(57)【要約】本開示は、バイオロジカルスキャフォールド、それらの合成方法、及び、それらの使用方法を提供する。当該バイオロジカルスキャフォールドは、少なくとも２つの成分、まず、哺乳動物細胞血小板溶解物、及び、脂肪組織由来細胞画分（ＡＴＤＣＦ）細胞を含む。当該バイオロジカルスキャフォールド（複数可）を含む製剤は、ゲル、半固体または、固体の基材とし得るものであり、当該基材の少なくとも１つの表面が、当該バイオロジカルスキャフォールドと接触して生体適合性材料を形成する。当該バイオロジカルスキャフォールド、及び、バイオロジカルスキャフォールド含有製剤は、広範囲の医療機器技術において有用性を見出すことができ、そして、治療目的のために、または、インビトロ及びインビボで様々な薬剤を試験する実験を実施するために使用し得る。【選択図】図１
2020506200.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物血小板溶解物、及び、脂肪組織由来細胞画分（ＡＴＤＣＦ）細胞を含む、バイオロジカルスキャフォールド。
【請求項２】
前記ＡＴＤＣＦ細胞が、間質血管画分細胞、脂肪由来間質細胞、脂肪由来幹細胞、骨髄由来間葉系間質細胞、及び、骨髄由来間葉系幹細胞を含む、請求項１に記載のバイオロジカルスキャフォールド。
【請求項３】
前記ＳＶＦ細胞が、ヒト脂肪組織に由来する、請求項２に記載のバイオロジカルスキャフォールド。
【請求項４】
前記哺乳動物血小板溶解物が、ヒト血小板に由来する、請求項１に記載のバイオロジカルスキャフォールド。
【請求項５】
前記バイオロジカルスキャフォールドが、ＳＶＦ細胞を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のバイオロジカルスキャフォールド。
【請求項６】
前記バイオロジカルスキャフォールドが、脂肪由来間質細胞、及び、脂肪由来幹細胞の少なくとも１つを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のバイオロジカルスキャフォールド。
【請求項７】
前記バイオロジカルスキャフォールドが、骨髄由来間葉系間質細胞、及び、骨髄由来間葉系幹細胞の少なくとも１つを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のバイオロジカルスキャフォールド。
【請求項８】
バイオロジカルスキャフォールド、及び、基材を含む治療薬であって、前記基材が、前記生物学的製剤を適用するための少なくとも１つの表面を有する、前記治療薬。
【請求項９】
前記基材が、組織培養プレート、整形外科用装置、歯科用移植片、脱塩骨スキャフォールド、包帯、合成メッシュ、金属製移植片、または、セラミック製移植片を含む、請求項８に記載の治療薬。
【請求項１０】
前記バイオロジカルスキャフォールドを、混合、播種、灌流、毛管作用による充填、遠心分離による充填、注入、印刷、または、バイオロジカルスキャフォールドのバイオ印刷によって、基材に接触させる、請求項９に記載の治療薬。
【請求項１１】
前記バイオロジカルスキャフォールドが、プレ脂肪細胞、血管平滑筋細胞、内皮細胞、及び、前駆体、Ｂ及びＴリンパ球、及び、前駆体、造血前駆体、マクロファージ、単球間葉系細胞、ニューロン、ニューロン前駆細胞、内皮細胞、内皮前駆細胞、線維芽細胞、真皮、表皮、がん由来細胞、がん幹細胞、軟骨細胞、筋肉細胞、脂肪細胞、骨芽細胞、破骨細胞、骨髄細胞、血液細胞、ならびに、それらの組み合わせさらに含む、請求項１に記載のバイオロジカルスキャフォールド、または、請求項８に記載の治療薬。
【請求項１２】
前記基材が、骨である、請求項８に記載の治療薬。
【請求項１３】
前記基材が、コラーゲン、脂肪細胞外マトリックスタンパク質、または、ｈＰＬゲルを含む、請求項８に記載の治療薬。
【請求項１４】
前記基材が、ゲル、半固体、または、固体基材である、請求項８に記載の治療薬。
【請求項１５】
前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項１１に記載のバイオロジカルスキャフォールド、または、治療薬。
【請求項１６】
前記細胞が、ヒト細胞である、請求項１１に記載のバイオロジカルスキャフォールド、または、治療薬。
【請求項１７】
前記細胞が、マウス細胞である、請求項１１に記載のバイオロジカルスキャフォールド、または、治療薬。
【請求項１８】
前記細胞が、脂肪由来幹細胞である、請求項１１に記載のバイオロジカルスキャフォールド、または、治療薬。
【請求項１９】
前記ＳＶＦ細胞が、内皮前駆体からなる、請求項１１に記載のバイオロジカルスキャフォールド、または、治療薬。
【請求項２０】
前記ＳＶＦ細胞が、造血前駆体からなる、請求項１１に記載のバイオロジカルスキャフォールド、または、治療薬。
【請求項２１】
前記ＳＶＦ細胞が、免疫細胞からなる、請求項１１に記載のバイオロジカルスキャフォールド、または、治療薬。
【請求項２２】
前記ＳＶＦ細胞が、血管平滑筋細胞からなる、請求項１１に記載のバイオロジカルスキャフォールド、または、治療薬。
【請求項２３】
前記ＳＶＦ細胞が、線維芽細胞からなる、請求項１１に記載のバイオロジカルスキャフォールド、または、治療薬。
【請求項２４】
バイオロジカルスキャフォールド含有製剤または装置を製造する方法であって、前記方法が、
脂肪組織を採取し、
前記脂肪組織からＡＴＤＣＦ細胞を単離し、
哺乳動物血小板溶解物を調製し、
前記ＡＴＤＣＦ細胞と、前記哺乳動物血小板溶解物とを合わせて、バイオロジカルスキャフォールドを形成し、及び、
前記スキャフォールドを、基材の少なくとも１つの表面に適用または接触させる、
工程を含む、前記方法。
【請求項２５】
前記ＡＴＤＣＦ細胞が、ＳＶＦ細胞である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＳＶＦ細胞が、内皮前駆体からなる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＳＶＦ細胞が、造血前駆体からなる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＳＶＦ細胞が、免疫細胞からなる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＳＶＦ細胞が、血管平滑筋細胞からなる、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＳＶＦ細胞が、線維芽細胞からなる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＳＶＦ細胞を、プレ脂肪細胞、血管平滑筋細胞、内皮細胞、及び、前駆細胞、Ｂ及びＴリンパ球、及び、前駆細胞、造血前駆細胞、マクロファージ、単球の１つ以上から選択する、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＡＴＤＣＦ細胞が、脂肪由来間質細胞、及び、脂肪由来幹細胞の１つ以上を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＡＴＤＣＦ細胞が、骨髄由来間葉系間質細胞、及び、骨髄由来間葉系幹細胞の少なくとも１つを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３４】
前記バイオロジカルスキャフォールドを、混合、播種、灌流、毛管作用による充填、遠心分離による充填、注入、印刷、または、バイオ印刷によって、前記基材の前記少なくとも１つの表面に適用または接触させる、請求項２４に記載の方法。
【請求項３５】
前記哺乳動物血小板を、凍結／解凍プロセスを用いて溶解する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
哺乳動物血小板が、ヒト血小板である、請求項２４に記載の方法。
【請求項３７】
患者の組織を再生または修復する方法であって、以下の工程、
バイオロジカルスキャフォールドを調製し、及び、
前記バイオロジカルスキャフォールドを患者に移植する、
ことを含む、前記方法。
【請求項３８】
患者の組織を再生または修復する方法であって、以下の工程、
バイオロジカルスキャフォールドを調製し、
前記バイオロジカルスキャフォールドを、約３７℃で、一晩、インキュベートし、及び
前記バイオロジカルスキャフォールドを患者に移植する、
ことを含む、前記方法。
【請求項３９】
前記組織が、脂肪、骨、筋肉、骨髄、血液、皮膚、または、軟骨を含む、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記組織を、白色脂肪、ベージュ色脂肪、または、褐色脂肪の１つ以上から選択する、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記患者が、ヒトである、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４２】
患者への前記バイオロジカルスキャフォールドの移植が、前記バイオロジカルスキャフォールドを、基材の少なくとも１つの表面に接触または適用し、及び、前記患者の組織再生または組織修復の箇所に、前記基材を移植する、ことをさらに含む、請求項３７〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
薬剤の有効性または毒性を試験する方法であって、前記方法が、
バイオロジカルスキャフォールドを調製し、
前記バイオロジカルスキャフォールドを、薬剤と接触させ、
前記バイオロジカルスキャフォールドを、前記薬剤と共に培養し、及び、
前記バイオロジカルスキャフォールドでの細胞の生存について試験をする、
ことを含む前記方法。
【請求項４４】
前記薬剤が、増殖因子、分化因子、サイトカイン、ケモカイン、アジポカイン、抗生物質、抗真菌薬、抗真菌剤、抗炎症剤、または、抗癌剤を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
バイオロジカルスキャフォールドと、ヒト疾患の再現病変とを含む機能性ヒト脂肪パッドを含む免疫障害または免疫不全マウスであって、前記マウスが、異種移植マウスである、前記免疫障害または免疫不全マウス。
【請求項４６】
１つ以上のバイオロジカルスキャフォールドを含有するマイクロ流体装置であって、前記バイオロジカルスキャフォールドが、単離され、かつ、培地、及び／または、薬剤の均一な流れに供することができる、前記マイクロ流体装置。
【請求項４７】
薬剤の有効性または毒性を試験する方法であって、前記方法が、
互いに分離されており、かつ、マイクロ流体装置に入れられている、少なくとも２つのバイオロジカルスキャフォールドを調製し、
前記マイクロ流体装置を薬剤で処理し、
前記マイクロ流体装置を、前記薬剤と共に培養し、及び、
前記マイクロ流体装置での細胞の生存について試験をする、
ことを含む前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
この国際ＰＣＴ出願は、２０１７年２月１０日に出願した米国仮特許出願第６２／４５７，３６６号の優先権及び利益を主張するものであり、その出願の全内容を、本明細書の一部を構成するものとして援用する。
【０００２】
連邦政府から資金提供を受けた研究に関する陳述
本発明は、ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈより、Ｆｅｄｅｒａｌ  Ｇｒａｎｔ番号第Ｒ２１ＤＫ０９４２５４号の下で、合衆国政府の支援を受けて完成をした。合衆国政府は、本発明について、一定の権利を有する。運営の一部を、ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈから拠出された補助金でまかなっているＣＯＢＲＥ（ＮＩＨ  ８  Ｐ２０−ＧＭ１０３５２８）、及び、ＮＯＲＣ（ＮＩＨ  ２Ｐ３０−ＤＫ０７２４７６）センターが運営しているｔｈｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｉｍａｇｉｎｇ  Ｃｏｒｅの施設の一部を使用して、本発明を完成した。
【０００３】
本開示は、脂肪組織に由来する新規のバイオロジカルスキャフォールド、そのようなスキャフォールドを利用する製品、及び、それらの使用方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
単離したヒトのプレ脂肪細胞及び脂肪細胞を、二次元（２Ｄ）培養において汎用して、健康脂肪組織、及び、罹患脂肪組織に関連するシグナル伝達経路を同定しているが、標準的な２Ｄ培養モデルは、実質的に制限を受けている。二次元モデルは、臨床的肥満に特徴的に関連する脂肪細胞の過形成及び肥大の進行を再現することができない。２Ｄモデルが被る生体力学的制約が故に、ヒトの肥満に特徴的な古典的な単房性または「印環」脂肪細胞を作製することは不可能である。これらの独特な構造は、三次元（３Ｄ）モデルにおいてのみ可能である。２Ｄモデルとは異なり、組織工学で作製した３ＤヒトＳＶＦ細胞構築物は、生体模倣環境における遺伝子発現、細胞極性、及び、細胞間相互作用に影響を与える生化学的、生体力学的、及び、生物物理学的シグナルを組み合わせる。３Ｄモデルとは対照的に、２Ｄ単分子層モデルは、生理学的条件、及び、病理学的条件の双方の条件下で、天然脂肪組織内に滞留する循環造血細胞を捕捉することができない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
以下に説明する本発明の特定の新規の特徴事項は、本明細書に添付をした特許請求の範囲で記載をしているが、当業者であれば、例示した本発明の形態及び詳細、そして、その動作について、本開示の趣旨から逸脱することなく、様々な省略、修正、置換、及び、変更が可能であると理解しているので、本発明を、詳細に説明したものに限定する意図はない。本開示のいかなる特徴も、それが「必須」または「不可欠」であると明確に述べられていない限りは、必須または不可欠ではない。
【０００６】
本開示は、組織工学で作製した、機能性、ヒト化、細胞バイオロジカルスキャフォールドを提供するものであり、同バイオロジカルスキャフォールドは、再生医療、組織リモデリング、ならびに、細胞増殖、及び、分化の研究のための実験モデル、ならびに、その他の創薬用途における使用のための様々な生体適合性製品の製造を可能にする。幾つかの実施形態では、当該バイオロジカルスキャフォールドは、少なくとも２つの成分、すなわち、哺乳動物血小板溶解物、及び、脂肪組織由来細胞画分（ＡＴＤＣＦ）を含む。関連する実施形態では、当該バイオロジカルスキャフォールドは、間質性血管画分細胞、脂肪由来間質細胞、脂肪由来幹細胞、骨髄由来間葉系間質細胞、及び、骨髄由来間葉幹細胞の１つ以上を含むが、これらに限定されない。
【０００７】
様々な実施形態では、本明細書で例示したバイオロジカルスキャフォールドは、細胞分化、新規の組織、例えば、脂肪、軟骨、骨、血球、血管、及び、それらの組み合わせの作製の研究に向けた数多くの用途を有する。さらに、当該バイオロジカルスキャフォールドを、自然環境に近い生理学的環境を必要とするあらゆる細胞型で播種して、疾患プロセスを模倣することができる。特定の例示的な実施形態は、患者由来の異種移植片腫瘍、または、標準がん細胞株由来のその他の腫瘍の作製を含むことができ、それらは、組織培養での二次元構築物、もしくは、三次元構築物で培養し得るものであり、または、例えば、マウスモデルにおいて、インビボで移植し得る。
【０００８】
さらなる実施形態では、本明細書に記載の当該生物学的構築物は、さらに利用し得る製品に組み込み得る。
【０００９】
幾つかの実施形態では、本明細書に開示したスキャフォールドを組み込んだ例示的な装置は、ａ）脂肪組織由来細胞画分（ＡＴＤＣＦ）由来の１つ以上の細胞成分、哺乳動物血小板溶解物、及び、任意に、細胞集団と、ｂ）入口と出口とを備えた微小流体形態を有する、ヒト由来、及び／または、シルクをベースとした静的三次元（３Ｄ）培養物との組み合わせを含み得る。これらの細胞とバイオロジカルスキャフォールドとの組み合わせは、当該ＡＴＤＣＦに存在する１つ以上の細胞サブタイプの様々な組み合わせについての短期及び長期の３Ｄでのインビトロ培養、または、小型動物及び大型動物モデルの双方へのインビボでの移植を可能にする。特定の実施形態では、本開示は、脂肪組織常在性間質血管画分（ＳＶＦ）細胞集団と哺乳動物血小板溶解物との組み合わせを含む、組織工学で作製した、ヒト化、脂肪デポーを提供するものであって、当該血小板溶解物は、ヒト血小板溶解物とし得る。この細胞／バイオロジカルスキャフォールドの組み合わせは、ＳＶＦ内に存在する１つ以上の細胞サブタイプの様々な組み合わせの短期及び長期の三次元インビトロ培養、または、小型動物及び大型動物モデルの双方へのインビボでの移植を可能にする。シルク、ヒト血小板溶解物、及び、ＡＴＤＣＦ（ＳＶＦ細胞）は、健常者、及び、代謝的に罹患したヒト脂肪デポーの双方に関連した、強固な細胞接着、脂肪細胞分化、及び、細胞多様性の保持を可能にする。これらの構築物は、それらの巨視的構造及び細胞構造、ならびに、機能を維持しながら、数週間以上にわたって培養することができる。加えて、本明細書で提案したバイオロジカルスキャフォールドは、生物活性であり、生体適合性であり、ドナーＤＮＡを含まず、起源がヒトであり、自家移植及び同種移植の双方に適しており、そして、間質／幹細胞増殖を支持する。
【００１０】
静的及びミクロ流体インビトロ構築物は、双方共に、それらの巨視的構造及び細胞構造、ならびに、機能を維持しながら、短期または長期の培養のために、培養することができる。加えて、本明細書で提案したバイオロジカルスキャフォールドは、生物活性であり、生体適合性であり、ドナーＤＮＡを含まず、起源がヒトであり、自家移植及び同種移植の双方に適しており、そして、間質／幹細胞増殖を支持する。
【００１１】
この発見に従って、本開示の目的は、脂肪組織由来幹／間質細胞、間質血管画分細胞、または、脂肪組織内に存在するその他の初代細胞のための静的なマイクロ流体３Ｄインビトロプラットフォームを提供することである。
【００１２】
本開示のさらなる目的は、インビトロでヒト化したマウス、もしくは、インビボにて、マウス、または、その他の小型もしくは大型の動物に由来する脂肪組織デポーを提供することにある。
【００１３】
本開示のさらなる目的は、薬理学的薬物検査、及び、がん微小環境研究のための方法を提供することにある。
【００１４】
本開示のその他の目的及び利点は、以下の説明から自明である。
【００１５】
以下の図面は、本明細書の一部を構成しており、かつ、本開示の特定の態様をさらに実証するために含めている。本開示を、これらの図面の１つ以上を、本明細書に示した特定の実施形態の説明と組み合わせて参照することで、理解を深め得る。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本研究で使用した細胞の特徴を示す。ｌａ）。ＳＶＦ連続移植研究のために利用したＧＦＰ−Ｔｇ  ＳＶＦ細胞での亜集団の円グラフ。１ｂ）。ＧＦＰ−Ｔｇ  ＡＳＣ連続移植研究のためにＰ２  ＡＳＣにまで培養増殖したＣＤ１４６−ＣＤ２９＋、及び、ＣＤ１４６−ＣＤ３４＋亜集団の選別及び集中。ｌｃ）。ＧＦＰ−Ｔｇ  ＳＶＦ細胞、及び、継代２（Ｐ２）まで培養増殖したＧＦＰ−Ｔｇ  ＡＳＣの免疫表現型。すべての実験を、３回繰り返した。試料の規模は、ｎ＝３／複製。数値を、平均＋標準偏差（μ＋ＳＤ）として報告した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図２】ＣＤ２９を豊富に含有した、及び、ＣＤ３４を豊富に含有したＧＦＰ−Ｔｇ  ＡＳＣの比較を示す。２ａ）。ＣＤ１４６−ＣＤ２９＋、及び、ＣＤ１４６−ＣＤ３４＋の免疫表現型を、ＧＦＰ−Ｔｇ  ＡＳＣ亜集団へと選別した。免疫表現型は、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１Ｂ、Ｓｃａ−１、及び、ＣＤ１０５表面抗原の発現に基づいた。２ｃ）。未分画ＧＦＰ−Ｔｇ  ＡＳＣ、ＣＤ１４６−ＣＤ２９＋ＧＦＰ−Ｔｇ  ＡＳＣ、及び、ＣＤ１４６−ＣＤ３４＋ＧＦＰ−Ｔｇ  ＡＳＣの脂質生成分化、及び、２ｄ）コロニー形成アッセイ。すべての実験を、３回繰り返した。試料の規模は、ｎ＝３／複製。数値は、平均＋標準偏差（μ＋ＳＤ）として報告した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１である。
【図３】マウスにおけるＧＦＰ−Ｔｇ  ＳＶＦ細胞移植片の内部、及び、周囲にある、組織工学で作製した脂肪の毎週の状態を示す。３ａ）。スキャフォールドを、細胞を含めずに移植し、または、５００ｋ  ＧＦＰ−Ｔｇ  ＳＶＦ細胞をシルクスキャフォールドに移植した。スキャフォールドを移植して、１週間後、２週間後、または、６週間後に取り出した。３ｂ）。移植直後、ならびに、最初の移植から１週間後、及び、６週間後に、パーセントヘモグロビン飽和度を測定した。３ｃ）。３ａの顕微鏡画像のＩｍａｇｅＪ分析を介した、取り出したスキャフォールド（外植片）生着の定量であり、試料の規模は、ｎ＝６／グループである。３ｄ）。移植して１週間後、２週間後、及び、６週間後のスキャフォールド質量測定。試料の規模は、ｎ＝２０である。定量は、移植の１週間後のＳＶＦ媒介生着促進を示す顕微鏡画像と符合する。３ｅ）。ＳＶＦ細胞の毎週の定量は、２週目までのＳＶＦ細胞の持続性と増殖、そして、分化と相関する。数値は、平均＋標準偏差（μ＋ＳＤ）として報告した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図４−１】２度の連続移植を経たマウスにおける、ＨＦＩＰ  ６週間のシルクスキャフォールド移植片を用いた、組織工学で作製した脂肪に由来するＧＦＰ−Ｔｇ  ＳＶＦの検出を示す。インビボでＧＦＰ−Ｔｇ  ＳＶＦ細胞の移植をして１週間後、４週間後、及び、６週間後の顕微鏡画像は、持続性、増殖性、及び、ＧＦＰ−Ｔｇ脂肪デポーを形成する能力を実証している。４ａ）。最初の６週間でのＧＦＰ−Ｔｇ  ＳＶＦ細胞（Ｔ０）移植片内のＧＦＰ、ＢＯＤＩＰＹ、ＤＡＰＩの共焦点顕微鏡画像、及び、合成画像。４ｂ）取り出した６週間のＧＦＰ−Ｔｇ  ＳＶＦ細胞の第１連続（Ｔ１）、及び、第２連続（Ｔ２）移植のＧＦＰ／ＢＯＤＩＰＹ／ＤＡＰＩの合成画像。試料の規模は、ｎ＝５である。４ｃ）Ｔ０、Ｔ１、及び、Ｔ２移植後に取り出した脂肪スキャフォールドにおけるＧＦＰ発現のフローサイトメトリー分析。試料の規模は、ｎ＝１８である。４ｄ）。Ｔ０外植片の毎週の共焦点画像についてのＩｍａｇｅＪ分析。４ｅ）取り出したＴ０  ＧＦＰ−Ｔｇ  ＳＶＦ細胞移植片についてのＧＦＰ発現の毎週のフローサイトメトリー分析の定量。４ｆ）。取り出した６週間のＴ０、Ｔ１、及び、Ｔ２移植片由来の試料でのＧＦＰ  ＤＮＡ発現。ＧＦＰ発現を、発現倍数として報告し、そして、ＧＡＰＤＨ発現に対して正規化した。４ｇ）。６週間のＴ２移植片から単離したＳＶＦ細胞におけるＧＦＰ、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、及び、Ｓｃａ−１抗原発現の発現に基づいた免疫表現型。数値を、平均＋標準偏差（μ＋ＳＤ）として報告した。個々のグループを、ＧＦＰ＋コントロールと比較している。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。播種したＧＦＰ−ＳＶＦ  Ｔ２を、播種していないコントロール群と比較している。及び、ｐ＜０．０５。
【図４−２】図４−１の続き。
【図５】連続シルク移植片に播種したＧＦＰ−Ｔｇ  ＡＳＣでの脂肪形成、及び、機能性を示す。５ａ）。細胞を含まない（コントロール）、または、シルクスキャフォールドに（ａ）５００ｋの未選別のＧＦＰ−Ｔｇ  ＡＳＣ、（ｂ）ＣＤ１４６−ＣＤ２９＋ＧＦＰ−Ｔｇ  ＡＳＣ、または、（ｃ）ＣＤ１４６−ＣＤ３４＋ＧＦＰ−Ｔｇ  ＡＳＣを移植したスキャフォールドの顕微鏡画像。スキャフォールドを、移植して６週間後に取り出した。５ｂ）。コホート（ａ）〜（ｃ）から取り出したスキャフォールドの画像。５ｃ）。最初の（Ｔ０）移植の６週間後に、グループ（ａ）〜（ｃ）において、パーセントヘモグロビン飽和度を測定した。５ｄ）。４ｂにおける顕微鏡画像のＩｍａｇｅＪ分析を経た、取り出したスキャフォールド（外植片）生着の定量であり、試料の規模は、ｎ＝６／グループである。５ｅ）。コホート（ａ）〜（ｃ）の６週間後の移植片、及び、細胞を播種しなかったコントロール移植であるスキャフォールドの質量測定。５ｆ）。６週間の移植片、コホート（ａ）〜（ｃ）に由来する周囲の脂肪、及び、播種をしていないコントロールグループから回収したＳＶＦの定量。試料の規模は、ｎ＝１８／グループである。機能性を、６週間のＴ１移植構築物を用いて、５ｇ）グルコースの取り込み、及び、５ｆ）グリセロール分泌アッセイで測定した。Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いて、データを分析した。二元配置分散分析を行った。データを、平均＋ＳＤとして報告した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。ＣＤ３４を豊富に含有したグループと比較している。ｐ＜０．０５。
【図６】２度の連続移植を経たマウスにおける、ＨＦＩＰ  ６週間のシルクスキャフォールド移植片を用いた、組織工学で作製した脂肪に由来するＣＤ１４６−ＣＤ２９＋ＧＦＰ−Ｔｇ  ＡＳＣ、及び、ＣＤ１４６−ＣＤ３４＋ＧＦＰ−Ｔｇ  ＡＳＣの検出を示す。ＧＦＰ−Ｔｇ  ＣＤ２９を豊富に含む、及び、ＣＤ３４を豊富に含む顕微鏡画像（コホート（ａ）〜（ｃ）細胞の移植は、インビボで、６週間後には、未選別のＧＦＰ−Ｔｇ  ＳＶＦコホートと同様に、持続性、増殖性、及び、ＧＦＰ−Ｔｇ脂肪デポーを形成する能力を実証している。６ａ）。６週間のＧＦＰ−Ｔｇ  ＡＳＣ連続（Ｔ１）移植片内のＧＦＰ、ＢＯＤＩＰＹ、ＤＡＰＩの共焦点顕微鏡画像、及び、合成画像。６ｂ）ＣＤ２９を豊富に含有した、及び、ＣＤ３４を豊富に含有した６週間のＴ１グループの共焦点画像は、ＣＤ２９を豊富に含有したグループよりも、ＣＤ３４を豊富に含有したグループにおける微小血管形成の観察を反映していた。ｎ＝５／グループ／複製。６ｃ）Ｔ０、及び、６ｄ）Ｔ１移植後のコホート（ａ）〜（ｃ）から取り出した脂肪スキャフォールドにおけるＧＦＰ発現のフローサイトメトリー分析。６ｅ）。取り出した６週間のＴ０及びＴ１移植片由来の試料におけるＧＦＰ  ＤＮＡ発現。ＧＦＰ発現は、発現倍数として報告しており、そして、ＧＡＰＤＨ発現に対して正規化した。６ｆ）Ｔ０、及び、６ｇ）Ｔ１  ＧＦＰ−Ｔｇ  ＡＳＣ細胞移植片を移植して６週間後の％ＧＦＰ陽性の定量。データを、平均＋ＳＤとして報告した。個々のグループを、未選別の細胞を播種したグループと比較している。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。ＣＤ３４を豊富に含有したグループと比較している。ｐ＜０．０５。
【図７】ＧＦＰ−Ｔｇ  ＳＶＦ細胞、ＣＤ２９を豊富に含有した、及び、ＣＤ３４を豊富に含有したＧＦＰ−Ｔｇ  ＡＳＣが、周囲の組織に浸潤して、機能的ＧＦＰ−Ｔｇ脂肪を生成する、ことを示す。ＳＶＦ及びＡＳＣ構築物を取り囲む２ｍｍ以内の脂肪の共焦点顕微鏡画像は、ＧＦＰ陽性を示した。７ａ）非ＧＦＰ−Ｔｇマウス、及び、ＧＦＰ−Ｔｇマウスにおいて、それぞれ、ＢＯＤＩＰＹ、及び、ＤＡＰＩで染色したネガティブコントロール脂肪、及び、ポジティブコントロール脂肪の合成画像。７ｂ）未選別ＧＦＰ−Ｔｇ  ＳＶＦ細胞、未選別ＧＦＰ−Ｔｇ  ＡＳＣ、ならびに、ＣＤ１４６−ＣＤ２９を豊富に含有した、及び、ＣＤ３４を豊富に含有したＧＦＰ−Ｔｇ  ＡＳＣを播種した、６週間構築物を取り囲む脂肪の画像。ｎ＝５／グループ／複製。７ｃ）７ａ及び７ｂの共焦点画像の定量。機能性を、７ｄ）グリセロール分泌、及び、７ｅ）６週間のＴ１移植構築物を用いたグルコース取り込みアッセイによって報告した。データを、平均＋ＳＤとして報告した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図８】シルクをベースとした３Ｄ培養物の開発に関与する全体的なプロセスを示す。ＳＶＦ細胞を、確立したプロトコルに従って、ＧＦＰ−Ｔｇ  Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの鼠径部白色脂肪組織から単離した（材料及び方法を、参照されたい）。ＣＤ１４６−ＧＦＰ−Ｔｇ  ＳＶＦ細胞を、ＣＤ２９＋、及び、ＣＤ３４＋発現に基づいて選別、及び、選択した。ＣＤ２９＋を豊富に含有した細胞、ＣＤ３４＋を豊富に含有した細胞、及び、未選別細胞をシルクスキャフォールドに播種して、非ＧＦＰ−Ｔｇマウスに移植するか、または、ＡＳＣ様集団を継代２まで培養増殖し、シルクスキャフォールドに播種し、そして、非Ｔｇマウスに移植した。移植の６週間後に、培養組織構築物を取り出し、コラゲナーゼ組織消化プロトコルを用いて消化した（材料及び方法を、参照されたい）。単離した細胞を、プレーティングし、増殖させ、そして、連続的に移植した。
【図９】移植研究のためのシルクスキャフォールドへのＧＦＰ−Ｔｇ  ＡＳＣのインビトロ播種を示す。９ａ）。ＤＡＰＩ及びＧＦＰ発現の１００倍率の共焦点画像、９ｂ）。インビトロでシルクスキャフォールドに播種して１８時間後の代謝的に活性なＧＦＰ−Ｔｇ  ＡＳＣにおけるＤＡＰＩ／ＧＦＰ発現の明視野、及び、合成。９ｃ）。脂質生成培地における５日間の脂質生成分化型ＧＦＰ−Ｔｇ  ＡＳＣの共焦点顕微鏡画像。９ｄ）。８０倍率での非接種スキャフォールドの極低温走査電子顕微鏡（ｃｒｙｏ−ＳＥＭ）画像。インビトロでシルクスキャフォールドに導入してから２時間後、及び、１８時間後に、９ｅ）Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ染色で存在しており、及び、９ｆ）ＤＡＰＩ染色で接着していた、代謝的に活性なＧＦＰ−Ｔｇ  ＡＳＣ。Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ分析で決定した相対蛍光強度（ＲＦＵ）を、スキャフォールドの湿重量に対して正規化し、そして、各スキャフォールドグループ内でＡＳＣを播種して２時間、及び、１８時間後に、細胞接着レベルの尺度として使用した。すべての実験を、３回繰り返した。試料の規模は、ｎ＝５／複製。数値を、平均＋標準偏差（μ＋ＳＤ）として報告した。＊＊ｐ＜０．０１。
【図１０】ヒト間質血管画分、及び、ヒト血小板溶解物の熱応答性３Ｄ培養物（ＳＶＦ／ハプリー３Ｄ構築物）を構築するためのプロセスの概略図を示す。ヒトＳＶＦ細胞を、消化したヒト脂肪組織から単離する。ｈＳＶＦ細胞を、至適濃度のｈＰＬ補充間質培地と混合し、そして、５％のＣＯ２を注入しながら、３７℃で、インキュベートする。熱応答性自己組織化マトリックスは、細胞−ｈＰＬ／培地の組み合わせと混合すると直ちに形成する。
【図１１】伝統的な２Ｄ単分子層培養と比較した、ｈＰＬにおける３Ｄ条件で培養したヒトＳＶＦ細胞の増殖能力を示す。細胞増殖を、２Ｄまたは３Ｄ培養条件で、３日間、５日間、及び、７日間培養した後に、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ試薬を介して測定した。存在し、かつ、接着している代謝的に活性なＳＶＦを、インビトロでシルクスキャフォールドに導入して２４時間後、４８時間後、及び、７２時間後に定量する。Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ吸光度分析によって決定した細胞数を、細胞数滴定標準曲線に対して正規化し、そして、各ｈＰＬマトリックスグループ内の細胞増殖の尺度として使用した。すべての実験を、３回繰り返した。試料の規模は、ｎ＝３／複製。数値を、平均＋標準偏差（μ＋ＳＤ）として報告した。＊ｐ＜０．０５。
【図１２】３Ｄ  ｈＰＬ培養におけるｈＳＶＦスフェロイド形成を示す。顕微鏡画像は、スフェロイド形成が、低濃度のｈＰＬで発生する、ことを実証している。スフェロイドの大きさ及び密度は、そのいずれもが、間質培地におけるパーセントｈＰＬ濃度と直接に相関している。すべての実験を、３回繰り返した。試料の規模は、ｎ＝３／複製。数値を、平均＋標準偏差（μ＋ＳＤ）として報告した。＊ｐ＜０．０５。
【図１３】細胞数に関連した、細胞媒介マトリックスのゲル化とマトリックス安定性との間の相関関係を示す。すべての実験を、３回繰り返した。試料の規模は、ｎ＝５／複製。数値を、平均＋標準偏差（μ＋ＳＤ）として報告した。＊ｐ＜０．０５。
【図１４】ｈＰＬをベースにしたマトリックスと共に培養した場合の、間質血管画分の増殖挙動、及び、スフェロイド形成挙動を示す。細胞増殖を、２Ｄまたは３Ｄ培養条件で、３日間、５日間、及び、７日間培養した後に、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ試薬を介して測定した。存在し、かつ、接着している代謝的に活性なＳＶＦを、当該マトリックスに接種して２４時間後、４８時間後、及び、７２時間後に定量する。Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ吸光度分析によって決定した細胞数を、細胞数滴定標準曲線に対して正規化し、そして、各ｈＰＬマトリックスグループ内の細胞増殖のスケールとして使用した。視野あたり（ＦＯＶ）での細胞増殖、及び、スフェロイド形成は、Ｈｏｅｓｃｈｔ（核）またはＢｏｄｉｐｙ（脂質液胞）で染色して、位相コントラスト、または、共焦点ＬＡＳＥＲ顕微鏡で決定した。スフェロイドの大きさ及び密度は、そのいずれもが、間質培地におけるパーセントｈＰＬ濃度と直接に相関している。顕微鏡画像は、スフェロイド形成が、低濃度のｈＰＬで発生する、ことを実証している。すべての実験を、３回繰り返した。試料の規模は、ｎ＝５／複製。数値を、平均±標準偏差（μ±ＳＤ）として報告した。＊ｐ＜０．０５。
【図１５】未播種状態、及び、ヒト血小板溶解物スキャフォールドに播種したヒトＳＶＦ細胞の顕微鏡画像を示す。Ｈｏｅｓｃｈｔ及びＢｏｄｉｐｙ色素で染色した共焦点画像を、脂質生成分化用培地を用いずに、または、同培地を用いて、インビトロで、３週間維持した３Ｄヒト血小板溶解物培養物と合成した。同一の培養物を、極低温走査電子顕微鏡検査（ｃｒｙｏ−ＳＥＭ）のために固定し、そして、３０〜５０μｍの倍率で画像化した。すべての実験を、３回繰り返した。試料の規模は、ｎ＝３／複製。
【図１６】ＳＶＦ細胞、及び、ｈＰＬをベースとしたマトリックスを用いた、ヒト白色脂肪組織（ｈＷＡＴ）、及び、ベージュ／ブライト脂肪組織（ｈｂＡＴ）のインビトロでの形成を示す。ＳＶＦ細胞を、ｈＰＬマトリックスに播種し、そして、２週間の培養で、白色またはベージュ／ブライトの脂質生成カクテルを用いて、脂質生成を誘導した。Ｈｏｅｓｃｈｔ及びＢｏｄｉｐｙ染料で染色した共焦点画像（１００倍の倍率）を、３Ｄヒト血小板溶解物培養と合成した。すべての実験を、３回繰り返した。試料の規模、ｎ＝３／複製。
【図１７】ＳＶＦ細胞、及び、ｈＰＬをベースとしたマトリックスを用いた、培養において形成をしたヒト白色脂肪組織（ｈＷＡＴ）、及び、ベージュ／ブライト脂肪組織（ｈｂＡＴ）の定量を示す。ＳＶＦ細胞を、ｈＰＬマトリックスに播種し、そして、２週間の培養で、白色またはベージュ／ブライトの脂質生成カクテルを用いて、脂質生成を誘導した。ＳＶＦ／ｈＰＬマトリックス構築物、及び、ポジティブコントロールのヒト脂肪の共焦点画像（１００倍の倍率）を、Ｈｏｅｓｃｈ及びＢｏｄｉｐｙ染料で染色した。Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｆｉｌｅｒソフトウェア（ｗｗｗ．ｃｅｌｌｐｒｏｆｉｌｅｒ．ｏｒｇ）を使用して、共焦点画像を定量した。すべての実験を、３回繰り返した。試料の規模は、ｎ＝５／複製。数値を、平均±標準偏差（μ±ＳＤ）として報告した。＊ｐ＜０．０５。
【図１８】ヌードマウスにおけるｈＳＶＦ細胞／ヒト血小板溶解物バイオスキャフォールドのインビボ移植片を示す。皮下移植片を８週間後に採取し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、そして、１０μｍスライスに切片化した。これらの切片を、イメージングスライドに載せ、核（ヘマトキシリン）、または、中性脂質（エオシン）で染色し、そして、スライドスキャナーで可視化した。すべての実験を、３回繰り返した。試料の規模は、ｎ＝３／複製。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
１つ以上の好ましい実施形態の詳細な説明を、本明細書に提供する。しかしながら、本開示は、様々な形態を具体化していることを理解されたい。従って、本明細書に開示した特定の詳細を、限定的に解釈すべきではなく、むしろ、特許請求の範囲を基礎として、及び、当業者に対して、あらゆる適切な方法で本開示を利用できるように教示するための代表的な基礎として解釈すべきである。
【００１８】
語句「例えば（ｆｏｒ  ｅｘａｍｐｌｅ）」、「など（ｓｕｃｈ  ａｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などのいずれかを、本明細書のいずれの箇所で使用する場合でも、特に断りが無い限りは、語句「及び、これらに限定されない（ａｎｄ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ）」が続く、ことを理解されたい。同様に、「例（ａｎ  ｅｘａｍｐｌｅ）」、「例示的（ｅｘｅｍｐｌａｙ）」などは、非限定的であると理解されたい。
【００１９】
用語「実質的に」とは、意図した目的に悪影響を及ぼさない記述からの逸脱を許容する。単語「実質的に」が明示的に記載されていなくても、記述的用語は、用語「実質的に」による修飾を受けるものと理解されたい。従って、例えば、「当該レバーが垂直に延びている」という語句は、レバーがその機能を果たすために正確な垂直配置を必要としていない限りは、「当該レバーが実質的に垂直に延びている」ことを意味する。
【００２０】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、及び、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、及び、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、及び、「含む（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」（ならびに、同様に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有する（ｈａｓ）」、及び、「含む（ｉｎｖｏｌｖｅｓ）」）などは、互換的に使用しており、そして、同じ意味を有する。具体的には、これらの用語の各々は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」の米国特許法での一般的な定義と符合するように定義しており、そして、従って、オープン用語「少なくとも以下の（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｔｈｅ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ）」を意味するものと解釈されており、また、追加の特徴、制限、態様などを排除しないものと解釈される。従って、例えば、「工程ａ、ｂ、及び、ｃを含むプロセス」は、当該プロセスが、少なくとも工程ａ、ｂ、及びｃを含む、ことを意味する。いずれの箇所で用語「ａ」または「ａｎ」を使用するにしても、その解釈が文脈において無意味でない限りは、「１つ以上」であると理解される。
【００２１】
用語「デポー」は、一般的に組織（例えば、脂肪）が認められる、身体の特定の箇所のことを意味する。
【００２２】
用語「薬剤」は、バイオロジカルスキャフォールドの成分としての使用、または、バイオロジカルスキャフォールドを使用する方法のいずれかでの使用に関係なく、当業者に公知の意味を有しており、そして、少なくとも以下の活性化剤、すなわち、増殖因子、分化因子、サイトカイン、ケモカイン、アジポカイン、抗生物質、抗カビ剤、抗真菌剤、抗炎症剤、及び、抗癌剤（化学療法剤）がある。
【００２３】
本開示は、少なくとも２つの成分、すなわち、哺乳動物血小板溶解物、及び、脂肪組織由来細胞画分（ＡＴＤＣＦ）を含む、バイオロジカルスキャフォールドを提供する。関連する実施形態では、当該バイオロジカルスキャフォールドは、間質血管画分（ＳＶＦ）細胞、脂肪由来間質細胞、脂肪由来幹細胞（本明細書では「ＡＳＣ」と総称する）、骨髄由来間葉系間質細胞、及び、骨髄由来間葉系幹細胞（本明細書ではＢＭ−ＭＳＣと総称する）のいずれか１つ以上を含むが、これらに限定されない脂肪組織由来細胞を含む。
【００２４】
本明細書で使用する用語「間質血管画分（ＳＶＦ）細胞」とは、その定義として、例示的なプロテアーゼ、例えば、コラゲナーゼ１型、または、細胞外マトリックスを撹乱するその他の関連酵素で、酵素的または機械的に撹乱／消化した後に脂肪組織から単離した不均一細胞集団を含む。当該ＳＶＦ細胞は、プラスチックに接着しておらず、または、インビトロで増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）／増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）することはない。この集団は、とりわけ、プレ脂肪細胞、間質細胞／幹細胞、リンパ球細胞、骨髄細胞、線維芽細胞、周皮細胞、内皮前駆細胞、及び、造血幹細胞を含む。
【００２５】
脂肪由来間質／幹細胞（ＡＳＣ）：この比較的に均質な細胞集団を、プラスチック製ティッシュプレートへの接着、及び、インビトロでの増殖因子／培地の存在下での培養増殖の後に、脂肪ＳＶＦ細胞から単離した。この集団は、接着性プレ脂肪細胞、間質／幹細胞、線維芽細胞、周皮細胞、及び、内リンパ系前駆細胞において比較的豊富にあるが、リンパ造血系統では枯渇している。このＡＳＣは、多能性であり、脂肪細胞、軟骨細胞、及び、骨芽細胞を分化することができる。
【００２６】
骨髄由来間葉系間質／幹細胞（ＢＭ−ＭＳＣ）：この比較的に均質な細胞集団を、プラスチック製ティッシュプレートへの接着、及び、インビトロでの増殖因子／培地の存在下での培養増殖の後に、骨髄穿刺物から単離した。このＢＭ−ＭＳＣは、多能性分化能（脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞）を有するＡＳＣと、表現型が類似している。
【００２７】
Ａ．バイオロジカルスキャフォールド
ある実施形態では、本開示は、様々な細胞型、及び、様々な増殖因子、細胞分化因子、及び、細胞増殖の研究に有用なその他の薬剤、例えば、腫瘍またはがんの成長の阻害剤において増強し得るバイオロジカルスキャフォールドを提供する。様々な実施形態では、当該バイオロジカルスキャフォールドは、少なくとも２つの成分を含む。第１の成分は、哺乳動物血小板溶解物である。用語「哺乳動物血小板溶解物は、ヒトを含むあらゆる哺乳動物供給源から単離した血小板から形成した溶解物を含むことができる。
【００２８】
当該哺乳動物血小板溶解物は、あらゆる天然の哺乳動物血小板、または、培養血小板の血小板から作製した血小板溶解物を含み得る。本開示での様々な実施形態では、哺乳動物血小板溶解物は、様々な製品における本明細書で使用するヒト血小板溶解物、及び、本明細書に記載のスキャフォールドの使用を含み得る。様々な実施形態では、組成物、製品、及び、使用方法において、開示したバイオロジカルスキャフォールドに使用するための哺乳動物血小板溶解物の製造に使用される血小板は、ヒト血小板である。当該哺乳動物血小板溶解物は、使用直前に解凍される凍結材料として凍結保存することができる液体形態で作製することができるが、当該製品は、（以下に概説するように）代替の方法、及び、物理的形態を用いて加工、及び、保存することもでき、同方法及び形態として、凍結乾燥、微粒子化、固化、または、併用製品があるが、これらに限定されない。哺乳動物血小板溶解物の例示的形態として、ヒト血小板溶解物由来の液体製品がある。ＡＡＢＢより認可を受けた血液収集センターが回収した無菌の有効期限の過ぎたヒト血小板を、実験室での加工のために、−２０℃で凍結したものを受け取る。血小板が空気に触れる全工程を、生物学的に安全なキャビネット（ＢＳＬ２）内で行う。これらの血小板を、室温（１５℃〜２５℃）と−８０℃との間で、交互に、３度の連続した凍結／解凍サイクルに供する。最後の解凍サイクルの後に、１〜５０名のドナーから得た血小板をプールし、そして、８，０００×ｇ（ｒｃｆ）で遠心分離する。遠心分離の後に、血小板膜を含有する頂部の白層を吸引する。当該血小板溶解物に対応する残りの透明な浸潤物は、哺乳動物血小板溶解産物を、未希釈の状態で含む。
【００２９】
本明細書に記載のバイオロジカルスキャフォールドの第２の成分は、脂肪組織由来細胞画分（ＡＴＤＣＦ）を含む。この用語は、脂肪組織に由来する少なくとも１つの細胞型のことを指す。幾つかの実施形態では、本開示のバイオロジカルスキャフォールドは、間質血管画分（ＳＶＦ）細胞、脂肪細胞由来間質細胞、脂肪由来幹細胞（本明細書では「ＡＳＣ」と総称する）、骨髄由来間葉系間質細胞、及び、骨髄由来間葉系幹細胞（本明細書でＢＭ−ＭＳＣと総称する）の群からの少なくとも１つの細胞型を含む。各事例において、当該ＡＴＤＣＦは、前述した細胞型の少なくとも１つを含み、かつ、当該ＡＴＤＣＦは、脂肪組織に由来する。本開示のバイオロジカルスキャフォールドは、当該哺乳動物血小板溶解物に対して、これらの細胞型の１つ以上、任意に、１つ以上の薬剤（例えば、増殖因子、分化因子、サイトカイン、ケモカイン、アジポカイン、抗生物質、抗カビ剤、抗真菌剤、抗炎症剤、抗癌剤（化学療法剤など）を補充して、特定の用途に適合させて、バイオロジカルスキャフォールド含有製剤、分化構築物、移植片、創傷被覆材、及び、本明細書に開示したその他の用途を提供する。
【００３０】
Ｂ．バイオロジカルスキャフォールドを組み込んだ製品
細胞分化のためのキット
幾つかの実施形態では、本明細書に記載のバイオロジカルスキャフォールドを、医師向けの出発成分として使用して、特定の分化した細胞及び組織を調製し得る。幾つかの例示的な実施形態では、これらのキットは、研究目的に使用し得る。例えば、例示的なキットは、哺乳動物血小板溶解物、マルチウェル基材、及び、試薬Ａ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍからなり、１％の抗生物質／抗真菌剤、そして、細胞培養、及び、白色または褐色の脂肪細胞分化のために必要な栄養素、アミノ酸、及び、増殖因子を含有するその他の関連する細胞培養培地を補充したもの）が入った容器を含み得る。特定の実施形態では、使用者が、三次元（３Ｄ）細胞培養物で分化細胞の調製を希望する場合には、使用する当該３Ｄ組織培養物は、以下の例示的な工程に従って調製し得る。１％抗生物質／抗真菌剤、及び、７４％Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ、または、細胞培養に必要な栄養素、アミノ酸、及び、増殖因子を含有する、その他の関連する細胞培養培地に対して、２５％（ｖ／ｖ）の当該哺乳動物血小板溶解物を加えることで、哺乳動物血小板溶解物補充培地を調製する。混合後は、水浴で温めない。室温に維持する。氷が消える瞬間まで、これらの細胞（ＳＶＦ細胞、及び／または、ＡＳＣ、及び／または、ＢＭ−ＭＳＣ）を、３７℃の水浴で、液体窒素から解凍する。各クライオバイアルを、１ｍＬの標準的なＳｔｒｏｍａｌ  Ｍｅｄｉｕｍで１回洗浄する。チューブを、３００×ｇ（１２００ｒｐｍ）で、５分間、遠心分離する。この細胞ペレットを、５×１０５細胞／ｍＬの濃度で、ｈＰＬ補充培地に再懸濁した。直ちに、細胞／ｈＰＬ混合液を、プレーティングする。ＣＯ２インキュベーターに入れると、混合物は、直ちにゲル化する。蒸発した培地を７日ごとに交換して、３Ｄ培養を維持する。培養物の古い培地を、１ｍＬのマイクロピペットで吸引して除去する。当該ゲルの上隅に、半量のｈＰＬ−培地を加えて、新しい培地と交換する。
【００３１】
別の関連する実施形態では、分化脂肪細胞を、本開示のバイオロジカルスキャフォールドにおいて誘導し得る。例示的な方法では、使用者は、哺乳動物血小板溶解物、白色または褐色の脂肪細胞／組織を培養するための基材、及び、試薬Ａを利用し得る。以下の指示に従って、３Ｄ組織培養物を調製する。１％抗生物質／抗真菌剤、及び、７４％Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ、または、細胞培養に必要な栄養素、アミノ酸、及び、増殖因子を含有する、その他の関連する細胞培養培地に対して、２５％（ｖ／ｖ）の当該哺乳動物血小板溶解物を加えることで、哺乳動物血小板溶解物補充培地を調製する。混合後は、水浴で温めない。室温に維持する。氷が消える瞬間まで、クライオバイアルに入れた間質血管画分（ＳＶＦ）、骨髄由来間葉系幹／間質（ＢＭ−ＭＳＣ）、または、脂肪間質／幹（ＡＳＣ）細胞を、３７℃の水浴で、液体窒素から解凍する。各クライオバイアルを、１ｍＬの標準的なＳｔｒｏｍａｌ  Ｍｅｄｉｕｍで１回洗浄する。チューブを、３００×ｇ（１２００ｒｐｍ）で、５分間、遠心分離する。この細胞ペレットを、５×１０５細胞／ｍＬの濃度で、ｈＰＬ補充培地に再懸濁した。直ちに、細胞／ｈＰＬ混合液を、プレーティングする。ＣＯ２インキュベーターに入れると、混合物は、直ちにゲル化する。蒸発した培地を７日ごとに交換して、３Ｄ培養を維持する。培養物の古い培地を、１ｍＬのマイクロピペットで吸引して除去する。当該ゲルの上隅に、半量のｈＰＬ−培地を加えて、新しい培地と交換する。
【００３２】
関連する実施形態では、前駆細胞を、脂肪組織、または、褐色／ベージュ色の脂肪組織に分化させるためのキットを提供する。例示的なキットでは、当該キットは、脂肪組織由来のＳＶＦ細胞の１つ以上のクライオバイアル、細胞増殖（ＳｔｒｏｍａＱｕａｌ）、脂質生成分化（ＡｄｉｐｏＱｕａｌ）、軟骨形成分化（ＣｈｏｎｄｒｏＱｕａｌ）、または、骨芽細胞分化（ＯｓｔｅｏＱｕａｌ）に特異的なＬａＣｅｌｌ  ＬＬＣ（ＬａＣｅｌｌ  ＬＬＣ，Ｎｅｗ  Ｏｒｌｅａｎｓ，Ｌｏｕｉｓｉａｎａ，ＵＳＡ）の製品の培地である１つ以上の１００ｍｌボトル、ならびに、無菌細胞増殖及び分化に好適な組織培養プレート（６、１２、または、２４ウェル）と組み合わせ得る、液体製品の形態の哺乳動物血小板溶解物を含み得る。当該キットは、選択的に白色脂肪組織（または、褐色／ベージュ色脂肪組織を促すようにデザインをした独自の脂質生成分化培地を取り入れることで、さらに改変し得る。
【００３３】
関連する実施形態では、細胞増殖（ＳｔｒｏｍａＱｕａｌ）、脂質生成分化（ＡｄｉｐｏＱｕａｌ）、軟骨形成分化（ＣｈｏｎｄｒｏＱｕａｌ）、または、骨芽細胞分化（ＯｓｔｅｏＱｕａｌ）のためのキットを提供する。例示的なキットでは、当該キットは、液体製品の形態の哺乳動物血小板溶解物の凍結管、脂肪組織由来のＡＳＣ細胞の１つ以上のクライオバイアル、細胞増殖（ＳｔｒｏｍａＱｕａｌ）、脂質生成分化（ＡｄｉｐｏＱｕａｌ）、軟骨形成分化（ＣｈｏｎｄｒｏＱｕａｌ）、または、骨芽細胞分化（ＯｓｔｅｏＱｕａｌ）に特異的なＬａＣｅｌｌ  ＬＬＣの製品の培地である１つ以上の１００ｍｌボトル、ならびに、無菌細胞増殖及び分化に好適な組織培養プレート（６、１２、または、２４ウェル）を含み得る。当該キットは、選択的に白色脂肪組織、または、褐色／ベージュ色脂肪組織を促すようにデザインをした独自の脂質生成分化培地を取り入れることで、さらに改変し得る。
【００３４】
関連する実施形態では、細胞増殖（ＳｔｒｏｍａＱｕａｌ）、脂質生成分化（ＡｄｉｐｏＱｕａｌ）、軟骨形成分化（ＣｈｏｎｄｒｏＱｕａｌ）、または、骨芽細胞分化（ＯｓｔｅｏＱｕａｌ）のためのキットを提供する。例示的なキットでは、当該キットは、液体製品の形態の哺乳動物血小板溶解物の凍結管、骨髄穿刺物由来の１つ以上のＢＭ−ＭＳＣのクライオバイアル、細胞増殖（ＳｔｒｏｍａＱｕａｌ）、脂質生成分化（ＡｄｉｐｏＱｕａｌ）、軟骨形成分化（ＣｈｏｎｄｒｏＱｕａｌ）、または、骨芽細胞分化（ＯｓｔｅｏＱｕａｌ）に特異的なＬａＣｅｌｌ  ＬＬＣの製品の培地である１つ以上のボトル、ならびに、無菌細胞増殖及び分化に好適な組織培養プレート（６、１２、または、２４ウェル）を含み得る。本明細書に記載のキットは、選択的に白色脂肪系統、または、褐色／ベージュ脂肪系統分化を促するようにデザインした独自の脂質生成分化培地を取り入れることで、さらに改変し得る。
【００３５】
例示的な実施形態では、例示的なバイオロジカルスキャフォールドを提供しており、このものは、組織再構成、もしくは、美容目的のために、修正せずに使用し得るものであり、または、組織欠損部、例えば、創傷、もしくは、損傷した骨への導入もしくは隣接させるための固体もしくは半固体表面に適用し得る。ある実施形態では、当該バイオロジカルスキャフォールドは、本明細書に記載の方法を使用して調製した、注射剤として使用することができる組み合わせ製品として脂肪組織由来のＳＶＦ細胞と直接に混合した、または、組織修復のために組織欠損部、例えば、骨に移植し得る固体もしくは半固体のスキャフォールドとして加工した、哺乳動物血小板溶解物、例えば、ヒト血小板溶解物の溶液を含み得る。同様に、当該バイオロジカルスキャフォールドは、整形外科用装置、例えば、骨ケージ、骨ネジ、骨茎、及び、患者の骨と少なくともある程度は接触しているその他の整形外科用装置の少なくとも１つの表面に対して、挿入または適用し得る。その他の実施形態では、罹患した骨の切片または一部を、当該バイオロジカルスキャフォールド、または、本明細書に記載した例示的なバイオロジカルスキャフォールドを含み、もしくは、それでコーティングをした固体基材を使用して処理し得る。非限定の例では、顎または大腿骨頭の骨壊死を、罹患した骨組織を切除して処置し、次いで、移植した自家または同種骨組織を移植して、当該移植骨の少なくとも１つの表面を、例示的なバイオロジカルスキャフォールド、例えば、ヒト血小板溶解物、及び、ＢＭ−ＤＳＣを含有するバイオロジカルスキャフォールドでコーティング、または、それを含有させ得る。大腿骨頭の例示的な骨壊死修復において、幾つかの初期治療は、本開示のバイオロジカルスキャフォールドを使用してデザインすることができる。例えば、関節温存手術として、大腿骨頭のコア減圧術があり、場合によっては、自家骨髄細胞移植、血管化した筋肉茎もしくは血管吻合を伴う自家骨移植術、または、非血管化自家骨移植術、及び、骨切り術を組み合わせ得る。
【００３６】
幾つかの実施形態では、コア減圧術は、疼痛を軽減することができる。幾つかの実施形態では、直径３ｍｍのドリルを使用して大腿骨頭に複数の孔を形成し、そして、本開示のバイオロジカルスキャフォールドを充填することができる。
【００３７】
幾つかの実施形態では、自家骨髄細胞移植を使用し得る。これらの実施形態では、外科医は、２００ｍＬを超える腸骨骨髄血を抽出し、インビトロで（培地なしで）単核細胞を単離し、そして、本開示のバイオロジカルスキャフォールドでそれらを単に注射するか、または、それらを移植する。その他の例示的な実施形態は、血管化筋茎、血管吻合部または非血管化自家骨移植片をコーティングする本開示のバイオロジカルスキャフォールドの使用に関係する自家骨移植手順の使用に関与することができ、当該移植片は、バイオロジカルスキャフォールドで、その表面の少なくとも一部をコーティングする。血管化骨移植片として、深腸骨、及び、表在腸骨静脈移植片、大転子の大腿外側回旋枝、大転子骨の臀筋枝などがある。筋肉茎を有する骨移植片は、一般的には、大腿骨方形筋を利用する。
【００３８】
同種または自家線維性移植片は、本開示のバイオロジカルスキャフォールドを含むように骨移植片でコーティングまたは加工する外科的処置に利用し得る。
【００３９】
衝撃骨移植は、当該技術分野で公知の骨形成タンパク質、ならびに、その他の骨の骨伝導剤、及び、骨誘導剤を用いて、または、用いずに、本開示のバイオロジカルスキャフォールドでコーティングした自家骨または同種移植骨を利用することができる。これらの骨移植手順において、ヒト血小板溶解物、及び、ＢＭ−ＤＳＣを含む例示的なバイオロジカルスキャフォールド。骨切り術は、最も一般的には、大転子、内反転子下骨切り術などによって、大腿骨頸部回転骨切り術の形態をとる。
【００４０】
その他の実施形態では、大腿骨頭の骨壊死を有する大抵の患者は、最終的には、関節形成術を受けることになる。人工関節のデザイン、材料、及び、技術の進歩に伴い、関節保存術の範囲は狭くなっているが、関節形成術の適応は拡大している。人工関節の種類は、次の推奨事項に従って選択することができる。１．メタル・オン・メタルのベアリング面に関連した複雑さが故に、ＯＮＦＨの対象にあっては、表面の再形成は限定的役割しか果たせない。これらの関節形成術手順の各々において、当該人工関節を、本開示のバイオロジカルスキャフォールド、例えば、ヒト血小板溶解物、及び、ＢＭ−ＤＳＣを含有する例示的なバイオロジカルスキャフォールドでコーティングする。
【００４１】
関連する実施形態では、本開示の例示的なバイオロジカルスキャフォールドは、脂肪間質細胞、及び／または、脂肪幹細胞を含有する細胞構築物を提供する。様々な関連する実施形態では、ＡＳＣ含有バイオロジカルスキャフォールドは、哺乳動物血小板溶解物、例えば、本明細書に記載の方法に従って作製したヒト血小板溶解物を、注射剤として使用することができ、または、組織修復のための固体もしくは半固体のスキャフォールドとして加工することができる組み合わせ製品として、脂肪組織由来のＡＳＣと直接に混合した、液体製剤の形態で含む。
【００４２】
関連する実施形態では、本開示の例示的なバイオロジカルスキャフォールドは、注射剤として使用することができ、または、組織修復のための固体もしくは半固体のスキャフォールドとして加工することができる組み合わせ製品として、骨髄穿刺物由来のＢＭ−ＭＳＣを含む細胞構築物を提供する。
【００４３】
様々な例示的な実施形態では、本開示は、哺乳動物血小板溶解物液体製剤の凍結管、脂肪組織由来のＳＶＦ細胞の１つ以上のクライオバイアル、細胞増殖（ＳｔｒｏｍａＱｕａｌ）、脂質生成分化（ＡｄｉｐｏＱｕａｌ）、軟骨形成分化（ＣｈｏｎｄｒｏＱｕａｌ）、または、骨芽細胞分化（ＯｓｔｅｏＱｕａｌ）に特異的なＬａＣｅｌｌ  ＬＬＣの製品（ＬａＣｅｌｌ  ＬＬＣ，Ｎｅｗ  Ｏｒｌｅａｎｓ，Ｌｏｕｉｓｉａｎａ）の培地の１つ以上のボトル、ならびに、無菌細胞増殖及び分化に好適な組織培養プレート（６、１２、または、２４ウェル）を含む、−２０℃または−８０℃で保管及び輸送し得るキットまたはパッケージを提供する。本明細書に記載した例示的なキットは、選択的に白色脂肪組織、または、褐色／ベージュ色脂肪組織を促すようにデザインをした独自の脂質生成分化培地を取り入れることで、さらに改変し得る。
【００４４】
様々な例示的な実施形態では、本開示は、哺乳動物血小板溶解物液体製剤の凍結管、脂肪組織由来のＡＳＣの１つ以上のクライオバイアル、細胞増殖（ＳｔｒｏｍａＱｕａｌ）、脂質生成分化（ＡｄｉｐｏＱｕａｌ）、軟骨形成分化（ＣｈｏｎｄｒｏＱｕａｌ）、または、骨芽細胞分化（ＯｓｔｅｏＱｕａｌ）に特異的なＬａＣｅｌｌ  ＬＬＣ製品の培地の１つ以上のボトル、ならびに、無菌細胞増殖及び分化に好適な組織培養プレート（６、１２、または、２４ウェル）を含む、−２０℃または−８０℃で保管及び輸送し得る、キットまたはパッケージを提供する。当該例示的なキットは、選択的に白色脂肪組織、または、褐色／ベージュ色脂肪組織を促すようにデザインをした独自の脂質生成分化培地を取り入れることで、さらに改変し得る。
【００４５】
様々な例示的な実施形態では、本開示は、哺乳動物血小板溶解物液体製剤の凍結管、骨髄穿刺物由来のＢＭ−ＭＳＣの１つ以上のクライオバイアル、細胞増殖（ＳｔｒｏｍａＱｕａｌ）、脂質生成分化（ＡｄｉｐｏＱｕａｌ）、軟骨形成分化（ＣｈｏｎｄｒｏＱｕａｌ）、または、骨芽細胞分化（ＯｓｔｅｏＱｕａｌ）に特異的なＬａＣｅｌｌ  ＬＬＣ製品の培地の１つ以上のボトル、ならびに、無菌細胞増殖及び分化に好適な組織培養プレート（６、１２、または、２４ウェル）を含む、−２０℃または−８０℃で保管及び輸送し得る、キットまたはパッケージを提供する。本開示のキットは、選択的に白色脂肪系、または、褐色／ベージュ色脂肪系分化を促すようにデザインをした独自の脂質生成分化培地を取り入れることで、さらに改変し得る。
【００４６】
様々な例示的な実施形態では、本開示は、哺乳動物血小板溶解物液体製剤の凍結管、及び、脱塩した骨粉末、もしくは、ヒドロキシアパタイト／リン酸三カルシウム、もしくは、同等の骨誘導性／骨伝導性骨粉末のパッケージだけを含み、または、ＳＶＦ細胞の１つ以上のクライオバイアル、及び／または、ＡＳＣの１つ以上のクライオバイアル、及び／または、ＢＭ−ＭＳＣの１つ以上のクライオバイアルをさらに含む、−２０℃または−８０℃で保管及び輸送し得る、キットまたはパッケージを提供する。キットの内容物は、臨床現場または手術室で、整形外科医、美容外科医、または、頭蓋顔面外科医が組み合わせを行い、そして、骨再生を促すペーストまたは固化物との混合物として、患者の手術または損傷部位に送達する。
【００４７】
幾つかの実施形態では、液体製剤の形態の哺乳動物血小板溶解物の凍結管、及び、ＳＶＦ細胞、及び／または、ＡＳＣ、及び／または、ＢＭ−ＭＳＣのクライオバイアルを具備する、または、具備しないノズル装置を含む、−２０℃または−８０℃で保管及び輸送し得る、キットを提供する。液体バイオロジカルスキャフォールドを含む、得られた組み合わせ製品を、化学的、電気的、放射線的、または、熱的熱傷または損傷を受けた患者の皮膚または創傷箇所への噴霧送達用にデザインする。キットの製品は、哺乳動物血小板溶解物単独として、または、ＳＶＦ細胞、及び／または、ＡＳＣ、及び／または、ＢＭ−ＭＳＣと組み合わせて送達することができる。
【００４８】
幾つかの実施形態では、本開示のバイオロジカルスキャフォールドを含む製品は、滅菌包帯、合成メッシュ、または、ガーゼ材料を含むパッケージ、及び、本開示のバイオロジカルスキャフォールドを含むことができる。例示的な例では、当該包帯、メッシュ、または、ガーゼは、製造プロセスの間に、哺乳動物血小板溶解物に予め浸して、そして、コーティングしており、続いて、凍結組み合わせ製品として、または、室温もしくは４℃で、長期間貯蔵することができる凍結乾燥製品として貯蔵する。使用時には、包帯、メッシュ、または、ガーゼを、その後、それら包帯、メッシュ、または、ガーゼ材料の被覆を必要とする組織に適用したＡＴＤＣＦ細胞でコーティングすることができる。例えば、軟骨または筋肉組織に対しては、メッシュを、哺乳動物血小板溶解物で含浸することができ、そして、外科手術の間にメッシュに固定される組織を、当該メッシュを当該組織内に誘導するように作動可能な特定の細胞画分に加えることができ、当該メッシュは、例えば、メッシュを筋肉または軟骨材料に固定し得る、ヘルニア修復術、ならびに、その他の腹部及び泌尿生殖器への用途で接触させる。あるいは、当該包帯、または、ガーゼ材料、及び、哺乳動物血小板溶解液を、別々に、パッケージに入れて輸送し、これにより、医師または外科医が、それらをＡＴＤＣＦと一緒に直接に臨床現場で組み合わせ得る。次に、当該包帯を、創傷部位または患者の傷口に直接投与する。
【００４９】
幾つかの実施形態では、本開示は、哺乳動物血小板溶解物の凍結保存容器と、ＡＴＤＣＦ細胞、例えば、ＳＶＦ細胞、及び／または、ＡＳＣ、及び／または、ＢＭ−ＭＳＣの１つ以上のクライオバイアルを含むパッケージを提供する。これらの材料は、ドライアイスを用いて利用者に向けて輸送され、使用前には、−２０℃または−８０℃で保存される。これらの材料は、カスタマイズした三次元細胞／スキャフォールド構造の製造を可能にするために、３Ｄプリンターと共に使用するようにデザインしている。幾つかの実施形態では、異なる領域、切片、及び／または、表面に、同じバイオロジカルスキャフォールド材料、または、異なるバイオロジカルスキャフォールド材料を刻み込み得る。
【００５０】
Ｃ．バイオロジカルスキャフォールドの例示的な使用
幾つかの実施形態では、哺乳動物血小板溶解物は、ヒト脂肪組織由来間質血管画分（ＳＶＦ）細胞、脂肪由来間質／幹細胞（ＡＳＣ）、及び／または、骨髄由来間葉系間質／幹細胞（ＢＭ−ＭＳＣ）と組み合わせて、脂肪組織、または、骨と骨髄の生物学の研究に適した組み合わせ製品を作製し得る。当該組み合わせ製品は、脂質生成（ＡｄｉｐｏＱｕａｌ）、軟骨形成（ＣｈｏｎｄｒｏＱｕａｌ）、または、骨形成（ＯｓｔｅｏＱｕａｌ）を促すことが公知のカクテル剤の存在下、または、非存在下で、インビトロで培養することができる。ＡｄｉｐｏＱｕａｌの存在下で、哺乳動物血小板溶解物を、ＳＶＦ細胞、ＡＳＣ、または、ＢＭ−ＭＳＣと組み合わせると、遺伝子、タンパク質、及び、小分子発現、ならびに、グルコース取り込み、脂肪分解、代謝活性、及び、その他の脂肪組織機能アッセイに基づいて評価できる三次元脂肪組織構造、及び、脂肪組織機能を形成する。ＣｈｏｎｄｒｏＱｕａｌの存在下で、哺乳動物血小板溶解物を、ＳＶＦ細胞、ＡＳＣ、または、ＢＭ−ＭＳＣと組み合わせると、遺伝子、タンパク質、及び、小分子発現、ならびに、グリコサミノグリカン産生、代謝活性、及び、その他の軟骨組織機能アッセイに基づいて評価できる三次元軟骨組織構造、及び、機能を形成する。ＯｓｔｅｏＱｕａｌの存在下で、哺乳動物血小板溶解物を、ＳＶＦ細胞、ＡＳＣ、または、ＢＭ−ＭＳＣと組み合わせると、遺伝子、タンパク質、及び、小分子発現、ならびに、細胞外マトリックス脱塩、カルシウム取り込み、代謝活性、及び、リンパ造血などのその他の骨組織機能アッセイに基づいて評価できる三次元の骨及び骨髄組織構造、及び、機能を形成する。
【００５１】
幾つかの実施形態では、本開示のバイオロジカルスキャフォールドは、正常または罹患した脂肪組織内での研究目的のための、ヒト脂肪組織由来細胞の発生、長期培養、及び、増殖のための組み合わせキット製品として使用することができる。バイオロジカルスキャフォールドを開始し、そして、３７℃で培養して、脂肪細胞化した三次元スキャフォールドを作製することができる。様々な実施形態では、本開示は、脂肪組織遺伝子、タンパク質、及び、小分子発現、ならびに、組織機能性を評価するための独立した設定、維持、及び、アッセイ終点に必要なＩ成分を含み得るキットを提供する。幾つかの実施形態では、本開示のキットは、凍結保存した初代ＡＴＤＣＦ細胞のバイアル（複数可）、哺乳動物血小板溶解物、培養培地、基材、及び、説明書を含む輸送パッケージを含むことができる。幾つかの実施形態では、白色または褐色／ベージュ色の脂肪分化組織バイオスキャフォールドは、ＳＶＦ細胞、及び／または、ＡＳＣ、及び／または、ＢＭ−ＭＳＣ、ならびに、白色または褐色／ベージュ色の脂肪組織デポーの形成及び分化を促すように特別にデザインした培地を含むようにカスタマイズすることができる。
【００５２】
関連する実施形態では、白色、及び／または、褐色／ベージュ色の脂肪分化組織バイオスキャフォールドは、組み合わせキット製品として、ＳＶＦ細胞、及び／または、ＡＳＣ、及び／または、ＢＭ−ＭＳＣを用いてカスタマイズすることができ、または、正常もしくは罹患した脂肪組織内での創薬研究目的のための契約サービスとして提案することができる。使用する細胞は、健康なドナー、または、肥満もしくは２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）などの目的とする特定の疾患もしくは病態を有するドナーから得ることができる。白色、及び／または、褐色／ベージュ色の脂肪分化組織バイオスキャフォールド組み合わせ製品／サービスは、医薬品または薬用化粧品の存在下、または、非存在下で、３７℃で、培養することができ、そして、組織の初期及び後期の反応を測定することができる。アッセイ終点を測定して、脂肪組織遺伝子、タンパク質、ならびに、小分子発現、薬剤に対する細胞生物学的、化学的、毒物学的、及び、機能的応答を評価することができる。幾つかの例示的な実施形態では、白色、及び／または、褐色／ベージュ色の脂肪分化組織バイオスキャフォールドは、凍結保存した初代細胞のバイアル（複数可）、哺乳動物血小板溶解物、培養培地、基材、及び、説明書を含む輸送パッケージを含み得る。当該サービスは、脂肪組織培養の設定、維持、及び、病状を処置するための化合物の添加からなる、ことができる。当該サービスは、アッセイによる化学化合物に対する脂肪組織の反応の評価を含むことができる。
【００５３】
ヒト化マウス脂肪デポーモデルの作製のためのバイオロジカルスキャフォールド製品。
【００５４】
幾つかの実施形態では、当該バイオロジカルスキャフォールドを使用して、ヒト脂肪または脂肪デポーのマウスモデルを作製することができる。バイオロジカルスキャフォールド（ヒトＳＶＦ細胞を含有する、及び／または、ヒトＡＳＣを含有する）を、無菌注射器と１９ゲージ針とを使用して、免疫正常マウスまたは免疫不全マウスのいずれかの表皮／真皮下に、２５０μｌ以上の容量で皮下注射することができる。皮下注射部位を、その後の漏出を防ぐために、Ｖｅｔｂｏｎｄまたは同等の材料で密封し得る。それら移植片を、最長で１２週間養生させる。この期間内に、それらの移植片は、分化脂肪デポーの特徴を獲得する。当該ヒト由来細胞は、最長で１２週間以上の間に、これらの脂肪デポー内における細胞の割合を構成する。マウスに、４５％以上の脂肪含有量の食餌（高脂肪食）を与えて、ヒト化脂肪デポーの増大及び分化を強化することができる。同様に、マウスを、小分子化学物質、または、ペプチド類／タンパク質で処置して、生理学的条件下で、ヒト脂肪組織の代謝に関するそれらの効果を評価することができる。これらのヒト化脂肪デポーは、標準的な科学的方法を用いてモニターし得るものであり、当該方法として、細胞生物学的方法、組織学的方法、インビボ画像検査法、代謝法、及び、関連する方法などがあるが、これらに限定されない。
【００５５】
本開示のバイオロジカルスキャフォールドは、インビボまたはインビトロで、患者由来の異種移植片または腫瘍を作製するために利用し得る。
【００５６】
ヒト脂肪組織由来のＳＶＦ細胞またはＡＳＣを含有するバイオロジカルスキャフォールドを用いて、ヒト腫瘍の培養及び増殖を促すことができる。本開示のバイオロジカルスキャフォールドを、腫瘍細胞株、または、腫瘍断片（１〜１０ｍｍ３体積）と組み合わせて、そして、３７℃で、インビトロで、培養をして、脂肪細胞化した三次元腫瘍含有スキャフォールドを作製することができる。この組み合わせバイオロジカルスキャフォールド製剤は、次いで、化学療法、または、放射線療法、または、免疫療法へ患者を曝露する前または後に取得した、ヒト由来の原発性または転移性腫瘍の長期生存率、増殖、及び、増殖を促す間質／血管の環境を提供する。１〜１０ｍｍ３の腫瘍断片を、インビトロで、組み合わせ脂肪細胞バイオロジカルスキャフォールドに直接に移植するか、または、免疫不全マウスの皮膚下で、インビボで、液体形態でバイオロジカルスキャフォールドを用いて注射する。これらの腫瘍は、インビトロ、または、インビボのいずれかで、１〜１２ヶ月の期間をかけて維持し、そして、体積、大きさ、細胞数、及び、因子の分泌に基づいて、増殖についてモニターをする。これらの腫瘍は、乳癌、前立腺癌、骨癌、大腸癌、または、その他の悪性腫瘍の供給源に由来する。
【００５７】
幾つかの実施形態では、本開示のバイオロジカルスキャフォールドは、マウスモデルにおいて、インビトロ、または、インビボで、ヒト骨またはヒト骨髄の発生のために利用し得る。
【００５８】
脱塩した骨粉末、または、ヒドロキシアパタイト／リン酸三カルシウム、または、同等の骨誘導性／骨伝導性骨粉末だけを使用する、または、使用しないＢＭ−ＭＳＣを含有するバイオロジカルスキャフォールドを用いて、ヒト造血及び骨形成の研究に適した、インビトロ、または、インビボ構築物を作製することができる。このバイオロジカルスキャフォールドは、リンパ造血を促すことが公知であるサイトカイン類、及び、増殖因子の存在下で、インビトロで、培養し得るものであり、そして、リンパ系及び骨髄系に関連する表面抗原を発現する非接着細胞及び接着細胞の検出及び増殖をモニターすることができる。あるいは、組み合せ製品を、空になった骨髄腔、または、免疫不全マウスの皮下に移植し、続いて、フローサイトメトリー、及び、硬組織の免疫組織化学的または分子生物学的分析に基づいて、ヒト造血細胞、及び、骨形成細胞の産生についてモニターすることができる。結果として得られるインビトロ及びインビボのモデルは、ヒトの血液、及び、骨の形成の実験をデザインするために使用することができる。
【００５９】
１つ以上のあらゆるＡＴＤＣＦ細胞、例えば、ＳＶＦ細胞、及び／または、ＡＳＣ、及び／または、ＢＭ−ＭＳＣを含有するバイオロジカルスキャフォールドは、臨床現場における骨の発達のために利用し得る。幾つかの実施形態では、１つ以上のあらゆるＡＴＤＣＦ細胞、例えば、ＳＶＦ細胞、及び／または、ＡＳＣ、及び／または、ＢＭ−ＭＳＣを含有するバイオロジカルスキャフォールドを、外傷性、先天性、または、体重負荷部位及び非体重負荷部位における外科的な骨の欠陥を修復するために、整形外科医、形成外科医、または、頭蓋顔面外科医は、使用することができる。ＡＴＤＣＦ（ＳＶＦ細胞、及び／または、ＡＳＣ、及び／または、ＢＭ−ＭＳＣ）を含有するバイオロジカルスキャフォールドと、骨誘導／骨伝導性セラミック材料との組み合わせを、臨床現場で組み合わせて、骨欠陥部位に送達されるペーストを作製し得る。この組み合わせた材料を、周囲の組織、または、適切な導管もしくは膜を使用して、外科医は、欠陥の寸法内に移植し、そして、欠陥の寸法内に封じ込め得る。外科医は、標準治療に適した開放縮小／内固定法を使用して、欠陥を安定させる。次いで、上記した組み合わせバイオロジカルスキャフォールドは、術後期間後における骨の修復、回復、及び、リモデリングを促進及び加速し、このことは、放射線画像診断法を用いて非侵襲的にモニターする。
【００６０】
幾つかの実施形態では、本開示のバイオロジカルスキャフォールドは、化学的、電気的、火炎、放射線、または、熱による負傷の後に発生する火傷の処置のために噴霧する製剤とし得る。
【００６１】
幾つかの実施形態では、スプレーで投与するために製剤するバイオロジカルスキャフォールドは、一般外科医、形成外科医、及び、再建外科医、ならびに、外傷外科医が使用して、第１度、第２度、または、第３度の火傷の皮膚と、急性及び慢性状態にある下層組織を処置することができる。当該バイオロジカルスキャフォールドを含有するスプレー製剤は、当該バイオロジカルスキャフォールドだけを、表面から１０ｃｍ以下の距離から負傷箇所に対して小さな液滴／粒子をスプレーとして制御して送達をする作動可能なノズルを含み得る。当該サービスを提供する外科医、または、その他の医療専門家は、目視検査に基づいて、創傷表面被覆の程度をモニターすることができる。適切な場合には、当該バイオロジカルスキャフォールドのスプレー製剤、及び、当該バイオロジカルスキャフォールドを塗布する装置は、自家または同種異系細胞を送達することができ、これらとして、ＳＶＦ細胞、及び、脂肪組織由来のＡＳＣ、骨髄由来のＢＭ−ＭＳＣ、または、さらに任意に、皮膚由来の真皮線維芽細胞、表皮細胞、及び／または、ケラチノサイトがあるが、これらに限定されない。細胞補充の有無に関係なく、噴霧したバイオロジカルスキャフォールドの適用は、色素上皮細胞、毛包、皮脂腺、汗腺、免疫細胞、及び、適切な表皮／真皮、及び、健康的な外皮をもたらす全ての機能を維持するために必要である、その下方にある組織構造を含有する、インタクトな新しい皮膚の形成を促し、及び、強化するようにデザインしており、同機能として、体液の蒸発及び保存の維持、免疫バリア、ビタミンＤ代謝、及び、紫外線防御などがあるが、これらに限定されない。
【００６２】
本開示のバイオロジカルスキャフォールドを含有する様々な製剤、製品、及び、アプリケーターは、圧迫潰瘍、または、外傷、または、糖尿病性潰瘍の処置のために使用し得る。
【００６３】
様々な実施形態では、ゲル、溶液として製剤し、そして、包帯、ガーゼ、及び、メッシュなどの半固体または固体の基材に塗布したバイオロジカルスキャフォールドを、一般外科医、及び、形成外科医、及び、再建外科医は、個別に、または、組み合わせて使用して、高齢者、及び、対麻痺／四肢麻痺患者における虚血性／再潅流障害に起因する圧迫外傷もしくは圧迫潰瘍、または、１型もしくは２型のいずれかの糖尿病患者における四肢遠位部の血管新生障害に起因する虚血に起因する糖尿病性潰瘍など、表皮、真皮、及び／または、その下方にある組織（脂肪、骨格筋、骨）に関係する急性及び慢性の皮膚創傷を処置することができる。当該バイオロジカルスキャフォールドを適用する前に、創傷箇所を創面切除し、そして、周囲の皮膚表面を、７０％エタノール、及び、ベタジン、または、同等の抗菌クレンザーで洗浄し得る。当該哺乳動物血小板溶解物、または、バイオロジカルスキャフォールド含有製剤を、＃１９または＃２１ゲージの針を用いて、創傷の全表面を覆う扇状の様式で、無菌技術下で、慢性皮膚創傷／圧迫潰瘍／糖尿病性潰瘍の基部に直接に注入し得る。創傷部位それ自体の周囲の外側から皮膚に入るようにして注射をして、汚染の危険性を回避する。当該哺乳動物血小板溶解物、または、バイオロジカルスキャフォールド含有注射は、外科医の臨床的判断に基づいて、隔週、毎月、または、低頻度の間隔で繰り返すことができる。さらに、当該哺乳動物血小板溶解物、または、バイオロジカルスキャフォールド含有製剤、例えば、当該哺乳動物血小板溶解物、または、バイオロジカルスキャフォールド、または、バイオロジカルスキャフォールドを含む製品、例えば、包帯、メッシュ、または、包帯剤を、創面切除圧迫潰瘍、または、糖尿病性潰瘍損傷部位の表面に送達または配置することができる。次いで、このものを、無菌のＡｄａｐｔｉｃまたはＴｅｇａｄｅｒｍ包帯で覆って、周囲から、ゲル化した製品、または、包帯を遮断する。外科医の判断に基づいて、この局所療法を、週に３回まで繰り返すことができる。さらに、当該局所療法は、現在の標準的なケア診療に従って、陰圧創傷真空と組み合わせて送達することができる。哺乳動物血小板溶解物、バイオロジカルスキャフォールド、または、当該バイオロジカルスキャフォールドを含む製品、例えば、包帯、メッシュ、または、包帯剤の適用は、直接観察、組織学的構造に基づく慢性皮膚創傷／潰瘍閉鎖、及び、治癒の速度、そして、皮膚の健全性、水分の喪失／蒸発、免疫バリア、及び、外見などの機能性効果指標を高め、及び、大きくする。
【００６４】
第１の実施形態では、哺乳動物（例えば、ヒト）血小板溶解物の使用と、１つ以上のＡＴＤＣＦ細胞とを混合して、バイオロジカルスキャフォールドを形成する。幾つかの実施形態では、１つ以上のあらゆるＡＴＤＣＦ細胞、例えば、間質血管画分（ＳＶＦ）細胞、及び／または、脂肪由来間質／幹細胞（ＡＳＣ）、及び／または、骨髄由来間葉系間質／幹細胞（ＢＭ−ＭＳＣ）から選択したＳＶＦ細胞、及び／または、ＡＳＣ、及び／または、ＢＭ−ＭＳＣ細胞型を含むバイオロジカルスキャフォールドを混合して、バイオロジカルスキャフォールドを形成する。そのようなバイオロジカルスキャフォールドの調製のための例示的な手順では、以下の工程を使用し得る：特に断りがない限り、生物学的に安全なキャビネット内で、すべての工程を実施する。所望量の濃縮した有効期限の過ぎたヒト血小板液を、１５ｍＬまたは５０ｍＬコニカルチューブに入れる。３Ｄ細胞培養にすぐに使用しない場合は、凍結／解凍サイクルを３回行って、ヒト血小板溶解調製液を調製する前に、−２０℃で保存する。凍結／解凍サイクルを３回行い、浸透によって、血小板を溶解する。これは、細胞培養のための増殖因子を最大収率で放出する。室温で、２０分間、８，０００ｘｇで遠心分離する。吸引をして、ヒト血小板膜の固体（白色）最上層を除去する。残りの液体浸潤物は、ヒト血小板溶解産物を含む。１％抗生物質／抗真菌剤、及び、９１．５％Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ、または、細胞培養に必須の栄養素、アミノ酸、及び、増殖因子を含有するその他の関連細胞培養培地に対して、７．５％（ｖ／ｖ）ヒト血小板溶解産物を加えることで、ヒト血小板溶解産物補充培地を調製する。注意；ヒト血小板溶解物の百分率濃度は、１％抗生物質／抗真菌剤の補充を続けながら、ＤＭＥＭ、または、その他の関連細胞培養培地の対応する含有量を適切に変えることで、変化させることができる。混合後は、水浴で温めない。室温に維持する。調製したヒト血小板溶解物を、細胞集団または細胞集団の混合物と組み合わせることで、細胞外マトリックスの細胞分泌、増殖、及び、分化を促すゲル化（厚いマトリックスの形成）を活性化する。細胞とヒト血小板溶解物とを混合した後に、ゲル化の活性化のために、２０分間、プレートをインキュベーターに加える。増殖、分化、マウスへの移植、または、その他の測定物の終点へと進む。
【００６５】
組織再建での使用のためのバイオロジカルスキャフォールド。
【００６６】
幾つかの実施形態では、本開示のバイオロジカルスキャフォールドは、置換、組織再建の拡大及び増強、ならびに、美容用途で使用し得る。例示的な方法では、外科医または医師は、本明細書に記載のバイオロジカルスキャフォールドを組み込んだ製品を使用して、外傷、外科手術、または、腫瘍切除、ならびに、ポーランド症候群またはトレチャー・コリンズ症候群などの先天異常に起因する瘢痕または欠陥を有する患者を処置するために選択し得る。そのような一例では、外科医は、現在のＧｏｏｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（ｃＧＭＰ）の下で製造がされ、かつ、臨床使用の承認を受けた哺乳動物血小板溶解物を含有する、−２０℃で保存した凍結保存容器（５または１０ｍＬ）を使用し得る。幾つかの実施形態では、当該血小板溶解物は、ヒト血小板溶解物である。しかしながら、その他の哺乳動物種由来の血小板を利用することができ、そして、当該ヒト血小板は、自家または同種異系のものとすることができる。幾つかの実施形態では、哺乳動物（例えば、ヒト）血小板溶解物は、単独で、または、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｇｅｎｅｓｉｓ（Ｈｏｎｏｌｕｌｕ  ＨＡ）、もしくは、Ｃｙｔｏｒｉ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）が製造したものなどの閉鎖系装置（ａｐｐａｒａｔｕｓ）、もしくは、装置（ｄｅｖｉｃｅ）を使用して、治療時に採取した脂肪吸引組織から単離した自家の患者由来間質血管画分（ＳＶＦ）細胞と組み合わせて使用することができる。あるいは、当該ヒト血小板溶解物は、注射可能な材料として使用でき、または、組織修復のために固体もしくは半固体のスキャフォールドとして加工することができる、組み合わせ製品として脂肪組織由来のＡＳＣと直接に混合した液体製剤の形態で、ヒト血小板溶解物と置換し得る。
【００６７】
幾つかの関連する実施形態では、組織の再建または拡大に使用するためのバイオロジカルスキャフォールドは、注射可能な材料として使用でき、または、組織修復のために固体もしくは半固体のスキャフォールドとして加工することができる組み合わせ製品として、骨髄穿刺物由来のＢＭ−ＭＳＣと直接に混合した液体製剤の形態で、ヒト血小板溶解物を含んでおり、現在のＧｏｏｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（ｃＧＭＰ）プロトコルの下で培養増殖した同種接着性脂肪または骨髄由来細胞を使用して、同種複合細胞治療剤を作り出すことができる。自家細胞または同種異系細胞を補充した、または、補充をしていない液体ヒト血小板溶解物の組み合わせを、外科医または医師は、注射可能な材料として使用し得る。医師は、自家または同種異系細胞（ＳＶＦ細胞、及び／または、ＡＳＣ、及び／または、ＢＭ−ＭＳＣ）を用いて、または、用いずに、液体ヒト血小板溶解物を、滅菌注射器に吸引する。次いで、この液体材料を、処置される組織の下方の皮下層、例えば、創傷、瘢痕、または、皮膚もしくは組織の欠損に対して皮下注射する。この液体を、＃１９または＃２１ゲージの針を用いて、注射部位から扇状の様式で送達して、下方にある真皮に十分に浸透させる。医師は、創傷または欠陥箇所の輪郭に関して、所望の美容効果を達成するのに十分な量を注射する。この手順は、所望の美容上及び再建上の結果を達成するために、１回だけ、または、複数回繰り返して行うことができる。
【００６８】
ある例示的な実施形態では、当該哺乳動物血小板溶解物、及び／または、バイオロジカルスキャフォールドは、組織再構成、及び、美容的改善のために使用し得る。例示的な方法は、以下を含み得る。当該哺乳動物血小板溶解物を、ＦＤＡ及びｃＧＭＰガイドラインに従って包装した１〜２０ｍｌの体積の哺乳動物血小板溶解物を含有する凍結滅菌アリコートとして、外科医、手術室、または、その他の健康配達センターに提供する。透明な容器が、破損の危険も無く、凍結／解凍サイクルにも耐えるので適切である。当該哺乳動物血小板溶解物の容器を、氷の結晶の大半が消えるまで、３７℃の浴槽、または、ドライオーブンで素早く解凍する。当該哺乳動物血小板溶解物の容器を、手術室で開け、そして、液体内容物を、滅菌１〜２０ｍｌの注射器へと吸引する。適用可能であれば、外科医は、同様にして、同種異系ＳＶＦ細胞、ＡＳＣ、または、ＢＭ−ＭＳＣの凍結保存したバイアルを解凍、及び、吸引する。あるいは、外科医は、自家ＳＶＦ細胞の供給源として、患者自身の脂肪吸引物を採取する。次いで、自家または同種異系細胞のいずれかを、滅菌ストップコックを介して２つの注射器を接続して、哺乳動物血小板溶解液と直接に混合させて、組み合わせバイオロジカルスキャフォールド製品を作製する。次いで、＃１９ゲージ以下の針を用いて、外科医は、針が引き抜かれ次第に少量の液体を注入し、そして、皮下組織全体への扇状の様式でそれを送達するコールマン技術の修正法を用いて、患者に対して、哺乳動物血小板溶解物、または、バイオロジカルスキャフォールド製品を注射する。外科医は、哺乳動物血小板溶解物、または、バイオロジカルスキャフォールド製品を、注射によって、皮下及び筋肉上の乳房組織に送達して、美容用途での容量増大、及び、乳房拡大を達成でき、顔面、もしくは、その他の箇所にある瘢痕もしくは不良外観の基部に送達させて、体積の不足を解消し、そして、外観を改善し、または、創面切除した圧迫潰瘍もしくは糖尿病性潰瘍の基部に送達させて、創縫合、及び、治癒を促すことができる。
【００６９】
バイオロジカルスキャフォールドの創薬への応用
【００７０】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載のバイオロジカルスキャフォールドは、創薬に有用な細胞構築物の調製に利用し得る。ある例示的な実施形態では、当該バイオロジカルスキャフォールドを含む細胞構築物は、液体もしくは半固体（ゼラチン状）、または、固体形態（固体基材に適用するスキャフォールド）のいずれかの哺乳動物血小板溶解物、白色または褐色の脂肪を培養するための基材、及び、試薬Ａの容器を含み得る。そのような細胞構築物の創薬のために使用するための例示的な方法は、以下の工程を含み得る。以下の指示を使用して３Ｄ組織培養物を調製する。１％抗生物質／抗真菌剤、及び、７４％Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ、または、細胞培養に必要な栄養素、アミノ酸、及び、増殖因子を含有する、その他の関連する細胞培養培地に対して、２５％（ｖ／ｖ）の当該哺乳動物血小板溶解物を加えて、哺乳動物血小板溶解物補充培地を調製する。混合後は、水浴で温めない。室温に維持する。氷が消える瞬間まで、クライオバイアルに入れた間質血管画分（ＳＶＦ）、骨髄由来間葉系幹／間質（ＢＭ−ＭＳＣ）、または、脂肪間質／幹（ＡＳＣ）細胞を、３７℃の水浴で、液体窒素から解凍する。各クライオバイアルを、１ｍＬの標準的なＳｔｒｏｍａｌ  Ｍｅｄｉｕｍで１回洗浄する。チューブを、３００×ｇ（１２００ｒｐｍ）で、５分間、遠心分離する。この細胞ペレットを、５×１０５細胞／ｍＬの濃度で、ｈＰＬ補充培地に再懸濁した。直ちに、細胞／ｈＰＬ混合液を、プレーティングする。ＣＯ２インキュベーターに入れると、混合物は、直ちにゲル化する。蒸発した培地を７日ごとに交換して、３Ｄ培養を維持する。培養物の古い培地を、１ｍＬのマイクロピペットで吸引して除去する。当該ゲルの上隅に、半量のｈＰＬ−培地を加えて、新しい培地と交換する。所望の薬剤を、創薬アッセイを実施する上で望ましい濃度で、培養物に対して、直接に加える。試験の終点として、細胞集団の変化、タンパク質の発現及び分泌、遺伝子の発現、グルコースの取り込み、脂肪分解、または、代謝活性の画像化がある。
【実施例】
【００７１】
Ｄ．実施例
【００７２】
実施例１：バイオロジカルスキャフォールドの成分の調製
骨髄間葉系幹細胞（ＢＭ−ＭＳＣ）の単離
ＢＭ−ＭＳＣを単離するために、まず、凝固を防ぐために、ヘパリンまたはクエン酸塩で抗凝固処理をした骨髄穿刺物を得る。使用前に、骨髄穿刺物を４℃の湿った氷上で維持し、そして、ＢＳＬ２生物学的安全キャビネット内の開封容器で、すべての工程を実行する。ＦｉｃｏｌｌＰａｑｕｅ溶液（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（商標）Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（商標）ＰＲＥＭＩＵＭ、１．０７８ｇ／ｍＬ）を完全に混合する。２０ｍｌのＦｉｃｏｌｌ  Ｐａｑｕｅ溶液を、滅菌５０ｍｌコニカルチューブに分注する。１０ｍｌの骨髄穿刺物を、Ｆｉｃｏｌｌ  Ｐａｑｕｅ層の上に慎重に重層し、そして、混和をせずにおく。チューブを密閉した後、卓上型Ｓｏｒｖａｌｌ（商標）Ｌｅｇｅｎｄ（商標）遠心分離機を使用して、ブレーキをかけずに、室温で、５００×ｇで、３０分間、遠心分離する。コニカルチューブを、ＢＳＬ２生物学的安全キャビネットに戻した後に、上部の透明な血漿層を吸引除去し、そして、新たな滅菌５０ｍｌコニカルチューブに分注する。次に、Ｆｉｃｏｌｌ  Ｐａｑｕｅ層の上部から単核球のバフィーコート層を吸引する。単核球を、滅菌１５ｍｌコニカルチューブに移し、そして、３倍量の滅菌Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）溶液に懸濁する。このチューブを、室温で、２００×ｇで、１０分間、遠心分離する。汚染物質とＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅを洗い流した後に、ペレット状の単核細胞から上清を吸引する。ペレット状の単核細胞を、１〜１０ｍｌのＬａＣｅｌｌ  Ｓｔｒｏｍａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（商標）に再懸濁する。１０μｌを除去し、そして、アクリジンオレンジ／エチジウムブロマイドを含有する等量のＬａＣｅｌｌのＬｉｖｅ  Ｄｅａｄ  Ａｓｓａｙ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（商標）と混合し、そして、蛍光顕微鏡（Ｍｏｔｉｃ  ＡＥ３０  Ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）で、生存（緑色）している、及び、死滅（赤色）した有核細胞を計数する。生細胞のパーセンテージと、細胞の総数／ミリリットルに基づいて、次の式を使用して、有核細胞の総数を計算する。
【００７３】
生細胞の総数＝生細胞の百分率×容量（ｍｌ）×細胞の総数／ｍｌ
【００７４】
１０５〜１０６／１ｍｌのＬａＣｅｌｌ  Ｓｔｒｏｍａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（商標）の濃度で、単核細胞を懸濁する。それぞれが、１５、２５、または、３５〜５０ｍｌのＬａＣｅｌｌ  Ｓｔｒｏｍａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（商標）の容積を有するＴ２５、Ｔ７５、または、Ｔ１７５フラスコに、５×１０３〜５×１０４／１ｃｍ２の密度で、細胞懸濁液を播種する。これらのフラスコを、３７℃の加湿５％ＣＯ２インキュベーターで、１〜３週間培養する。２〜３日ごとに、培地の５０％を、新たなＬａＣｅｌｌ  Ｓｔｒｏｍａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（商標）、または、１：１の新鮮：ＢＭ−ＭＳＣ馴化ＬａＣｅｌｌ  Ｓｔｒｏｍａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（商標）と交換する。ＢＭ−ＭＳＣが、７０〜９０％のコンフルエントに達したら、加湿５％ＣＯ２インキュベーターにて、３７℃で、０．２５％トリプシンで消化して、細胞を継代する。トリプシン消化が単一細胞懸濁液を放出したことを確認するために、位相差顕微鏡法でフラスコ内の接着細胞をモニターする。５〜２０分のトリプシン消化の後に、等量のＬａＣｅｌｌ  Ｓｔｒｏｍａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（商標）を加えて酵素消化反応を停止させ、そして、全細胞量を、滅菌１５ｍｌまたは５０ｍｌコニカルチューブに移す。１０μｌ容量の細胞懸濁液を除去し、そして、等量のトリパンブルー溶液と混合する。位相差顕微鏡（Ｍｏｔｉｃ）下で、Ｎｅｕｂａｕｅｒ血球計を使用して、透明（生存）、及び、青色（死滅）細胞を計数することで、細胞の総数と生細胞の割合を決定する。細胞懸濁液を、室温で、３００×ｇで遠心分離する。上清を吸引し、そして、（ａ）継代培養のための新たなＬａＣｅｌｌ  Ｓｔｒｏｍａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（商標）に、１５×１０３〜１５０×１０３生細胞／ｍｌの濃度で再懸濁し、そして、１ｍｌの培地／５ｃｍ２のフラスコ表面積の密度で培養し、または、（ｂ）Ｍｒ．Ｆｒｏｓｔｙ（商標）アルコールバスフリーザー容器を使用して、ＬａＣｅｌｌ  Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ（商標）に、１．８ｍｌの凍結保存チューブに分注した即時凍結保存のために、１０６〜１０７生細胞／ｍｌの濃度で再懸濁し、凍結保存チューブを、液体窒素デュワー貯蔵容器に移す前に、−８０℃で、一晩置く。ＢＭ−ＭＳＣの品質と特性は、次のアッセイを使用して、製造過程でモニターすることができる。
【００７５】
接着細胞数及び増殖能の分析のためのコロニー形成単位線維芽細胞（ＣＦＵ−Ｆ）アッセイ。
【００７６】
ＬａＣｅｌｉのＡｄｉｐｏＱｕａｌ（商標）、ＣｈｏｎｄｒｏＱｕａｌ（商標）、または、ＯｓｔｅｏＱｕａｌ（商標）分化誘導培地の存在下で、１４日間培養し、そして、Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ（Ａｄｉｐｏｃｔｙｅｓ）、Ａｌｃｉａｎ  Ｂｌｕｅ（Ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ）、または、Ａｌｉｚａｒｉｎ  Ｒｅｄ（Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ）で染色して検出する脂質生成、軟骨形成、骨形成分化アッセイ。
【００７７】
表面抗原のパネルの検出を伴うフローサイトメトリーとして、間質マーカーＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、造血マーカーＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ４５、幹細胞マーカーＣＤ３４、間葉系マーカーＣＤ１４６、内皮マーカーＣＤ３１があるが、これらに限定されない。
【００７８】
実施例２：間質血管画分（ＳＶＦ）細胞、及び、脂肪由来間質／幹細胞（ＡＳＣ）の単離
【００７９】
ＳＶＦ細胞を単離するために、まず、選択的脂肪吸引術または腹部形成術を受けている患者から、少なくとも１００ｍｌの量の脂肪吸引物、または、５０グラムの皮下脂肪組織を得る。この組織を、外科的処置をして２４時間まで室温で保存することができ、このことが、実験室への輸送、または、配送を可能にする。実験室に到着次第に、当該組織を、滅菌ＢＳＬ２生物学的安全キャビネットに移す。この組織をインタクトなままで（腹部形成術後に）到着した場合は、使用前に、滅菌またはオートクレーブ処理をした２本のメス、または、２対の細いハサミを使用して、当該組織を、２〜３ｍｍ３の断片に細かく刻む。当該組織を細かく刻むか、または、吸引脂肪組織を分注した後に、１００ｍｌ体積の組織を、滅菌２５０ｍｌキャップ付きＮａｌｇｅｎｅ（商標）プラスチック遠心チューブに移す。等量の滅菌ＰＢＳを加え、そして、当該組織と液相とを、２〜５分かけて分離させる。１ｍｌの滅菌吸引ピペットを使用して、浮遊組織層の下方からＰＢＳの血液の層を排除する。このＰＢＳ浸潤物が、もはや血色ではなく、せいぜい淡黄色になるまで、この手順を、３〜５回繰り返す。
【００８０】
０．１％コラゲナーゼＩ型（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  カタログ番号ＣＬＳ１，Ｌａｋｅｗｏｏｄ  ＮＪ）、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）画分Ｖ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含むＰＢＳの溶液を、１００ｍｇのコラゲナーゼＩ型と１ｇのＢＳＡを秤量し、１００ｍｌのＰＢＳに溶解し、そして、ＢＳＬ２生物学的安全キャビネット内で０．２２ミクロンのフィルターユニットを通して滅菌濾過することによって調製する。次いで、この溶液を、加熱水浴またはインキュベーターで、３７℃に温める。０．１％コラゲナーゼ／１％ＢＳＡ溶液を含むＰＢＳの１００ｍｌを、１００ｍｌの体積の脂肪組織と混合する。２５０ｍｌの遠心ボトルを密封し、Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋシェーカーインキュベーターへ、３７℃で、設置し、そして、２００〜２２０ｒｐｍで、５０〜７０分間、回転させる。インキュベーションと揺動とを完了した後に、当該脂肪組織断片は、消化の兆候と、構造的一体性の喪失を示すはずである。消化した内容物を、３００×ｇで、室温で、５分間、遠心分離する。得られたペレットを再懸濁して、遠心分離ステップを繰り返す。当該遠心チューブをＢＳＬ２生物学的安全キャビネットに戻し、そして、浮遊する脂肪組織及び上清を吸引する。ペレット化したＳＶＦ細胞を、１５ｍＬのＬａＣｅｌｌ  Ｓｔｒｏｍａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（商標）に再懸濁する。細胞懸濁液の１０μＬのアリコートを除去し、そして、アクリジンオレンジ／エチジウムブロマイドを含有する等量のＬａＣｅｌｌのＬｉｖｅ  Ｄｅａｄ  Ａｓｓａｙ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（商標）と混合し、そして、生存（緑色）及び死滅（赤色）有核細胞を、蛍光顕微鏡（Ｍｏｔｉｃ  ＡＥ３０  Ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）で計数する。生細胞のパーセンテージと、細胞の総数／ミリリットルとに基づいて、式：生細胞の総数＝生細胞のパーセンテージ×体積（ｍｌ）×細胞の総数／ｍｌ、を使用して、有核細胞の総数を計算する。
【００８１】
この時点で、当該ＳＶＦ細胞は、任意に、（ａ）細胞の総体積を、室温で、５分間、３００×ｇで遠心分離し、そして、１０６〜１０７／ｍｌの細胞濃度で、ＬａＣｅｌｌ  Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ（商標）へ再懸濁することでペレット化し、１．８ｍｌの凍結保存用バイアルに１ｍｌの体積で分注し、そして、長期保存のために液体窒素デュワーに移す前に、Ｍｒ．Ｆｒｏｓｔｙ（商標）容器で、一晩、−８０℃で凍結して凍結保存するか、または、（ｂ）１００ｍｌの脂肪吸引物から単離したＳＶＦ細胞体積を、総体積が１０５ｍｌのＬａＣｅｌｌ  Ｓｔｒｏｍａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（商標）に再懸濁して、接着性脂肪由来間質／幹細胞（ＡＳＣ）取得するために培養増殖し、そして、３５ｍｌを、３つのＴ１７５フラスコのそれぞれに分注することができる。これらのフラスコを、加湿５％ＣＯ２インキュベーターで、３７℃で、２４〜７２時間、インキュベートする。Ｍｏｔｉｃ顕微鏡を使用して、２０倍の倍率で、位相差顕微鏡下で検査して、細胞接着の程度を決定する。ＢＳＬ２生物学的安全キャビネット内で、３７℃に予熱した、２０ｍｌ容量の滅菌ＰＢＳで接着細胞を２回洗浄する前に、フラスコから培地を吸引する。Ｔ１７５フラスコあたり３５ｍｌの新たなＬａＣｅｌｌ  Ｓｔｒｏｍａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（商標）、または、３５ｍｌの１：１の新たな：ＡＳＣ馴化したＬａＣｅｌｌ  Ｓｔｒｏｍａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（商標）を、当該接着細胞集団に対して改めて供給する。新たな培地、または、１：１の新たな：ＡＳＣ馴化した培地を、２〜３日ごとに供給しながら、７０〜９０％のコンフルエントに達するまで、培養中のフラスコを維持する。この時点で、加湿５％ＣＯ２インキュベーターにて、３７℃で、０．２５％トリプシンで消化することで、ＡＳＣを継代させる必要がある。位相差顕微鏡法によって、フラスコ内の接着細胞をモニターして、トリプシン消化が、単一細胞懸濁液を放出したことを確認する。５〜２０分のトリプシン消化の後に、等容量のＬａＣｅｌｌ  Ｓｔｒｏｍａｌ  Ｍｅｄ（商標）を加えて酵素消化反応を停止させ、そして、細胞の総体積を、滅菌１５ｍｌまたは５０ｍｌコニカルチューブに移す。１０μｌの体積の細胞懸濁液を除去し、そして、等容量のトリパンブルー溶液と混合する。位相差顕微鏡（Ｍｏｔｉｃ）下でＮｅｕｂａｕｅｒ血球計を使用して、透明（生存）及び青色（死滅）細胞を計数することで、総細胞数と生細胞との割合を決定する。この細胞懸濁液を、室温で、３００×ｇで遠心分離する。この上清を吸引し、そして、（ａ）継代培養のために、新たなＬａＣｅｌｌ  Ｓｔｒｏｍａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（商標）に、１５×１０３〜１５０×１０３生細胞／ｍｌの濃度で再懸濁して、１ｍｌの培地／フラスコの表面積の５平方センチメートルの密度で培養することができ、または、（ｂ）即時凍結保存のために、ＬａＣｅｌｌ  Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ（商標）に、１０６〜１０７生細胞／ｍｌの濃度で再懸濁し、Ｍｒ．Ｆｒｏｓｔｙ（商標）アルコールバスフリーザー容器を使用して、１．８ｍｌの凍結保存チューブに分注し、当該凍結保存チューブを、液体窒素デュワー貯蔵容器に移す前に、同容器を、−８０℃で、一���、置くことができる。ＡＳＣの品質と特性は、次のアッセイを使用して、プロセスでモニターすることができる。
【００８２】
接着細胞数及び増殖能の分析のためのコロニー形成単位線維芽細胞（ＣＦＵ−Ｆ）アッセイ。
【００８３】
ＬａＣｅｌｌのＡｄｉｐｏＱｕａｌ（商標）、ＣｈｏｎｄｒｏＱｕａｌ（商標）、または、ＯｓｔｅｏＱｕａｌ（商標）分化誘導培地の存在下で、１４日間培養して誘導し、そして、Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ（Ａｄｉｐｏｃｔｙｅｓ）、Ａｌｃｉａｎ  Ｂｌｕｅ（Ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ）、または、Ａｌｉｚａｒｉｎ  Ｒｅｄ（Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ）で染色して検出する脂質生成、軟骨形成、骨形成分化アッセイ。
【００８４】
表面抗原のパネルの検出を伴うフローサイトメトリーとして、間質マーカーＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、造血マーカーＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ４５、幹細胞マーカーＣＤ３４、間葉系マーカーＣＤ１４６、内皮マーカーＣＤ３１があるが、これらに限定されない。
【００８５】
実施例３：例示的なバイオロジカルスキャフォールドの調製
別の実験例では、ＳＶＦとシルクバイオスキャフォールドとを含む脂肪組織装置を記載している。白色脂肪組織（ＷＡＴ）の間質血管画分（ＳＶＦ）由来の前駆細胞は、クローン集団を形成し、そして、複数の系統経路に沿って分化する能力を有する。しかしながら、文献は、脂肪細胞前駆体を「間質」または「幹」細胞として定義することに躊躇している。最近の研究は、表現型ＣＤ４５−／ＣＤ３１−／ＣＤ１４６−／ＣＤ３４＋を有する脂肪間質細胞の非周皮細胞亜集団が、間葉性であることを実証しており、そして、このものが、脂肪組織内の内因性前駆体亜集団であることを示唆する。Ｆｒａｚｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．は、ＧＦＰ導入遺伝子（ＧＦＰ−Ｔｇ）を偏在的に発現する間質血管画分（ＳＶＦ）細胞、及び、培養増殖脂肪間質／幹細胞（ＡＳＣ）を、フローサイトメトリーによって分画できることを実証した。新たに単離したＳＶＦと、培養増殖したＡＳＣの双方を、３Ｄシルクスキャフォールドに播種し、野生型宿主に皮下移植し、そして、１度の初期移植と、２度の連続移植（２°移植）とを首尾良く行った。６週間のＷＡＴ構築物を取り出し、そして、ＧＦＰ−Ｔｇ脂肪細胞及び幹細胞の存在について評価した。フローサイトメトリー、定量的ポリメラーゼ連鎖反応、及び、共焦点顕微鏡検査は、それぞれ、ＧＦＰ−Ｔｇ細胞の持続性、増殖、及び、増殖を示した。グリセロール分泌、及び、グルコース取り込みアッセイは、ＧＦＰ−Ｔｇ脂肪が、代謝的に機能的であることを明らかにした。ＧＦＰ−Ｔｇ  ＳＶＦ細胞、または、ＧＦＰ−Ｔｇ  ＡＳＣを播種した構築物は、播種していないコントロールと比較して、消化組織からのＳＶＦ収量が高く、また、構築物重量も大きかった。ＣＤ１４６−ＣＤ３４＋を豊富に含有するＧＦＰ−Ｔｇ  ＡＳＣ集団由来の構築物は、未選別、または、ＣＤ２９＋  ＧＦＰ−Ｔｇ  ＡＳＣ対応物よりも、ヘモグロビン飽和度が大きく、また、高頻度でＧＦＰ−Ｔｇ細胞を示した。これらのデータは、脂肪組織を固形臓器として再構成可能な非周皮性脂肪由来前駆細胞の連続移植の成功を実証した。
【００８６】
ある実施形態では、本開示は、ＳＶＦ、及び、脱細胞化細胞外脂肪マトリックス（ＥＣＭ）を含む脂肪組織装置を提供する。最適な脂肪組織脱細胞化について、３つの方法を比較した。方法１（Ｍ１）は、Ｏｎｔａｒｉｏ，ＣａｎａｄａにあるＤｒ．Ｌａｕｒｅｎ  Ｆｌｙｎｎの研究室で開発した、酵素に基づいた方法である。方法２（Ｍ２）は、Ｈａｎｙａｎｇ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｒｅｐｕｂｌｉｃ  ｏｆ  ＫｏｒｅａのＪｉ  Ｓｕｋ  Ｃｈｏｉ、及び、Ｐｕｒｄｕｅ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＫｉｎａｍ  Ｐａｒｋが報告した、溶媒ベースの方法を改良した、新規の無溶媒方法である。方法３（Ｍ３）は、市販の腫瘍由来細胞外マトリックス製品、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）の調製に基づいたものである。
【００８７】
ヒト脂肪組織は、ＩＲＢ承認プロトコルの下で、同意が得られた腹部形成術患者から得た。これらの研究は、最終的なＥＣＭ製品での所望の特性に関して代替的な脱細胞化プロセスを比較した。バイオスキャフォールドを、ＤＮＡ枯渇、ＥＣＭ組成、物理的構造、及び、タンパク質含有量について評価した。脱細胞化は、Ｈ＆Ｅ染色時に存在する細胞核の欠如によって確認され、そして、分光学的分析に基づく残留ＤＮＡが存在していないことで、さらに裏付けられた。広範囲のコラーゲン組成物を、三色染色により観察した。走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）は、複雑な繊維状の物理的構造を明らかにした。質量分析プロテオミクス分析は、２５個のタンパク質が、Ｍ１スキャフォールドに決定的に存在しており（２＋ペプチド配列のヒットを有する）、Ｍ２では、１４３個、そして、Ｍ３スキャフォールドでは、１０２個を同定しており、一方で、天然組織では、１５５個を同定した。構造タンパク質の幾つかは、脱細胞化の結果として、比較的に豊富な含有を示しており、これらには、ＶＩ型コラーゲン、フィブリリン、及び、ラミニンを含んでいた。本明細書に記載の結果は、脂肪組織由来バイオスキャフォールドのタンパク質成分の同定にまで及んでおり、そして、現在の技術より優れている、無溶媒方法でのＡＳＣ接着、増殖、及び、分化を促す機能的微小環境をさらに定義する。
【００８８】
シルクフィブロインをベースにしたバイオロジカルスキャフォールドの実験
材料及び方法
マウス
動物研究は、連邦、州、及び、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈの政策及び規制に従って、ｔｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによる審査を受け、かつ、承認がされたプロトコルの下で、ｔｈｅ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｕｌａｎｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅの監督下で行った。ＳＶＦ細胞、及び、ＡＳＣは、公開された方法に従って、８〜１２週齢のオスのＣ５７ＢＬ／６−Ｔｇ（ＵＢＣ−ＧＦＰ）３０ｃｈａ／Ｊマウス（ヒトユビキチンＣプロモーター駆動緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）導入遺伝子、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ，ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｊａｘ．ｏｒｇ）から単離した。ＧＦＰ導入遺伝子（ＧＦＰ−Ｔｇ）ＡＳＣは、単離した時にＧＦＰ導入遺伝子を発現すること、それに、少なくとも１０継代に向けてのインビトロでの増殖を維持し、そして、２〜２．５日の細胞倍加時間を示す。最初の特徴決定のために、これらの細胞を、マーカーＣＤ１１ｂ（Ｍａｃ−１α；インテグリンアルファＭ）、ＣＤ２９（β１インテグリン）、ＣＤ３４（ムコシアリン）、ＣＤ４５（白血球共通抗原；Ｌｙ５）、ＣＤ９０（Ｔｈｙ−１）、及び、Ｓｃａ−１（幹細胞抗原１；Ｌｙ６Ａ／Ｅ）の発現について調べた。
【００８９】
脂肪組織の回収、及び、ＳＶＦ細胞の調製
【００９０】
我々の研究室が公表しているプロトコルに従って、８〜１２週齢のオスのＣ５７ＢＬ／６−Ｔｇ（ＵＢＣ−ＧＦＰ）３０ｃｈａ／Ｊマウスから皮下鼠径部白色脂肪組織（ｉＷＡＴ）を単離し、細かく刻み、そして、コラゲナーゼで６０分間消化した。要するに、これらのｉＷＡＴ  ＳＶＦペレットを、遠心分離で回収し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、７０μｍメッシュ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｍｄｍｉｌｌｉｐｏｒｅ．ｃｏｍ／）に通して濾過をし、そして、これらのＳＶＦ細胞の濃度を、自動Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ｕｓ／ｅｎ／ｈｏｍｅ／ｂｒａｎｄｓ／ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｈｔｍｌ）計数で決定した。これらの１°ＳＶＦ細胞を、ＧＦＰ−Ｔｇ  ＡＳＣを得るための増殖及び培養のために、表面積の平方センチメートル当たり０．１５６ｍｌの組織消化物の密度で、Ｓｔｒｏｍａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２  Ｈａｍ’ｓ、１０％ＦＢＳ［Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｙｃｌｏｎｅ．ｃｏｍ］、１００Ｕペニシリン／１００ｇストレプトマイシン／０．２５ｇフビジゾン）に懸濁するか、または、染色の準備において、１×１０６個の有核細胞／ＰＢＳのｍｌの最終濃度で再懸濁する。
【００９１】
ＳＶＦ細胞の初期免疫表現型と細分画
細胞懸濁液を、Ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｔａｂｌｅに記載の細胞表面抗原に対する抗体と共に、室温（ＲＴ）で、３０分間、遮光して、インキュベートした。ＰＢＳで２回洗浄した後、Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｇａｌｉｏｓフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ｗｗｗ．ｂｄｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ）を用いて、フローサイトメトリー分析を行った。これらのＧＦＰ−Ｔｇ  ＳＶＦ細胞内の免疫表現型、及び、相対亜集団を、Ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｔａｂｌｅに示したスキームを用いて、内皮、造血、間葉、及び、幹細胞関連抗原の以下のパネルを検出する蛍光色素結合モノクローナル抗体を用いて、プラスチック接着培養の継代２まで決定した。
【００９２】
ＳＶＦ細胞の選択
ＧＦＰ−Ｔｇ  Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来のＧＦＰ−Ｔｇ細胞を利用した２つの研究を行った（図８）。これらは、ＧＦＰ−Ｔｇ未分画ＳＶＦ細胞の連続移植、及び、生細胞の選別をして、培養増殖したＧＦＰ−Ｔｇ  ＡＳＣ亜集団の連続移植を含む。最初の研究では、ＧＦＰ−Ｔｇ  ＳＶＦ細胞を、ＧＦＰ−Ｔｇ集団に対してフロー選別して選択し、そして、未分画ＧＦＰ−Ｔｇ  ＳＶＦ細胞を、非ＧＦＰ−ＴｇマウスのＧＦＰ−Ｔｇ  ＳＶＦ連続移植用のシルクスキャフォールドに直ちに導入した。第２の研究では、ＧＦＰ−Ｔｇ  ＣＤ１４６−ＳＶＦ亜集団を選択し、そして、（ａ）未分画コントロール、または、（ｂ）ＣＤ２９陽性、及び、（ｃ）ＣＤ３４陽性のいずれかとしてプレートした。これらの培養増殖集団（ａ〜ｃ）を、免疫表現型で分類し、そして、ＧＦＰ−Ｔｇ  ＡＳＣ連続移植のためにシルクスキャフォールドに導入した（ＡＳＣ連続移植研究；後述するＨｅｘａＦｌｕｏｒｏＩｓｏＰｒｏｐａｎｏｌシルクスキャフォールドの導入、培養、及び、移植を参照されたい）。
【００９３】
ＡＳＣの培養増殖
ＧＦＰ−Ｔｇ  １°ＳＶＦ細胞の生細胞選別を、２つのレーザーと、８つの検出器を装備したＧａｌｉｏｓ収集ソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を搭載した、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｇａｌｉｏｓフローサイトメーターを用いて行った。選択した全蛍光色素と、細胞選別目的のためのトランスジェニックＧＦＰの継続的使用との適合性を保った。マウス（ｍｕ）ＣＤ３、ＣＤ４５Ｒ、ＣＤ１１６、ＬｙＧ６、Ｔｅｒ−１１９（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；８８−７７７２）を検出するｅＦｌｕｏｒ結合抗体のカクテルを用いて、系統除去を行った。生ＳＶＦ細胞選択を、ＡＰＣコンジュゲート抗ｍｕＣＤ２９（１７−０２９１）と、ＰＥコンジュゲート抗ｍｕＣＤ３４（５６−０３４１）を用いて行った。プラスチック接着性培養増殖をした後に、かつ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｄｉｐｏｓｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（ＩＦＡＴＳ）及びＩＳＣＴが確立した表現型及び機能的基準を用いて、ＡＳＣを単離した。要するに、継代０°（Ｐ０）のＡＳＣを、５ｍｌの０．２５％トリプシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌｅ，ＮＹ）で、５分間、トリプシン処理した。等量のＡＳＣ培地を添加して、トリプシン消化を停止した。トリパンブルー染料排除法を用いてＰ０  ＡＳＣを計数し、そして、０．４×１０３個の細胞／平方センチメートルの密度で、新たなＴ１７５フラスコに継代した。これらの細胞を、それらが７０％のコンフルエントに達するまで培養した。これらの集団を、（ａ）コントロールとして未分画のもの、または（ｂ）ＣＤ２９＋を豊富に含有した集団（Ｌｉｎ−ＣＤ２９＋  ＣＤ１４６−）、または、（ｃ）ＣＤ３４＋を豊富に含有した集団（Ｌｉｎ−ＣＤ３４＋  ＣＤ１４６−）に細分化して、Ｐ２にまで培養増殖をした。これらの（ａ）未分画コントロール、（ｂ）ＣＤ２９＋を豊富に含有したＡＳＣ集団、及び（ｃ）ＣＤ３４＋を豊富に含有したＡＳＣ集団を、個別に、フラスコに播種し、そして、我々が公表し、かつ、検証をした方法に従って培養増殖した。ＣＤ２９について選別した後、これらの細胞の９５．０３±２％が、ＣＤ２９及びＧＦＰを発現した。播種に向けて相当数の集団を得るために、これらのＳＶＦ亜集団を、直ちに、プレーティングし、増殖し、そして、継代した。これらの細胞（ＣＤ２９＋、及び、ＣＤ３４＋亜集団）を個別に選択し、そして、ＣＤ２９及びＣＤ３４双方の共発現に基づいて選別しなかった、ことに留意されたい。加えて、最初に選別したＣＤ３４亜集団（ＧＦＰ及びＣＤ３４の双方に関して、９９．８５±４％が陽性）は、ＣＤ３４を共発現するその他のＳＶＦ前駆体集団を含み、かつ、接着性ＡＳＣ集団のプラスチック接着性の増殖及び選択をする間に排除されるので、ＳＶＦ細胞において最初に選別したＣＤ３４発現は、接着性及び増殖のプロセスに応じて、表面マーカーの発現を失う可能性がある培養増殖したＣＤ３４で選択したＡＳＣの発現よりも高発現である。継代２（Ｐ２）において、各ＳＶＦ画分由来のＡＳＣのアリコート（１×１０５  ＡＳＣ）を、ＧＦＰ陽性、及び、抗原ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１４６、及び、Ｓｃａ−１についての分析的フローサイトメトリーで特徴決定をして、増殖に起因するプロファイルの変化をモニターした。並行して、生Ｐ２  ＧＦＰ−Ｔｇ  ＡＳＣを、インビトロでの増殖、コロニー形成、及び、脂質生成分化について、または、移植研究について評価をした。
【００９４】
ＨｅｘａＦｌｕｏｒｏＩｓｏＰｒｏｐａｎｏｌ  Ｓｉｌｋ  Ｓｃａｆｆｏｌｄ導入、培養、及び移植
Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ，（Ｔｕｆｔｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｍｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ，ｈｔｔｐ：／／ａｓｅ．ｔｕｆｔｓ．ｅｄｕ／ｔｅｒｃ／）Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから入手した当該ＨｅｘａＦｌｕｏｒｏＩｓｏＰｒｏｐａｎｏｌ（ＨＦＩＰ）シルクスキャフォールドを、４℃で、一晩、Ｓｔｒｏｍａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（１０％ウシ胎児血清、及び、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ−Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２培地）で、予め湿潤させた。このスキャフォールドを、非分画ＳＶＦ細胞を用いた研究、ならびに、分画継代２（Ｐ２）ＡＳＣを用いた研究で使用した。ＳＶＦ研究のために、新たに単離したＧＦＰ−Ｔｇ  ｉＷＡＴ  １°ＳＶＦ細胞を、我々が公表した方法［３３］に従って、円筒形ＨＦＩＰシルクスキャフォールドの反対側にある面に対して、総数で２．５×１０５個の細胞を含む５０μｌの２つのアリコートを、それぞれ、ピペットで導入した。ＡＳＣ研究のために、新たに単離したＧＦＰ−Ｔｇ  ｉＷＡＴ  １°ＳＶＦ細胞の試料を、直接にプレーティングする（未分画）か、または、ＣＤ１４６−  ＣＤ２９＋、もしくは、ＣＤ１４６−／ＣＤ３４＋発現に基づいて選別した。これらの副画分をプレーティングし、そして、Ｐ２まで培養した。未分画ＳＶＦコントロール、ＣＤ１４６−ＣＤ２９＋を豊富に含有した集団、及び、ＣＤ１４６−ＣＤ３４＋を豊富に含有した集団に由来するＰ２  ＡＳＣを、円筒形ＨＦＩＰシルクスキャフォールドの反対側にある面に対して、２．５×１０５個の細胞を含む５０μｌの２つのアリコートを、それぞれ、ピペットで導入した。
【００９５】
両方の研究について、これらのスキャフォールドを、加湿３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに移し、そして、２時間かけて、１５分毎に回転させた。５ｍｌのＳｔｒｏｍａｌ  Ｍｅｄｉｕｍを添加した後に、各スキャフォールドを、直ちに、８週齢のオスの非トランスジェニックＣ５７Ｂ１／６マウスに移植した。一組の代表的なスキャフォールド（１°ＳＶＦ細胞、または、培養したＡＳＣ集団）を保持し、最適切断温度化合物（ＯＣＴ）で新たに凍結し、そして、ポジティブコントロールとして使用するために貯蔵した。ＳＶＦ細胞、または、ＡＳＣ（各亜集団についてｎ＝２０）を導入した残りの個々のスキャフォールドを、承認を受けたＩＡＣＵＣプロトコル（プロトコル＃４３０２）の下で、標準的な獣医学的の取り扱い方に従って、Ｃ５７Ｂ１／６マウスに作製した背部皮下パウチの両側に移植した。各移植マウスに、空のスキャフォールド（コントロール）、ＳＶＦ細胞を播種したもの、または、未分画コントロールであるＰ２  ＡＳＣ、ＣＤ２９＋を豊富に含有した集団（ＣＤ２９＋  ＣＤ１４６−）、または、ＣＤ３４＋を豊富に含有した集団（ＣＤ３４＋  ＣＤ１４６−）の無作為化した組み合わせを移植した。
【００９６】
増殖アッセイ
細胞播種直後に、各播種スキャフォールド内の代謝的に活性な幹細胞の相対数を、製造業者の指示に従って、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（商標）アッセイで決定した。播種したスキャフォールドを、１０％Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ試薬を補充したＳｔｒｏｍａｌ  Ｍｅｄｉｕｍにて、５％ＣＯ２、３７℃で、２時間、インキュベートした。培養培地のアリコート（１００μｌ）を、９６ウェルプレートに移し、そして、５６０ｎｍの励起波長、及び、５９０ｎｍの発光波長を利用する、マイクロタイタープレートリーダー（Ｆｌｕｏｓｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａ）を用いて、蛍光強度を定量した。播種していないスキャフォールド、及び、組織培養ウェルも、上記したようにして培養培地で維持し、そして、バックグラウンド蛍光を調整するためにブランクコントロールとして同様に分析をした。次いで、スキャフォールドを秤量し、そして、相対細胞数を、前述したようにして、スキャフォールド湿潤重量の１ミリグラム当たりにおける、それらの相対蛍光強度（ＲＦＵ）の程度を計算した。
【００９７】
脂質生成分化
培養増殖、及び、スキャフォールド接種した非ＧＦＰ−Ｔｇ  ＡＳＣまたはＧＦＰ−Ｔｇ  ＡＳＣの脂質生成分化を、前述したようにして、１５日間にわたって行った。要するに、培養したＡＳＣを、Ｓｔｒｏｍａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（１０％ウシ胎児血清、及び、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ−Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２培地）で増殖させた。次いで、ＡＳＣをトリプシン処理し、そして、ＡＳＣ培養培地で、１平方センチメートルあたり３×１０４個の細胞で、２４時間、プレーティングして、付着させた。１日目（プレーティングから２４時間後）に、培地を除去し、そして、細胞を、脂質生成分化培地（１０％ウシ胎児血清、１５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．４］、ビオチン［３３μＭ］、パントテン酸塩［１７μＭ、Ｓｉｇｍａ］、ヒト組換えインスリン［１００ｎＭ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ］、デキサメタゾン［１μＭ］、１−メチル−３−イソブチルキサンチン［ＩＢＭＸ；０．２５ｍＭ］、及び、ロシグリタゾン［１μＭ］を補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ−Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２培地）で、３日間、インキュベートした。脂肪細胞分化維持期間の残りの９日間は、当該培地を３日ごとに除去し、そして、ＩＢＭＸ及びロシグリタゾンを含まない同じ培地（維持培地）と交換した。
【００９８】
スキャフォールド播種細胞の脂質生成
【００９９】
スキャフォールドを播種したＧＦＰ−Ｔｇ  ＳＶＦ細胞、及び、ＧＦＰ−Ｔｇ  ＡＳＣについては、播種の１日前に、スキャフォールドを高圧滅菌し、そして、３７℃、５％ＣＯ２、９５％相対湿度で、脂質生成培地に浸した。次いで、ＧＦＰ−Ｔｇ  ＡＳＣをトリプシン処理し、そして、ＡＳＣ脂質生成分化培地に予め浸したスキャフォールドに、我々が公表した方法に従って、円筒形ＨＦＩＰシルクスキャフォールドの反対側にある面に対して、総数で２．５×１０５個の細胞を含む５０μｌの２つのアリコートを、ピペットで、プレーティング導入した。これらの細胞を、脂質生成分化培地（１０％ウシ胎児血清、１５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．４］、ビオチン［３３μＭ］、パントテン酸塩［１７μＭ、Ｓｉｇｍａ］、ヒト組換えインスリン［１００ｎＭ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ］、デキサメタゾン［１μＭ］、１−メチル−３−イソブチルキサンチン［ＩＢＭＸ；０．２５ｍＭ］、及び、ロシグリタゾン［１μＭ］を補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ−Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２培地）で、３日間、インキュベートした。脂肪細胞分化維持期間の残りの９日間は、当該培地を３日ごとに除去し、そして、ＩＢＭＸ及びロシグリタゾンを含まない同じ培地（維持培地）と交換した。同様に、コントロール培養物を、脂質生成刺激物質の非存在下で並行して維持した。播種した、及び、播種していない（コントロール）スキャフォールドはすべて、加湿インキュベーターにて、３７℃で、５％ＣＯ２で培養した。インビトロ培養期間の後に、播種したスキャフォールドを、それらの脂質生成の程度について評価した。
【０１００】
細胞質内脂質の定量
プラスチック接着培養ＡＳＣについては、Ｏｉｌ−Ｒｅｄ−Ｏ（ＯＲＯ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｉｄｒｉｃｈ）を、脂肪細胞分化培地で１２日間培養したＧＦＰ−Ｔｇ  ＡＳＣの単分子層へ組み込んで脂質形成を評価した。ＯＲＯ取り込みを定量した。要するに、０．５％（ｗ／ｖ）のＯＲＯを、エタノールにおいて調製した。次いで、３部のＯＲＯと、２部のＰＢＳを混合して、希釈標準溶液を作製した。１２ウェルプレートで培養したＧＦＰ−Ｔｇ  ＡＳＣの単分子層を、ＰＢＳで３回すすぎ、続いて、１０％（ｖ／ｖ）ホルマリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で、１５分間、固定した。これらの単分子層を、次いで、ＰＢＳで３回すすぎ、そして、室温で、４５分間、ＯＲＯ希釈標準溶液でインキュベートした。組み込まれていないＯＲＯの吸引後、単分子層をＰＢＳで４回すすいだ。これらの染色した単分子層を、位相差顕微鏡（Ｅｃｌｉｐｓｅ  ８００，Ｎｉｋｏｎ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｉｋｏｎ．ｃｏｍ／）で可視化した。これらの染色した単分子層を、１００％イソプロパノールで、１０分間、インキュベートして、取り込まれたＯＲＯを抽出した。次いで、各アリコートの５１０ｎｍでの吸光度を、９６ウェルプレートリーダーを用いて測定した。
【０１０１】
スキャフォールドに導入されたＡＳＣについては、ＯＲＯ染色を用いて蓄積脂質も可視化した。組織学のために、これらのスキャフォールドを、２Ｍスクロースで、一晩、固定した。スキャフォールドを、ＯＣＴ培地に包埋し、ドライアイスで凍結し、そして、−８０℃で保存した。次いで、凍結スキャフォールドを、クリオスタットを用いて切片化し（７μｍ切片）、そして、染色した。ＯＲＯ染色のために、凍結切片を、１０％緩衝化中性ホルマリンに、１５分間、固定し、そして、蒸留水ですすいだ。ＯＲＯ希釈標準溶液を、凍結切片上に置き、そして、２０分間、インキュベートした。スライドを蒸留水ですすぎ、そして、製造業者のプロトコルに従って、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で対比染色した。染色した切片を、ガラス製のカバーガラスを用いて覆った。位相差顕微鏡を用いて、画像を撮影した。
【０１０２】
連続移植
移植を行った動物を、６〜８週間維持し、安楽死させ、そして、無菌解剖技術を用いてスキャフォールドを取り出した。以前のインビボ研究は、４〜６週間が、移植したシルクスキャフォールドにおいて、ヒトＡＳＣ脂質生成を可能にするのに十分な期間である、ことを実証した。６週間後に、共焦点顕微鏡検査によって、ＧＦＰ−Ｔｇ細胞の急激な増殖及び分化が認められた。従って、我々の研究は、６週目に行った。顕微鏡分析のために、ｎ＝２個のスキャフォールドのセットを、ＯＣＴにおいて新たに凍結した。残りのｎ＝１８個のスキャフォールドを、０．１％コラゲナーゼＩ型（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｂｒｕｎｓｗｉｃｈ，Ｌａｋｅｗｏｏｄ，ＮＪ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ−ｂｉｏｃｈｅｍ．ｃｏｍ）、１％ウシ血清アルブミン、及び、２ｍＭのＣａＣｌ２を、断続的に振とうしながら、３７℃で、６０分間、補充したＰＢＳで、１時間、コラゲナーゼ消化に供した。これらの２°（二次移植）ＳＶＦ細胞を、ＨＦＩＰ  Ｓｉｌｋ  Ｓｃａｆｆｏｌｄの下で、上記したようにして単離した。
【０１０３】
導入、培養、及び、移植
２°ＳＶＦでのＧＦＰ−Ｔｇ細胞の頻度、ならびに、それらの関連抗原の発現（上記のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）のパネル）を、各グループ分けの試料を用いて、分析的フローサイトメトリーで決定した。当初のコホート由来の残りの選別した２°ＳＶＦ細胞を、上記と同じプロセスを繰り返すことで、新たに調製したＨＦＩＰシルクスキャフォールドに導入した。インキュベーション後、これらのスキャフォールドに、２°ＳＶＦ細胞を導入し、そして、６週間にわたってＣ５７Ｂｌ／６マウスの両側に移植した。その時点で、スキャフォールドの採取及び分析を繰り返して、３°ＳＶＦ細胞集団を得た。細胞採取の制約が故に、スキャフォールドの採取と分析は、３°ＳＶＦ細胞集団、及び、２°ＡＳＣ集団の後に終了した。ポジティブコントロールとして、Ｃ５７Ｂｌ／６（ＵＢＣ−ＧＦＰ）マウス由来のインタクトな鼠径部デポーを、同系の野生型レシピエントに、同期間にわたって連続移植した。加えて、取り出したシルクスキャフォールド構築物内のインスリン感受性を、機能性を保証するために、我々が公表したインビトログルコース取り込み及び脂肪分解アッセイを使用して、決定をした。本研究では、（細胞を含む、または、含まない）スキャフォールドの外科的移植の日と、動物からそれを外科的に取り出した日との間の生着時間を測定していた、ことに留意すべきである。ネガティブコントロール群については、年齢及び性別に適合した非ＧＦＰ−Ｔｇ  Ｃ５７ＢＬ６マウスから組織を採取した。
【０１０４】
ヘモグロビン飽和度測定
Ｚｅｎａｓｃｏｐｅ  ＰＣＩ分光計（Ｚｅｎａｌｕｘ，Ｄｕｒｈａｍ  ＮＣ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｚｅｎａｌｕｘ．ｃｏｍ）は、広帯域ハロゲン光源（プローブ）を使用して、標的組織を照明する。Ｚｅｎａｓｃｏｐｅは、侵襲的技術が無くとも、生存動物のタンパク質レベルの測定を可能にする。直径が０．２５”のステンレス鋼硬質共通端部にステンレス鋼ジャケットを有し、かつ、そこで終端する分岐光ファイバープローブを、組織の表面に適用し、標的組織に光を送達し、そして、反射した光信号を収集し、及び、当該組織の光学的特性（波長依存吸収、及び、散乱係数）を、５００〜６５０ｎｍの波長範囲にわたって測定した反射率スペクトルから定量的に抽出する。抽出した吸収係数から、携帯型の標準化した測定ハードウェアは、オキシヘモグロビン（ＨｂＯ２）、デオキシヘモグロビン（ｄＨｂ）、総ヘモグロビン濃度（Ｈｂ、ＨｂＯ２＋ｄＨｂとして定義した）、及び、ヘモグロビン酸素飽和度（ｓＯ２、比率ＨｂＯ２／Ｈｂとして定義した）の迅速リアルタイム定量分析を達成する。光学的に減少した散乱係数もまた、機器が測定及び報告を行い、このことは、組織発色団の測定値を、組織散乱における変化とは独立して正確に定量することを可能にする。積分時間は、検出器の線形応答範囲内に留まりながら反射率信号を最大にするために、各測定についてシステムソフトウェアによって自動的に設定されており、典型的には、１００から２００ｍｓの範囲であった。９９％の反射率標準を用いたプローブの反射率較正を、全ての実験の前に、そして、手順の間に定期的に行った。
【０１０５】
ＩｍａｇｅＪ移植片分析
ＡＳＣまたはＳＶＦ長期生着時間について報告するために、各コホートから取り出した全移植片の３つの代表的な画像を、ＴＩＦファイルに変換し、そして、分析のためにＩｍａｇｅＪにエクスポートした。未播種のスキャフォールドの画像（コントロール）を、（ＩｍａｇｅＪ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １．４６ソフトウェア、ＮＩＨ）を用いて定量した。画素値は、組織移植片全体からのものであり、切片化した画像ではない。閾値を、コントロールを用いて背景ピクセル数を差し引くことで設定した。組織切片の群からの相対平均ピクセル数を平均し、標準偏差を計算した。
【０１０６】
極低温走査型電子顕微鏡
２４時間の細胞培養後に、ＧＦＰ−Ｔｇ  ＡＳＣを播種したスキャフォールドについて、極低温走査電子顕微鏡検査を行った。Ｃｒｙｏ−ＳＥＭ構造研究を、Ｇａｔａｎ  ２５００  ａｌｔｏ  Ｃｒｙｏ−ｓｙｓｔｅｍ、及び、Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｓ−４８００走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて行った。組織を、７×５×５（ｍｍ）に切断し、そして、極低温ＳＥＭサンプルホルダー表面から約５ｍｍの高さに置き、ホルダーに固定して接着し、そして、約−２１０℃で、約３０秒間、液体窒素で凍結した。この凍結組織を、真空中で、ＳＥＭに取り付けられたプレチャンバーに移し、次いで、破砕し、そして、−９５℃で、５分間、昇華させた。−１３０℃で、８８秒間、Ｐｔ／Ｐｄでコーティングした後に、当該試料をＳＥＭに移し、そして、−１３０℃で、３ｋＶで観察した。
【０１０７】
組織化学
新たな凍結組織サンプルを切片にし、親油性蛍光色素（Ｂｏｄｉｐｙ）で染色し、そして、ＧＦＰと脂質シグナルの共局在について蛍光顕微鏡で評価した。
【０１０８】
ＧＦＰ遺伝子発現のための定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）
Ｑｉａｇｅｎ  ＦＦＰＥ  ｔｉｓｓｕｅ  ｐｒｅｐ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ  ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｑｉａｇｅｎ．ｃｏｍ）を、製造業者の指示書に従って使用して、取り出した組織改変脂肪パッド、または、ポジティブ、もしくは、ネガティブコントロールから全ＤＮＡを単離した。ＳＹＢＲグリーンリアルタイムＰＣＲ  ＤＮＡ結合色素を用いて、約５００ｎｇの全ＤＮＡを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応を行った。反応混合物を、ＧＦＰに特異的なオリゴヌクレオチドプライマーセット（フォワード：５’−ＴＣＧＣＣＴＡＣＣＡＧＣＴＣＡＴＧＣＡＴＡＡＣＡ−３’；リバース：５’−ＴＧＡＡＧＣＴＣＴＴＣＣＡＧＧＴＧＴＣＡＡＣＧＡ−３’）と共に、リアルタイム熱検出システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏ−ｒａｄ．ｃｏｍ）でインキュベートした。全ての結果を、グリセルアルデヒド３’リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）発現コントロールと比較して正規化した。
【０１０９】
統計
全ての研究を、少なくとも三重に繰り返し、そして、数値は、平均±標準偏差（ＳＤ）として報告する。個々の対は、スチューデントＴ検定を使用して比較し、一方で、大きいグループは、分散分析で分析した。最小ｐ値が、≦．０５であれば、所見は、有意であると定義した。
【０１１０】
結果
利用した細胞の単離及び特徴決定
図１Ａは、８〜１２週齢のオスのマウスから単離したｉＷＡＴのＧＦＰ−ＳＶＦ内で検出した細胞の代表的な亜集団を提供する。初期ＳＶＦは、１ミリリットルの脂肪組織当たり、平均３〜５×１０５個の１°（一次）ＳＶＦ細胞を産生する。これは、文献で報告されている数値と近似している。表面免疫表現型に基づく３つの最も大きな亜集団は、前脂肪細胞（２４．７±６．９％；ＣＤ１４−、ＣＤ３６＋）、ＡＳＣ様（２０±１０．７％；ＣＤ１４６−、ＣＤ３４＋、ＣＤ９０＋）、及び、白血球（１９．４±９．７％；ＣＤ３４−、ＣＤ４５＋）であった。注目すべきことに、当該ペレット化ＳＶＦ細胞集団は、コラゲナーゼＩ型組織消化、及び、分化遠心分離による単離のプロセスが故に、浮遊成熟脂肪細胞（全集団の約３０％と推定される）を排除する。最初のＳＶＦ画分を、まず、ＣＤ１４６−亜集団（８０．５±５％）について選別した。このことは、分画したＳＶＦ細胞の初期コホートとして役立った。その他のコホートを、ＣＤ３４及びＣＤ２９表面抗原発現、すなわち、（ｂ）ＣＤ２９＋（ＣＤ１４６−集団の１８．２±８．５％）、及び、（ｃ）ＣＤ３４＋（ＣＤ１４６−集団の２１．４±１２．８％）ＳＶＦ細胞についての選別に基づいて選択した。フローサイトメトリー選別プロトコルを、図２に示す。これらのコホートの特徴［（ａ）全ＣＤ１４６−ＳＶＦ細胞、（ｂ）ＣＤ１４６−、ＣＤ２９＋を豊富に含有した細胞、及び（ｃ）ＣＤ１４６−、ＣＤ３４＋を豊富に含有した細胞］を、プラスチック接着細胞培養の免疫表現型、増殖、コロニー形成、及び、継代２（Ｐ２）での脂質生成の可能性に基づいて決定した。その他の公表した報告と同様に、間質マーカー（ＣＤ２９）は、発現が大きくなっており、そして、内皮マーカー（ＣＤ３１、ＣＤ４５）、及び、造血マーカー（ＣＤ３４、ＣＤ１１ｂ）は、継代して発現が小さくなった。Ｓｃａ−１発現は、未選別のＳＶＦ集団内で平均６１．６±１０．７％であり、また、継代を通じて増加した（図２Ａ）。ＣＤ２９及びＣＤ３４の濃縮は、Ｓｃａ−１発現を小さくした（ＣＤ２９；１３．８±２．４％、ＣＤ３４、１３．７±０．９％）。ＣＤ３４＋を豊富に含有した亜集団は、ＣＤ２９＋を豊富に含有した亜集団よりも有意に高い増殖能と脂質生成能とを示した（図２Ｂ）。さらに、ＣＤ２９＋亜集団は、未選別の集団よりも倍加時間が遅く、また、細胞質内の脂質蓄積が少なかった（図２Ｃ、２Ｄ）。
【０１１１】
スキャフォールドへのＳＶＦ及びＡＳＣ播種
ＧＦＰ−ＡＳＣのインビトロでの播種、及び、増殖特性を、ＨＦＩＰをベースとしたシルクスキャフォールドに播種した後に調査した。インキュベーションの２４時間後に、播種した、及び、未播種のコントロールスキャフォールドに対して、共焦点顕微鏡観察を行った（図９）。ＧＦＰ検出、及び、Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ染色は、シルクスキャフォールドハニカム様構造の端部での細胞局在化の優先度を示した（図９Ｂ、明視野、及び、図９Ｄ、走査型電子顕微鏡）。これらの端部に残存した細胞は、分化（図９Ｃ）、及び、増殖（図９Ｄ、９Ｅ）を始めた。Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ（図９Ｄ）サイトゾル、及び、ＤＡＰＩ（図９Ｅ）核陽性の定量では、播種して２時間後に細胞は存在していた（１８時間；１６±２細胞；２時間、１１±８細胞；図９Ｅ）が、スキャフォールドに付着し、そして、播種して１８時間後にＲＦＵで測定可能な代謝活性を示した（１８時間、３６ＲＦＵ；２時間、０．００１ＲＦＵ；図９Ｅ）。
【０１１２】
ＳＶＦ細胞は生着を強化し、そして、インビボで脂肪を生成する
６週間の時間経過を用いて、未分画ＳＶＦ細胞を、増殖及び脂質生成についてモニターした。写真分析は、ＳＶＦ細胞の存在が、１週目までに生着を促すことを明らかにした（図３Ａ）。パーセントヘモグロビン飽和度の測定値（％Ｈｂ；図３Ｂ）も、観察したＳＶＦ細胞媒介血管新生の促進を支持した。ヘモグロビン測定は、生存しているマウスの皮膚表面で行っており、そして、飽和度の測定は、単なる動脈の血液供給ではなく、全ての組織を評価する、ことに留意すべきである。２週目以降は、視覚的にも、また、ＩｍａｇｅＪを用いた外植片画像の定量でも、生着に有意差は認められなかった（図３Ｃ）。このことは、インビボでの脂質生成を促すスキャフォールドの血管特性及び支持特性を示唆している公表されたデータと符合した。スキャフォールド質量の測定（図３Ｄ）、及び、播種したスキャフォールドから回収した総ＳＶＦ（図３Ｅ）は、１週目の間、未播種のコントロールよりも有意に大きかった。ＳＶＦ細胞計数、及び、スキャフォールド質量は、２週目に最大に達し、そして、４週目までに減少した（パネル３Ｄ、３Ｅ）。
【０１１３】
連続移植後に検出した未選別ＧＦＰ−ＳＶＦ細胞
１週目から６週目までの初期移植での未選別ＧＦＰ−ＳＶＦの毎週の検出（図４Ａ）は、ＧＦＰ−ＳＶＦ細胞が、スキャフォールド内で持続するだけでなく、移植をして１週目という早い時期に増殖、及び、分化することを明らかにした。最初のＳＶＦ外植片の１、４、５、及び、６週間目についての共焦点顕微鏡画像を示す（図４Ａ）。ＧＦＰ−Ｔｇ  ＳＶＦ細胞を、初期コホート（Ｔ０移植）、ならびに、初期移植（Ｔ１移植）、及び、二次連続（Ｔ２移植；図４Ｂ）移植片由来の外植片内で検出した。ＧＦＰ−Ｔｇ  ＳＶＦ細胞のフローサイトメトリーに基づいた検出は、共焦点顕微鏡観察と一致していた（図４Ｃ）。最初の移植では、４週目にフローサイトメトリーを介して１９％のＧＦＰ抗原陽性が認められたが、Ｔ１及びＴ２移植では、移植と比較して同じ時点で、それぞれ、１６．２％及び１３．１％のＧＦＰ陽性が認められた（図４Ｃ）。ＧＦＰの定量、ＢＯＤＩＰＹ親油性色素染色（構築物の脂質生成性を実証するため）、及び、核ＤＡＰＩ染色の共局在化を、ＩｍａｇｅＪを用いて行った。定量は、１週目と比較して、Ｔ０移植をして６週後までに、ＧＦＰ−Ｔｇ  ＳＶＦ細胞パーセンテージは５０％増加していた（図４Ｄ）。図４Ｄに報告したフローサイトメトリーデータは、図４Ｃに報告した組織から単離したＳＶＦ細胞について行っている、ことに留意することが重要である。脂肪組織は、成熟脂肪細胞、及び、組織消化手順に耐えられないその他の細胞を含有しており、そして、フローサイトメトリー数に反映されない。従って、図４Ｄは、組織試料での全ての細胞を反映していない。フローサイトメトリー、及び、ｑＰＣＲのそれぞれを介した、タンパク質及びＤＮＡレベルに基づいて、取り出した外植片でのＧＦＰ発現をさらに調査した（図４Ｅ、４Ｆ）。フローサイトメトリーを介した、パーセントＧＦＰ−Ｔｇ細胞の毎週の検出は、Ｔ０移植後の２週目の３．８％から４週目の１６％へと発現を増大することを明らかにした（図４Ｅ）。Ｔ２移植後、ＧＦＰ  ＤＮＡ発現を、２００倍以上へと豊富にした（非トランスジェニックマウスにおける未播種スキャフォールド移植）（図４Ｆ）。Ｔ２移植集団由来の細胞の表面免疫表現型も、６週間後に、ＧＦＰ−Ｔｇコントロール、及び、未播種のスキャフォールドコントロールと比較した（図４Ｇ）。このＴ２スキャフォールドは、３６．３±２．４％のＧＦＰ陽性、６７．８±４．１％のＣＤ２９陽性、及び、５２．４±２．４％のＣＤ４５陽性を示した（図４Ｇ）。
【０１１４】
ＣＤ３４を豊富に含有したＧＦＰ−Ｔｇ  ＡＳＣは生着を強化し、そして、インビボで機能性脂肪を生成する
ＧＦＰ−Ｔｇ  ＳＶＦ細胞を単離し、そして、未分画細胞として分類するか、または、ＣＤ１４６−  ＣＤ２９＋を豊富に含有した、または、ＣＤ１４６−  ＣＤ３４＋を豊富に含有した群として選別した。これらの細胞を、Ｐ２  ＧＦＰ−Ｔｇ  ＡＳＣまで培養増殖し、シルクスキャフォールドに播種し、そして、Ｔ０連続移植まで非トランスジェニックマウスに移植した。移植片の除去の６週目では、脂肪デポーサイズの視覚的差異は認められなかった（図５Ａ、５Ｂ）。パーセントヘモグロビン（％Ｈｂ）飽和度、及び、外植片生着の測定を行った。ＣＤ２９−、及び、ＣＤ３４−を豊富に含有するＧＦＰ−Ｔｇ  ＡＳＣの双方を播種した移植片は、未播種の移植片、及び、未選別のＡＳＣコントロールを播種した移植片の双方と比較して、移植の１週後に、高い％Ｈｂ飽和度を示した（図５Ｃ）。さらに、ＣＤ３４−を豊富に含有する移植片は、ＣＤ２９−を豊富に含有する移植片よりも有意に高い％Ｈｂ飽和度を示した（未播種ＡＳＣ：コントロール、３７．６±９．９％；ＣＤ３４−を豊富に含有するもの、６８．１±５．３％；ＣＤ２９−を豊富に含有するもの、４５±１０．８％；図５Ｃ）。このことは、顕微鏡画像のＩｍａｇｅＪソフトウェア分析を用いて、視覚的及び定量的に認められた（図５Ｄ）。外植片の質量、及び、周辺脂肪の質量の測定（図５Ｅ）は、ＣＤ３４−を豊富に含有する移植片由来の人工構築物が、ＣＤ２９−を豊富に含有する、及び、未選別のＧＦＰ−Ｔｇ  ＡＳＣ、ならびに、未播種のコントロールよりも著しく密度が大きい、ことを明らかにした（図５Ｅ）。ＣＤ３４−を豊富に含有するＡＳＣを接種したスキャフォールドから回収した総ＳＶＦ（図５Ｆ）もまた、１週目の間に、ＣＤ２９−を豊富に含有する未選別ＡＳＣ、及び、未接種のコントロールよりも有意に高かった（図５Ｆ）。組織を改変した脂肪の機能性のさらなる研究は、ＣＤ３４−を豊富に含有する構築物が、未選別のＡＳＣ構築物に匹敵するグリセロールレベルで分泌し、その一方で、ＣＤ２９−を豊富に含有する構築物は、有意に低いレベルのグリセロールを分泌することを明らかにした（図５Ｇ）。コホート間で、グルコース取り込みにおいて、有意差は認められなかった（図５Ｈ）。
【０１１５】
連続移植後に検出したＣＤ１４６−ＣＤ３４＋／ＣＤ２９＋  ＧＦＰ−Ｔｇ  ＡＳＣ
初期コホート（Ｔ０移植）、ならびに、初期連続（Ｔ１移植；図６Ａ）から６週間以内に、ＧＦＰ−Ｔｇ  ＡＳＣを検出した。これらの組織移植片を血管で浸潤させ、このことは、ＧＦＰ−Ｔｇ  ＳＶＦ、及び、ＧＦＰ−Ｔｇ  ＡＳＣを播種したスキャフォールドによる組織生着の早期の観察と符合している。新たに単離したＧＦＰ−Ｔｇ細胞のフローサイトメトリーをベースとした検出は、移植の６週後の共焦点顕微鏡観察でのＧＦＰ陽性を支持した（図６Ｃ、６Ｄ）。フローサイトメトリーによって、１０．９％のＧＦＰ陽性を示したＣＤ２９−を豊富に含有する構築物と比較して、当初のＣＤ３４−を豊富に含有する構築物では、２９．４％のＧＦＰ抗原陽性が検出された（図６Ｃ）。ＣＤ３４−を豊富に含有する、及び、ＣＤ２９−を豊富に含有するＴ１移植片は、それぞれ、２０．４％、及び、８．４％のＧＦＰ陽性を示した（図６Ｄ）。ＧＦＰ、ＢＯＤＩＰＹ親油性染料、及び、ＤＡＰＩ共局在化染色の定量を、ＩｍａｇｅＪを使用して行った。外植片内のＧＦＰ発現を、ｑＰＣＲ、及び、フローサイトメトリーのそれぞれを介して、ＤＮＡ、及び、タンパク質レベルに基づいてさらに調べた（図６Ｅ−６Ｇ）。検出したＧＦＰ  ＤＮＡは、ＣＤ２９−を豊富に含有する構築物と比較して、ＣＤ３４−を豊富に含有する構築物において１５倍多く、また、Ｔ１移植後の未選別のＡＳＣ構築物よりも１０倍以上も多かった（図６Ｅ）。フローサイトメトリーを介したパーセントＧＦＰ−Ｔｇ細胞の検出は、Ｔ０移植片（ＣＤ２９、９．８±１．１；ＣＤ３４、２４．７±６．５；図６Ｆ）、及び、Ｔ１移植片（ＣＤ２９、５．４±１．２；ＣＤ３４、１７．５±１．４；図６Ｇ）の８週間後のＣＤ２９−を豊富に含有する構築物と比較して、ＣＤ３４−を豊富に含有する構築物由来のＧＦＰ−Ｔｇ細胞の発現における有意差を支持した。
【０１１６】
ＣＤ１４６−  ＣＤ３４＋を豊富に含有した構築物は、インビボで、機能的ＧＦＰ＋脂肪を生成する
播種したＧＦＰ−Ｔｇ  ＳＶＦ、未選別のＧＦＰ−Ｔｇ  ＡＳＣ、ＧＦＰ−Ｔｇ  ＣＤ３４−を豊富に含有するＡＳＣ、ＧＦＰ−Ｔｇ  ＣＤ２９−を豊富に含有するＡＳＣ、ならびに、ＧＦＰポジティブ及びネガティブコントロール由来の脂肪周囲から除去した８週間連続移植片を取り出し、そして、ＧＦＰ陽性（図７Ａ−７Ｃ）と機能性（図７Ｄ、７Ｅ）について分析をした。ＢＯＤＩＰＹ染色して取り出した脂肪周囲の８週間構築物の共焦点顕微鏡画像は、ＣＤ２９−を豊富に含有した、未選別ＡＳＣ、及び、ＳＶＦ播種構築物と比較して、ＣＤ３４−を豊富に含有するコホートにおけるパーセントＧＦＰ−Ｔｇ脂肪細胞の有意な増加を明らかにした（図７Ａ、７Ｂ）。ＩｍａｇｅＪを用いた画像の定量は、目視の観察と符合した（ＳＶＦ，２．５±１．７％；未選別ＧＦＰ−Ｔｇ  ＡＳＣ，１５．５±０．２％；ＣＤ２９−を豊富に含有したもの、６．１±７．０％；ＣＤ３４−を豊富に含有したもの、３１．３±０．４％；図７Ｃ）。組織改変した脂肪機能性のさらなる研究は、ＣＤ３４−を豊富に含有する構築物が、未選別ＡＳＣ構築物に匹敵するグリセロールレベルを分泌するのに対して、ＣＤ２９−を豊富に含有する構築物は、有意に低いレベルのグリセロールを分泌することを示した（ＣＤ３４，７０±１６．１μＭ；未選別ＡＳＣ，７５±２２．１μＭ；ＣＤ２９，４０±１４．６μＭ；図７Ｄ）。図５での取り出した構築物と同様に、コホート間でグルコース取り込みに有意差は観察されなかった（図７Ｅ）。
【０１１７】
考察
本研究は、３Ｄシルクマトリックスを使用して、新たに単離したＧＦＰ−Ｔｇ  ＳＶＦ細胞を、１回の初期、及び、２回の連続移植（２°移植）で、首尾よく非−ＧＦＰ−Ｔｇトランスジェニック同系マウス宿主に移植した。初期の時間をベースとした移植片除去研究は、ＧＦＰ−Ｔｇ  ＳＶＦ細胞の生存、増殖、及び、分化を実証しており、代謝的に機能的な脂肪組織の形成に至った。時間をベースとしたＧＦＰ−Ｔｇ  ＳＶＦ実験はまた、生着を増強し、そして、生着時間を短縮するＳＶＦ細胞の能力を明らかにした。増殖したプラスチック接着性ＣＤ１４６−ＣＤ２９＋、及び、ＣＤ１４６−ＣＤ３４＋  Ｐ２  ＧＦＰ−Ｔｇ  ＡＳＣ集団を、３Ｄマトリックスに播種し、そして、初期、及び、連続移植（１°移植）へと首尾良く非ＧＦＰ−Ｔｇトランスジェニック宿主に移植した。我々の知る限りでは、我々は、間質性血管コンパートメント内の非周皮細胞性ＡＳＣの特定の亜集団が、連続移植を通じて機能的脂肪を生成する能力を初めて報告した。
【０１１８】
Ｍａｕｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．は、フローサイトメトリーによって選択をし、または、豊富にしていない、培養増殖した凍結保存ＡＳＣの能力について報告を行って、改変したスキャフォールドを使用して、ラットにおいて脂肪パッドを生成した。彼らの研究の目的として、脂肪組織改変戦略におけるそれらの有用性のために、コラーゲン及びポリ乳酸をベースとしたスキャフォールドと共に、水性（ＡＢ）及び有機（ＨＦＩＰ）溶媒をベースとしたプロセスによって調製したシルクフィブロイン由来の生体材料を比較することがあった。対照的に、本開示は、１）より効果的に脂質生成及び脂肪生着を促し、及び、保持する、表面抗原選択亜集団、及び、ＳＶＦ内のその他の細胞などの、別異の、より異質的な間質血管集団、２）本開示における細胞の挙動を説明するモデルとしての連続移植、及び、３）長期のインビトロ培養を提供する。
【０１１９】
マウス組織の体積に限りがあるため、本研究で使用したＡＳＣは、複数のマウスドナーからプールされ、そして、連続移植のための開始試料の規模は、ｎ＝２０であった。この研究における注意点は、新たに単離したマウスＧＦＰ−ＳＶＦから増殖したＣＤ３４−を豊富に含有する、及び、ＣＤ２９−を豊富に含有するＡＳＣ集団の使用であり、ＣＤ３４−単独、及び、ＣＤ２９−単独の集団ではない。新たに単離したＳＶＦ副画分内のＣＤ２９＋／ＣＤ３４＋二重陽性、及び、ＣＤ２９−／ＣＤ３４−二重陰性亜集団の希少性が故に、この研究における分類は、ＣＤ２９共発現を考慮せずに、培養増殖ＣＤ３４＋細胞を含んだ。ＣＤ３４共発現を考慮せずに、同じ選択を、ＣＤ２９にも使用した。従って、ＣＤ３４＋  ＧＦＦ−ＡＳＣ集団内の亜集団はまた、固定、増殖、遊走、及び、脂質生成調節に関与するＣＤ２９、ならびに、その他の細胞表面、及び、細胞内間質マーカーを共発現した。新たに単離したマウスＳＶＦ細胞内のＣＤ３４＋集団は、未分類の集団において、平均で２１．４％であったが、当該ＳＶＦでのＣＤ３４＋を豊富に含有した集団は、２回の継代培養後に、平均で３３％の陽性率を維持した。この研究におけるパーセンテージＣＤ３４＋  ＧＦＰ−Ｔｇ  ＡＳＣは、ヒトＳＶＦ内のＣＤ３４陽性に関して公表した報告と同様である。当該ヒトＣＤ３４陽性集団は、インビトロで強化した増殖能と、脂質生成能を有することを実証した。ＣＤ３４＋  ＡＳＣ収量と異種移植脂肪組織体積保持との間にも強い相関が同定されており、ＣＤ３４＋前駆体の濃度が、臨床現場でのヒト脂肪移植片の生存を予測できることを示唆している。将来の実験は、まず、免疫不全マウスモデルにおいて選別したヒト細胞の挙動を調べることで、この研究を、よりヒト化した系へと発展させる。これらの実験はまた、ｎ＝２０を超える、より大きな規模の初期試料を可能にする。
【０１２０】
現在の文献は、「脂肪間質」細胞、及び、「血管周囲幹」細胞という用語を互換的に使用して、脂肪移植生存を補助する細胞に言及している。伝統的に、血管周囲幹細胞は、ＣＤ４５−、ＣＤ１４６＋、及び、ＣＤ３４−の免疫表現型に基づいて同定する。ＣＤ１４６−ＣＤ３４＋を豊富に含有したＡＳＣ連続移植片からの結果は、連続的な移植にわたって、マウスにおいて機能的脂肪パッドを生成することができる、ＳＶＦ内の非周皮性ＡＳＣ亜集団の存在を示している。これらの知見は、新生児マウスの組織内在幹細胞を、ブロモ−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）で標識する、インビボでの細胞分解／マッピング研究が支持している。８週間後、鼠径部脂肪デポーの組織学的分析は、ＢｒｄＵ標識保持幹細胞を、成熟脂肪細胞（非周皮細胞集団と一致する）の近傍において、血管周囲腔（周皮細胞亜集団と一致する）、及び、毛細血管から離間した場所に認めた。この研究では、ＣＤ１４６−集団が、プラスチック接着集団の大部分（８０％）を占めているが、これらの細胞の２０％しか、前駆細胞抗原ＣＤ３４を共発現していない。それにもかかわらず、現在の結果は、非周皮細胞が、インビボで脂質生成幹細胞として役立つことができる、ことを示している。
【０１２１】
１及び４週目の％Ｈｂ飽和度の共焦点蛍光画像測定は、ＧＦＰ−Ｔｇ  ＳＶＦ、または、豊富に含有させたＧＦＰ−Ｔｇ  ＡＳＣの存在が、移植の１週目という早い時期に、スキャフォールドの生着を促すことを実証した。１及び２週目に、外植片から得たＳＶＦ、及び、スキャフォールド重量の測定は、これらのデータを支持した。現在公表されている報告は、軟組織及び硬組織のリモデリングの双方を含む様々な用途において、ＳＶＦ及びＡＳＣが、生着の強化、及び、創傷治癒の促進、ならびに、病態生理学的条件の改善を促す、ことを示唆している［４２］。Ｍｅｓｉｍａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．は、βリン酸三カルシウム、及び、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ２）を用いた、上顎組織片の強化のための増殖したＡＳＣの使用法を実証した。増殖したＡＳＣの添加は、成熟骨構造及び血管系の発達を助けた。Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．は、術後１２ヵ月で、人工乳房の増強の代わりに、「細胞付加型脂肪移植（ＣＡＬ）」と呼ばれる手法である、ＳＶＦ細胞で補強した脂肪組織移植片の導入を受けた５５名の患者において、外科医と患者の満足度が高いと報告した。最近になって、Ｂｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．は、重症の虚血性四肢を有する患者を処置するために自家のヒトＡＳＣを使用しており、そして、組織酸素送達の有意な改善を認めている。まとめると、これらのヒト臨床試験は、我々のマウス前臨床モデルにおける知見に信憑性を付与している。
【０１２２】
８週連続移植片の共焦点顕微鏡検査、及び、フローサイトメトリー分析は、ＣＤ３４  ＋−を豊富に含有する亜集団が、未選別のＡＳＣ移植片と同様に、機能的脂肪パッドを生成することができる、ことを示した。ＣＤ３４＋−を豊富に含有するＡＳＣは、インビトロで、ＣＤ２９＋−を豊富に含有する、及び、未選別のＡＳＣよりも高い速度で、増殖し、そして、脂質生成分化を受けることが実証された。インビボでは、より高い割合のＳＶＦ細胞を、ＣＤ３４−を豊富に含有する構築物から回収した。これらの外植片は、ＣＤ２９−を豊富に含む、及び、未選別のＡＳＣコホートよりも、平均してより高いスキャフォールド質量を有した。６週間後のスキャフォールド周囲の脂肪の機能分析は、ＣＤ３４−を豊富に含有する外植片が、ＣＤ２９−を豊富に含有する、未選別のＡＳＣ、及び、コントロールの未播種移植片よりも、グリセロール分泌が多いことを明示した。ＧＦＰ−Ｔｇ  ＳＶＦ、及び、−ＡＳＣを、周囲の脂肪デポーで検出した。ＢＯＤＩＰＹ染色、グリセロール取り込み、及び、脂肪分解分析は、これらの細胞が、増殖し、スキャフォールド内で分化し、そして、成熟脂肪細胞または前脂肪細胞として局所的に遊走している、ことを示唆している。これらのデータは、ＣＤ１４６−ＣＤ３４＋が豊富であるＡＳＣ集団内に表現型的に見出される亜集団が、連続継代にわたって機能的脂肪パッドを生成することを示唆する。これらの知見は、Ｐｈｉｌｉｐｓ  ｅｔ  ａｌ．による研究と一致しており、ドナー脂肪組織でのＣＤ３４＋細胞の頻度と相関するヒト脂肪組織異種移植片の機能性及び体積維持を明らかにした。
【０１２３】
結論
「間質／前駆体」細胞と「幹」細胞との間で、細胞カテゴリーを区別することには、依然として課題がある。それにもかかわらず、現在の連続移植での知見は、成体マウスの鼠径部ＷＡＴが、フローサイトメトリーと、機能性脂肪組織デポーの再生、及び、連続移植に寄与することができる細胞の選別可能な亜集団とを含む、ことを示唆している。これらの知見は、フローサイトメトリーで選別した脂肪由来細胞が奏する、脂肪異栄養性マウスにおける脂肪デポーの再生能力を試験しているＲｏｄｅｈｅｆｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．の初期の研究を確認し、また、発展させるものである。加えて、これらは、機能的組織改変のための自家脂肪由来細胞の有用性をさらに検証する。この研究はまた、単離した脂肪細胞前駆細胞の免疫表現型、及び、周皮細胞特性を特徴決定する以前の研究を発展させるものである。
【０１２４】
実施例３：ヒト血小板溶解物（ｈＰＬ）ゲル調製についての実験
ｈＰＬとＤＭＥＭ  Ｆ１２を組み合わせて、３７％で温めると、その生成物は、増殖した（１〜２ヶ月）３Ｄ培養物、及び／または、皮下注射によるインビボ移植に資する熱反応性バイオスキャフォールドとなる。
【０１２５】
方法
ｈＰＬの調製
特に断りがない限り、生物学的安全キャビネット内ですべての手順を行う。所望の量の濃縮した有効期限の過ぎたヒト血小板を、１５ｍＬまたは５０ｍＬのコニカルチューブに採取する。直ちに３Ｄ細胞培養に使用しない場合は、３回の凍結／解凍サイクルで、溶解物調製を行う前に、−２０℃で保存する。３回の凍結／解凍サイクルを実施して、浸透作用によって血小板を溶解する。これは、細胞培養のための増殖因子を最大収率で放出する。８，０００×ｇで、２０分間、遠心分離する。吸引によって、ヒトの血小板の固体（白色）最上層を除去する。
【０１２６】
ｈＰＬ補充培地調製
細胞培養に必要な栄養素、アミノ酸、及び、増殖因子を含有する１％抗生物質／抗真菌剤、及び、９１．５％Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ、または、その他の関連細胞培養培地に対して、７．５％（ｖ／ｖ）のｈＰＬを添加して、ｈＰＬ補充培地を調製する。混合した後は、水浴で温めない。室温に維持する。
【０１２７】
ｈＰＬマトリックス装置の活性化
調製したｈＰＬを、細胞集団、または、細胞集団の混合物と組み合わせることにより、細胞外マトリックスの細胞分泌、増殖、及び、分化を促すゲル化（厚いマトリックスの形成）を活性化する。これらの細胞とｈＰＬとを混合した後に、ゲル化の活性化のために、２０分間、プレートを、インキュベーターに加える。増殖、分化、マウスへの移植、または、その他の測定終点へと進む。
【０１２８】
実施例４：チップ上の脂肪テクノロジー
皮膚癌を除外すると、乳癌は米国の女性において最も頻繁に認められる腫瘍であり、がん関連の死因の第２位を保っている。乳癌死亡のリスクは、アフリカ系アメリカ人女性で特に高く、この疾患は、しばしば食事／栄養、経済的格差、遺伝、健康へのアクセス、及び、肥満に関連する要因に起因する予後不良と関連している。免疫不全マウスにおいて維持した患者由来の異種移植片（ＰＤＸ）モデルは、新規の乳癌療法を開発するための前臨床モデルとして有望であるが、受託研究、及び、腫瘍薬理学的開発のために市販されるＰＤＸ乳癌の数には限りがある。本発明者ら、すなわち、マイノリティーで、かつ、女性が所有しているバイオテクノロジー会社は、大都市のニューオーリンズ地域と、隣接するルイジアナ州南東部に居住する、民族的に多様な患者の人口統計学から乳房腫瘍標本にアクセスする、というユニークな立地にある。
【０１２９】
本発明者らは、（１）ヒト血小板溶解物は、血管形成を増強する豊富な増殖因子を高濃度で含有しており、かつ、原発性乳房腫瘍細胞によるコロニー形成を促すと報告されている、（２）皮下脂肪組織から単離した間質血管画分（ＳＶＦ）細胞は、リンパ球、骨髄球、周皮細胞、内皮前駆細胞、及び、三次元脂肪デポーを発達させるのに必要な前脂肪細胞を含んでおり、（３）ヒト脂肪由来間質／幹細胞（ＡＳＣ）は、アジポカイン（とりわけ、レプチン）の分泌、及び、関連メカニズムを介して、インビトロ、及び、インビボで、乳癌の増殖、移動、及び、浸潤を促す、などの特定の情報に関して構築を試みた。確立したヒト乳癌細胞株を用いた何十年もの研究が、何千もの論文原稿を生み出してきたが、これらの二次元培養システムでは、免疫及び間質細胞相互作用に関して、乳癌のマクロ環境を正確に模倣できていないことが多い。患者由来の異種移植片（ＰＤＸ）を用いた比較的限られた研究だけが、病理生理学的に正確で、かつ、再現可能なヒト疾患モデルに対して、未だに満足されていない必要性に対処し始めている。マウスにおけるヒト異種移植片を確立するのに必要とされる長い時間、及び、それらの生着速度の遅さが故に、研究の大部分が妨げられている。本発明者らは、これらの制限、及び、必要性に取り組む革新的な方法を開発した。
【０１３０】
皮下脂肪組織脂肪吸引物から単離したヒトＳＶＦ細胞を、フローサイトメトリー特徴決定、コロニー単位の形成、増殖、ならびに、脂質生成、及び、骨形成の分化に基づいて、凍結保存、及び、品質管理する（データは示さず）。凍結保存したＳＶＦ細胞の挙動を、３Ｄ哺乳動物血小板溶解物培養システムで評価する（図１６及び１７）。これらのｈＳＶＦ細胞は、１０％ＦＢＳを含有するコントロール培地と比較して、哺乳動物血小板溶解物の用量依存的存在下で、それらの増殖能力を高めた（ロットの特徴決定、ならびに、最適脂肪間質／幹細胞増殖、及び、脂質生成に基づくスクリーニング）。さらに、これらのｈＳＶＦ細胞は、漸増濃度の哺乳動物血小板溶解物の存在により、それらのスフェロイド形成を増加させる（図１６）。脂質生成誘導因子の非存在下では、スキャフォールドを含有する哺乳動物血小板溶解物でのｈＳＶＦ細胞は、３週間の培養期間にわたって、血管様ネットワークの形成を示す。添加した脂質生成誘導剤の存在下では、これらのｈＳＶＦ細胞は、脂質液胞を蓄積して、顕微鏡観察、及び、Ｂｏｄｉｐｙ染色で検出されるようになる（図１７）。
【０１３１】
機能性を、白色（ＷＡＴ）脂肪組織改変構築物におけるアジポカイン（アジポネクチン、レプチン）分泌の定量的生化学的評価で検証した。アジポカイン分泌は、２Ｄ構築物と比較して、３Ｄの方が強かった（データは示さず）。機能性を、フローサイトメトリーに基づいた、脂肪分解、グルコース取り込み、及び、細胞の不均一性の定量的生理学的評価によってさらに検証した（データは示さず）。
【０１３２】
このｈＳＶＦ細胞／哺乳動物血小板溶解物スキャフォールドを、免疫不全（ヌードｎｕ／ｎｕ）マウスに移植して、生理学的「ヒト化脂肪パッド」を作製した（図１８）。これらの予備データは、新規で機能的で、かつ、商業利用が可能な「チップ上の脂肪」を開発する際の本発明者らの技術的専門知識を証明している。
【０１３３】
脂肪由来細胞は、乳癌細胞株の増殖を促す：ＰＩ及び彼女の共同研究者による研究は、ヒト脂肪由来細胞が、インビトロ、及び、インビボで、乳癌細胞株の増殖を促すことを実証した。脂肪組織ドナーの肥満度指数は、乳癌細胞の増殖に寄与する。肥満は、痩身とは対照的に、ドナー由来間質細胞は、それらの増大したアジポカインレプチンの分泌を介して、乳癌細胞増殖を強める。従って、ヒト化した「チップ上の脂肪」内でｈＳＶＦ細胞の脂質生成を促すことによって、哺乳動物血小板溶解物は、免疫不全マウスにおける乳房腫瘍異種移植片の生着、及び、増殖に対して直接に影響を与える。
【０１３４】
統計：実験１及び実験２におけるすべての実験は、三連の動物において行われ、同動物は、それぞれ、二連の移植片を有する。定量結果は、平均値±標準偏差として評価して報告する。両側ｔ検定、ＡＮＯＶＡ、または、Ｔｕｋｅｙ（信頼区間９５％、ｐ−値＜０．０５は有意と見なす）に基づいて、コントロール（ＳＶＦ細胞、または、スキャフォールドの無い腫瘍移植片）と、実験条件（ＳＶＦ細胞、及び／または、スキャフォールドを有する腫瘍移植片）との比較を評価する。
【０１３５】
仮説１及び実験１：ヒトＳＶＦ細胞と組み合わせて免疫不全マウス（ＮＳＧ）に移植した乳癌細胞株の増殖のためのスキャフォールドとして、ヒト血小板溶解物が、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）と同等以上に機能すること。
【０１３６】
理論的根拠：腫瘍学界は、特に、アフリカ系アメリカ人患者が直面している健康格差の状況において、予後、診断、及び、治療の目的で、ＰＤＸモデルの範囲を拡大することに、相応の関心を持っている。主な課題は、（ａ）ＰＤＸの４０〜８０％が、免疫不全宿主に首尾良く移植できないこと、及び、（ｂ）移植の成功、または、失敗をリアルタイムでモニターするための感度の良い非終端法の欠如である［１０、２０］。結腸癌のＰＤＸモデルの研究は、原発性腫瘍の異種移植片と一緒にＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）を含めると、免疫不全マウスへの移植後に首尾良く生着する率を有意に増加させることができる、ことを実証した。Ｍａｔｒｉｇｅｌの正確なメカニズムは未だ解明されていないが、腫瘍の増殖速度を高め、かつ、加速するその能力は、腫瘍の微小環境に対する増殖因子、及び、サイトカインの寄与に起因している。このことは、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）が、インビトロで、乳癌細胞増殖を促することができる、という事実と符合する。本発明者らの特許製品（哺乳動物血小板溶解物、及び、脂肪由来ＳＶＦ細胞）は、サイトカイン、及び、増殖因子の供給源として独特の特徴を有しており、そして、さらに、体温でインキュベーションすると、三次元の細胞化マトリックスを作り出すことができる。加えて、Ｉｎｎｏｇｅｎｏｍｉｃの高感度ヒト細胞検出方法は、宿主の安楽死を必要とせずに、生存している動物における腫瘍細胞の増殖の早期検出、及び、定量的評価を可能にする。実験１は、１つ以上のヒト乳癌細胞株を用いて、脂肪細胞、及び／または、マトリックスの能力を実証する原理データの証明を確立して、インビボでの腫瘍増殖を加速する。
【０１３７】
実験計画：
厳密性と透明性：免疫不全マウス株は、そのマウス株の厳密な分析と品質保証を行い、ＮＩＨが支援する受託研究施設であるＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから直接に入手する。確立した乳癌細胞株は、その製品の厳密な分析を行い、ＮＩＨが支援する細胞貯蔵施設であるｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから直接に供給を受ける。発明者は、ＳＶＦ細胞ドナーの重要な人口統計（年齢、性別、肥満度指数、民族性）を、身元を伏せた匿名記録で維持する。同社の細胞製品のすべての凍結保存したバイアルは、最新のデータベースに入力され、そして、貯蔵容器の完全性を、同社の技術スタッフが毎日監視する。本発明者は、インビトロ培養、フローサイトメトリー、及び、分化アッセイを使用して、その哺乳動物血小板溶解産物、及び、ＳＶＦ細胞に対して、日常的に品質保証及び品質管理の試験を実施する。女性の乳癌の発生は、男性のそれを、ほぼ２桁上回っているので、第Ｉ相試験は、メスのＮＳＧマウスと、女性のドナーから単離したｈＳＶＦ細胞を用いて行う。オスのマウス、及び、男性の脂肪ドナーを対象としたその他の試験は、試験セクションで推奨されている場合にのみ、第ＩＩ相で検討する。
【０１３８】
方法：すべての研究を、適切に検討され、かつ、承認を受けたＩＲＢプロトコル（Ｗｅｓｔｅｒｎ  IＲＢ、または、Ｏｃｈｓｎｅｒ  ＩＲＢ）、患者の同意（署名し、または、権利放棄を謳った）、及び、ＩＡＣＵＣプロトコル（Ｔｕｌａｎｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ＩＡＣＵＣ）の下で行う。ＳＶＦ細胞の単離及び特徴決定：本発明者のサイエンスパートナーであるＬａＣｅｌｌ  ＬＬＣによるプロトコルの下で、選択的脂肪吸引術を受けている健康な対象から提供された皮下脂肪組織から、ヒトＳＶＦ細胞を単離する。組織をＰＢＳで洗浄し、１型コイラゲナーゼで消化し、そして、ＳＶＦ細胞を、密度遠心分離によって単離してから、前述したようにして凍結保存する。初期の研究は、ＢＭＩ＞３０である肥満女性ドナー、ｎ＝３、からプールしたｈＳＶＦ細胞を使用する。時間と資源が許す限り、ＢＭＩ＜２５である痩身女性ドナー、ｎ＝３、からプールしたｈＳＶＦ細胞を使用して、さらなる研究を実施する。解凍時に、ＳＶＦ細胞の生存率を、蛍光をベースとした生／死アッセイ（ＬａＣｅｌｌ  ＬＬＣ試薬）を使用して評価する。
【０１３９】
ｈＳＶＦ細胞／スキャフォールドの脂質生成：これらのｈＳＶＦ細胞（１０６）を、２５０μｌの２５％のＭａｔｒｉｇｅｌ、または、哺乳動物血小板溶解物と混合し、１２ウェルプレートの個々のウェルに播種し、そして、Ｓｔｒｏｍａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（商標）（ＬａＣｅｌｌ  ＬＬＣ）で、１週間、培養する。次いで、このＳＶＦ／スキャフォールド培地を、さらに１週間、ＡｄｉｐｏＱｕａｌ（商標）（ＬａＣｅｌｌ  ＬＬＣ）で交換し、そして、脂質空胞蓄積の可視化のために光学顕微鏡で「チップ上の脂肪」をモニターした。
【０１４０】
インビボ移植における乳癌細胞株：ヒト乳癌細胞株ＭＣＦ７、ＺＲ７５、及び／または、Ｔ４７Ｄを、ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから直接に入手し、そして、インビトロで増殖する。メスのＮＳＧマウスに麻酔をかけ、メスで正中切開を行い、そして、鈍的切開により背部脇腹から両側嚢状腔を皮下切開する。１０６個の乳癌細胞を、免疫不全のメスのＮＳＧマウスの両側背部脇腹に移植する前に、細胞だけ、Ｍａｔｒｉｇｅｌもしくは哺乳動物血小板溶解物だけを含む細胞、または、研究１及び研究２［６］に関する表に概説した１０６個の肥満もしくは痩身のｈＳＶＦ細胞のいずれかを加える。腫瘍の増殖速度は、腫瘍（複数可）の幅及び長さのノギス測定、ならびに、循環ヒトゲノムＤＮＡ  Ａｌｕの血清検出に基づいて、隔週で、評価する。腫瘍体積が、直径２０ｍｍを超えた場合に、ＩＡＣＵＣが承認したプロトコルに従って、動物を、ＣＯ２窒息、及び、頸椎脱臼により安楽死させる。
【表１】
2020506200.tif 000003
【０１４１】
組織学及び免疫組織化学：腫瘍を、１０％ホルマリンで固定し、パラフィン包埋し、切片にし、そして、前述したようにして、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色する［１７〜１９］。検出のためのアルカリホスファターゼ、または、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合した適切な二次抗体を用いて、血管（ＣＤ３１）、骨髄（ＧＤ１１ｂ、または、ＣＤ１４）、リンパ球（ＣＤ３、ＣＤ１９）、周皮細胞（ＣＤ１４６）、または、間質（ＣＤ４４またはＣＤ７３）表面抗原を検出する抗体で、腫瘍切片を染色する。ＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｃｅｌｌｐｒｏｆｉｌｅｒ．ｏｒｇ／）を用いて、画像分析を行う。
【０１４２】
ＳＡ１：予想される結果：研究１において、本発明者らは、ＭＣＦ７細胞を移植して５週間以降に、直径２０ｍｍの腫瘍を確立すると予想している。Ｍａｔｒｉｇｅｌだけを添加した場合は、ＭＣＦ７腫瘍の増殖速度を加速すると予想されるが、これは、哺乳動物血小板溶解物だけの場合に匹敵するか、または、それを超える。これらの腫瘍の組織学は、比較的に均質であり、そして、あらゆる間質または血管ネットワークについても、マウス宿主細胞に依存する。対照的に、いずれかのマトリックスに対する肥満ｈＳＶＦ細胞の存在は、間質及び血管ネットワークを提供することができる前駆細胞の存在に起因する腫瘍増殖速度のさらなる加速をもたらし、後者は、Ｈ＆Ｅ及び免疫組織化学的染色に基づいた細胞異質性の拡大によって、組織学的に明らかになる。最大増殖速度は、脂質生成条件下で予め条件決定したｈＳＶＦ細胞及びスキャフォールドを添加することで得られる。このことは、肥満が乳癌の増殖に寄与するメカニズムに関係しているとされている、レプチンの産生及び分泌の増大に起因するものと考えられる。研究２において、本発明者らは、肥満ＳＶＦ細胞が、それらのレプチン分泌の増大が故に、痩身ＳＶＦ細胞と比較して、すべての乳癌株について、より急速な腫瘍増殖を促すと考えられる。哺乳動物血小板溶解物は、Ｍａｔｒｉｇｅｌで観察したものと、同等以上の細胞株増殖を促すと考えられる。
【０１４３】
潜在的な見落とし、及び、代替方法：従来の研究は、培養増殖ＡＳＣを用いて行われていたが、本発明者らは、ＳＶＦ細胞が、その異質性、及び、血管形成能を有する内皮前駆細胞の包含に起因して、ＡＳＣと同等以上に機能すると考えている。それにもかかわらず、ＳＶＦ細胞が、ＡＳＣのように着実に腫瘍細胞の増殖を加速しないことは可能である。研究１でこのことが認められた場合、ＳＶＦ細胞：ＭＣＦ７細胞の比率を高くして（３．３、または、１０：１の比率）、別の研究を実施する。ＳＶＦ細胞の代わりにＡＳＣを使用した追加のコントロールを、試験デザインに追加する。さらに、本発明者らは、ＡＳＣを用いた従来の研究に基づいて、肥満ＳＶＦ細胞が、痩身のＳＶＦ細胞よりも着実に腫瘍の増殖を強めるものと考える。この課題は、間質／スキャフォールド／腫瘍相互作用のメカニズムに関するものであるので、それは、本研究の当初の「原理の証明」の意図を超えている。結果として、本発明者らは、予算、スケジュール、及び、人的資源が許容するのであれば、３つの異なる確立した腫瘍細胞株を用いて、痩身対肥満ｈＳＶＦ細胞を比較する研究２のデザインを行う。その時までに、本発明者らは「自社内で」誘導したＰＤＸ腫瘍を首尾よく発達させるので、この遅れは有利であることが証明され得る。次いで、同社の独自のＰＤＸモデルは、確立した腫瘍細胞株と並行して評価され、ＰＤＸ腫瘍増殖速度に対する痩身のＳＶＦ細胞と肥満のＳＶＦ細胞との相対的な寄与を調べることができる。
【０１４４】
実験１及び仮説１  哺乳動物血小板溶解物は、ヒトＳＶＦ細胞と組み合わせて免疫不全マウス（ＮＳＧ）に移植した乳癌患者由来異種移植片の樹立のためのインビボスキャフォールドとして、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）と同等以上に機能する。
【０１４５】
理論的根拠：Ｍａｔｒｉｇｅｌは、乳癌細胞株のインビトロでの細胞培養に日常的に使用されているが、ＰＤＸモデルを確立及び維持する間の成分としては、日常的に報告されていない。それにもかかわらず、結腸癌の文献は、Ｍａｔｒｉｇｅｌが、ＰＤＸ生着、及び、その後の腫瘍増殖を改善し、そして、促すことを示している。血小板溶解物が、原発性乳癌由来のコロニー形成を改善することは、３０年前に初めて報告がされているが、その間に、乳癌細胞培養またはＰＤＸモデルにおいて血小板溶解物を用いる研究は、ほとんど行われていない。本発明者は、脂肪由来細胞とヒト血小板溶解物とを組み合わせて、「チップ上の脂肪」モデルを作り出す新規の独自製品を開発した。脂肪組織及び肥満は、乳癌増殖を促すので、本発明者らは、その技術を利用して、免疫不全マウスモデルにおいて乳癌ＰＤＸ増殖を加速し、かつ、強化する。市販のヒトＡｌｕをベースとした検出アッセイを利用する。本発明者は、実験動物を犠牲にせずに、個々のマウスにおいて乳癌ＰＤＸ生着と増殖のリアルタイムモニタリングを連続的に効果的に行うことができる。この高度なアッセイは、ＰＤＸモデルの製造コストを削減し、そして、その商品化を加速する。
【０１４６】
実験デザイン：
生物学的試薬の認証は、実験１に概説したようにして行われる。加えて、本発明者らは、署名した患者の同意を得て、または、新たに改訂されたＦＤＡ規制を満足し、かつ、認可を受けている場合には、権利放棄を謳った署名入りの同意を得て、承認済みＩＲＢプロトコルの下で、協力病院を拠点とするバイオバンクから腫瘍標本を得る。発明者らに提供されたすべての標本は、特定事項については、匿名のままである。本発明者らは、腫瘍及び患者の人口統計（年齢、性別、肥満度指数、民族、過去の病歴、社会歴、腫瘍の組織学）に関連する患者情報だけを受け取る。バイオバンク、及び、そのＩＲＢプロトコルに関して指定された治験医だけが、組織ドナーに関する追加情報にアクセスすることができる。
【０１４７】
方法−実験１に記載したようにして、技術的方法を実施する。腫瘍標本を、無菌法で、３ｍｍ３の断片に切り分け、そして、麻酔をかけたＮＳＧマウスの両側脇腹の皮下に移植する。組織断片を、２５０μｌのＭａｔｒｉｇｅｌ、または、哺乳動物血小板溶解物の非存在下または存在下で、及び、１０６個のＳＶＦ細胞の非存在下または存在下で移植する。スキャフォールド及びＳＶＦ細胞は、改変せずに、または、移植する前にインビトロで脂質生成誘導後に注射する。腫瘍標本ドナーにつき、平均で１２匹のマウスに対して（組織量に応じて）移植を行い、最低でも合計で１０名の患者を評価する。
【０１４８】
実験２：予想される結果：本発明者らは、スキャフォールドまたは脂肪由来細胞が不存在であれば、腫瘍だけの生着（「テイク」）率は、約２０％になると考えている。さらに、腫瘍が物理的に出現するまでの時間は、そのような腫瘍が、スキャフォールド、及び／または、ＳＶＦ細胞を用いずに、視覚的検出に基づいて移植した場合、長期化する。ＡｌｕをベースとしたヒトゲノムＤＮＡ検出システムは、高感度であることが証明されており、また、腫瘍増殖の物理的及び視覚的検出の少なくとも１〜２ヶ月前に、循環ヒト腫瘍細胞を検出する。Ｍａｔｒｉｇｅｌスキャフォールドだけが存在すると、腫瘍の（ａ）増殖、及び、（ｂ）生着の速度を加速するものと考えられる。哺乳動物血小板溶解物だけでも、腫瘍増殖速度の加速、及び、生着速度の増大において、Ｍａｔｒｉｇｅｌと同等以上の効果があると考えられる。ＳＶＦ細胞を添加すると、腫瘍増殖及び生着速度はさらに加速されて、スキャフォールドだけを添加した場合よりも大きくなる。さらに、ＳＶＦ細胞の存在下での間質ネットワークとは、スキャフォールドだけ、または、腫瘍だけの場合と比較して、血管性のものであり、かつ、複雑であると考えられる。最後に、スキャフォールド＋ＳＶＦ細胞（「チップ上の脂肪」）の脂質生成分化は、マトリックス、及び／または、ＳＶＦ細胞だけの脂質生成分化、または、エクスビボで脂質生成分化を伴わない組み合わせよりも、腫瘍増殖を促し、及び、高めるものと考えられる。
【図１】
2020506200.tif 000004
【図２】
2020506200.tif 000005
【図３】
2020506200.tif 000006
【図４−１】
2020506200.tif 000007
【図４−２】
2020506200.tif 000008
【図５】
2020506200.tif 000009
【図６】
2020506200.tif 000010
【図７】
2020506200.tif 000011
【図８】
2020506200.tif 000012
【図９】
2020506200.tif 000013
【図１０】
2020506200.tif 000014
【図１１】
2020506200.tif 000015
【図１２】
2020506200.tif 000016
【図１３】
2020506200.tif 000017
【図１４】
2020506200.tif 000018
【図１５】
2020506200.tif 000019
【図１６】
2020506200.tif 000020
【図１７】
2020506200.tif 000021
【図１８】
2020506200.tif 000022
【配列表】
2020506200000001.app
【国際調査報告】
2020506200.tif 000023
2020506200.tif 000024
2020506200.tif 000025
2020506200.tif 000026