(57)【要約】  本開示は、血管のような安定な３次元脈管構造を形成するための方法、およびその使用を提供する。より具体的には、本開示は、スキャフォールド、周皮細胞、または灌流の使用なしに、マトリックス上でＥＴＶ２転写因子をコードする外因性核酸を含む分化型内皮細胞を、その内皮細胞において外因性ＥＴＶ２タンパク質を発現する条件下で培養して、安定な３次元人工血管を形成するための方法を提供する。本開示はまた、機能的３次元血管ネットワークを自律的に形成する能力がある安定な３次元血管、およびその使用を提供する。加えて、本開示は、ＥＴＶ２転写因子をコードする外因性核酸を含む内皮細胞と共に、その内皮細胞において外因性ＥＴＶ２タンパク質を発現する条件下で、オルガノイドまたは脱細胞化器官を培養して、そのオルガノイドまたは脱細胞化器官に脈管導入することにより、オルガノイドおよび脱細胞化器官に脈管導入するための方法を含む。
2020505053.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
安定な３次元血管を産生するための方法であって、
ａ）マトリックス上でＥＴＶ２転写因子をコードする外因性核酸を含む内皮細胞を、該内皮細胞が該ＥＴＶ２転写因子を少なくとも３〜４週間、発現する条件下で培養して、脈管形成を誘導する工程；および
ｂ）前記安定な３次元血管を単離する工程
を含む前記方法。
【請求項２】
工程ａ）の細胞を追加の期間培養する工程をさらに含み、前記さらに培養する工程は、該細胞がＥＴＶ２転写因子を発現しない条件下で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記さらに培養する工程は少なくとも１週間、行われる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記マトリックスは、ラミニン、エンタクチン、コラーゲン、またはそれらの組合せを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記マトリックスは
５．２５ｍｇ／ｍＬの合わせた濃度でのラミニンおよびエンタクチン；ならびに
０．２ｍｇ／ｍＬ  コラーゲンＩＶ
を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記マトリックスはＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記内皮細胞は、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、脂肪由来内皮細胞、または器官特異的内皮細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記器官特異的内皮細胞は、心臓、筋肉、腎臓、精巣、卵巣、リンパ系、肝臓、膵臓、脳、肺、骨髄、脾臓、大腸、および小腸からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記３〜４週間培養する工程は、前記内皮細胞を無血清培地において少なくとも７日間培養することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
無血清培地における前記培養は、大気中（２０％）酸素圧未満で実行される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記酸素圧は５％である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記培養する工程ａ）は、スキャフォールドまたは血管周囲サポートの非存在下で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の方法により産生された安定な３次元血管。
【請求項１４】
３次元血管ネットワークを自律的に形成する能力がある安定な３次元血管。
【請求項１５】
リプログラミング化内皮細胞の少なくとも１つの連続層を有する管状構造を含む、請求項１４に記載の安定な３次元血管。
【請求項１６】
前記リプログラミング化内皮細胞は、ＥＴＶ２をコードする外因性核酸配列を含む、請求項１５に記載の安定な３次元血管。
【請求項１７】
少なくとも２ヶ月間、機能的である、請求項１４に記載の安定な３次元血管。
【請求項１８】
対象において脈管導入を促進するための方法であって、請求項１３に記載の安定な３次元血管を該対象に投与することを含む前記方法。
【請求項１９】
前記投与が、前記対象において機能的３次元血管ネットワークを形成するように、前記対象において前記安定な３次元血管を植え込むことを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記機能的３次元血管ネットワークは、毛細血管、細動脈、細静脈、またはリンパ管を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
オルガノイドに脈管導入するための方法であって、マトリックス上でＥＴＶ２転写因子をコードする外因性核酸を含む内皮細胞と共に、該内皮細胞が該ＥＴＶ２転写因子を発現する条件下で、前記オルガノイドを培養する工程を含む前記方法。
【請求項２２】
マトリックスはラミニン、エンタクチン、コラーゲン、またはそれらの組合せを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
オルガノイドは、小腸オルガノイド、結腸オルガノイド、腎臓オルガノイド、心臓オルガノイド、および腫瘍オルガノイドからなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記培養する工程は、塩基性ＦＧＦ（ＦＧＦ−２）およびヘパリンを含む培地において少なくとも７日間培養することを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記脈管導入オルガノイドを単離する工程をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記単離された脈管導入オルガノイドは対象に投与される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記単離された脈管導入オルガノイドは外科的植え込みにより対象に投与される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記単離された脈管導入オルガノイドを治療剤と接触させ、前記治療剤の効能を決定する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
脱細胞化器官に脈管再導入するための方法であって、ＥＴＶ２転写因子をコードする外因性核酸を含む内皮細胞と共に、該内皮細胞がＥＴＶ２転写因子を発現する条件下で、前記脱細胞化器官を培養する工程を含み、前記培養する工程は、前記脱細胞化器官に脈管導入する、前記方法。
【請求項３０】
前記脱細胞化器官は、心臓、腎臓、精巣、卵巣、骨、リンパ、肝臓、膵臓、脳、肺、骨髄、脾臓、大腸、および小腸からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記脈管導入は、動脈、静脈、毛細血管、細動脈、細静脈、またはそれらの組合せの形成を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記培養する工程はバイオリアクター内で行われる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記脈管導入脱細胞化器官を単離する工程をさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記脈管導入脱細胞化器官を対象に投与する工程をさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
この出願は、２０１７年２月３日に出願された米国仮出願第６２／４５４，１６１号の優先権の恩恵を主張し、その米国仮出願の全内容は参照によって本明細書に組み入れられている。
【０００２】
配列表の参照による組み入れ
２０１８年２月１日に作成され、ＥＦＳ−Ｗｅｂにより米国特許商標局に提出された、８ＫＢの３４６３３＿７６００＿０２＿ＰＣ＿ＰＣＴＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔという名前のＡＳＣＩＩテキストファイルにおける配列表は、参照によって本明細書に組み入れられている。
【０００３】
本開示は一般的に、血管のような安定な３次元脈管構造を形成するための方法に関する。より具体的には、本開示は、安定な３次元人工血管、そのような脈管を形成するためのスキャフォールドを用いない方法、およびその使用を対象とする。
【背景技術】
【０００４】
胚器官形成および組織再生は、機能的な長持ちする血管による脈管導入に依存する。非特許文献１。血管は、組織特異的恒常性を持続させるために、および発生中の組織の適切なパターニングおよび形態形成を導くようにパラクリンのアンジオクライン因子を供給するために、重要である。例えば、非特許文献２；および非特許文献３参照。
【０００５】
血管新生として知られた過程である、傷害器官を修復するために新しい血管の形成を誘導する試みは、困難に直面している。非特許文献４参照。今まで、脈管導入を誘導するための血管新生因子の傷害器官への注射は、長期使用のために機能的な耐久性のある毛細血管を確立するのに効果的ではなかった。さらに、臨床設定への移行のために安定な血管をインビトロで作製するアプローチは、面倒で、かつ時間がかかった。例えば、現在のアプローチは、３次元脈管を形成するためにスキャフォールドの製作、血管周囲の周皮細胞の使用、および血行動態的微小環境を再現するための強制的灌流を必要とする。非特許文献５参照。
【０００６】
加えて、既存のモデルは、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ）のような臨床的に不適合な人工細胞外マトリックスを用い、そのことは、培養中の推定上の毛細血管ネットワークのリモデリングおよびパターニングを制限する。成熟した成体ヒト内皮細胞は、インビトロまたはインビボで、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ）マトリックスにおいて血管ネットワークを形成するが、これらの血管は、安定ではなく、リモデリング潜在能力が限られており、数週間以内に退行する。
【０００７】
ｏｒｇａｎ−ｏｎ−ｃｈｉｐモデルを作製するためのテクノロジー（非特許文献５参照）および３次元バイオプリンティング（非特許文献６参照）は疾患モデリングおよび薬物スクリーニングを驚異的に進歩させた。しかしながら、生理学的に適切な血管細胞をこれらのアプローチへ組み込む能力は後れを取っている。具体的には、このアプローチにおいて、組織特異的上皮細胞および腫瘍細胞との直接的内皮細胞の相互作用は、人工バイオマテリアルにより持ち込まれた物理的制約のせいで制限されている。さらに、このｏｒｇａｎ−ｏｎ−ｃｈｉｐまたは脈管スキャフォールドアプローチは、半透性人工バイオマテリアルの層による分離を必要とし、そのことは、内皮細胞と非血管細胞との間の必須の物理的細胞間相互作用を損ない、それにより、適応性または不適応性の内皮細胞リモデリングを制限する。非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９；および非特許文献１０参照。
【０００８】
スキャフォールド、物理的障壁、および人工マトリックスの使用の必要性が、オルガノイド培養物との内皮細胞クロストークのインビトロ研究、および組織特異的人工脈管構造の移行を制限している。したがって、器官型幹細胞と混じり合い、リモデリングすることができる内皮細胞を用いて、腫瘍オルガノイドもしくは組織特異的オルガノイドまたは脱細胞化器官に脈管導入するための新しいアプローチは、再生、薬物スクリーニング、および腫瘍ターゲティングのための臨床設定への移行を向上させるだろう。
【０００９】
本開示の安定な３次元血管および方法は、現在の人工脈管よりはるかに長い持続時間の間、インビボで完全に機能的である安定な３次元人工血管の形成を決定づける、認識されていないリプログラミング要素を利用する。さらに、本明細書に開示された組成物および方法は、傷害組織、オルガノイド、および脱細胞化器官に脈管導入する能力がある器官特異的血管を生成する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ，Ｐ．およびＪａｉｎ，Ｒ．Ｋ．  Ｎａｔｕｒｅ（２０１１）４７３、２９８〜３０７頁
【非特許文献２】Ｒａｍａｓａｍｙ，Ｓ．Ｋ．ら  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ（２０１５）２５、１４８〜１５７頁
【非特許文献３】Ｒａｆｉｉ，Ｓ．ら  Ｎａｔｕｒｅ（２０１６）５２９、３１６〜３２５頁
【非特許文献４】Ｓａｍｕｅｌ，Ｒ．ら  Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ（２０１５）７、３０９頁
【非特許文献５】Ｈｕｈ，Ｄ．ら  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ（２０１１）２１、７４５〜７５４頁
【非特許文献６】Ｚｈａｎｇ，Ｙ．Ｓ．ら  ＡＣＳ  Ｂｉｏｍａｔｅｒ  Ｓｃｉ  Ｅｎｇ（２０１６）２、１７１０〜１７２１頁
【非特許文献７】Ｇｉｎｓｂｅｒｇ，Ｍ．ら  Ｃｅｌｌ（２０１２）１５１、５５９〜５７５頁
【非特許文献８】Ｓｃｈａｃｈｔｅｒｌｅ，Ｗ．ら  Ｎａｔｕｒｅ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ（２０１７）８、１３９６３頁
【非特許文献９】Ｉｓｒａｅｌｙ，Ｅ．ら  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ（２０１３）１５２１頁
【非特許文献１０】Ｊａｍｅｓ，Ｄ．ら  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２０１０）２８、１６１〜１６６頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本開示は、ＥＴＳ転写因子バリアント２、ＥＴＶ２（ＥＲ７１、ＥＴＳＲＰ７１）が内皮細胞発生を方向づけること、および可塑性、展性、および環境刺激に対する応答性がより高く、加えて、正常上皮細胞および腫瘍細胞を含む他の非血管細胞型を受け容れる原始様内皮細胞へ分化型内皮細胞をリプログラミングすることにおいて一過性ＥＴＶ２発現が必須の役割を果たすことを明らかにしている。より具体的には、本開示の方法および組成物は、細胞外マトリックス成分を含有するマトリックス上で培養された内皮細胞におけるＥＴＶ２転写因子の外因性発現が、結果として、周皮細胞、灌流、および厄介なスキャフォールドの使用なしに、インビトロおよびインビボで、安定かつ機能的な３次元人工血管の形成を生じることを同定している。したがって、本開示は、ラミニン、エンタクチン、および／またはコラーゲンＩＶを含むマトリックスのような、マトリックス上で培養されたリプログラミング化内皮細胞が、インビトロで、加えて、インビボで、長持ちする機能的な３次元人工血管を形成するという発見を対象とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
したがって、本開示の第１の態様は、管腔を有する血管細管のような安定な３次元脈管構造を形成するための方法を対象とする。本明細書に記載された方法の大きな利点は、それらが３次元スキャフォールドを利用せず、それにより、有利なことには、人工３次元血管を形成するために現在必要とされる費用および時間のかかる要素を排除することである。本方法のさらなる利点は、生体適合性マトリックスの同定および使用であり、そのことは、結果として、安定な血管ネットワークのリモデリングおよびパターニングを生じる。このゆえに、本方法は、血管を形成するための既存の方法を損なう現在の欠点の多くを排除する。
【００１３】
本開示の一実施形態において、内皮細胞が、少なくとも３週間、ＥＴＶ２転写因子タンパク質を発現するように、ＥＴＶ２転写因子をコードする外因性核酸を含む内皮細胞をマトリックス上で培養することを含む、安定な３次元血管を形成するための方法が提供される。
【００１４】
分化型内皮細胞におけるＥＴＶ２転写因子タンパク質の外因性発現は、分化型内皮細胞をリプログラミングし、管腔を有する血管のような安定な機能的３次元脈管構造へ自己集合する能力をそれらに提供し、その後、その脈管構造は、単離され、例えば、傷害組織の脈管導入、オルガノイドの脈管導入、または脱細胞化器官の脈管再導入のようないくつもの目的のために用いることができる。したがって、いくつかの実施形態において、本方法に用いられる内皮細胞は分化型内皮細胞である。ある特定の実施形態において、分化型内皮細胞はヒト内皮細胞である。特定の実施形態において、分化型ヒト内皮細胞はヒト臍帯静脈由来内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、ヒト脂肪由来内皮細胞、または組織／器官特異的ヒト内皮細胞である。本方法のいくつかの実施形態において、分化型内皮細胞は、器官特異的内皮細胞であり、それには、心臓、腎臓、精巣、卵巣、網膜、肝臓、膵臓、脳、肺、脾臓、大腸、または小腸の内皮細胞が含まれるが、それらに限定されない。他の実施形態において、分化型内皮細胞は、筋肉、リンパ組織、嗅覚組織、造骨組織、口腔（歯）組織、または腺組織（例えば、内分泌腺、胸腺）由来の組織特異的内皮細胞である。
【００１５】
本方法のある特定の実施形態において、外因性ＥＴＶ２コード核酸は、内皮細胞内に存在する。一実施形態において、外因性ＥＴＶ２コード核酸は、配列番号１に示されたヒトＥＴＶ２遺伝子ヌクレオチド配列に対応し、それは、配列番号２に示されているようなアミノ酸配列を有するヒトＥＴＶ２転写因子タンパク質をコードする。他の実施形態において、外因性ＥＴＶ２コード核酸は、ＥＴＶ２転写因子タンパク質をコードするＥＴＶ２リボソーム核酸（ＲＮＡ）転写産物である。
【００１６】
ある特定の実施形態において、外因性ＥＴＶ２核酸は、トランスフェクションまたは形質導入により内皮細胞へ提供される。特定の実施形態において、ＥＴＶ２をコードする核酸は、レンチウイルスベクターのようなウイルスベクターを用いて、内皮細胞へ形質導入される。一実施形態において、外因性ＥＴＶ２転写因子コード核酸は、例えば、リバースｔｅｔトランス活性化因子（ｒｔＴＡ）−ドキシサイクリン誘導性発現系のような誘導性発現系を用いて分化型内皮細胞へ提供される。
【００１７】
いくつかの実施形態において、本方法は、外因性ＥＴＶ２コード核酸を含む内皮細胞を、ＥＴＶ２転写因子タンパク質を発現する条件下で培養することを含む。ＥＴＶ２タンパク質は、構成的に、または一過性に発現することができる。ある場合では、外因性ＥＴＶ２転写因子は、分化型内皮細胞において少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも７週間、少なくとも８週間、またはそれより長い間、発現して、分化型内皮細胞をリプログラミングし、かつ管腔を有する血管形成を誘導する。特定の実施形態において、外因性ＥＴＶ２タンパク質は、少なくとも３〜４週間、発現して、血管形成を誘導する。
【００１８】
他の実施形態において、本方法は、外因性ＥＴＶ２コード核酸を有する内皮細胞を、ＥＴＶ２転写因子タンパク質を発現する条件下で培養し、その後、該内皮細胞が外因性ＥＴＶ２を発現しない条件下でのさらなる培養期間が続くことを含む。この場合、内皮細胞は、まず、第１の期間、外因性ＥＴＶ２転写因子を発現する条件下で培養し、その後、誘導性プロモーターを活性化する能力がある物質（例えば、ドキシサイクリン、テトラサイクリン）の非存在下のような外因性ＥＴＶ２を発現しない条件下で第２の培養を行うことができる。場合によっては、本方法は、外因性ＥＴＶ２コード核酸を有する内皮細胞を、ＥＴＶ２転写因子タンパク質を一過性に発現する条件下で（例えば、ドキシサイクリンの存在下で）、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも７週間、少なくとも８週間、またはそれより長い間培養し、その後、ドキシサイクリンの非存在下のような外因性ＥＴＶ２を発現しない条件下で、数日間、数週間、または数ヶ月間、第２の培養を行うことを含む。
【００１９】
本方法のいくつかの実施形態において、外因性ＥＴＶ２コード核酸を含む内皮細胞はマトリックス上で培養される。ある特定の実施形態において、マトリックスは、ラミニン、エンタクチン、およびコラーゲンのような定義済みの細胞外マトリックス成分で構成される。特定の実施形態において、本方法に用いられるマトリックスは、ラミニン、エンタクチン、およびコラーゲンＩＶの組合せ（Ｌ．Ｅ．Ｃ．）で構成される。一実施形態において、マトリックスは、ラミニンおよびエンタクチンを少なくとも５ｍｇ／ｍＬの合わせた濃度で含み得る。例示的な実施形態において、ＥＴＶ２発現内皮細胞は、ラミニンおよびエンタクチンを５ｍｇ／ｍＬの合わせた濃度で含むマトリックス上で培養される。ラミニンおよびエンタクチンは、お互いに結合して、複合体を形成することができるので、マトリックスは、ラミニンとエンタクチンの複合体を含み得る。例えば、マトリックスは、少なくとも５ｍｇ／ｍＬのラミニンとエンタクチンの複合体を含み得る。例えば、内皮細胞は、少なくとも５ｍｇ／ｍＬの濃度でのラミニンとエンタクチンの複合体、および少なくとも０．２ｍｇ／ｍＬ  コラーゲンＩＶを含有するマトリックス上で培養されて、長持ちする機能的３次元人工血管を形成することができる。特定の実施形態において、内皮細胞は、５．２５ｍｇ／ｍＬの合わせた濃度でのラミニンおよびエンタクチン、ならびに０．２ｍｇ／ｍＬ  コラーゲンＩＶで構成されるマトリックス上で培養される。他の実施形態において、マトリックスはＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ）である。
【００２０】
本方法の一実施形態において、外因性ＥＴＶ２コード核酸を含む内皮細胞は、無血清培地において培養される。いくつかの実施形態において、本方法は、内皮細胞を無血清培地において少なくとも７日間、少なくとも１０日間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも７週間、少なくとも８週間、またはそれより長い間培養することを含む。他の実施形態において、本方法は、外因性ＥＴＶ２コード核酸を含む内皮細胞を無血清培地において低酸素圧、すなわち、大気中酸素圧（２０％酸素圧）未満で、培養することを含む。特定の実施形態において、細胞は、無血清培地において、４％から１５％の間、５％から１０％の間、４％から８％の間、または４％から６％の間の酸素圧で培養される。一実施形態において、細胞は、無血清培地において、５％の酸素圧で少なくとも７日間培養される。
【００２１】
いくつかの実施形態において、本方法は、外因性ＥＴＶ２コード核酸を含む内皮細胞を、マトリックス上で、ＥＴＶ２転写因子を発現する条件下で培養して、管腔を有する安定な３次元血管の形成を誘導する工程、および該安定な３次元血管を単離する工程を含む。
【００２２】
本開示はまた、分化型内皮細胞におけるＥＴＶ２タンパク質の外因性発現が、周皮細胞、灌流、およびスキャフォールドの非存在下でインビトロおよびインビボで、機能的血管ネットワークを形成する能力を有する安定な機能的３次元血管の自律的自己集合をもたらすことを明らかにしている。
【００２３】
したがって、本開示の別の態様において、３次元血管ネットワークを自律的に形成する能力がある安定な３次元血管が提供される。
【００２４】
ある特定の実施形態において、本開示の安定な３次元血管は、リプログラミング化内皮細胞の少なくとも１つの連続層で構成される、管腔を有する脈管のような管状構造を含む。いくつかの実施形態において、リプログラミング化内皮細胞は、外因性ＥＴＶ２転写因子コード核酸を含有する。
【００２５】
ある特定の実施形態において、安定な３次元血管の内皮細胞は、外因性ＥＴＶ２転写因子コード核酸を発現する。一実施形態において、ＥＴＶ２転写因子の発現は、一過性であり、すなわち、数日間、数週間、または数ヶ月間のような限りのある期間の間においてである。特定の実施形態において、ＥＴＶ２転写因子の一過性発現は、例えば、リバースｔｅｔトランス活性化因子（ｒｔＴＡ）−ドキシサイクリン誘導性発現系のような、誘導性発現系により調節される。他の実施形態において、本開示の安定な３次元血管は、外因性ＥＴＶ２転写因子を構成的に（すなわち、永久に）発現する内皮細胞を含有する。他の実施形態において、安定な３次元血管は、外因性ＥＴＶ２転写因子を発現する内皮細胞および外因性ＥＴＶ２を発現しない内皮細胞の組合せで構成される。さらに別の実施形態において、安定な３次元血管は、外因性ＥＴＶ２転写因子を発現しないリプログラミング化内皮細胞で構成される。
【００２６】
いくつかの実施形態において、本開示の安定な３次元血管が単離される。この場合、血管は、それが形成された環境から全部または一部、取り出される。ある特定の実施形態において、単離された安定な３次元血管は、培地、培地成分および添加物、ならびにそれが形成された任意のマトリックス、例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）またはＬ．Ｅ．Ｃ．マトリックスを含まない。他の実施形態において、本開示の単離された安定な３次元血管は、培地、培地成分および添加物から取り出されているが、例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）またはＬ．Ｅ．Ｃ．マトリックスのようなマトリックスの少なくとも一部分を含む。
【００２７】
本開示の一実施形態において、安定な３次元血管は機能的である。特定の実施形態において、機能的な安定な３次元血管は、その血管の中に流体を通過させる（灌流する）能力がある。他の実施形態において、機能的で安定な３次元血管は、その血管の中に血液を通過させる能力がある。さらに別の実施形態において、機能的で安定な３次元血管は、３次元血管ネットワークを形成する能力がある。一実施形態において、安定な３次元血管は、血液を組織へ輸送する能力がある、少なくとも１つの毛細血管、少なくとも１つの細動脈、少なくとも１つの細静脈、少なくとも１つのリンパ性血管、またはそれらの組合せを含む機能的３次元血管ネットワークを形成する（組織に脈管導入する）。
【００２８】
いくつかの実施形態において、本開示の機能的で安定な３次元血管は、少なくとも１ヶ月間、少なくとも２ヶ月間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも４ヶ月間、少なくとも５ヶ月間、またはそれより長い間、機能的である。特定の実施形態において、本開示の安定な３次元血管は、血管形成後４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、１３週間、１４週間、１５週間、１６週間、１７週間、１８週間、１９週間、２０週間、またはそれより長い間、安定である。
【００２９】
本開示は、外因性ＥＴＶ２を含む内皮細胞が、インビボで脈管導入する能力があるパターニングされた安定な人工血管へ自律的に組織化することを示しているので、本開示はまた、脈管導入を促進するための方法を提供する。このゆえに、別の態様において、安定な３次元血管を対象に投与することを含む、対象において脈管導入を促進するための方法が提供される。いくつかの実施形態において、対象は、脈管導入することを必要としている器官のような傷害組織を有する。特定の実施形態において、対象は、傷害心臓組織、傷害肝臓組織、傷害リンパ組織、傷害腎臓組織、傷害精巣組織、傷害卵巣組織、傷害網膜、傷害膵臓組織、傷害脳組織、傷害肺組織、傷害腸組織、傷害腺組織、傷害筋肉組織、またはそれらの組合せを有する。
【００３０】
一実施形態において、本方法は、脈管導入を必要としている対象の傷害組織への外科的植え込みにより対象へ安定な３次元血管を投与することを含む。特定の実施形態において、安定な３次元血管は、傷害器官またはその組織へ直接的に植え込まれる。他の実施形態において、本方法は、例えば、傷害組織への直接的な注射のような注射により、対象へ安定な３次元血管を投与することを含む。ある特定の実施形態において、安定な３次元血管は、静脈内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、またはそれらの組合せにより対象へ投与される。
【００３１】
いくつかの実施形態において、対象において脈管導入を促進する方法は、インビトロで形成された少なくとも１つの安定な３次元血管を対象へ投与することを含む。他の実施形態において、方法は、インビトロで形成された本開示の２つまたはそれ以上の安定な３次元血管の投与を含む。特定の実施形態において、本方法は、傷害組織のような脈管導入を必要としている組織へ直接的に、ラミニン、エンタクチン、およびコラーゲンＩＶで構成されたマトリックス上の複数の安定な３次元血管の投与を含む。
【００３２】
いったん安定な３次元血管が対象へ投与されたならば、その機能的で安定な３次元血管は、内因性組織に脈管導入する能力がある３次元血管ネットワークを確立する。いくつかの実施形態において、安定な３次元血管は、血液を組織へ輸送する能力がある、少なくとも１つの毛細血管、少なくとも１つの細動脈、少なくとも１つの細静脈、少なくとも１つのリンパ性血管、またはそれらの組合せを含む３次元血管ネットワークを形成する。
【００３３】
本開示の別の態様において、オルガノイドに脈管導入するための方法が提供される。この場合、オルガノイドに脈管導入するための方法は、オルガノイドを、マトリックス上で、ＥＴＶ２転写因子をコードする外因性核酸を含む内皮細胞と共に、内皮細胞において外因性ＥＴＶ２タンパク質を発現する条件下で培養して、オルガノイド上に安定な３次元血管ネットワークを形成することを含む。
【００３４】
いくつかの実施形態において、オルガノイドに脈管導入するための方法は、オルガノイドをマトリックス上で内皮細胞と共に培養することを含む。ある特定の実施形態において、マトリックスは、ラミニン、エンタクチン、およびコラーゲンのような定義済みの細胞外マトリックス成分で構成される。特定の実施形態において、本方法に用いられるマトリックスは、ラミニン、エンタクチン、およびコラーゲンＩＶの組合せ（Ｌ．Ｅ．Ｃ．）で構成される。一実施形態において、マトリックスは、ラミニンおよびエンタクチンを少なくとも５ｍｇ／ｍＬの合わせた濃度で含み得る。例示的な実施形態において、オルガノイドは、ラミニンおよびエンタクチンを５ｍｇ／ｍＬの合わせた濃度で含むマトリックス上で内皮細胞と共に培養される。ラミニンおよびエンタクチンは、お互いに結合して、複合体を形成することができるので、マトリックスは、ラミニンとエンタクチンの複合体を含み得る。例えば、マトリックスは、少なくとも５ｍｇ／ｍＬのラミニンとエンタクチンの複合体を含み得る。例えば、オルガノイドに脈管導入するために、内皮細胞を、少なくとも５ｍｇ／ｍＬの濃度でのラミニンとエンタクチンの複合体、および少なくとも０．２ｍｇ／ｍＬ  コラーゲンＩＶを含有するマトリックス上で培養することができる。特定の実施形態において、マトリックスは、５．２５ｍｇ／ｍＬの合わせた濃度でのラミニンおよびエンタクチン、ならびに０．２ｍｇ／ｍＬ  コラーゲンＩＶで構成される。他の実施形態において、マトリックスはＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ）である。
【００３５】
一実施形態において、オルガノイドに脈管導入するための方法は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を含む培地において、オルガノイドをマトリックス上で内皮細胞と共に培養することを含む。特定の実施形態において、培地は、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ２）を含む。いくつかの実施形態において、培地はヘパリンを含む。特定の実施形態において、オルガノイドに脈管導入するための方法は、ＦＧＦ２およびヘパリンを含む培地において、オルガノイドを、マトリックス上で内皮細胞と共に培養することを含む。
【００３６】
オルガノイド、およびＥＴＶ２転写因子をコードする外因性核酸を含む内皮細胞は、マトリックス上で、内皮細胞において外因性ＥＴＶ２タンパク質を発現する条件下で、オルガノイドに機能的３次元血管ネットワークの形成を誘導する、すなわち、オルガノイドへ脈管導入するのに必要な任意の期間培養することができる。例えば、ある特定の実施形態において、オルガノイドおよび分化型内皮細胞が、内皮細胞をリプログラミングし、オルガノイドに、パターニングされた長持ちする人工脈管の形成を誘導するように、少なくとも１週間（７日間）、少なくとも１０日間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも７週間、少なくとも８週間、またはそれより長い間培養される。いくつかの実施形態において、脈管導入オルガノイドは、オルガノイドに渡って血液を輸送する能力がある、少なくとも１つの毛細血管、少なくとも１つの細動脈、少なくとも１つの細静脈、少なくとも１つのリンパ性血管、またはそれらの組合せを含む３次元血管ネットワークを有する。
【００３７】
オルガノイドに脈管導入するための本方法は、任意の型のオルガノイドに適用することができる。例えば、本方法に用いられるオルガノイドは、小腸オルガノイド、結腸オルガノイド、腎臓オルガノイド、心臓オルガノイド、または腫瘍オルガノイドであり得る。いくつかの実施形態において、その方法は、腫瘍オルガノイドに脈管導入するために用いることができ、それにより、腫瘍オルガノイドは、乳がんオルガノイド、結腸がんオルガノイド、腎臓がんオルガノイド、または腸がんオルガノイドなど、組織特異的であり得る。
【００３８】
本開示の脈管導入オルガノイドを、いくつもの目的のために当業者が用いることができる。したがって、いくつかの実施形態において、オルガノイドに脈管導入するための本方法は、脈管導入オルガノイドを単離することを含む。
【００３９】
いったん脈管導入オルガノイドが得られたならば、脈管導入オルガノイドは、ヒトまたは動物（例えば、マウス、ラット、イヌ、サル）のような対象へ投与することができる。特定の実施形態において、脈管導入オルガノイドは、外科的植え込みによりマウスへ投与することができる。
【００４０】
他の実施形態において、単離された脈管導入オルガノイドは、治療剤の効能を決定するために用いることができる。この場合、脈管導入オルガノイドを、治療剤と接触させ、治療剤の存在下で、ある期間培養する。その後、培養中、オルガノイド機能、細胞の増殖および健康状態を分析して、治療剤の効能を決定することができる。
【００４１】
本開示はまた、ＥＴＶ２転写因子をコードする外因性核酸を含む内皮細胞と共に脱細胞化器官を、内皮細胞において外因性ＥＴＶ２タンパク質を発現する条件下で培養することが、結果として、脱細胞化器官に機能的脈管構造の発生を生じることを明らかにしている。したがって、本開示の一態様は、脱細胞化器官に脈管再導入するための方法を提供する。
【００４２】
いくつかの実施形態において、脱細胞化器官に脈管再導入するための方法は、脱細胞化器官を、マトリックス上でリプログラミング化内皮細胞と共に培養することを含む。特定の実施形態において、本方法に用いられるマトリックスは、ラミニン、エンタクチン、およびコラーゲンＩＶの組合せ（Ｌ．Ｅ．Ｃ．）で構成される。ある特定の実施形態において、マトリックスは、ラミニン、エンタクチン、およびコラーゲンのような定義済みの細胞外マトリックス成分で構成される。一実施形態において、マトリックスは、ラミニンおよびエンタクチンを少なくとも５ｍｇ／ｍＬの合わせた濃度で含み得る。例示的な実施形態において、器官は、ラミニンおよびエンタクチンを５ｍｇ／ｍＬの合わせた濃度で含むマトリックス上で内皮細胞と共に培養される。マトリックスは、少なくとも５ｍｇ／ｍＬのラミニンとエンタクチンの複合体を含み得る。例えば、器官に脈管導入するために、内皮細胞を、少なくとも５ｍｇ／ｍＬの濃度でのラミニンとエンタクチンの複合体、および少なくとも０．２ｍｇ／ｍＬ  コラーゲンＩＶを含有するマトリックス上で培養することができる。特定の実施形態において、マトリックスは、５．２５ｍｇ／ｍＬの合わせた濃度でのラミニンおよびエンタクチン、ならびに０．２ｍｇ／ｍＬ  コラーゲンＩＶで構成される。他の実施形態において、マトリックスはＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ）である。
【００４３】
いくつかの実施形態において、脱細胞化器官に脈管再導入するための方法は、バイオリアクターにおける脱細胞化器官を、マトリックス上の内皮細胞と共に、外因性ＥＴＶ２転写因子タンパク質を発現する条件下で培養することを含む。
【００４４】
一実施形態において、脱細胞化器官に脈管再導入するための方法は、脱細胞化器官を、マトリックス上で内皮細胞と共に、内皮細胞において外因性ＥＴＶ２タンパク質を発現する条件下で、脱細胞化器官に機能的３次元血管ネットワークの形成を誘導する、すなわち、その器官に脈管再導入するのに必要な任意の期間培養することを含む。例えば、ある特定の実施形態において、脱細胞化器官およびリプログラミング化内皮細胞が、内皮細胞が脱細胞化器官上で、管腔を有する長持ちする脈管へと組織化することを誘導するように、少なくとも１週間（７日間）、少なくとも１０日間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも７週間、少なくとも８週間、またはそれより長い間培養される。他の実施形態において、内皮細胞は、脱細胞化器官に、その器官に渡って血液を輸送する能力がある、少なくとも１つの毛細血管、少なくとも１つの細動脈、少なくとも１つの細静脈、少なくとも１つのリンパ性血管、またはそれらの組合せを含む機能的３次元血管ネットワークを形成する。
【００４５】
本方法は、任意の型の脱細胞化器官に適用することができる。例えば、内皮細胞は、脱細胞化した心臓、腎臓、精巣、卵巣、網膜、骨、内分泌腺、甲状腺、気管、リンパ節、肝臓、膵臓、脳、肺、脾臓、大腸、または小腸のような脱細胞化器官上で、内皮細胞において外因性ＥＴＶ２タンパク質を発現する条件下で培養することができる。
【００４６】
本開示の脈管再導入器官を、いくつもの目的のために当業者が用いることができる。したがって、いくつかの実施形態において、脱細胞化器官に脈管再導入するための本方法は、脈管再導入器官を単離することを含む。例示的な実施形態において、脈管再導入器官を単離し、その後、ヒトまたは動物（例えば、マウス、ラット、イヌ、サル）のような対象へ投与することができる。特定の実施形態において、脈管再導入脱細胞化器官は、単離され、外科的植え込みによりヒト対象へ投与される。
【００４７】
他の実施形態において、単離された脈管再導入脱細胞化器官は、治療剤の効能を決定するために用いることができる。この場合、脈管再導入脱細胞化器官を、治療剤と接触させ、治療剤の存在下で、ある期間培養する。その後、培養中、器官機能、細胞の増殖および健康状態を分析して、治療剤の効能を決定することができる。
【００４８】
この特許のファイルは、カラーで作成された少なくとも１枚の図面を含有する。カラー図面を含むこの特許のコピーは、依頼および必要な料金の支払いにより、特許商標局により提供されるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１−１】図１Ａ〜１Ｍは、外因性ＥＴＶ２を含むリプログラミング化内皮細胞は、インビトロで、安定な３次元の機能的で、管腔を有する人工血管へと自己集合する。Ａ．対照−ＨＵＶＥＣ（ＣＴＲＬ−ＥＣ）またはｌｅｎｔｉ−ＥＴＶ２形質導入ＨＵＶＥＣ（Ｒ−ＶＥＣ）の単層が、ＶＥＣＡＤ、ＥＴＶ２、およびＤＡＰＩについて染色されたことを示す図である。Ｂ．ＥＴＶ２、ＶＥＧＦＲ２、および転写因子Ｆｌｉ１についての対照−ＥＣまたはＲ−ＶＥＣのウェスタンブロット分析を示す図である。ＧＡＰＤＨが負荷対照として用いられた。Ｃ．外因性ＥＴＶ２を発現する内皮細胞（Ｒ−ＶＥＣ）により形成された１２週間目の管におけるＶＥＣＡＤおよびＥＴＶ２についての免疫染色を示す図である。Ｄ．ＣＴＲＬ−ＥＣとＲ−ＶＥＣの両方についての２４時間から８週間までの管形成の時間経過の画像である。Ｅ．１６週間目におけるＲ−ＶＥＣ脈管のウェル全体の概観の図であり、組織化された血管網の存在が実証されている。Ｆ．１２週間の培養を通しての様々な時点における脈管密度の定量化を示す図である。Ｇ．Ｒ−ＶＥＣ、またはＥＴＳ１もしくはｍｙｒＡＫＴを形質導入された内皮細胞を用いた場合の脈管形成の定量化を示す図である。Ｈ．Ｍａｔｒｉｇｅｌ上での脈管形成アッセイにおけるＥＴＳ１またはｍｙｒＡＫＴ１形質導入ＨＵＶＥＣについての代表的な画像を示す図である。Ｉ．外因性ＥＴＶ２を発現する内皮細胞（Ｒ−ＶＥＣ）により形成された人工脈管の、ポドカリキシン（頂端膜側、赤色）およびラミニン（基底膜側、緑色）での適切な管腔極性についての免疫染色を示す図である。Ｊ．８週間目／１２週間目時点における外因性ＥＴＶ２を発現する内皮細胞により形成された無傷の管腔人工脈管の存在を示す電子顕微鏡観察を示す図である。Ｋ．ＣＴＲＬ−ＥＣとＲ−ＶＥＣの両方についての１週間目および４週間目における細胞外マトリックスタンパク質の異なる混合物のスクリーニングの定量化を示す図である。Ｌ．８週間目時点までの、Ｒ−ＶＥＣを用いた、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ｃｏｒｎｉｎｇ）またはラミニン／エンタクチン／コラーゲンＩＶ（Ｌ．Ｅ．Ｃ．）マトリックス上での脈管形成の長期間の脈管定量化を示す図である。Ｍ．電子顕微鏡観察により示されているように、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）とＬ．Ｅ．Ｃ．マトリックスの両方が用いられた場合、外因性ＥＴＶ２を発現する内皮細胞（Ｒ−ＶＥＣ）により形成された人工脈管に管腔が存在することを示す図である。ｎｓ＝有意性なし、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図１−２】図１−１の続き。
【図１−３】図１−２の続き。
【図１−４】図１−３の続き。
【図２】図２Ａ〜２Ｂは、安定な３次元血管はインビトロで機能的である。Ａ．赤色蛍光標識ビーズでの灌流により、脈管耐久性および機能性が示された図である。Ｂ．マイクロ流体デバイスにおける、培養後６日目での脈管密度の定量化を示す図である。＊Ｐ＜０．０５。
【図３−１】図３Ａ〜３Ｍは、外因性ＥＴＶ２を含む内皮細胞は、インビボで脈管導入する能力がある、パターニングされた長持ちする血管へと組織化する。Ａ．２ヶ月目における、ＣＴＲＬ−ＥＣを含有するプラグ、およびＥＴＶ２を発現するリプログラミング化内皮細胞（Ｒ−ＶＥＣ）を含有するプラグの画像である。Ｂ〜Ｃ．ラミニン／エンタクチン／コラーゲンＩＶ（Ｌ．Ｅ．Ｃ．）マトリックスおよび内皮細胞を含むプラグが２ヶ月目時点および５ヶ月目時点に単離され、Ｒ−ＶＥＣプラグが、ＣＴＲＬ−ＥＣ含有プラグと比較されたという、全載共焦点画像である。ヒト内皮細胞に特異的で、かつＡｌｅｘａ６４７（白色）にコンジュゲートされたモノクローナルＶＥＣＡＤ抗体が、屠殺前にマウスにおいて後眼窩に注射された（生体内注射）。Ｄ．１ヶ月目および２ヶ月目における切片におけるパーセント蛍光強度として測定された脈管密度の定量化を示す図である。Ｅ．１週間目、１ヶ月目、および２ヶ月目におけるプラグの全載画像である。Ｆ．１週間目時点、１ヶ月目時点、および２ヶ月目時点におけるＲ−ＶＥＣプラグおよびＣＴＲＬ−ＥＣプラグにおいて形成された脈管の定量化を示す図である。Ｇ．２ヶ月目におけるプラグの切片のＨ＆Ｅ染色を示す図である。Ｈ．２ヶ月におけるプラグの切片（２０μｍ）の免疫蛍光染色を示す図である。プラグ内で形成された脈管は、マウスＰＤＧＦＲβについて染色された。Ｉ．Ｒ−ＶＥＣ、ＥＴＳ１発現内皮細胞（ＥＴＳ１−ＶＥＣ）またはｍｙｒＡＫＴ１発現内皮細胞（ｍｙｒＡＫＴ１−ＥＣ）、およびＣＴＲＬ−ＥＣを含むプラグから得られた、１ヶ月目時点におけるＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）プラグの画像である。Ｊ．Ｒ−ＶＥＣ、ＥＴＳ１−ＶＥＣまたはｍｙｒＡＫＴ１−ＥＣ、およびＣＴＲＬ−ＥＣの１ヶ月目における全載顕微鏡観察を示す図である。Ｋ．１ヶ月目におけるＲ−ＶＥＣ、ＥＴＳ１−ＶＥＣまたはｍｙｒＡＫＴ１−ＥＣ、およびＣＴＲＬ−ＥＣのＨ＆Ｅ染色を示す図である。赤血球の存在により示されているように、リプログラミング化内皮細胞（Ｒ−ＶＥＣプラグ）だけが、灌流され、かつパターニングされた脈管を形成した。Ｌ．植え込まれた脈管（ヒトＶＥＣＡＤ、青色）およびマウス周皮細胞（マウスＰＤＧＦＲβ、緑色）の染色された切片を示す図である。より小さい毛細血管および細動脈様構造の画像である。Ｍ．インビボでのマウスＰＤＧＦＲβ陽性周皮細胞により包まれている、植え込まれたＲ−ＶＥＣ脈管を示す図である。パネル（ｉおよびｉｉ）：図３Ｌからのズームインされた画像。パネル（ｉｉｉ）：植え込まれたＲ−ＶＥＣ脈管の３Ｄ再構築。ｎｓ＝有意性なし、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図３−２】図３−１の続き。
【図３−３】図３−２の続き。
【図３−４】図３−３の続き。
【図３−５】図３−４の続き。
【図４−１】図４Ａ〜４Ｈは、一過性ＥＴＶ２発現は、安定で機能的な長持ちするヒト脈管の形成および維持に十分である。人工脈管形成は、ＥＴＶ２発現がドキシサイクリンの存在により駆動される誘導性ＥＴＶ２系を用いて達成された。ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）は、アッセイの０日目に除去されるか、アッセイの開始後１ヶ月目に除去されるか、または常に存在するかのいずれかであった。Ａ．ｒｔＴａのみが存在した場合、Ｄｏｘが０日目に除去された誘導性ＥＴＶ２の場合、Ｄｏｘが１ヶ月後に除去された場合、または２Ｄもしくは３Ｄ培養物に連続的に加えられた場合における試料についての脈管形成を描く蛍光画像である。Ｂ．マウスが一度もＤｏｘ食餌に曝されなかった場合、マウスが１ヶ月間、Ｄｏｘ食餌であり、その後、１ヶ月間、通常食餌に移った場合、および連続してＤｏｘ食餌のままであった場合のインビボプラグアッセイの図である。赤色は、注射されたヒト内皮細胞を表す。白色は、灌流されかつ吻合した脈管を同定するために、マウスを屠殺する前に静脈内（生体内）注射されたＶＥＣＡＤを提供する。Ｃ．一過性ＥＴＶ２発現中、１ヶ月間および２ヶ月間の発生における脈管密度の定量化を示す図である。Ｄ．ドキシサイクリンが連続的に存在した場合の脈管、およびドキシサイクリンが１ヶ月後に除去された脈管に存在した管腔の電子顕微鏡観察画像の図である。Ｅ．４週間後のＥＴＶ２を発現するリプログラミング化内皮細胞（Ｒ−ＶＥＣ）、および培養された対照ＨＵＶＥＣにより形成された脈管における、異なって発現した遺伝子の重複する数を示すベン図である。Ｆ．対照ＨＵＶＥＣと比較した、培養の４週間後のＲ−ＶＥＣ脈管間で共有された（倍数変化によりランク付けされた）上位２０個の上方制御および下方制御された遺伝子を示すヒートマップである。Ｇ．培養の４週間後の、Ｒ−ＶＥＣ脈管およびＲ−ＶＥＣ単層において（倍数変化によりランク付けされた）上位２５個の上方制御および下方制御された遺伝子を示すヒートマップである。Ｈ．ＧＡＰＤＨ発現に対するｑＰＣＲ分析により示されているように、１週間後および４週間後において、Ｄｏｘ除去によりＥＴＶ２はオフに変わっていることを示す図である。ｎｓ＝有意性なし、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図４−２】図４−１の続き。
【図４−３】図４−２の続き。
【図４−４】図４−３の続き。
【図５−１】図５Ａ〜５Ｌは、外因性ＥＴＶ２を発現するリプログラミング化内皮細胞はオルガノイドに脈管導入する。ヒトまたはマウス由来オルガノイドは、単独で、またはヒトＣＴＲＬ−ＥＣ（対照）もしくは外因性ＥＴＶ２を含有するリプログラミング化内皮細胞（Ｒ−ＶＥＣ）と共に培養された。Ａ．単独での、およびＣＴＲＬ−ＥＣまたはＲ−ＶＥＣ（赤色蛍光）と共培養された、マウス小腸オルガノイド（緑色）の２４時間の培養、４日間の培養、および７日間の培養時点における時間経過の代表的な共焦点顕微鏡観察画像である。Ｂ．７日間の期間に渡る、ＣＴＲＬ−ＥＣオルガノイド対Ｒ−ＶＥＣオルガノイドにおける脈管密度時間経過を示す図である。Ｃ．ＣＴＲＬ−ＥＣと共に培養されたオルガノイド対Ｒ−ＶＥＣと共に培養されたオルガノイドにおける、出芽／オルガノイドとして定量化された脈管分枝（脈管導入）を示す図である。Ｄ．単独での、ＣＴＲＬ−ＥＣと共の、またはＲ−ＶＥＣと共のヒト正常結腸オルガノイドの共培養実験についての代表的な共焦点画像である。画像は、８日目に取得された。Ｅ．８日目における結腸オルガノイド／視野の定量化を示す図である。Ｆ．８日目におけるＣＴＲＬ−ＥＣオルガノイド共培養物対Ｒ−ＶＥＣオルガノイド共培養物における脈管密度／視野を示す図である。Ｇ．単独での、またはＣＴＲＬ−ＥＣと共に共培養された、もしくはＲ−ＶＥＣと共に共培養された、結腸腫瘍オルガノイドの代表的な共焦点画像である。オルガノイドは、Ｒ−ＶＥＣの腫瘍オルガノイドと共の共培養の８日目において、ケラチン２０（ＫＲＴ２０）およびＥｄＵについてポストステインされた。Ｈ．８日目におけるＣＴＲＬ−ＥＣまたはＲ−ＶＥＣのオルガノイド共培養物の脈管密度の定量化を示す図である。Ｉ．８日目におけるＥｐＣａｍ、ＥＤＵ、およびＤＡＰＩで染色された腫瘍結腸オルガノイドの免疫蛍光分析を示す図である。Ｊ．様々な正常オルガノイドおよび腫瘍オルガノイドの分枝後に達成されたＲ−ＶＥＣ形態学的教育の概略図である。腸オルガノイドのＲ−ＶＥＣとの密接な細胞相互作用は、結果として、幾何学的に組織化され、適切にパターニングされた適応可能な脈管の形成を生じる。対照的に、Ｒ−ＶＥＣの腫瘍オルガノイドとの混合は、結果として、インビボでの異常な腫瘍脈管構造において典型的に見られる、組織化されず、崩壊した脈管の生成を生じる。したがって、ＥＴＶ２を形質導入された内皮細胞は、正常なオルガノイドに対して適応し、かつ腫瘍オルガノイドに対して不適当に対応して、それにより、成体脈管構造のインビボ挙動の表現型複写するような独特の可塑性のある属性を獲得している。Ｋ．２４時間目における、単独での、またはＣＴＲＬ−ＥＣもしくはＲ−ＶＥＣと共培養された、トリプルネガティブヒト乳房腫瘍オルガノイドの代表的な共焦点画像である。Ｌ．８日目における乳房腫瘍オルガノイドのＲ−ＶＥＣ脈管導入の共焦点画像である。リプログラミング化内皮細胞は、インビボの異常化腫瘍脈管を暗示する、組織化されず、不十分にパターニングされた脈管を形成する。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図５−２】図５−１の続き。
【図５−３】図５−２の続き。
【図５−４】図５−３の続き。
【図５−５】図５−４の続き。
【図６−１】図６Ａ〜６Ｊは、外因性ＥＴＶ２を含む内皮細胞は、脱細胞化ラット腸に生着および増殖し、その再内皮化腸の異所性植え込みで、宿主脈管構造内に生着する。Ａ．採取されたラット腸は、管腔、腸間膜動脈、および腸間膜静脈を通してカニューレ処置されたことを示す図である。スケールバー  １ｃｍ。Ｂ．脱細胞化腸は肉眼的に、天然の脈管構造スキャフォールド構造を保っていることを示す図である。スケールバー  ５ｍｍ。Ｃ．播種されたＲ−ＶＥＣは、遠位の毛細血管へ遊走し、かつそれを覆うことを示す図である。スケールバー  ５ｍｍ。Ｄ．バイオリアクターにおける７日間の培養後、蛍光低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）での灌流により、開存性内皮化脈管が明らかにされていることを示す図である。スケールバー  ５０μｍ。Ｅ．Ｒ−ＶＥＣが脈管構造に再配置されることを示す図である。スケールバー  １００μｍ。Ｆ．Ｒ−ＶＥＣは、脈管構造全体に均等に広がって、遠位の毛細血管および血管を形成し、一方、ＣＴＲＬ−ＥＣは、器官に脈管導入することができないことを示す図である。スケールバー  ５００μｍ。Ｇ．対照ＥＣと比較して、Ｒ−ＶＥＣにより脈管導入された領域の定量化により、Ｒ−ＶＥＣによる再内皮化の増加が示されていることを示す図である。Ｈ〜Ｋ．蛍光イソレクチンおよび抗ヒトＶＥ−カドヘリン抗体の生体内静脈内注射により、再内皮化腸の異所性植え込みが、その細胞の１週間後および４週間後の生着、ならびに宿主脈管構造への吻合を示していることを示す図である（スケールバー５０μｍおよび２０μｍ）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図６−２】図６−１の続き。
【図６−３】図６−２の続き。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
内皮細胞（ＥＣ）におけるＥＴＳ転写因子バリアント２、ＥＴＶ２（ＥＲ７１、ＥＴＳＲＰ７１）の外因性発現が、機能的で安定な３次元血管および血管ネットワークを自律的に形成する能力がある、より原始的な内皮細胞へ分化型内皮細胞をリプログラミングすることにおいて必須の役割を果たすことが、本明細書で認識されている。したがって、この開示は、周皮細胞、強制灌流、および人工スキャフォールドの非存在下で、内皮細胞においてＥＴＶ２を外因的に発現することにより安定な３次元血管を形成するための方法、これらの方法により産生された安定かつ機能的な３次元人工血管、およびそれを用いるための方法を提供する。
【００５１】
安定な３次元血管を形成するための方法
本開示の第１の態様は、人工血管のような安定な３次元脈管構造を形成するための方法を対象とする。いかなる特定の理論にも縛られるつもりはないが、インビトロ、加えてインビボで、適切な時間の間での内皮細胞におけるＥＴＶ２発現が、培養中の内皮細胞をリプログラミングして、長持ちする機能的３次元血管を形成し得ると考えられる。定義済みのマトリックス上で培養した場合、分化型内皮細胞における外因性ＥＴＶ２転写因子の発現が、機能的で安定な３次元血管の自律的形成を生じる。本方法は３次元スキャフォールドを利用しないため、本明細書に提供された方法は、有利なことには、３次元血管を形成するために現在、必要とされる費用と時間のかかる要素を排除する。
【００５２】
一般的に、安定な３次元血管を形成するための本方法は、生体適合性マトリックス上でＥＴＶ２転写因子をコードする外因性核酸を含む内皮細胞を、外因性ＥＴＶ２転写因子を発現する条件下で少なくとも３週間培養することを含む。分化型内皮細胞におけるＥＴＶ２転写因子タンパク質の外因性発現は、分化型内皮細胞をリプログラミングし、管腔を有する血管のような安定な機能的３次元脈管構造へと自己集合する能力をその細胞に与え、その後、その３次元脈管構造を単離し、例えば、傷害組織の脈管導入、オルガノイドの脈管導入、または脱細胞化器官の脈管再導入のようないくつもの目的のために用いることができる。
【００５３】
一実施形態において、本方法に用いられる内皮細胞は、分化型内皮細胞（ＥＣ）である。本明細書で用いられる場合、用語「分化した」または「分化型内皮細胞」は、内皮細胞が、特定の機能に特殊化される、例えば、細胞が、最初の細胞型とは異なる１つまたはそれ以上の形態学的特徴および／または機能を獲得する、発生過程を指す。用語「分化」は、分化系列決定と、細胞の成熟の完全に分化した成体内皮細胞への発生の両方を含む。分化は、例えば、免疫組織化学法または当業者に知られた他の手順を用いて、細胞系マーカーの有無をモニターすることにより、評価される。
【００５４】
内皮細胞は、当技術分野において知られた方法により得ることができる。例えば、内皮細胞は、Ｇｉｎｓｂｅｒｇ，Ｍ．ら  Ｃｅｌｌ（２０１２）１５１、５５９〜５７５頁およびＦｅｒｒａｒａらの米国特許第６，８９９，８２２号に記載されているように、コラゲナーゼに基づいた消化アプローチを用いて、組織から単離することができる。内皮細胞系譜は、例えば、抗ＣＤ３１抗体、ＶＥ−カドヘリン、または抗フォンビルブランド因子抗体で染色することにより検証することができる。ＥＣの単離は、磁気または蛍光活性化細胞ソーティング（ＭＡＣＳまたはＦＡＣＳ）に用いられる磁気ビーズまたはフルオロフォアに付着した、ＶＥ−カドヘリン、ＣＤ３１、またはＶＥＧＦＲ２のようなＥＣ表面マーカーに特異的な抗体を用いて達成することができる。
【００５５】
代替手段においては、内皮細胞は、商業的供給源から得られる。内皮細胞は、それらの分化した細胞系譜および複製する能力を維持する条件下で培養および維持（増殖）することができる。そのような条件は、当技術分野において十分、実証されている。例えば、単離された内皮細胞は、コーティングされた組織培養ディッシュにおいて、内皮細胞増殖サプリメントを含む完全培地中、培養することができる。その後、内皮細胞を、用いるまで、分割して、継代することができる。
【００５６】
いくつかの実施形態において、分化型内皮細胞はヒト内皮細胞である。ある特定の実施形態において、分化型ヒト内皮細胞は、ヒト臍帯静脈由来内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、ヒト脂肪由来内皮細胞、または組織／器官特異的ヒト内皮細胞である。本方法のいくつかの実施形態において、分化型内皮細胞は、器官特異的内皮細胞であり、それには、心臓、腎臓、精巣、卵巣、網膜、肝臓、膵臓、脳、肺、脾臓、大腸、または小腸の内皮細胞が含まれるが、それらに限定されない。他の実施形態において、分化型内皮細胞は、筋肉、リンパ組織、嗅覚組織、造骨組織、口腔（歯）組織、または腺組織（例えば、内分泌腺、胸腺）由来の組織特異的内皮細胞である。
【００５７】
分化型内皮細胞は、培養されて、安定な３次元血管の形成を惹起することができる。細胞は、内皮細胞の増殖を持続させる能力がある任意の培地において培養することができ、その培地には、ＤＭＥＭ（高グルコースまたは低グルコース）、ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／ＭＣＤＢ  ２０１、Ｅａｇｌｅの基本培地、ＨａｍのＦ１０培地（Ｆ１０）、ＨａｍのＦ−１２培地（Ｆ１２）、Ｈａｙｆｌｉｃｋの培地、Ｉｓｃｏｖｅの改変Ｄｕｌｂｅｃｃｏの培地、間葉系幹細胞増殖培地（ＭＳＣＧＭ）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＲＰＭＩ  １６４０、およびＣＥＬＬ−ＧＲＯ−ＦＲＥＥ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ｃｅｌｌｇｒｏ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）が含まれるが、それらに限定されない。培地は、１つまたはそれ以上の成分を追加することができ、その成分には、例えば、単独または組合せのいずれかでの、ウシ胎仔血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）、好ましくは約２〜１５％（ｖ／ｖ）；ウマ血清；ヒト血清；ウシ胎仔血清（ｆｅｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ）；β−メルカプトエタノール、好ましくは約０．００１％（ｖ／ｖ）；１つまたはそれ以上の増殖因子、例えば、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、白血球阻止因子（ＬＩＦ）およびエリスロポイエチン；アミノ酸、例えば、Ｌ−バリン；ならびに、微生物汚染を制御するための１つまたはそれ以上の抗生物質および／または抗真菌剤、例えば、ペニシリンＧ、ストレプトマイシン硫酸塩、アンホテリシンＢ、ゲンタマイシン、およびナイスタチンが含まれる。
【００５８】
内皮細胞は、リプログラミングの前に、細胞数を増加させるために培養することができる。十分な数の内皮細胞が最初の試料から単離される場合もあるが、たとえ、許容できる数の分化型内皮細胞が最初の試料に存在したとしても、培養における細胞の増殖により、リプログラミングのために内皮細胞のよりいっそう多い供給量を提供することができる。細胞を培養および増殖する方法は当技術分野において知られている。例えば、Ｈｅｌｇａｓｏｎら、Ｂａｓｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、第４版、Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、２０１３；およびＭｉｔｒｙら、Ｈｕｍａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、第３版、Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、２０１２参照。
【００５９】
分化型内皮細胞を、分化型内皮細胞による外因性ＥＴＶ２コード核酸の組込みおよび発現により「リプログラミング」することができる。
【００６０】
内皮細胞は、本明細書に開示された方法に従って、管状（管腔を有する）血管および他の脈管構造を形成する内皮細胞の能力を変化させる、外因性ＥＴＶ２転写因子タンパク質を発現することにより、「リプログラミング」される（より可塑性の高い状態へ脱分化するように方向づけられる）。
【００６１】
用語「ＥＴＶ２」または「ＥＴＶ２転写因子」は、ＮＰ  ０５５０２４に示されたアミノ酸配列を有するＤＮＡ結合転写因子タンパク質をコードする、ＲｅｆＳｅｑ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ  ２１１６、ＮＣＢＩ参照配列Ｎｏ．ＮＣ＿００００１９．１０に示されたヒトＥＴＳ−転写因子バリアント２、ＥＴＶ２（ＥＲ７１、ＥＴＳＲＰ７１）を指すように、本明細書で交換可能に用いられる。本開示のＥＴＶ２核酸は、アクセッション番号：ＮＭ＿００１３００９７４．１、ＮＭ＿０１４２０９．３、およびＮＭ＿００１３０４５４９．１に示されたもののような、ＥＴＶ２  ＤＮＡ配列またはその一部分、およびそのＲＮＡ転写産物を含み得る。ＥＴＶ２の機能的誘導体および相同体が、開示された方法における使用についてさらに企図される。本明細書で用いられる場合、「機能的誘導体」は、ＥＴＶ２の生物学的機能を実施する能力を有する分子である。例えば、本明細書に開示されているようなＥＴＶ２の機能的誘導体は、ＥＴＶ２転写因子がそうであるように、ＤＮＡを結合し、かつ分化型内皮細胞をリプログラミングすることができる分子である。機能的誘導体には、融合タンパク質を含む、天然、合成、または組換えの供給源由来の、断片、バリアント、部分（ｐａｒｔ）、部分（ｐｏｒｔｉｏｎ）、均等物、類似体、変異体、模倣体が含まれる。「相同体」は、共通の祖先核酸配列から由来することにより、ＥＴＶ２転写因子に関連したタンパク質である。本明細書で企図される相同体には、例えば、マウス、ラット、およびサルのような異なる種に由来したＥＴＶ２タンパク質が含まれるが、それらに限定されない。
【００６２】
本方法の特定の実施形態において、内皮細胞に存在する外因性ＥＴＶ２コード核酸は、配列番号２に示されたヒトＥＴＶ２転写因子タンパク質をコードする、配列番号１に示されているようなヒトＥＴＶ２である。別の実施形態において、内皮細胞に存在する外因性ＥＴＶ２コード核酸は、ヒトＥＴＶ２転写因子タンパク質をコードする、ヒトＥＴＶ２リボソーム核酸（ＲＮＡ）転写産物である。他の実施形態において、分化型内皮細胞へ提供される外因性ＥＴＶ２コード核酸は、修飾型合成ＲＮＡである。修飾型合成ＲＮＡ分子は、Ｍａｃｈｎｉｃｋａ，ＭＡら  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（２０１３）４１  Ｄ２６２〜Ｄ２６７頁に示された方法のような、当業者に知られた方法により作製することができる。本発明に用いられる例示的な修飾型合成分子は、安定性（ヌクレアーゼ抵抗性を変化させる）または細胞取り込み（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチドのコレステロール、リンカー、脂質、ポリマー、ペプチド、またはアプタマーへのコンジュゲーション）を調節する、ＲＮＡポリヌクレオチドへの化学修飾を含む。
【００６３】
ＥＴＶ２転写因子をコードする核酸を、当業者によく知られた方法により細胞へ提供することができる。例えば、ＥＴＶ２コード核酸は、ＥＴＶ２核酸配列を内皮細胞ゲノムへ組み込むことができ、または非組込み性である、つまり、ＥＴＶ２遺伝子が、染色体外位置から発現してもよい。いくつかの実施形態において、ＥＴＶ２コード核酸配列は、その核酸配列が当技術分野において知られた技術によりクローニングされているベクターにより提供される。ベクターは、トランスフェクションまたはウイルス媒介性形質導入のような任意の適切な方法により導入することができる。
【００６４】
ＥＴＶ２転写因子を発現するのに用いられるベクターには、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、および他のベクターが含まれ、それらは、いったん細胞へ導入されたならば、対象のゲノム内の染色体位置に組み込まれて、ＥＴＶ２の安定な長期間発現を提供する。他のベクターには、エピソームベクター、加えて、非組込み性である、操作されたレンチウイルスベクターが含まれる。この場合、ＥＴＶ２ヌクレオチド配列は、ベクター配列へクローニングされる；そのベクターは、分化型内皮細胞において増殖し、本明細書に記載された方法を用いて内皮細胞をリプログラミングするために用いられる。
【００６５】
一実施形態において、ＥＴＶ２核酸は、レンチウイルスベクターに含まれ、レンチウイルス媒介性形質導入により内皮細胞へ提供される。特定の実施形態において、配列番号１のＥＴＶ２をコードする核酸は、レンチウイルスベクターを用いて、分化型内皮細胞へ形質導入される。一実施形態において、レンチウイルスベクターはｌｅｎｔｉ  ｐｇｋ−ベクターである。特定の実施形態において、配列番号１の外因性ＥＴＶ２コード核酸は、例えば、リバースｔｅｔトランス活性化因子（ｒｔＴＡ）−ドキシサイクリン誘導性発現系のような誘導性発現系での形質導入により内皮細胞へ提供される。
【００６６】
他の実施形態において、ＥＴＶ２核酸は、内皮細胞へ送達されるＲＮＡ転写産物である。ある特定の具体的な実施形態において、細胞へ送達されるＥＴＶ２  ＲＮＡは修飾型合成ＲＮＡ分子である。ＲＮＡ分子を細胞へ導入するための方法は、当業者によく知られており、そのような方法はここで用いることができる。例えば、ｍＲＮＡ転写産物のようなＥＴＶ２  ＲＮＡ転写産物は、トランスフェクションにより内皮細胞へ送達することができる。別の非限定的例において、ＥＴＶ２  ＲＮＡ転写産物がエレクトロポレーションにより細胞へ送達される。
【００６７】
本方法は、外因性ＥＴＶ２コード核酸を含む分化型内皮細胞を、ＥＴＶ２転写因子タンパク質を発現する条件下で培養することを含む。ある特定の実施形態において、ＥＴＶ２タンパク質は構成的に発現する。他の実施形態において、ＥＴＶ２タンパク質は、誘導性プロモーターの制御下のように、一過性に発現する。ある特定の実施形態において、外因性ＥＴＶ２転写因子は、内皮細胞において、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも７週間、少なくとも８週間、少なくとも９週間、少なくとも１０週間、少なくとも１１週間、少なくとも１２週間、またはそれより長い間、発現して、内皮細胞を、管腔を有する血管を形成するように誘導する。特定の実施形態において、外因性ＥＴＶ２タンパク質は、少なくとも４週間、発現して、血管形成を誘導する。別の実施形態において、外因性ＥＴＶ２タンパク質は、少なくとも３〜４週間、発現して、管腔形成を誘導する。
【００６８】
他の実施形態において、本方法は、外因性ＥＴＶ２コード核酸を有する内皮細胞を、ＥＴＶ２転写因子タンパク質を発現する条件下で培養すること、その後、該内皮細胞が外因性ＥＴＶ２を発現しない条件下でのさらなる培養期間が続くことを含む。この場合、内皮細胞は、まず、第１の期間、外因性ＥＴＶ２転写因子を発現する条件下で培養され、その後、誘導性プロモーターを活性化する能力がある物質（例えば、ドキシサイクリン、テトラサイクリン）の非存在下のような外因性ＥＴＶ２を発現しない条件下で第２の培養を行うことができる。一実施形態において、外因性ＥＴＶ２コード核酸は、培養中、一過性ＥＴＶ２転写因子発現を生じる修飾型合成ＲＮＡ分子である。
【００６９】
いくつかの実施形態において、本方法は、外因性ＥＴＶ２コード核酸を有する内皮細胞を、ＥＴＶ２転写因子タンパク質を発現する条件下で、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも７週間、少なくとも８週間、少なくとも９週間、少なくとも１０週間、少なくとも１１週間、少なくとも１２週間、またはそれより長い間培養し、その後、ドキシサイクリンの非存在下のような外因性ＥＴＶ２を発現しない条件下で、数日間、数週間、または数ヶ月間、第２の培養を行うことを含む。特定の実施形態において、内皮細胞は、外因性ＥＴＶ２転写因子タンパク質を発現する条件下で、少なくとも３〜４週間培養され、その後、内皮細胞は、該ＥＴＶ２転写因子を発現しない条件下で、７日間から６ヶ月間まで、７日間から５ヶ月間まで、７日間から４ヶ月間まで、７日間から３ヶ月間まで、７日間から２ヶ月間まで、または７日間から１ヶ月間までの範囲の期間培養される。リプログラミングされた内皮細胞が、ＥＴＶ２タンパク質を発現する条件下で培養される時間の量に関わらず、内皮細胞は、図４Ａ〜４Ｈに示されているように、血管のような安定な機能的３次元脈管構造を発生し続けるだろう。
【００７０】
本方法は、外因性ＥＴＶ２コード核酸を含有する内皮細胞をマトリックス上で培養することを含む。実際、本開示は、必須の細胞外マトリックス成分、すなわち、ラミニン、エンタクチン、およびコラーゲンＩＶを同定しており、それらは、リプログラミング化内皮細胞を培養するために用いられる場合、周皮細胞、灌流、および厄介なスキャフォールドの使用なしに、インビトロおよびインビボで、安定かつ機能的な３次元人工脈管の形成を生じる。したがって、ある特定の実施形態において、マトリックスは、ラミニン、エンタクチン、および／またはコラーゲンのような細胞外マトリックス成分で構成される。
【００７１】
一実施形態において、本方法に用いられるマトリックスは、ラミニンおよびエンタクチンを少なくとも５ｍｇ／ｍＬの合わせた濃度で含み得る。ラミニンおよびエンタクチンは、お互いに結合して、複合体を形成することができるので、本方法に用いられるマトリックスは、ラミニンとエンタクチンの複合体を含み得る。例えば、マトリックスは、少なくとも５ｍｇ／ｍＬのラミニンとエンタクチンの複合体を含み得る。例示的な実施形態において、ＥＴＶ２発現内皮細胞は、ラミニンおよびエンタクチンを５ｍｇ／ｍＬの合わせた濃度で含むマトリックス上で培養される。特定の実施形態において、本方法に用いられるマトリックスは、ラミニン、エンタクチン、およびコラーゲンＩＶの組合せ（Ｌ．Ｅ．Ｃ．）で構成される。例えば、内皮細胞は、少なくとも５ｍｇ／ｍＬのラミニンとエンタクチン、および少なくとも０．２ｍｇ／ｍＬ  コラーゲンＩＶを含有するマトリックス上で培養されて、長持ちする機能的な３次元人工血管を形成することができる。特定の実施形態において、内皮細胞は、５．２５ｍｇ／ｍＬの合わせた濃度でのラミニンおよびエンタクチン、ならびに０．２ｍｇ／ｍＬ  コラーゲンＩＶで構成されるマトリックス上で培養される。他の実施形態において、マトリックスはＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ）である。
【００７２】
溶液または材料中の物質（例えば、分子およびタンパク質、またはそれらの複合体）の濃度を決定するための方法は、当業者に知られている。例えば、試料中の物質の濃度を決定するために、分光光度法を用いることができる。
【００７３】
本方法の一実施形態において、外因性ＥＴＶ２コード核酸を含む内皮細胞は、無血清培地において、ある期間培養される。いくつかの実施形態において、本方法は、内皮細胞を無血清培地において、少なくとも７日間、少なくとも１０日間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも７週間、少なくとも８週間、またはそれより長い間培養することを含む。
【００７４】
他の実施形態において、本方法は、外因性ＥＴＶ２コード核酸を含む内皮細胞を無血清培地において低酸素圧で培養することを含む。いくつかの実施形態において、内皮細胞は、無血清培地において、大気中酸素圧未満、すなわち２０％酸素圧未満で培養される。特定の実施形態において、細胞は、無血清培地において、４％から１５％の間、５％から１０％の間、４％から８％の間、または４％から６％の間の酸素圧で培養される。一実施形態において、細胞は、無血清培地において、５％の酸素圧で培養される。特定の実施形態において、本方法は、外因性ＥＴＶ２コードベクターを含む内皮細胞を無血清培地において、５％の酸素圧で７日間培養することを含む。
【００７５】
持続期間または特定の培養条件に関わらず、本方法は、外因性ＥＴＶ２コード核酸を含む内皮細胞を、マトリックス上で、ＥＴＶ２転写因子を発現する条件下で培養して、管腔を有する安定で機能的な３次元血管の形成を誘導すること、およびそれを単離することを含む。
【００７６】
「安定な」とは、３次元血管がそれの構造および機能を、長期間、例えば、少なくとも１ヶ月間、少なくとも２ヶ月間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも４ヶ月間、少なくとも５ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、またはそれより長い間、維持することを意味する。安定な３次元血管は、無傷の管腔を有し、適切な頂端膜側−基底膜側の極性を示し、および管状（管腔を有する）構造を少なくとも１ヶ月間、崩壊、パンク、または解離することなく、かつスキャフォールド、強制的灌流、または血管周囲サポートの使用なしに、維持する、内皮細胞の管状構造を意味する。
【００７７】
本明細書で用いられる場合、用語「機能的な」は、安定な３次元血管が、典型的には天然（内因性）の血管により行われる過程を実行し得ることを意味する。例えば、本開示の機能的血管は、血液のような流体を灌流し、他の脈管（例えば、毛細血管、静脈、動脈、細動脈、細静脈、またはリンパ管）または組織へ吻合し、組織上に血管の統合されたパターニングされた（分岐した）ネットワークを自律的に形成することができ、その結果、スキャフォールド、強制的灌流、または血管周囲サポートの使用なしに、血液および／または流体が組織へ供給される（「脈管導入する」）。
【００７８】
図２Ａ〜２Ｂおよび３Ａ〜３Ｍに示されているように、本方法により産生された安定な３次元血管は、流体を灌流する機能的血管を形成することができ（図２Ａ）、かつ単離されて、対象に植え込まれた場合、毛細血管および細動脈構造を含む３次元血管ネットワークを形成することができる（図３Ｌ〜３Ｍ）。さらに、図３Ｍに示されているように、植え込まれた安定な３次元血管は、内因性周皮細胞を、その管腔を有する脈管へ統合することにより、周囲組織へ吻合した。加えて、図１Ｅに示されているように、本開示の安定な３次元血管は、４ヶ月間（１６週間）を超えて、安定かつ機能的のままである。
【００７９】
したがって、いくつかの実施形態において、本開示の安定な３次元血管は、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも７週間、少なくとも８週間、少なくとも９週間、少なくとも１０週間、少なくとも１１週間、少なくとも１２週間、少なくとも１３週間、少なくとも１４週間、少なくとも１６週間、少なくとも１７週間、少なくとも１８週間、少なくとも１９週間、少なくとも２０週間、またはそれより長い間、安定かつ機能的である。特定の実施形態において、本方法により形成された３次元血管は、少なくとも１ヶ月間または少なくとも２ヶ月間、安定かつ機能的である。他の実施形態において、本方法により形成された３次元血管は、少なくとも３ヶ月間、少なくとも４ヶ月間、少なくとも５ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、またはそれより長い間、安定かつ機能的である。一実施形態において、本方法により形成された３次元血管は、４ヶ月間、安定かつ機能的である。
【００８０】
安定な３次元血管組成物および治療的使用方法
本明細書に開示された培養方法は、安定な３次元血管の再現可能な産生を可能にし、その３次元血管は、オルガノイドの脈管導入および傷害組織の治療的脈管導入（組織再生）のようないくつかの目的にとって有用である。本開示はまた、分化型内皮細胞におけるＥＴＶ２タンパク質の外因性発現が、周皮細胞、灌流、およびスキャフォールドの非存在下で、インビトロおよびインビボで、機能的血管ネットワークを形成する能力を有する安定な機能的３次元血管の自律的自己集合をもたらすことを明らかにしている。
【００８１】
したがって、さらなる態様において、本開示は、３次元血管ネットワークを自律的に形成する能力がある安定な３次元血管を含有する組成物を提供する。
【００８２】
ある特定の実施形態において、本開示の安定な３次元血管は、リプログラミング化内皮細胞の少なくとも１つの連続層で構成される脈管のような管状構造（管腔）を含む。他の実施形態において、安定な３次元血管は、リプログラミング化内皮細胞の少なくとも２層で構成される管腔を含む。さらに別の実施形態において、安定な３次元血管は、リプログラミング化内皮細胞の少なくとも１つの層、および細胞、例えば、分化型血管内皮細胞または非血管細胞の少なくとも１つの他の層で構成された管腔を有する。他の実施形態において、安定な３次元血管は、外因性ＥＴＶ２転写因子を発現するリプログラミング化内皮細胞、および外因性ＥＴＶ２を発現しない内皮細胞の組合せで構成される。
【００８３】
ある特定の実施形態において、安定な３次元血管の内皮細胞は、外因性ＥＴＶ２転写因子コード核酸を発現する。一実施形態において、ＥＴＶ２転写因子の発現は、一過性、すなわち、数日間、数週間、または数カ月間のような限りのある期間の間である。特定の実施形態において、ＥＴＶ２転写因子の一過性発現は、例えば、リバースｔｅｔトランス活性化因子（ｒｔＴＡ）−ドキシサイクリン誘導性発現系のような、誘導性発現系により調節される。他の実施形態において、ＥＴＶ２転写因子の一過性発現は、ＥＴＶ２タンパク質をコードする修飾型合成ＲＮＡ分子の導入により調節される。他の実施形態において、本開示の安定な３次元血管は、外因性ＥＴＶ２転写因子を構成的に（すなわち、永久に）発現する内皮細胞を含有する。他の実施形態において、安定な３次元血管は、外因性ＥＴＶ２転写因子を発現する内皮細胞および外因性ＥＴＶ２を発現しない内皮細胞の組合せで構成される。さらに別の実施形態において、安定な３次元血管は、外因性ＥＴＶ２転写因子を発現しないリプログラミング化内皮細胞で構成される。
【００８４】
いくつかの実施形態において、本開示の安定な３次元血管は、単離された血管である。
【００８５】
安定な３次元血管またはリプログラミング化内皮細胞に関して用いられる場合の用語「単離された」は、血管または細胞が、それの天然で存在する環境、またはそれが形成された環境から取り出されており、かつ他の分子または培地を実質的に含まないことを意味する。「実質的に含まない」とは、単離された３次元血管または単離された細胞が、組成物または調製物の（乾燥重量または体積で）少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％を占めることを意味する。例えば、単離された安定な３次元血管は、培地を実質的に含まないであり得、すなわち、培地は、その調製物の体積の約２０％未満、その調製物の体積の約１０％未満、またはその調製物の体積の約５％未満に相当する。精製のレベルは、意図された使用に基づき得る。ある特定の非限定的例において、本開示の単離された安定な３次元血管は、安定な３次元血管を形成するために用いられた細胞培地、および細胞培地に加えられた任意の分子、例えば、サイトカイン、増殖因子、またはアミノ酸から、取り出すことができる。別の例において、リプログラミング化内皮細胞は、リプログラミング化内皮細胞を形成するために用いられた細胞培地、および任意の細胞培養添加物からその細胞を取り出すことにより単離することができるが、マトリックスの少なくとも一部分は、その単離された細胞と共に残存する。
【００８６】
いくつかの実施形態において、単離された安定な３次元血管は、それが形成された環境、例えば、細胞培養物、バイオリアクター、または対象から全部または一部、取り出される。ある特定の実施形態において、単離された安定な３次元血管は、培地、培地成分および添加物、ならびにそれが形成された任意のマトリックス、例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）またはＬ．Ｅ．Ｃマトリックスを含まない。他の実施形態において、本開示の単離された安定な３次元血管は、培地、培地成分および添加物から取り出されているが、例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）またはＬ．Ｅ．Ｃ．マトリックスのようなマトリックスの少なくとも一部分を含む。本開示の一実施形態において、安定な３次元血管は機能的である。特定の実施形態において、機能的な安定な３次元血管は、その管腔を有する血管の中に流体を通過させる（灌流する）能力がある。一実施形態において、機能的で安定な３次元血管は、その血管の中に血液を通過させる能力がある。さらに別の実施形態において、機能的で安定な３次元血管は、３次元血管ネットワークを形成する能力がある。いくつかの実施形態において３次元血管ネットワークは、スキャフォールド、強制的灌流、または血管周囲サポートの使用なしに、組織上に血管の統合されたパターニング化ネットワークを含み、その結果、血液および／または流体は、組織へ供給される（「脈管導入する」）。特定の実施形態において、３次元血管ネットワークは、安定な３次元血管、および少なくとも１つの毛細血管、少なくとも１つの細動脈、少なくとも１つの細静脈、少なくとも１つのリンパ性血管、またはそれらの組合せにより自律的に形成される。
【００８７】
いくつかの実施形態において、本開示の機能的で安定な３次元血管は、少なくとも１ヶ月間、少なくとも２ヶ月間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも４ヶ月間、少なくとも５ヶ月間、またはそれより長い間、機能的である。特定の実施形態において、本開示の安定な３次元血管は、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、１３週間、１４週間、１５週間、１６週間、１７週間、１８週間、１９週間、２０週間、またはそれより長い間、機能的である。一実施形態において、本開示の３次元血管は、図１Ｅに示されているように、少なくとも４ヶ月間（１６週間）、安定である。
【００８８】
脈管導入を促進するための方法
本開示の図３Ｌおよび３Ｍは、外因性ＥＴＶ２を含む内皮細胞を培養することにより形成された安定な３次元血管が、植え込み後、内因性組織に脈管導入する能力がある、パターニングされた長持ちする血管ネットワークへ自律的に組織化することを示しているため、本開示の安定な３次元血管はまた、対象における傷害組織の脈管導入を促進するために用いられる。
【００８９】
それゆえ、別の態様において、安定な３次元血管を対象に投与することを含む、対象において脈管導入を促進するための方法が提供される。例えば、本３次元血管は、虚血組織の修復、血管および心臓弁の形成、損傷脈管の修復、および（例えば、移植前に）操作された組織において血管の形成を誘導することのために、治療的に用いることができる。いくつかの実施形態において、対象は、脈管導入を必要としている器官のような傷害組織を有する。
【００９０】
この方法は、そのような組織における脈管導入を促進するために、本開示の３次元血管を含有する組成物を、そのような処置を必要としているヒト対象へ投与することを含む。組織における脈管導入（血管新生）を促進することは、虚血性状態、例えば、心筋梗塞、うっ血性心不全、および末梢血管閉塞性疾患、脳卒中、再灌流傷害、肢虚血；ニューロパチー（例えば、末梢性ニューロパチー、または糖尿病性ニューロパチー）、臓器不全（例えば、肝不全、腎不全など）、糖尿病、関節リウマチ、および骨粗鬆症を含む状態を有し、または発症するリスクがある対象にとって有益であり得る。
【００９１】
脈管導入を必要としている組織は、損傷し、かつ過剰な細胞死により特徴づけられる組織、損傷のリスクがある組織、または人工的に操作された組織であり得る、とりわけ、心臓組織、肝臓組織、膵臓組織、腎臓組織、筋肉組織、神経組織、骨組織であり得る。特定の実施形態において、対象は、傷害心臓組織、傷害肝臓組織、傷害リンパ組織、傷害腎臓組織、傷害精巣組織、傷害卵巣組織、傷害網膜、傷害膵臓組織、傷害脳組織、傷害肺組織、傷害腸組織、傷害腺組織、傷害筋肉組織、またはそれらの組合せを有する。
【００９２】
本方法は、安定な３次元血管を対象に、修復または脈管導入を必要としている組織へ、またはその組織の近くに該血管の送達を生じる様式で、投与することを含む。場合によっては、安定な３次元血管は、局所的に投与され、例えば、脈管導入を必要としている組織へ、またはその組織の近くに直接的に（例えば、注射、植え込み、または任意の適切な手段により）送達される。一実施形態において、安定な３次元血管は、脈管導入を必要としている対象の傷害組織への外科的植え込みにより投与される。特定の実施形態において、安定な３次元血管は、傷害器官またはその組織へ直接的に植え込まれる。他の実施形態において、本方法は、例えば、傷害組織への直接的な注射のような注射により、対象へ安定な３次元血管を投与することを含む。ある特定の実施形態において、安定な３次元血管は、静脈内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、またはそれらの組合せにより対象へ投与される。
【００９３】
一実施形態において、安定な３次元血管は、細胞外マトリックス成分の懸濁液においてのように、マトリックスと共に投与される。特定の実施形態において、安定な３次元血管は、ラミニン、エンタクチン、およびコラーゲンＩＶの組合せ（Ｌ．Ｅ．Ｃ．）を含むマトリックス上で投与される。一実施形態において、マトリックスは、ラミニンおよびエンタクチンを少なくとも５ｍｇ／ｍＬの合わせた濃度で含み得る。例示的な実施形態において、血管は、ラミニンおよびエンタクチンを５ｍｇ／ｍＬの合わせた濃度で含むマトリックスと共に投与される。ラミニンおよびエンタクチンは、お互いに結合して、複合体を形成することができるので、マトリックスは、ラミニンとエンタクチンの複合体を含み得る。例えば、マトリックスは、少なくとも５ｍｇ／ｍＬのラミニンとエンタクチンの複合体を含み得る。例えば、血管は、少なくとも５ｍｇ／ｍＬの濃度でのラミニンとエンタクチンの複合体、および少なくとも０．２ｍｇ／ｍＬ  コラーゲンＩＶを含有するマトリックスと共に投与される。特定の実施形態において、マトリックスは、５．２５ｍｇ／ｍＬの合わせた濃度でのラミニンおよびエンタクチン、ならびに０．２ｍｇ／ｍＬ  コラーゲンＩＶで構成される。他の実施形態において、マトリックスはＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ）である。
【００９４】
いくつかの実施形態において、対象において脈管導入を促進する方法は、インビトロで形成された少なくとも１つの安定な３次元血管を対象に投与することを含む。他の実施形態において、方法は、インビトロで形成された本開示の２つまたはそれ以上の安定な３次元血管の投与を含む。
【００９５】
投与経路に関わらず、いったん安定な３次元血管が対象に投与されたならば、その機能的で安定な３次元血管は、傷害組織に脈管導入する能力がある３次元血管ネットワークを確立する。例えば、安定な３次元血管は、血液を傷害組織へ輸送する能力がある、少なくとも１つの毛細血管、少なくとも１つの細動脈、少なくとも１つの細静脈、少なくとも１つのリンパ性血管、またはそれらの組合せを含む３次元血管ネットワークを形成することができる。
【００９６】
本開示はまた、外因性ＥＴＶ２転写因子を発現する分化型内皮細胞が、ある特定の細胞外マトリックス成分と共に対象に注射された場合、安定な３次元血管を自律的に形成し得ることを明らかにしている。
【００９７】
したがって、本開示のさらなる態様は、マトリックス上の複数のリプログラミング化内皮細胞を組織または器官に投与することにより脈管導入を促進するための方法を提供する。例えば、本方法は、本明細書に示されたマトリックス上の外因性ＥＴＶ２転写因子コード核酸を含む複数のリプログラミング化内皮細胞の投与を含む。
【００９８】
いくつかの実施形態において、リプログラミング化内皮細胞およびマトリックスは、脈管導入を必要としている対象へ直接的に投与することができる。この場合、リプログラミング化内皮細胞およびマトリックスは、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、外科的植え込み、またはそれらの組合せにより傷害組織へ直接的に送達することができる。
【００９９】
オルガノイドまたは脱細胞化器官に脈管導入するための方法
本開示の別の態様において、オルガノイドに脈管導入するための方法が提供される。この場合、方法は、ＥＴＶ２転写因子をコードする外因性核酸を含む内皮細胞と共にオルガノイドをマトリックス上で、内皮細胞において外因性ＥＴＶ２タンパク質を発現する条件下で培養して、オルガノイド上に安定な３次元血管ネットワークを形成することを含む。
【０１００】
いくつかの実施形態において、オルガノイドに脈管導入するための方法は、オルガノイドをリプログラミング化内皮細胞と共にマトリックス上で培養することを含む。本方法に用いられるマトリックスは、ラミニンおよびエンタクチンを少なくとも５ｍｇ／ｍＬの合わせた濃度で含み得る。ラミニンおよびエンタクチンは、お互いに結合して、複合体を形成することができるので、本方法に用いられるマトリックスは、ラミニンとエンタクチンの複合体を含み得る。例えば、マトリックスは、少なくとも５ｍｇ／ｍＬのラミニンとエンタクチンの複合体を含み得る。例示的な実施形態において、リプログラミング化内皮細胞は、ラミニンおよびエンタクチンを５ｍｇ／ｍＬの合わせた濃度で含むマトリックス上で培養される。特定の実施形態において、本方法に用いられるマトリックスは、ラミニン、エンタクチン、およびコラーゲンＩＶの組合せ（Ｌ．Ｅ．Ｃ．）で構成される。例えば、内皮細胞およびオルガノイドは、少なくとも５ｍｇ／ｍＬのラミニンとエンタクチン、および少なくとも０．２ｍｇ／ｍＬ  コラーゲンＩＶを含有するマトリックス上で培養されて、オルガノイドに長持ちする機能的３次元人工血管を形成することができる。特定の実施形態において、マトリックスは、５．２５ｍｇ／ｍＬの合わせた濃度でのラミニンおよびエンタクチン、ならびに０．２ｍｇ／ｍＬ  コラーゲンＩＶで構成される。他の実施形態において、マトリックスはＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ）である。
【０１０１】
内皮細胞およびオルガノイドは、内皮細胞の増殖および発生を持続させる能力がある任意の培地において培養することができ、その培地には、ＤＭＥＭ（高グルコースまたは低グルコース）、ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／ＭＣＤＢ  ２０１、Ｅａｇｌｅの基本培地、ＨａｍのＦ１０培地（Ｆ１０）、ＨａｍのＦ−１２培地（Ｆ１２）、Ｈａｙｆｌｉｃｋの培地、Ｉｓｃｏｖｅの改変Ｄｕｌｂｅｃｃｏの培地、間葉系幹細胞増殖培地（ＭＳＣＧＭ）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＲＰＭＩ  １６４０、およびＣＥＬＬ−ＧＲＯ−ＦＲＥＥ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ｃｅｌｌｇｒｏ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）が含まれるが、それらに限定されない。培地は、１つまたはそれ以上の成分を追加することができ、その成分には、例えば、単独または組合せのいずれかでの、ウシ胎仔血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）、好ましくは約２〜１５％（ｖ／ｖ）；ウマ血清；ヒト血清；ウシ胎仔血清（ｆｅｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ）；β−メルカプトエタノール、好ましくは約０．００１％（ｖ／ｖ）；１つまたはそれ以上の増殖因子、例えば、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、白血球阻止因子（ＬＩＦ）およびエリスロポイエチン；アミノ酸、例えば、Ｌ−バリン；ならびに、微生物汚染を制御するための１つまたはそれ以上の抗生物質および／または抗真菌剤、例えば、ペニシリンＧ、ストレプトマイシン硫酸塩、アンホテリシンＢ、ゲンタマイシン、およびナイスタチンが含まれる。
【０１０２】
一実施形態において、オルガノイドに脈管導入するための方法は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を含む培地において、マトリックス上の内皮細胞と共にオルガノイドを培養することを含む。特定の実施形態において、培地は、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ２）を含む。いくつかの実施形態において、培地はヘパリンを含む。特定の実施形態において、オルガノイドに脈管導入するための方法は、ＦＧＦ２およびヘパリンを含む培地において、マトリックス上の内皮細胞と共にオルガノイドを培養することを含む。
【０１０３】
オルガノイド、およびＥＴＶ２転写因子をコードする外因性核酸を含む内皮細胞は、マトリックス上で、内皮細胞において外因性ＥＴＶ２タンパク質を発現する条件下で、オルガノイドに機能的な、管腔を有する３次元血管ネットワークの形成を誘導する、すなわち、オルガノイドに脈管導入するのに必要な任意の期間培養することができる。リプログラミング化内皮細胞と共のオルガノイドの培養中、オルガノイドに渡って血液を輸送する能力がある、少なくとも１つの毛細血管、少なくとも１つの細動脈、少なくとも１つの細静脈、少なくとも１つのリンパ性血管、またはそれらの組合せを含む機能的血管ネットワークが生じるだろう。例えば、ある特定の実施形態において、オルガノイドおよび内皮細胞は、内皮細胞がオルガノイドにパターニングされた長持ちする血管へと組織化するのを誘導するように、少なくとも１週間（７日間）、少なくとも１０日間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも７週間、少なくとも８週間、またはそれより長い間培養される。
【０１０４】
オルガノイドに脈管導入するための本方法は、任意の型のオルガノイドに適用することができる。例えば、本方法に用いられるオルガノイドは、小腸オルガノイド、結腸オルガノイド、腎臓オルガノイド、心臓オルガノイド、または腫瘍オルガノイドであり得る。いくつかの実施形態において、その方法は、腫瘍オルガノイドに脈管導入するために用いることができ、それにより、腫瘍オルガノイドは、乳がんオルガノイド、結腸がんオルガノイド、腎臓がんオルガノイド、または腸がんオルガノイドなど、組織特異的であり得る。
【０１０５】
本開示の脈管導入オルガノイドを、いくつもの目的のために当業者が用いることができる。したがって、いくつかの実施形態において、オルガノイドに脈管導入するための本方法は、脈管導入オルガノイドを単離することを含む。
【０１０６】
いったん脈管導入オルガノイドが得られたならば、脈管導入オルガノイドは、ヒトまたは動物（例えば、マウス、ラット、イヌ、サル）のような対象へ投与することができる。特定の実施形態において、脈管導入オルガノイドは、外科的植え込みによりヒト対象へ投与することができる。
【０１０７】
他の実施形態において、単離された脈管導入オルガノイドは、治療剤の効能を決定するために用いることができる。この場合、脈管導入オルガノイドを、治療剤と接触させ、治療剤の存在下で、ある期間培養する。その後、オルガノイド機能、細胞の増殖および健康状態を分析して、治療剤の効能を決定することができる。
【０１０８】
本方法に利用することができる治療剤の例には、抗炎症薬、抗血管新生分子、抗体、細胞傷害性薬、他の毒素、放射線核種、免疫細胞調節物質、小分子、エキソソーム、および遺伝子発現産物が含まれるが、それらに限定されない。例えば、化学療法剤が、その化学療法剤の抗腫瘍活性（効能）を決定するために、脈管導入オルガノイド（すなわち、腫瘍オルガノイド）へ投与される。
【０１０９】
本開示はまた、ＥＴＶ２転写因子をコードする外因性核酸を含む内皮細胞と共に脱細胞化器官を、その細胞において外因性ＥＴＶ２タンパク質を発現する条件下で培養することが、脱細胞化器官に機能的脈管構造の発生を生じることを明らかにしている。
【０１１０】
したがって、本開示の別の態様は、脱細胞化器官を脈管再導入するための方法を提供する。脱細胞化器官に脈管再導入するための方法は、脱細胞化器官に機能的３次元血管ネットワークを形成するのに十分な期間、マトリックス上で内皮細胞と共に脈管除去器官を、培養することを含む。脱細胞化器官のリプログラミング化内皮細胞と共の培養中、そのオルガノイドに渡って血液を輸送する能力がある、少なくとも１つの毛細血管、少なくとも１つの細動脈、少なくとも１つの細静脈、少なくとも１つのリンパ性血管、またはそれらの組合せを含む機能的３次元血管ネットワークが生じるだろう。例えば、ある特定の実施形態において、脱細胞化器官および内皮細胞は、内皮細胞を、脱細胞化器官で、パターニングされた長持ちする血管へと組織化するように誘導し、その後、脱細胞化器官に脈管再導入する機能的血管ネットワークを形成するように、少なくとも１週間（７日間）、少なくとも１０日間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも７週間、少なくとも８週間、またはそれより長い間培養される。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、脱細胞化器官に脈管再導入するための方法は、バイオリアクターにおいて、脱細胞化器官をマトリックス上の内皮細胞と共に、外因性ＥＴＶ２タンパク質を発現する条件下で培養することを含む。本方法に用いられるマトリックスは、ラミニンおよびエンタクチンを、少なくとも５ｍｇ／ｍＬの合わせた濃度で含み得る。例えば、マトリックスは、少なくとも５ｍｇ／ｍＬのラミニンとエンタクチンの複合体を含み得る。例示的な実施形態において、マトリックスは、ラミニンおよびエンタクチンを、５ｍｇ／ｍＬの合わせた濃度で含む。特定の実施形態において、本方法に用いられるマトリックスは、ラミニン、エンタクチン、およびコラーゲンＩＶの組合せ（Ｌ．Ｅ．Ｃ．）で構成される。例えば、方法は、少なくとも５ｍｇ／ｍＬのラミニンとエンタクチン、および少なくとも０．２ｍｇ／ｍＬ  コラーゲンＩＶを含有するマトリックス上で培養して、長持ちする機能的な３次元人工血管を形成することを含む。特定の実施形態において、マトリックスは、５．２５ｍｇ／ｍＬの合わせた濃度でのラミニンおよびエンタクチン、ならびに０．２ｍｇ／ｍＬ  コラーゲンＩＶを含有する。他の実施形態において、マトリックスはＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ）である。
【０１１２】
本方法は、任意の型の脱細胞化器官に適用することができる。例えば、内皮細胞は、脱細胞化した、心臓、腎臓、精巣、卵巣、網膜、骨、内分泌腺、甲状腺、気管、リンパ節、肝臓、膵臓、脳、肺、脾臓、大腸、または小腸のような脱細胞化器官上で、外因性ＥＴＶ２タンパク質を発現する条件下で培養することができる。
【０１１３】
本開示の脈管再導入器官を、いくつもの目的のために当業者が用いることができる。したがって、いくつかの実施形態において、脱細胞化器官に脈管再導入するための本方法は、脈管再導入器官を単離することを含む。
【０１１４】
例示的な実施形態において、脈管再導入器官を得て、その後、ヒトまたは動物（例えば、マウス、ラット、イヌ、サル）のような対象へ投与することができる。特定の実施形態において、脈管再導入オルガノイドは、単離され、外科的植え込みによりヒト対象へ投与される。
【０１１５】
他の実施形態において、単離された脈管再導入器官は、治療剤の効能を決定するために用いることができる。この場合、脈管再導入器官を、治療剤と接触させ、治療剤の存在下で、ある期間培養する。その後、脈管再導入器官機能、細胞の増殖および器官健康状態を分析して、治療剤の効能を決定することができる。
【実施例】
【０１１６】
本説明は、以下の実施例によってさらに例証され、その実施例は、決して、限定するものとして解釈されるべきではない。（この出願を通して引用されているような、参照文献、発行された特許、および公開された特許出願を含む）全ての引用された参考文献の内容は、参照により本明細書に明確に組み入れられている。
【実施例１】
【０１１７】
材料および方法
細胞培養。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）およびヒト脂肪組織内皮細胞を、実験室において、Ｇｉｎｓｂｅｒｇ，Ｍ．ら  Ｃｅｌｌ（２０１２）１５１、５５９〜５７５頁（その全内容は参照により本明細書に組み入れられている）に示されているようなコラゲナーゼに基づいた消化アプローチを用いて単離した。その後、単離された内皮細胞を、０．２％ゼラチンでコーティングされた組織培養ディッシュにおいて、完全培地（Ｍ１９９  ４００ｍｌ、熱失活ＦＢＳ  １００ｍｌ、Ｈｅｐｅｓ  ７．５ｍｌ、抗生物質  ５ｍｌ、ｇｌｕｔａｍａｘ  ５ｍｌ、脂質混合物  ５ｍｌ、および内皮細胞増殖サプリメント  １／２ボトル（Ａｌｐｈａ  Ａｅｓａｒ））中、増殖させた。継代後、その細胞に、ｌｅｎｔｉ  ｐｇｋ−ＥＴＶ２または空のレンチベクターを形質導入した。必要に応じて、細胞をまた、ｐｇｋ−ｍＣｈｅｒｒｙまたはｐｇｋ−ＧＦＰレンチウイルスを用いることにより標識した。その細胞を、ａｃｃｕｔａｓｅを用いて１：２で分割し、ゼラチン化プレート上で継代した。必要に応じて、細胞を、将来的実験に用いるために凍結させた。全体として、異なるＨＵＶＥＣの１０個より多いバッチが実験に用いられた。管形成アッセイについて用いられた内皮細胞は、継代５〜１０であった。
【０１１８】
ヒト脂肪由来内皮細胞を、機械的断片化、続いて、３０分間のコラゲナーゼ消化により単離した。粗細胞集団をプラスティックディッシュ上に蒔き、５〜７日間、増殖させた後、その細胞を、ＶＥ−カドヘリン＋  ＣＤ３１＋内皮細胞を精製するためにソーティングし、上記のように増殖させた。
【０１１９】
管形成アッセイ。２４ウェルプレートを、インキュベーターにおいて、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ）  ２５０〜３００μｌで３０分間、コーティングした。それと同時に、ＥＴＶ２を含む、または含まない細胞を、ａｃｃｕｔａｓｅ処理し、カウントした。その後、細胞を、ｋｎｏｃｋ  ｏｕｔ血清およびサイトカイン（１０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ−２、１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＧＦ１、２０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ、２０ｎｇ／ｍｌ  ＳＣＦ、１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ６）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を追加したＳｔｅｍＳｐａｎ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に再懸濁した。その後、ＥＴＶ２を含むかまたは含まないかのいずれかの１００，０００個の細胞を、各ウェルに分散させた。実験の残りについて、プレートを５％酸素においてインキュベートした。ラミニン／エンタクチン／コラーゲンＩＶ（Ｌ．Ｅ．Ｃ）に基づいた実験について、高濃度（すなわち、１５ｍｇ／ｍｌ）のラミニンおよびエンタクチン（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を、リン酸バッファー溶液（ＰＢＳ）中の異なる量のコラーゲンＩＶ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）と混合した。管腔形成について最も効果的な濃度のＬ．Ｅ．Ｃ．は、２．０ｍｇ／ｍＬのコラーゲンＩＶと共に５．２５ｍｇ／ｍＬ  ラミニン／エンタクチン複合体で構成される最終マトリックスについて、ラミニン／エンタクチン複合体  ２００μｌ（１５ｍｇ／ｍｌ）およびコラーゲンＩＶ  １００μｌを含んだ。脈管密度を、２４時間〜１６週間の経過に渡って測定した。ＥＶＯＳ（登録商標）倒立顕微鏡を用いて、４×倍率で、各条件および時点について各ウェルにおける４つの異なるランダム化ゾーンでの画像を撮影した。その後、全ての画像を、ＩｍａｇｅＪによるトレースを用いて脈管密度について分析した。ＥＴＳ１またはｍｙｒＡＫＴ１を形質導入された細胞について、同じ手順を用いた。
【０１２０】
インビトロでの管の染色。８〜１２週間目において、全ての培地をウェルから除去した。管を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で１回、洗浄し、その後、室温で３０分間、固定させ、ＰＢＳで再び洗浄し、室温で１時間、ブロッキングバッファー中に置いた。その後、管を、ＶＥＣＡＤ（Ｒ＆Ｄ）、ラミニン（ａｂｃａｍ）、コラーゲンＩＶ（ａｂｃａｍ）、および／またはポドカリキシン（Ｒ＆Ｄ）に関して染色した。次の日、管をＰＢＳにおいて再び洗浄し、二次抗体と３時間、インキュベートし、ＤＡＰＩで対比染色した。全ての画像を、Ｚｅｉｓｓ  ７１０共焦点顕微鏡により取得した。
【０１２１】
電子顕微鏡観察。組織を、無血清培地またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、その後、０．１Ｍカコジル酸ナトリウムバッファー  ｐＨ７．２中２．５％グルタルアルデヒド、４％パラホルムアルデヒド、および０．０２％ピクリン酸の改変Ｋａｒｎｏｖｓｋｙの固定液で固定させた。１％四酸化オスミウムにおける二次固定後、１．５％フェリシアン化カリウム試料を、段階的エタノールシリーズにより脱水させ、Ｅｐｏｎ類似体樹脂に包埋した。超薄切片を、Ｌｅｉｃａ  Ｕｌｔｒａｃｕｔ  Ｓ  ｕｌｔｒａｍｉｃｒｏｔｏｍｅ（Ｌｅｉｃａ、Ｖｉｅｎｎａ、Ａｕｓｔｒｉａ）においてＤｉａｔｏｍｅダイアモンドナイフ（Ｄｉａｔｏｍｅ、ＵＳＡ、Ｈａｔｆｉｅｌｄ、ＰＡ）を用いて切り出した。切片を、銅グリッド上に収集し、鉛でさらに対比させ、１００ｋＶで作動したＪＥＭ  １４００電子顕微鏡（ＪＥＯＬ，ＵＳＡ，Ｉｎｃ．、Ｐｅａｂｏｄｙ、ＭＡ）において観察した。画像を、Ｖｅｌｅｔａ  ２Ｋ×２Ｋデジタルカメラ（Ｏｌｙｍｐｕｓ−ＳＩＳ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で記録した。
【０１２２】
３次元血管の灌流能力を評価するためのビーズフロー。各デバイスは、シリコンウエハーマスターから成型された２層のポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ；Ｓｙｌｇａｒｄ  １８４；Ｄｏｗ−Ｃｏｒｎｉｎｇ）から形成された。デバイスを、プラズマエッチング機（ＰｌａｓｍａＥｔｃｈ）でプラズマ処理し、続いて、トリメトキシシラン（Ｓｉｇｍａ）で一晩、処理した。使用前に、デバイスをＭｉｌｉＱ  Ｈ２Ｏで一晩、洗浄した。２．５ｍｇ／ｍｌ  ウシフィブリノーゲン（Ｓｉｇｍａ）および３Ｕ／ｍｌ  ウシトロンビン（Ｓｉｇｍａ）における３百万個のリプログラミング化内皮細胞（Ｒ−ＶＥＣ）または対照の非トランスフェクション化内皮細胞（ＣＴＲＬ−ＥＣ）の混合物を、デバイスへ２本の４００μｍ鍼治療用針（Ｈｗａｔｏ）で注射した。細胞とゲルの混合物を重合させた後、針を引き抜き、２つの中空チャネルを形成した。ＥＴＶ２形質導入内皮細胞（リプログラミング化内皮細胞）および非形質導入内皮細胞（対照）を別々に、中空チャネルへ播種し、次の日、２つの親脈管が形成された。細胞を、内皮細胞増殖培地２（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ）において培養し、６日目まで、培地を毎日、新しくした。６日目、デバイスを、シリンジポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）に接続し、４μｍ赤色蛍光ミクロスフェア（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、各デバイスにおける親脈管の１つへ５０μＬ／分で注射した。デバイス内を流れる蛍光ビーズの低速度撮影を、Ａｎｄｏｒ  Ｚｙｌａ  ｓＣＭＯＳ  ５．５ＭＰカメラ（Ａｎｄｏｒ）を備えたＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴｉＥ（Ｎｉｋｏｎ）で、５０ミリ秒間隔で撮った。蛍光ビーズの低速度撮影画像を、一緒に積み重ね、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて、ＨＵＶＥＣ脈管でオーバーレイした。
【０１２３】
例示的な血管のインビボ評価。レンチウイルス空ベクターまたはｌｅｎｔｉ−ＥＴＶ２ベクターを形質導入され、かつＧＦＰまたはｍＣｈｅｒｒｙ蛍光マーカーで標識された、ヒト臍帯静脈由来内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）およびヒト脂肪由来ヒト内皮細胞（２百万個の細胞／プラグ）を、雄または雌週齢８〜１２週間のＳＣＩＤ−ｂｅｉｇｅマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ）に皮下注射した。細胞を、まず、ＰＢＳ（５０μｌ）中に再懸濁し、その後、上記のようなＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）またはＬ．Ｅ．Ｃ．マトリックス（３５０μｌ）と混合した。細胞／マトリックス懸濁液はまた、ＦＧＦ−２（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＶＥＧＦ−Ａ（２０ｎｇ／ｍｌ）、およびヘパリン（１００ｎｇ／ｍｌ）を含んだ。各マウスは、対照細胞についての１つとＥＴＶ２を発現する細胞についての１つである、２つのプラグを受けた。１週間目、１ヶ月目、２ヶ月目、または５ヶ月目において、マウスに、ヒト内皮細胞だけを検出するＡｌｅｘａ−６４７にコンジュゲートしたＶＥＣＡＤ（クローンＢＶ９  −  Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）（ＰＢＳ  １００μｌ中２５μｇ）を注射して、ＥＴＶ２発現ヒト内皮細胞（リプログラミング化、Ｒ−ＶＥＣ）および非ＥＴＶ２発現ヒト内皮細胞（対照）の灌流および吻合潜在能力を評価した。全載画像を、カバースリップ底を含有するウェルを用いてＺｅｉｓｓ  ７１０共焦点顕微鏡で直接的に取得した。プラグを４％ＰＦＡ中、一晩、固定させ、その後、エタノール中で脱水させ、またはさらなる免疫染色のためにスクロース中に置いた。脱水したプラグを切片化し、Ｈ＆Ｅで染色した。切片を、下記のように免疫染色のために処理した。ＥＴＳ１発現細胞および／またはｍｙｒＡＫＴ１発現細胞を１ヶ月間、植え込みした時、同じ手順に従った。
【０１２４】
組織切片の免疫染色。前に４％ＰＦＡ中に固定され、かつスクロース中で処理された凍結切片（２０μＭ）を、ＰＢＳで１回、洗浄した。その後、そのスライドを、ブロッキングバッファー中室温で３０分間、および一次抗体（１：５００）中４℃で一晩、インキュベートした。次の日、スライドを、室温で１０分間、３回、洗浄し、その後、蛍光コンジュゲート型二次抗体中、３時間、インキュベートした。最後に、スライドを、１０分間、３回、洗浄し、ＤＡＰＩで対比染色した。切片にカバースリップを載せ、さらにそれを用いて、共焦点顕微鏡で画像を取得した。ストロマ染色について、マウス血管周囲細胞を検出するＰＤＧＦＲβ抗体（１：５００、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を用いた。各プラグの異なる部分由来の切片から数個の画像を取得した。各条件および時点について、異なるスライドから少なくとも１２個の画像が得られた。画像を、ＩｍａｇｅＪを用いて処理し、各画像視野の領域に対する脈管領域のパーセンテージを、ＩｍａｇｅＪソフトウェアにおける閾値機能を用いることにより定量化した。
【０１２５】
前もって形成された安定な３次元人工血管の移植。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）またはＬ．Ｅ．Ｃ．マトリックス上に上記のように形成された８〜１２週間後の人工血管を、培地を除去することにより単離し、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）またはＬ．Ｅ．Ｃ．  ２００μｌでオーバーレイした。３０分以内に、ゲル化プラグをＳＣＩＤ−ｂｅｉｇｅマウスへ皮下に投与した。プラグ全体を、皮下切開により形成されたポケットへ外科的に挿入し、縫合して閉じた。２週間後、吻合および灌流された血管の形成を検出するために、マウスに、ヒトＶＥＣＡＤに対する生体内抗体を注射した。
【０１２６】
腸組織の採取および器官の脱細胞化。腸を、体重が２５０ｇ〜３５０ｇの範囲であるＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットから採取した。簡単に述べれば、無菌条件下で正中開腹術を実施し、腸を曝露させた。単離された区域を灌流する腸間膜動脈および腸間膜静脈を保存しながら、５ｃｍの長さの腸の区域を単離した。両方の血管を、２６Ｇカニューレでカニューレ処置し、腸管腔を、１／４インチの有棘コネクターを用いてカニューレ処置した。単離された腸区域を、蠕動ポンプ（ｉＰｕｍｐ）を用いて１ｍｌ／分で脈管構造および管腔を灌流することにより脱細胞化した。脱細胞化過程は、ｍｉｌｌｉＱ水を２４時間、デオキシコール酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）を４時間、およびＤｎａｓｅ  Ｉ（Ｓｉｇｍａ）を３時間、灌流することからなった。脱細胞化腸を、使用前にガンマ線照射で滅菌した。
【０１２７】
バイオリアクター培養。脱細胞化腸に、５百万個のＧＦＰ＋  ＥＴＶ２＋ヒト内皮細胞（外因性ＥＴＶ２を発現するリプログラミング化ＥＣ）または５百万個のＧＦＰ＋対照内皮細胞（ＣＴＲＬ−ＥＣ）のいずれかを播種した。細胞を、腸間膜動脈および腸間膜静脈を通して播種した。播種された腸を、無菌条件下でバイオリアクターの内部へ搭載した。２４時間後、灌流を、蠕動ポンプ（ｉＰｕｍｐ）を用いて１ｍｌ／分で腸間膜動脈を通して開始した。細胞を、２０％熱失活ＦＢＳ、１％  Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ、１．５％  ＨＥＰＥＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、１％  Ｇｌｕｔａｍａｘ（商標）（Ｇｉｂｃｏ）、１％  脂質混合物（Ｇｉｂｃｏ）、１％  ヘパリン（Ｓｉｇｍａ）および１５μｇ／ｍｌ  内皮細胞増殖サプリメント（Ｍｅｒｃｋ）を追加したＭ１９９／ＥＢＳＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）中、最初の５日間、増殖させ、その後、細胞を、１．１％  ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ血清（Ｔｈｅｒｍｏ）、１％  Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ、１％  Ｇｌｕｔａｍａｘ、１０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、２０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＧＦ２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、２０ｎｇ／ｍｌ  ＳＣＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、および１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ６（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を追加したＳｔｅｍＳｐａｎ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中、２日間、増殖させた。７日後、再内皮化された腸を、無菌条件下で採取し、植え込みのために５×７ｍｍの区域を切除した。その後、残りの腸組織を、４％パラホルムアルデヒド中で固定し、蛍光顕微鏡観察による画像化のためにマウントして、調製した。脈管の開存性を評価するために、いくつかの再内皮化された腸を、蛍光標識ＬＤＬまたはヒトＰＥＣＡＭ（ＣＤ３１）に対する抗体で生体内灌流させた。
【０１２８】
異所性移植片植え込み。週齢８〜１２週間の免疫不全ＮＯＤ−ＳＣＩＤ−ガンマ（ＮＳＧ）マウスを、２〜５％イソフルラン−酸素ガス混合物で麻酔した。鎮痛の誘導時にブプレノルフィン０．１ｍｇ／Ｋｇを投与した。無菌条件下で、正中開腹術を実施した。胃をその切り込みから外面化させ、網を、大きく曲がった状態から伸ばした。その後、操作された腸の区域を、網の包みの閉鎖を確実にするために８／０縫合糸を用いて、網内に包んだ。胃および網を、腹部に戻し、６／０縫合糸を用いて開腹を閉じた。動物を、手術後すぐに通常に食べたり飲んだりするようにさせ、術後の期間中、さらなる薬物療法を与えなかった。１週間または４週間後、マウスに、蛍光標識抗ＶＥＣＡＤまたは蛍光標識イソレクチンを静脈内注射し、安楽死させた。移植片を、網の包みと共に回収し、４％パラホルムアルデヒド中で固定させ、蛍光顕微鏡による画像化のためにマウントし、調製した。
【０１２９】
機能的脈管の灌流、吻合、サイズ、形、および密度の分析。インビトロでの内皮の再脈管化の定量化を、１０×視野における５×５の面積上で実施した。画像を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて、閾値を設定し、かつ腸面積に対してＣＤ３１シグナルに覆われる面積を定量化することにより、処理した。ＧＦＰおよびＶＥ−カドヘリンが陽性の細胞のインビボ定量化を、共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ７１０）で獲得された画像上で実施し、２０×視野における３×３の面積を評価した。脈管パラメータの評価を、Ａｎｇｉｏｔｏｏｌソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を用いて実施した。
【０１３０】
オルガノイド単離および培養。マウス小腸オルガノイドを、Ｏ’Ｒｏｕｒｋｅ，Ｋ．  Ｐ．ら  Ｂｉｏ  Ｐｒｏｔｏｃ．（２０１６）６（その全内容は参照により本明細書に組み入れられている）に以前に記載されているように、単離および維持した。ヒト結腸陰窩および腺腫の単離；オルガノイドの培養および維持を、Ｓｕｇｉｍｏｔｏ，Ｓ．  ＆  Ｓａｔｏ，Ｔ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ（２０１７）１６１２、９７〜１０５頁（その全内容は参照により本明細書に組み入れられている）に以前に記載されているように実施した。正常組織および腺腫組織を収集した。簡単に述べれば、１０ｍＭニコチンアミド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と共にＷｎｔ３ａ、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ−３、およびＮｏｇｇｉｎを含有する無血清培地中で培養物を成長させ、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ）において増殖させた。オルガノイドを、１０μＭ  Ｙ２７６３２（Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を追加したＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）において消化させることにより、７日間ごとに継代した。
【０１３１】
リプログラミング化ヒト内皮細胞とのオルガノイドの共培養。ＭＣｈｅｒｒｙ  ＥＴＶ２  ＥＣまたは対照（ＣＴＲＬ）ＥＣ（４百万個の細胞／ｍｌの最終濃度）を、マウス小腸オルガノイド、正常なヒト結腸、または患者由来腫瘍オルガノイドと、２４ウェルプレートにおけるＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）バブル  ７５μｌ中、またはチャンバースライドにおけるＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）バブル  ４０μｌ中で混合し（正常なオルガノイドは１：２継代し、腫瘍オルガノイドは１：３で継代した）、ＦＧＦ−２（１０ｎｇ／ｍｌ）およびヘパリン（１００ｎｇ／ｍｌ）を添加したオルガノイド培地において培養した。２４時間目、４日目、５日目、７日目において、生きている培養物から画像を取得した。８日目において、共培養物を固定させ、マウント全体を、ケラチン２０（ＫＲＴ２０）、ＥｄＵ、および／またはＥｐＣａｍで染色した。
【０１３２】
ＲＮＡライブラリー調製および配列データ処理。全ＲＮＡ  少なくとも１００ｎｇを、各試料について単離し（ＴＲＩｚｏｌ  ＬＳのフェノール−クロロホルム分離）、ＱｉａｇｅｎのＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを用いて精製した。ＲＮＡの品質を、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを用いて検証した。ＲＮＡライブラリー調製物を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＴｒｕＳｅｑ  ＲＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖ２（非ストランド型およびポリＡ選択）を用いて、調製および多重化し、１０ｎＭ  ｃＤＮＡを、５１塩基ペアエンドリードを生じるＩｌｌｕｍｉｎａのＨｉＳｅｑ  ２５００によるハイスループットシーケンシングのためのインプットとして用いた。シーケンシングリードを、逆多重化し（ｂｃｌ２ｆａｓｔｑ）、高品質リードを、ＨＵＶＥＣ試料について構築されたＵＣＳＣ  ｈｇ１９ゲノム、およびマウスＥＣについて構築されたＵＣＳＣ  ｍｍ１０ゲノムのトランスクリプトーム配列参照へマッピングした（ＴｏｐＨａｔ２；Ｂｏｗｔｉｅ２）。遺伝子量測定（ＦＰＫＭ値）について、マッピングされたリードを、転写産物へ組み立て、定量化した（Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓ）。ＦＰＫＭ＜１を有する遺伝子を、フィルターにかけて除去し、塩基−２  ｌｏｇ変換されたＦＰＫＭ値を、ＭＤＳ、ｖｏｌｃａｎｏ、およびヒートマップのプロットをプロットするために用いた。遺伝子オントロジー分析を、ＤＡＶＩＤ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｔｏｏｌｓを用いて実施した。ベン図内に示されたＰ値は、超幾何分布曲線の累積分布関数（ＣＤＦ）に基づいて計算された。
【０１３３】
ＣｈＩＰおよび抗体。ＣｈＩＰアッセイを、実験あたりおよそ１×１０７個の細胞を用いて実施した。簡単に述べれば、細胞を、１％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中、３７℃で１０分間、クロスリンクさせ、その後、０．１２５Ｍ  グリシンにより停止させた。クロマチンを、Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ（Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ）を用いて剪断して、２００〜４００塩基対の断片を生じ、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）  ７５μｌと結合した抗体  ２〜５μｇと４℃で一晩、インキュベートした。磁気ビーズを洗浄し、クロマチンを溶出した。ＣｈＩＰ  ＤＮＡを、リバースクロスリンクさせ、カラム精製した。ＣｈＩＰを、以下の抗体を用いて実施した：Ｆｌａｇ（Ｓｉｇｍａ  Ｆ１８０４）；Ｈ３Ｋ４ｍｅ３（Ａｂｃａｍ  ａｂ８５８０）；およびＨ３Ｋ２７ａｃ（Ａｂｃａｍ  ａｂ４７２９）。ＱＩＡＧＥＮ  ＲＮｅａｓｙ  ｋｉｔを用いてＲＮＡを単離した。ＲＮＡ−ｓｅｑライブラリーを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＴｒｕＳｅｑ  ＲＮＡ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔで調製した。ＣｈＩＰ−ｓｅｑライブラリーを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＴｒｕＳｅｑ  ＤＮＡ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔで調製した。ＲＮＡ−ｓｅｑライブラリーとＣｈＩＰ−ｓｅｑライブラリーの両方を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ４０００  ｓｙｓｔｅｍでシーケンシングした。
【０１３４】
ＣｈＩＰ−ｓｅｑリードを、ＢＷＡアラインメントソフトウェア（バージョン０．５．９）を用いて参照ヒトゲノム（ｈｇ１９、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  ＧＲＣｈ３７）に対してアラインメントした。ミスマッチがリード長の４％以下である単一の最良マッチング位置にマッピングされた固有リードを、ピーク同定およびプロファイル作成のために保持した。配列データを、百万個のリードに対して標準化することによりＩＧＶで可視化した。インプットＤＮＡからのシーケンシングデータを対照として、ソフトウェアＭＡＣＳ２をＣｈＩＰ−ｓｅｑデータに適用して、ＥＴＶ２のゲノム濃縮（ピーク）または特異的なヒストン修飾を同定した。生じたピークを、ＥＴＶ２についてｐ値＜０．０５およびＫ４ｍｅ３またはＫ２７ａｃ修飾についてｐ値＜０．０１によるフィルターにかけた。リードカウント数を、ＨＯＭＥＲにより個々のプロモーターにおいて算出した。各同定されたピークに、ＨＯＭＥＲにより、プロモーター（転写開始部位から±２ｋｂ）、遺伝子本体、または遺伝子間領域をアノテーションした。
【実施例２】
【０１３５】
内皮細胞における外因性ＥＴＶ２の一過性発現はインビトロで、長持ちし、かつ安定な３次元人工血管を形成する
本研究は、分化型内皮細胞におけるＥＴＶ２の一過性誘導が、内皮細胞を、非血管細胞に対する細胞親和性の増強を獲得し、加えて、インビトロおよびインビボで安定な３次元人工脈管を形成するように耐久性およびパターニング可塑性を生じるように、リプログラミングするだろうことを示す。ＥＴＶ２転写因子発現が脈管形成を変化させるかどうかを決定するために、ＥＴＶ２を形質導入された内皮細胞を、単一細胞ＦＡＣＳソーティングし、クローン的に増殖させた。内皮細胞における外因性ＥＴＶ２発現は、一貫して、細胞外マトリックスの表面に局在する場合が多い、人工血管の組織化された耐久性のある幾何学的パターンを有する分岐型出芽血管ネットワークの形成を生じた。
【０１３６】
レンチウイルスベクターによるＥＴＶ２の投与を、免疫染色およびウェスタンブロット分析により、典型的な平面状単層丸石形を形成する扁平内皮細胞と、３次元（３Ｄ）管を形成する扁平内皮細胞の両方において評価した。図１Ａ〜１Ｃ参照。７日間の培養に渡って、５％酸素圧（正常酸素圧）における無血清条件下で、外因性ＥＴＶ２を発現するヒト臍帯静脈内皮細胞または成体脂肪由来内皮細胞（Ｒ−ＶＥＣ）は、図１Ｄ〜１Ｆに示されているように、外因性ＥＴＶ２を含まない対照内皮細胞と比較して、機能的３Ｄ人工脈管を形成することにおいて有意に優れており、脈管形成において５０倍より高い増加を示した。注目すべきことには、形成された３次元人工脈管は、図１Ｅに示されているように、１６週間より長い間、インビトロで維持されることができた。
【０１３７】
分化型内皮細胞の、管腔を有する安定な３Ｄ人工血管へ自己集合する能力が、転写因子の他のＥＴＳファミリーの管の属性であるかどうかを決定するために、分化型内皮細胞に、別のＥＴＳ転写因子、ＥＴＳ１を形質導入した。さらに、ＥＴＶ２が、内皮細胞へ血管新生機能を、その細胞生存を増加させることにより与えるのかどうかを調べるために、内皮細胞に、構成的に活性のあるミリストイル化ＡＫＴ１（ｍｙｒＡＫＴ１）を形質導入した。図１Ｇに示されているように、ＥＴＳ１発現もｍｙｒＡＫＴ１発現も、分化型内皮細胞が安定な３Ｄ人工血管を形成するのを、ＥＴＶ２のようには可能にしなかった。したがって、分化型ヒト内皮細胞における外因性ＥＴＶ２発現が、その細胞をリプログラミングし、かつ、人工血管を形成するための既存の方法により必要とされる人工スキャフォールド、周皮細胞被覆、強制的灌流、またはずり応力に束縛されることなく、安定な３Ｄ血管へ自己集合する能力をそのＥＣに提供することが示されている。
【０１３８】
適切な管腔形成は、人工３Ｄ血管機能に必要とされる。図１Ｈに示されているように、共焦点顕微鏡により、本開示の安定な３Ｄ人工血管における連続した中断されていない管腔の存在が明らかにされている。その脈管は、適切な極性化を現し、ポドカリキシンが頂端膜側に発現し、基底膜側にラミニンが発現した（図１Ｉ）。さらに、図１Ｊに示されているように、脈管形成後８〜１２週間目において、人工３Ｄ血管は、開存性管腔およびタイトジャンクションを有する分岐パターニング脈管を自律的に形成する。したがって、本開示の安定な３次元血管は、管腔を有し、かつ適切な頂端膜側−基底膜側極性を示す。
【０１３９】
インビトロでの脈管パターニングおよびオルガノイド形成のための現在のアプローチは、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）のような細胞外マトリックスの粗調製物の使用を必要とする。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）は、多数の消化されたマトリックス成分を含有し、それゆえに、特定の成分が脈管形成またはそれらのオルガノイド細胞成分との相互作用に必要とされるかどうかを決定することは困難である。脈管細胞外マトリックスの多数の組合せによりスクリーニングして、マトリックス成分、ラミニン、エンタクチン、およびコラーゲンＩＶ（Ｌ．Ｅ．Ｃ．）の正確な化学量論が、本開示の安定な３Ｄ血管の自己集合を可能にすることが決定された。顕著なことには、図１Ｋに示されているように、対照のナイーブのヒト内皮細胞が、Ｌ．Ｅ．Ｃ．をマトリックスとして用いた場合、血管ネットワークを形成しなかった。さらに、図１Ｌに示されているように、Ｌ．Ｅ．Ｃ．およびＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）上で形成された脈管は、８週間を超えて、類似した脈管密度および分岐を示した。電子顕微鏡観察により、Ｌ．Ｅ．Ｃ．上に形成された脈管における管腔の存在が確認された。図１Ｍ参照。総合すれば、分化型内皮細胞におけるＥＴＶ２の外因性発現は、少なくともラミニン、エンタクチン、およびコラーゲンＩＶを含むマトリックス上で安定な３次元人工血管を形成する。
【０１４０】
灌流、および層流を持続させるＲ−ＶＥＣ脈管の能力を試験するために、蛍光標識された、対照−ＥＣ（ＣＴＲＬ−ＥＣ）またはＥＴＶ２をコードする外因性核酸を含む内皮細胞を、マイクロ流体デバイスにおいて、並行して播種した。図２Ａに示されているように、播種後、外因性ＥＴＶ２を発現する内皮細胞は、管腔を有する脈管へと組織化および自己集合したが、対照細胞は、血管を生成することができなかった。いったん人工血管の血管ネットワークが確立されたならば、本開示の安定な３次元人工血管が層流を持続させ得るかどうかを決定するために、ｍＣｈｅｒｒｙ標識ビーズ（４μＭ）を、そのデバイスの１つのチャネルを通して循環させた。図２Ａに示されているように、外因性ＥＴＶ２を発現する内皮細胞から形成された安定な３次元人工血管は、チャネルに渡るビーズの流れに耐えた。対照的に、対照の非ＥＴＶ２形質導入内皮細胞（ＣＴＲＬ−ＥＣ）を含むチャネルを渡って、ビーズは流れなかった。さらに、図２Ｂに示されているように、外因性ＥＴＶ２を発現する内皮細胞から形成された人工血管において、ＣＴＲＬ−ＥＣを含有するものと比較して、脈管密度が有意に高かった。したがって、外因性ＥＴＶ２を発現する内皮細胞から形成された安定な３次元の管腔を有する血管細管は、血管周囲サポートも、スキャフォールドによる、限定をもたらす拘束も必要とせずに、灌流を持続させる。
【実施例３】
【０１４１】
外因性ＥＴＶ２を発現する内皮細胞はインビボで安定な３次元機能的脈管を形成する
外因性ＥＴＶ２を発現する内皮細胞の、機能的なパターニング化脈管を持続させる潜在能力を、インビボのマウスモデルを用いて評価した。この場合、ＳＣＩＤ−ｂｅｉｇｅマウスに、ラミニン、エンタクチン、およびコラーゲンＩＶ（Ｌ．Ｅ．Ｃ．）と混合された、ｍＣｈｅｒｒｙまたはＧＦＰ標識の、対照ヒト内皮細胞、または外因性ＥＴＶ２を発現するリプログラミング化内皮細胞を含有するプラグを皮下に植え込んだ。植え込みから１〜５ヶ月後、脈管導入の程度（脈管存続および既存のマウス脈管構造への吻合）を、図３Ａ〜Ｍに示されているように、生体内染色により評価した。図３Ａは、外因性ＥＴＶ２を発現するリプログラミング化内皮細胞（Ｒ−ＶＥＣ）を有するプラグを投与されたマウスが、対照の非ＥＴＶ２形質導入内皮細胞を投与されたマウスより、見かけ上はより多く脈管導入されたことを示している。全載共焦点写真と後のプラグの切片化の両方により、外因性ＥＴＶ２を発現するリプログラミング化内皮細胞を投与されたマウスにおいて、対照のＥＴＶ２を発現しない内皮細胞プラグと比較して、はるかに高い脈管密度、組織化、およびパターニングが明らかにされた。
【０１４２】
安定な３Ｄ人工血管の、液体を灌流し、かつマウス脈管構造へ吻合する能力を調べることにより、脈管機能をインビボでさらに評価した。図３Ｂ〜Ｃ参照。さらに、図３Ｄに示されているように、脈管密度は、１ヶ月目時点と２ヶ月目時点の両方において、外因性ＥＴＶ２を発現するリプログラミング化内皮細胞を注射された動物において、対照ＥＣより、有意に高かった。同様の結果は、１週間目時点、１ヶ月目時点、および２ヶ月目時点において、Ｌ．Ｅ．Ｃ．の代わりにマトリックスとしてＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）を用いて形成された人工血管の機能性を分析した場合に得られた。図３Ｅ〜Ｆ参照。組織学的分析により、機能的な灌流脈管が、外因性ＥＴＶ２を発現するリプログラミング化内皮細胞に関して、対照内皮細胞と比較して、よりずっと高い率で形成されたことが示された。図３Ｇ。さらに図３Ｈは、本開示の安定な３Ｄ血管がマウス周皮細胞を含有したことを示しており、その周皮細胞は、管腔幾何学的配置をさらに安定させている。顕著なことには、ｍｙｒＡＫＴ１またはＥＴＳ１を形質導入された内皮細胞は、機能的ではない人工脈管を形成した。例えば、これらの脈管は、図３Ｉ〜３Ｋに示されているように、灌流されておらず、マウスにおいて脈管導入することはできなかった。前述を鑑みれば、本開示の外因性ＥＴＶ２を発現するリプログラミング化内皮細胞は、定義済みのマトリックスにおける単一細胞集団として注射された場合、インビボで、脈管化して、機能的血管ネットワークを形成する。
【０１４３】
同様に、外因性ＥＴＶ２を発現する内皮細胞から形成された安定な３次元血管が、単一細胞懸濁液として投与される代わりに植え込まれた場合、脈管機能性および脈管密度は、長い期間をかけて、維持された。これは、本開示の安定な３Ｄ血管を、器官特異的組織を再生するためにオルガノイドと共に移植し得ることを示している。外因性ＥＴＶ２を発現する内皮細胞は、８週間培養されて、インビトロで安定な血管ネットワークを形成し、その後、それを、ＳＣＩＤ−ｂｅｉｇｅマウスへ、完全に形成された血管移植片として皮下注射した。その後、マウスに、灌流された脈管を同定するためにＶＥｃａｄ抗体を注射した。図３Ｌおよび３Ｍに示されているように、マウスＰＦＧＦＲβ＋周皮細胞が、移植された脈管の周りにリクルートされて、毛細血管様脈管および小さい細動脈の血管ネットワークを安定化および形成したことから、植え込まれた脈管は、内因性マウス血管と機能的に吻合した。したがって、本開示の３次元血管は、安定で機能的であり、かつスキャフォールドも血管周囲サポートも必要とすることなく、移植の応力を持続させる。これは、本開示の安定な３Ｄ血管が、対象において脈管導入を促進するための実行可能な媒介物であることを示している。
【実施例４】
【０１４４】
一過性ＥＴＶ２発現は機能的人工血管を形成する
ＥＴＶ２の一過性発現が、安定な３Ｄ血管形成を持続させるのに十分であるかどうかを決定するために、リバースｔｅｔトランス活性化因子（ｒｔＴＡ）−ドキシサイクリン誘導性発現系を用いた。定量的ＰＣＲ分析により、ドキシサイクリン除去でのＥＴＶ２の急速な下方制御が確認された。図４Ｈ。上記のインビトロの脈管形成アッセイおよびインビボのプラグアッセイにより、ＥＴＶ２発現が、４週間目（すなわち、１ヶ月目）において脈管が適切に生じるまで必要とされるだけで、その後は必須でなかったことが示されている。図４Ａ〜Ｂ。実際、図４Ｃ〜Ｄに示されているように、培養の最初の４週間の間にＥＴＶ２を発現する内皮細胞により形成された人工脈管が、それらのＥＴＶ２が賦与した脈管適応性を持続させた。
【０１４５】
さらに、図４Ｅおよび４Ｆに示されているように、インビトロで培養された内皮細胞と比較した場合、ＥＴＶ２を発現する内皮細胞により形成された人工脈管は、新鮮に単離された内皮細胞との転写の類似性を獲得している。顕著なことには、３Ｄ人工血管が４週間目において安定になるため、上方制御された遺伝子の発現は、下方制御されて、その細胞は、全体的な微小環境の環境に適応する。図４Ｇ参照。
【実施例５】
【０１４６】
ＥＴＶ２を発現するリプログラミング化内皮細胞がオルガノイドに脈管導入する
ＥＴＶ２を発現する内皮細胞についての、マウス、ヒト、または悪性上皮のオルガノイド培養物において、分枝する、すなわち、分岐３次元血管ネットワークを形成する潜在能力を、解明した。ＧＦＰ標識ヒトまたはマウス小腸オルガノイドを、ＥＴＶ２を発現するリプログラミング化内皮細胞（Ｒ−ＶＥＣ）またはナイーブ内皮細胞（ＣＴＲＬ−ＥＣ）のいずれかと混合した。図５Ａに示されているように、Ｒ−ＶＥＣは、２４時間以内に、高度に組織化された３Ｄ脈管を形成し、かつ陰窩蕾を含有する幹細胞と分化型絨毛様中央ドメインの両方を付随することができた。ＥＴＶ２を発現するリプログラミング化内皮細胞による腸オルガノイドの脈管導入は、より組織化されて、４日目および７日目までに、事実上あらゆるオルガノイドユニットに広がって分枝する、パターニング化脈管を形成した。対照的に、ナイーブの非ＥＴＶ２形質導入内皮細胞（ＣＴＲＬ−ＥＣ）は、オルガノイドの存在下で脈管を形成することができず、それにより、オルガノイドに脈管導入する能力を欠損した。図５Ａ。
【０１４７】
図５Ｂおよび５Ｃに示されているように、オルガノイドあたりの脈管密度および形成された毛細血管の数は、リプログラミング化内皮細胞と共に培養されたオルガノイドにおいて有意により高いことが見出された。
【０１４８】
図５Ｄ〜５Ｆに示されているように、ヒト由来正常結腸オルガノイドに関して、ＥＴＶ２を発現するリプログラミング化内皮細胞は、分枝し、血管ネットワークを形成した。さらに、結腸オルガノイドの脈管密度、数、加えて、オルガノイドサイズが、ＥＴＶ２を発現するリプログラミング化内皮細胞と共培養された場合、より高いことが見出された。したがって、リプログラミング化内皮細胞は、分化型内皮細胞が、内因性上皮細胞に結合して、機能的血管ネットワークを形成することを可能にする。
【０１４９】
図５Ｇ〜５Ｊに示されているように、２４時間以内に、ＥＴＶ２を発現するリプログラミング化内皮細胞（Ｒ−ＶＥＣ）は、腫瘍オルガノイドへ遊走し、腫瘍オルガノイドに、積極的かつ豊富に脈管導入したが、ナイーブ内皮細胞（ＣＴＲＬ−ＥＣ）は、そのように行うことができなかった。例えば、図５Ｇは、７日間で、全ての腫瘍オルガノイドが、分枝状態にされ、組織化されていない非常に高密度の脈管集団を有したことを示している。図５Ｈに示されているように、脈管密度はまた、対照の非ＥＴＶ２形質導入内皮細胞と比較して、Ｒ−ＶＥＣ共培養物においてずっと高いことが見出された。上皮マーカーＥｐＣａｍについての染色により、腫瘍結腸オルガノイド細胞とリプログラミング化内皮細胞との間の密接な細胞間相互作用が明らかにされた。図５Ｉ参照。顕著なことには、リプログラミング化内皮細胞が組織化された血管網を形成した、正常な腸と結腸オルガノイドの共培養と違って、腫瘍オルガノイド内の脈管は、腫瘍脈管構造を模倣して、組織化されず、形およびサイズが異常であった。図５Ｇおよび５Ｊ参照。
【０１５０】
トリプルネガティブ乳がんオルガノイドを含む他の患者由来腫瘍オルガノイドもまた、図５Ｋ〜５Ｌに例示されているように、同様の結果を生じた。
【０１５１】
前述を鑑みれば、本開示のリプログラミング化内皮細胞および安定な３Ｄ人工血管は、多くの異なる組織型のオルガノイドに脈管導入する能力があり、それらが導入される環境に適応し、正常なオルガノイドおよび腫瘍原性オルガノイドの設定においてリモデリングおよび形態が変化した挙動を示す。例えば、図５Ｊ参照。
【実施例６】
【０１５２】
リプログラミング化内皮細胞は脱細胞化器官に脈管導入する
再生医学において、毛細血管および細動脈を含む長持ちする機能的脈管構造の生成は、まだ達成されていない。具体的には、大口径脈管は、内皮細胞でコロニー形成することができるが、器官またはモデル器官へ、長期に渡って分配される血液供給を提供することができるより小さい毛細血管サイズの脈管を形成することは困難である。ここで、外因性ＥＴＶ２を発現するリプログラミング化内皮細胞を、脱細胞化腸器官モデルへ導入し、そのモデルにおいて、それらは、バイオリアクターの内部でのインビトロで、脈管化構造を確立することができた。図６Ａ〜Ｂ参照。結果は、外因性ＥＴＶ２を発現するリプログラミング化内皮細胞（Ｒ−ＶＥＣ）が、脱細胞化腸の毛細血管に豊富に配置され、腸壁の全領域に渡る均等な分布を達成したことを示す。図６Ｃ参照。図６Ｄ〜６Ｅに示されているように、ＣＤ３１抗体での生体内染色およびアセチル化ＬＤＬ取り込みにより、対照の非ＥＴＶ２形質導入内皮細胞（ＣＴＲＬ−ＥＣ）を用いた場合と比較して、Ｒ−ＶＥＣを用いた場合、ずっと高い脈管被覆が明らかにされた。図６Ｆおよび６Ｇに示されているように、再内皮化領域の定量化および血管ネットワークパラメータが、外因性ＥＴＶ２を発現するリプログラミング化内皮細胞のより高い脈管導入潜在能力を裏付けている。インビトロでの１週間の培養後、脈管再導入された腸を、免疫不全ＮＯＤ−ＳＣＩＤ−γマウスの網に植え込んだ。１週間目および４週間目の両方において、生体内イソレクチンおよびヒトＶＥｃａｄ注射により示されているように、外因性ＥＴＶ２を発現するリプログラミング化内皮細胞は、脱細胞化腸に脈管導入し、大口径脈管（動脈および静脈）および小口径脈管（毛細血管）の連続性を保持して、マウス脈管構造へ吻合した。図６Ｈ〜６Ｊ参照。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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