(57)【要約】本発明は、周縁キメラ植物を生産する際に使用するための、第１及び第２の目的とされる形質をＬ１シュート分裂組織層に含む近親交配植物を生産するための方法、そのようにして得られた近親交配植物、該周縁キメラ植物を生産するための該近親交配植物の使用、該近親交配植物を使用して周縁キメラ植物を生産するための方法、そのようにして得られた周縁キメラ植物、植物産物の生産における該周縁キメラ植物の使用、並びにそのようにして得られた植物産物を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも第１及び第２の目的とされるＬ１局在化形質の組合せを含む周縁キメラ植物を生産するための方法であって、
ａ）目的とされるＬ１局在化形質の前記組合せを含む、第１の植物を提供するステップと、
ｂ）形質の前記組合せを含まない、第２の植物を提供するステップと、
ｃ）前記第１の植物のＬ１シュート分裂組織層、並びに前記第２の植物のＬ２及びＬ３シュート分裂組織層を含む周縁キメラ植物を作製するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記第１の形質が、前記第２の形質を含まない野生種に由来するＬ１局在化形質であり、前記第２の形質が、前記第１の形質を含まない栽培種に由来するＬ１局在化形質である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１の形質が、生物的又は非生物的ストレス抵抗性形質であり、前記第２の形質が、果実色形質及び／又は前記第２の植物によって生産された花粉を受ける能力である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の植物が、前記第１の形質を含む第１の親植物と前記第２の形質を含む第２の親植物とのＦ１ハイブリッド又は近親交配植物である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記第１の植物が、遺伝子修飾により前記組合せ内の前記Ｌ１局在化形質のうちの少なくとも１つを導入することによって得られる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記生物的又は非生物的ストレス抵抗性が、乾燥抵抗性、昆虫抵抗性、真菌抵抗性、卵菌抵抗性、アシル糖生産のレベル及び／若しくは組成、又はこれらの任意の組合せからなる群のうちのいずれか１つに由来する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
１つ又は複数のさらなるＬ１局在化形質が、果実色、前記植物自体によって生産された花粉を受ける能力、及びこれらの組合せからなる群のうちのいずれか１つから選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記第１の植物が、商業に関連しない植物であり、前記第２の植物が、商業に関連する品種又は栽培種のものである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記第１の親植物が、商業に関連しない品種又は野生種のものであり、前記第２の親植物が、商業に関連する品種又は栽培種である、請求項２〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１及び第２の植物が、ソラナム属に属する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
周縁キメラ植物を生産する際にＬ１シュート分裂組織層を提供するための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の少なくとも第１及び第２の目的とされるＬ１局在化形質の組合せを含む第１の植物の使用。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる周縁キメラ植物、又はそれに栄養繁殖的に由来する植物。
【請求項１３】
植物産物を生産するための、請求項１２に記載の周縁キメラ植物の使用。
【請求項１４】
請求項１２に記載の周縁キメラ植物から植物産物を生産するための方法であって、
Ａ）請求項１２に記載の周縁キメラ植物を提供するステップと、
Ｂ）ステップＡ）の前記周縁キメラ植物を成長させるステップと、
Ｃ）ステップＢ）において成長させた前記植物から植物産物を誘導するステップと、
Ｄ）任意選択で、ステップＣ）において得られた前記植物産物をさらに処理するステップと
を含む方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法によって得ることができる植物産物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、農業の分野に関する。特に、本発明は、組織技術を使用した複合形質を有する植物の生産に関する。
【背景技術】
【０００２】
作物の形質を強化するための標準的な解決策は、遺伝学法及び交配である。しかしながら、交雑（生殖交雑）によって、商業に関連する品種（ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｌｙ  ｒｅｌｅｖａｎｔ  ｖａｒｉｅｔｙ）に、新しい形質を導入し、同時に（複数ゲノム及び／又は複合的な）商業に関連する形質、たとえば、果実サイズ及び作物の収量を維持するには、扱いにくく長期にわたるプロセス又は交雑及び選択（浸透性交雑）が必要である。比較的短い期間で新しい形質を獲得する遺伝子修飾ツールが利用可能となっているが、これらの技法は、（作物）植物の形質を修飾するために広く許容されるものではない。したがって、植物、特に、作物植物に形質を導入するための、革新的であるが商用に許容される手法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００３】
〔発明により提供される解決〕
遺伝子修飾技法を利用することなく、当該技術分野の水準である交雑及び選択と比較して、有意に短縮された期間で、新しい形質を有する商業に関連する作物植物を生産したのは、本発明者らが初めてであった。本発明者らは、組織技術を、古典的な交配技法と組み合わせて利用することによって、この目標を達成した。組織技術を利用することによって、本発明は、必要とされる戻し交雑及び／又は自家受粉の量、並びに系統に引きずられる問題を著しく低減する。実際に、本発明は、他の方法では存在しないであろう表現型の生産を可能にする。
【０００４】
双子葉植物では、細胞の３つの別個の層（Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３シュート分裂組織層）が、通常、シュート分裂組織に存在している。これらの別個のシュート分裂組織層は、制限され方向付けられた指向的細胞分裂により生じる。シュート分裂組織層は、組織化されたパターンで、すべての地上器官に生じ、最も外側の層が、Ｌ１であり、そのすぐ下の細胞が、Ｌ２を構成し、内部組織が、Ｌ３を定めている。シュート頂分裂組織の３つの細胞層におけるそれぞれの幹細胞に由来する細胞及び組織は、シュート頂分裂組織の３つの細胞層におけるこれらの幹細胞それぞれの遺伝子型を有する。空間的に離間しているが、これらの層は一体となっており、互いにコミュニケートする（たとえば、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．２００８  Ｆｅｂ；１１（１）；４２−４８）。組織技術法では、ある品種の１つ又は２つのシュート分裂組織層を、別のものと置き換え、いわゆる周縁キメラがもたらされており、この方法は、これらの分裂組織層における差次的遺伝子発現及び形質局在化を研究するために、従来から使用されてきた（たとえば、Ｆｉｌｉｐｐｉｓら、Ｕｓｉｎｇ  ａ  ｐｅｒｉｃｌｉｎａｌ  ｃｈｉｍｅｒａ  ｔｏ  ｕｎｒａｖｅｌ  ｌａｙｅｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ，Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ，２０１３，７５：１０３９−１０４９）。さらに、新しい栽培種を提供することにおける、この技術の有用性を調査するために、たとえば、イヌホオズキ（ｎｉｇｈｔｓｈａｄｅ）及びトマトを使用してキメラを作製することによって、予備的調査が行われたが、結果は残念なものとなった（Ｌｉｎｄｓａｙら、Ｇｒａｆｔ  ｃｈｉｍｅｒａｓ  ａｎｄ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｈｙｂｒｉｄｓ  ｆｏｒ  ｎｅｗ  ｃｕｌｔｉｖａｒｓ，Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｏｔａｎｙ，１９９５，Ｖｏｌ．３３：７９−９２）。
【０００５】
本発明者らが、今回初めて、これらの組織技術法を利用して、比較的短い期間で新しい形質を含む商業に関連する作物植物の生産を成功させた。本発明者らは、Ｌ１シュート分裂組織層に局在化する、ある特定の形質を特定した。組織技術法を利用することによって、そのような目的とされるＬ１局在化形質を含むように最適化されており、好ましくは本明細書に定義される特定の遺伝子型を有する、第１の植物のＬ１シュート分裂組織層を、該形質が欠如している商業に関連する第２の植物のさらなるシュート分裂組織層と組み合わせて、目的とされる新しい形質を有する商業に関連する周縁キメラ植物を生産することができる。第１の植物は、全体として、商業に関連するように最適化されている必要はないため、目的とされる新しい形質を含む商業に関連する植物を得るために必要とされるステップの数が、有意に低減される。加えて、本発明は、浸透性交雑を行うには複雑すぎる形質を導入するための解決策を提供する。
【０００６】
〔発明の概要〕
付記１．
少なくとも第１及び第２の目的とされるＬ１局在化形質の組合せを含む周縁キメラ植物を生産するための方法であって、
ａ）目的とされるＬ１局在化形質の該組合せを含む、第１の植物を提供するステップと、
ｂ）形質の該組合せを含まない、第２の植物を提供するステップと、
ｃ）第１の植物のＬ１シュート分裂組織層、並びに第２の植物のＬ２及びＬ３シュート分裂組織層を含む周縁キメラ植物を作製するステップと
を含む方法。
【０００７】
付記２．
該第１の形質が、該第２の形質を含まない野生種に由来するＬ１局在化形質であり、該第２の形質が、該第１の形質を含まない栽培種に由来するＬ１局在化形質である、付記１に記載の方法。
【０００８】
付記３．
該第１の形質が、生物的又は非生物的ストレス抵抗性形質であり、該第２の形質が、果実色形質及び／又は第２の植物によって生産された花粉を受ける能力である、付記１又は２に記載の方法。
【０００９】
付記４．
該第１の植物が、該第１の形質を含む第１の親植物と該第２の形質を含む第２の親植物とのＦ１ハイブリッド又は近親交配植物である、付記１〜３のいずれか１つに記載の方法。
【００１０】
付記５．
第１の植物が、遺伝子修飾により組合せ内の少なくとも第１及び第２のＬ１局在化形質のうちの少なくとも１つを導入することによって得られる、付記１〜４のいずれか１つに記載の方法。
【００１１】
付記６．
生物的又は非生物的ストレス抵抗性が、乾燥抵抗性、昆虫（コナジラミ）抵抗性、真菌（ウドンコ病）抵抗性、卵菌（フィトフトラ（ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ））抵抗性、アシル糖生産のレベル及び／若しくは組成、又はこれらの任意の組合せからなる群のうちのいずれか１つに由来する、付記１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【００１２】
付記７．
１つ又は複数のさらなるＬ１局在化形質が、果実色、植物自体によって生産された花粉を受ける能力、及びこれらの組合せからなる群のうちのいずれか１つから選択される、付記１〜６のいずれか１つに記載の方法。
【００１３】
付記８．
第１の植物が、商業に関連しない植物であり、第２の植物が、商業に関連する品種又は栽培種のものである、付記１〜７のいずれか１つに記載の方法。
【００１４】
付記９．
第１の親植物が、商業に関連しない品種又は野生種のものであり、第２の親植物が、商業に関連する品種又は栽培種である、付記２〜８のいずれか１つに記載の方法。
【００１５】
付記１０．
第１及び第２の植物が、ソラナム（Ｓｏｌａｎｕｍ）属に属する、付記１〜９のいずれか１つに記載の方法。
【００１６】
付記１１．
周縁キメラ植物を生産する際にＬ１シュート分裂組織層を提供するための、付記１〜１０のいずれか１つに記載の少なくとも第１及び第２の目的とされるＬ１局在化形質の組合せを含む第１の植物の使用。
【００１７】
付記１２．
付記１〜１０のいずれか１つに記載の方法によって得ることができる周縁キメラ植物、又はそれに栄養繁殖的に由来する（ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅｌｙ  ｄｅｒｉｖｅｄ）植物。
【００１８】
付記１３．
植物産物を生産するための、付記１２に記載の周縁キメラ植物の使用。
【００１９】
付記１４．
付記１２に記載の周縁キメラ植物から植物産物を生産するための方法であって、
Ａ）付記１２に記載の周縁キメラ植物を提供するステップと、
Ｂ）ステップＡ）の周縁キメラ植物を成長させるステップと、
Ｃ）ステップＢ）において成長させた植物から植物産物を誘導するステップと、
Ｄ）任意選択で、ステップＣ）において得られた植物産物をさらに処理するステップと
を含む方法。
【００２０】
付記１５．
付記１４に記載の方法によって得ることができる植物産物。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】３つの植物遺伝子型における成体タバココナジラミ（Ｂｅｍｉｓｉａ  Ｔａｂａｃｉ）の平均数を示す。Ａ：ソラナム・ペンネリイ（Ｓ．ｐｅｎｎｅｌｌｉｉ）×ソラナム・リコペルシクム（Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）のＬ１シュート分裂組織層が移入されたソラナム・リコペルシクム（試験植物、ソラナム・リコペルシクムのＬ２及びＬ３並びにソラナム・ペンネリイ×ソラナム・リコペルシクムの交雑により得られたＦ１のＬ１を有する周縁キメラ）、Ｂ：ソラナム・リコペルシクム（感受性対照）、Ｃ：ソラナム・ペンネリイ×ソラナム・リコペルシクム（Ｆ１、抵抗性対照）。
【図２】３つの植物遺伝子型におけるタバココナジラミの卵の平均数を示す。Ａ：ソラナム・ペンネリイ×ソラナム・リコペルシクムのＬ１シュート分裂組織層が移入されたソラナム・リコペルシクム（試験植物、ソラナム・リコペルシクムのＬ２及びＬ３並びにソラナム・ペンネリイ×ソラナム・リコペルシクムの交雑により得られたＦ１のＬ１を有する周縁キメラ）、Ｂ：ソラナム・リコペルシクム（感受性対照）、Ｃ：ソラナム・ペンネリイ×ソラナム・リコペルシクム（Ｆ１、抵抗性対照）。
【図３】３つの植物遺伝子型におけるタバココナジラミの幼虫の平均数を示す。Ａ：ソラナム・ペンネリイ×ソラナム・リコペルシクムのＬ１シュート分裂組織層が移入されたソラナム・リコペルシクム（試験植物、ソラナム・リコペルシクムのＬ２及びＬ３並びにソラナム・ペンネリイ×ソラナム・リコペルシクムの交雑により得られたＦ１のＬ１を有する周縁キメラ）、Ｂ：ソラナム・リコペルシクム（感受性対照）、Ｃ：ソラナム・ペンネリイ×ソラナム・リコペルシクム（Ｆ１、抵抗性対照）。
【図４】３つの植物遺伝子型におけるタバココナジラミの脱皮の平均数を示す。Ａ：ソラナム・ペンネリイ×ソラナム・リコペルシクムのＬ１シュート分裂組織層が移入されたソラナム・リコペルシクム（試験植物、ソラナム・リコペルシクムのＬ２及びＬ３並びにソラナム・ペンネリイ×ソラナム・リコペルシクムの交雑により得られたＦ１のＬ１を有する周縁キメラ）、Ｂ：ソラナム・リコペルシクム（感受性対照）、Ｃ：ソラナム・ペンネリイ×ソラナム・リコペルシクム（Ｆ１、抵抗性対照）。
【図５】種子の密度分布を示す。密度クラス「３」において、線は、上から下に：Ｆ１＿キメラ（キメラとＰＰ株との他家受精の後代）及びＦ１＿ＴＴ（非キメラ植物ＴＴとＰＰ株との他家受精の後代）を表す。
【図６】種子の発芽率を示す。左のカラムは、Ｆ１＿ＴＴ（非キメラ植物ＴＴとＰＰ株との他家受精の後代）を表し、右のカラムは、Ｆ１＿キメラ（キメラとＰＰ株との他家受精の後代）を表す。
【図７】インビトロ発芽能力を示す。上の線は、Ｆ１＿キメラ（キメラとＰＰ株との他家受精の後代）を表し、下の線は、Ｆ１＿ＴＴ（非キメラ植物ＴＴとＰＰ株との他家受精の後代）を表す。
【図８】ＴＨハイブリッド種子の比重を示す。黒色の線は、Ｆ１＿キメラ（キメラ、キメラとＨＨ株との他家受精の後代）を表し、灰色の線は、Ｆ１＿ＴＴ（対照、ＴＴとＨＨ株との他家受精の後代）を表す。
【図９】ＴＨハイブリッド種子の発芽率を示す。黒色のカラムは、Ｆ１＿キメラ（キメラ、キメラとＨＨ株との他家受精の後代）を表し、灰色のカラムは、Ｆ１＿ＴＴ（対照、ＴＴとＨＨ株との他家受精の後代）を表す。
【図１０】ＴＨハイブリッド種子のインビトロ発芽能力を示す。黒色の線は、Ｆ１＿キメラ（キメラ、キメラとＨＨ株との他家受精の後代）を表し、灰色の線は、Ｆ１＿ＴＴ（対照、ＴＴとＨＨ株との他家受精の後代）を表す。
【図１１】異なる発芽能力を有する植物株の発芽した種子の割合の経時的な展開を示す。発芽能力は、所与の期間における植えた種子の総数に対する割合として表される、発芽した種子の数である。取得期間は、発芽した種子の数がやがて横ばいになり、プラトー期に達するのを確実にするように十分に長いものである。この期間は、たとえば、ピーク値時間の３倍である。このプラトー期は、すべての種子が発芽している場合には１００％であり得るか、又は一部の種子がまったく発芽していない場合には、それよりも低い割合であり得る。この図において、線Ｂは、８０％の発芽能力を有する対照株である。線Ａは、改善された発芽能力（１００％）を有する株の例であり、線Ｃは、発芽能力が劣る例である。
【図１２】ピーク値時間の概念を示す図である。ピーク値時間は、発芽曲線の接線が最も急勾配となる時点である、すなわち、単位時間当たりの発芽する種子の増加が最も高い時点である。発芽の動力学に関連する時点であるピーク値時間は、発芽能力を評価するのに必要な期間、たとえば、種子植え付けからピーク値時間までの時間の２倍、３倍、４倍、又は５倍、好ましくは、３倍に等しい期間を定めるために使用することができる。
【図１３】４つの植物遺伝子型に対する成体トリアレウロデス・バポラリオルム（Ｔｒｉａｌｅｕｒｏｄｅｓ  ｖａｐｏｒａｒｉｏｒｕｍ）の数（平均±標準偏差）を示す。Ａ：ソラナム・リコペルシクム（感受性対照）、Ｂ：ソラナム・リコペルシクムに由来するＬ２及びＬ３並びにソラナム・ペンネリイ×ソラナム・リコペルシクムのＦ１に由来するＬ１を有する周縁キメラ（試験植物）、Ｃ：ソラナム・リコペルシクムに由来するＬ２及びＬ３並びにソラナム・ハブロカイテス（Ｓ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）×ソラナム・リコペルシクムのＦ１に由来するＬ１を有する周縁キメラ（試験植物）、Ｄ：ソラナム・リコペルシクムに由来するＬ２及びＬ３並びにソラナム・ピンピネリフォリウム（Ｓ．ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍ）×ソラナム・リコペルシクムのＦ１に由来するＬ１が移入された周縁キメラ（試験植物）。
【図１４】３つの植物遺伝子型における５日後のタバココナジラミの死亡率を示す。Ａ：ソラナム・リコペルシクム（感受性対照）、Ｂ：ソラナム・リコペルシクムとソラナム・ペンネリイ×ソラナム・リコペルシクムとの交雑により得られたＢＣ１Ｓ３が移入されたもの（試験植物）、Ｃ：ソラナム・リコペルシクムとソラナム・ペンネリイ×ソラナム・リコペルシクムとの交雑により得られたＢＣ１Ｓ４が移入されたもの（試験植物）。
【図１５】３つの植物遺伝子型における５日後のタバココナジラミの卵の数（平均±標準偏差）を示す。Ａ：ソラナム・リコペルシクム（感受性対照）、Ｂ：ソラナム・リコペルシクム×ソラナム・ペンネリイのＢＣ１Ｓ３（ドナー植物）、Ｃ：ソラナム・リコペルシクム×ソラナム・ペンネリイのＢＣ１Ｓ４（ドナー植物）。
【図１６】３つの植物遺伝子型における２日後のアザミウマの死亡率を示す。Ａ：ソラナム・リコペルシクム（感受性対照）、Ｂ：ソラナム・リコペルシクム×ソラナム・ペンネリイのＦ１（ドナー植物）、Ｃ：ソラナム・リコペルシクムに由来するＬ２及びＬ３並びにソラナム・ペンネリイ×ソラナム・リコペルシクムのＦ１に由来するＬ１を有する周縁キメラ（試験植物）。
【図１７】３つの植物遺伝子型における産み付けられた卵の数（平均±標準偏差）を示す。Ａ：ソラナム・リコペルシクム（感受性対照）、Ｂ：ソラナム・リコペルシクムに由来するＬ２及びＬ３並びにソラナム・ペンネリイ×ソラナム・リコペルシクムのＦ１に由来するＬ１を有する周縁キメラ（試験植物）、Ｃ：ソラナム・リコペルシクムに由来するＬ２及びＬ３並びにソラナム・ハブロカイテス×ソラナム・リコペルシクムのＦ１に由来するＬ１を有する周縁キメラ（試験植物）。
【図１８】２つの植物遺伝子型におけるｍｍ単位での病変部直径（平均±標準偏差）を示す。Ａ：ソラナム・リコペルシクム（感受性対照）、Ｂ：ソラナム・リコペルシクムに由来するＬ２及びＬ３並びにソラナム・ハブロカイテス×ソラナム・リコペルシクムのＦ１に由来するＬ１を有する周縁キメラ（試験植物）。
【図１９】ビーフトマト植物（対照）又はビーフトマトのＬ２及びＬ３並びにアイルサ・クレイグ×チェリータイプソラナム・リコペルシクム近親交配株の交雑により得られたＦ１のＬ１を含むキメラ（キメラ、黒色の線）を自家受粉させることによって生産したＢＢ種子のインビトロ発芽能力を示す。
【図２０】ＭＨ２種子のインビトロ発芽能力を示す。黒色の線は、Ｆ１＿キメラ（キメラ、キメラとＨ２Ｈ２株との他家受精の後代）を表し、灰色の線は、Ｆ１＿ＭＭ（対照、ＭＭとＨ２Ｈ２株との他家受精の後代）を表す。
【図２１】ＭＨ２種子のインビトロ発芽能力を示す。黒色の線は、Ｆ１＿キメラ（キメラ、キメラとＨ２Ｈ２株との他家受精の後代）を表し、灰色の線は、Ｆ１＿ＭＭ（対照、ＭＭとＨ２Ｈ２株との他家受精の後代）を表す。
【図２２】ＭＰ２種子のインビトロ発芽能力を示す。黒色の線は、Ｆ１＿キメラ（キメラ、キメラとＰ２Ｐ２株との他家受精の後代）を表し、灰色の線は、Ｆ１＿ＭＭ（対照、ＭＭとＰ２Ｐ２株との他家受精の後代）を表す。
【図２３】ＭＰ２種子のインビトロ発芽能力を示す。黒色の線は、Ｆ１＿キメラ（キメラ、キメラとＰ２Ｐ２株との他家受精の後代）を表し、灰色の線は、Ｆ１＿ＭＭ（対照、ＭＭとＰ２Ｐ２株との他家受精の後代）を表す。
【図２４】ＭＰ３種子のインビトロ発芽能力を示す。黒色の線は、Ｆ１＿キメラ（キメラ、キメラとＰ３Ｐ３株との他家受精の後代）を表し、灰色の線は、Ｆ１＿ＭＭ（対照、ＭＭとＰ３Ｐ３株との他家受精の後代）を表す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
定義
以下の説明及び実施例において、いくつかの用語が使用される。そのような用語に与えられる範囲を含め、本明細書及び特許請求の範囲の明確で一貫した理解を提供するために、以下の定義が提供される。本明細書において別途定義されない限り、使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって広く理解されているものと同じ意味を有する。
【００２３】
本明細書において使用されるとき、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」及び「含む（ｔｏ  ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語、並びにそれらの活用形は、これらの用語が、この単語に続く品目が含まれるが、具体的に述べられていない品目が除外されるわけではないことを意味して、非限定的に使用される状況を指す。これは、「からなる」というより制限的な動詞をもまた包含する。加えて、「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」という不定冠詞による要素への参照は、文脈によりその要素が１つ及び１つだけ存在することが明確に求められていない限り、その要素が１つを上回って存在する可能性を排除するものではない。「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」という不定冠詞は、したがって、通常、「少なくとも１つ」を意味する。
【００２４】
本明細書において使用されるとき、「及び／又は」という用語は、言及された事例のうちの１つ又はそれ以上が、単独で生じ得る、又は言及された事例のうちの少なくとも１つとの組合せで生じ得、最大で言及された事例のすべてとの組合せで生じ得る、状況を指す。
【００２５】
「近親交配」とは、本明細書において、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０世代、好ましくは、少なくとも３世代の制御された自家受精、同胞交配、又は反復親への戻し交雑のための、制御された自家受精、同胞交配、又は反復親への戻し交雑として、理解されるものとする。Ｆ１ハイブリッド植物の自家受精、同胞交配、又は戻し交雑の近親交配により得られる植物は、本明細書において近親交配植物として表記される。
【００２６】
本明細書において使用されるとき、「形質」という用語は、表現型形質、すなわち、観察可能及び測定可能である特性を指す。形質は、遺伝子の発現、並びに環境的要因、並びに遺伝子発現及び環境的要因の間の相互作用によって決定される。植物の形質の例としては、果実のサイズ、果実の数、１ｈａ当たりのｋｇ単位での収量、植物の高さ、相対成長速度、開花期、改善された種子発芽、葉面積、疾患及び／又は害虫抵抗性、乾燥抵抗性、収量構成要素、並びに果実色がある（が、これらに限定されない）。形質は、商業に関連する形質であることが好ましい。本明細書において定義されるさらなる形質は、表現型に基づいて互いを区別することができる、異なる形質として理解されるものとする。任意選択で、形質は、該形質を担う（１つ又は複数の）遺伝子及び／又は多型性が当業者に公知であるとすると、遺伝子型に基づいて評価することができる。本明細書において定義される該１つ又は複数のさらなる形質は、複数の遺伝子が、該形質に関与及び寄与しているという意味で、複合形質であり得る。「さらなる形質」は、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０の形質などであると理解されるものとする。形質を増加（改善）又は減少（劣化）させることが所望され得、集団における特徴の平均値のそれぞれのシフトは、その植物世代の経済的価値を、（１つ又は複数の）親世代と比較して改善することができる。ある植物が、ある形質を含む、示す、保有する、又は有すると言われない対照植物（好ましくは、同じか又は類似の植物）と比較して、有意に多いか又は増加した該形質を示す（たとえば、少なくとも１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、又はそれ以上）場合、その植物は、本明細書において、「その形質を含む、示す、保有する、又は有する」と言われる。ある植物の形質の、対照植物と比較した増加は、目的とされる植物及び対照植物の両方で本質的に同一又は類似である制御された環境的状況下において、判定される。当業者であれば、制御された環境的状況又は形質を測定する条件を選択することができる。
【００２７】
「類似の環境条件」とは、とりわけ、類似の温度、湿度、栄養、及び光の条件、並びに類似の灌水、昼／夜リズム、及び受精レジメンの使用を意味する。これらの条件は、たとえば、周縁キメラのＬ３シュート分裂組織層の幹細胞の遺伝子型を有する非キメラ植物、又は周縁キメラのＬ１シュート分裂組織層の幹細胞の遺伝子型を有する非キメラ植物を含むがこれらに限定されない、本発明の方法において使用することができる植物が、成長する条件である。類似の環境条件には、同一の環境条件が含まれる。
【００２８】
ある形質が、植物又は植物品種の経済価値に適している場合、そのような形質は、「商業に関連する形質」であり得、これは、市場及び植物又は作物植物の種類によって決定される。当業者であれば、特定の状況下において、商業に関連する形質が何であるかを認識している。たとえば、植物が作物植物である場合、市場は、該作物植物からの特定の収量（１ｈａ当たりのｋｇ単位で）を必要とし、十分な収量は、商業に関連する形質と考えることができる。当業者であれば、所与の状況下において特定の作物植物にとっての「十分な収量」と考えられるであろうものが何かを認識している。さらに、植物が、果実がなる植物であり、市場で特定の色を有する果実が求められている場合、この形質は、商業に関連する形質と考えることができる。果実がなる植物のさらなる商業に関連する形質は、植物に（手作業で）異花受粉させる必要なしに、植物が果実をつけるために、その植物自体によって生産された花粉を受ける能力であり得る。
【００２９】
「害虫抵抗性」又は「増加／強化された害虫抵抗性」は、本明細書において、１つ若しくは複数の植物害虫の攻撃に耐える強化された（抵抗性を有さない対照植物と比較して）植物の能力を指すか、又は換言すると、この用語は、対照植物と比較して、植物における疾患症状の有意な低減を指すために使用される。害虫抵抗性又は強化された害虫抵抗性は、様々な方法を使用して判定することができる。疾患症状は、害虫（たとえば、節足動物害虫、昆虫害虫、真菌害虫、細菌害虫、卵菌、若しくはウイルス害虫）の蔓延又は害虫との接触後の１つ又は複数の時点において、疾患症状を評価することによって、目視的にスコア付けされることが多い（バイオアッセイ又は野外において）。代替的な方法には、害虫を検出し、任意選択で定量する方法が含まれる。したがって、植物が、組織中／上において検出される害虫の量若しくは数が、対照と比較して有意に少ない場合、又は害虫の拡がりが、対照よりも有意に遅い場合、その植物は、強化された害虫抵抗性を示し得る。最終的に、同等の昆虫害虫圧（野外におけるものが好ましい）下において成長させた場合に、対照と比較して、害虫抵抗性の有意な増加（たとえば、少なくとも１％、２％、５％、１０％、又はそれ以上）は、強化された害虫抵抗性の間接的な測定を提供する。
【００３０】
「生物的ストレス抵抗性」又は「害虫抵抗性」は、害虫節足動物、害虫真菌、害虫細菌、害虫卵菌、又は害虫ウイルスに対する抵抗性であり得る。害虫節足動物は、ダニ類（Ａｃａｒｉ）（ハダニ、たとえば、テトラニクス・ウルチカエ（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ  ｕｒｔｉｃａｅ）及びテトラニクス・エバンシ（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ  ｅｖａｎｓｉ））、チョウ目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）（組織をかじるイモムシ（ｔｉｓｓｕｅ−ｃｈｅｗｉｎｇ  ｃａｔｅｒｐｉｌｌａｒ）、たとえば、トマトキバガ（Ｔｕｔａ  ａｂｓｏｌｕｔａ））、甲虫目（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）（組織をかじる甲虫（ｔｉｓｓｕｅ−ｃｈｅｗｉｎｇ  ｂｅｅｔｌｅ）、たとえば、コロラドハムシ（Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ  ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ））、カメムシ木（Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ）（樹液を吸うアブラムシ、たとえば、マクロシファム・ユーフォリビアエ（Ｍａｃｒｏｓｉｐｈｕｍ  ｅｕｐｈｏｒｂｉａｅ）、又はコナジラミ、たとえば、タバココナジラミなど）、アザミウマ目（Ｔｈｙｓａｎｏｐｔｅｒａ）（細胞内容物を食べるアザミウマ（ｃｅｌｌ  ｃｏｎｔｅｎｔ−ｆｅｅｄｉｎｇ  ｔｈｒｉｐ）、たとえば、ミカンキイロアザミウマ（Ｆｒａｎｋｌｉｎｉｅｌｌａ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ））、並びにハエ目（Ｄｉｐｔｅｒａ）（ハモグリバエ（ｌｅａｆ−ｍｉｎｉｎｇ  ｆｌｙ）、たとえば、リリオミザ・ブリオニアエ（Ｌｉｒｉｏｍｙｚａ  ｂｒｙｏｎｉａｅ））であり得るが、これらに限定されず、害虫真菌は、オイジウム・ネオリコペルシシ（Ｏｉｄｉｕｍ  ｎｅｏｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ）（ウドンコ病を引き起こす）、クラドスポリウム・フルバム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｆｕｌｖｕｍ）（葉カビを引き起こす）、及びボトリティス・シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）（灰色カビを引き起こす）であり得るが、これらに限定されず、害虫細菌は、キサントモナス・ベシカトリア（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ）（細菌性葉斑点を引き起こす）、及びシュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ）（細菌性斑点を引き起こす）であり得るが、これらに限定されず、害虫卵菌は、フィトフトラ・インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）（疫病を引き起こす）抵抗性であり得、害虫ウイルスは、ジャガイモウイルスＸ及びペピーノモザイクウイルスであり得るが、これらに限定されない。
【００３１】
「非生物的ストレス抵抗性」は、本明細書において、特定の環境、たとえば、乾燥、浸透圧ストレス及び／又は塩分、紫外線、冷気、熱、生体異物処置（たとえば、除草剤及び／若しくはホルモン）、並びに機械的ストレスにおいて、生存生物に対する１つ又は複数の非生存的（たとえば、物理的）要因の負の影響に耐える、強化された植物の能力（抵抗性を有さない対照植物と比較して）を指すために使用される。換言すると、この用語は、非生物的ストレスの条件下において、対照植物（好ましくは、抵抗性を有さない植物）と比較して、（１つ若しくは複数の）有害反応の有意な低減又は植物の成長（たとえば、収量）の有意な増加を指す。
【００３２】
「Ｌ１局在化形質」は、本明細書において、「Ｌ１シュート分裂組織層に局在化される形質」として理解されるものとし、これは、本質的にＬ１シュート分裂組織層内にある形質であり、少なくとも本質的にはＬ１シュート分裂組織層の遺伝子型によって、場合によっては１つ又は複数の環境的要因と一緒に、決定される。Ｌ１シュート分裂組織層に局在化される形質は、この形質を有するＬ１シュート分裂組織層を、周縁キメラ植物の生産に使用した場合、該周縁キメラ植物を生産するために使用されるＬ２及び／又はＬ３シュート分裂組織層に、該形質が欠如している場合であっても、周縁キメラ植物に受け継がれる。そのような形質の例としては、果実色、害虫抵抗性、乾燥抵抗性、特定の植物、好ましくはその植物自体によって生産された花粉を受ける能力、及び改善された種子発芽が挙げられるが、これらに限定されない。ある形質が、Ｌ１シュート分裂組織層に局在化される形質であるかどうかは、組織技法によって、すなわち、ある植物に含まれる形質が、該形質を含む該植物のＬ１シュート分裂組織層を使用し、該形質を呈さない植物のＬ２及びＬ３シュート分裂組織層を使用して調製された周縁キメラ植物に移入されるかどうかを研究することによって、評価することができる。
【００３３】
「品種」とは、本明細書において、世代から世代へ、「種類に忠実に」再生成され得る類似の形質を有する個体又は植物の群として理解されるものとする。
【００３４】
「商業に関連する植物又は植物品種」とは、本明細書において、市場の需要を満たす、すなわち、経済価値のある、十分な商業に関連する形質を有する植物又は植物品種として、理解されるものとする。そのような品種は、したがって、該品種の作物種、及び気候などのさらなる特定の環境状況に応じて、商業に関連するものであるために、少なくともある特定の本質的な形質を含む。当業者であれば、商業に関連する品種のそのような形質要件を認識している。そのような形質は、商業に関連する形質として、本明細書において上記に定義されている。
【００３５】
「商業に関連しない植物又は植物品種又は植物種」とは、本明細書において、植物又は品種又は種を、商業に関連するものにするのに必要とされる、少なくとも１つの本質的な商業に関連する形質が欠如している植物又は品種又は種として、理解されるものとする。たとえば、あるトマト植物に、その植物自体によって生産された花粉を受ける能力が欠如している場合、そのようなトマト植物は、手作業による受粉を必要とするため、そのような植物は、商業に関連するような経済価値がまったくないか、又は不十分である。
【００３６】
「栽培種」とは、本明細書において、ヒトの介入によって、すなわち、望ましい形質の交配及び選択によって生産された、商業に関連する品種として理解されるものとする。
【００３７】
「野生種」とは、自然において、すなわち、交配及び選択というヒトの介入なしに、発生し、また存在する植物種である。
【００３８】
「作物植物」とは、本明細書において、食物、衣類、家畜、飼料、バイオ燃料、医薬、又は他の用途、たとえば、装飾用途のために収穫される植物として、理解されるものとする。
【００３９】
「後代」という用語は、他家受精によって得られる最初の世代又はさらなる世代を指す。Ｆ１ハイブリッドとは、本明細書において、遺伝子的に異なる個体の交雑、好ましくは、異なる品種に由来する２つの植物間の交雑又は栽培種と野生種との間の交雑により得られる第１世代の後代として、理解されるものとする。
【００４０】
「表現型」という用語は、形質学上、物理的、生化学上、発生上、又は挙動上の形質などであるがこれらに限定されない、個体の形質の複合物を指し、これは、したがって、遺伝子の発現並びに環境的要因によって決定され、遺伝子発現及び環境的要因の間の相互作用に基づいて、決定される。
【００４１】
本明細書において使用されるとき、「遺伝子型」という用語は、通常、考慮下にある目的とされる特定の特徴又は表現型形質と関連する、細胞、生物、又は個体（すなわち、個体の特定のアレル構成）の遺伝子構成を指す。しかしながら、外観及び挙動は、環境及び発生上の条件によって修飾されるため、同じ遺伝子型を有するすべての生物が、かならずしも、同じように見えるわけでも作用するわけでもない。同様に、よく似ているすべての生物が、かならずしも同じ遺伝子型を有するわけではない。
【００４２】
本明細書において使用されるとき、「遺伝子型判定」又は「遺伝子型を判定すること」という用語は、種における個体間での遺伝子変動を判定するプロセスを指す。単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）は、遺伝子型判定に使用される最も一般的な種類の遺伝子変動であり、定義としては、集団の１％よりも多くに見出される特定の遺伝子座における単一の塩基の相違である。ＳＮＰは、ゲノムのコーディング領域及び非コーディング領域の両方に見出され、目的とされる表現型形質、たとえば、目的とされる定量的表現型形質と関連付けることができる。したがって、ＳＮＰは、目的とされる定量的表現型形質のマーカーとして使用することができる。遺伝子型判定に使用される別の一般的な種類の遺伝子変動は、様々な長さのヌクレオチドの「ＩｎＤｅｌ」、すなわち、挿入及び欠失である。ＳＮＰ及びＩｎＤｅｌの両方の遺伝子型判定について、個体間の遺伝子型を判定するための多数の方法が存在する。選択される方法は、一般的に、必要とされるスループットに依存するが、このスループットは、遺伝子型判定を受ける個体の数及びそれぞれの個体について試験される遺伝子型の数の両方の関数である。選択される方法はまた、それぞれの個体又はサンプルから入手可能なサンプル材料の量にも依存する。たとえば、ＳＮＰなどのマーカーの有無を判定するために、シーケンシング、たとえば、サンガーシーケンシング及び高スループットシーケンシング技術（ＨＴＳ）などを使用することができる。サンガーシーケンシングは、（キャピラリー）電気泳動を通じた検出によるシーケンシングを伴い得、ここで、最大３８４個のキャピラリーが、１回の泳動で配列分析され得る。高スループットシーケンシングは、数千又は数百万又はそれ以上の配列を一度に並行してシーケンシングすることを伴う。ＨＴＳは、次世代シーケンシング、すなわち、固相ピロシーケンシングに基づく技法、又は単一ヌクレオチドリアルタイムシーケンシング（ＳＭＲＴ）に基づく次々世代シーケンシングとして定義することができる。Ｒｏｃｈｅ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、及びＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって提供されるものなどのＨＴＳ技術が、利用可能である。さらなる高スループットシーケンシング技術は、Ｈｅｌｉｃｏｓ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｎａｂｓｙｓ、ＺＳ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、ＧｎｕＢｉｏによって説明されており、及び／又はそれらから入手可能である。これらのシーケンシング技術のそれぞれは、実際のシーケンシングステップの前に、サンプルを調製する独自の手法を有する。これらのステップは、高スループットシーケンシング法に含まれ得る。ある特定の事例において、シーケンシングステップに特有のステップが、効率性又は経済性の理由により、実際のシーケンシングステップの前に、サンプル調製プロトコールに組み込まれ得る。たとえば、フラグメントにライゲーションされるアダプターには、後続のシーケンシングステップにおいて使用され得る部分が含まれ得る（いわゆる、シーケンシングアダプター）。シーケンシングの前にフラグメントのサブセットを増幅させるために使用されるプライマーは、たとえば、増幅ステップの間に、後続のシーケンシングステップにおいて使用され得るアンプリコンに、シーケンシングアダプター又は捕捉部分を導入することによって、それらの配列内に、後続のシーケンシングステップにおいて使用することができる部分を導入する部分を含み得る。また、使用されるシーケンシング技術に応じて、増幅ステップは、省略することができる。
【００４３】
本明細書において使用されるとき、「分子マーカー技法」という用語は、個々の（作物）植物における目的とされるマーカーアレルの有無を（直接的又は間接的に）示す（ＤＮＡに基づく）アッセイを指す。これにより、たとえば、シーケンシングによって、特定のアレルが、任意の個体の遺伝子座の位置のうちの一方に存在しているか又は存在していないかを判定することが可能となることが、好ましい。
【００４４】
本明細書において使用されるとき、「遺伝子座」又は（複数の）「遺伝子座」という用語は、ゲノムにおける特定の部位（場所）又は複数の部位を指す。たとえば、「遺伝子座」は、遺伝子座の２つのアレルが見出されるか（二倍体生物について）、又は多倍数体の個体若しくは植物の場合には複数のアレルが見出される、ゲノムにおける部位を指す。定量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）は、（遺伝子型／表現型関連性モデルに基づいて）定量的形質に関連するアレルを含むゲノム上の部位である。
【００４５】
「アレル」という用語は、特定の遺伝子座の位置のうちの一方に存在する、ヌクレオチド配列バリアントを指す。二倍体の個体は、１つの遺伝子座につき１つのアレルに２つの位置を有し、２つの相同染色体のうちの一方に１つの位置がある。特定の遺伝子座の位置のそれぞれについて、１つ又は複数の代替的なヌクレオチド配列バリアントが、集団に存在し得る、すなわち、それぞれの位置について、異なる考えられ得るアレルが、集団に存在し得る。しかしながら、それぞれの個体は、１つの遺伝子座のそれぞれの位置に、考えられ得るアレルのうちの１つのみを有し得る。代替的なヌクレオチド配列バリアント、すなわち、異なる考えられ得るアレルは、ヌクレオチド配列が少なくともわずかに異なり、典型的は、少なくとも１つのＳＮＰ又はＩｎＤｅｌの有無に基づいて、区別することができる。本明細書において、「アレル状態」について言及する場合、特定の遺伝子座内の位置におけるアレルの有無についての参照がなされ、これは、特定の遺伝子座におけるそれぞれのマーカー（たとえば、ＳＮＰ又はｉｎｄｅｌ）の有無として表現することができる。
【００４６】
本明細書において使用されるとき、「ヘテロ接合性」という用語は、２つの異なるアレルが、特定の遺伝子座、たとえば、アレルＡ／Ｂを有する遺伝子座に存在する場合に生じる、遺伝子状態を指し、ここで、Ａ及びＢは、２つの相同染色体のうちのいずれか一方に、個別に位置する。逆に、本明細書において使用されるとき、「ホモ接合性」という用語は、２つの同一なアレルが、特定の遺伝子座、たとえば、２つの相同染色体のうちのいずれか一方に個別に位置する、アレルＡ／Ａを有する遺伝子座に存在する場合に生じる、遺伝子状態を指す。
【００４７】
「周縁キメラ」は、１つ又は複数の細胞（組織）層（１つ又は複数）Ｌ１、Ｌ２、及び／又はＬ３全体が、別の細胞層とは遺伝子的に異なる、キメラである。周縁キメラの事例において、単一の組織層自体は、同種であり、キメラではない。周縁キメラは、最も安定な形態のキメラであり、明確に異なった価値のある植物表現型をもたらす。これらの植物は、それらが生成された末端分裂組織と同じ頂組織を有する腋芽を生産する。したがって、周縁キメラは、栄養繁殖によって倍増し得、それらのキメラ層組織を維持することができる。周縁キメラは、シュート分裂組織の（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）層のうちの１つにおける幹細胞の体細胞変異生成によって、作製することができる。周縁キメラはまた、たとえば、Ｓｚｙｍｋｏｗｉａｋ，Ｅ．Ｊ．及びＳｕｓｓｅｘ，Ｉ．Ｍ．（１９９２），Ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｍｅｒｉｓｔｅｍ  ｌａｙｅｒ（Ｌ３）ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ  ｆｌｏｒａｌ  ｍｅｒｉｓｔｅｍ  ｓｉｚｅ  ａｎｄ  ｃａｒｐｅｌ  ｎｕｍｂｅｒ  ｉｎ  ｔｏｍａｔｏ  ｐｅｒｉｃｌｉｎａｌ  ｃｈｉｍｅｒａｓ，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ４，１０８９−１１００によって記載されているように、合成方法によって生産することもできる。該周縁キメラは、２つの接木された種の間で生じる種間の細胞層移入の例である。この特定の方法は、栽培室又は温室において、周囲条件下で実施される。これは、一方を台木とし、もう一方を穂木とした、２つの植物の通常の接木からなる。接木接着部は、癒合した後、切断され、不定シュートを再生成することが可能となる。これらの不定シュートの中に、キメラが自発的に出現し得る。周縁キメラを生産するためのインビトロ合成技法もまた、開発されている。これらには、次のものが含まれる：（１）２つの異なる植物に由来する隣接した幹切片を、一緒に培養してキメラカルスにし、不定キメラシュートが、ホルモンを補充したインビトロ成長培地でこれらのカルスから再生成される、細胞の共培養。（２）２つの異なる植物の細胞懸濁液を混合し、混合物を、成長させてキメラカルスにし、不定キメラシュートが、ホルモンを補充したインビトロ成長培地でこれらのカルスから再生成される、混合カルス培養。（３）２つの異なる植物のプロトプラスト懸濁液を、アガロースに埋め込み、非常に高い細胞密度に成長させると、キメラシュートが、ホルモンを補充したインビトロ成長培地でこれらのカルスから再生成される、プロトプラストの共培養。（４）２つの実生を、滅菌条件下において、それらの胚軸に沿って接木し、接木の頂端下の断面を培養して、キメラ不定カルス及びシュートを誘導する、インビトロ接木培養。このような技法は、組織培養の共通点に含まれ、個々の植物株又は種に特異的であり得る多数の異なるプロトコールからなる。当業者であれば、２つの異なる植物の細胞を一緒に組織培養して、周縁キメラである場合もそうでない場合もある植物を再生成する方法を、理解するであろう。植物キメラに関する詳細な考察については、Ｒｉｃｈａｒｄ  Ａ．Ｅ．Ｔｉｌｎｅｙ−Ｂａｓｓｅｔｔによる「Ｐｌａｎｔ  Ｃｈｉｍｅｒａｓ」（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９１）を参照されたい。
【００４８】
「ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）」とは、本明細書において、ナス科に属する植物の属、種、及びその品種を指す。これらには、ソラナム属（かつてはリコペルシコン・エスクレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）として知られていたソラナム・リコペルシクム）、タバコ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）、トウガラシ属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）、ペチュニア属（Ｐｅｔｕｎｉａ）、及び他の属に属する種が含まれる。
【００４９】
本明細書において引用されているすべての特許及び参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００５０】
〔詳細な説明〕
本明細書において記載される任意の方法、使用、植物、又は植物産物が、本明細書において記載される任意の他の方法、使用、植物、又は植物産物と関連して実装され得ることが、企図される。本発明の方法、使用、植物、及び／又は植物産物の文脈において考察される実施形態は、本明細書において記載される任意の他の方法、使用、植物、又は植物産物と関連して用いることができる。したがって、１つの方法、使用、植物、又は植物産物に関する実施形態を、本発明の他の方法、使用、植物、及び植物産物にも同様に適用することができる。
【００５１】
目的とされるＬ１局在化形質を含む周縁キメラ植物を生産するための方法であって、
ａ）目的とされる該Ｌ１局在化形質を含む、第１の植物を提供するステップと、
ｂ）目的とされる該Ｌ１局在化形質を含まない、第２の植物を提供するステップと、
ｃ）第１の植物のＬ１シュート分裂組織層、並びに第２の植物のＬ２及びＬ３シュート分裂組織層を含む周縁キメラ植物を作製するステップと
を含む方法が、提供される。
【００５２】
本発明の方法は、目的とされるＬ１局在化形質の組合せを含む周縁キメラ植物を生産するためのものであることが好ましく、ここで、該方法は、
ａ）目的とされるＬ１局在化形質の該組合せを含む、第１の植物を提供するステップと、
ｂ）目的とされるＬ１局在化形質の該組合せを含まない、第２の植物を提供するステップと、
ｃ）第１の植物のＬ１シュート分裂組織層、並びに第２の植物のＬ２及びＬ３シュート分裂組織層を含む周縁キメラ植物を作製するステップと
を含む。
【００５３】
本明細書において定義される第１の植物、及び該第１の植物のＬ１シュート分裂組織層を含む周縁キメラ植物を生産するための該第１の植物の使用もまた、提供される。
【００５４】
目的とされるＬ１局在化形質の組合せは、少なくとも２つの目的とされるＬ１局在化形質の組合せとして理解されるものであり、換言すると、該組合せは、少なくとも第１及び第２の目的とされるＬ１局在化形質を含む。
【００５５】
ある実施形態において、該第１の形質は、該第２の形質を含まない第１の親植物に由来するか又はそれから誘導することができるＬ１局在化形質であり、該第２の形質は、該第１の形質を含まない第２の親植物に由来するか又はそれから誘導することができるＬ１局在化形質である。第１の親植物及び第２の親植物は、近親交配株、栽培種、及び／又は野生アクセッション若しくは種であり得る。好ましい実施形態において、該第１の形質は、該第２の形質を含まない野生種に由来するか又はそれから誘導することができるＬ１局在化形質であり、該第２の形質は、該第１の形質を含まない栽培種に由来するか又はそれから誘導することができるＬ１局在化形質である。そのような野生種及び栽培種は、本明細書においてさらに定義されている。本発明者らは、野生種には含まれない、さらなるＬ１、Ｌ２、及び／又はＬ３局在化形質、たとえば、栽培種に存在する形質を含む植物において形質として有することが有益な、いくつかのＬ１局在化形質を、該野生種において特定している。野生種に存在する特定のＬ１局在化形質は、生物的及び非生物的ストレス抵抗性形質である。栽培種に存在する特定のＬ１局在化形質は、果実色、及び特定の植物、好ましくは本明細書において定義される第２の植物によって生産された花粉を受ける能力である。これら及び他のＬ１局在化形質は、本明細書においてさらに詳述される。好ましい実施形態において、目的とされるＬ１局在化形質の該組合せは、自然には、すなわち、交雑及び選択、遺伝子修飾、及び／又は組織技術など、ヒトによる介入なしには、単一の植物又は植物種に生じることはない。換言すると、該組合せの発生は、好ましくは、単一の植物又は植物品種に出現させるためには、ヒトによる介入を必要とする。
【００５６】
任意選択で、目的とされるＬ１局在化形質の組合せは、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、又はそれ以上の目的とされるＬ１局在化形質の組合せである。
【００５７】
目的とされるＬ１局在化形質の組合せは、交雑及び選択によって、又は遺伝子修飾によって、第１の植物に導入することができる。
【００５８】
たとえば、第１の植物は、第１の目的とされる形質を含む第１の親植物を、第２の目的とされる形質を含む第２の親植物と交雑させ、任意選択で、続いて、第１及び第２の目的とされるＬ１局在化形質の組合せを含む植物を得るために、複数回の近親交配を行うことによって、得ることができるか、又はそれによって得られたものであり得る。そのような交雑及び選択の方法は、第１及び／又は第２の形質が、複合形質である場合に、特に好ましい。ある植物が、商業に関連するものとなるためには、複数の形質、しばしば複合形質が、必要とされることが、作物科学の分野において理解されている。新しい形質の導入には、商業に関連する植物に到達するために、多数の交雑及び選択のステップが必要である。本発明者らは、目的とされる新しいＬ１局在化形質を、周縁キメラの生産を介して植物に導入する場合には、商業に関連する植物に到達するために必要とされる交雑及び選択のステップが有意に少ないという重大な利点があるという見識を得た。本発明の方法を使用する場合、交雑及び選択は、商業に関連するＬ１シュート分裂組織層、すなわち、目的とされる新しい形質と、１つ又は複数のさらなる商業に関連するＬ１局在化形質との組合せを含むものが得られるまで行われ得るが、一方で、全体としての植物は、依然として、好ましくない特性を示しても、又はたとえば、作物植物に適した商業的特性が欠如していてもよく、これは、この部分が第２の植物のＬ２及びＬ３層で補われるためである。
【００５９】
したがって、本発明の方法のステップａ）には、第１の親植物を第２の親植物と交雑させ、任意選択で、目的とされるＬ１局在化形質の組合せの選択下において、複数回の近親交配を行うことが、先行する場合がある。
【００６０】
換言すると、本発明はまた、目的とされるＬ１局在化形質の組合せを含む第１の植物を生産するための方法であって、
ａ１）第１の目的とされるＬ１局在化形質を含む、第１の親植物を提供するステップと、
ａ２）第２の目的とされるＬ１局在化形質を含む、第２の親植物を提供するステップと、
ａ３）Ｆ１ハイブリッドを得るために、第１の親植物を第２の親植物と交雑させ、任意選択で、該Ｆ１ハイブリッドを近親交配するステップと、
ａ４）第１及び第２の目的とされるＬ１局在化形質の組合せを含む、ステップａ３）のＦ１ハイブリッド又は近親交配植物を選択するステップと
を含む方法も提供する。
【００６１】
したがって、周縁植物を生産するための方法において定義される第１の植物は、Ｆ１ハイブリッド又は近親交配植物であり得る。該第１の植物は、該第１の形質を含む第１の親植物及び該第２の形質を含む第２の親植物のＦ１ハイブリッド又は近親交配植物であることが好ましい。上述の方法によって得られたか又はそれによって得ることができ、第１及び第２の目的とされるＬ１局在化形質の組合せを含むことを特徴とするＦ１ハイブリッド又は近親交配植物もまた、提供される。このＦ１ハイブリッド又は近親交配植物は、該Ｆ１ハイブリッド又は近親交配植物のＬ１シュート分裂組織層を含む周縁キメラ植物を生産するのに使用することができるか、それに使用するためのものであるか、又はそのための使用に好適である。したがって、該ハイブリッド又は近親交配植物のＬ１シュート分裂組織層を含む周縁キメラ植物を生産するための、該Ｆ１ハイブリッド又は近親交配植物の使用もまた、提供される。
【００６２】
本明細書において上記に定義される周縁キメラ植物を生産する方法は、上記に定義される第１の植物を生産する方法を含み得る。より詳細には、本明細書において上記に定義される周縁キメラ植物を生産する方法のステップａ）は、本明細書において第１の植物を生産する方法で定義される方法ステップａ１）〜ａ４）を含み得る。第１及び第２の植物は、異なる遺伝子型を有することが好ましい。さらに、第１の親植物及び第２の親植物は、異なる遺伝子型を有することが好ましい。任意選択で、第１の親植物は、野生種であり得、第２の親植物は、商業に関連する品種又は栽培種であり得る。第１の親植物は、該第１の形質を天然に含む野生種であり得、該第２の植物は、該第２の形質を含む栽培種であり得る。本発明者らによって野生種のＬ１シュート分裂組織層に局在化していることが特定された特定の形質は、特定の生物的及び非生物的ストレス抵抗性、並びに改善された種子発品質、特に、該野生種と栽培種との交雑種の遺伝子型を有する種子の改善された種子発芽品質である。栽培種のＬ１シュート分裂組織層に局在化している特定の形質は、特定の色を有する果実の形質（すなわち、トマトの事例では赤色の果実）、及び／又は特定の植物、好ましくは、本明細書において定義される、栽培種であることが好ましい第２の植物によって生産された花粉を受ける能力である。栽培種には存在するが、野生種には欠如しているそのようなＬ１局在化形質は、好ましくは、本明細書において定義される商業に関連する形質である。
【００６３】
本明細書において上記に定義される第１の植物を生産するための方法において、野生種を、栽培種と交雑させ、続いて、少なくとも該第１の形質の選択下において、複数回の近親交配が行われ得る。任意選択で、該方法のＦ１ハイブリッドは、目的とされるＬ１局在化形質をすでに含んでいる。その場合には、さらなる近親交配は必要ない。任意選択で、上記の方法のＦ１ハイブリッドは、組合せ内のすべてのＬ１局在化形質を含んでいない。後者の場合には、目的とされるＬ１局在化形質の組合せを含む近親交配植物を得るために、Ｆ１ハイブリッドの近親交配を行うことが、好ましい。
【００６４】
近親交配は、目的とされるＬ１局在化形質の組合せを含む近親交配植物が得られるまで、継続することができる。任意選択で、近親交配は、該組合せについて、遺伝子が固定された近親交配植物が得られるまで、継続される。任意選択で、上記に定義される方法における近親交配は、組合せ内のすべてのＬ１局在化形質の継続的な選択下におけるものである。換言すると、交雑又は近親交配が１回終わるごとに、組合せ内のＬ１局在化形質のうちのすべての存在に基づいて、さらなる近親交配のための後代が選択される。或いは、複数回の近親交配の後に、選択を行ってもよい。任意選択で、近親交配が１回終わるごとに、組合せ内の少なくとも１つの形質に基づいて、さらなる近親交配のための後代が選択されるが、一方で、さらなる形質に基づいた選択は、複数回の近親交配の後に行われる。少なくとも１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、又は１０回、好ましくは少なくとも３回の連続的な近親交配を行うことが、好ましい。１０回、９回、８回、７回、６回、５回、４回、又は３回以下の連続的な近親交配を行うことが、好ましい。
【００６５】
任意選択で、第１の植物は、第１の植物の全遺伝子型に対する第２の親植物の遺伝子型の寄与が、少なくとも０．５％、好ましくは少なくとも２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、又は少なくとも７０％である、植物である。任意選択で、第１の植物は、第１の植物の全遺伝子型に対する第１の親植物の遺伝子型の寄与が、少なくとも０．５％、好ましくは少なくとも２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、又は少なくとも７０％である、植物である。
【００６６】
上記に示されるように、任意選択で、本明細書において定義される第１の植物の目的とされるＬ１局在化形質の組合せは、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、又はそれ以上の目的とされるＬ１局在化形質の組合せである。任意選択で、これらの形質の一部は、第１の親植物を起源とし、一部は、第２の親植物を起源とする。たとえば、第１の親植物は、生物的及び／又は非生物的両方のストレス抵抗性の組合せを含み得、一方で、第２の親植物は、１つ又は複数のＬ１局在化形質、たとえば、果実色及び／又は第２の植物によって生産された花粉を受ける能力を含む。任意選択で、第１の植物は、生物的及び／又は非生物的ストレス抵抗性と、１つ又は複数の改善された種子発芽特性（好ましくは、特定の所望される遺伝子型を有する種子のもの）との組合せを含み、一方で、第２の親植物は、１つ又は複数の形質、たとえば、果実色及び／又は第２の植物によって生産された花粉を受ける能力を含む。
【００６７】
本明細書において定義される周縁キメラ植物のＬ２及びＬ３シュート分裂組織層を提供する第２の植物は、本明細書において上記に定義される第１の植物又は第１及び第２の親植物のうちのいずれか１つとは異なる植物であり得る。第２の植物は、上記に定義される目的とされるＬ１局在化形質の組合せを含まない植物であることが好ましい。第２の植物は、少なくとも、その植物が商業に関連するものとして分類されるために十分な形質を含むことが好ましい。任意選択で、第２の植物は、上記に定義される第１の親植物に由来する第１の目的とされる形質を含まないが、上記に定義される第２の親植物に由来する第２の形質及び任意選択でさらなる形質を含み得る。第２の植物は、上記に定義される第２の親植物と同じ品種のものであってもよい。第２の植物は、該第２の親植物と同じ遺伝子型を有してもよい。
【００６８】
さらなる実施形態において、第１の植物は、遺伝子修飾を利用して生産される。目的とされる形質を導入するために遺伝子修飾を利用することは、該形質と関連する（１つ又は複数の）遺伝子が特定されている場合に、特に好ましい。該形質は、単一の遺伝子の発現を改変することによって若しくは遺伝子のヌクレオチド配列を改変することによって、又は好ましくはさらには該遺伝子内の単一のヌクレオチドを改変することによって導入することができる、単純な形質であることが好ましい。遺伝子修飾技法と本明細書において上記に定義される交雑及び選択との組合せもまた、本発明によって包含される。任意選択で、本明細書において定義される組合せ内のＬ１局在化形質のうちの少なくとも１つは、遺伝子修飾によって植物に導入され、ここで、該植物は、組合せ内の１つ又は複数のさらなるＬ１局在化形質をすでに含んでいる。そのような方法は、古典的な交配及び／又は選択技法を含まなくてもよい。本明細書において定義される組合せ内のＬ１局在化形質のうちの少なくとも１つを、遺伝子修飾によって植物に導入することもまた、本発明によって包含される。該少なくとも１つの形質は、本明細書において定義される第１及び第２の親植物の交雑及び／又は近親交配の前又は後に、導入され得る。まとめると、第１の植物を生産するための交雑及び選択と遺伝子修飾との組合せが、本発明において想起され、包含される。周縁キメラのＬ１シュート分裂組織層を提供するために遺伝子修飾された第１の植物を使用して生産した該キメラの重要な利点は、該キメラによって生産される配偶子が、第２の植物の遺伝子型に由来し、第２の植物は遺伝子修飾を含まないことを踏まえると、この配偶子は、したがって、遺伝子修飾を含まないと考えることができることである。さらなる利点は、アレルが、１つの層（たとえば、Ｌ１）には有益な表現型作用を有し得ることであるが、他の層（たとえば、Ｌ２及びＬ３）には多面的な作用をもたらし得る。アレルのそのような多面的作用は、本発明の組織技術を使用し、本発明の方法により周縁キメラ植物を生産することによって、回避することができる。そのような周縁キメラの例は、白カビ遺伝子座Ｏ又はＤＭＲ６（ベト病抵抗性６）のホモログの表皮特異的（Ｌ１）ノックアウトを有するソラナム・リコペルシクム植物に由来するＬ１層を含み、該ホモログの野生型を発現するソラナム・リコペルシクムに由来するＬ２及びＬ３をさらに含むキメラである。そのような植物を、ナス科特異的白カビ病又は生体栄養性の生存スタイルを有する他の病原体、たとえば、それぞれ、オイジウム・ネオリコペルシシ（Ｎｅｋｒａｓｏｖら、２０１７）及びフィトフトラ・カプシシ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｃａｐｓｉｃｉ）（ｄｅ  Ｔｅｌｅｄｏ  Ｔｈｏｍａｚｅｌｌａら、２０１６）に対する抵抗性について評価する。
【００６９】
本発明によって包含される遺伝子修飾のための方法は、目的とされる形質と関連する１つ又は複数の遺伝子の修飾をもたらす方法である。そのような修飾は、日常的なランダム変異生成法又は標的化変異生成法を使用した修飾しようとする該（１つ又は複数の）遺伝子のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つの組込み、欠失、又は改変であり得るが、これらに限定されない。後者には、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、Ｃａｓ９様、Ｃａｓ９／ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ、若しくはＣａｓ９／ｇＲＮＡ  ＣＲＩＳＰＲ系を用いるもの、又は変異原性オリゴヌクレオチドを用いた標的化変異生成法（たとえば、ＫｅｙＢａｓｅ（登録商標）若しくはＴＡＬＥＮ）が含まれるが、これらに限定されない。改変は、少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、欠失、及び／又は置換えであり得る。そのような修飾はまた、植物、植物細胞、又は植物プロトプラストへのベクター、たとえば、発現ベクター、たとえば、サイレンシングベクター、又は他の構築物の一過的又は安定な組込みであってもよい。そのような発現ベクターは、目的とされる形質と関連する（１つ又は複数の）遺伝子の過剰発現又はデノボ発現のためのベクターであり得る。そのようなベクターはまた、目的とされる形質と関連する（１つ又は複数の）遺伝子をサイレンシング（たとえば、ＲＮＡｉ発現構築物）、ノックダウン、又はノックアウト（たとえば、Ｔ−ＤＮＡ挿入により）するためのベクターであってもよい。任意選択で、そのようなベクターは、組織特異的プロモーターを含み、これは、好ましくは、表皮特異的プロモーター、たとえば、トリコーム特異的又はストーマ特異的プロモーターである。該プロモーターは、遺伝子修飾に必要とされる配列、たとえば、（過剰又はデノボ）発現させようとする遺伝子をコードする配列、標的化変異生成のための酵素をコードする配列、又はＲＮＡｉをコードする配列に作動可能に連結されている。
【００７０】
該第１の植物において（過剰又はデノボ）発現させようとする目的とされる遺伝子は、害虫の毒素若しくは忌避物質（たとえば、ある特定の昆虫若しくは真菌害虫に対する毒素若しくは忌避物質）であるタンパク質をコードする遺伝子、害虫に対する毒素若しくは忌避物質（たとえば、テルペノイド、テルペノイド誘導体、メチルケトン、及びアシル糖）の生産（たとえば、Ｋｕａｉら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １９９７，１１５：１５８１−１５８７；Ｙｕ及びＰｉｃｈｅｒｓｋｙ、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１４，１６４（２）：６１２−６２２；Ｙｕ及びＰｉｃｈｅｒｓｋｙ、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１４，１６４（２）：６１２−６２２；Ｐａｌｍａら、Ｔｏｘｉｎｓ（Ｂａｓｅｌ）．２０１４，６（１２）：３２９６−３３２５；Ｓｃｈｉｌｍｉｌｌｅｒら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１６，１７０（３）：１３３１−１３４４を参照されたい）、ワックス生産（Ｌｅｅ及びＳｕｈ、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．２０１５；３４（４）：５５７−５７２；Ｃｈａｎｇら、Ｔｈｅｏｒ  Ａｐｐｌ  Ｇｅｎｅｔ．２０１６；１２９（８）：１５３１−１５３９；Ｙａｎｇら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２０１１  Ｊｕｌ  １９；１０８（２９）：１１８３６−１１８４１；Ｔｉａｎら、Ｐｌａｎｔａ．２０１２；２３６（４）：１０５３−１０６６）、遺伝子トリコーム形成（Ｋａｎｇら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｂｏｔ．２０１６；６７（１８）：５３１３−５３２４）、及び／若しくはストーマ形成に関与するタンパク質若しくは酵素をコードする遺伝子であり得る。目的とされるさらなるものは、その発生に重要なＲＮＡｉ標的化昆虫特異的遺伝子をもたらすか又はコードする、構築物である（Ｇｏｒｄｏｎ及びＷａｔｅｒｈｏｕｓｅ、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００７；２５（１１）：１２３１−１２３２）。
【００７１】
本明細書において定義される周縁キメラ植物のＬ２及びＬ３シュート分裂組織層を提供する第２の植物は、遺伝子修飾された第１の植物を生産するために使用される第１の植物と同じ種又は品種の植物であってもよい。第２の植物は、遺伝子修飾による目的とされるＬ１局在化形質又は目的とされるＬ１局在化形質の組合せの導入の前の第１の植物、すなわち、遺伝子修飾の出発材料として使用される植物、又は植物細胞、又はプロトプラストと、同じ遺伝子型を有し得る。
【００７２】
上記に定義される第１の植物、第２の植物、第１の親植物、及び第２の親植物は、ナス科に属し、好ましくは、ソラナム属に属する。商業に関連する植物又は栽培種は、栽培トマト植物、好ましくは、ソラナム・リコペルシクム（たとえば、アイルサ・クレイグ）品種のものであり得る。商業に関連しない植物は、野生トマト、好ましくは、ソラナム・ペンネリイ種（たとえば、株ＬＡ７１６）、ソラナム・ハブロカイテス種（たとえば、アクセッションＰＩ１２７８２６）、ソラナム・ガラパゲンス種（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｇａｌａｐａｇｅｎｓｅ）、又はソラナム・ピンピネリフォリウム種であり得る。第１の親植物は、野生トマト種、好ましくは、ソラナム・ペンネリイの植物であり、第２の親植物、及び任意選択で第２の植物は、栽培種、好ましくは、ソラナム・リコペルシクム品種の植物であることが、好ましい。第１の植物、第２の植物、第１の親植物、及び／又は第２の親植物は、ソラナム・ニグラム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｎｉｇｒｕｍ）種のものではないことが好ましい。
【００７３】
本明細書において定義される目的とされるＬ１局在化形質は、生物的又は非生物的ストレス抵抗性、改善された種子発芽、果実色、並びに植物自体によって生産された花粉を受ける能力であり得るが、これらに限定されない。生物的ストレス抵抗性形質は、本明細書において定義される節足動物、害虫真菌、害虫細菌、害虫卵菌、及び／又は害虫ウイルスに対する抵抗性であり得るが、これらに限定されない。生物的ストレス抵抗性形質はまた、害虫の毒素又は忌避物質、たとえば、テルペノイド、テルペノイド誘導体、メチルケトン、及びアシル糖（多様な長さの短鎖長及び／若しくは中鎖長の脂肪酸でアシル化されたグルコースを含む糖の群のうちの任意のもの）の生産の増加、並びにワックス生産の増加を包含し得る。
【００７４】
本明細書において定義される目的とされるＬ１局在化形質の組合せは、以下のＬ１局在化形質の任意の組合せであり得るが、これらに限定されない：生物的ストレス抵抗性、非生物的ストレス抵抗性、本明細書において定義される改善された種子発芽、果実色、及び本明細書において定義される第２の植物によって生産された花粉を受ける能力。
【００７５】
好ましい実施形態において、第１の目的とされるＬ１局在化形質は、野生植物種に含まれる形質であるが、本明細書において定義される目的とされるＬ１局在化形質の組合せ内の第２のＬ１局在化形質は、栽培種に含まれるものである。該第１の形質は、生物的又は非生物的ストレス抵抗性であることが、好ましい。第１の形質はまた、１つ又は複数の改善された種子発芽特性、好ましくは、種子の改善された発芽特性であり得、ここで、種子胚は、特定の所望される遺伝子型、たとえば、該野生植物種と本明細書において定義される第２の植物との交雑により得られた種子の遺伝子型を有する。栽培種に由来する該第２の形質は、商業に関連するＬ１局在化形質、たとえば、果実色、並びに／又は周縁キメラ植物自体及び／若しくは本明細書において定義される第２の植物に由来する花粉を受ける能力であることが、好ましい。
【００７６】
好ましい実施形態において、第１の目的とされる形質は、生物的ストレス抵抗性である。目的とされるＬ１局在化形質の組合せは、特定の果実色（植物によって生産される果実がトマトである場合には赤色であることが好ましい）、並びに周縁キメラ植物自体及び／若しくは本明細書において定義される第２の植物に由来する花粉を受ける能力と組み合わせた、生物的ストレス抵抗性、好ましくは、コナジラミ抵抗性であることが、好ましい。任意選択で、生物的ストレス抵抗性は、本明細書において定義される第１の親植物（ソラナム・ペンネリイのアクセッションであり得る）に含まれるが、一方で、果実色並びに周縁キメラ植物自体及び／若しくは本明細書において定義される第２の植物に由来する花粉を受ける能力は、第２の親植物（ソラナム・リコペルシクムの栽培種であり得る）に含まれる。これらの３つのＬ１局在化形質の組合せを含む第１の植物は、該第１及び第２の親植物を交雑させ、続いて、得られたＦ１ハイブリッドを少なくとも３回近親交配することによって得られるか又は得ることができることが、好ましい。本明細書において定義される周縁キメラ植物を生産するために使用することができる第１の植物を得るために、Ｆ１ハイブリッドを、第２の親植物を用いた戻し交雑を３回行い、自家受粉を１回行うことが、好ましい。
【００７７】
上述のように、周縁キメラを生産するため及び／又は本明細書において定義される第１の植物を生産するために、本発明の方法において、後代又は遺伝子修飾された植物を選択することが、必要である。優性形質がその後代に継代されていることの評価は、表現型により行うことができる。しかしながら、劣性形質の場合、そのような形質がその後代に継代されたかどうかは、遺伝子型により（任意選択で、分子マーカー技法により）、並びに／又は後期、すなわち、１回若しくは複数回のさらなる交雑ステップ（近親交配）により、その劣性形質のホモ接合性遺伝子型が得られた後においては表現型により、評価する必要があり得る。
【００７８】
遺伝子型に基づく選択には、好ましくは、目的とされる表現型形質と特定の遺伝子型との直接的な公知の連鎖が必要とされる。目的とされる形質が、公知の遺伝子型に直接的に連鎖していない場合、又は連鎖が複雑である場合には、選択は、表現型アッセイ、たとえば、バイオアッセイに基づくものであってもよい。
【００７９】
生物的ストレス抵抗性形質又は害虫抵抗性形質は、コナジラミ抵抗性、フィトフトラ抵抗性、潜葉虫抵抗性（トマトキバガ）、ハダニ抵抗性、温室コナジラミ抵抗性、ジャガイモ／トマトアブラムシ抵抗性、アザミウマ抵抗性、ウドンコ病抵抗性、クラドスポリウム抵抗性、ボトリティス・シネレア抵抗性、細菌抵抗性、又はこれらの任意の組合せであり得るが、これらに限定されない。任意選択で、コナジラミ抵抗性、トマトキバガ、アザミウマ、及びアブラムシ抵抗性は、ソラナム・ペンネリイ種に由来する形質である。任意選択で、フィトフトラ抵抗性、クラドスポリウム抵抗性、及び／又は細菌抵抗性は、ソラナム・ピンピネリフォリウム種に由来する形質である。任意選択で、ウドンコ病抵抗性、ボトリティス・シネレア抵抗性、及びフィトフトラ抵抗性は、ソラナム・ハブロカイテス種に由来する形質である。「由来する」とは、本明細書において、示される野生種を第１の親植物として使用することによって、任意選択で、該第１の親植物を、ソラナム・リコペルシクム品種又は栽培種である第２の親植物と交雑させ、任意選択で、それらをさらに近親交配させることによって、形質が、本明細書において定義される第１の植物に導入され得ることを意味するとして、理解されるものとする。
【００８０】
そのような抵抗性を検出及び選択するための好適なバイオアッセイは、温室／野外試験に基づくものであり、その場合、植物に、害虫、たとえば、上述の節足動物、真菌、細菌、卵菌、及び／又はウイルス害虫でチャレンジが行われ得、該植物を、続いて、抵抗性について高い信頼性でスコア付けする。コナジラミ抵抗性の場合、抵抗性の基準には、植物に存在する成体の数、又は産み付けられた卵の数、又は成体に成長した卵の数、又はこれらの基準の組合せが含まれ得る。潜葉虫（トマトキバガ）の場合、抵抗性の基準には、植物に存在する潜葉虫の数、産み付けられた卵の数、食べられた及び／又は損傷した葉表面が含まれ得る。ウドンコ病の場合、抵抗性の基準には、植物に存在する感染斑の数及び／若しくはサイズ、又は分生子（胞子）の数が含まれ得る。
【００８１】
タバココナジラミ（コナジラミ）抵抗性を検出するのに好適なバイオアッセイは、国際公開第２０１２／１６５９６１号に記載されており、これは、参照により本明細書に組み込まれる。簡単に述べると、タバココナジラミ抵抗性について試験しようとする植物及び対照植物に、４つのクリップケージを付け、そのそれぞれが、２０匹の成体タバココナジラミ（好ましくは、バイオタイプＱ）を含み、これは、研究室条件下において、キュウリにおいて継続的に飼育したものである（Ｂｌｅｅｋｅｒら、２００９  −Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．を参照されたい）。５日後に、死亡した成体の総数及び割合、並びに卵の総数（葉の背軸側及び向軸側の組合せ）を判定する。
【００８２】
トリアレウロデス・バポラリオルム（温室コナジラミ）抵抗性を検出するのに好適な（表現型）バイオアッセイもまた、国際公開第２０１２／１６５９６１号に記載されており、これは、参照により本明細書に組み込まれる。簡単に述べると、トリアレウロデス・バポラリオルム（目：カメムシ）を、トマト（ソラナム・リコペルシクム）において飼育する。選択アッセイを、２４時間行う。成体を、試験しようとする植物及び対照植物を有するケージに放った。続いて、成体が定着する優先度を、植物の葉において判定した。
【００８３】
マクロシファム・ユーフォリビアエ（ジャガイモ／トマトアブラムシ）抵抗性を検出するのに好適なバイオアッセイもまた、国際公開第２０１２／１６５９６１号に記載されており、これは、参照により本明細書に組み込まれる。簡単に述べると、マクロシファム・ユーフォリビアエ（目：カメムシ）を、トマト（ソラナム・リコペルシクム）において飼育する。選択肢なしアッセイを、４８時間行う。１匹の成体アブラムシを、試験しようとする植物及び対照植物のクリップケージに入れる。続いて、アブラムシの性能（生存及び後代の数）を判定する。
【００８４】
トマトキバガ抵抗性を検出するのに好適なバイオアッセイもまた、国際公開第２０１２／１６５９６１号に記載されており、これは、参照により本明細書に組み込まれる。簡単に述べると、トマトキバガ（目：チョウ）を、トマト（ソラナム・リコペルシクム）において飼育する。選択肢なしアッセイを、７日間行う。５匹の成体に、試験しようとする植物及び対照植物に卵を産卵させた。７日後に、トマトキバガの産卵（産み付けられた卵の数）を、それぞれの植物遺伝子型の背軸側及び向軸側において判定する。
【００８５】
ハダニ（テトラニクス・ウルチカエ及び／又はテトラニクス・エバンシ）を検出するのに好適なバイオアッセイもまた、国際公開第２０１２／１６５９６１号に記載されており、これは、参照により本明細書に組み込まれる。ハダニは、昆虫と同様に節足動物に属するが、異なる綱の生物である。簡単に述べると、節足動物種を、一般的なソラマメにおいて飼育する。４日間の選択肢なしアッセイを、テトラニクス・ウルチカエ及び／又はテトラニクス・エバンシの同期集団を用いて行う。ダニを、試験しようとする植物及び対照植物の葉ディスクに置いた。続いて、ダニの生存及び繁殖力（卵／ダニの数）を評価する。
【００８６】
害虫抵抗性は、さらに、又は前述のものと組み合わせて、表皮細胞に存在する毒性及び／若しくは忌避性分子（たとえば、テルペノイド、テルペノイド誘導体、メチルケトン、及びアシル糖）の生産の増加、トリコームの数の増加、並びに／又はワックスの量の増加によって、評価してもよい。
【００８７】
非生物的ストレス抵抗性は、乾燥抵抗性であり得、これは、乾燥抵抗性を有さない対照植物と比較して、改善された乾燥抵抗性を有するとして理解されるものとする。改善された乾燥抵抗性を有する植物は、改善された乾燥抵抗性が提供されている場合、乾燥又は乾燥ストレスに供されたときに、改善された乾燥抵抗性が提供されていない植物において観察される作用を示さないか、又はそれよりも軽減された作用を示す、植物を指す。正常な植物は、ある程度の乾燥抵抗性を有する。植物が、改善された乾燥抵抗性を有するかどうかは、対照植物において、ある特定の期間の後に、すなわち、植物を乾燥又は乾燥ストレスに供した場合に、乾燥の兆候が観察され得るように選択した制御条件下において、対照植物を、改善された乾燥抵抗性が提供されている植物と比較することによって、容易に判定することができる。改善された乾燥抵抗性を有する植物は、対照植物と比較して、示される乾燥に供されたという兆候、たとえば、萎れが、少ない及び／又は低減される。当業者であれば、好適な条件、たとえば、実施例における制御条件などを選択する方法を認識している。植物が、「改善された乾燥抵抗性」を有する場合、通常であれば正常な（対照）植物の成長の低減及び／又は発生の低減をもたらすであろう乾燥又は乾燥ストレスに供した場合に、正常な成長及び／又は正常な発生を持続することができる。したがって、「改善された乾燥抵抗性」は、植物を比較することによって判定することができ、それにより、乾燥ストレス下において（正常な）成長を維持する能力が最も高い植物が、「改善された乾燥抵抗性」を有する植物である。当業者であれば、植物の乾燥抵抗性を判定するのに適切な条件を選択する方法、及び乾燥の兆候を測定する方法、たとえば、ＩＲＲＩ，Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  ｒｉｃｅ  ｆｏｒ  ｄｒｏｕｇｈｔ  ｐｒｏｎｅ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ，Ｆｉｓｃｈｅｒら、２００３及びＣＩＭＭＹＴ，Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  ｆｏｒ  ｄｒｏｕｇｈｔ  ａｎｄ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｓｔｒｅｓｓ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｉｎ  ｍａｉｚｅ：ｆｒｏｍ  ｔｈｅｏｒｙ  ｔｏ  ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｂａｎｚｉｎｇｅｒら、２０００によって提供されているマニュアルに記載されているものなどを、十分に認識している。植物における改善された乾燥抵抗性を判定する方法の例は、Ｓｎｏｗ及びＴｉｎｇｅｙ、１９８５，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，７７，６０２−７並びにＨａｒｂら、Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｄｒｏｕｇｈｔ  ｓｔｒｅｓｓ  ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ，ＡＯＰ  ２０１０，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗに提供されており、以下の実施例の節に記載されている通りである。乾燥抵抗性の増加は、さらに、又は前述のものと組み合わせて、対照植物と比較した、トリコームの量の増加及び／又はストーマの量の減少によって、評価してもよい。
【００８８】
発芽特性は、発芽能力、ピーク値時間、発芽の均質性、発芽率、種子密度、及び／又は種子活力であり得るが、これらに限定されない。発芽特性を、目的とされる植物によって生産された種子において評価する。より詳細には、種子発芽の特性を、本発明のキメラ植物について評価する場合、該特性は、該植物の受粉後に、該キメラ植物によって生産された種子について評価するものとする。改善された発芽は、本明細書において、類似の花粉（すなわち、同じ植物に由来し、同じ遺伝子型を有する花粉）で受粉させた場合に、非キメラ対照植物から得られた種子と比較して、キメラ植物から得られた該種子の、少なくとも１つの改善された発芽特性として理解されるものとし、ここで、該キメラ植物の種子の種子胚は、該対照植物から得られた種子のものと同じ遺伝子型を有する。好ましい実施形態において、本明細書において定義される第１の親植物に由来する花粉で受粉させた後に本発明のキメラ植物から得られた種子の発芽特性を、該第１の親植物に由来する花粉で受粉させた後に本明細書において定義される第２の植物から得られた種子と比較する。
【００８９】
発芽能力は、所与の植物種に適切な固定期間以内に発芽する、すなわち、幼根の出現を示す、蒔かれたか、又は植えられたか、又はそうでなければ分配された種子の割合として、理解されるものとする。したがって、発芽能力は、所与の期間以内に、発芽した種子の数を、蒔かれたか、又は植えられたか、又はそうでなければ分配された種子の総数で除し、割合として再計算したものとして計算することができる。種子発芽特性は、たとえば、分類及び選択の手順、たとえば、農業及び園芸における通常のものを行った後に、判定することができ、特定の植物種を目的とするものであり得る。種子は、たとえば、液体密度分離によって、又はＸ線分類（たとえば、トマト種子に使用することができるようなもの）によって、分離することができる。種子はまた、まず、プライミングしてもよい。当業者であれば、所与の植物種に適切な固定期間がどれほどの長さであるかを認識している。この期間は、たとえば、ピーク値時間の２倍、３倍、４倍、又は５倍であり得る。これは、ピーク値時間の３倍であることが、好ましい。この期間が、環境条件に応じて変動し得ることもまた、当業者には公知である。これらの条件は種子発芽に最適な条件であることが、好ましい。したがって、発芽率又は発芽均質性における変動性が、発芽能力の計算に影響を及ぼさない長さの期間が、選択される。この期間は、当業者が、発芽能力のある種子の大半が実際にこの期間内に発芽すると妥当に予測することができる場合、適切である。図１１は、異なる発芽能力を有する植物株の発芽した種子の割合の経時的な展開を示す。取得期間は、発芽した種子の数がやがて横ばいになり、プラトー期に達するのを確実にするように十分に長いものである。このプラトー期は、すべての種子が発芽している場合には１００％であり得るか、又は一部の種子がまったく発芽していない場合には、それよりも低い割合であり得る。発芽能力とは、植物種に応じて、たとえば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％を意味する。したがって、８５％の発芽能力は、たとえば、ピーク値時間の３倍であるがこれに限定されない、所与の植物種に適切な期間以内に、蒔かれたか、又は植えられたか、又はそうでなければ分配された種子のうちの８５％が発芽する、すなわち、幼根の出現を示すことを、示唆する。高い発芽能力は、より多くの種子が幼根の出現を示すことを意味する。最適な環境条件下において発芽能力を構築するための、所与の植物種に適切な固定期間の例は、たとえば、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）については５日間、オオムギについては約７日間、オトギリソウ（Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ）については約７日間、タバコについては約７日間、トマトについては約７日間、キンポウゲについては約２８日間、及びインパチェンスについては約３０日間であるが、これらに限定されない。
【００９０】
ピーク値時間は、本明細書において、種子が発芽するように種子を蒔いたか、植えたか、又はそうでなければ分配してからの、場合によっては種子の分類及び選択からの、又はたとえば種子のプライミング及び／若しくは湿層処理からの期間であって、発芽した種子の割合をｙ軸にプロットし、時間をｘ軸にプロットした曲線において、最も大きい正接に到達する期間として理解されるものとする。図１２は、ピーク値時間の概念を図示する。したがって、ピーク値時間は、時間単位当たりの発芽する種子の数の増加が最も高くなる瞬間に到達するのに必要な期間として決定される。ピーク値時間は、たとえば、ピーク値時間の２倍、３倍、４倍、又は５倍、好ましくはピーク値時間の３倍の期間で固定することによって、発芽能力又は発芽率の計算に役立てるために使用することができる。
【００９１】
種子発芽の均質性又は発芽均質性は、固定割合の発芽した種子（Ｘ）に到達するのに必要な時間（Ｔ）として理解されるものとする。この固定割合は、５０％（Ｔ５０）、７５％（Ｔ７５）、８０％（Ｔ８０）、９０％（Ｔ９０）、９５％（Ｔ９５）、９９％（Ｔ９９）、又は特定の播種バッチに適切な任意の割合であり得る。時間が短いほど、均質性が高い。種子発芽の均質性が、環境条件に応じて変動し得ることが、当業者には公知である。これらの条件が、種子発芽の最適な条件であることが、好ましい。種子発芽の均質性は、原則として、発芽能力又は発芽率とは独立しているが、かならずしもそうとは限らない様式で、測定される。
【００９２】
発芽率は、１日当たりの総発芽種子の加重合計として定義される。式形式では、発芽率＝（１日目に発芽した種子の数を１で除したもの）＋（２日目に発芽した種子の数を２で除したもの）＋…＋（Ｚ日目に発芽した種子の数をＺで除したもの）であり、式中、Ｚは、測定の最終日である。この測定は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｅｅｄ  Ａｎａｌｙｓｔｓ（ＡＯＳＡ）（ＡＯＳＡ．，１９８３．Ｓｅｅｄ  ｖｉｇｏｒ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｈａｎｄｂｏｏｋ．Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｎｏ．３２  ｔｏ  ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｎ  ｓｅｅｄ  ｔｅｓｔｉｎｇ．Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｓｅｅｄ  Ａｎａｌｙｓｔｓ）によって定義される発芽指数（ＧＩ）と同じである。発芽率は、所与の植物種に適切な期間にわたって判定され、この期間は、当業者が、発芽する能力のある種子の大半が実際に発芽すると妥当に予測することができる期間である。当業者であれば、この期間を判定する方法を認知している。この期間は、たとえば、ピーク値時間の２倍、３倍、４倍、又は５倍であり得る。これは、ピーク値時間の３倍であることが、好ましい。発芽率が、環境条件に応じて変動し得ることが、当業者には公知である。これらの条件は種子発芽に最適な条件であることが、好ましい。しかしながら、準最適条件下においては、改善された播種バッチ品質もまた、強化された発芽率として評価することができ、これは、農業又は園芸の実施において一般的であり得る。
【００９３】
種子密度は、種子の比重に関連し、たとえば、種子の、たとえばスクロース勾配における、液体密度分離によって、判定することができる。
【００９４】
種子活力は、種子から生じる実生が、植えたときに、生存し、成長する能力を意味する。したがって、高い活力を有する種子は、類似の条件下であれば、生存し、まず子葉が展開され、次に、シュートが大きくなり、最後に、第１の本葉が生じることによって、第１の本葉が生じた実生又は小植物体に成長する割合が高い。同じ条件下であれば、植物種に応じたある特定の期間内に観察され得る第１の本葉が生じた実生又は小植物体の割合が高いほど、種子活力が、より高いと考えられる。また、播種後の固定期間後の実生の総生物量（生重量及び／又は乾燥重量）が大きいほど、種子活力が、より高いと考えられる。したがって、実生の生重量は、とりわけ、種子活力の尺度である。
【００９５】
特定の植物、好ましくはその植物自体によって生産された花粉、すなわち、生産しようとする周縁キメラ植物に由来する花粉を受ける能力は、試験しようとするＦ１ハイブリッド又は近親交配した第１の（親）植物を、周縁キメラ植物のＬ２シュート分裂組織層を提供する第２の植物に由来する花粉で受粉させることによって、評価することができる。花粉の受容は、そのような受粉が果実及び種子の形成をもたらした場合に、陽性としてスコア付けする。
【００９６】
特定の実施形態において、目的とされるＬ１局在化形質は、本明細書において定義される第１の親植物によって生産された花粉を受ける能力である。この形質は、該第１の親植物の花粉を用いた受粉後に生産された種子の改善された発芽特性の形質と組み合わせる場合に、特に興味深い。特に、該第１の親植物が、野生種であり、本発明のキメラ植物のＬ２及びＬ３層を提供する第２の植物が、栽培種である場合、ハイブリッド種子が、キメラ植物によって生産され得、これは、該第１の親植物の花粉を用いた受粉後に、非キメラ対照植物（すなわち、第２の植物）を用いて生産されたハイブリッド種子と比較して、改善された発芽特性を示す。なおもさらに好ましい実施形態において、目的とされるＬ１局在化形質の該組合せは、生物的又は非生物的ストレス抵抗性の形質をさらに含む。
【００９７】
本発明はまた、本明細書において定義される方法のうちのいずれかによって得ることができる周縁キメラを提供する。結果として得られる周縁キメラ植物は、Ｌ１シュート分裂組織層に（第１、第２、及び任意選択でさらなる）目的とされる形質を含むとことを特徴とする、商業に関連する植物であることが、好ましい。本発明は、本明細書において定義される方法のうちのいずれかによって得られたか又は得ることができる周縁キメラに栄養繁殖的に由来する、周縁キメラをさらに提供する。
【００９８】
第１の植物は、第１及び第２の目的とされるＬ１局在化形質を含むことが、好ましい。したがって、本明細書において定義される第１の植物が、全体として、商業に関連する植物であるという要件は存在しない。該第１の植物のＬ１シュート分裂組織層は、商業に関連することが好ましく、すなわち、該植物のＬ１シュート分裂組織層が、周縁キメラ植物を生産するために、第２の商業に関連する植物のＬ２及びＬ３シュート分裂組織層と組み合わされている場合、そのような周縁キメラ植物は、商業に関連する。
【００９９】
本明細書において使用される「第１の植物」、「第２の植物」、「第１の親植物」、「第２の親植物」、「Ｆ１ハイブリッド」、及び「近親交配植物」は、本明細書において、それぞれ、「第１の植物のゲノムを有する植物」、「第２の植物のゲノムを有する植物」、「第１の親植物のゲノムを有する植物」、「第２の親植物のゲノムを有する植物」、「Ｆ１ハイブリッドのゲノムを有する植物」、及び「近親交配植物のゲノムを有する植物」と置き換えることができる。
【０１００】
周縁キメラ植物は、当該技術分野における好適な方法によって作製することができる。たとえば、周縁キメラは、Ｌ１シュート分裂組織層を提供する植物又は植物品種（本明細書において上記に定義される第１の植物）の実生、並びにＬ２及びＬ３シュート分裂組織層を提供する植物又は植物品種（本明細書において上記に定義される第２の植物）の実生を接木することによって作製することができ、これは、（１）胚軸を横方向に切断した後に隣接させて再接着させるステップ、（２）接木接合部を横方向に切断するステップ、並びに（３）カルスを成長させ、不定シュートが、接木接着の部位から再生成するステップ、並びに（４）再生成された植物の中からキメラを選択するステップからなる。ステップ１〜４の技法は、当業者に公知である。一般に、接木及び再生成を使用する場合、周縁キメラが、不定シュートに生じる頻度は、約０．２％〜１０％であろう。したがって、多数の第１の植物及び第２の植物の実生、並びに多数の独立した不定シュートを生成することが、好ましい。これらの不定シュートのそれぞれを、長さおよそ５ｃｍで、いくつかの葉を有する小植物体に成長させていてもよい。これらの小植物体から、シュート頂端を除去して、葉腋から葉腋シュートを生じさせてもよい。これらの葉腋シュートの中から、構成物質である第１の植物及び第２の植物を区別する遺伝子マーカーを使用して、周縁キメラを特定することができる。これらのマーカーは、表現型、たとえば、異なる葉の色であってもよく、又は任意の形態学的若しくは生化学的な違い、たとえば、果実の形状であってもよい。これらのマーカーはまた、遺伝子型、たとえば、Ｌ１シュート分裂組織層を提供する植物とＬ２及びＬ３シュート分裂組織層を提供する植物との間のＤＮＡ又はＲＮＡ配列多型性であってもよい。表現型及び／又は遺伝子型マーカーは、適切な検出方法によって検出することができ、すべての個々の接木された植物対から再生成されたすべての不定シュートに由来するすべての葉腋シュートに適用することができる。周縁キメラは、生殖交雑の結果ではなく、接木接合部からの不定シュートの再生成の結果として、第１の植物及び第２の植物の両方のマーカーの組合せを単一の植物に有するとして認識することができる。そのようなキメラは、その葉腋シュート、花序、開花、並びに周縁キメラのシュート頂分裂組織からの自然の成長及び発生から生じる植物のすべての他の成長部分を含め、植物のさらなる成長の間、これらのマーカーを安定に保持する。その幹細胞層Ｌ（１、２、３）の構成という点で、所望される種類の周縁キメラは、特定の組織、たとえば、表皮（Ｌ１）、脈管（Ｌ３）、花粉粒（Ｌ２）、又は主としてこれらの層に由来することが公知の任意の他の組織における、マーカーの存在を観察することによって、特定される。
【０１０１】
たとえば、第１及び第２の目的とされる形質の両方を含む周縁キメラ植物を生産するための第１の植物を、台木又は穂木として、上記に定義される第２の植物に接木し、続いて、１０日間、接木を癒合させることができる。接木接合部を、次いで、横方向に切断してもよく、そうすると、カルスの成長及びシュートの再生成が、自発的に生じる。再生成されたシュートの中から、周縁キメラを、目視によって、たとえば、表現型マーカーｘａ（Ｓｚｙｍｋｏｗｉａｋ，Ｅ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｓｕｓｓｅｘ，Ｉ．Ｍ．（１９９２）（１９９２），Ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｍｅｒｉｓｔｅｍ  ｌａｙｅｒ（Ｌ３）ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ  ｆｌｏｒａｌ  ｍｅｒｉｓｔｅｍ  ｓｉｚｅ  ａｎｄ  ｃａｒｐｅｌ  ｎｕｍｂｅｒ  ｉｎ  ｔｏｍａｔｏ  ｐｅｒｉｃｌｉｎａｌ  ｃｈｉｍｅｒａｓ，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ４，ｐｐ．１０８９−１１００）及びトリコーム密度を使用して、選択することができる。半優性マーカーｘａは、ヘテロ接合性条件下において、Ｌ２及び／又はＬ３に存在する場合、黄色い葉をもたらす。たとえば、第１の植物（すなわち、Ｌ１シュート分裂組織層を提供する植物）が、ｘａマーカーを含むが、このマーカーが、本明細書において定義される第２の植物（すなわち、Ｌ２及びＬ３シュート分裂組織層を提供する植物）には存在せず、第１の植物が、トリコーム密度の表現型を有し、これが、第２の植物には存在しない場合、所望される種類のキメラは、緑色の葉（第２の植物のＬ２及びＬ３）に加えて、高いトリコーム密度（近親交配株のＬ１）を有することによって、認識することができる。さらに、Ｌ１層の同一性は、第１の植物の遺伝子型を、第２の植物の遺伝子型と区別するＳＮＰマーカーの、表皮細胞における有無をスコア付けすることによって、判定することができる。
【０１０２】
本発明はまた、上記に定義される方法によって得られたか若しくは得ることができる周縁キメラ植物、並びに／又は該周縁キメラ植物に栄養繁殖的に由来する任意の植物も提供する。そのような周縁植物は、Ｌ１シュート分裂組織層の遺伝子型が、Ｌ２及びＬ３シュート分裂組織層の遺伝子型とは異なるという点で、並びに／又はその植物が、本明細書において上記に定義される目的とされる（第１、第２、及び任意選択でさらなる）形質を含むという点で、認識することができる。本発明はさらに、受精している、すなわち、種子胚を含む周縁キメラ植物を提供する。周縁キメラ植物は、第１の植物又は第２の植物の遺伝子型を有する植物の花粉で受精していることが、好ましい。植物は、台木品種であってもよい。
【０１０３】
周縁植物は、商業に関連する植物であることが好ましいという点において、さらに認識され得る。周縁キメラ植物（又はそれに栄養繁殖的に由来する植物）は、植物産物を生産するために使用することができる。したがって、植物産物を生産するための該周縁キメラ植物（又はそれに栄養繁殖的に由来する植物）の使用また、提供される。より詳細には、第１及び第２の目的とされる形質を含む周縁キメラ植物から、植物産物を生産するための方法であって、
Ａ）上記に定義される第１及び第２の形質を含む、及び／又は上記に定義される周縁キメラ植物を生産するための方法によって得ることができる、周縁キメラ植物を提供するステップと、
Ｂ）ステップＡ）の周縁キメラ植物を成長させるステップと、
Ｃ）ステップＢ）において成長させた植物から植物産物を誘導するステップと、
Ｄ）任意選択で、ステップＣ）において得られた植物産物をさらに処理するステップと
を含む方法が、提供される。
【０１０４】
そのようにして得られた植物産物もまた、提供される。該植物産物は、果実、植物器官、植物の一部（たとえば、葉、根、根端、茎、花、蕾、葯、種子、子実、花粉、胚珠）から選択され得るが、これらに限定されず、植物自体を生じ得ない産物（すなわち、繁殖しないもの）、たとえば、植物油脂、植物油、植物デンプン、及び植物タンパク質画分であってもよい。植物産物は、かならずしも光合成の特性を有するとは限らない。ステップＤ）における該処理は、粉砕、磨砕、又はインタクトなまま、他の材料との混合、乾燥、凍結、及びこれらの任意の組合せから選択され得るが、これらに限定されない。植物産物は、Ｌ１シュート分裂組織層の遺伝子型、並びにＬ２及びＬ３シュート分裂組織層の遺伝子型の存在によって認識することができる。
【０１０５】
本発明の方法又は使用の実施形態において、第１の植物、及び周縁キメラ植物のＬ１シュート分裂組織層は、ソラナム・リコペルシクム近親勾配株と、ソラナム・ペンネリイとの第１世代のＦ１ハイブリッドの遺伝子型を有し、第２の植物、並びに周縁キメラ植物のＬ２シュート及びＬ３シュート分裂組織層は、ソラナム・リコペルシクムの近親交配株の遺伝子型を有する。すべての他の変数は、本明細書において上記に定義されている。この実施形態において、第１の植物、及び周縁キメラ植物のＬ１シュート分裂組織層は、ソラナム・リコペルシクム近親交配株アイルサ・クレイグと、ソラナム・ペンネリイ株ＬＡ７１６との第１世代のＦ１ハイブリッドの遺伝子型を有することが、好ましい。第２の植物、並びに周縁キメラ植物のＬ２シュート及びＬ３シュート分裂組織層は、ソラナム・リコペルシクム栽培種マネーメーカーの近親交配株の遺伝子型を有することが、好ましい。
【０１０６】
本発明の方法又は使用の実施形態において、第１の植物、及び周縁キメラ植物のＬ１シュート分裂組織層は、ソラナム・リコペルシクム近親交配株と、チェリータイプソラナム・リコペルシクム近親交配株との第１世代のＦ１ハイブリッドの遺伝子型を有し、第２の植物、並びに周縁キメラのＬ２シュート及びＬ３シュート分裂組織層は、ビーフ品種のソラナム・リコペルシクムの近親交配株の遺伝子型を有する。すべての他の変数は、本明細書において上記に定義されている。この実施形態において、第１の植物、及び周縁キメラ植物のＬ１シュート分裂組織層は、ソラナム・リコペルシクム近親交配株アイルサ・クレイグと、チェリータイプソラナム・リコペルシクム近親交配株との第１世代のＦ１ハイブリッドの遺伝子型を有することが、好ましい。
【０１０７】
本発明の方法又は使用の実施形態において、第１の植物、及び周縁キメラ植物のＬ１シュート分裂組織層は、ソラナム・リコペルシクム近親勾配株と、ソラナム・ハブロカイテスとの第１世代のＦ１ハイブリッドの遺伝子型を有し、第２の植物、並びに周縁キメラのＬ２シュート及びＬ３シュート分裂組織層は、ソラナム・リコペルシクムの近親交配株の遺伝子型を有する。すべての他の変数は、本明細書において上記に定義されている。この実施形態において、第２の植物、並びに周縁キメラのＬ２シュート及びＬ３シュート分裂組織層は、ソラナム・リコペルシクム栽培種マネーメーカーの近親交配株の遺伝子型を有し、第１の植物、及び周縁キメラ植物のＬ１シュート分裂組織層は、ソラナム・リコペルシクム近親交配株アイルサ・クレイグと、ソラナム・ハブロカイテスアクセッションＰＩ１２７８２６との第１世代のＦ１ハイブリッドの遺伝子型を有することが、好ましい。
【０１０８】
本発明の方法又は使用の実施形態において、第１の植物、及び周縁キメラ植物のＬ１シュート分裂組織層は、ソラナム・リコペルシクム近親勾配株と、ソラナム・ペンネリイとの第１世代のＦ１ハイブリッドを、雄性として続いてソラナム・リコペルシクムの雌性に戻し交雑させて、ＢＣ１集団を生産させたものの遺伝子型を有し、第２の植物、並びに周縁キメラのＬ２シュート及びＬ３シュート分裂組織層は、ソラナム・リコペルシクムの近親交配株の遺伝子型を有する。すべての他の変数は、本明細書において上記に定義されている。第１の植物、及び周縁キメラ植物のＬ１シュート分裂組織層は、ソラナム・リコペルシクム近親交配株ＬＡ３５７９と、ソラナム・ペンネリイとの第１世代のＦ１ハイブリッドを、雄性として続いてソラナム・リコペルシクムＬＡ３５７９の雌性に戻し交雑させて、ＢＣ１集団を生産させたものの遺伝子型を有することが、好ましい。このＢＣ１集団は、コナジラミ抵抗性、任意の父アクセッションに由来する花粉との雌性としての交雑適合性、及びＬＡ３５７９のｘａマーカーの同時表現型発現について選択することが、好ましかった。
【０１０９】
本発明の方法又は使用の実施形態において、第１の植物、及び周縁キメラ植物のＬ１シュート分裂組織層は、ソラナム・リコペルシクム近親勾配株と、ソラナム・ピンピネリフォリウムとの第１世代のＦ１ハイブリッドの遺伝子型を有し、第２の植物、並びに周縁キメラのＬ２シュート及びＬ３シュート分裂組織層は、ソラナム・リコペルシクムの近親交配株の遺伝子型を有する。すべての他の変数は、本明細書において上記に定義されている。この実施形態において、第１の植物、及び周縁キメラ植物のＬ１シュート分裂組織層は、ソラナム・リコペルシクム近親勾配株アイルサ・クレイグと、ソラナム・ピンピネリフォリウムアクセッションＣＧＮ１５５２９３７との第１世代のＦ１ハイブリッドの遺伝子型を有し、第２の植物、並びに周縁キメラのＬ２シュート及びＬ３シュート分裂組織層は、ソラナム・リコペルシクム栽培種マネーメーカーの遺伝子型を有することが、好ましい。
【０１１０】
本開示において、ソラナム・リコペルシクム植物品種アイルサ・クレイグは、アクセッション番号ＬＡ３５７９を有し得、ソラナム・リコペルシクム植物品種マネーメーカーは、たとえば、アクセッションＬＡ２７０６を有し得る。
【実施例】
【０１１１】
本発明を、以下の実施例においてさらに説明する。これらの実施形態は、本発明の範囲を制限するものではなく、単に、本発明を明らかにするよう機能するものである。
【０１１２】
実施例１
コナジラミ（タバココナジラミ、バイオタイプＱ）に抵抗性のトマト植物を、以下のように作製した。Ｆ１ハイブリッドを、コナジラミ抵抗性のアクセッション（ソラナム・ペンネリイＬＡ７１６）及びコナジラミ感受性のアクセッション（ソラナム・リコペルシクムＬＡ３５７９）との間で作製したが、後者は、半優性ｘａ表現型マーカー、市場性のある赤色の果実色、並びにソラナム・リコペルシクムの任意の父アクセッション、株、又はハイブリッドに由来する花粉との雌性としての交雑適合性を含む。Ｆ１ハイブリッドを、コナジラミ抵抗性及びＬＡ３５７９のｘａマーカーの表現型同時発現について選択した。
【０１１３】
結果として得られたＦ１ハイブリッドを穂木として、本明細書においてさらに「感受性対照」と表記される、商業に関連するソラナム・リコペルシクムの感受性近親交配品種に接木し、７日間、接木を癒合させた。接木接合部を、次いで、横方向に切断し、そうすると、カルスの成長及びシュートの再生成が、自発的に生じた。再生成されたシュートの中から、周縁キメラを、表現型マーカーｘａに加えてハイブリッド穂木によってもたらされる高いトリコーム密度を使用して、目視により選択した。半優性マーカーｘａは、ヘテロ接合性条件下において、Ｌ２及び／又はＬ３に存在する場合、黄色の葉をもたらす。所望される種類のキメラは、緑色の葉（栽培種のＬ２及びＬ３）に加えて、高いトリコーム密度（ハイブリッドのＬ１）を有することによって、認識した。このキメラは、葉及び茎において黄色の区域として現れたであろうＬ１細胞のＬ２への自発的な侵入が完全に存在しないことから判断すると、発生の間及び葉腋シュートの挿木苗からの繁殖の間、非常に安定していた。
【０１１４】
このようにして生産した（１つ又は複数の）キメラを、高いタバココナジラミ及びＴＹＬＣＶ（トマト黄化葉巻ウイルス）圧を伴う商用の地中海生育条件（Ｅｌ  Ｅｊｉｄｏ、Ｓｐａｉｎ）下で、温室試験において、コナジラミ抵抗性について試験した。植物を、２．５ヶ月の期間にわたって、植物に存在する成体、卵、幼虫、及び脱皮の数を計数し、これを、抵抗性対照（Ｆ１ハイブリッド）及び感受性対照で比較することによって、抵抗性について高い信頼性でスコア付けした。
【０１１５】
抵抗性対照（Ｆ１ハイブリッド）は、実験の全期間（２．５ヶ月間）にわたって、十分な性能であったことが見出された。これらの植物には、限られた数のコナジラミ（成体及び幼虫の段階）しか検出されず、実験の終わり頃に、植物の頂端部に軽度のＴＹＬＣＶの症状が観察されただけであった。対照的に、感受性植物は、コナジラミ（すべての生存段階）で覆われており、２０１５年１１月４日ほどの早期に、ＴＹＬＣＶの症状を示した。ＴＹＬＣＶの症状は、急速に悪化し、植物は、実験の残りの期間の間、発育が阻止されたままであった（約５０ｃｍ）。
【０１１６】
試験用植物である、ソラナム・ペンネリイ×ソラナム・リコペルシクムのＬ１シュート分裂組織層が移入されたソラナム・リコペルシクムには、コナジラミがほとんどおらず（すべての生存段階、抵抗性対照植物と類似）、成長が強力であり、実験の終わり頃に軽度のＴＹＬＣＶ症状を生じただけであったことは、興味深い。
【０１１７】
図１〜４は、重度に蔓延させた温室において、これらの植物（Ａ、Ｂ、及びＣ）で経時的に観察されたコナジラミの成体、卵、幼虫、及び脱皮の平均数を表す。すべてのデータは、Ａ又はＣの植物を、感受性対照（Ｂ）と比較した場合、有意な差を示す。
【０１１８】
この実験の独立した反復において、少なくとも４つの本葉を含み、上述のように生産させた２０個のキメラ植物を、本明細書において定義されるクリップケージアッセイを使用して、タバココナジラミ抵抗性について試験したが、４８時間後に、タバココナジラミ死亡率には、表１に示されるように、感受性対照植物（ソラナム・リコペルシクム）、Ｆ１ドナー植物、及びキメラ植物の間で明らかな差が見出された。このクリップケージ実験において使用したコナジラミは、４週齢であり（卵−成体の段階）、ワタ植物での同期飼育により得られ、排気装置を用いて収集したものであった。コナジラミを、ＣＯ２で５秒間麻痺させている間に、チューブからクリップケージに移した（クリップケージ１つ当たり６匹の雌性コナジラミ）。４８時間後に、クリップケージを再度開け、コナジラミを再捕捉し、死亡率をスコア付けした。
【０１１９】
【表１】
2020501549.tif 000002
成体の死亡率に加えて、サナギ及び脱皮の数を、３週間後に、これらの植物において判定した。表２に示されるように、卵から脱皮までのコナジラミの発生は、ソラナム・リコペルシクムと比較して、ドナー及びキメラ植物では有意に低く、コナジラミに対する抵抗性のレベルがより高いことを示している。
【０１２０】
【表２】
2020501549.tif 000003
実施例２
コナジラミ（タバココナジラミ、バイオタイプＱ）に抵抗性のトマト植物を、以下のように作製する。Ｆ１ハイブリッドを、コナジラミ抵抗性のアクセッション（ソラナム・ペンネリイＬＡ７１６）及び感受性のアクセッション（ソラナム・リコペルシクムＬＡ３５７９）との間で作製したが、後者は、半優性ｘａ表現型マーカー、市場性のある赤色の果実色、並びにソラナム・リコペルシクムの任意の父アクセッション、株、又はハイブリッドに由来する花粉との雌性としての交雑適合性を含む。結果として得られたＦ１ハイブリッドを雄性として、雌性ソラナム・リコペルシクムＬＡ３５７９に戻し交雑させて、ＢＣ１集団を生産した。このＢＣ１集団を、コナジラミ抵抗性、任意の父アクセッションに由来する花粉との雌性としての交雑適合性、及びＬＡ３５７９のｘａマーカーの同時表現型発現について選択した。
【０１２１】
コナジラミ抵抗性の選択は、実施例１に示されるように行った。加えて、選択には、植物がソラナム・リコペルシクムの花粉を受ける能力が含まれた。後者は、選択した植物に、ソラナム・リコペルシクムの株又はハイブリッドに由来する花粉で受粉させることによって行った。花粉の受容は、そのような受粉が果実及び種子の形成をもたらした場合に、陽性としてスコア付けした。選択した植物を、続いて、３世代及び４世代近親交配させて、それぞれ、ＢＣ１Ｓ３及びＢＣ１Ｓ４集団を生産した。これらの３世代及び４世代のそれぞれにおいて、それぞれ、選択を、上記と同じ様式で、市場性のある赤色の果実色の形質を含めて行い、コナジラミ抵抗性であり、ソラナム・リコペルシクムの花粉と適合性があり、成熟果実に赤色色素を有する植物を得た。コナジラミ（タバココナジラミ）の死亡率を、本明細書において定義されるクリップケージアッセイを使用して試験し、タバココナジラミの死亡率を、５日後に判定した。さらに、産み付けられた卵の数を計数した。コナジラミ（タバココナジラミ）の死亡率は、ＢＣ１Ｓ３植物及びＢＣ１Ｓ４植物では有意に増加していた（図１４）。これらの植物では、観察された卵がほとんどなかったことが、より顕著な点であった（図１５）。
【０１２２】
上述のように選択し、繁殖させた（株の後代又はクローン）コナジラミに抵抗性のこれらのＢＣ１Ｓ３及びＢＣ１Ｓ４植物を、本明細書において以降「ＢＣ１Ｓ３」及び「ＢＣ１Ｓ４」と称し、これらを台木又は穂木として、本明細書において以降「栽培種」と称されるソラナム・リコペルシクムの商業に関連する近親交配品種又はＦ１ハイブリッドに接木した。
【０１２３】
まず、ＢＣ１Ｓ３又はＢＣ１Ｓ４の穂木を栽培種の台木に接木した後、７日間、接木を癒合させることによって、周縁を生産させる。接木接合部を、次いで、横方向に切断し、そうすると、カルスの成長及びシュートの再生成が、自発的に生じる。再生成されたシュートの中から、周縁キメラを、表現型マーカーｘａに加えてＢＣ１Ｓ３及びＢＣ１Ｓ４穂木によってもたらされる高いトリコーム密度を使用して、目視により選択する。半優性マーカーｘａは、ヘテロ接合性条件下において、Ｌ２及び／又はＬ３に存在する場合、黄色の葉をもたらす。所望される種類のキメラは、緑色の葉（栽培種のＬ２及びＬ３）に加えて、高いトリコーム密度（ＢＣ１Ｓ３及びＢＣ１Ｓ４のＬ１）を有することによって、認識する。
【０１２４】
このようにして生産した１つ又は複数のキメラを、上述の方法によって、コナジラミ抵抗性について試験し、周縁キメラ植物の自家受精によって花粉適合性について試験し、赤色果実の形成について試験する。続いて、キメラを、葉腋シュートを挿木苗とすることによって、クローンとして繁殖させる。そのようなクローンの集団は、当該技術分野において一般的な様式で、商用トマト果実生産に使用することができる。
【０１２５】
実施例３
種間Ｆ１ハイブリッドＴＰに由来するトマト種子の発芽特性が、改善された。このＦ１ハイブリッドは、ソラナム・リコペルシクムの母系近親交配株ＴＴを、ソラナム・ペンネリイの父系株ＰＰに交雑させることによって、生産する。
【０１２６】
｛Ｌ３（ＴＴ）、Ｌ２（ＴＴ）、Ｌ１（ＥＰ）｝型の周縁キメラを作製し、ここで、ＴＴ及びＥＰは、二倍体を示す（Ｔ及びＥ及びＰが、半数体である）。ＴＴは、標準的な近親交配トマト（ソラナム・リコペルシクム）品種である。ＥＰは、ソラナム・リコペルシクム近親交配株ＥＥ（栽培種アイルサ・クレイグアクセッションＬＡ３５７９）とソラナム・ペンネリイ株ＰＰ（アクセッションＬＡ７１６）との第１世代のＦ１ハイブリッドである。まず、ＥＰ穂木をＴＴ台木に接木した後、１０日間、接木を癒合させることによって、周縁を生産させた。接木接合部を、次いで、横方向に切断し、そうすると、カルスの成長及びシュートの再生成が、自発的に生じた。再生成されたシュートの中から、周縁キメラを、表現型マーカーｘａに加えてＥＰ穂木によってもたらされる高いトリコーム密度を使用して、目視により選択した。半優性マーカーｘａは、ヘテロ接合性条件下において、Ｌ２及び／又はＬ３に存在する場合、黄色の葉をもたらす。所望される種類のキメラは、緑色の葉（ＴＴのＬ２及びＬ３）に加えて、高いトリコーム密度（ＥＰのＬ１）を有することによって、認識した。このキメラは、葉及び茎において黄色の区域として現れたであろうＬ１細胞のＬ２への自発的な侵入が完全に存在しないことから判断すると、発生の間及び葉腋シュートの挿木苗からの繁殖の間、非常に安定していた。このキメラの交配挙動を、ｘａマーカーの分離比分析を使用して、分析した。５００個のキメラの実生において、ＰＰとの戻し交雑により、黄色の実生は１つも観察されなかった。これらのデータは、このキメラが、遺伝子型Ｔ由来の配偶体を排他的に保持していたこと、及びＥＰ組織が、胞子体の役割しか果たさなかったことを示した。Ｌ１層は、胚珠の外皮を生じ、後に成熟種子の種皮を生じることが周知であるため、キメラの種子発生におけるＥＰの胞子体の役割は、外皮及び種皮のものである。
【０１２７】
種間のＴＰ  Ｆ１ハイブリッド種子を、キメラ並びに非キメラＴＴ植物から生産させた。この目的で、それぞれの６つの植物を、遺伝子型ＴＴの台木に接木して、それらの根系を等しくした。それらを、ＰＰ株由来の花粉で他家受精させて、ＴＰハイブリッド種子（Ｆ１）を生産させた。すべての植物を、４月〜８月の期間、通常の温室で成長させた。交雑は、開花期の直前に花の除雄を行い、１〜２日後に受粉させることによって行った。成熟果実から種子を採取し、０．５％  ＨＣｌ中に１時間浸漬した後、水道水で十分にすすぎ、ろ紙の上で乾燥させ、使用するまで摂氏１０度／相対湿度１０％で保管した。
【０１２８】
種子の３つの発芽特性を定め、測定した。
（ａ）密度
（ｂ）発芽率
（ｃ）発芽能力
【０１２９】
すべての測定は、以下の逐次的な方法で行った。
【０１３０】
（ａ）密度
成熟種子の密度は、その生理学的組成の一次関数である。これは、主として、種皮内の空間を占める胚乳及び胚における代謝化合物の量及び生化学的性質によって決定される。密度（比重）は、スクロース水溶液における液体密度分離によって判定した。約５００個の種子を、メスシリンダーにおいて、水１リットル当たり０、２００、及び４００グラムのスクロースに順番に通過させた。軽い溶液中に沈む種子を収集し、次へ進めた。これにより、低いものから高いものへ、次の４つの密度画分が得られた：０、２００、４００、及び４００＋。これらの画分を、水道水で十分にすすぎ、室温において、ろ紙の上で少なくとも７２時間乾燥させた。１画分当たりの種子の数を計数し、密度クラスにわたる分布を判定した。
【０１３１】
図５に示されるように、非キメラＴＴをＰＰに交雑させることにより作製した種間Ｆ１種子は、キメラをＰＰと交雑させたものとは大きく異なる密度分布を有していた。キメラ交雑とは対照的に、非キメラ交雑は、充填度の低い軽い種子を高比率で有していた。これらの２つの交雑種における胚及び胚乳の遺伝子型は、同一であるため、密度分布における差は、ＥＰ胞子体によって種子に生理学的に付与されたものであると結論付けなければならない。充填度の低い種子の比率が高いことは、ソラナム・リコペルシクム×ソラナム・ペンネリイの交雑種の特徴であり、これらの種間における軽度の種間交雑障壁の現れである。キメラでは、この障壁が有意に緩和されていた。
【０１３２】
（ｂ）発芽率
１００個の種子を、密封したペトリ皿において、湿潤させた（水道水）ろ紙の上の格子状のアレイに蒔き、続いて、人工気候チャンバにおいて、摂氏２３度で１６／２４時間の白色光下においてインキュベートすることによって、発芽率をインビトロで判定した。発芽は、７日間の期間にわたって、目に見える幼根の出現として、２４時間間隔でスコア付けした。次いで、発芽率を、以下の式に従って計算した：発芽率＝（＃１／１）＋（＃２／２）＋……＋（＃７／７）、式中、＃１は、２４時間後に発芽していた種子の数であり、＃２は、４８時間後に発芽していた種子の数である。発芽率の数字が大きいほど、幼根の出現が速い。試験は、種子１００個のサンプルで行った。
【０１３３】
図６は、キメラ植物及びＴＴ対照植物に由来するＦ１種子のインビトロ発芽率試験の結果を示す。未処理の播種バッチのみを播種した、すなわち、播種前に、密度分画は行わなかった。図６から、キメラが、より発芽率の高い播種バッチを生産したことは明らかである。キメラ及びＴＴ対照に由来する胚及び胚乳は、遺伝子的に同一であるため、発芽率の差は、胞子体ＥＰによって生理学的に付与されていると結論付けなければならない。遅い種子発芽は、ソラナム・リコペルシクム×ソラナム・ペンネリイの交雑種の特徴であり、これらの種間における軽度の種間交雑障壁の現れである。キメラでは、この障壁が有意に克服される。
【０１３４】
（ｃ）発芽能力
発芽能力を、上述の（ｂ）部に記載されるものと同じアレイにおいて、１０日後に発芽した種子の総数（％）をスコア付けすることによって、インビトロで測定した。結果を、図７に示す。インビトロでの発芽能力は、キメラの種子では、ＴＴ対照植物と比較して高かった。
【０１３５】
実施例４
種間Ｆ１ハイブリッドＴＨに由来するトマト種子の発芽特性が、改善された。このＦ１ハイブリッドは、ソラナム・リコペルシクムの母系近親交配株ＴＴを、ソラナム・ハブロカイテスに由来する父系株ＨＨに交雑させることによって、生産される。
【０１３６】
｛Ｌ３（ＴＴ）、Ｌ２（ＴＴ）、Ｌ１（ＥＰ）｝型の周縁キメラを作製し、ここで、ＴＴ及びＥＰは、二倍体を示す（Ｔ及びＥ及びＰが、半数体である）。ＴＴは、標準的な近親交配トマト（ソラナム・リコペルシクム）品種である。ＥＰは、標準的なソラナム・リコペルシクム近親交配株ＥＥ（栽培種アイルサ・クレイグアクセッションＬＡ３５７９）とソラナム・ペンネリイ株ＰＰ（アクセッションＬＡ７１６）との第１世代のＦ１ハイブリッドである。まず、ＥＰ穂木をＴＴ台木に接木した後、１０日間、接木を癒合させることによって、周縁を生産させた。接木接合部を、次いで、横方向に切断し、そうすると、カルスの成長及びシュートの再生成が、自発的に生じた。再生成されたシュートの中から、周縁キメラを、表現型マーカーｘａに加えてＥＰ穂木によってもたらされる高いトリコーム密度を使用して、目視により選択した。ヘテロ接合性条件下において存在する半優性マーカーｘａは、Ｌ２及び／又はＬ３に存在する場合、黄色い葉をもたらす。所望される種類のキメラは、緑色の葉（ＴＴのＬ２及びＬ３）に加えて、高いトリコーム密度（ＥＰのＬ１）を有することによって、認識した。このキメラは、葉及び茎において黄色の区域として現れたであろうＬ１細胞のＬ２への自発的な侵入が完全に存在しないことから判断すると、発生の間及び葉腋シュートの挿木苗からの繁殖の間、非常に安定していた。このキメラの交配挙動を、ｘａマーカーの分離比分析を使用して、分析した。５００個のキメラの実生において、ＰＰとの戻し交雑により、黄色の実生は１つも観察されなかった。これらのデータは、このキメラが、遺伝子型Ｔ由来の配偶体を排他的に保持していたこと、及びＥＰ組織が、胞子体の役割しか果たさなかったことを示した。Ｌ１層は、胚珠の外皮を生じ、後に成熟種子の種皮を生じることが周知であるため、キメラの種子発生におけるＥＰの胞子体の役割は、外皮及び種皮のものである。
【０１３７】
キメラ、並びに非キメラＴＴ対照植物を、ＨＨと表記されるソラナム・ハブロカイテスアクセッションＰＩ１２７８２６に由来する花粉で他家受精させて、ＴＨハイブリッド種子（Ｆ１）を生産させた。すべての植物を、４月〜８月の期間、通常の温室で成長させた。交雑は、開花期の直前に花の除雄を行い、１〜２日後に受粉させることによって行った。成熟果実から種子を採取し、０．５％  ＨＣｌ中に１時間浸漬した後、水道水で十分にすすぎ、ろ紙の上で乾燥させ、使用するまで１週間〜数週間、周囲条件で保管した。
【０１３８】
種子の４つの発芽特性を定め、測定した。
（ａ）比重
（ｂ）発芽率
（ｃ）発芽能力
【０１３９】
すべての測定は、以下の逐次的な方法で行った。
【０１４０】
（ａ）比重
成熟種子の密度は、その生理学的組成の一次関数である。これは、主として、種皮内の空間を占める胚乳及び胚における代謝化合物の量及び生化学的性質によって決定される。比重は、スクロース水溶液における液体密度分離によって判定した。約５００個の種子を、メスシリンダーにおいて、水１リットル当たり０、２００、及び４００グラムのスクロースに順番に通過させた。軽い溶液中に沈む種子を収集し、次へ進めた。これにより、低いものから高いものへ、次の４つの密度画分が得られた：０、２００、４００、及び４００＋。これらの画分を、水道水で十分にすすぎ、室温において、ろ紙の上で少なくとも７２時間乾燥させた。１画分当たりの種子の数を計数し、密度画分にわたる分布を判定した。
【０１４１】
図８に示されるように、非キメラＴＴをＨＨに対照交雑させることにより作製した種間Ｆ１種子は、キメラをＨＨと交雑させたものとは異なる密度分布を有していた。対照交雑は、充填度の低い軽い種子を高比率で有していた。これらの２つの交雑種における胚及び胚乳の遺伝子型は、同一であるため、密度分布における差は、ＥＰ胞子体によって種子に生理学的に付与されたものであると結論付けなければならない。充填度の低い種子の比率が高いことは、ソラナム・リコペルシクム×ソラナム・ハブロカイテスの交雑種の特徴であり、これらの種間における種間交雑障壁の現れである。キメラ交雑におけるＥＰ胞子体組織により、これが補正された。
【０１４２】
（ｂ）発芽率
１００個の種子のバッチを、密封したペトリ皿において、湿潤させた（水道水）ろ紙の上の格子状のアレイに蒔き、続いて、人工気候チャンバにおいて、摂氏２３度で１６／２４時間の白色光下においてインキュベートすることによって、発芽率をインビトロで判定した。発芽は、７日間の期間にわたって、目に見える幼根の出現として、２４時間間隔でスコア付けした。次いで、発芽率を、以下の式に従って計算した：発芽率＝（＃１／１）＋（＃２／２）＋……＋（＃７／７）、式中、＃１は、２４時間後に発芽していた種子の数であり、＃２は、４８時間後に発芽していた種子の数である。発芽率の数字が大きいほど、幼根の出現が速い。試験は、種子１００個のサンプル３つで行った。
【０１４３】
図９は、キメラ植物及びＴＴ対照植物で生産されたＦ１種子の発芽率試験の結果を示す。未処理の播種バッチのみを播種した、すなわち、播種前に、密度分画は行わなかった。図９から、キメラが、より発芽率の高い播種バッチを生産したことは明らかである。キメラ及びＴＴ対照に由来する胚及び胚乳は、遺伝子的に同一であるため、発芽率の差は、胞子体ＥＰによって生理学的に付与されていると結論付けなければならない。非常に低い種子発芽は、ソラナム・リコペルシクム×ソラナム・ハブロカイテスの交雑種の特徴であり、これらの種間における種間交雑障壁の現れである。キメラ交雑種におけるＥＰ胞子体組織により、この障壁が緩和された。
【０１４４】
（ｃ）発芽能力
発芽能力を、上述の（ｂ）部に記載されるものと同じアレイにおいて、７日後に発芽した種子の総数（％）をスコア付けすることによって、インビトロで測定した。結果を、図１０に示す。インビトロでの発芽能力は、キメラで作製した種子では、ＴＴ対照植物で作製した種子と比較してさらに高かった。
【０１４５】
実施例５
ビーフ品種ＢＢに由来する近親交配種子の発芽特性が、改善された。ビーフトマト品種は、２つを上回る、好ましくは３つを上回る子房を有する品種として、当該技術分野において公知である。この品種は、ソラナム・リコペルシクムの近親交配株ＢＢの自家受精によって生産される。
【０１４６】
｛Ｌ３（ＢＢ）、Ｌ２（ＢＢ）、Ｌ１（ＥＲ）｝型の周縁キメラを作製し、ここで、ＢＢ及びＥＲは、二倍体を示す（Ｂ及びＥ及びＲが、半数体である）。ＥＲは、ソラナム・リコペルシクム近親交配株ＥＥ（栽培種アイルサ・クレイグアクセッションＬＡ３５７９）とチェリータイプソラナム・リコペルシクム近親交配株ＲＲとの第１世代のＦ１ハイブリッドである。まず、ＥＲ穂木をＢＢ台木に接木した後、１０日間、接木を癒合させることによって、周縁を生産させた。接木接合部を、次いで、横方向に切断し、そうすると、カルスの成長及びシュートの再生成が、自発的に生じた。再生成されたシュートの中から、まず、半優性表現型マーカーｘａ（ＥＲハイブリッドに存在する）を使用して、黄緑色の葉の不完全周縁キメラを目視により特定することによって選択した後、完全に緑色の葉腋枝を選択することによって、周縁キメラを選択した。緑色の枝は、ＢＢをＥＥと区別するＳＮＰマーカーを用いて遺伝子型判定した。ＥＥ  ＳＮＰの存在は、シュートが、ＢＢのＬ２及びＬ３層の上に、遺伝子型ＥＲのＬ１層を保持する周縁キメラであることを示した。このキメラは、本来であれば緑色の組織において黄色の区画として現れたであろうＬ１細胞のＬ２への自発的な侵入が存在しないことから判断すると、発生の間及び葉腋シュートの挿木苗からの繁殖の間、非常に安定していた。
【０１４７】
キメラ、並びに非キメラＢＢ対照植物を、自家受精させた。成熟果実から種子を採取し、０．５％  ＨＣｌ中に１時間浸漬した後、水道水で十分にすすぎ、ろ紙の上で乾燥させ、使用するまで１週間〜数週間、周囲条件で保管した。
【０１４８】
１００個の種子のバッチを、密封したペトリ皿において、湿潤させた（水道水）ろ紙の上の格子状のアレイに蒔き、続いて、人工気候チャンバにおいて、摂氏２３度で１６／２４時間の白色光下においてインキュベートすることによって、発芽率をインビトロで判定した。発芽は、８日間の期間にわたって、目に見える幼根の出現として、２４時間間隔でスコア付けした。図１９で見ることができるように、キメラは、強力に改善された発芽速度及び能力を有する種子を生産した。
【０１４９】
実施例６
Ｆ１ハイブリッドＭＨ２に由来するトマト種子の発芽特性が、改善された。このＦ１ハイブリッドは、ソラナム・リコペルシクムの母系近親交配株ＭＭ（マネーメーカー）を、ソラナム・ハブロカイテスに由来する父系株Ｈ２Ｈ２に交雑させることによって、生産させる。
【０１５０】
｛Ｌ３（ＭＭ）、Ｌ２（ＭＭ）、Ｌ１（ＥＨ１）｝型の周縁キメラを作製し、ここで、ＭＭ及びＥＨ１は、二倍体を示す（Ｍ及びＥ及びＨ１が、半数体である）。ＥＨ１は、ソラナム・リコペルシクム近親交配株ＥＥ（栽培種アイルサ・クレイグアクセッションＬＡ３５７９）とソラナム・ハブロカイテスアクセッションＰＩ１２７８２６との第１世代のＦ１ハイブリッドである。まず、ＥＨ１穂木をＭＭ台木に接木した後、１０日間、接木を癒合させることによって、周縁を生産させた。接木接合部を、次いで、横方向に切断し、そうすると、カルスの成長及びシュートの再生成が、自発的に生じた。再生成されたシュートの中から、まず、半優性表現型マーカーｘａ（ＥＨ１ハイブリッドに存在する）を使用して、黄緑色の葉の不完全周縁キメラを目視により特定することによって選択した後、完全に緑色の葉腋枝を選択することによって、周縁キメラを選択した。緑色の枝は、ＭＭをＥＥと区別するＳＮＰマーカーを用いて遺伝子型判定した。ＥＥ  ＳＮＰの存在は、シュートが、ＭＭのＬ２及びＬ３層の上に、遺伝子型ＥＨ１のＬ１層を保持する周縁キメラであることを示した。そのようなキメラは、さらに、ＥＨ１ハイブリッドの異なるトリコーム構造によって、容易に認識することができる。
【０１５１】
このキメラは、本来であれば緑色の組織において黄色の区画として現れたであろうＬ１細胞のＬ２への自発的な侵入が存在しないことから判断すると、発生の間及び葉腋シュートの挿木苗からの繁殖の間、非常に安定していた。
【０１５２】
キメラ、並びに非キメラＭＭ対照植物を、ソラナム・ハブロカイテス遺伝子型Ｈ２（アクセッションＬＡ１６２５）に由来する花粉で他家受精させて、ＭＨ２ハイブリッド種子を生産させた。交雑は、開花期の直前に花の除雄を行い、１〜２日後に受粉させることによって行った。成熟果実から種子を採取し、０．５％  ＨＣｌ中に１時間浸漬した後、水道水で十分にすすぎ、ろ紙の上で乾燥させ、使用するまで１週間〜数週間、周囲条件で保管した。
【０１５３】
１００個の種子のバッチを、密封したペトリ皿において、湿潤させた（水道水）ろ紙の上の格子状のアレイに蒔き、続いて、人工気候チャンバにおいて、摂氏２３度で１６／２４時間の白色光下においてインキュベートすることによって、発芽率をインビトロで判定した。発芽は、７日間の期間にわたって、目に見える幼根の出現として、２４時間間隔でスコア付けした。図２０で見ることができるように、キメラは、強力に改善された発芽速度及び能力を有する種子を生産した。
【０１５４】
実施例７
Ｆ１ハイブリッドＭＨ２に由来するトマト種子の発芽特性が、改善された。このＦ１ハイブリッドは、ソラナム・リコペルシクムの母系近親交配株ＭＭ（マネーメーカー）を、ソラナム・ハブロカイテスに由来する父系株Ｈ２Ｈ２に交雑させることによって、生産させる。
【０１５５】
｛Ｌ３（ＭＭ）、Ｌ２（ＭＭ）、Ｌ１（ＥＰ１）｝型の周縁キメラを作製し、ここで、ＭＭ及びＥＰ１は、二倍体を示す（Ｍ及びＥ及びＰ１が、半数体である）。ＥＰ１は、ソラナム・リコペルシクム近親交配株ＥＥ（栽培種アイルサ・クレイグアクセッションＬＡ３５７９）とソラナム・ペンネリイアクセッションＬＡ７１６との第１世代のＦ１ハイブリッドである。まず、ＥＰ１穂木をＭＭ台木に接木した後、１０日間、接木を癒合させることによって、周縁を生産させた。接木接合部を、次いで、横方向に切断し、そうすると、カルスの成長及びシュートの再生成が、自発的に生じた。再生成されたシュートの中から、まず、半優性表現型マーカーｘａ（ＥＰ１ハイブリッドに存在する）を使用して、黄緑色の葉の不完全周縁キメラを目視により特定することによって選択した後、完全に緑色の葉腋枝を選択することによって、周縁キメラを選択した。緑色の枝は、ＭＭをＥＥと区別するＳＮＰマーカーを用いて遺伝子型判定した。ＥＥ  ＳＮＰの存在は、シュートが、ＭＭのＬ２及びＬ３層の上に、遺伝子型ＥＰ１のＬ１層を保持する周縁キメラであることを示した。そのようなキメラは、さらに、ＥＰ１ハイブリッドの異なるトリコーム構造によって、容易に認識することができる。
【０１５６】
このキメラは、本来であれば緑色の組織において黄色の区画として現れたであろうＬ１細胞のＬ２への自発的な侵入が存在しないことから判断すると、発生の間及び葉腋シュートの挿木苗からの繁殖の間、非常に安定していた。
【０１５７】
キメラ、並びに非キメラＭＭ対照植物を、ソラナム・ハブロカイテス遺伝子型Ｈ２（アクセッションＬＡ１６２５）に由来する花粉で他家受精させて、ＭＨ２ハイブリッド種子を生産させた。交雑は、開花期の直前に花の除雄を行い、１〜２日後に受粉させることによって行った。成熟果実から種子を採取し、０．５％  ＨＣｌ中に１時間浸漬した後、水道水で十分にすすぎ、ろ紙の上で乾燥させ、使用するまで１週間〜数週間、周囲条件で保管した。
【０１５８】
１００個の種子のバッチを、密封したペトリ皿において、湿潤させた（水道水）ろ紙の上の格子状のアレイに蒔き、続いて、人工気候チャンバにおいて、摂氏２３度で１６／２４時間の白色光下においてインキュベートすることによって、発芽率をインビトロで判定した。発芽は、７日間の期間にわたって、目に見える幼根の出現として、２４時間間隔でスコア付けした。図２１で見ることができるように、キメラは、強力に改善された発芽速度能力を有する種子を生産した。
【０１５９】
実施例８
Ｆ１ハイブリッドＭＰ２に由来するトマト種子の発芽特性が、改善された。このＦ１ハイブリッドは、ソラナム・リコペルシクムの母系近親交配株ＭＭ（マネーメーカー）を、ソラナム・ペンネリイに由来する父系株Ｐ２Ｐ２に交雑させることによって、生産させる。
【０１６０】
｛Ｌ３（ＭＭ）、Ｌ２（ＭＭ）、Ｌ１（ＥＨ１）｝型の周縁キメラを作製し、ここで、ＭＭ及びＥＨ１は、二倍体を示す（Ｍ及びＥ及びＨ１が、半数体である）。ＥＨ１は、ソラナム・リコペルシクム近親交配株ＥＥ（栽培種アイルサ・クレイグアクセッションＬＡ３５７９）とソラナム・ハブロカイテスアクセッションＰＩ１２７８２６との第１世代のＦ１ハイブリッドである。まず、ＥＨ１穂木をＭＭ台木に接木した後、１０日間、接木を癒合させることによって、周縁を生産させた。接木接合部を、次いで、横方向に切断し、そうすると、カルスの成長及びシュートの再生成が、自発的に生じた。再生成されたシュートの中から、まず、半優性表現型マーカーｘａ（ＥＨ１ハイブリッドに存在する）を使用して、黄緑色の葉の不完全周縁キメラを目視により特定することによって選択した後、完全に緑色の葉腋枝を選択することによって、周縁キメラを選択した。緑色の枝は、ＭＭをＥＥと区別するＳＮＰマーカーを用いて遺伝子型判定した。ＥＥ  ＳＮＰの存在は、シュートが、ＭＭのＬ２及びＬ３層の上に、遺伝子型ＥＨ１のＬ１層を保持する周縁キメラであることを示した。そのようなキメラは、さらに、ＥＨ１ハイブリッドの異なるトリコーム構造によって、容易に認識することができる。
【０１６１】
このキメラは、本来であれば緑色の組織において黄色の区画として現れたであろうＬ１細胞のＬ２への自発的な侵入が存在しないことから判断すると、発生の間及び葉腋シュートの挿木苗からの繁殖の間、非常に安定していた。
【０１６２】
キメラ、並びに非キメラＭＭ対照植物を、ソラナム・ペンネリイ遺伝子型Ｐ２（アクセッションＬＡ１８０９）に由来する花粉で他家受精させて、ＭＰ２ハイブリッド種子を生産させた。交雑は、開花期の直前に花の除雄を行い、１〜２日後に受粉させることによって行った。成熟果実から種子を採取し、０．５％  ＨＣｌ中に１時間浸漬した後、水道水で十分にすすぎ、ろ紙の上で乾燥させ、使用するまで１週間〜数週間、周囲条件で保管した。
【０１６３】
１００個の種子のバッチを、密封したペトリ皿において、湿潤させた（水道水）ろ紙の上の格子状のアレイに蒔き、続いて、人工気候チャンバにおいて、摂氏２３度で１６／２４時間の白色光下においてインキュベートすることによって、発芽率をインビトロで判定した。発芽は、７日間の期間にわたって、目に見える幼根の出現として、２４時間間隔でスコア付けした。図２２で見ることができるように、キメラは、強力に改善された発芽速度及び能力を有する種子を生産した。
【０１６４】
実施例９
Ｆ１ハイブリッドＭＰ２に由来するトマト種子の発芽特性が、改善された。このＦ１ハイブリッドは、ソラナム・リコペルシクムの母系近親交配株ＭＭ（マネーメーカー）を、ソラナム・ペンネリイに由来する父系株Ｐ２Ｐ２に交雑させることによって、生産させる。
【０１６５】
｛Ｌ３（ＭＭ）、Ｌ２（ＭＭ）、Ｌ１（ＥＰ１）｝型の周縁キメラを作製し、ここで、ＭＭ及びＥＰ１は、二倍体を示す（Ｍ及びＥ及びＰ１が、半数体である）。ＥＰ１は、ソラナム・リコペルシクム近親交配株ＥＥ（栽培種アイルサ・クレイグアクセッションＬＡ３５７９）とソラナム・ペンネリイアクセッションＬＡ７１６との第１世代のＦ１ハイブリッドである。まず、ＥＰ１穂木をＭＭ台木に接木した後、１０日間、接木を癒合させることによって、周縁を生産させた。接木接合部を、次いで、横方向に切断し、そうすると、カルスの成長及びシュートの再生成が、自発的に生じた。再生成されたシュートの中から、まず、半優性表現型マーカーｘａ（ＥＰ１ハイブリッドに存在する）を使用して、黄緑色の葉の不完全周縁キメラを目視により特定することによって選択した後、完全に緑色の葉腋枝を選択することによって、周縁キメラを選択した。緑色の枝は、ＭＭをＥＥと区別するＳＮＰマーカーを用いて遺伝子型判定した。ＥＥ  ＳＮＰの存在は、シュートが、ＭＭのＬ２及びＬ３層の上に、遺伝子型ＥＰ１のＬ１層を保持する周縁キメラであることを示した。そのようなキメラは、さらに、ＥＰ１ハイブリッドの異なるトリコーム構造によって、容易に認識することができる。
【０１６６】
このキメラは、本来であれば緑色の組織において黄色の区画として現れたであろうＬ１細胞のＬ２への自発的な侵入が存在しないことから判断すると、発生の間及び葉腋シュートの挿木苗からの繁殖の間、非常に安定していた。
【０１６７】
キメラ、並びに非キメラＭＭ対照植物を、ソラナム・ペンネリイ遺伝子型Ｐ２（アクセッションＬＡ１８０９）に由来する花粉で他家受精させて、ＭＨ２ハイブリッド種子を生産させた。交雑は、開花期の直前に花の除雄を行い、１〜２日後に受粉させることによって行った。成熟果実から種子を採取し、０．５％  ＨＣｌ中に１時間浸漬した後、水道水で十分にすすぎ、ろ紙の上で乾燥させ、使用するまで１週間〜数週間、周囲条件で保管した。
【０１６８】
１００個の種子のバッチを、密封したペトリ皿において、湿潤させた（水道水）ろ紙の上の格子状のアレイに蒔き、続いて、人工気候チャンバにおいて、摂氏２３度で１６／２４時間の白色光下においてインキュベートすることによって、発芽率をインビトロで判定した。発芽は、７日間の期間にわたって、目に見える幼根の出現として、２４時間間隔でスコア付けした。図２３で見ることができるように、キメラは、強力に改善された発芽速度能力を有する種子を生産した。
【０１６９】
実施例１０
Ｆ１ハイブリッドＭＰ３に由来するトマト種子の発芽特性が、改善された。このＦ１ハイブリッドは、ソラナム・リコペルシクムの母系近親交配株ＭＭ（マネーメーカー）を、ソラナム・ペンネリイに由来する父系株Ｐ３Ｐ３に交雑させることによって、生産させる。
【０１７０】
｛Ｌ３（ＭＭ）、Ｌ２（ＭＭ）、Ｌ１（ＥＨ１）｝型の周縁キメラを作製し、ここで、ＭＭ及びＥＨ１は、二倍体を示す（Ｍ及びＥ及びＨ１が、半数体である）。ＥＨ１は、ソラナム・リコペルシクム近親交配株ＥＥ（栽培種アイルサ・クレイグアクセッションＬＡ３５７９）とソラナム・ハブロカイテスアクセッションＰＩ１２７８２６との第１世代のＦ１ハイブリッドである。まず、ＥＨ１穂木をＭＭ台木に接木した後、１０日間、接木を癒合させることによって、周縁を生産させた。接木接合部を、次いで、横方向に切断し、そうすると、カルスの成長及びシュートの再生成が、自発的に生じた。再生成されたシュートの中から、まず、半優性表現型マーカーｘａ（ＥＨ１ハイブリッドに存在する）を使用して、黄緑色の葉の不完全周縁キメラを目視により特定することによって選択した後、完全に緑色の葉腋枝を選択することによって、周縁キメラを選択した。緑色の枝は、ＭＭをＥＥと区別するＳＮＰマーカーを用いて遺伝子型判定した。ＥＥ  ＳＮＰの存在は、シュートが、ＭＭのＬ２及びＬ３層の上に、遺伝子型ＥＨ１のＬ１層を保持する周縁キメラであることを示した。そのようなキメラは、さらに、ＥＨ１ハイブリッドの異なるトリコーム構造によって、容易に認識することができる。
【０１７１】
このキメラは、本来であれば緑色の組織において黄色の区画として現れたであろうＬ１細胞のＬ２への自発的な侵入が存在しないことから判断すると、発生の間及び葉腋シュートの挿木苗からの繁殖の間、非常に安定していた。
【０１７２】
キメラ、並びに非キメラＭＭ対照植物を、ソラナム・ペンネリイ遺伝子型Ｐ３（アクセッションＬＡ２６５７）に由来する花粉で他家受精させて、ＭＰ３ハイブリッド種子を生産させた。交雑は、開花期の直前に花の除雄を行い、１〜２日後に受粉させることによって行った。成熟果実から種子を採取し、０．５％  ＨＣｌ中に１時間浸漬した後、水道水で十分にすすぎ、ろ紙の上で乾燥させ、使用するまで１週間〜数週間、周囲条件で保管した。
【０１７３】
１００個の種子のバッチを、密封したペトリ皿において、湿潤させた（水道水）ろ紙の上の格子状のアレイに蒔き、続いて、人工気候チャンバにおいて、摂氏２３度で１６／２４時間の白色光下においてインキュベートすることによって、発芽率をインビトロで判定した。発芽は、７日間の期間にわたって、目に見える幼根の出現として、２４時間間隔でスコア付けした。図２４で見ることができるように、キメラは、強力に改善された発芽速度及び能力を有する種子を生産した。
【０１７４】
実施例１１
温室コナジラミ（トリアレウロデス・バポラリオルム）、Ｔｖ）は、トマト栽培における重大な害虫である。Ｆ１ハイブリッドを、ソラナム・ペンネリイアクセッションＬＡ７１６及びソラナム・リコペルシクムアクセッションＬＡ３５７９の間（ソラナム・ペンネリイ×ソラナム・リコペルシクムのＦ１）、ソラナム・ハブロカイテスアクセッションＰＩ１２７８２６及びソラナム・リコペルシクムアクセッションＬＡ３５７９の間（ソラナム・ハブロカイテス×ソラナム・リコペルシクムのＦ１）、並びにソラナム・ピンピネリフォリウムアクセッションＣＧＮ１５５２９３７及びソラナム・リコペルシクムアクセッションＬＡ３５７９の間（ソラナム・ピンピネリフォリウム×ソラナム・リコペルシクムのＦ１）で、それぞれ、作製した。これらの３つのＦ１ハイブリッドのそれぞれに由来する表皮（Ｌ１）、並びにソラナム・リコペルシクムマネーメーカーに由来するＬ２及びＬ３を有する周縁キメラを、実施例１に詳述されている方法を使用して、作製した。続いて、周縁キメラが、タバココナジラミに対する抵抗性の増加を示すかどうかを判定した。ソラナム・リコペルシクムマネーメーカー及び周縁キメラ（遺伝子型１つ当たり２つの植物）の３０日齢での切穂を、タバココナジラミを蔓延させた温室（夜間の最低温度１８〜２０℃及び日中の最高温度２５〜２６℃）に移した。植物を移してから３週間後に、生存している成体コナジラミの数を判定した（図１３を参照されたい）。この実験により、感受性の栽培トマト（ソラナム・リコペルシクム）とは対照的に、ソラナム・ペンネリイ×ソラナム・リコペルシクムのＦ１に由来するＬ１を有する周縁キメラ、並びにソラナム・ハブロカイテス×ソラナム・リコペルシクムのＦ１に由来するＬ１を有する周縁キメラが、タバココナジラミに対する抵抗性の改善を示したが、ソラナム・ピンピネリフォリウム×ソラナム・リコペルシクムのＦ１のＦ１に由来するＬ１を有する周縁キメラは、その改善を示さなかったことが、示される。図１３には示されていないが、Ｆ１植物におけるタバココナジラミ抵抗性は、ソラナム・ハブロカイテス×ソラナム・リコペルシクム（平均±標準偏差：１６．３±１１．２）、及びソラナム・ピンピネリフォリウム×ソラナム・リコペルシクム（平均±標準偏差：２６．８±６．２）についても試験した。
【０１７５】
実施例１２
アザミウマ（ミカンキイロアザミウマ、Ｆｏ）は、トマト栽培における重大な害虫である。周縁キメラを、Ｌ１としてソラナム・ペンネリイアクセッションＬＡ７１６とソラナム・リコペルシクムアクセッションＬＡ３５７９との交雑によるＦ１に由来するＬ１、並びにソラナム・リコペルシクムマネーメーカーに由来するＬ２及びＬ３を用いて、実施例１に詳述されるように、生産した。続いて、これらの周縁キメラが、ミカンキイロアザミウマに対する抵抗性の増加を示すかどうかを判定した。葉ディスクバイオアッセイを行った。簡単に述べると、ソラナム・リコペルシクムアクセッションマネーメーカー（感受性対照）の葉ディスク、周縁キメラ（対照植物）、及びソラナム・ペンネリイアクセッションＬＡ７１６とソラナム・リコペルシクムアクセッションＬＡ３５７９の交雑により得られたもの（ドナー植物）を、それぞれの遺伝子型に由来する２４個の葉ディスク（直径３０ｍｍ）を使用して、６ウェルプレートに入れた。葉ディスクを、背軸側を上にして、寒天の上に置いた。成体アザミウマを、ＣＯ２で麻酔し、それぞれの葉ディスクの上に、１匹の成体を置いた。それぞれのウェルを、発泡スチロール及びメッシュケージで封止した。プレートを、２５℃、相対湿度６０％で、１６時間の明／８時間の暗の光レジメンで、人工気候制御チャンバに入れた。４８時間後に、成体を取り出し、生存を記録した。接種から６日後、幼虫の数を記録した。
【０１７６】
感受性対照植物とは対照的に、ドナーＦ１植物及び周縁キメラは、ミカンキイロアザミウマに対する抵抗性の改善を示した（図１６）。周縁キメラでは、生存したミカンキイロアザミウマはいなかったことが、最も顕著であった。さらに、感受性対照植物とは対照的に、ドナー植物にも周縁キメラにも、後代は観察されず、これにより、雌性アザミウマによって産み付けられた卵がなかったことが示された（表３）。
【０１７７】
【表３】
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実施例１３
ナミハダニ（テトラニクス・ウルチカエ、Ｔｕ）は、トマト栽培における重大な害虫である。この植物害虫が、昆虫網ではなく、蛛形網に属することに留意することが重要である。
【０１７８】
Ｆ１ハイブリッドを、ソラナム・ペンネリイアクセッションＬＡ７１６とソラナム・リコペルシクムアクセッションＬＡ３５７９との間（ソラナム・ペンネリイ×ソラナム・リコペルシクムのＦ１）、並びにソラナム・ハブロカイテスアクセッションＰＩ１２７８２６とソラナム・リコペルシクムアクセッションＬＡ３５７９との間（ソラナム・ハブロカイテス×ソラナム・リコペルシクムのＦ１）で、それぞれ、作製した。これらの２つのＦ１ハイブリッドのそれぞれに由来する表皮（Ｌ１）、並びにソラナム・リコペルシクムマネーメーカーに由来するＬ２及びＬ３を有する周縁キメラを、実施例１に詳述されている方法を使用して、作製した。
【０１７９】
続いて、周縁キメラが、テトラニクス・ウルチカエに対する抵抗性の増加を示すかどうかを判定した。葉ディスクバイオアッセイを行った。簡単に述べると、ソラナム・リコペルシクムマネーメーカー（感受性対照）及び周縁キメラの葉ディスクを、６ウェルプレートに入れた。それぞれのウェルに、６ｍｌの１％技術用寒天を満たした。遺伝子型１つ当たり４つのプレートを使用した。遺伝子型１つ当たり２４個の葉ディスク（直径３０ｍｍ）を、使用した。葉ディスクを、背軸側を上にして、寒天の上に置いた。１匹の成体ハダニを、それぞれの葉ディスクの上に置いた。それぞれのウェルを、発泡スチロール及びメッシュケージで封止した。プレートを、２５℃、相対湿度６０％で、１６時間の明／８時間の暗の光レジメンで、人工気候制御チャンバに入れた。４８時間後に、成体を取り出し、生存を記録した。同じ時点で、卵の産み付けも記録した。感受性対照植物とは対称的に、周縁キメラは、テトラニクス・ウルチカエに対する抵抗性の改善を示した（表４及び図１７）。
【０１８０】
【表４】
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実施例１４
灰色カビ病（ボトリティス・シネレア、Ｂｃ）は、トマト栽培における重大な疾患である。この病原真菌は、地上の組織に灰色カビ病を引き起こし、トマト果実を販売できなくする。周縁キメラを、Ｌ１としてソラナム・ハブロカイテスアクセッションＰＩ１２７８２６とソラナム・リコペルシクムアクセッションＬＡ３５７９との交雑によるＦ１に由来するＬ１、並びにソラナム・リコペルシクムマネーメーカーに由来するＬ２及びＬ３を用いて、実施例１に詳述されるように、生産した。続いて、キメラ植物が、ボトリティス・シネレアに対する抵抗性の増加を示すかどうかを判定した。切断葉アッセイを行った。簡単に述べると、ソラナム・リコペルシクムマネーメーカー（感受性対照）及び周縁キメラの複葉を、１０Ｅ＋６胞子／ｍＬの液滴３ｕＬで感染させた。平均病変直径（ｍｍ）を、感染の３日後に判定した。感受性対照における疾患の進行と比較した場合、周縁キメラには、ボトリティス・シネレア病変直径に、有意な低減が観察された（図１８）。
【０１８１】
実施例１５
疫病（フィトフトラ・インフェスタンス、Ｐｉ）は、トマト栽培における重大な疾患である。この病原卵菌は、地上の組織に疾患を引き起こし、緑色の組織並びにトマト果実に重大な損傷を引き起こす。実施例１１において詳述されるように生産した周縁キメラ植物を、フィトフトラ・インフェスタンスに対する抵抗性の増加について試験した。切断葉アッセイを行った。簡単に述べると、ソラナム・リコペルシクムマネーメーカー（感受性対照）及び周縁キメラの小葉を、３０００個のフィトフトラ・インフェスタンス胞子で感染させた。小葉１つ当り１５μｌを２滴。平均疾患重症度スコア及び平均病変直径（ｍｍ）を、接種の４日後及び７日後に判定した。７日目に、フィトフトラ・インフェスタンスの胞子形成を示す葉の割合を判定した。表５を参照されたい。
【０１８２】
【表５】
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2020501549.tif 000007
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2020501549.tif 000013
【図７】
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【図８】
2020501549.tif 000015
【図９】
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【図１０】
2020501549.tif 000017
【図１１】
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【図１２】
2020501549.tif 000019
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
2020501549.tif 000025
【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【国際調査報告】
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