(57)【要約】  本開示は、少なくとも１つの異種部分（例えばＸＴＥＮ）を含む因子ＩＸ（ＦＩＸ）融合タンパク質を提供する。本開示にはさらに、ＦＩＸ融合タンパクを製造および使用する方法が開示される。
2020505424.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
因子ＩＸ（ＦＩＸ）融合タンパク質を、それを必要とする対象に投与する方法であって、対象にＦＩＸ融合タンパク質を皮下投与することを含み、
（ａ）該ＦＩＸ融合タンパク質は、ＦＩＸポリペプチドと、少なくとも１つのＸＴＥＮとを含み、該ＸＴＥＮは、配列番号２のアミノ酸１０３、配列番号２のアミノ酸１０５、配列番号２のアミノ酸１４２、配列番号２のアミノ酸１４９、配列番号２のアミノ酸１６２、配列番号２のアミノ酸１６６、配列番号２のアミノ酸１７４、配列番号２のアミノ酸２２４、配列番号２のアミノ酸２２６、配列番号２のアミノ酸２２８、配列番号２のアミノ酸４１３およびそれらのいずれかの組合せからなる群から選択されるアミノ酸に対応する挿入部位で該ＦＩＸポリペプチド内に挿入され、
（ｂ）投与後に、該ＦＩＸ融合タンパク質は、該対象において約５％〜約３０％の血漿中活性を示す、前記方法。
【請求項２】
因子ＩＸ（ＦＩＸ）融合タンパク質を、それを必要とする対象に投与する方法であって、対象にＦＩＸポリペプチドおよびＦｃドメインを含むＦＩＸ融合タンパク質を皮下投与することを含み、該ＦＩＸ融合タンパク質は、配列番号２２９と少なくとも約８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、投与後に、該ＦＩＸ融合タンパク質は、該対象において約５％〜約３０％の血漿中活性を示す、前記方法。
【請求項３】
ＦＩＸ融合タンパク質は、約５０ＩＵ／ｋｇ〜約４００ＩＵ／ｋｇの用量で投与される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ＦＩＸ融合タンパク質は、約１０％〜約３０％の血漿中活性ピーク値を示す、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ＦＩＸ融合タンパク質は、約５％〜約１０％の血漿中活性ピーク値を示す、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
挿入部位は、配列番号２のアミノ酸１４９、配列番号２のアミノ酸１６２、配列番号２のアミノ酸１６６、配列番号２のアミノ酸１７４およびそれらのいずれかの組合せからなる群から選択されるアミノ酸に対応する、請求項１および３〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ＸＴＥＮは、少なくとも約６のアミノ酸、少なくとも約１２のアミノ酸、少なくとも約３６のアミノ酸、少なくとも約４２のアミノ酸、少なくとも約７２のアミノ酸、少なくとも約１４４のアミノ酸または少なくとも約２８８のアミノ酸を含む、請求項１および３〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ＸＴＥＮは、配列番号３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２３０およびそれらのいずれかの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１および３〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ＸＴＥＮは、ＡＥ７２を含む、請求項１および３〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ＦＩＸ融合タンパク質は、第２のＸＴＥＮをさらに含み、ＸＴＥＮは、配列番号２のアミノ酸１６６に対応する挿入部位で、ＦＩＸポリペプチド内に挿入され、第２のＸＴＥＮは、ＦＩＸポリペプチドのＣ末端に融合する、請求項１および３〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ＦＩＸ融合タンパク質は、Ｆｃドメインをさらに含む、請求項１および３〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ＦＩＸ融合タンパク質は、第２のＦｃドメインをさらに含む、請求項２〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ＦＩＸ融合タンパク質は、２つのポリペプチド鎖をさらに含み、第１のポリペプチド鎖は、Ｆｃドメインに融合するＦＩＸポリペプチドを含み、第２のポリペプチド鎖は、第２のＦｃドメインを含み、第１のＦｃドメインおよび第２のＦｃドメインは、共有結合によって会合する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＦＩＸポリペプチドは、Ｒ３３８Ｌ  ＦＩＸ変異体である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ＦＩＸ融合タンパク質は、第１の鎖および第２の鎖を含み、
（ａ）第１の鎖は、
（ｉ）３３８Ｌの変異を有するＦＩＸポリペプチドと、
（ｉｉ）場合により、配列番号２のアミノ酸１６６に対応する挿入部位でＦＩＸポリペプチド内に挿入され、少なくとも約７２のアミノ酸を有するアミノ酸配列を含む、ＸＴＥＮと、
（ｉｉｉ）ＦＩＸポリペプチドに融合する第１のＦｃドメインと
を含み、
（ｂ）第２の鎖は、第２のＦｃドメインを含み、
第１のＦｃドメインおよび第２のＦｃドメインは、共有結合によって会合する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも１つの異種部分（例えばＸＴＥＮ）を含む因子ＩＸ（ＦＩＸ）融合タンパク質、ならびにＦＩＸ融合タンパクを製造および使用する方法に関する。アスキーテキストファイルとして電子的に提出された配列表の内容（ファイル名：４１５９＿４８７ＰＣ０１＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ、サイズ：６９，４５０４バイト、作成日：２０１８年１月２９日）は、本願と共に提出され、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
血友病Ｂ（別名クリスマス病）は、世界中で最も一般的な遺伝性出血障害の１つである。それはインビボおよびインビトロでの血液凝固活性の低下をもたらし、罹患者の生涯全体にわたって、積極的な医療的モニターを必要とする。介入がない場合、罹患個体は関節における特発性の出血を患い、それにより重い痛みおよび衰弱性の不動状態がもたらされ、また筋肉への出血によりその組織内へ血液が蓄積し、早期に治療されない場合には、喉および頸部における特発性の出血により窒息に至る場合もあり、また腎出血や、手術後の重症出血、小規模な偶発的損傷、または歯周からの出血も一般的に見られる。
【０００３】
通常のインビボでの血液凝固は、セリンプロテアーゼである因子ＩＩ（プロトロンビン）、ＶＩＩ、ＩＸ、ＸおよびＸＩ（可溶性血漿タンパク質）、膜貫通タンパク質組織因子および血漿タンパクである因子ＶおよびＶＩＩＩを含む補因子、フィブリノゲン、トランスグルタミナーゼである因子ＸＩＩＩ、リン脂質（活性化血小板を含む）およびカルシウムを最低限必要とする。カリクレイン、高分子量キニノーゲンおよび因子ＸＩＩを含む更なるタンパク質は、いくつかのインビトロ凝固試験で必要とされ、また病理学的症状においてもインビボでの役割を果たすことがある。
【０００４】
血友病において、特定の血漿血液凝固因子の欠損により血液凝固が妨げられる。血友病Ｂは、因子ＩＸ（ＦＩＸ）の不全により生じ、それはＦＩＸタンパク質の合成の低さもしくは欠如、または低い活性を有する不完全な分子であることから生じ得る。血友病の処置は、ＦＩＸを十分豊化した外因性の因子濃縮物により、欠損する凝固因子を置き換えることにより行われる。しかしながら、後述するように、血液からかかる濃縮物を得ることは技術的困難性が大きい。
【０００５】
血漿からのＦＩＸ（血漿由来ＦＩＸ、ｐｄＦＩＸ）の精製を行うと、ほぼ排他的に完全にγ−カルボキシル化されたＦＩＸが得られる。しかしながら、ＦＩＸは血漿中に低濃度（５μｇ／ｍＬ）でのみ存在するため、血漿からのＦＩＸのかかる精製は非常に困難である。非特許文献１。さらに、血液からの精製は、感染因子（例えばＨＩＶおよびＨＣＶ）の除去または不活性化を必要とする。加えて、ｐｄＦＩＸは半減期が短いため、頻繁な投与を必要とする。組換え因子ＩＸ（ｒＦＩＸ）を利用することもできるが、ｐｄＦＩＸと同様、短い半減期であり、頻繁な投与（例えば予防のためには週２〜３回）が必要となる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７：４５１  ４５９（１９７５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
低い死亡率、関節の損傷の予防および生活の質の改善は、血漿由来のおよび組換え型のＦＩＸの開発による重要な業績であった。出血を長期にわたり保護することは、血友病Ｂの対象の処置における他の鍵となる進展を表すものである。したがって、より長い半減期を有する一方で、有効な活性が維持される、改良された組換え型ＦＩＸに対するニーズは依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
因子ＩＸ（ＦＩＸ）融合タンパク質を、それを必要とする対象に投与する方法であって、対象にＦＩＸ融合タンパク質を皮下投与することを含み、
（ａ）ＦＩＸ融合タンパク質は、ＦＩＸポリペプチドと、少なくとも１つのＸＴＥＮとを含み、ＸＴＥＮは、配列番号２のアミノ酸１０３、配列番号２のアミノ酸１０５、配列番号２のアミノ酸１４２、配列番号２のアミノ酸１４９、配列番号２のアミノ酸１６２、配列番号２のアミノ酸１６６、配列番号２のアミノ酸１７４、配列番号２のアミノ酸２２４、配列番号２のアミノ酸２２６、配列番号２のアミノ酸２２８、配列番号２のアミノ酸４１３およびそれらのいずれかの組合せからなる群から選択されるアミノ酸に対応する挿入部位でＦＩＸポリペプチド内に挿入され、
（ｂ）投与後に、ＦＩＸ融合タンパク質は、対象において約５％〜約３０％の血漿中活性を示す、方法が開示される。
【０００９】
本開示の他の態様は、因子ＩＸ（ＦＩＸ）融合タンパク質を、それを必要とする対象に投与する方法であって、対象にＦＩＸポリペプチドおよびＦｃドメインを含むＦＩＸ融合タンパク質を皮下投与することを含み、ＦＩＸ融合タンパク質は、配列番号２２９と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、投与後に、ＦＩＸ融合タンパク質は、対象において約１％〜約３０％の血漿中活性を示す、方法に関する。
【００１０】
いくつかの実施形態では、ＦＩＸ融合タンパク質は、約５０ＩＵ／ｋｇ〜約４００ＩＵ／ｋｇの用量で、例えば、約５０ＩＵ／ｋｇ、約１００ＩＵ／ｋｇ、約２００ＩＵ／ｋｇまたは約４００ＩＵ／ｋｇの用量で投与される。
【００１１】
いくつかの実施形態では、ＦＩＸ融合タンパク質は、約１０％〜約３０％の血漿中活性ピーク値を示す。いくつかの実施形態では、ＦＩＸ融合タンパク質は、約１％〜約１０％の血漿中活性トラフ値を示す。
【００１２】
他の実施形態では、因子ＩＸ融合タンパク質は、少なくとも１つのＸＴＥＮを含む。一態様では、因子ＩＸ（ＦＩＸ）融合タンパク質は、ＦＩＸポリペプチドと、少なくとも１つのＸＴＥＮとを含み、ＸＴＥＮは、配列番号２のアミノ酸１０３、配列番号２のアミノ酸１０５、配列番号２のアミノ酸１４２、配列番号２のアミノ酸１４９、配列番号２のアミノ酸１６２、配列番号２のアミノ酸１６６、配列番号２のアミノ酸１７４、配列番号２のアミノ酸２２４、配列番号２のアミノ酸２２６、配列番号２のアミノ酸２２８、配列番号２のアミノ酸４１３およびそれらのいずれかの組合せからなる群から選択されるアミノ酸に対応する挿入部位で、ＦＩＸポリペプチド内に挿入され、ＦＩＸ融合タンパク質は、凝血原活性を示す。特定の実施形態では、挿入部位は、配列番号２のアミノ酸１４９、配列番号２のアミノ酸１６２、配列番号２のアミノ酸１６６、配列番号２のアミノ酸１７４およびそれらのいずれかの組合せからなる群から選択されるアミノ酸に対応する。
【００１３】
いくつかの実施形態では、ＸＴＥＮは、少なくとも約６のアミノ酸、少なくとも約１２のアミノ酸、少なくとも約３６のアミノ酸、少なくとも約４２のアミノ酸、少なくとも約７２のアミノ酸、少なくとも約１４４のアミノ酸または少なくとも約２８８のアミノ酸を含む。特定の実施形態では、ＸＴＥＮは、配列番号３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２３０およびそれらのいずれかの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＸＴＥＮは、ＡＥ７２を含む。特定の一実施形態では、ＸＴＥＮは、配列番号２３０を含む。
【００１４】
いくつかの実施形態では、ＦＩＸ融合タンパク質は、第２のＸＴＥＮをさらに含み、ＸＴＥＮは、配列番号２のアミノ酸１６６に対応する挿入部位で、ＦＩＸポリペプチド内に挿入され、第２のＸＴＥＮは、ＦＩＸポリペプチドのＣ末端に融合する。
【００１５】
いくつかの実施形態では、ＦＩＸ融合タンパク質は、Ｆｃドメインをさらに含む。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＦＩＸポリペプチドのＣ末端に融合する。特定の実施形態では、ＦＩＸ融合タンパク質は、第２のＦｃドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＦＩＸ融合タンパク質は、２つのポリペプチド鎖をさらに含み、第１のポリペプチド鎖は、Ｆｃドメインに融合するＦＩＸポリペプチドを含み、第２のポリペプチド鎖は、第２のＦｃドメインを含み、第１のＦｃドメインおよび第２のＦｃドメインは、共有結合によって会合する。
【００１６】
いくつかの実施形態では、ＦＩＸポリペプチドは、Ｒ３３８Ｌ  ＦＩＸ（「Ｐａｄｕａ」）変異体である。
【００１７】
いくつかの実施形態では、ＦＩＸ融合タンパク質は、第１の鎖および第２の鎖を含み、（ａ）第１の鎖は、（ｉ）３３８Ｌの変異を有するＦＩＸポリペプチドと、（ｉｉ）場合により、配列番号２のアミノ酸１６６に対応する挿入部位でＦＩＸポリペプチド内に挿入され、少なくとも約７２のアミノ酸を有するアミノ酸配列を含む、ＸＴＥＮと、（ｉｉｉ）ＦＩＸポリペプチドに融合する第１のＦｃドメインとを含み、（ｂ）第２の鎖は、第２のＦｃドメインを含み、第１のＦｃドメインおよび第２のＦｃドメインは、共有結合によって会合する。
【００１８】
本開示に関する方法はまた、ＦＩＸポリペプチドと、ＸＴＥＮを含む異種部分とを含むＦＩＸ融合タンパク質であって、ＸＴＥＮは、ＦＩＸポリペプチドのＣ末端に融合し、長さが４２アミノ酸より長く１４４アミノ酸より短いアミノ酸配列を含む、ＦＩＸ融合タンパク質を提供する。
【００１９】
本発明の方法のＦＩＸ融合タンパク質は、それを必要とする患者の凝固病または症状を予防するか、処置するか、改善するか、または管理する方法を提供することを含む、いくつかの使用を有する。
【００２０】
本開示はまた、ＦＩＸポリペプチドの半減期を延長する方法であって、配列番号２のアミノ酸１０３、配列番号２のアミノ酸１０５、配列番号２のアミノ酸１４２、配列番号２のアミノ酸１４９、配列番号２のアミノ酸１６２、配列番号２のアミノ酸１６６、配列番号２のアミノ酸１７４、配列番号２のアミノ酸２２４、配列番号２のアミノ酸２２６、配列番号２のアミノ酸２２８、配列番号２のアミノ酸４１３およびそれらのいずれかの組合せからなる群から選択されるアミノ酸に対応する挿入部位でＦＩＸポリペプチド内にＸＴＥＮを挿入し、それにより、ＦＩＸ融合タンパク質を構築することを含み、ＦＩＸタンパク質は、凝血原活性を示す、方法を提供する。
【００２１】
さらに開示される実施形態は、以下の詳細な説明および図面から明らかである。
（参照による組み込み）
【００２２】
本明細書において開示されるすべての刊行物、特許および特許出願は、参照により本明細書に組み込まれるが、それは、個々の刊行物、特許または特許出願があたかも具体的かつ個別的に記載されたのと同様に本明細書に組み込まれるものとする。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】各種の挿入部位（例えば、配列番号２のアミノ酸に対応するアミノ酸５２、アミノ酸５９、アミノ酸６６、アミノ酸８０、アミノ酸８５、アミノ酸８９、アミノ酸１０３、アミノ酸１０５、アミノ酸１１３、アミノ酸１２９、アミノ酸１４２、アミノ酸１４９、アミノ酸１６２、アミノ酸１６６、アミノ酸１７４、アミノ酸１８８、アミノ酸２０２、アミノ酸２２４、アミノ酸２２６、アミノ酸２２８、アミノ酸２３０、アミノ酸２４０、アミノ酸２５７、アミノ酸２６５、アミノ酸２７７、アミノ酸２８３、アミノ酸２９２、アミノ酸３１６、アミノ酸３４１、アミノ酸３５４、アミノ酸３９２、アミノ酸４０３およびアミノ酸４１３）で挿入されるか、またはＦＩＸポリペプチドのＣ末端（Ｃ−ｔｅｒｍ）に融合する４２アミノ酸のＸＴＥＮ（例えば、ＡＥ４２）を含むＦＩＸ融合タンパク質の活性を表しているグラフである。Ｃ末端に融合したＸＴＥＮ配列は、ＦＩＸとＣ末端融合分子との間にトロンビン切断可能部位を含む。Ｙ軸は、発色アッセイによる調整培地におけるベース構築物（ＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌ）の活性に対するパーセントとしてのＦＩＸ活性を示す。Ｘ軸は、（配列番号２に対応する）アミノ酸番号およびアミノ酸一文字表記として、特異的な挿入部位を示す。ＦＩＸの対応するドメイン（例えばＧＬＡ、ＥＧＦ１、ＥＧＦ２、リンカー、ＡＰおよび触媒ドメイン）、リンカー領域およびＣ末端（「Ｃ−ｔｅｒｍ」）をＸ軸の下に示す。
【図２】各種の挿入部位（例えば配列番号２のアミノ酸に対応するアミノ酸１０３、アミノ酸１０５、アミノ酸１４２、アミノ酸１４９、アミノ酸１６２、アミノ酸１６６、アミノ酸１７４、アミノ酸２２４およびアミノ酸４１３）で挿入されるか、またはＦＩＸポリペプチドのＣ末端（Ｃ−ｔｅｒｍ、アミノ酸４１５）に融合する、４２アミノ酸（ＡＥ４２）、７２アミノ酸（ＡＥ７２）、１４４アミノ酸（ＡＥ１４４）、２８８アミノ酸（ＡＥ２８８）および８６４アミノ酸（ＡＥ８６４）のＸＴＥＮを含むＦＩＸ融合タンパク質の活性を表すグラフである。Ｙ軸は、発色アッセイによる調整培地におけるベース構築物（ＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌ）の活性に対するパーセントとしてのＦＩＸ活性を示す。Ｘ軸は、各挿入部位のドメイン（例えばＥＧＦ２、ＡＰおよび触媒ドメイン）または領域（例えばリンカーおよびＣ末端）、ならびにアミノ酸番号として特異的挿入部位（配列番号２に対応する）を示す。矢印は、更なる実験のために選抜された挿入部位を示す（ＦＩＧ３Ａ〜３Ｂを参照）。
【図３】図３Ａは、Ｒ３３８Ｌ  ＦＩＸ変異体の領域およびドメインの概略図である。特異的なアミノ酸残基（例えば、Ｎ１０５、Ｄ１６６およびＥ２２４）およびＣ末端を、潜在的異種部分（例えばＸＴＥＮ）挿入部位として強調する。図３Ｂは、３つの異なる角度からのブタのＦＩＸ（ＰＤＢ：１ＰＦＸ）の三次元構造の具体例を示す。挿入部位Ｎ１０５、Ｄ１６６およびＥ２２４、Ｃ末端およびＲ３３８Ｌ変異（例えばＲ３３８Ｌ  ＦＩＸ変異体における）の位置を標識する。
【図４】１つもしくは２つのＸＴＥＮ（例えば４２、７２、１４４および２８８アミノ酸のＸＴＥＮ）を含むか、または１つのＸＴＥＮおよび１つのＦｃ領域を含む（またはＦＩＸＦｃ）、ＦＩＸ融合タンパク質の相対活性を要約する。Ｙ軸は、発色アッセイによる調整培地におけるベース構築物（ＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌ）の活性に対するパーセントとしてのＦＩＸ活性を示す。Ｘ軸は構築物番号を示し、Ｘ軸の下の表は試験した構築物ごとのＸＴＥＮおよびＦｃの組成を示す。ＥＧＦ２（１０５）、ＡＰ（１６６）、６０ループ（２２４）およびＣ末端のＸＴＥＮまたはＦｃは、ＸＴＥＮまたはＦｃが挿入されるか融合する位置を示す。Ｘ軸の下の表の各ボックスの数（例えば４２、７２、１４４および２８８、ＸＴＥＮのサイズを示す）および「Ｆｃ」は、いずれの部分が、ＦＩＸポリペプチド中に挿入されるかまたはそのＣ末端に融合するかを示す。
【図５】図５Ａは、様々な長さを有するトロンビン切断可能Ｃ末端ＸＴＥＮ融合物を有する様々なＦＩＸ融合タンパク質（例えばＦＩＸ−ＣＴ．２８８（２８８アミノ酸（例えばＡＥ２８８）のＸＴＥＮ）およびＦＩＸ−ＣＴ．８６４（８６４アミノ酸（例えばＡＥ８６４）のＸＴＥＮ））を、血友病Ｂマウスに単回ボーラス静脈内投与後に測定した、血漿における、投与されたＦＩＸの時間に対する凝固活性のパーセンタイルを、ｒＦＩＸおよびｒＦＩＸＦｃとの比較において表したグラフを示す。図５Ｂは、活性化ペプチド（ＡＰ）ドメインに挿入される様々な長さのＸＴＥＮ融合物を有する様々なＦＩＸ融合タンパク質（例えばＦＩＸ−ＡＰ．１４４、ＦＩＸ−ＡＰ．７２およびＦＩＸ−ＡＰ．４２）を、血友病Ｂマウスに単回ボーラス静脈内投与後に測定した、血漿における、投与されたＦＩＸの時間に対する凝固活性のパーセンタイルを、ｒＦＩＸおよびｒＦＩＸＦｃとの比較において表したグラフを示す。図５Ｃは、図５Ａおよび５Ｂに示される単回静脈内ボーラス投与されたＦＩＸ融合タンパク質の算出された薬物動態学的パラメーターのグラフィック編集を示す。示される各分子の血漿中活性回復のパーセンタイルをＹ軸に示す。Ｘ軸は、算出された平均滞留時間（ＭＲＴ、時間）を示し、ドットの領域は、用量当たりの曲線下面積の相対算出値（ＡＵＣ／Ｄ（ｈ／ｋｇ／ｍＬ））を表す。
【図６】図６Ａは、活性化ペプチド（ＡＰ）ドメインまたはＥＧＦ２ドメインに挿入される様々な長さのＸＴＥＮ融合物を有する様々なＦＩＸ融合タンパク質（例えばＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２およびＦＩＸＦｃ−ＡＰ．４２、または例えばＦＩＸＦｃ−ＥＧＦ．４２）を、血友病Ｂマウスに単回ボーラス静脈内投与後に測定した、血漿における、投与されたＦＩＸの時間に対する凝固活性のパーセンタイルを、ｒＦＩＸおよびｒＦＩＸＦｃとの比較において表したグラフを示す。図６Ｂは、図６Ａに示される単回静脈内ボーラス投与されたＦＩＸ融合タンパク質の算出された薬物動態学的パラメーターのグラフィック編集を示す。示される各分子の血漿中活性回復のパーセンタイルをＹ軸に示す。Ｘ軸は、算出された平均滞留時間（ＭＲＴ、時間）を示す。ドットの領域は、用量当たりの曲線下面積の相対算出値（ＡＵＣ／Ｄ（ｈ／ｋｇ／ｍＬ））を表す。
【図７】図７Ａは、ＦＩＸポリペプチドのＣ末端に融合する２８８アミノ酸のトロンビン切断可能ＸＴＥＮ（ｒＦＩＸ−ＣＴ．２８８）、ＦＩＸポリペプチドのＡＰドメイン内に挿入される７２アミノ酸のＸＴＥＮを含むＦＩＸ融合タンパク質（ｒＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２）、およびＦＩＸポリペプチドのＥＧＦ２ドメイン内に挿入される４２アミノ酸のＸＴＥＮを含むＦＩＸ融合タンパク質（ｒＦＩＸＦｃ−ＥＧＦ２．４２）を含むＦＩＸ融合タンパク質を、血友病Ｂマウスへの単回ボーラス皮下投与後に測定した、血漿における、投与されたＦＩＸの時間に対する凝固活性のパーセンタイルを、ｒＦＩＸおよびｒＦＩＸＦｃとの比較において表したグラフを示す。図７Ｂは、図７Ａに示される単回ボーラス皮下投与されたＦＩＸ融合タンパク質の算出された薬物動態学的パラメーターのグラフィック編集を示す。示される各分子のバイオアベイラビリティのパーセンタイルをＹ軸に示す。Ｘ軸は、算出された平均滞留時間（ＭＲＴ、時間）を示す。ドットの領域は、用量当たりの曲線下面積の相対算出値（ＡＵＣ／Ｄ（ｈ／ｋｇ／ｍＬ））を表す。
【図８】図８Ａは、ＦＩＸ（例えばｒＦＩＸＦｃ−ＡＰ−ＸＴＥＮ．７２）のＡＰドメイン内に挿入される７２アミノ酸のＸＴＥＮを含むｒＦＩＸＦｃおよびＦＩＸ融合タンパク質の回転トロンボエラストメリー（ＲＯＴＥＭ）によって測定される、ヒト血友病Ｂの血液における凝固時間（数秒）のグラフを示す。図８Ｂは、ヒト血友病Ｂ血液における、ｒＦＩＸＦｃおよびＦＩＸ融合タンパク質（例えばｒＦＩＸＦｃ−ＡＰ−ＸＴＥＮ．７２）のα角の角度のグラフを示す。図８Ｃは、ヒト血友病Ｂ血液における、ｒＦＩＸＦｃおよびＦＩＸ融合タンパク質（例えばｒＦＩＸＦｃ−ＡＰ−ＸＴＥＮ．７２）の最大凝血塊堅牢性（ＭＣＦ：ｍｍで示す）のグラフを示す。
【図９】尾部クリップ出血モデルにおける、ｒＦＩＸＦｃとの比較によるｒＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２の急性的な効果を示すグラフである。結果は、示される用量および３０分間にわたる投与の５分後における、個体毎およびメジアンの失血量（μｌ）を示す。アスタリスクは、ビヒクル対他の全ての処置における有意なｐ値を示す。データは、ｒＦＩＸＦｃとの比較における、ｒＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２を投与されたマウスの同程度またはより高い有効性を示す。
【図１０】尾静脈切断後の時間（時間）（Ｘ軸）に対する生存するＨｅｍＢマウスのパーセンテージ（Ｙ軸）をプロットしたグラフである。すべてのマウスは、尾静脈切断の７２時間前に、示されるＩＵ／ｋｇで、静注によりＦＩＸＦｃ（点線）を、または皮下投与によりＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２を（ＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２：１００ＩＵ／ｋｇ（黒丸）、５０ＩＵ／ｋｇ（灰色三角形）および１５ＩＵ／ｋｇ（灰色逆三角）；ｒＦＩＸＦｃ：１００ＩＵ／ｋｇ（白丸）、５０ＩＵ／ｋｇ（白三角）および１５ＩＵ／ｋｇ（白逆三角）およびビヒクル（灰色丸））それぞれ事前投与した。ビヒクル処理されたマウスと比較したとき、ｒＦＩＸＦｃまたはＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２を投与されたマウスの生存プロット線は全て顕著に異なる（ｐ＜０．０００１、Ｌｏｇ−ｒａｎｋ（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）試験）。
【図１１】図１１Ａは、静脈内（点線）または皮下注入（実線）により、ｒＦＩＸ（灰色）またはｒＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２融合タンパク質（黒）を単回ボーラス投与（２００ＩＵ／ｋｇ）した血友病Ｂマウスにおける、１段階血漿アッセイにより測定した血漿中ＦＸ活性レベルを時間に対してプロットしたグラフを示す。図１１Ｂは、Ｐｈｏｅｎｉｘ  ＷｉｎＮｏｎＬｉｎ  ６．２．１ソフトウェア（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ社、Ｃｅｒｔａｒａ）を用い、非区画分析法（ＮＣＡ）を用いて測定した薬物動態学的パラメーターを示す。
【図１２】図１２Ａは、ｒＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２単鎖Ｆｃのドメイン構造を示す略図である。図１２Ｂは、ｒＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２二重鎖Ｆｃのドメイン構造を示す略図である。「ＦＩＸ  ＨＣ」はＦＩＸの重鎖を指し、「ＦＩＸ  ＬＣ」はＥＧＦおよびＦＩＸのＧＬＡドメインを含むＦＩＸの軽鎖を指し、ＡＰはＦＩＸの活性化ペプチドを指す。
【図１３】実施例において用いられるＦＩＸ−ＸＴＥＮ構築物を、対応する配列番号、説明およびプラスミドコードと共に要約した表である。
【図１４】図１４Ａおよび１４Ｂは、ＨｅｍＢマウスの単鎖ｒＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２の投与後の血漿中ＦＩＸ活性のグラフを示す。５０ＩＵ／ｋｇ（薄灰色丸）、１００ＩＵ／ｋｇ（灰色丸）、２００ＩＵ／ｋｇ（濃灰色丸）および４００ＩＵ／ｋｇ（黒丸）のｒＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２の投与後の皮下における薬物動態学的曲線を、ＩＵ／ｄＬのＦＩＸ血漿中活性として（図１４Ａ）、注入された用量からの回復のパーセンタイルとして（図１４Ｂ）示す。図１４Ｃは、Ｐｈｏｅｎｉｘ  ＷｉｎＮｏｎＬｉｎソフトウェアを用いて図１４Ａの結果から算出した薬理学的パラメーターを列挙するマッチングテーブルを示す。
【図１５】図１５Ａは、カニクイザルに１００ＩＵ／ｋｇで静脈内（灰色線）または皮下（黒線）注入（平均±ＳＤ、ｎ＝３）により投与したときの、単鎖ｒＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２（ｐＪＨ８４、配列番号１５１）の血漿中活性（実線）および抗原（点線）のグラフ図である。図１５Ｂは、Ｐｈｏｅｎｉｘ  ＷｉｎＮｏｎＬｉｎソフトウェアを用いて図１５Ａの結果から算出した薬理学的パラメーターを列挙するマッチングテーブルを示す。
【図１６】ｒＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２（ｐＪＨ８４、配列番号１５１）の１００ＩＵ／ｋｇ（濃い灰色）または２００ＩＵ／ｋｇ（薄い灰色）の皮下（ＳＱ）投与後のＨｅｍＢマウスにおける、ならびにｒＦＩＸＦｃの５０ＩＵ／ｋｇ（実線）、１００ＩＵ／ｋｇ（大きな点線）または２００ＩＵ／ｋｇ（小さな点線）の静脈内（ＩＶ）投与後のＨｅｍＢマウスにおける、血漿中活性レベル（ＩＵ／ｄＬ）のグラフを示す。データは、投与後１日目から７日目のトラフまでを示す。水平の横線は、３０％のピーク値および５％のトラフレベルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本開示は、ＦＩＸポリペプチドと少なくとも１つの異種部分とを含むＦＩＸ融合タンパク質、ならびにその製造および使用方法を提供する。特定の態様では、ＦＩＸ融合タンパク質はＦＩＸポリペプチド内で挿入されるか、ＦＩＸポリペプチドのＣ末端に融合するか、またはその両方である、少なくとも１つの異種部分を含み、ＦＩＸ融合タンパク質は凝血原活性を示す。特定の態様では、異種部分はＸＴＥＮである。
【００２５】
Ｉ．定義
本開示の全体にわたり、用語「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」が付けられた実体は、その実体が１つまたはそれ以上であることを指し、例えば「ポリヌクレオチド（ａ  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」は、１つまたはそれ以上のポリヌクレオチドを表すと解される。かかる用語「１つの（ａ）」（または「ａｎ」）、「１つまたはそれ以上」および「少なくとも１つの」は、本明細書において交換可能に使用できる。
【００２６】
さらに、本明細書において使用される「および／または」は、２つの特定の特徴または成分のうちのいずれかが、もう一方の有無にかかわらずに開示されるものと解釈する。すなわち、本明細書における「Ａおよび／またはＢ」などのフレーズにおいて用いられる用語「および／または」は、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）および「Ｂ」（単独）を含むものとする。同様に、「Ａ、Ｂおよび／またはＣ」などのフレーズで使用される用語「および／または」は、「Ａ、ＢおよびＣ」、「Ａ、ＢまたはＣ」、「ＡまたはＣ」、「ＡまたはＢ」、「ＢまたはＣ」、「ＡおよびＣ」、「ＡおよびＢ」、「ＢおよびＣ」、「Ａ」（単独）、「Ｂ」（単独）および「Ｃ」（単独）の態様の各々を含むものとする。
【００２７】
本明細書において記載される、「含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）を有するいずれの態様も、それ以外の類似する態様である「からなる」および／または「から基本的になる」という観点から記載される場合も包含されるものと解するものとする。
【００２８】
特に定義されない限り、本明細書において用いられる全ての専門的および科学的用語は一般に、本開示に関連する当業者によって理解されるのと同じ意味を有する。例えば、「Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｊｕｏ，Ｐｅｉ−Ｓｈｏｗ、第２版、２００２、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ）「Ｔｈｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（第３版、１９９９、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）および「Ｏｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  Ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｒｅｖｉｓｅｄ、２０００、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）は、当業者に対し、本開示において使用する多くの用語を有する一般的な辞書である。
【００２９】
単位、接頭辞および記号は、国際単位系（ＳＩ）により認められる形式で記載される。数値範囲は、範囲を画定する数値を含むものとする。特に明記しない限り、アミノ酸配列は、左から右に向かって、アミノ側からカルボキシル側として記載する。本明細書において提供される見出しは、本開示の各種態様を限定するものではなく、明細書全体を参照することによって限定が可能である。したがって、以下に定義される用語は、明細書の全内容を参照することにより完全に定義される。
【００３０】
用語「約」は、本明細書において、ほぼ、概ね、およそ、またはその周辺であることを示す際に使用される。用語「約」は、数値的範囲に関連して使用されるとき、記載される数値の上下限値を延長することによってその範囲を修飾する。一般に、用語「約」は、所定の数値の上下の数値を、例えば１０パーセント上下に変動させることにより修飾することができる。
【００３１】
用語「ポリヌクレオチド」または「ヌクレオチド」には、単一の核酸および複数の核酸、ならびに単離された核酸分子または構築物（例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ））が包含されるものとする。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、通常のホスホジエステル結合または通常にはない結合（例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）に存在するアミド結合）を含む。用語「核酸」は、ポリヌクレオチドに存在する１つまたはそれ以上のあらゆる核酸セグメント（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ断片）を指す。「単離された」核酸またはポリヌクレオチドとは、その天然の環境から隔離された核酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡを指すものとする。例えば、ベクターに含まれるＦＩＸポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、本開示では単離されたものと考える。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例には、異種宿主細胞において維持されるか、または（部分的にまたは実質的に）溶液中にて他のポリヌクレオチドから精製された組換えポリヌクレオチドが含まれる。単離されたＲＮＡ分子には、本開示のポリヌクレオチドのインビボまたはインビトロでのＲＮＡ転写物が含まれる。本開示に係る単離されたポリヌクレオチドまたは核酸には、合成された該分子がさらに含まれる。加えて、ポリヌクレオチドまたは核酸は、調節エレメント（例えばプロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位または転写終結シグナル）を含んでもよい。
【００３２】
本明細書における「コーディング領域」または「コーディング配列」とは、アミノ酸に翻訳可能なコドンからなるポリヌクレオチド部分である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡまたはＴＡＡ）は、典型的にはアミノ酸に翻訳されないにもかかわらず、それはコーディング領域の一部であると考えることができる一方、何らかの隣接配列（例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン等）はコーディング領域の一部ではない。コーディング領域の境界は典型的には、得られるポリペプチドのアミノ末端をコードする５’末端の開始コドン、および得られるポリペプチドのカルボキシル末端をコードする３’末端の翻訳終止コドンによって決定される。例えば、本開示の２つ以上のコーディング領域は、例えば単一のベクターなどの単一のポリヌクレオチド構築物において、または、別々の（異なる）ベクターなどの別々のポリヌクレオチド構築物において、存在し得る。それはすなわち、単一のベクターが、ただ１つのコード領域を含んでも、または２つ以上のコード領域を含んでもよく、例えば、単一のベクターが、後述するように、結合ドメインＡおよび結合ドメインＢを別々にコードしてもよい。加えて、本開示のベクター、ポリヌクレオチドまたは核酸は、本開示の結合ドメインをコードする核酸に融合するかまたは融合しない形で、異種コード領域をコードすることができる。異種コード領域としては、限定されないが、機能特化されたエレメントまたはモチーフ（例えば分泌シグナルペプチドまたは異種の機能性ドメイン）が挙げられる。
【００３３】
哺乳動物細胞によって分泌されるある種のタンパク質は、分泌シグナルペプチドと会合しており、該ペプチドは、粗面小胞体を通じて合成されたタンパク質鎖の輸送が開始されると、成熟タンパク質から分離される。当業者であれば、シグナルペプチドは一般にポリペプチドのＮ末端に融合し、完全型または「全長」ポリペプチドから分離されることにより、ポリペプチドの分泌型または「成熟」型を生成させることを認識する。特定の実施形態では、天然シグナルペプチドまたはその配列の機能的誘導体は、それと作動可能な状態で会合するポリペプチドの分泌を促進する能力を保持する。あるいは、異種哺乳類のシグナルペプチド（例えばヒトまたはマウスの組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ））、またはβ−グルクロニダーゼシグナルペプチド、またはそれらの機能的誘導体を用いることができる。
【００３４】
用語「下流」とは、参照ヌクレオチド配列に対して３’側に位置するヌクレオチド配列を指す。特定の実施形態では、下流のヌクレオチド配列は、転写開始点に従う配列を指す。例えば、遺伝子の翻訳開始コドンは、転写開始部位の下流に位置する。「下流」とは、参照ペプチド配列に対してＣ末端側に位置するペプチド配列を指すこともある。
【００３５】
用語「上流」とは、参照ヌクレオチド配列に対して５’側に位置するヌクレオチド配列を指す。特定の実施形態では、上流のヌクレオチド配列は、コード領域の５’側または転写開始点の配列を指す。例えば、ほとんどのプロモーターは、転写開始部位の上流に位置する。「上流」とは、参照ペプチド配列に対してＮ末端側に位置するペプチド配列を指すこともある。
【００３６】
本明細書における用語「制御領域」は、コード領域の上流（５’非コード配列）、内部または下流（３’非コード配列）に位置するヌクレオチド配列であって、関連するコード領域の転写、ＲＮＡプロセシング、安定性または翻訳に影響するものを指す。制御領域としては、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位およびステム−ループ構造が挙げられる。コード領域が真核細胞における発現を目的とする場合、ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列は通常、コーディング配列に対して３’側に位置する。
【００３７】
遺伝子産物（例えばポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドは、作動可能に１つまたはそれ以上のコード領域と連結するプロモーターまたは他の転写もしくは翻訳調節エレメントを含んでもよい。作動可能な連結において、遺伝子産物（例えばポリペプチド）のコード領域は、制御領域の影響または制御下に遺伝子産物の発現が置かれる態様で、１つまたはそれ以上の制御領域と連結される。例えば、コード領域およびプロモーターが「作動可能に連結される」とは、プロモーター機能の誘導により、コード領域によってコードされる遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写がもたらされる場合、ならびに、プロモーターとコード領域との結合の性質が、遺伝子産物の発現を促進するプロモーターの能力を妨げないか、または、転写されるＤＮＡテンプレートの能力を妨げない場合のことを指す。プロモーター以外の他の転写調節エレメント（例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサーおよび転写終結シグナル）が、コード領域と作動可能に連結して遺伝子産物発現を制御することもあり得る。
【００３８】
様々な転写制御領域が当業者に公知である。それらとしては、限定されないがサイトメガロウイルス（初期プロモーター、イントロンＡと関連）、シミアンウイルス４０（初期プロモーター）およびレトロウイルス（例えばラウス肉腫ウイルス）由来のプロモーターおよびエンハンサーセグメントなど、脊椎動物細胞において機能する転写制御領域等が挙げられるが、これらに限定されない。他の転写制御領域としては、例えばアクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモンおよびウサギβ−グロビンなどの、脊椎動物の遺伝子に由来するそれら、ならびに真核細胞の遺伝子発現を制御できる他の配列が挙げられる。更なる適切な転写制御領域としては、組織特異的プロモーターおよびエンハンサー、ならびにリンフォカイン−誘導性プロモーター（例えばインターフェロンまたはインターロイキン誘導性プロモーター）が挙げられる。
【００３９】
同様に、様々な翻訳制御エレメントが当業者に公知である。それらとしては、限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始および終結コドン、およびピコルナウイルス由来のエレメント（特に内部リボソームエントリー部位またはＩＲＥＳ、またＣＩＴＥ配列とも呼ばれる）が挙げられる。
【００４０】
本明細書で用いられる用語「発現」とは、ポリヌクレオチドが遺伝子産物（例えばＲＮＡまたはポリペプチド）を産生するプロセスのことを指す。かかるプロセスとしては、限定されないが、ポリヌクレオチドのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、運搬ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、小型ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、小型干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または他のあらゆるＲＮＡ産物への転写、ならびに、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳が挙げられる。発現により「遺伝子産物」が産生される。本発明において、遺伝子産物は、核酸（例えば遺伝子の転写によって産生されるｍＲＮＡ）、または転写物から翻訳されるポリペプチドであってもよい。本明細書において記載される遺伝子産物には、転写後修飾（例えばポリアデニル化またはスプライシング）を有する核酸、または翻訳後修飾（例えばメチル化、グリコシレーション、脂質付加、他のサブユニットタンパク質との会合）を有するポリペプチド、またはタンパク質切断がさらに包含される。
【００４１】
「ベクター」とは、宿主細胞への核酸のクローニングおよび／または輸送を行うためのあらゆるビヒクルを意味する。ベクターは、他の核酸セグメントが連結して、連結された該セグメントの複製をもたらすことができるレプリコンでもよい。「レプリコン」とは、インビボにおけるＤＮＡ複製の自律的単位として機能する、すなわちそれ自身の制御下で複製し得る任意の遺伝的要素（例えばプラスミド、染色体、ウイルス）を指す。用語「ベクター」には、インビトロ、エクスビボまたはインビボで、核酸を細胞に導入するためのウイルス性および非ウイルス性のビヒクルが包含される。例えば、プラスミド、修飾された真核生物ウイルス、または修飾させた細菌ウイルスなど、多数のベクターが従来技術において公知であり、使用されている。ポリヌクレオチドの適切なベクターへの挿入は、相補的結合性を有する末端を有する適切なベクターに適切なポリヌクレオチド断片をライゲートすることにより実施できる。
【００４２】
ベクターは、ベクターが導入された細胞を選抜または識別するためのレポーターまたは選抜マーカーをコードするよう設計してもよい。選択マーカーまたはレポーターの発現により、ベクター上の他のコード領域の導入および発現を示す宿主細胞の識別および／または選抜が可能となる。従来技術において公知であり、使用される選抜可能なマーカー遺伝子の例としては、アンピシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ネオマイシン、ピューロマイシン、ビアラホス除草剤、スルホンアミド等に対する抵抗性を付与する遺伝子、ならびにアントシアニン調節遺伝子、イソペンタニルトランスフェラーゼ遺伝子等の表現型マーカーとして使用される遺伝子が挙げられる。従来技術において公知であり、使用されるレポーターの例としては、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、β−グルクロニダーゼ（Ｇｕｓ）等が挙げられる。選抜マーカーは、レポーターであるとも考えられる。
【００４３】
用語「プラスミド」は、細胞の中心的な代謝の一部を構成しない遺伝子を担持し、通常環状の二本鎖ＤＮＡ分子の形態である細胞質因子のことを指す。かかる因子は、自己複製配列、ゲノム統合配列、ファージ由来配列、または直鎖状、環状もしくは超コイル状の、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡのヌクレオチド配列であって、あらゆる起源に由来してもよく、それらは多くのヌクレオチド配列が連結または再結合してユニークな構成を有し、細胞に適切な３’非翻訳配列とともに、プロモーター断片および選択された遺伝子産物のためのＤＮＡの塩基配列を導入できるものである。
【００４４】
使用できる真核生物ウイルスベクターとしては、限定されないが、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターおよびポックスウイルス（例えばワクシニアウイルスベクター、バキュロウイルスベクターまたはヘルペスウイルスベクター）が挙げられる。非ウイルス性のベクターとしては、プラスミド、リポソーム、荷電脂質（サイトフェクチン）、ＤＮＡ−タンパク質複合体およびバイオポリマーが挙げられる。
【００４５】
「クローニングベクター」とは、連続的に複製する、所定の長さを有する核酸ユニットである「レプリコン」を指し、例えばプラスミド、ファージまたはコスミドなどが挙げられ、それらは複製開始点を有し、他の核酸セグメントが連結して連結された該セグメントを複製するものである。特定のクローニングベクターは、一方では例えば細菌などのタイプの細胞において複製し、他方では例えば真核細胞などにおいて発現を行うことができる。クローニングベクターは典型的には、ベクターを含む細胞の選抜のために使用できる１つまたはそれ以上の配列、および／または目的の核酸配列の挿入のための１つまたはそれ以上のマルチクローニングサイトを含む。
【００４６】
用語「発現ベクター」は、挿入された核酸配列の宿主細胞への導入後、その発現を可能にするよう設計されたビヒクルを指す。挿入された核酸配列は、上記の調節領域との間で作動可能な位置関係に置かれる。
【００４７】
ベクターは、例えばトランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、トランスダクション、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション（リソソーム融合）、遺伝子銃またはＤＮＡベクタートランスポーターの使用など、公知技術の方法によって宿主細胞に導入される。
【００４８】
本明細書で用いられる「培養」、「培養すること」および「培養工程」とは、インビトロの条件で細胞の増殖または分裂を可能にし、または生きた細胞の状態を維持するよう細胞をインキュベートすることを意味する。本明細書で用いられる「培養細胞」とは、インビトロで増殖させた細胞を意味する。
【００４９】
本明細書において、用語「ポリペプチド」には、単一の「ポリペプチド」ならびに複数の「ポリペプチド」が包含されるものとし、アミド結合（別名ペプチド結合）によって直鎖状に連結されたモノマー（アミノ酸）から構成される分子を指す。用語「ポリペプチド」は、２つ以上のアミノ酸によるあらゆる１つまたはそれ以上の鎖を指し、生成物の具体的な長さには関係しない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」または２つ以上のアミノ酸の鎖を指すために用いる他のいずれの用語も、「ポリペプチド」の定義に包含され、用語「ポリペプチド」は、これらの用語のいずれかの代わりに、またはそれらの交換可能に用いることができる。用語「ポリペプチド」は、ポリペプチド発現後の修飾を有する生成物を指すこともあり、かかる修飾としては、限定されないが、グリコシレーション、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護／ブロック基による誘導体化、タンパク質切断または非天然アミノ酸による修飾が挙げられる。ポリペプチドは、天然の生物給源から誘導するか、または組換技術により製造してもよいが、必ずしも指定された核酸配列から翻訳される必要はない。それはあらゆる方法（化学合成を含む）で産生させてもよい。
【００５０】
「単離された」ポリペプチド、またはその断片、変異体もしくは誘導体とは、その天然の環境に存在しない状態であるポリペプチドを指す。具体的な精製の程度は関係がない。例えば、単離されたポリペプチドは、単にその固有または天然の環境から取り出されたものであってもよい。宿主細胞において発現される組換産生されたポリペプチドおよびタンパク質は、本開示の目的において、分離されたか、分画されたか、またはいずれかの適切な方法により部分的もしくは実質的に精製された天然または組換え型ポリペプチドと同様に、単離されたものとする。
【００５１】
本明細書において、用語「宿主細胞」とは、組換え核酸を担持しているかまたは担持できる細胞または細胞集団を指す。宿主細胞は原核細胞（例えば大腸菌）であってもよく、あるいは宿主細胞は、例えば真核細胞（例えば酵母細胞（例えばサッカロマイセス・セレビジエ、ピキア・パストリスまたはサッパロマイセス・ポンベ）、および各種の動物細胞（例えば昆虫細胞（例えばＳｆ−９）または哺乳動物細胞（例えばＨＥＫ２９３Ｆ、ＣＨＯ、ＣＯＳ−７、ＮＩＨ−３Ｔ３）であってもよい。
【００５２】
本開示にはまた、ポリペプチドの断片または変異体、ならびにそれらのあらゆる組合せも包含される。「断片」または「変異体」という用語は、本開示のポリペプチド結合ドメインまたは結合分子を指すときは、参照ポリペプチドの特性（例えばＦｃＲｎ結合ドメインまたはＦｃ変異体のＦｃＲｎとの結合親和性、またはＦＩＸ変異体の凝固活性）の少なくともいくつかを保持するあらゆるポリペプチドも包含する。ポリペプチドの断片には、本明細書に記載される特異的な抗体断片に加えて、タンパク質の切断による断片、および欠失型断片が包含されるが、天然に存在する全長ポリペプチド（または成熟ポリペプチド）は含まれない。本開示に係るポリペプチド結合ドメインまたは結合分子の変異体には、上記の断片、さらにはアミノ酸の置換、欠失または挿入による改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドが包含される。変異体は、天然に、または非天然に発生し得る。非天然に生じる変異体は、公知の変異導入技術を使用して作製することができる。変異体ポリペプチドは、保存的または非保存的なアミノ酸の置換、欠失または挿入を含み得る。本明細書において開示される具体的な１つのＦＩＸ変異体は、Ｒ３３８Ｌ  ＦＩＸ（Ｐａｄｕａ）変異体（配列番号２）である。全開示内容が、参照により本明細書に組み込まれる、例えばＳｉｍｉｏｎｉ，Ｐ．ら、「Ｘ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｔｈｒｏｍｂｏｐｈｉｌｉａ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｍｕｔａｎｔ  Ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ（Ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ  Ｐａｄｕａ）」（ＮＥＪＭ  ３６１：１６７１〜７５（２００９年１０月））を参照されたい。
【００５３】
「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基と置換されることである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、従来技術において定義されており、塩基性側鎖（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、無極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分岐側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が包含される。したがって、ポリペプチドのアミノ酸が同じ側鎖ファミリーに属する他のアミノ酸と置換される場合、該置換は保守的であると考えられる。別の実施形態では、アミノ酸鎖が、側鎖ファミリーのメンバーの順序および／または組成において異なるが構造的に類似する鎖と、保守的に置換されることもある。
【００５４】
２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列間の「配列同一性（％）」という用語は、比較ウインドウの２つの配列のアラインメントにおいて共有される、最適アラインメントを得るために必要な挿入または欠失（すなわちギャップ）を考慮した、同一のマッチ部位の数を意味する。マッチ部位は、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸が標的および参照配列において示されるあらゆる部位であってもよい。標的配列に示されるギャップは、ギャップはヌクレオチドまたはアミノ酸でないため、カウントされない。同様に、参照配列に示されるギャップは、標的配列ヌクレオチドまたはアミノ酸がカウントされ、参照配列からのヌクレオチドまたはアミノ酸がカウントされないため、これもカウントされない。
【００５５】
配列同一性のパーセンテージは、両配列に存在する同一のアミノ酸残基または核酸塩基の部位数を決定してマッチ部位の数を得ることと、比較ウインドウ中の全部位数で、マッチ部位の数を除算することと、得られた数に１００を乗算して配列同一性のパーセンテージを得ることと、により算出される。２つの配列間の比較および配列同一性（％）の決定は、オンライン使用用の、およびダウンロードにより入手可能なソフトウェアを使用して実施できる。適切なソフトウェアプログラムは、タンパク質およびヌクレオチド配列のアラインメント用のいずれの場合も、様々な供給元から入手可能である。配列同一性（％）を決定する１つの適切なプログラムは、ｂｌ２ｓｅｑであり、米国政府のＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＢＬＡＳＴウェブサイト（ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から入手可能なプログラムのＢＬＡＳＴサイトの一部である。Ｂｌ２ｓｅｑは、ＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを使用する２つの配列間の比較を行う。ＢＬＡＳＴＮは核酸配列を比較するために用い、一方、ＢＬＡＳＴＰはアミノ酸配列を比較するために用いる。他の適切なプログラムは、例えばＮｅｅｄｌｅ、Ｓｔｒｅｔｃｈｅｒ、ＷａｔｅｒまたはＭａｔｃｈｅｒであり、バイオインフォマティクスプログラムのＥＭＢＯＳＳサイトの一部であり、またのＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＢＩ、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ）から入手可能である。
【００５６】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチド参照配列とアラインメントされた単一のポリヌクレオチドまたはポリペプチド標的配列中のそれぞれの領域は、自分自身のパーセント配列同一性を各々有することができる。配列同一性（％）値は、最も近い値に四捨五入されることに留意されたい。例えば、８０．１１、８０．１２、８０．１３および８０．１４は、８０．１に切り捨てられる一方、８０．１５、８０．１６、８０．１７、８０．１８および８０．１９は、８０．２に切り上げられる。また、長さの値が常に整数である点に留意されたい。
【００５７】
当業者は、配列同一性（％）算出のための配列アラインメントの作成が、一次配列データによって行われる２つの配列−配列間比較のみに限定されないことを理解するであろう。配列アラインメントは、複数の配列アラインメントに由来してもよい。複数の配列アラインメントを作成する１つの適切なプログラムは、ＣｌｕｓｔａｌＷ２（ｗｗｗ．ｃｌｕｓｔａｌ．ｏｒｇから入手可能）である。他の適切なプログラムは、ＭＵＳＣＬＥ（ｗｗｗ．ｄｒｉｖｅ５．ｃｏｍ／ｍｕｓｃｌｅ／から入手可能）である。あるいは、ＣｌｕｓｔａｌＷ２およびＭＵＳＣＬＥは、例えばＥＢＩから入手可能である。
【００５８】
例えば構造データ（例えば結晶学的タンパク質構造）、機能データ（例えば変異の位置）または系統発生データなどの異なる情報源からの配列データを統合することによって、配列アラインメントを作成してもよいことが理解される。異種のデータを統合して複数の配列アラインメントを作成する適切なプログラムは、Ｔ−Ｃｏｆｆｅｅであり、ｗｗｗ．ｔｃｏｆｆｅｅ．ｏｒｇから入出してもよく、あるいは、例えばＥＢＩから入手してもよい。配列同一性（％）算出に用いる最終的なアラインメントは、自動的に、または手動により調整してもよいことが理解される。
【００５９】
本明細書において、因子ＩＸのタンパク質配列「に対応するアミノ酸」、「に対応する部位」または「と同等なアミノ酸」は、第１ＦＩＸ配列と第２ＦＩＸ配列の同一性または類似性を最大にするアラインメントにより同定される。第２ＦＩＸ配列と同等なアミノ酸を同定するために用いる数は、第１ＦＩＸ配列の対応するアミノ酸を同定するために用いる数に基づく。
【００６０】
本明細書において、用語「挿入部位」とは、ＦＩＸポリペプチド（典型的には成熟型ＦＩＸポリペプチド）またはその断片、変異体または誘導体中の、異種部分を挿入できる部位の直ぐ上流のアミノ酸残基番号を指す。「挿入部位」は数字として特定され、その数字は、Ｒ３３８Ｌ  ＦＩＸ（Ｐａｄｕａ）変異体（配列番号２）中の挿入部位に対応し、該挿入部位の直ぐＮ末端側のアミノ酸の番号である。例えば、「配列番号２のアミノ酸１０５に対応する挿入部位で、ＥＧＦ２ドメインがＸＴＥＮを含む」というフレーズは、異種部分が、配列番号２のアミノ酸１０５およびアミノ酸１０６に対応する２つのアミノ酸の間に位置することを示す。しかしながら、当業者であれば、ＦＩＸ変異体中の対応する部位を容易に同定することができ、また本開示は、Ｒ３３８Ｌ  ＦＩＸ（Ｐａｄｕａ）変異体への挿入のみに限定されるものではない。むしろ、本明細書において開示される挿入は、凝血原活性を有するあらゆるＦＩＸ変異体または断片中の、Ｒ３３８Ｌ  ＦＩＸ変異体の部位に対応するあらゆる部位においても行うことができる。
【００６１】
本明細書中で使用する「アミノ酸の直ぐ下流」というフレーズは、アミノ酸の末端カルボキシル基の直ぐ隣の部位を指す。同様に、「アミノ酸の直ぐ上流」というフレーズは、アミノ酸の末端アミン基の直ぐ隣の部位を指す。したがって、本明細書において使用される「挿入部位の２つのアミノ酸の間」というフレーズは、ＸＴＥＮまたは他のいずれかのポリペプチドが２つの隣接するアミノ酸の間に挿入される部位を指す。
【００６２】
本明細書で用いられる用語「挿入された」、「挿入される」、「〜に挿入される」、または文法的に同等の用語は、Ｒ３３８Ｌ  ＦＩＸ（Ｐａｄｕａ）変異体（配列番号２）の類似する部位に対応する、融合ポリペプチド中のＸＴＥＮの部位を指す。当業者であれば、例えば配列番号１として示される他のＦＩＸポリペプチド配列に対応する挿入部位を同定するための方法を理解するであろう。本明細書において、当該用語は、Ｒ３３８Ｌ  ＦＩＸ（Ｐａｄｕａ）変異体に対応する組換え型ＦＩＸポリペプチドの特徴のことを指すのであって、融合ポリペプチドを製造する何らかの方法またはプロセスを示すか、意味するか、または示唆するものではない。例えば、本明細書において提供される融合ポリペプチドに関して、「ＸＴＥＮが、ＦＩＸポリペプチドの残基１０５の直ぐ下流の、ＥＧＦ２ドメイン中に挿入される」というフレーズは、融合ポリペプチドが、Ｒ３３８Ｌ  ＦＩＸ変異体（配列番号２）のアミノ酸１０５に対応するアミノ酸の直ぐ下流にＸＴＥＮを含み、例えば、Ｒ３３８Ｌ  ＦＩＸ変異体のアミノ酸１０５および１０６に対応するアミノ酸と結合することを意味する。
【００６３】
「融合」または「キメラ」タンパク質は、天然において連結されない第２のアミノ酸配列に連結された第１のアミノ酸配列を含む。通常別々のタンパク質として存在するアミノ酸配列を、融合ポリペプチドとしてまとめてもよく、または、通常同じタンパク質中に存在するアミノ酸配列を、新規な配置にて融合ポリペプチド（例えば、本開示のＦＩＸドメインとＩｇ  Ｆｃドメインとの融合）としてもよい。融合タンパク質は、例えば化学合成によって、または、ペプチド領域が好ましい関係においてコードされるポリヌクレオチドを作製し、翻訳することによって製造される。融合タンパク質は、第１のアミノ酸配列と共有結合、非ペプチド結合または非共有結合によって会合する第２のアミノ酸配列をさらに含んでもよい。
【００６４】
用語「異種」および「異種部分」は、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは他の部分が、それと比較されるそれらとは異なるものに由来することを意味する。例えば、異種ポリペプチドは、合成物であってもよく、または異なる種、個体内の異なるタイプの細胞、または異なる個体の同じもしくは異なるタイプの細胞に由来するものであってもよい。一態様では、異種部分は、他のポリペプチドに融合して、融合ポリペプチドまたはタンパク質を生じさせるポリペプチドである。別の態様では、異種部分は、例えばポリペプチドまたはタンパク質にコンジュゲートするＰＥＧなどの非ポリペプチドである。
【００６５】
本明細書において、用語「半減期」とは、インビボでの特定のポリペプチドの生物学的半減期を指す。半減期は、対象に投与された量の半分が、動物の血流および／または他の組織から排除されるために必要となる時間により表される。所定のポリペプチドのクリアランス曲線が時間の関数として作成されるとき、該曲線は通常、迅速なα相および長いβ相の二相型となる。α相は典型的には、血管内および血管外空間の間に投与されたポリペプチドの平衡を表し、ポリペプチドのサイズにより部分的に決定される。β相は典型的には、血管内空間におけるポリペプチドの異化作用を表す。いくつかの実施形態では、ＦＩＸ、およびＦＩＸを含む融合タンパク質は一相型であり、したがって、α相を有さず、β相のみを有する。したがって、特定の実施形態では、本明細書で用いられる用語「半減期」は、β相のポリペプチドの半減期を指す。ヒトにおけるヒト抗体の典型的なβ相半減期は２１日である。
【００６６】
本明細書において用いられる用語「連結される」および「融合する」とは、それぞれ、第１のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列が、第２アミノ酸配列またはヌクレオチド配列と、共有結合により、または非共有結合的に結合することを指す。第１のアミノ酸またはヌクレオチド配列は、第２のアミノ酸またはヌクレオチド配列に直接結合するかまたは並置されてもよく、あるいは、介在配列が第１の配列および第２の配列と共有結合してもよい。用語「連結される」とは、Ｃ末端またはＮ末端において第２のアミノ酸配列が第１のアミノ酸配列と融合することを意味するのみならず、第１のアミノ酸配列（または第２アミノ酸配列）の全部が、それぞれ第２のアミノ酸配列（または第１のアミノ酸配列）中のいずれかの２つのアミノ酸の間へ挿入されることをも意味する。一実施形態では、第１のアミノ酸配列は、ペプチド結合またはリンカーによって第２のアミノ酸配列に連結される。第１のヌクレオチド配列は、ホスホジエステル結合またはリンカーによって第２のヌクレオチド配列に連結されてもよい。リンカーは、ペプチドもしくは（ポリペプチド鎖の場合）ポリペプチド、またはヌクレオチドもしくは（ヌクレオチド鎖の場合）ヌクレオチド鎖、または（ポリペプチドおよびポリヌクレオチド鎖の場合）あらゆる化学部分であってもよい。用語「連結される」はまた、ハイフン（−）によって示されることもある。
【００６７】
本明細書において使用する用語「会合する」とは、第１のアミノ酸鎖と第２のアミノ酸鎖の間で形成される共有結合または非共有結合を指す。一実施形態では、該用語「会合する」とは、共有結合、非ペプチド結合または非共有結合を意味する。この会合は、コロン（：）によって示すこともある。別の実施形態では、それはペプチド結合を除く共有結合を意味する。例えば、アミノ酸のシステインはチオール基を含み、該チオール基により、第２のシステイン残基に対してジスルフィド結合または架橋を形成することができる。ほとんどの天然に存在するＩｇＧ分子において、ＣＨ１およびＣＬ領域は、ジスルフィド結合により会合し、また２つの重鎖は、Ｋａｂａｔ付番では２３９および２４２に対応する部位（ＥＵ付番では２２６または２２９部位）における２つのジスルフィド結合により会合する。共有結合の例としては、ペプチド結合、金属結合、水素結合、ジスルフィド結合、σ結合、π結合、δ結合、グリコシド結合、アゴスティック結合、曲がった結合、双極性結合、πバックボンド、二重結合、三重結合、四重結合、五重結合、六重結合、コンジュゲーション、ハイパーコンジュゲーション、芳香族性、多座性または反結合が挙げられるが、これらに限定されない。非共有結合の非限定的な例としては、イオン結合（例えばカチオン−π結合または塩結合）、金属結合、水素結合（例えば二水素結合、二水素錯体、低バリア水素結合または対称性水素結合）、ファン・デル・ワールス力、ロンドン分散力、機械的結合、ハロゲン結合、金親和性（ａｕｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ）、インターカレーション、重層、エントロピー力または化学極性が挙げられる。
【００６８】
本明細書中で使用する「切断部位」または「酵素的切断部位」という用語は、酵素によって認識される部位を意味する。特定の酵素的切断部位は、細胞内プロセシング部位を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、凝血カスケードの間に活性化される酵素によって切断される酵素的切断部位を有し、かかる部位の切断は、血餅形成部位で生じる。かかる部位の例としては、例えばトロンビン、因子ＸＩａまたは因子Ｘａによって認識されるそれらが挙げられる。ＦＸＩａ切断部位の例としては、例えばＴＱＳＦＮＤＦＴＲ（配列番号１６６）およびＳＶＳＱＴＳＫＬＴＲ（配列番号１６７）が挙げられる。トロンビン切断部位の例としては、例えばＤＦＬＡＥＧＧＧＶＲ（配列番号１６８）、ＴＴＫＩＫＰＲ（配列番号１６９）、ＬＶＰＲＧ（配列番号１７０）およびＡＬＲＰＲ（配列番号１７１）が挙げられる。他の酵素的切断部位は、従来技術において公知である。
【００６９】
本明細書における「プロセシング部位」または「細胞内プロセシング部位」という用語は、ポリペプチドの翻訳後に機能する酵素の標的となるポリペプチドの酵素的切断部位の一種を意味する。一実施形態では、かかる酵素は、ゴルジ体ルーメンからトランスゴルジ区画までの輸送の間に機能する。細胞内プロセシング酵素は、細胞からのタンパク質の分泌前にポリペプチドを切断する。かかるプロセシング部位の例としては、例えば、ＰＡＣＥ／フーリン（ｆｕｒｉｎ）（ＰＡＣＥはＰａｉｒｅｄ  ｂａｓｉｃ  Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  Ｃｌｅａｖｉｎｇ  Ｅｎｚｙｍｅの頭文字）ファミリーのエンドペプチダーゼが標的とするそれらが挙げられる。これらの酵素は、ゴルジ膜に局在化し、配列モチーフＡｒｇ−［任意の残基］−（ＬｙｓまたはＡｒｇ）−Ａｒｇのカルボキシ末端側のタンパク質を切断する。本明細書において、「フーリン」ファミリーの酵素としては、例えばＰＣＳＫ１（別名ＰＣ１／Ｐｃ３）、ＰＣＳＫ２（別名ＰＣ２）、ＰＣＳＫ３（別名フーリンまたはＰＡＣＥ）、ＰＣＳＫ４（別名ＰＣ４）、ＰＣＳＫ５（別名ＰＣ５またはＰＣ６）、ＰＣＳＫ６（別名ＰＡＣＥ４）またはＰＣＳＫ７（別名ＰＣ７／ＬＰＣ、ＰＣ８またはＳＰＣ７）が挙げられる。他のプロセシング部位は、従来技術において公知である。本明細書において参照される用語「プロセシング可能なリンカー」とは、細胞内プロセシング部位を含むリンカーを意味する。
【００７０】
複数のプロセシングまたは切断部位を含む構築物において、かかる部位が同一でもよく、または異なってもよいことが理解されよう。
【００７１】
本明細書で用いられる「プロセシング可能なリンカー」とは、少なくとも１つの細胞内プロセシング部位を含むリンカーを指し、それは本明細書の他の箇所に記載されている。
【００７２】
本明細書で用いられる「ベースライン」とは、投与前の対象における最も低い血漿中ＦＩＸの測定濃度である。血漿中ＦＩＸ濃度は、投与前の２つの時点、すなわちスクリーニング通院時および投与の直前前に測定することができる。あるいは、（ａ）前処置ＦＩＸ活性が＜１％であり、検出可能なＦＩＸ抗原を有さず、ナンセンス遺伝子型を有する対象のベースラインを０％として定義し、（ｂ）前処置ＦＩＸ活性が＜１％であり、検出可能なＦＩＸ抗原を有する対象のベースラインを０．５％として定義し、（ｃ）前処置ＦＩＸ活性が１〜２％である対象のベースラインをＣｍｉｎ（ＰＫ試験全体にわたり最も低い活性）とし、（ｄ）前処置ＦＩＸ活性が≧２％である対象のベースラインを２％として定義してもよい。
【００７３】
本明細書で用いられる「対象」は、ヒトを意味する。本明細書で用いられる対象には、抑制できない出血エピソードを少なくとも一回発症したが知られているか、抑制できない出血エピソードと関連する疾患もしくは障害（例えば出血性の疾患もしくは障害、例えば血友病Ｂ）と診断されたか、抑制できない出血エピソード（例えば血友病）に罹患し易いか、またはそれらのいずれかの組合せを有する個体が包含される。対象はまた、特定の活動（例えば手術、スポーツ活動または何らかの激しい活動）前に１つまたはそれ以上の制御できない出血エピソードの危険を有する個体も含んでいてもよい。対象は、１％、０．５％未満、２％未満、２．５％未満、３％未満または４％未満のベースラインＦＩＸ活性を有し得る。対象にはまた、小児のヒトが包含される。小児のヒト対象は、出生〜２０歳、好ましくは出生〜１８歳、出生〜１６歳、出生〜１５歳、出生〜１２歳、出生〜１１歳、出生〜６歳、出生〜５歳、出生〜２歳、および２〜１１歳である。
【００７４】
本明細書において使用される処置する、処置、処置することとは、例えば疾患または症状の重症度を低減し、疾病経過の持続期間を減少させ、疾患または症状と関連する１つまたはそれ以上の兆候を改善させ、疾患または症状を有する対象に対して、疾患または症状を必ずしも治療せずに有益な効果を提供し、または疾患もしくは症状と関連する１つまたはそれ以上の兆候を予防することを指す。一実施形態では、「処置」という用語は、本開示の融合タンパク質を投与することによって、対象物のＦＩＸトラフレベルを少なくとも１ＩＵ／ｄＬ、２ＩＵ／ｄＬ、３ＩＵ／ｄＬ、４ＩＵ／ｄＬ、５ＩＵ／ｄＬ、６ＩＵ／ｄＬ、７ＩＵ／ｄＬ、８ＩＵ／ｄＬ、９ＩＵ／ｄＬ、１０ＩＵ／ｄＬ、１１ＩＵ／ｄＬ、１２ＩＵ／ｄＬ、１３ＩＵ／ｄＬ、１４ＩＵ／ｄＬ、１５ＩＵ／ｄＬ、１６ＩＵ／ｄＬ、１７ＩＵ／ｄＬ、１８ＩＵ／ｄＬ、１９ＩＵ／ｄＬまたは２０ＩＵ／ｄＬに維持することを意味する。別の実施形態では、処置とは、約１〜約２０ＩＵ／ｄＬ、２〜約２０ＩＵ／ｄＬ、約３〜約２０ＩＵ／ｄＬ、約４〜約２０ＩＵ／ｄＬ、約５〜約２０ＩＵ／ｄＬ、約６〜約２０ＩＵ／ｄＬ、約７〜約２０ＩＵ／ｄＬ、約８〜約２０ＩＵ／ｄＬ、約９〜約２０ＩＵ／ｄＬまたは約１０〜約２０ＩＵ／ｄＬにＦＩＸトラフレベルを維持することを意味する。疾患または症状の処置にはまた、対象のＦＩＸ活性を、少なくとも非血友病対象のＦＩＸ活性の１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％または２０％についてレベルと同等に維持することが包含される。処置のために必要とされる最低限のトラフレベルは、１つまたはそれ以上の公知の方法により決定してもよく、また対象毎に調整（増加または減少）してもよい。
【００７５】
本明細書で用いられる止血性障害とは、フィブリンクロットを形成する能力に障害を有するか、またはかかる能力がないために、自発的に、または外傷の結果として出血する傾向を有することを特徴とする、遺伝的または後天性の症状を意味する。かかる障害の例としては、血友病が挙げられる。３つの主な形態として、血友病Ａ（因子ＶＩＩＩ欠損）、血友病Ｂ（因子ＸＩ欠損または「クリスマス病」）および血友病Ｃ（因子ＸＩ欠損、軽度の出血傾向）が存在する。他の止血性障害としては、例えばＶｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ病、因子ＸＩ欠損（ＰＴＡ欠乏症）、因子ＸＩＩ欠損、フィブリノゲン、プロトロンビン、因子Ｖ、因子ＶＩＩ、因子Ｘまたは因子ＸＩＩＩの欠損または構造異常、ＧＰＩｂの欠損または欠陥であるベルナール−スーリエ症候群が挙げられる。ＧＰＩｂ（ＶＷＦの受容体）は、不完全となり易く、一次血餅形成（一次性止血）の不足および高い出血傾向、またグランツマンおよびネーゲリ血小板無力症（グランツマン血小板無力症）をもたらすことがある。肝不全（急性および慢性形態）において、肝臓での凝固因子の不十分な産生が見られ、これは出血の危険性を増加させ得る。
【００７６】
本明細書中で使用する「急性出血」という用語は、出血エピソードを指し、その基となる理由は問わない。例えば、対象は、外傷、尿毒症、遺伝出血障害（例えば因子ＶＩＩ欠損）、血小板障害、または抗凝固因子抗体の産生による抵抗性を有し得る。
【００７７】
ＩＩ．ＦＩＸ融合タンパク質：
本開示は、ＦＩＸポリペプチドと、ＦＩＸポリペプチド内に挿入されるか、ＦＩＸポリペプチドのＣ末端に融合するか、またはその両方である少なくとも１つの異種部分とを含むＦＩＸ融合タンパク質の皮下投与に関する。本開示の特定の態様は、ＦＩＸポリペプチドおよび異種部分（例えばＦｃ領域）を含むＦＩＸ融合タンパク質の皮下投与に関し、ＦＩＸポリペプチドは、Ｒ３３８Ｌ変異（Ｐａｄｕａ変異）を含む。ＦＩＸ融合タンパク質は、異種部分による挿入または融合の後も、１つまたはそれ以上のＦＩＸ活性を維持される。一実施形態では、ＦＩＸ活性は凝血原活性である。用語「凝血原活性」とは、血液の凝固カスケードに関与し、天然のＦＩＸの代替となる、本開示のＦＩＸタンパク質の能力を意味する。例えば、本開示の組換え型ＦＩＸタンパク質は、例えば発色アッセイによる試験において、因子ＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ）の存在下で因子Ｘ（ＦＸ）を活性化因子Ｘ（ＦＸａ）に変換できるときに、凝血原活性を有する。別の実施形態では、ＦＩＸ活性は、テナーゼ複合体を生成させる能力である。他の実施形態では、ＦＩＸ活性は、トロンビン（または凝血塊）を生成させる能力である。
【００７８】
本開示の組換えＦＩＸタンパク質は、天然の成熟型ヒトＦＩＸの凝血原活性の１００％を示す必要はない。実際には、特定の態様では、本開示のＦＩＸポリペプチドに挿入される異種部分が顕著にタンパク質の半減期または安定性を増加させるため、その活性が低くとも申し分なく許容される。したがって、特定の態様では、本開示のＦＩＸ融合タンパク質は、天然のＦＩＸの凝血原活性の、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約１００％を有する。しかしながらいくつかの開示される実施形態では、本開示の組換えＦＩＸタンパク質は、ＦＩＸ  Ｐａｄｕａ  Ｒ３３８Ｌ高活性変異体を含むタンパク質における天然のＦＩＸ活性に対して１００％超の活性を有してもよく、例えば、その活性の少なくとも約１０５％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％または２００％、またはそれ以上の活性を有してもよい。
【００７９】
凝血原活性は、いずれかの適切なインビトロまたはインビボアッセイにより測定できる。ＦＩＸの活性は、凝血塊の生成をモニターすることによる凝血カスケードの下流側の測定（凝固アッセイ）、または、ＦＶＩＩＩ−ＦＩＸ複合体の活性化後に直接ＦＸの酵素活性を測定することによる上流側の測定（発色アッセイ）により測定できる（Ｂａｒｒｏｗｃｌｉｆｆｅら、Ｓｅｍｉｎ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．２８：２４７〜５６（２００２）、Ｌｅｅら、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．８２：１６４４〜４７（１９９９）、Ｌｉｐｐｉら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．４５：２〜１２（２００７）、Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら、Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．４：３７７〜８４（２００６）を参照）。したがって、凝血原活性は、発色基質アッセイ、凝固アッセイ（例えば１段階または２段階凝固アッセイ）、またはその両方を用いて測定することができる。発色アッセイのメカニズムは、血液凝固カスケードの原則に基づくものであり、活性化ＦＩＸがＦＶＩＩＩ、リン脂質およびカルシウムイオンの存在下でＦＸをＦＸａに変換するというものである。ＦＸａ活性は、ＦＸａに特異的なｐ−ニトロアニリド（ｐＮＡ）基質の加水分解により評価する。４０５ｎＭで測定されるｐ−ニトロアニリン放出の初速度は、ＦＸａ活性に、すなわちサンプルのＦＩＸ活性に正比例する。発色アッセイは、国際血栓止血学会議（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｎ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ、ＩＳＴＨ）の学術標準化委員会（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ａｎｄ  Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ、ＳＳＣ）の因子ＶＩＩＩおよび因子ＩＸ分科会により推奨されている。
【００８０】
凝血原活性の測定に有用な他の適切なアッセイとしては、例えば全開示内容が参照により本明細書に組み込まれるＳｃｈｅｉｆｌｉｎｇｅｒおよびＤｏｃｋａｌの米国特許出願公開第２０１０／００２２４４５号に開示されるアッセイが挙げられる。
【００８１】
特定の態様では、本開示の組換えＦＩＸタンパク質の凝血原活性は天然の成熟型ＦＩＸと比較され、特定の態様では、それは国際標準と比較される。
【００８２】
少なくとも１つの異種部分は、以下に詳細に説明するように、あらゆる異種部分も含んでもよく、または改善された特性をＦＩＸタンパク質に提供できる部分であってもよい。例えば、一態様では、本開示において有用な異種部分は、ＦＩＸタンパク質の半減期を延長できる部分、またはＦＩＸタンパク質の安定性を改善できる部分であり得る。本開示のＦＩＸ融合タンパク質は、ＦＩＸポリペプチドに挿入されるかまたは融合する複数の異種部分を有してもよい。一実施形態では、複数の異種部分は同一のものである。別の実施形態では、複数の異種部分は異なるものである。他の実施形態では、異種部分は、ＸＴＥＮ、アルブミン、アルブミン結合ペプチド、アルブミン小結合分子、Ｆｃドメイン、ＦｃＲｎ結合パートナー、ＰＡＳ、ＣＴＰ、ＰＥＧ、ＨＥＳ、ＰＳＡまたはそれらのいずれかの組合せからなる群から選択される。
【００８３】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種部分は、ＦＩＸポリペプチドのドメイン間でなく、ドメイン内に挿入される。ＦＩＸポリペプチドは、例えばγ−カルボキシグルタミン酸（ＧＬＡ）ドメイン、上皮成長因子様ドメイン１（ＥＧＦ１）、上皮成長因子様ドメイン２（ＥＧＦ２）、活性化ペプチド（ＡＰ）ドメイン、ＥＧＦ２ドメインとＡＰドメインとの間のリンカー、および触媒ドメイン（例えばセリンプロテアーゼドメイン）などの複数のドメインを含む。ＦＩＸチモーゲンは、４６１のアミノ酸を含み、アミノ酸１〜２８（配列番号３に対応）はシグナルペプチドであり、アミノ酸２９〜４６（配列番号３に対応）はプロペプチドであり、４１５アミノ酸のＦＩＸタンパク質配列がそれに続く。この４１５にプロセシングされたＦＩＸは、ＦＩＸ  軽鎖であるアミノ酸１〜１４５（配列番号１または配列番号２に対応）と、活性化ペプチドであるアミノ酸１４６〜１８０と、触媒的ＦＩＸ重鎖であるアミノ酸１８１〜４１５（配列番号１または配列番号２に対応）とを含む。軽鎖および重鎖において、ＧＬＡドメインは、配列番号１または配列番号２のアミノ酸１〜４６に対応し、ＥＧＦ１ドメインは、配列番号１または配列番号２のアミノ酸４７〜８４に対応し、ＥＧＦ２ドメインは、配列番号１または配列番号２のアミノ酸８５〜１２７に対応し、ＥＧＦ２ドメインとＡＰドメインとの間のリンカーは、配列番号１または配列番号２のアミノ酸１２８〜１４５に対応し、ＡＰドメインは、配列番号１または配列番号２のアミノ酸１４６〜１８０に対応し、触媒ドメインは、配列番号１または配列番号２のアミノ酸１８１〜４１５に対応する。
【００８４】
特定の実施形態では、少なくとも１つの異種部分は、ＦＩＸポリペプチドの１つまたはそれ以上のドメイン内に挿入される。例えば、少なくとも１つの異種部分（例えばＸＴＥＮ）は、ＧＬＡドメイン、ＥＧＦ１ドメイン、ＥＧＦ２ドメイン、ＡＰドメイン、ＥＧＦ２ドメインとＡＰドメインとの間のリンカー、触媒ドメインおよびそれらのいずれかの組合せからなる群から選択されるドメイン内に挿入することができる。特定の一実施形態では、少なくとも１つの異種部分（例えばＸＴＥＮ）は、ＧＬＡドメイン内（例えば配列番号１または配列番号２のアミノ酸１〜４６内）に挿入される。特定の一実施形態では、少なくとも１つの異種部分（例えばＸＴＥＮ）は、ＥＧＦ１ドメイン内（例えば配列番号１または配列番号２のアミノ酸４７〜８３内）に挿入される。特定の一実施形態では、少なくとも１つの異種部分（例えばＸＴＥＮ）は、ＥＧＦ２ドメイン内（例えば配列番号１または配列番号２のアミノ酸８４〜１２５内）に挿入される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種部分（例えばＸＴＥＮ）は、ＥＧＦ２ドメインとＡＰドメインの間にリンカー内（例えば配列番号１または配列番号２のアミノ酸１３２〜１４５内）に挿入される。特定の一実施形態では、少なくとも１つの異種部分（例えばＸＴＥＮ）は、ＡＰドメイン内（例えば配列番号１または配列番号２のアミノ酸１４６〜１８０内）に挿入される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種部分（例えばＸＴＥＮ）は、触媒ドメイン内（例えば配列番号１または配列番号２のアミノ酸１８１〜４１５内）に挿入される。
【００８５】
いくつかの実施形態では、１つまたはそれ以上の異種部分は、各種の挿入部位内に挿入することができる。特定の実施形態では、これらの１つまたはそれ以上の部位への少なくとも１つの異種部分（例えばＸＴＥＮ）の挿入は、ＦＩＸ活性の損失をもたらさず、および／またはＦＩＸタンパク質の性質改善をもたらす。例えば、少なくとも１つの異種部分は、以下からなる群：配列番号２のアミノ酸１０３（すなわち配列番号２のアミノ酸１０３に対応するアミノ酸の直ぐ下流）、配列番号２のアミノ酸１０５（すなわち配列番号２のアミノ酸１０５に対応するアミノ酸の直ぐ下流）、配列番号２のアミノ酸１４２（すなわち配列番号２のアミノ酸１４２に対応するアミノ酸の直ぐ下流）、配列番号２のアミノ酸１４９（すなわち配列番号２のアミノ酸１４９に対応するアミノ酸の直ぐ下流）、配列番号２のアミノ酸１６２（すなわち配列番号２のアミノ酸１６２に対応するアミノ酸の直ぐ下流）、配列番号２のアミノ酸１６６（すなわち配列番号２のアミノ酸１６６に対応するアミノ酸の直ぐ下流）、配列番号２のアミノ酸１７４（すなわち配列番号２のアミノ酸１７４に対応するアミノ酸の直ぐ下流）、配列番号２のアミノ酸２２４（すなわち配列番号２のアミノ酸２２４に対応するアミノ酸の直ぐ下流）、配列番号２のアミノ酸２２６（すなわち配列番号２のアミノ酸２２６に対応するアミノ酸の直ぐ下流）、配列番号２のアミノ酸２２８（すなわち配列番号２のアミノ酸２２８に対応するアミノ酸の直ぐ下流）、配列番号２のアミノ酸４１３（すなわち配列番号２のアミノ酸４１３に対応するアミノ酸の直ぐ下流）、およびそれらのいずれかの組合せから選択されるアミノ酸に対応する挿入部位でＦＩＸポリペプチド内に挿入され、ＦＩＸ融合タンパク質は、凝血原活性を示す。
【００８６】
一実施形態では、異種部分（例えばＸＴＥＮ）は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸１４９、配列番号１または配列番号２のアミノ酸１６２、配列番号１または配列番号２のアミノ酸１６６、配列番号１または配列番号２のアミノ酸１７４、およびそれらのいずれかの組合せからなる群から選択されるアミノ酸に対応する挿入部位でＦＩＸポリペプチド内に挿入される。別の実施形態では、異種部分（例えばＸＴＥＮ）は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸２２４、配列番号１または配列番号２のアミノ酸２２６、配列番号１または配列番号２のアミノ酸２２８、配列番号１または配列番号２のアミノ酸４１３、およびそれらのいずれかの組合せからなる群から選択されるアミノ酸に対応する挿入部位でＦＩＸポリペプチド内に挿入される。他の実施形態では、異種部分（例えば、ＸＴＥＮ）は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸１０３、配列番号１または配列番号２のアミノ酸１０５、およびその両方、からなる群から選択されるアミノ酸に対応する挿入部位でＦＩＸポリペプチド内に挿入される。別の実施形態では、異種部分（例えばＸＴＥＮ）は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸１４２に対応する挿入部位でＦＩＸポリペプチド内に挿入される。
【００８７】
以下さらに詳細に説明するように、異種部分はＸＴＥＮであってもよく、それは様々な長さを有し得る。例えば、ＸＴＥＮは少なくとも約４２のアミノ酸、少なくとも約７２のアミノ酸、少なくとも約１４４のアミノ酸、少なくとも約２８８のアミノ酸または少なくとも約８６４のアミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態では、ＸＴＥＮは、ＡＥ４２、ＡＧ４２、ＡＥ７２、ＡＧ７２、ＡＥ１４４、ＡＧ１４４、ＡＥ２８８、ＡＧ２８８、ＡＥ８６４およびＡＧ８６４からなる群から選択される。ＦＩＸポリペプチドに挿入できるかまたは融合させることができるＸＴＥＮの非限定的な例は、本明細書に記載されるとおりである。
【００８８】
いくつかの実施形態では、４２アミノ酸（例えばＡＥ４２またはＡＧ４２）を含むＸＴＥＮは、配列番号１または２のアミノ酸１０３、配列番号１または２のアミノ酸１０５、配列番号１または２のアミノ酸１４２、配列番号１または２のアミノ酸１４９、配列番号１または２のアミノ酸１６２、配列番号１または２のアミノ酸１６６、配列番号１または２のアミノ酸１７４、配列番号１または２のアミノ酸２２４、配列番号１または２のアミノ酸２２６、配列番号１または２のアミノ酸２２８、配列番号１または２のアミノ酸４１３、およびそれらのいずれかの組合せからなる群から選択されるアミノ酸に対応する挿入部位でＦＩＸポリペプチド内に挿入され、ＦＩＸ融合タンパク質は、凝血原活性を示す。
【００８９】
いくつかの実施形態では、７２アミノ酸（例えばＡＥ７２またはＡＧ７２）を含むＸＴＥＮは、配列番号１または２のアミノ酸１４９、配列番号１または２のアミノ酸１６２、配列番号１または２のアミノ酸１６６、配列番号１または２のアミノ酸１７４、配列番号１または２のアミノ酸２２４、配列番号１または２のアミノ酸２２６、配列番号１または２のアミノ酸２２８、配列番号１または２のアミノ酸４１３、およびそれらのいずれかの組合せからなる群から選択されるアミノ酸に対応する挿入部位でＦＩＸポリペプチド内に挿入されるか、または、ＸＴＥＮはＣ末端に融合し、ＦＩＸ融合タンパク質は、凝血原活性を示す。
【００９０】
いくつかの実施形態では、１４４アミノ酸（例えばＡＥ１４４またはＡＧ１４４）を含むＸＴＥＮは、配列番号１または２のアミノ酸１４９、配列番号１または２のアミノ酸１６２、配列番号１または２のアミノ酸１６６、配列番号１または２のアミノ酸１７４、配列番号１または２のアミノ酸２２４、配列番号１または２のアミノ酸２２６、配列番号１または２のアミノ酸２２８、配列番号１または２のアミノ酸４１３、およびそれらのいずれかの組合せからなる群から選択されるアミノ酸に対応する挿入部位でＦＩＸポリペプチド内に挿入され、ＦＩＸ融合タンパク質は、凝血原活性を示す。
【００９１】
いくつかの実施形態では、２８８アミノ酸（例えばＡＥ２８８またはＡＧ２８８）を含むＸＴＥＮは、配列番号１または２のアミノ酸１４９、配列番号１または２のアミノ酸１６２、配列番号１または２のアミノ酸１６６、配列番号１または２のアミノ酸１７４、配列番号１または２のアミノ酸２２４、配列番号１または２のアミノ酸２２６、配列番号１または２のアミノ酸２２８、配列番号１または２のアミノ酸４１３、およびそれらのいずれかの組合せからなる群から選択されるアミノ酸に対応する挿入部位でＦＩＸポリペプチド内に挿入され、ＦＩＸ融合タンパク質は、凝血原活性を示す。
【００９２】
さらに他の実施形態では、８６４アミノ酸（例えばＡＥ８６４またはＡＧ８６４８）を含むＸＴＥＮは、配列番号１または２のアミノ酸１４９、配列番号１または２のアミノ酸１６２、配列番号１または２のアミノ酸１６６、配列番号１または２のアミノ酸１７４、配列番号１または２のアミノ酸２２４、配列番号１または２のアミノ酸２２４、配列番号１または２のアミノ酸２２６、配列番号１または２のアミノ酸２２８、配列番号１または２のアミノ酸４１３、およびそれらのいずれかの組合せからなる群から選択されるアミノ酸に対応する挿入部位でＦＩＸポリペプチド内に挿入され、ＦＩＸ融合タンパク質は、凝血原活性を示す。
【００９３】
本開示のＦＩＸ融合タンパク質は、ＦＩＸ内に挿入されるか、ＦＩＸのＣ末端に融合するか、またはその両方である、第２の異種部分（例えば第２のＸＴＥＮ）をさらに含んでもよい。第２の異種部分は、配列番号１または２のアミノ酸１０３、配列番号１または２のアミノ酸１０５、配列番号１または２のアミノ酸１４２、配列番号１または２のアミノ酸１４９、配列番号１または２のアミノ酸１６２、配列番号１または２のアミノ酸１６６、配列番号１または２のアミノ酸１７４、配列番号１または２のアミノ酸２２４、配列番号１または２のアミノ酸２２６、配列番号１または２のアミノ酸２２８、配列番号１または２のアミノ酸４１３、およびそれらのいずれかの組合せからなる群から選択されるアミノ酸に対応する挿入部位でＦＩＸポリペプチド内に挿入されてもよく、または、第２のＸＴＥＮは、ＦＩＸポリペプチドのＣ末端に融合する。いくつかの実施形態では、第１のＸＴＥＮおよび第２のＸＴＥＮは、配列番号１または２の以下からなる群からそれぞれ選択されるアミノ酸に対応する挿入部位でＦＩＸポリペプチド内に挿入されるか、および／またはＦＩＸポリペプチドのＣ末端に融合する：配列番号１または２のアミノ酸１０５および配列番号１または２のアミノ酸１６６；配列番号１または２のアミノ酸１０５および配列番号１または２のアミノ酸２２４；配列番号１または２のアミノ酸１０５およびＣ末端に融合される；配列番号１または２のアミノ酸１６６および配列番号１または２のアミノ酸２２４；配列番号１または２のアミノ酸１６６およびＣ末端に融合される；配列番号１または２のアミノ酸２２４およびＣ末端に融合される。一実施形態では、第１のＸＴＥＮは配列番号１または２のアミノ酸１６６に対応する挿入部位でＦＩＸポリペプチド内に挿入され、第２のＸＴＥＮはＦＩＸポリペプチドのＣ末端に融合する。
【００９４】
第２のＸＴＥＮは、少なくとも約６のアミノ酸、少なくとも約１２のアミノ酸、少なくとも約３６のアミノ酸、少なくとも約４２のアミノ酸、少なくとも約７２のアミノ酸、少なくとも約１４４のアミノ酸または少なくとも約２８８のアミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態では、第２のＸＴＥＮは、６のアミノ酸、１２のアミノ酸、３６のアミノ酸、４２のアミノ酸、７２のアミノ酸、１４４のアミノ酸または２８８のアミノ酸を含む。第２のＸＴＥＮは、ＡＥ４２、ＡＥ７２、ＡＥ８６４、ＡＥ５７６、ＡＥ２８８、ＡＥ１４４、ＡＧ８６４、ＡＧ５７６、ＡＧ２８８、ＡＧ１４４、およびそれらのいずれかの組合せからなる群から選択することができる。特定の一実施形態では、第２のＸＴＥＮは、ＡＥ７２またはＡＥ１４４である。
【００９５】
特定の一実施形態では、第２のＸＴＥＮは、配列番号３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、およびそれらのいずれかの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。
【００９６】
いくつかの実施形態では、ＦＩＸ融合タンパク質は、第３、第４、第５および／または第６のＸＴＥＮをさらに含む。
【００９７】
いくつかの実施形態では、ＦＩＸ融合タンパク質は、配列番号５４〜配列番号１５３からなる群から選択される配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一のアミノ酸配列を、シグナルペプチドおよびプロペプチド配列なしで含む。特定の実施形態では、ＦＩＸ融合タンパク質は、配列番号５４〜配列番号１５３からなる群から選択されるアミノ酸配列を、シグナルペプチドおよびプロペプチド配列なしで含む。一実施形態では、ＦＩＸ融合タンパク質は、配列番号１１９、１２０、１２１および１２３からなる群から選択される配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一のアミノ酸配列を、シグナルペプチドおよびプロペプチド配列なしで含む。別の実施形態では、ＦＩＸ融合タンパク質は、配列番号１１９、１２０、１２３、１２１および２２６または１２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を、シグナルペプチドおよびプロペプチド配列なしで含む。いくつかの実施形態では、ＦＩＸ融合タンパク質は、シグナルペプチドおよびプロペプチド配列のない、ＦＩＸ−ＡＰ．７２、ＦＩＸ−ＡＰ．１４４、ＦＩＸ−ＣＴ．７２、ＦＩＸ−ＣＴ．１４４、ＦＩＸ−ＡＰ．２８８およびＦＩＸ−ＣＴ．２８８からなる群から選択される。
【００９８】
いくつかの実施形態では、ＦＩＸ融合タンパク質は、２種類の異なる異種部分を含む。いくつかの実施形態では、ＦＩＸ融合タンパク質は、ＦＩＸポリペプチドと、ＸＴＥＮと、Ｆｃドメイン（またはＦｃＲｎ結合パートナー）またはその断片とを含む。いくつかの実施形態では、ＸＴＥＮはＦＩＸ内に挿入され、Ｆｃドメイン（またはＦｃＲｎ結合パートナー）またはその断片は、ＦＩＸのＣ末端に融合する。いくつかの実施形態では、ＸＴＥＮは、表３に列挙される挿入部位から選択される１つまたはそれ以上の挿入部位で、ＦＩＸポリペプチド内に挿入される。一実施形態では、ＸＴＥＮは、配列番号１または２のアミノ酸１０３、配列番号１または２のアミノ酸１０５、配列番号１または２のアミノ酸１４２、配列番号１または２のアミノ酸１４９、配列番号１または２のアミノ酸１６２、配列番号１または２のアミノ酸１６６、配列番号１または２のアミノ酸１７４、配列番号１または２のアミノ酸２２４、配列番号１または２のアミノ酸２２６、配列番号１または２のアミノ酸２２８、および配列番号１または２のアミノ酸４１３からなる群から選択されるアミノ酸に対応する挿入部位で、ＦＩＸポリペプチド内に挿入され、Ｆｃドメイン（またはＦｃＲｎ結合パートナー）またはその断片は、ＦＩＸのＣ末端に融合する。特定の実施形態では、ＸＴＥＮは、配列番号１または２のアミノ酸１０５、配列番号１または２のアミノ酸１６６、および配列番号１または２のアミノ酸２２４からなる群から選択されるアミノ酸に対応する挿入部位で、ＦＩＸポリペプチド内に挿入され、Ｆｃドメイン（またはＦｃＲｎ結合パートナー）またはその断片は、ＦＩＸのＣ末端に融合する。いくつかの実施形態では、ＸＴＥＮは、ＡＥ４２、ＡＥ７２およびＡＥ１４４から選択される。
【００９９】
本開示の特定の態様では、ＦＩＸ融合タンパク質は、１つまたは２つのポリペプチド鎖を含む。一実施形態では、ＦＩＸ融合タンパク質は、２つのポリペプチド鎖を含み、第１のポリペプチド鎖はＦｃドメイン（またはＦｃＲｎ結合パートナー）に融合したＦＩＸポリペプチドを含み、第２のポリペプチド鎖は第２のＦｃドメインを含み、第１のＦｃドメイン（またはＦｃＲｎ結合パートナー）および第２のＦｃドメイン（またはＦｃＲｎ結合パートナー）は、共有結合により会合する。
【０１００】
別の実施形態では、ＦＩＸ融合タンパク質は、ＦＩＸポリペプチドおよびＦｃドメイン（またはＦｃＲｎ結合パートナー）を含む単一のポリペプチド鎖を含む。特定の一実施形態では、ＦＩＸ融合タンパク質はリンカーをさらに含み、それはＦＩＸポリペプチドとＦｃドメイン（またはＦｃＲｎ結合パートナー）とを連結する。別の実施形態では、ＦＩＸ融合タンパク質は、ＦＩＸポリペプチド、Ｆｃドメインおよび第２のＦｃドメイン（またはＦｃＲｎ結合パートナー）を含む。特定の一実施形態では、ＦＩＸ融合タンパク質はリンカーをさらに含み、それはＦｃドメイン（またはＦｃＲｎ結合パートナー）と第２のＦｃドメイン（またはＦｃＲｎ結合パートナー）とを連結する。別の実施形態では、ＦＩＸ融合タンパク質は、ＦＩＸポリペプチド、Ｆｃドメイン（またはＦｃＲｎ結合パートナー）および第２のＦｃドメイン（またはＦｃＲｎ結合パートナー）を含み、ＦＩＸポリペプチドは、リンカーによりＦｃドメイン（またはＦｃＲｎ結合パートナー）と連結される。別の実施形態では、ＦＩＸ融合タンパク質は、ＦＩＸポリペプチド、Ｆｃドメイン（またはＦｃＲｎ結合パートナー）および第２のＦｃドメイン（またはＦｃＲｎ結合パートナー）を含み、ＦＩＸポリペプチドは、第１のリンカーによりＦｃドメイン（またはＦｃＲｎ結合パートナー）と連結され、Ｆｃドメイン（またはＦｃＲｎ結合パートナー）は、リンカーにより第２のＦｃドメイン（またはＦｃＲｎ結合パートナー）と連結される。特定の実施形態では、ＦＩＸ融合タンパク質は、以下からなる群：
（ｉ）ＦＩＸ（Ｘ）−Ｆ１；
（ｉｉ）ＦＩＸ（Ｘ）−Ｌ１−Ｆ１；
（ｉｉｉ）ＦＩＸ（Ｘ）−Ｆ１−Ｆ２；
（ｉｖ）ＦＩＸ（Ｘ）−Ｌ１−Ｆ１−Ｆ２；
（ｖ）ＦＩＸ（Ｘ）−Ｌ１−Ｆ１−Ｌ２−Ｆ２；
（ｖｉ）ＦＩＸ（Ｘ）−Ｆ１−Ｌ１−Ｆ２；
（ｖｉｉ）ＦＩＸ（Ｘ）−Ｆ１：Ｆ２；
（ｖｉｉｉ）ＦＩＸ（Ｘ）−Ｌ１−Ｆ１：Ｆ２；および
（ｉｘ）それらのいずれかの組合せ
から選択される式を含み、式中、ＦＩＸ（Ｘ）は、本明細書に記載の１つまたはそれ以上の挿入部位にＸＴＥＮが挿入されたＦＩＸポリペプチドであり、Ｌ１およびＬ２は各々リンカーであり、Ｆ１はＦｃドメインまたはＦｃＲｎ結合パートナーであり、Ｆ２は第２のＦｃドメインまたは第２のＦｃＲｎ結合パートナーであり、（−）はペプチド結合または１つもしくはそれ以上のアミノ酸であり、（：）は共有結合（例えばジスルフィド結合）である。
【０１０１】
リンカー（Ｌ１およびＬ２）は、同一であっても異なってもよい。リンカーは切断可能であっても切断不可能であってもよく、リンカーは１つまたはそれ以上の細胞内プロセシング部位を含んでもよい。リンカーの非限定的な例は、本明細書において記載されている。いずれかのリンカーを用いて、ＦＩＸと異種部分（例えばＸＴＥＮまたはＦｃ）、または第１の異種部分（例えば第１のＦｃ）と第２の異種部分（例えば第２のＦｃ）とを結合させることができる。
【０１０２】
特定の実施形態では、リンカーは、トロンビン切断部位を含む。特定の一実施形態では、トロンビン切断部位はＸＶＰＲを含み、Ｘはいずれかの脂肪族アミノ酸（例えばグリシン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン）である。特定の一実施形態では、トロンビン切断部位はＬＶＰＲを含む。いくつかの実施形態では、リンカーはＰＡＲ１エキソサイト相互作用モチーフを含み、それはＳＦＬＬＲＮ（配列番号１９０）を含む。いくつかの実施形態では、ＰＡＲ１エキソサイト相互作用モチーフは、Ｐ、ＰＮ、ＰＮＤ、ＰＮＤＫ（配列番号１９１）、ＰＮＤＫＹ（配列番号１９２）、ＰＮＤＫＹＥ（配列番号１９３）、ＰＮＤＫＹＥＰ（配列番号１９４）、ＰＮＤＫＹＥＰＦ（配列番号１９５）、ＰＮＤＫＹＥＰＦＷ（配列番号１９６）、ＰＮＤＫＹＥＰＦＷＥ（配列番号１９７）、ＰＮＤＫＹＥＰＦＷＥＤ（配列番号１９８）、ＰＮＤＫＹＥＰＦＷＥＤＥ（配列番号１９９）、ＰＮＤＫＹＥＰＦＷＥＤＥＥ（配列番号２００）、ＰＮＤＫＹＥＰＦＷＥＤＥＥＳ（配列番号２０１）、またはそれらのいずれかの組合せから選択されるアミノ酸配列をさらに含む。他の実施形態では、リンカーは、ＦＸＩａ切断部位ＬＤＰＲを含む。
【０１０３】
特定の一実施形態では、ＦＩＸ融合タンパク質は、ＦＩＸポリペプチドと、ＸＴＥＮを含む異種部分とを含み、ＸＴＥＮは、ＦＩＸポリペプチドのＣ末端に、リンカーの有無にかかわらず融合し、該リンカーは、切断可能であっても切断可能でなくともよく、また該融合タンパク質は４２超のアミノ酸長および８６４未満のアミノ酸長のアミノ酸配列を含み、１４４未満のアミノ酸長がより好ましい。ＸＴＥＮは、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０または７１超のアミノ酸長、かつ、１４０、１３９、１３８、１３７、１３６、１３５、１３４、１３３、１３２、１３１、１３０、１２９、１２８、１２７、１２６、１２５、１２４、１２３、１２２、１２１、１２０、１１９、１１８、１１７、１１６、１１５、１１４、１１３、１１２、１１１、１１０、１０９、１０８、１０７、１０６、１０５、１０４、１０３、１０２、１０１、１００、９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８９、８８、８７、８６、８５、８４、８３、８２、８１、８０、７９、７８、７６、７５、７４または７３未満のアミノ酸長、またはそれらのいずれかの組合せのアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＸＴＥＮは、７２アミノ酸長である。特定の一実施形態では、ＸＴＥＮは、ＡＥ７２である。別の実施形態では、ＸＴＥＮは、配列番号３５と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、ＦＩＸ融合タンパク質は、少なくとも１つの挿入されたＸＴＥＮ配列と、ＸＴＥＮを含む異種部分とを含むＦＩＸポリペプチドを含み、ＸＴＥＮは、リンカーの有無にかかわらずＦＩＸポリペプチドのＣ末端に融合し、該リンカーは、切断可能であっても切断可能でなくともよい。いくつかの実施形態では、ＸＴＥＮは、８６４アミノ酸長より短く、好ましくは１４４アミノ酸長より短い。他の実施形態では、ＸＴＥＮは、２４４、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０または７５アミノ酸長より短いアミノ酸配列を含む。
【０１０５】
他の実施形態では、ＦＩＸ融合タンパク質は、以下からなる群：
（ｉ）ＦｉＸ−Ｘ
（ｉｉ）ＦＩＸ−Ｌ１−Ｘ
（ｉｉｉ）ＦＩＸ（Ｘ）−Ｘ
（ｉｖ）ＦＩＸ（Ｘ）−Ｌ１−Ｘ
（ｖ）ＦＩＸ（Ｘ）−Ｌ１：Ｘ
（ｖｉ）それらのいずれかの組合せ
から選択される式を含み、式中、ＦＩＸはＦＩＸポリペプチドであり、ＦＩＸ（Ｘ）は、本明細書に記載される１つまたはそれ以上の挿入部位に挿入される少なくとも１つのＸＴＥＮを有するＦＩＸポリペプチドであり、（Ｘ）は４２超のアミノ酸長および１４４未満のアミノ酸長のＸＴＥＮであり、Ｘは、４２超のアミノ酸長および８６４未満のアミノ酸長（例えば２８８アミノ酸長）、好ましくは１４４未満のアミノ酸長のＸＴＥＮ（例えば７２アミノ酸長のＸＴＥＮ）であり、Ｌ１はリンカーであり、（−）はペプチド結合または１つもしくはそれ以上のアミノ酸であり、（：）は共有結合（例えばジスルフィド結合）である。
【０１０６】
リンカー（Ｌ１）は、同一であっても異なってもよい。リンカーは必要に応じて切断可能であっても切断不可能であってもよく、リンカーは１つまたはそれ以上の細胞内プロセシング部位を含んでもよい。リンカーの非限定的な例は、本明細書において記載されている。いずれかのリンカーを用いて、ＦＩＸと異種部分（例えばＸＴＥＮまたはＦｃ）とを結合させることができる。以下は、多くの開示される実施形態に適するリンカーの非限定的な例である：
【化１】
2020505424.tif 000003
【０１０７】
特定の他の実施形態では、リンカーは、トロンビン切断部位を含む。特定の一実施形態では、トロンビン切断部位はＸＶＰＲを含み、Ｘはいずれかの脂肪族アミノ酸（例えばグリシン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン）である。特定の一実施形態では、トロンビン切断部位は、ＬＶＰＲを含む。いくつかの実施形態では、リンカーはＰＡＲ１エキソサイト相互作用モチーフを含み、それはＳＦＬＬＲＮ（配列番号１９０）を含む。いくつかの実施形態では、ＰＡＲ１エキソサイト相互作用モチーフは、Ｐ、ＰＮ、ＰＮＤ、ＰＮＤＫ（配列番号１９１）、ＰＮＤＫＹ（配列番号１９２）、ＰＮＤＫＹＥ（配列番号１９３）、ＰＮＤＫＹＥＰ（配列番号１９４）、ＰＮＤＫＹＥＰＦ（配列番号１９５）、ＰＮＤＫＹＥＰＦＷ（配列番号１９６）、ＰＮＤＫＹＥＰＦＷＥ（配列番号１９７）、ＰＮＤＫＹＥＰＦＷＥＤ（配列番号１９８）、ＰＮＤＫＹＥＰＦＷＥＤＥ（配列番号１９９）、ＰＮＤＫＹＥＰＦＷＥＤＥＥ（配列番号２００）、ＰＮＤＫＹＥＰＦＷＥＤＥＥＳ（配列番号２０１）、またはそれらのいずれかの組合せから選択されるアミノ酸配列をさらに含む。特定の他の実施形態では、リンカーは、ＬＤＰＲを含むＦＸＩａ切断部位を含み、それはＰＡＲ１エキソサイト相互作用モチーフと組み合わせることができる。
【０１０８】
特定の実施形態では、Ｃ末端でＸＴＥＮに融合するＦＩＸポリペプチドは、第２のＸＴＥＮをさらに含んでもよい。第２のＸＴＥＮは、本明細書に開示される挿入部位を含むがこれに限られない、ＦＩＸ融合タンパク質のあらゆる部分に融合してもよく、またはそれに挿入されてもよい。ＦＩＸ融合タンパク質は、第３のＸＴＥＮ、第４のＸＴＥＮ、第５のＸＴＥＮまたは第６のＸＴＥＮをさらに含んでもよい。
【０１０９】
本開示のＦＩＸ融合タンパク質は、天然のＦＩＸと比較して活性のレベルが維持される。いくつかの実施形態では、ＦＩＸ融合タンパク質は、天然のＦＩＸの凝血原活性の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または１００％を有する。凝血原活性は、公知技術のあらゆる方法によって測定してもよく、発色基質アッセイ、一段階凝固アッセイまたはその両方が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１０】
ＩＩ．Ａ．因子ＸＩ
ヒト因子ＩＸ（ＦＩＸ）は、血液凝固カスケードの固有の経路の重要なコンポーネントであるセリンプロテアーゼである。本明細書で用いられる「因子ＩＸ」または「ＦＩＸ」は、凝固因子タンパク質、ならびにその種および配列変異体を指し、限定されないが、ヒトＦＩＸ前駆体ポリペプチド（「プレプロ」）である単鎖の４６１アミノ酸の配列、成熟型ヒトＦＩＸ（配列番号１）である単鎖の４１５アミノ酸の配列およびＲ３３８Ｌ  ＦＩＸ（Ｐａｄｕａ）変異体（配列番号２）が挙げられる。ＦＩＸには、血液凝固因子ＩＸの典型的特徴を有するいずれのＦＩＸ分子も包含される。本明細書において、「因子ＩＸ」および「ＦＩＸ」は、ドメインＧｌａ（γ−カルボキシグルタミン酸残基を含む領域）、ＥＧＦ１およびＥＧＦ２（ヒト上皮成長因子と相同な配列を含む領域）、活性化ペプチド（「ＡＰ」、成熟型ＦＩＸの残基Ｒ１３６〜Ｒ１８０により形成される）およびＣ末端プロテアーゼドメイン（「プロ」）、または従来技術において公知のこれらのドメインの同等物、を含むポリペプチドを含むものとし、あるいは、天然タンパク質の少なくとも一部の生物活性が維持された短縮型の断片または配列変異体であってもよい。ＦＩＸまたは配列変異体は、米国特許第４，７７０，９９９号および第７，７００，７３４号にて説明されるようにクローニングされおり、またヒト因子ＩＸをコードするｃＤＮＡは単離され、解析され、発現ベクターにクローニングされている（Ｃｈｏｏら、Ｎａｔｕｒｅ  ２９９：１７８〜１８０（１９８２）、Ｆａｉｒら、Ｂｌｏｏｄ  ６４：１９４〜２０４（１９８４）およびＫｕｒａｃｈｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、Ｕ．Ｓ．Ａ．７９：６４６１〜６４６４（１９８２）を参照）。Ｓｉｍｉｏｎｉら（２００９）により解析されたＦＩＸ（Ｒ３３８Ｌ  ＦＩＸ（Ｐａｄｕａ）変異体（配列番号２））の１つの特定の変異体は、機能獲得型変異を含み、それは天然のＦＩＸと比較しＰａｄｕａ変異体の活性の約８倍の増加に相当する（表１）。ＦＩＸ変異体には、ＦＩＸポリペプチドのＦＩＸ活性に影響を及ぼさない、１つまたはそれ以上の保存的アミノ酸置換を有するあらゆるＦＩＸポリペプチドが包含される。
【０１１１】
【表１】
2020505424.tif 000004
【０１１２】
ＦＩＸポリペプチドは５５ｋＤａであり、３つの領域：２８アミノ酸（配列番号３のアミノ酸１〜２８）のシグナルペプチド、グルタミン酸残基のγ−カルボキシル化に必要とされる１８アミノ酸（アミノ酸２９〜４６）のプロペプチド、および４１５アミノ酸（配列番号１または２）の成熟型因子ＩＸ、から構成されるプレプロポリペプチド鎖（配列番号１）として合成される。プロペプチドは、Ｎ末端〜γ−カルボキシグルタミン酸ドメインの１８アミノ酸残基の配列である。プロペプチドは、ビタミンＫ依存性γカルボキシラーゼと結合し、次に内因性のプロテアーゼ、ほとんどの場合ＰＡＣＥ（対塩基性アミノ酸切断酵素）（別名フーリンまたはＰＣＳＫ３）によりＦＩＸの前駆体ポリペプチドから分離される。γカルボキシル化なしでは、Ｇｌａドメインは、負荷電タンパク質をリン脂質表面に固定するのに必要となる正しいコンフォメーションをとるために必要なカルシウムとの結合ができず、それにより因子ＩＸが機能しなくなる。カルボキシル化される場合であっても、Ｇｌａドメインはまた、適切な機能を発揮するためにはプロペプチドの切断が必要であり、さもなければ、保持されたプロペプチドがカルシウムおよびリン脂質への最適な結合のために必要となるＧｌａドメインのコンフォメーション変化が妨げられる。ヒトにおいて、結果として得られる成熟型因子ＩＸは、約１７重量％の炭水化物を含む４１５アミノ酸残基の単鎖タンパク質である不活性チモーゲンとして肝細胞により血流中に分泌される（Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ａ．Ｅ．ら、（２００３）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｍｅｄ、１３：３９）。
【０１１３】
成熟型ＦＩＸは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、いくつかのドメイン：ＧＬＡドメイン、ＥＧＦ１ドメイン、ＥＧＦ２ドメイン、活性化ペプチド（ＡＰ）ドメインおよびプロテアーゼ（または触媒）ドメイン、から構成される。短いリンカーは、ＥＧＦ２ドメインをＡＰドメインと連結する。ＦＩＸは、それぞれ、Ｒ１４５〜Ａ１４６およびＲ１８０〜Ｖ１８１により形成される２つの活性化ペプチドを含む。活性化の後、単鎖ＦＩＸは２鎖状分子になり、そこでは２つの鎖はジスルフィド結合により連結される。凝固因子は、それらの活性化ペプチドを置換して異なる活性化特異性をもたらすよう、改変することができる。哺乳動物において、成熟型ＦＩＸは活性化因子ＸＩにより活性化され、因子ＩＸａとならなければならない。プロテアーゼドメインは、ＦＩＸのＦＩＸａへの活性化により、ＦＩＸの触媒活性を得る。活性化因子ＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩａ）は、ＦＩＸａ活性の完全な発現のための特異的な補因子である。
【０１１４】
他の実施形態では、ＦＩＸポリペプチドは、血漿由来の因子ＩＸのＴｈｒ１４８アレル形態を含み、内因性因子ＩＸと類似する構造および機能的特徴を有する。
【０１１５】
多数の機能的ＦＩＸ変異体が公知である。国際公開第０２／０４０５４４号Ａ３パンフレットは、ヘパリンによる阻害に対する高い抵抗性を示す変異体を開示する（４頁目９〜３０行および１５頁目６〜３１行）。国際公開第０３／０２０７６４号Ａ２パンフレットは、表２および３（１４〜２４頁）および１２頁目１〜２７行において、低いＴ細胞免疫原性を有するＦＩＸ変異体を開示する。国際公開第２００７／１４９４０６号Ａ２パンフレットは、高いタンパク質安定性、高いインビボおよびインビトロ半減期、およびプロテアーゼに対する高い抵抗を示す機能的変異体ＦＩＸ分子を開示する（４頁目１行〜１９頁目１１行）。国際公開第２００７／１４９４０６号Ａ２はまた、キメラおよび他の変異体ＦＩＸ分子を開示する（１９頁目１２行〜２０頁目９行）。国際公開第０８／１１８５０７号Ａ２は、高い凝固活性を示すＦＩＸ変異体を開示する（５頁目１４行〜６頁目５行）。国際公開第０９／０５１７１７号Ａ２は、Ｎ−結合および／またはＯ−結合グリコシル化部位の数が多いＦＩＸ変異体が、高い半減期および／または回復をもたらすことを開示する（９頁目１１行〜２０頁目２行）。国際公開第０９／１３７２５４号Ａ２は、グリコシル化部位の数が多い因子ＩＸ変異体を開示する（２頁目段落［００６］〜５頁目段落［０１１］、および１６頁目段落［０４４］〜２４頁目段落［０５７］）。国際公開第０９／１３０１９８号Ａ２は、グリコシル化部位の数の増加した機能的変異体ＦＩＸ分子が高い半減期を有することを開示する（４頁目２６行〜１２頁目６行）。国際公開第０９／１４００１５号Ａ２は、ポリマー（例えばＰＥＧ）コンジュゲーションに使用できる、システイン残基数が増加した機能的ＦＩＸ変異体を開示する（１１頁目段落［００４３］〜１３頁目段落［００５３］）。２０１１年７月１１日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０４３５６９に記載され、２０１２年１月１２日に国際公開第２０１２／００６６２４号パンフレットとして公開されたＦＩＸポリペプチドも、参照により全内容が本明細書に組み込まれる。
【０１１６】
加えて、ＦＩＸの何百もの非機能的変異が血友病対象において同定されており、それらの多くは、国際公開第０９／１３７２５４号Ａ２パンフレットの１１〜１４頁の表５に開示されている。かかる非機能的変異は本開示には含まれず、それらはむしろ、あらゆる変異が多少なりとも機能的なＦＩＸポリペプチドをもたらすかに関する更なる指針を提供するものである。
【０１１７】
一実施形態では、ＦＩＸポリペプチド（または融合ポリペプチドの因子ＩＸ部分）は、配列番号１または２に記載される配列（配列番号１または２のアミノ酸１〜４１５）と、あるいは、プロペプチド配列またはプロペプチドおよびシグナル配列（完全長ＦＩＸ）と、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ＦＩＸポリペプチドは、配列番号２に記載される配列と、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む。
【０１１８】
ＩＸ因子の凝血活性は、国際単位（ＩＵ）として表される。１ＩＵのＦＩＸ活性は、約１ｍＬの健常ヒト血漿中のＦＩＸの量に対応する。１段階凝固アッセイ（活性化部分的トロンボプラスチン時間；ａＰＴＴ）、トロンビン世代時間（ＴＧＡ）および回転トロンボエラストメリー（ＲＯＴＥＭ（登録商標））などの、因子ＩＸ活性を測定するためのいくつかのアッセイが利用できる。本開示には、ＦＩＸ配列との相同性を有する配列、天然の配列断片（ヒト、非ヒト霊長類、哺乳動物（家畜等）に由来）、ならびに少なくとも部分的に生物活性またはＦＩＸの生物学的機能を維持し、および／または、凝固因子関連の疾患、不全、障害または症状（例えば外傷、手術または凝固因子の欠損に関連する出血エピソード）を予防、治療、緩和または改善するため有用である、非天然の配列変異体が包含される。ヒトＦＩＸに対するホモロジーを有する配列は、標準的なホモロジー検索技術（例えばＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ）により見出すことができる。
【０１１９】
ＩＩ．Ｂ．異種部分
本開示のＦＩＸ融合タンパク質は、ＦＩＸポリペプチド内の１つまたはそれ以上の部位に挿入されるか、Ｃ末端に融合するか、またはその両方である少なくとも１つの異種部分を含むことができ、ＦＩＸ融合タンパク質は、凝血原活性を有し、インビボで、またはインビトロで宿主細胞において発現することができる。「異種部分」は、異種ポリペプチド、非ポリペプチド部分、またその両方を含んでもよい。特定の態様では、異種部分はＸＴＥＮである。いくつかの態様では、本開示のＦＩＸ融合タンパク質は、ＦＩＸポリペプチド内の１つまたはそれ以上の部位に挿入される少なくとも１つのＸＴＥＮを含む。いくつかの態様では、本開示のＦＩＸ融合タンパク質は、ＦＩＸポリペプチドのＣ末端に融合する少なくとも１つのＦｃ領域を含む。他の実施形態として、ＦＩＸ融合タンパク質は、ＦＩＸポリペプチド内の１つまたはそれ以上の部位に挿入される少なくとも１つの異種部分を含み、異種部分は、半減期を延長させる部分（例えばインビボ半減期を延長させる部分）である。
【０１２０】
ＦＩＸの凝血原活性の少なくとも一部が保持される挿入部位を発見したことにより、同じ１つまたはそれ以上の部位でＦＩＸタンパク質と融合したときに半減期を延長させる、構造化されていないかまたは構造化された特徴を有する他のペプチドおよびポリペプチドを挿入することも可能となると考えられる。異種部分（例えば半減期を延長させる部分）の非限定的な例としては、アルブミン、アルブミン断片、イムノグロブリンＦｃ断片、ＦｃＲｎ結合パートナー、ヒト絨毛性ゴナドトロピンβサブユニットのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）、ＨＡＰ配列、トランスフェリン、米国特許出願公開第２０１００２９２１３０号のＰＡＳポリペプチド、ポリグリシンリンカー、ポリセリンリンカー、５０％未満から５０％超の様々な程度の二次構造を有し、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン酸塩（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）から選択される２種類のアミノ酸の６〜４０アミノ酸のペプチドおよび短鎖ポリペプチドが挙げられ、それらがとりわけ、ＦＩＸの同定された活性挿入部位への挿入に適する。
【０１２１】
特定の態様では、異種部分は、ＦＩＸ融合タンパク質のインビボまたはインビトロ半減期を増加させる。他の態様では、異種部分は、ＦＩＸ融合タンパク質の視覚化または局在化を促進する。ＦＩＸ融合タンパク質の視覚化および／または局在化は、インビボ、インビトロ、エクスビボまたはそれらの組合せであってもよい。他の態様では、異種部分は、ＦＩＸ融合タンパク質の安定性を増加させる。本明細書において、用語「安定性」とは、環境要因（例えば温度の上下）に応答したＦＩＸ融合タンパク質の１つまたはそれ以上の物理的特性の維持に関する、当業者に公知の尺度を指す。特定の態様では、物理的特性とは、ＦＩＸ融合タンパク質の共有結合的な構造の維持（例えばタンパク質の切断や、不必要な酸化または脱アミド化がないこと）である。別の態様では、物理的特性とは、適切にフォールディングされた状態のＦＩＸ融合タンパク質の存在（例えば可溶性または不溶性の凝集物または沈殿物がないこと）であってもよい。一態様では、ＦＩＸ融合タンパク質の安定性は、ＦＩＸ融合タンパク質の、例えば熱安定性、ｐＨによる脱フォールディングプロファイル、グリカンの安定な除去、溶解性、生化学的機能（例えば別のタンパク質と結合する能力）、および／またはそれらの組合せ、等の生物物理学的特性をアッセイすることにより測定される。別の態様では、生化学的機能は、相互作用における結合能により示される。一態様では、タンパク質安定性の尺度は、熱安定性（すなわち熱負荷に対する抵抗性）である。安定性は、例えばＨＰＬＣ（高性能液体クロマトグラフィー）、ＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）、ＤＬＳ（動的光散乱）等の従来技術において公知の方法を用いて測定することができる。熱安定性の測定方法としては、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）、示差走査蛍光測定（ＤＳＦ）、円二色性（ＣＤ）および熱負荷アッセイが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２２】
特定の態様では、ＦＩＸ融合タンパク質における１つまたはそれ以上の挿入部位に挿入される異種部分は、ＦＩＸ融合タンパク質の生物化学的活性を保持する。特定の実施形態では、異種部分はＸＴＥＮである。一実施形態では、生物化学的活性はＦＩＸ活性であり、それは発色アッセイにより測定することができる。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種部分は、異種部分のＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端およびＣ末端の両方に位置するリンカーを介して、間接的に挿入部位に挿入される。異種部分のＮ末端およびＣ末端のリンカーは、同一であっても異なってもよい。いくつかの実施形態では、いくつかのリンカーは、異種部分の一方または両方の末端に隣接して直接に位置し得る。いくつかの実施形態では、リンカーは「Ｇｌｙ−Ｓｅｒペプチドリンカー」である。用語「Ｇｌｙ−Ｓｅｒペプチドリンカー」とは、グリシンおよびセリン残基を含むペプチドを指す。
【０１２４】
例示的なＧｌｙ／Ｓｅｒペプチドリンカーとしては、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（配列番号１６１）が挙げられるが、これに限定されず、式中、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４６、５０、５５、６０、７０、８０、９０または１００、またはそれらを超える整数である。一実施形態では、ｎ＝１であり、すなわちリンカーは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）（配列番号１６１）である。一実施形態では、ｎ＝２であり、すなわちリンカーは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２（配列番号１６２）である。別の実施形態では、ｎ＝３であり、すなわちリンカーは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号１７２）である。別の実施形態では、ｎ＝４であり、すなわちリンカーは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４（配列番号１７３）である。別の実施形態では、ｎ＝５であり、すなわちリンカーは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５（配列番号１７４）である。さらに別の実施形態では、ｎ＝６であり、すなわちリンカーは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）６（配列番号１７５）である。別の実施形態では、ｎ＝７であり、すなわちリンカーは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）７（配列番号１７６）である。さらに別の実施形態では、ｎ＝８であり、すなわちリンカーは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）８（配列番号１７７）である。別の実施形態では、ｎ＝９であり、すなわちリンカーは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）９（配列番号１７８）である。さらに別の実施形態では、ｎ＝１０であり、すなわちリンカーは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）１０（配列番号１７９）である。
【０１２５】
別の例示的なＧｌｙ／Ｓｅｒペプチドリンカーは、アミノ酸配列Ｓｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（配列番号１８０）を含み、式中、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４６、５０、５５、６０、７０、８０、９０または１００、またはそれらを超える整数である。一実施形態では、ｎ＝１であり、すなわちリンカーはＳｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）（配列番号１８０）である。一実施形態では、ｎ＝２であり、すなわちリンカーはＳｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２（配列番号１８１）である。別の実施形態では、ｎ＝３であり、すなわちリンカーはＳｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号１８２）である。別の実施形態では、ｎ＝４であり、すなわちリンカーはＳｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４（配列番号１８３）である。別の実施形態では、ｎ＝５であり、すなわちリンカーはＳｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５（配列番号１８４）である。さらに別の実施形態では、ｎ＝６であり、すなわちリンカーはＳｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）６（配列番号１８５）である。さらに別の実施形態では、ｎ＝７であり、すなわちリンカーはＳｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）７（配列番号１８６）である。さらに別の実施形態では、ｎ＝８であり、すなわちリンカーはＳｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）８（配列番号１８７）である。さらに別の実施形態では、ｎ＝９であり、すなわちリンカーはＳｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）９（配列番号１８８）である。さらに別の実施形態では、ｎ＝１０であり、すなわちリンカーはＳｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）１０（配列番号１８９）である。
【０１２６】
特定の態様では、ＦＩＸ融合タンパク質は、表７に列挙される１つの挿入部位に挿入される１つの異種部分を含む。他の態様では、ＦＩＸ融合タンパク質は、表７に列挙される２つの挿入部位に挿入される２つの異種部分を含む。特定の実施形態では、表８に列挙される２つの挿入部位に２つの異種部分が挿入される。特定の態様では、ＦＩＸ融合タンパク質は、表７に列挙される３つの挿入部位に挿入される３つの異種部分を含む。特定の態様では、ＦＩＸ融合タンパク質は、表７に列挙される４つの挿入部位に挿入される４つの異種部分を含む。特定の態様では、ＦＩＸ融合タンパク質は、表７に列挙される５つの挿入部位に挿入される５つの異種部分を含む。特定の態様では、ＦＩＸ融合タンパク質は、表７に列挙される６つの挿入部位に挿入される６つの異種部分を含む。いくつかの態様では、挿入されるすべての異種部分は同一である。他の態様では、挿入される異種部分の少なくとも１つは、残りの挿入される異種部分と異なる。
【０１２７】
ＦＩＸポリペプチドの少なくとも１つの異種部分（例えばＸＴＥＮ）との融合は、本開示の融合タンパク質の物理的または化学的性質（例えば薬物動態）に影響を及ぼし得る。特定の実施形態では、ＦＩＸタンパク質に連結される異種部分は、少なくとも１つの薬物動態学的特性を向上させ（例えば終末相半減期の増加または曲線下面積（ＡＵＣ）の増加）、その結果、異種部分を欠く野生型ＦＩＸまたは対応するＦＩＸと比較し、本明細書に記載される融合タンパク質は、長期間生体内に留まる。更なる実施形態では、本開示において使用するＸＴＥＮ配列は、少なくとも１つの薬物動態学的特性を向上させ、例えば、終末相半減期の増加、皮下投与における回復および／またはバイオアビアビリティの増加、曲線下面積（ＡＵＣ）の増加をもたらし、その結果、異種部分を欠く野生型ＦＩＸまたは対応するＦＩＸと比較し、本明細書に記載される融合タンパク質は、長期間生体内に留まる。
【０１２８】
特定の態様では、本開示のＦＩＸ融合タンパク質の半減期を増加させる異種部分は、限定されないが、例えばアルブミン、免疫グロブリンＦｃ領域、ＸＴＥＮ配列、ヒト絨毛性ゴナドトロピンβサブユニットのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）、ＰＡＳ配列、ＨＡＰ配列、トランスフェリン、アルブミン−結合部分、などの異種ポリペプチド、またはこれらのポリペプチドの断片、誘導体、変異体もしくは組合せを含む。特定の態様では、本開示のＦＩＸ融合タンパク質は、半減期を増加させる異種ポリペプチドを含み、該異種ポリペプチドはＸＴＥＮ配列である。他の関連する態様では、異種部分は、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ポリシアル酸などの非ポリペプチド部分のための付着部位、またはこれらの部分の誘導体、変異体もしくは組合せを含んでもよい。
【０１２９】
他の実施形態では、本開示のＦＩＸ融合タンパク質は、１つまたはそれ以上のポリマーとコンジュゲートする。ポリマーは、水溶性であっても非水溶性であってもよい。ポリマーは共有結合または非共有結合により、ＦＩＸに、またはＦＩＸにコンジュゲートする他の部分に付着してもよい。ポリマーの非限定的な例としては、ポリ（アルキレンオキシド）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリオキサゾリンまたはポリ（アクリロイルモルホリン）が挙げられる。
【０１３０】
特定の態様では、本開示のＦＩＸ融合タンパク質は１つ、２つ、３つまたはそれ以上の異種部分を含み、それらは各々同じまたは異なる分子であってもよい。いくつかの実施形態では、ＦＩＸ融合タンパク質は、１つまたはそれ以上のＸＴＥＮを含む。他の実施形態では、ＦＩＸ融合タンパク質は、１つまたはそれ以上のＸＴＥＮおよび１つまたはそれ以上のＦｃドメインを含む。特定の一実施形態では、ＦＩＸ融合タンパク質は、ＦＩＸ内に挿入されるＸＴＥＮおよびＦＩＸのＣ末端に融合するＦｃを含んでもよい。
【０１３１】
本開示のＦＩＸ融合タンパク質は、天然のＦＩＸ、ｒＦＩＸＦｃまたはＦＩＸ  Ｒ３３８Ｌと比較し、インビボ半減期が増加している。いくつかの実施形態では、ＦＩＸ融合タンパク質は、異種部分を欠く天然のＦＩＸと比較し、または異種部分を欠くＦＩＸ  Ｒ３３８Ｌと比較し、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍増加したインビボ半減期を有し得る。特定の一実施形態では、ＦＩＸ融合タンパク質は、異種部分のないＦＩＸポリペプチドと比較し２倍以上増加したインビボ半減期を有する。
【０１３２】
他の実施形態では、ＦＩＸ融合タンパク質は、異種部分を欠くＦＩＸポリペプチドのインビボ半減期と比較し、少なくとも約５時間、少なくとも約６時間、少なくとも約７時間、少なくとも８時間、少なくとも約９時間、少なくとも約１０時間、少なくとも１１時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約１３時間、少なくとも１４時間、少なくとも約１５時間、少なくとも約１６時間、少なくとも１７時間、少なくとも約１８時間、少なくとも約１９時間、少なくとも２０時間、少なくとも約２１時間、少なくとも約２２時間、少なくとも２３時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約２５時間、少なくとも２６時間、少なくとも約２７時間、少なくとも約２８時間、少なくとも２９時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３１時間、少なくとも３２時間、少なくとも約３３時間、または少なくとも約３４時間長いインビボ半減期を有し得る。
【０１３３】
ＩＩ．Ｂ．１．ＸＴＥＮ
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種部分はＸＴＥＮである。本明細書で用いられる「ＸＴＥＮ配列」とは、主に小型の親水性アミノ酸から構成される非天然の実質的に非反復的な配列を有する拡張された長さのポリペプチドを指し、該配列は、生理的条件下で二次または三次構造を採る程度が低いかまたはない。融合タンパク質パートナーとして、ＸＴＥＮは担体として機能することができ、本開示のＦＩＸ配列に連結されて融合タンパク質を形成するとき、特定の望ましい薬物動態学的、物理化学的および薬学的特性を付与する。かかる望ましい特性としては、強化された薬物動態学的パラメーターおよび溶解特性が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で用いられる「ＸＴＥＮ」において、特に抗体または抗体断片（例えば単鎖抗体、または軽鎖もしくは重鎖のＦｃ断片）は除外される。
【０１３４】
特定の態様では、本開示のＦＩＸ融合タンパク質は、ＦＩＸに挿入される少なくとも１つのＸＴＥＮまたはその断片、変異体もしくは誘導体を含み、ＦＩＸ融合タンパク質は、凝血原活性を有し、インビボで、またはインビトロで宿主細胞において発現することができる。特定の態様では、異種部分の２つはＸＴＥＮ配列である。いくつかの態様では、異種部分の３つはＸＴＥＮ配列である。いくつかの態様では、異種部分の４つはＸＴＥＮ配列である。いくつかの態様では、異種部分の５つはＸＴＥＮ配列である。いくつかの態様では、異種部分の６つ以上はＸＴＥＮ配列である。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、本開示において有用なＸＴＥＮ配列は、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００または２０００個の、またはそれを超える数のアミノ酸残基を有するペプチドまたはポリペプチドである。特定の実施形態では、ＸＴＥＮは、約２０超〜約３０００アミノ酸残基、３０超〜約２５００、４０超〜約２０００残基、５０超〜約１５００残基、６０超〜約１０００残基、７０超〜約９００残基、８０超〜約８００残基、９０超〜約７００残基、１００超〜約６００残基、１１０超〜約５００残基、または１２０超〜約４００残基を有するペプチドまたはポリペプチドである。特定の一実施形態では、ＸＴＥＮは、４２超のアミノ酸長および１４４未満のアミノ酸長のアミノ酸配列を含む。
【０１３６】
本開示のＸＴＥＮ配列は、５〜１４（例えば９〜１４）アミノ酸残基による１つまたはそれ以上の配列モチーフ、または配列モチーフと少なくとも８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を含んでもよく、該モチーフは、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）からなる群から選択される４〜６種類のアミノ酸（例えば５つのアミノ酸）を含むか、それらから基本的になるか、またはそれらからなる。米国特許出願公開第２０１０／０２３９５５４号Ａ１明細書を参照されたい。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、ＸＴＥＮは、非オーバーラップ配列モチーフを含み、配列の約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または約９１％、または約９２％、または約９３％、または約９４％、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％、または約１００％が、表２Ａから選択される単一モチーフファミリーら選択される非オーバーラップ配列の複数のユニットからなり、それによりファミリー配列が形成される。本明細書において、「ファミリー」とは、ＸＴＥＮが表２Ａの単一モチーフのカテゴリー、すなわちＡＤ、ＡＥ、ＡＦ、ＡＧ、ＡＭ、ＡＱ、ＢＣまたはＢＤ  ＸＴＥＮのみから選択されるモチーフを有し、ファミリーのモチーフ以外に由来するＸＴＥＮ内のアミノ酸については、コード化ヌクレオチドによる制限部位の導入、切断配列の導入を可能にするか、またはＦＩＸへの良好な結合を可能にするなどの、必要とされる特性が得られるよう選択されることを意味する。ＸＴＥＮファミリーのいくつかの実施形態では、ＸＴＥＮ配列は、ＡＤのモチーフファミリーの、またはＡＥのモチーフファミリーの、またはＡＦのモチーフファミリーの、またはＡＧのモチーフファミリーの、またはＡＭのモチーフファミリーの、またはＡＱのモチーフファミリーの、またはＢＣのファミリーの、またはＢＤのファミリーの非オーバーラップ配列モチーフの複数のユニットを含み、それにより、得られるＸＴＥＮが上記のホモロジー範囲を示す。他の実施形態では、ＸＴＥＮは、表２Ａのモチーフファミリーの２つ以上に由来するモチーフ配列の複数のユニットを含む。これらの配列は、さらに詳細に後述するモチーフのアミノ酸組成により与えられる総電荷、親水性、二次構造の欠如または反復の欠如など、所望の物理的／化学的性質が得られるよう選択することができる。本段落で上記した実施形態では、本明細書に記載される方法を用いてＸＴＥＮに導入されるモチーフは、約３６〜約３０００アミノ酸残基のＸＴＥＮを得るために選択され、また組み合わせることができる。
【０１３８】
【表２】
2020505424.tif 000005
【０１３９】
ＸＴＥＮは、ＦＩＸへの挿入または連結のために様々な長さを有し得る。一実施形態では、１つまたはそれ以上のＸＴＥＮ配列の長さは、融合タンパク質において得られる特性または機能に基づき選択される。意図される特性または機能に応じて、ＸＴＥＮは、短いもしくは中間の長さの配列であってもよく、または担体としての有用性を発揮できる長い配列であってもよい。特定の実施形態では、ＸＴＥＮには、約６〜約９９のアミノ酸残基の短いセグメント、約１００〜約３９９のアミノ酸残基の中間の長さのセグメント、および約４００〜約１０００であって最長約３０００のアミノ酸残基長の長いセグメントが包含される。したがって、ＦＩＸに挿入されるかまたは連結されるＸＴＥＮは、約６、約１２、約３６、約４０、約４２、約７２、約９６、約１４４、約２８８、約４００、約５００、約５７６、約６００、約７００、約８００、約８６４、約９００、約１０００、約１５００、約２０００、約２５００または最大約３０００アミノ酸残基長を有し得る。他の実施形態では、ＸＴＥＮ配列は約６〜約５０、約５０〜約１００、約１００〜１５０、約１５０〜２５０、約２５０〜４００、約４００〜約５００、約５００〜約９００、約９００〜１５００、約１５００〜２０００または約２０００〜約３０００アミノ酸残基長である。ＦＩＸに挿入されるかまたは連結されるＸＴＥＮの実際の長さは、ＦＩＸの活性に悪影響を与えることなく変化し得る。一実施形態では、本発明において用いられるＸＴＥＮの１つまたはそれ以上は、４２アミノ酸長、７２アミノ酸長、１４４アミノ酸長、２８８アミノ酸長、５７６アミノ酸長または８６４アミノ酸長を有し、ＸＴＥＮファミリー配列の１つまたはそれ以上、すなわちＡＤ、ＡＥ、ＡＦ、ＡＧ、ＡＭ、ＡＱＢＣまたはＢＤから選択することができる。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、本開示において使用するＸＴＥＮ配列は、ＡＥ４２、ＡＧ４２、ＡＥ４８、ＡＭ４８、ＡＥ７２、ＡＧ７２、ＡＥ１０８、ＡＧ１０８、ＡＥ１４４、ＡＦ１４４、ＡＧ１４４、ＡＥ１８０、ＡＧ１８０、ＡＥ２１６、ＡＧ２１６、ＡＥ２５２、ＡＧ２５２、ＡＥ２８８、ＡＧ２８８、ＡＥ３２４、ＡＧ３２４、ＡＥ３６０、ＡＧ３６０、ＡＥ３９６、ＡＧ３９６、ＡＥ４３２、ＡＧ４３２、ＡＥ４６８、ＡＧ４６８、ＡＥ５０４、ＡＧ５０４、ＡＦ５０４、ＡＥ５４０、ＡＧ５４０、ＡＦ５４０、ＡＤ５７６、ＡＥ５７６、ＡＦ５７６、ＡＧ５７６、ＡＥ６１２、ＡＧ６１２、ＡＥ６２４、ＡＥ６４８、ＡＧ６４８、ＡＧ６８４、ＡＥ７２０、ＡＧ７２０、ＡＥ７５６、ＡＧ７５６、ＡＥ７９２、ＡＧ７９２、ＡＥ８２８、ＡＧ８２８、ＡＤ８３６、ＡＥ８６４、ＡＦ８６４、ＡＧ８６４、ＡＭ８７５、ＡＥ９１２、ＡＭ９２３、ＡＭ１３１８、ＢＣ８６４、ＢＤ８６４、ＡＥ９４８、ＡＥ１０４４、ＡＥ１１４０、ＡＥ１２３６、ＡＥ１３３２、ＡＥ１４２８、ＡＥ１５２４、ＡＥ１６２０、ＡＥ１７１６、ＡＥ１８１２、ＡＥ１９０８、ＡＥ２００４Ａ、ＡＧ９４８、ＡＧ１０４４、ＡＧ１１４０、ＡＧ１２３６、ＡＧ１３３２、ＡＧ１４２８、ＡＧ１５２４、ＡＧ１６２０、ＡＧ１７１６、ＡＧ１８１２、ＡＧ１９０８、ＡＧ２００４、およびそれらのいずれかの組合せからなる群から選択される配列と、少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である。米国特許出願公開第２０１０／０２３９５５４号Ａ１明細書を参照されたい。特定の一実施形態では、ＸＴＥＮは、ＡＥ４２、ＡＥ７２、ＡＥ１４４、ＡＥ２８８、ＡＥ５７６、ＡＥ８６４、ＡＧ  ４２、ＡＧ７２、ＡＧ１４４、ＡＧ２８８、ＡＧ５７６、ＡＧ８６４またはそれらのいずれかの組合せを含む。
【０１４１】
一実施形態では、ＸＴＥＮ配列は、ＡＥ３６（配列番号２１７）、ＡＥ４２（配列番号３４）、ＡＥ７２（配列番号３５）、ＡＥ７８（配列番号２１８）、ＡＥ１４４（配列番号３６）、ＡＥ１４４＿２Ａ（配列番号３７）、ＡＥ１４４＿３Ｂ（配列番号３８）、ＡＥ１４４＿４Ａ（配列番号３９）、ＡＥ１４４＿５Ａ（配列番号４０）、ＡＥ１４４＿６Ｂ（配列番号４１）、ＡＧ１４４（配列番号４２）、ＡＧ１４４＿Ａ（配列番号４３）、ＡＧ１４４＿Ｂ（配列番号４４）、ＡＧ１４４＿Ｃ（配列番号４５）、ＡＧ１４４＿Ｆ（配列番号４６）、ＡＥ２８８（配列番号４７）、ＡＥ２８８＿２（配列番号４８）、ＡＧ２８８（配列番号４９）、ＡＥ５７６（配列番号５０）、ＡＧ５７６（配列番号５１）、ＡＥ８６４（配列番号５２）、ＡＧ８６４（配列番号５３）、ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２＿２Ａ＿１（配列番号２０２）、ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２＿２Ａ＿２（配列番号２０３）、ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２＿３Ｂ＿１（配列番号２０４）、ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２＿３Ｂ＿２（配列番号２０５）、ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２＿４Ａ＿２（配列番号２０６）、ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２＿５Ａ＿２（配列番号２０７）、ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２＿６Ｂ＿１（配列番号２０８）、ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２＿６Ｂ＿２（配列番号２０９）、ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２＿１Ａ＿１（配列番号２１０）、ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２＿１Ａ＿２（配列番号２１１）、配列番号２３０）、ＸＴＥＮ＿ＡＥ１４４＿１Ａ（配列番号２１２）、ＡＥ１５０（配列番号２１３）、ＡＧ１５０（配列番号２１４）、ＡＥ２９４（配列番号２１５）、ＡＧ２９４（配列番号２１６）およびそれらのいずれかの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、ＸＴＥＮのアミノ酸の１００％未満は、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）から選択されるか、または、配列の１００％未満は、表２Ａまたは表２ＢのＸＴＥＮ配列の配列モチーフからなる。かかる実施形態では、ＸＴＥＮの残りのアミノ酸残基は、その他の１４種の天然Ｌ−アミノ酸のいずれかから選択されるが、その際、ＸＴＥＮ配列が親水性アミノ酸を少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または少なくとも約９９％含むよう、親水性アミノ酸から優先的に選択することができる。コンジュゲート構築物において用いられるＸＴＥＮの疎水性アミノ酸の含量は、５％未満、２％未満、または１％未満の疎水性アミノ酸含量であり得る。ＸＴＥＮの構成において望ましくない疎水性残基としては、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、ロイシン、イソロイシン、バリンおよびメチオニンが挙げられる。さらに、ＸＴＥＮ配列は、以下のアミノ酸を５％未満、または４％未満、または３％未満、または２％未満、または１％未満で含むか、または含まない：メチオニン（例えば酸化を回避）、またはアスパラギンおよびグルタミン（非アミド化を回避）。
【０１４３】
別の実施形態では、ＸＴＥＮ配列は、ＡＥ３６（配列番号２１７）、ＡＥ４２（配列番号３４）、ＡＥ７２（配列番号３５）、ＡＥ７８（配列番号２１８）、ＡＥ１４４（配列番号３６）、ＡＥ１４４＿２Ａ（配列番号３７）、ＡＥ１４４＿３Ｂ（配列番号３８）、ＡＥ１４４＿４Ａ（配列番号３９）、ＡＥ１４４＿５Ａ（配列番号４０）、ＡＥ１４４＿６Ｂ（配列番号４１）、ＡＧ１４４（配列番号４２）、ＡＧ１４４＿Ａ（配列番号４３）、ＡＧ１４４＿Ｂ（配列番号４４）、ＡＧ１４４＿Ｃ（配列番号４５）、ＡＧ１４４＿Ｆ（配列番号４６）、ＡＥ２８８（配列番号４７）、ＡＥ２８８＿２（配列番号４８）、ＡＧ２８８（配列番号４９）、ＡＥ５７６（配列番号５０）、ＡＧ５７６（配列番号５１）、ＡＥ８６４（配列番号５２）、ＡＧ８６４（配列番号５３）、ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２＿２Ａ＿１（配列番号２０２）、ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２＿２Ａ＿２（配列番号２０３）、ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２＿３Ｂ＿１（配列番号２０４）、ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２＿３Ｂ＿２（配列番号２０５）、ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２＿４Ａ＿２（配列番号２０６）、ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２＿５Ａ＿２（配列番号２０７）、ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２＿６Ｂ＿１（配列番号２０８）、ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２＿６Ｂ＿２（配列番号２０９）、ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２＿１Ａ＿１（配列番号２１０）、ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２＿１Ａ＿２（配列番号２１１）、配列番号２３０）、ＸＴＥＮ＿ＡＥ１４４＿１Ａ（配列番号２１２）、ＡＥ１５０（配列番号２１３）、ＡＧ１５０（配列番号２１４）、ＡＥ２９４（配列番号２１５）、ＡＧ２９４（配列番号２１６）およびそれらのいずれかの組合せからなる群から選択される。特定の実施形態では、ＸＴＥＮ配列は、ＡＥ７２、ＡＥ１４４およびＡＥ２８８からなる群から選択される。本開示の特定のＸＴＥＮ配列のアミノ酸配列を表２Ｂに示す。
【０１４４】
【表３】
2020505424.tif 000006
【０１４５】
【表４】
2020505424.tif 000007
【０１４６】
【表５】
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【０１４７】
【表６】
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【０１４８】
更なる実施形態では、本開示において使用するＸＴＥＮ配列は、本開示の融合タンパク質の物理的または化学的性質（例えば薬物動態）に影響を及ぼす。本開示において使用するＸＴＥＮ配列は、以下の１つまたはそれ以上の有利な特性を示し得る：立体配座の柔軟性、高い水溶性、高いプロテアーゼ抵抗性、低い免疫原性、哺乳動物の受容体に対する低い結合性、または高い水力学的（またはＳｔｏｋｅｓ）半径。特定の実施形態では、本開示のＦＩＸタンパク質に連結されるＸＴＥＮ配列は薬物動態学的特性を向上させ（例えば長い終末半減期、高いバイオアビアビリティまたは高い曲線下面積（ＡＵＣ））、その結果、本明細書に記載されるタンパク質は、野生型ＦＩＸと比較し長期間、生体内に留まる。更なる実施形態では、本開示において使用するＸＴＥＮ配列は薬物動態学的特性を向上させ（例えば長い終末半減期または高い曲線下面積（ＡＵＣ））、その結果、ＦＩＸタンパク質は野生型ＦＩＸと比較し長期間、生体内に留まる。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、ＦＩＸタンパク質は、天然のＦＩＸ、ｒＦＩＸＦｃ、ＦＩＸ  Ｒ３３８ＬまたはＸＴＥＮを欠く対応するＦＩＸタンパク質と比較し、少なくとも１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、またはそれを超過するインビボ半減期を示す。特定の一実施形態では、ＦＩＸ融合タンパク質は、異種部分のないＦＩＸポリペプチドより２倍超のインビボ半減期を有し得る。
【０１５０】
他の実施形態では、ＦＩＸ融合タンパク質は、異種部分を欠くＦＩＸポリペプチドのインビボ半減期と比較し、少なくとも約５時間、少なくとも約６時間、少なくとも約７時間、少なくとも８時間、少なくとも約９時間、少なくとも約１０時間、少なくとも１１時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約１３時間、少なくとも１４時間、少なくとも約１５時間、少なくとも約１６時間、少なくとも１７時間、少なくとも約１８時間、少なくとも約１９時間、少なくとも２０時間、少なくとも約２１時間、少なくとも約２２時間、少なくとも２３時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約２５時間、少なくとも２６時間、少なくとも約２７時間、少なくとも約２８時間、少なくとも２９時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３１時間、少なくとも３２時間、少なくとも約３３時間、または少なくとも約３４時間長いインビボ半減期を示す。
【０１５１】
ＸＴＥＮ配列を含むタンパク質の物理的／化学特性を決定するために、各種の方法およびアッセイを使用することができる。かかる方法としては、分析的遠心法、ＥＰＲ、イオン交換ＨＰＬＣ、サイズ除外ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ、光散乱法、キャピラリー電気泳動法、円二色法、示差走査熱量測定法、蛍光測定法、イオン交換ＨＰＬＣ、サイズ排除ＨＰＬＣ、ＩＲ法、ＮＭＲ法、ラマン分光法、屈折測定法およびＵＶ／可視光分光法が挙げられるが、これらに限定されない。更なる方法は、Ａｍａｕら、Ｐｒｏｔ  Ｅｘｐｒ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆ  ４８、１〜１３（２００６）において開示される。
【０１５２】
本開示に従い使用できるＸＴＥＮ配列の更なる例は、米国特許出願公開第２０１０／０２３９５５４号Ａ１、第２０１０／０３２３９５６号Ａ１、第２０１１／００４６０６０号Ａ１、第２０１１／００４６０６１号Ａ１、第２０１１／００７７１９９号Ａ１または第２０１１／０１７２１４６号Ａ１明細書、または国際公開第２０１０／０９１１２２号Ａ１、第２０１０／１４４５０２号Ａ２、第２０１０／１４４５０８号Ａ１、第２０１１／０２８２２８号Ａ１、第２０１１／０２８２２９号Ａ１、第２０１１／０２８３４４号Ａ２、第２０１４／０１１８１９号Ａ２または第２０１５／０２３８９１号パンフレットに開示されている。
【０１５３】
いくつかの態様では、ＦＩＸ融合タンパク質は、ＦＩＸ内に挿入されるか、ＦＩＸのＣ末端に融合するか、またはその両方である、１つまたはそれ以上のＸＴＥＮ配列を含む。一実施形態では、１つまたはそれ以上のＸＴＥＮ配列は、ＧＬＡドメイン内に挿入される。別の実施形態では、１つまたはそれ以上のＸＴＥＮ配列は、ＥＧＦ１ドメイン内に挿入される。他の実施形態では、１つまたはそれ以上のＸＴＥＮ配列は、ＥＧＦ２内に挿入される。さらに他の実施形態では、１つまたはそれ以上のＸＴＥＮ配列は、ＡＰ内に挿入される。さらに他の実施形態では、１つまたはそれ以上のＸＴＥＮ配列は、触媒ドメイン内に挿入される。いくつかの実施形態では、１つまたはそれ以上のＸＴＥＮ配列は、ＦＩＸのＣ末端に融合する。
【０１５４】
特定の態様では、ＦＩＸ融合タンパク質は、表７に列挙される挿入部位に挿入される１つのＸＴＥＮ配列を含む。他の態様では、ＦＩＸ融合タンパク質は、表７に列挙される２つの挿入部位に挿入される２つのＸＴＥＮ配列を含む。具体的実施形態では、２つのＸＴＥＮ配列が、表８に列挙される２つの挿入部位に挿入される。特定の態様では、ＦＩＸ融合タンパク質は、表７に列挙される３つの挿入部位に挿入される３つのＸＴＥＮ配列を含む。特定の態様では、ＦＩＸ融合タンパク質は、表７に列挙される４つの挿入部位に挿入される４つのＸＴＥＮ配列を含む。特定の態様では、ＦＩＸ融合タンパク質は、表７に列挙される５つの挿入部位に挿入される５つのＸＴＥＮ配列を含む。特定の態様では、ＦＩＸ融合タンパク質は、表７に列挙される６つの挿入部位に挿入される６つのＸＴＥＮ配列を含む。いくつかの態様では、すべての挿入されるＸＴＥＮ配列は同一である。他の態様では、挿入されるＸＴＥＮ配列の少なくとも１つは、残りの挿入されるＸＴＥＮ配列と異なる。
【０１５５】
いくつかの態様では、ＦＩＸ融合タンパク質は、配列番号２のアミノ酸１０３、配列番号２のアミノ酸１０５、配列番号２のアミノ酸１４２、配列番号２のアミノ酸１４９、配列番号２のアミノ酸１６２、配列番号２のアミノ酸１６６、配列番号２のアミノ酸１７４、配列番号２のアミノ酸２２４、配列番号２のアミノ酸２２６、配列番号２のアミノ酸２２８、配列番号２のアミノ酸４１３およびそれらのいずれかの組合せからなる群から選択されるアミノ酸に対応する挿入部位で、ＦＩＸポリペプチド内に挿入される、少なくとも１つのＸＴＥＮを含み、ＦＩＸ融合タンパク質は、凝血原活性を示す。いくつかの態様では、ＦＩＸ融合タンパク質は、ＦＩＸポリペプチド内の、配列番号２のアミノ酸１０３、配列番号２のアミノ酸１０５、配列番号２のアミノ酸１４２、配列番号２のアミノ酸１４９、配列番号２のアミノ酸１６２、配列番号２のアミノ酸１６６、配列番号２のアミノ酸１７４、配列番号２のアミノ酸２２４、配列番号２のアミノ酸２２６、配列番号２のアミノ酸２２８、配列番号２のアミノ酸４１３からなる群から選択されるアミノ酸およびそれらのいずれかの組合せに対応する挿入部位に第２のＸＴＥＮ配列を含むか、または、第２のＸＴＥＮはＦＩＸポリペプチドのＣ末端に融合し、ＦＩＸ融合タンパク質は凝血原活性を示す。１つの特定の態様では、ＦＩＸ融合タンパク質は、ＦＩＸのＣ末端に融合する１つのＸＴＥＮ配列を含み、ＸＴＥＮは、４２アミノ酸超および１４４アミノ酸未満のアミノ酸配列長を含む。
【０１５６】
ＩＩ．Ｂ．２．Ｆｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナー：
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種部分は、Ｆｃ領域（例えばＦｃＲｎ結合パートナー）またはその断片である。特定の態様では、開示のＦＩＸ融合タンパク質は、ＦＩＸ内に挿入されるか、ＦＩＸのＣ末端に融合するか、またはその両方である、少なくとも１つのＦｃ領域（例えばＦｃＲｎ結合パートナー）を含み、ＦＩＸ融合タンパク質は、凝血原活性を有し、インビボで、またはインビトロで宿主細胞において発現することができる。いくつかの実施形態では、ＦＩＸ融合タンパク質は、ＦＩＸポリペプチドのＣ末端に融合するＦｃ領域を含む。特定の実施形態では、ＦＩＸ融合タンパク質（例えばＦＩＸ−Ｆｃ融合タンパク質）は、ＸＴＥＮ配列を含まない。本明細書で用いられる「Ｆｃ」または「Ｆｃ領域」は、特に明記しない限り、Ｆｃドメイン、その変異体または断片を含むパートナーと結合する機能性新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）であってもよい。ＦｃＲｎ結合パートナーは、ＦｃＲｎ受容体と特異的に結合でき、それに伴い、ＦｃＲｎ受容体により能動輸送されるいずれかのＦｃＲｎ結合パートナー分子であってもよく、アルブミンが例示されるがこれに限定されない。したがって、用語Ｆｃには、機能性を有するあらゆるＩｇＧのＦｃの変異体が包含される。ＦｃＲｎ受容体に結合するＩｇＧのＦｃ部分の領域は、Ｘ線結晶解析に基づき報告されている（Ｂｕｒｍｅｉｓｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３７２：３７９（１９９４）、全開示内容が参照により本明細書に組み込まれる）。ＦｃのＦｃＲｎとの主な接触領域は、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインのジャンクション部付近である。Ｆｃ−ＦｃＲｎの接触はいずれも、単一のＩｇ重鎖内でなされる。ＦｃＲｎ結合パートナーには、全ＩｇＧ、ＩｇＧのＦｃ断片、ならびにＦｃＲｎの全結合領域を含む他のＩｇＧ断片が包含されるが、これらに限定されない。Ｆｃは、免疫グロブリンのヒンジ領域の有無にかかわらず、免疫グロブリンのＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含み得る。また、融合タンパク質におけるＦｃ領域の望ましい特性（例えば半減期、例えばインビボ半減期、の増加）が維持されたＦｃフラグメント、変異体または誘導体も包含される。多くの変異体、断片、変異体および誘導体が、例えば国際公開第２０１１／０６９１６４号Ａ２、第２０１２／００６６２３号Ａ２、第２０１２／００６６３５号Ａ２または第２０１２／００６６３３号Ａ２パンフレットに記載されており、それらの全開示内容が本明細書に参照により組み込まれる。
【０１５７】
１つまたはそれ以上のＦｃドメインは、ＦＩＸポリペプチド内で挿入してもよく、ポリペプチドのＣ末端に融合させてもよく、またはその両方であってもよい。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、ＦＩＸポリペプチドに融合する。特定の実施形態では、ＦＩＸポリペプチドは、配列番号２２９のアミノ酸配列と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％同一のアミノ酸配列を有するＦＩＸＦｃ融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、他の異種部分（例えばＸＴＥＮ）に融合し、その際、ＦＩＸ内に挿入されるか、またはＸＴＥＮのＣ末端に融合する。いくつかの実施形態では、ＦＩＸ融合タンパク質は、第２のＦｃドメインを含む。第２のＦｃドメインは、例えば１つまたはそれ以上の共有結合を介して、第１のＦｃドメインと会合し得る。
【０１５８】
ＩＩ．Ｂ．３．アルブミン：
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種部分は、アルブミン、アルブミン結合ドメイン、またはアルブミン結合小分子、またはその変異体、誘導体もしくは断片である。特定の態様では、本開示のＦＩＸ融合タンパク質は、ＦＩＸに挿入される、ＦＩＸのＣ末端に融合する、またはその両方である、少なくとも１つのアルブミンポリペプチド、またはその断片、変異体もしくは誘導体を含み、ＦＩＸ融合タンパク質は、凝血原活性を有し、インビボで、またはインビトロで宿主細胞において発現することができる。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡまたはＨＡ）は、その全長型が６０９アミノ酸のタンパク質であり、血清の浸透圧を左右する主要な物質であり、また内因性および外因性リガンドの担体としても機能する。本明細書で用いられる用語「アルブミン」には、全長アルブミンまたはその機能性断片、変異体、誘導体もしくは類似体が包含される。アルブミンまたはその断片もしくは変異体の例は、全開示内容が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００８／０１９４４８１号Ａ１、第２００８／０００４２０６号Ａ１、第２００８／０１６１２４３号Ａ１、第２００８／０２６１８７７号Ａ１または第２００８／０１５３７５１号Ａ１明細書、または国際公開第２００８／０３３４１３号Ａ２、第２００９／０５８３２２号Ａ１または第２００７／０２１４９４号Ａ２パンフレットに開示されている。
【０１５９】
アルブミン結合ポリペプチド（ＡＢＰ）としては、限定されないが、細菌由来のアルブミン結合ドメイン、アルブミン結合ペプチド、またはアルブミンと結合できるアルブミン結合抗体断片が含まれる。Ｋｒａｕｌｉｓら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３７８：１９０〜１９４（１９９６）およびＬｉｎｈｕｌｔら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．１１：２０６〜２１３（２００２）に開示される連鎖球菌のプロテインＧ由来のドメイン３は、細菌由来のアルブミン結合ドメインの一例である。アルブミン結合ペプチドの例としては、コア配列ＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷ（配列番号１６３）を有する一連のペプチドが挙げられる。Ｄｅｎｎｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２、２７７：３５０３５〜３５０４３（２００２）を参照されたい。アルブミン結合抗体断片の例は、ＭｕｌｌｅｒおよびＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．９：３１９〜３２６（２００７）、Ｒｏｏｖｅｒｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５６：３０３〜３１７（２００７）およびＨｏｌｔら、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．Ｄｅｓｉｇｎ  Ｓｃｉ．、２１：２８３〜２８８（２００８）において開示され、それらの全開示内容が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１６０】
特定の態様では、本開示のＦＩＸ融合タンパク質は、ＦＩＸに挿入されるか、ＦＩＸのＣ末端に融合するか、またはその両方である、アルブミンと結合できる非ポリペプチド小分子（例えばアルブミン結合小分子）、またはその変異体もしくは誘導体のための少なくとも１つの付着部位を含み、ＦＩＸ融合タンパク質は、凝血原活性を有し、インビボで、またはインビトロで宿主細胞において発現することができる。例えば、本開示のＦＩＸ融合タンパク質は、ＦＩＸ内の１つまたはそれ以上の挿入部位に付着するか、ＦＩＸのＣ末端に融合するか、またはその両方である、１つまたはそれ以上の有機アルブミン結合部分を含むことができ、ＦＩＸ融合タンパク質は、凝血原活性を有し、インビボで、またはインビトロで宿主細胞において発現することができる。Ｔｒｕｓｓｅｌら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２０：２２８６〜２２９２（２００９）により開示されるように、かかるアルブミン結合部分の一例は、２−（３−マレイミドプロパンアミド）−６−（４−（４−ヨードフェニル）ブタンアミド）ヘキサノエート（「Ａｌｂｕ」タグ）である。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、アルブミン結合ポリペプチド配列は、Ｇｌｙ−Ｓｅｒペプチドリンカー配列を介して、Ｃ末端、Ｎ末端または両末端に隣接配置される。いくつかの実施形態では、Ｇｌｙ−Ｓｅｒペプチドリンカーは、Ｇｌｙ４Ｓｅｒ（配列番号１６１）である。他の実施形態では、Ｇｌｙ−Ｓｅｒペプチドリンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２（配列番号１６２）である。
【０１６２】
ＩＩ．Ｂ．４．ＣＴＰ
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種部分は、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのβサブユニットのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）、またはその断片、変異体もしくは誘導体である。特定の態様では、本開示のＦＩＸ融合タンパク質は、ＦＩＸに挿入されるか、ＦＩＸのＣ末端に融合するか、またはその両方である、少なくとも１つのＣＴＰ、またはその断片、変異体もしくは誘導体を含み、ＦＩＸ融合タンパク質は、凝血原活性を有し、インビボで、またはインビトロで宿主細胞において発現することができる。組換えタンパク質に挿入される１つまたはそれ以上のＣＴＰペプチドは、そのタンパク質の半減期を増加させることが知られている。全開示内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，７１２，１２２号を参照されたい。典型的なＣＴＰペプチドとしては、ＤＰＲＦＱＤＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬ（配列番号１６４）またはＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（配列番号１６５）が挙げられる。参照により組み込む米国特許出願公開第２００９／００８７４１１号Ａ１を参照されたい。いくつかの実施形態では、ＣＴＰ配列は、Ｇｌｙ−Ｓｅｒペプチドリンカー配列を介して、Ｃ末端、Ｎ末端または両末端に隣接配置される。いくつかの実施形態では、Ｇｌｙ−Ｓｅｒペプチドリンカーは、Ｇｌｙ４Ｓｅｒ（配列番号１６１）である。他の実施形態では、Ｇｌｙ−セリンペプチドリンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２（配列番号１６２）である。
【０１６３】
ＩＩ．Ｂ．５．ＰＡＳ
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種部分はＰＡＳペプチドである。特定の態様では、本開示のＦＩＸ融合タンパク質は、ＦＩＸに挿入される、ＦＩＸのＣ末端に融合する、またはその両方である、少なくとも１つのＰＡＳペプチド、またはその断片、変異体もしくは誘導体を含み、ＦＩＸ融合タンパク質は、凝血原活性を有し、インビボで、またはインビトロで宿主細胞において発現することができる。本明細書で用いられる「ＰＡＳペプチド」または「ＰＡＳ配列」は、主にアラニンおよびセリン残基を含むかまたは主にアラニン、セリンおよびプロリン残基を含むアミノ酸配列を意味し、該アミノ酸配列は生理学的条件下でランダムコイル高次構造を形成する。したがって、ＰＡＳ配列は、融合タンパク質の異種部分の一部として使用できる、アラニン、セリンおよびプロリンを含むか、それらから基本的になるか、またはそれらからなる、構成部材、アミノ酸ポリマーまたは配列カセットである。アミノ酸ポリマーはまた、アラニン、セリンおよびプロリン以外の残基がＰＡＳ配列の微量要素として追加されたときでもランダムコイル高次構造を形成することができる。「微量要素」とは、アラニン、セリンおよびプロリン以外のアミノ酸を一定の程度で、例えばアミノ酸の約１２％（すなわちＰＡＳ配列の１００のアミノ酸のうちの約１２）以下、約１０％以下、約９％以下、約８％以下、約６％、約５％、約４％、３％（すなわち約２％または約１％）で、ＰＡＳ配列に追加できることを意味する。アラニン、セリンおよびプロリンと異なるアミノ酸は、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＶａｌからなる群から選択することができる。ＰＡＳペプチドは、生理学的条件下でランダムコイル高次構造を形成させることにより、本開示の組換えタンパク質のインビボおよび／またはインビトロ安定性を増加させ、また凝血原活性を有する。
【０１６４】
ＰＡＳペプチドの非限定的な例としては、ＡＳＰＡＡＰＡＰＡＳＰＡＡＰＡＰＳＡＰＡ（配列番号１５４）、ＡＡＰＡＳＰＡＰＡＡＰＳＡＰＡＰＡＡＰＳ（配列番号１５５）、ＡＰＳＳＰＳＰＳＡＰＳＳＰＳＰＡＳＰＳＳ（配列番号１５６）、ＡＰＳＳＰＳＰＳＡＰＳＳＰＳＰＡＳＰＳ（配列番号１５７）、ＳＳＰＳＡＰＳＰＳＳＰＡＳＰＳＰＳＳＰＡ（配列番号１５８）、ＡＡＳＰＡＡＰＳＡＰＰＡＡＡＳＰＡＡＰＳＡＰＰＡ（配列番号１５９）、ＡＳＡＡＡＰＡＡＡＳＡＡＡＳＡＰＳＡＡＡ（配列番号１６０）またはそれらの変異体、誘導体、断片、またはそれらのいずれかの組合せが挙げられる。例えば、ＰＡＳ配列の更なる例は、米国特許出願公開第２０１０／０２９２１３０号Ａ１明細書および国際公開第２００８／１５５１３４号Ａ１パンフレット、欧州特許第２１７３８９０号明細書から公知である。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、ＰＡＳ配列は、Ｇｌｙ−Ｓｅｒペプチドリンカー配列を介して、Ｃ末端、Ｎ末端または両末端に隣接配置される。いくつかの実施形態では、Ｇｌｙ−Ｓｅｒペプチドリンカーは、Ｇｌｙ４Ｓｅｒ（配列番号１６１）である。他の実施形態では、Ｇｌｙ−セリンペプチドリンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２（配列番号１６２）である。
【０１６６】
ＩＩ．Ｂ．６．ＨＡＰ
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種部分は、ホモアミノ酸ポリマー（ＨＡＰ）ペプチド、またはその断片、変異体もしくは誘導体である。特定の態様では、本開示のＦＩＸ融合タンパク質は、ＦＩＸ内に挿入される、ＦＩＸのＣ末端に融合する、またはその両方である、少なくとも１つのホモアミノ酸ポリマー（ＨＡＰ）ペプチド、またはその断片、変異体もしくは誘導体を含み、ＦＩＸ融合タンパク質は、凝血原活性を有し、インビボで、またはインビトロで宿主細胞において発現することができる。ＨＡＰペプチドは、少なくとも５０アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、１２０アミノ酸、１４０アミノ酸、１６０アミノ酸、１８０アミノ酸、２００アミノ酸、２５０アミノ酸、３００アミノ酸、３５０アミノ酸、４００アミノ酸、４５０アミノ酸または５００アミノ酸のグリシンの反復配列を含んでもよい。ＨＡＰ配列は、ＨＡＰ配列に融合するかまたは連結される部分の半減期を増加させることができる。ＨＡＰ配列の非限定的な例としては、限定されないが（Ｇｌｙ）ｎ、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎまたはＳ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎが挙げられ、式中、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０である。一実施形態では、ｎは２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２６、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０である。別の実施形態では、ｎは５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０または２００である。Ｓｃｈｌａｐｓｃｈｙ  Ｍら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓｉｇｎ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ、２０：２７３〜２８４（２００７）を参照されたい。
【０１６７】
ＩＩ．Ｂ．７．有機ポリマー
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種部分は、有機ポリマー（例えばポリエチレングリコール、ポリシアル酸またはヒドロキシエチルデンプン）である。特定の態様では、本開示のＦＩＸ融合タンパク質は、ＦＩＸに挿入される、ＦＩＸのＣ末端に融合する、またはその両方である、非ポリペプチド異種部分またはその断片、変異体もしくは誘導体のための少なくとも１つの付着部位を含み、ＦＩＸ融合タンパク質は、凝血原活性を有し、インビボで、またはインビトロで宿主細胞において発現することができる。例えば、本開示のＦＩＸ融合タンパク質は、ＦＩＸ配列内に付着するか、ＦＩＸのＣ末端に付着するか、またはその両方である、１つまたはそれ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含んでもよく、ＦＩＸ融合タンパク質は、凝血原活性を有し、インビボで、またはインビトロで宿主細胞において発現することができる。
【０１６８】
ＰＥＧ化ＦＩＸとは、ＦＩＸと少なくとも１つのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子との間で形成されるコンジュゲートのことを指す。ＰＥＧは、多様な分子量および平均分子量範囲のものが市販されている。ＰＥＧの平均分子量範囲の典型例としては、約２００、約３００、約４００、約６００、約１０００、約１３００〜１６００、約１４５０、約２０００、約３０００、約３０００〜３７５０、約３３５０、約３０００〜７０００、約３５００〜４５００、約５０００〜７０００、約７０００〜９０００、約８０００、約１００００、約８５００〜１１５００、約１６０００〜２４０００、約３５０００、約４００００、約６００００および約８００００ダルトンが挙げられるが、これらに限定されない。これらの平均分子量は、単なる例示として示すものであり、いかなる形であれ限定的なものでない。
【０１６９】
本開示のＦＩＸ融合タンパク質は、モノまたはポリ（例えば２〜４）ＰＥＧ部分を含むようＰＥＧ化することができる。ＰＥＧ化は、従来技術において公知のいずれかのＰＥＧ化反応によって実施することができる。ＰＥＧ化タンパク質生成物の調製方法は一般に、（ｉ）本開示のペプチドが、１つまたはそれ以上のＰＥＧ基と付着する条件下で、ポリペプチドをポリエチレングリコール（例えばＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体）と反応させる工程と、（ｉｉ）反応生成物を得る工程とを含む。一般に、反応のための最適反応条件は、公知のパラメーターおよび所望の結果に基づき、ケースバイケースにより決定される。
【０１７０】
当業者が利用できる多くのＰＥＧの付着方法が、例えばＭａｌｉｋ  Ｆら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０：１０２８〜３５（１９９２）、Ｆｒａｎｃｉｓ、Ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ３（２）：４〜１０（１９９２）、欧州特許出願公開第０４０１３８４号、第０１５４３１６号および第０４０１３８４号明細書、ならびに国際公開第９２／１６２２１号および第９５／３４３２６号パンフレットに記載されている。非限定的な例としては、ＦＩＸ変異体の本明細書に記載される１つまたはそれ以上の挿入部位、またはその近傍に、システイン置換を設け、さらに該システインをＰＥＧポリマーとコンジュゲートさせることが挙げられる。全開示内容が参照により本明細書に組み込まれるＭｅｉら、Ｂｌｏｏｄ  １１６：２７０〜２７９（２０１０）および米国特許第７，６３２，９２１号を参照されたい。
【０１７１】
他の実施形態では、有機ポリマーはポリシアル酸（ＰＳＡ）である。ＰＳＡは、特定の菌株により、および哺乳動物の特定の細胞において産生される、天然に存在する、分岐のないシアル酸ポリマーである。Ｒｏｔｈ  Ｊ．ら、（１９９３）ｉｎ  Ｐｏｌｙｓｉａｌｉｃ  Ａｃｉｄ：Ｆｒｏｍ  Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  ｔｏ  Ｍａｎ編、Ｒｏｔｈ  Ｊ．、Ｒｕｔｉｓｈａｕｓｅｒ  Ｕ．、Ｔｒｏｙ  Ｆ．Ａ．（ＢｉｒｋｈａｕｓｅｒＶｅｒｌａｇ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、３３５〜３４８頁を参照されたい。ＰＳＡは、限定酸加水分解により、またはノイラミニダーゼの切断により、または天然の細菌由来の形態のポリマーの分画により、シアル酸残基数ｎ＝約８０超からｎ＝２まで、各種の重合度で製造することができる。当業者が利用できる多くのＰＳＡ付着方法が存在し、例えば上記のＰＥＧ付着方法と同様である。特定の態様では、活性化ＰＳＡはまた、ＦＩＸ上のシステインアミノ酸残基に付着することができる。米国特許第５８４６９５１号を参照されたい。
【０１７２】
他の実施形態では、有機ポリマーはヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）である。特定の態様では、本開示のＦＩＸ融合タンパク質は、ＦＩＸ内の１つまたはそれ以上の部位にコンジュゲートするか、ＦＩＸのＣ末端に融合するか、またはその両方である、少なくとも１つのＨＥＳポリマーを含み、ＦＩＸ融合タンパク質は、凝血原活性を有し、インビボで、またはインビトロで宿主細胞において発現することができる。
【０１７３】
ＩＩＩ．ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞および製造方法
本開示はさらに、本明細書に記載されるＦＩＸ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、該ポリヌクレオチドもしくはベクターを含む宿主細胞、またはＦＩＸ融合タンパク質を製造する方法を提供する。
【０１７４】
ＦＩＸ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、単一のヌクレオチド配列、２つのヌクレオチド配列、３つのヌクレオチド配列またはそれ以上であり得る。一実施形態では、単一のヌクレオチド配列は、ＦＩＸポリペプチドおよび異種部分（例えばＸＴＥＮ）を含むＦＩＸ融合タンパク質をコードし、ＦＩＸ融合タンパク質は例えば、ＦＩＸポリペプチドと、ＦＩＸポリペプチド内に挿入されるＸＴＥＮと、ＦＩＸポリペプチドのＣ末端に融合するＦｃドメインと、任意のリンカーを介してＦＩＸポリペプチドに融合する第２のＦｃドメインとを含む。別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、２つのヌクレオチド配列を含み、第１のヌクレオチド配列は、ＦＩＸポリペプチドおよびＦＩＸポリペプチド内に挿入されるＸＴＥＮをコードし、第２のヌクレオチド配列は、異種部分（例えばＦｃ）をコードする。他の実施形態では、ポリヌクレオチドは、２つのヌクレオチド配列を含み、第１のヌクレオチド配列は、ＦＩＸポリペプチドと、ＦＩＸポリペプチド内に挿入されるＸＴＥＮと、ＦＩＸポリペプチドに融合するＦｃドメインとをコードし、第２のヌクレオチド配列は、第２のＦｃドメインをコードする。コードされるＦｃドメインは、発現後に共有結合を形成することができる。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、ＦＩＸ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、コドンを最適化される。
【０１７６】
本明細書中で使用する場合、「発現ベクター」とは、適切な宿主細胞に導入されたときに、挿入されたコーディング配列の転写および翻訳を行うために必要なエレメントを含む、またはＲＮＡウイルスベクターの場合には、複製および翻訳を行うために必要なエレメントを含む、あらゆる核酸構築物を意味する。発現ベクターとしては、プラスミド、ファージミド、ウイルスおよびその誘導体が挙げられる。
【０１７７】
本明細書で用いられる遺伝子発現の制御配列は、例えばプロモーター配列またはプロモーター、エンハンサーの組合せなど、いずれの制御的ヌクレオチド配列であってもよく、それらは作動可能連結されるコーディング核酸の効率的な転写および翻訳を促進する。遺伝子発現の制御配列は、例えば、哺乳動物またはウイルス由来のプロモーター（例えば構成的または誘導性プロモーター）であってもよい。哺乳動物の構成的プロモーターとしては、限定されないが、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、アデノシンデアミナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、β−アクチンプロモーター遺伝子のプロモーター、および他の構成的プロモーターが挙げられる。例えば、真核細胞において構成的に機能する例示的なウイルス由来プロモーターとしては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス（例えば、ＳＶ４０）、乳頭腫ウイルス、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ラウス肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス由来のプロモーター、モロニー白血病ウイルスおよび他のレトロウイルスの末端反復配列（ＬＴＲ）、および単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターが挙げられる。他の構成的プロモーターは、当業者に公知である。本開示の遺伝子発現配列として有用なプロモーターにはまた、誘導性プロモーターが含まれる。誘導性プロモーターは、誘導剤の存在下で発現する。例えば、メタロチオネインプロモーターは、特定の金属イオンの存在下で誘導され、転写および翻訳を促進する。他の誘導性プロモーターは、当業者に公知である。
【０１７８】
本開示の目的において、多くの発現ベクター系を使用することができる。発現ベクターは、典型的には、エピソームとして、または宿主の染色体ＤＮＡの一部として、宿主生物内で複製することができる。発現ベクターは、限定されないがプロモーター（例えば天然のまたは異種プロモーター）、エンハンサー、シグナル配列、スプライスシグナル、エンハンサーエレメントおよび転写終結配列などの発現制御配列を含み得る。好ましくは、発現制御配列は、真核生物の宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションできるベクターの真核生物プロモーター系である。発現ベクターでは、例えばウシ乳頭腫ウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶまたはＭＯＭＬＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）またはＳＶ４０ウイルスなどの動物性のウイルスに由来するＤＮＡエレメントを利用することもできる。その他としては、内部リボソーム結合部位を有するポリシストロン性の系の使用が挙げられる。
【０１７９】
一般に、発現ベクターは、選択マーカー（例えばアンピシリン耐性、ハイグロマイシン耐性、テトラサイクリン耐性またはネオマイシン耐性）を含み、所望のＤＮＡの塩基配列によって変換された細胞の検出が可能になっている（例えば、Ｉｔａｋｕｒａら、米国特許第４，７０４，３６２号を参照）。ＤＮＡが染色体に組み込まれた細胞は、トランスフェクトされた宿主細胞の選択を可能にする１つまたはそれ以上のマーカーを導入することによって選抜できる。マーカーは、栄養要求性、生物致死剤（例えば抗生物質）抵抗性または銅などの重金属への耐性を、原栄養性宿主に提供することができる。選択マーカーの遺伝子配列は、発現させるＤＮＡ遺伝子配列と直接連結させてもよく、同時トランスフェクションにより同じ細胞内に導入してもよい。
【０１８０】
最適化されたＦＩＸ配列の発現に有用なベクターの一例は、ＮＥＯＳＰＬＡ（米国特許第６，１５９，７３０号）である。このベクターは、サイトメガロウイルスプロモーター／エンハンサー、マウスβグロビン主要プロモーター、ＳＶ４０複製開始点、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼのエキソン１およびエキソン２、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子およびリーダー配列を含む。このベクターは、可変領域および定常領域の遺伝子の取り込み、細胞へのトランスフェクション、それに続くＧ４１８を含む培地における選抜およびメトトレキセート増幅に応じて、抗体の非常に高レベルでの発現をもたらすことがわかっている。ベクター系は、米国特許第５，７３６，１３７号および第５，６５８，５７０号明細書においても教示され、それぞれの全開示内容が参照により本明細書に組み込まれる。この系は、例えば＞３０ｐｇ／細胞／日の高い発現レベルを提供するものである。他の例示的なベクター系は、例えば米国特許第６，４１３，７７７号に開示される。
【０１８１】
他の実施形態では、本開示のポリペプチドは、ポリシストロン性の構築物を使用して発現される。これらの発現系において、例えばマルチマー結合タンパク質の複数のポリペプチドなどの、目的の多重遺伝子産物は、単一のポリシストロン性構築物から産生させることができる。これらの系では、内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）を使用して、真核生物宿主細胞において相対的に高いレベルのポリペプチドを提供するのが好適である。互換性を有するＩＲＥＳ配列は、本明細書に参照により組み込まれる米国特許第６，１９３，９８０号に開示されている。
【０１８２】
さらに一般的にいえば、ポリペプチドをコードするベクターまたはＤＮＡの塩基配列を調製した後、発現ベクターを適切な宿主細胞に導入することができる。すなわち、宿主細胞を形質転換することができる。宿主細胞へのプラスミドの導入は、上記のように、当業者に公知の各種の技術により行うことができる。形質転換細胞は、ＦＩＸポリペプチドの産生に適する条件で増殖させ、ＦＩＸポリペプチドの合成についてのアッセイに供される。例示的なアッセイ技術としては、酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）または蛍光活性化セルソーター分析（ＦＡＣＳ）、免疫組織化学分析等が挙げられる。
【０１８３】
組換え宿主からのポリペプチドの単離プロセスの説明において、用語「細胞」および「細胞培養」は、特に断りのない限り、ポリペプチドの給源を意味するものとして、交換可能に用いられる。換言すれば、「細胞」からのポリペプチドの回収は、スピンダウンさせた細胞全体からのもの、または、培地および懸濁している細胞を含む細胞培養物からのもの、のいずれを意味するものであってもよい。
【０１８４】
タンパク質の発現に使用する宿主細胞系は、好ましくは哺乳動物由来であり、最も好ましくはヒトまたはマウス由来である。例示的な宿主細胞系は、上記のとおりである。ＦＩＸ活性を有するポリペプチドを産生する方法の一実施形態では、宿主細胞はＨＥＫ２９３細胞である。ＦＩＸ活性を有するポリペプチドを産生する方法の別の一実施形態では、宿主細胞はＣＨＯ細胞である。
【０１８５】
本開示のポリペプチドをコードする遺伝子は、例えば細菌または酵母または植物細胞などの非哺乳動物の細胞において発現させてもよい。この点に関しては、細菌などの各種の非哺乳動物の単細胞性微生物、すなわち培養または発酵において増殖させることができる微生物を形質転換できることは明らかである。形質転換され易い細菌としては、腸内細菌（例えば大腸菌またはサルモネラ菌の株）のメンバー、バチルス属細菌（例えば枯草菌）、肺炎球菌、レンサ球菌およびインフルエンザ菌が挙げられる。さらに前記のポリペプチドは、細菌内で発現させたとき、典型的には封入体の一部となることが理解される。該ポリペプチドは、単離され、精製され、さらに機能的な分子として構成されなければならない。
【０１８６】
あるいは、本開示のポリヌクレオチド配列は、トランスジェニック動物のゲノムへの導入用の導入遺伝子に組み込むことにより、トランスジェニック動物の乳中にそれを発現することができる（例えばＤｅｂｏｅｒら、米国特許第５，７４１，９５７号明細書、Ｒｏｓｅｎ、米国特許第５，３０４，４８９号明細書、およびＭｅａｄｅら、米国特許第５，８４９，９９２号明細書を参照）。適切な導入遺伝子では、ポリペプチドのコーディング配列が、プロモーターおよび乳腺特異的遺伝子（例えばカゼインまたはβラクトグロブリン）由来エンハンサーと作動可能に連結された形で含まれる。
【０１８７】
インビトロ製造によりスケールアップが可能となり、所望のポリペプチドを大量生産することができる。組織培養条件下での哺乳動物細胞培養技術は当業者に公知の技術であり、例えばエアーリフト反応装置、または連続撹拌反応装置における均一な懸濁培養、または、例えば中空糸、マイクロカプセルもしくはアガロースマイクロビーズ中に、またはセラミックカートリッジ上に細胞を固定化もしくは捕捉させた培養が挙げられる。ポリペプチドの溶液は、例えばゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥセルロースクロマトグラフィーまたは（イムノ）アフィニティークロマトグラフィーなどの慣習的なクロマトグラフィー法により、例えば合成ヒンジ領域ポリペプチドの優先的な生合成の後、または本明細書に記載されるＨＩＣクロマトグラフィーの前後において、必要に応じて、および／または望ましい場合に、精製することができる。アフィニティータグ配列（例えばＨｉｓ（６）タグ）を、ポリペプチド配列内に任意に付着させるかまたは含めることにより、下流側での精製を容易にすることが可能となる。
【０１８８】
ＦＩＸタンパク質は、発現させた後、硫安沈殿、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ精製、ゲル電気泳動等の当技術分野の標準的な手順に従い精製することができる（一般的方法についてはＳｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．、（１９８２）を参照）。医薬用途において、少なくとも約９０〜９５％の均一性の実質的に純粋なタンパク質が好ましく、最も好ましくは９８〜９９％、またはそれより高い均一性である。
【０１８９】
一実施形態では、宿主細胞は真核細胞である。本明細書中で使用する場合、「真核細胞」とは、明確な核を有するあらゆる動物または植物細胞を意味する。動物の真核細胞としては、例えば脊椎動物（例えば哺乳動物）および無脊椎動物（例えば昆虫）の細胞が挙げられる。植物の真核細胞としては、限定されないが、酵母細胞が特に挙げられる。真核細胞は、原核細胞（例えば細菌）とは別である。
【０１９０】
特定の実施形態では、真核細胞は哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞は、哺乳動物に由来するあらゆる細胞である。具体的には、哺乳動物細胞には、限定されないが、哺乳動物細胞系が包含される。一実施形態では、哺乳動物細胞はヒト細胞である。別の実施形態では、哺乳動物細胞はＨＥＫ２９３細胞であり、それはヒト胎生期の腎臓細胞系である。ＨＥＫ２９３細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）からＣＲＬ−１５３３として、２９３Ｈ細胞は、カタログ番号１１６３１−０１７として、または２９３Ｆ細胞は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）からカタログ番号１１６２５−０１９として入手可能である。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞はＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞であり、それは網膜由来のヒト細胞系であり、またＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞は、Ｃｒｕｃｅｌｌ社（Ｌｅｉｄｅｎ、オランダ）から入手可能である。他の実施形態では、哺乳動物細胞はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。ＣＨＯ細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手可能である（例えば、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＣＬ−６１）。さらに他の実施形態では、哺乳動物細胞は乳児ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞である。ＢＨＫ細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．）から入手可能である（例えばＣＲＬ−１６３２）。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞はＨＫＢ１１細胞であり、それはＨＥＫ２９３細胞およびヒトＢ細胞系のハイブリッド細胞系である。Ｍｅｉら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３４（２）：１６５〜７８（２００６）を参照されたい。
【０１９１】
さらに他の実施形態では、トランスフェクション細胞は、安定的にトランスフェクトされる。これらの細胞は、当業者に公知の従来技術を用いて、安定な細胞系として選抜され、また維持することができる。
【０１９２】
タンパク質のためのＤＮＡ構築物を含む宿主細胞は、適切な増殖培地において増殖させる。本明細書で用いる適切な成長培地という用語は、細胞増殖のために必要となる栄養分を含む培地を意味する。細胞増殖のために必要となる栄養分としては、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミン、ミネラルおよび成長因子が挙げられる。培地には、１つまたはそれ以上の選択因子を任意に含めることができる。培地には、子ウシ血清またはウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を任意に含めることができる。一実施形態では、培地は実質的にＩｇＧを含まない。増殖培地では一般に、ＤＮＡ構築物上の選抜マーカーにより、またはＤＮＡ構築物のコトランスフェクションにより補足される、例えば薬剤選抜または必須栄養素の欠損に基づき、ＤＮＡ構築物を含む細胞を選抜する。哺乳動物細胞は一般に、市販の血清含有培地または無血清培地（例えばＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２）におい増殖する。一実施形態では、培地はＣＤ２９３培地である（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ．）。他の実施形態では、培地はＣＤ１７培地である（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ．）。使用する特定の細胞系に適切な培地の選択は、当業者の技量の範囲内である。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、核酸、ベクターまたは宿主細胞は、タンパク質コンベルターゼをコードする更なるヌクレオチドをさらに含む。タンパク質コンベルターゼは、プロタンパク質コンベルターゼサブチリシン／ケキシン５型（ＰＣＳＫ５またはＰＣ５）、プロタンパク質コンベルターゼサブチリシン／ケキシン７型（ＰＣＳＫ７またはＰＣ５）、酵母Ｋｅｘ２、プロタンパク質コンベルターゼサブチリシン／ケキシン３型（ＰＡＣＥまたはＰＣＳＫ３）およびそれらの２つ以上の組合せからなる群から選択することができる。いくつかの実施形態では、タンパク質コンベルターゼはＰＡＣＥ、ＰＣ５またはＰＣ７である。特定の一実施形態では、タンパク質コンベルターゼはＰＣ５またはＰＣ７である。参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１２／００６６２３号を参照されたい。別の実施形態では、タンパク質コンベルターゼはＰＡＣＥ／フーリンである。
【０１９４】
特定の態様では、本開示は、本明細書に記載される方法により産生されるＦＩＸ融合タンパク質に関する。
【０１９５】
特定の態様では、本開示の宿主細胞は、インビボで、またはインビトロで、ＦＩＸ融合タンパク質を発現することができる。インビトロ製造によりスケールアップが可能となり、本開示の所望の改変されたポリペプチドを大量生産することができる。ＦＩＸ融合タンパク質は、ＦＩＸ融合タンパク質が発現される条件下で本明細書に記載される宿主細胞を培養することにより製造することができる。組織培養条件下での哺乳動物細胞培養技術は当業者に公知の技術であり、例えばエアーリフト反応装置、または連続撹拌反応装置における均一な懸濁培養、または、例えば中空糸、マイクロカプセルもしくはアガロースマイクロビーズ中に、またはセラミックカートリッジ上に細胞を固定化もしくは捕捉させた培養が挙げられる。必要に応じて、および／または望ましい場合には、ポリペプチドの溶液を、例えばゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、ＤＥＡＥセルロースクロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィーなどの慣習的なクロマトグラフィー法により精製することができる。他の態様では、宿主細胞はインビボでＦＩＸ融合タンパク質を発現する。
【０１９６】
一実施形態では、本開示は、本明細書に記載されるように異種部分を挿入部位に挿入するか、ＦＩＸのＣ末端に異種部分を融合させるか、またはその両方を行うことを含み、ＦＩＸ融合タンパク質が凝血原活性を示す、ＦＩＸ融合タンパク質を製造する方法を包含する。
【０１９７】
他の実施形態では、本開示は、本明細書に記載されるように異種部分を挿入部位に挿入するか、ＦＩＸのＣ末端に異種部分を融合させるか、またはその両方を行うことを含み、ＦＩＸ融合タンパク質が、異種部分のないＦＩＸタンパク質と比較し凝血原活性および増加した半減期を示す、ＦＩＸタンパク質の凝血原活性を除去させるかまたは低下させることなくＦＩＸタンパク質の半減期を増加させる方法を包含する。
【０１９８】
他の実施形態では、本開示は、ＦＩＸ融合タンパク質を構築する方法であって、本明細書に記載されるように、少なくとも１つの異種部分が、挿入部位に含まれるか、ＦＩＸのＣ末端に融合するか、またはその両方であるＦＩＸ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を設計することを含む、方法を提供する。
【０１９９】
特定の実施形態では、本開示は、本明細書に記載されるように、挿入部位に異種部分を挿入するか、ＦＩＸのＣ末端に融合させるか、またはその両方を行うことを含み、ＦＩＸ融合タンパク質が凝血原活性を示す、ＦＩＸ融合タンパク質の発現を増加させる方法を包含する。
【０２００】
さらに別の実施形態では、本開示は、ＦＩＸ融合タンパク質の凝血原活性を保持する方法であって、本明細書に記載されるように、異種部分を挿入部位に挿入するか、異種部分をＦＩＸのＣ末端に融合させるか、またはその両方を行うことを含み、ＦＩＸ融合タンパク質が凝血原活性を示す、方法を提供する。
【０２０１】
ＩＶ．医薬組成物および処置方法
本開示はさらに、本開示のＦＩＸ融合タンパク質を含む医薬組成物を使用して、それを必要とするヒト対象の凝固疾患もしくは症状、または出血症状を予防、治療、改善または管理する方法を提供する。例示的な方法は、本開示のＦＩＸ融合タンパク質を含む医薬組成物／製剤を治療的有効量でそれを必要とする対象に投与することを含む。他の態様では、本開示の融合タンパク質をコードするＤＮＡを含む組成物を、それを必要とする対象に投与することができる。本開示の特定の態様では、本開示のＦＩＸ融合タンパク質を発現する細胞を、それを必要とする対象に投与することができる。本開示の特定の態様では、医薬組成物は、（ｉ）ＦＩＸ融合タンパク質、（ｉｉ）ＦＩＸ融合タンパク質をコードする単離された核酸、（ｉｉｉ）ＦＩＸ融合タンパク質をコードする核酸を含むベクター、（ｉｖ）ＦＩＸ融合タンパク質をコードする単離された核酸および／またはＦＩＸ融合タンパク質をコードするベクターを含む細胞、または、（ｖ）それらのいずれかの組合せとを含み、また該医薬組成物は、許容される賦形剤または担体をさらに含む。
【０２０２】
一態様では、本開示は、対象にＦＩＸ融合タンパク質を投与することを含む、因子ＩＸ（ＦＩＸ）融合タンパク質を投与する方法であって、
（ａ）ＦＩＸ融合タンパク質は、ＦＩＸポリペプチドと、少なくとも１つのＸＴＥＮとを含み、ＸＴＥＮは、ＦＩＸポリペプチドの、配列番号２のアミノ酸１０３、配列番号２のアミノ酸１０５、配列番号２のアミノ酸１４２、配列番号２のアミノ酸１４９、配列番号２のアミノ酸１６２、配列番号２のアミノ酸１６６、配列番号２のアミノ酸１７４、配列番号２のアミノ酸２２４、配列番号２のアミノ酸２２６、配列番号２のアミノ酸２２８、配列番号２のアミノ酸４１３、およびそれらのいずれかの組合せからなる群から選択されるアミノ酸に対応する挿入部位に挿入され、
（ｂ）ＦＩＸ融合タンパク質は、皮下投与され、
（ｃ）投与後、ＦＩＸ融合タンパク質は、約１％〜約３０％の（例えば約５％〜約３０％の）血漿中活性を示す、方法に関する。
【０２０３】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＦＩＸ融合タンパク質の投与後、ＦＩＸ融合タンパク質の血漿中活性は、処置の間（例えば第１の投与から第２投与までの間）、約１％〜約３０％、例えば５％〜３０％、例えば１％〜２０％、例えば５％〜２０％、例えば１％〜１０％、例えば５％〜１０％、例えば約１０％〜約３０％、約１０％〜約２０％である。例えば、本明細書に開示されるＦＩＸ融合タンパク質の投与の後の血漿中活性は、処置期間中（例えば第１の投与から第２、３、４、５、６、７、８、９または１０、またはそれ以上の投与までの間）、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％または１０％超、かつ３０％、２９％、２８％、２７％、２６％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％または１１％未満であり得る。
【０２０４】
いくつかの実施形態では、ＦＩＸ融合タンパク質は有効量で投与される。特定の実施形態では、ＦＩＸ融合タンパク質は、約１ＩＵ／ｋｇ〜約５００ＩＵ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態では、ＦＩＸ融合タンパク質は、約５０ＩＵ／ｋｇ〜約３００ＩＵ／ｋｇ、約５０ＩＵ／ｋｇ〜約２５０ＩＵ／ｋｇ、約５０ＩＵ／ｋｇ〜約２００ＩＵ／ｋｇ、約５０ＩＵ／ｋｇ〜約１５０ＩＵ／ｋｇ、約５０ＩＵ／ｋｇ〜約１００ＩＵ／ｋｇ、約１００ＩＵ／ｋｇ〜約３００ＩＵ／ｋｇ、約１５０ＩＵ／ｋｇ〜約３００ＩＵ／ｋｇ、約２００ＩＵ／ｋｇ〜約３００ＩＵ／ｋｇ、約２５０ＩＵ／ｋｇ〜約３００ＩＵ／ｋｇ、約１００ＩＵ／ｋｇ〜約２５０ＩＵ／ｋｇ、約１００ＩＵ／ｋｇ〜約２００ＩＵ／ｋｇ、約１００ＩＵ／ｋｇ〜約１５０ＩＵ／ｋｇ、約１５０ＩＵ／ｋｇ〜約２５０ＩＵ／ｋｇまたは約１５０ＩＵ／ｋｇ〜約２００ＩＵ／ｋｇの用量で投与される。一実施形態では、ＦＩＸ融合タンパク質は、約５０ＩＵ／ｋｇ〜約３００ＩＵ／ｋｇの用量で投与される。
【０２０５】
いくつかの実施形態では、ＦＩＸ融合タンパク質は、約２５ＩＵ／ｋｇ、約５０ＩＵ／ｋｇ、約７５ＩＵ／ｋｇ、約１００ＩＵ／ｋｇ、約１２５ＩＵ／ｋｇ、約１５０ＩＵ／ｋｇ、約１７５ＩＵ／ｋｇ、約２００ＩＵ／ｋｇ、約２２５ＩＵ／ｋｇ、約２５０ＩＵ／ｋｇ、約２７５ＩＵ／ｋｇ、約３００ＩＵ／ｋｇ、約３２５ＩＵ／ｋｇ、約３５０ＩＵ／ｋｇ、約３７５ＩＵ／ｋｇまたは約４００ＩＵ／ｋｇの用量で投与される。一実施形態では、ＦＩＸ融合タンパク質は、約１００ＩＵ／ｋｇの用量で投与される。別の実施形態では、ＦＩＸ融合タンパク質は、約２００ＩＵ／ｋｇの用量で投与される。
【０２０６】
いくつかの実施形態では、ＦＩＸ融合タンパク質は、約１％〜約５０％の血漿中活性ピーク値を示す。いくつかの実施形態では、ＦＩＸ融合タンパク質は、約５％〜約５０％、約１０％〜約５０％、約１５％〜約５０％、約２０％〜約５０％、約２５％〜約５０％、約３０％〜約５０％、約３５％〜約５０％、約４０％〜約５０％、約１０％〜約４５％、約１５％〜約４０％、約２０％〜約４０％、約２０％〜約３５％、約２５％〜約４０％または約２５％〜約３５％の血漿中活性ピーク値を示す。特定の実施形態では、ＦＩＸ融合タンパク質は、約１０％〜約３０％の血漿中活性ピーク値を示す。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、ＦＩＸ融合タンパク質は、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、約２６％、約２７％、約２８％、約２９％または約３０％の血漿中活性ピーク値を示す。特定の一実施形態では、ＦＩＸ融合タンパク質は、約３０％の血漿中活性ピーク値を示す。別の実施形態では、ＦＩＸ融合タンパク質は、約１５％の血漿中活性ピーク値を示す。
【０２０８】
いくつかの実施形態では、ＦＩＸ融合タンパク質は、約１％〜約２０％の血漿中活性トラフ値を示す。特定の実施形態では、ＦＩＸ融合タンパク質は、約５％〜約２０％、約１０％〜約２０％、約１５％〜約２０％、約１％〜約１５％、約１％〜約１０％、約１％〜約５％または約５％〜約１５％の血漿中活性トラフ値を示す。一実施形態では、ＦＩＸ融合タンパク質は、約５％〜約１０％の血漿中活性トラフ値を示す。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、ＦＩＸ融合タンパク質は、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％または約１５％の血漿中活性トラフ値を示す。特定の一実施形態では、ＦＩＸ融合タンパク質は、約５％の血漿中活性トラフ値を示す。
【０２１０】
本開示のＦＩＸ融合タンパク質は、静脈内に、皮下に、または経口的に、患者に投与することができる。特定の実施形態では、ＦＩＸ融合タンパク質は、静脈内注入により対象に投与される。他の実施形態では、ＦＩＸ融合タンパク質は、皮下注入により対象に投与される。注入では、単回ボーラスを含めることができる。対象には、複数回の注入を行うことができる。
【０２１１】
本開示の融合タンパク質は、予防目的で使用することができる。本明細書中で使用する場合、「予防的処置」という用語は、出血エピソード以前における分子の投与を意味する。一実施形態では、一般的な止血剤を必要とする対象は、手術を受けているか、または受けようとしている。本開示の融合タンパク質は、予防薬として、手術前に、または手術後に投与することができる。本開示の融合タンパク質は、手術の間または後に投与され、急性の出血エピソードを制御することができる。手術には、肝移植、肝臓切除、歯科的手順または幹細胞移植が含まれるが、これらに限定されない。
【０２１２】
本開示の融合タンパク質はまた、オンデマンドでの処置に使用される。用語「オンデマンドでの処置」とは、出血エピソードの兆候に応答するか、または出血を引き起こし得る活動前における、融合タンパク質の投与を意味する。一態様では、オンデマンドでの処置は、例えば損傷後などの出血が始まるとき、または例えば手術前などの出血が予想されるとき、対象に与えられる。別の態様では、オンデマンドでの処置は、例えば接触の多いスポーツなど、出血の危険度が高い活動の前に行われる。
【０２１３】
他の実施形態では、融合タンパク質は、急性の出血エピソードを制御、改善または処理するために用いる。他の実施形態では、ＦＩＸ融合タンパク質は、異種部分のない対応するＦＩＸタンパク質との比較における１つまたはそれ以上の薬物動態学的パラメーターを示す。ＰＫパラメーターは、ＦＩＸ抗原量（しばしば「抗原」として括弧書きで本明細書に示す）またはＦＩＸ活性レベル（しばしば「活性」として括弧書きで本明細書に示す）に基づいてもよい。文献では、ＰＫパラメーターはＦＩＸ活性レベルに基づくものが多いが、それは、対象の血漿中に存在する、投与された（すなわち外因性の）ＦＩＸを抗ＦＩＸ抗体を使用して測定することを妨げる、内因性の不活性なＦＩＸが存在するからである。しかしながら、本明細書に示すようにＦｃ融合タンパク質の一部としてＦＩＸを投与するとき、投与された（すなわち外因性の）ＦＩＸ抗原は、異種ポリペプチドに対する抗体を使用することで正確に測定することができる。加えて、特定のＰＫパラメーターは、モデル予測データ（しばしば「モデル予測」として括弧書きで本明細書に示す）か、または観察されたデータ（しばしば「観察された」として括弧書きで本明細書に示す）に基づいてもよく、好ましくは、観察されたデータに基づく。
【０２１４】
ＦＩＸ融合タンパク質は、公知技術のあらゆる手段で対象に投与してもよい。例えば、ＦＩＸ融合タンパク質は、局所（例えば経皮もしくは眼内）、経口、バッカル、鼻腔内、膣内、直腸内、非経口（例えば皮下、皮内、血管内／静脈内、筋肉内、脊髄、頭蓋内、鞘内、眼内、眼球内、眼窩内、腱滑液鞘内および腹腔内）投与により投与することができる。特定の一実施形態では、ＦＩＸ融合タンパク質は皮下注入により投与される。例えば、皮下注入は、ＦＩＸ融合タンパク質の用量の単回ボーラスを含む、１つまたはそれ以上のボーラスを含んでもよい。あるいは、ＦＩＸ融合タンパク質は、静脈内注入により投与してもよい。
【０２１５】
ＦＩＸ融合タンパク質の用量は、特定の融合タンパク質の性質および対象の症状の性質に応じて変化させることができる。いくつかの実施形態では、ＦＩＸ融合タンパク質の用量は、ＦＩＸ融合タンパク質１〜１０００ＩＵ／ｋｇとし得る。
【０２１６】
出血症状は、血液凝固障害により生じることもある。血液凝固障害は、凝血異常とも呼ばれる。１つの例において、本開示の医薬組成物で治療できる血液凝固障害は、血友病である。別の例において、本開示の医薬組成物で治療できる血液凝固障害は、血友病Ｂである。
【０２１７】
いくつかの実施形態では、出血症状と関連する出血のタイプは、出血性関節症、筋肉内出血、口腔出血、多量出血、筋肉への多量出血、口腔での多量出血、外傷、頭部外傷、消化管出血、頭蓋内多量出血、腹腔内多量出血、胸腔内多量出血、骨折、中枢神経系出血、咽頭後隙の出血、腹膜後隙の出血および腸腰筋鞘の出血から選択される。
【０２１８】
他の実施形態では、出血症状に罹患する対象は、例えば外科手術前の予防的管理または手術中の管理など、手術の際の処置を必要とする。１つの例において、手術は、小手術および大手術から選択される。例示的な外科的手技としては、抜歯、扁桃摘出、鼠径部のヘルニア切開、滑膜切除、開頭、骨接合、外傷手術、頭蓋内手術、腹腔内手術、胸腔内手術、関節置換手術（例えば全膝置換、臀部置換等）、心臓手術および帝王切開が挙げられる。
【０２１９】
別の例では、対象は同時に因子ＶＩＩＩによる処置を受ける。本開示の化合物はＦＩＸａを活性化できるため、それらは対象へのＦＩＸａの投与前にＦＩＸａポリペプチドを予め活性化するために使用できると考えられる。
【０２２０】
本開示の方法は、予防的処置またはオンデマンドでの処置を必要とする対象に施すことができる。
【０２２１】
例えば、本開示のＦＩＸ融合タンパク質を含む医薬組成物は、局所（例えば経皮もしくは眼内）、経口、バッカル、鼻腔内、膣内、直腸内、非経口投与など、あらゆる適切な投与方法のためにも調製することができる。
【０２２２】
本明細書で用いられる用語「非経口」とは、皮下、皮内、血管内（例えば静脈）、筋肉内、脊髄、頭蓋内、鞘内、眼内、眼球内、眼窩内、腱滑液鞘内および腹腔内への注入、ならびにあらゆる類似の注入もしくは点滴技術を包含する。特に、本開示のＦＩＸ融合タンパク質を含む医薬組成物は、皮下投与用に調製することができる。組成物は、例えば懸濁液、エマルジョン、持続的放出製剤、クリーム剤、ゲル剤または粉剤としてもよい。組成物は、トリグリセリド等の伝統的な結合剤および担体を用いて坐剤として製剤化してもよい。
【０２２３】
１つの例において、医薬製剤は、例えば緩衝化等張水溶液などの液状製剤である。別の例において、医薬組成物は、生理的ｐＨ、または生理的ｐＨ付近のｐＨを有する。他の例において、水性製剤は生理的、または生理的に近いモル浸透圧および塩分濃度を有する。それは塩化ナトリウムおよび／または酢酸ナトリウムを含んでもよい。いくつかの例において、本開示の組成物は凍結乾燥される。
【０２２４】
本開示の融合タンパク質は、遺伝子療法を用いて、哺乳動物（例えばヒト患者）においてインビボで産生されてもよく、出血性凝固障害、出血性関節症、筋肉内出血、口腔出血、多量出血、筋肉への多量出血、口腔での多量出血、外傷、頭部外傷、消化管出血、頭蓋内多量出血、腹腔内多量出血、胸腔内多量出血、骨折、中枢神経系出血、咽頭後隙の出血、腹膜後隙の出血および腸腰筋鞘の出血からなる群から選択される出血性の疾患または障害の治療的アプローチにおいて有用である。一実施形態では、出血性の疾患または障害は、血友病である。他の実施形態では、出血性の疾患または障害は、血友病Ｂである。この場合、適切な発現制御配列に作動可能に連結された、適切な融合タンパク質をコードする核酸を投与することを含む。特定の実施形態では、これらの配列は、ウイルスベクターに組み込まれる。かかる遺伝子治療用の適切なウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスのベクター、エプスタイン＝バーウイルスベクター、パポバウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、単純ヘルぺスウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが挙げられる。ウイルス性ベクターは、複製能に欠陥を有するウイルスベクターであり得る。他の実施形態では、アデノウイルスベクターは、そのＥ１遺伝子またはＥ３遺伝子の欠失を有する。アデノウイルスベクターを用いるとき、哺乳動物は、選択可能なマーカー遺伝子をコードする核酸に曝露させないのが望ましい。他の実施形態では、当業者に公知の非ウイルスベクターに前記配列を組み込む。
【０２２５】
本開示の実施は、特に明記しない限り、従来技術の細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、細菌学、組換えＤＮＡ学および免疫学的方法を使用して行われ、またそれらは当業者の技量の範囲内である。かかる技術は、以下の文献において詳細に説明されている。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編、Ｉ巻およびＩＩ巻（１９８５）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編（１９８４）、Ｍｕｌｌｉｓら、米国特許第４，６８３，１９５号明細書、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、（１９８４）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ、Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８４）、Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ、Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．、（１９８７）、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、（１９８６）、Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、Ｎ．Ｙ．、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ、Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８７）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１５４および１５５巻（Ｗｕら編）、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ（１９８７）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｉ〜ＩＶ巻、Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編（１９８６）、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、（１９８６）、およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）を参照されたい。
【０２２６】
免疫学の一般的原理を記載する標準的な参考図書としては、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｋｌｅｉｎ、Ｊ．、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｓｅｌｆ−Ｎｏｎｓｅｌｆ  Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８２）、Ｒｏｉｔｔ，Ｉ．、Ｂｒｏｓｔｏｆｆ，Ｊ．およびＭａｌｅ  Ｄ．、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第６版、Ｌｏｎｄｏｎ：Ｍｏｓｂｙ（２００１）、Ａｂｂａｓ  Ａ．、Ａｂｕｌ，Ａ．およびＬｉｃｈｔｍａｎ，Ａ．、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第５版、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（２００５）、ならびにＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８）が挙げられる。
【０２２７】
以上のとおり本開示を詳細に記載したが、それらは以下の実施例を参照することでより明確に理解されるが、それらは説明を目的とするものに過ぎず、本開示を限定することを目的とするものではない。
【実施例】
【０２２８】
実施例１：活性ＦＩＸ−ＸＴＥＮ変異体の同定
１つまたはそれ以上のＸＴＥＮが挿入されたＦＩＸポリペプチドを含むことでＦＩＸタンパク質の特性が改善されたＦＩＸ融合タンパク質を構築した。しかしながら、ＸＴＥＮ修飾の位置、長さ、組成および数を容易に変化させることにより、それによりＦＩＸの活性およびクリアランスに対するこれらの修飾の影響を評価することもできる。
【０２２９】
本実施例は、ＦＩＸ活性を損なうことなくＸＴＥＮの導入に適応でき、このアプローチをその他の未変性ＦＩＸおよび組換えＦＩＸ−Ｆｃ融合タンパク質に適用できるＦＩＸの部位を同定することを意図するものである。
【０２３０】
方法：
開始Ｍｅｔ残基をコードするＡＴＧコドンの直ぐ５’側へのＫｏｚａｋ翻訳開始配列（ＧＣＣＧＣＣＡＣＣ）の導入の後、ＦＩＸポリペプチドのコーディング配列を、発現ベクターｐｃＤＮＡ４／ｍｙｃ−ＨｉｓＣ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（登録商標）Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）のＢｓｉＷＩとＰｍｅＩとの間にライゲートした。
【０２３１】
ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＰＡ）を使用して、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（商標）、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）にプラスミドをトランスフェクトした。一時的にトランスフェクトした細胞を、ＦＲＥＥＳＴＹＬＥ（商標）２９３培地またはＦＲＥＥＳＴＹＬＥ（商標）２９３培地とＣＤ  ＯＰＴＩＣＨＯ（商標）培地（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（商標）、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）との混合物において増殖させた。細胞培地をトランスフェクションの５日後に回収し、発色またはａＰＴＴ  ＦＩＸ活性アッセイにより、ＦＩＸ活性を解析した。
【０２３２】
発色ＦＩＸ活性はＡｎｉａｒａ社製のＢＩＯＰＨＥＮ因子ＩＸキットを用いて測定し、またすべてのインキュベーションを３７℃のプレートヒーターにて振とうしながら行った。６ウェルプレートから得たＦＩＸ−ＸＴＥＮ変異体の一時的なトランスフェクション培地から培養細胞を回収し、トリス−ＢＳＡ希釈バッファー（Ｒ４）を使用して所望のＦＩＸ活性範囲に希釈した。ＦＩＸ標準もまた、トリス−ＢＳＡ希釈バッファーにおいて調製した。標準、希釈された細胞培養サンプルおよびプールされた正常ヒト血漿アッセイ対照（５０μＬ／ウェル）を、ＩＭＭＵＬＯＮ（登録商標）２ＨＢ  ９６ウェルプレート２枚ずつに添加した。ヒト因子Ｘ、ＦＶＩＩＩ：Ｃおよびフィブリン重合阻害剤（５０μＬ）、５０μＬの因子ＸＩａ、トロンビン、リン脂質およびカルシウムの混合物、ならびに因子Ｘａ特異的な発色基質（ＳＸａ−１１）５０μＬを各ウェルに順次添加し、その際、各添加の間に２分間インキュベートした。基質とインキュベートした後、５０μＬの２０％酢酸を添加して呈色反応を終了させ、４０５ｎｍの吸光度をＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ（登録商標）プラス（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＤＥＶＩＣＥＳ（登録商標））装置により測定した。ＳＯＦＴＭＡＸ（登録商標）Ｐｒｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（バージョン５．２）を使用してデータ解析を行った。
【０２３３】
一段階活性化部分的トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）凝固アッセイを用い、ＦＩＸ活性を評価した。ＳＹＳＭＥＸ（登録商標）ＣＡ−１５００機器（Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ、ＮＹ）を使用してＦＩＸ−ＸＴＥＮ  ａＰＴＴ活性を測定した。アッセイの標準曲線を作成するため、ＷＨＯの因子ＩＸ標準を、試験サンプルとして適切な培地濃度を有するｍｏｃｋトランスフェクション培地で希釈した。６ウェルプレートから得たＦＩＸ−ＸＴＥＮ変異体の一時的なトランスフェクション培地から培養細胞を回収し、ｍｏｃｋトランスフェクション培地を使用して所望のＦＩＸ活性範囲に希釈した。希釈後、Ｓｙｓｍｅｘ装置を使用して以下のようにａＰＴＴアッセイを行った：５０μＬの希釈された標準およびサンプルを、５０μＬのＳｉｅｍｅｎｓヒトＦＩＸ除去血漿、および５０μＬのＳｉｅｍｅｎｓアクチンＦＳＬ（エラグ酸）アクチベーターと混合した。混合物を１分間インキュベートした。次に、５０μＬのＳｉｅｍｅｎｓ  ＣａＣｌ２を混合物に添加し、混合物を２４０秒間インキュベートした。このインキュベートの直後、凝固時間を測定した。試験サンプルのＦＩＸ活性を測定するため、対数スケールを使用して凝固時間とＦＩＸ活性との間の相関式を外挿して標準の凝固時間をプロットし、次にＦＩＸ−ＸＴＥＮ活性を標準曲線に対して算出した。
【０２３４】
挿入部位の選抜：
タンパク質データバンクを用い、１ＰＦＸ、１ＩＸＡ、１ＣＦＩ、１ＣＦＨ、１ＥＤＭ、３ＬＣ３、３ＬＣ５、１ＲＦＮ、１Ｘ７Ａおよび３ＫＣＧのＦＩＸ構造を解析し、ＦＩＸ内のＸＴＥＮ挿入部位を選抜した。リン脂質表面および内皮下タイプＩＶコラーゲンへの固定というＦＩＸのＧＬＡドメインの基本的役割を考慮し、ＧＬＡドメイン内へのＸＴＥＮ挿入は回避した。以下の基準に従い、タンパク質データバンクの利用可能なＦＩＸ構造の解析を行い、ＸＴＥＮ挿入部位を選抜した：１）ＡＳＡ  Ｖｉｅｗ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｂｒｅｎ．ｎｅｔ／ａｓａｖｉｅｗ／）およびＧｅｔ  Ａｒｅａ（ｈｔｔｐ：／／ｃｕｒｉｅ．ｕｔｍｂ．ｅｄｕ／ｇｅｔａｒｅａ．ｈｔｍｌ）アルゴリズムソフトウェアによるアクセス可能な表面領域の算出、
２）水素／重水素交換質量スペクトロメトリー（Ｈ／ＤＸ−ＭＳ）による溶媒のアクセス可能性、
３）決定された二次構造エレメント、
４）顕著な種間タンパク質配列可変性に基づく部位の選択性、および
５）公知の血友病Ｂ変異に近接する部位の除外。
【０２３５】
ＥＧＦ１ドメインの４つの部位、ＥＧＦ２ドメインの５つの部位、ＡＰドメインとＥＧＦ２ドメインとの間のリンカー領域の２つの部位、ＡＰ（活性化ペプチド）ドメインの４つの部位、および触媒ドメインの１８の部位を、ＸＴＥＮの挿入のために選抜した（表６）。
【０２３６】
【表７】
2020505424.tif 000010
【０２３７】
４２アミノ酸のＸＴＥＮの挿入およびC末端への融合の際の活性スクリーニング
高活性のＦＩＸ  Ｐａｄｕａ変異体（Ｒ３３８Ｌ）を用いて、ＸＴＥＮの導入により生じる活性低下に起因する潜在的なＦＩＸ活性低下に対応する足場とした。４２残基ＸＴＥＮエレメント（ＡＥ４２）を、上記の基準を用いて選抜した部位に挿入し、またはＦＩＸのＣ末端に融合させた。上記のトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の調整培地において、これらの変異体のＦＩＸ活性を評価した。ＸＴＥＮのないベース構築物（ＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌ）に対するパーセンテージとして、ＦＩＸ−ＡＥ４２のＦＩＸ活性を示す（図１）。
【０２３８】
ＸＴＥＮ挿入は、ＦＩＸ発色アッセイにより決定された限られた部位において許容されるものであった（図１および表７）。ＦＩＸ内の合計３３の部位を選抜し、ＡＥ−４２の挿入により評価した。これらの内、ＥＧＦ２ドメインの２つ、ＥＧＦ２ドメインとＡＰドメインとの間のリンカー領域の１つ、ＡＰドメインの４つ、および触媒ドメインの４つ（またＣ末端を含む）を、ＦＩＸ活性アッセイによる許容部位として同定した（図１および表７）。
【０２３９】
【表８】
2020505424.tif 000011
【０２４０】
長いＸＴＥＮの挿入およびＣ末端への融合における活性：
次に、長いＸＴＥＮ（ＡＥ−７２、−１４４および−２８８）を、ＡＥ４２の挿入が許容された部位において同様に試験した。ＦＩＸ活性を前述のように測定し、ＸＴＥＮのないベース構築物ＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌに対するパーセンテージとして示す（図２）。
【０２４１】
ＡＰ内の部位およびＦＩＸのＣ末端もしくはそれ近傍の部位のみにおいて、長いＸＴＥＮ（ＡＥ１４４、ＡＥ２８８またはＡＥ８６４）が許容された（図２）。ＦＩＸ活性は、調整培地において、導入されたＸＴＥＮの長さと逆相関する形で検出された（図２、表７）。ＦＩＸの異なるドメインにおける４つの挿入可能部位を選抜し、コンビナトリアルライブラリーを作製した。
複数のＸＴＥＮの挿入：
【０２４２】
ＸＴＥＮ単一変異体により得られた結果に基づき、様々な長さの複数のＸＴＥＮ挿入を有する、４つの異なる部位におけるＦＩＸ変異体（図４および表８を参照）を、ａＰＴＴアッセイにより、トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の調整培地中でのＦＩＸ活性を評価した（表８〜１０）。ＦＩＸ活性は、ＸＴＥＮのないベース構築物であるＦＩＸ−Ｒ３３８Ｌに対するパーセンテージとして示す（図４）。
【０２４３】
【表９】
2020505424.tif 000012
【０２４４】
【表１０】
2020505424.tif 000013
【０２４５】
【表１１】
2020505424.tif 000014
【０２４６】
３つの群（単一のＸＴＥＮを有するＦＩＸ、二重にＸＴＥＮを挿入されたＦＩＸおよび単一のＸＴＥＮ挿入を有するＦＩＸ−Ｆｃ）では、検出可能な活性が示された一方、３つ以上の部位での挿入／融合の組合せを有する場合にはＦＩＸ活性が失われた（図４）。
【０２４７】
結論として、ＸＴＥＮ挿入のためのいくつかの許容される部位はＦＩＸに存在し、またＸＴＥＮ挿入変異の選択された組合せはＦＩＸ活性が保持される。ここで同定された活性型のＦＩＸ−ＸＴＥＮ変異体は、血友病Ｂマウスの薬物動態学的解析の候補となる。
【０２４８】
実施例２：ＦＩＸ融合タンパク質およびその血漿における回復およびＡＵＣ／Ｄ
最初に、因子ＸＩ欠損マウス（ＨｅｍＢ、Ｂ６．１２９Ｐ２−Ｆ９ｔｍ１Ｄｗｓ／Ｊ、ＭＧＩ：１９３２２９７）（Ｌｉｎら、１９９７）を、Ｄａｒｒｅｌ  Ｓｔａｆｆｏｒｄ博士（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ、Ｃｈａｐｅｌ  Ｈｉｌｌ）から取得した。オス／メスのＨｅｍＢマウスに、各々、５０または２００ＩＵ／ｋｇのＦＩＸ融合タンパク質（例えばＦＩＸ−ＣＴ．２８８（ＡＥ２８８  ＸＴＥＮがＦＩＸポリペプチドのＣ末端に融合）、ＦＩＸ−ＣＴ．８６４（ＡＥ８６４  ＸＴＥＮがＦＩＸポリペプチドのＣ末端に融合）、ＦＩＸ−ＡＰ．１４４（ＦＩＸポリペプチドのＡＰドメイン内のＤ１６６の後にＡＥ１４４  ＸＴＥＮが挿入）、ＦＩＸ−ＡＰ．７２（ＦＩＸポリペプチドのＡＰドメイン内のＤ１６６の後にＡＥ７２  ＸＴＥＮが挿入）、ＦＩＸ−ＡＰ．４２（ＦＩＸポリペプチドのＡＰドメイン内のＤ１６６の後にＡＥ４２  ＸＴＥＮが挿入）、ＦＩＸＦｃおよびＦＩＸ）を、ｔ＝０時間において１０ｍＬ／ｋｇの投与体積で、静脈内へ単回ボーラス注入した。投与後５分〜最大１６８時間（７日）において、血液を採取した。示される各時点において、各時点当たり３〜４匹のマウスの眼窩後または末梢大静脈から、〜１００μＬのクエン酸添加血液を採取した。マウス当たりの採血部位は多くとも３箇所とした。血漿を５０００ｒｐｍで８分間遠心分離し、血漿サンプルをドライアイス・エタノール浴において瞬間凍結し、−８０℃で保存し、その後、Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ試薬、および活性化剤としてのアクチンＦＳＬ、および活性標準としての投与材料を用い、Ｓｙｓｍｅｘ−ＣＡ１５００凝固アナライザーにおける一段階活性トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）−アッセイによる分析を行った。図５Ａ〜５Ｂにおいて、血漿中活性を、注入された用量に対する％としてプロットする。平均滞留時間（ＭＲＴ）および他の薬物動態学的（ＰＫ）パラメーターは、Ｐｈｏｅｎｉｘ  ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ  ６．２．１（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ社、Ｃｅｒｔｅｒａ、ＮＣＡ分析）による非区画モデリングを用いて算出した。図５Ｃは、血漿における回復（Ｙ軸）とそれに対するＭＲＴ（Ｘ軸）の相対値を表す。ドットの領域は、用量あたりの曲線下領域（ＡＵＣ／Ｄ（ｈ／ｋｇ／ｍＬ））を表し、ＦＩＸの血漿中活性の回復およびＡＵＣ／Ｄが、ＸＴＥＮの長さの増加と共に増加することを示す（図５Ｃ）。図は、長いＸＴＥＮ長（Ｃ末端における２８８および８６４、ならびにＡＰドメインにおける１４４、７２および４２）を有するＦＩＸ融合タンパク質では、静脈内ボーラス投与後、血漿における回復がサイズ依存的に最大６０％に増加し、またＡＵＣ／Ｄが増加したことを示す。
【０２４９】
実施例３：ＦＩＸ融合タンパク質およびそれらの半減期
ＦＩＸ欠損マウスに、以下のＦＩＸ融合タンパク質５０または２００ＩＵ／ｋｇの用量を静脈内投与した：２８８アミノ酸を有するＸＴＥＮ（例えばＡＥ２８８）を融合させたＦＩＸ；７２アミノ酸を有するＸＴＥＮ（例えばＡＥ７２）をＡＰドメインのＤ１６６の後に挿入したＦＩＸ−Ｆｃ；４２アミノ酸を有するＸＴＥＮ（例えばＡＥ４２）をＡＰドメインのＤ１６６の後に挿入したＦＩＸ−Ｆｃ；および対照（例えばＦＩＸＦｃおよびＦＩＸ）。血漿を回収し、ＦＩＸ活性およびＰＫ分析を、実施例５に記載されるのと同様に行った。図６Ａは、血漿中活性を注入された用量に対する％としてプロットしたものである。薬物動態学的（ＰＫ）パラメーターは、Ｐｈｏｅｎｉｘ  ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ  ６．２．１（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ社、Ｃｅｒｔｅｒａ、ＮＣＡ分析）を用いて算出し、図６Ｂは、血漿における回復（Ｙ軸）とそれに対するＭＲＴ（Ｘ軸）の相対値を表す。ドットの領域は、用量あたりの曲線下領域（ＡＵＣ／Ｄ（ｈ／ｋｇ／ｍＬ））を表し、ＦＩＸＦｃの活性化ペプチド（ＡＰ）ドメインへのＸＴＥＮ配列の挿入が、ＦＩＸ（図６Ｂ）と比較し、ｒＦＩＸＦｃ単独のそれ以上に、平均滞留時間を延長することを示す。加えて、血漿中活性の回復およびＡＵＣ／Ｄは、ＸＴＥＮ長の増加と共に改善される（図６Ａ〜６Ｂ）。ｒＦＩＸ−ＣＴ．２８８（配列番号２２６）およびｒＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２（配列番号１５１）のＡＵＣ／Ｄは、それぞれ、ｒＦＩＸＦｃと比較し３．４および４．５倍の改善であった（図６Ａ〜６Ｂ）。これは、ｒＦＩＸの静脈内投与と比較し、それぞれ、８．５および１４．５倍のＡＵＣ／Ｄの改善に相当する（図６Ａ〜６Ｂ）。したがって、ＡＰドメインへのＸＴＥＮ挿入と、ｒＦＩＸＦｃ−Ｒ３３８ＬのＦｃにより媒介される半減期増加との組合せにより、ｒＦＩＸおよびｒＦＩＸＦｃと比較し、半減期の増加、血漿中活性の回復およびＡＵＣ／用量の増加がもたらされる。
【０２５０】
実施例４：皮下送達によるＦＩＸ融合タンパク質の薬物動態の改善
ＦＩＸ欠損マウスに、以下のＦＩＸ融合タンパク質５０または２００ＩＵ／ｋｇの用量を、ｔ＝０において皮下投与した：２８８アミノ酸のＸＴＥＮ（例えばＡＥ２８８）をＣ末端に融合させたＦＩＸ（ＦＩＸ−ＣＴ．２８８）；ＡＰドメインに７２アミノ酸（例えば、ＡＥ７２）のＸＴＥＮを有するＦＩＸＦｃ（ＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２）；ＥＧＦ２ドメインに４２アミノ酸（例えばＡＥ４２）のＸＴＥＮを有するＦＩＸＦｃ（例えばＦＩＸＦｃ−ＥＧＦ．４２）；ならびに対照（ＦＩＸＦｃおよびＦＩＸ）。血漿を回収し、ＦＩＸ活性およびＰＫ分析を、実施例１に記載されるのと同様に行った。図７Ａは、血漿中活性を注入された用量に対する％としてプロットしたものである。薬物動態学的（ＰＫ）パラメーターは、Ｐｈｏｅｎｉｘ  ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ  ６．２．１（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ社、Ｃｅｒｔｅｒａ、ＮＣＡ分析）を用いて算出し、図７Ｂは、バイオアベイラビリティ（Ｙ軸）とそれに対するＭＲＴ（Ｘ軸）の相対値を表す。ドットの領域は、ドットの領域は、用量あたりの曲線下領域（ＡＵＣ／Ｄ（ｈ／ｋｇ／ｍＬ））を表し、ｒＦＩＸのＸＴＥＮポリペプチド配列のカルボキシル末端への融合、またはＦＩＸＦｃの活性化ペプチド（ＡＰ）ドメインまたはＥＧＦ２ドメインへのＸＴＥＮ配列の挿入が、ＦＩＸ融合タンパク質の皮下投与プロファイルを非常に改善することを示す（図７Ｂ）。ｒＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２およびｒＦＩＸ−ＣＴ．２８８は、ＨｅｍＢマウスへのｒＦＩＸＦｃの皮下投与と比較し、ＡＵＣ／Ｄの６〜９倍の改善、バイオアビアビリティの１．５〜２倍の改善、およびＣｍａｘ／Ｄの３〜１０倍の改善を示した。ｒＦＩＸと比較し、ＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２およびｒＦＩＸ−ＣＴ．２８８では、薬物動態学的パラメーターの２８〜４０倍のＡＵＣ／Ｄの改善、バイオアビアビリティの３倍の増加、およびＣｍａｘ／Ｄの１５〜３０倍の改善が見られた（図７Ａ〜７Ｂ）。
【０２５１】
まとめると、ＦＩＸ融合タンパク質（例えばｒＦＩＸ−ＣＴ．２８８およびｒＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２）は、ｒＦＩＸＦｃの静脈内投与と比較し、皮下投与において２．６および１．９倍のＡＵＣ／Ｄの改善を示し、これは週一回以下のヒトへの静脈内への予防的投与をサポートするものである。
【０２５２】
実施例５：ＦＩＸ融合タンパク質のインビトロ有効性
ヒトの血友病Ｂ血液を、ｒＦＩＸＦｃ（白丸、点線）、またはＦＩＸ融合タンパク質（例えばｒＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２）（黒丸、実線）またはビヒクル（白三角）３、１０および３０ＩＵ／ｄＬの示される用量によりスパイクした（図８Ａ〜８Ｃ）。全血の凝固特徴を回転トロンボエラストメリー（ＲＯＴＥＭ）を用いて測定し、血液（ＮＡＴＥＭ）の再石灰化により凝固を開始させた。凝固時間（ＣＴ、秒）、α角度（度）および最大凝血塊硬さ（ＭＣＦ、ｍｍ）に関しては、ｒＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２は、血友病Ｂの血液において、ｒＦＩＸＦｃと比較し同等の活性を示した（図８Ａ〜８Ｃ）。各時点のデータは、４〜５サンプルの反復実験の平均＋／−標準偏差である（図８Ａ〜８Ｃ）。
【０２５３】
ｒＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２およびｒＦＩＸ−ＣＴ．２８８は、ＨｅｍＢマウスにおいて、ｒＦＩＸおよびｒＦＩＸＦｃと比較し非常に改善された皮下における薬物動態を示す。前臨床動物モデルにおける有効性およびアロメトリックスケーリングに関する更なる研究は、現在進行中である。
【０２５４】
実施例６：急性マウス尾部クリップ出血モデルにおけるｒＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２のインビボ有効性
文献の記載に従い（Ｄｕｍｏｎｔら、Ｂｌｏｏｄ、１１９（１３）：３０２４〜３０３０、２０１２）、盲検のマウスの尾部クリップ出血モデルにおいて、投与を受けたマウスの尾部切断後の全失血を測定することにより、急性有効性を試験した。簡潔に述べると、８〜１５週齢のオスの血友病Ｂマウス（Ｌｉｎら、Ｂｌｏｏｄ（１９９７）９０：３９６２〜３９６６）を、５０ｍｇ／ｋｇのケタミンおよび０．５ｍｇ／ｋｇのデキスメデトミジンの混合液により麻酔した。尾部を３７℃にて１０分間食塩水に浸漬して側脈を拡張させ、次に、ビヒクル（３．８８ｇ／ＬのＬ−ヒスチジン、２３．８ｇ／Ｌのマンニトール、１１．９ｇ／Ｌのスクロース、３．２５ｇ／Ｌの塩化ナトリウム、０．０１％（ｗ／ｖ）のポリソルベート２０（ｐＨ７．１）、３％のヒト血清アルブミン）、５０、１００および２００ＩＵ／ｋｇのｒＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２またはｒＦＩＸＦｃを尾静脈注入した。注入後５分において、尾部の遠位側先端５ｍｍをクリップし、１３ｍＬの食塩水を含む予め秤量した試験管に３０分間浸漬させた。失血を重量により測定した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６にて、対応のない両側ｔ検定を使用し、統計的有意差を算出した。かかる両側ｔ検定により、ｒＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２の５０、１００および２００ＩＵ／ｋｇの投与が、ビヒクルと著しく異なる効果を奏することが示された（ｐ値＜０．０００１）。加えて、このデータは、低用量のｒＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２（例えば５０ＩＵ／ｋｇ）が、同じ低用量のｒＦＩＸＦｃ（すなわち５０ＩＵ／ｋｇ）と比較し著しく失血を抑制することを示す。これらの結果は、本出血モデルにおいて、ｒＦＩＸＦｃと比較した、ｒＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２の同等もしくは改善された急性有効性を示す。
【０２５５】
実施例７：予防的マウス尾静脈切断出血モデルにおけるＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２のインビボ有効性
文献の記載に従い（Ｔｏｂｙら、ＰＬＯＳ  Ｏｎｅ、ＤＯＩ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１４８２５５、２０１６、Ｐａｎら、Ｂｌｏｏｄ  １１４：２８０２〜２８２２（２００９））、盲検のマウスの尾静脈切断（ＴＶＴ）出血モデルにおいて、投与を受けた血友病Ｂマウスの外側尾静脈横断切断後の生存期間を測定することにより、長期有効性を試験した。簡潔には、８〜１５週齢のオスの血友病Ｂマウス（Ｌｉｎら、Ｂｌｏｏｄ  ９０：３９６２〜３９６６（１９９７））に、ｒＦＩＸＦｃを１５、５０、１００ＩＵ／ｋｇのＦＩＸ活性にて静脈内に、またはＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２をそれとマッチングする用量にて皮下に前投薬し、ビヒクルをボーラス投与したマウスと比較した。投与後７２時間において、すべてのマウスを麻酔し、外側尾静脈を２．７ｍｍの尾部直径において横断切断した。ＴＶＴ後９〜１１時間の間、および２４時間（一晩）の時点にて、再出血および致死時間（安楽死する時間として定義、動物がいつ死に瀕したかを測定）を含む質的エンドポイントをモニターし、１時間ごとに記録した。すべてのマウスを２４時間の試験終了後に安楽死させた一方で、死んでいないか瀕死でない動物を、２４時間目において生存していたものと決定した。
【０２５６】
ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６を用い、ＴＶＴ後のパーセント生存率としてデータをプロットした。マウスに対し、ビヒクル（点線）で皮下投与、ＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２（実線、塗りつぶし記号）で皮下投与、またはＦＩＸＦｃ（点線、白抜き記号）で静脈内投与（１５ＩＵ／ｋｇ、５０ＩＵ／ｋｇ、１００ＩＵ／ｋｇ、ｎ＝２０／用量、但しビヒクル投与ではｎ＝３０）を行った（図１０）。皮下投与されたＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２とそれに対する静脈内投与されたｒＦＩＸＦｃのマッチングＩＵ／ｋｇ用量で処理したマウスの生存曲線から、試験したすべてのｒＦＩＸＦｃの静脈内投与量の場合と比較し、ＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２を皮下投与したＨｅｍＢマウスにおいて、改善された生存率が示された（図１０）。
【０２５７】
実施例８：ＨｅｍＢマウスにおける、ｒＦＩＸと比較した、ＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２（ＦＩＸ−２１６、二重鎖Ｆｃ）の改善された静脈内および皮下薬物動態学的パラメーター
血友病Ｂマウスに、２００ＩＵ／ｋｇのＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２（ＦＩＸ−２１６、二重鎖Ｆｃ）またはｒＦＩＸを投与した。示す時点における眼窩後出血により血液を採取した。活性標準として投与材料を用いた１段階凝固アッセイ活性により、ＦＩＸの血漿中レベルを測定した。図１１Ａにおいて、注入された用量に対する％として血漿中活性をプロットする。図１１Ｂは、ＮＣＡ（非区画）分析により、Ｐｈｏｅｎｉｘ  ＷｉｎＮｏｎＬｉｎ  ６．２．１（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ社製、Ｃｅｒｔａｒａ）を用いて算出した薬物動態学的パラメーターの表を示す。ＦＩＸ−２１６に対するｒＦＩＸの改善された薬物動態学的パラメーターには、平均滞留時間（ＭＲＴ）、ＡＵＣ／用量および他のパラメーターが含まれる。
【０２５８】
ＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２の皮下投与は、マウスへの投与後２０時間周辺においてｔｍａｘを示し、また同等量（ＩＵ／ｋｇ）で静脈内投与されたｒＦＩＸまたはｒＦＩＸＦｃと比較し血漿中活性レベルが改善された。ＨｅｍＢマウスのＴＶＴ出血モデルを用いた結果、投与後７２時間において、皮下投与されたＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２ではすべての試験された用量の静脈内投与されたｒＦＩＸＦｃと比較し、インビボ有効性が改善されたことが示された。同様に、ＨｅｍＢマウス尾部クリップ出血モデルにおける急性有効性テストでは、ｒＦＩＸＦｃと比較し、静脈内投与されたＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２の改善された有効性が示された。これらのデータは、ヒトにおけるＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２の週一回以下の頻度での皮下への予防的投与の可能性を支持するものである。
【０２５９】
実施例９：皮下投与されたｒＦＩＸＦｃ−ＸＴＥＮのＰＫの用量直線性
皮下投与されたｒＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２（ｐＪＨ８４；配列番号１５１）のＰＫ用量直線性を、ＨｅｍＢマウスにおいて評価した。４匹のマウス３群に対し、５０、１００、２００または４００ＩＵ／ｋｇのｒＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２を各々投与した。連続する３時点において、１０％（ｗ／ｖ）のクエン酸中への眼窩後採血により、各マウスから血液を採取した（すなわち投与後１、６、２４、４８、７２、９６、１４４、１６８および１９２時間）。ＦＩＸ活性は、自己標準に対する１段階活性アッセイにより測定した。投与溶液を、ＦＩＸ  ＷＨＯ標準に対して確認した。Ｐｈｏｅｎｉｘプログラム（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ社、Ｍｏｕｎｔａｉｎｖｉｅｗ、ＣＡ）を使用して薬物動態学的分析を行った。血漿中ＦＩＸ活性および回復の算出値をそれぞれ図１４Ａおよび図１４Ｂに示す。ＦＩＸ活性曲線は、用量増加に伴い平行的に移動し（図１４Ａ）、注入した用量の回復のパーセンタイル（％）としてプロットしたときに重複し（図１４Ｂ）、すなわちＨｅｍＢマウスにおける５０〜４００ＩＵ／ｋｇの用量範囲での用量直線性を示すものである。用量直線性は、試験した用量ごとに、実際の測定された用量およびマッチング血漿中活性レベルデータについて、Ｐｈｏｅｎｉｘ  ＷｉｎＮｏｎＬｉｎソフトウェアにより非区画分析を用いて算出したＰＫパラメーターにより確認した（図１４Ｃ）。
【０２６０】
実施例１０：カニクイザルにおけるｒＦＩＸＦｃ−ＸＴＥＮの薬物動態
コホート当たり３匹のナイーブなオスのカニクイザルに対し、静脈内または皮下投与経路により、各々、１００ＩＵ／ｋｇのｒＦＩＸＦｃ−ＸＴＥＮ（ｐＪＨ８４；配列番号１５１）を投与した。示す時点の前後に血液を採取した（図１５Ａ）。ｒＦＩＸＦｃ−ＸＴＥＮ特異的なＥＬＩＳＡ（ＸＴＥＮ−捕捉およびヒトＦＩＸ検出）により、およびｒＦＩＸＦｃ−ＸＴＥＮ特異的な血漿中活性を測定する修飾（ＸＴＥＮ−捕捉）ＦＩＸ発色活性アッセイにより、ＦＩＸの血漿中レベルを測定した。用量はＦＩＸ  ＷＨＯ標準に対して確認し、またｒＦＩＸＦｃ−ＸＴＥＮ血漿中レベルは標準としてｒＦＩＸＦｃ−ＸＴＥＮを使用し測定した。図１５Ａにおいて、血漿中抗原量（点線）および血漿中活性（実線、ｎ＝３）の平均±標準偏差を、注入した用量からの回復のパーセンタイルとしてプロットする。図１５Ｂは、Ｐｈｏｅｎｉｘ  ＷｉｎＮｏｎＬｉｎ  ６．２．１（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ、Ｃｅｒｔａｒａ）を使用して、平均滞留時間（ＭＲＴ）、ＡＵＣ／用量および他のパラメーターを含むＮＣＡ分析により算出したＰＫパラメーターの表を示す。
【０２６１】
実施例１１：静脈内投与および皮下投与の比較
ＨｅｍＢマウスに対し、５０ＩＵ／ｋｇ（実線）、１００（大きな点線）または２００ＩＵ／ｋｇ（小さな点線）でｒＦＩＸＦｃを静脈内投与し、ＦＩＸ血漿中活性レベルを、投与後７日目までの各時点で測定した（図１６）。陰影付きの領域は、１００および２００ＩＵ／ｋｇで皮下投与されたｒＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２（ｐＪＨ８４；配列番号１５１）のモデル化されたＦＩＸ血漿中活性レベルを表し、それは、図１４Ａ〜１４Ｃに記載されるすべての測定された血漿中活性データにフィッティングさせた１区画ＰＫモデルを使用して算出されたものである。皮下投与されたｒＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２は、投与後約１日で、その予測された血漿中ピークに達した。１００ＩＵ／ｋｇおよび２００ＩＵ／ｋｇで皮下投与されたｒＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２の、それぞれ約１５ＩＵ／ｄＬおよび３０ＩＵ／ｄＬのピーク値は、皮下投与経路により過剰投与されるおそれが少なくなることを示すものである。血栓症の潜在的危険性は、１５０ＩＵ／ｋｇ超のピーク値として予想され、それは１５０ＩＵ／ｋｇ以上のｒＦＩＸの静脈内投与により容易に達する注目に値するのは、皮下投与されるｒＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２が、同等の用量で静脈内投与により投与されるｒＦＩＸＦｃよりも高い、投与後１日目における血漿中レベル、および毎週投与による一貫したレベルを提供することを見出したことである。このことは、７日のサイクルの１日目に静脈内投与されるｒＦＩＸＦｃの当量と比較し、ｒＦＩＸＦｃ−ＡＰ．７２の皮下投与により、投与後７日間のうちの６日目まで、より良好に出血を防止し得ることを示唆するものである。
【０２６２】
上記の具体的な実施形態に関する記載は、本開示の一般的な内容が、本開示の一般的な概念を逸脱しない範囲で、過度な実験を要さずに、他の当業者が公知技術を適用することにより、かかる具体的な実施形態を容易に変更でき、および／または、各種の用途に適応させることができることを明確に示すものである。したがって、かかる適応および変更は、本明細書に示される教示および指針に基づき、開示された実施形態と均等の範囲内にあることを意味するものである。本明細書における語法または用語は、説明を目的とするものであり、限定を目的とするものではないことを理解すべきであり、ゆえに、本明細書の用語または語法は、その教示および指針を考慮して、当業者により解釈されるべきものである。
【０２６３】
本開示の他の実施形態は、本明細書の検討および本明細書に開示される内容の実施から、当業者にとり明らかである。明細書および実施例は、例示を目的とするものであり、本開示の真の範囲および趣旨は、後述する特許請求の範囲により示される。
【０２６４】
本願は、全開示内容が参照により本明細書に組み込まれる、２０１７年１月３１日に出願の米国仮特許出願第６２／４５２，８２６号の優先権を主張するものである。
【０２６５】
実施形態：
Ｅ１．因子ＩＸ（ＦＩＸ）融合タンパク質を、それを必要とする対象に投与する方法であって、対象にＦＩＸ融合タンパク質を皮下投与することを含み、
（ａ）該ＦＩＸ融合タンパク質が、ＦＩＸポリペプチドと、少なくとも１つのＸＴＥＮとを含み、該ＸＴＥＮは、配列番号２のアミノ酸１０３、配列番号２のアミノ酸１０５、配列番号２のアミノ酸１４２、配列番号２のアミノ酸１４９、配列番号２のアミノ酸１６２、配列番号２のアミノ酸１６６、配列番号２のアミノ酸１７４、配列番号２のアミノ酸２２４、配列番号２のアミノ酸２２６、配列番号２のアミノ酸２２８、配列番号２のアミノ酸４１３およびそれらのいずれかの組合せからなる群から選択されるアミノ酸に対応する挿入部位で該ＦＩＸポリペプチド内に挿入され、
（ｂ）投与後に、該ＦＩＸ融合タンパク質が、該対象において約５％〜約３０％の血漿中活性を示す、前記方法。
【０２６６】
Ｅ２．ＦＩＸ融合タンパク質が、約５０ＩＵ／ｋｇ〜約４００ＩＵ／ｋｇの用量で投与される、Ｅ１に記載の方法。
【０２６７】
Ｅ３．ＦＩＸ融合タンパク質が、約５０ＩＵ／ｋｇ、約１００ＩＵ／ｋｇ、約２００ＩＵ／ｋｇ、または約４００ＩＵ／ｋｇの用量で投与される、Ｅ１またはＥ２に記載の方法。
【０２６８】
Ｅ４．ＦＩＸ融合タンパク質が、約１０％〜約３０％の血漿中活性ピーク値を示す、Ｅ１〜Ｅ３のいずれか一項に記載の方法。
【０２６９】
Ｅ５．ＦＩＸ融合タンパク質が、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、約２６％、約２７％、約２８％、約２９％または約３０％の血漿中活性ピーク値を示す、Ｅ１〜Ｅ４のいずれか一項に記載の方法。
【０２７０】
Ｅ６．ＦＩＸ融合タンパク質が、約３０％の血漿中活性ピーク値を示す、Ｅ１〜Ｅ５のいずれか一項に記載の方法。
【０２７１】
Ｅ７．ＦＩＸ融合タンパク質が、約５％〜約１０％の血漿中活性トラフ値を示す、Ｅ１〜Ｅ６のいずれか一項に記載の方法。
【０２７２】
Ｅ８．ＦＩＸ融合タンパク質が、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％または約１０％の血漿中活性トラフ値を示す、Ｅ１〜Ｅ７のいずれか一項に記載の方法。
【０２７３】
Ｅ９．ＦＩＸ融合タンパク質が、約５％の血漿中活性トラフ値を示す、Ｅ１〜Ｅ８のいずれか一項に記載の方法。
【０２７４】
Ｅ１０．ＦＩＸ融合タンパク質が、約３０％の血漿中活性ピーク値を示し、ＦＩＸタンパク質が、約５％の血漿中活性トラフ値を示す、Ｅ１〜Ｅ９のいずれか一項に記載の方法。
【０２７５】
Ｅ１１．挿入部位が、配列番号２のアミノ酸１４９、配列番号２のアミノ酸１６２、配列番号２のアミノ酸１６６、配列番号２のアミノ酸１７４およびそれらのいずれかの組合せからなる群から選択されるアミノ酸に対応する、Ｅ１〜Ｅ１０のいずれか一項に記載の方法。
【０２７６】
Ｅ１２．挿入部位が、配列番号２のアミノ酸２２４、配列番号２のアミノ酸２２６、配列番号２のアミノ酸２２８、配列番号２のアミノ酸４１３およびそれらのいずれかの組合せからなる群から選択されるアミノ酸に対応する、Ｅ１〜Ｅ１１のいずれか一項に記載の方法。
【０２７７】
Ｅ１３．挿入部位が、配列番号２のアミノ酸１０３、配列番号２のアミノ酸１０５およびその両方からなる群から選択されるアミノ酸に対応する、Ｅ１〜Ｅ１２のいずれか一項に記載の方法。
【０２７８】
Ｅ１４．挿入部位が配列番号２のアミノ酸１４２に対応する、Ｅ１〜Ｅ１３のいずれか一項に記載の方法。
【０２７９】
Ｅ１５．ＸＴＥＮが、少なくとも約６のアミノ酸、少なくとも約１２のアミノ酸、少なくとも約３６のアミノ酸、少なくとも約４２のアミノ酸、少なくとも約７２のアミノ酸、少なくとも約１４４のアミノ酸または少なくとも約２８８のアミノ酸を含む、Ｅ１〜Ｅ１４のいずれか一項に記載の方法。
【０２８０】
Ｅ１６．ＸＴＥＮが、Ａ４２、Ａ７２、Ａ８６４、Ａ５７６、Ａ２８８、ＡＥ１４４、ＡＧ８６４、ＡＧ５７６、ＡＧ２８８、ＡＧ１４４、またはそれらのいずれかの組合せを含む、Ｅ１〜Ｅ１５のいずれか一項に記載の方法。
【０２８１】
Ｅ１７．ＸＴＥＮが、配列番号３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、およびそれらのいずれかの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一のアミノ酸配列を含む、Ｅ１〜Ｅ１６のいずれか一項に記載の方法。
【０２８２】
Ｅ１８．ＸＴＥＮがＡＥ７２またはＡＥ１４４を含む、Ｅ１６またはＥ１７に記載の方法。
【０２８３】
Ｅ１９．ＸＴＥＮがＡＥ７２を含む、Ｅ１６〜Ｅ１８のいずれか一項に記載の方法。
【０２８４】
Ｅ２０．第２のＸＴＥＮをさらに含む、Ｅ１〜Ｅ１９のいずれか一項に記載の方法。
【０２８５】
Ｅ２１．第２のＸＴＥＮが、配列番号２のアミノ酸１０３、配列番号２のアミノ酸１０５、配列番号２のアミノ酸１４２、配列番号２のアミノ酸１４９、配列番号２のアミノ酸１６２、配列番号２のアミノ酸１６６、配列番号２のアミノ酸１７４、配列番号２のアミノ酸２２４、配列番号２のアミノ酸２２６、配列番号２のアミノ酸２２８、配列番号２のアミノ酸４１３、およびそれらのいずれかの組合せからなる群から選択されるアミノ酸に対応する挿入部位でＦＩＸポリペプチド内に挿入されるか、または、第２のＸＴＥＮが、ＦＩＸポリペプチドのＣ末端に、もしくはＦＩＸポリペプチドのＣ末端に融合するリンカーに融合されている、Ｅ２０に記載の方法。
【０２８６】
Ｅ２２．ＸＴＥＮおよび第２のＸＴＥＮが、それぞれ、以下からなる群から選択されるアミノ酸に対応する挿入部位でＦＩＸポリペプチド内に挿入されるか、および／または、ＦＩＸポリペプチドのＣ末端に融合する、Ｅ２０またはＥ２１に記載の方法：
ｉ．配列番号２のアミノ酸１０５および配列番号２のアミノ酸１６６；
ｉｉ．配列番号２のアミノ酸１０５および配列番号２のアミノ酸２２４；
ｉｉｉ．配列番号２のアミノ酸１０５およびＣ末端に融合される；
ｉｖ．配列番号２のアミノ酸１６６および配列番号２のアミノ酸２２４；
ｖ．配列番号２のアミノ酸１６６およびＣ末端に融合される；および
ｖｉ．配列番号２のアミノ酸２２４およびＣ末端に融合される。
【０２８７】
Ｅ２３．ＸＴＥＮが、配列番号２のアミノ酸１６６に対応する挿入部位で、ＦＩＸポリペプチド内に挿入され、第２のＸＴＥＮは、ＦＩＸポリペプチドのＣ末端に融合する、Ｅ２０またはＥ２１に記載の方法。
【０２８８】
Ｅ２４．第２のＸＴＥＮが、少なくとも約６のアミノ酸、少なくとも約１２のアミノ酸、少なくとも約３６のアミノ酸、少なくとも約４２のアミノ酸、少なくとも約７２のアミノ酸、少なくとも約１４４のアミノ酸または少なくとも約２８８のアミノ酸を含む、Ｅ２０〜Ｅ２３のいずれか一項に記載の方法。
【０２８９】
Ｅ２５．第２のＸＴＥＮが、Ａ４２、Ａ７２、Ａ８６４、Ａ５７６、Ａ２８８、ＡＥ１４４、ＡＧ８６４、ＡＧ５７６、ＡＧ２８８、ＡＧ１４４、またはそれらのいずれかの組合せからなる群から選択される、Ｅ２０からＥ２４のいずれか一項に記載の方法。
【０２９０】
Ｅ２６．第２のＸＴＥＮが、Ａ７２またはＡＥ１４４である、Ｅ２５に記載の方法。
【０２９１】
Ｅ２７．第２のＸＴＥＮが、配列番号３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、およびそれらのいずれかの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一のアミノ酸配列を含む、Ｅ２０〜Ｅ２６のいずれか一項に記載の方法。
【０２９２】
Ｅ２８．第３、第４、第５または第６のＸＴＥＮをさらに含む、Ｅ２０〜Ｅ２７のいずれか一項に記載の方法。
【０２９３】
Ｅ２９．ＦＩＸポリペプチドと、ＸＴＥＮを含む異種部分とを含む方法であって、ＸＴＥＮが、ＦＩＸポリペプチドのＣ末端に融合し、長さが４２アミノ酸より長く１４４アミノ酸より短いアミノ酸配列を含む、方法。
【０２９４】
Ｅ３０．ＸＴＥＮが、５０、５５、６０、６５または７０アミノ酸超、かつ、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０または８０アミノ酸未満、またはそれらのいずれかの組合せの長さのアミノ酸配列を含む、Ｅ２９に記載の方法。
【０２９５】
Ｅ３１．ＸＴＥＮが７２アミノ酸長である、Ｅ３０に記載の方法。
【０２９６】
Ｅ３２．ＸＴＥＮがＡ７２である、Ｅ３１に記載の方法。
【０２９７】
Ｅ３３．ＸＴＥＮが、配列番号３５と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む、Ｅ２９に記載の方法。
【０２９８】
Ｅ３４．Ｆｃドメインをさらに含む、Ｅ１〜Ｅ３３のいずれか一項に記載の方法。
【０２９９】
Ｅ３５．Ｆｃドメインが、ＦＩＸポリペプチドまたはＸＴＥＮに融合する、Ｅ３４に記載の方法。
【０３００】
Ｅ３６．第２のＦｃドメインを含む、Ｅ３４またはＥ３５に記載の方法。
【０３０１】
Ｅ３７．第２のＦｃドメインが、第１のＦｃドメインと会合する、Ｅ３６に記載の方法。
【０３０２】
Ｅ３８．２つのポリペプチド鎖を含み、第１のポリペプチド鎖が、Ｆｃドメインに融合するＦＩＸポリペプチドを含み、第２のポリペプチド鎖が、第２のＦｃドメインを含み、第１のＦｃドメインおよび第２のＦｃドメインが、共有結合によって会合する、Ｅ３６またはＥ３７に記載の方法。
【０３０３】
Ｅ３９．ＦＩＸポリペプチドと、Ｆｃドメインと、第２のＦｃドメインと、Ｆｃドメインおよび第２のＦｃドメインを連結するリンカーとを含む単一のポリペプチド鎖である、Ｅ３６またはＥ３７に記載の方法。
【０３０４】
Ｅ４０．リンカーが、１つまたはそれ以上の細胞内プロセシング部位をさらに含む、Ｅ３９に記載の方法。
【０３０５】
Ｅ４１．リンカーが、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（ｎは１〜１００から選択される整数である）を含む、Ｅ３９またはＥ４０に記載の方法。
【０３０６】
Ｅ４２．配列番号５４〜配列番号１５３からなる群から選択される配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一のアミノ酸配列を、シグナルペプチドおよびプロペプチド配列なしで含む、Ｅ１〜Ｅ４１のいずれか一項に記載の方法。
【０３０７】
Ｅ４３．天然のＦＩＸの凝血原活性の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または１００％を有する、Ｅ１〜Ｅ４２のいずれか一項に記載の方法。
【０３０８】
Ｅ４４．凝血原活性が、発色基質アッセイ、一段階凝固アッセイ、またはその両方により測定される、Ｅ４３に記載の方法。
【０３０９】
Ｅ４５．ＦＩＸポリペプチドが、Ｒ３３８Ｌ  ＦＩＸ変異体である、Ｅ１〜Ｅ４４のいずれか一項に記載の方法。
【０３１０】
Ｅ４６．Ｒ３３８Ｌ  ＦＩＸ変異体が、配列番号２と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む、Ｅ４５に記載の方法。
【０３１１】
Ｅ４７．ＦＩＸ融合タンパク質が、第１の鎖および第２の鎖を含み、
（ａ）第１の鎖が、
（ｉ）ＦＩＸポリペプチドと、
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸１６６に対応する挿入部位で、ＦＩＸポリペプチド内に挿入され、少なくとも約７２のアミノ酸を有するアミノ酸配列を含む、少なくとも１つのＸＴＥＮと、
（ｉｉｉ）前記少なくとも１つのＸＴＥＮのＦＩＸポリペプチドに融合する第１のＦｃドメインと
を含み、
（ｂ）第２の鎖が、第２のＦｃドメインを含み、
第１のＦｃドメインおよび第２のＦｃドメインが、共有結合によって会合する、Ｅ１〜Ｅ１０のいずれか一項に記載の方法。
【０３１２】
Ｅ４８．少なくとも１つのＸＴＥＮが、配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％同一のアミノ酸配列を含む、Ｅ４７に記載の方法。
【０３１３】
Ｅ４９．ＦＩＸ融合タンパク質の第１の鎖が、配列番号２２７のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一のアミノ酸配列を含み、ＦＩＸ融合タンパク質の第２の鎖が、配列番号２２８のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一のアミノ酸配列を含む、Ｅ４７またはＥ４８の方法。
【０３１４】
Ｅ５０．ＦＩＸ融合タンパク質の第１の鎖が、配列番号２２７のアミノ酸配列を含み、ＦＩＸ融合タンパク質の第２の鎖が、配列番号２２８のアミノ酸配列を含む、Ｅ４７〜Ｅ４９のいずれか一項に記載の方法。
【０３１５】
以下のベクター配列は、上記実施例および本願の他の部分において参照される。以下の記号は、配列情報の理解を助けるものである。
【０３１６】
【化２】
2020505424.tif 000015
【化３】
2020505424.tif 000016
【化４】
2020505424.tif 000017
【化５】
2020505424.tif 000018
【化６】
2020505424.tif 000019
【化７】
2020505424.tif 000020
【化８】
2020505424.tif 000021
【化９】
2020505424.tif 000022
【化１０】
2020505424.tif 000023
【化１１】
2020505424.tif 000024
【化１２】
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【化１３】
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【化１４】
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【化１５】
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【化１６】
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【化１７】
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【化１８】
2020505424.tif 000031
【化１９】
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【化２０】
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【化２１】
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【化２２】
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【化２３】
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【化２４】
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【化２５】
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【化２６】
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【化２７】
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【化２８】
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【化２９】
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【化３０】
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【化３１】
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【化３２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
2020505424000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年10月4日(2019.10.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
本発明は、少なくとも１つの異種部分（例えばＸＴＥＮ）を含む因子ＩＸ（ＦＩＸ）融合タンパク質、ならびにＦＩＸ融合タンパクを製造および使用する方法に関する。アスキーテキストファイルとして電子的に提出された配列表の内容（ファイル名：ＳＡ９＿４５６＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ、サイズ：７１２，３６４バイト、作成日：２０１９年７月１５日）は、本願と共に提出され、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０２】
特定の実施形態では、リンカーは、トロンビン切断部位を含む。特定の一実施形態では、トロンビン切断部位はＸＶＰＲを含み、Ｘはいずれかの脂肪族アミノ酸（例えばグリシン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン）である。特定の一実施形態では、トロンビン切断部位はＬＶＰＲ（配列番号２３１）を含む。いくつかの実施形態では、リンカーはＰＡＲ１エキソサイト相互作用モチーフを含み、それはＳＦＬＬＲＮ（配列番号１９０）を含む。いくつかの実施形態では、ＰＡＲ１エキソサイト相互作用モチーフは、Ｐ、ＰＮ、ＰＮＤ、ＰＮＤＫ（配列番号１９１）、ＰＮＤＫＹ（配列番号１９２）、ＰＮＤＫＹＥ（配列番号１９３）、ＰＮＤＫＹＥＰ（配列番号１９４）、ＰＮＤＫＹＥＰＦ（配列番号１９５）、ＰＮＤＫＹＥＰＦＷ（配列番号１９６）、ＰＮＤＫＹＥＰＦＷＥ（配列番号１９７）、ＰＮＤＫＹＥＰＦＷＥＤ（配列番号１９８）、ＰＮＤＫＹＥＰＦＷＥＤＥ（配列番号１９９）、ＰＮＤＫＹＥＰＦＷＥＤＥＥ（配列番号２００）、ＰＮＤＫＹＥＰＦＷＥＤＥＥＳ（配列番号２０１）、またはそれらのいずれかの組合せから選択されるアミノ酸配列をさらに含む。他の実施形態では、リンカーは、ＦＸＩａ切断部位ＬＤＰＲ（配列番号２３２）を含む。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０７】
特定の他の実施形態では、リンカーは、トロンビン切断部位を含む。特定の一実施形態では、トロンビン切断部位はＸＶＰＲを含み、Ｘはいずれかの脂肪族アミノ酸（例えばグリシン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン）である。特定の一実施形態では、トロンビン切断部位は、ＬＶＰＲ（配列番号２３１）を含む。いくつかの実施形態では、リンカーはＰＡＲ１エキソサイト相互作用モチーフを含み、それはＳＦＬＬＲＮ（配列番号１９０）を含む。いくつかの実施形態では、ＰＡＲ１エキソサイト相互作用モチーフは、Ｐ、ＰＮ、ＰＮＤ、ＰＮＤＫ（配列番号１９１）、ＰＮＤＫＹ（配列番号１９２）、ＰＮＤＫＹＥ（配列番号１９３）、ＰＮＤＫＹＥＰ（配列番号１９４）、ＰＮＤＫＹＥＰＦ（配列番号１９５）、ＰＮＤＫＹＥＰＦＷ（配列番号１９６）、ＰＮＤＫＹＥＰＦＷＥ（配列番号１９７）、ＰＮＤＫＹＥＰＦＷＥＤ（配列番号１９８）、ＰＮＤＫＹＥＰＦＷＥＤＥ（配列番号１９９）、ＰＮＤＫＹＥＰＦＷＥＤＥＥ（配列番号２００）、ＰＮＤＫＹＥＰＦＷＥＤＥＥＳ（配列番号２０１）、またはそれらのいずれかの組合せから選択されるアミノ酸配列をさらに含む。特定の他の実施形態では、リンカーは、ＬＤＰＲ（配列番号２３２）を含むＦＸＩａ切断部位を含み、それはＰＡＲ１エキソサイト相互作用モチーフと組み合わせることができる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６６】
ＩＩ．Ｂ．６．ＨＡＰ
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種部分は、ホモアミノ酸ポリマー（ＨＡＰ）ペプチド、またはその断片、変異体もしくは誘導体である。特定の態様では、本開示のＦＩＸ融合タンパク質は、ＦＩＸ内に挿入される、ＦＩＸのＣ末端に融合する、またはその両方である、少なくとも１つのホモアミノ酸ポリマー（ＨＡＰ）ペプチド、またはその断片、変異体もしくは誘導体を含み、ＦＩＸ融合タンパク質は、凝血原活性を有し、インビボで、またはインビトロで宿主細胞において発現することができる。ＨＡＰペプチドは、少なくとも５０アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、１２０アミノ酸、１４０アミノ酸、１６０アミノ酸、１８０アミノ酸、２００アミノ酸、２５０アミノ酸、３００アミノ酸、３５０アミノ酸、４００アミノ酸、４５０アミノ酸または５００アミノ酸のグリシンの反復配列を含んでもよい。ＨＡＰ配列は、ＨＡＰ配列に融合するかまたは連結される部分の半減期を増加させることができる。ＨＡＰ配列の非限定的な例としては、限定されないが（Ｇｌｙ）ｎ（配列番号２３３）、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（配列番号２３４）またはＳ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（配列番号２３５）が挙げられ、式中、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０である。一実施形態では、ｎは２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２６、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０である。別の実施形態では、ｎは５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０または２００である。Ｓｃｈｌａｐｓｃｈｙ  Ｍら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓｉｇｎ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ、２０：２７３〜２８４（２００７）を参照されたい。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８７】
インビトロ製造によりスケールアップが可能となり、所望のポリペプチドを大量生産することができる。組織培養条件下での哺乳動物細胞培養技術は当業者に公知の技術であり、例えばエアーリフト反応装置、または連続撹拌反応装置における均一な懸濁培養、または、例えば中空糸、マイクロカプセルもしくはアガロースマイクロビーズ中に、またはセラミックカートリッジ上に細胞を固定化もしくは捕捉させた培養が挙げられる。ポリペプチドの溶液は、例えばゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥセルロースクロマトグラフィーまたは（イムノ）アフィニティークロマトグラフィーなどの慣習的なクロマトグラフィー法により、例えば合成ヒンジ領域ポリペプチドの優先的な生合成の後、または本明細書に記載されるＨＩＣクロマトグラフィーの前後において、必要に応じて、および／または望ましい場合に、精製することができる。アフィニティータグ配列（例えばＨｉｓ（６）（配列番号２３６）タグ）を、ポリペプチド配列内に任意に付着させるかまたは含めることにより、下流側での精製を容易にすることが可能となる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３０５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３０５】
Ｅ４１．リンカーが、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（ｎは１〜１００から選択される整数である）（配列番号２３７）を含む、Ｅ３９またはＥ４０に記載の方法。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2020505424000001.app
【国際調査報告】
2020505424.tif 000062
2020505424.tif 000063
2020505424.tif 000064
2020505424.tif 000065