(57)【要約】  本発明は、がんの免疫療法的処置に関する。特に、本発明は、ＧＤ２特異的キメラ抗原受容体を発現するように操作された免疫細胞を含む免疫療法組成物を用いて、ヒストンＨ３  Ｋ２７Ｍ（Ｈ３Ｋ２７Ｍ）変異を有するがん（例えば、Ｈ３Ｋ２７Ｍ変異を有するびまん性正中グリオーマ）を処置する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガングリオシドＧＤ２（ＧＤ２）に特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝的に改変された有効量の免疫細胞を個体に投与する工程を含む、ヒストンＨ３  Ｋ２７Ｍ（Ｈ３Ｋ２７Ｍ）変異によって特徴付けられるがんを有する個体を処置する方法。
【請求項２】
前記ヒストンＨ３  Ｋ２７Ｍ（Ｈ３Ｋ２７Ｍ）変異によって特徴付けられるがんが、グリオーマである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記グリオーマが、びまん性内因性橋グリオーマ（ＤＩＰＧ）である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ヒストンＨ３  Ｋ２７Ｍ（Ｈ３Ｋ２７Ｍ）変異によって特徴付けられるがんが、びまん性正中グリオーマである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記免疫細胞がＴ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記免疫細胞がナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＧＤ２に特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が、１４Ｇ２ａ、ｃｈ１４．１８、ｈｕ１４．１８Ｋ３２２Ａ、ｍ３Ｆ８、ｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１、ｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ４、ＨＭ３Ｆ８、およびＤＭＡｂ−２０からなる群より選択される抗体の抗原結合ドメインを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記抗原結合ドメインが、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＧＤ２に特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が、Ｔ細胞膜貫通ドメイン、Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメイン、および／または少なくとも１つの共刺激ドメインをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記共刺激ドメインが、ＣＤ２８、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、４−１ＢＢ／ＣＤ１３７／ＴＮＦＲＳＦ９、ＦｃＥＲＩγ、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＩＬＲＢ／ＣＤ１２２、ＩＬ−２ＲＧ／ＣＤ１３２、およびＣＤ４０の１つ以上の一部または全部を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＧＤ２に特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が、ＧＤ２エピトープ：ＧａｌＮＡｃβ１−４（ＮｅｕＡｃα２−８ＮｅｕＡｃα２−３）Ｇａｌに特異的に結合する重鎖および軽鎖可変領域を含む抗原結合ドメイン（ｓｃＦｖ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＣＡＲが、１４Ｇ２ａ  ｓｃＦｖを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
がんがヒストンＨ３  Ｋ２７Ｍ（Ｈ３Ｋ２７Ｍ）変異によって特徴付けられる、患者におけるがんの進行を処置するかまたは遅延させる方法であって、以下の工程を含む、方法：
ａ）患者からがん細胞を含む生物学的試料を得る工程；
ｂ）前記がん細胞内のＨ３Ｋ２７Ｍ変異の存在または非存在を決定する工程；および
ｃ）前記がん細胞がＨ３Ｋ２７Ｍ変異を有すると特徴付けられる場合に、ガングリオシドＧＤ２（ＧＤ２）に特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝的に改変されたＴ細胞を含む組成物の治療有効量を前記患者に投与する工程。
【請求項１４】
前記がんが、びまん性内因性橋グリオーマ（ＤＩＰＧ）およびびまん性正中グリオーマからなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記投与が、患者におけるＨ３Ｋ２７Ｍ陽性がん細胞の数を減少させる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記投与が、前記患者における腫瘍負荷を低減および／または排除する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
１つ以上の抗がん剤および／または１つ以上の化学療法剤を患者に投与する工程をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記投与が、前記患者が放射線療法を受ける前に、受けると同時に、および／または受けた後に行われる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
対象におけるがんの進行の処置または遅延において使用するための、ガングリオシドＧＤ２（ＧＤ２）に特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝的に改変されたＴ細胞を含む治療有効量の組成物であって、がんがヒストンＨ３  Ｋ２７Ｍ（Ｈ３Ｋ２７Ｍ）変異を有する、組成物。
【請求項２０】
１つ以上の抗がん剤および／または１つ以上の化学療法剤をさらに含む、請求項１９に記載の使用のための組成物。
【請求項２１】
前記対象が、びまん性内因性橋グリオーマ（ＤＩＰＧ）を有する対象、および、びまん性正中グリオーマを有する対象からなる群より選択される、請求項１９に記載の使用のための組成物。
【請求項２２】
前記ＧＤ２に特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝的に改変されたＴ細胞を含む組成物が、以下の効果の１つ以上を提供する、請求項１９に記載の使用のための組成物：
患者におけるＨ３Ｋ２７Ｍ陽性がん細胞の数を減少させる、
患者における腫瘍負荷を低減および／または排除する。
【請求項２３】
ＧＤ２に特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝的に改変されたＴ細胞を含む医薬品、および任意の薬学的に受容可能なキャリア、ならびに個体におけるがんの進行を処置するかまたは遅延させるための医薬品の投与のための説明書を含む添付文書を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［関連出願の相互参照〕
本発明は、米国仮特許出願第６２／６５１，４０６号（２０１８年４月２日出願）及び米国仮特許出願第６２／５３１，８７２号（２０１７年７月１２日出願）の優先権を主張し、その各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
〔発明の分野〕
本発明は、がんの免疫療法的処置に関する。特に、本発明は、ＧＤ２特異的キメラ抗原受容体を発現するように操作された免疫細胞を含む免疫療法組成物を用いて、ヒストンＨ３  Ｋ２７Ｍ（Ｈ３Ｋ２７Ｍ）変異を有するがん（例えば、Ｈ３Ｋ２７Ｍ変異を有するグリオーマ）を処置する方法に関する。本発明の組成物および方法は、臨床および研究の両方の場面、例えば、生物学、免疫学、医学、および腫瘍学の分野内での使用を見出す。
【０００３】
〔背景〕
がんは、人類の生命機会損失および医療費の両方の点で最も破壊的な疾患の１つである。それはまた、未対処の臨床的必要性を提示する。がんは、典型的には、手術、化学療法、放射線療法、またはそれらの組み合わせを用いて処置される。しかし、これらの処置はしばしば、免疫系抑制、体内の正常細胞の破壊、自己免疫、異常な細胞代謝、さらには転移および二次がんの発症を含む重大な副作用を有する。
【０００４】
びまん性内因性橋グリオーマ（ＤＩＰＧ）および他のヒストンＨ３  Ｋ２７Ｍ（Ｈ３Ｋ２７Ｍ）変異正中グリオーマは、極めて攻撃的でありそして普遍的に致命的な小児がんの例である。これらの腫瘍の分子的起源を特徴付けて、多くの進歩が達成されてきたが、臨床管理における改善は依然としてとらえどころがなく、ＤＩＰＧの生存期間の中央値は約１０ヶ月のままであった。チェックポイント阻害剤を含む免疫療法剤は、伝統的な治療で難治性の多数の成人がんにおいて実質的な臨床的利益を提供しているが、これらの薬剤はＤＩＰＧのような小児がんにおける決定的な利益をまだ実証していない。
【０００５】
〔概要〕
本発明は、がんの免疫療法的処置に関する。特に、本発明は、ＧＤ２特異的キメラ抗原受容体（ＧＤ２  ＣＡＲ）を発現するように操作された免疫細胞を含む免疫療法組成物を用いて、ヒストンＨ３  Ｋ２７Ｍ（Ｈ３Ｋ２７Ｍ）変異を有するがん（例えば、Ｈ３Ｋ２７Ｍ変異を有するＤＩＰＧ）を処置する方法に関する。
【０００６】
本明細書に記載されるように、Ｈ３Ｋ２７Ｍ変異がん（例えば、びまん性グリオーマ（例えば、びまん性正中グリオーマおよびびまん性内因性橋グリオーマ（ＤＩＰＧ））のために、免疫療法のための新たな標的およびストラテジーが同定された。特に、本発明は、びまん性グリオーマの文脈において生じる有意かつ著しく高いレベルのジシアロガングリオシドＧＤ２発現を同定した。
【０００７】
従って、１つの態様において、Ｈ３Ｋ２７Ｍ変異によって特徴付けられるがんを処置する方法が提供され、この方法は、このようながんを有する個体（例えば、患者）に、ＧＤ２に特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝的に改変された有効量の免疫細胞を投与する工程を含む。特定の実施形態では、がんはグリオーマである。いくつかの実施形態では、グリオーマはびまん性内因性橋グリオーマである。他の実施形態では、がんはびまん性正中グリオーマである。しかし、本発明は、それに限定されない。実際、Ｈ３Ｋ２７Ｍ変異を有する任意のがんが、本明細書中に記載される組成物および方法を用いて処置され得る。
【０００８】
特定の実施形態において、ＧＤ２に特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝的に改変された免疫細胞はＴ細胞である。本発明は、そのように改変されたＴ細胞の型によって限定されない。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞はＣＤ３＋Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の組合せ）である。特定の実施形態において、Ｔ細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞である。他の実施形態では、Ｔ細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞はナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞はγδＴ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞はＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の組合せ（例えば、ＣＤ３＋である）である。特定の実施形態において、Ｔ細胞は記憶Ｔ細胞（例えば、組織常在性記憶Ｔ（Ｔｒｍ）細胞、幹記憶ＴＳＣＭ細胞、または仮想記憶Ｔ細胞）である。特定の実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、記憶Ｔ細胞、および／またはγδＴ細胞の組合せである。いくつかの実施形態において、改変された免疫細胞は、サイトカイン誘導キラー細胞である。
【０００９】
特定の実施形態において、免疫細胞において発現されるＣＡＲは、ＧＤ２を特異的に認識する（例えば、ＧＤ２のエピトープ（例えば、ＧａｌＮＡｃβ１−４（ＮｅｕＡｃα２−８ＮｅｕＡｃα２−３）Ｇａｌ）に特異的に結合する）任意のＣＡＲである。本発明は、ＧＤ２特異的ＣＡＲの型によって限定されない。実際、ＧＤ２に特異的に結合する任意のＣＡＲを使用して、免疫細胞を遺伝的に改変する（例えば、免疫細胞において発現させる）ことができる。例示的なＣＡＲには、限定するものではないが、１４Ｇ２ａ、ｃｈ１４．１８、ｈｕ１４．１８Ｋ３２２Ａ、ｍ３Ｆ８、ｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１、ｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ４、ＨＭ３Ｆ８、およびＤＭＡｂ−２０（これらに限定されない）などのＧＤ２特異的抗体のＧＤ２結合ドメインを含むＣＡＲが含まれる。特定の実施形態において、抗原結合ドメインは、ＧＤ２のエピトープを認識するかまたはそれに特異的に結合する重鎖および軽鎖可変領域を含む単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、膜貫通ドメイン（例えば、Ｔ細胞膜貫通ドメイン（例えば、ＣＤ２８膜貫通ドメイン））、および、１つ以上の免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）（例えば、Ｔ細胞共受容体シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３−ゼータ鎖（ＣＤ３ζ））を含むシグナル伝達ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、１つ以上の共刺激ドメイン（例えば、Ｔ細胞活性化を刺激するための第二シグナルを提供するドメイン）を含む。本発明は、共刺激ドメインの型によって限定されない。実際、限定するものではないが、ＣＤ２８、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、４−１ＢＢ／ＣＤ１３７／ＴＮＦＲＳＦ９、ＦｃεＲＩγ、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＩＬＲＢ／ＣＤ１２２、ＩＬ−２ＲＧ／ＣＤ１３２、およびＣＤ４０を含む、当技術分野で公知の任意の共刺激ドメインを使用することができる。特定の実施形態において、共刺激ドメインは４−１ＢＢである。
【００１０】
特定の実施形態において、Ｈ３Ｋ２７Ｍ発現細胞によって特徴付けられるがん（例えば、Ｈ３Ｋ２７Ｍ発現細胞を有するＤＩＰＧ）に罹患している動物（例えば、ヒト）を、ＧＤ２特異的ＣＡＲを発現するように遺伝的に改変された免疫細胞を含む治療有効量の免疫療法組成物に暴露することにより、そのようなＨ３Ｋ２７Ｍ発現がん細胞または支持細胞の増殖が完全に阻害され、そして／または集団としてのそのような細胞を他の処置（例えば、がん治療薬または放射線療法の細胞死誘導活性）に対してより感受性にすることが、本発明により提供される。
【００１１】
本発明は、本明細書に記載される方法および組成物が、単独療法として投与される場合（例えば、がん細胞を死滅させるため、および／またはがん細胞における細胞増殖阻害、アポトーシスおよび／または細胞周期停止を誘導するため）、または追加の薬剤、例えば、他の細胞死誘導または細胞周期破壊がん治療薬または放射線療法（例えば、がん治療薬または放射線療法単独でのみ処置された動物における細胞の対応する割合と比較して、がん細胞のより多い割合をアポトーシスプログラムの実行に感受性にするため）とともに時間的な関係で投与される場合（例えば、併用療法において）、小児脳がん、特にＨ３Ｋ２７Ｍ発現細胞によって特徴付けられるがん型の処置のための、長年にわたるが未対処の医学的必要性を満たすことを意図する。
【００１２】
従って、特定の実施形態において、本発明は、患者におけるがんの進行を処置するかまたは遅延させる方法を提供し、ここで、がんはヒストンＨ３  Ｋ２７Ｍ（Ｈ３Ｋ２７Ｍ）変異によって特徴付けられ、方法は、患者からがん細胞を含む生物学的試料を得る工程；がん細胞内のＨ３Ｋ２７Ｍ変異の存在または非存在を決定する工程；および、がん細胞がＨ３Ｋ２７Ｍ変異を有すると特徴付けられる場合に、ＧＤ２に特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝的に改変されたＴ細胞を含む組成物の治療有効量を患者に投与する工程を含む。特定の実施形態において、ＧＤ２特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞を含む遺伝的に改変されたＴ細胞組成物の治療有効量は、このような処置後の患者におけるＨ３Ｋ２７Ｍ陽性がん細胞の数を減少させる。特定の実施形態において、ＧＤ２特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞を含む遺伝的に改変されたＴ細胞組成物の治療有効量は、このような処置後の患者における腫瘍負荷を低減および／または排除する。特定の実施形態において、投与は、患者が放射線療法を受ける前、受けると同時に、および／または受けた後に行われる。特定の実施形態において、方法は、１つ以上の抗がん剤および／または１つ以上の化学療法剤を患者に投与する工程をさらに含む。特定の実施形態において、ＧＤ２に特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝的に改変された治療有効量のＴ細胞と、抗がん剤のコースとを用いた患者の組み合わせ処置は、改変Ｔ細胞または抗がん剤／放射線単独で処置された患者と比較して、このような患者においてより大きな腫瘍応答および臨床的利益を生じる。全ての承認された抗がん剤および放射線処置のための用量が知られているので、本発明は、改変されたＴ細胞とのそれらの種々の組み合わせを意図する。
【００１３】
特定の実施形態において、本発明は、ＧＤ２に特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝的に改変されたＴ細胞を含む治療有効量の組成物（例えば、免疫療法組成物）を提供する（例えば、対象におけるがんの進行を処置するかまたは遅延させるための使用のための（例えば、がんがヒストンＨ３  Ｋ２７Ｍ（Ｈ３Ｋ２７Ｍ）変異を有する））。本明細書中に記載されるように、組成物は、１つ以上の抗がん剤および／または１つ以上の化学療法剤をさらに含み得る。本発明はまた、Ｈ３Ｋ２７Ｍ発現細胞（例えば、Ｈ３Ｋ２７Ｍ発現細胞によって特徴付けられるＤＩＰＧ）における細胞周期停止および／またはアポトーシスを誘導するための組成物の使用を提供する。本発明はまた、アポトーシスおよび／または細胞周期停止のインデューサーのような追加の薬剤、および化学療法剤での処置前の細胞周期停止の誘導を介する正常細胞の化学防御に対して細胞を感作させるための組成物の使用に関する。本発明の組成物は、Ｈ３Ｋ２７Ｍ発現細胞によって特徴付けられる任意の型のがん（例えば、Ｈ３Ｋ２７Ｍ発現細胞によって特徴付けられるＤＩＰＧ）、およびさらに、アポトーシス細胞死の誘導に応答性の任意の細胞（例えば、がんなどの過剰増殖性疾患を含む、アポトーシスの調節不全によって特徴付けられる障害）などの障害の処置、寛解、または予防に有用である。特定の実施形態において、組成物を、Ｈ３Ｋ２７Ｍ発現細胞によって特徴付けられるがん（例えば、Ｈ３Ｋ２７Ｍ発現細胞によって特徴付けられるＤＩＰＧ）であって、がん治療に対する耐性によってさらに特徴付けられるがん（例えば、化学耐性、放射線耐性、ホルモン耐性などであるがん細胞）を処置、寛解、または予防するために使用することができる。本発明はまた、薬学的に受容可能なキャリア中でＧＤ２に特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝的に改変されたＴ細胞を含む組成物（例えば、免疫療法組成物）を含む医薬組成物を提供する。
【００１４】
本発明はさらに、本明細書中に提供される記載に従って使用するための、ＧＤ２に特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝的に改変されたＴ細胞を含む、１つ以上の記載される組成物（例えば、免疫療法組成物）を含むキットを提供する。例えば、特定の実施形態において、本発明は、ＧＤ２に特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝的に改変されたＴ細胞、およびこの組成物を動物（例えば、Ｈ３Ｋ２７Ｍがんを有すると診断された）に投与するための説明書を含む、１つ以上の記載される組成物（例えば、免疫療法組成物）を含むキットを提供する。キットは必要に応じて、他の治療薬（例えば、抗がん剤またはアポトーシス調節剤）を含み得る。いくつかの実施形態において、このキットは、ＧＤ２に特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝的に改変されたＴ細胞を含む医薬、任意選択の薬学的に受容可能なキャリア、および個体におけるがんの進行を処置するかまたは遅延させるための医薬の投与のための説明書を含む添付文書を含む。
【００１５】
〔図面の説明〕
図１は、ＤＩＰＧにおけるＧＤ２過剰発現の同定を示す。図１Ａは、患者由来ＤＩＰＧ細胞培養物中の細胞表面抗原のフローサイトメトリーに基づくスクリーニングを示す。供与された死後ＤＩＰＧ患者に由来する４つの独立した低継代（＜１２）培養物を、無血清神経球形成培養条件下で拡大し、そして２８４個のモノクローナル抗体のパネル（ＢＤ  Ｌｙｏｐｌａｔｅ）を使用して表面抗原をプロファイリングした。ダブレットおよび死細胞を除外するためにゲートした後、標的抗原で染色された生細胞（全てのアッセイにおいて生存率＞８０％）の蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を、対応するアイソタイプ対照で染色された生細胞のＭＦＩで割り、そしてＬｏｇ１０スケール化した（図３を参照のこと）。図１Ｂは、スクリーニングされた培養物間のヒット重複の評価が、全てのスクリーニングされた培養物において、アイソタイプ対照の少なくとも１０倍のＭＦＩで存在する合計３６個のヒットを同定したことを示す。図１Ｃは、ＤＩＰＧと診断された、ヒストンＨ３  ＷＴの小児高悪性度グリオーマ培養物ＶＵ−ＤＩＰＧ１０、および皮質に生じたｐｃＧＢＭ２のフローサイトメトリー染色が、ヒストンＨ３  Ｋ２７Ｍ  ＤＩＰＧと比較して著しく低いＧＤ２発現レベルを示すことを示す。図１Ｄは、腫瘍細胞を同定するための変異Ｈ３Ｋ２７Ｍに対する抗体およびマウス抗ＧＤ２（１４ｇ２ａ）を利用する初代ＤＩＰＧ腫瘍標本の二重免疫組織化学を示し、これは、初代ＤＩＰＧにおける広範な局所的ＧＤ２発現を示す（スケールバー＝１００ミクロン）。図１Ｅは、ＤＩＰＧに対する有効性を評価するために使用される、ＧＤ２指向性１４ｇ２ａ  ｓｃＦｖ；４−１ＢＢ；ＣＤ３ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞および対照構築物の模式図を描写する。図１Ｆは、ＤＩＰＧ細胞のＧＤ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞とのインキュベーションが、ＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞の存在下での大部分の条件下での最小溶解比と比較して、低いエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で強力なＤＩＰＧ細胞溶解を達成することを示す。図１Ｇは、ＧＤ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞のＤＩＰＧ培養物とのインキュベーションが、ＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞による最小の産生と比較して、実質的なサイトカイン（ＩＦＮ−ｇおよびＩＬ−２）生成を誘導したことを示す。対照的に、ＧＤ２を発現していないＨ３  ＷＴ株であるＶＵ−ＤＩＰＧ  １０は（図１Ｃを参照のこと）、ＧＤ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞によるサイトカイン産生を引き起こさなかった。図１Ｈは、ＧＤ２シンターゼのＣａｓ９媒介欠失が、ＤＩＰＧ培養物におけるＧＤ２発現を排除することを示す。図１Ｈ（ａ）Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体を用いてエレクトロポレーションしたＳＵ−ＤＩＰＧ１３細胞は、ＧＤ２表面発現を排除した。図１Ｈ（ｂ）ｇＲＮＡ標的部位における約４５ｂｐの欠失後（ＤｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎウェブツールによるＩｎｄｅｌのＴｒａｃｋｉｎｇにおいて実施した、モデル化インデルトレースと親配列との間の標準誤差の分散−共分散行列の両側Ｔ検定）。対照として、ＡＡＶＳ１遺伝子座を標的とするｇＲＮＡを使用した。図１Ｈ（ｃ）は、ＧＤ２陰性株ＶＵＭＣ−１０またはＧＤ２−高ＳＵ−ＤＩＰＧ１３とのインビトロでのインキュベーション後にＧＤ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞に対して行ったＣｅｌｌ  Ｔｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ増殖アッセイが、ＧＤ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞の抗原特異的増殖を実証したことを示す。図１Ｉは、非改変対照細胞または対照ＡＡＶＳ１遺伝子座を標的とするＣａｓ９と比較して、ＧＤ２シンターゼをノックアウトするためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用して生成されたＨ３Ｋ２７Ｍ  ＧＤ２ｎｅｇ株との共培養後に、ＧＤ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞が実質的なレベルのＩＦＮ−γまたはＩＬ−２を産生しないことを示す。図１Ｊは、ガングリオシド酵素発現の経路分析を示す。標的ガングリオシド合成経路酵素の転写を、半定量的ＲＴ−ＰＣＲによって評価した。生合成フロー図を提供する。ここで、所定の遺伝子型の各培養物にわたる主要経路酵素（太字の遺伝子）の平均発現値（２−ｄＣｔ（ＨＰＲＴ））を示し、そして矢印の大きさをＨ３Ｆ３Ａ  Ｋ２７Ｍ培養物における平均発現に対してスケール化している。Ｈ３Ｆ３Ａ  Ｋ２７Ｍ培養物の大部分にわたって、ＧＤ２の上流のガングリオシド合成酵素の発現は、Ｈ３ＷＴ小児高悪性度グリオーマ（ｐＨＧＧ）培養物と比較して実質的に増加した。全ての培養物にわたって、Ｂ３ＧＡＬＴ４発現は、上流遺伝子と比較して最小であり、このことは、ＧＤ２からＧＤ１ｂへの変換の速度が潜在的に制限されていることを示す。各々のＨ３遺伝子型カテゴリーにおける個々の培養物についての発現値のヒートマップおよび棒グラフ表示（各々技術的二連で３つの生物学的複製物）を提供する。ｑＰＣＲ発現分析に利用したプライマーを実施例１、表２に示す。
【００１６】
図２は、ＧＤ２標的化ＣＡＲ免疫療法が、ＤＩＰＧ同所性異種移植片において強力かつ持続的な抗腫瘍応答を達成したことを示す。図２Ａは、橋中にルシフェラーゼ発現ＳＵ−ＤＩＰＧ  ６を異種移植し（全ての画像に対するマップ：輝度、最小＝（５×１０４）、最大＝（５×１０６））、そして指定された（１×１０７）ＧＤ２−ＣＡＲまたはＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞を静脈内注入したＮＳＧマウスの生物発光イメージングを示す。形質導入効率を、投与前に抗イディオタイプ抗体を用いたフローサイトメトリーによって評価し、それは日常的に＞７０％であった。処置後（ＤＰＴ）１４日と２８日の間に、劇的かつ普遍的な抗腫瘍応答が、ＧＤ２−ＣＡＲ処置マウスで観察され、一方、ＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞を用いて処置したマウスでは自然退行は観察されなかった。図２Ｂは、フラックスの変化倍率として表される、経時的な腫瘍負荷を示す。図２Ｃは、ＳＵ−ＤＩＰＧ６  ＧＤ２−ＣＡＲ対ＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞処置マウスの浸潤脳幹領域内のＨ３Ｋ２７Ｍ＋腫瘍細胞密度の定量を示す。ＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞処置対照のサンプリングした体積におけるマウス１匹当たり約１８，５９６細胞と比較して、ＧＤ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞処置ＳＵ−ＤＩＰＧ６異種移植片内では、マウス１匹当たり約３６個のＨ３Ｋ２７Ｍ＋細胞の残存が、サンプリングした体積において同定された。図２Ｄは、変異ヒストンＨ３Ｋ２７Ｍについて染色されたＣＤ１９−ＣＡＲおよびＧＤ２−ＣＡＲ処置ＳＵ−ＤＩＰＧ６腫瘍の代表的な免疫蛍光共焦点顕微鏡観察を示す。図２ｅ〜２ｉは、ＤＩＰＧ、ＳＵ  ＤＩＰＧ１３ＦＬの第２の患者由来同所性異種移植片モデルにおけるＧＤ２−ＣＡＲ活性を示す。図２ｅおよび２ｆは、上記のような経時的な生物発光イメージングを示す。図２ｇは、ＣＤ１９−またはＧＤ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞を用いて処置したＳＵ−ＤＩＰＧ１３ＦＬ異種移植片の代表的な免疫蛍光共焦点顕微鏡観察であり、そしてＨ３Ｋ２７Ｍ＋腫瘍細胞の排除を示す。図２ｈは、移植領域を横切るタイル免疫蛍光画像を示す。図２Ｉは、ＳＵ  ＤＩＰＧ１３ＦＬの浸潤脳幹領域内のＨ３Ｋ２７Ｍ＋腫瘍細胞密度の定量を示す。ＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞処置対照のサンプリングした体積におけるマウス１匹当たり約３１，９５３細胞と比較して、ＳＵ−ＤＩＰＧ１３ＦＬ異種移植片において、各ＧＤ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞処置マウスのサンプリングした体積中に合計約３２個のＨ３Ｋ２７Ｍ＋細胞が残存していた。示すデータは、平均±ＳＥＭである。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５（生物発光イメージングデータのために適用した多重比較のためのＨｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ修正を用いた独立両側スチューデントｔ検定による）。スケールバー＝１００ミクロン。
【００１７】
図３は、ＧＤ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞の単回静脈内投与が、ルシフェラーゼ発現患者由来ＤＩＰＧ異種移植片をバックグランド生物発光レベルまで排除したことを示す。図３（ａ）は、インビボ生物発光イメージング（図２に示す）によってモニターしたＳＵ−ＤＩＰＧ６およびＳＵ−ＤＩＰＧ１３ＦＬ異種移植片腫瘍負荷を示す。この測定によって腫瘍排除が完全であったかどうかを評価するために、動物の側腹の腫瘍保有領域および未関与領域にわたって、全フラックスの対応関心領域（ＲＯＩ）測定を行った。次いで、バックグラウンドを超える変化倍率を、バックグラウンドＲＯＩフラックスに対する腫瘍ＲＯＩフラックスの比率として計算した（ＳＵ−ＤＩＰＧ６  ｎ＝１０  ＣＤ１９−ＣＡＲ、１１  ＧＤ２−ＣＡＲ；ＳＵ−ＤＩＰＧ１３−ＦＬ  ｎ＝１３  ＣＤ１９−ＣＡＲ、１４  ＧＤ２−ＣＡＲ）。それゆえ、１の比率はバックグラウンドレベルへの腫瘍発光シグナルの排除を示し、これは、両方のモデルにおいてＤＰＴ４０までに達成された（＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．０００１、多重比率のためのＨｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ修正を用いた両側スチューデントｔ検定）。図２（ｂ）は、ＳＵ−ＤＩＰＧ６、ＳＵ−ＤＩＰＧ１３ＦＬ、または追加のＨ３Ｋ２７Ｍ＋ＤＭＧ培養物ＳＵ−ｐＳＣＧ１およびＱＣＴＢ−Ｒ０５９のＣＤ１９−ＣＡＲまたはＧＤ２−ＣＡＲ処置コホートにおいて、動物間に、インビボ生物発光イメージングによって評価した初期腫瘍負荷における統計的有意差が存在しなかったことを示す（多重比較のためのＴｕｋｅｙ修正を用いた二元配置ＡＮＯＶＡ、ｎ．ｓ．＝α＝０．０５で有意ではない）。散乱点は個々のマウスを示し、棒は平均を示し、そしてエラーバーはＳＥＭを示す。
【００１８】
図４は、ＤＩＰＧ異種移植片におけるＧＤ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞療法の選択圧を示す。ＣＤ１９またはＧＤ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞処置ＳＵ−ＤＩＰＧ１３ＦＬ異種移植片におけるＧＤ２についての免疫蛍光染色は（クローン１４ｇ２ａ）、殺腫瘍活性の急性期の間のＧＤ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞療法の選択圧を示した。ＤＰＴ１４（実質腫瘍の大部分がＧＤ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞処置動物において排除された）までに、少数の残存ＧＦＰ＋腫瘍細胞は、ＧＤ２について同時染色されなかった。スケールバーは１０ミクロンを表す。各チャートについて与えられた合計ｎは、各々のＣＡＲ／時点の組み合わせについて２匹の動物にわたって評価された細胞の数を示す。
【００１９】
図５は、ＤＩＰＧ培養物が、他のＧＤ２陽性腫瘍細胞株と比較して、均一に高レベルでＧＤ２を発現することを示す。図５Ａは、神経芽細胞腫（ＫＣＮＲ、ＣＨＬＡ１３６、ＣＨＬＡ２５５）、骨肉腫（１４３Ｂ、ＭＧ６３−３）、およびユーイング肉腫（ＴＣ３２、ＥＷ８）を含む、ＧＤ２標的化免疫療法について調査中の他の悪性腫瘍に由来する細胞と比較して、ＤＩＰＧ培養物の表面上でのＧＤ２についてのフローサイトメトリー染色（クローン１４ｇ２ａ）がより強くかつより一様な発現を示したことを示す。図５Ｂは、ＤＩＰＧおよび他のがん株についての蛍光ビーズ標準（Ｑｕａｎｔｉｂｒｉｔｅ、ＢＤ）を使用して得られたＧＤ２表面発現の定量的推定を示す。
【００２０】
図６は、ＧＤ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞療法が、ＤＩＰＧ同所性異種移植片の生存を改善することを示す。図６Ａは、ＳＵ  ＤＩＰＧ−１３Ｐ＊（これは、移植の１ヶ月以内に致死的であるＤＩＰＧの特に攻撃性の患者由来異種移植片モデルである）におけるＧＤ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞処置同所性異種移植片の生存解析が、ＧＤ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞処置動物における強固な生存向上を明らかにしたことを示す（ｐ＜０．０００１  ログランク（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）検定、３つの独立したコホートにわたるｎ＝２２  ＣＤ１９−ＣＡＲおよび２３  ＧＤ２  ＣＡＲ（図７を参照のこと））。ＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞処置異種移植片は研究終了時までに普遍的に致死的であり、一方、治療の急性毒性を生き残った全てのＧＤ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞処置動物は、それらがＧＶＨＤ様症状を示した研究終了時まで生き残った（図８を参照のこと）。図６Ｂは、ＤＰＴ５０でのＳＵ−ＤＩＰＧ１３Ｐ＊異種移植片のヘマトキシリン−エオシン染色が、ＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞処置対照における脳、および正常全体組織構造の全体にわたって観察される高浸潤性実質腫瘍のＧＤ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞による排除を実証したことを示す。図６Ｃは、ＤＰＴ１４で分析したＳＵ−ＤＩＰＧ６  ＧＤ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞処置異種移植片のヘマトキシリン−エオシン染色が、皮質、海馬、および脳幹において、脳室拡大であるが組織学的に正常に見えるニューロンを示したことを示す（挿入画像）。図６Ｄは、ＤＰＴ７  ＳＵ−ＤＩＰＧ１３ＦＬ異種移植片の蛍光顕微鏡観察が、静脈内投与されたＧＤ２−ＣＡＲ−ｍＣｈｅｒｒｙ  Ｔ細胞が移植された腫瘍に浸潤していることを示したことを示す。図６Ｅは、ＳＵ−ＤＩＰＧ１３ＦＬ異種移植髄質中のＤＰＴ１４における浸潤ＧＤ２−ＣＡＲ−ｍＣｈｅｒｒｙ  Ｔ細胞の代表的な画像が、Ｉｂａ１＋マクロファージとの空間的関連を示したことを示す。図６Ｆは、切断カスパーゼ３＋との共局在化によって証明される、ＧＦＰ＋腫瘍細胞のアポトーシスでのＧＤ２−ＣＡＲ  ｍＣｈｅｒｒｙ  Ｔ細胞媒介腫瘍細胞死滅の代表的な画像を示す。図６Ｇは、ＤＰＴ７で示される、異種移植された橋における非アポトーシス性ＮｅｕＮ＋ニューロンに近接して生じる殺腫瘍活性を示す（図１０を参照のこと）。図６Ｈは、急性抗腫瘍活性の期間の間にＳＵ−ＤＩＰＧ１３ＦＬ異種移植片の実質に浸潤しているＧＤ２−ＣＡＲ−ｍＣｈｅｒｒｙ  Ｔ細胞の代表的な画像を示す（図９を参照のこと）。
【００２１】
図７は、ＳＵ−ＤＩＰＧ１３Ｐ＊異種移植片の３つの独立したコホートにおいて評価したＧＤ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞療法の生存利益を示す。合わせたコホートデータおよび統計解析を提示する。１／３のコホート（コホート２）において、ＧＤ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞処置動物におけるいくつかの死亡が、ＤＰＴ８〜１３から、急性に観察された。動物は以下の通りであった：コホート１  ＣＤ１９−ＣＡＲ、５  ＧＤ２−ＣＡＲ、コホート２  ＣＤ１９−ＣＡＲ、１０  ＧＤ２−ＣＡＲ、コホート３  ＣＤ１９−ＣＡＲ、９  ＧＤ２−ＣＡＲ。
【００２２】
図８は、異種移植片対宿主病の発症が、ＧＤ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞処置患者由来異種移植片モデルにおけるモニター期間を制限することを示す。ヒトＴ細胞のＮＳＧマウスへの養子移入が、移植片対宿主病を生じることが示されている。図８Ａは、ＳＵ−ＤＩＰＧ１３Ｐ＊異種移植片において、ＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞を用いて処置されたマウスが、麻痺および異常な運動行動を含む、腫瘍進行と一致する終了時での神経学的障害の広範な徴候を示すが；しかし、脱毛などのＧｖＨＤの古典的徴候はこの時点では存在しないことを示す。この時点で、ＧＤ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞を用いて処置した動物は正常に見える。図８Ｂは、ＤＰＴ１４でのＣＤ１９  ＣＡＲ処置動物由来の皮膚標本のヘマトキシリン／エオシン染色が、全体的に正常に見えることを示す。図８Ｃは、ＤＰＴ５０までに、ＧＤ２−ＣＡＲ処置動物が広範な脱毛を示すことを示し、そして図８Ｄは、皮膚標本のヘマトキシリン／エオシン染色が、ＧｖＨＤの発症と一致する、真皮の広範なリンパ球浸潤および表皮過形成を示すことを示す。Ｈ＆Ｅ画像のスケールバーは１００ｕｍである。
【００２３】
図９は、標識ＧＤ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞が、抗腫瘍活性の期間の間に腫瘍部位に侵入することを示す。ｍＣｈｅｒｒｙとＣ末端で融合されたＣＡＲを有するヒトＴ細胞を、示される時点で安楽死させたＤＩＰＧ異種移植片の組織学的標本において追跡した。レンチウイルスＧＦＰ−ルシフェラーゼ構築物を用いて安定に形質導入されたＤＩＰＧ１３−ＦＬを、Ｐ２  ＮＳＧマウスの橋中に移植し、そして１×１０７のＧＤ２−ＣＡＲ−ｍＣｈｅｒｒｙまたはＣＤ１９−ＣＡＲ−ｍＣｈｅｒｒｙ  Ｔ細胞の単回静脈内投与を用いて処置した。生物発光イメージングを使用して、等価な初期腫瘍負荷を有する動物をＧＤ２−またはＣＤ１９−ＣＡＲ群に無作為化した。髄質腫瘍負荷の代表的な蛍光顕微鏡写真を示す。ＧＤ２−ＣＡＲ−ｍＣｈｅｒｒｙ  Ｔ細胞は、ＤＰＴ７ほど早く腫瘍実質に浸潤する。この時点までに、髄膜腫瘍はＧＤ２−ＣＡＲｍＣｈｅｒｒｙ群において排除されているが、実質腫瘍負荷は残存している。対照的に、ＣＤ１９−ＣＡＲｍＣｈｅｒｒｙ  Ｔ細胞は有意な腫瘍排除を達成しないが、散乱したＣＤ１９−ＣＡＲ−ｍＣｈｅｒｒｙ細胞を、組織実質内で同定することができる。ＧＤ２−ＣＡＲ−ｍＣｈｅｒｒｙ動物からのＤＰＴ７および１４の画像を図６Ｈに示す；これらを、対応するＣＤ１９−ＣＡＲ−ｍＣｈｅｒｒｙ画像との比較のために図９において再び示す。スケールバーは５００ｕｍを表す。
【００２４】
図１０は、ＧＤ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞処置ＤＩＰＧ異種移植片の切断カスパーゼ−３染色を示す。図１０Ａは、ＤＰＴ７で安楽死させ、そしてニューロンマーカーＮｅｕＮおよびアポトーシスマーカー切断カスパーゼ３（ＣＣａｓｐ３）について染色した、ＧＤ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞の単回静脈内投与を用いて処置したＤＩＰＧ１３−ＦＬ異種移植片の免疫蛍光顕微鏡観察を示す。図１０Ｂは、小脳における抗腫瘍活性の免疫蛍光顕微鏡写真を示し、これは局所的抗腫瘍活性の存在下でのインタクトな顆粒層ニューロンを示す。図１０Ｃは、ＧＤ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞処置異種移植片において同定されたＣＣａｓｐ３＋細胞の総集団のうち、＜２％がＮｅｕＮについて同時染色されることを示す。
【００２５】
図１１は、ＧＤ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞療法が、多数の型の正中Ｈ３Ｋ２７Ｍ変異小児びまん性正中グリオーマを有効に排除し、そして視床異種移植片における毒性と関連することを示す。図１１Ａは、Ｈ３Ｋ２７Ｍ＋  ＤＭＧの起源の解剖学的部位を示す。図１１Ｂおよび１１Ｃは、視床（ＱＣＴＢ−Ｒ０５９）および脊髄（ＳＵ−ｐＳＣＧ１）において生じたＨ３Ｋ２７Ｍ変異腫瘍の患者由来培養物モデルが、フローサイトメトリーによって評価したところＧＤ２を高度にかつ一様に発現し（図１１Ｂ）、そしてインビトロでＧＤ２またはＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞とインキュベートした場合に、ＩＦＮγおよびＩＬ−２の抗原依存性分泌を誘導することを示す（図１１Ｃ）。図１１Ｄおよび１１Ｅは、ＧＦＰおよびルシフェラーゼを発現するように安定に形質導入されたＳＵ−ｐＳＣＧ１細胞をＮＳＧマウスの髄質中に移植し、そして１×１０７のＧＤ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞またはＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞の静脈内注入を用いて処置し、そして移植された腫瘍の実質的な排除がＤＰＴ１４までに観察されたことを示す。図１１Ｆは、研究終了時にＳＵ−ｐＳＣＧ１の異種移植片中に残存していたＨ３Ｋ２７Ｍ＋細胞の定量が、ＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞の対照と比較して、ＧＤ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞処置動物における移植腫瘍のほぼ完全な排除を明らかにしたことを示す。図１１Ｇは、罹患領域を横切るタイル免疫蛍光画像を示す（ＧＦＰ、Ｈ３Ｋ２７Ｍ、およびＤＡＰＩ）。図１１Ｈおよび１１Ｉは、Ｈ３Ｋ２７Ｍ変異患者由来細胞培養物ＱＣＴＢ−Ｒ０５９を、ＮＳＧマウスの視床中に同所性に移植し、そしてＳＵ−ｐＳＣＧ１について記載したようにＧＤ２またはＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞の全身投与によって処置したことを示す。生物発光イメージングによって決定した経時的な腫瘍負荷は、ＤＰＴ  １４までの顕著な低減、およびＤＰＴ３０における生存動物における組織学的排除を示した（図１２を参照のこと）。図１１Ｊは、視床における炎症を伴うテント小脳を介するヘルニアおよび第３脳室圧縮の危険性を示す図を提供する。図１１Ｋは、ＤＰＴ１４までに観察された視床異種移植片を有するマウスにおけるＧＤ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞療法関連死を示し、これは正中腫瘍に対する免疫療法の潜在的な害を示す。示すデータは、平均±ＳＥＭである。＊＊＊ｐ＜０．００１、＊ｐ＜０．０５、多重比較のためのＨｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ修正を用いた独立両側スチューデントｔ検定による。
【００２６】
図１２は、ＧＤ２  ＣＡＲ−Ｔ細胞療法が、生存しているＱＣＴＢ−Ｒ０５９視床Ｈ３Ｋ２７Ｍ異種移植片において腫瘍負荷の組織学的排除を達成することを示す。ＣＤ１９およびＧＤ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞処置動物からの代表的な画像は、ＧＦＰ発現腫瘍細胞の排除を示す。実質的な残存腫瘍負荷の領域は同定できなかった。
【００２７】
図１３は、患者由来ＤＩＰＧ培養物においてスクリーニングした細胞表面抗原を示す。ＢＤ  Ｌｙｏｐｌａｔｅパネルからの表面マーカー発現（アイソタイプ対照に対する蛍光強度の中央値）を示す。
【００２８】
〔定義〕
本明細書を解釈する目的で、以下の定義が適用され、そして適切な場合はいつでも、単数形で使用される用語は複数形も含み、その逆も同様である。以下に記載されるいずれかの定義が、参照により本明細書に組み込まれるいずれかの文献と矛盾する場合、以下に記載される定義が優先されるものとする。
【００２９】
本明細書中で使用される用語「疾患」および「病的状態」は、本明細書中で別段の指示がない限り、互換的に使用されて、その種または群の個体の大部分に対して不都合ではない条件下で罹患個体に対して有害である、種または群（例えば、ヒト）のメンバーについて正常または平均とみなされる状態からの逸脱を示す。このような逸脱は、正常な機能の遂行を妨げるかまたは変更する、対象またはその任意の器官もしくは組織の正常な状態の任意の障害に関連する状態、徴候、および／または症状（例えば、下痢、悪心、発熱、疼痛、水疱、おでき、発疹、免疫抑制、炎症など）として現れ得る。疾患または病的状態は、微生物（例えば、病原体または他の感染因子（例えば、ウイルスまたは細菌））との接触によって引き起こされ得るか、またはそれから生じ得、環境要因（例えば、栄養不良、工業災害、および／または気候）に応答したものであり得、生物における固有のもしくは潜在的な欠損（例えば、遺伝的異常）またはこれらおよび他の要因の組み合わせに応答したものであり得る。
【００３０】
用語「宿主」、「対象」または「患者」は、本発明の組成物および方法によって処置される（例えば、投与される）個体を指すように、本明細書において互換的に使用される。対象としては、限定するものではないが、哺乳動物（例えば、マウス、サル、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコなど）が挙げられ、そして最も好ましくはヒトが挙げられる。本発明の文脈において、用語「対象」は、一般に、本発明の１つ以上の組成物（例えば、本明細書に記載の遺伝的に改変された免疫細胞）が投与されるか、または投与されている個体を指す。
【００３１】
用語「緩衝液」または「緩衝剤」は、溶液に添加されたときに、溶液をｐＨの変化に抵抗させる材料を指す。
【００３２】
用語「還元剤」および「電子供与体」は、第２の材料に電子を供与して、第２の材料の原子のうちの１つ以上の酸化状態を低下させる材料を指す。
【００３３】
用語「一価塩」は、金属（例えば、Ｎａ、Ｋ、またはＬｉ）が溶液中で正味の１＋電荷（すなわち、電子よりも１つ多い陽子）を有する任意の塩を指す。
【００３４】
用語「二価塩」は、金属（例えば、Ｍｇ、Ｃａ、またはＳｒ）が溶液中で正味の２＋電荷（すなわち、電子よりも２つ多い陽子）を有する任意の塩を指す。
【００３５】
用語「キレーター」または「キレート剤」は、金属イオンへの結合に利用可能な孤立電子対を有する１つより多い原子を有する任意の材料を指す。
【００３６】
用語「溶液」は、水性または非水性の混合物を指す。
【００３７】
「障害」は、本発明の組成物または方法を用いた処置から利益を得る任意の状態または疾患である。これには、哺乳動物に問題の障害への素因を与える病的状態を含む、慢性および急性障害が含まれる。本明細書で処置される障害の非限定的な例は、がんなどの状態を含む。
【００３８】
用語「細胞増殖性障害」および「増殖性障害」は、ある程度の異常な細胞増殖性に関連する障害を指す。例えば、「過剰増殖性障害または疾患」は、細胞の過度な増殖によって引き起こされる疾患または障害である。一実施形態では、細胞増殖性障害はがんである。
【００３９】
本明細書中で使用される用語「がん」および「腫瘍」は、増殖制御の喪失を示す細胞または細胞の制御されない成長もしくは増殖の組織を指す。がんおよび腫瘍細胞は、一般に、接触阻害の喪失によって特徴付けられ、侵襲性であり得、そして転移する能力を示し得る。本発明は、がんの型または処置の型（例えば、予防的および／または治療的処置）によって限定されない。実際、脳がんまたは中枢神経系の他のがん（例えば、びまん性正中グリオーマまたはびまん性内因性橋グリオーマ（ＤＩＰＧ、脳の底部に見出される高度に攻撃性のグリア腫瘍、例えば、Louis et al., Acta Neuropathol (2016) 131:803-820を参照のこと）、黒色腫、リンパ腫、上皮がん、乳がん、卵巣がん、子宮内膜がん、結腸直腸がん、肺がん、腎臓がん、黒色腫、腎臓がん、前立腺がん、肉腫、がん腫、および／またはこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない、種々のがんが、本明細書中に記載される組成物および方法を用いて処置され得る。
【００４０】
本明細書中で使用される「転移」は、新たな位置における類似のがん性病変の発達をともなって、がんが起源の部位から身体の他の領域に広がるかまたは移動するプロセスを指す。「転移性」または「転移する」細胞は、隣接する細胞との接着接触を喪失し、そして血流またはリンパを介して疾患の原発部位から移動して、隣接する身体構造に侵入するものである。
【００４１】
本明細書中で使用される用語「抗がん剤」は、がんなどの過剰増殖性疾患の処置（例えば、哺乳類、例えば、ヒトにおける）において使用される、任意の治療剤（例えば、化学療法化合物および／または分子療法化合物）、アンチセンス療法、放射線療法、または外科的介入を指す。
【００４２】
「有効量」は、所望の治療的または予防的結果を達成するために、必要な投与量および期間で、有効な量を指す。
【００４３】
本明細書中で使用される用語「治療有効量」は、障害の１つ以上の症状の寛解をもたらすか、または障害の進行を防止するか、または障害の退行を引き起こすのに十分な治療剤の量を指す。例えば、がんの処置に関して、一実施形態において、治療有効量は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％、腫瘍成長の速度を低下させる（例えば、患者における腫瘍負荷を低減および／または排除する（例えば、患者におけるＨ３Ｋ２７Ｍ陽性がん細胞の数を減少させる））、腫瘍体積を減少させる、転移の数を減少させる、腫瘍進行を低下させる、または生存期間を増加させる治療剤の量を指す。
【００４４】
本明細書中で使用される用語「感作する」および「感作」は、第１の薬剤の投与を通じて、第２の薬剤の生物学的効果（例えば、細胞分裂、細胞増殖、増殖、浸潤、血管新生、壊死、またはアポトーシスを含むがこれらに限定されない細胞機能の態様の促進または遅延）に対して、動物または動物内の細胞を、より感受性、またはより応答性にすることを指す。標的細胞に対する第１の薬剤の感作効果を、第１の薬剤の投与有りまたは無しでの、第２の薬剤の投与に際して観察される、意図される生物学的効果（例えば、細胞増殖、増殖、浸潤、血管新生、またはアポトーシスを含むがこれらに限定されない細胞機能の態様の促進または遅延）の差異として測定することができる。感作された細胞の応答は、第１の薬剤の非存在下での応答に対して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、少なくとも３００％、少なくとも約３５０％、少なくとも約４００％、少なくとも約４５０％、または少なくとも約５００％増加し得る。
【００４５】
本明細書中で使用される用語「精製」または「精製する」は、試料または組成物からの混入物または所望されない化合物の除去を指す。本明細書中で使用される用語「実質的に精製」は、試料または組成物からの約７０〜９０％、最大で１００％の混入物または所望されない化合物の除去を指す。
【００４６】
本明細書中で使用される用語「投与」および「投与する」は、対象に本発明の組成物を与える行為を指す。人体への投与の例示的な経路としては、眼（点眼）、口（経口）、皮膚（経皮）、鼻（経鼻）、肺（吸入）、口腔粘膜（頬側）、耳、直腸を介する、注射による（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、腫瘍内など）、局所的などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４７】
本明細書中で使用される用語「共投与」および「共投与する」は、少なくとも２つの薬剤（例えば、遺伝的に改変された免疫細胞および１つ以上の他の薬剤（例えば、抗がん剤））または治療の対象への投与を指す。いくつかの実施形態において、２つ以上の薬剤または治療の共投与は同時である。他の実施形態では、第１の薬剤／治療は、第２の薬剤／治療の前に投与される。いくつかの実施形態において、共投与は、同じまたは異なった投与経路を介することができる。当業者は、使用される種々の薬剤または治療の製剤および／または投与経路が変動し得ることを理解する。共投与のための適切な投薬量は、当業者によって容易に決定され得る。いくつかの実施形態において、薬剤または治療が共投与される場合、それぞれの薬剤または治療は、それらの単独での投与に適切な投薬量よりも低い投薬量で投与される。したがって、薬剤または治療の共投与が潜在的に有害な（例えば、毒性の）薬剤の要求される投薬量を低下させる実施形態において、および／または２つ以上の薬剤の共投与が他の薬剤の共投与を介する薬剤のうちの１つの有益な効果に対する対象の感作をもたらす場合に、共投与が特に所望される。
【００４８】
本明細書中で使用される用語「薬学的に受容可能」または「薬理学的に受容可能」は、対象に投与された場合に有害な反応（例えば、毒性、アレルギー性または他の免疫学的反応）を実質的に生じない組成物を指す。
【００４９】
本明細書中で使用される用語「薬学的に受容可能なキャリア」は、リン酸緩衝食塩水、水、および種々の型の湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）、任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング、ラウリル硫酸ナトリウム、等張および吸収遅延剤、崩壊剤（例えば、バレイショデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）、ポリエチレングリコールなどを含むが、これらに限定されない、任意の標準的な薬学的キャリアを指す。組成物はまた、安定剤および防腐剤を含むことができる。担体、安定剤およびアジュバントの例は記載されており、そして当該分野で知られている（例えば、Martin,Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Ed., Mack Publ. Co., Easton,Pa (1975)（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。
【００５０】
本明細書中で使用される用語「薬学的に受容可能な塩」は、標的対象において生理学的に許容される本発明の組成物の任意の塩（例えば、酸または塩基との反応によって得られる）を指す。本発明の組成物の「塩」は、無機または有機の酸および塩基から誘導され得る。酸の例としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、リン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、コハク酸、トルエン−ｐ−スルホン酸、酒石酸、酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、スルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ベンゼンスルホン酸などが挙げられるが、これらに限定されない。シュウ酸のような他の酸は、それ自体は薬学的に受容可能ではないが、本発明の組成物およびその薬学的に受容可能な酸付加塩の取得において中間体として有用な塩の調製において用いられ得る。塩基の例としては、アルカリ金属（例えば、ナトリウム）水酸化物、アルカリ土類金属（例えば、マグネシウム）水酸化物、アンモニア、および式ＮＷ４＋（式中、ＷはＣ１〜４アルキルである）の化合物などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５１】
塩の例としては、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、ショウノウ酸塩、ショウノウスルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、フルコヘプタノ酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサノ酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル化物、ウンデカン酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。塩の他の例としては、Ｎａ＋、ＮＨ４＋、およびＮＷ４＋（ここで、ＷはＣ１〜４アルキル基である）などの適切な陽イオンと調合された本発明の化合物の陰イオンが挙げられる。治療的使用のために、本発明の化合物の塩は、薬学的に受容可能であることが意図される。しかし、薬学的に受容可能でない酸および塩基の塩も、例えば、薬学的に受容可能な化合物の調製または精製における使用を見出し得る。
【００５２】
治療的使用のために、本発明の組成物の塩は、薬学的に受容可能であることが意図される。しかし、薬学的に受容可能でない酸および塩基の塩も、例えば、薬学的に受容可能な組成物の調製または精製における使用を見出し得る。
【００５３】
本明細書中で使用される用語「疾患の危険性がある」は、特定の疾患を経験する素因がある対象を指す。この素因は、遺伝性（例えば、遺伝性障害のような疾患を経験する特定の遺伝的傾向）であり得、または他の要因（例えば、環境条件、環境中に存在する有害化合物への曝露など）に起因し得る。従って、本発明が任意の特定の危険性に限定されることを意図するものではなく（例えば、対象は、単に他人に曝露され、そして他人と相互作用することによって、「疾患の危険性」があり得る）、また、本発明が任意の特定の疾患（例えば、がん）に限定されることを意図するものでもない。
【００５４】
本明細書中で使用される用語「キット」は、材料を送達するための任意の送達システムを指す。免疫療法剤の文脈において、このような送達システムは、免疫原性薬物および／または支持材料（例えば、材料の使用のための説明書面など）をある位置から別の位置に貯蔵、輸送、または送達することを可能にするシステムを含む。例えば、キットは、関連する免疫療法剤（例えば、遺伝的に改変された免疫細胞および／または支持材料）を含む１つ以上の封入物（例えば、箱）を含む。本明細書中で使用される用語「分離キット」は、各々がキット全体の構成要素の小部分を含む２つ以上の別個の容器を含む送達システムを指す。容器は、意図される受領者に、一緒にまたは別々に送達されてもよい。例えば、第１の容器が、特定の使用のための免疫療法組成物を含む組成物を含み得、一方、第２の容器が、第２の薬剤（例えば、化学療法剤）を含む。実際、各々がキット全体の構成要素の小部分を含む２つ以上の別個の容器を含む任意の送達システムは、用語「分離キット」に含まれる。対照的に、「複合キット」は、単一の容器中（例えば、所望の構成要素の各々を収容する単一の箱中）の、特定の使用に必要とされる免疫原性物質の構成要素の全てを含む送達システムを指す。用語「キット」は、分離キットおよび複合キットの両方を含む。
【００５５】
本明細書中で使用される用語「免疫グロブリン」または「抗体」は、特定の抗原に結合するタンパク質を指す。免疫グロブリンとしては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体、ならびに以下のクラスのＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントが挙げられるが、これらに限定されない：ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、および分泌免疫グロブリン（ｓＩｇ）。免疫グロブリンは、一般に、２つの同一の重鎖および２つの軽鎖を含む。しかし、用語「抗体」および「免疫グロブリン」は、単鎖抗体および２鎖抗体も包含する。
【００５６】
抗体の「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗体の重鎖または軽鎖のアミノ末端ドメインを指す。重鎖の可変ドメインを「ＶＨ」と称してもよい。軽鎖の可変ドメインを「ＶＬ」と称してもよい。これらのドメインは、一般に、抗体の最も可変性の部分であり、そして抗原結合部位を含んでいる。
【００５７】
「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、ここで、これらのドメインは単一ポリペプチド鎖中に存在する。一般に、ｓｃＦｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にする、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓｃＦｖの概説については、例えば、Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York, 1994), pp.269-315を参照のこと。
【００５８】
本明細書中で使用される用語「抗原結合タンパク質」は、特定の抗原に結合するタンパク質を指す。「抗原結合タンパク質」としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、およびヒト化抗体を含む免疫グロブリン；Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、およびＦａｂ発現ライブラリー；ならびに単鎖抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５９】
本明細書中で使用される用語「エピトープ」は、特定の免疫グロブリンと接触する抗原の部分を指す。
【００６０】
用語「特異的結合」または「特異的に結合」は、抗体（またはその部分（例えば、ｓｃＦｖ））とタンパク質またはペプチドとの相互作用に関して使用される場合、その相互作用が、タンパク質上の特定の構造（例えば、抗原決定基またはエピトープ）の存在に依存することを意味する；換言すれば、抗体（またはその部分（例えば、ｓｃＦｖ））は、一般にタンパク質ではなく特定のタンパク質構造を認識し、そしてそれに結合している。例えば、抗体がエピトープ「Ａ」に特異的である場合、抗体および標識「Ａ」を含む反応物におけるエピトープＡ（または遊離の、非標識Ａ）を含むタンパク質の存在は、抗体に結合する標識Ａの量を減少させる。
【００６１】
本明細書中で使用される用語「非特異的結合」および「バックグラウンド結合」は、抗体とタンパク質またはペプチドとの相互作用に関して使用される場合、特定の構造の存在に依存しない相互作用を指す（すなわち、抗体は、エピトープのような特定の構造ではなく、一般にタンパク質に結合している）。
【００６２】
本明細書中で使用される用語「がんを有する疑いがある対象」は、がんを暗示する１つ以上の症状（例えば、注目すべき腫物または塊）を示すか、またはがんについてスクリーニングされている（例えば、日常的身体的の間に）対象を指す。がんを有する疑いがある対象は、がんを発症する１つ以上の危険因子も有し得る。がんを有する疑いがある対象は、一般に、がんについて試験されていない。しかし、「がんを有する疑いがある対象」は、予備的な診断（例えば、塊を示すＣＴスキャン）を受けたが、確認検査（例えば、生検および／または組織学）が行われていないか、またはがんの型および／またはステージが知られていない個体を包含する。この用語は、がんを以前に有した人（例えば、鎮静にある個体）をさらに含む。「がんを有する疑いがある対象」は、時にはがんと診断され、そして時にはがんを有しないことが見出される。
【００６３】
本明細書中で使用される用語「がんと診断された対象」は、検査され、そしてがん性細胞を有することが見出された対象を指す。がんは、生検、Ｘ線、血液検査などを含むがこれらに限定されない、任意の適切な方法を使用して診断され得る。
【００６４】
本明細書中で使用される用語「手術後腫瘍組織」は、対象から（例えば、手術中に）取り出されたがん性組織（例えば、器官組織）を指す。
【００６５】
本明細書中で使用される用語「がんの危険性がある対象」は、特定のがんの発症について１つ以上の危険因子を有する対象を指す。危険因子としては、性別、年齢、遺伝的素因、環境曝露、およびがんの以前の事象、既存の非がん疾患、および生活様式が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６６】
本明細書中で使用される用語「対象におけるがんの特徴付け」は、対象におけるがん試料の１つ以上の性質（限定するものではないが、良性、前がん性またはがん性組織の存在およびがんのステージを含む）の同定を指す。
【００６７】
本明細書中で使用される用語「対象における組織の特徴付け」は、組織試料の１つ以上の性質（例えば、限定するものではないが、がん性組織の存在、がん性になる可能性がある前がん性組織の存在、および転移する可能性があるがん性組織の存在を含む）の同定を指す。
【００６８】
本明細書中で使用される用語「がんのステージ」は、がんの進行のレベルの定性的または定量的評価を指す。がんのステージを決定するために使用される基準としては、腫瘍の大きさ、腫瘍が身体の他の部分に広がっているかどうか、およびがんが広がっている場所（例えば、身体の同じ器官もしくは領域内、または別の器官へ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６９】
本明細書中で使用される用語「初代腫瘍細胞」は、哺乳動物における腫瘍から単離され、そしてインビトロで長く培養されていないがん細胞を指す。
【００７０】
本明細書中で使用される用語「処置」、「治療的使用」、または「医薬的使用」は、疾患状態または症状を直すか、そうでなければ、疾患もしくは他の所望されない症状の進行を、それが何であれいかにしても、防止、妨害、遅延、または逆転する、本発明の組成物および方法の任意のそして全ての使用を指す。例えば、用語「がんの処置」または「腫瘍の処置」または本明細書中の文法的等価物は、既存のがんまたは腫瘍の抑制、退行、または部分的もしくは完全な消失を意味する。この定義は、既存のがんまたは腫瘍の大きさ、攻撃性、または成長速度の任意の減少を含むように意味される。
【００７１】
本明細書中で使用される用語（がんと比較して）「改善された治療結果」および「増強された治療有効性」は、がん細胞もしくは固形腫瘍の成長の遅滞もしくは減少、またはがん細胞の総数もしくは総腫瘍負荷の低減を指す。「改善された治療結果」または「増強された治療有効性」は、確立された腫瘍の逆転、平均余命の増加、または生活の質の向上を含む、任意の臨床的に許容される基準に従った個体の状態の改善が存在することを意味する。
【００７２】
本明細書中で使用される用語「遺伝子移入システム」は、核酸配列を含む組成物を細胞または組織に送達する任意の手段を指す。例えば、遺伝子移入システムとしては、ベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、および他の核酸ベースの送達システム）、裸の核酸のマイクロインジェクション、ポリマーベースの送達システム（例えば、リポソームベースおよび金属粒子ベースのシステム）、微粒子銃注入などが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中で使用される用語「ウイルス遺伝子移入システム」は、所望の細胞または組織への試料の送達を容易にするためのウイルス性要素（例えば、インタクトなウイルス、改変ウイルス、および核酸またはタンパク質などのウイルス成分）を含む遺伝子移入システムを指す。本発明の組成物および方法において有用なウイルス遺伝子移入システムの非限定的な例は、レンチウイルスおよびレトロウイルス遺伝子移入システムである。
【００７３】
本明細書中で使用される用語「部位特異的組換え標的配列」は、組換え因子のための認識配列および組換えが起こる位置を提供する核酸配列を指す。
【００７４】
本明細書中で使用される用語「核酸分子」は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含むがこれらに限定されない、任意の核酸含有分子を指す。この用語は、４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、プソイドイソシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）−ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルプソイドウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシ−アミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルケオシン、５’−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン、プソイドウラシル、ケオシン、２チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、および２，６−ジアミノプリンを含むが、これらに限定されない、ＤＮＡおよびＲＮＡの任意の公知の塩基アナログを含む配列を包含する。
【００７５】
用語「遺伝子」は、ポリペプチド、前駆体、またはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ）の産生に必要なコード配列を含む核酸（例えば、ＤＮＡ）配列を指す。ポリペプチドは、完全長遺伝子産物またはその断片の、所望の活性または機能的性質（例えば、酵素活性、リガンド結合、シグナル伝達、免疫原性等）が保持される限り、完全長コード配列によって、またはコード配列の任意の部分によってコードされ得る。この用語は、構造遺伝子のコード領域、および、遺伝子が全長ｍＲＮＡの長さに対応するようにいずれもの末端の約１ｋｂ以上の距離の５’および３’末端の両方のコード領域に隣接して位置する配列も包含する。コード領域の５’側に位置し、そしてｍＲＮＡ上に存在する配列は、５’非翻訳配列と称される。コード領域の３’側または下流に位置し、そしてｍＲＮＡ上に存在する配列は、３’非翻訳配列と称される。用語「遺伝子」は、遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノム両方の形態を包含する。遺伝子のゲノム形態またはクローンは、「イントロン」または「介在領域」または「介在配列」と称される非コード配列で中断されたコード領域を含む。イントロンは、核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）に転写される遺伝子のセグメントである；イントロンは、エンハンサーのような調節エレメントを含み得る。イントロンは、核または一次転写物から除去または「スプライスアウト」される；それゆえ、イントロンは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写物には存在しない。ｍＲＮＡは、翻訳（例えば、タンパク質合成）中の新生ポリペプチド中のアミノ酸の配列または順序を特定する。
【００７６】
本明細書中で使用される用語「異種遺伝子」は、その天然環境にない遺伝子を指す。例えば、異種遺伝子は、他方の種に導入された一方の種由来の遺伝子を含む。異種遺伝子は、何らかの方法で変更されている（例えば、変異された、多コピーで加えられた、非天然調節配列に連結されたなど）生物にとって天然の遺伝子も含む。異種遺伝子は、異種遺伝子配列が、典型的には染色体中の遺伝子配列に天然には関連して見いだされないか、または天然には見出されない染色体の部分に関連しているＤＮＡ配列（例えば、遺伝子が通常には発現されていない遺伝子座において発現される遺伝子）に連結されている点で、内因性遺伝子と区別される。
【００７７】
本明細書中で使用される用語「遺伝子発現」は、遺伝子中にコードされる遺伝情報を、遺伝子の「転写」を介して（すなわち、ＲＮＡポリメラーゼの酵素作用を介して）ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、またはｓｎＲＮＡ）に、そしてタンパク質をコードする遺伝子については、ｍＲＮＡの「翻訳」を介してタンパク質に、変換するプロセスを指す。遺伝子発現はプロセスの多くの段階で調節され得る。「アップレギュレーション」または「活性化」は、遺伝子発現産物（すなわち、ＲＮＡまたはタンパク質）の産生を増加させる調節を指し、一方、「ダウンレギュレーション」または「抑制」は、産生を低下させる調節を指す。アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションに関与する分子（例えば、転写因子）はしばしば、それぞれ「アクチベーター」および「リプレッサー」と称される。
【００７８】
イントロンを含むことに加えて、遺伝子のゲノム形態は、ＲＮＡ転写物上に存在する配列の５’および３’末端の両方に位置する配列も含み得る。これらの配列は、「フランキング」配列または領域といわれる（これらのフランキング配列は、ｍＲＮＡ転写物上に存在する非翻訳配列の５’または３’側に位置する）。５’フランキング領域は、遺伝子の転写を制御するかまたはそれに影響を与えるプロモーターおよびエンハンサーのような調節配列を含み得る。３’フランキング領域は、転写の終結、転写後切断およびポリアデニル化を指示する配列を含み得る。
【００７９】
本明細書中で使用される用語「コードする核酸分子」、「コードするＤＮＡ配列」、および「コードするＤＮＡ」は、デオキシリボ核酸の鎖に沿ったデオキシリボヌクレオチドの順序または配列を指す。これらのデオキシリボヌクレオチドの順序によってポリペプチド（タンパク質）の鎖に沿ったアミノ酸の順序が決定される。ＤＮＡ配列は、従って、アミノ酸配列をコードする。
【００８０】
本明細書中で使用される用語「遺伝子をコードするヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド」および「遺伝子をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド」は、遺伝子のコード領域を含む核酸配列、換言すれば、遺伝子産物をコードする核酸配列を意味する。コード領域は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡの形態で存在し得る。ＤＮＡの形で存在する場合、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは一本鎖（すなわちセンス鎖）であっても二本鎖であってもよい。転写の適切な開始および／または１次ＲＮＡ転写物の正しいプロセシングが必要とされている場合、エンハンサー／プロモーター、スプライスジャンクション、ポリアデニル化シグナルなどの適切な調節領域を遺伝子のコード領域の直ぐ近くに配置することもできる。あるいは、本発明の発現ベクターにおいて利用されるコード領域は、内因性エンハンサー／プロモーター、スプライスジャンクション、介在配列、ポリアデニル化シグナルなど、または内因性および外因性の調節領域の両方の組合せを含み得る。
【００８１】
本明細書で使用される用語「作動可能な組み合わせで」、「作動可能な順序で」、および「作動可能に連結された」は、所定の遺伝子の転写および／または所望のタンパク質分子の合成を指示することができる核酸分子が産生されるような様式での核酸配列の連結を指す。このタームはまた、機能性タンパク質が産生されるような様式でのアミノ酸配列の連結をいう。
【００８２】
用語「単離された」は、「単離されたオリゴヌクレオチド」または「単離されたポリヌクレオチド」におけるように、核酸に関して使用される場合、その天然の供給源において通常関連する少なくとも１つの構成成分または混入物から同定および分離される核酸配列を指す。単離された核酸は、天然に見出られるものとは異なる形態または整定性で存在する。対照的に、ＤＮＡおよびＲＮＡのような核酸のような単離されていない核酸は、それらが天然に存在する状態で見つかる。例えば、所定のＤＮＡ配列（例えば、遺伝子）は、宿主細胞の染色体上で、隣接する遺伝子の近傍に見つかり、ＲＮＡ配列（例えば、特定のタンパク質をコードする特異的なｍＲＮＡ配列）は、細胞内で、多数のタンパク質をコードする多数の他のｍＲＮＡとの混合物として見つけられる。しかしながら、所定のタンパク質をコードする単離された核酸は、例えば、細胞内に、通常所定のタンパク質を発現している核酸を含み、この核酸は、天然細胞の染色体位置とは異なる染色体位置にあるか、または天然に見出されるものとは異なる核酸配列に隣接している。単離された核酸、オリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖形成で存在し得る。タンパク質の発現のために、単離された核酸、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが利用される場合、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、最低でもセンス鎖またはコード鎖（すなわち、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは一本鎖であってもよい）を含むが、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含有し得る（すなわち、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは二本鎖であってもよい）。
【００８３】
本明細書中で使用される用語「精製された」または「精製する」は、試料からの成分（例えば、混入物）の除去を指す。例えば、抗体は、混入している非免疫グロブリンタンパク質を除去することによって精製される；また、抗体は、標的分子に結合しない免疫グロブリンを除去することによっても精製される。非免疫グロブリンタンパク質の除去および／または標的分子に結合しない免疫グロブリンの除去によって、試料中の標的反応性免疫グロブリンの割合が増加する。別の例では、組換えポリペプチドを細菌宿主細胞中で発現させ、宿主細胞タンパク質を取り除いてポリペプチドを精製し、それによって組換えポリペプチドの割合を試料中で増加させる。
【００８４】
「アミノ酸配列」および用語「ポリペプチド」または「タンパク質」などは、アミノ酸配列を、上述のタンパク質分子に関連する完全な天然アミノ酸配列に限定することを意味しない。
【００８５】
本明細書中で使用される用語「天然のタンパク質」は、タンパク質がベクター配列によってコードされるアミノ酸残基を含まないことを指す。すなわち、天然のタンパク質は、天然に存在するようなタンパク質中に見出されるアミノ酸のみを含む。天然タンパクは、組換えの手段によって産生されてもよく、または天然に存在する供給源から単離されてもよい。
【００８６】
本明細書中で使用される用語「部分」は、タンパク質に言及する場合（「所定のタンパク質の一部」などように）、そのタンパク質の断片を指す。断片の大きさは、４アミノ酸残基からアミノ酸配列全体から１アミノ酸だけ小さい大きさの範囲であってもよい。
【００８７】
本明細書中で使用される用語「ベクター」は、核酸分子であって、その核酸分子が連結しているのとは別の核酸を輸送可能な核酸分子を指すことが意図される。ベクターの一例は「プラスミド」であり、これはさらなるＤＮＡセグメントが連結され得る環状二本鎖ＤＮＡを指す。別のタイプのベクターはファージベクターである。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、ここで、さらなるＤＮＡセグメントが、ウイルスゲノムに連結され得る。特定のベクターはそれらが導入される宿主細胞において自律的複製が可能である（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクター、およびエピソーム哺乳動物ベクター）。レンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターが使用され得る（例えば、ＣＡＲ構築物をコードするＤＮＡを細胞（例えば、Ｔ細胞）に導入するため）。他のベクター（非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入の際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ得、それによって宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターは、それらが作動的に連結された遺伝子の発現を方向付け得る。このようなベクターは、ここでは「組換え表現ベクター」、すなわち単に「発現ベクター」を指す。一般的には組換えＤＮＡ技術において用いられる発現ベクターは、プラスミドの形をとることが多い。プラスミドはベクターの最も一般的に使用される形態であるので、本明細書において、「プラスミド」と「ベクター」とは、互換的に使用され得る。本発明の組成物および方法において有効なベクターには、レンチウイルスベクターおよびレトロウイルスベクターが含まれるが、この例に限定されない。レンチウイルスベクターとしてはヒト、サル、およびネコ免疫不全ウイルス（それぞれ、ＨＩＶ、ＳＩＶ、およびＦＩＶ）ベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８８】
本明細書中で使用される用語「発現ベクター」は、組換えＤＮＡ分子を意味し、ここで、組換えＤＮＡ分子は、所望のコード配列、および特定の宿主生物内において作動可能に連結されたコード配列の発現に必要な適切な核酸配列を含む。原核生物における発現に必要な核酸配列には、通常、プロモーター、オペレーター（任意）およびリボソーム結合部位が含まれ、しばしば他の配列も共に含まれる。真核細胞は、プロモーター、エンハンサー、ならびに終止およびポリアデニル化シグナルを利用することが知られている。
【００８９】
本明細書中に使用される用語「トランスフェクション」は、外来ＤＮＡの真核細胞への導入を指す。トランスフェクションは、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン法によるトランスフェクション、ポリブレン法によるトランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポソーム融合、リポフェクション、プロトプラスト融合、レトロウイルス感染、およびバイオリスティック法を含む、当該分野で公知の種々の手段によって行われ得る。
【００９０】
用語「安定なトランスフェクション」または「安定にトランスフェクトされた」は、トランスフェクトされた細胞のゲノムへの外来ＤＮＡの導入および組み込みを指す。「安定なトランスフェクタント」という用語は、ゲノムＤＮＡに安定して組み込まれた外来ＤＮＡを有する細胞を指す。「一過性トランスフェクション」又は「一過性にトランスフェクトされた」とは、外来ＤＮＡがトランスフェクトされた細胞のゲノムに外来ＤＮＡが組み込まれない細胞中への外来ＤＮＡの導入をいう。外来ＤＮＡはトランスフェクトされた細胞の核内に（例えば数日間）残存する。この間、外来ＤＮＡは、染色体における内因性遺伝子の発現を支配する調節制御に供される。用語「一過性トランスフェクタント」は、外来ＤＮＡを取り込んだがこのＤＮＡを組み込まなかった細胞を指す。
【００９１】
本明細書中で使用される用語「選択マーカー」は、そうでなければ必須栄養素を欠いている培地において増殖する能力を付与する酵素活性をコードする遺伝子の使用を指す。さらに、選択マーカーは、選択マーカーが発現された細胞に、抗生物質または薬物に対する耐性を付与し得る。選択マーカーは、「優性」であり得る。優性選択マーカーは、任意の真核細胞株において検出され得る酵素活性をコードする。優性選択マーカーの例としては、哺乳動物細胞において薬物Ｇ４１８に対する耐性を付与する細菌アミノグリコシド−３’−ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏ遺伝子とも呼ばれる）、抗生物質ハイグロマイシンに対する耐性を付与する細菌ハイグロマイシンＧホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇ）遺伝子、およびミコフェノール酸の存在下での増殖能を付与する細菌キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（ｇｐｔ遺伝子とも呼ばれる）が挙げられる。他の選択マーカーは、関連する酵素活性を欠いている細胞株と一緒でなければ使用できないという点で優性ではない。非優性選択マーカーの例には、ｔｋ陰性（ｔｋ−）細胞株と併用されるチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子、ＣＡＤ欠損細胞と併用されるＣＡＤ遺伝子、およびｈｐｒｔ陰性（ｈｐｒｔ−）細胞株と併用される哺乳動物ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｈｐｒｔ）遺伝子がある。哺乳動物細胞系における選択マーカーの使用の概説は、Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989) pp.16.9-16.15に開示されている。
【００９２】
本明細書で使用される用語「インビトロ」は、人工的な環境、および人工的な環境下で起こるプロセスまたは反応を指す。インビトロの環境は、試験管および細胞培養を含むことができるが、これらに限定されない。用語「インビボ」は、自然環境（例えば、動物または細胞）および自然環境下で起こるプロセスまたは反応を指す。
【００９３】
本明細書に用いられる場合、用語「細胞培養」とは、細胞の任意のインビトロ培養を指す。この用語には、連続細胞株（例えば、不死表現型を有する）、初代細胞培養物、形質転換細胞株、有限細胞株（例えば、非形質転換細胞）、およびインビトロで維持される任意の他の細胞集団が含まれる。
【００９４】
本明細書において使用される用語「試料」は、その最も広範な意味で使用される。１つの意味では、それは任意の供給源から得られた標本または培養物、ならびに生物学的試料および環境試料を含むことを意味する。生物学的試料は、動物（ヒトを含む）から採取され得、液体、固体、組織、気体を包含している。生物学的試料は、血漿、血清などのような血液産物を含む。しかしながら、このような例は、本発明に適用可能な試料の種類を限定するものと解されるべきではない。
【００９５】
〔実施形態の詳細な説明〕
ヒストンＨ３は、真核細胞におけるクロマチンの構造に関与する５つの主要なヒストンタンパク質の１つである。Ｈ３は、主要な球状ドメインと長いＮ末端部を特徴とし、「数珠玉構造」のヌクレオソームの構造に関与する。ヒストンＨ３のＮ末端部は球状ヌクレオソームコアから突出し、細胞内プロセスに影響を及ぼすいくつかの異なる種類のエピジェネティック修飾を受け得る。これらの修飾には、メチル基またはアセチル基のリジンおよびアルギニンアミノ酸への共有結合、およびセリンまたはトレオニンのリン酸化が含まれる。ヒストン変異Ｈ３．３は、典型的には活性クロマチンに富む。
【００９６】
ヒストンＨ３  Ｋ２７Ｍ（Ｈ３Ｋ２７Ｍ）変異を伴う腫瘍は致死性が高い。これらは主に小児に発生し、中正中脳腫瘍または脊髄腫瘍として存在する。過去３０年間にわたる数十の臨床試験が行われたにもかかわらず、標準的な治療は放射線療法に限定され、患者の大多数は診断から１８ヶ月以内に疾患により死亡する。したがって、現在利用可能なＨ３Ｋ２７Ｍ腫瘍のための治療は不十分である。放射線療法を除いて、他の抗腫瘍療法は、これらの疾患において有益性が実証されていない。
【００９７】
例えば、びまん性内因性橋グリオーマ（ＤＩＰＧ）および他のヒストンＨ３  Ｋ２７Ｍ（Ｈ３Ｋ２７Ｍ）変異正中グリオーマは、極めて攻撃的でありそして普遍的に致命的である。これらの腫瘍の分子起源を特徴付けて、多くの進歩が達成されてきたが、臨床管理における改善は依然としてとらええどころが無く、ＤＩＰＧの生存期間の中央値は約１０ヶ月のままであった。チェックポイント阻害剤を含む免疫療法剤は、伝統的な治療で難治性の多数の成人がんにおいて実質的な利益をもたらした。一方、これらの薬剤は、散発性小児がんにおいては決定的な利益はまだ実証されていない。これは、おそらく、これらの疾患における非同義の体細胞突然変異の不足に起因する（例えば、Majzner et al., Cancer Cell, 2017. 31(4): p. 476-485.を参照のこと）。キメラ抗原受容体発現（ＣＡＲ発現）Ｔ細胞の養子細胞移入が、Ｂ細胞悪性腫瘍および中枢神経系（ＣＮＳ）悪性腫瘍において活性を実証した。
【００９８】
歴史的に、小児グリオーマと、組織学的に外観が類似する成人グリオーマとで挙動が異なることは既知であったにもかかわらず、小児びまん性グリオーマは、成人の対応物と共にグループ分けされていた。小児びまん性グリオーマにおける明確で根底的な遺伝的異常に関する情報によって、組織学的に類似した成人の対応物から、いくつかの実体を区別することが可能になり始めている。主に小児に発生する狭義での腫瘍群は、ヒストンＨ３遺伝子Ｈ３Ｆ３ＡにおけるＫ２７Ｍ変異、またはこれより一般的ではないが、関連するＨＩＳＴ１Ｈ３Ｂ遺伝子におけるＫ２７Ｍ変異、びまん性増殖パターン、および正中位置（例えば、視床、脳幹、および脊髄）によって特徴付けられる。この新たに定義された実体は、びまん性正中グリオーマ、Ｈ３Ｋ２７Ｍ変異体と呼ばれ、これまでびまん性内因性橋グリオーマ（ＤＩＰＧ）と呼ばれていた腫瘍を含む。
【００９９】
ＧＤ２は、神経芽細胞腫を含むいくつかの小児および成人がんにおいて高度に発現するジシアロガングリオシドである。ＧＤ２は胎児発達中に広範囲で発現するが、正常な出生後の組織の間では、その発現は、骨前駆細胞、脳、末梢神経および皮膚メラニン細胞上での低レベルの発現に限られる。ＧＤ２は、腫瘍細胞上での表面発現が高く、正常組織上での発現が低いため、免疫療法モノクローナル抗体の開発の標的とされてきた。これらの有望な臨床結果に由来する抗ＧＤ２抗体療法は、神経芽細胞腫のための多くの最前線プロトコールに取り入れられる。ＧＤ２ベースのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）治療は、ｍＡｂがＣＮＳに効率的に輸送されないため、Ｈ３Ｋ２７Ｍ腫瘍患者に有益である可能性は低い。
【０１００】
ＤＩＰＧおよび他のヒストンＨ３  Ｋ２７Ｍ（Ｈ３Ｋ２７Ｍ）変異がん（例えば、正中グリオーマ）における免疫療法のための新たな標的およびストラテジーを同定するため、本発明の実施形態の開発中に実験が実施された。患者由来ＤＩＰＧ培養物中の細胞表面抗原を、潜在的な免疫療法の標的についてスクリーニングした（例えば、実施例１および２を参照のこと）。独立した患者由来培養物間での有意な重複によって、ＤＩＰＧ患者間で保存された表面マーカーの中核群を同定した（例えば、実施例２ならびに図１Ａおよび１Ｂを参照のこと）。これらの共通の標的から、スクリーニングされた患者由来のＤＩＰＧ培養物の各々において有意に高レベルで共通に発現している標的として、ジシアロガングリオシドＧＤ２を同定した。さらなる実験により、試験した全てのＨ３Ｋ２７Ｍグリオーマ、ならびにより一般的でないＨＩＳＴ１Ｈ３Ｂ  Ｋ２７Ｍ変異を有するものにおいて、有意かつ著しく高いレベルのＧＤ２発現が起こることが確認された。一方、野生型ヒストンＨ３を保有する小児高悪性度グリオーマ（ｐＨＧＧ）は有意に低いＧＤ２発現を示した（例えば、実施例１および２ならびに図１Ｃを参照）。
【０１０１】
Ｈ３Ｋ２７Ｍ変異から生じる転写攪乱がＧＤ２発現の増加と関連しているかどうかを決定するために、さらなる実験を行った。患者由来ＤＩＰＧおよびｐＨＧＧ培養物のパネルにおけるガングリオシド合成酵素の発現は、Ｈ３Ｋ２７Ｍ変異を有する培養物における上流ガングリオシド合成酵素の一貫してより高い発現を同定した（例えば、実施例２および図１Ｊを参照）。従って一実施形態において、本発明は、Ｈ３  ＷＴ  ｐＨＧＧと比較して、Ｈ３Ｋ２７Ｍ変異腫瘍においてガングリオシド合成経路を構成する遺伝子がアップレギュレーションされていることで、ＧＤ２過剰発現が生じることを提供する。
【０１０２】
さらに、浸潤悪性細胞およびＧＤ２を同定するためのＨ３Ｋ２７Ｍについての初代ヒトＤＩＰＧ組織の二重免疫染色によって、天然腫瘍の文脈におけるＧＤ２の局所発現が同定された（例えば、実施例２および図１Ｄを参照）。従って、一実施形態において、本発明は、Ｈ３Ｋ２７Ｍ腫瘍（例えば、ＧＤ２）の治療的介入のための未知の標的を同定することを提供する。
【０１０３】
ＧＤ２標的免疫療法は、現在、神経芽細胞腫、骨肉腫および黒色腫を含むいくつかの疾患において、臨床および前臨床研究中である（例えば、Thomas et al., PLoS One, 2016. 11(3): p. e0152196、Long et al., Nature Medicine, 2015. 21(6): p. 581-590、Long et al., Cancer Immunology Research, 2016. 4(10): p. 869-880、Yu et al., N Engl J Med, 2010. 363(14): p. 1324-34、Perez Horta et al., Immunotherapy, 2016. 8(9): p. 1097-117、Heczey et al, Molecular Therapy）。効率的に血液脳関門を越えないｍＡｂｓとは異なり、活性化ＣＡＲ  Ｔ細胞は、養子移入後に効率的にＣＮＳに浸潤する。
【０１０４】
ＧＤ２が標的とする操作された免疫細胞の能力を、Ｈ３Ｋ２７Ｍ腫瘍に対する潜在的な治療的介入として評価および特徴付けるために、さらなる実験を本発明の実施形態の開発中に行った（例えば、実施例３〜５を参照）。ヒトＧＤ２を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞を作製し、試験した。患者由来ＤＩＰＧ培養物を曝露時に、ＭｏｃｋまたはＣＤ１９指向性ＣＡＲ  Ｔ細胞と比較して、ＧＤ２依存性の細胞死滅およびサイトカイン分泌が、観察された（例えば、実施例３を参照）。さらに、患者由来ＤＩＰＧ同所性異種移植片中の、養子細胞移入によって送達されたＧＤ２指向性ＣＡＲ  Ｔ細胞を使用すると強力な抗腫瘍有効性が観察された（例えば、実施例４を参照）。
【０１０５】
ＣＡＲ  Ｔ細胞療法は、様々なタイプの正中Ｈ３Ｋ２７Ｍ変異小児びまん性正中グリオーマを効果的に排除した（例えば、実施例５を参照）。グリオーマの排除は、視床異種移植片における毒性と関連していた。
【０１０６】
１つの態様において、本発明は、ＧＤ２を標的とするＣＡＲを発現するように操作された免疫細胞を使用して、Ｈ３Ｋ２７Ｍ正（Ｈ３Ｋ２７Ｍ＋）がん／腫瘍を処置するための新規な方法を提供する。種々の態様において、Ｈ３Ｋ２７Ｍがん／腫瘍を処置する方法が提供され、この方法はこのようながんまたは腫瘍を有する患者に、ＧＤ２を標的とするＣＡＲを発現するように操作された有効量の免疫細胞を投与する工程を包含する。特定の実施形態では、Ｈ３Ｋ２７ＭがんはＤＩＰＧである。別の実施形態では、Ｈ３Ｋ２７Ｍがんはびまん性正中グリオーマである。
【０１０７】
特定の実施形態において、Ｈ３Ｋ２７Ｍがん／腫瘍の表面上の有意に上昇したレベルのＧＤ２の存在は、ＧＤ２指向性ＣＡＲ  Ｔ細胞によるＨ３Ｋ２７Ｍがん／腫瘍の有効な治療（例えば、死滅および／または進行の抑制）をもたらす。例えば、Ｈ３Ｋ２７Ｍがん／腫瘍におけるＧＤ２  ＣＡＲの有効性は、Ｈ３Ｋ２７Ｍ変異ＤＩＰＧにおける標的抗原の均一な高発現によって広く出現し（図１Ｃを参照）、これはＧＤ２＋神経芽細胞腫および肉腫細胞株に存在するものよりも一貫して高かった。メカニズムを理解することは本発明を実施するために必要ではなく、本発明はいかなる特定のメカニズムにも限定されないが、Ｈ３Ｋ２７Ｍがん／腫瘍における標的ＧＤ２抗原の均一な高発現は、ＧＤ２に特異的なＣＡＲ  Ｔ細胞を用いたＨ３Ｋ２７Ｍがん／腫瘍の治療の有効性に関連する。
【０１０８】
特定の実施形態において、本発明は、免疫細胞の増殖および／または腫瘍死滅を誘導することを目的として、ＧＤ２を認識（例えば、Ｈ３Ｋ２７Ｍグリオーマの表面上において）する受容体を発現し、かつ免疫細胞を活性化するシグナルを伝達するように操作された免疫細胞（例えば、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ３＋Ｔ細胞））を使用することによって、Ｈ３Ｋ２７Ｍ腫瘍を処置する（例えば、増殖を阻害する、および／または死滅させる）方法を提供する。受容体の非限定的な例は、ＧＤ２を認識するｍＡｂに由来するｓｃＦｖおよび膜貫通ドメイン、ならびに１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインを組み込むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。ＣＡＲは、操作された細胞の長期間の生存を可能にする要素だけでなく、ＧＤ２抗原と出会った後に操作された細胞の増殖を容易にする他のシグナル伝達要素を組み込むように、さらに操作され得る。本発明はさらに、遺伝的に改変された細胞を含む組成物（例えば、中枢神経系におけるＨ３Ｋ２７Ｍ腫瘍に到達するのに十分な量で産生および投与される免疫療法組成物）を提供する。
【０１０９】
本明細書に記載の組成物および方法は、体細胞においてヒストンＨ３（Ｈ３）遺伝子Ｈ３Ｆ３Ａのリジン２７（例えば、Ｌｙｓ２７ＭｅｔまたはＫ２７Ｍ（Ｈ３Ｋ２７Ｍ））に変異を有する任意のがん／腫瘍の治療における使用を見出す。本発明の組成物および方法で治療することができるＨ３Ｋ２７Ｍ変異を有するがんの例として、びまん性内因性橋グリオーマ（ＤＩＰＧ）および／またはびまん性正中グリオーマが含まれるが、これに限定されない。
【０１１０】
＜ＧＤ２特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の構築および発現＞
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）はヒンジ／スペーサーペプチドに連結された細胞外抗原結合ドメイン（例えば、抗体由来の一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ））、膜貫通ドメイン、および、さらに細胞内シグナル伝達に関するドメイン（例えば、Ｔ細胞受容体の細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン）を含む組換え受容体構築物である。ＣＡＲを発現するように遺伝的に改変された免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）は、エフェクター細胞の機能性（例えば、Ｔ細胞の細胞傷害性および／または記憶機能）を有する抗体（例えば、これらはＭＨＣ／ＨＬＡの制限を受けているものではない）に特異性を示す。
【０１１１】
本発明は、免疫細胞において発現されるＧＤ２に特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）（例えば、本発明の方法において使用されるＣＡＲ構築物）に限定されない。一実施形態では、ＣＡＲは、ＧＤ２に特異的に結合する免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）（例えば、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ））の可変領域の融合タンパク質を含む。さらなる実施形態において、免疫グロブリンは、ＧＤ２エピトープＧａｌＮＡｃβ１−４（ＮｅｕＡｃα２−８ＮｅｕＡｃα２−３）Ｇａｌに特異的に結合する。当業者にとって、ｓｃＦｖがリンカーペプチド（例えば、約１０〜約２５アミノ酸）に連結された免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質であることは既知である。本発明は、リンカーのタイプによって限定されない。いくつかの実施形態において、リンカーはグリシンリッチである（例えば、柔軟性のために）。いくつかの実施形態において、リンカーは、セリンおよび／またはトレオニン（例えば、溶解性のため）を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、グリシンリッチである部分と、セリンおよび／またはトレオニンを含む部分とを含む。
【０１１２】
ＧＤ２に特異を有して結合する任意の抗体／免疫グロブリンを、（例えば、本発明の治療方法で使用される）免疫細胞における発現のためのＣＡＲの構築に用いることができる（例えば、ＶＨ領域およびＶＬ領域を用いて融合タンパク質を構築する、ｓｃＦｖ）。このような抗体／免疫グロブリンの例には、１４Ｇ２ａ、ｃｈ１４．１８、ｈｕ１４．１８Ｋ３２２Ａ、ｍ３Ｆ８、ｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ１、ｈｕ３Ｆ８−ＩｇＧ４、ＨＭＤ３Ｆ８、ＵＮＩＴＵＸＩＮ、ＤＭＡｂ−２０またはＧＤ２に特異的に結合する任意のその他の抗体（例えば、当技術分野において既知あるは開示されているか、またはまだ特定されていない）を含むが、これに限定されない。一実施形態では、ＣＡＲは、１４ｇ２ａ  ｓｃＦｖを含む。ＧＤ２  ＣＡＲは、親和性を増強し、および／またはトニックシグナルを減少させるために生成された抗ＧＤ２抗体のｓｃＦｖ（例えば、１４ｇ２ａ  ｓｃＦｖ）内に改変体を組み込んでいる受容体を含み得る。ＧＤ２  ＣＡＲは可変長のヒンジ領域（例えば、ｓｃＦｖとシグナル伝達ドメインとの間）および／または可変膜貫通ドメインを組み込み得る。本発明は、使用される膜貫通ドメインによって限定されない。実際、任意の膜貫通ドメインを使用することができ、例えば、ＣＤ３−ゼータ鎖（ＣＤ３ζ）、ＣＤ２８、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、４−１ＢＢ／ＣＤ１３７／ＴＮＦＲＳＦ９、ＦｃｅＲＩｇ、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＩＬＲＢ／ＣＤ１２２、ＩＬ−２ＲＧ／ＣＤ１３２またはＣＤ４０の膜貫通ドメインの全部または一部を使用することができる。
【０１１３】
本発明のＣＡＲ構築物は、細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、ナイーブＴ細胞受容体複合体のＣＤ３ゼータおよび／または他のシグナル伝達ドメイン（例えば、ＭｙＤ８８シグナル伝達ドメイン））を含み得る。この細胞内シグナル伝達ドメインは、リガンドの細胞内シグナルへの結合を引き起こす（例えば、免疫細胞（例えば、Ｔリンパ球）を活性化する（例えば、部分的に））。共刺激シグナルが存在しないと、受容体−リガンド結合はしばしば、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）の完全な活性化および増殖には不十分である。従って、ＣＡＲ構築物は、１つ以上の共刺激ドメイン（例えば、完全な免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）活性化を刺激する第二シグナルを提供する）を含み得る。一実施形態において、共刺激ドメインは、ＣＡＲ免疫Ｔ細胞のサイトカイン産生を増加させるために使用される。別の実施形態では、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）の複製を促進する共刺激ドメインが使用される。さらに別の実施形態では、ＣＡＲ免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）の枯渇を防止する共刺激ドメインが使用される。別の実施形態では、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）の抗腫瘍活性を増加させる共刺激ドメインが使用される。なおさらなる実施形態において、ＣＡＲ免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）の生存を強化する共刺激ドメインが使用される（例えば、患者への注入後）。例示的な共刺激ドメインには以下の共刺激分子の全部または一部が含まれるが、これらに限定されない。すなわちこのような共刺激分子は、Ｂ７−１／ＣＤ８０、ＣＤ２８、Ｂ７−２／ＣＤ８６、ＣＴＬＡ−４、Ｂ７−Ｈ１／ＰＤ−Ｌ１、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＩＬＲＢ／ＣＤ１２２、ＩＬ−２ＲＧ／ＣＤ１３２、Ｂ７−Ｈ２、ＰＤ−１、Ｂ７−Ｈ３、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ４、ＰＤＣＤ６、ＢＴＬＡ、４−１ＢＢ／ＴＮＦＲＳＦ９／ＣＤ１３７、ＦｃｅＲＩｇ、ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ５、４−１ＢＢリガンド／ＴＮＦＳＦ９、ＧＩＴＲ／ＴＮＦＲＳＦ１８、ＢＡＦＦ／ＢＬｙＳ／ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＧＩＴＲリガンド／ＴＮＦＳＦ１８、ＢＡＦＦ  Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ、ＨＶＥＭ／ＴＮＦＲＳＦ１４、ＣＤ２７／ＴＮＦＲＳＦ７、ＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４、ＣＤ２７リガンド／ＴＮＦＳＦ７、ＯＸ４０／ＴＮＦＲＳＦ４、ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８、ＯＸ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ４、ＣＤ３０リガンド／ＴＮＦＳＦ８、ＴＡＣｌ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＣＤ４０／ＴＮＦＲＳＦ５、２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４、ＣＤ８４／ＳＬＡＭＦ５、ＢＬＡＭＥ／ＳＬＡＭＦ８、ＣＤ２２９／ＳＬＡＭＦ３、ＣＤ２  ＣＲＡＣＣ／ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ２Ｆ−１０／ＳＬＡＭＦ９、ＮＴＢ−Ａ／ＳＬＡＭＦ６、ＣＤ４８／ＳＬＡＭＦ２、ＳＬＡＭ／ＣＤ１５０、ＣＤ５８／ＬＦＡ−３、ＣＤ２、Ｉｋａｒｏｓ、ＣＤ５３、インテグリンα４／ＣＤ４９ｄ、ＣＤ８２／Ｋａｉ−１、インテグリンα４β１、ＣＤ９０／Ｔｈｙ１、インテグリンα４β７／ＬＰＡＭ−１、ＣＤ９６、ＬＡＧ−３、ＣＤ１６０、ＬＭＩＲ１／ＣＤ３００Ａ、ＣＲＴＡＭ、ＴＣＬ１Ａ、ＤＡＰ１２、ＴＩＭ−１／ＫＩＭ−１／ＨＡＶＣＲ、デクチン１／ＣＬＥＣ７Ａ、ＴＩＭ−４、ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６、ＴＳＬＰ、ＥｐｈＢ６、ＴＳＬＰ  ＲおよびＨＬＡ−ＤＲである。一実施形態��おいて、本発明の方法において使用される免疫細胞で発現するＣＡＲ構築物は、ＣＤ２８エンドドメイン、４−１ＢＢエンドドメイン、および／またはＯＸ４０エンドドメインを含む。特定の実施形態において、本発明のＧＤ２に特異的なＣＡＲ構築物は、抗体のｓｃＦｖを含み、該抗体は、ＧＤ２（例えば、１４ｇ２ａ）、膜貫通ドメイン（例えば、ＣＤ８の）、Ｔ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ゼータ）、および少なくとも１つの共刺激ドメイン（例えば、４−１ＢＢ）に特異的に結合する。
【０１１４】
本発明は、ＧＤ２に特異的なＣＡＲを発現するように遺伝的に改変された免疫細胞の種類によって限定されない。例示的な免疫細胞としては、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ガンマデルタＴ細胞などのエフェクター細胞、記憶Ｔ細胞、マクロファージ、およびサイトカイン誘導キラー細胞が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、免疫細胞は、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、ＣＤ３＋）である。
【０１１５】
本発明は、免疫細胞においてＣＡＲを遺伝的に発現させる手段によって限定されない。実際、当技術分野で知られている、および／または本明細書に記載されている任意の手段を使用することができる。免疫細胞を遺伝的に操作する方法の非限定的な例としては、レトロウイルスまたはレンチウイルス媒介遺伝子組み込み、遺伝子組み込み用のトランスポザーゼを用いたシステムでの遺伝子組み込み、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介遺伝子組み込み、ＲＮＡまたはアデノ随伴ウイルスのような非組み込みベクター、あるいは本明細書中に記載される他の方法が挙げられるが、これらに限定されない。操作された免疫細胞産物は、選択されていないＴ細胞または他の免疫細胞を含み得るか、あるいはよりよい増殖または生存能力のために選択されたＴ細胞サブセットを組み込み得る。毒性を減少させるために、ＧＤ２標的化シグナル伝達分子を発現するように操作された細胞の死滅を可能にする要素の組み込みが含まれ得る。毒性を減少させ、および／または有効性を強化するために、操作された細胞におけるタンパク質発現の調節を可能にする素子の組み込みが含まれ得る。
【０１１６】
＜治療方法、組成物、および併用療法＞
特定の実施形態において、本発明はまた、ＧＤ２に特異的なＣＡＲを発現するように遺伝的に改変された有効量の免疫細胞（例えば、ＧＤ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞）を個体に投与する工程を包含する、個体におけるがんの進行を処置または遅延するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、処置は、処置の停止後に個体において持続的な反応を生じる。本明細書に記載の方法は、がんの治療のために腫瘍免疫原性を増加させるなど、増強された免疫原性が所望される状態を治療する際に使用することができる。ＧＤ２に特異的なＣＡＲ（例えば、ＧＤ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞）を発現するように遺伝的に改変された有効量の免疫細胞を個体に投与することを含む、がんを有する個体における免疫機能を増強する方法もまた、本明細書中に提供される。当技術分野で公知のまたは本明細書に記載のＧＤ２に特異的なＣＡＲを発現するように遺伝的に改変された任意の免疫細胞（例えば、任意のＴ細胞（例えば、ＣＤ３＋Ｔ細胞））を、これらの方法において使用することができる。いくつかの実施形態において、個体はヒトである。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、個体は１つ以上の他の形態の抗がん処置（例えば、化学療法、免疫療法など）に対して耐性である（例えば、耐性があることが実証されている）がんを有する。一部の実施形態では、耐性には、がんの再発または難治性がんの再発が含まれる。再発とは、治療後に元の部位または新たな部位にがんが再発することを指し得る。一部の実施形態では、耐性には、化学療法による治療中のがんの進行が含まれる。いくつかの実施形態において、耐性には、化学療法剤による伝統的またはこれまでの治療に応答しないがんが含まれる。がんは治療開始時に耐性を示すこともあれば、治療中に耐性を示すこともある。一部の実施形態では、がんは早期または後期に発生する。
【０１１８】
特定の実施形態において、本発明は、Ｈ３Ｋ２７Ｍ発現細胞（例えば、Ｈ３Ｋ２７Ｍ発現細胞によって特徴付けられるＤＩＰＧ）によって特徴付けられるがん／腫瘍に罹患している動物（例えば、ヒト）を、ＧＤ２に特異的なＣＡＲを発現するように遺伝的に改変された免疫細胞（例えば、ＧＤ２発現している腫瘍を標的化および死滅させる）を含む免疫療法組成物の治療有効量に暴露することによって、そのようなＨ３Ｋ２７Ｍ発現がん細胞の増殖を完全に阻害し、および／または個体群のような細胞をがん治療薬または放射線療法（例えば、その細胞死誘導活性のための）に対してより感受性を高めることを提供する。本発明の免疫療法組成物および免疫療法は、Ｈ３Ｋ２７Ｍ発現細胞（例えば、Ｈ３Ｋ２７Ｍ発現細胞によって特徴付けられるＤＩＰＧ）によって特徴付けられる任意の種類のがんなどの障害への処置、寛解、または予防のために使用され得る。
【０１１９】
特定の実施形態において、ＧＤ２に特異的なＣＡＲを発現するように遺伝的に改変された免疫細胞を含む免疫療法組成物は、Ｈ３Ｋ２７Ｍ発現細胞によって特徴付けられるがん（例えば、Ｈ３Ｋ２７Ｍ発現細胞によって特徴付けられるＤＩＰＧ）を処置、寛解、または予防するために使用される。このがんはさらに、１つ以上の従来のがん治療に対する耐性によって特徴付けられる（例えば、化学耐性、放射線耐性、ホルモン耐性などを有するがん細胞）。特定の実施形態において、がんはＤＩＰＧである。他の実施形態では、がんはびまん性正中グリオーマである。本明細書中に記載されるように、ＧＤ２に特異的なＣＡＲを発現するように遺伝的に改変された任意の免疫細胞が、本発明の免疫療法組成物および免疫療法において使用され得る。
【０１２０】
本発明の免疫療法組成物（例えば、ＧＤ２に特異的なＣＡＲを発現するように遺伝的に改変された免疫細胞を含む）および方法は、腫瘍細胞に対する細胞傷害活性を誘導するために、および／または、細胞の生存および機能（例えば、改変された免疫細胞の生存および機能）を促進するために使用され得る。例えば、本発明の免疫療法組成物および免疫療法は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）を誘導してＴ細胞の生存を促進するために；Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）および／または腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）を誘導するために（例えば、腫瘍細胞アポトーシスを誘導するために）；および／またはインターフェロン（ＩＦＮ）−ガンマを誘導するために（例えば、先天性免疫反応（例えば、がんに対する）を活性化するために）使用され得る。いくつかの実施形態において、本発明の組成物および方法は、細胞周期停止および／またはアポトーシスを誘導するために使用される。また、本発明の組成物および方法は、単独、またはさらなるアポトーシス誘導シグナルに応じて、細胞周期停止および／またはアポトーシス誘導を増強するために使用される。いくつかの実施形態において、ＧＤ２に特異的なＣＡＲを発現するように遺伝的に改変された免疫細胞は、細胞周期停止および／またはアポトーシスの誘発のためにＨ３Ｋ２７Ｍ発現がん細胞を感作し、このような誘発刺激に対して通常耐性である細胞が含まれる。他の実施形態では、アポトーシスの誘発によって処置、寛解、または予防することができるＨ３Ｋ２７Ｍ発現がん細胞の存在によって特徴付けられる任意の障害（例えば、Ｈ３Ｋ２７Ｍがん細胞の存在を特徴とするＤＩＰＧおよび／またはびまん性正中グリオーマ）においてアポトーシスを誘発するために、ＧＤ２に特異的なＣＡＲを発現するように遺伝的に改変された免疫細胞が使用される。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、本発明の組成物および方法は、動物（例えば、ヒトおよびコンパニオンアニマルを含むが、これに限定されない哺乳動物患者）における疾患細胞、組織、器官、または病的状態および／または疾患状態を処置するために使用される。この点に関して、Ｈ３Ｋ２７Ｍ細胞の存在によって特徴付けられる種々の疾患および病理は、本発明の方法および組成物を使用する治療又は予防で扱いやすい。一部の実施形態では、治療されるがん細胞は転移性である。他の実施形態において、処置されるがん細胞は、抗がん剤に対して耐性が有る。他の実施形態では、障害がＨ３Ｋ２７Ｍ変異の存在を特徴とする細胞を有する任意の障害である。
【０１２２】
本発明におけるいくつかの実施形態は、ＧＤ２に特異的なＣＡＲを発現するように遺伝的に改変された有効量の免疫細胞を投与するための方法、および少なくとも１つの付加的な治療剤（化学療法抗腫瘍剤、アポトーシス調節剤、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、および抗炎症剤を含むが、これらに限定されない）、および／または治療技術（例えば、外科的処置、および／または放射線療法）を提供する。特定の実施形態において、付加的な治療剤は抗がん剤である。例えば、本発明の免疫療法組成物および免疫療法を使用すると有意な腫瘍の排除が達成されたが、ＧＤ２発現が陰性の腫瘍細胞が少数残存していること（例えば、免疫蛍光染色による）から、次のようなことが示された。すなわち、いくつかの実施形態において、本発明の免疫療法Ｔ細胞組成物に加え、本明細書中に記載の任意の１つ以上のがん治療を使用いるマルチモーダル療法または組合せ療法は、抗原逃避を低減および／または回避のために、本発明の免疫療法Ｔ細胞組成物と共に有効であり得ることが示された（実施例、図４を参照）。
【０１２３】
本発明の方法において用いられるため、またはそれと組合せて使用するために適した、多数の抗がん剤が意図される。実際、本発明は以下のような多数の抗がん剤の投与を意図するが、これらに限定されない：アポトーシスを誘導する薬剤；ポリヌクレオチド（例えば、アンチセンス、リボザイム、ｓｉＲＮＡ）；ポリペプチド（例えば、酵素および抗体）；バイオミメティクス；アルカロイド；抗腫瘍剤；抗代謝物質；ホルモン；白金化合物；モノクローナルまたはポリクローナル抗体（例えば、抗がん剤、毒素、ディフェンシンと結合した抗体）、毒素；放射性核種；生物学的応答調節物質（例えば、インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−α）およびインターロイキン（例えば、ＩＬ−２））；養子免疫療法因子；造血成長因子；腫瘍細胞分化を誘導する薬剤（例えば、オールトランスレチノイン酸）；遺伝子療法試薬（例えば、アンチセンス療法試薬およびヌクレオチド）；腫瘍ワクチン；血管新生阻害剤；プロテオソーム阻害剤：ＮＦ−КＢモジュレーター；抗ＣＤＫ化合物；ＨＤＡＣ阻害剤など。開示された化合物との共投与に適した多数の他の化学療法化合物および抗がん療法の例は、当業者に公知である。
【０１２４】
特定の実施形態において、抗がん剤は、アポトーシスを誘導または促す薬剤を含む。アポトーシスを誘導する薬剤としては放射線（例えば、Ｘ線、ガンマ線、ＵＶ）；腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）関連因子（例えば、ＴＮＦファミリー受容体タンパク質、ＴＮＦファミリーリガンド、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１またはＴＲＡＩＬ−Ｒ２に対する抗体）；キナーゼ阻害剤（例えば、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）キナーゼ阻害剤、血管成長因子受容体（ＶＧＦＲ）キナーゼ阻害剤、線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）キナーゼ阻害剤、血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）キナーゼ阻害剤、およびＢｃｒ−Ａｂｌキナーゼ阻害剤（例えば、グリベック（登録商標））；アンチセンス分子；抗体（例えば、ハーセプチン（登録商標）、リツキサン（登録商標）、ゼバリン（登録商標）およびアバスチン（登録商標））；抗エストロゲン剤（例えば、ラロキシフェン、タモキシフェン）；抗アンドロゲン剤（例えば、フルタミド、ビカルタミド、フィナステリド、アミノグルテタミド、ケトコナゾール、およびコルチコステロイド）；シクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ−２）阻害剤（例えば、セレコキシブ、メロキシカム、ＮＳ−３９８、および非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ））；抗炎症剤（例えば、ブタゾリン、デカドロン（登録商標）、デルタソン（登録商標）、デキサメタゾン、デキサメタゾンインテンソール、デキソン（登録商標）、ヘキサドロール（登録商標）、ヒドロキシクロロキン、メチコルテン（登録商標）、オラデキソン（登録商標）、オラソン、オキシフェナゾン、ＰＥＤＩＡＰＲＥＤ（登録商標）、フェニルブタゾン、プラケニル（登録商標）、プレドニゾロン、プレドニゾン、プレロン（登録商標）、およびタンデアリル）；ならびにがん化学療法薬（例えば、イリノテカン（ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標））、ＣＰＴ−１１、フルダラビン（フルダラ（登録商標））、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、デキサメタゾン、ミトキサントロン、マイロターグ、ＶＰ−１６、カルボプラチン、オキサリプラチン、５−ＦＵ、ドキソルビシン、ゲムシタビン、ボルテゾミブ、ゲフィチニブ、ベバシズマブ、タキソテール（登録商標）またはタキソール（登録商標））；細胞シグナル伝達分子；セラミドおよびサイトカイン；スタウロスポリンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２５】
さらに他の実施形態では、本発明の組成物および方法は、アルキル化剤、代謝拮抗剤、および天然産物（例えば、ハーブおよび他の植物および／または動物由来化合物）から選択される少なくとも１つの抗過増殖剤または抗腫瘍剤と一緒に使用される。
【０１２６】
本組成物および方法での使用に適したアルキル化剤には、１）窒素マスタード（例えば、メクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン（Ｌ−サルコリシン）；およびクロラムブシル）；２）エチレンイミンおよびメチルメラミン（例えば、ヘキサメチルアミンおよびチオテパ）；３）アルキルスルホネート（例えば、ブスルファン）；４）ニトロソウレア（例えば、カルムスチン（ＢＣＮＵ）；ロムスチン（ＣＣＮＵ）；セムスチン（メチル−ＣＣＮＵ）；およびストレプトゾチン（ストレプトゾトシン））；ならびに５）トリアゼン（例えば、ダカルバジン（ＤＴＩＣ；ジメチルトリアゼノイミド−アゾレカルボキサミド）が含まれるが、これに限定されない。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、本組成物および方法での使用に適した代謝拮抗物質には、１）葉酸類似体（例えば、メトトレキサート（アメトプテリン））；２）ピリミジン類似体（例えば、フルオロウラシル（５−フルオロウラシル；５−ＦＵ）、フロックスウリジン（フルオロデオキシウリジン；ＦｕｄＲ）、およびシタラビン（シトシンアラビノシド））；ならびに３）プリン類似体（例えば、メルカプトプリン（６−メルカプトプリン；６−ＭＰ）、チオグアニン（６−チオグアニン；ＴＧ）、およびペントスタチン（２’−デオキシコホルミシン））が含まれるが、これに限定されない。
【０１２８】
なおさらなる実施形態において、本発明の組成物および方法における使用に適した化学療法剤には、１）ビンカアルカロイド（例えば、ビンブラスチン（ＶＢＬ）、ビンクリスチン）；２）エピポドフィルロトキシン（例えば、エトポシドおよびテニポシド）；３）抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ダウノルビシン（ダウノマイシン；ルビドマイシン）、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン（マイトラマイシン）、およびマイトマイシン（マイトマイシンＣ））；４）酵素（例えば、Ｌ−アスパラギナーゼ）；５）生物学的応答調節物質（例えば、インターフェロン−アルファ）；６）白金配位複合体（例えば、シスプラチン（ｃｉｓ−ＤＤＰ）およびカルボプラチン）；７）アントラセンジオン（例えば、ミトキサントロン）；８）置換尿素（例えば、ヒドロキシ尿素）；９）メチルヒドラジン誘導体（例えば、プロカルバジン（Ｎ−メチルヒドラジン；ＭＩＨ））；１０）副腎皮質抑制剤（例えば、ミトタン（ｏ，ｐ’−ＤＤＤ）およびアミノグルテチミド；１１）アドレノコルチコステロイド（例えば、プレドニゾン）；１２）プロゲスチン（例えば、ヒドロキシプロゲステロンカプロエート、メドロキシプロゲステロンアセテート、およびメゲストロールアセテート）；１３）エストロゲン（例えば、ジエチルスチルベストロールおよびエチニルエストラジオール）；１４）抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン）；１５）アンドロゲン（例えば、プロピオン酸テストステロンおよびフルオキシメステロン）；１６）抗アンドロゲン（例えば、フルタミド）；および１７）ゴナドトロピン放出ホルモン類似体（例えば、ロイプロリド）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２９】
がん治療の流れにおいて日常的に使用される任意の腫瘍溶解剤もまた、本発明の組成物および方法において使用され得る。例として、米国食品医薬品局は、米国での使用が承認された腫瘍溶解剤の処方を継続している。米国Ｆ．Ｄ．Ａ．に対応する国際的な機関は、同様の承認を継続している。
【０１３０】
抗がん剤はさらに、抗がん活性を有することが同定された化合物を含む。例としては３−ＡＰ、１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−１３−アセテート、１７ＡＡＧ、８５２Ａ、ＡＢＩ−００７、ＡＢＲ−２１７６２０、ＡＢＴ−７５１、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０、ＡＥ−９４１、ＡＧ−０１３７３６、ＡＧＲＯ１００、アラノシン、ＡＭＧ７０６、抗体Ｇ２５０、アンチネオプラストン、ＡＰ２３５７３、アパジクオン、ＡＰＣ８０１５、アチプリモド、ＡＴＮ−１６１、アトラセンタン、アザシチジン、ＢＢ−１０９０１、ＢＣＸ−１７７７、ベバシズマブ、ＢＧ００００１、ビカルタミド、ＢＭＳ２４７５５０、ボルテゾミブ、ブリオスタチン−１、ブセレリン、カルシトリオール、ＣＣＩ−７７９、ＣＤＢ−２９１４、セフィキシム、セツキシマブ、ＣＧ００７０、シレンジタイド、クロファラビン、コンブレタスタチンＡ４リン酸塩、ＣＰ−６７５、２０６、ＣＰ−７２４、７１４、ＣｐＧ７９０９、クルクミン、デシタビン、DENSPM、ドキセルカルシフェロール、Ｅ７０７０、Ｅ７３８９、エクセインシジン７４３、エファプロキシラル、エフロルニチン、ＥＫＢ−５６９、エンザウリン、エルロチニブ、エクシスリンド、フェンレチニド、フラボピリドール、フルダラビン、フルタミド、フォテムスチン、ＦＲ９０１２２８、Ｇ１７ＤＴ、ガリキシマブ、ゲフィチニブ、ゲニステイン、グルホスファミド、ＧＴＩ−２０４０、ヒストリン、ＨＫＩ−２７２、ホモハリングトニン、ＨＳＰＰＣ−９６、ｈｕ１４．１８インターロイキン−２融合タンパク、ＨｕＭａｘ−ＣＤ４、イロプロスト、イミキモド、インフリキシマブ、インターロイキン１２、ＩＰＩ−５０４、イロフルベン、イキサベピロン、ラパチミブ、レナリドシド、レスタウルチニブ、ロイプロリド、ＬＭＢ−９イムノトキシン、ロナファルニブ、ルニリシキマブ、マホスファミド、ＭＢ０７１３３、ＭＤＸ−０１０、ＭＬＮ２７０４、モノクローナル抗体３Ｆ８、モノクローナル抗体Ｊ５９１、モテキサフィン、ＭＳ−２７５、ＭＶＡ−ＭＵＣ１−ＩＬ２、ニルタミド、ニトロカンプトテシン、ノラトレキセドジヒドロクロリド、ノルバデックス、ＮＳ−９，Ｏ６−ベンジルグアニン、オブリメルセンナトリウム、ＯＮＹＸ−０１５、オレゴマブ、ＯＳＩ−７７４、パニツムマブ、パラプラチン、ＰＤ−０３２５９０１、ペメトレキセド、ＰＨＹ９０６、ピオグリタゾン、ピルフェニドン、ピキサントロン、ＰＳ−３４１、ＰＳＣ８３３、ＰＸＤ１０１、ピラゾラクリジン、Ｒ１１５７７７、ＲＡＤ００１、ランピルナーゼ、レベカマイシン類似体、ｒｈｕアンギオスタチンタンパク質、ｒｈｕＭａｂ２Ｃ４、ロシグリタゾン、ルビテカン、Ｓ−１、Ｓ−８１８４、サトラプラチン、ＳＢ−、１５９９２、ＳＧＮ−００１０、ＳＧＮ−４０、ソラフェニブ、ＳＲ３１７４７Ａ、ＳＴ１５７１、ＳＵ０１１２４８、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、スラミン、タラボスタット、タランペニル、タリキダ、テムシロリムス、ＴＧＦａ−ＰＥ３８免疫毒素、サリドマイド、チマルファシン、チピファルニブ、チラパザミン、ＴＬＫ２８６、トラベクテジン、トリメトレキサートグルクロネート、ＴｒｏＶａｘ、ＵＣＮ−１、バルプロ酸、ビンフルニン、ＶＮＰ４０１０１Ｍ、ボロシキシマブ、ボリノスタット、ＶＸ−６８０、ＺＤ１８３９、ＺＤ６４７４、ジレウトン、およびゾスキダートリヒドロクロリドが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３１】
抗がん剤および他の治療剤のより詳細な説明については、当業者が任意の取扱説明書を参照すればよく、例えば、Physician's Desk Reference and to Goodman and Gilman's “Pharmaceutical Basis of Therapeutics” tenth edition, Eds. Hardman et al., 2002を挙げることができるが、これに限らない。
【０１３２】
本発明は（例えば、放射線療法の前、間、または後に）、本発明の組成物を投与する方法、および放射線療法を伴う本発明の方法を提供する。本発明は、動物に送られるために使用される治療用量の放射線の種類、量、または送達、ならびに投与システムによって限定されない。例として、動物は、光子放射線療法、粒子ビーム放射線療法、他の種類の放射線療法、およびそれらの組み合わせを受けてもよい。いくつかの実施形態では、線形加速器を使用して放射線が動物体に当てられる。さらに他の実施形態では、ガンマナイフを使用して放射線が当てられる。
【０１３３】
放射線源は、動物の外部または内部であり得る。外部放射線療法は最も一般的であり、例えば線形加速器を使用し、高エネルギー放射線のビームを、皮膚を通して腫瘍部位に直射することを含む。放射線ビームは腫瘍部位において局所的であるが、正常で健康な組織の被曝を避けることはほとんど不可能である。しかしながら、外部放射線は、通常、動物に十分に許容される。内部放射線療法は、腫瘍部位またはその近くの体内に、ビーズ、ワイヤ、ペレット、カプセル、粒子などの放射線放出源を移植することを含み、がん細胞を特異的に標的化する送達システムを使用すること（例えば、がん細胞結合リガンドに付着した粒子を使用する）を含む。このような移植物は、治療後に除去され得るか、または体内に不活性のまま残り得る。内部放射線療法のタイプには、近接放射線療法、間質照射、腔内照射、放射線免疫療法などが含まれるが、これらに限定されない。
【０１３４】
動物は任意に、放射線増感剤（例えば、メトロニダゾール、ミソニダゾール、動脈内Ｂｕｄｒ、静脈内ヨードデオキシウリジン（ＩｕｄＲ）、ニトロイミダゾール、５−置換４ニトロイミダゾール、２Ｈ−イソインドリン、［［（２−ブロモエチル）−アミノ］−メチル］−ニトロ−１Ｈ−イミダゾール−１−エタノール、ニトロアニリン誘導体、ＤＮＡ親和性低酸素選択的細胞毒素、ハロゲン化ＤＮＡリガンド、１，２，４ベンゾトリアジン酸化物、２−ニトロイミダゾール誘導体、フッ素含有ニトロアゾール誘導体、ベンズアミド、ニコチンアミド、アクリジンインターカレーター、５−チオレトラゾール誘導体、３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール、４，５−ジニトロイミダゾール誘導体、ヒドロキシル化テキサフリン、シスプラチン、ミトマイシン、チリパザミン、ニトロソウレア、メルカプトプリン、メトトレキサート、フルオロウラシル、ブレオマイシン、ビンクリスチン、カルボプラチン、エピルビシン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンデシン、エトポシド、パクリタキセル、熱（温熱療法）など）、放射線防護剤（例えば、システアミン、アミノアルキル二水素ホスホロチオエート、アミホスチン（ＷＲ２７２１）、ＩＬ−１、ＩＬ−６など）を投与されてもよい。放射線増感剤は、腫瘍細胞の死滅を増強する。ラジオプロテクタは、放射線による有害な影響から健全な組織を保護する。
【０１３５】
放射線量が、動物にとって許容不可能な悪い副作用を伴うことなく許容される限り、任意のタイプの放射線を動物に投与することができる。適切なタイプ放射線療法には、例として、電離（電磁気）放射線療法（例えば、Ｘ線またはガンマ線）または粒子ビーム放射線療法（例えば、高線形エネルギ放射線）が含まれる。電離放射線は、粒子または光子を含む放射線であって、電離が生じる、すなわち、電子の獲得または喪失を生じるのに充分なエネルギーを有する放射線と定義される（例えば、米国特許第５，７７０，５８１号に記載されているように）。放射線の効果は、臨床医によって少なくとも部分的に制御することができる。一実施形態では、標的細胞を最もよく被曝させるために放射線量は分割され、毒性が減少される。
【０１３６】
一実施形態では、動物体に投与される放射の総線量は約０．１グレイ（Ｇｙ）〜約１００Ｇｙである。別の実施形態では、約１０Ｇｙ〜約６５Ｇｙ（例えば、約１５Ｇｙ、２０Ｇｙ、２５Ｇｙ、３０Ｇｙ、３５Ｇｙ、４０Ｇｙ、４５Ｇｙ、５０Ｇｙ、５５Ｇｙ、または６０Ｇｙ）が、治療過程にわたって投与される。ある実施形態では、放射線量の全量を１日程で投与することができるが、理想的には分割され、数日にわたって投与される。望ましくは、放射線療法は、少なくとも約３日間、例えば、少なくとも５、７、１０、１４、１７、２１、２５、２８、３２、３５、３８、４２、４６、５２、または５６日間（約１〜８週間）にわたって投与される。したがって、１日の放射線量は、約１〜５Ｇｙ（例えば、約１Ｇｙ、１．５Ｇｙ、１．８Ｇｙ、２Ｇｙ、２．５Ｇｙ、２．８Ｇｙ、３Ｇｙ、３．２Ｇｙ、３．５Ｇｙ、３．８Ｇｙ、４Ｇｙ、４．２Ｇｙ、または４．５Ｇｙ）、または１〜２Ｇｙ（例えば、１．５〜２Ｇｙ）である。１日当たりの放射線量は、標的細胞の破壊を誘導するのに十分な量であるべきである。一実施形態において、ある時間にわたって延長される場合、照射は毎日投与されず、それによって、動物が休息でき、治療の効果が現れる。例えば、照射は、治療の各週について、５日間連続して投与され、２日間は投与されず、それにより１週間あたり２日間の休息できることが好ましい。しかし、放射線は、動物の応答性および任意の潜在的な副作用に応じて、１日／週、２日／週、３日／週、４日／週、５日／週、６日／週、または７日／週全てで投与することができる。放射線療法は、治療期間中の任意の時点で開始することができる。一実施形態において、照射は、１週目または２週目に開始され、そして治療時間の残りの期間にわたって投与される。例えば、照射は、例えば固形腫瘍を治療するための６週間の治療期間の、１〜６週目または２〜６週目で投与される。あるいは、５週間の治療期間の、１〜５週目または２〜５週目に放射線が投与される。しかしながら、これらの例示的な放射線療法投与スケジュールは、本発明を限定することを意図するものではない。
【０１３７】
本発明において、抗菌治療剤もまた、治療剤として使用され得る。微生物の機能を、消滅させる、阻害する、またはこれ以外の減弱することができる任意の剤、加えて、そのような活性をもつように期待される任意の剤が用いられうる。抗菌剤は、限定されるわけではないが、天然および合成抗生物質、抗体、阻害性タンパク質（例えば、デフェンシン）、アンチセンス核酸、膜破壊性剤などを含み、単独でまたは組み合わせて用いられる。限定されるわけではないが、実際、抗細菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤などを含む抗生物質の任意の型が用いられ得る。
【０１３８】
いくつかの実施形態の本発明において、ＧＤ２に特異的なＣＡＲを発現するように遺伝的に改変された免疫細胞（例えば、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８および／またはＣＤ４Ｔ細胞））ならびに１つ以上の治療剤または抗がん剤は、以下の条件のうちの１つ以上の下で動物に投与される：異なる周期で、異なる持続時間で、異なる濃度で、異なる投与経路によってなど。いくつかの実施形態において、ＧＤ２に特異的なＣＡＲを発現するように遺伝的に改変された免疫細胞（例えば、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８および／またはＣＤ４Ｔ細胞））は、治療剤または抗がん剤の前に、例えば、治療剤または抗がん剤の投与の０．５、１、２、３、４、５、１０、１２、１８時間前またはそれ以上前、１、２、３、４、５、６日前またはそれ以上前、あるいは１、２、３、４、５、６週間前またはそれ以上前に投与される。いくつかの実施形態において、ＧＤ２に特異的なＣＡＲを発現するように遺伝的に改変された免疫細胞（例えば、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８および／またはＣＤ４Ｔ細胞））は、治療剤または抗がん剤の投与後、例えば、抗がん剤の投与後０．５、１、２、３、４、５、１０、１２、１８時間後またはそれ以上後、１、２、３、４、５、６日後またはそれ以上後、あるいは１、２、３、４、５、６週間後またはそれ以上後に投与される。いくつかの実施形態において、ＧＤ２に特異的なＣＡＲを発現するように遺伝的に改変された免疫細胞（例えば、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８および／またはＣＤ４Ｔ細胞））ならびに治療剤または抗がん剤は同時に投与されるが、異なるスケジュール、例えば、改変された免疫細胞は毎日投与され、一方、治療剤または抗がん剤は週に１回、２週に１回、３週に１回、４週に１回、またはそれ以上で投与される。他の実施形態では、改変された免疫細胞が週に１回投与され、一方、治療剤または抗がん剤は毎日、週に１回、２週に１回、３週に１回、４週に１回、またはそれ以上投与される。
【０１３９】
本発明の範囲内に含まれる組成物は、ＧＤ２に特異的なＣＡＲを発現するように遺伝的に改変された免疫細胞（例えば、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８および／またはＣＤ４Ｔ細胞））がその意図される目的を達成するために有効な量で含まれている、全ての組成物を含む。個々の必要性は変化するが、各成分の治療有効量の最適範囲を決定することは、当技術分野の技術の範囲内である。１つの非限定的な例において、ＧＤ２に特異的なＣＡＲを発現するように遺伝的に改変された免疫細胞（例えば、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８および／またはＣＤ４Ｔ細胞））を、哺乳動物、例えば、ヒトに投与して、（例えば、がんを治療するための）１日当たり１０００〜１０１０の改変された免疫細胞を提供することができる。別の実施形態では、１０００〜１０１０の改変された免疫細胞を投与して、がんを処置、寛解、または予防する（例えば、がんの転移、再発および／または進行を予防する）。単位用量は、１日１回またはそれ以上（例えば、１、２、３、４、５、６日間、またはそれ以上の日または週の間）の、１回以上の投与で投与されてもよい。
【０１４０】
改変された免疫細胞は、適切な薬学的に受容可能な担体を含む薬学的調製物の一部として、薬学的に使用され得る調製物へ投与され得る。この担体は、改変された細胞のプロセシングおよび／または投与を容易にする賦形剤および補助剤を含む担体である。改変された免疫細胞および／またはそれを含有する薬学的調製物またはそれと同時に使用される他の治療は、静脈内、筋肉内、皮下、腫瘍内、腹腔内、くも膜下、または脳室内に投与され得る。病気の予防または治療のために、治療有効量の改変された免疫細胞および／またはそれを含有する薬学的調製物を投与することができる。適切な投薬量は、治療される疾患のタイプ、改変された免疫細胞のタイプ、疾患の重篤度および経過、個体の臨床状態、個体の臨床履歴および治療に対する反応、ならびに主治医の判断に基づいて決定され得る。
【０１４１】
本明細書中に記載される方法のいずれかの有効性（例えば、本明細書中に記載される１つ以上の化学療法剤と組み合わせて、ＣＡＲ標的化ＧＤ２を単独で発現するように操作された免疫細胞での治療）は、臨床モデルまたは前臨床モデルのような、当該分野で公知の種々のモデルにおいて試験され得る。適切な前臨床モデルを本明細書に例示する。Ｈ３Ｋ２７Ｍ変異がん／腫瘍の他のモデルを使用してもよい。任意の例示的なモデルについて、腫瘍を発生させた後、マウスを、処置または対照処置を受ける処置群に無作為にふりわける。腫瘍のサイズ（例えば、腫瘍体積）は、処置の過程の間に測定され、そして全体の生存率もまたモニターされる。
【０１４２】
いくつかの実施形態において、試料は、ＧＤ２を標的とするＣＡＲを発現するように操作された免疫細胞での治療（例えば、単独でまたは、本明細書に記載の他の治療と組み合わせて）の前に得られる。いくつかの実施形態において、試料は、組織試料（例えば、ホルマリン固定およびパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）、保管された、生のまたは凍結された）である。いくつかの実施形態では、試料は全血である。いくつかの実施形態において、全血は、免疫細胞、循環腫瘍細胞、およびそれらの任意の組み合わせを含む。
【０１４３】
いくつかの実施形態において、Ｈ３Ｋ２７Ｍ変異の存在は、腫瘍または腫瘍試料において評価される。本明細書中で使用される場合、腫瘍または腫瘍試料は、腫瘍細胞によって占有される腫瘍領域の一部または全部を包含し得る。いくつかの実施形態において、腫瘍または腫瘍試料は、腫瘍関連腫瘍内細胞および／または腫瘍関連間質（例えば、隣接腫瘍周囲線維形成性間質）によって占有される腫瘍領域をさらに包含し得る。腫瘍関連腫瘍内細胞および／または腫瘍関連間質は、主な腫瘍塊に直接隣接および／または隣接する免疫浸潤領域を含み得る。
【０１４４】
バイオマーカー（例えば、Ｈ３Ｋ２７Ｍ）の存在および／または発現レベル／量は、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、タンパク質、タンパク質断片、および／または遺伝子コピー数を含むがこれらに限定されない当該分野で公知の任意の適切な基準に基づいて、定性的および／または定量的に決定され得る。特定の実施形態において、第１の試料中のバイオマーカーの存在および／または発現レベル／量は、第２の試料中の存在または非存在および／または発現レベル／量と比較して、増加または上昇する。特定の実施形態において、第１の試料中のバイオマーカーの存在または非存在および／または発現レベル／量は、第２の試料中の存在および／または発現レベル／量と比較して、減少または低減する。特定の実施形態において、第２の試料は、参照試料、参照細胞、参照組織、対照試料、対照細胞、または対照組織である。遺伝子の存在または非存在および／または発現レベル／量を決定するためのさらなる開示は、本明細書中に記載される。
【０１４５】
試料中の種々のバイオマーカーの存在および／または発現レベル／量は、数々の方法論によって分析され得、その多くは免疫組織化学（「ＩＨＣ」）、ウェスタンブロット分析、免疫沈降、分子結合アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＦＡ、蛍光活性化細胞選別（「ＦＡＣＳ」）、マスアレイ、プロテオミクス、血液の定量に基づく分析（例えば、血清ＥＬＩＳＡ）、生化学的酵素活性アッセイ、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、サザン分析、ノーザン分析、全ゲノム配列決定、定量的リアルタイムＰＣＲ（「ｑＲＴ−ＰＣＲ」）を含むポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）、および他の増幅型検出方法（例えば、分岐ＤＮＡ、ＳＩＳＢＡ、ＴＭＡなど）、ＲＮＡ−Ｓｅｑ、ＦＩＳＨ、ミクロアレイ分析、遺伝子発現プロファイリングおよび／または遺伝子発現の連続分析（「ＳＡＧＥ」）、そして、タンパク質、遺伝子および／または組織アレイ分析によって行うことができる多種多様なアッセイのいずれか１つを含むが、これらに限定されない。遺伝子および遺伝子産物の状態を評価するための典型的なプロトコールは、例えば、Ausubel et al., eds., 1995, Current Protocols In Molecular Biology, Units 2 (Northern Blotting), 4 (Southern Blotting), 15 (Immunoblotting) and 18 (PCR Analysis)に記載されている。Rules Based MedicineまたはMeso Scale Discovery（「ＭＳＤ」）から入手可能な多重イムノアッセイもまた使用され得る。
【０１４６】
別の方法では、抗体−バイオマーカー複合体が形成されるのに十分な条件下で、バイオマーカーに特異的な抗体と試料を接触させてから、前記複合体を検出することができる。バイオマーカーの存在は、多くの方法で検出することができ、例えば、ウェスタンブロット法およびＥＬＩＳＡ法などの、血漿または血清を含む多種多様な組織および試料をアッセイするための方法によって検出することができる。そのような分析法式を用いた広範囲の免疫アッセイ技術が利用可能である（例えば、米国特許４，０１６，０４３、４，４２４，２７９および４，０１８，６５３を参照）。これらには、非競合タイプのシングルサイトおよび２−サイトアッセイの両方または「サンドイッチ」アッセイ、ならびに従来の競合結合アッセイが含まれる。これらのアッセイはまた、標的バイオマーカーへの標識抗体の直接結合を含む。
【０１４７】
組織または細胞試料において選択されたバイオマーカーの存在および／または発現レベル／量はまた、機能または活性に基づくアッセイによって試験され得る。例えば、バイオマーカーが酵素である場合、組織または細胞試料中の所定の酵素活性の存在を決定または検出するために、当該分野で公知のアッセイを行い得る。
【０１４８】
特定の実施形態において、試料は、アッセイされるバイオマーカーの量の差異と使用される試料の質の変動性との両方、およびアッセイを行う間の変動性について正規化される。このような正規化は、周知のハウスキーピング遺伝子を含む特定の正規化バイオマーカーの発現を検出し、組み込むことによって達成され得る。あるいは、正規化は、全てのアッセイされた遺伝子シグナルの平均値または中央値あるいはその大きなサブセットに基づいて行うことができる（グローバル正規化アプローチ）。測定された対象腫瘍ｍＲＮＡまたはタンパク質の正規化量を、遺伝子ごとに、参照セットで見られる量と比較する。対象当たりの試験された腫瘍当たりのｍＲＮＡまたはタンパク質それぞれの正規化された発現レベルは、参照セットにおいて測定された発現レベルに対する割合として表すことができる。分析される特定の対象試料において測定される存在および／または発現レベル／量は、この範囲内の数パーセンタイルに入り、これは、当該分野で周知の方法によって決定され得る。
【０１４９】
一実施形態では、試料は臨床試料である。別の実施形態では、試料は診断検査に使用される。いくつかの実施形態において、試料は、原発性または転移性腫瘍から得られる。組織の生検は、腫瘍組織の代表的な断片を得るためにしばしば使用される。あるいは、関心のあるがん細胞を含んでいることが知られているまたは考えられる組織または液体を形成することで、間接的にがん細胞を得ることもできる。遺伝子または遺伝子産物は、がんまたは腫瘍組織から、あるいは尿、痰、血清または血漿のような他の身体試料から検出され得る。上記で議論された、がん性試料中の標的遺伝子または遺伝子産物の検出のための技術と同じ技術が、他の身体試料に適用され得る。がん細胞はがん病変から剥離し、そのような身体試料中に出現することがある。このような身体試料をスクリーニングすることにより、これらのがんについて簡単な早期診断をすることができる。さらに、治療の進行は、標的遺伝子（バイオマーカー）または遺伝子産物についてこのような身体試料を試験することによって、より容易にモニターされ得る。
【０１５０】
特定の実施形態では参照試料、参照細胞、参照組織、対照試料、対照細胞、または対照組織は、同じ対象または個体から得られる単一試料または複数組み合わされた試料であり、試験試料が得られる時とは異なった１以上の時点で得られる試料である。例えば、参照試料、参照細胞、参照組織、対照試料、対照細胞、または対照組織は、試験試料が得られる時よりも早い時点において、同じ対象または個体から得られる。がんの初期診断の間に参照試料が得られ、がんが転移性になった場合に試験試料を後から得る場合、このような参照試料、参照細胞、参照組織、対照試料、対照細胞、または対照組織は、有用であり得る。
【０１５１】
特定の実施形態において、参照試料、参照細胞、参照組織、対照試料、対照細胞、または対照組織は、対象または個体ではない１つ以上の健康な個体から得られる複数組み合わされた試料である。特定の実施形態において、参照試料、参照細胞、参照組織、対照試料、対照細胞、または対照組織は、対象または個体ではなく、かつ疾病または障害（例えば、がん）を有する１つ以上の個体から得られる複数組み合わされた試料である。特定の実施形態において、参照試料、参照細胞、参照組織、対照試料、対照細胞、または対照組織は、正常組織からプールされたＲＮＡ試料、または対象または個体ではない１つ以上の個体からプールされた血漿または血清試料である。特定の実施形態において、参照試料、参照細胞、参照組織、対照試料、対照細胞、または対照組織は、対象または個体ではなく、かつ疾病または障害（例えば、がん）を有する１つ以上の個体から得られる、腫瘍組織からプールされたＲＮＡ試料あるいは血漿または血清試料である。
【０１５２】
いくつかの実施形態において、試料は、個体由来の組織試料である。いくつかの実施形態において、組織試料は腫瘍組織試料（例えば、生検組織）である。いくつかの実施形態では、組織試料はＣＮＳ組織である。いくつかの実施形態では、組織試料は脳組織（例えば、グリア組織）である。
【０１５３】
腫瘍試料は、当該分野で公知の任意の方法によって対象から得ることができ、この方法には生検、内視鏡検査、または外科的処置が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、腫瘍試料は、凍結、固定（例えば、ホルマリンまたは類似の固定剤を使用することによる）、および／またはパラフィンワックス中に包埋することなどの方法によって調製され得る。いくつかの実施形態では、腫瘍試料を切片化することができる。いくつかの実施形態において、生の腫瘍試料（すなわち、上記の方法によって調製されていないもの）が使用され得る。いくつかの実施形態において、腫瘍試料は、ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質の完全性を保存するために、水溶液中でインキュベートすることによって調製することができる。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、治療に対する応答性は、生存期間の拡張（全生存期間および無増悪生存期間を含む）、客観的奏効（完全奏効または部分奏効を含む）の結果、またはがんの徴候または症状の改善、のうちの任意の１つまたは複数を指すことができる。いくつかの実施形態では、応答性は、がん患者における腫瘍の状態（すなわち応答、安定化、または進行）を決定するために公表された一連のＲＥＣＩＳＴガイドラインに規定される１つ以上の因子の改善を指すことができる。これらのガイドラインのより詳細な議論については、Eisenhauer et al., Eur J Cancer 2009;45: 228-47、Topalian et al., N Engl J Med 2012;366:2443-54、Wolchok et al., Clin Can Res 2009;15:7412-20、およびTherasse, P., et al. J. Natl. Cancer Inst. 92:205-16 (2000) を参照。応答性の対象は、例えば、ＲＥＣＩＳＴ基準に基づく１つ以上の因子に従って、がんが改善を示す対象をいうことができる。非応答性対象とは、例えば、ＲＥＣＩＳＴ基準に基づく１つ以上の因子に従って、がんが改善を示さない対象をいうことができる。
【０１５５】
従来の応答基準は、免疫療法剤の抗腫瘍活性を特徴付けるのに十分ではない場合がある。これは応答の遅延を生じ得、応答の遅延に先行して、初期の明らかな放射線学的な進行（新たな病変の出現を含む）が起こり得る。そのため、新たな病変の出現の可能性を考慮し、その後の評価で放射線学的な進行を確認できるように改変された応答基準が開発されている。したがって、いくつかの実施形態において、応答性は、免疫関連応答基準２（ｉｒＲＣ）に従った１つ以上の因子の改善を指し得る。例えば、Wolchok et al., Clin Can Res 2009; 15:7412-20を参照。いくつかの実施形態では、定義された腫瘍負荷へ新たな病変が追加され、追跡されている（例えば、その後の評価における放射線学的な進行のため）。一部の実施形態では、非標的病変の存在は、完全奏効の評価に含まれ、放射線学的な進行の評価には含まれない。いくつかの実施形態において、放射線学的な進行は、測定可能な疾病に基づいてのみ決定されてもよく、および／または最初に文書化された日から４週間を超える連続評価によって確認されてもよい。
【０１５６】
本発明の改変された免疫細胞（例えば、ＣＡＲ  Ｔ細胞）を利用する治療は、多数の型の正中Ｈ３Ｋ２７Ｍ変異小児びまん性正中グリオーマを効果的に排除した。しかし、いくつかの例において、腫瘍／がんの減少および／または排除を導く免疫応答の強さは、その後の膨潤不耐性の神経解剖学的位置における、神経炎症と関連し得る（例えば、Richman et al., Cancer Immunol. Res. (2018) 6(1); １７／１１／２７オンライン公開を参照）。例として、小脳テント切痕のすぐ上に位置する視床は、浮腫にとって不安定な位置であり、特に腫瘍によってすでに拡張されている場合、この位置での膨潤は、第３脳室圧縮、頭蓋内圧亢進、および致死的なテントヘルニアによって水頭症を引き起こし得る。
【０１５７】
従って、いくつかの実施形態において、臨床結果を成功させるために、浮腫の臨床的モニタリングおよび／または神経系の管理は、本発明の免疫療法組成物および免疫療法と共に利用される。本発明は、使用されるモニタリングのタイプまたは管理のタイプによって限定されない。実際、頭蓋の炎症および／または腫脹をモニタリングするための任意の手段を使用することができる。同様に、頭蓋の炎症および／または腫脹を管理するための任意の手段を使用することができる。１つの非限定的な例では、頻繁な神経学的底視鏡検査および／または神経画像化を伴って入院患者をモニタリングする間に、水頭症および／または頭蓋内圧上昇の徴候のモニタリングが行われる。いくつかの実施形態では、水頭症を軽減するための脳室内シャント設置、または減圧のための開頭術などの神経外科的介入が、殺腫瘍性神経炎症を介して患者をサポートするために利用される。
【０１５８】
本明細書は、当業者が実施することを可能にするのに充分であると考えられる。本明細書に示され、説明されたものに加えて、本発明の様々な改変が前述の説明から当業者に明らかになり、特許請求の範囲内に入る。本明細書に引用される全ての刊行物、特許、および特許出願は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５９】
〔実施例〕
以下の実施例は、本発明の化合物、組成物、および方法を例示するものであり、限定するものではない。臨床治療において通常遭遇し、そして当業者に明らかである種々の条件およびパラメーターの他の適切な改変および適応は、本発明の精神および範囲内である。
【０１６０】
＜実施例１＞
材料及び方法
ＤＩＰＧ／ＤＭＧ培養物。患者由来グリオーマ細胞培養物を、以前に記載されるように生成した（例えば、Ｌｉｎ  ａｎｄ  Ｍｏｎｊｅ、Ｊ  Ｖｉｓ  Ｅｘｐ，２０１７（１２１）を参照のこと）。簡潔には、ショ糖遠心分離によるミエリンおよびデブリの分離の前に、死後腫瘍組織を機械的および酵素的に（Ｌｉｂｅｒａｓｅ  ＤＨ、Ｒｏｃｈｅ）解離させた。神経球生成培養物を、Ｂ２７（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ（Ｓｈｅｎａｎｄｏａｈ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、およびヘパリン（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充した無血清培地中で維持した。全ての培養物を、ＳＴＲフィンガープリンティング（以下の表１を参照のこと）によって検証およびモニターし、そして以前の６ヶ月以内にマイコプラズマフリーであることを確証した（ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ  Ｐｌｕｓ、Ｌｏｎｚａ）。
【０１６１】
【表１】
2020532493.tif 000002
【０１６２】
表１．細胞株ＳＴＲフィンガープリンティング
ＳＵ−ＤＩＰＧ６およびＳＵ−ＤＩＰＧ１３は既に参照されており、そしてそれぞれＳＵ−ＤＩＰＧ−ＶＩおよびＳＵ−ＤＩＰＧ−ＸＩＩＩと同一である。
【０１６３】
細胞表面スクリーニング。ＤＩＰＧ細胞培養物上に存在する細胞表面マーカーを、ヒト細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体のパネルを使用してスクリーニングした（Ｌｙｏｐｌａｔｅ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。無血清、神経球形成状態で剖検で収集した腫瘍組織から拡大した低継代（＜１２）のＤＩＰＧ培養物を９６ウェルプレートに分配し、そして１００万細胞当たり１μｇのヤギＩｇＧでブロックして、その後アッセイにおいて使用する二次抗体の非特異的結合を減少させた。次いで、細胞を、製造業者の説明書に従って、中間洗浄工程を伴って、連続的に一次抗体および二次抗体とともにインキュベートした。次いで、死細胞をＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ  ｖｉｏｌｅｔ染色（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて標識し、そして洗浄後、細胞を１％  ＰＦＡ中で１０分間室温で固定した。翌日、染色された細胞をフローサイトメトリーによって分析した。ダブレットおよび死細胞をゲートによって除外し、そしてパネル上の各標的に対する抗体標識の蛍光強度の中央値を、対応するアイソタイプ対照に対する蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）に対して正規化した。
【０１６４】
免疫組織化学および光学顕微鏡観察。初代ＤＩＰＧ患者腫瘍試料を、到着時に４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ中で一晩固定し、次いで、組織試料が沈降するまで（２〜３日）、３０％スクロースに移した。次いで、組織をクリオモルドに移し、そしてＯＣＴ（ＴｉｓｓｕｅＴｅｋ）に包埋した。１０ミクロンの凍結切片をクリオスタット（Ｌｅｉｃａ）上で生成し、そして透過処理（０．３％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ＴＢＳ）およびブロッキング（５％ウマ血清、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の前に、内因性ペルオキシダーゼ活性を中和した（Ｂｌｏｘａｌｌ、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。Ｈ３Ｋ２７Ｍ  （Ａｂｃａｍ  ａｂ１９０６３１、１：１０００、１時間、室温）およびＧＤ２（１４ｇ２ａ、ＢＤ、１：５００、１時間、室温）について、連続的な二重免疫組織化学を実施した。Ｈ３Ｋ２７Ｍは、ポリマーベースのペルオキシダーゼ二次（ＩｍｍＰＲＥＳＳ  ＶＲ抗ウサギＩｇＧ、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、３０分、室温）およびＤＡＢ基質（ＢＤ、４５秒、室温）を用いて発色させた。これらの条件下で、Ｈ３Ｋ２７Ｍ＋細胞を、Ｓａｎｇｅｒ配列決定によってＨ３Ｆ３ＡおよびＨＩＳＴＨ１Ｂ３変異の両方を有することが確認された複数の組織において、日常的に同定することができた。ＴＢＳ中でＤＡＢ基質の発色をクエンチし、そして１４ｇ２ａ一次抗体で染色した後、ポリマーベースのアルカリホスファターゼ二次（ＩｍｍＰＲＥＳＳ  ＡＰ抗マウスＩｇＧ、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、３０分、室温）および青色アルカリホスファターゼ基質（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｂｌｕｅ  ＡＰ基質キット、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、１５０秒、室温）を使用してＧＤ２シグナルを発色させた。ＡＰ発色をＴＢＳ中でクエンチし、そして試料をマウントおよびイメージングした（Ｚｅｉｓｓ  ＡｘｉｏＯｂｓｅｒｖｅｒ）。ヘマトキシリン−エオシン染色のために、マウスをトリブロモエタノールの腹腔内注射によって深く麻酔し、そして冷ＰＢＳを経心的に潅流し、脳を取り出し、そして４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ中で一晩固定した。次いで、脳を７０％エタノールに移し、続いてパラフィンに包埋し、切片化し、そしてヘマトキシリン／エオシンで染色した。次いで、Ｈ＆Ｅ組織学を分析した。
【０１６５】
免疫蛍光および共焦点顕微鏡観察。マウスをトリブロモエタノール（Ａｖｅｒｔｉｎ）で深く麻酔した後、冷ＰＢＳで経心的に潅流した。次いで、脳および他の目的の組織を取り出し、そして４％  ＰＦＡ／ＰＢＳ中で一晩固定した後、３０％スクロースに移し、そして沈降させた（２〜３日）。次いで、連続的な４０ミクロンの冠状切片を凍結ミクロトームで切断し、そして組織凍結保護溶液（グリセロール、エチレングリコール、リン酸緩衝液）中に浮遊させた後、−２０℃で貯蔵した。次いで、連続切片を４℃で一晩染色した。使用した一次抗体は以下のとおりであった：ウサギ抗Ｈ３Ｋ２７Ｍ（Ａｂｃａｍ、１：１０００）、ウサギ抗切断カスパーゼ−３（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９６６１、１：２５０）、マウス抗ＮｅｕＮ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＡＢ３７７、１：５００）、およびウサギＩｂａ１（Ｗａｋｏ、０１９−１９７４１、１：５００）。ロバにおいて惹起され、そしてＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ５９４または６４７と結合した二次抗体を４℃で一晩使用して、一次標識を検出した（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、１：５００）。マウントした試料を共焦点顕微鏡観察（Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ７１０）によってイメージングし、そして腫瘍領域を通して獲得されたＺ積層を最大強度投影（ＩｍａｇｅＪ）によって平坦化した。腫瘍細胞密度を定量するために、獲得された顕微鏡写真における浸潤腫瘍の境界内の細胞を計数し、そして腫瘍面積に対して正規化し（ＩｍａｇｅＪ）、そして全ての細胞の合計を、１：１２シリーズで各動物について３〜４個の切片にわたって調査した総面積に対して正規化した。
【０１６６】
ＲＴ−ｑＰＣＲ。培養物を、標準的な増殖条件下で３連でプレーティングし、そして２４時間後にトリゾール中に収集した。ＤＮＡｓｅ処理後、抽出したＲＮＡを逆転写し（Ｍａｘｉｍａ  ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、そしてｑＰＣＲ反応のための鋳型として利用した（Ｍａｘｉｍａ  ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）。利用したプライマーを以下の表２に列挙する。
【０１６７】
【表２】
2020532493.tif 000003
【０１６８】
表２．ＲＴ−ＰＣＲに使用したプライマー
鋳型なしおよびＲＴ対照は有意に増幅しなかった。
【０１６９】
ＣＡＲ構築、レトロウイルスベクター産生およびＴ細胞形質導入。ＧＤ２．ＢＢｚおよびＣＤ１９．ＢＢｚ  ＣＡＲレトロウイルスベクターを構築した（例えば、Lynn et al., Blood, 2015, 125 (22):p.3466−76を参照のこと）。ＧＤ２．ＢＢｚおよびＣＤ１９．ＢＢｚ  ＣＡＲをコードするレトロウィルス上清を、２９３ＧＰ細胞株の一過性トランスフェクションを介して産生した（例えば、Haso et al, Blood, 2013. 121(7): p. 1165-74を参照のこと）。簡潔には、２９３ＧＰ細胞を、ＣＡＲおよびＲＤ１１４エンベロープタンパク質をコードするプラスミドを用いて、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を介して、ポリ−ｄ−リジンコートしたプレート上でトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後および７２時間後に上清を回収した。単離したヒトＴ細胞を、３日間４０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２とともに３：１のビーズ：細胞比で抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて活性化した。次いで、活性化Ｔ細胞を、３日目および４日目にＲｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（Ｔａｋａｒａ）コートプレートを使用してレトロウイルス形質導入し（例えば、Long et al., Nat Med, 2015. 21(6): p.581-90を参照のこと）、そして３００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２中で培養した。抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを５日目に除去した。培地およびＩＬ−２を２〜３日毎に交換した。形質導入効率を、ＧＤ２．ＢＢｚ  ＣＡＲについては１Ａ７抗イディオタイプ抗体（例えば、Sen et al., J Immunother, 1998. 21(1): p. 75-83を参照のこと）を用い、そしてＣＤ１９．ＢＢｚ  ＣＡＲについてはＦＭＣ６３抗イディオタイプ抗体１３６．２０．１（例えば、Jena et al., PLoS One, 2013. 8(3): p.e57838を参照のこと）、またはＰｒｏｔｅｉｎ  Ｌ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてフローサイトメトリーによってチェックした。
【０１７０】
インビトロサイトカイン生成および細胞死滅。標準的なルシフェラーゼベースのアッセイを行って、ＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞溶解能を評価した（例えば、Lynn et al., Blood, 2015. 125(22): p.3466-76を参照のこと）。ホタルルシフェラーゼ発現標的腫瘍細胞（１ウェル当たり１０，０００個）を、１０：１〜１：１の範囲のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で、２４時間ＣＡＲ  Ｔ細胞と共インキュベートした。ＳＴＥＡＤＹ−ＧＬＯ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、残存する標的からの残留ルシフェラーゼ活性を測定し、そして溶解を以下のように計算した：％溶解＝１００−［［（Ｔ細胞処理ウェルからの平均シグナル）／（未処理標的ウェルからの平均シグナル）］×１００］。
【０１７１】
インビトロでのＣＡＲ  Ｔ細胞によるサイトカイン産生を、ＣＡＲ＋Ｔ細胞の、標的腫瘍細胞との１：１比（各々１００，０００細胞）での共インキュベーションによって評価し、ＣＡＲ＋Ｔ細胞カウントは、抗イディオタイプ染色およびフローサイトメトリーによって評価される形質導入効率を組み込んだ。対照ＣＤ１９−４−１ＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞のために使用したＴ細胞の総数を、ＧＤ２−４−１ＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞のために使用した数と一致させて、Ｔ細胞の総数が群間で一定のままであることを確実にした。２４時間後、上清を収集し、そしてＩＬ−２およびＩＦＮ−γについてＥＬＩＳＡによってサイトカインレベルを測定した（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）。
【０１７２】
Ｔ細胞増殖。培養１５日目のＧＤ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞を、製造業者のプロトコールに従ってＣｅｌｌ  Ｔｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて標識した。標識ＧＤ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞を、腫瘍なし、ＶＵＭＣ−ＤＩＰＧ１０（ＧＤ２陰性、Ｈ３Ｋ２７Ｍ陰性）またはＳＵ−ＤＩＰＧ１３（ＧＤ２陽性、Ｈ３Ｋ２７Ｍ陽性）のいずれかとともにインキュベートした。５日間のインキュベーションの後、細胞を収集し、そして増殖についてフローサイトメトリーによって分析した。分析を、抗６８７イディオタイプ染色によって同定されるＣＡＲ＋Ｔ細胞のみに対して行った。
【０１７３】
同所性異種移植片の生成および処置。同所性ＤＩＰＧ異種移植片を生成した（例えば、Grasso et al., Nat Med, 2015. 21(6): p.555-9を参照のこと）。全てのインビボ実験は、Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認され、施設ガイドラインに従って実施された。動物を、１２時間明／暗サイクルで、食物および水への自由なアクセスで、施設ガイドラインに従って飼育した。簡潔には、ＣＭＶプロモーターによって駆動されるｅＧＦＰおよびホタルルシフェラーゼを発現するレンチウイルスを用いて事前に形質導入された患者由来ＤＩＰＧ細胞培養物を、定位注入器（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ）によって、冷麻酔した新生（Ｐ０−２）ＮＳＧマウス（Ｊａｘ）の橋（座標ラムダＡＰ−３ｍｍ、ＤＶ−３ｍｍ）中に注入した。イソフルラン麻酔したＰ３５  ＮＳＧマウスの髄質中への、ＣＡＧプロモーターによって駆動されるｅＧＦＰおよびホタルルシフェラーゼを発現するレンチウイルスを用いて形質導入したＳＵ−ｐＳＣＧ１の定位注入によって、同所性小児脊髄グリオーマ異種移植片を生成した（座標ラムダＭＬ＋０．７ｍｍ、ＡＰ−３．５ｍｍ、ＤＶ−４．５ｍｍ、６００ｋ細胞）。同所性視床グリオーマ異種移植片を、ＣＭＶプロモーターによって駆動されるｅＧＦＰおよびホタルルシフェラーゼを発現するレンチウイルスを用いて形質導入したＱＣＴＢ−Ｒ０５９の、イソフルラン麻酔したＰ３５  ＮＳＧマウスの視床中への定位注入によって生成した（座標ブレグマＭＬ＋０．８ｍｍ、ＡＰ１ｍｍ、ＤＶ−３．５ｍｍ、６００ｋ細胞）。次いで、腫瘍を６０日間発達させた。処置前に、腫瘍負荷をインビボ発光イメージング（ＩＶＩＳ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）によって評価し、そして含まれるソフトウェア（Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）によって、動物の頭部を中心とする標準円形ＲＯＩを通した輝度として全フラックスを計算した。対になったバックグラウンド領域を、バックグラウンドを超えた有意な発光が検出されなかった動物の側腹にわたって、円形ＲＯＩを使用して定量した。動物を腫瘍負荷によって順位付けし、そしてＧＤ２またはＣＤ１９−ＣＡＲ処置群に連続的に分配して、等価な初期腫瘍負荷の集団が治療の各群を受けるようにした。この方法で評価した初期負荷は、処置群および移植した細胞株にわたって等価であった（図３を参照のこと）。ＳＵ−ＤＩＰＧ１３Ｐ＊細胞を、イソフルラン麻酔したＰ３５  ＮＳＧマウスの橋中に注射し（座標ラムダＭＬ＋１ｍｍ、ＡＰ−０．８ｍｍ、ＤＶ−５ｍｍ、６００ｋ細胞）、そしてＴ細胞投与前１４日間発達させた。２００マイクロリットルのＰＢＳ中で１×１０７個の形質導入細胞を送達するように調整した濃度のＣＡＲ  Ｔ細胞（フローサイトメトリーを用いたイディオタイプ染色によって評価、ルーチンに＞６０％）を、次いで動物の尾静脈中への静脈注射によって投与した。形質導入効率がＧＤ２−ＣＡＲとＣＤ１９−ＣＡＲとの間で変動した場合、ＣＤ１９−ＣＡＲ細胞の濃度を、ＧＤ２ＣＡＲ注入に存在するヒトＴ細胞の総投与量に一致するように調整した。腫瘍負荷を、インビボ発光イメージングによって長期にモニターした。ＧＤ２−ＣＡＲ応答の性質に起因して、初期コホートにおける盲検化は有効でないとみなされ、その後実施されなかった。全ての画像を、最小フラックス強度を５×１０４、最大を５×１０６として示すようにスケール化し、次いで、個々の動物の画像を、図に表示するためにコホート内で処置動物と同様に配列した。処置５０日後の試験終了時を、初期コホートにおいて決定した。ここで、安楽死の罹患基準を誘発するＧＤ２−ＣＡＲ群とＣＤ１９−ＣＡＲ群の両方における実質的な脱毛、活動低下、および体重減少があった。
【０１７４】
ＧＤ２シンターゼのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介欠失。ＳＵ−ＤＩＰＧ１３細胞におけるＧＤ２シンターゼ（Ｂ４ＧＡＬＮＴ１）の欠失を、記載されるように、Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡリボ核タンパク質複合体を用いたＤＩＰＧ１３のエレクトロポレーションによって達成した（Hendel et al., Nat Biotechnol 33, 985-989 (2015)を参照のこと）。簡潔には、Ｂ４ＧＡＬＮＴ１のエキソン１を標的とするガイドＲＮＡ（ＣＧＵＣＣＣＧＧＧＧＵＧＣＵＣＧＣＧＵＡＣ（配列番号１５）およびＣＣＧＧＣＵＡＣＣＵＣＵＵＣＵＧＣＧＣＣＧＵ（配列番号１６）、Ｓｙｎｔｈｅｇｏ）を、Ｃａｓ９ヌクレアーゼと共にインキュベートして、リボ核タンパク質複合体を形成させ、そしてＡｍａｘａ  ４−Ｄ  ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（ＳＥ  Ｂｕｆｆｅｒ、プログラムＤＳ−１１２）を用いてエレクトロポレーションした。並行して、ＡＡＶＳ１遺伝子座４６を標的とする対照ｇＲＮＡ（ＧＧＧＧＣＣＡＣＵＡＧＧＧＡＣＡＧＧＡＧＡＵ（配列番号１７））を、同一のパラメーターを使用して、リボ核タンパク質複合体としてＣａｓ９ヌクレアーゼとともにエレクトロポレーションした。Ｂ４ＧＡＬＮＴ１標的ｇＲＮＡを用いてエレクトロポレーションしたＧＤ２陰性細胞を、ＦＡＣＳソーティングによって単離し、そして欠失をＳａｎｇｅｒ配列決定およびＴＩＤＥ分析によって確認した（Nucleic Acids Res 42, e168 (2014)を参照のこと）。
【０１７５】
統計および再現性。統計的検定は、特に指定がない限り、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ）ソフトウェアを使用して行った。ガウス分布をＳｈａｐｉｒｏ−Ｗｉｌｋ正規性検定によって確認した。パラメーターデータについては、対ごとの差異をさらに調べるために、独立両側スチューデントｔ検定およびＴｕｋｅｙの事後検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを使用した。生存分析のために、ログランク（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）検定を使用した。有意差を示すために、Ｐ＜０．０５のレベルを使用した。対照マウスにおける異種移植片成長の分散に基づいて、処置群あたり少なくとも３匹のマウスを使用して、０．０５の有意水準で２０％の効果量を検出するために８０％の検定力を与えた。全ての動物実験について、使用した独立したマウスの数を図に示すか、または図面の簡単な説明に列挙する。使用した５つの患者由来異種移植片モデルの各々について、少なくとも２つの独立したコホートを試験した（すなわち、細胞の独立したバッチを用いた異なる日のマウスの独立した同腹仔）。サイトカインおよびインビトロ細胞死滅実験について、ｎ＝３、そして実験を２回繰り返した。
【０１７６】
＜実施例２＞
ヒストンＨ３  Ｋ２７Ｍ（Ｈ３Ｋ２７Ｍ）変異びまん性内因性橋グリオーマ（ＤＩＰＧ）におけるジシアロガングリオシドＧＤ２の過剰発現の同定
ＤＩＰＧにおける免疫療法（例えば、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法）のための潜在的な標的を同定するために、細胞表面抗原（図１３を参照のこと）を、患者由来ＤＩＰＧ培養物においてスクリーニングした（図１Ａを参照のこと）。独立した患者由来培養物間の有意な重複（図１Ｂを参照のこと）は、ＤＩＰＧ患者にわたる表面マーカーの中核群の保存を示した。これらの共通の標的から、ジシアロガングリオシドＧＤ２が、スクリーニングされた４つの患者由来ＤＩＰＧ培養物の各々において高レベルで共通に発現されると同定された。フローサイトメトリーによるヒット検証により、Ｈ３Ｆ３Ａ  Ｋ２７Ｍ変異およびより一般的でないＨＩＳＴ１Ｈ３Ｂ  Ｋ２７Ｍ変異を有するものの両方を含む、試験した全てのＨ３Ｋ２７Ｍ  ＤＩＰＧ培養物における一様かつ著しく高いレベルのＧＤ２発現が確認された（図１Ｃ、Wu et al., Nature Genetics, 2012. 44(3): p. 251-253；Khuong-Quang et al., Acta Neuropathol, 2012. 124(3): p. 439-47；およびSchwartzentruber et al., Nature, 2012. 482(7384): p.226-31を参照のこと）。興味深いことに、ＧＤ２発現は、ＤＩＰＧと診断された症例を含む、ヒストンＨ３  ＷＴ小児高悪性度グリオーマ（ｐＨＧＧ）において、はるかに低いことが同定された（図１Ｃを参照のこと）。
【０１７７】
Ｈ３Ｋ２７Ｍ変異から生じる転写攪乱が、ＧＤ２発現の増加に関連するかどうかを評価するために、ガングリオシド合成酵素の遺伝子発現を、患者由来ＤＩＰＧおよびｐＨＧＧ培養物のパネルにおいてプロファイリングし、そしてＨ３Ｋ２７Ｍ変異を有する培養物において上流ガングリオシド合成酵素の一貫してより高い発現が見出された（図１Ｊを参照のこと）。浸潤悪性細胞およびＧＤ２を同定するためのＨ３Ｋ２７Ｍについての初代ヒトＤＩＰＧ組織の二重免疫染色は、天然腫瘍の文脈においてＧＤ２の局所発現を確認した（図１Ｄを参照のこと）。
【０１７８】
＜実施例３＞
ＧＤ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞を用いたＤＩＰＧ細胞のＧＤ２依存性細胞死滅
ヒトＧＤ２標的化ＣＡＲ  Ｔ細胞を、１４ｇ２ａ  ｓｃＦｖおよび４−１ＢＢｚ共刺激ドメインを用いて生成した（図１ＥおよびLong et al., Nature Medicine, 2015. 21(6): p.581-590を参照のこと）。有意なＧＤ２依存性細胞死滅（図１Ｆを参照のこと）およびサイトカイン生成（図１Ｇを参照のこと）が、４−１ＢＢｚ（ＣＤ１９−ＣＡＲ）を組み込んだ対照ＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞と比較して、患者由来ＤＩＰＧ培養物への曝露に際して観察された。注目すべきことに、ＧＤ２指向性ＣＡＲ  Ｔ細胞は、Ｈ３ＷＴ、ＧＤ２陰性ＶＵ−ＤＩＰＧ１０患者由来ＤＩＰＧ培養物に曝露されたときに、有意なサイトカインを産生せず、細胞死滅を誘導しなかった。それによって、Ｈ３Ｋ２７Ｍ  ＤＩＰＧに対するＧＤ２−ＣＡＲの治療的特異性が実証された。
【０１７９】
ＧＤ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞の標的特異性をさらに確認するために、患者由来ＤＩＰＧ細胞におけるＧＤ２シンターゼ（Ｂ４ＧＡＬＮＴ１）のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９媒介欠失を使用して、ＧＤ２ノックアウトＤＩＰＧ細胞を生成した（図１Ｈ（ａ）、１Ｈ（ｂ）および１Ｈ（ｃ）を参照のこと）。ＧＤ２抗原発現の喪失は、ＡＡＶＳ１遺伝子座を標的とする対照ガイド配列を用いてエレクトロポレーションしたＤＩＰＧ細胞または未処理と比較して、ＧＤ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞によるサイトカイン産生を排除した（図１Ｉを参照のこと）。これらのデータは、Ｈ３Ｋ２７Ｍ＋グリオーマ細胞に対するＧＤ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞の特異的反応性を示す。
【０１８０】
＜実施例４＞
ＤＩＰＧに対するＧＤ２指向性ＣＡＲ  Ｔ細胞のインビボ有効性
ＤＩＰＧに対するＧＤ２指向性ＣＡＲ  Ｔ細胞のインビボ有効性を評価するために、死後の患者組織に由来するＤＩＰＧ培養物の同所性マウス異種移植片を調製し、次いで、腫瘍負荷の長期モニタリングを可能にするためにルシフェラーゼ発現構築物を用いて形質導入した。異種移植片モデルは、ＤＩＰＧのびまん性浸潤組織学を忠実に再現する（例えば、Monje et al. Proc Natl Acad Sci USA 108, 4453-4458 (2011)；およびQin et al., Cell 170, 845-859 e819 (2017)を参照のこと）。マウスを、橋異種移植片の確立後７〜８週間の単回静脈内注射による１×１０７個のＧＤ２−ＣＡＲまたはＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞を受ける前に、初期腫瘍負荷によって等価の処置群および対照群に分配した。処置後４０日（ＤＰＴ）以内に、ＳＵ−ＤＩＰＧ６異種移植片を有するマウスの２つの独立したＧＤ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞処置コホートにわたって、腫瘍負荷の顕著な低減が観察された（図２ＡおよびGrasso et al., Nat Med 21, 555-559 (2015)を参照のこと）。同様の結果が、第２の患者由来異種移植片モデル、ＳＵ−ＤＩＰＧ１３ＦＬ３０において観察された（図２ｅを参照のこと）。全てのＧＤ２−ＣＡＲ処置動物が、生物発光イメージングによって完全な腫瘍排除を示した（図３を参照のこと）。対照的に、ＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞対照群におけるマウスは、有意な腫瘍退行を示さなかった。５０ＤＰＴで脳を採取し、そして変異ヒストンＨ３Ｋ２７Ｍ（全ての移植腫瘍細胞に中存在する）についての免疫染色は、ＧＤ２−ＣＡＲ処置腫瘍が大部分根絶されたことを明らかにした（図２Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｉを参照のこと）。
【０１８１】
処置後に残存する少数のＨ３Ｋ２７Ｍ＋腫瘍細胞は、免疫染色によってＧＤ２について陰性であった（図４を参照のこと）。このデータは、ＧＤ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞の効力がＨ３Ｋ２７Ｍ変異ＤＩＰＧにおける標的抗原の高発現によって駆動されたことを証明し、これはＧＤ２＋神経芽細胞腫および肉腫細胞株上に存在するものよりも一貫して高いことが観察された（図５を参照のこと）。
【０１８２】
大部分の患者由来同所性ＤＩＰＧ異種移植片モデルは、致死性のために何ヶ月も必要とし、これは、ヒトＴ細胞での処置後の異種移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の発達に起因する生存利益をモニターする能力を制限している（Ali et al., PLoS One 7, e44219 (2012)を参照のこと）。それゆえ、ＳＵ−ＤＩＰＧ−１３Ｐ＊を使用した。なぜなら、それは、組織学的に密な成長パターンを示すモデルであり（Nagaraja et al., Cancer Cell 31, 635-652 e636 (2017)を参照のこと）、そして１ヶ月以内に一貫して致死的であるからである。生存の実質的な改善が、ＣＤ１９−ＣＡＲ処置対照と比較して、ＧＤ２−ＣＡＲ処置動物において観察された（図６Ａを参照のこと）。しかし、３つの独立したコホートのうちの１つにおいて、致死毒性がいくつかのＧＤ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞処置動物において生じ、一方、他のコホートにおける全てのＧＤ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞処置動物は終了時まで生存した（図７を参照のこと）。グリオーマ排除の初期を生き残ったＧＤ２−ＣＡＲ処置動物は、終了時基準を一定不変に誘発したＣＡＲ投与の４＋週間後のＧＶＨＤ症状の開始まで、未処置免疫不全マウスと区別できない視覚的に健康な状態に戻った（図８を参照のこと）。終了時ＧＤ２−ＣＡＲ処置動物の脳の組織学的分析は、この高負荷腫瘍の排除を明らかにし、周囲の神経組織は全体的に正常であるように見えた（図６Ｂを参照のこと）。
【０１８３】
これらのＤＩＰＧ異種移植片モデルにおける処置関連毒性の病因をより良く理解するために、処置したＳＵ−ＤＩＰＧ６異種移植片を有するマウスの脳を、ＤＰＴ１４で急性に試験した（図３ｃ）。ＧＤ２−ＣＡＲ処置は、脳実質、髄膜および脳室を含む広範囲の炎症性浸潤を伴い、これは脳幹において最も顕著であった。水頭症と一致して、脳室拡大が観察された。組織学的に正常に見えるニューロンが、ＧＤ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞処置動物の橋、海馬、および皮質全体に存在することが観察され、このモデルにおいてニューロン細胞死滅または他の組織破壊の証拠はなかった（図６Ｃを参照のこと）。従って、神経病理学的評価は、上記の毒性が、ＧＤ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞のオンターゲット、オフ腫瘍毒性ではなく、腫瘍排除間隔の間の第４脳室圧縮に起因する脳幹炎症および水頭症から生じたことを示した。
【０１８４】
実質および腫瘍中へのＣＡＲ  Ｔ細胞浸潤を可視化するために、ＧＤ２−４−１ＢＢｚ−ｍＣｈｅｒｒｙおよびＣＤ１９−４−１ＢＢｚ−ｍＣｈｅｒｒｙ融合構築物を生成した（図６Ｄを参照のこと）。ＤＰＴ７までに、ＧＤ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞は処置動物の軟髄膜全体に広範囲に分布し、軟髄膜腫瘍は大部分が根絶され、そして脳実質内にｍＣｈｅｒｒｙ＋細胞はほとんど存在しなかった（図６Ｈおよび図９を参照のこと）。ＤＰＴ１４までに、ｍＣｈｅｒｒｙ＋ＧＤ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞は実質全体に広く浸潤しており、そしてＩｂａ１＋マクロファージの多数の病巣（図６Ｅを参照のこと）が広範なアポトーシス性切断カスパーゼ３＋細胞と共に、異種移植部位に存在した（図６Ｆを参照のこと）。注目すべきことに、非常に少数の切断カスパーゼ３＋アポトーシス性細胞が、ＮｅｕＮ二重免疫染色によって同定されるニューロンであった（４匹のマウスにわたって同定された１０個の全アポトーシス性ニューロン）（図６Ｇおよび図１０を参照のこと）。ＤＰＴ２１までに、ｍＣｈｅｒｒｙ＋ＧＤ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞はＣＮＳ全体に存在したままであった；一方、実質に浸潤したＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞はほとんどなかった（図９を参照のこと）。このことは、静脈内投与されたＧＤ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞が髄膜リンパ系を通って進入し（Louveau et al., Nature 523, 337-341 (2015)を参照のこと）、次いでその後、脳実質に浸潤することを示した。腫瘍排除および脳室拡大の消散が処置動物において時間的に一致するとすれば、データはまた、オンターゲット、オフ腫瘍細胞死滅ではなく、抗原特異的抗腫瘍活性が、水頭症を生じる活発な殺腫瘍活性の間の神経炎症および浮腫を生じさせる可能性を示す。
【０１８５】
＜実施例５＞
ＣＡＲ  Ｔ細胞療法は複数の型の正中Ｈ３Ｋ２７Ｍ変異小児びまん性正中グリオーマを有効に排除するが、視床異種移植片における毒性と関連する
近年のＷＨＯ基準は、Ｈ３Ｋ２７Ｍ変異を発現するびまん性正中グリオーマ（ＤＭＧ）のより大きな分類内にＤＩＰＧを置いている（図１１Ａ、およびLouis et al., Acta Neuropathol 131, 803-820 (2016)を参照のこと）。小児Ｈ３Ｋ２７Ｍ視床（ＱＣＴＢ−Ｒ０５９、切除由来）および脊髄（ＳＵ−ｐＳＣＧ１、死後由来）ＤＭＧの患者由来培養物において、ＧＤ２はまた、高度かつ一様に発現しており（図１１Ｂを参照のこと）、そしてＧＤ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞によるＩＦＮγおよびＩＬ−２産生を誘発する（図１１Ｃを参照のこと）。疾患の神経解剖学的部位がＣＡＲ  Ｔ細胞療法の成績に影響し得るかどうかを決定するために、そしてこれらのＨ３Ｋ２７Ｍ  ＤＭＧにおけるインビボのＧＤ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞の有効性を探索するために、脊髄（ＳＵｐＳＣＧ１）および視床（ＱＣＴＢ−Ｒ０５９）グリオーマの患者由来同所性異種移植片モデルを生成した。脊髄中への注入によって誘導される麻痺を回避するために髄質中に移植した場合、広範囲のＳＵｐＳＣＧ１成長がＣＮＳ全体にわたって観察された（図１１Ｄを参照のこと）。ＧＤ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞の全身投与は、脊髄グリオーマ異種移植片モデルにおいて強力かつ持続的な腫瘍排除を達成した。これを、長期生物発光イメージング（図１１Ｄおよび１１Ｅを参照のこと）および終了時組織学の両方によって評価した。ここで、動物あたり約１６個の残存Ｈ３Ｋ２７Ｍ＋細胞が、３匹のＧＤ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞処置動物のサンプリングした体積にわたって残存していた（図１１Ｆおよび１１Ｇを参照のこと）。このコホートからのマウスは腫瘍排除期に死亡しなかった。
【０１８６】
Ｈ３Ｋ２７Ｍ視床グリオーマにおける有効性を評価するために、ＱＣＴＢ−Ｒ０５９細胞を視床に同所的に移植した（図１１Ｈを参照のこと）。上記のＤＩＰＧおよび脊髄腫瘍について観察されたのと同様のタイムスケールで、このモデルにおいて腫瘍排除が観察された（図１１Ｈ、１１Ｉおよび図１２を参照のこと）。しかし、最大治療効果の期間中に、ＧＤ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞処置動物において実質的な毒性が生じ（図１１Ｋを参照のこと）。結果は、チェックポイント阻害剤を用いた免疫療法後に十分に記載されている「偽増悪」を連想させ（Wolchok et al., Clin Cancer Res 15, 7412-7420 (2009)を参照のこと）、そして膨潤不耐性の神経解剖学的位置における強固な免疫療法応答およびその後の神経炎症の潜在的欠点を強調する。
【０１８７】
上記の明細書において言及された全ての刊行物および特許は、本明細書中に参考として援用される。ここに記載した本発明の方法およびシステムに本発明の範囲および精神から逸脱することなく各種の改変および変更を加えることは当業者に明らかである。本発明を特定の好ましい実施形態に関連して説明してきたが、特許請求の範囲に記載されている本発明はそのような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解されたい。実際、関連分野の当業者に明らかな、本発明を実施するための記載された様式の種々の改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１８８】
【図１Ａ】図１Ａは、患者由来ＤＩＰＧ細胞培養物中の細胞表面抗原のフローサイトメトリーに基づくスクリーニングを示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、スクリーニングされた培養物間のヒット重複の評価が、全てのスクリーニングされた培養物において、アイソタイプ対照の少なくとも１０倍のＭＦＩで存在する合計３６個のヒットを同定したことを示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ＤＩＰＧと診断された、ヒストンＨ３  ＷＴの小児高悪性度グリオーマ培養物ＶＵ−ＤＩＰＧ１０、および皮質に生じたｐｃＧＢＭ２のフローサイトメトリー染色が、ヒストンＨ３  Ｋ２７Ｍ  ＤＩＰＧと比較して著しく低いＧＤ２発現レベルを示すことを示す。
【図１Ｄ】図１Ｄは、腫瘍細胞を同定するための変異Ｈ３Ｋ２７Ｍに対する抗体およびマウス抗ＧＤ２（１４ｇ２ａ）を利用する初代ＤＩＰＧ腫瘍標本の二重免疫組織化学を示し、これは、初代ＤＩＰＧにおける広範な局所的ＧＤ２発現を示す（スケールバー＝１００ミクロン）。
【図１Ｅ】図１Ｅは、ＤＩＰＧに対する有効性を評価するために使用される、ＧＤ２指向性１４ｇ２ａ  ｓｃＦｖ；４−１ＢＢ；ＣＤ３ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞および対照構築物の模式図を描写する。
【図１Ｆ】図１Ｆは、ＤＩＰＧ細胞のＧＤ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞とのインキュベーションが、ＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞の存在下での大部分の条件下での最小溶解比と比較して、低いエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で強力なＤＩＰＧ細胞溶解を達成することを示す。
【図１Ｇ】図１Ｇは、ＧＤ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞のＤＩＰＧ培養物とのインキュベーションが、ＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞による最小の産生と比較して、実質的なサイトカイン（ＩＦＮ−ｇおよびＩＬ−２）生成を誘導したことを示す。
【図１Ｈ】図１Ｈは、ＧＤ２シンターゼのＣａｓ９媒介欠失が、ＤＩＰＧ培養物におけるＧＤ２発現を排除することを示す。
【図１Ｉ】図１Ｉは、非改変対照細胞または対照ＡＡＶＳ１遺伝子座を標的とするＣａｓ９と比較して、ＧＤ２シンターゼをノックアウトするためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用して生成されたＨ３Ｋ２７Ｍ  ＧＤ２ｎｅｇ株との共培養後に、ＧＤ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞が実質的なレベルのＩＦＮ−γまたはＩＬ−２を産生しないことを示す。
【図１Ｊ】図１Ｊは、ガングリオシド酵素発現の経路分析を示す。
【図２−１】図２は、ＧＤ２標的化ＣＡＲ免疫療法が、ＤＩＰＧ同所性異種移植片において強力かつ持続的な抗腫瘍応答を達成したことを示す。
【図２−２】図２の続きである。
【図２−３】図２の続きである。
【図３】図３は、ＧＤ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞の単回静脈内投与が、ルシフェラーゼ発現患者由来ＤＩＰＧ異種移植片をバックグランド生物発光レベルまで排除したことを示す。
【図４】図４は、ＤＩＰＧ異種移植片におけるＧＤ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞療法の選択圧を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、神経芽細胞腫（ＫＣＮＲ、ＣＨＬＡ１３６、ＣＨＬＡ２５５）、骨肉腫（１４３Ｂ、ＭＧ６３−３）、およびユーイング肉腫（ＴＣ３２、ＥＷ８）を含む、ＧＤ２標的化免疫療法について調査中の他の悪性腫瘍に由来する細胞と比較して、ＤＩＰＧ培養物の表面上でのＧＤ２についてのフローサイトメトリー染色（クローン１４ｇ２ａ）がより強くかつより一様な発現を示したことを示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＤＩＰＧおよび他のがん株についての蛍光ビーズ標準（Ｑｕａｎｔｉｂｒｉｔｅ、ＢＤ）を使用して得られたＧＤ２表面発現の定量的推定を示す。
【図６】図６は、ＧＤ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞療法が、ＤＩＰＧ同所性異種移植片の生存を改善することを示す。
【図７】図７は、ＳＵ−ＤＩＰＧ１３Ｐ＊異種移植片の３つの独立したコホートにおいて評価したＧＤ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞療法の生存利益を示す。
【図８】図８は、異種移植片対宿主病の発症が、ＧＤ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞処置患者由来異種移植片モデルにおけるモニター期間を制限することを示す。
【図９】図９は、標識ＧＤ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞が、抗腫瘍活性の期間の間に腫瘍部位に侵入することを示す。
【図１０】図１０は、ＧＤ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞処置ＤＩＰＧ異種移植片の切断カスパーゼ−３染色を示す。
【図１１】図１１は、ＧＤ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞療法が、多数の型の正中Ｈ３Ｋ２７Ｍ変異小児びまん性正中グリオーマを有効に排除し、そして視床異種移植片における毒性と関連することを示す。
【図１２】図１２は、ＧＤ２  ＣＡＲ−Ｔ細胞療法が、生存しているＱＣＴＢ−Ｒ０５９視床Ｈ３Ｋ２７Ｍ異種移植片において腫瘍負荷の組織学的排除を達成することを示す。
【図１３】図１３は、患者由来ＤＩＰＧ培養物においてスクリーニングした細胞表面抗原を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図１Ｉ】
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【図１Ｊ】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１３−４】
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【図１３−５】
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【図１３−６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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