(57)【要約】  本発明は、ヒト化カルシトニン模倣体と、糖尿病（Ｉ型および／またはＩＩ型）、体重過多、過剰な摂食量、メタボリック症候群、関節リウマチ、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪性肝疾患、アルコール性脂肪性肝疾患、骨粗鬆症、もしくは変形性関節症、血糖値の調節不良、糖負荷試験に対する反応の調節不良、または食物摂取の調節不良の治療におけるそれらの使用とに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチドであって、前記ペプチドは、
【化１】
2020511479.tif 000009
であり、
式中、
Ｘ１＝ＭまたはＶであり、
Ｘ２＝ＴまたはＳであり、
Ｘ３＝ＦまたはＬであり、
Ｘ４＝ＮまたはＨであり、
Ｘ５＝ＦまたはＬであり、
Ｘ６＝ＱまたはＨであり、
Ｘ７＝ＱまたはＫである、ペプチド。
【請求項２】
Ｘ２はＴであり、Ｘ３はＬであり、Ｘ４はＮであり、Ｘ５はＦであり、Ｘ６はＨであり、および／またはＸ７はＫである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
Ｘ４はＮであり、Ｘ５はＦであり、Ｘ６はＨである、請求項１または２に記載のペプチド。
【請求項４】
前記ペプチドは、ヒトカルシトニンに対して少なくとも６５％の同一性を有する、請求項１〜３に記載のペプチド。
【請求項５】
前記ペプチドは、以下のうちの１つから選択される、請求項１に記載のペプチド：
【化２】
2020511479.tif 000010
【請求項６】
経腸投与のために製剤化される、請求項１〜５のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項７】
非経口投与のために製剤化される、請求項１〜６のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項８】
注射のために製剤化される、請求項７に記載のペプチド。
【請求項９】
経口投与のための担体を用いて製剤化される、請求項１〜５のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１０】
前記担体は、５−ＣＮＡＣ、ＳＮＡＤ、またはＳＮＡＣを含む、請求項９に記載のペプチド。
【請求項１１】
前記ペプチドは、コーティングされたクエン酸粒子を含む経口投与のための薬学的組成物に製剤化され、前記コーティングされたクエン酸粒子は、前記ペプチドの経口バイオアベイラビリティを増加させる、請求項６に記載のペプチド。
【請求項１２】
薬物として使用される、請求項１〜５のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１３】
糖尿病（Ｉ型および／またはＩＩ型）、体重過多、過剰な摂食量、メタボリック症候群、関節リウマチ、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪性肝疾患、アルコール性脂肪性肝疾患、骨粗鬆症、もしくは変形性関節症、血糖値の調節不良、糖負荷試験に対する反応の調節不良、または食物摂取の調節不良の治療に使用される、請求項１２に記載のペプチド。
【請求項１４】
前記ペプチドは、メトホルミンまたは別のインスリン抵抗性改善薬を用いた治療と併せて投与するためのものである、請求項１２または請求項１３に記載の薬物として使用されるペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カルシトニンの模倣体に関し、限定されないが、糖尿病（Ｉ型およびＩＩ型）、体重過多、過剰な摂食量およびメタボリック症候群、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、アルコール性および非アルコール性脂肪性肝疾患、血糖値の調節、糖負荷試験に対する反応の調節、食物摂取の調節、骨粗鬆症の治療、ならびに変形性関節症の治療を含む種々の疾患および障害の治療における薬物としてのそれらの使用にまで及ぶ。
【背景技術】
【０００２】
世界的に約２億５千万人の糖尿病患者が存在し、その数は次の２０年間で倍増することが予測されている。この集団の９０％超が２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）を患っている。現在のところ、Ｔ２ＤＭに罹患しているか、または顕性Ｔ２ＤＭに先行する段階にある人々の５０〜６０％しか診断されていないと推定されている。
【０００３】
Ｔ２ＤＭは、炭水化物代謝および脂肪代謝の異常を特徴とする異種疾患である。Ｔ２ＤＭの原因は多因子性であり、筋組織、肝組織、膵組織、および脂肪組織等の組織におけるβ細胞機能およびインスリン感受性に影響を及ぼす遺伝的要素および環境的要素の両方が含まれる。結果として、インスリン分泌障害が観察され、β細胞機能の進行性の低下および慢性インスリン抵抗性が平行して起こる。膵内分泌部が末梢インスリン抵抗性を補償できないため、高血糖および臨床的糖尿病の発症に至る。インスリン媒介性のグルコース取り込みに対する組織抵抗性は、現在のところ、Ｔ２ＤＭの主要な病態生理学的決定要因として認識されている。
【０００４】
Ｔ２ＤＭの最適な介入の成功基準は、血糖値を低下させることであり、これは、より低いピークグルコースレベルおよびより急速なクリアランスによって説明される、血糖値の慢性的な低下と、食物摂取後の高いグルコースレベルを許容する能力の増大の両方であり得る。これらの状況はどちらも、β細胞のインスリン産生量および機能にかかる負担が少ない。
【０００５】
Ｉ型糖尿病は、食物摂取に応答してインスリンを産生する能力の喪失を特徴とし、したがって、血中グルコースを正常な生理学的レベルまで調節できないことを特徴とする。
【０００６】
骨の物理的構造は、疾患および傷害を含む様々な要因によって損なわれ得る。最も一般的な骨疾患の１つは骨粗鬆症であり、これは、骨量の低下および骨組織の構造的劣化を特徴とし、骨の脆弱性をもたらし、特に、股関節、脊椎、および手首を骨折しやすくなる。骨粗鬆症は、骨吸収の速度が骨形成の速度を上回るような不均衡が存在する場合に発症する。有効量の抗吸収剤、例えば、カルシトニンの投与によって、骨の吸収が防止されることが示されている。
【０００７】
関節の疾患、例えば、変形性関節症（ＯＡ）、関節リウマチ（ＲＡ）、または若年性関節リウマチ（ＪＲＡ）を含み、また、自己免疫応答から生じる炎症、例えば、ループス、強直性脊椎炎（ＡＳ）、または多発性硬化症（ＭＳ）を含む、炎症性疾患および変性疾患は、疼痛および関節の破壊に起因した実質的な運動の喪失をもたらし得る。関節内の骨を覆って緩衝する軟骨は、経時的に劣化する場合があり、したがって、一方の骨に対する他方の骨の運動を制限し得る、かつ／または関節の運動中に一方の骨による他方の骨への損傷を引き起こし得る、２つの骨の直接的な接触を不必要に許容する。軟骨直下の軟骨下骨もまた劣化し得る。有効量の抗吸収剤、例えば、カルシトニンの投与によって、骨の吸収が防止され得る。
【０００８】
カルシトニンは、広範囲の種にわたって高度に保存されている。天然の全長カルシトニンは、３２アミノ酸長である。天然カルシトニンの配列の例を以下に示す。
【化１】
2020511479.tif 000002
【０００９】
改善された特性を提供することを目的とする修飾されたアミノ酸配列を有する天然カルシトニンの合成変異体が、ＷＯ２０１３／０６７３５７およびＷＯ２０１５／０７１２２９に開示されている。
【００１０】
さらに改善された特性を有するカルシトニン類似体、または、ＣＧＲＰ受容体アゴニズムを排除する一方で、特にアミリンおよびカルシトニン受容体アゴニズムについて、天然に存在するカルシトニンの特性を改善し、それによってインビボでの最適な有効性と安全性の割合を保証する代替的な人工配列を少なくとも提供するカルシトニン類似体を開発することが継続的に必要とされている。
【００１１】
しかしながら、ペプチドによって左右される治療薬の課題は、所与の治療への宿主の曝露に応答した抗薬物抗体（ＡＤＡ）の形成である（Ｗｕ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ  ＡＡＰＳＪ．２０１６  Ｎｏｖ；１８（６）：１３３５−１３５０；Ｓｃｈｅｌｌｅｋｅｎｓ  Ｈ，Ｃｌｉｎ  Ｔｈｅｒ．２００２  Ｎｏｖ；２４（１１）：１７２０−４０）。ＡＤＡの出現は、種々の骨関連疾患における治療薬としてのサケカルシトニン（Ｇｒａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｘｐ  ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ，１９９５）、およびＴ２ＤＭを治療するためのエキセナチド（Ｆｉｎｅｍａｎ  ＭＳ  ｅｔ  ａｌ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｏｂｅｓ  Ｍｅｔａｂ．２０１２  Ｊｕｎ；１４（６）：５４６−５４）等の他の生物由来のペプチド治療薬を使用した場合により多く見られ、所与の治療の有効性を妨げる可能性がある。
【００１２】
硬骨類／鳥類のカルシトニンは、内在性リガンドであるヒトカルシトニン（ｈＣＴ）と約５０％の配列相同性を有し、したがって、硬骨類／鳥類群のカルシトニンに特有のリガンド特性を保持する一方で内因性標的を模倣することにより、ＡＤＡ産生を減衰させる努力においてｈＣＴに対する配列相同性を増加させることが有利であろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２０１３／０６７３５７号公報
【特許文献２】国際公開ＷＯ２０１５／０７１２２９号公報
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】AAPSJ．2016 Nov; 18(6):1335-1350
【非特許文献２】Clin Ther. 2002 Nov; 24(11):1720-40
【非特許文献３】Exp clin Endo Diabetes, 1995
【非特許文献４】Diabetes Obes Metab. 2012 Jun; 14(6):546-54
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
ここで、本発明は、ヒトカルシトニンと高度に類似している（％同一性による）が、驚くべきことに、改善された食欲抑制等の有用な治療特性も同時に示すカルシトニン模倣体を提供する。本明細書に示されるように、そのような効果的な「ヒト化」カルシトニン模倣体の開発は極めて重要である。表１（下）は、本出願人によって開発および試験されたカルシトニン模倣体のアミノ酸配列を提供する。ある特定の残基をヒト化すること（すなわち、ある特定の残基をヒトカルシトニン中に見られる同等の残基で置き換えること）によって有効性の改善が見られたが、他の残基を置き換えると有効性が著しく低下した。
【表１】
2020511479.tif 000003
【００１７】
試験を行ったペプチドのほとんどが４時間にわたってある程度の食欲抑制をもたらしたが、表１で強調したペプチド（ＫＢＰ−０４７［配列番号１２］、−０５３［配列番号１８］、−０５８［配列番号２０］、−０６２［配列番号２４］、および−０６３［配列番号２５］）は、食物摂取量における大幅な減少をもたらし、２４時間にわたって持続する効果をもたらすことを示したのはこれらのペプチドだけであった。
【００１８】
したがって、第１の態様において、本発明はカルシトニン模倣体であるペプチドに関し、該ペプチドは、
【化２】
2020511479.tif 000004
であり、
式中、
Ｘ１＝ＭまたはＶであり、
Ｘ２＝ＴまたはＳであり、
Ｘ３＝ＦまたはＬであり、
Ｘ４＝ＮまたはＨであり、
Ｘ５＝ＦまたはＬであり、
Ｘ６＝ＱまたはＨであり、
Ｘ７＝ＱまたはＫである。
【００１９】
好ましくは、Ｘ２はＴであり、Ｘ３はＬであり、Ｘ４はＮであり、Ｘ５はＦであり、Ｘ６はＨであり、かつ／またはＸ７はＫである。
【００２０】
好ましくは、Ｘ４はＮであり、Ｘ５はＦであり、Ｘ６はＨである。
【００２１】
好ましくは、ペプチドは、ヒトカルシトニンに対して少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、最も好ましくは少なくとも７５％の同一性を有する。
【００２２】
好ましくは、ペプチドは、以下のうちの１つから選択される
【化３】
2020511479.tif 000005
【００２３】
本発明のペプチドは、そのＮ末端がアシル化されてもよいか、または第１のアミノ酸の正電荷を減少させるように別様に修飾されてもよく、それとは無関係に、そのＣ末端がアミド化されてもよい。
【００２４】
ペプチドは、医薬品として投与するために製剤化することができ、経腸または非経口投与のために製剤化することができる。好ましい製剤は注射剤であり、好ましくは皮下注射用の注射剤であるが、ペプチドは、経口投与のための担体を用いて製剤化することもでき、任意選択的に、担体はペプチドの経口バイオアベイラビリティを増加させる。好適な担体として、５−ＣＮＡＣ、ＳＮＡＤ、またはＳＮＡＣを含むものが挙げられる。
【００２５】
任意選択的に、ペプチドは、コーティングされたクエン酸粒子を含む経口投与のための薬学的組成物に製剤化され、コーティングされたクエン酸粒子は、ペプチドの経口バイオアベイラビリティを増加させる。
【００２６】
本発明は、薬物として使用される本発明のペプチドを含む。ペプチドは、糖尿病（Ｉ型および／またはＩＩ型）、体重過多、過剰な摂食量、メタボリック症候群、関節リウマチ、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪性肝疾患、アルコール性脂肪性肝疾患、骨粗鬆症、もしくは変形性関節症、血糖値の調節不良、糖負荷試験に対する反応の調節不良、または食物摂取の調節不良の治療に使用することができる。具体的には、ペプチドは、望ましくなく高い絶食時血糖値を低下させるため、または望ましくなく高いＨｂＡ１ｃを低下させるため、または糖負荷試験に対する望ましくなく高い反応を低下させるために使用することができる。
【００２７】
いくつかの実施形態において、上で論じたカルシトニン模倣体のＮ末端側は、第１のアミノ酸の正電荷を減少させるように修飾される。例えば、アセチル、プロピオニル、またはスクシニル基は、システイン−１上で置換されてもよい。正電荷を減少させる代替の方法は、限定されないが、ポリエチレングリコールに基づくＰＥＧ化、またはＮ末端でのグルタミン酸もしくはアスパラギン酸等の別のアミノ酸の付加を含む。代替として、リジン、グリシン、ホルミルグリシン、ロイシン、アラニン、アセチルアラニン、およびジアラニルを含む他のアミノ酸が、上で論じたペプチドのＮ末端に付加されてもよい。当業者は理解するように、複数のシステイン残基を有するペプチドは、そのような２つのシステイン残基間に頻繁にジスルフィド結合を形成する。本明細書に記載される全てのそのようなペプチドは、特にＣｙｓ１〜Ｃｙｓ７の位置に、１つ以上のそのようなジスルフィド結合を任意選択的に含むと定義される。これを模倣して、１位および７位のシステインは、α−アミノスベリン酸結合によって一緒に置換されてもよい。
【００２８】
本開示のカルシトニン模倣体は遊離酸の形態で存在し得るが、Ｃ末端アミノ酸がアミド化されていることが好ましい。本発明者は、そのようなアミド化がペプチドの有効性および／またはバイオアベイラビリティに寄与し得ると予想する。本開示のカルシトニン模倣体のアミド化形態を製造するための好ましい技法は、既知の技法に従ってペプチジルグリシンα−アミド化モノオキシゲナーゼの存在下で前駆体（所望のアミド化生成物のＣ末端アミノ基の代わりにグリシンを有する）を反応させることであり、前駆体は、例えば、ＵＳ４７０８９３４およびＥＰ０３０８０６７およびＥＰ０３８２４０３に記載される反応においてアミド化生成物に変換される。
【００２９】
アミド化生成物の生成は、ＵＳ７４４５９１１においてＣｏｎｓａｌｖｏら、ＵＳ２００６／０２９２６７２においてＭｉｌｌｅｒら、２００２，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，２６：２４９−２５９においてＲａｙら、および２００４，Ｂｉｏｐｈａｒｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｊｕｌｙ，ｐｐ．４４−４６においてＭｅｈｔａによって記載されるプロセスおよびアミド化酵素を用いても達成することができる。
【００３０】
好ましいアミド化ペプチドの生成は、例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとの可溶性融合タンパク質として、Ｅ．ｃｏｌｉ中でグリシン伸長前駆体を生成することによって、またはＵＳ６１０３４９５に記載される技法に従って前駆体を直接発現させることによって進めてもよい。そのようなグリシン伸長前駆体は、Ｃ末端を除いて、所望のアミド化生成物と同一の分子構造を有する（生成物は−−Ｘ−−ＮＨ２で終結するのに対し、前駆体は−−Ｘ−ｇｌｙで終結し、Ｘは生成物のＣ末端アミノ酸残基である）。上記刊行物に記載されるα−アミド化酵素は、前駆体の生成物への変換を触媒する。その酵素は、上記で引用したＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈａｒｍの記事に記載されるように、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において組み換えによって生成されるのが好ましい。
【００３１】
本開示のペプチド活性剤の遊離酸形態も、「前駆体」上にＣ末端グリシンを含まないことを除いて同様の様式で生成することができ、前駆体は、代わりに最終ペプチド生成物であり、アミド化ステップを必要としない。
【００３２】
別途記載される場合を除いて、本開示のカルシトニン模倣体の好ましい投与量は、治療目的および予防目的の両方で同一である。所望の投与量は、以下により詳細に論じられ、投与様式に応じて異なる。
【００３３】
別途記載される場合および文脈から明らかな場合を除いて、本明細書における投与量は、薬学的賦形剤、希釈剤、担体、または他の成分による影響を受けないまたはそれらを考慮に入れない活性化合物（すなわち、カルシトニン模倣体）の重量を指すが、そのような追加の成分が含まれることが望ましい。ペプチド活性剤の送達のために医薬品産業において一般的に使用されるいずれの剤形（カプセル、錠剤、注射等）も、本明細書における使用に適しており、「賦形剤」、「希釈剤」、または「担体」という用語は、該産業において活性成分と一緒にそのような剤形に典型的に含まれるような非活性成分を含む。好ましい経口剤形は以下により詳細に論じられるが、それは本開示の活性剤を投与する排他的な様式であると見なされるべきではない。
【００３４】
本開示のカルシトニン模倣体は、多数の疾患または障害を治療するために患者に投与することができる。本明細書で使用される場合、「患者」という用語は、動物界に属する任意の生物を意味する。ある実施形態において、「患者」という用語は、脊椎動物、より好ましくは、ヒトを含む哺乳動物を指す。
【００３５】
したがって、本開示は、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病もしくはメタボリック症候群、肥満の治療方法、または食欲抑制の方法、またはインスリン抵抗性を軽減するための方法、または、望ましくなく高い絶食時血清グルコースレベルを低下させるための方法、または望ましくなく高いピーク血清グルコースレベルを低下させるための方法、または望ましくなく高いピーク血清インスリンレベルを低下させるための方法、または糖負荷試験に対する望ましくなく大きな反応を軽減するための方法、または骨粗鬆症を治療するための方法、または変形性関節症を治療するための方法、または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を治療するための方法、またはアルコール性脂肪性肝疾患を治療するための方法におけるペプチドの使用を含む。
【００３６】
性別、年齢、および身長等の多数の因子を考慮に入れた、正常な体重の範囲に関する当該技術分野で認識されている数多くの尺度が存在する。本明細書に記載される治療計画または予防計画を必要とする患者は、その体重が認識されている基準を超える患者、または、遺伝的因子、環境的因子、もしくは他の認識されている危険因子に起因して、一般的な集団よりも過体重もしくは肥満となる危険性が高い患者を含む。本開示によれば、糖尿病を治療するためにカルシトニン模倣体が使用され得ることが想定され、その場合、体重管理が治療の一態様である。
【００３７】
ある実施形態において、方法は、前記状態の治療のために、薬学的有効量の本明細書に記載のペプチドのうちのいずれか１つを、それを必要とする患者に経腸投与することを含む。
【００３８】
ある実施形態において、方法は、前記状態の治療のために、薬学的有効量の本明細書に記載のペプチドのうちのいずれか１つを、それを必要とする患者に非経口投与することを含む。非経口投与（腹腔内注射、皮下注射、静脈内注射、皮内注射、または筋肉内注射を含む）には、例えば、ゴマ油もしくはラッカセイ油中または水性プロピレングリコール中のいずれかの本開示のペプチドの溶液が用いられ得る。水溶液は、必要であれば適切に緩衝されるべきであり（好ましくは８を超えるｐＨ）、液体希釈剤を最初に等張性にするべきである。これらの水溶液は、静脈内注射の目的に適している。油性溶液は、動脈内注射、筋肉内注射、および皮下注射の目的に適している。滅菌条件下におけるこれら全ての溶液の調製は、当業者に周知の標準的な製薬技術によって容易に達成される。非経口用途の場合、好適な調製物の例として、溶液、好ましくは油性溶液または水溶液、および懸濁液、エマルジョン、または坐剤を含む植込剤が挙げられる。ペプチドは、注射剤とともに一般的に使用される滅菌生理食塩水または５％食塩水デキストロース溶液等の液体担体に分散させる等、複数回または単回投与形式の滅菌形態に製剤化することができる。
【００３９】
前記方法は、患者が前記状態を患っているかどうかを決定する予備ステップ、および／または、例えば、各症例において、経口糖負荷試験もしくは安静時血糖値の測定を行い、前記患者における状態を軽減するのに前記治療がどの程度有効であるのかを決定する後続ステップを含み得る。
【００４０】
患者の体重管理を改善する目的で、体重減少をもたらすかまたは体重増加を回避するためには、活性化合物が１日１回またはそれ以上、例えば、１日当たり少なくとも２回、例えば、１日当たり２〜４回投与されることが好ましい。活性化合物の製剤は、そのような投与スケジュールに適切な単位投与量を含有し得る。活性化合物は、糖尿病またはメタボリック症候群のための治療を受けている患者の体重を管理することを視野に入れて投与することができる。
【００４１】
経口腸溶性製剤は、舌下経路または頬側経路を介した血流への移動を可能にするように口腔内に保持される製剤とは対照的に、胃の下の腸において後に放出され、したがって門脈を経由して肝臓に送達されるように、嚥下によって摂取される。
【００４２】
本開示における使用に適した剤形は、錠剤、ミニ錠剤、カプセル、顆粒、ペレット、粉末、発泡性固体、およびチュアブル固体製剤を含む。そのような製剤は、好ましくは加水分解ゼラチンまたは低分子量ゼラチンであるゼラチンを含み得る。そのような製剤は、カルシトニン模倣体と加水分ゼラチンまたは低分子量ゼラチンとを含む均質な水溶液を凍結乾燥し、結果として得られた固体材料を前記経口医薬製剤にさらに加工することによって得ることができ、この場合、ゼラチンは１０００〜１５０００ダルトンの平均分子量を有し得る。そのような製剤は、５−ＣＮＡＣまたは本明細書に開示される他の化合物等の保護的担体化合物を含み得る。
【００４３】
錠剤およびカプセル等の経口製剤が好ましいが、本開示において使用される組成物は、シロップ、エリキシル剤等、および坐剤等の形態を取ることができる。経口送達は、便利で、比較的容易であり、また概ね無痛であり、他の送達様式と比較して患者コンプライアンスの増大をもたらすため、最適な送達経路である。しかしながら、消化管内で変動するｐＨ、強力な消化酵素、ならびに活性薬剤不透過性の消化管膜等の生物学的、化学的、および物理的障壁は、カルシトニン様ペプチドの哺乳動物への経口送達を問題のあるものにし、例えば、哺乳動物において甲状腺の濾胞傍細胞によって、ならびに鳥類および魚類の鰓後腺によって分泌される長鎖ポリペプチドホルモンであるカルシトニンの経口送達は、消化管におけるカルシトニンの安定性が不十分であること、および腸壁を通ってカルシトニンを血流へと容易に輸送する能力の不足に少なくとも部分的に起因して、本来困難であることが分かっていた。
【００４４】
しかしながら、好適な経口製剤を以下に記載する。
【００４５】
患者の治療
ある実施形態において、本開示のカルシトニン模倣体は、患者における模倣体の血清レベルを１ミリリットル当たり５ピコグラム〜５００ナノグラム、好ましくは５０ピコグラム〜２５０ナノグラム、例えば、１ミリリットル当たり１〜１００ナノグラムに維持するのに十分な投与量で投与される。血清レベルは、当該技術分野で既知のラジオイムノアッセイ法によって測定することができる。担当医は、患者の反応をモニタリングすることができ、次いで、個々の患者の代謝および反応を考慮に入れるように用量をある程度変更することができる。ほぼ同時の放出は、本開示の全ての構成成分を単一の丸剤またはカプセルとして投与することによって最も良好に達成される。しかしながら、本開示はまた、例えば、必要な量のカルシトニン模倣体を２つ以上の錠剤またはカプセルに分割することも含み、それらは一緒になって全ての成分の必要量を提供するように一緒に投与されてもよい。本明細書で使用される「薬学的組成物」は、限定されないが、所与の投与で１つ以上の錠剤またはカプセル（または他の剤形）が推奨されているかどうかにかかわらず、患者への特定の投与に適切な完全な投与量を含む。
【００４６】
本開示のカルシトニン模倣体は、Ｕｎｉｇｅｎｅ  Ｅｎｔｅｒｉｐｅｐ（登録商標）製品に用いられる方法を使用して経口投与のために製剤化することができる。これらは、米国特許第５，９１２，０１４号、米国特許第６，０８６，９１８号、米国特許第６，６７３，５７４号、米国特許第７，３１６，８１９号、米国特許第８，０９３，２０７号、および米国公開公報第２００９／０３１７４６２号に記載されるような方法を含み得る。具体的には、これらは、ＨＩＶ  ＴＡＴタンパク質のタンパク質形質導入ドメイン等の膜輸送体への化合物のコンジュゲーション、１つ以上のプロテアーゼ阻害剤との合剤、ならびに／またはコーティングされ得るｐＨ降下剤および／もしくは耐酸性保護ビヒクルおよび／もしくは界面活性剤であり得る吸収促進剤の使用を含み得る。
【００４７】
ある実施形態において、本開示のカルシトニン模倣体は、米国特許公開第２００９／０３１７４６２号において既知の様式で経口投与されるように製剤化されることが好ましい。
【００４８】
ある実施形態において、本開示のカルシトニン模倣体は、好適な担体化合物との混合によって、経腸投与、特に経口投与のために製剤化することができる。好適な担体化合物は、米国特許第５，７７３，６４７号および米国特許第５８６６５３６号に記載されるものを含み、それらの中でも、５−ＣＮＡＣ（一般的にその二ナトリウム塩としての、Ｎ−（５−クロロサリチロイル）−８−アミノカプリル酸）は特に効果的である。他の好ましい担体または送達剤は、ＳＮＡＤ（１０−（２−ヒドロキシベンズアミド）デカン酸のナトリウム塩）およびＳＮＡＣ（Ｎ−（８−［２−ヒドロキシベンゾイル］アミノ）カプリル酸のナトリウム塩）である。ある実施形態において、本開示の薬学的組成物は、送達有効量の、すなわち、所望の効果のために化合物を送達するのに十分な量の、５−ＣＮＡＣ等の担体を含む。一般に、５−ＣＮＡＣ等の担体は、全組成物の２．５重量％〜９９．４重量％、より好ましくは２５重量％〜５０重量％の量で存在する。
【００４９】
加えて、ＷＯ００／０５９８６３は、式Ｉ
【化４】
2020511479.tif 000006
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、独立して、水素、−ＯＨ、−ＮＲ６Ｒ７、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４アルキル、またはＣ１−Ｃ４アルコキシであり、Ｒ５は、置換もしくは非置換のＣ２−Ｃ１６アルキレン、置換もしくは非置換のＣ２−Ｃ１６アルケニレン、置換もしくは非置換のＣ２−Ｃ１２アルキル（アリーレン）、または置換もしくは非置換のアリール（Ｃ１−Ｃ１２アルキレン）であり、Ｒ６およびＲ７は、独立して、水素、酸素、またはＣ１−Ｃ４アルキルである）の二ナトリウム塩、ならびに、カルシトニン、例えば、サケカルシトニン等の活性薬剤の経口送達に特に有効であるそれらの水和物および溶媒和物を開示しており、それらは本開示において使用することができる。
【００５０】
任意選択的に微粒子化された５−ＣＮＡＣを使用した好ましい腸溶性製剤は、概してＷＯ２００５／０１４０３１に記載される通りであり得る。
【００５１】
化合物は、Ｂｏｎｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＬｉｍｉｔｅｄのＣａｐｓｉｔｏｎｉｎ製品に用いられる方法を使用して経口投与のために製剤化することができる。それらは、Ａｘｃｅｓｓ製剤に取り入れられた方法を含み得る。より具体的には、活性成分は、胃を通過することに耐えられる腸溶性カプセルに封入することができる。腸溶性カプセルは、例えば、ＷＯ０２／０２８４３６に記載されるように、親水性の芳香族アルコール吸収促進剤と一緒に活性化合物を含有し得る。既知の様式において、腸溶性コーティングは、例えば、３〜７のｐＨで、ｐＨ感受性の様式で透過性になり得る。ＷＯ２００４／０９１５８４もまた、芳香族アルコール吸収促進剤を用いた好適な製剤化方法を記載している。
【００５２】
化合物は、Ｏｒａｍｅｄ製品に見られる方法を使用して製剤化することができ、これは、ＷＯ２００７／０２９２３８に見られるような、またはＵＳ５，１０２，６６６に記載されるようなω−３脂肪酸を用いた製剤を含み得る。
【００５３】
一般に、薬学的に許容される塩（特に、一ナトリウム塩または二ナトリウム塩）、溶媒和物（例えば、アルコール溶媒和物）、およびこれらの担体または送達剤の水和物が使用され得る。
【００５４】
本開示による薬学的組成物の経口投与は、定期的に、例えば、毎日または毎週ベースで１回以上；間欠的に、例えば、１日または１週間の間に不定期に；または周期的に、例えば、数日間または数週間の期間中に定期的に投与した後、投与しない期間を伴って、達成することができる。本明細書に開示される実施形態の薬学的組成物の剤形は、任意の既知の形態であってもよく、例えば、液体剤形または固体剤形であり得る。液体剤形は、溶液、エマルジョン、懸濁液、シロップ、およびエリキシル剤を含む。活性化合物および５−ＣＮＡＣ等の担体に加えて、液体製剤は、当該技術分野において一般的に使用される不活性賦形剤、例えば、可溶化剤、例えば、エタノール；綿実油、ヒマシ油、およびゴマ油等の油；湿潤剤；乳化剤；懸濁剤；甘味剤；香味剤；および水等の溶媒も含み得る。固体剤形は、カプセル、軟質ゲルカプセル、錠剤、カプレット、粉末、顆粒、または他の固体経口剤形を含み、それらの全てが当該技術分野で周知の方法によって調製され得る。薬学的組成物は、限定されないが、ｐＨ調整剤、防腐剤、香味剤、矯味剤、芳香剤、保湿剤、等張剤、着色剤、界面活性剤、可塑化剤、ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤、流動補助剤、圧縮補助剤、可溶化剤、賦形剤、微晶質セルロース、例えば、ＦＭＣ社によって供給されるＡｖｉｃｅｌ  ＰＨ  １０２等の希釈剤、またはそれらの任意の組み合わせを含む添加剤を、慣例的に用いられる量で追加的に含み得る。他の添加剤は、リン酸緩衝塩、クエン酸、グリコール、および他の分散剤を含み得る。組成物はまた、アクチノニンまたはエピアクチノニンおよびそれらの誘導体；アプロチニン、トラジロール、およびボーマンバーク阻害剤等の、１つ以上の酵素阻害剤も含み得る。さらに、輸送阻害剤、すなわち、ケトプロフェン等の［ｒｈｏ］−糖タンパク質が、本開示の組成物中に存在してもよい。本開示の固体薬学的組成物は、従来の方法によって、例えば、活性化合物、５−ＣＮＡＣ等の担体、および任意の他の成分の混合物をブレンドし、練り、カプセルに充填するか、または、カプセルに充填する代わりに、成形した後、さらに打錠または圧縮成形して錠剤を得ることによって調製することができる。加えて、既知の方法によって固体分散液を形成した後、さらに加工して錠剤またはカプセルを形成してもよい。好ましくは、本開示の薬学的組成物中の成分は、固体剤形全体にわたって均質にまたは均一に混合される。
【００５５】
代替として、活性化合物は、ＵＳ２００３／００６９１７０に記載されるようなオリゴマー、例えば、
【化５】
2020511479.tif 000007
【００５６】
そのようなコンジュゲートは、そこに記載されるような脂肪酸および胆汁塩と組み合わせて投与することができる。
【００５７】
例えば、Ｍａｎｓｏｏｒらに記載されるように、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とのコンジュゲートが用いられてもよい。
【００５８】
代替として、活性化合物を、ニトロソ−Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−ペニシラミン（ＳＮＡＰ）およびカーボポール溶液と、またはタウロコール酸塩およびカーボポール溶液と混合して、粘膜付着性エマルジョンを形成することができる。
【００５９】
活性化合物は、Ｐｒｅｇｏらに開示されるようなキトサンナノカプセルに充填することによって（任意選択的に、ＰｒｅｇｏＰｒｅｇｏ  Ｃ、Ｔｏｒｒｅｓ  Ｄ、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｍｅｇｉａ  Ｅ、Ｎｏｖｏａ−Ｃａｒｂａｌｌａｌ  Ｒ、Ｑｕｉｎｏａ  Ｅ、Ａｌｏｎｓｏ  ＭＪ．にＰＥＧ修飾した）、またはＧａｒｃｉａ−Ｆｕｅｎｔｅｓらに開示されるようにキトサンまたはＰＥＧでコーティングされた脂質ナノ粒子に充填することによって製剤化することができる。この目的のためのキトサンナノ粒子は、Ｇｕｇｇｉらに記載されるようにイミノチオラン修飾されてもよい。それらは、Ｄｏｇｒｕらに記載されるように、水／油／水エマルジョン中に製剤化することができる。活性化合物のバイオアベイラビリティは、ＳｉｎｋｏらまたはＳｏｎｇらに記載されるように、タウロデオキシコール酸またはラウロイルカルニチンを用いることにより増加させることができる。一般に、担体として好適なナノ粒子は、ｄｅ  ｌａ  Ｆｕｅｎｔｅらにおいて論じられており、本開示において使用することができる。
【００６０】
経口製剤に好適な他の戦略は、Ｃｈｉａｓｍａ  ＬｔｄのＷＯ２００５／０９４７８５に記載されるような一過性の透過性促進剤（ＴＰＥ）系の使用を含む。ＴＰＥは、疎水性溶媒中の固体親水性粒子の油性懸濁液を用いて、薬物分子を好ましくない消化管（ＧＩ）環境による不活性化から保護し、また同時に、そのカーゴ薬物分子の透過を誘導するようにＧＩ壁に対して作用する。
【００６１】
粘膜上の排出ポンプの作用を阻害するために、ＵＳ２００８／０２００５６３に記載されるようなグルタチオンまたは多数のチオール基を含有する化合物の使用もさらに含まれる。そのような技法の実例は、Ｃａｌｉｃｅｔｉ，Ｐ．Ｓａｌｍａｓｏ，Ｓ．，Ｗａｌｋｅｒ，Ｇ．ａｎｄ  Ｂｅｒｎｋｏｐ−Ｓｃｈｎｕｒｃｈ，Ａ．（２００４）‘Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｏｒａｌ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ＰＥＧ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ．’Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，２２，３１５−３２３、Ｇｕｇｇｉ，Ｄ．，Ｋｒａｕｌａｎｄ，Ａ．Ｈ．，ａｎｄ  Ｂｅｒｎｋｏｐ−Ｓｃｈｎｕｒｃｈ，Ａ．（２００３）‘Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｖｉａ  ｔｈｅ  ｓｔｏｍａｃｈ：ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｏｒａｌ  ｄｏｓａｇｅ  ｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｓａｌｍｏｎ  ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ’．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．９２，１２５−１３５、およびＢｅｒｎｋｏｐ−Ｓｃｈｎｕｒｃｈ，Ａ．，Ｐｉｎｔｅｒ，Ｙ．，Ｇｕｇｇｉ，Ｄ．，Ｋａｈｌｂａｃｈｅｒ，Ｈ．，Ｓｃｈｏｆｆｍａｎｎ，Ｇ．，Ｓｃｈｕｈ，Ｍ．，Ｓｃｈｍｅｒｏｌｄ，Ｉ．，Ｄｅｌ  Ｃｕｒｔｏ，Ｍ．Ｄ．，Ｄ’Ａｎｔｏｎｉｏ，Ｍ．，Ｅｓｐｏｓｉｔｏ，Ｐ．ａｎｄ  Ｈｕｃｋ，Ｃｈ．（２００５）‘Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｈｉｏｌａｔｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ａｓ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｉｎ  ｏｒａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ’−Ｐｒｏｏｆ  ｏｆ  ｃｏｎｃｅｐｔ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ，１０６，２６−３３にも記載されている。
【００６２】
活性化合物は、ＷＯ２００４／０８４８７０に記載されるようなシームレスのマイクロスフェアに製剤化することができ、活性な薬学的成分は、ミニスフェアに製剤化されるエマルジョン、マイクロエマルジョン、または懸濁液として可溶化され、従来のまたは新規のコーティング技術のいずれかによって様々にコーティングされる。その結果は、「予め可溶化された」形態で封入された薬物であり、経口投与されると、消化管に沿った特定の位置に対して、特定の速度で、活性薬物の所定の即時放出または持続放出を提供する。基本的に、薬物を予め可溶化することで、同時に透過性および薬物安定性を増強しながら、その動態プロファイルの予測可能性を高める。
【００６３】
ＵＳ２００９／００７４８２４に記載されるように、キトサンでコーティングされたナノカプセルを用いてもよい。ナノカプセルは胃液の作用に対して安定であるため、この技術を用いて投与される活性分子はナノカプセル内で保護される。加えて、この系の粘膜付着特性は腸壁への付着時間を延長し（これらの系の消化管通過に遅延が見られることが確認されている）、活性分子のより効果的な吸収を促進する。
【００６４】
ＴＳＲｌ  Ｉｎｃ．によって開発された方法が使用されてもよい。これらは、正電荷および負電荷の両方を担持する天然由来のコラーゲン抽出物であるゼラチンが、レシチンミセル中に含有される活性成分の粒子をコーティングし、それらの凝集またはクランピングを防止する、親水性可溶化技術（ＨＳＴ）を含む。この結果、極性相互作用を介して疎水性薬物粒子の改善された水和性がもたらされる。加えて、両親媒性のレシチンが、溶解流体と粒子表面との間の表面張力を低下させる。
【００６５】
活性成分は、賦形剤としてククルビットウリルを用いて製剤化されてもよい。
【００６６】
代替として、Ｍｅｒｒｉｏｎ  ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓのＧＩＰＥＴ技術を用いて、ＵＳ２００７／０２３８７０７に記載されるような中間鎖脂肪酸もしくは中間鎖脂肪酸誘導体、またはＵＳ７２６８２１４に記載されるような膜移行ペプチドであり得る吸収促進剤とともに活性成分を含有する腸溶性コーティング錠剤を生成することもできる。
【００６７】
膨張式パウチ内で、経口投与用の薬物カプセルに入れられた制御放出剤形からなるＧＩＲＥＳ（商標）技術を用いることができる。カプセルが溶解すると、ガス発生系が胃内でパウチを膨張させる。臨床試験において、パウチが胃内に１６〜２４時間保持されることが示されている。
【００６８】
代替として、胃内の酵素分解に耐えることを可能にし、その吸収を促進させる保護修飾因子に活性成分をコンジュゲートさせてもよい。活性成分は、単分散の短鎖メトキシポリエチレングリコール糖脂質誘導体と共有結合的にコンジュゲートさせることができ、それを精製した後で、乾燥した活性な薬学的成分に結晶化および凍結乾燥させる。そのような方法は、ＵＳ５４３８０４０およびｗｗｗ．ｂｉｏｃｏｎ．ｃｏｍに記載されている。
【００６９】
また、活性成分の送達のために肝指向性小胞（ＨＤＶ）を用いてもよい。ＨＤＶは、活性成分を封入するリポソーム（≦１５０ｎｍの直径）からなってもよく、それらの脂質二重層内に肝細胞ターゲティング分子も含有する。ターゲティング分子は、封入された活性成分の肝細胞への送達を誘導し、したがって、比較的少量の活性成分が効果をもたらすのに必要とされる。そのような技術はＵＳ２００９／００８７４７９に記載され、さらにｗｗｗ．ｄｉａｓｏｍｅ．ｃｏｍにも記載されている。
【００７０】
活性成分は、インスリンに関してＵＳ２００２／０１１５５９２に記載されるような長鎖ＰＥＧ種と任意選択的に混合された中鎖部分グリセリドと会合して、アルコールおよび共溶媒を含む実質的に非水性の親水性媒体を追加的に含有する組成物に組み込まれてもよい。
【００７１】
代替として、Ｓｈｅｎ  Ｚ，Ｍｉｔｒａｇｏｔｒｉ  Ｓ，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．２００２  Ａｐｒ；１９（４）：３９１−５‘Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｐａｔｃｈｅｓ  ｆｏｒ  ｏｒａｌ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ’に記載されるような腸パッチが使用されてもよい。
【００７２】
活性成分は、米国特許第７１８９４１４号に記載されるような疎水性ポリマーとブレンドされたハイドロゲルから形成される浸食性マトリックスに組み込むことができる。
【００７３】
治療される成人ヒトの好適な経口投与量レベルは、０．０５〜５ｍｇの範囲、好ましくは約０．１〜２．５ｍｇであり得る。
【００７４】
患者の投薬治療の頻度は、１日に１回〜６回、例えば、１日に２回〜４回であってもよい。治療は、少なくとも６週間、好ましくは少なくとも６ヶ月間、好ましくは少なくとも１年間の長期間にわたって、また任意選択的に生涯にわたって維持されることが望ましいであろう。
【００７５】
関連する状態のための併用治療は、本発明による組成物と、１つ以上の他の治療薬の別個の投与とを用いて行うことができる。代替として、本開示による組成物は、併用投与のために１つ以上の他の治療薬を組み込んでもよい。
【００７６】
本開示による併用療法は、記載されるような活性化合物と、インスリン、ＧＬＰ−２、ＧＬＰ−１、ＧＩＰ、もしくはアミリンとの組み合わせ、または一般的に他の抗糖尿病薬との組み合わせを含む。したがって、合剤を含む併用療法は、メトホルミン、ブホルミンおよびフェンホルミン等のビグアナイド、バラグリタゾン、ピオグリタゾン、リボグリタゾン、ロシグリタゾンおよびトログリタゾン等のＴＺＤ（ＰＰＡＲ）、アレグリタザール、ムラグリタザールおよびテサグリタザール等の二重ＰＰＡＲアゴニストを含むインスリン抵抗性改善薬；またはカルブタミド、クロルプロパミド、グリクラジド、トルブタミド、トラザミド、グリピジド、グリベンクラミド、グリブリド、グリキドン、グリクロピラミドおよびグリメピリド等のスルホニルウレア、ナテグリニド、レパグリニドおよびミチグリニド等のメグリチニド／グリニド（Ｋ＋）、エキセナチド、リラグルチドおよびアルビグルチド等のＧＬＰ−１類似体、アログリプチン、リナグリプチン、サキサグリプチン、シタグリプチンおよびビルダグリプチン等のＤＰＰ−４阻害剤を含む分泌促進物質；（即効型）インスリンリスプロ、インスリンアスパルト、インスリングルリジン、（長時間作用型）インスリングラルギン、インスリンデテミル等のインスリン類似体または特殊な製剤、吸入用のインスリンエクスベラおよびＮＰＨインスリン；ならびにアカルボース、ミグリトール、およびボグリボース等のα−グルコシダーゼ阻害剤、プラムリンチド等のアミリン類似体、ダパグリフロジン、レモグリフロジンおよびセルグリフロジン等のＳＧＬＴ２阻害剤を含む他の薬剤だけではなくベンフルオレックスおよびトルレスタットを含む様々な薬剤とともに行われ得る。
【００７７】
さらなる組み合わせは、レプチンとの同時投与または合剤化を含む。レプチン抵抗性は、２型糖尿病の十分に確立された構成要素であるが、レプチンの注射は、これまでこの状態を改善することができていない。これとは対照的に、アミリンが、したがってアミリン様能力を有する分子が、サケカルシトニン模倣体として、レプチン感受性を改善することが可能であることを支持する証拠が存在する。アミリン／レプチンの組み合わせは、体重および食物摂取に対する相乗効果、およびインスリン抵抗性も示している［Ｋｕｓａｋａｂｅ  Ｔら］。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】カルシトニン受容体活性化の関数としてのＫＢＰ−０４６〜ＫＢＰ−０５４（図１Ａ）およびＫＢＰ−０５８〜ＫＢＰ−０６３（図１Ｂ）によるβアレスチン動員の用量反応である。用量範囲は１μＭ〜１５ｐＭであり、データはビヒクルの倍数として示される。ＤｉｓｃｏｖｅＲｘのＵ２ＯＳ  ＣＡＬＣＲ  Ｐａｔｈｈｕｎｔｅｒ細胞においてスクリーニングを行った。
【図２】アミリン受容体活性化の関数としてのＫＢＰ−０４６〜ＫＢＰ−０５４（図２Ａ）およびＫＢＰ−０５８〜ＫＢＰ−０６３（図２Ｂ）によるβアレスチン動員の用量反応である。用量範囲は１μＭ〜１５ｐＭであり、データはビヒクルの倍数として示される。ＤｉｓｃｏｖｅＲｘのＣＨＯ−Ｋ１  ＣＡＬＣＲ  ＲＡＭＰ３  Ｐａｔｈｈｕｎｔｅｒ細胞においてスクリーニングを行った。
【図３】カルシトニン受容体活性化の関数としてのＫＢＰ−０４６〜ＫＢＰ−０５４（図３Ａ）およびＫＢＰ−０５８〜ＫＢＰ−０６３（図３Ｂ）およびヒトカルシトニンによる長期βアレスチン動員である。ｔ＝０に１００ｎＭを単回投与し、最初の処置から３、６、２４、４８および７２時間後にβアレスチン動員を評価して各リガンドの長期に及ぶ可能性を調べた。データはビヒクルの倍数として示される。ＤｉｓｃｏｖｅＲｘのＵ２ＯＳ  ＣＡＬＣＲ  Ｐａｔｈｈｕｎｔｅｒ細胞においてスクリーニングを行った。
【図４】ＫＢＰ−０４６〜ＫＢＰ−０５４（図４Ａ）およびＫＢＰ−０５８〜ＫＢＰ−０６３（図４Ｂ）によるＳＤラットにおける食物摂取量の長期に及ぶ減衰。２．５μｇ／ｋｇのＫＢＰを単回皮下投与した後、０〜４時間および４〜２４時間の間隔で食物摂取量をモニタリングして個々のＫＢＰの長期に及ぶ作用を評価した。個々のラットは、各群ｎ＝４で１匹ずつケージに入れた。
【実施例】
【００７９】
本開示の実施形態を以下の実施例において説明するが、これらは、本開示を理解するのに役立つように記載されるのであって、その後に続く特許請求の範囲において定義される本開示の範囲を限定すると見なされるべきではない。以下の実施例は、当業者に、記載される実施形態をどのように作製および使用するかの完全な開示および説明を提供するために記載されるのであって、本開示の範囲を限定することを意図するものでもなく、また、以下の実験が実施した全てのまたは唯一の実験であることを表すことを意図するものでもない。用いられる数（例えば、量、温度等）に関して精度を確保する努力を行ったが、ある程度の実験誤差および偏差を考慮に入れるべきである。別途示されない限り、部は重量部であり、分子量は重平均分子量であり、温度は摂氏度であり、圧力は大気圧または大気圧近傍である。
【００８０】
以下の実施例において、以下の材料および方法が用いられた。
【００８１】
カルシトニン、アミリンおよびＣＧＲＰ受容体を発現する以下の細胞株を購入し、製造者の指示に従って培養した。
１．カルシトニン受容体（ＣＴＲ）：ＤｉｓｃｏｖｅＲｘのＵ２ＯＳ−ＣＡＬＣＲ（カタログ番号９３−０５６６Ｃ３）
２．アミリン受容体（ＡＭＹ−Ｒ）：ＤｉｓｃｏｖｅＲｘのＣＨＯ−Ｋ１  ＣＡＬＣＲ＋ＲＡＭＰ３（カタログ番号９３−０２６８Ｃ２）
【００８２】
独立したバイオアッセイにおいて、ＣＴＲおよびＡＭＹ−Ｒ細胞を、表１に特定される漸増用量のＫＢＰ（１０００、２５０、６２．５、１５．６、３．９、１．０、０．２４、０．０６、０．０２ｎＭおよびビヒクル）で表示される時点に処理した。
【００８３】
実施例１：βアレスチンアッセイ
ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ  βアレスチンＧＰＣＲアッセイは、βアレスチンと活性化ＧＰＣＲとの相互作用を検出することによってＧＰＣＲを活性化させるリガンドの能力を直接測定する全細胞機能アッセイである。βアレスチン動員はＧタンパク質シグナル伝達とは独立しているため、これらのアッセイは、事実上任意のＧｉ−、Ｇｓ、またはＧｑ−カップリング受容体のために使用され得る、強力かつ普遍的なスクリーニングおよびプロファイリングのプラットフォームを提供する。
【００８４】
このシステムにおいて、ＧＰＣＲをインフレームで小さな酵素断片であるＰｒｏＬｉｎｋ（商標）と融合させ、β−アレスチンと、より大きなβ−ｇａｌのＮ末端欠失突然変異体との融合タンパク質（酵素アクセプターまたはＥＡと称される）を安定に発現する細胞において共発現させた。ＧＰＣＲの活性化は、ＰｒｏＬｉｎｋでタグ付けされたＧＰＣＲへのβアレスチンの結合を刺激し、２つの酵素断片に相補性を持たせ、その結果として活性β−ｇａｌ酵素の形成をもたらす。この相互作用は、化学発光性のＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（登録商標）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔを使用して測定され得る酵素活性を増加させる。
【００８５】
アッセイは、白色３８４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ、７８４０８０）で行った。１０μＬの細胞型特異的培地に１ウェル当たり２５００個の細胞で細胞を播種した。ＧＰＣＲによって媒介されるβアレスチン動員を定量化するために、Ｐａｔｈｈｕｎｔｅｒ（商標）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（９３−０００１、ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ）を使用して、製造者の指示書に従ってアッセイを行った。さらに、Ｐａｔｈｈｕｎｔｅｒ（商標）βアレスチン動員アッセイからのデータを内部標準に対して正規化し、優れた性能を有するＫＢＰとそうではないものとの区別を改善した。
【００８６】
その結果は、図１、図２、および図３に見られる。図１に見られるように、ペプチドの活性は非常に類似しているが、図３に示すように、時間の経過に伴って、ＫＢＰ−０４７、ＫＢＰ−０５３（図３Ａ）ならびにＫＢＰ−０５８、０６２および０６３（図３Ｂ）は、ＣＴＲを活性化させてその活性化を維持する優れた能力を示し、個々のリガンドを１つの所与の濃度で、時間の関数としてプロットした。ここでは、ＫＢＰ−０４７、ＫＢＰ−０５３、ＫＢＰ−０５８、ＫＢＰ−０６２およびＫＢＰ−０６３が、長期に及ぶカルシトニン受容体活性化という観点から他のペプチドよりも優れていることは明らかである。これは、ＤｉｓｃｏｖｅＲｘのカルシトニン受容体（ＣＴＲ）：Ｕ２ＯＳ−ＣＡＬＣＲ（カタログ番号９３−０５６６Ｃ３）細胞株を使用して行われ、古典的な３時間のアウトプットとは対照的に、２４、４８、および７２時間にわたってβアレスチンの蓄積を行い、次いで分析した。
【００８７】
このクラスの分子の別の重要な特色は、アミリン受容体を活性化する能力である。図２Ａおよび図２Ｂに見られるように、ＫＢＰは、この受容体を活性化することが完全に可能であり、ＫＢＰ−０４７、ＫＢＰ−０５３、ＫＢＰ−０５８、ＫＢＰ−０６２およびＫＢＰ−０６３は、強力なアミリンアゴニストであることが証明される。図のサブセットにおいて、βアレスチンアッセイを用いて長期の受容体活性化を評価した。
【００８８】
実施例２：健康なスプラーグドーリーラットにおける食物摂取量に対するＫＢＰ−０４７対ＫＢＰ−０６３の比較効果
個々の試験の４日前に、ラットを１匹ずつケージに入れた。それらを体重により７つの群に無作為化した（ビヒクル（０．９％のＮａＣｌ）、ＫＢＰ（用量：２．５μｇ／ｋｇ）。ラットを一晩絶食させ、次いで、午前中に、皮下投与を用いてペプチドまたはビヒクルの単回投与で処理した。食物摂取量を以下の間隔（０〜４時間および４〜２４時間）でモニタリングした。
【００８９】
図４Ａに見られるように、ＫＢＰ−０４７およびＫＢＰ−０５３はいずれも、４時間の間隔内に食物摂取量の減少をもたらし、その効果は２４時間まで維持され、ＫＢＰ−０４７が最大の減少をもたらし、そのすぐ後にＫＢＰ−０５３が続いた。
【００９０】
図４Ｂに見られるように、ＫＢＰ−０５８、ＫＢＰ−０６２およびＫＢＰ−０６３はいずれも、４時間の間隔内に食物摂取量の減少をもたらし、その効果は２４時間まで維持され、ＫＢＰ−０６２が最大の減少をもたらし、その後にＫＢＰ−０５８およびＫＢＰ−０６３がその順序で続いた。ｈＣＴ相同性の関数としての食物摂取量の概要を表２に見ることができる。
【表２】
2020511479.tif 000008
【００９１】
全体的に、ＫＢＰ−０６２が、スクリーニングにおける対応する優れた性能と併せた、高いｈＣＴ相同性の最良の組み合わせを有する。
【００９２】
本明細書において、別途明示的に示されない限り、「または」という語は、条件のうちの１つのみが満たされることを必要とする操作語「排他的または」とは対照的に、記載される条件のいずれかまたは両方が満たされる場合に真値を返す操作語の意味で使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語は、「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」を意味するのではなく、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の意味で使用される。上記で認められた全ての先行する教示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【図１Ａ】
2020511479.tif 000011
【図１Ｂ】
2020511479.tif 000012
【図２Ａ】
2020511479.tif 000013
【図２Ｂ】
2020511479.tif 000014
【図３Ａ】
2020511479.tif 000015
【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
2020511479.tif 000017
【図４Ｂ】
2020511479.tif 000018
【配列表】
2020511479000001.app
【国際調査報告】
2020511479.tif 000019
2020511479.tif 000020