(57)【要約】  本発明は、式Ｐ−Ｌ−Ｉの共役体に関し、式中、Ｐはインビボで炭水化物の代謝を行うペプチドホルモンであり、ＬはＬｐ及びＬｉからなる加水分解性リンカー分子であり、Ｉはインビボで炭水化物の代謝に対するペプチドホルモンＰの効果を阻害することができる分子である。インビボの条件下で、該共役体が主な化合物である。インビボでグルコースの濃度が増加する場合、インビボの炭水化物の代謝に影響するペプチドホルモンの濃度も増加する。
2020511421.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｐ−Ｌ−Ｉの共役体であって、
式中、Ｐはインビボで炭水化物の代謝に影響するペプチドホルモンであり、ＬはＬｐ及びＬｉからなる加水分解性連結体分子であり、Ｉはインビボで炭水化物の代謝に対する前記ペプチドホルモンＰの効果を不活性化又は阻害することができる分子であり、
ａ．共役体部分Ｐ−Ｌｐ及びＬｉ−Ｉの少なくとも１つのモル過剰で共役体Ｐ−Ｌ−Ｉが存在するインビボにおいて、共役体Ｐ−Ｌ−Ｉ並びに共役体部分Ｐ−Ｌｐ及びＬｉ−Ｉが動的平衡状態で存在するように、前記連結体分子Ｌがインビボで加水分解性であり、
ｂ．前記共役体部分Ｐ−Ｌｐ及びＬｉ−Ｉの少なくとも１つがグルコースに共有結合し、それによって、インビボでグルコースの濃度が増加した場合に、Ｉに結合していないＰの濃度がインビボで増加し、あるいは加水分解性連結体Ｌの加水分解がグルコースによって促進される、前記共役体。
【請求項２】
前記反応物Ｐ−Ｌｐがグルコースに共有結合する、請求項１に記載の共役体。
【請求項３】
Ｐがインスリン又はインスリン類似体である、請求項１又は２に記載の共役体。
【請求項４】
ＩがＰの活性部位を阻害することができる作用物質である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の共役体。
【請求項５】
Ｉがインビボで式Ｐ−Ｌ−Ｉの複数の共役体をクラスター化することができる作用物質である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の共役体。
【請求項６】
Ｉが血清アルブミンに結合することができる作用物質である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の共役体。
【請求項７】
Ｉが構造Ａを備え、Ａが以下から選択され、ａが少なくとも１０である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の共役体：
【化１】
2020511421.tif 000067
【請求項８】
Ｌが、ヒドラゾン、Ｏ，Ｏ−アセタール、Ν，Ｏ−アセタール、Ν，Ν−アセタール、チアゾリジン及びチアゾリンを含むＳ，Ｎ−アセタール、又はジチオランを含むＳ，Ｓ−アセタール、並びにそれらの誘導体から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の共役体。
【請求項９】
Ｌが以下の一般式である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の共役体：
【化２】
2020511421.tif 000068
式中、
Ｒ１はＩ又はＰを含み、好ましくは芳香族部分に結合し、
Ｒ２はＰ又はＩを含む。
【請求項１０】
Ｌが以下の一般式である、請求項７に記載の共役体：
【化３】
2020511421.tif 000069
式中、
Ｒ１がＩ又はＰが結合される芳香族部分を含み、
Ｒ３が１以上の電子供与基であり、及び
Ｒ４はＰ又はＩを含む。
【請求項１１】
ヒト又は動物の被験体の治療又は予防処置のための、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の共役体。
【請求項１２】
ヒト又は動物の被験体の糖尿病を治療するための、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の共役体。
【請求項１３】
ヒト又は動物の被験体の糖尿病を治療するための請求項１〜１０のいずれか１項に記載の共役体であって、前記治療が１日当たり２回以下の投与頻度で前記共役体を投与することを含む、前記共役体。
【請求項１４】
ヒト又は動物の被験体の糖尿病を治療するための請求項１〜１０のいずれか１項に記載の共役体であって、前記治療が１日当たり１回以下の投与頻度で前記共役体を投与することを含む、前記共役体。
【請求項１５】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の共役体と、少なくとも１つの薬学的又は獣医学的な賦形剤と、を含む、薬学的又は獣医学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インビボ（インビボ）で炭水化物の代謝に影響するペプチドホルモンを含むグルコース応答性ペプチド共役体、及び加水分解性連結体分子を介して複合化されたペプチドホルモンの活性を不活性化する又は阻害する作用物質（又はペプチドホルモンの活性を不活性化若しくは阻害を促進する作用物質）に関する。
【０００２】
更に、本発明は、医薬として、特に糖尿病の治療のための医薬としての使用に対するグルコース応答性ペプチド共役体の使用に関する。
【０００３】
本発明による共役体のペプチドホルモン部分は、ペプチドホルモンの活性を不活性化する又は阻害する阻害物質の存在により、共役体で不活性の状態である。
【０００４】
上記共役体の加水分解性連結体は、インビボで動的平衡状態にあるペプチドホルモン、阻害物質、及び共役体の存在を促進する。
【０００５】
本発明は、更に、本発明による共役体と、少なくとも１つの薬学的又は獣医学的な賦形剤とを含む薬学的又は獣医学的組成物に関する。
【０００６】
グルコース等の炭水化物が存在する状態で炭水化物に結合されると（ペプチドホルモンが結合した炭水化物は、ペプチドホルモン、炭水化物、及びペプチドホルモン−炭水化物共役体の間の新たな動的平衡に関与するが）、共役体のペプチドホルモン部分は平衡から取り除かれ、それによって、活性なペプチドホルモン部分の濃度がインビボのグルコースの濃度の増加に応じて増加するように、複合化されていないペプチドホルモン部分のプールが増加されてホルモン活性が増加する。あるいは、グルコース等の炭水化物が存在する状態で、グルコースは、より活性なＰを与える平衡シフトを促進する。
【背景技術】
【０００７】
ペプチド、特にホルモンは、一連の疾患を治癒する又は管理する治療剤として頻繁に使用される。炭水化物の代謝に対して治療効果を有する一連の治療用ペプチドホルモンは、糖尿病、肥満、及び代謝障害等のヒトにおける一連の疾患の管理に使用される。
【０００８】
好ましくは、これらのペプチドの活性は、血糖レベルの上昇（即ち、インビボで上昇するグルコース濃度）に応じて必要であり、従って、炭水化物の代謝に影響する一連の治療用ペプチドは食後に、即ち血糖レベルの上昇に応じて、投与されることになっている。
【０００９】
かかる投与は煩わしく、頻繁な投与に加えて、患者の持続的なモニタリングを必要とする。
【００１０】
インビボでのグルコース濃度の上昇に応じて活性なペプチドホルモンを放出及び／又は活性化するデポー（ｄｅｐｏｔ）としてペプチドホルモンを投与することによって、これらの課題を解決することができた。
【００１１】
分子を安定するため共有結合によって安定性及び有効性が増したポリペプチドを達成する幾つかの技術が存在する。かかるポリペプチドは、本発明によるポリペプチド共役体がヒト体内のインビボ状態に類似する条件下で加水分解性である点で本発明によるグルコース応答性ペプチド共役体と根本的に異なる。
【００１２】
例として、特許文献１は、実施例１２において、インサイチュ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）で安定なヒドラジン連結体へと還元されたヒドラジン連結を介してＰＥＧに複合化されたインスリンポリペプチドを含む、インスリンポリペプチド共役体を記載する。得られたポリペプチドは安定であり、インビボではヒドラジン連結を加水分解することができない。特許文献１によるインスリン共役体は、そのため、本発明によるグルコース応答性ペプチド共役体と根本的に異なる。
【００１３】
特許文献２は、Ｆｃ分子に対するリンケージによって安定性が増したポリペプチドを記載する。この引用文献の請求項７では、かかる分子を作製する方法が記載されている。その方法を行う際に、活性化ＧＬＰ−１ペプチドを含む中間体ヒドラゾン及びＦｃ分子が形成され、それらは、後に最終の安定なヒドラジン生成物へと還元される。
【００１４】
非特許文献１は、オキシム付加物を介してＰＥＧに対して安定化されたＦＧＦ２１を記載する。そのため、非特許文献１による安定なペプチド共役体は、本発明によるグルコース応答性ペプチド共役体とは根本的に異なる。
【００１５】
上記の開示とは対照的に、本発明は、インビボで炭水化物の代謝を行うペプチドホルモンに関し、ここで、該ペプチドホルモンは加水分解性連結体分子を介して不活性化部分に複合化され、それによって、不活性化されたペプチドホルモンと活性なペプチドホルモンの間の平衡がインビボで作り出される。そのため、例えばグルコース依存性インスリン活性をインビボで達成することができる。
【００１６】
インスリンのグルコース−依存性放出を達成する幾つかの技術が知られている。
【００１７】
例えば、フェニルボロン酸（ＰＢＡ）に複合化されたインスリンは、ＰＢＡ部分によってＤ−グルコースに結合することができる。非特許文献２は、かかるグルコースセンシングインスリンを記載している（非特許文献２）。例えばＤ−グルコサミンポリアミドポリマーに製剤化されたボロネート−インスリンは、置換によってグルコースの存在下でインスリンの放出を可能とする。更に、非特許文献３は、ＨＳＡ等の血漿タンパク質に結合するフェニルボロン酸−脂質化インスリンを報告し、グルコースの存在下で、ボロン酸−インスリンＨＳＡ複合体が妨害されて、血液中の遊離インスリン画分を増加させる（非特許文献３）。ＰＢＡ技術による挑戦は、特異性の欠如及びフルクトース等の他のジオールへの高親和性である。
【００１８】
ＣｏｎＡ（コンカナバリンＡ）はグルコース及びマルトースを結合するレクチンである。ポリマーに製剤化される場合、ＣｏｎＡは、ポリマーの膨潤又は分解、及びインスリンの放出に結び付く高血糖状態の間、グルコースを結合することができる（非特許文献４）。この方法による挑戦は、非天然ＣｏｎＡ分子に対する免疫応答及びＣｏｎＡ天然分子の安定性である。
【００１９】
グルコースオキシダーゼは、グルコースに対して非常に特異的であり、グルコースを酸素、過酸化水素及びグルコン酸へと変換する。グルコースオキシダーゼを体内でミクロゲル又はナノ粒子に組み立てることが、高血糖状態の間に酸性微小環境をもたらし、これはインスリン放出に結びつく（非特許文献５〜７）。後者の方法による挑戦は、センサーにおいて過酸化水素はクエンチされなければならないことから、細胞毒性であるということである。上記技術は、応答速度が遅く、ｐＨの影響を受けやすい。
【００２０】
それゆえに、インビボでのグルコース濃度の上昇に応えて活性の変更、好ましくは増加を得るためのペプチドホルモンを提供する新たな手段及び方法に対するニーズが当該技術分野においていたるところに存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２１】
【特許文献１】国際公開第２００９／０６７６３６号Ａ２公報
【特許文献２】国際公開第２００９／０５９２７８号Ａ１公報
【非特許文献】
【００２２】
【非特許文献１】Ｊ．Ｍｕら。（“ＦＧＦ２１  Ａｎａｌｏｇｓ  ｏｆ  ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  Ａｃｔｉｏｎ  Ｅｎａｂｌｅｄ  ｂｙ  Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ａｎｔｉｄｉａｂｅｔｉｃ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｉｎ  Ｒｏｄｅｎｔｓ”，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，Ｖｏｌ．６１，ｎｏ．２，３０Ｄｅｃｅｍｂｅｒ２０１１）
【非特許文献２】Ｈｏｅｇ−Ｊｅｎｓｅｎら、Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ．２００５，１１，３３９−３４６
【非特許文献３】Ｃｈｏｕら。ＰＮＡＳ，２０１４，１１２（８），２４０１−２４０６
【非特許文献４】Ｂｒｏｗｎｌｅｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９７９，２０６（４４２３），１１９０−１１９１；Ｚｉｏｎ  ＴＣ，２００４，ＰｈＤ  ｔｈｅｓｉｓ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，“Ｇｌｕｃｏｓｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  ｓｅｌｆ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ”
【非特許文献５】Ｇｕら、ＡＣＳ  Ｎａｎｏ，２０１３，７（８），６７５８−６７６６
【非特許文献６】Ｌｕｏら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２０１２，３３，８７３３−８７４２
【非特許文献７】Ｑｉら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２００９，３０，２７９９−２８０６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
従って、本発明の一つの目的は、ヒト又は動物の体内においてインビボでグルコース濃度の上昇に応えてペプチドホルモンの活性を変更する、好ましくは増加させる手段及び方法を提供することである。
【００２４】
本発明の更なる目的は、ヒト又は動物の体内においてインビボでグルコース濃度の低下に応えてペプチドホルモンの活性を変更する、好ましくは減少させる手段及び方法を提供することである。
【００２５】
本発明の更なる目的は、ヒト又は動物の体内においてインビボでグルコース濃度の低下に応えてペプチドホルモンの活性が減少し、グルコースの濃度の増加に応えて増加するように、ヒト又は動物の体内においてインビボでグルコース濃度の変動に応えてペプチドホルモンの活性を変更する手段及び方法を提供することである。
【００２６】
更に、本発明の目的は、グルコース応答性治療用ペプチド共役体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
定義：
本発明によれば、ペプチド共役体は、ペプチドホルモンを含む第１の部分と、不活性化手段、即ち、本明細書では「阻害物質」とも称されるペプチドホルモンを不活性化する手段を含む第２の部分と、を備え、第１及び第２の部分が加水分解性連結体部分を介して複合化されている共役体である。
【００２８】
本発明によれば、ペプチドホルモンは、インビボで特定の分子経路を活性化又は不活性化するペプチドであり、該ペプチドによってペプチドホルモンが投与される被験体の代謝活性が変更される。好ましくは、本発明によるペプチドホルモンとして、インスリン又はアミリン等の膵臓ホルモン、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、胃阻害ポリペプチド（ＧＩＰ：ｇａｓｔｒｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ、グルコース依存性インスリン分泌刺激ペプチドとしても知られる）又はコレシストキニン（ＣＣＫ）等の消化管ホルモン、アディポネクチン又はレプチン等の脂肪細胞由来ホルモン、インターロイキン６（ＩＬ−６）はインターロイキン８（ＩＬ−８）等マイオカイン、ベータトロフィン、線維芽細胞増殖因子１９（ＦＧＦ１９）及び線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）等の肝臓由来ホルモンが挙げられる。更に、本発明によるペプチドホルモンは、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）及び成長ホルモン等の脳由来タンパク質であってもよい。
【００２９】
本発明によれば、インスリンアナログは、ヒト又は動物の体内においてインビボでインスリン様機能、即ち特にグルコースの血液から脂肪、肝臓、及び骨格筋細胞への吸収を促進することによって炭水化物、脂肪、及びタンパク質の代謝の調節における機能を有するペプチドである。
【００３０】
本発明によれば、加水分解性連結体は、共役体のペプチドホルモン部分の大半が阻害物質と会合して、即ち、インビボ条件下で（正常な血糖レベルで）本発明によるペプチド共役体の部分として存在し、共役体のペプチドホルモン部分の少数がインビボ条件下で（正常な血糖レベルで）連結体化合物を含まない状態で存在するように、ペプチドホルモン及び阻害物質を共に結合するが、インビボ条件下である程度まで加水分解されやすい化合物を意味する。本発明によれば、少なくとも１％最大５０％の連結体が加水分解されるように、連結体と加水分解された連結体の間の平衡が５時間以内に存在するように、ｐＨ７．４のリン酸緩衝液中においてｉｎ  ｖｉｔｒｏで連結体が加水分解する場合、該連結体はインビボで加水分解性である。
【００３１】
本発明によれば、実施例６に記載される条件下で、連結体が９６時間以内に、好ましくは７２時間以内に、より好ましくは２４時間以内にグルコースと、連結体の少なくとも一部との間で共役体を生成する場合、Ｐ−Ｌｐ及びＬｉ−Ｉの少なくとも１つの共役体部分はインビボでグルコースに共有結合する。
【００３２】
本発明によれば、加水分解性連結体Ｌの加水分解は、少なくとも２％最大１００％の連結体が加水分解されるように、連結体と加水分解された連結体との間の平衡が５時間以内に存在するように、また加水分解された連結体の量がグルコースの存在によって増加されるように、該連結体が１００００当量のグルコースが存在する状態でｐＨ７．４のリン酸緩衝液中、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で加水分解する場合に、グルコースによって促進されている。
【００３３】
本発明によれば、不活性化物質（Ｉ）はペプチド（Ｐ）の活性部位を不活性化することができる分子である。かかる分子（Ｉ）は、例えば、環境へのＰの活性部位の露出を制限することができる分子であってもよい。例として、環境に対するＰの活性部位の露出の制限は、例えば、ＰＥＧ、Ｆｃ抗体、ＸＴＥＮ、ＰＡＳｙｌａｔｉｏｎ、血清アルブミン（共有結合）、炭水化物ポリマー（デキストラン、ＨＥＳ、ポリアシル化等）、ナノ粒子及びヒドロゲル等の高分子物質にＰを（加水分解性連結体及び共役体の不活性化物質部分を介して）結合することによって達成され得る。本発明によれば、実施例９（ここでＰはインスリンである）に記載される条件下で、ＰＩの活性がＰの活性の５０％以下である場合、不活性化物質（Ｉ）はペプチド（Ｐ）を不活性化することができる分子である。
【００３４】
本発明によれば、阻害物質又は不活性化物質（Ｉ）は、代替的には、ヒト血清中でより大きなタンパク質構造に非共有結合的に結合することによってインビボで本発明による複数の共役体のクラスター化を促進することができる分子であってもよい。本発明のこの態様によれば、阻害物質又は不活性化物質（Ｉ）は、低分子アルブミンバインダー若しくは脂質分子、又は血清アルブミンに対して非共有結合することができる任意の分子であってもよい。
【００３５】
また、インスリンの不活性化物質又は阻害物質は、インスリンの活性を阻害する位置で、Ｌを介して連結されて、インスリンに結合される分子であってもよい。
【００３６】
本発明によれば、ペプチド（Ｐ）の活性部位を不活性化することができる分子は、共役体で存在する場合、或る程度まで関連するペプチドホルモンの活性を減少させることを担っており、実施例９（ここで、Ｐはインスリンである）に記載されるインビトロ条件下で、関連するペプチドホルモンの活性は、ペプチド（Ｐ）の活性（即ち、ペプチド（Ｐ）の活性部位を不活性化することができる分子がない状態でのＰの活性）の５０％未満、好ましくは４０％未満、更に好ましくは３０％未満、更に好ましくは２０％未満、最も好ましくは１０％未満まで減少される、分子構造である。不活性化物質又は阻害物質の阻害能力は、ペプチド「Ｐ」に対する機能的受容体測定法を使用して測定され得る。最初に、ｐＨ７．４のＰＢＳに溶解したＰ−Ｌ−Ｉ分子の官能価（ＥＣ５０）を測定することができ、次に、Ｐ−Ｌｐ−Ｇｌｃ又はＰ−Ｌ分子を測定することができた（該当する場合、関連する巨大分子構造が存在する状態で）。ＰＢＳ  ｐＨ７．４に溶解したＰ−Ｌ−Ｉ混合物に１０００当量のグルコースを添加し、７２時間反応させることによってＰ−Ｌｐ−Ｇｌｃを形成することができた。阻害物質「Ｉ」が、血漿タンパク質に結合することができる分子等のヒト血清中のより大きなタンパク質構造への非共有結合が可能な分子である場合、関連する構造又はタンパク質を実験に含むべきである。Ｐ−Ｌｐ−Ｇｌｃと比較されるＰ−Ｌ−Ｉの官能価（ＥＣ５０）は、ペプチド「Ｐ」の活性を減少させるための阻害物質「Ｉ」の能力を決定する。
【００３７】
本発明によるペプチド共役体は、インビボでのグルコース濃度の上昇に応えて活性なペプチドホルモンを放出する動的平衡を作り出すことによって、インビボで炭水化物濃度の変動に応えてペプチドホルモンのホルモン活性を変更する課題に対処し解決するインビボで低下するグルコース濃度に応えて、活性なペプチドホルモンのプールは、複合化されたペプチドのプールからの放出が少ないこと、及びペプチドホルモン自体の比較的短い半減期に起因して減少される。
【００３８】
従って、本発明は、グルコース応答療法を提供する新たな方法及び手段を提供する。本発明による治療用ペプチド共役体は、不活性化手段を備える第２の部分に結合されている、活性なペプチドホルモンを備える第１の部分からなることによってグルコース応答性である。不活性化手段は、例えば、デポー形成を促進すること、血清アルブミン等の大きな分子への結合を促進することによって、又はペプチドホルモンの活性部位を直接阻害することによって、ペプチドホルモンを不活性化し得る。ペプチドホルモンを不活性化する手段を備える第２の部分に結合されたペプチドホルモンを備える第１の部分からなる共役体、すなわち、インスリンが血清アルブミン等のより大きな分子に共有結合又は非共有結合されているインスリンデポーとして当該技術分野で知られている。これらのインスリンデポーは、インビボでゆっくりと絶えず身体にインスリンを送達する。
【００３９】
本発明は、例えば、加水分解性連結体（又はその一部分）が加水分解後に炭水化物、好ましくはグルコースを結合することができる場合、ペプチドホルモン及び不活性化手段と会合させるための加水分解性連結体の使用にある。加水分解後の再会合は、炭水化物、好ましくはグルコースの存在によって妨げられる。代替的な実施の形態では、炭水化物、好ましくはグルコースの存在は、別の機構によるＬの加水分解後の連結体（Ｌ）の再編成を妨げる。代替的な実施の形態では、炭水化物、好ましくはグルコースの存在は、Ｌの加水分解を促進する。
【００４０】
本発明の共役体の第１及び第２の部分は加水分解性連結体を介して連結される。加水分解された後に加水分解性連結体の少なくとも一部がグルコースを結合するか、或いはグルコースが加水分解性連結体の加水分解を促進する。
【００４１】
溶液中、例えばインビボでは、本発明による共役体は、不活性なペプチド共役体（連結体は加水分解されていない）に加えて分離されたその２つの部分、即ち、分離された、連結体が加水分解されている活性なペプチドホルモン及び不活性化手段を含む動的平衡状態で存在する。
【００４２】
グルコースが存在する場合、グルコースは加水分解性連結体の少なくとも一部分に結合することにより、そのグルコースが結合した部分、すなわちグルコース結合活性ペプチドホルモン及び／又はグルコース結合不活性化手段は、それ以上ＰＬＩ、ＰＬＰ及びＬＩＩの間の動的平衡に加わることはない。
【００４３】
動的平衡は、除去された部分を置き換えることにより、グルコース濃度が増加する場合に新たな活性なペプチドホルモンを送達する。
【００４４】
代替的な実施の形態では、グルコースが存在する場合、グルコースは加水分解性連結体の加水分解を促進し、それによって、動的平衡状態で量が増した活性なペプチドホルモンが形成されるように動的平衡が変更される。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】
【発明を実施するための形態】
【００４６】
本発明は、ペプチドホルモン及びその活性が、加水分解された場合にグルコースを結合する加水分解性連結体を介して不活性化手段に該ペプチドホルモンを結合すること、又はグルコースによって促進される加水分解によって、インビボでグルコース濃度に対して応答性とされ得るという独創的な知見に基づく。
【００４７】
そのために、インビボで活性なペプチドホルモンと不活性化されたペプチド共役体の間に動的平衡が存在する。
【００４８】
グルコース（Ｇｌｃ）の不在下で、又は非常に低濃度のグルコースの存在下で、ペプチドホルモンの大半は、本発明によるペプチド共役体の形態となり、すなわち、該ペプチドホルモンは、不活性化された共役体を好む動的平衡によって不活性化形態となる。
【００４９】
しかしながら、グルコースの存在下では、グルコースは活性なペプチドホルモン及び／又は不活性化物質に結合することにより、グルコースが結合するそのペプチドホルモンからの不活性化ペプチド共役体の形成が妨げられる。かかる状況では、動的平衡は、グルコースと会合している各ペプチドホルモンに対して、不活性ペプチド共役体のリザーバから１つの活性なペプチドホルモンを生成する。言い換えれば、グルコースの存在は、不活性ペプチド共役体の一部として存在しているペプチドホルモンのリザーバからの活性なペプチドホルモンの放出を引き起こす。グルコースの濃度の低下は、活性なペプチドホルモンレベルの減少を引き起こす。別の代替法として、炭水化物、好ましくはグルコースの存在によって同じ効果が達成され得て、任意の他の機構によってＬの加水分解後に連結体（Ｌ）の再編成が抑制される。
【００５０】
或いは、グルコースによって促進される加水分解性連結体の加水分解によって同じ効果が達成され得る。
【００５１】
この知見は、例えば、インスリンのグルコース応答性デポー等のペプチドホルモンのグルコース応答性デポーの製造に道を開く。
【００５２】
従って、最も広い態様では、本発明は、式Ｐ−Ｌ−Ｉの共役体に関し、式中、Ｐはインビボで炭水化物の代謝を行うペプチドホルモンであり、ＬはＬｐ及びＬｉからなる連結体分子であり、Ｉはインビボで炭水化物の代謝に対するペプチドホルモンＰの効果を不活性化又は阻害することができる分子であり、
ａ．上記共役体部分Ｐ−Ｌｐ及びＬｉ−Ｉの少なくとも１つのモル過剰で上記共役体Ｐ−Ｌ−Ｉが存在するインビボにおいて、上記共役体Ｐ−Ｌ−Ｉ及び上記加水分解された共役体部分Ｐ−Ｌｐ＋Ｌｉ−Ｉが動的平衡状態で存在するように、上記連結体分子Ｌがインビボで加水分解性であることを特徴とし、
ｂ．共役体部分Ｐ−Ｌｐ及びＬｉ−Ｉの少なくとも１つがグルコースに共有結合し、それによってインビボでグルコースの濃度が増加した場合に、インビボでＩに結合していないＰの濃度が増加することを更に特徴とする、或いは加水分解性連結体Ｌの加水分解がグルコースによって促進されることを更に特徴とする。
【００５３】
Ｐ：
Ｐはインビボで炭水化物の代謝を行うペプチドホルモンである。
【００５４】
本発明の一態様では、ペプチドホルモンＰは、インスリン又はアミリン等の膵臓ホルモンである。本発明の別の態様では、ペプチドホルモンは、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）胃阻害ポリペプチド（ＧＩＰ、グルコース依存性インスリン分泌刺激ペプチドとしても知られる）若しくはコレシストキニン（ＣＣＫ）、又はそれらのアナログ等の消化管ホルモンである。本発明の別の態様では、ペプチドホルモンは、アディポネクチン又はレプチン等の脂肪細胞由来ホルモンである。本発明の別の態様では、ペプチドホルモンは、インターロイキン６（ＩＬ−６）若しくはインターロイキン８（ＩＬ−８）、又はそれらのアナログ等のマイオカインである。本発明の別の態様では、ペプチドホルモンは、ベータトロフィン、線維芽細胞増殖因子１９（ＦＧＦ１９）若しくは線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）、又はそれらのアナログ等の肝臓由来ホルモンである。本発明の別の態様では、ペプチドホルモンは、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）又はそのアナログ等の脳由来タンパク質である。本発明の別の態様では、ペプチドホルモンは成長ホルモン又はそのアナログである。
【００５５】
本発明の非常に好ましい態様では、ペプチドホルモンは、インスリン又はそのアナログであるか、又はインスリン受容体（ＩＮＲ）を活性化することができる分子である。
【００５６】
本発明によれば、グルコースが結合されるペプチドホルモンもＰの定義によって含まれる。
【００５７】
Ｉ：
Ｉは、例えば、インビボで不活性な複合体の形成によって又はペプチドホルモンの活性部位の直接的な阻害によって、ペプチドホルモンの活性の不活性化又は阻害を亢進することにより、インビボで炭水化物の代謝に対するペプチドホルモンＰの効果を不活性化又は阻害することができる分子又は物質である。
【００５８】
インビボで炭水化物の代謝に対するペプチドホルモンＰの効果を不活性化する又は阻害することができる分子及び機構は当該技術分野でよく知られている。インビボでペプチドホルモンを不活性化又は阻害することは、一般的には、環境に対するＰの活性部位の曝露を制限することによって達成され得る。例として、環境に対するＰの活性部位の曝露を制限することは、例えば、Ｐを（加水分解性連結体及び共役体の不活性化物質部分を介して）、ＰＥＧ、Ｆｃ抗体、ＸＴＥＮ、ＰＡＳｙｌａｔｉｏｎ、血清アルブミン（共有結合）、炭水化物ポリマー（デキストラン、ＨＥＳ、ポリシアリル化等）、ナノ粒子及びヒドロゲル等の巨大分子物質に結合することによって達成され得る。或いは、Ｉは、低分子アルブミンバインダー又は血清アルブミンに非共有結合することができる脂質であってもよい。また、インスリンの不活性化物質又は阻害物質は、インスリンの活性を阻害する位置で、Ｌを介して連結されて、インスリンに結合される分子であってもよい。
【００５９】
共役体として存在する場合、本発明による不活性化物質又は阻害物質は、関連するペプチドホルモンの活性が、インビトロ条件下での付着された不活性化物質又は阻害物質が無い状態の活性の５０％未満、好ましくは４０％未満、更に好ましくは３０％未満、更に好ましくは２０％未満、最も好ましくは１０％未満まで減少される程度まで関連するペプチドホルモンの活性を減少させなければならない。不活性化物質又は阻害物質の阻害能力は、ペプチド「Ｐ」に対する機能的受容体測定法を使用して測定され得る。第１に、ｐＨ７．４のＰＢＳに溶解されたＰ−Ｌ−Ｉ分子の官能価（ＥＣ５０）を測定することができ、次に、Ｐ−Ｌｐ−Ｇｌｃ分子を測定することができた（該当する場合、関連する巨大分子構造が存在する状態で）。１０００当量のグルコースをｐＨ７．４のＰＢＳに溶解したＰ−Ｌ−Ｉ混合物に添加して、７２時間置いて反応させることにより、Ｐ−Ｌｐ−Ｇｌｃを形成することができた。阻害物質「Ｉ」が、血漿タンパク質に結合することができる分子である場合、該タンパク質が実験に含まれるべきである。Ｐ−Ｌｐ−Ｇｌｃと比較されるＰ−Ｌ−Ｉの官能価（ＥＣ５０）は、ペプチド「Ｐ」の活性を減少させるための阻害物質「Ｉ」の能力を決定する。
【００６０】
Ｌ：
Ｌは、Ｌｐ及びＬｉからなる加水分解性連結体分子である。Ｌが加水分解されると、水の分子はＬに付加され、ＬがＬｐ及びＬｉへと断片化される。
【００６１】
Ｌはインビトロ及びインビボで加水分解性でなくてはならないが、Ｌ、Ｌｐ、及びＬｉが、Ｌ（共役体）が主な化合物であり、Ｌｉ及びＬｐ（共役体部分）が少数の化合物である、インビトロ及びインビボ条件下で、水中で動的平衡状態にあるように、Ｌは低頻度で加水分解されるに留まることが好ましい。言い換えれば、ＬはＬｐ及びＬｉのモル過剰でインビトロ条件下で存在し、Ｐ−Ｌ−Ｉがインビトロ条件下でＰ−Ｌｐ及びＬｉ−Ｉのモル過剰で存在することを意味する。連結体が実施例６に記載されるインビトロ条件下で動的平衡の存在をもたらす場合、該連結体は本発明による加水分解性とされ、ここで、Ｐ−Ｌ−Ｉは、共役体部分Ｐ−Ｌｉ及び／又はＬｐ−Ｉの存在に関して、少なくとも２：１、好ましくは少なくとも３：１、より好ましくは少なくとも４：１、更に好ましくは少なくとも５：１、更に好ましくは少なくとも１０：１、更に好ましくは少なくとも５０：１、最も好ましくは少なくとも１００：１のモル過剰で存在する。Ｐ−Ｌ−Ｉ分子のインビトロ加水分解性をｐＨ７．４のＰＢＳ中にＰ−Ｌ−Ｉ分子を溶解し、２４時間後にＰ−Ｌｐ又はＬｉ−ＩとＰ−Ｌ−Ｉの間の比をＵＰＬＣ−ＭＳを使用して調べることによって測定することができた。
【００６２】
本発明の好ましい実施形態では、Ｌｐ又はＬｉのいずれか（又はＬｐとＬｉの両方）は、好ましくはグルコースなどの炭水化物に共有結合することができなければならない。グルコースに結合した後、グルコースが結合される各フラグメント（Ｐ−Ｌｐ−Ｇｌｃ及び／又はＧｌｃ−Ｌｉ−Ｉ）は、もはや共役体Ｐ−Ｌ−Ｉの形成に加わることができない。モル過剰のグルコースと或る化合物を接触させて７２時間以内にグルコース複合化構造を形成することができる場合、該化合物はグルコースに共有結合することができるとされている。インビトロでの連結体のグルコース結合能は、実施例２に示されるように測定され得る。連結体「Ｌ」をｐＨ７．４のＰＢＳ中に１０００当量のグルコースと共に溶解し、生成されたＬｐ−Ｇｌｃを２４時間、４８時間及び７２時間後にＬＣ−ＭＳによって測定する。
【００６３】
代替的な実施形態では、グルコースは、Ｌｐ及びＬｉの一方又は両方に結合する機構とは別の機構によってＬｐ及びＬｉの再会合を妨げてもよい。
【００６４】
更に別の代替的な実施形態では、グルコースは、Ｌの加水分解を促進、亢進し、又は増強する。
【００６５】
本発明の好ましい態様では、Ｌはヒドラゾン、Ｏ，Ｏ−アセタール、Ｎ，Ｏ−アセタール、Ｎ，Ｎ−アセタール、チアゾリジン及びチアゾリンを含むＳ，Ｎ−アセタール、又はジチオランを含むＳ，Ｓ−アセタール、並びにそれらの誘導体のいずれかである。
【００６６】
ヒドラゾンは、それらの詳しく説明される化学、容易な形成、並びに加水分解及び他の反応に対する結合の安定性及び不安定を直接的に調整することができるため特に好ましい。
【００６７】
アセタール（Ｏ、Ｎ、Ｓを含む）はヒドラゾンよりもゆっくりと交換すると予想されるが、加水分解及び他の反応に対する結合の安定性及び不安定性と並んで、生物学的に容易に分解される切断産物の形成を調整し得ることから、アセタールもまた特に好ましい。
【００６８】
本発明の非常に好ましい態様では、Ｌは一般式１のヒドラゾンである：
【化１】
2020511421.tif 000003
【００６９】
式中、Ｒ１は好ましくは芳香環とヒドラゾンの間に１個〜１０個の炭素スペーサーアルキル鎖を有する芳香環であり、Ｒ２は好ましくはベンゾイルである。
【００７０】
好ましくは、Ｒ１は、アルキル連結体を介してヒドラゾンに付着した弱〜中程度に活性化する（電子供与性）又は非活性化する（電子吸引性）置換基を有する芳香環である。
【００７１】
最も好ましくは、Ｒ２は、−アミド、−ＯＭｅ、−Ｎ（ＣＨ３）２、又は−ＯＨ等の中程度〜強い電子供与性置換基（複数の場合もある）を有するベンゾイルである。
【００７２】
特に、Ｌは一般式２の共役体であってもよい：
【化２】
2020511421.tif 000004
【００７３】
式中、Ｒ１は好ましくは芳香環とヒドラゾンの間に１個〜１０個の炭素スペーサーアルキル鎖を有する芳香環であり、Ｒ３は電子供与性基であり、Ｒ４はＰ又はＩを含む。
【００７４】
最も好ましくは、Ｒ１はアルキル連結体を介してヒドラゾンに付着された弱〜中程度に活性化する又は非活性化する置換基を有する芳香環である。
【００７５】
本発明の好ましい実施形態では、Ｌは一般式の共役体である：
【化３】
2020511421.tif 000005
【００７６】
式中、Ｒ１は以下から選択され：
【化４】
2020511421.tif 000006
2020511421.tif 000007
2020511421.tif 000008
2020511421.tif 000009
ａは１〜１０であり；ｎは０〜４であり；Ｒ５は水素、メチル、又はエチルであり；Ｒ６は水素、メチル、エチル、アルカン、ペプチド（Ｐ）、及び／又は阻害物質（Ｉ）であり；Ｒ７は水素、Ｏ−ベンジル、Ｏ−メチル、Ｏ−アルカン、アミド、アミン、ハロゲン、ＮＯ２、ペプチド（Ｐ）、及び／又は阻害物質（Ｉ）であり、Ｗは炭素（ＣＨ２、ＣＨ、又はＣ）、窒素（ＮＨ）、ＮＣＨ３、硫黄（Ｓ）及び／又は酸素（Ｏ）であり、且つ
【００７７】
式中、Ｒ２が以下から選択され：
【化５】
2020511421.tif 000010
2020511421.tif 000011
ｂは１〜１０であり；ｎは０〜４であり；Ｒ８は水素、ベンジル、メチル、アルカン、ペプチド（Ｐ）、及び／又は阻害物質（Ｉ）であり；Ｒ９は水素、メチル、アルカン、ペプチド（Ｐ）、及び／又は阻害物質（Ｉ）であり、Ｒ１０はハロゲン（Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、又はＦ）、エステル、カルボン酸、及び／又は阻害物質Ｉであり；Ｒ１１は水素、Ｏ−ベンジル、Ｏ−メチル、Ｏ−アルカン、アミド、アミン、ハロゲン、ペプチド（Ｐ）、及び／又は阻害物質（Ｉ）であり；Ｗは炭素（ＣＨ２、ＣＨ、又はＣ）、窒素（Ｎ又はＮＨ）、硫黄（Ｓ）、及び／又は酸素（Ｏ）である。
【００７８】
Ｐ−Ｌ−Ｉ：
本発明による式Ｐ−Ｌ−Ｉの共役体は、上に言及される構成要素Ｐ、Ｌ、及びＩを含む共役体である。
【００７９】
Ｌの加水分解性の性質により、共役体Ｐ−Ｌ−Ｉは、Ｐ−Ｌ−ＩがＰ−Ｌｐ及びＬｉ−Ｉの一方又は両方のモル過剰である動的平衡状態でインビボにおいて存在する。
【００８０】
Ｐ及びＩの会合に起因して、共役体Ｐ−Ｌ−Ｉはインビボでは不活性（又は有効性が減少している）であるのに対し、ペプチドホルモンＰ−Ｌｐと並んでペプチドホルモンＰ−Ｌｐ−Ｇｌｃはインビボで活性なペプチドホルモンである。
【００８１】
本発明の非常に好ましい態様では、Ｐ−Ｌｐは、グルコース（Ｇｌｃ）に共有結合する。
【００８２】
次いで、それにより活性化Ｐ（それ以上Ｉと会合しないＰ）が阻害物質と更に会合するのを阻む。例として、Ｌがヒドラゾンである場合、Ｐ−Ｌｐはヒドラジドである。ヒドラジドはグルコースと反応して、新たなヒドラゾンであるＰ−Ｌｐ−Ｇｌｃを形成し得る。それにより、グルコースに結合することによって、活性なペプチドホルモンのヒドラジドが阻害物質と更に反応することを阻む。理論上、Ｐ−Ｌｐ−Ｇｌｃ分子はＰ−Ｌｐ及びグルコースと新たな平衡状態にあるが、グルコース濃度がインビボにおいてＰ−Ｌｐ部分よりも１００００当量超高いことから、グルコースがＰ−Ｌｐと結合してＰ−Ｌｐ−Ｇｌｃを形成した場合に、解離は非常にゆっくりであるため、Ｐ−Ｌｐ−Ｇｌｃは安定な分子とされ得ることが期待される。対照的に、Ｌｉ−Ｉ部分は、ここでは他の成分と反応し得るアルデヒドである。
【００８３】
本発明の代替的な実施形態では、加水分解性連結体Ｌの加水分解はグルコースによって促進され、それによりグルコースの存在下で動的平衡が変更される。
【００８４】
本発明の非常に好ましい態様では、Ｐはインスリン若しくはインスリンアナログであるか、又はインスリン受容体（ＩＮＲ）を活性化することができる分子である。好ましくは、Ｐは、１μＭ未満等の濃度のμＭ濃度未満でインスリン受容体を活性化することができる。
【００８５】
更なる態様では、本発明は、ヒトにおける疾患の治療に対する式Ｐ−Ｌ−Ｉの共役体の使用に関し、式中、Ｐはインビボで炭水化物の代謝を行うペプチドホルモンであり、ＬはＬｐ及びＬｉからなる連結体分子であり、Ｉはインビボで炭水化物の代謝に対するペプチドホルモンＰの効果を阻害することができる分子であり、
ａ．連結体分子Ｌは、共役体Ｐ−Ｌ−Ｉ及び加水分解された共役体Ｐ−Ｌｐ＋Ｌｉ−Ｉが、共役体Ｐ−Ｌ−Ｉが共役体部分Ｐ−Ｌｐ及びＬｉ−Ｉの少なくとも１つのモル過剰で存在するインビボにおいて動的平衡状態で存在するようにインビボで加水分解性であることを特徴とし、
ｂ．共役体部分Ｐ−Ｌｐ及びＬｉ−Ｉの少なくとも１つがグルコースに共有結合し、それによって、インビボでグルコースの濃度が増加した場合に、インビボでＩに結合していないＰ−Ｌｐの濃度が増加することを更に特徴とする、或いは加水分解性連結体Ｌの加水分解がグルコースによって促進されていることを更に特徴とする。
【００８６】
更なる態様では、本発明は、被験体における疾患の治療方法に関し、該方法は、式Ｐ−Ｌ−Ｉの共役体を被験体に投与することを含み、式中、Ｐはインビボで炭水化物、好ましくはグルコースの代謝を行うペプチドホルモンであり、ＬはＬｐ及びＬｉからなる連結体分子であり、Ｉはインビボで炭水化物の代謝に対するペプチドホルモンＰの効果を阻害することができる分子であり、
ａ．連結体分子Ｌは、共役体Ｐ−Ｌ−Ｉ及び加水分解された共役体部分Ｐ−Ｌｐ＋Ｌｉ−Ｉが、共役体Ｐ−Ｌ−Ｉが共役体部分Ｐ−Ｌｐ及びＬｉ−Ｉの少なくとも１つのモル過剰で存在するインビボで動的平衡状態で存在するようにインビボで加水分解性であることを特徴とし、
ｂ．共役体部分Ｐ−Ｌｐ及びＬｉ−Ｉ少なくとも１つがグルコースに共有結合し、それによって、インビボでグルコースの濃度が増加した場合に、インビボでＩに結合していないＰ−Ｌｐの濃度が増加することを更に特徴とする、或いは加水分解性連結体Ｌの加水分解がグルコースによって促進されていることを更に特徴とする。
【００８７】
本発明の非常に好ましい態様では、Ｐはインスリン又はインスリンアナログである。
【００８８】
本発明の非常に好ましい態様では、Ｉは、デポー形成を容易にすることにより、例えば血清アルブミン等の大きな分子への結合を容易にすることにより、Ｐを不活性化又は阻害することができる作用物質である。
【００８９】
本発明の別の非常に好ましい態様では、Ｉは、Ｐの活性部位を阻害することができる作用物質、例えば、ペプチドホルモンの活性を阻害する位置でペプチドホルモン（例えばインスリン）に結合されている阻害物質である。
【００９０】
本発明の別の非常に好ましい態様では、Ｉは、デポー形成を容易にすることにより、例えば血清アルブミン等の大きな分子へのＰの結合を容易にすることにより、Ｐを不活性化又は阻害することができる作用物質である。或いは、Ｉは、ヒドロゲル又はナノ粒子等の構造中の複数の構成要素をクラスター化することができる作用物質であってもよい。
【００９１】
本発明の別の態様では、Ｉは血清アルブミン等の大きな分子である。
【００９２】
本発明の別の態様では、Ｉはヒドロゲルである。ヒドロゲルは、水が分散媒であるポリマー鎖のネットワークからなる親水性ゲルである。本発明のこの態様では、ヒドロゲルが阻害物質（Ｉ）であり、ヒドロゲル上の化学ハンドル（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｈａｎｄｌｅ）が連結体（Ｌ）を介するペプチドホルモン（Ｐ）の共有結合による付着を可能とする。
【００９３】
本発明の一態様では、Ｉはナノ粒子である。ナノ粒子（コロイド薬物送達システムの一種として見なされる場合がある）は、直径２ｎｍ〜１０００ｎｍのサイズ範囲を有する粒子を含む。本発明のこの態様では、ナノ粒子はポリマーで被覆されて、連結体（Ｌ）を介してペプチドホルモン（Ｐ）の共有結合による付着を可能とし得る。
【００９４】
しかしながら、非常に好ましい態様では、Ｉは、脂肪酸又は低分子アルブミンバインダー等の血清アルブミン、又は他の血漿タンパク質に非共有結合的に結合することができる作用物質である。
【００９５】
本発明の非常に好ましい態様では、Ｉは、デポー形成を容易にすることによって、例えば血清アルブミン等の大きな分子へのＰの結合を容易にすることによって、Ｐを不活性化又は阻害することができる作用物質である。好ましくは、かかる作用物質は、構造Ａを備える脂肪酸であり、ここでＡは、
【化６】
2020511421.tif 000012
から選択され、ｃは少なくとも１０である。
【００９６】
その他の好ましい阻害物質（Ｉ）：
別の非常に好ましい態様では、Ｉは、複合化されたペプチドが腎臓で除去されることを妨げる大きな分子である。かかる分子は、組み換えアルブミン、Ｆｃ抗体、ＰＥＧ，又はデキストラン、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）若しくはシアル酸のポリマー（ポリアシル化）等の炭水化物ポリマーであってもよい。
【００９７】
共役体中のホルモンＰの活性の阻害に加えて、組み換えアルブミンは、連結体（Ｌ）を介してペプチド（Ｐ）をロード（ｌｏａｄ）することができ、ペプチドホルモンＰの低い腎排泄をもたらし、インビボで長寿命のシステムを提供する。同様に、ＩｇＧ抗体のＦｃ部分への連結体（Ｌ）を介するペプチド（Ｐ）の複合化は、Ｆｃ受容体を介する共役体の再利用を可能とし、低い腎臓クリアランスに結びつく。同じ方法、即ちＰＥＧ２０〜ＰＥＧ８０を使用するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）への連結体（Ｌ）を介するペプチド（Ｐ）の化学的複合化において、ペプチドの流体力学の体積を増加させることにより腎排泄を抑制する。従って、本発明の一つの非常に好ましい態様では、Ｉは、組み換えアルブミン、Ｆｃ抗体、又はＰＥＧである。
【００９８】
同じ方法で、デキストラン、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）又はポリシアリル化されたそれらの共役体等の炭水化物ポリマーは、複合化されたペプチドが腎臓で除去されること妨げる。デキストランポリマーは、Ｌ．メセンテロイデス（Ｌ．ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）等の細菌から得られてもよく、α（１−６）グリコシドリンケージ及びわずかなα（１−３）結合（Ｌ．メセンテロイデスの場合、約９５％のα（１−６）及び５％のα（１−３））によって連結されたＤ−グルコースポリマーである。未修飾のデキストランに加え、カルボキシメチル−デキストラン（ＣＭＤ）、ジエチルアミノエチルデキストラン（ＤＥＡＥＤ）等の様々な合成デキストラン誘導体、ガラクトース−ＣＭＤ（Ｇａｌ−ＣＭＤ）及びマンノース−ＣＭＤ（Ｍａｎ−ＣＭＤ）等のグリコシル化型のＣＭＤ、カルボキシメチルベンジルアミドデキストラン（ＤＣＭＢ）、カルボキシメチル硫酸デキストラン（ＤＣＭＳｕ）及びカルボキシメチルベンジルアミド硫酸デキストラン（ＤＣＭＢＳｕ）を使用し、連結体（Ｌ）を介してペプチド（Ｐ）を化学修飾することができる。デキストランは、ＰＥＧとして、ペプチドの流体力学的容積を増加させ、腎濾過の減少に結び付く。ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）は、植物多糖アミロペクチンの制御されたヒドロキシエチル化によって得られる修飾された天然高分子である。アミロペクチンは、一次α−１，４−グリコシド結合のみならず、存在量の少ないα−１，６リンケージも含むＤ−グルコースのポリマーであり、天然の分岐鎖炭水化物をもたらす。デンプン前駆物質のヒドロキシエチル化は、第１に、水結合能力を増加させて粘度を減少させることにより水への溶解度を増加させること、第２に、血漿α−アミラーゼによる即時の分解、そしてその後の腎排泄を妨げるという２つの目的を果たす。ＨＥＳは、還元末端で化学修飾されてＰ−Ｌ部分の付着を可能とし得る。「シアル酸」は単一の化学物質を指さず、むしろ炭素が９個の単糖のグループ全体を指し、最も重要な例は、５−Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）、５−Ｎ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）及び２−ケト−３−デオキシノヌロソン酸（Ｋｄｎ）である。しかしながら、ヒトにおいて唯一観察されたポリシアル酸（ＰＳＡ）変異体は、Ｎｅｕ５Ａｃの直鎖α−２−８−連結ホモポリマーであるコロミン酸（ＣＡ）である。ペプチド又はタンパク質へのポリシアル酸の複合化はポリアシル化と呼ばれる。ＰＥＧ及びＰＥＧ模倣物と同様に、デキストラン及びＨＥＳ、すなわちポリシアリル化共役体の長期の薬物動態学的プロファイルの裏にある駆動力は、腎臓クリアランスの減少に加えて、酵素分解及び抗体認識からの遮蔽をもたらす流体力学半径の増加であると考えられている。
【００９９】
好ましい加水分解性連結体：
本発明の好ましい態様では、Ｌは、ヒドラゾン、Ｏ，Ｏ−アセタール、Ｎ，Ｏ−アセタール、Ν，Ν−アセタール、チアゾリジン及びチアゾリンを含むＳ，Ｎ−アセタール、又はジチオランを含むＳ，Ｓ−アセタール、並びにそれらの誘導体から選択される。
【０１００】
本発明の非常に好ましい態様では、Ｌはヒドラゾン若しくはアセタール、又はそれらの誘導体である。
【０１０１】
本発明の非常に好ましい態様では、Ｌはヒドラゾン又はヒドラゾン誘導体である。
【０１０２】
特に、Ｌは一般式：
【化７】
2020511421.tif 000013
【０１０３】
式中、Ｒ１は好ましくは芳香族部分に付着されたＩ又はＰを含み、及びＲ２はＰ又はＩを含む。
【０１０４】
特に、Ｌは一般式：
【化８】
2020511421.tif 000014
【０１０５】
式中、Ｒ１はＩ又はＰが付着される芳香族部分を含み、Ｒ３は電子供与性基であり、及びＲ４はＰ又はＩを含む。
【０１０６】
Ｒ３は芳香族部分の唯一の電子供与性基でなくてもよい。
【０１０７】
また、Ｐ又はＩは、芳香族部分の電子供与性基を介してＬに付着され得る。
【０１０８】
本発明の非常に好ましい態様では、Ｒ１は、少なくとも３個の炭素原子を含む炭素鎖からなるスペーサー領域を含む。
【０１０９】
本発明による共役体は、ヒト又は動物の被験体の治療又は予防処置に使用され得る。
【０１１０】
特に、本発明による共役体はヒト又は動物の被験体における糖尿病の治療に使用され得る。より一層詳しくは、本発明による共役体は、ヒト又は動物の被験体における糖尿病の治療に使用されてもよく、該治療は、１日当たり２回以下の投与頻度で該共役体を投与することを含む。より一層詳しくは、本発明による共役体は、ヒト又は動物の被験体において糖尿病の治療に使用されてもよく、該治療は、１日当たり１回以下の投与頻度で該共役体を投与することを含む。
【０１１１】
したがって、本発明はまた、糖尿病の治療方法に関し、該方法は、本発明による共役体を、それを必要とする人に投与することを含む。
【０１１２】
別の態様では、本発明は、本発明による共役体と、少なくとも１つの薬学的賦形剤と、を含む薬学的組成物に関する。
【０１１３】
別の態様では、本発明は、本発明による共役体と、少なくとも１つの獣医学的賦形剤と、を含む獣医学的組成物に関する。
【０１１４】
非常に好ましい実施形態では、本発明は、ヒト又は動物の体内の処置における、式Ｐ−Ｌ−Ｉの共役体の使用に関し、式中、Ｐはインビボで炭水化物の代謝を行うペプチドホルモンであり、ＬはＬｐ及びＬｉからなる加水分解性連結体分子であり、Ｉはインビボで炭水化物の代謝に対するペプチドホルモンＰの効果を不活性化又は阻害することができる分子であり、
ａ．共役体部分Ｐ−Ｌｐ及びＬｉ−Ｉの少なくとも１つのモル過剰で共役体Ｐ−Ｌ−Ｉが存在するインビボにおいて、共役体Ｐ−Ｌ−Ｉ及び共役体部分Ｐ−Ｌｐ及びＬｉ−Ｉが動的平衡状態で存在するように、連結体分子Ｌがインビボで加水分解性であることを特徴とし、
ｂ．共役体部分Ｐ−Ｌｐ及びＬｉ−Ｉの少なくとも１つがグルコースに共有結合し、それによって、インビボでグルコースの濃度が増加した場合に、インビボでＩに結合していないＰの濃度が増加することを更に特徴とする、或いは加水分解性連結体Ｌの加水分解がグルコースによって促進されていることを更に特徴とする。
【０１１５】
別の非常に好ましい実施形態では、本発明は、式Ｐ−Ｌ−Ｉの共役体に関し、式中、Ｐはインスリン又はインスリンアナログであり；Ｌはヒドラゾン、Ｏ，Ｏ−アセタール、Ν，Ｏ−アセタール、Ν，Ν−アセタール、チアゾリジン及びチアゾリンを含むＳ，Ｎ−アセタール、又はジチオランを含むＳ，Ｓ−アセタール、及びそれらの誘導体から選択され；並びにＩは血清アルブミンに非共有結合することができる分子であるか、或いはＩは血清アルブミンである。
【０１１６】
式中、Ｉが血清アルブミンである式Ｐ−Ｌ−Ｉの共役体は、例えば、Ｐ−Ｌの投与後にヒト又は動物の体内においてインビボで形成され得る。
【０１１７】
非常に好ましい実施形態では、本発明は、ヒト被験体の治療におけるその使用に関する。非常に好ましい実施形態では、本発明は、ヒト被験体における糖尿病の治療におけるその使用に関する。非常に好ましい実施形態では、本発明は、ヒト被験体における糖尿病の治療に対する医薬の製造におけるその使用に関する。
【０１１８】
別の非常に好ましい実施形態では、本発明は、式Ｐ−Ｌ−Ｉの共役体に関し、式中、Ｐはインスリン又はインスリンアナログであり；Ｌはヒドラゾン、Ｏ，Ｏ−アセタール、Ν，Ｏ−アセタール、Ν，Ν−アセタール、チアゾリジン及びチアゾリンを含むＳ，Ｎ−アセタール、又はジチオランを含むＳ，Ｓ−アセタール、及びそれらの誘導体から選択され；並びにＩは血清アルブミンに非共有結合することができる分子であるか、或いはＩは血清アルブミンであり、
ａ．共役体部分Ｐ−Ｌｐ及びＬｉ−Ｉの少なくとも１つのモル過剰で共役体Ｐ−Ｌ−Ｉが存在するインビボにおいて、共役体Ｐ−Ｌ−Ｉ及び共役体部分Ｐ−Ｌｐ及びＬｉ−Ｉが動的平衡状態で存在するように、連結体分子Ｌがインビボで加水分解性であることを特徴とし、
ｂ．共役体部分Ｐ−Ｌｐ及びＬｉ−Ｉの少なくとも１つがグルコースに共有結合し、それによって、インビボでグルコースの濃度が増加した場合に、インビボでＩに結合していないＰの濃度が増加することを更に特徴とする、或いは加水分解性連結体Ｌの加水分解がグルコースによって促進されていることを更に特徴とする。
【０１１９】
非常に好ましい実施形態では、本発明は、ヒト被験体の治療におけるその使用に関する。非常に好ましい実施形態では、本発明は、ヒト被験体における糖尿病の治療におけるその使用に関する。非常に好ましい実施形態では、本発明は、ヒト被験体における糖尿病の治療に対する医薬の製造におけるその使用に関する。
【実施例】
【０１２０】
実施例１は、例示的な加水分解性連結体（Ｌ）分子の合成を例示する。
【０１２１】
実施例２は、ペプチド（Ｐ）及び阻害物質（Ｉ）をグラフト化する準備ができているハンドルを有する連結体（Ｌ）を形成するための手順を例示する。
【０１２２】
実施例３は、阻害物質（Ｉ）に付着された連結体の合成を例示する。この実施例では、阻害物質又は不活性化物質の複合体（Ｉ）はＣ１８脂肪酸であり、該脂肪酸はそれ自体でペプチドの活性を阻害しない（実施例４を参照されたい）が、アルブミンにインビボで結合することが知られている。したがって、インビボ不活性化は、最終的にはアルブミンに共役体を結合してクラスター化する阻害物質によって達成される。
【０１２３】
実施例４は、加水分解性連結体によらずに、不活性化物質（Ｉ）に複合化された参照ペプチドホルモンの合成を例示する。示される例は、ＬｙｓＢ２９Ｎε−オクタデカノイルヒトインスリンである。
【０１２４】
実施例５は、本発明によるインスリン共役体の合成を例示する。
【０１２５】
実施例６は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで加水分解した後グルコースに結合するそれらの能力について、実施例１の例示的な加水分解性連結体（Ｌ）分子１〜１９を分析する。
【０１２６】
実施例７は、様々なグルコース濃度における３種類の異なる連結体（連結体１、１４、及び１５）の反応速度、即ち、加水分解してグルコースと反応し、連結体グルコース化合物を形成するそれらの能力を評価する。
【０１２７】
実施例８は、グルコースの存在下で、インスリンに付着された連結体（実施例５の共役体２）の加水分解性を評価する。
【０１２８】
実施例９は、ヒトインスリン、実施例５のインスリン共役体１及び２（共役体１は阻害物質（Ｉ）を含まず、共役体２は阻害物質（Ｉ）を含む）のインスリンＢ受容体に対するインビトロの効力、及び実施例４からの連結体によらずに阻害物質（Ｉ）に複合化された参照インスリンを評価する。
【０１２９】
実施例１０は、実施例４のＣ１８脂肪酸と複合化されたヒトインスリン、及び肥満でないラットにおいてｓｃＩＴＴによって測定される、そのアルブミンと相互作用してインスリン活性を減少させる能力を評価する。
【０１３０】
実施例１：加水分解性連結体分子−ヒドラゾンの合成
基本手順：
ヒドラジド（１当量）をメタノールに溶解し、そこにアルデヒド（１当量）及び触媒量の酢酸を添加した。該混合物を加熱して還流させた。反応後、ＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）を行った。溶媒を真空下で除去し、油状物又は固体として粗製生成物を得た。個々の精製条件を各分子について以下に列挙する。
【０１３１】
連結体１．（（Ｅ）−（Ｎ’−（３−（ベンジルオキシ）プロピリデン）−４−メトキシベンゾヒドラジド）
【化９】
2020511421.tif 000015
【０１３２】
ヒドラジド：４−メトキシベンゾヒドラジド（ＣＡＳ番号：３２９０−９９−１）
アルデヒド：３−ベンジルオキシプロピオンアルデヒド（ＣＡＳ番号：１９７９０−６０−４）
【０１３３】
精製方法：
０％〜３％のメタノール／ジクロロメタンのカラムクロマトグラフイーによって精製した。
【０１３４】
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１１．３５（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），７．８４（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ，Ｃ２’Ｈ，Ｃ６’Ｈ），７．７８（ｍ，１Ｈ，ＣＨＮ），７．３７−７．２５（ｍ，５Ｈ，Ｐｈ），７．０２（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ，Ｃ３’Ｈ，Ｃ５’Ｈ），４．５０（ｓ，２Ｈ，ＰｈＣＨ２Ｏ），３．８２（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ３），３．６５（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ，ＯＣＨ２），２．５５（ｑ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２ＣＨＮ）．
【０１３５】
１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１６２．２（Ｃ４’ＯＣＨ３），１６１．８２（ＣＯ），１４９．２７（ＣＨＮ），１３８．３４（Ｃ１），１２９．３７（Ｃ２’，Ｃ６’），１２８．２２（Ｃ３，Ｃ５），１２７．９（Ｃ２，Ｃ６），１２７．３９（Ｃ４），１２５．４９（Ｃ１’），１１３．５７（Ｃ３’，Ｃ５’），７１．８５（Ａｒ−ＣＨ２Ｏ），６６．９７（ＯＣＨ２），５５．３４（ＯＣＨ３），３２．６７（ＣＨ２ＣＨＮ）．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ：Ｃ１８Ｈ２１Ｎ２Ｏ３に対する計算値：３１３．１５５２［Ｍ＋Ｈ］＋；実測値３１３．１５４８．
【０１３６】
連結体２．（（Ｅ）−Ｎ’−（３−（ベンジルオキシ）プロピリデン）ベンゾヒドラジド）
【化１０】
2020511421.tif 000016
【０１３７】
ヒドラジド：ベンゾヒドラジド（ＣＡＳ番号：６１３−９４−５）
アルデヒド：３−ベンジルオキシプロピオンアルデヒド（ＣＡＳ番号：１９７９０−６０−４）
【０１３８】
精製方法：
０．５％〜１％メタノール／ジクロロメタンのカラムクロマトグラフイーによって精製した。
【０１３９】
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１１．４９（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），７．８５（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ，Ｃ２’Ｈ，Ｃ６’Ｈ）７．８０（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，１Ｈ，ＣＨＮ），７．５６（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ，Ｃ３’Ｈ，Ｃ５’Ｈ），７．５（ｍ，１Ｈ，Ｃ４’Ｈ），７．３７−７．２５（ｍ，５Ｈ，Ｃ２−６Ｈ），４．５０（ｓ，２Ｈ，Ａｒ−ＣＨ２Ｏ），３．６６（ｔ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，２Ｈ，ＯＣＨ２），２．５５（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２ＣＨＮ）．
【０１４０】
１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１６２．７５（ＣＯ），１５０．０（ＣＨＮ），１３８．３３（Ｃ１），１３３．５１（Ｃ４’），１２８．３５（Ｃ３，Ｃ５），１２８．２２（Ｃ３’，Ｃ５’），１２７．４７（Ｃ２，Ｃ６，Ｃ２’，Ｃ６’），１２７．４０（Ｃ４），１２６．３６（Ｃ１’），７１．８４（Ａｒ−ＣＨ２Ｏ），６６．９１（ＯＣＨ２），３２．６９（ＣＨ２ＣＨＮ）．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ：Ｃ１７Ｈ１９Ｎ２Ｏ２に対する計算値：２８３．１４４７［Ｍ＋Ｈ］＋；実測値２８３．１４３９．
【０１４１】
連結体３．（（Ｅ）−Ｎ’−（３−（ベンジルオキシ）プロピリデン）−１−ヒドロキシ−２−ナフトヒドラジド）
【化１１】
2020511421.tif 000017
【０１４２】
ヒドラジド：１−ヒドロキシ−２−ナフトヒドラジド（ＣＡＳ番号：７７３２−４４−７）
アルデヒド：３−ベンジルオキシプロピオンアルデヒド（ＣＡＳ番号：１９７９０−６０−４）
【０１４３】
精製方法：
０％〜５％メタノール／ジクロロメタンのカラムクロマトグラフイーによって精製した。
【０１４４】
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１４．２０（Ｃ１’−ＯＨ），１１．７９（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．３０（ｍ，１Ｈ，Ｃ５’Ｈ）７．９８−７．８７（ｍ，３Ｈ，  Ｃ８’Ｈ，Ｃ４’Ｈ，ＣＨＮ），７．７１−７．５４（ｍ，２Ｈ，Ｃ６’Ｈ，Ｃ７’Ｈ），７．４８−７．１８（ｍ，６Ｈ，Ｃ３’Ｈ，Ｃ２−６Ｈ），４．５３（ｓ，２Ｈ，Ａｒ−ＣＨ２Ｏ），３．７０（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ，ＯＣＨ２），２．６７−２．５８（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２ＣＨＮ）．
【０１４５】
１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１６６．８６（ＣＯ），１６０．２０（Ｃ１’−ＯＨ），１５３．１（ＣＨＮ），１３８．３２（Ｃ１），１３５．８５（Ｃ９’），１２９．０９（Ｃ７’），１２８．２２（Ｃ３，Ｃ５），１２７．９６（Ｃ８’），１２７．４９（Ｃ２，Ｃ６），１２７．４１（Ｃ４），１２６．５６（Ｃ１０’），１２６．３６（Ｃ６’），１２５．９（Ｃ２’），１２４．６１（Ｃ５’），１２２．９４（Ｃ４’），１１７．６８（Ｃ３’），７１．９０（Ａｒ−ＣＨ２Ｏ），６６．７９（ＯＣＨ２），３２．７９（ＣＨ２ＣＨＮ）．ＥＳＩ：ｍ／ｚ：Ｃ２１Ｈ２１Ｎ２Ｏ３に対する計算値：３４９．１５５２［Ｍ＋Ｈ］＋；実測値３４９．０．
【０１４６】
連結体４（（Ｅ）−Ｎ’−（２，４，６−トリヒドロキシベンジリデン）ベンゾヒドラジド）
【化１２】
2020511421.tif 000018
【０１４７】
ヒドラジド：ベンゾヒドラジド（ＣＡＳ番号：６１３−９４−５）
アルデヒド：２，４，６−トリヒドロキシベンズアルデヒド（ＣＡＳ番号：４８７−７０−７）
【０１４８】
精製方法：
溶媒の除去後、生成された固体を冷メタノールで洗浄し、褐色から橙色の粉体として生成物を与えた。
【０１４９】
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１１．９３（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１１．１４（ｓ，２Ｈ，Ｃ２−ＯＨ，Ｃ６−ＯＨ），９．８５（ｓ，１Ｈ，Ｃ４−ＯＨ），８．８７（ｓ，１Ｈ，ＣＨＮ），８．０５−７．９５（ｍ，２Ｈ，Ｃ２’Ｈ，Ｃ６’Ｈ），７．７０−７．５０（ｍ，３Ｈ，Ｃ３’Ｈ，Ｃ４’Ｈ，Ｃ５’Ｈ），５．９１（ｓ，２Ｈ，Ｃ３Ｈ，Ｃ５Ｈ）．
【０１５０】
１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１６２．０９（Ｃ４），１６１．５２（ＣＯ），１５９．６７（Ｃ２，Ｃ６），１４６．８０（ＣＨＮ），１３２．８７（Ｃ４’），１３１．７０（Ｃ１’），１２８．４５（Ｃ３’，Ｃ５’），１２７．４５（Ｃ２’，Ｃ６’），９９．０３（Ｃ１），９４．３４（Ｃ３，Ｃ５）．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ：Ｃ１４Ｈ１３Ｎ２Ｏ４に対する計算値：２７２．０８７５［Ｍ＋Ｈ］＋；実測値２７３．０８６７．
【０１５１】
連結体５（（Ｅ）−Ｎ’−（２−ヒドロキシベンジリデン）−４−ニトロベンゾヒドラジド）
【化１３】
2020511421.tif 000019
【０１５２】
ヒドラジド：４−ニトロベンゾヒドラジド（ＣＡＳ番号：６３６−９７−５）
アルデヒド：サリチルアルデヒド（ＣＡＳ番号：９０−０２−８）
【０１５３】
精製方法：
還流中に白色沈殿が形成され、粗製沈殿を濾過し、冷メタノールで洗浄して、淡黄色粉体を与えた。
【０１５４】
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１２．３５（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１１．１０（ｓ，１Ｈ，Ｃ２−ＯＨ），８．６９（ｓ，１Ｈ，ＣＨＮ），８．４０（ｄｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．９，２．０Ｈｚ，２Ｈ，Ｃ３Ｈ，Ｃ５Ｈ），８．１８（ｄｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．９，２．７Ｈｚ，Ｃ２Ｈ，Ｃ６Ｈ），７．６０（ｄｄ，Ｊ＝７．７，１．４Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ６Ｈ），７．３２（ｄｄｄ，Ｊ＝７．５，１．８Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ４Ｈ），６．９５（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ３Ｈ），６．９４−６．９０（ｍ，１Ｈ，Ｃ５Ｈ）．
【０１５５】
１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１６１．１８（ＣＯ），１５７．４６（Ｃ２−ＯＨ），１４９．３６（Ｃ４’−ＮＯ２），１４８．９３（ＣＨＮ），１３８．５３（Ｃ１’），１３１．６８（Ｃ４），１２９．２３（Ｃ２’，Ｃ６’），１２９．１６（Ｃ６），１２３．６７（Ｃ３’，Ｃ５’），１１９．３９（Ｃ５），１１８．６６（Ｃ１），１１６．４１（Ｃ３）．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ：Ｃ１４Ｈ１１Ｎ３Ｏ４Ｎａに対する計算値：３０８．０６４７［Ｍ＋Ｎａ］＋；実測値３０８．０６３９．
【０１５６】
連結体６．（（Ｅ）−４−メトキシ−Ｎ’−（２−ニトロベンジリデン）ベンゾヒドラジド）
【化１４】
2020511421.tif 000020
【０１５７】
ヒドラジド：４−メトキシベンゾヒドラジド（ＣＡＳ番号：３２９０−９９−１）
アルデヒド：２−ニトロベンズアルデヒド（ＣＡＳ番号：５５２−８９−６）
【０１５８】
精製方法：
反応混合物を室温まで冷却した後に淡黄色の針状物が沈殿した。沈殿を濾過し、冷メタノールで洗浄して所望の生成物を与えた。
【０１５９】
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１２．０７（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．８６（ｓ，１Ｈ，ＣＨＮ），８．１３（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，Ｃ６Ｈ），８．０８（ｄｄ，Ｊ＝８．２，１．１Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ３Ｈ），７．９４（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，２Ｈ，Ｃ２’Ｈ，Ｃ６’Ｈ），７．８２（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ５Ｈ），７．７２−７．６２（ｍ，１Ｈ，Ｃ４Ｈ），７．０８（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，２Ｈ，Ｃ３’Ｈ，Ｃ５’Ｈ），３．８５（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３）
【０１６０】
１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１６２．５６（ＣＯ），１６１．７１（Ｃ４’−ＯＣＨ３）１４８．１９（Ｃ２−ＮＯ２），１４２．０４（ＣＨＮ），１３３．６４（Ｃ５），１３０．４９（Ｃ４），１２９．７１（Ｃ２’，Ｃ６’），１２８．７９（Ｃ１），１２７．８３（Ｃ６），１２４．９８（Ｃ１’），１２４．５９（Ｃ３），１１３．７１（Ｃ３’，Ｃ５’），５５．４３（ＣＨ３）．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ：Ｃ１５Ｈ１４Ｎ３Ｏ４に対する計算値：３００．０９８４［Ｍ＋Ｈ］＋；実測値３００．０９７５．
【０１６１】
連結体７．（（Ｅ）−２，４−ジヒドロキシ−Ｎ’−（２−ニトロベンジリデン）ベンゾヒドラジド）
【化１５】
2020511421.tif 000021
【０１６２】
ヒドラジド：２，４−ジヒドロキシベンゾヒドラジド（ＣＡＳ番号：１３２２１−８６−８）
アルデヒド：２−ニトロベンズアルデヒド（ＣＡＳ番号：５５２−８９−６）
【０１６３】
精製方法：
還流中に黄色の沈殿物が形成された。反応混合物を濾過し、冷メタノールで洗浄して、淡黄色粉体の生成物を与えた。
【０１６４】
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１２．２５（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１２．０１（ｓ，１Ｈ，Ｃ６’−ＯＨ），１０．２７（ｓ，１Ｈ，Ｃ４’−ＯＨ），８．８４（ｓ，１Ｈ，ＣＨＮ），８．１３（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｃ５Ｈ），８．０９（ｄｄ，Ｊ＝８．３，１．１Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ３Ｈ），７．８７−７．７８（ｍ，２Ｈ，Ｃ４Ｈ，Ｃ２’Ｈ），７．６９（ｄｄｄ，Ｊ＝７．２，１，５Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ４Ｈ），６．３８（ｄｄ，Ｊ＝８．７，２．４Ｈｚ，１Ｈ），６．３３（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ）
【０１６５】
１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１６５．８９（ＣＯ），１６２．９４（Ｃ４’−ＯＨ），１６２．４７（Ｃ６’−ＯＨ），１４８．２３（Ｃ２−ＮＯ２），１４２．８９（ＣＨＮ），１３３．６９（Ｃ５），１３０．６８（Ｃ２’），１２８．５９（Ｃ６），１２７．９６（Ｃ１），１２４．６３（Ｃ３），１０８．６８（Ｃ１’），１０７．４８（Ｃ３’），１０２．８４（Ｃ５’）．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ：Ｃ１４Ｈ１２Ｎ３Ｏ５に対する計算値：３０２．０７７７［Ｍ＋Ｈ］＋；実測値３０２．０７６７．
【０１６６】
連結体８．（（Ｅ）−Ｎ’−（３−（ベンジルオキシ）−２−メチルプロピリデン）−４−メトキシベンゾヒドラジド）
【化１６】
2020511421.tif 000022
【０１６７】
ヒドラジド：４−メトキシベンゾヒドラジド（ＣＡＳ番号：３２９０−９９−１）
アルデヒド：（Ｒ，Ｓ）−３−ベンジルオキシ−２−メチルプロピオンアルデヒド（ＣＡＳ番号：７３８１４−７３−０）
【０１６８】
精製方法：
溶媒を真空下で除去した後、透明な油状物が形成された。生成物は、その油状物から白色針状物としてゆっくりと（一晩）沈降し、それをヘプタンで洗浄して所望の生成物を得た。
【０１６９】
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１１．３３（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），７．８５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，Ｃ２’Ｈ，Ｃ６’Ｈ），７．７５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，ＣＨＮ），７．３７−７．２８（ｍ，５Ｈ，Ｐｈ），７．０２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，Ｃ３’Ｈ，Ｃ５’Ｈ），４．５（ｓ，２Ｈ，ＣＨ２Ｏ），３．５２，３．４９（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，ＯＣＨ２ＣＨ），２．７７−２．６８（ｍ，１Ｈ，ＣＨ２ＣＨＣＨ３），１．０９（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，ＣＨ３）．
【０１７０】
１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１６１．７８（ＣＯ，Ｃ４’），１５３．２５（ＣＨＮ），１３８．３７（Ｃ１），１２９．３５（Ｃ２’，Ｃ６’），１２８．２２（Ｃ３，Ｃ５），１２７．４１（Ｃ２，Ｃ６），１２７．３８（Ｃ４），１２５．５６（Ｃ１’），１１３．５７（Ｃ３’，Ｃ５’），７２．６０（ＯＣＨ２ＣＨ），７２．０５（ＰｈＣＨ２Ｏ），５５．３４（ＯＣＨ３），３６．８２（ＣＨ２ＣＨＣＨ３），１４．５１（ＣＨ３）．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ：Ｃ１９Ｈ２３Ｎ２Ｏ３に対する計算値：３２７．１７０９［Ｍ＋Ｈ］＋；実測値３２７．１７０５．
【０１７１】
連結体９．（（Ｅ）−Ｎ’−（３−（ベンジルオキシ）−２−メチルプロピリデン）−２，４−ジヒドロキシベンゾヒドラジド）
【化１７】
2020511421.tif 000023
【０１７２】
ヒドラジド：２，４−ジヒドロキシベンゾヒドラジド（ＣＡＳ番号：１３２２１−８６−８）
アルデヒド：（Ｒ，Ｓ）−３−ベンジルオキシ−２−メチルプロピオンアルデヒド（ＣＡＳ番号：７３８１４−７３−０）
【０１７３】
精製方法：
４０％〜６０％酢酸エチル／ヘプタンのカラムクロマトグラフイー。
【０１７４】
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１２．４５（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１１．３（ｓ，１Ｈ，Ｃ２−ＯＨ），１０．２（ｓ，１Ｈ，Ｃ４−ＯＨ），７．７６−７．７０（ｍ，２Ｈ，ＣＨＮ，Ｃ６Ｈ），７．３８−７．２５（ｍ，５Ｈ，Ｐｈ’），６．３２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，Ｃ５Ｈ）６．２７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，Ｃ３Ｈ），４．５１（ｓ，２ＨＡｒ’ＣＨ２），３．５（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，ＯＣＨ２ＣＨ），２．７８−２．６８（ｍ，１Ｈ，ＣＨ２ＣＨＣＨ３），１．０９（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，ＣＨ３）．
【０１７５】
１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１６２．５２（ＣＯ），１６２．５（Ｃ４’−ＯＨ，Ｃ２’−ＯＨ），１５４．３８（ＣＨＮ），１３８．３４（Ｃ１），１２９．３１（Ｃ６’），１２８．２２（Ｃ２，Ｃ６），１２７．４３（Ｃ３，Ｃ５），１２９．３９（Ｃ４），１０７．１６（Ｃ５’），１０５．８１（Ｃ１’），１０２．７９（Ｃ３’），７２．４９（ＯＣＨ２），７２．０６（ＰｈＣＨ２Ｏ），３６．８５（ＣＨ２ＣＨＣＨ３），１４．４０（ＣＨ３）．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ：Ｃ１８Ｈ２０Ｎ２Ｏ４に対する計算値：３２９．１５０１［Ｍ＋Ｈ］＋；実測値３２９．１４９８８．
【０１７６】
連結体１０．（（Ｅ）−Ｎ’−（３−（ベンジルオキシ）プロピリデン）−２，４−ジヒドロキシベンゾヒドラジド）
【化１８】
2020511421.tif 000024
【０１７７】
ヒドラジド：２，４−ジヒドロキシベンゾヒドラジド（ＣＡＳ番号：１３２２１−８６−８）
アルデヒド：３−ベンジルオキシプロピオンアルデヒド（ＣＡＳ番号：１９７９０−６０−４）
【０１７８】
精製方法：
１％〜３％のメタノール／ジクロロメタンのカラムクロマトグラフイー。
【０１７９】
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１２．４２（ｓ，１Ｈ，Ｃ２−ＯＨ），１１．４（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１０．１７（ｓ，１Ｈ，Ｃ４−ＯＨ），７．７８−７．７０（ｍ，２Ｈ，ＣＨＮ，Ｃ６Ｈ），７．４０−７．２０（ｍ，５Ｈ，Ｐｈ’），６．３２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９Ｈｚ，Ｊ＝３Ｈｚ，Ｃ５Ｈ），６．２８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３Ｈｚ，Ｃ３Ｈ），４．５０（ｓ，２ＨＡｒ’ＣＨ２Ｏ），３．６６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６Ｈｚ，ＯＣＨ２ＣＨ），２．５１（ｍ，１Ｈ，ＣＨ２ＣＨＣＨＮ）．
【０１８０】
１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１６５．３（ＣＯ），１６２．５（Ｃ４’−ＯＨ，Ｃ２’−ＯＨ），１５０．６（ＣＨＮ），１３８．３（Ｃ１），１２８．１７（Ｃ４），１２８．２２（Ｃ２，Ｃ６），１２８．０（Ｃ６’），１２７．５（Ｃ３，Ｃ５），１０７．１６（Ｃ５’），１０５．８（Ｃ１’），１０２．８０（Ｃ３’），７１．９（ＰｈＣＨ２Ｏ），６６．８（ＯＣＨ２），３２．９（ＣＨ２ＣＨＣＨＮ）．
【０１８１】
連結体１１．（（Ｅ）−Ｎ’−（３−（ベンジルオキシ）プロピリデン）−４−（ジメチルアミノ）ベンゾヒドラジド）
【化１９】
2020511421.tif 000025
【０１８２】
ヒドラジド：４−（ジメチルアミノ）ベンゾヒドラジド（ＣＡＳ番号：１９３５３−９２−５）
アルデヒド：３−ベンジルオキシプロピオンアルデヒド（ＣＡＳ番号：１９７９０−６０−４）
【０１８３】
精製方法：
１％〜３％のメタノール／ジクロロメタンのカラムクロマトグラフイー。
【０１８４】
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１１．１７（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），７．７６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９Ｈｚ，Ｃ２Ｈ，Ｃ６Ｈ），７．７５（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，１Ｈ，ＣＨＮ），７．３６−７．２７（ｍ，５Ｈ，Ｐｈ’），６．７２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９Ｈｚ，Ｃ３Ｈ，Ｃ５Ｈ），４．５１（ｓ，２ＨＡｒ’ＣＨ２Ｏ），３．６５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６Ｈｚ，ＯＣＨ２ＣＨ），２．９８（ｓ，６Ｈ，Ｎ（ＣＨ３）２），２．５５（ｑ，２Ｈ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，ＣＨ２ＣＨＣＨＮ）．
【０１８５】
１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１６２．６（ＣＯ），１５２．３（Ｃ４’Ｎ（ＣＨ３）２），１４８．０（ＣＨＮ），１３８．４（Ｃ１），１２８．９（Ｃ４），１２８．２（Ｃ２，Ｃ６，Ｃ２’，Ｃ６’），１２７．５（Ｃ３，Ｃ５），１１９．６（Ｃ１’），１１０．７（Ｃ３’，Ｃ５’），７１．９（ＰｈＣＨ２Ｏ），６７．１（ＯＣＨ２），４２．１（Ｎ（ＣＨ３）２），３２．７（ＣＨ２ＣＨＣＨ３）．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ：Ｃ１９Ｈ２４Ｎ３Ｏ２に対する計算値：３２６．１８６８５［Ｍ＋Ｈ］＋；実測値３２６．１８６７．
【０１８６】
連結体１２．（（Ｅ）−Ｎ’−（２−（ベンジルオキシ）エチリデン）−２，４−ジヒドロキシベンゾヒドラジド）
【化２０】
2020511421.tif 000026
【０１８７】
ヒドラジド：２，４−ジヒドロキシベンゾヒドラジド（ＣＡＳ番号：１３２２１−８６−８）
アルデヒド：ベンジルオキシアセトアルデヒド（ＣＡＳ番号：６０６５６−８７−３）
【０１８８】
精製方法：
３０％〜８０％酢酸エチル／ヘプタンのカラムクロマトグラフイー。
【０１８９】
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１２．２５（ｓ，１Ｈ，Ｃ２−ＯＨ），１１．５（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１０．２（ｓ，１Ｈ，Ｃ４−ＯＨ），７．８１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５Ｈｚ，ＣＨＮ），７．７４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，Ｃ６Ｈ），７．３９−７．２７（ｍ，５Ｈ，Ｐｈ），６．３５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，Ｃ５Ｈ）６．３０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，Ｃ３Ｈ），４．５５（ｓ，２ＨＡｒ’ＣＨ２Ｏ），４．１８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５Ｈｚ，ＯＣＨ２ＣＨＮ）．
【０１９０】
１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１６５．８（ＣＯ），１６２．７（Ｃ２’−ＯＨ），１６２．３（Ｃ４’−ＯＨ），１４８．４（ＣＨＮ），１３７．９（Ｃ１），１２９．６（Ｃ４），１２８．３（Ｃ６’），１２８．１（Ｃ３，Ｃ５），１２７．７（Ｃ２，Ｃ６），１０７．３（Ｃ５’），１０５．９（Ｃ１’），１０２．８（Ｃ３’），７１．８（ＰｈＣＨ２Ｏ），６９．１（ＯＣＨ２ＣＨＮ）．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ：Ｃ１６Ｈ１６Ｎ２Ｏ４Ｎａに対する計算値：３２３．１００７８［Ｍ＋Ｎａ］＋；実測値３２３．１００７５．
【０１９１】
連結体１３．（（Ｅ）−Ｎ’−（２−（ベンジルオキシ）エチリデン）−４−（ジメチルアミノ）ベンゾヒドラジド）
【化２１】
2020511421.tif 000027
【０１９２】
ヒドラジド：４−（ジメチルアミノ）ベンゾヒドラジド（ＣＡＳ番号：１９３５３−９２−５）
アルデヒド：ベンジルオキシアセトアルデヒド（ＣＡＳ番号：６０６５６−８７−３）
【０１９３】
精製方法：
反応混合物を冷却する間に白色粉体として沈殿した所望の生成物。
【０１９４】
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１１．３（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），７．７６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９Ｈｚ，Ｃ２Ｈ，Ｃ６Ｈ），７．７５（ｍ，１Ｈ，ＣＨＮ），７．３８−７．２７（ｍ，５Ｈ，Ｐｈ），６．７２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９Ｈｚ，Ｃ３Ｈ，Ｃ５Ｈ），４．５４（ｓ，２ＨＡｒ’ＣＨ２Ｏ），４．１６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５Ｈｚ，ＯＣＨ２ＣＨＮ），２．９８（ｓ，６Ｈ，Ｎ（ＣＨ３）２）．
【０１９５】
１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１６４．７（ＣＯ），１５２．４（Ｃ４’−Ｎ（ＣＨ３）２），１４８．４（ＣＨＮ），１３８．０（Ｃ１），１２９．２（Ｃ４），１２８．３（Ｃ６），１２８．１（Ｃ３，Ｃ５），１２７．６（Ｃ２，Ｃ６），１２７．５（Ｃ２’，Ｃ６’），１１９．３（Ｃ１’），１１０．８（Ｃ３’，Ｃ５’），７１．７（ＰｈＣＨ２Ｏ），６９．２（ＯＣＨ２ＣＨＮ），３９．６（Ｎ（ＣＨ３）２）．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ：Ｃ１８Ｈ２２Ｎ３Ｏ２に対する計算値：３１２．１７１２［Ｍ＋Ｈ］＋；実測値３１２．１７９８．
【０１９６】
連結体１４．（（Ｅ）−Ｎ’−（２−（ベンジルオキシ）エチリデン）−４−メトキシベンゾヒドラジド）
【化２２】
2020511421.tif 000028
【０１９７】
ヒドラジド：４−メトキシベンゾヒドラジド（ＣＡＳ番号：３２９０−９９−１）
アルデヒド：ベンジルオキシアセトアルデヒド（ＣＡＳ番号：６０６５６−８７−３）
【０１９８】
精製方法：
０％〜２％メタノール／ジクロロメタンのカラムクロマトグラフイーによって精製した。
【０１９９】
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１１．５２（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），７．８６（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，２Ｈ，Ｃ２’Ｈ，Ｃ６’Ｈ），７．８１（ｍ，１Ｈ，ＣＨＮ），７．３９−７．２５（ｍ，５Ｈ，Ｐｈ），７．０４（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，２Ｈ，Ｃ３’Ｈ，Ｃ５’Ｈ），４．５４（ｓ，２Ｈ，ＰｈＣＨ２Ｏ），４．１７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，ＯＣＨ３ＣＨＮ），３．８４（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ３）．
【０２００】
１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１６８．１（Ｃ４’ＯＣＨ３），１６１．９（ＣＯ），１４７．６（ＣＨＮ），１３８．０（Ｃ１），１２９．５（Ｃ４），１２８．３（Ｃ２’，Ｃ６’），１２８．２（Ｃ３，Ｃ５），１２７．６（Ｃ２，Ｃ６），１２０．７（Ｃ１’），１１５．６，１１３．６（Ｃ３’，Ｃ５’），７１．７（ＰｈＣＨ２Ｏ），６６．１（ＯＣＨ２ＣＨＮ），５５．４（ＯＣＨ３）．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ：Ｃ１７Ｈ１９Ｎ２Ｏ３に対する計算値：２９９．１３９６［Ｍ＋Ｈ］＋；実測値２９９．１４０４．
【０２０１】
連結体１５．（（Ｅ）−Ｎ’−（２−（ベンジルオキシ）エチリデン）−２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾヒドラジド）
【化２３】
2020511421.tif 000029
【０２０２】
ヒドラジド：２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾヒドラジド（ＣＡＳ番号：４１６９７−０８−９）
アルデヒド：ベンジルオキシアセトアルデヒド（ＣＡＳ番号：６０６５６−８７−３）
【０２０３】
精製方法：
０％〜０．２％メタノール／ジクロロメタンのカラムクロマトグラフイーによって精製した。
【０２０４】
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１２．３９（ｓ，１Ｈ，Ｃ２−ＯＨ），１１．６（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），７．８３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９Ｈｚ，Ｃ６’Ｈ），７．８３（ｍ，１Ｈ，ＣＨＮ），７．３８−７．２７（ｍ，５Ｈ，Ｐｈ），６．５３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９Ｈｚ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，Ｃ５’Ｈ）６．４８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，Ｃ３’Ｈ），４．５５（ｓ，２ＨＰｈ’ＣＨ２Ｏ），４．１９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．１，ＯＣＨ２ＣＨＮ），３．７７（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ３）．
【０２０５】
１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１６５．５（ＣＯ），１６３．９（Ｃ４’−ＯＣＨ３），１６２．３（Ｃ２’−ＯＨ），１４８．７（ＣＨＮ），１３７．９（Ｃ１），１２９．４（Ｃ６’），１２８．３（Ｃ６’），１２７．７（Ｃ２，Ｃ６），１２７．６（Ｃ３，Ｃ５），１０７．１（Ｃ１’），１０６．３（Ｃ３’），１０１．３（Ｃ５’），７１．８（ＰｈＣＨ２Ｏ），６９．０（ＯＣＨ２ＣＨＮ），５５．４（ＯＣＨ３）．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ：Ｃ１７Ｈ１８Ｎ２Ｏ４に対する計算値：３１５．１３４５［Ｍ＋Ｈ］＋；実測値３１５．１３４６．
【０２０６】
連結体１６．（（Ｅ）−４−メトキシ−Ｎ’−（ベンジリデン）ベンゾヒドラジド）
【化２４】
2020511421.tif 000030
【０２０７】
ヒドラジド：４−メトキシベンゾヒドラジド（ＣＡＳ番号：３２９０−９９−１）
アルデヒド：ベンズアルデヒド（ＣＡＳ番号：１００−５２−７）
【０２０８】
Ｔａｈａら、Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２０１４，１９（１），１２８６−１３０１に従って合成した。
【０２０９】
連結体１７．（（Ｅ）−２，４−ジヒドロキシ−Ｎ’−（ベンジリデン）ベンゾヒドラジド）
【化２５】
2020511421.tif 000031
【０２１０】
ヒドラジド：２，４−ジヒドロキシベンゾヒドラジド（ＣＡＳ番号：１３２２１−８６−８）
アルデヒド：ベンズアルデヒド（ＣＡＳ番号：１００−５２−７）
【０２１１】
Ｂ．ＣａｍｂｅｒａｎｄＤ．Ｄ．Ｄｚｉｅｗｉａｔｋｏｗｓｋｉ，ＪＡＣＳ，１９５１，７３（８），４０２１−４０２１に従って合成した。
【０２１２】
連結体１８．（（Ｅ）−４−アミノ−Ｎ’−（ベンジリデン）ベンゾヒドラジド）
【化２６】
2020511421.tif 000032
【０２１３】
ヒドラジド：４−アミノ−ベンゾヒドラジド（ＣＡＳ番号：５３５１−１７−７）
アルデヒド：ベンズアルデヒド（ＣＡＳ番号：１００−５２−７）
【０２１４】
Ａｄｅｎｉｙｉら、ＰａｋｉｓｔａｎＪ．Ｓｃｉ．ＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＲｅｓ．，２００６，４９（４），２４６−２５０に従って合成した。
【０２１５】
連結体１９．（（Ｅ）−４−ジメチルアミノ−Ｎ’−（ベンジリデン）ベンゾヒドラジド）
【化２７】
2020511421.tif 000033
【０２１６】
ヒドラジド：４−（ジメチルアミノ）ベンゾヒドラジド（ＣＡＳ番号：１９３５３−９２−５）
アルデヒド：ベンズアルデヒド（ＣＡＳ番号：１００−５２−７）
【０２１７】
Ｗｅｎら、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２００６，１０６−１０８に従って合成した。
【０２１８】
実施例２：ペプチド（Ｐ）及び阻害物質（Ｉ）のグラフト化のために用意されたハンドルを有する連結体（Ｌ）２０の合成手順
【化２８】
2020511421.tif 000034
【０２１９】
中間体化合物２２の合成
【化２９】
2020511421.tif 000035
【０２２０】
メチル３−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾエート（２１）（０．９５６ｇ、５．１９ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）に溶解した。Ｋ２ＣＯ３（炭酸カリウム）（１．４４ｇ、１０．４ｍｍｏｌ）、及びメチルブロモ酢酸（１．４５ｍＬ、５．７１ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で２４時間撹拌した。残留物を濾過して濃縮し、酢酸エチルに再度溶解して、１Ｍ  ＮａＯＨ（水酸化ナトリウム）、ブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４（硫酸マグネシウム）で乾燥させた。シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル３：１）による精製は、化合物２２（１．６１ｇ、４．８８ｍｍｏｌ、９４％）を与えた。ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚＣ１８Ｈ１８Ｏ６に対する計算値［Ｍ＋Ｈ］＋３３１．１１；実測値３３１．５７．
【０２２１】
中間体化合物２３の合成
【化３０】
2020511421.tif 000036
【０２２２】
化合物２２（０．９８３ｇ、２．９８ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン／メタノール／水１：１：１（９ｍＬ）に溶解した。２Ｍ  ＮａＯＨ（１．５ｍＬ）を添加し、反応物を室温で３０分間撹拌した。該反応物を１Ｍ  ＨＣｌ（塩化水素）の添加によって酸性とし、濃縮し、酢酸エチルに再度溶解した。有機相を水、ブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過して蒸発させた。生成物である化合物２３（０．９１４ｇ、２．８９ｍｍｏｌ、９７％）をそれ以上の精製せずに次の反応に使用した。ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚＣ１１Ｈ１２Ｏ６に対する計算値［Ｍ＋Ｎａ］＋３３９．０６；実測値３３９．３６．
【０２２３】
中間体化合物２４の合成
【化３１】
2020511421.tif 000037
【０２２４】
化合物２３（６０ｍｇ、０．１８９ｍｍｏｌ）をジクロロメタンに溶解し、０℃に冷却した。塩化オキサリル（５１μＬ、０．３７８ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を０℃で１時間及び室温で１時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、残留物をジクロロメタンに再度溶解した。カルバジン酸ｔｅｒｔ−ブチル（ＮＨ２ＮＨＢｏｃ）（５０ｍｇ、０．３７８ｍｍｏｌ）及びＥｔ３Ｎ（トリエチルアミン）（５３μＬ、０．３７８ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を室温で４時間撹拌した。蒸発及びシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル１：１）による精製は、化合物２４（５０ｍｇ、０．１１６ｍｍｏｌ、６１％）を与えた。
【０２２５】
中間体化合物２５の合成
【化３２】
2020511421.tif 000038
【０２２６】
化合物２４（２５ｍｇ、０．０５８ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５ｍＬ）に溶解した。ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）（２００μＬ）を添加し、反応物を室温で２時間撹拌した。蒸発により化合物２５を得て、該化合物２５をそれ以上の精製せずに次の反応に使用した。
【０２２７】
中間体化合物２７の合成
【化３３】
2020511421.tif 000039
【０２２８】
ベンジル２−［４−（ヒドロキシメチル）フェノキシ］エチルカルバメート（ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ，２００５，６，２２７１−２２８０に記載される手順に従って合成された化合物２６）をジメチルホルムアミドに溶解し、０℃のＮ２雰囲気でジメチルホルムアミド中のＮａＨ（水素化ナトリウム）を滴加した。２−（２−ブロモエチル）−１，３−ジオキソランを滴加し、室温で更に４時間撹拌した後、反応混合物を０℃撹拌した。水を添加して反応をクエンチし、酢酸エチルで抽出した。有機相をＮａ２ＳＯ４（硫酸ナトリウム）上で乾燥させ、濾過し、真空で濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン中、０％〜１００％の酢酸エチル）による精製は、化合物２７を与えた。
【０２２９】
連結体化合物２０の合成
【化３４】
2020511421.tif 000040
【０２３０】
化合物２５及び化合物２７をメタノールに溶解した。酢酸を添加し、反応物を室温で２４時間撹拌した。生成物２０を、ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚＣ３７Ｈ３９Ｎ３Ｏ９に対する計算値［Ｍ＋Ｈ］＋６７０．２７；実測値６７１．３２によって検出した。
【０２３１】
実施例３：連結体及び不活性化物質の複合体の合成
【０２３２】
中間体化合物２９の合成
【化３５】
2020511421.tif 000041
【０２３３】
ベンジル３−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾエート（２８）（０．７０ｇ、２．７１ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）に溶解した。Ｋ２ＣＯ３（０．７５ｇ、５．４２ｍｍｏｌ）及びメチルブロモ酢酸（０．２６ｍＬ、２．７１ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で２４時間撹拌した。残留物を濾過して濃縮し、酢酸エチルに再度溶解して、１Ｍ  ＮａＯＨ、ブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過して蒸発させた。シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル３：１）による精製は、化合物２９（０．７２ｇ、２．１８ｍｍｏｌ、８０％）を与えた。
【０２３４】
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．７７（ｄｄ，１Ｈ，ＡｒＨ），７．５２（ｄ，１Ｈ，ＡＲＨ），７．３３−７．４４（ｍ，５Ｈ，ＡｒＨ），６．９２（ｄ，１Ｈ，ＡｒＨ），５．３３（ｓ，２Ｈ，ＯＣＨ２Ａｒ），４．７３（ｓ，２Ｈ，ＯＣＨ２Ｃ＝Ｏ），３．９４（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ３），３．７９（ｓ，３Ｈ，Ｏ＝Ｃ−ＯＣＨ３）；ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚＣ１８Ｈ１８Ｏ６に対する計算値［Ｍ＋Ｈ］＋３３１．１１；実測値３３１．４６；
【０２３５】
中間体化合物３０の合成
【化３６】
2020511421.tif 000042
【０２３６】
化合物２９（１２１ｍｇ、０．３６６ｍｍｏｌ）をメタノール（５ｍＬ）に溶解し、Ｎ２ガスでフラッシュ（ｆｌｕｓｈ）した。１０％Ｐｄ／Ｃ（１０重量％、４ｍｇ、０．０３７ｍｍｏｌ）に続いて、少しずつＮａＢＨ４（水素化ホウ素ナトリウム）（２１ｍｇ、０．５４９ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で３０分間撹拌し、セライトを通して濾過した。１Ｍ  ＨＣｌの添加によって濾液を酸性にし、濃縮して、酢酸エチルに再度溶解した。有機相を水、ブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過して蒸発させた。生成物である化合物３０（８５ｍｇ、０．３５４ｍｍｏｌ、９７％）をそれ以上の精製せずに次の反応に使用した。ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚＣ１１Ｈ１３Ｏ６に対する計算値［Ｍ＋Ｈ］＋２４１．０６；実測値２４１．４２．
【０２３７】
中間体化合物３１の合成
【化３７】
2020511421.tif 000043
【０２３８】
化合物３０（１０６ｍｇ、０．４４２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却した。塩化オキサリル（１１８μＬ、１．３３ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を０℃で１時間、及び室温で１時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、残留物をジクロロメタン（５ｍＬ）に再度溶解した。ＮＨ２ＮＨＢｏｃ（１１７ｍｇ、０．８８４ｍｍｏｌ）及びＥｔ３Ｎ（１２３μＬ、０．８８４ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を室温で４時間撹拌した。溶媒の蒸発、及びシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル１：１）による精製は、化合物３１（１０１ｍｇ、０．２８６ｍｍｏｌ、６５％）を与えた。
【０２３９】
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．４３（ｄｄ，１Ｈ，ＡｒＨ），７．３３（ｄ，１Ｈ，ＡｒＨ），６．８３（ｄ，１Ｈ，ＡｒＨ），４．７１（ｓ，２Ｈ，ＣＨ２Ｃ＝Ｏ），３．９１（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ３），３．８０（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３ＯＣ＝Ｏ），１．４９（ｓ，９Ｈ，ＣＨ３Ｃ）；ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚＣ１６Ｈ２３Ｎ２Ｏ７に対する計算値［Ｍ＋Ｈ］＋３５５．１４；実測値３５５．４６．
【０２４０】
中間体化合物３２の合成
【化３８】
2020511421.tif 000044
【０２４１】
化合物３１（１７０ｍｇ、０．４８０ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５ｍＬ）に溶解した。ＴＦＡ（２００μＬ）を添加し、反応物を室温で２時間撹拌した。溶媒の蒸発は、化合物３２（１１２ｍｇ、０．４３９ｍｍｏｌ、９１％）を与えた。粗製化合物をそれ以上の精製せずに次の反応に使用した。ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚＣ１１Ｈ１５Ｎ２Ｏ５に対する計算値［Ｍ＋Ｈ］＋２５５．０９；実測値２５５．４９．
【０２４２】
中間体化合物３３の合成
【化３９】
2020511421.tif 000045
【０２４３】
２−ブロモ−エタノールアミンＨＢｒ（９４４ｍｇ、４．６ｍｍｏｌ）及びジクロロメタン（５ｍＬ）を混合し、Ｅｔ３Ｎ（０．５ｍＬ、６．９ｍｍｏｌ）を添加すると、スラリー混合物を生じた。１−［２−（トリメチルシリル）エトキシカルボニルオキシ］ピロリジン−２，５−ジオン（１ｇ、３．９ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５ｍＬ）に溶解し、混合物に添加すると、直ちに沈殿を溶解した。反応物を室温で５時間撹拌した後、水でクエンチし、ジクロロメタン（３倍）で抽出した。有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過して、溶解物（ｓｏｌｖｅｄ）を真空下（ｉｎ  ｖａｃｏｕ）で除去した。シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン中、０％〜５０％酢酸エチル）による精製は、化合物３３（８４９ｍｇ、０．３１７ｍｍｏｌ、８２％）を与えた。
【０２４４】
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ５．０３（ｂｓ，１Ｈ，ＮＨ），４．１３（ｔ，２Ｈ，ＣＨ２Ｏ），３．５３（ｔ，２Ｈ，ＮＨＣＨ２），３．４２（ｔ，２Ｈ，ＣＨ２Ｂｒ），０．９６（ｔ，２Ｈ，（ＣＨ３）３ＳｉＣＨ２），０．０（ｓ，９Ｈ，（ＣＨ３）３Ｓｉ））．
【０２４５】
中間体化合物３４の合成
【化４０】
2020511421.tif 000046
【０２４６】
４−ヒドロキシベンジルアルコール（２４８ｍｇ、２ｍｍｏｌ）を無水メチルホルムアミド（９．５ｍＬ）に溶解し、Ｃｓ２ＣＯ３（炭酸セシウム）（６５１ｍｇ、２ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を７５℃に加熱し、３時間撹拌した。化合物３３（５３６ｍｇ、２ｍｍｏｌ）を無水ジメチルホルムアミド（０．５ｍＬ）に溶解し、赤色／褐色の懸濁液に滴加した。４時間後、混合物を室温まで冷却し、一晩撹拌した。その後、反応を水でクエンチし、酢酸エチル（３倍）で抽出した。合わせた有機相を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（炭酸水素ナトリウム）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過して、真空下（ｉｎ  ｖａｃｕｏ）で濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン中、０％〜１００％酢酸エチル）による精製は、化合物３４（２８５ｍｇ、０．９１７ｍｍｏｌ、４６％）を与えた。
【０２４７】
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．２５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９Ｈｚ，Ｃ２Ｈ，Ｃ６Ｈ），６．８３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９Ｈｚ，Ｃ３Ｈ，Ｃ５Ｈ），５．１（ｂｓ，１Ｈ，ＮＨ），４．５８（ｓ，２Ｈ，ＰｈＣＨ２Ｏ），４．１３（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，ＣＨ２ＯＣＯ），３．９９（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，ＣＨ２Ｏ），３．５３（ｑ，２Ｈ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，ＮＨＣＨ２），１．８８（ｂｓ，１Ｈ，ＯＨ），０．９５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，ＳｉＣＨ２），０．０（ｓ，９Ｈ，（ＣＨ３）３Ｓｉ）
【０２４８】
１３Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１５８．２（ＣＯ），１５７．０（Ｃ１），１３８．８（Ｃ４），１２８．８（Ｃ２，Ｃ６），１１４．６（Ｃ３，Ｃ５），６７．２（ＣＨ２Ｏ），６５．０（ＣＨ２Ｏ），６３．３（ＣＨ２Ｏ），４０．５（ＮＨＣＨ２），１７．９（ＳｉＣＨ２），−１．４（（ＣＨ３）３Ｓｉ）．
【０２４９】
中間体化合物３５の合成
【化４１】
2020511421.tif 000047
【０２５０】
ＮａＨ（１４０ｍｇ、５．８ｍｍｏｌ）を冷たい無水テトラヒドロフラン（２０ｍＬ、Ｎ２下、０℃）に添加した。化合物３４（９０８ｍｇ、２．９ｍｍｏｌ）を無水テトラヒドロフラン（０．５ｍＬ）に溶解し、１５分間に亘って滴加した。混合物を室温で４５分間撹拌した。次いで、３−ブロモプロピオンアルデヒドエチレンアセタールを１０分間に亘り滴加した。混合物を室温で４８時間撹拌し、次いで濾過して、真空下で濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン中、０％〜６０％酢酸エチル）による精製は、化合物３５（１８８ｍｇ、０．４５７ｍｍｏｌ、１６％）を与えた。
【０２５１】
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．２１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，Ｃ３Ｈ，Ｃ５Ｈ），６．８３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，Ｃ２Ｈ，Ｃ６Ｈ），５．０３（ｂｓ，１Ｈ，ＮＨ），４．９４（ｄｑ，１Ｈ，ＣＨ），４．４１（ｓ，２Ｈ，ＰｈＣＨ２Ｏ），４．１１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，ＣＨ２ＯＣＯ），３．９７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，ＣＨ２Ｏ），３．９５−３．７９（ｍ，４Ｈ，ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ），３．５６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ），３．５９−３．５３（ｍ，２Ｈ，ＮＨＣＨ２），１．９４（ｄｑ，２Ｈ，ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ），０．９５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，ＳｉＣＨ２），０．０（ｓ，９Ｈ，（ＣＨ３）３Ｓｉ）
【０２５２】
１３Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１９１．７，１７２．７，１３３．５，１３０．７，１１６．２，１１５．５，１０４．０，１０２．２，７４．２，６８．８，６８．６，６７．２，６６．１，６１．９，４２．９，３５．８，２４．１，２２．５，１９．３，１５．７，０．０（（ＣＨ３）３Ｓｉ）．
【０２５３】
中間体化合物３６の合成
【化４２】
2020511421.tif 000048
【０２５４】
化合物３５（２００ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）をメタノール（１．５ｍＬ）に溶解し、酢酸（５０μＬ）を添加した。反応混合物を５０℃で１時間３０分に亘り撹拌した。化合物３２をメタノール（１ｍＬ）に溶解し、上記混合物に添加した。溶液は直ちに黄色になり、３０分後、沈殿が形成された。懸濁液を濾過し、白色粉体をメタノール（０．５ｍＬ）で洗浄して、化合物３６（２３０ｍｇ、０．３８１ｍｍｏｌ、８０％）を与えた。
【０２５５】
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１１．５２（ｓ，１Ｈ，ＮＮＨＣＯ），８．３９（ｓ，１Ｈ，ＣＨＮ），７．６５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，Ｃ２Ｈ，Ｃ６Ｈ），７．６０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，Ｃ４’Ｈ），７．３５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，Ｃ６’Ｈ），７．２１（ｂｔ，１Ｈ，ＮＨ），７．１２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，Ｃ３’Ｈ），７．０（ｄ，２ＨＪ＝８．５Ｈｚ，Ｃ３Ｈ，Ｃ５Ｈ），４．８５（ｓ，２Ｈ，ＰｈＣＨ２Ｏ），４．０８−４．０１（ｍ，６Ｈ，ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＯ，ＣＨ２ＯＰｈ，ＯＣＨ２ＣＨ２），３．８６（ｓ，３Ｈ，ＰｈＯＣＨ３，ＯＣＨ２ＣＯＯ）３．８（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２ＣＨ２ＣＨＮ），３．６９（ｓ，３Ｈ，ＣＯＯＣＨ３），３．３６（ｑ，２Ｈ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，ＮＨＣＨ２ＣＨ２Ｏ），０．９２（ｍ，２Ｈ，ＳｉＣＨ２），０．０（ｓ，９Ｈ，（ＣＨ３）３Ｓｉ）．
【０２５６】
１３Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１６８．９（ＣＯ），１６３．０（ＣＯ）１５９．９，１５６．４，１５４．５，１５１．９，１４７．２（ＣＨＮ），１４６．５，１２８．６（Ｃ２，Ｃ６），１２７．０，１２５．５，１２１．９（Ｃ４’），１１４．８（Ｃ３，Ｃ５），１１２．７（Ｃ６’），１１１．５（Ｃ３’），６６．５（ＣＨ２ＯＰｈ），６６．３（ＣＨ２Ｏ），６５．４（ＰｈＣＨ２Ｏ），６１．６（ＣＨ２Ｏ），５７．８，５５．８（ＯＣＨ３），５４．８（ＯＣＨ２ＣＯ），５１．８（ＣＯＯＣＨ３），３９．５（ＮＨＣＨ２），１７．３（ＳｉＣＨ２），−１．８（（ＣＨ３）３Ｓｉ）．
【０２５７】
中間体化合物３７の合成
【化４３】
2020511421.tif 000049
【０２５８】
化合物３６（１００ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフランに溶解し、ＴＢＡＦ（テトラブチルアンモニウムフルオリド）（０．２ｍＬ、テトラヒドロフラン中１Ｍ、０．２ｍｍｏｌ）を添加した。該混合物を２０時間に亘って６０℃まで加熱した後、室温まで冷却した。ステアリン酸（２０ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）を、テトラヒドロフラン（１ｍＬ）及びＤＩＰＥＡ（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン）（１５μＬ、０．０８６ｍｍｏｌ）に溶解した。ＴＳＴＵ（Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）−１，１，３，３−テトラメチルウラニウムテトラフルオロボロネート）（２８ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ）を添加し、室温で３０分間撹拌した。活性化脂肪酸を反応混合物に添加し、室温で４８時間撹拌した。過剰な活性化脂肪酸をヘキサンで抽出して除去し、残留物を真空下で濃縮した。ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚＣ４１Ｈ６３Ｎ３Ｏ８に対する計算値［Ｍ＋Ｈ］＋７２５．４６：実測値７２５．８４．
【０２５９】
中間体化合物３８の合成
【化４４】
2020511421.tif 000050
【０２６０】
Ｐｈａｍら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ，２００７，５０（１５），３５６１−３５７２に従って、メチル４−アセタミド２−メトキシベンゾエートを合成した。
【０２６１】
メチル４−アセタミド２−メトキシベンゾエート（０．２０１ｇ、０．９０ｍｍｏｌ）及びヒドラジン一水和物（０．４４０ｍＬ、９．０ｍｍｏｌ）をエタノールに溶解し、２６時間還流させた。反応混合物を室温に冷却し、沈殿を濾過し、乾燥させて化合物３８（０．１５７ｇ、０．７０ｍｍｏｌ、７８％）を与えた。
【０２６２】
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１０．１４（ｓ，１Ｈ），９．０８（ｓ，１Ｈ），７．７１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），７．４８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．３Ｈｚ），７．１８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），３．８４（ｓ，３Ｈ），２．０６（ｓ，３Ｈ）．
【０２６３】
中間体化合物３９の合成
【化４５】
2020511421.tif 000051
【０２６４】
Ｋａｒｌｓｓｏｎら、Ｏｒｇ．Ｐｒｏｃｅｓｓ．Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．２０１２，１６，５８６−５９４．に従って、メチル２−（４−ホルミルフェノキシ）アセテートを合成した。
【０２６５】
メタノール（１０ｍＬ）を化合物３８（８２ｍｇ、０．３６７ｍｍｏｌ）に添加し、化合物が完全に可溶化するまで該混合物を穏やかに加熱した。メチル２−（４−ホルミルフェノキシ）アセテート（６５ｍｇ、０．３３４ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を１時間還流した。反応混合物の冷却後、形成された沈殿を濾過し、乾燥させて白色固体として化合物３９（１３０ｍｇ、０．３２５ｍｍｏｌ、８９％）を与えた。
【０２６６】
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１１．１７（ｓ，１Ｈ），１０．２１（ｓ，１Ｈ），８．３１（ｓ，１Ｈ），７．６６（ｔ，３Ｈ），７．５３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．４Ｈｚ），７．２２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，Ｊ＝１．６Ｈｚ），７．０１（ｄ，２Ｈ），４．８６（ｓ，２Ｈ），３．８８（ｓ，３Ｈ），３．７１（ｓ，３Ｈ），２．０７（２，３Ｈ）．ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚＣ２０Ｈ２１Ｎ３Ｏ６に対する計算値：４００．１４［Ｍ＋Ｈ］＋；実測値４００．０４．
【０２６７】
中間体化合物４０の合成
【化４６】
2020511421.tif 000052
【０２６８】
化合物３９（５０ｍｇ、０．１２４ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン／メタノール／水２／１／１（８ｍＬ）に溶解した。ＮａＯＨ（５Ｍ、１００μＬ）を添加し、反応物を室温で３０分間撹拌した。溶媒を蒸発させ、テトラヒドロフラン（１０ｍＬ）を添加した。形成された沈殿を遠心分離によって分離し、乾燥して化合物４０（４５ｍｇ、０．１１０ｍｍｏｌ、８８％）を与えた。
【０２６９】
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ８．１３（ｓ，１Ｈ），７．５２（ｄ，２Ｈ，１Ｈ，Ｊ＝８．９Ｈｚ），７．２２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．１３（ｓ，１Ｈ），６．８２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），６．７７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），４．１２（ｓ，２Ｈ），３．６１（ｓ，３Ｈ），１．８５（ｓ，３Ｈ）．ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚＣ１９Ｈ１９Ｎ３Ｏ６に対する計算値：３８６．１５［Ｍ＋Ｈ］＋；実測値３８６．１２．
【０２７０】
中間体化合物４１の合成
【化４７】
2020511421.tif 000053
【０２７１】
塩化オキサリル（０．９ｍＬ、１０．５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１０ｍＬ）中のステアリン酸（１．０ｇ、３．５２ｍｍｏｌ）に添加した。懸濁液を室温で１時間撹拌した後、開始材料を溶解させ、反応を終了した。溶媒を蒸発させ、メチル４−アミノ２−メトキシベンゾエート（０．７６ｇ、４．２２ｍｍｏｌ）を添加した後、活性化された酸をジクロロメタン（１０ｍＬ）に再度溶解した。該反応物を室温で一晩撹拌した。蒸発後、粗製物をシリカゲルクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール２５：１）によって精製し、化合物４１（１．３３ｇ、２．９７ｍｍｏｌ、８４％）を与えた。
【０２７２】
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．８０（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７０（ｓ，１Ｈ），６．７８（ｄｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），３．９１（ｓ，３Ｈ），３．８６（ｓ，３Ｈ），２．３７（ｍ，２Ｈ），１．７２（ｍ，２Ｈ），１．２５（ｍ，２８Ｈ），０．８８（ｍ，３Ｈ）．
【０２７３】
中間体化合物４２の合成
【化４８】
2020511421.tif 000054
【０２７４】
ヒドラジン一水和物（０．１６ｍＬ、３．３５ｍｍｏｌ）をエタノール（１０ｍＬ）中の化合物４１（０．１５ｇ、０．３３５ｍｍｏｌ）に添加した。反応混合物を一晩還流した後、室温に冷却した。生成物が沈殿し、濾過によって分離して乾燥させ、化合物４２（０．１２２ｇ、０．２７３ｍｍｏｌ、８１％）を与えた。
【０２７５】
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ８．８９（ｓ，１Ｈ），８．１２（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ），７．９１（ｓ，１Ｈ），７．４２（ｓ，１Ｈ），６．７４（ｄｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，１Ｈ），２．３８（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），１．７７−１．６７（ｍ，２Ｈ），１．２４（ｓ，２８Ｈ），０．８７（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ）．
【０２７６】
中間体化合物４３の合成
【化４９】
2020511421.tif 000055
【０２７７】
化合物４２（３５ｍｇ、０．０７８ｍｍｏｌ）を、混合物を６０℃に加熱することによって酢酸エチル（１０ｍＬ）に溶解した。メチル２−（４−ホルミルフェノキシ）アセテート（１４ｍｇ、０．０７１ｍｍｏｌ）に続いて酢酸（３滴）を添加し、反応物を３０分間還流させた。溶媒を蒸発させ、残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール、５０：１から２５：１の勾配）によって精製し、化合物４３（３１ｍｇ、０．０５０ｍｍｏｌ、６４％）を与えた。
【０２７８】
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１１．１５（ｓ，１Ｈ），１０．１３（ｓ，１Ｈ），８．３２（ｓ，１Ｈ），７．７０−７．５８（ｍ，４Ｈ），７．２２（ｄｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，１Ｈ），７．０２（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），４．８６（ｓ，２Ｈ），３．８８（ｓ，３Ｈ），３．７１（ｓ，３Ｈ），２．３３（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），１．６０−１．５６（ｍ，２Ｈ），１．２３（ｓ，２８Ｈ），０．８５（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，３Ｈ）．
【０２７９】
中間体化合物４４の合成
【化５０】
2020511421.tif 000056
【０２８０】
化合物４３（１０．５ｍｇ、０．０１７ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（１ｍＬ）に溶解した。メタノール（１ｍＬ）に続いて水（１ｍＬ）を添加すると、溶液は乳濁した。ＮａＯＨ（５Ｍ、１００μＬ）を添加し、反応物を３０分間撹拌した。形成された沈殿を濾過し、乾燥して化合物４４（９．０ｍｇ、０．０１４８ｍｍｏｌ、８９％）を与えた。
【０２８１】
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１１．０７，（ｓ，１Ｈ），１０．１２（ｓ，１Ｈ），８．２９（ｍ，２Ｈ），７．６９（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．５６（ｍ，３Ｈ），７．２１（ｄｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，Ｊ＝１．７Ｈｚ，１Ｈ），６．８３（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１Ｈ），４．０９（ｓ，２Ｈ），３．８９（ｓ，３Ｈ），２．３２（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），１．６６−１．５５（ｍ，２Ｈ），１．２４（ｓ，２８Ｈ），０．８５（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ）．
【０２８２】
実施例４：ＬｙｓＢ２９Ｎε−オクタデカノイルヒトインスリンの合成（非加水分解性結合を介して不活性化物質に複合化された参照インスリン）
【０２８３】
ＤＩＰＥＡ（４１μＬ、０．２３ｍｍｏｌ）及びＴＳＴＵ（３０．５ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（６ｍＬ）中のオクタデカン酸（２２ｍｇ、０．０７８ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に添加した。反応をＴＬＣによってモニターし、活性エステルへの完全な変換を３時間後に観察した。ヒトインスリン（１００ｍｇ、０．０１７８ｍｍｏｌ）を３ｍＬの０．１Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３に溶解し、０．１Ｍ  ＮａＯＨでｐＨを１０．５に調整した。活性エステルを穏やかに撹拌しながら滴加し、添加する間にｐＨを１０．５に調整した。反応に続いてＬＣ−ＭＳを行い、１５分後に５８％の生成物への変換を観察した。ｐＨを４〜５まで低下させ、水を添加し、混合物を凍結乾燥した。粗製白色粉体を逆相ＨＰＬＣ（Ｃ４カラム、水／アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ）によって精製し、ＵＰＬＣ−ＭＳ（Ｃ１８カラム、アセトニトリル／水／ギ酸）によって定量した。
【０２８４】
ＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ２７５Ｈ４１７Ｎ６５Ｏ７８Ｓ６に対する計算値：６０７４．１０［Ｍ＋Ｈ］＋，２０２５．７１［Ｍ＋３Ｈ］３＋，１５１９．５３［Ｍ＋４Ｈ］４＋，１２１５．８３［Ｍ＋５Ｈ］５＋，１０１３．３６［Ｍ＋６Ｈ］６＋；実測値２０２５．７９，１５１９．５４，１２１６．００，１０１３．５１．
【０２８５】
実施例５：本発明によるインスリン共役体（共役体２）の合成
【０２８６】
基本手順：
ジメチルホルムアミド（０．５ｍＬ）及び１５−クラウン−５（１０当量）を化合物４０又は化合物４４（１ｍｇ）に添加し、開始材料が溶解するまで１時間撹拌した。ジメチルホルムアミド（０．１ｍＬ）中のＴＳＴＵ（１．３当量）を添加し、反応物を室温で１０分間撹拌した後、Ｅｔ３Ｎ（１００当量）を含むＤＭＳＯ中でヒトインスリン（２当量）の穏やかに撹拌した溶液に滴加した。１０分後、反応混合物をＬＣ−ＭＳによって分析し、インスリン共役体の形成を確認した。アセトニトリル（０．５ｍＬ）及び水（０．５ｍＬ）を添加し、酢酸の添加によってｐＨを７．５に調整した。水、０．１％ギ酸からアセトニトリル０．１％ギ酸への勾配を使用する１０ｇのＣ４カラム上のＲＰ−フラッシュクロマトグラフィー（ＩｓｏｌｅｒａＯｎｅ（商標）、Ｂｉｏｔａｇｅ）による精製。水性ＮＨ３を使用して、各画分のｐＨをおよそ７．５に調整した。純粋な画分を集め、アセトニトリルを蒸発させて、水性ＮＨ３によってｐＨを８に調整した後、凍結乾燥によって白色粉体としてインスリン共役体を与えた。
【０２８７】
インスリン共役体１
【化５１】
2020511421.tif 000057
【０２８８】
ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚＣ２７６Ｈ４００Ｎ６８Ｏ８２Ｓ６に対する計算値：６１７５．９９［Ｍ＋Ｈ］＋，１５４４．７６［Ｍ＋４Ｈ］４＋，１２３６．０１［Ｍ＋５Ｈ］５＋，１０３０．１７［Ｍ＋６Ｈ］６＋；実測値１５４４．９２，１２３５．８６，１０３０．１１．
【０２８９】
インスリン共役体２
【化５２】
2020511421.tif 000058
【０２９０】
ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚＣ２９２Ｈ４３２Ｎ６８Ｏ８２Ｓ６に対する計算値：６３９９．４２［Ｍ＋Ｈ］＋，１６００．８６［Ｍ＋４Ｈ］４＋，１２８０．８９［Ｍ＋５Ｈ］５＋，１０６７．５８［Ｍ＋６Ｈ］６＋；実測値１６０１．０３，１２８１．１０，１０６７．６７．
【０２９１】
実施例６：ｉｎ  ｖｉｔｒｏグルコースセンシング評価（ＬＣ−ＭＳ）
この実施例による目的は、グルコースに対する各連結体の応答性を評価することである。
【０２９２】
基本プロトコル：
１ｍｇ〜１．５ｍｇの連結体を１００μＬのＤＭＳＯに溶解した。溶媒和の直後、１０００当量のグルコースを含むｐＨ７のリン酸緩衝液９９５μｌに５μｌを添加した。混合物を３７℃に加熱し、ＬＣ−ＭＳによって連続的に分析した。
【０２９３】
【数１】
2020511421.tif 000059
【０２９４】
結果及び考察：
実施例２より、連結体分子の以下の構造とグルコースの反応関係は合理的なようである：
【０２９５】
下記一般式から開始
【化５３】
2020511421.tif 000060
【０２９６】
Ｒ１成分は柔軟であるが、ヒドラゾンに対してアルカン鎖で間を置いて配置される芳香環は、連結体グルコース結合の速度にとって重要となるようである。また、アルキル鎖はアルカンエーテルとなる場合がある。Ｒ２成分は、好ましくは、オルト位及び／又はパラ位に供与基を有する芳香環でなくてはならない。
【０２９７】
実施例６でグルコース結合が最も速い速度の連結体は連結体１５であり、５時間以内に連結体グルコースを形成する。
【０２９８】
実施例７：種々のグルコース濃度でのｉｎ  ｖｉｔｒｏグルコースセンシング
本実施例による目的は、様々なグルコース濃度において３種類の異なる連結体の反応速度、即ち、加水分解し、グルコースと反応して連結体グルコース共役体を形成するそれらの能力を評価することである。
【０２９９】
手順１：
連結体１（（Ｅ）−Ｎ’−（３−（ベンジルオキシ）プロピリデン）−４−メトキシベンゾヒドラジド）１．４ｍｇを１００μＬのＤＭＳＯに溶解した。ＤＭＳＯ原液１０μＬを、１０００当量又は５０００当量のグルコースを含むｐＨ７．４の１×ＰＢＳ緩衝液９９０μＬに添加して、最終濃度０．４２ｍＭの連結体１を与えた。該溶液を３７℃に加熱し、ＵＰＬＣ−ＭＳ（Ｃ１８カラム、アセトニトリル／水／ギ酸）によって０時間〜４８時間、種々の時間点で分析した。連結体グルコース化合物を、反応物の完全な変換の割合として分析した。
【０３００】
表１：連結体１（％連結体グルコース）
【表１】
2020511421.tif 000061
【０３０１】
手順２
１．３ｍｇ及び１．４ｍｇの連結体１４（（Ｅ）−Ｎ’−（２−（ベンジルオキシ）エチリデン）−４−メトキシベンゾヒドラジド）及び連結体１５（（Ｅ）−Ｎ’−（２−（ベンジルオキシ）エチリデン）−２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾヒドラジド）を、それぞれ１００μＬのＤＭＳＯに溶解した。各原液１０μＬを１０００当量、５０００当量又は１０，０００当量のグルコースを含むｐＨ７．４の１×ＰＢＳ緩衝液９９０μＬに添加して、０．４２ｍＭの最終連結体濃度を与えた。該溶液を３７℃に加熱し、ＵＰＬＣ−ＭＳ（Ｃ１８カラム、アセトニトリル／水／ギ酸）によって０時間〜７２時間種々の時間点で分析した。連結体グルコース化合物を、反応物の完全変換の割合として分析した。
【０３０２】
表２：連結体１４（％連結体グルコース）
【表２】
2020511421.tif 000062
【０３０３】
表３：連結体１５（％連結体グルコース）
【表３】
2020511421.tif 000063
【０３０４】
結果及び考察：
３つ全ての実施例において、反応速度、即ち形成された連結体グルコース共役体の量は、増加するグルコース濃度と相関する。
【０３０５】
実施例８：インスリン共役体のｉｎｖｉｔｒｏグルコースセンシング評価
この実施例による目的は、グルコースが存在する状態で、インスリンに付着された連結体の加水分解性を評価することである。
【０３０６】
基本プロトコル：
インスリン共役体１．０ｍｇを１００μＬのＤＭＳＯに溶解した。５００００当量のグルコースを含むｐＨ７．４の１×ＰＢＳ緩衝液４９０μＬに１０μＬを添加して、３２μＭの最終濃度を与えた。試料を３７℃でインキュベートし、ＨＰＬＣ（Ｃ１８カラム、アセトニトリル／水／ギ酸）によって１時間、２４時間、４８時間及び７２時間に分析した。
【０３０７】
【数２】
2020511421.tif 000064
【０３０８】
結果及び考察：
グルコースがない状態では、インスリン共役体は加水分解され、平衡は安定化されて、実験を通して同じままである。グルコースが存在する場合、動的平衡は、インスリン共役体から加水分解された連結体を有するインスリンへとシフトし、連結体のグルコース感受性を示す。
【０３０９】
実施例９：ｉｎ  ｖｉｔｒｏインスリン受容体Ｂ（ＩＮＳＲｂ）の機能アッセイ
この実施例の目的は、インスリンＢ受容体に対するインビトロの効力を検査することである。
【０３１０】
基本プロトコル：
製造緩衝液に代えて、０．１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含むｐＨ７．４の１×ＰＢＳ緩衝液を用いて、ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ  ＩＮＳＲｂ機能アッセイキット（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ）を使用した。
【０３１１】
【数３】
2020511421.tif 000065
【０３１２】
結果及び考察：
インスリン共役体１（阻害物質を含まないインスリン）の効力は、ヒトインスリンの効力に類似する。インスリン共役体２の効力は、ヒトインスリンのものより１００倍低く、インスリン−Ｃ１８の効力はヒトインスリンの効力の３００倍低い。
【０３１３】
実施例１０：肥満でないラットにおけるインスリン−Ｃ１８のインビボ  ｓｃＩＴＴ
この実施例による目的は、Ｃ１８脂肪酸と複合化されたヒトインスリン、並びに肥満でないラットにおいてｓｃＩＴＴによって測定される、アルブミンと相互作用してインスリン活性を減少させるその能力を評価することである。ビヒクル、５単位のインスリン−Ｃ１８又は０．５単位のヒトインスリン（ｎ＝４）の皮下投与の前及びその後の５つの時間点で血糖濃度を測定した。
【０３１４】
【数４】
2020511421.tif 000066
【０３１５】
結果及び考察：
結果は、インスリン−Ｃ１８がアルブミンとの強い相互作用を有することにより、測定時間の間、インスリンの作用を排除することを示す。
【図１】
2020511421.tif 000070
【手続補正書】
【提出日】平成31年3月20日(2019.3.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト又は動物の被験体の治療又は予防処置に使用するための式Ｐ−Ｌ−Ｉの共役体であって、
式中、Ｐはインビボで炭水化物の代謝に影響するインスリン又はインスリン類似体であり、ＬはＬｐ及びＬｉからなる加水分解性連結体分子であり、Ｉはインビボで炭水化物の代謝に対する前記インスリン又はインスリン類似体Ｐの効果を不活性化又は阻害することができる分子であり、
ａ．Ｌが以下の一般式であり：
【化１】
2020511421.tif 000071
式中、Ｒ１がＩ又はＰが結合される芳香族部分を含み；Ｒ３が１以上の電子供与基であり；及びＲ４はＰ又はＩを含み；並びに共役体部分Ｐ−Ｌｐ及びＬｉ−Ｉの少なくとも１つのモル過剰で共役体Ｐ−Ｌ−Ｉが存在するインビボにおいて、共役体Ｐ−Ｌ−Ｉ並びに共役体部分Ｐ−Ｌｐ及びＬｉ−Ｉが動的平衡状態で存在するように、前記連結体がインビボで加水分解性であり、
ｂ．前記共役体部分Ｐ−Ｌｐ及びＬｉ−Ｉの少なくとも１つがグルコースに共有結合し、それによって、インビボでグルコースの濃度が増加した場合に、Ｉに結合していないＰの濃度がインビボで増加し、あるいは加水分解性連結体Ｌの加水分解がグルコースによって促進される、前記共役体。
【請求項２】
前記反応物Ｐ−Ｌｐがグルコースに共有結合する、請求項１に記載の使用のための共役体。
【請求項３】
ＩがＰの活性部位を阻害することができる作用物質である、請求項１又は２に記載の使用のための共役体。
【請求項４】
Ｉがインビボで式Ｐ−Ｌ−Ｉの複数の共役体をクラスター化することができる作用物質である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用のための共役体。
【請求項５】
Ｉが血清アルブミンに結合することができる作用物質である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用のための共役体。
【請求項６】
Ｉが構造Ａを備え、Ａが以下から選択され、ａが少なくとも１０である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用のための共役体：
【化２】
2020511421.tif 000072
【請求項７】
ヒト又は動物の被験体の糖尿病の治療に使用するための、請求項１〜６のいずれか１項に記載の共役体。
【請求項８】
ヒト又は動物の被験体の糖尿病の治療に使用するための請求項１〜７のいずれか１項に記載の共役体であって、前記治療が１日当たり２回以下の投与頻度で前記共役体を投与することを含む、前記共役体。
【請求項９】
ヒト又は動物の被験体の糖尿病の治療に使用するための請求項１〜８のいずれか１項に記載の共役体であって、前記治療が１日当たり１回以下の投与頻度で前記共役体を投与することを含む、前記共役体。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用のための共役体と、少なくとも１つの薬学的又は獣医学的な賦形剤と、を含む、薬学的又は獣医学的組成物。
【国際調査報告】
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