(57)【要約】本発明は、テルペン及びテルペノイド産物を生産するための方法及び細菌株に関し、該細菌株はＭＥＰ経路を通り流入し、下流の組換え合成経路に至る炭素を向上させる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
テルペンまたはテルペノイド産物の生産方法であって、
上流のメチルエリスリトールリン酸経路（ＭＥＰ経路）を介してイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）及びジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）を生産し、かつ、下流合成経路を介してＩＰＰ及びＤＭＡＰＰをテルペンまたはテルペノイド産物に変換する細菌株を提供することであって、
１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル４−二リン酸（ＨＭＢＰＰ）中間体への炭素フラックスの増加をもたらすようにＩｓｐＧ活性とＩｓｐＨ活性のバランスを調整すると同時に、ＭＥＰ経路のフラックス及びテルペンまたはテルペノイドの生産性をフィードバック及び低減する量でのＨＭＢＰＰの蓄積を防止するように、前記細菌株でＩｓｐＧ及びＩｓｐＨを過剰発現させ、前記株は場合により、前記ＭＥＰ経路を介した電子の供給及び／または伝達、及び／またはテルペンもしくはテルペノイド産物への電子の供給及び／または伝達を増強する１つ以上の遺伝子改変を含む前記細菌株を提供することと、前記テルペンまたはテルペノイド産物を生産する前記細菌株を培養することとを含む、前記方法。
【請求項２】
前記細菌株が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．、Ｖｉｂｒｉｏ  ｓｐｐ．、及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．から選択される細菌である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細菌株が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓ、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａから選択される種である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記細菌株がＥ．ｃｏｌｉである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記細菌株が、場合によりオペロンとして発現される組換え遺伝子としてｄｘｓ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＦ、及びｉｄｉを発現する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記細菌株が、場合により１、２、または３個のオペロンとして発現される組換え遺伝子としてｄｘｓ、ｄｘｒ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＥ、ｉｓｐＦ、及びｉｄｉを発現する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＭＥＰ経路の前記組換え遺伝子が、１つ以上のプラスミドから発現されるか、または染色体に組み込まれる、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
ＩｓｐＧ及びＩｓｐＨが、組換えｉｓｐＧ及びｉｓｐＨ遺伝子を前記細菌株に導入することによって過剰発現される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記組換えＩｓｐＧ及び／またはＩｓｐＨ酵素が、１つ以上の有益な変異を含むか、または培養に使用される条件下で改善された特性もしくは活性を有するオルソログである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記組換えＩｓｐＨの活性及び／または発現が、前記組換えＩｓｐＧの活性及び／または発現よりも高い、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記組換えＩｓｐＨの前記発現が、前記組換えＩｓｐＧの前記発現よりも高い、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記組換えＩｓｐＨ及びＩｓｐＧが、オペロンから発現し、前記オペロン内で前記ＩｓｐＧ遺伝子の前にＩｓｐＨ遺伝子が位置する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記オペロンが強力なプロモーターの制御下で発現される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記組換えＩｓｐＧ及びＩｓｐＨ酵素の発現が、前記ｉｓｐＧ及び／またはｉｓｐＨの組換え遺伝子の前記プロモーター強度、遺伝子コピー数、及び／またはリボソーム結合部位配列を変更することによってバランスが調整される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記組換えｉｓｐＧ及びｉｓｐＨ遺伝子を含まない親株の場合よりも実質的に多くＨＭＢＰＰが細胞に蓄積されることがない、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記組換えｉｓｐＧ及びｉｓｐＨ遺伝子がプラスミドから発現されるか、または前記染色体に組み込まれる、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記組換えｉｄｉ遺伝子の発現または活性が、テルペンまたはテルペノイドの生産量が増加するように調整される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記プロモーター強度、遺伝子コピー数、オペロン内の位置、またはリボソーム結合部位を変更することにより、前記組換えｉｄｉ遺伝子の前記発現を調整する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ＨＭＢＰＰが１０ｍｇ／ｇ乾燥細胞重量を超えて蓄積しない、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記細菌株が、前記ＭＥＰ経路を介した電子の供給及び／または伝達、及び／またはテルペンもしくはテルペノイド産物への電子の供給及び／または伝達を増強し、場合によりピルビン酸を酸化する及び／またはフェレドキシンを還元する１つ以上の遺伝子改変を含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記細菌株がオキシドレダクターゼの過剰発現を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記オキシドレダクターゼがピルビン酸：フラボドキシンオキシドレダクターゼ（ＰＦＯＲ）である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＰＦＯＲがＹｄｂＫである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記細菌株が組換えＹｄｂＫ遺伝子を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記組換えＹｄｂＫ遺伝子が、前記染色体に組み込まれるか、またはプラスミドから発現され、場合により弱強度または中強度のプロモーターの制御下にある、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記株が、テルペノイド化合物を生産するための１つ以上のＰ４５０酵素を含む、請求項２１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
フラボドキシン、フラボドキシンレダクターゼ、フェレドキシン、及びフェレドキシンレダクターゼのうちの１つ以上の過剰発現をさらに含む、請求項２１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
Ｄｘｒ、Ｄｘｓ、ＩｓｐＤ、ＩｓｐＥ、及びＩｓｐＦの発現または活性に対する、前記ＩｓｐＧ及びＩｓｐＨの発現または活性のバランスを調整し、培養物中のＭＥｃＰＰ代謝産物を減少させる、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記細菌株が、ＰｇｐＢ及び／またはＮｕｄＢの過剰発現を含む、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記細菌株が少なくとも１つの組換えｐｇｐＢ及び／またはｎｕｄＢ遺伝子を発現する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記組換えＰｇｐＢ及び／またはＮｕｄＢの前記発現が、場合によりプロモーター強度、遺伝子コピー数、オペロン内での位置、及び／またはリボソーム結合部位を変更することによって、テルペンまたはテルペノイド生産力価を高めるように調整される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記組換えＰｇｐＢ及び／またはＮｕｄＢが、弱強度または中強度のプロモーターの制御下で発現される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記組換えｐｇｐＢまたはｎｕｄＢが、前記染色体に組み込まれるか、またはプラスミドから発現される、請求項３０〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記細菌株が、補因子の可用性または代謝回転を増加させるための１つ以上の追加改変を有し、前記１つ以上の追加改変はグリセルアルデヒド−３−リン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＧＡＰＯＲ）の組換え発現；ｙｄｈＶ及び／またはｙｄｈＹの過剰発現；ｇｓｈＡの下方制御、不活性化、または欠失：ならびにＣＨＡＣ１及び／またはＣＨＡＣ２の組換え発現から場合により選択される、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
細菌細胞における前記ＭＥＰ経路からの過剰な炭素フラックスの排出方法であって、
上流のメチルエリスリトールリン酸経路（ＭＥＰ経路）を介してイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）及びジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）を生産し、かつ、場合により下流合成経路を介してＩＰＰ及びＤＭＡＰＰをテルペンまたはテルペノイド産物に変換する細菌株を提供することであって、
前記細菌株は１つ以上のＭＥＰ経路遺伝子を過剰発現し、ＰｇｐＢ及び／またはＮｕｄＢを過剰発現する、前記細菌株を提供することと、、
ＭＥＰ炭素を生産する前記細菌株を培養することとを含む、前記方法。
【請求項３６】
前記細菌株が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．、Ｖｉｂｒｉｏ  ｓｐｐ．、及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．から選択される細菌である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記細菌株が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓ、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａから選択される種である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記細菌株がＥ．ｃｏｌｉである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記細菌株が少なくとも１つの組換えｐｇｐＢ及び／またはＮｕｄＢ遺伝子を発現する、請求項３５〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記組換えＰｇｐＢ及び／またはＮｕｄＢの前記発現が、場合によりプロモーター強度、遺伝子コピー数、オペロン内での位置、及び／またはリボソーム結合部位を変更することによって、テルペンまたはテルペノイド生産力価を高めるように調整される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記組換えＰｇｐＢ及び／またはＮｕｄＢが、弱強度または中強度のプロモーターの制御下で発現される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記組換えｐｇｐＢまたはｎｕｄＢが、前記染色体に組み込まれるか、またはプラスミドから発現される、請求項３９〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記細菌株が、ＨＭＢＰＰ中間体への炭素フラックスの増加をもたらすようにＩｓｐＧ活性とＩｓｐＨ活性のバランスを調整すると同時に、細胞増殖、生存率、ＭＥＰフラックス、または生産力価が実質的に減少する量でのＨＭＢＰＰの蓄積を防止するように、ＩｓｐＧ及びＩｓｐＨを過剰発現する、請求項３５〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
ＨＭＢＰＰが１０ｍｇ／ｇ乾燥細胞重量を超えて蓄積しない、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記細菌株が、場合によりオペロンとして発現される組換え遺伝子としてｄｘｓ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＦ、及びｉｄｉを発現する、請求項３５〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記細菌株が、場合により１、２、または３個のオペロンとして発現される組換え遺伝子としてｄｘｓ、ｄｘｒ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＥ、ｉｓｐＦ、及びｉｄｉを発現する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記ＭＥＰ経路の前記組換え遺伝子が、１つ以上のプラスミドから発現されるか、または前記染色体に組み込まれる、請求項４５または４６に記載の方法。
【請求項４８】
ＩｓｐＧ及びＩｓｐＨが、少なくとも１つの組換えＩｓｐＧ及びＩｓｐＨ遺伝子を前記細菌株に導入することによって過剰発現される、請求項４３〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記組換えＩｓｐＨの活性及び／または発現が、前記組換えＩｓｐＧの活性及び／または発現よりも高い、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記組換えＩｓｐＨ及びＩｓｐＧが、オペロンとして発現し、前記オペロン内でＩｓｐＨがＩｓｐＧの前に位置し、前記オペロンが場合により強力なプロモーターの制御下で発現される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記組換えＩｓｐＧ及びＩｓｐＨ遺伝子がプラスミドから発現されるか、または前記染色体に組み込まれる、請求項４３〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
組換えｉｄｉ遺伝子の発現または活性が、テルペンまたはテルペノイドの生産量が増加するように調整される、請求項３５〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記細菌株がオキシドレダクターゼの過剰発現を含む、請求項４２〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記オキシドレダクターゼがピルビン酸：フラボドキシンオキシドレダクターゼ（ＰＦＯＲ）である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記ＰＦＯＲがＹｄｂＫである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
組換えＹｄｂＫ遺伝子が、前記染色体に組み込まれるか、またはプラスミドから発現される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記株が、テルペノイド化合物を生産するための１つ以上のＰ４５０酵素を含む、請求項５３〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
フラボドキシン、フラボドキシンレダクターゼ、フェレドキシン、及びフェレドキシンレダクターゼのうちの１つ以上の過剰発現をさらに含む、請求項５３〜５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
前記細菌株が、補因子の可用性または代謝回転を増加させるための１つ以上の追加改変を有し、前記１つ以上の追加改変はグリセルアルデヒド−３−リン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＧＡＰＯＲ）の組換え発現；ｙｄｈＶ及び／またはｙｄｈＹの過剰発現；ｇｓｈＡの下方制御、不活性化、または欠失：ならびにＣＨＡＣ１及び／またはＣＨＡＣ２の組換え発現から場合により選択される、請求項３５〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記細菌株が、ＰＤＨを介在したピルビン酸のアセチル−ＣｏＡへの変換を低減または排除する、請求項１〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
前記細菌株が変異型ａｃｅＥを発現し、前記変異がＧ２６７Ｃである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記細菌株がａｃｅＥの欠失または不活性化を有する、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
前記細菌株が、１つ以上の非天然のｆｄｘ及び／またはｆｌｄＡホモログを過剰発現する、請求項１〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
前記ｆｄｘホモログが、Ｈｍ．ｆｄｘ１（Ｈｅｌｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｏｄｅｓｔｉｃａｌｄｕｍ）、Ｐａ．ｆｄｘ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ｃｖ．ｆｄｘ（Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ  ｖｉｎｏｓｕｍ）、Ｃａ．ｆｄｘ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、Ｃｐ．ｆｄｘ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ）、Ｅｖ２．ｆｄｘ（Ｅｃｔｏｔｈｉｏｒｈｏｄｏｓｐｉｒａ  ｓｈａｐｏｓｈｎｉｋｏｖｉｉ）、Ｐｐ１．ｆｄｘ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、及びＰｐ２．ｆｄｘ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、または前記のいずれかの誘導体から選択される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記ｆｌｄＡホモログが、Ａｃ．ｆｌｄＡ２（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃｈｒｏｏｃｏｃｃｕｍ）、Ａｖ．ｆｌｄＡ２（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）、及びＢｓ．ｆｌｄＡ（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、またはその誘導体から選択される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
前記テルペンまたはテルペノイド産物が、ファルネセン、アモルファジエン、アルテミシン酸、アルテミシニン、ビサボロール、ビサボレン、アルファ−シネンサール、ベータ−ツジョン、カンファー、カルベオール、カルボン、シネオール、シトラール、シトロネラール、クベボール、ゲラニオール、リモネン、メントール、メントン、ミルセン、ヌートカトン、ヌートカトール、パチョリ、ピペリトン、ローズオキシド、サビネン、ステビオール、ステビオールグリコシド（レバウジオシドＤまたはレバウジオシドＭを含む）、タキサジエン、チモール、及びバレンセンから選択される少なくとも１つの化合物を含む、請求項１〜６５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
前記株が、酵素反応速度論、テルペンまたはテルペノイド産物のプロファイル、安定性、及び温度耐性のうちの１つ以上を改善するための１つ以上の変更を有するテルペンシンターゼ酵素を含む、請求項１〜６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６８】
前記株が、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、またはＣ６炭素源とともに培養される、請求項１〜６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６９】
前記炭素源がグルコース、スクロース、またはグリセロールである、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記細菌株が、２２℃〜３７℃の温度で培養される、請求項６８または６９に記載の方法。
【請求項７１】
培養段階が、細菌バイオマスが生成される第１段階と、それに続くテルペンまたはテルペノイド生産段階とを含む流加法である、請求項１〜７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７２】
前記培養物が少なくとも約１００Ｌである、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記培養物が約３００Ｌ〜約１，０００，０００Ｌである、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記培養物が好気条件下に維持される、請求項６８〜７３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７５】
前記培養物が微好気条件下に維持される、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記バイオマス生産段階を好気条件下で行った後、約１０〜約２０時間後まで酸素レベルを低下させる、請求項７４または７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記生産段階が、場合により水酸化アンモニウムを含む、窒素源を供給することを含む、請求項６８〜７６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７８】
前記生産段階が、場合によりグルコース、スクロース、及び／またはグリセロールを含む、炭素源を供給することを含む、請求項６８〜７７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７９】
前記窒素及び炭素の供給が、所定量のバッチ培地が消費されたときに開始される、請求項７６〜７８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８０】
前記窒素の供給速度が、１時間あたり約８Ｌから１時間あたり約２０Ｌである、請求項７８または７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記培養物中のインドールの蓄積を監視または試験することをさらに含む、請求項６８〜８０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８２】
前記培養物中のＭＥｃＰＰの蓄積を監視または試験することを含む、請求項６８〜８１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８３】
前記細胞中のＨＭＢＰＰのレベルを監視または試験することをさらに含む、請求項６８〜８２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８４】
前記テルペンまたはテルペノイド産物を回収することをさらに含む、請求項１〜８３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８５】
前記産物が揮発性テルペンまたはテルペノイド産物である、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記培養物から機械的に分離された有機相または疎水相から、前記テルペンまたはテルペノイド産物を回収する、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記テルペンまたはテルペノイド産物を液相及び／または固相から採取する、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
場合により単蒸留、水蒸気蒸留、分別蒸留、薄膜蒸留、または連続蒸留である蒸留によって、前記産物を精製する、請求項８５〜８７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８９】
前記産物が逐次抽出及び精製によって精製される、請求項８５〜８８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９０】
前記産物が、場合により超臨界流体クロマトグラフィーである、クロマトグラフィーを用いた分離及び回収によって精製される、請求項８５〜８９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９１】
前記産物が不揮発性テルペンまたはテルペノイド産物である、請求項８４に記載の方法。
【請求項９２】
前記産物が前記培養培地から回収された細胞外産物である、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記産物が、採取された細胞材料から回収された細胞内産物である、請求項９１に記載の方法。
【請求項９４】
前記産物が溶解性に乏しく、場合により溶媒抽出による濾過によって回収される、請求項９１〜９３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９５】
前記溶媒がエタノールである、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記産物が、場合により液体クロマトグラフィーである、クロマトグラフィーを用いた分離によって回収される、請求項９１〜９５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９７】
前記産物が濾過により回収される、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
前記産物が逐次抽出及び精製によって回収される、請求項８９〜９６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９９】
前記産物が溶液から晶出される、請求項９２または９３に記載の方法。
【請求項１００】
工業製品または消費者製品を製造する方法であって、請求項１〜１００のいずれか１項に記載の方法に従って生産された前記テルペンまたはテルペノイドを前記工業製品または消費者製品に組み込むことを含む、前記方法。
【請求項１０１】
前記工業製品または消費者製品が、香味製品、芳香製品、甘味剤、化粧品、洗浄製品、洗剤もしくは石鹸、または害虫駆除製品である、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記工業製品または消費者製品が、食品、飲料、食感改良剤、医薬品、タバコ製品、栄養補助食品、口腔衛生製品、または化粧品である、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０３】
前記細菌株または細胞が、ゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＰＰＳ）、ファルネシル二リン酸シンターゼ（ＦＰＰＳ）、及びゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＧＰＰＳ）のうちの１つ以上を過剰発現する、請求項１〜１０２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０４】
イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）及びジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）前駆体からの産物の生産量を増加させる１つ以上の遺伝子改変を有する細菌株であって、前記細菌株が、ＭＥＰ経路を介してイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）及びジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）を産生し、かつ前記ＭＥＰ経路が１つ以上の過剰発現遺伝子を含み、前記株は、下流合成経路を介して前記ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰをテルペンまたはテルペノイド産物に変換し、前記遺伝子改変が、
（ａ）ＨＭＢＰＰ中間体の蓄積を防止するようにＩｓｐＧ及びＩｓｐＨ酵素の発現または活性のバランスを調整する、前記ＩｓｐＧ及びＩｓｐＨ酵素の組換えまたは改変、
（ｂ）前記ＭＥＰ経路を介した電子の供給及び／または伝達、及び／またはテルペンもしくはテルペノイド産物への電子の供給及び／または伝達を増強する酵素をコードする遺伝子の組換えまたは改変であって、場合によりＹｄｂＫ遺伝子の過剰発現及び場合により非天然ｆｄｘ及び／またはｆｌｄＡホモログによる過剰発現である、前記遺伝子の組換えまたは改変、
（ｃ）ａｃｅＥまたはａｃｅＥ酵素複合体の不活性化もしくは欠失、または発現もしくは活性の低減、ならびに場合により
（ｄ）テルペンまたはテルペノイド生産量を高めるように活性を調整する、ｉｄｉ遺伝子の組換えまたは改変を含む、前記細菌株。
【請求項１０５】
前記細菌株が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．、Ｖｉｂｒｉｏ  ｓｐｐ．、及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．から選択される細菌である、請求項１０４に記載の細菌株。
【請求項１０６】
前記細菌株が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓ、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａから選択される種である、請求項１０５に記載の細菌株。
【請求項１０７】
前記細菌株がＥ．ｃｏｌｉである、請求項１０６に記載の細菌株。
【請求項１０８】
前記細菌株が、場合によりオペロンとして発現される、組換え遺伝子としてｄｘｓ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＦ、及びｉｄｉを発現する、請求項１０４〜１０７のいずれか１項に記載の細菌株。
【請求項１０９】
前記細菌株が、場合により１、２、または３個のオペロンとして発現される組換え遺伝子としてｄｘｓ、ｄｘｒ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＥ、ｉｓｐＦ、及びｉｄｉを発現する、請求項１０８に記載の細菌株。
【請求項１１０】
前記ＭＥＰ経路の前記組換え遺伝子が、１つ以上のプラスミドから発現されるか、または前記染色体に組み込まれる、請求項１０８または１０９に記載の細菌株。
【請求項１１１】
ＨＭＢＰＰが１０ｍｇ／ｇ乾燥細胞重量を超えて蓄積しない、請求項１０４〜１１０のいずれか１項に記載の細菌株。
【請求項１１２】
前記組換えｉｓｐＧ及びｉｓｐＨ遺伝子が、１つ以上の有益な変異を含むか、または特性もしくは活性が改善されたＩｓｐＧまたはＩｓｐＨオルソログをコードする、請求項１０４〜１１１のいずれか１項に記載の細菌株。
【請求項１１３】
前記組換えＩｓｐＨの発現が、前記組換えＩｓｐＧの発現よりも高い、請求項１０４〜１１２のいずれか１項に記載の細菌株。
【請求項１１４】
前記組換えｉｓｐＨ及びｉｓｐＧが、オペロンとして発現し、前記オペロン内でｉｓｐＨがｉｓｐＧの前に位置する、請求項１１３に記載の細菌株。
【請求項１１５】
前記オペロンが強力なプロモーターの制御下で発現される、請求項１１４に記載の細菌株。
【請求項１１６】
前記組換えｉｓｐＧ及びｉｓｐＨ遺伝子がプラスミドから発現されるか、または前記染色体に組み込まれる、請求項１１２〜１１５のいずれか１項に記載の細菌株。
【請求項１１７】
組換えｉｄｉ遺伝子の発現または活性が、前記プロモーター強度、遺伝子コピー数、オペロン内の位置、またはリボソーム結合部位を場合により変更することにより、テルペンまたはテルペノイド生産量を増加させるように調整されている、請求項１０４〜１１６のいずれか１項に記載の細菌株。
【請求項１１８】
前記細菌株がオキシドレダクターゼの過剰発現を含む、請求項１０４〜１１７のいずれか１項に記載の細菌株。
【請求項１１９】
前記オキシドレダクターゼがピルビン酸：フラボドキシンオキシドレダクターゼ（ＰＦＯＲ）である、請求項１１８に記載の細菌株。
【請求項１２０】
前記ＰＦＯＲがＹｄｂＫである、請求項１１９に記載の細菌株。
【請求項１２１】
前記株が、ピルビン酸を酸化する及び／またはフェレドキシンを還元する酵素を含み、場合により組換えＹｄｂＫ遺伝子であり、場合により前記染色体に組み込まれるか、またはプラスミドから発現される、請求項１０４〜１２０のいずれか１項に記載の細菌株。
【請求項１２２】
前記株が、前記テルペノイド化合物の生産のための１つ以上のＰ４５０酵素を含む、請求項１２１に記載の細菌株。
【請求項１２３】
フラボドキシン、フラボドキシンレダクターゼ、フェレドキシン、及びフェレドキシンレダクターゼのうちの１つ以上の過剰発現をさらに含む、請求項１２１または１２２に記載の細菌株。
【請求項１２４】
前記組換えｐｇｐＢ及び／またはｎｕｄＢの前記発現が、場合により前記プロモーター強度、遺伝子コピー数、オペロン内での位置、及び／またはリボソーム結合部位を変更することによって、テルペンまたはテルペノイド生産力価を高めるように調整される、請求項１０４〜１２３のいずれか１項に記載の細菌株。
【請求項１２５】
前記株が、グリセルアルデヒド−３−リン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＧＡＰＯＲ）の組換え発現；ｙｄｈＶ及び／またはｙｄｈＹの過剰発現；ｇｓｈＡの下方制御、不活性化、または欠失：ならびにＣＨＡＣ１及び／またはＣＨＡＣ２の組換え発現から選択される１つ以上の追加改変を有する、請求項１０４〜１２４のいずれか１項に記載の細菌株。
【請求項１２６】
前記組換えｐｇｐＢ及び／またはｎｕｄＢが、弱強度または中強度のプロモーターの制御下で発現される、請求項１２５に記載の細菌株。
【請求項１２７】
前記組換えｐｇｐＢまたはｎｕｄＢが、前記染色体に組み込まれるか、またはプラスミドから発現される、請求項１２６に記載の細菌株。
【請求項１２８】
前記細菌株が、ＰＤＨを介在したピルビン酸のアセチル−ＣｏＡへの変換を低減または排除する、請求項１０４〜１２７のいずれか１項に記載の細菌株。
【請求項１２９】
前記細菌株が変異型ａｃｅＥを発現し、前記変異がＧ２６７Ｃである、請求項１２８に記載の細菌株。
【請求項１３０】
前記細菌株がａｃｅＥの欠失または不活性化を有する、請求項１２９に記載の細菌株。
【請求項１３１】
前記細菌株が、１つ以上の非天然のｆｄｘ及び／またはｆｌｄＡホモログを過剰発現する、請求項１０４〜１３０のいずれか１項に記載の細菌株。
【請求項１３２】
前記非天然のｆｄｘホモログが、Ｈｍ．ｆｄｘ１（Ｈｅｌｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｏｄｅｓｔｉｃａｌｄｕｍ）、Ｐａ．ｆｄｘ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ｃｖ．ｆｄｘ（Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ  ｖｉｎｏｓｕｍ）、Ｃａ．ｆｄｘ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、Ｃｐ．ｆｄｘ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ）、Ｅｖ２．ｆｄｘ（Ｅｃｔｏｔｈｉｏｒｈｏｄｏｓｐｉｒａ  ｓｈａｐｏｓｈｎｉｋｏｖｉｉ）、Ｐｐ１．ｆｄｘ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、及びＰｐ２．ｆｄｘ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、または前記のいずれかの誘導体から選択される、請求項１３１に記載の細菌株。
【請求項１３３】
前記ｆｌｄＡホモログが、Ａｃ．ｆｌｄＡ２（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃｈｒｏｏｃｏｃｃｕｍ）、Ａｖ．ｆｌｄＡ２（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）、及びＢｓ．ｆｌｄＡ（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、またはその誘導体から選択される、請求項１３２に記載の細菌株。
【請求項１３４】
前記テルペンまたはテルペノイド産物が、ファルネセン、アモルファジエン、アルテミシン酸、アルテミシニン、ビサボロール、ビサボレン、アルファ−シネンサール、ベータ−ツジョン、カンファー、カルベオール、カルボン、シネオール、シトラール、シトロネラール、クベボール、ゲラニオール、リモネン、メントール、メントン、ミルセン、ヌートカトン、ヌートカトール、パチョリ、ピペリトン、ローズオキシド、サビネン、ステビオール、ステビオールグリコシド（レバウジオシドＤまたはレバウジオシドＭを含む）、タキサジエン、チモール、及びバレンセンから選択される少なくとも１つの化合物を含む、請求項１０４〜１３３のいずれか１項に記載の細菌株。
【請求項１３５】
前記株が、酵素反応速度論、テルペンまたはテルペノイド産物のプロファイル、安定性、及び温度耐性のうちの１つ以上を改善するための１つ以上の変更を有するテルペンシンターゼ酵素を含む、請求項１３４に記載の細菌株。
【請求項１３６】
前記細菌株が、ゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＰＰＳ）、ファルネシル二リン酸シンターゼ（ＦＰＰＳ）、及びゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＧＰＰＳ）のうちの１つ以上を過剰発現する、請求項１０４〜１３５のいずれか１項に記載の細菌株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年１月２６日出願の米国仮出願第６２／４５０，７０７号の優先権を主張するものであり、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式でＥＦＳ−Ｗｅｂを経由して提出された配列表を含み、配列表はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０１８年１月２６日に作成された上記ＡＳＣＩＩコピーは、ＭＡＮ−００９ＰＣ＿ＳＴ２５という名称であり、そのサイズは１２５，１０３バイトである。
【背景技術】
【０００３】
食品産業及び飲料産業はもとより、香料産業、化粧品産業、及びヘルスケア産業などの他の産業も、テルペン及び／またはテルペノイド産物を日常的に使用しており、それには着香剤及び芳香剤としての使用を含む。しかしながら、（ｉ）植物原料の可用性及び高価格；（ｉｉ）植物中のテルペン含有量の相対的低さ；ならびに（ｉｉｉ）十分量のテルペン産物を工業的規模で生産するには抽出方法が面倒で非効率などの要因はすべて、植物に依存しない系を用いたテルペンの生合成に関する研究を活性化させた。その結果、グルコースなどの再生可能資源をテルペノイド産物に変換するように微生物を操作する技術の開発に労力が費やされてきた。従来の方法と比較して、微生物は土地を必要とせずに急速に成長し、開発を持続できるという利点がある。
【０００４】
重要なイソプレノイド前駆体であるイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）及びジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）には、メバロン酸（ＭＶＡ）経路とメチルエリスリトールリン酸（ＭＥＰ）経路という２つの主要な生合成経路がある。ＭＶＡ経路は、ほとんどの真核生物、古細菌、及びいくつかの真正細菌に見られる。ＭＥＰ経路は、真正細菌、植物の葉緑体、シアノバクテリア、藻類、及びアピコンプレックス門寄生生物に見られる。Ｅ．ｃｏｌｉ及び他のグラム陰性菌は、ＭＥＰ経路を利用してＩＰＰ及びＤＭＡＰＰ代謝前駆体を合成する。ＭＥＰ経路はＭＶＡ経路よりも理論上の化学量論的収率が高いが、Ｅ．ｃｏｌｉ及び他の細菌におけるＭＥＰ経路は、この経路を通る炭素フラックスを制御及び／または制限する様々な固有の調節機構を有する。Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｙｌｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｐａｔｈｗａｙ  ｏｆ  Ｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄ  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１３；８２：４９７−５３０；Ａｊｉｋｕｍａｒ  ＰＫ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄ  ｐａｔｈｗａｙ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｔａｘｏｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｏｖｅｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１０；３３０−７０−７４を参照のこと。
【０００５】
細菌系においてテルペン及びテルペノイドを工業的規模で生産するには、ＭＥＰ経路、ならびに組換え型下流テルペン及びテルペノイド合成経路を通る炭素フラックスを向上させるための微生物株及び方法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
様々な態様において、本発明は、テルペン及びテルペノイド産物を生産するための方法及び細菌株に関する。ある特定の態様では、本発明は、ＭＥＰ経路及び下流の組換え合成経路への炭素フラックスを向上させる細菌株を提供し、それによって安価な炭素源（例えば、グルコース）を用いた発酵によってテルペン及び／またはテルペノイドの生産量を増加させる。
【０００７】
いくつかの態様では、本発明は、１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル−４−二リン酸（ＨＭＢＰＰ）中間体への炭素フラックスが増加するようにＩｓｐＧ及びＩｓｐＨを過剰発現するが、細胞増殖または生存率を低下させる量、またはＭＥＰ経路のフラックス及び／またはテルペノイドの生産を阻害する量でのＨＭＢＰＰの蓄積を防止するように発現のバランスが調整された細菌株に関する。ＩｓｐＧ及びＩｓｐＨ両方の発現が増加すると、テルペン及びテルペノイド産物の力価が著しく増加する。対照的に、ＩｓｐＧのみが過剰発現すると増殖が欠如し、対してＩｓｐＨのみが過剰発現すると生産力価に著しい影響を及ぼさない。ＨＭＢＰＰ代謝産物は、ＭＥＰ経路の制御因子または阻害因子として作用でき、ある一定レベルで細菌細胞に対して毒性であり得る。例えば、いくつかの実施形態では、ＨＭＢＰＰは、約１０ｍｇ／ｇ乾燥細胞重量（ＤＣＷ）を超えて蓄積せず、またはいくつかの実施形態では、約５ｍｇ／ｇＤＣＷを超えて、または約２ｍｇ／ｇＤＣＷを超えて蓄積しない。したがって、ＩｓｐＧ及びＩｓｐＨの過剰発現のバランスを調整する（例えば、ＩｓｐＨ活性をより有利にする）ことが、ＭＥＰの炭素を不均衡及び蓄積を防止しつつ、下流のＨＭＢＰＰからＩＰＰへと流入させるために重要である。
【０００８】
様々な実施形態において、この細菌株は、ＭＥＰの炭素をＩｓｐＧの基質であるＭＥｃＰＰ中間体に移動させるようにバランス調整されたＭＥＰ経路を過剰発現し、かつ、Ｆｅ−硫黄クラスター酵素であるＩｓｐＧ及びＩｓｐＨ酵素の活性を助ける１つ以上の遺伝子改変を含む。例示的な改変としては、ＭＥＰ経路を介した電子の供給及び伝達、及び／またはテルペンもしくはテルペノイド産物への電子の供給及び伝達を増強するものが挙げられる。これには、ピルビン酸を酸化する及び／またはフェレドキシン（ＭＥＰ経路に電子を供給する）の還元をもたらすオキシドレダクターゼを含めた、１つ以上のオキシドレダクターゼ酵素の組換え発現が含まれる。例示的なオキシドレダクターゼは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＹｄｂＫならびにそのオルソログ及び誘導体である。
【０００９】
様々な実施形態において、微生物株は、フラボドキシン（ｆｌｄＡ）、フラボドキシンレダクターゼ、フェレドキシン（ｆｄｘ）、及びフェレドキシンレダクターゼのうちの１つ以上の過剰発現または補完を含む。
【００１０】
他の態様では、本発明は、ＦＰＰをファルネソールに、ならびにＩＰＰ及びＤＭＡＰＰをそれぞれイソプレノール及びプレノールに脱リン酸化するＰｇｐＢまたはＮｕｄＢを過剰発現する細菌株を提供する。こうした実施形態では、細胞は、ＭＥＰ経路でのさらなる産物の流入を含むと同時に、過剰なＭＥＰ炭素を経路から細胞外に排出することによって、固有のフィードバック阻害機構を回避する。さらに、これらの産物は細胞外に蓄積するので、下流のテルペノイド合成経路を導入しない場合でも、ＭＥＰ経路を通る炭素フラックスの追跡にこの産物を使用することができる。したがって、ＰｇｐＢ及び／またはＮｕｄＢを過剰発現する細菌株は、ＭＥＰ経路遺伝子の発現バランスを調整するには利便な手段である。それに加えて、またはそれに代わり、いくつかの実施形態では、細菌株は、固有のフィードバック阻害機構を回避する十分な産物をＭＥＰ経路に流入させる１つ以上の強力なシンターゼを過剰発現する。例として、いくつかの実施形態では、シンターゼはＡｒｔｅｍｉｓｉａ  ａｎｎｕａファルネセンシンターゼである。
【００１１】
この細菌細胞は、テルペンまたはテルペノイド産物を生産するために、ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰ前駆体からテルペノイドを生産する組換え型下流経路を備えることになる。ある特定の実施形態では、細菌細胞は、特に、モノテルペノイド、セスキテルペノイド、トリテルペノイド、及びジテルペノイドなどの１つ以上のテルペノイド化合物を産生する。そのようなテルペノイド化合物は、香料に（例えばパチョロール）、香料産業で（例えばヌートカトン）、甘味剤として（例えばステビオールグリコシド）、着色剤として、または治療薬として（例えばタキソール）使用される。
【００１２】
回収されたテルペンまたはテルペノイドを製品（例えば、消費者製品または工業製品）に組み込むことができる。例えば、製品は、着香製品、芳香製品、甘味剤、化粧品、洗浄製品、洗剤もしくは石鹸、または害虫駆除製品であり得る。本発明の実施形態では、生産収率が高いため、大幅なコスト上の利点に加え、テルペンまたはテルペノイド成分の持続可能性及び品質管理をもたらすことができる。
【００１３】
本発明の他の態様及び実施形態は、本発明に関する以下の詳細な説明から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＭＥＰ経路によるテルペノイド生産の概略図である。炭素源としてグルコースを取り入れる細菌細胞を表している。グルコースは、ＴＣＡサイクルを経てバイオマスに変換されるか、またはＭＥＰ経路を通り目的とするテルペノイド産物になる。グルコースは細胞内に入り、中間体であるグリセルアルデヒド３−リン酸（ＧＡＰ）によりピルビン酸（ＰＹＲ）に変換される。ＰＹＲとＧＡＰが化合してＤＯＸＰを生成し、これがＭＥＰに変換され、（ＭＥｃＰＰを通過して）ＦＰＰへの経路に渡される。ＤＯＸ及びＭＥは、それぞれＤＯＸＰ及びＭＥＰの脱リン酸化産物である。ＤＯＸ、ＭＥ、及びＭＥｃＰＰは細胞外に見られる。ＭＥＰ経路に送り込まれるフラックスが多いほど、これらの産物が細胞外に多く見られる。これらの副産物は、ＭＥＰ経路におけるボトルネックのマーカーとして、操作の標的を特定するために使用することができる。ｎｕｄＢまたはｐｇｐＢを過剰発現することによって、ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰまたはＦＰＰは、それぞれプレノール及びイソプレノールまたはファルネソールに脱リン酸化されて、細胞外に蓄積するが、これを利用して、ＭＥＰ経路の中間体の蓄積及びフィードバック阻害の活性化を緩和することができる。黒色の矢印はテルペノイドに対する酵素介在性の生化学反応を示し、薄灰色の矢印は競合する副産物を示し、暗灰色の矢印は細胞外への産物の輸送を示し、白色の矢印は簡潔にするために簡略化された経路を示す。
【図２】ｉｓｐＨのみ、またはｉｓｐＨ及びｉｓｐＧ両方の発現が増加すると、ＭＥＰ経路に流入する炭素量を増加させるように操作されている株におけるテルペノイド生産力価が向上するが、ｉｓｐＧのみでは生産性が低下することを示す。ＭＥＰ経路のフラックスを向上させる変更はその他にもあるが、対照株は、特にｄｘｓ、ｄｘｒ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＥ、ｉｓｐＦ、及びｉｄｉの追加のコピーを有する（ｉｓｐＧまたはｉｓｐＨの追加コピーは含まない）Ｅ．ｃｏｌｉである。株は、２０ｋｂの欠失を含むが、操作はしなかった。
【図３】ＭＥＰ経路が増強された改変生産株におけるｉｓｐＧ及び／またはｉｓｐＨの発現の増加が、ＭＥＰ産物の分布パターンに影響を与えることを示す。上段パネル（縮尺１倍）はＭＥＰ経路の代謝産物すべてを示し、産物の大部分はＤＯＸ、ＭＥ、及びＭＥｃＰＰである。中段パネル（縮尺１００倍）は、ＤＯＸ、ＭＥ、及びＭＥｃＰＰを報告から除外したＭＥＰ経路の代謝産物を示す。この図で最も代表的なのはＤＯＸＰとＭＥＰである。下段パネル（縮尺２５０００倍）はＨＭＢＰＰ濃度のみを示す。これらのパネルでは、抽出培養物（ブロス＋細胞）からの細胞外及び細胞内の総代謝産物が示されているため、抽出物の量に比例して濃度が記載されている。
【図４】細胞の内側または細胞の外側（「細胞内」と「細胞外」）に見られる、それぞれ個々のＭＥＰ代謝産物の比率を示す。これらの値は絶対存在量を反映しておらず、例えば、ＨＭＢＰＰが存在するよりも、合計に占めるＤＯＸの方がはるかに多く存在する。ＤＯＸは１００％細胞外にあるが、ＨＭＢＰＰは１００％細胞内にある。図４でプロファイリングした株は、最上位の有効株である「対照＋ｉｓｐＨ／ｉｓｐＧ」である。ＤＯＸＰ／ＤＯＸ、ＭＥＰ／ＭＥ、及びＭＥｃＰＰは、すべてではないとしても、ほぼすべて細胞外培地に蓄積するが、ＣＤＰ−ＭＥ、ＣＤＰ−ＭＥＰ、ＨＭＢＰＰ、ＩＰＰ／ＤＭＡＰＰ、及びＦＰＰは１００％細胞内で観察される。細胞内に見られる各代謝産物の比率をグラフの上部に示す。
【図５】未補正のｉｓｐＧの上方制御は、６００ｎｍでのＵＶ吸光度によって決定される、細胞増殖の著しい低下を引き起こすことを示す。ｉｓｐＨ、またはｉｓｐＨとｉｓｐＧの両方を補正した株では、最終細胞密度に対して、ある程度の変化が観察されるが、その変動は著しくはない。
【図６】ｐｇｐＢの過剰発現が、ＭＥＰ経路を通るフラックスを増強するように操作されているが、下流のテルペノイド産物経路は導入されていない株において、ファルネソール力価を３倍にできることを示す。対照株は、様々なレベルの構成的発現下で、ｄｘｓ、ｄｘｒ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＦ、ｉｓｐＥ、ｉｓｐＧ、ｉｓｐＨ、及びｉｄｉの追加コピーを有し、また過剰発現したｙｄｂＫを有している。この株は、おそらくＦＰＰの過剰な蓄積で生じる「流出」により、経路でフィードバックが生じ、野生型と比較して著しく増殖が遅くなるため、中程度の量のファルネソールを蓄積する。この株でｐｇｐＢが過剰発現されると、過剰なＦＰＰがより効率的にファルネソールに変換され（フィードバック制御を阻止する）、フラックスが効果的にＭＥＰ経路を通り流入する。
【図７】ファルネソールを産生する株において、ＩｓｐＧ’及び／またはＩｓｐＨの発現を増加させる及び調整することで、生産力価を改善できることを示す。対照株は、ｄｘｓ、ｄｘｒ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＦ、ｉｓｐＥ、ｉｓｐＧ、ｉｓｐＨ、及びｉｄｉの追加コピー、ならびにｙｄｂＫ及びｐｇｐＢの追加コピーを有する。漸増するプロモーター強度で（＋、＋＋、＋＋＋）、ｉｓｐＨ及び／またはｉｓｐＧ’の追加コピーを株に組み込む。
【図８】ファルネソールの生産力価の増加（図７に示す）は、ＭＥｃＰＰプールサイズの減少を伴うが、それはｉｓｐＧとｉｓｐＨの比率次第であることを示す。
【図９】ｉｄｉの過剰発現はｉｓｐＧＨを過剰発現しない株では生産力価を増加させるが、ｉｓｐＧＨを過剰発現する２つの株では力価を減少させることを示す。このことは、ＩＰＰとＤＭＡＰＰとのバランスをＩｄｉ活性によって制御し、下流経路の需要に応じて上方または下方に調整できることを示している。
【図１０】テルペノイド生合成を増強する、ピルビン酸：フラボドキシンオキシドレダクターゼ及び／またはピルビン酸シンターゼとしてのＹｄｂＫの役割を示す。
【図１１】プロモーター強度を漸増させながらｙｄｂＫの追加コピーを発現させると、テルペノイドの生産量を向上できることを示す。対照株はテルペノイド産物Ａを生産し、定義された構成的発現下でＭＥＰ経路の遺伝子ｄｘｓ、ｄｘｒ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＥ、ｉｓｐＦ、ｉｓｐＧ’、ｉｓｐＨ、及びｉｄｉの追加コピーを有する。
【図１２】ｙｄｂＫの過剰発現によるテルペノイドの生産力価の向上には、十分なｉｓｐＧ及び／またはｉｓｐＨが必要であることを示す。対照Ａは、ＭＥＰ経路のｄｘｓ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＦ、及びｉｄｉの追加コピー、操作されていない２０ｋｂの欠失、ならびに鉄−硫黄クラスタータンパク質の性能を向上させるための他の修飾を有する。対照Ｂは、対照Ａに加え、オペロン構成にｉｓｐＧ’及びｉｓｐＨの追加コピーが組み込まれ（Ｇ’が最初であることによりＨ／Ｇ比がＧに有利である）、対する対照Ｃは、対照Ａに加え、オペロン構成にｉｓｐＨ及びｉｓｐＧ’の追加コピーが組み込まれている（Ｈが最初であることによりＨ／Ｇ比がＨに有利である）。
【図１３】ｙｄｂＫに加えてｆｄｘを発現させると、テルペノイドの力価を向上できることを示す。対照株はテルペノイド産物Ａを生産し、定義された構成的発現下でＭＥＰ経路の遺伝子ｄｘｓ、ｄｘｒ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＥ、ｉｓｐＦ、ｉｓｐＧ’、ｉｓｐＨ、及びｉｄｉの追加コピーを有する。この株はまた、操作されていない２０ｋｂの欠失、及び鉄−硫黄クラスタータンパク質の性能を改善するための他の修飾を有する。
【図１４】解糖系とＭＥＰ経路との境界を示し、オキシドレダクターゼ酵素の発現を変えることによって補因子の可用性を調整する可能性を示す。
【図１５】ピルビン酸（ＰＹＲ）をアセチル−ＣｏＡ（ＡｃＣｏＡ）に変換する、Ｅ．ｃｏｌｉにおける３つの公知の反応を示す図であり、ＰＤＨを介在したＰＹＲのＡｃＣｏＡへの変換を低減または排除することで、ＰＦＯＲを介在したＰＹＲのＡｃＣｏＡへの変換がどのように増加するかを示す。
【図１６】図１６Ａ〜Ｄは、対照と比較した、ＹｄｂＫの過剰発現及びａｃｅＥのノックアウト（ΔａｃｅＥ）を有する細菌株におけるテルペノイド産物の生産量の倍率変化を示すグラフである。対照は（ΔａｃｅＥ）を含まない同じ株である。ΔａｃｅＥは、ＰＤＨが介在したＰＹＲのＡｃＣｏＡへの変換を防止する。図１６Ａは、テルペノイド産物Ｂを生産する細菌株の倍率変化を示す。図１６Ｂは、テルペノイド産物Ｃを生産する細菌株の倍率変化を示す。図１６Ｃは、テルペノイド産物Ｄを生産する細菌株の倍率変化を示す。図１６Ｄは、テルペノイド産物Ｅを生産する細菌株の倍率変化を示す。図１６Ｅは、テルペノイド産物Ｄを生産し、ＹｄｂＫを過剰発現し、ΔａｃｅＥを有する細菌株が、対照（ΔａｃｅＥなし）と比較して細胞外ＭＥｃＰＰの減少を示すことを示しているグラフである。
【図１７】図１７Ａ〜Ｃは、対照（ａｃｅＥ  ｍｕｔなし）と比較した、ＹｄｂＫの過剰発現及び変異型ａｃｅＥ（ａｃｅＥ  ｍｕｔ）を有する細菌株におけるテルペノイド産物の倍率変化を示すグラフである。ａｃｅＥ  ｍｕｔは、ＰＤＨが介在したＰＹＲのＡｃＣｏＡへの変換を低減する。図１７Ａは、テルペノイド産物Ｂを生産する細菌株の倍率変化を示す。図１７Ｂは、テルペノイド産物Ｃを生産する細菌株の倍率変化を示す。図１７Ｃは、テルペノイド産物Ｄを生産する細菌株の倍率変化を示す。図１７Ｄは、テルペノイド産物Ｄを生産し、ＹｄｂＫを過剰発現し、ａｃｅＥ  ｍｕｔを発現する細菌株が、対照（ａｃｅＥ  ｍｕｔなし）と比較して細胞外ＭＥｃＰＰの減少を有することを示すグラフである。
【図１８】ピルビン酸（ＰＹＲ）をアセチル−ＣｏＡ（ＡｃＣｏＡ）に変換する、Ｅ．ｃｏｌｉにおける３つの公知の反応を示す図であり、ｆｄｘまたはｆｌｄＡホモログの発現がＦｄ酸化還元反応（太字で示す）を介してＩｓｐＧ及び／またはＩｓｐＨへの電子供給をどのように増加できるかを示す。
【図１９Ａ】ＹｄｂＫを過剰発現し、ｆｄｘまたはｆｌｄＡホモログを過剰発現するように操作された細菌株におけるテルペノイド産物Ｂの生産量の倍率変化（空ベクター対照（ｅｍｐ）との比較）を示すグラフである。
【図１９Ｂ】ＹｄｂＫ及びＣｖ．ｆｄｘ（Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ  ｖｉｎｏｓｕｍ由来のｆｄｘホモログ）を過剰発現するように操作された細菌株におけるテルペノイド産物Ｄの倍率変化（対照との比較）を示すグラフである。
【図１９Ｃ】テルペノイド産物Ｄを生産し、ＹｄｂＫ及びＣｖ．ｆｄｘを過剰発現する細菌株が、対照（Ｃｖ．ｆｄｘの過剰発現なし）と比較して細胞外ＭＥｃＰＰの減少を有することを示すグラフである。
【図２０】テルペノイド産物Ｆを生産し、１つ以上のＰＦＯＲまたはｆｐｒホモログ、及び場合によりｆｄｘまたはｆｌｄＡホモログを過剰発現する細菌株におけるテルペノイド産物の生産量の倍率変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
様々な態様において、本発明は、テルペン及びテルペノイド産物を生産するための細菌株及び方法に関し、ＭＥＰ経路を経て、下流の組換え合成経路に至る炭素フラックスを向上させる細菌株に関する。様々な実施形態において、本発明は、グルコース、グリセロール、スクロースなどの炭素源を用いた細菌株の発酵によるテルペン及び／またはテルペノイド産物の収率を増加させるために提供する。
【００１６】
例えば、いくつかの態様では、本発明は、ＭＥＰ経路を介してイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）及びジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）を生産し、かつ、下流合成経路を介してＩＰＰ及びＤＭＡＰＰをテルペンまたはテルペノイド産物に変換する細菌株を提供する。この細菌株では、１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル４−二リン酸（ＨＭＢＰＰ）中間体への炭素フラックスが増加するようにＩｓｐＧ活性及びＩｓｐＨ活性が増強されるが、バランスを調整して、細胞増殖、生存率、ＭＥＰ経路のフラックス、または生産力価が大幅に減少する量でのＨＭＢＰＰの蓄積を防止するように、ＩｓｐＧ及びＩｓｐＨを過剰発現する。
【００１７】
ＩｓｐＧとＩｓｐＨ両方の発現を増加させると、テルペン産物及びテルペノイド産物の力価を著しく増加させることができる。ＩｓｐＧのみまたはＩｓｐＨのみの発現を増加させるだけでは、力価は著しく改善しない。さらに、ＩｓｐＧのみの過剰発現は増殖の欠如をもたらすことがあり、これは、ＨＭＢＰＰ（ＩｓｐＧによって生産され、ＩｓｐＨによって消費されるＭＥＰ経路の中間体）が細胞外では見られないが、細胞内では１００％見られるという観察と関連する可能性がある。ＨＭＢＰＰ代謝産物は、ＭＥＰ経路の阻害因子として作用すると思われ、ある一定レベルで細菌細胞に対して毒性であると思われる。したがって、ＨＭＢＰＰの不均衡及び蓄積を防ぐには、ＩｓｐＧとＩｓｐＨとの間の活性のバランスが重要である。
【００１８】
ＨＭＢＰＰの蓄積は乾燥細胞重量（ＤＣＷ）あたりの量で決定することができる。例えば、いくつかの実施形態では、ＨＭＢＰＰは、約１０ｍｇ／ｇＤＣＷを超えて蓄積せず、またはいくつかの実施形態では、約８ｍｇ／ｇＤＣＷを超えて蓄積せず、またはいくつかの実施形態では、約５ｍｇ／ｇＤＣＷを超えて蓄積せず、またはいくつかの実施形態では、約４ｍｇ／ｇＤＣＷを超えて蓄積せず、またはいくつかの実施形態では、約２ｍｇ／ｇＤＣＷを超えて蓄積しない。いくつかの実施形態では、ＨＭＢＰＰは、約１ｍｇ／ｇＤＣＷを超えて蓄積せず、または約０．５ｍｇ／ｇＤＣＷを超えて、もしくは約０．２ｍｇ／ｇＤＣＷを超えて、もしくは約０．１ｍｇ／ｇＤＣＷを超えて蓄積しない。ＩｓｐＧ及びＩｓｐＨの過剰発現のバランスを調整する（例えば、ＩｓｐＨ活性をより有利にする）ことが、ＭＥＰの炭素を不均衡及び蓄積を防止しつつ、下流のＨＭＢＰＰからＩＰＰへと流入させるために重要である。
【００１９】
いくつかの実施形態では、ＩｓｐＧ及びＩｓｐＨは、組換え型のｉｓｐＧ及びｉｓｐＨ遺伝子を細菌株に導入することによって過剰発現される。他の実施形態では、内因性遺伝子を、例えば、内因性プロモーターまたはリボソーム結合部位を変更することによって過剰発現させることができる。組換えｉｓｐＧ及び／またはｉｓｐＨ遺伝子を導入する場合、遺伝子が場合により１つ以上の有益な変異を含んでいてもよい。
【００２０】
いくつかの実施形態では、追加遺伝子は、野生型酵素（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ野生型酵素）と実質的に同一であってもよく、または活性を増加させるために改変されていても、または天然の細菌（例えばＥ．ｃｏｌｉ）酵素と活性が同等の、それより活性が高い、もしくはそれより活性が低いＩｓｐＧまたはＩｓｐＨのオルソログであってもよい。例えば、ＩｓｐＧに関して、アミノ酸配列は、配列番号１と５０％以上の配列同一性、または配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも約６０％の配列同一性、または少なくとも約７０％の配列同一性、または少なくとも約８０％の配列同一性、または少なくとも約９０％の配列同一性、または少なくとも約９５％の配列同一性、または少なくとも約９８％の配列同一性を有していてもよい。いくつかの実施形態では、タンパク質の活性を変化させるために、ＩｓｐＧアミノ酸配列（配列番号１）に対して１〜約１０個、または１〜約５個のアミノ酸の置換、欠失、及び／または挿入が加えられ、これには、１つ以上の基質結合部位または活性部位への置換を含む。Ｅ．ｃｏｌｉまたは他のＩｓｐＧに対する改変は、相同性モデルの構築によって知ることができる。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのＩｓｐＧ相同性モデルの構築に適したホモログは、Ｌｅｅ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄｓ：ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ［４Ｆｅ−４Ｓ］  ｃｌｕｓｔｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＩｓｐＧ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２０１０  Ｄｅｃ  １０；４０４（４）：６００−１０に開示されている。活性の向上がある例示的なＩｓｐＧ変異体は、野生型Ｅ．ｃｏｌｉ酵素と比較して４つのアミノ酸置換を有する（本明細書でＩｓｐＧ’と称する）。
【００２１】
さらに、ＩｓｐＨに関して、アミノ酸配列は、配列番号２と５０％以上の配列同一性、または配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも約６０％の配列同一性、または少なくとも約７０％の配列同一性、または少なくとも約８０％の配列同一性、または少なくとも約９０％の配列同一性、または少なくとも約９５％の配列同一性、または少なくとも約９８％の配列同一性を有していてもよい。いくつかの実施形態では、タンパク質の活性を変化させるために、ＩｓｐＨアミノ酸配列（配列番号２）に対して１〜約１０個、または１〜約５個のアミノ酸の置換、欠失、及び／または挿入が加えられ、これには、１つ以上の基質結合部位または活性部位への置換を含む。ＩｓｐＨ酵素に対する修飾は、Ｇｒａｗｅｒｔ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｃｔｉｖｅ  ＩｓｐＨ  ｅｎｚｙｍｅ  ｆｒｏｍ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｐｒｏｖｉｄｅｓ  ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ２００９  Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．４８：５７５６−５７５９を含め、入手可能なＩｓｐＨ構造によって知ることができる。
【００２２】
表１は、細菌株を構築する、及び／または細菌細胞における発現の増強または物理的特性の増強のためにＩｓｐＧまたはＩｓｐＨ酵素を変更するのに有用な代替酵素の一覧を示している。これらはそれぞれ、アミノ酸の置換、欠失、及び／または挿入によって修飾することができる。例えば、アミノ酸配列が、表１に記載のアミノ酸配列と５０％以上の配列同一性、または少なくとも約６０％の配列同一性、または少なくとも約７０％の配列同一性、または少なくとも約８０％の配列同一性、または少なくとも約９０％の配列同一性、または少なくとも約９５％の配列同一性、または少なくとも約９８％の配列同一性を有していてもよい。いくつかの実施形態では、タンパク質の活性を変化させるために、表１の配列に対して１〜約１０個、または１〜約５個のアミノ酸の置換、欠失、及び／または挿入が加えられ、これには、１つ以上の基質結合部位または活性部位への置換を含む。いくつかの実施形態では、ＩｓｐＧ及び／またはＩｓｐＨ酵素は、培養に用いられる条件下で改善された特性または活性を有するＥ．ｃｏｌｉ酵素のオルソログである。
【表１】
2020505051.tif 000003
【００２３】
組換えＩｓｐＧ及びＩｓｐＨ酵素の発現は、例えば、プロモーター強度、遺伝子コピー数、オペロン内の遺伝子の位置を変更すること、及び／またはｉｓｐＧ及び／またはｉｓｐＨの組換え遺伝子のリボソーム結合部位配列を変更することによってバランスをとることができる。ＩｓｐＧ及びＩｓｐＨの発現及び／または活性のバランスがとれている場合、組換えまたは改変されたｉｓｐＧ及びｉｓｐＨ遺伝子を含まない親株の場合よりも実質的に多くＨＭＢＰＰ中間体が細胞に蓄積されることがない。それにもかかわらず、発酵によるテルペン及びテルペノイドの商用生産に必要とされる、ＭＥＰ経路を通る炭素フラックスは実質的に増加する。この結果を図３に示す。ここで、ｉｓｐＧ及びｉｓｐＨを過剰発現する株は、ｉｓｐＧ及びｉｓｐＨを過剰発現しない対照株と比較して、生産力価の４倍近い増加を生じさせることができるが（図２）、対照以上にＨＭＢＰＰ中間体を蓄積することはない。
【００２４】
いくつかの実施形態では、組換えＩｓｐＨの活性及び／または発現は、組換えＩｓｐＧの活性及び／または発現よりも高い。ＩｓｐＧ／ＩｓｐＨ比がＨ酵素の方に有利であると、その比がＩｓｐＧ側に有利である株と比較して、ＭＥＰ経路を通るフラックスが上昇する。ＩｓｐＧ及びＩｓｐＨが逐次作用して、ＭＥｃＰＰがＨＭＢＰＰに、さらにＩＰＰへと変換される。ＩｓｐＧが増加すると、ＨＭＢＰＰプール（株の増殖に対して阻害効果を示す可能性がある）の蓄積が大きくなり、対してＩｓｐＨが増加すると、ＩＰＰに変換されるにつれてＨＭＢＰＰプールは縮小する。したがって、ＩｓｐＧとＩｓｐＨとのバランスが理想的であれば、ＨＭＢＰＰの形成と消費双方の速度を高め、ＨＭＢＰＰの蓄積を回避しながら、ＭＥＰ経路から標的テルペノイドへのフラックスを著しく改善する。さらにＩｓｐＧよりもＩｓｐＨがわずかに有利であれば、生産性を２５％、親株の力価のほぼ４倍まで向上させることができる。図２を参照のこと。
【００２５】
したがって、いくつかの実施形態では、組換えＩｓｐＨの発現が、組換えＩｓｐＧの発現よりも高い。例えば、組換えＩｓｐＨ及びＩｓｐＧ酵素を、オペロン内でｉｓｐＧの前にｉｓｐＨが位置するオペロンから発現させることができる。オペロンの最初に位置する遺伝子は発現にわずかに有利であり、ＩｓｐＨとＩｓｐＧのバランスをとる精密なメカニズムを提供する。いくつかの実施形態では、ｉｓｐＧが最初に配置されてもよく、場合により他の改変、例えば発現を低下させるＲＢＳに対する変異、または酵素生産性のレベルで活性のバランスをとるためのＩｓｐＧ及びＩｓｐＨの一方または両方への点変異などとともに配置することができる。いくつかの実施形態では、ｉｓｐＧ及びｉｓｐＨは別々のオペロン（例えば、モノシストロン性）で発現され、異なる強度のプロモーターまたはＲＢＳを使用して発現のバランスが保たれる。
【００２６】
いくつかの実施形態では、ＩｓｐＨ及びＩｓｐＧは、（ｉｓｐＨ遺伝子がｉｓｐＧ遺伝子の前に位置する）オペロンから同時に発現し、かつ、そのオペロンは強力なプロモーターの制御下で発現される。オペロン内でｉｓｐＨがｉｓｐＧの前に位置する場合、プロモーター強度の増加は生産性に対して良い影響を与えるが、ｉｓｐＧがｉｓｐＨの前に位置する場合、プロモーター強度の増加は悪い影響を与える可能性がある。ファルネソール産物を代替物として生産に利用している図７を参照のこと。
【００２７】
組換えＩｓｐＧ及びＩｓｐＨ酵素はプラスミドから発現させることも、またはそのコード遺伝子を染色体に組み込むこともでき、単一または複数のコピー、いくつかの実施形態では、例えば細胞あたり約２コピー、約５コピー、または約１０コピー存在させることができる。（当技術分野において周知のように）異なるコピー数を有するプラスミドを使用することによって、または例えば、タンデム遺伝子複製により複数のコピーをゲノムに組み込むことによって、コピー数を制御することができる。
【００２８】
いくつかの実施形態では、微生物株は、例えば、１つ以上のＭＥＰ酵素（例えばＩｓｐＧ及びＩｓｐＨに加えて）の過剰発現によるものを含め、ＭＥＰ経路を通るフラックスが多い。炭素源としてグルコースを用いると、ＭＥＰ経路に流入する炭素の理論上の最大値は、Ｅ．ｃｏｌｉの場合の約３０％である。文献に報告されているＭＥＰ炭素の以前の収率は１％未満である。Ｚｈｏｕ  Ｋ，Ｚｏｕ  Ｒ，Ｓｔｅｐｈａｎｏｐｏｕｌｏｓ  Ｇ，Ｔｏｏ  Ｈ−Ｐ（２０１２）Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  Ｍｅｔｈｙｌｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ  Ｃｙｃｌｏｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｅｆｆｌｕｘ  ａｓ  ａ  Ｌｉｍｉｔｉｎｇ  Ｓｔｅｐ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ７（１１）：ｅ４７５１３．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００４７５１３を参照のこと。本明細書に記載の他の改変に加えて、ＭＥＰ経路遺伝子の過剰発現及びバランスにより、ＭＥＰ経路から下流の合成経路へと炭素を流入させ、テルペン及び／またはテルペノイド産物への炭素フラックスを向上させることができる。
【００２９】
この宿主細胞（細菌株）は、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）及びジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）を産生するＭＥＰ経路を発現する。具体的には、グルコースが細胞内に入り、中間体としてのグリセルアルデヒド−３−リン酸（Ｇ３ＰまたはＧＡＰ）によりピルビン酸（ＰＹＲ）に変換される。Ｇ３ＰとＰＹＲが化合して１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸（ＤＯＸＰ）を生成し、これが２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸（ＭＥＰ）に変換され、ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰへの経路に渡される。ＤＯＸ、ＭＥ、及びＭＥｃＰＰは細胞外に見られる。不均衡経路を有する株では、ＭＥＰ経路へのフラックスが多いほど、これらの産物が細胞外に多く見られる。図１を参照のこと。
【００３０】
ＭＥＰ（２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸）経路はまた、ＭＥＰ／ＤＯＸＰ（２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸／１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸）経路または非メバロン酸経路またはメバロン酸非依存性経路とも呼ばれる。この経路は典型的には以下の酵素の作用を伴う：１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ（Ｄｘｓ）、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼ（Ｄｘｒ、またはＩｓｐＣ）、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールシンターゼ（ＩｓｐＤ）、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールキナーゼ（ＩｓｐＥ）、２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロ二リン酸シンターゼ（ＩｓｐＦ）、１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル４−二リン酸シンターゼ（ＩｓｐＧ）、１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル４−二リン酸レダクターゼ（ＩｓｐＨ）、及びイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（Ｉｄｉ）。ＭＥＰ経路、ならびにＭＥＰ経路を構成する遺伝子及び酵素は、ＵＳ８，５１２，９８８に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。したがって、ＭＥＰ経路を構成する遺伝子として、ｄｘｓ、ｄｘｒ（またはｉｓｐＣ）、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＥ、ｉｓｐＦ、ｉｓｐＧ、ｉｓｐＨ、ｉｄｉ、及びｉｓｐＡが挙げられる。ＭＥＰ経路酵素のアミノ酸配列は添付の配列表に示されている。
【００３１】
ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰ（ＭＥＰ経路の産物）は、モノテルペノイド、セスキテルペノイド、トリテルペノイド、及びジテルペノイドを含むテルペン及びテルペノイドの前駆体であり、これらは、香料、芳香剤、化粧品、及び食品の分野において特に有用である。テルペン及びテルペノイドの合成は、プレニルトランスフェラーゼ酵素（例えば、ＧＰＰＳ、ＦＰＰＳ、またはＧＧＰＰＳ）の作用により、ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰ前駆体をゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）、またはゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）に変換することによって進行する。そのような酵素は公知であり、例えば、ＵＳ８，９２７，２４１、ＷＯ２０１６／０７３７４０、及びＷＯ２０１６／０２９１５３に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００３２】
様々な実施形態において、本発明はＭＥＰ炭素に実質的な改善をもたらす。本明細書で使用される場合、用語「ＭＥＰ炭素」とは、ＭＥＰ経路の投入物、中間体、代謝産物、または産物として存在する全炭素を指す。代謝産物には、分解産物などの誘導体、ならびにリン酸化及び脱リン酸化の産物が含まれる。ＭＥＰ炭素には、テルペノイド合成経路を含む下流経路の産物及び中間体を含む。本開示の目的では、ＭＥＰ炭素には、ＭＥＰ経路の以下の投入物、中間体、及び代謝産物を含む：Ｄ−グリセルアルデヒド３−リン酸、ピルビン酸、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール−５−リン酸、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール、２−ホスホ−４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール、２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロ二リン酸、１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル４−二リン酸、イソペンテニル二リン酸、及びジメチルアリル二リン酸。ＭＥＰ炭素には、細胞によって発現する下流のテルペノイド合成経路における中間体及び主要な代謝産物をさらに含む。同一性は使用される経路及び酵素に応じて異なるが、そのような産物には以下が含まれる：ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）、ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）、またはゲラニルファルネシル二リン酸（ＦＧＰＰ）；それらのモノリン酸化型であるゲラニルリン酸、ファルネシルリン酸、ゲラニルゲラニルリン酸、またはゲラニルファルネシルリン酸；それらのアルコール類であるゲラニオール、ファルネソール、ゲラニルゲラニオール、またはゲラニルファルネソール；ならびに下流のテルペン及びテルペノイド産物。ＭＥＰ炭素には、ＦＰＰまたはＦＰＰを使用する経路に由来する化合物がさらに含まれ、これには、スクアレン、ウンデカプレニル二リン酸（ＵＰＰ）、ウンデカプレニルリン酸、オクタプレニル二リン酸（ＯＰＰ）、４−ヒドロキシベンゾエート、３−オクタプレニル−４−ヒドロキシベンゾエート、２−オクタプレニルフェノール、３−オクタプレニルベンゼン−１，２−ジオール、２−メトキシ−６−オクタプレニル−２−メトキシ−１，４−ベンゾキノール、６−メトキシ−３−メチルオクタプレニル−１，４−ベンゾキノール、３−デメチルユビキノール−８、ユビキノール−８、ユビキノン、２−カルボキシ−１，４−ナフトキノール、デメチルメナキノール−８、メナキノール−８、及びメナキノンを含む。ＭＥＰ炭素には、イソプレノール、プレノール、イソペンテニルリン酸、及びジメチルアリルリン酸代謝産物をさらに含む。ＭＥＰ炭素（上記中間体及び代謝産物）は、三連四重極（ＱＱＱ）質量検出器によるタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）などの質量分析（ＭＳ）によって定量することができる。例示的なシステムは、Ａｇｉｌｅｎｔ  ６４６０  ＱＱＱである。あるいは、定量的飛行時間型（ＱＴＯＦ）、飛行時間型（ＴＯＦ）、またはイオントラップ質量検出器を用いる。
【００３３】
いくつかの実施形態では、微生物株は、ｄｘｓ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＦ、及び／またはｉｄｉ遺伝子の少なくとも１つの追加コピーを有する。これらは律速を可能にし、オペロンまたはモジュールからプラスミドで発現させることも、または細菌染色体に組み込むこともできる。いくつかの実施形態では、細菌株は、オペロン／モジュールとして発現させたｄｘｓ及びｉｄｉ；またはオペロンもしくはモジュールとして発現させたｄｘｓ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＦ、及びｉｄｉのうち、少なくとも１つの追加コピーを有する。いくつかの実施形態では、細菌株は組換え遺伝子としてｄｘｓ、ｄｘｒ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＥ、ｉｓｐＦ、及びｉｄｉを発現し、これらは場合により１、２、または３個の個々のオペロンまたはモジュールとして発現される。ＭＥＰ経路の組換え遺伝子は、１つ以上のプラスミドから発現されるか、または染色体に組み込まれる。これらの実施形態では、この株は、野生型と比較して、ＭＥＰ経路を通るフラックスを増加させる。
【００３４】
野生型Ｅ．ｃｏｌｉ酵素Ｄｘｓ、Ｄｘｒ、ＩｓｐＤ、ＩｓｐＥ、ＩｓｐＦ、及びＩｄｉのアミノ酸配列を、配列番号３〜８として本明細書に示す。様々な実施形態において、構造的相同性または配列相同性、および同等の機能性を有する酵素を使用することができる（細菌ホモログを含む）。例えば、アミノ酸配列は、配列番号３〜８のいずれか１つと５０％以上の配列同一性、または配列番号３〜８のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも約６０％の配列同一性、または少なくとも約７０％の配列同一性、または少なくとも約８０％の配列同一性、または少なくとも約９０％の配列同一性、または少なくとも約９５％の配列同一性、または少なくとも約９８％の配列同一性を有していてもよい。いくつかの実施形態では、タンパク質の活性を変化させるために、アミノ酸配列（配列番号３〜８）に対して１〜約１０個、または１〜約５個のアミノ酸の置換、欠失、及び／または挿入が加えられ、これには、１つ以上の基質結合部位または活性部位への置換を含む。酵素に対する修飾は、相同性モデルの構築によって知ることができる。そのような変異体は、Ｙａｊｉｍａ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  １−ｄｅｏｘｙ−Ｄ−ｘｙｌｕｌｏｓｅ  ５−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ  ｉｎ  ａ  ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｗｉｔｈ  ａ  ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ｉｏｎ，ＮＡＤＰＨ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｍａｌａｒｉａｌ  ｄｒｕｇ  ｆｏｓｍｉｄｏｍｙｃｉｎ，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．Ｆ６３，４６６−４７０（２００７）を含め、当技術分野において利用可能な酵素構造によって知ることができる。
【００３５】
いくつかの実施形態では、ＭＥＰの補完は、ＩｓｐＧの基質であるＭＥｃＰＰへのＤＯＸＰ及びＭＥＰプールの変換を増強する。図１を参照のこと。ＭＥＰ経路におけるｄｘｓからｉｓｐＦへのボトルネックを、細胞外で検出できるＤＯＸ、ＭＥ、及びＭＥｃＰＰレベルに基づいて決定することができる。ＭＥＰ経路酵素の補完及び発現のバランスをとることで、代謝産物のプロファイリングによって決定される、ＭＥｃＰＰ中間体へと炭素フラックスを移動させることができる。いくつかの実施形態では、ＭＥｃＰＰ代謝産物をＩＰＰ及びＤＭＡＰＰ前駆体へと流入させるため、Ｄｘｒ、Ｄｘｓ、ＩｓｐＤ、ＩｓｐＥ、及びＩｓｐＦの発現または活性に対するＩｓｐＧ及びＩｓｐＨの発現または活性のバランスが調整される。ＭＥｃＰＰは細胞外培地に移されることがあるため、ＭＥｃＰＰプールが多いとＭＥＰ炭素の損失を招く可能性がある。
【００３６】
いくつかの実施形態では、組換えｉｄｉ遺伝子の発現または活性は、テルペンまたはテルペノイドの生産量が増加するように調整される。Ｉｄｉ酵素は、ＩＰＰとＤＭＡＰＰとの可逆的異性化を触媒する。あらゆる望ましいテルペノイド産物または望ましくないＭＥＰ副産物（例えばＵＰＰ）は１つのＤＭＡＰＰ及び様々な数のＩＰＰを使用するため、２つの前駆体間の比率は株の生産性に影響を及ぼす可能性がある。例えば、Ｉｄｉの発現または活性を変えることによって、利用可能なＩＰＰ：ＤＭＡＰＰの比率を変更すると、ＭＥＰ経路からの他の望ましくない産物と比較した、望ましいテルペノイドの生産量に影響を及ぼすことができる。例えば、図９に示すように、Ｉｄｉの過剰発現はＩｓｐＧＨを過剰発現しない株（株１）では生産力価をわずかに増加させるが、過剰発現する２つの株（株２及び３）では力価を減少させる。このことは、ＩＰＰとＤＭＡＰＰとのバランスをＩｄｉによって制御し、下流経路の需要に応じて上方または下方に調整できることを示している。しかしながら、ＭＥＰ経路の酵素発現のバランスが異なる株４（図９）は、Ｉｄｉの補完により力価が２倍以上になる。酵素生産性を増加または減少させる点変異に加えて、プロモーター強度、遺伝子コピー数、オペロン内の位置、またはリボソーム結合部位を変更することにより、様々な実施形態において、組換えｉｄｉ遺伝子の発現を調整することができる。
【００３７】
微生物株は、例えば培養中の光学密度（Ｏ．Ｄ．）、ピークＯ．Ｄ．、及び／または増殖速度によって決定される、株の増殖及び生存率に実質的な影響を与えることなく、ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰ前駆体フラックスの実質的な増加を含め、ＭＥＰ炭素の実質的な増加をもたらす。例えば、ＭＥＰ経路を通るフラックスの増加が、細菌細胞において厳密に制御されているにもかかわらず、微生物株はピークＯ．Ｄ．が約２０％を超えて低下せず、またはいくつかの実施形態では、ピークＯ．Ｄ．が約１５％を超えて、または約１０％を超えて、または約５％を超えて低下しない。いくつかの実施形態では、株は、例えば増殖速度またはピークＯ．Ｄ．を測定することによって決定される、株の増殖または生存率に対して測定可能な影響を示さない。
【００３８】
いくつかの実施形態では、細菌株は、ＭＥＰ経路を介した電子の供給及び伝達、及び／またはテルペンもしくはテルペノイド産物への電子の供給及び伝達を増強する１つ以上の遺伝子改変を含む。いくつかの実施形態では、ＭＥＰ経路を介した電子の供給及び伝達の増強は、ピルビン酸を酸化する及び／またはフェレドキシンの還元をもたらすオキシドレダクターゼを含む、１つ以上のオキシドレダクターゼ酵素の組換え発現によるものである。フェレドキシンはＭＥＰ経路に電子を供給し、（Ｆｅ−Ｓクラスター酵素である）ＩｓｐＧ及びＩｓｐＨの活性を助ける。図１０を参照のこと。様々な実施形態において、微生物株は、フラボドキシン（ｆｌｄＡ）、フラボドキシンレダクターゼ、フェレドキシン（ｆｄｘ）、及びフェレドキシンレダクターゼのうちの１つ以上の過剰発現または補完を含む。
【００３９】
例として、いくつかの実施形態では、オキシドレダクターゼはピルビン酸：フラボドキシンオキシドレダクターゼ（ＰＦＯＲ）である。いくつかの実施形態では、ＰＦＯＲはＹｄｂＫである。いくつかの実施形態では、ＹｄｂＫはＥ．ｃｏｌｉ  ＹｄｂＫ、またはそのオルソログ及び誘導体である。
【００４０】
いくつかの実施形態では、株はＹｄｂＫの補完または過剰発現を含む。ＹｄｂＫは、ピルビン酸：フラボドキシンオキシドレダクターゼ及び／またはピルビン酸シンターゼとして機能すると予測される。オキシドレダクターゼは、ピルビン酸をアセチル−ＣｏＡに酸化し、フェレドキシンを還元することで、ＭＥＰ経路に電子を供給することができ、特にＦｅ−Ｓクラスターを含んでいるＩｓｐＧ及びＩｓｐＨ酵素の大幅な上方制御を助けると考えられている。いくつかの実施形態では、組換えＹｄｂＫの発現は、ＩｓｐＧ及びＩｓｐＨの発現とバランスが保たれており、これは生産力価（または以下に記載のファルネソール力価）によって決定することができる。いくつかの実施形態では、ＹｄｂＫ遺伝子は弱強度または中強度のプロモーターの制御下にある。加えて、過剰な電子を保有または伝達する補因子を、ＹｄｂＫの過剰発現に加えて発現させることができる。例えば、Ａｋｈｔａｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１１（３）：１３９−１４７（２００９）を参照のこと。いくつかの実験では、ＹｄｂＫは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ（配列番号１０）及び／またはＥ．ｃｏｌｉ（Ｅｃ．ｙｄｈＹ）（配列番号３４）由来のｆｄｘ（フェレドキシン）、またはそれと少なくとも８０％または少なくとも９０％の配列同一性を有する酵素により過剰発現する。この細菌株は、染色体に組み込むことも、またはプラスミドから発現させることもできる、組換えＹｄｂＫ遺伝子を含み得る。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＹｄｂＫ酵素のアミノ酸配列は、本明細書に配列番号９として示す。様々な実施形態において、構造的相同性または配列相同性、および同等の機能性を有する酵素を使用することができる。例えば、アミノ酸配列は、配列番号９のいずれか１つと５０％以上の配列同一性、または配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも約６０％の配列同一性、または少なくとも約７０％の配列同一性、または少なくとも約８０％の配列同一性、または少なくとも約９０％の配列同一性、または少なくとも約９５％の配列同一性、または少なくとも約９７％の配列同一性、または少なくとも約９８％の配列同一性を有していてもよい。いくつかの実施形態では、タンパク質の活性を変化させるために、アミノ酸配列（配列番号９）に対して１〜約１０個、または１〜約５個のアミノ酸の置換、欠失、及び／または挿入が加えられる。
【００４１】
いくつかの実施形態では、株は、テルペノイド化合物を生産するための１つ以上のＰ４５０酵素を含む。ＹｄｂＫ及び場合により他のオキシドレダクターゼの過剰発現が、より高レベルのＰ４５０の酸化化学を助ける場合がある。
【００４２】
細菌株がピルビン酸：フラボドキシンオキシドレダクターゼ（ＰＦＯＲ）を過剰発現するかまたはより高い活性を有する実施形態を含め、いくつかの実施形態では、この株は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）によるピルビン酸のアセチル−ＣＯＡへの変換に減少を示す。いくつかの実施形態では、ＰＤＨによるピルビン酸のアセチル−ＣＯＡへの変換が、ＰＤＨを欠失させるもしくは不活性化することによって、またはＰＤＨの発現もしくは活性を低下させることによって低減される。いくつかの実施形態では、ＰＤＨが欠失している。あるいは、ＰＤＨの活性が、１つ以上のアミノ酸修飾によって低減される場合もある。ＰＤＨ活性を低減するための例示的な変異は、ａｃｅＥのＧ２６７Ｃ変異である。
【００４３】
いくつかの実施形態では、ＰＤＨによるピルビン酸のアセチル−ＣＯＡへの変換が、ＰＤＨのａｃｅＥ−ａｃｅＦ−ｌｐｄ複合体を改変することによって低減される。いくつかの実施形態では、ａｃｅＥ−ａｃｅＦ−ｌｐｄ複合体は、ａｃｅＥ、ａｃｅＦ、ｌｐｄ、またはそれらの組み合わせの欠失、不活性化、または発現もしくは活性の低減によって改変されている。例として、いくつかの実施形態では、ａｃｅＥは（例えば、ノックアウトにより）欠失されている。あるいは、いくつかの実施形態では、ａｃｅＥ−ａｃｅＦ−ｌｐｄ複合体は、ａｃｅＥ、ａｃｅＦ、ｌｐｄ、またはそれらの組み合わせの１つ以上の変異によって改変されている。
【００４４】
ＰＤＨによるピルビン酸のアセチル−ＣＯＡへの変換を低減することによって、細菌株は、ピルビン酸をアセチル−ＣＯＡに変換する際に、ＰＦＯＲ（例えば、ＹｄｂＫ）の方により依存することになる。図１５を参照のこと。この依存性により、ＩｓｐＧ及びＩｓｐＨの活性が増強される。
【００４５】
いくつかの実施形態では、ＩｓｐＧ及びＩｓｐＨへの電子の供給及び伝達は、例えばＰＦＯＲなどの１つ以上のオキシドレダクターゼの過剰発現または補完によって改善される。例として、いくつかの実施形態では、ＰＦＯＲ、またはそのホモログは、ＹｄｂＫ（配列番号９）、Ｓｃｙ．ｐｆｏｒ（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．）（配列番号２９）、Ｋｉ．ｐｆｏｒ（Ｋｌｕｙｖｅｒａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）（配列番号３０）、Ｄａ．ｐｆｏｒ（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ａｆｒｉｃａｎｕｓ）（配列番号３１）、Ｎｓ．ｐｆｏｒ（Ｎｏｓｔｏｃ  ｓｐ．）（配列番号３２）、Ｅｃ．ｙｄｈＶ（Ｅ．Ｃｏｌｉ）（配列番号３３）、Ｇａ．ｐｆｏｒ（Ｇｉｌｌｉａｍｅｌｌａ  ａｐｉｃｏｌａ）（配列番号３５）、及びＳｃｏ．ｐｆｏｒ（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）から選択される。いくつかの実施形態では、ＰＦＯＲはＹｄｂＫである。
【００４６】
いくつかの実施形態では、ＰＦＯＲは配列番号２９〜３５のいずれか１つと少なくとも６０％同一である配列を含む。例えば、ＰＦＯＲは、配列番号２９〜３５のいずれか１つと少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一である配列を含み得る。
【００４７】
いくつかの実施形態では、例えばＹｄｂＫなどのＰＦＯＲの過剰発現または補完は、約４００〜５５０ｍＶ、またはいくつかの実施形態では約４００〜５００ｍＶの範囲内、もしくは約４００〜４７５ｍＶの範囲内の酸化還元電位を有する電子伝達体の発現により生産力の向上をもたらすことができる。いくつかの実施形態では、電子伝達体はフェロドキシン、フラボドキシン、またはＮＡＤＰＨである。例として、いくつかの実施形態では、電子伝達体はＣｖ．ｆｄｘ（Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ  ｖｉｎｏｓｕｍ）である。
【００４８】
いくつかの実施形態では、細菌株は、１つ以上のｆｐｒホモログの過剰発現または補完を有する。例として、いくつかの実施形態では、ｆｐｒホモログは、Ｎｓ．ｆｐｒ（Ｎｏｓｔｏｃ  ｓｐ．）（配列番号３６）、Ｓｃｏ．ｆｐｒ（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）（配列番号３７）、及びＥｃ．ｆｐｒ（Ｅ．ｃｏｌｉ）（配列番号３８）から選択される。
【００４９】
いくつかの実施形態では、ｆｐｒは配列番号３６〜３８のいずれか１つと少なくとも６０％同一である配列を含む。例えば、ｆｐｒは、配列番号３６〜３８のいずれか１つと少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一である配列を含み得る。
【００５０】
いくつかの実施形態では、ＹｄｂＫまたはそのホモログもしくは誘導体を過剰発現する細菌株は、１つ以上の非天然のｆｄｘ及び／またはｆｌｄＡホモログなどの非天然の電子受容体／供与体をさらに発現する。例として、ｆｄｘホモログは、Ｈｍ．ｆｄｘ１（Ｈｅｌｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｏｄｅｓｔｉｃａｌｄｕｍ）（配列番号１５）、Ｐａ．ｆｄｘ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（配列番号１６）、Ｃｖ．ｆｄｘ（Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ  ｖｉｎｏｓｕｍ）（配列番号１７）、Ｃｖ．ｆｄｘ＿Ｃ５７Ａ（合成）（配列番号１８）、Ｅｃ．ｙｆｈＬ（Ｅ．Ｃｏｌｉ）（配列番号１９）、Ｃａ．ｆｄｘ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（配列番号２０）、Ｃｐ．ｆｄｘ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ）（配列番号１０）、Ｅｃ．ｆｄｘ（Ｅ．Ｃｏｌｉ）（配列番号２１）、Ｅｖ２．ｆｄｘ（Ｅｃｔｏｔｈｉｏｒｈｏｄｏｓｐｉｒａ  ｓｈａｐｏｓｈｎｉｋｏｖｉｉ）（配列番号２２）、Ｐｐ１．ｆｄｘ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）（配列番号２３）、及びＰｐ２．ｆｄｘ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）（配列番号２４）から選択され得る。いくつかの実施形態では、ｆｌｄＡホモログは、Ｅｃ．ｆｌｄＡ（Ｅ．ｃｏｌｉ）（配列番号２７）、Ａｃ．ｆｌｄＡ２（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃｈｒｏｏｃｏｃｃｕｍ）（配列番号２６）、Ａｖ．ｆｌｄＡ２（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）（配列番号２５）、及びＢｓ．ｆｌｄＡ（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（配列番号２８）から選択される１つ以上を含む。非天然のｆｄｘホモログ及び／またはｆｌｄＡホモログの発現は、ＩｓｐＧ及び／またはＩｓｐＨへの電子供給の増加、ＩｓｐＧ／Ｈ活性の増加、ならびにテルペノイド生産量の増加をもたらす。図１９Ａ〜Ｃを参照のこと。
【００５１】
いくつかの実施形態では、非天然のｆｄｘホモログは、配列番号１０及び１５〜２４のいずれか１つと少なくとも６０％同一である配列を含む。例えば、非天然のｆｄｘホモログは、配列番号１０及び１５〜２４のいずれか１つと少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一である配列を含み得る。
【００５２】
いくつかの実施形態では、非天然のｆｌｄＡホモログは、配列番号２５〜２８のいずれか１つと少なくとも６０％同一である配列を含む。例えば、非天然のｆｌｄＡホモログは、配列番号２５〜２８のいずれか１つと少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一である配列を含み得る。
【００５３】
いくつかの実施形態では、細菌株は、１つ以上のＰＦＯＲ及び／またはｆｐｒ、ならびに場合により１つ以上のフラボドキシン（ｆｌｄＡ）、フラボドキシンレダクターゼ、フェレドキシン（ｆｄｘ）、及びフェレドキシンレダクターゼの過剰発現または補完を有する。例として、いくつかの実施形態では、細菌株は、Ｅｃ．ｙｄｈＶ（Ｅ．Ｃｏｌｉ）（配列番号３３）及びＥｃ．ｙｄｈＹ（Ｅ．Ｃｏｌｉ）（配列番号３４）；Ｅｃ．ｙｄｂＫ（Ｅ．Ｃｏｌｉ）（配列番号９）及びＣｐ．ｆｄｘ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ）（配列番号１０）；Ｅｃ．ｆｐｒ（Ｅ．Ｃｏｌｉ）（配列番号３８）及びＥｃ．ｆｄｘ（Ｅ．Ｃｏｌｉ）（配列番号２１）；またはＥｃ．ｆｐｒ（Ｅ．Ｃｏｌｉ）（配列番号３８）及びＥｃ．ｆｌｄＡ（Ｅ．ｃｏｌｉ）（配列番号２７）を含む。
【００５４】
他の態様では、本発明は、ＭＥＰ炭素の流入を増加させるため、ＰｇｐＢまたはＮｕｄＢ酵素を過剰発現する細菌株を提供する。ｐｇｐＢ及びｎｕｄＢなどの遺伝子を過剰発現させることによって、この代替「産物」の流入を導入することで、さらに多くのフラックスがＭＥＰ経路を通り流入し（非目標産物に至る）、潜在的毒性またはフィードバック阻害性の中間体（例えば、ＩＰＰ、ＤＭＡＰＰ、ＦＰＰ）の蓄積が最小限に抑えられる。いくつかの実施形態では、ＰｇｐＢまたはＮｕｄＢの過剰発現は、下流テルペノイド経路が存在しないことで、「汎用シャーシ」、すなわち、どのような下流テルペノイドも転換することができ、商用生産向けに迅速に最適化できる株を形成する。
【００５５】
より具体的には、炭素がＭＥＰ経路を通り流入し、細胞外にプールすることになる代替産物を生成することができる。ＰｇｐＢはＦＰＰをファルネソール（ＦＯＨ）に脱リン酸化し、ＮｕｄＢはＩＰＰ及びＤＭＡＰＰをイソプレノール（３−メチル−３−ブテン−１−オール）及びプレノール（３−メチル−２−ブテン−１−オール）にそれぞれ脱リン酸化する（図１を参照）。細胞外へのこれらの産物の輸送を増強すると、ＩＰＰ、ＤＭＡＰＰ、及びＦＰＰの蓄積が防止され、ＨＭＢＰＰと同様に、ＭＥＰ経路でのフィードバック及び抑制が可能になる。ＩＰＰは増殖を阻害し、フィードバックはＤｘｓを阻害する。Ｃｏｒｄｏｂａ，Ｓａｌｍｉ  ＆  Ｌｅｏｎ（２００９）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔ．６０，１０，２９３３−２９４３を参照のこと。ＦＰＰは増殖を阻害し、フィードバックはｉｓｐＦ−ＭＥＰ複合体を阻害する。この複合体自体は、ＭＥＰが結合して、フィードフォワード方式でＩｓｐＦ活性を増強するときに形成される。Ｂｉｔｏｋ  ＆  Ｍｅｙｅｒｓ（２０１２）ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１２，７，１７０２−１７１０。ファルネソール、イソプレノール、及びプレノールは細胞外に蓄積し、ＭＥＰ経路の中間体と同様に、これを使用して、ＬＣ／ＭＳまたはＧＣ／ＭＳ定量法によって、ＭＥＰ経路を通る炭素フラックスを追跡することができる。
【００５６】
様々な実施形態において、構造的相同性または配列相同性、および同等の機能性を有する酵素を使用することができる。例えば、アミノ酸配列は、配列番号１１（ＰｇｐＢ）または１２（ＮｕｄＢ）のいずれかと５０％以上の配列同一性、または配列番号１１または１２のアミノ酸配列と少なくとも約６０％の配列同一性、または少なくとも約７０％の配列同一性、または少なくとも約８０％の配列同一性、または少なくとも約９０％の配列同一性、または少なくとも約９５％の配列同一性を有していてもよい。いくつかの実施形態では、タンパク質の活性を変化させるために、アミノ酸配列（配列番号１１または１２）に対して１〜約１０個、または１〜約５個のアミノ酸の置換、欠失、及び／または挿入が加えられ、これには、１つ以上の基質結合部位または活性部位への置換を含む。
【００５７】
したがって、ｐｇｐＢまたはｎｕｄＢの追加コピーを構成的に発現させることによって、ＭＥＰ経路からの炭素フラックスを向上させ、増殖の遅い表現型を改善することができる。ｉｓｐＧとｉｓｐＨのバランスが保たれ、ｐｇｐＢまたはｎｕｄＢが過剰発現している場合、ファルネソール産物の増加または減少はＭＥｃＰＰレベルと逆相関する（図７及び８）。
【００５８】
しかしながら、ＰｇｐＢまたはＮｕｄＢが過度に発現すると、ファルネソールに至る総フラックスに悪影響を及ぼし、力価はより低く、倍率変化は小さくなる可能性がある。図６を参照のこと。したがって、様々な実施形態において、組換えＰｇｐＢ及び／またはＮｕｄＢの発現は、場合によりプロモーター強度、遺伝子コピー数、オペロン内での位置、及び／またはリボソーム結合部位を変更することによって、テルペンまたはテルペノイド生産力価を高めるように調整される。いくつかの実施形態では、組換えｐｇｐＢ及び／またはｎｕｄＢ遺伝子は、弱強度または中強度のプロモーターの制御下で発現される。組換えｐｇｐＢまたはｎｕｄＢは、染色体に組み込むことも、またはプラスミドから発現させることもできる。
【００５９】
いくつかの実施形態では、細菌株は、ＭＥＰ炭素の流入を増加させるために１つ以上のシンターゼを過剰発現する。例として、いくつかの実施形態では、このシンターゼはＡｒｔｅｍｉｓｉａ  ａｎｎｕａファルネセンシンターゼ及びバレンセンシンターゼから選択される。
【００６０】
いくつかの実施形態では、細菌株は、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨ補因子を含む、補因子の可用性または代謝回転を増加させるための１つ以上のさらなる改変を有し、それによってＭＥＰ炭素の増加をもたらす。図１４を参照のこと。いくつかの実施形態では、細菌株は、例えば、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ（配列番号１４）または他の中温性生物由来のグリセルアルデヒド３−リン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＧＡＰＯＲ）を発現する。ＧＡＰＯＲの発現は、中央の炭素代謝においてフェレドキシンに電子を供給することになり、ＩｓｐＧ、ＩｓｐＨ、またはＰ４５０酵素に電子を供給することができる。いくつかの実施形態では、細菌株は、（例えば、野生型遺伝子を補完するかまたは内因性細菌遺伝子の発現を増強することによって）ｙｄｈＶまたはｙｄｈＹなどのｙｄｈオペロンの１つ以上の遺伝子を過剰発現する。ＹｄｈＶ、またはＧＡＰＯＲ様活性を有する他の細菌遺伝子は、補因子の可用性を増加させてＭＥＰ炭素をさらに増強することができる。他の遺伝子改変としては、ｇｓｈＡの下方制御、不活性化、もしくは欠失、またはＣＨＡＣ１及び／またはＣＨＡＣ２（例えば、ホモサピエンス由来）の発現が挙げられる。このような改変により、グルタチオンレベルを変化させることによって、ＮＡＤＰＨの可用性を間接的に増加させることができる。
【００６１】
本開示によれば様々な細菌種を改変することができるが、いくつかの実施形態では、細菌株は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．、Ｖｉｂｒｉｏ  ｓｐｐ．、及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．から選択される細菌である。いくつかの実施形態では、細菌株は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓ、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａから選択される種である。いくつかの実施形態では、細菌株はＥ．ｃｏｌｉである。
【００６２】
本明細書に記載の実施形態に従って、様々な戦略を用いて、組換え遺伝子及び酵素の発現または活性を操作することができる。これには特に、例えば、異なる強度のプロモーターの改変または置換、リボソーム結合配列の改変、オペロンまたはモジュール内の遺伝子順序、遺伝子コドン使用頻度、ＲＮＡまたはタンパク質安定性、ＲＮＡ二次構造、及び遺伝子コピー数の変更を含む。
【００６３】
いくつかの実施形態では、リボソーム結合部位配列を変更して、ｍＲＮＡの翻訳を調整することができる。シャイン−ダルガノ（ＳＤ）配列は、細菌中のリボソーム結合部位であり、一般に、開始コドンＡＵＧの約８塩基上流に位置する。このＲＮＡ配列は、リボソームをメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に動員するのを助け、リボソームを開始コドンに配置することによってタンパク質合成を開始させる。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの６塩基コンセンサス配列はＡＧＧＡＧＧ（配列番号１３）である。コンセンサス配列内の変異を、生産力価（いくつかの実施形態ではファルネソール力価を含む）の改善についてスクリーニングすることも、またはＭＥＰ炭素のメタボローム解析によってスクリーニングすることもできる。
【００６４】
遺伝子の補完に野生型遺伝子を用いることができ、いくつかの実施形態では、遺伝子は野生型Ｅ．ｃｏｌｉ遺伝子である。あるいは、Ｅ．ｃｏｌｉ遺伝子に対してヌクレオチドまたはアミノ酸の相同性を示し得る種々のオルソログを使用することができる。例示的な遺伝子は、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．、Ｖｉｂｒｉｏ  ｓｐｐ．、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．、Ｃｈｌｏｒｏｂｏｃｕｌｕｍ  ｓｐｐ．、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐｐ．、及びＳｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａのオルソログに由来し得る。
【００６５】
ヌクレオチド及びアミノ酸配列の類似性、すなわち配列同一性の比率は、配列アラインメントによって決定することができる。そのようなアラインメントは、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌの数学的アルゴリズム（Ｋａｒｌｉｎ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７）、ｈｍｍａｌｉｇｎ（ＨＭＭＥＲパッケージ、ｈｔｔｐ：／／ｈｍｍｅｒ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／）、またはＣＬＵＳＴＡＬアルゴリズム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．＆Ｇｉｂｓｏｎ，Ｔ．Ｊ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２，４６７３−８０）などによる、技術分野で公知のいくつかのアルゴリズムを用いて実施することができる。配列同一性（配列一致）の程度は、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＴ、またはＢｌａｓｔＺ（またはＢｌａｓｔＸ）を用いて計算することができる。同様のアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０のＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＰに組み込まれている。ＢＬＡＳＴポリヌクレオチド検索は、ＢＬＡＳＴＮプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて実施することができる。
【００６６】
ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＢＬＡＳＴＰプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて実施することができる。比較目的としてギャップありアラインメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２に記載されるようなＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴが利用される。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムの初期設定パラメーターを使用する。Ｓｈｕｆｆｌｅ−ＬＡＧＡＮ（Ｂｒｕｄｎｏ  Ｍ．、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２００３ｂ，１９  Ｓｕｐｐｌ  １：１５４−１６２）またはマルコフ確率場のような確立された相同性マッピング技術によって、配列一致解析を補完することができる。
【００６７】
「保存的置換」は、例えば、関与するアミノ酸残基の極性、電荷、サイズ、溶解度、疎水性、親水性、及び／または両親媒性といった性質の類似性に基づいて行うことができる。２０種の天然型アミノ酸は、以下の６つの標準アミノ酸群に分類することができる：
（１）疎水性：Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ａｓｎ、Ｇｉｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖の配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；及び
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【００６８】
本明細書で使用される場合、「保存的置換」は、あるアミノ酸を上記の６つの標準アミノ酸群の同じ群内に列挙された別のアミノ酸に交換することであると定義される。例えば、ＡｓｐをＧｌｕに交換しても、そのように修飾されたポリペプチドには１つの負電荷が保持される。加えて、グリシンとプロリンとは、α−ヘリックスを妨害するその能力に基づいて、互いに置換可能である。上記の６つの群内でのいくつかの好ましい保存的置換は、以下のサブグループ内での交換である：（ｉ）Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、及びＩｌｅ；（ｉｉ）Ｓｅｒ及びＴｈｒ；（ｉｉ）Ａｓｎ及びＧｉｎ；（ｉｖ）Ｌｙｓ及びＡｒｇ；ならびに（ｖ）Ｔｙｒ及びＰｈｅ。
【００６９】
本明細書で使用される場合、「非保存的置換」は、あるアミノ酸を上記（１）〜（６）の６つの標準アミノ酸群の異なる群内に列挙された別のアミノ酸に交換することであると定義される。
【００７０】
本明細書に記載の酵素の修飾は、保存的変異及び／または非保存的変異を含み得る。
【００７１】
いくつかの実施形態では、酵素における特異的変異の構築に「合理的設計」を伴う。合理的設計とは、反応熱力学及び反応速度論、３次元構造、活性部位（複数可）、基質（複数可）、及び／または酵素と基質との間の相互作用など、酵素または関連酵素の知見を特異的変異の設計に取り入れることを指す。合理的設計手法に基づいて、酵素に変異を生じさせた後、親株レベルと比較したテルペンまたはテルペノイド生産量の増加について、またはＭＥＰ炭素の改善と一致する代謝産物プロファイルについてスクリーニングすることができる。いくつかの実施形態では、相同性モデリングに基づいて、変異を合理的に設計することができる。「相同性モデリング」とは、関連する相同タンパク質の３次元構造を利用して、タンパク質のアミノ酸配列から、その原子分解能モデルを構築する方法を指す。
【００７２】
酵素にアミノ酸修飾を加えて、酵素または酵素複合体の活性を増加または減少させることができる。遺伝子変異は、当技術分野で公知の任意の遺伝子変異方法を用いて行うことができる。いくつかの実施形態では、遺伝子ノックアウトにより、遺伝子産物の全部または一部を排除する。遺伝子ノックアウトは、当技術分野で公知の任意のノックアウト方法を用いて行うことができる。
【００７３】
遺伝子モジュールを含む遺伝子及び／またはタンパク質の発現の操作は、様々な方法によって達成することができる。例えば、遺伝子またはオペロンの発現を、異なる強度（例えば、強、中、または弱）を有する、誘導性または構成的プロモーターなどのプロモーターの選択によって制御することができる。プロモーターのいくつかの非限定的な例としては、Ｔｒｃ、Ｔ５、及びＴ７が挙げられる。加えて、遺伝子またはオペロンの発現を、細胞内の遺伝子またはオペロンのコピー数を操作することによって制御することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子またはオペロンの発現を、モジュール内の遺伝子の順序を操作することによって制御することができる。その場合、最初に転写された遺伝子が一般に、より高レベルで発現する。いくつかの実施形態では、遺伝子またはオペロンの発現は、１つ以上の遺伝子またはオペロンの染色体への組み込みによって制御される。
【００７４】
いくつかの実施形態では、遺伝子発現のバランス調整には、高コピー数プラスミド、または単一コピー数、低コピー数、もしくは中コピー数プラスミドの選択を含む。さらに他の実施形態では、転写終結の段階を対象として、ステムループなどの構造の導入または排除によって遺伝子発現を制御することもできる。
【００７５】
発現に必要なすべての要素が含まれた発現ベクターが市販されており、当業者に知られている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９を参照のこと。細胞は、異種ＤＮＡの細胞への導入によって遺伝子操作される。異種ＤＮＡは、宿主細胞内での異種ＤＮＡの発現が可能になるように、転写要素の機能的制御下に置かれる。
【００７６】
遺伝子の補完とは対照的に、いくつかの実施形態では内因性遺伝子が編集される。編集により、内因性プロモーター、リボソーム結合配列、または他の発現制御配列を変更することができ、及び／またはいくつかの実施形態では、遺伝子制御におけるトランス作用性因子及び／またはシス作用性因子が変更される。ゲノム編集は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓゲノム編集技術、またはジンクフィンガーヌクレアーゼ及びＴＡＬＥＮを使用する類似の技術を用いて行うことができる。いくつかの実施形態では、内因性遺伝子は相同組換えによって置換される。
【００７７】
いくつかの実施形態では、遺伝子コピー数を制御することによって遺伝子を少なくとも部分的に過剰発現させる。異なるコピー数を有するプラスミドを用いて遺伝子コピー数を制御すると利便であるが、遺伝子重複及び染色体組み込みもまた用いることができる。例えば、遺伝的に安定なタンデム遺伝子複製のための方法が、ＵＳ２０１１／０２３６９２７に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００７８】
ある特定の実施形態では、細菌細胞は、１つ以上のテルペンまたはテルペノイド化合物を産生する。イソプレノイドとも呼ばれるテルペノイドは、５炭素イソプレン単位（Ｃ５）に由来する有機化学物質である。テルペノイドは、テルペノイドに含まれるイソプレン単位の数に基づいて分類され、いくつかの非限定的な例として、ヘミテルペノイド（１イソプレン単位）、モノテルペノイド（２イソプレン単位）、セスキテルペノイド（３イソプレン単位）、ジテルペノイド（４イソプレン単位）、セスタテルペノイド（５イソプレン単位）、トリテルペノイド（６イソプレン単位）、テトラテルペノイド（８イソプレン単位）、及びこれより多数のイソプレン単位を有するポリテルペノイドが挙げられる。一実施形態では、細菌宿主細胞は、モノテルペノイド、セスキテルペノイド、ジテルペノイド、セステルペノイド、またはトリテルペノイドから選択されるテルペノイドを産生する。テルペノイドとは、食品及び飲料産業はもとより、香料産業、化粧品産業、及びヘルスケア産業を含む多数の商業的用途を提供する多様なクラスの分子を表す。例として、テルペノイド化合物は、香料に（例えばパチョロール）、香味産業で（例えばヌートカトン）、甘味剤として（例えばステビオール）、着色剤として、または治療薬として（例えばタキソール）使用され、従来は多くが植物から抽出されている。それにもかかわらず、テルペノイド分子は本質的にｐｐｍレベルで存在するため、商業的用途に足る量を得るには大量の収穫を必要とする。
【００７９】
この細菌細胞は一般に、ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰ前駆体からテルペノイドを生産する組換え下流経路を備えることになる。モノテルペン（Ｃ１０）、セスキテルペン（Ｃ１５）、ジテルペン（Ｃ２０）、セスタテルペン（Ｃ２５）、及びトリテルペン（Ｃ３０）などのテルペンは、テルペン（テルペノイド）シンターゼと呼ばれる非常に大きな酵素群の作用によって、プレニル二リン酸基質である、ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）、ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）、ゲラニルファルネシル二リン酸（ＦＧＰＰ）、及び２つのＦＰＰからそれぞれ誘導される。これらの酵素は、反応産物が環化され、様々なモノテルペン、セスキテルペン、ジテルペン、セスタテルペン、及びトリテルペン炭素骨格産物を形成しているため、テルペンシクラーゼと呼ばれる場合が多い。得られた炭素骨格の多くは、シトクロムＰ４５０酵素による後続の酸素化を受けて、大きなファミリーの誘導体となる。
【００８０】
本発明に従って生産することができる例示的なテルペンまたはテルペノイド産物は、参照により本明細書に組み込まれるＵＳ８，９２７，２４１に記載されており、これには、ファルネセン、アモファジエン、アルテミシン酸、アルテミシニン、ビサボロール、ビサボレン、アルファ−シネンサール、ベータ−ツジョン、カンファー、カルベオール、カルボン、シネオール、シトラール、シトロネラール、クベボール、ゲラニオール、リモネン、メントール、メントン、ミルセン、ヌートカトン、ヌートカトール、パチョリ、ピペリトン、ローズオキシド、サビネン、ステビオール、ステビオールグリコシド（レバウジオシドＤまたはレバウジオシドＭを含む）、タキサジエン、チモール、及びバレンセンが挙げられる。Ｅ．ｃｏｌｉの経路を組換えにより構築するための酵素は、参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ８，９２７，２４１、ＷＯ２０１６／０７３７４０、及びＷＯ２０１６／０２９１５３に記載されている。
【００８１】
セスキテルペン骨格に作用して酸素化テルペノイドを産生する例示的なＰ４５０酵素は、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１６／０２９１５３に記載されている。さらに、本明細書に記載の細菌株に使用されるＰ４５０レダクターゼタンパク質は、ＷＯ２０１６／０２９１５３及びＷＯ２０１６／０７３７４０に記載されている。
【００８２】
本明細書で使用される場合、用語「酸素化テルペノイド」とは、１つ以上の酸素化事象を有し、対応するアルコール、アルデヒド、カルボン酸、及び／またはケトンを生成するテルペン骨格を指す。いくつかの実施形態では、細菌細胞は、アビエタジエン、アビエチン酸、アルファ−シネンサール、ベータ−ツジョン、カンファー、カルベオール、カルボン、セラストロール、セロプラストール、シネオール、シトラール、シトロネラール、クベボール、ククルビタン、フォルスコリン、ガスカルジン酸（Ｇａｓｃａｒｄｉｃ  Ａｃｉｄ）、ゲラニオール、ハスレン、レボピマル酸、リモネン、ルペオール、メントール、メントン、モグロサイド、ヌートカトン、ヌートカトール、オフィオボリンＡ、パチョリ、ピペリトン、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＭ、サビネン、ステビオール、ステビオールグリコシド、タキサジエン、チモール、及びウルソール酸から選択される少なくとも１つのテルペノイドを産生する。
【００８３】
いくつかの実施形態では、例えば、本明細書に組み込まれるＷＯ２０１６／０２９１５３及びＷＯ２０１６／０７３７４０に開示されるように、テルペノイドシンターゼ酵素を上方制御して、酵素の反応速度、安定性、産物プロファイル、及び／または温度耐性を増強する。
【００８４】
別の実施形態では、細菌細胞はバレンセン及び／またはヌートカトンを産生する。そのような実施形態では、細菌細胞は、ファルネシル二リン酸シンターゼ、バレンセンシンターゼ、及びバレンセンオキシダーゼをさらに含む生合成経路を発現させることができる。ファルネシル二リン酸シンターゼ（ＦＰＰＳ）は、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）及びジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）からファルネシル二リン酸を生成する。例示的なファルネシル二リン酸シンターゼは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＥＲＧ２０（ＮＣＢＩアクセッション番号Ｐ０８５２４）及びＥ．ｃｏｌｉ  ｉｓｐＡである。バレンセンシンターゼはセスキテルペン骨格を生成し、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１２／０１０７８９３、ＵＳ２０１２／０２４６７６７、及びＵＳ７，２７３，７３５に記載されている。バレンセン及び／またはヌートカトンを含むテルペノイド産物を生産するための遺伝子及び宿主細胞は、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１６／０２９１５３に記載されている。
【００８５】
一実施形態では、細菌細胞はステビオールまたはステビオールグリコシド（例えば、ＲｅｂＤまたはＲｅｂＭ）を産生する。ステビオールは、２つのＰ４５０酵素、カウレンオキシダーゼ（ＫＯ）、及びカウレン酸ヒドロキシラーゼ（ＫＡＨ）の作用によってカウレンから生産される。ステビオールの生産後に、一連のグリコシル化反応を経て、様々なステビオールグリコシド産物を生産することができる。これは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで行われ得る。ステビオール及びステビオールグリコシドを生産するための経路及び酵素は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１３／０１７１３２８、ＵＳ２０１２／０１０７８９３、ＷＯ２０１２／０７５０３０、ＷＯ２０１４／１２２３２８に開示されている。ＷＯ２０１６／０７３７４０はさらに、ＲｅｂＭを生産するための酵素及び細菌宿主細胞を開示している。
【００８６】
テルペンまたはテルペノイド化合物を生産するための他の生合成経路は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ８，９２７，２４１に開示されている。
【００８７】
この細菌株は、バッチ培養、連続培養、または半連続培養で培養することができる。いくつかの実施形態では、細菌株は、細菌バイオマスが生成される第１段階と、それに続くテルペンまたはテルペノイド生産段階とを含む流加法を使用して培養される。流加培養とは、培養中に栄養分をバイオリアクターに供給するが、産物（複数可）は工程終了までバイオリアクター内に貯留する方法である。一般に、基本培地は初期の細胞培養を助け、フィード培地は栄養分の枯渇を防ぐために添加される。栄養分の添加を制御することは、培養の増殖速度に直接影響を及ぼし、オーバーフロー代謝及び副代謝産物の形成を回避するのに役立つ。
【００８８】
細菌株を増殖させる（バイオマスを生産する）ための例示的なバッチ培地には、酵母抽出物を含むが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、及び／またはＣ６炭素基質のような炭素基質を培養物に供給して、テルペンまたはテルペノイド産物を生産する。例示的実施形態では、炭素源はグルコース、スクロース、フルクトース、キシロース、及び／またはグリセロールである。培養条件は、一般に、好気性、微好気性、及び嫌気性から選択される。
【００８９】
いくつかの実施形態では、好気条件下または微好気条件下に培養物が維持される。例えば、流加法を使用する場合に、好気条件下でバイオマス生産段階を行った後、産物生産段階で酸素レベルを低下させることができる。例えば、約１０〜約２０時間後に培養物を微好気条件に移してもよい。これに関連して、用語「微好気条件」とは、検出可能な溶存酸素量よりわずか下に培養物が維持されることを意味する。Ｐａｒｔｒｉｄｇｅ  ＪＤ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｆｒｏｍ  Ａｅｒｏｂｉｃ  ｔｏ  Ｍｉｃｒｏ−ａｅｒｏｂｉｃ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  Ｉｎｖｏｌｖｅｓ  Ｆａｓｔ  ａｎｄ  Ｓｌｏｗ  Ｒｅａｃｔｉｎｇ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２（１５）：１１２３０−１１２３７（２００７）を参照のこと。
【００９０】
生産段階には、窒素源及び炭素源の供給を含む。例えば、窒素源にはアンモニウム（例えば、水酸化アンモニウム）を含み得る。炭素源にはＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、及び／またはＣ６炭素源を含み得るが、いくつかの実施形態では、グルコース、スクロース、またはグリセロールなどである。所定量のバッチ培地が消費されたときに窒素及び炭素の供給を開始することができ、容易なスケーリングを可能にする方法である。いくつかの実施形態では、窒素供給速度は、１時間あたり約８Ｌから１時間あたり約２０Ｌであるが、ある程度は産物、株、及び規模に依存することになる。
【００９１】
様々な実施形態において、細菌宿主細胞は、２２℃〜３７℃の温度で培養され得る。Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌中での商業的生合成は、過剰発現酵素及び／または外来酵素が安定である温度によって制限される可能性があるが、組換え酵素（テルペノイドシンターゼを含む）は、より高温で培養物を維持することを可能にするように操作できるため、収率及び全体生産性をより高めることができる。いくつかの実施形態では、培養は、約２２℃以上、約２３℃以上、約２４℃以上、約２５℃以上、約２６℃以上、約２７℃以上、約２８℃以上、約２９℃以上、約３０℃以上、約３１℃以上、約３２℃以上、約３３℃以上、約３４℃以上、約３５℃以上、約３６℃以上、または約３７℃で実施される。いくつかの実施形態では、温度２２〜３７℃、または温度２５〜３７℃、または温度２７〜３７℃、または温度３０〜３７℃に培養物が維持される。
【００９２】
いくつかの実施形態では、細菌株は商業規模で培養される。いくつかの実施形態では、培養物の規模は、少なくとも約１００Ｌ、または少なくとも約２００Ｌ、または少なくとも約５００Ｌ、または少なくとも約１，０００Ｌ、または少なくとも約１０，０００Ｌ、または少なくとも約１００，０００Ｌ、または少なくとも約５００，０００Ｌである。いくつかの実施形態では、培養物は約３００Ｌ〜約１，０００，０００Ｌである。
【００９３】
様々な実施形態において、方法には、細胞培養物または細胞溶解物からテルペンまたはテルペノイド産物を回収することをさらに含む。いくつかの実施形態では、少なくとも約１００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１５０ｍｇ／Ｌ、または少なくとも約２００ｍｇ／Ｌ、または少なくとも約５００ｍｇ／Ｌ、または少なくとも約１ｇ／Ｌ、または少なくとも約５ｇ／Ｌ、または少なくとも約１０ｇ／Ｌ、または少なくとも約１５ｇ／Ｌのテルペンまたはテルペノイド産物が培養物から生産される。
【００９４】
いくつかの実施形態では、インドールの生産量がテルペノイド生産量の代用マーカーとして使用され、及び／または培養物中のインドールの蓄積を制御して生産量を増加させる。例えば、様々な実施形態において、培養物中のインドールの蓄積は、約１００ｍｇ／Ｌ未満、または約７５ｍｇ／Ｌ未満、または約５０ｍｇ／Ｌ未満、または約２５ｍｇ／Ｌ未満、または約１０ｍｇ／Ｌ未満に制御される。インドールの蓄積は、ＵＳ８，９２７，２４１（参照により本明細書に組み込まれる）に記載の多変数モジュラー手法を用いて酵素の発現及び活性のバランス（及び具体的には上流経路と下流経路のバランス）を調整することによって制御することができる。いくつかの実施形態では、インドールの蓄積は化学的手段によって制御される。
【００９５】
テルペン及びテルペノイドの効率的生産についての他のマーカーとして、培養培地中のＤＯＸまたはＭＥの蓄積が挙げられる。一般に、本明細書に記載の細菌株は、これらの化学種を大量に蓄積することがなく、培養物中の蓄積が、約５ｇ／Ｌ未満、または約４ｇ／Ｌ未満、または約３ｇ／Ｌ未満、または約２ｇ／Ｌ未満、または約１ｇ／Ｌ未満、または約５００ｍｇ／Ｌ未満、または約１００ｍｇ／Ｌである。
【００９６】
いくつかの実施形態では、ＭＥｃＰＰが培養培地中で優勢なＭＥＰ代謝産物であるが、その蓄積は細菌株に対する遺伝子改変によって制限されており、ＭＥＰ炭素が下流のＩＰＰ及びＤＭＡＰＰ前駆体へと流入される。様々な実施形態において、培養物中に蓄積するＭＥｃＰＰは、約３０ｇ／Ｌ未満、または約２０ｇ／Ｌ未満、または約２ｇ／Ｌ未満、または約１ｇ／Ｌ未満、または約５００ｍｇ／Ｌ未満、または約１００ｍｇ／Ｌ未満である。
【００９７】
ＭＥＰ経路遺伝子の操作、ならびに上流経路及び下流経路の操作によるテルペンまたはテルペノイド生産の最適化は、単純な線形過程または加法過程になるとは予測されない。むしろ、組み合わせ論によって、ＭＥＰ経路の構成成分ならびに上流経路及び下流経路のバランスをとることにより最適化が達成される。培養物または細胞中でのインドールの蓄積（プレニル化インドールを含む）及びＭＥＰ代謝産物の蓄積（例えば、ＤＯＸ、ＭＥ、ＭＥｃＰＰ、ＨＭＢＰＰ、ファルネソール、プレノール、及びイソプレノール）を、この過程の指標となる代用マーカーとして使用することができる。
【００９８】
テルペンまたはテルペノイド産物は任意の好適な方法で回収することができる。一般に、回収には、培養物または細胞からの、産物を含む物質の分離と、それに続く抽出及び精製を含む。例えば、回収には、望ましい産物を有機相または疎水相に分配することを含み得る。あるいは、水相を回収して、または全細胞バイオマスを回収して、さらに処理することもできる。
【００９９】
例えば、いくつかの実施形態では、産物は揮発性テルペンまたはテルペノイド産物である。そのような実施形態では、培養物から機械的に分離された有機相または疎水相から、テルペンまたはテルペノイド産物を回収することができる。その代わりに、またはそれに加えて、液相及び／または固相からテルペンまたはテルペノイド産物を採取する。いくつかの実施形態では、逐次抽出及び精製によって産物を精製する。例えば、超臨界流体クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを用いた分離及び回収によって産物を精製することができる。単蒸留、水蒸気蒸留、分別蒸留、薄膜蒸留、または連続蒸留を含む蒸留によって、産物を精製することができる。
【０１００】
いくつかの実施形態では、産物は不揮発性テルペンまたはテルペノイド産物であり、いくつかの実施形態では、これは培養培地から回収された細胞外産物である。あるいは、産物は採取された細胞材料から回収された細胞内産物である。産物が溶解性に乏しい場合、濾過によって、及び場合により溶媒抽出（例えば、エタノールによる抽出）によって回収することができる。その代わりに、またはそれに加えて、液体クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを用いた分離によって産物を回収する。いくつかの実施形態では、逐次抽出及び精製によって産物を回収する。さらに他の実施形態では、産物を溶液から晶出させる。
【０１０１】
望ましい産物の生産量は、例えばガスクロマトグラフィー（例えばＧＣ−ＭＳ）によって決定及び／または定量することができる。産物の生産、その産物の回収及び／または分析は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１２／０２４６７６７に記載されるように実施することができる。例えば、いくつかの実施形態では、産生油を、ヘプタンまたはドデカンなどのアルカンのような有機溶媒を使用して水性反応媒から抽出した後、分別蒸留する。他の実施形態では、植物油などの疎水相を使用して水性反応媒から産生油を抽出した後、有機溶媒抽出及び分別蒸留を行う。画分のテルペン及びテルペノイド成分を、ＧＣ／ＭＳによって定量的に測定した後、画分を混合して、所望する産物プロファイルを生成することができる。
【０１０２】
様々な実施形態において、回収されたテルペンまたはテルペノイドが、製品（例えば、消費者製品または工業製品）に組み込まれる。例えば、製品は、着香製品、芳香製品、甘味剤、化粧品、洗浄製品、洗剤もしくは石鹸、または害虫駆除製品であり得る。例えば、いくつかの実施形態では、回収される産物にはヌートカトンを含み、製品は飲料、チューインガム、キャンディー、または香味添加剤から選択される着香製品であるか、または製品は虫除け剤である。いくつかの実施形態では、酸素化産物はステビオールまたはステビオールグリコシド（例えば、ＲｅｂＭ）であり、これは甘味料として提供されるか、または原材料、香料、飲料、または食品に組み込まれる。
【０１０３】
本発明はさらに、本明細書で生産されるテルペンまたはテルペノイドを組み込むことにより、食品、飲料、食感改良剤（例えば、デンプン、繊維、ガム、脂肪及び脂肪模倣物、ならびに乳化剤）、医薬品、タバコ製品、栄養補助食品、口腔衛生製品、及び化粧品などの製品を製造する方法を提供する。本発明の実施形態で生産されるような種の収率は高いため、大幅なコスト上の利点に加え、持続可能性をもたらすことができる。
【０１０４】
他の態様では、本発明は、ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰ前駆体の産物を増加させる１つ以上の遺伝子改変を有する、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌細胞を提供する。様々な実施形態において、この細菌細胞は、ＭＥＰ経路を介してイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）及びジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）を生産し、かつ、下流合成経路を介してＩＰＰ及びＤＭＡＰＰをテルペンまたはテルペノイド産物に変換する。下流合成経路は一般に組換え経路であり、プレニルトランスフェラーゼ、１つ以上のテルペンシンターゼ、ならびに場合により１つ以上のＰ４５０酵素及びＰ４５０レダクターゼ酵素（例えば、それぞれ上記の通り）を含み得る。例えば、産物はジテルペンまたはジテルペノイドであり得るが、その場合、ＧＧＰＰに対する組換えＩＩ型ジテルペンシンターゼ（ＤｉＴＰＳ）と、それに続く組換えＩ型ＤｉＴＰＳの逐次作用を用いるか、またはその代わりに、単一の組換えシンターゼで両方の工程を実施する。
【０１０５】
さらに、産物の生合成に利用可能なＭＥＰ炭素を向上させるために、細菌株は、以下の遺伝子改変のうちの１つ以上を有する：
（ａ）ＩｓｐＧ及びＩｓｐＨ酵素の過剰発現。ＩｓｐＧ及びＩｓｐＨ酵素は、ＨＭＢＰＰ中間体の蓄積を防止するように発現のバランスを調整されている。
（ｂ）ＭＥＰ経路を介した及び／またはテルペンもしくはテルペノイド産物への電子の供給及び／または伝達を増強するような酵素をコードする遺伝子の組換えまたは改変。これは、ＹｄｂＫ遺伝子の過剰発現の場合もあれば、非天然ｆｄｘ及び／またはｆｌｄＡホモログによる場合もある。
（ｃ）ａｃｅＥまたはａｃｅＥ酵素複合体の不活性化もしくは欠失、または発現もしくは活性の低減。ならびに場合により
（ｄ）テルペンまたはテルペノイド生産量を高めるように活性を調整する、ｉｄｉ遺伝子の組換えまたは改変。
【０１０６】
本明細書の他の箇所に開示されているように、組換え遺伝子の補完によって遺伝子を過剰発現させることも、または内因性遺伝子を改変して発現を変化させることもできる。
【０１０７】
細菌株は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．、Ｖｉｂｒｉｏ  ｓｐｐ．、及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．から選択される細菌である。例えば、細菌株は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓ、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａから選択される種である。いくつかの実施形態では、細菌株はＥ．ｃｏｌｉである。
【０１０８】
様々な実施形態において、培養時にＨＭＢＰＰは、約１０ｍｇ／ｇＤＣＷを超えて蓄積せず、またはいくつかの実施形態では、約８ｍｇ／ｇＤＣＷを超えて蓄積せず、またはいくつかの実施形態では、約５ｍｇ／ｇＤＣＷを超えて蓄積せず、またはいくつかの実施形態では、約４ｍｇ／ｇＤＣＷを超えて蓄積せず、またはいくつかの実施形態では、約２ｍｇ／ｇＤＣＷを超えて蓄積しない。いくつかの実施形態では、ＨＭＢＰＰは、約１ｍｇ／ｇＤＣＷを超えて蓄積せず、または約０．５ｍｇ／ｇＤＣＷを超えて、もしくは約０．２ｍｇ／ｇＤＣＷを超えて、もしくは約０．１ｍｇ／ｇＤＣＷを超えて蓄積しない。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、細菌株は組換え遺伝子として（例えば、野生型ＭＥＰ経路酵素を補完する）ｄｘｓ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＦ、及びｉｄｉを発現し、これらは場合によりオペロンとして発現される。いくつかの実施形態では、細菌株は組換え遺伝子としてｄｘｓ、ｄｘｒ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＥ、ｉｓｐＦ、及びｉｄｉを発現し、これらは場合により１、２、または３個の個々のオペロンとして発現される。ＭＥＰ経路の組換え遺伝子は、１つ以上のプラスミドから発現されるか、または染色体に組み込まれ、ＭＥＰ炭素フラックスを改善するように発現のバランスが保たれる。具体的には、細菌細胞は、細胞外培地中で優勢なＭＥＰ代謝産物としてＭＥｃＰＰを生産することができる。
【０１１０】
組換えＩｓｐＧ及びＩｓｐＨ遺伝子は、本明細書に記載するように、１つ以上の有益な変異を含む場合もあれば、または特性もしくは活性が改善されたＩｓｐＧまたはｉｓｐＨオルソログである場合もある。さらに、様々な実施形態において、組換えＩｓｐＨの発現は組換えＩｓｐＧの発現よりも高く、これは、少なくとも部分的には、オペロン内でｉｓｐＨをｉｓｐＧの前に配置することによって達成できる場合がある。したがって、細菌株は、強力なプロモーターの制御下で同じオペロン（ｉｓｐＨが最初に位置する）からｉｓｐＨ及びｉｓｐＧを発現することができる。組換えＩｓｐＧ及びＩｓｐＨ遺伝子はプラスミドから発現されるか、または染色体に組み込まれる。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、細菌株は組換えｉｄｉ遺伝子を発現するが、この遺伝子は、プロモーター強度、遺伝子コピー数、オペロン内の位置、またはリボソーム結合部位を場合により変更することにより、産物を増加させるように調整されている。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、細菌株は、染色体に組み込まれるか、またはプラスミドから発現される組換えＹｄｂＫ遺伝子を発現する。細菌株は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍフェレドキシン（Ｃｐ．ｆｄｘ）など、フラボドキシン、フラボドキシンレダクターゼ、フェレドキシン、及びフェレドキシンレダクターゼのうちの１つ以上の過剰発現をさらに含む。いくつかの実施形態では、株は、１つ以上の非天然のｆｄｘ及び／またはｆｌｄＡホモログを発現する。例として、ｆｄｘホモログは、Ｈｍ．ｆｄｘ１（Ｈｅｌｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｏｄｅｓｔｉｃａｌｄｕｍ）、Ｐａ．ｆｄｘ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ｃｖ．ｆｄｘ（Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ  ｖｉｎｏｓｕｍ）、Ｃａ．ｆｄｘ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、Ｃｐ．ｆｄｘ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ）、Ｅｖ２．ｆｄｘ（Ｅｃｔｏｔｈｉｏｒｈｏｄｏｓｐｉｒａ  ｓｈａｐｏｓｈｎｉｋｏｖｉｉ）、Ｐｐ１．ｆｄｘ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、及びＰｐ２．ｆｄｘ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）から選択され得る。いくつかの実施形態では、ｆｌｄＡホモログは、Ｅｃ．ｆｌｄＡ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ａｃ．ｆｌｄＡ２（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃｈｒｏｏｃｏｃｃｕｍ）、Ａｖ．ｆｌｄＡ２（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）、及びＢｓ．ｆｌｄＡ（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）から選択される１つ以上を含む。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、ｆｄｘホモログは、配列番号１０及び１５〜２４のいずれか１つと少なくとも６０％同一である配列を含む。例えば、非天然のｆｄｘホモログは、配列番号１０及び１５〜２４のいずれか１つと少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一である配列を含み得る。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、ｆｌｄＡホモログは、配列番号２５〜２８のいずれか１つと少なくとも６０％同一である配列を含む。例えば、非天然のｆｌｄＡホモログは、配列番号２５〜２８のいずれか１つと少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一である配列を含み得る。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、細菌株は、１つ以上のＰＦＯＲ及び／またはｆｐｒ、ならびに場合により１つ以上のフラボドキシン（ｆｌｄＡ）、フラボドキシンレダクターゼ、フェレドキシン（ｆｄｘ）、及びフェレドキシンレダクターゼの過剰発現または補完を有する。例として、いくつかの実施形態では、細菌株は、Ｅｃ．ｙｄｈＶ（Ｅ．Ｃｏｌｉ）（配列番号３３）及びＥｃ．ｙｄｈＹ（Ｅ．Ｃｏｌｉ）（配列番号３４）；Ｅｃ．ｙｄｂＫ（Ｅ．Ｃｏｌｉ）（配列番号９）及びＣｐ．ｆｄｘ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ）（配列番号１０）；Ｅｃ．ｆｐｒ（Ｅ．Ｃｏｌｉ）（配列番号３８）及びＥｃ．ｆｄｘ（Ｅ．Ｃｏｌｉ）（配列番号２１）；またはＥｃ．ｆｐｒ（Ｅ．Ｃｏｌｉ）（配列番号３８）及びＥｃ．ｆｌｄＡ（Ｅ．ｃｏｌｉ）（配列番号２７）を含む。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、細菌株は、１つ以上のＰＦＯＲまたはそのホモログの過剰発現または補完を有する。例として、いくつかの実施形態では、ＰＦＯＲは、ＹｄｂＫ（配列番号９）、Ｓｃｙ．ｐｆｏｒ（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．）（配列番号２９）、Ｋｉ．ｐｆｏｒ（Ｋｌｕｙｖｅｒａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）（配列番号３０）、Ｄａ．ｐｆｏｒ（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ａｆｒｉｃａｎｕｓ）（配列番号３１）、Ｎｓ．ｐｆｏｒ（Ｎｏｓｔｏｃ  ｓｐ．）（配列番号３２）、Ｅｃ．ｙｄｈＶ（Ｅ．Ｃｏｌｉ）（配列番号３３）、Ｇａ．ｐｆｏｒ（Ｇｉｌｌｉａｍｅｌｌａ  ａｐｉｃｏｌａ）（配列番号３５）、及びＳｃｏ．ｐｆｏｒ（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）から選択される。いくつかの実施形態では、ＰＦＯＲはＹｄｂＫである。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、ＰＦＯＲは配列番号２９〜３５のいずれか１つと少なくとも６０％同一である配列を含む。例えば、ＰＦＯＲは、配列番号２９〜３５のいずれか１つと少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一である配列を含み得る。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、例えばＹｄｂＫなどのＰＦＯＲの過剰発現または補完は、約４００〜５５０ｍＶ、またはいくつかの実施形態では約４００〜５００ｍＶの範囲内、もしくは約４００〜４７５ｍＶの範囲内の酸化還元電位を有する電子伝達体の発現により生産力の向上をもたらすことができる。いくつかの実施形態では、電子伝達体はフェロドキシン、フラボドキシン、またはＮＡＤＰＨである。例として、いくつかの実施形態では、電子伝達体はＣｖ．ｆｄｘ（Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ  ｖｉｎｏｓｕｍ）である。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、細菌株は、１つ以上のｆｐｒホモログの過剰発現または補完を有する。例として、いくつかの実施形態では、ｆｐｒホモログは、Ｎｓ．ｆｐｒ（Ｎｏｓｔｏｃ  ｓｐ．）（配列番号３６）、Ｓｃｏ．ｆｐｒ（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）（配列番号３７）、及びＥｃ．ｆｐｒ（Ｅ．ｃｏｌｉ）（配列番号３８）から選択される。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、ｆｐｒは配列番号３６〜３８のいずれか１つと少なくとも６０％同一である配列を含む。例えば、ｆｐｒは、配列番号３６〜３８のいずれか１つと少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一である配列を含み得る。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、Ｅ．ｃｏｌｉは、ｐｇｒＲ、ｍｐｐＡ、ｙｎａＩ、ｉｎｓＨ−４、ｙｎａＪ、ｕｓｐＥ、ｆｎｒ、ｏｇｔ、ａｂｇＴ、ａｂｇＢ、ａｂｇＡ、ａｂｇＲ、ｍｃａＳ、ｉｓｒＡ、ｓｍｒＡ、ｙｄａＭ、ｙｄａＮ、ｆｎｒＳ、Ｃ０３４３、ｄｂｐＡ、ＲＥＰ１１５、ｔｔｃＡ、ｉｎｔＲ、ｙｄａＱ、ｙｄａＣ、ｒａｌＡ、ｒａｌＲ、ｒｅｃＴ、ｒｅｃＥ、ｒａｃＣ、ｙｄａＥ、及びｋｉｌＲから選択される１つ以上の遺伝子の欠失を含む。
【０１２２】
組換えｐｇｐＢ及び／またはｎｕｄＢの発現は、場合によりプロモーター強度、遺伝子コピー数、オペロン内での位置、及び／またはリボソーム結合部位を変更することによって、生産力価を高めるように調整することができる。いくつかの実施形態では、組換えｐｇｐＢ及び／またはｎｕｄＢは、弱強度または中強度のプロモーターの制御下で発現される。組換えｐｇｐＢまたはｎｕｄＢは、染色体に組み込まれるか、またはプラスミドから発現される。
【０１２３】
様々な実施形態において、細菌株は、アモファジエン、アルテミシン酸、アルテミシニン、ビサボロール、ビサボレン、アルファ−シネンサール、ベータ−ツジョン、カンファー、カルベオール、カルボン、シネオール、シトラール、シトロネラール、クベボール、ファルネセン、ゲラニオール、リモネン、メントール、メントン、ミルセン、ヌートカトン、ヌートカトール、パチョリ、ピペリトン、ローズオキシド、サビネン、ステビオール、ステビオールグリコシド（レバウジオシドＤまたはレバウジオシドＭを含む）、タキサジエン、チモール、及びバレンセンのうち少なくとも１つを含むテルペンまたはテルペノイド産物を生産する。
【０１２４】
本発明の態様及び実施形態を、以降の実施例を参照して以下でさらに説明する。
【実施例】
【０１２５】
実施例１：ＩｓｐＧ／ＩｓｐＨ発現の調整
結論
ＭＥＰ経路遺伝子の過剰発現及びバランス調整により、ＭＥＰ経路に流入する炭素を増加させることができ、その炭素をＤＯＸＰ及びＭＥＰからＭＥｃＰＰへと「下流」に移動させることができる。ｉｓｐＧ及び／またはｉｓｐＨの発現を改変することで、ＭＥｃＰＰをＨＭＢＰＰからＩＰＰへとさらに変換することができる。
【０１２６】
実際に、ｉｓｐＧ及びｉｓｐＨ両方の発現が増加すると、テルペン及びテルペノイド産物の力価が著しく増加した。しかしながら、ｉｓｐＧのみまたはｉｓｐＨのみの発現を増加させるだけでは、力価は改善しなかった。ｉｓｐＧのみが過剰発現すると増殖が欠如し、ＩｓｐＨのみが過剰発現すると、ＨＭＢＰＰがＩＰＰに変換されたが、力価に著しい影響を及ぼさなかった。ｉｓｐＧの過剰発現の影響は、ＨＭＢＰＰが細胞外では見られないが、細胞内では１００％見られるという観察に関連する可能性がある。分子は細胞外へ輸送されていないと思われるため、これがフィードバック分子として作用し、ＭＥＰ経路で急停止が生じる可能性がある。例えば、ＨＭＢＰＰのプールが一定の規模を超えると、経路が遮断される。あるいは、または加えて、ＨＭＢＰＰは一定レベルで毒性を示す場合があり、これはＩｓｐＧの過剰発現が細胞増殖に与える影響についての観察と一致している。
【０１２７】
したがって、ＨＭＢＰＰの不均衡及び蓄積を防ぐには、ｉｓｐＧとｉｓｐＨとの間の活性のバランスが重要である。場合によっては少ないほど良好であり、すなわち、ＭＥＰ遺伝子の過剰発現が最も強くなると、生産性が損なわれ始める可能性がある。
【０１２８】
要約すると、ｉｓｐＧまたはｉｓｐＨの一方または両方が野生型であるか、または適切にバランスのとれた構成で変異／操作されている場合、ｉｓｐＧ及びｉｓｐＨがともに過剰発現すると、ＨＭＢＰＰの蓄積が毒性になるのを防ぎ、かつ、ＭＥＰ経路からＩＰＰ、ＤＭＡＰＰ、ならびに下流のテルペン及びテルペノイド産物へと炭素が流出される。
【０１２９】
実験結果の説明
図２は、ＩｓｐＨのみ、またはＩｓｐＨ及びＩｓｐＧ両方の発現が増加すると、ＭＥＰ経路に流入する炭素量を増加させるように予め操作されている生産株におけるテルペノイド生産力価が向上するが、ｉｓｐＧのみでは生産性が低下することを示している。本実施例では、対照株は、ＭＥＰ経路遺伝子がバランス調整された過剰発現を有し（ただし、ｉｓｐＧまたはｉｓｐＨの追加コピーは含まない）、ＭＥＰ経路に流入する炭素量を増加させるＥ．ｃｏｌｉ株である。示されるように、ＩｓｐＧの過剰発現は生産力価を約１５％減少させるが、同じ発現強度でのＩｓｐＨの過剰発現は生産力価を１７％増加させる。ＩｓｐＧ及びＩｓｐＨ両方の過剰発現は生産力価を３倍以上にする。
【０１３０】
このデータはまた、ｉｓｐＧ／ｉｓｐＨ比がＨ酵素の方に有利であると、その比がｉｓｐＧ側に有利である株と比較して、ＭＥＰ経路を通るフラックスがさらに向上することを示す。ｉｓｐＧ及びｉｓｐＨは、本明細書ではオペロン型で発現されるため、オペロンの２番目の遺伝子は、１番目の遺伝子よりも発現レベルが低くなる。したがって、ｉｓｐＨ／ｉｓｐＧオペロンは、ｉｓｐＧ／ｉｓｐＨよりも著しく高い生産力価を示した。
【０１３１】
ｉｓｐＧ及びｉｓｐＨが逐次作用して、ＭＥｃＰＰがＨＭＢＰＰに、さらにＩＰＰへと変換される。ｉｓｐＧが増加すると、ＨＭＢＰＰプールの蓄積が大きくなり、対してｉｓｐＨが増加すると、ＩＰＰに変換されるにつれてＨＭＢＰＰプールが縮小することになる。ＩｓｐＧのみでは生産性が低下するが、ｉｓｐＨのみでは生産性を増加するという事実は、ＨＭＢＰＰの蓄積がＭＥＰ経路に対して負のフィードバック効果を有することを強く示唆している。ＩｓｐＧとＩｓｐＨの両方を過剰発現させると、ＨＭＢＰＰの形成と消費双方の速度を高め、ＭＥＰ経路から標的テルペノイドへのフラックスを著しく改善する。しかしながら、このフラックスを増強した方式であっても、ＩｓｐＧとＩｓｐＨのバランスは重要である。なぜなら、ｉｓｐＧよりもｉｓｐＨがわずかに有利であれば、生産性を２５％、すなわちＩｓｐＧ及びＩｓｐＨの野生型発現を有する親株の力価のほぼ４倍までさらに向上させることができるからである。
【０１３２】
ＭＥＰ経路が増強された改変生産株におけるＩｓｐＧ及び／またはＩｓｐＨの発現の増加は、ＭＥＰ産物の分布パターンに影響を与える（図３）。産物の大部分はＤＯＸ、ＭＥ、及びＭＥｃＰＰ（図３、上段パネル）であり、続いてＤＯＸＰ及びＭＥＰ（図３、中段パネル）、そしてＨＭＢＰＰ（図３、下段パネル）である。これらのパネルでは、培養物（ブロス＋細胞）から細胞外及び細胞内の総代謝産物が抽出されているため、抽出物の量に比例して濃度記載されている。
【０１３３】
ＩｓｐＨが生産力価増加させ、ＩｓｐＧが生産力価を失う場合でも、ＩｓｐＧのみまたはＩｓｐＨのみが増加すると、ＭＥｃＰＰの変換率が増加し、プールサイズは減少する（上段パネル）。しかしながら、２つの変異体間の著しい差は、ＨＭＢＰＰ濃度（下段パネル）で明らかであり、ＩｓｐＧのみでは対照に対して２．５倍増加し、ＩｓｐＨのみでは２０％減少する。ＨＭＢＰＰのこの蓄積により、ＭＥＰ経路にフィードバックが生じ、フラックスの増強が停止する可能性がある。蓄積されるＨＭＢＰＰが非常に低レベル（ｎＭ濃度）であれば、その１００％が細胞内に見られる。
【０１３４】
オペロンでの順序を問わず、ｉｓｐＧとｉｓｐＨの発現がともに増加すると、残りのＤＯＸを完全に変換できるようになり、ＭＥプールの規模が減少する。さらに、ＩｓｐＨに有利であるＩｓｐＧ／ＩｓｐＨ比は、ＩｓｐＧに有利である株と比較して、ＭＥｃＰＰの改善された変換（及び改善された生産力価）が可能である。
【０１３５】
細胞の内側または細胞の外側（「細胞内」と「細胞外」）に見られる、それぞれ個々のＭＥＰ代謝産物の比率を図４に示す。これらの値は絶対存在量を反映しておらず、図３に示すように、ＨＭＢＰＰが存在するよりも、合計に占めるＤＯＸの方がはるかに多く存在する。ＤＯＸは１００％細胞外にあるが、ＨＭＢＰＰは１００％細胞内にある。図２及び図３から、本実施例でプロファイリングした株は、最上位の有効株である「対照＋ｉｓｐＨ／ｉｓｐＧ」である。ＤＯＸＰ／ＤＯＸ、ＭＥＰ／ＭＥ、及びＭＥｃＰＰは、ほぼすべて細胞外培地に蓄積するが、ＣＤＰ−ＭＥ、ＣＤＰ−ＭＥＰ、ＨＭＢＰＰ、ＩＰＰ／ＤＭＡＰＰ、及びＦＰＰは１００％細胞内で観察される。細胞内に見られる各代謝産物の比率をグラフの上部に示す。
【０１３６】
未補正のｉｓｐＧの上方制御は、６００ｎｍでのＵＶ吸光度によって決定される、細胞増殖の著しい低下を引き起こす（図５）。ｉｓｐＨ、またはｉｓｐＨとｉｓｐＧの両方を補正した株では、最終細胞密度に対して、ある程度の変化が観察されるが、その変動は大きくはない。
【０１３７】
ＨＭＢＰＰの蓄積を決定する際、ＨＭＢＰＰを乾燥細胞重量（ＤＣＷ）換算で表すことができる。例えば、ｉｓｐＧＨの発現バランスのとれた株を使用した場合：
［ＨＭＢＰＰ］＝０．３５ｍＬのサンプル培養物中０．４２ｕｇ／ｍＬ
［ＯＤ６００］＝１２．６９
推定値：１  ＯＤ６００＝０．４ｇ−ＤＣＷ／Ｌ＝０．４ｍｇ−ＤＣＷ／ｍＬ
ＨＭＢＰＰ収率＝［（０．４２ｕｇ／ｍＬ）＊（０．３５ｍＬ）］／［（１２．６９＊０．４ｍｇ−ＤＣＷ／ｍＬ）＊０．３５ｍＬ）］
【０１３８】
この例では、ＨＭＢＰＰ＝０．０８２７ｕｇ／ｍｇＤＣＷまたは０．０８２７ｍｇ／ｇＤＣＷである。
【０１３９】
実施例２：ｐｇｐＢ及びｎｕｄＢの過剰発現
結論
ｐｇｐＢ及びｎｕｄＢなどの遺伝子を過剰発現させることによって、代替「産物」の流入を導入することで、さらに多くのフラックスがＭＥＰ経路を通り流入することができる（非目標産物に至る）か、または様々な下流テルペノイド経路と置き換えて、「汎用シャーシ」（すなわち、どのような下流テルペノイドも転換することができ、商用生産向けに迅速に最適化できる株）を操作する手段をも生み出すことができる。
【０１４０】
炭素はＭＥＰ経路を通り流入し、細胞外にプールすることになる代替産物を生成することができる。ＰｇｐＢはＦＰＰをファルネソール（ＦＯＨ）に脱リン酸化し、ｎｕｄＢはＩＰＰ及びＤＭＡＰＰをイソプレノール（３−メチル−３−ブテン−１−オール）及びプレノール（３−メチル−２−ブテン−１−オール）にそれぞれ脱リン酸化する。細胞外へのこれらの産物の輸送を増強すると、ＩＰＰ、ＤＭＡＰＰ、及びＦＰＰの蓄積が防止され、ＨＭＢＰＰと同様に、ＭＥＰ経路でのフィードバック及び抑制が可能になる。ＩＰＰは増殖を阻害し、フィードバックはＤｘｓを阻害する。Ｃｏｒｄｏｂａ，Ｓａｌｍｉ  ＆  Ｌｅｏｎ（２００９）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔ．６０，１０，２９３３−２９４３を参照のこと。ＦＰＰフィードバックはＩｓｐＦ−ＭＥＰ複合体を阻害する。この複合体自体は、ＭＥＰが結合して、フィードフォワード方式でＩｓｐＦ活性を増強するときに形成される。Ｂｉｔｏｋ＆Ｍｅｙｅｒｓ（２０１２）ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１２，７，１７０２−１７１０。これらの産物は細胞外に蓄積し、ＭＥＰ経路の中間体と同様に、これを使用して、ＬＣ／ＭＳ代謝定量法によって、ＭＥＰ経路を通るＣフラックスを追跡することができる。
【０１４１】
ｐｇｐＢの追加コピーを構成的に発現させることによって、ＭＥＰ遺伝子は過剰発現しているが、その炭素をすべて産物まで流入させるための追加の下流経路はない株において、ＭＥＰ経路からの炭素フラックスを向上させ、増殖の遅い表現型を改善することができる。実際には、下流への「流入」が、ＦＰＰからファルネソールへの変換となり、ファルネソールは細胞外に排出される。同様に、ｎｕｄＢの構成的発現により、ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰプールの細胞外産物イソプレノール及びプレノールへの再誘導は増加するはずである。
【０１４２】
さらに、過剰発現されたｐｇｐＢまたはｎｕｄＢの存在下でＭＥＰ経路遺伝子の発現レベルを調節することで、この経路を通るＭＥＰフラックス及び炭素分配に著しい影響を及ぼすことができる。ファルネソール、プレノール、またはイソプレノール産物の増加または減少は、ＭＥｃＰＰのレベルと逆相関する可能性がある。
【０１４３】
実験結果の説明
ＭＥＰ経路を通るフラックスを増強するように操作されているが、下流のテルペノイド産物経路は導入されていない株において、ＰｇｐＢの過剰発現はファルネソール力価を３倍にすることができる（図６）。対照株は、様々なレベルの構成的発現下で、ｄｘｓ、ｄｘｒ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＦ、ｉｓｐＥ、ｉｓｐＧ、ｉｓｐＨ、及びｉｄｉの追加コピーを有し、また過剰発現したＹｄｂＫを有している（実施例４）。この対照は、おそらくＦＰＰの過剰な蓄積で生じる「流出」により、経路でフィードバックが生じ、野生型と比較して著しく増殖が遅くなるため、中程度の量のファルネソールを蓄積する。この株でＰｇｐＢが過剰発現されると、過剰なＦＰＰがより効率的にファルネソールに変換され（フィードバック制御を阻止する）、フラックスが効果的にＭＥＰ経路を通り流入する。
【０１４４】
しかしながら、ＰｇｐＢの過度な発現（「＋＋＋」条件）は、ファルネソールに至る総フラックスに悪影響を及ぼすと思われ、平均的に力価の低下及び倍率変化の減少が観察された。この結果のいくつかの理由として以下の可能性が考えられる：（１）ＰｇｐＢからの流入が強すぎて、ＦＰＰの需要、特に必要な競合産物からの需要にＭＥＰ経路の能力が追いつくことが困難になる；または（２）ＰｇｐＢは、必須の膜リン脂質を含め、複数の標的をｉｎ  ｖｉｖｏで脱リン酸化することが知られているため、ＰｇｐＢの発現レベルの高さが、細胞の健常性に意図しない悪影響を及ぼした可能性がある。
【０１４５】
ファルネソールを産生する株において、ＩｓｐＧ’及び／またはＩｓｐＨの発現を増加させる及び調整することで、生産力価を改善することができる（図７）。本実施例では、ＩｓｐＧ’酵素は、野生型よりも高活性を有する操作型である。対照株は、ｄｘｓ、ｄｘｒ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＦ、ｉｓｐＥ、ｉｓｐＧ、ｉｓｐＨ、及びｉｄｉの追加コピー、ならびにＹｄｂＫ及びｐｇｐＢの追加コピーを有する。漸増するプロモーター強度で（＋、＋＋、＋＋＋）、ｉｓｐＨ及び／またはｉｓｐＧ’の追加コピーを株に組み込む。
【０１４６】
ＩｓｐＨが過剰発現している場合（図７、パネルＡ）、生産力価に著しい変化は観察されない。ＩｓｐＨの量が増加すると、ＨＭＢＰＰのＩＰＰへの変換は改善に向かうが、ＩｓｐＧ’が追加されていないと、追加のＨＭＢＰＰが供給されない。ＩｓｐＧ活性が介在するＭＥｃＰＰプールは、経路内で律速段階になる。しかしながら、ＩｓｐＨに加えてＩｓｐＧ’が過剰発現している場合（図７、パネルＢ）、ファルネソールの生産力価は大幅に増加することがわかっている。この状況では、ＩｓｐＧ’の追加コピーによってＨＭＢＰＰの追加が可能になり、ＩｓｐＨレベルの増加によって急速にＩＰＰに変換され、ＨＭＢＰＰが蓄積して経路でフィードバックを生じさせることを阻止する。
【０１４７】
ＩｓｐＧとＩｓｐＨとのバランスが重要であることは明らかである。このデータは、ＩｓｐＧ／Ｈがオペロン型で発現され、それによってオペロンの２番目の遺伝子が１番目の遺伝子よりも発現レベルが低くなることを示している。オペロン内でｉｓｐＧ’とｉｓｐＨの遺伝子の順序が入れ替わっている場合（すなわち、ｉｓｐＨ＋ｉｓｐＧ’とｉｓｐＧ’＋ｉｓｐＨ）、それによってＩｓｐＧ’／ＩｓｐＨの発現比が変化し、データに相反する傾向が生じることがわかっている。比率がＩｓｐＧ’よりもＩｓｐＨに有利である場合（Ｂ）、プロモーター強度が増加するにつれて、徐々に生産力価が増加する。しかしながら、比率がＩｓｐＨよりもＩｓｐＧ’に有利である場合（Ｃ）、この不均衡な経路によって生成され得る過剰なＨＭＢＰＰが、プロモーター強度が増加するにつれて徐々に蓄積し、その結果、生産量の向上が次第に減少し、増殖が遅くなる。
【０１４８】
ファルネソールの生産力価の増加は、ＭＥｃＰＰプールサイズの減少を伴うことがあるが、それはＩｓｐＧとＩｓｐＨの比率次第である（図８）。図７で明らかなように、ファルネソール産生株において、ＩｓｐＧ’及びＩｓｐＨの追加コピーは、ファルネソールの生産力価を最大２．５倍まで改善することができる。ＩｓｐＧを追加せず、ＩｓｐＨのみが上方制御されている場合（図８、パネルＡ）、力価は著しく変化せず、またＭＥｃＰＰも変化しなかった。ＭＥｃＰＰはわずかに減少するが、これはおそらく、過剰なＩｓｐＨ酵素によってＨＭＢＰＰがＩＰＰにより効率的に変換されるため、ＭＥｃＰＰが下流に流入することによる。ＩｓｐＧ’よりも比較的多くのＩｓｐＨが発現している場合（図８、パネルＢ）、プロモーター強度が増加するにつれて、ファルネソールの生産力価が増加した。ＭＥｃＰＰは逆に減少するが、これは目的の最終産物にフラックスが分配するように経路のバランスをとることで、ＭＥｃＰＰが消費されるためである。
【０１４９】
しかしながら、ＩｓｐＨよりもＩｓｐＧ’に有利である非至適な比率では、ＭＥｃＰＰのＨＭＢＰＰを経たＩＰＰへの変換を改善し、ファルネソールの生産力価を改善できるものの、Ｅ．ｃｏｌｉ株で許容できないほど不均衡が過度になると、生産量の向上がなくなり、それと同時にさらに多くのＭＥｃＰＰが蓄積し、ＭＥＰ経路の中間体炭素プールに捕捉される。
【０１５０】
実施例３：Ｉｄｉ発現の調整
結論
Ｉｄｉ酵素は、ＩＰＰとＤＭＡＰＰとの可逆的異性化を触媒する。あらゆる望ましいテルペノイド産物または望ましくないＭＥＰ副産物（例えばＵＰＰ）は１つのＤＭＡＰＰ及び様々な数のＩＰＰを使用するため、２つの前駆体間の比率は株の生産性に重要な影響を及ぼす可能性がある。例えば、１  ＦＰＰ＝１  ＤＭＡＰＰ＋２  ＩＰＰ、対して１  ＵＰＰ＝１  ＦＰＰ＋８  ＩＰＰ（または１  ＤＭＡＰＰ＋１０  ＩＰＰ）である。したがって、ＦＰＰを生産するＦＰＰＳの至適なＩＰＰ：ＤＭＡＰＰ比は２：１であるが、ＵＰＰでは１０：１である。したがって、ｉｄｉの発現を変えることによって、ＩＰＰ：ＤＭＡＰＰの比率を変更すると、ＭＥＰ経路からの他の望ましくない産物と比較した、望ましいテルペノイドの生産量に影響を及ぼすことになる。
【０１５１】
実験結果の説明
産物ＡまたはＢを生産する異なる株にＩｄｉを補完した。グルコースを炭素源として用いたカスタム培地を入れた９６丸型ウェル培養プレート中で、３７℃、２８０ＲＰＭで４８時間、細胞を培養した。ＩＰＴＧ誘導性プロモーター下で、ｐＢＡＣからＩｄｉを発現させた。株１は、ｄｘｓ、ｄｘｒ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＦ、ｉｓｐＥ、ｉｄｉ、ＦＰＰＳ、及びＹｄｂＫを予め過剰発現しているが、株２及び３はそれに加えて、ｉｓｐＨ及び変異型のＩｓｐＧをさらに過剰発現している。逆に、株４は同じ酵素を過剰発現しているが、発現方式は大きく異なっている。
【０１５２】
Ｉｄｉの過剰発現はｉｓｐＧＨを過剰発現しない株では生産力価を増加させるが、過剰発現する２つの株では力価を減少させる。このことは、ＩＰＰとＤＭＡＰＰとのバランスをＩｄｉによって制御し、下流経路の需要に応じて上方または下方に調整できることを示している（図９）。しかしながら、株４は、ｉｄｉの補完により力価が２倍を超える。この株では同じ遺伝子が過剰発現しているが、ＭＥＰ遺伝子の発現のバランスは大きく異なっている。
【０１５３】
実施例４：ＹｄｂＫの過剰発現
結論
ＹｄｂＫは、ピルビン酸：フラボドキシンオキシドレダクターゼ及び／またはピルビン酸シンターゼとして機能すると予測される。オキシドレダクターゼは、ピルビン酸をアセチル−ＣｏＡに酸化し、フェレドキシンを還元することで、ＭＥＰ経路に電子を供給することができ、特にＦｅ−Ｓクラスターを含んでいるＩｓｐＧ及びＩｓｐＨ酵素の大幅な上方制御を助けると考えられている。ＹｄｂＫの過剰発現は、水素（Ｈ２）の生産については示されているが（Ａｋｈｔａｒ  ＭＫ＆Ｊｏｎｅｓ  ＰＲ（２０１４），Ｃｏｆａｃｔｏｒ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｆｏｒ  ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｔｈｅ  ｆｌｕｘ  ｏｆ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｐａｔｈｗａｙｓ．”Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｅｎｇ．ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．）、テルペノイドの生産については示されていない。
【０１５４】
これらの株ではテルペン産物Ａの生産力価が２倍になった。Ｆｅ−Ｓクラスターは追加のＹｄｂＫ補因子によってより良好に促進され、その活性が向上する。生産力価が上昇するほか、ＭＥＰ代謝産物をプロファイリングしたとき、対照株がｉｓｐＨ−ｉｓｐＧ’オペロンの別のコピーをさらに付加されたときに観察されるのと同様に、ＭＥｃＰＰの変換が増加することがわかっている。
【０１５５】
他方で、ＷＴと比較してＩｓｐＧ／Ｈを過剰発現していない産物Ｂ株がＹｄｂＫで補完されている場合、産物Ｂの力価は低下した。この株でＩｓｐＧ／Ｈが増加した場合、ＹｄｂＫの補完は産物Ｂの力価を改善した。このことは、ＹｄｂＫの発現をＩｓｐＧ／Ｈの発現と注意深くバランスを調整しなければならない（さらには、Ｈ／Ｇ比を注意深くバランス調整する必要がある）ことを示唆している。
【０１５６】
加えて、過剰な電子を保有または伝達する補因子を、ＹｄｂＫの過剰発現の上位に追加し、力価をさらに改善できるかどうかを確認した。いくつかの実験では、ＹｄｂＫ＋Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ由来のｆｄｘ（フェレドキシン）は生産性をある程度改善した。
【０１５７】
実験結果の説明
Ｅ．ｃｏｌｉのＹｄｂＫ遺伝子の追加コピーは、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下で、染色体に組み込まれるか、またはプラスミド（具体的には、シングルコピーｐＢＡＣ、またはマルチコピープラスミド）で発現される。さらに、天然または非天然の組換え電子受容体／供与体のコピーをＹｄｂＫとともに過剰発現させ、生合成に供給される追加電子を最も効率的に活用及び利用することもできる。
【０１５８】
プロモーター強度を漸増させながらＹｄｂＫの追加コピーを発現させると、テルペノイドの生産量を向上させることができる。本実施例では、対照株はテルペノイド産物Ａを生産し、定義された構成的発現下でＭＥＰ経路の遺伝子ｄｘｓ、ｄｘｒ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＥ、ｉｓｐＦ、ｉｓｐＧ’、ｉｓｐＨ、及びｉｄｉの追加コピーを有する。
【０１５９】
この株に、オペロン形式でｉｓｐＨ及びｉｓｐＧ’の追加コピーを（Ｈ／Ｇ’比がＨに有利になるように）付加すると、産物Ａの力価はさらに増加するが、この段階は限定的であることを示している（図１０、パネルＡ）。これらのＦｅ−Ｓクラスターが含まれている遺伝子を増加させると、明らかにＭＥｃＰＰの変換が増加し、培養物で観察される濃度が低下する（図１０、パネルＣ）。
【０１６０】
対照株にＹｄｂＫを補うと、上方制御に段階的に応答することがわかっている。その場合、発現が増加するとテルペノイドの生産はある時点まで増加するが、強度の発現に移行すると、＋＋＋ＹｄｂＫ株では産物Ａの５０％の減少をもたらすとみられる（図１０、パネルＢ）。これらの株についてＭＥｃＰＰの同様の変換が起こることがわかっており（図１０、パネルＤ）、このことはＹｄｂＫがＩｓｐＧ及び／またはＩｓｐＨ活性の増強を促進することを示唆している。特筆すべきは、＋＋株対＋＋＋株のＭＥＰ代謝産物プロファイルは著しく変化しないが、生産力価は約３分の１に減少していることである。これは、ある種のフィードバック機構が活性化されたことを示唆している。ＩｓｐＧ及びＩｓｐＨを用いた研究の観察を考慮すると、このフィードバックはＨＭＢＰＰの蓄積による可能性がある。
【０１６１】
ＹｄｂＫ発現の増加によるテルペノイドの生産力価の向上には、十分なＩｓｐＧ及び／またはＩｓｐＨが発現している必要がある（図１１）。本実施例では、対照Ａは、ＭＥＰ経路のｄｘｓ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＦ、及びｉｄｉの追加コピー、ならびにｒｈｙＢの欠失及びｉｓｃオペロンの変更を有する。対照Ｂは、対照Ａに加え、オペロン構成にｉｓｐＧ’及びｉｓｐＨの追加コピーが組み込まれ（Ｇ’が最初であることによりＨ／Ｇ比がＧに有利である）、対する対照Ｃは、対照Ａに加え、オペロン構成にｉｓｐＨ及びｉｓｐＧ’の追加コピーが組み込まれている（Ｈが最初であることによりＨ／Ｇ比がＨに有利である）。
【０１６２】
パネルＡでは、ＩｓｐＧ／Ｈの上方制御がない場合、ＹｄｂＫを補うと、テルペノイド産物Ｂの力価が約２５％減少することがわかる。しかしながら、ｉｓｐＧ’−ｉｓｐＨまたはｉｓｐＨ−ｉｓｐＧ’のコピーが追加された株にＹｄｂＫを補うと、テルペノイド力価に１８％及び２７％の向上が観察された。明らかに、ＹｄｂＫの利点を見出すには、ＷＴ  ＭＥＰ経路と比較してＩｓｐＧ及びＩｓｐＨが過剰発現されていなければならない。
【０１６３】
さらに、このデータでもまた、ＩｓｐＧとＩｓｐＨとの間の発現バランスがＭＥＰ経路のフラックス及びテルペノイド生産性にとっていかに重要であり得るかが特に注目される。対照ＢとＣを比較すると、同じプロモーター強度で同じ酵素が上方制御されており、その差はオペロン内の遺伝子の順序による。プロモーターに最も近い遺伝子は、オペロン内の後続の遺伝子よりも強く発現されるため、Ｈ／Ｇ酵素比は、対照ＢではＩｓｐＧに、対照ＣではＩｓｐＨに有利になる。このことから、Ｈが有利な比率は、Ｇが有利な比率よりも力価が向上することがわかる。さらに、ＹｄｂＫによって可能となる向上は、Ｈに有利である株において増強される。したがって、ＩｓｐＨとＩｓｐＧとの間のバランスは、株の生産性にとって非常に重要である。
【０１６４】
ＹｄｂＫに加えてｆｄｘを発現させると、テルペノイド力価をさらに向上させることができる（図１２）。本実施例では、対照株はテルペノイド産物Ａを生産し、定義された構成的発現下でＭＥＰ経路の遺伝子ｄｘｓ、ｄｘｒ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＥ、ｉｓｐＦ、ｉｓｐＧ’、ｉｓｐＨ、及びｉｄｉの追加コピーを有する。
【０１６５】
図１０に示すように、構成的発現下でＹｄｂＫの追加コピーを発現させると、産物Ａの生産が増加する。３種の追加電子受容体／供与体、ｆｌｄＡ、ｆｌｄＡ及びｅｒｐＡ（それぞれＥ．ｃｏｌｉ由来）、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ由来のｆｄｘ（ＩｓｐＧ及びＩｓｐＨに見られるように、２Ｆｅ−２Ｓクラスターではなく４Ｆｅ−４Ｓクラスターを促進できる）による補完を試みた。
【０１６６】
ＹｄｂＫに加えて、ｆｌｄＡ（フラボドキシン）、またはｆｌｄＡ及びｅｒｐＡ（必須呼吸タンパク質Ａ）の別のコピーを追加しても、産物Ａの力価はさらに向上しなかったが、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ  ｆｄｘを追加すると産物Ａの力価が向上した。興味深いことに、ＹｄｂＫの追加は、下流のＭＥ／ＭＥＰへのＤＯＸ／ＤＯＸＰの完全な変換をもたらすが、ｆｌｄＡをさらに追加することで、いくらかの炭素がＭＥＰ経路の上流にＤＯＸ／ＤＯＸＰとしてプールされる。この混合物にｅｒｐＡを追加すると、プロファイルが元に戻る。しかしながら、さらに強化されたｙｄｂＫ＋ｆｄｘ株のＭＥＰ代謝産物プロファイルは、ｙｄｂＫ＋ｆｌｄＡと最も類似しており、至適なＭＥＰフラックスが、ＭＥＰ経路の遺伝子発現のバランス調整、ならびに重要な電子供与体／受容体の発現に起因することを示唆している。
【０１６７】
実施例５：ピルビン酸からアセチル−ＣＯＡへのＰＤＨ変換の減少は、ピルビン酸からアセチル−ＣＯＡへのＹｄｂＫの変換を増強する。
ＹｄｂＫは、ｆｌｄＡのＦＭＮヒドロキノン／セミキノンの対よりも酸化還元電位が低い（表４で絶対数が大きい）ため、ピルビン酸のアセチル−ＣＯＡへの変換に対するＹｄｂＫへの依存度を増加させると、操作された微生物株によるテルペン及び／またはテルペノイド産物の生産を向上させることができる。そのため、ＹｄｂＫは、ＩｓｐＧ及びＩｓｐＨによる（ｆｐｒ／ＮＡＤＰＨではない）好ましい電子源である。
【０１６８】
酵素（ＩｓｐＧ及びＩｓｐＨなど）の鉄硫黄クラスター（例えばＦｅ４Ｓ４）は、広範囲の還元電位を利用する（例えば−２００〜−８００ｍＶ）。Ｂｌａｃｈｌｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５４（１３）：６４３９−６４６１（２０１５）。
【０１６９】
電子伝達体ＹｄｂＫ及びｆｐｒを荷電する還元電位は、それぞれ表２及び３に開示されており、ＩｓｐＧ及びＩｓｐＨに電子伝達体（例えばＹｄｂＫ及びｆｐｒ）を放出する還元電位は表４に開示されている。ＭｃＩｖｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｊ，２５７（３）：５７７−８５（１９９８）及びＬｕｐｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１５９：８４３−９（１９８４）を参照のこと。
【表２】
2020505051.tif 000004
【表３】
2020505051.tif 000005
【表４】
2020505051.tif 000006
【０１７０】
ＩｓｐＧの至適活性は、様々な酸化還元色素を使用することによってｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験した。Ｘｉａｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４８（４４）：１０４８３−１０４８５（２００９）。ＩｓｐＧの至適活性は、外部から供給されたメチルビオロゲン（ε０＝４４６ｍＶ）を用いて試験した。供給されたメチルビオロゲン（ε０＝４４６ｍＶ）を用いたＩｓｐＧの活性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのｆｐｒ−ｆｌｄＡ系よりも２０倍大きかった。
【０１７１】
ＩｓｐＨの活性は、メチルビオロゲン（ε０＝４４６ｍＶ）では５０倍大きく、外部から供給された亜ジチオン酸塩−ＭＤＱ（ε０＝４９０ｍＶ）では１００倍大きかった。Ｘｉａｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，１３１（２９）：９９３１−９９３３（２００９）。
【０１７２】
ＹｄｂＫによる接触は可能であるがｆｐｒによる接触は不可能であるｆｌｄＡセミキノン／ヒドロキノン対が、ＩｓｐＧ及びＩｓｐＨにとって好ましいｉｎ  ｖｉｖｏ還元系であると仮定される。
【０１７３】
ＰＦＯＲ（例えば、ＹｄｂＫ）を介在したピルビン酸からアセチル−ＣＯＡへの変換に対する微生物株の依存度を高めるために、ＰＤＨを介在したピルビン酸からアセチル−ＣＯＡへの変換を減少させた。図１５を参照のこと。
【０１７４】
Ｅ．ｃｏｌｉでは、ピルビン酸（ＰＹＲ）をアセチル−ＣｏＡ（ＡｃＣｏＡ）に変換する３つの反応物が知られており、それはｐｆｌＢ、ＰＤＨ、及びＰＦＯＲまたはＹｄｂＫである。
【０１７５】
３つの酵素のうち、ＰＤＨが優位であり、これは、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ａｃｅＥ）の２４サブユニット、リポ酸アセチルトランスフェラーゼ（ａｃｅＦ）の２４サブユニット、及びジヒドロリポ酸デヒドロゲナーゼ（ｌｐｄ）の１２サブユニットからなる多酵素複合体（ａｃｅＥ−ａｃｅＦ−ｌｐｄ）である。ＰＤＨ系の正味の反応は、ＮＡＤ＋の還元に加えて、中央代謝系の主要反応である、ピルビン酸からＡｃＣｏＡ及びＣＯ２への変換である。これは、ピルビン酸を生成する解糖系Ｉを、ＡｃＣｏＡが流入するＴＣＡサイクルと連結しているためである。好気性増殖の間、ＰＤＨはＡｃＣｏＡの必須供給源であり、ＡｃＣｏＡをＴＣＡサイクルに供給し、それによってサイクルが形成する前駆体代謝産物に対する細胞の要求を満たす。ＰＤＨ複合体に欠損のある変異株は、この要求を満たすには外因性の酢酸源を必要とする。
【０１７６】
ｐｆｌＢは嫌気条件下でのみ活性である。したがって、これは、微好気条件及び好気条件下でＰＹＲをＡｃＣｏＡに変換する際の主要反応物ではない。
【０１７７】
少なくともＹｄｂＫの過剰発現を有する微生物株では、ＹｄｂＫを使用してＡｃＣｏＡを供給することができるため、ＰＤＨ（例えば、実施例４を参照）はもはや必須ではない。ＰＹＲからＡｃＣｏＡへの段階が主にＹｄｂＫによって触媒され、それによってＩｓｐＧ及びＩｓｐＨに電子を供給することを確実にするために、ＰＤＨ活性を遺伝子ノックアウトまたはノックダウン（例えば変異による）によって低減または排除した。
【０１７８】
ａｃｅＥのノックアウトによるＰＤＨの排除
４種類のテルペノイド産物（産物Ｂ、産物Ｃ、産物Ｄ、及び産物Ｅと表記）を生産するように操作された４種類のＥ．ｃｏｌｉ株を、ａｃｅＥをノックアウト（ΔａｃｅＥ）するようにさらに操作し、ＰＤＨ活性を除去した。対照株は同じであったが、ａｃｅＥをノックアウトしなかった。
【０１７９】
データによると、ａｃｅＥの欠失により、４つのテルペノイド産物それぞれの力価が、対照と比較して増加を示している。図１６Ａ〜Ｄを参照のこと。倍率変化の向上にみられる差異は、下流経路に使用される異なるテルペノイドシンターゼ酵素の生化学的特徴（例えば、Ｋｍ及びｋｃａｔ）に大きく起因し得る。具体的には、産物Ｄのシンターゼ（最も触媒効率が高い）と比較してシンターゼ活性が低い酵素は、倍率変化の向上がわずかに少なかった。これはおそらく、ＦＰＰ基質の蓄積に起因し、ＦＰＰ基質が蓄積すると、ＭＥＰ経路の上流成分に対する細胞毒性またはフィードバック制御のいずれかをもたらす可能性があるためである。
【０１８０】
データはまた、対照と比較した、細胞外ブロス中のＭＥｃＰＰ濃度の減少を示しており（図１６Ｅ）、これは、炭素フラックスがＩｓｐＧ／Ｈ段階を経て産物に流出されたことを立証している。図１を参照のこと。
【０１８１】
変異ａｃｅＥによるＰＤＨのノックダウン
それぞれが３種類のテルペノイド産物（産物Ｂ、産物Ｃ、及び産物Ｄと記載）を生産するように操作された３種類のＥ．ｃｏｌｉ株を、変異型ａｃｅＥ（Ｇ２６７Ｃ；ａｃｅＥ  ｍｕｔ）を発現するようにさらに操作し、ＰＤＨ活性を低下させた。対照株は同じであったが、変異型ａｃｅＥを有していなかった。
【０１８２】
ａｃｅＥノックアウトの結果と同様に、データによると、変異型ａｃｅＥを発現する微生物株では、３つのテルペノイド産物それぞれの力価が、対照と比較して増加を示している。図１７Ａ〜Ｃを参照のこと。
【０１８３】
データはまた、対照と比較した、細胞外ブロス中のＭＥｃＰＰ濃度の減少を示しており（図１７Ｄ）、これは、炭素フラックスがＩｓｐＧ／Ｈ段階を経て産物に流出されたことを立証している。図１を参照のこと。
【０１８４】
実施例６：非天然の電子受容体／供与体は、ＹｄｂＫ依存性イソプレノイド生産量を増加させる
Ｅ．ｃｏｌｉでＹｄｂＫが過剰発現している場合、天然のフェレドキシン（ｆｄｘ）またはフラボドキシン（ｆｌｄＡ）はＩｓｐＧ及びＩｓｐＨに電子を輸送した（ＰＹＲ／ＹｄｂＫ／ｆｌｄＡまたはｆｄｘ）。産物Ｂを生産し、ＹｄｂＫを過剰発現するように操作されたＥ．ｃｏｌｉを、以下の表５のｆｄｘホモログまたは表６のｆｌｄＡホモログのうちの１つを過剰発現するようにさらに操作した。最初の７つのｆｄｘホモログは、２［４Ｆｅ−４Ｓ］フェレドキシンであり、これは、酸化還元電位が同じであるかまたは異なる可能性のある、２つの４Ｆｅ−４Ｓ鉄−硫黄クラスターが含まれることを意味する。ＹｄｂＫの酸化還元電位を考慮すると、クラスターの酸化還元電位が異なるフェレドキシンでは、ほとんどの場合、クラスター１が関連するクラスターになると予想される。残りのｆｄｘホモログは、どちらも単一クラスターを含んでいる、２Ｆｅ−２Ｓフェレドキシン及び高電位の４Ｆｅ−４Ｓフェレドキシンである。対照Ｅ．ｃｏｌｉは、どのｆｄｘまたはｆｌｄＡホモログも発現していなかった。
【表５】
2020505051.tif 000007
【表６】
2020505051.tif 000008
【０１８５】
データは、Ｅ．ｃｏｌｉでの特定のｆｄｘまたはｆｌｄＡホモログの過剰発現、及びＹｄｂＫの過剰発現が、空ベクター対照（ｅｍｐ）と比較して、テルペノイド産物（本実施例では産物Ｂ）の力価を増加させたことを示す（例えば、Ｈ．ｆｄｘ、Ｃｖ．ｆｄｘ、Ｃｖ．ｆｄｘＣ５７Ａ、及びＰａ．ｆｄｘ）。図１９Ａ。
【０１８６】
産物Ｄを生産し、ＹｄｂＫを過剰発現するように操作されたＥ．ｃｏｌｉを、Ｃｖ．ｆｄｘを過剰発現するようにさらに操作した。先の結果と同様に、データは、テルペノイド産物（本実施例では産物Ｄ）を生産し、ＹｄｂＫを過剰発現するように操作されたＥ．ｃｏｌｉでのＣｖ．ｆｄｘの過剰発現が、対照と比較して、テルペノイド産物の力価を増加させたことを示す。図１９Ｂ。さらに、データは、対照と比較した、細胞外ブロス中のＭＥｃＰＰ濃度の減少を示しており（図１９Ｃ）、これは、炭素フラックスがＩｓｐＧ／Ｈ段階を経て産物に流出されたことを立証している。図１を参照のこと。
【０１８７】
実施例７：ＰＦＯＲホモログ、ｆｐｒホモログ、及び／またはｆｄｘもしくはｆｌｄＡホモログによる過剰発現または補完
産物Ｆを生産するように操作されたＥ．ｃｏｌｉを、表７に示すような、少なくとも１つのＰＦＯＲホモログまたはｆｐｒホモログ、及び場合によりｆｄｘまたはｆｌｄＡホモログを過剰発現するようにさらに操作した。
【表７】
2020505051.tif 000009
【０１８８】
データは、ＰＦＯＲ及びｆｐｒホモログを発現するように操作された、いくつかの細菌株が、空ベクター対照（ＣＴＲＬ）と比較して、テルペノイド産物（本実施例では産物Ｆ）の力価を増加させたことを示す（例えば、Ｄａ．ｐｆｏｒ（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ａｆｒｉｃａｎｕｓ）（配列番号３１）；Ｓｃｏ．ｐｆｏｒ（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）；Ｇａ．ｐｆｏｒ（Ｇｉｌｌｉａｍｅｌｌａ  ａｐｉｃｏｌａ）（配列番号３５）；Ｅｃ．ｙｄｂｋ（Ｅ．Ｃｏｌｉ）（配列番号９）；及びＳｃｏ．ｆｐｒ（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）（配列番号３７））。図２０を参照のこと。
【０１８９】
データはまた、少なくとも１つのＰＦＯＲホモログ及びｆｄｘを過剰発現するように操作された細菌株が、空ベクター対照（ＣＴＲＬ）と比較して、テルペノイド産物（産物Ｆ）の力価を増加させたことを示す（例えば、Ｅｃ．ｙｄｈＶ／Ｅｃ．ｙｄｈＹ；Ｅ．ｃｏｌｉ（それぞれ配列番号３３及び配列番号３４）、及びＥｃ．ｙｄｂＫ／Ｃｐ．ｆｄｘ；Ｅ．ｃｏｌｉ（それぞれ配列番号９及び１０））。図２０を参照のこと。
【０１９０】
さらに、データは、少なくとも１つのｆｐｒホモログ及びｆｄｘまたはｆｌｄＡのいずれかを過剰発現するように操作された細菌株が、空ベクター対照（ＣＴＲＬ）と比較して、テルペノイド産物（産物Ｆ）の力価を増加させたことを示す（例えば、Ｅｃ．ｆｐｒ／Ｅｃ．ｆｄｘ；Ｅ．ｃｏｌｉ（それぞれ、配列番号３８及び配列番号２１）、及びＥｃ．ｆｐｒ／Ｅｃ．ｆｌｄＡ；Ｅ．ｃｏｌｉ（それぞれ配列番号３８及び配列番号２７））。図２０を参照のこと。
配列
2020505051.tif 000010
2020505051.tif 000011
2020505051.tif 000012
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【図１】
2020505051.tif 000048
【図２】
2020505051.tif 000049
【図３】
2020505051.tif 000050
【図４】
2020505051.tif 000051
【図５】
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【図６】
2020505051.tif 000053
【図７】
2020505051.tif 000054
【図８】
2020505051.tif 000055
【図９】
2020505051.tif 000056
【図１０】
2020505051.tif 000057
【図１１】
2020505051.tif 000058
【図１２】
2020505051.tif 000059
【図１３】
2020505051.tif 000060
【図１４】
2020505051.tif 000061
【図１５】
2020505051.tif 000062
【図１６−１】
2020505051.tif 000063
【図１６−２】
2020505051.tif 000064
【図１６−３】
2020505051.tif 000065
【図１７−１】
2020505051.tif 000066
【図１７−２】
2020505051.tif 000067
【図１７−３】
2020505051.tif 000068
【図１８】
2020505051.tif 000069
【図１９Ａ】
2020505051.tif 000070
【図１９Ｂ】
2020505051.tif 000071
【図１９Ｃ】
2020505051.tif 000072
【図２０】
2020505051.tif 000073
【配列表】
2020505051000001.app
【国際調査報告】
2020505051.tif 000074
2020505051.tif 000075