため、水と混合しなければならない。しかしながら、少数の製品は、ダストとしても、又は水和性粉末としても施用し得る  −  その選択は、施用者次第である。水和性粉末は、活性成分を約１〜約９５重量パーセント；場合により約５０パーセント超有する。粒子は、水に溶解しない。粒子は、絶えず撹拌して懸濁しない限り直ちに沈降する。粒子は、ほとんどの病害虫問題及び撹拌が可能なほとんどのタイプの散布機器で使用することができる。水和性粉末は、優れた残効性を有する。その物理的特性を理由として、大部分の製剤は、加工された多孔質材料、例えばコンクリート、石膏及び未加工木材などの表面上に留まる。そのような場合、水のみが材料に浸透する。
【０３３０】
一部の例では、本組成物は、可溶性粉末として製剤化される。可溶性粉末製剤は、水和性粉末と類似している。しかしながら、可溶性粉末は、水と混合すると容易に溶解し、真溶液を形成する。完全に混合した後に更なる撹拌は必要ない。可溶性粉末中の活性成分の量は、約１５〜約９５重量パーセントの範囲であり；場合により約５０パーセント超である。可溶性粉末は、水和性粉末のあらゆる利点を有し、且つ混合中に吸入の危険性があることを除き、不利な点が１つもない。
【０３３１】
一部の例では、本組成物は、水分散性顆粒として製剤化される。乾燥流動性体としても知られる水分散性顆粒は、代わりにダスト様であることを除いて水和性粉末に類似しており、計量が容易な小さい顆粒として製剤化される。水分散性顆粒は、施用するには水と混合しなければならない。水中に入ると、顆粒は、水和性粉末と同様に粉々に崩れて微細粒子になる。製剤を水中に懸濁しておくには絶えず撹拌する必要がある。活性成分の割合は、高く、往々にして９０重量パーセントにも上る。水分散性顆粒は、計量及び混合がより容易であることを除き、水和性粉末と同じ利点及び不利点の多くを共有する。粉立ちが少ないため、これは、取り扱い時に施用者に吸入危害を引き起こしにくい。
【０３３２】
ｖ．ベイト
一部の例では、本組成物は、ベイトを含む。ベイトは、固体、ペースト、ペレット又は粉末状形態など、任意の好適な形態であり得る。ベイトは、宿主によって運び去られ、前記宿主の個体群（例えば、コロニー又は巣箱）に持ち帰られることもある。ベイトは、次にコロニーの他のメンバーの飼料供給源としての役割を果たすことができ、従って多数の宿主、潜在的に宿主のコロニー全体に有効な調節薬剤を付与し得る。
【０３３３】
ベイトは、好適な「ハウジング」又は「トラップ」に提供することができる。かかるハウジング及びトラップは、市販されており、本明細書に記載される組成物を含むように既存のトラップを適合させることができる。ハウジング又はトラップは、例えば、箱形であり得るか、予め形成された状態で提供され得るか、又は例えば折り畳み可能なボール紙で形成され得る。ハウジング又はトラップに好適な材料としては、プラスチック及びボール紙、特に段ボール紙が挙げられる。トラップの内表面は、トラップ内に入った後の宿主の移動を制限するため粘着性物質で裏打ちされ得る。ハウジング又はトラップは、ベイトをその内部に入れて適所に保つことができる好適な陥凹部を含むことができる。宿主は、侵入後にトラップを容易に離れることができない一方、ハウジングは、「餌場」として役割を果たし、そこで宿主が摂餌し、捕食者の恐れなしに安心できる好ましい環境を宿主に提供するため、トラップは、ハウジングと区別される。
【０３３４】
ｖｉ．誘引剤
一部の例では、本組成物は、誘引剤（例えば、化学誘引剤）を含む。誘引剤は、組成物の近傍に成虫宿主又は幼若宿主（例えば、幼虫）を誘引し得る。誘引剤としては、動物、特に昆虫によって分泌される、同じ種の他の動物の行動又は発育に影響を及ぼす化学物質であるフェロモン類が挙げられる。他の誘引剤としては、糖及びタンパク質加水分解物のシロップ、酵母及び腐りかけの肉が挙げられる。誘引剤は、活性成分と組み合わされ、茎葉又は処理範囲にある他の物品にも噴霧され得る。
【０３３５】
宿主の行動、例えば宿主の餌探し、産卵又は交配場所又は交配相手に影響を及ぼす様々な誘引剤が公知である。本明細書に記載される方法及び組成物において有用な誘引剤としては、例えば、オイゲノール、プロピオン酸フェネチル、ジメチルイソブチルシクロプロパンカルボン酸エチル、ベンゾジオキサンカルボン酸プロピル、ｃｉｓ−７，８−エポキシ−２−メチルオクタデカン、ｔｒａｎｓ−８，ｔｒａｎｓ−０−ドデカジエノール、ｃｉｓ−９−テトラデセナール（加えてｃｉｓ−１１−ヘキサデセナール）、ｔｒａｎｓ−１１−テトラデセナール、ｃｉｓ−１１−ヘキサデセナール、（Ｚ）−１１，１２−ヘキサデカジエナール、酢酸ｃｉｓ−７−ドデセニル、酢酸ｃｉｓ−８−ドデセニル、酢酸ｃｉｓ−９−ドデセニル、酢酸ｃｉｓ−９−テトラデセニル、酢酸ｃｉｓ−１１−テトラデセニル、酢酸ｔｒａｎｓ−１１−テトラデセニル（加えてｃｉｓ−１１）、酢酸ｃｉｓ−９，ｔｒａｎｓ−１１−テトラデカジエニル（加えてｃｉｓ−９，ｔｒａｎｓ−１２）、酢酸ｃｉｓ−９，ｔｒａｎｓ−１２−テトラデカジエニル、酢酸ｃｉｓ−７，ｃｉｓ−１１−ヘキサデカジエニル（加えてｃｉｓ−７，ｔｒａｎｓ−１１）、酢酸ｃｉｓ−３，ｃｉｓ−１３−オクタデカジエニル、酢酸ｔｒａｎｓ−３，ｃｉｓ−１３−オクタデカジエニル、アネトール及びサリチル酸イソアミルが挙げられる。
【０３３６】
様々な波長又は色の光を含め、化学誘引剤以外の手段も昆虫の誘引に使用され得る。
【０３３７】
ｖｉｉ．ナノカプセル／マイクロカプセル化／リポソーム
一部の例では、本組成物は、マイクロカプセル化製剤で提供される。マイクロカプセル化製剤は、水と混合され、他の噴霧可能製剤と同じように噴霧される。噴霧後、プラスチックコーティングが破れ、活性成分が徐々に放出される。
【０３３８】
ｖｉｉｉ．担体
本明細書に記載される組成物のいずれも、本明細書に記載される調節薬剤と不活性担体とを含むように製剤化され得る。かかる担体は、固体担体、液体担体、ゲル担体及び／又はガス担体であり得る。特定の例では、担体は、種子コーティングであり得る。種子コーティングは、種子の表面に全面的に又は部分的に付着する任意の天然に存在しない製剤である。製剤は、アジュバント又は界面活性剤を更に含み得る。製剤は、作用域を拡大するために１つ以上の調節薬剤も含み得る。
【０３３９】
製剤に使用される固体担体としては、粘土（例えば、カオリン粘土、珪藻土、ベントナイト、フバサミ（Ｆｕｂａｓａｍｉ）粘土、酸性粘土等）、合成酸化ケイ素水和物、タルク、セラミック、他の無機ミネラル（例えば、セリサイト、石英、硫黄、活性炭、炭酸カルシウム、水和シリカ等）、昇華させることができる室温で固形の物質（例えば、２，４，６−トリイソプロピル−１，３，５−トリオキサン、ナフタレン、ｐ−ジクロロベンゼン、樟脳、アダマンタン等）；羊毛；絹；綿；麻；パルプ；合成樹脂（例えば、低密度ポリエチレン、直鎖低密度ポリエチレン及び高密度ポリエチレンなどのポリエチレン樹脂；エチレン−酢酸ビニル共重合体などのエチレン−ビニルエステル共重合体；エチレン−メタクリル酸メチル共重合体及びエチレン−メタクリル酸エチル共重合体などのエチレン−メタクリル酸エステル共重合体；エチレン−アクリル酸メチル共重合体及びエチレン−アクリル酸エチル共重合体などのエチレン−アクリル酸エステル共重合体；エチレン−アクリル酸共重合体などのエチレン−ビニルカルボン酸共重合体；エチレン−テトラシクロドデセン共重合体；プロピレンホモポリマー及びプロピレン−エチレン共重合体などのポリプロピレン樹脂；ポリ−４−メチルペンテン−１、ポリブテン−１、ポリブタジエン、ポリスチレン；アクリロニトリル−スチレン樹脂；アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン樹脂、スチレン−共役ジエンブロック共重合体及びスチレン−共役ジエンブロック共重合体水素化物などのスチレン系エラストマー；フッ素樹脂；ポリ（メタクリル酸メチル）などのアクリル樹脂；ナイロン６及びナイロン６６などのポリアミド樹脂；ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、ポリブチレンテレフタレート及びポリシクロへキシレンジメチレンテレフタレートなどのポリエステル樹脂；ポリカーボネート類、ポリアセタール類、ポリアリールスルホン類、ポリアリレート類、ヒドロキシ安息香酸ポリエステル類、ポリエーテルイミド類、炭酸ポリエステル類、ポリフェニレンエーテル樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリウレタン及び多孔質樹脂、例えば発泡ポリウレタン、発泡ポリプロピレン又は発泡エチレン等）、ガラス、金属、セラミック、繊維、布、編物、シート、紙、糸、泡、多孔性物質及びマルチフィラメントの微細粉末又は顆粒が挙げられる。
【０３４０】
液体担体としては、例えば、芳香族又は脂肪族炭化水素（例えば、キシレン、トルエン、アルキルナフタレン、フェニルキシリルエタン、ケロシン、ガス油、ヘキサン、シクロヘキサン等）、ハロゲン化炭化水素（例えば、クロロベンゼン、ジクロロメタン、ジクロロエタン、トリクロロエタン等）、アルコール類（例えば、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ブタノール、ヘキサノール、ベンジルアルコール、エチレングリコール等）、エーテル類（例えば、ジエチルエーテル、エチレングリコールジメチルエーテル、ジエチレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、プロピレングリコールモノメチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン等）、エステル類（例えば、酢酸エチル、酢酸ブチル等）、ケトン類（例えば、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、シクロヘキサノン等）、ニトリル類（例えば、アセトニトリル、イソブチロニトリル等）、スルホキシド類（例えば、ジメチルスルホキシド等）、アミド類（例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、環状イミド類（例えば、Ｎ−メチルピロリドン）、炭酸アルキリデン類（例えば、炭酸プロピレン等）、植物油（例えば、ダイズ油、綿実油等）、植物性揮発油（例えば、オレンジ油、ヒソップ油、レモン油等）又は水を挙げることができる。
【０３４１】
ガス担体としては、例えば、ブタンガス、フロンガス、液化石油ガス（ＬＰＧ）、ジメチルエーテル及び炭酸ガスを挙げることができる。
【０３４２】
ｉｘ．アジュバント
一部の例では、本明細書に提供される組成物は、アジュバントを含み得る。アジュバントは、活性を有しない化学物質である。アジュバントは、混合又は施用の向上のため、又はパフォーマンスの増強のため、製剤中に予め混合されるか又は噴霧タンクに加えられるかのいずれかである。アジュバントは、葉面施用向けに設計された製品に広く使用されている。アジュバントを使用すると、製剤を具体的な必要性に合わせてカスタマイズし、局所的条件を補うことができる。アジュバントは、濡れ、展着、粘着、蒸発の低減、揮発の低減、緩衝、乳化、分散、散布ドリフトの低減及び起泡の低減を含め、特定の機能を果たすように設計され得る。単一のアジュバントがこれらの全ての機能を果たすことはできず、多くの場合、適合性のあるアジュバントが組み合わされて複数の機能を同時に果たし得る。
【０３４３】
製剤中に含まれるアジュバントの非限定的な例の中には、結合剤、分散剤及び安定剤、具体的には例えばカゼイン、ゼラチン、多糖類（例えば、デンプン、アラビアゴム、セルロース誘導体、アルギン酸等）、リグニン誘導体、ベントナイト、糖類、合成水溶性ポリマー（例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸等）、ＰＡＰ（酸性リン酸イソプロピル）、ＢＨＴ（２，６−ジ−ｔ−ブチル−４−メチルフェノール）、ＢＨＡ（２−ｔ−ブチル−４−メトキシフェノールと３−ｔ−ブチル−４−メトキシフェノールとの混合物）、植物油、鉱油、脂肪酸及び脂肪酸エステルがある。
【０３４４】
ｘ．界面活性剤
一部の例では、本明細書に提供される組成物は、界面活性剤を含む。界面活性剤は、濡れ剤及び展着剤とも称され、噴霧液滴の表面張力を物理的に変化させる。製剤がその機能を正しく果たすには、噴霧液滴が茎葉を濡らし、葉の全面にわたって均一に広がることが可能でなければならない。界面活性剤は、製剤被覆面積を拡大し、それにより病害虫の化学物質への曝露を増加させる。界面活性剤は、製剤を蝋質の葉又は有毛の葉に施用するときに特に重要である。適切な濡れ性及び展着性がないと、往々にして噴霧液滴が流亡するか、又は葉の表面を十分に被覆することができない。しかしながら、界面活性剤が多過ぎると過剰な流亡が引き起こされ、有効性が低下し得る。
【０３４５】
界面活性剤は、イオンと呼ばれる電荷を帯びた原子又は分子へのそのイオン化の方法又は分離の方法によって分類される。負電荷の界面活性剤は、アニオン性である。正電荷のものは、カチオン性であり、及び電荷を帯びていないものは、非イオン性である。非イオン性界面活性剤の存在下における製剤活性は、カチオン性又はアニオン性界面活性剤の存在下における活性と全く異なり得る。誤った界面活性剤を選択すると、農薬製品の有効性が低下し、標的植物が傷害を受け得る。アニオン性界面活性剤は、接触性農薬（吸収されて全体に行き渡るのでなく、直接的な接触によって病害虫を防除する農薬）との使用時に最も有効である。カチオン性界面活性剤は、通常、植物毒性であるため、決して単独の界面活性剤として使用してはならない。
【０３４６】
非イオン性界面活性剤は、浸透性農薬と使用されることが多く、噴霧農薬が植物クチクラに浸透することを促進する。非イオン性界面活性剤は、ほとんどの農薬と適合性があり、界面活性剤が必要なＥＰＡ登録農薬のほとんどが非イオン性タイプを推奨している。アジュバントとしては、限定はされないが、粘着剤、増量剤、植物浸透剤、適合性薬剤、緩衝液又はｐＨ調整剤、ドリフト制御添加剤、消泡剤及び増粘剤が挙げられる。
【０３４７】
本明細書に記載される組成物に含まれる界面活性剤の非限定的な例の中には、アルキル硫酸エステル塩、スルホン酸アルキル類、スルホン酸アルキルアリール、アルキルアリールエーテル類及びそのポリオキシエチレン化生成物、ポリエチレングリコールエーテル類、多価アルコールエステル類及び糖アルコール誘導体がある。
【０３４８】
ｘｉ．併用
製剤において及びこれらの製剤から調製される使用形態において、調節薬剤は、農薬用薬剤（例えば、殺虫剤、滅菌剤、殺ダニ剤、殺線虫剤、殺軟体動物剤又は殺真菌剤；例えば、表１２に挙げる農薬を参照されたい）、誘引剤、成長調整物質又は除草剤など、他の活性化合物との混合物であり得る。本明細書で使用されるとき、用語「農薬用薬剤」は、任意の病害虫を予防、駆逐、忌避又は軽減することを意図した任意の物質又は物質の混合物を指す。農薬は、食物に関してヒトと競合するか、所有物を破壊するか、疾患を蔓延させるか、又は不快害虫である昆虫、病原体、雑草及び微生物を含め、病害虫に対して使用される化学的物質又は生物学的薬剤であり得る。用語「農薬用薬剤」は、抗生物質、抗ウイルス薬  農薬、抗真菌薬、駆虫薬、栄養素、花粉、ショ糖及び／又は昆虫の動きを止める又は遅くする薬剤など、他の生物活性分子を更に包含し得る。
【０３４９】
調節薬剤が植物に施用される例では、除草剤、肥料、成長調節物質、毒性緩和剤、情報化学物質などの他の公知の化合物との、或いは植物特性を改善するための薬剤との混合物も可能である。
【０３５０】
Ｖ．送達
本明細書に記載される宿主は、昆虫への組成物の送達又は投与を可能にする任意の好適な方法において、本明細書に記載される組成物のいずれかに曝露され得る。調節薬剤は、単独で送達され得るか、或いは他の活性又は不活性物質と組み合わせて送達され得、有効濃度の調節薬剤を送達するように製剤化された濃縮液、ゲル、溶液、懸濁液、散布液、粉末、ペレット、ブリケット、ブリックなどの形態で例えば噴霧、マイクロインジェクション、植物経由、注入、浸漬によって施用され得る。本明細書に記載される組成物の施用量及び施用部位は、概して、宿主の習性、宿主の微生物が調節薬剤の標的となり得るのがいずれの生活環ステージであるか、施用が行われる部位並びに調節薬剤の物理的及び機能的特性によって決まる。本明細書に記載される調節薬剤は、昆虫に経口摂取によって投与され得るが、クチクラを通じた浸透又は昆虫の呼吸器系への浸透を可能にする手段によっても投与され得る。
【０３５１】
一部の例では、昆虫は、単純に調節薬剤を含む溶液に「浸漬」されるか、又はそれが「噴霧」され得る。或いは、調節薬剤を昆虫の飼料成分（例えば、摂食可能物）に連結して送達を容易にし、及び／又は昆虫による調節薬剤の取込みを増加させ得る。経口導入方法には、例えば、調節薬剤を昆虫の飼料と直接混合すること、昆虫の生息場所又は活動場所に調節薬剤を噴霧すること、並びに飼料として使用される種が調節薬剤を発現するように改変され、次に影響を与えようとする昆虫に給餌されるエンジニアリング手法が含まれる。一部の例では、例えば、調節薬剤組成物は、昆虫の食餌中に配合するか又は食餌の上にかけることができる。例えば、調節薬剤組成物は、昆虫が生息する作物畑の上に噴霧することができる。
【０３５２】
一部の例では、本組成物は、例えば、背負式散布、空中散布、作物散布／散粉等により、植物、例えば作物の上に直接噴霧される。調節薬剤が植物に送達される例では、調節薬剤を受け取る植物は、いずれの植物成長段階にもあり得る。例えば、製剤化された調節薬剤は、植物成長初期に種子コーティング又は経根処理として、又は作物サイクル後期に植物全体の処理として施用することができる。一部の例では、調節薬剤は、局所薬剤として植物に施用され得、宿主昆虫がその植物を食べるか、又は他にその植物との相互作用時に植物と接触することになる。
【０３５３】
更に、調節薬剤は、植物又は動物宿主の組織（例えば、茎又は葉）を通じて吸収され、分布する浸透性薬剤として（例えば、植物が成長する土壌中又は植物の水やりに使用される水中に）施用され得、それを餌にする昆虫が有効用量の調節薬剤を得ることになる。一部の例では、植物又は飼料生物は、調節薬剤を発現するように遺伝的に形質転換され得、その植物又は飼料生物を餌にする宿主が調節薬剤を食べることになる。
【０３５４】
遅延放出又は継続的放出も、調節薬剤又は１つ以上の調節薬剤を含有する組成物をゼラチンなどの溶解性又は生体内分解性コーティング層で被覆することにより、このコーティングが使用環境内で溶解又は分解し、次に調節薬剤が利用可能になることで達成でき、又は薬剤を溶解性又は分解性マトリックス中に分散させることにより達成できる。このような継続的放出及び／又は分注手段装置が有利に用いられることにより、本明細書に記載される調節薬剤の１つ以上の有効濃度が特定の宿主生息場所において常に維持され得る。
【０３５５】
調節薬剤は、昆虫が成長、生活、繁殖、摂餌又は寄生する媒体に配合することもできる。例えば、調節薬剤は、飼料容器、餌場、保護用ラッピング材又は巣箱に配合することができる。一部の適用について、調節薬剤は、粉末形態での又は「トラップ」若しくは「餌場」における施用のための固体支持体に結合され得る。例として、組成物が特定の宿主昆虫のためのトラップにおいて又はベイトとして使用される適用について、組成物はまた、固体支持体に結合されるか、又は時限放出材料に封入され得る。例えば、本明細書に記載される組成物は、ベクター（例えば、動物病原体のベクター、例えばカ、コダニ、ハジラミ又はマダニ）が成長、生活、繁殖、摂餌又は寄生する少なくとも１つの生息場所に組成物を送達することにより投与され得る。
【０３５６】
ＶＩ．スクリーニング
本明細書では、宿主（例えば、昆虫）の微生物叢を変化させ、且つそれにより宿主適応度を低下させるのに有効な調節薬剤のスクリーニング方法が含まれる。本明細書に提供されるスクリーニングアッセイは、宿主に常在する共生微生物を標的とし、且つそれにより宿主の適応度を低下させる１つ以上の調節薬剤（例えば、ファージ）を同定するのに有効であり得る。例えば、同定された調節薬剤（例えば、ファージ）は、農薬分解性又はアレロケミカル分解性微生物（例えば、細菌、例えば表１２に挙げられる農薬を分解する細菌）の生存能を低下させ、且つそれにより宿主の農薬に対する感度（例えば、表１２に挙げられる農薬に対する感度）又はアレロケミカル薬剤に対する感度を増加させるのに有効であり得る。
【０３５７】
例えば、ファージライブラリをスクリーニングすることにより、宿主に常在する特異的な内部共生微生物を標的とするファージを同定し得る。一部の例では、ファージライブラリは、１つ以上の環境サンプル（例えば、土壌、池底質又は下水）の形態で提供され得る。或いは、ファージライブラリは、実験室分離株から作成され得る。ファージライブラリは、標的細菌株と共培養され得る。細菌株とのインキュベーション後、標的細菌に感染してそれを溶解させることに成功するファージが培養培地で集積される。ファージ集積培養物は、目的のファージを更に集積するため、追加的な細菌で任意の回数だけ継代培養され得る。ファージは、本明細書に記載される任意の方法又は組成物において調節薬剤として使用するために分離することができ、ここで、ファージは、宿主適応度を低下させる方法で宿主の微生物叢を変化させる。
【０３５８】
【表１２３】
2020506960.tif 000125
【０３５９】
【表１２４】
2020506960.tif 000126
【実施例】
【０３６０】
以下は、本発明の方法の例である。上記に提供される概要を所与として、様々な他の実施形態を実施し得ることが理解される。
【０３６１】
実施例１：アエデス・ベクサンス（Ａｅｄｅｓ  ｖｅｘａｎｓ）蚊の抗生物質溶液処理
本実施例は、タンパク質生産を阻害する広域スペクトル抗生物質であるドキシサイクリンで処理することにより、アエデス・ベクサンス（Ａｅｄｅｓ  ｖｅｘａｎｓ）蚊を死滅させるか又はその適応度を低下させることが可能であることを実証する。ドキシサイクリンが蚊に及ぼす効果は、ドキシサイクリンに敏感である、蚊にとって内因性の細菌個体群の調節を通じて媒介される。１つの標的となる細菌株は、ボルバキア属（Ｗｏｌｂａｃｈｉａ）である。
【０３６２】
ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）の防除及び根絶の成功は、今日の全世界の養豚産業にとって非常に重要である。ＰＲＲＳＶの侵入リスクを低減するため、豚生産者は、万全の方策を用いてその農場の生物学的安全性（ｂｉｏｓｅｃｕｒｉｔｙ）を高めている。しかしながら、ＰＲＲＳＶへの豚の集団感染は、なおも頻発している。ＰＲＲＳＶを伝播するベクターの１つは、アエデス・ベクサンス（Ａｅｄｅｓ  ｖｅｘａｎｓ）蚊である。アエデス・ベクサンス（Ａｅｄｅｓ  ｖｅｘａｎｓ）は、汎存種であり、よく見られる害虫蚊である。ＰＲＲＳＶに加えて、これは、ディロフィラリア・イミティス（Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ  ｉｍｍｉｔｉｓ）（イヌ糸状虫）；粘液腫症（致死性のウサギウイルス疾患）及び東部ウマ脳炎（米国における致死性のウマウイルス疾患）の公知のベクターでもある。アエデス・ベクサンス（Ａｅｄｅｓ  ｖｅｘａｎｓ）は、ヨーロッパで最も一般的な蚊であり、多くの場合にヨーロッパの蚊の群集の８０％超を占める。その存在量は、洪水時の溜まり水がどの程度利用可能であるかに依存する。夏には、蚊取りトラップは、一晩に１トラップ当たり８，０００匹の蚊を捕集し得る。
【０３６３】
治療計画：１ｍｌの血液中に０（陰性対照）、１、１０又は５０μｇ／ｍｌの抗生物質終濃度で血液ミールをドキシサイクリン溶液と混合して製剤化する。
【０３６４】
実験計画：
処理の準備のため、蚊を実験室環境及び培地中で成長させる。実験は、アエデス・ベクサンス（Ａｅｄｅｓ  ｖｅｘａｎｓ）の雌蚊で実施し、これは、当初、ミネソタ大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）のセントポール（Ｓｔ．Ｐａｕｌ）キャンパスの野外で採集された野外蚊から樹立されたものであり、ヒト血液に維持し、成虫として５％フルクトースを供給する。ドキシサイクリン（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ、Ｄ９８９１）を滅菌水中に溶解することによりドキシサイクリン溶液を作成する。血液ミールの調製で新鮮な血液に合計１ｍＬとなるように種々の容積のドキシサイクリン溶液を加える。最終的な血中ドキシサイクリン濃度は、約０（対照溶液）、１、１０又は５０μｇ／ｍｌである。
【０３６５】
各レプリケートについて、パラフィルムで覆い３７℃に保ったメンブレン供給装置（２ｍｌエッペンドルフ試験管）から年齢対応の２〜３日齢の蚊に対照又は実験血液ミールを提供する。充血していない蚊は、廃棄する。ミールは、４日毎に合計３回血液ミールを与える。血液ミール間で、産卵のため蒸留水で湿らせた綿パッドを蚊に提供する。２回目及び／又はそれ以降の血液ミール後、摂餌していない蚊を取り除かない。毎日死亡数をカウントし、死骸を取り出して、本明細書に記載されるとおりのボルバキア属（Ｗｏｌｂａｃｈｉａ）分析のために保管した。各レプリケートについて、ドキシサイクリンの濃度当たり少なくとも５０匹の蚊を使用する。最後の血液ミールの終了時、蚊を１２時間保管した後に解剖する。
【０３６６】
定量的ポリメラーゼ連鎖反応による微生物叢分析：
解剖前に蚊を７０％エタノールに５分間浸漬し、次に滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回リンスして、表在細菌を死滅させて取り除き、従って解剖中のサンプルのクチクラ細菌による汚染を最小限に抑える。各蚊（対照及びドキシサイクリン処理）の中腸を取り出し、直ちにドライアイスで凍結し、処理まで２０℃で保存する。中腸が破裂して相当量の腸内容物が失われた場合に限り、それを分析から除外する。Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ  ２４ホモジナイザー（Ｂｅｒｔｉｎ）において、０．５ｍｍ幅のガラスビーズ（Ｂｅｒｔｉｎ）を使用してサンプルをフェノール−クロロホルム中で６８００ｒｐｍにおいて３０秒間ホモジナイズし、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）をフェノール−クロロホルムで抽出する。ボルバキア属（Ｗｏｌｂａｃｈｉａ）の定量化には１６ＳリボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）を使用し、これは、ヤブカ属（Ａｅｄｅｓ）ハウスキーピング遺伝子４０Ｓリボソームタンパク質Ｓ７（Ｖｅｃｔｏｒ−Ｂａｓｅ遺伝子ＩＤ  ＡＡＥＬ００９４９６）の比として示される。ボルバキア属（Ｗｏｌｂａｃｈｉａ）のプライマー配列は、フォワードプライマー５’−ＴＣＡＧＣＣＡＣＡＣＴＧＧＡＡＣＴＧＡＧ−３’（配列番号２２１）及びリバースプライマー５’−ＴＡＡＣＧＣＴＡＧＣＣＣＴＣＴＣＣＧＴＡ−３’（配列番号２２２）及びＳ７について：フォワード５’−ＡＡＧＧＴＣＧＡＣＡＣＣＴＴＣＡＣＧＴＣ−３’（配列番号２２３）及びリバース５’−ＣＣＧＴＴＴＧＧＴＧＡＧＧＧＴＣＴＴＴＡ−３’（配列番号２２４）である。ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑキット（Ｔａｋａｒａ）を製造者の指示に従って使用して、７５００  Ｆａｓｔリアルタイムサーモサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を実施する。ドキシサイクリン処理した蚊は、ボルバキア属（Ｗｏｌｂａｃｈｉａ）特異的遺伝子の減少を示す。
【０３６７】
ドキシサイクリン溶液で処理した蚊の生存率を陰性対照処理の蚊と比較する。ドキシサイクリン溶液で処理した蚊の生存率は、対照と比較して低下する。
【０３６８】
実施例２：ハマダラカ属（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ）蚊のアジスロマイシン溶液処理
本実施例は、比較的広域であるが、浅い抗細菌活性であるアジスロマイシンでの処理により、アノフェレス・コルッツィ（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｃｏｌｕｚｚｉｉ）蚊を死滅させるか又はその適応度を低下させ、及び寄生虫の伝播率を低下させることが可能であることを実証する。アジスロマイシンは、一部のグラム陽性細菌、一部のグラム陰性細菌及び多くの非定型細菌を阻害する。アジスロマイシンが蚊に及ぼす効果は、アジスロマイシンに敏感である、蚊にとって内因性の細菌個体群の調節を通じて媒介される。１つの標的となる細菌株は、アサイア属（Ａｓａｉａ）である。
【０３６９】
蚊は、世界で最も危険な動物と言われており、マラリアは、ヒトに悪影響を及ぼす蚊媒介性疾患の１つである。蚊には約３，５００の種が存在し、マラリアを伝播させるものは、全てハマダラカ属（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ）と呼ばれるサブセットに属する。約４０のハマダラカ属（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ）種は、ヒトの健康に深刻な影響を及ぼすマラリアを伝播させる能力を有する。
【０３７０】
治療計画：１ｍｌの血液中に０（陰性対照）、０．１、１又は５μｇ／ｍｌの抗生物質終濃度で血液ミールをアジスロマイシン溶液と混合して製剤化する。
【０３７１】
実験計画：
処理の準備のため、蚊を実験室環境及び培地中で成長させる。実験は、アノフェレス・コルッツィ（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｃｏｌｕｚｚｉｉ）のゴウッソ（Ｎｇｏｕｓｓｏ）コロニーからの雌蚊で実施し、これは、当初、カメルーンで採集された野外蚊から樹立されたものであり、ヒト血液に維持し、成虫として５％フルクトースを供給する。幼虫にはテトラミン（ｔｅｔｒａｍｉｎ）魚用飼料を与える。１２時間明期／暗期サイクル下７０〜８０％湿度において温度を２８℃（±１℃）に維持する。
【０３７２】
ヒト血液供給及びマラリア原虫感染：
抗生物質不含の、５０ｍｇ／Ｌヒポキサンチン、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ＋１０％熱失活ヒト血清を補充した３００ｍｇ  Ｌ−１  Ｌ−グルタミンを含むＲＰＭＩ培地（ＧＩＢＣＯ）で熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）ＮＦ５４生殖母細胞を培養する。６％ｖ／ｖ洗浄Ｏ＋赤血球（ＲＢＣ）中０．５％寄生虫血で感染させる１７及び１４日前に２つの２５ｍＬ培養を開始する。培地は、毎日交換する。蚊を感染させる前に、遠心したＲＢＣをプールし、２０％の新鮮な洗浄ＲＢＣ及びヒト血清（ＲＢＣと血清との間で２：３ｖ／ｖ比）を補充する。パラフィルムで覆い３７℃に保ったメンブレン供給装置（２ｍｌエッペンドルフ試験管）から蚊に血液ミールを与える。
【０３７３】
アジスロマイシン溶液は、アジスロマイシン（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ、ＰＺ０００７）をＤＭＳＯ中に溶解させることにより作成する。血液ミールの調製で合計１ｍＬとなるように新鮮血液に種々の容積のアジスロマイシン溶液を加える。血液中のアジスロマイシン終濃度は、０（対照溶液としての単なる溶媒）、０．１、１又は５μｇ／ｍｌである。
【０３７４】
各マラリア原虫感染につき、条件当たり少なくとも１００匹の年齢対応２〜３日齢蚊に、パラフィルムで覆い３７℃に保ったメンブレン供給装置（２ｍｌエッペンドルフ試験管）から対照又は実験血液ミールを与え、充血していない蚊を取り除く。ミールは、４日毎に合計３回血液ミールを与える。血液ミール間で、産卵のために蒸留水で湿らせた綿パッドを蚊に提供する。２回目及び／又はそれ以降の血液ミール後、摂餌していない蚊を取り除かない。毎日死亡数をカウントし、死骸を取り除いて、本明細書に記載されるとおりのアサイア属（Ａｓａｉａ）分析のために保管する。各レプリケートについて、アジスロマイシンの濃度当たり少なくとも５０匹の蚊を使用する。最後の血液ミールの終了時、蚊を１２時間保管した後に解剖する。
【０３７５】
定量的ポリメラーゼ連鎖反応による微生物叢分析：
解剖前に蚊を７０％エタノールに５分間浸漬し、次に滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回リンスして、表在細菌を死滅させて取り除き、従って解剖中のサンプルのクチクラ細菌による汚染を最小限に抑える。各蚊（対照及びアジスロマイシン処理）の中腸を取り出し、直ちにドライアイスで凍結し、処理まで２０℃で保存する。中腸が破裂して相当量の腸内容物が失われた場合に限り、それを分析から除外する。Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ  ２４ホモジナイザー（Ｂｅｒｔｉｎ）において、０．５ｍｍ幅ガラスビーズ（Ｂｅｒｔｉｎ）を使用してサンプルをフェノール−クロロホルム中で６８００ｒｐｍにおいて３０秒間ホモジナイズし、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）をフェノール−クロロホルムで抽出する。アサイア属（Ａｓａｉａ）の定量化に１６ＳリボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）を使用し、これは、ハマダラカ属（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ）ハウスキーピング遺伝子４０Ｓリボソームタンパク質Ｓ７（Ｖｅｃｔｏｒ−Ｂａｓｅ遺伝子ＩＤ  ＡＧＡＰ０１０５９２）の比として示される。アサイア属（Ａｓａｉａ）のプライマー配列は、フォワード５’−ＧＴＧＣＣＧＡＴＣＴＣＴＡＡＡＡＧＣＣＧＴＣＴＣＡ−３’（配列番号２４８）及びリバース５’−ＴＴＣＧＣＴＣＡＣＣＧＧＣＴＴＣＧＧＧＴ−３’（配列番号２４９）及びＳ７について：フォワード５’−ＧＴＧＣＧＣＧＡＧＴＴＧＧＡＧＡＡＧＡ−３’（配列番号２５０）及びリバース５’−ＡＴＣＧＧＴＴＴＧＧＧＣＡＧＡＡＴＧＣ−３’（配列番号２５１）である。ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑキット（Ｔａｋａｒａ）を製造者の指示に従って使用して、７５００  Ｆａｓｔリアルタイムサーモサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を実施する。アジスロマイシン処理した蚊は、アサイア属（Ａｓａｉａ）特異的遺伝子の減少を示す。
【０３７６】
アジスロマイシンで処理した蚊の生存率を陰性対照処理の蚊と比較する。アジスロマイシン溶液で処理した蚊の生存率は、対照と比較して低下する。
【０３７７】
実施例３：デルマセントル・アンデルソニ（Ｄｅｒｍａｃｅｎｔｏｒ  ａｎｄｅｒｓｏｎｉ）の抗生物質溶液処理
本実施例は、ウシにおける広範囲の細菌感染の治療によく使用される広域スペクトル抗生物質であるリカマイシンＬＡ−２００オキシテトラサイクリンで処理することにより、マダニのデルマセントル・アンデルソニ（Ｄｅｒｍａｃｅｎｔｏｒ  ａｎｄｅｒｓｏｎｉ）を死滅させるか又はその適応度を低下させることが可能であることを実証する。リカマイシンＬＡ−２００オキシテトラサイクリンがマダニに及ぼす効果は、リカマイシンＬＡ−２００オキシテトラサイクリンに敏感である、マダニにとって内因性の細菌個体群の調節を通じて媒介される。１つの標的となる細菌株は、リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）である。
【０３７８】
マダニは、脊椎動物を餌とする偏性吸血性節足動物であり、ヒト及び動物に疾患を伝播させる能力を有するため、家畜に多大な経済的損失を引き起こす。詳細には、マダニは、全大陸にわたって病原体を伝播させ、人畜共通病原体の主要なベクターと見なされている。事実、１９８２年にライム病が特徴付けられて以来、４１５種の新規ダニ媒介性細菌病原体が発見されている。ロッキー山脈森林ダニであるデルマセントル・アンデルソニ（Ｄｅｒｍａｃｅｎｔｏｒ  ａｎｄｅｒｓｏｎｉ）は、「病原媒介物の万能のパンドラの箱」と名付けられており、ロッキー山紅斑熱リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）及び野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）を含め、幾つかの病原体を伝播させる。これは、アナプラズマ症の媒介物であり、且つ世界的に最も蔓延している家畜のマダニ媒介性病原体であるアナプラズマ・マージナーレ（Ａｎａｐｌａｓｍａ  ｍａｒｇｉｎａｌｅ）のベクターでもある（Ｇａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ＩＳＭＥ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １０：１８４６−１８５５，２０１６）。ウシのアナプラズマ症に起因する経済的損失は、米国で年間３億ドルと推定されている（Ｒｏｃｈｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．４９：２５３−２６１，２０１２）。
【０３７９】
治療計画：マダニの適用後−４、−１、＋３及び＋５日目における治療用量（１１ｍｇ／ｋｇ体重）のリカマイシンＬＡ−２００オキシテトラサイクリン注射。
【０３８０】
実験計画：
オレゴン州バーンズ（Ｂｕｒｎｓ）及びモンタナ州コモ湖（Ｌａｋｅ  Ｃｏｍｏ）の現地において、（Ｓｃｏｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．４２：１５３−１６２，２００５）に記載されるとおり、対象の成虫Ｄ．アンデルソニ（Ｄ．ａｎｄｅｒｓｏｎｉ）をフランネル法によって採集する。野外採集したマダニを使用して実験室コロニーを樹立する。マダニ細菌分析のため、各コロニーからの成虫Ｆ１又はＦ２雄マダニのコホートをホルスタイン仔ウシで育て、以下のとおりゲノムＤＮＡ単離及び細菌定量化のため、解剖して中腸（ＭＧ）及び唾液腺（ＳＧ）を採取する。
【０３８１】
Ｆ１マダニのコホートを、抗生物質処理した仔ウシ又は未処理の仔ウシ（対照）のいずれかで育てる。抗生物質処理した仔ウシは、マダニの適用後−４、−１、＋３及び＋５日目に治療用量（１１ｍｇ／ｋｇ体重）のリカマイシンＬＡ−２００オキシテトラサイクリン注射を受けた一方、未処理の仔ウシは、いかなる注射も受けなかった（未処理対照）。雌マダニは、産卵させて、未処理及び処理済みのマダニの第２の世代を継続させる（Ｆ２世代）。Ｆ２処理済み世代は、抗生物質に曝露されたＦ１成虫から生じた。Ｆ２マダニは、抗生物質に供されない。
【０３８２】
Ｆ１及びＦ２世代成虫雄マダニを７日間飼育し、次に２４時間以内に解剖する。毎日死亡をカウントし、マダニを取り出して、本明細書に記載されるとおりのリケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）分析のために保存する。解剖前にマダニを表面滅菌し、各解剖間で全ての解剖用具を滅菌する。マダニＭＧ及びＳＧを解剖し、３バイオロジカルレプリケートで３０匹の群をプールする。組織は、細胞溶解溶液（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ、ＵＳＡ）及びプロテイナーゼＫ（１．２５ｍｇ／ｍｌ）に保存する。ＰｕｒｅＧｅｎｅ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造者の仕様に従って使用してゲノムＤＮＡを単離する。
【０３８３】
リケッチア・ベリイ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｂｅｌｌｉｉ）の定量分析：
リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）を定量化するため、未処理の及び抗生物質処理したＦ１及びＦ２マダニのＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ定量的ＰＣＲを用いてｒｉｃｋＡ遺伝子コピー数を測定する。リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）の定量化は、フォワード（５’−ＴＡＣＧＣＣＡＣＴＣＣＣＴＧＴＧＴＣＡ−３’；配列番号２２５）及びリバース（５’−ＧＡＴＧＴＡＡＣＧＧＴＡＴＴＡＣＡＣＣＡＡＣＡＧ−３’；配列番号２２６）プライマーを使用して決定する。細菌定量化は、プールサンプルのＦ１及びＦ２  ＭＧ及びＳＧで測定する。ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑキット（Ｔａｋａｒａ）を製造者の指示に従って使用して、７５００  Ｆａｓｔリアルタイムサーモサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を実施する。リカマイシンＬＡ−２００オキシテトラサイクリン処理したマダニは、リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）特異的遺伝子の減少を示す。
【０３８４】
抗生物質溶液で処理したマダニの生存率を未処理のマダニと比較する。リカマイシンＬＡ−２００オキシテトラサイクリン溶液で処理したマダニの生存率は、未処理と比較して低下する。
【０３８５】
実施例４：家畜に感染するコダニのリファンピシン溶液による処理
本実施例は、抗生物質溶液で処理することによりコダニを死滅させるか又はその適応度を低下させることが可能であることを実証する。本実施例は、オキシテトラサイクリンがコダニに及ぼす効果は、オキシテトラサイクリンに敏感である、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）などのコダニにとって内因性の細菌個体群の調節を通じて媒介されることを実証する。
【０３８６】
疥癬は、動物に寄生するコダニが皮膚の深部まで巣穴を掘り、その巣穴の内部に産卵することによって引き起こされる。卵は、孵化して幼虫期に入る。次に、幼虫コダニが巣穴を離れ、皮膚表面まで上り、健康な皮膚組織に新しい巣穴を作り始める。卵から成虫になるまでの発育は、約２週間で完了する。こうしたコダニの寄生によって生じる病変は、動物の免疫系がコダニの存在に応答した結果である。動物の免疫応答の強度上の理由から、広範囲の病変及び全身性皮膚炎を生じさせるのに必要なコダニは、ごく少数である。コダニは、化学合成殺ダニ剤で死滅させることができるが、この種の化学物質は、高圧油圧式噴霧器具で群れ内の動物各々に噴霧して、皮膚への噴霧液の浸透を確実にしなければならない。更に、この種の化学農薬は、生態学上及び／又は農業上有害な効果を有し得る。
【０３８７】
治療計画：０．５％ショ糖及び必須アミノ酸を含有する１０ｍＬの滅菌水中に０（陰性対照）、１、１０又は５０μｇ／ｍｌでオキシテトラサイクリン溶液を製剤化する。
【０３８８】
実験計画：
繁殖期の成虫コダニが、便乗性ダニ又はその子孫と比較して、そのクチクラが硬化していないことに起因して異なる感受性を有するかどうかを決定するため、家畜に寄生しているコダニ並びに幼虫及び蛹に関連するコダニを採集する。このアッセイは、異なる種類のコダニで抗生物質溶液を試験し、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）などの内因性微生物を標的とすることによりその適応度がどのように変化するかを決定する。
【０３８９】
コダニに寄生されたブタからコダニを採集する。ブタの内耳領域から先の尖った小匙により痂皮で覆われた範囲を優しく掻き出して剥がし取ることにより皮膚サンプルを採取し、続いてコダニに関して調べる。
【０３９０】
コダニは、年齢毎に群に分け、別個にアッセイする。年齢は、以下のとおり幼虫又は蛹の形態及び色素沈着に基づき決定する：動き回るのに十分に小さい吐糸幼虫から採取されるコダニは、群１に分類し；巣房にいるには大き過ぎ、その口を巣房開口の方に向けて直立に伸長し始める、伸びた幼虫から採取されるコダニは、群２に分類し；及び蛹から採取されるコダニは、群３に分類する。コダニは、５０単位を収集するまで、ガラスペトリ皿内でその宿主幼虫又は蛹の上に保存する。これにより、その摂餌ルーチン及び生理学的状態が変化しないままであることが確実になる。コダニがその宿主幼虫又は蛹からはぐれたり、又は互いの上によじ登ったりすることを防ぐため、同じディッシュには同じ発育段階の宿主のみを飼育した。
【０３９１】
器具  −  ステンレス鋼リング（５６ｍｍ内径、２〜３ｍｍ高さ）及び２枚の円形ガラス（６２ｍｍ直径）  −  をアセトン及びヘキサン又はペンタンで清浄にして、試験アリーナを形成する。アリーナのガラス円盤及びリングに一様に噴霧することにより、オキシテトラサイクリン溶液及び対照溶液を器具に適用する。このため、リザーバに１ｍｌの溶液を装填する。チューブの底端からの噴霧表面の距離は、１１ｍｍに設定し、０．０２７５インチノズルを使用する。堆積した溶液の量が１±０．０５ｍｇ／ｃｍ２になるまで圧力を調整する（通常、３５０〜５００ｈＰａの範囲）。抗生物質溶液をそのそれぞれのディッシュに対し、ディッシュの底面が全て隠れるように注ぎ、残留液体は、ドラフト下で蒸発させる。円形ガラス間にリングを置いてケージを組み立てる。ケージは、３つ以下のアッセイのために調製から６０時間以内に使用して、抗生物質溶液へのコダニの曝露を制御する。このケージに１０〜１５匹のコダニを導入し、器具のピースを溶融ワックスの液滴で共につなぎ合わせる。吐糸幼虫、伸長した幼虫、白色眼蛹及び白色乃至蒼白色の体を有する暗色眼期から収集されるコダニが使用される。
【０３９２】
４時間後、餌となる２又は３匹の白色眼蛹（蓋をして４〜５日後）と共にコダニを清浄なガラスペトリ皿（６０ｍｍ直径）に移す。抗生物質又は対照溶液による処理後４時間、２４時間及び４８時間でコダニを解剖顕微鏡下に観察し、以下のカテゴリに従って分類する：
・可動：その脚上を針でつつかれた後かどうかに関わらず、コダニは歩き回る。
・麻痺：コダニは、１つ以上の付属器を未刺激で又は刺激後に動かすが、歩き回ることはできない。
・死亡：動けず、３回の連続した刺激に反応しない。
【０３９３】
滅菌つまようじ又は針を使用してその脚に触れることによりコダニを刺激する。各群の刺激には新しいつまようじ又は滅菌針を使用して、コダニ群間での汚染を避ける。
【０３９４】
アッセイは、３２．５℃及び６０〜７０％相対湿度で実施する。対照の死亡率が３０％を超えた場合、そのレプリケートを除外する。各実験を４つの一連のケージで反復する。
【０３９５】
コダニ群におけるバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の状態をＰＣＲによって評価する。ＤＮＡ  Ｋｉｔ（ＯＭＥＧＡ、Ｂｉｏ−ｔｅｋ）を製造者のプロトコルに従って使用して、対照（オキシテトラサイクリン処理なし）及びオキシテトラサイクリン処理した個体（全身）から全ＤＮＡを単離する。バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）のプライマー、フォワードプライマー５’−ＧＡＧＧＴＡＧＡＣＧＡＡＧＣＧＡＣＣＴＧ−３’（配列番号２３３）及びリバースプライマー５’−ＴＴＣＣＣＴＣＡＣＧＧＴＡＣＴＧＧＴＴＣ−３’（配列番号２３４）は、Ｐｒｉｍｅｒ  ５．０ソフトウェア（Ｐｒｉｍｅｒ−Ｅ  Ｌｔｄ．，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ，ＵＫ）を使用して、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ゲノム（受託番号：ＡＰ００７２０９．１）から得られる２３Ｓ−５Ｓ  ｒＲＮＡ配列（Ｔａｋｅｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９４（１７）：４７６７−４７６８，２０１２）に基づいて設計する。ＰＣＲ増幅サイクルには、９５℃で５分の初期変性ステップ、９５℃で１分、５９℃で１分、及び７２℃で２分を３５サイクル、及び７２℃で５分の最終延長ステップが含まれた。オキシテトラサイクリン処理サンプル及び対照サンプルからの増幅産物を１％アガロースゲル上で分析し、ＳＹＢＲ  ｓａｆｅで染色し、イメージングシステムを使用して可視化する。
【０３９６】
オキシテトラサイクリン溶液で処理したコダニの生存率を陰性対照で処理したミツバチヘギイタダニと比較する。
【０３９７】
オキシテトラサイクリン溶液で処理したコダニの生存率及び移動性は、対照と比較して低下するものと予想される。
【０３９８】
実施例５：ファージライブラリの作成
本実施例は、環境サンプルからのファージコレクションの取得を実証する。
【０３９９】
治療計画：以下のファージ科を有するファージライブラリコレクション：マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）、サイフォウイルス科（Ｓｉｐｈｏｖｉｒｉｄａｅ）、ポドウイルス科（Ｐｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、リポスリクスウイルス科（Ｌｉｐｏｔｈｒｉｘｖｉｒｉｄａｅ）、ルディウイルス科（Ｒｕｄｉｖｉｒｉｄａｅ）、アンピュラウイルス科（Ａｍｐｕｌｌａｖｉｒｉｄａｅ）、ビカウダウイルス科（Ｂｉｃａｕｄａｖｉｒｉｄａｅ）、クラバウイルス科（Ｃｌａｖａｖｉｒｉｄａｅ）、コルチコウイルス科（Ｃｏｒｔｉｃｏｖｉｒｉｄａｅ）、シストウイルス科（Ｃｙｓｔｏｖｉｒｉｄａｅ）、フセロウイルス科（Ｆｕｓｅｌｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、グロブロウイルス科（Ｇｌｕｂｏｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、グッタウイルス科（Ｇｕｔｔａｖｉｒｉｄａｅ）、イノウイルス科（Ｉｎｏｖｉｒｉｄａｅ）、レビウイルス科（Ｌｅｖｉｖｉｒｉｄａｅ）、ミクロウイルス科（Ｍｉｃｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、プラズマウイルス科（Ｐｌａｓｍａｖｉｒｉｄａｅ）、テクティウイルス科（Ｔｅｃｔｉｖｉｒｉｄａｅ）
【０４００】
実験計画：
２週間にわたって複数の環境サンプル（土壌、池底質、下水）を滅菌１Ｌフラスコに採取し、採取後直ちに以下に記載するとおり処理し、その後、４℃で保存する。土壌サンプルは、最終容積が１００ｍＬになるように２ｍＭ  ＣａＣｌ２を補充した滅菌２倍濃度ディフコルリアブロス（ＬＢ）又はトリプトソイブロス（ＴＳＢ）中でホモジナイズする。リン酸塩試験ストリップを使用してｐＨ及びリン酸塩レベルを測定する。精製のため、全てのサンプルをＭｅｇａｆｕｇｅ  １．０Ｒ、Ｈｅｒａｅｕｓ又はＥｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心機５７０２  Ｒにおいて３０００〜６０００ｇ、＋４℃で１０〜１５分間遠心し、０．２μｍ低タンパク質フィルタでろ過することにより、全ての残留細菌細胞を除去する。上清をガラスボトルに入れてクロロホルムの存在下において４℃で保存する。
【０４０１】
実施例６：標的特異的ファージの同定
本実施例は、異種ファージライブラリからの単一の標的特異的ファージの分離、精製及び同定を実証する。
【０４０２】
実験計画：
２０〜３０ｍｌの実施例５に記載されるファージライブラリをＬＢブロスで３０〜４０ｍｌの容積に希釈する。標的細菌株、例えばブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）を加えて（ＬＢブロスで成長させた５０〜２００μｌ一晩培養物）、培養物中におけるこの特異的細菌株を標的とするファージを集積する。この培養物を２３０ｒｐｍで振盪して＋３７℃で一晩インキュベートする。この集積培養物から細菌を遠心（Ｍｅｇａｆｕｇｅ  １．０Ｒ、Ｈｅｒａｅｕｓ又はＥｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心機５７０２  Ｒにおいて３０００〜６０００ｇ、１５〜２０分、＋４℃）及びろ過（０．２又は０．４５μｍフィルタ）によって除去する。２．５ｍｌの細菌不含培養物を２．５ｍｌのＬＢブロス及び５０〜１００μｌの標的細菌に加えてファージを集積する。集積培養物を上記のとおり一晩成長させる。この集積培養物からのサンプルを室温において１３，０００ｇで１５分間遠心し、１００〜３００μｌの標的細菌及び３ｍｌの融解した０．７％軟寒天と共にＬＢ寒天が入ったペトリ皿に１０μｌの上清をプレーティングする。プレートを＋３７℃で一晩インキュベートする。菌叢に観察されるプラークの各々をピッキングし、５００μｌのＬＢブロスに移す。このプラークストックからのサンプルを標的細菌上に更にプレーティングする。見出される全てのファージについてプラーク精製を３回実施し、それにより不均質なファージ混合物から単一の均質なファージを分離する。
【０４０３】
コンフルエントな溶解を呈する宿主細菌株のオーバーレイプレートを回収することにより、高力価ファージ（＞１×１０＾１０  ＰＦＵ／ｍｌ）のプレートからのライセートを調製する。５ｍｌの緩衝液をあふれさせた後、軟寒天オーバーレイを浸軟させ、遠心によって清澄化し、ろ過滅菌する。得られたライセートは、４℃で保存する。高力価ファージライセートは、（Ｓｕｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９２：１７９−１９０，２０１０）に記載されるとおり等密度ＣｓＣｌ遠心によって更に精製する。
【０４０４】
（Ｓｕｍｍｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５０２：２７−４６，２００９）に記載されるとおり、ＣｓＣｌ精製ファージ懸濁液からＤＮＡを単離する。４５４パイロシーケンシング法を用いることにより２プールのファージゲノムの一部として個々の分離したファージをシーケンシングする。ファージゲノムＤＮＡを約１００ｎｇ／Ｌの最終濃度となるように等モル量で混合する。プールＤＮＡを剪断し、プールの各々に特異的な多重識別（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：ＭＩＤ）タグとライゲートし、Ｒｏｃｈｅ  ＦＬＸ  Ｔｉｔａｎｉｕｍシーケンサーで製造者のプロトコルに従って全プレート反応を用いてパイロシーケンシングにより配列決定する。プールファージＤＮＡは、２つのシーケンシング反応に存在する。Ｎｅｗｂｌｅｒ  Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ、バージョン２．５．３（４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用することにより、１アセンブリ当たり単一のＭＩＤを含むリードのみを含むように設定を調整することによってプールの各々に対応するトリミング後のＦＬＸ  Ｔｉｔａｎｉｕｍフローグラム出力を個別にアセンブルする。コンティグ配列に対して生成されるプライマー及び鋳型としての個々のファージゲノムＤＮＡ調製物を使用したＰＣＲにより、個々のコンティグのアイデンティティを決定する。Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ  ４．８（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して配列アセンブリ及び編集を行う。ファージ染色体末端構造を実験的に決定する。ファージの付着（ｃｏｓ）末端は、（Ｓｕｍｍｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５０２：２７−４６，２００９）に記載されるとおり、ファージゲノムの末端までシーケンシングし、環状化したゲノムＤＮＡのライゲート接合部を介した増幅によって得られるＰＣＲ産物をシーケンシングすることにより決定される。ＧｅｎｅＭａｒｋ．ｈｍｍを使用して初めにタンパク質コード領域を予測し（Ｌｕｋａｓｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６：１１０７−１１１５，１９９８）、Ａｒｔｅｍｉｓにおける手動分析で精緻化し（Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １６：９４４−９４５，２０００．）、ＢＬＡＳＴ（０．００５のＥ値カットオフ）を用いて分析する（Ｃａｍａｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １０：４２１，２００９）。特に興味深いタンパク質は、ＩｎｔｅｒＰｒｏＳｃａｎによって更に分析する（Ｈｕｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．４０：Ｄ３０６−Ｄ３１２，２０１２）。
【０４０５】
内部共生細菌ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）を溶解させたＣｓＣｌ精製ファージ（＞１×１０＾１１  ＰＦＵ／ｍｌ）について、ストックをトリプトソイブロス緩衝液で希釈することにより電子顕微鏡法を実施する。薄い４００メッシュ炭素被覆フォルムバールグリッドにファージを適用し、２％（ｗｔ／ｖｏｌ）酢酸ウラニルで染色し、風乾する。１００ｋＶの加速電圧で動作するＪＥＯＬ  １２００ＥＸ透過型電子顕微鏡で標本を観察する。各ファージにつき５個のビリオンを測定し、適宜、カプシド及び尾部の寸法の平均値及び標準偏差を計算する。
【０４０６】
実施例７：精製ファージ溶液によるアブラムシの処理
本実施例は、アブラムシをファージ溶液で処理することによりそれを死滅させるか又はその適応度を低下させることが可能であることを実証する。本実施例は、ファージがアブラムシに及ぼす効果が、ファージに敏感である、アブラムシにとって内因性の細菌個体群の調節を通じて媒介されることを実証する。１つの標的となる細菌株は、実施例６で同定されたファージによるブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）である。
【０４０７】
アブラムシは、微生物叢調節薬剤及びアブラムシの適応度への効果の試験に代表的な種である。
【０４０８】
治療計画：
０．５％ショ糖及び必須アミノ酸を含有する１０ｍＬの滅菌水中に０（陰性対照）、１０２、１０５又は１０８プラーク形成単位（ｐｆｕ）／ｍｌの実施例６からのファージでファージ溶液を製剤化する。
【０４０９】
実験計画：
処理の準備のため、アブラムシを実験室環境及び培地中で成長させる。環境制御された室内において（１６時間光周期；６０±５％ＲＨ；２０±２℃）、ソラマメ植物をバーミキュライトとパーライトとの混合物において１６時間明期及び８時間暗期として２４℃で成長させる。母性効果又は植物間の健康の差を抑制するため、異なる植物からの５〜１０匹の成虫を１０本の２週齢植物に分配し、高密度になるまで５〜７日間増殖させる。実験のため、健康植物から２齢及び３齢アブラムシを採集し、各処理が採集植物の各々からほぼ同じ数の個体を受け取るように処理に分ける。
【０４１０】
ファージ溶液を本明細書に記載されるとおり調製する。９６ウェルプレートのウェルに２００μｌのアブラムシ用人工食（Ｆｅｂｖａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｚｏｏｌｏｇｙ  ６６（１１）：２４４９−２４５３，１９８８）を充填し、プレートをパラフィルムで覆って給餌サシェを作る。人工食は、陰性対照としての滅菌水並びに０．５％ショ糖及び必須アミノ酸と混合するか、又は様々なファージ濃度のファージ溶液と混合する。ファージ溶液は、１０２〜１０８（ｐｆｕ）／ｍｌのファージ終濃度となるように人工食と混合する。
【０４１１】
各レプリケート処理について、３０〜５０匹の２齢及び３齢アブラムシを９６ウェルプレートのウェルに個別に置き、給餌サシェプレートを逆さにしてその上に被せることにより、昆虫を、パラフィルムを通じて摂餌させると共に、個々のウェルに拘束しておく。実験用アブラムシは、アブラムシコロニーと同じ環境条件下に保つ。アブラムシに２４時間給餌した後、給餌サシェを滅菌人工食が入った新しいサシェに交換し、４日間にわたって２４時間毎に新しい滅菌サシェを提供する。サシェの交換時、アブラムシの死亡に関しても確認する。アブラムシは、褐色に変化していた場合、又はウェルの底にいて、観察している間に動かない場合に死んでいると見なす。アブラムシが給餌サシェのパラフィルム上にいるものの動かない場合、摂餌中で生きていると考える。
【０４１２】
アブラムシサンプル中のブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）の状態をＰＣＲによって評価する。陰性対照からのアブラムシ成虫（ファージ処理なし）及びファージ処理群は、初めに７０％エタノールで１分間、１０％ブリーチで１分間表面滅菌し、超純水で１分間の洗浄を３回行う。各個体（全身）から、昆虫ＤＮＡキット（ＯＭＥＧＡ、Ｂｉｏ−ｔｅｋ）を製造者のプロトコルに従って使用して全ＤＮＡを抽出する。ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）のプライマー、フォワードプライマー５’−ＧＴＣＧＧＣＴＣＡＴＣＡＣＡＴＣＣ−３’（配列番号２３５）及びリバースプライマー５’−ＴＴＣＣＧＴＣＴＧＴＡＴＴＡＴＣＴＣＣＴ−３’（配列番号２３６）は、Ｐｒｉｍｅｒ  ５．０ソフトウェア（Ｐｒｉｍｅｒ−Ｅ  Ｌｔｄ．，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ，ＵＫ）を使用して、ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）ゲノム（受託番号：ＧＣＡ＿０００００９６０５．１）から得られた２３Ｓ−５Ｓ  ｒＲＮＡ配列をベースとして設計する（Ｓｈｉｇｅｎｏｂｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４０７：８１−８６，２０００）。ＰＣＲ増幅サイクルには、９５℃で５分の初期変性ステップと、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒及び７２℃で６０秒の３５サイクルと、７２℃で１０分の最終延長ステップとが含まれた。リファンピシン処理サンプル及び対照サンプルからの増幅産物を１％アガロースゲル上で分析し、ＳＹＢＲ  ｓａｆｅで染色し、イメージングシステムを使用して可視化する。ファージ処理したアブラムシは、ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）特異的遺伝子の減少を示す。
【０４１３】
ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）特異的ファージで処理したアブラムシの生存率を陰性対照処理のアブラムシと比較する。ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）特異的ファージで処理したアブラムシの生存率は、対照処理アブラムシと比較したときに低下する。
【０４１４】
実施例８：ｃｏｌＡバクテリオシン溶液の作製
本実施例は、ｃｏｌＡバクテリオシンの作製及び精製を実証する。
コンストラクト配列：
【化１】
2020506960.tif 000127
【０４１５】
実験計画：
上流（ＮｄｅＩ）及び下流（ＸｈｏＩ）制限部位を有する特異的プライマーによるＰＣＲによってＤＮＡを作成する。フォワードプライマーＧＴＡＴＣＴＡＴＴＣＣＣＧＴＣＴＡＣＧＡＡＣＡＴＡＴＧＧＡＡＴＴＣＣ（配列番号２３８）及びリバースプライマーＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＣＡＴＣＴＧＡＣＡＣＴＴＣＣＴＣＣＡＡ（配列番号２３９）。精製したＰＣＲ断片（Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔ  ＩＩ−Ｍａｃｈｅｒｅｙ  Ｎａｇｅｌ）をＮｄｅＩ又はＸｈｏＩで消化し、次に断片をライゲートする。ｃｏｌＡクローニングのため、ライゲートしたＤＮＡ断片をｐｃｒ２．１（ＧｅｎＢａｎｋデータベース受託番号ＥＹ１２２８７２）ベクターにクローニングする（Ａｎｓｅｌｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｂｉｏｌ．６：４３，２００８）。ヌクレオチド配列を系統的に確認する（Ｃｏｇｅｎｉｃｓ）。
【０４１６】
ｃｏｌＡ配列を有するプラスミドをＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＬｙｓで発現させる。細菌をＬＢブロス中において３０℃で成長させる。ＯＤ６００が０．９になったところで、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を１ｍＭの終濃度となるように加え、細胞を６時間成長させた。１００ｍＭ  ＮａＣＬ、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１００ｍＭトリス塩基ｐＨ９．５中での音波処理によって細菌を溶解させ、ＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にタンパク質をロードする。カラムを１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ６．８及びＰＢＳで連続的に洗浄する。ＰＢＳ中０．３Ｍイミダゾールで溶出を実施する。脱塩ＰＤ−１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してイミダゾールを除去し、ＰＢＳに可溶化したペプチドを遠心フィルタユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濃縮する。
ＣｏｌＡタンパク質配列：
【化２】
2020506960.tif 000128
【０４１７】
実施例９：ｃｏｌＡバクテリオシン溶液によるアブラムシの処理
本実施例は、アブラムシをバクテリオシン溶液で処理することによりそれを死滅させるか又はその適応度を低下させることが可能であることを実証する。本実施例は、バクテリオシンがアブラムシに及ぼす効果が、ＣｏｌＡバクテリオシンに敏感である、アブラムシにとって内因性の細菌個体群の調節を通じて媒介されることを実証する。１つの標的となる細菌株は、実施例８で作製されたバクテリオシンによるブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）である。
【０４１８】
治療計画：
０．５％ショ糖及び必須アミノ酸を含有する１０ｍＬの滅菌水中に０（陰性対照）、０．６、１、５０又は１００ｍｇ／ｍｌの実施例８からのＣｏｌＡでＣｏｌＡ溶液を製剤化する。
【０４１９】
実験計画：
処理の準備のため、アブラムシを実験室環境及び培地中で成長させる。環境制御された室内において（１６時間光周期；６０±５％ＲＨ；２０±２℃）、植物をバーミキュライトとパーライトとの混合物で成長させて、アブラムシを寄生させる。同じ環境条件でホソヒラタアブ（Ｅ．ｂａｌｔｅａｔｕｓ）幼虫を大量生産から入手する。ハナアブは、糖、花粉及び水で育て；及び３時間中に飼育箱に寄生を受けた宿主植物を導入することにより産卵を誘発する。完全なライフサイクルが宿主植物上で行われ、植物は、毎日新しくアブラムシの寄生を受ける。
【０４２０】
９６ウェルプレートのウェルに２００μｌのアブラムシ用人工食（Ｆｅｂｖａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｚｏｏｌｏｇｙ  ６６（１１）：２４４９−２４５３，１９８８）を充填し、プレートをパラフィルムで覆って給餌サシェを作る。人工食は、陰性対照としての０．５％ショ糖及び必須アミノ酸を含有する滅菌水の溶液と混合するか、又は様々な濃度のＣｏｌＡを含有するＣｏｌＡ溶液と混合する。ＣｏｌＡ溶液は、０．６〜１００ｍｇ／ｍｌの終濃度に達するように人工食と混合する。
【０４２１】
各レプリケート処理について、３０〜５０匹の２齢及び３齢アブラムシを９６ウェルプレートのウェルに個別に置き、給餌サシェプレートを逆さにしてその上に被せることにより、昆虫を、パラフィルムを通じて摂餌させると共に、個々のウェルに拘束しておく。実験用アブラムシは、アブラムシコロニーと同じ環境条件下に保つ。アブラムシに２４時間給餌した後、給餌サシェを滅菌人工食が入った新しいサシェに交換し、４日間にわたって２４時間毎に新しい滅菌サシェを提供する。サシェの交換時、アブラムシの死亡に関しても確認する。アブラムシは、褐色に変化していた場合、又はウェルの底にいて、観察している間に動かない場合に死んでいると見なす。アブラムシが給餌サシェのパラフィルム上にいるものの動かない場合、摂餌中で生きていると考える。
【０４２２】
アブラムシサンプル中のブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）の状態をＰＣＲによって評価する。陰性対照の及びファージ処理したアブラムシ成虫は、初めに７０％エタノールで１分間、１０％ブリーチで１分間表面滅菌し、超純水で１分間の洗浄を３回行う。各個体（全身）から、昆虫ＤＮＡキット（ＯＭＥＧＡ、Ｂｉｏ−ｔｅｋ）を製造者のプロトコルに従って使用して全ＤＮＡを抽出する。ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）のプライマー、フォワードプライマー５’−ＧＴＣＧＧＣＴＣＡＴＣＡＣＡＴＣＣ−３’（配列番号２３５）及びリバースプライマー５’−ＴＴＣＣＧＴＣＴＧＴＡＴＴＡＴＣＴＣＣＴ−３’（配列番号２３６）は、Ｐｒｉｍｅｒ  ５．０ソフトウェア（Ｐｒｉｍｅｒ−Ｅ  Ｌｔｄ．，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ，ＵＫ）を使用して、ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）ゲノム（受託番号：ＧＣＡ＿０００００９６０５．１）から得られた２３Ｓ−５Ｓ  ｒＲＮＡ配列をベースとして設計する（Ｓｈｉｇｅｎｏｂｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２００．４０７，８１−８６）。ＰＣＲ増幅サイクルには、９５℃で５分の初期変性ステップと、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒及び７２℃で６０秒の３５サイクルと、７２℃で１０分の最終延長ステップとが含まれた。リファンピシン処理サンプル及び対照サンプルからの増幅産物を１％アガロースゲル上で分析し、ＳＹＢＲ  ｓａｆｅで染色し、イメージングシステムを使用して可視化する。ＣｏｌＡ処理したアブラムシは、ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）特異的遺伝子の減少を示す。
【０４２３】
ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）特異的ＣｏｌＡバクテリオシンで処理したアブラムシの生存率を陰性対照処理のアブラムシと比較する。ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）特異的ＣｏｌＡバクテリオシンで処理したアブラムシの生存率は、対照処理アブラムシと比較したとき低下する。
【０４２４】
実施例１０：リファンピシン溶液によるアブラムシの処理
本実施例は、細菌ＲＮＡポリメラーゼの阻害によってＤＮＡ依存性ＲＮＡ合成を阻害する狭域スペクトル抗生物質であるリファンピシンでアブラムシを処理することによりそれを死滅させるか又はその適応度を低下させることが可能であることを実証する。本実施例は、リファンピシンがアブラムシに及ぼす効果が、リファンピシンに敏感である、アブラムシにとって内因性の細菌個体群の調節を通じて媒介されることを実証する。１つの標的となる細菌株は、ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）である。
【０４２５】
治療計画：
０．５％ショ糖及び必須アミノ酸を含有する１０ｍＬの滅菌水中に０（陰性対照）、１、１０又は５０μｇ／ｍｌリファンピシンで抗生物質溶液を製剤化する。
【０４２６】
実験計画：
処理の準備のため、アブラムシを実験室環境及び培地中で成長させる。環境制御された室内において（１６時間光周期；６０±５％ＲＨ；２０±２℃）、ソラマメ植物をバーミキュライトとパーライトとの混合物において１６時間明期及び８時間暗期として２４℃で成長させる。母性効果又は植物間の健康の差を抑制するため、異なる植物からの５〜１０匹の成虫を１０本の２週齢植物に分配し、高密度になるまで５〜７日間増殖させる。実験のため、健康植物から２齢及び３齢アブラムシを採集し、各処理が採集植物の各々からほぼ同じ数の個体を受け取るように処理に分ける。
【０４２７】
リファンピシン溶液は、０．５％ショ糖及び必須アミノ酸を含有する滅菌水中にリファンピシン（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ、５５７３０３）を溶解させることにより作成する。９６ウェルプレートのウェルに２００μｌのアブラムシ用人工食（Ｆｅｂｖａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｚｏｏｌｏｇｙ  ６６（１１）：２４４９−２４５３，１９８８）を充填し、プレートをパラフィルムで覆って給餌サシェを作る。人工食は、陰性対照として滅菌水並びに０．５％ショ糖及び必須アミノ酸と混合するか、又はリファンピシン濃度の１つのリファンピシン溶液と混合する。リファンピシン溶液は、１〜５０μｇ／ｍｌの抗生物質終濃度が得られるように人工食と混合する。
【０４２８】
各レプリケート処理について、３０〜５０匹の２齢及び３齢アブラムシを９６ウェルプレートのウェルに個別に置き、給餌サシェプレートを逆さにしてその上に被せることにより、昆虫を、パラフィルムを通じて摂餌させると共に、個々のウェルに拘束しておく。実験用アブラムシは、アブラムシコロニーと同じ環境条件下に保つ。アブラムシに２４時間給餌した後、給餌サシェを滅菌人工食が入った新しいサシェに交換し、４日間にわたって２４時間毎に新しい滅菌サシェを提供する。サシェの交換時、アブラムシの死亡に関しても確認する。アブラムシは、褐色に変化していた場合、又はウェルの底にいて、観察している間に動かない場合に死んでいると見なす。アブラムシが給餌サシェのパラフィルム上にいるものの動かない場合、摂餌中で生きていると考える。
【０４２９】
アブラムシサンプル中のブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）の状態をＰＣＲによって評価する。対照（リファンピシン処理なし）及びリファンピシン処理した個体から、昆虫ＤＮＡキット（ＯＭＥＧＡ、Ｂｉｏ−ｔｅｋ）を製造者のプロトコルに従って使用して全ＤＮＡを単離する。ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）のプライマー、フォワードプライマー５’−ＧＴＣＧＧＣＴＣＡＴＣＡＣＡＴＣＣ−３’（配列番号２３５）及びリバースプライマー５’−ＴＴＣＣＧＴＣＴＧＴＡＴＴＡＴＣＴＣＣＴ−３’（配列番号２３６）は、Ｐｒｉｍｅｒ  ５．０ソフトウェア（Ｐｒｉｍｅｒ−Ｅ  Ｌｔｄ．，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ，ＵＫ）を使用して、ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）ゲノム（受託番号：ＧＣＡ＿０００００９６０５．１）から得られた２３Ｓ−５Ｓ  ｒＲＮＡ配列をベースとして設計する（Ｓｈｉｇｅｎｏｂｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４０７：８１−８６，２０００）。ＰＣＲ増幅サイクルには、９５℃で５分の初期変性ステップと、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒及び７２℃で６０秒の３５サイクルと、７２℃で１０分の最終延長ステップとが含まれた。リファンピシン処理サンプル及び対照サンプルからの増幅産物を１％アガロースゲル上で分析し、ＳＹＢＲ  ｓａｆｅで染色し、イメージングシステムを使用して可視化する。リファンピシン処理したアブラムシは、ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）特異的遺伝子の減少を示す。
【０４３０】
リファンピシン溶液で処理したアブラムシの生存率を陰性対照処理のアブラムシと比較する。リファンピシン溶液で処理したアブラムシの生存率は、対照と比較して低下する。
【０４３１】
実施例１１：ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）ターゲティング分子のハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）
本実施例は、ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）を標的とする分子の同定を実証する。
【０４３２】
実験計画：標的細菌株、ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）の阻害薬を同定するためのＨＴＳでは、ｐＨ−ＭＭＳｕｃ培地中でのショ糖発酵（Ｙｍｅｌｅ−Ｌｅｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ７（２）：ｅ３１３０７，２０１２）を用いて培地のｐＨを低下させる。培地中のｐＨ指示薬により、６１５ｎｍにおける吸光度（Ａ６１５）の変化によって培地酸性化を分光光度的にモニタする。グリセロールストックに由来する標的細菌株、ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）をＬＢ寒天平板にプレーティングし、３７℃で一晩インキュベートする。白金耳量の細胞を回収し、ＰＢＳで３回洗浄し、次に０．０１５の光学濃度でＰＢＳに再懸濁する。
【０４３３】
ＨＴＳのため、１０μＬのこの細菌細胞懸濁液をアリコートに分けて、（Ｙｍｅｌｅ−Ｌｅｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ７（２）：ｅ３１３０７，２０１２）に記載される、３０μＬのｐＨ−ＭＭＳｕｃ培地と、内部寄生真菌、内部寄生細菌、土壌細菌及び海洋細菌などの微生物供給源からの予め分画された抽出物（３８４ウェルプレートにアレイ化された３９，３１４個の抽出物）の天然産物ライブラリからの１００ｎＬの試験化合物画分とが入った３８４ウェルプレートのウェルに入れる。各アッセイについて、室温で６時間及び２０時間インキュベートした後、Ａ６１５を測定する。このステップは、ライブラリからの全ての画分の試験にＥｎＶｉｓｉｏｎ（商標）マルチウェル分光光度計を使用して３８４ウェルプレートフォーマットで自動化及びバリデートされる。ショ糖発酵による培地酸性化の遅延及び細胞成長の阻害を実証する画分を更なる精製及び同定に選択する。
【０４３４】
実施例１２：ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）特異的分子の分離及び同定
本実施例は、ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）のショ糖発酵を遮断し且つ細胞成長を阻害する、実施例１１に記載される画分からの分離株の分離及び同定を実証する。
【０４３５】
実験計画：
実施例１１に記載される画分を９０％水／メタノール中に再懸濁し、Ｃ１８  ＳＰＥカラムに通して画分Ｉを得る。次に、このカラムをメタノールで洗浄して画分ＩＩを得る。画分ＩＩを、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズＨＰＬＣで分取用フェニルヘキシルカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｌｕｎａ、２５ｃｍ６１０ｍｍ、５ｍｍ粒径）により２０％アセトニトリル／０．１％ギ酸含有水の溶出緩衝液を使用して２ｍＬ／分の流速で５０分間分離する。これにより、異なる溶出時間で複数の化合物が得られる。Ａｌｐｈａ  ＦＴ−ＩＲ質量分析計（Ｂｒｕｋｅｒ）、Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ（商標）５３００  ｐｒｏ紫外／可視光分光光度計（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＩＮＯＶＡ  ６００ＭＨｚ核磁気共鳴分光計（Ｖａｒｉａｎ）で各化合物のスペクトルを入手する。
【０４３６】
実施例１３：ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）特異的分子の溶液によるアブラムシの処理
本実施例は、実施例１２で同定された化合物の１つでアブラムシを処理することにより、その化合物に敏感である、アブラムシにとって内因性の細菌個体群の調節を通じてそれを死滅させるか又はその適応度を低下させることが可能であることを実証する。１つの標的となる細菌株は、ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）である。
【０４３７】
治療計画：
０．５％ショ糖及び必須アミノ酸を含有する１０ｍＬの滅菌水中に実施例１２からの各化合物を０（陰性対照）、０．６、１、２０又は８０μｇ／ｍｌで製剤化する。
【０４３８】
実験計画：
処理の準備のため、アブラムシを実験室環境及び培地中で成長させる。環境制御された室内において（１６時間光周期；６０±５％ＲＨ；２０±２℃）、ソラマメ植物をバーミキュライトとパーライトとの混合物において１６時間明期及び８時間暗期として２４℃で成長させる。母性効果又は植物間の健康の差を抑制するため、異なる植物からの５〜１０匹の成虫を１０本の２週齢植物に分配し、高密度になるまで５〜７日間増殖させる。実験のため、健康植物から２齢及び３齢アブラムシを採集し、各処理が採集植物の各々からほぼ同じ数の個体を受け取るように処理に分ける。
【０４３９】
９６ウェルプレートのウェルに２００μｌのアブラムシ用人工食（Ｆｅｂｖａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｚｏｏｌｏｇｙ  ６６（１１）：２４４９−２４５３，１９８８）を充填し、プレートをパラフィルムで覆って給餌サシェを作る。人工食は、陰性対照としての０．５％ショ糖及び必須アミノ酸を含有する滅菌水と混合するか、又は様々な濃度の化合物を含む溶液と混合する。
【０４４０】
各レプリケート処理について、３０〜５０匹の２齢及び３齢アブラムシを９６ウェルプレートのウェルに個別に置き、給餌サシェプレートを逆さにしてその上に被せることにより、昆虫を、パラフィルムを通じて摂餌させると共に、個々のウェルに拘束しておく。実験用アブラムシは、アブラムシコロニーと同じ環境条件下に保つ。アブラムシに２４時間給餌した後、給餌サシェを滅菌人工食が入った新しいサシェに交換し、４日間にわたって２４時間毎に新しい滅菌サシェを提供する。サシェの交換時、アブラムシの死亡に関しても確認する。アブラムシは、褐色に変化していた場合、又はウェルの底にいて、観察している間に動かない場合に死んでいると見なす。アブラムシが給餌サシェのパラフィルム上にいるものの動かない場合、摂餌中で生きていると考える。
【０４４１】
アブラムシサンプル中のブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）の状態をＰＣＲによって評価する。陰性対照の及び化合物１で処理したアブラムシは、初めに７０％エタノールで１分間、１０％ブリーチで１分間表面滅菌し、超純水で１分間の洗浄を３回行う。各個体（全身）から、昆虫ＤＮＡキット（ＯＭＥＧＡ、Ｂｉｏ−ｔｅｋ）を製造者のプロトコルに従って使用して全ＤＮＡを抽出する。ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）のプライマー、フォワードプライマー５’−ＧＴＣＧＧＣＴＣＡＴＣＡＣＡＴＣＣ−３’（配列番号２３５）及びリバースプライマー５’−ＴＴＣＣＧＴＣＴＧＴＡＴＴＡＴＣＴＣＣＴ−３’（配列番号２３６）は、Ｐｒｉｍｅｒ  ５．０ソフトウェア（Ｐｒｉｍｅｒ−Ｅ  Ｌｔｄ．，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ，ＵＫ）を使用して、ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）ゲノム（受託番号：ＧＣＡ＿０００００９６０５．１）から得られた２３Ｓ−５Ｓ  ｒＲＮＡ配列をベースとして設計する（Ｓｈｉｇｅｎｏｂｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４０７：８１−８６，２０００）。ＰＣＲ増幅サイクルには、９５℃で５分の初期変性ステップと、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒及び７２℃で６０秒の３５サイクルと、７２℃で１０分の最終延長ステップとが含まれた。化合物１処理サンプル及び対照サンプルからの増幅産物を１％アガロースゲル上で分析し、ＳＹＢＲ  ｓａｆｅで染色し、イメージングシステムを使用して可視化する。ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）特異的遺伝子の減少が化合物１の抗微生物活性を示す。
【０４４２】
化合物で処理したアブラムシの生存率を陰性対照処理のアブラムシと比較する。化合物で処理したアブラムシの生存率の低下は、化合物の抗微生物活性を示すことが予想される。
【０４４３】
実施例１４：抗生物質溶液で処理される昆虫
本実施例は、細菌ＲＮＡポリメラーゼの阻害によってＤＮＡ依存性ＲＮＡ合成を阻害する狭域スペクトル抗生物質であるリファンピシンによるアブラムシの処理を実証する。本実施例は、リファンピシンがモデル昆虫種のアブラムシに及ぼす効果が、リファンピシンに敏感である、昆虫にとって内因性の細菌個体群の調節を通じて媒介されたことを実証する。１つの標的となる細菌株は、ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）である。
【０４４４】
治療計画
以下のとおり、送達手段に応じて抗生物質溶液を製剤化した（図１Ａ〜図１Ｇ）：
１）経植物：必須アミノ酸（２ｍｇ／ｍｌヒスチジン、２ｍｇ／ｍｌイソロイシン、２ｍｇ／ｍｌロイシン、２ｍｇ／ｍｌリジン、１ｍｇ／ｍｌメチオニン、１．６２ｍｇ／ｍｌフェニルアラニン、２ｍｇ／ｍｌスレオニン、１ｍｇ／ｍｌトリプトファン及び２ｍｇ／ｍｌバリン）含有及び不含の人工食（Ａｋｅｙ  ａｎｄ  Ｂｅｃｋ，１９７１をベースとする；実験計画を参照されたい）に製剤化した０（陰性対照）又は１００μｇ／ｍｌのリファンピシン含有。
２）葉面塗布：水中１００μｌの０．０２５％非イオン性有機ケイ素系界面活性剤溶媒Ｓｉｌｗｅｔ  Ｌ−７７（陰性対照）又は溶媒溶液中に製剤化した１００μｌの５０μｇ／ｍｌのリファンピシンを葉の表面に直接塗って乾燥させた。
３）マイクロインジェクション：注入溶液は、水中０．０２５％非イオン性有機ケイ素系界面活性剤溶媒Ｓｉｌｗｅｔ  Ｌ−７７（陰性対照）又は溶媒溶液中に製剤化した５０μｇ／ｍｌのリファンピシンのいずれかであった。
４）局所送達：３０ｍＬ噴霧ボトルを使用して、１００μｌの０．０２５％非イオン性有機ケイ素系界面活性剤溶媒Ｓｉｌｗｅｔ  Ｌ−７７（陰性対照）又は溶媒溶液中に製剤化した５０μｇ／ｍｌのリファンピシンを噴霧した。
５）葉への注入法Ａ  −  葉の灌流及び切断：食品着色料を含有する水中約１ｍｌの５０μｇ／ｍｌのリファンピシン又は水及び食品着色料を含む約１ｍｌの陰性対照を葉に注入した。葉を２×２ｃｍ四方の断片に切断し、葉の断片上にアブラムシを置いた。
６）葉の灌流及び経植物送達：水＋食品着色料中約１ｍｌの１００μｇ／ｍｌのリファンピシン又は水及び食品着色料を含む約１ｍｌの陰性対照を葉に注入した。次に、１ｍｌの１００μｇ／ｍｌのリファンピシン＋水及び食品着色料又は水及び食品着色料のみを含む１ｍｌの陰性対照が入ったエッペンドルフ試験管に、注入した葉の茎を入れた。
７）併用送達方法：ａ）アブラムシ及び植物への局所送達：水中０．０２５％非イオン性有機ケイ素系界面活性剤溶媒Ｓｉｌｗｅｔ  Ｌ−７７（陰性対照）又は溶媒溶液中に製剤化した１００μｇ／ｍｌのリファンピシンを、３０ｍＬを使用してアブラムシ及び植物の両方に噴霧することによる、ｂ）経植物送達：水のみ（陰性対照）又は水中に製剤化した１００μｇ／ｍｌのリファンピシン。
【０４４５】
植物送達実験計画：
アブラムシ（ＬＳＲ−１系統、アキルトシフォン・ピスム（Ａｃｙｒｔｈｏｓｉｐｈｏｎ  ｐｉｓｕｍ））を、環境制御されたインキュベーター（１６時間明期／８時間暗期の光周期；６０±５％ＲＨ；２５±２℃）においてソラマメ植物（Ｊｏｈｎｎｙ’ｓ  Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｓｅｅｄｓからのブロマソラマメ（Ｖｒｏｍａ  ｖｉｃｉａ  ｆａｂａ））上で育てた。アブラムシの飼育に使用する前に、ソラマメ植物は、鉢植えのための土において２４℃で１６時間明期及び８時間暗期で成長させた。母性効果又は植物間の健康の差を抑制するため、異なる植物からの５〜１０匹の成虫を１０本の２週齢植物に分配し、高密度になるまで５〜７日間増殖させた。実験のため、健康植物から初齢アブラムシを採集し、３つの異なる処理群に分割した：１）必須アミノ酸不含の人工食単独、２）必須アミノ酸不含の人工食単独及び１００μｇ／ｍｌリファンピシン、及び３）必須アミノ酸含有人工食及び１００μｇ／ｍｌリファンピシン）。各処理群が採集植物の各々からほぼ同じ数の個体を受け取った。
【０４４６】
使用した人工食は、必須アミノ酸（２ｍｇ／ｍｌヒスチジン、２ｍｇ／ｍｌイソロイシン、２ｍｇ／ｍｌロイシン、２ｍｇ／ｍｌリジン、１ｍｇ／ｍｌメチオニン、１．６２ｍｇ／ｍｌフェニルアラニン、２ｍｇ／ｍｌスレオニン、１ｍｇ／ｍｌトリプトファン及び２ｍｇ／ｍｌバリン）含有及び不含で、いずれの食餌もホモセリン又はβ−アラニルチロシンを含まなかったことを除いて既発表のとおり作成した（Ａｋｅｙ  ａｎｄ  Ｂｅｃｋ，１９７１  Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  Ｒｅａｒｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｅａ  Ａｐｈｉｄ，Ａｃｙｒｔｈｏｓｉｐｈｏｎ  ｐｉｓｕｍ，ｏｎ  ａ  Ｈｏｌｉｄｉｃ  Ｄｉｅｔ）。食餌のｐＨをＫＯＨで７．５に調整し、０．２２μｍフィルタで食餌をろ過滅菌し、短期（＜７日）について４℃又は長期について−８０℃で保存した。
【０４４７】
リファンピシン（東京化成工業株式会社）ストック溶液をメタノール中に２５ｍｇ／ｍｌで作成し、０．２２μｍシリンジフィルタに通して滅菌し、−２０℃で保存した。処理のため（治療計画を参照されたい）、必須アミノ酸含有又は不含の人工食に、１００μｇ／ｍｌリファンピシンの終濃度に達するように適量のストック溶液を加えた。次に、ソラマメ茎が葉と共に入った１．５ｍｌエッペンドルフ試験管にこの食餌を入れ、パラフィルムを使用して管の口を閉じた。次に、この人工食給餌システムを深底ペトリ皿（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＦＢ０８７５７１１）内に置き、植物の葉にアブラムシを当てがった。
【０４４８】
各処理につき３３匹のアブラムシを各葉の上に置いた。人工食給餌システムは、実験全体を通じて２〜３日毎に交換した。毎日生存に関してアブラムシをモニタし、死亡したアブラムシは、見付け次第、人工給餌システムを収容している深底ペトリ皿から取り除いた。
【０４４９】
加えて、実験全体を通じて発育段階（１齢、２齢、３齢、４齢、５齢）を毎日決定した。アブラムシが４齢期に達したら、深底ペトリ皿にそれ専用の人工給餌システムを付与して、成虫期に達したときに繁殖力をモニタできるようにした。
【０４５０】
成虫アブラムシについては、毎日新しい若虫をカウントし、次に廃棄した。実験の終了時、アブラムシが成虫期に達した後に１日に産生される子孫の数の平均値として繁殖力を決定した。実験全体を通じてアブラムシの写真を撮ることにより、処理群間でのサイズの違いを評価した。
【０４５１】
７日間の処理後、各処理群の複数のアブラムシからＤＮＡを抽出した。簡潔に言えば、アブラムシを６％ブリーチ溶液に約５秒間浸漬することによりアブラムシの体表を滅菌した。次に、アブラムシを滅菌水でリンスし、ＤＮＡ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、ＤＮｅａｓｙキット）を製造者の指示に従って使用して各個別のアブラムシからＤＮＡを抽出した。ｎａｎｏｄｒｏｐ核酸定量化を用いてＤＮＡ濃度を測定し、ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）及びアブラムシＤＮＡコピー数をｑＰＣＲによって測定した。ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）に使用したプライマーは、Ｂｕｃｈ＿ｇｒｏＥＳ＿１８Ｆ（ＣＡＴＧＡＴＣＧＴＧＴＧＣＴＴＧＴＴＡＡＧ；配列番号２４０）及びＢｕｃｈ＿ｇｒｏＥＳ＿９８Ｒ（ＣＴＧＴＴＣＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＴＴＴＣＣ；配列番号２４１）であった（Ｃｈｏｎｇ  ａｎｄ  Ｍｏｒａｎ，２０１６  ＰＮＡＳ）。アブラムシに使用したプライマーは、ＡｐＥＦ１ａ  １０７Ｆ（ＣＴＧＡＴＴＧＴＧＣＣＧＴＧＣＴＴＡＴＴＧ；配列番号２４２）及びＡｐＥＦ１ａ  ２４６Ｒ（ＴＡＴＧＧＴＧＧＴＴＣＡＧＴＡＧＡＧＴＣＣ；配列番号２４３）であった（Ｃｈｏｎｇ  ａｎｄ  Ｍｏｒａｎ，２０１６  ＰＮＡＳ）。ｑＰＣＲを１．６℃／ｓのｑＰＣＲ増幅ランプ及び以下の条件を用いて実施した：１）９５℃で１０分、２）９５℃で１５秒、３）５５℃で３０秒、４）ステップ２〜３を４０回繰り返す、５）９５℃で１５秒、６）５５℃で１分、７）ランプを０．１５℃／ｓに変更、８）９５℃で１秒。分析（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）ソフトウェアを使用してｑＰＣＲデータを分析した。
【０４５２】
抗生物質処理は、アブラムシの発育の進行を遅らせ且つ止める
ＬＳＲ−１  １齢アブラムシを実験計画（上記）に定義されるとおりの３つの別個の処理群に分割した。アブラムシを毎日モニタして、各発育段階にあるアブラムシの数を決定した。必須アミノ酸不含の人工食単独で処理したアブラムシは、約６日で成虫期（５齢期）に達し始めた（図２Ａ）。リファンピシンで処理したアブラムシでは発育が遅れ、処理６日まで、ほとんどのアブラムシの成熟は、１２日後であっても３齢期より先に進まなかったと共に、そのサイズが劇的に影響を受ける（図２Ａ〜図２Ｃ）。
【０４５３】
対照的に、必須アミノ酸を補充したリファンピシンを含む人工食で処理したアブラムシは、リファンピシン単独で処理したアブラムシと比較したとき、より速くより高い齢期まで発育したが、必須アミノ酸不含の人工食で処理したアブラムシほど速くはなかった（図２Ａ〜図２Ｃ）。これらのデータは、リファンピシンによる処理がアブラムシの発育を妨げたことを示している。必須アミノ酸のアドバックにより、発育不足が部分的にレスキューされた。
【０４５４】
抗生物質処理は、アブラムシ死亡率を増加させた
処理時にアブラムシの生存率も測定した。必須アミノ酸不含の人工食単独で処理したアブラムシの大多数が処理後５日の時点で生存していた（図３）。５日以降、アブラムシは、徐々に死に始め、一部が処理後１３日を超えて生き延びた。
【０４５５】
対照的に、必須アミノ酸不含のリファンピシンで処理したアブラムシは、人工食単独で処理したアブラムシよりも生存率が低かった（ｐ＜０．００００１）。リファンピシン処理したアブラムシは、１日の処理後に死に始め、９日までに全てのアブラムシが処理で死亡した。リファンピシン及び必須アミノ酸の両方で処理したアブラムシは、リファンピシン単独で処理したアブラムシよりも長く生存した（ｐ＝０．０１７）。これらのデータは、リファンピシン処理がアブラムシの生存に影響を及ぼしたことを示している。
【０４５６】
抗生物質処理は、アブラムシの繁殖を低下させた
処理下のアブラムシにおいて、繁殖力もモニタした。処理後７日目及び８日目までに、必須アミノ酸不含の人工食で処理した成虫アブラムシの大多数が繁殖し始めた。必須アミノ酸不含の人工食で処理したアブラムシによって成虫になった後に１日に産生される子孫の数の平均値は、約４であった（図４）。対照的に、必須アミノ酸含有又は不含のリファンピシンで処理したアブラムシは、成虫期に達して子孫を産生することができなかった。これらのデータは、リファンピシン処理がアブラムシの繁殖の消失を引き起こしたことを示している。
【０４５７】
抗生物質処理は、アブラムシ内のブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）を減少させた
リファンピシンがアブラムシ内のブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）の消失を特異的に引き起こしたかどうか、及びこの消失がアブラムシの適応度に影響を及ぼしたことを試験するため、７日間の処理後に各処理群のアブラムシからＤＮＡを抽出し、ｑＰＣＲを実施してブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）／アブラムシコピー数を決定した。必須アミノ酸不含の人工食単独で処理したアブラムシは、高いブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）／アブラムシＤＮＡコピー比を有した。対照的に、リファンピシンで処理したアブラムシは、約４分の１のブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）／アブラムシＤＮＡコピーを有し（図５）、リファンピシン処理がブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）レベルを低下させたことが示された。
【０４５８】
葉面塗布送達実験計画
０．０２５％の非イオン性有機ケイ素系界面活性剤溶媒、Ｓｉｌｗｅｔ  Ｌ−７７に、５０μｇ／ｍｌリファンピシンの終濃度に達するようにリファンピシンストック溶液を加えた。前の実施例に記載されるとおり、アブラムシ（ｅＮＡＳＣＯ系統、アキルトシフォン・ピスム（Ａｃｙｒｔｈｏｓｉｐｈｏｎ  ｐｉｓｕｍ））をソラマメ植物上で育てた。実験のため、健康植物から初齢アブラムシを採集し、２つの異なる処理群に分割した：葉に１）陰性対照（溶媒溶液のみ）、２）溶媒中５０μｇ／ｍｌリファンピシンを噴霧した。溶液を２×２ｃｍ断片のソラマメの葉に吸収させた。
【０４５９】
各処理群が採集植物の各々からほぼ同じ数の個体を受け取った。各処理につき２０匹のアブラムシを各葉の上に置いた。毎日生存に関してアブラムシをモニタし、死亡したアブラムシは、見付け次第、取り除いた。加えて、実験全体を通じて発育段階（１齢、２齢、３齢、４齢、５齢及び５Ｒ、繁殖する５齢を表す）を毎日決定した。実験全体を通じてアブラムシの写真を撮ることにより、処理群間でのサイズの違いを評価した。
【０４６０】
６日間の処理後、各処理群の複数のアブラムシからＤＮＡを抽出し、前の実施例に記載されるとおり、ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）レベルを定量化するためのｑＰＣＲを行った。
【０４６１】
葉面塗布によって抗生物質処理を送達すると、アブラムシの発育の進行が遅れ且つ止まる
ＬＳＲ−１  １齢アブラムシを本明細書に記載される実験計画に定義されるとおり２つの別個の処理群に分割した。アブラムシを毎日モニタして、各発育段階にあるアブラムシの数を決定した。対照で処理した塗布した葉に置いたアブラムシは、約６日で成虫期（５齢繁殖期；５Ｒ）に達し始めた（図６Ａ）。リファンピシンを塗布した葉に置いたアブラムシでは発育が遅れ、処理６日まで、ほとんどのアブラムシの成熟は、１２日後であっても３齢期より先に進まなかったと共に、そのサイズが劇的に影響を受ける（図６Ａ及び６Ｂ）。
【０４６２】
これらのデータは、リファンピシンの葉面塗布がアブラムシの発育を妨げたことを示している。
【０４６３】
葉面塗布によって抗生物質処理を送達すると、アブラムシ死亡率が増加した
葉面塗布処理時のアブラムシの生存率も測定した。リファンピシンを塗布した葉に置いたアブラムシは、対照を塗布した葉に置いたアブラムシよりも生存率が低かった（図７）。これらのデータは、リファンピシン処理を葉面塗布によって送達すると、アブラムシの生存が影響を受けたことを示している。
【０４６４】
葉面塗布によって抗生物質処理を送達すると、アブラムシ内のブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）が減少した
葉面塗布によって送達されるリファンピシンがアブラムシ内のブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）の消失を特異的に引き起こしたかどうか、及びこの消失がアブラムシの適応度に影響を及ぼしたことを試験するため、６日間の処理後に各処理群のアブラムシからＤＮＡを抽出し、ｑＰＣＲを実施してブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）／アブラムシコピー数を決定した。
【０４６５】
対照で処理した葉上に置いたアブラムシは、高いブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）／アブラムシＤＮＡコピー比を有した。対照的に、リファンピシンで処理した葉上に置いたアブラムシでは、ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）／アブラムシＤＮＡコピーが劇的に減少し（図８）、リファンピシン葉面塗布処理が内部共生体ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）を排除したことが示された。
【０４６６】
マイクロインジェクション送達実験計画：
ＮａｎｏＪｅｔ  ＩＩＩオートナノリットルインジェクタを使用して、インハウスの熱引きしたホウケイ酸ニードル（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；カタログ番号３−０００−２０３−Ｇ／ＸＬ）でマイクロインジェクションを実施した。前の実施例に記載されるとおり、アブラムシ（ｅＮＡＳＣＯ系統、アキルトシフォン・ピスム（Ａｃｙｒｔｈｏｓｉｐｈｏｎ  ｐｉｓｕｍ））をソラマメ植物上で育てた。アブラムシを、絵筆を使用して、真空に接続されたチュービングシステムに移す（図１Ｃ）。注入部位は、アブラムシの腹側胸部であった。注入溶液は、水中の有機ケイ素系界面活性剤溶媒０．０２５％Ｓｉｌｗｅｔ  Ｌ−７７（Ｌｅｈｌｅ  Ｓｅｅｄｓ、カタログ番号ＶＩＳ−０１）（陰性対照）又は溶媒溶液中に製剤化した５０μｇ／ｍｌのリファンピシンのいずれかであった。注入容積は、若虫が１０ｎｌ及び成虫が２０ｎｌ（両方とも２ｎｌ／ｓｅｃの速度）であった。各処理群は、採集植物の各々からほぼ同じ数の注入された個体を有した。注入後、茎が２％寒天中にあるソラマメの葉が入ったペトリ皿にアブラムシを放した。
【０４６７】
抗生物質処理によるマイクロインジェクションによってアブラムシ内のブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）が減少した
マイクロインジェクションによって送達されたリファンピシンがアブラムシ内のブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）の消失をもたらすかどうか、及び前出の実施例で実証されたとおり、この消失がアブラムシの適応度に影響を及ぼすことを試験するため、４日間の処理後に各処理群のアブラムシからＤＮＡを抽出し、前の実施例に記載されるとおりｑＰＣＲを実施してブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）／アブラムシコピー数を決定した。
【０４６８】
陰性対照をマイクロインジェクションしたアブラムシは、高いブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）／アブラムシＤＮＡコピー比を有した。対照的に、リファンピシンをマイクロインジェクションしたアブラムシの若虫及び成虫では、ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）／アブラムシＤＮＡコピーが劇的に減少し（図９）、リファンピシンマイクロインジェクション処理が内部共生体ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）の存在を低下させたことが示された。
【０４６９】
局所送達実験計画：
前の実施例に記載されるとおり、アブラムシ（ＬＳＲ−１系統、アキルトシフォン・ピスム（Ａｃｙｒｔｈｏｓｉｐｈｏｎ  ｐｉｓｕｍ））をソラマメ植物上で育てた。噴霧ボトルに２ｍｌの対照（０．０２５％Ｓｉｌｗｅｔ  Ｌ−７７）又はリファンピシン溶液（溶媒溶液中５０μｇ／ｍｌ）を充填した。清浄なペトリ皿の底にアブラムシ（ｎ＝１０）を移し、絵筆を使用してペトリ皿の隅に集めた。続いて、アブラムシを２つのコホートに分け、約１００μｌの対照又はリファンピシン溶液のいずれかを噴霧した。噴霧後直ちにペトリ皿を蓋で覆った。噴霧５分後、２％寒天中に茎があるソラマメの葉が入ったペトリ皿にアブラムシを放した。
【０４７０】
抗生物質処理を局所送達すると、アブラムシ内のブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）が減少した
局所送達によって送達されるリファンピシンがアブラムシ内のブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）の消失をもたらすかどうか、及び前出の実施例で実証されたとおり、この消失がアブラムシの適応度に影響を及ぼすことを試験するため、３日間の処理後に各処理群のアブラムシからＤＮＡを抽出し、前の実施例に記載されるとおりｑＰＣＲを実施してブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）／アブラムシコピー数を決定した。
【０４７１】
対照溶液を噴霧したアブラムシは、高いブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）／アブラムシＤＮＡコピー比を有した。対照的に、リファンピシンを噴霧したアブラムシではブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）／アブラムシＤＮＡコピーが劇的に減少し（図１０）、リファンピシン処理を局所処理によって送達すると、内部共生体ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）の存在が低下することが示された。
【０４７２】
葉への注入法Ａ  −  葉の灌流及び切断
実験計画：
アブラムシＬＳＲ−１（これは、ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）のみを含む）、アキルトシフォン・ピスム（Ａｃｙｒｔｈｏｓｉｐｈｏｎ  ｐｉｓｕｍ）を、環境制御されたインキュベーター（１６時間明期／８時間暗期の光周期；６０±５％ＲＨ；２５±２℃）においてソラマメ植物（Ｊｏｈｎｎｙ’ｓ  Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｓｅｅｄｓからのブロマソラマメ（Ｖｒｏｍａ  ｖｉｃｉａ  ｆａｂａ））上で育てた。アブラムシの飼育に使用する前に、ソラマメ植物は、鉢植えのための土において２４℃で１６時間明期及び８時間暗期で成長させた。母性効果又は植物間の健康の差を抑制するため、異なる植物からの５〜１０匹の成虫を１０本の２週齢植物に分配し、高密度になるまで５〜７日間増殖させた。実験のため、健康植物から１齢及び２齢アブラムシを採集し、２つの異なる処理群に分割した：１）陰性対照（水＋青色食品着色料を注入した葉）、及び２）水＋青色食品着色料中５０μｇ／ｍｌリファンピシンを注入した葉。各処理群が採集植物の各々からほぼ同じ数の個体を受け取った。処理のため、リファンピシンストック溶液（１００％メタノール中２５ｍｇ／ｍｌ）を水＋青色食品着色料中５０μｇ／ｍｌに希釈した。次に、この溶液で灌流したソラマメ茎が入った１．５ｍｌエッペンドルフ試験管に溶液を入れ、パラフィルムを使用して管の口を閉じた。次に、この給餌システムを深底ペトリ皿（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＦＢ０８７５７１１）内に置き、植物の葉にアブラムシを当てがった。各処理につき７４〜８１匹のアブラムシを各葉の上に置いた。給餌システムは、実験全体を通じて２〜３日毎に交換した。毎日生存に関してアブラムシをモニタし、死亡したアブラムシは、見付け次第、深底ペトリ皿から取り除いた。加えて、実験全体を通じて発育段階（１齢、２齢、３齢、４齢、５齢及び５Ｒ（繁殖済みの５齢））を毎日決定した。
【０４７３】
葉への注入法Ａによって抗生物質処理を送達すると、アブラムシの発育の進行が遅れ且つ止まる
ＬＳＲ−１  １齢及び２齢アブラムシを葉への注入法Ａ  −  葉の灌流及び切断実験計画（本明細書に記載される）に定義されるとおり２つの別個の処理群に分割した。アブラムシを毎日モニタして、各発育段階にあるアブラムシの数を決定した。水＋食品着色料で処理したアブラムシは、約６日で成虫期（５齢期）に達し始めた（図１１）。リファンピシンを注入した葉を摂餌するアブラムシでは発育が遅れ、処理６日まで、ほとんどのアブラムシの成熟は、４齢期より先に進まなかった。８日後でもなお、リファンピシンを注入した葉を摂餌するアブラムシの発育は、劇的に遅れていた（図１１）。これらのデータは、葉の灌流によるリファンピシン処理がアブラムシの発育を妨げたことを示している。
【０４７４】
葉への注入法Ａによって抗生物質処理を送達すると、アブラムシ死亡率が増加した
葉の灌流実験時にアブラムシの生存率も測定した。リファンピシンを注入した葉上に置いたアブラムシは、対照溶液を注入した葉上に置いたアブラムシよりも生存率が低かった（図１２）。これらのデータは、葉への注入によって送達されるリファンピシン処理がアブラムシの生存に影響を及ぼしたことを示している。
【０４７５】
葉への注入法Ａによって抗生物質処理を送達すると、ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）のレベルの低下が引き起こされる
葉の灌流を用いて送達されるリファンピシンがアブラムシ内のブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）の消失をもたらすかどうか、及び前出の実施例で実証されたとおり、この消失がアブラムシの適応度に影響を及ぼすことを試験するため、８日間の処理後に各処理群のアブラムシからＤＮＡを抽出し、前の実施例に記載されるとおりｑＰＣＲを実施してブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）／アブラムシコピー数を決定した。
【０４７６】
対照溶液を注入した葉を摂餌するアブラムシは、高いブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）／アブラムシＤＮＡコピー比を有した。対照的に、リファンピシンを注入した葉を摂餌するアブラムシは、ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）／アブラムシＤＮＡコピーが減少し（図１３）、前出の実施例に示されるとおり、葉への注入を用いてリファンピシン処理を送達すると、内部共生体ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）の存在が低下し、適応度の低下が引き起こされたことが示された。
【０４７７】
葉の灌流及び経植物送達
実験計画：
アブラムシＬＳＲ−１（これは、ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）のみを含む）、アキルトシフォン・ピスム（Ａｃｙｒｔｈｏｓｉｐｈｏｎ  ｐｉｓｕｍ）を、環境制御されたインキュベーター（１６時間明期／８時間暗期の光周期；６０±５％ＲＨ；２５±２℃）においてソラマメ植物（Ｊｏｈｎｎｙ’ｓ  Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｓｅｅｄｓからのブロマソラマメ（Ｖｒｏｍａ  ｖｉｃｉａ  ｆａｂａ））上で育てた。アブラムシの飼育に使用する前に、ソラマメ植物は、鉢植えのための土において２４℃で１６時間明期及び８時間暗期で成長させた。
【０４７８】
母性効果又は植物間の健康の差を抑制するため、異なる植物からの５〜１０匹の成虫を１０本の２週齢植物に分配し、高密度になるまで５〜７日間増殖させた。実験のため、健康植物から１齢及び２齢アブラムシを採集し、２つの異なる処理群に分割した：１）陰性対照溶液（水及び食品着色料）を注入し、陰性対照溶液が入ったエッペンドルフ試験管に入れた葉上に置いたアブラムシ、又は２）水＋食品着色料中１００ｕｇ／ｍｌリファンピシンを注入し、水中１００ｕｇ／ｍｌリファンピシンが入ったエッペンドルフ試験管に入れた葉上に置いたアブラムシ。各処理群が採集植物の各々からほぼ同じ数の個体を受け取った。
【０４７９】
処理のため、リファンピシンストック溶液（１００％メタノール中２５ｍｇ／ｍｌ）を水＋青色食品着色料中１００μｇ／ｍｌに希釈した。次に、同様に溶液で灌流した葉と共にソラマメ茎が入った１．５ｍｌエッペンドルフ試験管にこの溶液を入れ、パラフィルムを使用して管の口を閉じた。次に、この給餌システムを深底ペトリ皿（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＦＢ０８７５７１１）内に置き、植物の葉にアブラムシを当てがった。
【０４８０】
各処理につき４９〜５０匹のアブラムシを各葉の上に置いた。給餌システムは、実験全体を通じて２〜３日毎に交換した。毎日生存に関してアブラムシをモニタし、死亡したアブラムシは、見付け次第、深底ペトリ皿から取り除いた。
【０４８１】
加えて、実験全体を通じて発育段階（１齢、２齢、３齢、４齢、５齢及び５Ｒ（繁殖済みの５齢））を毎日決定した。
【０４８２】
葉への注入及び経植物送達によって抗生物質処理を送達すると、アブラムシの発育の進行が遅れ且つ止まる
ＬＳＲ−１  １齢及び２齢アブラムシを葉の灌流及び経植物送達実験計画（本明細書に記載される）に定義されるとおり２つの別個の処理群に分割した。アブラムシを毎日モニタして、各発育段階にあるアブラムシの数を決定した。対照溶液（水＋食品着色料のみ）で処理したアブラムシは、約６日で成虫期（５齢期）に達し始めた（図１４）。
【０４８３】
リファンピシンで処理したアブラムシでは発育が遅れ、処理６日まで、ほとんどのアブラムシの成熟は、３齢期より先に進まなかった。８日後でもなお、その発育は、劇的に遅れていた（図１４）。これらのデータは、葉の灌流によるリファンピシン処理がアブラムシの発育を妨げたことを示している。
【０４８４】
葉への注入及び経植物送達によって抗生物質処理を送達すると、アブラムシ死亡率が増加した
葉の灌流及び経植物で送達される対照溶液又はリファンピシンのいずれかでアブラムシを処理した実験中にアブラムシの生存率も測定した。リファンピシンで灌流及び処理した葉を摂餌するアブラムシは、対照溶液で灌流及び処理した葉を摂餌するアブラムシよりも生存率が低かった（図１５）。これらのデータは、葉の灌流及び経植物でリファンピシン処理を送達すると、アブラムシの生存に負の影響があったことを示している。
【０４８５】
葉への注入及び経植物を用いて抗生物質処理を送達すると、ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）のレベルの低下が引き起こされる
葉の灌流及び経植物を用いて送達されるリファンピシンがアブラムシ内のブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）の消失をもたらすかどうか、及び前出の実施例で実証されたとおり、この消失がアブラムシの適応度に影響を及ぼすことを試験するため、６及び８日間の処理後に各処理群のアブラムシからＤＮＡを抽出し、前出の実施例に記載されるとおり、ｑＰＣＲを実施してブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）／アブラムシコピー数を決定した。
【０４８６】
対照溶液を注入して処理した葉を摂餌するアブラムシは、高いブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）／アブラムシＤＮＡコピー比を有した。対照的に、リファンピシンで灌流及び処理した葉を摂餌するアブラムシは、両方の時点でブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）／アブラムシＤＮＡコピーが統計的に有意に減少し（６日目及び８日目について、それぞれｐ＝０．００３７及びｐ＝０．００２５）（図１６Ａ及び図１６Ｂ）、葉の灌流及び経植物を用いてリファンピシン処理を送達すると、内部共生体ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）の存在が低下し、及び前出の実施例に示されるとおり、及び適応度の低下が引き起こされたことが示された。
【０４８７】
併用送達方法
実験計画：
アブラムシＬＳＲ−１（これは、ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）のみを含む）、アキルトシフォン・ピスム（Ａｃｙｒｔｈｏｓｉｐｈｏｎ  ｐｉｓｕｍ）を、環境制御されたインキュベーター（１６時間明期／８時間暗期の光周期；６０±５％ＲＨ；２０±２℃）においてソラマメ植物（Ｊｏｈｎｎｙ’ｓ  Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｓｅｅｄｓからのブロマソラマメ（Ｖｒｏｍａ  ｖｉｃｉａ  ｆａｂａ））上で育てた。アブラムシの飼育に使用する前に、ソラマメ植物は、鉢植えのための土において２４℃で１６時間明期及び８時間暗期で成長させた。母性効果又は植物間の健康の差を抑制するため、異なる植物からの５〜１０匹の成虫を１０本の２週齢植物に分配し、高密度になるまで５〜７日間増殖させた。
【０４８８】
実験のため、健康植物から１齢及び２齢アブラムシを採集し、２つの異なる処理群に分割した：１）Ｓｉｌｗｅｔ−Ｌ７７又は水対照溶液による処理、又は２）ｓｉｌｗｅｔ  Ｌ−７７又は水に希釈したリファンピシンによる処理。各処理群が採集植物の各々からほぼ同じ数の個体を受け取った。送達方法の組み合わせは、以下のとおりであった：ａ）３０ｍＬ噴霧ボトルを使用して０．０２５％非イオン性有機ケイ素系界面活性剤溶媒Ｓｉｌｗｅｔ  Ｌ−７７（陰性対照）又は溶媒溶液中に製剤化した１００μｇ／ｍｌのリファンピシンを噴霧することによるアブラムシ及び植物への局所送達、及びｂ）水（陰性対照）又は水中に製剤化した１００μｇ／ｍｌのリファンピシンのいずれかの経植物送達。処理のため、リファンピシンストック溶液（１００％メタノール中２５ｍｇ／ｍｌ）をＳｉｌｗｅｔ  Ｌ−７７中（アブラムシへの局所処理及び葉の塗布用）又は水中（経植物送達用）１００μｇ／ｍｌに希釈した。次に、同様に溶液で灌流した葉と共にソラマメ茎が入った１．５ｍｌエッペンドルフ試験管にこの溶液を入れ、パラフィルムを使用して管の口を閉じた。次に、この給餌システムを深底ペトリ皿（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＦＢ０８７５７１１）内に置き、植物の葉にアブラムシを当てがった。
【０４８９】
各処理につき７６〜８０匹のアブラムシを各葉の上に置いた。給餌システムは、実験全体を通じて２〜３日毎に交換した。毎日生存に関してアブラムシをモニタし、死亡したアブラムシは、見付け次第、深底ペトリ皿から取り除いた。
【０４９０】
加えて、実験全体を通じて発育段階（１齢、２齢、３齢、４齢、５齢及び５Ｒ（繁殖済みの５齢））を毎日決定した。
【０４９１】
併用抗生物質処理は、アブラムシの発育を遅らせる
ＬＳＲ−１  １齢及び２齢アブラムシを併用送達方法実験計画（本明細書に記載される）に定義されるとおり２つの別個の処理群に分割した。アブラムシを毎日モニタして、各発育段階にあるアブラムシの数を決定した。対照で処理したアブラムシは、約６日で成虫期（５齢期）に達し始めた（図１７）。リファンピシンで処理したアブラムシでは発育が遅れ、処理６日まで、ほとんどのアブラムシの成熟は、３齢期より先に進まず、７日後であっても、その発育は、劇的に遅れていた（図１７）。これらのデータは、リファンピシン処理の併用がアブラムシの発育を妨げたことを示している。
【０４９２】
併用抗生物質処理は、アブラムシ死亡率の増加を引き起こす
アブラムシをリファンピシン処理の併用で処理した実験中、アブラムシの生存率も測定した。リファンピシンで処理したアブラムシは、対照溶液で処理したアブラムシと比べて生存率がやや低かった（図１８）。これらのデータは、処理の併用によって送達されたリファンピシン処理がアブラムシの生存に影響を及ぼしたことを示している。
【０４９３】
ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）のレベルの低下における併用抗生物質処理
方法の併用によって送達されたリファンピシンがアブラムシ内のブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）の消失をもたらすかどうか、及び前出の実施例で実証されたとおり、この消失がアブラムシの適応度に影響を及ぼすことを試験するため、７日間の処理後に各処理群のアブラムシからＤＮＡを抽出し、前の実施例に記載されるとおりｑＰＣＲを実施してブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）／アブラムシコピー数を決定した。
【０４９４】
対照溶液で処理したアブラムシは、高いブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）／アブラムシＤＮＡコピー比を有した。対照的に、リファンピシンで処理したアブラムシは、ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）／アブラムシＤＮＡコピーが統計的に有意に且つ劇的に減少し（ｐ＝０．２２７；図１９）、リファンピシン処理を方法の併用によって送達すると、内部共生体ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）の存在が低下し、及び前出の実施例に示されるとおり、これが適応度の低下を引き起こしたことが示された。
【０４９５】
まとめると、前出の実施例に記載されるこのデータから、複数の送達方法によって抗生物質で処理することによりアブラムシを死滅させ、且つその発育、繁殖能力、寿命及び内因性細菌個体群、例えば適応度を低下させることが可能であることが実証された。
【０４９６】
実施例１５：天然抗微生物性多糖で処理される昆虫
本実施例は、キチンに由来する脱アセチル化β−１，４−Ｄ−グルコサミンの天然カチオン性線状多糖であるキトサンによるアブラムシの処理を実証する。キチンは、昆虫、甲殻類（主にエビ及びカニ）の外骨格及び真菌の細胞壁の構造要素であり、セルロースに次いで２番目に最も豊富な天然多糖である。本実施例は、キトサンが昆虫に及ぼす効果が、キトサンに敏感である、昆虫にとって内因性の細菌個体群の調節を通じて媒介されたことを実証する。１つの標的となる細菌株は、ブフネラ・アフィディコラ（Ｂｕｃｈｎｅｒａ  ａｐｈｉｄｉｃｏｌａ）である。
【０４９７】
治療計画
葉の灌流及び経植物送達の組み合わせを用いてキトサン溶液を製剤化した（図２０）。対照溶液は、水＋青色食品着色料を注入した葉及び試験管内の水であった。葉への注入（青色食品着色料を含む）及び経植物（エッペンドルフ試験管内）を用いた水中３００ｕｇ／ｍｌキトサン（低分子量）による処理溶液。
【０４９８】
葉の灌流  −  植物送達実験計画：
アブラムシＬＳＲ−１（これは、ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）のみを含む）、アキルトシフォン・ピスム（Ａｃｙｒｔｈｏｓｉｐｈｏｎ  ｐｉｓｕｍ）を、環境制御されたインキュベーター（１６時間明期／８時間暗期の光周期；６０±５％ＲＨ；２５±２℃）においてソラマメ植物（Ｊｏｈｎｎｙ’ｓ  Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｓｅｅｄｓからのブロマソラマメ（Ｖｒｏｍａ  ｖｉｃｉａ  ｆａｂａ））上で育てた。アブラムシの飼育に使用する前に、ソラマメ植物は、鉢植えのための土において２４℃で１６時間明期及び８時間暗期で成長させた。母性効果又は植物間の健康の差を抑制するため、異なる植物からの５〜１０匹の成虫を１０本の２週齢植物に分配し、高密度になるまで５〜７日間増殖させた。実験のため、健康植物から１齢及び２齢アブラムシを採集し、２つの異なる処理群に分割した：１）陰性対照（水処理）、２）処理溶液が水中３００ｕｇ／ｍｌキトサン（低分子量）を含んだ。各処理群が採集植物の各々からほぼ同じ数の個体を受け取った。
【０４９９】
キトサン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号４４８８６９−５０Ｇ）ストック溶液を酢酸中に１％で作成し、オートクレーブ滅菌し、４℃で保存した。処理のため（治療計画を参照されたい）、適量のストック溶液を水で希釈してキトサン処理終濃度を達成した。次に、同様に溶液で灌流した葉と共にソラマメ茎が入った１．５ｍｌエッペンドルフ試験管にこの溶液を入れ、パラフィルムを使用して管の口を閉じた。次に、この給餌システムを深底ペトリ皿（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＦＢ０８７５７１１）内に置き、植物の葉にアブラムシを当てがった。
【０５００】
各処理につき５０〜５１匹のアブラムシを各葉の上に置いた。給餌システムは、実験全体を通じて２〜３日毎に交換した。毎日生存に関してアブラムシをモニタし、死亡したアブラムシは、見付け次第、深底ペトリ皿から取り除いた。
【０５０１】
加えて、実験全体を通じて発育段階（１齢、２齢、３齢、４齢、５齢及び５Ｒ（繁殖済みの５齢））を毎日決定した。
【０５０２】
８日間の処理後、各処理群の複数のアブラムシからＤＮＡを抽出した。簡潔に言えば、アブラムシを６％ブリーチ溶液に約５秒間浸漬することによりアブラムシの体表を滅菌した。次に、アブラムシを滅菌水でリンスし、ＤＮＡ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、ＤＮｅａｓｙキット）を製造者の指示に従って使用して各個別のアブラムシからＤＮＡを抽出した。ｎａｎｏｄｒｏｐ核酸定量化を用いてＤＮＡ濃度を測定し、ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）及びアブラムシＤＮＡコピー数をｑＰＣＲによって測定した。ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）に使用したプライマーは、Ｂｕｃｈ＿ｇｒｏＥＳ＿１８Ｆ（ＣＡＴＧＡＴＣＧＴＧＴＧＣＴＴＧＴＴＡＡＧ；配列番号２４０）及びＢｕｃｈ＿ｇｒｏＥＳ＿９８Ｒ（ＣＴＧＴＴＣＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＴＴＴＣＣ；配列番号２４１）であった（Ｃｈｏｎｇ  ａｎｄ  Ｍｏｒａｎ，２０１６  ＰＮＡＳ）。アブラムシに使用したプライマーは、ＡｐＥＦ１ａ  １０７Ｆ（ＣＴＧＡＴＴＧＴＧＣＣＧＴＧＣＴＴＡＴＴＧ；配列番号２４２）及びＡｐＥＦ１ａ  ２４６Ｒ（ＴＡＴＧＧＴＧＧＴＴＣＡＧＴＡＧＡＧＴＣＣ；配列番号２４３）であった（Ｃｈｏｎｇ  ａｎｄ  Ｍｏｒａｎ，２０１６  ＰＮＡＳ）。ｑＰＣＲを１．６℃／ｓのｑＰＣＲ増幅ランプ及び以下の条件を用いて実施した：１）９５℃で１０分、２）９５℃で１５秒、３）５５℃で３０秒、４）ステップ２〜３を４０回繰り返す、５）９５℃で１５秒、６）５５℃で１分、７）ランプを０．１５℃／ｓに変更、８）９５℃で１秒。分析（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）ソフトウェアを使用してｑＰＣＲデータを分析した。
【０５０３】
天然抗微生物性多糖で処理したとき、昆虫適応度に負の応答があった
ＬＳＲ−１  Ａ．ピスム（Ａ．ｐｉｓｕｍ）１齢及び２齢アブラムシを実験計画（上記）に定義されるとおり２つの別個の処理群に分割した。アブラムシを毎日モニタして、各発育段階にあるアブラムシの数を決定した。陰性対照単独で処理したアブラムシは、約６日で成虫期（５齢期）に達し始めた（図２１）。キトサン溶液で処理したアブラムシでは発育が遅れ、キトサンによる処理６日までに、ほとんどのアブラムシの成熟は、４齢期より先に進まなかった。これらのデータは、キトサンによる処理がアブラムシの発育の進行を遅らせ且つ止めたことを示している。
【０５０４】
キトサン処理は、アブラムシ死亡率を増加させた
処理時にアブラムシの生存率も測定した。対照単独で処理したアブラムシの大多数が処理後３日の時点で生存していた（図２２）。４日以降、アブラムシは、徐々に死に始め、一部が処理後７日を超えて生き延びた。
【０５０５】
対照的に、キトサン溶液で処理したアブラムシは、対照で処理したアブラムシよりも生存率が低かった。これらのデータは、天然抗微生物性多糖で処理したときに生存の低下があったことを示している。
【０５０６】
キトサン処理は、アブラムシ内のブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）を減少させた
キトサン溶液処理がアブラムシ内のブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）の消失を特異的に引き起こしたかどうか、及びこの消失がアブラムシの適応度に影響を及ぼしたことを試験するため、８日間の処理後に各処理群のアブラムシからＤＮＡを抽出し、ｑＰＣＲを実施してブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）／アブラムシコピー数を決定した。対照単独で処理したアブラムシは、高いブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）／アブラムシＤＮＡコピー比を有した。対照的に、水中３００ｕｇ／ｍｌキトサンで処理したアブラムシは、約２〜５分の１のブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）／アブラムシＤＮＡコピーとなり（図２３）、キトサン処理がブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）レベルを低下させたことが示された。
【０５０７】
まとめると、前述のこのデータから、天然抗微生物性多糖で処理することによりアブラムシを死滅させ、且つその発育、寿命及び内因性細菌個体群、例えば適応度を低下させることが可能であることが実証された。
【０５０８】
実施例１６：天然抗微生物ペプチドのナイシンで処理される昆虫
本実施例は、食品保存剤としてよく使用される細菌ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）によって産生される天然の「広域スペクトル」多環式抗細菌性ペプチドによるアブラムシの処理を実証する。ナイシンの抗細菌活性は、細菌細胞膜に孔を開け、特異的リピドＩＩ相互作用によって細菌細胞壁の生合成を妨害するその能力を通じて媒介される。本実施例は、ナイシンが昆虫適応度に及ぼす負の効果が、ナイシンに敏感である、昆虫にとって内因性の細菌個体群の調節を通じて媒介されることを実証する。１つの標的となる細菌株は、ブフネラ・アフィディコラ（Ｂｕｃｈｎｅｒａ  ａｐｈｉｄｉｃｏｌａ）である。
【０５０９】
治療計画：
葉の灌流及び経植物送達の組み合わせを用いてナイシンを製剤化した。対照溶液（水）又は処理溶液（ナイシン）を葉に注入し、エッペンドルフ試験管に入れた。処理溶液は、水中１．６又は７ｍｇ／ｍｌナイシンからなった。
【０５１０】
葉の灌流  −  植物送達実験計画：
ＬＳＲ−１アブラムシ、アキルトシフォン・ピスム（Ａｃｙｒｔｈｏｓｉｐｈｏｎ  ｐｉｓｕｍ）を、環境制御されたインキュベーター（１６時間明期／８時間暗期の光周期；６０±５％ＲＨ；２５±２℃）においてソラマメ植物（Ｊｏｈｎｎｙ’ｓ  Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｓｅｅｄｓからのブロマソラマメ（Ｖｒｏｍａ  ｖｉｃｉａ  ｆａｂａ））上で育てた。アブラムシの飼育に使用する前に、ソラマメ植物は、鉢植えのための土において２４℃で１６時間明期及び８時間暗期で成長させた。母性効果又は植物間の健康の差を抑制するため、異なる植物からの５〜１０匹の成虫を１０本の２週齢植物に分配し、高密度になるまで５〜７日間増殖させた。実験のため、健康植物から１齢及び２齢アブラムシを採集し、２つの異なる処理群に分割した：１）陰性対照（水処理）、２）水中１．６ｍｇ／ｍｌ又は７ｍｇ／ｍｌのいずれかのナイシンによるナイシン処理。各処理群が採集植物の各々からほぼ同じ数の個体を受け取った。
【０５１１】
処理のため（治療計画を参照されたい）、ナイシン（Ｓｉｇｍａ、製品番号：Ｎ５７６４）溶液を水中１．６又は７ｍｇ／ｍｌ（ｗ／ｖ）で作成し、０．２２ｕｍシリンジフィルタを使用してろ過滅菌した。次に、植物の葉に溶液を注入し、植物の茎を１．５ｍｌエッペンドルフ試験管に入れた。パラフィルムを使用して管の口を閉じた。次に、この給餌システムを深底ペトリ皿（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＦＢ０８７５７１１）内に置き、植物の葉にアブラムシを当てがった。
【０５１２】
各処理につき５６〜５９匹のアブラムシを各葉の上に置いた。給餌システムは、実験全体を通じて２〜３日毎に交換した。毎日生存に関してアブラムシをモニタし、死亡したアブラムシは、見付け次第、深底ペトリ皿から取り除いた。
【０５１３】
加えて、実験全体を通じて発育段階（１齢、２齢、３齢、４齢、５齢及び５Ｒ（繁殖中の５齢アブラムシ））を毎日決定した。
【０５１４】
８日間の処理後、各処理群中の残りのアブラムシからＤＮＡを抽出した。簡潔に言えば、アブラムシを６％ブリーチ溶液に約５秒間浸漬することによりアブラムシの体表を滅菌した。次に、アブラムシを滅菌水でリンスし、ＤＮＡ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、ＤＮｅａｓｙキット）を製造者の指示に従って使用して各個別のアブラムシからＤＮＡを抽出した。ｎａｎｏｄｒｏｐ核酸定量化を用いてＤＮＡ濃度を測定し、ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）及びアブラムシＤＮＡコピー数をｑＰＣＲによって測定した。ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）に使用したプライマーは、Ｂｕｃｈ＿ｇｒｏＥＳ＿１８Ｆ（ＣＡＴＧＡＴＣＧＴＧＴＧＣＴＴＧＴＴＡＡＧ；配列番号２４０）及びＢｕｃｈ＿ｇｒｏＥＳ＿９８Ｒ（ＣＴＧＴＴＣＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＴＴＴＣＣ；配列番号２４１）であった（Ｃｈｏｎｇ  ａｎｄ  Ｍｏｒａｎ，２０１６  ＰＮＡＳ）。アブラムシに使用したプライマーは、ＡｐＥＦ１ａ  １０７Ｆ（ＣＴＧＡＴＴＧＴＧＣＣＧＴＧＣＴＴＡＴＴＧ；配列番号２４２）及びＡｐＥＦ１ａ  ２４６Ｒ（ＴＡＴＧＧＴＧＧＴＴＣＡＧＴＡＧＡＧＴＣＣ；配列番号２４３）であった（Ｃｈｏｎｇ  ａｎｄ  Ｍｏｒａｎ，２０１６  ＰＮＡＳ）。ｑＰＣＲを１．６℃／ｓのｑＰＣＲ増幅ランプ及び以下の条件を用いて実施した：１）９５℃で１０分、２）９５℃で１５秒、３）５５℃で３０秒、４）ステップ２〜３を４０回繰り返す、５）９５℃で１５秒、６）５５℃で１分、７）ランプを０．１５℃／ｓに変更、８）９５℃で１秒。分析（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）ソフトウェアを使用してｑＰＣＲデータを分析した。
【０５１５】
ナイシンで処理したとき、昆虫適応度に用量依存的負の応答があった
ＬＳＲ−１  Ａ．ピスム（Ａ．ｐｉｓｕｍ）１齢及び２齢アブラムシを実験計画（上記）に定義されるとおりの３つの別個の処理群に分割した。アブラムシを毎日モニタして、各発育段階にあるアブラムシの数を決定した。陰性対照溶液（水）で処理したアブラムシは、約６日で成虫期（５齢期）に達し始め、７日までに繁殖（５Ｒ期）し始めた（図２４）。７ｍｇ／ｍｌナイシンで処理したアブラムシでは、発育が重度に遅れた。７ｍｇ／ｍｌナイシンで処理したアブラムシは、３日目までに２齢期までのみ発育し、６日目までに群内の全てのアブラムシが死亡した（図２４）。低濃度のナイシン（１．６ｍｇ／ｍｌ）で処理したアブラムシでは生育がやや遅れ、評価したいずれの時点においても、水で処理した対照と比較して、発育しにくいアブラムシが多かった（図２４）。これらのデータは、ナイシンによる処理がアブラムシの発育の進行を遅らせ且つ止めたと共に、この発育の遅れが投与したナイシンの用量に依存したことを示している。
【０５１６】
しかしながら、７ｍｇ／ｍｌのナイシンによる処理は、アッセイで使用した葉の健康に負の影響も及ぼした点に留意することが重要である。７ｍｇ／ｍｌのナイシンの葉の灌流直後、葉が褐変し始めた。２日後、７ｍｇ／ｍｌで灌流した葉は、黒変した。１．６ｍｇ／ｍｌナイシンで処理した葉の状態には、顕著な違いは認められなかった。
【０５１７】
ナイシンで処理すると、アブラムシ死亡率が増加した
処理時にアブラムシの生存率も測定した。対照単独で処理したアブラムシの約５０％が８日間の実験を生き延びた（図２５）。対照的に、７ｍｇ／ｍｌナイシンで処理したアブラムシについては、生存率は、有意に低く（ｐ＜０．０００１、ログ・ランク・マンテル・コックス検定による）、この群の全てのアブラムシが６日までに処理で死亡した（図２５）。低用量のナイシン（１．６ｍｇ／ｍｌ）で処理したアブラムシは、対照処理のアブラムシと比較して死亡率が高かったが、この差は、統計的有意性に達しなかった（ｐ＝０．０５０１  ログ・ランク・マンテル・コックス検定による）。これらのデータは、ナイシンで処理したときに生存の用量依存的低下があったことを示している。
【０５１８】
ナイシンで処理すると、アブラムシ内のブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）が減少した
ナイシンによる処理がアブラムシ内のブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）の消失を特異的に引き起こしたかどうか、及びこの消失がアブラムシの適応度に影響を及ぼしたことを試験するため、８日間の処理後に各処理群のアブラムシからＤＮＡを抽出し、ｑＰＣＲを実施してブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）／アブラムシコピー数を決定した。対照単独で処理したアブラムシは、高いブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）／アブラムシＤＮＡコピー比を有した。対照的に、１．６ｍｇ／ｍｌナイシンで処理したアブラムシは、約８日間の処理後に約１．４分の１のブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）／アブラムシＤＮＡコピーを有した（図２６）。７ｍｇ／ｍｌナイシンで処理した群に生きているアブラムシはなく、従って、この群ではブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）／アブラムシＤＮＡコピーを評価しなかった。これらのデータは、ナイシン処理がブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）レベルを低下させたことを示している。
【０５１９】
まとめると、前述のこのデータは、抗微生物ペプチドナイシンで処理することによりアブラムシを死滅させ、且つその発育、寿命及び内因性細菌個体群、例えば適応度を低下させることが可能であることを実証している。
【０５２０】
実施例１７：レブリン酸で処理した昆虫は、昆虫適応度を低下させる
本実施例は、炭水化物をヘキソース（例えば、木、デンプン、コムギ、麦わら又はショ糖）と共に希鉱酸を加えて加熱することにより生じるケト酸であるレブリン酸でアブラムシを処理すると、昆虫の適応度が低下することを実証する。レブリン酸は、食肉生産において、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）及びサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）に対する抗微生物剤として既に試験されている（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｍｅａｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ；Ｓａｖａｎｎａｈ  Ｇ．Ｈａｗｋｉｎｓ，２０１４，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｎｎｅｓｓｅｅ  Ｈｏｎｏｒｓ  Ｔｈｅｓｉｓ）。本実施例は、レブリン酸が昆虫に及ぼす効果が、レブリン酸に敏感である、昆虫にとって内因性の細菌個体群の調節を通じて媒介されたことを実証する。１つの標的となる細菌株は、ブフネラ・アフィディコラ（Ｂｕｃｈｎｅｒａ  ａｐｈｉｄｉｃｏｌａ）である。
【０５２１】
治療計画：
葉の灌流及び経植物送達の組み合わせを用いてレブリン酸を製剤化した。対照溶液は、水を注入した葉であり、及びエッペンドルフ試験管に水を入れた。処理溶液は、（エッペンドルフ試験管内に）葉への注入及び経植物による水中０．０３又は０．３％レブリン酸を含んだ。
【０５２２】
葉の灌流  −  植物送達
実験計画：
ｅＮＡＳＣＯアブラムシ、アキルトシフォン・ピスム（Ａｃｙｒｔｈｏｓｉｐｈｏｎ  ｐｉｓｕｍ）を、環境制御されたインキュベーター（１６時間明期／８時間暗期の光周期；６０±５％ＲＨ；２５±２℃）においてソラマメ植物（Ｊｏｈｎｎｙ’ｓ  Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｓｅｅｄｓからのブロマソラマメ（Ｖｒｏｍａ  ｖｉｃｉａ  ｆａｂａ））上で育てた。アブラムシの飼育に使用する前に、ソラマメ植物は、鉢植えのための土において２４℃で１６時間明期及び８時間暗期で成長させた。母性効果又は植物間の健康の差を抑制するため、異なる植物からの５〜１０匹の成虫を１０本の２週齢植物に分配し、高密度になるまで５〜７日間増殖させた。実験のため、健康植物から１齢及び２齢アブラムシを採集し、２つの異なる処理群に分割した：１）陰性対照（水処理）、２）処理溶液は、水中０．０３又は０．３％レブリン酸を含んだ。各処理群が採集植物の各々からほぼ同じ数の個体を受け取った。
【０５２３】
処理のため（治療計画を参照されたい）、レブリン酸（Ｓｉｇｍａ、製品番号：Ｗ２６２７０６）を水中０．０３％又は０．３％のいずれかに希釈した。次に、同様に溶液で灌流した葉と共にソラマメ茎が入った１．５ｍｌエッペンドルフ試験管にこの溶液を入れ、パラフィルムを使用して管の口を閉じた。次に、この給餌システムを深底ペトリ皿（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＦＢ０８７５７１１）内に置き、植物の葉にアブラムシを当てがった。
【０５２４】
各処理につき５７〜５９匹のアブラムシを各葉の上に置いた。給餌システムは、実験全体を通じて２〜３日毎に交換した。毎日生存に関してアブラムシをモニタし、死亡したアブラムシは、見付け次第、深底ペトリ皿から取り除いた。
【０５２５】
加えて、実験全体を通じて発育段階（１齢、２齢、３齢、４齢及び５齢）を毎日決定した。
【０５２６】
７の治療後、各処理群中の残りのアブラムシからＤＮＡを抽出した。簡潔に言えば、アブラムシを６％ブリーチ溶液に約５秒間浸漬することによりアブラムシの体表を滅菌した。次に、アブラムシを滅菌水でリンスし、ＤＮＡ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、ＤＮｅａｓｙキット）を製造者の指示に従って使用して各個別のアブラムシからＤＮＡを抽出した。ｎａｎｏｄｒｏｐ核酸定量化を用いてＤＮＡ濃度を測定し、ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）及びアブラムシＤＮＡコピー数をｑＰＣＲによって測定した。ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）に使用したプライマーは、Ｂｕｃｈ  ｇｒｏＥＳ＿１８Ｆ（ＣＡＴＧＡＴＣＧＴＧＴＧＣＴＴＧＴＴＡＡＧ；配列番号２４０）及びＢｕｃｈ  ｇｒｏＥＳ＿９８Ｒ（ＣＴＧＴＴＣＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＴＴＴＣＣ；配列番号２４１）であった（Ｃｈｏｎｇ  ａｎｄ  Ｍｏｒａｎ，２０１６  ＰＮＡＳ）。アブラムシに使用したプライマーは、ＡｐＥＦ１ａ  １０７Ｆ（ＣＴＧＡＴＴＧＴＧＣＣＧＴＧＣＴＴＡＴＴＧ；配列番号２４２）及びＡｐＥＦ１ａ  ２４６Ｒ（ＴＡＴＧＧＴＧＧＴＴＣＡＧＴＡＧＡＧＴＣＣ；配列番号２４３）であった（Ｃｈｏｎｇ  ａｎｄ  Ｍｏｒａｎ，２０１６  ＰＮＡＳ）。ｑＰＣＲを１．６℃／ｓのｑＰＣＲ増幅ランプ及び以下の条件を用いて実施した：１）９５℃で１０分、２）９５℃で１５秒、３）５５℃で３０秒、４）ステップ２〜３を４０回繰り返す、５）９５℃で１５秒、６）５５℃で１分、７）ランプを０．１５℃／ｓに変更、８）９５℃で１秒。分析（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）ソフトウェアを使用してｑＰＣＲデータを分析した。
【０５２７】
レブリン酸で処理したとき、昆虫適応度に用量依存的負の応答があった
ｅＮＡＳＣＯ  Ａ．ピスム（Ａ．ｐｉｓｕｍ）１齢及び２齢アブラムシを実験計画（上記）に定義されるとおりの３つの別個の処理群に分割した。アブラムシを毎日モニタして、各発育段階にあるアブラムシの数を決定した。陰性対照単独で処理したアブラムシは、約７日で成虫期（５齢期）に達し始めた（図２７）。レブリン酸で処理したアブラムシでは発育が遅れ、処理後１１日までにほぼ全ての対照処理のアブラムシが成熟期に達した一方、０．０３及び０．３％レブリン酸で処理したアブラムシのそれぞれ約２３及び６３％の成熟は、４齢期より先に進まなかった。これらのデータは、レブリン酸での処理がアブラムシの発育の進行を遅らせ且つ止めたと共に、この発育の遅れがレブリン酸の投与用量に依存することを示している。
【０５２８】
レブリン酸での処理は、アブラムシ死亡率の増加を引き起こす
処理時にアブラムシの生存率も測定した。対照単独で処理したアブラムシの約５０％が１１日間の実験を生き延びた（図２８）。対照的に、０．３％レブリン酸（ｐ＜０．０１）で処理したアブラムシについては、生存率は、有意に低かった。低用量のレブリン酸（０．０３％）で処理したアブラムシは、対照処理のアブラムシと比較して死亡率が高かったが、この差は、統計的有意性に達しなかった。これらのデータは、レブリン酸で処理したときに生存の用量依存的低下があったことを示している。
【０５２９】
レブリン酸での処理は、アブラムシ内のブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）の低下を引き起こす
レブリン酸での処理がアブラムシ内のブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）の消失を特異的に引き起こしたかどうか、及びこの消失がアブラムシの適応度に影響を及ぼしたことを試験するため、７日間の処理後に各処理群のアブラムシからＤＮＡを抽出し、ｑＰＣＲを実施してブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）／アブラムシコピー数を決定した。対照単独で処理したアブラムシは、高いブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）／アブラムシＤＮＡコピー比を有した。対照的に、水中０．０３又は０．３％レブリン酸で処理したアブラムシは、７日間の処理後に約６分の１のブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）／アブラムシＤＮＡコピーを有した（図２９、左側のパネル）。これらのデータは、レブリン酸処理によりブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）レベルが低下したことを示している。
【０５３０】
まとめると、前述のこのデータから、レブリン酸で処理することによりアブラムシを死滅させ、且つその発育、寿命及び内因性細菌個体群、例えば適応度を低下させることが可能であることが実証された。
【０５３１】
実施例１８：植物由来二次代謝産物溶液によって処理した昆虫
本実施例は、細胞に透過し、且つ幾つかのデヒドロゲナーゼ酵素の阻害薬としての役割を果たす綿植物（ワタ属（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ））に由来する天然フェノール、ゴシポール酢酸によるアブラムシの処理を実証する。本実施例は、ゴシポールが昆虫に及ぼす効果が、ゴシポールに敏感である、昆虫にとって内因性の細菌個体群の調節を通じて媒介されたことを実証する。１つの標的となる細菌株は、ブフネラ・アフィディコラ（Ｂｕｃｈｎｅｒａ  ａｐｈｉｄｉｃｏｌａ）である。
【０５３２】
治療計画：ゴシポール溶液を送達方法に応じて製剤化した：
１）経植物：必須アミノ酸（ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン及びバリン）不含の人工食（Ａｋｅｙ  ａｎｄ  Ｂｅｃｋ，１９７１をベースとする；実験計画を参照されたい）に製剤化した０（陰性対照）又は０．５％、０．２５％及び０．０５％のゴシポール。
２）マイクロインジェクション：注入溶液は、０．５％のゴシポール又は人工食のみ（陰性対照）のいずれかであった。
【０５３３】
植物送達実験計画：
アブラムシ（ｅＮＡＳＣＯ（ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）及びセラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）一次及び二次共生者の両方をそれぞれ含む）又はＬＳＲ−１（これは、ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）のみを含む）のいずれかの株、アキルトシフォン・ピスム（Ａｃｙｒｔｈｏｓｉｐｈｏｎ  ｐｉｓｕｍ））を、環境制御されたインキュベーター（１６時間明期／８時間暗期の光周期；６０±５％ＲＨ；２５±２℃）においてソラマメ植物（Ｊｏｈｎｎｙ’ｓ  Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｓｅｅｄｓからのブロマソラマメ（Ｖｒｏｍａ  ｖｉｃｉａ  ｆａｂａ））上で育てた。アブラムシの飼育に使用する前に、ソラマメ植物は、鉢植えのための土において２４℃で１６時間明期及び８時間暗期で成長させた。母性効果又は植物間の健康の差を抑制するため、異なる植物からの５〜１０匹の成虫を１０本の２週齢植物に分配し、高密度になるまで５〜７日間増殖させた。実験のため、健康植物から１齢及び２齢アブラムシを採集し、４つの異なる処理群に分割した：１）必須アミノ酸不含の人工食単独、２）必須アミノ酸不含の人工食単独及び０．０５％のゴシポール、３）必須アミノ酸不含の人工食単独及び０．２５％のゴシポール、及び４）必須アミノ酸不含の人工食単独及び０．５％のゴシポール。各処理群が採集植物の各々からほぼ同じ数の個体を受け取った。
【０５３４】
使用した人工食は、必須アミノ酸（２ｍｇ／ｍｌヒスチジン、２ｍｇ／ｍｌイソロイシン、２ｍｇ／ｍｌロイシン、２ｍｇ／ｍｌリジン、１ｍｇ／ｍｌメチオニン、１．６２ｍｇ／ｍｌフェニルアラニン、２ｍｇ／ｍｌスレオニン、１ｍｇ／ｍｌトリプトファン及び２ｍｇ／ｍｌバリン）含有及び不含で、いずれの食餌もホモセリン又はβ−アラニルチロシンを含まなかったことを除いて既発表のとおり作成した（Ａｋｅｙ  ａｎｄ  Ｂｅｃｋ，１９７１  Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  Ｒｅａｒｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｅａ  Ａｐｈｉｄ，Ａｃｙｒｔｈｏｓｉｐｈｏｎ  ｐｉｓｕｍ，ｏｎ  ａ  Ｈｏｌｉｄｉｃ  Ｄｉｅｔ）。食餌のｐＨをＫＯＨで７．５に調整し、０．２２μｍフィルタで食餌をろ過滅菌し、短期（＜７日）について４℃又は長期について−８０℃で保存した。
【０５３５】
ゴシポール酢酸（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｇ４３８２−２５０ＭＧ）ストック溶液をメタノール中５％で作成し、０．２２μｍシリンジフィルタに通して滅菌し、４℃で保存した。処理のため（治療計画を参照されたい）、人工食に適量のストック溶液を加えて種々のゴシポール終濃度を達成した。次に、ソラマメ茎が葉と共に入った１．５ｍｌエッペンドルフ試験管に食餌を入れ、パラフィルムを使用して管の口を閉じた。次に、この給餌システムを深底ペトリ皿（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＦＢ０８７５７１１）内に置き、植物の葉にアブラムシを当てがった。
【０５３６】
各処理につき１５〜８７匹のアブラムシを各葉の上に置いた。人工食給餌システムは、実験全体を通じて２〜３日毎に交換した。毎日生存に関してアブラムシをモニタし、死亡したアブラムシは、見付け次第、人工給餌システムを収容している深底ペトリ皿から取り除いた。
【０５３７】
加えて、実験全体を通じて発育段階（１齢、２齢、３齢、４齢、５齢及び５Ｒ（繁殖済みの５齢））を毎日決定した。アブラムシが４齢期に達したら、深底ペトリ皿にそれ専用の人工給餌システムを付与して、成虫期に達したときに繁殖力をモニタできるようにした。
【０５３８】
成虫アブラムシについては、毎日新しい若虫をカウントし、次に廃棄した。実験の終了時、２つの方法で繁殖力を測定した：１）その処理群の最初の子孫が決定された時点の平均日数、及び２）アブラムシが成虫期に達した後に１日に産生される子孫の数の平均値。実験全体を通じてアブラムシの写真を撮ることにより、処理群間でのサイズの違いを評価した。
【０５３９】
５又は１３日間の処理後、各処理群の複数のアブラムシからＤＮＡを抽出した。簡潔に言えば、アブラムシを６％ブリーチ溶液に約５秒間浸漬することによりアブラムシの体表を滅菌した。次に、アブラムシを滅菌水でリンスし、ＤＮＡ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、ＤＮｅａｓｙキット）を製造者の指示に従って使用して各個別のアブラムシからＤＮＡを抽出した。ｎａｎｏｄｒｏｐ核酸定量化を用いてＤＮＡ濃度を測定し、ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）及びアブラムシＤＮＡコピー数をｑＰＣＲによって測定した。ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）に使用したプライマーは、Ｂｕｃｈ＿ｇｒｏＥＳ＿１８Ｆ（ＣＡＴＧＡＴＣＧＴＧＴＧＣＴＴＧＴＴＡＡＧ；配列番号２４０）及びＢｕｃｈ＿ｇｒｏＥＳ＿９８Ｒ（ＣＴＧＴＴＣＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＴＴＴＣＣ；配列番号２４１）であった（Ｃｈｏｎｇ  ａｎｄ  Ｍｏｒａｎ，２０１６  ＰＮＡＳ）。アブラムシに使用したプライマーは、ＡｐＥＦ１ａ  １０７Ｆ（ＣＴＧＡＴＴＧＴＧＣＣＧＴＧＣＴＴＡＴＴＧ；配列番号２４２）及びＡｐＥＦ１ａ  ２４６Ｒ（ＴＡＴＧＧＴＧＧＴＴＣＡＧＴＡＧＡＧＴＣＣ；配列番号２４３）であった（Ｃｈｏｎｇ  ａｎｄ  Ｍｏｒａｎ，２０１６  ＰＮＡＳ）。ｑＰＣＲを１．６℃／ｓのｑＰＣＲ増幅ランプ及び以下の条件を用いて実施した：１）９５℃で１０分、２）９５℃で１５秒、３）５５℃で３０秒、４）ステップ２〜３を４０回繰り返す、５）９５℃で１５秒、６）５５℃で１分、７）ランプを０．１５℃／ｓに変更、８）９５℃で１秒。分析（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）ソフトウェアを使用してｑＰＣＲデータを分析した。
【０５４０】
アレロケミカルゴシポールで処理したとき、昆虫適応度に用量依存的負の応答があった
ｅＮＡＳＣＯ及びＬＳＲ−１  Ａ．ピスム（Ａ．ｐｉｓｕｍ）１齢及び２齢アブラムシを実験計画（本明細書に記載される）に定義されるとおり４つの別個の処理群に分割した。アブラムシを毎日モニタして、各発育段階にあるアブラムシの数を決定した。人工食単独で処理したアブラムシは、約３日で成虫期（５齢期）に達し始めた（図３０Ａ）。ゴシポールで処理したアブラムシでは発育が遅れ、０．５％のゴシポールによる５日間の処理までに、ほとんどのアブラムシの成熟は、３齢期より先に進まなかったと共に、そのサイズも影響を受ける（図３０Ａ及び図３０Ｂ）。これらのデータは、ゴシポールによる処理がアブラムシの発育の進行を遅らせ且つ止めたこと、及びこの応答が用量依存的であったことを示している。
【０５４１】
ゴシポール処理によってアブラムシ死亡率が増加した
処理時にアブラムシの生存率も測定した。必須アミノ酸不含の人工食単独で処理したアブラムシの大多数は、処理後２日の時点で生存していた（図３１）。４日以降、アブラムシは、徐々に死に始め、一部が処理後７日を超えて生き延びた。
【０５４２】
対照的に、０．２５（対照と有意差なし、ｐ＝０．２７９４）及び０．５％のゴシポールで処理したアブラムシは、人工食単独で処理したアブラムシよりも生存率が低く、０．５％ゴシポール処理は、ＥＡＡ不含のＡＤ対照と有意に異なった（ｐ＝０．００２）。０．５％ゴシポール処理したアブラムシは、２日間の処理後に死に始め、４日までに全てのアブラムシが処理で死亡した。０．２５％で処理したアブラムシは、０．５％で処理したアブラムシよりも少し長く生存したが、同様に劇的に影響を受けた。これらのデータは、アレロケミカルゴシポールで処理したときに生存の用量依存的低下があったことを示している。
【０５４３】
ゴシポール処理によってアブラムシの繁殖が低下した
処理下のアブラムシにおいて、繁殖力もモニタした。処理後７日目及び８日目までに、必須アミノ酸不含の人工食で処理した成虫アブラムシの大多数が繁殖し始めた。必須アミノ酸不含の人工食で処理したアブラムシによって成虫になった後に１日に産生される子孫の数の平均値は、約５であった（図３２Ａ及び図３２Ｂ）。
【０５４４】
対照的に、０．２５％のゴシポールで処理したアブラムシは、成虫期に達して子孫を産生するまでの減少を示す。これらのデータは、ゴシポール処理がアブラムシの繁殖の低下をもたらしたことを示している。
【０５４５】
ゴシポール処理によってアブラムシ内のブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）が減少した
種々の濃度のゴシポールがアブラムシ内のブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）の消失を特異的に引き起こしたかどうか、及びこの消失がアブラムシの適応度に影響を及ぼしたことを試験するため、５又は１３日間の処理後に各処理群のアブラムシからＤＮＡを抽出し、ｑＰＣＲを実施してブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）／アブラムシコピー数を決定した。必須アミノ酸不含の人工食単独で処理したアブラムシ（対照）は、高いブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）／アブラムシＤＮＡコピー比を有した。対照的に、０．２５及び０．５％のゴシポールで処理したアブラムシは、約４分の１のブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）／アブラムシＤＮＡコピーを有し（図３３）、ゴシポール処理がブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）レベルを低下させたこと、及びこの低下が濃度依存的であったことが示された。
【０５４６】
マイクロインジェクション送達実験計画：
ＮａｎｏＪｅｔ  ＩＩＩオートナノリットルインジェクタを使用してインハウスの熱引きしたホウケイ酸ニードル（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；カタログ番号３−０００−２０３−Ｇ／ＸＬ）でマイクロインジェクションを実施した。アブラムシ（ＬＳＲ−１系統、Ａ．ピスム（Ａ．ｐｉｓｕｍ））を前の実施例に記載されるとおりソラマメ植物上で育てた。各処理群が採集植物の各々からほぼ同じ数の注入された個体を有した。若虫アブラムシ（＜３齢期）を、絵筆を使用して、真空に接続されたチュービングシステムに移し、必須アミノ酸不含の人工食（陰性対照）又は必須アミノ酸不含の人工食中０．０５％のゴシポール溶液のいずれか２０ｎｌを腹側胸部にマイクロインジェクションした。注入後、アブラムシは、茎が２％寒天中にあるソラマメの葉が入った深底ペトリ皿に置いた。
【０５４７】
抗生物質処理によるマイクロインジェクションによってアブラムシ内のブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）が減少した
マイクロインジェクションによって送達されたゴシポールがアブラムシ内のブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）の消失をもたらすかどうか、及び前出の実施例で実証されたとおり、この消失がアブラムシの適応度に影響を及ぼすことを試験するため、４日間の処理後に各処理群のアブラムシからＤＮＡを抽出し、前の実施例に記載されるとおりｑＰＣＲを実施してブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）／アブラムシコピー数を決定した。
【０５４８】
陰性対照をマイクロインジェクションしたアブラムシは、高いブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）／アブラムシＤＮＡコピー比を有した。対照的に、ゴシポールをマイクロインジェクションしたアブラムシの若虫及び成虫は、ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）／アブラムシＤＮＡコピーが劇的に減少し（図３４）、ゴシポールマイクロインジェクション処理によって内部共生体ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）の存在が低下すること、及び前出の実施例に示されるとおりこれによって適応度の低下が引き起こされたことが示された。
【０５４９】
まとめると、前出の実施例に記載されるこのデータから、複数の送達方法によって植物二次代謝産物溶液で処理することによりアブラムシを死滅させ、且つその発育、繁殖能力、寿命及び内因性細菌個体群、例えば適応度を低下させることが可能であることが実証された。
【０５５０】
実施例１９：天然植物由来の抗微生物化合物、ｔｒａｎｓ−シンナムアルデヒドで処理される昆虫
本実施例は、桂皮（シナモマム・ゼイラニクム（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｚｅｙｌａｎｄｉｃｕｍ））の樹皮抽出物の主成分である天然芳香族アルデヒド、ｔｒａｎｓ−シンナムアルデヒドによるアブラムシの処理により適応度の低下が引き起こされることを実証する。ｔｒａｎｓ−シンナムアルデヒドは、グラム陰性生物及びグラム陽性生物の両方に対して抗微生物活性を有することが示されているが、しかし、その抗微生物活性の正確な作用機構は、依然として不明である。ｔｒａｎｓ−シンナムアルデヒドは、細菌細胞膜に損傷を与え、特異的細胞過程又は酵素を阻害し得る（Ｇｉｌｌ  ａｎｄ  Ｈｏｌｌｅｙ，２００４  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）。本実施例は、ｔｒａｎｓ−シンナムアルデヒドが昆虫に及ぼす効果が、ｔｒａｎｓ−シンナムアルデヒドに敏感である、昆虫にとって内因性の細菌個体群の調節を通じて媒介されたことを実証する。１つの標的となる細菌株は、ブフネラ・アフィディコラ（Ｂｕｃｈｎｅｒａ  ａｐｈｉｄｉｃｏｌａ）である。
【０５５１】
治療計画：
ｔｒａｎｓ−シンナムアルデヒドを水中０．０５％、０．５％又は５％に希釈し、葉の灌流（約１ｍｌを葉に注入した）及び経植物によって送達した。
【０５５２】
実験計画：
アブラムシ（ＬＳＲ−１（これは、ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）のみを含む）系統、アキルトシフォン・ピスム（Ａｃｙｒｔｈｏｓｉｐｈｏｎ  ｐｉｓｕｍ））を、環境制御されたインキュベーター（１６時間明期／８時間暗期の光周期；６０±５％ＲＨ；２５±２℃）においてソラマメ植物（Ｊｏｈｎｎｙ’ｓ  Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｓｅｅｄｓからのブロマソラマメ（Ｖｒｏｍａ  ｖｉｃｉａ  ｆａｂａ））上で育てた。アブラムシの飼育に使用する前に、ソラマメ植物は、鉢植えのための土において２４℃で１６時間明期及び８時間暗期で成長させた。母性効果又は植物間の健康の差を抑制するため、異なる植物からの５〜１０匹の成虫を１０本の２週齢植物に分配し、高密度になるまで５〜７日間増殖させた。実験のため、健康植物から１齢及び２齢アブラムシを採集し、４つの異なる処理群に分割した：１）水で処理した対照、２）水中０．０５％ｔｒａｎｓ−シンナムアルデヒド、３）水中０．５％ｔｒａｎｓ−シンナムアルデヒド、及び４）水中５％ｔｒａｎｓ−シンナムアルデヒド。各処理群が採集植物の各々からほぼ同じ数の個体を受け取った。
【０５５３】
ｔｒａｎｓ−シンナムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｃ８０６８７）を水で適切な濃度に希釈し（治療計画を参照されたい）、０．２２μｍシリンジフィルタに通して滅菌し、４℃で保存した。約１ｍｌの処理液をソラマメの葉に注入し、次に同じ処理溶液が入った１．５ｍｌエッペンドルフ試験管に葉を入れた。ソラマメ茎を入れた試験管の口を、パラフィルムを使用して閉じた。次に、この処理液給餌システムを深底ペトリ皿（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＦＢ０８７５７１１）内に置き、植物の葉にアブラムシを当てがった。
【０５５４】
各処理につき４０〜４９匹のアブラムシを各葉の上に置いた。処理液給餌システムは、実験全体を通じて２〜３日毎に交換した。毎日生存に関してアブラムシをモニタし、死亡したアブラムシは、見付け次第、処理液給餌システムを収容する深底ペトリ皿から取り除いた。
【０５５５】
加えて、実験全体を通じて発育段階（１齢、２齢、３齢、４齢、５齢及び５Ｒ（繁殖済みの５齢））を毎日決定した。
【０５５６】
３日間の処理後、各処理群の残りの生存アブラムシからＤＮＡを抽出した。簡潔に言えば、アブラムシを６％ブリーチ溶液に約５秒間浸漬することによりアブラムシの体表を滅菌した。次に、アブラムシを滅菌水でリンスし、ＤＮＡ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、ＤＮｅａｓｙキット）を製造者の指示に従って使用して各個別のアブラムシからＤＮＡを抽出した。ｎａｎｏｄｒｏｐ核酸定量化を用いてＤＮＡ濃度を測定し、ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）及びアブラムシＤＮＡコピー数をｑＰＣＲによって測定した。ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）に使用したプライマーは、Ｂｕｃｈ＿ｇｒｏＥＳ＿１８Ｆ（ＣＡＴＧＡＴＣＧＴＧＴＧＣＴＴＧＴＴＡＡＧ；配列番号２４０）及びＢｕｃｈ＿ｇｒｏＥＳ＿９８Ｒ（ＣＴＧＴＴＣＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＴＴＴＣＣ；配列番号２４１）であった（Ｃｈｏｎｇ  ａｎｄ  Ｍｏｒａｎ，２０１６  ＰＮＡＳ）。アブラムシに使用したプライマーは、ＡｐＥＦ１ａ  １０７Ｆ（ＣＴＧＡＴＴＧＴＧＣＣＧＴＧＣＴＴＡＴＴＧ；配列番号２４２）及びＡｐＥＦ１ａ  ２４６Ｒ（ＴＡＴＧＧＴＧＧＴＴＣＡＧＴＡＧＡＧＴＣＣ；配列番号２４３）であった（Ｃｈｏｎｇ  ａｎｄ  Ｍｏｒａｎ，２０１６  ＰＮＡＳ）。ｑＰＣＲを１．６℃／ｓのｑＰＣＲ増幅ランプ及び以下の条件を用いて実施した：１）９５℃で１０分、２）９５℃で１５秒、３）５５℃で３０秒、４）ステップ２〜３を４０回繰り返す、５）９５℃で１５秒、６）５５℃で１分、７）ランプを０．１５℃／ｓに変更、８）９５℃で１秒。分析（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）ソフトウェアを使用してｑＰＣＲデータを分析した。
【０５５７】
天然抗微生物性ｔｒａｎｓ−シンナムアルデヒドで処理したとき、昆虫適応度に用量依存的負の応答があった
ＬＳＲ−１  Ａ．ピスム（Ａ．ｐｉｓｕｍ）１齢及び２齢アブラムシを実験計画（本明細書に記載される）に定義されるとおり４つの別個の処理群に分割した。アブラムシを毎日モニタして、各発育段階にあるアブラムシの数を決定した。水単独で処理したアブラムシは、処理後３日で３齢期に達し始めた（図３５）。ｔｒａｎｓ−シンナムアルデヒドで処理したアブラムシでは発育が遅れ、３つのｔｒａｎｓ−シンナムアルデヒド濃度の各々による３日間の処理までに、第２の齢期を超えて成熟したアブラムシはなかった（図３５）。更に、最も高い濃度のｔｒａｎｓ−シンナムアルデヒド（５％）で処理したアブラムシの全ては、実験の経過全体を通じて１齢期に留まった。これらのデータは、ｔｒａｎｓ−シンナムアルデヒドによる処理がアブラムシの発育の進行を遅らせ且つ止めること、及びこの応答が用量依存的であることを示している。
【０５５８】
ｔｒａｎｓ−シンナムアルデヒド処理によってアブラムシ死亡率が増加した
処理時にアブラムシの生存率も測定した。水単独で処理したアブラムシの約７５パーセントが処理後３日の時点で生きていた（図３６）。対照的に、０．０５％、０．５％及び５％ｔｒａｎｓ−シンナムアルデヒドで処理したアブラムシは、水単独で処理したアブラムシと比べて生存率が有意に低かった（水で処理した対照と比較した各処理群についてｐ＜０．０００１）。これらのデータは、天然抗微生物性ｔｒａｎｓ−シンナムアルデヒドで処理したときに生存の用量依存的低下があったことを示している。
【０５５９】
ｔｒａｎｓ−シンナムアルデヒド処理によってアブラムシ内のブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）が減少した
種々の濃度のｔｒａｎｓ−シンナムアルデヒドがアブラムシ内のブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）の消失を特異的に引き起こしたかどうか、及びこの消失がアブラムシの適応度に影響を及ぼしたことを試験するため、３日間の処理後に各処理群のアブラムシからＤＮＡを抽出し、ｑＰＣＲを実施してブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）／アブラムシコピー数を決定した。水単独で処理したアブラムシ（対照）は、高いブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）／アブラムシＤＮＡコピー比を有した。同様に、最も低い濃度のｔｒａｎｓ−シンナムアルデヒド（０．５％）で処理したアブラムシは、高いブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）／アブラムシＤＮＡコピー比を有した。
【０５６０】
対照的に、０．５及び５％のｔｒａｎｓ−シンナムアルデヒドで処理したアブラムシは、約８７０分の１のブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）／アブラムシＤＮＡコピー（図３７）を有したことから、ｔｒａｎｓ−シンナムアルデヒド処理がブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）レベルを低下させたこと、及びこの低下が濃度依存的であったことが指摘される。
【０５６１】
まとめると、前出の実施例に記載されるこのデータは、複数の送達方法によって植物二次代謝産物溶液で処理することによりアブラムシを死滅させ、且つその発育、繁殖能力、寿命及び内因性細菌個体群、例えば適応度を低下させることが可能であることを実証している。
【０５６２】
実施例２０：サソリ抗微生物ペプチドで処理される昆虫
本実施例は、そのうちの幾つかがサソリのウロダクス・ヤシェンコイ（Ｕｒｏｄａｃｕｓ  ｙａｓｃｈｅｎｋｏｉ）の毒腺トランスクリプトームにおけるＡＭＰと同定される（Ｌｕｎａ−Ｒａｍｉｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７，Ｔｏｘｉｎｓ）、複数のサソリ抗微生物ペプチド（ＡＭＰ）によるアブラムシの処理を実証する。ＡＭＰは、典型的には正味正電荷を有し、従って細菌膜に対して高親和性を有する。本実施例は、ＡＭＰが昆虫に及ぼす効果が、ＡＭＰペプチドに敏感である、昆虫にとって内因性の細菌個体群の調節を通じて媒介されたことを実証する。１つの標的となる細菌株は、アブラムシの偏性共生者であるブフネラ・アフィディコラ（Ｂｕｃｈｎｅｒａ  ａｐｈｉｄｉｃｏｌａ）である。
【０５６３】
治療計画：
葉の灌流及び経植物送達の組み合わせを用いてＵｙ１９２溶液を製剤化した。対照溶液は、水＋青色食品着色料を注入した葉及び試験管内の水であった。処理溶液は、葉への注入（青色食品着色料を含む）及び経植物（エッペンドルフ試験管内）による水中１００ｕｇ／ｍｌ  Ｕｙ１９２からなった。
【０５６４】
葉の灌流  −  植物送達実験計画：
アブラムシＬＳＲ−１（これは、ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）のみを含む）、アキルトシフォン・ピスム（Ａｃｙｒｔｈｏｓｉｐｈｏｎ  ｐｉｓｕｍ）を、環境制御されたインキュベーター（１６時間明期／８時間暗期の光周期；６０±５％ＲＨ；２０±２℃）においてソラマメ植物（Ｊｏｈｎｎｙ’ｓ  Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｓｅｅｄｓからのブロマソラマメ（Ｖｒｏｍａ  ｖｉｃｉａ  ｆａｂａ））上で育てた。アブラムシの飼育に使用する前に、ソラマメ植物は、鉢植えのための土において２４℃で１６時間明期及び８時間暗期で成長させた。母性効果又は植物間の健康の差を抑制するため、異なる植物からの５〜１０匹の成虫を１０本の２週齢植物に分配し、高密度になるまで５〜７日間増殖させた。実験のため、健康植物から１齢及び２齢アブラムシを採集し、２つの異なる処理群に分割した：１）陰性対照（水処理）、２）水中１００ｕｇ／ｍｌ  ＡＭＰの処理溶液。各処理群が採集植物の各々からほぼ同じ数の個体を受け取った。
【０５６５】
Ｕｙ１９２は、Ｂｉｏ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓによって＞７５％純度で合成された。１ｍｇの凍結乾燥ペプチドを５００ｕｌの８０％アセトニトリル、２０％水及び０．１％ＴＦＡに再構成し、１００ｕｌ（１００ｕｇ）をアリコートに分けて１０本の個別のエッペンドルフ試験管に入れ、乾燥させた。処理のため（治療計画を参照されたい）、Ｕｙ１９２の終濃度（１００ｕｇ／ｍｌ）に達するように１００ｕｇアリコートのペプチドに１ｍｌの水を加えた。次に、同様に溶液で灌流した葉と共にソラマメ茎が入った１．５ｍｌエッペンドルフ試験管にこの溶液を入れ、パラフィルムを使用して管の口を閉じた。次に、この給餌システムを深底ペトリ皿（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＦＢ０８７５７１１）内に置き、植物の葉にアブラムシを当てがった。
【０５６６】
各処理につき５０匹のアブラムシを各葉の上に置いた。給餌システムは、実験全体を通じて２〜３日毎に交換した。毎日生存に関してアブラムシをモニタし、死亡したアブラムシは、見付け次第、深底ペトリ皿から取り除いた。
【０５６７】
加えて、実験全体を通じて発育段階（１齢、２齢、３齢、４齢、５齢及び５Ｒ（繁殖済みの５齢））を毎日決定した。
【０５６８】
８日間の処理後、各処理群中の残りのアブラムシからＤＮＡを抽出した。簡潔に言えば、アブラムシを６％ブリーチ溶液に約５秒間浸漬することによりアブラムシの体表を滅菌した。次に、アブラムシを滅菌水でリンスし、ＤＮＡ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、ＤＮｅａｓｙキット）を製造者の指示に従って使用して各個別のアブラムシからＤＮＡを抽出した。ｎａｎｏｄｒｏｐ核酸定量化を用いてＤＮＡ濃度を測定し、ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）及びアブラムシＤＮＡコピー数をｑＰＣＲによって測定した。ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）に使用したプライマーは、Ｂｕｃｈ＿ｇｒｏＥＳ＿１８Ｆ（ＣＡＴＧＡＴＣＧＴＧＴＧＣＴＴＧＴＴＡＡＧ；配列番号２４０）及びＢｕｃｈ＿ｇｒｏＥＳ＿９８Ｒ（ＣＴＧＴＴＣＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＴＴＴＣＣ；配列番号２４１）であった（Ｃｈｏｎｇ  ａｎｄ  Ｍｏｒａｎ，２０１６  ＰＮＡＳ）。アブラムシに使用したプライマーは、ＡｐＥＦ１ａ  １０７Ｆ（ＣＴＧＡＴＴＧＴＧＣＣＧＴＧＣＴＴＡＴＴＧ；配列番号２４２）及びＡｐＥＦ１ａ  ２４６Ｒ（ＴＡＴＧＧＴＧＧＴＴＣＡＧＴＡＧＡＧＴＣＣ；配列番号２４３）であった（Ｃｈｏｎｇ  ａｎｄ  Ｍｏｒａｎ，２０１６  ＰＮＡＳ）。ｑＰＣＲを１．６℃／ｓのｑＰＣＲ増幅ランプ及び以下の条件を用いて実施した：１）９５℃で１０分、２）９５℃で１５秒、３）５５℃で３０秒、４）ステップ２〜３を４０回繰り返す、５）９５℃で１５秒、６）５５℃で１分、７）ランプを０．１５℃／ｓに変更、８）９５℃で１秒。分析（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）ソフトウェアを使用してｑＰＣＲデータを分析した。
【０５６９】
サソリＡＭＰで処理したとき、昆虫適応度に負の応答があった
ＬＳＲ−１  Ａ．ピスム（Ａ．ｐｉｓｕｍ）１齢及び２齢アブラムシを実験計画（上記）に定義されるとおり２つの別個の処理群に分割した。アブラムシを毎日モニタして、各発育段階にあるアブラムシの数を決定した。陰性対照単独で処理したアブラムシは、約６日で成虫期（５齢期）に達し始めた（図３８）。Ｕｙ１９２で処理したアブラムシでは発育が遅れ、８日間の処理後、アブラムシの成熟は、４齢期より先に進まなかった。これらのデータは、Ｕｙ１９２による処理がアブラムシの発育の進行を遅らせ且つ止めたことを示している。
【０５７０】
サソリＡＭＰによる処理によってアブラムシ死亡率が増加した
処理時にアブラムシの生存率も測定した。対照単独で処理したアブラムシの大多数が処理後３日の時点で生存していた（図３９）。４日以降、アブラムシは、徐々に死に始め、一部が処理後７日を超えて生き延びた。
【０５７１】
対照的に、Ｕｙ１９２で処理したアブラムシは、対照で処理したアブラムシよりも生存率が低かった。これらのデータは、サソリＡＭＰ  Ｕｌｙ１９２で処理したときに生存の低下があったことを示している。
【０５７２】
サソリＡＭＰ  Ｕｙ１９２による処理によってアブラムシ内のブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）の減少が引き起こされる
Ｕｙ１９２による処理がアブラムシ内のブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）の消失を特異的に引き起こしたかどうか、及びこの消失がアブラムシの適応度に影響を及ぼしたことを試験するため、８日間の処理後に各処理群のアブラムシからＤＮＡを抽出し、ｑＰＣＲを実施してブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）／アブラムシコピー数を決定した。対照単独で処理したアブラムシは、高いブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）／アブラムシＤＮＡコピー比を有した。対照的に、水中１００ｕｇ／ｍｌ  Ｕｙ１９２で処理したアブラムシは、約７分の１のブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）／アブラムシＤＮＡコピーであったことから（図４０）、Ｕｙ１９２処理がブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）レベルを低下させたことが示される。
【０５７３】
まとめると、前述のこのデータから、天然サソリ抗微生物ペプチドで処理することによりアブラムシを死滅させ、且つその発育、寿命及び内因性細菌個体群、例えば適応度を低下させることが可能であることが実証された。
【０５７４】
実施例２１：サソリ抗微生物ペプチドで処理される昆虫
本実施例は、最近になってサソリのウロダクス・ヤシェンコイ（Ｕｒｏｄａｃｕｓ  ｙａｓｃｈｅｎｋｏｉ）の毒腺トランスクリプトームにおいてＡＭＰと同定された（Ｌｕｎａ−Ｒａｍｉｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７，Ｔｏｘｉｎｓ）幾つかのサソリ抗微生物ペプチド（ＡＭＰ）Ｄ１０、Ｄ３、Ｕｙｃｔ３及びＵｙ１７によるアブラムシの処理を実証する。ＡＭＰは、典型的には正味正電荷を有し、従って細菌膜に対して高親和性を有する。本実施例は、ＡＭＰが昆虫に及ぼす効果が、ＡＭＰペプチドに敏感である、昆虫にとって内因性の細菌個体群の調節を通じて媒介されたことを実証する。１つの標的となる細菌株は、アブラムシの偏性共生者、ブフネラ・アフィディコラ（Ｂｕｃｈｎｅｒａ  ａｐｈｉｄｉｃｏｌａ）である。
【０５７５】
アブラムシは、植物に直接的な食害を引き起こし、且つ植物ウイルスのベクターとしての役割を果たす農業害虫である。加えて、アブラムシの蜜は、すす病の増殖を促進し、害虫アリを誘引する。残念ながら、依然として広く用いられている化学的処理が抵抗性の個体の選択につながり、その根絶がますます困難になっている。
【０５７６】
治療計画：
指示されるペプチド又はペプチドカクテル（詳細については以下のアブラムシマイクロインジェクション実験計画及び葉の灌流  −  植物実験計画の節を参照されたい）をアブラムシに直接マイクロインジェクションするか、又は葉の灌流と経植物送達との組み合わせを用いて送達した。陰性対照として、アブラムシに水をマイクロインジェクションするか（マイクロインジェクション実験について）、又は水を注入した葉上及び管内の水に置いた（葉の灌流及び植物送達実験について）。処理溶液は、水中に溶解した２０ｎｌの５μｇ／μｌのＤ３又はＤ１０（アブラムシマイクロインジェクションについて）、又は葉への注入及び経植物による水中４０μｇ／ｍｌのＤ１０、Ｕｙ１７、Ｄ３及びＵｙＣｔ３のカクテル（エッペンドルフ試験管内）からなった。
【０５７７】
アブラムシマイクロインジェクション実験計画
ＮａｎｏＪｅｔ  ＩＩＩオートナノリットルインジェクタを使用してインハウスの熱引きしたホウケイ酸ニードル（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；カタログ番号３−０００−２０３−Ｇ／ＸＬ）でマイクロインジェクションを実施した。アブラムシ（ＬＳＲ−１系統、アキルトシフォン・ピスム（Ａｃｙｒｔｈｏｓｉｐｈｏｎ  ｐｉｓｕｍ））を、環境制御されたインキュベーター（１６時間明期／８時間暗期の光周期；６０±５％ＲＨ；２５±２℃）においてソラマメ植物（Ｊｏｈｎｎｙ’ｓ  Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｓｅｅｄｓからのブロマソラマメ（Ｖｒｏｍａ  ｖｉｃｉａ  ｆａｂａ））上で育てた。アブラムシの飼育に使用する前に、ソラマメ植物は、鉢植えのための土において２４℃で１６時間明期及び８時間暗期で成長させた。母性効果又は植物間の健康の差を抑制するため、異なる植物からの５〜１０匹の成虫を１０本の２週齢植物に分配し、高密度になるまで５〜７日間増殖させた。各処理群が採集植物の各々からほぼ同じ数の注入された個体を有した。成虫アブラムシの腹側胸部に２０ｎｌの水又は１００ｎｇ（２０ｕｌの５ｕｇ／ｍｌペプチドＤ３又はＤ１０溶液のいずれかをマイクロインジェクションした。マイクロインジェクション速度は、５ｎｌ／ｓｅｃであった。注入後、茎が２％寒天中にあるソラマメの葉が入った深底ペトリ皿にアブラムシを置いた。
【０５７８】
ペプチドは、Ｂｉｏ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓによって＞７５％純度で合成された。１ｍｇの凍結乾燥ペプチドを５００μｌの８０％アセトニトリル、２０％水及び０．１％ＴＦＡに再構成し、１００μｌ（１００μｇ）をアリコートに分けて１０本の個別のエッペンドルフ試験管に入れ、乾燥させた。
【０５７９】
５日間の処理後、各処理群中の残りのアブラムシからＤＮＡを抽出した。簡潔に言えば、アブラムシを６％ブリーチ溶液に約５秒間浸漬することによりアブラムシの体表を滅菌した。次に、アブラムシを滅菌水でリンスし、ＤＮＡ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、ＤＮｅａｓｙキット）を製造者の指示に従って使用して各個別のアブラムシからＤＮＡを抽出した。ｎａｎｏｄｒｏｐ核酸定量化を用いてＤＮＡ濃度を測定し、ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）及びアブラムシＤＮＡコピー数をｑＰＣＲによって測定した。ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）に使用したプライマーは、Ｂｕｃｈ＿ｇｒｏＥＳ＿１８Ｆ（ＣＡＴＧＡＴＣＧＴＧＴＧＣＴＴＧＴＴＡＡＧ；配列番号２４０）及びＢｕｃｈ＿ｇｒｏＥＳ＿９８Ｒ（ＣＴＧＴＴＣＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＴＴＴＣＣ；配列番号２４１）であった（Ｃｈｏｎｇ  ａｎｄ  Ｍｏｒａｎ，２０１６  ＰＮＡＳ）。アブラムシに使用したプライマーは、ＡｐＥＦ１ａ  １０７Ｆ（ＣＴＧＡＴＴＧＴＧＣＣＧＴＧＣＴＴＡＴＴＧ；配列番号２４２）及びＡｐＥＦ１ａ  ２４６Ｒ（ＴＡＴＧＧＴＧＧＴＴＣＡＧＴＡＧＡＧＴＣＣ；配列番号２４３）であった（Ｃｈｏｎｇ  ａｎｄ  Ｍｏｒａｎ，２０１６  ＰＮＡＳ）。ｑＰＣＲを１．６℃／ｓのｑＰＣＲ増幅ランプ及び以下の条件を用いて実施した：１）９５℃で１０分、２）９５℃で１５秒、３）５５℃で３０秒、４）ステップ２〜３を４０回繰り返す、５）９５℃で１５秒、６）５５℃で１分、７）ランプを０．１５℃／ｓに変更、８）９５℃で１秒。分析（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）ソフトウェアを使用してｑＰＣＲデータを分析した。
【０５８０】
サソリペプチドＤ３及びＤ１０によるアブラムシのマイクロインジェクションは、昆虫生存率の低下を引き起こす
ＬＳＲ−１  Ａ．ピスム（Ａ．ｐｉｓｕｍ）１齢及び２齢アブラムシを実験計画（本明細書に記載される）に定義されるとおり３つの別個の処理群に分割した。アブラムシを毎日モニタして、生存率を決定した。５日間の処理後、サソリペプチドを注入したアブラムシは、水を注入した対照と比較して生存率が低かった（Ｄ３、Ｄ１０及び水の注入について、それぞれ９、３５及び４５％の生存）（図４１）。これらのデータは、サソリＡＭＰ  Ｄ３及びＤ１０で処理したときに生存の低下があったことを示している。
【０５８１】
サソリペプチドＤ３及びＤ１０によるアブラムシのマイクロインジェクションは、ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）内部共生体の減少を引き起こす
サソリＡＭＰ  Ｄ３及びＤ１０の注入がアブラムシ内のブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）の消失を特異的に引き起こしたかどうか、及びこの消失がアブラムシの適応度に影響を及ぼしたことを試験するため、注入後５日で各処理群のアブラムシからＤＮＡを抽出し、ｑＰＣＲを実施してブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）／アブラムシコピー数を決定した。水単独を注入したアブラムシは、高いブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）／アブラムシＤＮＡ（４７．４）比を有する一方、Ｄ３及びＤ１０を注入したアブラムシは、低いブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）／アブラムシＤＮＡ比を有した（それぞれ２５．３及び３０．９）（図４２）。これらのデータは、サソリペプチドＤ３及びＤ１０による処理が細菌共生者ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）のレベルの低下を引き起こしたことを示している。
【０５８２】
葉の灌流  −  植物送達実験計画：
ｅＮＡＳＣＯアブラムシ（ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）及びセラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）を含む）、アキルトシフォン・ピスム（Ａｃｙｒｔｈｏｓｉｐｈｏｎ  ｐｉｓｕｍ）を上記に記載したとおりソラマメ植物（Ｊｏｈｎｎｙ’ｓ  Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｓｅｅｄｓからのブロマソラマメ（Ｖｒｏｍａ  ｖｉｃｉａ  ｆａｂａ））上で育てた。実験のため、健康植物から１齢及び２齢アブラムシを採集し、２つの異なる処理群に分割した：１）陰性対照（水処理）、２）処理溶液は、水中各４０μｇ／ｍｌのＤ１０、Ｕｙ１７、Ｄ３及びＵｙＣｔ３からなった。各処理群が採集植物の各々からほぼ同じ数の個体を受け取った。
【０５８３】
ペプチドを上記に記載したとおり合成し、溶解し、及びアリコートに分けた。処理のため（治療計画を参照されたい）、所望の終濃度（４０μｇ／ｍｌ）に達するようにペプチドの１００μｇアリコートに水を加えた。４つのペプチドを合わせてペプチドカクテル溶液を作成した。この溶液を使用して、注入によって葉を灌流した。注入後、注入した葉の茎を１．５ｍｌエッペンドルフ試験管に入れ、次にそれをパラフィルムで密閉した。次に、この給餌システムを深底ペトリ皿（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＦＢ０８７５７１１）内に置き、植物の葉にアブラムシを当てがった。
【０５８４】
各処理につき４１〜４９匹のアブラムシを各葉の上に置いた。給餌システムは、実験全体を通じて２〜３日毎に交換した。毎日生存に関してアブラムシをモニタし、死亡したアブラムシは、見付け次第、深底ペトリ皿から取り除いた。
【０５８５】
サソリペプチドのカクテルで処理すると、アブラムシ死亡率の増加が引き起こされる
処理時にアブラムシの生存率も測定した。６日間の処理後、ペプチドカクテルで処理したアブラムシは、水で処理したアブラムシと比較して生存率が低かった。９日後には、この効果が一層明らかである（ペプチドカクテル処理及び水処理について、それぞれ１６及び２９％生存）（図４３）。これらのデータは、サソリＡＭＰのカクテルで処理したときに生存の低下があったこと、及び前出の実施例に示されるとおり、これらのＡＭＰがアブラムシの内部共生体レベルを低下させたことを示している。
【０５８６】
まとめると、前述のこのデータから、単一の天然サソリ抗微生物ペプチド又はペプチドカクテルで処理することによりアブラムシを死滅させ、その寿命及び内因性細菌個体群、例えば適応度を低下させることが可能であることが実証された。
【０５８７】
実施例２２：細胞透過性ペプチドに融合した抗微生物ペプチドで処理される昆虫
本実施例は、ウイルスに由来する細胞透過性ペプチドとの融合サソリ抗微生物ペプチド（ＡＭＰ）（Ｕｙ１９２）によるアブラムシの処理を実証する。ＡＭＰ  Ｕｙ１９２は、サソリのウロダクス・ヤシェンコイ（Ｕｒｏｄａｃｕｓ  ｙａｓｃｈｅｎｋｏｉ）の毒腺トランスクリプトームにおける幾つかの近年同定されたＡＭＰの１つである（Ｌｕｎａ−Ｒａｍｉｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７，Ｔｏｘｉｎｓ）。ＡＭＰは、典型的には正味正電荷を有し、従って細菌膜に対して高親和性を有する。アブラムシ細胞へのサソリペプチドＵｙ１９２の送達を増強するため、ヒト免疫不全ウイルスＩ型（ＨＩＶ−１）のトランス活性化転写因子（ＴＡＴ）タンパク質の一部分に融合したペプチドを合成した。先行研究では、この細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）を他の分子にコンジュゲートすると、形質導入を介した細胞への取り込みが増加したことが示されている（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｃｅｒｍｅｎａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）。本実施例は、融合ペプチドが昆虫に及ぼす効果が、抗微生物ペプチドに敏感である、昆虫にとって内因性の細菌個体群の調節を通じて媒介されたことを実証する。１つの標的となる細菌株は、ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）である。
【０５８８】
治療計画
細胞透過性ペプチドにコンジュゲートし、且つ６ＦＡＭで蛍光タグを付加したサソリペプチド（Ｕｙ１９２＋ＣＰＰ＋ＦＡＭ）を、葉の灌流及び経植物送達の組み合わせを用いて製剤化した。対照溶液（水）又は処理溶液（Ｕｙ１９２＋ＣＰＰ＋ＦＡＭ）を葉に注入し、エッペンドルフ試験管に入れた。処理溶液は、水中１００μｇ／ｍｌ  Ｕｙ１９２＋ＣＰＰ＋ＦＡＭを含んだ。
【０５８９】
葉の灌流  −  植物送達実験計画
ＬＳＲ−１アブラムシ、アキルトシフォン・ピスム（Ａｃｙｒｔｈｏｓｉｐｈｏｎ  ｐｉｓｕｍ）を、環境制御されたインキュベーター（１６時間明期／８時間暗期の光周期；６０±５％ＲＨ；２５±２℃）においてソラマメ植物（Ｊｏｈｎｎｙ’ｓ  Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｓｅｅｄｓからのブロマソラマメ（Ｖｒｏｍａ  ｖｉｃｉａ  ｆａｂａ））上で育てた。アブラムシの飼育に使用する前に、ソラマメ植物は、鉢植えのための土において２４℃で１６時間明期及び８時間暗期で成長させた。母性効果又は植物間の健康の差を抑制するため、異なる植物からの５〜１０匹の成虫を１０本の２週齢植物に分配し、高密度になるまで５〜７日間増殖させた。実験のため、健康植物から初齢アブラムシを採集し、２つの異なる処理群に分割した：１）陰性対照（水処理）、２）水中１００μｇ／ｍｌ  Ｕｙ１９２＋ＣＰＰ＋ＦＡＭで処理したＵｙ１９２＋ＣＰＰ＋ＦＡＭ。各処理群が採集植物の各々からほぼ同じ数の個体を受け取った。
【０５９０】
処理のため（治療計画を参照されたい）、Ｕｙ１９２＋ＣＰＰ＋ＦＡＭ（アミノ酸配列：ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＦＬＳＴＩＷＮＧＩＫＧＬＬ−ＦＡＭ）がＢｉｏ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓによって＞７５％純度で合成された。５ｍｇの凍結乾燥ペプチドを１ｍｌの８０％アセトニトリル、２０％水及び０．１％ＴＦＡに再構成し、５０μｌ（１００μｇ）をアリコートに分けて個別のエッペンドルフ試験管に入れ、乾燥させた。処理のため（治療計画を参照されたい）、Ｕｙ１９２＋ＣＰＰ＋ＦＡＭの終濃度（１００μｇ／ｍｌ）に達するようにペプチドの１００μｇアリコートに１ｍｌの滅菌水を加えた。次に、植物の葉に溶液を注入し、植物の茎を１．５ｍｌエッペンドルフ試験管に入れた。パラフィルムを使用して管の口を閉じた。次に、この給餌システムを深底ペトリ皿（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＦＢ０８７５７１１）内に置き、植物の葉にアブラムシを当てがった。葉の落射蛍光イメージングにより、葉がその脈管系に緑色蛍光タグ付きのペプチドを含むことが確認された。
【０５９１】
各処理につきトリプリケートで３０匹のアブラムシを各葉の上に置いた。給餌システムは、実験全体を通じて２〜３日毎に交換した。毎日生存に関してアブラムシをモニタし、死亡したアブラムシは、見付け次第、深底ペトリ皿から取り除いた。加えて、実験全体を通じて発育段階（１齢、２齢、３齢、４齢、５齢及び５Ｒ（繁殖中の５齢アブラムシ））を毎日決定した。
【０５９２】
処理後５日で各処理群中の数匹のアブラムシからＤＮＡを抽出した。簡潔に言えば、アブラムシを６％ブリーチ溶液に約５秒間浸漬することによりアブラムシの体表を滅菌した。次に、アブラムシを滅菌水でリンスし、ＤＮＡ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、ＤＮｅａｓｙキット）を製造者の指示に従って使用して各個別のアブラムシからＤＮＡを抽出した。ｎａｎｏｄｒｏｐ核酸定量化を用いてＤＮＡ濃度を測定し、ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）及びアブラムシＤＮＡコピー数をｑＰＣＲによって測定した。ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）に使用したプライマーは、Ｂｕｃｈ＿ｇｒｏＥＳ＿１８Ｆ（ＣＡＴＧＡＴＣＧＴＧＴＧＣＴＴＧＴＴＡＡＧ；配列番号２４０）及びＢｕｃｈ＿ｇｒｏＥＳ＿９８Ｒ（ＣＴＧＴＴＣＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＴＴＴＣＣ；配列番号２４１）であった（Ｃｈｏｎｇ  ａｎｄ  Ｍｏｒａｎ，２０１６  ＰＮＡＳ）。アブラムシに使用したプライマーは、ＡｐＥＦ１ａ  １０７Ｆ（ＣＴＧＡＴＴＧＴＧＣＣＧＴＧＣＴＴＡＴＴＧ；配列番号２４２）及びＡｐＥＦ１ａ  ２４６Ｒ（ＴＡＴＧＧＴＧＧＴＴＣＡＧＴＡＧＡＧＴＣＣ；配列番号２４３）であった（Ｃｈｏｎｇ  ａｎｄ  Ｍｏｒａｎ，２０１６  ＰＮＡＳ）。ｑＰＣＲを１．６℃／ｓのｑＰＣＲ増幅ランプ及び以下の条件を用いて実施した：１）９５℃で１０分、２）９５℃で１５秒、３）５５℃で３０秒、４）ステップ２〜３を４０回繰り返す、５）９５℃で１５秒、６）５５℃で１分、７）ランプを０．１５℃／ｓに変更、８）９５℃で１秒。分析（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）ソフトウェアを使用してｑＰＣＲデータを分析した。
【０５９３】
細胞透過性ペプチドに融合したサソリペプチドＵｙ１９２による処理は、アブラムシの発育の進行を遅らせ且つ止めた
ＬＳＲ−１  Ａ．ピスム（Ａ．ｐｉｓｕｍ）１齢アブラムシを実験計画（上記）に定義されるとおり３つの別個の処理群に分割した。アブラムシを毎日モニタして、各発育段階にあるアブラムシの数を決定した。０日目及び１日目について、水で処理したアブラムシ及び細胞透過性ペプチドに融合したサソリペプチドで処理したアブラムシの両方とも同様の発育であった（図４４）。しかしながら、２日目までに対照処理のアブラムシは、２齢期又は３齢期のいずれかにまで発育した一方、細胞透過性ペプチドに融合したサソリペプチドで処理した一部のアブラムシは、初齢期のままであった（図４４）。処理後３日においてもなお、細胞透過性ペプチドに融合したサソリペプチドで処理した一部のアブラムシは、初齢期のままであった（図４４）。処理後７日までに、水で処理したアブラムシの大多数が５齢期又は５齢繁殖期まで発育した。対照的に、細胞透過性ペプチドに融合したサソリペプチドで処理したアブラムシは、５０パーセントのみが５齢期まで発育した一方、約４２及び約８パーセントのアブラムシは、それぞれ３齢期又は４齢期に留まった（図４４）。これらのデータは、細胞透過性ペプチドに融合したサソリペプチドＵｙ１９２による処理がアブラムシの発育の進行を遅らせ且つ止めたことを示している。
【０５９４】
細胞透過性ペプチドに融合したサソリペプチドＵｙ１９２で処理すると、アブラムシ死亡率が増加した
処理時にアブラムシの生存率も測定した。対照単独で処理したアブラムシの約４０％が７日間の実験を生き延びた（図４５）。対照的に、１００μｇ／ｍｌ  Ｕｙ１９２＋ＣＰＰ＋ＦＡＭで処理したアブラムシについて、生存率は、有意に低く（ｐ＝０．００３６、ログ・ランク・マンテル・コックス検定による）、僅か１６％のアブラムシのみが７日目まで生き延びた（図４５）。これらのデータは、細胞透過性ペプチドに融合したサソリペプチドＵｙ１９２で処理したときに生存の低下があったことを示している。
【０５９５】
細胞透過性ペプチドに融合したサソリペプチドで処理すると、ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）／アブラムシＤＮＡ比が低下した
Ｕｙ１９２＋ＣＰＰ＋ＦＡＭによる処理がアブラムシ内のブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）の消失を特異的に引き起こしたかどうか、及びこの消失がアブラムシの適応度に影響を及ぼしたことを試験するため、５日間の処理後に各群のアブラムシからＤＮＡを抽出し、ｑＰＣＲを実施してブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）／アブラムシコピー数を決定した。水で処理したアブラムシは、高いブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）／アブラムシＤＮＡ比（約１３４）を有した。対照的に、細胞透過性ペプチドに融合したサソリペプチドで処理したアブラムシは、５日間の処理後に約１．８分の１のブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）／アブラムシＤＮＡコピーであった（図４６）。これらのデータは、細胞透過性ペプチドに融合したサソリペプチドによる処理が内部共生体レベルを低下させたことを示している。
【０５９６】
細胞透過性ペプチドに融合したサソリペプチドは、バクテリオサイトに自由に侵入してブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）に対抗して作用する
細胞透過性ペプチドがバクテリオサイトへのサソリペプチドの直接的な送達に役立つかどうかを試験するため、分離したバクテリオサイトを融合タンパク質に直接曝露し、イメージングした。１％ｗ／ｖ  ＢＳＡを補充したシュナイダー培地（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ−ＢＳＡ培地）でアブラムシからバクテリオサイトを解離し、２０ｕｌのシュナイダー培地が入ったイメージングウェルに置いた。サソリペプチドの１００ｕｇ凍結乾燥アリコートを１００ｕｌのシュナイダー培地に再懸濁して１ｍｇ／ｍｌ溶液を作製し、バクテリオサイトが入ったウェルに５ｕｌのこの溶液を混合した。室温で３０分間インキュベートした後、バクテリオサイトを徹底的に洗浄して、溶液中のいかなる過剰な遊離ペプチドも除去した。インキュベーション前及びその後にバクテリオサイトの画像を取得した（図４７）。融合ペプチドは、バクテリオサイト膜を通過し、ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）に直接利用可能となった。
【０５９７】
まとめると、このデータは、細胞透過性ペプチドに融合したサソリ抗微生物ペプチドＵｙ１９２で処理することによりアブラムシを死滅させ、且つその発育、寿命及び内因性細菌個体群、例えば適応度を低下させることが可能であることを実証している。
【０５９８】
実施例２３：ビタミン類似体で処理される昆虫
本実施例は、パントテン酸（ビタミンＢ５）のアルコール類似体であるプロビタミンのパントテノールによるアブラムシの処理を実証する。アブラムシは、偏性内部共生細菌、ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）を有し、これは、アブラムシが必須アミノ酸及びビタミンＢ５を含めたビタミン類を作り出すことを促進する。先行研究では、パントテノールが特異的寄生虫キナーゼの阻害によって熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｉｕｍ）の成長を阻害することが示されている（Ｓａｌｉｂａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。昆虫をパントテノールで処理すれば、細菌−昆虫共生にとって有害であり、従って昆虫適応度に影響するであろうと仮定された。本実施例は、パントテノールによる処理が昆虫適応度を低下させたことを実証する。
【０５９９】
治療計画：
パントテノール溶液を送達方法に応じて製剤化した：
１）経植物人工食中：必須アミノ酸（２ｍｇ／ｍｌヒスチジン、２ｍｇ／ｍｌイソロイシン、２ｍｇ／ｍｌロイシン、２ｍｇ／ｍｌリジン、１ｍｇ／ｍｌメチオニン、１．６２ｍｇ／ｍｌフェニルアラニン、２ｍｇ／ｍｌスレオニン、１ｍｇ／ｍｌトリプトファン及び２ｍｇ／ｍｌバリン）不含の人工食（Ａｋｅｙ  ａｎｄ  Ｂｅｃｋ，１９７１をベースとする；実験計画を参照されたい）に製剤化した０（陰性対照）又は１０若しくは１００ｕＭパントテノール含有。
２）葉面塗布：水中１００μｌの０．０２５％非イオン性有機ケイ素系界面活性剤溶媒Ｓｉｌｗｅｔ  Ｌ−７７（陰性対照）又は１００μｌの溶媒溶液中に製剤化した５０μｇ／ｍｌのリファンピシンを葉の表面に直接塗って乾燥させた。
【０６００】
植物送達実験計画
アブラムシ（ｅＮＡＳＣＯ、アキルトシフォン・ピスム（Ａｃｙｒｔｈｏｓｉｐｈｏｎ  ｐｉｓｕｍ））を、環境制御されたインキュベーター（１６時間明期／８時間暗期の光周期；６０±５％ＲＨ；２５±２℃）においてソラマメ植物（Ｊｏｈｎｎｙ’ｓ  Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｓｅｅｄｓからのブロマソラマメ（Ｖｒｏｍａ  ｖｉｃｉａ  ｆａｂａ））上で育てた。アブラムシの飼育に使用する前に、ソラマメ植物は、鉢植えのための土において２４℃で１６時間明期及び８時間暗期で成長させた。母性効果又は植物間の健康の差を抑制するため、異なる植物からの５〜１０匹の成虫を１０本の２週齢植物に分配し、高密度になるまで５〜７日間増殖させた。実験のため、健康植物から１齢及び２齢アブラムシを採集し、３つの異なる処理群に分割した：１）必須アミノ酸不含の人工食単独、２）必須アミノ酸不含の人工食単独及び１０ｕＭパントテノール、及び３）必須アミノ酸不含の人工食単独及び１００ｕＭパントテノール。各処理群が採集植物の各々からほぼ同じ数の個体を受け取った。
【０６０１】
使用した人工食は、必須アミノ酸（２ｍｇ／ｍｌヒスチジン、２ｍｇ／ｍｌイソロイシン、２ｍｇ／ｍｌロイシン、２ｍｇ／ｍｌリジン、１ｍｇ／ｍｌメチオニン、１．６２ｍｇ／ｍｌフェニルアラニン、２ｍｇ／ｍｌスレオニン、１ｍｇ／ｍｌトリプトファン及び２ｍｇ／ｍｌバリン）含有及び不含で、いずれの食餌もホモセリン又はβ−アラニルチロシンを含まなかったことを除いて既発表のとおり作成した（Ａｋｅｙ  ａｎｄ  Ｂｅｃｋ，１９７１  Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  Ｒｅａｒｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｅａ  Ａｐｈｉｄ，Ａｃｙｒｔｈｏｓｉｐｈｏｎ  ｐｉｓｕｍ，ｏｎ  ａ  Ｈｏｌｉｄｉｃ  Ｄｉｅｔ）。食餌のｐＨをＫＯＨで７．５に調整し、０．２２μｍフィルタで食餌をろ過滅菌し、短期（＜７日）について４℃又は長期について−８０℃で保存した。
【０６０２】
パントテノール（Ｓｉｇｍａ  カタログ番号２９５７８７）溶液を必須アミノ酸不含の人工食中１０ｕＭ及び１００ｕＭで作成し、０．２２μｍシリンジフィルタに通して滅菌し、−２０℃で保存した。処理のため（治療計画を参照されたい）、１０又は１００ｕＭパントテノールの終濃度に達するように必須アミノ酸不含の人工食に適量のストック溶液を加えた。次に、ソラマメ茎が葉と共に入った１．５ｍｌエッペンドルフ試験管に食餌を入れ、パラフィルムを使用して管の口を閉じた。次に、この人工食給餌システムを深底ペトリ皿（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＦＢ０８７５７１１）内に置き、植物の葉にアブラムシを当てがった。
【０６０３】
各処理につき１６〜２０匹のアブラムシを各葉の上に置いた。人工食給餌システムは、実験全体を通じて２〜３日毎に交換した。毎日生存に関してアブラムシをモニタし、死亡したアブラムシは、見付け次第、人工給餌システムを収容している深底ペトリ皿から取り除いた。
【０６０４】
加えて、実験全体を通じて発育段階（１齢、２齢、３齢、４齢、５齢）を毎日決定した。アブラムシが４齢期に達したら、深底ペトリ皿にそれ専用の人工給餌システムを付与して、成虫期に達したときに繁殖力をモニタできるようにした。
【０６０５】
成虫アブラムシについては、毎日新しい若虫をカウントし、次に廃棄した。実験の終了時、アブラムシが成虫期に達した後に１日に産生される子孫の数の平均値として繁殖力を決定した。実験全体を通じてアブラムシの写真を撮ることにより、処理群間でのサイズの違いを評価した。
【０６０６】
８日間の処理後、各処理群の複数のアブラムシからＤＮＡを抽出した。簡潔に言えば、アブラムシを６％ブリーチ溶液に約５秒間浸漬することによりアブラムシの体表を滅菌した。次に、アブラムシを滅菌水でリンスし、ＤＮＡ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、ＤＮｅａｓｙキット）を製造者の指示に従って使用して各個別のアブラムシからＤＮＡを抽出した。ｎａｎｏｄｒｏｐ核酸定量化を用いてＤＮＡ濃度を測定し、ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）及びアブラムシＤＮＡコピー数をｑＰＣＲによって測定した。ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）に使用したプライマーは、Ｂｕｃｈ＿ｇｒｏＥＳ＿１８Ｆ（ＣＡＴＧＡＴＣＧＴＧＴＧＣＴＴＧＴＴＡＡＧ；配列番号２４０）及びＢｕｃｈ＿ｇｒｏＥＳ＿９８Ｒ（ＣＴＧＴＴＣＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＴＴＴＣＣ；配列番号２４１）であった（Ｃｈｏｎｇ  ａｎｄ  Ｍｏｒａｎ，２０１６  ＰＮＡＳ）。アブラムシに使用したプライマーは、ＡｐＥＦ１ａ  １０７Ｆ（ＣＴＧＡＴＴＧＴＧＣＣＧＴＧＣＴＴＡＴＴＧ；配列番号２４２）及びＡｐＥＦ１ａ  ２４６Ｒ（ＴＡＴＧＧＴＧＧＴＴＣＡＧＴＡＧＡＧＴＣＣ；配列番号２４３）であった（Ｃｈｏｎｇ  ａｎｄ  Ｍｏｒａｎ，２０１６  ＰＮＡＳ）。ｑＰＣＲを１．６℃／ｓのｑＰＣＲ増幅ランプ及び以下の条件を用いて実施した：１）９５℃で１０分、２）９５℃で１５秒、３）５５℃で３０秒、４）ステップ２〜３を４０回繰り返す、５）９５℃で１５秒、６）５５℃で１分、７）ランプを０．１５℃／ｓに変更、８）９５℃で１秒。分析（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）ソフトウェアを使用してｑＰＣＲデータを分析した。
【０６０７】
ビタミン類似体処理は、アブラムシの発育を遅らせる
ｅＮＡＳＣＯ１齢及び２齢アブラムシを植物送達実験計画（本明細書に記載される）に定義されるとおり３つの別個の処理群に分割した。アブラムシを毎日モニタして、各発育段階にあるアブラムシの数を決定した。必須アミノ酸不含の人工食単独で処理したアブラムシは、約５日で成虫期（５齢期）に達し始めた（図４８Ａ）。パントテノールで処理したアブラムシでは、特に処理後２及び３日目の時点で発育が遅れたことから（図４８Ａ）、パントテノールによる処理がアブラムシの発育を妨げることが指摘される。最終的には、各処理群のほとんどのアブラムシが成虫になり、繁殖し始めた。時間の経過に伴うアブラムシの発育段階をモニタすることに加えて、アブラムシをまたイメージングして、アブラムシの表面積を決定した。１日間の処理後は、全てのアブラムシが同じサイズであったが、しかしながら、処理後３日までに、パントテノールで処理したアブラムシは、未処理対照と比べて表面積が小さかった。更に、パントテノールで処理したアブラムシは、実験の経過にわたって必須アミノ酸不含の人工食単独で処理したアブラムシと比較して体のサイズ（表面積によって決定したとき）の増加が大幅に少なかった（図４８Ｂ）。
【０６０８】
ビタミン類似体処理によってアブラムシ死亡率が増加した
処理時にアブラムシの生存率も測定した。必須アミノ酸不含の人工食単独で飼育したアブラムシは、１０又は１００ｕＭパントテノールで処理したアブラムシと比較してより高い生存率を有したことから（図４９）、パントテノール処理がアブラムシ適応度に負の影響を及ぼしたことが指摘される。
【０６０９】
パントテノールで処理すると、アブラムシ繁殖力が低下する
処理下のアブラムシにおいて繁殖力もモニタした。成虫まで生き延びて繁殖するアブラムシの割合を決定した。必須アミノ酸不含の人工食で処理したアブラムシは、約４分の１が生き延びて処理後８日までに成虫になった（図５０Ａ）。対照的に、１０又は１００ｕＭパントテノールで処理したうちの１０分の１をごく僅かに超えるアブラムシが生き延びて処理後８日までに成虫になり、繁殖した。各処理群のアブラムシが繁殖し始める平均日数も測定し、全ての処理群について、アブラムシが繁殖し始める平均日数は、７日であった（図５０Ｂ）。加えて、成虫の繁殖アブラムシによって産生される１日当たりの子孫の数の平均値もモニタした。必須アミノ酸不含の人工食単独で処理したアブラムシは、約７子孫／日を産生した。対照的に、１０及び１００ｕＭパントテノールで処理したアブラムシは、図５０Ｃに示される、それぞれ約４及び５子孫／日を産生するに過ぎなかった。まとめると、これらのデータは、パントテノール処理がアブラムシの繁殖の消失を引き起こしたことを示している。
【０６１０】
パントテノール処理は、アブラムシ内のブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）に影響を及ぼさない
パントテノールがアブラムシ内のブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）の消失を特異的に引き起こしたかどうか、及びこの消失がアブラムシの適応度に影響を及ぼしたことを試験するため、８日間の処理後に各処理群のアブラムシからＤＮＡを抽出し、ｑＰＣＲを実施してブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）／アブラムシコピー数を決定した。必須アミノ酸不含の人工食単独で処理したアブラムシは、高いブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）／アブラムシＤＮＡコピー比を有し、２つの濃度のパントテノールの各々で処理したアブラムシも同じであった（図５１）。これらのデータは、パントテノール処理がブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）／アブラムシＤＮＡコピー数に直接的な影響を及ぼさないことを示している。
【０６１１】
葉面塗布送達実験計画：
０．０２５％の非イオン性有機ケイ素系界面活性剤溶媒、Ｓｉｌｗｅｔ  Ｌ−７７に、１０ｕＭパントテノールの終濃度に達するようにパントテノール粉末を加えた。この処理液を、０．２２ｕｍフィルタを使用してろ過滅菌し、４℃で保存した。前の実施例に記載されるとおり、アブラムシ（ｅＮＡＳＣＯ系統、アキルトシフォン・ピスム（Ａｃｙｒｔｈｏｓｉｐｈｏｎ  ｐｉｓｕｍ））をソラマメ植物上で育てた。実験のため、健康植物から初齢アブラムシを採集し、２つの異なる処理群に分割した：１）陰性対照（溶媒溶液のみ）、及び２）溶媒中１０ｕＭパントテノール。１００ｕｌの溶液を２×２ｃｍ断片のソラマメの葉に吸収させた。
【０６１２】
各処理群が採集植物の各々からほぼ同じ数の個体を受け取った。各処理につき２０匹のアブラムシを各葉の上に置いた。毎日生存に関してアブラムシをモニタし、死亡したアブラムシは、見付け次第取り除いた。加えて、実験全体を通じて発育段階（１齢、２齢、３齢、４齢、５齢及び５Ｒ、繁殖する５齢を表す）を毎日決定した。
【０６１３】
葉面塗布によって送達されるパントテノール処理は、アブラムシの発育に影響を及ぼさない
ｅＮＡＳＣＯ  １齢アブラムシを本明細書に記載される実験計画に定義されるとおり２つの別個の処理群に分割した。アブラムシを毎日モニタして、各発育段階にあるアブラムシの数を決定した。対照又はパントテノール溶液のいずれかで処理した塗布した葉に置いたアブラムシは、処理後２日まで同じ速度で成熟した（図５２）。これらのデータは、パントテノールの葉面塗布がアブラムシの発育に影響を及ぼさなかったことを示している。
【０６１４】
葉面塗布によってパントテノール処理を送達すると、アブラムシ死亡率が増加した
葉面塗布処理時にアブラムシの生存率も測定した。パントテノールを塗布した葉に置いたアブラムシは、対照溶液を塗布した葉に置いたアブラムシよりも生存率が低かった（図５３）。これらのデータは、葉面塗布によって送達されるパントテノール処理がアブラムシの生存に有意に（ｐ＝０．００１９）影響を及ぼしたことを示している。この実験では、全てのアブラムシが死亡し、ＤＮＡを抽出してブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）／アブラムシＤＮＡ比を決定するためにとっておくアブラムシは残っていなかった。
【０６１５】
まとめると、前出の実施例に記載されるこのデータは、複数の送達方法を用いてパントテノールで処理することによりアブラムシを死滅させ、且つその発育、繁殖能力、寿命及び内因性細菌個体群、例えば適応度を低下させることが可能であることを実証している。
【０６１６】
実施例２４：アミノ酸トランスポーター阻害薬のカクテルで処理される昆虫
本実施例は、アミノ酸類似体のカクテルによるアブラムシの処理を実証する。この処理の目的は、ＡｐＧＬＮＴ１グルタミントランスポーターを介したバクテリオサイトへのグルタミンの取り込みを阻害することであった。以前、アルギニンがグルタミントランスポーターによるグルタミン取り込みを阻害することが示されており（Ｐｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４  ＰＮＡＳ）、本発明者らは、アルギニンの類似体又は他のアミノ酸類似体による処理もアブラムシバクテリオサイトへの必須アミノ酸の取り込みを阻害し得ると仮定した。本実施例は、処理時の適応度の低下が、アミノ酸類似体に敏感である、昆虫にとって内因性の細菌個体群の調節を通じて媒介されたことを実証する。１つの標的となる細菌株は、ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）である。
【０６１７】
治療計画：
葉の灌流及び経植物による送達のためにアミノ酸カクテルを製剤化した。この送達方法は、葉に水中約１ｍｌのアミノ酸カクテル（カクテル中の成分のリストについては以下を参照されたい）又は水のみを含有する１ｍｌの陰性対照溶液を注入することからなった。
【０６１８】
葉の灌流及び経植物送達実験計画：
アブラムシＬＳＲ−１（これは、ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）のみを含む）、アキルトシフォン・ピスム（Ａｃｙｒｔｈｏｓｉｐｈｏｎ  ｐｉｓｕｍ）を、環境制御されたインキュベーター（１６時間明期／８時間暗期の光周期；６０±５％ＲＨ；２５±２℃）においてソラマメ植物（Ｊｏｈｎｎｙ’ｓ  Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｓｅｅｄｓからのブロマソラマメ（Ｖｒｏｍａ  ｖｉｃｉａ  ｆａｂａ））上で育てた。アブラムシの飼育に使用する前に、ソラマメ植物は、鉢植えのための土において２４℃で１６時間明期及び８時間暗期で成長させた。母性効果又は植物間の健康の差を抑制するため、異なる植物からの５〜１０匹の成虫を１０本の２週齢植物に分配し、高密度になるまで５〜７日間増殖させた。実験のため、健康植物から初齢アブラムシを採集し、２つの異なる処理群に分割した：１）陰性対照（水処理）、及び２）アミノ酸カクテル処理。アミノ酸カクテルは、以下の薬剤の各々を指示される終濃度で含有した：３３０μＭ  Ｌ−ＮＮＡ（Ｎ−ニトロ−Ｌ−アルギニン；Ｓｉｇｍａ）、０．１ｍｇ／ｍｌ  Ｌ−カナバニン（Ｓｉｇｍａ）、０．５ｍｇ／ｍｌ  Ｄ−アルギニン（Ｓｉｇｍａ）、０．５ｍｇ／ｍｌ  Ｄ−フェニルアラニン（Ｓｉｇｍａ）、０．５ｍｇ／ｍｌ  Ｄ−ヒスチジン（Ｓｉｇｍａ）、０．５ｍｇ／ｍｌ  Ｄ−トリプトファン（Ｓｉｇｍａ）、０．５ｍｇ／ｍｌ  Ｄ−スレオニン（Ｓｉｇｍａ）、０．５ｍｇ／ｍｌ  Ｄ−バリン（Ｓｉｇｍａ）、０．５ｍｇ／ｍｌ  Ｄ−メチオニン（Ｓｉｇｍａ）、０．５ｍｇ／ｍｌ  Ｄ−ロイシン及び６μＭ  Ｌ−ＮＭＭＡ（クエン酸塩）（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）。約１ｍｌの処理溶液を注入によってソラマメの葉に灌流し、植物の茎を、処理溶液が入った１．５ｍｌエッペンドルフ試験管に入れた。パラフィルムを使用して管の口を閉じた。次に、この給餌システムを深底ペトリ皿（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＦＢ０８７５７１１）内に置き、植物の葉にアブラムシを当てがった。各処理につき合計５６〜５８匹のアブラムシを各葉の上に置いた（各処理は２８〜３１匹のアブラムシの２レプリケートからなった）。各処理群が採集植物の各々からほぼ同じ数の個体を受け取った。給餌システムは、実験全体を通じて２〜３日毎に交換した。毎日生存に関してアブラムシをモニタし、死亡したアブラムシは、見付け次第、深底ペトリ皿から取り除いた。実験全体を通じてアブラムシの発育段階（１齢、２齢、３齢、４齢及び５齢）を毎日決定し、５日目にアブラムシの顕微鏡画像を撮影してアブラムシの面積測定値を決定した。
【０６１９】
Ｌ−ＮＮＡのストック溶液は、水中５ｍＭで作成し、０．２２μｍシリンジフィルタに通して滅菌し、−２０℃で保存した。Ｌ−カナバニンのストック溶液は、水中１００ｍｇ／ｍｌで作成し、０．２２μｍシリンジフィルタに通して滅菌し、４℃で保存した。Ｄ−アルギニン及びＤ−スレオニンのストック溶液は、水中５０ｍｇ／ｍｌで作成し、０．２２μｍシリンジフィルタに通して滅菌し、４℃で保存した。Ｄ−バリン及びＤ−メチオニンのストック溶液は、水中２５ｍｇ／ｍｌで作成し、０．２２μｍシリンジフィルタに通して滅菌し、４℃で保存した。Ｄ−ロイシンのストック溶液は、水中１２ｍｇ／ｍｌで作成し、０．２２μｍシリンジフィルタに通して滅菌し、４℃で保存した。Ｄ−フェニルアラニン及びＤ−ヒスチジンのストック溶液は、１Ｍ  ＨＣｌ中５０ｍｇ／ｍｌで作成し、０．２２μｍシリンジフィルタに通して滅菌し、４℃で保存した。Ｄ−トリプトファンのストック溶液は、０．５Ｍ  ＨＣｌ中５０ｍｇ／ｍｌで作成し、０．２２μｍシリンジフィルタに通して滅菌し、４℃で保存した。Ｌ−ＮＭＭＡのストック溶液は、滅菌ＰＢＳ中６ｍｇ／ｍｌで作成し、０．２２μｍシリンジフィルタに通して滅菌し、−２０℃で保存した。処理のため（治療計画を参照されたい）、上記に指摘したとおりのカクテル中の薬剤の終濃度に達するように水に適量のストック溶液を加えた。
【０６２０】
６日間の処理後、各処理群の複数のアブラムシからＤＮＡを抽出した。簡潔に言えば、アブラムシを６％ブリーチ溶液に約５秒間浸漬することによりアブラムシの体表を滅菌した。次に、アブラムシを滅菌水でリンスし、ＤＮＡ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、ＤＮｅａｓｙキット）を製造者の指示に従って使用して各個別のアブラムシからＤＮＡを抽出した。ｎａｎｏｄｒｏｐ核酸定量化を用いてＤＮＡ濃度を測定し、ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）及びアブラムシＤＮＡコピー数をｑＰＣＲによって測定した。ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）に使用したプライマーは、Ｂｕｃｈ＿ｇｒｏＥＳ＿１８Ｆ（ＣＡＴＧＡＴＣＧＴＧＴＧＣＴＴＧＴＴＡＡＧ；配列番号２４０）及びＢｕｃｈ＿ｇｒｏＥＳ＿９８Ｒ（ＣＴＧＴＴＣＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＴＴＴＣＣ；配列番号２４１）であった（Ｃｈｏｎｇ  ａｎｄ  Ｍｏｒａｎ，２０１６  ＰＮＡＳ）。アブラムシに使用したプライマーは、ＡｐＥＦ１ａ  １０７Ｆ（ＣＴＧＡＴＴＧＴＧＣＣＧＴＧＣＴＴＡＴＴＧ；配列番号２４２）及びＡｐＥＦ１ａ  ２４６Ｒ（ＴＡＴＧＧＴＧＧＴＴＣＡＧＴＡＧＡＧＴＣＣ；配列番号２４３）であった（Ｃｈｏｎｇ  ａｎｄ  Ｍｏｒａｎ，２０１６  ＰＮＡＳ）。ｑＰＣＲを１．６℃／ｓのｑＰＣＲ増幅ランプ及び以下の条件を用いて実施した：１）９５℃で１０分、２）９５℃で１５秒、３）５５℃で３０秒、４）ステップ２〜３を４０回繰り返す、５）９５℃で１５秒、６）５５℃で１分、７）ランプを０．１５℃／ｓに変更、８）９５℃で１秒。分析（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）ソフトウェアを使用してｑＰＣＲデータを分析した。
【０６２１】
アミノ酸類似体のカクテルによる処理がアブラムシの発育の進行を遅らせ且つ止めた
ＬＳＲ−１  １齢アブラムシを葉の灌流及び経植物送達実験計画（本明細書に記載される）に定義されるとおり２つの別個の処理群に分割した。アブラムシを毎日モニタして、各発育段階にあるアブラムシの数を決定した。水で処理したアブラムシは処理後５日目に成虫期（５齢期）に達し始めた（図５４Ａ）。処理後６日までに、水で処理したアブラムシの約２０パーセントが５齢期に達した。対照的に、アミノ酸カクテルで処理したアブラムシのうち、５齢期に達したのは、６日後であっても３パーセント未満であった（図５４Ａ）。アミノ酸カクテルで処理したときのこの発育の遅れは、処理後５日で取ったアブラムシのサイズ測定値により更に例証された。水単独で処理したアブラムシは、約０．４５ｍｍ２であった一方、アミノ酸カクテルで処理したアブラムシは、約０．３３ｍｍ２であった（図５４Ｂ）。これらのデータは、アミノ酸カクテルによる処理がアブラムシの発育を遅らせ、アブラムシ適応度に負の影響を与えたことを示している。
【０６２２】
アミノ酸類似体カクテルで処理すると、アブラムシ内のブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）が減少した
アミノ酸類似体カクテルによる処理がアブラムシ内のブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）の消失を特異的に引き起こしたかどうか、及びこの消失がアブラムシの適応度に影響を及ぼしたことを試験するため、６日間の処理後に各処理群のアブラムシからＤＮＡを抽出し、ｑＰＣＲを実施してブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）／アブラムシコピー数を決定した。対照溶液に置いたアブラムシは、高いブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）／アブラムシＤＮＡコピー比を有した。対照的に、ＡＡカクテル処理に置いたアブラムシは、ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）／アブラムシＤＮＡコピーが劇的に減少したことから（図５５）、ＡＡ類似体カクテル処理が内部共生体ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）を除去したことが示される。
【０６２３】
まとめると、このデータは、アミノ酸類似体のカクテルで処理することによりアブラムシの発育及び内因性細菌個体群、例えば適応度を低下させることが可能であることを実証している。
【０６２４】
実施例２５：薬剤の併用（抗生物質、ペプチド及び天然抗微生物薬）で処理される昆虫
本実施例は、３つの抗微生物剤の併用−抗生物質（リファンピシン）、ペプチド（サソリペプチドＵｙ１９２）及び天然抗微生物薬（低分子量キトサン）による昆虫の処理を実証する。他の実施例において、これらの薬剤の各々を個別に投与したところ、アブラムシ適応度が低下し、内部共生体レベルが減少した。本実施例は、併用処理を送達することにより、各個別の薬剤単独による処理と同様に又はそれよりも良好に昆虫適応度及び内部共生体レベルが減少したことを実証する。
【０６２５】
治療計画
葉の灌流及び経植物による送達のために併用処理を製剤化した。この送達方法は、水中約１ｍｌの併用処理液（１００μｇ／ｍｌリファンピシン、１００μｇ／ｍｌ  Ｕｙ１９２及び３００μｇ／ｍｌキトサンの終濃度で）又は水のみを含有する１ｍｌの陰性対照溶液を葉に注入することからなった。
【０６２６】
葉の灌流及び経植物送達実験計画
アブラムシＬＳＲ−１（これは、ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）のみを含む）、アキルトシフォン・ピスム（Ａｃｙｒｔｈｏｓｉｐｈｏｎ  ｐｉｓｕｍ）を、環境制御されたインキュベーター（１６時間明期／８時間暗期の光周期；６０±５％ＲＨ；２５±２℃）においてソラマメ植物（Ｊｏｈｎｎｙ’ｓ  Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｓｅｅｄｓからのブロマソラマメ（Ｖｒｏｍａ  ｖｉｃｉａ  ｆａｂａ））上で育てた。アブラムシの飼育に使用する前に、ソラマメ植物は、鉢植えのための土において２４℃で１６時間明期及び８時間暗期で成長させた。母性効果又は植物間の健康の差を抑制するため、異なる植物からの５〜１０匹の成虫を１０本の２週齢植物に分配し、高密度になるまで５〜７日間増殖させた。実験のため、健康植物から初齢アブラムシを採集し、２つの異なる処理群に分割した：１）陰性対照（水処理）及び２）１００μｇ／ｍｌリファンピシン、１００μｇ／ｍｌ  Ｕｙ１９２及び３００μｇ／ｍｌキトサン処理の併用。約１ｍｌの処理溶液を注入によってソラマメの葉に灌流し、処理溶液が入った１．５ｍｌエッペンドルフ試験管に植物の茎を入れた。パラフィルムを使用して管の口を閉じた。次に、この処理システムを深底ペトリ皿（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＦＢ０８７５７１１）内に置き、植物の葉にアブラムシを当てがった。各処理につき合計５６匹のアブラムシを各葉の上に置いた（各処理は２８匹のアブラムシの２レプリケートからなった）。各処理群が採集植物の各々からほぼ同じ数の個体を受け取った。給餌システムは、実験全体を通じて２〜３日毎に交換した。毎日生存に関してアブラムシをモニタし、死亡したアブラムシは、見付け次第、深底ペトリ皿から取り除いた。実験全体を通じてアブラムシの発育段階（１齢、２齢、３齢、４齢及び５齢）を毎日決定し、５日目にアブラムシの顕微鏡画像を撮影してアブラムシの面積測定値を決定した。
【０６２７】
リファンピシン（東京化成工業株式会社）ストック溶液をメタノール中２５ｍｇ／ｍｌで作成し、０．２２μｍシリンジフィルタに通して滅菌し、−２０℃で保存した。処理のため、１００μｇ／ｍｌリファンピシンの終濃度に達するように水に適量のストック溶液を加えた。Ｕｙ１９２は、Ｂｉｏ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓによって＞７５％純度で合成された。１ｍｇの凍結乾燥ペプチドを５００μｌの８０％アセトニトリル、２０％水及び０．１％ＴＦＡに再構成した。１００μｌ（１００μｇ）をアリコートに分けて１０本の個別のエッペンドルフ試験管に入れ、乾燥させた。処理のため、１００μｇ／ｍｌ  Ｕｙ１９２の終濃度に達するようにペプチドの１００μｇアリコートに１ｍｌの水を加えた。キトサン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号４４８８６９−５０Ｇ）ストック溶液を酢酸中に１％で作成し、オートクレーブ滅菌し、４℃で保存した。処理のため、３００μｇ／ｍｌキトサンの終濃度に達するように水に適量のストック溶液を加えた。
【０６２８】
６日間の処理後、各処理群の複数のアブラムシからＤＮＡを抽出した。簡潔に言えば、アブラムシを６％ブリーチ溶液に約５秒間浸漬することによりアブラムシの体表を滅菌した。次に、アブラムシを滅菌水でリンスし、ＤＮＡ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、ＤＮｅａｓｙキット）を製造者の指示に従って使用して各個別のアブラムシからＤＮＡを抽出した。ｎａｎｏｄｒｏｐ核酸定量化を用いてＤＮＡ濃度を測定し、ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）及びアブラムシＤＮＡコピー数をｑＰＣＲによって測定した。ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）に使用したプライマーは、Ｂｕｃｈ＿ｇｒｏＥＳ＿１８Ｆ（ＣＡＴＧＡＴＣＧＴＧＴＧＣＴＴＧＴＴＡＡＧ；配列番号２２８）及びＢｕｃｈ＿ｇｒｏＥＳ＿９８Ｒ（ＣＴＧＴＴＣＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＴＴＴＣＣ；配列番号２２９）であった（Ｃｈｏｎｇ  ａｎｄ  Ｍｏｒａｎ，２０１６  ＰＮＡＳ）。アブラムシに使用したプライマーは、ＡｐＥＦ１ａ  １０７Ｆ（ＣＴＧＡＴＴＧＴＧＣＣＧＴＧＣＴＴＡＴＴＧ；配列番号２３０）及びＡｐＥＦ１ａ  ２４６Ｒ（ＴＡＴＧＧＴＧＧＴＴＣＡＧＴＡＧＡＧＴＣＣ；配列番号２３１）であった（Ｃｈｏｎｇ  ａｎｄ  Ｍｏｒａｎ，２０１６  ＰＮＡＳ）。ｑＰＣＲを１．６℃／ｓのｑＰＣＲ増幅ランプ及び以下の条件を用いて実施した：１）９５℃で１０分、２）９５℃で１５秒、３）５５℃で３０秒、４）ステップ２〜３を４０回繰り返す、５）９５℃で１５秒、６）５５℃で１分、７）ランプを０．１５℃／ｓに変更、８）９５℃で１秒。分析（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）ソフトウェアを使用してｑＰＣＲデータを分析した。
【０６２９】
３つの抗微生物剤の併用による処理がアブラムシの発育の進行を遅らせ且つ止めた
ＬＳＲ−１  １齢アブラムシを葉の灌流及び経植物送達実験計画（本明細書に記載される）に定義されるとおり２つの別個の処理群に分割した。アブラムシを毎日モニタして、各発育段階にあるアブラムシの数を決定した。水で処理したアブラムシは処理後５日目で成虫期（５齢期）に達し始めた（図５６Ａ）。処理後６日までに、水で処理したアブラムシの約２０パーセントが５齢期に達した。対照的に、３つの薬剤の併用で処理したアブラムシは、６日後であっても５齢期に達しなかった（図５６Ａ）。併用処理時のこの発育の遅れは、処理後５日で取ったアブラムシのサイズ測定値により更に例証された。水単独で処理したアブラムシは、約０．４５ｍｍ２であった一方、３剤併用で処理したアブラムシは、約０．２６ｍｍ２であった（図５６Ｂ）。これらのデータは、薬剤の併用による処理がアブラムシの発育を遅らせ、アブラムシ適応度に負の影響を与えたことを示している。
【０６３０】
３つの抗微生物剤の併用による処理によりアブラムシ死亡率が増加した
処理後に生存も毎日モニタした。処理後２日で、水で処理したアブラムシの約７５パーセントが生存していた一方、薬剤の併用で処理したアブラムシのうち、生存していたのは６２パーセントのみであった。対照（水で処理した）群でより多くのアブラムシが処理を生き延びるというこの傾向は、実験の継続期間中にわたって続いた。処理後６日で、対照（水で処理した）アブラムシの６４パーセントが生存した一方、リファンピシン、Ｕｙ１９２及びキトサンの併用で処理したアブラムシの５８パーセントが生存した（図５７）。これらのデータは、処理の併用がアブラムシの生存に負の影響を与えたことを示している。
【０６３１】
３つの薬剤の併用で処理すると、アブラムシ内のブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）が減少した
ペプチド、抗生物質及び天然抗微生物性の併用による処理がアブラムシ内のブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）の消失を特異的に引き起こしたかどうか、及びこの消失がアブラムシの適応度に影響を及ぼしたことを試験するため、６日間の処理後に各処理群のアブラムシからＤＮＡを抽出し、ｑＰＣＲを実施してブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）／アブラムシコピー数を決定した。水単独で処理したアブラムシ、約２．３の比のブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）／アブラムシＤＮＡ（図５８）。対照的に、ペプチド、抗生物質及び天然抗微生物性の併用で処理したアブラムシは、約２分の１のブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）／アブラムシＤＮＡ比であった（図５８）。これらのデータは、併用処理により内部共生体レベルが減少し、そのためアブラムシ適応度の低下が引き起こされたことを示している。
【０６３２】
まとめると、このデータは、ペプチド、抗生物質及び天然抗微生物薬の併用で処理することによりアブラムシの発育及び内因性細菌個体群、例えば適応度を低下させることが可能であることを実証している。
【０６３３】
実施例２６：抗生物質溶液で処理される昆虫
本実施例は、ＤＮＡ複製に必須の２つの酵素、ＤＮＡジャイレース及びトポイソメラーゼの活性を阻害する殺菌性抗生物質であるシプロフロキサシンによるゾウムシの処理の効果を実証する。本実施例は、シプロフロキサシンが別のモデル昆虫ゾウムシに及ぼす表現型効果が、シプロフロキサシンに敏感である、昆虫にとって内因性の細菌個体群の調節を通じて媒介されたことを実証する。１つの標的となる細菌株は、コクゾウムシ属（Ｓｉｔｏｐｈｉｌｕｓ）一次内部共生体（ＳＰＥ、カンディダトゥス・ソダリス・ピエラントニウス（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｓｏｄａｌｉｓ  ｐｉｅｒａｎｔｏｎｉｕｓ））である。
【０６３４】
実験計画：
コクゾウムシ属（Ｓｉｔｏｐｈｉｌｕｓ）のコクゾウムシ（シトフィルス・ゼアマイス（Ｓｉｔｏｐｈｉｌｕｓ  ｚｅａｍａｉｓ））を有機トウモロコシ上、２７．５℃及び７０％相対湿度で飼育した。ゾウムシ飼育に使用する前に、トウモロコシは、７日間凍結し、次に滅菌水で１０％湿度に調湿した。実験のため、成虫雄／雌交配対を３つの異なる処理群に分割し、これは、トリプリケートで行った：１）水対照、２）２５０μｇ／ｍｌシプロフロキサシン、及び３）２．５ｍｇ／ｍｌシプロフロキサシン。シプロフロキサシン（Ｓｉｇｍａ）ストック溶液を０．１Ｎ  ＨＣｌ中２５ｍｇ／ｍｌで作成し、０．２２μｍシリンジフィルタに通して滅菌し、−２０℃で保存した。処理のため、適量のストック溶液を滅菌水で希釈した。
【０６３５】
ゾウムシを３連続処理に供した：
１．第１の処理は、２５ｇのトウモロコシを上記に挙げた３つの処理群：１）水対照、２）２５０μｇ／ｍｌシプロフロキサシン、及び３）２．５ｍｇ／ｍｌシプロフロキサシンの各々に浸漬することを含んだ。簡潔に言えば、２５ｇのトウモロコシを５０ｍｌコニカルチューブに入れ、処理の各々を加えてチューブを完全に満たした。チューブを振盪機に１．５時間かけ、その後、トウモロコシを取り出して深底ペトリ皿に置き、風乾させた。次に、各処理群に雄／雌交配対を加え、４日間摂餌させた。
２．４日後、交配対を取り出し、１）水対照、２）２５０μｇ／ｍｌシプロフロキサシン、及び３）２．５ｍｇ／ｍｌシプロフロキサシンで処理した２５ｇの新しいトウモロコシに置くことにより第２の処理に供した。交配対は、このトウモロコシ上で７日間摂餌し、産卵した。第２の処理からのトウモロコシを子孫の羽化に関して評価した（以下の子孫の評価を参照されたい）
３．交配対を最終処理に供し、これには、交配対を処理液（１）水対照、２）２５０μｇ／ｍｌシプロフロキサシン、及び３）２．５ｍｇ／ｍｌシプロフロキサシンに５秒間沈めること、及び次に１ｍｌの１）水対照、２）２５０μｇ／ｍｌシプロフロキサシン、及び３）２．５ｍｇ／ｍｌシプロフロキサシンでコーティングしておいた１０粒のトウモロコシカーネルが入ったバイアルに入れることの組み合わせが含まれた。
【０６３６】
ゾウムシの生存を１８日間毎日モニタし、その後、各群の残りのゾウムシからＤＮＡを抽出した。簡潔に言えば、ゾウムシを６％ブリーチ溶液に約５秒間浸漬することによりゾウムシの体を表面滅菌した。次に、ゾウムシを滅菌水でリンスし、ＤＮＡ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、ＤＮｅａｓｙキット）を製造者の指示に従って使用して各個別のアブラムシからＤＮＡを抽出した。ｎａｎｏｄｒｏｐ核酸定量化を用いてＤＮＡ濃度を測定し、ＳＰＥ及びゾウムシのＤＮＡコピー数をｑＰＣＲによって測定した。ＳＰＥに使用したプライマーは、ｑＰＣＲ＿Ｓｏｄ＿Ｆ（ＡＴＡＧＣＴＧＴＣＣＡＧＡＣＧＣＴＴＣＧ；配列番号２４４）及びｑＰＣＲ＿Ｓｏｄ＿Ｒ（ＡＴＧＴＣＧＴＣＧＡＧＧＣＧＡＴＴＡＣＣ；配列番号２４５）であった。ゾウムシ（β−アクチン）に使用したプライマーは、ＳＡＣＴ１４４＿ＦＯＲ（ＧＧＴＧＴＴＧＧＣＧＴＡＣＡＡＧＴＣＣＴ；配列番号２４６）及びＳＡＣＴ３１４＿ＲＥＶ（ＧＡＡＴＴＧＣＣＴＧＡＴＧＧＡＣＡＧＧＴ；配列番号２４７）であった（Ｌｏｇｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。ｑＰＣＲを１．６℃／ｓのｑＰＣＲ増幅ランプ及び以下の条件を用いて実施した：１）９５℃で１０分、２）９５℃で１５秒、３）５７℃で３０秒、４）ステップ２〜３を４０回繰り返す、５）９５℃で１５秒、６）５５℃で１分、７）ランプを０．１５℃／ｓに変更、８）９５℃で１秒。分析（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）ソフトウェアを使用してｑＰＣＲデータを分析した。
【０６３７】
子孫の評価：
２５日後、成虫交配対の第２の処理からのトウモロコシカーネルの１つのレプリケートを切開し（上記の実験計画を参照されたい）、発育中の幼虫、蛹又は成虫ゾウムシの存在について確認した。コクゾウムシ属（Ｓｉｔｏｐｈｉｌｕｓ）ゾウムシの発育のほとんどは、穀粒／コメ／トウモロコシの中で行われ、その発育が完了し次第、成虫は、カーネルから羽化する。トウモロコシカーネルをメスで静かに切開し、発育中のゾウムシを全て採集し、成虫、蛹及び幼虫の割合を決定した。次に、切開からのゾウムシを表面滅菌し、ＳＰＥのレベルをｑＰＣＲによって決定した。第２の処理からの群の各々の残りの２レプリケートのトウモロコシカーネルは、切開しなかったが、成虫ゾウムシの羽化に関して毎日確認した。
【０６３８】
トウモロコシへの抗生物質透過の評価
２５ｍｇのトウモロコシカーネルを５０ｍｌコニカルチューブに入れ、水又は水中２．５ｍｇ／ｍｌ若しくは０．２５ｍｇ／ｍｌシプロフロキサシンを加えてチューブを満たした。カーネルを本明細書に記載されるとおり１．５時間浸漬した。浸漬後、カーネルを風乾し、抗生物質がカーネルを被覆してそれに透過することが可能であったかどうかを決定するために評価した。これを試験するため、水中の大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＤＨ５αの濃縮サンプルを５つのルリアブロス（ＬＢ）プレートに塗沫した。各プレートに対し、以下を行った、１）水中に浸漬したトウモロコシカーネルを加え、２）２．５又は０．２５ｍｇ／ｍｌシプロフロキサシンに浸漬しておいたトウモロコシカーネル全体を加え、及び３）２．５又は０．２５ｍｇ／ｍｌシプロフロキサシンに浸漬しておいたトウモロコシカーネルの半分を加え、内側を下にプレートに付けて置いた。プレートを３７℃で一晩インキュベートし、翌日、細菌の成長及び／又は阻害領域を評価した。
【０６３９】
トウモロコシカーネルを抗生物質に浸漬すると、抗生物質が表面をコーティングしてトウモロコシカーネルに浸透することが可能になった
シプロフロキサシンがカーネル後にトウモロコシカーネルの表面をコーティングすることができたかどうかを試験するため、トウモロコシカーネルを抗生物質不含の水又は２．５若しくは０．２５ｍｇ／ｍｌシプロフロキサシンを含有する水に（上記に記載したとおり）浸漬した。次に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の濃縮培養物をＬＢプレートに塗り広げ、次にコーティングされたカーネルの１つをプレートの中央に置いた。プレートを一晩インキュベートし、翌日細菌の成長を評価した。
【０６４０】
いかなる抗生物質も含まない水中でコーティングしたトウモロコシカーネルでは、細菌の菌叢がプレート全体に成長した（図５６Ａ）。対照的に、２つの濃度のシプロフロキサシンのいずれかにトウモロコシカーネル全体を浸漬すると、プレート上に細菌は成長しなかった（図５６Ｂ、左側のパネル）。これらのデータは、これらの実験で用いたコーティング方法により、シプロフロキサシンでトウモロコシカーネルの表面を被覆して細菌の成長を阻害することが成功可能であったことを示している。
【０６４１】
シプロフロキサシンがトウモロコシカーネルに浸透することができたかどうかを試験するため、２．５又は０．２５ｍｇ／ｍｌシプロフロキサシンに浸漬したトウモロコシカーネルを半分に切断し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の濃縮培養物が入ったＬＢプレート上に切り口を下にして置いた。プレートを一晩インキュベートし、翌日、細菌の成長を評価した。いずれかの濃度の抗生物質に浸漬したカーネルでも、プレートに細菌の成長は存在しなかったことから、シプロフロキサシンがトウモロコシカーネルに浸透したことが示される（図５６Ｂ、右側のパネル）。まとめると、これらのデータは、これらの実験に使用したトウモロコシカーネル浸漬方法が、抗生物質によるカーネルのコーティング及び浸透に成功したことを示している。
【０６４２】
抗生物質処理は、Ｆ０世代のＳＰＥレベルを低下させる
Ｓ．ゼアマイス（Ｓ．ｚｅａｍａｉｓ）交配対を実験計画（上記）に定義されるとおり３つの別個の処理群に分割した。ゾウムシを毎日モニタし、実験の経過中、全てのゾウムシが生き残った。１８日間の処理後、ゾウムシを表面滅菌し、ゲノムＤＮＡを抽出し、ｑＰＣＲによってＳＰＥレベルを測定した。水のみで処理したゾウムシは、２５０ｕｇ／ｍｌ及び２．５ｍｇ／ｍｌシプロフロキサシンで処理したゾウムシと比較してＳＰＥ量がそれぞれ約４倍及び８倍であった（図５７）。これらのデータは、ゾウムシをシプロフロキサシンで処理することによりＳＰＥレベルが低下したことを示している。
【０６４３】
抗生物質処理は、ゾウムシのＦ１世代の発育を遅らせ、ＳＰＥレベルを低下させる
７日間にＦ０交配対が卵を産み付け、続いて取り出されたトウモロコシカーネルを切開することにより、Ｆ１世代のゾウムシの発育を評価した。２５日後、水／対照処理のトウモロコシには１２の子孫が見られ、大多数（約６７％）の子孫が蛹の形態であった（図５８Ａ）。２５０ｕｇ／ｍｌ及び２．５ｍｇ／ｍｌシプロフロキサシンで処理したゾウムシでは、それぞれ１３及び２０の子孫が見られた。興味深いことに、抗生物質で処理したゾウムシは、対照処理のゾウムシと比較して発育の遅れを示し、大多数（２５０ｕｇ／ｍｌ及び２．５ｍｇ／ｍｌシプロフロキサシンについて、それぞれ３８及び６５％）の子孫が幼虫の形態であった（図５８Ａ）。
【０６４４】
トウモロコシカーネルから切開したゾウムシからゲノムＤＮＡを抽出し、ｑＰＣＲを実施してＳＰＥレベルを測定した。水で処理したＦ１ゾウムシは、２．５ｍｇ／ｍｌシプロフロキサシンで処理したゾウムシと比較してＳＰＥレベルが約４倍の高さであった（図５８Ｂ）。これらのデータは、シプロフロキサシンで処理するとゾウムシのＳＰＥレベルが低下し、それが発育の遅れにつながったことを示している。
【０６４５】
抗生物質処理は、ゾウムシの繁殖を低下させた
第２の処理から当初の交配対を取り除いた後４３日の間に羽化したゾウムシの数を繁殖力の尺度として使用した（図５９Ａ及び図５９Ｂ）。最初のゾウムシは、２９日目に羽化し、４３日目までに羽化したゾウムシの総数をカウントした。水及び２５０ｕｇ／ｍｌで処理したゾウムシは、同程度の量のＦ１子孫を有したが、２．５ｍｇ／ｍｌ処理群から羽化した子孫は、はるかに少なかったことから、抗生物質処理がＳＰＥレベルを低下させ、ゾウムシの繁殖力に影響を及ぼしたことが示される。
【０６４６】
前出の実施例と併せると、このデータは、複数の送達方法によって抗生物質で処理することによりゾウムシを死滅させ、且つその発育、繁殖能力、寿命及び内因性細菌個体群、例えば適応度を低下させることが可能であることを実証している。
【０６４７】
実施例２７：抗生物質溶液で処理されるダニ
本実施例は、細菌ＲＮＡポリメラーゼの阻害によってＤＮＡ依存性ＲＮＡ合成を阻害する狭域スペクトル抗生物質、リファンピシン及びタンパク質合成の阻害によって細菌の繁殖を妨げる広域スペクトル抗生物質、ドキシサイクリンで処理することにより、ナミハダニを死滅させ、その適応度を低下させることが可能であることを実証する。リファンピシン及びドキシサイクリンがダニに及ぼす効果は、抗生物質に敏感である、ダニにとって内因性の細菌個体群の調節によって媒介された。
【０６４８】
蚊などの昆虫及びマダニなどのクモ類は、ライム病、デング熱、トリパノソーマ症及びマラリアなど、ヒト及び動物に重篤な疾患を引き起こす病原体のベクターとして機能し得る。ベクター媒介性疾患は、毎年何百万人ものヒトの死亡を引き起こしている。また、家畜などの動物に感染するベクター媒介性疾患は、世界的に公衆衛生上の大きい負担となっている。従って、ベクター媒介性疾患を運ぶ昆虫及びクモ類の防除方法及び組成物が必要とされている。ナミハダニは、マダニと同じ亜綱のクモ類である。従って、本実施例は、ナミハダニの適応度を低下させるために使用される方法及び組成物を実証し、マダニ適応度の低下に関する洞察をもたらす。
【０６４９】
治療計画
これらの実験には２つの処理、１）０．０２５％Ｓｉｌｗｅｔ  Ｌ−７７（陰性対照）又は２）２５０μｇ／ｍｌリファンピシンと５００μｇ／ｍｌドキシサイクリンとを含有する抗生物質のカクテルを用いた。リファンピシン（東京化成工業株式会社）ストック溶液は、メタノール中に２５ｍｇ／ｍｌで作成し、０．２２μｍシリンジフィルタに通して滅菌し、−２０℃で保存した。ドキシサイクリン（製造者）ストック溶液は、水中５０ｍｇ／ｍｌで作成し、０．２２μｍシリンジフィルタに通して滅菌し、−２０℃で保存した。
【０６５０】
実験計画：
このアッセイでは、ナミハダニに対する抗生物質溶液を試験し、内因性微生物を標的とすることによりその適応度がどのように変化したかを決定した。
【０６５１】
インゲン植物を鉢植えのための土において２４℃で１６時間明期及び８時間暗期で成長させた。ダニをインゲンマメ植物上、２６℃及び１５〜２０％相対湿度で飼育した。処理のため、インゲンマメ葉から直径１インチの円形の葉を切断し、マスターエアブラシブランド圧縮機モデルＣ−１６−Ｂ  Ｂｌａｃｋ  Ｍｉｎｉエアブラシ空気圧縮機を使用して、０．０２５％Ｓｉｌｗｅｔ  Ｌ−７７（陰性対照）又は抗生物質カクテル（０．０２５％Ｓｉｌｗｅｔ  Ｌ−７７中２５０μｇ／ｍｌリファンピシン及び５００μｇ／ｍｌドキシサイクリン）のいずれかを噴霧した。圧縮機は、処理前、その後及びその間にエタノールで清浄にした。液体は、４分の１インチチューブを使用して圧縮機から供給した。処理毎に新しいチューブを使用した。
【０６５２】
円形の葉を乾燥させた後、各処理につき４つをカップ内のキムワイプ片を被せた湿った綿ボール上に置いた。各処理セットアップは、デュプリケートで行った。次に、２５匹の成虫雌ダニをカップに置いた。４日目、カップから雌を取り除くと、卵及び幼虫が円形の葉上に残された。
【０６５３】
１１日目、第１若虫期及び第２若虫期のダニをカップから取り出し、生存を測定することができるように専用のチューブ内に置いた。各チューブには、キムワイプ片を被せた湿った綿ボールと、陰性対照又はカクテルで処理した２分の１インチの円形の葉とが含まれた。
【０６５４】
抗生物質又は対照溶液で処理した葉を摂餌させた後、解剖顕微鏡下で毎日ダニを観察し、以下のカテゴリに従って分類した：
・生存：元気に歩き回り、又は絵筆でつつかれた後に動く。
・死亡：動かず、絵筆による刺激に反応しない。
【０６５５】
滅菌絵筆を使用して脚に触れることによりダニを刺激した。死亡と分類されたダニは、アッセイ全体を通じて保管し、動くかどうかを毎日再チェックした。アッセイは、２６℃及び１５〜２０％相対湿度で行った。
【０６５６】
抗生物質処理は、ダニの死亡率を増加させた
抗生物質カクテルで処理したナミハダニの生存率を、陰性対照で処理したダニと比較した。カクテルで処理したダニの生存率は、対照と比較して低下した（図６０）。
【０６５７】
このデータは、抗生物質溶液で処理することによりダニの適応度を低下させることが可能であることを実証している。
【０６５８】
実施例２８：精製ファージ溶液で処理した昆虫
本実施例は、特定の昆虫細菌を標的とした環境サンプルからのファージの分離及び精製を実証する。本実施例は、プラークアッセイにより、その酸素消費速度及び細胞外酸性化速度を測定することにより、分離されたファージのインビトロでの標的細菌に対する有効性も実証する。最後に、本実施例は、細菌に対して分離されたファージでハエを処理することによるハエからの標的細菌に対するファージの能力を測定することにより、インビボでのファージの有効性を実証する。本実施例は、昆虫の適応度を低下させた病原性細菌の標的化にファージを使用してその細菌を除去し得ることを実証する。具体的には、園芸コンポストから分離されたファージを使用して、ハエの病原性細菌であるセラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）を除去することができる。
【０６５９】
実験計画
天然サンプルからの特異的バクテリオファージの分離：
標的細菌に対するバクテリオファージを環境由来材料から分離した。簡潔に言えば、セラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）の飽和培養物を新鮮な２倍濃度トリプトソイブロス（ＴＳＢ）に希釈して２４〜２６℃で対数期初期まで約１２０分間成長させるか、又は２倍濃度ルリア−ベルターニ（ＬＢ）ブロスに希釈して３７℃で約９０分間成長させた。園芸コンポストをＰＢＳ中にホモジナイズすることにより調製し、０．２μｍろ過によって滅菌した。未処理の下水を０．２μｍろ過によって滅菌した。１容積のろ過した原材料を対数期細菌培養物に加え、インキュベーションを２４時間継続した。培養物をペレット化し、上清液を０．４５μｍメンブレンでろ過することにより、集積原材料を調製した。
【０６６０】
サンプルを２重寒天菌叢にプレーティングすることによりファージを分離した。定常期細菌培養物を融解０．６％寒天ＬＢ又はＴＳＢと合わせ、１．５％寒天ＬＢ又はＴＳＢプレートに注入した。固化後、２．５μＬのファージサンプル希釈液を２重寒天プレートにスポッティングし、吸収させた。次に、プレートを包み、２５℃（ＴＳＡ）又は３７℃（ＬＢ）で一晩インキュベートし、次に目に見えるプラークの形成に関して評価した。プラークをＳＭ緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ［ｐＨ７．４］、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１００ｍＭ  ＮａＣｌ）中にピッキングして５５℃で１５分間インキュベートし、次にプラーク懸濁液を使用して上記からの２重寒天スポッティング法を繰り返すことにより、新規に分離したプラークを標的株上の個々のプラークの連続継代によって精製した。
【０６６１】
下水及びコンポストの両方から上記に詳述したとおりバクテリオファージを分離することに成功した。集積に使用したＳ．マルセセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）細菌の菌叢上へのサンプルのスポッティング後、プラーク形成が明白に認められた。
【０６６２】
バクテリオファージの継代、定量化及び増殖：
上記のとおり分離及び精製したバクテリオファージを使用して、後続の実験に用いるファージライセートの増殖及び生成を実施した。簡潔に言えば、飽和細菌培養物を新鮮培地に１００倍希釈し、６０〜１２０分間成長させて、有効なファージ感染のための初期対数増殖状態を実現した。対数期初期培養物にファージ懸濁液又はライセートを加え、ファージ増殖及び溶菌の指標である澄明なブロスが観察されるまで又は感染後最長２４時間までインキュベーションを継続した。細胞を７，１９７×ｇで２０分間ペレット化し、次に０．４５又は０．２μｍメンブレンで上清液をろ過することによりライセートを回収した。ろ過したライセートを４℃で保存した。
【０６６３】
２重寒天スポッティング法を用いて感染性ファージ粒子の計数を実施した。簡潔に言えば、ＰＢＳでサンプルの１：１０系列希釈を実施し、上記のとおり宿主細菌で調製した固化２重寒天プレートに希釈液をスポッティングした。一晩インキュベートした後にプラーク形成単位（ＰＦＵ）をカウントし、サンプルの近似的力価を決定した。
【０６６４】
細菌の呼吸を測定する分離したファージのインビトロ分析：
Ｓｅａｈｏｒｓｅ  ＸＦｅ９６アナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して、感染中に酸素消費速度（ＯＣＲ）及び細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）をモニタすることによりファージが細菌に及ぼす効果を測定した。実験前日に、１ウェル当たり１５μＬの１ｍｇ／ｍＬ  ポリ−Ｌ−リジンストックでＸＦｅ９６プレートをコーティングし、２８℃で一晩乾燥させ、及び２００μＬのＸＦ  Ｃａｌｉｂｒａｎｔが入ったウェルに入れて暗所下室温でインキュベートすることによりＸＦｅ９６プローブを平衡化した。翌日、ポリ−Ｌ−リジンでコートしたプレートをｄｄＨ２Ｏで２回洗浄した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＬＢ、３７℃）又はＳ．マルセセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）（ＴＳＢ、２５℃）の飽和一晩培養物を同じ培地に１：１００で継代培養し、曝気しながら３０℃で約２．５時間成長させた。次に、同じ培地を使用して培養物をＯ．Ｄ．６００ｎｍ  約０．０２に希釈した。処理液は、ストックをＳＭ緩衝液に１０×最終濃度で希釈し、２０μＬの１０×溶液をプローブプレートの適切な注入ポートにロードすることにより調製した。ＸＦｅ９６フラックスアナライザーでプローブを平衡化している間、９０μＬの細菌懸濁液又は培地対照を加えることにより細菌プレートを調製し、３，０００ｒｐｍで１０分間スピンした。遠心後、ウェルに更なる９０μＬの適切な培地を、細菌付着を妨げないように静かに加え、１ウェル当たりの総容積を１８０μＬにした。
【０６６５】
ＸＦｅ９６フラックスアナライザーを１：００、０：３０、３：００の混合、待機、読取りサイクルに従って約３０℃で実行した。４サイクルを完了すると細菌の平衡化／標準化が可能となり、次に２０μＬ処理を注入して上記のとおりのサイクル処理を約６時間の総時間にわたって継続した。データは、Ｓｅａｈｏｒｓｅ  ＸＦｅ９６  Ｗａｖｅソフトウェアパッケージを使用して分析した。
【０６６６】
Ｓｅａｈｏｒｓｅ  ＸＦｅ９６アナライザーで細菌の酸素消費速度（ＯＣＲ）及び細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）を測定することにより、分離したバクテリオファージの効果をアッセイした。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）がファージＴ７に感染し、及びＳ．マルセセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）が新規に分離されたΦＳｍＶＬ−Ｃ１に感染すると、ＯＣＲの劇的な低下がこの速度の短時間のバースト後に観察された（図６４）。両方の宿主生物での両方のファージについて、プラークアッセイの必要なしに、Ｓｅａｈｏｒｓｅアッセイによりファージ感染の成功を検出することが可能であった。従って、この方法は、従来のファージ検出方法に適さない宿主生物のファージ感染の検出に適用可能である。
【０６６７】
感染同定のためのＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ形質導入アッセイ：
ヌクレアーゼで前処理して、蛍光シグナル解釈を妨げ得るウイルス外核酸を取り除くことにより、バクテリオファージ調製物を染色のため調製した。簡潔に言えば、１０ｍＬのファージライセートに１０ｍＭの最終濃度でＭｇＣｌ２を加え、ＲＮａｓｅ  Ａ（Ｑｉａｇｅｎ）及びＤＮａｓｅ  Ｉ（Ｓｉｇｍａ）を両方とも１０μｇ／ｍＬの最終濃度となるように加えた。サンプルを室温で１時間インキュベートした。ヌクレアーゼ処理後、５ｍＬのライセートを１μＬのＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ（Ｔｈｅｒｍｏ、１０，０００×）と合わせ、室温で約１．５時間インキュベートした。続いて、Ａｍｉｃｏｎ限外ろ過カラムを使用してサンプルから過剰な色素を取り除いた。簡潔に言えば、１０ｍＬのＳＭ緩衝液を加え、５，０００×ｇ、４℃で５分間スピンすることにより、Ａｍｉｃｏｎカラム（１５ｍＬ、１０ｋ  ＭＷＣＯ）を洗浄した。次に、標識したファージサンプルを、カラムを通じて５，０００×ｇ、４℃でスピンして、最終的に容積を約１０倍低下させた（１５〜３０分）。サンプルを洗浄するため、各リザーバに５ｍＬ  ＳＭ緩衝液を加えてスピンを繰り返し、続いて更に２回洗浄した。３回目の洗浄後、Ａｍｉｃｏｎリザーバから保持サンプルをピペッティングにより取り除き、ＳＭ緩衝液を使用して約１ｍＬにした。より大きい夾雑物を取り除くため、洗浄及び標識したファージサンプルを１０，０００×ｇで２分間スピンし、続いて上清を０．２μｍメンブレンでろ過して黒色マイクロチューブに入れ、４℃で保存した。
【０６６８】
１ｍＬアリコートをスピンダウンし、１ｍＬ  ＰＢＳで１回洗浄した後、１ｍＬ  ＰＢＳを使用して最終的に再懸濁することにより、飽和細菌培養物（ＬＢ中３７℃で成長させた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５、ＴＳＢ中２６℃で成長させたＳ．マルセセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）及びＳ．シンビオティカ（Ｓ．ｓｙｍｂｉｏｔｉｃａ））を調製した。５００μＬの洗浄した細菌を１μＬのＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄと合わせ、暗所下室温で１時間インキュベートすることにより、陽性対照で標識した細菌を染色した。８，０００×ｇで５分間スピンすることにより細菌をペレット化し、等容積のＰＢＳで２回洗浄した後、続いて５００μＬ  ＰＢＳの最終容積に再懸濁した。２５μＬの容積の染色した細菌を２５μＬのＳＭ緩衝液と黒色マイクロチューブに合わせ、そこに５０μＬの１０％ホルマリン（５％最終容積、約２％ホルムアルデヒド）を加え、軽く叩くことにより混合した。サンプルを室温で約３時間固定し、次にＡｍｉｃｏｎ限外ろ過カラムを使用して洗浄した。簡潔に言えば、５００μＬのピコピュア（ｐｉｃｏｐｕｒｅ）水をＡｍｉｃｏｎカラム（０．５ｍＬ、１００ｋ  ＭＷＣＯ）に加え、１４，０００×ｇで５分間スピンしてメンブレンを洗浄した。４００μＬのＰＢＳを加えることにより、固定されたサンプルを希釈して、次に予め洗浄したスピンカラムに移し、１４，０００×ｇで１０分間スピンした。カラムを新鮮な収集チューブに移し、５００μＬのＰＢＳを加えて、保持液中に残る固定液を希釈して除いた。続いて、２つの更なるＰＢＳ希釈を実施して、合計３回洗浄した。最終的な保持液を約１００μＬに希釈し、次にカラムを逆さにして新鮮な収集チューブに入れ、１，０００×ｇで２分間スピンしてサンプルを回収した。洗浄したサンプルを黒色マイクロチューブに移し、４℃で保存した。
【０６６９】
形質導入実験及び対照のため、２５μＬの細菌（又はＰＢＳ）と２５μＬのＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ標識ファージ（又はＳＭ緩衝液）とを黒色マイクロチューブに合わせ、静的に室温で１５〜２０分インキュベートすることにより、レシピエント細菌へのファージの吸着及び注入を可能にした。インキュベーション後直ちにサンプルに５０μＬの１０％ホルマリンを加え、固定を室温で約４時間実施した。上記のとおりＡｍｉｃｏｎカラムを使用してサンプルをＰＢＳで洗浄した。
【０６７０】
ファージによる宿主細菌細胞の感染の成功には、バクテリオファージ核酸の注入が必要であった。大腸菌ファージＰ１ｋｃをＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄで標識し、Ｓ．マルセセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）とコインキュベートすると、顕微鏡法によって蛍光細菌の存在が明らかとなり、ファージ分離パイプラインにおけるこのアッセイの使用がバリデートされた。Ｓｅａｈｏｒｓｅアッセイと同様に、この手法は、従来のファージ方法に代わる手段を提供し、プラークアッセイに適しない生物への拡張が可能になった。加えて、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ形質導入アッセイは、細菌を成長させる必要がなかったため、ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）などの内部共生体を含め、培養困難又は更には培養不可能な生物を標的とするファージの分析に適用可能である。
【０６７１】
ドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）ハエにおけるＳ．マルセセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）に対するファージのインビボ有効性の試験
Ｓ．マルセセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）培養物をトリプトソイブロス（ＴＳＢ）中３０℃において２００ｒｐｍで絶えず振盪しながら成長させた。
【０６７２】
ハエストックを育てるために使用される培地は、コーンミール、糖蜜及び酵母培地（１１ｇ／ｌ酵母、５４ｇ／ｌイエローコーンミール、５ｇ／ｌ寒天、６６ｍｌ／ｌ糖蜜及び４．８ｍｌ／ｌプロピオン酸）であった。プロピオン酸を除く食餌の全ての成分を一緒に脱イオン水中で絶えず混合しながら３０分間８０℃に加熱し、６０℃に放冷した。次に、プロピオン酸を入れて混合し、５０ｍｌの食餌をアリコートに分けて個別のボトルに入れ、放冷して固化させた。ハエは、２６℃、１６：８時間の明期：暗期サイクル、約６０％湿度で飼育した。
【０６７３】
ハエをＳ．マルセセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）に感染させるため、細針（約１０ｕｍ幅先端）を高密度一晩定常期培養物に浸漬し、ハエの胸部を穿刺した。この実験のため、ハエ死亡率の陽性対照として、針穿刺法を使用して各１０匹の雄及び１０匹の雌の４つのレプリケートをＳ．マルセセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）に感染させた。処理群について、各１０匹の雄及び１０匹の雌の４つのレプリケートをＳ．マルセセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）及び約１０８個のファージ粒子／ｍｌを含有するファージ溶液で穿刺した。最後に、いずれでも穿刺又は処理しなかった各１０匹の雄及び１０匹の雌の２つのレプリケートを死亡率の陰性対照として使用した。
【０６７４】
全ての条件のハエを飼料ボトルに入れ、２６℃、１６：８明期：暗期サイクル、６０％湿度でインキュベートした。ハエの生死の数を穿刺後４日間にわたって毎日カウントした。Ｓ．マルセセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）単独で穿刺したハエは、全て処理から２４時間以内に全て死亡した。比較すると、ファージ処理群のハエの６０％超及び未処理対照群の全てのハエがその時点で生きていた（図６５）。更に、ファージ処理群及び陰性対照群のハエの大部分は、実験が終了しても更に４日間生存し続けた。
【０６７５】
ハエの死亡理由を確かめるため、Ｓ．マルセセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）を穿刺したハエ及びＳ．マルセセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）＋ファージを穿刺したハエの両方からの死亡したハエをホモジナイズし、プレートアウトした。Ｓ．マルセセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）処理及びＳ．マルセセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）＋ファージ処理の両方の４つのレプリケートの各々からの４匹の死亡したハエを１００ｕｌのＴＳＢ中にホモジナイズした。ホモジネートをＴＳＢに希釈することにより１：１００希釈液も作成した。１０ｕｌの濃縮ホモジネート並びに１：１００希釈液をＴＳＡプレートにプレートアウトし、３０℃で一晩インキュベートした。細菌成長に関してプレートを調べると、死んだＳ．マルセセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）穿刺ハエからの全てのプレートは、その上に成長する細菌の菌叢を有する一方、死亡したＳ．マルセセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）＋ファージ穿刺ハエからのプレートは、その上に細菌を有しなかった。これは、ファージが存在しないとき、Ｓ．マルセセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）がハエに敗血症性ショックを引き起こし、その致死につながった可能性があることを示す。しかしながら、ファージの存在下では、死亡は、針による穿刺によって引き起こされた外傷が原因であった可能性もある。
【０６７６】
他の実施形態
前述の本発明は、理解を明確にするために説明及び例として幾らか詳細に記載されているが、そうした記載及び例が本発明の範囲を限定するものと解釈されてはならない。本明細書に引用される全ての特許及び科学文献の開示は、全体として参照により明示的に援用される。
【図１Ａ−１Ｇ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ−２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ−１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３１】
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【図３２Ａ−３２Ｂ】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８Ａ−４８Ｂ】
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【図４９】
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【図５０Ａ−５０Ｃ】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４Ａ−５４Ｂ】
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【図５５】
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【図５６Ａ−５６Ｂ】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９Ａ−５９Ｂ】
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【図６０】
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【図６１Ａ−６１Ｂ】
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【図６２Ａ−６２Ｂ】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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