(57)【要約】  エクスビボ増殖用臍帯血ユニットの選択方法、ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋陽性画分と未培養のＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋陰性画分の分離、選択したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋画分を増殖させるための方法、増殖したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血細胞集団を必要とする対象へ移植するためのその細胞集団の選択、及び血液系腫瘍の治療のために臨床環境での移植用に適切に選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋及び未選択ＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性臍帯血画分の治療的使用が提供される。本発明は、増殖臍帯血画分と未選択臍帯血画分を含むキットも想定している。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
エクスビボ増殖用および対象への移植用の解凍した臍帯血ユニットを選択するための方法であって、前記解凍した臍帯血ユニット中の細胞の生存率を確認することと、生存率が約４０％〜約８５％のユニットを選択した後に前記臍帯血ユニットをＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋画分とＣＤ／１３３−／ＣＤ３４−画分とに分離することで、エクスビボ増殖と前記対象への移植に適した解凍した臍帯ユニットを選択することを含む、方法。
【請求項２】
生存率が約４０％〜約７０％のユニットを選択することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ａ）選択した、前記エクスビボ増殖と前記対象への移植に適した解凍臍帯血ユニットを（ｉ）ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択細胞を含む第１の選択血液細胞画分と、（ｉｉ）ＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性細胞を含む第２の未選択血液細胞画分に分離する工程と、
（ｂ）ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋画分である前記第１の選択血液細胞画分において、次の分離後のパラメータ：
（ｉ）総細胞数が約２０×１０５〜約７５×１０５個、
（ｉｉ）生存率が約７０％〜約８５％、
（ｉｉｉ）ＣＤ１３３＋細胞が約７０％〜約８５％、
（ｉｖ）ＣＤ３４＋細胞が約７０％〜約８５％、
（ｖ）ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択後収率が約０．０２〜約１％、
（ｖｉ）細胞１０００個当たりのＣＦＵが約１５〜約７５個、及び
（ｖｉｉ）内毒素が３Ｅｕ／ｍｌ未満、
を確認する工程と、
（ｃ）前記パラメータに従って、ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋画分である前記第１の選択血液細胞画分を選択又は除外して、エクスビボ増殖と前記対象への移植に適したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分を選択する工程とを更に含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記工程（ａ）の分離は、ＣＤ１３３＋用の免疫磁気ビーズによる選択を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性細胞を含む第２の未選択血液細胞画分は、ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋細胞が０．５％未満である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記ＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性細胞を含む第２の未選択血液細胞画分は、ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋細胞が０．０１％未満である、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記ＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性細胞を含む第２の未選択血液細胞画分は、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む免疫細胞を包含する、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
対象への移植用の臍帯血ユニットを調製するための方法であって、
（ａ）前記対象への移植に適した、解凍後の単一の臍帯血ユニットを、（ｉ）ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択細胞を含む第１の選択血液細胞画分と、（ｉｉ）ＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性細胞を含む第２の未選択血液細胞画分とに分離する工程と、
（ｂ）細胞増殖可能な条件下において、ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択細胞を含む前記第１の選択血液細胞画分をエクスビボ培養する工程であって、前記条件は、栄養素、血清、並びに幹細胞因子、トロンボポエチン、ＦＬｔ３リガンド及びＩＬ−６の各々を含むサイトカイン、並びに１．０ｍＭ〜１０ｍＭのニコチンアミドを供給することを含む、方法。
【請求項９】
前記工程（ａ）の（ｉ）ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択細胞を含む前記第１の選択血液細胞画分は、請求項３又は４に記載の方法に従って選択した、エクスビボ増殖と前記対象への移植に適したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記エクスビボ増殖の７日目又は１４日目に内毒素が３．０Ｅｕ／ｍｌを超えたユニット、及び／又は細菌、酵母又はカビの成長が見られるユニットを除外する工程を更に含む、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
移植に適した前記単一の臍帯血ユニットは、次の凍結保存前パラメータ：
（ｉ）総ＣＤ３４＋細胞が約８×１０６〜約１５×１０６個、
（ｉｉ）６種のＨＬＡクラスＩ（ＨＬＡ−ＡとＨＬＡ−Ｂ、低解像度）座位及びＨＬＡクラスＩＩ（ＨＬＡ−ＤＲＢ１、高解像度）座位の内の少なくとも４種において、前記対象とＨＬＡ適合、
（ｉｉｉ）凍結保存前の総有核細胞数が約１．８×１０９〜約３．０×１０９個、及び
（ｉｖ）凍結保存前の総有核細胞数が対象重量１キログラム当たり約１．５×１０７〜約３．０×１０７個、
によって特徴付けられる、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記血清はＦＢＳを１０％含む、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記サイトカインは、幹細胞因子、トロンボポエチン、ＦＬｔ３リガンド及びＩＬ−６の各々を５０ｎｇ含む、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ニコチンアミドを２．５ｍＭで供給する、請求項８〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記エクスビボ培養を１８〜２５日間行う、請求項８〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
培養１９〜２３日後に、前記エクスビボ培養したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択細胞を含む第１の選択血液細胞画分を回収することを更に含む、請求項８〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
培養２１日後に、前記エクスビボ培養したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択細胞を含む第１の選択血液細胞画分を回収することを更に含む、請求項８〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択細胞を含む前記エクスビボ培養した第１の選択血液細胞画分と、ＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性細胞を含む前記第２の未選択血液細胞画分とを、別々に凍結保存することを更に含む、請求項８〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
対象への移植用の、ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択臍帯血細胞を含むエクスビボ培養臍帯血細胞画分を選択する方法であって、
（ａ）エクスビボ増殖後のエクスビボ培養臍帯血画分において次のパラメータ：
（ｉ）総生細胞数が約８×１０８〜約１５×１０８個、
（ｉｉ）細胞生存率が約７０％〜８５％、
（ｉｉｉ）ＣＤ３４＋細胞が約７〜１５％、
（ｉｖ）総ＣＤ３４＋細胞数が約５．６×１０７〜約５×１０８個、
（ｖ）総ＣＤ１３３＋細胞数が約２．４×１０７〜約２×１０８個、
（ｖｉ）ＣＤ１３３＋／ＣＤ３８−細胞数が約８×１０５〜約２５×１０５個、
（ｖｉｉ）総ＣＤ１４＋細胞数が約８×１０７〜約１５×１０８個、
（ｖｉｉｉ）総ＣＤ１５＋細胞数が約２×１０８〜約２×１０９個、
（ｉｘ）総ＣＤ１１ｂ＋細胞数が約８×１０７〜約８×１０９個、
（ｘ）総ＣＤ１（ａ＋ｃ）＋細胞数が約３．２×１０７〜約３×１０８個、
（ｘｉ）培養マイコプラズマ又は細菌、酵母又はカビの成長なし、
を確認する工程と、
（ｂ）前記パラメータに従って前記エクスビボ培養臍帯血画分を選択又は除外して、対象への移植に適したエクスビボ培養ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分を選択する工程と
を含む方法。
【請求項２０】
前記パラメータ（ｉ）が少なくとも８．０×１０８個の生細胞と等しい場合に、前記エクスビボ培養ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分を選択する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記エクスビボ培養臍帯血画分は、次の凍結保存前パラメータ：
（ｉ）総ＣＤ３４＋細胞数が約８×１０６〜約１５×１０６個、
（ｉｉ）６種のＨＬＡクラスＩ（ＨＬＡ−ＡとＨＬＡ−Ｂ、低解像度）座位及びＨＬＡクラスＩＩ（ＨＬＡ−ＤＲＢ１、高解像度）座位の内の少なくとも４種で前記対象とＨＬＡ適合、
（ｉｉｉ）凍結保存前の総有核細胞数が約１．８×１０９〜約３．０×１０９個、
（ｉｖ）凍結保存前の総有核細胞数が対象重量１キログラム当たり約１．５×１０７〜約３．０×１０７個、
に従ってエクスビボ増殖用に選択した臍帯血ユニットから培養されたものである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
黄色がかっていて、混濁〜不透明な色を呈し、白い凝集塊や異物粒子を含まないエクスビボ培養臍帯血画分を選択する工程を更に含む、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２３】
対象への移植用のＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性細胞を含む未選択臍帯血細胞画分を選択する方法であって、
（ａ）ＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性細胞を選択した後、未培養の臍帯血画分において次のパラメータ：
（ｉ）総生細胞数が約４×１０８〜約１５×１０８個、
（ｉｉ）細胞生存率が約７０〜８５％、
（ｉｉｉ）ＣＤ３＋細胞数が約２．４×１０７〜約８×１０７個、
（ｉｖ）細菌、酵母又はカビの成長なし、
を確認する工程と、
（ｂ）前記パラメータに従って、前記未選択臍帯血細胞画分を選択又は除外して、対象への移植に適したＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性細胞を含む未選択臍帯血細胞画分を選択する工程と
を含む方法。
【請求項２４】
赤く不透明な色を呈し、凝集塊や異物粒子を含まない未選択臍帯血細胞画分を選択する工程を更に含む、請求項２２又は２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エクスビボ（ex vivo）増殖用臍帯血ユニットの選択方法、ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋陽性画分と未培養のＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋陰性画分の分離、選択したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋画分を増殖させるための方法、臍帯血細胞集団の移植を必要とする対象へ移植するための増殖したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血細胞集団の選択、及び血液系腫瘍の治療のための、臨床環境における移植に適した選択エクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋画分及び未選択ＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性臍帯血画分の治療的使用に関する。本発明は、増殖臍帯血画分と未選択臍帯血画分を含むキットも想定している。
【背景技術】
【０００２】
造血幹細胞移植を待っている患者の３分の２以上は、適切な適合血縁ドナーがいないため、非血縁ドナーの移植片が必要となる。臍帯血、骨髄及び他の造血性組織は、特に適合非血縁ドナーが妥当な時間内に見つからない場合には、幹細胞の貴重な供給源である。臍帯血を使用する利点としては、容易に入手可能であり、血液媒介感染症の伝染リスクが低く、血縁又は非血縁ドナーの末梢血又は骨髄由来の同様の非適合幹細胞と比べて、移植片対宿主病のリスクを抑えながらもＨＬＡバリアを越えて移植可能であるという事実が挙げられる。臍帯血の他の重要な利点は、許容し得る臍帯血ユニットが一旦特定されれば、迅速に取得できることである。
【０００３】
しかし、臍帯血の主な臨床的制限は、動員末梢血（ＰＢ）や骨髄と比べて、移植に利用できる幹細胞の量が少ない点にある。このように幹細胞の量が少ないと、生着の機会を損なう可能性があり、好中球や血小板の回復の動態が遅延すると共に、他の移植結果にも影響を及ぼす。その結果、移植関連の合併症や罹患率、死亡率に影響を及ぼし、入院期間が延長する。このような問題に対処するため、二重臍帯血移植（ＤＣＢＴ）や臍帯血幹細胞のエクスビボ増殖等の幾つかのアプローチが開発されている。ＤＣＢＴは、適切な細胞量の単一臍帯血ユニットが利用できないレシピエントへの臍帯血移植で標準的に行われている。
【０００４】
それでもＤＣＢＴの生着動態は単一ユニット移植と大差はない。エクスビボ増殖はまだ実験的なアプローチである。臍帯血のエクスビボ増殖の目的は、迅速且つ着実にインビボ（in vivo）で好中球と血小板の産生能を有する十分な数の細胞を移植片に提供して移植を成功可能とすることである。Delaney et al.（2010, Nat Med 16:232-236）とDe Lima et al.（2012, N Engl J Med, 367:2305-2315）は、エクスビボで増殖させた臍帯血移植片を二重臍帯構成で用いた２種の臨床研究（即ち、一方のユニットを増殖に使用し、もう一方のユニットを未処置で投与）の結果を発表し、増殖させた細胞は移植後１週間という早い時期に観察されたが、生着の前後で殆ど失われ、一方、未処置のユニットは全てのレシピエントで優勢であったと報告した。
【０００５】
本発明者らは、サイトカイン（ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ−６及びＦＬＴ−３リガンド）とニコチンアミドの存在下でＣＤ１３３＋臍帯血細胞を培養すると、後期及び初期前駆細胞（これは、短期間の初期三血球系生着に重要である）の両方がより良好且つ長期に亘って増殖し、分化した骨髄単球細胞（ＣＤ１４＋、ＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ１１ｃ＋）の割合が減少し、分化の程度が低い初期前駆細胞（ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞）の割合が増加したことを示した。ＮＡＭとの培養後に得たＣＤ３４＋細胞は、サイトカインのみと共に培養した細胞又は未培養細胞に比べて高い有効性でＳＤＦ−１への移動と骨髄へのホーミング（輸注後２４時間）の増加を示した。更に、インビトロ研究によって、このような培養条件ではＴ細胞の増殖がサポートされないため、Ｔ細胞の表現型を示す細胞は増殖した臍帯血画分にはごく少量しか存在し得ないことが分かっている（米国特許第７，９５５，８５２号及び第８，８４６，３９３号、及びPeled et al, 2012, Exp Hematol 40:342-55を参照）。
【０００６】
Horowitz et al（2014、J Clin Invest 124：3121-3128）は、二重臍帯血移植アプローチを用いて、サイトカインとニコチンアミドによって臍帯血ユニット全体からエクスビボで増殖させた同種幹細胞と前駆細胞は、未処置の臍帯血移植片を打ち負かすことができ、迅速な生着と着実な長期多系統造血をもたらすことを実証した。
【０００７】
Wagner et al（Cell Stem Cell 2016 18：144-55）は、アリール炭化水素受容体拮抗薬で増殖させた臍帯血造血幹細胞を独立型移植片として用いた第Ｉ／ＩＩ相臨床試験で良好な結果が得られたことを報告した。
【発明の概要】
【０００８】
本発明の幾つかの実施形態の一様相によれば、エクスビボ増殖と対象への移植用の解凍臍帯血ユニットを選択するための方法であって、解凍臍帯血ユニット中の細胞の生存率を確認する工程と、生存率が約４０％〜約８５％のユニットを選択した後にこの臍帯血ユニットをＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋画分とＣＤ／１３３−／ＣＤ３４−画分とに分離することで、エクスビボ増殖と対象への移植に適した解凍した臍帯ユニットを選択することを含む方法が提供される。
【０００９】
本発明の幾つかの実施形態によれば、この方法は、生存率が約４０％〜約７０％のユニットを選択することを含む。
【００１０】
本発明の幾つかの実施形態によれば、この方法は、
（ａ）選択した、エクスビボ増殖と対象への移植に適した解凍臍帯血ユニットを（ｉ）ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択細胞を含む第１の選択血液細胞画分と、（ｉｉ）ＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性細胞を含む第２の未選択血液細胞画分に分離する工程と、
（ｂ）ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋画分である上記第１の選択血液細胞画分において、次の分離後パラメータ：
（ｉ）総細胞数が約２０×１０５〜約７５×１０５個、
（ｉｉ）生存率が約７０％〜約８５％、
（ｉｉｉ）ＣＤ１３３＋細胞が約７０％〜約８５％、
（ｉｖ）ＣＤ３４＋細胞が約７０％〜約８５％、
（ｖ）ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択後収率が約０．０２〜約１％、
（ｖｉ）細胞１０００個当たりのＣＦＵが約１５〜約７５個、及び
（ｖｉｉ）内毒素が３Ｅｕ／ｍｌ未満、
を確認する工程と、
（ｃ）これらのパラメータに従って、ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋画分である上記第１の選択血液細胞画分を選択又は除外して、エクスビボ増殖と対象への移植に適したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分を選択する工程とを更に含む。
【００１１】
本発明の幾つかの実施形態によれば、工程（ａ）の分離はＣＤ１３３＋用の免疫磁気ビーズによる選択を含む。
【００１２】
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性細胞を含む第２の未選択血液細胞画分はＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋細胞が０．５％未満である。
【００１３】
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性細胞を含む第２の未選択血液細胞画分はＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋細胞が０．０１％未満である。
【００１４】
本発明の幾つかの実施形態によれば、ＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性細胞を含む第２の未選択血液細胞画分は、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む免疫細胞を包含する。
【００１５】
本発明の幾つかの実施形態の一様相によれば、対象への移植用の臍帯血ユニットを調製するための方法であって、
（ａ）対象への移植に適した、解凍後の単一の臍帯血ユニットを、（ｉ）ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択細胞を含む第１の選択血液細胞画分と、（ｉｉ）ＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性細胞を含む第２の未選択血液細胞画分とに分離する工程と、
（ｂ）細胞増殖可能な条件下において、ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択細胞を含む第１の血液細胞画分をエクスビボで培養する工程を含み、この条件は、栄養素、血清、並びに幹細胞因子、トロンボポエチン、ＦＬｔ３リガンド及びＩＬ−６の各々を含むサイトカイン、並びに１．０ｍＭ〜１０ｍＭのニコチンアミドを供給することを含む、方法が提供される。
【００１６】
本発明の幾つかの実施形態によれば、工程（ａ）の（ｉ）ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択細胞を含む第１の選択血液細胞画分は、請求項３又は４に記載の方法に従って選択した、エクスビボ増殖と対象への移植に適したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分である。
【００１７】
本発明の幾つかの実施形態によれば、この方法は、エクスビボ増殖の７日目又は１４日目に内毒素が３．０Ｅｕ／ｍｌを超えたユニット、及び／又は細菌、酵母又はカビの成長が見られるユニットを除外する工程を更に含む。
【００１８】
本発明の幾つかの実施形態によれば、移植に適した単一の臍帯血ユニットは、次の凍結保存前パラメータ：
（ｉ）総ＣＤ３４＋細胞が約８×１０６〜約１５×１０６個、
（ｉｉ）６種のＨＬＡクラスＩ（ＨＬＡ−ＡとＨＬＡ−Ｂ、低解像度）座位及びＨＬＡクラスＩＩ（ＨＬＡ−ＤＲＢ１、高解像度）座位の内の少なくとも４種において、対象とＨＬＡ適合、
（ｉｉｉ）凍結保存前の総有核細胞数が約１．８×１０９〜約３．０×１０９個、及び
（ｉｖ）凍結保存前の総有核細胞数が対象重量１キログラム当たり約１．５×１０７〜約３．０×１０７個、
によって特徴付けられる。
【００１９】
本発明の幾つかの実施形態によれば、血清はＦＢＳを１０％含む。
【００２０】
本発明の幾つかの実施形態によれば、サイトカインは、幹細胞因子、トロンボポエチン、ＦＬｔ３リガンド及びＩＬ−６の各々を５０ｎｇ含む。
【００２１】
本発明の幾つかの実施形態によれば、ニコチンアミドを２．５ｍＭで供給する。
【００２２】
本発明の幾つかの実施形態によれば、エクスビボ培養を１８〜２５日間行う。
【００２３】
本発明の幾つかの実施形態によれば、この方法は、培養１９〜２３日後に、エクスビボ培養したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択細胞を含む第１の選択血液細胞画分を回収することを更に含む。
【００２４】
本発明の幾つかの実施形態によれば、この方法は、培養２１日後に、エクスビボ培養したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択細胞を含む第１の選択血液細胞画分を回収することを更に含む。
【００２５】
本発明の幾つかの実施形態によれば、この方法は、ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択細胞を含むエクスビボ培養した第１の選択血液細胞画分とＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性細胞を含む第２の未選択血液細胞画分を別々に凍結保存することを更に含む。
【００２６】
本発明の幾つかの実施形態の一様相によれば、対象への移植用のＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択臍帯血細胞を含むエクスビボ培養臍帯血細胞画分を選択する方法であって、
（ａ）エクスビボ増殖後のエクスビボ培養臍帯血画分において次のパラメータ：
（ｉ）総生細胞数が約８×１０８〜約１５×１０８個、
（ｉｉ）細胞生存率が約７０％〜８５％、
（ｉｉｉ）ＣＤ３４＋細胞が約７〜１５％、
（ｉｖ）総ＣＤ３４＋細胞数が約５．６×１０７〜約５×１０８個、
（ｖ）総ＣＤ１３３＋細胞数が約２．４×１０７〜約２×１０８個、
（ｖｉ）ＣＤ１３３＋／ＣＤ３８−細胞数が約８×１０５〜約２５×１０５個、
（ｖｉｉ）総ＣＤ１４＋細胞数が約８×１０７〜約１５×１０８個、
（ｖｉｉｉ）総ＣＤ１５＋細胞数が約２×１０８〜約２×１０９個、
（ｉｘ）総ＣＤ１１ｂ＋細胞数が約８×１０７〜約８×１０９個、
（ｘ）総ＣＤ１（ａ＋ｃ）＋細胞数が約３．２×１０７〜約３×１０８個、
（ｘｉ）培養マイコプラズマ又は細菌、酵母又はカビの成長なし、
を確認する工程と、
（ｂ）これらのパラメータに従ってエクスビボ培養臍帯血画分を選択又は除外して、対象への移植に適したエクスビボ培養ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分を選択する工程とを含む方法が提供される。
【００２７】
本発明の幾つかの実施形態によれば、パラメータ（ｉ）が少なくとも８．０×１０８個の生細胞と等しい場合に、エクスビボ培養ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分を選択する。
【００２８】
本発明の幾つかの実施形態によれば、エクスビボ培養臍帯血画分は、次の凍結保存前パラメータ：
（ｉ）総ＣＤ３４＋細胞数が約８×１０６〜約１５×１０６個、
（ｉｉ）６種のＨＬＡクラスＩ（ＨＬＡ−ＡとＨＬＡ−Ｂ、低解像度）座位及びＨＬＡクラスＩＩ（ＨＬＡ−ＤＲＢ１、高解像度）座位の内の少なくとも４種において、対象とＨＬＡ適合、
（ｉｉｉ）凍結保存前の総有核細胞数が約１．８×１０９〜約３．０×１０９個、
（ｉｖ）凍結保存前の総有核細胞数が対象重量１キログラム当たり約１．５×１０７〜約３．０×１０７個、
に従ってエクスビボ増殖用に選択した臍帯血ユニットから培養されたものである。
【００２９】
本発明の幾つかの実施形態によれば、この方法は、黄色がかっていて、混濁〜不透明な色を呈し、白い凝集塊や異物粒子を含まないエクスビボ培養臍帯血画分を選択する工程を更に含む。
【００３０】
本発明の幾つかの実施形態の一様相によれば、対象への移植用のＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性細胞を含む未選択臍帯血細胞画分を選択する方法であって、
（ａ）ＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性細胞を選択した後、未培養の臍帯血画分において次のパラメータ：
（ｉ）総生細胞数が約４×１０８〜約１５×１０８個、
（ｉｉ）細胞生存率が約７０〜８５％、
（ｉｉｉ）ＣＤ３＋細胞数が約２．４×１０７〜約８×１０７個、
（ｉｖ）細菌、酵母又はカビの成長なし
を確認する工程と、
（ｂ）これらのパラメータに従って未選択臍帯血細胞画分を選択又は除外して、対象への移植に適したＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性細胞を含む未選択臍帯血細胞画分を選択する工程とを含む方法が提供される。
【００３１】
本発明の幾つかの実施形態によれば、この方法は、赤く不透明な色を呈し、凝集塊や異物粒子を含まない未選択臍帯血細胞画分を選択する工程を更に含む。
【００３２】
特に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術用語及び／又は科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が通常理解するものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様の又は等価な方法及び材料を、本発明の実施形態の実践又は試験に使用することができるが、例示的な方法及び／又は材料を以下に記載する。矛盾する場合、定義を含む本特許明細書が優先する。また、材料、方法及び実施例は単なる例示であり、必ずしも限定を意図するものではない。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明は、エクスビボ増殖用臍帯血ユニットの選択方法、ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋陽性画分と未培養のＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋陰性画分の分離、選択したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋画分を増殖させるための方法、増殖したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血細胞集団を必要とする対象へ移植するためのその細胞集団の選択、及び血液系腫瘍の治療のために臨床環境での移植用に適切に選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分及び未選択ＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性臍帯血画分の治療的使用に関する。本発明は、増殖した未選択臍帯血画分を含むキットも想定している。
【００３４】
また、本発明は、増殖臍帯血ユニットを含むキット、及び血液系腫瘍の治療におけるその使用のための説明書に関する。
【００３５】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、必ずしもその用途が以下の説明で記載される詳細に限定されるものではないことを理解すべきである。本発明は他の実施形態が可能であり、様々な手段で実施又は実行することが可能である。
【００３６】
同種造血幹細胞移植は血液障害患者の救命手順であるが、この手順の幅広い適用は、適切なＨＬＡ適合ドナーの入手可能性によって制限される。
【００３７】
従って、臍帯血移植片は、小児移植の状況では日常的に、より成功裏に使用されている（推奨閾値細胞量によると、７５ｋｇの患者にとって十分量となり得るものはバンク内の臍帯血ユニットの２０％に過ぎない）。臍帯血移植を受けた成人の場合、生着の遅れや失敗の割合が高いことに起因し、高い早期死亡率（１００日での死亡率が３０〜６０％と高く）、高い感染症リスクが見られる。実際、臍帯血と他の移植片源との結果の違いを概説する文献では、一般に不十分な造血回復に起因して臍帯血移植後に非再発死亡率が高いことが報告されており、生着の遅延は臍帯血移植成功の唯一最大の障壁であり、早期の非再発死亡率の最も重要な要因と見なされている。
【００３８】
現在利用可能な移植片生産方法に対する重要な課題は、分化の程度が低い前駆細胞（ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞又はＣＤ３４＋Ｌｉｎ−細胞）の数を損なうことなく、関与する造血前駆細胞の集団を増殖させる能力である。本発明は、骨髄ホーミング及び生着有効性を高めるためにニコチンアミド（ＮＡＭ）を利用する増殖技術を提供する。生着は、接種細胞の定方向遊走、骨髄（ＢＭ）へのホーミング、ＢＭニッチ内の保持とそれに続く自己再生及び分化を含む多段階プロセスである。新鮮なＣＤ３４＋細胞と比較して骨髄へのホーミングが不十分であることや、培養での分化増強による自己再生の低下に起因して、増殖後の生着有効性は低いことが知られている。
【００３９】
本明細書で提供する臍帯血ユニットの選択及び造血前駆細胞（ＨＰＣ）のエクスビボ増殖のための方法によって、その自己再生能力及びその骨髄（ＢＭ）へのホーミングと効率的に造血を再構成する能力を維持させながら、その数を増やすことができる。ニコチンアミドの添加によって分化が遅延し、４種のサイトカイン（ＦＬＴ３、ＳＣＦ、ＴＰＯ及びＩＬ６）の組み合わせと共に２１（±２）日間（１９〜２３日）培養した臍帯血由来の精製ＣＤ１３３＋細胞のホーミング及び生着有効性が高まる。このような培養条件はＴ細胞の増殖をサポートしない（Ｔ細胞の表現型を示す細胞は培養増殖した細胞中にはごく少量しか存在し得ない）ため、本発明は、Ｔ細胞を提供するための、未培養で未処置の同臍帯血ユニット由来画分を提供する。
【００４０】
本発明は、培養したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分及び未培養のＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性臍帯血画分を調製するための臍帯血ユニットの選択基準、ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分の培養とエクスビボ増殖の方法、生着可能性が高い有効な移植に適した増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分及び未培養のＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性臍帯血画分の選択基準、及び培養及び未培養臍帯血画分の凍結保存と調製の方法を提供する。また、本発明は、悪性血液障害の治療のために臨床環境での移植の選択基準を満たす増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分及び未培養のＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性臍帯血画分の使用方法も提供する。
【００４１】
エクスビボ増殖用臍帯血ユニットの選択
幾つかの実施形態によれば、本発明は、エクスビボ増殖と対象への移植用に凍結保存した臍帯血ユニットを選択する方法であって、エクスビボ増殖の前に上記臍帯血ユニットにおいて次の凍結保存前パラメータ：
（ｉ）総ＣＤ３４＋細胞数が約８×１０６〜約１５×１０６個、
（ｉｉ）６種のＨＬＡクラスＩ（ＨＬＡ−ＡとＨＬＡ−Ｂ、低解像度）座位及びＨＬＡクラスＩＩ（ＨＬＡ−ＤＲＢ１、高解像度）座位の内の少なくとも４種において、対象とＨＬＡが適合、
（ｉｉｉ）凍結保存前の総有核細胞数が約１．８×１０９〜約３．０×１０９個、
（ｉｖ）凍結保存前の総有核細胞数が対象重量１キログラム当たり約１．５×１０７〜約３．０×１０７個
を確認する工程と、
上記パラメータに従って上記臍帯血ユニットを選択又は除外して、エクスビボ増殖と上記対象への移植に適した臍帯血ユニットを選択する工程を含む方法を提供する。
【００４２】
全ての臍帯血ユニットは、国の適用規制を満たす公的なバンクから調達される。ドナーのスクリーニングと試験は関連する規制要件に従って行う。臍帯血バンクでは通常、採取したばかりの臍帯血を効率的に保存する方法（例えば、赤血球の除去や血漿の除去等）を用いており、その結果、体積が減少し、体積の小さい臍帯血ユニットの凍結保存が行われる。臍帯血ユニットを凍結保存する前に、ユニットの試料を分析してユニットのプロファイルを得るが、このプロファイルとしては、細胞生存率、特定の細胞集団の量、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）分類、安全性基準（例えば、細菌／ウイルス汚染）、ユニット体積、特に、ユニット全体の合計値、相対値（例えば、細胞総数に対する特定の細胞型の割合等）、及び体積に対する調整値（例えば、単位体積における特定の細胞型の濃度）が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用される「凍結保存」という用語は、非制御の化学反応速度論による損傷を受ける生物学的実体（例えば、細胞、組織、小器官等）を極低温（通常、固体二酸化炭素を使用して−８０℃、又は液体窒素を使用して−１９６℃）まで冷却して保存するプロセスを意味する。一実施形態では、臍帯血細胞を液体窒素を使用して凍結保存する。造血細胞集団の保存方法は当技術分野で周知である（Watts et al, Cryopreservation and Freeze-Drying Protocols, in Methods in Molecular Biology, 2007; 368:237-259を参照）。
【００４３】
本明細書で使用される「凍結保存前」という用語は、凍結保存の前、例えば、貯蔵された凍結保存臍帯血ユニットの凍結保存の前に記録されたパラメータ、値又は特性を意味する。幾つかの実施形態では、そのような「凍結保存前」データを参照して、本発明の方法で使用する臍帯血ユニットの候補を選択することができる。
【００４４】
従って、本発明の一実施形態によれば、臍帯血ユニットに関して凍結保存前パラメータである総ＣＤ３４＋細胞数、総有核細胞数、及び赤血球枯渇と体積減少を確認してエクスビボ増殖と移植用の臍帯血ユニットを選択又は除外する。移植候補者（例えば、「対象」）の身元が分かっている場合、ＨＬＡ適合（適合性）や凍結保存前の対象重量１キログラム当たりの総有核細胞数等のパラメータも確認し、選択基準として使用することができる。
【００４５】
特定の実施形態では、エクスビボ増殖用に選択した臍帯血ユニットは、凍結保存前の総ＣＤ３４＋値である総ＣＤ３４＋細胞数が約８×１０６〜約１５×１０６個、約９×１０６〜約１３×１０６個、約１０×１０６〜約１２×１０６個である。一実施形態では、エクスビボ増殖用に選択した臍帯血ユニットは、凍結保存前の総ＣＤ３４＋細胞数が少なくとも１２×１０６個である。一実施形態では、エクスビボ増殖用に選択した臍帯血ユニットは、凍結保存前の総ＣＤ３４＋細胞数が少なくとも８×１０６個である。一実施形態では、エクスビボ増殖用に選択した臍帯血ユニットは、凍結保存前の総ＣＤ３４＋細胞数が少なくとも１０×１０６個である。
【００４６】
特定の実施形態では、エクスビボ増殖用に選択した臍帯血ユニットは、凍結保存前の総有核細胞値である総有核細胞数が約１．８×１０９〜約３．０×１０９個、約２×１０９〜約２．７×１０９個、又は約２．２×１０９〜約２．５×１０９個である。一実施形態では、エクスビボ増殖用に選択した臍帯血ユニットは、凍結保存前の総有核細胞数が少なくとも２．５×１０９個である。一実施形態では、エクスビボ増殖用に選択した臍帯血ユニットは、凍結保存前の総有核細胞数が少なくとも２．０×１０９個である。一実施形態では、エクスビボ増殖用に選択した臍帯血ユニットは、凍結保存前の総有核細胞数が少なくとも１．８×１０９個である。通常、有核細胞の計数は、血球計（例えば、Ｎｅｕｂａｕｅｒ）によって手動で行うか、又は自動計数器で行うことができる。
【００４７】
特定の実施形態では、エクスビボ増殖用に選択した臍帯血ユニットは、凍結保存前の総有核細胞数が対象重量１キログラム当たり約１．５×１０７〜約３．０×１０７個、対象重量１キログラム当たり約１．７×１０７〜約２．８×１０７個、対象重量１キログラム当たり約１．９×１０７〜約２．５×１０７個、又は対象重量１キログラム当たり約２×１０７〜約２．２×１０７個である。一実施形態では、エクスビボ増殖用に選択した臍帯血ユニットは、凍結保存前の総有核細胞数が対象重量１キログラム当たり少なくとも３．０×１０７個である。一実施形態では、エクスビボ増殖用に選択した臍帯血ユニットは、凍結保存前の総有核細胞数が対象重量１キログラム当たり少なくとも２．３×１０７個である。一実施形態では、エクスビボ増殖用に選択した臍帯血ユニットは、凍結保存前の総有核細胞数が対象重量１キログラム当たり少なくとも１．５×１０７個である。
【００４８】
特定の実施形態では、エクスビボ増殖用に選択した臍帯血ユニットは、凍結保存前に６種のＨＬＡクラスＩ（ＨＬＡ−ＡとＨＬＡ−Ｂ、低解像度）座位及びＨＬＡクラスＩＩ（ＨＬＡ−ＤＲＢ１、高解像度）座位の内の少なくとも４種において、対象とＨＬＡが適合する。あるいは６種のＨＬＡクラスＩ（ＨＬＡ−ＡとＨＬＡ−Ｂ、低解像度）座位及びＨＬＡクラスＩＩ（ＨＬＡ−ＤＲＢ１、高解像度）座位の内の少なくとも５種において、対象とＨＬＡが適合し、又は６種のＨＬＡクラスＩ（ＨＬＡ−ＡとＨＬＡ−Ｂ、低解像度）座位及びＨＬＡクラスＩＩ（ＨＬＡ−ＤＲＢ１、高解像度）座位の内の６種において、対象とＨＬＡが適合する。幾つかの実施形態では、臍帯血ユニットは、凍結保存前に６種のＨＬＡクラスＩ（ＨＬＡ−ＡとＨＬＡ−Ｂ、低解像度）座位及びＨＬＡクラスＩＩ（ＨＬＡ−ＤＲＢ１、高解像度）座位の内の少なくとも４種において、対象とＨＬＡが適合し、少なくとも１種のＨＬＡ−ＤＲＢ１適合を伴う。幾つかの実施形態では、臍帯血ユニットは、凍結保存前に６種のＨＬＡクラスＩ（ＨＬＡ−ＡとＨＬＡ−Ｂ、低解像度）座位及びＨＬＡクラスＩＩ（ＨＬＡ−ＤＲＢ１、高解像度）座位の内の少なくとも５種において、対象とＨＬＡが適合する。幾つかの実施形態では、臍帯血ユニットは、凍結保存前に６種のＨＬＡクラスＩ（ＨＬＡ−ＡとＨＬＡ−Ｂ、低解像度）座位及びＨＬＡクラスＩＩ（ＨＬＡ−ＤＲＢ１、高解像度）座位の内の少なくとも５種において、対象とＨＬＡが適合し、少なくとも１種のＨＬＡ−ＤＲＢ１適合を伴う。通常、クラスＩ  ＨＬＡ（又は主要組織適合性複合体（ＭＨＣ））抗原は、特定のＨＬＡの同種抗血清、細胞傷害性補体、及び死滅細胞を識別する色素を使用したマイクロ細胞毒性アッセイによって臍帯血細胞で確認される。ＨＬＡクラスＩＩは通常、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）によって確認され、混合リンパ球集団の培養後にリンパ球増殖を測定する。ＨＬＡ  ＤＲ抗原は、Ｂ細胞が富化されたマイクロ細胞毒性アッセイでＢ細胞抗血清によって特定することができる。抗血清の代わりに特定のモノクローナル抗体を用いることができる。
【００４９】
幾つかの実施形態では、エクスビボ増殖用に選択した臍帯血ユニットは、凍結保存前の総ＣＤ３４＋細胞数が少なくとも８×１０６個であり、凍結保存前の総有核細胞数が対象重量１キログラム当たり少なくとも１．５×１０７個である。
【００５０】
幾つかの実施形態では、エクスビボ増殖用に選択した臍帯血ユニットは、凍結保存前の総ＣＤ３４＋細胞数が少なくとも１０×１０６個であり、凍結保存前の総有核細胞数が対象重量１キログラム当たり少なくとも２．５×１０７個である。
【００５１】
エクスビボ増殖と対象への移植用の臍帯血ユニットの凍結保存前の選択基準の例を以下の表１〜４に示す。
【００５２】
【表１】
2020520237.tif 000002
【００５３】
【表２】
2020520237.tif 000003
【００５４】
【表３】
2020520237.tif 000004
【００５５】
【表４】
2020520237.tif 000005
【００５６】
本明細書で使用される「エクスビボ」という用語は、細胞を生体から取り出し、その生体の外部（例えば、試験管、細胞培養バッグ等）で増殖させるプロセスを意味する。
【００５７】
本明細書で使用される「インビトロ」という用語は、実験室で維持された細胞株（例えば、胚細胞株等）に由来する細胞を生体の外部で処置するプロセスを意味する。そのような細胞株は不死化細胞であることが多い。
【００５８】
本明細書で使用される「幹細胞」という語句は、組織又は体内での急速な細胞塊の生成の原因となる最初期の再生可能な細胞集団に関与する系列と、分化の程度がやや低く、特定の系列に関与しておらず、容易に長期の再生可能な細胞集団の一部に復帰することができる非常に初期の前駆細胞との両方を意味する。造血幹細胞は、赤血球や白血球、血小板等の血液の細胞成分を再生することができる幹細胞である。
【００５９】
本明細書で使用される「非幹」、「非前駆体」及び「関与細胞」という語句は、一般には再生可能な細胞集団の一部に復帰する能力を保持してしない、分化の様々な段階の細胞を意味する。幹細胞、前駆細胞、及び非幹、非前駆体関与細胞をエクスビボで培養する方法は、細胞培養の分野で周知である。この効果については、例えば、次の教科書「Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique」by Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), Third Edition（その教示が本明細書の一部を構成するものとして援用される）を参照されたい。
【００６０】
適切に凍結保存された臍帯血ユニットが一旦特定されれば、それを輸送して更なる処理（例えば、解凍及びエクスビボ増殖）をしてもよく、移植用の準備で更なる処理が必要になるまで、表示した上で冷凍状態で維持してもよい。従って、エクスビボ増殖と移植に適した凍結保存臍帯血ユニットの「バンク」及び対応するユニットのデータベースを確立することができ、適切な臍帯血ユニットへのより迅速なアクセスが可能となる。
【００６１】
幾つかの実施形態では、エクスビボ増殖用に選択した臍帯血ユニットは、凍結保存前の総有核細胞数が少なくとも１．８×１０９個であり、凍結保存前の総有核細胞数が対象重量１キログラム当たり少なくとも１．５×１０７個である。
【００６２】
幾つかの実施形態では、エクスビボ増殖用に選択した臍帯血ユニットは、凍結保存前の総有核細胞数が少なくとも２．５×１０９個であり、凍結保存前の総有核細胞数が対象重量１キログラム当たり少なくとも２．０×１０７個である。
【００６３】
エクスビボ増殖と移植に適した、選択した臍帯血ユニットの更なる処理には、次が含まれる。選択した凍結保存ユニットの解凍、解凍した臍帯血細胞の更なる選択や、ＣＤ１３３−／ＣＤ３４−臍帯血細胞画分からのＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血細胞画分の分離への適合性の確認。
【００６４】
従って、幾つかの実施形態によれば、エクスビボ増殖と対象への移植用の解凍臍帯血ユニットを選択するための方法であって、上記解凍臍帯血ユニット中の細胞の生存率を確認する工程と、生存率が約４０％〜約８５％のユニットを選択した後に上記臍帯血ユニットをＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋画分とＣＤ／１３３−／ＣＤ３４−画分とに分離することで、エクスビボ増殖と対象への移植に適した解凍した臍帯ユニットを選択することを含む方法が提供される。
【００６５】
幾つかの実施形態では、生存率が約４０％〜約７０％のユニットを選択する。幾つかの実施形態では、生存率が約４２％、約４６％、約４８％、約５０％、約５２％、約５４％、約５６％、約５８％、約６０％、約６２％、約６４％、約６６％、約６８％〜約７０％のユニットを選択する。
【００６６】
解凍臍帯血ユニットは通常、本明細書に記載の基準及び方法を用いた更なる処理に適する、選択された凍結保存臍帯血ユニットであることが理解されよう。
【００６７】
幾つかの実施形態によれば、選択した凍結臍帯血ユニットを臍帯血バンクの手順に従って製造所に移送する。臍帯血ユニットの同一性を確認した後、細胞選択及び増殖手順の開始までユニットを液体窒素中央保管施設で保存する。
【００６８】
製造所では、滅菌アルコールワイプを使用して臍帯血バッグを慎重に拭き、３７±１℃の水浴で解凍し、製造現場（例えば、クリーンルーム）に移送して更なる処理に備える。
【００６９】
幾つかの実施形態では、解凍した臍帯血ユニットを次のように細胞選択用に調製する。解凍した血液を１７５ｍｌの遠心管内に移す。凍結バッグを生理食塩水中の１０％ｗ／ｖデキストラン−４０と５％ｗ／ｖＨＳＡで洗浄した後、遠心管に添加する。２種の試料を取り出し、細胞懸濁液の細胞生存率と生存細胞濃度、及び解凍したＣＢＵのＣＤ３４＋、ＣＤ１３３＋含有量を確認する。遠心分離後、上清を除去し、０．４％ｗ／ｖクエン酸ナトリウムと１％ｖ／ｖＨＳＡを含むＰＢＳ緩衝液を添加して体積を１００ｍｌとする。ＩＶ  Ｉｇを添加し、室温で１０分間インキュベートした後、細胞懸濁液を遠心分離し、ペレット状の細胞を再懸濁させる。
【００７０】
幾つかの実施形態では、エクスビボ増殖用に選択した臍帯血ユニットは、凍結保存前に６種のＨＬＡクラスＩ（ＨＬＡ−ＡとＨＬＡ−Ｂ、低解像度）座位及びＨＬＡクラスＩＩ（ＨＬＡ−ＤＲＢ１、高解像度）座位の内の少なくとも４種において、対象とＨＬＡが適合しており、凍結保存前の総ＣＤ３４＋細胞数が少なくとも８×１０６個である。
【００７１】
幾つかの実施形態では、エクスビボ増殖用に選択した臍帯血ユニットは、凍結保存前に６種のＨＬＡクラスＩ（ＨＬＡ−ＡとＨＬＡ−Ｂ、低解像度）座位及びＨＬＡクラスＩＩ（ＨＬＡ−ＤＲＢ１、高解像度）座位の内の少なくとも４種において、対象とＨＬＡが適合しており、凍結保存前の総有核細胞数が対象重量１キログラム当たり少なくとも２．０×１０７個である。
【００７２】
本明細書で使用される「生存率」という用語は、生細胞と非生存細胞との区別を意味する。細胞生存率は、形態学的変化、又は特定の色素の排除や他の色素の取り込みと保持から推測される膜透過性及び／又は生理学的状態の変化によって判断することができる。細胞生存率アッセイは当技術分野では周知であり、その例としては、トリパンブルー又はヨウ化プロピジウム排除やローダミン代謝染色が挙げられるが、これらに限定されない（Coder, D., Current Protocols in Cytometry, 1997, John Wiley and Sons, Inc., Unit 9.2, 9.2.1-9.2.14）。
【００７３】
生存率の基準に従って除外した解凍臍帯血ユニットは廃棄され、移植可能な臍帯血ユニット処理の更なる段階に進めることはできない。生存率の基準を満たす解凍臍帯血ユニットは、解凍ユニット中のＣＤ１３３＋細胞の割合とＣＤ３４＋細胞の割合についてアッセイすることができ、そのデータを記録して後の参照用とする。
【００７４】
幾つかの実施形態では、エクスビボ増殖用に選択した臍帯血ユニットは、凍結保存前に６種のＨＬＡクラスＩ（ＨＬＡ−ＡとＨＬＡ−Ｂ、低解像度）座位及びＨＬＡクラスＩＩ（ＨＬＡ−ＤＲＢ１、高解像度）座位の内の少なくとも４種において対象とＨＬＡが適合しており、凍結保存前の総有核細胞数が対象重量１キログラム当たり少なくとも１．５×１０７個であり、凍結保存前の総ＣＤ３４＋細胞数が少なくとも８×１０６個である。
【００７５】
生存率によりエクスビボ増殖と移植用の更なる処理に適していると考えられる解凍臍帯血ユニットを、その後、幹細胞マーカーＣＤ１３３＋による選択によって２種の臍帯血画分に分離する。臍帯血ユニットのＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋細胞画分は、全ての血液細胞系列を増殖、分化及び再構成する可能性がある造血幹細胞と前駆細胞集団を示す一方、未選択ＣＤ１３３−／ＣＤ３４−「陰性」細胞画分は、Ｂ細胞、Ｔ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞等の成熟免疫細胞に富む画分を示す。
【００７６】
幾つかの実施形態では、エクスビボ増殖用に選択した臍帯血ユニットは、凍結保存前に６種のＨＬＡクラスＩ（ＨＬＡ−ＡとＨＬＡ−Ｂ、低解像度）座位及びＨＬＡクラスＩＩ（ＨＬＡ−ＤＲＢ１、高解像度）座位の内の少なくとも４種において対象とＨＬＡが適合しており、凍結保存前の総有核細胞数が少なくとも１．８×１０７個である。
【００７７】
幹細胞の同定と濃縮は、ＣＤ３４＋、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−、ＣＤ１３３＋、ＣＤ３４＋／Ｌｉｎ−等の幹細胞マーカーや当技術分野で既知の他の幹細胞マーカーを使用して行うことができる。解凍臍帯血細胞のＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋画分の同定と分離は、ＦＡＣＳ、免疫磁気分離又はＰＣＲ等の核酸方法を用いた選択によって行うことができ、また、Stem Cell Biology Daniel R. Marshak (Editor) Richard L. Gardner (Editor), Publisher: Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2001) and Hematopoietic Stem Cell Transplantation. Anthony D. Ho (Editor) Richard Champlin (Editor), Publisher: Marcel Dekker (2000) に記載の臍帯血及び成体幹細胞の単離又は濃縮方法等を用いて行うことができる。
【００７８】
特定の実施形態では、エクスビボ増殖と移植に適した、選択した解凍臍帯血ユニットは、抗ＣＤ１３３結合免疫磁気ビーズ（ＣｌｉｎｉＭａｃｓ）（ドイツ国、Ｍｉｌｅｎｔｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社）を使用してＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋（陽性）画分とＣＤ１３３−／ＣＤ３４−（陰性）画分に分離する。
【００７９】
特定の実施形態では、ＣＤ１３３＋画分の分離は次のように行う。１．２ｍｌのＭｉｌｔｅｎｙｉ  ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  ＣＤ１３３試薬を臍帯血細胞懸濁液に添加し、室温で５分間インキュベートする。緩衝液を添加し、懸濁液を室温にて４５０×ｇで１０分間遠心分離する。上清を除去し、細胞ペレットを０．４％ｗ／ｖクエン酸ナトリウムと１％ｖ／ｖＨＳＡを含むＰＢＳ緩衝液に再懸濁させ、細胞懸濁液を移送バッグに移す。ＣｌｉｎｉＭＡＣＳシステム（ドイツ国、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社）を製造業者の指示に従って組み立て、選択ＣＤ１３３＋細胞を「収集」移送バッグに収集する一方、未選択、非結合のＣＤ１３３−細胞を陰性画分バッグに収集する。「収集」バッグから細胞を１７５ｍｌの遠心管に無菌的に移す。選択細胞懸濁液を室温にて４５０×ｇで１０分間遠心分離し、上清を除去し、細胞を滅菌管に移して安全性試験に備える。細胞ペレットを再懸濁させ、正確な体積を測定して記録する。
【００８０】
細胞懸濁液の試料を取り出し、細胞生存率と生細胞濃度を測定する。生細胞の総数とカラムから得た細胞収量を計算する。精製したＣＤ１３３＋細胞とＣＤ３４＋細胞の割合を測定する。選択細胞集団内のＣＤ１３３＋細胞の割合を純度と定義する。
【００８１】
一旦分離すれば、ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋陽性画分をエクスビボで増殖させることができるが、先ず更なる処理への適合性についてスクリーニングする必要がある。従って、幾つかの実施形態では、エクスビボ増殖と対象への移植用の解凍臍帯血ユニットを選択するための方法は、
（ａ）選択した、エクスビボ増殖と上記対象への移植に適した解凍臍帯血ユニットを（ｉ）ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択細胞を含む第１の選択血液細胞画分と、（ｉｉ）ＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性細胞を含む第２の未選択血液細胞画分に分離する工程と、
（ｂ）ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋画分である上記第１の選択血液細胞画分において、次の分離後パラメータ：
（ｉ）総細胞数が約２０×１０５〜約７５×１０５個、
（ｉｉ）生存率が約７０％〜約８５％、
（ｉｉｉ）ＣＤ１３３＋細胞が約７０％〜約８５％、
（ｉｖ）ＣＤ３４＋細胞が約７０％〜約８５％、
（ｖ）ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択後収率が約０．０２〜約１％、
（ｖｉ）細胞１０００個当たりのＣＦＵが約１５〜約５０個、及び
（ｖｉｉ）内毒素が３Ｅｕ／ｍｌ未満
を確認する工程と、
（ｃ）上記パラメータに従って、ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋画分である上記第１の選択血液細胞画分を選択又は除外して、エクスビボ増殖と上記対象への移植に適したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分を選択する工程とを更に含む。
【００８２】
特定の実施形態では、エクスビボ増殖用に選択したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、分離後の総細胞数が約２０×１０５〜約７５×１０５個、約２５×１０５〜約６５×１０５個、約３０×１０５〜約６０×１０５個、約３６×１０５〜約５５×１０５個、約４０×１０５〜約５０×１０５個である。一実施形態では、エクスビボ増殖用に選択したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、分離後の総細胞数が少なくとも２０×１０６個、少なくとも３０×１０６個、少なくとも３５×１０６個、少なくとも４０×１０６個、少なくとも４５×１０６個、少なくとも５０×１０６個、少なくとも５５×１０６個、少なくとも６０×１０６個、少なくとも７０×１０６個である。更なる実施形態では、エクスビボ増殖用に選択したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、分離後の総細胞数が少なくとも２５×１０６個である。更なる実施形態では、エクスビボ増殖用に選択したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、分離後の総細胞数が少なくとも２０×１０６個である。更なる実施形態では、エクスビボ増殖用に選択したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、分離後の総細胞数が少なくとも４５×１０６個である。
【００８３】
幾つかの実施形態では、エクスビボ増殖用に選択した臍帯血ユニットは、凍結保存前に６種のＨＬＡクラスＩ（ＨＬＡ−ＡとＨＬＡ−Ｂ、低解像度）座位及びＨＬＡクラスＩＩ（ＨＬＡ−ＤＲＢ１、高解像度）座位の内の少なくとも４種において、対象とＨＬＡが適合しており、凍結保存前の総有核細胞数が少なくとも１．８×１０９個である。
【００８４】
幾つかの実施形態では、エクスビボ増殖用に選択した臍帯血ユニットは、凍結保存前に６種のＨＬＡクラスＩ（ＨＬＡ−ＡとＨＬＡ−Ｂ、低解像度）座位及びＨＬＡクラスＩＩ（ＨＬＡ−ＤＲＢ１、高解像度）座位の内の少なくとも４種において、対象とＨＬＡが適合しており、凍結保存前の総有核細胞数が少なくとも２．５×１０９個である。
【００８５】
幾つかの実施形態では、生存率が約７０％〜約８５％のＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分を選択する。幾つかの実施形態では、生存率が約７１％、約７３％、約７５％、約７８％、約８０％、約８２％、約８３％、約８４％〜約８５％のＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分を選択する。更なる実施形態では、エクスビボ増殖用に選択したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、生細胞が少なくとも７０％である。更なる実施形態では、エクスビボ増殖用に選択したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、生細胞が少なくとも７７％である。更なる実施形態では、エクスビボ増殖用に選択したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、生細胞が少なくとも８５％である。
【００８６】
分離した臍帯血画分のＣＤ１３３＋、ＣＤ３４＋及びＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋細胞含有量は、移植した増殖臍帯血細胞の生着を成功させるのに重要であるため、エクスビボ増殖へ進める上での主要な基準である。従って、特定の実施形態では、エクスビボ増殖用に選択したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、分離後の総ＣＤ１３３＋細胞数が約７０％〜約８５％、約７３％〜約８２％、約７５％〜８０％、約７６〜７９％である。一実施形態では、エクスビボ増殖用に選択したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、分離後の総ＣＤ１３３＋細胞数が少なくとも７０％、少なくとも７４％、少なくとも７８％、少なくとも８０％、少なくとも８３％又は少なくとも８５％である。更なる実施形態では、エクスビボ増殖用に選択したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、ＣＤ１３３＋細胞分離後の総ＣＤ１３３＋細胞数が少なくとも８０％である。更なる実施形態では、エクスビボ増殖用に選択したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、ＣＤ１３３＋細胞分離後の総ＣＤ１３３＋細胞数が少なくとも７０％である。更なる実施形態では、エクスビボ増殖用に選択したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、ＣＤ１３３＋細胞分離後の総ＣＤ１３３＋細胞数が少なくとも７５％である。
【００８７】
従って、特定の実施形態では、エクスビボ増殖用に選択したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、分離後の総ＣＤ１３３＋細胞数が約７０％〜約８５％、約７３％〜約８２％、約７５％〜８０％であり、総ＣＤ３４＋細胞数が約７６〜７９％である。一実施形態では、エクスビボ増殖用に選択したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、分離後の総ＣＤ３４＋細胞数が少なくとも７０％、少なくとも７４％、少なくとも７８％、少なくとも８０％、少なくとも８３％又は少なくとも８５％である。更なる実施形態では、エクスビボ増殖用に選択したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、ＣＤ１３３＋細胞分離後の総ＣＤ３４＋細胞数が少なくとも８２％である。更なる実施形態では、エクスビボ増殖用に選択したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、ＣＤ１３３＋細胞分離後の総ＣＤ３４＋細胞数が少なくとも７０％である。更なる実施形態では、エクスビボ増殖用に選択したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、ＣＤ１３３＋細胞分離後の総ＣＤ３４＋細胞数が少なくとも７８％である。
【００８８】
特定の実施形態では、エクスビボ増殖用に選択したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分の選択後収率は、ＣＤ１３３＋細胞分離後で約０．０２％〜約１．０％、約０．０５％〜約０．８％、約０．０８％〜約０．７％、約０．１％〜約０．５５％、約０．２５％〜約０．４５％及び約０．３〜０．４％である。一実施形態では、エクスビボ増殖用に選択したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分の選択後収率は、ＣＤ１３３＋細胞選択後で少なくとも０．０１％、少なくとも０．０５％、少なくとも０．１％、少なくとも０．３％、少なくとも０．５％、少なくとも０．６５％、少なくとも０．７５％、少なくとも０．９％又は少なくとも１．０％である。更なる実施形態では、エクスビボ増殖用に選択したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分の選択後収率は、分離後で少なくとも０．０２％である。更なる実施形態では、エクスビボ増殖用に選択したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分の選択後収率は、分離後で少なくとも０．３％である。更なる実施形態では、エクスビボ増殖用に選択したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分の選択後収率は、分離後で少なくとも０．５％である。更なる実施形態では、エクスビボ増殖用に選択したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分の選択後収率は、分離後で少なくとも０．８％である。
【００８９】
幾つかの実施形態では、エクスビボ増殖用に選択したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は分離後、細胞１０００個当たりのＣＦＵが約１５〜約７５個、細胞１０００個当たりのＣＦＵが約２０〜約６０個、細胞１０００個当たりのＣＦＵが約２５〜約５０個、細胞１０００個当たりのＣＦＵが約３０〜約４０個である。一実施形態では、エクスビボ増殖用に選択したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分はＣＤ１３３＋細胞選択後、細胞１０００個当たりのＣＦＵが少なくとも１５個、細胞１０００個当たりのＣＦＵが少なくとも２２個、細胞１０００個当たりのＣＦＵが少なくとも２５個、細胞１０００個当たりのＣＦＵが少なくとも３０個、細胞１０００個当たりのＣＦＵが少なくとも３６個、細胞１０００個当たりのＣＦＵが少なくとも４０個、細胞１０００個当たりのＣＦＵが少なくとも４５個、細胞１０００個当たりのＣＦＵが少なくとも５２個、細胞１０００個当たりのＣＦＵが少なくとも６０個、細胞１０００個当たりのＣＦＵが少なくとも６８個、又は細胞１０００個当たりのＣＦＵが少なくとも７５個である。更なる実施形態では、エクスビボ増殖用に選択したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分はＣＤ１３３＋細胞選択後、細胞１０００個当たりのＣＦＵが少なくとも１５個である。更なる実施形態では、エクスビボ増殖用に選択したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分はＣＤ１３３＋細胞選択後、細胞１０００個当たりのＣＦＵが少なくとも２５個である。更なる実施形態では、エクスビボ増殖用に選択したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分はＣＤ１３３＋細胞選択後、細胞１０００個当たりのＣＦＵが少なくとも４０個である。更なる実施形態では、エクスビボ増殖用に選択したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分はＣＤ１３３＋細胞選択後、細胞１０００個当たりのＣＦＵが少なくとも４５個である。
【００９０】
エクスビボ増殖と対象への移植に適した解凍臍帯血ユニットを選択するための基準の例を、以下の表５〜８に示す。
【００９１】
【表５】
2020520237.tif 000006
【００９２】
【表６】
2020520237.tif 000007
【００９３】
【表７】
2020520237.tif 000008
【００９４】
【表８】
2020520237.tif 000009
【００９５】
エクスビボ増殖と移植用の解凍ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血ユニットの無菌性と安全性は、特に、内毒素含有量と細菌、真菌、ウイルス及びマイコプラズマ汚染の存在をモニターすることによって保証する。幾つかの実施形態では、エクスビボ増殖用に選択したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、増殖（細胞培養）プロセス中の任意の時点で内毒素含有量が３Ｅｕ／ｍｌ以下である。幾つかの実施形態では、エクスビボ増殖用に選択したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、ＣＤ１３３＋選択後のいずれの試験日でも細菌、酵母、カビ及びマイコプラズマを含んでいない。幾つかの実施形態では、エクスビボ増殖の０日目と７日目に内毒素含有量をモニターする。幾つかの実施形態では、エクスビボ増殖の０日目、７日目及び１４日目に細菌、酵母、カビ及びマイコプラズマをモニターする。
【００９６】
幾つかの実施形態では、エクスビボ増殖用に選択したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、細胞１０００個当たりのＣＦＵが少なくとも１５個であり、選択後収率が少なくとも０．０２％である。他の実施形態では、エクスビボ増殖用に選択したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、細胞１０００個当たりのＣＦＵが少なくとも１５個であり、選択後収率が少なくとも０．０２％であり、ＣＤ１３３＋細胞分離後の総ＣＤ１３３＋細胞数が少なくとも７５％である。他の実施形態では、エクスビボ増殖用に選択したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、細胞１０００個当たりのＣＦＵが少なくとも３５個であり、選択後収率が少なくとも０．１％である。
【００９７】
他の実施形態では、エクスビボ増殖用に選択したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、細胞１０００個当たりのＣＦＵが少なくとも１５個であり、ＣＤ１３３＋細胞分離後の総ＣＤ１３３＋細胞数が少なくとも７０％である。
【００９８】
未選択陰性ＣＤ１３３−画分は免疫細胞（例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞等が挙げられるが、これらに限定されない）のレパートリーを含む。ＣＤ１３３＋細胞用の解凍臍帯血細胞を選択した後、未選択陰性ＣＤ１３３−画分を洗浄し、凍結保存溶液に懸濁させて凍結保存用に調製する。多くの凍結保存溶液が市販されている。幾つかの実施形態では、凍結保存溶液はＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０（ＢｉｏＬｉｆｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ）である。凍結保存の前に、未選択ＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性臍帯血細胞画分についても、生存率、ＣＤ３＋細胞（Ｔ細胞）含有量、ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋含有量及び無菌性等のパラメータをモニターする。従って、幾つかの実施形態では、本発明は、対象への移植用のＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性細胞を含む未選択臍帯血細胞画分を選択する方法であって、
（ａ）ＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性細胞を選択した後、上記未培養臍帯血画分で次のパラメータ：
（ｉ）総生細胞数が約４×１０８〜約１５×１０８個、
（ｉｉ）細胞生存率が約７０〜８５％、
（ｉｉｉ）ＣＤ３＋細胞数が約２．４×１０７〜約８×１０７個、
（ｉｖ）細菌、酵母又はカビの成長なし
を確認する工程と、
（ｂ）上記パラメータに従って上記未選択臍帯血細胞画分を選択又は除外して、対象への移植に適したＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性細胞を含む未選択臍帯血細胞画分を選択することを含む方法を提供する。
【００９９】
幾つかの実施形態では、エクスビボ増殖用に選択したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、分離後の総細胞数が少なくとも２０×１０６個であり、分離後の生細胞が少なくとも７０％である。
【０１００】
幾つかの実施形態では、エクスビボ増殖用に選択したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、分離後の総細胞数が少なくとも２０×１０６個であり、ＣＤ１３３＋細胞が少なくとも８０％である。
【０１０１】
他の実施形態では、エクスビボ増殖用に選択したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、細胞１０００個当たりのＣＦＵが少なくとも１５個であり、選択後収率が少なくとも０．０２％であり、ＣＤ１３３＋細胞分離後の総ＣＤ３４＋細胞数が少なくとも７０％である。
【０１０２】
幾つかの実施形態では、生存率が約７０％〜約８５％の未選択ＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性臍帯血画分を移植用に選択する。幾つかの実施形態では、生存率が約７１％、約７３％、約７５％、約７８％、約８０％、約８２％、約８３％、約８４％〜約８５％のＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性臍帯血画分を選択する。更なる実施形態では、移植用に選択したＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性臍帯血画分は生細胞が少なくとも７０％である。
【０１０３】
幾つかの実施形態では、エクスビボ増殖用に選択したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、分離後の総細胞数が少なくとも２０×１０６個であり、ＣＤ１３３＋細胞が少なくとも７０％である。
【０１０４】
幾つかの実施形態では、エクスビボ増殖用に選択したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、分離後の総細胞数が少なくとも２０×１０６個であり、ＣＤ３４＋細胞が少なくとも７０％である。
【０１０５】
他の実施形態では、エクスビボ増殖用に選択したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、細胞１０００個当たりのＣＦＵが少なくとも１５個であり、選択後収率が少なくとも０．０２％であり、ＣＤ１３３＋細胞分離後の総ＣＤ３４＋細胞数が少なくとも８５％である。
【０１０６】
他の実施形態では、エクスビボ増殖用に選択したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、細胞１０００個当たりのＣＦＵが少なくとも１５個であり、選択後収率が少なくとも０．０２％であり、ＣＤ１３３＋細胞分離後の総ＣＤ１３３＋細胞数が少なくとも７０％である。
【０１０７】
幾つかの実施形態では、エクスビボ増殖用に選択したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、生存率が少なくとも７０％であり、ＣＤ３４＋細胞が少なくとも７０％である。
【０１０８】
幾つかの実施形態では、総生細胞数が約４×１０８〜約１５×１０８個の未選択ＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性臍帯血画分を移植用に選択する。幾つかの実施形態では、移植用に選択したＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性画分中の総生細胞数は、約６×１０８〜約１３×１０８個、約７．５×１０８〜約１１×１０８個、又は約９×１０８〜約１０×１０８個である。幾つかの実施形態では、移植用に選択したＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性画分中の総生細胞数は、少なくとも４×１０８個、少なくとも６×１０８個、少なくとも７．５×１０８個、少なくとも９×１０８個、少なくとも１０×１０８個、少なくとも１２×１０８個、少なくとも１４×１０８個、又は少なくとも１５×１０８個である。特定の実施形態では、移植用に選択したＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性画分中の総生細胞数は少なくとも４×１０８個である。
【０１０９】
幾つかの実施形態では、エクスビボ増殖用に選択したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、生細胞が少なくとも７０％であり、ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋細胞の選択後収率が少なくとも０．０２％である。幾つかの実施形態では、エクスビボ増殖用に選択したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、ＣＤ３４＋細胞が少なくとも８０％であり、生細胞が８５％であり、ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋細胞の選択後収率が少なくとも０．１％である。幾つかの実施形態では、エクスビボ増殖用に選択したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、ＣＤ３４＋細胞が少なくとも７０％であり、生細胞が８０％であり、ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋細胞の選択後収率が少なくとも０．０２％である。
【０１１０】
幾つかの実施形態では、ＣＤ３＋細胞数が約２．４×１０７〜約８×１０７個の未選択ＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性臍帯血画分を移植用に選択する。幾つかの実施形態では、ＣＤ３＋細胞数が約２．４×１０７〜約８×１０７個、約３．５×１０７〜約７×１０７個、約４．３×１０７〜約６．２×１０７個、又は約４．８×１０７〜約５×１０７個の未選択ＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性臍帯血画分を移植用に選択する。他の実施形態では、ＣＤ３＋細胞数が少なくとも２．４×１０７個、少なくとも３．０×１０７個、少なくとも３．５×１０７個、少なくとも４．０×１０７個、少なくとも４．５×１０７個、少なくとも５×１０７個、少なくとも６×１０７個、少なくとも７×１０７個、又は少なくとも８×１０７個の未選択ＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性臍帯血画分を移植用に選択する。幾つかの実施形態では、移植用に選択する未選択ＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性臍帯血画分はＣＤ３＋細胞数が少なくとも３．０×１０７個である。幾つかの実施形態では、移植用に選択する未選択ＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性臍帯血画分はＣＤ３＋細胞数が少なくとも２．４×１０７個である。幾つかの実施形態では、移植用に選択する未選択ＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性臍帯血画分はＣＤ３＋細胞数が少なくとも５×１０７個である。
【０１１１】
他の実施形態では、ＣＤ３＋細胞数が少なくとも５×１０７個であり、総生細胞数が６×１０８個の未選択ＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性臍帯血画分を移植用に選択する。幾つかの実施形態では、ＣＤ３＋細胞数が少なくとも２．４×１０７個、総生細胞数が４×１０８個の未選択ＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性臍帯血画分を移植用に選択する。更に他の実施形態では、ＣＤ３＋細胞数が少なくとも６×１０７個、総生細胞数が４×１０８個の未選択ＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性臍帯血画分を移植用に選択する。
【０１１２】
幾つかの実施形態では、ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋細胞が約０．０１％〜約０．５％の未選択ＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性臍帯血画分を移植用に選択する。幾つかの実施形態では、ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋細胞が約０．０３％、約０．０５％、約０．０８％、約０．１％、約０．２５％、約３％、約４％又は約５％以下のＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性臍帯血画分を選択する。更なる実施形態では、移植用に選択するＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性臍帯血画分はＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋細胞が０．０１％以下である。更なる実施形態では、移植用に選択するＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性臍帯血画分はＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋細胞が０．０５％以下である。更なる実施形態では、移植用に選択するＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性臍帯血画分はＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋細胞が０．１％以下である。更なる実施形態では、移植用に選択するＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性臍帯血画分はＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋細胞が０．２５％以下である。更なる実施形態では、移植用に選択するＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性臍帯血画分はＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋細胞が０．５％以下である。
【０１１３】
幾つかの実施形態では、総生細胞数が少なくとも４×１０８個で生存率が８５％の未選択ＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性臍帯血画分を移植用に選択する。幾つかの実施形態では、生存率が少なくとも７０％でＣＤ３＋細胞数が２．４×１０７個の未選択ＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性臍帯血画分を移植用に選択する。
【０１１４】
移植に適した、選択した凍結保存ＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性臍帯血画分は、移植に必要となるまで保存し凍結を維持することができる。幾つかの実施形態では、移植に適した、選択したＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性臍帯血画分を液体窒素に保存する。
【０１１５】
幾つかの実施形態では、総生細胞数が少なくとも４×１０８個で生存率が７０％の未選択ＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性臍帯血画分を移植用に選択する。幾つかの実施形態では、生存率が少なくとも７０％でＣＤ３＋細胞数が２．４×１０７個の未選択ＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性臍帯血画分を移植用に選択する。幾つかの実施形態では、総生細胞数が少なくとも４×１０８個、ＣＤ３＋細胞数が少なくとも２．４×１０７個で生存率が７０％の未選択ＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性臍帯血画分を移植用に選択する。幾つかの実施形態では、総生細胞数が少なくとも６×１０８個、ＣＤ３＋細胞数が少なくとも２．７×１０７個で生存率が少なくとも７５％の未選択ＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性臍帯血画分を移植用に選択する。幾つかの実施形態では、総生細胞数が少なくとも４×１０８個で生存率が少なくとも８０％の未選択ＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性臍帯血画分を移植用に選択する。
【０１１６】
未選択ＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性臍帯血画分の分離と取扱いには、培養ユニットをモニターして安全性と汚染を確認することを含めることができる。従って、特定の実施形態によれば、内毒素が３．０Ｅｕ／ｍｌを超え、及び／又は細菌、酵母又はカビの成長が見られる臍帯血画分又はユニットを凍結保存から除外するか、或いは、調製プロセス中の任意の時点で検出された場合には、更なる処理を終了させ、汚染ユニットを廃棄する。
【０１１７】
ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択画分の培養（エクスビボ増殖）
上述のエクスビボ増殖用の臍帯血ユニットを選択するための方法のいずれか、及びそれらの実施形態の各々を単独又は様々な組み合わせで用いて、本節とそれに続く節で説明するように、ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択画分を培養（エクスビボ増殖）する方法を行うことができる。
【０１１８】
ニコチンアミド（ＮＡＭ）はビタミンＢの水溶性誘導体であり、その生理活性型はニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ）とニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨ）である。ＮＡＭの生理活性型は様々な重要な代謝反応の補酵素として機能する。ニコチンアミドはＣＤ３８の酵素活性を阻害し、それによってｃＡＤＰＲシグナル伝達経路に影響を及ぼすことが更に知られている。
【０１１９】
本発明の増殖と移植に適した、選択したＣＤ１３３＋ＣＤ３４＋画分をエクスビボで増殖させるための方法は、ニコチンアミド自体を細胞に提供するか、或いはニコチンアミド類似体、ニコチンアミド誘導体又はニコチンアミド類似体誘導体、又はニコチンアミド代謝物又はニコチンアミド類似体代謝物を細胞に提供して行うことができる。
【０１２０】
本明細書で使用される「ニコチンアミド類似体」という語句は、ニコチンアミドと同様に作用することが知られている任意の分子を意味する。ニコチンアミド類似体の代表例としては、ベンズアミド、ニコチンチオアミド（ニコチンアミドのチオール類似体）、ニコチン酸、及びα−アミノ−３−インドールプロピオン酸が挙げられるが、これらに限定されない。「ニコチンアミド誘導体又はニコチンアミド類似体誘導体」という語句は、ニコチンアミド自体又はニコチンアミド類似体の任意の構造誘導体を意味する。このような誘導体の例としては、置換ベンズアミド、置換ニコチンアミド及びニコチンチオアミド、及びＮ−置換ニコチンアミド及びニコチンチオアミドが挙げられるが、これらに限定されない。「ニコチンアミド代謝物又はニコチンアミド類似体代謝物」という語句は、ニコチンアミド又はその類似体に由来する生成物（例えば、ＮＡＤ、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨ等）を意味する。特定の実施形態では、増殖と移植に適した、選択したＣＤ１３３＋ＣＤ３４＋画分をエクスビボ増殖用のニコチンアミドと共に培養する。
【０１２１】
ニコチンアミド又はその類似体、誘導体又は代謝物の最終濃度は、特定の用途に応じてミリモル範囲であることが好ましい。例えば、約１ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲内、約２．５ｍＭ〜約８ｍＭの範囲内、又は約２．５ｍＭ〜約５ｍＭの範囲内である。
【０１２２】
本明細書に記載の本発明の好ましい実施形態における更なる特徴によれば、エクスビボ細胞増殖の条件は、細胞に血清、栄養素及びサイトカインを提供することを含む。
【０１２３】
サイトカインは初期作用性サイトカインとすることができる。幾つかの実施形態では、初期作用性サイトカインは、幹細胞因子、ＦＬＴ３リガンド、インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−６、インターロイキン−１０、インターロイキン−１２、腫瘍壊死因子−α及びトロンボポエチンを含む群から選択される。特定の実施形態では、サイトカインは、幹細胞因子、トロンボポエチン、ＦＬｔ３リガンド及びＩＬ-６の各々を含むサイトカインの組み合わせである。
【０１２４】
本発明の方法によれば、増殖と移植に適した、選択したＣＤ１３３＋ＣＤ３４＋臍帯血画分のエクスビボ増殖は、細胞増殖を可能な条件下において、ＣＤ１３３＋ＣＤ３４＋選択細胞を含む第１の選択血液細胞画分をエクスビボで培養することによって行い、上記条件は、栄養素、血清、並びに幹細胞因子、トロンボポエチン、ＦＬｔ３リガンド及びＩＬ６の各々を含むサイトカインの組み合わせを提供し、同じ培地で１．０〜１０．０ｍＭの量のニコチンアミドを提供することを含む。
【０１２５】
従って、本発明によれば、対象への移植用の臍帯血ユニットを調製するための方法であって、
（ａ）対象への移植に適した解凍後の単一の臍帯血ユニットを（ｉ）ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択細胞を含む第１の選択血液細胞画分と（ｉｉ）ＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性細胞を含む第２の未選択血液細胞画分に分離する工程と、
（ｂ）細胞増殖を可能な条件下において、ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択細胞を含む上記第１の血液細胞画分をエクスビボで培養することを含み、上記条件は、栄養素、血清、並びに幹細胞因子、トロンボポエチン、ＦＬｔ３リガンド及びＩＬ−６の各々を含むサイトカイン、並びに１．０ｍＭ〜１０ｍＭのニコチンアミドを供給する工程を含む方法が提供される。
【０１２６】
幾つかの実施形態では、対象への移植に適した単一臍帯血ユニットは、増殖と対象への移植用に凍結保存した臍帯血を選択するための本明細書に記載の方法に従って選択した、エクスビボ増殖と対象への移植に適した解凍臍帯血ユニットである。例えば、対象への移植に適した解凍単一臍帯血ユニットは、（ｉ）総ＣＤ３４＋細胞数が約８×１０６〜約１５×１０６個、（ｉｉ）６種のＨＬＡクラスＩ（ＨＬＡ−ＡとＨＬＡ−Ｂ、低解像度）座位及びＨＬＡクラスＩＩ（ＨＬＡ−ＤＲＢ１、高解像度）座位の内の少なくとも４種において、対象とＨＬＡが適合、（ｉｉｉ）凍結保存前の総有核細胞数が約１．８×１０９〜約３．０×１０９個、及び（ｉｖ）凍結保存前の総有核細胞数が対象重量１キログラム当たり約１．５×１０７〜約３．０×１０７個であることによって特徴付けることができる。
【０１２７】
幾つかの実施形態では、工程（ａ）の（ｉ）ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択細胞を含む第１の選択血液細胞画分は、エクスビボ増殖と対象への移植に適したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分を選択するための本明細書に記載の方法に従って選択した、エクスビボ増殖と上記対象への移植に適したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分である。例えば、エクスビボ増殖と対象への移植に適したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、（ｉ）総ＣＤ３４＋細胞数が約８×１０６〜約１５×１０６個、（ｉｉ）６種のＨＬＡクラスＩ（ＨＬＡ−ＡとＨＬＡ−Ｂ、低解像度）座位及びＨＬＡクラスＩＩ（ＨＬＡ−ＤＲＢ１、高解像度）座位の内の少なくとも４種において、対象とＨＬＡが適合、（ｉｉｉ）凍結保存前の総有核細胞数が約１．８×１０９〜約３．０×１０９個、及び（ｉｖ）凍結保存前の総有核細胞数が対象重量１キログラム当たり約１．５×１０７〜約３．０×１０７個であることによって特徴付けることができる。
【０１２８】
本発明の方法の更なる実施形態では、上記エクスビボ増殖の０日目、７日目又は１４日目に内毒素が３．０Ｅｕ／ｍｌを超える、及び／又は細菌、酵母又はカビの成長が見られる臍帯血画分又はユニットを、培養（エクスビボ増殖）から除外する。
【０１２９】
更なる実施形態では、エクスビボ増殖と対象への移植に適したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分を増殖させるための培地中の血清は、ＦＢＳを１０％含み、幹細胞因子、トロンボポエチン、ＦＬｔ３リガンド及びＩＬ−６を各々５０ｎｇ含む。特定の実施形態では、ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分を増殖させるための培地は、ニコチンアミドを２．５ｍＭ含む。更なる実施形態では、細胞増殖可能な条件下における細胞の培養は、栄養素と、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）と、幹細胞因子、トロンボポエチン、Ｆｌｔ３リガンド及びＩＬ−６を各々５０ｎｇ含むサイトカインと、２．５ｍＭのニコチンアミドとを供給することを含む。幾つかの実施形態では、ニコチンアミドを５．０ｍＭ供給する。
【０１３０】
幾つかの実施形態では、エクスビボ増殖と対象への移植に適したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、本明細書に記載の条件下で１８〜２５日間培養を行ってエクスビボ増殖用に培養する。特定の実施形態では、ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分を１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間又は２５日間培養する。幾つかの実施形態では、ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分をエクスビボ増殖用に２１日間培養する。
【０１３１】
本明細書に記載のように、エクスビボ増殖用のＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分の培養は、培養ユニットの安全性及び汚染についてのモニタリングを含むことができる。従って、特定の実施形態によれば、上記エクスビボ増殖の７日目又は１４日目に内毒素が３．０Ｅｕ／ｍｌを超える、及び／又は細菌、酵母又はカビの成長が見られる臍帯血画分又はユニットを培養（エクスビボ増殖）から除外する。或いは、培養プロセス中に検出された場合には、培養（増殖）を終了させ、汚染ユニットを廃棄する。
【０１３２】
移植用エクスビボ増殖臍帯血ユニットの選択
エクスビボ増殖に適した、ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋画分である第１の選択血液細胞画分の培養（エクスビボ増殖）の終了時に、エクスビボ培養した、ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋画分である第１の選択画分を保存用に回収することができる。
【０１３３】
上述のエクスビボ増殖用の臍帯血ユニットを選択するための方法、及び上述の臍帯血ユニットを増殖（エクスビボ培養）するための方法のいずれか、及びそれらの実施形態の各々を単独又は様々な組み合わせで用いて、本節とそれに続く節で説明するように、培養した（エクスビボ増殖した）ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択画分を選択する方法を実施することができる。
【０１３４】
エクスビボ増殖したＣＤ１３３＋ＣＤ３４＋臍帯血画分に対して、その保存前に、対象への移植用の増殖ＣＤ１３３＋ＣＤ３４＋臍帯血画分としての凍結保存への適合性について特徴付けを行う。従って、本発明によれば、対象への移植用のＣＤ１３３＋ＣＤ３４＋選択臍帯血細胞を含むエクスビボ培養臍帯血細胞画分を選択する方法であって、
（ａ）エクスビボ増殖後のエクスビボ培養臍帯血画分において次のパラメータ：
（ｉ）総生細胞数が約８×１０８〜約１５×１０８個、
（ｉｉ）細胞生存率が約７０％〜８５％、
（ｉｉｉ）ＣＤ３４＋細胞が約７〜１５％、
（ｉｖ）総ＣＤ３４＋細胞数が約５．６×１０７〜約５×１０８個、
（ｖ）総ＣＤ１３３＋細胞数が約２．４×１０７〜約２×１０８個、
（ｖｉ）ＣＤ１３３＋／ＣＤ３８−細胞数が約８×１０５〜約２５×１０５個、
（ｖｉｉ）総ＣＤ１４＋細胞数が約８×１０７〜約１５×１０９個、
（ｖｉｉｉ）総ＣＤ１５＋細胞数が約２×１０８〜約２×１０９個、
（ｉｘ）総ＣＤ１１ｂ＋細胞数が約８×１０７〜約８×１０９個、
（ｘ）総ＣＤ１（ａ＋ｃ）＋細胞数が約３．２×１０７〜約３×１０８個、
（ｘｉ）培養マイコプラズマ又は細菌、酵母又はカビの成長なし
を確認する工程と、
（ｂ）上記パラメータに従ってエクスビボ培養臍帯血画分を選択又は除外して、対象への移植に適したエクスビボ培養ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分を選択する工程とを含む方法が提供される。
【０１３５】
幾つかの実施形態では、総生細胞数が約８×１０８〜約１５×１０８個のエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分を選択する。幾つかの実施形態では、総生細胞数が約９×１０８〜約１３×１０８個、約１０×１０８〜約１２×１０８個、又は約１０．５×１０８〜約１１×１０８個のエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分を移植用に選択する。一実施形態では、移植用に選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、総生細胞数が少なくとも８×１０８個、少なくとも１０×１０８個、少なくとも１１×１０８個、少なくとも１２×１０８個、少なくとも１３×１０８個、少なくとも１４×１０８個、少なくとも１５×１０８個である。特定の実施形態では、移植用に選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、総生細胞数が少なくとも８×１０８個である。特定の実施形態では、移植用に選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、総生細胞数が少なくとも１１．５×１０８個である。特定の実施形態では、移植用に選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、総生細胞数が少なくとも１５×１０８個である。
【０１３６】
幾つかの実施形態では、生存率が約７０％〜約８５％のエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分を選択する。幾つかの実施形態では、生存率が約７１％、約７３％、約７５％、約７８％、約８０％、約８２％、約８３％、約８４％〜約８５％のエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分を移植用に選択する。幾つかの実施形態では、生存率が少なくとも７１％、少なくとも７３％、少なくとも７５％、少なくとも７８％、少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％又は少なくとも８５％のエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分を選択する。更なる実施形態では、移植用に選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、生細胞が少なくとも７０％である。更なる実施形態では、移植用に選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、生細胞が少なくとも７８％である。更なる実施形態では、移植用に選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、生細胞が少なくとも８３％である。
【０１３７】
エクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分のＣＤ１３３＋細胞含有量、ＣＤ３４＋及びＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋細胞含有量、ＣＤ１３３＋／ＣＤ３８−細胞含有量、ＣＤ１４＋細胞含有量、ＣＤ１５＋細胞含有量、ＣＤ１１ｂ＋細胞含有量及びＣＤ１（ａ及びｃ）＋細胞含有量は、移植した増殖臍帯血細胞の生着を成功させるのに重要であるため、エクスビボ増殖に先行する選択のための主要な基準である。
【０１３８】
従って、特定の実施形態では、移植用に選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、増殖後（培養後）のＣＤ３４＋細胞の総量が少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％又は少なくとも１５％である。更なる実施形態では、移植用に選択したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、増殖後（培養後）のＣＤ３４＋細胞の総量が少なくとも７％である。更なる実施形態では、移植用に選択したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、増殖後（培養後）のＣＤ３４＋細胞の総量が少なくとも７．８％である。更なる実施形態では、移植用に選択したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、増殖後（培養後）のＣＤ３４＋細胞の総量が少なくとも９％である。更なる実施形態では、移植用に選択したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、増殖後（培養後）のＣＤ３４＋細胞の総量が少なくとも１３％である。
【０１３９】
従って、特定の実施形態では、移植用に選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、増殖後（培養後）の総ＣＤ３４＋細胞数が約５．６×１０７〜約５×１０８個である。幾つかの実施形態では、移植用に選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、増殖後（培養後）の総ＣＤ３４＋細胞数が約６×１０７〜約４×１０８個、約９×１０７〜約３×１０８個、約１×１０８〜約２．５×１０８個、約１．５×１０８〜約２×１０８個である。幾つかの実施形態では、移植用に選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、増殖後（培養後）の総ＣＤ３４＋細胞数が少なくとも５．６×１０７個、少なくとも６×１０７個、少なくとも８×１０７個、少なくとも９×１０７個、少なくとも１×１０８個、少なくとも２×１０８個、少なくとも３×１０８個、少なくとも４×１０８個、又は少なくとも５×１０８個である。幾つかの実施形態では、移植用に選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、増殖後（培養後）の総ＣＤ３４＋細胞数が少なくとも２×１０８個である。幾つかの実施形態では、移植用に選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、増殖後（培養後）の総ＣＤ３４＋細胞数が少なくとも８×１０７個である。幾つかの実施形態では、移植用に選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、増殖後（培養後）の総ＣＤ３４＋細胞数が少なくとも５．６×１０７個である。
【０１４０】
特定の実施形態では、移植用に選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、増殖後（培養後）の総ＣＤ１３３＋細胞数が約２．４×１０７〜約２×１０８個である。幾つかの実施形態では、移植用に選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、増殖後（培養後）の総ＣＤ１３３＋細胞数が約３×１０７〜約１×１０８個、約５×１０７〜約８×１０７個、約６×１０７〜約７×１０７個である。幾つかの実施形態では、移植用に選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、増殖後（培養後）の総ＣＤ１３３＋細胞数が少なくとも２．４×１０７個、少なくとも３．５×１０７個、少なくとも５×１０７個、少なくとも７×１０７個、少なくとも８×１０７個、少なくとも１×１０８個、少なくとも１．５×１０８個、又は少なくとも２×１０８個である。幾つかの実施形態では、移植用に選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、増殖後（培養後）の総ＣＤ１３３＋細胞数が少なくとも２．４×１０７個である。幾つかの実施形態では、移植用に選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、増殖後（培養後）の総ＣＤ１３３＋細胞数が少なくとも４×１０７個である。幾つかの実施形態では、移植用に選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、増殖後（培養後）の総ＣＤ１３３＋細胞数が少なくとも７．５×１０７個である。幾つかの実施形態では、移植用に選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、増殖後（培養後）の総ＣＤ１３３＋細胞数が少なくとも１．２×１０８個である。
【０１４１】
更なる実施形態では、移植用に選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、増殖後（培養後）の総ＣＤ１３３＋／ＣＤ３８−細胞数が約８×１０５〜約２５×１０５個である。幾つかの実施形態では、移植用に選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、増殖後（培養後）の総ＣＤ１３３＋／ＣＤ３８−細胞数が約１０×１０５〜約２２×１０５個、約１３×１０５〜約２０×１０５個、又は約１５×１０５〜約１７×１０５個である。幾つかの実施形態では、移植用に選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、増殖後（培養後）の総ＣＤ１３３＋／ＣＤ３８−細胞数が少なくとも８×１０５個、少なくとも１０×１０５個、少なくとも１１．５×１０５個、少なくとも１３×１０５個、少なくとも１５×１０５個、少なくとも１８×１０５個、少なくとも２０．０×１０５個、少なくとも２２×１０５個、又は少なくとも２５×１０５個である。幾つかの実施形態では、移植用に選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、増殖後（培養後）の総ＣＤ１３３＋／ＣＤ３８−細胞数が少なくとも１３×１０５個である。幾つかの実施形態では、移植用に選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、増殖後（培養後）の総ＣＤ１３３＋／ＣＤ３８−細胞数が少なくとも８×１０５個である。幾つかの実施形態では、移植用に選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、増殖後（培養後）の総ＣＤ１３３＋／ＣＤ３８−細胞数が少なくとも１０×１０５個である。
【０１４２】
更なる実施形態では、移植用に選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、増殖後（培養後）の総ＣＤ１４＋細胞数が約８×１０７〜約１５×１０８個である。幾つかの実施形態では、移植用に選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、増殖後（培養後）の総ＣＤ１４＋細胞数が約１０×１０７〜約１０×１０８個、約１２×１０７〜約８×１０８個、約１５×１０７〜約６×１０８個、約２×１０８〜約５×１０８個、又は約３×１０８〜約４×１０８個である。幾つかの実施形態では、移植用に選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、増殖後（培養後）の総ＣＤ１４＋細胞数が少なくとも８×１０７個、少なくとも１０×１０７個、少なくとも２×１０８個、少なくとも４×１０８個、少なくとも６×１０８個、少なくとも８×１０８個、少なくとも１０．０×１０８個、少なくとも１２×１０８個、又は少なくとも１５×１０８個である。幾つかの実施形態では、移植用に選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、増殖後（培養後）の総ＣＤ１４＋細胞数が少なくとも８×１０７個である。幾つかの実施形態では、移植用に選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４臍帯血画分は、増殖後（培養後）の総ＣＤ１４＋細胞数が少なくとも２×１０８個である。幾つかの実施形態では、移植用に選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４臍帯血画分は、増殖後（培養後）の総ＣＤ１４＋細胞数が少なくとも７．５×１０８個である。
【０１４３】
更なる実施形態では、移植用に選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、増殖後（培養後）の総ＣＤ１５＋細胞数が約２×１０８〜約２×１０９個である。幾つかの実施形態では、移植用に選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、増殖後（培養後）の総ＣＤ１５＋細胞数が約２．５×１０８〜約１．５×１０９個、約４×１０８〜約０．５×１０９個、約６×１０８〜約９×１０８個、又は約７×１０８〜約８×１０８個である。幾つかの実施形態では、移植用に選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、増殖後（培養後）の総ＣＤ１５＋細胞数が少なくとも２×１０８個、少なくとも４×１０８個、少なくとも６×１０８個、少なくとも８×１０８個、少なくとも１×１０９個、又は少なくとも２×１０９個である。幾つかの実施形態では、移植用に選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、増殖後（培養後）の総ＣＤ１５＋細胞数が少なくとも２×１０８個である。幾つかの実施形態では、移植用に選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４臍帯血画分は、増殖後（培養後）の総ＣＤ１５＋細胞数が少なくとも６×１０８個である。幾つかの実施形態では、移植用に選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４臍帯血画分は、増殖後（培養後）の総ＣＤ１５＋細胞数が少なくとも８．５×１０８個である。幾つかの実施形態では、移植用に選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４臍帯血画分は、増殖後（培養後）の総ＣＤ１５＋細胞数が少なくとも１．１×１０９個である。
【０１４４】
更なる実施形態では、移植用に選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、増殖後（培養後）の総ＣＤ１１ｂ＋細胞数が約８×１０７〜約８×１０９個である。幾つかの実施形態では、移植用に選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、増殖後（培養後）の総ＣＤ１１ｂ＋細胞数が約１×１０８〜約５×１０９個、約４×１０８〜約２×１０９個、約６×１０８〜約１×１０９個、又は約８×１０８〜約９×１０８個である。幾つかの実施形態では、移植用に選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、増殖後（培養後）の総ＣＤ１１ｂ＋細胞数が少なくとも８×１０７個、少なくとも１×１０８個、少なくとも４×１０８個、少なくとも６×１０８個、少なくとも８×１０８個、少なくとも１×１０９個、少なくとも２×１０９個、少なくとも４×１０９個、少なくとも６×１０９個、又は少なくとも８×１０９個である。幾つかの実施形態では、移植用に選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４臍帯血画分は、増殖後（培養後）の総ＣＤ１１ｂ＋細胞数が少なくとも８×１０７個である。幾つかの実施形態では、移植用に選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４臍帯血画分は、増殖後（培養後）の総ＣＤ１１ｂ＋細胞数が少なくとも１０×１０７個である。幾つかの実施形態では、移植用に選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４臍帯血画分は、増殖後（培養後）の総ＣＤ１１ｂ＋細胞数が少なくとも２×１０８個である。幾つかの実施形態では、移植用に選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４臍帯血画分は、増殖後（培養後）の総ＣＤ１１ｂ＋細胞数が少なくとも５×１０８個である。幾つかの実施形態では、移植用に選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４臍帯血画分は、増殖後（培養後）の総ＣＤ１１ｂ＋細胞数が少なくとも３×１０９個である。
【０１４５】
幾つかの実施形態では、移植用に選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、増殖後（培養後）の総ＣＤ１（ａ及びｃ）＋細胞数が約３．２×１０７〜約３×１０８個である。幾つかの実施形態では、移植用に選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、増殖後（培養後）の総ＣＤ１（ａ及びｃ）＋細胞数が約４×１０７〜約１×１０８個、約６×１０７〜約９×１０７個、又は約７×１０７〜約８×１０７個である。幾つかの実施形態では、移植用に選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、増殖後（培養後）の総ＣＤ１（ａ及びｃ）＋細胞数が少なくとも３．２×１０７個、少なくとも４×１０７個、少なくとも６×１０７個、少なくとも８×１０７個、少なくとも１×１０８個、又は少なくとも３×１０８個である。幾つかの実施形態では、移植用に選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、増殖後（培養後）の総ＣＤ１（ａ及びｃ）＋細胞数が少なくとも３．２×１０７個である。幾つかの実施形態では、移植用に選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、増殖後（培養後）の総ＣＤ１（ａ及びｃ）＋細胞数が少なくとも５×１０７個である。幾つかの実施形態では、移植用に選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、増殖後（培養後）の総ＣＤ１（ａ及びｃ）＋細胞数が少なくとも７．３×１０７個である。幾つかの実施形態では、移植用に選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、増殖後（培養後）の総ＣＤ１（ａ及びｃ）＋細胞数が少なくとも２．２×１０８個である。
【０１４６】
対象へのエクスビボ移植用臍帯血ユニットの増殖後選択基準の例を以下の表９〜１２に示す。
【０１４７】
【表９】
2020520237.tif 000010
【０１４８】
【表１０】
2020520237.tif 000011
【０１４９】
【表１１】
2020520237.tif 000012
【０１５０】
【表１２】
2020520237.tif 000013
【０１５１】
上述のように、安全性と汚染に関するパラメータをモニターして、マイコプラズマ又は細菌、酵母又はカビの成長が見られるエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分を、確実に移植用には選択しないようにする。従って、幾つかの実施形態では、移植用に選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は、増殖開始後、７日目、１４日目及び増殖終了時には細菌、酵母、カビ及びマイコプラズマを含んでいない。
【０１５２】
幾つかの実施形態では、移植に適するものとして選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋細胞は、総生細胞数が少なくとも８×１０８個であり、総ＣＤ３４＋細胞数が少なくとも５．６×１０７個であり、総ＣＤ１３３＋細胞数が少なくとも２．４×１０７個であり、総ＣＤ１４＋細胞数が少なくとも８×１０７個であり、総ＣＤ１（ａ及びｃ）＋細胞数が少なくとも３．２×１０７個である。更なる実施形態では、移植に適した、選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋細胞は、総生細胞数が少なくとも１０×１０８個であり、ＣＤ３４＋細胞が少なくとも９％であり、総ＣＤ３４＋細胞数が少なくとも５．６×１０７個であり、総ＣＤ１３３＋細胞数が少なくとも４×１０７個であり、総ＣＤ１５＋細胞数が少なくとも２×１０８個であり、総ＣＤ１１ｂ＋細胞数が少なくとも１０×１０７個であり、総ＣＤ１（ａ及びｃ）＋細胞数が少なくとも５×１０７個である。
【０１５３】
他の実施形態では、移植に適した、選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋細胞は、総生細胞数が少なくとも８×１０８個であり、細胞生存率が少なくとも７０％であり、ＣＤ３４＋細胞が少なくとも７％であり、ＣＤ１３３＋／ＣＤ３８−細胞数が少なくとも８×１０５個であり、総ＣＤ１５＋細胞数が少なくとも２×１０８個であり、総ＣＤ１１ｂ＋細胞数が少なくとも８×１０７個である。
【０１５４】
更なる実施形態では、エクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分の外観をモニターする。増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋細胞画分の観察は画分の色と質感を対象とする。幾つかの実施形態では、黄色がかっていて、混濁〜不透明な色を呈し、白い凝集塊や異物粒子を含まないエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋細胞画分を選択する。
【０１５５】
幾つかの実施形態では、移植に適した、選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋細胞を洗浄し、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０（ＢｉｏＬｉｆｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．）等の凍結保存溶液に懸濁させる。増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋画分細胞懸濁液を凍結保存バッグ（ＣｒｙｏＭＡＣＳ凍結バッグ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に移し、標識し、制御速度冷凍庫を使用して凍結させる。保存は液体窒素（ＬＮ）中で行う。
【０１５６】
幾つかの実施形態では、第１のエクスビボ培養ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択臍帯血画分と第２の未選択ＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性臍帯血画分を液体窒素中で別々に凍結保存する。
【０１５７】
増殖エクスビボ培養ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択臍帯血画分と未選択ＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性臍帯血画分の対象への移植
移植に適するものとして選択した増殖選択ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分と未選択ＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性画分は、それを必要とする対象への移植に使用することができる。上述のエクスビボ増殖用の臍帯血ユニットを選択する方法、上述の臍帯血ユニットを増殖（エクスビボ培養）する方法、及び／又はエクスビボ増殖後に移植する方法、及び／又は臍帯血画分を凍結保存する方法のいずれか、及びそれらの実施形態の各々を単独又は様々な組み合わせで用いて、本節とそれに続く節で説明するように、培養した（エクスビボ増殖した）ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択画分と未選択ＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性画分を選択する方法を実施することができる。本明細書に開示の選択パラメータの少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種以上に従って、又はそのパラメータの全てに従って、エクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分及び未培養のＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性臍帯血細胞画分を選択又は除外できることは理解されよう。
【０１５８】
幾つかの実施形態では、移植を必要とする対象は血液疾患に罹患している。幾つかの実施形態では、対象は血液系腫瘍に罹患している。
【０１５９】
本発明の方法、組成物、キット及び製品を用いて他の適応症（例えば、慢性骨髄性白血病、他の骨髄増殖性疾患、多発性骨髄腫、再生不良性貧血、純粋な赤血球無形成、発作性夜間血色素尿症、ファンコニ貧血、重症型サラセミア、鎌状赤血球貧血、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、ウィスコット・アルドリッチ症候群、血球貪食性リンパ組織球症、先天性代謝異常、表皮水疱症、重症先天性好中球減少症、シュワックマン・ダイアモンド症候群、ダイアモンド・ブラックファン貧血、白血球粘着不全症、自己免疫疾患及び代謝疾患が挙げられるが、これらに限定されない）の症状を治療又は改善できることは理解されよう。
【０１６０】
幾つかの実施形態では、移植に適した、選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋細胞は、総生細胞数が少なくとも８×１０８個であり、総ＣＤ１３３＋細胞数が少なくとも２．４×１０７個であり、総ＣＤ１５＋細胞数が少なくとも２×１０８個であり、総ＣＤ１（ａ及びｃ）＋細胞数が少なくとも３．２×１０７個である。
【０１６１】
更なる実施形態では、移植に適した、選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋細胞は、総生細胞数が少なくとも８×１０８個であり、細胞生存率が少なくとも８３％であり、総ＣＤ１４＋細胞数が少なくとも２×１０８個であり、総ＣＤ１１ｂ＋細胞数が少なくとも１×１０８個であり、総ＣＤ１（ａ及びｃ）＋細胞数が少なくとも６×１０７個である。
【０１６２】
更なる実施形態では、移植に適した、選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋細胞は、総生細胞数が少なくとも８×１０８個であり、細胞生存率が少なくとも８３％であり、総ＣＤ１４＋細胞数が少なくとも２×１０８個であり、総ＣＤ１１ｂ＋細胞数が少なくとも１×１０８個であり、総ＣＤ１（ａ及びｃ）＋細胞数が少なくとも６×１０７個である。
【０１６３】
幾つかの実施形態では、移植に適した、選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋細胞は、生存率が少なくとも７０％であり、総ＣＤ１３３＋／ＣＤ３８−細胞数が少なくとも８×１０５個であり、総ＣＤ１１ｂ＋細胞数が少なくとも８×１０７個である。
【０１６４】
幾つかの実施形態では、移植に適した、選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋細胞は、総生細胞数が少なくとも８×１０８個であり、生存率が少なくとも７０％であり、総ＣＤ１３３＋／ＣＤ３８−細胞数が少なくとも８×１０５個であり、総ＣＤ１１ｂ＋細胞数が少なくとも８×１０７個である。
【０１６５】
更なる実施形態では、移植に適した、選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋細胞は、総ＣＤ３４＋割合が少なくとも７％であり、総ＣＤ１４＋細胞数が少なくとも８×１０７個であり、総ＣＤ１１ｂ＋細胞数が少なくとも８×１０７個である。
【０１６６】
対象
本明細書で使用される「対象」又は「患者」は、任意の哺乳動物、例えば、ヒト、霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラクダとすることができる。特定の実施形態では、対象はヒトである。
【０１６７】
本明細書で使用される「それを必要とする対象」とは、疾患、障害又は病態を治療又は改善するために本発明の臍帯血画分の輸血、輸注又は移植を必要とする対象である。一実施形態では、対象は血液疾患を有する（と診断されている）か、又は血液疾患に罹患している。幾つかの実施形態では、血液疾患は細胞増殖性障害である。他の実施形態では、血液疾患は血液系腫瘍である。
【０１６８】
本明細書で使用される「〜のリスク」又は「〜の確率」という用語は発生の可能性を意味する。幾つかの実施形態では、個体における発生（例えば、臍帯血移植片の生着又は非生着、非再発死亡率等）のリスク又は確率は、治療を受けた群と同じ治療を受けていない群との比較データから計算されたリスクを意味する。幾つかの実施形態では、リスク又は確率の上昇や低下は、検討中の結果に関する治療群と対照群との差を反映する。幾つかの実施形態では、特定の出来事又は状態のリスク又は確率の上昇や低下は相対的なものに過ぎず、数値では表されない。
【０１６９】
本明細書で使用される「細胞増殖性障害」という用語は、細胞の非制御又は異常な成長又はその両方が（癌性であるかないかに関わらず）望ましくない病態又は疾患の発症につながる可能性がある状態を意味する。本発明の細胞増殖性障害の例としては、細胞分裂が調節解除される様々な病態が挙げられる。細胞増殖性障害の例としては、腫瘍、良性腫瘍、悪性腫瘍、前癌状態、原位置腫瘍、被包性腫瘍、転移性腫瘍、液性腫瘍、固形腫瘍、免疫腫瘍、血液腫瘍、癌、癌腫、白血病、リンパ腫、肉腫及び急速分裂細胞が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用される「急速分裂細胞」という用語は、同じ組織内の隣接又は並置する細胞間で予測又は観察される速度を超えた速度で分裂する任意の細胞と定義される。細胞増殖性障害には前癌又は前癌状態が含まれる。細胞増殖性障害には癌が含まれる。特定の実施形態では、本明細書で提供される方法を用いて癌の症状を治療又は軽減する。「癌」という用語は固形腫瘍を包含すると共に、血液腫瘍及び／又は悪性腫瘍を包含する。好ましい実施形態では、対象は血液系腫瘍を有する（診断されている）か又は血液系腫瘍に罹患している。血液系腫瘍は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、非ホジキンリンパ腫又はホジキン病から成る群から選択することができる。
【０１７０】
更なる実施形態では、移植に適した、選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋細胞は、総生細胞数が少なくとも８×１０８個であり、細胞生存率が少なくとも７５％であり、ＣＤ３４＋細胞が少なくとも７％であり、総ＣＤ３４＋細胞数が少なくとも８．１×１０７個であり、総ＣＤ１３３＋細胞数が少なくとも６×１０７個であり、総ＣＤ１５＋細胞数が少なくとも３×１０８個であり、総ＣＤ１１ｂ＋細胞数が少なくとも８．７×１０７個であり、総ＣＤ１（ａ及びｃ）＋細胞数が少なくとも５×１０７個である。
【０１７１】
幾つかの実施形態では、移植に適した、選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋細胞は、総生細胞数が少なくとも８×１０８個であり、ＣＤ３４＋細胞が少なくとも７％であり、ＣＤ１３３＋／ＣＤ３８−細胞数が少なくとも８×１０５個であり、総ＣＤ１５＋細胞数が少なくとも２×１０８個であり、総ＣＤ１１ｂ＋細胞数が少なくとも８×１０７個である。
【０１７２】
幾つかの実施形態では、本発明の方法と組成物とキットは全年齢層の対象の治療に用いることができる。特定の実施形態では、対象又は患者は１６〜６０歳の間である。
【０１７３】
幾つかの実施形態では、移植に適した、選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋細胞は、総生細胞数が少なくとも８×１０８個であり、総ＣＤ１３３＋細胞数が少なくとも２．４×１０７個であり、総ＣＤ３４＋細胞数が少なくとも５．６×１０７個である。
【０１７４】
更なる実施形態では、移植に適した、選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋細胞は、総生細胞数が少なくとも１０×１０８個であり、細胞生存率が少なくとも８３％であり、総ＣＤ１（ａ及びｃ）＋細胞数が少なくとも７×１０７個である。
【０１７５】
幾つかの実施形態では、移植に適した、選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋細胞は、ＣＤ３４＋細胞割合が少なくとも７％であり、総ＣＤ１３３＋／ＣＤ３８−細胞数が少なくとも８×１０５個であり、総ＣＤ１４＋細胞数が少なくとも８×１０７個である。
【０１７６】
幾つかの実施形態では、それを必要とする対象は、次のいずれかのステージの急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）を有する可能性がある。（ａ）ｔ（４；１１）、ｔ（９；２２）、ｔ（１；１９）又はＭＬＬ再編成ｔ（１１ｑ２３）の存在；極端な白血球増加症（ＷＢＣがＢ−ＡＬＬでは３０，０００／μｌ超、Ｔ−ＡＬＬでは１００，０００／μｌ超）；最初の導入療法後に完全な形態学的寛解が達成不可能；フローサイトメトリーによるスクリーニング時の最小残存病変（ＭＲＤ）の内の１種以上で定義される高リスクの最初の完全な形態学的寛解（ＣＲ１）、又は（ｂ）２回目以降の寛解。
【０１７７】
それを必要とする対象は、次のいずれかのステージの急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を有する可能性がある。（ａ）スクリーニング時のＭＲＤの欠如とｃＫＩＴ変異のないｔ（８，２１）；ｃＫＩＴ変異のないｉｎｖ（１６）又はｔ（１６；６）、ＮＰＭ１の変異を伴い、ＦＬＴ−３内部縦列重複のない正常な核型；二重変異ＣＥＢＰＡを伴う正常な核型；圧密終了時の１回目又は２回目の分子寛解におけるＡＰＬの内の１種以上によって定義される好ましいリスクとは見なされない最初の完全な形態学的寛解（ＣＲ１）、又は（ｂ）２回目以降の寛解。
【０１７８】
幾つかの実施形態では、移植に適した、選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋細胞は、総生細胞数が少なくとも８×１０８個であり、細胞生存率が少なくとも７０％であり、総ＣＤ１４＋細胞数が少なくとも８×１０７個であり、総ＣＤ１（ａ及びｃ）＋細胞数が少なくとも３．２×１０７個である。
【０１７９】
更なる実施形態では、移植に適した、選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋細胞は、総ＣＤ３４＋割合が少なくとも７％であり、総ＣＤ１４＋細胞数が少なくとも８×１０７個であり、総ＣＤ１１ｂ＋細胞数が少なくとも８×１０７個である。
【０１８０】
更なる実施形態では、移植に適した、選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋細胞は、総生細胞数が少なくとも８×１０８個であり、細胞生存率が少なくとも８３％であり、総ＣＤ１４＋細胞数が少なくとも２×１０８個であり、総ＣＤ１１ｂ＋細胞数が少なくとも１×１０８個であり、総ＣＤ１（ａ及びｃ）＋細胞数が少なくとも６×１０７個である。
【０１８１】
それを必要とする対象は、次のいずれかのステージの慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を有する可能性がある。（ａ）次の特徴：ニロチニブ又はダサチニブのいずれかに対する血液学的又は細胞原性応答の達成不可能（欧州白血病ネットのタイムラインに従う）；２種のチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）の不耐性／障害及びＴ３１５Ｉ変異の１種以上を伴う慢性期、（ｂ）次の特徴：欧州白血病ネットのタイムラインで概説されているように、ＴＫＩに対して最適な応答を達成していない新たに診断された患者；慢性期から進行しているＴＫＩ患者の１種以上を伴う加速期、又は（ｃ）現在の完全な形態学的寛解以前の急性転化（骨髄系及びリンパ系）。
【０１８２】
それを必要とする対象は、国際予後スコアリングシステム（ＩＰＳＳ）リスクカテゴリーがＩＮＴ−１以上の骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）を有する可能性がある。形態学的解析のスクリーニングでは、患者は循環骨髄芽球を有しておらず、骨髄中の骨髄芽球が１０％以下である。一次症状でＩＮＴ−１に分類されるＭＤＳ患者は、生命を脅かす好中球減少症（ＡＮＣ＜０．５×１０９個／Ｌ）又は血小板減少症（血小板＜３０×１０９個／Ｌ）を有している。
【０１８３】
それを必要とする対象は、非ホジキンリンパ腫又は次の特徴の少なくとも１種を伴うホジキン病を有する可能性がある。（ａ）先行化学療法に対して進行又は非反応性であり、その後の治療に対して部分寛解（以前の化学療法から５０％以上の疾患の抑制として定義される部分寛解）又は（ｂ）２回目以降の完全又は部分寛解（以前の化学療法から５０％以上の疾患の抑制として定義される部分寛解）及び自己幹細胞移植に関して適切ではない候補。
【０１８４】
幾つかの実施形態では、移植に適した、選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋細胞は、細胞生存率が少なくとも７０％であり、ＣＤ３４＋細胞が少なくとも７％であり、総ＣＤ１３３＋細胞数が少なくとも２．４×１０７個であり、総ＣＤ１４＋細胞数が少なくとも８×１０７個であり、総ＣＤ１（ａ及びｃ）＋細胞数が少なくとも３．２×１０７個である。幾つかの実施形態では、移植に適した、選択したエクスビボ増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋細胞は、総生細胞数が少なくとも８×１０８個であり、総ＣＤ１５＋細胞数が少なくとも２×１０８個であり、総ＣＤ１１ｂ＋細胞数が少なくとも８×１０７個である。
【０１８５】
幾つかの実施形態では、それを必要とする対象は、次の基準に従って定義することができる。カルノフスキーによるパフォーマンススコアが少なくとも７０％と十分な生理学的予備力（ａ．心臓：心エコー、放射性核種スキャン又は心臓ＭＲＩによる左室駆出率（ＬＶＥＦ）が４０％以上、ｂ．肺機能検査でＦＶＣとＦＥＶ１が年齢の予測の５０％を超え、ｃＤＬＣＯが予測の５０％を超える、ｃ．腎臓：クレアチニンクリアランス試験（コッククロフト・ゴールト式による）で６０ｍＬ／分以上、及びｄ．肝臓：血清ビリルビンが２．０ｍｇ／ｄｌ未満；肝トランスアミナーゼ（ＡＬＴ及びＡＳＴ）が３×正常範囲の上限未満）。
【０１８６】
幾つかの実施形態では、次のいずれかの理由により治療検討から対象を除外することができる。
１．「顕著な」又は「３＋」の線維症を伴うＭＤＳ又はＣＭＬ。
２．ＣＭＭｏＬ又はＭＤＳ／ＣＭＭｏＬ重複。
３．患者の最後の化学療法サイクルの開始と幹細胞移植準備レジメンの開始から２１日未満（髄腔内剤、ヒドロキシ尿素、チロシンキナーゼ阻害剤、低メチル化剤、リツキシマブ及びレナリドマイドは化学療法とは見なされない）。
４．患者を移植に適さないようにする持続的な臨床的に重要な毒性。
５．候補臍帯血ユニットプロファイルに対する抗ＨＬＡ抗体の証拠（ＨＬＡ  Ａ、Ｂ、Ｃ又はＤＲＢ１に対してＭＦＩ＞３０００）。
６．ＨＩＶ感染又はＨＩＶ血清陽性の証拠。
７．血清学又はＰＣＲで確認された活動性Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎又はＥＢＶの証拠。
８．血清ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）検査陽性で示される妊娠又は授乳。
９．治療プログラムへの登録から１２ヶ月以内にＵＣＢ移植が実施されているもの以外の活動性悪性腫瘍。登録から１２ヶ月以内に完全に切除された皮膚扁平上皮細胞癌又は基底細胞癌又は子宮頸癌。
１０．患者が移植に耐えられなかったことを示す、非制御の細菌、真菌又はウイルス感染症又は重度の付随疾患の証拠。
１１．中枢神経系（ＣＮＳ）に白血病性芽球の徴候と症状が見られる患者。
１２．８／８対立遺伝子レベルでＨＬＡ適合し、容易に利用可能な血縁又は非血縁ドナー（レシピエントの結果を危うくすることなく、幹細胞を適時に採取できる）が存在する患者。
１３．事前の同種造血幹細胞移植。
１４．ウシ製品、ゲンタマイシン又は治療を妨げる可能性のある他の製品に対するアレルギー。
１５．治療要件の遵守を制限する厳重隔離又は薬剤不服用及び／又は精神疾患及び／又は社会的状況の履歴を伴い、骨髄移植（ＢＭＴ）を受けることが心理的に不可能であること。
１６．介入臨床試験への登録、又は許可された治療日前３０日以内に治験治療を受診。
【０１８７】
幾つかの実施形態では、それを必要とする対象は、骨髄破壊的療法又は移植前処置を受けている。特定の実施形態では、対象は、本発明の組成物の移植又は投与前に、骨髄破壊的療法又は移植前処置を受けている。対象は、本発明の組成物の移植又は投与の１１日前（−１１）〜２日前（−２）の間に、骨髄破壊的療法又は移植前処置を受けることができ、他のレジメンでは、本発明の組成物の移植又は投与の８日前（−８）〜１日前（−１）の間、又は本発明の組成物の移植又は投与の７日前（−７）〜３日前（−３）の間に受けることができる。骨髄破壊的療法又は移植前処置には、全身照射（ＴＢＩ）とフルダラビンが含まれる場合があり、ブスルファン、シクロホスファミド又はチオテパが含まれる場合もある。１レジメンでは、総放射線量は１３５０ｃＧｙであり、５日間で８分割又は９分割する。同一日で２分割の場合、例えば、１１日間のレジメンの−９〜−５日目にビームオン間の間隔を最低６時間として照射する。１１日間のレジメンでは、フルダラビン（４０ｍｇ／ｍ２／日）を、例えば、−５〜−２日目に静脈内投与する。フルダラビンは調整理想体重に従って投与する。１１日間のレジメンでは、チオテパ（５ｍｇ／ｋｇ）を−１１日目と−１０日目に静脈内投与する。
【０１８８】
８日間のレジメンでは、総放射線量は１３５０ｃＧｙであり、４日間で８分割し、同一日で２分割の場合、−４日目〜−１日目にビームオン間の間隔を最低６時間として照射する。フルダラビン（２５ｍｇ／ｍ２／日）を−８日目〜−６日目に６０分間で点滴静脈内投与する。フルダラビンは調整理想体重に従って投与する。幾つかの実施形態では、レジメンにシクロホスファミドが含まれる場合もある。シクロホスファミドは、調整理想体重に従って、例えば、８日間のレジメンの−８日目と−７日目に６０ｍｇ／Ｋｇ／日で投与することができる。
【０１８９】
一部の移植前処置にはＴＢＩが含まれない。７日間レジメンの一例では、チオテパ（５ｍｇ／ｋｇ）を−７日目と−６日目に静脈内投与し、ブスルファン（３．２ｍｇ／ｋｇ又は３日後に７５ｍｇ＊ｈ／Ｌの累積ブスルファン曝露に調整）を−５日目〜−４日目に静脈内投与する。このようなレジメンでは、フルダラビン（５０ｍｇ／ｍ２／日）を−５日目〜−３日目に６０分間で点滴静脈内投与する。
【０１９０】
幾つかの実施形態では、それを必要とする対象は移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）予防レジメンを受けている。一実施形態では、対象は、本発明の組成物の移植又は投与の前にＧｖＨＤ予防レジメンを受けている。対象は、本発明の組成物の移植又は投与の９日前（−９）〜１日前（−１）の間にＧｖＨＤ予防レジメンを受けることができる。他の実施形態では、対象は、本発明の組成物の移植又は投与の少なくとも３日前（−３）から少なくとも＋１５０日目までＧｖＨＤ予防レジメンを受ける。対象は、骨髄破壊的療法又は移植前処置又はＧｖＨＤ予防レジメンのいずれかを個別に又は組み合わせて受けることができる。ＧｖＨＤ予防レジメンには、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）とタクロリムスが含まれる場合がある。幾つかの実施形態では、タクロリムスを経口薬物が許容されるまで−３日目から静脈内投与した後、＋１５０日目まで経口投与して５〜１５ｎｇ／ｍｌの血中濃度を目標とし、ＭＭＦ１ｇを１日３回静脈内又は経口投与（患者の体重が５０ｋｇ未満の場合には１５ｍｇ／ｋｇで１日３回静脈内投与）し、これを−３日目から少なくとも＋６０日目まで行う。
【０１９１】
幾つかの実施形態では、それを必要とする対象は、移植前処置の前に適切な長期の中心静脈アクセスを行う。幾つかの実施形態では、対象は三重管腔トンネル型カテーテルを有している。
【０１９２】
幾つかの実施形態では、対象は、輸注サポート（例えば、ジフェニルヒドラミン又はデクスクロルフェニラミン、ヒドロコルチゾン及びアセトアミノフェン）、支持サイトカイン（例えば、Ｇ−ＣＳＦ）、必要に応じて血液製剤、抗ウイルス、抗菌、ＰＣＰ及び／又は真菌予防、ＣＭＶ、ＥＢＶ及びＨＨＶ６サーベイランス及び必要に応じて静脈内免疫グロブリンの内のいずれか又は全てを受けることができる。
【０１９３】
幾つかの実施形態では、対象は血液疾患用の追加治療のいずれか又は全てを受ける。上記治療は、免疫抑制治療、化学療法及び放射線療法から成る群から選択される治療とすることができる。
【０１９４】
従って、幾つかの実施形態では、血液疾患の治療を必要とする対象において血液疾患を治療する方法であって、
（ａ）対象への移植に適した単一の臍帯血ユニットを（ｉ）ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択細胞を含む第１の選択血液細胞画分と、（ｉｉ）ＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性細胞を含む第２の未選択血液細胞画分に分離する工程と、
（ｂ）細胞増殖が可能な条件下において、ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択細胞を含む上記第１の血液細胞画分をエクスビボで培養する工程（上記条件は、栄養素、血清、並びに幹細胞因子、トロンボポエチン、ＦＬｔ３リガンド及びＩＬ−６の各々を含むサイトカインの組み合わせ、及び１．０ｍＭ〜１０ｍＭのニコチンアミドを供給することを含む）と、
（ｃ）工程（ｂ）で得た、エクスビボ培養した第１のＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択血液細胞画分と未培養の第２の未選択血液細胞画分とを凍結保存する工程と、
（ｄ）エクスビボ培養した第１の選択血液細胞画分と上記未培養の第２の未選択血液細胞画分とを解凍する工程と、
（ｅ）工程（ｄ）で得た、解凍後のエクスビボ培養したの第１の選択血液細胞画分と未培養の第２の未選択血液細胞画分とを、それを必要とする対象に移植して、対象の血液疾患を治療する工程とを含む方法が提供される。
【０１９５】
幾つかの実施形態では、血液疾患の治療を必要とする対象において血液疾患を治療する方法は、
（ａ）対象への移植に適した単一の臍帯血ユニットを（ｉ）ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択細胞を含む第１の選択血液細胞画分と（ｉｉ）ＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性細胞を含む第２の未選択血液細胞画分とに分離する工程と、
（ｂ）細胞増殖が可能な条件下において、ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択細胞を含む第１の血液細胞画分をエクスビボで培養する工程（条件は、栄養素、血清、並びに幹細胞因子、トロンボポエチン、ＦＬｔ３リガンド及びＩＬ−６の各々を含むサイトカインの組み合わせ、及び１．０ｍＭ〜１０ｍＭのニコチンアミドを供給することを含む）と、
（ｃ）工程（ｂ）で得た、エクスビボ培養した第１のＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択血液細胞画分と上記未培養の第２の未選択血液細胞画分とを凍結保存する工程と、
（ｄ）エクスビボ培養した第１の選択血液細胞画分と未培養の第２の未選択血液細胞画分とを解凍する工程と、
（ｅ）工程（ｄ）で得た、解凍後のエクスビボ培養した第１の選択血液細胞画分と未培養の第２の未選択血液細胞画分とを、それを必要とする対象に移植して上記対象の血液疾患を治療する工程から成る。
【０１９６】
幾つかの実施形態では、移植に適した単一の臍帯血ユニットは、次の凍結保存前パラメータ：
（ｉ）総ＣＤ３４＋細胞が少なくとも８×１０６個、
（ｉｉ）６種のＨＬＡクラスＩ（ＨＬＡ−ＡとＨＬＡ−Ｂ、低解像度）座位及びＨＬＡクラスＩＩ（ＨＬＡ−ＤＲＢ１、高解像度）座位の内の少なくとも４種において、対象とＨＬＡが適合、
（ｉｉｉ）凍結保存前の総有核細胞数が約１．８×１０９〜約３．０×１０９個、及び
（ｉｖ）凍結保存前の総有核細胞数が対象重量１キログラム当たり約１．５×１０７〜約３．０×１０７個によって特徴付けられる。
【０１９７】
特定の実施形態では、第１の凍結保存したエクスビボ培養後の選択血液細胞画分と、未培養の第２の未選択血液細胞画分とを同じ移植日に解凍する。幾つかの実施形態では、第１の凍結保存したエクスビボ培養（増殖）ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋画分を移植の日まで凍結状態に保つ。移植当日、臨床現場では、第１の凍結保存したエクスビボ培養（増殖）ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋画分を解凍し、閉鎖系にて輸液（８％ｗ／ｖヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と６．８％ｗ／ｖデキストラン−４０）で再構成する。
【０１９８】
幾つかの実施形態では、同一臍帯血ユニットの未選択ＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性臍帯血画分は、ＣＤ１３３＋細胞の分離（例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ陽性分離）中に溶出される細胞の画分である。この画分には、Ｂ細胞、Ｔ細胞及びＮＫ細胞等の免疫細胞のレパートリー全体が含まれている。選択カラム（例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳカラム）から溶出させた後、細胞を洗浄し、凍結保存溶液ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０（ＢｉｏＬｉｆｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．）に懸濁し、標識した後、制御速度冷凍庫を使用して凍結させる。保存は液体窒素中で行う。未選択ＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性画分は、対象へ移植する日まで凍結させたままにする。移植当日、未選択ＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性画分を解凍し、閉鎖系にて輸液（８％ｗ／ｖＨＳＡと６．８％ｗ／ｖデキストラン−４０）で再構成する。幾つかの実施形態では、注入溶液をスクリーニングし、本発明の方法及び組成物との使用適合性について確認する。適切な輸液の選択基準の例としては、安全性試験で下記結果が得られることが挙げられる。細菌、酵母又はカビの成長がなく、内毒素含有量が０．５Ｅｕ／ｍｌ未満であり、透明で異物粒子のない外観を示す。
【０１９９】
幾つかの実施形態では、使用（例えば、移植）するまで輸液を２〜８℃でバッグに保存する。
【０２００】
幾つかの特定の実施形態では、移植当日に臍帯血画分を移植する前に、それを必要とする対象の安全性評価と、ＲＢＣや血小板輸血等の併用薬の投与とを行う。安全性評価には、通常、身体検査、ＣＢＣ、血液化学（例えば、少なくとも血清クレアチニン、総ビリルビン、アルカリホスファターゼ、ＡＳＴ、ＡＬＴ及びマグネシウム）、バイタルサイン（即ち、体重、体温、血圧、脈拍及び呼吸数）の確認が含まれる。
【０２０１】
選択した増殖ＣＤ１３３＋ＣＤ３４＋臍帯血画分と未選択ＣＤ１３３、ＣＤ３４陰性臍帯血画分のそれを必要とする対象への輸注は、通常、患者の中心静脈カテーテルを介した輸血によって行うが、各医療機関の方針に従うものとする。幾つかの実施形態では、選択した増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分を最初に輸注し、その後すぐに未選択ＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性（未処置）臍帯血画分の輸注を行う。他の実施形態では、未選択ＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性（未処置）臍帯血画分を最初に輸注し、その後すぐに選択した増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分の輸注を行う。
【０２０２】
従って、本発明の幾つかの実施形態では、上記患者への輸液の輸注によって移植を行い、上記エクスビボ培養後の第１の選択血液細胞画分を上記未培養の第２の未選択血液細胞画分の前に輸注する。一方、他の実施形態では、未培養の第２の未選択血液細胞画分を上記エクスビボ培養後の第１の選択血液細胞画分の前に輸注する。
【０２０３】
上で詳述したように、移植に適した、選択した増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分と未選択ＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性（未処置）臍帯血画分の両方を、特に総生細胞含有量についてスクリーニングする。幾つかの実施形態では、対象への輸注用の第１のエクスビボ培養ＣＤ１３３＋ＣＤ３４＋血液細胞画分は、総生細胞数が少なくとも８×１０８個である。幾つかの実施形態では、対象への輸注用の第２の未培養のＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性血液細胞画分は、総生細胞数が少なくとも４×１０８個である。
【０２０４】
本発明の血液疾患の治療方法を用いて、血液系腫瘍（例えば、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）及び骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）が挙げられるが、これらに限定されない）を治療することができる。ホジキン病と非ホジキンリンパ腫の治療も企図される。本明細書で使用される「血液疾患の治療」又は「血液系腫瘍の治療」という用語は、血液疾患の症状又は徴候を抑制することを意味する。幾つかの実施形態では、血液疾患又は血液系腫瘍の治療は、経時的な症状の抑制、好中球や血小板数等の臨床パラメータの改善、入院の減少、及び再発のリスク又は死亡率の低下によって評価されるが、これらに限定されない。
【０２０５】
従って、本発明の方法の幾つかの実施形態によれば、上記対象への移植に適した単一の臍帯血ユニットを（ｉ）ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択細胞を含む第１の選択血液細胞画分と（ｉｉ）ＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性細胞を含む第２の未選択血液細胞画分とに分離する工程と、細胞増殖を可能な条件下において、ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択細胞を含む第１の血液細胞画分をエクスビボで培養すること（上記条件は、栄養素、血清、並びに幹細胞因子、トロンボポエチン、ＦＬｔ３リガンド及びＩＬ−６の各々を含むサイトカインの組み合わせ、及び１．０ｍＭ〜１０ｍＭのニコチンアミドを供給することを含む）と、エクスビボ培養後の第１のＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択血液細胞画分と上記未培養の第２の未選択血液細胞画分とを凍結保存する工程と、上記エクスビボ培養ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋の第１の選択血液細胞画分と上記未培養のＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性の第２の未選択血液細胞画分とを解凍する工程と、解凍したエクスビボ培養後の第１の選択血液細胞画分と未培養の第２の未選択血液細胞画分とをそれを必要とする対象に移植する工程とによって、未処置の単一又は二重の臍帯血ユニットを移植する場合と比べて、上記対象における移植から好中球生着までの時間が短縮される。
【０２０６】
本明細書で使用される「未処置の臍帯血」という用語は、本明細書に記載の選択及び／又は増殖を行っていない臍帯血を意味する。幾つかの実施形態では、未処置の臍帯血は、臍帯血バンク由来の新鮮なユニット又は凍結保存した臍帯血ユニットである。
【０２０７】
幾つかの実施形態では、上記第１のエクスビボ培養ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋血液細胞画分と上記第２の未培養のＣＤ１３３−／ＣＤ３４−血液の移植によって、未処置の単一又は二重の臍帯血ユニットを移植する場合と比べて、好中球生着までの時間が５〜１４日間短縮される。
【０２０８】
本明細書で使用される「好中球生着」という用語は、移植後４２日以前（及び追加の幹細胞製品の輸注前）の別々の日に３回連続の測定を行ったとき、絶対好中球数（ＡＮＣ）が０．５×１０９／Ｌ以上となり、その後にドナーキメラ現象（末梢血キメラ現象により宿主細胞が１０％以下）が生じることを意味する。幾つかの実施形態では、好中球生着までの時間の短縮とは、移植後１６日以前の別々の日に３回連続の測定を行ったとき、絶対好中球数（ＡＮＣ）が０．５×１０９／Ｌ以上となり、その後にドナーキメラ現象（末梢血キメラ現象により宿主細胞が１０％以下）が生じることを意味する。
【０２０９】
本発明の方法の幾つかの実施形態によれば、上記対象への移植に適した単一の臍帯血ユニットを（ｉ）ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択細胞を含む第１の選択血液細胞画分と（ｉｉ）ＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性細胞を含む第２の未選択血液細胞画分とに分離する工程と、細胞増殖を可能な条件下において、ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択細胞を含む上記第１の血液細胞画分をエクスビボで培養する工程（上記条件は、栄養素、血清、並びに幹細胞因子、トロンボポエチン、ＦＬｔ３リガンド及びＩＬ−６の各々を含むサイトカインの組み合わせ、及び１．０ｍＭ〜１０ｍＭのニコチンアミドを供給することを含む）と、上記エクスビボ培養後の第１のＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択血液細胞画分と上記未培養の第２の未選択血液細胞画分とを凍結保存する工程と、上記エクスビボ培養ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋の第１の選択血液細胞画分と上記未培養のＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性の第２の未選択血液細胞画分とを解凍する工程と、解凍したエクスビボ培養後の第１の選択血液細胞画分と未培養の第２の未選択血液細胞画分とをそれを必要とする対象に移植する工程とによって、未処置の単一又は二重の臍帯血ユニットを移植する場合と比べて、上記対象における移植から血小板生着までの時間が短縮される。
【０２１０】
他の実施形態では、上記第１のエクスビボ培養ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋造血幹細胞／前駆血液細胞画分と上記第２の未培養のＣＤ１３３−／ＣＤ３４−血液細胞画分を移植することによって、未処置の単一又は二重の臍帯血ユニットを移植する場合と比べて、移植後４２日での上記対象における血小板生着の確率が高まる。
【０２１１】
特定の実施形態では、「血小板生着」という用語は、過去７日間で血小板輸血をせずに別々の日に最低３回の連続測定を行って患者の血小板数が２０×１０９／Ｌを超えた最初の日に関する（過去７日間の内の１日を生着日と見なす）。３回の測定の最初の日を血小板生着の日と指定し、これは第２の幹細胞製品の輸注前に生じる。
【０２１２】
本発明の方法の幾つかの実施形態によれば、上記対象への移植に適した単一の臍帯血ユニットを（ｉ）ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択細胞を含む第１の選択血液細胞画分と（ｉｉ）ＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性細胞を含む第２の未選択血液細胞画分とに分離する工程と、細胞増殖を可能な条件下において、ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択細胞を含む上記第１の血液細胞画分をエクスビボで培養する工程（上記条件は、栄養素、血清、並びに幹細胞因子、トロンボポエチン、ＦＬｔ３リガンド及びＩＬ−６の各々を含むサイトカインの組み合わせ、及び１．０ｍＭ〜１０ｍＭのニコチンアミドを供給することを含む）と、上記エクスビボ培養後の第１のＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択血液細胞画分と上記未培養の第２の未選択血液細胞画分とを凍結保存する工程と、上記エクスビボ培養ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋の第１の選択血液細胞画分と上記未培養のＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性の第２の未選択血液細胞画分とを解凍する工程と、解凍したエクスビボ培養後の第１の選択血液細胞画分と未培養の第２の未選択血液細胞画分とをそれを必要とする対象に移植することによって、未処置の単一又は二重の臍帯血ユニットを移植する場合と比べて、上記対象における移植後４２日目までの非生着の確率が低下する。特定の実施形態では、「一次移植不全」又は「非生着」という用語は、上述のように４２日目までに好中球生着が達成されないことに関する。移植後４２日目以前の対象への第２の幹細胞製品の輸注の要件も一次移植不全と見なされる。しかし、好中球生着が実証された後の追加の幹細胞製品の輸注の必要性は、移植後４２日目以前に生じたとしても、二次移植不全と見なされることがある。一次移植不全の日は移植後４３日目と指定される。
【０２１３】
他の実施形態では、本発明の方法に従って上記第１のエクスビボ培養ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋血液細胞画分と上記第２の未培養のＣＤ１３３−／ＣＤ３４−血液細胞画分とをそれを必要とする対象に移植することによって、未処置の単一又は二重の臍帯血ユニットを移植する場合と比べて、二次移植不全又は二次非生着の確率が低下する。特定の実施形態では、「二次移植不全」又は「非生着」という用語は、好中球生着が実証された後、５％未満の骨髄細胞性を伴う重度の好中球減少症（別々の日における３個以上の連続検査値について＜０．５×１０９／Ｌ）が生じ、その後、自発的にも、成長因子治療後にも、改善が見られないことに関する。好中球生着が実証された後の追加の幹細胞製品の輸注は二次移植不全と見なされる。上述の重度の好中球減少症の初日又は追加の幹細胞輸注日のいずれか早い方が二次移植不全の日と指定される。
【０２１４】
本発明の方法の幾つかの実施形態によれば、上記対象への移植に適した単一の臍帯血ユニットを（ｉ）ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択細胞を含む第１の選択血液細胞画分と（ｉｉ）ＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性細胞とを含む第２の未選択血液細胞画分に分離する工程と、細胞増殖を可能な条件下において、ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択細胞を含む上記第１の血液細胞画分をエクスビボで培養する工程（上記条件は、栄養素、血清、並びに幹細胞因子、トロンボポエチン、ＦＬｔ３リガンド及びＩＬ−６の各々を含むサイトカインの組み合わせ、及び１．０ｍＭ〜１０ｍＭのニコチンアミドを供給することを含む）と、上記エクスビボ培養後の第１のＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択血液細胞画分と上記未培養の第２の未選択血液細胞画分とを凍結保存する工程と、上記エクスビボ培養ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋の第１の選択血液細胞画分と上記未培養のＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性の第２の未選択血液細胞画分とを解凍する工程と、解凍したエクスビボ培養後の第１の選択血液細胞画分と未培養の第２の未選択血液細胞画分とをそれを必要とする対象に移植することによって、未処置の単一又は二重の臍帯血ユニットとを移植する場合と比べて、上記対象における移植後の非再発死亡の確率が低下する。本明細書で使用される「非再発死亡」という用語は、死亡する前に対象の血液疾患の再発が生じないことを意味する。
【０２１５】
幾つかの実施形態では、上記第１のエクスビボ培養ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋血液細胞画分と上記第２の未培養のＣＤ１３３−／ＣＤ３４−血液細胞画分を移植することによって、未処置の単一又は二重の臍帯血ユニットを移植する場合と比べて、移植後１８０〜２１０日での非再発死亡の確率が低下する。
【０２１６】
幾つかの実施形態では、上記第１のエクスビボ培養ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋血液細胞画分と上記第２の未培養のＣＤ１３３−／ＣＤ３４−血液細胞画分とを移植することによって、未処置の単一又は二重の臍帯血ユニットを移植する場合と比べて、１年以内の非再発死亡のリスクが低下する。幾つかの実施形態では、本発明の方法に従って上記第１のエクスビボ培養ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋血液細胞画分と上記第２の未培養のＣＤ１３３−／ＣＤ３４−血液細胞画分とを移植することによって、未処置の単一又は二重の臍帯血ユニットを移植する場合と比べて、移植後１５ヶ月での非再発死亡のリスクが低下する。
【０２１７】
本発明の方法の幾つかの実施形態によれば、上記対象への移植に適した単一の臍帯血ユニットを（ｉ）ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択細胞を含む第１の選択血液細胞画分と（ｉｉ）ＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性細胞を含む第２の未選択血液細胞画分とに分離する工程と、細胞増殖を可能な条件下において、ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択細胞を含む上記第１の血液細胞画分をエクスビボで培養すること（上記条件は、栄養素、血清、並びに幹細胞因子、トロンボポエチン、ＦＬｔ３リガンド及びＩＬ−６の各々を含むサイトカインの組み合わせ、及び１．０ｍＭ〜１０ｍＭのニコチンアミドを供給することを含む）と、上記エクスビボ培養後の第１のＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択血液細胞画分と上記未培養の第２の未選択血液細胞画分とを凍結保存する工程と、上記エクスビボ培養ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋の第１の選択血液細胞画分と上記未培養のＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性の第２の未選択血液細胞画分とを解凍する工程と、解凍したエクスビボ培養後の第１の選択血液細胞画分と未培養の第２の未選択血液細胞画分とをそれを必要とする対象に移植する工程とによって、未処置の単一又は二重の臍帯血ユニットを移植する場合と比べて、移植後最初の１００日における上記対象の入院期間が短縮される。本明細書で使用される「入院期間」という用語は、移植から最初の退院までの総日数を意味する。
【０２１８】
幾つかの実施形態では、第１のエクスビボ培養ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋血液細胞画分と上記第２の未培養のＣＤ１３３−／ＣＤ３４−血液細胞画分を移植することによって、未処置の単一又は二重の臍帯血ユニットを移植する場合と比べて、移植後の入院期間が５〜３０日間短縮される。幾つかの実施形態では、第１のエクスビボ培養ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋血液細胞画分と上記第２の未培養のＣＤ１３３−／ＣＤ３４−血液細胞画分とを移植することによって、未処置の単一又は二重の臍帯血ユニットを移植する場合と比べて、移植後の生存日数と院外日数が増加する。本明細書で使用される「生存日数と院外日数」は、患者が生存し且つ入院していない全日数（暦日数）と定義される。
【０２１９】
本発明の方法の幾つかの実施形態によれば、上記対象への移植に適した単一の臍帯血ユニットを（ｉ）ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択細胞を含む第１の選択血液細胞画分と（ｉｉ）ＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性細胞とを含む第２の未選択血液細胞画分に分離する工程と、細胞増殖を可能な条件下において、ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択細胞を含む上記第１の血液細胞画分をエクスビボで培養する工程（上記条件は、栄養素、血清、並びに幹細胞因子、トロンボポエチン、ＦＬｔ３リガンド及びＩＬ−６の各々を含むサイトカインの組み合わせ、及び１．０ｍＭ〜１０ｍＭのニコチンアミドを供給することを含む）と、上記エクスビボ培養後の第１のＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択血液細胞画分と上記未培養の第２の未選択血液細胞画分とを凍結保存する工程と、上記エクスビボ培養ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋の第１の選択血液細胞画分と上記未培養のＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性の第２の未選択血液細胞画分とを解凍する工程と、解凍したエクスビボ培養後の第１の選択血液細胞画分と未培養の第２の未選択血液細胞画分とをそれを必要とする対象に移植する工程とによって、未処置の単一又は二重の臍帯血ユニットを移植する場合と比べて、上記対象における移植後のグレード２／３の細菌感染症又は侵襲性真菌感染症のリスクが低下する。細菌感染症及び／又は侵襲性真菌感染症の段階分けは当技術分野で周知である。グレード３の細菌感染症の徴候としては、深部臓器合併症を伴う菌血症（例えば、肺浸潤の新規発症又は悪化、心内膜炎を伴う）、菌血症を伴う重症敗血症、創傷郭清を必要とする筋膜炎、挿管を必要とする肺炎、菌血症のない脳膿瘍又は髄膜炎、下痢を伴う／伴わない中毒性拡張又は腎不全を伴うディフィシル毒素陽性便が挙げられるが、これらに限定されない。グレード３の真菌感染症の徴候としては、カンジダ血症を含む真菌血症、判明した又は可能性のある侵襲性真菌感染症（例えば、アスペルギルス、ムコール、フザリウム、スケドスポリウム）、ヒストプラスマ症、ブラストミセス症、コクシジオイデス症、又はクリプトコッカス及びニューモシスティスジロベチ肺炎（ＰａＯ２レベルに関係なく）を伴う播種性感染症（多巣性肺炎、尿又は血液抗原の存在、及び／又はＣＮＳの関与として定義される）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２０】
幾つかの実施形態では、本発明の方法に従って第１のエクスビボ培養ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋血液細胞画分と上記第２の未培養のＣＤ１３３−／ＣＤ３４−血液細胞画分とを移植することによって、未処置の単一又は二重の臍帯血ユニットを移植する場合と比べて、上記対象における移植後１００日までのグレード２／３の細菌感染症又は侵襲性真菌感染症のリスクが低下する。
【０２２１】
本発明の方法の幾つかの実施形態によれば、上記対象への移植に適した単一の臍帯血ユニットを（ｉ）ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択細胞を含む第１の選択血液細胞画分と（ｉｉ）ＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性細胞を含む第２の未選択血液細胞画分とに分離する工程と、細胞増殖を可能な条件下において、ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択細胞を含む上記第１の血液細胞画分をエクスビボで培養する工程（上記条件は、栄養素、血清、並びに幹細胞因子、トロンボポエチン、ＦＬｔ３リガンド及びＩＬ−６の各々を含むサイトカインの組み合わせ、及び１．０ｍＭ〜１０ｍＭのニコチンアミドを供給することを含む）と、上記エクスビボ培養後の第１のＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択血液細胞画分と上記未培養の第２の未選択血液細胞画分とを凍結保存する工程と、上記エクスビボ培養ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋の第１の選択血液細胞画分と上記未培養のＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性の第２の未選択血液細胞画分とを解凍する工程と、解凍したエクスビボ培養後の第１の選択血液細胞画分と未培養の第２の未選択血液細胞画分とをそれを必要とする対象に移植する工程とによって、未処置の単一又は二重の臍帯血ユニットを移植する場合と比べて、移植後１００日での上記対象における急性移植片対宿主病グレードＩＩＩ−ＩＶのリスクが低下する。幾つかの実施形態では、本発明の方法に従って第１のエクスビボ培養ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋血液細胞画分と上記第２の未培養のＣＤ１３３−／ＣＤ３４−血液細胞画分とを移植することによって、未処置の単一又は二重の臍帯血ユニットを移植する場合と比べて、上記対象への移植後１８０日での上記対象における急性移植片対宿主病グレードＩＩＩ−ＩＶのリスクが低下する。
【０２２２】
幾つかの実施形態では、本発明の方法に従って第１のエクスビボ培養ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋血液細胞画分と上記第２の未培養のＣＤ１３３−／ＣＤ３４−血液細胞画分とを移植することによって、未処置の単一又は二重の臍帯血ユニットを移植する場合と比べて、上記対象への移植後１８０日又は１年での上記対象における慢性移植片対宿主病（軽度／中程度／重度）のリスクが低下する。
【０２２３】
本明細書で使用される「急性ＧｖＨＤ」という用語は、移植後早期に起こる急性移植片対宿主病を意味し、慢性又はｃＧｖＨＤは、移植後の急性ＧｖＨＤのカットオフポイント後の慢性移植片対宿主病を意味する。幾つかの実施形態では、急性ＧｖＨＤは急性ＧｖＨＤの段階分けに関するコンセンサス会議に従って分類され（Przepiorka et al., Bone Marrow Transplant 1995, 15:825-828参照）、ｃＧｖＨＤはｃＧｖＨＤを段階分けするためのＮＩＨコンセンサス基準に従って分類される（Jagasia et al, Biol. Blood Marrow Transplant, 2015 21:389-401参照）。
【０２２４】
本発明の方法の幾つかの実施形態では、上記対象への移植に適した単一の臍帯血ユニットを（ｉ）ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択細胞を含む第１の選択血液細胞画分と（ｉｉ）ＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性細胞を含む第２の未選択血液細胞画分とに分離する工程と、細胞増殖を可能な条件下において、ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択細胞を含む上記第１の血液細胞画分をエクスビボで培養する工程（上記条件は、栄養素、血清、並びに幹細胞因子、トロンボポエチン、ＦＬｔ３リガンド及びＩＬ−６の各々を含むサイトカインの組み合わせ、及び１．０ｍＭ〜１０ｍＭのニコチンアミドを供給することを含む）と、上記エクスビボ培養後の第１のＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択血液細胞画分と上記未培養の第２の未選択血液細胞画分とを凍結保存する工程と、上記エクスビボ培養ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋の第１の選択血液細胞画分と上記未培養のＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性の第２の未選択血液細胞画分とを解凍する工程と、解凍したエクスビボ培養後の第１の選択血液細胞画分と未培養の第２の未選択血液細胞画分とをそれを必要とする対象に移植する工程とによって、未処置の単一又は二重の臍帯血ユニットを移植する場合と比べて、移植後１５ヶ月までの無病生存の確率が高まり、移植後２１０日及び／又は１５ヶ月までの全生存の確率が高まり、上記対象における免疫再構成（異なるリンパ球亜集団の数と割合）が、例えば、移植後２８日、７０日、１００日、１８０日及び３６５日までに改善される。
【０２２５】
本発明の方法の幾つかの実施形態では、上記対象への移植に適した単一の臍帯血ユニットを（ｉ）ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択細胞を含む第１の選択血液細胞画分と（ｉｉ）ＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性細胞を含む第２の未選択血液細胞画分とに分離する工程と、細胞増殖を可能な条件下において、ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択細胞を含む上記第１の血液細胞画分をエクスビボで培養する工程（上記条件は、栄養素、血清、並びに幹細胞因子、トロンボポエチン、ＦＬｔ３リガンド及びＩＬ−６の各々を含むサイトカインの組み合わせ、及び１．０ｍＭ〜１０ｍＭのニコチンアミドを供給することを含む）と、上記エクスビボ培養後の第１のＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択血液細胞画分と上記未培養の第２の未選択血液細胞画分とを凍結保存する工程と、上記エクスビボ培養ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋の第１の選択血液細胞画分と上記未培養のＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性の第２の未選択血液細胞画分とを解凍する工程と、解凍したエクスビボ培養後の第１の選択血液細胞画分と未培養の第２の未選択血液細胞画分とをそれを必要とする対象に移植する工程とによって、未処置の単一又は二重の臍帯血ユニットを移植する場合と比べて、移植後の上記対象における疾患再発と再発死亡の確率が低下する。
【０２２６】
幾つかの実施形態では、疾患再発は次の基準に従って定義される。
【０２２７】
悪性腫瘍の再発：再発は、移植前の特徴と一致するＡＭＬ、ＡＬＬ、ＣＭＬ又はＭＤＳの形態学的又は細胞遺伝学的証拠によって定義される。
【０２２８】
最小残存病変：最小残存病変（ＭＲＤ）は、血液又は骨髄の疾患の形態学的又は細胞遺伝学的証拠がない場合には、フローサイトメトリー、又は蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、又はサザンブロット又はウェスタンブロット、又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、又は他の技法による悪性細胞の唯一の証拠によって定義される。最小残存病変の証拠だけでは再発の定義を満たすのに十分ではないが、進行する最小残存病変は再発と見なすことができる。
【０２２９】
急性白血病：再発は次のいずれかで定義することができる。
他の原因（例えば、骨髄再生）によらない骨髄での５％超の芽球。
他の原因によらない骨髄内の新しい異形成変化の出現。
末梢血中での白血病性芽球の再出現。
移植前に存在していた疾患の以前の細胞遺伝学的マーカー又は分子マーカーの再出現。
脳脊髄液中での髄外白血病又は白血病性細胞の発生。
【０２３０】
免疫抑制療法の中止又はチロシンキナーゼ阻害剤又は低メチル化剤の追加を含む、ＭＲＤの検出に応じた治療の開始は、上述の基準が満たされているかどうかに関わらず再発の証拠と見なされる。
【０２３１】
慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）
血液学的再発は次の場合に診断することができる。
１．未熟な造血細胞が末梢血で持続的に示されている、又は
２．細胞遺伝学的再発の存在下で骨髄に骨髄過形成がある。
【０２３２】
細胞遺伝学的再発は次の場合に診断することができる。
１．分裂中期の５０％が特徴的な（９；２２）転座を示し、少なくとも１０個の分裂中期が分析されている、又は
２．少なくとも１個の分裂中期が、分析された分裂中期の数に関係なく、少なくとも１ヶ月間隔の２回の別々の連続検査の各々で（９；２２）転座を示す。最も早い試験日が再発の日と見なされる。
【０２３３】
ＭＤＳ
再発は次のいずれかとして定義することができる。
急性白血病への進展に関する上述の基準を満たすこと、又は
少なくとも１ヶ月間隔で採取した２回の連続した骨髄試料で検出された移植前の形態学的異常の再発（最も早い検査日が再発の日と見なされる）、又は
分析された分裂中期の数に関係なく、少なくとも１ヶ月間隔の２回の別々の連続検査の各々で少なくとも１個の分裂中期で移植前の細胞遺伝学的異常の再発。
【０２３４】
免疫抑制療法の中止や低メチル化剤による治療等、ＭＲＤの検出に応じた治療の開始は、上述の基準が満たされているかどうかに関わらず再発の証拠と見なされる。
【０２３５】
幾つかの実施形態では、本発明は、包装材料と臍帯血細胞画分を含む製造品、組成物又はキットであって、臍帯血細胞画分は、
（ｉ）細胞増殖を可能にする条件下（栄養素、血清、並びに幹細胞因子、トロンボポエチン、ＦＬｔ３リガンド及びＩＬ−６の各々を含むサイトカインの組み合わせ、及び１．０ｍＭ〜１０ｍＭのニコチンアミドを供給することを含む条件下）でエクスビボ培養したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択臍帯血細胞を含む、それを必要とする対象への移植に適した第１の血液細胞画分、および（ｉｉ）ＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性細胞を含む、それを必要とする対象への移植に適した第２の未培養未選択血液細胞画分を含み、上記包装材料は、上記第１及び第２の臍帯血細胞集団がそれを必要とする対象の血液疾患を治療するためのものであることを示すラベル又は添付文書を含む、製造品、組成物又はキットを提供する。
【０２３６】
幾つかの実施形態では、本発明の製造品、組成物又はキットは、（ｉ）ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択臍帯血細胞を含む、それを必要とする対象への移植に適した第１の血液細胞画分、および（ｉｉ）ＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性細胞を含む、それを必要とする対象への移植に適した第２の未培養未選択血液細胞画分を、それを必要とする対象に投与するための説明書を更に含む。
【０２３７】
本発明の製造品、組成物又はキットの幾つかの実施形態では、（ｉ）ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択臍帯血細胞を含む、それを必要とする対象への移植に適した第１の血液細胞画分は、総生細胞数が少なくとも８×１０８個である。幾つかの実施形態では、第１のＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択臍帯血画分は、総生細胞数が少なくとも１０×１０８個、少なくとも１５×１０８個、少なくとも２０×１０８個、又は少なくとも２５×１０８個である。本発明の製造品、組成物又はキットの幾つかの実施形態では、（ｉｉ）ＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性細胞を含む、それを必要とする対象への移植に適した第２の未培養未選択血液細胞画分は、総生細胞数が４×１０８個である。幾つかの実施形態では、ＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性細胞を含む、それを必要とする対象への移植に適した第２の未培養未選択血液細胞画分は、総生細胞数が少なくとも６×１０８個、少なくとも８×１０８個、少なくとも１０×１０８個、又は少なくとも１５×１０８個である。
【０２３８】
本発明の製造品、組成物又はキットの幾つかの実施形態では、（ｉ）ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択臍帯血細胞を含む、それを必要とする対象への移植に適した第１の血液細胞画分と、（ｉｉ）ＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性細胞を含む、それを必要とする対象への移植に適した第２の未培養未選択血液細胞画分とを、凍結保存臍帯血細胞画分として供給する。
【０２３９】
本発明の選択細胞集団は、その細胞集団自体をそれを含む培地と共に提供してもよく、培地から単離してもよく、薬学的に許容し得る担体と細胞生着及び／又は臓器機能を促進し得る更なる剤（例えば、免疫抑制剤、抗生物質、成長因子）と組み合わせてもよい。従って、本発明の細胞集団は、滅菌生理食塩水や水性緩衝液等の薬学的に許容し得る担体又は希釈剤にて投与することができる。このような担体及び希釈剤の使用は当技術分野で周知である。
【０２４０】
本発明の組成物は、必要に応じて、有効成分（例えば、細胞）を含む１種以上の単位剤形を含み得るＦＤＡ承認キットや製造品等のパック又はディスペンサー装置にて提供することができる。パックは、例えば、金属又はプラスチック箔を含んでいて、ブリスターパック等とすることができる。パック又はディスペンサー装置には投与用の説明書を添付することができる。パック又はディスペンサー装置には医薬品の製造、使用又は販売を規制する政府機関によって規定された形式の通知を添付することもでき、この通知は、ヒト又は動物投与用の組成物の形式の機関による承認を反映している。このような通知には、例えば、処方薬又は承認された製品挿入物に関して米国食品医薬品局によって承認されたラベルが含まれる場合がある。上で更に詳述したように、薬学的に許容し得る担体で処方した本発明の製剤を含む組成物を調製し、適切な容器に入れ、表示病態の治療用にラベルを貼ることもできる。
【０２４１】
本発明の方法に従って調製した細胞はそれ自体を対象に投与してもよく、適切な担体又は賦形剤と混合した医薬組成物として対象に投与してもよい。
【０２４２】
本明細書で使用される「医薬組成物」とは、生理学的に適切な担体や賦形剤等の他の化学成分を含む、本明細書に記載の１種以上の有効成分の製剤を意味する。医薬組成物の目的は生物への化合物の投与を容易にすることである。
【０２４３】
以下、「生理学的に許容し得る担体」及び「薬学的に許容し得る担体」という語句（これらは互換的に使用することができる）は、生物に対して顕著な刺激を引き起こさず、投与化合物の生物学的活性及び特性を無効にしない担体又は希釈剤を意味する。これらの語句にはアジュバントが含まれる。
【０２４４】
本明細書における「賦形剤」という用語は、医薬組成物に添加して有効成分の投与を更に容易にする不活性物質を意味する。薬物の処方と投与の技術は「Remington’s Pharmaceutical Sciences」（ペンシルバニア州イーストン、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．）の最新版に見出すことができるが、これを本明細書の一部を構成するものとして援用する。
【０２４５】
よって、本発明に従って使用する医薬組成物は、賦形剤及び助剤を含む１種以上の生理学的に許容し得る担体を用いて従来の方法で処方することができ、これによって、有効成分を薬学的に使用可能な製剤に加工し易くなる。適切な処方は選択した投与経路に依存する。
【０２４６】
注射の場合、医薬組成物の有効成分は、水溶液、好ましくはハンクス液、リンゲル液又は生理的塩緩衝液等の生理学的に適合性のある緩衝液で処方することができる。
【０２４７】
本発明の状況での使用に適した医薬組成物は、所期の目的を達成するのに有効な量の有効成分を含む組成物を包含する。より具体的には、「治療有効量」とは、障害（例えば、白血病）の症状を予防、軽減又は改善するか、又は治療中の対象の生存期間を延長するのに有効な主成分（例えば、増殖ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋細胞）の量を意味する。
【０２４８】
治療有効量の決定は、特に本明細書で提供される詳細な開示を考慮すれば、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０２４９】
本明細書に記載の有効成分の毒性と治療効果は、インビトロ、細胞培養又は実験動物での標準的な製薬手順によって確認することができる。このようなインビトロ、細胞培養アッセイ及び動物研究から得たデータは、ヒトで使用する用量範囲を策定する際に用いることができる。用量は使用剤形や用いる投与経路に応じて変わり得る。正確な処方、投与経路及び用量は、患者の病態を考慮して個々の医師で選択することができる（例えば、Fingl, E. et al. (1975), "The Pharmacological Basis of Therapeutics," Ch. 1, p.1.参照）。
【０２５０】
治療する病態の重症度と応答性に応じて、単回又は複数回の投与とすることができる。投与する組成物の量は、当然のことながら、治療する対象、苦痛の重症度、投与方法、処方医師の判断等に依存する。
【０２５１】
移植を伴う臨床経験
本発明の方法に従って第１のエクスビボ培養ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋血液細胞画分および上記第２の未培養のＣＤ１３３−／ＣＤ３４−血液細胞画分の移植を受けたヒト患者における血小板生着の評価から、未処置の単一又は二重の臍帯血ユニットの移植で観察された日数よりも少ない日数で血小板生着が成功したことが分かる。
【０２５２】
本発明の方法に従って第１のエクスビボ培養ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋血液細胞画分および上記第２の未培養のＣＤ１３３−／ＣＤ３４−血液細胞画分の移植を受けた血液系腫瘍を有する３６人の患者を含む臨床試験では、移植日と過去７日間で血小板輸血をせずに別々の日に最低３回の連続測定を行って患者の血小板数が２０×１０９／Ｌを超えた最初の日（過去７日間の内の１日を生着日と見なす）との間隔を血小板生着までの時間として決定した。３回の測定の最初の日を血小板生着（これは第２の幹細胞製品の輸注前に生じる）の日と指定した。（モニタリング時に）血小板生着が成功した患者では、本発明の方法に従って移植を受けた患者の血小板生着までの時間の中央値は３４日（９５％ＣＩ：３２〜４２日）（ｐ＜０．００１）であった。比較コホートでの血小板生着までの時間（文献による）は４６日（９５％ＣＩ：４２〜５０日）である。
【０２５３】
個々の患者の血小板数を生着前のパラメータに従って分析した際、輸注された総生細胞数と生着までの時間との間に極めて統計的に有意な相関が見られた。表１３は、総生細胞数値が異なる患者間で任意の時間に生着が得られる確率の比率を示す（「比例部分分布ハザードモデル」）。合計演算及びウィンザー化演算の両方で低い「ｐ値」（ｐｒ＞カイ二乗）が得られたことは、総生細胞数の増加によって特許請求の移植方法を用いた血小板生着が早くなるという仮説を支持する。
【０２５４】
【表１３】
2020520237.tif 000014
【０２５５】
原因別ハザードモデルを使用して血小板生着データを分析した際、ウィンザー化データセットのｐ値は９５％確率を僅かに下回った（表１４）。
【０２５６】
【表１４】
2020520237.tif 000015
【０２５７】
本発明の方法に従って、第１のエクスビボ培養ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋血液細胞画分および上記第２の未培養のＣＤ１３３−／ＣＤ３４−血液細胞画分の移植を受けた患者からの血小板生着までの時間データを追加のパラメータ（患者体重１キログラム当たりの輸注した総生細胞数（ＴＶＣ））を用いて分析した際、血小板生着を連続変数（ＴＶＣ／Ｋｇ及びＴＶＣ／Ｋｇウィンザー化）として処理すると、輸注した総生細胞数／ｋｇと生着までの時間との相関は極めて統計的に有意であった（表１５）。データを３個の群に分けて最高四分位値を最低四分位値と比較すると、相関は極めて有意なままであった（表１５の「＞Ｑ３」を参照）。
【０２５８】
【表１５】
2020520237.tif 000016
【０２５９】
原因別ハザードモデルを使用してＴＶＣ／Ｋｇ対血小板生着までの時間を分析した際、ＴＶＣ／Ｋｇ、ＴＶＣ／Ｋｇ（ウィンザー化）及びＴＶＣ／Ｋｇ（＞Ｑ３）の３種全てにおいて相関は極めて有意なままであった（最高四分位値対最低四分位値）（表１６）。
【０２６０】
【表１６】
2020520237.tif 000017
【０２６１】
血小板減少症の長期化は移植レシピエントの生存にとって危険因子であるため、移植後の血小板生着までの時間は非常に重要である。以上をまとめると、ここで分析された有望な結果は、本発明の方法に従って移植を受けた血液系腫瘍の患者における効率的な血小板生着を反映し、未処置血液の単一ユニット又は二重ユニットを移植した患者について報告されている通常の血小板回復までの時間（例えば、Barker et al. 2015, Brit J Hemat 168:405：二重ユニット臍帯血移植による血小板生着までの中央値が４９日（９５％ＣＩ：３１〜３２０日）を参照）と比較して、生着が得られるまでの時間が大幅に短縮した（中央値が３４日（９５％ＣＩ：３２〜４２日）。
【０２６２】
本明細書で使用される「約」という用語は±１０％を意味する。
【０２６３】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語及びその活用形は「含んでいるが、それに限定されない」ことを意味する。
【０２６４】
「から成る」という用語は「含み、それに限定される」ことを意味する。
【０２６５】
「から実質的になる」という用語は、組成物、方法または構造が追加の成分、工程および／または部分を含み得ることを意味する。但しこれは、追加の成分、工程および／または部分が、請求項に記載の組成物、方法または構造の基本的かつ新規な特性を実質的に変更しない場合に限られる。
【０２６６】
本明細書で使用される、単数形を表す「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他を示さない限り、複数も対象とする。例えば、「化合物（ａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」又は「少なくとも１種の化合物」という用語の場合には、複数の化合物が含まれ、それらの混合物も含み得る。
【０２６７】
本願全体を通して、本発明の様々な実施形態は範囲形式にて示すことができる。範囲形式での記載は、単に利便性や簡潔さのためであり、本発明の範囲の柔軟性を欠く制限ではないことを理解されたい。従って、範囲の記載は可能な部分範囲の全て、及びその範囲内の個々の数値を具体的に開示していると考えるべきである。例えば、１〜６のような範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６等の部分範囲だけでなく、その範囲内の個々の数値、例えば、１、２、３、４、５及び６も具体的に開示していると考えるべきである。これは範囲の大きさに関わらず適用される。
【０２６８】
本明細書において数値範囲を示す場合、それは示される範囲内の任意の引用数（分数又は整数）を含むことを意図する。第１の指示数と第２の指示数「との間の範囲」という表現と、第１の指示数「から」第２の指示数「までの範囲」という表現は、本明細書で交換可能に使用され、第１の指示数及び第２の指示数と、それらの間の分数及び整数の全てを含むことを意図する。
【０２６９】
本明細書で使用される「方法」という用語は、所定の課題を達成するための様式、手段、技術及び手順を意味し、化学、薬理学、生物学、生化学及び医療の各分野の従事者に既知のもの、又は既知の様式、手段、技術及び手順から従事者が容易に開発できるものが含まれるが、これらに限定されない。
【０２７０】
明確さのために別々の実施形態に関連して記載された本発明の複数の特徴は、単一の実施形態において、これらの特徴を組み合わせても提供できることを理解されたい。逆に、簡潔さのために単一の実施形態に関連して記載された本発明の複数の特徴は、別々に提供してもよく、又は任意の適切な部分的な組み合わせにおいて提供してもよく、本発明の他に記載された実施形態において適切に提供してもよい。様々な実施形態に関連して記載される複数の特徴は、その要素なしで実施形態が不作用ではない限り、その実施形態の本質的な特徴であると見なしてはならない。
【国際調査報告】
2020520237.tif 000018
2020520237.tif 000019
2020520237.tif 000020