(57)【要約】  本開示は、いくつかの態様では、バリアントＲＮＡポリメラーゼであって、その使用により、インビトロ転写反応において生成される二本鎖ＲＮＡ混入物及びランオン転写物の数を減少させながら転写効率を増加させる、該バリアントＲＮＡポリメラーゼを提供する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼバリアント（例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント）は、高ヘリックス性向を有する残基（例えば、アラニン）か、または骨格柔軟性を伸長複合体の骨格柔軟性に特異的に一致させる残基に対する変異を含む。Ｓ４３Ａ及びＧ４７Ａを含むＣヘリックス及びＴ７  ＲＮＡポリメラーゼのＣリンカー領域内のアミノ酸置換、ならびにＣ末端グリシン残基の付加についても記載する。キャップ類似体を使用した共転写法についても記載する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
リボ核酸（ＲＮＡ）ポリメラーゼバリアントであって、野生型ＲＮＡポリメラーゼと比較して、前記ＲＮＡポリメラーゼバリアントが開始複合体から伸長複合体に移行するにつれて前記ＲＮＡポリメラーゼバリアントのループ構造にヘリックス構造へのコンフォメーション変化を受けさせるアミノ酸置換を含む、前記リボ核酸（ＲＮＡ）ポリメラーゼバリアント。
【請求項２】
前記アミノ酸置換が、野生型アミノ酸と比較して高いヘリックス性向を有する、請求項１に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【請求項３】
前記ＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼである、請求項１または２に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【請求項４】
前記ループ構造が、Ｃヘリックス構造中にある、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【請求項５】
前記ループ構造が、Ｃリンカー構造中にある、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【請求項６】
前記アミノ酸置換が、高ヘリックス性向アミノ酸置換である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【請求項７】
前記高ヘリックス性向酸置換が、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、リジン、グルタミン、及びグルタミン酸から選択される、請求項６に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【請求項８】
前記高ヘリックス性向アミノ酸置換が、アラニンである、請求項７に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【請求項９】
前記Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントが、配列番号１と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【請求項１０】
前記Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼが、Ｅ４２、Ｓ４３、Ｙ４４、Ｅ４５、Ｍ４６、Ｇ４７、Ａ２５５、Ｒ２５７、Ａ２５８、Ｇ２５９、Ａ２６０、Ｌ２６１、及びＡ２６２から選択される位置に高ヘリックス性向アミノ酸のアミノ酸置換を含むように修飾された配列番号１と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項９に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【請求項１１】
前記アミノ酸置換が、Ｓ４３Ａを含む、請求項１０に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【請求項１２】
前記アミノ酸置換が、Ｇ４７Ａを含む、請求項１０に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【請求項１３】
追加のＣ末端アミノ酸をさらに含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【請求項１４】
前記追加のＣ末端アミノ酸が、グリシン（Ｇ）を含む、請求項１３に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【請求項１５】
前記ＲＮＡポリメラーゼバリアントが、配列番号１０８のアミノ酸配列を含む、請求項１１、１３、または１４のいずれか１項に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【請求項１６】
前記ＲＮＡポリメラーゼバリアントが、配列番号１１０のアミノ酸配列を含む、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【請求項１７】
野生型ＲＮＡポリメラーゼと比較して追加のＣ末端アミノ酸を含む、リボ核酸（ＲＮＡ）ポリメラーゼバリアント。
【請求項１８】
前記ＲＮＡポリメラーゼバリアントが、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントである、請求項１７に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【請求項１９】
前記ＲＮＡポリメラーゼバリアントが、野生型Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する、請求項１８に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【請求項２０】
前記ＲＮＡポリメラーゼバリアントが、野生型Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼと比較してアミノ酸置換を含む、請求項１７または１８に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【請求項２１】
２つの追加のＣ末端アミノ酸を含む、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【請求項２２】
前記２つの追加のＣ末端アミノ酸が、同じ種類のアミノ酸または２つの異なる種類のアミノ酸を含む、請求項２１に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【請求項２３】
１〜５個または１〜１０個の追加のＣ末端アミノ酸を含む、請求項１７〜２２のいずれか１項に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【請求項２４】
ＦＡＦＡＸｎモチーフを含むＣ末端を含み、Ｘが任意のアミノ酸であり、ｎがゼロより大きい任意の整数である、ＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【請求項２５】
Ｘが、ＧまたはＡである、請求項２４に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【請求項２６】
ｎがゼロより大きい任意の整数であり、任意選択により、ｎが１、２、３、４、または５である、請求項２４または２５に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【請求項２７】
ＦＡＦＡＧモチーフを含むＣ末端を含む、ＲＮＡポリメラーゼバリアント、任意選択によりＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【請求項２８】
ＸＡＦＡＸｎモチーフ、ＦＸＦＡＸｎモチーフ、ＦＡＸＡＸｎモチーフ、またはＦＡＦＸＸｎモチーフを含むＣ末端を含み、各Ｘが任意のアミノ酸であり、ｎはゼロより大きい任意の整数である、ＲＮＡポリメラーゼバリアント、任意選択によりＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【請求項２９】
アミノ酸置換をさらに含む、請求項１７〜２８のいずれか１項に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【請求項３０】
前記アミノ酸置換が、野生型ＲＮＡポリメラーゼのＥ４２、Ｓ４３、Ｙ４４、Ｅ４５、Ｍ４６、Ｇ４７、Ｒ２５７、Ａ２５８、Ｇ２５９、Ａ２６０、Ｌ２６１、及びＡ２６２から選択される位置の高ヘリックス性向アミノ酸であり、任意選択により、前記野生型ＲＮＡポリメラーゼが、配列番号１のアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２９に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【請求項３１】
前記高ヘリックス性向アミノ酸が、アラニンである、請求項３０に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【請求項３２】
前記アミノ酸置換が、Ｓ４３ＡまたはＧ４７Ａである、請求項３１に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【請求項３３】
ＲＮＡ転写物の生成をもたらす条件下で、ＤＮＡ鋳型を請求項１〜３２のいずれか１項に記載のＲＮＡポリメラーゼと接触させることを含む、リボ核酸（ＲＮＡ）を生成する方法。
【請求項３４】
ヌクレオシド三リン酸及び緩衝液の存在下において、ＲＮＡ転写物の生成をもたらす条件下で、ＤＮＡ鋳型を請求項１〜３２のいずれか１項に記載のＲＮＡポリメラーゼと接触させることを含む、インビトロ転写（ＩＶＴ）反応を行う方法。
【請求項３５】
前記生成されたＲＮＡ転写物が、任意選択により未精製の形態で細胞に送達されたとき、野生型ＲＮＡポリメラーゼを用いて生成されたＲＮＡと比較して少なくとも５０％低いサイトカイン応答を刺激する、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項３６】
生成された二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）転写物の濃度が、野生型ポリメラーゼを使用して生成されたｄｓＲＮＡ転写物と比較して少なくとも５０％低い、請求項３３〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記生成されたＲＮＡ転写物の２０％未満が、３´不均一性を示す、請求項３３〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記生成されたＲＮＡ転写物の５０％未満が、二本鎖混入物である、請求項３３〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記生成されたＲＮＡ転写物の５０％未満が、ランオンＲＮＡ転写物である、請求項３３〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
生成された完全長ＲＮＡ転写物の量が、前記ＤＮＡ鋳型の量よりも少なくとも１５倍大きい、請求項３３〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
二本鎖混入物：生成された完全長ＲＮＡ転写物の比が、１：１未満である、請求項３３〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記生成されたＲＮＡ転写物が、前記ＤＮＡ鋳型と比較して１００ヌクレオチドあたり１未満の変異を有する、請求項３３〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
請求項１〜３２のいずれか１項に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアントをコードする核酸。
【請求項４４】
請求項４３に記載の核酸を含むベクター。
【請求項４５】
請求項４３に記載の核酸または請求項４４に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項４６】
請求項１〜３２のいずれか１項に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント及び任意選択によりインビトロ転写（ＩＶＴ）試薬を含む、組成物またはキット。
【請求項４７】
請求項３３〜４２のいずれか１項に記載の方法により生成される、リボ核酸（ＲＮＡ）、任意選択によりメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）。
【請求項４８】
脂質ナノ粒子中に製剤化された請求項４７に記載のＲＮＡであって、任意選択により、前記脂質ナノ粒子が、２０〜６０％のイオン化可能なアミノ脂質、５〜２５％の非カチオン性脂質、２５〜５５％のステロール、及び０．５〜１５％のＰＥＧ修飾脂質のモル比を含む、前記ＲＮＡ。
【請求項４９】
ＲＮＡ転写物を生成するためのインビトロ転写反応条件下で、ポリヌクレオチド鋳型をＲＮＡポリメラーゼバリアント、任意選択によりＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント、ヌクレオシド三リン酸、及びキャップ類似体と反応させることを含む、リボ核酸（ＲＮＡ）合成のための共転写キャッピング方法。
【請求項５０】
前記生成されたＲＮＡ転写物の８０％超、８５％超、９０％超、または９５％超が、機能性キャップを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記ヌクレオシド三リン酸が、非修飾もしくは修飾ＡＴＰ、修飾もしくは非修飾ＵＴＰ、修飾もしくは非修飾ＧＴＰ、及び／または修飾もしくは非修飾ＣＴＰを含む、請求項４９または５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記ＲＮＡポリメラーゼバリアントが、請求項１〜３２のいずれか１つに記載のＲＮＡポリメラーゼバリアントである、請求項４９〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記ヌクレオシド三リン酸及びキャップ類似体が、前記反応において等モル濃度で存在する、請求項４９〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記反応におけるキャップ類似体とヌクレオシド三リン酸とのモル比が、１：１より大きいか、または１：１に等しく、任意選択により、前記ヌクレオシド三リン酸がＧＴＰ及び／またはＡＴＰを含む、請求項４９〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記キャップ類似体が、ジヌクレオチドキャップ、トリヌクレオチドキャップ、またはテトラヌクレオチドキャップである、請求項４９〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
前記キャップが、以下の配列：ＧＡＡ、ＧＡＣ、ＧＡＧ、ＧＡＵ、ＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、ＧＣＵ、ＧＧＡ、ＧＧＣ、ＧＧＧ、ＧＧＵ、ＧＵＡ、ＧＵＣ、ＧＵＧ、及びＧＵＵから選択される配列を含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記トリヌクレオチドキャップが、以下の配列：
（ａ）ｍ７ＧｐｐｐＡｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＡｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＡｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＡｐＵ、ｍ７ＧｐｐｐＣｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＣｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＣｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＣｐＵ、ｍ７ＧｐｐｐＧｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＧｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＧｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＧｐＵ、ｍ７ＧｐｐｐＵｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＵｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＵｐＧ、及びｍ７ＧｐｐｐＵｐＵ；
（ｂ）ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡｐＡ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡｐＣ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡｐＧ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡｐＵ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣｐＡ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣｐＣ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣｐＧ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣｐＵ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧｐＡ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧｐＣ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧｐＧ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧｐＵ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵｐＡ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵｐＣ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵｐＧ、及びｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵｐＵ；
（ｃ）ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＡ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＣ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＧ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＵ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＡ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＣ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＧ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＵ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＡ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＣ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＧ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＵ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＡ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＣ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＧ、及びｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＵ；または
（ｄ）ｍ７ＧｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＵ、ｍ７ＧｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＵ、ｍ７ＧｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＵ、ｍ７ＧｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＧ、及びｍ７ＧｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＵから選択される配列を含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記トリヌクレオチドキャップが、以下の配列：ＧＡＧ、ＧＣＧ、ＧＵＧ、及びＧＧＧから選択される配列を含む、請求項５６または５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記トリヌクレオチドキャップが、配列ＧＡＧを含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記トリヌクレオチドキャップが、ＧｐｐｐＡ２′ＯｍｅｐＧを含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記ポリヌクレオチド鋳型が、鋳型位置＋１に２´−デオキシチミジン残基を含む、請求項４９〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
前記ポリヌクレオチド鋳型が、鋳型位置＋１に２´−デオキシシチジン残基を含む、請求項４９〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
ＲＮＡ合成のための共転写キャッピング方法であって、ＲＮＡ転写物を生成するためのインビトロ転写反応条件下で、ポリヌクレオチド鋳型を（ａ）Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントであって、野生型ＲＮＡポリメラーゼと比較して、前記ＲＮＡポリメラーゼバリアントが開始複合体から伸長複合体に移行するにつれてＲＮＡポリメラーゼバリアントの少なくとも１つのループ構造にヘリックス構造へのコンフォメーション変化を受けさせる少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、前記Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント、（ｂ）ヌクレオシド三リン酸、及び（ｃ）配列ＧｐｐｐＡ２′ＯｍｅｐＧを含むトリヌクレオチドキャップと反応させることを含み、前記ポリヌクレオチド鋳型が、鋳型位置＋１に２´−デオキシチミジン残基を含む、前記方法。
【請求項６４】
前記生成されたＲＮＡ転写物が、任意選択により未精製の形態で、細胞に送達されたときに、検出可能なサイトカイン応答を刺激しないか、またはベースライン対照を上回るサイトカイン応答を刺激しない、請求項４９〜６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
インビトロ転写（ＩＶＴ）ＲＮＡ及び薬学的に許容される賦形剤を含む組成物であって、ＩＶＴ後の精製なしでサイトカイン誘導ＲＮＡ混入物を実質的に含まない、前記組成物。
【請求項６６】
インビトロ転写（ＩＶＴ）ＲＮＡ及び薬学的に許容される賦形剤を含む組成物であって、５％未満のキャップされていないＲＮＡ種を含む、前記組成物。
【請求項６７】
前記ＩＶＴ  ＲＮＡの８０％超、８５％超、９０％超、または９５％超が機能性キャップを含む、請求項６５または６６に記載の組成物。
【請求項６８】
前記ＩＶＴ  ＲＮＡが化学修飾されていない、請求項６５〜６７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６９】
前記ＩＶＴ  ＲＮＡが化学修飾されている、請求項６５〜６７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７０】
前記ＩＶＴ  ＲＮＡの９５％超が、一本鎖完全長転写物を含む、請求項６５〜６９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７１】
前記ＲＮＡが、
ＲＮＡ転写物を生成するためのインビトロ転写反応条件下で、ポリヌクレオチド鋳型を（ａ）Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントであって、野生型ＲＮＡポリメラーゼと比較して、前記ＲＮＡポリメラーゼバリアントが開始複合体から伸長複合体に移行するにつれてＲＮＡポリメラーゼバリアントの少なくとも１つのループ構造にヘリックス構造へのコンフォメーション変化を受けさせる少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、前記Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント、（ｂ）ヌクレオシド三リン酸、及び（ｃ）配列ＧｐｐｐＡ２′ＯｍｅｐＧを含むトリヌクレオチドキャップと反応させることを含むプロセスによって生成され、前記ポリヌクレオチド鋳型が、鋳型位置＋１に２´−デオキシチミジン残基を含む、請求項６５〜７０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７２】
野生型Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼと少なくとも９０％の同一性を有し、（ａ）配列番号１のアミノ酸４７位に対応するアミノ酸位置のアラニン及び（ｂ）追加のＣ末端グリシンを含むように修飾されているアミノ酸配列を含む、Ｔ７リボ核酸（ＲＮＡ）ポリメラーゼ。
【請求項７３】
トリヌクレオチドキャップをさらに含む、請求項７２に記載のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ。
【請求項７４】
前記トリヌクレオチドキャップが、ＧｐｐｐＡ２′ＯｍｅｐＧである、請求項７３に記載のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ。
【請求項７５】
野生型Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼと少なくとも９０％の同一性を有し、（ａ）配列番号１のアミノ酸４３位に対応するアミノ酸位置のアラニン及び（ｂ）追加のＣ末端グリシンを含むように修飾されているアミノ酸配列を含む、Ｔ７リボ核酸（ＲＮＡ）ポリメラーゼ。
【請求項７６】
トリヌクレオチドキャップをさらに含む、請求項７５に記載のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ。
【請求項７７】
前記トリヌクレオチドキャップが、ＧｐｐｐＡ２′ＯｍｅｐＧである、請求項７６に記載のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１７年８月１８日に出願された米国仮出願第６２／５４７，６７７号、２０１８年２月９日に出願された米国仮出願第６２／６２８，４８４号、及び２０１８年３月５日に出願された米国仮出願第６２／６３８，６８４号、２０１８年５月２９日に出願された米国仮出願第６２／６７７，５２７号の３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）下の利益を主張し、それらの各出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
インビトロ転写（ＩＶＴ）は、バクテリオファージＤＮＡ依存性リボ核酸（ＲＮＡ）ポリメラーゼ（例えば、ＳＰ６、Ｔ３、及びＴ７）を使用して、鋳型に対するｍＲＮＡ転写物を合成する。ＩＶＴ反応における問題により、完全な失敗（例えば、転写物が生成しない）またはサイズが正しくない（例えば、予想よりも短いまたは長い）転写物となり得る。ＩＶＴ反応に関連する特定の問題には、例えば、アボーティブ（ａｂｏｒｔｉｖｅ）（切断型）転写物、ランオン（ｒｕｎ−ｏｎ）転写物、ポリＡテールバリアント／３´不均一性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）、変異転写物、及び／または反応中に生成される二本鎖混入物が含まれる。
【０００３】
ＲＮＡポリメラーゼは、転写の３つの段階−開始、伸長、及び終了を示す。開始段階では、ＲＮＡポリメラーゼは、特定のプロモーターＤＮＡ配列に結合し、ＤＮＡ二重鎖を開かせ、鋳型鎖を活性部位へと供給する。例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは、プロモーターと相互作用してＤＮＡ二重鎖融解を開始する６つのヘリックス束のサブドメイン（プロモーター結合ドメイン）を含む開始複合体と呼ばれる構造を形成する。ポリメラーゼは、プロモーターに結合している間、２〜１２ヌクレオチド（ｎｔ）の長さの短い多くの（切断型）転写物を生成し、プロセスはしばしばアボーティブ合成／開始と呼ばれる。切断型ＲＮＡ転写物は、ＲＮＡポリメラーゼによって完全長の転写物に変換され得ず、転写中に蓄積する副産物となる。伸長段階への移行及びプロモーターのリリース後、ポリメラーゼは、ＤＮＡ鋳型へと働きかけ、完全長ＲＮＡ転写物を生成する。
【０００４】
伸長段階の間、ＲＮＡポリメラーゼはしばしば、終了が開始されるべき位置を超えてＤＮＡを転写し続け、予想よりも長いＲＮＡ転写物（「ランオン転写物」）を生成する。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは、例えば、鋳型から「フォーリングオフする（ｆａｌｌｉｎｇ  ｏｆｆ）」前に、ヌクレオチドを転写物の末端に追加する。研究では、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによってインビトロで生成された転写物の７０％超がランオン転写物であり得ることが示唆されている。いくつか場合では、これらの異常なＲＮＡ産物は、コードされた配列の２倍の長さである。ランオン転写は推計学的であるため、所与のＩＶＴ反応における生成物中に多くの３´不均一性がしばしば存在する。この３´不均一性は、規定の長さ及び／またはヌクレオチド組成のＲＮＡ転写物に依存するライゲーション反応などの下流での用途において問題になる。
【発明の概要】
【０００５】
転写開始の際、ＲＮＡポリメラーゼは２つの相反する段階の平衡を保つ。ポリメラーゼはまず、２つのＤＮＡ鎖（そのうちの１つは鋳型鎖である）の解離を可能にするのに十分にしっかりとプロモーターと結合し、転写を開始する必要がある。次いで、ポリメラーゼはプロモーターをリリースし、高度にプロセッシブな（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｅ）伸長段階に入る必要がある。これらの２つの段階の間の競合により、アボーティブな転写物が生成する。ポリメラーゼは繰り返しプロモーターを除こうとするが、移行障壁を克服することができず、短い（アボーティブな）ＲＮＡ産物を放出する。逆に、ポリメラーゼはしばしばＤＮＡ鋳型を「ランオフ」せず、３´不均一性を有するＲＮＡ転写物の集団を生成する。例えば、インビトロ転写（ＩＶＴ）反応において生成される転写効率及び３´均一性を増加させるバリアントＲＮＡポリメラーゼ、ランオン転写物、二本鎖混入物、またはそれらの任意の組み合わせが本明細書で提供される。
【０００６】
開始から伸長への移行中に、ＲＮＡポリメラーゼは、アミノ末端ドメイン（Ｎ末端ドメイン）の大きな再配列を必要とするコンフォメーション変化を受ける（例えば、Ｂａｎｄｗａｒ，ＲＰ  ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８２，２２８７９−２２８８６（２００９）；Ｇｕｉｌｌｅｒｅｚ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １０２，５９５８−５９６３（２００５）；Ｄｕｒｎｉａｋ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）３２２，５５３（２００８）；及びＴａｈｉｒｏｖ，Ｔ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ４２０，４３−５０（２００２）を参照のこと、これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる）。このＮ末端ドメイン内には、「Ｃヘリックス」（例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸２８〜７１）及び「Ｃリンカー」（例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸２５８〜２６６）があり、その各々が、ＲＮＡポリメラーゼが開始複合体から伸長複合体に移行するにつれて、プロモーター結合部位が廃棄され、活性部位が拡張され、ＲＮＡ転写物の出口トンネルが作出される、ループ構造からヘリックス構造へのコンフォメーション変化を受けるサブ領域（それぞれ、アミノ酸４２〜４７及び２５７〜２６２）を含む（例えば、図１０を参照のこと）。Ｃヘリックス構造のサブ領域及び／またはＣリンカーのリンカー領域に対する変異は、開始複合体と比較して伸長複合体の熱力学的安定性を高めることにより、伸長複合体に対するコンフォメーション平衡を推進し得る。理論に縛られることなく、Ｃヘリックス構造及び／またはＣリンカーのリンカー領域などの選択領域の変異は、伸長中にポリメラーゼの出口トンネルが転写物と相互作用する方法を変化させることができ、転写エラー（例えば、ランオン転写物）を大幅に減少させると考えられている。したがって、本開示のバリアントポリメラーゼは、Ｃヘリックス及び／またはＣリンカーにおいて、伸長複合体に対するコンフォメーション平衡を推進するための（少なくとも１つの）変異を含む。
【０００７】
本明細書で提供されるように、ポリメラーゼが開始から伸長に進むにつれてヘリックス構造に移行するループ構造を含むＮ末端ドメインの他の領域は、変異され得る（置換と呼ばれる、点変異）。そのようなループ−ヘリックス（ｌｏｏｐ−ｔｏ−ｈｅｌｉｘ）領域の非限定的な例には、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、配列番号１）のアミノ酸５５〜７３、１６４〜１６９、もしくは１７６〜１８７に及ぶ領域、または前述の領域と相同である（例えば、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一である）他の単一サブユニットＲＮＡポリメラーゼの領域（例えば、Ｃｅｒｍａｋｉａｎ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｖｏｌ  ４５，６７１−６８１（１９９７）を参照のこと）を含む。他の単一サブユニットＲＮＡポリメラーゼの非限定的な例には、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｋ１１  ＲＮＡポリメラーゼ、及びＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼが含まれる。
【０００８】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼバリアント（例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント）は、高ヘリックス性向を有する残基（例えば、アラニン）か、または骨格柔軟性を伸長複合体の骨格柔軟性に特異的に一致させる残基に対する変異を含む。
【０００９】
ポリメラーゼのＣ末端に少なくとも１つの追加のアミノ酸を含むＲＮＡポリメラーゼバリアントが本明細書でさらに提供される。例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、ポリメラーゼのＣ末端に、追加のグリシン（Ｇ）などの少なくとも１つの追加のアミノ酸を含み得る。驚くべきことに、Ｃ末端「足（ｆｏｏｔ）」領域（例えば、野生型Ｔ７  ＲＮＡＰの８８０〜８８３位に「ＦＡＦＡ」アミノ酸を含む領域）に追加のＧを含むように修飾されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用して生成されたＲＮＡ転写物の集団は、より少ない３´不均一性を示す。例えば、図２３に示すように、Ｃ末端グリシン（すなわち、…ＦＡＦＡＧ）を含むＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、転写物の少なくとも８５％が３´末端において均一であるＲＮＡ転写物集団を生成する。これまでの研究では、Ｃ末端の付加／挿入によりＴ７ポリメラーゼの機能が失われることが示されていることを考慮すると、このデータは特に予想外である（Ｇａｒｄｎｅｒ  ＬＰ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６，２９０８−２９１８（１９９７）及びＧｒｏｓｓ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２２８，４８８−５０５（１９９２））。
【００１０】
本明細書に記載されているＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント（例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントＧ４７ＡまたはＧ４７Ａ＊  Ｃ末端バリアント）を使用したインビトロ転写アッセイにおいて、ｓｓＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）をキャップ類似体（例えば、トリヌクレオチド）で共転写で（ｃｏ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｌｙ）キャッピングする方法（共転写キャッピング方法）もまた、本明細書で提供される。効率的な共転写キャッピングには、通常、５′ＡＴＰならびに等モル濃度のＮＴＰ及びトリヌクレオチドを用いて転写を開始する二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）鋳型が含まれる。これらの条件下で、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、５′ＡＴＰを用いると開始活性が著しく低下する。予想外に、本明細書で提供されるデータは、ＧＡＧトリヌクレオチド（例えば、ｍ７ＧｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＧ）の存在下において、例えば、５′ＡＴＰを用いたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼの限定された開始活性は、５′ＡＴＰではなくトリヌクレオチドで開始が推進され、キャップされたＲＮＡを共転写で生成する。驚くべきことに、いくつかの実施形態では、生成されたＲＮＡの９０％超が一本鎖完全長転写物を含み、生成されたＲＮＡの少なくとも９０％が機能性キャップを含み、生成されたＲＮＡがＩＶＴ後に精製なしでも実質的なサイトカイン応答を示さない。
【００１１】
したがって、本開示のいくつかの態様は、野生型ＲＮＡポリメラーゼと比較して、ＲＮＡポリメラーゼバリアントが開始複合体から伸長複合体に移行するにつれてＲＮＡポリメラーゼバリアントの少なくとも１つのループ構造にヘリックス構造へのコンフォメーション変化を受けさせる少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、ＲＮＡポリメラーゼバリアントを提供する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、開始複合体よりも伸長複合体においてフォールディング自由エネルギーの負の変化が大きいと推定される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、野生型アミノ酸と比較して、高いヘリックス性向を有する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、Ｃ末端に（少なくとも１つの）追加のアミノ酸残基を含む。例えば、ＲＮＡポリメラーゼバリアント（例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント）は、Ｃ末端にグリシン（Ｇ）を含み得る。
【００１２】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、Ｋ１１  ＲＮＡポリメラーゼである。
【００１３】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのループ構造が、Ｃヘリックス構造中にある。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのループ構造が、Ｃリンカー構造中にある。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのループ構造が、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸５５〜７３、１６４〜１６９、もしくは１７６〜１８７、またはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼに相同なＲＮＡポリメラーゼ内の領域に存在する。
【００１４】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、少なくとも１つの高ヘリックス性向アミノ酸置換である。例えば、少なくとも１つの高ヘリックス性向アミノ酸置換は、アラニン、イソロイシン、ロイシン、アルギニン、メチオニン、リジン、グルタミン、及び／またはグルタミン酸から選択され得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの高ヘリックス性向アミノ酸置換は、アラニンである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの高ヘリックス性向アミノ酸置換は、イソロイシンである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの高ヘリックス性向アミノ酸置換は、ロイシンである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの高ヘリックス性向アミノ酸置換は、アルギニンである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの高ヘリックス性向アミノ酸置換は、メチオニンである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの高ヘリックス性向のアミノ酸置換は、リジンである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの高ヘリックス性向のアミノ酸置換は、グルタミンである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの高ヘリックス性向アミノ酸置換は、グルタミン酸である。
【００１５】
いくつかの実施形態では、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは、Ｅ４２（例えば、Ｅ４２Ｒ）、Ｓ４３（例えば、Ｓ４３Ａ）、Ｙ４４（例えば、Ｙ４４Ａ）、Ｅ４５（例えば、Ｅ４５Ｒ／Ｌ）、Ｍ４６（例えば、Ｍ４６Ａ）、Ｇ４７（例えば、Ｇ４７Ａ）、Ａ２５５（例えば、Ａ２５５Ｋ／Ｑ／Ｙ／Ｉ）、Ｒ２５７（例えば、Ｒ２５７Ａ）、Ａ２５８（例えば、Ａ２５８Ｒ／Ｅ／Ｌ）、Ｇ２５９（例えば、Ｇ２５９Ａ）、Ａ２６０（例えば、Ａ２６０Ｒ／Ｅ／Ｌ）、Ｌ２６１（例えば、Ｌ２６１Ａ）及びＡ２６２（例えば、Ａ２６２Ｒ／Ｅ／Ｌ）から選択される少なくとも１つの位置に高ヘリックス性向アミノ酸の少なくとも１つのアミノ酸置換を含むように修飾される。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは、いくつかの実施形態では、（少なくとも１つの高ヘリックス性向アミノ酸置換に加えて）１つ以上の追加のアミノ酸置換をさらに含み得る。したがって、本開示は、本明細書で提供される１つ以上の高ヘリックス性向アミノ酸置換を有する既存の（例えば、現在入手できる及び／または市販の）Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントのさらなる修飾を包含する。
【００１６】
いくつかの実施形態では、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは、Ｅ４２（例えば、Ｅ４２Ｒ）、Ｓ４３（例えば、Ｓ４３Ａ）、Ｙ４４（例えば、Ｙ４４Ａ）、Ｅ４５（例えば、Ｅ４５Ｒ／Ｌ）、Ｍ４６（例えば、Ｍ４６Ａ）及びＧ４７（例えば、Ｇ４７Ａ）から選択される位置に高ヘリックス性向アミノ酸の少なくとも１つのアミノ酸置換を含むように修飾された配列番号１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｓ４３Ａを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｇ４７Ａを含む。
【００１７】
いくつかの実施形態では、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは、Ｅ４２（例えば、Ｅ４２Ｒ）、Ｓ４３（例えば、Ｓ４３Ａ）、Ｙ４４（例えば、Ｙ４４Ａ）、Ｅ４５（例えば、Ｅ４５Ｒ／Ｌ）、Ｍ４６（例えば、Ｍ４６Ａ）及びＧ４７（例えば、Ｇ４７Ａ）から選択される位置に高ヘリックス性向アミノ酸の少なくとも１つのアミノ酸置換を含むように修飾された配列番号９９、配列番号１００、配列番号２９４、配列番号２９５、または配列番号２９６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｓ４３Ａを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｇ４７Ａを含む。
【００１８】
いくつかの実施形態では、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは、Ａ２５５（例えば、Ａ２５５Ｋ／Ｑ／Ｙ／Ｉ）、Ｒ２５７（例えば、Ｒ２５７Ａ）、Ａ２５８（例えば、Ａ２５８Ｒ／Ｅ／Ｌ）、Ｇ２５９（例えば、Ｇ２５９Ａ）、Ａ２６０（例えば、Ａ２６０Ｒ／Ｅ／Ｌ）、Ｌ２６１（例えば、Ｌ２６１Ａ）及びＡ２６２（例えば、Ａ２６２Ｒ／Ｅ／Ｌ）から選択される位置に高ヘリックス性向アミノ酸の少なくとも１つのアミノ酸置換を含むように修飾された配列番号１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｒ２５７Ａを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｇ２５９Ａを含む。
【００１９】
いくつかの実施形態では、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは、Ａ２５５（例えば、Ａ２５５Ｋ／Ｑ／Ｙ／Ｉ）、Ｒ２５７（例えば、Ｒ２５７Ａ）、Ａ２５８（例えば、Ａ２５８Ｒ／Ｅ／Ｌ）、Ｇ２５９（例えば、Ｇ２５９Ａ）、Ａ２６０（例えば、Ａ２６０Ｒ／Ｅ／Ｌ）、Ｌ２６１（例えば、Ｌ２６１Ａ）及びＡ２６２（例えば、Ａ２６２Ｒ／Ｅ／Ｌ）から選択される位置に高ヘリックス性向アミノ酸の少なくとも１つのアミノ酸置換を含むように修飾された配列番号９９、配列番号１００、配列番号２９４、配列番号２９５、または配列番号２９６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｒ２５７Ａを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｇ２５９Ａを含む。
【００２０】
いくつかの態様では、位置Ｇ４７、Ｓ４３、Ｒ２５７、またはＧ２５９に高ヘリックス性向アミノ酸（例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシン、アルギニン、メチオニン、リジン、グルタミン、及び／またはグルタミン酸）のアミノ酸置換を含むように修飾された配列番号１のアミノ酸配列を含むＴ７  ＲＮＡポリメラーゼもまた、本明細書で提供される。いくつかの態様では、位置Ｇ４７、Ｓ４３、Ｒ２５７、またはＧ２５９に高ヘリックス性向アミノ酸（例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシン、アルギニン、メチオニン、リジン、グルタミン、及び／またはグルタミン酸）のアミノ酸置換を含むように修飾された配列番号９９、配列番号１００、配列番号２９４、配列番号２９５、または配列番号２９６のアミノ配列を含むＴ７  ＲＮＡポリメラーゼがさらに提供される。
【００２１】
いくつかの実施形態では、本開示のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼは、配列番号１０７もしくは１０８、配列番号１０９もしくは１１０、配列番号１１１もしくは１１２、または配列番号１１３もしくは１１４のアミノ酸配列を含む。
【００２２】
いくつかの実施形態では、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは、少なくとも１つの追加のＣ末端アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは、少なくとも２つの追加のＣ末端アミノ酸を含む。
【００２３】
いくつかの実施形態では、少なくとも２つの追加のＣ末端アミノ酸は、同じ種類のアミノ酸（例えば、すべてＧｌｙ、すべてＡｌａ）を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つの追加のＣ末端アミノ酸は、少なくとも２つの異なる種類のアミノ酸（例えば、ＧｌｙＡｌａ、ＡｌａＧｌｙ）を含む。
【００２４】
いくつかの実施形態では、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは、少なくとも３つの追加のＣ末端アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも３つの追加のＣ末端アミノ酸は、少なくとも２つもしくは少なくとも３つの同じ種類または異なる種類のアミノ酸（例えば、ＧｌｙＧｌｙＧｌｙ、ＡｌａＡｌａＡｌａ）を含む。
【００２５】
いくつかの実施形態では、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは、１〜１０個（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個）の追加のＣ末端アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは、１〜５つの追加のＣ末端アミノ酸を含む。
【００２６】
いくつかの実施形態では、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼはＦＡＦＡＸｎモチーフを含むＣ末端を含み、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｎはゼロより大きい任意の整数である。いくつかの実施形態では、Ｘはグリシン（Ｇ）である。いくつかの実施形態では、ｎは１、２、３、４、または５である。ｎが１より大きく、したがって、Ｃ末端モチーフは、例えばＦＡＦＸＸ、ＦＡＦＡＸＸＸ、ＦＡＦＡＸＸＸＸ、またはＦＡＦＡＸＸＸＸＸである実施形態では、例えば、Ｘ´が同じアミノ酸であり得、または異なるアミノ酸であり得ると理解されるべきである。例えば、Ｃ末端モチーフは、ＦＡＦＡＧＧもしくはＦＡＦＡＧＧＧであってもよく、またはＣ末端モチーフは、ＦＡＦＡＧＡ、ＦＡＦＡＧＣ、ＦＡＦＡＧＡＡ、ＦＡＦＡＧＡＧ、ＦＡＦＡＧＡＣなどであり得る。他のＣ末端アミノ酸の組み合わせを使用し得る。
【００２７】
いくつかの実施形態では、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは、ＦＡＦＡＧモチーフを含むＣ末端を含む。
【００２８】
いくつかの実施形態では、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは、ＸＡＦＡＸｎモチーフ、ＦＸＦＡＸｎモチーフ、ＦＡＸＡＸｎモチーフ、またはＦＡＦＸＸｎモチーフを含み、各Ｘは任意のアミノ酸であり、ｎはゼロより大きい任意の整数である。したがって、本開示は、様々なＣ末端、Ｆ８８０Ａ８８１Ｆ８８２Ａ８８３モチーフを含み、８８０位、８８１位、８８２位、または８８３位のうちの１つ以上のアミノ酸（例えば、野生型Ｔ７  ＲＮＡＰと比較して、例えば、配列番号１）が、追加のＣ末端アミノ酸（Ｘｎ）の有無にかかわらず、少なくとも１つのアミノ酸置換を含むように修飾されている。
【００２９】
いくつかの態様では、本開示は、対応する野生型ＲＮＡポリメラーゼと比較して少なくとも１つの追加のＣ末端アミノ酸を含む、ＲＮＡポリメラーゼを提供する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ、及びＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼから選択される。
【００３０】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、少なくとも１つの追加のアミノ酸置換をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、Ｇ４７Ａ、Ｓ４３Ａ、Ｒ２５７Ａ、及びＧ２５９Ａから選択される配列番号１のアミノ酸置換に対応するアミノ酸置換をさらに含む。
【００３１】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、４３±１（例えば、４２、４３、または４４）位、４７±１（例えば、４６、４７、または４８）位、２５７±１（例えば、２５６位、２５７位、または２５８）位，及び／または２５９±１（例えば、２５８位、２５９位、または２６０）位にアミノ酸を含むように修飾された、配列番号１と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含むＴ７  ＲＮＡポリメラーゼであり、任意選択により、アミノ酸置換はアラニン（Ａ）である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、野生型Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの４３±１位、４７±１位、２５７±１位，及び／または２５９±１位（配列または構造アライメントに基づく）に対応する位置にアミノ酸置換を含むように修飾された、配列番号６と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含むＴ３  ＲＮＡポリメラーゼであり、任意選択により、アミノ酸置換はアラニン（Ａ）である。いくつかの実施形態では、野生型Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの４３±１位、４７±１位、２５７±１位，及び／または２５９±１位（配列または構造アライメントに基づく）に対応する位置にアミノ酸置換を含むように修飾された、配列番号７と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含むＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼであり、任意選択により、アミノ酸置換はアラニン（Ａ）である。
【００３２】
本開示のいくつかの態様は、４３位、４７位、２５７位，及び／または２５９位にアミノ酸置換を含むように修飾された、配列番号１と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含むＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを提供し、任意選択により、アミノ酸置換はアラニン（Ａ）である。
【００３３】
本開示の他の態様は、野生型Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの４３位、４７位、２５７位、及び／または２５９位に対応する位置にアミノ酸置換を含むように修飾された、配列番号６と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含むＴ３  ＲＮＡポリメラーゼを提供し、任意選択により、アミノ酸置換はアラニン（Ａ）である。したがって、いくつかの実施形態では、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼは、４４位、４８位、２５８位，及び／または２６０位にアミノ酸置換を含むように修飾された、配列番号６と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含み、任意選択により、アミノ酸置換はアラニン（Ａ）である。
【００３４】
本開示のさらに他の態様は、野生型Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの４３位、４７位、２５７位、及び／または２５９位に対応する位置にアミノ酸置換を含むように修飾された、配列番号７と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含むＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼを提供し、任意選択により、アミノ酸置換はアラニン（Ａ）である。したがって、いくつかの実施形態では、ＳＰ６  ＴＮＡポリメラーゼは、１５位、１９位、２３０位，及び／または２３２位にアミノ酸置換を含むように修飾された、配列番号７と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含み、任意選択により、アミノ酸置換はアラニン（Ａ）である。
【００３５】
本開示はまた、ＲＮＡ転写物の生成をもたらす条件下で（例えばＩＶＴ条件下で）、ＤＮＡ鋳型を本明細書に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアントと接触させることを含む、ＲＮＡの生成方法を提供する。
【００３６】
本開示は、ヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）及び緩衝液の存在下において、ＲＮＡ転写物の生成をもたらす条件下で、ＤＮＡ鋳型を本明細書で提供されるＲＮＡポリメラーゼバリアントと接触させることを含む、ＩＶＴ反応を行う方法をさらに提供する。
【００３７】
いくつかの実施形態では、生成されたＲＮＡ転写物は、任意選択により未精製形態で細胞に送達されたときに、同じＩＶＴ条件下で野生型ＲＮＡポリメラーゼを使用して生成されたＲＮＡと比較して、少なくとも５０％（例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％）低いサイトカイン応答を刺激する。
【００３８】
いくつかの実施形態では、ＩＶＴにより生成されたｄｓＲＮＡ転写物の濃度は、野生型ポリメラーゼを使用して生成されたｄｓＲＮＡ転写物と比較して、少なくとも５０％（例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％）低い。
【００３９】
いくつかの実施形態では、生成されたＲＮＡ転写物の２０％未満（例えば、１５％未満、１０％未満、５％未満）が３´不均一性を示す。
【００４０】
いくつかの実施形態では、生成されたＲＮＡ転写物の５０％未満（例えば、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満）が切断型ＲＮＡ転写物である。
【００４１】
いくつかの実施形態では、生成されたＲＮＡ転写物の５０％未満（例えば、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満）がランオンＲＮＡ転写物である。
【００４２】
いくつかの態様では、生成された全長ＲＮＡ転写物の量が、ＤＮＡ鋳型の量よりも少なくとも１５倍大きい。
【００４３】
いくつかの実施形態では、切断型ＲＮＡ転写物：生成された完全長ＲＮＡ転写物の比率が、１：１未満である。
【００４４】
いくつかの実施形態では、生成されたＲＮＡ転写物は、ＤＮＡ鋳型と比較して１００ヌクレオチドあたり１未満の変異を有する。
【００４５】
本開示は、いくつかの態様では、ＲＮＡポリメラーゼバリアントをコードする核酸を提供し、いくつかの実施形態では、該核酸を含むベクター（例えばプラスミド）及び／または宿主細胞（例えば哺乳動物細胞、例えばヒト細胞）を提供する。
【００４６】
本開示の方法により生成されたＲＮＡ転写物も提供される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写物（例えば、ｍＲＮＡ）は、脂質ナノ粒子中に製剤化される。脂質ナノ粒子は、例えば、２０〜６０％のイオン化可能なアミノ脂質、５〜２５％の非カチオン性脂質、２５〜５５％のステロール、及び０．５〜１５％のＰＥＧ修飾脂質のモル比を含み得る。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、２０１７年４月２７日に公開されたＷＯ２０１７／０７０６２４を参照のこと。
【００４７】
ＲＮＡポリメラーゼバリアントを含む他の組成物及びキットが本明細書で包含される。
【００４８】
リボ核酸（ＲＮＡ）合成のための共転写キャッピング方法であって、ＲＮＡ転写物を生成するためのインビトロ転写反応条件下で、ポリヌクレオチド鋳型をＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント、ヌクレオシド三リン酸、及びキャップ類似体と反応させることを含む方法も本明細書で提供される。
【００４９】
いくつかの実施形態では、生成されたＲＮＡ転写物の８０％超、８５％超、または９０％超が機能性キャップを含む。いくつかの実施形態では、生成されたＲＮＡ転写物の９５％超が機能性キャップを含む。
【００５０】
いくつかの実施形態では、ヌクレオシド三リン酸は、非修飾もしくは修飾ＡＴＰ、修飾もしくは非修飾ＵＴＰ、修飾もしくは非修飾ＧＴＰ、及び／または修飾もしくは非修飾ＣＴＰを含む。
【００５１】
いくつかの実施形態では、Ｔ７ポリメラーゼバリアントは、Ｅ４２、Ｓ４３、Ｙ４４、Ｅ４５、Ｍ４６、Ｇ４７、Ａ２５５、Ｒ２５７、及びＧ２５９から選択される位置に高性向アミノ酸の少なくとも１つのアミノ酸置換を含むように修飾された、配列番号１のアミノ酸配列（または配列番号１と９０％〜９９％、例えば少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列）を含む。いくつかの実施形態では、Ｔ７ポリメラーゼバリアントは、Ｇ４７Ａのアミノ酸置換を含むように修飾された、配列番号１のアミノ酸配列（または配列番号１と９０％〜９９％、例えば少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列）を含む。いくつかの実施形態では、Ｔ７ポリメラーゼバリアントは、Ｓ４３Ａのアミノ酸置換を含むように修飾された、配列番号１のアミノ酸配列（または配列番号１と９０％〜９９％、例えば少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列）を含む。
【００５２】
いくつかの実施形態では、Ｔ７ポリメラーゼバリアントは、Ｅ４２、Ｓ４３、Ｙ４４、Ｅ４５、Ｍ４６、Ｇ４７、Ａ２５５、Ｒ２５７、及びＧ２５９から選択される位置に高性向アミノ酸の少なくとも９９つのアミノ酸置換を含むように修飾された、配列番号９９のアミノ酸配列（または配列番号９９と９０％〜９９％、例えば少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列）を含む。いくつかの実施形態では、Ｔ７ポリメラーゼバリアントは、Ｇ４７Ａのアミノ酸置換を含むように修飾された、配列番号９９のアミノ酸配列（または配列番号９９と９０％〜９９％、例えば少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列）を含む。いくつかの実施形態では、Ｔ７ポリメラーゼバリアントは、Ｓ４３Ａのアミノ酸置換を含むように修飾された、配列番号９９のアミノ酸配列（または配列番号９９と９０％〜９９％、例えば少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列）を含む。
【００５３】
いくつかの実施形態では、Ｔ７ポリメラーゼバリアントは、Ｅ４２、Ｓ４３、Ｙ４４、Ｅ４５、Ｍ４６、Ｇ４７、Ａ２５５、Ｒ２５７、及びＧ２５９から選択される位置に高性向アミノ酸の少なくとも１００つのアミノ酸置換を含むように修飾された、配列番号１００のアミノ酸配列（または配列番号１００と９０％〜９９％、例えば少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列）を含む。いくつかの実施形態では、Ｔ７ポリメラーゼバリアントは、Ｇ４７Ａのアミノ酸置換を含むように修飾された、配列番号１００のアミノ酸配列（または配列番号１００と９０％〜９９％、例えば少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列）を含む。いくつかの実施形態では、Ｔ７ポリメラーゼバリアントは、Ｓ４３Ａのアミノ酸置換を含むように修飾された、配列番号１００のアミノ酸配列（または配列番号１００と９０％〜９９％、例えば少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列）を含む。
【００５４】
いくつかの実施形態では、ヌクレオシド三リン酸及びキャップ類似体は、反応において等モル濃度で存在する。いくつかの実施形態では、反応におけるキャップ類似体とヌクレオシド三リン酸とのモル比は、１：１より大きい。いくつかの実施形態では、反応におけるキャップ類似体とヌクレオシド三リン酸とのモル比は、１：１未満である。
【００５５】
いくつかの実施形態では、キャップ類似体は、ジヌクレオチドキャップ、トリヌクレオチドキャップ、またはテトラヌクレオチドキャップである。いくつかの実施形態では、キャップ類似体は、トリヌクレオチドキャップである。
【００５６】
いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、以下の配列：ＧＡＡ、ＧＡＣ、ＧＡＧ、ＧＡＵ、ＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、ＧＣＵ、ＧＧＡ、ＧＧＣ、ＧＧＧ、ＧＧＵ、ＧＵＡ、ＧＵＣ、ＧＵＧ、及びＧＵＵから選択される配列を含む。
【００５７】
いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、以下の配列：ｍ７ＧｐｐｐＡｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＡｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＡｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＡｐＵ、ｍ７ＧｐｐｐＣｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＣｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＣｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＣｐＵ、ｍ７ＧｐｐｐＧｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＧｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＧｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＧｐＵ、ｍ７ＧｐｐｐＵｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＵｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＵｐＧ、及びｍ７ＧｐｐｐＵｐＵから選択される配列を含む。
【００５８】
いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、以下の配列：ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡｐＡ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡｐＣ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡｐＧ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡｐＵ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣｐＡ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣｐＣ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣｐＧ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣｐＵ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧｐＡ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧｐＣ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧｐＧ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧｐＵ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵｐＡ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵｐＣ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵｐＧ、及びｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵｐＵから選択される配列を含む。
【００５９】
いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、以下の配列：ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＡ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＣ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＧ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＵ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＡ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＣ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＧ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＵ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＡ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＣ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＧ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＵ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＡ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＣ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＧ、及びｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＵから選択される配列を含む。
【００６０】
いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、以下の配列：ｍ７ＧｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＵ、ｍ７ＧｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＵ、ｍ７ＧｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＵ、ｍ７ＧｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＧ、及びｍ７ＧｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＵから選択される配列を含む。
【００６１】
いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、以下の配列：ＧＡＧ、ＧＣＧ、ＧＵＧ、及びＧＧＧから選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、配列ＧＡＧを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７ＧｐｐｐＡ２′ＯｍｅｐＧを含む。
【００６２】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド鋳型は、鋳型位置＋１に２´−デオキシチミジン残基を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド鋳型は、鋳型位置＋１に２´−デオキシシチジン残基を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド鋳型は、鋳型位置＋１に２´−デオキシアデノシン残基を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド鋳型は、鋳型位置＋１に２´−デオキシグアノシン残基を含む。
【００６３】
ＲＮＡ合成のための共転写キャッピング方法であって、ＲＮＡ転写物を生成するためのインビトロ転写反応条件下で、ポリヌクレオチド鋳型を（ａ）Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントであって、野生型ＲＮＡポリメラーゼと比較して、該ＲＮＡポリメラーゼバリアントが開始複合体から伸長複合体に移行するにつれてＲＮＡポリメラーゼバリアントの少なくとも１つのループ構造にヘリックス構造へのコンフォメーション変化を受けさせる少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、該Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント、（ｂ）ヌクレオシド三リン酸、及び（ｃ）配列ＧｐｐｐＡ２′ＯｍｅｐＧを含むトリヌクレオチドキャップと反応させることを含み、ポリヌクレオチド鋳型は、鋳型位置＋１に２´−デオキシチミジン残基を含む、該方法も本明細書で提供される。
【００６４】
いくつかの実施形態では、生成されたＲＮＡ転写物は、任意選択により未精製の形態で細胞に送達されたときに、検出可能なサイトカイン応答を刺激しない。
【００６５】
インビトロ転写（ＩＶＴ）ＲＮＡ及び薬学的に許容される賦形剤を含む組成物であって、ＩＶＴ後の精製なしでサイトカイン誘導ＲＮＡ混入物を実質的に含まない組成物が、本明細書でさらに提供される。
【００６６】
組成物は、いくつかの実施形態では、ＩＶＴ  ＲＮＡ及び薬学的に許容される賦形剤を含み、該組成物は５％未満のキャップされていないＲＮＡ種を有する。
【００６７】
いくつかの実施形態では、ＩＶＴ  ＲＮＡの８０％超、８５％超、または９０％超が機能性キャップを含む。いくつかの実施形態では、ＩＶＴ  ＲＮＡの９５％超が機能性キャップを含む。
【００６８】
いくつかの実施形態では、ＩＶＴ  ＲＮＡは化学修飾されていない。他の実施形態では、ＩＶＴ  ＲＮＡは化学的に修飾されている。
【００６９】
いくつかの実施形態では、ＩＶＴ  ＲＮＡの９５％超が一本鎖完全長転写物を含む。
【００７０】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、ＲＮＡ転写物を生成するためのインビトロ転写反応条件下で、ポリヌクレオチド鋳型を（ａ）Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントであって、野生型ＲＮＡポリメラーゼと比較して、該ＲＮＡポリメラーゼバリアントが開始複合体から伸長複合体に移行するにつれてＲＮＡポリメラーゼバリアントの少なくとも１つのループ構造にヘリックス構造へのコンフォメーション変化を受けさせる少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、該Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント、（ｂ）ヌクレオシド三リン酸、及び（ｃ）配列ＧｐｐｐＡ２′ＯｍｅｐＧを含むトリヌクレオチドキャップと反応させることを含むプロセスによって生成され、ポリヌクレオチド鋳型が、鋳型位置＋１に２´−デオキシチミジン残基を含む。
【００７１】
いくつかの態様では、本開示は、配列番号２９４〜３１３のアミノ酸配列を含むＴ７  ＲＮＡＰバリアントを提供し、ｘは任意のアミノ酸であり、ｎは任意の整数、例えば１〜５（例えば、１、２、３、４、または５）である。
【００７２】
いくつかの態様では、本開示は、ヌクレオシド三リン酸及び緩衝液の存在下において、ＲＮＡ転写物の生成をもたらす条件下で、ＤＮＡ鋳型を本開示のＲＮＡポリメラーゼバリアントと接触させることを含む、ＩＶＴ反応を行う方法を提供する。いくつかの実施形態では、生成されたＲＮＡは、任意選択により未精製形態で細胞に送達されたときに、野生型を使用して生成されたｄｓＲＮＡ転写物と比較して少なくとも５０％低いサイトカイン応答を刺激する。いくつかの実施形態では、ＩＶＴ反応により生成されたＲＮＡ転写物の３０％未満が３´不均一性を示す。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】野生型（ＷＴ）Ｔ７ポリメラーゼまたはＴ７ポリメラーゼバリアントＧ４７Ａ＊（Ｃ末端Ｇを有する）及びＳ４３Ａ＊（Ｃ末端Ｇを有する）を使用して生成されたヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）ｍＲＮＡの２６０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図２】左のパネルは、逆相（ＲＰ）精製ありまたは精製なしのＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼまたはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントＳ４３Ａ＊（Ｃ末端Ｇを有する）もしくはＧ４７Ａ＊（Ｃ末端Ｇを有する）の１つを使用して生成された化学修飾されていないｈＥＰＯ  ＲＮＡ転写物でトランスフェクトされたＢＪ線維芽細胞におけるＩＦＮβ応答を示すグラフを示す。右パネルは、トランスフェクトされた細胞におけるｈＥＰＯ発現を示すグラフを示す。
【図３】上パネルは、逆相（ＲＰ）精製ありまたは精製なしのＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼまたはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントＳ４３Ａ＊（Ｃ末端Ｇを有する）もしくはＧ４７Ａ＊（Ｃ末端Ｇを有する）の１つを使用して生成された化学修飾されたｈＥＰＯ  ＲＮＡ転写物（Ｎ１−メチルシュードウラシル（ｍ１ψ）修飾）でトランスフェクトされたＢＪ線維芽細胞におけるＩＦＮβ応答を示すグラフを示す。下パネルは、逆相（ＲＰ）精製ありまたは精製なしのＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼまたはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントＳ４３Ａ＊（Ｃ末端Ｇを有する）もしくはＧ４７Ａ＊（Ｃ末端Ｇを有する）の１つを使用して生成された化学修飾されたｈＥＰＯ  ＲＮＡ転写物（５−メトキシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ）修飾）でトランスフェクトされた細胞におけるＩＦＮβ応答を示すグラフを示す。
【図４】上パネル及び下パネルは、図３に使用したｈＥＰＯ  ＲＮＡ転写物でトランスフェクトされた細胞におけるｈＥＰＯ発現を示すグラフを示す。Ｎ１−メチルシュードウラシル（ｍ１ψ）修飾ｈＥＰＯ発現は上グラフに示され、５−メトキシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ）修飾ｈＥＰＯ発現は下グラフに示されている。
【図５】ＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼまたはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントＳ４３Ａ＊（Ｃ末端Ｇを有する）もしくはＧ４７Ａ＊（Ｃ末端Ｇを有する）を使用して生成された化学修飾されたｈＥＰＯ  ＲＮＡ転写物でトランスフェクトされた単球由来マクロファージにおけるＩＰ１０応答を示すグラフを示す。
【図６】上パネルは、ＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼまたはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントＳ４３Ａ＊（Ｃ末端Ｇを有する）もしくはＧ４７Ａ＊（Ｃ末端Ｇを有する）を使用して生成された化学修飾されたｈＥＰＯ  ＲＮＡ転写物（Ｎ１−メチルシュードウラシル（ｍ１ψ））でトランスフェクトされた単球由来マクロファージにおけるＩＰ１０応答を示すグラフを示す。下パネルは、ＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼまたはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントＳ４３Ａ＊（Ｃ末端Ｇを有する）もしくはＧ４７Ａ＊（Ｃ末端Ｇを有する）を使用して生成された、化学修飾されたｈＥＰＯ  ＲＮＡ転写物（５−メトキシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ））でトランスフェクトされた単球由来マクロファージにおけるＩＰ１０応答を示すグラフを示す。
【図７】ＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼまたはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントＳ４３Ａ＊（Ｃ末端Ｇを有する）もしくはＧ４７Ａ＊（Ｃ末端Ｇを有する）を使用してＩＶＴ反応により生成された１μｇの化学的に修飾されていないｈＥＰＯ  ＲＮＡ転写物（左）または５μｇの化学的に修飾されていないｈＥＰＯ  ＲＮＡ転写物を使用してｄｓＲＮＡ  ＥＬＩＳＡを用いて検出された混入した二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡの濃度を示すグラフを示す。
【図８】化学修飾されたｈＥＰＯ  ＲＮＡ転写物（Ｎ１−メチルシュードウラシル（ｍ１ψ）修飾、上；５−メトキシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ）修飾、下）を用いてｄｓＲＮＡ  ＥＬＩＳＡを使用して検出された混入ｄｓＲＮＡの濃度を示すグラフを示す。
【図９Ａ】ＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼまたはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントＳ４３Ａ  ＊（Ｃ末端Ｇを有する）もしくはＧ４７Ａ＊（Ｃ末端Ｇを有する）を使用して生成されたｈＥＰＯ  ＲＮＡ転写物のＲＮａｓｅ  Ｔ１テール消化から得られた質量クロマトグラム結果を示す。ＬＣＭＳ分析の結果を示す。
【図９Ｂ】ＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼまたはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントＳ４３Ａ  ＊（Ｃ末端Ｇを有する）もしくはＧ４７Ａ＊（Ｃ末端Ｇを有する）を使用して生成されたｈＥＰＯ  ＲＮＡ転写物のＲＮａｓｅ  Ｔ１テール消化から得られた質量クロマトグラム結果を示す。図９Ａの３´末端集団分布の定量化を示す。
【図１０】Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼが開始複合体から伸長複合体に移行するにつれて、Ｃヘリックス及びＣリンカーループ構造がコンフォメーションをＣヘリックス及びＣループヘリックスへと変化する概略図を示す。ＰＤＢ結晶構造１ＭＳＷ及び１ＱＬＮから生成され、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ［Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ  ＵＬＣ］で描写した。
【図１１Ａ】リガーゼの存在下でＤＮＡスプリント（ＤＮＡ  ｓｐｌｉｎｔ）を使用して、ＩＶＴによって生成された「レフトマー（ｌｅｆｔｍｅｒ）」ＲＮＡ転写物を「ライトマー（ｒｉｇｈｔｍｅｒ）」蛍光標識ポリＡシグナルにライゲーションする概略図を示す。ライゲーション部位における単一ヌクレオチドのオーバーハング（ｏｖｅｒｈａｎｇ）でさえ、ライゲーションを効率的になくす。
【図１１Ｂ】ＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ及びＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントＧ４７Ａ＊（Ｃ末端Ｇを有する）またはＳ４３Ａ＊（Ｃ末端Ｇを有する）を用いて生成されたライトマーのライゲーション効率を示すＰＡＧＥ−Ｄゲルである。
【図１２】３２Ｐ−ＧＴＰを使用してアボーティブ転写物を標識したまたは３２Ｐ−ＣＴＰを使用して逆相補体を標識した放射性ゲルを示す。ＩＶＴは、短いモデル転写物を使用して行った。このデータは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントＳ４３Ａ＊（Ｃ末端Ｇを有する）及びＧ４７Ａ＊（Ｃ末端Ｇを有する）が逆補体形成を減少させることを実証している。
【図１３】インビトロ転写によりキャップされたｍＲＮＡを生成する従来の方法の概略図である。
【図１４Ａ】野生型Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼまたは本開示のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント（Ｇ４７Ａ＊）のいずれかを使用した共転写キャッピングアッセイの結果を示すグラフである。ジヌクレオチドキャップ（ワクシニアキャップ１）またはトリヌクレオチドキャップ（ＧＡＧまたはＧｍＡＧ）の例を示す。共転写キャッピングアッセイをトリヌクレオチドキャップアッセイで使用した。
【図１４Ｂ】野生型Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼまたは本開示のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント（Ｇ４７Ａ＊）のいずれかを使用した共転写キャッピングアッセイの結果を示すグラフである。共転写キャッピングアッセイのｍＲＮＡ収量を示す。
【図１４Ｃ】野生型Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼまたは本開示のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント（Ｇ４７Ａ＊）のいずれかを使用した共転写キャッピングアッセイの結果を示すグラフである。共転写キャッピングアッセイで生成されたｍＲＮＡが高い完全性であることを示す。
【図１４Ｄ】野生型Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼまたは本開示のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント（Ｇ４７Ａ＊）のいずれかを使用した共転写キャッピングアッセイの結果を示すグラフである。ＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによって生成されたキャップされたｍＲＮＡが、ＢＪ線維芽細胞においてサイトカイン生成を誘導したが、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントＧ４７Ａ＊（Ｃ末端Ｇを有する）によって生成されたキャップされたｍＲＮＡは、驚くべきことに、サイトカイン生成を誘導しなかったことを示す。
【図１４Ｅ】野生型Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼまたは本開示のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント（Ｇ４７Ａ＊）のいずれかを使用した共転写キャッピングアッセイの結果を示すグラフである。ＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによって生成されたキャップされたｍＲＮＡは、ＢＪ線維芽細胞においてコードされたタンパク質（ｈＥＰＯ）を発現しなかったが、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントＧ４７Ａ＊（Ｃ末端Ｇを有する）によって生成されたキャップされたｍＲＮＡは、対照に匹敵するｈＥＰＯ発現レベルをもたらした。対照は、ＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによって生成され、かつワクシニアキャップ１でキャップされたｍＲＮＡである。
【図１５】共転写キャッピングアッセイで生成されたｍＲＮＡのＬＣ質量分析の結果を示す。結果は、予想外にも、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントＧ４７Ａ＊（Ｃ末端Ｇを有する）がＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼよりも均質な（ｃｌｅａｎｅｒ）ｍＲＮＡを生成したことを示している。トリヌクレオチドが組み込まれる比率は、両方の酵素で同等のようであった。
【図１６Ａ】共転写キャッピングアッセイにおいて生成されかつＧＡＧトリヌクレオチドでキャップされたｍＲＮＡまたはワクシニアキャップ１を使用した標準キャッピングアッセイにおいてキャップされたｍＲＮＡのサイトカイン応答を比較するグラフである。
【図１６Ｂ】共転写キャッピングアッセイにおいて生成されかつＧＡＧトリヌクレオチドでキャップされたｍＲＮＡまたはワクシニアキャップ１を使用した標準キャッピングアッセイにおいてキャップされたｍＲＮＡの発現を比較するグラフである。
【図１７】Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントＧ４７Ａ＊及びトリヌクレオチドキャップｍ７ＧｐｐｐＡ２′ＯｍｅｐＧを使用した本明細書に記載の共転写キャッピングアッセイを示す概略図である。
【図１８Ａ】５′ＡＴＰまたは５´ＧＴＰで始まるｍＲＮＡのキャッピング効率の比較を示す液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣＭＳ）結果である。無傷のｍＲＮＡの分析を示す。
【図１８Ｂ】５′ＡＴＰまたは５´ＧＴＰで始まるｍＲＮＡのキャッピング効率の比較を示す液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣＭＳ）結果である。ＲＮａｓｅ  Ｈによって切断型ｍＲＮＡの５´末端の分析を示す。
【図１９Ａ】３つのモデル構築物（ｈＥＰＯ、ルシフェラーゼ、及びｅＧＦＰ）のＰＣＲ断片鋳型から生成された１−メチルシュードウリジンで化学修飾されたｍＲＮＡの分析を示すグラフである。ＲＮａｓｅＴ１フィンガープリンティングアッセイによって分析したところ、ｍＲＮＡが同じ配列を有することを示す。
【図１９Ｂ】３つのモデル構築物（ｈＥＰＯ、ルシフェラーゼ、及びｅＧＦＰ）のＰＣＲ断片鋳型から生成された１−メチルシュードウリジンで化学修飾されたｍＲＮＡの分析を示すグラフである。ｍＲＮＡが高度の完全性を有することを示す。
【図１９Ｃ】３つのモデル構築物（ｈＥＰＯ、ルシフェラーゼ、及びｅＧＦＰ）のＰＣＲ断片鋳型から生成された１−メチルシュードウリジンで化学修飾されたｍＲＮＡの分析を示すグラフである。ｍＲＮＡがＢＪ線維芽細胞においてサイトカイン応答を誘導しなかったことを示す。
【図２０Ａ】３つのモデル構築物（ｈＥＰＯ、Ｌｕｃ、及びｅＧＦＰ）のプラスミド鋳型から生成された、１−メチルシュードウリジンで化学的に修飾されたｍＲＮＡの分析を示すグラフである。ｈＥＰＯプラスミドを鋳型として使用した共転写キャッピングアッセイにおけるＮＴＰ消費が示されている。
【図２０Ｂ】３つのモデル構築物（ｈＥＰＯ、Ｌｕｃ、及びｅＧＦＰ）のプラスミド鋳型から生成された、１−メチルシュードウリジンで化学的に修飾されたｍＲＮＡの分析を示すグラフである。ｅＧＦＰプラスミドを鋳型として使用した共転写キャッピングアッセイにおけるＮＴＰ消費が示されている。
【図２０Ｃ】３つのモデル構築物（ｈＥＰＯ、Ｌｕｃ、及びｅＧＦＰ）のプラスミド鋳型から生成された、１−メチルシュードウリジンで化学的に修飾されたｍＲＮＡの分析を示すグラフである。ｍＲＮＡ産物が高い完全性を有していることを示す。
【図２０Ｄ】３つのモデル構築物（ｈＥＰＯ、Ｌｕｃ、及びｅＧＦＰ）のプラスミド鋳型から生成された、１−メチルシュードウリジンで化学的に修飾されたｍＲＮＡの分析を示すグラフである。ｍＲＮＡ産物のサイトカイン応答を示す。
【図２０Ｅ】３つのモデル構築物（ｈＥＰＯ、Ｌｕｃ、及びｅＧＦＰ）のプラスミド鋳型から生成された、１−メチルシュードウリジンで化学的に修飾されたｍＲＮＡの分析を示すグラフである。ＢＪ線維芽細胞におけるｈＥＰＯをコードするｍＲＮＡの発現を示す。
【図２０Ｆ】３つのモデル構築物（ｈＥＰＯ、Ｌｕｃ、及びｅＧＦＰ）のプラスミド鋳型から生成された、１−メチルシュードウリジンで化学的に修飾されたｍＲＮＡの分析を示すグラフである。ＢＪ線維芽細胞におけるルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）をコードするｍＲＮＡの発現を示す。
【図２０Ｇ】３つのモデル構築物（ｈＥＰＯ、Ｌｕｃ、及びｅＧＦＰ）のプラスミド鋳型から生成された、１−メチルシュードウリジンで化学的に修飾されたｍＲＮＡの分析を示すグラフである。ＢＪ線維芽細胞におけるｅＧＦＰをコードするｍＲＮＡの発現を示す。
【図２１】Ｃ末端グリシン（Ｇ）を含むＴ７  ＲＮＡＰバリアントＧ４７Ａ＊を使用して生成されたｍＲＮＡ転写物の８５％（例えば、約９０％）超が３´末端にヒドロキシル基を有することを示すグラフである。
【図２２】ＷＴまたはＧ４７Ａ  Ｔ７  ＲＮＡＰバリアント（そのうちのいくつかはＣ末端に追加のアミノ酸（例えば、１つもしくは２つのグリシン、または２つのアラニン）を含むＩＶＴ反応からの非修飾ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ生成を示す。
【図２３】示されているＷＴ、Ｇ４７Ａ、またはＳ４３Ａ／Ｇ４７Ａ  Ｔ７  ＲＮＡＰバリアント（そのうちのいくつかはＣ末端に追加のアミノ酸（例えば、１つもしくは２つのグリシン、または２つのアラニン）を有する）を含むＩＶＴ反応からの１−メチル−シュードウリジン修飾ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ生成を示す。
【図２４Ａ】示されているＷＴ、Ｇ４７Ａ、またはＳ４３Ａ／Ｇ４７Ａ  Ｔ７  ＲＮＡＰバリアント（そのうちのいくつかはＣ末端に追加のアミノ酸（例えば、１つもしくは２つのグリシン、または２つのアラニン）を有する）を使用して生成されたｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ転写物のＲＮＡｓｅ  Ｔ１テール消化物の結果を示す。等モル濃度のＮＴＰを有するＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡＰ（ＷＴ  ＥＱ）、過剰なＧＴＰ及びＡＴＰを含むＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡＰ（ＷＴアルファ）、または追加のＣ末端グリシンを有し、等モル濃度のＮＴＰを有するＧ４７Ａ＊  Ｔ７  ＲＮＡＰ（Ｇ４７Ａ＊  ＥＱ）を使用したＩＶＴ反応から生成されたｈＥＰＯ  ｍＲＮＡのＬＣＭＳ分析の結果を示す。
【図２４Ｂ】示されているＷＴ、Ｇ４７Ａ、またはＳ４３Ａ／Ｇ４７Ａ  Ｔ７  ＲＮＡＰバリアント（そのうちのいくつかはＣ末端に追加のアミノ酸（例えば、１つもしくは２つのグリシン、または２つのアラニン）を有する）を使用して生成されたｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ転写物のＲＮＡｓｅ  Ｔ１テール消化物の結果を示す。図２４Ａの３´末端集団分布の定量化を示す。
【図２４Ｃ】示されているＷＴ、Ｇ４７Ａ、またはＳ４３Ａ／Ｇ４７Ａ  Ｔ７  ＲＮＡＰバリアント（そのうちのいくつかはＣ末端に追加のアミノ酸（例えば、１つもしくは２つのグリシン、または２つのアラニン）を有する）を使用して生成されたｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ転写物のＲＮＡｓｅ  Ｔ１テール消化物の結果を示す。非修飾ｍＲＮＡを使用したＩＶＴ反応において生成された均質な３´末端集団のパーセンテージを示す。
【図２４Ｄ】示されているＷＴ、Ｇ４７Ａ、またはＳ４３Ａ／Ｇ４７Ａ  Ｔ７  ＲＮＡＰバリアント（そのうちのいくつかはＣ末端に追加のアミノ酸（例えば、１つもしくは２つのグリシン、または２つのアラニン）を有する）を使用して生成されたｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ転写物のＲＮＡｓｅ  Ｔ１テール消化物の結果を示す。１−メチル−シュードウリジン修飾ｍＲＮＡを使用したＩＶＴ反応において生成された均質な３´末端集団のパーセンテージを示す。
【図２５Ａ】示されているＷＴ、Ｇ４７Ａ、またはＳ４３Ａ／Ｇ４７Ａ  Ｔ７  ＲＮＡＰバリアント（そのうちのいくつかはＣ末端に置換を有する）を含むＩＶＴ反応から生成された非修飾ｍＲＮＡに対するＢＪ線維芽細胞のサイトカイン応答を比較するグラフを示す。
【図２５Ｂ】示されているＷＴ、Ｇ４７Ａ、またはＳ４３Ａ／Ｇ４７Ａ  Ｔ７  ＲＮＡＰバリアント（そのうちのいくつかはＣ末端に置換を有する）を含むＩＶＴ反応から生成された１−メチル−シュードウリジン修飾ｍＲＮＡに対するＢＪ線維芽細胞のサイトカイン応答を比較するグラフを示す。
【図２６Ａ】示されているＷＴまたはＧ４７Ａ  Ｔ７  ＲＮＡＰバリアント（そのうちのいくつかはＣ末端に追加のアミノ酸を有する）を含むＩＶＴ反応から生成された放射標識ｍＲＮＡを示す。ＩＶＴ  ｍＲＮＡ産物は、ポリアクリルアミド変性ゲル上でサイズ別に分離される。非修飾ｍＲＮＡまたは１−メチル−シュードウリジン修飾ｍＲＮＡのいずれかが３２Ｐ−ＣＴＰで放射標識されている。
【図２６Ｂ】示されているＷＴまたはＧ４７Ａ  Ｔ７  ＲＮＡＰバリアント（そのうちのいくつかはＣ末端に追加のアミノ酸を有する）を含むＩＶＴ反応から生成された放射標識ｍＲＮＡを示す。ＩＶＴ  ｍＲＮＡ産物は、ポリアクリルアミド変性ゲル上でサイズ別に分離される。逆補体ｍＲＮＡは３２Ｐ−ＣＴＰで放射標識されている。
【図２７Ａ】ホタルルシフェラーゼ（ｆｆＬｕｃ）をコードするトリヌクレオチドキャップされたＧ４７Ａ＊  ｍＲＮＡが、１日目に、ｍＲＮＡ対照と同様のインビボでのＩＰ−１０血清サイトカインレベルを誘導することを実証するデータのグラフを示す。
【図２７Ｂ】ホタルルシフェラーゼ（ｆｆＬｕｃ）をコードするトリヌクレオチドキャップされたＧ４７Ａ＊  ｍＲＮＡが、２９日目に、ｍＲＮＡ対照と同様のインビボでのＩＰ−１０血清サイトカインレベルを誘導することを実証するデータのグラフを示す。
【図２８Ａ】ｆｆＬｕｃをコードするトリヌクレオチドキャップされたＧ４７Ａ＊  ｍＲＮＡが、ＢＪ線維芽細胞（ＢＪＦ）において、ｍＲＮＡ対照と同様のインビトロでのベースラインサイトカインレベルを誘導することを示すデータのグラフを示す。
【図２８Ｂ】ｆｆＬｕｃをコードするトリヌクレオチドキャップされたＧ４７Ａ＊  ｍＲＮＡが、単球由来マクロファージ（ＭＤＭ）において、ｍＲＮＡ対照と同様のインビトロでのベースラインサイトカインレベルを誘導することを示すデータのグラフを示す。
【図２９】ｆｆＬｕｃをコードするトリヌクレオチドキャップされたＧ４７Ａ＊  ｍＲＮＡが、週６回の投与後に、インビボで高発現を維持することを実証するデータのグラフを示す。
【図３０】ｆｆＬｕｃをコードするトリヌクレオチドキャップされたＧ４７Ａ＊  ｍＲＮＡが、週６回の投与後に、低い抗ＰＥＧ  ＩｇＭレベルを誘導することを実証するデータのグラフを示す。
【図３１】ｆｆＬｕｃをコードするトリヌクレオチドキャップされたＧ４７Ａ＊  ｍＲＮＡが、ｍＲＮＡ対照と同様の低いＢ細胞活性化を示すことを実証するデータのグラフを示す。
【図３２Ａ】ヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）をコードするトリヌクレオチドキャップされたＧ４７Ａ＊  ｍＲＮＡが、１日目に、ｍＲＮＡ対照と同様のインビボでのＩＰ−１０血清サイトカインレベルを誘導することを示すデータのグラフを示す。
【図３２Ｂ】ヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）をコードするトリヌクレオチドキャップされたＧ４７Ａ＊  ｍＲＮＡが、２２日目に、ｍＲＮＡ対照と同様のインビボでのＩＰ−１０血清サイトカインレベルを誘導することを示すデータのグラフを示す。
【図３３Ａ】ｈＥＰＯをコードするトリヌクレオチドキャップされたＧ４７Ａ＊  ｍＲＮＡが、ＢＪ線維芽細胞（ＢＪＦ）において、ｍＲＮＡ対照と同様のインビトロでのベースラインサイトカインレベルを誘導することを示すデータのグラフを示す。
【図３３Ｂ】は、ｈＥＰＯをコードするトリヌクレオチドキャップされたＧ４７Ａ＊  ｍＲＮＡが、単球由来マクロファージ（ＭＤＭ）において、ｍＲＮＡ対照と同様のインビトロでのベースラインサイトカインレベルを誘導することを示すデータのグラフを示す。
【図３４】ｈＥＰＯをコードするトリヌクレオチドキャップされたＧ４７Ａ＊  ｍＲＮＡが、週に６回の投与後に、インビボで高い発現を維持することを実証するデータのグラフを示す。
【図３５】ｈＥＰＯをコードするトリヌクレオチドキャップされたＧ４７Ａ＊  ｍＲＮＡが、週６回の投与後に、低い抗ＰＥＧ  ＩｇＭレベルを誘導することを実証するデータのグラフを示す。
【図３６】ｈＥＰＯをコードするトリヌクレオチドキャップされたＧ４７Ａ＊  ｍＲＮＡが、ｍＲＮＡ対照と同様の低いＢ細胞活性化を示すことを実証するデータのグラフを示す。
【図３７Ａ】Ｇ４７Ａ＊  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントがインデル頻度に影響しないことを示す。
【図３７Ｂ】Ｇ４７Ａ＊  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントが点変異頻度に影響しないことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００７４】
本開示は、例えば、インビトロ転写（ＩＶＴ）反応中に生成されたランオン転写物及び／または二本鎖混入物を減少させながら、転写効率及び３´均一性を増加させる、ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）バリアントを提供する。いくつかの実施形態では、単一のアミノ酸置換を含むこれらのＲＮＡＰバリアントは、開始複合体から伸長複合体へのＲＮＡＰコンフォメーション転移を促進し、それにより転写開始段階に関連する問題の多くを軽減する。
【００７５】
ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ）のＮ末端Ｃヘリックス及び／またはＣリンカー構造（複数可）の修飾（複数可）が、伸長複合体へのポリメラーゼのコンフォメーション平衡を推進し、ＤＮＡ鋳型プロモーターの放出及び高度に進行性の伸長段階の開始を促進することを示す予測しなかった実験結果が本明細書で提供される。驚くべきことに、ＩＶＴ反応における本明細書で提供されるポリメラーゼバリアントの使用は、生成された転写物間の３´不均一性を低減し、二本鎖混入物の生成も低減（または排除）する。さらに、結果は、ポリメラーゼバリアントを使用して生成された転写物の純度及び発現レベルが、野生型ポリメラーゼを使用して生成された転写物のものに匹敵することを示している。
【００７６】
したがって、本開示のＲＮＡポリメラーゼバリアントの使用は、ＩＶＴ反応生成物に関連する問題の多くを減らす。野生型Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）は、産業界及び学界の両方で一般的に使用されており、その活性のうちのいくつかは、得られるＲＮＡ転写物の純度を著しく損なう。特に、この野生型Ｔ７  ＲＮＡＰ酵素を使用すると、ＲＮＡ転写物の３´末端への、ヌクレオチドの鋳型のない（ｎｏｎ−ｔｅｍｐｌａｔｅｄ）付加がもたらされる。例えば、野生型Ｔ７  ＲＮＡＰは、核酸塩基の同一性にとってほとんど好ましくないと思われる、少なくとも１つ、しばしば２つ以上の鋳型なしのヌクレオチドを３´末端に挿入する。驚くべきことに、本明細書で提供されるＴ７  ＲＮＡＰバリアントは３´不均一性の発生を低減させる。いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡポリメラーゼバリアントを使用してＩＶＴによって生成されたＲＮＡ転写物の３０％未満が３´不均一性を示す。いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡポリメラーゼバリアントを使用してＩＶＴによって生成されたＲＮＡ転写物の２０％未満（例えば、１５％、１０％、または５％未満）が３´不均一性を示す。いくつかの実施形態では、ＩＶＴによって生成されたＲＮＡ転写物の１〜２０％、１〜１５％、１〜１０％、または１〜５％が３´不均一性を示す。いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡポリメラーゼバリアントを使用してＩＶＴによって生成されたＲＮＡ転写物の１％未満が３´不均一性を示す。
【００７７】
したがって、例えばＩＶＴ反応における、本開示のＲＮＡポリメラーゼバリアントの使用は、「より均質な」ＲＮＡ転写物（３´末端における不均一性が低減し／均一性が増大したＲＮＡ転写物の集団）の生成をもたらす。いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡポリメラーゼバリアントを使用して生成されたＲＮＡ転写物の少なくとも７０％が３´均一性を示す。いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡポリメラーゼバリアントを使用して生成されたＲＮＡ転写物の少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％が３´均一性を示す。いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡポリメラーゼバリアントを使用して生成されたＲＮＡ転写物の少なくとも９０％が３´均一性を示す。いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡポリメラーゼバリアントを使用して生成されたＲＮＡ転写物の少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％が３´均一性を示す。
【００７８】
また、本明細書において、驚くべきことは、アミノ酸置換（例えば、配列番号１のＳ４３Ａ及び／またはＧ４７Ａ）またはＣ末端付加（例えば、１つ以上のアミノ酸が付加されたＷＴ、Ｓ４３Ａ＊、及び／またはＧ４７Ａ＊）Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントを使用して生成されたＲＮＡ転写物は、任意選択により未精製の形態で（例えば、逆相クロマトグラフィーにより精製されずに）細胞に送達されたときに、野生型ＲＮＡポリメラーゼを使用して生成されたＲＮＡに比べて低いサイトカイン応答を刺激する示す結果であった。いくつかの実施形態では、本開示のＴ７  ＲＮＡ変異型ポリメラーゼを使用して生成されたＲＮＡ転写物を受け取った細胞からの検出可能なサイトカイン応答はない。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼバリアント（例えば、Ｔ７  ＲＮＡＰ  Ｓ４３Ａ＊バリアント及び／またはＴ７  ＲＮＡＰ  Ｇ４７Ａ＊バリアント）を使用して生成されたＲＮＡは、野生型ＲＮＡポリメラーゼを使用して生成されたＲＮＡと比較して、少なくとも５０％（例えば、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％）低いサイトカイン応答を刺激する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼバリアント（例えば、Ｔ７  ＲＮＡＰ  Ｓ４３Ａ＊バリアント及び／またはＴ７  ＲＮＡＰ  Ｇ４７Ａ＊バリアント）を使用して生成されたＲＮＡは、野生型ＲＮＡポリメラーゼを使用して生成されたＲＮＡと比較して、５０〜６０％、５０〜７０％、５０〜８０％、５０〜９０％、５０〜１００％、６０〜７０％、６０〜８０％、６０〜９０％、６０〜１００％、７０〜８０％、７０〜９０％、７０〜１００％、８０〜９０％、８０〜１００％、または９０〜１００％低いサイトカイン応答を刺激する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼバリアント（例えば、Ｔ７  ＲＮＡＰ  Ｓ４３Ａ＊バリアント及び／またはＴ７  ＲＮＡＰ  Ｇ４７Ａ＊バリアント）を使用して生成されたＲＮＡは、野生型ＲＮＡポリメラーゼを使用して生成されたＲＮＡと比較して、少なくとも２倍、３倍、４倍、または５倍低いサイトカイン応答を刺激する。いくつかの実施形態では、サイトカイン応答を試験するために使用される細胞は、ヒト線維芽細胞（例えば、ＢＪ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２５２２（商標））細胞）である。いくつかの実施形態では、サイトカイン応答を試験するために使用される細胞は、単球由来マクロファージ（ＭＤＭ）である。
【００７９】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼバリアントを使用して生成されたｄｓＲＮＡ転写物の濃度は、野生型ポリメラーゼを使用して生成されたｄｓＲＮＡ転写産物と比較して、少なくとも５０％（例えば、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％）低い。いくつかの実施形態では、生成されたｄｓＲＮＡ転写物の濃度は、野生型ポリメラーゼを使用して生成されたｄｓＲＮＡ転写物と比較して、５０〜６０％、５０〜７０％、５０〜８０％、５０〜９０％、５０〜１００％、６０〜７０％、６０〜８０％、６０〜９０％、６０〜１００％、７０〜８０％、７０〜９０％、７０〜１００％、８０〜９０％、８０〜１００％、または９０〜１００％低い。いくつかの実施形態では、生成されたｄｓＲＮＡ転写物の濃度は、野生型ポリメラーゼを使用して生成されたｄｓＲＮＡ転写物と比較して、少なくとも２倍、３倍、４倍、または５倍低い。
【００８０】
本開示のＲＮＡポリメラーゼバリアントの使用により、二本鎖混入物の生成及びより少ないランオン転写物の生成が予想外にもたらされた。
【００８１】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼバリアントを使用して例えばＩＶＴによって生成されたＲＮＡ転写物の５０％未満（例えば、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満）は、二本鎖混入物である。いくつかの実施形態において、生成されたＲＮＡ転写産物の１〜５０％、１〜４０％、１〜３０％、１〜２０％、１〜１０％、１〜５％、５〜５０％、５〜４０％、５〜３０％、５〜２０％、５〜１０％、１０〜５０％、１０〜４０％、１０〜３０％、または１０〜２０％は、二本鎖混入物である。
【００８２】
いくつかの実施形態において、ＲＮＡポリメラーゼバリアントを使用して生成されたＲＮＡ転写産物の５０％未満（例えば、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満）は、ランオンＲＮＡ転写産物である。いくつかの実施形態では、生成されたＲＮＡ転写物の１〜５０％、１〜４０％、１〜３０％、１〜２０％、１〜１０％、１〜５％、５〜５０％、５〜４０％、５〜３０％、５〜２０％、５〜１０％、１０〜５０％、１０〜４０％、１０〜３０％、または１０〜２０％は、ランオンＲＮＡ転写物である。
【００８３】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼバリアントを使用して生成された全長ＲＮＡ転写物の量は、ＤＮＡ鋳型の量よりも少なくとも１５倍大きい。例えば、生成された全長ＲＮＡ転写物の量は、ＤＮＡ鋳型の量よりも少なくとも２０倍、３０倍、４０倍、４５倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、または１００倍大きいものであり得る。いくつかの実施形態では、生成された全長ＲＮＡ転写物の量は、ＤＮＡ鋳型の量よりも１５〜１００倍、１５〜９０倍、１５〜８０倍、１５〜７０倍、１５〜６０倍、１５〜５０倍、１５〜４０倍、１５〜３０、１５〜２０倍、２０〜１００倍、２０〜９０倍、２０〜８０倍、２０〜７０倍、２０〜６０倍、２０〜５０倍、２０〜４０倍、または２０〜３０倍大きいものであり得る。いくつかの実施形態において、生成された全長ＲＮＡ転写物の量は、ＤＮＡ鋳型の量よりも２倍、３倍、４倍、または５倍大きい。
【００８４】
いくつかの実施形態では、二本鎖混入物：ＲＮＡポリメラーゼバリアントを使用して生成された完全長ＲＮＡ転写物の比は、１：１未満である。たとえば、二本鎖混入物：生成された完全長ＲＮＡ転写物の比率は、０．９：１、０．８：１、０．７：１、０．６：１、０．５：１、０．４：１、０．３：１、０．２：１、または０．１：１である。
【００８５】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼバリアントを使用して生成されたＲＮＡ転写物は、ＤＮＡ鋳型と比較して、１００ヌクレオチドあたり１未満の変異を有する。例えば、生成されたＲＮＡ転写物は、ＤＮＡ鋳型と比較して、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００ヌクレオチドあたり１未満の変異を有し得る。
【００８６】
ＲＮＡポリメラーゼ
ＲＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ）は、成長中のＲＮＡ鎖の３´末端へのリボヌクレオチドの連続的な付加を触媒する酵素であり（５´→３´方向のＲＮＡの転写）、ヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）を酵素の基質として作用し、ヌクレオチドの配列はＤＮＡ鋳型によって特定される。転写は、塩基の相補的対合に依存する。二重ヘリックスの２本の鎖は局所的に分離し、分離した鎖の１つは鋳型（ＤＮＡ鋳型）として機能する。次いで、ＲＮＡポリメラーゼは、鋳型中の相補的な塩基によって、ＤＮＡ鋳型上の遊離ヌクレオチドのアライメントを触媒する。したがって、ポリメラーゼが成長中のＲＮＡ鎖の３´末端へのリボヌクレオチドの連続的な追加を触媒する場合、ＲＮＡポリメラーゼはＲＮＡポリメラーゼ活性を有するとみなす。
【００８７】
Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７  ＲＮＡＰ）は、バクテリオファージＴ７のゲノムによりコードされる９９ｋＤａのＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであり、Ｔ７ファージプロモーターに非常に特異的である。Ｔ７  ＲＮＡＰの構造研究により、Ｎ末端ドメインのコンフォメーションが転写の開始段階と伸長段階との間で大きく変化することが示されている。Ｎ末端ドメインは、Ｃヘリックスサブドメイン及びプロモーター結合ドメイン（サブドメインＨで分離された２つのセグメントを含む）を含む。プロモーター結合ドメイン及び結合したプロモーターは、８ｎｔＲＮＡ転写物の合成の際に約４５度回転し、活性部位が拡張して成長中のヘテロ二本鎖を収容しながら、プロモーターの接触の維持が可能となる。Ｃヘリックスサブドメインは、その伸長コンフォメーションに向かって緩やかに移動するのに対し、サブドメインＨは、伸長段階の位置でなく、開始段階の位置のままであり、７０オングストローム超離れる。Ｔ７  ＲＮＡＰ開始及び伸長複合体の構造の比較により、Ｎ末端２６７残基（Ｎ末端ドメイン）内の大きなコンフォメーション変化及びＲＮＡＰの残部のわずかな変化が明らかになった。プロモーター結合ドメインの剛体回転ならびに末端Ｃヘリックス（残基２８〜７１）及びＨ（残基１５１〜１９０）サブドメインのリフォールディングは、プロモーター結合部位の廃棄、活性部位の拡張、及びＲＮＡ転写物の出口トンネルの作出に関与している。Ｎ末端ドメイン内の構造変化は、伸長複合体の安定性の増加及び加工性の主な要因である（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｄｕｒｎｉａｋ，Ｋ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２２（５９０１）：  ５５３−５５７，２００８，を参照のこと）。
【００８８】
いくつかの態様では、ＲＮＡＰ開始複合体からＲＮＡＰ伸長複合体へのコンフォメーション変化を促進するＲＮＡポリメラーゼバリアント（例えば、Ｔ７  ＲＮＡＰバリアント）が本明細書で提供される。ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、ＲＮＡポリメラーゼ活性及び対応する野生型ＲＮＡポリメラーゼと比較して少なくとも１つの置換を有する酵素である。上に示したように、ＲＮＡポリメラーゼは、該ポリメラーゼが成長中のＲＮＡ鎖の３´末端へのリボヌクレオチドの連続的な付加を触媒する場合、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有しているとみなされる。例えば、位置Ｓ４３（例えば、Ｓ４３Ａ）またはＧ４７（例えば、Ｇ４７Ａ）にアミノ酸置換を有する配列番号１のアミノ酸配列を含み、ＲＮＡポリメラーゼ活性を維持する酵素は、野生型Ｔ７  ＲＮＡＰ（配列番号１）のＴ７  ＲＮＡＰバリアントとみなされる。
【００８９】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、野生型ＲＮＡポリメラーゼと比較して、ＲＮＡポリメラーゼバリアントが開始複合体から伸長複合体に移行するにつれて、ＲＮＡポリメラーゼバリアントの少なくとも１つの三次元ループ構造にヘリックス構造へのコンフォメーション変化を受けさせる少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。したがって、いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸修飾は、野生型アミノ酸と比較して高ヘリックス性向を有する。
【００９０】
ループ構造の例には、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ開始複合体（ＩＣ）コンフォメーションのＣヘリックス構造中のアミノ酸（ａａ）４２〜４７（例えば、配列番号１のａａ２８〜７１）及びＣリンカー構造中のアミノ酸２５７〜２６２（例えば、配列番号１のアミノ酸２５８〜２６６）が含まれるが、これらに限定されない。
【００９１】
Ｃ末端に少なくとも１つの追加のアミノ酸を含むＲＮＡポリメラーゼバリアント（例えば、Ｔ７  ＲＮＡＰバリアント）も本明細書で提供される。少なくとも１つの追加のアミノ酸は、いくつかの実施形態では、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリンから選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの追加のアミノ酸は、極性アミノ酸である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの追加のアミノ酸は、非極性アミノ酸である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの追加のアミノ酸は、グリシンである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの追加のアミノ酸は、アラニンである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの追加のアミノ酸は、セリンである。
【００９２】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼのＣ末端は、以下のコンセンサス配列：ＦＡＦＡＸｎ（配列番号２９４）を含み、ｘは任意のアミノ酸であり、ｎは任意の整数、例えば１〜５（例えば、１、２、３、４、または５）である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼのＣ末端は、以下のコンセンサス配列：ＦＡＦＡＧｎ（配列番号２９５）を含み、ｎは任意の整数、例えば１〜５である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼのＣ末端は、以下のコンセンサス配列：ＦＡＦＡＡｎ（配列番号２９６）を含み、ｎは任意の整数、例えば１〜５である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼのＣ末端は、以下のコンセンサス配列：ＦＡＦＡＲｎ（配列番号２９７）を含み、ｎは任意の整数、例えば１〜５である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼのＣ末端は、以下のコンセンサス配列：ＦＡＦＡＮｎ（配列番号２９８）を含み、ｎは任意の整数、例えば１〜５である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼのＣ末端は、以下のコンセンサス配列：ＦＡＦＡＤｎ（配列番号２９９）を含み、ｎは任意の整数、例えば１〜５である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼのＣ末端は、以下のコンセンサス配列：ＦＡＦＡＣｎ（配列番号３００）を含み、ｎは任意の整数、例えば１〜５である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼのＣ末端は、以下のコンセンサス配列：ＦＡＦＡＥｎ（配列番号３０１）を含み、ｎは任意の整数、例えば１〜５である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼのＣ末端は、以下のコンセンサス配列：ＦＡＦＡＱｎ（配列番号３０２）を含み、ｎは任意の整数、例えば１〜５である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼのＣ末端は、以下のコンセンサス配列：ＦＡＦＡＨｎ（配列番号３０３）を含み、ｎは任意の整数、例えば１〜５である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼのＣ末端は、以下のコンセンサス配列：ＦＡＦＡＩｎ（配列番号３０４）を含み、ｎは任意の整数、例えば１〜５である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼのＣ末端は、以下のコンセンサス配列：ＦＡＦＡＬｎ（配列番号３０５）を含み、ｎは任意の整数、例えば１〜５である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼのＣ末端は、以下のコンセンサス配列：ＦＡＦＡＫｎ（配列番号３０６）を含み、ｎは任意の整数、例えば１〜５である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼのＣ末端は、以下のコンセンサス配列：ＦＡＦＡＭｎ（配列番号３０７）を含み、ｎは任意の整数、例えば１〜５である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼのＣ末端は、以下のコンセンサス配列：ＦＡＦＡＦｎ（配列番号３０８）を含み、ｎは任意の整数、例えば１〜５である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼのＣ末端は、以下のコンセンサス配列：ＦＡＦＡＰｎ（配列番号３０９）を含み、ｎは任意の整数、例えば１〜５である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼのＣ末端は、以下のコンセンサス配列：ＦＡＦＡＳｎ（配列番号３１０）を含み、ｎは任意の整数、例えば１〜５である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼのＣ末端は、以下のコンセンサス配列：ＦＡＦＡＴｎ（配列番号３１１）を含み、ｎは任意の整数、例えば１〜５である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼのＣ末端は、以下のコンセンサス配列：ＦＡＦＡＷｎ（配列番号３１２）を含み、ｎは任意の整数、例えば１〜５である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼのＣ末端は、以下のコンセンサス配列：ＦＡＦＡＹｎ（配列番号３１３）を含み、ｎは任意の整数、例えば１〜５である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼのＣ末端は、以下のコンセンサス配列：ＦＡＦＡＶｎ（配列番号３１４）を含み、ｎは任意の整数、例えば１〜５である。
【００９３】
いくつかの実施形態では、Ｃ末端モチーフ（ＦＡＦＡまたはＦＡＦＡＸｎ）は、野生型Ｔ７  ＲＮＡＰ（例えば、配列番号１）と比較して、８８０位、８８１位、８８２位、または８８３位のうちの１つ以上にアミノ酸置換を含む。したがって、本開示は、様々なＣ末端Ｆ８８０Ａ８８１Ｆ８８２Ａ８８３モチーフを含み、８８０位、８８１位、８８２位、または８８３位のうちの１つ以上のアミノ酸が、野生型Ｔ７  ＲＮＡＰ（例えば、配列番号１）と比較して、追加のＣ末端アミノ酸（Ｘｎ）の有無にかかわらず、少なくとも１つのアミノ酸置換が含まれるように修飾されている。
【００９４】
アミノ酸置換
本開示のＲＮＡポリメラーゼバリアントは、ＷＴ  ＲＮＡポリメラーゼと比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有するＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼに関して、４３位のセリンは「野生型アミノ酸」とみなされ、４３位のセリンのアラニンへの置換は高いヘリックス性向を有する「アミノ酸置換」とみなされる。
【００９５】
平均的な球状タンパク質は、３０％の、最も一般的な種類の二次構造であるαヘリックスを含む。いくつかのアミノ酸は、他のアミノ酸よりもαヘリックスにおいてより頻繁に存在し、この傾向はヘリックス性向として知られている。例えば、Ｐａｃｅ，Ｎ．Ｃ．  ａｎｄ  Ｓｃｈｏｌｔｚ，Ｊ．Ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，７５：４２２−４２７（１９９８）を参照のこと。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、野生型アミノ酸と比較して高いヘリックス性向を有する。一般に、高ヘリックス性向のアミノ酸置換は、ポリメラーゼ配座異性体の集団を伸長複合体へと熱力学的に偏らせるように選択される。相対ΔΔＧｓ（自由エネルギー）は、公に利用可能なソフトウェア（例えば、ワシントン大学のＲｏｓｅｔｔａ  とシュレディンガーのＭａｅｓｔｒｏ）を使用して、ＩＣ及び伸長複合体（ＥＣ）構造の置換について計算される。次いで、置換は、計算ならびに例えばアミノ酸ヘリックス性向及び／またはポリペプチド骨格ｐｈｉ−ｐｓｉ適合性を含む追加の知識に基づいて選択される。
【００９６】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、ＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有するＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ）と比較して少なくとも１つ（１つ以上）のアミノ酸置換を含むＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、高ヘリックス性向アミノ酸置換である。高ヘリックス性向アミノ酸の例には、アラニン、イソロイシン、ロイシン、アルギニン、メチオニン、リジン、グルタミン、及び／またはグルタミン酸が含まれる。
【００９７】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、Ｃ末端に少なくとも１つの追加のアミノ酸を含むＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント（例えば、配列番号９９、配列番号１００、配列番号２９４、配列番号２９５、もしくは配列番号２９６、または配列番号９９、配列番号１００、配列番号２９４、配列番号２９５、もしくは配列番号２９６と９０％〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列）である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、ＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼと比較して、Ｃ末端に少なくとも１つの追加のアミノ酸及びアミノ酸置換を含むＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、高ヘリックス性向アミノ酸置換である。
【００９８】
本明細書では、コンフォメーション平衡を熱力学的にＥＣへと偏らせる／支持する高いまたはより高いヘリックス性向のアミノ酸置換を特定するために使用し得る２つのアプローチが提供される。どちらのアプローチでも、（構造のレビュー、文献検索に基づいて）プロモーターの結合または触媒に直接関与する任意の位置へのアミノ酸置換を避けるように注意が払われる。方法Ａでは、専用のソフトウェアを使用して、ＥＣ及びＩＣの変異（ΔΔＧｍｕｔ）によるタンパク質折りたたみの自由エネルギーの変化を算定する。望ましい配列位置でのすべての可能なアミノ酸置換は、この方法によって評価される。望ましいアミノ酸置換（すなわち、ＩＣよりもＥＣを好む置換）は、ΔΔＧｍｕｔの差
【数１】
2020532963.tif 000003
が負であるアミノ酸置換である。方法Ｂでは、ＩＣ及びＥＣ二次構造アノテーション（例えば、ＤＳＳＰソフトウェアを使用したＩＣ及びＥＣ三次構造の３Ｄモデルから決定される（Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ：  ｐａｔｔｅｒｎ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ−ｂｏｎｄｅｄ  ａｎｄ  ｇｅｏｍｅｔｒｉｃａｌ  ｆｅａｔｕｒｅｓ．Ｋａｂｓｃｈ  Ｗ，Ｓａｎｄｅｒ  Ｃ，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ．１９８３  ２２  ２５７７−２６３７））は、ＩＣ中にループを有し、かつＥＣ中にヘリックスを有する領域を同定するために検査される。次いで、低ヘリックス性向を有する残基（例えばＧｌｙ）を有する配列位置を高ヘリックス性向のアミノ酸（例えばＡｌａ）で置換する。Ｔ７  ＲＮＡＰの場合、例えば、方法Ａ及びＢの変異（例えば、置換）オーバーラップ及び方法Ｂのトップ（ｔｏｐ）バリアントを同定した。
【００９９】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１のアミノ酸４２〜４７位（Ｅ４２、Ｓ４３、Ｙ４４、Ｅ４５、Ｍ４６、及び／またはＧ４７）のいずれか１つにおける高ヘリックス性向アミノ酸（例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシン、アルギニン、メチオニン、リジン、グルタミン、及び／またはグルタミン酸）置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸４２〜４７位（Ｅ４２、Ｓ４３、Ｙ４４、Ｅ４５、Ｍ４６、及び／またはＧ４７）のいずれか１つにおける高ヘリックス性向アミノ酸（例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシン、アルギニン、メチオニン、リジン、グルタミン、及び／またはグルタミン酸）置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１のアミノ酸４２位における高ヘリックス性向アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１のアミノ酸４３位における高ヘリックス性向アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１のアミノ酸４４位における高ヘリックス性向アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１のアミノ酸４５位における高ヘリックス性向アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１のアミノ酸４６位における高ヘリックス性向アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１のアミノ酸４７位における高ヘリックス性向アミノ酸置換である。
【０１００】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６のアミノ酸４２〜４７位（Ｅ４２、Ｓ４３、Ｙ４４、Ｅ４５、Ｍ４６、及び／またはＧ４７）のいずれか１つにおける高ヘリックス性向アミノ酸（例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシン、アルギニン、メチオニン、リジン、グルタミン、及び／またはグルタミン酸）置換である。アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸４２〜４７位（Ｅ４２、Ｓ４３、Ｙ４４、Ｅ４５、Ｍ４６、及び／またはＧ４７）のいずれか１つにおける高ヘリックス性向アミノ酸（例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシン、アルギニン、メチオニン、リジン、グルタミン、及び／またはグルタミン酸）置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６のアミノ酸置４２位における高ヘリックス性向アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６のアミノ酸４３位における高ヘリックス性向アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６のアミノ酸４４位における高ヘリックス性向アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６のアミノ酸４５位における高ヘリックス性向アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６のアミノ酸４６位における高ヘリックス性向アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６のアミノ酸４７位における高ヘリックス性向アミノ酸置換である。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１のアミノ酸４２〜４７位のいずれか１つにおけるアラニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１と９０〜９９％、例えば少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸４２〜４７位のいずれか１つにおけるアラニンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４２位におけるアラニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４３位におけるアラニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４４位におけるアラニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４５位におけるアラニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４６位におけるアラニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４７位におけるアラニンである。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６のアミノ酸４２〜４７位のいずれか１つにおけるアラニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸４２〜４７位のいずれか１つにおけるアラニンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４２位におけるアラニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４３位におけるアラニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４４位におけるアラニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４５位におけるアラニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４６位におけるアラニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４７位におけるアラニンである。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１のアミノ酸４２〜４７位のいずれか１つにおけるイソロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸４２〜４７位のいずれか１つにおけるイソロイシンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４２位におけるイソロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４３位におけるイソロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４４位のイソロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４５位におけるイソロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４６位におけるイソロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４７位におけるイソロイシンである。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６のアミノ酸４２〜４７位のいずれか１つにおけるイソロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸４２〜４７位のいずれか１つにおけるイソロイシンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４２位におけるイソロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４３位におけるイソロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４４位におけるイソロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４５位におけるイソロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４６位におけるイソロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４７位におけるイソロイシンである。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１のアミノ酸４２〜４７位のいずれか１つにおけるロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸４２〜４７位のいずれか１つにおけるロイシンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４２位におけるロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４３位におけるロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４４位におけるロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４５位におけるロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４６位におけるロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４７位におけるロイシンである。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６のアミノ酸４２〜４７位のいずれか１つにおけるロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸４２〜４７位のいずれか１つにおけるロイシンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４２位におけるロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４３位におけるロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４４位におけるロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４５位におけるロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４６位におけるロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４７位におけるロイシンである。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１のアミノ酸４２〜４７位のいずれか１つにおけるアルギニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸４２〜４７位のいずれか１つにおけるアルギニンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４２位におけるアルギニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４３位におけるアルギニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４４位におけるアルギニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４５位におけるアルギニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４６位におけるアルギニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４７位におけるアルギニンである。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６のアミノ酸４２〜４７位のいずれか１つにおけるアルギニンである。いくつかの実施形態では、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸４２〜４７位のいずれか１つにおけるアルギニンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４２位におけるアルギニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４３位におけるアルギニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４４位におけるアルギニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４５位におけるアルギニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４６位におけるアルギニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４７位におけるアルギニンである。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１のアミノ酸４２〜４７位のいずれか１つにおけるメチオニンである。いくつかの実施形態では、配列番号１と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸４２〜４７位のいずれか１つにおけるメチオニンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４２位におけるメチオニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４３位におけるメチオニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４４位におけるメチオニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４５位におけるメチオニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４６位におけるメチオニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４７位におけるメチオニンである。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６のアミノ酸４２〜４７位のいずれか１つにおけるメチオニンである。いくつかの実施形態では、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸４２〜４７位のいずれか１つにおけるメチオニンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４２位におけるメチオニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４３位におけるメチオニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４４位におけるメチオニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４５位におけるメチオニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４６位におけるメチオニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４７位におけるメチオニンである。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１のアミノ酸４２〜４７位のいずれか１つにおけるリジンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸４２〜４７位のいずれか１つにおけるリジンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４２位におけるリジンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４３位におけるリジンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４４位におけるリジンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４５位におけるリジンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４６位におけるリジンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４７位におけるリジンである。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６のアミノ酸４２〜４７位のいずれか１つにおけるリジンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸４２〜４７位のいずれか１つにおけるリジンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４２位におけるリジンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４３位におけるリジンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４４位におけるリジンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４５位におけるリジンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４６位におけるリジンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４７位におけるリジンである。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１のアミノ酸４２〜４７位のいずれか１つにおけるグルタミンである。いくつかの実施形態では、配列番号１と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸４２〜４７位のいずれか１つにおけるグルタミンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４２位におけるグルタミンであるいくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４３位におけるグルタミンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４４位におけるグルタミンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４５位におけるグルタミンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４６位におけるグルタミンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４７位におけるグルタミンである。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６のアミノ酸４２〜４７位のいずれか１つにおけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸４２〜４７位のいずれか１つにおけるグルタミンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４２位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４３位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４４位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４５位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４６位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４７位におけるグルタミン酸である。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１のアミノ酸４２〜４７位のいずれか１つにおけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸４２〜４７位のいずれか１つにおけるグルタミン酸である。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４２位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４３位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４４位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４５位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４６位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４７位におけるグルタミン酸である。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６のアミノ酸４２〜４７位のいずれか１つにおけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸４２〜４７位のいずれか１つにおけるグルタミン酸である。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４２位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４３位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４４位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４５位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４６位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４７位におけるグルタミン酸である。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１のアミノ酸２５７〜２６２位（Ｒ２５７、Ａ２５８、Ｇ２５９、Ａ２６０、Ｌ２６１、及び／またはＡ２６２）のいずれか１つにおける高ヘリックス性向アミノ酸（例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシン、アルギニン、メチオニン、リジン、グルタミン、及び／またはグルタミン酸）置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸２５７〜２６２位（Ｒ２５７、Ａ２５８、Ｇ２５９、Ａ２６０、Ｌ２６１、及び／またはＡ２６２）のいずれか１つにおける高ヘリックス性向アミノ酸（例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシン、アルギニン、メチオニン、リジン、グルタミン、及び／またはグルタミン酸）置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１のアミノ酸２５７位における高ヘリックス性向アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１のアミノ酸２５８位における高ヘリックス性向アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１のアミノ酸２５９位における高ヘリックス性向アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１のアミノ酸２６０位における高ヘリックス性向アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１のアミノ酸２６１位における高ヘリックス性向アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１のアミノ酸２６２位における高ヘリックス性向アミノ酸置換である。
【０１１８】
アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６のアミノ酸２５７〜２６２位（Ｒ２５７、Ａ２５８、Ｇ２５９、Ａ２６０、Ｌ２６１、及び／またはＡ２６２）のいずれか１つにおける高ヘリックス性向アミノ酸（例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシン、アルギニン、メチオニン、リジン、グルタミン、及び／またはグルタミン酸）置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸２５７〜２６２位（Ｒ２５７、Ａ２５８、Ｇ２５９、Ａ２６０、Ｌ２６１、及び／またはＡ２６２）のいずれか１つにおける高ヘリックス性向アミノ酸（例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシン、アルギニン、メチオニン、リジン、グルタミン、及び／またはグルタミン酸）置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６のアミノ酸２５７位における高ヘリックス性向アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６のアミノ酸２５８位における高ヘリックス性向アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６のアミノ酸２５９位における高ヘリックス性向アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６のアミノ酸２６０位における高ヘリックス性向アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６のアミノ酸２６１位における高ヘリックス性向アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６のアミノ酸２６２位における高ヘリックス性向アミノ酸置換である。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１のアミノ酸２５７〜２６２位のいずれか１つにおけるアラニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸２５７〜２６２位のいずれか１つにおけるアラニンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２５７位におけるアラニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２５８位におけるアラニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２５９位におけるアラニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２６０位におけるアラニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２６１位におけるアラニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２６２位におけるアラニンである。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６のアミノ酸２５７〜２６２位のいずれか１つにおけるアラニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸２５７〜２６２位のいずれか１つにおけるアラニンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２５７位におけるアラニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２５８位におけるアラニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２５９位におけるアラニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２６０位におけるアラニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２６１位におけるアラニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２６２位におけるアラニンである。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１のアミノ酸２５７〜２６２位のいずれか１つにおけるイソロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸２５７〜２６２位のいずれか１つにおけるイソロイシンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２５７位におけるイソロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２５８位におけるイソロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２５９位におけるイソロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２６０位におけるイソロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２６１位におけるイソロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２６２位におけるイソロイシンである。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６のアミノ酸２５７〜２６２位のいずれか１つにおけるイソロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸２５７〜２６２位のいずれか１つにおけるイソロイシンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２５７位におけるイソロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２５８位におけるイソロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２５９位におけるイソロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２６０位におけるイソロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２６１位におけるイソロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２６２位におけるイソロイシンである。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１のアミノ酸２５７〜２６２位のいずれか１つにおけるロイシンであるアミノ酸置換は、配列番号１と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸２５７〜２６２位のいずれか１つにおけるロイシンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２５７位におけるロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２５８位におけるロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２５９位におけるロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２６０位におけるロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２６１位におけるロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２６２位におけるロイシンである。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６のアミノ酸２５７〜２６２位のいずれか１つにおけるロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸２５７〜２６２位のいずれか１つにおけるイソロイシンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２５７位におけるロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２５８位におけるロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２５９位におけるロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２６０位におけるロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２６１位におけるロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２６２位におけるロイシンである。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１のアミノ酸２５７〜２６２位のいずれか１つのアルギニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸２５７〜２６２位のいずれか１つにおけるアルギニンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２５７位におけるアルギニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２５８位におけるアルギニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２５９位におけるアルギニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２６０位におけるアルギニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２６１位におけるアルギニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２６２位におけるアルギニンである。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６のアミノ酸２５７〜２６２位のいずれか１つのアルギニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸２５７〜２６２位のいずれか１つにおけるアルギニンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２５７位におけるアルギニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２５８位におけるアルギニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２５９位におけるアルギニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２６０位におけるアルギニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２６１位におけるアルギニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２６２位におけるアルギニンである。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１のアミノ酸２５７〜２６２位のいずれか１つにおけるメチオニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸２５７〜２６２位のいずれか１つにおけるメチオニンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２５７位におけるメチオニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２５８位におけるメチオニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２５９位におけるメチオニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２６０位におけるメチオニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２６１位におけるメチオニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２６２位におけるメチオニンである。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６のアミノ酸２５７〜２６２位のいずれか１つのメチオニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸２５７〜２６２位のいずれか１つにおけるメチオニンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２５７位におけるメチオニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２５８位におけるメチオニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２５９位におけるメチオニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２６０位におけるメチオニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２６１位におけるメチオニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２６２位におけるメチオニンである。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１のアミノ酸２５７〜２６２位のいずれか１つのリジンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸２５７〜２６２位のいずれか１つにおけるリジンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２５７位におけるリジンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２５８位におけるリジンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２５９位におけるリジンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２６０位におけるリジンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２６１位におけるリジンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２６２位におけるリジンである。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６のアミノ酸２５７〜２６２位のいずれか１つのリジンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸２５７〜２６２位のいずれか１つにおけるリジンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２５７位におけるリジンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２５８位におけるリジンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２５９位におけるリジンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２６０位におけるリジンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２６１位におけるリジンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２６２位におけるリジンである。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１のアミノ酸２５７〜２６２位のいずれか１つにおけるグルタミンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸２５７〜２６２位のいずれか１つにおけるグルタミンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２５７位におけるグルタミンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２５８位におけるグルタミンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２５９位におけるグルタミンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２６０位におけるグルタミンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２６１位におけるグルタミンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２６２位におけるグルタミンである。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６のアミノ酸２５７〜２６２位のいずれか１つにおけるグルタミンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸２５７〜２６２位のいずれか１つにおけるグルタミンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２５７位におけるグルタミンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２５８位におけるグルタミンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２５９位におけるグルタミンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２６０位におけるグルタミンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２６１位におけるグルタミンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２６２位におけるグルタミンである。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１のアミノ酸２５７〜２６２位のいずれか１つにおけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸２５７〜２６２位のいずれか１つにおけるグルタミン酸である。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２５７位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２５８位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２５９位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２６０位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２６１位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２６２位におけるグルタミン酸である。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６のアミノ酸２５７〜２６２位のいずれか１つのグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸２５７〜２６２位のいずれか１つにおけるグルタミン酸である。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２５７位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２５８位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２５９位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２６０位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２６１位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２６２位におけるグルタミン酸である。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、位置Ｇ４７、Ｓ４３、Ｒ２５７、及び／またはＧ２５９において高ヘリックス性向アミノ酸のアミノ酸置換を含むように修飾された配列番号１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、位置Ｇ４７、Ｓ４３、Ｒ２５７、及び／またはＧ２５９において高ヘリックス性向アミノ酸のアミノ酸置換を含むように修飾された配列番号１と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、位置Ｇ４７、Ｓ４３、Ｒ２５７、及び／またはＧ２５９において高ヘリックス性向アミノ酸のアミノ酸置換を含むように修飾された配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、位置Ｇ４７、Ｓ４３、Ｒ２５７、及び／またはＧ２５９において高ヘリックス性向アミノ酸のアミノ酸置換を含むように修飾された配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、配列番号２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、配列番号３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、配列番号５のアミノ酸配列を含む。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、配列番号１０７または１０８のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、配列番号１０９または１１０のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、配列番号１１１または１１２のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、配列番号１１３または１１４のアミノ酸配列を含む。
【０１３９】
少なくとも２つ（２つ以上）の置換を有するＲＮＡポリメラーゼバリアントも本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、配列番号１または配列番号１と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸４２〜４７位（Ｅ４２、Ｓ４３、Ｙ４４、Ｅ４５、Ｍ４６、及び／またはＧ４７）及び／またはアミノ酸２５７〜２６２位（Ｒ２５７、Ａ２５８、Ｇ２５９、Ａ２６０、Ｌ２６１、及び／またはＡ２６２）のいずれか１つにおける少なくとも２つの高ヘリックス性向アミノ酸（例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシン、アルギニン、メチオニン、リジン、グルタミン、及び／またはグルタミン酸）置換を含む。
【０１４０】
例えば、ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、配列番号１または配列番号１と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のＥ４２及びＳ４３、Ｅ４２及びＹ４４、Ｅ４２及びＥ４５、Ｅ４２及びＭ４６、Ｅ４２及びＧ４７、Ｓ４３及びＹ４４、Ｓ４３及びＥ４５、Ｓ４３及びＭ４６、Ｓ４３及びＧ４７、Ｙ４４及びＥ４５、Ｙ４４及びＭ４６、Ｙ４４及びＧ４７、Ｅ４５及びＭ４６、Ｅ４５及びＧ４７、またはＭ４６及びＧ４７におけるアミノ酸置換（例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシン、アルギニン、メチオニン、リジン、グルタミン、及び／またはグルタミン酸）を含み得る。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、配列番号１または配列番号１と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のＲ２５７及びＡ２５８、Ｒ２５７及びＧ２５９、Ｒ２５７及びＡ２６０、Ｒ２５７及びＬ２６１、Ｒ２５７及びＡ２６２、Ａ２５８及びＧ２５９、Ａ２５８及びＡ２６０、Ａ２５８及びＬ２６１、Ａ２５８及びＡ２６２、Ｇ２５９及びＡ２６０、Ｇ２５９及びＬ２６１、Ｇ２５９及びＡ２６２、Ａ２６０及びＬ２６１、Ａ２６０及びＡ２６２、またはＬ２６１及びＡ２６２におけるアミノ酸置換（例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシン、アルギニン、メチオニン、リジン、グルタミン、及び／またはグルタミン酸）を含み得る。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、配列番号１または配列番号１と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のＥ４２及びＲ２５７、Ｅ４２及びＡ２５８、Ｅ４２及びＧ２５９、Ｅ４２及びＡ２６０、Ｅ４２及びＬ２６１、Ｅ４２及びＡ２６２、Ｓ４３及びＲ２５７、Ｓ４３及びＡ２５８、Ｓ４３及びＧ２５９、Ｓ４３及びＡ２６０、Ｓ４３及びＬ２６１、Ｓ４３及びＡ２６２、Ｙ４４及びＲ２５７、Ｙ４４及びＡ２５８、Ｙ４４及びＧ２５９、Ｙ４４及びＡ２６０、Ｙ４４及びＬ２６１、Ｙ４４及びＡ２６２、Ｅ４５及びＲ２５７、Ｅ４５及びＡ２５８、Ｅ４５及びＧ２５９、Ｅ４５及びＡ２６０、Ｅ４５及びＬ２６１、Ｅ４５及びＡ２６２、Ｍ４６及びＲ２５７、Ｍ４６及びＡ２５８、Ｍ４６及びＧ２５９、Ｍ４６及びＡ２６０、Ｍ４６及びＬ２６１、Ｍ４６及びＡ２６２、Ｇ４７及びＲ２５７、Ｇ４７及びＡ２５８、Ｇ４７及びＧ２５９、Ｇ４７及びＡ２６０、Ｇ４７及びＬ２６１、またはＧ４７及びＡ２６２におけるアミノ酸置換（例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシン、アルギニン、メチオニン、リジン、グルタミン、及び／またはグルタミン酸）を含み得る。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、配列番号１または配列番号１と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のＳ４３Ａ及びＧ４７Ａにおけるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、配列番号１または配列番号１と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のＳ４３Ａ及びＲ２５７Ａにおけるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、配列番号１または配列番号１と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のＳ４３Ａ及びＧ２５９Ａにおけるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、配列番号１または配列番号１と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のＧ４７Ａ及びＲ２５７Ａにおけるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、配列番号１または配列番号１と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のＧ４７Ａ及びＲ２５７Ａにおけるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、配列番号１または配列番号１と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のＲ２５７Ａ及びＧ２５９Ａにおけるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、配列番号１または配列番号１と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のＧ４７Ａ及びＧ２５９Ａにおけるアミノ酸置換を含む。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、配列番号１または配列番号１と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸４２〜４７位（Ｅ４２、Ｓ４３、Ｙ４４、Ｅ４５、Ｍ４６、及び／またはＧ４７）及び／またはアミノ酸２５７〜２６２位（Ｒ２５７、Ａ２５８、Ｇ２５９、Ａ２６０、Ｌ２６１、及び／またはＡ２６２）のいずれか１つにおける少なくとも３つ（もしくは少なくとも４つ、または少なくとも５つ）の高ヘリックス性向アミノ酸（例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシン、アルギニン、メチオニン、リジン、グルタミン、及び／またはグルタミン酸）置換を含む。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、Ｅ４２Ｒ、Ｓ４３Ａ、Ｓ４３Ｅ、Ｓ４３Ｌ、Ｓ４３Ｒ、Ｅ４５Ｒ、Ｅ４５Ｌ、Ｍ４６Ａ、Ｇ４７Ａ、Ｇ４７Ｅ、Ｇ４７Ｌ、Ｇ４７Ｒ、Ｎ１６５Ｗ、Ｅ１６７Ｍ、Ｅ１６７Ｎ、Ｅ１６８Ｉ、Ｅ１６８Ｔ、Ｅ１６８Ｖ、Ａ１８１Ｆ、Ａ１８１Ｗ、Ｇ１８４Ｍ、Ｅ１８７Ｆ、Ａ２５５Ｑ、Ａ２５５Ｋ、Ａ２５５Ｉ、Ａ２５５Ｙ、Ｒ２５７Ａ、Ｒ２５７Ｅ、Ｒ２５７Ｌ、Ｒ２５７Ｗ、Ｇ２５９Ａ、Ｇ２５９Ｅ、Ｇ２５９Ｌ、Ｇ２５９Ｒ、Ａ２６０Ｗ、及びＡ２６０Ｒから選択される、配列番号１または配列番号１と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列における少なくとも１つ（もしくは少なくとも２つ、もしくは少なくとも３つ、もしくは少なくとも４つ、または少なくとも５つ）のアミノ酸置換（複数可）を含む。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６または配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸４２〜４７位（Ｅ４２、Ｓ４３、Ｙ４４、Ｅ４５、Ｍ４６、及び／またはＧ４７）及び／またはアミノ酸２５７〜２６２位（Ｒ２５７、Ａ２５８、Ｇ２５９、Ａ２６０、Ｌ２６１、及び／またはＡ２６２）のいずれか１つにおける少なくとも２つの高ヘリックス性向アミノ酸（例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシン、アルギニン、メチオニン、リジン、グルタミン、及び／またはグルタミン酸）置換を含む。
【０１４７】
例えば、ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６または配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸位置Ｅ４２及びＳ４３、Ｅ４２及びＹ４４、Ｅ４２及びＥ４５、Ｅ４２及びＭ４６、Ｅ４２及びＧ４７、Ｓ４３及びＹ４４、Ｓ４３及びＥ４５、Ｓ４３及びＭ４６、Ｓ４３及びＧ４７、Ｙ４４及びＥ４５、Ｙ４４及びＭ４６、Ｙ４４及びＧ４７、Ｅ４５及びＭ４６、Ｅ４５及びＧ４７、またはＭ４６及びＧ４７におけるアミノ酸置換（例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシン、アルギニン、メチオニン、リジン、グルタミン、及び／またはグルタミン酸）を含み得る。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６または配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸位置Ｒ２５７及びＡ２５８、Ｒ２５７及びＧ２５９、Ｒ２５７及びＡ２６０、Ｒ２５７及びＬ２６１、Ｒ２５７及びＡ２６２、Ａ２５８及びＧ２５９、Ａ２５８及びＡ２６０、Ａ２５８及びＬ２６１、Ａ２５８及びＡ２６２、Ｇ２５９及びＡ２６０、Ｇ２５９及びＬ２６１、Ｇ２５９及びＡ２６２、Ａ２６０及びＬ２６１、Ａ２６０及びＡ２６２、またはＬ２６１及びＡ２６２におけるアミノ酸置換（例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシン、アルギニン、メチオニン、リジン、グルタミン、及び／またはグルタミン酸）を含む。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６または配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸位置Ｅ４２及びＲ２５７、Ｅ４２及びＡ２５８、Ｅ４２及びＧ２５９、Ｅ４２及びＡ２６０、Ｅ４２及びＬ２６１、Ｅ４２及びＡ２６２、Ｓ４３及びＲ２５７、Ｓ４３及びＡ２５８、Ｓ４３及びＧ２５９、Ｓ４３及びＡ２６０、Ｓ４３及びＬ２６１、Ｓ４３及びＡ２６２、Ｙ４４及びＲ２５７、Ｙ４４及びＡ２５８、Ｙ４４及びＧ２５９、Ｙ４４及びＡ２６０、Ｙ４４及びＬ２６１、Ｙ４４及びＡ２６２、Ｅ４５及びＲ２５７、Ｅ４５及びＡ２５８、Ｅ４５及びＧ２５９、Ｅ４５及びＡ２６０、Ｅ４５及びＬ２６１、Ｅ４５及びＡ２６２、Ｍ４６及びＲ２５７、Ｍ４６及びＡ２５８、Ｍ４６及びＧ２５９、Ｍ４６及びＡ２６０、Ｍ４６及びＬ２６１、Ｍ４６及びＡ２６２、Ｇ４７及びＲ２５７、Ｇ４７及びＡ２５８、Ｇ４７及びＧ２５９、Ｇ４７及びＡ２６０、Ｇ４７及びＬ２６１、またはＧ４７及びＡ２６２におけるアミノ酸置換（例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシン、アルギニン、メチオニン、リジン、グルタミン、及び／またはグルタミン酸）を含む。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６または配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸置換Ｓ４３Ａ及びＧ４７Ａを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６または配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸置換Ｓ４３Ａ及びＲ２５７Ａを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６または配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸置換Ｓ４３Ａ及びＧ２５９Ａを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６または配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸置換Ｇ４７Ａ及びＲ２５７Ａを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６または配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸置換Ｇ４７Ａ及びＲ２５７Ａを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６または配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸置換Ｒ２５７Ａ及びＧ２５９Ａを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６または配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸置換Ｇ４７Ａ及びＧ２５９Ａを含む。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６または配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸４２〜４７位（Ｅ４２、Ｓ４３、Ｙ４４、Ｅ４５、Ｍ４６、及び／またはＧ４７）及び／またはアミノ酸２５７〜２６２位（Ｒ２５７、Ａ２５８、Ｇ２５９、Ａ２６０、Ｌ２６１、及び／またはＡ２６２）のいずれか１つにおける少なくとも３つ（もしくは少なくとも４つ、または少なくとも５つ）の高ヘリックス性向アミノ酸（例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシン、アルギニン、メチオニン、リジン、グルタミン、及び／またはグルタミン酸）置換を含む。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、Ｅ４２Ｒ、Ｓ４３Ａ、Ｓ４３Ｅ、Ｓ４３Ｌ、Ｓ４３Ｒ、Ｅ４５Ｒ、Ｅ４５Ｌ、Ｍ４６Ａ、Ｇ４７Ａ、Ｇ４７Ｅ、Ｇ４７Ｌ、Ｇ４７Ｒ、Ｎ１６５Ｗ、Ｅ１６７Ｍ、Ｅ１６７Ｎ、Ｅ１６８Ｉ、Ｅ１６８Ｔ、Ｅ１６８Ｖ、Ａ１８１Ｆ、Ａ１８１Ｗ、Ｇ１８４Ｍ、Ｅ１８７Ｆ、Ｒ２５７Ａ、Ｒ２５７Ｅ、Ｒ２５７Ｌ、Ｒ２５７Ｗ、Ｇ２５９Ａ、Ｇ２５９Ｅ、Ｇ２５９Ｌ、Ｇ２５９Ｒ、Ａ２６０Ｗ、及びＡ２６０Ｒから選択される、配列番号９９、１００、２９４、２９５、もしくは２９６または配列番号９９、１００、２９４、２９５、もしくは２９６と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列における少なくとも１つ（もしくは少なくとも２つ、もしくは少なくとも３つ、もしくは少なくとも４つ、または少なくとも５つ）のアミノ酸置換（複数可）を含む。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、Ｅ４２Ｒ、Ｓ４３Ａ、Ｓ４３Ｅ、Ｓ４３Ｌ、Ｓ４３Ｒ、Ｅ４５Ｒ、Ｅ４５Ｌ、Ｍ４６Ａ、Ｇ４７Ａ、Ｇ４７Ｅ、Ｇ４７Ｌ、Ｇ４７Ｒ、Ｎ１６５Ｗ、Ｅ１６７Ｍ、Ｅ１６７Ｎ、Ｅ１６８Ｉ、Ｅ１６８Ｔ、Ｅ１６８Ｖ、Ａ１８１Ｆ、Ａ１８１Ｗ、Ｇ１８４Ｍ、Ｅ１８７Ｆ、Ｒ２５７Ａ、Ｒ２５７Ｅ、Ｒ２５７Ｌ、Ｒ２５７Ｗ、Ｇ２５９Ａ、Ｇ２５９Ｅ、Ｇ２５９Ｌ、Ｇ２５９Ｒ、Ａ２６０Ｗ、及びＡ２６０Ｒから選択される、少なくとも１つ（もしくは少なくとも２つ、もしくは少なくとも３つ、もしくは少なくとも４つ、または少なくとも５つ）のアミノ酸置換（複数可）を含み、少なくとも１つ（もしくは少なくとも２つ、もしくは少なくとも３つ、もしくは少なくとも４つ、または少なくとも５つ）の他のアミノ酸置換（例えば、本明細書に提供されていないアミノ酸置換）をさらに含む。
【０１５４】
したがって、本開示は、Ｅ４２Ｒ、Ｓ４３Ａ、Ｓ４３Ｅ、Ｓ４３Ｌ、Ｓ４３Ｒ、Ｅ４５Ｒ、Ｅ４５Ｌ、Ｍ４６Ａ、Ｇ４７Ａ、Ｇ４７Ｅ、Ｇ４７Ｌ、Ｇ４７Ｒ、Ｎ１６５Ｗ、Ｅ１６７Ｍ、Ｅ１６７Ｎ、Ｅ１６８Ｉ、Ｅ１６８Ｔ、Ｅ１６８Ｖ、Ａ１８１Ｆ、Ａ１８１Ｗ、Ｇ１８４Ｍ、Ｅ１８７Ｆ、Ａ２５５Ｋ、Ａ２５５Ｑ、Ａ２５５Ｙ、Ａ２５５Ｉ、Ｒ２５７Ａ、Ｒ２５７Ｅ、Ｒ２５７Ｌ、Ｒ２５７Ｗ、Ｇ２５９Ａ、Ｇ２５９Ｅ、Ｇ２５９Ｌ、Ｇ２５９Ｒ、Ａ２６０Ｗ、及びＡ２６０Ｒから選択される少なくとも１つ（もしくは少なくとも２つ、もしくは少なくとも３つ、もしくは少なくとも４つ、または少なくとも５つ）のアミノ酸置換（複数可）を含み、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する、ＲＮＡポリメラーゼバリアントを包含する。
【０１５５】
「同一性」という用語は、配列を比較することにより決定される２つ以上のポリペプチド（例えば酵素）またはポリヌクレオチド（核酸）の配列間の関係を指す。同一性はまた、２つ以上のアミノ酸残基または核酸残基のストリング間の一致数によって決定される配列間または配列の間での配列関連性の程度も指す。同一性は、特定の数学的モデルまたはコンピュータープログラム（例えば、「アルゴリズム」）によって指定されたギャップアライメント（存在する場合）を有する２つ以上の配列間の同一性一致のパーセントを測定する。関連するタンパク質または核酸の同一性は、既知の方法で容易に計算することができる。ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列に適用される「同一性パーセント（％）（ｐｅｒｃｅｎｔ（％）ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」は、配列をアラインさせ、必要に応じてギャップを導入して、最大パーセントの同一性を達成した後の第２の配列のアミノ酸配列または核酸配列中の残基と同一である候補アミノ酸または核酸配列中の残基（アミノ酸残基または核酸残基）のパーセントとして定義される。アライメントのための方法及びコンピュータープログラムは、当該分野で周知である。同一性は、同一性パーセントの計算に依るが、計算に導入されるギャップ及びペナルティにより値が異なる場合があることが理解される。一般的に、特定のポリヌクレオチドまたはポリペプチド（例えば、抗原）のバリアントは、本明細書に記載され、当業者に既知である配列アライメントプログラム及びパラメーターによって決定される特定の参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのものに対して、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％であるが、１００％未満の配列同一性を有する。そのようなアライメント用ツールには、ＢＬＡＳＴスイートのツールが含まれる（Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｆ．  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ（１９９７），「Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：  ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ」，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）。別の一般的なローカルアライメント手法は、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムに基づく（Ｓｍｉｔｈ，Ｔ．Ｆ．＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｍ．Ｓ．（１９８１）「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｍｍｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７）。ダイナミック（ｄｙｎａｍｉｃ）プログラミングに基づく一般的なグローバルアライメント手法は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムである（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．＆  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（１９７０）「Ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）。最近では、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈア��ゴリズムを含む他の最適なグローバルアライメント手法よりも高速にヌクレオチド及びタンパク質配列のグローバルアライメントを生成するといわれる、Ｆａｓｔ  Ｏｐｔｉｍａｌ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ（ＦＯＧＳＡＡ）が開発された。
【０１５６】
トリヌクレオチドキャップ
リボ核酸（ＲＮＡ）合成のための共転写キャッピング方法も本明細書で提供される。すなわち、ＲＮＡは「ワンポット（ｏｎｅ−ｐｏｔ）」反応で生成され、別々のキャッピング反応を必要としない。したがって、本方法は、いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写物を生成するためのインビトロ転写反応条件下で、ポリヌクレオチド鋳型をＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント、ヌクレオシド三リン酸、及びキャップ類似体と反応させることを含む。
【０１５７】
キャップ類似体は、例えば、ジヌクレオチドキャップ、トリヌクレオチドキャップ、またはテトラヌクレオチドキャップであり得る。いくつかの実施形態では、キャップ類似体は、ジヌクレオチドキャップである。いくつかの実施形態では、キャップ類似体は、トリヌクレオチドキャップである。いくつかの実施形態では、キャップ類似体は、テトラヌクレオチドキャップである。
【０１５８】
トリヌクレオチドキャップは、いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物
【化１】
2020532963.tif 000004
またはその立体異性体、互変異性体、もしくは塩を含み、式中、
【化２】
2020532963.tif 000005
環Ｂ１は、修飾または未修飾グアニンであり、
環Ｂ２及び環Ｂ３はそれぞれ独立して、核酸塩基または修飾核酸塩基であり、
Ｘ２はＯ、Ｓ（Ｏ）ｐ、ＮＲ２４、またはＣＲ２５Ｒ２６であり、ｐは０、１、または２であり、
Ｙ０は、ＯまたはＣＲ６Ｒ７であり、
Ｙ１は、Ｏ、Ｓ（Ｏ）ｎ、ＣＲ６Ｒ７、またはＮＲ８であり、ｎは０、１、または２であり、
各−−−は、単結合または不存在であり、各−−−が単結合の場合、ＹｉはＯ、Ｓ（Ｏ）ｎ、ＣＲ６Ｒ７、またはＮＲ８であり、各−−−が不存在である場合、Ｙ１は空（ｖｏｉｄ）であり、
Ｙ２は、（ＯＰ（Ｏ）Ｒ４）ｍ（ｍは０、１、または２である）または−Ｏ−（ＣＲ４０Ｒ４１）ｕ−Ｑ０−（ＣＲ４２Ｒ４３）ｖ−であり、ここで、Ｑ０は結合、Ｏ、Ｓ（Ｏ）ｒ、ＮＲ４４、またはＣＲ４５Ｒ４６であり、ｒは０、１、または２であり、ｕ及びｖの各々は、独立して、１、２、３または４であり、
各Ｒ２及びＲ２´は、独立して、ハロ、ＬＮＡ、またはＯＲ３であり、
各Ｒ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、またはＣ２−Ｃ６アルキニルであり、Ｒ３は、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、またはＣ２−Ｃ６アルキニルである場合、ハロ、ＯＨ、または１つ以上のＯＨもしくはＯＣ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ６アルキルで任意選択により置換されたＣ１−Ｃ６アルコキシルのうちの１つ以上で任意選択により置換され、
各Ｒ４及びＲ４´は、独立して、Ｈ、ハロ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、ＯＨ、ＳＨ、ＳｅＨ、またはＢＨ３−であり、
Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８の各々は、独立して、−Ｑ１−Ｔ１であり、ここで、Ｑ１は、結合、またはハロ、シアノ、ＯＨ、及びＣ１−Ｃ６アルコキシのうちの１つ以上で任意選択により置換されたＣ１−Ｃ３アルキルリンカーであり、Ｔ１は、Ｈ、ハロ、ＯＨ、ＣＯＯＨ、シアノ、またはＲｓ１であり、ここで、Ｒｓ１は、Ｃ１−Ｃ３アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシル、Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、Ｃ６−Ｃ１０アリール、ＮＲ３１Ｒ３２、（ＮＲ３１Ｒ３２Ｒ３３）＋、４〜１２員のヘテロシクロアルキル、または５もしくは６員のヘテロアリールであり、Ｒｓ１は、ハロ、ＯＨ、オキソ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、ＣＯＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ６アルキル、シアノ、Ｃ１−Ｃ６アルコキシル、ＮＲ３１Ｒ３２、（ＮＲ３１Ｒ３２Ｒ３３）＋、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、Ｃ６−Ｃ１０アリール、４〜１２員のヘテロシクロアルキル、及び５または６員のヘテロアリールからなる群から選択される１つ以上の置換基で任意選択により置換され、
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３Ｒ１４、及びＲ１５の各々は、独立して、−Ｑ２−Ｔ２であり、ここで、Ｑ２は、結合、またはハロ、シアノ、ＯＨ、及びＣ１−Ｃ６アルコキシのうちの１つ以上で任意選択により置換されたＣ１−Ｃ３アルキルリンカーであり、Ｔ２は、Ｈ、ハロ、ＯＨ、ＮＨ２、シアノ、ＮＯ２、Ｎ３、Ｒｓ２、またはＯＲｓ２であり、ここで、Ｒｓ２は、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、Ｃ６−Ｃ１０アリール、ＮＨＣ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ６アルキル、ＮＲ３１Ｒ３２、（ＮＲ３１Ｒ３２Ｒ３３）＋、４〜１２員のヘテロシクロアルキル、または５もしくは６員のヘテロアリールあり、Ｒｓ２は、ハロ、ＯＨ、オキソ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、ＣＯＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ６アルキル、シアノ、Ｃ１−Ｃ６アルコキシル、ＮＲ３１Ｒ３２、（ＮＲ３１Ｒ３２Ｒ３３）＋、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、Ｃ６−Ｃ１０アリール，４〜１２員のヘテロシクロアルキル、及び５または６員のヘテロアリールからなる群から選択される１つ以上の置換基で任意選択により置換され、あるいはＲ１２はＲ１４と一緒にオキソであり、またはＲ１３はＲ１５と一緒にオキソであり、
Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２、及びＲ２３の各々は、独立して、−Ｑ３−Ｔ３であり、ここで、Ｑ３は、結合、またはハロ、シアノ、ＯＨ、及びＣ１−Ｃ６アルコキシのうちの１つ以上で任意選択により置換されたＣ１−Ｃ３アルキルリンカーであり、Ｔ３は、Ｈ、ハロ、ＯＨ、ＮＨ２、シアノ、ＮＯ２、Ｎ３、ＲＳ３、またはＯＲＳ３であり、ここで、ＲＳ３は、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、Ｃ６−Ｃ１０アリール、ＮＨＣ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ６アルキル、モノ−Ｃ１−Ｃ６アルキルアミノ、ジ−Ｃ１−Ｃ６アルキルアミノ、４〜１２員のヘテロシクロアルキル、または５もしくは６員のヘテロアリールあり、Ｒｓ３は、ハロ、ＯＨ、オキソ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、ＣＯＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ６アルキル、シアノ、Ｃ１−Ｃ６アルコキシル、アミノ、モノ−Ｃ１−Ｃ６アルキルアミノ、ジ−Ｃ１−Ｃ６アルキルアミノ、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、Ｃ６−Ｃ１０アリール、４〜１２員のヘテロシクロアルキル、及び５または６員のヘテロアリールからなる群から選択される１つ以上の置換基で任意選択により置換され、
Ｒ２４、Ｒ２５、及びＲ２６の各々は、独立して、ＨまたはＣ１−Ｃ６アルキルであり、
Ｒ２７及びＲ２８の各々は、独立して、ＨまたはＯＲ２９であり、あるいはＲ２７及びＲ２８は一緒になって、Ｏ−Ｒ３０−Ｏを形成し、各Ｒ２９は、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、またはＣ２−Ｃ６アルキニルであり、Ｒ２９、は、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、またはＣ２−Ｃ６アルキニルである場合、ハロ、ＯＨ、または１つ以上のＯＨもしくはＯＣ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ６アルキルで任意選択により置換されたＣ１−Ｃ６アルコキシルのうちの１つ以上で任意選択により置換され、
Ｒ３０は、ハロ、ＯＨ、及びＣ１−Ｃ６アルコキシルのうちの１つ以上で任意選択により置換されたＣ１−Ｃ６アルキレンであり、
Ｒ３１、Ｒ３２、及びＲ３３の各々は、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、Ｃ６−Ｃ１０アリール、４〜１２員のヘテロシクロアルキル、または５または６員のヘテロアリールであり、
Ｒ４０、Ｒ４１、Ｒ４２、及びＲ４３の各々は、独立して、Ｈ、ハロ、ＯＨ、シアノ、Ｎ３、ＯＰ（Ｏ）Ｒ４７Ｒ４８、または１つ以上のＯＰ（Ｏ）Ｒ４７Ｒ４８で任意選択により置換されたＣ１−Ｃ６アルキルであり、あるいは１つのＲ４１及び１つのＲ４３は、それらが結合している炭素原子及びＱ０と一緒になって、Ｃ４−Ｃ１０シクロアルキル、４〜１４員のヘテロシクロアルキル、Ｃ６−Ｃ１０アリール、または５〜１４員のヘテロアリールを形成し、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、フェニル、または５〜６員のヘテロアリールの各々は、ＯＨ、ハロ、シアノ、Ｎ３、オキソ、ＯＰ（Ｏ）Ｒ４７Ｒ４８、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキル、ＣＯＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシル、Ｃ１−Ｃ６ハロアルコキシル、アミノ、モノ−Ｃ１−Ｃ６アルキルアミノ、及びジ−Ｃ１−Ｃ６アルキルアミノのうちの１つ以上で任意選択により置換され、
Ｒ４４は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、またはアミン保護基であり、
Ｒ４５及びＲ４６の各々は、独立して、Ｈ、ＯＰ（Ｏ）Ｒ４７Ｒ４８、または１つ以上のＯＰ（Ｏ）Ｒ４７Ｒ４８で任意選択により置換されたＣ１−Ｃ６アルキルであり、
Ｒ４７及びＲ４８の各々は、独立して、Ｈ、ハロ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、ＯＨ、ＳＨ、ＳｅＨ、またはＢＨ３−である。
【０１５９】
本明細書で提供されるキャップ類似体は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１７年４月２０日に公開された国際公開ＷＯ２０１７／０６６７９７に記載のキャップ類似体のいずれかを含み得ることを理解されたい。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、Ｂ２中間位置は、アラビノースなどの非リボース分子であり得る。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、Ｒ２はエチル系である。
【０１６２】
したがって、いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、以下の構造を含む：
【化３】
2020532963.tif 000006
【０１６３】
他の実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、以下の構造を含む：
【化４】
2020532963.tif 000007
【０１６４】
さらに他の実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、以下の構造を含む：
【化５】
2020532963.tif 000008
【０１６５】
さらに他の実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、以下の構造を含む：
【化６】
2020532963.tif 000009
【０１６６】
トリヌクレオチドキャップは、いくつかの実施形態では、以下の配列：ＧＡＡ、ＧＡＣ、ＧＡＧ、ＧＡＵ、ＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、ＧＣＵ、ＧＧＡ、ＧＧＣ、ＧＧＧ、ＧＧＵ、ＧＵＡ、ＧＵＣ、ＧＵＧ、及びＧＵＵから選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ＧＡＡを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ＧＡＣを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ＧＡＧを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ＧＡＵを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ＧＣＡを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ＧＣＣを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ＧＣＧを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ＧＣＵを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ＧＧＡを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ＧＧＣを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ＧＧＧを含むいくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ＧＧＵを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ＧＵＡを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ＧＵＣを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ＧＵＧを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ＧＵＵを含む。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、以下の配列：ｍ７ＧｐｐｐＡｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＡｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＡｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＡｐＵ、ｍ７ＧｐｐｐＣｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＣｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＣｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＣｐＵ、ｍ７ＧｐｐｐＧｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＧｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＧｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＧｐＵ、ｍ７ＧｐｐｐＵｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＵｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＵｐＧ、及びｍ７ＧｐｐｐＵｐＵから選択される配列を含む。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７ＧｐｐｐＡｐＡを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７ＧｐｐｐＡｐＣを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７ＧｐｐｐＡｐＧを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７ＧｐｐｐＡｐＵを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７ＧｐｐｐＣｐＡを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７ＧｐｐｐＣｐＣを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７ＧｐｐｐＣｐＧを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７ＧｐｐｐＣｐＵを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７ＧｐｐｐＧｐＡを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７ＧｐｐｐＧｐＣを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７ＧｐｐｐＧｐＧを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７ＧｐｐｐＧｐＵを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７ＧｐｐｐＵｐＡを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７ＧｐｐｐＵｐＣを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７ＧｐｐｐＵｐＧを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７ＧｐｐｐＵｐＵを含む。
【０１６９】
トリヌクレオチドキャップは、いくつかの実施形態では、以下の配列：ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡｐＡ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡｐＣ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡｐＧ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡｐＵ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣｐＡ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣｐＣ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣｐＧ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣｐＵ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧｐＡ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧｐＣ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧｐＧ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧｐＵ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵｐＡ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵｐＣ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵｐＧ、及びｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵｐＵから選択される配列を含む。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡｐＡを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡｐＣを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡｐＧを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡｐＵを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣｐＡを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣｐＣを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣｐＧを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣｐＵを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧｐＡを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧｐＣを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧｐＧを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧｐＵを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵｐＡを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵｐＣを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵｐＧを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵｐＵを含む。
【０１７１】
トリヌクレオチドキャップは、いくつかの実施形態では、以下の配列：ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＡ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＣ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＧ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＵ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＡ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＣ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＧ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＵ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＡ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＣ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＧ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＵ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＡ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＣ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＧ、及びｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＵから選択される配列を含む。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＡを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＣを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＧを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＵを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＡを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＣを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＧを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＵを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＡを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＣを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＧを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＵを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＡを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＣを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＧを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＵを含む。
【０１７３】
トリヌクレオチドキャップは、さらにいくつかの実施形態では、以下の配列：ｍ７ＧｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＵ、ｍ７ＧｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＵ、ｍ７ＧｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＵ、ｍ７ＧｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＧ、及びｍ７ＧｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＵから選択される配列を含む。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７ＧｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＡを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７ＧｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＣを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７ＧｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＧを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７ＧｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＵを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７ＧｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＡを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７ＧｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＣを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７ＧｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＧを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７ＧｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＵを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７ＧｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＡを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７ＧｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＣを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７ＧｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＧを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７ＧｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＵを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７ＧｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＡを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７ＧｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＣを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７ＧｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＧを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７ＧｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＵを含む。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ＧＡＧを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ＧＣＧを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ＧＵＧを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ＧＧＧを含む。
【０１７６】
インビトロ転写方法
本開示のいくつかの態様は、ＲＮＡ転写物の生成をもたらす条件下で、ＤＮＡ鋳型をＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントなどのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ）と接触させることを含む、ＲＮＡ転写物（例えば、ｍＲＮＡ転写物）を生成（合成）する方法を提供する。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、本方法は、ＲＮＡ転写物の生成をもたらす条件下で、ＤＮＡ鋳型を、Ｓ４３Ａ置換を有するＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、配列番号１、９９、または１００）バリアント（例えば、Ｓ４３Ａ  Ｔ７  ＲＮＡＰバリアントまたはＳ４３Ａ＊  Ｔ７  ＲＮＡＰバリアント）と接触させることを含む。他の実施形態では、本方法は、ＲＮＡ転写物の生成をもたらす条件下で、ＤＮＡ鋳型を、Ｇ４７Ａ置換を有するＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、配列番号１、９９、または１００）バリアント（例えば、Ｇ４７Ａ  Ｔ７  ＲＮＡＰバリアントまたはＧ４７Ａ＊  Ｔ７  ＲＮＡＰバリアント）と接触させることを含む。さらに他の実施形態では、本方法は、ＲＮＡ転写物の生成をもたらす条件下で、ＤＮＡ鋳型を、Ｒ２５７Ａ置換を有するＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、配列番号１、９９、または１００）バリアント（例えば、Ｒ２５７Ａ  Ｔ７  ＲＮＡＰバリアントまたはＲ２５７Ａ＊  Ｔ７  ＲＮＡＰバリアント）と接触させることを含む。さらに他の実施形態では、本方法は、ＲＮＡ転写物の生成をもたらす条件下で、ＤＮＡ鋳型を、Ｇ２５９Ａ置換を有するＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、配列番号１、９９、または１００）バリアント（例えば、Ｇ２５９Ａ  Ｔ７  ＲＮＡＰバリアントまたはＧ２５９Ａ＊  Ｔ７  ＲＮＡＰバリアント）と接触させることを含む。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、本方法は、ＤＮＡ鋳型を（少なくとも１つの）追加のＣ末端アミノ酸（例えば、Ｇｌｙ、Ａｌａ、ＧｌｙＧｌｙ、ＡｌａＡｌａ、ＧｌｙＡｌａ、またはＡｌａＧｌｙ）を含むＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントと接触させることを含む。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、本方法は、ＤＮＡ鋳型を、Ｅ４２Ｒ、Ｓ４３Ａ、Ｓ４３Ｅ、Ｓ４３Ｌ、Ｓ４３Ｒ、Ｅ４５Ｒ、Ｅ４５Ｌ、Ｍ４６Ａ、Ｇ４７Ａ、Ｇ４７Ｅ、Ｇ４７Ｌ、Ｇ４７Ｒ、Ｎ１６５Ｗ、Ｅ１６７Ｍ、Ｅ１６７Ｎ、Ｅ１６８Ｉ、Ｅ１６８Ｔ、Ｅ１６８Ｖ、Ａ１８１Ｆ、Ａ１８１Ｗ、Ｇ１８４Ｍ、Ｅ１８７Ｆ、Ａ２５５Ｑ、Ａ２５５Ｋ、Ａ２５５Ｉ、Ａ２５５Ｙ、Ｒ２５７Ａ、Ｒ２５７Ｅ、Ｒ２５７Ｌ、Ｒ２５７Ｗ、Ｇ２５９Ａ、Ｇ２５９Ｅ、Ｇ２５９Ｌ、Ｇ２５９Ｒ、Ａ２６０Ｗ、またはＡ２６０Ｒ置換、または前述の置換のうちの２つ以上及び任意選択による追加のＣ末端アミノ酸（例えば、Ｇｌｙ、Ａｌａ、ＧｌｙＧｌｙ、ＡｌａＡｌａ、ＧｌｙＡｌａ、またはＡｌａＧｌｙ）の任意の組み合わせを含むＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントと接触させることを含む。
【０１８０】
いくつかの態様では、本開示は、ＲＮＡ転写物の生成をもたらす条件下で、ヌクレオシド三リン酸及び緩衝液の存在下において、ＤＮＡ鋳型をＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントなどのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ）と接触させることを含む、ＩＶＴ反応を行う方法を提供する。
【０１８１】
本開示の他の態様は、インビトロ転写物を生成するための条件下で、ポリヌクレオチド鋳型をＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント、ヌクレオシド三リン酸、及びキャップ類似体と反応させてＲＮＡ転写物を生成することを含む、共転写キャッピング方法を提供する。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ合成のための共転写キャッピング方法は、ＲＮＡ転写物を生成するためのインビトロ転写反応条件下で、ポリヌクレオチド鋳型を（ａ）Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントであって、野生型ＲＮＡポリメラーゼと比較して、該ＲＮＡポリメラーゼバリアントが開始複合体から伸長複合体に移行するにつれてＲＮＡポリメラーゼバリアントの少なくとも１つのループ構造にヘリックス構造へのコンフォメーション変化を受けさせる少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、該Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント、（ｂ）ヌクレオシド三リン酸、及び（ｃ）配列ＧｐｐｐＡ２′ＯｍｅｐＧを含むトリヌクレオチドキャップと反応させることを含み、ポリヌクレオチド鋳型が、鋳型位置＋１に２´−デオキシチミジン残基を含む。
【０１８３】
ＩＶＴ条件は、典型的には、プロモーター、ヌクレオシド三リン酸、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）及びマグネシウムイオンを含む緩衝系、ならびにＲＮＡポリメラーゼを含む精製した線形ＤＮＡ鋳型を必要とする。転写反応で使用される正確な条件は、特定の用途に必要なＲＮＡの量に依拠する。典型的なＩＶＴ反応は、転写緩衝液中でＤＮＡ鋳型をＲＮＡポリメラーゼ及びＧＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ（またはヌクレオチド類似体）を含むヌクレオシド三リン酸とともにインキュベートすることにより行われる。５´末端グアノシン三リン酸を有するＲＮＡ転写物は、この反応から生成される。
【０１８４】
デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）は、単にＲＮＡポリメラーゼの核酸鋳型である。ＤＮＡ鋳型は、目的のポリペプチド（例えば、抗原性ポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドを含み得る。ＤＮＡ鋳型は、いくつかの実施形態では、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドから５´に位置し、該ポリヌクレオチドに機能的に連結されたＲＮＡポリメラーゼプロモーター（例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター）を含む。ＤＮＡ鋳型は、目的の遺伝子の３´末端に位置するポリアデニル化（ポリＡ）テールをコードするヌクレオチド配列も含み得る。
【０１８５】
目的のポリペプチドには、生物製剤、抗体、抗原（ワクチン）、及び治療用タンパク質が含まれるが、これらに限定されない。「タンパク質」という用語には、ペプチドが包含される。
【０１８６】
ＲＮＡ転写物は、いくつかの実施形態では、ＩＶＴ反応の産物である。ＲＮＡ転写物は、いくつかの実施形態では、ポリＡ尾部に連結された目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む修飾されたｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）である。
【０１８７】
ヌクレオチドは、窒素塩基、五炭糖（リボースまたはデオキシリボース）、及び少なくとも１つのリン酸基を含む。ヌクレオチドには、ヌクレオシド一リン酸、ヌクレオシド二リン酸、及びヌクレオシド三リン酸が含まれる。ヌクレオシド一リン酸（ＮＭＰ）には、リボースに結合した核酸塩基及び１つのリン酸が含まれる。ヌクレオシド二リン酸（ＮＤＰ）には、リボースに結合した核酸塩基及び２つのリン酸が含まれる。ヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）には、リボースに結合した核酸塩基及び３つのリン酸が含まれる。ヌクレオチド類似体は、ヌクレオチドの一般構造を有するか、またはヌクレオチドに構造的に類似した化合物である。ヌクレオチド類似体には、例えば、核酸塩基の類似体、糖の類似体、及び／またはヌクレオチドのリン酸基（複数可）の類似体が含まれる。
【０１８８】
ヌクレオシドは、窒素塩基及び五炭糖を含む。したがって、ヌクレオシドとリン酸基とにより、ヌクレオチドとなる。ヌクレオシド類似体は、ヌクレオシドの一般構造を有するか、またはヌクレオシドに構造的に類似した化合物である。例えば、ヌクレオシド類似体には、核酸塩基の類似体及び／またはヌクレオシドの糖の類似体が含まれる。
【０１８９】
「ヌクレオチド」という用語には、別段で明記しない限り、天然に存在するヌクレオチド、合成ヌクレオチド、及び修飾ヌクレオチドが含まれることを理解されたい。本明細書で提供される、例えばＩＶＴ反応においてＲＮＡの生成に使用される天然に存在するヌクレオチドの例には、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、及び５−メチルウリジン三リン酸（ｍ５ＵＴＰ）が含まれる。いくつかの実施形態では、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）、及び／またはウリジン二リン酸（ＵＤＰ）が使用される。
【０１９０】
ヌクレオチド類似体の例には、抗ウイルスヌクレオチド類似体、リン酸類似体（可溶性または固定化（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ）、加水分解性または非加水分解性）、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、例えば、キャップ類似体、または酵素キャッピングの前駆体／基質（ワクシニアまたはリガーゼ）、キャップもしくは５´部分（ＩＲＥＳ）のライゲーション／コンジュゲーションを促進するための官能基で標識されたヌクレオチド、キャップもしくは５´部分のライゲーションを促進するための５′ＰＯ４で標識されたヌクレオチド、または化学的もしくは酵素的に切断することができる官能基／保護基で標識されたヌクレオチが含まれるが、これらに限定されない。抗ウイルスヌクレオチド／ヌクレオシド類似体の例には、ガンシクロビル、エンテカビル、テルビブジン、ビダラビン、及びシドフォビルが含まれるが、これらに限定されない。
【０１９１】
修飾ヌクレオチドは、修飾核酸塩基を含み得る。例えば、本開示のＲＮＡ転写物（例えば、ｍＲＮＡ転写物）は、シュードウリジン（ψ）、１−メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）、１−エチルシュードウリジン、２−チオウリジン、４´−チオウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−シュードウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオ−ジヒドロシュードウリジン、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−シュードウリジン、４−メトキシ−２−チオ−シュードウリジン、４−メトキシ−シュードウリジン、４−チオ−１−メチル−シュードウリジン、４−チオ−シュードウリジン、５−アザ−ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５−メチルウリジン、５−メトキシウリジン（ｍｏ５Ｕ）、及び２´−Ｏ−メチルウリジンから選択される修飾核酸塩基を含み得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写物（例えば、ｍＲＮＡ転写物）には、前述の修飾核酸塩基のうちの少なくとも２つ（例えば、２、３、４つまたはそれ以上）の組み合わせが含まれる。
【０１９２】
本明細書で提供されるヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）は、非修飾もしくは修飾ＡＴＰ、修飾もしくは非修飾ＵＴＰ、修飾もしくは非修飾ＧＴＰ、及び／または修飾もしくは非修飾ＣＴＰを含み得る。いくつかの実施形態では、ＩＶＴ反応のＮＴＰは、非修飾ＡＴＰを含む。いくつかの実施形態では、ＩＶＴ反応のＮＴＰは、修飾ＡＴＰを含む。いくつかの実施形態では、ＩＶＴ反応のＮＴＰは、非修飾ＵＴＰを含む。いくつかの実施形態では、ＩＶＴ反応のＮＴＰは、修飾ＵＴＰを含む。いくつかの実施形態では、ＩＶＴ反応のＮＴＰは、非修飾ＧＴＰを含む。いくつかの実施形態では、ＩＶＴ反応のＮＴＰは、修飾ＧＴＰを含む。いくつかの実施形態では、ＩＶＴ反応のＮＴＰは、非修飾ＣＴＰを含む。いくつかの実施形態では、ＩＶＴ反応のＮＴＰは、修飾ＣＴＰを含む。
【０１９３】
ＩＶＴ反応において存在するヌクレオシド三リン酸及びキャップ類似体の濃度は変動し得る。いくつかの実施形態では、ＮＴＰ及びキャップ類似体は、反応において等モル濃度で存在する。いくつかの実施形態では、反応におけるキャップ類似体（例えば、トリヌクレオチドキャップ）とヌクレオシド三リン酸とのモル比は、１：１より大きい。例えば、反応におけるキャップ類似体とヌクレオシド三リン酸とのモル比は、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、５０：１、または１００：１であり得る。いくつかの実施形態では、反応におけるキャップ類似体（例えば、トリヌクレオチドキャップ）とヌクレオシド三リン酸とのモル比は、１：１未満である。例えば、反応におけるキャップ類似体（例えば、トリヌクレオチドキャップ）とヌクレオシド三リン酸とのモル比は、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１５、１：２０、１：２５、１：５０、または１：１００であり得る。
【０１９４】
ＩＶＴ反応におけるＮＴＰの組成も変化し得る。例えば、ＡＴＰは、ＧＴＰ、ＣＴＰ、及びＵＴＰより超過して使用され得る。非限定的な例として、ＩＶＴ反応には、７．５ミリモルのＧＴＰ、７．５ミリモルのＣＴＰ、７．５ミリモルのＵＴＰ、及び３．７５ミリモルのＡＴＰが含まれ得る。同じＩＶＴ反応には、３．７５ミリモルのキャップ類似体（例えば、トリヌクレオチドキャップ）が含まれ得る。いくつかの実施形態では、Ｇ：Ｃ：Ｕ：Ａ：キャップのモル比は、１：１：１：０．５：０．５である。いくつかの実施形態では、Ｇ：Ｃ：Ｕ：Ａ：キャップのモル比は、１：１：０．５：１：０．５である。いくつかの実施形態では、Ｇ：Ｃ：Ｕ：Ａ：キャップのモル比は、１：０．５：１：１：０．５である。いくつかの実施形態では、Ｇ：Ｃ：Ｕ：Ａ：キャップのモル比は、０．５：１：１：１：０．５である。
【０１９５】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写物（例えば、ｍＲＮＡ転写物）には、シュードウリジン（ψ）、１−メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）、５−メトキシウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、α−チオグアノシン、及びα−チオアデノシンから選択される修飾核酸塩基が含まれる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写物（例えば、ｍＲＮＡ転写物）には、前述の修飾核酸塩基のうちの少なくとも２つ（例えば、２、３、４つまたはそれ以上）の組み合わせが含まれる。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写物（例えばｍＲＮＡ転写物）には、シュードウリジン（ψ）が含まれる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写物（例えば、ｍＲＮＡ転写物）には、１−メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）が含まれる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写物（例えば、ｍＲＮＡ転写物）には、５−メトキシウリジン（ｍｏ５Ｕ）が含まれる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写物（例えば、ｍＲＮＡ転写物）には、５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）が含まれる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写物（例えば、ｍＲＮＡ転写物）には、α−チオ−グアノシンが含まれる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写物（例えば、ｍＲＮＡ転写物）には、α−チオ−アデノシンが含まれる。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、特定の修飾のために均一に修飾される（例えば、完全に修飾される、配列全体にわたって修飾される）。例えば、ポリヌクレオチドを１−メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）で均一に修飾することができ、このことは、ｍＲＮＡ配列中のすべてのウリジン残基が１−メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）で置換されることを意味する。同様に、ポリヌクレオチドは、上記のもののうちのいずれかなどの修飾残基での置換により、配列中に存在する任意の種類のヌクレオシド残基について均一に修飾することができる。あるいは、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、均一に修飾されていなくてもよい（例えば、部分的に修飾され、配列の一部が修飾されている）。各々の選択肢は、本発明の別々の実施形態を表す。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、緩衝系は、トリス（ｔｒｉｓ）を含む。例えば、ＩＶＴ反応で使用されるトリスの濃度は、少なくとも１０ｍＭ、少なくとも２０ｍＭ、少なくとも３０ｍＭ、少なくとも４０ｍＭ、少なくとも５０ｍＭ、少なくとも６０ｍＭ、少なくとも７０ｍＭ、少なくとも８０ｍＭ、少なくとも９０ｍＭ、少なくとも１００ｍＭ、または少なくとも１１０ｍＭのリン酸塩である。いくつかの実施形態では、リン酸塩の濃度は、２０〜６０ｍＭまたは１０〜１００ｍＭである。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、緩衝系は、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含む。ＩＶＴ反応で使用されるＤＴＴの濃度は、例えば、少なくとも１ｍＭ、少なくとも５ｍＭ、または少なくとも５０ｍＭであり得る。いくつかの実施形態では、ＩＶＴ反応で使用されるＤＴＴの濃度は、１〜５０ｍＭまたは５〜５０ｍＭである。いくつかの実施形態では、ＩＶＴ反応で使用されるＤＴＴの濃度は、５ｍＭである。
【０２００】
いくつかの実施形態では、緩衝系は、マグネシウムを含む。いくつかの実施形態では、ＩＶＴ反応において存在するＮＴＰとマグネシウムイオン（Ｍｇ２＋；例えばＭｇＣｌ２）とのモル比は、１：１〜１：５である。例えば、ＮＴＰとマグネシウムイオンとのモル比は、１：１、１：２、１：３、１：４、または１：５であり得る。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、ＩＶＴ反応において存在するＮＴＰ及びキャップ類似体（例えば、ＧＡＧなどのトリヌクレオチドキャップ）とマグネシウムイオン（Ｍｇ２＋；例えばＭｇＣｌ２）とのモル比は、１：１〜１：５である。例えば、ＮＴＰ＋トリヌクレオチドキャップ（例えば、ＧＡＧ）とマグネシウムイオンとのモル比は、１：１、１：２、１：３、１：４、または１：５であり得る。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、緩衝系は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、スペルミジン（例えば、１〜３０ｍＭの濃度）、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００（ポリエチレングリコールｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェニルエーテル）、及び／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。
【０２０３】
成長中のＲＮＡ鎖の３´末端へのヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）の付加は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼなどのポリメラーゼ、例えば、本開示のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントのいずれか１つ以上（例えば、Ｓ４３Ａ及び／またはＧ４７Ａ）によって触媒される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント）は、０．０１ｍｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌの濃度で反応（例えば、ＩＶＴ反応）において存在する。例えば、ＲＮＡポリメラーゼは、０．０１ｍｇ／ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、または１．０ｍｇ／ｍｌの濃度で反応において存在し得る。
【０２０４】
驚くべきことに、例えば、インビトロ転写反応において、本明細書で提供されるＴ７  ＲＮＡＰバリアント（例えば、Ｅ４２、Ｓ４３、Ｙ４４、Ｅ４５、Ｍ４６、Ｇ４７、Ａ２５５、Ｒ２５７、またはＧ２５９、例えばＳ４３ＡまたはＧ４７Ａ）とキャップ類似体（例えば、ＧｐｐｐＡ２′ＯｍｅｐＧ）とを組み合わせて使用すると、ＲＮＡ転写物が生成され、生成されたＲＮＡ転写物の８０％超が機能性キャップを含む。いくつかの実施形態では、生成されたＲＮＡ転写物の８５％超が機能性キャップを含む。いくつかの実施形態では、生成されたＲＮＡ転写物の９０％超が機能性キャップを含む。いくつかの実施形態では、生成されたＲＮＡ転写物の９５％超が機能性キャップを含む。いくつかの実施形態では、生成されたＲＮＡ転写物の９６％超が機能性キャップを含む。いくつかの実施形態では、生成されたＲＮＡ転写物の９７％超が機能性キャップを含む。いくつかの実施形態では、生成されたＲＮＡ転写物の９８％超が機能性キャップを含む。いくつかの実施形態では、生成されたＲＮＡ転写物の９９％超が機能性キャップを含む。
【０２０５】
また、鋳型位置＋１に２´−デオキシチミジン残基または２´−デオキシシチジン残基を含むポリヌクレオチド鋳型を使用すると、ＲＮＡ転写物が生成され、生成されたＲＮＡ転写物の８０％超（例えば、８５％超、９０％超、または９５％超）が機能性キャップを含むことが見出されたことは驚くべきことであった。したがって、いくつかの実施形態では、例えばＩＶＴ反応で使用されるポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ）鋳型は、鋳型位置＋１に２´−デオキシチミジン残基を含む。他の実施形態では、例えばＩＶＴ反応で使用されるポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ）鋳型は、鋳型位置＋１に２´−デオキシシチジン残基を含む。
【０２０６】
用途
本開示に従って生成されたＲＮＡ転写物には、ｍＲＮＡ（修飾ｍＲＮＡ及び／または非修飾ＲＮＡを含む）、ｌｎｃＲＮＡ、自己複製ＲＮＡ、環状ＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡなどが含まれる。実施形態では、ＲＮＡは、ポリペプチド（例えば、治療用ポリペプチド）をコードするＲＮＡ（例えばｍＲＮＡまたは自己複製ＲＮＡ）である。したがって、本開示のＲＮＡポリメラーゼバリアントを使用して生成されたＲＮＡ転写物は、非常に多くの用途で使用され得る。
【０２０７】
例えば、ＲＮＡ転写物は、目的のポリペプチド、例えば治療用タンパク質、ワクチン抗原などを生成するために使用され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写物は、治療用ＲＮＡである。治療用ｍＲＮＡは、治療用タンパク質をコードするｍＲＮＡである（「タンパク質」という用語には、ペプチドが包含される）。治療用タンパク質は、宿主細胞または対象における様々な効果を媒介して、疾患を治療し、または疾患の徴候及び症状を改善する。例えば、治療用タンパク質は、欠損または異常なタンパク質を置換し、内因性タンパク質の機能を増強し、細胞に新規機能を提供する（例えば、内因性細胞活性を阻害もしくは活性化し、または別の治療用化合物（例えば、抗体−抗体コンジュゲートなど）のための送達剤として作用する）。治療用ｍＲＮＡは、以下の疾患及び状態：細菌感染症、ウイルス感染症、寄生虫感染症、細胞増殖障害、遺伝障害、及び自己免疫障害の治療に有用であり得る。他の疾患及び状態が本明細書において包含される。
【０２０８】
本明細書で提供されるｍＲＮＡによってコードされる目的のタンパク質は、本質的に任意のタンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、治療用タンパク質は、サイトカイン、成長因子、抗体、または融合タンパク質である。治療用タンパク質の非限定的な例には、血液因子（ＶＩＩＩ因子及びＶＩＩ因子など）、補体因子、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）、及びＭＵＴ１が含まれる。サイトカインの非限定的な例には、インターロイキン、インターフェロン、ケモカイン、リンホカインなどが含まれる。成長因子の非限定的な例には、エリスロポエチン、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦ、ＩＧＦ、ＴＮＦ、ＣＳＦ、ＭＣＳＦ、ＧＭＣＳＦなどが含まれる。抗体の非限定的な例には、アダリムマブ、インフリキシマブ、リツキシマブ、イピリムマブ、トシリズマブ、カナキヌマブ、イトリズマブ、トラロキヌマブが含まれる。融合タンパク質の非限定的な例には、例えば、エタネルセプト、アバタセプト、及びベラタセプトが含まれる。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、ヒトエリスロポエチン、ＬＤＬＲ（コレステロールの阻害に使用）、またはＭＵＴ１（メチルマロン酸血症（ＭＭＡ）の治療に使用）である。他の実施形態では、ｍＲＮＡによってコードされる目的のタンパク質は、治療抗体であり、上記抗体を含むがこれらに限定されない。
【０２１０】
本明細書に開示されるＲＮＡポリメラーゼバリアントを使用して生成されたＲＮＡ転写物は、１つ以上の生物製剤をコードし得る。生物製剤は、重篤なもしくは生命を脅かす疾患または状態の治療、治癒、緩和、予防、または診断に使用され得るポリペプチドベースの分子である。生物学には、特に、アレルゲン抽出物（例えば、アレルギー注射（ｓｈｏｔ）及び検査用）、血液成分、遺伝子治療製品、移植に使用されるヒト組織または細胞製品、ワクチン、モノクローナル抗体、サイトカイン、成長因子、酵素、血栓溶解剤、及び免疫調整剤が含まれるが、これらに限定されない。
【０２１１】
現在市販されているまたは開発中の１つ以上の生物製剤は、本発明のＲＮＡによってコードされ得る。理論に拘束されることを望まないが、既知の生物製剤のコード化ポリヌクレオチドを本開示のＲＮＡに組み込むと、構築設計物の特異性、純度、及び／または選択性に少なくとも部分的に起因して、治療効果の改善がもたらされると考えられる。
【０２１２】
本明細書に開示されるＲＮＡポリメラーゼバリアントを使用して生成されたＲＮＡ転写物は、１つ以上の抗体をコードし得る。「抗体」という用語には、モノクローナル抗体（免疫グロブリンＦｃ領域を有する全長抗体を含む）、ポリエピトープ特異性を有する抗体組成物、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体、ダイアボディ、及び単鎖分子）、及び抗体断片が含まれる。「免疫グロブリン」（Ｉｇ）という用語は、本明細書において「抗体」と互換的に使用される。モノクローナル抗体は、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体である。すなわち、集団を構成する個々の抗体は、わずかな量で存在し得る起こり得る天然に存在する変異及び／または翻訳後修飾（例えば、異性化、アミド化）を除いて同一である。モノクローナル抗体は非常に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。
【０２１３】
モノクローナル抗体には、具体的には、重鎖及び／または軽鎖の一部が、特定の種に由来するか、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同であり、鎖（複数可）の残りが、別の抗体に由来するか、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同である、キメラ抗体（免疫グロブリン）、及び所望の生物学的活性を示す限り、そのような抗体の断片が含まれる。キメラ抗体には、非ヒト霊長類（例えば、旧世界猿、類人猿など）及びヒト定常領域配列に由来する可変ドメイン抗原結合配列を含む「霊長類化（ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ）」抗体が含まれるが、これらに限定されない。
【０２１４】
本開示のＲＮＡにコードされる抗体は、血液、心臓血管、ＣＮＳ、中毒（抗毒素を含む）、皮膚病学、内分泌学、胃腸、医用画像、筋骨格、腫瘍学、免疫学、呼吸器、感覚、及び抗感染症などの多くの治療分野における状態または疾患を治療するために利用され得る。
【０２１５】
本明細書に開示されるＲＮＡポリメラーゼバリアントを使用して生成されたＲＮＡ転写物は、１つ以上のワクチン抗原をコードし得る。ワクチン抗原は、特定の疾患または感染因子に対する免疫を改善する生物学的製剤である。現在市販されているまたは開発中の１つ以上のワクチン抗原は、本開示のＲＮＡによってコードされ得る。ＲＮＡにコードされたワクチン抗原は、がん、アレルギー、感染症などの多くの治療分野における状態または疾患を治療するために利用され得る。いくつかの実施形態では、がんワクチンは、コンカテマーまたはペプチドエピトープをコードする個々のＲＮＡまたはそれらの組み合わせの形態の個別化されたがんワクチンであり得る。
【０２１６】
本明細書に開示されるＲＮＡポリメラーゼバリアントを使用して生成されたＲＮＡ転写物は、１つ以上の抗菌ペプチド（ＡＭＰ）または抗ウイルスペプチド（ＡＶＰ）をコードするように設計され得る。ＡＭＰ及びＡＶＰは、限定するものではないが、微生物、無脊椎動物、植物、両生類、鳥類、魚類、及び哺乳類などの広範囲の動物から単離及び記述されている。抗菌ポリペプチドは、細胞融合及び／または１つ以上のエンベロプウイルス（例えば、ＨＩＶ、ＨＣＶ）によるウイルス侵入を遮断し得る。例えば、抗菌ポリペプチドは、領域、例えば、ウイルスエンベロープタンパク質、例えばＨＩＶ−１  ｇｐｌ２０またはｇｐ４１の膜貫通サブユニットの少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、または６０個のアミノ酸の連続配列に対応する合成ペプチドを含むか、またはそれからなることができる。ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０またはｇｐ４１のアミノ酸及びヌクレオチド配列は、例えば、Ｋｕｉｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００８）．「ＨＩＶ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ」，Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに記載されている。
【０２１７】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写物は、放射標識ＲＮＡプローブとして使用される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写物は、非同位体ＲＮＡ標識のために使用される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写物は、遺伝子ターゲティングのためのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）として使用される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写物（例えば、ｍＲＮＡ）は、インビトロ翻訳及び微量注入に使用される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写物は、ＲＮＡ構造、プロセシング、及び触媒研究に使用される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写物は、ＲＮＡ増幅に使用される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写物は、遺伝子発現実験のためのアンチセンスＲＮＡとして使用される。他の用途が本開示に包含される。
【０２１８】
組成物
本開示のＴ７  ＲＮＡＰバリアントは、いくつかの実施形態では、ＩＶＴ反応においてトリヌクレオチドキャップなどのキャップ類似体と組み合わせて使用されるとき、ＩＶＴ後の精製がなくても、検出可能なサイトカイン応答を誘導しないＲＮＡを生成する。したがって、いくつかの実施形態では、ＩＶＴ  ＲＮＡ及び薬学的に許容される賦形剤を含む組成物であって、ＩＶＴ後の精製なしで、サイトカイン誘導ＲＮＡ混入物を実質的に含まない（例えば、含まないか、または１０％未満、１％未満、０．１％未満、または０．０１％未満含む）、該組成物が本明細書で提供される。
【０２１９】
本明細書の他の箇所で説明するように、本開示のＴ７  ＲＮＡＰバリアント及び本開示の方法はＲＮＡ転写物を生成し、該転写物の少なくとも８０％（例えば、８０％〜９０％、８０〜９５％、９０〜９５％、８０〜９９％、９０〜９９％、または９０〜１００％）は機能的なキャップを含む。したがって、ＩＶＴ  ＲＮＡ及び薬学的に許容される賦形剤を含む組成物も本明細書で提供され、組成物は、２０％（例えば、５〜１５％、５〜１０％、１〜１５％、または１〜１０％）未満のキャップされていないＲＮＡ種を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、１５％（例えば、５〜１０％、１〜１０％、または１〜５％）未満のキャップされていないＲＮＡ種を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、１０％未満のキャップされていないＲＮＡ種を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、５％未満のキャップされていないＲＮＡ種を含む。
【０２２０】
いくつかの実施形態では、ＩＶＴ  ＲＮＡの８０％超が機能性キャップを含む。いくつかの実施形態では、ＩＶＴ  ＲＮＡの８５％超が機能性キャップを含む。いくつかの実施形態では、ＩＶＴ  ＲＮＡの９０％超が機能性キャップを含む。いくつかの実施形態では、ＩＶＴ  ＲＮＡの９５％超が機能性キャップを含む。
【０２２１】
いくつかの実施形態では、ＩＶＴ  ＲＮＡは化学修飾されていないが、他の実施形態では、ＩＶＴ  ＲＮＡは化学修飾されている。
【０２２２】
いくつかの実施形態では、予想外に、ＩＶＴ  ＲＮＡの８０％超が一本鎖完全長転写物を含む。例えば、ＩＶＴ  ＲＮＡの８５％超が一本鎖完全長転写物を含み得る。いくつかの実施形態では、ＩＶＴ  ＲＮＡの９０％超が一本鎖完全長転写物を含み、ＩＶＴ  ＲＮＡの９５％超が一本鎖完全長転写物を含む。
【０２２３】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、ＲＮＡ転写物を生成するためのインビトロ転写反応条件下で、ポリヌクレオチド鋳型を（ａ）Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントであって、野生型ＲＮＡポリメラーゼと比較して、該ＲＮＡポリメラーゼバリアントが開始複合体から伸長複合体に移行するにつれてＲＮＡポリメラーゼバリアントの少なくとも１つのループ構造にヘリックス構造へのコンフォメーション変化を受けさせる少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、該Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント、（ｂ）ヌクレオシド三リン酸、及び（ｃ）配列ＧｐｐｐＡ２′ＯｍｅｐＧを含むトリヌクレオチドキャップと反応させることを含む方法によって生成され、ポリヌクレオチド鋳型は、鋳型位置＋１に２´−デオキシチミジン残基を含む。
【０２２４】
キット
本開示のＲＮＡポリメラーゼバリアントを含むインビトロ転写キットなどのキットも本明細書で提供される。キットは、本明細書に記載の任意の１つ以上（少なくとも１つ）のＩＶＴ成分及び任意の１つ以上（少なくとも１つ）のＲＮＡポリメラーゼバリアントを含み得る。例えば、キットは、緩衝系、ＮＴＰ、及び位置Ｅ４２、Ｓ４３、Ｙ４４、Ｅ４５、Ｍ４６、Ｇ４７、Ａ２５５、Ｒ２５７、Ａ２５８、Ｇ２５９、Ａ２６０、Ｌ２６１及び／またはＡ２６２における少なくとも１つ（もしくは少なくとも２つ、または少なくとも３つ）のアミノ酸置換ならびに任意選択によりＣ末端において少なくとも１つのアミノ酸付加を有する配列番号１、９９、または１００のアミノ酸配列を有するＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントを含み得る。
【０２２５】
追加の実施形態
本開示の追加の実施形態には、以下の番号の段落のものが包含される：
段落１．リボ核酸（ＲＮＡ）ポリメラーゼバリアントであって、野生型ＲＮＡポリメラーゼと比較して、前記ＲＮＡポリメラーゼバリアントが開始複合体から伸長複合体に移行するにつれて前記ＲＮＡポリメラーゼバリアントの少なくとも１つのループ構造にヘリックス構造へのコンフォメーション変化を受けさせる少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、前記リボ核酸（ＲＮＡ）ポリメラーゼバリアント。
【０２２６】
段落２．前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、野生型アミノ酸と比較して高いヘリックス性向を有する、段落１に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【０２２７】
段落３．前記ＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼである、段落１または２に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【０２２８】
段落４．前記少なくとも１つのループ構造が、Ｃヘリックス構造中にある、段落１〜３のいずれか１つに記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【０２２９】
段落５．前記少なくとも１つのループ構造が、Ｃリンカー構造中にある、段落１〜４のいずれか１つに記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【０２３０】
段落６．前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、少なくとも１つの高ヘリックス性向アミノ酸置換である、段落１〜４のいずれか１つに記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【０２３１】
段落７．前記少なくとも１つの高ヘリックス性向酸置換が、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、リジン、グルタミン、及び／またはグルタミン酸から選択される、段落６に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【０２３２】
段落８．前記少なくとも１つの高ヘリックス性向アミノ酸置換が、アラニンである、段落７に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【０２３３】
段落９．前記Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼが、Ｅ４２、Ｓ４３、Ｙ４４、Ｅ４５、Ｍ４６、Ｇ４７、Ｒ２５７、及びＧ２５９から選択される位置に高ヘリックス性向アミノ酸の少なくとも１つのアミノ酸置換を含むように修飾された、配列番号１、配列番号９９、または配列番号１００によって特定されるアミノ酸配列を含む、段落４〜８のいずれか１つに記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【０２３４】
段落１０．前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｓ４３Ａを含む、段落９に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【０２３５】
段落１１．前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｇ４７Ａを含む、段落９に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【０２３６】
段落１２．前記Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼが、Ｒ２５７、Ａ２５８、Ｇ２５９、Ａ２６０、Ｌ２６１及びＡ２６２から選択される位置に高ヘリックス性向アミノ酸の少なくとも１つのアミノ酸置換を含むように修飾された、配列番号１、配列番号９９、または配列番号１００によって特定されるアミノ酸配列を含む、段落５〜８のいずれか１つに記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【０２３７】
段落１３．前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｒ２５７Ａを含む、段落１２に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【０２３８】
段落１４．前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｇ２５９Ａを含む、段落１２に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【０２３９】
段落１５．Ｇ４７、Ｓ４３、Ｒ２５７、またはＧ２５９の位置における高ヘリックス性向アミノ酸のアミノ酸置換を含むように修飾された、配列番号１、配列番号９９、または配列番号１００によって特定されるアミノ酸配列を含む、Ｔ７リボ核酸（ＲＮＡ）ポリメラーゼ。
【０２４０】
段落１６．前記高ヘリックス性向アミノ酸が、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、リジン、グルタミン、及び／またはグルタミン酸から選択される、段落１５に記載のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ。
【０２４１】
１７．前記高ヘリックス性向アミノ酸が、アラニンである、段落１６に記載のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ。
【０２４２】
段落１８．配列番号２、配列番号１０７、または配列番号１０８によって特定されるアミノ酸配列を含む、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ。
【０２４３】
段落１９．配列番号３、配列番号１０９、または配列番号１１０によって特定されるアミノ酸配列を含む、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ。
【０２４４】
段落２０．配列番号４、配列番号１１１、または配列番号１１２によって特定されるアミノ酸配列を含む、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ。
【０２４５】
段落２１．配列番号５、配列番号１１３、または配列番号１１４によって特定されるアミノ酸配列を含む、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ。
【０２４６】
段落２２．ＲＮＡ転写物の生成をもたらす条件下で、ＤＮＡ鋳型を段落１〜２１のいずれか１つに記載のＲＮＡポリメラーゼと接触させることを含む、リボ核酸（ＲＮＡ）を生成する方法。
【０２４７】
段落２３．ヌクレオシド三リン酸及び緩衝液の存在下において、ＲＮＡ転写物の生成をもたらす条件下で、ＤＮＡ鋳型を段落１〜２１のいずれか１つに記載のＲＮＡポリメラーゼと接触させることを含む、インビトロ転写（ＩＶＴ）反応を行う方法。
【０２４８】
段落２４．前記生成されたＲＮＡ転写物が、任意選択により未精製形態で細胞に送達されたときに、野生型ＲＮＡポリメラーゼを使用して生成されたＲＮＡと比較して少なくとも５０％低いサイトカイン応答を刺激する、段落２３に記載の方法。
【０２４９】
段落２５．ＩＶＴにより生成された前記二本鎖ＲＮＡ転写物の濃度が、野生型ポリメラーゼを用いて生成されたｄｓＲＮＡ転写物と比較して少なくとも５０％低い、段落２３〜２４のいずれか１つに記載の方法。
【０２５０】
段落２６．前記生成されたＲＮＡ転写物の２０％未満が、３´不均一性を示す、段落２３〜２５のいずれか１つに記載の方法。
【０２５１】
段落２７．前記生成されたＲＮＡ転写物の５０％未満が、切断型ＲＮＡ転写物である、段落２３〜２６のいずれか１つに記載の方法。
【０２５２】
段落２８．前記生成されたＲＮＡ転写物の５０％未満が、ランオンＲＮＡ転写物である、段落２３〜２８のいずれか１つに記載の方法。
【０２５３】
段落２９．前記生成された完全長ＲＮＡ転写物の量が、前記ＤＮＡ鋳型の量よりも少なくとも１５倍多い、段落２３〜２８のいずれか１つに記載の方法。
【０２５４】
段落３０．切断型ＲＮＡ転写物：生成された完全長ＲＮＡ転写物の比が、１：１未満である、段落２３〜２９のいずれか１つに記載の方法。
【０２５５】
段落３１．前記生成されたＲＮＡ転写物が、前記ＤＮＡ鋳型と比較して１００ヌクレオチドあたり１未満の変異を有する、段落２３〜３０のいずれか１つに記載の方法。
【０２５６】
段落３２．段落１〜２１のいずれか１つに記載のＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸。
【０２５７】
段落３３．段落３３の核酸を含むベクター。
【０２５８】
段落３４．段落３３に記載の核酸または段落３４に記載のベクターを含む宿主細胞。
【０２５９】
段落３５．段落１〜２１のいずれか１つに記載のＲＮＡポリメラーゼを含むキット。
【０２６０】
段落３６．段落１〜２１のいずれか１つに記載のＲＮＡポリメラーゼを含む組成物。
【０２６１】
段落３７．段落２２〜３１のいずれか１つに記載の方法で生成されたリボ核酸（ＲＮＡ）。
【０２６２】
段落３８．脂質ナノ粒子中に製剤化された段落３７に記載のＲＮＡ。
【０２６３】
段落３９．前記脂質ナノ粒子が、２０〜６０％のイオン化可能なアミノ脂質、５〜２５％の非カチオン性脂質、２５〜５５％のステロール、及び０．５〜１５％のＰＥＧ修飾脂質のモル比を含む、段落３８に記載のＲＮＡ。
【０２６４】
段落４０．ＲＮＡ転写物を生成するためのインビトロ転写反応条件下で、ポリヌクレオチド鋳型をＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント、ヌクレオシド三リン酸、及びキャップ類似体と反応させることを含む、リボ核酸（ＲＮＡ）合成のための共転写キャッピング方法。
【０２６５】
段落４１．前記生成されたＲＮＡ転写物の８０％超、８５％超、または９０％超が、機能性キャップを含む、段落４０に記載の方法。
【０２６６】
段落４２．前記生成されたＲＮＡ転写物の９５％超が、機能性キャップを含む、段落４１に記載の方法。
【０２６７】
段落４３．前記ヌクレオシド三リン酸が、非修飾もしくは修飾ＡＴＰ、修飾もしくは非修飾ＵＴＰ、修飾もしくは非修飾ＧＴＰ、及び／または修飾もしくは非修飾ＣＴＰを含む、段落４０〜４２のいずれか１つに記載の方法。
【０２６８】
段落４４．前記Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントが、段落１〜２１のいずれか１つに記載のＴ７ポリメラーゼバリアントである、段落４０〜４３のいずれか１つに記載の方法。
【０２６９】
段落４５．前記Ｔ７ポリメラーゼバリアントが、Ｅ４２、Ｓ４３、Ｙ４４、Ｅ４５、Ｍ４６、Ｇ４７、Ｒ２５７、及びＧ２５９から選択される位置に高性向アミノ酸の少なくとも１つのアミノ酸置換を含むように修飾された配列番号１、配列番号９９、または配列番号１００によって特定されるアミノ酸配列を含む、段落４４に記載の方法。
【０２７０】
段落４６．前記Ｔ７ポリメラーゼバリアントが、Ｇ４７Ａの位置にアミノ酸置換を含むように修飾された配列番号１、配列番号９９、または配列番号１００によって特定されるアミノ酸配列を含む、段落４０〜４５のいずれか１つに記載の方法。
【０２７１】
段落４７．前記Ｔ７ポリメラーゼバリアントが、Ｓ４３Ａのアミノ酸置換を含むように修飾された配列番号１、配列番号９９、または配列番号１００によって特定されるアミノ酸配列を含む、段落４０〜４５のいずれか１つに記載の方法。
【０２７２】
段落４８．前記ヌクレオシド三リン酸及びキャップ類似体が、前記反応において等モル濃度で存在する、段落４０〜４７のいずれか１つに記載の方法。
【０２７３】
段落４９．前記反応におけるキャップ類似体とヌクレオシド三リン酸とのモル比が１：１より大きい、段落４０〜４７のいずれか１つに記載の方法。
【０２７４】
５０．前記反応におけるキャップ類似体とヌクレオシド三リン酸のモル比が１：１未満である、段落４０〜４７のいずれか１つに記載の方法。
【０２７５】
段落５１．前記キャップ類似体が、ジヌクレオチドキャップ、トリヌクレオチドキャップ、またはテトラヌクレオチドキャップである、段落４０〜５０のいずれか１つに記載の方法。
【０２７６】
段落５２．キ前記ャップ類似体が、トリヌクレオチドキャップである、段落４０〜５０のいずれか１つに記載の方法。
【０２７７】
段落５３．前記トリヌクレオチドキャップが、以下の配列：ＧＡＡ、ＧＡＣ、ＧＡＧ、ＧＡＵ、ＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、ＧＣＵ、ＧＧＡ、ＧＧＣ、ＧＧＧ、ＧＧＵ、ＧＵＡ、ＧＵＣ、ＧＵＧ、及びＧＵＵから選択される配列を含む、段落５１に記載の方法。
【０２７８】
段落５４．前記トリヌクレオチドキャップが、以下の配列：ｍ７ＧｐｐｐＡｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＡｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＡｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＡｐＵ、ｍ７ＧｐｐｐＣｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＣｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＣｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＣｐＵ、ｍ７ＧｐｐｐＧｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＧｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＧｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＧｐＵ、ｍ７ＧｐｐｐＵｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＵｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＵｐＧ、及びｍ７ＧｐｐｐＵｐＵから選択される配列を含む、段落５３に記載の方法。
【０２７９】
段落５５．前記トリヌクレオチドキャップが、以下の配列：ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡｐＡ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡｐＣ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡｐＧ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡｐＵ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣｐＡ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣｐＣ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣｐＧ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣｐＵ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧｐＡ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧｐＣ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧｐＧ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧｐＵ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵｐＡ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵｐＣ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵｐＧ、及びｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵｐＵから選択される配列を含む、段落５３に記載の方法。
【０２８０】
段落５６．前記トリヌクレオチドキャップが、以下の配列：ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＡ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＣ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＧ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＵ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＡ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＣ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＧ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＵ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＡ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＣ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＧ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＵ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＡ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＣ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＧ、及びｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＵから選択される配列を含む、段落５３に記載の方法。
【０２８１】
段落５７．前記トリヌクレオチドキャップが、以下の配列：ｍ７ＧｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＵ、ｍ７ＧｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＵ、ｍ７ＧｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＵ、ｍ７ＧｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＧ、及びｍ７ＧｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＵから選択される配列を含む、段落５３に記載の方法。
【０２８２】
段落５８．前記トリヌクレオチドキャップが、以下の配列：ＧＡＧ、ＧＣＧ、ＧＵＧ、及びＧＧＧから選択される配列を含む、段落５３〜５７のいずれか１つに記載の方法。
【０２８３】
段落５９．前記トリヌクレオチドキャップが、配列ＧＡＧを含む、段落５８に記載の方法。
【０２８４】
段落６０．前記トリヌクレオチドキャップが、ＧｐｐｐＡ２′ＯｍｅｐＧを含む、段落５９に記載の方法。
【０２８５】
段落６１．前記ポリヌクレオチド鋳型が、鋳型位置＋１に２´−デオキシチミジン残基を含む、段落４０〜６０のいずれか１つに記載の方法。
【０２８６】
段落６２．前記ポリヌクレオチド鋳型が、鋳型位置＋１に２´−デオキシシチジン残基を含む、段落４０〜６０のいずれか１つに記載の方法。
【０２８７】
段落６３．ＲＮＡ合成のための共転写キャッピング方法であって、ＲＮＡ転写物を生成するためのインビトロ転写反応条件下で、ポリヌクレオチド鋳型を（ａ）Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントであって、野生型ＲＮＡポリメラーゼと比較して、前記ＲＮＡポリメラーゼバリアントが開始複合体から伸長複合体に移行するにつれてＲＮＡポリメラーゼバリアントの少なくとも１つのループ構造にヘリックス構造へのコンフォメーション変化を受けさせる少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、前記Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント、（ｂ）ヌクレオシド三リン酸、及び（ｃ）配列ＧｐｐｐＡ２′ＯｍｅｐＧを含むトリヌクレオチドキャップと反応させることを含み、前記ポリヌクレオチド鋳型が、鋳型位置＋１に２´−デオキシチミジン残基を含む、前記方法。
【０２８８】
段落６４．前記生成されたＲＮＡ転写物が、任意選択により未精製形態で細胞に送達されたときに、検出可能なサイトカイン応答を刺激しない、段落４０〜６３のいずれか１つに記載の方法。
【０２８９】
段落６５．インビトロ転写（ＩＶＴ）ＲＮＡ及び薬学的に許容される賦形剤を含む組成物であって、ＩＶＴ後の精製なしでサイトカイン誘導性ＲＮＡ混入物を実質的に含まない、前記組成物。
【０２９０】
段落６６．インビトロ転写（ＩＶＴ）ＲＮＡ及び薬学的に許容される賦形剤を含む組成物であって、５％未満のキャップされていないＲＮＡ種を有する、前記組成物。
【０２９１】
段落６７．前記ＩＶＴ  ＲＮＡの８０％、８５％、または９０％超が機能性キャップを含む、段落６５または６６に記載の組成物。
【０２９２】
段落６８．前記ＩＶＴ  ＲＮＡの９５％超が機能性キャップを含む、段落６７に記載の組成物。
【０２９３】
段落６９．前記ＩＶＴ  ＲＮＡが化学修飾されていない、段落６５〜６８のいずれか１つに記載の組成物。
【０２９４】
段落７０．前記ＩＶＴ  ＲＮＡが化学修飾されている、項６５〜６８のいずれか１項に記載の組成物。
【０２９５】
段落７１．前記ＩＶＴ  ＲＮＡの９５％超が一本鎖完全長転写物を含む、段落６５〜７０のいずれか１つに記載の組成物。
【０２９６】
段落７２．前記ＲＮＡが、
ＲＮＡ転写物を生成するためのインビトロ転写反応条件下で、ポリヌクレオチド鋳型を（ａ）Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントであって、野生型ＲＮＡポリメラーゼと比較して、前記ＲＮＡポリメラーゼバリアントが開始複合体から伸長複合体に移行するにつれてＲＮＡポリメラーゼバリアントの少なくとも１つのループ構造にヘリックス構造へのコンフォメーション変化を受けさせる少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、前記Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント、（ｂ）ヌクレオシド三リン酸、及び（ｃ）配列ＧｐｐｐＡ２′ＯｍｅｐＧを含むトリヌクレオチドキャップと反応させることを含むプロセスによって生成され、前記ポリヌクレオチド鋳型が、鋳型位置＋１に２´−デオキシチミジン残基を含む、請求項６５〜７１のいずれか１項に記載の組成物。
【０２９７】
段落７３．野生型Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼと比較して少なくとも１つの追加のＣ末端アミノ酸を含む、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ。
【０２９８】
段落７４．少なくとも２つの追加のＣ末端アミノ酸を含む、段落７３に記載のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ。
【０２９９】
段落７５．前記少なくとも２つの追加のＣ末端アミノ酸が、同じ種類のアミノ酸または少なくとも２つの異なる種類のアミノ酸を含む、段落７４に記載のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ。
【０３００】
段落７６．１〜１０個の追加のＣ末端アミノ酸を含む、段落７３〜７５のいずれか１つに記載のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ。
【０３０１】
段落７７．１〜５個の追加のＣ末端アミノ酸を含む、段落７６に記載のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ。
【０３０２】
段落７８．前記Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼがＦＡＦＡＸｎモチーフを含むＣ末端を含み、Ｘが任意のアミノ酸であり、ｎがゼロより大きい任意の整数である、段落７３〜７７のいずれか１つに記載のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ。
【０３０３】
段落７９．ＸがＧまたはＡであり、任意選択により、ＸｎがＧＧまたはＡＡである、段落７８に記載のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ。
【０３０４】
段落８０．ｎが１、２、３、４、または５である、段落７８または７９に記載のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ
【０３０５】
段落８１．ＦＡＦＡＧモチーフを含むＣ末端を含む、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ。
【０３０６】
段落８２．  ＸＡＦＡＸｎモチーフ、ＦＡＸＡＸｎモチーフ、ＦＡＸＡＸｎモチーフ、またはＦＡＦＸＸｎモチーフを含むＣ末端を含み、各Ｘが任意のアミノ酸であり、ｎがゼロより大きい任意の整数である、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ。
【０３０７】
段落８３．前記Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼが、野生型Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの位置Ｓ４３、Ｇ４７、Ｒ２５７、またはＧ２５９に対応する位置に少なくとも１つの置換及び任意選択により少なくとも１つの追加の置換を含む、段落７３〜８２のいずれか１つに記載のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ。
【０３０８】
段落８４．前記野生型Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼが、配列番号１により特定されるアミノ酸配列を含む、段落８３に記載のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ。
【０３０９】
段落８５．Ｇ４７、Ｓ４３、Ｒ２５７、及びＧ２５９から選択される少なくとも１つの置換、及び任意選択により少なくとも１つの追加のアミノ酸置換を含むように修飾された配列番号９９のアミノ酸配列を含む、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ。
【０３１０】
段落８６．Ｇ４７、Ｓ４３、Ｒ２５７、及びＧ２５９から選択される少なくとも１つの置換、及び任意選択により少なくとも１つの追加のアミノ酸置換を含むように修飾された配列番号１００、２９４、２９６、または２９６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ。
【０３１１】
段落８７．Ｓ４３Ａ、Ｇ４７Ａ、Ｒ２５７Ａ、及びＧ２５９Ａから選択される少なくとも１つの置換を含む、段落８３〜８６のいずれか１つに記載のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ。
【０３１２】
段落８８．配列番号２９４〜３１３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＴ７  ＲＮＡポリメラーゼであって、ｘは任意のアミノ酸であり、ｎは任意の整数、例えば１〜５（例えば、１、２、３、４、または５）であり、任意選択により、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼが少なくとも１つの追加のアミノ酸置換をさらに含む、前記Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ。
【０３１３】
段落８９．ヌクレオシド三リン酸及び緩衝液の存在下において、ＲＮＡ転写物の生成をもたらす条件下で、ＤＮＡ鋳型を段落７３〜８８のいずれかのＲＮＡポリメラーゼと接触させることを含む、インビトロ転写（ＩＶＴ）反応を行う方法。
【０３１４】
段落９０．前記生成されたＲＮＡが、細胞に送達されたときに、ＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡＰを用いて生成されたｄｓＲＮＡ転写物と比較して少なくとも５０％低いサイトカイン応答を刺激する、段落８９に記載の方法。
【０３１５】
９１．前記ＲＮＡが未精製の形態で細胞に送達される、段落９０に記載の方法。
【０３１６】
段落９２．前記生成されたＲＮＡ転写物の３０％未満が３´不均一性を示す、段落８９〜９２のいずれか１つに記載の方法。
【０３１７】
段落９３．段落７３〜９２のいずれか１つに記載のＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸。
【０３１８】
段落９４．段落９３の核酸を含むベクター。
【０３１９】
段落９５．段落９３の核酸または段落９４のベクターを含む宿主細胞。
【０３２０】
段落９６．段落７３〜９２のいずれか１つに記載のＲＮＡポリメラーゼを含むキット。
【０３２１】
段落９７．段落７３〜９２のいずれか１つに記載のＲＮＡポリメラーゼを含む組成物。
【０３２２】
段落９８．段落８９〜９２のいずれか１つに記載の方法によって生成されたリボ核酸（ＲＮＡ）。
【０３２３】
段落９９．脂質ナノ粒子中に製剤化された段落９８に記載のＲＮＡ。
【０３２４】
段落１００．前記脂質ナノ粒子が、２０〜６０％のイオン化可能なアミノ脂質、５〜２５％の非カチオン性脂質、２５〜５５％のステロール、及び０．５〜１５％のＰＥＧ修飾脂質のモル比を含む、段落９８に記載のＲＮＡ。
【０３２５】
段落１０１．対応する野生型ＲＮＡポリメラーゼと比較して少なくとも１つの追加のＣ末端アミノ酸を含むＲＮＡポリメラーゼであって、任意選択により、少なくとも１つの追加のＣ末端アミノ酸が、グリシン（Ｇ）及び／またはアラニン（Ａ）を含む、前記ＲＮＡポリメラーゼ。
【０３２６】
段落１０２．前記ＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ、及びＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼから選択される、段落１０１に記載のＲＮＡポリメラーゼ。
【０３２７】
段落１０３．前記ＲＮＡポリメラーゼが、少なくとも１つの追加のアミノ酸置換をさらに含み、任意選択により、Ｓ４３Ａ、Ｇ４７Ａ、Ｒ２５７Ａ、及びＧ２５９Ａから選択される配列番号１のアミノ酸置換に対応するアミノ酸置換をさらに含む、段落１０１または１０２に記載のＲＮＡポリメラーゼ。
【０３２８】
段落１０４．前記ＲＮＡポリメラーゼが、４３位、４７位、２５７位、及び／または２５９位にアミノ酸置換を含むように修飾された配列番号１と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含むＴ７  ＲＮＡポリメラーゼであり、任意選択により、アミノ酸置換がアラニン（Ａ）である、段落１０１〜１０４のいずれか１つに記載のＲＮＡポリメラーゼ。
【０３２９】
段落１０５．前記ＲＮＡポリメラーゼが、４４位、４８位、２５８位、及び／または  ２６０位にアミノ酸置換を含むように修飾された配列番号６と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含むＴ３  ＲＮＡポリメラーゼであり、任意選択により、アミノ酸置換がアラニン（Ａ）である、段落１０１〜１０４のいずれか１つに記載のＲＮＡポリメラーゼ。
【０３３０】
段落１０６．  前記ＲＮＡポリメラーゼが、１５位、１９位、２３０位、及び／または  ２３２位にアミノ酸置換を含むように修飾された配列番号７と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含むＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼであり、任意選択により、アミノ酸置換がアラニン（Ａ）である、段落１０１〜１０４のいずれか１つに記載のＲＮＡポリメラーゼ。
【０３３１】
段落１０７．４３位、４７位、２５７位、及び／または２５９位にアミノ酸置換を含むように修飾された配列番号１と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含み、任意選択により、アミノ酸置換がアラニン（Ａ）である、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ。
【０３３２】
段落１０８．４４位、４８位、２５８位、及び／または２６０位にアミノ酸置換を含むように修飾された配列番号６と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含み、任意選択により、アミノ酸置換がアラニン（Ａ）である、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ。
【０３３３】
段落１０９．１５位、１９位、２３０位、及び／または２３２位にアミノ酸置換を含むように修飾された配列番号７と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含み、任意選択により、アミノ酸置換がアラニン（Ａ）である、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ。
【表１】
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【表２】
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【実施例】
【０３３４】
実施例１．バリアントＴ７  ＲＮＡポリメラーゼの生成
Ｃヘリックス及びＣリンカーＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントを、表３及び表４に示される置換を用いて生成した。
【表３】
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【表４】
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【０３３５】
実施例２．Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントを使用して生成されたｈＥＰＯ  ｍＲＮＡの純度は、野生型Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用して生成されたｈＥＰＯ  ｍＲＮＡの純度に匹敵する。
ｈＥＰＯ  ＤＮＡ鋳型、ならびに（１）野生型（ＷＴ）Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（ＷＴ  ＃１及びＷＴ  ＃２）、（２）Ｇ４７Ａ  Ｃ末端Ｇ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント（「Ｇ４７Ａ＊」）（配列番号１１０）、及び（３）Ｓ４３Ａ  Ｃ末端Ｇ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント（「Ｓ４３Ａ＊」）（配列番号１０８）を使用して、インビトロ転写反応を行った。ＤＢＡＡ（ジブチルアンモニウムアセテート）ＨＰＬＣ分析は、すべてのｈＥＰＯ転写物の純度がほぼ同じであったことを示した（図１）。
【０３３６】
実施例３．  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントを使用して生成されたｈＥＰＯ  ｍＲＮＡは、細胞サイトカイン応答を示さない。
ＢＪ線維芽細胞を、実施例２に記載されるＩＶＴ反応により生成されたｈＥＰＯ  ｍＲＮＡでトランスフェクトした。ｍＲＮＡを、精製しないか、または逆相（ＲＰ）クロマトグラフィーにより精製した。図２（左のグラフ）に示されるように、Ｓ４３Ａ＊  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントまたはＧ４７Ａ＊  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントを使用して生成された精製されていないｍＲＮＡは、ＷＴ  Ｔ７ポリメラーゼを使用して生成された精製されたｍＲＮＡと同程度に「コールド（ｃｏｌｄ）」（サイトカイン応答を示さなかった）であった。ほぼ同等のｍＲＮＡ発現レベルを、図２（右のグラフ）に示す。これらの実験で使用されたｍＲＮＡは、いずれのヌクレオチド修飾も含まなかった。
【０３３７】
ｍ１ψヌクレオチド修飾（図３、上のグラフ）またはｍｏ５Ｕヌクレオチド修飾（図３、下のグラフ）のいずれかを含むｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを使用して、同様の細胞トランスフェクションアッセイを繰り返した。Ｇ４７Ａ＊及びＳ４３Ａ＊  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントを使用して生成された精製されていないｍ１ψ  ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡでトランスフェクトされたＢＪ線維芽細胞は、ＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用して生成された精製されていないｍ１ψ  ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡでトランスフェクトされた細胞より低いＩＦＮβ応答を示した。ほぼ同等のｍＲＮＡ発現レベルを、図４に示す。
【０３３８】
次いで、単球由来マクロファージ（ＭＤＭ）を使用して、さらにサイトカイン応答を試験した。ＩＰ１０対ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）の比を、実施例２に記載される条件下で生成されたｈＥＰＯ  ｍＲＮＡでトランスフェクトされたＭＤＭで測定した。ＭＤＭは、非修飾化学に対して非常に感受性であるため、試料間の強烈な違いは、非修飾ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを使用して見られなかった。しかしながら、Ｇ４７Ａ＊及びＳ４３Ａ＊  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントを使用して生成された精製されていないｍ１ψ  ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡでトランスフェクトされたＭＤＭは、ＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用して生成された精製されたｍ１ψ  ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡでトランスフェクトされたＭＤＭより低いＩＰ１０応答を示した（図５、上のグラフ）。
【０３３９】
実施例４．Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、ＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼよりも少ない混入ｄｓＲＮＡに関連するｍＲＮＡを生成する。
標準ｄｓＲＮＡ  ＥＬＩＳＡを使用して、非修飾ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ（図７）またはｍ１ψヌクレオチド修飾（図８、上のグラフ）もしくはｍｏ５Ｕヌクレオチド修飾（図８、下のグラフ）のいずれかを含むｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを生成するために使用されるＩＶＴ反応におけるｄｓＲＮＡ混入物（例えば、４０ヌクレオチド塩基対よりも長い）を評価した。ｄｓＲＮＡアッセイは、Ｓ４３Ａ＊  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント及びＧ４７Ａ＊  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントが、ＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼよりも少ないｄｓＲＮＡを生成したことを示した（図７及び図８）。
【０３４０】
実施例５．Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、ｍＲＮＡの３′不均一性を低減する。
転写物の３′不均一性は、ＲＮＡｓｅ  Ｔ１消化を使用して測定することができる。ＲＮＡｓｅ  Ｔ１は、Ｇヌクレオチドの後にｍＲＮＡを特異的に切断する。エンドヌクレオチド切断は、５′水酸化物（ＯＨ）及び３′一リン酸（ｍＰ）「瘢痕」をもたらす。したがって、ＲＮＡｓｅ  Ｔ１消化は、３′末端で鋳型のない付加を有する及び有さない転写物を区別するために使用され得る。この実施例では、実施例２で生成されたｈＥＰＯ  ｍＲＮＡは、ポリＡテール及びＸｂａＩ制限部位（例えば、ＡｎＵＣＵＡＧ）で終了する。ＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用して生成されたｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ、Ｓ４３Ａ＊  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント、またはＧ４７Ａ＊  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントを、ＲＮＡｓｅ  Ｔ１で消化し、ＬＣＭＳによって分析して、オリゴフィンガープリントを生成した。均質な３′末端（５´ＯＨ／３´ＯＨ）は、３２７８０Ｄａでピークに達することが見出されたが、一方で、「瘢痕」（５´ＯＨ／３´ｍＰ）は、３２８６０Ｄａでピークに達した（図９Ａ）。「瘢痕」は、転写物が、カルボキシ末端で鋳型のない付加を有したことを示す。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントを使用して生成されたｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ、Ｓ４３Ａ＊、またはＧ４７Ａ＊は、より高い３′末端集団分布を有し、それらがより均質な３′末端及び改善された３′末端不均一性を有することを示す（図９Ｂ）。
【０３４１】
実施例６．「より均質な」３′末端を生成するＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント
アッセイを使用して、Ｔ７  ＲＮＡＰバリアント、Ｇ４７Ａ＊、及びＳ４３Ａ＊によって生成された鋳型のない付加の程度を調べた。このアッセイでは、酵素ポリメラーゼを使用してライゲーションレフトマーを作製した（例えば、図１１Ａを参照のこと）。次いで、レフトマーを、５´−モノリン酸化ライトマーＲＮＡにすぐ隣接する完全に相補的なＤＮＡスプリントにアニーリングした。ＤＮＡスプリントは、典型的には、４０ｎｔ長であり、ライトマーは、典型的には、５´末端においてフルオロフォアで修飾される。次いで、ＤＮＡリガーゼＩを、触媒条件下で添加し、反応がＥＤＴＡでクエンチされる前に、所望の反応時間の間、ライゲーションを進めた。次いで、混合物を、変性ポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ−Ｄ）に充填される前に、９５℃で５分間４Ｍの尿素中で変性した（図１１Ｂ）。ゲル中のアクリルアミドのパーセンテージは、予期される構築物の長さによるが、典型的には、＞５０ｎｔのレフトマー長については６％アクリルアミド、及び典型的なｍＲＮＡの長さにアプローチするレフトマーについては２０％アクリルアミドである。６％アクリルアミドゲルを、一定の１８０Ｖで２５分間実行し、２０％アクリルアミドゲルを、一定の１８０Ｖで１２０分間実行した。次いで、ゲルを、ライトマー及び新しくライゲーションされた産物に存在するフルオロフォアに適切な励起波長及び発光波長を使用してＴｙｐｈｏｏｎまたは同様のスキャナーで画像化した。ライトマー及びライゲーションされた産物は、サイズに基づくゲル上で異なって移動し、２つのバンドの強度は、ライゲーション反応の効率に正確に対応するであろう。レフトマーの酵素合成の間の鋳型のないヌクレオチド付加の程度がより大きいほど、予期されるライゲーション収量はより低い。
【０３４２】
ライゲーション収量を、ライゲーションされていないライトマー及びライゲーションされた完全長産物に対応するバンドの比率として計算した。反応を、反応収量の差を誇張するために早く終了した。これらの結果に基づいて、Ｔ７  ＲＮＡＰバリアント  Ｇ４７Ａ＊は、レフトマーＲＮＡの３´末端で最も少ない鋳型のないヌクレオチドを組み込んだ。
【０３４３】
実施例７．単回インビトロ転写反応におけるキャップされたｍＲＮＡの生成
標準インビトロ転写（ＩＶＴ）アッセイでは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは、５′ＧＴＰで転写を開始することが好ましい。そのような標準ＩＶＴアッセイによって生成された一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）分子は、別々の酵素キャッピングステップを必要とする（図１３）。例えば、キャップ１  ＲＮＡ（７ｍＧｐｐｐＮ２′−Ｏｍ−ＲＮＡ）は、ワクシニアキャッピング及び２´−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（２´ＯＭＴａｓｅ）を使用してキャッピングアッセイにおいて生成され得る。キャップ１は、典型的には、細胞における効率的なタンパク質翻訳及びｍＲＮＡ安定性のために使用される。しかしながら、いくつかのｍＲＮＡ配列は、キャッピングすることが難しく、キャッピング／メチル化酵素は、非常に高価である。
【０３４４】
本開示は、いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント（例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントＧ４７Ａ＊）を使用したインビトロ転写アッセイにおいて、ｓｓＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を共転写で、トリヌクレオチドでキャッピングする方法を提供する。効率的な共転写キャッピングには、通常、５′ＡＴＰならびに等モル濃度のＮＴＰ及びトリヌクレオチドを用いて転写を開始する二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）鋳型が含まれる。通常、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは、５′ＡＴＰを用いると開始活性が著しく低下した。しかしながら、ＸＡＧ（Ｘは任意のヌクレオチド、例えば、５´ｍＧｐｐｐである）トリヌクレオチドの存在下で、５′ＡＴＰを用いたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼの限定された開始活性は、５′ＡＴＰではなくトリヌクレオチドで開始が推進され、キャップされたｍＲＮＡを共転写で生成する。
【０３４５】
例示的な市販のジ−及びトリヌクレオチドキャップを、図１４Ａに示す。ワクシニアキャップ１は、典型的なジ−ヌクレオチドキャップであり、共転写で添加することができない。共転写で添加され得る別のジ−ヌクレオチドキャップは、抗逆方向キャップ類似体（Ａｎｔｉ−Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｃａｐ  Ａｎａｌｏｇ）（ＡＲＣＡ）であり、また市販されている（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒから、カタログ番号：  ＡＭ８０４５）。ＡＲＣＡは、３´ＯＨ基（ｍ７Ｇに近接する）が−ＯＣＨ３で置き換えられる修飾されたキャップ類似体である。ＡＲＣＡを、この研究において記載される共転写キャッピングアッセイのいくつかにおいて対照として使用する。
【０３４６】
共転写キャッピングアッセイでは、ヒトＥＰＯ（ｈＥＰＯ）ＤＮＡ鋳型を使用した。５ｍＭのトリヌクレオチドありまたはなしで５ｍＭ  ＮＴＰもまたアッセイ混合物に存在した（ｍＧｐｐｐＡＧ、ｍＧｍｐｐｐＡＧ、及びＡＲＣＡ）。非修飾ｍＲＮＡ産物を、ＲＮａｓｅ  ＨキャップアッセイまたはＬＣＭＳによって分析した。表５に示されるように、野生型（ＷＴ）Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ及びＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントＧ４７Ａ＊は、均等に高い効率で完全にキャップされたｍＲＮＡを生成することができた。ＲＮＡ収量は、異なるＩＶＴ反応（図１４Ｂ）の中でも匹敵し、高度の完全性を有するｍＲＮＡ産物が生成された（図１４Ｃ）。
【表５】
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【０３４７】
ｍＲＮＡ産物の免疫刺激活性を、ＢＪ線維芽細胞におけるサイトカイン（ＩＦＮβ）生成を誘発するそれらの能力を評価することによって評価した。興味深いことに、ＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは、高いサイトカイン応答を誘発した非修飾ｍＲＮＡを生成したが、一方で、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント  Ｇ４７Ａ＊は、ＢＪ線維芽細胞においてサイトカイン生成を刺激しなかった非修飾ｍＲＮＡを生成し（図１４Ｄ）、ＩＶＴ／キャッピングアッセイの後にＲＮＡをさらに精製する必要性を最小化した。ｍＲＮＡ産物からのｈＥＰＯ発現もまた評価した。ｈＥＰＯ発現を、ＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによって生成されたｍＲＮＡから観察したが、一方で、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントＧ４７Ａ＊によって生成されたｍＲＮＡは、ワクシニアキャップ１でキャップされた１−メチル−シュードウリジンで修飾されたｍＲＮＡに匹敵するｈＥＰＯ発現をもたらした（図１４Ｅ）。ＬＣＭＳ実験はまた、トリヌクレオチド組み込み効率は２つの酵素と同等であるように思われたが、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントＧ４７Ａ＊が、ＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼより均質なＲＮＡを生成したことを示す（図１５）。
【０３４８】
異なる実験では、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントＧ４７Ａ＊のキャッピング効率を、ワクシニアキャップ１を使用する標準キャッピングアッセイにおいて達成された効率と比較した。この実験では、反応混合物は、鋳型鎖上の＋１位でデオキシチミジンを含むｈＥＰＯ  ｄｓＤＮＡ鋳型（第１の鋳型のあるヌクレオチドについては「Ａｓｔａｒｔ」とも命名される）、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントＧ４７Ａ＊、ならびに等モル（７．５ｍＭ）ＮＴＰ及びＧＡＧトリヌクレオチドを含んだ。得られるｍＲＮＡ産物を、オリゴｄＴを使用して精製し、キャッピング効率、インビトロサイトカイン応答、及びインビトロ発現について分析した。結果は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントＧ４７Ａ＊が、標準キャッピングプロセスと比較できる程に高い効率でキャップされたｍＲＮＡを生成し（表６）、ｍＲＮＡは、ＢＪ線維芽細胞においてサイトカイン応答を誘発せず（図１６Ａ）、ｍＲＮＡは、ＢＪ線維芽細胞において高いｈＥＰＯ発現をもたらす（図１６Ｂ）ことを示す。
【表６】
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【０３４９】
要約すると、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントＧ４７Ａ＊は、ＸＡＧトリヌクレオチド（例えば、ＧＡＧまたはＧｍＡＧ）の存在下で、鋳型鎖の３′ｄＴＴＰで転写を効率的に開始することができることを本明細書に示された。アッセイにおいてＮＴＰとして等モル濃度を条件として、トリヌクレオチドは、免疫応答を刺激しない完全にキャップされたｍＲＮＡを生成するために共転写で添加され、高タンパク質発現をもたらし得る（図１７）。
【０３５０】
実施例８．５′ＧＴＰ（Ｇｓｔａｒｔ）または５′ＡＴＰ（Ａｓｔａｒｔ）での転写開始の比較
実施例７に記載される共転写キャッピングアッセイを使用して、転写開始が５´−ＧＴＰ（Ｇｓｔａｒｔ）または５´−ＡＴＰ（Ａｓｔａｒｔ）を必要とするモデル構築物へのキャッピング効率を比較した。５′ＵＴＲ及び４７−ｍｅｒ  ＲＮＡオリゴヌクレオチドをコードするモデル構築物を、ＩＶＴの鋳型として使用した。全ＲＮＡ産物を、質量分析によって評価し、結果は、Ａｓｔａｒｔ構築物が、Ｇｓｔａｒｔ構築物と比較して  ＧＡＧまたはＧｍＡＧトリヌクレオチドをより効率的に組み込むことを示す（図１８Ａ）。データはここでは示されていないが、Ｃｓｔａｒｔ及びＵｓｔａｒｔ構築物が少量のキャップされた生成物を生成したこともまた観察された。
【０３５１】
さらに、ＲＮＡ産物を、ＲＮａｓｅ  Ｈ切断させ、ＲＮＡ産物の切断された５′末端を、質量分析を使用して分析し、キャップの存在を判定した。同様の結果を全ＲＮＡ産物のものとして得た（図１８Ｂ）。
【０３５２】
図１８Ａ及び図１８Ｂで使用されるモデル構築物を使用して、トリヌクレオチド滴定実験もまた行った。共転写キャッピングアッセイでは、５ｍＭのＮＴＰ（Ａ、等モル比で修飾されたＵ、Ｇ、Ｃ）を使用したが、一方で、トリヌクレオチド（ＧＡＧまたはＧｍＡＧ）の濃度は、変化し、ＮＴＰ及びトリヌクレオチドの異なるモル比でキャッピング効率を評価した。次いで、粗ＲＮＡ産物をＬＣ−ＭＳによって分析した。結果は、ＮＴＰ及びトリヌクレオチドが、ＧＡＧ及びＧｍＡＧの両方について等モル比であるときに、キャッピング効率が最も高いことを示す（表７）。
【表７】
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【０３５３】
実施例９．１−メチル−シュードウリジンで化学修飾されたｍＲＮＡのキャッピング
１−メチル−シュードウリジンで化学修飾されたｍＲＮＡの共転写キャッピングもまた評価した。３つのモデル構築物を使用した：ｈＥＰＯ、Ｌｕｃ（ルシフェラーゼをコードする）、及びｅＧＦＰ。すべてのＩＶＴ鋳型は、Ａｓｔａｒｔ鋳型であった。鋳型は、ＰＣＲ断片またはプラスミドであり得る。キャッピングアッセイ反応混合物は、鋳型、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントＧ４７Ａ＊、７．５ｍＭのＮＴＰ、及び７．５ｍＭのトリヌクレオチド（ＧＡＧまたはＧｍＡＧ）を含んだ。ＮＴＰ中のＵＴＰを、１−メチルシュードウリジンで置き換えて、化学修飾されたｍＲＮＡを生成した。ワクシニアキャップ１を、標準キャッピングアッセイにおいて生成対照として使用した。ｍＲＮＡ産物を、ＲＮａｓｅ  Ｈキャップアッセイ、Ｔ１フィンガープリンティング、及びフラグメントアナライザーを使用して分析し、それらの完全性を判定した。サイトカイン応答を誘発すること及びＢＪ線維芽細胞においてコードされたタンパク質を発現することにおけるｍＲＮＡ産物の能力もまた試験した。
【０３５４】
表８に示されるように、ＰＣＲ断片から生成されたすべての３つのモデル構築物の１−メチル−シュードウリジンで化学修飾されたｍＲＮＡは、効率的にキャップされ、キャッピング効率は、ワクシニアキャップ１対照に匹敵した。化学Ａは、非修飾ウリジン三リン酸ヌクレオチドの使用を示し、化学Ｂは、１−メチル−シュードウリジン三リン酸ヌクレオチドの使用を示す。化学Ｃは、５−メチル−シチジン三リン酸及び１−メチル−シュードウリジン三リン酸ヌクレオチドを示す。プラスミド鋳型から生成された１−メチル−シュードウリジンで化学修飾されたｍＲＮＡについて同様の結果を得た（表９）。さらに、ＲＮａｓｅ  Ｔ１フィンガープリンティング分析は、ＰＣＲ断片鋳型を使用してモデル構築物から生成されたｍＲＮＡが、正しい配列のものであったことを示した（図１９Ａ）。ＰＣＲ断片鋳型（図１９Ｂ）またはプラスミド鋳型（図２０Ｃ）のいずれかから生成されたｍＲＮＡもまた、高度の完全性を有することを示した。ＰＣＲ断片鋳型ならびにプラスミド鋳型から生成されたキャップされたｍＲＮＡは、ＢＪ線維芽細胞においていずれのサイトカイン発現も誘発しなかった（図１９Ｃ、図２０Ｄ）。さらに、プラスミド鋳型から生成されたｍＲＮＡは、ＢＪ線維芽細胞においてコードされたタンパク質の発現をもたらした（図２０Ｅ〜図２０Ｇ）。ＧＡＧキャップされたｍＲＮＡの発現レベルは、わずかにより高いか、ワクシニアキャップ１対照ｍＲＮＡからの発現レベルに匹敵するか、またはそれよりもわずかに低かった。
【表８】
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【表９】
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【０３５５】
共転写キャッピングアッセイにおけるＮＴＰ消費もまた、モデル構築物ｈＥＰＯ（図２０Ａ）及びｅＧＦＰ（図２０Ｂ）についてプラスミド鋳型を使用する反応を評価した。結果は、ＧＡＧ及びＧｍＡＧが、アッセイの期間（２時間）にわたってほとんど消費されなかったことを示す。これは、アッセイにおけるトリヌクレオチドの濃度が極端に超過していたという事実と一貫している。アッセイが完了した後にトリヌクレオチドを回収することが可能であり得る。
【０３５６】
実施例１０．ＲＮＡ収量に影響を与えるＴ７  ＲＮＡポリメラーゼＣ末端での置換
Ｇ４７Ａ＊ポリメラーゼは、翻訳されたタンパク質のＣ末端で余分なグリシン（「フットグリシン」）を含む。フットグリシンの存在を、トリプシン消化及び精製されたＧ４７Ａ＊タンパク質の質量分析によって確認した（データには示されていない）。Ｇ４７Ａ＊のＣ末端フット領域の役割を、Ｇ４７Ａ＊の活性部位に対するその近接のために、より詳細に試験した。
【０３５７】
インビトロ転写（ＩＶＴ）反応を、ｈＥＰＯ  ＤＮＡ鋳型、ならびに（１）野生型（ＷＴ）Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（ＷＴ）、（２）フットグリシンを有するＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（ＷＴ＋Ｇ）、（３）２つのフットグリシンを有するＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（ＷＴ＋ＧＧ）、（４）２つのフットアラニンを有する野生型ＲＮＡポリメラーゼ（ＷＴ＋ＡＡ）、（５）Ｇ４７Ａ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント、（６）フットグリシンを有するＧ４７Ａ＊  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント（Ｇ４７Ａ＋Ｇ）、（７）２つのフットグリシンを有するＧ４７Ａ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント（Ｇ４７Ａ＋ＧＧ）、（７）２つのフットアラニンを有するＧ４７Ａ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント（Ｇ４７Ａ＋ＡＡ）、（９）Ｓ４３Ａ／Ｇ４７Ａ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント（Ｓ４３Ａ／Ｇ４７Ａ）、及び（１０）フットグリシンを有するＳ４３Ａ／Ｇ４７Ａ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント（Ｓ４３Ａ／Ｇ４７Ａ＋Ｇ）を使用して行った。ＩＶＴ反応混合物は、ｈＥＰＯ  ＤＮＡ鋳型、上に列挙されるＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントのうちの１つ、及びＮＴＰを含んだ。非修飾化学を有するＩＶＴ反応（図２２）を、標準ＮＴＰ（ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ）で行ったが、一方で、シュードウリジン修飾（ｍ１ψ）化学を有するＩＶＴ反応（図２３）は、ＵＴＰの代わりに１−メチルシュードウリジンを含み、化学修飾されたｍＲＮＡを生成した。ＲＮＡ収量を、ＵＶ吸収によって測定した。
【０３５８】
ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ収量は、ＷＴまたはＧ４７Ａ＊バリアントＴ７  ＲＮＡポリメラーゼのいずれかにおいてフットグリシンの存在とともに減少した（図２２及図２３）。ｍＲＮＡ収量は、ＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼよりもＧ４７Ａ＊でのより少ない減少があったが、２つのフットグリシンまたは２つのフットアラニン残基のいずれかとともに減少し続けた。
【０３５９】
実施例１１．３´−ｍＲＮＡ不均一性へのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼフットグリシンの影響
実施例５のように、フットグリシンを有するＷＴまたはＧ４７Ａ＊  Ｔ７  ＲＮＡＰを使用して生成されたｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを、ＲＮＡｓｅ  Ｔ１で消化し、ＬＣＭＳによって分析して、オリゴフィンガープリントを生成した。ＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡＰ  ＩＶＴ反応を、ＮＴＰの等モル濃度（ＷＴ  ＥＱ）またはＧＴＰ及びＡＴＰ（ＷＴアルファ（Ａ））のモル過剰のいずれかで行った。ＬＣＭＳ分析は、均質な３′末端（５´ＯＨ／３´ＯＨ）は、３２７８０Ｄａでピークに達し、「瘢痕」（５´ＯＨ／３´ｍＰ）は、３２８６０Ｄａでピークに達することを明らかにした（図２４Ａ）。「瘢痕」は、転写物が、３´末端で鋳型のない付加を有したことを示す。ＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡＰ及びＮＴＰの等モル濃度（ＷＴ  ＥＱ）を使用して生成されたｈＥＰＯ  ｍＲＮＡは、３´末端集団分布を減少し、減少された３´均一性及び鋳型のない付加を有するより多くのランオン生成物を示す（図２４Ｂ）。しかしながら、フットグリシンを有するＧ４７Ａ＊  Ｔ７  ＲＮＡＰを使用して生成されたｈＥＰＯ  ｍＲＮＡは、より高い３′末端集団分布を有し、それらはより均質な３′末端を有し、３′末端の不均一性を改善したことを示す（図２４Ｂ）。
【０３６０】
ｈＥＰＯ  ３´ｍＲＮＡ均一性へのＴ７  ＲＮＡＰフット領域の影響を直接試験するために、ＩＶＴ反応を、ｈＥＰＯ  ＤＮＡ鋳型、ならびに（１）野生型Ｔ７  ＲＮＡＰ（ＷＴ）、（２）フットグリシンを有するＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡＰ（ＷＴ＋Ｇ）、（３）２つのフットグリシンを有するＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡＰ（ＷＴ＋ＧＧ）、（４）２つのフットアラニンを有する野生型Ｔ７  ＲＮＡＰ（ＷＴ＋ＡＡ）、（５）Ｇ４７Ａ  Ｔ７  ＲＮＡＰバリアント、（６）フットグリシンを有するＧ４７Ａ＊  Ｔ７  ＲＮＡＰバリアント（Ｇ４７Ａ＋Ｇ）、（７）２つのフットグリシンを有するＧ４７Ａ  Ｔ７  ＲＮＡＰバリアント（Ｇ４７Ａ＋ＧＧ）、（８）２つのフットアラニンを有するＧ４７Ａ  Ｔ７  ＲＮＡＰバリアント（Ｇ４７Ａ＋ＡＡ）、（９）Ｓ４３Ａ／Ｇ４７Ａ  Ｔ７  ＲＮＡＰバリアント（Ｓ４３Ａ／Ｇ４７Ａ）、及び（１０）フットグリシンを有するＳ４３Ａ／Ｇ４７Ａ  Ｔ７  ＲＮＡＰバリアント（Ｓ４３Ａ／Ｇ４７Ａ＋Ｇ）を使用して行った。ＩＶＴ反応混合物は、ｈＥＰＯ  ＤＮＡ鋳型、上に列挙されるＴ７  ＲＮＡＰバリアントのうちの１つ、及び等モルＮＴＰを含んだ。ＩＶＴ反応を行い、それは、非修飾ｍＲＮＡ（図２４Ｃ）またはシュードウリジン修飾されたｍＲＮＡ（図２４Ｄ）のいずれかを生成した。ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを、実施例５及び上記のようにＲＮａｓｅ  Ｔ１で消化した。フットグリシンの存在は、ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ  ３´末端の均一性を６０％増加させた（図２４Ｃ〜図２４Ｄ）。Ｔ７  ＲＮＡＰにおける、２つのフットグリシンまたは２つのアラニンもまた、ＷＴまたはＧ４７Ａ  Ｔ７  ＲＮＡＰにわたって３´末端の均一性を６０〜７０％改善した（図２４Ｃ及び図２４Ｄ）。これらの結果は、Ｔ７  ＲＮＡＰ中の単一のフットグリシンの存在が、図２４Ｂに観察される３´末端均一性を増加させることができることを示す。
【０３６１】
実施例１２．免疫刺激へのＴ７  ＲＮＡＰフットグリシンの影響
ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ生成物への免疫応答を刺激することにおけるＴ７  ＲＮＡＰフットグリシンの役割は、実施例７のように、ＢＪ線維芽細胞におけるサイトカイン（ＩＦＮβ）生成を誘発するそれらの能力を評価することによって評価した。興味深いことに、ＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡＰ生成された非修飾及びシュードウリジン修飾ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡが、高いサイトカイン応答を誘発したが、一方で、フットグリシン生成された非修飾及びシュードウリジン修飾ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを有するＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡＰは、ＢＪ線維芽細胞においてより少ないサイトカイン生成を刺激した（図２５）。フットグリシンを有するＧ４７Ａ＊バリアント  Ｔ７  ＲＮＡＰによって生成されたｈＥＰＯ  ｍＲＮＡは、ＢＪ線維芽細胞においてサイトカイン生成を刺激することをしそびれて、免疫応答を誘発しそびれることにおいてフットグリシン及びＧ４７Ａ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントの間の相加的効果を示す（図２５）。
【０３６２】
実施例１３．ｍＲＮＡ生成へのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼフットグリシンの影響
アッセイを開発して、ＷＴ及びＧ４７ＡバリアントＴ７  ＲＮＡＰによって生成されたｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ種へのフットグリシン残基の効果を調べた。試験されたＴ７  ＲＮＡＰは、以下の通りであった。（１）ＷＴ＋Ｇ（フットグリシン）、（２）Ｇ４７Ａバリアント、または（３）Ｇ４７Ａバリアント＋Ｇ（Ｇ４７Ａ＊バリアント）。ＩＶＴ反応は、列挙されるＴ７  ＲＮＡＰのうちの１つ、ｓｈＯＲＦａｎ鋳型、ＮＴＰ（非修飾または修飾されたＵＴＰのいずれか）、及び３２Ｐ−ＣＴＰを含んだ。反応を、所望の長さの時間の後にＥＤＴＡで終了した。次いで、反応混合物を、変性ポリアクリルアミドゲル（２０％アクリルアミド）に充填される前に、９５℃で５分間４Ｍの尿素中で変性した（図２６Ａ）。ゲルを２０ワットで３０分間、次いで４０ワットで２時間実行した。画像を、Ｔｙｐｈｏｏｎスキャナーを使用する画像化の前にホスフォイメージャースクリーンに移動した（１時間の露光時間）。３２Ｐ−ＣＴＰの使用は、完全長生成物（ｓｈＯＲＦａｎ  ｍＲＮＡを示す）、ランオン転写生成物（上の箱）（図２６Ａ）、及び逆相補ｍＲＮＡ産物（図２６Ａ、下の箱）を標識する。結果はまた、以下の表１０に要約される。これらのデータは、フットグリシンを有するＴ７  ＲＮＡＰが、ＷＴまたはＧ４７Ａ  Ｔ７  ＲＮＡＰのいずれかより少ない混入ｄｓＲＮＡに関連することを示す（図２６Ａ（下の箱）及び図２６Ｂ）。さらに、フットグリシンは、ＷＴまたはＧ４７ＡバリアントＴ７  ＲＮＡＰと比較して、減少されたランオン転写（図２６Ａ（上の箱）、図２６Ｂ）と関連する。
【表１０】
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【０３６３】
実施例１４．ホタルルシフェラーゼをコードするトリヌクレオチドキャップされたＧ４７Ａ＊  ｍＲＮＡの繰り返し投与の評価
インビトロ転写ｍＲＮＡは、典型的には、例えば、逆相クロマトグラフィー（ＲＰ）によって精製され、サイトカイン誘発不純物（ｄｓＲＮＡ）及びプロセス不純物（例えば、タンパク質／ＤＮＡ）を除去し、全ＲＮＡ純度を改善する。しかしながら、この精製プロセスはしばしば、ｍＲＮＡ産物の著しい喪失をもたらす。ＲＰを排除することは、ターンアラウンドタイムを低減し、大規模に動作及び操作複雑性を排除し、費用を節約する。さらに、ＲＰ中に使用される高温度が、ｍＲＮＡの画分を加水分解することができるため、ＲＰを排除することは、ｍＲＮＡ発現レベルを増加させる。したがって、ＲＰの必要性を排除するためにｍＲＮＡ産物及び精製戦略を開発した。この実施例に提供される方法によって生成されたｍＲＮＡは、「トリヌクレオチドキャップされたＧ４７Ａ＊  ｍＲＮＡ」  と称され、それは、Ｇ４７Ａ＊  Ｔ７  ＲＮＡＰバリアント（Ｇ４７Ａ置換及び追加のＣ末端Ｇを有する）を使用するインビトロ転写アッセイにおいてトリヌクレオチドＧｐｐｐＡ２′ＯｍｅｐＧで共転写でキャップされているｍＲＮＡである。
【０３６４】
この実施例では、ホタルルシフェラーゼ（ｆｆＬｕｃ）をコードするｍＲＮＡの単回の０．５ｍｐｋ用量を、ＭＣ３脂質ナノ粒子中に配合し、６週間（１日目、８日目、１５日目、２２日目、２９日目、及び３６日目に）Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（ｎ＝５）に毎週投与した。以下のｍＲＮＡを投与した。（１）ＮＴＰの等モル濃度の存在下で野生型Ｔ７ポリメラーゼを使用して生成され、オリゴｄＴ精製によって精製された非修飾ｍＲＮＡ（化学Ａプロセス１  ｄＴ）、（２）ＧＴＰ／ＡＴＰの過剰濃度の存在下で野生型Ｔ７ポリメラーゼを使用して生成され、逆相クロマトグラフィーによって精製されたシュードウリジン修飾ｍＲＮＡ（化学Ｂプロセス２  ＲＰ）、（３）ＧＴＰ／ＡＴＰの過剰濃度の存在下で野生型Ｔ７ポリメラーゼを使用して生成され、オリゴｄＴ精製によって精製されたシュードウリジン修飾ｍＲＮＡ（化学Ｂプロセス２  ｄＴ）、（４）ＮＴＰの等モル濃度の存在下で野生型Ｔ７ポリメラーゼを使用して生成され、オリゴｄＴ精製によって精製されたシュードウリジン修飾ｍＲＮＡ（化学Ｂプロセス１  ｄＴ）、（５）逆相クロマトグラフィーによって精製されたシュードウリジン修飾トリヌクレオチドキャップされたＧ４７Ａ＊  ｍＲＮＡ（Ｇ４７Ａ＊  Ｔ７  ＲＮＡＰバリアントを使用してキャップ及び生成されたトリヌクレオチド）（化学Ｂプロセス３  ＲＰ）、（６）オリゴｄＴ精製によって精製されたシュードウリジン修飾トリヌクレオチドキャップＧ４７Ａ＊  ｍＲＮＡ（化学Ｂプロセス３  ｄＴ）、ならびに（７）Ｇ４７Ａ＊  Ｔ７  ＲＮＡＰバリアントを使用して生成され、オリゴｄＴ精製によって精製されたキャップされていないシュードウリジン修飾ｍＲＮＡ（化学Ｂプロセス４  ｄＴ））。各用量後６時間、以下を評価した：血清サイトカインレベル、ｍＲＮＡ発現、及び抗−ＰＥＧ  ＩｇＭレベル。Ｂ細胞活性化を、３６日目の用量後６時間評価した。化学Ａは、非修飾ウリジン三リン酸ヌクレオチドの使用を示し、化学Ｂは、１−メチル−シュードウリジン三リン酸ヌクレオチドの使用を示す。プロセス１は、ＩＶＴ及びワクシニアキャップ１における等モルＮＴＰを指し、プロセス２は、４：２：１：１のＧＴＰ：ＡＴＰ：ＣＴＰ：ＵＴＰ（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１８年３月２２日に公開されたＷＯ２０１８／０５３２０９  Ａ１を参照のこと）及びワクシニアキャップ１を含むＩＶＴを指し、プロセス３は、ＩＶＴにおける等モルＮＴＰ及びＧＡＧを指し、プロセス４は、ＩＶＴ及びキャップなしにおける等モルＮＴＰを指す。
【０３６５】
１日目及び２９日目のマウスにおける血清サイトカイン評価（ＩＰ−１０）からの結果を、図２７Ａ及び図２７Ｂに表し、トリヌクレオチドキャップされたＧ４７Ａ＊  ｍＲＮＡが、インビボで血清サイトカインレベルを誘発し、アルファｍＲＮＡ対照と同様であることを示す。結果は、ｍＲＮＡが、ＢＪヒト線維芽細胞（図２８Ａ）及び単球由来マクロファージ（ＭＤＭ）（図２８Ｂ）に送達されたインビトロ実験について同様であった。
【０３６６】
ｍＲＮＡ発現研究（図２９）は、トリヌクレオチドキャップされたＧ４７Ａ＊  ｍＲＮＡが、６回の隔週用量後にインビボで高い発現を維持したことを示した。
【０３６７】
抗−ＰＥＧ  ＩｇＭ評価（図３０）は、Ｎ１ＵトリヌクレオチドキャップされたＧ４７Ａ＊  ｍＲＮＡが、６回の隔週用量後に低い抗−ＰＥＧ  ＩｇＭレベル生成したことを示した。
【０３６８】
Ｂ細胞活性化分析（図３１）は、トリヌクレオチドキャップされたＧ４７Ａ＊  ｍＲＮＡでトランスフェクトされた脾臓Ｂ細胞の活性化が低く、アルファｍＲＮＡ対照と同様であったことを示した。
【０３６９】
まとめると、これらの結果は、ＲＰ精製されていないｆｆＬｕｃをコードするトリヌクレオチドキャップされたＧ４７Ａ＊  ｍＲＮＡが、ベースラインを超えてサイトカイン応答を誘発せず、インビボで低い抗−ＰＥＧ  ＩｇＭレベルを維持し、低いＢ細胞活性化を呈することを示す。
【０３７０】
実施例１５．ヒトエリスロポエチンをコードするトリヌクレオチドキャップされたＧ４７Ａ＊  ｍＲＮＡの繰り返し投与の評価
この実施例では、ヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）をコードするｍＲＮＡの単回の０．５ｍｐｋ用量を、ＭＣ３脂質ナノ粒子中に配合し、６週間（１日目、８日目、１５日目、２２日目、２９日目、及び３６日目に）Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（ｎ＝５）に毎週投与した。以下のｍＲＮＡを投与した。（１）ＮＴＰの等モル濃度の存在下で野生型Ｔ７ポリメラーゼを使用して生成され、オリゴｄＴ精製によって精製された非修飾ｍＲＮＡ（化学Ａプロセス１  ｄＴ）、（２）ＧＴＰ／ＡＴＰの過剰濃度の存在下で野生型Ｔ７ポリメラーゼを使用して生成され、逆相クロマトグラフィーによって精製されたシュードウリジン修飾ｍＲＮＡ（化学Ｂプロセス２  ＲＰ）、（３）ＧＴＰ／ＡＴＰの過剰濃度の存在下で野生型Ｔ７ポリメラーゼを使用して生成され、オリゴｄＴ精製によって精製されたシュードウリジン修飾ｍＲＮＡ（化学Ｂプロセス２  ｄＴ）、（４）ＮＴＰの等モル濃度の存在下で野生型Ｔ７ポリメラーゼを使用して生成され、オリゴｄＴ精製によって精製されたシュードウリジン修飾ｍＲＮＡ（化学Ｂプロセス１  ｄＴ）、（５）逆相クロマトグラフィーによって精製されたシュードウリジン修飾トリヌクレオチドキャップされたＧ４７Ａ＊  ｍＲＮＡ（Ｇ４７Ａ＊  Ｔ７  ＲＮＡＰバリアントを使用してキャップ及び生成されたトリヌクレオチド）（化学Ｂプロセス３  ＲＰ）、（６）オリゴｄＴ精製によって精製されたシュードウリジン修飾トリヌクレオチドキャップＧ４７Ａ＊  ｍＲＮＡ（化学Ｂプロセス３  ｄＴ）、ならびに（７）Ｇ４７Ａ＊  Ｔ７  ＲＮＡＰバリアントを使用して生成され、オリゴｄＴ精製によって精製されたキャップされていないシュードウリジン修飾ｍＲＮＡ（化学Ｂプロセス４  ｄＴ））。各用量後６時間、以下を評価した：血清サイトカインレベル、ｍＲＮＡ発現、及び抗−ＰＥＧ  ＩｇＭレベル。Ｂ細胞活性化を、３６日目の用量後６時間評価した。化学Ａは、非修飾ウリジン三リン酸ヌクレオチドの使用を示し、化学Ｂは、１−メチル−シュードウリジン三リン酸ヌクレオチドの使用を示す。プロセス１は、ＩＶＴ及びワクシニアキャップ１における等モルＮＴＰを指し、プロセス２は、４：２：１：１のＧＴＰ：ＡＴＰ：ＣＴＰ：ＵＴＰ及びワクシニアキャップ１を含むＩＶＴを指し、プロセス３は、ＩＶＴにおける等モルＮＴＰ及びＧＡＧを指し、プロセス４は、ＩＶＴ及びキャップなしにおける等モルＮＴＰを指す。
【０３７１】
１日目及び２２日目のマウスにおける血清サイトカイン評価（ＩＰ−１０）からの結果を、図３２Ａ及び図３２Ｂに表し、トリヌクレオチドキャップされたＧ４７Ａ＊  ｍＲＮＡが、インビボで血清サイトカインレベルを誘発し、アルファｍＲＮＡ対照と同様であることを示す。結果は、ｍＲＮＡが、ＢＪヒト線維芽細胞（図３３Ａ）及び単球由来マクロファージ（ＭＤＭ）（図３３Ｂ）に送達されたインビトロ実験について同様であった。
【０３７２】
ｍＲＮＡ発現研究（図３４）は、トリヌクレオチドキャップされたＧ４７Ａ＊  ｍＲＮＡが、６回の隔週用量後にインビボで高い発現を維持したことを示した。
【０３７３】
抗−ＰＥＧ  ＩｇＭ評価（図３５）は、トリヌクレオチドキャップされたＧ４７Ａ＊  ｍＲＮＡが、６回の隔週用量後に低い抗−ＰＥＧ  ＩｇＭレベル生成したことを示した。
【０３７４】
Ｂ細胞活性化分析（図３６）は、トリヌクレオチドキャップされたＧ４７Ａ＊  ｍＲＮＡでトランスフェクトされた脾臓Ｂ細胞の活性化が低く、アルファｍＲＮＡ対照と同様であったことを示した。
【０３７５】
まとめると、これらの結果は、ＲＰ精製されていないｈＥＰＯをコードするトリヌクレオチドキャップされたＧ４７Ａ＊  ｍＲＮＡが、ベースラインを超えてサイトカイン応答を誘発せず、インビボで低い抗−ＰＥＧ  ＩｇＭレベルを維持し、低いＢ細胞活性化を呈することを示す。
【０３７６】
実施例１６．インデル頻度及び点変異頻度の評価
ｍＲＮＡを、プロセス１（等モルＮＴＰ）またはプロセス２（４：２：１：１のＧＴＰ：ＡＴＰ：ＣＴＰ：ＵＴＰ）を使用してＷＴまたはＧ４７Ａ＊酵素のいずれかで調製した。次世代シーケンシング（ＮＧＳ）について、ｍＲＮＡを、逆転写酵素によってｃＤＮＡに変換し、アダプターをライゲーションしてシーケンシングライブラリを準備した。ＮＧＳデータを、親配列と比較し、観察された任意のインデルを表にした。インデル頻度は、ＷＴ及びＧ４７Ａ＊に匹敵した（図３７Ａ）。同様に、ＮＧＳデータを、任意の点変異について分析した。点変異頻度は、ＷＴ及びＧ４７Ａ＊に匹敵した（図３７Ｂ）。
【０３７７】
本明細書に開示されるすべての参考文献、特許、及び特許出願は、各々が示される主題に関して参照により組み込まれ、いくつかの場合において、それは書類の全体を包含し得る。
【０３７８】
明細書及び特許請求の範囲において本明細書で使用されるように、不定冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、明らかに矛盾する記載がない限り、「少なくとも１つ」を意味するものとして理解されるべきである。
【０３７９】
明らかに矛盾する記載がない限り、１を超えるステップまたは行為を含む本明細書に請求されるあらゆる方法において、方法のステップまたは行為の順番は、方法のステップまたは行為が言及されているその順番に必ずしも限定されない。
【０３８０】
特許請求の範囲、ならびに上の明細書において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｃａｒｒｙｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、「有する（ｈｏｌｄｉｎｇ）」、「から構成される（ｃｏｍｐｏｓｅｄ  ｏｆ）」などのすべての移行句は、無制限、すなわち、含むが限定されないと意味すると理解されたい。「からなる」及び「から本質的になる」の移行句のみが、ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｏｆｆｉｃｅ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｅｘａｍｉｎｉｎｇ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，Ｓｅｃｔｉｏｎ  ２１１１．０３に示されるように、それぞれ閉鎖または半閉鎖的移行句であるものとする。
【図１】
2020532963.tif 000163
【図２】
2020532963.tif 000164
【図３】
2020532963.tif 000165
【図４】
2020532963.tif 000166
【図５】
2020532963.tif 000167
【図６】
2020532963.tif 000168
【図７】
2020532963.tif 000169
【図８】
2020532963.tif 000170
【図９】
2020532963.tif 000171
【図１０】
2020532963.tif 000172
【図１１Ａ】
2020532963.tif 000173
【図１１Ｂ】
2020532963.tif 000174
【図１２】
2020532963.tif 000175
【図１３】
2020532963.tif 000176
【図１４−１】
2020532963.tif 000177
【図１４−２】
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【図１４−３】
2020532963.tif 000179
【図１４−４】
2020532963.tif 000180
【図１５】
2020532963.tif 000181
【図１６】
2020532963.tif 000182
【図１７】
2020532963.tif 000183
【図１８Ａ】
2020532963.tif 000184
【図１８Ｂ】
2020532963.tif 000185
【図１９Ａ】
2020532963.tif 000186
【図１９Ｂ】
2020532963.tif 000187
【図１９Ｃ】
2020532963.tif 000188
【図２０−１】
2020532963.tif 000189
【図２０−２】
2020532963.tif 000190
【図２０−３】
2020532963.tif 000191
【図２０−４】
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【図２０−５】
2020532963.tif 000193
【図２１】
2020532963.tif 000194
【図２２】
2020532963.tif 000195
【図２３】
2020532963.tif 000196
【図２４−１】
2020532963.tif 000197
【図２４−２】
2020532963.tif 000198
【図２４−３】
2020532963.tif 000199
【図２５】
2020532963.tif 000200
【図２６Ａ】
2020532963.tif 000201
【図２６Ｂ】
2020532963.tif 000202
【図２７】
2020532963.tif 000203
【図２８】
2020532963.tif 000204
【図２９】
2020532963.tif 000205
【図３０】
2020532963.tif 000206
【図３１】
2020532963.tif 000207
【図３２】
2020532963.tif 000208
【図３３】
2020532963.tif 000209
【図３４】
2020532963.tif 000210
【図３５】
2020532963.tif 000211
【図３６】
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【図３７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年4月21日(2020.4.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１７年８月１８日に出願された米国仮出願第６２／５４７，６７７号、２０１８年２月９日に出願された米国仮出願第６２／６２８，４８４号、及び２０１８年３月５日に出願された米国仮出願第６２／６３８，６８４号、２０１８年５月２９日に出願された米国仮出願第６２／６７７，５２７号の３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）下の利益を主張し、それらの各出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
インビトロ転写（ＩＶＴ）は、バクテリオファージＤＮＡ依存性リボ核酸（ＲＮＡ）ポリメラーゼ（例えば、ＳＰ６、Ｔ３、及びＴ７）を使用して、鋳型に対するｍＲＮＡ転写物を合成する。ＩＶＴ反応における問題により、完全な失敗（例えば、転写物が生成しない）またはサイズが正しくない（例えば、予想よりも短いまたは長い）転写物となり得る。ＩＶＴ反応に関連する特定の問題には、例えば、アボーティブ（ａｂｏｒｔｉｖｅ）（切断型）転写物、ランオン（ｒｕｎ−ｏｎ）転写物、ポリＡテールバリアント／３´不均一性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）、変異転写物、及び／または反応中に生成される二本鎖混入物が含まれる。
【０００３】
ＲＮＡポリメラーゼは、転写の３つの段階−開始、伸長、及び終了を示す。開始段階では、ＲＮＡポリメラーゼは、特定のプロモーターＤＮＡ配列に結合し、ＤＮＡ二重鎖を開かせ、鋳型鎖を活性部位へと供給する。例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは、プロモーターと相互作用してＤＮＡ二重鎖融解を開始する６つのヘリックス束のサブドメイン（プロモーター結合ドメイン）を含む開始複合体と呼ばれる構造を形成する。ポリメラーゼは、プロモーターに結合している間、２〜１２ヌクレオチド（ｎｔ）の長さの短い多くの（切断型）転写物を生成し、プロセスはしばしばアボーティブ合成／開始と呼ばれる。切断型ＲＮＡ転写物は、ＲＮＡポリメラーゼによって完全長の転写物に変換され得ず、転写中に蓄積する副産物となる。伸長段階への移行及びプロモーターのリリース後、ポリメラーゼは、ＤＮＡ鋳型へと働きかけ、完全長ＲＮＡ転写物を生成する。
【０００４】
伸長段階の間、ＲＮＡポリメラーゼはしばしば、終了が開始されるべき位置を超えてＤＮＡを転写し続け、予想よりも長いＲＮＡ転写物（「ランオン転写物」）を生成する。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは、例えば、鋳型から「フォーリングオフする（ｆａｌｌｉｎｇ  ｏｆｆ）」前に、ヌクレオチドを転写物の末端に追加する。研究では、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによってインビトロで生成された転写物の７０％超がランオン転写物であり得ることが示唆されている。いくつか場合では、これらの異常なＲＮＡ産物は、コードされた配列の２倍の長さである。ランオン転写は推計学的であるため、所与のＩＶＴ反応における生成物中に多くの３´不均一性がしばしば存在する。この３´不均一性は、規定の長さ及び／またはヌクレオチド組成のＲＮＡ転写物に依存するライゲーション反応などの下流での用途において問題になる。
【発明の概要】
【０００５】
転写開始の際、ＲＮＡポリメラーゼは２つの相反する段階の平衡を保つ。ポリメラーゼはまず、２つのＤＮＡ鎖（そのうちの１つは鋳型鎖である）の解離を可能にするのに十分にしっかりとプロモーターと結合し、転写を開始する必要がある。次いで、ポリメラーゼはプロモーターをリリースし、高度にプロセッシブな（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｅ）伸長段階に入る必要がある。これらの２つの段階の間の競合により、アボーティブな転写物が生成する。ポリメラーゼは繰り返しプロモーターを除こうとするが、移行障壁を克服することができず、短い（アボーティブな）ＲＮＡ産物を放出する。逆に、ポリメラーゼはしばしばＤＮＡ鋳型を「ランオフ」せず、３´不均一性を有するＲＮＡ転写物の集団を生成する。例えば、インビトロ転写（ＩＶＴ）反応において生成される転写効率及び３´均一性を増加させるバリアントＲＮＡポリメラーゼ、ランオン転写物、二本鎖混入物、またはそれらの任意の組み合わせが本明細書で提供される。
【０００６】
開始から伸長への移行中に、ＲＮＡポリメラーゼは、アミノ末端ドメイン（Ｎ末端ドメイン）の大きな再配列を必要とするコンフォメーション変化を受ける（例えば、Ｂａｎｄｗａｒ，ＲＰ  ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８２，２２８７９−２２８８６（２００９）；Ｇｕｉｌｌｅｒｅｚ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １０２，５９５８−５９６３（２００５）；Ｄｕｒｎｉａｋ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）３２２，５５３（２００８）；及びＴａｈｉｒｏｖ，Ｔ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ４２０，４３−５０（２００２）を参照のこと、これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる）。このＮ末端ドメイン内には、「Ｃヘリックス」（例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸２８〜７１）及び「Ｃリンカー」（例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸２５８〜２６６）があり、その各々が、ＲＮＡポリメラーゼが開始複合体から伸長複合体に移行するにつれて、プロモーター結合部位が廃棄され、活性部位が拡張され、ＲＮＡ転写物の出口トンネルが作出される、ループ構造からヘリックス構造へのコンフォメーション変化を受けるサブ領域（それぞれ、アミノ酸４２〜４７及び２５７〜２６２）を含む（例えば、図１０を参照のこと）。Ｃヘリックス構造のサブ領域及び／またはＣリンカーのリンカー領域に対する変異は、開始複合体と比較して伸長複合体の熱力学的安定性を高めることにより、伸長複合体に対するコンフォメーション平衡を推進し得る。理論に縛られることなく、Ｃヘリックス構造及び／またはＣリンカーのリンカー領域などの選択領域の変異は、伸長中にポリメラーゼの出口トンネルが転写物と相互作用する方法を変化させることができ、転写エラー（例えば、ランオン転写物）を大幅に減少させると考えられている。したがって、本開示のバリアントポリメラーゼは、Ｃヘリックス及び／またはＣリンカーにおいて、伸長複合体に対するコンフォメーション平衡を推進するための（少なくとも１つの）変異を含む。
【０００７】
本明細書で提供されるように、ポリメラーゼが開始から伸長に進むにつれてヘリックス構造に移行するループ構造を含むＮ末端ドメインの他の領域は、変異され得る（置換と呼ばれる、点変異）。そのようなループ−ヘリックス（ｌｏｏｐ−ｔｏ−ｈｅｌｉｘ）領域の非限定的な例には、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、配列番号１）のアミノ酸５５〜７３、１６４〜１６９、もしくは１７６〜１８７に及ぶ領域、または前述の領域と相同である（例えば、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一である）他の単一サブユニットＲＮＡポリメラーゼの領域（例えば、Ｃｅｒｍａｋｉａｎ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｖｏｌ  ４５，６７１−６８１（１９９７）を参照のこと）を含む。他の単一サブユニットＲＮＡポリメラーゼの非限定的な例には、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｋ１１  ＲＮＡポリメラーゼ、及びＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼが含まれる。
【０００８】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼバリアント（例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント）は、高ヘリックス性向を有する残基（例えば、アラニン）か、または骨格柔軟性を伸長複合体の骨格柔軟性に特異的に一致させる残基に対する変異を含む。
【０００９】
ポリメラーゼのＣ末端に少なくとも１つの追加のアミノ酸を含むＲＮＡポリメラーゼバリアントが本明細書でさらに提供される。例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、ポリメラーゼのＣ末端に、追加のグリシン（Ｇ）などの少なくとも１つの追加のアミノ酸を含み得る。驚くべきことに、Ｃ末端「足（ｆｏｏｔ）」領域（例えば、野生型Ｔ７  ＲＮＡＰの８８０〜８８３位に「ＦＡＦＡ」（配列番号１７２）アミノ酸を含む領域）に追加のＧを含むように修飾されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用して生成されたＲＮＡ転写物の集団は、より少ない３´不均一性を示す。例えば、図２３に示すように、Ｃ末端グリシン（すなわち、…ＦＡＦＡＧ（配列番号３２９））を含むＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、転写物の少なくとも８５％が３´末端において均一であるＲＮＡ転写物集団を生成する。これまでの研究では、Ｃ末端の付加／挿入によりＴ７ポリメラーゼの機能が失われることが示されていることを考慮すると、このデータは特に予想外である（Ｇａｒｄｎｅｒ  ＬＰ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６，２９０８−２９１８（１９９７）及びＧｒｏｓｓ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２２８，４８８−５０５（１９９２））。
【００１０】
本明細書に記載されているＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント（例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントＧ４７ＡまたはＧ４７Ａ＊  Ｃ末端バリアント）を使用したインビトロ転写アッセイにおいて、ｓｓＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）をキャップ類似体（例えば、トリヌクレオチド）で共転写で（ｃｏ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｌｙ）キャッピングする方法（共転写キャッピング方法）もまた、本明細書で提供される。効率的な共転写キャッピングには、通常、５′ＡＴＰならびに等モル濃度のＮＴＰ及びトリヌクレオチドを用いて転写を開始する二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）鋳型が含まれる。これらの条件下で、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、５′ＡＴＰを用いると開始活性が著しく低下する。予想外に、本明細書で提供されるデータは、ＧＡＧトリヌクレオチド（例えば、ｍ７ＧｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＧ）の存在下において、例えば、５′ＡＴＰを用いたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼの限定された開始活性は、５′ＡＴＰではなくトリヌクレオチドで開始が推進され、キャップされたＲＮＡを共転写で生成する。驚くべきことに、いくつかの実施形態では、生成されたＲＮＡの９０％超が一本鎖完全長転写物を含み、生成されたＲＮＡの少なくとも９０％が機能性キャップを含み、生成されたＲＮＡがＩＶＴ後に精製なしでも実質的なサイトカイン応答を示さない。
【００１１】
したがって、本開示のいくつかの態様は、野生型ＲＮＡポリメラーゼと比較して、ＲＮＡポリメラーゼバリアントが開始複合体から伸長複合体に移行するにつれてＲＮＡポリメラーゼバリアントの少なくとも１つのループ構造にヘリックス構造へのコンフォメーション変化を受けさせる少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、ＲＮＡポリメラーゼバリアントを提供する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、開始複合体よりも伸長複合体においてフォールディング自由エネルギーの負の変化が大きいと推定される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、野生型アミノ酸と比較して、高いヘリックス性向を有する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、Ｃ末端に（少なくとも１つの）追加のアミノ酸残基を含む。例えば、ＲＮＡポリメラーゼバリアント（例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント）は、Ｃ末端にグリシン（Ｇ）を含み得る。
【００１２】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、Ｋ１１  ＲＮＡポリメラーゼである。
【００１３】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのループ構造が、Ｃヘリックス構造中にある。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのループ構造が、Ｃリンカー構造中にある。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのループ構造が、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸５５〜７３、１６４〜１６９、もしくは１７６〜１８７、またはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼに相同なＲＮＡポリメラーゼ内の領域に存在する。
【００１４】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、少なくとも１つの高ヘリックス性向アミノ酸置換である。例えば、少なくとも１つの高ヘリックス性向アミノ酸置換は、アラニン、イソロイシン、ロイシン、アルギニン、メチオニン、リジン、グルタミン、及び／またはグルタミン酸から選択され得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの高ヘリックス性向アミノ酸置換は、アラニンである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの高ヘリックス性向アミノ酸置換は、イソロイシンである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの高ヘリックス性向アミノ酸置換は、ロイシンである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの高ヘリックス性向アミノ酸置換は、アルギニンである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの高ヘリックス性向アミノ酸置換は、メチオニンである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの高ヘリックス性向のアミノ酸置換は、リジンである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの高ヘリックス性向のアミノ酸置換は、グルタミンである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの高ヘリックス性向アミノ酸置換は、グルタミン酸である。
【００１５】
いくつかの実施形態では、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは、Ｅ４２（例えば、Ｅ４２Ｒ）、Ｓ４３（例えば、Ｓ４３Ａ）、Ｙ４４（例えば、Ｙ４４Ａ）、Ｅ４５（例えば、Ｅ４５Ｒ／Ｌ）、Ｍ４６（例えば、Ｍ４６Ａ）、Ｇ４７（例えば、Ｇ４７Ａ）、Ａ２５５（例えば、Ａ２５５Ｋ／Ｑ／Ｙ／Ｉ）、Ｒ２５７（例えば、Ｒ２５７Ａ）、Ａ２５８（例えば、Ａ２５８Ｒ／Ｅ／Ｌ）、Ｇ２５９（例えば、Ｇ２５９Ａ）、Ａ２６０（例えば、Ａ２６０Ｒ／Ｅ／Ｌ）、Ｌ２６１（例えば、Ｌ２６１Ａ）及びＡ２６２（例えば、Ａ２６２Ｒ／Ｅ／Ｌ）から選択される少なくとも１つの位置に高ヘリックス性向アミノ酸の少なくとも１つのアミノ酸置換を含むように修飾される。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは、いくつかの実施形態では、（少なくとも１つの高ヘリックス性向アミノ酸置換に加えて）１つ以上の追加のアミノ酸置換をさらに含み得る。したがって、本開示は、本明細書で提供される１つ以上の高ヘリックス性向アミノ酸置換を有する既存の（例えば、現在入手できる及び／または市販の）Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントのさらなる修飾を包含する。
【００１６】
いくつかの実施形態では、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは、Ｅ４２（例えば、Ｅ４２Ｒ）、Ｓ４３（例えば、Ｓ４３Ａ）、Ｙ４４（例えば、Ｙ４４Ａ）、Ｅ４５（例えば、Ｅ４５Ｒ／Ｌ）、Ｍ４６（例えば、Ｍ４６Ａ）及びＧ４７（例えば、Ｇ４７Ａ）から選択される位置に高ヘリックス性向アミノ酸の少なくとも１つのアミノ酸置換を含むように修飾された配列番号１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｓ４３Ａを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｇ４７Ａを含む。
【００１７】
いくつかの実施形態では、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは、Ｅ４２（例えば、Ｅ４２Ｒ）、Ｓ４３（例えば、Ｓ４３Ａ）、Ｙ４４（例えば、Ｙ４４Ａ）、Ｅ４５（例えば、Ｅ４５Ｒ／Ｌ）、Ｍ４６（例えば、Ｍ４６Ａ）及びＧ４７（例えば、Ｇ４７Ａ）から選択される位置に高ヘリックス性向アミノ酸の少なくとも１つのアミノ酸置換を含むように修飾された配列番号９９、配列番号１００、配列番号２９４、配列番号２９５、または配列番号２９６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｓ４３Ａを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｇ４７Ａを含む。
【００１８】
いくつかの実施形態では、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは、Ａ２５５（例えば、Ａ２５５Ｋ／Ｑ／Ｙ／Ｉ）、Ｒ２５７（例えば、Ｒ２５７Ａ）、Ａ２５８（例えば、Ａ２５８Ｒ／Ｅ／Ｌ）、Ｇ２５９（例えば、Ｇ２５９Ａ）、Ａ２６０（例えば、Ａ２６０Ｒ／Ｅ／Ｌ）、Ｌ２６１（例えば、Ｌ２６１Ａ）及びＡ２６２（例えば、Ａ２６２Ｒ／Ｅ／Ｌ）から選択される位置に高ヘリックス性向アミノ酸の少なくとも１つのアミノ酸置換を含むように修飾された配列番号１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｒ２５７Ａを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｇ２５９Ａを含む。
【００１９】
いくつかの実施形態では、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは、Ａ２５５（例えば、Ａ２５５Ｋ／Ｑ／Ｙ／Ｉ）、Ｒ２５７（例えば、Ｒ２５７Ａ）、Ａ２５８（例えば、Ａ２５８Ｒ／Ｅ／Ｌ）、Ｇ２５９（例えば、Ｇ２５９Ａ）、Ａ２６０（例えば、Ａ２６０Ｒ／Ｅ／Ｌ）、Ｌ２６１（例えば、Ｌ２６１Ａ）及びＡ２６２（例えば、Ａ２６２Ｒ／Ｅ／Ｌ）から選択される位置に高ヘリックス性向アミノ酸の少なくとも１つのアミノ酸置換を含むように修飾された配列番号９９、配列番号１００、配列番号２９４、配列番号２９５、または配列番号２９６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｒ２５７Ａを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｇ２５９Ａを含む。
【００２０】
いくつかの態様では、位置Ｇ４７、Ｓ４３、Ｒ２５７、またはＧ２５９に高ヘリックス性向アミノ酸（例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシン、アルギニン、メチオニン、リジン、グルタミン、及び／またはグルタミン酸）のアミノ酸置換を含むように修飾された配列番号１のアミノ酸配列を含むＴ７  ＲＮＡポリメラーゼもまた、本明細書で提供される。いくつかの態様では、位置Ｇ４７、Ｓ４３、Ｒ２５７、またはＧ２５９に高ヘリックス性向アミノ酸（例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシン、アルギニン、メチオニン、リジン、グルタミン、及び／またはグルタミン酸）のアミノ酸置換を含むように修飾された配列番号９９、配列番号１００、配列番号２９４、配列番号２９５、または配列番号２９６のアミノ配列を含むＴ７  ＲＮＡポリメラーゼがさらに提供される。
【００２１】
いくつかの実施形態では、本開示のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼは、配列番号１０７もしくは１０８、配列番号１０９もしくは１１０、配列番号１１１もしくは１１２、または配列番号１１３もしくは１１４のアミノ酸配列を含む。
【００２２】
いくつかの実施形態では、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは、少なくとも１つの追加のＣ末端アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは、少なくとも２つの追加のＣ末端アミノ酸を含む。
【００２３】
いくつかの実施形態では、少なくとも２つの追加のＣ末端アミノ酸は、同じ種類のアミノ酸（例えば、すべてＧｌｙ、すべてＡｌａ）を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つの追加のＣ末端アミノ酸は、少なくとも２つの異なる種類のアミノ酸（例えば、ＧｌｙＡｌａ、ＡｌａＧｌｙ）を含む。
【００２４】
いくつかの実施形態では、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは、少なくとも３つの追加のＣ末端アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも３つの追加のＣ末端アミノ酸は、少なくとも２つもしくは少なくとも３つの同じ種類または異なる種類のアミノ酸（例えば、ＧｌｙＧｌｙＧｌｙ、ＡｌａＡｌａＡｌａ）を含む。
【００２５】
いくつかの実施形態では、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは、１〜１０個（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個）の追加のＣ末端アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは、１〜５つの追加のＣ末端アミノ酸を含む。
【００２６】
いくつかの実施形態では、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼはＦＡＦＡＸｎ（配列番号１７１）モチーフを含むＣ末端を含み、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｎはゼロより大きい任意の整数である。いくつかの実施形態では、Ｘはグリシン（Ｇ）である。いくつかの実施形態では、ｎは１、２、３、４、または５である。ｎが１より大きく、したがって、Ｃ末端モチーフは、例えばＦＡＦＸＸ、ＦＡＦＡＸＸＸ（配列番号３１９）、ＦＡＦＡＸＸＸＸ（配列番号３２０）、またはＦＡＦＡＸＸＸＸＸ（配列番号３２１）である実施形態では、例えば、Ｘ´が同じアミノ酸であり得、または異なるアミノ酸であり得ると理解されるべきである。例えば、Ｃ末端モチーフは、ＦＡＦＡＧＧ（配列番号３２２）もしくはＦＡＦＡＧＧＧ（配列番号３２３）であってもよく、またはＣ末端モチーフは、ＦＡＦＡＧＡ（配列番号３２４）、ＦＡＦＡＧＣ（配列番号３２５）、ＦＡＦＡＧＡＡ（配列番号３２６）、ＦＡＦＡＧＡＧ（配列番号３２７）、ＦＡＦＡＧＡＣ（配列番号３２８）などであり得る。他のＣ末端アミノ酸の組み合わせを使用し得る。
【００２７】
いくつかの実施形態では、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは、ＦＡＦＡＧ（配列番号３２９）モチーフを含むＣ末端を含む。
【００２８】
いくつかの実施形態では、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは、ＸＡＦＡＸｎモチーフ、ＦＸＦＡＸｎモチーフ、ＦＡＸＡＸｎモチーフ、またはＦＡＦＸＸｎモチーフを含み、各Ｘは任意のアミノ酸であり、ｎはゼロより大きい任意の整数である。したがって、本開示は、様々なＣ末端、Ｆ８８０Ａ８８１Ｆ８８２Ａ８８３（配列番号１７２）モチーフを含み、８８０位、８８１位、８８２位、または８８３位のうちの１つ以上のアミノ酸（例えば、野生型Ｔ７  ＲＮＡＰと比較して、例えば、配列番号１）が、追加のＣ末端アミノ酸（Ｘｎ）の有無にかかわらず、少なくとも１つのアミノ酸置換を含むように修飾されている。
【００２９】
いくつかの態様では、本開示は、対応する野生型ＲＮＡポリメラーゼと比較して少なくとも１つの追加のＣ末端アミノ酸を含む、ＲＮＡポリメラーゼを提供する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ、及びＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼから選択される。
【００３０】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、少なくとも１つの追加のアミノ酸置換をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、Ｇ４７Ａ、Ｓ４３Ａ、Ｒ２５７Ａ、及びＧ２５９Ａから選択される配列番号１のアミノ酸置換に対応するアミノ酸置換をさらに含む。
【００３１】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、４３±１（例えば、４２、４３、または４４）位、４７±１（例えば、４６、４７、または４８）位、２５７±１（例えば、２５６位、２５７位、または２５８）位，及び／または２５９±１（例えば、２５８位、２５９位、または２６０）位にアミノ酸を含むように修飾された、配列番号１と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含むＴ７  ＲＮＡポリメラーゼであり、任意選択により、アミノ酸置換はアラニン（Ａ）である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、野生型Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの４３±１位、４７±１位、２５７±１位，及び／または２５９±１位（配列または構造アライメントに基づく）に対応する位置にアミノ酸置換を含むように修飾された、配列番号６と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含むＴ３  ＲＮＡポリメラーゼであり、任意選択により、アミノ酸置換はアラニン（Ａ）である。いくつかの実施形態では、野生型Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの４３±１位、４７±１位、２５７±１位，及び／または２５９±１位（配列または構造アライメントに基づく）に対応する位置にアミノ酸置換を含むように修飾された、配列番号７と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含むＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼであり、任意選択により、アミノ酸置換はアラニン（Ａ）である。
【００３２】
本開示のいくつかの態様は、４３位、４７位、２５７位，及び／または２５９位にアミノ酸置換を含むように修飾された、配列番号１と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含むＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを提供し、任意選択により、アミノ酸置換はアラニン（Ａ）である。
【００３３】
本開示の他の態様は、野生型Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの４３位、４７位、２５７位、及び／または２５９位に対応する位置にアミノ酸置換を含むように修飾された、配列番号６と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含むＴ３  ＲＮＡポリメラーゼを提供し、任意選択により、アミノ酸置換はアラニン（Ａ）である。したがって、いくつかの実施形態では、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼは、４４位、４８位、２５８位，及び／または２６０位にアミノ酸置換を含むように修飾された、配列番号６と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含み、任意選択により、アミノ酸置換はアラニン（Ａ）である。
【００３４】
本開示のさらに他の態様は、野生型Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの４３位、４７位、２５７位、及び／または２５９位に対応する位置にアミノ酸置換を含むように修飾された、配列番号７と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含むＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼを提供し、任意選択により、アミノ酸置換はアラニン（Ａ）である。したがって、いくつかの実施形態では、ＳＰ６  ＴＮＡポリメラーゼは、１５位、１９位、２３０位，及び／または２３２位にアミノ酸置換を含むように修飾された、配列番号７と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含み、任意選択により、アミノ酸置換はアラニン（Ａ）である。
【００３５】
本開示はまた、ＲＮＡ転写物の生成をもたらす条件下で（例えばＩＶＴ条件下で）、ＤＮＡ鋳型を本明細書に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアントと接触させることを含む、ＲＮＡの生成方法を提供する。
【００３６】
本開示は、ヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）及び緩衝液の存在下において、ＲＮＡ転写物の生成をもたらす条件下で、ＤＮＡ鋳型を本明細書で提供されるＲＮＡポリメラーゼバリアントと接触させることを含む、ＩＶＴ反応を行う方法をさらに提供する。
【００３７】
いくつかの実施形態では、生成されたＲＮＡ転写物は、任意選択により未精製形態で細胞に送達されたときに、同じＩＶＴ条件下で野生型ＲＮＡポリメラーゼを使用して生成されたＲＮＡと比較して、少なくとも５０％（例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％）低いサイトカイン応答を刺激する。
【００３８】
いくつかの実施形態では、ＩＶＴにより生成されたｄｓＲＮＡ転写物の濃度は、野生型ポリメラーゼを使用して生成されたｄｓＲＮＡ転写物と比較して、少なくとも５０％（例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％）低い。
【００３９】
いくつかの実施形態では、生成されたＲＮＡ転写物の２０％未満（例えば、１５％未満、１０％未満、５％未満）が３´不均一性を示す。
【００４０】
いくつかの実施形態では、生成されたＲＮＡ転写物の５０％未満（例えば、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満）が切断型ＲＮＡ転写物である。
【００４１】
いくつかの実施形態では、生成されたＲＮＡ転写物の５０％未満（例えば、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満）がランオンＲＮＡ転写物である。
【００４２】
いくつかの態様では、生成された全長ＲＮＡ転写物の量が、ＤＮＡ鋳型の量よりも少なくとも１５倍大きい。
【００４３】
いくつかの実施形態では、切断型ＲＮＡ転写物：生成された完全長ＲＮＡ転写物の比率が、１：１未満である。
【００４４】
いくつかの実施形態では、生成されたＲＮＡ転写物は、ＤＮＡ鋳型と比較して１００ヌクレオチドあたり１未満の変異を有する。
【００４５】
本開示は、いくつかの態様では、ＲＮＡポリメラーゼバリアントをコードする核酸を提供し、いくつかの実施形態では、該核酸を含むベクター（例えばプラスミド）及び／または宿主細胞（例えば哺乳動物細胞、例えばヒト細胞）を提供する。
【００４６】
本開示の方法により生成されたＲＮＡ転写物も提供される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写物（例えば、ｍＲＮＡ）は、脂質ナノ粒子中に製剤化される。脂質ナノ粒子は、例えば、２０〜６０％のイオン化可能なアミノ脂質、５〜２５％の非カチオン性脂質、２５〜５５％のステロール、及び０．５〜１５％のＰＥＧ修飾脂質のモル比を含み得る。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、２０１７年４月２７日に公開されたＷＯ２０１７／０７０６２４を参照のこと。
【００４７】
ＲＮＡポリメラーゼバリアントを含む他の組成物及びキットが本明細書で包含される。
【００４８】
リボ核酸（ＲＮＡ）合成のための共転写キャッピング方法であって、ＲＮＡ転写物を生成するためのインビトロ転写反応条件下で、ポリヌクレオチド鋳型をＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント、ヌクレオシド三リン酸、及びキャップ類似体と反応させることを含む方法も本明細書で提供される。
【００４９】
いくつかの実施形態では、生成されたＲＮＡ転写物の８０％超、８５％超、または９０％超が機能性キャップを含む。いくつかの実施形態では、生成されたＲＮＡ転写物の９５％超が機能性キャップを含む。
【００５０】
いくつかの実施形態では、ヌクレオシド三リン酸は、非修飾もしくは修飾ＡＴＰ、修飾もしくは非修飾ＵＴＰ、修飾もしくは非修飾ＧＴＰ、及び／または修飾もしくは非修飾ＣＴＰを含む。
【００５１】
いくつかの実施形態では、Ｔ７ポリメラーゼバリアントは、Ｅ４２、Ｓ４３、Ｙ４４、Ｅ４５、Ｍ４６、Ｇ４７、Ａ２５５、Ｒ２５７、及びＧ２５９から選択される位置に高性向アミノ酸の少なくとも１つのアミノ酸置換を含むように修飾された、配列番号１のアミノ酸配列（または配列番号１と９０％〜９９％、例えば少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列）を含む。いくつかの実施形態では、Ｔ７ポリメラーゼバリアントは、Ｇ４７Ａのアミノ酸置換を含むように修飾された、配列番号１のアミノ酸配列（または配列番号１と９０％〜９９％、例えば少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列）を含む。いくつかの実施形態では、Ｔ７ポリメラーゼバリアントは、Ｓ４３Ａのアミノ酸置換を含むように修飾された、配列番号１のアミノ酸配列（または配列番号１と９０％〜９９％、例えば少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列）を含む。
【００５２】
いくつかの実施形態では、Ｔ７ポリメラーゼバリアントは、Ｅ４２、Ｓ４３、Ｙ４４、Ｅ４５、Ｍ４６、Ｇ４７、Ａ２５５、Ｒ２５７、及びＧ２５９から選択される位置に高性向アミノ酸の少なくとも９９つのアミノ酸置換を含むように修飾された、配列番号９９のアミノ酸配列（または配列番号９９と９０％〜９９％、例えば少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列）を含む。いくつかの実施形態では、Ｔ７ポリメラーゼバリアントは、Ｇ４７Ａのアミノ酸置換を含むように修飾された、配列番号９９のアミノ酸配列（または配列番号９９と９０％〜９９％、例えば少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列）を含む。いくつかの実施形態では、Ｔ７ポリメラーゼバリアントは、Ｓ４３Ａのアミノ酸置換を含むように修飾された、配列番号９９のアミノ酸配列（または配列番号９９と９０％〜９９％、例えば少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列）を含む。
【００５３】
いくつかの実施形態では、Ｔ７ポリメラーゼバリアントは、Ｅ４２、Ｓ４３、Ｙ４４、Ｅ４５、Ｍ４６、Ｇ４７、Ａ２５５、Ｒ２５７、及びＧ２５９から選択される位置に高性向アミノ酸の少なくとも１００つのアミノ酸置換を含むように修飾された、配列番号１００のアミノ酸配列（または配列番号１００と９０％〜９９％、例えば少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列）を含む。いくつかの実施形態では、Ｔ７ポリメラーゼバリアントは、Ｇ４７Ａのアミノ酸置換を含むように修飾された、配列番号１００のアミノ酸配列（または配列番号１００と９０％〜９９％、例えば少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列）を含む。いくつかの実施形態では、Ｔ７ポリメラーゼバリアントは、Ｓ４３Ａのアミノ酸置換を含むように修飾された、配列番号１００のアミノ酸配列（または配列番号１００と９０％〜９９％、例えば少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列）を含む。
【００５４】
いくつかの実施形態では、ヌクレオシド三リン酸及びキャップ類似体は、反応において等モル濃度で存在する。いくつかの実施形態では、反応におけるキャップ類似体とヌクレオシド三リン酸とのモル比は、１：１より大きい。いくつかの実施形態では、反応におけるキャップ類似体とヌクレオシド三リン酸とのモル比は、１：１未満である。
【００５５】
いくつかの実施形態では、キャップ類似体は、ジヌクレオチドキャップ、トリヌクレオチドキャップ、またはテトラヌクレオチドキャップである。いくつかの実施形態では、キャップ類似体は、トリヌクレオチドキャップである。
【００５６】
いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、以下の配列：ＧＡＡ、ＧＡＣ、ＧＡＧ、ＧＡＵ、ＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、ＧＣＵ、ＧＧＡ、ＧＧＣ、ＧＧＧ、ＧＧＵ、ＧＵＡ、ＧＵＣ、ＧＵＧ、及びＧＵＵから選択される配列を含む。
【００５７】
いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、以下の配列：ｍ７ＧｐｐｐＡｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＡｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＡｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＡｐＵ、ｍ７ＧｐｐｐＣｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＣｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＣｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＣｐＵ、ｍ７ＧｐｐｐＧｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＧｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＧｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＧｐＵ、ｍ７ＧｐｐｐＵｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＵｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＵｐＧ、及びｍ７ＧｐｐｐＵｐＵから選択される配列を含む。
【００５８】
いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、以下の配列：ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡｐＡ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡｐＣ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡｐＧ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡｐＵ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣｐＡ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣｐＣ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣｐＧ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣｐＵ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧｐＡ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧｐＣ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧｐＧ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧｐＵ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵｐＡ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵｐＣ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵｐＧ、及びｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵｐＵから選択される配列を含む。
【００５９】
いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、以下の配列：ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＡ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＣ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＧ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＵ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＡ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＣ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＧ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＵ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＡ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＣ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＧ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＵ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＡ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＣ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＧ、及びｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＵから選択される配列を含む。
【００６０】
いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、以下の配列：ｍ７ＧｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＵ、ｍ７ＧｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＵ、ｍ７ＧｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＵ、ｍ７ＧｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＧ、及びｍ７ＧｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＵから選択される配列を含む。
【００６１】
いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、以下の配列：ＧＡＧ、ＧＣＧ、ＧＵＧ、及びＧＧＧから選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、配列ＧＡＧを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７ＧｐｐｐＡ２′ＯｍｅｐＧを含む。
【００６２】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド鋳型は、鋳型位置＋１に２´−デオキシチミジン残基を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド鋳型は、鋳型位置＋１に２´−デオキシシチジン残基を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド鋳型は、鋳型位置＋１に２´−デオキシアデノシン残基を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド鋳型は、鋳型位置＋１に２´−デオキシグアノシン残基を含む。
【００６３】
ＲＮＡ合成のための共転写キャッピング方法であって、ＲＮＡ転写物を生成するためのインビトロ転写反応条件下で、ポリヌクレオチド鋳型を（ａ）Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントであって、野生型ＲＮＡポリメラーゼと比較して、該ＲＮＡポリメラーゼバリアントが開始複合体から伸長複合体に移行するにつれてＲＮＡポリメラーゼバリアントの少なくとも１つのループ構造にヘリックス構造へのコンフォメーション変化を受けさせる少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、該Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント、（ｂ）ヌクレオシド三リン酸、及び（ｃ）配列ＧｐｐｐＡ２′ＯｍｅｐＧを含むトリヌクレオチドキャップと反応させることを含み、ポリヌクレオチド鋳型は、鋳型位置＋１に２´−デオキシチミジン残基を含む、該方法も本明細書で提供される。
【００６４】
いくつかの実施形態では、生成されたＲＮＡ転写物は、任意選択により未精製の形態で細胞に送達されたときに、検出可能なサイトカイン応答を刺激しない。
【００６５】
インビトロ転写（ＩＶＴ）ＲＮＡ及び薬学的に許容される賦形剤を含む組成物であって、ＩＶＴ後の精製なしでサイトカイン誘導ＲＮＡ混入物を実質的に含まない組成物が、本明細書でさらに提供される。
【００６６】
組成物は、いくつかの実施形態では、ＩＶＴ  ＲＮＡ及び薬学的に許容される賦形剤を含み、該組成物は５％未満のキャップされていないＲＮＡ種を有する。
【００６７】
いくつかの実施形態では、ＩＶＴ  ＲＮＡの８０％超、８５％超、または９０％超が機能性キャップを含む。いくつかの実施形態では、ＩＶＴ  ＲＮＡの９５％超が機能性キャップを含む。
【００６８】
いくつかの実施形態では、ＩＶＴ  ＲＮＡは化学修飾されていない。他の実施形態では、ＩＶＴ  ＲＮＡは化学的に修飾されている。
【００６９】
いくつかの実施形態では、ＩＶＴ  ＲＮＡの９５％超が一本鎖完全長転写物を含む。
【００７０】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、ＲＮＡ転写物を生成するためのインビトロ転写反応条件下で、ポリヌクレオチド鋳型を（ａ）Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントであって、野生型ＲＮＡポリメラーゼと比較して、該ＲＮＡポリメラーゼバリアントが開始複合体から伸長複合体に移行するにつれてＲＮＡポリメラーゼバリアントの少なくとも１つのループ構造にヘリックス構造へのコンフォメーション変化を受けさせる少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、該Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント、（ｂ）ヌクレオシド三リン酸、及び（ｃ）配列ＧｐｐｐＡ２′ＯｍｅｐＧを含むトリヌクレオチドキャップと反応させることを含むプロセスによって生成され、ポリヌクレオチド鋳型が、鋳型位置＋１に２´−デオキシチミジン残基を含む。
【００７１】
いくつかの態様では、本開示は、配列番号２９４〜３１３のアミノ酸配列を含むＴ７  ＲＮＡＰバリアントを提供し、ｘは任意のアミノ酸であり、ｎは任意の整数、例えば１〜５（例えば、１、２、３、４、または５）である。
【００７２】
いくつかの態様では、本開示は、ヌクレオシド三リン酸及び緩衝液の存在下において、ＲＮＡ転写物の生成をもたらす条件下で、ＤＮＡ鋳型を本開示のＲＮＡポリメラーゼバリアントと接触させることを含む、ＩＶＴ反応を行う方法を提供する。いくつかの実施形態では、生成されたＲＮＡは、任意選択により未精製形態で細胞に送達されたときに、野生型を使用して生成されたｄｓＲＮＡ転写物と比較して少なくとも５０％低いサイトカイン応答を刺激する。いくつかの実施形態では、ＩＶＴ反応により生成されたＲＮＡ転写物の３０％未満が３´不均一性を示す。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】野生型（ＷＴ）Ｔ７ポリメラーゼまたはＴ７ポリメラーゼバリアントＧ４７Ａ＊（Ｃ末端Ｇを有する）及びＳ４３Ａ＊（Ｃ末端Ｇを有する）を使用して生成されたヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）ｍＲＮＡの２６０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図２】左のパネルは、逆相（ＲＰ）精製ありまたは精製なしのＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼまたはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントＳ４３Ａ＊（Ｃ末端Ｇを有する）もしくはＧ４７Ａ＊（Ｃ末端Ｇを有する）の１つを使用して生成された化学修飾されていないｈＥＰＯ  ＲＮＡ転写物でトランスフェクトされたＢＪ線維芽細胞におけるＩＦＮβ応答を示すグラフを示す。右パネルは、トランスフェクトされた細胞におけるｈＥＰＯ発現を示すグラフを示す。
【図３】上パネルは、逆相（ＲＰ）精製ありまたは精製なしのＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼまたはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントＳ４３Ａ＊（Ｃ末端Ｇを有する）もしくはＧ４７Ａ＊（Ｃ末端Ｇを有する）の１つを使用して生成された化学修飾されたｈＥＰＯ  ＲＮＡ転写物（Ｎ１−メチルシュードウラシル（ｍ１ψ）修飾）でトランスフェクトされたＢＪ線維芽細胞におけるＩＦＮβ応答を示すグラフを示す。下パネルは、逆相（ＲＰ）精製ありまたは精製なしのＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼまたはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントＳ４３Ａ＊（Ｃ末端Ｇを有する）もしくはＧ４７Ａ＊（Ｃ末端Ｇを有する）の１つを使用して生成された化学修飾されたｈＥＰＯ  ＲＮＡ転写物（５−メトキシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ）修飾）でトランスフェクトされた細胞におけるＩＦＮβ応答を示すグラフを示す。
【図４】上パネル及び下パネルは、図３に使用したｈＥＰＯ  ＲＮＡ転写物でトランスフェクトされた細胞におけるｈＥＰＯ発現を示すグラフを示す。Ｎ１−メチルシュードウラシル（ｍ１ψ）修飾ｈＥＰＯ発現は上グラフに示され、５−メトキシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ）修飾ｈＥＰＯ発現は下グラフに示されている。
【図５】ＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼまたはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントＳ４３Ａ＊（Ｃ末端Ｇを有する）もしくはＧ４７Ａ＊（Ｃ末端Ｇを有する）を使用して生成された化学修飾されたｈＥＰＯ  ＲＮＡ転写物でトランスフェクトされた単球由来マクロファージにおけるＩＰ１０応答を示すグラフを示す。
【図６】上パネルは、ＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼまたはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントＳ４３Ａ＊（Ｃ末端Ｇを有する）もしくはＧ４７Ａ＊（Ｃ末端Ｇを有する）を使用して生成された化学修飾されたｈＥＰＯ  ＲＮＡ転写物（Ｎ１−メチルシュードウラシル（ｍ１ψ））でトランスフェクトされた単球由来マクロファージにおけるＩＰ１０応答を示すグラフを示す。下パネルは、ＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼまたはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントＳ４３Ａ＊（Ｃ末端Ｇを有する）もしくはＧ４７Ａ＊（Ｃ末端Ｇを有する）を使用して生成された、化学修飾されたｈＥＰＯ  ＲＮＡ転写物（５−メトキシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ））でトランスフェクトされた単球由来マクロファージにおけるＩＰ１０応答を示すグラフを示す。
【図７】ＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼまたはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントＳ４３Ａ＊（Ｃ末端Ｇを有する）もしくはＧ４７Ａ＊（Ｃ末端Ｇを有する）を使用してＩＶＴ反応により生成された１μｇの化学的に修飾されていないｈＥＰＯ  ＲＮＡ転写物（左）または５μｇの化学的に修飾されていないｈＥＰＯ  ＲＮＡ転写物を使用してｄｓＲＮＡ  ＥＬＩＳＡを用いて検出された混入した二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡの濃度を示すグラフを示す。
【図８】化学修飾されたｈＥＰＯ  ＲＮＡ転写物（Ｎ１−メチルシュードウラシル（ｍ１ψ）修飾、上；５−メトキシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ）修飾、下）を用いてｄｓＲＮＡ  ＥＬＩＳＡを使用して検出された混入ｄｓＲＮＡの濃度を示すグラフを示す。
【図９Ａ】ＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼまたはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントＳ４３Ａ  ＊（Ｃ末端Ｇを有する）もしくはＧ４７Ａ＊（Ｃ末端Ｇを有する）を使用して生成されたｈＥＰＯ  ＲＮＡ転写物のＲＮａｓｅ  Ｔ１テール消化から得られた質量クロマトグラム結果を示す。ＬＣＭＳ分析の結果を示す。
【図９Ｂ】ＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼまたはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントＳ４３Ａ  ＊（Ｃ末端Ｇを有する）もしくはＧ４７Ａ＊（Ｃ末端Ｇを有する）を使用して生成されたｈＥＰＯ  ＲＮＡ転写物のＲＮａｓｅ  Ｔ１テール消化から得られた質量クロマトグラム結果を示す。図９Ａの３´末端集団分布の定量化を示す。
【図１０】Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼが開始複合体から伸長複合体に移行するにつれて、Ｃヘリックス及びＣリンカーループ構造がコンフォメーションをＣヘリックス及びＣループヘリックスへと変化する概略図を示す。ＰＤＢ結晶構造１ＭＳＷ及び１ＱＬＮから生成され、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ［Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ  ＵＬＣ］で描写した。
【図１１Ａ】リガーゼの存在下でＤＮＡスプリント（ＤＮＡ  ｓｐｌｉｎｔ）を使用して、ＩＶＴによって生成された「レフトマー（ｌｅｆｔｍｅｒ）」ＲＮＡ転写物を「ライトマー（ｒｉｇｈｔｍｅｒ）」蛍光標識ポリＡシグナルにライゲーションする概略図を示す。ライゲーション部位における単一ヌクレオチドのオーバーハング（ｏｖｅｒｈａｎｇ）でさえ、ライゲーションを効率的になくす。
【図１１Ｂ】ＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ及びＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントＧ４７Ａ＊（Ｃ末端Ｇを有する）またはＳ４３Ａ＊（Ｃ末端Ｇを有する）を用いて生成されたライトマーのライゲーション効率を示すＰＡＧＥ−Ｄゲルである。
【図１２】３２Ｐ−ＧＴＰを使用してアボーティブ転写物を標識したまたは３２Ｐ−ＣＴＰを使用して逆相補体を標識した放射性ゲルを示す。ＩＶＴは、短いモデル転写物を使用して行った。このデータは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントＳ４３Ａ＊（Ｃ末端Ｇを有する）及びＧ４７Ａ＊（Ｃ末端Ｇを有する）が逆補体形成を減少させることを実証している。
【図１３】インビトロ転写によりキャップされたｍＲＮＡを生成する従来の方法の概略図である。
【図１４Ａ】野生型Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼまたは本開示のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント（Ｇ４７Ａ＊）のいずれかを使用した共転写キャッピングアッセイの結果を示すグラフである。ジヌクレオチドキャップ（ワクシニアキャップ１）またはトリヌクレオチドキャップ（ＧＡＧまたはＧｍＡＧ）の例を示す。共転写キャッピングアッセイをトリヌクレオチドキャップアッセイで使用した。
【図１４Ｂ】野生型Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼまたは本開示のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント（Ｇ４７Ａ＊）のいずれかを使用した共転写キャッピングアッセイの結果を示すグラフである。共転写キャッピングアッセイのｍＲＮＡ収量を示す。
【図１４Ｃ】野生型Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼまたは本開示のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント（Ｇ４７Ａ＊）のいずれかを使用した共転写キャッピングアッセイの結果を示すグラフである。共転写キャッピングアッセイで生成されたｍＲＮＡが高い完全性であることを示す。
【図１４Ｄ】野生型Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼまたは本開示のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント（Ｇ４７Ａ＊）のいずれかを使用した共転写キャッピングアッセイの結果を示すグラフである。ＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによって生成されたキャップされたｍＲＮＡが、ＢＪ線維芽細胞においてサイトカイン生成を誘導したが、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントＧ４７Ａ＊（Ｃ末端Ｇを有する）によって生成されたキャップされたｍＲＮＡは、驚くべきことに、サイトカイン生成を誘導しなかったことを示す。
【図１４Ｅ】野生型Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼまたは本開示のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント（Ｇ４７Ａ＊）のいずれかを使用した共転写キャッピングアッセイの結果を示すグラフである。ＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによって生成されたキャップされたｍＲＮＡは、ＢＪ線維芽細胞においてコードされたタンパク質（ｈＥＰＯ）を発現しなかったが、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントＧ４７Ａ＊（Ｃ末端Ｇを有する）によって生成されたキャップされたｍＲＮＡは、対照に匹敵するｈＥＰＯ発現レベルをもたらした。対照は、ＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによって生成され、かつワクシニアキャップ１でキャップされたｍＲＮＡである。
【図１５】共転写キャッピングアッセイで生成されたｍＲＮＡのＬＣ質量分析の結果を示す。結果は、予想外にも、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントＧ４７Ａ＊（Ｃ末端Ｇを有する）がＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼよりも均質な（ｃｌｅａｎｅｒ）ｍＲＮＡを生成したことを示している。トリヌクレオチドが組み込まれる比率は、両方の酵素で同等のようであった。
【図１６Ａ】共転写キャッピングアッセイにおいて生成されかつＧＡＧトリヌクレオチドでキャップされたｍＲＮＡまたはワクシニアキャップ１を使用した標準キャッピングアッセイにおいてキャップされたｍＲＮＡのサイトカイン応答を比較するグラフである。
【図１６Ｂ】共転写キャッピングアッセイにおいて生成されかつＧＡＧトリヌクレオチドでキャップされたｍＲＮＡまたはワクシニアキャップ１を使用した標準キャッピングアッセイにおいてキャップされたｍＲＮＡの発現を比較するグラフである。
【図１７】Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントＧ４７Ａ＊及びトリヌクレオチドキャップｍ７ＧｐｐｐＡ２′ＯｍｅｐＧを使用した本明細書に記載の共転写キャッピングアッセイを示す概略図である。
【図１８Ａ】５′ＡＴＰまたは５´ＧＴＰで始まるｍＲＮＡのキャッピング効率の比較を示す液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣＭＳ）結果である。無傷のｍＲＮＡの分析を示す。
【図１８Ｂ】５′ＡＴＰまたは５´ＧＴＰで始まるｍＲＮＡのキャッピング効率の比較を示す液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣＭＳ）結果である。ＲＮａｓｅ  Ｈによって切断型ｍＲＮＡの５´末端の分析を示す。
【図１９Ａ】３つのモデル構築物（ｈＥＰＯ、ルシフェラーゼ、及びｅＧＦＰ）のＰＣＲ断片鋳型から生成された１−メチルシュードウリジンで化学修飾されたｍＲＮＡの分析を示すグラフである。ＲＮａｓｅＴ１フィンガープリンティングアッセイによって分析したところ、ｍＲＮＡが同じ配列を有することを示す。
【図１９Ｂ】３つのモデル構築物（ｈＥＰＯ、ルシフェラーゼ、及びｅＧＦＰ）のＰＣＲ断片鋳型から生成された１−メチルシュードウリジンで化学修飾されたｍＲＮＡの分析を示すグラフである。ｍＲＮＡが高度の完全性を有することを示す。
【図１９Ｃ】３つのモデル構築物（ｈＥＰＯ、ルシフェラーゼ、及びｅＧＦＰ）のＰＣＲ断片鋳型から生成された１−メチルシュードウリジンで化学修飾されたｍＲＮＡの分析を示すグラフである。ｍＲＮＡがＢＪ線維芽細胞においてサイトカイン応答を誘導しなかったことを示す。
【図２０Ａ】３つのモデル構築物（ｈＥＰＯ、Ｌｕｃ、及びｅＧＦＰ）のプラスミド鋳型から生成された、１−メチルシュードウリジンで化学的に修飾されたｍＲＮＡの分析を示すグラフである。ｈＥＰＯプラスミドを鋳型として使用した共転写キャッピングアッセイにおけるＮＴＰ消費が示されている。
【図２０Ｂ】３つのモデル構築物（ｈＥＰＯ、Ｌｕｃ、及びｅＧＦＰ）のプラスミド鋳型から生成された、１−メチルシュードウリジンで化学的に修飾されたｍＲＮＡの分析を示すグラフである。ｅＧＦＰプラスミドを鋳型として使用した共転写キャッピングアッセイにおけるＮＴＰ消費が示されている。
【図２０Ｃ】３つのモデル構築物（ｈＥＰＯ、Ｌｕｃ、及びｅＧＦＰ）のプラスミド鋳型から生成された、１−メチルシュードウリジンで化学的に修飾されたｍＲＮＡの分析を示すグラフである。ｍＲＮＡ産物が高い完全性を有していることを示す。
【図２０Ｄ】３つのモデル構築物（ｈＥＰＯ、Ｌｕｃ、及びｅＧＦＰ）のプラスミド鋳型から生成された、１−メチルシュードウリジンで化学的に修飾されたｍＲＮＡの分析を示すグラフである。ｍＲＮＡ産物のサイトカイン応答を示す。
【図２０Ｅ】３つのモデル構築物（ｈＥＰＯ、Ｌｕｃ、及びｅＧＦＰ）のプラスミド鋳型から生成された、１−メチルシュードウリジンで化学的に修飾されたｍＲＮＡの分析を示すグラフである。ＢＪ線維芽細胞におけるｈＥＰＯをコードするｍＲＮＡの発現を示す。
【図２０Ｆ】３つのモデル構築物（ｈＥＰＯ、Ｌｕｃ、及びｅＧＦＰ）のプラスミド鋳型から生成された、１−メチルシュードウリジンで化学的に修飾されたｍＲＮＡの分析を示すグラフである。ＢＪ線維芽細胞におけるルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）をコードするｍＲＮＡの発現を示す。
【図２０Ｇ】３つのモデル構築物（ｈＥＰＯ、Ｌｕｃ、及びｅＧＦＰ）のプラスミド鋳型から生成された、１−メチルシュードウリジンで化学的に修飾されたｍＲＮＡの分析を示すグラフである。ＢＪ線維芽細胞におけるｅＧＦＰをコードするｍＲＮＡの発現を示す。
【図２１】Ｃ末端グリシン（Ｇ）を含むＴ７  ＲＮＡＰバリアントＧ４７Ａ＊を使用して生成されたｍＲＮＡ転写物の８５％（例えば、約９０％）超が３´末端にヒドロキシル基を有することを示すグラフである。
【図２２】ＷＴまたはＧ４７Ａ  Ｔ７  ＲＮＡＰバリアント（そのうちのいくつかはＣ末端に追加のアミノ酸（例えば、１つもしくは２つのグリシン、または２つのアラニン）を含むＩＶＴ反応からの非修飾ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ生成を示す。
【図２３】示されているＷＴ、Ｇ４７Ａ、またはＳ４３Ａ／Ｇ４７Ａ  Ｔ７  ＲＮＡＰバリアント（そのうちのいくつかはＣ末端に追加のアミノ酸（例えば、１つもしくは２つのグリシン、または２つのアラニン）を有する）を含むＩＶＴ反応からの１−メチル−シュードウリジン修飾ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ生成を示す。
【図２４Ａ】示されているＷＴ、Ｇ４７Ａ、またはＳ４３Ａ／Ｇ４７Ａ  Ｔ７  ＲＮＡＰバリアント（そのうちのいくつかはＣ末端に追加のアミノ酸（例えば、１つもしくは２つのグリシン、または２つのアラニン）を有する）を使用して生成されたｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ転写物のＲＮＡｓｅ  Ｔ１テール消化物の結果を示す。等モル濃度のＮＴＰを有するＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡＰ（ＷＴ  ＥＱ）、過剰なＧＴＰ及びＡＴＰを含むＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡＰ（ＷＴアルファ）、または追加のＣ末端グリシンを有し、等モル濃度のＮＴＰを有するＧ４７Ａ＊  Ｔ７  ＲＮＡＰ（Ｇ４７Ａ＊  ＥＱ）を使用したＩＶＴ反応から生成されたｈＥＰＯ  ｍＲＮＡのＬＣＭＳ分析の結果を示す。
【図２４Ｂ】示されているＷＴ、Ｇ４７Ａ、またはＳ４３Ａ／Ｇ４７Ａ  Ｔ７  ＲＮＡＰバリアント（そのうちのいくつかはＣ末端に追加のアミノ酸（例えば、１つもしくは２つのグリシン、または２つのアラニン）を有する）を使用して生成されたｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ転写物のＲＮＡｓｅ  Ｔ１テール消化物の結果を示す。図２４Ａの３´末端集団分布の定量化を示す。
【図２４Ｃ】示されているＷＴ、Ｇ４７Ａ、またはＳ４３Ａ／Ｇ４７Ａ  Ｔ７  ＲＮＡＰバリアント（そのうちのいくつかはＣ末端に追加のアミノ酸（例えば、１つもしくは２つのグリシン、または２つのアラニン）を有する）を使用して生成されたｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ転写物のＲＮＡｓｅ  Ｔ１テール消化物の結果を示す。非修飾ｍＲＮＡを使用したＩＶＴ反応において生成された均質な３´末端集団のパーセンテージを示す。
【図２４Ｄ】示されているＷＴ、Ｇ４７Ａ、またはＳ４３Ａ／Ｇ４７Ａ  Ｔ７  ＲＮＡＰバリアント（そのうちのいくつかはＣ末端に追加のアミノ酸（例えば、１つもしくは２つのグリシン、または２つのアラニン）を有する）を使用して生成されたｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ転写物のＲＮＡｓｅ  Ｔ１テール消化物の結果を示す。１−メチル−シュードウリジン修飾ｍＲＮＡを使用したＩＶＴ反応において生成された均質な３´末端集団のパーセンテージを示す。
【図２５Ａ】示されているＷＴ、Ｇ４７Ａ、またはＳ４３Ａ／Ｇ４７Ａ  Ｔ７  ＲＮＡＰバリアント（そのうちのいくつかはＣ末端に置換を有する）を含むＩＶＴ反応から生成された非修飾ｍＲＮＡに対するＢＪ線維芽細胞のサイトカイン応答を比較するグラフを示す。
【図２５Ｂ】示されているＷＴ、Ｇ４７Ａ、またはＳ４３Ａ／Ｇ４７Ａ  Ｔ７  ＲＮＡＰバリアント（そのうちのいくつかはＣ末端に置換を有する）を含むＩＶＴ反応から生成された１−メチル−シュードウリジン修飾ｍＲＮＡに対するＢＪ線維芽細胞のサイトカイン応答を比較するグラフを示す。
【図２６Ａ】示されているＷＴまたはＧ４７Ａ  Ｔ７  ＲＮＡＰバリアント（そのうちのいくつかはＣ末端に追加のアミノ酸を有する）を含むＩＶＴ反応から生成された放射標識ｍＲＮＡを示す。ＩＶＴ  ｍＲＮＡ産物は、ポリアクリルアミド変性ゲル上でサイズ別に分離される。非修飾ｍＲＮＡまたは１−メチル−シュードウリジン修飾ｍＲＮＡのいずれかが３２Ｐ−ＣＴＰで放射標識されている。
【図２６Ｂ】示されているＷＴまたはＧ４７Ａ  Ｔ７  ＲＮＡＰバリアント（そのうちのいくつかはＣ末端に追加のアミノ酸を有する）を含むＩＶＴ反応から生成された放射標識ｍＲＮＡを示す。ＩＶＴ  ｍＲＮＡ産物は、ポリアクリルアミド変性ゲル上でサイズ別に分離される。逆補体ｍＲＮＡは３２Ｐ−ＣＴＰで放射標識されている。
【図２７Ａ】ホタルルシフェラーゼ（ｆｆＬｕｃ）をコードするトリヌクレオチドキャップされたＧ４７Ａ＊  ｍＲＮＡが、１日目に、ｍＲＮＡ対照と同様のインビボでのＩＰ−１０血清サイトカインレベルを誘導することを実証するデータのグラフを示す。
【図２７Ｂ】ホタルルシフェラーゼ（ｆｆＬｕｃ）をコードするトリヌクレオチドキャップされたＧ４７Ａ＊  ｍＲＮＡが、２９日目に、ｍＲＮＡ対照と同様のインビボでのＩＰ−１０血清サイトカインレベルを誘導することを実証するデータのグラフを示す。
【図２８Ａ】ｆｆＬｕｃをコードするトリヌクレオチドキャップされたＧ４７Ａ＊  ｍＲＮＡが、ＢＪ線維芽細胞（ＢＪＦ）において、ｍＲＮＡ対照と同様のインビトロでのベースラインサイトカインレベルを誘導することを示すデータのグラフを示す。
【図２８Ｂ】ｆｆＬｕｃをコードするトリヌクレオチドキャップされたＧ４７Ａ＊  ｍＲＮＡが、単球由来マクロファージ（ＭＤＭ）において、ｍＲＮＡ対照と同様のインビトロでのベースラインサイトカインレベルを誘導することを示すデータのグラフを示す。
【図２９】ｆｆＬｕｃをコードするトリヌクレオチドキャップされたＧ４７Ａ＊  ｍＲＮＡが、週６回の投与後に、インビボで高発現を維持することを実証するデータのグラフを示す。
【図３０】ｆｆＬｕｃをコードするトリヌクレオチドキャップされたＧ４７Ａ＊  ｍＲＮＡが、週６回の投与後に、低い抗ＰＥＧ  ＩｇＭレベルを誘導することを実証するデータのグラフを示す。
【図３１】ｆｆＬｕｃをコードするトリヌクレオチドキャップされたＧ４７Ａ＊  ｍＲＮＡが、ｍＲＮＡ対照と同様の低いＢ細胞活性化を示すことを実証するデータのグラフを示す。
【図３２Ａ】ヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）をコードするトリヌクレオチドキャップされたＧ４７Ａ＊  ｍＲＮＡが、１日目に、ｍＲＮＡ対照と同様のインビボでのＩＰ−１０血清サイトカインレベルを誘導することを示すデータのグラフを示す。
【図３２Ｂ】ヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）をコードするトリヌクレオチドキャップされたＧ４７Ａ＊  ｍＲＮＡが、２２日目に、ｍＲＮＡ対照と同様のインビボでのＩＰ−１０血清サイトカインレベルを誘導することを示すデータのグラフを示す。
【図３３Ａ】ｈＥＰＯをコードするトリヌクレオチドキャップされたＧ４７Ａ＊  ｍＲＮＡが、ＢＪ線維芽細胞（ＢＪＦ）において、ｍＲＮＡ対照と同様のインビトロでのベースラインサイトカインレベルを誘導することを示すデータのグラフを示す。
【図３３Ｂ】は、ｈＥＰＯをコードするトリヌクレオチドキャップされたＧ４７Ａ＊  ｍＲＮＡが、単球由来マクロファージ（ＭＤＭ）において、ｍＲＮＡ対照と同様のインビトロでのベースラインサイトカインレベルを誘導することを示すデータのグラフを示す。
【図３４】ｈＥＰＯをコードするトリヌクレオチドキャップされたＧ４７Ａ＊  ｍＲＮＡが、週に６回の投与後に、インビボで高い発現を維持することを実証するデータのグラフを示す。
【図３５】ｈＥＰＯをコードするトリヌクレオチドキャップされたＧ４７Ａ＊  ｍＲＮＡが、週６回の投与後に、低い抗ＰＥＧ  ＩｇＭレベルを誘導することを実証するデータのグラフを示す。
【図３６】ｈＥＰＯをコードするトリヌクレオチドキャップされたＧ４７Ａ＊  ｍＲＮＡが、ｍＲＮＡ対照と同様の低いＢ細胞活性化を示すことを実証するデータのグラフを示す。
【図３７Ａ】Ｇ４７Ａ＊  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントがインデル頻度に影響しないことを示す。
【図３７Ｂ】Ｇ４７Ａ＊  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントが点変異頻度に影響しないことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００７４】
本開示は、例えば、インビトロ転写（ＩＶＴ）反応中に生成されたランオン転写物及び／または二本鎖混入物を減少させながら、転写効率及び３´均一性を増加させる、ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）バリアントを提供する。いくつかの実施形態では、単一のアミノ酸置換を含むこれらのＲＮＡＰバリアントは、開始複合体から伸長複合体へのＲＮＡＰコンフォメーション転移を促進し、それにより転写開始段階に関連する問題の多くを軽減する。
【００７５】
ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ）のＮ末端Ｃヘリックス及び／またはＣリンカー構造（複数可）の修飾（複数可）が、伸長複合体へのポリメラーゼのコンフォメーション平衡を推進し、ＤＮＡ鋳型プロモーターの放出及び高度に進行性の伸長段階の開始を促進することを示す予測しなかった実験結果が本明細書で提供される。驚くべきことに、ＩＶＴ反応における本明細書で提供されるポリメラーゼバリアントの使用は、生成された転写物間の３´不均一性を低減し、二本鎖混入物の生成も低減（または排除）する。さらに、結果は、ポリメラーゼバリアントを使用して生成された転写物の純度及び発現レベルが、野生型ポリメラーゼを使用して生成された転写物のものに匹敵することを示している。
【００７６】
したがって、本開示のＲＮＡポリメラーゼバリアントの使用は、ＩＶＴ反応生成物に関連する問題の多くを減らす。野生型Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）は、産業界及び学界の両方で一般的に使用されており、その活性のうちのいくつかは、得られるＲＮＡ転写物の純度を著しく損なう。特に、この野生型Ｔ７  ＲＮＡＰ酵素を使用すると、ＲＮＡ転写物の３´末端への、ヌクレオチドの鋳型のない（ｎｏｎ−ｔｅｍｐｌａｔｅｄ）付加がもたらされる。例えば、野生型Ｔ７  ＲＮＡＰは、核酸塩基の同一性にとってほとんど好ましくないと思われる、少なくとも１つ、しばしば２つ以上の鋳型なしのヌクレオチドを３´末端に挿入する。驚くべきことに、本明細書で提供されるＴ７  ＲＮＡＰバリアントは３´不均一性の発生を低減させる。いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡポリメラーゼバリアントを使用してＩＶＴによって生成されたＲＮＡ転写物の３０％未満が３´不均一性を示す。いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡポリメラーゼバリアントを使用してＩＶＴによって生成されたＲＮＡ転写物の２０％未満（例えば、１５％、１０％、または５％未満）が３´不均一性を示す。いくつかの実施形態では、ＩＶＴによって生成されたＲＮＡ転写物の１〜２０％、１〜１５％、１〜１０％、または１〜５％が３´不均一性を示す。いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡポリメラーゼバリアントを使用してＩＶＴによって生成されたＲＮＡ転写物の１％未満が３´不均一性を示す。
【００７７】
したがって、例えばＩＶＴ反応における、本開示のＲＮＡポリメラーゼバリアントの使用は、「より均質な」ＲＮＡ転写物（３´末端における不均一性が低減し／均一性が増大したＲＮＡ転写物の集団）の生成をもたらす。いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡポリメラーゼバリアントを使用して生成されたＲＮＡ転写物の少なくとも７０％が３´均一性を示す。いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡポリメラーゼバリアントを使用して生成されたＲＮＡ転写物の少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％が３´均一性を示す。いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡポリメラーゼバリアントを使用して生成されたＲＮＡ転写物の少なくとも９０％が３´均一性を示す。いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡポリメラーゼバリアントを使用して生成されたＲＮＡ転写物の少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％が３´均一性を示す。
【００７８】
また、本明細書において、驚くべきことは、アミノ酸置換（例えば、配列番号１のＳ４３Ａ及び／またはＧ４７Ａ）またはＣ末端付加（例えば、１つ以上のアミノ酸が付加されたＷＴ、Ｓ４３Ａ＊、及び／またはＧ４７Ａ＊）Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントを使用して生成されたＲＮＡ転写物は、任意選択により未精製の形態で（例えば、逆相クロマトグラフィーにより精製されずに）細胞に送達されたときに、野生型ＲＮＡポリメラーゼを使用して生成されたＲＮＡに比べて低いサイトカイン応答を刺激する示す結果であった。いくつかの実施形態では、本開示のＴ７  ＲＮＡ変異型ポリメラーゼを使用して生成されたＲＮＡ転写物を受け取った細胞からの検出可能なサイトカイン応答はない。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼバリアント（例えば、Ｔ７  ＲＮＡＰ  Ｓ４３Ａ＊バリアント及び／またはＴ７  ＲＮＡＰ  Ｇ４７Ａ＊バリアント）を使用して生成されたＲＮＡは、野生型ＲＮＡポリメラーゼを使用して生成されたＲＮＡと比較して、少なくとも５０％（例えば、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％）低いサイトカイン応答を刺激する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼバリアント（例えば、Ｔ７  ＲＮＡＰ  Ｓ４３Ａ＊バリアント及び／またはＴ７  ＲＮＡＰ  Ｇ４７Ａ＊バリアント）を使用して生成されたＲＮＡは、野生型ＲＮＡポリメラーゼを使用して生成されたＲＮＡと比較して、５０〜６０％、５０〜７０％、５０〜８０％、５０〜９０％、５０〜１００％、６０〜７０％、６０〜８０％、６０〜９０％、６０〜１００％、７０〜８０％、７０〜９０％、７０〜１００％、８０〜９０％、８０〜１００％、または９０〜１００％低いサイトカイン応答を刺激する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼバリアント（例えば、Ｔ７  ＲＮＡＰ  Ｓ４３Ａ＊バリアント及び／またはＴ７  ＲＮＡＰ  Ｇ４７Ａ＊バリアント）を使用して生成されたＲＮＡは、野生型ＲＮＡポリメラーゼを使用して生成されたＲＮＡと比較して、少なくとも２倍、３倍、４倍、または５倍低いサイトカイン応答を刺激する。いくつかの実施形態では、サイトカイン応答を試験するために使用される細胞は、ヒト線維芽細胞（例えば、ＢＪ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２５２２（商標））細胞）である。いくつかの実施形態では、サイトカイン応答を試験するために使用される細胞は、単球由来マクロファージ（ＭＤＭ）である。
【００７９】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼバリアントを使用して生成されたｄｓＲＮＡ転写物の濃度は、野生型ポリメラーゼを使用して生成されたｄｓＲＮＡ転写産物と比較して、少なくとも５０％（例えば、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％）低い。いくつかの実施形態では、生成されたｄｓＲＮＡ転写物の濃度は、野生型ポリメラーゼを使用して生成されたｄｓＲＮＡ転写物と比較して、５０〜６０％、５０〜７０％、５０〜８０％、５０〜９０％、５０〜１００％、６０〜７０％、６０〜８０％、６０〜９０％、６０〜１００％、７０〜８０％、７０〜９０％、７０〜１００％、８０〜９０％、８０〜１００％、または９０〜１００％低い。いくつかの実施形態では、生成されたｄｓＲＮＡ転写物の濃度は、野生型ポリメラーゼを使用して生成されたｄｓＲＮＡ転写物と比較して、少なくとも２倍、３倍、４倍、または５倍低い。
【００８０】
本開示のＲＮＡポリメラーゼバリアントの使用により、二本鎖混入物の生成及びより少ないランオン転写物の生成が予想外にもたらされた。
【００８１】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼバリアントを使用して例えばＩＶＴによって生成されたＲＮＡ転写物の５０％未満（例えば、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満）は、二本鎖混入物である。いくつかの実施形態において、生成されたＲＮＡ転写産物の１〜５０％、１〜４０％、１〜３０％、１〜２０％、１〜１０％、１〜５％、５〜５０％、５〜４０％、５〜３０％、５〜２０％、５〜１０％、１０〜５０％、１０〜４０％、１０〜３０％、または１０〜２０％は、二本鎖混入物である。
【００８２】
いくつかの実施形態において、ＲＮＡポリメラーゼバリアントを使用して生成されたＲＮＡ転写産物の５０％未満（例えば、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満）は、ランオンＲＮＡ転写産物である。いくつかの実施形態では、生成されたＲＮＡ転写物の１〜５０％、１〜４０％、１〜３０％、１〜２０％、１〜１０％、１〜５％、５〜５０％、５〜４０％、５〜３０％、５〜２０％、５〜１０％、１０〜５０％、１０〜４０％、１０〜３０％、または１０〜２０％は、ランオンＲＮＡ転写物である。
【００８３】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼバリアントを使用して生成された全長ＲＮＡ転写物の量は、ＤＮＡ鋳型の量よりも少なくとも１５倍大きい。例えば、生成された全長ＲＮＡ転写物の量は、ＤＮＡ鋳型の量よりも少なくとも２０倍、３０倍、４０倍、４５倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、または１００倍大きいものであり得る。いくつかの実施形態では、生成された全長ＲＮＡ転写物の量は、ＤＮＡ鋳型の量よりも１５〜１００倍、１５〜９０倍、１５〜８０倍、１５〜７０倍、１５〜６０倍、１５〜５０倍、１５〜４０倍、１５〜３０、１５〜２０倍、２０〜１００倍、２０〜９０倍、２０〜８０倍、２０〜７０倍、２０〜６０倍、２０〜５０倍、２０〜４０倍、または２０〜３０倍大きいものであり得る。いくつかの実施形態において、生成された全長ＲＮＡ転写物の量は、ＤＮＡ鋳型の量よりも２倍、３倍、４倍、または５倍大きい。
【００８４】
いくつかの実施形態では、二本鎖混入物：ＲＮＡポリメラーゼバリアントを使用して生成された完全長ＲＮＡ転写物の比は、１：１未満である。たとえば、二本鎖混入物：生成された完全長ＲＮＡ転写物の比率は、０．９：１、０．８：１、０．７：１、０．６：１、０．５：１、０．４：１、０．３：１、０．２：１、または０．１：１である。
【００８５】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼバリアントを使用して生成されたＲＮＡ転写物は、ＤＮＡ鋳型と比較して、１００ヌクレオチドあたり１未満の変異を有する。例えば、生成されたＲＮＡ転写物は、ＤＮＡ鋳型と比較して、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００ヌクレオチドあたり１未満の変異を有し得る。
【００８６】
ＲＮＡポリメラーゼ
ＲＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ）は、成長中のＲＮＡ鎖の３´末端へのリボヌクレオチドの連続的な付加を触媒する酵素であり（５´→３´方向のＲＮＡの転写）、ヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）を酵素の基質として作用し、ヌクレオチドの配列はＤＮＡ鋳型によって特定される。転写は、塩基の相補的対合に依存する。二重ヘリックスの２本の鎖は局所的に分離し、分離した鎖の１つは鋳型（ＤＮＡ鋳型）として機能する。次いで、ＲＮＡポリメラーゼは、鋳型中の相補的な塩基によって、ＤＮＡ鋳型上の遊離ヌクレオチドのアライメントを触媒する。したがって、ポリメラーゼが成長中のＲＮＡ鎖の３´末端へのリボヌクレオチドの連続的な追加を触媒する場合、ＲＮＡポリメラーゼはＲＮＡポリメラーゼ活性を有するとみなす。
【００８７】
Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７  ＲＮＡＰ）は、バクテリオファージＴ７のゲノムによりコードされる９９ｋＤａのＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであり、Ｔ７ファージプロモーターに非常に特異的である。Ｔ７  ＲＮＡＰの構造研究により、Ｎ末端ドメインのコンフォメーションが転写の開始段階と伸長段階との間で大きく変化することが示されている。Ｎ末端ドメインは、Ｃヘリックスサブドメイン及びプロモーター結合ドメイン（サブドメインＨで分離された２つのセグメントを含む）を含む。プロモーター結合ドメイン及び結合したプロモーターは、８ｎｔＲＮＡ転写物の合成の際に約４５度回転し、活性部位が拡張して成長中のヘテロ二本鎖を収容しながら、プロモーターの接触の維持が可能となる。Ｃヘリックスサブドメインは、その伸長コンフォメーションに向かって緩やかに移動するのに対し、サブドメインＨは、伸長段階の位置でなく、開始段階の位置のままであり、７０オングストローム超離れる。Ｔ７  ＲＮＡＰ開始及び伸長複合体の構造の比較により、Ｎ末端２６７残基（Ｎ末端ドメイン）内の大きなコンフォメーション変化及びＲＮＡＰの残部のわずかな変化が明らかになった。プロモーター結合ドメインの剛体回転ならびに末端Ｃヘリックス（残基２８〜７１）及びＨ（残基１５１〜１９０）サブドメインのリフォールディングは、プロモーター結合部位の廃棄、活性部位の拡張、及びＲＮＡ転写物の出口トンネルの作出に関与している。Ｎ末端ドメイン内の構造変化は、伸長複合体の安定性の増加及び加工性の主な要因である（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｄｕｒｎｉａｋ，Ｋ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２２（５９０１）：  ５５３−５５７，２００８，を参照のこと）。
【００８８】
いくつかの態様では、ＲＮＡＰ開始複合体からＲＮＡＰ伸長複合体へのコンフォメーション変化を促進するＲＮＡポリメラーゼバリアント（例えば、Ｔ７  ＲＮＡＰバリアント）が本明細書で提供される。ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、ＲＮＡポリメラーゼ活性及び対応する野生型ＲＮＡポリメラーゼと比較して少なくとも１つの置換を有する酵素である。上に示したように、ＲＮＡポリメラーゼは、該ポリメラーゼが成長中のＲＮＡ鎖の３´末端へのリボヌクレオチドの連続的な付加を触媒する場合、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有しているとみなされる。例えば、位置Ｓ４３（例えば、Ｓ４３Ａ）またはＧ４７（例えば、Ｇ４７Ａ）にアミノ酸置換を有する配列番号１のアミノ酸配列を含み、ＲＮＡポリメラーゼ活性を維持する酵素は、野生型Ｔ７  ＲＮＡＰ（配列番号１）のＴ７  ＲＮＡＰバリアントとみなされる。
【００８９】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、野生型ＲＮＡポリメラーゼと比較して、ＲＮＡポリメラーゼバリアントが開始複合体から伸長複合体に移行するにつれて、ＲＮＡポリメラーゼバリアントの少なくとも１つの三次元ループ構造にヘリックス構造へのコンフォメーション変化を受けさせる少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。したがって、いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸修飾は、野生型アミノ酸と比較して高ヘリックス性向を有する。
【００９０】
ループ構造の例には、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ開始複合体（ＩＣ）コンフォメーションのＣヘリックス構造中のアミノ酸（ａａ）４２〜４７（例えば、配列番号１のａａ２８〜７１）及びＣリンカー構造中のアミノ酸２５７〜２６２（例えば、配列番号１のアミノ酸２５８〜２６６）が含まれるが、これらに限定されない。
【００９１】
Ｃ末端に少なくとも１つの追加のアミノ酸を含むＲＮＡポリメラーゼバリアント（例えば、Ｔ７  ＲＮＡＰバリアント）も本明細書で提供される。少なくとも１つの追加のアミノ酸は、いくつかの実施形態では、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリンから選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの追加のアミノ酸は、極性アミノ酸である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの追加のアミノ酸は、非極性アミノ酸である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの追加のアミノ酸は、グリシンである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの追加のアミノ酸は、アラニンである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの追加のアミノ酸は、セリンである。
【００９２】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼのＣ末端は、以下のコンセンサス配列：ＦＡＦＡＸｎ（配列番号１７１）を含み、ｘは任意のアミノ酸であり、ｎは任意の整数、例えば１〜５（例えば、１、２、３、４、または５）である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼのＣ末端は、以下のコンセンサス配列：ＦＡＦＡＧｎ（配列番号３３０）を含み、ｎは任意の整数、例えば１〜５である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼのＣ末端は、以下のコンセンサス配列：ＦＡＦＡＡｎ（配列番号３３１）を含み、ｎは任意の整数、例えば１〜５である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼのＣ末端は、以下のコンセンサス配列：ＦＡＦＡＲｎ（配列番号３３２）を含み、ｎは任意の整数、例えば１〜５である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼのＣ末端は、以下のコンセンサス配列：ＦＡＦＡＮｎ（配列番号３３３）を含み、ｎは任意の整数、例えば１〜５である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼのＣ末端は、以下のコンセンサス配列：ＦＡＦＡＤｎ（配列番号３３４）を含み、ｎは任意の整数、例えば１〜５である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼのＣ末端は、以下のコンセンサス配列：ＦＡＦＡＣｎ（配列番号３３５）を含み、ｎは任意の整数、例えば１〜５である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼのＣ末端は、以下のコンセンサス配列：ＦＡＦＡＥｎ（配列番号３３６）を含み、ｎは任意の整数、例えば１〜５である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼのＣ末端は、以下のコンセンサス配列：ＦＡＦＡＱｎ（配列番号３０２）を含み、ｎは任意の整数、例えば１〜５である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼのＣ末端は、以下のコンセンサス配列：ＦＡＦＡＨｎ（配列番号３０３）を含み、ｎは任意の整数、例えば１〜５である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼのＣ末端は、以下のコンセンサス配列：ＦＡＦＡＩｎ（配列番号３０４）を含み、ｎは任意の整数、例えば１〜５である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼのＣ末端は、以下のコンセンサス配列：ＦＡＦＡＬｎ（配列番号３０５）を含み、ｎは任意の整数、例えば１〜５である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼのＣ末端は、以下のコンセンサス配列：ＦＡＦＡＫｎ（配列番号３０６）を含み、ｎは任意の整数、例えば１〜５である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼのＣ末端は、以下のコンセンサス配列：ＦＡＦＡＭｎ（配列番号３０７）を含み、ｎは任意の整数、例えば１〜５である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼのＣ末端は、以下のコンセンサス配列：ＦＡＦＡＦｎ（配列番号３０８）を含み、ｎは任意の整数、例えば１〜５である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼのＣ末端は、以下のコンセンサス配列：ＦＡＦＡＰｎ（配列番号３０９）を含み、ｎは任意の整数、例えば１〜５である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼのＣ末端は、以下のコンセンサス配列：ＦＡＦＡＳｎ（配列番号３１０）を含み、ｎは任意の整数、例えば１〜５である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼのＣ末端は、以下のコンセンサス配列：ＦＡＦＡＴｎ（配列番号３１１）を含み、ｎは任意の整数、例えば１〜５である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼのＣ末端は、以下のコンセンサス配列：ＦＡＦＡＷｎ（配列番号３１２）を含み、ｎは任意の整数、例えば１〜５である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼのＣ末端は、以下のコンセンサス配列：ＦＡＦＡＹｎ（配列番号３１３）を含み、ｎは任意の整数、例えば１〜５である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼのＣ末端は、以下のコンセンサス配列：ＦＡＦＡＶｎ（配列番号３１４）を含み、ｎは任意の整数、例えば１〜５である。
【００９３】
いくつかの実施形態では、Ｃ末端モチーフ（ＦＡＦＡ（配列番号１７２）またはＦＡＦＡＸｎ（配列番号１７１））は、野生型Ｔ７  ＲＮＡＰ（例えば、配列番号１）と比較して、８８０位、８８１位、８８２位、または８８３位のうちの１つ以上にアミノ酸置換を含む。したがって、本開示は、様々なＣ末端Ｆ８８０Ａ８８１Ｆ８８２Ａ８８３（配列番号１７２）モチーフを含み、８８０位、８８１位、８８２位、または８８３位のうちの１つ以上のアミノ酸が、野生型Ｔ７  ＲＮＡＰ（例えば、配列番号１）と比較して、追加のＣ末端アミノ酸（Ｘｎ）の有無にかかわらず、少なくとも１つのアミノ酸置換が含まれるように修飾されている。
【００９４】
アミノ酸置換
本開示のＲＮＡポリメラーゼバリアントは、ＷＴ  ＲＮＡポリメラーゼと比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有するＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼに関して、４３位のセリンは「野生型アミノ酸」とみなされ、４３位のセリンのアラニンへの置換は高いヘリックス性向を有する「アミノ酸置換」とみなされる。
【００９５】
平均的な球状タンパク質は、３０％の、最も一般的な種類の二次構造であるαヘリックスを含む。いくつかのアミノ酸は、他のアミノ酸よりもαヘリックスにおいてより頻繁に存在し、この傾向はヘリックス性向として知られている。例えば、Ｐａｃｅ，Ｎ．Ｃ．  ａｎｄ  Ｓｃｈｏｌｔｚ，Ｊ．Ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，７５：４２２−４２７（１９９８）を参照のこと。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換は、野生型アミノ酸と比較して高いヘリックス性向を有する。一般に、高ヘリックス性向のアミノ酸置換は、ポリメラーゼ配座異性体の集団を伸長複合体へと熱力学的に偏らせるように選択される。相対ΔΔＧｓ（自由エネルギー）は、公に利用可能なソフトウェア（例えば、ワシントン大学のＲｏｓｅｔｔａ  とシュレディンガーのＭａｅｓｔｒｏ）を使用して、ＩＣ及び伸長複合体（ＥＣ）構造の置換について計算される。次いで、置換は、計算ならびに例えばアミノ酸ヘリックス性向及び／またはポリペプチド骨格ｐｈｉ−ｐｓｉ適合性を含む追加の知識に基づいて選択される。
【００９６】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、ＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有するＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ）と比較して少なくとも１つ（１つ以上）のアミノ酸置換を含むＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、高ヘリックス性向アミノ酸置換である。高ヘリックス性向アミノ酸の例には、アラニン、イソロイシン、ロイシン、アルギニン、メチオニン、リジン、グルタミン、及び／またはグルタミン酸が含まれる。
【００９７】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、Ｃ末端に少なくとも１つの追加のアミノ酸を含むＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント（例えば、配列番号９９、配列番号１００、配列番号２９４、配列番号２９５、もしくは配列番号２９６、または配列番号９９、配列番号１００、配列番号２９４、配列番号２９５、もしくは配列番号２９６と９０％〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列）である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、ＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼと比較して、Ｃ末端に少なくとも１つの追加のアミノ酸及びアミノ酸置換を含むＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、高ヘリックス性向アミノ酸置換である。
【００９８】
本明細書では、コンフォメーション平衡を熱力学的にＥＣへと偏らせる／支持する高いまたはより高いヘリックス性向のアミノ酸置換を特定するために使用し得る２つのアプローチが提供される。どちらのアプローチでも、（構造のレビュー、文献検索に基づいて）プロモーターの結合または触媒に直接関与する任意の位置へのアミノ酸置換を避けるように注意が払われる。方法Ａでは、専用のソフトウェアを使用して、ＥＣ及びＩＣの変異（ΔΔＧｍｕｔ）によるタンパク質折りたたみの自由エネルギーの変化を算定する。望ましい配列位置でのすべての可能なアミノ酸置換は、この方法によって評価される。望ましいアミノ酸置換（すなわち、ＩＣよりもＥＣを好む置換）は、ΔΔＧｍｕｔの差
【数１】
2020532963.tif 000214
が負であるアミノ酸置換である。方法Ｂでは、ＩＣ及びＥＣ二次構造アノテーション（例えば、ＤＳＳＰソフトウェアを使用したＩＣ及びＥＣ三次構造の３Ｄモデルから決定される（Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ：  ｐａｔｔｅｒｎ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ−ｂｏｎｄｅｄ  ａｎｄ  ｇｅｏｍｅｔｒｉｃａｌ  ｆｅａｔｕｒｅｓ．Ｋａｂｓｃｈ  Ｗ，Ｓａｎｄｅｒ  Ｃ，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ．１９８３  ２２  ２５７７−２６３７））は、ＩＣ中にループを有し、かつＥＣ中にヘリックスを有する領域を同定するために検査される。次いで、低ヘリックス性向を有する残基（例えばＧｌｙ）を有する配列位置を高ヘリックス性向のアミノ酸（例えばＡｌａ）で置換する。Ｔ７  ＲＮＡＰの場合、例えば、方法Ａ及びＢの変異（例えば、置換）オーバーラップ及び方法Ｂのトップ（ｔｏｐ）バリアントを同定した。
【００９９】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１のアミノ酸４２〜４７位（Ｅ４２、Ｓ４３、Ｙ４４、Ｅ４５、Ｍ４６、及び／またはＧ４７）のいずれか１つにおける高ヘリックス性向アミノ酸（例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシン、アルギニン、メチオニン、リジン、グルタミン、及び／またはグルタミン酸）置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸４２〜４７位（Ｅ４２、Ｓ４３、Ｙ４４、Ｅ４５、Ｍ４６、及び／またはＧ４７）のいずれか１つにおける高ヘリックス性向アミノ酸（例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシン、アルギニン、メチオニン、リジン、グルタミン、及び／またはグルタミン酸）置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１のアミノ酸４２位における高ヘリックス性向アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１のアミノ酸４３位における高ヘリックス性向アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１のアミノ酸４４位における高ヘリックス性向アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１のアミノ酸４５位における高ヘリックス性向アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１のアミノ酸４６位における高ヘリックス性向アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１のアミノ酸４７位における高ヘリックス性向アミノ酸置換である。
【０１００】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６のアミノ酸４２〜４７位（Ｅ４２、Ｓ４３、Ｙ４４、Ｅ４５、Ｍ４６、及び／またはＧ４７）のいずれか１つにおける高ヘリックス性向アミノ酸（例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシン、アルギニン、メチオニン、リジン、グルタミン、及び／またはグルタミン酸）置換である。アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸４２〜４７位（Ｅ４２、Ｓ４３、Ｙ４４、Ｅ４５、Ｍ４６、及び／またはＧ４７）のいずれか１つにおける高ヘリックス性向アミノ酸（例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシン、アルギニン、メチオニン、リジン、グルタミン、及び／またはグルタミン酸）置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６のアミノ酸置４２位における高ヘリックス性向アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６のアミノ酸４３位における高ヘリックス性向アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６のアミノ酸４４位における高ヘリックス性向アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６のアミノ酸４５位における高ヘリックス性向アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６のアミノ酸４６位における高ヘリックス性向アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６のアミノ酸４７位における高ヘリックス性向アミノ酸置換である。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１のアミノ酸４２〜４７位のいずれか１つにおけるアラニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１と９０〜９９％、例えば少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸４２〜４７位のいずれか１つにおけるアラニンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４２位におけるアラニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４３位におけるアラニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４４位におけるアラニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４５位におけるアラニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４６位におけるアラニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４７位におけるアラニンである。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６のアミノ酸４２〜４７位のいずれか１つにおけるアラニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸４２〜４７位のいずれか１つにおけるアラニンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４２位におけるアラニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４３位におけるアラニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４４位におけるアラニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４５位におけるアラニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４６位におけるアラニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４７位におけるアラニンである。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１のアミノ酸４２〜４７位のいずれか１つにおけるイソロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸４２〜４７位のいずれか１つにおけるイソロイシンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４２位におけるイソロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４３位におけるイソロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４４位のイソロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４５位におけるイソロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４６位におけるイソロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４７位におけるイソロイシンである。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６のアミノ酸４２〜４７位のいずれか１つにおけるイソロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸４２〜４７位のいずれか１つにおけるイソロイシンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４２位におけるイソロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４３位におけるイソロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４４位におけるイソロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４５位におけるイソロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４６位におけるイソロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４７位におけるイソロイシンである。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１のアミノ酸４２〜４７位のいずれか１つにおけるロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸４２〜４７位のいずれか１つにおけるロイシンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４２位におけるロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４３位におけるロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４４位におけるロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４５位におけるロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４６位におけるロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４７位におけるロイシンである。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６のアミノ酸４２〜４７位のいずれか１つにおけるロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸４２〜４７位のいずれか１つにおけるロイシンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４２位におけるロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４３位におけるロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４４位におけるロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４５位におけるロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４６位におけるロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４７位におけるロイシンである。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１のアミノ酸４２〜４７位のいずれか１つにおけるアルギニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸４２〜４７位のいずれか１つにおけるアルギニンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４２位におけるアルギニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４３位におけるアルギニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４４位におけるアルギニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４５位におけるアルギニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４６位におけるアルギニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４７位におけるアルギニンである。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６のアミノ酸４２〜４７位のいずれか１つにおけるアルギニンである。いくつかの実施形態では、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸４２〜４７位のいずれか１つにおけるアルギニンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４２位におけるアルギニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４３位におけるアルギニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４４位におけるアルギニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４５位におけるアルギニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４６位におけるアルギニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４７位におけるアルギニンである。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１のアミノ酸４２〜４７位のいずれか１つにおけるメチオニンである。いくつかの実施形態では、配列番号１と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸４２〜４７位のいずれか１つにおけるメチオニンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４２位におけるメチオニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４３位におけるメチオニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４４位におけるメチオニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４５位におけるメチオニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４６位におけるメチオニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４７位におけるメチオニンである。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６のアミノ酸４２〜４７位のいずれか１つにおけるメチオニンである。いくつかの実施形態では、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸４２〜４７位のいずれか１つにおけるメチオニンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４２位におけるメチオニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４３位におけるメチオニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４４位におけるメチオニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４５位におけるメチオニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４６位におけるメチオニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４７位におけるメチオニンである。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１のアミノ酸４２〜４７位のいずれか１つにおけるリジンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸４２〜４７位のいずれか１つにおけるリジンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４２位におけるリジンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４３位におけるリジンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４４位におけるリジンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４５位におけるリジンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４６位におけるリジンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４７位におけるリジンである。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６のアミノ酸４２〜４７位のいずれか１つにおけるリジンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸４２〜４７位のいずれか１つにおけるリジンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４２位におけるリジンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４３位におけるリジンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４４位におけるリジンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４５位におけるリジンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４６位におけるリジンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４７位におけるリジンである。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１のアミノ酸４２〜４７位のいずれか１つにおけるグルタミンである。いくつかの実施形態では、配列番号１と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸４２〜４７位のいずれか１つにおけるグルタミンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４２位におけるグルタミンであるいくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４３位におけるグルタミンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４４位におけるグルタミンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４５位におけるグルタミンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４６位におけるグルタミンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４７位におけるグルタミンである。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６のアミノ酸４２〜４７位のいずれか１つにおけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸４２〜４７位のいずれか１つにおけるグルタミンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４２位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４３位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４４位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４５位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４６位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４７位におけるグルタミン酸である。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１のアミノ酸４２〜４７位のいずれか１つにおけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸４２〜４７位のいずれか１つにおけるグルタミン酸である。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４２位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４３位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４４位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４５位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４６位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の４７位におけるグルタミン酸である。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６のアミノ酸４２〜４７位のいずれか１つにおけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸４２〜４７位のいずれか１つにおけるグルタミン酸である。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４２位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４３位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４４位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４５位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４６位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の４７位におけるグルタミン酸である。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１のアミノ酸２５７〜２６２位（Ｒ２５７、Ａ２５８、Ｇ２５９、Ａ２６０、Ｌ２６１、及び／またはＡ２６２）のいずれか１つにおける高ヘリックス性向アミノ酸（例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシン、アルギニン、メチオニン、リジン、グルタミン、及び／またはグルタミン酸）置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸２５７〜２６２位（Ｒ２５７、Ａ２５８、Ｇ２５９、Ａ２６０、Ｌ２６１、及び／またはＡ２６２）のいずれか１つにおける高ヘリックス性向アミノ酸（例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシン、アルギニン、メチオニン、リジン、グルタミン、及び／またはグルタミン酸）置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１のアミノ酸２５７位における高ヘリックス性向アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１のアミノ酸２５８位における高ヘリックス性向アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１のアミノ酸２５９位における高ヘリックス性向アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１のアミノ酸２６０位における高ヘリックス性向アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１のアミノ酸２６１位における高ヘリックス性向アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１のアミノ酸２６２位における高ヘリックス性向アミノ酸置換である。
【０１１８】
アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６のアミノ酸２５７〜２６２位（Ｒ２５７、Ａ２５８、Ｇ２５９、Ａ２６０、Ｌ２６１、及び／またはＡ２６２）のいずれか１つにおける高ヘリックス性向アミノ酸（例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシン、アルギニン、メチオニン、リジン、グルタミン、及び／またはグルタミン酸）置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸２５７〜２６２位（Ｒ２５７、Ａ２５８、Ｇ２５９、Ａ２６０、Ｌ２６１、及び／またはＡ２６２）のいずれか１つにおける高ヘリックス性向アミノ酸（例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシン、アルギニン、メチオニン、リジン、グルタミン、及び／またはグルタミン酸）置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６のアミノ酸２５７位における高ヘリックス性向アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６のアミノ酸２５８位における高ヘリックス性向アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６のアミノ酸２５９位における高ヘリックス性向アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６のアミノ酸２６０位における高ヘリックス性向アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６のアミノ酸２６１位における高ヘリックス性向アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６のアミノ酸２６２位における高ヘリックス性向アミノ酸置換である。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１のアミノ酸２５７〜２６２位のいずれか１つにおけるアラニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸２５７〜２６２位のいずれか１つにおけるアラニンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２５７位におけるアラニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２５８位におけるアラニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２５９位におけるアラニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２６０位におけるアラニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２６１位におけるアラニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２６２位におけるアラニンである。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６のアミノ酸２５７〜２６２位のいずれか１つにおけるアラニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸２５７〜２６２位のいずれか１つにおけるアラニンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２５７位におけるアラニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２５８位におけるアラニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２５９位におけるアラニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２６０位におけるアラニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２６１位におけるアラニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２６２位におけるアラニンである。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１のアミノ酸２５７〜２６２位のいずれか１つにおけるイソロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸２５７〜２６２位のいずれか１つにおけるイソロイシンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２５７位におけるイソロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２５８位におけるイソロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２５９位におけるイソロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２６０位におけるイソロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２６１位におけるイソロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２６２位におけるイソロイシンである。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６のアミノ酸２５７〜２６２位のいずれか１つにおけるイソロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸２５７〜２６２位のいずれか１つにおけるイソロイシンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２５７位におけるイソロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２５８位におけるイソロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２５９位におけるイソロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２６０位におけるイソロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２６１位におけるイソロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２６２位におけるイソロイシンである。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１のアミノ酸２５７〜２６２位のいずれか１つにおけるロイシンであるアミノ酸置換は、配列番号１と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸２５７〜２６２位のいずれか１つにおけるロイシンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２５７位におけるロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２５８位におけるロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２５９位におけるロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２６０位におけるロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２６１位におけるロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２６２位におけるロイシンである。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６のアミノ酸２５７〜２６２位のいずれか１つにおけるロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸２５７〜２６２位のいずれか１つにおけるイソロイシンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２５７位におけるロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２５８位におけるロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２５９位におけるロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２６０位におけるロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２６１位におけるロイシンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２６２位におけるロイシンである。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１のアミノ酸２５７〜２６２位のいずれか１つのアルギニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸２５７〜２６２位のいずれか１つにおけるアルギニンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２５７位におけるアルギニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２５８位におけるアルギニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２５９位におけるアルギニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２６０位におけるアルギニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２６１位におけるアルギニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２６２位におけるアルギニンである。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６のアミノ酸２５７〜２６２位のいずれか１つのアルギニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸２５７〜２６２位のいずれか１つにおけるアルギニンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２５７位におけるアルギニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２５８位におけるアルギニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２５９位におけるアルギニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２６０位におけるアルギニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２６１位におけるアルギニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２６２位におけるアルギニンである。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１のアミノ酸２５７〜２６２位のいずれか１つにおけるメチオニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸２５７〜２６２位のいずれか１つにおけるメチオニンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２５７位におけるメチオニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２５８位におけるメチオニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２５９位におけるメチオニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２６０位におけるメチオニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２６１位におけるメチオニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２６２位におけるメチオニンである。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６のアミノ酸２５７〜２６２位のいずれか１つのメチオニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸２５７〜２６２位のいずれか１つにおけるメチオニンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２５７位におけるメチオニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２５８位におけるメチオニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２５９位におけるメチオニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２６０位におけるメチオニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２６１位におけるメチオニンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２６２位におけるメチオニンである。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１のアミノ酸２５７〜２６２位のいずれか１つのリジンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸２５７〜２６２位のいずれか１つにおけるリジンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２５７位におけるリジンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２５８位におけるリジンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２５９位におけるリジンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２６０位におけるリジンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２６１位におけるリジンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２６２位におけるリジンである。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６のアミノ酸２５７〜２６２位のいずれか１つのリジンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸２５７〜２６２位のいずれか１つにおけるリジンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２５７位におけるリジンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２５８位におけるリジンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２５９位におけるリジンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２６０位におけるリジンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２６１位におけるリジンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２６２位におけるリジンである。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１のアミノ酸２５７〜２６２位のいずれか１つにおけるグルタミンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸２５７〜２６２位のいずれか１つにおけるグルタミンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２５７位におけるグルタミンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２５８位におけるグルタミンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２５９位におけるグルタミンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２６０位におけるグルタミンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２６１位におけるグルタミンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２６２位におけるグルタミンである。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６のアミノ酸２５７〜２６２位のいずれか１つにおけるグルタミンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸２５７〜２６２位のいずれか１つにおけるグルタミンである。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２５７位におけるグルタミンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２５８位におけるグルタミンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２５９位におけるグルタミンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２６０位におけるグルタミンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２６１位におけるグルタミンである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２６２位におけるグルタミンである。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１のアミノ酸２５７〜２６２位のいずれか１つにおけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸２５７〜２６２位のいずれか１つにおけるグルタミン酸である。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２５７位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２５８位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２５９位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２６０位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２６１位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１の２６２位におけるグルタミン酸である。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６のアミノ酸２５７〜２６２位のいずれか１つのグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸２５７〜２６２位のいずれか１つにおけるグルタミン酸である。したがって、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２５７位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２５８位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２５９位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２６０位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２６１位におけるグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６の２６２位におけるグルタミン酸である。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、位置Ｇ４７、Ｓ４３、Ｒ２５７、及び／またはＧ２５９において高ヘリックス性向アミノ酸のアミノ酸置換を含むように修飾された配列番号１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、位置Ｇ４７、Ｓ４３、Ｒ２５７、及び／またはＧ２５９において高ヘリックス性向アミノ酸のアミノ酸置換を含むように修飾された配列番号１と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、位置Ｇ４７、Ｓ４３、Ｒ２５７、及び／またはＧ２５９において高ヘリックス性向アミノ酸のアミノ酸置換を含むように修飾された配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、位置Ｇ４７、Ｓ４３、Ｒ２５７、及び／またはＧ２５９において高ヘリックス性向アミノ酸のアミノ酸置換を含むように修飾された配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、配列番号２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、配列番号３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、配列番号５のアミノ酸配列を含む。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、配列番号１０７または１０８のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、配列番号１０９または１１０のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、配列番号１１１または１１２のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、配列番号１１３または１１４のアミノ酸配列を含む。
【０１３９】
少なくとも２つ（２つ以上）の置換を有するＲＮＡポリメラーゼバリアントも本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、配列番号１または配列番号１と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸４２〜４７位（Ｅ４２、Ｓ４３、Ｙ４４、Ｅ４５、Ｍ４６、及び／またはＧ４７）及び／またはアミノ酸２５７〜２６２位（Ｒ２５７、Ａ２５８、Ｇ２５９、Ａ２６０、Ｌ２６１、及び／またはＡ２６２）のいずれか１つにおける少なくとも２つの高ヘリックス性向アミノ酸（例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシン、アルギニン、メチオニン、リジン、グルタミン、及び／またはグルタミン酸）置換を含む。
【０１４０】
例えば、ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、配列番号１または配列番号１と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のＥ４２及びＳ４３、Ｅ４２及びＹ４４、Ｅ４２及びＥ４５、Ｅ４２及びＭ４６、Ｅ４２及びＧ４７、Ｓ４３及びＹ４４、Ｓ４３及びＥ４５、Ｓ４３及びＭ４６、Ｓ４３及びＧ４７、Ｙ４４及びＥ４５、Ｙ４４及びＭ４６、Ｙ４４及びＧ４７、Ｅ４５及びＭ４６、Ｅ４５及びＧ４７、またはＭ４６及びＧ４７におけるアミノ酸置換（例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシン、アルギニン、メチオニン、リジン、グルタミン、及び／またはグルタミン酸）を含み得る。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、配列番号１または配列番号１と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のＲ２５７及びＡ２５８、Ｒ２５７及びＧ２５９、Ｒ２５７及びＡ２６０、Ｒ２５７及びＬ２６１、Ｒ２５７及びＡ２６２、Ａ２５８及びＧ２５９、Ａ２５８及びＡ２６０、Ａ２５８及びＬ２６１、Ａ２５８及びＡ２６２、Ｇ２５９及びＡ２６０、Ｇ２５９及びＬ２６１、Ｇ２５９及びＡ２６２、Ａ２６０及びＬ２６１、Ａ２６０及びＡ２６２、またはＬ２６１及びＡ２６２におけるアミノ酸置換（例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシン、アルギニン、メチオニン、リジン、グルタミン、及び／またはグルタミン酸）を含み得る。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、配列番号１または配列番号１と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のＥ４２及びＲ２５７、Ｅ４２及びＡ２５８、Ｅ４２及びＧ２５９、Ｅ４２及びＡ２６０、Ｅ４２及びＬ２６１、Ｅ４２及びＡ２６２、Ｓ４３及びＲ２５７、Ｓ４３及びＡ２５８、Ｓ４３及びＧ２５９、Ｓ４３及びＡ２６０、Ｓ４３及びＬ２６１、Ｓ４３及びＡ２６２、Ｙ４４及びＲ２５７、Ｙ４４及びＡ２５８、Ｙ４４及びＧ２５９、Ｙ４４及びＡ２６０、Ｙ４４及びＬ２６１、Ｙ４４及びＡ２６２、Ｅ４５及びＲ２５７、Ｅ４５及びＡ２５８、Ｅ４５及びＧ２５９、Ｅ４５及びＡ２６０、Ｅ４５及びＬ２６１、Ｅ４５及びＡ２６２、Ｍ４６及びＲ２５７、Ｍ４６及びＡ２５８、Ｍ４６及びＧ２５９、Ｍ４６及びＡ２６０、Ｍ４６及びＬ２６１、Ｍ４６及びＡ２６２、Ｇ４７及びＲ２５７、Ｇ４７及びＡ２５８、Ｇ４７及びＧ２５９、Ｇ４７及びＡ２６０、Ｇ４７及びＬ２６１、またはＧ４７及びＡ２６２におけるアミノ酸置換（例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシン、アルギニン、メチオニン、リジン、グルタミン、及び／またはグルタミン酸）を含み得る。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、配列番号１または配列番号１と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のＳ４３Ａ及びＧ４７Ａにおけるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、配列番号１または配列番号１と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のＳ４３Ａ及びＲ２５７Ａにおけるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、配列番号１または配列番号１と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のＳ４３Ａ及びＧ２５９Ａにおけるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、配列番号１または配列番号１と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のＧ４７Ａ及びＲ２５７Ａにおけるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、配列番号１または配列番号１と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のＧ４７Ａ及びＲ２５７Ａにおけるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、配列番号１または配列番号１と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のＲ２５７Ａ及びＧ２５９Ａにおけるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、配列番号１または配列番号１と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のＧ４７Ａ及びＧ２５９Ａにおけるアミノ酸置換を含む。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、配列番号１または配列番号１と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸４２〜４７位（Ｅ４２、Ｓ４３、Ｙ４４、Ｅ４５、Ｍ４６、及び／またはＧ４７）及び／またはアミノ酸２５７〜２６２位（Ｒ２５７、Ａ２５８、Ｇ２５９、Ａ２６０、Ｌ２６１、及び／またはＡ２６２）のいずれか１つにおける少なくとも３つ（もしくは少なくとも４つ、または少なくとも５つ）の高ヘリックス性向アミノ酸（例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシン、アルギニン、メチオニン、リジン、グルタミン、及び／またはグルタミン酸）置換を含む。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、Ｅ４２Ｒ、Ｓ４３Ａ、Ｓ４３Ｅ、Ｓ４３Ｌ、Ｓ４３Ｒ、Ｅ４５Ｒ、Ｅ４５Ｌ、Ｍ４６Ａ、Ｇ４７Ａ、Ｇ４７Ｅ、Ｇ４７Ｌ、Ｇ４７Ｒ、Ｎ１６５Ｗ、Ｅ１６７Ｍ、Ｅ１６７Ｎ、Ｅ１６８Ｉ、Ｅ１６８Ｔ、Ｅ１６８Ｖ、Ａ１８１Ｆ、Ａ１８１Ｗ、Ｇ１８４Ｍ、Ｅ１８７Ｆ、Ａ２５５Ｑ、Ａ２５５Ｋ、Ａ２５５Ｉ、Ａ２５５Ｙ、Ｒ２５７Ａ、Ｒ２５７Ｅ、Ｒ２５７Ｌ、Ｒ２５７Ｗ、Ｇ２５９Ａ、Ｇ２５９Ｅ、Ｇ２５９Ｌ、Ｇ２５９Ｒ、Ａ２６０Ｗ、及びＡ２６０Ｒから選択される、配列番号１または配列番号１と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列における少なくとも１つ（もしくは少なくとも２つ、もしくは少なくとも３つ、もしくは少なくとも４つ、または少なくとも５つ）のアミノ酸置換（複数可）を含む。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６または配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸４２〜４７位（Ｅ４２、Ｓ４３、Ｙ４４、Ｅ４５、Ｍ４６、及び／またはＧ４７）及び／またはアミノ酸２５７〜２６２位（Ｒ２５７、Ａ２５８、Ｇ２５９、Ａ２６０、Ｌ２６１、及び／またはＡ２６２）のいずれか１つにおける少なくとも２つの高ヘリックス性向アミノ酸（例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシン、アルギニン、メチオニン、リジン、グルタミン、及び／またはグルタミン酸）置換を含む。
【０１４７】
例えば、ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６または配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸位置Ｅ４２及びＳ４３、Ｅ４２及びＹ４４、Ｅ４２及びＥ４５、Ｅ４２及びＭ４６、Ｅ４２及びＧ４７、Ｓ４３及びＹ４４、Ｓ４３及びＥ４５、Ｓ４３及びＭ４６、Ｓ４３及びＧ４７、Ｙ４４及びＥ４５、Ｙ４４及びＭ４６、Ｙ４４及びＧ４７、Ｅ４５及びＭ４６、Ｅ４５及びＧ４７、またはＭ４６及びＧ４７におけるアミノ酸置換（例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシン、アルギニン、メチオニン、リジン、グルタミン、及び／またはグルタミン酸）を含み得る。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６または配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸位置Ｒ２５７及びＡ２５８、Ｒ２５７及びＧ２５９、Ｒ２５７及びＡ２６０、Ｒ２５７及びＬ２６１、Ｒ２５７及びＡ２６２、Ａ２５８及びＧ２５９、Ａ２５８及びＡ２６０、Ａ２５８及びＬ２６１、Ａ２５８及びＡ２６２、Ｇ２５９及びＡ２６０、Ｇ２５９及びＬ２６１、Ｇ２５９及びＡ２６２、Ａ２６０及びＬ２６１、Ａ２６０及びＡ２６２、またはＬ２６１及びＡ２６２におけるアミノ酸置換（例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシン、アルギニン、メチオニン、リジン、グルタミン、及び／またはグルタミン酸）を含む。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６または配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸位置Ｅ４２及びＲ２５７、Ｅ４２及びＡ２５８、Ｅ４２及びＧ２５９、Ｅ４２及びＡ２６０、Ｅ４２及びＬ２６１、Ｅ４２及びＡ２６２、Ｓ４３及びＲ２５７、Ｓ４３及びＡ２５８、Ｓ４３及びＧ２５９、Ｓ４３及びＡ２６０、Ｓ４３及びＬ２６１、Ｓ４３及びＡ２６２、Ｙ４４及びＲ２５７、Ｙ４４及びＡ２５８、Ｙ４４及びＧ２５９、Ｙ４４及びＡ２６０、Ｙ４４及びＬ２６１、Ｙ４４及びＡ２６２、Ｅ４５及びＲ２５７、Ｅ４５及びＡ２５８、Ｅ４５及びＧ２５９、Ｅ４５及びＡ２６０、Ｅ４５及びＬ２６１、Ｅ４５及びＡ２６２、Ｍ４６及びＲ２５７、Ｍ４６及びＡ２５８、Ｍ４６及びＧ２５９、Ｍ４６及びＡ２６０、Ｍ４６及びＬ２６１、Ｍ４６及びＡ２６２、Ｇ４７及びＲ２５７、Ｇ４７及びＡ２５８、Ｇ４７及びＧ２５９、Ｇ４７及びＡ２６０、Ｇ４７及びＬ２６１、またはＧ４７及びＡ２６２におけるアミノ酸置換（例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシン、アルギニン、メチオニン、リジン、グルタミン、及び／またはグルタミン酸）を含む。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６または配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸置換Ｓ４３Ａ及びＧ４７Ａを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６または配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸置換Ｓ４３Ａ及びＲ２５７Ａを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６または配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸置換Ｓ４３Ａ及びＧ２５９Ａを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６または配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸置換Ｇ４７Ａ及びＲ２５７Ａを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６または配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸置換Ｇ４７Ａ及びＲ２５７Ａを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６または配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸置換Ｒ２５７Ａ及びＧ２５９Ａを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６または配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸置換Ｇ４７Ａ及びＧ２５９Ａを含む。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６または配列番号９９、１００、２９４、２９５、または２９６と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列のアミノ酸４２〜４７位（Ｅ４２、Ｓ４３、Ｙ４４、Ｅ４５、Ｍ４６、及び／またはＧ４７）及び／またはアミノ酸２５７〜２６２位（Ｒ２５７、Ａ２５８、Ｇ２５９、Ａ２６０、Ｌ２６１、及び／またはＡ２６２）のいずれか１つにおける少なくとも３つ（もしくは少なくとも４つ、または少なくとも５つ）の高ヘリックス性向アミノ酸（例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシン、アルギニン、メチオニン、リジン、グルタミン、及び／またはグルタミン酸）置換を含む。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、Ｅ４２Ｒ、Ｓ４３Ａ、Ｓ４３Ｅ、Ｓ４３Ｌ、Ｓ４３Ｒ、Ｅ４５Ｒ、Ｅ４５Ｌ、Ｍ４６Ａ、Ｇ４７Ａ、Ｇ４７Ｅ、Ｇ４７Ｌ、Ｇ４７Ｒ、Ｎ１６５Ｗ、Ｅ１６７Ｍ、Ｅ１６７Ｎ、Ｅ１６８Ｉ、Ｅ１６８Ｔ、Ｅ１６８Ｖ、Ａ１８１Ｆ、Ａ１８１Ｗ、Ｇ１８４Ｍ、Ｅ１８７Ｆ、Ｒ２５７Ａ、Ｒ２５７Ｅ、Ｒ２５７Ｌ、Ｒ２５７Ｗ、Ｇ２５９Ａ、Ｇ２５９Ｅ、Ｇ２５９Ｌ、Ｇ２５９Ｒ、Ａ２６０Ｗ、及びＡ２６０Ｒから選択される、配列番号９９、１００、２９４、２９５、もしくは２９６または配列番号９９、１００、２９４、２９５、もしくは２９６と９０〜９９％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列における少なくとも１つ（もしくは少なくとも２つ、もしくは少なくとも３つ、もしくは少なくとも４つ、または少なくとも５つ）のアミノ酸置換（複数可）を含む。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、Ｅ４２Ｒ、Ｓ４３Ａ、Ｓ４３Ｅ、Ｓ４３Ｌ、Ｓ４３Ｒ、Ｅ４５Ｒ、Ｅ４５Ｌ、Ｍ４６Ａ、Ｇ４７Ａ、Ｇ４７Ｅ、Ｇ４７Ｌ、Ｇ４７Ｒ、Ｎ１６５Ｗ、Ｅ１６７Ｍ、Ｅ１６７Ｎ、Ｅ１６８Ｉ、Ｅ１６８Ｔ、Ｅ１６８Ｖ、Ａ１８１Ｆ、Ａ１８１Ｗ、Ｇ１８４Ｍ、Ｅ１８７Ｆ、Ｒ２５７Ａ、Ｒ２５７Ｅ、Ｒ２５７Ｌ、Ｒ２５７Ｗ、Ｇ２５９Ａ、Ｇ２５９Ｅ、Ｇ２５９Ｌ、Ｇ２５９Ｒ、Ａ２６０Ｗ、及びＡ２６０Ｒから選択される、少なくとも１つ（もしくは少なくとも２つ、もしくは少なくとも３つ、もしくは少なくとも４つ、または少なくとも５つ）のアミノ酸置換（複数可）を含み、少なくとも１つ（もしくは少なくとも２つ、もしくは少なくとも３つ、もしくは少なくとも４つ、または少なくとも５つ）の他のアミノ酸置換（例えば、本明細書に提供されていないアミノ酸置換）をさらに含む。
【０１５４】
したがって、本開示は、Ｅ４２Ｒ、Ｓ４３Ａ、Ｓ４３Ｅ、Ｓ４３Ｌ、Ｓ４３Ｒ、Ｅ４５Ｒ、Ｅ４５Ｌ、Ｍ４６Ａ、Ｇ４７Ａ、Ｇ４７Ｅ、Ｇ４７Ｌ、Ｇ４７Ｒ、Ｎ１６５Ｗ、Ｅ１６７Ｍ、Ｅ１６７Ｎ、Ｅ１６８Ｉ、Ｅ１６８Ｔ、Ｅ１６８Ｖ、Ａ１８１Ｆ、Ａ１８１Ｗ、Ｇ１８４Ｍ、Ｅ１８７Ｆ、Ａ２５５Ｋ、Ａ２５５Ｑ、Ａ２５５Ｙ、Ａ２５５Ｉ、Ｒ２５７Ａ、Ｒ２５７Ｅ、Ｒ２５７Ｌ、Ｒ２５７Ｗ、Ｇ２５９Ａ、Ｇ２５９Ｅ、Ｇ２５９Ｌ、Ｇ２５９Ｒ、Ａ２６０Ｗ、及びＡ２６０Ｒから選択される少なくとも１つ（もしくは少なくとも２つ、もしくは少なくとも３つ、もしくは少なくとも４つ、または少なくとも５つ）のアミノ酸置換（複数可）を含み、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する、ＲＮＡポリメラーゼバリアントを包含する。
【０１５５】
「同一性」という用語は、配列を比較することにより決定される２つ以上のポリペプチド（例えば酵素）またはポリヌクレオチド（核酸）の配列間の関係を指す。同一性はまた、２つ以上のアミノ酸残基または核酸残基のストリング間の一致数によって決定される配列間または配列の間での配列関連性の程度も指す。同一性は、特定の数学的モデルまたはコンピュータープログラム（例えば、「アルゴリズム」）によって指定されたギャップアライメント（存在する場合）を有する２つ以上の配列間の同一性一致のパーセントを測定する。関連するタンパク質または核酸の同一性は、既知の方法で容易に計算することができる。ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列に適用される「同一性パーセント（％）（ｐｅｒｃｅｎｔ（％）ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」は、配列をアラインさせ、必要に応じてギャップを導入して、最大パーセントの同一性を達成した後の第２の配列のアミノ酸配列または核酸配列中の残基と同一である候補アミノ酸または核酸配列中の残基（アミノ酸残基または核酸残基）のパーセントとして定義される。アライメントのための方法及びコンピュータープログラムは、当該分野で周知である。同一性は、同一性パーセントの計算に依るが、計算に導入されるギャップ及びペナルティにより値が異なる場合があることが理解される。一般的に、特定のポリヌクレオチドまたはポリペプチド（例えば、抗原）のバリアントは、本明細書に記載され、当業者に既知である配列アライメントプログラム及びパラメーターによって決定される特定の参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのものに対して、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％であるが、１００％未満の配列同一性を有する。そのようなアライメント用ツールには、ＢＬＡＳＴスイートのツールが含まれる（Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｆ．  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ（１９９７），「Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：  ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ」，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）。別の一般的なローカルアライメント手法は、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムに基づく（Ｓｍｉｔｈ，Ｔ．Ｆ．＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｍ．Ｓ．（１９８１）「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｍｍｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７）。ダイナミック（ｄｙｎａｍｉｃ）プログラミングに基づく一般的なグローバルアライメント手法は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムである（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．＆  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（１９７０）「Ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）。最近では、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈア��ゴリズムを含む他の最適なグローバルアライメント手法よりも高速にヌクレオチド及びタンパク質配列のグローバルアライメントを生成するといわれる、Ｆａｓｔ  Ｏｐｔｉｍａｌ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ（ＦＯＧＳＡＡ）が開発された。
【０１５６】
トリヌクレオチドキャップ
リボ核酸（ＲＮＡ）合成のための共転写キャッピング方法も本明細書で提供される。すなわち、ＲＮＡは「ワンポット（ｏｎｅ−ｐｏｔ）」反応で生成され、別々のキャッピング反応を必要としない。したがって、本方法は、いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写物を生成するためのインビトロ転写反応条件下で、ポリヌクレオチド鋳型をＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント、ヌクレオシド三リン酸、及びキャップ類似体と反応させることを含む。
【０１５７】
キャップ類似体は、例えば、ジヌクレオチドキャップ、トリヌクレオチドキャップ、またはテトラヌクレオチドキャップであり得る。いくつかの実施形態では、キャップ類似体は、ジヌクレオチドキャップである。いくつかの実施形態では、キャップ類似体は、トリヌクレオチドキャップである。いくつかの実施形態では、キャップ類似体は、テトラヌクレオチドキャップである。
【０１５８】
トリヌクレオチドキャップは、いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物
【化１】
2020532963.tif 000215
またはその立体異性体、互変異性体、もしくは塩を含み、式中、
【化２】
2020532963.tif 000216
環Ｂ１は、修飾または未修飾グアニンであり、
環Ｂ２及び環Ｂ３はそれぞれ独立して、核酸塩基または修飾核酸塩基であり、
Ｘ２はＯ、Ｓ（Ｏ）ｐ、ＮＲ２４、またはＣＲ２５Ｒ２６であり、ｐは０、１、または２であり、
Ｙ０は、ＯまたはＣＲ６Ｒ７であり、
Ｙ１は、Ｏ、Ｓ（Ｏ）ｎ、ＣＲ６Ｒ７、またはＮＲ８であり、ｎは０、１、または２であり、
各−−−は、単結合または不存在であり、各−−−が単結合の場合、ＹｉはＯ、Ｓ（Ｏ）ｎ、ＣＲ６Ｒ７、またはＮＲ８であり、各−−−が不存在である場合、Ｙ１は空（ｖｏｉｄ）であり、
Ｙ２は、（ＯＰ（Ｏ）Ｒ４）ｍ（ｍは０、１、または２である）または−Ｏ−（ＣＲ４０Ｒ４１）ｕ−Ｑ０−（ＣＲ４２Ｒ４３）ｖ−であり、ここで、Ｑ０は結合、Ｏ、Ｓ（Ｏ）ｒ、ＮＲ４４、またはＣＲ４５Ｒ４６であり、ｒは０、１、または２であり、ｕ及びｖの各々は、独立して、１、２、３または４であり、
各Ｒ２及びＲ２´は、独立して、ハロ、ＬＮＡ、またはＯＲ３であり、
各Ｒ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、またはＣ２−Ｃ６アルキニルであり、Ｒ３は、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、またはＣ２−Ｃ６アルキニルである場合、ハロ、ＯＨ、または１つ以上のＯＨもしくはＯＣ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ６アルキルで任意選択により置換されたＣ１−Ｃ６アルコキシルのうちの１つ以上で任意選択により置換され、
各Ｒ４及びＲ４´は、独立して、Ｈ、ハロ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、ＯＨ、ＳＨ、ＳｅＨ、またはＢＨ３−であり、
Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８の各々は、独立して、−Ｑ１−Ｔ１であり、ここで、Ｑ１は、結合、またはハロ、シアノ、ＯＨ、及びＣ１−Ｃ６アルコキシのうちの１つ以上で任意選択により置換されたＣ１−Ｃ３アルキルリンカーであり、Ｔ１は、Ｈ、ハロ、ＯＨ、ＣＯＯＨ、シアノ、またはＲｓ１であり、ここで、Ｒｓ１は、Ｃ１−Ｃ３アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシル、Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、Ｃ６−Ｃ１０アリール、ＮＲ３１Ｒ３２、（ＮＲ３１Ｒ３２Ｒ３３）＋、４〜１２員のヘテロシクロアルキル、または５もしくは６員のヘテロアリールであり、Ｒｓ１は、ハロ、ＯＨ、オキソ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、ＣＯＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ６アルキル、シアノ、Ｃ１−Ｃ６アルコキシル、ＮＲ３１Ｒ３２、（ＮＲ３１Ｒ３２Ｒ３３）＋、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、Ｃ６−Ｃ１０アリール、４〜１２員のヘテロシクロアルキル、及び５または６員のヘテロアリールからなる群から選択される１つ以上の置換基で任意選択により置換され、
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３Ｒ１４、及びＲ１５の各々は、独立して、−Ｑ２−Ｔ２であり、ここで、Ｑ２は、結合、またはハロ、シアノ、ＯＨ、及びＣ１−Ｃ６アルコキシのうちの１つ以上で任意選択により置換されたＣ１−Ｃ３アルキルリンカーであり、Ｔ２は、Ｈ、ハロ、ＯＨ、ＮＨ２、シアノ、ＮＯ２、Ｎ３、Ｒｓ２、またはＯＲｓ２であり、ここで、Ｒｓ２は、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、Ｃ６−Ｃ１０アリール、ＮＨＣ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ６アルキル、ＮＲ３１Ｒ３２、（ＮＲ３１Ｒ３２Ｒ３３）＋、４〜１２員のヘテロシクロアルキル、または５もしくは６員のヘテロアリールあり、Ｒｓ２は、ハロ、ＯＨ、オキソ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、ＣＯＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ６アルキル、シアノ、Ｃ１−Ｃ６アルコキシル、ＮＲ３１Ｒ３２、（ＮＲ３１Ｒ３２Ｒ３３）＋、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、Ｃ６−Ｃ１０アリール，４〜１２員のヘテロシクロアルキル、及び５または６員のヘテロアリールからなる群から選択される１つ以上の置換基で任意選択により置換され、あるいはＲ１２はＲ１４と一緒にオキソであり、またはＲ１３はＲ１５と一緒にオキソであり、
Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２、及びＲ２３の各々は、独立して、−Ｑ３−Ｔ３であり、ここで、Ｑ３は、結合、またはハロ、シアノ、ＯＨ、及びＣ１−Ｃ６アルコキシのうちの１つ以上で任意選択により置換されたＣ１−Ｃ３アルキルリンカーであり、Ｔ３は、Ｈ、ハロ、ＯＨ、ＮＨ２、シアノ、ＮＯ２、Ｎ３、ＲＳ３、またはＯＲＳ３であり、ここで、ＲＳ３は、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、Ｃ６−Ｃ１０アリール、ＮＨＣ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ６アルキル、モノ−Ｃ１−Ｃ６アルキルアミノ、ジ−Ｃ１−Ｃ６アルキルアミノ、４〜１２員のヘテロシクロアルキル、または５もしくは６員のヘテロアリールあり、Ｒｓ３は、ハロ、ＯＨ、オキソ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、ＣＯＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ６アルキル、シアノ、Ｃ１−Ｃ６アルコキシル、アミノ、モノ−Ｃ１−Ｃ６アルキルアミノ、ジ−Ｃ１−Ｃ６アルキルアミノ、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、Ｃ６−Ｃ１０アリール、４〜１２員のヘテロシクロアルキル、及び５または６員のヘテロアリールからなる群から選択される１つ以上の置換基で任意選択により置換され、
Ｒ２４、Ｒ２５、及びＲ２６の各々は、独立して、ＨまたはＣ１−Ｃ６アルキルであり、
Ｒ２７及びＲ２８の各々は、独立して、ＨまたはＯＲ２９であり、あるいはＲ２７及びＲ２８は一緒になって、Ｏ−Ｒ３０−Ｏを形成し、各Ｒ２９は、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、またはＣ２−Ｃ６アルキニルであり、Ｒ２９、は、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、またはＣ２−Ｃ６アルキニルである場合、ハロ、ＯＨ、または１つ以上のＯＨもしくはＯＣ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ６アルキルで任意選択により置換されたＣ１−Ｃ６アルコキシルのうちの１つ以上で任意選択により置換され、
Ｒ３０は、ハロ、ＯＨ、及びＣ１−Ｃ６アルコキシルのうちの１つ以上で任意選択により置換されたＣ１−Ｃ６アルキレンであり、
Ｒ３１、Ｒ３２、及びＲ３３の各々は、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、Ｃ６−Ｃ１０アリール、４〜１２員のヘテロシクロアルキル、または５または６員のヘテロアリールであり、
Ｒ４０、Ｒ４１、Ｒ４２、及びＲ４３の各々は、独立して、Ｈ、ハロ、ＯＨ、シアノ、Ｎ３、ＯＰ（Ｏ）Ｒ４７Ｒ４８、または１つ以上のＯＰ（Ｏ）Ｒ４７Ｒ４８で任意選択により置換されたＣ１−Ｃ６アルキルであり、あるいは１つのＲ４１及び１つのＲ４３は、それらが結合している炭素原子及びＱ０と一緒になって、Ｃ４−Ｃ１０シクロアルキル、４〜１４員のヘテロシクロアルキル、Ｃ６−Ｃ１０アリール、または５〜１４員のヘテロアリールを形成し、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、フェニル、または５〜６員のヘテロアリールの各々は、ＯＨ、ハロ、シアノ、Ｎ３、オキソ、ＯＰ（Ｏ）Ｒ４７Ｒ４８、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキル、ＣＯＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシル、Ｃ１−Ｃ６ハロアルコキシル、アミノ、モノ−Ｃ１−Ｃ６アルキルアミノ、及びジ−Ｃ１−Ｃ６アルキルアミノのうちの１つ以上で任意選択により置換され、
Ｒ４４は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、またはアミン保護基であり、
Ｒ４５及びＲ４６の各々は、独立して、Ｈ、ＯＰ（Ｏ）Ｒ４７Ｒ４８、または１つ以上のＯＰ（Ｏ）Ｒ４７Ｒ４８で任意選択により置換されたＣ１−Ｃ６アルキルであり、
Ｒ４７及びＲ４８の各々は、独立して、Ｈ、ハロ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、ＯＨ、ＳＨ、ＳｅＨ、またはＢＨ３−である。
【０１５９】
本明細書で提供されるキャップ類似体は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１７年４月２０日に公開された国際公開ＷＯ２０１７／０６６７９７に記載のキャップ類似体のいずれかを含み得ることを理解されたい。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、Ｂ２中間位置は、アラビノースなどの非リボース分子であり得る。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、Ｒ２はエチル系である。
【０１６２】
したがって、いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、以下の構造を含む：
【化３】
2020532963.tif 000217
【０１６３】
他の実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、以下の構造を含む：
【化４】
2020532963.tif 000218
【０１６４】
さらに他の実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、以下の構造を含む：
【化５】
2020532963.tif 000219
【０１６５】
さらに他の実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、以下の構造を含む：
【化６】
2020532963.tif 000220
【０１６６】
トリヌクレオチドキャップは、いくつかの実施形態では、以下の配列：ＧＡＡ、ＧＡＣ、ＧＡＧ、ＧＡＵ、ＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、ＧＣＵ、ＧＧＡ、ＧＧＣ、ＧＧＧ、ＧＧＵ、ＧＵＡ、ＧＵＣ、ＧＵＧ、及びＧＵＵから選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ＧＡＡを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ＧＡＣを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ＧＡＧを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ＧＡＵを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ＧＣＡを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ＧＣＣを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ＧＣＧを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ＧＣＵを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ＧＧＡを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ＧＧＣを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ＧＧＧを含むいくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ＧＧＵを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ＧＵＡを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ＧＵＣを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ＧＵＧを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ＧＵＵを含む。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、以下の配列：ｍ７ＧｐｐｐＡｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＡｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＡｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＡｐＵ、ｍ７ＧｐｐｐＣｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＣｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＣｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＣｐＵ、ｍ７ＧｐｐｐＧｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＧｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＧｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＧｐＵ、ｍ７ＧｐｐｐＵｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＵｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＵｐＧ、及びｍ７ＧｐｐｐＵｐＵから選択される配列を含む。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７ＧｐｐｐＡｐＡを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７ＧｐｐｐＡｐＣを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７ＧｐｐｐＡｐＧを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７ＧｐｐｐＡｐＵを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７ＧｐｐｐＣｐＡを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７ＧｐｐｐＣｐＣを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７ＧｐｐｐＣｐＧを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７ＧｐｐｐＣｐＵを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７ＧｐｐｐＧｐＡを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７ＧｐｐｐＧｐＣを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７ＧｐｐｐＧｐＧを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７ＧｐｐｐＧｐＵを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７ＧｐｐｐＵｐＡを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７ＧｐｐｐＵｐＣを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７ＧｐｐｐＵｐＧを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７ＧｐｐｐＵｐＵを含む。
【０１６９】
トリヌクレオチドキャップは、いくつかの実施形態では、以下の配列：ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡｐＡ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡｐＣ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡｐＧ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡｐＵ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣｐＡ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣｐＣ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣｐＧ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣｐＵ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧｐＡ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧｐＣ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧｐＧ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧｐＵ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵｐＡ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵｐＣ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵｐＧ、及びｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵｐＵから選択される配列を含む。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡｐＡを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡｐＣを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡｐＧを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡｐＵを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣｐＡを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣｐＣを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣｐＧを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣｐＵを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧｐＡを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧｐＣを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧｐＧを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧｐＵを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵｐＡを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵｐＣを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵｐＧを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵｐＵを含む。
【０１７１】
トリヌクレオチドキャップは、いくつかの実施形態では、以下の配列：ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＡ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＣ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＧ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＵ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＡ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＣ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＧ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＵ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＡ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＣ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＧ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＵ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＡ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＣ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＧ、及びｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＵから選択される配列を含む。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＡを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＣを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＧを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＵを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＡを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＣを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＧを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＵを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＡを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＣを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＧを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＵを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＡを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＣを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＧを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＵを含む。
【０１７３】
トリヌクレオチドキャップは、さらにいくつかの実施形態では、以下の配列：ｍ７ＧｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＵ、ｍ７ＧｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＵ、ｍ７ＧｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＵ、ｍ７ＧｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＧ、及びｍ７ＧｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＵから選択される配列を含む。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７ＧｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＡを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７ＧｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＣを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７ＧｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＧを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７ＧｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＵを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７ＧｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＡを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７ＧｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＣを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７ＧｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＧを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７ＧｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＵを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７ＧｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＡを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７ＧｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＣを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７ＧｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＧを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７ＧｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＵを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７ＧｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＡを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７ＧｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＣを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７ＧｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＧを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ｍ７ＧｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＵを含む。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ＧＡＧを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ＧＣＧを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ＧＵＧを含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、ＧＧＧを含む。
【０１７６】
インビトロ転写方法
本開示のいくつかの態様は、ＲＮＡ転写物の生成をもたらす条件下で、ＤＮＡ鋳型をＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントなどのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ）と接触させることを含む、ＲＮＡ転写物（例えば、ｍＲＮＡ転写物）を生成（合成）する方法を提供する。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、本方法は、ＲＮＡ転写物の生成をもたらす条件下で、ＤＮＡ鋳型を、Ｓ４３Ａ置換を有するＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、配列番号１、９９、または１００）バリアント（例えば、Ｓ４３Ａ  Ｔ７  ＲＮＡＰバリアントまたはＳ４３Ａ＊  Ｔ７  ＲＮＡＰバリアント）と接触させることを含む。他の実施形態では、本方法は、ＲＮＡ転写物の生成をもたらす条件下で、ＤＮＡ鋳型を、Ｇ４７Ａ置換を有するＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、配列番号１、９９、または１００）バリアント（例えば、Ｇ４７Ａ  Ｔ７  ＲＮＡＰバリアントまたはＧ４７Ａ＊  Ｔ７  ＲＮＡＰバリアント）と接触させることを含む。さらに他の実施形態では、本方法は、ＲＮＡ転写物の生成をもたらす条件下で、ＤＮＡ鋳型を、Ｒ２５７Ａ置換を有するＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、配列番号１、９９、または１００）バリアント（例えば、Ｒ２５７Ａ  Ｔ７  ＲＮＡＰバリアントまたはＲ２５７Ａ＊  Ｔ７  ＲＮＡＰバリアント）と接触させることを含む。さらに他の実施形態では、本方法は、ＲＮＡ転写物の生成をもたらす条件下で、ＤＮＡ鋳型を、Ｇ２５９Ａ置換を有するＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、配列番号１、９９、または１００）バリアント（例えば、Ｇ２５９Ａ  Ｔ７  ＲＮＡＰバリアントまたはＧ２５９Ａ＊  Ｔ７  ＲＮＡＰバリアント）と接触させることを含む。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、本方法は、ＤＮＡ鋳型を（少なくとも１つの）追加のＣ末端アミノ酸（例えば、Ｇｌｙ、Ａｌａ、ＧｌｙＧｌｙ、ＡｌａＡｌａ、ＧｌｙＡｌａ、またはＡｌａＧｌｙ）を含むＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントと接触させることを含む。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、本方法は、ＤＮＡ鋳型を、Ｅ４２Ｒ、Ｓ４３Ａ、Ｓ４３Ｅ、Ｓ４３Ｌ、Ｓ４３Ｒ、Ｅ４５Ｒ、Ｅ４５Ｌ、Ｍ４６Ａ、Ｇ４７Ａ、Ｇ４７Ｅ、Ｇ４７Ｌ、Ｇ４７Ｒ、Ｎ１６５Ｗ、Ｅ１６７Ｍ、Ｅ１６７Ｎ、Ｅ１６８Ｉ、Ｅ１６８Ｔ、Ｅ１６８Ｖ、Ａ１８１Ｆ、Ａ１８１Ｗ、Ｇ１８４Ｍ、Ｅ１８７Ｆ、Ａ２５５Ｑ、Ａ２５５Ｋ、Ａ２５５Ｉ、Ａ２５５Ｙ、Ｒ２５７Ａ、Ｒ２５７Ｅ、Ｒ２５７Ｌ、Ｒ２５７Ｗ、Ｇ２５９Ａ、Ｇ２５９Ｅ、Ｇ２５９Ｌ、Ｇ２５９Ｒ、Ａ２６０Ｗ、またはＡ２６０Ｒ置換、または前述の置換のうちの２つ以上及び任意選択による追加のＣ末端アミノ酸（例えば、Ｇｌｙ、Ａｌａ、ＧｌｙＧｌｙ、ＡｌａＡｌａ、ＧｌｙＡｌａ、またはＡｌａＧｌｙ）の任意の組み合わせを含むＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントと接触させることを含む。
【０１８０】
いくつかの態様では、本開示は、ＲＮＡ転写物の生成をもたらす条件下で、ヌクレオシド三リン酸及び緩衝液の存在下において、ＤＮＡ鋳型をＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントなどのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ）と接触させることを含む、ＩＶＴ反応を行う方法を提供する。
【０１８１】
本開示の他の態様は、インビトロ転写物を生成するための条件下で、ポリヌクレオチド鋳型をＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント、ヌクレオシド三リン酸、及びキャップ類似体と反応させてＲＮＡ転写物を生成することを含む、共転写キャッピング方法を提供する。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ合成のための共転写キャッピング方法は、ＲＮＡ転写物を生成するためのインビトロ転写反応条件下で、ポリヌクレオチド鋳型を（ａ）Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントであって、野生型ＲＮＡポリメラーゼと比較して、該ＲＮＡポリメラーゼバリアントが開始複合体から伸長複合体に移行するにつれてＲＮＡポリメラーゼバリアントの少なくとも１つのループ構造にヘリックス構造へのコンフォメーション変化を受けさせる少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、該Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント、（ｂ）ヌクレオシド三リン酸、及び（ｃ）配列ＧｐｐｐＡ２′ＯｍｅｐＧを含むトリヌクレオチドキャップと反応させることを含み、ポリヌクレオチド鋳型が、鋳型位置＋１に２´−デオキシチミジン残基を含む。
【０１８３】
ＩＶＴ条件は、典型的には、プロモーター、ヌクレオシド三リン酸、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）及びマグネシウムイオンを含む緩衝系、ならびにＲＮＡポリメラーゼを含む精製した線形ＤＮＡ鋳型を必要とする。転写反応で使用される正確な条件は、特定の用途に必要なＲＮＡの量に依拠する。典型的なＩＶＴ反応は、転写緩衝液中でＤＮＡ鋳型をＲＮＡポリメラーゼ及びＧＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ（またはヌクレオチド類似体）を含むヌクレオシド三リン酸とともにインキュベートすることにより行われる。５´末端グアノシン三リン酸を有するＲＮＡ転写物は、この反応から生成される。
【０１８４】
デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）は、単にＲＮＡポリメラーゼの核酸鋳型である。ＤＮＡ鋳型は、目的のポリペプチド（例えば、抗原性ポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドを含み得る。ＤＮＡ鋳型は、いくつかの実施形態では、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドから５´に位置し、該ポリヌクレオチドに機能的に連結されたＲＮＡポリメラーゼプロモーター（例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター）を含む。ＤＮＡ鋳型は、目的の遺伝子の３´末端に位置するポリアデニル化（ポリＡ）テールをコードするヌクレオチド配列も含み得る。
【０１８５】
目的のポリペプチドには、生物製剤、抗体、抗原（ワクチン）、及び治療用タンパク質が含まれるが、これらに限定されない。「タンパク質」という用語には、ペプチドが包含される。
【０１８６】
ＲＮＡ転写物は、いくつかの実施形態では、ＩＶＴ反応の産物である。ＲＮＡ転写物は、いくつかの実施形態では、ポリＡ尾部に連結された目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む修飾されたｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）である。
【０１８７】
ヌクレオチドは、窒素塩基、五炭糖（リボースまたはデオキシリボース）、及び少なくとも１つのリン酸基を含む。ヌクレオチドには、ヌクレオシド一リン酸、ヌクレオシド二リン酸、及びヌクレオシド三リン酸が含まれる。ヌクレオシド一リン酸（ＮＭＰ）には、リボースに結合した核酸塩基及び１つのリン酸が含まれる。ヌクレオシド二リン酸（ＮＤＰ）には、リボースに結合した核酸塩基及び２つのリン酸が含まれる。ヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）には、リボースに結合した核酸塩基及び３つのリン酸が含まれる。ヌクレオチド類似体は、ヌクレオチドの一般構造を有するか、またはヌクレオチドに構造的に類似した化合物である。ヌクレオチド類似体には、例えば、核酸塩基の類似体、糖の類似体、及び／またはヌクレオチドのリン酸基（複数可）の類似体が含まれる。
【０１８８】
ヌクレオシドは、窒素塩基及び五炭糖を含む。したがって、ヌクレオシドとリン酸基とにより、ヌクレオチドとなる。ヌクレオシド類似体は、ヌクレオシドの一般構造を有するか、またはヌクレオシドに構造的に類似した化合物である。例えば、ヌクレオシド類似体には、核酸塩基の類似体及び／またはヌクレオシドの糖の類似体が含まれる。
【０１８９】
「ヌクレオチド」という用語には、別段で明記しない限り、天然に存在するヌクレオチド、合成ヌクレオチド、及び修飾ヌクレオチドが含まれることを理解されたい。本明細書で提供される、例えばＩＶＴ反応においてＲＮＡの生成に使用される天然に存在するヌクレオチドの例には、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、及び５−メチルウリジン三リン酸（ｍ５ＵＴＰ）が含まれる。いくつかの実施形態では、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）、及び／またはウリジン二リン酸（ＵＤＰ）が使用される。
【０１９０】
ヌクレオチド類似体の例には、抗ウイルスヌクレオチド類似体、リン酸類似体（可溶性または固定化（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ）、加水分解性または非加水分解性）、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、例えば、キャップ類似体、または酵素キャッピングの前駆体／基質（ワクシニアまたはリガーゼ）、キャップもしくは５´部分（ＩＲＥＳ）のライゲーション／コンジュゲーションを促進するための官能基で標識されたヌクレオチド、キャップもしくは５´部分のライゲーションを促進するための５′ＰＯ４で標識されたヌクレオチド、または化学的もしくは酵素的に切断することができる官能基／保護基で標識されたヌクレオチが含まれるが、これらに限定されない。抗ウイルスヌクレオチド／ヌクレオシド類似体の例には、ガンシクロビル、エンテカビル、テルビブジン、ビダラビン、及びシドフォビルが含まれるが、これらに限定されない。
【０１９１】
修飾ヌクレオチドは、修飾核酸塩基を含み得る。例えば、本開示のＲＮＡ転写物（例えば、ｍＲＮＡ転写物）は、シュードウリジン（ψ）、１−メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）、１−エチルシュードウリジン、２−チオウリジン、４´−チオウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−シュードウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオ−ジヒドロシュードウリジン、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−シュードウリジン、４−メトキシ−２−チオ−シュードウリジン、４−メトキシ−シュードウリジン、４−チオ−１−メチル−シュードウリジン、４−チオ−シュードウリジン、５−アザ−ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５−メチルウリジン、５−メトキシウリジン（ｍｏ５Ｕ）、及び２´−Ｏ−メチルウリジンから選択される修飾核酸塩基を含み得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写物（例えば、ｍＲＮＡ転写物）には、前述の修飾核酸塩基のうちの少なくとも２つ（例えば、２、３、４つまたはそれ以上）の組み合わせが含まれる。
【０１９２】
本明細書で提供されるヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）は、非修飾もしくは修飾ＡＴＰ、修飾もしくは非修飾ＵＴＰ、修飾もしくは非修飾ＧＴＰ、及び／または修飾もしくは非修飾ＣＴＰを含み得る。いくつかの実施形態では、ＩＶＴ反応のＮＴＰは、非修飾ＡＴＰを含む。いくつかの実施形態では、ＩＶＴ反応のＮＴＰは、修飾ＡＴＰを含む。いくつかの実施形態では、ＩＶＴ反応のＮＴＰは、非修飾ＵＴＰを含む。いくつかの実施形態では、ＩＶＴ反応のＮＴＰは、修飾ＵＴＰを含む。いくつかの実施形態では、ＩＶＴ反応のＮＴＰは、非修飾ＧＴＰを含む。いくつかの実施形態では、ＩＶＴ反応のＮＴＰは、修飾ＧＴＰを含む。いくつかの実施形態では、ＩＶＴ反応のＮＴＰは、非修飾ＣＴＰを含む。いくつかの実施形態では、ＩＶＴ反応のＮＴＰは、修飾ＣＴＰを含む。
【０１９３】
ＩＶＴ反応において存在するヌクレオシド三リン酸及びキャップ類似体の濃度は変動し得る。いくつかの実施形態では、ＮＴＰ及びキャップ類似体は、反応において等モル濃度で存在する。いくつかの実施形態では、反応におけるキャップ類似体（例えば、トリヌクレオチドキャップ）とヌクレオシド三リン酸とのモル比は、１：１より大きい。例えば、反応におけるキャップ類似体とヌクレオシド三リン酸とのモル比は、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、５０：１、または１００：１であり得る。いくつかの実施形態では、反応におけるキャップ類似体（例えば、トリヌクレオチドキャップ）とヌクレオシド三リン酸とのモル比は、１：１未満である。例えば、反応におけるキャップ類似体（例えば、トリヌクレオチドキャップ）とヌクレオシド三リン酸とのモル比は、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１５、１：２０、１：２５、１：５０、または１：１００であり得る。
【０１９４】
ＩＶＴ反応におけるＮＴＰの組成も変化し得る。例えば、ＡＴＰは、ＧＴＰ、ＣＴＰ、及びＵＴＰより超過して使用され得る。非限定的な例として、ＩＶＴ反応には、７．５ミリモルのＧＴＰ、７．５ミリモルのＣＴＰ、７．５ミリモルのＵＴＰ、及び３．７５ミリモルのＡＴＰが含まれ得る。同じＩＶＴ反応には、３．７５ミリモルのキャップ類似体（例えば、トリヌクレオチドキャップ）が含まれ得る。いくつかの実施形態では、Ｇ：Ｃ：Ｕ：Ａ：キャップのモル比は、１：１：１：０．５：０．５である。いくつかの実施形態では、Ｇ：Ｃ：Ｕ：Ａ：キャップのモル比は、１：１：０．５：１：０．５である。いくつかの実施形態では、Ｇ：Ｃ：Ｕ：Ａ：キャップのモル比は、１：０．５：１：１：０．５である。いくつかの実施形態では、Ｇ：Ｃ：Ｕ：Ａ：キャップのモル比は、０．５：１：１：１：０．５である。
【０１９５】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写物（例えば、ｍＲＮＡ転写物）には、シュードウリジン（ψ）、１−メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）、５−メトキシウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、α−チオグアノシン、及びα−チオアデノシンから選択される修飾核酸塩基が含まれる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写物（例えば、ｍＲＮＡ転写物）には、前述の修飾核酸塩基のうちの少なくとも２つ（例えば、２、３、４つまたはそれ以上）の組み合わせが含まれる。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写物（例えばｍＲＮＡ転写物）には、シュードウリジン（ψ）が含まれる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写物（例えば、ｍＲＮＡ転写物）には、１−メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）が含まれる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写物（例えば、ｍＲＮＡ転写物）には、５−メトキシウリジン（ｍｏ５Ｕ）が含まれる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写物（例えば、ｍＲＮＡ転写物）には、５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）が含まれる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写物（例えば、ｍＲＮＡ転写物）には、α−チオ−グアノシンが含まれる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写物（例えば、ｍＲＮＡ転写物）には、α−チオ−アデノシンが含まれる。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、特定の修飾のために均一に修飾される（例えば、完全に修飾される、配列全体にわたって修飾される）。例えば、ポリヌクレオチドを１−メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）で均一に修飾することができ、このことは、ｍＲＮＡ配列中のすべてのウリジン残基が１−メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）で置換されることを意味する。同様に、ポリヌクレオチドは、上記のもののうちのいずれかなどの修飾残基での置換により、配列中に存在する任意の種類のヌクレオシド残基について均一に修飾することができる。あるいは、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、均一に修飾されていなくてもよい（例えば、部分的に修飾され、配列の一部が修飾されている）。各々の選択肢は、本発明の別々の実施形態を表す。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、緩衝系は、トリス（ｔｒｉｓ）を含む。例えば、ＩＶＴ反応で使用されるトリスの濃度は、少なくとも１０ｍＭ、少なくとも２０ｍＭ、少なくとも３０ｍＭ、少なくとも４０ｍＭ、少なくとも５０ｍＭ、少なくとも６０ｍＭ、少なくとも７０ｍＭ、少なくとも８０ｍＭ、少なくとも９０ｍＭ、少なくとも１００ｍＭ、または少なくとも１１０ｍＭのリン酸塩である。いくつかの実施形態では、リン酸塩の濃度は、２０〜６０ｍＭまたは１０〜１００ｍＭである。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、緩衝系は、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含む。ＩＶＴ反応で使用されるＤＴＴの濃度は、例えば、少なくとも１ｍＭ、少なくとも５ｍＭ、または少なくとも５０ｍＭであり得る。いくつかの実施形態では、ＩＶＴ反応で使用されるＤＴＴの濃度は、１〜５０ｍＭまたは５〜５０ｍＭである。いくつかの実施形態では、ＩＶＴ反応で使用されるＤＴＴの濃度は、５ｍＭである。
【０２００】
いくつかの実施形態では、緩衝系は、マグネシウムを含む。いくつかの実施形態では、ＩＶＴ反応において存在するＮＴＰとマグネシウムイオン（Ｍｇ２＋；例えばＭｇＣｌ２）とのモル比は、１：１〜１：５である。例えば、ＮＴＰとマグネシウムイオンとのモル比は、１：１、１：２、１：３、１：４、または１：５であり得る。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、ＩＶＴ反応において存在するＮＴＰ及びキャップ類似体（例えば、ＧＡＧなどのトリヌクレオチドキャップ）とマグネシウムイオン（Ｍｇ２＋；例えばＭｇＣｌ２）とのモル比は、１：１〜１：５である。例えば、ＮＴＰ＋トリヌクレオチドキャップ（例えば、ＧＡＧ）とマグネシウムイオンとのモル比は、１：１、１：２、１：３、１：４、または１：５であり得る。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、緩衝系は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、スペルミジン（例えば、１〜３０ｍＭの濃度）、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００（ポリエチレングリコールｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェニルエーテル）、及び／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。
【０２０３】
成長中のＲＮＡ鎖の３´末端へのヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）の付加は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼなどのポリメラーゼ、例えば、本開示のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントのいずれか１つ以上（例えば、Ｓ４３Ａ及び／またはＧ４７Ａ）によって触媒される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント）は、０．０１ｍｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌの濃度で反応（例えば、ＩＶＴ反応）において存在する。例えば、ＲＮＡポリメラーゼは、０．０１ｍｇ／ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、または１．０ｍｇ／ｍｌの濃度で反応において存在し得る。
【０２０４】
驚くべきことに、例えば、インビトロ転写反応において、本明細書で提供されるＴ７  ＲＮＡＰバリアント（例えば、Ｅ４２、Ｓ４３、Ｙ４４、Ｅ４５、Ｍ４６、Ｇ４７、Ａ２５５、Ｒ２５７、またはＧ２５９、例えばＳ４３ＡまたはＧ４７Ａ）とキャップ類似体（例えば、ＧｐｐｐＡ２′ＯｍｅｐＧ）とを組み合わせて使用すると、ＲＮＡ転写物が生成され、生成されたＲＮＡ転写物の８０％超が機能性キャップを含む。いくつかの実施形態では、生成されたＲＮＡ転写物の８５％超が機能性キャップを含む。いくつかの実施形態では、生成されたＲＮＡ転写物の９０％超が機能性キャップを含む。いくつかの実施形態では、生成されたＲＮＡ転写物の９５％超が機能性キャップを含む。いくつかの実施形態では、生成されたＲＮＡ転写物の９６％超が機能性キャップを含む。いくつかの実施形態では、生成されたＲＮＡ転写物の９７％超が機能性キャップを含む。いくつかの実施形態では、生成されたＲＮＡ転写物の９８％超が機能性キャップを含む。いくつかの実施形態では、生成されたＲＮＡ転写物の９９％超が機能性キャップを含む。
【０２０５】
また、鋳型位置＋１に２´−デオキシチミジン残基または２´−デオキシシチジン残基を含むポリヌクレオチド鋳型を使用すると、ＲＮＡ転写物が生成され、生成されたＲＮＡ転写物の８０％超（例えば、８５％超、９０％超、または９５％超）が機能性キャップを含むことが見出されたことは驚くべきことであった。したがって、いくつかの実施形態では、例えばＩＶＴ反応で使用されるポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ）鋳型は、鋳型位置＋１に２´−デオキシチミジン残基を含む。他の実施形態では、例えばＩＶＴ反応で使用されるポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ）鋳型は、鋳型位置＋１に２´−デオキシシチジン残基を含む。
【０２０６】
用途
本開示に従って生成されたＲＮＡ転写物には、ｍＲＮＡ（修飾ｍＲＮＡ及び／または非修飾ＲＮＡを含む）、ｌｎｃＲＮＡ、自己複製ＲＮＡ、環状ＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡなどが含まれる。実施形態では、ＲＮＡは、ポリペプチド（例えば、治療用ポリペプチド）をコードするＲＮＡ（例えばｍＲＮＡまたは自己複製ＲＮＡ）である。したがって、本開示のＲＮＡポリメラーゼバリアントを使用して生成されたＲＮＡ転写物は、非常に多くの用途で使用され得る。
【０２０７】
例えば、ＲＮＡ転写物は、目的のポリペプチド、例えば治療用タンパク質、ワクチン抗原などを生成するために使用され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写物は、治療用ＲＮＡである。治療用ｍＲＮＡは、治療用タンパク質をコードするｍＲＮＡである（「タンパク質」という用語には、ペプチドが包含される）。治療用タンパク質は、宿主細胞または対象における様々な効果を媒介して、疾患を治療し、または疾患の徴候及び症状を改善する。例えば、治療用タンパク質は、欠損または異常なタンパク質を置換し、内因性タンパク質の機能を増強し、細胞に新規機能を提供する（例えば、内因性細胞活性を阻害もしくは活性化し、または別の治療用化合物（例えば、抗体−抗体コンジュゲートなど）のための送達剤として作用する）。治療用ｍＲＮＡは、以下の疾患及び状態：細菌感染症、ウイルス感染症、寄生虫感染症、細胞増殖障害、遺伝障害、及び自己免疫障害の治療に有用であり得る。他の疾患及び状態が本明細書において包含される。
【０２０８】
本明細書で提供されるｍＲＮＡによってコードされる目的のタンパク質は、本質的に任意のタンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、治療用タンパク質は、サイトカイン、成長因子、抗体、または融合タンパク質である。治療用タンパク質の非限定的な例には、血液因子（ＶＩＩＩ因子及びＶＩＩ因子など）、補体因子、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）、及びＭＵＴ１が含まれる。サイトカインの非限定的な例には、インターロイキン、インターフェロン、ケモカイン、リンホカインなどが含まれる。成長因子の非限定的な例には、エリスロポエチン、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦ、ＩＧＦ、ＴＮＦ、ＣＳＦ、ＭＣＳＦ、ＧＭＣＳＦなどが含まれる。抗体の非限定的な例には、アダリムマブ、インフリキシマブ、リツキシマブ、イピリムマブ、トシリズマブ、カナキヌマブ、イトリズマブ、トラロキヌマブが含まれる。融合タンパク質の非限定的な例には、例えば、エタネルセプト、アバタセプト、及びベラタセプトが含まれる。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、ヒトエリスロポエチン、ＬＤＬＲ（コレステロールの阻害に使用）、またはＭＵＴ１（メチルマロン酸血症（ＭＭＡ）の治療に使用）である。他の実施形態では、ｍＲＮＡによってコードされる目的のタンパク質は、治療抗体であり、上記抗体を含むがこれらに限定されない。
【０２１０】
本明細書に開示されるＲＮＡポリメラーゼバリアントを使用して生成されたＲＮＡ転写物は、１つ以上の生物製剤をコードし得る。生物製剤は、重篤なもしくは生命を脅かす疾患または状態の治療、治癒、緩和、予防、または診断に使用され得るポリペプチドベースの分子である。生物学には、特に、アレルゲン抽出物（例えば、アレルギー注射（ｓｈｏｔ）及び検査用）、血液成分、遺伝子治療製品、移植に使用されるヒト組織または細胞製品、ワクチン、モノクローナル抗体、サイトカイン、成長因子、酵素、血栓溶解剤、及び免疫調整剤が含まれるが、これらに限定されない。
【０２１１】
現在市販されているまたは開発中の１つ以上の生物製剤は、本発明のＲＮＡによってコードされ得る。理論に拘束されることを望まないが、既知の生物製剤のコード化ポリヌクレオチドを本開示のＲＮＡに組み込むと、構築設計物の特異性、純度、及び／または選択性に少なくとも部分的に起因して、治療効果の改善がもたらされると考えられる。
【０２１２】
本明細書に開示されるＲＮＡポリメラーゼバリアントを使用して生成されたＲＮＡ転写物は、１つ以上の抗体をコードし得る。「抗体」という用語には、モノクローナル抗体（免疫グロブリンＦｃ領域を有する全長抗体を含む）、ポリエピトープ特異性を有する抗体組成物、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体、ダイアボディ、及び単鎖分子）、及び抗体断片が含まれる。「免疫グロブリン」（Ｉｇ）という用語は、本明細書において「抗体」と互換的に使用される。モノクローナル抗体は、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体である。すなわち、集団を構成する個々の抗体は、わずかな量で存在し得る起こり得る天然に存在する変異及び／または翻訳後修飾（例えば、異性化、アミド化）を除いて同一である。モノクローナル抗体は非常に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。
【０２１３】
モノクローナル抗体には、具体的には、重鎖及び／または軽鎖の一部が、特定の種に由来するか、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同であり、鎖（複数可）の残りが、別の抗体に由来するか、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同である、キメラ抗体（免疫グロブリン）、及び所望の生物学的活性を示す限り、そのような抗体の断片が含まれる。キメラ抗体には、非ヒト霊長類（例えば、旧世界猿、類人猿など）及びヒト定常領域配列に由来する可変ドメイン抗原結合配列を含む「霊長類化（ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ）」抗体が含まれるが、これらに限定されない。
【０２１４】
本開示のＲＮＡにコードされる抗体は、血液、心臓血管、ＣＮＳ、中毒（抗毒素を含む）、皮膚病学、内分泌学、胃腸、医用画像、筋骨格、腫瘍学、免疫学、呼吸器、感覚、及び抗感染症などの多くの治療分野における状態または疾患を治療するために利用され得る。
【０２１５】
本明細書に開示されるＲＮＡポリメラーゼバリアントを使用して生成されたＲＮＡ転写物は、１つ以上のワクチン抗原をコードし得る。ワクチン抗原は、特定の疾患または感染因子に対する免疫を改善する生物学的製剤である。現在市販されているまたは開発中の１つ以上のワクチン抗原は、本開示のＲＮＡによってコードされ得る。ＲＮＡにコードされたワクチン抗原は、がん、アレルギー、感染症などの多くの治療分野における状態または疾患を治療するために利用され得る。いくつかの実施形態では、がんワクチンは、コンカテマーまたはペプチドエピトープをコードする個々のＲＮＡまたはそれらの組み合わせの形態の個別化されたがんワクチンであり得る。
【０２１６】
本明細書に開示されるＲＮＡポリメラーゼバリアントを使用して生成されたＲＮＡ転写物は、１つ以上の抗菌ペプチド（ＡＭＰ）または抗ウイルスペプチド（ＡＶＰ）をコードするように設計され得る。ＡＭＰ及びＡＶＰは、限定するものではないが、微生物、無脊椎動物、植物、両生類、鳥類、魚類、及び哺乳類などの広範囲の動物から単離及び記述されている。抗菌ポリペプチドは、細胞融合及び／または１つ以上のエンベロプウイルス（例えば、ＨＩＶ、ＨＣＶ）によるウイルス侵入を遮断し得る。例えば、抗菌ポリペプチドは、領域、例えば、ウイルスエンベロープタンパク質、例えばＨＩＶ−１  ｇｐｌ２０またはｇｐ４１の膜貫通サブユニットの少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、または６０個のアミノ酸の連続配列に対応する合成ペプチドを含むか、またはそれからなることができる。ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０またはｇｐ４１のアミノ酸及びヌクレオチド配列は、例えば、Ｋｕｉｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００８）．「ＨＩＶ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ」，Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに記載されている。
【０２１７】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写物は、放射標識ＲＮＡプローブとして使用される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写物は、非同位体ＲＮＡ標識のために使用される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写物は、遺伝子ターゲティングのためのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）として使用される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写物（例えば、ｍＲＮＡ）は、インビトロ翻訳及び微量注入に使用される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写物は、ＲＮＡ構造、プロセシング、及び触媒研究に使用される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写物は、ＲＮＡ増幅に使用される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写物は、遺伝子発現実験のためのアンチセンスＲＮＡとして使用される。他の用途が本開示に包含される。
【０２１８】
組成物
本開示のＴ７  ＲＮＡＰバリアントは、いくつかの実施形態では、ＩＶＴ反応においてトリヌクレオチドキャップなどのキャップ類似体と組み合わせて使用されるとき、ＩＶＴ後の精製がなくても、検出可能なサイトカイン応答を誘導しないＲＮＡを生成する。したがって、いくつかの実施形態では、ＩＶＴ  ＲＮＡ及び薬学的に許容される賦形剤を含む組成物であって、ＩＶＴ後の精製なしで、サイトカイン誘導ＲＮＡ混入物を実質的に含まない（例えば、含まないか、または１０％未満、１％未満、０．１％未満、または０．０１％未満含む）、該組成物が本明細書で提供される。
【０２１９】
本明細書の他の箇所で説明するように、本開示のＴ７  ＲＮＡＰバリアント及び本開示の方法はＲＮＡ転写物を生成し、該転写物の少なくとも８０％（例えば、８０％〜９０％、８０〜９５％、９０〜９５％、８０〜９９％、９０〜９９％、または９０〜１００％）は機能的なキャップを含む。したがって、ＩＶＴ  ＲＮＡ及び薬学的に許容される賦形剤を含む組成物も本明細書で提供され、組成物は、２０％（例えば、５〜１５％、５〜１０％、１〜１５％、または１〜１０％）未満のキャップされていないＲＮＡ種を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、１５％（例えば、５〜１０％、１〜１０％、または１〜５％）未満のキャップされていないＲＮＡ種を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、１０％未満のキャップされていないＲＮＡ種を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、５％未満のキャップされていないＲＮＡ種を含む。
【０２２０】
いくつかの実施形態では、ＩＶＴ  ＲＮＡの８０％超が機能性キャップを含む。いくつかの実施形態では、ＩＶＴ  ＲＮＡの８５％超が機能性キャップを含む。いくつかの実施形態では、ＩＶＴ  ＲＮＡの９０％超が機能性キャップを含む。いくつかの実施形態では、ＩＶＴ  ＲＮＡの９５％超が機能性キャップを含む。
【０２２１】
いくつかの実施形態では、ＩＶＴ  ＲＮＡは化学修飾されていないが、他の実施形態では、ＩＶＴ  ＲＮＡは化学修飾されている。
【０２２２】
いくつかの実施形態では、予想外に、ＩＶＴ  ＲＮＡの８０％超が一本鎖完全長転写物を含む。例えば、ＩＶＴ  ＲＮＡの８５％超が一本鎖完全長転写物を含み得る。いくつかの実施形態では、ＩＶＴ  ＲＮＡの９０％超が一本鎖完全長転写物を含み、ＩＶＴ  ＲＮＡの９５％超が一本鎖完全長転写物を含む。
【０２２３】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、ＲＮＡ転写物を生成するためのインビトロ転写反応条件下で、ポリヌクレオチド鋳型を（ａ）Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントであって、野生型ＲＮＡポリメラーゼと比較して、該ＲＮＡポリメラーゼバリアントが開始複合体から伸長複合体に移行するにつれてＲＮＡポリメラーゼバリアントの少なくとも１つのループ構造にヘリックス構造へのコンフォメーション変化を受けさせる少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、該Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント、（ｂ）ヌクレオシド三リン酸、及び（ｃ）配列ＧｐｐｐＡ２′ＯｍｅｐＧを含むトリヌクレオチドキャップと反応させることを含む方法によって生成され、ポリヌクレオチド鋳型は、鋳型位置＋１に２´−デオキシチミジン残基を含む。
【０２２４】
キット
本開示のＲＮＡポリメラーゼバリアントを含むインビトロ転写キットなどのキットも本明細書で提供される。キットは、本明細書に記載の任意の１つ以上（少なくとも１つ）のＩＶＴ成分及び任意の１つ以上（少なくとも１つ）のＲＮＡポリメラーゼバリアントを含み得る。例えば、キットは、緩衝系、ＮＴＰ、及び位置Ｅ４２、Ｓ４３、Ｙ４４、Ｅ４５、Ｍ４６、Ｇ４７、Ａ２５５、Ｒ２５７、Ａ２５８、Ｇ２５９、Ａ２６０、Ｌ２６１及び／またはＡ２６２における少なくとも１つ（もしくは少なくとも２つ、または少なくとも３つ）のアミノ酸置換ならびに任意選択によりＣ末端において少なくとも１つのアミノ酸付加を有する配列番号１、９９、または１００のアミノ酸配列を有するＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントを含み得る。
【０２２５】
追加の実施形態
本開示の追加の実施形態には、以下の番号の段落のものが包含される：
段落１．リボ核酸（ＲＮＡ）ポリメラーゼバリアントであって、野生型ＲＮＡポリメラーゼと比較して、前記ＲＮＡポリメラーゼバリアントが開始複合体から伸長複合体に移行するにつれて前記ＲＮＡポリメラーゼバリアントの少なくとも１つのループ構造にヘリックス構造へのコンフォメーション変化を受けさせる少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、前記リボ核酸（ＲＮＡ）ポリメラーゼバリアント。
【０２２６】
段落２．前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、野生型アミノ酸と比較して高いヘリックス性向を有する、段落１に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【０２２７】
段落３．前記ＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼである、段落１または２に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【０２２８】
段落４．前記少なくとも１つのループ構造が、Ｃヘリックス構造中にある、段落１〜３のいずれか１つに記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【０２２９】
段落５．前記少なくとも１つのループ構造が、Ｃリンカー構造中にある、段落１〜４のいずれか１つに記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【０２３０】
段落６．前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、少なくとも１つの高ヘリックス性向アミノ酸置換である、段落１〜４のいずれか１つに記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【０２３１】
段落７．前記少なくとも１つの高ヘリックス性向酸置換が、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、リジン、グルタミン、及び／またはグルタミン酸から選択される、段落６に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【０２３２】
段落８．前記少なくとも１つの高ヘリックス性向アミノ酸置換が、アラニンである、段落７に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【０２３３】
段落９．前記Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼが、Ｅ４２、Ｓ４３、Ｙ４４、Ｅ４５、Ｍ４６、Ｇ４７、Ｒ２５７、及びＧ２５９から選択される位置に高ヘリックス性向アミノ酸の少なくとも１つのアミノ酸置換を含むように修飾された、配列番号１、配列番号９９、または配列番号１００によって特定されるアミノ酸配列を含む、段落４〜８のいずれか１つに記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【０２３４】
段落１０．前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｓ４３Ａを含む、段落９に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【０２３５】
段落１１．前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｇ４７Ａを含む、段落９に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【０２３６】
段落１２．前記Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼが、Ｒ２５７、Ａ２５８、Ｇ２５９、Ａ２６０、Ｌ２６１及びＡ２６２から選択される位置に高ヘリックス性向アミノ酸の少なくとも１つのアミノ酸置換を含むように修飾された、配列番号１、配列番号９９、または配列番号１００によって特定されるアミノ酸配列を含む、段落５〜８のいずれか１つに記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【０２３７】
段落１３．前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｒ２５７Ａを含む、段落１２に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【０２３８】
段落１４．前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｇ２５９Ａを含む、段落１２に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【０２３９】
段落１５．Ｇ４７、Ｓ４３、Ｒ２５７、またはＧ２５９の位置における高ヘリックス性向アミノ酸のアミノ酸置換を含むように修飾された、配列番号１、配列番号９９、または配列番号１００によって特定されるアミノ酸配列を含む、Ｔ７リボ核酸（ＲＮＡ）ポリメラーゼ。
【０２４０】
段落１６．前記高ヘリックス性向アミノ酸が、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、リジン、グルタミン、及び／またはグルタミン酸から選択される、段落１５に記載のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ。
【０２４１】
１７．前記高ヘリックス性向アミノ酸が、アラニンである、段落１６に記載のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ。
【０２４２】
段落１８．配列番号２、配列番号１０７、または配列番号１０８によって特定されるアミノ酸配列を含む、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ。
【０２４３】
段落１９．配列番号３、配列番号１０９、または配列番号１１０によって特定されるアミノ酸配列を含む、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ。
【０２４４】
段落２０．配列番号４、配列番号１１１、または配列番号１１２によって特定されるアミノ酸配列を含む、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ。
【０２４５】
段落２１．配列番号５、配列番号１１３、または配列番号１１４によって特定されるアミノ酸配列を含む、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ。
【０２４６】
段落２２．ＲＮＡ転写物の生成をもたらす条件下で、ＤＮＡ鋳型を段落１〜２１のいずれか１つに記載のＲＮＡポリメラーゼと接触させることを含む、リボ核酸（ＲＮＡ）を生成する方法。
【０２４７】
段落２３．ヌクレオシド三リン酸及び緩衝液の存在下において、ＲＮＡ転写物の生成をもたらす条件下で、ＤＮＡ鋳型を段落１〜２１のいずれか１つに記載のＲＮＡポリメラーゼと接触させることを含む、インビトロ転写（ＩＶＴ）反応を行う方法。
【０２４８】
段落２４．前記生成されたＲＮＡ転写物が、任意選択により未精製形態で細胞に送達されたときに、野生型ＲＮＡポリメラーゼを使用して生成されたＲＮＡと比較して少なくとも５０％低いサイトカイン応答を刺激する、段落２３に記載の方法。
【０２４９】
段落２５．ＩＶＴにより生成された前記二本鎖ＲＮＡ転写物の濃度が、野生型ポリメラーゼを用いて生成されたｄｓＲＮＡ転写物と比較して少なくとも５０％低い、段落２３〜２４のいずれか１つに記載の方法。
【０２５０】
段落２６．前記生成されたＲＮＡ転写物の２０％未満が、３´不均一性を示す、段落２３〜２５のいずれか１つに記載の方法。
【０２５１】
段落２７．前記生成されたＲＮＡ転写物の５０％未満が、切断型ＲＮＡ転写物である、段落２３〜２６のいずれか１つに記載の方法。
【０２５２】
段落２８．前記生成されたＲＮＡ転写物の５０％未満が、ランオンＲＮＡ転写物である、段落２３〜２８のいずれか１つに記載の方法。
【０２５３】
段落２９．前記生成された完全長ＲＮＡ転写物の量が、前記ＤＮＡ鋳型の量よりも少なくとも１５倍多い、段落２３〜２８のいずれか１つに記載の方法。
【０２５４】
段落３０．切断型ＲＮＡ転写物：生成された完全長ＲＮＡ転写物の比が、１：１未満である、段落２３〜２９のいずれか１つに記載の方法。
【０２５５】
段落３１．前記生成されたＲＮＡ転写物が、前記ＤＮＡ鋳型と比較して１００ヌクレオチドあたり１未満の変異を有する、段落２３〜３０のいずれか１つに記載の方法。
【０２５６】
段落３２．段落１〜２１のいずれか１つに記載のＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸。
【０２５７】
段落３３．段落３３の核酸を含むベクター。
【０２５８】
段落３４．段落３３に記載の核酸または段落３４に記載のベクターを含む宿主細胞。
【０２５９】
段落３５．段落１〜２１のいずれか１つに記載のＲＮＡポリメラーゼを含むキット。
【０２６０】
段落３６．段落１〜２１のいずれか１つに記載のＲＮＡポリメラーゼを含む組成物。
【０２６１】
段落３７．段落２２〜３１のいずれか１つに記載の方法で生成されたリボ核酸（ＲＮＡ）。
【０２６２】
段落３８．脂質ナノ粒子中に製剤化された段落３７に記載のＲＮＡ。
【０２６３】
段落３９．前記脂質ナノ粒子が、２０〜６０％のイオン化可能なアミノ脂質、５〜２５％の非カチオン性脂質、２５〜５５％のステロール、及び０．５〜１５％のＰＥＧ修飾脂質のモル比を含む、段落３８に記載のＲＮＡ。
【０２６４】
段落４０．ＲＮＡ転写物を生成するためのインビトロ転写反応条件下で、ポリヌクレオチド鋳型をＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント、ヌクレオシド三リン酸、及びキャップ類似体と反応させることを含む、リボ核酸（ＲＮＡ）合成のための共転写キャッピング方法。
【０２６５】
段落４１．前記生成されたＲＮＡ転写物の８０％超、８５％超、または９０％超が、機能性キャップを含む、段落４０に記載の方法。
【０２６６】
段落４２．前記生成されたＲＮＡ転写物の９５％超が、機能性キャップを含む、段落４１に記載の方法。
【０２６７】
段落４３．前記ヌクレオシド三リン酸が、非修飾もしくは修飾ＡＴＰ、修飾もしくは非修飾ＵＴＰ、修飾もしくは非修飾ＧＴＰ、及び／または修飾もしくは非修飾ＣＴＰを含む、段落４０〜４２のいずれか１つに記載の方法。
【０２６８】
段落４４．前記Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントが、段落１〜２１のいずれか１つに記載のＴ７ポリメラーゼバリアントである、段落４０〜４３のいずれか１つに記載の方法。
【０２６９】
段落４５．前記Ｔ７ポリメラーゼバリアントが、Ｅ４２、Ｓ４３、Ｙ４４、Ｅ４５、Ｍ４６、Ｇ４７、Ｒ２５７、及びＧ２５９から選択される位置に高性向アミノ酸の少なくとも１つのアミノ酸置換を含むように修飾された配列番号１、配列番号９９、または配列番号１００によって特定されるアミノ酸配列を含む、段落４４に記載の方法。
【０２７０】
段落４６．前記Ｔ７ポリメラーゼバリアントが、Ｇ４７Ａの位置にアミノ酸置換を含むように修飾された配列番号１、配列番号９９、または配列番号１００によって特定されるアミノ酸配列を含む、段落４０〜４５のいずれか１つに記載の方法。
【０２７１】
段落４７．前記Ｔ７ポリメラーゼバリアントが、Ｓ４３Ａのアミノ酸置換を含むように修飾された配列番号１、配列番号９９、または配列番号１００によって特定されるアミノ酸配列を含む、段落４０〜４５のいずれか１つに記載の方法。
【０２７２】
段落４８．前記ヌクレオシド三リン酸及びキャップ類似体が、前記反応において等モル濃度で存在する、段落４０〜４７のいずれか１つに記載の方法。
【０２７３】
段落４９．前記反応におけるキャップ類似体とヌクレオシド三リン酸とのモル比が１：１より大きい、段落４０〜４７のいずれか１つに記載の方法。
【０２７４】
５０．前記反応におけるキャップ類似体とヌクレオシド三リン酸のモル比が１：１未満である、段落４０〜４７のいずれか１つに記載の方法。
【０２７５】
段落５１．前記キャップ類似体が、ジヌクレオチドキャップ、トリヌクレオチドキャップ、またはテトラヌクレオチドキャップである、段落４０〜５０のいずれか１つに記載の方法。
【０２７６】
段落５２．キ前記ャップ類似体が、トリヌクレオチドキャップである、段落４０〜５０のいずれか１つに記載の方法。
【０２７７】
段落５３．前記トリヌクレオチドキャップが、以下の配列：ＧＡＡ、ＧＡＣ、ＧＡＧ、ＧＡＵ、ＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、ＧＣＵ、ＧＧＡ、ＧＧＣ、ＧＧＧ、ＧＧＵ、ＧＵＡ、ＧＵＣ、ＧＵＧ、及びＧＵＵから選択される配列を含む、段落５１に記載の方法。
【０２７８】
段落５４．前記トリヌクレオチドキャップが、以下の配列：ｍ７ＧｐｐｐＡｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＡｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＡｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＡｐＵ、ｍ７ＧｐｐｐＣｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＣｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＣｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＣｐＵ、ｍ７ＧｐｐｐＧｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＧｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＧｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＧｐＵ、ｍ７ＧｐｐｐＵｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＵｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＵｐＧ、及びｍ７ＧｐｐｐＵｐＵから選択される配列を含む、段落５３に記載の方法。
【０２７９】
段落５５．前記トリヌクレオチドキャップが、以下の配列：ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡｐＡ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡｐＣ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡｐＧ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡｐＵ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣｐＡ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣｐＣ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣｐＧ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣｐＵ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧｐＡ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧｐＣ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧｐＧ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧｐＵ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵｐＡ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵｐＣ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵｐＧ、及びｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵｐＵから選択される配列を含む、段落５３に記載の方法。
【０２８０】
段落５６．前記トリヌクレオチドキャップが、以下の配列：ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＡ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＣ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＧ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＵ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＡ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＣ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＧ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＵ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＡ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＣ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＧ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＵ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＡ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＣ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＧ、及びｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＵから選択される配列を含む、段落５３に記載の方法。
【０２８１】
段落５７．前記トリヌクレオチドキャップが、以下の配列：ｍ７ＧｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＵ、ｍ７ＧｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＵ、ｍ７ＧｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＵ、ｍ７ＧｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＧ、及びｍ７ＧｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＵから選択される配列を含む、段落５３に記載の方法。
【０２８２】
段落５８．前記トリヌクレオチドキャップが、以下の配列：ＧＡＧ、ＧＣＧ、ＧＵＧ、及びＧＧＧから選択される配列を含む、段落５３〜５７のいずれか１つに記載の方法。
【０２８３】
段落５９．前記トリヌクレオチドキャップが、配列ＧＡＧを含む、段落５８に記載の方法。
【０２８４】
段落６０．前記トリヌクレオチドキャップが、ＧｐｐｐＡ２′ＯｍｅｐＧを含む、段落５９に記載の方法。
【０２８５】
段落６１．前記ポリヌクレオチド鋳型が、鋳型位置＋１に２´−デオキシチミジン残基を含む、段落４０〜６０のいずれか１つに記載の方法。
【０２８６】
段落６２．前記ポリヌクレオチド鋳型が、鋳型位置＋１に２´−デオキシシチジン残基を含む、段落４０〜６０のいずれか１つに記載の方法。
【０２８７】
段落６３．ＲＮＡ合成のための共転写キャッピング方法であって、ＲＮＡ転写物を生成するためのインビトロ転写反応条件下で、ポリヌクレオチド鋳型を（ａ）Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントであって、野生型ＲＮＡポリメラーゼと比較して、前記ＲＮＡポリメラーゼバリアントが開始複合体から伸長複合体に移行するにつれてＲＮＡポリメラーゼバリアントの少なくとも１つのループ構造にヘリックス構造へのコンフォメーション変化を受けさせる少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、前記Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント、（ｂ）ヌクレオシド三リン酸、及び（ｃ）配列ＧｐｐｐＡ２′ＯｍｅｐＧを含むトリヌクレオチドキャップと反応させることを含み、前記ポリヌクレオチド鋳型が、鋳型位置＋１に２´−デオキシチミジン残基を含む、前記方法。
【０２８８】
段落６４．前記生成されたＲＮＡ転写物が、任意選択により未精製形態で細胞に送達されたときに、検出可能なサイトカイン応答を刺激しない、段落４０〜６３のいずれか１つに記載の方法。
【０２８９】
段落６５．インビトロ転写（ＩＶＴ）ＲＮＡ及び薬学的に許容される賦形剤を含む組成物であって、ＩＶＴ後の精製なしでサイトカイン誘導性ＲＮＡ混入物を実質的に含まない、前記組成物。
【０２９０】
段落６６．インビトロ転写（ＩＶＴ）ＲＮＡ及び薬学的に許容される賦形剤を含む組成物であって、５％未満のキャップされていないＲＮＡ種を有する、前記組成物。
【０２９１】
段落６７．前記ＩＶＴ  ＲＮＡの８０％、８５％、または９０％超が機能性キャップを含む、段落６５または６６に記載の組成物。
【０２９２】
段落６８．前記ＩＶＴ  ＲＮＡの９５％超が機能性キャップを含む、段落６７に記載の組成物。
【０２９３】
段落６９．前記ＩＶＴ  ＲＮＡが化学修飾されていない、段落６５〜６８のいずれか１つに記載の組成物。
【０２９４】
段落７０．前記ＩＶＴ  ＲＮＡが化学修飾されている、項６５〜６８のいずれか１項に記載の組成物。
【０２９５】
段落７１．前記ＩＶＴ  ＲＮＡの９５％超が一本鎖完全長転写物を含む、段落６５〜７０のいずれか１つに記載の組成物。
【０２９６】
段落７２．前記ＲＮＡが、
ＲＮＡ転写物を生成するためのインビトロ転写反応条件下で、ポリヌクレオチド鋳型を（ａ）Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントであって、野生型ＲＮＡポリメラーゼと比較して、前記ＲＮＡポリメラーゼバリアントが開始複合体から伸長複合体に移行するにつれてＲＮＡポリメラーゼバリアントの少なくとも１つのループ構造にヘリックス構造へのコンフォメーション変化を受けさせる少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、前記Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント、（ｂ）ヌクレオシド三リン酸、及び（ｃ）配列ＧｐｐｐＡ２′ＯｍｅｐＧを含むトリヌクレオチドキャップと反応させることを含むプロセスによって生成され、前記ポリヌクレオチド鋳型が、鋳型位置＋１に２´−デオキシチミジン残基を含む、請求項６５〜７１のいずれか１項に記載の組成物。
【０２９７】
段落７３．野生型Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼと比較して少なくとも１つの追加のＣ末端アミノ酸を含む、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ。
【０２９８】
段落７４．少なくとも２つの追加のＣ末端アミノ酸を含む、段落７３に記載のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ。
【０２９９】
段落７５．前記少なくとも２つの追加のＣ末端アミノ酸が、同じ種類のアミノ酸または少なくとも２つの異なる種類のアミノ酸を含む、段落７４に記載のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ。
【０３００】
段落７６．１〜１０個の追加のＣ末端アミノ酸を含む、段落７３〜７５のいずれか１つに記載のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ。
【０３０１】
段落７７．１〜５個の追加のＣ末端アミノ酸を含む、段落７６に記載のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ。
【０３０２】
段落７８．前記Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼがＦＡＦＡＸｎ（配列番号１７１）モチーフを含むＣ末端を含み、Ｘが任意のアミノ酸であり、ｎがゼロより大きい任意の整数である、段落７３〜７７のいずれか１つに記載のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ。
【０３０３】
段落７９．ＸがＧまたはＡであり、任意選択により、ＸｎがＧＧまたはＡＡである、段落７８に記載のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ。
【０３０４】
段落８０．ｎが１、２、３、４、または５である、段落７８または７９に記載のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ
【０３０５】
段落８１．ＦＡＦＡＧ（配列番号３２９）モチーフを含むＣ末端を含む、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ。
【０３０６】
段落８２．  ＸＡＦＡＸｎモチーフ、ＦＡＸＡＸｎモチーフ、ＦＡＸＡＸｎモチーフ、またはＦＡＦＸＸｎモチーフを含むＣ末端を含み、各Ｘが任意のアミノ酸であり、ｎがゼロより大きい任意の整数である、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ。
【０３０７】
段落８３．前記Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼが、野生型Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの位置Ｓ４３、Ｇ４７、Ｒ２５７、またはＧ２５９に対応する位置に少なくとも１つの置換及び任意選択により少なくとも１つの追加の置換を含む、段落７３〜８２のいずれか１つに記載のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ。
【０３０８】
段落８４．前記野生型Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼが、配列番号１により特定されるアミノ酸配列を含む、段落８３に記載のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ。
【０３０９】
段落８５．Ｇ４７、Ｓ４３、Ｒ２５７、及びＧ２５９から選択される少なくとも１つの置換、及び任意選択により少なくとも１つの追加のアミノ酸置換を含むように修飾された配列番号９９のアミノ酸配列を含む、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ。
【０３１０】
段落８６．Ｇ４７、Ｓ４３、Ｒ２５７、及びＧ２５９から選択される少なくとも１つの置換、及び任意選択により少なくとも１つの追加のアミノ酸置換を含むように修飾された配列番号１００、２９４、２９６、または２９６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ。
【０３１１】
段落８７．Ｓ４３Ａ、Ｇ４７Ａ、Ｒ２５７Ａ、及びＧ２５９Ａから選択される少なくとも１つの置換を含む、段落８３〜８６のいずれか１つに記載のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ。
【０３１２】
段落８８．配列番号２９４〜３１３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＴ７  ＲＮＡポリメラーゼであって、ｘは任意のアミノ酸であり、ｎは任意の整数、例えば１〜５（例えば、１、２、３、４、または５）であり、任意選択により、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼが少なくとも１つの追加のアミノ酸置換をさらに含む、前記Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ。
【０３１３】
段落８９．ヌクレオシド三リン酸及び緩衝液の存在下において、ＲＮＡ転写物の生成をもたらす条件下で、ＤＮＡ鋳型を段落７３〜８８のいずれかのＲＮＡポリメラーゼと接触させることを含む、インビトロ転写（ＩＶＴ）反応を行う方法。
【０３１４】
段落９０．前記生成されたＲＮＡが、細胞に送達されたときに、ＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡＰを用いて生成されたｄｓＲＮＡ転写物と比較して少なくとも５０％低いサイトカイン応答を刺激する、段落８９に記載の方法。
【０３１５】
９１．前記ＲＮＡが未精製の形態で細胞に送達される、段落９０に記載の方法。
【０３１６】
段落９２．前記生成されたＲＮＡ転写物の３０％未満が３´不均一性を示す、段落８９〜９２のいずれか１つに記載の方法。
【０３１７】
段落９３．段落７３〜９２のいずれか１つに記載のＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸。
【０３１８】
段落９４．段落９３の核酸を含むベクター。
【０３１９】
段落９５．段落９３の核酸または段落９４のベクターを含む宿主細胞。
【０３２０】
段落９６．段落７３〜９２のいずれか１つに記載のＲＮＡポリメラーゼを含むキット。
【０３２１】
段落９７．段落７３〜９２のいずれか１つに記載のＲＮＡポリメラーゼを含む組成物。
【０３２２】
段落９８．段落８９〜９２のいずれか１つに記載の方法によって生成されたリボ核酸（ＲＮＡ）。
【０３２３】
段落９９．脂質ナノ粒子中に製剤化された段落９８に記載のＲＮＡ。
【０３２４】
段落１００．前記脂質ナノ粒子が、２０〜６０％のイオン化可能なアミノ脂質、５〜２５％の非カチオン性脂質、２５〜５５％のステロール、及び０．５〜１５％のＰＥＧ修飾脂質のモル比を含む、段落９８に記載のＲＮＡ。
【０３２５】
段落１０１．対応する野生型ＲＮＡポリメラーゼと比較して少なくとも１つの追加のＣ末端アミノ酸を含むＲＮＡポリメラーゼであって、任意選択により、少なくとも１つの追加のＣ末端アミノ酸が、グリシン（Ｇ）及び／またはアラニン（Ａ）を含む、前記ＲＮＡポリメラーゼ。
【０３２６】
段落１０２．前記ＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ、及びＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼから選択される、段落１０１に記載のＲＮＡポリメラーゼ。
【０３２７】
段落１０３．前記ＲＮＡポリメラーゼが、少なくとも１つの追加のアミノ酸置換をさらに含み、任意選択により、Ｓ４３Ａ、Ｇ４７Ａ、Ｒ２５７Ａ、及びＧ２５９Ａから選択される配列番号１のアミノ酸置換に対応するアミノ酸置換をさらに含む、段落１０１または１０２に記載のＲＮＡポリメラーゼ。
【０３２８】
段落１０４．前記ＲＮＡポリメラーゼが、４３位、４７位、２５７位、及び／または２５９位にアミノ酸置換を含むように修飾された配列番号１と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含むＴ７  ＲＮＡポリメラーゼであり、任意選択により、アミノ酸置換がアラニン（Ａ）である、段落１０１〜１０４のいずれか１つに記載のＲＮＡポリメラーゼ。
【０３２９】
段落１０５．前記ＲＮＡポリメラーゼが、４４位、４８位、２５８位、及び／または  ２６０位にアミノ酸置換を含むように修飾された配列番号６と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含むＴ３  ＲＮＡポリメラーゼであり、任意選択により、アミノ酸置換がアラニン（Ａ）である、段落１０１〜１０４のいずれか１つに記載のＲＮＡポリメラーゼ。
【０３３０】
段落１０６．  前記ＲＮＡポリメラーゼが、１５位、１９位、２３０位、及び／または  ２３２位にアミノ酸置換を含むように修飾された配列番号７と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含むＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼであり、任意選択により、アミノ酸置換がアラニン（Ａ）である、段落１０１〜１０４のいずれか１つに記載のＲＮＡポリメラーゼ。
【０３３１】
段落１０７．４３位、４７位、２５７位、及び／または２５９位にアミノ酸置換を含むように修飾された配列番号１と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含み、任意選択により、アミノ酸置換がアラニン（Ａ）である、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ。
【０３３２】
段落１０８．４４位、４８位、２５８位、及び／または２６０位にアミノ酸置換を含むように修飾された配列番号６と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含み、任意選択により、アミノ酸置換がアラニン（Ａ）である、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ。
【０３３３】
段落１０９．１５位、１９位、２３０位、及び／または２３２位にアミノ酸置換を含むように修飾された配列番号７と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含み、任意選択により、アミノ酸置換がアラニン（Ａ）である、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ。
【表１】
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【表２】
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【実施例】
【０３３４】
実施例１．バリアントＴ７  ＲＮＡポリメラーゼの生成
Ｃヘリックス及びＣリンカーＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントを、表３及び表４に示される置換を用いて生成した。
【表３】
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【表４】
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【０３３５】
実施例２．Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントを使用して生成されたｈＥＰＯ  ｍＲＮＡの純度は、野生型Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用して生成されたｈＥＰＯ  ｍＲＮＡの純度に匹敵する。
ｈＥＰＯ  ＤＮＡ鋳型、ならびに（１）野生型（ＷＴ）Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（ＷＴ  ＃１及びＷＴ  ＃２）、（２）Ｇ４７Ａ  Ｃ末端Ｇ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント（「Ｇ４７Ａ＊」）（配列番号１１０）、及び（３）Ｓ４３Ａ  Ｃ末端Ｇ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント（「Ｓ４３Ａ＊」）（配列番号１０８）を使用して、インビトロ転写反応を行った。ＤＢＡＡ（ジブチルアンモニウムアセテート）ＨＰＬＣ分析は、すべてのｈＥＰＯ転写物の純度がほぼ同じであったことを示した（図１）。
【０３３６】
実施例３．  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントを使用して生成されたｈＥＰＯ  ｍＲＮＡは、細胞サイトカイン応答を示さない。
ＢＪ線維芽細胞を、実施例２に記載されるＩＶＴ反応により生成されたｈＥＰＯ  ｍＲＮＡでトランスフェクトした。ｍＲＮＡを、精製しないか、または逆相（ＲＰ）クロマトグラフィーにより精製した。図２（左のグラフ）に示されるように、Ｓ４３Ａ＊  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントまたはＧ４７Ａ＊  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントを使用して生成された精製されていないｍＲＮＡは、ＷＴ  Ｔ７ポリメラーゼを使用して生成された精製されたｍＲＮＡと同程度に「コールド（ｃｏｌｄ）」（サイトカイン応答を示さなかった）であった。ほぼ同等のｍＲＮＡ発現レベルを、図２（右のグラフ）に示す。これらの実験で使用されたｍＲＮＡは、いずれのヌクレオチド修飾も含まなかった。
【０３３７】
ｍ１ψヌクレオチド修飾（図３、上のグラフ）またはｍｏ５Ｕヌクレオチド修飾（図３、下のグラフ）のいずれかを含むｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを使用して、同様の細胞トランスフェクションアッセイを繰り返した。Ｇ４７Ａ＊及びＳ４３Ａ＊  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントを使用して生成された精製されていないｍ１ψ  ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡでトランスフェクトされたＢＪ線維芽細胞は、ＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用して生成された精製されていないｍ１ψ  ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡでトランスフェクトされた細胞より低いＩＦＮβ応答を示した。ほぼ同等のｍＲＮＡ発現レベルを、図４に示す。
【０３３８】
次いで、単球由来マクロファージ（ＭＤＭ）を使用して、さらにサイトカイン応答を試験した。ＩＰ１０対ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）の比を、実施例２に記載される条件下で生成されたｈＥＰＯ  ｍＲＮＡでトランスフェクトされたＭＤＭで測定した。ＭＤＭは、非修飾化学に対して非常に感受性であるため、試料間の強烈な違いは、非修飾ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを使用して見られなかった。しかしながら、Ｇ４７Ａ＊及びＳ４３Ａ＊  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントを使用して生成された精製されていないｍ１ψ  ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡでトランスフェクトされたＭＤＭは、ＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用して生成された精製されたｍ１ψ  ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡでトランスフェクトされたＭＤＭより低いＩＰ１０応答を示した（図５、上のグラフ）。
【０３３９】
実施例４．Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、ＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼよりも少ない混入ｄｓＲＮＡに関連するｍＲＮＡを生成する。
標準ｄｓＲＮＡ  ＥＬＩＳＡを使用して、非修飾ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ（図７）またはｍ１ψヌクレオチド修飾（図８、上のグラフ）もしくはｍｏ５Ｕヌクレオチド修飾（図８、下のグラフ）のいずれかを含むｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを生成するために使用されるＩＶＴ反応におけるｄｓＲＮＡ混入物（例えば、４０ヌクレオチド塩基対よりも長い）を評価した。ｄｓＲＮＡアッセイは、Ｓ４３Ａ＊  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント及びＧ４７Ａ＊  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントが、ＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼよりも少ないｄｓＲＮＡを生成したことを示した（図７及び図８）。
【０３４０】
実施例５．Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、ｍＲＮＡの３′不均一性を低減する。
転写物の３′不均一性は、ＲＮＡｓｅ  Ｔ１消化を使用して測定することができる。ＲＮＡｓｅ  Ｔ１は、Ｇヌクレオチドの後にｍＲＮＡを特異的に切断する。エンドヌクレオチド切断は、５′水酸化物（ＯＨ）及び３′一リン酸（ｍＰ）「瘢痕」をもたらす。したがって、ＲＮＡｓｅ  Ｔ１消化は、３′末端で鋳型のない付加を有する及び有さない転写物を区別するために使用され得る。この実施例では、実施例２で生成されたｈＥＰＯ  ｍＲＮＡは、ポリＡテール及びＸｂａＩ制限部位（例えば、ＡｎＵＣＵＡＧ）で終了する。ＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用して生成されたｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ、Ｓ４３Ａ＊  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント、またはＧ４７Ａ＊  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントを、ＲＮＡｓｅ  Ｔ１で消化し、ＬＣＭＳによって分析して、オリゴフィンガープリントを生成した。均質な３′末端（５´ＯＨ／３´ＯＨ）は、３２７８０Ｄａでピークに達することが見出されたが、一方で、「瘢痕」（５´ＯＨ／３´ｍＰ）は、３２８６０Ｄａでピークに達した（図９Ａ）。「瘢痕」は、転写物が、カルボキシ末端で鋳型のない付加を有したことを示す。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントを使用して生成されたｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ、Ｓ４３Ａ＊、またはＧ４７Ａ＊は、より高い３′末端集団分布を有し、それらがより均質な３′末端及び改善された３′末端不均一性を有することを示す（図９Ｂ）。
【０３４１】
実施例６．「より均質な」３′末端を生成するＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント
アッセイを使用して、Ｔ７  ＲＮＡＰバリアント、Ｇ４７Ａ＊、及びＳ４３Ａ＊によって生成された鋳型のない付加の程度を調べた。このアッセイでは、酵素ポリメラーゼを使用してライゲーションレフトマーを作製した（例えば、図１１Ａを参照のこと）。次いで、レフトマーを、５´−モノリン酸化ライトマーＲＮＡにすぐ隣接する完全に相補的なＤＮＡスプリントにアニーリングした。ＤＮＡスプリントは、典型的には、４０ｎｔ長であり、ライトマーは、典型的には、５´末端においてフルオロフォアで修飾される。次いで、ＤＮＡリガーゼＩを、触媒条件下で添加し、反応がＥＤＴＡでクエンチされる前に、所望の反応時間の間、ライゲーションを進めた。次いで、混合物を、変性ポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ−Ｄ）に充填される前に、９５℃で５分間４Ｍの尿素中で変性した（図１１Ｂ）。ゲル中のアクリルアミドのパーセンテージは、予期される構築物の長さによるが、典型的には、＞５０ｎｔのレフトマー長については６％アクリルアミド、及び典型的なｍＲＮＡの長さにアプローチするレフトマーについては２０％アクリルアミドである。６％アクリルアミドゲルを、一定の１８０Ｖで２５分間実行し、２０％アクリルアミドゲルを、一定の１８０Ｖで１２０分間実行した。次いで、ゲルを、ライトマー及び新しくライゲーションされた産物に存在するフルオロフォアに適切な励起波長及び発光波長を使用してＴｙｐｈｏｏｎまたは同様のスキャナーで画像化した。ライトマー及びライゲーションされた産物は、サイズに基づくゲル上で異なって移動し、２つのバンドの強度は、ライゲーション反応の効率に正確に対応するであろう。レフトマーの酵素合成の間の鋳型のないヌクレオチド付加の程度がより大きいほど、予期されるライゲーション収量はより低い。
【０３４２】
ライゲーション収量を、ライゲーションされていないライトマー及びライゲーションされた完全長産物に対応するバンドの比率として計算した。反応を、反応収量の差を誇張するために早く終了した。これらの結果に基づいて、Ｔ７  ＲＮＡＰバリアント  Ｇ４７Ａ＊は、レフトマーＲＮＡの３´末端で最も少ない鋳型のないヌクレオチドを組み込んだ。
【０３４３】
実施例７．単回インビトロ転写反応におけるキャップされたｍＲＮＡの生成
標準インビトロ転写（ＩＶＴ）アッセイでは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは、５′ＧＴＰで転写を開始することが好ましい。そのような標準ＩＶＴアッセイによって生成された一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）分子は、別々の酵素キャッピングステップを必要とする（図１３）。例えば、キャップ１  ＲＮＡ（７ｍＧｐｐｐＮ２′−Ｏｍ−ＲＮＡ）は、ワクシニアキャッピング及び２´−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（２´ＯＭＴａｓｅ）を使用してキャッピングアッセイにおいて生成され得る。キャップ１は、典型的には、細胞における効率的なタンパク質翻訳及びｍＲＮＡ安定性のために使用される。しかしながら、いくつかのｍＲＮＡ配列は、キャッピングすることが難しく、キャッピング／メチル化酵素は、非常に高価である。
【０３４４】
本開示は、いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント（例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントＧ４７Ａ＊）を使用したインビトロ転写アッセイにおいて、ｓｓＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を共転写で、トリヌクレオチドでキャッピングする方法を提供する。効率的な共転写キャッピングには、通常、５′ＡＴＰならびに等モル濃度のＮＴＰ及びトリヌクレオチドを用いて転写を開始する二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）鋳型が含まれる。通常、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは、５′ＡＴＰを用いると開始活性が著しく低下した。しかしながら、ＸＡＧ（Ｘは任意のヌクレオチド、例えば、５´ｍＧｐｐｐである）トリヌクレオチドの存在下で、５′ＡＴＰを用いたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼの限定された開始活性は、５′ＡＴＰではなくトリヌクレオチドで開始が推進され、キャップされたｍＲＮＡを共転写で生成する。
【０３４５】
例示的な市販のジ−及びトリヌクレオチドキャップを、図１４Ａに示す。ワクシニアキャップ１は、典型的なジ−ヌクレオチドキャップであり、共転写で添加することができない。共転写で添加され得る別のジ−ヌクレオチドキャップは、抗逆方向キャップ類似体（Ａｎｔｉ−Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｃａｐ  Ａｎａｌｏｇ）（ＡＲＣＡ）であり、また市販されている（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒから、カタログ番号：  ＡＭ８０４５）。ＡＲＣＡは、３´ＯＨ基（ｍ７Ｇに近接する）が−ＯＣＨ３で置き換えられる修飾されたキャップ類似体である。ＡＲＣＡを、この研究において記載される共転写キャッピングアッセイのいくつかにおいて対照として使用する。
【０３４６】
共転写キャッピングアッセイでは、ヒトＥＰＯ（ｈＥＰＯ）ＤＮＡ鋳型を使用した。５ｍＭのトリヌクレオチドありまたはなしで５ｍＭ  ＮＴＰもまたアッセイ混合物に存在した（ｍＧｐｐｐＡＧ、ｍＧｍｐｐｐＡＧ、及びＡＲＣＡ）。非修飾ｍＲＮＡ産物を、ＲＮａｓｅ  ＨキャップアッセイまたはＬＣＭＳによって分析した。表５に示されるように、野生型（ＷＴ）Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ及びＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントＧ４７Ａ＊は、均等に高い効率で完全にキャップされたｍＲＮＡを生成することができた。ＲＮＡ収量は、異なるＩＶＴ反応（図１４Ｂ）の中でも匹敵し、高度の完全性を有するｍＲＮＡ産物が生成された（図１４Ｃ）。
【表５】
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【０３４７】
ｍＲＮＡ産物の免疫刺激活性を、ＢＪ線維芽細胞におけるサイトカイン（ＩＦＮβ）生成を誘発するそれらの能力を評価することによって評価した。興味深いことに、ＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは、高いサイトカイン応答を誘発した非修飾ｍＲＮＡを生成したが、一方で、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント  Ｇ４７Ａ＊は、ＢＪ線維芽細胞においてサイトカイン生成を刺激しなかった非修飾ｍＲＮＡを生成し（図１４Ｄ）、ＩＶＴ／キャッピングアッセイの後にＲＮＡをさらに精製する必要性を最小化した。ｍＲＮＡ産物からのｈＥＰＯ発現もまた評価した。ｈＥＰＯ発現を、ＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによって生成されたｍＲＮＡから観察したが、一方で、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントＧ４７Ａ＊によって生成されたｍＲＮＡは、ワクシニアキャップ１でキャップされた１−メチル−シュードウリジンで修飾されたｍＲＮＡに匹敵するｈＥＰＯ発現をもたらした（図１４Ｅ）。ＬＣＭＳ実験はまた、トリヌクレオチド組み込み効率は２つの酵素と同等であるように思われたが、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントＧ４７Ａ＊が、ＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼより均質なＲＮＡを生成したことを示す（図１５）。
【０３４８】
異なる実験では、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントＧ４７Ａ＊のキャッピング効率を、ワクシニアキャップ１を使用する標準キャッピングアッセイにおいて達成された効率と比較した。この実験では、反応混合物は、鋳型鎖上の＋１位でデオキシチミジンを含むｈＥＰＯ  ｄｓＤＮＡ鋳型（第１の鋳型のあるヌクレオチドについては「Ａｓｔａｒｔ」とも命名される）、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントＧ４７Ａ＊、ならびに等モル（７．５ｍＭ）ＮＴＰ及びＧＡＧトリヌクレオチドを含んだ。得られるｍＲＮＡ産物を、オリゴｄＴを使用して精製し、キャッピング効率、インビトロサイトカイン応答、及びインビトロ発現について分析した。結果は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントＧ４７Ａ＊が、標準キャッピングプロセスと比較できる程に高い効率でキャップされたｍＲＮＡを生成し（表６）、ｍＲＮＡは、ＢＪ線維芽細胞においてサイトカイン応答を誘発せず（図１６Ａ）、ｍＲＮＡは、ＢＪ線維芽細胞において高いｈＥＰＯ発現をもたらす（図１６Ｂ）ことを示す。
【表６】
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【０３４９】
要約すると、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントＧ４７Ａ＊は、ＸＡＧトリヌクレオチド（例えば、ＧＡＧまたはＧｍＡＧ）の存在下で、鋳型鎖の３′ｄＴＴＰで転写を効率的に開始することができることを本明細書に示された。アッセイにおいてＮＴＰとして等モル濃度を条件として、トリヌクレオチドは、免疫応答を刺激しない完全にキャップされたｍＲＮＡを生成するために共転写で添加され、高タンパク質発現をもたらし得る（図１７）。
【０３５０】
実施例８．５′ＧＴＰ（Ｇｓｔａｒｔ）または５′ＡＴＰ（Ａｓｔａｒｔ）での転写開始の比較
実施例７に記載される共転写キャッピングアッセイを使用して、転写開始が５´−ＧＴＰ（Ｇｓｔａｒｔ）または５´−ＡＴＰ（Ａｓｔａｒｔ）を必要とするモデル構築物へのキャッピング効率を比較した。５′ＵＴＲ及び４７−ｍｅｒ  ＲＮＡオリゴヌクレオチドをコードするモデル構築物を、ＩＶＴの鋳型として使用した。全ＲＮＡ産物を、質量分析によって評価し、結果は、Ａｓｔａｒｔ構築物が、Ｇｓｔａｒｔ構築物と比較して  ＧＡＧまたはＧｍＡＧトリヌクレオチドをより効率的に組み込むことを示す（図１８Ａ）。データはここでは示されていないが、Ｃｓｔａｒｔ及びＵｓｔａｒｔ構築物が少量のキャップされた生成物を生成したこともまた観察された。
【０３５１】
さらに、ＲＮＡ産物を、ＲＮａｓｅ  Ｈ切断させ、ＲＮＡ産物の切断された５′末端を、質量分析を使用して分析し、キャップの存在を判定した。同様の結果を全ＲＮＡ産物のものとして得た（図１８Ｂ）。
【０３５２】
図１８Ａ及び図１８Ｂで使用されるモデル構築物を使用して、トリヌクレオチド滴定実験もまた行った。共転写キャッピングアッセイでは、５ｍＭのＮＴＰ（Ａ、等モル比で修飾されたＵ、Ｇ、Ｃ）を使用したが、一方で、トリヌクレオチド（ＧＡＧまたはＧｍＡＧ）の濃度は、変化し、ＮＴＰ及びトリヌクレオチドの異なるモル比でキャッピング効率を評価した。次いで、粗ＲＮＡ産物をＬＣ−ＭＳによって分析した。結果は、ＮＴＰ及びトリヌクレオチドが、ＧＡＧ及びＧｍＡＧの両方について等モル比であるときに、キャッピング効率が最も高いことを示す（表７）。
【表７】
2020532963.tif 000370
【０３５３】
実施例９．１−メチル−シュードウリジンで化学修飾されたｍＲＮＡのキャッピング
１−メチル−シュードウリジンで化学修飾されたｍＲＮＡの共転写キャッピングもまた評価した。３つのモデル構築物を使用した：ｈＥＰＯ、Ｌｕｃ（ルシフェラーゼをコードする）、及びｅＧＦＰ。すべてのＩＶＴ鋳型は、Ａｓｔａｒｔ鋳型であった。鋳型は、ＰＣＲ断片またはプラスミドであり得る。キャッピングアッセイ反応混合物は、鋳型、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントＧ４７Ａ＊、７．５ｍＭのＮＴＰ、及び７．５ｍＭのトリヌクレオチド（ＧＡＧまたはＧｍＡＧ）を含んだ。ＮＴＰ中のＵＴＰを、１−メチルシュードウリジンで置き換えて、化学修飾されたｍＲＮＡを生成した。ワクシニアキャップ１を、標準キャッピングアッセイにおいて生成対照として使用した。ｍＲＮＡ産物を、ＲＮａｓｅ  Ｈキャップアッセイ、Ｔ１フィンガープリンティング、及びフラグメントアナライザーを使用して分析し、それらの完全性を判定した。サイトカイン応答を誘発すること及びＢＪ線維芽細胞においてコードされたタンパク質を発現することにおけるｍＲＮＡ産物の能力もまた試験した。
【０３５４】
表８に示されるように、ＰＣＲ断片から生成されたすべての３つのモデル構築物の１−メチル−シュードウリジンで化学修飾されたｍＲＮＡは、効率的にキャップされ、キャッピング効率は、ワクシニアキャップ１対照に匹敵した。化学Ａは、非修飾ウリジン三リン酸ヌクレオチドの使用を示し、化学Ｂは、１−メチル−シュードウリジン三リン酸ヌクレオチドの使用を示す。化学Ｃは、５−メチル−シチジン三リン酸及び１−メチル−シュードウリジン三リン酸ヌクレオチドを示す。プラスミド鋳型から生成された１−メチル−シュードウリジンで化学修飾されたｍＲＮＡについて同様の結果を得た（表９）。さらに、ＲＮａｓｅ  Ｔ１フィンガープリンティング分析は、ＰＣＲ断片鋳型を使用してモデル構築物から生成されたｍＲＮＡが、正しい配列のものであったことを示した（図１９Ａ）。ＰＣＲ断片鋳型（図１９Ｂ）またはプラスミド鋳型（図２０Ｃ）のいずれかから生成されたｍＲＮＡもまた、高度の完全性を有することを示した。ＰＣＲ断片鋳型ならびにプラスミド鋳型から生成されたキャップされたｍＲＮＡは、ＢＪ線維芽細胞においていずれのサイトカイン発現も誘発しなかった（図１９Ｃ、図２０Ｄ）。さらに、プラスミド鋳型から生成されたｍＲＮＡは、ＢＪ線維芽細胞においてコードされたタンパク質の発現をもたらした（図２０Ｅ〜図２０Ｇ）。ＧＡＧキャップされたｍＲＮＡの発現レベルは、わずかにより高いか、ワクシニアキャップ１対照ｍＲＮＡからの発現レベルに匹敵するか、またはそれよりもわずかに低かった。
【表８】
2020532963.tif 000371
【表９】
2020532963.tif 000372
【０３５５】
共転写キャッピングアッセイにおけるＮＴＰ消費もまた、モデル構築物ｈＥＰＯ（図２０Ａ）及びｅＧＦＰ（図２０Ｂ）についてプラスミド鋳型を使用する反応を評価した。結果は、ＧＡＧ及びＧｍＡＧが、アッセイの期間（２時間）にわたってほとんど消費されなかったことを示す。これは、アッセイにおけるトリヌクレオチドの濃度が極端に超過していたという事実と一貫している。アッセイが完了した後にトリヌクレオチドを回収することが可能であり得る。
【０３５６】
実施例１０．ＲＮＡ収量に影響を与えるＴ７  ＲＮＡポリメラーゼＣ末端での置換
Ｇ４７Ａ＊ポリメラーゼは、翻訳されたタンパク質のＣ末端で余分なグリシン（「フットグリシン」）を含む。フットグリシンの存在を、トリプシン消化及び精製されたＧ４７Ａ＊タンパク質の質量分析によって確認した（データには示されていない）。Ｇ４７Ａ＊のＣ末端フット領域の役割を、Ｇ４７Ａ＊の活性部位に対するその近接のために、より詳細に試験した。
【０３５７】
インビトロ転写（ＩＶＴ）反応を、ｈＥＰＯ  ＤＮＡ鋳型、ならびに（１）野生型（ＷＴ）Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（ＷＴ）、（２）フットグリシンを有するＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（ＷＴ＋Ｇ）、（３）２つのフットグリシンを有するＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（ＷＴ＋ＧＧ）、（４）２つのフットアラニンを有する野生型ＲＮＡポリメラーゼ（ＷＴ＋ＡＡ）、（５）Ｇ４７Ａ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント、（６）フットグリシンを有するＧ４７Ａ＊  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント（Ｇ４７Ａ＋Ｇ）、（７）２つのフットグリシンを有するＧ４７Ａ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント（Ｇ４７Ａ＋ＧＧ）、（７）２つのフットアラニンを有するＧ４７Ａ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント（Ｇ４７Ａ＋ＡＡ）、（９）Ｓ４３Ａ／Ｇ４７Ａ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント（Ｓ４３Ａ／Ｇ４７Ａ）、及び（１０）フットグリシンを有するＳ４３Ａ／Ｇ４７Ａ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント（Ｓ４３Ａ／Ｇ４７Ａ＋Ｇ）を使用して行った。ＩＶＴ反応混合物は、ｈＥＰＯ  ＤＮＡ鋳型、上に列挙されるＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントのうちの１つ、及びＮＴＰを含んだ。非修飾化学を有するＩＶＴ反応（図２２）を、標準ＮＴＰ（ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ）で行ったが、一方で、シュードウリジン修飾（ｍ１ψ）化学を有するＩＶＴ反応（図２３）は、ＵＴＰの代わりに１−メチルシュードウリジンを含み、化学修飾されたｍＲＮＡを生成した。ＲＮＡ収量を、ＵＶ吸収によって測定した。
【０３５８】
ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ収量は、ＷＴまたはＧ４７Ａ＊バリアントＴ７  ＲＮＡポリメラーゼのいずれかにおいてフットグリシンの存在とともに減少した（図２２及図２３）。ｍＲＮＡ収量は、ＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼよりもＧ４７Ａ＊でのより少ない減少があったが、２つのフットグリシンまたは２つのフットアラニン残基のいずれかとともに減少し続けた。
【０３５９】
実施例１１．３´−ｍＲＮＡ不均一性へのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼフットグリシンの影響
実施例５のように、フットグリシンを有するＷＴまたはＧ４７Ａ＊  Ｔ７  ＲＮＡＰを使用して生成されたｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを、ＲＮＡｓｅ  Ｔ１で消化し、ＬＣＭＳによって分析して、オリゴフィンガープリントを生成した。ＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡＰ  ＩＶＴ反応を、ＮＴＰの等モル濃度（ＷＴ  ＥＱ）またはＧＴＰ及びＡＴＰ（ＷＴアルファ（Ａ））のモル過剰のいずれかで行った。ＬＣＭＳ分析は、均質な３′末端（５´ＯＨ／３´ＯＨ）は、３２７８０Ｄａでピークに達し、「瘢痕」（５´ＯＨ／３´ｍＰ）は、３２８６０Ｄａでピークに達することを明らかにした（図２４Ａ）。「瘢痕」は、転写物が、３´末端で鋳型のない付加を有したことを示す。ＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡＰ及びＮＴＰの等モル濃度（ＷＴ  ＥＱ）を使用して生成されたｈＥＰＯ  ｍＲＮＡは、３´末端集団分布を減少し、減少された３´均一性及び鋳型のない付加を有するより多くのランオン生成物を示す（図２４Ｂ）。しかしながら、フットグリシンを有するＧ４７Ａ＊  Ｔ７  ＲＮＡＰを使用して生成されたｈＥＰＯ  ｍＲＮＡは、より高い３′末端集団分布を有し、それらはより均質な３′末端を有し、３′末端の不均一性を改善したことを示す（図２４Ｂ）。
【０３６０】
ｈＥＰＯ  ３´ｍＲＮＡ均一性へのＴ７  ＲＮＡＰフット領域の影響を直接試験するために、ＩＶＴ反応を、ｈＥＰＯ  ＤＮＡ鋳型、ならびに（１）野生型Ｔ７  ＲＮＡＰ（ＷＴ）、（２）フットグリシンを有するＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡＰ（ＷＴ＋Ｇ）、（３）２つのフットグリシンを有するＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡＰ（ＷＴ＋ＧＧ）、（４）２つのフットアラニンを有する野生型Ｔ７  ＲＮＡＰ（ＷＴ＋ＡＡ）、（５）Ｇ４７Ａ  Ｔ７  ＲＮＡＰバリアント、（６）フットグリシンを有するＧ４７Ａ＊  Ｔ７  ＲＮＡＰバリアント（Ｇ４７Ａ＋Ｇ）、（７）２つのフットグリシンを有するＧ４７Ａ  Ｔ７  ＲＮＡＰバリアント（Ｇ４７Ａ＋ＧＧ）、（８）２つのフットアラニンを有するＧ４７Ａ  Ｔ７  ＲＮＡＰバリアント（Ｇ４７Ａ＋ＡＡ）、（９）Ｓ４３Ａ／Ｇ４７Ａ  Ｔ７  ＲＮＡＰバリアント（Ｓ４３Ａ／Ｇ４７Ａ）、及び（１０）フットグリシンを有するＳ４３Ａ／Ｇ４７Ａ  Ｔ７  ＲＮＡＰバリアント（Ｓ４３Ａ／Ｇ４７Ａ＋Ｇ）を使用して行った。ＩＶＴ反応混合物は、ｈＥＰＯ  ＤＮＡ鋳型、上に列挙されるＴ７  ＲＮＡＰバリアントのうちの１つ、及び等モルＮＴＰを含んだ。ＩＶＴ反応を行い、それは、非修飾ｍＲＮＡ（図２４Ｃ）またはシュードウリジン修飾されたｍＲＮＡ（図２４Ｄ）のいずれかを生成した。ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを、実施例５及び上記のようにＲＮａｓｅ  Ｔ１で消化した。フットグリシンの存在は、ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ  ３´末端の均一性を６０％増加させた（図２４Ｃ〜図２４Ｄ）。Ｔ７  ＲＮＡＰにおける、２つのフットグリシンまたは２つのアラニンもまた、ＷＴまたはＧ４７Ａ  Ｔ７  ＲＮＡＰにわたって３´末端の均一性を６０〜７０％改善した（図２４Ｃ及び図２４Ｄ）。これらの結果は、Ｔ７  ＲＮＡＰ中の単一のフットグリシンの存在が、図２４Ｂに観察される３´末端均一性を増加させることができることを示す。
【０３６１】
実施例１２．免疫刺激へのＴ７  ＲＮＡＰフットグリシンの影響
ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ生成物への免疫応答を刺激することにおけるＴ７  ＲＮＡＰフットグリシンの役割は、実施例７のように、ＢＪ線維芽細胞におけるサイトカイン（ＩＦＮβ）生成を誘発するそれらの能力を評価することによって評価した。興味深いことに、ＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡＰ生成された非修飾及びシュードウリジン修飾ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡが、高いサイトカイン応答を誘発したが、一方で、フットグリシン生成された非修飾及びシュードウリジン修飾ｈＥＰＯ  ｍＲＮＡを有するＷＴ  Ｔ７  ＲＮＡＰは、ＢＪ線維芽細胞においてより少ないサイトカイン生成を刺激した（図２５）。フットグリシンを有するＧ４７Ａ＊バリアント  Ｔ７  ＲＮＡＰによって生成されたｈＥＰＯ  ｍＲＮＡは、ＢＪ線維芽細胞においてサイトカイン生成を刺激することをしそびれて、免疫応答を誘発しそびれることにおいてフットグリシン及びＧ４７Ａ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントの間の相加的効果を示す（図２５）。
【０３６２】
実施例１３．ｍＲＮＡ生成へのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼフットグリシンの影響
アッセイを開発して、ＷＴ及びＧ４７ＡバリアントＴ７  ＲＮＡＰによって生成されたｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ種へのフットグリシン残基の効果を調べた。試験されたＴ７  ＲＮＡＰは、以下の通りであった。（１）ＷＴ＋Ｇ（フットグリシン）、（２）Ｇ４７Ａバリアント、または（３）Ｇ４７Ａバリアント＋Ｇ（Ｇ４７Ａ＊バリアント）。ＩＶＴ反応は、列挙されるＴ７  ＲＮＡＰのうちの１つ、ｓｈＯＲＦａｎ鋳型、ＮＴＰ（非修飾または修飾されたＵＴＰのいずれか）、及び３２Ｐ−ＣＴＰを含んだ。反応を、所望の長さの時間の後にＥＤＴＡで終了した。次いで、反応混合物を、変性ポリアクリルアミドゲル（２０％アクリルアミド）に充填される前に、９５℃で５分間４Ｍの尿素中で変性した（図２６Ａ）。ゲルを２０ワットで３０分間、次いで４０ワットで２時間実行した。画像を、Ｔｙｐｈｏｏｎスキャナーを使用する画像化の前にホスフォイメージャースクリーンに移動した（１時間の露光時間）。３２Ｐ−ＣＴＰの使用は、完全長生成物（ｓｈＯＲＦａｎ  ｍＲＮＡを示す）、ランオン転写生成物（上の箱）（図２６Ａ）、及び逆相補ｍＲＮＡ産物（図２６Ａ、下の箱）を標識する。結果はまた、以下の表１０に要約される。これらのデータは、フットグリシンを有するＴ７  ＲＮＡＰが、ＷＴまたはＧ４７Ａ  Ｔ７  ＲＮＡＰのいずれかより少ない混入ｄｓＲＮＡに関連することを示す（図２６Ａ（下の箱）及び図２６Ｂ）。さらに、フットグリシンは、ＷＴまたはＧ４７ＡバリアントＴ７  ＲＮＡＰと比較して、減少されたランオン転写（図２６Ａ（上の箱）、図２６Ｂ）と関連する。
【表１０】
2020532963.tif 000373
【０３６３】
実施例１４．ホタルルシフェラーゼをコードするトリヌクレオチドキャップされたＧ４７Ａ＊  ｍＲＮＡの繰り返し投与の評価
インビトロ転写ｍＲＮＡは、典型的には、例えば、逆相クロマトグラフィー（ＲＰ）によって精製され、サイトカイン誘発不純物（ｄｓＲＮＡ）及びプロセス不純物（例えば、タンパク質／ＤＮＡ）を除去し、全ＲＮＡ純度を改善する。しかしながら、この精製プロセスはしばしば、ｍＲＮＡ産物の著しい喪失をもたらす。ＲＰを排除することは、ターンアラウンドタイムを低減し、大規模に動作及び操作複雑性を排除し、費用を節約する。さらに、ＲＰ中に使用される高温度が、ｍＲＮＡの画分を加水分解することができるため、ＲＰを排除することは、ｍＲＮＡ発現レベルを増加させる。したがって、ＲＰの必要性を排除するためにｍＲＮＡ産物及び精製戦略を開発した。この実施例に提供される方法によって生成されたｍＲＮＡは、「トリヌクレオチドキャップされたＧ４７Ａ＊  ｍＲＮＡ」  と称され、それは、Ｇ４７Ａ＊  Ｔ７  ＲＮＡＰバリアント（Ｇ４７Ａ置換及び追加のＣ末端Ｇを有する）を使用するインビトロ転写アッセイにおいてトリヌクレオチドＧｐｐｐＡ２′ＯｍｅｐＧで共転写でキャップされているｍＲＮＡである。
【０３６４】
この実施例では、ホタルルシフェラーゼ（ｆｆＬｕｃ）をコードするｍＲＮＡの単回の０．５ｍｐｋ用量を、ＭＣ３脂質ナノ粒子中に配合し、６週間（１日目、８日目、１５日目、２２日目、２９日目、及び３６日目に）Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（ｎ＝５）に毎週投与した。以下のｍＲＮＡを投与した。（１）ＮＴＰの等モル濃度の存在下で野生型Ｔ７ポリメラーゼを使用して生成され、オリゴｄＴ精製によって精製された非修飾ｍＲＮＡ（化学Ａプロセス１  ｄＴ）、（２）ＧＴＰ／ＡＴＰの過剰濃度の存在下で野生型Ｔ７ポリメラーゼを使用して生成され、逆相クロマトグラフィーによって精製されたシュードウリジン修飾ｍＲＮＡ（化学Ｂプロセス２  ＲＰ）、（３）ＧＴＰ／ＡＴＰの過剰濃度の存在下で野生型Ｔ７ポリメラーゼを使用して生成され、オリゴｄＴ精製によって精製されたシュードウリジン修飾ｍＲＮＡ（化学Ｂプロセス２  ｄＴ）、（４）ＮＴＰの等モル濃度の存在下で野生型Ｔ７ポリメラーゼを使用して生成され、オリゴｄＴ精製によって精製されたシュードウリジン修飾ｍＲＮＡ（化学Ｂプロセス１  ｄＴ）、（５）逆相クロマトグラフィーによって精製されたシュードウリジン修飾トリヌクレオチドキャップされたＧ４７Ａ＊  ｍＲＮＡ（Ｇ４７Ａ＊  Ｔ７  ＲＮＡＰバリアントを使用してキャップ及び生成されたトリヌクレオチド）（化学Ｂプロセス３  ＲＰ）、（６）オリゴｄＴ精製によって精製されたシュードウリジン修飾トリヌクレオチドキャップＧ４７Ａ＊  ｍＲＮＡ（化学Ｂプロセス３  ｄＴ）、ならびに（７）Ｇ４７Ａ＊  Ｔ７  ＲＮＡＰバリアントを使用して生成され、オリゴｄＴ精製によって精製されたキャップされていないシュードウリジン修飾ｍＲＮＡ（化学Ｂプロセス４  ｄＴ））。各用量後６時間、以下を評価した：血清サイトカインレベル、ｍＲＮＡ発現、及び抗−ＰＥＧ  ＩｇＭレベル。Ｂ細胞活性化を、３６日目の用量後６時間評価した。化学Ａは、非修飾ウリジン三リン酸ヌクレオチドの使用を示し、化学Ｂは、１−メチル−シュードウリジン三リン酸ヌクレオチドの使用を示す。プロセス１は、ＩＶＴ及びワクシニアキャップ１における等モルＮＴＰを指し、プロセス２は、４：２：１：１のＧＴＰ：ＡＴＰ：ＣＴＰ：ＵＴＰ（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１８年３月２２日に公開されたＷＯ２０１８／０５３２０９  Ａ１を参照のこと）及びワクシニアキャップ１を含むＩＶＴを指し、プロセス３は、ＩＶＴにおける等モルＮＴＰ及びＧＡＧを指し、プロセス４は、ＩＶＴ及びキャップなしにおける等モルＮＴＰを指す。
【０３６５】
１日目及び２９日目のマウスにおける血清サイトカイン評価（ＩＰ−１０）からの結果を、図２７Ａ及び図２７Ｂに表し、トリヌクレオチドキャップされたＧ４７Ａ＊  ｍＲＮＡが、インビボで血清サイトカインレベルを誘発し、アルファｍＲＮＡ対照と同様であることを示す。結果は、ｍＲＮＡが、ＢＪヒト線維芽細胞（図２８Ａ）及び単球由来マクロファージ（ＭＤＭ）（図２８Ｂ）に送達されたインビトロ実験について同様であった。
【０３６６】
ｍＲＮＡ発現研究（図２９）は、トリヌクレオチドキャップされたＧ４７Ａ＊  ｍＲＮＡが、６回の隔週用量後にインビボで高い発現を維持したことを示した。
【０３６７】
抗−ＰＥＧ  ＩｇＭ評価（図３０）は、Ｎ１ＵトリヌクレオチドキャップされたＧ４７Ａ＊  ｍＲＮＡが、６回の隔週用量後に低い抗−ＰＥＧ  ＩｇＭレベル生成したことを示した。
【０３６８】
Ｂ細胞活性化分析（図３１）は、トリヌクレオチドキャップされたＧ４７Ａ＊  ｍＲＮＡでトランスフェクトされた脾臓Ｂ細胞の活性化が低く、アルファｍＲＮＡ対照と同様であったことを示した。
【０３６９】
まとめると、これらの結果は、ＲＰ精製されていないｆｆＬｕｃをコードするトリヌクレオチドキャップされたＧ４７Ａ＊  ｍＲＮＡが、ベースラインを超えてサイトカイン応答を誘発せず、インビボで低い抗−ＰＥＧ  ＩｇＭレベルを維持し、低いＢ細胞活性化を呈することを示す。
【０３７０】
実施例１５．ヒトエリスロポエチンをコードするトリヌクレオチドキャップされたＧ４７Ａ＊  ｍＲＮＡの繰り返し投与の評価
この実施例では、ヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）をコードするｍＲＮＡの単回の０．５ｍｐｋ用量を、ＭＣ３脂質ナノ粒子中に配合し、６週間（１日目、８日目、１５日目、２２日目、２９日目、及び３６日目に）Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（ｎ＝５）に毎週投与した。以下のｍＲＮＡを投与した。（１）ＮＴＰの等モル濃度の存在下で野生型Ｔ７ポリメラーゼを使用して生成され、オリゴｄＴ精製によって精製された非修飾ｍＲＮＡ（化学Ａプロセス１  ｄＴ）、（２）ＧＴＰ／ＡＴＰの過剰濃度の存在下で野生型Ｔ７ポリメラーゼを使用して生成され、逆相クロマトグラフィーによって精製されたシュードウリジン修飾ｍＲＮＡ（化学Ｂプロセス２  ＲＰ）、（３）ＧＴＰ／ＡＴＰの過剰濃度の存在下で野生型Ｔ７ポリメラーゼを使用して生成され、オリゴｄＴ精製によって精製されたシュードウリジン修飾ｍＲＮＡ（化学Ｂプロセス２  ｄＴ）、（４）ＮＴＰの等モル濃度の存在下で野生型Ｔ７ポリメラーゼを使用して生成され、オリゴｄＴ精製によって精製されたシュードウリジン修飾ｍＲＮＡ（化学Ｂプロセス１  ｄＴ）、（５）逆相クロマトグラフィーによって精製されたシュードウリジン修飾トリヌクレオチドキャップされたＧ４７Ａ＊  ｍＲＮＡ（Ｇ４７Ａ＊  Ｔ７  ＲＮＡＰバリアントを使用してキャップ及び生成されたトリヌクレオチド）（化学Ｂプロセス３  ＲＰ）、（６）オリゴｄＴ精製によって精製されたシュードウリジン修飾トリヌクレオチドキャップＧ４７Ａ＊  ｍＲＮＡ（化学Ｂプロセス３  ｄＴ）、ならびに（７）Ｇ４７Ａ＊  Ｔ７  ＲＮＡＰバリアントを使用して生成され、オリゴｄＴ精製によって精製されたキャップされていないシュードウリジン修飾ｍＲＮＡ（化学Ｂプロセス４  ｄＴ））。各用量後６時間、以下を評価した：血清サイトカインレベル、ｍＲＮＡ発現、及び抗−ＰＥＧ  ＩｇＭレベル。Ｂ細胞活性化を、３６日目の用量後６時間評価した。化学Ａは、非修飾ウリジン三リン酸ヌクレオチドの使用を示し、化学Ｂは、１−メチル−シュードウリジン三リン酸ヌクレオチドの使用を示す。プロセス１は、ＩＶＴ及びワクシニアキャップ１における等モルＮＴＰを指し、プロセス２は、４：２：１：１のＧＴＰ：ＡＴＰ：ＣＴＰ：ＵＴＰ及びワクシニアキャップ１を含むＩＶＴを指し、プロセス３は、ＩＶＴにおける等モルＮＴＰ及びＧＡＧを指し、プロセス４は、ＩＶＴ及びキャップなしにおける等モルＮＴＰを指す。
【０３７１】
１日目及び２２日目のマウスにおける血清サイトカイン評価（ＩＰ−１０）からの結果を、図３２Ａ及び図３２Ｂに表し、トリヌクレオチドキャップされたＧ４７Ａ＊  ｍＲＮＡが、インビボで血清サイトカインレベルを誘発し、アルファｍＲＮＡ対照と同様であることを示す。結果は、ｍＲＮＡが、ＢＪヒト線維芽細胞（図３３Ａ）及び単球由来マクロファージ（ＭＤＭ）（図３３Ｂ）に送達されたインビトロ実験について同様であった。
【０３７２】
ｍＲＮＡ発現研究（図３４）は、トリヌクレオチドキャップされたＧ４７Ａ＊  ｍＲＮＡが、６回の隔週用量後にインビボで高い発現を維持したことを示した。
【０３７３】
抗−ＰＥＧ  ＩｇＭ評価（図３５）は、トリヌクレオチドキャップされたＧ４７Ａ＊  ｍＲＮＡが、６回の隔週用量後に低い抗−ＰＥＧ  ＩｇＭレベル生成したことを示した。
【０３７４】
Ｂ細胞活性化分析（図３６）は、トリヌクレオチドキャップされたＧ４７Ａ＊  ｍＲＮＡでトランスフェクトされた脾臓Ｂ細胞の活性化が低く、アルファｍＲＮＡ対照と同様であったことを示した。
【０３７５】
まとめると、これらの結果は、ＲＰ精製されていないｈＥＰＯをコードするトリヌクレオチドキャップされたＧ４７Ａ＊  ｍＲＮＡが、ベースラインを超えてサイトカイン応答を誘発せず、インビボで低い抗−ＰＥＧ  ＩｇＭレベルを維持し、低いＢ細胞活性化を呈することを示す。
【０３７６】
実施例１６．インデル頻度及び点変異頻度の評価
ｍＲＮＡを、プロセス１（等モルＮＴＰ）またはプロセス２（４：２：１：１のＧＴＰ：ＡＴＰ：ＣＴＰ：ＵＴＰ）を使用してＷＴまたはＧ４７Ａ＊酵素のいずれかで調製した。次世代シーケンシング（ＮＧＳ）について、ｍＲＮＡを、逆転写酵素によってｃＤＮＡに変換し、アダプターをライゲーションしてシーケンシングライブラリを準備した。ＮＧＳデータを、親配列と比較し、観察された任意のインデルを表にした。インデル頻度は、ＷＴ及びＧ４７Ａ＊に匹敵した（図３７Ａ）。同様に、ＮＧＳデータを、任意の点変異について分析した。点変異頻度は、ＷＴ及びＧ４７Ａ＊に匹敵した（図３７Ｂ）。
【０３７７】
本明細書に開示されるすべての参考文献、特許、及び特許出願は、各々が示される主題に関して参照により組み込まれ、いくつかの場合において、それは書類の全体を包含し得る。
【０３７８】
明細書及び特許請求の範囲において本明細書で使用されるように、不定冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、明らかに矛盾する記載がない限り、「少なくとも１つ」を意味するものとして理解されるべきである。
【０３７９】
明らかに矛盾する記載がない限り、１を超えるステップまたは行為を含む本明細書に請求されるあらゆる方法において、方法のステップまたは行為の順番は、方法のステップまたは行為が言及されているその順番に必ずしも限定されない。
【０３８０】
特許請求の範囲、ならびに上の明細書において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｃａｒｒｙｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、「有する（ｈｏｌｄｉｎｇ）」、「から構成される（ｃｏｍｐｏｓｅｄ  ｏｆ）」などのすべての移行句は、無制限、すなわち、含むが限定されないと意味すると理解されたい。「からなる」及び「から本質的になる」の移行句のみが、ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｏｆｆｉｃｅ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｅｘａｍｉｎｉｎｇ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，Ｓｅｃｔｉｏｎ  ２１１１．０３に示されるように、それぞれ閉鎖または半閉鎖的移行句であるものとする。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リボ核酸（ＲＮＡ）ポリメラーゼバリアントであって、野生型ＲＮＡポリメラーゼと比較して、前記ＲＮＡポリメラーゼバリアントが開始複合体から伸長複合体に移行するにつれて前記ＲＮＡポリメラーゼバリアントのループ構造にヘリックス構造へのコンフォメーション変化を受けさせるアミノ酸置換を含む、前記リボ核酸（ＲＮＡ）ポリメラーゼバリアント。
【請求項２】
前記アミノ酸置換が、野生型アミノ酸と比較して高いヘリックス性向を有する、請求項１に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【請求項３】
前記ＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼである、請求項１または２に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【請求項４】
、
前記ループ構造が、Ｃヘリックス構造中にある、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【請求項５】
前記ループ構造が、Ｃリンカー構造中にある、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【請求項６】
前記アミノ酸置換が、高ヘリックス性向アミノ酸置換である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【請求項７】
前記高ヘリックス性向酸置換が、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、リジン、グルタミン、及びグルタミン酸から選択される、請求項６に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【請求項８】
前記高ヘリックス性向アミノ酸置換が、アラニンである、請求項７に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【請求項９】
前記Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントが、配列番号１と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【請求項１０】
前記Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼが、Ｅ４２、Ｓ４３、Ｙ４４、Ｅ４５、Ｍ４６、Ｇ４７、Ａ２５５、Ｒ２５７、Ａ２５８、Ｇ２５９、Ａ２６０、Ｌ２６１、及びＡ２６２から選択される位置に高ヘリックス性向アミノ酸のアミノ酸置換を含むように修飾された配列番号１と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項９に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【請求項１１】
前記アミノ酸置換が、Ｓ４３Ａを含む、請求項１０に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【請求項１２】
前記アミノ酸置換が、Ｇ４７Ａを含む、請求項１０に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【請求項１３】
追加のＣ末端アミノ酸をさらに含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【請求項１４】
前記追加のＣ末端アミノ酸が、グリシン（Ｇ）を含む、請求項１３に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【請求項１５】
前記ＲＮＡポリメラーゼバリアントが、配列番号１０８のアミノ酸配列を含む、請求項１１、１３、または１４のいずれか１項に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【請求項１６】
前記ＲＮＡポリメラーゼバリアントが、配列番号１１０のアミノ酸配列を含む、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【請求項１７】
野生型ＲＮＡポリメラーゼと比較して追加のＣ末端アミノ酸を含む、リボ核酸（ＲＮＡ）ポリメラーゼバリアント。
【請求項１８】
前記ＲＮＡポリメラーゼバリアントが、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントである、請求項１７に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【請求項１９】
前記ＲＮＡポリメラーゼバリアントが、野生型Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する、請求項１８に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【請求項２０】
前記ＲＮＡポリメラーゼバリアントが、野生型Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼと比較してアミノ酸置換を含む、請求項１７または１８に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【請求項２１】
２つの追加のＣ末端アミノ酸を含む、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【請求項２２】
前記２つの追加のＣ末端アミノ酸が、同じ種類のアミノ酸または２つの異なる種類のアミノ酸を含む、請求項２１に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【請求項２３】
１〜５個または１〜１０個の追加のＣ末端アミノ酸を含む、請求項１７〜２２のいずれか１項に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【請求項２４】
ＦＡＦＡＸｎ（配列番号１７１）モチーフを含むＣ末端を含み、Ｘが任意のアミノ酸であり、ｎがゼロより大きい任意の整数である、ＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【請求項２５】
Ｘが、ＧまたはＡである、請求項２４に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【請求項２６】
ｎがゼロより大きい任意の整数であり、任意選択により、ｎが１、２、３、４、または５である、請求項２４または２５に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【請求項２７】
ＦＡＦＡＧ（配列番号３２９）モチーフを含むＣ末端を含む、ＲＮＡポリメラーゼバリアント、任意選択によりＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【請求項２８】
ＸＡＦＡＸｎモチーフ、ＦＸＦＡＸｎモチーフ、ＦＡＸＡＸｎモチーフ、またはＦＡＦＸＸｎモチーフを含むＣ末端を含み、各Ｘが任意のアミノ酸であり、ｎはゼロより大きい任意の整数である、ＲＮＡポリメラーゼバリアント、任意選択によりＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【請求項２９】
アミノ酸置換をさらに含む、請求項１７〜２８のいずれか１項に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【請求項３０】
前記アミノ酸置換が、野生型ＲＮＡポリメラーゼのＥ４２、Ｓ４３、Ｙ４４、Ｅ４５、Ｍ４６、Ｇ４７、Ｒ２５７、Ａ２５８、Ｇ２５９、Ａ２６０、Ｌ２６１、及びＡ２６２から選択される位置の高ヘリックス性向アミノ酸であり、任意選択により、前記野生型ＲＮＡポリメラーゼが、配列番号１のアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２９に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【請求項３１】
前記高ヘリックス性向アミノ酸が、アラニンである、請求項３０に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【請求項３２】
前記アミノ酸置換が、Ｓ４３ＡまたはＧ４７Ａである、請求項３１に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【請求項３３】
ＲＮＡ転写物の生成をもたらす条件下で、ＤＮＡ鋳型を請求項１〜３２のいずれか１項に記載のＲＮＡポリメラーゼと接触させることを含む、リボ核酸（ＲＮＡ）を生成する方法。
【請求項３４】
ヌクレオシド三リン酸及び緩衝液の存在下において、ＲＮＡ転写物の生成をもたらす条件下で、ＤＮＡ鋳型を請求項１〜３２のいずれか１項に記載のＲＮＡポリメラーゼと接触させることを含む、インビトロ転写（ＩＶＴ）反応を行う方法。
【請求項３５】
前記生成されたＲＮＡ転写物が、任意選択により未精製の形態で細胞に送達されたとき、野生型ＲＮＡポリメラーゼを用いて生成されたＲＮＡと比較して少なくとも５０％低いサイトカイン応答を刺激する、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項３６】
生成された二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）転写物の濃度が、野生型ポリメラーゼを使用して生成されたｄｓＲＮＡ転写物と比較して少なくとも５０％低い、請求項３３〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記生成されたＲＮＡ転写物の２０％未満が、３´不均一性を示す、請求項３３〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記生成されたＲＮＡ転写物の５０％未満が、二本鎖混入物である、請求項３３〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記生成されたＲＮＡ転写物の５０％未満が、ランオンＲＮＡ転写物である、請求項３３〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
生成された完全長ＲＮＡ転写物の量が、前記ＤＮＡ鋳型の量よりも少なくとも１５倍大きい、請求項３３〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
二本鎖混入物：生成された完全長ＲＮＡ転写物の比が、１：１未満である、請求項３３〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記生成されたＲＮＡ転写物が、前記ＤＮＡ鋳型と比較して１００ヌクレオチドあたり１未満の変異を有する、請求項３３〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
請求項１〜３２のいずれか１項に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアントをコードする核酸。
【請求項４４】
請求項４３に記載の核酸を含むベクター。
【請求項４５】
請求項４３に記載の核酸または請求項４４に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項４６】
請求項１〜３２のいずれか１項に記載のＲＮＡポリメラーゼバリアント及び任意選択によりインビトロ転写（ＩＶＴ）試薬を含む、組成物またはキット。
【請求項４７】
請求項３３〜４２のいずれか１項に記載の方法により生成される、リボ核酸（ＲＮＡ）、任意選択によりメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）。
【請求項４８】
脂質ナノ粒子中に製剤化された請求項４７に記載のＲＮＡであって、任意選択により、前記脂質ナノ粒子が、２０〜６０％のイオン化可能なアミノ脂質、５〜２５％の非カチオン性脂質、２５〜５５％のステロール、及び０．５〜１５％のＰＥＧ修飾脂質のモル比を含む、前記ＲＮＡ。
【請求項４９】
ＲＮＡ転写物を生成するためのインビトロ転写反応条件下で、ポリヌクレオチド鋳型をＲＮＡポリメラーゼバリアント、任意選択によりＴ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント、ヌクレオシド三リン酸、及びキャップ類似体と反応させることを含む、リボ核酸（ＲＮＡ）合成のための共転写キャッピング方法。
【請求項５０】
前記生成されたＲＮＡ転写物の８０％超、８５％超、９０％超、または９５％超が、機能性キャップを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記ヌクレオシド三リン酸が、非修飾もしくは修飾ＡＴＰ、修飾もしくは非修飾ＵＴＰ、修飾もしくは非修飾ＧＴＰ、及び／または修飾もしくは非修飾ＣＴＰを含む、請求項４９または５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記ＲＮＡポリメラーゼバリアントが、請求項１〜３２のいずれか１つに記載のＲＮＡポリメラーゼバリアントである、請求項４９〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記ヌクレオシド三リン酸及びキャップ類似体が、前記反応において等モル濃度で存在する、請求項４９〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記反応におけるキャップ類似体とヌクレオシド三リン酸とのモル比が、１：１より大きいか、または１：１に等しく、任意選択により、前記ヌクレオシド三リン酸がＧＴＰ及び／またはＡＴＰを含む、請求項４９〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記キャップ類似体が、ジヌクレオチドキャップ、トリヌクレオチドキャップ、またはテトラヌクレオチドキャップである、請求項４９〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
前記キャップが、以下の配列：ＧＡＡ、ＧＡＣ、ＧＡＧ、ＧＡＵ、ＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、ＧＣＵ、ＧＧＡ、ＧＧＣ、ＧＧＧ、ＧＧＵ、ＧＵＡ、ＧＵＣ、ＧＵＧ、及びＧＵＵから選択される配列を含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記トリヌクレオチドキャップが、以下の配列：
（ａ）ｍ７ＧｐｐｐＡｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＡｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＡｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＡｐＵ、ｍ７ＧｐｐｐＣｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＣｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＣｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＣｐＵ、ｍ７ＧｐｐｐＧｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＧｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＧｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＧｐＵ、ｍ７ＧｐｐｐＵｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＵｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＵｐＧ、及びｍ７ＧｐｐｐＵｐＵ；
（ｂ）ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡｐＡ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡｐＣ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡｐＧ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡｐＵ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣｐＡ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣｐＣ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣｐＧ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣｐＵ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧｐＡ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧｐＣ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧｐＧ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧｐＵ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵｐＡ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵｐＣ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵｐＧ、及びｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵｐＵ；
（ｃ）ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＡ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＣ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＧ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＵ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＡ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＣ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＧ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＵ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＡ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＣ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＧ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＵ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＡ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＣ、ｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＧ、及びｍ７Ｇ３′ＯＭｅｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＵ；または
（ｄ）ｍ７ＧｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＡ２′ＯＭｅｐＵ、ｍ７ＧｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＣ２′ＯＭｅｐＵ、ｍ７ＧｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＧ２′ＯＭｅｐＵ、ｍ７ＧｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＣ、ｍ７ＧｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＧ、及びｍ７ＧｐｐｐＵ２′ＯＭｅｐＵから選択される配列を含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記トリヌクレオチドキャップが、以下の配列：ＧＡＧ、ＧＣＧ、ＧＵＧ、及びＧＧＧから選択される配列を含む、請求項５６または５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記トリヌクレオチドキャップが、配列ＧＡＧを含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記トリヌクレオチドキャップが、ＧｐｐｐＡ２′ＯｍｅｐＧを含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記ポリヌクレオチド鋳型が、鋳型位置＋１に２´−デオキシチミジン残基を含む、請求項４９〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
前記ポリヌクレオチド鋳型が、鋳型位置＋１に２´−デオキシシチジン残基を含む、請求項４９〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
ＲＮＡ合成のための共転写キャッピング方法であって、ＲＮＡ転写物を生成するためのインビトロ転写反応条件下で、ポリヌクレオチド鋳型を（ａ）Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントであって、野生型ＲＮＡポリメラーゼと比較して、前記ＲＮＡポリメラーゼバリアントが開始複合体から伸長複合体に移行するにつれてＲＮＡポリメラーゼバリアントの少なくとも１つのループ構造にヘリックス構造へのコンフォメーション変化を受けさせる少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、前記Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント、（ｂ）ヌクレオシド三リン酸、及び（ｃ）配列ＧｐｐｐＡ２′ＯｍｅｐＧを含むトリヌクレオチドキャップと反応させることを含み、前記ポリヌクレオチド鋳型が、鋳型位置＋１に２´−デオキシチミジン残基を含む、前記方法。
【請求項６４】
前記生成されたＲＮＡ転写物が、任意選択により未精製の形態で、細胞に送達されたときに、検出可能なサイトカイン応答を刺激しないか、またはベースライン対照を上回るサイトカイン応答を刺激しない、請求項４９〜６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
インビトロ転写（ＩＶＴ）ＲＮＡ及び薬学的に許容される賦形剤を含む組成物であって、ＩＶＴ後の精製なしでサイトカイン誘導ＲＮＡ混入物を実質的に含まない、前記組成物。
【請求項６６】
インビトロ転写（ＩＶＴ）ＲＮＡ及び薬学的に許容される賦形剤を含む組成物であって、５％未満のキャップされていないＲＮＡ種を含む、前記組成物。
【請求項６７】
前記ＩＶＴ  ＲＮＡの８０％超、８５％超、９０％超、または９５％超が機能性キャップを含む、請求項６５または６６に記載の組成物。
【請求項６８】
前記ＩＶＴ  ＲＮＡが化学修飾されていない、請求項６５〜６７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６９】
前記ＩＶＴ  ＲＮＡが化学修飾されている、請求項６５〜６７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７０】
前記ＩＶＴ  ＲＮＡの９５％超が、一本鎖完全長転写物を含む、請求項６５〜６９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７１】
前記ＲＮＡが、
ＲＮＡ転写物を生成するためのインビトロ転写反応条件下で、ポリヌクレオチド鋳型を（ａ）Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアントであって、野生型ＲＮＡポリメラーゼと比較して、前記ＲＮＡポリメラーゼバリアントが開始複合体から伸長複合体に移行するにつれてＲＮＡポリメラーゼバリアントの少なくとも１つのループ構造にヘリックス構造へのコンフォメーション変化を受けさせる少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、前記Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼバリアント、（ｂ）ヌクレオシド三リン酸、及び（ｃ）配列ＧｐｐｐＡ２′ＯｍｅｐＧを含むトリヌクレオチドキャップと反応させることを含むプロセスによって生成され、前記ポリヌクレオチド鋳型が、鋳型位置＋１に２´−デオキシチミジン残基を含む、請求項６５〜７０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７２】
野生型Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼと少なくとも９０％の同一性を有し、（ａ）配列番号１のアミノ酸４７位に対応するアミノ酸位置のアラニン及び（ｂ）追加のＣ末端グリシンを含むように修飾されているアミノ酸配列を含む、Ｔ７リボ核酸（ＲＮＡ）ポリメラーゼ。
【請求項７３】
トリヌクレオチドキャップをさらに含む、請求項７２に記載のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ。
【請求項７４】
前記トリヌクレオチドキャップが、ＧｐｐｐＡ２′ＯｍｅｐＧである、請求項７３に記載のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ。
【請求項７５】
野生型Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼと少なくとも９０％の同一性を有し、（ａ）配列番号１のアミノ酸４３位に対応するアミノ酸位置のアラニン及び（ｂ）追加のＣ末端グリシンを含むように修飾されているアミノ酸配列を含む、Ｔ７リボ核酸（ＲＮＡ）ポリメラーゼ。
【請求項７６】
トリヌクレオチドキャップをさらに含む、請求項７５に記載のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ。
【請求項７７】
前記トリヌクレオチドキャップが、ＧｐｐｐＡ２′ＯｍｅｐＧである、請求項７６に記載のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ。
【国際調査報告】
2020532963.tif 000374
2020532963.tif 000375
2020532963.tif 000376
2020532963.tif 000377
2020532963.tif 000378
2020532963.tif 000379
2020532963.tif 000380
2020532963.tif 000381
2020532963.tif 000382
2020532963.tif 000383
2020532963.tif 000384
2020532963.tif 000385
2020532963.tif 000386
2020532963.tif 000387