(57)【要約】  本願発明は、癌のサブタイプ、特にＢＣＡＴ１の発現増加を特徴とする癌のサブタイプ、特に急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、の識別および層別化のための新規アプローチに関する。さらに、本発明は、癌、特にＢＣＡＴ１の発現増加を特徴とする癌のサブタイプ、特に急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、の治療に関する新規アプローチに関する。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＭＬに罹患している患者の治療における使用のための、α−ケトグルタラートの細胞内レベルを増強する化合物であって、ここで、前記ＡＭＬが、ＢＣＡＴ１高発現とＩＤＨｗｔＴＥＴｗｔを特徴とする化合物。
【請求項２】
ＢＣＡＴ１阻害剤である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記ＢＣＡＴ１阻害剤が：アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ分子、ｓｈＲＮＡ分子、ＢＣＡＴ１の不活性変異体、および低分子阻害剤、特に、１−（アミノメチル）シクロヘキサン酢酸、から選択される、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
α−ケトグルタル酸、α−ケトグルタル酸の一もしくは二塩基性塩、またはエステルもしくはアミドとして誘導体化される少なくとも１つのカルボン酸を有するα−ケトグルタル酸の誘導体、特にα−ケトグルタル酸のモノエステルもしくはα−ケトグルタル酸のジエステルから選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
２−オキソ−ペンタン二酸、１−ヘキシルエステル、２−オキソ−ペンタン二酸、１−オクチルエステル、ベンジル−α−ケトグルタラートエステルおよび３−トリフルオロメチルベンジル−α−ケトグルタラートエステルから選択される、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
前記ＢＣＡＴ１高発現が、定量的ＰＣＲによって測定される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
前記ＢＣＡＴ１高発現が、基準の発現との関連で決定され、特にここで、前記基準がＡＢＬ１であり、特にここで、ＢＣＡＴ１高発現が、０．９０超のＢＣＡＴ１／ＡＢＬ１比を特徴とする、請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
α−ケトグルタラートの細胞内レベルを増強する化合物を投与するステップを含む、ＡＭＬに罹患している患者を治療する方法であって、ここで、前記ＡＭＬが、ＢＣＡＴ１高発現とＩＤＨｗｔＴＥＴｗｔを特徴とする方法。
【請求項９】
前記化合物が、ＢＣＡＴ１阻害剤である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＢＣＡＴ１阻害剤が：アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ分子、ｓｈＲＮＡ分子、ＢＣＡＴ１の不活性変異体、および低分子阻害剤、特に、１−（アミノメチル）シクロヘキサン酢酸、から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記化合物が、α−ケトグルタル酸、α−ケトグルタル酸の一もしくは二塩基性塩、またはエステルもしくはアミドとして誘導体化される少なくとも１つのカルボン酸を有するα−ケトグルタル酸の誘導体、特にα−ケトグルタル酸のモノエステルもしくはα−ケトグルタル酸のジエステルから選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
２−オキソ−ペンタン二酸、１−ヘキシルエステル、２−オキソ−ペンタン二酸、１−オクチルエステル、ベンジル−α−ケトグルタラートエステルおよび３−トリフルオロメチルベンジル−α−ケトグルタラートエステルから選択される、請求項８に記載の化合物。
【請求項１３】
前記ＢＣＡＴ１高発現が、定量的ＰＣＲによって測定される、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＢＣＡＴ１高発現が、基準の発現との関連で決定され、特にここで、前記基準がＡＢＬ１であり、特にここで、ＢＣＡＴ１高発現が、０．９０超のＢＣＡＴ１／ＡＢＬ１比を特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＡＭＬに罹患している患者の状態を特徴づけるインビトロ法であって、前記患者からのＡＭＬ細胞を含むサンプルにおいて（ｉ）ＢＣＡＴ１の発現を計測し、および（ｉｉ）ＩＤＨとＴＥＴに関して遺伝子型を決定する、ステップを特徴とする方法。
【請求項１６】
以下のステップ：
（ａ）前記患者から得られたＡＭＬ腫瘍細胞におけるＢＣＡＴ１の発現をインビトロにおいて計測し；
（ｂ）ＩＤＨとＴＥＴに関して前記ＡＭＬ腫瘍細胞の状態を決定し；および
（ｃ）ステップ（ａ）および（ｂ）で決定した状態に基づいて薬物療法コホートに前記患者を層別化すること、
を含む、ＡＭＬに罹患している患者を層別化するインビトロ法であって、
ここで、ＢＣＡＴ１高発現とＩＤＨｗｔＴＥＴｗｔによって特徴づけられる患者が、α−ケトグルタラートの細胞内レベルを増強する化合物によって治療され得る方法。
【請求項１７】
前記ＢＣＡＴ１高発現が、定量的ＰＣＲによって測定される、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＢＣＡＴ１高発現が、基準の発現との関連で決定され、特にここで、前記基準がＡＢＬ１であり、特にここで、ＢＣＡＴ１高発現が、０．９０超のＢＣＡＴ１／ＡＢＬ１比を特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、癌のサブタイプ、特にＢＣＡＴ１の発現増加を特徴とする癌のサブタイプ、特に急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、の識別および層別化のための新規アプローチに関する。さらに、本発明は、癌、特に急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の治療に関する新規アプローチに関する。
【背景技術】
【０００２】
個別化腫瘍学は、将来、癌患者が治療される方法に革命をもたらす可能性を秘めている。実体の異なる癌は、治療応答と臨床的転帰をしばしば決定するシグナル伝達の特異的活性化を含む分子的差異に基づいて、サブクラスに分割することができる。乳癌、肺癌および結腸癌を含む種々の癌について、斯かるサブタイプの同定やコホートへの患者の層別化は、既にサブタイプ特異的な方法で患者を治療するために臨床診療に応用されている。
【０００３】
最近になって、分岐鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）経路と（ＢＣＡＡ）トランスアミナーゼ（ＢＣＡＴ１）の過剰発現が、実体の異なった癌の攻撃性に関連していたことがわかった１−４。ＢＣＡＴ１は、必須ＢＣＡＡのバリン、ロイシンまたはイソロイシンからα−ケトグルタラート（αＫＧ）にα−アミノ基を転移させ、そしてそれは、トリカルボン酸（ＴＣＡ）サイクルにおけるその役割とは別の、ＥＧＬＮ１などのＫＧ依存性ジオキシゲナーゼまたはＴＥＴファミリーのαＤＮＡデメチラーゼの必須の補因子である（図１を参照）。
【０００４】
ＢＣＡＴ１は、例えば、神経膠腫、卵巣癌および上咽頭癌におけるその潜在的関連性に加えて、最近、ＡＭＬ患者における遺伝子識別特性の一部として列挙され、そしてそこでは、該識別特性が、低リスク患者と高リスク患者の明白な差異を示した（Xie et al., Computational Biology and Chemistry, 67 (2017) 150-157）。
【０００５】
しかしながら、ＢＣＡＴ１発現とそれが関与する異化経路がどのように腫瘍形成に寄与するかに関する分子機序は、不明なままである。
【０００６】
したがって、癌の特徴づけとサブタイピングで得られたある程度の進歩、および層別化の発展と斯かる発展に基づく治療アプローチにもかかわらず、癌患者の層別化の更なるおよび／または洗練された方法の開発、ならびに、特にＡＭＬの治療のための、より効果的な治療スキームの開発の大きな必要性が依然として存在している。
【０００７】
この問題、すなわち、ＢＣＡＴ１発現状態と遺伝子型との組み合わせに基づくＡＭＬ患者のサブタイピング、および斯かる状態を緩和する、および／または妨げる治療アプローチの識別、に対する解決策は、従来技術によって提供も、または示唆もされていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、本発明の課題は、ＡＭＬのサブタイプの識別と層別化のための新規アプローチを提供することである。さらに、本発明の課題は、癌の斯かるＡＭＬサブタイプの治療に関する新規アプローチを提供することである。斯かる新規アプローチは、予後評価およびサブタイプ特異的な薬剤投薬計画を利用する新規癌治療アプローチの導入を大いに改善するための、迅速かつ信頼性の高い患者の層別化に関する大きな必要性を満足させる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の基本は、白血病幹細胞を特徴とするＡＭＬ細胞集団が、高いＢＣＡＴ１発現レベルを示し、細胞内の存在するα−ケトグルタラートレベルの明らかな低下をもたらし、そしてそれが、ＢＣＡＴ１発現の阻害によって増強され得ることの確認である。α−ケトグルタラートは、抗発癌経路および／または抗増殖経路の補因子であるので、斯かる増加は、増大したＢＣＡＴ１発現を有するＡＭＬ患者にとって潜在的に利益をもたらし得る。驚いたことに、特定のサブタイプのＡＭＬ患者、ＢＣＡＴ１高発現を特徴とするものとＩＤＨｗｔＴＥＴｗｔが、特に斯かる増大から利益を受けることを見出した。いかなる理論にも縛られることを望むものではないが、ＢＣＡＴ過剰発現からより少ない程度（ＢＣＡＴ１低）まで、依然として十分な量のα−ケトグルタラートを維持しているのに対して、ＩＤＨに突然変異を有する細胞（ＩＤＨｍｕｔｔ）では、α−ケトグルタラートが補因子として関与する経路を阻害する代替機構が存在すると推察される。高レベルのＢＣＡＴ１がＩＤＨｗｔＴＥＴｗｔにおけるより短い全生存とは強く相関するが、ＩＤＨｍｕｔ ＡＭＬとは相関しないので、これは、特に重要である。
【００１０】
よって一態様において、本発明は、ＡＭＬに罹患している患者の治療における使用のための、α−ケトグルタラートの細胞内レベルを増強する化合物に関し、ここで、前記ＡＭＬが、ＢＣＡＴ１高発現とＩＤＨｗｔＴＥＴｗｔを特徴とする。
【００１１】
別の態様において、本発明は、ＡＭＬに罹患している患者を治療する方法であって、α−ケトグルタラートの細胞内レベルを増強する化合物を投与するステップを含む方法に関し、ここで、前記ＡＭＬが、ＢＣＡＴ１高発現とＩＤＨｗｔＴＥＴｗｔを特徴とする。
【００１２】
別の態様において、本発明は、ＡＭＬに罹患している患者の状態を特徴づけるインビトロ法であって、前記患者からのＡＭＬ細胞を含むサンプルにおいて、（ｉ）ＢＣＡＴ１の発現を計測し、および（ｉｉ）ＩＤＨとＴＥＴに関して遺伝子型を決定する、ステップを特徴とする方法に関する。
【００１３】
別の態様において、本発明は、ＡＭＬに罹患している患者を層別化するインビトロ法であって、以下のステップ：
前記患者から得られたＡＭＬ腫瘍細胞におけるＢＣＡＴ１の発現をインビトロにおいて計測し；
ＩＤＨとＴＥＴに関して前記ＡＭＬ腫瘍細胞の状態を決定し；および
ステップ（ａ）および（ｂ）で決定した状態に基づいて薬物療法コホートに前記患者を層別化すること、
を含む方法に関し、ここで、ＢＣＡＴ１高発現とＩＤＨｗｔＴＥＴｗｔによって特徴づけられた患者は、α−ケトグルタラートの細胞内レベルを増強する化合物によって治療され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、分岐鎖アミノ酸異化におけるＢＣＡＴ１とα−ケトグルタラートの特定の役割と機能、ならびにＥＧＬＮ１などのα−ケトグルタラート依存性ジオキシゲナーゼまたはＤＮＡデメチラーゼのＴＥＴファミリーの補因子としてのα−ケトグルタラートの概略図を示す。
【００１５】
【図２−１】図２〜５は、実施例１に記載の実験の結果を示す。該図面およびそれらの個々の従属部分に関する更なる説明は、実施例１のテキストで見ることができる。
【図２−２】図２〜５は、実施例１に記載の実験の結果を示す。該図面およびそれらの個々の従属部分に関する更なる説明は、実施例１のテキストで見ることができる。
【図２−３】図２〜５は、実施例１に記載の実験の結果を示す。該図面およびそれらの個々の従属部分に関する更なる説明は、実施例１のテキストで見ることができる。
【図２−４】図２〜５は、実施例１に記載の実験の結果を示す。該図面およびそれらの個々の従属部分に関する更なる説明は、実施例１のテキストで見ることができる。
【図２−５】図２〜５は、実施例１に記載の実験の結果を示す。該図面およびそれらの個々の従属部分に関する更なる説明は、実施例１のテキストで見ることができる。
【図２−６】図２〜５は、実施例１に記載の実験の結果を示す。該図面およびそれらの個々の従属部分に関する更なる説明は、実施例１のテキストで見ることができる。
【図３−１】図２〜５は、実施例１に記載の実験の結果を示す。該図面およびそれらの個々の従属部分に関する更なる説明は、実施例１のテキストで見ることができる。
【図３−２】図２〜５は、実施例１に記載の実験の結果を示す。該図面およびそれらの個々の従属部分に関する更なる説明は、実施例１のテキストで見ることができる。
【図３−３】図２〜５は、実施例１に記載の実験の結果を示す。該図面およびそれらの個々の従属部分に関する更なる説明は、実施例１のテキストで見ることができる。
【図４−１】図２〜５は、実施例１に記載の実験の結果を示す。該図面およびそれらの個々の従属部分に関する更なる説明は、実施例１のテキストで見ることができる。
【図４−２】図２〜５は、実施例１に記載の実験の結果を示す。該図面およびそれらの個々の従属部分に関する更なる説明は、実施例１のテキストで見ることができる。
【図５−１】図２〜５は、実施例１に記載の実験の結果を示す。該図面およびそれらの個々の従属部分に関する更なる説明は、実施例１のテキストで見ることができる。
【図５−２】図２〜５は、実施例１に記載の実験の結果を示す。該図面およびそれらの個々の従属部分に関する更なる説明は、実施例１のテキストで見ることができる。
【図５−３】図２〜５は、実施例１に記載の実験の結果を示す。該図面およびそれらの個々の従属部分に関する更なる説明は、実施例１のテキストで見ることができる。
【図５−４】図２〜５は、実施例１に記載の実験の結果を示す。該図面およびそれらの個々の従属部分に関する更なる説明は、実施例１のテキストで見ることができる。
【図５−５】図２〜５は、実施例１に記載の実験の結果を示す。該図面およびそれらの個々の従属部分に関する更なる説明は、実施例１のテキストで見ることができる。
【図５−６】図２〜５は、実施例１に記載の実験の結果を示す。該図面およびそれらの個々の従属部分に関する更なる説明は、実施例１のテキストで見ることができる。
【図５−７】図２〜５は、実施例１に記載の実験の結果を示す。該図面およびそれらの個々の従属部分に関する更なる説明は、実施例１のテキストで見ることができる。
【００１６】
【図６】図６は、ＢＣＡＴ１低患者集団（ＢＣＡＴ１／ＡＢＬ１比＜０．９）と比較した、ＢＣＡＴ１高患者集団（ＢＣＡＴ１／ＡＢＬ１比＞０．９）の全生存分析を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
発明の詳細な説明
本発明は、本明細書中の以下の発明の詳細な説明および実施例を参照することによってより容易に理解され得る。
【００１８】
したがって、一態様において、本発明は、ＡＭＬに罹患している患者の治療における使用のための、α−ケトグルタラートの細胞内レベルを増強する化合物に関し、ここで、前記ＡＭＬは、ＢＣＡＴ１高発現とＩＤＨｗｔＴＥＴｗｔを特徴とする。
【００１９】
本発明との関連において、用語「含む（comprises）」または「含んでいる（comprising）」は、「含有するが、それに限定されない（including, but not limited to）」ことを意味する。この用語は、含むものを限定するのではなく、記載した何らかの特徴、要素、整数、ステップ、または成分の存在を示すことを目的としており、１もしくは複数の他の特徴、要素、整数、ステップ、成分や、これらの群がさらに存在することを排除することは意図していない。したがって、用語「含んでいる」は、より限定的な用語である「からなる（consisting of）」および「主に…からなる（consisting essentially of）」を含有する。
【００２０】
特定の実施形態において、化合物とは、ＢＣＡＴ１阻害剤である。
【００２１】
特定の実施形態において、前記ＢＣＡＴ１阻害剤は：アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ分子、ｓｈＲＮＡ分子、ＢＣＡＴ１の不活性変異体、および低分子阻害剤、特に、１−（アミノメチル）シクロヘキサン酢酸、から選択される。
【００２２】
本発明との関連において、「アンチセンス分子」という用語は、８〜３０ヌクレオチド、特に１２〜２５ヌクレオチド、より特に１３〜２０ヌクレオチドから成るオリゴヌクレオチドを指し、ここで、前記オリゴヌクレオチドの配列は、阻害される着目のタンパク質をコードする核酸配列のアンチセンス鎖に相当する。特定の実施形態において、前記オリゴヌクレオチド内の１もしくは複数のヌクレオチド、および／または１もしくは複数のリン酸連結基が修飾される。
【００２３】
ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの基本単位を形成し、たとえば、核酸塩基（窒素塩基、たとえばプリンまたはピリミジン）、５炭素糖（たとえばリボース、２−デオキシリボース、アラビノース、キシロース、リキソース、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、またはそれらの糖の安定化修飾体）、および１つ以上のリン酸基から構成される。修飾リン酸基の例は、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートである。ヌクレオチドのそれぞれの化合物は、修飾可能であり、天然に存在するまたは天然に存在しない。後者の例は、ロックド核酸（ＬＮＡ）、２’，４’拘束エチル核酸（constrained ethyl nucleic acid）（ｃ−ＥＴ）、２’−０，４’−Ｃ−エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）、ポリアルキレンオキシド−（トリエチレングリコール（ＴＥＧ）など）、２’−フルオロ−、２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノ核酸（ＦＡＮＡ）、２’−０−メトキシ−、および２’−Ｏ−メチル−修飾ヌクレオチドである。図５は、本発明において使用されてもよい多くの様々な修飾ヌクレオチドの例を示す。
【００２４】
「ＬＮＡ」は、修飾ＲＮＡヌクレオチドであり、リボース成分は、２’酸素および４’炭素をつなぐ追加のブリッジにより修飾されている（２’−４’リボヌクレオシド）。ブリッジは、３’−ｅｎｄｏ（Ｎｏｒｔｈ）コンホメーションでリボースをロックし、これは、Ａ型二重鎖で見出されることが多い。ＬＮＡヌクレオシドおよびヌクレオチドは、それぞれ、たとえば、α−Ｄまたはβ−Ｌ立体配置をしたチオ−ＬＮＡ、オキシ−ＬＮＡ、またはアミノ−ＬＮＡの形態を含み、オリゴヌクレオチド中のＤＮＡまたはＲＮＡの残基と、それぞれ混合するまたは組み合わせることができる。
【００２５】
「架橋核酸」は、修飾ＲＮＡヌクレオチドであり、時に拘束または隔絶（inaccessible）ＲＮＡ分子とも呼ばれ、これは、「固定」Ｃ３’−ｅｎｄｏ糖パッカリングを有する５員、６員、またはさらには７員架橋構造を含有してもよい。ブリッジは、リボースの２’，４’位に合成により組み込まれ、２’，４’−ＢＮＡ単量体がもたらされる。詳細な例は、「ＥＮＡ」ヌクレオチドであり、ブリッジは、エチレンブリッジである。図５は、本発明において使用されてもよい多くのＢＮＡヌクレオチドを示す。
【００２６】
特定の実施形態では、前記オリゴヌクレオチドにおける１つ以上のヌクレオチドは、修飾されており、修飾ヌクレオチドは、特にホスホロチオエートおよびメチルホスホネート、特にホスホロチオエートから選択される修飾リン酸基を含有する。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドのリン酸基はすべて、特にホスホロチオエートおよびメチルホスホネートから独立して選択される修飾リン酸基であり、特に、リン酸基はすべて、ホスホロチオエートである。
【００２７】
特定の実施形態では、前記オリゴヌクレオチドにおける１つ以上のヌクレオチドは、修飾されており、修飾ヌクレオチドは、ＬＮＡ、ｃ−ＥＴ、ＥＮＡ、ポリアルキレンオキシド、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メトキシ、ＦＡＮＡ、および／または２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドである。
【００２８】
特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの５’および／または３’末端の５ヌクレオチドのストレッチ内にある、特に、オリゴヌクレオチドの５’および３’末端にある。
【００２９】
特定の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの５’および／または３’末端に少なくとも１つの修飾ヌクレオチド、特に、少なくとも１つのＬＮＡ、ｃ−ＥＴ、および／またはＥＮＡを含む。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’末端の５つ以下のヌクレオチドのストレッチ内に１、２、３、または４つのＬＮＡまたはｃ−ＥＴまたはＥＮＡおよび３’末端の５つ以下のヌクレオチドのストレッチ内に１、２、３、または４つのＬＮＡまたはｃ−ＥＴまたはＥＮＡを含む。別の特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’末端または３’末端の５ヌクレオチドのストレッチ内に１、２、３、または４つのＬＮＡ、ｃ−ＥＴ、またはＥＮＡおよび３’末端または５’末端の５ヌクレオチドのストレッチ内にＴＥＧなどのようなポリアルキレンオキシドを含む。
【００３０】
特定の実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、前記オリゴヌクレオチドの５’末端の５ヌクレオチドのストレッチ内に少なくとも１つのＬＮＡヌクレオチドおよび前記オリゴヌクレオチドの３’末端の５ヌクレオチドのストレッチ内に少なくとも１つのＬＮＡヌクレオチドを含むギャップマーである。特定の実施形態では、前記ギャップマーは、前記オリゴヌクレオチドの５’末端の５ヌクレオチドのストレッチ内に２または３つのＬＮＡヌクレオチドおよび前記オリゴヌクレオチドの３’末端の５ヌクレオチドのストレッチ内に２または３つのＬＮＡヌクレオチドを含む。
【００３１】
本発明では、用語「ギャップマー（Gapmer）」は、ＲＮａｓｅ Ｈ切断を誘発するのに十分に長いデオキシヌクレオチド単量体の中央にあるブロックを含有するキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドを指す。ギャップマーの中央にあるブロックは、内側のブロックをヌクレアーゼ分解から保護する２’−Ｏ修飾リボヌクレオチドまたは架橋核酸（ＢＮＡ）などのような他の人工的に修飾されたリボヌクレオチド単量体のブロックが側面に位置する。多くの以前の研究において、修飾ＤＮＡアナログは、体液中でのそれらの安定性について調査された。これらの実験の大多数において、ホスホロチオエートＤＮＡアナログが、使用された。より最近では、ＢＮＡ単量体を含むいくつかのタイプの人工ヌクレオチド単量体が、ギャップマーの設計におけるそれらの有用性について調査された。ギャップマーは、ホスホロチオエート連結の数を低下させると同時に、標的ＲＮＡのＲＮアーゼ−Ｈ媒介性の切断を達成するために使用された。ホスホロチオエートは、未修飾ＤＮＡと比較して、ヌクレアーゼに対する抵抗性が増加している。しかしながら、それらにはいくつかの不都合がある。これらには、相補的な核酸に対する結合能力が低いことおよび毒性の副作用を引き起こしてそれらの利用を制限する、タンパク質への非特異的な結合が含まれる。オフターゲットの影響を引き起こす非特異的な結合に加えて毒性の副作用が発生したことにより、毒性の副作用を示すことなく、インビボにおいて効率的で特異的なアンチセンス活性をもたらす修飾オリゴヌクレオチドの開発のための新たな人工核酸の設計が促された。
【００３２】
ＬＮＡギャップマーは、タンパク質、ｍＲＮＡ、およびｌｎｃＲＮＡの機能喪失型の研究についての強力なツールである。これらの単鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、相補的なＲＮＡ標的のＲＮａｓｅ Ｈ依存性の分解を触媒する。ＬＮＡギャップマーは、典型的に１２〜２０ヌクレオチド長で、フランキング領域にはＬＮＡが、ＬＮＡがない中央にあるギャップにはＤＮＡが豊富で、よってギャップマーと名付けられた。ＬＮＡ含有フランキング領域は、アンチセンスオリゴに対するヌクレアーゼ抵抗性を与え、同時に、ＧＣ含有量にかかわらず標的結合親和性を増加させる。中央にあるＤＮＡ「ギャップ」は、結合と同時に標的ＲＮＡのＲＮａｓｅ Ｈ切断を活性化する。
【００３３】
ＢＣＡＴ１の阻害のためのアンチセンス分子は、従来技術（例えば、ＥＰ２ ４８１ ８０１ Ａ１中）に記載されている。
【００３４】
本発明との関連において、「ｓｉＲＮＡ」という用語は、小さい（短い）欠損ＲＮＡ分子を指し、そしてそれは、２０〜３０、特に、２０〜２５塩基対の長さを有する二本鎖ＲＮＡ分子のクラスである。ｓｉＲＮＡ分子は、相補的なヌクレオチド配列を有する遺伝子のｍＲＮＡの発現を妨げ、そして、転写後に切断されて結果的に翻訳されないｍＲＮＡを生じる。ＢＣＡＴ１の阻害のためのｓｉＲＮＡ構築物は、従来技術（例えば、ＷＯ２０１２／１００９５７中）に記載されており、かつ、（例えば、ThermoFisher Scientific、SigmaAldrichまたはDharmaconから）市販されている。
【００３５】
本発明との関連において、「ｓｈＲＮＡ」という用語は、小さい（短い）ヘアピン型を形成する配列を含む小ＲＮＡベースの分子を指す。斯かるｓｈＲＮＡ配列は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介して標的遺伝子発現をサイレンシングするのに使用できる。細胞におけるｓｈＲＮＡの発現は、プラスミドの送達によって、またはウイルス性もしくは細菌性ベクターによって典型的に達成される。ＢＣＡＴ１の阻害のためのｓｈＲＮＡ構築物は、従来技術（例えば、Tonjes et al., Nature Medicine 19 (2013) 901-908中）に記載されており、かつ、（例えば、Origene、SigmaAldrichまたはDharmaconから）市販されている。
【００３６】
本発明との関連において、「ＢＣＡＴ１の不活性変異体」という用語は、活性部位（２０２位アミノ酸のリジン）またはコアＣＸＸＣモチーフ（ＢＣＡＴ１の３１５〜３１８位アミノ酸）における、またはその付近の修飾によって生じる野生型ＢＣＡＴ１の、特に変異体における、強力に低減されたか、または完全に破壊された酵素活性を有するＢＣＡＴ１のタンパク質変異体を指す。斯かる修飾には、スルフィドリル試薬によるｈＢＣＡＴｍの酸化または標識が含まれる。ＢＣＡＴ１の不活性変異体は、従来技術（例えば、Coles et al., Biochemistry 48 (2009):645-56中）に記載されている。
【００３７】
ＢＣＡＴ１の特異的低分子阻害剤は、当該技術分野で公知である。例えば、１−（アミノメチル）シクロヘキサン酢酸は、ＷＯ２０１２／１００９５７に記載されている。５−ケト吉草酸の誘導体である追加の低分子阻害剤は、以下の化合物２および８を含めてＵＳ２０１６／３６８８６２に記載されている：
【化１】
2020506928.tif 000003
【００３８】
他の特定の実施形態において、前記化合物は、α−ケトグルタル酸、α−ケトグルタル酸の一もしくは二塩基性塩、またはエステルもしくはアミドとして誘導体化される少なくとも１つのカルボン酸を有するα−ケトグルタル酸の誘導体、特にα−ケトグルタル酸のモノエステルもしくはα−ケトグルタル酸のジエステルから選択される。
【００３９】
化合物α−ケトグルタラートは、「多面的活性を有する分子」としても知られており、そして、多くの治療学的な適応症におけるその使用が、試験されるか、または少なくとも示唆されている（総説に関して、Zdzisinska et al. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 65 (2017) 21-36を参照）。
【００４０】
特定の斯かる実施形態において、前記化合物は、２−オキソ−ペンタン二酸、１−ヘキシルエステル、２−オキソ−ペンタン二酸、１−オクチルエステル、ベンジル−α−ケトグルタラートエステルおよび３−トリフルオロメチルベンジル−α−ケトグルタラートエステルから選択される。
【００４１】
α−ケトグルタル酸の誘導体の合成は、公開されている（例えば、Zengeya et al., Org Lett. 17 (2015):2326-9; MacKenzie et al., Mol Cell Biol. 27 (2007) 3282-3289を参照）。
【００４２】
本発明との関連において、「ＢＣＡＴ１高発現とＩＤＨｗｔＴＥＴｗｔを特徴とする」とは、ＩＤＨおよびＴＥＴ２変異を欠く正常核型ＡＭＬ患者における中央値を超えるＢＣＡＴ１発現を指す。
【００４３】
特定の実施形態において、前記ＢＣＡＴ１高発現は、定量的ＰＣＲによって測定される。
【００４４】
特定の実施形態において、前記ＢＣＡＴ１高発現は、基準の発現と関連で決定され、特にここで、前記基準は、ＡＢＬ１であり、特にここで、ＢＣＡＴ１高発現は、０．９０超のＢＣＡＴ１／ＡＢＬ１比を特徴とする。特定の実施形態において、ＢＣＡＴ１高発現は、０．９５超、特に１．００超のＢＣＡＴ１／ＡＢＬ１比を特徴とする。
【００４５】
別の態様において、本発明は、ＡＭＬに罹患している患者を治療する方法であって、α−ケトグルタラートの細胞内レベルを増強する化合物を投与するステップを含む方法に関し、ここで、前記ＡＭＬが、ＢＣＡＴ１高発現とＩＤＨｗｔＴＥＴｗｔを特徴とする。
【００４６】
特定の実施形態において、化合物とは、ＢＣＡＴ１阻害剤である。
【００４７】
特定の実施形態において、前記ＢＣＡＴ１阻害剤は：アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ分子、ｓｈＲＮＡ分子、ＢＣＡＴ１の不活性変異体、および低分子阻害剤、特に、１−（アミノメチル）シクロヘキサン酢酸、から選択される。
【００４８】
他の特定の実施形態において、前記化合物は、α−ケトグルタル酸、α−ケトグルタル酸の一もしくは二塩基性塩、またはエステルもしくはアミドとして誘導体化される少なくとも１つのカルボン酸を有するα−ケトグルタル酸の誘導体、特にα−ケトグルタル酸のモノエステルもしくはα−ケトグルタル酸のジエステルから選択される。
【００４９】
特定の斯かる実施形態において、前記化合物は、２−オキソ−ペンタン二酸、１−ヘキシルエステル、および２−オキソ−ペンタン二酸から選択される。
【００５０】
特定の実施形態において、前記ＢＣＡＴ１高発現は、定量的ＰＣＲによって測定される。
【００５１】
特定の斯かる実施形態において、前記ＢＣＡＴ１高発現は、基準の発現と関連で決定され、特にここで、前記基準は、ＡＢＬ１であり、特にここで、ＢＣＡＴ１高発現は、０．９０超のＢＣＡＴ１／ＡＢＬ１比を特徴とする。特定の実施形態において、ＢＣＡＴ１高発現は、０．９５超、特に１．００超のＢＣＡＴ１／ＡＢＬ１比を特徴とする。
【００５２】
別の態様において、本発明は、ＡＭＬに罹患している患者の状態を特徴づけるインビトロ法であって、前記患者からのＡＭＬ細胞を含むサンプルにおいて、（ｉ）ＢＣＡＴ１の発現を計測し、および（ｉｉ）ＩＤＨとＴＥＴに関して遺伝子型を決定する、ステップを特徴とする方法に関する。
【００５３】
別の態様において、本発明は、ＡＭＬに罹患している患者を層別化するインビトロ法であって、以下のステップ：
前記患者から得られたＡＭＬ腫瘍細胞におけるＢＣＡＴ１の発現をインビトロにおいて計測し；
ＩＤＨとＴＥＴに関して前記ＡＭＬ腫瘍細胞の状態を決定し；および
ステップ（ａ）および（ｂ）で決定した状態に基づいて薬物療法コホートに前記患者を層別化すること、
を含む方法に関し、ここで、ＢＣＡＴ１高発現とＩＤＨｗｔＴＥＴｗｔによって特徴づけられた患者は、α−ケトグルタラートの細胞内レベルを増強する化合物によって治療され得る。
【００５４】
特定の実施形態において、前記ＢＣＡＴ１高発現は、定量的ＰＣＲによって測定される。
【００５５】
特定の実施形態において、前記ＢＣＡＴ１高発現は、基準の発現と関連で決定され、特にここで、前記基準は、ＡＢＬ１であり、特にここで、ＢＣＡＴ１高発現は、０．９０超のＢＣＡＴ１／ＡＢＬ１比を特徴とする。特定の実施形態において、ＢＣＡＴ１高発現は、０．９５超、特に１．００超のＢＣＡＴ１／ＡＢＬ１比を特徴とする。
【００５６】
特定の実施形態において、前記腫瘍細胞は、腫瘍サンプルからの細胞である。
【００５７】
特定の実施形態において、前記サンプルは、哺乳動物、特にヒトから得られる。
【００５８】
本発明との関連において、用語「層別化する」または「層別化」は、患者の最適な管理法を選択するため分子診断試験と生化学的診断試験を利用して「生物学的」特徴を共有する患者の群を同定することに関する。
【００５９】
特定の実施態様において、前記腫瘍細胞は、前記腫瘍サンプルから腫瘍細胞を精製することによって得られ、特にここで、該精製は、流動選別（flow sorting）またはレーザー捕獲顕微解剖（laser capture microdissection）を含んでいる。
【００６０】
特別な一実施態様では、患者サンプルは、血液、血清、及び血漿から選択される。特別な一実施態様では、患者サンプルは、特に患者の血液から単離された循環している腫瘍細胞（ＣＴＣ）を集めたものである。特別な実施態様では、ＣＴＣは血漿交換によって単離される。
【００６１】
特定の実施形態において、前記腫瘍細胞は、（ｉ）前記患者の血液から単離されるか；または（ｉｉ）腫瘍生検である腫瘍サンプルから単離される。
【実施例】
【００６２】
実施例１：分岐鎖アミノ酸異化は、ＩＤＨおよびＴＥＴ２の変異によって誘導される後成的変化を模倣する白血病幹細胞において過剰活性化される。
ヒト急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）サンプルの白血病幹細胞（ＬＳＣ＋）および非ＬＳＣ（ＬＳＣ−）集団の無作為の高解像度プロテオミクス分析において、我々は、ＢＣＡＡ経路と、ＬＳＣにおいて一般的に過剰発現されるＢＣＡＴ１を確認した。白血病細胞におけるＢＣＡＴ１のノックダウン（ＫＤ）は、αＥＧＬＮ１活性によって媒介されるＨＩＦ１タンパク質分解をもたらすαＫＧの蓄積を引き起こした。ＢＣＡＴ１−ＫＤ細胞は、ＨＩＦ１の過剰発現またはＥＧＬＮ１のノックダウンによって救われる、低下した白血病開始能力、ならびに成長および生存の欠陥を示す。対照的に、白血病細胞におけるＢＣＡＴ１の過剰発現（ＯＥ）は、細胞内αＫＧレベルを減少させ、そして、低下したａＫＧ依存性ＤＮＡデメチラーゼ活性によって媒介されたＤＮＡ過剰メチル化をもたらす。ＢＣＡＴ１高ＡＭＬサンプルは、ａＫＧが癌代謝物２−ＨＧによって阻害されるＩＤＨｍｕｔ症例に類似したＤＮＡ過剰メチル化表現型を表した。高レベルのＢＣＡＴ１は、ＩＤＨｗｔＴＥＴｗｔにおけるより短い全生存と強く相関するが、ＩＤＨｍｕｔ ＡＭＬとは相関しなかった。ＩＤＨｍｕｔ ＡＭＬおよびＬＳＣに特徴的な遺伝子セットは、ＩＤＨｗｔＴＥＴｗｔ ＢＣＡＴ１高患者およびＢＣＡＴ１−ＯＥ白血病細胞の両方で濃縮されていた。要約すれば、ＢＣＡＴ１は、細胞内ａＫＧおよびαＫＧ依存性ジオキシゲナーゼの結合活性を制御することによって細胞メチロームに影響を及ぼす。高ＢＣＡＴ１発現は、ＡＭＬにおけるＩＤＨ変異を部分的に模倣し、そして、ＢＣＡＴ１誘導αＫＧは、天然に存在する腫瘍抑制因子代謝産物として機能する。ＬＳＣ機能を低下させるための、ＢＣＡＴ１の阻害によってαＫＧを増強するための治療戦略は、再発率の低下につながり、そして、ＡＭＬ患者の生存率を改善し得る。
【００６３】
２つの別々のサブグループ（ＦＬＴ３ＩＴＤ／ＮＰＭ１ｍｕｔおよびＦＬＴ３ｗｔ／ＮＰＭ１ｗｔ）の初代ＡＭＬサンプルを、ＣＤ３４およびＣＤ３８表面発現にしたがって分画化し、そして、ＮＯＤ．Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ．Ｉｌ２ｒｇｎｕｌｌ（ＮＳＧ）マウスへの異種移植によって白血病幹細胞（ＬＳＣ）の存在について機能的に試験した（図２ａ）。ＬＳＣ活性が主にＣＤ３４＋画分に存在するという我々が見出した従来の報告と一致したが５−７、しかしながら、ＬＳＣは、ＣＤ３４−ＣＤ３８＋以外のすべての画分で検出され（図２ｂ）、ＬＳＣ活性を規定するための機能的アッセイの重要さが強調された。６個の初代ＡＭＬサンプルの１８個の画分（１０ＬＳＣ＋および８ＬＳＣ−）を、タンデム質量タグ（ＴＭＴ）標識化および高解像度質量分析法を用いた詳細な定量的な多重プロテオーム解析に供した（図２ａ、ｂ）。例えば、転写因子、受容体および細胞接着分子などの存在量が少ないタンパク質を含めた７，２００超のタンパク質を検出した（図２ｃ）。個々のＡＭＬ症例についてＬＳＣタンパク質識別特性を引き出すために、我々は、最初に、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＬＳＣとＣＤ３４−ＣＤ３８＋ＬＳＣ画分（ｐａｄｊ＜０．００１）との間で示差的な発現タンパク質について計算し、それに続いて、個々の患者の、残りのＬＳＣ＋またはＬＳＣ−画分のそれぞれにおいても過剰であるタンパク質を選択した。我々は、各サンプルに関して、１０９７〜１９３７個の示差的な発現タンパク質を検出し（図２ｄ）、そして、興味深いことに、これらのタンパク質は、ＡＭＬサブタイプごとにクラスター化し、ＬＳＣ含有コンパートメントについてもサブタイプ特異的差異を示唆した（図２ｅ）。タンパク質データに対する遺伝子セット濃縮分析（ＧＳＥＡ）では、とりわけ、それらのより高い増殖状態と合致した、ＬＳＣ−画分におけるＤＮＡ複製とタンパク質翻訳の有意な濃縮を明らかにした８（図２ｆ）。すべての患者を通じてＬＳＣ＋画分で最も高度に濃縮されたプロセスは、分岐鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）バリン、ロイシンおよびイソロイシンの分解であった。最近になって、ＢＣＡＡ経路が、ＩＤＨｗｔグリオーマ１、肝細胞癌３および卵巣癌２を含めた実体の異なっている腫瘍の攻撃性に関連することがわかった。ＧＳＥＡ結果に一致して、この経路内の酵素の大部分が、ＬＳＣで過剰発現されていた（図２ｇ）。我々は、ＢＣＡＡ分解の第１ステップを触媒するＢＣＡＴ１に焦点を合わせ、拡大した初代ＡＭＬサンプルのセットのＬＳＣにおいて、より高い発現レベルを確認した（図２ｈ）。ＢＣＡＴ１の機能的な役割を評価するために、我々は、機能的にバリデーションしたＬＳＣ＋集団を用いたレンチウイルスノックダウン（ＫＤ）実験を実施した（図２ｉ）。対照形質導入細胞が、普通に増殖したのに対して、ＢＣＡＴ１−ＫＤは、増殖および生存が有意に損なわれた（図２ｊ−ｌ）。すべての試験患者のＢＣＡＴ１−ＫＤ ＡＭＬのＬＳＣは、コロニー形成単位（ＣＦＵ）アッセイにおいて有意に少ないコロニーを生じ（図２ｍ）、ＮＳＧマウスに移植したときに、強力に低減された白血病開始能力を示した（図２ｎ）。健常なＣＤ３４＋臍帯血におけるＢＣＡＴ１−ＫＤが、赤血球コロニ��形成だけを減弱したのに対して、骨髄性コロニーを形成する能力に影響を及ぼすことなく（図２ｏ）、グルタミン／グルタマート代謝への干渉が赤血球の分化を害するという最近の報告に一致していた９（以下を参照）。まとめると、我々は、ＢＣＡＴ１が、ＡＭＬのＬＳＣ＋コンパートメントにおいて過剰発現され、かつ、初代ＡＭＬの増殖、生存および幹細胞維持のために重要な酵素を構成していることを見出した。
【００６４】
細胞質ＢＣＡＴ１は、ＢＣＡＡからα−ケトグルタラート（αＫＧ）へとα−アミノ群を転移させ、グルタマートとそれぞれの分岐鎖αケト酸（ＢＣＫＡ）をもたらす１０。このアミノ基転移後に、ＢＣＫＡは、アセチルおよびスクシニルＣｏＡへとさらに代謝され、そしてそれが、トリカルボン酸（ＴＣＡ）サイクルに入ると考えられる（図３ａ）。しかしながら、ＨＬ−６０ＡＭＬ細胞株を使用して、同位体標識ＢＣＡＡを用いたトレーシング実験では、標識炭素はＴＣＡ中間体中に検出されず、これらの細胞における代替のＢＣＫＡ代謝系路が示唆された（図３ｂ）。同様の観察結果が、最近になって、他の細胞型についても報告され、ＢＣＡＡ分解経路の全体的な特徴が示唆された４、１１。ＢＣＡＡ窒素アミノ基転移は、非必須アミノ酸生合成に寄与し、そして、この経路の下流では、窒素がヌクレオチド（ｒｅｆ）に組み込まれ得る。一貫して、我々は、グルタマートおよびアスパルタート（図３ｃ）、ならびに他の非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）の中への１５Ｎの取り込みを見出した（データ未掲載）。ＢＣＡＴ１のノックダウン時には、１５Ｎ標識ＮＥＡＡの画分は有意に減少した（図３ｃ）。意外なことに、ＢＣＡＴ１−ＫＤ細胞において、全体的なヌクレオチドレベルは減少せず（むしろ増加し）（図３ｄ）、これらの細胞におけるヌクレオチド生産に対するＢＣＡＡ誘導窒素の非常に限定的な寄与が示唆された。その結果、ヌクレオチドの添加は、ＢＣＡＴ１−ＫＤ細胞の増殖欠損を救うためには不十分であった。ＢＣＡＴ１がアミノ基転移のための基質としてαＫＧを利用すると仮定して、我々は、次に、ＢＣＡＴ１活性が細胞内αＫＧレベルの調整に寄与すると仮定した。実際には、ＢＣＡＴ１−ＫＤによって、αＫＧの細胞内レベルは、ＨＬ−６０細胞において有意に増強された（図３ｅ）。我々は、この知見を、Ｋ５６２（白血病）、Ｕ８７およびＵ２５１（神経膠腫）、ならびにＭＤＡ ＭＢ−２３１（乳癌）細胞株においてバリデーションし、ＢＣＡＴ１のノックダウン時に有意に高レベルのαＫＧ（１．４〜２．４倍）を一貫して示した（図３ｅ）。要約すれば、これらの実験では、ＢＣＡＴ１が、広範な異なる腫瘍型における細胞内αＫＧレベルの重要な調節物質であると確認した。中間代謝におけるその役割を超えて、シグナル伝達分子としてのαＫＧ機能はまた、細胞ジオキシゲナーゼの不可欠な補基質でもあり１２、そしてそれは、αＫＧレベルのわずかな変化に対して潜在的に感受性の活性を有する１３。特に、これらの酵素としては、プロテアソーム分解のためにＨＩＦをヒドロキシル化し、そして、標的する、Ｅｇｌ−９ファミリーである低酸素誘導性因子１（ＥＧＬＮ１）１４、およびＴＥＴファミリーであるＤＮＡデメチラーゼ１５が挙げられる。
【００６５】
ＢＣＡＴ１によって影響を受ける細胞経路に対するさらなる機構的洞察を得るために、我々は、ＨＬ−６０ＡＭＬ細胞株を利用した。ＢＣＡＴ１ノックダウン時に、増殖欠陥（図４ａ）および減損したコロニー形成能（図４ｂ）の両方が繰り返され、そして、ＫＤ細胞は、高い骨髄分化を示した（図４ｃ）。ｓｈＢＣＡＴ１由来のトランスクリプトームデータ、および対照形質導入ＨＬ−６０細胞の遺伝子セット濃縮分析では、ＨＩＦ１標的遺伝子が、ＢＣＡＴ１−ＫＤによって下方制御され（図４ｄ）、それに対して、ＰＵ．１標的遺伝子は濃縮され、分化表現型を分子的に明らかにした。ウェスタンブロット分析では、ＢＣＡＴ１の下流標的としてのＨＩＦ１を確認し（図４ｅ）、そして、細胞内αＫＧがＥＧＬＮ１活性の補因子であるため１４、ＢＣＡＴ１ノックダウン後に（図４ｆ）、ヒドロキシル化プロリン５６４の相対量が増大するので、減少したＨＩＦ１レベルは、高められたタンパク質分解によるものであった。ＥＧＬＮ１活性を阻害するために、我々は、細胞を塩化コバルト（Carmeliet Review）で処理し、そしてそれが、ＢＣＡＴ１ノックダウン細胞におけるＨＩＦ１タンパク質レベルの弱い減少をもたらした（図４ｇ）。最終的に、レンチウイルスのＨＩＦ１過剰発現、ならびにＥＧＬＮ１のｓｈＲＮＡ媒介性ノックダウンは、ＢＣＡＴ１−ＫＤ後の増殖および生存欠陥を救うために十分であった（図４ｈ、ｉ）。まとめると、これらの分析は、ＥＧＬＮ１のαＫＧ依存活性化を介してその効果を媒介するＨＩＦ１の上流にＢＣＡＴ１を配置する。この活性化は、ＢＣＡＴ１ノックダウンによるＨＩＦ１タンパク質の分解促進をもたらし、これらの細胞の増殖および生存欠陥に至った。ＨＩＦ１のノックダウンは、ＬＳＣ機能を無効にするのに十分である１６。
【００６６】
イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＤＨ）１および２遺伝子の突然変異は、ＡＭＬにおいて頻繁に起こり１７、癌代謝物２−ヒドロキシグルタル酸（２−ＨＧ）の産生をもたらす１８。２−ＨＧは、例えば、ＴＥＴ２などのαＫＧ依存性ジオキシゲナーゼの拮抗阻害剤として機能するので１９、これにより、低細胞内αＫＧレベルの状況が模倣される。そのため、我々は、ＢＣＡＴ１発現レベルが、ＩＤＨｗｔおよびＴＥＴ２ｗｔ（ＴＥＴ２突然変異はＩＤＨ突然変異に対して互いに排他的である２０）ＡＭＬ患者においてのみ、臨床成果に対して影響を及ぼし得ると仮定した。実際、ＢＣＡＴ１低患者と比較して、ＩＤＨおよびＴＥＴ２変異を欠いている正常核型ＡＭＬ患者の中央値を超えたＢＣＡＴ１発現（ＢＣＡＴ１高）は、２つの独立したコホートにおいて著しく短い全生存と相関していた（Bullinger and Delwel, GSE14468）（４０２日対未定義；ｐ＝０．０００９、ＨＲ＝２．５７、および３０６対１２７９日間、ｐ＝０．０００２、ＨＲ＝２．１１）。予想されるように、ＩＤＨまたはＴＥＴ２突然変異を担持している患者のＢＣＡＴ１高群には、より良好なＯＳに向かう有意な傾向が見られなかった（３８０対３０６日間、ｐ＝０．３５、ＨＲ＝０．７６および１７０８対１０４６日間、ｐ＝０．５８、ＨＲ＝０．７９）（図５ａ）。全体的なＢＣＡＴ１発現レベルの分布は、これらの群の間で類似しており、そしてそれは、ＩＤＨ突然変異およびＢＣＡＴ１発現が互いに排他的である１神経膠腫と対照的である。類似した結果はまた、ＴＣＧＡ２１データセットの分析によっても得られた。ＩＤＨ突然変異は、ＴＥＴ２突然変異に対して互いに排他的であり、かつ、αＫＧ依存性ジオキシゲナーゼＴＥＴ２の活性低下のため２０、共に、ＤＮＡの過剰メチル化に至る。次に、我々は、高ＢＣＡＴ１発現が、ＩＤＨまたはＴＥＴ２遺伝子に突然変異を担持しているＡＭＬサンプルに匹敵するＤＮＡ過剰メチル化につながるであろうと仮定した。実際には、（後成的な修飾因子ＤＮＭＴ３ａに突然変異を有するサンプルを除いた）ＴＣＧＡデータセットにおいて、我々は、ＩＤＨｗｔＴＥＴ２ｗｔ ＡＭＬ症例におけるＢＣＡＴ１発現レベルと全体的なＤＮＡメチル化の間の有意な正の相関を見出し、そしてそれは、ＩＤＨｍｕｔとＴＥＴ２ｍｕｔ症例それぞれにおいて有意でなかった（図５ｂ）。ＧｐＧメチル化状態の教師なし階層的クラスタリングでは、ＩＤＨｗｔＴＥＴ２ｗｔＢＣＡＴ１高 ＡＭＬサンプルとＩＤＨｍｕｔおよびＴＥＴ２ｍｕｔ患者との密接な関係が明らかになったのに対して、ＩＤＨｗｔＴＥＴ２ｗｔＢＣＡＴ１低サンプルは別々にクラスタリングさせた（図５ｃ）。ＢＣＡＴ１高とＢＣＡＴ１低サンプルのトランスクリプトームを比較すると、すべての患者コホートの中のＩＤＨｗｔＴＥＴ２ｗｔＢＣＡＴ１高症例のＩＤＨｍｕｔ ＡＭＬ２２に特徴的な遺伝子セットの強い濃縮が明らかになった（図５ｄ）。加えて、ＬＳＣ識別特性５の濃縮は、ＬＳＣにおけるＢＣＡＴ１の役割をさらに裏づける（図５ｄ）。高いＢＣＡＴ１発現、αＫＧレベルおよびＤＮＡメチル化の間の因果関係を証明するために、我々は、ＨＬ６０細胞においてＢＣＡＴ１を過剰発現させた。αＫＧレベルが有意に減少し（図５ｅ）��かつ、トランスクリプトームレベルにて、我々は、ＢＣＡＴ１過剰発現細胞におけるＩＤＨｍｕｔ遺伝子セット２２およびＬＳＣ識別特性の濃縮を見出した（図５ｆ）。１０週間（約３５回の細胞倍加）にわたる長期間のＢＣＡＴ１過剰発現は、ＤＮＡ過剰メチル化に向けた明確なシフトをもたらした（図５ｇ）。ＴＣＧＡデータセットでは、ＩＤＨｗｔＢＣＡＴ１高とＩＤＨｗｔＢＣＡＴ１低 ＡＭＬ患者の間の高度メチル化プローブ（ｐ＜０．００１、ｄｉｆｆＭｅｔｈ＞０．２５）の７７％が、ＩＤＨｍｕｔ患者（ｐ＜０．００１、ｄｉｆｆＭｅｔｈ＞０．２５）においても高度メチル化を示した（図５ｈ）。これらの１１９３プローブのうちの１０３９（８７％）もまた、ＢＣＡＴ１過剰発現ＨＬ６０細胞においてより高度にメチル化された。
まとめると、初代ＡＭＬにおける高レベルのＢＣＡＴ１発現とＨＬ−６０細胞におけるＢＣＡＴ１の過剰発現は、ＩＤＨｍｕｔ ＡＭＬに特徴的であるＤＮＡメチル化の変化に関連している。ＩＤＨｍｕｔ ＡＭＬ自体が、（２−ＨＧによる拮抗阻害を介した１９）ａＫＧ依存性ジオキシゲナーゼの活性低下を示し、かつ、ＢＣＡＴ１による細胞内ａＫＧレベルの低下は、これらの酵素の活性をさらに低下させることができないので、ＢＣＡＴ１発現レベルの予後効果を、ＩＤＨｗｔ症例に関してのみ観察した。
【００６７】
通常、ＡＭＬ患者の生存は、標準的な化学療法に対する感受性に関連している２３、２４。長期ＢＣＡＴ１過剰発現を伴ったＡＭＬ細胞において、我々は、ダウノルビシンに対する抵抗性増大を観察した（図５ｉ）。これらの方針に沿って、ＢＣＡＴ１発現は、対応する診断サンプルに対して、再発において一貫して高かった（平均で６．６倍）（図５ｊ）。
【００６８】
要約すれば、我々の試験では、ＢＣＡＴ１が、ａＫＧの恒常性のため、ひいては、ａＫＧ依存性ジオキシゲナーゼの調整を通じた、分岐鎖アミノ酸代謝の後成的および翻訳後調整に特異的に関連する、重要な酵素であると特定した。ＢＣＡＴ１は、後成的修飾因子であるＩＤＨおよびＴＥＴ２の突然変異の上流に作用するので、ａＫＧは、天然に存在する腫瘍抑制因子代謝産物として作用し得る。我々は、技術的な制限のため、ａＫＧレベルがＢＣＡＴ１高初代ＡＭＬ細胞において低いことを形式的に立証できないが、我々の結果は、原因となる因果関係を強力に裏づけている。最近の刊行物では、ＬＳＣ画分が低メチル化状態であることが示唆された２５。しかしながら、階層的組織、すなわち、ある個人の中のＬＳＣ＋およびＬＳＣ−集団の存在、を有する症例のサブグループを分析するとき、ＬＳＣ＋集団はよりメチル化されており、我々の結果と一致していた。
【００６９】
高い細胞内ａＫＧレベルがマウス胚幹細胞の多能性を維持しているのに対して２６、白血病幹細胞は、高ＢＣＡＴ１レベルがａＫＧを抑制したまま維持する。将来的に、ＬＳＣ機能を弱めるために、すなわち、ＢＣＡＴ１の阻害によって、αＫＧを増強する治療戦略が、ＡＭＬ患者のより低い再発率および改善された生存率につながり得る。
実施例２：ＢＣＡＴ１発現レベルの測定
【００７０】
特に、ＢＣＡＴ１／ＡＢＬ１発現比を使用することによる、ＢＣＡＴ１発現レベルおよびＢＣＡＴ１高またはＢＣＡＴ１低状態の決定は、ｑＰＣＲによって、具体的には、文献に示されているような、例えば、Tonjes et al., Nat Med. 2013 Jul; 19(7): 901-908にあるような、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定できる。
【００７１】
具体的には、AllPrep DNA/RNA/Protein Mini Kit（Qiagen）を、製造業者の取扱説明書に従って使用して、全ＲＮＡを抽出できる。Ambion製のFirstChoice Human Brain Reference Total RNAは、正常脳ＲＮＡプールとしての役割を果たすことができる。製造業者の取扱説明書に従ってランダムプライマーおよびsuperscript II（Invitrogen）を使用し、全ＲＮＡ（５００ｎｇ）を逆転写させ得る。各ｃＤＮＡサンプルを、Absolute SYBR Green ROX Mix（ABgene）を使用したApplied Biosystems Prism 7900HT Fast Real-Time PCR Systemを用いて、三連で分析し得る。特異的ＢＣＡＴ１ ｍＲＮＡの相対量を、ＡＢＬ１ ｍＲＮＡに対して正規化してもよい。あるいは、特異的ＢＣＡＴ１ ｍＲＮＡの相対量を、ＡＲＦ１、Ｂ２ＭまたはリＴＢＰ ｍＲＮＡに対して正規化してもよい。プライマー配列を、以下の表１に示す。
【表１】
2020506928.tif 000004
参照文献
【化２−１】
2020506928.tif 000005
【化２−２】
2020506928.tif 000006
【化２−３】
2020506928.tif 000007
【図１】
2020506928.tif 000008
【図２−１】
2020506928.tif 000009
【図２−２】
2020506928.tif 000010
【図２−３】
2020506928.tif 000011
【図２−４】
2020506928.tif 000012
【図２−ｇ】
2020506928.tif 000013
【図２−５】
2020506928.tif 000014
【図２−６】
2020506928.tif 000015
【図３−１】
2020506928.tif 000016
【図３−２】
2020506928.tif 000017
【図３−３】
2020506928.tif 000018
【図４−１】
2020506928.tif 000019
【図４ｄ−４ｅ】
2020506928.tif 000020
【図４−２】
2020506928.tif 000021
【図５−１】
2020506928.tif 000022
【図５−２】
2020506928.tif 000023
【図５−３】
2020506928.tif 000024
【図５−４】
2020506928.tif 000025
【図５−５】
2020506928.tif 000026
【図５−６】
2020506928.tif 000027
【図５−７】
2020506928.tif 000028
【図６】
2020506928.tif 000029
【配列表】
2020506928000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年1月9日(2020.1.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＭＬに罹患している患者の治療における使用のための、α−ケトグルタラートの細胞内レベルを増強する化合物を含有する医薬組成物であって、ここで、前記ＡＭＬが、ＢＣＡＴ１高発現とＩＤＨｗｔＴＥＴｗｔを特徴とする医薬組成物。
【請求項２】
前記化合物がＢＣＡＴ１阻害剤である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記ＢＣＡＴ１阻害剤が：アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ分子、ｓｈＲＮＡ分子、ＢＣＡＴ１の不活性変異体、および低分子阻害剤、特に、１−（アミノメチル）シクロヘキサン酢酸、から選択される、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記化合物が、α−ケトグルタル酸、α−ケトグルタル酸の一もしくは二塩基性塩、またはエステルもしくはアミドとして誘導体化される少なくとも１つのカルボン酸を有するα−ケトグルタル酸の誘導体、特にα−ケトグルタル酸のモノエステルもしくはα−ケトグルタル酸のジエステルから選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記化合物が、２−オキソ−ペンタン二酸、１−ヘキシルエステル、２−オキソ−ペンタン二酸、１−オクチルエステル、ベンジル−α−ケトグルタラートエステルおよび３−トリフルオロメチルベンジル−α−ケトグルタラートエステルから選択される、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記ＢＣＡＴ１高発現が、定量的ＰＣＲによって測定される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記ＢＣＡＴ１高発現が、基準の発現との関連で決定され、特にここで、前記基準がＡＢＬ１であり、特にここで、ＢＣＡＴ１高発現が、０．９０超のＢＣＡＴ１／ＡＢＬ１比を特徴とする、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
ＡＭＬに罹患している患者の状態を特徴づけるインビトロ法であって、前記患者からのＡＭＬ細胞を含むサンプルにおいて（ｉ）ＢＣＡＴ１の発現を計測し、および（ｉｉ）ＩＤＨとＴＥＴに関して遺伝子型を決定する、ステップを特徴とする方法。
【請求項９】
以下のステップ：
（ａ）前記患者から得られたＡＭＬ腫瘍細胞におけるＢＣＡＴ１の発現をインビトロにおいて計測し；
（ｂ）ＩＤＨとＴＥＴに関して前記ＡＭＬ腫瘍細胞の状態を決定し；および
（ｃ）ステップ（ａ）および（ｂ）で決定した状態に基づいて薬物療法コホートに前記患者を層別化すること、
を含む、ＡＭＬに罹患している患者を層別化するインビトロ法であって、
ここで、ＢＣＡＴ１高発現とＩＤＨｗｔＴＥＴｗｔによって特徴づけられる患者が、α−ケトグルタラートの細胞内レベルを増強する化合物によって治療され得る方法。
【請求項１０】
前記ＢＣＡＴ１高発現が、定量的ＰＣＲによって測定される、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＢＣＡＴ１高発現が、基準の発現との関連で決定され、特にここで、前記基準がＡＢＬ１であり、特にここで、ＢＣＡＴ１高発現が、０．９０超のＢＣＡＴ１／ＡＢＬ１比を特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【国際調査報告】
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