(57)【要約】所定のＭＨＣ背景における関心対象のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に対するリガンドであるペプチド配列に対して、組成物及び方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１〜配列番号：２５７または配列番号：２６２のいずれかのアミノ酸配列を含む、ペプチド。
【請求項２】
配列番号：１〜配列番号：２５７または配列番号：２６２のいずれかのアミノ酸配列からなる、ペプチド。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載のペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、ペプチド、またはペプチドの組み合わせ、及び、薬学的に許容される賦形剤を含む、薬学的組成物。
【請求項５】
ワクチンアジュバントを含む、請求項４に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
前記ペプチドまたはペプチドの組み合わせはＭＨＣ抗原と複合している、請求項４または請求項５に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
請求項１または請求項２に記載のペプチドまたはペプチドの組み合わせを含む、抗原提示細胞。
【請求項８】
がん細胞抗原に対する免疫応答を誘導する方法であって、
有効用量の、請求項４〜６のいずれか一項に記載の薬学的組成物または請求項７に記載の抗原提示細胞を個体に投与することを含む、方法。
【請求項９】
配列番号：２５８、２５９、または２６０のいずれかのＣＤＲ配列を含む、Ｔ細胞受容体または抗体。
【請求項１０】
配列番号：２５９または配列番号：２６０の配列と対合した、配列番号：２５８のアミノ酸配列を含む、請求項９に記載のＴ細胞受容体。
【請求項１１】
請求項９または請求項１０に記載のＴ細胞受容体または抗体を含むように操作された、免疫細胞。
【請求項１２】
抗原に対する個体の応答性を判定する方法であって、
配列番号：１〜２５７または２６２のいずれかに従ったペプチドに応答したＴ細胞刺激について、前記個体由来のＴ細胞を含むサンプルを分析することを含み、
前記ペプチドに応答したＴ細胞刺激は、前記個体が請求項８に記載の方法に従って処理され得ることを示す、方法。
【請求項１３】
関心対象のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と、ＭＨＣタンパク質の結合ドメイン及びペプチドリガンドを含む一本鎖ポリペプチドをコードする少なくとも１０8 種の異なるポリヌクレオチドの多重化ライブラリーを細胞表面に発現する宿主細胞の集団とを接触させること、
関心対象の前記ＴＣＲに結合する一本鎖ポリペプチドを発現する宿主細胞を選択すること、
少なくとも３つのラウンドに対して前記選択することを反復すること、
最終選択集団に存在する前記ポリヌクレオチドのＤＮＡシーケンシングを実施して、前記ペプチドリガンドの各箇所に対する考え得るアミノ酸のデータセットを決定すること、
前記データセットをコンピュータ可読媒体に入力して、検索アルゴリズムを作り出すこと、ならびに、
前記検索アルゴリズムを用いて配列データベースを検索して、前記ＴＣＲに結合するペプチドのセットを同定すること
を含む方法によって同定された、ＴＣＲに対するペプチド抗原。
【請求項１４】
前記ペプチドリガンドは長さが８〜２０アミノ酸である、請求項１３に記載のペプチド抗原。
【請求項１５】
前記多重化ライブラリーは、複数の箇所にランダム化されたペプチドリガンドを含有する、請求項１４に記載のペプチド抗原。
【請求項１６】
ペプチドリガンドの前記多重化ライブラリーは、ＭＨＣアンカー箇所において限定された多様性を有する、請求項１５に記載のペプチド抗原。
【請求項１７】
前記ＭＨＣタンパク質の結合ドメインは、クラスＩ  ＭＨＣタンパク質のアルファ１及びアルファ２ドメイン、ならびにβ２ミクログロブリンを含む、請求項１３〜１６のいずれか一１項に記載のペプチド抗原。
【請求項１８】
前記クラスＩ  ＭＨＣタンパク質はＨＬＡ−Ａ２のアレルである、請求項１７に記載のペプチド抗原。
【請求項１９】
前記ＨＬＡ−Ａ２のアレルはアミノ酸変化｛Ｙ８４Ａ｝を含む、請求項１８に記載のペプチド抗原。
【請求項２０】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のペプチド抗原をスクリーニングする方法であって、
関心対象のＴＣＲと、ＭＨＣタンパク質の結合ドメイン及びペプチドリガンドを含む一本鎖ポリペプチドをコードする少なくとも１０8 種の異なるポリヌクレオチドの多重化ライブラリーを細胞表面に発現する宿主細胞の集団とを接触させること、
関心対象の前記ＴＣＲに結合する一本鎖ポリペプチドを発現する宿主細胞を選択すること、
少なくとも３つのラウンドに対して前記選択することを反復すること、
最終選択集団に存在する前記ポリヌクレオチドのＤＮＡシーケンシングを実施して、前記ペプチドリガンドの各箇所に対する考え得るアミノ酸のデータセットを決定すること、
前記データセットをコンピュータ可読媒体に入力して、検索アルゴリズムを作り出すこと、ならびに、
前記検索アルゴリズムを用いて配列データベースを検索して、前記ＴＣＲに結合するペプチドのセットを同定すること
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
Ｔ細胞は適応免疫系に不可欠であり、病原体及びがんからの保護を提供する。それらは、細胞上のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）上に提示される短いペプチドに特異的であるＴＣＲによる細胞外認識を通じて機能する（Ｂｉｒｎｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１４）Ｃｅｌｌ  １５７，１０７３−１０８７）。ＴＣＲ、ペプチド、及びＨＬＡ分子に特有の多様性により、いずれか１つのＴＣＲの特異性を同定することは極めて複雑な問題となる。
【０００２】
Ｔ細胞を特徴付けし及びそれらのＴＣＲをシーケンスし得る本発明者らの能力は近年かなり改善しているものの（Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１４）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３２，６８４−６９２、Ｓｔｕｂｂｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１６）Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １３，３２９−３３２）、Ｔ細胞の抗原特異性を判定し及び調査し得る能力は同様には進歩していない。
【０００３】
各ヒト個体は、１０7 〜１０8 種の固有のＴ細胞受容体とともに、彼らの身体内に１０12個のＴ細胞を有する。各Ｔ細胞は、ペプチドを提示する主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子に結合し得る能力に対して選択される固有のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する。ペプチド−ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）のＴＣＲ認識は、Ｔ細胞の発達、生存、及びエフェクター機能を推進する。たとえＴＣＲリガンドは比較的低いアフィニティー（１〜１００μＭ）であるとしても、ＴＣＲは非常に高感度であり、Ｔ細胞を充分に活性化するためにわずか１０個のアゴニストペプチドを要する。認識後、シグナル伝達カスケードにより、Ｔ細胞はそれらの免疫機能を果たすことが可能となる。
【０００４】
ｐＭＨＣのＴＣＲ認識についての広範な構造調査は、調査されたＴＣＲ−ｐＭＨＣ複合体の圧倒的多数が、ＭＨＣヘリックスの上部と生殖系列によってコードされるＴＣＲ  ＣＤＲ１及びＣＤＲ２ループとの間の保存された接触によって推進される、一貫した結合配向を共有することを示している（Ｇａｒｃｉａ  ａｎｄ  Ａｄａｍｓ（２００５）Ｃｅｌｌ  １２２，３３３−３３６、Ｇａｒｃｉａ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １０，１４３−１４７、及びＲｕｄｏｌｐｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２４，４１９−４６６を参照されたい）。これらの保存された接触は、適応免疫系の発達を通して共進化している可能性が高く、αβＴＣＲレパートリーのＭＨＣ制限の基礎として働く（Ｓｃｏｔｔ−Ｂｒｏｗｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。典型的なＴＣＲ−ｐＭＨＣ相互作用の変更は、シグナル伝達の無効、及び発達中に存在する場合にはＴＣＲレパートリーの歪みと相関することが示されている（Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３５（５）：６８１−９３、Ｂｉｒｎｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２５０（１）：８２−１０１）。
【０００５】
ＴＣＲの付加的な重要な特徴は、交差反応と特異性との平衡を保ち得る能力である。あらゆる考え得るｐＭＨＣ組み合わせを一意的に認識するために必要であるＴ細胞の数は極めて高いため、及びＴＣＲレパートリーにおいて特徴付けされる「穴」はたとえあったとしてもごくわずかであるため、かなりの程度のＴＣＲ交差反応が機能的抗原認識の要件であると断定されている。どのようにしてＴ細胞レパートリーが同時にＭＨＣ制限的であり得、すべての潜在的抗原チャレンジが満たされ得ることを確実にするために十分なほど交差反応性であり得、しかし異常な自己免疫を回避するために十分なほどさらに特異的であり得るかは、免疫学における未解決でかつ差し迫った問いのままである。
【０００６】
オーファンＴＣＲの特異性を判定するために用いられるいくつかのストラテジーが存在している（Ｂｉｒｎｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  ２５０，８２−１０１）。質量分析は、抗原単離の不偏的な方法を提供し得るが、典型的に１０7 〜１０9 個という大量の細胞数を要する実験に制限され、かつ標的は、正しいＨＬＡによってさらに提示されなければならない。伝統的に、Ｔ細胞抗原特異性についてのほとんどの調査は、経験的に候補抗原を試験することを伴っている。例えば、抗腫瘍Ｔ細胞特異性についての調査は、新抗原に対する生産的Ｔ細胞応答が存在すると正しく仮定している。そのような調査は、変異を同定するための腫瘍のシーケンシング、免疫原性変異体ペプチドを予測するためにエピトープ予測アルゴリズムを用いること、及びこれらの変異体ペプチドに向けられたＴ細胞応答について試験することを伴う（Ｋｒｅｉｔｅｒ  ｅｔ
ａｌ．，（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ  ５２０，６９２−６９６、Ｒａｊａｓａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１４）Ｂｌｏｏｄ  １２４，４５３−４６２、Ｔｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４４，６４１−６４５）。他のストラテジーは、ｐＨＬＡ多量体を用いることによって、患者における確立されたＴ細胞特異性の問い合わせを行う（Ｂｅｎｔｚｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１６）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３４，１０３７−１０４５、Ｎｅｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１３）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３１，６２３−６２９）。
【０００７】
がん免疫療法、自己免疫、及び感染症に対する潜在的標的を明らかにすることを助け及び疾患病因についてのメカニズム的洞察を提供し得る、「オーファン」ＴＣＲ（すなわち、未知の抗原特異性のＴＣＲ）の特異性を判定するためのハイスループットでかつ高感度の手法は大きな関心である。
【発明の概要】
【０００８】
規定のＭＨＣ背景における関心対象のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に対するリガンドに対して組成物が提供される。組成物は、規定のペプチドを含み得るもしくはそれからなり得る、またはそのようなペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み得るもしくはそれからなり得る。そのようなペプチドは、天然に存在する抗原タンパク質のフラグメントであり得るか、腫瘍発生中の体細胞変異の対象である新抗原タンパク質のフラグメントであり得るか、または抗原タンパク質の合成的に生成された模倣体であり得る。合成ペプチドは、Ｔ細胞受容体の非常に強力なアゴニストとして作用し得る。一部の実施形態において、ペプチドまたはコード配列は、限定されることなく配列番号：１〜２５７に明示されるペプチド配列のいずれか１つまたは組み合わせを含む、本明細書において提供される配列から選択される。ペプチドは、Ｔ細胞を刺激することにおいて活性がある短い抗原配列として提供され得るか、またはより大きなタンパク質、例えば無傷ドメイン、可溶性タンパク質部分、完全タンパク質等の形態で提供され得る。一部の実施形態において、患者間で共有されかつ幅広く適用可能な療法のための手段を提供するペプチド抗原が同定される。他の実施形態において、抗原の同定は個別化医療手法を提供する。
【０００９】
Ｔ細胞受容体及び同族抗原の同定は、応答性についての患者Ｔ細胞のスクリーニング、ペプチドまたはそのようなペプチドをコードする核酸の接種、細胞に基づく療法、タンパク質に基づく療法等を含めた、免疫療法に対する標的を提供する。本明細書において開示されるペプチド及び方法は、ペプチド抗原特異性に基づいてＴＣＲを分類することにおいて有用であり、それは、患者にわたって共有される抗原を認識する臨床候補ＴＣＲの同定を可能にする。
【００１０】
一部の実施形態において、がん、例えば結腸直腸癌に対するワクチン接種のための方法が提供され、当該方法は、有効用量のワクチン組成物を投与することを含み、当該組成物は、本明細書において同定されるペプチド、ペプチドの組み合わせ、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０種またはそれを上回る種類の個別のペプチド、ペプチドとＭＨ
Ｃタンパク質の少なくとも一部との複合体、本明細書において同定される抗原ペプチドに応答するように刺激されている自家または同種異系Ｔ細胞、本明細書において同定される抗原ペプチドをコードする核酸、及び任意で、ワクチンアジュバントを含み得る薬学的に許容される賦形剤、を含み得る。ペプチドワクチン接種ストラテジーを用いて、例えば本明細書において提供される合成ペプチドで、免疫応答を初めにプライムし得、その後に、対応する公知の野生型抗原または野生型総タンパク質でのブーストが続き得る。
【００１１】
規定のペプチドは、個々のＴ細胞受容体の認識形状を同定するために用いられる酵母ディスプレイによりペプチド−ＭＨＣライブラリーをスクリーニングすることによって同定される。スクリーニング法は、複数のペプチドライブラリーを同時にスクリーニングする、例えば２、３、４つ、またはそれを上回る数のライブラリーを同時にスクリーニングする多重方法において利用され得る。多重化により、抗原発見の効率の改善が可能となる。各ライブラリーは、同定を可能にする固有のエピトープタグ、例えば抗体によって標的化可能なエピトープを含み得、ＤＮＡバーコード、タンパク質バーコード等を含み得る。エピトープタグを利用する各ライブラリーは別個に作り出され、多様性は、例えば成長プレート上での初回ライブラリーの限界希釈からのコロニーカウントに基づいて算出された。ライブラリー選択のためにＴ細胞受容体をプールすることにより、選択、例えばペプチド配列、ペプチド長、種々のＭＨＣまたはＨＬＡアレルのコレクション等をさらに多重化し得る。選択に関して、各バーコード、エピトープタグ等は、ペプチド特異的富化のレベルを検出する抗エピトープタグ染色を介してモニターされ得る。統計アルゴリズム及び機械学習アルゴリズムが同定に用いられ得る。
【００１２】
一部の実施形態において、がん抗原に応答性があるＴ細胞受容体の配列が提供される。Ｔ細胞受容体配列には、限定されることなく、任意で配列番号：２５９または配列番号：２６０のベータ鎖配列と組み合わせた、配列番号：２５８に明示される配列を有するアルファ鎖を有するタンパク質が含まれ得る。これらＴ細胞受容体の結合領域（ＣＤＲ）配列を抗体フレームワークにグラフトして、ＴＣＲ様抗体を提供し得る。Ｔ細胞受容体は、適応性がありかつ患者ごとにしばしば固有であるため、個々のＴ細胞受容体配列は患者間で異なり得る。これらの差異にもかかわらず、異なるＴＣＲは、同じ標的をなおも認識し得る。ゆえに、異なるＴ細胞受容体は、同じ標的に結合し得るこれらＴ細胞受容体からのわずかな配列変動を有し得る。加えて、Ｔ細胞受容体を、同じ抗原への結合を可能にするアミノ酸置換を導入するように改変し得る。そのような事例には、特異的標的に対するＴ細胞受容体の親和性成熟、またはＴ細胞受容体のその標的に対する特異性を改善する受容体改変が含まれる。Ｔ細胞受容体の認識部分は、治療用試薬として用いられる対象となる他のタンパク質足場にグラフトされ得る。Ｔ細胞受容体はやや交差反応性であるため、合成ペプチドのリストは網羅的ではない。ペプチド配列のわずかな改変は、Ｔ細胞刺激をなおももたらし得る。
【００１３】
一部の実施形態において、スクリーニングのためのＴＣＲ配列が獲得されるＴ細胞は、腫瘍部位から単離され、限定されることなく腫瘍浸潤Ｔ細胞（ＴＩＬ）を含み得る。他の実施形態において、Ｔ細胞は、感染症、例えば細菌、ウイルス、原生動物等の感染症に応答性がある個体から獲得される。他の実施形態において、Ｔ細胞はグラフトレシピエントから獲得され、グラフトの部位から単離され得る。
【００１４】
本発明は、添付の図面と合わせて読んだ場合、以下の詳細な説明から最もよく理解される。特許または出願ファイルは、カラーで示される少なくとも１つの図面を含有する。一般的な慣行に従い、図面の様々な特徴は、一定の比率に縮小しているわけではない。それどころか、様々な特徴の寸法は、明確性のために任意で拡大されているまたは縮小されている。以下の図が図面に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１−１】ペプチド−ＨＬＡ−Ａ* ０２：０１酵母ディスプレイライブラリーの設計を示す。Ａにて、ｐＨＬＡの酵母ディスプレイライブラリーを選択するための方法論を示す。各酵母は、遺伝子コードされる固有のペプチドを呈示する。典型的なライブラリーは、関心対象のＴＣＲによって選択される約１０8 種の固有のペプチドを含有する。酵母を、ビーズ多量体化ＴＣＲを用いたアフィニティーに基づく選択において富化し、反復ラウンドの選択のために成長させる。ペプチドを連続的に富化し、全酵母ＤＮＡをディープシーケンスする。これらの合成ペプチド配列を用いて、ヒトプロテオーム及び／または患者特異的エクソームに由来するＴＣＲリガンドについて予測するモデルを作り出す。Ｂにて、調査の目標は、酵母ディスプレイ選択を用いて、未知の抗原特異性のＴＣＲを脱オーファン化することである。酵母ディスプレイ選択からＴＣＲによって選択されたペプチドは、特定のＴＣＲに対する認識形状を作り出し、次いでそれを用いて、オーファンＴＣＲに対する抗原特異性を予測する。予測された標的は、Ｔ細胞刺激アッセイにおいて検証され得る。Ｃにて、構築物は一本鎖設計を利用して、エピトープタグと酵母上の天然Ａｇａ１タンパク質に結合するＡｇａ２ｐとにつながれたｐＨＬＡ−Ａ* ０２：０１複合体を呈示する。各構成要素は、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーによって共有結合で接続されている。エピトープタグを導入して、ライブラリーの発現をモニターする。Ｄにて、オレンジの矢印で２つのペプチドアンカーを強調したＭＡＲＴ−１／ＨＬＡ−Ａ* ０２複合体構造（ＰＤＢ  ４Ｌ３Ｅ）を示す。ペプチドのＰ２及びＰΩにおけるこれらのペプチド箇所は、ＨＬＡ−Ａ* ０２へのペプチド結合を可能にする。
【図１−２】ペプチド−ＨＬＡ−Ａ* ０２：０１酵母ディスプレイライブラリーの設計を示す。Ｅにて、例としての８ｍｅｒペプチドライブラリーは、ＨＬＡ−Ａ* ０２：０１ライブラリー、及び２０種のアミノ酸のいずれかにランダム化される残りの箇所に対するアンカー選好性を示している（Ｘ＝２０種のアミノ酸及び終止コドン）。コドン使用法のためのヌクレオチド略語は、ＩＵＰＡＣヌクレオチドコードに従って記入されている。Ｆにて、ＨＬＡ−Ａ* ０２：０１によって提示される最もよく見られる長さのペプチドを捉えるように設計された複数の長さのライブラリーを示す。各ペプチド長を、選択モニタリングのために固有のエピトープタグを用いた構築物内に置く。ライブラリーは、ペプチド長及びライブラリー組成によって決定付けられる理論的ヌクレオチド多様性を有する。機能的多様性は、ライブラリーの限界希釈後の酵母コロニーカウントに基づく物理的ライブラリーの真の能力を表す。
【図２】ＤＭＦ５  ＴＣＲを用いたＨＬＡ−Ａ* ０２：０１ライブラリーの検証を示す。Ａにて、酵母の表面上のＨＬＡ−Ａ* ０２：０１と複合して、ＭＡＲＴ−１ペプチド（ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ）（配列番号：２６４）を呈示するＤＭＦ５  ＴＣＲ系統酵母を示す。ストレプトアビジン−６４７（ＳＡ−６４７）を用いて、ＤＭＦ５  ＴＣＲを四量体化し及び蛍光標識した。Ｂにて、フローサイトメトリーによる抗ＨＡエピトープタグ染色によって測定されるＤＭＦ５  ＴＣＲによる、１０ｍｅｒ長のＨＬＡ−Ａ* ０２：０１酵母ディスプレイライブラリーの富化を示す。選択の４つのラウンドのうちの３つが示されている。Ｃにて、ＤＭＦ５  ＴＣＲによる１０ｍｅｒ選択からシーケンスされた高度に富化されたペプチドが、ＤＭＦ５  ＴＣＲ四量体によって染色され、フローサイトメトリーによって測定されている。（Ｃにおける左から右への配列：配列番号：２６４、３２４、２８６、３２３、２８３、２８５）。Ｄにて、ＤＭＦ５  ＴＣＲによる１０ｍｅｒのＨＬＡ−Ａ* ０２：０１ライブラリー選択のラウンド３のディープシーケンシングに従った、上位１０種のペプチドの総シーケンシングリードカウントについての割合を示す。（Ｄにおける上から下への配列：配列番号：２８７、３２６、３２５、３２４、２８６、３２３、２８５、３２２、２８４、２８３）。Ｅにて、選択のラウンド３からの固有のペプチドは、野生型ＭＡＲＴ−１ペプチド配列（配列番号：２６７）と類似しているように見える２つの主要なクラスターに入る。選択のラウンド３に存在するすべてのペプチド間の逆ハミング距離をまず算出し、次いでスコアによってクラスター化することによって、クラスターを決定する。ＭＡＲＴ−１十量体構造（ＰＤＢ：４Ｌ３Ｅ）が、選択されたペプチドにアラインされている。Ｆにて、クラスター１ペプチドを用いた置換行列（２０１４ＰＷＭ）は、他の８種の予測ペプチドの中で、ＭＡＲＴ−１ペプチドをＤＭＦ５  ＴＣＲに結合する最も可能性が高いペプチドとして予測する。（Ｆにおける上から下への配列：配列番号：３２１、３２０、３１９、３１８、３１７、３１６、３１５、３１４、２６７）。
【図３−１】新抗原特異的ＴＣＲによるＨＬＡ−Ａ* ０２：０１ライブラリーのブラインド検証を示す。Ａにて、ブラインド特異性の３種のＴＣＲは、選択のラウンドにわたるエピトープタグ染色に従い、特異的ペプチド長に対するＨＬＡ−Ａ* ０２：０１ライブラリーを別個に富化する。左のパネルは、選択の全４ラウンドが完了した後の四量体及びエピトープ染色を示し、右のパネルは、選択の過程を通じたエピトープ染色を示す。
【図３−２】新抗原特異的ＴＣＲによるＨＬＡ−Ａ* ０２：０１ライブラリーのブラインド検証を示す。Ｂにて、選択のラウンド３においてＮＫＩ２によって選択された固有のペプチドを、ペプチド長によって解析し、逆ハミング距離によってクラスター化する。クラスターにおいて同定されたペプチドの数が、それぞれのペプチド長とともに右側に示されている。
【図３−３】新抗原特異的ＴＣＲによるＨＬＡ−Ａ* ０２：０１ライブラリーのブラインド検証を示す。Ｃにて、ラウンド３におけるＮＫＩ２による選択されたペプチドのあらゆる１０ｍｅｒと、１２７種の全新抗原のリストからの各１０ｍｅｒ新抗原ペプチドとの間で計算された最大逆ハミング距離を示す。（Ｃにおける上から下への配列：配列番号：５０１、５０２、６２０、５０３〜５１９）。Ｄにて、選択されたライブラリーからの２種のペプチドＬｉｂ−１（配列番号：４３４）及びＬｉｂ−２（配列番号：２６９）は、ＣＤＫ４に由来する１０ｍｅｒの新抗原ペプチドＡＬＤＰＨＳＧＨＦＶ（配列番号：２６５）に酷似している。新抗原との同一アミノ酸が赤で色付けされている。Ｅにて、ＮＫＩ２  ＴＣＲによって選択された長さ１０の上位５種のペプチドを用いて、両方ともＣＤＫ４新抗原ＡＬＤＰＨＳＧＨＦＶ（配列番号：２６５）に特異的であるＴＣＲ  ＮＫＩ１またはＮＫＩ２を発現するように形質導入された末梢血リンパ球を刺激した。形質導入されたリンパ球を、ペプチド、対照ペプチド、またはペプチドなしでパルスされたＪＹ細胞と１：１で混合し、細胞内抗体染色によって測定されるＩＦＮγ産生をフローサイトメトリーを用いて査定した。（Ｅにおける上から下への配列：１）配列番号：２６９、２）配列番号：４２７、３）配列番号：４２３、４）配列番号：４２０、５）配列番号：４１７）。
【図４−１】結腸直腸腺癌を有する２人のＨＬＡ−Ａ* ０２患者において同定されたＴＣＲのプロファイリングを示す。Ａにて、要約された結果と合わせた、ＨＬＡ−Ａ* ０２：０１ライブラリーで患者由来ＴＣＲを脱オーファン化する調査設計を示す。Ｂにて、ＴＩＬ由来の固有の対合したαβＴＣＲ配列の存在量についての棒グラフを示す。＊＝ライブラリーからペプチドを富化したＴＣＲである。
【図４−２】結腸直腸腺癌を有する２人のＨＬＡ−Ａ* ０２患者において同定されたＴＣＲのプロファイリングを示す。Ｃにて、各患者に対する、腫瘍及び健常組織間の個々の固有のＣＤＲ３αまたはＣＤＲ３β鎖配列の重複を表したベン図を示す。数字は、ベン図の最も近い区域におけるＣＤＲ３配列の量を示す。Ｄにて、増幅されかつバーコード化された転写産物のシーケンシングを用いて、転写因子のバイナリ測定を同定したヒートマップを示す。交互の黒及び白のパネルは、単一Ｔ細胞クローンと同じ受容体配列との境界を示し、最も豊富なクローンが最も左側から始まる。左のパネルは、スクリーニングされる対象となる患者Ａから選定されたＴＣＲを有するそうしたＴ細胞を同定し、緑は転写産物の存在を意味する。右のパネルは、スクリーニングされる対象となる患者Ｂから選定されたＴＣＲを有するそうしたＴ細胞を同定し、青は転写産物の存在を意味する。白は、検出された転写産物がないことを示す。ＴＣＲ  １Ａ、２Ａ、３Ｂ、及び４Ｂがラベルされている。
【図５−１】４種のＴＩＬ由来ＴＣＲは、ペプチドに対するＨＬＡ−Ａ* ０２：０１ライブラリーを富化することを示す。Ａにて、ＨＬＡ−Ａ* ０２：０１ライブラリーからペプチドを選択した４種のオーファンＴＣＲのＴＣＲ配列を示す。ＴＣＲ遺伝子セグメント可変及び接合が、対応するＣＤＲ３配列とともに示されている。存在量は、単一細胞が腫瘍／健常組織において精確なＴＣＲ配列を有することが見い出された回数の量を表す。（Ａにおける配列：１Ａ  ＣＤＲ３α：（配列番号：４７２）、２Ａ  ＣＤＲ３α：（配列番号：２６１）、３Ｂ  ＣＤＲ３α：（配列番号：２６１）、４Ｂ  ＣＤＲ３α：（配列番号：４９５）、１Ａ  ＣＤＲ３β：（配列番号：４６３）、２Ａ  ＣＤＲ３β：（配列番号：２６２）、３Ｂ  ＣＤＲ３β：（配列番号：２６３）、４Ｂ  ＣＤＲ３β：（配列番号：４８４））。Ｂにて、患者Ａ及びＢから単離された２種の配列類似ＴＣＲのヌクレオチド配列を示す。非コードヌクレオチドは赤で強調されている。（Ｂにおけるアミノ酸配列：ＣＤＲ３α  ２Ａ：（配列番号：２６１）、ＣＤＲ３α  ３Ｂ：（配列番号：２６１）、ＣＤＲ３β  ２Ａ：（配列番号：２６２）、ＣＤＲ３β  ３Ｂ：（配列番号：２６３））、ヌクレオチド配列：ＣＤＲ３α  ２Ａヌクレオチド配列：（配列番号：５３６）、ＣＤＲ３α  ３Ｂヌクレオチド配列：（配列番号：５３７）、ＣＤＲ３β  ２Ａヌクレオチド配列：（配列番号：５３８）、ＣＤＲ３β  ３Ｂヌクレオチド配列：（配列番号：５３９）。
【図５−２】４種のＴＩＬ由来ＴＣＲは、ペプチドに対するＨＬＡ−Ａ* ０２：０１ライブラリーを富化することを示す。Ｃにて、フローサイトメトリーによって測定される、４種のオーファンＴＣＲによる選択のラウンドごとのＨＬＡ富化及び四量体染色を示す。左のパネルは、選択の全４ラウンドが完了した後の四量体及びエピトープ染色を示し、右のパネルは、選択の過程を通じたエピトープ染色を示す。
【図５−３】４種のＴＩＬ由来ＴＣＲは、ペプチドに対するＨＬＡ−Ａ* ０２：０１ライブラリーを富化することを示す。Ｃ（続）にて、フローサイトメトリーによって測定される、４種のオーファンＴＣＲによる選択のラウンドごとのＨＬＡ富化及び四量体染色を示す。左のパネルは、選択の全４ラウンドが完了した後の四量体及びエピトープ染色を示し、右のパネルは、選択の過程を通じたエピトープ染色を示す。
【図６】４種のＴＩＬ  ＴＣＲによる酵母選択のディープシーケンシング結果を示す。Ａにて、単語ロゴは、各ＴＣＲに対するラウンド３で選択された固有のペプチドを呈示しており、ディープシーケンシングリードカウント存在量を説明するわけではない。アミノ酸文字のサイズは、固有のペプチドの中での所定の箇所におけるその比例する存在量を表す。Ｂにて、選択のラウンド３におけるペプチド富化を説明する、ペプチドの箇所あたりのアミノ酸組成を示したヒートマッププロットを示す。より暗い色は、所定の箇所における所定のアミノ酸のより大きな存在量を示す。アンカー残基は黒で輪郭が描かれている。Ｃにて、ＴＣＲ  ２Ａ及び３Ｂは、ラウンド３における総リードについての割合として示される、選択のラウンド３における１１種のペプチドの重複するセットを選択する。（Ｃにおける上から下への配列：配列番号：９５、２４９、５４、１９５、４２、１９１、１９６、１９８、２００、２０１、４）。
【図７−１】予測されたヒト標的及びペプチドミモトープを用いたＴＩＬ  ＴＣＲの活性化を示す。。ＴＣＲを、ＣＤ８+ ＳＫＷ−３細胞にレトロウイルスにより感染させ、安定したＴＣＲ（ＩＰ２６）及びＣＤ３（ＵＣＨＴ１）共発現について選別する。Ｔ２抗原提示細胞を１００μＭペプチドで３時間パルスし、Ｔ細胞株とともに１８時間共インキュベートし、フローサイトメトリーによってＣＤ６９発現について分析する。ＴＣＲ１Ａ（Ａ）及びＴＣＲ２Ａ（Ｃ）を、ペプチド刺激によるＣＤ６９活性化について技術的三つ組で試験し、標準偏差が示されている。生物学的三つ組から代表的実験が示されている。（Ａにおける左から右への配列：配列番号：５４０〜５５５、Ｃにおける配列番号：５５６〜５７４）。Ｂ、Ｄにて、平均の標準誤差とともに生物学的三つ組の平均をプロットされた、各刺激性ペプチドに関する用量応答曲線が右側に示されている。両実験に関して、ｐ値は、普通の一元配置ＡＮＯＶＡを用いて算出されている。ＴＣＲ２Ａ及び３Ｂに関して、簡潔性のために、１７種の非刺激性ペプチドは除去されている。（Ｂにおける上から下への配列：配列番号：５４０〜５４３、Ｄにおける上から下への配列：５５６〜５５８、５６０、５６２〜５６７）。
【図７−２】予測されたヒト標的及びペプチドミモトープを用いたＴＩＬ  ＴＣＲの活性化を示す。。ＴＣＲを、ＣＤ８+ ＳＫＷ−３細胞にレトロウイルスにより感染させ、安定したＴＣＲ（ＩＰ２６）及びＣＤ３（ＵＣＨＴ１）共発現について選別する。Ｔ２抗原提示細胞を１００μＭペプチドで３時間パルスし、Ｔ細胞株とともに１８時間共インキュベートし、フローサイトメトリーによってＣＤ６９発現について分析する。ＴＣＲ３Ｂ（Ｅ）及びＴＣＲ４Ｂ（Ｇ）を、ペプチド刺激によるＣＤ６９活性化について技術的三つ組で試験し、標準偏差が示されている。生物学的三つ組から代表的実験が示されている。（Ｅにおける左から右への配列：配列番号：５５６〜５７４、Ｇにおける配列番号：５９６〜６１９）。Ｆ、Ｈにて、平均の標準誤差とともに生物学的三つ組の平均をプロットされた、各刺激性ペプチドに関する用量応答曲線が右側に示されている。両実験に関して、ｐ値は、普通の一元配置ＡＮＯＶＡを用いて算出されている。ＴＣＲ２Ａ及び３Ｂに関して、簡潔性のために、１７種の非刺激性ペプチドは除去されている。（Ｆにおける上から下への配列：配列番号：４１、４２、１９３、１９４、１９５、２５７、Ｈにおける上から下への配列：５９６〜６０２、６０４、６０８、６１０、６１３、６１５）。
【図８】ＤＭＦ５  ＴＣＲを用いたＨＬＡ−Ａ２* ０１ライブラリーの検証を示す。Ａにて、ＤＭＦ５  ＴＣＲ野生型ペプチドまたはペプチドミモトープとの正しくフォールディングされたＨＬＡ−Ａ* ０２：０１複合体に対するＭＡ２．１抗体染色を示す。ヒストグラムは、ＭＡ２．１抗体、それに続く二次抗体による染色を示している。（Ａにおける左から右への配列：配列番号：２６４、３２４、２８６、３２３、２８３、２８５）。Ｂにて、ＤＭＦ５  ＴＣＲ  １０ｍｅｒ選択に対するラウンド３配列のクラスター２に対して２０１４ＰＷＭアルゴリズムを用いた、予測されたヒトペプチドのスコアを示す。Ｃにて、８Ｂにおいて同定された上位１０種のペプチドのスコアを示す。（Ｃにおける上から下への配列：配列番号：３６４、３６３、３６２、３６１、３６０、３５９、３５８、３５７、３５６、３５５）。
【図９−１】患者組織免疫組織化学、ならびにＴＣＲレパートリーのシーケンシング及び表現型判定を示す。Ａにて、Ｈ＆Ｅ染色、抗ＣＤ４／ヘマトキシリン、または抗ＣＤ８／ヘマトキシリンを用いた患者免疫組織化学を示す。すべての代表的画像は、３００×倍率を用いて撮影されている。Ｂにて、ＣｙｓからＰｈｅまで測定される患者ＣＤＲ３の長さを示す。
【図９−２】患者組織免疫組織化学、ならびにＴＣＲレパートリーのシーケンシング及び表現型判定を示す。Ｃにて、健常及び腫瘍組織におけるＴＣＲ可変α遺伝子の患者分布を示す。
【図９−３】患者組織免疫組織化学、ならびにＴＣＲレパートリーのシーケンシング及び表現型判定を示す。Ｄにて、健常及び腫瘍組織におけるＴＣＲ可変β遺伝子の患者分布を示す。
【図９−４】患者組織免疫組織化学、ならびにＴＣＲレパートリーのシーケンシング及び表現型判定を示す。Ｅにて、転写産物シーケンシングによる転写プロファイリングを示す（患者Ｂ  Ｔ細胞のｔ−ＳＮＥプロット（左）、及びフローサイトメトリーによる細胞表面マーカーのｔ−ＳＮＥプロット（右））。転写産物の存在は、ディープシーケンシングリードに基づくバイナリ（１＝はい、０＝いいえ）であり、強度は細胞表面マーカーのＭＦＩに関連している。
【図１０】ヒトペプチド特異性を予測する、機械学習アルゴリズム２０１７ＤＬの設計を示す。Ａは、酵母ディスプレイライブラリー選択からのデータを取り出して、機械学習モデルを訓練し、それがＵｎｉｐｒｏｔデータベースまたは患者特異的エクソームからのタンパク質に由来するペプチドを採点する工程を示した略図である。モデルは、ペプチドあたりのディープシーケンシングラウンドカウント及びペプチドの組成を利用した酵母ディスプレイ選択データから作り出されている。指数曲線を各ペプチドにフィットさせて、適合度関数を用いて選択のラウンドにわたる富化を捉える。Ｂにて、ＴＣＲによって選択されたペプチドに対するディープシーケンシングラウンドカウントに指数曲線をフィットさせるための適合度関数を示す。Ｃにて、各アミノ酸がｏｎｅ−ｈｏｔベクトルとして表される、例としてのペプチドの行列表現を示す。Ｄにて、二層畳み込みニューラルネットワークを利用した機械学習アルゴリズムのアーキテクチャーを示す。入力は、ｏｎｅ−ｈｏｔベクトルのベクトルとして表されるペプチド配列、及び適合度関数から決定されるペプチドの適合度スコアからなる。出力は適合度スコアである。
【図１１−１】ＣＤ６９  ＭＦＩ中央値、及び予測されたペプチド標的を発現する酵母のＴＣＲ四量体染色に従った、ＳＫＷ−３細胞の活性化を示す。図７からのデータが分析されているが、Ａ及びＢに関しては、ＣＤ６９発現が陽性の細胞パーセントの代わりに、ＣＤ６９発現の平均蛍光強度を用いている。ＴＣＲ（Ａ）１Ａまたは（Ｂ）２Ａを有するＳＫＷ−３  Ｔ細胞を、図７におけるように、ペプチドパルスされたＴ２抗原提示細胞とともに共培養した。平均蛍光強度を、ＣＤ３でゲートをかけたＳＫＷ−３細胞の抗ＣＤ６９染色から技術的三つ組で測定し、平均値及び標準偏差が示されている。生物学的三つ組からの代表的実験が示されている。ｐ値を、普通の一元配置ＡＮＯＶＡを用いて測定した。（Ａにおける上から下への配列：配列番号：５４０〜５４２）
【図１１−２】ＣＤ６９  ＭＦＩ中央値、及び予測されたペプチド標的を発現する酵母のＴＣＲ四量体染色に従った、ＳＫＷ−３細胞の活性化を示す。図７からのデータが分析されているが、Ｃ及びＤに関しては、ＣＤ６９発現が陽性の細胞パーセントの代わりに、ＣＤ６９発現の平均蛍光強度を用いている。ＴＣＲ（Ｃ）３Ｂまたは（Ｄ）４Ｂを有するＳＫＷ−３  Ｔ細胞を、図７におけるように、ペプチドパルスされたＴ２抗原提示細胞とともに共培養した。平均蛍光強度を、ＣＤ３でゲートをかけたＳＫＷ−３細胞の抗ＣＤ６９染色から技術的三つ組で測定し、平均値及び標準偏差が示されている。生物学的三つ組からの代表的実験が示されている。ｐ値を、普通の一元配置ＡＮＯＶＡを用いて測定した。
【図１１−３】ＣＤ６９  ＭＦＩ中央値、及び予測されたペプチド標的を発現する酵母のＴＣＲ四量体染色に従った、ＳＫＷ−３細胞の活性化を示す。ＴＣＲ（Ｅ）１Ａ及び（Ｆ）２Ａに対するライブラリーペプチド及び予測された標的ペプチドの一本鎖三量体を発現する酵母を、４００ｎＭ  ＴＣＲ四量体で染色した。四量体陰性集団は、ストレプトアビジン−６４７のみで染色される。すべての酵母は、エピトープタグ陽性酵母に対してゲートをかけられている。
【図１１−４】ＣＤ６９  ＭＦＩ中央値、及び予測されたペプチド標的を発現する酵母のＴＣＲ四量体染色に従った、ＳＫＷ−３細胞の活性化を示す。ＴＣＲ（Ｇ）３Ｂ及び（Ｈ）４Ｂに対するライブラリーペプチド及び予測された標的ペプチドの一本鎖三量体を発現する酵母を、４００ｎＭ  ＴＣＲ四量体で染色した。四量体陰性集団は、ストレプトアビジン−６４７のみで染色される。すべての酵母は、エピトープタグ陽性酵母に対してゲートをかけられている。
【図１２−１】Ｕ２ＡＦ２定量ＲＮＡ発現、及びＵ２ＡＦ２ペプチドに対するアフィニティー測定を示す。Ａにて、１８Ｓをハウスキーピング遺伝子として用いた、患者Ａ及びＢにおける健常組織と比べた腫瘍のＵ２ＡＦ２転写産物発現についての定量ＰＣＲ発現を示す。サンプルは技術的四つ組でなされ、標準偏差が示されている。Ｂにて、１８Ｓをハウスキーピング遺伝子として用いた、患者Ａ健常組織におけるＵ２ＡＦ２  ＲＮＡ発現と比較した、様々なヒト由来腫瘍におけるＵ２ＡＦ２  ＲＮＡについての２を底とする対数の定量ＰＣＲ発現を示す。サンプルは技術的四つ組でなされ、標準偏差が示されている。示される細胞株は、適当な順序で方法の節において挙げられている。
【図１２−２】Ｕ２ＡＦ２定量ＲＮＡ発現、及びＵ２ＡＦ２ペプチドに対するアフィニティー測定を示す。Ｃにて、１８Ｓをハウスキーピング遺伝子として用いた、患者Ｂ健常組織におけるＵ２ＡＦ２  ＲＮＡ発現と比較した、様々なヒト由来腫瘍におけるＵ２ＡＦ２  ＲＮＡについての２を底とする対数の定量ＰＣＲ発現を示す。サンプルは技術的四つ組でなされ、標準偏差が示されている。示される細胞株は、適当な順序で方法の節において挙げられている。Ｄにて、２倍希釈を用いた９３．６μＭ〜０．３６５μＭの範囲で、ＭＭＤＦＦＮＡＱＭ−ＨＬＡ−Ａ* ０２：０１（配列番号：２６６）をコーティングされたチップの上を流れる増加する濃度のＴＣＲ２Ａについての表面プラズモン共鳴トレースを示す。フローセル差し引きにより生じたペプチド−ＨＬＡ−Ａ* ０２へのＴＣＲの会合の前及び後のピークは、簡潔性のために除去されている。濃度をラベルされた色付きの曲線のみを用いて、Ｋd を算出している。Ｅにて、図４ＤにおいてラベルされたＴＣＲの様々な濃度で生み出されたデータ点への曲線適合を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明をさらに記載する前に、本発明は、特定の実施形態の変形が行われ得、かつ添付の特許請求の範囲の内になおも入り得ることから、以下で記載される本発明の特定の実施形態に限定されるわけではないことが理解されるべきである。採用される技術用語は、特定の実施形態を記載する目的のためのものであり、限定することを意図されるわけではないことも理解されるべきである。本明細書及び添付の特許請求の範囲において、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」という単数形態は、文脈上はっきりと別様に述べられていない限り、複数の指示対象を含む。
【００１７】
値の値域が提供される場合、その値域の上限と下限との間にある、文脈上はっきりと別様に述べられていない限りは下限の単位の１０分の１までの各介在値、及びその記述される値域における他の任意の記述される値または介在値は、本発明の内に包含されると理解される。これらのより小さな値域の上限及び下限は、当該より小さな値域内に独立して含まれ得、記述される値域において具体的に除外される任意の限度次第で、本発明の内にも包含される。記述される値域が限度の一方または両方を含む場合、そうした含まれる限度のいずれかまたは両方を除外する値域も本発明に含まれる。
【００１８】
別様に定義されていない限り、本明細書において用いられるすべての技術的及び科学的な用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書において記載されるものと類似のまたは同等の任意の方法、機器、及び材料が、本発明の実践または試験において用いられ得るものの、例示的な方法、機器、及び材料がここで記載される。
【００１９】
本明細書において言及されるすべての刊行物は、当該刊行物に記載されている本発明の主題構成要素を記載する及び開示する目的のために参照により本明細書に組み入れられ、その構成要素は、以下に記載される発明と関連して用いられ得る。
【００２０】
本発明は、本発明の実践のための好ましい様態を含むように、本発明者によって見い出されたまたは提案された特定の実施形態の観点から記載されている。本開示に照らして、本発明の意図される範囲から逸脱することなく、例示される特定の実施形態において数々の改変及び変化が加えられ得ることは、当業者によって解される。例えば、コドン冗長性により、タンパク質配列に影響を及ぼすことなく、根本的なＤＮＡ配列において変化が加えられ得る。さらに、生物学的な機能等価性の考察により、種類または量における生物学的作用に影響を及ぼすことなく、タンパク質構造において変化が加えられ得る。すべてのそのような改変は、添付の特許請求の範囲の内に含まれることが意図される。
【００２１】
スクリーニング法。主要組織適合性複合体タンパク質の結合ドメイン、及び多様なペプチドリガンドを含む一本鎖ポリペプチドのライブラリーを作り出すことによって、抗原配列を発見した。ライブラリーを、コードされたポリペプチドを発現する適切な宿主細胞内に導入し、その宿主細胞には、限定されることなく酵母細胞が含まれる。関心対象のＴＣＲを多量体化して結合を増強し、それを用いて、Ｔ細胞受容体に結合するそうした一本鎖ポリペプチドを発現する宿主細胞を選択する。選択集団がバックグラウンドを上回るシグナルを有するまで、反復ラウンドの選択が実施され、すなわち第一のラウンドにおいて選択される細胞は、第二のラウンドのための開始集団を提供する等、通常では少なくとも３ラウンド及びより通常では少なくとも４ラウンドの選択が実施される。一本鎖ポリペプチ
ドのライブラリーからの最終選択集団をコードするポリヌクレオチドは、ハイスループットシーケンシングに供される。ペプチドリガンドの選択されたセットは、残基、例えばＴＣＲに接触する残基においてアミノ酸の制限された選定を呈し、その情報はアルゴリズムに入力され得、それを用いて、結合の基準を満たすすべてのペプチドについて公共データベースを分析し得、それは、これらの基準を満たす一連のペプチドを提供する。
【００２２】
ペプチドリガンドは、長さが約８〜約２０アミノ酸、通常では約８〜約１８アミノ酸、約８〜約１６アミノ酸、約８〜約１４アミノ酸、約８〜約１２アミノ酸、約１０〜約１４アミノ酸、約１０〜約１２アミノ酸である。完全にランダムなライブラリーは、膨大な数の考え得る組み合わせとなることが解される。好ましい方法において、多様性は、ペプチドをＭＨＣ結合ドメインにアンカーする残基においては限定され、それは本明細書においてＭＨＣアンカー残基と呼ばれる。ペプチドにおけるアンカー残基の箇所は、特異的ＭＨＣ結合ドメインによって決定される。クラスＩ結合ドメインは、Ｐ２箇所において及び最後の接触残基においてアンカー残基を有し得る。クラスＩＩ結合ドメインは、Ｐ１において、及びアレルに応じてＰ４、Ｐ６、またはＰ９のうちの１箇所においてアンカー残基を有する。例えば、ＩＥk に対するアンカー残基は、Ｐ１｛Ｉ、Ｌ、Ｖ｝及びＰ９｛Ｋ｝であり、ＨＬＡ−ＤＲ１５に対するアンカー残基は、Ｐ１｛Ｉ、Ｌ、Ｖ｝及びＰ４｛Ｆ、Ｙ｝である。ＤＲアレルに対するアンカー残基はＰ１において共有され、Ｐ４、Ｐ６、Ｐ７、及び／またはＰ９においてアレル特異的アンカー残基を有する。
【００２３】
一部の実施形態において、主要組織適合性複合体タンパク質の結合ドメインは、クラスＩＩアルファ及びベータ鎖の可溶性ドメインである。一部のそのような実施形態において、結合ドメインを突然変異誘発に供し、ペプチド結合接触を変更することなく一本鎖ポリペプチドの可溶性を増強するアミノ酸変化について選択する。ある特定の具体的な実施形態において、結合ドメインは、アミノ酸変化｛Ｍ３６Ｌ、Ｖ１３２Ｍ｝のセットを含むＨＬＡ−ＤＲ４α、及びアミノ酸変化｛Ｈ６２Ｎ、Ｄ７２Ｅ｝のセットを含むＨＬＡ−ＤＲ４βである。ある特定の具体的な実施形態において、結合ドメインは、アミノ酸変化｛Ｆ１２Ｓ、Ｍ２３Ｋ｝のセットを含むＨＬＡ−ＤＲ１５α、及びアミノ酸変化｛Ｐ１１Ｓ｝を含むＨＬＡ−ＤＲ１５βである。ある特定の具体的な実施形態において、結合ドメインは、アミノ酸変化｛Ｉ８Ｔ、Ｆ１２Ｓ、Ｌ１４Ｔ、Ａ５６Ｖ｝のセットを含むＨ２  ＩＥk α、及びアミノ酸変化｛Ｗ６Ｓ、Ｌ８Ｔ、Ｌ３４Ｓ｝のセットを含むＨ２  ＩＥk βである。
【００２４】
一部の実施形態において、主要組織適合性複合体タンパク質の結合ドメインは、クラスＩ  ＭＨＣタンパク質のアルファ１及びアルファ２ドメインを含み、それはβ２ミクログロブリンとともに一本鎖で提供される。一部のそのような実施形態において、クラスＩタンパク質を突然変異誘発に供し、ペプチド結合接触を変更することなく一本鎖ポリペプチドの可溶性を増強するアミノ酸変化について選択する。ある特定の具体的な実施形態において、結合ドメインは、アミノ酸変化｛Ｙ８４Ａ｝を含むＨＬＡ−Ａ２アルファ１及びアルファ２ドメインである。ある特定の具体的な実施形態において、結合ドメインは、アミノ酸変化｛Ｍ３１Ｒ｝を含むＨ２−Ｌd アルファ１及びアルファ２ドメインである。ある特定の具体的な実施形態において、結合ドメインは、アミノ酸変化｛Ｙ８４Ａ｝を含むＨＬＡ−Ｂ５７アルファ１、アルファ２、及びアルファ３ドメインである。
【００２５】
ペプチドの配列は、ハイスループットシーケンシングの任意の好都合な方法によって決定される。配列は、クラスタリングアルゴリズムを用いて、例えば実施例において開示される方法によって分析され得る。ペプチドを分析して、ヒトタンパク質（Ｕｎｉｐｒｏｔ）または患者特異的エクソームを検索して、スライディングウィンドウを用いて固定長のペプチドを採点し得る。置換行列は、ペプチドの箇所あたりの全アミノ酸の頻度を決定することによって作成される。所定の箇所におけるアミノ酸に対する０．１％頻度のカット
オフを設けて、ノイズを除去し得る。
【００２６】
ペプチドの統計的有意性を判定するために、ヒトプロテオーム及びエクソームペプチドセットを採点する。エクソームペプチドセットに対するｐ値を算出するために、ヒトプロテオームスコアの背景においてパーセンタイルスコアを算出する。非補正ｐ値は１パーセンタイルである。ボンフェローニ補正されたｐ値は、変異体セットにおけるペプチドの数を掛けた非補正ｐ値である。
【００２７】
ＭＨＣタンパク質。主要組織適合性複合体タンパク質（ヒト白血球抗原、ＨＬＡ、またはマウスにおけるＨ２遺伝子座とも称される）は、細胞の表面に発現した、これらの細胞に固有の抗原同一性を付与するタンパク質分子である。ＭＨＣ／ＨＬＡ抗原は、免疫エフェクター細胞のように造血再構成幹細胞の同じ供給源に由来するものとして（「自己」）、または造血再構成細胞の別の供給源に由来するものとして（「非自己」）、Ｔ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞によって認識される標的分子である。ＨＬＡ抗原の２つの主要なクラスであるＨＬＡクラスＩ及びＨＬＡクラスＩＩが認識される。
【００２８】
本発明のライブラリー及び方法において用いられるＭＨＣタンパク質は、任意の哺乳類または鳥類種、例えば霊長類種、特にヒト、マウス、ラット、及びハムスターを含めた齧歯類、ウサギ、ウマ、ウシ、イヌ、ネコ等由来のものであり得る。特に関心対象は、ヒトＨＬＡタンパク質及びマウスＨ−２タンパク質である。ＨＬＡタンパク質には、クラスＩＩサブユニットのＨＬＡ−ＤＰα、ＨＬＡ−ＤＰβ、ＨＬＡ−ＤＱα、ＨＬＡ−ＤＱβ、ＨＬＡ−ＤＲα、及びＨＬＡ−ＤＲβ、ならびにクラスＩタンパク質のＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、及びβ2 −ミクログロブリンが含まれる。マウスＨ−２サブユニットには、クラスＩのＨ−２Ｋ、Ｈ−２Ｄ、Ｈ−２Ｌ、ならびにクラスＩＩのＩ−Ａα、Ｉ−Ａβ、Ｉ−Ｅα、及びＩ−Ｅβ、ならびにβ2 −ミクログロブリンが含まれる。
【００２９】
ＭＨＣ結合ドメインは、典型的に、通常では膜結合型タンパク質の可溶型である。可溶型は、膜貫通ドメインの欠失によって天然型に由来する。好都合なことに、タンパク質は切り取られ、細胞質ドメイン及び膜貫通ドメインの両方が除去される。一部の実施形態において、主要組織適合性複合体タンパク質の結合ドメインは、クラスＩＩアルファ及びベータ鎖の可溶性ドメインである。一部のそのような実施形態において、結合ドメインを突然変異誘発に供し、ペプチド結合接触を変更することなく一本鎖ポリペプチドの可溶性を増強するアミノ酸変化について選択する。
【００３０】
「アレル」とは、染色体上の特定の遺伝子座における遺伝子の異なる核酸配列のうちの一方である。１つまたは複数の遺伝的差異がアレルを構成し得る。ＨＬＡ遺伝子システムの重要な態様は、その多型である。各遺伝子、ＭＨＣクラスＩ（Ａ、Ｂ、及びＣ）及びＭＨＣクラスＩＩ（ＤＰ、ＤＱ、及びＤＲ）は、異なるアレルに存在する。ＨＬＡアレルに対する現在の命名法は、参照により本明細書に具体的に組み入れられるＭａｒｓｈ  ｅｔ
ａｌ．：Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｆｏｒ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＨＬＡ
ｓｙｓｔｅｍ，２０１０．Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ７５：２９１−４５５によって記載されるように、番号によって指定される。ＨＬＡタンパク質及び核酸配列に関しては、参照により本明細書に具体的に組み入れられるＲｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１），Ｔｈｅ  ＩＭＧＴ／ＨＬＡ  ｄａｔａｂａｓｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３９  Ｓｕｐｐｌ  １：Ｄ１１７１−６を参照されたい。
【００３１】
本明細書において開示される様々なＭＨＣタンパク質及びバリアント上のアミノ酸残基の番号付けは、全長ポリペプチドと一致するようになされている。境界は、例えばＩ−Ｅｋ、Ｈ２−Ｌｄ、及びＨＬＡ−ＤＲ１５を用いて本明細書において例示されるように、「ミニ」ＭＨＣに対するＭＨＣペプチド結合ドメイン（結晶構造を調べることによって判断
される）の末端、ならびにＨＬＡ−Ａ２、−Ｂ５７、及び−ＤＲ４を用いて本明細書において例示されるように、「全長」ＭＨＣに対する、構造及び／または配列によって判断されるベータ２／アルファ２／アルファ３ドメインの末端のいずれかであるように設定された。
【００３２】
一部の実施形態において、構築物のＭＨＣ部分は、配列番号：１〜６のいずれかに描かれるＭＨＣ部分である。ペプチド及びリンカー部分は、提供される配列から変動し得ることが当業者によって理解される。
【００３３】
ＭＨＣ背景。ＭＨＣ分子の機能は、病原体に由来するペプチドフラグメントに結合し、かつ適当なＴ細胞による認識のためにそれらを細胞表面に呈示することである。ゆえに、Ｔ細胞受容体認識は、抗原を提示しているＭＨＣタンパク質によって影響され得る。ＭＨＣ背景という用語は、所定のペプチドが特異的ＭＨＣタンパク質によって提示される場合の、ＴＣＲによる認識を指す。
【００３４】
クラスＩＩ  ＨＬＡ／ＭＨＣ。クラスＩＩ結合ドメインは、一般的に、α鎖に対するα１及びα２ドメイン、ならびにβ鎖に対するβ１及びβ２ドメインを含む。膜貫通ドメインのアミノ酸の多くて約１０個、通常では多くて約５個が含まれ、好ましくはいずれも含まれない。欠失は、それが、α２またはβ２ドメインがペプチドリガンドに結合し得る能力を妨げないようなものである。
【００３５】
一部の実施形態において、主要組織適合性複合体タンパク質の結合ドメインは、クラスＩＩアルファ及びベータ鎖の可溶性ドメインである。一部のそのような実施形態において、結合ドメインを突然変異誘発に供し、ペプチド結合接触を変更することなく一本鎖ポリペプチドの可溶性を増強するアミノ酸変化について選択する。
【００３６】
ある特定の具体的な実施形態において、結合ドメインはＨＬＡ−ＤＲアレルである。ＨＬＡ−ＤＲＡタンパク質は、限定されることなく、ＤＲＡ* ０１：０１：０１：０１、ＤＲＡ* ０１：０１：０１：０２、ＤＲＡ* ０１：０１：０１：０３、ＤＲＡ* ０１：０１：０２、ＤＲＡ* ０１：０２：０１、ＤＲＡ* ０１：０２：０２、及びＤＲＡ* ０１：０２：０３の結合ドメインから選択され得、それは、全長またはミニアレルの背景で提供されるかどうかに応じて、アミノ酸変化｛Ｍ３６Ｌ、Ｖ１３２Ｍ｝または｛Ｆ１２Ｓ、Ｍ２３Ｋ｝を含むように改変され得る。ＨＬＡ−ＤＲＡ結合ドメインは、ＨＬＡ−ＤＲＢ結合ドメインのいずれか１つと結び付けられ得る。
【００３７】
ある特定のそのような実施形態において、ＨＬＡ−ＤＲＡアレルは、ＨＬＡ−ＤＲＢ４アレルの結合ドメインと対合する。ＨＬＡ−ＤＲＢ４アレルは、公的に入手可能なＤＲＢ４アレルから選択され得る。
【００３８】
他のそのような実施形態において、ＨＬＡ−ＤＲＡアレルは、ＨＬＡ−ＤＲＢ１５アレルの結合ドメインと対合する。ＨＬＡ−ＤＲＢ１５アレルは、公的に入手可能なＤＲＢ１５アレルから選択され得る。
【００３９】
他の実施形態において、クラスＩＩ結合ドメインは、Ｈ２タンパク質、例えばＩ−Ａα、Ｉ−Ａβ、Ｉ−Ｅα、及びＩ−Ｅβである。一部のそのような実施形態において、結合ドメインは、アミノ酸変化｛Ｉ８Ｔ、Ｆ１２Ｓ、Ｌ１４Ｔ、Ａ５６Ｖ｝のセットを含み得るＨ２  ＩＥk α、及びアミノ酸変化｛Ｗ６Ｓ、Ｌ８Ｔ、Ｌ３４Ｓ｝のセットを含み得るＨ２  ＩＥk βである。
【００４０】
クラスＩ  ＨＬＡ／ＭＨＣ。クラスＩタンパク質に関して、結合ドメインは、限定され
ることなくＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、Ｈ−２Ｋ、Ｈ−２Ｄ、Ｈ−２Ｌを含めた、クラスＩアレルのα１、α２、及びα３ドメインを含み得、それはβ2 −ミクログロブリンと結び付けられる。膜貫通ドメインのアミノ酸の多くて約１０個、通常では多くて約５個が含まれ、好ましくはいずれも含まれない。欠失は、それが、当該ドメインがペプチドリガンドに結合し得る能力を妨げないようなものである。
【００４１】
ある特定の具体的な実施形態において、結合ドメインは、例えばＡ２タンパク質の少なくともアルファ１及びアルファ２ドメインを含む、ＨＬＡ−Ａ２結合ドメインである。限定されることなくＨＬＡ−Ａ* ０２：０１：０１：０１〜ＨＬＡ−Ａ* ０２：４７８を含めた、多数のアレルがＨＬＡ−Ａ２において同定されており、その配列は、例えばＲｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１），Ｔｈｅ  ＩＭＧＴ／ＨＬＡ  ｄａｔａｂａｓｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３９  Ｓｕｐｐｌ  １：Ｄ１１７１−６において入手可能である。ＨＬＡ−Ａ２アレルバリアントの中で、ＨＬＡ−Ａ* ０２：０１が最も多く見られる。結合ドメインは、アミノ酸変化｛Ｙ８４Ａ｝を含み得る。
【００４２】
ある特定の具体的な実施形態において、結合ドメインは、例えばＢ５７タンパク質の少なくともアルファ１及びアルファ２ドメインを含む、ＨＬＡ−Ｂ５７結合ドメインである。ＨＬＡ−Ｂ５７アレルは、公的に入手可能なＢ５７アレルから選択され得る。
【００４３】
Ｔ細胞受容体とは、ヒトＴＣＲα、β、γ、及びδ鎖を含む、脊椎動物、例えば哺乳類のＴＣＲ遺伝子複合体の抗原／ＭＨＣ結合ヘテロ二量体タンパク質産物を指す。例えば、ヒトβＴＣＲ遺伝子座の完全配列は、Ｒｏｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２（５２６９）：１７５５−１７６２によって公開されているようにシーケンスされており、ヒトαＴＣＲ遺伝子座はシーケンスされ及びリシーケンスされており、例えばＭａｃｋｅｌｐｒａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ．１１９（３）：２５５−６６を参照されたい。Ａｒｄｅｎ，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．１９９５；４２（６）：４５５−５００におけるＴ細胞受容体可変遺伝子セグメントファミリーの一般的分析を参照されたい。これらのそれぞれは、当該刊行物において提供され及び参照される配列情報に関して、参照により本明細書に具体的に組み入れられる。
【００４４】
本発明の方法における選択のための多量体化されたＴ細胞受容体は、関心対象のＴＣＲ、例えばＴＣＲα／β、ＴＣＲγ／δの結合ドメインを含む可溶性タンパク質である。可溶性タンパク質は、一本鎖、またはより通常ではヘテロ二量体であり得る。一部の実施形態において、可溶性ＴＣＲは、一方のポリペプチドのＣ末におけるビオチンアクセプターペプチド配列の付加によって修飾される。アクセプターペプチドにおけるビオチン化後、ＴＣＲは、ビオチン結合パートナー、例えばアビジン、ストレプトアビジン、トラプトアビジン（ｔｒａｐｔａｖｉｄｉｎ）、ニュートラアビジン等に結合させることによって多量体化され得る。ビオチン結合パートナーは、検出可能な標識、例えばフルオロフォア、質量標識（ｍａｓｓ  ｌａｂｅｌ）等を含み得る、または粒子、例えば常磁性粒子に結合され得る。ＴＣＲに結合したリガンドの選択は、当技術分野において公知のフローサイトメトリー、磁気選択等によって実施され得る。
【００４５】
ＴＣＲのペプチドリガンドは、それに対してＴリンパ球抗原特異的応答を伴う免疫応答が生じ得るペプチド抗原である。そのような抗原には、自己免疫疾患、感染症、グルテンなどの食品、アレルギー、または組織移植拒絶反応と関連した抗原が含まれる。抗原には、ウイルス、細菌、真菌、原生動物、寄生生物、及び腫瘍細胞を含むがそれらに限定されない、例えば感染症、ワクチン接種等において見い出される、様々な微生物抗原も含まれる。腫瘍抗原には、腫瘍特異的抗原、例えば免疫グロブリンイディオタイプ及びＴ細胞抗原受容体、ｐ２１／ｒａｓ、ｐ５３、ｐ２１０／ｂｃｒ−ａｂｌ融合産物などのがん遺伝子、発達抗原（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ）、例えばＭＡＲＴ−１／
メランＡ、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＧＡＧＥファミリー、テロメラーゼ等、ウイルス抗原、例えばヒトパピローマウイルス、エプスタイン・バールウイルス等、組織特異的自己抗原、例えばチロシナーゼ、ｇｐ１００、前立腺酸性ホスファターゼ、前立腺特異的抗原、前立腺特異的膜抗原、サイログロブリン、α−フェトプロテイン等、及び自己抗原、例えばｈｅｒ−２／ｎｅｕ、癌胎児性抗原、ｍｕｃ−１等が含まれる。
【００４６】
本発明の方法において、多様なペプチド抗原のライブラリーが作り出される。ペプチドリガンドは、長さが約８〜約２０アミノ酸、通常では約８〜約１８アミノ酸、約８〜約１６アミノ酸、約８〜約１４アミノ酸、約８〜約１２アミノ酸、約１０〜約１４アミノ酸、約１０〜約１２アミノ酸である。完全にランダムなライブラリーは、膨大な数の考え得る組み合わせとなることが解される。好ましい方法において、多様性は、ペプチドをＭＨＣ結合ドメインにアンカーする残基においては限定され、それは本明細書においてＭＨＣアンカー残基と呼ばれる。ペプチドにおけるアンカー残基の箇所は、特異的ＭＨＣ結合ドメインによって決定される。多様性は、結合調査によって情報を与えられる他の箇所において、例えばＴＣＲアンカーにおいても限定され得る。
【００４７】
ライブラリー。本発明の一部の実施形態において、ポリペプチドの、またはそのようなポリペプチドをコードする核酸のライブラリーが提供され、当該ポリペプチド構造は、式：Ｐ−Ｌ1 −β−Ｌ2 −α−Ｌ3 −Ｔポリペプチドをコードするポリヌクレオチド組成を有し、式中、Ｌ1 、Ｌ2 、及びＬ3 のそれぞれは、長さが約４〜約１２アミノ酸の柔軟性があるリンカーであり、例えばグリシン、セリン、アラニン等を含み、αは、クラスＩ  ＭＨＣタンパク質のαドメインまたはクラスＩＩαＭＨＣタンパク質の可溶型であり、βは、（ｉ）クラスＩＩ  ＭＨＣタンパク質のβ鎖または（ｉｉ）クラスＩ  ＭＨＣタンパク質に対するβ2 ミクログロブリンの可溶型であり、Ｔは、限定されることなく酵母Ａｇａ２を含めた、ポリペプチドが細胞表面につながれることを可能にするドメインであり、かつ、Ｐはペプチドリガンド、通常ではこれまでに記載された種々のペプチドリガンドのライブラリーであって、少なくとも１０6 種、少なくとも１０7 種、より通常では少なくとも１０8 種の異なるペプチドリガンドがライブラリーに存在する。
【００４８】
コード配列を組み立てる従来の方法が用いられ得る。ペプチドリガンドの多様性を生み出すために、当技術分野において公知のランダム化、エラープローンＰＣＲ、突然変異誘発プライマー等を用いて、一連のポリヌクレオチドを創出する。ポリヌクレオチドのライブラリーは、典型的に、関心対象の宿主細胞に適切なベクターにライ
ゲーションされる。様々な実施形態において、ライブラリーは、Ｐ−Ｌ1 −β−Ｌ2 −α−Ｌ3 −Ｔポリペプチドをコードする精製されたポリヌクレオチド組成物として、発現ベクターに作動的に連結された、Ｐ−Ｌ1 −β−Ｌ2 −α−Ｌ3 −Ｔポリペプチドをコードする精製されたポリヌクレオチド組成物であって、当該ベクターは、限定されることなく酵母細胞における発現に適切であり得るポリヌクレオチド組成物として、Ｐ−Ｌ1 −β−Ｌ2 −α−Ｌ3 −Ｔポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのライブラリーを含む細胞の集団であって、当該細胞の集団は、限定されることなく酵母細胞であり得、かつ当該酵母細胞は、ポリペプチドライブラリーを発現するように誘導され得る細胞の集団として、提供される。
【００４９】
「適切な条件」とは、この用語が用いられる背景に依存した意味を有するものとする。つまり、Ｐ−Ｌ1 −β−Ｌ2 −α−Ｌ3 −Ｔポリペプチドをコードするポリヌクレオチド組成という式のポリペプチドへのＴ細胞受容体の結合と関連して用いられる場合、当該用語は、ＴＣＲが同族ペプチドリガンドに結合することを可能にする条件を意味するものとする。この用語が、核酸ハイブリダイゼーションと関連して用いられる場合、当該用語は、長さが少なくとも１５ヌクレオチドの核酸が、それと相補的な配列を有する核酸にハイブリダイズすることを可能にする条件を意味するものとする。作用物質を細胞に接触させ
ることに関連して用いられる場合、この用語は、そうすることが可能な作用物質が細胞に入りかつその意図される機能を果たすことを可能にする条件を意味するものとする。１つの実施形態において、本明細書において用いられる「適切な条件」という用語は、生理学的条件を意味する。
【００５０】
「特異性」という用語は、真陰性の試験結果である陰性の試験結果の割合を指す。陰性の試験結果には、偽陽性及び真陰性の試験結果が含まれる。
【００５１】
「感度」という用語は、少量の分析物を検出し得る分析法の能力を指すことが企図される。ゆえに、本明細書で使用するとき、増幅されたＤＮＡの検出のためのより高感度な方法は、例えば、少量のそのようなＤＮＡを、より低感度な方法がするよりも良好に検出し得る。「感度」とは、陽性の試験結果を有する予想結果の割合を指す。
【００５２】
本明細書において用いられる「再現性」という用語は、同じサンプルのアリコートに対して繰り返し行われた場合、同じ結果を与え得る分析手順の全般的能力を指す。
【００５３】
本開示において用いられ得るシーケンシングプラットフォームには、パイロシーケンシング、合成時解読（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、一分子シーケンシング、第二世代シーケンシング、ナノポアシーケンシング、ライゲーションによるシーケンシング、またはハイブリダイゼーションによるシーケンシングが含まれるが、それらに限定されるわけではない。好ましいシーケンシングプラットフォームは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（ＲＮＡ−Ｓｅｑ）及びＨｅｌｉｃｏｓ（Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、すなわち「ＤＧＥ」）から市販されているものである。「次世代」シーケンシング法には、１）Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２００５）４３７：３７６−３８０（２００５）、及び米国特許第７，２４４，５５９号；第７，３３５，７６２号；第７，２１１，３９０号；第７，２４４，５６７号；第７，２６４，９２９号；第７，３２３，３０５号に記載される方法及び装置を含むがそれらに限定されない４５４／Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓによって商品化されているもの、２）米国特許出願第１１／１６７０４６号及び米国特許第７５０１２４５号；第７４９１４９８号；第７，２７６，７２０号に、及び米国特許出願公報第ＵＳ２００９００６１４３９号；第ＵＳ２００８００８７８２６号；第ＵＳ２００６０２８６５６６号；第ＵＳ２００６００２４７１１号；第ＵＳ２００６００２４６７８号；第ＵＳ２００８０２１３７７０号；及び第ＵＳ２００８０１０３０５８号に記載されるＨｅｌｉｃｏｓ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）によって商品化されているもの、３）Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって商品化されているもの（例えば、ＳＯＬｉＤシーケンシング）、４）Ｄｏｖｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓによって商品化されているもの（例えば、Ｐｏｌｏｎａｔｏｒ  Ｇ．００７シーケンシング）、５）米国特許第５，７５０，３４１号；第６，３０６，５９７号；及び第５，９６９，１１９号に記載されるＩｌｌｕｍｉｎａによって商品化されているもの、ならびに６）米国特許第７，４６２，４５２号；第７，４７６，５０４号；第７，４０５，２８１号；第７，１７０，０５０号；第７，４６２，４６８号；第７，４７６，５０３号；第７，３１５，０１９号；第７，３０２，１４６号；第７，３１３，３０８号、及び米国特許出願公報第ＵＳ２００９００２９３８５号；第ＵＳ２００９００６８６５５号；第ＵＳ２００９００２４３３１号；及び第ＵＳ２００８０２０６７６４号に記載されるＰａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによって商品化されているものが含まれるが、それらに限定されるわけではない。すべての参考文献は、参照により本明細書に組み入れられる。そのような方法及び装置は、例として本明細書で提供されるものであり、限定することを意図されるわけではない。
【００５４】
発現構築物。本明細書において開示されるペプチドまたは本明細書において開示される
ＴＣＲをコードする配列は、ワクチン等として発現ベクターに、例えば操作される対象となる細胞内に導入され得る。ＴＣＲ配列は、例えばＣＲＩＳＰＲ技術（例えば、Ｅｙｑｕｅｍ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｎａｔｕｒｅ  ５４３：１１３−１１７、Ｒｅｎ  ｅｔ
ａｌ．（２０１７）Ｐｒｏｔｅｉｎ＆Ｃｅｌｌ  １−１０、Ｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ  ８（１０）：１７００２−１７０１１を参照されたい）を用いて、内因性遺伝子の部位に導入され得る。
【００５５】
アミノ酸配列バリアントは、本明細書において記載されるように、コード配列内に適当なヌクレオチド変化を導入することによって調製される。そのようなバリアントは、記される残基の挿入、置換、及び／または指定の欠失を表す。挿入、置換、及び／または指定の欠失の任意の組み合わせは、最終構築物が、本明細書において規定される所望の生物学的活性を有するという条件で、最終構築物に達するように行われる。
【００５６】
当該配列をコードする核酸は、発現及び／または組み込みのためのベクター内に挿入される。多くのそのようなベクターが使用可能である。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、Ｃａｓ９及びｓｇＲＮＡをコードするプラスミドを用いたトランスフェクションによってヒト細胞に直接適用され得る。ＣＲＩＳＰＲ構成要素のウイルス送達は、レンチウイルス及びレトロウイルスベクターを用いて広範に実証されている。アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）など、非組み込み型ウイルスによってコードされるＣＲＩＳＰＲによる遺伝子編集も報告されている。より小さなＣａｓタンパク質の最近の発見は、この技術と、ＡＡＶベクターなど、それらの安全性プロファイル及び効率に関してますます成功を収めているベクターとの組み合わせを可能にしかつ増強している。
【００５７】
ベクター構成要素には、一般的に、複製の起点、１種もしくは複数種のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列のうちの１つまたは複数が含まれるが、それらに限定されるわけではない。ベクターには、ウイルスベクター、プラスミドベクター、組み込み型ベクター等が含まれる。
【００５８】
配列は、異種ポリペプチドとの、例えば成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有するシグナル配列または他のポリペプチドとの融合ポリペプチドとして、組み換えにより産生され得る。一般的に、シグナル配列はベクターの構成要素であり得る、またはそれは、ベクター内に挿入されるコード配列の一部であり得る。好ましく選択される異種シグナル配列は、宿主細胞によって認識されかつ処理される（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものである。哺乳類細胞発現では、天然シグナル配列が用いられ得る、または同じ種もしくは近縁種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列、ならびにウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスｇＤシグナルなど、他の哺乳類シグナル配列が適切であり得る。
【００５９】
発現ベクターは、選択可能マーカーとも称される選択遺伝子を含有し得る。この遺伝子は、選択培養培地中で成長した形質転換宿主細胞の生存または成長に必要なタンパク質をコードする。選択遺伝子を含有するベクターで形質転換されていない宿主細胞は、培養培地中で生存しない。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質もしくは他の毒素、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、もしくはテトラサイクリンに対する耐性を付与する、（ｂ）栄養要求欠損を補う、または（ｃ）複合培地からは入手できない重大な栄養素を供給する、タンパク質をコードする。
【００６０】
発現ベクターは、宿主生物によって認識されかつコード配列に作動的に連結されるプロモーターを含有する。プロモーターは、それらが作動的に連結される特定の核酸配列の転写及び翻訳を制御する構造遺伝子（一般的に、約１００〜１０００ｂｐ以内）の開始コドンに対して上流（５’）に位置する非翻訳配列である。そのようなプロモーターは、典型
的に、誘導性及び構成的という２つのクラスに分けられる。誘導性プロモーターは、培養条件のいくらかの変化、例えば栄養素の有無または温度の変化に応答して、それらの制御下でＤＮＡからの転写のレベルの増加を始動するプロモーターである。多様な潜在的宿主細胞によって認識される多数のプロモーターが周知である。
【００６１】
哺乳類宿主細胞におけるベクターからの転写は、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２など）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス（マウス幹細胞ウイルスなど）、Ｂ型肝炎ウイルス、及び最も好ましくはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから、異種哺乳類プロモーター、例えばアクチンプロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）、もしくは免疫グロブリンプロモーターから、または熱ショックプロモーターから獲得されたプロモーターによって、そのようなプロモーターは宿主細胞システムと適合性であるという条件で、制御され得る。ＳＶ４０ウイルスの初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製の起点も含有するＳＶ４０制限フラグメントとして好都合に獲得される。
【００６２】
より高等な真核生物による転写は、ベクター内にエンハンサー配列を挿入することによってしばしば増加する。エンハンサーは、プロモーターに作用してその転写を増加させる、通常では長さが約１０〜３００ｂｐの、ＤＮＡのシス作用性エレメントである。エンハンサーは、配向及び箇所に比較的無関係であり、イントロン内ならびにコード配列自体の内に、転写単位に対して５’及び３’に見い出されている。哺乳類遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、及びインスリン）から、多くのエンハンサー配列が現在公知である。しかしながら、典型的に、真核生物ウイルス由来のエンハンサーが用いられる。例には、複製起点の後期側にあるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側にあるポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、コード配列に対して５’または３’の箇所で発現ベクター内にスプライスされ得るが、好ましくはプロモーターから５’の部位に位置する。
【００６３】
真核生物宿主細胞における使用のための発現ベクターは、転写の終結に及びｍＲＮＡを安定させるために必要な配列も含有する。そのような配列は、真核生物またはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’及び時には３’非翻訳領域から一般に入手可能である。これまでに挙げられた構成要素のうちの１つまたは複数を含有する適切なベクターの構築は、標準的な技法を採用する。
【００６４】
本明細書における、ベクター内のＤＮＡをクローニングするまたは発現するための適切な宿主細胞は、原核生物、酵母、またはこれまでに記載された他の真核細胞である。有用な哺乳類宿主細胞株の例は、マウスＬ細胞（Ｌ−Ｍ［ＴＫ−］、ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−２６４８）、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）、ヒト胎児腎臓株（２９３または浮遊培養での成長のためにサブクローニングされた２９３細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１０）、チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ）、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４）、マウス腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１  ５８７）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１４４２）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７５）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ８０６５）、マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）、ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、ＦＳ４細胞、及びヒトヘパトーマ株（Ｈｅｐ  Ｇ２）である。
【００６５】
操作されたＴ細胞等を含めた宿主細胞に、上記の発現ベクターをトランスフェクトし得る。細胞は、プロモーターを誘導するために、形質転換体を選択するために、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当であるように改変された従来の栄養培地中で培養され得る。哺乳類宿主細胞は、多様な培地中で培養され得る。Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ１６４０（Ｓｉｇｍａ）、及びダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）などの市販の培地は、宿主細胞を培養するために適切である。これらの培地のいずれかに、必要に応じて、ホルモン及び／または他の成長因子（インスリン、トランスフェリン、または上皮成長因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸塩など）、バッファー（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオシド（アデノシン及びチミジンなど）、抗生物質、微量元素、ならびにグルコースまたは同等のエネルギー源を補給し得る。他の任意の必要な補給剤も、当業者に公知である適当な濃度で含まれ得る。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞とともに以前に用いられたものであり、当業者には明白である。
【００６６】
核酸は、別の核酸配列との機能的関係性に置かれた場合、「作動的に連結され」ている。例えば、シグナル配列に対するＤＮＡは、それが、ポリペプチドの分泌の前兆となるプレタンパク質として発現される場合、当該ポリペプチドに対するＤＮＡに作動的に連結されており、プロモーターまたはエンハンサーは、それがコード配列の転写に影響を及ぼす場合、当該配列に作動的に連結されており、及びリボソーム結合部位は、それが、翻訳を促すように位置付けされている場合、コード配列に作動的に連結されている。一般的に、「作動的に連結された」とは、連結されているＤＮＡ配列が近接していること、及び分泌リーダーの場合には近接しておりかつリーディング相にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは近接している必要はない。
【００６７】
本開示のポリペプチドまたは核酸が「実質的に純粋」である事象において、それらは、少なくとも約６０重量％（乾燥重量）の関心対象の生体分子であり得る。例えば、組成物は、少なくとも約７５重量％、約８０重量％、約８５重量％、約９０重量％、約９５重量％、または約９９重量％の関心対象の生体分子であり得る。純度は、任意の適当な標準的方法、例えばカラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはＨＰＬＣ分析によって測定され得る。
【００６８】
本発明の別の実施形態において、これまでに記載された病状の治療に有用な材料を含有する製造品が提供される。製造品は、容器及びラベルを含む。適切な容器には、例えばボトル、バイアル、シリンジ、及び試験管が含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの多様な材料から形成され得る。容器は、病状を治療するために有効である組成物を入れ、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は静脈注射用溶液バッグ、または皮下注射針によって貫通可能な栓を有するバイアルであり得る）。組成物中の活性剤は、発現のための標的細胞内に配列を導入する際に適切なベクターであり得る。容器上にあるまたはそれに伴うラベルは、組成物が、選定される病状を治療するために用いられることを示す。例えば、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、またはデキストロース溶液などの薬学的に許容されるバッファーを入れ得るさらなる容器（複数可）が、製造品とともに提供され得る。製造品は、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用のための指示を有する添付文書を含めた、商業的な及びユーザーの視点から望ましい他の材料をさらに含み得る。
【００６９】
ポリペプチドまたはＤＮＡ配列に関連して本明細書において用いられる「配列同一性」という用語は、２つの分子間のサブユニット配列同一性を指す。分子の両方におけるサブユニット箇所が、同じ単量体サブユニット（例えば、同じアミノ酸残基またはヌクレオチド）によって占有される場合には、当該分子はその箇所において同一である。２つのアミ
ノ酸配列または２つのヌクレオチド配列間の類似性は、同一箇所の数の一次関数である。一般的に、配列は、最も高位の合致が得られるようにアラインされる。必要であれば、同一性は、公開された技法、及びＧＣＳプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：３８７，１９８４）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌ．２１５：４０３，１９９０）など、広く使用可能なコンピュータプログラムを用いて算出され得る。
【００７０】
「ポリペプチド」、「タンパク質」、または「ペプチド」という用語は、その長さまたは翻訳後修飾（例えば、グリコシル化またはリン酸化）にかかわらず、アミノ酸残基の任意の鎖を指す。
【００７１】
本明細書における「タンパク質バリアント」または「バリアントタンパク質」または「バリアントポリペプチド」は、少なくとも１個のアミノ酸改変によって野生型タンパク質とは異なるタンパク質を意味する。親ポリペプチドは、天然に存在するもしくは野生型（ＷＴ）のポリペプチドであり得る、またはＷＴポリペプチドの改変型であり得る。バリアントポリペプチドとは、当該ポリペプチド自体、当該ポリペプチドを含む組成物、またはそれをコードするアミノ酸配列を指し得る。好ましくは、バリアントポリペプチドは、親ポリペプチドと比較して少なくとも１個のアミノ酸改変、例えば親と比較して約１〜約１０個のアミノ酸改変、及び好ましくは約１〜約５個のアミノ酸改変を有する。
【００７２】
本明細書において開示されるペプチドは、当該ペプチドがそのＴＣＲ誘導性を保持する限りにおいて付加的なアミノ酸残基と隣接し得る。そのようなペプチドは、約４０アミノ酸未満、例えば約２０アミノ酸未満、例えば約１５アミノ酸未満であり得る。配列番号：３〜５、７〜９、１２、１５〜１９、２２、２４、２７〜３０、３７、６７、及び７４の群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドに隣接するアミノ酸配列は限定されるわけではなく、それがＴＣＲ認識を阻害しない限りにおいて任意の種類のアミノ酸から構成され得る。アミノ酸配列は、その中の１個または複数個のアミノ酸を置換することによって改変され得る。当業者であれば、単一アミノ酸またはわずかなパーセンテージのアミノ酸を変更する、アミノ酸配列への個々の付加または置換は、元のアミノ酸側鎖の特性の保存をもたらし、ゆえに、それは「保存的置換」または「保存的改変」と呼ばれ、タンパク質の変更は、類似の機能を有するタンパク質をもたらすことを認識する。
【００７３】
ペプチドの上記の配列改変に加えて、ペプチドは、それらがＴＣＲ結合活性を保持する限りにおいて、他の物質にさらに連結され得る。使用可能な物質には、ペプチド、脂質、糖類及び糖鎖、アセチル基、天然及び合成ポリマー等が含まれる。ペプチドは、修飾が、本明細書において記載されるペプチドの生物学的活性を破壊しない限りにおいて、グリコシル化、側鎖酸化、またはリン酸化などの修飾を含有し得る。これらの種類の修飾を実施して、付加的な機能（例えば、標的化機能及び送達機能）を付与し得るまたはポリペプチドを安定させ得る。
【００７４】
例えば、ポリペプチドのインビボ安定性を増加させるために、特に有用な様々なＤ−アミノ酸、アミノ酸模倣体、または非天然アミノ酸を導入することが当技術分野において公知であり、この概念は、本ポリペプチドにも取り入れられ得る。ポリペプチドの安定性は、いくつかのやり方でアッセイされ得る。例えば、安定性を試験するために、ペプチダーゼ、ならびにヒト血漿及び血清などの様々な生物学的媒体が用いられている（例えば、Ｖｅｒｈｏｅｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎ  １１：２９１−３０２，１９８６、［００５３］ＩＩＩ．ペプチドの調製を参照されたい）。
【００７５】
本明細書において開示されるペプチドは、周知の技法を用いて調製され得る。例えば、ペプチドは、合成的に、組み換えＤＮＡ技術によって、または化学合成によって調製され得る。本明細書において開示されるペプチドは、個々に、または２個もしくはそれを上回る数のペプチド（例えば、２個もしくはそれを上回る数のペプチド、またはペプチド及び非ペプチド）を含むより長いポリペプチドとして合成され得る。ペプチドは単離され得る、すなわち、他の天然に存在する宿主細胞タンパク質及びそのフラグメントを実質的に含まないように精製され得る、例えば少なくとも約７０％、８０％、または９０％精製され得る。
【００７６】
本明細書において用いられる「親ポリペプチド」、「親タンパク質」、「前駆体ポリペプチド」、または「前駆体タンパク質」は、その後に改変されてバリアントを生成する、改変されていないポリペプチドを意味する。親ポリペプチドは、野生型（または天然）ポリペプチド、または野生型ポリペプチドのバリアントもしくは操作された型であり得る。親ポリペプチドとは、当該ポリペプチド自体、当該親ポリペプチドを含む組成物、またはそれをコードするアミノ酸配列を指し得る。
【００７７】
「レシピエント」、「個体」、「対象」、「宿主」、及び「患者」という用語は、本明細書において互換可能に用いられ、それに対して診断、治療、または療法が望まれる任意の哺乳類対象、特にヒトを指す。治療の目的のための「哺乳類」とは、イヌ、ウマ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタなど、ヒト、飼育動物、及び家畜、ならびに動物園用、運動用、またはペット用動物を含めた、哺乳類として分類される任意の動物を指す。好ましくは、哺乳類はヒトである。
【００７８】
本明細書において使用するとき、「治療上有効な量」とは、疾患または障害を治療するまたは管理するために十分な、治療剤、例えばプライムされたＴ細胞、ペプチド、またはポリヌクレオチドワクチン等の注入の量を指す。治療上有効な量とは、疾患の発症を遅延させるもしくは最小限に抑える、例えばがんの広がりを遅延させるもしくは最小限に抑えるために十分な治療剤の量、または関心対象の受容体からのシグナル伝達を減少させるもしくは増加させるために有効な量を指し得る。治療上有効な量とは、疾患の治療または管理において治療的有益性を提供する治療剤の量も指し得る。さらに、本発明の治療剤に関する治療上有効な量とは、疾患の治療または管理において治療的有益性を提供する、単独でのまたは他の療法との組み合わせでの治療剤の量を意味する。
【００７９】
本明細書において使用するとき、「投薬レジメン」という用語は、典型的には期間によって分離された、対象に個々に施される単位投薬のセット（典型的に１回を上回る回数）を指す。一部の実施形態において、所定の治療剤は、１回または複数回の投薬を伴い得る推奨される投薬レジメンを有する。一部の実施形態において、投薬レジメンは、それぞれが、同じ長さの期間によって互いから分離されている複数回の投薬を含み、一部の実施形態において、投薬レジメンは、複数回の投薬、及び個々の投薬を分離する少なくとも２つの異なる期間を含む。一部の実施形態において、投薬レジメン内のすべての投薬は、同じ単位投薬量のものである。一部の実施形態において、投薬レジメン内の異なる投薬は、異なる量のものである。一部の実施形態において、投薬レジメンは、第一の投薬量での第一の投薬、それに続く、当該第一の投薬量とは異なる第二の投薬量での１回または複数回の付加的な投薬を含む。一部の実施形態において、投薬レジメンは、第一の投薬量での第一の投薬、それに続く、当該第一の投薬量と同じ第二の投薬量での１回または複数回の付加的な投薬を含む。一部の実施形態において、投薬レジメンは、関連性がある集団にわたって施される場合、所望のまたは有益な成果と相関する（すなわち、治療的投薬レジメンである）。
【００８０】
本明細書において使用するとき、「がん」（または「がん性」）、または「腫瘍」とい
う用語は、自律的成長能（例えば、細胞成長を急速に増殖させることによって特徴付けされる異常な状態または病状）を有する細胞を指すために用いられる。過剰増殖性疾患状態及び新生物疾患状態は、病的（例えば、疾患状態を特徴付けするまたは構成する）として類別され得る、またはそれらは非病理的として（例えば、正常からの逸脱であるが、疾患状態とは関連しないものとして）類別され得る。当該用語は、組織病理学的タイプまたは侵襲のステージに関係なく、すべてのタイプのがん性成長もしくは発がん過程、転移性組織、または悪性形質転換した細胞、組織、もしくは器官を含むことを企図される。病的過剰増殖性細胞は、悪性腫瘍成長によって特徴付けされる疾患状態において生じる。非病理的過剰増殖性細胞の例には、創傷修復に伴う細胞の増殖が含まれる。「がん」または「腫瘍」という用語は、肺、乳房、甲状腺、リンパ腺及びリンパ系組織、消化器器官、ならびに尿生殖器管に影響を及ぼすものを含めた、様々な器官系の悪性腫瘍、ならびにほとんどの結腸癌、腎細胞癌、前立腺癌及び／または精巣腫瘍、肺の非小細胞癌、小腸の癌、ならびに食道の癌などの悪性腫瘍を含むと一般的に考えられる腺癌を指すためにも用いられる。
【００８１】
「癌腫」という用語は、当技術分野において認められており、呼吸器系癌、消化器系癌、尿生殖器系癌、精巣癌、乳癌、前立腺癌、内分泌系癌、及び黒色腫を含めた、上皮組織または内分泌組織の悪性腫瘍を指す。「腺癌」とは、腺組織に由来する、または腫瘍細胞が認識可能な腺構造を形成する癌腫を指す。
【００８２】
例示的ながんタイプには、ＡＭＬ、ＡＬＬ、ＣＭＬ、副腎皮質癌、肛門癌、再生不良性貧血、胆管癌、膀胱癌、骨癌、骨転移、脳腫瘍、中枢神経系（ＣＮＳ）癌、末梢神経系（ＰＮＳ）癌、乳癌、子宮頸癌、小児期非ホジキンリンパ腫、結腸及び直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、ユーイングファミリー腫瘍（例えば、ユーイング肉腫）、眼癌、胆嚢癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、ホジキンリンパ腫、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭及び下咽頭癌、肝臓癌、肺癌、肺カルチノイド腫瘍、非ホジキンリンパ腫、男性乳癌、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性障害、鼻腔及び副鼻腔癌、上咽頭癌、神経芽細胞腫、口腔及び口腔咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、陰茎癌、下垂体腫瘍、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、肉腫、黒色腫皮膚癌、非黒色腫皮膚癌、胃癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宮癌（例えば、子宮肉腫）、移行上皮癌、膣癌、外陰癌、中皮腫、扁平上皮細胞または類表皮癌、気管支腺腫、絨毛癌、頭頸部癌、奇形癌、またはワルデンシュトレームマクログロブリン血症が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００８３】
方法及び組成物
組成物及び方法が、所定のＭＨＣ背景におけるＴ細胞受容体によって認識されるペプチドのセットを正確に同定するために提供され、２、３、４、５個、またはそれを上回る数のライブラリーを同時にスクリーニングする多重方法を用いたそのようなスクリーニングから獲得された抗原を提供する。ゆえに同定されたペプチドリガンド（抗原）は、長さが約８〜約２０アミノ酸、通常では約８〜約１８アミノ酸、約８〜約１６アミノ酸、約８〜約１４アミノ酸、約８〜約１２アミノ酸、約１０〜約１４アミノ酸、約１０〜約１２アミノ酸であり、配列番号：１〜２５７として本明細書において提供されるペプチドのいずれかを含み得る。
【００８４】
関心対象のＴＣＲに結合するペプチドの選択は、多量体化されたＴＣＲとライブラリーを発現する宿主細胞の集団とを結び付けることによって実施される。選択のための多量体化されたＴ細胞受容体は、関心対象のＴＣＲ、例えばα／β、ＴＣＲγ／δの結合ドメインを含む可溶性タンパク質であり、任意の好都合な方法によって合成され得る。ＴＣＲは一本鎖またはヘテロ二量体であり得る。一部の実施形態において、可溶性ＴＣＲは、一方のポリペプチドのＣ末端におけるビオチンアクセプターペプチド配列の付加によって修飾
される。アクセプターペプチドにおけるビオチン化後、ＴＣＲは、ビオチン結合パートナー、例えばアビジン、ストレプトアビジン、トラプトアビジン、ニュートラアビジン等に結合させることによって多量体化され得る。ビオチン結合パートナーは、検出可能な標識、例えばフルオロフォア、質量標識等を含み得る、または粒子、例えば常磁性粒子に結合され得る。ＴＣＲに結合したリガンドの選択は、当技術分野において公知のフローサイトメトリー、磁気選択等によって実施され得る。
【００８５】
選択集団がバックグラウンドを上回るシグナルを有するまで、選択のラウンドが実施され、通常では少なくとも３ラウンド及びより通常では少なくとも４ラウンドの選択が実施される。一部の実施形態において、初回ラウンドの選択は、例えばバックグラウンドを上回るシグナルがあるまで、超常磁性微粒子などの磁性試薬に共役したＴＣＲを用いて実施され、それは「磁化された」と呼ばれ得る。参照により本明細書に組み入れられる、Ｍｏｌｄａｙ（米国特許第４，４５２，７７３号）は、磁性鉄−デキストラン微粒子の調製を記載しており、生物学的材料への付着に適切な粒子を調製する様々な手段を記載した概要を提供している。高勾配磁気分離（ＨＧＭＳ）法において用いられる磁性粒子に対するポリマーコーティングについての記載は、米国特許第５，３８５，７０７号に見い出される。超常磁性粒子を調製する方法は、米国特許第４，７７０，１８３号に記載されている。微粒子は、通常直径が約１００ｎｍ未満であり、通常直径が約１０ｎｍよりも大きい。共役のための精確な方法は本発明の実践に重大ではなく、いくつかの代替策が当技術分野において公知である。直接共役は、ＴＣＲを粒子に付着させる。間接共役は、いくつかの方法によって達成され得る。ＴＣＲは、高アフィニティー結合システムの一方のメンバー、例えばビオチンに、及び他方のメンバー、例えばアビジンに付着した粒子に共役され得る。あるいは、ＴＣＲの種特異的エピトープを認識する二次抗体、例えば抗マウスＩｇ、抗ラットＩｇ等も用いられ得る。間接共役法は、多様な分離抗体とともに、単一の磁気的に共役した実体、例えば抗体、アビジン等の使用を可能にする。
【００８６】
もしくは、最終ラウンドの選択のための好ましい実施形態において、ＴＣＲは、例えばフローサイトメトリー、マスサイトメトリー等のために、検出可能な標識を有する試薬に多量体化される。例えば、ＦＡＣＳ選別を用いて、ＴＣＲに結合するペプチドリガンドを有する細胞の濃度を増加させ得る。技法には、多色チャネル、低角度でかつ鈍い光散乱検出チャネル、インピーダンスチャネルなど、様々な洗練度を有し得る蛍光活性化細胞選別機が含まれる。
【００８７】
最終ラウンドの選択の後、ポリヌクレオチドが選択宿主細胞から単離され、選択されたペプチドリガンドの配列は、通常ではハイスループットシーケンシングによって決定される。選択工程は、特異的ＨＬＡ背景におけるＴＣＲによって結合されるペプチドのセットの決定をもたらすことが本明細書において示されている。Ｔ細胞の活性化におけるこれらのリガンドの生物学的活性が検証されている。選択されたリガンドのセットは、Ｔ細胞受容体への結合に要されるアミノ酸箇所の制限についての情報を提供する。通常では複数種のペプチドリガンド、例えば最高で１０種、最高で１００種、最高で５００種、最高で１０００種、またはそれを上回る種類の異なるペプチド配列が選択される。
【００８８】
ペプチドリガンドのこの選択されたセットからの配列データは、ペプチドリガンドの各箇所におけるアミノ酸の制限についての情報を提供する。これはグラフで示され得る。制限は、ＴＣＲに接触する残基において特に関連性があり得る。ペプチドの箇所におけるアミノ酸の制限に関するデータを入力して、公共データベースの分析のための検索アルゴリズムを設計する。検索の結果は、ＭＨＣ背景におけるＴＣＲへの結合の基準を満たすペプチドのセットを提供する。検索アルゴリズムは、通常、コンピュータによって実行可能な指示のプログラムとして具体化され、コンピュータに搭載されるソフトウェア構成要素によって実施される。
【００８９】
これらの方法によって同定されるペプチド及びＴ細胞受容体は、ワクチン法において、患者Ｔ細胞集団を分類するスクリーニング法において、インビトロでＴ細胞をプライムするため等に用いられ得る。
【００９０】
一部の実施形態において、組成物は、ＨＬＡ−Ａ２である少なくとも１つのＨＬＡアレルを有する対象において、がん細胞、例えば結腸直腸癌細胞に対する免疫応答を引き出す１種または複数種のペプチドを含む。別の態様において、本発明は、本明細書において開示される１種のペプチドをコードする１種のポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。一部の実施形態において、組成物は、本明細書において開示される複数種のペプチドをコードする複数種（すなわち、２種またはそれを上回る種類）のポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、組成物は、本明細書において開示される複数種のペプチドをコードする１種のポリヌクレオチドを含む。
【００９１】
関連する態様において、本明細書において開示されるペプチドまたはペプチドをコードするポリヌクレオチドを個体に投与することによって、がんを治療する（例えば、腫瘍細胞成長を低下させる、腫瘍細胞死を促進する）ための方法が提供される。関連する態様において、本明細書において開示されるペプチドでプライムされている、単離されたプライムされたＴ細胞が提供される。別の態様において、ＨＬＡ抗原と本明細書において開示されるペプチドとの間で形成される複合体を含む抗原提示細胞が提供される。一部の実施形態において、抗原提示細胞は単離される。
【００９２】
「ワクチン」（免疫原性組成物とも呼ばれる）という用語は、動物への接種があると抗腫瘍（または抗病原体）免疫を誘導する機能を有する物質を指す。
【００９３】
薬学的作用物質によって治療される対象となるがんは限定されるわけではなく、本明細書において同定されるペプチドへの対応するタンパク質が対象において発現するすべての種類のがんを含む。例示されるがんは、癌腫、例えば結腸直腸癌である。
【００９４】
必要であれば、ペプチドまたはペプチドをコードするポリヌクレオチドのいずれかから構成される薬学的作用物質は、他の治療用物質を、当該物質が関心対象のペプチドのＴＣＲ刺激効果を阻害しない限りにおいて、活性成分として任意で含み得る。例えば、製剤は、抗炎症剤、鎮痛剤、化学療法剤等を含み得る。医薬品それ自体に他の治療用物質を含めることに加えて、医薬品は、１種または複数種の他の薬理学的作用物質と逐次的にまたは並行しても投与され得る。医薬品及び薬理学的作用物質の量は、例えば、どのようなタイプの薬理学的作用物質（複数可）が用いられるか、治療されている疾患、ならびに投与のスケジュール及び経路に依存する。
【００９５】
ペプチドは、必要であれば、従来の製剤化法によって製剤化されている薬学的作用物質として直接投与され得る。そのような場合、ペプチドに加えて、キャリア、賦形剤、及び薬物に普通用いられるようなものが、特に限定されることなく必要に応じて含まれ得る。そのようなキャリアの例は、滅菌水、生理的食塩水、リン酸塩バッファー、培養液などである。さらに、薬学的作用物質は、必要に応じて、安定剤、懸濁液、防腐剤、界面活性剤などを含有し得る。薬学的作用物質は、がんを治療する及び／または予防するために用いられ得る。
【００９６】
ペプチドを、本明細書において開示されるペプチドの２種またはそれを上回る種類を含む組み合わせで調製して、Ｔ細胞をインビボで刺激し得る。ペプチドはカクテルの状態であり得る、または標準的技法を用いて互いに抱合され得る。例えば、ペプチドは、単一のポリペプチド配列として発現され得る。組み合わせにおけるペプチドは、同じであり得る
または異なり得る。ペプチドを投与することによって、ペプチドは、抗原提示細胞のＨＬＡ抗原上に高密度で提示され、次いで、呈示されたペプチドとＨＬＡ抗原との間で形成される複合体に対して特異的に反応するＴ細胞が刺激される。あるいは、それらの細胞表面にペプチドを固定している抗原提示細胞を、対象由来の樹状細胞を取り出すことによって獲得し、それをペプチドによって刺激し、次いで、ペプチド搭載樹状細胞を対象に再投与することによって内因性Ｔ細胞を対象において刺激し、結果として、標的細胞に対する攻撃性が増加し得る。
【００９７】
本明細書において記載されるペプチドを活性成分として含む薬学的作用物質は、細胞性免疫が有効に確立されるようにアジュバントを任意で含み得る、またはそれらは他の活性成分とともに投与され得る、及びそれらは顆粒への製剤化によって投与され得る。アジュバントとは、免疫学的活性を有するタンパク質と一緒に（または連続的に）投与された場合、当該タンパク質に対する免疫応答を増強する化合物を指す。適用され得るアジュバントには、文献に記載されているものが含まれる。例示的なアジュバントには、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ミョウバン、コレラ毒素、サルモネラ毒素などが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００９８】
さらに、リポソーム製剤、ペプチドが数ｍｃｍ径のビーズに結合している顆粒製剤、及び脂質がペプチドに結合している製剤が好都合に用いられ得る。あるいは、エクソソームと称される細胞内小胞が提供され、それは、ペプチドとそれらの表面上のＨＬＡ抗原との間で形成される複合体を提示する。エクソソームは、ペプチドと同様に、ワクチンとして接種され得る。
【００９９】
一部の実施形態において、本明細書において開示される薬学的作用物質は、Ｔリンパ球をプライムする構成要素を含む。脂質は、ウイルス抗原に対してＣＴＬをインビボでプライムし得る作用物質として同定されている。例えば、パルミチン酸残基は、リジン残基のエプシロン−及びアルファ−アミノ基に付着し得、次いで本明細書において開示されるペプチドに連結され得る。脂質化されたペプチドは、次いで、ミセルもしくは粒子のいずれかの状態で直接投与され得る、リポソーム内に組み入れられ得る、またはアジュバント中に乳化され得る。ＣＴＬ応答の脂質プライミングの別の例として、適当なペプチドに共有結合で付着した場合、トリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステインリセリル−セリン（Ｐ３ＣＳＳ）などのＥ．ｃｏｌｉリポタンパク質を用いて、ＣＴＬをプライムし得る（例えば、Ｄｅｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：５６１，１９８９を参照されたい）。
【０１００】
投与の方法は、経口、皮内、皮下、静脈内注射などであり得、全身投与または標的部位の付近への局所投与が用途を見い出す。投与は、単回投与によって実施され得る、または複数回投与によってブーストされ得る。ペプチドの用量は、治療される対象となる疾患、患者の年齢、体重、投与の方法などに従って適当に調整され得、普通、０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、例えば０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、例えば０．１ｍｇ〜１０ｍｇであり、数日ごとに１回〜数ヶ月ごとに１回投与され得る。当業者であれば、適切な用量を適当に選択し得る。
【０１０１】
本明細書において開示される薬学的作用物質は、発現可能な形態で、本明細書において開示されるペプチドをコードする核酸も含み得る。本明細書において、「発現可能な形態で」という語句は、ポリヌクレオチドが、細胞内に導入された場合に、抗腫瘍免疫を刺激するポリペプチドとしてインビボで発現されることを意味する。１つの実施形態において、関心対象のポリヌクレオチドの核酸配列は、標的細胞における当該ポリヌクレオチドの発現に必要な調節エレメントを含む。ポリヌクレオチド（複数可）は、標的細胞のゲノム内に安定して挿入するように配備され得る（例えば、相同組み換えカセットベクターの説
明に関しては、Ｔｈｏｍａｓ  ＫＲ＆Ｃａｐｅｃｃｈｉ  ＭＲ，Ｃｅｌｌ  ５１：５０３−１２，１９８７を参照されたい）。例えば、Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１４６５−８，１９９０、米国特許第５，５８０，８５９号；第５，５８９，４６６号；第５，８０４，５６６号；第５，７３９，１１８号；第５，７３６，５２４号；第５，６７９，６４７号、及びＷＯ９８／０４７２０を参照されたい。ＤＮＡに基づく送達技術の例には、「ネイキッドＤＮＡ」、促進（ブピバカイン、ポリマー、ペプチド媒介性）送達、カチオン性脂質複合体、及び粒子媒介性（「遺伝子銃」）または圧力媒介性送達（例えば、米国特許第５，９２２，６８７号を参照されたい）が含まれる。
【０１０２】
本明細書において開示されるペプチドは、ウイルスまたは細菌ベクターによっても発現され得る。発現ベクターの例には、ワクシニアまたは鶏痘など、弱毒化ウイルス宿主が含まれる。この手法は、例えばペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現するベクターとして、ワクシニアウイルスの使用を伴う。宿主内への導入があると、組み換えワクシニアウイルスは免疫原性ペプチドを発現し、それによって免疫応答を引き出す。免疫付与プロトコールにおいて有用なワクシニアベクター及び方法は、例えば米国特許第４，７２２，８４８号に記載されている。別のベクターはＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）である。ＢＣＧベクターは、Ｓｔｏｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５１：４５６−６０，１９９１に記載されている。治療的投与または免疫付与に有用な多種多様の他のベクター、例えばアデノ及びアデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）ベクター、無毒化炭疽毒素ベクター等が明白である。例えば、Ｓｈａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  Ｔｏｄａｙ  ６：６６−７１，２０００、Ｓｈｅｄｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ  ６８：７９３−８０６，２０００、Ｈｉｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  １４：５７１−８５，２０００を参照されたい。
【０１０３】
投与の方法は、経口、皮内、皮下、静脈内注射などであり得、全身投与または標的部位の付近への局所投与が用途を見い出す。投与は、単回投与によって実施され得る、または複数回投与によってブーストされ得る。適切なキャリア中のポリヌクレオチドの用量、またはペプチドをコードするポリヌクレオチドで形質転換された細胞の用量は、治療される対象となる疾患、患者の年齢、体重、投与の方法などに従って適当に調整され得、普通、０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、例えば０．００１ｍｇ〜１００ｍｇ、例えば０．１ｍｇ〜１０ｍｇであり、数日ごとに１回〜数ヶ月ごとに１回投与され得る。当業者であれば、適切な用量を適当に選択し得る。
【０１０４】
抗原提示細胞（ＡＰＣ）も提供され、それは、ＨＬＡ抗原とその表面上のペプチドとの間で形成される複合体を提示する。ＡＰＣは、ペプチド、またはペプチドをコードするヌクレオチドを接触させることによって獲得され、治療及び／または予防の標的である対象から調製され得、それだけで、またはペプチド、エクソソーム、もしくは細胞傷害性Ｔ細胞を含めた他の薬物と組み合わせてワクチンとして投与され得る。ＡＰＣは、任意の種類の細胞に限定されるわけではなく、樹状細胞（ＤＣ）、ランゲルハンス細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、及び活性化Ｔ細胞を含み、そのすべては、リンパ球によって認識されるようにそれらの細胞表面にタンパク質性抗原を提示することが知られている。ＤＣは、ＡＰＣの中で最も強いＣＴＬ誘導作用を有する代表的なＡＰＣであるため、ＤＣはＡＰＣとしての特定の用途を見い出す。
【０１０５】
例えば、ＡＰＣは、末梢血単球から樹状細胞を誘導し、次いでそれらをインビトロ、エクスビボ、またはインビボでペプチドと接触させる（で刺激する）ことによって獲得され得る。ペプチドを対象に投与する場合、それらに固定されたペプチドを有するＡＰＣは、対象の身体内で刺激される。「ＡＰＣを誘導すること」には、細胞をペプチドまたはペプチドをコードするヌクレオチドと接触させて（で刺激して）、ＨＬＡ抗原と細胞の表面上
のペプチドとの間で形成される複合体を提示することが含まれる。あるいは、ペプチドをＡＰＣに固定した後、ＡＰＣは対象にワクチンとして投与され得る。例えば、エクスビボ投与は、ａ：対象からＡＰＣを回収するステップ、及びｂ：ステップａのＡＰＣとペプチドとを接触させるステップを含み得る。ステップｂによって獲得されたＡＰＣは、対象にワクチンとして投与され得る。
【０１０６】
そのようなＡＰＣは、ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子をインビトロでＡＰＣに移動させるステップを含む方法によって調製され得る。導入された遺伝子は、ＤＮＡまたはＲＮＡの形態であり得る。導入の方法に関しては、特に限定されることなく、リポフェクション、エレクトロポレーション、及びリン酸カルシウム法など、本分野において好都合に実施される様々な方法が用いられ得る。
【０１０７】
細胞は、本明細書で提供されるＴＣＲを発現するように、または本明細書において提供されるペプチド抗原に応答するように操作され得る。いくつかの異なる細胞タイプ、特にＴ細胞またはＮＫ細胞が操作に適切である。一部の実施形態において、操作のための細胞は自家である。一部の実施形態において、細胞は同種異系である。
【０１０８】
本明細書において開示されるペプチドのいずれかに対して刺激されたＴ細胞は、ペプチドと同様のワクチンとして用いられ得る。ゆえに、本発明は、本ペプチドのいずれかによって刺激される単離されたＴ細胞を提供する。そのようなＴ細胞は、（１）対象に投与する、または（２）対象由来のＡＰＣ、及びＣＤ８陽性細胞、もしくは末梢血単核白血球をインビトロでペプチドと接触させる（で刺激する）、ことによって獲得され得る。ペプチドを提示するＡＰＣからの刺激によって刺激されているＴ細胞は、治療及び／または予防の標的である対象に由来し得、それだけで、または効果を調節する目的のためにペプチドもしくはエクソソームを含めた他の薬物と組み合わせて投与され得る。獲得されたＴ細胞は、ペプチド、例えばプライミングに用いられた同じペプチドを提示する標的細胞に対して特異的に作用する。標的細胞は、内因的に発現する細胞または遺伝子をトランスフェクトされる細胞であり得、これらのペプチドによる刺激に起因して細胞表面にペプチドを提示する細胞も攻撃の標的になり得る。
【０１０９】
一部の実施形態において、操作される細胞はＴ細胞である。「Ｔ細胞」という用語は、ＣＤ３及び／またはＴ細胞抗原受容体の発現によって特徴付けされ得る哺乳類免疫エフェクター細胞を指し、その細胞は、本明細書において提供されるＴＣＲを発現するように操作され得るまたは本明細書において提供されるペプチドに応答するように刺激され得る。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、ナイーブＣＤ８+ Ｔ細胞、細胞傷害性ＣＤ８+ Ｔ細胞、ナイーブＣＤ４+ Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、例えばＴH １、ＴH ２、ＴH ９、ＴH １１、ＴH ２２、ＴFH、調節性Ｔ細胞、例えばＴR １、ナチュラルＴReg 、誘導性ＴReg 、メモリＴ細胞、例えばセントラルメモリＴ細胞、Ｔ幹細胞メモリ細胞（ＴSCM ）、エフェクターメモリＴ細胞、ＮＫＴ細胞、γδＴ細胞から選択される。一部の実施形態において、操作された細胞は、免疫細胞の複合混合物、例えば治療を必要としている個体から単離された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む。例えば、Ｙａｎｇ  ａｎｄ  Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（２０１６）Ａｄｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３０：２７９−９４，「Ａｄｏｐｔｉｖｅ
Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ」、Ｆｅｌｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ（２０１５）Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．４２（４）：６２６−３９「Ａｄｏｐｔｉｖｅ
Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｔｕｍｏｒ−Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ，Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，ａｎｄ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ」、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌ  ＮＣＴ０１１７４１２１，「Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｔｕｍｏｒ  Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ
Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｆｏｒ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  Ｗｉｔｈ  Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  Ｃａｎｃｅｒ」、Ｔｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４４（６
１８４）６４１−６４５，「Ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｍｕｔａｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＣＤ４＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ａ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃａｎｃｅｒ」を参照されたい。一部の実施形態において、Ｔ細胞とペプチドとをインビトロで接触させ、すなわち、そこで当該Ｔ細胞を、次いでレシピエントに移動させる。
【０１１０】
本発明の目的のためのエフェクター細胞には、限定されることなく腫瘍細胞を含めた、標的細胞に対する細胞溶解活性を有する自家または同種異系の免疫細胞が含まれ得る。エフェクター細胞は、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）をインビトロで操作し、次いで、活性化を増加させるサイトカイン及び／または抗原の組み合わせとともに培養することによって獲得され得る。細胞は、培養前、投与前、またはその両方に、非所望の細胞から任意で分離される。免疫学的エフェクター細胞による標的細胞の細胞媒介性細胞溶解は、結合している標的細胞の細胞膜に浸透する細胞質顆粒の局所指向性エキソサイトーシスによって媒介されると思われる。
【０１１１】
腫瘍細胞に反応性がある細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、養子免疫療法のための特異的エフェクター細胞であり、本明細書において開示されるペプチドでプライムすることによって操作するための、または本明細書において開示されるＴＣＲを発現するように操作するための関心対象である。ＣＴＬの誘導及び拡張は、抗原特異的でありかつＭＨＣ制限的である。
【０１１２】
対象から回収されたＴ細胞は、所望の細胞を富化する技法によって細胞の混合物から分離され得る、または分離することなく操作され得及び培養され得る。適当な溶液が、分散または懸濁に用いられ得る。そのような溶液は、一般的に、低濃度の、一般的に５〜２５ｍＭの許容されるバッファーと合わせて、ウシ胎仔血清または他の天然に存在する因子を好都合に補給された、平衡塩類溶液、例えば正常生理食塩水、ＰＢＳ、ハンクス平衡塩類溶液等である。好都合なバッファーには、ＨＥＰＥＳ、リン酸塩バッファー、乳酸塩バッファー等が含まれる。
【０１１３】
アフィニティー分離のための技法には、抗体をコーティングされた磁気ビーズを用いた磁気分離、アフィニティークロマトグラフィー、モノクローナル抗体に接合したもしくはモノクローナル抗体と合わせて用いられる細胞毒性剤、例えば補体もしくは細胞毒素、及び固体マトリックス、例えばプレートに付着した抗体を用いた「パニング」、または他の好都合な技法が含まれ得る。正確な分離を提供する技法には、多色チャネル、低角度でかつ鈍い光散乱検出チャネル、インピーダンスチャネルなど、様々な洗練度を有し得る蛍光活性化細胞選別機が含まれる。細胞は、死細胞と関連した色素（例えば、ヨウ化プロピジウム）を採用することによって、死細胞に反して選択され得る。選択された細胞の生存率に過度に有害でない任意の技法が採用され得る。アフィニティー試薬は、上記の細胞表面分子に対する特異的受容体またはリガンドであり得る。抗体試薬に加えて、ペプチドリガンドと受容体、エフェクターと受容体分子等、ペプチド−ＭＨＣ抗原とＴ細胞受容体とのペアが用いられ得る。
【０１１４】
分離された細胞は、通常では回収チューブの底に血清のクッションを有する、細胞の生存率を維持する任意の適当な培地中に回収され得る。ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）をしばしば補給された、ｄＭＥＭ、ＨＢＳＳ、ｄＰＢＳ、ＲＰＭＩ、イスコフ培地等を含めた、様々な培地が市販されており、細胞の性質に従って用いられ得る。
【０１１５】
回収された及び任意で富化された細胞集団は、遺伝子改変に直ちに用いられ得る、または液体窒素温度で凍結され得及び保管され得、融解され及び再利用され得る。細胞は、通常、１０％ＤＭＳＯ、５０％ＦＣＳ、４０％ＲＰＭＩ１６４０培地中で保管される。
【０１１６】
操作された細胞は、投与の任意の好都合な経路によって、通常では血管内に、任意の生理学的に許容される手段にて対象に注入され得る、とはいえそれらは他の経路によっても導入され得、そこで細胞は成長にとって適当な部位を見い出し得る。通常、少なくとも１×１０6 個細胞／ｋｇ、少なくとも１×１０7 個細胞／ｋｇ、少なくとも１×１０8 個細胞／ｋｇ、少なくとも１×１０9 個細胞／ｋｇ、少なくとも１×１０10個細胞／ｋｇ、またはそれを上回る量が投与され、通常では回収の間に獲得されるＴ細胞の数によって限定される。
【０１１７】
ペプチド及びＴ細胞受容体配列も、患者サンプルに対するスクリーニングアッセイにおいて有用であり、個体由来のＴ細胞含有サンプル、例えば血液サンプル、腫瘍生検サンプル、リンパ節サンプル、骨髄サンプル等が、（ｉ）本明細書において同定されるＴＣＲを含むＴ細胞の存在について、及び／または（ｉｉ）本明細書において記載されるペプチドに応答性があるＴ細胞の存在について分析される。Ｔ細胞の存在についての判定は、任意の好都合な方法、例えばＨＬＡ複合体におけるまたはＡＰＣによって提示されるペプチドの存在に応答した増殖等を測定することにより刺激を判定することに従ってなされ得る。特異的ＴＣＲの存在は、ｍＲＮＡのシーケンシング、ゲノムＤＮＡのシーケンシング等によって判定され得る。ペプチドに応答性があるまたは関心対象であるＴＣＲを有するＴ細胞の存在により、患者を、ワクチン接種、ＡＰＣ移動等によって治療され得る群に、その群とともに、割り当てることが可能となる。
【０１１８】
機械可読媒体において有形的に具体化されたソフトウェア商品も本明細書において提供され、当該ソフトウェア商品は、１つまたは複数のデータ処理装置に、本発明のスクリーニング法によって獲得される選択されたペプチドリガンドの箇所頻度からｎ×２０行列を作り出すことを含む操作を実施させるよう操作可能な指示を含み、ｎはペプチドリガンドライブラリーにおけるアミノ酸箇所の番号である。アミノ酸頻度のカットオフは、例えば０．１未満、０．０５未満、０．０１未満に設定され、カットオフを下回る頻度はゼロに設定される。配列のデータベース、例えばヒトポリペプチド配列のセット、病原体ポリペプチド配列のセット、微生物ポリペプチド配列のセット、アレルゲンポリペプチド配列のセット等は、置換行列から箇所的アミノ酸頻度の積を採点するとともに、ｎ箇所スライディングウィンドウアライメントを用いたアルゴリズムを用いて検索される。頻度がカットオフを下回る少なくとも１個のアミノ酸を含有するアラインされたセグメントは、合致から除外される。検索の結果は、コンピュータ可読媒体においてデータファイルとして出力され得る。
【０１１９】
ペプチド配列結果及びデータベース検索結果は、それらの使用を容易にする多様な媒体で提供され得る。「媒体」とは、本発明の発現レパートリー情報を含有する製品を指す。本発明のデータベースは、コンピュータ可読媒体、例えばコンピュータによって読み取られ得及び直接アクセスされ得る任意の媒体に記録され得る。そのような媒体には、フロッピーディスク、ハードディスク記憶媒体、及び磁気テープなどの磁気記憶媒体、ＣＤ−ＲＯＭなどの光学記憶媒体、ＲＡＭ及びＲＯＭなどの電子記憶媒体、ならびに磁気／光学記憶媒体などのこれらのカテゴリーのハイブリッドが含まれるが、それらに限定されるわけではない。当業者であれば、現在公知のコンピュータ可読媒体のいずれかをどのように用いて、本データベース情報の記録を含む製品を創出し得るかを容易に解し得る。「記録された」とは、当技術分野において公知の任意のそのような方法を用いて、コンピュータ可読媒体に情報を記憶させる工程を指す。任意の好都合なデータ記憶構造は、記憶される情報にアクセスするために用いられる手段に基づいて選定され得る。多様なデータプロセッサプログラム及び形式、例えばワードプロセッシングテキストファイル、データベース形式等が、記憶に用いられ得る。
【０１２０】
本明細書において使用するとき、「コンピュータに基づくシステム」とは、本発明の情報を分析するために用いられるハードウェア手段、ソフトウェア手段、及びデータ記憶手段を指す。本発明のコンピュータに基づくシステムの最小限のハードウェアは、中央処理装置（ＣＰＵ）、入力手段、出力手段、及びデータ記憶手段を含む。当業者であれば、現在使用可能なコンピュータに基づくシステムのいずれか１つは、本発明における使用に適切であることを容易に解し得る。データ記憶手段は、上記の本情報の記録を含む任意の製品、またはそのような製品にアクセスし得るメモリアクセス手段を含み得る。
【０１２１】
入力及び出力手段のための多様な構造形式を用いて、本発明のコンピュータに基づくシステムにおいて情報を入力し得及び出力し得る。そのような提示は、当業者に類似性のランキングを提供し、試験発現レパートリーに含有される類似性の程度を同定する。
【０１２２】
検索アルゴリズム及び配列分析は、ハードウェアもしくはソフトウェア、またはその両方の組み合わせで遂行され得る。本発明の１つの実施形態において、機械可読記憶媒体が提供され、当該媒体は、データを用いるための指示とともにプログラム化された機械を用いた場合に本発明のデータセット及びデータ比較のいずれかを呈示し得る、機械可読データでコード化されたデータ記憶材料を含む。一部の実施形態において、本発明は、プロセッサ、データ記憶システム（揮発性及び非揮発性のメモリ及び／または記憶素子を含む）、少なくとも１つの入力機器、及び少なくとも１つの出力機器を含む、プログラム可能なコンピュータで実行するコンピュータプログラムにおいて遂行される。プログラムコードを適用してデータを入力して、上記のような機能を果たし及び出力情報を生み出す。出力情報は、公知の仕方で１つまたは複数の出力機器に適用される。コンピュータは、例えばパーソナルコンピュータ、マイクロコンピュータ、または従来設計のワークステーションであり得る。
【０１２３】
各プログラムを、高レベルの手続きプログラミング言語またはオブジェクト指向プログラミング言語で遂行して、コンピュータシステムと通信し得る。しかしながら、プログラムは、所望の場合、アセンブリ言語または機械語で遂行され得る。いずれの場合でも、言語は、コンパイラ型言語またはインタープリタ型言語であり得る。そのような各コンピュータプログラムは、記憶媒体または機器がコンピュータによって読み取られた場合に、本明細書において記載される手順を実施するようにコンピュータを構成し及び操作するために、汎用性のまたは特殊目的のプログラム可能なコンピュータによって可読な記憶媒体または機器（例えば、ＲＯＭまたは磁気ディスケット）に記憶され得る。システムも、コンピュータプログラムで構成されたコンピュータ可読記憶媒体として遂行されると考えられ得、そのように構成された記憶媒体は、コンピュータを特異的でかつあらかじめ規定された様式で作動させて、本明細書において記載される機能を果たす。
【０１２４】
本明細書において開示される方法によって収集された配列及び他のデータを、コンピュータを介して記憶する及び／または送信する方法が、本明細書においてさらに提供される。ソフトウェア及び記憶機器を含むがそれらに限定されない任意のコンピュータまたはコンピュータ付属品を利用して、本発明を実践し得る。配列または他のデータは、ユーザーによって直接的または間接的にコンピュータに入力され得る。加えて、ＤＮＡをシーケンスするまたはＤＮＡを分析するまたはペプチド結合データを分析するために用いられ得る機器のいずれかは、データがコンピュータ及び／またはコンピュータに適合した記憶機器に転送されるように、コンピュータに連結され得る。データは、コンピュータまたは適切な記憶機器（例えば、ＣＤ）に記憶され得る。データは、当技術分野において周知の方法により、コンピュータから別のコンピュータまたはデータ収集場所にも送られ得る（例えば、インターネット、地上便、航空便）。ゆえに、本明細書において記載される方法によって収集されたデータは、任意の場所または地理的位置で収集され得、他の任意の地理的位置に送られ得る。
【実施例】
【０１２５】
実験
実施例１
腫瘍浸潤リンパ球上に発現したオーファンＴ細胞受容体に対する抗原同定
免疫系は、腫瘍に対するＴ細胞応答を開始させ得るが、しかしながら、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の抗原特異性はよく理解されていない。ＴＣＲがそれらの内因性リガンドに対して強い選好性をしばしば呈するという最近の知見を考慮して、本発明者らは、ペプチドヒト白血球抗原（ｐＨＬＡ）の酵母ディスプレイライブラリーを用いて、ヒト結腸直腸腺癌由来のＴＩＬ上に発現した「オーファン」Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の抗原をスクリーニングした。４種のＴＩＬ由来ＴＣＲは、非常に多様なｐＨＬＡ−Ａ* ０２：０１ライブラリーにおいて提示されるペプチドに対して強い選択を呈した。ＴＩＬ  ＴＣＲのうちの３種は、非変異型自己抗原に特異的であり、そのうちの２種は別個の患者腫瘍に存在し、Ｕ２ＡＦ２に由来する非変異型自己抗原に対する特異性を共有した。これらの結果は、ＴＣＲに接近可能なＭＨＣ結合ペプチドの限定された認識表面が、未知の特異性の病原性ＴＣＲに対するペプチド標的の配列の再構築を可能にするために十分な構造情報を含有することを示している。この知見は、腫瘍抗原の簡易同定を可能にしている。
【０１２６】
現在までのところ、オーファンＴＣＲの抗原特異性を判定するために、直接相互作用スクリーニングまたは組み合わせディスプレイシステムは用いられていない。本明細書で、本発明者らは、ＴＩＬに由来するＴＣＲによって認識される抗原を同定することを目標として、本発明者らの方法論を試験した（図１Ｂ）。本発明者らは、結腸直腸腺癌を有する２人のＨＬＡ−Ａ２ホモ接合型患者におけるＣＤ８+ ＴＩＬについての単一細胞Ｔ細胞表現型判定及びＴＣＲシーケンシングを適用して、酵母ディスプレイライブラリー選択から候補抗原標的を予測した（図１Ｂ）。スクリーニングされたＴＣＲのうち、４種のＴＣＲは、ＨＬＡ−Ａ* ０２：０１ライブラリーにおけるペプチド標的を単離した。これらのＴＣＲのうちの２種は配列が非常に類似しており、ペプチドの重複群に対する特異性を有し、共有された抗原特異性が暗示された。Ｕｎｉｐｒｏｔヒト参照ゲノムからの予測ペプチドに加えて、ライブラリーから単離された合成ペプチドは、関心対象のそれぞれのＴ細胞受容体を刺激した。驚くべきことに、４種の受容体のうちの３種は、非変異型自己抗原を認識した。これは、Ｔ細胞免疫応答及びそれらのクローンＴＣＲを、酵母ディスプレイライブラリーを用いた直接抗原同定法と関連付けるための原理の証明として働く。この方法論は、免疫応答によって認識される新規のがん抗原を同定する強力なツールとして働き得る。
【０１２７】
ＨＬＡ−Ａ* ０２：０１酵母ディスプレイライブラリーの設計。ＨＬＡ−Ａ* ０２：０１アレルは非常によく見られ、いくつかの集団の最高で５０％に存在する。ＨＬＡ−Ａ* ０２によって提示されるペプチドに対する結合モチーフは十分に特徴付けされており、いくつかの限られた臨床的に関連するＴＣＲが同定されている。これらの理由で、本発明者らは、潜在的ＨＬＡ−Ａ* ０２：０１制限Ｔ細胞受容体をスクリーニングするための酵母ディスプレイライブラリーを作り出した（図１Ａ）。個々の酵母は、ＨＬＡ分子に共有結合で連結したランダムなペプチドを発現し、それにより、ＤＮＡシーケンシングによるペプチド同定が可能となる（図１Ｃ）。このｐＨＬＡライブラリーは、野生型β−２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、及び単一点変異Ｙ８４Ａを有するＨＬＡ−Ａ* ０２：０１重鎖に連結されたＮ末端ペプチドライブラリーを特徴とする（ＳＴＡＲ法を参照されたい）。結合溝におけるペプチドの適正な呈示を確実にするために、ペプチドライブラリーは、Ｐ２及びＰΩにおけるアミノ酸使用法を、ＨＬＡ−Ａ* ０２：０１によって好まれる脂肪族疎水性残基に制限する（図１Ｄ〜Ｆ）。他の箇所では、ＮＮＫコドンが２０種すべてのアミノ酸をランダムにコードして、不偏的ライブラリーを提供する。ＨＬＡ−Ａ* ０２：０１は、典型的に長さが８〜１１アミノ酸のペプチドを提示するため、本発明者らは、多重
化選択のためのエピトープタグを用いて複数のペプチド長のライブラリーを作り出した（図１Ｆ）。各ライブラリーは、ライブラリーの組成及び長さによって決定付けられる理論的ヌクレオチド多様性を有するが、ライブラリーの機能的多様性は限定される（図１Ｆ）。合計で、本発明者らは、８〜１１アミノ酸に及ぶおよそ４億種の固有のペプチドが、組み合わせたライブラリーにおいて表されると推定する。
【０１２８】
ＭＡＲＴ−１特異的ＤＭＦ５  ＴＣＲを用いたライブラリーの検証。ＨＬＡ−Ａ* ０２：０１複合体が適正にフォールディングされてペプチドを提示するか否かを判定するために、本発明者らは、既知の特異性を有する「代理」ＴＣＲを用いた。本発明者らは、ＨＬＡ−Ａ* ０２：０１に結合したＭＡＲＴ−１黒色腫抗原に由来する１０アミノ酸配列（ＥＡＡＧＩＧＩＬＴＶ）（配列番号：２６７）を認識する天然に存在するＴＣＲであるＤＭＦ５  ＴＣＲを用いた。ＨＬＡ−Ａ* ０２：０１ライブラリーを検証するために、改善したＨＬＡ安定性を有する１０ｍｅｒのヘテロクリットなペプチドＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号：２６４）を酵母上にＨＬＡ−Ａ* ０２：０１とともに呈示し、抗ヘマグルチニン（ＨＡ）抗体及び４００ｎＭ四量体化ＤＭＦ５  ＴＣＲの両方によって染色し、タンパク質複合体の表面発現及びｐＨＬＡの適正なフォールディングが示された（図２Ａ）。ライブラリーを用いてＤＭＦ５  ＴＣＲの抗原を同定し得ることを確認するために、ＨＬＡ−Ａ* ０２：０１  １０ｍｅｒライブラリー（図１Ｆ）をＭＡＣＳビーズ多量体化ＤＭＦ５  ＴＣＲによって選択した（ＳＴＡＲ法、図２Ｂを参照されたい）。選択の第四のラウンドのサンプルをサンガーシーケンシングによってシーケンスして、富化されたペプチドを同定し、そのほとんどは、ＭＡＲＴ−１  １０ｍｅｒペプチドと高度に関連することが見い出された（図２Ｃ）。５つの配列をＨＬＡ−Ａ* ０２：０１とともに酵母上に個々に発現させ、４００ｎＭ  ＤＭＦ５  ＴＣＲ四量体で染色してＴＣＲ特異的結合を示し（図２Ｃ）、及び抗ＨＬＡ−Ａ* ０２で染色して複合体の立体構造的発現を示した（図８Ａ）。
【０１２９】
ＤＭＦ５  ＴＣＲによる酵母ディスプレイ選択の全ラウンドをディープシーケンスした。ライブラリーは、選択のラウンド３によって６８種の固有のペプチドに有意に収束し、そのうちの上位１０種のペプチドは、ライブラリーの９１．７％を支配した（図２Ｄ）。最も顕著な観察結果は、選択されたほとんどすべてのペプチドがＰ６においてＧｌｙ（Ｐ６Ｇ）を有し（表１）、Ｐ６Ｇ水素が結合するＣＤＲ３β  １００Ｆのための裂け目を可能にする柔軟性をＰ６Ｇが提供することを示したＤＭＦ５−ＭＡＲＴ−１／ＨＬＡ−Ａ* ０２：０１結晶構造と一致することであった。ディープシーケンシングにより、ペプチド配列の２つの主要なクラスターが明らかになった（図２Ｅ）。これらのクラスターを明確にするために、２種のペプチド間の精確なアミノ酸合致の数を同定する計量法である逆ハミング距離（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｈａｍｍｉｎｇ  ｄｉｓｔａｎｃｅ）をすべてのペプチド間で算出し、次いでスコアによってクラスター化した（図２Ｅ、表１）。２つの主要なクラスターはＰ４〜Ｐ６において分岐し、２９種のペプチドにおいて中心的「ＧＩＧ」モチーフを有し（クラスター１）、３２種のペプチドにおいて中心的「ＤＲＧ」モチーフを有した（クラスター２）。酵母ディスプレイ選択データからヒト抗原を予測するために以前用いられた方法である、潜在的ヒトペプチド標的を採点する検索行列において、クラスター１ペプチドを用いた（２０１４ＰＷＭ）。しかしながら、１０ｍｅｒライブラリーは、ライブラリーのＰ２におけるＡｌａを認めないため、Ｐ２Ａは検索行列に手作業によって含められ、１６．６７％でのＬｅｕという最も低い頻度を有するアンカーと合致した。この分析から、ヒトプロテオームからの９種のペプチドは、様々な確率的スコアでＤＭＦ５
ＴＣＲに結合すると予測された（図２Ｆ、表１）。顕著には、ヒトＭＡＲＴ−１ペプチドは、予測された９種のペプチドのうち、ＤＭＦ５  ＴＣＲに結合する可能性が最も高かった（図２Ｆ）。クラスター２を用いると、桁違いに多くのペプチドが、ＴＣＲに結合すると予測された（図８Ｂ、８Ｃ、表１）。しかしながら、ＤＭＦ５  ＴＣＲは、いかなるオフターゲット毒性も示しておらず、この他の「ＤＲＧ」ペプチドモチーフが、その調査
におけるがん患者の免疫応答において生理学的に関連していない可能性があることを示している。
【０１３０】
新抗原特異的ＴＣＲを用いたＨＬＡ−Ａ* ０２：０１ライブラリーのブラインド検証。未知の抗原特異性を有するＴＣＲの抗原を同定し得るＨＬＡ−Ａ* ０２：０１ライブラリーの能力を試験するために、本発明者らは、黒色腫患者に由来する３種のＴＣＲをスクリーニングし、すべてのＴＣＲは、新抗原に対するブラインド特異性を有した。これらの抗原は、腫瘍材料のエクソームシーケンシング、ＨＬＡ−Ａ* ０２：０１による新抗原提示の予測、及びペプチド搭載ＨＬＡ−Ａ* ０２：０１多量体による患者由来腫瘍浸潤Ｔ細胞の染色によって、独立して同定された。ＮＫＩ１、ＮＫＩ２、及びＮＫＩ３とラベルされた３種のＴＣＲを組み換えにより発現させ、それらを用いて、４つすべてのペプチド長を含有するＨＬＡ−Ａ* ０２：０１ライブラリーを選択した。
【０１３１】
ＮＫＩ２に対する選択のみが、選択のラウンド２から始まる４００ｎＭ四量体陽性の酵母を生み出し、ペプチド−ＨＬＡ−Ａ* ０２：０１ライブラリーの強い結合が示された（図３Ａ）。選択の全ラウンドをディープシーケンスし、次いでデータを、選択ラウンドごとにペプチド長に基づいて解析した（表２）。ペプチドは選択のラウンド３によって収束し、ペプチドを逆ハミング距離によってクラスター化した（図３Ｂ）。ＮＫＩ２に関する選択結果は、９ｍｅｒ、１０ｍｅｒ、及び１１ｍｅｒ配列における劇的な類似性を示した。これらのペプチド配列は、９ｍｅｒ、１０ｍｅｒ、及び１１ｍｅｒ配列においてそれぞれＰ６、Ｐ７、及びＰ８で保存されたＧｌｕを共有し、当該ペプチドは、９ｍｅｒ、１０ｍｅｒ、及び１１ｍｅｒのＰ５でプラスに帯電した残基を共有する。ＮＫＩ１及びＮＫＩ３は、四量体陽性の選択酵母を生み出さず（図３Ａ）、ディープシーケンシングも強いペプチド選択を示さなかった。
【０１３２】
ブラインド検証の一部として、ＨＬＡ−Ａ* ０２：０１によって提示されると予測される１２７種の新抗原のリストは、ＮＫＩ２  ＴＣＲに対する候補リガンドとして働いた。ＮＫＩ２によって選択される１０ｍｅｒ合成ペプチドのリストと比較して、これら１２７種の潜在的新抗原ペプチドのそれぞれに対して、逆ハミング距離を算出した（図３Ｃ）。サイクリン依存性キナーゼ４（ＣＤＫ４）に由来するペプチド新抗原であるＡＬＤＰＨＳＧＨＦＶ（配列番号：２６５）は、ライブラリーペプチドＬｉｂ−１及びＬｉｂ−２と同一である１０箇所のうち、それぞれ５箇所及び６箇所を有した（図３Ｄ）。ＣＤＫ４を正しく同定し、ＮＫＩ２の新抗原標的として確認した。ＮＫＩ１及びＮＫＩ３の標的は、このブラインド検証を通して明確に同定され得なかった。ＮＫＩ１は、同じＣＤＫ４新抗原に特異的であり、ＮＫＩ３は、ＧＣＮ１Ｌ１新抗原ＡＬＬＥＴＰＳＬＬＬ（配列番号：２６８）に特異的である。標的同定の欠如の理由は、後に考察されている。
【０１３３】
本発明者らは、ｐＨＬＡライブラリーから単離されたこれらの合成ペプチドがＮＫＩ２によって特異的に認識されることを確証した。本発明者らは、次に、それらがＮＫＩ１またはＮＫＩ２発現Ｔ細胞のいずれかを刺激し得るかどうかを問うた。ヒト末梢血リンパ球にＮＫＩ１またはＮＫＩ２のいずれかを形質導入し、ＮＫＩ２によって選択された上位５種のペプチドのそれぞれを搭載したＨＬＡ−Ａ* ０２：０１+ ＪＹ細胞とともに共培養した。興味深いことに、５種すべてのペプチドが、ＮＫＩ２を形質導入されたＴ細胞によるＩＦＮγ産生を用量依存的様式で引き出した（図３Ｆ）。さらに、最上位の選択されたペプチドミモトープＡＬＤＳＲＳＥＨＦＭ（配列番号：２６９）は、ＣＤＫ４新抗原ＡＬＤＰＨＳＧＨＦＶそれ自体と同じくらい強力にこれらの細胞を刺激した。ＮＫＩ２による５番目に最も選択されたペプチドは、ＮＫＩ１受容体を用量依存的様式で刺激し、重複する特異性が示された。
【０１３４】
結腸直腸癌患者における腫瘍浸潤リンパ球の単一細胞特徴付け。本発明者らの究極の目
標は、酵母ディスプレイプラットフォームを用いて、患者腫瘍に浸潤する拡張されかつ細胞傷害性のＴ細胞集団に由来するＴＣＲに対するペプチドリガンドを同定することである（図１Ｂ）。Ｔ細胞を分析するための単一細胞技術は、単一Ｔ細胞を個々に表現型判定する、及びそれらの対合したαβＴＣＲをハイスループット様式でシーケンスする手段を提供する。
【０１３５】
本発明者らは、ＨＬＡ−Ａ* ０２アレルに関してホモ接合型の患者を選択した（図４Ａ）。これは、患者から単離されたＴ細胞が、ＨＬＡ−Ａ* ０２アレルに制限された受容体を有する確率を向上させるが、それは、このＴＣＲが、他の古典的または非古典的に制限された抗原に対する特異性を有し得る可能性を除外しない。全ＨＬＡ遺伝子座を、ＨＬＡ−Ｃなしの両患者に対してタイプ分けした（表３）。ＨＬＡ−Ａ* ０２：０１及びＨＬＡ−Ａ* ０２：０６は、βシートフロアにおけるＦ９Ｙ置換だけ異なり、それはＴＣＲ認識に影響を及ぼす可能性は低い。これらの部分アレルは、提示され得るペプチド抗原の部分集合を共有することが記載されているが、とはいえ差異はｐＨＬＡのＴＣＲ多量体染色の個別のパターンになり得る。
【０１３６】
両患者は、結腸直腸腺癌を有する６０代半ばの男性であった（図４Ａ）。腫瘍の組織サンプルを、ＣＤ８+ 及びＣＤ４+ Ｔ細胞の浸潤について分析し、全体構造をＨ＆Ｅ染色によって観察した（図９Ａ）。患者Ａに関して、ＣＤ４+ 及びＣＤ８+ Ｔ細胞は、結腸の固有層に見い出されたが、腫瘍においてはそれほどではなかった。患者Ｂに関して、ＣＤ４+ Ｔ細胞は、結腸組織内で豊富ではなかったが、しかしながら、腫瘍内への有意なＣＤ８+ Ｔ細胞浸潤があった。
【０１３７】
これら２人の患者から、数百個のＣＤ８+ Ｔ細胞を表現型判定し、健常組織由来の５３対の配列及び腫瘍組織由来の７０９対の配列とともに、腫瘍の部位からシーケンスした（図４Ｂ）。腫瘍の部位において１回を上回って見られる任意のクローンは、拡張されたクローンと見なされる。両症例において、拡張されたＴＣＲクローンが腫瘍に存在し、抗原特異的な拡張が示唆された。最も拡張されたＴＣＲクローンは、それぞれ、患者Ａにおいてシーケンスされた集団の１２．９％（２３／１７８）及び患者Ｂにおいて６．６７％（３５／５２６）を構成した。腫瘍における拡張のこのレベルは、原発性肝臓癌及びＣＤ４+ Ｔ細胞浸潤結腸直腸癌におけるＴ細胞レパートリー集団についての他の報告と一致している。多くのＴ細胞が健常組織から同定されたわけではないため、クローンは腫瘍に限られると考えられ、αまたはβ鎖のいずれかが共有されない場合、健常組織と共有されなかった。両患者に関して、α及びβ鎖配列の両方は、腫瘍及び健常組織の間で配列のほんのわずかな重複を示した（図４Ｃ）。このことは、腫瘍により推進される応答の結果として、ほとんどのＴＩＬ  Ｔ細胞クローンが腫瘍において富化され及び存在することを示唆するが、しかしながら、健常組織の限定されたサンプリングに起因して、本発明者らは、任意のＴＩＬ  ＴＣＲが腫瘍内にだけ存在すると結論付けることはできない。
【０１３８】
患者からシークエンスされたＴ細胞受容体は、典型的なＣＤＲ３α及びＣＤＲ３β長を呈した（図９Ｂ）。両患者は、ＴＲＡＶ８−３、ＴＲＡＶ１９（図９Ｃ）、及びＴＲＢＶ７−２（図９Ｄ）発現の優位性を有した。患者Ａ由来のＴ細胞とは異なり、患者Ｂ由来のＴ細胞を、細胞表面マーカー発現と転写産物発現とのペアリングを可能にするインデックスソーティングによって分析した。ｔ−分布型確率的近傍埋め込み法（ｔ−ＳＮＥ）を用いて、細胞表面マーカー及び転写プロファイルに基づいてＴ細胞集団を分離する場合、ＣＤ８+ 及びＣＤ４+ Ｔ細胞集団は主要クラスターに分かれた（図９Ｅ）。患者Ｂに関して、腫瘍内への有意なＣＤ８+ Ｔ細胞浸潤があり、サンプリングされた細胞の大多数は、グランザイムＢ、パーフォリン、及びＴＮＦ−αという他の細胞毒性マーカーの異種発現とともにＰＤ−１及びＩＦＮγを共発現した。ＰＤ−１+ ＣＤ８+ Ｔ細胞集団は腫瘍反応性集団であることが示唆されている。
【０１３９】
ＨＬＡ−Ａ* ０２：０１ライブラリーでのオーファンＴＣＲのスクリーニング。腫瘍における局所的拡張、細胞毒性プロファイル（ＩＦＮγ、ＴＮＦα、パーフォリン、グランザイムＢ）に基づいて、及びある場合には共通のＴＣＲ鎖使用法に基づいて、２０種の候補受容体を選定した（図４Ｂ、４Ｄ）。ＨＬＡ−Ａ* ０２：０１ライブラリーでスクリーニングされた２０種の候補ＴＣＲ（表４）のうち、患者Ａに由来するＴＣＲ１Ａ及び２Ａならびに患者Ｂに由来するＴＣＲ３Ｂ及び４Ｂという４種のＴＣＲは、ライブラリーからペプチドを富化した（図５Ａ）。興味深いことに、別個の患者から単離された２種の受容体２Ａ及び３Ｂは、同じＴＣＲα鎖及び類似のＴＣＲβ鎖を発現し、それは、５個の保存的アミノ酸の差異及びＮＰ付加によって完全に生成される中心Ｖａｌ残基を有する、同じ長さのＣＤＲ３β配列を含有する（図５Ｂ）。
【０１４０】
各ＴＣＲをＨＬＡ−Ａ* ０２：０１ライブラリーでスクリーニングした。４種のＴＣＲのそれぞれは、酵母によって発現されたＨＬＡ連結エピトープタグを富化し、一方で残り１６種のＴＣＲはそうでなかった（図５Ｃ）。ＴＣＲ１Ａ、２Ａ、及び３Ｂに関して、四量体染色された酵母は、選択のラウンドにわたって次第に増加した。しかしながら、ＴＣＲ４Ｂは、９ｍｅｒエピトープタグの連続的富化にもかかわらず、酵母を染色しなかった（図５Ｃ）。残り１６種のＴＣＲの富化の欠如の理由は、考察において探られる他の可能性とともに、代替的ＨＬＡアレルへのＨＬＡ制限である可能性が最も高い。
【０１４１】
ＴＣＲ１Ａ、２Ａ、３Ｂ、及び４Ｂによって選択された酵母をディープシーケンスした（表４）。４種すべてのＴＣＲに関して、選択のラウンド３によって収束した配列及び固有のペプチド配列を用いて、ペプチドモチーフを作り出して、箇所的ホットスポットを同定した（図６Ａ）。高度に類似したＴＣＲ２Ａ及び３Ｂを、関連するペプチド配列に対して選択し、そのうちの１１種は両方に共通していた（図６Ｃ）。ペプチドの共通プールの選択は、これらのＴＣＲが同じ抗原を認識することを示唆する。しかしながら、ＴＣＲ２Ａに関して不変のＡｓｎならびにＴＣＲ３Ｂに関して優位なＡｓｎ、Ｇｌｕ、及びＳｅｒを有して、Ｐ６においてこれら２つのモチーフの間には有意な差異が見られる。一般的に、ＴＣＲ２Ａは、ＴＣＲ３Ｂによって選択される６６種の固有のペプチドにおいてよりも、より多くのアミノ酸置換を認める箇所Ｐ１、Ｐ４、及びＰ５を有する１９０種の固有のペプチドを選択するより広い程度の交差反応を呈示する。ＴＣＲ１Ａ及び４Ｂは、選択の第三のラウンドでそれぞれ選択された１５種及び６１種の固有のペプチドを有して、全く異なるモチーフを有する。
【０１４２】
Ｔ細胞受容体の交差反応を測定する１つの方法は、ペプチドの特定の箇所における許容されるアミノ酸の選択幅を観察することである。これを行うために、本発明者らは、あらゆる箇所におけるすべてのアミノ酸の割合を決定し、ラウンド３におけるペプチド富化を説明した（図６Ｂ）。ＴＣＲ１Ａ及び３Ｂは、箇所あたりのアミノ酸選好性においてより硬直性を有して、それらのペプチドモチーフに比較的特異的である。対照的に、ＴＣＲ２Ａ及び４Ｂは、それらの特異性においてより交差反応性であり、限定されたアンカー残基を除いて、ペプチドに沿った箇所において縮重を認める。２Ａと３Ｂとの間のアミノ酸配列の密接な類似性にもかかわらず、ＴＣＲは、それらのペプチド形状に対する交差反応において高い対比を呈示する。この点において、ｐＨＬＡライブラリースクリーニングは、ＴＣＲの相対的交差反応を「測定する」ことにおいて有効であり、それは、自己反応性を限定するために限定された交差反応が望ましくあり得る養子細胞療法のためのＴＣＲの選択にとって重要であり得る。
【０１４３】
ヒトプロテオーム及び患者エクソームからのＴＣＲ標的予測。酵母ディスプレイ選択において同定されたペプチドは、各ＴＣＲに対して配列の認識形状を作り出す。２０１４ＰＷＭを用いてＤＭＦ５  ＴＣＲに対してなされたように、この情報をアルゴリズムにおい
て用いて、刺激性ヒト抗原を予測し得る。アルゴリズムを結腸直腸癌データに適用する際に、本発明者らは、ＴＣＲ２Ａに対してヒト予測を生み出したが、ＴＣＲ１Ａ及びＴＣＲ３Ｂに対しては予測を出さず、ＴＣＲ４Ｂに対しては限られた予測を出した。このことは、以前の統計的方法の改変されたバリアント（２０１７ＰＷＭ）、及び二層畳み込みニューラルネットワークを利用した方法（２０１７ＤＬ）という、選択データからヒトペプチドを予測する２つの付加的な方法の開発の動機になった（ＳＴＡＲ法を参照されたい）。ＤＲ１５ライブラリーを用いた以前の選択からのデータを用いて、ペプチド抗原を予測することにおける２０１７ＰＷＭ及び２０１７ＤＬアルゴリズムの正確性を試験した。ＭＢＰは、ＴＣＲ  ＯＢ１．Ａ１２に対する２０１７ＤＬを用いた最善の予測、２０１７ＰＷＭを用いた次善の予測であり、ＴＣＲ  ＯＢ１．２Ｆ３に対する両アルゴリズムにおける次善の予測であった。
【０１４４】
２つの付加的なアルゴリズムを用いて、ＵｎｉＰｒｏｔデータベースを用いたヒトプロテオームからの予測ペプチドを採点した。ＴＣＲ２Ａ及び３Ｂに関して、両ＴＣＲに対する複数のアルゴリズムによって予測された多くのペプチドが存在し、共有される標的特異性が示された。全体として、３つのアルゴリズムは、４種すべてのＴＣＲに対して、ヒトプロテオームから集合的に予測することができた。
【０１４５】
患者変異は、Ｔ細胞によって認識される新抗原を生み出し得るため、本発明者らは、エクソームシーケンシング及びバリアントコールを実施して、潜在的候補を同定した。健常及び腫瘍組織の両方に対して少なくとも３０×シーケンシング被覆率を用いて、合計で、７６２種のＰＡＳＳバリアントが患者Ａにおいて同定され、４，７６３種のＰＡＳＳバリアントが患者Ｂにおいて同定された。エクソームペプチドを２０１７ＰＷＭ及び２０１７ＤＬアルゴリズムによって採点したが、ＴＣＲにわたって有意なものはほとんどなかった。１つの例外は、同じＷＤＲ６６遺伝子のイントロンからエクソン７への２１ヌクレオチド転座であり、それは、たとえあったとしてもそれがほとんど提示されないという結果をもたらす準最適なＨＬＡアンカーを有するにもかかわらず、患者Ａにおいて新抗原ペプチドを生み出した。これは、患者Ａ由来ＴＣＲ１Ａに対するペプチドモチーフと密接に合致する、新規のペプチド配列ＥＹＧＶＳＹＥＷ（配列番号：２７０）をもたらした。全体として、４種のＴＣＲに対する予測は、当該４種のうちの３種が、非変異型自己抗原に結合する可能性が高いことを示唆する。
【０１４６】
合成の及び予測されたヒトペプチドのインビトロ標的検証。ライブラリーから選択された合成ペプチド、ならびにヒト及び／またはエクソームからの予測されたヒトペプチドの両方を、患者から同定された４種のＴＣＲを発現するように改変されたＳＫＷ−３  ＣＤ８+ Ｔ細胞株を刺激するために用いられるＴ２細胞によって提示した。興味深いことに、ＴＣＲ１Ａによって選択された合成ライブラリーペプチドはすべて、ＣＤ６９活性化を介して（図７Ａ、図１０Ａ）及び用量依存的様式で（図７Ｂ）、Ｔ細胞を強力に刺激した。ＴＣＲ１Ａに関して、エクソームペプチド（ＥＹＧＶＳＹＥＷ）（配列番号：２７０）も、アンカー改変されたエクソームペプチド（ＥＭＧＶＳＹＥＭ）（配列番号：２７１）も、またはヒトペプチド予測も、細胞株を刺激しなかった（図７Ａ）。本発明者らは、ＴＣＲ１Ａに対する強い抗原認識モチーフを同定したものの、本発明者らは、刺激性内因性抗原であるミモトープのみを復元することができていない。
【０１４７】
３種のＴＣＲ２Ａ、３Ｂ、及び４Ｂに対して（図７Ｃ〜Ｈ）、本発明者らは刺激性内因性抗原を同定することができた。ＴＣＲ４Ｂは、その選択された合成ペプチドライブラリーによって刺激され、予測されたヒトペプチドの６／１９によっても刺激され、それは、酵母選択ディープシーケンシング分析において見られるより高い程度の交差反応と一致している（図７Ｇ、７Ｈ、図１０Ｄ）。興味深いことには、本発明者らは、ＴＣＲ４Ｂが、結腸直腸癌において再発的に変異することが見い出された精巣発現抗原であるＷＤＲ８７
1310-1318 （ペプチドＬＬＥＤＬＤＷＤＶ）（配列番号：２７２）、及び公知の機能を有しない、多くのがんにおいて発現されるタンパク質であるＣＲＩＳＰＬＤ１82-90 （ペプチドＮＭＥＹＭＴＷＤＶ）（配列番号：２７３）という２種の異なる推定ドライバー遺伝子由来の抗原によって刺激されることを知る。システインリッチな分泌タンパク質、抗原４、及び病原性関連１タンパク質（ＣＡＰ）スーパーファミリーはＣＲＩＳＰＬＤ１を含み、これらのタンパク質は、イオンチャネル調節、生殖、がん、細胞−細胞接着等を含めた広範な機能に関与している。エクソーム分析から、患者Ｂは、ＣＲＩＳＰＬＤ１においてＤ１４３Ｙで変異を有する。ＴＣＲ４Ｂは、ＣＤ７４181- 189 ペプチドＴＭＥＴＩＤＷＫＶ（配列番号：２７４）、ＦＡＮＣＩ1104-1112 ペプチドＶＬＥＥＶＤＷＬＩ（配列番号：２７５）、ＧＥＭＩＮ４771-779 ペプチドＫＬＥＱＬＤＷＴＶ（配列番号：２７６）、ＰＤＥ４ａ243- 251 ペプチドＴＬＥＥＬＤＷＣＬ（配列番号：２７７）またはＰＤＥ４ｂ231- 239 ペプチドＴＬＥＥＬＤＷＣＬ（配列番号：２７７）、及びＫＬＨＬ７506-514 ペプチドＮＶＥＹＹＤＩＫＬ（配列番号：２７８）を含めた、他の５種のヒト抗原によっても刺激される。真のインビボ特異性は、付加的な腫瘍情報なしでは明確に同定され得ない。
【０１４８】
高度に類似したＴＣＲ２Ａ及び３Ｂは、選択された合成ペプチドに対して異なる刺激プロファイルを有する（図７Ｃ〜Ｆ、図１０Ｂ〜Ｃ）。ＴＣＲ２Ａ細胞を、ＴＣＲ２Ａによって選択された上位５種のペプチドのうちの４種、及びＴＣＲ３Ｂによって選択された上位５種のペプチドのうちの４種によって刺激した。しかしながら、ＴＣＲ３Ｂ細胞は、それ自身のＴＣＲによって選択された上位５種のペプチドのうちの４種によってのみ刺激され、ＴＣＲ２Ａによって選択されたもののどれによっても刺激されなかった。これらの結果は、ＴＣＲ３Ｂが、ＴＣＲ２Ａと比較して相対的に選択的であるという知見を支持する（図６Ｂ）。顕著には、予測から試験された２６種のヒトペプチドのうち（表６）、たった１種のヒトペプチドが、いずれかの受容体を持つＴ細胞を刺激することが見い出された（図６Ｃ、６Ｅ）。このペプチドはＭＭＤＦＦＮＡＱＭ（配列番号：２７９）であり、それは、ＲＮＡスプライシング複合体に関与するタンパク質であるＵ２ＡＦ２174-182 に由来する。Ｕ２ＡＦ２は、通常多くのヒト組織において発現し、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｔｌａｓに寄託された抗体染色によって判定されるように、結腸直腸癌を含めた多くのがんにおいて過剰発現する。実際、Ｕ２ＡＦ２  ＲＮＡは、患者Ａ及び患者Ｂにおいて、健常組織よりも腫瘍組織においてそれぞれ２．１１倍及び２．６５倍過剰発現した（図１１Ａ）。ヒトリンパ腫、乳房、結腸、及び肺腫瘍細胞株を調べた場合、Ｕ２ＡＦ２  ＲＮＡは、患者サンプルと比べて有意に過剰発現している（図１１Ｂ〜Ｃ）。Ｕ２ＡＦ２は、黒色腫における腫瘍転移の促進に関与しており、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、及び肺腺癌のような固形腫瘍において滅多に変異しない。Ｕ２ＡＦ２の結合パートナーであるＵ２ＡＦ１は、がんにおいて変異することが多く、変異はＲＮＡスプライシング及びエクソンスキッピングを増強し、インビトロで遺伝子調節異常につながることが示されている。両患者において、Ｕ２ＡＦ２またはＵ２ＡＦ１において変異は見い出されなかった。ＴＣＲ３Ｂと比較してより交差反応性のＴＣＲ２Ａに関して、タンパク質ＴＸＮＤＣ１１107-115 に由来する付加的なヒトペプチド（配列番号：２８０）ＶＬＤＦＱＧＱＬは、がんに関与することは以前に記載されていないが結腸及び他の多くの組織タイプにおいて発現される受容体を刺激し得た。
【０１４９】
本発明者らは、ＨＬＡ−Ａ* ０２：０１によって呈示されるペプチドＭＭＤＦＦＮＡＱＭ（配列番号：２７９）に対するＴＣＲ２Ａのアフィニティーが１１０μＭであることを表面プラズモン共鳴によって決定し、真正の相互作用が同定された（図１１Ｄ〜Ｅ）。アフィニティーは、ＴＣＲ３Ｂに対して決定され得なかった。これらの低いアフィニティーは、一本鎖ＭＭＤＦＦＮＡＱＭ−ＨＬＡ−Ａ* ０２：０１（配列番号：２８１）を発現する酵母のＴＣＲ四量体染色の欠如を部分的に説明し得る（図１０Ｆ〜Ｇ）。刺激対四量体結合のこれら不一致の結果は、調査されたすべてのＴＣＲにわたって見られる（図１０Ｅ
〜Ｈ）。逆に、ＭＭＤＦＦＮＡＱＭ−ＨＬＡ−Ａ* ０２：０１（配列番号：２８１）四量体は、ＴＣＲ２ＡまたはＴＣＲ３Ｂのいずれかを発現するＳＫＷ−３細胞を染色し得なかった。残念ながら、質量分析によってＨＬＡ−Ａ* ０２によるペプチド提示を確認するための組織サンプルは入手不能であった。本発明者らは、Ｕ２ＡＦ２に由来するペプチドを標的にする免疫応答を断定的に決定し得ないものの、酵母ディスプレイスクリーニング、予測アルゴリズム、及びインビトロ刺激からの証拠は、このペプチドを有力な標的として同定する。これらの結果は、ｐＨＬＡライブラリーがＴＣＲの抗原特異性を同定し得、２人の患者にわたって共有される特異性が同定されたという原理の証明として働く。ｐＨＬＡライブラリーは、ペプチド抗原に対する相対的交差反応も正しく区別し得る。
【０１５０】
本発明者らの調査からの根本的に驚くべき洞察は、ＴＣＲにとって可視のＭＨＣ結合ペプチドの小さな認識カーネルにおいてコードされる特異性が、未知の特異性のＴＣＲに対する内因性ペプチドの配列全体の再構築を可能にするために十分であるということである。この知見は、Ｔ細胞媒介性疾患における抗原の同定にとって重要な意味合いを有する。Ｔ細胞は、感染性疾患、自己免疫、アレルギー、及びがんにおける治療的処置の道を提供する。これらのほとんどにおいて、本発明者らは、限定された方法が理由で、とりわけヒトにおけるＴ細胞特異性についての情報をほとんど有していない。この状況は、単一Ｔ細胞からＴＣＲ配列をエクスビボで直接獲得するハイスループット法を使用できることによって進歩しているが、ペプチドリガンド（複数可）を決定するという困難な仕事に依然として直面する。本明細書で、本発明者らは、単一細胞ＴＣＲ分析法と酵母ディスプレイライブラリースクリーニング手法の洗練型とを組み合わせて、ヒト結腸直腸腺癌における新規のｐＨＬＡ特異性を発見する。これは、がんにおけるＴ細胞特異性についての本発明者らの理解にとって大きな意味合いを有し、他の疾患に適用され得る。
【０１５１】
本発明者らの知る限りでは、これは、コンビナトリアル生物学スクリーニング技術を用いたＴＣＲリガンド同定の最初の例であり、３種のＴＣＲが、がんにおいて役割を担う野生型抗原に特異的であることが見い出された。Ｕ２ＡＦ２に由来する単一の野生型抗原は、調査された２／２の患者において共有される免疫応答標的である可能性が高い。ＨＬＡ−Ａ* ０２ライブラリーでスクリーニングに成功したすべてのＴＣＲに関して、本発明者らは、しばしば天然ペプチドよりも強力にこれらのＴＣＲを刺激する複数のミモトープペプチドを同定することができた。新抗原と同様に、合成ペプチド抗原またはミモトープは、特定の抗原特異的Ｔ細胞を刺激するＤＮＡ、ＲＮＡ、またはペプチドワクチンとしての実用性を有し、それに対して免疫応答が寛容である可能性が高い自己抗原よりも多くの免疫原性応答を生み出す。
【０１５２】
ディープシーケンシング選択データから同族腫瘍抗原を予測することの成功は、改善されかつ洗練された検索アルゴリズム及び患者組織検証に依存する。加えて、所定の腫瘍から多数のＴＣＲをスクリーニングすることは、とりわけＲＮＡ発現及び／または溶出されたペプチドの質量分析を含めた関連する患者データにつなげた場合、選択データを同族抗原に関連付けする確率を増加させ得る。
【０１５３】
１）オーファンＴＣＲに対する内因性及びミモトープリガンドを同定するために、及び／または、２）ペプチド抗原特異性に基づいてＴＣＲを分類する手段として、２つの主たる適用が免疫療法における本方法に使用可能であり、それは、患者にわたって共有される抗原を認識する臨床的候補ＴＣＲの同定を可能にする。共有されるＴＣＲは、共有される抗原特異性に潜在的につながり得る類似のＴＣＲ配列を共有する受容体、またはいかなる共有配列も有しないが同じ抗原を認識するＴＣＲのいずれかであり得る。共有される抗原を認識するそのようなＴＣＲは、操作されたＴ細胞またはワクチン療法においてとりわけ有用である。ＴＣＲシーケンシングは進歩し続け、より多くのＴＣＲシーケンシングデータが使用可能になるにつれて、本発明者らは、患者ＨＬＡに対するＴＣＲ制限を推測し得
、収束性ＴＣＲ配列クラスターに対する共通のＴＣＲ特異性を推測し得る。これにより、ＴＣＲリガンド同定を、公知のＨＬＡ制限を有する影響力のあるＴＣＲにより有効に向けることが可能となる。
【０１５４】
エクソームデータを利用して、Ｔ細胞免疫応答の潜在的標的として働き得る患者特異的新抗原を同定する他の方法とは異なり、本方法は、ＴＣＲとｐＨＬＡとの間の物理的相互作用に依存する目下の免疫応答のＴＣＲ特異性についての不偏的取り調べである。このリガンド同定法は、低い変異量を有し、新抗原標的が野生型抗原と比較して普及していない可能性があるがんにおいてとりわけ重要であり得る。本発明者らは、臨床的に重要なＴＣＲ及び新規の抗原を同定するための手段を提供し得る、ＴＣＲを脱オーファン化する酵母ディスプレイライブラリーの使用を改善する方法論を開発した。本発明者らは、結腸直腸腺癌を有する２人の患者におけるＴＩＬの脱オーファン化のためのツールとしてＨＬＡ−Ａ* ０２：０１ライブラリーを検証した。本発明者らは、潜在的治療価値がある野生型抗原に対する共有される応答とともに、これらの患者免疫応答の標的として野生型抗原を主に同定した。
【０１５５】
ＳＴＡＲ法
実験モデル及び対象詳細
ヒト対象。両者ともに結腸直腸腺癌を有する、６４歳及び６６歳の２人の男性対象。スタンフォード大学施設内倫理委員会は、ヒト組織及び血液の回収のためのすべてのプロトコールを承認した。患者サンプルを、スタンフォード病院における病理学部門から患者同意と合わせて獲得した。両患者は、ＨＬＡ−ＣなしのＨＬＡ型であり、彼らのＨＬＡ−Ａ* ０２アレル発現に対して特異的に選定された。
【０１５６】
初代及び細胞株。別様に記述されていない限り、すべての細胞を５％ＣＯ2 を有する３７℃で成長させる。
【０１５７】
ヒトＰＢＭＣを、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ならびに５０Ｕ／ｍＬペニシリン及びストレプトマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を含有するＲＰＭＩ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）中で培養した。ＳＫＷ−３細胞はヒトＴ細胞白血病に由来し、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ
Ｌ−グルタミン、ならびに５０Ｕ／ｍＬペニシリン及びストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ中で培養される。形質導入された細胞を、付加的な１ｕｇ／ｍＬピューロマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）及び２０ｕｇ／ｍＬゼオシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）とともに培養する。Ｔ２細胞は、ＳＫＷ−３細胞に対する抗原提示細胞として用いられるＨＬＡ−Ａ* ０２陽性細胞である。それらを、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、ならびに５０Ｕ／ｍＬペニシリン及びストレプトマイシンを有するＩＭＤＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）中で培養した。ＪＹ細胞は、１０％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン、ならびに５０Ｕ／ｍＬペニシリン及びストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ中で培養されるＥＢＶ不死化Ｂ細胞株である。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、ならびに５０Ｕ／ｍＬペニシリン及びストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）中で成長させる。ＦＬＹＲＤ１８を、５０Ｕ／ｍＬペニシリン及びストレプトマイシンとともに２ｍＭグルタミンとともに１０％ＦＢＳを有するＤＭＥＭ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ中で成長させる。
【０１５８】
ＥＢＹ１００酵母細胞を、ｐＨ４．５で１リットルのＨ2 Ｏあたり２０ｇデキストロース、６．７ｇ  Ｄｉｆｃｏ酵母窒素原（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、５ｇ  Ｂａｃｔｏカザミノ酸（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、１４．７ｇクエン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、４．２９ｇクエン酸一水和物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃ
ｈ）を含有するＳＤＣＡＡ、またはデキストロースをガラクトースで置き換えるＳＧＣＡＡのいずれかの中で成長させる。酵母を、大気ＣＯ2 で、ＳＤＣＡＡ中３０℃にてまたはタンパク質誘導のためのＳＧＣＡＡ中２０℃にて成長させる。
【０１５９】
Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ細胞を、大気ＣＯ2 で２７℃にて、最終濃度１０ｍｇ／Ｌの硫酸ゲンタマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を有するＩｎｓｅｃｔ  Ｘ−ｐｒｅｓｓ培地（Ｌｏｎｚａ）中で成長させる。ＳＦ９細胞を、大気ＣＯ2 で２７℃にて、１０％ＦＢＳ及び最終濃度１０ｍｇ／Ｌの硫酸ゲンタマイシンを有するＳＦ９００−ＩＩＩ血清不含培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）中で成長させる。
【０１６０】
酵母ディスプレイライブラリーの調製及び選択。ケミカルコンピテントＥＢＹ１００酵母（ＡＴＣＣ）を用いて、以前に報告されるように（Ｂｉｒｎｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）酵母ディスプレイライブラリーを作り出した。簡潔には、選定されたコドンセットをコードするプライマーを用いて、ＤＮＡによりコードされるペプチドライブラリーを作り出した。ペプチドのＰ２及びＰΩにおけるアンカー箇所は、それぞれＬｅｕ−Ｍｅｔ及びＬｅｕ−Ｍｅｔ−Ｖａｌへの限定されたコドン使用法を有し、一方で他のすべての箇所ではＮＮＫコドン多様性が認められた（図１Ｅ、表８）。別個の長さのライブラリーは、異なる長さのコドンセット、及び多重化選択のための固有のエピトープタグ（８ｍｅｒ−Ｖ５タグ、９ｍｅｒ−ｍｙｃタグ、１０ｍｅｒ−ＨＡタグ、１１ｍｅｒ−ＶＳＶタグ）を用いたベクターをコードする。酵母上にペプチド／ＨＬＡ−Ａ* ０２：０１複合体を呈示するために、ＨＬＡ−Ａ* ０２：０１の重鎖をＹ８４Ａ変異で改変し、重鎖をＳ３０２で切り取った。この変異は、リンカーのための開口部が、Ｂ２Ｍまで、ペプチド結合溝の末端を通ってペプチドのＣ末端の間を通り抜けることを可能にして、一本鎖三量体を生成する。膜貫通的に切り取られた重鎖を、酵母ディスプレイのために、Ａｇａ２ｐタンパク質に連結されたエピトープタグに連結させる。酵母ライブラリーの多様性を、限界希釈後のコロニーカウントによってエレクトロポレーション後に判定した。
【０１６１】
酵母を１０×多様性の個々の長さのライブラリーで混合し、２％グリセロール及び０．６７％酵母窒素原中で−８０℃にて凍結した。ライブラリーを、必要に応じてＳＤＣＡＡ
ｐＨ４．５中で融解し、継代し、ＳＧＣＡＡ中で誘導し、その後、ストレプトアビジンをコーティングされた磁気ＭＡＣＳビーズ（ＳＡｂ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）に共役したビオチン化可溶性ＴＣＲを用いて、以前に記載されるように（Ｂｉｒｎｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）選択した。簡潔には、４つすべての長さのライブラリーを含有する酵母の１０×多様性（４×１０9 個細胞）を、１０ｍＬのＰＢＳ＋０．５％ウシ血清アルブミン及び１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ＰＢＥ）中で、４℃で１時間、２５０μＬ  ＳＡｂを用いて陰性選択した。酵母を、磁気スタンド（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）に取り付けられたＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）に通し、３回洗浄した。次いで、素通りを、４００ｎＭビオチン化ＴＣＲとともに４℃で１５分間プレインキュベートされた２５０μＬ  ＳＡｂとともに４℃で３時間インキュベートした。再度、酵母をＬＳカラムに通し、溶出物を、ＳＤＣＡＡ洗浄後に、ＳＤＣＡＡ  ｐＨ４．５中で一晩成長させた。酵母がＯＤ＞２に達したら、付加的選択の前に、それらを、１０％ＳＤＣＡＡを有するＳＧＣＡＡ中で２〜３日間誘導した。その後のすべての選択を、５００μＬのＰＢＥ中５０μＬ  ＳＡｂまたはＴＣＲをコーティングされたＳＡｂを用いて行った。５００ｕＬ  ＰＢＥ中４００ｎＭ  ＳＡ−６４７との酵母の１時間のインキュベーション、それに続くＰＢＥ洗浄、及び５０μＬの抗Ａｌｅｘａ６４７マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）との２０分間のインキュベーションの後、第四のラウンドを、陰性選択を用いて行った。４００ｎＭ  ＳＡ−６４７  ＴＣＲ四量体との３時間のインキュベーション、それに続く抗Ａｌｅｘａ６４７マイクロビーズとの２０分間のインキュベーションの後、陽性選択を行った。ナイーブライブラリー及び選択の全ラウンドを、下で記載されるディープシーケンシングのために処理した。誘導後に各ラウンドを抗エピトープ染色でモニターし、４００ｎＭ  ＴＣＲ四量体染色を３時間４
℃で完了した。
【０１６２】
選択から単離された個々の酵母クローン、またはディープシーケンシングから同定されて再構築されたペプチド−ＨＬＡ構築物をエレクトロポレーションされたコンピテント酵母を、抗エピトープタグと組み合わせて、ＳＡ−６４７で標識された４００ｎＭ  ＴＣＲ四量体またはＳＡ−６４７単独で染色した。
【０１６３】
ｐＨＬＡライブラリーのディープシーケンシング。選択のラウンドあたり５×１０7 個酵母からＤＮＡをミニプレップによって単離した（Ｚｙｍｏｐｒｅｐ  ＩＩキット、Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）。個々のバーコード及びランダムな８ｍｅｒ配列を、シーケンシング産物の隣接領域にＰＣＲによって付加し、２５サイクルで増幅した（表８）。これらのプライマーは、構築物のシグナルペプチドからＢ２Ｍの配列半ばまで増幅した。この後に、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ｃｈｉｐプライマー配列を付加する付加的ＰＣＲ増幅が続いて、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｐ５−Ｔｒｕｓｅｑリード１−（Ｎ8 ）−バーコード−ｐＨＬＡ−（Ｎ8 ）−Ｔｒｕｓｅｑリード２−ｌｌｌｕｍｉｎａ  Ｐ７を生成した。ライブラリーをアガロースゲル精製によって精製し、ｎａｎｏｄｒｏｐ及び／またはＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）によって定量し、低多様性ライブラリーのための２×１５０  Ｖ２キットを用いたＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｍｉｓｅｑシーケンサーによってディープシーケンスした。
【０１６４】
可溶性ＴＣＲの発現。Ｆ５  ＴＣＲの各鎖をＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）において別個に発現させ、精製し、リフォールディングさせ、機能的検証した。他のすべてのＴＣＲに関しては、ＴＣＲの各鎖をＳＦ９細胞を用いて別個に発現させて、ｐＡｃＧＰ６７ａベクター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）においてバキュロウイルスを産生した。α及びβ鎖の両方は、ＴＣＲ  ＶαまたはＴＣＲ  Ｖβに対応するｇｐ６７シグナルペプチドを含有した。両構築物は、可溶性発現のために接続ペプチドで切り取られたヒト定常領域とともに、及び操作されたジスルフィドとともに、ＴＣＲ  Ｖ領域を発現するポリヘドリンプロモーターを利用した（Ｂｏｕｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。両鎖は、Ｃ末端酸性ＧＣＮ４ジッパー−６×ＨｉｓタグまたはＣ末端塩基性ＧＣＮ４ジッパー−６×Ｈｉｓタグのいずれかを発現した。酸性ジッパーを含有するすべての鎖は、ビオチン化アクセプターペプチドを含有した。両鎖は、ＴＣＲ外部ドメインのＣ末端とＧＣＮ４ジッパーとの間に３Ｃプロテアーゼ部位を含有した。ＤＮＡを、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ  ＩＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、ＢＤ  ｂａｃｕｌｏｇｏｌｄ  ｌｉｎｅａｒｉｚｅｄ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ＤＮＡ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とともにＳＦ９細胞に共トランスフェクトした。ウイルスを２ｍＬ培養物中に生成した。ウイルスを、１×１０6 個細胞／ｍＬの２５ｍＬ培養物中に１：１０００の希釈で継代してより強力なウイルスを生成し、それを次いで、２×１０6 個細胞／ｍＬの２ｍＬのＨｉｇｈ  Ｆｉｖｅ（Ｈｉ５）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）細胞に共タイトレート（ｃｏ−ｔｉｔｒａｔｅ）して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル及びクマシー染色によってＴＣＲα及びβ鎖の１：１発現の希釈物を生成した。共タイトレーションは、各鎖に対して１：１０００〜１：２５０に及んだ。
【０１６５】
ウイルスを用いて、１〜４Ｌ容量でのタンパク質発現のために２×１０6 個Ｈｉ５細胞／ｍＬのＨｉ５細胞に感染させた。感染の２〜３日後に細胞を除去し、上清を１００ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＮｉＣｌ2 、及び５ｍＭ  ＣａＣｌ2 に処理して、混入物質を沈殿させた。沈殿物を遠心分離によって除去し、上清を、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）とともに室温で３時間インキュベートした。タンパク質を、１×ＨＢＳ  ｐＨ７．２中２０ｍＭイミダゾールで洗浄し、次いで１×ＨＢＳ  ｐＨ７．２中２００ｍＭイミダゾール中で溶出した。３０ｋＤａフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）における１×ＨＢＳ  ｐＨ７．２へのバッファー交換の後、タンパク質を、ｂｉｒＡリガーゼ
、１００ｕＭビオチン、４０ｍＭビシンｐＨ８．３、１０ｍＭ  ＡＴＰ、及び１０ｍＭ酢酸マグネシウムを用いて４℃で一晩ビオチン化した。表面プラズモン共鳴に用いられるタンパク質を、３Ｃプロテアーゼ（１０ｕｇ／ｍｇのＴＣＲ）で一晩処理した。ＡＫＴＡＰｕｒｉｆｉｅｒ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ
Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたサイズ排除クロマトグラフィーによって、タンパク質を精製した。画分を単離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルでランして、１：１化学量論及びストレプトアビジンシフトによるビオチン化を確認した。画分をプールし、ＴＣＲをｎａｎｏｄｒｏｐによって定量し、保管のために１×ＨＢＳバッファーｐＨ７．２中に−８０℃で凍結した。
【０１６６】
スタンフォード大学施設内倫理委員会は、ヒト組織及び血液の回収のためのすべてのプロトコールを承認した。６４歳及び６６歳の２人の男性からの患者サンプルを、スタンフォード病院における病理学部門から患者の同意に合わせて獲得した。腫瘍組織サンプルの一部を、免疫組織化学染色のために、ホルマリン固定パラフィン包埋によって処理した。抗ＣＤ４（クローン１Ｆ６、Ｌｅｉｃａ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、抗ＣＤ８（クローンＣ８／１４４ｂ、Ｄａｋｏ）、またはヘマトキシリン／エオシンを用いて、組織を染色した。新鮮な腫瘍及び健常サンプルを、以前に行われたように（Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）処理した。簡潔には、腫瘍組織を分割し、ＰＢＳ中１０ＭＭ  ＥＤＴＡとともに３０分間インキュベートした。細胞懸濁液を作り、１０−μＭナイロンセルストレーナー（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に通し、５％ＦＢＳを有するＲＰＭＩ中０．５ｍｇ／ｍＬタイプ４コラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）で３０分間処理した。組織を、平滑末端１６ゲージ針及びシリンジで分断した。一部のサンプルを抗体染色のために残して、ＥｐＣａｍ（クローン９Ｃ４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）に対する染色及びＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって腫瘍組織を単離し、ＡＲＩＡ  ＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いたＦＡＣＳによって選別して、ＤＮＡ／ＲＮＡ抽出のためのＡｌｌＰｒｅｐ  ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）によって処理した。その他の点では、リンパ球をＰｅｒｃｏｌｌ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）勾配遠心分離によって富化し、細胞を、１０％ジメチルスルホキシド及び４０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ中で凍結した、または抗体染色のために直ちに用いた。ＦＡＣＳのための染色の前に、１５０ｎｇ／ｍＬ  ＰＭＡ＋１μＭイオノマイシンを用いて、リンパ球を３時間非特異的に予備刺激した。細胞を、ＰＢＳ＋０．０５％アジ化ナトリウム＋２ｍＭ  ＥＤＴＡ＋２％ＦＣＳで洗浄した。
【０１６７】
リンパ球を、抗ＣＤ４（ＲＰＡ−Ｔ４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗ＣＤ８（ＯＫＴ８、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗αβＴＣＲ（ＩＰ２６、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗ＴＩＭ３（Ｆ３８−２Ｅ２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗ＣＤ２８（ＣＤ２８．２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、抗ＣＤ１０３（Ｂｅｒ−ＡＣＴ８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗ＣＣＲ７（Ｇ０４３Ｈ７、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗ＬＡＧ３（３ＤＳ２２３Ｈ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、抗ＣＤ３８（ＨＩＴ２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗ＣＤ４５ＲＯ（ＵＣＨＬ１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、及び抗ＰＤ１（ＥＨ１２．２Ｈ７、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）の抗体で染色した。ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、死細胞を除外した。ＡＲＩＡ  ＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いた蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって、細胞をＯｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲバッファー（Ｑｉａｇｅｎ）中に直接的に選別した。患者Ｂサンプルをインデックスソーティングによって分析した。反応物を、以前に生成された（Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）プールされたプライマーセットを用いて増幅し、バーコード化し、アガロースゲル精製による精製のためにプールし、２×２５０  Ｖ２キットを用いたＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｍｉｓｅｑによってディープシーケンスした。データを特注ソフトウェアパイプラインを用いて処理し、個々のウェルを、ＶＤＪＦａｓｔａを用い
てＣＤＲ３、ＴＣＲα及びＴＣＲβ可変、接合、ならびに多様性領域に対してコールした。データを、Ｔ細胞転写マーカー及び表現型マーカーに基づいてｔ−ＳＮＥを用いて分析して、細胞集団を分離した。
【０１６８】
患者エクソームのシーケンシング及びバリアントコール。腫瘍及び健常組織から抽出されたＤＮＡを用いて、エクソームシーケンシングのためのライブラリーを作り出した。腫瘍及び正常組織からの５０ｎｇのＤＮＡを、Ｎｅｘｔｅｒａ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いてＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングライブラリーに仕立てた。ライブラリーをプールし、Ｒｏｃｈｅ  Ｎｉｍｂｌｅｇｅｎ  ＳｅｑＣａｐ  ＥＺ  ３．０（Ｒｏｃｈｅ）を用いてエクソン領域について富化した。Ｎｅｘｔｓｅｑ５００を用いて、ペアエンド７５ｂｐリードを生成した。ＧＡＴＫ  Ｂｅｓｔ  Ｐｒａｃｔｉｃｅｓの後に、腫瘍特異的バリアントを判定した。簡潔には、ｃｕｔａｄａｐｔ  ｖ１．９を用いて、アダプター及び低品質塩基をトリミングした。ＢＷＡ  ＭＥＭ  ０．７．１２を用いて、リードをｈｇ１９にアラインした。Ｐｉｃａｒｄ  ｔｏｏｌｓ  ｖ１．１１９を用いて重複するものを除去し、その後に、ｉｎｄｅｌリアライメント、ならびにＧＡＴＫ  ｖ３．５及びＧＡＴＫ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｂｕｎｄｌｅ  ２．８からダウンロードされた参照ファイルを用いたベースリキャリブレーションが続いた。ｂｅｄｔｏｏｌｓ  ｖ２．２５．０を用いて、被覆率中央値を決定した。最後に、ｍｕｔｅｃｔ２を用いて、正常と腫瘍との間のバリアントを判定した。すべてのキットにおいてメーカーの指示に従い、すべてのパイプラインにおいて初期設定ソフトウェアパラメーターを用いた。
【０１６９】
ＥｎｓｅｍｂｌからのＧｒｃｈ３７アセンブリを用いて、すべてのエクソームバリアントを用いて代替コード配列を作り出した。各代替コード配列を処理し、ライブラリーペプチドの長さに基づいて採点した。ペプチドを２０１７ＰＷＭ及び２０１７ＤＬアルゴリズムを用いて採点した。
【０１７０】
アルゴリズムの開発及びヒトペプチドついての予測。種々のペプチド長に対するライブラリーのデコンボリューションを取り入れる改変を有して、以前に行われたように（Ｂｉｒｎｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）ディープシーケンシング結果を分析した。シグナルペプチド及びＧＳリンカーに隣接するアミノ酸の数に基づいて、種々のペプチド長を同定した。簡潔には、ＰａｎｄａＳｅｑを用いて、ディープシーケンシング結果からペアエンドリードを判定した。ペアエンドリードを、Ｇｅｎｅｉｏｕｓバージョン６を用いてバーコードによって解析して、選択のラウンドを同定する。選択のラウンド３及び４において１０カウント未満を有する、ならびにラウンドにおいて別の配列と１ヌクレオチド配列のみ異なる全ヌクレオチド配列を、ドミナント配列に合体させた。フレームシフトまたは終止コドンを有するいかなるデータも、さらなる分析から除去された。カスタムパールスクリプト及びシェルコマンドを用いて、配列を処理した。
【０１７１】
逆ハミング距離は、ペプチドの全長から差し引かれたハミング距離であり、２つのペプチド間の共有されるアミノ酸の数を表す。選択されたラウンド３ライブラリー配列からの他のすべてのペプチドに対して各ペプチドを反復することによって、Ｍａｔｌａｂ（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ  Ｉｎｃ．）を用いてそれらを算出した。生み出された出力スコアは、ペプチド間の合致するアミノ酸箇所の数である。逆ハミング距離に基づいて、Ｃｙｔｏｓｃａｐｅを用いてペプチドをクラスター化し、ペプチド類似性に基づいてカットオフを手作業で決定した。ＤＭＦ５  ＴＣＲに関しては、クラスター化を行い、クラスターを用いて、アミノ酸頻度に対するカットオフを用いずに、予測のための置換行列を作り出した。ＮＫＩ  ＴＣＲに関しては、ＮＫＩ２  ＴＣＲに対する新抗原特異性を判定するために、逆ハミング距離は十分であった。２０１４ＰＷＭモデルは、１２７種の新抗原のリストからいかなる予測結果も出さなかった。アルゴリズム予測の前に、４種の結腸直腸癌由来ＴＣＲに対してクラスター化は行われなかった。
【０１７２】
２０１４ＰＷＭ及び２０１７ＰＷＭに関して、置換行列を全選択のラウンド３から作り出し、それを用いてヒトタンパク質（Ｕｎｉｐｒｏｔ）または患者特異的エクソームを検索して、スライディングウィンドウを用いて固定長のペプチドを採点した。置換行列は、ペプチドの箇所あたりの全アミノ酸の頻度を決定することによって作成される。ＤＭＦ５
ＴＣＲに対して行われたものを除いて、２０１４ＰＷＭを用いてなされたすべての予測に関して、所定の箇所におけるアミノ酸に対する０．１％頻度のカットオフを設けて、ノイズを除去した。ペプチドのスコアは、各箇所におけるアミノ酸頻度の積として算出される。２０１７ＰＷＭは、予測ペプチドがライブラリーの選択されたペプチドにおいて見い出されない箇所にアミノ酸を組み入れることを認めるという点において、２０１４ＰＷＭよりもストリンジェンシーが低い。これは、選択されていない可能性があるが潜在的に実行可能なペプチド解決策であり得るペプチド配列を破棄することを防ぐ。
【０１７３】
以前のアルゴリズムが行うように、ペプチドのそれぞれ個々の箇所を他のあらゆるものとは無関係なものとして見なすのではなく、ペプチドをひとまとまりの実体として考えるように、ディープラーニング法２０１７ＤＬを作り出した（図１２Ａ）。ペプチド配列及びラウンドカウントを含むシーケンシングデータをＲで前処理して、全ラウンドにわたって３カウントよりも少ない数を有するいかなるペプチド配列も除去した。次いで、各ラウンドカウントとラウンドにわたるカウントの平均数とを掛け、次いで所定のラウンドにおけるカウントの数で割ることによってデータを正規化した。適応させた適合度スコアを用いて、正規化されたラウンドカウントを通して各ペプチドにフィットさせた指数曲線によって表される適合度関数から導き出されるライブラリーにおける各ペプチドを採点した（図１２Ｂ）。
【０１７４】
次に、各ペプチドに対する適合度スコアを用いてモデルを作り出し、ペプチドは２０×Ｌ行列として表され、式中、Ｌはペプチド配列の長さである（図１２Ｃ）。行列の２０行は、２０種の考え得るアミノ酸に関係する。アミノ酸はｏｎｅ−ｈｏｔベクトルとして表され、ベクトルは単一の１を含有し、残りは０である。ペプチドを表す行列を、ニューラルネットワークを訓練することにおける使用のために、２０×Ｌの長さの特徴ベクトルに平坦化した。ｏｎｅ−ｈｏｔ行列を入力として用い、適合度スコアを出力として用いた。それぞれ１０ノード及び５ノードを用いた２つの隠れ層ネットワークを利用した以前に記載されたネットワークアーキテクチャーを、ライブラリーペプチドからのデータを用いて遂行した（図１２Ｄ）。Ｔｏｒｃｈパッケージを用いて、訓練をＬｕａで行った。このモデルを用いて、ニューラルネットワーク入力のためにｏｎｅ−ｈｏｔ行列に変換されたＬ長のスライディングウィンドウから単離されたペプチドを用いて、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース（２０１５年１２月１８日にダウンロードした）及び患者特異的エクソームからの所定のペプチドを採点した。プロテオーム全体からの各ペプチドに対して、ランダム選択の確率を表すｐ値及びボンフェローニ補正されたｐ値を算出し、ペプチドは、採点されたペプチドと同じくらい高いまたはそれよりも高い適合度スコアを有した。
【０１７５】
共培養アッセイにおけるＴ細胞活性化の測定。ライブラリーからペプチドを選択した、結腸直腸癌患者から単離された４種のＴＣＲを、ＴＣＲ可変遺伝子及び全長の非改変定常領域の野生型シグナルペプチドを用いて、α−Ｐ２Ａ−βの立体配置で、ＭＳＣＶに基づくベクターｐＭＩＧ  ＩＩ内にクローニングした。Ｐ２Ａスキップ配列は、ＴＣＲの１：１の化学量論的発現を可能にする。ＭＳＣＶに基づくベクターｐＭＩＧ  ＩＩを用いて、δ−Ｆ２Ａ−γ−Ｔ２Ａ−ε−Ｐ２Ａ−ζの形式のヒトＣＤ３も作り出した。パッケージングベクターｐＣＬ１０Ａを用いて、ｅｎｖ、ｇａｇ、及びｐｏｌを組み入れて、ヒト哺乳類指向性及びウイルス作出を可能にした。ベクターによって、感染細胞にピューロマイシン及びゼオシン選択性が導入された。５μｇ  ＴＣＲまたはヒトＣＤ３  ＤＮＡ及び３．３μｇ  ｐＣＬ１０Ａ  ＤＮＡを用いて、ヒト胎児腎臓２９３Ｔ細胞において、各ＴＣ
Ｒ及びヒトＣＤ３に対してレトロウイルスを作り出した。血清不含ＤＭＥＭ中Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ  ９  ＤＮＡトランスフェクション試薬（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて、ウイルスを作り出した。細胞培養において、２％ＦＢＳ  ＤＭＥＭを用いて細胞を回収し、培地を１２時間の時点で変えた。ウイルスを、プールされるべきそれぞれ２．５ｍＬ量で３６、４０、４４、及び４８時間の時点で収穫し、０．４５μＭシリンジフィルター（Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で濾過し、−８０℃で凍結するか、または直ちに用いてＴＣＲ- ＣＤ８+ ＳＫＷ−３細胞に感染させた。ＴＣＲの２ｍＬウイルス及びヒトＣＤ３の２ｍＬウイルスを用いて、３２℃で２５００ｒｐｍにて２時間スピンすることによって、５ｕｇ／ｍＬポリブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて２×１０6 個のＳＫＷ−３細胞に共感染させた。ウイルスを除去し、培地で置き換え、細胞を培養した。形質導入されたＳＫＷ−３細胞を、２〜３日後に無期限に２０ｕｇゼオシン及び１ｕｇピューロマイシン中で培養して、ＴＣＲ及びヒトＣＤ３共発現に対して選択した。次いで、細胞をＴＣＲ（ＩＰ２６、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）及びヒトＣＤ３（ＵＣＨＴ１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）に対して共染色し、ＳＨ８００細胞選別機（Ｓｏｎｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．）で選別した。
【０１７６】
形質導入されたＳＫＷ−３細胞を、様々なペプチド希釈物とともに、２：１比でＴＡＰ欠損Ｔ２細胞と共培養した。酵母ディスプレイ選択から単離された上位５種の合成ペプチドを、３つの予測アルゴリズムから決定された予測に沿って試験した。ペプチドを＞７０％純度に合成し（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）（Ｅｌｉｍ  Ｂｉｏｐｈａｒｍ）、ジメチルスルホキシド中２０ｍＭに再懸濁し、−２０℃で保管した。ＣＤ６９（ＦＮ５０、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を１８時間の時点で測定して、Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いたフローサイトメトリーによって初期Ｔ細胞活性化を検出した。ＳＫＷ−３  Ｔ細胞をＵＣＨＴ１染色によって検出し、ＴＣＲ及びＣＤ３発現についてチェックした。Ｔ２細胞を抗体（ＢＢ７．２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）によってＨＬＡ−Ａ* ０２発現についてチェックした。ＦｌｏｗＪｏバージョン１０（ＦｌｏｗＪｏ、ＬＬＣ）を用いてデータを分析し、サンプルを、前方及び側方散乱光によってＳＫＷ−３細胞に対して、ならびにＵＣＨＴ１＋細胞に対してゲートをかけ、その後にＣＤ６９発現についての分析が続いた。実験を生物学的三つ組及び技術的三つ組で行った。Ｐｒｉｓｍにおいて普通の一元配置ＡＮＯＶＡによってｐ値を算出し、表示される標準偏差または平均の標準誤差のいずれかとともに実験をプロットした。
【０１７７】
ＣＤＫ４特異的ＴＣＲクローン１０（ＮＫＩ１）及び１７（ＮＫＩ２）は黒色腫患者のＴＩＬに由来し、それを、本質的には記載されるように、予測された新抗原を搭載したＨＬＡ多量体を用いてスクリーニングした。両ＴＣＲの可変部分を、マウスＴＣＲα及びβ定常ドメインをコードするレトロウイルスベクター内にクローニングした。ＦＬＹＲＤ１８パッケージング細胞を、１．２×１０6 個細胞／ウェルで１０ｃｍディッシュに播種した。１日後、細胞に、２５μｌ  Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ  ＨＰ  ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて、ＣＤＫ４  ＴＣＲをコードする１０μｇレトロウイルスベクターＤＮＡをトランスフェクトした。４８時間後、レトロウイルス上清を単離し、レトロネクチンをコーティングされた２４ウェルプレートに移し、４３０ｇで９０分間遠心分離した。ＰＢＭＣを活性化し、３：１のビーズ対細胞比で抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて選択した。刺激の４８時間後、ウイルスをコーティングされたプレート上にＴ細胞を０．５×１０6 個細胞／ｍＬで播種した。形質導入されたＴ細胞上での導入されたＣＤＫ４  ＴＣＲの表面発現を、抗マウスＶβ  ＴＣＲ−ＰＥ標識抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と組み合わせてＡＰＣ標識ＣＤＫ４  Ｒ＞Ｌ  ＨＬＡ−Ａ* ０２：０１四量体を用いて測定した。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ
Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて細胞を分析した。ＪＹ細胞を、表示される濃度のＣＤＫ４ペプチドまたは予測ペプチドで３７℃で１時間パルスし、次いで２回洗浄した。次に、０．２×１０6 個のＴＣＲ形質導入されたＴ細胞を、１μＬ／ｍＬ  Ｇｏｌｇｉｐｌｕｇ
（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の存在下で、０．２×１０6 個のペプチドパルスされたＪＹ細胞とともにインキュベートした。ＪＹ細胞に曝露されていないＴ細胞、非搭載ＪＹ細胞に曝露されたＴ細胞、及び非関連ペプチド（ＭＡＲＴ−１）を搭載されたＪＹ細胞に曝露されたＴ細胞を、対照として用いた。３７℃、５％ＣＯ2 での５時間のインキュベーションの後、細胞を洗浄し、ＰｅｒＣＰ−ｃｙ５．５抗ＣＤ８、ＦＩＴＣ抗ＣＤ３、ＰＥ抗マウスＶβ  ＴＣＲ、及びＡＰＣ抗ＩＦＮγ標識抗体で染色した。
【０１７８】
外因性ペプチドとのリフォールディングされたＨＬＡ−Ａ* ０２：０１の発現。ｐｅｔ２６ｂベクターを用いて、Ｒｏｓｅｔｔａ  ＢＬ２１  ＤＥ３  Ｅ．ｃｏｌｉ細胞においてＨＬＡ−Ａ* ０２：０１（１〜２７５）及びβ２Ｍ（１〜１００）を別個に発現させた。別個のタンパク質を含有する封入体を、８Ｍ尿素、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、及び１０ｍＭ  ＤＴＴ中に溶解した。インビトロでのリフォールディングに関しては、ＨＬＡ−Ａ* ０２重鎖、β２Ｍ、及びＭＭＤＦＦＮＡＱＭ（配列番号：２７９）ペプチドを１：２：１０のモル比で混合し、０．４Ｍ  Ｌ−アルギニン−ＨＣｌ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、４ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ酸化型グルタチオン、及び４ｍＭ還元型グルタチオンを含有するリフォールディングバッファー中に希釈した。４℃で７２時間後、タンパク質を１０Ｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ中で透析し、ＤＥＡＥセルロースカラムを用いた弱いイオン交換により精製した。タンパク質溶出物を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラムでのサイズ排除クロマトグラフィー及び５／５０  Ｍｏｎｏ  Ｑカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのイオン交換クロマトグラフィーを用いて精製した。サイズ排除Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラムでランさせる前に、３０ｋＤａフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）における１×ＨＢＳ  ｐＨ７．２へのバッファー交換の後、タンパク質を、ｂｉｒＡリガーゼ、１００ｕＭビオチン、４０ｍＭビシンｐＨ８．３、１０ｍＭ  ＡＴＰ、及び１０ｍＭ酢酸マグネシウムを用いて４℃で一晩ビオチン化した。
【０１７９】
ＭＭＤＦＦＮＡＱＭ−ＨＬＡ−Ａ* ０２：０１へのＴＣＲ２Ａ及び３Ｂ結合アフィニティーを測定するための表面プラズモン共鳴。ＴＣＲ２Ａ及び３ＢとＭＭＤＦＦＮＡＱＭ−ＨＬＡ−Ａ* ０２（配列番号：２８１）との相互作用を、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ１００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）バイオセンサーを用いた表面プラズモン共鳴によって２５℃で測定した。ビオチン化ＭＭＤＦＦＮＡＱＭ−ＨＬＡ−Ａ２（配列番号：２８２）を、ストレプトアビジンをコーティングされたＢＩＡｃｏｒｅ  ＳＡチップにおよそ１０００共鳴単位（ＲＵ）で固定した。異なるフローセルに、ブランク対照として働く非関連ペプチド−ＨＬＡ−Ａ２を固定した。種々の濃度の２Ａまたは３Ｂ  ＴＣＲのいずれかを、ブランク及びＭＭＤＦＦＮＡＱＭ−ＨＬＡ−Ａ２（配列番号：２８２）の上に逐次的に流した。ＳＰＲシグナルがプラトーに達するために十分な時間を与える６０秒後に、ＴＣＲのインジェクションを停止した。ＢＩＡｃｏｒｅ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを用いて、平衡データと１：１結合モデルとをフィットさせることによって、解離定数（ＫD ）を獲得した。
【０１８０】
Ｕ２ＡＦ２の相対的ＲＮＡ発現を判定するための定量ＰＣＲ。腫瘍及び健常患者組織から以前にこれまで述べられたように抽出されたＲＮＡを用いて、Ｕ２ＡＦ２  ＲＮＡ発現の相対的分量を判定した。加えて、ＲＮＡを、リンパ腫：Ｋ５６２、Ｄａｕｄｉ、乳房：ＭＤＡ  ＭＢ  ２３１、肺：Ａ５４９、ＥＫＶＸ、ＨＣＣ７８、Ｈ３５８、Ｈ４４１、Ｈ１３７３、Ｈ１４３７の細胞株から抽出した、Ｈ１６５０、Ｈ１７９２、Ｈ２００９、Ｈ２１２６、Ｈ３１２２、ＬＣ−２／ａｄ。Ｈｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ  ＲＮＡ−ｔｏ−ｃＤＮＡキット（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を用いて、ｃＤＮＡを三つ組で生成した。ｃＤＮＡサンプルを分量のためにプールし、ＴａｑＭａｎプローブ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ＩＩ，ｎｏ  ＵＮＧ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、及びＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  ３  Ｒｅａｌ−Ｔｉ
ｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて、定量リアルタイムＰＣＲを技術的四つ組で行った。Ｕ２ＡＦ２プローブ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｈｓ００２００７３７＿ｍ１）は、Ｕ２ＡＦ２のエクソンに及ぶ７５ｂｐ領域を増幅した。１８Ｓ  ＲＮＡプローブ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｈｓ９９９９９９０１＿ｓ１）をハウスキーピング遺伝子として用い、１８７ｂｐ領域が増幅された。１８Ｓ  ＲＮＡに対するＵ２ＡＦ２のサイクル閾値を各サンプルに対して算出し、患者Ａ健常組織または患者Ｂ健常組織サイクル閾値のいずれかと比較して、相対的発現レベルを判定した。標準偏差がプロットされている。
【０１８１】
定量及び統計分析。ＳＫＷ−３細胞を用いたＴ細胞刺激アッセイ。データをＦｌｏｗｊｏを用いて分析して、ＳＫＷ−３細胞及びＣＤ３+ 群をゲートにかけて、Ｔ細胞を同定する。次いで、陰性対照（ペプチドなし）を用いて、Ｔ細胞をＣＤ６９発現に対してゲートをかける。ＣＤ３+ 群におけるＣＤ６９の発現のＭＦＩ中央値及びＣＤ６９を発現する細胞のパーセンテージが分析されている。陰性対照（ペプチドなし）と比較した、普通の一元配置ＡＮＯＶＡを、Ｐｒｉｓｍを用いて両分析に対して判定した。１００μＭペプチド刺激を生物学的及び技術的三つ組で完了させる。生物学的三つ組のうちの１つのみが示されている。ペプチドタイトレーション実験を生物学的三つ組で行った。すべての生物学的三つ組を集合的に分析した。ｐ値指定に関する凡例が、各図に対して挙げられている。ＳＥＭ（ｎ＝３、技術的三つ組）またはＳＤ（ｎ＝３、生物学的三つ組）のいずれかが用いられ、対応する図の凡例において挙げられている。
【０１８２】
２０１４ＰＷＭ採点。（Ｂｉｒｎｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）に提示されるように採点を行う。シーケンシングリードカウントをペプチド配列に対する乗数として用いて、ラウンド３選択データから頻度行列を作り出す。ペプチドの各箇所にリードカウントを掛けて、所定のアミノ酸が存在する回数のカウントを得る。これを、ラウンド３における各固有のペプチドに対して行い、箇所あたりのアミノ酸カウントを総リードの数で割る。次いで、頻度行列を用いて、ヒトプロテオームのあらゆるＮｍｅｒペプチドを採点し、Ｎはライブラリーからの選択されたペプチドの長さである。ペプチドにわたる所定のアミノ酸の頻度を掛けることによって採点を行う。
【０１８３】
２０１７ＰＷＭ及び２０１７ＤＬペプチド採点。この論文においてアルゴリズムを作り出した。両２０１７ＰＷＭに関して、ラウンド３だけでなく選択の全ラウンドにわたるデータに対して付加的な頻度行列を作り出すことを除いて、２０１４ＰＷＭにおけるように頻度行列を作り出す。アミノ酸あたりの箇所あたりの比率は、全ラウンド頻度行列に対するラウンド３頻度行列と見なされる。ゼロ値に対して０．０５の疑似カウント頻度を遂行し、比率のｌｏｇ１０を取る。このスコアは、箇所における特定のアミノ酸の富化比率として解釈される。このスコアを用いて、各箇所に対してスコアを掛けることによって、エクソームまたはヒトプロテオームからの所定のペプチドの全体的富化を判定する。２０１７ＤＬアルゴリズムは、方法において記載されるように遂行される。
【０１８４】
ペプチドの統計的有意性を判定するために、ヒトプロテオーム及びエクソームペプチドセットを採点する。エクソームペプチドセットに対するｐ値を算出するために、ヒトプロテオームスコアの背景においてパーセンタイルスコアを算出する。非補正ｐ値は１パーセンタイルである。ボンフェローニ補正されたｐ値は、変異体セットにおけるペプチドの数を掛けた非補正ｐ値である。
【０１８５】
定量ＰＣＲ分析。技術的四つ組サンプルにおいて定量ＰＣＲを行った。１８Ｓ  ＲＮＡに対するＵ２ＡＦ２ＲＮＡの相対的発現レベル（デルタサイクル閾値）を、サイクル閾値を差し引くことによって算出した。健常と比べた倍変化を（デルタデルタサイクル閾値）を、サンプルに対する参照の相対的サイクル閾値（デルタサイクル閾値）を差し引くこと
によって決定した。デルタサイクル閾値の標準偏差を、下記の式を用いて算出する。式中、ｓ＝標準偏差、ｓ1 ＝標的サンプルの標準偏差、及びｓ2 ＝参照サンプルの標準偏差である。デルタデルタサイクル閾値標準偏差は、デルタサイクル閾値試験サンプルの標準偏差を利用する。
【０１８６】
【数１】
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【０１８７】
データ及びソフトウェア入手可能性。エクソームシーケンシング。データは、ＢｉｏＳａｍｐｌｅアクセッションＳＡＭＮ０７３５００２１、ＳＡＭＮ０７３５００２２、ＳＡＭＮ０７３５００２３、ＳＡＭＮ０７３５００２４、ＳＡＭＮ０７３５００２５、ＳＡＭＮ０７３５００２６、ＳＡＭＮ０７３５００２７、ＳＡＭＮ０７３５００２８、ＳＡＭＮ０７３５００２９、ＳＡＭＮ０７３５００３０、ＳＡＭＮ０７３５００３１、及びＳＡＭＮ０７３５００３２の下で、ショートリードアーカイブにおいて入手可能である。
【０１８８】
ディープシーケンシング。データは、ＢｉｏＳａｍｐｌｅアクセッションＳＡＭＮ０７９７７１６４、ＳＡＭＮ０７９７７１６５、ＳＡＭＮ０７９７７１６６、ＳＡＭＮ０７９７７１６７、ＳＡＭＮ０７９７７１６８、及びＳＡＭＮ０７９７７１６９の下で、ショートリードアーカイブにおいて入手可能である。
【０１８９】
【表１−１】
2020511964.tif 000003
【０１９０】
【表１−２】
2020511964.tif 000004
【０１９１】
【表１−３】
2020511964.tif 000005
【０１９２】
逆ハミング距離によるクラスター化後の、ＤＭＦ５  １０ｍｅｒライブラリー選択のラウンド３ディープシーケンシングから同定された配列。これらのクラスターを用い、２０１４ＰＰＭを用いてＵｎｉｐｒｏｔデータベースに対して予測を行った。「ＧＩＧ」クラスターに対する９種の予測、及び「ＤＲＧ」クラスターに対する上位１０種の予測が挙げられている。
【０１９３】
【表２−１】
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【０１９４】
【表２−２】
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【０１９５】
【表２−３】
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【０１９６】
ペプチド長によって挙げられたＮＫＩ２ライブラリー選択のラウンド３ディープシーケンシングから同定された配列。図３と関連している。
【０１９７】
【表３】
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【０１９８】
【表４−１】
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【０１９９】
【表４−２】
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【０２００】
ＨＬＡ−Ａ* ０２：０１ライブラリーに対してスクリーニングされたＴＣＲ。腫瘍におけるクローン性、表現型プロファイル、腫瘍への排他性に基づいて、及び付加的に、関連するＴＣＲ配列によって、ＴＣＲ配列を選定した。腫瘍及び健常のラベルの下にある数は、対合したＴＣＲ配列がこの組織から見られた回数を示す。図５及び６と関連している。
【０２０１】
【表５−１】
2020511964.tif 000012
【０２０２】
【表５−２】
2020511964.tif 000013
【０２０３】
【表５−３】
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【０２０４】
ＴＣＲ２Ａ：
ＴＲＡＶ１９、ＴＲＡＪ３２、ＣＤＲ３：（配列番号：２６１）ＣＡＬＳＥＡＲＧＧＡＴＮＫＬＩＦ、及びＴＲＢＶ１０−１、ＴＲＢＪ１−１、ＣＤＲ３：（配列番号：２６２）ＣＡＳＳＲＤＴＶＮＴＥＡＦＦから構成されるＴＣＲ
【０２０５】
【化１】
2020511964.tif 000015
【０２０６】
【化２】
2020511964.tif 000016
【０２０７】
ＴＣＲ３Ｂ：
ＴＲＡＶ１９、ＴＲＡＪ３２、ＣＤＲ３：（配列番号：２６１）ＣＡＬＳＥＡＲＧＧＡＴＮＫＬＩＦ、及びＴＲＢＶ１０−１、ＴＲＢＪ２−７、ＣＤＲ３：（配列番号：２６３）ＣＡＳＳＲＤＦＶＳＮＥＱＹＦから構成されるＴＣＲ
ＴＣＲ２Ａと同じアルファ
【０２０８】
【化３】
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【０２０９】
相互参照
本出願は、２０１７年３月２４日に出願された米国仮特許出願第６２／４７６，５７５号の利益を主張するものであり、その出願は参照によりその全体として本明細書に組み入れられる。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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