(57)【要約】  本明細書において、ゲラニルゲラニルジホスフェートとコパリルジホスフェート（ＣＰＰ）シンターゼとを接触させて、（９Ｓ，１０Ｓ）−コパリルジホスフェートを形成し、そしてＣＰＰとスクラレオールシンターゼ酵素とを接触させて（＋）−マノオール及びそれらの誘導体を形成することを含む（＋）−マノオールの製造方法が提供される。また、該方法において使用するためのＣＰＰシンターゼ及びスクラレオールシンターゼをコードする核酸も提供される。さらに、本明細書において記載されたＣＰＰシンターゼ及びスクラレオールシンターゼをコードする核酸を含む発現ベクター及び非ヒト宿主生物及び細胞が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（＋）−マノオールの製造方法であって、
ａ）ゲラニルゲラニルジホスフェート（ＧＧＰＰ）とコパリルジホスフェート（ＣＰＰ）シンターゼとを接触させて、コパリルジホスフェートを形成すること、ここでＣＰＰシンターゼは、
ｉ）配列番号１４又は配列番号１５に対して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は
ｉｉ）配列番号１７又は配列番号１８に対して、少なくとも７１％、７２％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は
ｉｉｉ）配列番号２０又は配列番号２１に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列
を含むものとする、かつ
ｂ）ＣＰＰとスクラレオールシンターゼとを接触させて、（＋）−マノオールを形成すること、かつ
ｃ）任意に、（＋）−マノオールを単離すること
を含む、（＋）−マノオールの製造方法。
【請求項２】
前記ＣＰＰシンターゼが、
ａ）配列番号１４又は配列番号１５に対して、少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は
ｂ）配列番号１７又は配列番号１８に対して、少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は
ｃ）配列番号２０又は配列番号２１に対して、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ステップａ）が、ＧＧＰＰを製造できる非ヒト宿主生物又は細胞を培養し、そしてＣＰＰの製造に良い条件下で形質転換させて、
ａ）配列番号１４又は配列番号１５に対して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は
ｂ）配列番号１７又は配列番号１８に対して、少なくとも７１％、７２％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は
ｃ）配列番号２０又は配列番号２１に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列
を含み、かつＣＰＰシンターゼ活性を有する少なくとも１つのポリペプチドを発現することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
さらに、前記ステップａ）の前に、ＧＧＰＰを製造することができる非ヒト宿主生物又は細胞を、
ａ）以下、
ｉ）配列番号１４又は配列番号１５に対して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は
ｉｉ）配列番号１７又は配列番号１８に対して、少なくとも７１％、７２％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は
ｉｉｉ）配列番号２０又は配列番号２１に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列
を含み、かつＣＰＰシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸で形質転換させて、前記生物又は細胞が、該ＣＰＰシンターゼ活性を有するポリペプチドを発現すること、及び
ｂ）スクラレオールシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸で形質転換させて、前記生物又は細胞が、該スクラレオールシンターゼ活性を有するポリペプチドを発現すること
を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記スクラレオールシンターゼ活性を有するポリペプチドが、配列番号４、配列番号５、配列番号２３、又は配列番号２５に対して、少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１から４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
さらに、化学合成又は生化学合成又は双方の組み合わせを使用して、（＋）−マノオールを（＋）−マノオール誘導体に加工することを含む、請求項１から５までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記誘導体が、アルコール、アセタール、アルデヒド、酸、エーテル、ケトン、ラクトン、アセテート及び／又はエステルである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記誘導体が、コパロール、コパラル、マノオールオキシ、Ｚ−１１、ガンマ−アンブロール及びアンブロックスからなる群から選択される、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
宿主細胞又は非ヒト生物を形質転換する方法であって、宿主細胞又は非ヒト生物をコパリルジホスフェートシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸で及びスクラレオールシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸で形質転換することを含み、ここで、コパリルジホスフェートシンターゼ活性を有するポリペプチドが、
ａ）配列番号１４又は配列番号１５に対して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は
ｂ）配列番号１７又は配列番号１８に対して、少なくとも７１％、７２％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は
ｃ）配列番号２０又は配列番号２１に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列
を含み、かつスクラレオールシンターゼ活性を有するポリペプチドが、配列番号４、配列番号５、配列番号２３、又は配列番号２５に対して、少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記方法。
【請求項１０】
前記宿主細胞又は非ヒト生物が、植物、原核生物、又は真菌である、請求項４から９までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記非ヒト宿主生物又は細胞が、Ｅ．コリ（E. coli）又はサッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）である、請求項４から１０までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
発現ベクターであって、
ａ）以下、
ｉ）配列番号１４又は配列番号１５に対して、少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は
ｉｉ）配列番号１７又は配列番号１８に対して、少なくとも９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は
ｉｉｉ）配列番号２０又は配列番号２１に対して、少なくとも９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列
を含むＣＰＰシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、又は
ｂ）配列番号１３、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２６、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、又は配列番号３２に示される核酸配列に対して、少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むＣＰＰシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸
を含む発現ベクター。
【請求項１３】
さらに、
ａ）スクラレオールシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸であって、スクラレオールシンターゼ活性を有するポリペプチドが、配列番号４、配列番号５、配列番号２３又は配列番号２５に対して、少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む核酸、又は
ｂ）配列番号６、配列番号２４、配列番号２７、配列番号３３、又は配列番号３４に対して、少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むスクラレオールシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸
を含む、請求項１２に記載の発現ベクター。
【請求項１４】
非ヒト宿主生物又は細胞であって、
ａ）請求項１２又は１３に記載の発現ベクター、又は
ｂ）コパリルジホスフェートシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸及びスクラレオールシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸であって、コパリルジホスフェートシンターゼ活性を有するポリペプチドが、
ｉ．配列番号１４又は配列番号１５に対して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は
ｉｉ．配列番号１７又は配列番号１８に対して、少なくとも７１％、７２％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は
ｉｉｉ．配列番号２０又は配列番号２１に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列
を含み、かつ
スクラレオールシンターゼ活性を有するポリペプチドが、配列番号４、配列番号５、配列番号２３、又は配列番号２５に対して、少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ
少なくとも１つの核酸が、非ヒト宿主生物又は細胞に対して異種性である、
前記非ヒト宿主生物又は細胞。
【請求項１５】
植物、原核生物、真菌、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）、又はサッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）である、請求項１４に記載の非ヒト宿主生物又は細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書において、コパリルジホスフェートシンターゼ及びスクラレオールシンターゼを使用した（＋）−マノオールの生化学的製造方法が提供される。
【０００２】
背景技術
テルペンは、ほとんどの生物（微生物、動物及び植物）において見出される。これらの化合物は、５個の炭素単位、いわゆるイソプレン単位からなり、それらの構造において存在するこれらの単位の数により分類される。したがって、モノテルペン、セスキテルペン及びジテルペンは、それぞれ炭素原子１０個、１５個及び２０個を含むテルペンである。例えば、セスキテルペンは、植物界において広く見いだせる。多くのセスキテルペン分子は、それらのフレーバー及びフレグランス特性、並びにそれらの化粧品効果、医薬品効果及び抗菌効果について公知である。多数のセスキテルペン炭化水素及びセスキテルペノイドが、同定されている。
【０００３】
テルペンの生合成生成物は、酵素、いわゆるテルペンシンターゼを含む。これらの酵素は、非環式テルペン前駆体を１つ以上のテルペン生成物に変換する。特に、ジテルペンシンターゼは、前駆体ゲラニルゲラニルジホスフェート（ＧＧＰＰ）の環化によりジテルペンを製造する。ＧＧＰＰの環化は、しばしば、２つの酵素ポリペプチドである、２つの連続した酵素反応において組み合わせて作用するＩ型及びＩＩ型のジテルペンシンターゼを必要とする。ＩＩ型ジテルペンシンターゼは、環状ジテルペンジホスフェート中間体を生じるＧＧＰＰの末端二重結合のプロトン付加により開始されるＧＧＰＰの環化／転位を触媒作用する。そしてこの中間体を、イオン化により開始される環化を触媒作用するＩ型ジテルペンシンターゼによりさらに変換する。
【０００４】
ジテルペンシンターゼは、植物及び他の生物に存在し、かつ基質、例えばＧＧＰＰを使用するが、それらは異なる生成物プロフィールを有する。ジテルペンシンターゼをコードする遺伝子及びｃＤＮＡは、クローンを生じ、かつ相応する組換え酵素を特徴付ける。
【０００５】
コパリルジホスフェート（ＣＰＰ）シンターゼ酵素及びスクラレオールシンターゼ酵素は、植物中で生じる酵素である。したがって、生化学的プロセスにおいてこれらの酵素及び多様体を発見し、かつそれらを使用して（＋）−マノオールを生成することが望ましい。
【０００６】
要約
本明細書において、
ａ）ゲラニルゲラニルジホスフェート（ＧＧＰＰ）とコパリルジホスフェート（ＣＰＰ）シンターゼとを接触させて、コパリルジホスフェートを形成すること、ここでＣＰＰシンターゼは、
ｉ）配列番号１４及び配列番号１５からなる群から選択されるポリペプチドに対して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は
ｉｉ）配列番号１７及び配列番号１８からなる群から選択されるポリペプチドに対して、少なくとも７１％、７２％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は
ｉｉｉ）配列番号２０及び配列番号２１からなる群から選択されるポリペプチドに対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列
を含むものとする、かつ
ｂ）ＣＰＰとスクラレオールシンターゼとを接触させて、（＋）−マノオールを形成すること、かつ
ｃ）任意に、（＋）−マノオールを単離すること
を含む、（＋）−マノオールの製造方法が提供される。
【０００７】
本明細書において、さらに（＋）−マノオールを（＋）−マノオール誘導体に加工することをさらに含む前記方法が提供される。
【０００８】
本明細書において、ＣＰＰシンターゼ活性を有するポリペプチドであって、
ａ）配列番号１４及び配列番号１５からなる群から選択されるポリペプチドに対して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は
ｂ）配列番号１７及び配列番号１８からなる群から選択されるポリペプチドに対して、少なくとも７１％、７２％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は
ｃ）配列番号２０及び配列番号２１からなる群から選択されるポリペプチドに対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
を含む、ポリペプチドも提供される。
【０００９】
さらに、スクラレオールシンターゼ活性を有するポリペプチドであって、配列番号４、配列番号５、配列番号２３、及び配列番号２５からなる群から選択されるポリペプチドに対して、少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。
【００１０】
本明細書において、前記ポリペプチドをコードする核酸も提供される。
【００１１】
本明細書において、ＣＰＰシンターゼをコードする核酸であって、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２６、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、又は配列番号３２に示される核酸配列に対して、少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸も提供される。
【００１２】
さらに、本明細書において、スクラレオールシンターゼをコードする核酸であって、配列番号６、配列番号２４、配列番号２７、配列番号３３、又は配列番号３４に対して、少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸が提供される。
【００１３】
前記核酸を含む発現ベクター、前記核酸もしくは前記発現ベクターを含む非ヒト宿主生物又は細胞、ＧＧＰＰを製造することができる非ヒト宿主生物又は細胞、非ヒト宿主生物又は細胞の形質転換方法、及び（＋）−マノオールを製造するための非ヒト宿主生物又は細胞の培養方法も提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ゲラニルゲラニルジホスフェート（ＧＧＰＰ）から（＋）−マノオールへの酵素経路を示す図。
【図２】ゲラニルゲラニルジホスフェート（ＧＧＰＰ）から（＋）−マノオール及びスクラレオールへの酵素経路を示す図。
【図３】ＧＧＰＰのｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素変換のＧＣＭＳ分析を示す図。Ａ．組換えＳｍＣＰＳ酵素を使用。Ｂ．組換えＳｃＳｃＳ酵素を使用。Ｃ．単一アッセイにおけるＳｍＣＰＳ酵素とＳｃＳｃＳ酵素の組み合わせ。
【図４】ＳｍＣＰＳ、ＳｃＳｃＳ及びメバロン酸経路酵素を発現するエシェリキア・コリ（Escherichia coli）（大腸菌）細胞を使用して製造した（＋）−マノオールのＧＣＭＳ分析を示す図。Ａ． Ｅ．コリ培地の抽出物の合計イオンクロマトグラム。Ｂ．（＋）−マノオール標準の合計イオンクロマトグラム。Ｃ．クロマトグラムＡにおける主なピーク（保持時間１４．５５分）の質量スペクトル。Ｄ．（＋）−マノオール基準品の質量スペクトル。
【図５】メバロン酸経路酵素、ＧＧＰＰシンターゼ、ＳｃＳＣＳ、並びに５つの異なるＣＰＰシンターゼ：サルビア・ミルティオリザ（Salvia miltiorrhiza）（タンジン）からのＳｍＣＰＳ２、コレウス・フォルスコリ（Coleus forskohlii）からのＣｆＣＰＳ１、トリチクム・アエスチブム（Triticum aestivum）（パンコムギ）からのＴａＴｐｓ１、マルビウム・ヴルガレ（Marrubium vulgare）（ニガハッカ）からのＭｖＣｐｓ３、ロスマリヌス・オフィキナリス（Rosmarinus officinalis）（ローズマリー）からのＲｏＣＰＳ１を発現するＥ．コリ細胞を使用して製造した（＋）−マノオールのＧＣＭＳ分析を示す図。
【図６】メバロン酸経路酵素、ＧＧＰＰシンターゼ、ＳｍＣＰＳ２、及びＩ型ジテルペンシンターゼ：ニコチアナ・グルチノサ（Nicotiana glutinosa）からのＮｇＳＣＳ−ｄｅｌ２９又はサルビア・スクラレア（Salvia sclarea）（クラリセージ）からのＳｓＳｃＳを発現するＥ．コリ細胞を使用して製造した（＋）−マノオールのＧＣＭＳ分析を示す図。
【図７】サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）発現プラスミドを、６つのＤＮＡ断片：ａ）ＬＥＵ２酵母マーカー、ｂ）ＡｍｐＲ  Ｅ．コリマーカー、ｃ）酵母複製源、ｄ）Ｅ．コリ複製源、ｅ）ＣｒｔＥと試験したスクラレオールシンターゼをコードする配列の１つとの同時発現のための断片、及びｆ）試験したコパリルジホスフェート（ＣＰＰ）シンターゼをコードする配列の１つの発現のための断片と一緒に酵母の同時形質転換によりｉｎ ｖｉｖｏで構築した図。
【図８】ＧＧＰＰシンターゼ、ＳｃＳＣＳ、並びに５つの異なるＣＰＰシンターゼ：サルビア・ミルティオリザからのＳｍＣＰＳ２、コレウス・フォルスコリからのＣｆＣＰＳ１、トリチクム・アエスチブムからのＴａＴｐｓ１、マルビウム・ヴルガレからのＭｖＣｐｓ３及びロスマリヌス・オフィキナリスからのＲｏＣＰＳ１の短縮型を発現する改質したＳ．セレビジエ株ＹＳＴ０４５を使用して製造した（＋）−マノオールのＧＣＭＳ分析を示す図。
【００１５】
発明の詳細な説明
定義
明細書及び付属の特許請求の範囲について、「又は」の使用は、特に明記されない限り「及び／又は」を意味する。
【００１６】
同様に、「含有する（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含有する（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含有している（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」及び「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、置き換えることができ、かつ制限することを意図しない。
【００１７】
さらに、種々の実施形態の記載が「含有している（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」の用語を使用する場合に、当業者は、ある特定の例において、一実施形態が「実質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」又は「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」の言語を使用して代わりに記載されてよいことを理解していることを、さらに理解すべきである。
【００１８】
以下の用語は、他に特定されない限りそれらに帰する意味を有する。
【００１９】
「ポリペプチド」の用語は、連続して重合させたアミノ酸残基、例えば、少なくとも１５残基、少なくとも３０残基、少なくとも５０残基のアミノ酸配列を意味する。本明細書において提供されるいくつかの実施形態において、ポリペプチドは、酵素、又はそれらの断片、又はそれらの多様体であるアミノ酸配列を含む。
【００２０】
「単離された」ポリペプチドの用語は、その自然環境から、組換え法、生化学的方法及び合成法を含む当業者に公知の任意の方法又は方法の組み合わせによって取り出したアミノ酸配列を言う。
【００２１】
「タンパク質」の用語は、天然に生じようと合成であろうと、アミノ酸が、共有ペプチド結合によって連結されており、かつオリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド及び完全長タンパク質を含む、任意の長さのアミノ酸配列を言う。
【００２２】
「生物学的機能」、「機能」、「生物学的活性」又は「活性」の用語は、（＋）−マノオールの形成に触媒作用を及ぼすＣＰＰシンターゼ及びスクラレオールシンターゼ活性の能力を言う。
【００２３】
「核酸配列」、「核酸」及び「ポリヌクレオチド」の用語は、互換的にヌクレオチドの配列を意味するために使用される。核酸配列は、一本鎖又は二本鎖のデオキシリボヌクレオチド、又は任意の長さのリボヌクレオチドであってよく、遺伝子のコード配列及び非コード配列、エキソン、イントロン、センス及びアンチセンスの相補的配列、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、組換え核酸配列、単離された及び精製された天然に生じるＤＮＡ及び／又はＲＮＡ配列、合成ＤＮＡ及びＲＮＡ配列、断片、プライマー及び核酸プローブ；並びにかかる配列の相補体を含む。当業者は、ＲＮＡの核酸配列が、種々のチミン（Ｔ）をウラシル（Ｕ）によって置き換えたＤＮＡの配列と同一であることに気付いている。
【００２４】
単離された核酸又は単離された核酸配列は、天然に生じる核酸又は核酸配列とは異なる環境にある核酸又は核酸配列を言う。本明細書において使用される核酸に適用される「天然に生じる」の用語は、天然に細胞中で見られる核酸を言う。例えば、生物において、例えば生物の細胞において存在し、天然に源から単離されてよく、研究室において人間によって意図的に改質されていない核酸配列が、天然に生じるものである。
【００２５】
本明細書において使用される「精製された」、「実質的に精製された」、及び「単離された」の用語は、本発明の化合物が通常その天然の状態で会合している他の異なる化合物を有さない状態を言い、そのため、「精製された」、「実質的に精製された」、及び「単離された」対象物は、所与の試料の質量の少なくとも０．５質量％、１質量％、５質量％、１０質量％もしくは２０質量％、又は少なくとも５０質量％もしくは７５質量％を含む。特定の一実施形態において、これらの用語は、所与の試料の質量の少なくとも９５質量％、９６質量％、９７質量％、９８質量％、９９質量％又は１００質量％を含む本発明の化合物を言う。本明細書において使用されるように、核酸又はタンパク質に関する場合に、「精製された」、「実質的に精製された」、及び「単離された」核酸又はタンパク質の用語は、細胞又は生物中で天然に生じるものとは異なる精製又は濃縮された状態も言う。（１）他の関連する構造もしくは化合物からの精製又は（２）細胞又は生物中で通常会合しないものに対する構造又は化合物との会合、を含む、細胞又は生物中で天然に生じるものよりも高い精製又は濃縮の任意の程度は、「単離された」の意味の範囲内である。本明細書において記載された核酸もしくはタンパク質又は核酸もしくはタンパク質の種類は、当業者に公知の種々の方法及びプロセスに従って単離されてよく又はそうでなければ通常天然に会合していないものに対する構造又は化合物と会合されてよい。
【００２６】
本明細書において使用されるように、「増幅している」及び「増幅」の用語は、以下に詳細に記載されるように、天然に発現された核酸の組換えを生じる又は検出するための任意の適した増幅法の使用を言う。例えば、本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏで天然に発現されたもの（例えばゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡ）又は本発明の組換え（例えばｃＤＮＡ）核酸を（例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって）増幅するための方法及び試薬（例えば、特異的縮重オリゴヌクレオチドプライマー対、オリゴｄＴプライマー）を提供する。
【００２７】
「組換え核酸配列」は、天然に生じない、そうでなければ生物学的生物において見られない核酸配列を生じる、１種以上の源からの遺伝物質と一緒にもたらすための実験的方法（分子クローニング）の使用から生じる核酸配列である。
【００２８】
「組換えＤＮＡ技術」は、例えば、Weigel及びGlazebrookによって編集されたLaboratory Manuals（2002 Cold Spring Harbor Lab Press）、並びにSambrookら（1989 Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press）において記載されているような組換え核酸配列を生成するための分子生物学的方法を言う。
【００２９】
「遺伝子」の用語は、適した調節領域、例えばプロモーターに操作可能に連結された、ＲＮＡ分子、例えば細胞中のｍＲＮＡに転写された領域を含むＤＮＡ配列を意味する。したがって、遺伝子は、いくつかの操作可能に連結された配列、例えばプロモーター、例えば翻訳開始において含まれる配列を含む５’リーダー配列、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡのコード領域、イントロン、エキソン、及び／又は例えば転写終結点を含む３’非翻訳配列を含む。
【００３０】
「キメラ遺伝子」は、通常、種において天然に見られないあらゆる遺伝子、特に、天然に互いに関連しない核酸配列の１つ以上の部位が存在する遺伝子を言う。例えば、プロモーターは、転写領域の一部もしくは全てと又は他の調節領域と天然に関連しない。「キメラ遺伝子」の用語は、プロモーター又は転写制御配列が、１つ以上のコード配列に、もしくは１つのアンチセンス、すなわちセンス鎖の逆相補鎖に操作可能に連結され、又は繰り返し配列を逆転させる（センス及びアンチセンス、それによりＲＮＡ転写が転写に対して二本鎖ＲＮＡを形成する）、発現構築物を含むと解される。「キメラ遺伝子」という用語は、新たな遺伝子を製造するために１つ以上のコード配列の一部の組合せによって得られる遺伝子も含む。
【００３１】
「３’ＵＴＲ」又は「３’非翻訳配列」（「３’非翻訳領域」又は「３’末端」とも言われる）は、例えば転写終結点及び（ほとんど、しかし全てではないが真核ｍＲＮＡの）ポリアデニル化シグナル、例えばＡＡＵＡＡＡ又はそれらの多様体を含む、遺伝子のコード配列の下流に見られる核酸配列を言う。転写の終結後に、ｍＲＮＡ転写は、ポリアデニル化シグナルの下流で開裂してよく、かつ翻訳の場所、例えば細胞質へのｍＲＮＡの輸送中に含まれるポリ（Ａ）末端が付加されてよい。
【００３２】
「遺伝子の発現」は、タンパク質中への遺伝子の転写及びｍＲＮＡの翻訳を含む。過剰発現は、同一の遺伝的背景の非形質転換細胞又は非形質転換生物における生成のレベルを超える、トランスジェニック細胞又はトランスジェニック生物におけるｍＲＮＡ、ポリペプチド及び／又は酵素活性のレベルによって測定される遺伝子生成物の生成を言う。
【００３３】
本明細書において使用される「発現ベクター」は、宿主細胞中へ異物又は外因性のＤＮＡを導入するための分子生物学的方法及び組換えＤＮＡ技術を使用して設計された核酸分子を意味する。発現ベクターは、典型的に、ヌクレオチド配列の適正な転写のために要求される配列を含む。コード領域は、通常、関心のあるタンパク質についてコードするが、ＲＮＡ、例えばアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ等についてもコードしてよい。
【００３４】
本明細書において使用される「発現ベクター」は、ウィルスベクター、バクテリオファージ及びプラスミドを含む、あらゆる線状又は環状の組み換えベクターを含むが、これらに制限されない。当業者は、発現系に従って適したベクターを選択することができる。一実施形態において、発現ベクターは、転写、翻訳、開始及び終結を調節する少なくとも１つの制御配列、例えば転写プロモーター、オペレーター又はエンハンサー、又はｍＲＮＡリボソーム結合部位に操作可能に連結され、及び任意に、少なくとも１つの選択マーカーを含む、本明細書における一実施形態の核酸を含む。ヌクレオチド配列は、制御配列が、本明細書における一実施形態の核酸に機能的に関連する場合に、「操作可能に連結」される。「制御配列」は、本明細書の一実施形態の核酸配列の発現レベルを決定し、かつ制御配列に操作可能に連結される核酸配列の転写の割合を制御することができる核酸配列をいう。制御配列は、プロモーター、エンハンサー、転写因子、プロモーターエレメント等を含む。
【００３５】
「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼのための結合部位、及びこれらに制限されないが転写因子結合部位、リプレッサー及び活性化タンパク質結合部位を含む適正な転写のために要求される他の因子を提供することにより、コード配列の発現を制御する核酸配列をいう。プロモーターの用語の意味は、「プロモーター制御配列」の用語も含む。プロモーター制御配列は、転写、ＲＮＡプロセシング又は関連してコードする核酸配列の安定性に影響しうる上流及び下流のエレメントを含みうる。プロモーターは、天然由来の配列及び合成の配列を含む。コード核酸配列は、通常、転写開始部位で出発する転写の方向に関連してプロモーターの下流に配置される。
【００３６】
「構成的プロモーター」の用語は、操作可能に連結される核酸配列の連続的な転写を可能にする非制御プロモーターをいう。
【００３７】
本明細書において使用されるように、「操作可能に連結」の用語は、機能的関連にあるポリヌクレオチドエレメントの連結をいう。核酸は、それが他の核酸配列と機能的関係に置かれる場合に「操作可能に連結」される。例えば、プロモーター、むしろ転写制御配列は、コード配列の転写に影響する場合に、コード配列に操作可能に連結される。操作可能に連結は、連結されているＤＮＡ配列が典型的に隣接することを意味する。プロモーター配列に関連付けられたヌクレオチド配列は、形質転換されるべき細胞又は生物、例えば宿主細胞、植物細胞、植物もしくは微生物に関して相同性又は異種性の起源のものであってよい。前記配列は、全体的に又は部分的に合成されているものでもよい。起源に関わらず、プロモーター配列に関連する核酸配列は、連結されるプロモーター特性に従って発現されるか又は発現抑制される。関連する核酸は、全ての時間で又は代わりに特定の時間で生物を通じて、又は特異的な組織、細胞もしくは細胞コンパートメント中で、発現又は抑制されるべきであることが所望されるタンパク質をコードしてよい。かかるヌクレオチド配列は、特に、それらで改変された又は形質転換された宿主細胞又は生物に対して所望の表現型の特徴を付与するタンパク質をコードする。より詳述すれば、関連するヌクレオチド配列は、宿主細胞又は生物中で（＋）−マノオールシンターゼの製造をもたらす。
【００３８】
「標的ペプチド」は、タンパク質、又は細胞内オルガネラ、すなわちミトコンドリア、もしくは色素体に対するポリペプチド、又は細胞外空間に対するポリペプチド（分泌シグナルペプチド）を標的とするアミノ酸配列をいう。標的ペプチドをコードする核酸配列は、タンパク質又はポリペプチドのアミノ末端、例えばＮ−末端をコードする核酸配列に融合されてよく、又は天然の標的ポリペプチドを置き換えるために使用されてよい。
【００３９】
「プライマー」の用語は、鋳型の核酸配列にハイブリダイズされ、かつ鋳型に対して相補的な核酸配列の重合のために使用される、短い核酸配列をいう。
【００４０】
本明細書において使用されるように、「宿主細胞」又は「形質転換細胞」の用語は、転写に対してＣＰＰシンターゼタンパク質及び／又はスクラレオールシンターゼタンパク質をもたらす、又は（＋）−マノオールを共に製造する、少なくとも１つの核酸分子、例えば所望のタンパク質又は核酸配列をコードする組換え遺伝子を保有するために改変された細胞（又は生物）をいう。
【００４１】
宿主細胞は、特に細菌細胞、真菌細胞又は植物細胞である。宿主細胞は、宿主細胞の核ゲノム又はオルガネラゲノムに組込まれる組換え遺伝子を含んでよい。代わりに、宿主は、組換え遺伝子を染色体外で含んでよい。相同配列は、オルソガス配列又はパラロガス配列を含む。系統学的方法、配列類似性、及びハイブリダイゼーション法を含む、オルソガス又はパラロガスを同定する方法は、当業者に公知であり、本明細書において記載されている。
【００４２】
パラログは、類似した配列及び類似した機能を有する２以上の遺伝子を生じる遺伝子重複から生じる。パラログは、典型的に、一緒にクラスター形成し、関連する植物種内で遺伝子の重複によって形成される。パラログは、ペアワイズのＢｌａｓｔ解析を使用して類似の遺伝子の群で見出されるか、又はプログラム、例えばＣＬＵＳＴＡＬを使用した遺伝子ファミリーの系統発生解析中に見出される。パラログにおいて、コンセンサス配列は、関連する遺伝子内の配列及び遺伝子の類似の機能を有する配列に対して特徴的に同定されうる。
【００４３】
オルソログ、又はオルソガス配列は、それらが共通祖先の子孫である種において見出されることから、互いに類似する配列である。例えば、共通祖先を有する植物種は、類似した配列及び機能を有する多くの酵素を含むことが公知である。当業者は、オルソガス配列を同定することができ、かつオルソログの機能を、例えばＣＬＵＳＴＡＬ又はＢＬＡＳＴプログラムを使用して１つの種の遺伝子ファミリーについてのポリジーン系図（ｐｏｌｙｇｅｎｉｃ ｔｒｅｅ）を構築することによって予測することができる。
【００４４】
「選択可能なマーカー」の用語は、発現に対して、選択可能なマーカーを含む１つの細胞又は複数の細胞を選択するために使用されてよい任意の遺伝子をいう。選択可能なマーカーの例を以下に記載する。当業者は、種々の抗生物質、殺菌剤、栄養要求性又は除草剤の選択可能なマーカーが種々の標的種に適用可能であることを周知している。
【００４５】
「生物」の用語は、任意の非ヒト多細胞生物又は単細胞生物、例えば植物、又は微生物をいう。特に、微生物は、細菌、酵母、藻類又は真菌である。
【００４６】
「植物」の用語は、植物プロトプラスト、植物組織、再生植物を生じる植物細胞組織培養物、又は植物の一部、又は植物器官、例えば根、茎、葉、芽、花、葉柄、花弁、花粉、胚珠、胚、塊茎、果実、種子、それらの子孫等を含む植物細胞を含むために区別なく使用される。任意の植物は、本明細書における一実施形態の方法を実施するために使用されてよい。
【００４７】
特定の実施形態
一実施形態において、本明細書において、宿主細胞又は非ヒト生物を、コパリルジホスフェートシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸で及びスクラレオールシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸で形質転換することを含む、宿主細胞又は非ヒト生物の形質転換方法が提供され、ここで、コパリルジホスフェートシンターゼ活性を有するポリペプチドは、
ａ）配列番号１４及び配列番号１５からなる群から選択されるポリペプチドに対して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は
ｂ）配列番号１７及び配列番号１８からなる群から選択されるポリペプチドに対して、少なくとも７１％、７２％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は
ｃ）配列番号２０及び配列番号２１からなる群から選択されるポリペプチドに対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列
を含む。
【００４８】
一実施形態において、スクラレオールシンターゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号４、配列番号５、配列番号２３、及び配列番号２５からなる群から選択されるポリペプチドに対して、少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００４９】
一実施形態において、本明細書において、ゲラニルゲラニルジホスフェート（ＧＧＰＰ）を製造することができる非ヒト宿主生物又は細胞を培養し、そして形質転換させて、コパリルジホスフェートシンターゼ活性を有するポリペプチドを発現させ、かつさらに形質転換させてスクラレオールシンターゼ活性を有するポリペプチドを発現させることを含む方法が提供され、ここで、コパリルジホスフェートシンターゼ活性を有するポリペプチドは、
ａ）配列番号１４及び配列番号１５からなる群から選択されるポリペプチドに対して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は
ｂ）配列番号１７及び配列番号１８からなる群から選択されるポリペプチドに対して、少なくとも７１％、７２％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は
ｃ）配列番号２０及び配列番号２１からなる群から選択されるポリペプチドに対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列
を含む。
【００５０】
特に、スクラレオールシンターゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号４、配列番号５、配列番号２３、及び配列番号２５からなる群から選択されるポリペプチドに対して、少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００５１】
さらに、本明細書において、ＣＰＰシンターゼをコードする核酸を含む発現ベクターが提供され、ここで、ＣＰＰシンターゼは、
ａ）配列番号１４又は配列番号１５に対して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は
ｂ）配列番号１７又は配列番号１８に対して、少なくとも７１％、７２％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は
ｃ）配列番号２０又は配列番号２１に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列
を含むポリペプチドを含み、さらに発現ベクターは、スクラレオールシンターゼ酵素をコードする核酸を含む。
【００５２】
特に、スクラレオールシンターゼは、配列番号４、配列番号５、配列番号２３、又は配列番号２５に対して、少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、２つの酵素、すなわちＣＰＰシンターゼ及びスクラレオールシンターゼは、同一の細胞中で形質転換される２つの異なるベクター又はプラスミド上にあってよい。さらなる実施形態において、これらの２つの酵素は、２つの異なる細胞中で形質転換された２つの異なるベクター又はプラスミド上にあってよい。
【００５３】
さらに、本明細書において、ＣＰＰシンターゼをコードする少なくとも１つの核酸及びスクラレオール酵素をコードする少なくとも１つの核酸を含むか又は該核酸を保有させるために形質転換させた非ヒト宿主生物又は細胞が提供され、ここで、ＣＰＰシンターゼは、
ａ）配列番号１４又は配列番号１５に対して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は
ｂ）配列番号１７又は配列番号１８に対して、少なくとも７１％、７２％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は
ｃ）配列番号２０又は配列番号２１に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列
を含む。
【００５４】
特に、スクラレオールシンターゼは、配列番号４、配列番号５、配列番号２３、又は配列番号２５に対して、少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００５５】
さらに、本明細書において、ＣＰＰシンターゼをコードする少なくとも１つの核酸及びスクラレオール酵素をコードする少なくとも１つの核酸を含むか又は該核酸を保有させるために形質転換させた非ヒト宿主生物又は細胞が提供され、ここで、ＣＰＰシンターゼは、配列番号１及び配列番号２からなる群から選択されるポリペプチドに対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、スクラレオールシンターゼは、配列番号２３及び配列番号２５からなる群から選択されるポリペプチドに対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００５６】
一実施形態において、本明細書において提供されるＣＰＰシンターゼをコードする核酸は、配列番号３、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２６、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、又は配列番号３２に対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００５７】
一実施形態において、本明細書において提供されるＣＰＰシンターゼをコードする核酸は、配列番号３、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２６、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、又は配列番号３２に対して少なくとも９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００５８】
一実施形態において、本明細書において提供されるＣＰＰシンターゼをコードする核酸は、配列番号３、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２６、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、又は配列番号３２に対して少なくとも９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００５９】
一実施形態において、本明細書において提供されるＣＰＰシンターゼをコードする核酸は、配列番号３、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２６、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、又は配列番号３２に対して９９％又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００６０】
一実施形態において、本明細書において提供されるＣＰＰシンターゼをコードする核酸は、配列番号３、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２６、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、又は配列番号３２に示されるヌクレオチド配列を含む。
【００６１】
一実施形態において、ＣＰＰシンターゼは、
ａ）配列番号１４及び配列番号１５からなる群から選択されるポリペプチドに対して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は
ｂ）配列番号１７及び配列番号１８からなる群から選択されるポリペプチドに対して、少なくとも７１％、７２％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は
ｃ）配列番号２０及び配列番号２１からなる群から選択されるポリペプチドに対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列
を含むポリペプチドを含む。
【００６２】
一実施形態において、ＣＰＰシンターゼは、配列番号１４に対して少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【００６３】
一実施形態において、ＣＰＰシンターゼは、配列番号１４に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【００６４】
一実施形態において、ＣＰＰシンターゼは、配列番号１４に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【００６５】
一実施形態において、ＣＰＰシンターゼは、配列番号１４に対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【００６６】
一実施形態において、ＣＰＰシンターゼは、配列番号１４に対して少なくとも９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【００６７】
一実施形態において、ＣＰＰシンターゼは、配列番号１４に挙げたアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【００６８】
一実施形態において、ＣＰＰシンターゼは、配列番号１５に対して少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【００６９】
一実施形態において、ＣＰＰシンターゼは、配列番号１５に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【００７０】
一実施形態において、ＣＰＰシンターゼは、配列番号１５に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【００７１】
一実施形態において、ＣＰＰシンターゼは、配列番号１５に対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【００７２】
一実施形態において、ＣＰＰシンターゼは、配列番号１５に対して少なくとも９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【００７３】
一実施形態において、ＣＰＰシンターゼは、配列番号１５に挙げたアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【００７４】
一実施形態において、ＣＰＰシンターゼは、配列番号１７に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【００７５】
一実施形態において、ＣＰＰシンターゼは、配列番号１７に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【００７６】
一実施形態において、ＣＰＰシンターゼは、配列番号１７に対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【００７７】
一実施形態において、ＣＰＰシンターゼは、配列番号１７に対して少なくとも９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【００７８】
一実施形態において、ＣＰＰシンターゼは、配列番号１７に挙げたアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【００７９】
一実施形態において、ＣＰＰシンターゼは、配列番号１８に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【００８０】
一実施形態において、ＣＰＰシンターゼは、配列番号１８に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【００８１】
一実施形態において、ＣＰＰシンターゼは、配列番号１８に対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【００８２】
一実施形態において、ＣＰＰシンターゼは、配列番号１８に対して少なくとも９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【００８３】
一実施形態において、ＣＰＰシンターゼは、配列番号１８に挙げたアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【００８４】
一実施形態において、ＣＰＰシンターゼは、配列番号２０に対して少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【００８５】
一実施形態において、ＣＰＰシンターゼは、配列番号２０に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【００８６】
一実施形態において、ＣＰＰシンターゼは、配列番号２０に対して少なくとも９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【００８７】
一実施形態において、ＣＰＰシンターゼは、配列番号２０に挙げたアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【００８８】
一実施形態において、ＣＰＰシンターゼは、配列番号２１に対して少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【００８９】
一実施形態において、ＣＰＰシンターゼは、配列番号２１に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【００９０】
一実施形態において、ＣＰＰシンターゼは、配列番号２１に対して少なくとも９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【００９１】
一実施形態において、ＣＰＰシンターゼは、配列番号２１に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【００９２】
一実施形態において、ＣＰＰシンターゼは、配列番号２１に挙げたアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【００９３】
一実施形態において、スクラレオールシンターゼ酵素をコードする核酸は、配列番号６、配列番号２４、配列番号２７、配列番号３３、又は配列番号３４に対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００９４】
一実施形態において、スクラレオールシンターゼは、配列番号４に対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００９５】
一実施形態において、スクラレオールシンターゼは、配列番号４に対して少なくとも９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００９６】
一実施形態において、スクラレオールシンターゼは、配列番号４に対して少なくとも９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００９７】
一実施形態において、スクラレオールシンターゼは、配列番号４に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００９８】
一実施形態において、スクラレオールシンターゼは、配列番号４に挙げたアミノ酸配列を含む。
【００９９】
一実施形態において、スクラレオールシンターゼは、配列番号５に対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１００】
一実施形態において、スクラレオールシンターゼは、配列番号５に対して少なくとも９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１０１】
一実施形態において、スクラレオールシンターゼは、配列番号５に対して少なくとも９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１０２】
一実施形態において、スクラレオールシンターゼは、配列番号５に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１０３】
一実施形態において、スクラレオールシンターゼは、配列番号５に挙げたアミノ酸配列を含む。
【０１０４】
一実施形態において、スクラレオールシンターゼは、配列番号２３に対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１０５】
一実施形態において、スクラレオールシンターゼは、配列番号２３に対して少なくとも９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１０６】
一実施形態において、スクラレオールシンターゼは、配列番号２３に対して少なくとも９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１０７】
一実施形態において、スクラレオールシンターゼは、配列番号２３に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１０８】
一実施形態において、スクラレオールシンターゼは、配列番号２３に挙げたアミノ酸配列を含む。
【０１０９】
一実施形態において、スクラレオールシンターゼは、配列番号２５に対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１１０】
一実施形態において、スクラレオールシンターゼは、配列番号２５に対して少なくとも９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１１１】
一実施形態において、スクラレオールシンターゼは、配列番号２５に対して少なくとも９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１１２】
一実施形態において、スクラレオールシンターゼは、配列番号２５に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１１３】
一実施形態において、スクラレオールシンターゼは、配列番号２５に挙げたアミノ酸配列を含む。
【０１１４】
他の実施形態において、本明細書において記載された少なくとも１つの核酸を含む発現ベクターが本明細書において提供される。
【０１１５】
他の実施形態において、本明細書において記載されたＣＰＰシンターゼをコードする核酸及び本明細書において記載されたスクラレオールシンターゼをコードする核酸を含む１つ以上の発現ベクターを含む非ヒト宿主生物又は細胞が本明細書において提供される。
【０１１６】
他の実施形態において、本明細書に記載された少なくとも１つの核酸を含む非ヒト宿主生物又は細胞、又は本明細書に記載された少なくとも１つの核酸を保有するために形質転換させて、本明細書において記載された少なくとも１つのポリペプチドを異種発現又は過剰発現する非ヒト宿主生物又は細胞が本明細書において提供される。
【０１１７】
実施形態において、本発明は、形質転換されていない同様の細胞又は生物よりも高い量でポリペプチドを発現する、形質転換させた細胞又は生物を提供する。
【０１１８】
トランスジェニック宿主生物又は細胞、例えば植物、真菌、原生動物、又は高次真核細胞の培養物の製造について、当業者に公知のいくつかの方法がある。細菌、真菌、酵母、植物及び哺乳動物細胞の宿主との使用に適したクローニング及び発現ベクターは、例えば、Pouwelsら, Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985, Elsevier, New York、及び Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Pressにおいて記載されている。特に高次植物及び／又は植物細胞のためのクローニングベクター及び発現ベクターは、当業者に入手可能である。例えば、Schardlら、Gene, 1987, 61:1-11を参照されたい。
【０１１９】
宿主生物又は細胞を形質転換してトランスジェニック核酸を保有させるための方法は、当業者によく知られている。トランスジェニック植物の製造のために、例えば現在の方法は以下を含む：植物プロトプラストのエレクトロポレーション、リポソーム媒介形質転換、アグロバクテリウム媒介形質転換、ポリエチレングリコール媒介形質転換、微粒子銃、植物細胞のマイクロインジェクション、及びウィルスを使用する形質転換。
【０１２０】
一実施形態において、形質転換したＤＮＡは、非ヒト宿主生物及び／又は細胞の染色体中に組み込まれて、安定な組換えシステムをもたらす。これらに制限されないが、レコンビナーゼ媒介カセット変換（ＲＭＣＥ）、ウィルス部位特異的染色体挿入、アデノウィルス及び前核注入を含む、当業者に公知のあらゆる染色体組込み方法が、本発明の実施において使用されうる。
【０１２１】
（＋）−マノオールを製造するための方法を実施するための一実施形態において、本発明の任意の実施形態において記載されたＣＰＰシンターゼ活性を有する少なくとも１つのポリペプチド及びスクラレオールシンターゼ活性を有する少なくとも１つのポリペプチドを作成するための方法が本明細書において提供される。
【０１２２】
一実施形態は、
ａ）本明細書において記載されたゲラニルゲラニルジホスフェート（ＧＧＰＰ）とコパリルジホスフェート（ＣＰＰ）シンターゼとを接触させて、コパリルジホスフェートを形成すること、及び
ｂ）本明細書において記載されたＣＰＰとスクラレオールシンターゼとを接触させて、（＋）−マノオールを形成すること
を含むマノオールの製造方法を提供し、ここで、ステップａ）は、ＧＧＰＰを製造することができる非ヒト宿主生物又は宿主細胞を培養し、本明細書において記載された１つ以上の核酸で又は本明細書において記載された１つ以上の発現ベクターで形質転換させて、非ヒト宿主生物又は宿主細胞に本明細書において記載されたＣＰＰシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸及び本明細書において記載されたスクラレオールシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を保有させ、そして該ポリペプチドを発現又は過剰発現させることを含む。
【０１２３】
一実施形態は、ステップａ）の前に、ＧＧＰＰを製造することができる非ヒト宿主生物又は宿主細胞を
ａ）ＣＰＰシンターゼ活性を有する、
ｉ）配列番号１４又は配列番号１５に対して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は
ｉｉ）配列番号１７又は配列番号１８に対して、少なくとも７１％、７２％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は
ｉｉｉ）配列番号２０又は配列番号２１に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列
を含むポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸で形質転換させて、前記生物又は細胞がＣＰＰシンターゼ活性を有するポリペプチドを発現させ、かつ
ｂ）本明細書において記載されたスクラレオールシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸で形質転換させて、前記生物又は細胞がスクラレオールシンターゼ活性を有するポリペプチドを発現させること
をさらに含む、マノオールを製造するための前記方法を提供する。
【０１２４】
一実施形態において、ＧＧＰＰを製造できる非ヒト宿主生物又は宿主細胞は、
ａ）配列番号１５を含むＣＰＰシンターゼをコードする核酸と配列番号５を含むスクラレオールシンターゼをコードする核酸、又は
ｂ）配列番号１８を含むＣＰＰシンターゼをコードする核酸と配列番号５を含むスクラレオールシンターゼをコードする核酸、又は
ｃ）配列番号２１を含むＣＰＰシンターゼをコードする核酸と配列番号５を含むスクラレオールシンターゼをコードする核酸、又は
ｄ）ＣＰＰシンターゼをコードする配列番号１６を含む核酸とスクラレオールシンターゼをコードする配列番号６を含む核酸、又は
ｅ）ＣＰＰシンターゼをコードする配列番号１９を含む核酸とスクラレオールシンターゼをコードする配列番号６を含む核酸、又は
ｆ）ＣＰＰシンターゼをコードする配列番号２２を含む核酸とスクラレオールシンターゼをコードする配列番号６を含む核酸、又は
ｇ）ＣＰＰシンターゼをコードする配列番号２６を含む核酸とスクラレオールシンターゼをコードする配列番号２７を含む核酸、又は
ｈ）ＣＰＰシンターゼをコードする配列番号２９を含む核酸とスクラレオールシンターゼをコードする配列番号２７を含む核酸、又は
ｉ）ＣＰＰシンターゼをコードする配列番号３０を含む核酸とスクラレオールシンターゼをコードする配列番号２７を含む核酸、又は
ｊ）ＣＰＰシンターゼをコードする配列番号３１を含む核酸とスクラレオールシンターゼをコードする配列番号２７を含む核酸、又は
ｋ）ＣＰＰシンターゼをコードする配列番号３２を含む核酸とスクラレオールシンターゼをコードする配列番号２７を含む核酸、又は
ｌ）配列番号２を含むＣＰＰシンターゼをコードする核酸と配列番号２３を含むスクラレオールシンターゼをコードする核酸、又は
ｍ）配列番号１５を含むＣＰＰシンターゼをコードする核酸と配列番号２３を含むスクラレオールシンターゼをコードする核酸、又は
ｎ）配列番号１８を含むＣＰＰシンターゼをコードする核酸と配列番号２３を含むスクラレオールシンターゼをコードする核酸、又は
ｏ）配列番号２１を含むＣＰＰシンターゼをコードする核酸と配列番号２３を含むスクラレオールシンターゼをコードする核酸、又は
ｐ）配列番号２を含むＣＰＰシンターゼをコードする核酸と配列番号２５を含むスクラレオールシンターゼをコードする核酸、又は
ｑ）配列番号１５を含むＣＰＰシンターゼをコードする核酸と配列番号２５を含むスクラレオールシンターゼをコードする核酸、又は
ｒ）配列番号１８を含むＣＰＰシンターゼをコードする核酸と配列番号２５を含むスクラレオールシンターゼをコードする核酸、又は
ｓ）配列番号２１を含むＣＰＰシンターゼをコードする核酸と配列番号２５を含むスクラレオールシンターゼをコードする核酸、又は
ｔ）ＣＰＰシンターゼをコードする配列番号１６を含む核酸とスクラレオールシンターゼをコードする配列番号２４を含む核酸、又は
ｕ）ＣＰＰシンターゼをコードする配列番号１９を含む核酸とスクラレオールシンターゼをコードする配列番号２４を含む核酸、又は
ｖ）ＣＰＰシンターゼをコードする配列番号２２を含む核酸とスクラレオールシンターゼをコードする配列番号２４を含む核酸、又は
ｗ）ＣＰＰシンターゼをコードする配列番号２６を含む核酸とスクラレオールシンターゼをコードする配列番号３３を含む核酸、又は
ｘ）ＣＰＰシンターゼをコードする配列番号２６を含む核酸とスクラレオールシンターゼをコードする配列番号３４を含む核酸、
ｙ）ＣＰＰシンターゼをコードする配列番号２９を含む核酸とスクラレオールシンターゼをコードする配列番号３３を含む核酸、又は
ｚ）ＣＰＰシンターゼをコードする配列番号２９を含む核酸とスクラレオールシンターゼをコードする配列番号３４を含む核酸、
ａａ）ＣＰＰシンターゼをコードする配列番号３０を含む核酸とスクラレオールシンターゼをコードする配列番号３３を含む核酸、又は
ｂｂ）ＣＰＰシンターゼをコードする配列番号３０を含む核酸とスクラレオールシンターゼをコードする配列番号３４を含む核酸、又は
ｃｃ）ＣＰＰシンターゼをコードする配列番号３１を含む核酸とスクラレオールシンターゼをコードする配列番号３３を含む核酸、又は
ｄｄ）ＣＰＰシンターゼをコードする配列番号３１を含む核酸とスクラレオールシンターゼをコードする配列番号３４を含む核酸、又は
ｅｅ）ＣＰＰシンターゼをコードする配列番号３２を含む核酸とスクラレオールシンターゼをコードする配列番号３３を含む核酸、又は
ｆｆ）ＣＰＰシンターゼをコードする配列番号３２を含む核酸とスクラレオールシンターゼをコードする配列番号３４を含む核酸
を含み、ここで、核酸配列及び／シンターゼの組み合わせは、本明細書において記載されたように列挙された配列番号に対する多様体及び種々の割合の同一性も含む。
【０１２５】
一実施形態において、本明細書において提供される非ヒト宿主生物は、植物、原核生物又は真菌である。
【０１２６】
一実施形態において、本明細書において提供される非ヒト宿主は、微生物、特に細菌又は酵母である。
【０１２７】
一実施形態において、本明細書において提供される細菌はエシェリキア・コリ（Escherichia coli）であり、かつ酵母はサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）である。
【０１２８】
一実施形態において、本明細書において提供される非ヒト生物はサッカロミセス・セレビジエである。
【０１２９】
一実施形態において、前記細胞は原核細胞である。
【０１３０】
他の実施形態において、前記細胞は細菌細胞である。
【０１３１】
一実施形態において、前記細胞は真核細胞である。
【０１３２】
一実施形態において、前記真核細胞は、酵母細胞又は植物細胞である。
【０１３３】
一実施形態において、マノオールは、例えばＰａｄｄｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ， ２０１３， ４９６：５２８−５３２において記載されたように、発酵を介することを含む、本明細書において記載された形質転換された細菌又は酵母の培養によって製造されてよい。
【０１３４】
一実施形態において、（＋）−マノオールを製造するためのプロセスは、少なくとも９８．５％の純度で（＋）−マノオールを製造する。
【０１３５】
他の実施形態において、本明細書において提供される方法は、さらに、当業者に通常公知の方法を使用して化学的合成もしくは生化学的合成又は双方の組み合わせを使用して（＋）−マノオールを誘導体に加工することを含む。
【０１３６】
一実施形態において、（＋）−マノオール誘導体は、炭化水素、アルコール、アセタール、アルデヒド、酸、エーテル、ケトン、ラクトン、アセテート及びエステルからなる群から選択される。
【０１３７】
本発明の任意の実施形態に従って、前記（＋）−マノオール誘導体は、任意に１、２又は３個の酸素原子を含むＣ10〜Ｃ25化合物である。
【０１３８】
さらなる実施形態において、前記誘導体は、マノオールアセテート（（３Ｒ）−３−メチル−５−［（１Ｓ，４ａＳ，８ａＳ）−５，５，８ａ−トリメチル−２−メチレンデカヒドロ−１−ナフタレニル］−１−ペンテン−３−イルアセテート）、コパロール（（２Ｅ）−３−メチル−５−［（１Ｓ，４ａＳ，８ａＳ）−５，５，８ａ−トリメチル−２−メチレンデカヒドロ−１−ナフタレニル］−２−ペンテン−１−オール）、コパロールアセテート（（２Ｅ）−３−メチル−５−［（１Ｓ，４ａＳ，８ａＳ）−５，５，８ａ−トリメチル−２−メチレンデカヒドロ−１−ナフタレニル］−２−ペンテン−１−イルアセテート）、コパラル（（２Ｅ）−３−メチル−５−［（１Ｓ，４ａＳ，８ａＳ）−５，５，８ａ−トリメチル−２−メチレンデカヒドロ−１−ナフタレニル］−２−ペンテナール）、（＋）−マノオールオキシ（４−［（１Ｓ，４ａＳ，８ａＳ）−５，５，８ａ−トリメチル−２−メチレンドデカヒドロ−１−ナフタレニル］−２−ブタノン）、Ｚ−１１（（３Ｓ，５ａＲ，７ａＳ，１１ａＳ，１１ｂＲ）−３，８，８，１１ａ−テトラメチルドデカヒドロ−３，５ａ−エポキシナフト［２，１−ｃ］オキセピン）、ガンマ−アンブロール（ａｍｂｒｏｌ）（２−［（１Ｓ，４ａＳ，８ａＳ）−５，５，８ａ−トリメチル−２−メチレンドデカヒドロ−１−ナフタレニル］エタノール）及びＡｍｂｒｏｘ（登録商標）（３ａＲ，５ａＳ，９ａＳ，９ｂＲ）−３ａ，６，６，９ａ−テトラメチルドデカヒドロナフト［２，１−ｂ］フラン）からなる群から選択される。
【０１３９】
他の実施形態において、本明細書において提供される方法は、さらに、（＋）−マノオールと適した反応系とを接触させて、該（＋）−マノオールを適した（＋）−マノオール誘導体に変換することを含む。前記適した反応系は、酵素的性質（例えば、１つ以上の酵素の要求）又は化学的性質（例えば、１つ以上の合成化学物質の要求）のものであってよい。
【０１４０】
例えば、（＋）−マノオールは、例えば米国特許番号第７，２９４，４９２号（ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ７，２９４，４９２）において挙げられているように、文献において記載されたプロセスを使用してマノオールオキシ又はガンマ−アンブロールに酵素により変換されてよく、ここで該文献は、参照をもってその全体を本明細書に組み込まれたものとする。
【０１４１】
さらに他の実施形態において、（＋）−マノオール誘導体は、コパロール、及びＣ1〜Ｃ5カルボン酸とのそのエステルである。
【０１４２】
さらに他の実施形態において、（＋）−マノオール誘導体は、Ｃ1〜Ｃ5カルボン酸との（＋）−マノオールエステルである。
【０１４３】
一実施形態において、（＋）−マノオール誘導体は、コパラルである。
【０１４４】
一実施形態において、（＋）−マノオール誘導体は、マノオールオキシである。
【０１４５】
さらに他の実施形態において、（＋）−マノオール誘導体は、Ｚ−１１である。
【０１４６】
一実施形態において、（＋）−マノオール誘導体は、アンブロール、又はそれらの混合物及びＣ1〜Ｃ5カルボン酸とそのエステル、及び特にガンマ−アンブロール及びそのエステルである。
【０１４７】
さらなる実施形態において、（＋）−マノオール誘導体は、Ａｍｂｒｏｘ（登録商標）、スクラレオリド（ｓｃｌａｒｅｏｌｉｄｅ）（３ａ，６，６，９ａ−テトラメチルデカヒドロナフト［２，１−ｂ］フラン−２（１Ｈ）−オン及びその全てのジアステレオマー及び立体異性体としても公知）、３，４ａ，７，７，１０ａ−ペンタメチルドデカヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｆ］クロメン−３−オール又は３，４ａ，７，７，１０ａ−ペンタメチル−４ａ，５，６，６ａ，７，８，９，１０，１０ａ，１０ｂ−デカヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｆ］クロメン及びその全てのジアステレオマー及び立体異性体の環状ケトン及び開環型、（１Ｒ，２Ｒ，４ａＳ，８ａＳ）−１−（２−ヒドロキシエチル）−２，５，５，８ａ−テトラメチルデカヒドロナフタレン−２−オール  ＤＯＬ、ガンマ−アンブロールである。
【０１４８】
どのようにして前記誘導体（例えば、トリエン炭化水素、アセテート又はコパロール）が得られるかについての特定の例を実施例において詳述する。
【０１４９】
例えば、本発明により得られるマノオールは、欧州特許第２１２２５４号（ＥＰ ２１２２５４）に従って、マノオールオキシ（ケトン、それ自体公知の方法）に、そしてアンブロール（アルコール）及びアンブロックス（エーテル）に加工されてよい。
【０１５０】
特定のセスキテルペンを触媒により合成するポリペプチドの能力は、本明細書において提供される実施例において詳述するように、酵素アッセイを実行することによって確認できる。
【０１５１】
ポリペプチドは、それらの（＋）−マノオールシンターゼ活性及びそれらのスクラレオールシンターゼ活性を維持することが提供された短縮ポリペプチドを含むことも意味する。
【０１５２】
本明細書において以下で意図されるように、本明細書において記載された配列を改質することによって得られるヌクレオチド配列は、当業者に公知の任意の方法を使用して、例えば任意のタイプの変異、例えば欠失、挿入又は置換の変異を導入することによって実施されてよい。かかる方法の例は、多様体ポリペプチド及びそれらの製造方法に関する記載の一部に挙げられている。
【０１５３】
２つのペプチド配列又はヌクレオチド配列の同一性のパーセンテージは、２つの配列のアライメントが生じる場合に２つの配列において同一であるアミノ酸残基又はヌクレオチド残基の数の関数である。同一残基は、アライメントの与えられた位置で２つの配列において同一である残基と定義される。配列同一性のパーセンテージは、本明細書において使用されるように、２つの配列間の同一の残基の数を最も短い配列における残基の総数で割り、１００をかけることによって最適なアライメントから算出される。最適なアライメントは、同一性のパーセンテージが最も高い可能性があるアライメントである。ギャップは、１つ又は双方の配列中に、最適なアライメントを得るためにアライメントの１つ以上の位置で導入されうる。これらのギャップは、同一でない残基として、配列同一性のパーセンテージの計算のために考慮に入れられる。アミノ酸又は核酸の配列同一性のパーセンテージを決定する目的のためのアライメントは、コンピュータプログラム及び例えばウェブ上で入手できる公的に入手可能なコンピュータプログラムを使用する種々の方法で得られてよい。好ましくは、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/bl2seq/wblast2.cgiで国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ））から入手できるデフォルトパラメータに対するＢＬＡＳＴプログラム（Ｔａｔｉａｎａら， ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．， １９９９， １７４：２４７−２５０）セットは、タンパク質又は核酸配列の最適なアライメントを得るため、及び配列同一性のパーセンテージを算出するために使用されてよい。
【０１５４】
インビトロでＧＧＰＰと接触されるべきポリペプチドは、標準のタンパク質又は酵素抽出技術を使用して、それを発現する任意の生物から抽出することによって得られてよい。宿主生物が培地中に本明細書における実施形態のポリペプチドを放出する単細胞生物又は細胞である場合に、ポリペプチドは、培地から、例えば遠心分離、任意に続いて洗浄ステップ及び適した緩衝溶液中での再懸濁によって簡単に採取されてよい。他の実施形態において、ＧＧＰＰは、培地中でポリペプチドと接触されてよく、ポリペプチドは、宿主生物、単細胞生物、又は細胞から遊離されてよい。前記生物又は細胞が、その細胞内でポリペプチドを蓄積する場合に、ポリペプチドは、細胞の破壊又は溶解によって得られてよい。細胞溶解物からのポリペプチドのさらなる抽出に対して、又は必ずしもかかる抽出を行わずに細胞溶解物との接触を解して、ＧＧＰＰをポリペプチドと接触させてよい。
【０１５５】
他の特定の実施形態に従って、任意の前記実施形態の方法を、ｉｎ ｖｉｖｏで実施する。本明細書において提供されるこれらの実施形態は、予めポリペプチドを単離することなくｉｎ ｖｉｖｏで前記方法を実施することができるため、特に有利である。前記反応は、形質転換した生物又は細胞内で直接生じて、前記ポリペプチドを発現する。
【０１５６】
前記生物又は細胞は、ポリペプチドを「発現」することを意味するが、但し該生物又は細胞は、該ポリペプチドをコードする核酸を保有するために形質転換され、この核酸は、ｍＲＮＡに転写され、そしてポリペプチドが、宿主生物又は細胞中で見出される。「発現」の用語は、「異種発現」及び「過剰発現」を含み、後者は、形質転換していない生物又は細胞中で測定されるものを超える、及びそれより多いｍＲＮＡ、ポリペプチド及び／又は酵素活性のレベルをいう。非ヒト宿主生物又は細胞を形質転換するための適した方法のより詳細な記載は、かかる形質転換した非ヒト宿主生物又は細胞について記載された明細書の一部で以下に記載されている。
【０１５７】
特定の生物又は細胞は、本明細書において記載された核酸で形質転換する前に、又は前記核酸と一緒に、天然にＧＧＰＰを製造する場合に、又は天然にＧＧＰＰを製造しないがＧＧＰＰを製造するように形質転換される場合に、「ＧＧＰＰを製造できる」ことを意味する。生物又は細胞を天然に生じるよりも高い量のＧＧＰＰを製造するために形質転換させた生物又は細胞は、「ＧＧＰＰを製造することができる生物又は細胞」にも包含される。生物、例えば微生物を形質転換して、それらがＧＧＰＰを製造するためのいくつか方法は、例えば、Schalkら、J. Am. Chem. Soc., 2013, 134:18900−18903において公知である。
【０１５８】
ｉｎ ｖｉｖｏで本明細書における実施形態の方法を実施するために適した非ヒト宿主生物は、任意の非ヒト多細胞又は単細胞生物であってよい。特定の実施形態において、ｉｎ ｖｉｖｏで本明細書における一実施形態を実施するために使用される非ヒト宿主生物は、植物、原核生物又は真菌である。あらゆる植物、原核生物又は真菌を使用できる。特に有用な植物は、多量のテルペンを自然に製造するものである。より特定の実施形態において、ｉｎ ｖｉｖｏで本明細書における実施形態の方法を実施するために使用される非ヒト宿主生物は、微生物である。あらゆる微生物を使用できるが、さらにより特定の実施形態に従って、該微生物は細菌又は酵母である。最も特に、細菌はＥ．コリであり、かつ前記酵母はサッカロミセス・セレビジエである。
【０１５９】
これらの生物のいくつかは、天然にＧＧＰＰを製造しないか、少量のみ製造する。本明細書における実施形態の方法を実施するために適切であるために、これらの生物は、前記前駆体を製造するために形質転換されるか、又は前記前駆体を大量に製造するために操作されうる。それらは、前記で説明されているように、前記実施形態のいずれかに従って記載された核酸での改質前、又は同時に、形質転換されてよい。
【０１６０】
一実施形態において、ＧＧＰＰを製造できる非ヒト宿主生物又細胞は、本明細書において記載されたＣＰＰシンターゼ又はそれらの多様体をコードする核酸及び本明細書において記載されたスクラレオールシンターゼ又はそれらの多様体をコードする核酸で形質転換され、その際、ＧＧＰＰを製造できる非ヒト宿主生物又細胞は、操作されてＧＧＰＰシンターゼを過剰発現するか、又はＧＧＰＰシンターゼをコードする核酸で形質転換される。
【０１６１】
一実施形態において、非ヒト宿主生物又細胞は、ＧＧＰＰシンターゼをコードする核酸、本明細書において記載されたＣＰＰシンターゼ又はそれらの多様体をコードする核酸、及び本明細書において記載されたスクラレオールシンターゼ又はそれらの多様体をコードする核酸を含み、その際少なくとも１つの該核酸は、非ヒト宿主生物又細胞に対して異種性である。
【０１６２】
単離された高次真核細胞を、完全な生物の代わりに、ｉｎ ｖｉｖｏで本明細書における実施形態の方法を実施するための宿主としても使用できる。適した真核細胞は、あらゆる非ヒト細胞であってよいが、しかし特に植物細胞又は真菌細胞である。
【０１６３】
他の実施形態に従って、本明細書に記載された任意の実施形態において使用されるＣＰＰシンターゼ活性を有するポリペプチド又は本明細書に記載された核酸によりコードされるポリペプチドは、遺伝子操作によって得られた多様体であってよいが、但し該多様体は、そのＣＰＰシンターゼ活性を維持している。
【０１６４】
他の実施形態に従って、本明細書に記載された任意の実施形態において使用されるスクラレオールシンターゼ活性を有するポリペプチド又は本明細書に記載された核酸によりコードされるポリペプチドは、遺伝子操作によって得られた多様体であってよいが、但し該多様体は、そのスクラレオールシンターゼ活性を維持しているか、又はマノオールシンターゼ活性を有している。
【０１６５】
本明細書において使用されるように、ポリペプチドは、本明細書において同定されるアミノ酸配列を含むポリペプチド又はペプチド断片、並びに短縮されたポリペプチド又は多様体ポリペプチドとして意図され、但し、それらは、ＣＰＰシンターゼ活性及びそれらのスクラレオールシンターゼ活性及び／又はマノオールシンターゼ活性を維持している。
【０１６６】
多様体ポリペプチドの例は、選択的ｍＲＮＡスプライシング事象から又は本明細書において記載されたポリペプチドのタンパク質切断からもたらされる天然に生じるタンパク質である。タンパク質分解による変異は、例えば、本明細書における実施形態のポリペプチドからの１つ以上の末端アミノ酸のタンパク質分解性除去による、種々のタイプの宿主細胞における発現に対するＮ末端又はＣ末端での差異を含む。以下に記載されているように、本明細書における実施形態の核酸の天然又は人工の変異によって得られた核酸によってコードされたポリペプチドも、本明細書における実施形態により含まれる。
【０１６７】
アミノ末端及びカルボキシル末端で追加のペプチド配列の融合から得られるポリペプチド多様体も、本明細書における実施形態の方法で使用されうる。特に、かかる融合は、ポリペプチドの発現を高めることができ、タンパク質の精製において有用であり、又は所望の環境又は発現システムでポリペプチドの酵素活性を改良する。かかる追加のペプチド配列は、例えばシグナルペプチドであってよい。したがって、多様体ポリペプチド、例えば他のオリゴペプチド又はポリペプチドとの融合によって得られたもの、及び／又はシグナルペプチドに連結させたものを使用する方法が本明細書において含まれる。他の機能性タンパク質、例えばテルペン生合成経路からの他のタンパク質との融合から得られるポリペプチドは、有利には、本明細書における実施形態の方法においても使用されうる。
【０１６８】
多様体は、ポリペプチド骨格に共有結合又は非共有結合する改質基の付着により、本明細書における実施形態のポリペプチドとも異なる。
【０１６９】
多様体は、導入されたＮ結合した又はＯ結合したグリコシル化部位、及び／又はシステイン残基の付加によって本明細書に記載のポリペプチドとは異なるポリペプチドも含む。当業者は、どのようにアミノ酸配列を改質するか、及び生物学的活性を保持するかを認識している。
【０１７０】
したがって、一実施形態において、本発明は、前記実施形態のいずれかにおいて記載されたＣＰＰシンターゼ活性又はスクラレオールシンターゼ活性又はマノオールシンターゼ活性を有する多様体ポリペプチドを製造するための方法を提供し、該方法は、
（ａ）前記実施形態のいずれかに従って核酸を選択するステップ、
（ｂ）選択した核酸を改質して、少なくとも１つの変異体核酸を得るステップ、
（ｃ）宿主細胞又は単細胞生物を変異体核酸配列で形質転換して、変異体核酸配列によってコードされたポリペプチドを発現するステップ、
（ｄ）少なくとも１つの改質された性質についてポリペプチドをスクリーニングするステップ、及び
（ｅ）任意に、ポリペプチドが所望の多様体ＣＰＰシンターゼ活性、スクラレオールシンターゼ活性、又はマノオールシンターゼ活性を有さない場合に、プロセスステップ（ａ）〜（ｄ）を、所望の多様体ＣＰＰシンターゼ活性、スクラレオールシンターゼ活性、又はマノオールシンターゼ活性を有するポリペプチドが得られるまで繰り返すステップ、
（ｆ）任意に、所望の多様体ＣＰＰシンターゼ活性又はスクラレオールシンターゼ活性又はマノオールシンターゼ活性を有するポリペプチドが、ステップ（ｄ）において同定された場合に、ステップ（ｃ）において得られた対応する変異体核酸を単離するステップ
を含む。
【０１７１】
一実施形態に従って、ＣＰＰシンターゼ活性又はスクラレオールシンターゼ活性を有するポリペプチドと組み合わせた場合に製造された多様体ポリペプチドは、（＋）−マノオールを製造することができる。
【０１７２】
ステップ（ｂ）において、多数の変異体核酸配列を、例えばランダム変異、部位特異的変異、又はＤＮＡシャッフリングによって製造してよい。遺伝子シャッフリングの詳細な手法は、Ｓｔｅｍｍｅｒ、ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ｂｙ ｒａｎｄｏｍ ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ ： ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．， １９９４， ９１（２２）： １０７４７−１０７５）において見いだせる。要するに、ＤＮＡシャッフリングは、組換えのために選択された少なくとも２つの核酸を含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの公知の配列のランダム組換えのプロセスを言う。例えば、変異は、野生型配列の断片にライゲーションできる制限酵素部位に置かれた変異体配列を含むオリゴヌクレオチドを合成することによって特定の座で導入されてよい。ライゲーションに続いて、得られた再構築された配列は、所望のアミノ酸の挿入、置換又は欠失を有する類似体をコードする。代わりに、オリゴヌクレオチド指定部位特異的変異法を実施して、予め決定したコドンを置換、欠失又は挿入によって改変できる、改変した遺伝子を提供してよい。
【０１７３】
例えば本発明の実施例において開示されているような標準法に従って宿主細胞を形質転換するために使用されうる変異体核酸が得られ、かつ分離されうる。
【０１７４】
ステップ（ｄ）において、ステップ（ｃ）において得られたポリペプチドを、少なくとも１つの改質された性質、例えば所望の改質された酵素活性についてスクリーニングする。発現させたポリペプチドをスクリーニングしてよい所望の酵素活性の例は、ＫM値又はＶmax値により測定される高められた又は低減された酵素活性、改質された位置化学又は立体化学、及び改変された基質利用率又は生成物分布を含む。酵素活性のスクリーニングを、当業者によく知られている方法及び本発明の実施例において開示されている方法に従って実施してよい。
【０１７５】
ステップ（ｅ）は、プロセスステップ（ａ）〜（ｄ）の繰り返しを提供し、好ましくは並行して実施してよい。したがって、著しい数の変異体核酸を製造することによって、多くの宿主細胞を、高められた数のポリペプチドの続くスクリーニングを可能にする、同時の種々の変異体核酸で形質転換してよい。したがって、所望の多様体ポリペプチドを得る機会は、当業者の裁量で増加させてよい。
【０１７６】
本明細書に開示された配列において示されている遺伝子配列に加えて、ＤＮＡ配列多型が所与の集団内に存在してよく、本明細書に開示されるポリペプチドのアミノ酸配列の変化をもたらしうることは、当業者に明白であろう。かかる遺伝的多型は、異なる集団からの細胞中に又は天然の対立遺伝子変異による集団内に存在しうる。対立遺伝子変異型は機能的等価物を含んでもよい。
【０１７７】
さらなる実施形態は、具体的に開示された核酸からかかる配列多型によって誘導された分子にも関する。これらの自然変異は、通常、本明細書に開示された遺伝子のヌクレオチド配列又はポリペプチドのアミノ酸配列において約１〜５％の変動をもたらす。前記のように、本明細書における実施形態のポリペプチドをコードする核酸は、前記方法がｉｎ ｖｉｖｏで実施される場合に使用されることが意図される非ヒト宿主生物又は細胞を改質するために有用な手段である。
【０１７８】
したがって、前記実施形態のいずれかに従ってポリペプチドをコードする核酸も、本明細書において提供される。
【０１７９】
本明細書における実施形態の核酸は、一本鎖形又は二本鎖形（ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ）でのデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドポリマーを含むと定義されてよい。「ヌクレオチド配列」の用語は、別々の断片の形で、又はより大きい核酸の成分としてポリヌクレオチド分子又はオリゴヌクレオチド分子を含むとも解されるべきである。本明細書における実施形態の核酸は、実質的に内在性材料を汚染することを有さないものを含むある単離されたヌクレオチド配列も含む。本明細書における実施形態の核酸は短縮されていてよいが、但し前記のように本明細書において含まれるポリペプチドをコードする。
【０１８０】
一実施形態において、ＣＰＰシンターゼをコードする本明細書における実施形態の核酸は、植物、例えばサルビア・ミルティオリザ（Salvia miltiorrhiza）、又は他の種、例えばコレウス・フォルスコリ（Coleus forskohlii）、トリチクム・アエスチブム（Triticum aestivum）、マルビウム・ヴルガレ（Marrubium vulgare）又はロスマリヌス・オフィキナリス（Rosmarinus officinalis）において天然に存在するか、又は配列番号３、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２６、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、又は配列番号３２を改質することによって得られてよい。
【０１８１】
さらなる実施形態において、スクラレオールシンターゼをコードする本明細書における実施形態の核酸は、植物、例えばサルビア・スクラレア（Salvia sclarea）、又は他の種、例えばニコチアナ・グルチノサ（Nicotiana glutinosa）において天然に存在するか、又は配列番号６、配列番号２４、配列番号２７、配列番号３３又は配列番号３４を改質することによって得られてよい。
【０１８２】
変異は、これらの核酸のあらゆる種類の変異、例えば点変異、欠失変異、挿入変異及び／又はフレームシフト変異であってよい。多様体核酸は、そのヌクレオチド配列を特定の発現系に適応するために製造されてよい。例えば、細菌発現系は、アミノ酸が特定のコドンによってコードされる場合に、ポリペプチドをより効率的に発現することが公知である。
【０１８３】
遺伝子コードの縮重によって、１つより多いコドンが、同一のアミノ酸配列をコードしてよく、多重核酸配列は、同一のタンパク質又はポリペプチドについてコードでき、その際、全てのこれらのＤＮＡ配列は、本明細書における実施形態に含まれる。適宜、ＣＰＰシンターゼ及びスクラレオールシンターゼをコードする核酸配列は、宿主細胞中で増加させた発現について最適化されてよい。例えば、本明細書における実施形態のヌクレオチドを、改良された発現のために特に宿主にコドンを使用して合成してよい。
【０１８４】
本明細書における実施形態の方法をｉｎ ｖｉｖｏで実施するために適した宿主生物又は細胞を形質転換するための他の重要な手段は、本明細書における実施形態のあらゆる実施形態に従った核酸を含む発現ベクターである。したがって、かかるベクターも、本明細書において提供される。
【０１８５】
本明細書における実施形態の少なくとも１つの核酸を保有するために形質転換させて、本明細書における実施形態の少なくとも１つのポリペプチドを異種発現又は過剰発現する組換えた非ヒト宿主生物及び細胞は、本明細書における実施形態の方法を実施するための非常に有用な手段でもある。したがって、かかる非ヒト宿主生物及び細胞も本明細書において提供される。
【０１８６】
前記実施形態のいずれかに従った核酸は、非ヒト宿主生物及び細胞を形質転換するために使用されてよく、かつ発現されたポリペプチドは、前記ポリペプチドのいずれかであってよい。
【０１８７】
本明細書における実施形態の非ヒト宿主生物は、任意の非ヒト多細胞又は単細胞生物であってよい。特定の実施形態において、非ヒト宿主生物は、植物、原核生物又は真菌である。あらゆる植物、原核生物又は真菌が、本明細書において提供される方法に従って形質転換されるために適している。特に有用な植物は、多量のテルペンを自然に製造するものである。
【０１８８】
より特定の実施形態において、非ヒト宿主生物は、微生物である。あらゆる微生物が本明細書における使用に適しているが、さらにより特定の実施形態に従って、該微生物は細菌又は酵母である。最も特に、前記細菌はＥ．コリであり、かつ前記酵母はサッカロミセス・セレビジエである。
【０１８９】
単離された高次真核細胞を、完全な生物の代わりに、形質転換させることもできる。高次真核細胞とは、ここで酵母細胞を除いたあらゆる非ヒト真核細胞を意味する。特定の高次真核細胞は、植物細胞又は真菌細胞である。
【０１９０】
本明細書において提供される実施形態は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ及びＲＮＡ配列を含むが、これらに制限されない。
【０１９１】
本明細書における実施形態のポリヌクレオチドを含む遺伝子は、利用できるヌクレオチド配列情報、例えば付属の配列表において見出される情報に基づいて、及び当業者に公知の方法により、クローン作製されてよい。これらは、例えば、センス方向で生じ、かつセンス鎖の合成を開始し、かつ他は逆相補的な方法で作製され、かつアンチセンス鎖を生じる、かかる遺伝子のフランキング配列を示すＤＮＡプライマーの設計を含む。熱安定性のＤＮＡポリメラーゼ、例えばポリメラーゼ連鎖反応において使用されるものは、かかる実験を実施するために一般に使用される。代わりに、遺伝子を表すＤＮＡ配列は、化学的に合成され、続いて、例えば適合性の細菌、例えばＥ．コリによって増殖されてよいＤＮＡベクター分子中で導入されてよい。
【０１９２】
本明細書において、配列番号３、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２６、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、又は配列番号３２、及び配列番号６、配列番号２４、配列番号２７、配列番号３３、又は配列番号３４の変異によって得られる核酸配列が提供され、かかる変異は、常に生じてよい。１つ以上のヌクレオチドの変異、欠失、挿入、及び／又は置換を、それらＤＮＡ配列に導入することができることは、当業者に明らかである。
【０１９３】
ＣＰＰシンターゼ及びスクラレオールシンターゼタンパク質をコードする本明細書における実施形態の核酸配列は、宿主細胞又は宿主生物中でＣＰＰシンターゼ及びスクラレオールシンターゼを製造するために、発現ベクター中に挿入されてよく、及び／又は発現ベクター中で挿入されたキメラ遺伝子において含まれてよい。宿主細胞のゲノム中へ導入遺伝子を挿入するためのベクターは、当業者に周知であり、かつプラスミド、ウィルス、コスミド及び人工染色体を含む。キメラ遺伝子が挿入される二元の又は同時組み込み型のベクターも、宿主細胞を形質転換するために使用される。
【０１９４】
本明細書において提供される実施形態は、それぞれ別々に、ＣＰＰシンターゼ及びスクラレオールシンターゼをコードする核酸を含む組換え発現ベクターを提供し、関連する核酸配列、例えばプロモーター配列に操作可能に連結する。
【０１９５】
代わりに、プロモーター配列は、ベクター中で既に存在していてよく、その結果、転写されるべき核酸配列は、プロモーター配列の下流のベクター中に挿入される。ベクターは、典型的に、複製、マルチクローニング部位、及び選択可能なマーカーの起点を有するために操作される。
【０１９６】
実施例
実施例１
ジテルペンシンターゼ遺伝子
２つのジテルペンシンターゼ：ＩＩ型及びＩ型ジテルペンシンターゼが、ゲラニルゲラニルジホスフェート（ＧＧＰＰ）をマノオールに変換するために必要である。次の実施例において、いくつかのＩＩ型及びＩ型ジテルペンシンターゼの組合せを選択し、そしてマノオールの製造について評価した。ＩＩ型シンターゼについて、５つのコパリルジホスフェート（ＣＰＰ）シンターゼを選択した：
−  サルビア・ミルティオリザからのＳｍＣＰＳ、ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＢＶ５７８３５．１。
−  コレウス・フォルスコリからのＣｆＣＰＳ１、ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＨＷ０４０４６．１。
−  トリチクム・アエスチブムからのＴａＴｐｓ１、ＮＣＢＩアクセッション番号ＢＡＨ５６５５９．１。
−  マルビウム・ヴルガレからのＭｖＣｐｓ３、ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＩＥ７７０９２．１。
−  ロスマリヌス・オフィキナリスからのＲｏＣＰＳ１、ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＨＬ６７２６１．１。
【０１９７】
５つのＣＰＰシンターゼをコードするｃＤＮＡのコドン使用頻度を、Ｅ．コリ中で最適な発現のために改質し（ＤＮＡ ２．０、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ ９４０２５）、そしてＮｄｅＩ及びＫｐｎＩ制限酵素部位を、それぞれ５’−末端及び３’−末端で追加した。さらに、ｃＤＮＡを、予測されるペプチドシグナル（それぞれ、ＳｍＣＰＳ、ＣｆＣＰＳ１、ＴａＴｐｓ１、ＭｖＣｐｓ３及びＲｏＣＰＳ１について５８アミノ酸、６３アミノ酸、５９アミノ酸、６３アミノ酸及び６７アミノ酸）の消失を有する組換えＣＰＰシンターゼを発現するように設計した。
【０１９８】
Ｉ型ジテルペンシンターゼについては、サルビア・スクラレアからのスクラレオールシンターゼ（ＳｓＳｃＳ）を使用した（ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＥＴ２１２４６．１、国際公開特許番号第２００９０９５３６６号（ＷＯ２００９０９５３６６））。ｃＤＮＡのコドン使用頻度を、Ｅ．コリ発現について最適化し（ＤＮＡ ２．０、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ ９４０２５）、５０個の最初のＮ末端コドンを除去し、そしてＮｄｅＩ及びＫｐｎＩ制限酵素部位を、それぞれ５’−末端及び３’−末端で追加した。全てのｃＤＮＡを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成し、そしてｐＪ２０８プラスミド又はｐＪ４０１プラスミド（ＤＮＡ ２．０、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ ９４０２５、ＵＳＡ）中でクローニングした。
【０１９９】
実施例２
発現プラスミド
改質したＳｍＣＰＳをコードするｃＤＮＡ（ＳｍＣＰＳ２）及びスクラレオールシンターゼ（ＳｓＳｃＳ）をコードするｃＤＮＡ（１１３２−２−５＿ｏｐｔ）を、ＮｄｅＩ及びＫｐｎＩで消化し、そしてそれぞれｐＥＴＤｕｅｔ−ＳｍＣＰＳ２発現プラスミド及びｐＥＴＤｕｅｔ−１１３２ｏｐｔ発現プラスミドを提供するｐＥＴＤｕｅｔ−１プラスミドにライゲートした。
【０２００】
他のプラスミドを、ゲラニルゲラニルジホスフェート（ＧＧＰＰ）シンターゼと一緒にＳｍＣＰＳ２酵素及びＳｓＳｃＳ酵素を同時発現させるように構築した。ＧＧＰＰシンターゼについて、ＧＧＰＰシンターゼ（ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＡＡ２４８１９．１）をコードするパントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）からのＣｒｔＥ遺伝子（ＮＣＢＩアクセッション番号Ｍ３８４２４．１）を使用した。ＣｒｔＥ遺伝子を、コドン最適化及び３’末端及び５’末端でのＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩ 制限酵素認識部位の追加により合成し（ＤＮＡ ２．０、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ ９４０２５、ＵＳＡ）、そしてｐＥＴＤｕｅｔ−１プラスミドのＮｃｏＩ部位とＢａｍＨＩ部位との間でライゲートして、ｐＥＴＤｕｅｔ−ＣｒｔＥプラスミドを得た。ＳｍＣＰＳ２をコードするｃＤＮＡを、ＮｄｅＩ及びＫｐｎＩで消化し、そしてｐＥＴＤｕｅｔ−１−ＣｒｔＥプラスミドにライゲートして、ｐＥＴＤｕｅｔ−ＣｒｔＥ−ＳｍＣＰＳ２構築物を提供した。そして短縮したＳｓＳｃＳをコードする最適化したｃＤＮＡ（１１３２−２−５＿ｏｐｔ）を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）技術（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｅｕｒｏｐｅ）を使用して、ｐＥＴＤｕｅｔ−ＣｒｔＥ−ＳｍＣＰＳ２プラスミドに導入した。このクローニングのために、ｐＥＴＤｕｅｔ−１１３２ｏｐｔを、フォワードプライマーＳｍＣＰＳ２−１１３２Ｉｎｆ＿Ｆ１  ５’−ＣＴＧＴＴＴＧＡＧＣＣＧＧＴＣＧＣＣＴＡＡＧＧＴＡＣＣＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＡＡＴＡＡＴＧＧＣＧＡＡＡＡＴＧＡＡＧＧＡＧＡＡＣＴＴＴＡＡＡＣＧ−３’（配列番号９）及びリバースプライマー１１３２−ｐＥＴ＿Ｉｎｆ＿Ｒ１  ５’−ＧＣＡＧＣＧＧＴＴＴＣＴＴＴＡＣＣＡＧＡＣＴＣＧＡＧＧＴＣＡＧＡＡＣＡＣＧＡＡＧＣＴＣＴＴＣＡＴＧＴＣＣＴＣＴ−３’（配列番号１０）を使用するＰＣＲ増幅における鋳型として使用した。ＰＣＲ産物を、ＫｐｎＩ制限酵素及びＸｈｏＩ制限酵素で消化したプラスミドｐＥＴＤｕｅｔ−ＣｒｔＥ−ＳｍＣＰＳ２に、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標） Ｄｒｙ−Ｄｏｗｎ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｅｕｒｏｐｅ）を使用してライゲートして、新たなプラスミドｐＥＴＤｕｅｔ−ＣｒｔＥ−ＳｍＣＰＳ２−ＳｓＳｃＳを提供した。このプラスミドにおいて、ＣｒｔＥ遺伝子は、ｐＥＴＤｕｅｔプラスミドの第１のＴ７プロモーターの制御下にあり、かつＣＰＰシンターゼ及びスクラレオールシンターゼをコードするｃＤＮＡは、第２のＴ７プロモーターの制御下でバイシストロン性構築物中で組織化される。
【０２０１】
ｐＥＴＤｕｅｔ−ＣｒｔＥ−ＳｍＣＰＳ２−ＳｓＳｃＳプラスミドを、４つの他のＣＰＰシンターゼをコードする酵素を保有する新たな発現プラスミドの構築のための鋳型として使用した。ＳｍＣＰＳ２  ｃＤＮＡを、ＮｄｅＩ−ＫｐｎＩ制限酵素による消化−ライゲーションアプローチを使用して、４つの新たなＣＰＰシンターゼをコードするｃＤＮＡの１つによって置き換えて、新たなプラスミドｐＥＴＤｕｅｔ−ＣｒｔＥ−ＣｆＣＰＳ１ｄｅｌ６３−ＳｓＳｃＳ、ｐＥＴＤｕｅｔ−ＣｒｔＥ−ＴａＴｐｓ１ｄｅｌ５９−ＳｓＳｃＳ、ｐＥＴＤｕｅｔ−ＣｒｔＥ−ＭｖＣｐｓ３ｄｅｌ６３−ＳｓＳｃＳ及びｐＥＴＤｕｅｔ−ＣｒｔＥ−ＲｏＣＰＳ１ｄｅｌ６７−ＳｓＳｃＳを提供した。
【０２０２】
実施例３
Ｅ．コリにおける異種発現及び酵素活性
発現プラスミド（ｐＥＴＤｕｅｔ−ＳｍＣＰＳ２又はｐＥＴＤｕｅｔ−１１３２ｏｐｔ）を使用して、Ｂｌ２１（ＤＥ３）Ｅ．コリ細胞（Ｎｏｖａｇｅｎｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を形質転換させた。形質転換させた細胞の単コロニーを使用して、ＬＢ培地２５ｍｌに植え付けた。３７℃で５〜６時間のインキュベート後に、培養物を２０℃のインキュベーターに移し、そして平衡のために１時間置いた。そしてタンパク質の発現を、０．１ｍＭ ＩＰＴＧを添加することにより誘発し、その培養物を２０℃で一夜インキュベートした。翌日、その細胞を遠心分離により採取し、ｐＨ７で５０ｍＭ ＭＯＰＳＯ（３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸ナトリウム塩、３−（Ｎ−モルホリニル）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸ナトリウム塩）緩衝液、１０%グリセロール、１ｍＭ ＤＴＴの０．１容量で再懸濁し、そして超音波破砕により分解した。抽出物を遠心分離（２００００ｇで３０分）により清浄し、そして可溶性タンパク質を含む上清を、他の実験のために使用した。
【０２０３】
実施例４
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのジテルペンシンターゼ活性アッセイ
２０ｍＭのＭｇＣｌ2で補った５０ｍＭ ＭＯＰＳＯ（ｐＨ７、１０％グリセロール）及び５０〜２００μＭの精製したゲラニルゲラニルジホスフェート（ＧＧＰＰ）（Ｋｅｌｌｅｒ及びＴｈｏｍｐｓｏｎ、Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ， １９９３， ６４５（１）：１６１−１６７により記載されたように製造した）の最終容量１ｍＬ中でタンパク質抽出物５０〜１００μｌを使用してＴｅｆｌｏｎ密閉ガラス管中で酵素アッセイを実施した。そのガラス管を５〜４８時間３０℃でインキュベートし、その酵素生成物をペンタン１容量で２回抽出した。窒素流下での濃縮後に、抽出物をＧＣ−ＭＳにより分析し、そして対照タンパク質（空のプラスミドで形質転換した細胞から得られる）からの抽出物と比較した。ＧＣ−ＭＳ分析を、ＤＢ１カラム（３０ｍ×０．２５ｍｍ×０．２５ｍｍの膜厚、Ａｇｉｌｅｎｔ）を備え、５９７５シリーズの質量分析器を連結したＡｇｉｌｅｎｔ ６８９０シリーズＧＣシステムで実施した。キャリヤーガスは、１ｍｌ／分の一定流でのヘリウムであった。注入は、２６０℃での注射器温度設定でスプリットレスモードであり、そして炉の温度を、１０℃／分で１００℃〜２２５℃、そして３０℃／分で〜２８０℃としてプログラムした。生成物の同定を、基準品の保持指数及び質量スペクトルとの一致に基づいて確認した。
【０２０４】
これらの条件下で及びプラスミドｐＥＴＤｕｅｔ−ＳｍＣＰＳ２又はｐＥＴＤｕｅｔ−１１３２ｏｐｔ（それぞれＳｍＣＰＳ酵素又はＳｃＳｃＳ酵素を異種発現する）で形質転換させたＥ．コリ細胞からの組換えタンパク質と一緒に、ジテルペン分子の製造は、溶媒抽出物中で検出されなかった（ジホスフェート含有ジテルペンはこれらの条件下で検出されない）。そして同様のアッセイを実施したが、シングルアッセイにおいて組換えＳｍＣＰＳ及びＳｓＳｃＳを含む２つのタンパク質抽出物を組み合わせた。これらのアッセイにおいて、１つの主生成物が形成され、基準品との質量スペクトル及び保持指数の一致により（＋）−マノオールと同定された（図３）。この実験は、スクラレオールシンターゼをＣＰＰシンターゼと一緒に使用してマノオールを製造できたことを証明した。
【０２０５】
実施例５
Ｅ．コリ細胞を使用したｉｎ ｖｉｖｏでのマノオール製造
全細胞の培養物を使用してマノオールのｉｎ ｖｉｖｏでの製造を、Ｅ．コリ細胞を使用して評価した。実施例２において記載した同時発現プラスミドに挿入されたＣｒｔＥ遺伝子は、ファルネシル−ジホスフェート（ＦＰＰ）を使用するＧＧＰＰシンターゼ活性を有する酵素をコードし、ゲラニルゲラニルジホスフェート（ＧＧＰＰ）を製造する。内在性ＧＧＰＰプールのレベル及びしたがって細胞のジテルペンにおける生産性を増加するために、ＦＰＰを導く異種性完全メバロン酸経路を、同一の細胞中で同時発現させた。この経路の酵素を、２つのプロモーターの制御下で２つのオペロン中で組織化させた全ての遺伝子を含む単一プラスミドを使用して発現させた。この発現プラスミドの構築は、特許文献国際公開特許番号第２０１３０６４４１１号（ＷＯ２０１３０６４４１１）又はＳｃｈａｌｋら（Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， ２０１３， １３４：１８９００−１８９０３）において記載されている。簡単に説明すると、Ｅ．コリアセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ（ａｔｏＢ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）（黄色ブドウ球菌）ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ（ｍｖａＳ）、スタフィロコッカス・アウレウスＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（ｍｖａＡ）及びサッカロミセス・セレビジエＦＰＰシンターゼ（ＥＲＧ２０）遺伝子からなる第一の合成オペロンを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成し（ＤＮＡ２．０、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ、ＵＳＡ）、そしてＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩで消化したｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に連結して、ｐＡＣＹＣ−２９２５８を得た。メバロン酸キナーゼ（ＭｖａＫ１）、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＭｖａＫ２）、メバロン酸ジホスフェートデカルボキシラーゼ（ＭｖａＤ）、及びイソペンテニルジホスフェートイソメラーゼ（ｉｄｉ）を含む第二のオペロンを、ストレプトコッカス・ニューモニア（Streptococcus pneumoniae）（肺炎連鎖球菌）のゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣ ＢＡＡ−３３４）から増幅し、そしてｐＡＣＹＣ−２９２５８の第二のマルチクローニング部位にらいげーとして、プラスミドｐＡＣＹＣ−２９２５８−４５０６を提供した。したがって、このプラスミドは、アセチル補酵素ＡからＦＰＰを導く生合成経路の全ての酵素をコードする遺伝子を含む。
【０２０６】
ＫＲＸ  Ｅ．コリ細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、プラスミドｐＡＣＹＣ−２９２５８−４５０６と、ｐＥＴＤｕｅｔ−ＣｒｔＥ−ＳｍＣＰＳ２−ＳｓＳｃ、ｐＥＴＤｕｅｔ−ＣｒｔＥ−ＣｆＣＰＳ１ｄｅｌ６３−ＳｓＳｃＳ、ｐＥＴＤｕｅｔ−ＣｒｔＥ−ＴａＴｐｓ１ｄｅｌ５９−ＳｓＳｃＳ、ｐＥＴＤｕｅｔ−ＣｒｔＥ−ＭｖＣｐｓ３ｄｅｌ６３−ＳｓＳｃＳ、又はｐＥＴＤｕｅｔ−ＣｒｔＥ−ＲｏＣＰＳ１ｄｅｌ６７−ＳｓＳｃＳから選択される１つのプラスミドと共に同時形質転換させた。形質転換させた細胞を、カルベニシリン（５０μｇ／ｍｌ）及びクロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）ＬＢアガロースプレート上で選択した。単コロニーを使用して、同一の抗生物質で補足した５ｍＬの液体ＬＢ培地に植え付けた。その培養物を３７℃で一夜インキュベートした。翌日、同一の抗生物質で補った２ｍＬのＴＢ培地を一夜培養物の０．２ｍＬに植えた。３７℃で６時間インキュベートした後に、その培養物を２８℃まで冷却させ、そして０．１ｍＭ ＩＰＴＧ、０．２％ラムノース及びデカン１：１０容量をそれぞれの管に添加した。その培養物を４８時間２８℃でインキュベートした。そしてその培養物をＭＴＢＥ（メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル）２容量で２回抽出し、その有機相を５００μＬまで濃縮させ、そして炉温度を１００℃で１分保持し、続いて２２０℃まで１０℃／分及び３０００℃まで２０℃／分の温度勾配であったことを除いて実施例４において前記したＧＣ−ＭＳにより分析した。
【０２０７】
これらの培養条件下で、マノオールを、ＩＩ型ジテルペンシンターゼ及びサルビア・スクラレアのスクラレオールシンターゼ（ＳｓＳｃＳ）のそれぞれの組み合わせで製造した（図４及び５）。製造されたジテルペン化合物の量を、内部標準（アルファ−ロンギピネン）を使用して定量した。以下の表は、ＳｃＳｃＳを種々のＩＩ型ジテルペンシンターゼと組み合わせた場合にＳｍＣＰＳ／ＳｓＳｃＳの組合せと比較した製造されたマノオールの量を示す（これらの実験条件下で、ＳｍＣＰＳ及びＳｓＳｃＳを発現する細胞により製造されたマノオールの濃度は３００〜５００ｍｇ／Ｌ（図４）であった）。これらの条件下で、製造されたマノオールの最も高い相対量は、ＴａＴｐｓ１ｄｅｌ５９との組合せであった。
【表１】
2020513755.tif 000002
【０２０８】
実施例６
組換え細胞を使用した（＋）−マノオールの製造、精製及びＮＭＲ分析
Ｅ．コリ培養物１リットルを、ＳｍＣＰＳ／ＳｓＳｃＳ酵素の組合せを使用して、デカン有機相を固相抽出のために５０ｇ／Ｌ Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−４に置き換えたことを除いて、実施例５に記載した条件下で製造した。培養液を濾過し、樹脂を回収した。そしてその樹脂を３カラム容量の水で洗浄し、そして３カラム容量のＭＴＢＥを使用して溶出した。そして生成物を、さらにヘプタン：ＭＴＢＥ  ８：２（ｖ／ｖ）から構成される移動相を使用してシリカゲル上でフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。マノオールの構造を、Ｂｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ５００ＭＨｚ質量分析計を使用して１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲにより確認した。旋光度を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ２４１旋光計を使用して測定し、［α］D20＝＋２６．９°（０．３％、ＣＨＣｌ3）の値で（＋）−マノオールの製造を確認した。
【０２０９】
実施例７
ニコチアナ・グルチノサからのスクラレオールシンターゼを使用したＥ．コリ中でのｉｎ ｖｉｖｏでのマノオールの製造
ニコチアナ・グルチノサからのスクラレオールシンターゼは、国際公開特許番号第２０１４／０２２４３４号（ＷＯ ２０１４／０２２４３４）において記載されており、かつラブデンジオールジホスフェート（ＬＰＰ）からスクラレオールを製造することが示されている。国際公開特許番号第２０１４／０２２４３４号において記載されている２つのスクラレオールシンターゼＮｇＳＣＳ−ｄｅｌ２９（国際公開特許番号第２０１４／０２２４３４号における配列番号７８に対応する）及びＮｇＳＣＳ−ｄｅｌ３８（国際公開特許番号第２０１４／０２２４３４号における配列番号４０に対応する）を、実施例５と同一の条件下で（＋）−マノオールの製造について評価した。
【０２１０】
ＮｇＳＣＳ−ｄｅｌ２９をコードするｃＤＮＡを、Ｅ．コリ発現について最適化したコドン使用頻度及びそれぞれ５’末端及び３’末端でＫｐｎＩ部位及びＸｈｏＩ部位を含むように設計した。このＤＮＡを、ＤＮＡ ２．０（Ｎｅｗａｒｋ、ＣＡ ９４５６０）により合成した。
【０２１１】
ｐＥＴＤｕｅｔ−ＣｒｔＥ−ＳｍＣＰＳ２−ＳｓＳｃＳプラスミド（実施例２）を、新たな発現プラスミドの構築のための鋳型として使用した。ｐＥＴＤｕｅｔ−ＣｒｔＥ−ＳｍＣＰＳ２−ＳｓＳｃＳプラスミドを、ＫｐｎＩ制限酵素部位及びＸｈｏＩ制限酵素部位で消化して、ＳｓＳｃＳ ｃＤＮＡをＮｇＳＣＳ−ｄｅｌ２９ ｃＤＮＡに置き換えて、新たなｐＥＴＤｕｅｔ−ＣｒｔＥ−ＳｍＣＰＳ２−ｄｅｌ２９プラスミドを提供した。
【０２１２】
ＫＲＸ Ｅ．コリ細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、プラスミドｐＡＣＹＣ−２９２５８−４５０６（実施例５）及びｐＥＴＤｕｅｔ−ＣｒｔＥ−ＳｍＣＰＳ２−ｄｅｌ２９プラスミドと一緒に同時形質転換させた。形質転換させた細胞を選択し、そして実施例５において記載したジテルペンの製造のための条件下で培養した。ジテルペンの製造をＧＣ−ＭＳ分析を使用して評価し、そして製造されたジテルペン化合物を内部標準（アルファ−ロンギピネン）を使用して定量した。ジテルペンシンターゼＳｍＣＰＳ２及びＮｇＳＣＳ−ｄｅｌ２９の新たな組合せで、マノオールを、形質転換したＥ．コリ細胞により製造した（図６）。ジテルペンシンターゼＳｍＣＰＳ２及びＮｇＳＣＳ−ｄｅｌ３８の組合せは、使用した実験条件下でマノオールを製造しなかった。したがって、試験したニコチアナ・グルチノサのスクラレオールシンターゼの少なくとも１つを使用しても、ＣＰＰからマノオールを製造できる。しかしながら、ニコチアナ・グルチノサシンターゼを使用して製造した量は、ＳｓＳＣＳシンターゼよりも非常に低かった（以下の表を参照されたい）。
【表２】
2020513755.tif 000003
【０２１３】
実施例８
前記実施例において得られたマノオールを、次の実験に従ってそのエステルに変換した（そのアセテートへの実施例としては以下である）：
【化１】
2020513755.tif 000004
文献（Ｇ． Ｏｈｌｏｆｆ， Ｈｅｌｖ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ ４１， ８４５ （１９５８））に従って、純結晶の（＋）−マノオール３２．０ｇ（０．１１モル）を、ジメチルアニリン１００ｍｌ中で塩化アセチル２０．０ｇ（０．２５モル）により、室温で５日間処理した。その混合物を、変換率１００％に達するまで５０℃で７時間さらに保持した。冷却後に、その反応混合物をエーテルで希釈し、連続して１０％Ｈ2ＳＯ4、水性ＮａＨＣＯ3及び水で洗浄して中和した。乾燥（Ｎａ2ＳＯ4）及び濃縮後に、生成物を蒸留（バルブツーバルブ、沸点＝１６０℃、０．１ｍｂａｒ）して、さらなる精製なしに使用したマノオールアセテート２０．０１ｇ（７９．４％）を得た。
MS: M+ 332 (0); m/e: 272 (27), 257 (83), 137 (62), 95 (90), 81 (100).
1H-NMR (CDCl3): 0.67, 0.80, 0.87, 1.54及び2.01 (それぞれ5s, 3H), 4.49 (s, 1H), 4.80 (s, 1H), 5.11 (m, 1H), 5.13 (m, 1H), 5.95 (m, 1H).
13C-NMR (CDCl3): 14.5 (q), 17.4 (t), 19.4 (t), 21.7 (q), 22.2 (q), 23.5 (q), 24.2 (t), 33.5 (s), 33.6 (t), 38.3 (t), 39.0 (t), 39.3 (t), 39.8 (s), 42.2 (t), 55.6 (d), 57.2 (t), 83.4 (s), 106.4 (t), 113.0 (t), 142.0 (d), 148.6 (s), 169.9 (s).。
【０２１４】
実施例９
前記実施例において得られたマノオールアセテートを、次の実験に従ってそのトリエンに変換した（そのスクラレン及び（Ｚ＋Ｅ）−ビホルメンへの実施例としては以下である）：
【化２】
2020513755.tif 000005
室温でシクロヘキサン４ｍｌ中でマノオールアセテート０．４ｇの溶液に、ＢＦ3．ＡｃＯＨ複合体０．０２９ｇ（０．０５等量）を添加した。室温で１５分後に、その反応物を水性ＮａＨＣＯ3で急冷し、そして水で洗浄して中和した。ＧＣ−ＭＳ分析は、スクラレン、（Ｚ）−ビホルメン及び（Ｅ）−ビホルメンとして同定された炭化水素のみを示した。コパロールアセテートは検出されなかった。
【０２１５】
より多い触媒（０．１５等量）での他のトライアルは同一の結果を得た。
・  スクラレン：MS: M+ 272 (18); m/e: 257 (100), 149 (15), 105 (15).
・  （Ｚ）−ビホルメン及び（Ｅ）−ビホルメン（同一のスペクトル）：MS: M+ 272 (29); m/e: 257 (100), 187 (27), 161 (33), 105 (37)。
【０２１６】
実施例１０
前記実施例において得られたマノオールを、次の実験に従ってそのコパリルエステルに変換した（アセテートへの実施例としては以下である）：
【化３】
2020513755.tif 000006
室温でシクロヘキサン１００ｍｌ中でＢＦ3．ＡｃＯＨ０．４７４ｇ（０．８２６ｍｍｏｌ、０．２７等量）の溶液に、無水酢酸４．４ｇ及び酢酸１２．１ｇを添加した。室温で、シクロヘキサン１５ｍｌ中で純結晶マノオール１０．０ｇ（３３ｍｍｏｌ）を添加し（わずかに発熱性）、その温度を、水浴を使用して室温で維持した。室温で３０分撹拌した後に、ＧＣ対照は出発材料を示さなかった。反応混合物を水性飽和ＮａＨＣＯ3  ３００ｍｌで急冷し、通常の処理をした。粗混合物（９．９ｇ）を、フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ2、ペンタン／エーテル  ９５：５）及びバルブツーバルブ蒸留（Ｅｂ．＝１３０°、０．１ｍｂａｒ）により精製し、（Ｚ）−コパリルアセテートと（Ｅ）−コパリルアセテートの２７／７３混合物４．３４ｇ（３７．１％）を得た。
・  （Ｚ）−コパリルアセテート：
MS: M+ 332 (0); m/e: 317 (2), 272 (35)=, 257 (100), 137 (48),95 (68), 81 (70).
1H-NMR (CDCl3): 0.67, 0.80, 0.87 1.76及び2.04 (それぞれ5s, 3H), 4.86 (s, 1H), 5.35 (t: J = 6Hz, 1H).
・  （Ｅ）−コパリルアセテート：
MS: M+ 332 (0); m/e: 317 (2), 272 (33)=, 257 (100), 137 (54),95 (67), 81 (74).  
1H-NMR (CDCl3): 0.68, 0.80,0.87 1.70及び2.06 (それぞれ5s, 3H), 4.82 (s, 1H), 5.31 (t: J = 6Hz, 1H).
13C-NMR (CDCl3) : ((Z/E)混合物に対して記録されたスペクトル、著しいシグナルのみが得られる): 61.4 (t), 106.2 (t), 117.9 (d), 143.1 (s), 148.6 (s), 171.1 (s).。
【０２１７】
実施例１１
前記実施例において得られたコパリルアセテートを、次の実験に従ってコパロールに変換した：
【化４】
2020513755.tif 000007
コパリルアセテート（４．１７ｇ、１２．５ｍｍｏｌ）、ＫＯＨペレット（３．３５ｇ、５９．７ｍｍｏｌ）、水（１．５ｇ）及びＥｔＯＨ（９．５ｍｌ）を一緒に混合し、そして３時間５０℃で撹拌した。通常の後処理後に、粗（Ｚ＋Ｅ）−コパロール３．７ｇが得られ、そしてフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ2、ペンタン／エーテル  ７：２）により精製した。溶媒を蒸発した後に、バルブツーバルブ蒸留（Ｅｂ＝１７０°、０．１ｍｂａｒ）により（Ｚ）−コパロール及び（Ｅ）−コパロールの２７／７３混合物３．２５ｇ（９２％）を得た。
・  （Ｚ）−コパロール
MS: M+290 (3); m/e: 275 (18), 272 (27), 257 (82), 137 (71), 95 (93), 81 (100), 69 (70).
1H-NMR (CDCl3): 0.67, 0.80, 0.87及び1.74 (それぞれ4s, 3H); 4.06 (m, 2H), 4.55 (s, 1H), 4.86 (s, 1H), 5.42 (t: J = 6Hz, 1H).
・  （Ｅ）−コパロール
MS: M+290 (3); m/e: 275 (27), 272 (22), 257 (75), 137 (75), 95 (91), 81 (100), 69 (68).
1H-NMR (CDCl3): 0.68, 0.80, 0.87及び1.67 (それぞれ4s, 3H); 4.15 (m, 2H), 4.51 (s, 1H), 4.83 (s, 1H), 5.39 (t, J = 6Hz, 1H)
13C-NMR (CDCl3): ((Z/E)混合物に対して記録されたスペクトル、著しいシグナルのみが得られる):  59.4 (t), 106.2 (t), 123.0 (d), 140.6 (s), 148.6 (s).。
【０２１８】
実施例１２
ＣＰＰシンターゼとスクラレオールシンターゼの異なる組み合わせを使用したサッカロミセス・セレビジエにおけるｉｎ ｖｉｖｏでのマノオールの製造
Ｉ型ジテルペンシンターゼとＩＩ型ジテルペンシンターゼの異なる組み合わせを、Ｓ．セレビジエ細胞中でのマノオールの製造について評価した。
【０２１９】
ＩＩ型ジテルペンシンターゼについて、５つのＣＰＰシンターゼを選択した：
−  サルビア・ミルティオリザからのＳｍＣＰＳ、ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＢＶ５７８３５．１。
−  コレウス・フォルスコリからのＣｆＣＰＳ１、ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＨＷ０４０４６．１。
−  トリチクム・アエスチブムからのＴａＴｐｓ１、ＮＣＢＩアクセッション番号ＢＡＨ５６５５９．１。
−  マルビウム・ヴルガレからのＭｖＣｐｓ３、ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＩＥ７７０９２．１。
−  ロスマリヌス・オフィキナリスからのＲｏＣＰＳ１、ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＨＬ６７２６１．１。
【０２２０】
Ｉ型について、ニコチアナ・グルチノサから２つの推定スクラレオールシンターゼ及びサルビア・スクラレアから１つを選択した：
−  ＮｇＳＣＳ−ｄｅｌ３８（国際公開特許番号第２０１４／０２２４３４号の配列番号４０に対応）。
−  ＮｇＳＣＳ−ｄｅｌ２９（国際公開特許番号第２０１４／０２２４３４号の配列番号７８に対応）。
−  サルビア・スクラレアからのＳｓＳｃＳ、ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＥＴ２１２４６．１。
【０２２１】
異なるＣＰＰシンターゼをコードするＤＮＡのコドン使用頻度を、Ｓ．セレビジエにおける最適な発現のために改良した。さらに、ＤＮＡ配列を、予測されるペプチドシグナル（それぞれ、ＳｍＣＰＳ、ＣｆＣＰＳ１、ＴａＴｐｓ１、ＭｖＣｐｓ３及びＲｏＣＰＳ１について５８アミノ酸、６３アミノ酸、５９アミノ酸、６３アミノ酸及び６７アミノ酸）の消失を有する組換えＣＰＰシンターゼを発現するように設計した。ＮｇＳＣＳ−ｄｅｌ３８、ＮｇＳＣＳ−ｄｅｌ２９及びＳａＳＣＳのＤＮＡ配列は、Ｓ．セレビジエ発現に最適化されたコドンでもあった。
【０２２２】
Ｓ．セレビジエ中での異なる遺伝子の発現のために、プラスミドのセットを、Ｋｕｉｊｐｅｒｓら（Ｍｉｃｒｏｂ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ．， ２０１３， １２：４７）において以前に記載された酵母の内在性相同組換えを使用してｉｎ ｖｉｖｏで構築した。それぞれのプラスミドを、Ｓ．セレビジエの同時形質転換のために使用した６つのＤＮＡ断片から構成する。断片は以下である：
ａ）プライマー５’−ＡＧＧＴＧＣＡＧＴＴＣＧＣＧＴＧＣＡＡＴＴＡＴＡＡＣＧＴＣＧＴＧＧＣＡＡＣＴＧＴＴＡＴＣＡＧＴＣＧＴＡＣＣＧＣＧＣＣＡＴＴＣＧＡＣＴＡＣＧＴＣＧＴＡＡＧＧＣＣ−３’（配列番号４４）及び５’−ＴＣＧＴＧＧＴＣＡＡＧＧＣＧＴＧＣＡＡＴＴＣＴＣＡＡＣＡＣＧＡＧＡＧＴＧＡＴＴＣＴＴＣＧＧＣＧＴＴＧＴＴＧＣＴＧＡＣＣＡＴＣＧＡＣＧＧＴＣＧＡＧＧＡＧＡＡＣＴＴ−３’（配列番号４５）を使用して、鋳型としてプラスミドｐＥＳＣ−ＬＥＵ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）と一緒にＰＣＲにより構築させたＬＥＵ２酵母マーカー；
ｂ）プライマー５’−ＴＧＧＴＣＡＧＣＡＡＣＡＡＣＧＣＣＧＡＡＧＡＡＴＣＡＣＴＣＴＣＧＴＧＴＴＧＡＧＡＡＴＴＧＣＡＣＧＣＣＴＴＧＡＣＣＡＣＧＡＣＡＣＧＴＴＡＡＧＧＧＡＴＴＴＴＧＧＴＣＡＴＧＡＧ−３’（配列番号３７）及び５’−ＡＡＣＧＣＧＴＡＣＣＣＴＡＡＧＴＡＣＧＧＣＡＣＣＡＣＡＧＴＧＡＣＴＡＴＧＣＡＧＴＣＣＧＣＡＣＴＴＴＧＣＣＡＡＴＧＣＣＡＡＡＡＡＴＧＴＧＣＧＣＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡ−３’（配列番号３８）を使用して、鋳型としてプラスミドｐＥＳＣ−ＵＲＡと一緒にＰＣＲにより構築されたＡｍｐＲ  Ｅ．コリマーカー；
ｃ）プライマー５’−ＴＴＧＧＣＡＴＴＧＧＣＡＡＡＧＴＧＣＧＧＡＣＴＧＣＡＴＡＧＴＣＡＣＴＧＴＧＧＴＧＣＣＧＴＡＣＴＴＡＧＧＧＴＡＣＧＣＧＴＴＣＣＴＧＡＡＣＧＡＡＧＣＡＴＣＴＧＴＧＣＴＴＣＡ−３’（配列番号３９）及び５’−ＣＣＧＡＧＡＴＧＣＣＡＡＡＧＧＡＴＡＧＧＴＧＣＴＡＴＧＴＴＧＡＴＧＡＣＴＡＣＧＡＣＡＣＡＧＡＡＣＴＧＣＧＧＧＴＧＡＣＡＴＡＡＴＧＡＴＡＧＣＡＴＴＧＡＡＧＧＡＴＧＡＧＡＣＴ−３’（配列番号４０）を使用して鋳型としてｐＥＳＣ−ＵＲＡと一緒にＰＣＲにより得られた酵母複製起点；
ｄ）プライマー５’−ＡＴＧＴＣＡＣＣＣＧＣＡＧＴＴＣＴＧＴＧＴＣＧＴＡＧＴＣＡＴＣＡＡＣＡＴＡＧＣＡＣＣＴＡＴＣＣＴＴＴＧＧＣＡＴＣＴＣＧＧＴＧＡＧＣＡＡＡＡＧＧＣＣＡＧＣＡＡＡＡＧＧ−３’（配列番号４１）及び５’−ＣＴＣＡＧＡＴＧＴＡＣＧＧＴＧＡＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＧＡＣＧＧＡＡＧＣＴＡＴＣＣＴＧＡＣＡＧＴＧＴＡＧＣＡＡＧＴＧＣＴＧＡＧＣＧＴＣＡＧＡＣＣＣＣＧＴＡＧＡＡ−３’（配列番号４２）を使用して鋳型としてｐＥＳＣ−ＵＲＡと一緒にＰＣＲにより得られたＥ．コリ複製起点；
ｅ）断片「ｄ」の少なくとも６０ヌクレオチド、酵母遺伝子ＰＧＫ１の終止コドンの２００ヌクレオチド下流、Ｓ．セレビジエにおいてその発現をコドン最適化したＧＧＰＰシンターゼをコードする配列ＣｒｔＥ（パントエア・アグロメランスから、ＮＣＢＩアクセッション番号Ｍ３８４２４．１）、ＧＡＬ１０／ＧＡＬ１の双方向性酵母プロモーター、試験したスクラレオールシンターゼをコードする配列の１つ、酵母遺伝子ＣＹＣ１の終止コドンの２００ヌクレオチド下流、及び配列５’−ＡＴＴＣＣＴＡＧＴＧＡＣＧＧＣＣＴＴＧＧＧＡＡＣＴＣＧＡＴＡＣＡＣＧＡＴＧＴＴＣＡＧＴＡＧＡＣＣＧＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＧ−３’（配列番号４３）により構成される断片、この断片をＤＮＡ合成（ＤＮＡ ２．０， Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ， ＣＡ ９４０２５）により得た、並びに
ｆ）断片「ｅ」の少なくとも６０ヌクレオチド、酵母遺伝子ＣＹＣ１の終止コドンの２００ヌクレオチド下流、試験したＣＰＰシンターゼをコードする配列の１つ、ＧＡＬ１０／ＧＡＬ１の双方向性酵母プロモーター、及び断片「ａ」の開始に対応する６０ヌクレオチドにより構成された断片、この断片をＤＮＡ合成（ＤＮＡ ２．０， Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ， ＣＡ ９４０２５）により得た。
【０２２３】
前記Ｉ型及びＩＩ型ジテルペンシンターゼの全ての可能な組み合わせを包含する、合計１５個のプラスミドを構築した。以下の表は全てのプラスミドを示す。
【表３】
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【０２２４】
Ｓ．セレビジエ細胞において内在性ファルネシルジホスフェート（ＦＰＰ）プールのレベルを増加させるために、アセチル−ＣｏＡ  Ｃ−アセチルトランスフェラーゼをコードするＥＲＧ１０からＦＰＰシンテターゼをコードするＥＲＧ２０までのメバロン酸経路に含まれる全ての酵母内在性遺伝子の余分なコピーを、Ｐａｄｄｏｎら（Ｎａｔｕｒｅ、２０１３、４９６：５２８−５３２）における記載と同様に、ガラクトース誘発性プロモーターの制御下でＳ．セレビジエ株ＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｃ（Ｅｕｒｏｓｃａｒｆ、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のゲノム中に組み込んだ。簡単に説明すると、３つのカセットを、それぞれＬＥＵ２、ＴＲＰ１及びＵＲＡ３の位置で組み込んだ。遺伝子ＥＲＧ２０及び双方向性プロモーターＧＡＬ１０／ＧＡＬ１の制御下でＤｏｎａｌｄら（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、１９９７、１０９：Ｅ１１１−８）において記載されたように切断したＨＭＧ１（ｔＨＭＧ１）及びプロモーターＧＡＬ１０／ＧＡＬ１の制御下で遺伝子ＥＲＧ１９及びＥＲＧ１３もを含む第１のカセット、該カセットは、ＬＥＵ２の上流部位及び下流部位に対応する２つの１００ヌクレオチド領域と隣接している。遺伝子ＩＤＩ１及びｔＨＭＧ１がプロモーターＧＡＬ１０／ＧＡＬ１の制御下にあり、遺伝子ＥＲＧ１３がＧＡＬ７のプロモーター領域の制御下にある第２のカセット、該カセットは、ＴＲＰ１の上流部位及び下流部位に対応する２つの１００ヌクレオチド領域と隣接している。全てＧＡＬ１０／ＧＡＬ１プロモーターの制御下にある遺伝子ＥＲＧ１０、ＥＲＧ１２、ｔＨＭＧ１及びＥＲＧ８を有する第３のカセット、該カセットは、ＵＲＡ３の上流部位及び下流部位に対応する２つの１００ヌクレオチド領域と隣接している。３つのカセットにおける全ての遺伝子は、それら自体のターミネーター領域の２００ヌクレオチドを含んだ。また、Ｇｒｉｇｇｓ及びＪｏｈｎｓｔｏｎ（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ， １９９１， ８８：８５９７−８６０１）において記載されたようにそれ自体のプロモーターの変異型の制御下でＧＡＬ４の余分なコピーを、ＥＲＧ９プロモーター領域の上流で組み込んだ。さらに、ＥＲＧ９の内在性プロモーターを、株ＹＳＴ０３５を生じるＣＴＲ３の酵母プロモーター領域に置き換えた。最終的に、ＹＳＴ０３５を、株ＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｄ（Ｅｕｒｏｓｃａｒｆ、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で変異させて、ＹＳＴ０４５と名付けた二倍体株を得た。
【０２２５】
ＹＳＴ０４５を、ｉｎ ｖｉｖｏでプラスミドアセンブリのために要求された前記断片で形質転換させた。酵母形質転換を、Ｇｉｅｔｚ及びＷｏｏｄｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， ２００２， ３５０：８７−９６）において記載された酢酸リチウムプロトコルにより実施した。形質転換混合物を、アミノ酸不含酵母ニトロゲンベース（ＢＤ Ｄｉｆｃｏ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳＡ）６．７ｇ／Ｌ、ロイシン不含Ｄｒｏｐｏｕｔ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、ＵＳＡ）１．６ｇ／Ｌ、グルコース２０ｇ／Ｌ及び寒天２０ｇ／Ｌを含むＳｍＬｅｕ培地に蒔いた。そのプレートを、３０℃で３〜４日間インキュベートした。単一細胞を使用して、Ｗｅｓｔｆａｌｌら（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ， ２０１２， １０９：Ｅ１１１−１１８）において記載された培養物中でマノオールを製造した。
【０２２６】
これらの培養条件下で、マノオールを、Ｉ型ジテルペンシンターゼ及びＩＩ型ジテルペンシンターゼのいくつかの組合せで製造した。マノオールの製造をＧＣ−ＭＳ分析を使用して評価し、そして内部標準を使用して定量した。以下の表は、ＳｍＣＰＳ／ＳｓＳｃＳの組合せと比較した製造されたマノオールの量を示す（これらの実験条件下で、ＳｍＣＰＳ及びＳｓＳｃＳを発現する細胞により製造されたマノオールの濃度は１００〜２５０ｍｇ／Ｌであり、製造されたマノオールの最も高い量であった）。
【０２２７】
【表４】
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【０２２８】
【数１】
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【数２】
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【数３】
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【数４】
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【数５】
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【数６】
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【数７】
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【数８】
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【数９】
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【数１０】
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【数１１】
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【数１２】
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【数１３】
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【数１４】
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【数１５】
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【数１６】
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【数１７】
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【数１８】
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【数１９】
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【数２０】
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【数２１】
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【数２２】
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【数２３】
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【数２４】
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【数２５】
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【数２６】
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【数２７】
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【数２８】
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【数２９】
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【数３０】
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【数３１】
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【数３２】
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【数３３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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