(57)【要約】本発明は、シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼを共発現する遺伝子組換え菌及びその応用を提供し、構築された遺伝子組換え菌は高濃度のオメプラゾールスルフィドをエソメプラゾールに触媒転化させることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼを共発現する遺伝子組換え菌。
【請求項２】
請求項１に記載の遺伝子組換え菌において、前記遺伝子組換え菌は、シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ遺伝子及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼ遺伝子を共に含むことを特徴とする遺伝子組換え菌。
【請求項３】
請求項１又は請求項２に記載の遺伝子組換え菌において、
（１）シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ遺伝子断片をテンプレートとし、ＰＣＲ増幅を行い、ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素部位を利用して前記遺伝子断片をプラスミドに挿入し、ライゲーションさせて得たベクターを大腸菌Ｔｒａｎｓ−Ｔ１コンピテント細胞に形質転換することにより、組換えプラスミドｐＥＴＣ−ｎを構築し、
（２）イソプロパノールデヒドロゲナーゼ遺伝子断片をテンプレートとし、ＰＣＲ増幅を行い、ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ制限酵素部位を利用して前記遺伝子断片を上記ステップ（１）で構築された組換えプラスミドｐＥＴＣ−ｎに挿入し、ライゲーションさせて得たベクターを大腸菌Ｔｒａｎｓ−Ｔ１コンピテント細胞に形質転換することにより、組換え発現ベクターｐＥＴＣＫ−ｎを構築し、
（３）上記のように構築された組換え発現ベクターｐＥＴＣＫ−ｎを用いて発現宿主を形質転換させ、プライマーＴ７／Ｔ７  ｔｅｒｍを用いてコロニーＰＣＲを行い、正確性が確認されると、シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ遺伝子及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼ遺伝子を共発現する遺伝子組換え菌ＢＬ２１（ＤＥ３）−ｐＥＴＣＫ−ｎを得るというように構築されることを特徴とする遺伝子組換え菌。
【請求項４】
請求項３に記載の遺伝子組換え菌において、ステップ（１）に記載のプラスミドは、ｐＥＴ  ２１ａプラスミド、ｐＥＴ  ２８ａプラスミド、ｐＥＴ  ２２ｂプラスミド、ｐＥＴＤｕｅｔ  １プラスミド、ｐＲＳＦＤｕｅｔ  １プラスミド、又はｐＡＣＹＣＤｕｅｔ  １プラスミドから選ばれることを特徴とする遺伝子組換え菌。
【請求項５】
請求項３に記載の遺伝子組換え菌において、ステップ（１）におけるＰＣＲ増幅で設計されたフォワードプライマー、リバースプライマー配列はそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３０に示されるとおりであり、ステップ（２）におけるＰＣＲ増幅で設計されたフォワードプライマー、リバースプライマー配列はそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３２に示されるとおりであることを特徴とする遺伝子組換え菌。
【請求項６】
請求項３に記載の遺伝子組換え菌において、ステップ（３）に記載の宿主は大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳ又はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｓｔａｒであることを特徴とする遺伝子組換え菌。
【請求項７】
請求項１、請求項２又は請求項３に記載の遺伝子組換え菌において、前記シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１２から選ばれ、前記イソプロパノールデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２４から選ばれることを特徴とする遺伝子組換え菌。
【請求項８】
請求項７に記載の遺伝子組換え菌において、前記シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列は、対応してＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１１からそれぞれ選ばれ、前記イソプロパノールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列は、対応してＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２３からそれぞれ選ばれることを特徴とする遺伝子組換え菌。
【請求項９】
エソメプラゾールの製造方法であって、適切な反応条件において、請求項１〜請求項８のいずれか１項に記載の遺伝子組換え菌を反応系に加え、反応基質オメプラゾールスルフィドをエソメプラゾールに触媒転化させることを特徴とするエソメプラゾールの製造方法。
【請求項１０】
請求項９に記載のエソメプラゾールの製造方法において、反応系における液相中のオメプラゾールスルフィドの含有量が１ｗｔ％以下となるよう制御することを特徴とするエソメプラゾールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子工学及び発酵工学の分野に関し、より詳しくは、シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼを共発現する遺伝子組換え菌及びその応用に関し、特に、シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼを高レベルで共発現する遺伝子組換え菌、及びキラルなスルホキシド系化合物、特にエソメプラゾールの製造におけるその応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロトンポンプ阻害薬（Ｐｒｏｔｏｎ  ｐｕｍｐ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ、略称ＰＰＩｓ）は、ここ数十年、胃潰瘍を治療する薬物として臨床で幅広く使用されている。従来のプロトンポンプ阻害薬としては主に、キラルなスルホキシド系薬物、例えばエソメプラゾール、（Ｓ）−パントプラゾール及び（Ｒ）−ランソプラゾール等が挙げられる。このうちエソメプラゾールはＳ配置のオメプラゾールで、その化学名は５−メトキシ−２−（（Ｓ）−（（４−メトキシ−３，５−ジメチル−２−ピリジル）メチル）スルフィニル）−１Ｈ−ベンゾイミダゾールで、ＣＡＳ登録番号は１１９１４１−８８−７であり、その化学構造は下記式Ｉに示されるとおりである。オメプラゾールの化学名は５−メトキシ−２−［（４−メトキシ−３，５−ジメチル−２−ピリジル）スルフィニル］−３Ｈ−ベンゾイミダゾールで、ＣＡＳ登録番号は７３５９０−５８−６であり、その化学構造は下記式ＩＩに示されるとおりである。
【０００３】
【化１】
2020513758.tif 000002
【０００４】
オメプラゾールと比べ、エソメプラゾールは初回通過効果が小さい、血中薬物濃度が高い、血中半減期が長い、生物学的利用能が高い、薬物間相互作用が小さい、薬効が強く長続きする等のメリットを有するため、高齢者、腎不全及び軽度ないし中等度の肝不全患者等特殊患者への投与にはとりわけ適する。この他に、エソメプラゾールは既に治癒された食道炎患者に対し再発予防のための維持治療として長期投与することにも適し、適切な抗菌療法と併用すればヘリコバクター・ピロリ菌を根絶できるだけでなく、ヘリコバクター・ピロリ菌感染に関連する十二指腸潰瘍を回復させ、ヘリコバクター・ピロリ菌に関連する消化性潰瘍の再発を予防することもできる。エソメプラゾールはその優れた品質から２００４年に売上高４３億ドル（約４７２３億円）に達し、同年のグローバル医薬品売上高ランキングで第５位となった。
【０００５】
従来のプラゾール系薬物の生体酵素合成法は、主に次の２タイプに大別される。１つは、野生菌株を用いて全細胞触媒を行う方法であり、もう１つは、補酵素又は補酵素再生系と共に、モノオキシゲナーゼを担持する遺伝子組換え菌を用いて触媒する方法である。米国特許登録第５８４０５５２Ａ号では、スクリーニングにより生体酸化反応に利用可能な一連の菌株を得て、プラゾール系化合物を製造する方法を開示し、触媒による優れたキラル選択性を実現し、産物の鏡像体過剰率（ｅｅ値）は９９％を超える一方、産物の濃度が低く、ｐｐｍレベルにとどまるという欠点もある。中国特許公開第１０２８８４１７８Ａ号では、プラゾール系化合物の触媒合成に用いられる天然に存在しないモノオキシゲナーゼを開示し、当該発明による方法において、補因子及び当該補因子を再生するための酵素を加える必要があり、当該方法により得た産物の濃度が高い一方、各種酵素を別々に発酵して得る必要があるため、操作手順が複雑で、コストが高いという問題があり、１ロットの反応では触媒可能な基質濃度が低い（３３ｇ／Ｌ）ため、産業的な大量生産には適さない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記従来の課題を解決するためになされるものであり、シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ（ＣＨＭＯ）及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼ（ＫＲＥＤ）を共発現する遺伝子組換え菌、構築方法、及びキラルなスルホキシド系化合物の製造におけるその応用、特に、エソメプラゾールの製造におけるその応用を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を実現するため、本発明は、シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼを共発現する遺伝子組換え菌を提供し、前記遺伝子組換え菌はシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ遺伝子及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼ遺伝子を共に含む。なお、上記遺伝子組換え菌において、シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ（ＣＨＭＯ）の遺伝子及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼ（ＫＲＥＤ）の遺伝子が同一の発現ベクター、例えばプラスミドに組み入れられることが好ましい。ただし前記シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１２から選ばれ、前記イソプロパノールデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２４から選ばれ、前記シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列は、対応してＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１１からそれぞれ選ばれ、前記イソプロパノールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列は、対応してＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２３からそれぞれ選ばれる。
【０００８】
前記シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼを共発現する遺伝子組換え菌は、次の方法により構築することができる。
（１）シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ遺伝子断片をテンプレートとし、ＰＣＲ増幅を行い、ＮｄｅＩ和ＢａｍＨＩ制限酵素部位を利用して当該遺伝子断片をプラスミドに挿入し、ライゲーションさせて得たベクターを大腸菌Ｔｒａｎｓ−Ｔ１コンピテント細胞（ＴｒａｎｓＧｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社提供）に形質転換することにより、組換えプラスミドｐＥＴＣ−ｎを構築する。
（２）イソプロパノールデヒドロゲナーゼ遺伝子断片をテンプレートとし、ＰＣＲ増幅を行い、ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ制限酵素部位を利用して当該遺伝子断片を上記ステップ（１）で構築された組換えプラスミドｐＥＴＣ−ｎに挿入し、ライゲーションさせて得たベクターを大腸菌Ｔｒａｎｓ−Ｔ１コンピテント細胞に形質転換することにより、組換え発現ベクターｐＥＴＣＫ−ｎを構築する。
（３）上記のように構築された組換え発現ベクターｐＥＴＣＫ−ｎを用いて発現宿主を形質転換させ、プライマーＴ７／Ｔ７ｔｅｒｍを用いてコロニーＰＣＲを行い、正確性が確認されると、シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ遺伝子及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼ遺伝子を共発現する遺伝子組換え菌ＢＬ２１（ＤＥ３）−ｐＥＴＣＫ−ｎを得る。
【０００９】
ただし上記方法において、ステップ（１）に記載のプラスミドは、ｐＥＴ  ２１ａプラスミド、ｐＥＴ  ２８ａプラスミド、ｐＥＴ  ２２ｂプラスミド、ｐＥＴＤｕｅｔ  １プラスミド、ｐＲＳＦＤｕｅｔ  １プラスミド、又はｐＡＣＹＣＤｕｅｔ  １プラスミドから選ばれる。
【００１０】
ステップ（３）に記載のプライマーＴ７、Ｔ７ｔｅｒｍは、本分野で一般的に使用されるプライマーで、市販品として入手可能であり、前記宿主は、大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳ又はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｓｔａｒを含み、ただしこれらに限定されない。
【００１１】
本発明の一つの実施形態において、上記方法によりシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼを共発現する遺伝子組換え菌を構築し、前記遺伝子組換え菌はシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ遺伝子及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼ遺伝子を共に含み、ただし前記シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２に示されるとおりであり、前記イソプロパノールデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１６に示されるとおりであり、前記シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１に示されるとおりであり、前記イソプロパノールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１５に示されるとおりである。
【００１２】
本発明のもう一つの実施形態において、上記方法によりシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼを共発現する遺伝子組換え菌を構築し、前記遺伝子組換え菌はシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ遺伝子及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼ遺伝子を共に含み、ただし前記シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４に示されるとおりであり、前記イソプロパノールデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１４に示されるとおりであり、前記シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３に示されるとおりであり、前記イソプロパノールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１３に示されるとおりである。
【００１３】
本発明のもう一つの実施形態において、上記方法によりシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼを共発現する遺伝子組換え菌を構築し、前記遺伝子組換え菌はシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ遺伝子及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼ遺伝子を共に含み、ただし前記シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６に示されるとおりであり、前記イソプロパノールデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１８に示されるとおりであり、前記シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５に示されるとおりであり、前記イソプロパノールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１７に示されるとおりである。
【００１４】
本発明のもう一つの実施形態において、上記方法によりシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼを共発現する遺伝子組換え菌を構築し、前記遺伝子組換え菌はシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ遺伝子及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼ遺伝子を共に含み、ただし前記シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．８に示されるとおりであり、前記イソプロパノールデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２０に示されるとおりであり、前記シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７に示されるとおりであり、前記イソプロパノールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１９に示されるとおりである。
【００１５】
本発明のもう一つの実施形態において、上記方法によりシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼを共発現する遺伝子組換え菌を構築し、前記遺伝子組換え菌はシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ遺伝子及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼ遺伝子を共に含み、ただし前記シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１０に示されるとおりであり、前記イソプロパノールデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２２に示されるとおりであり、前記シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．９に示されるとおりであり、前記イソプロパノールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２１に示されるとおりである。
【００１６】
本発明のもう一つの実施形態において、上記方法によりシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼを共発現する遺伝子組換え菌を構築し、前記遺伝子組換え菌はシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ遺伝子及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼ遺伝子を共に含み、ただし前記シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１２に示されるとおりであり、前記イソプロパノールデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２４に示されるとおりであり、前記シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１１に示されるとおりであり、前記イソプロパノールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２３に示されるとおりである。
【００１７】
さらに、本発明は、シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼを共発現する前記遺伝子組換え菌（ＢＬ２１（ＤＥ３）−ｐＥＴＣＫ−ｎ）の振盪培養法を提供し、当該方法は、下記ステップを含む。
前記遺伝子組換え菌ＢＬ２１（ＤＥ３）−ｐＥＴＣＫ−ｎを相当の耐性を有する液体ＬＢ培地３〜５ｍＬに接種し、３７℃で振盪培養装置において１２〜３６時間活性化させ、活性化して得た培養物を０．５〜５％（ｖ／ｖ）の接種量で発酵培地に移し、２５〜４０℃で１〜３時間発酵培養し、次に、誘導剤として最終濃度０．０５〜２ｇ／Ｌのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を加え、１５〜３５℃で２〜２４時間誘導発現させ、遠心、濾過又は限外濾過を行って菌泥を得ると、−８０℃で冷凍保存する。
【００１８】
ただし前記接種量とは、前記発酵培地の体積に対する加えられる活性化された遺伝子組換え菌の体積のパーセントを指す。
【００１９】
さらに、本発明は、シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼを共発現する前記遺伝子組換え菌のキラルなスルホキシド系化合物の製造におけるその応用、特にエソメプラゾールの製造におけるその応用を提供する。
【００２０】
これに伴い、本発明はエソメプラゾールの製造方法にも関し、当該方法は、適切な反応条件において、本発明に係るシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼを共発現する遺伝子組換え菌を反応系に加え、反応基質オメプラゾールスルフィドをエソメプラゾールに触媒転化させることを含む。
【００２１】
具体的に、前記エソメプラゾールの製造方法は、本発明に係る遺伝子組換え菌ＢＬ２１（ＤＥ３）−ｐＥＴＣＫ−ｎ、リン酸緩衝液（ｐＨ＝７．０〜１０．０）を反応系に加え、均一に攪拌し、次に、オメプラゾールスルフィド、イソプロパノール、補酵素ＮＡＤＰを順に加え、酸素雰囲気の中で０〜４０℃に保温しながら２〜７２時間反応させ、液相中のオメプラゾールスルフィドの含有量が１ｗｔ％（質量パーセント濃度）以下となり、例えば０．９５ｗｔ％、０．９０ｗｔ％、０．８５ｗｔ％、０．８０ｗｔ％、０．７５ｗｔ％、０．７０ｗｔ％等となるようよう制御し、最後に、適量の酢酸エチルを加えて反応を停止させ、静置して分離させ、水層を除去し、飽和塩化ナトリウム溶液で酢酸エチルを２〜３回洗浄し、乾燥させて遠心脱水し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分析して、高純度の目的物質エソメプラゾールを得ることを含み、収率は８０％以上で、ｅｅ値は９８％以上である。
【００２２】
なお、上記方法において、反応物を加える順は限定されない。反応物を反応系に同時に加えることができる。又は任意的に、一部の反応物を別々に加えてから、その他の反応物を加えるようにしてもよい。
【００２３】
本発明に記載の方法において、反応基質、例えばオメプラゾールスルフィドの全て又はほぼ全てが目的産物エソメプラゾールに転化されるまで反応させることが可能である。基質の転化及び産物の生成を検出するには従来の方法を用いることができ、前記方法は、例えばガスクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ等を含み、ただしこれらに限定されない。
【発明の効果】
【００２４】
生体酵素法によりプラゾール系薬物を合成する従来技術と比べ、本発明は、シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼの同一菌株における高レベルの共発現を実現し、シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ発現菌株の発酵及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼ発現菌株の発酵を１つの共発現菌株の発酵として統合させることにより、発酵のステップを減らし、生産コストを削減するとともに、全細胞触媒を実現し、細胞の破砕や遠心等の操作が不要となるため、産業上幅広く応用されることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、本発明に係る遺伝子組換え菌ＢＬ２１（ＤＥ３）−ｐＥＴＣＫ−ｎによる誘導発現タンパク質の電気泳動図である。ここで、Ｍはタンパク質マーカーであり、１は遺伝子組換え菌ＢＬ２１（ＤＥ３）−ｐＥＴＣＫ−１による誘導菌体タンパク質で、２は遺伝子組換え菌ＢＬ２１（ＤＥ３）−ｐＥＴＣＫ−２による誘導菌体タンパク質で、３は遺伝子組換え菌ＢＬ２１（ＤＥ３）−ｐＥＴＣＫ−３による誘導菌体タンパク質で、４は遺伝子組換え菌ＢＬ２１（ＤＥ３）−ｐＥＴＣＫ−４による誘導菌体タンパク質で、５は遺伝子組換え菌ＢＬ２１（ＤＥ３）−ｐＥＴＣＫ−５による誘導菌体タンパク質で、６は遺伝子組換え菌ＢＬ２１（ＤＥ３）−ｐＥＴＣＫ−６による誘導菌体タンパク質である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、具体的な実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。なお下記実施例は、本発明の範囲を限定することなく説明目的で用いられるものに過ぎない。
【００２７】
本明細書に記載の各種物質の加えられた量、含有量、濃度、及びパーセント含有量は、別途説明がない限り、いずれも質量パーセント含有量を指す。
【００２８】
本明細書において、説明の便宜上、場合によってはあるタンパク質の名称とそれをコードする遺伝子（ＤＮＡ）の名称を入れ替えて用いることもあるが、本当業者ならば理解できるように、場合によってこれらの記載は異なる物質を表している。例えば、あるシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ（遺伝子）は、基質を触媒して反応させるものとして説明される場合にタンパク質を指し、遺伝子として説明される場合に、当該シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼをコードする遺伝子を指し、その他に関し同様のように理解される。
【００２９】
シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼを共発現する微生物は、いかなる形質転換体としての宿主であってもよく、例えば細菌及び真菌が挙げられ、ただしこれらに限定されない。なお細菌、とりわけ大腸菌、例えば大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳ又はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｓｔａｒを含み、ただしこれらに限定されない大腸菌であることが好ましい。
【００３０】
生体酵素触媒としてエソメプラゾールの生産に用いる場合、本発明は、シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼを共発現さえできれば、いかなる形式でも利用可能であり、例えば酵素の形式、微生物菌体の形式又はその他の形式が挙げられる。前記酵素の形式は遊離酵素、固定化酵素を含み、精製酵素、粗酵素、発酵液、ベクターで固定された酵素等を含み、前記菌体の形式は生菌体及び死菌体を包む。なお、遺伝子組換え菌の菌体の形式であることが好ましい。
【００３１】
本発明に用いられるプライマーＴ７、Ｔ７ｔｅｒｍは、いずれも一般的に使用されるプライマーであり、当業者は従来技術に従って自ら合成するか、又は市販品として入手してもよい。
【００３２】
本発明で用いられるプラスミド、例えばｐＥＴ  ２１ａプラスミド、ｐＥＴ  ２８ａプラスミド、ｐＥＴ  ２２ｂプラスミド、ｐＥＴＤｕｅｔ  １プラスミド、ｐＲＳＦＤｕｅｔ  １プラスミド、又はｐＡＣＹＣＤｕｅｔ  １プラスミドは、いずれも本分野で一般的に使用されるプラスミドであり、市販品として入手可能である。
【００３３】
本発明に記載のＬＢ培地、発酵培地はいずれも一般的な製品であり、当業者は従来技術に従って自ら調製するか、又は市販品として入手可能であり、例えば、「分子克隆実験指南」（第三版）（米Ｊ・サムブルック、Ｄ・Ｗ・ラッセル著、黄培堂等訳、科学出版社、北京２００２）を参照して自ら調製することができる。例えば、前記ＬＢ培地は、次の配合で調製することができる。酵母エキス５ｇ、ペプトン１０ｇ、ＮａＣｌ  ５ｇ、寒天１５〜２０ｇに、１０００ｍＬになるまで水を加えて、ｐＨを７．４〜７．６とする。前記「相当の耐性を有するＬＢ培地」とは、ＬＢ培地を調製する過程で適量の抗生物質を加えることを指し、抗生物質の種類は、選択されたプラスミドによって異なるが、いずれも本分野で一般的に使用されるものであり、例えばアンピシリン及び／又はカナマイシンである。前記発酵培地は、次の配合で調製することができる。Ｎａ２ＨＰＯ４  ６ｇ、ＫＨ２ＰＯ４  ３ｇ、ＮａＣｌ  ０．５ｇ、ＮＨ４Ｃｌ  １ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．５ｇ、ＣａＣｌ２  ０．０１１ｇ、グルコース２〜１０ｇに、１０００ｍＬになるまで水を加えて、ｐＨを７．０とする。
【００３４】
実施例１：シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ遺伝子断片の合成及び部位特異的変異導入
【００３５】
ＮＣＢＩにおいてシクロヘキサノン−１，２−モノオキシゲナーゼ遺伝子１（ＮＣＢＩ登録番号は５７８０２６７６７）を検索し、当該遺伝子断片を合成し、そのヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１に示されるとおりであり、それによってコードされるアミノ酸配列は、対応してＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるとおりである。
【００３６】
ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異導入法（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ、ストラタジーン社とアジレント社提供）を用いて、上記シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ遺伝子に対しタンパク質工学による改造を行った。具体的には、下記のとおりプライマーＦ１及びＲ１を設計し（下線部は変異部位に対応する）、当該シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ遺伝子のアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２における４３５番目のセリン（Ｓｅｒ）に対し部位特異的変異導入による改造を行い、トレオニン（Ｔｈｒ）として突然変異させた。
フォワードプライマーＦ１：ＧＧＴＣＣＡＣＴＧＧＣＣＡＡＴＡＣＴＣＣＴＣＣＴＡＴＣＡＴＣＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２５）
リバースプライマーＲ１：ＣＧＡＴＧＡＴＡＧＧＡＧＧＡＧＴＡＴＴＧＧＣＣＡＧＴＧＧＡＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２６）
ＰＣＲプログラム設定：
９５℃初期変性３ｍｉｎ
９５℃、４５秒／５５℃、４５秒／７２℃、２ｍｉｎ  １８サイクル
７２℃、７ｍｉｎ。
【００３７】
本発明に係るシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ突然変異遺伝子２を得て、そのヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示されるとおりであり、対応するアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に示されるとおりである。
【００３８】
ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異導入法（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ、ストラタジーン社とアジレント社提供）を用いて、上記のように得たシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ遺伝子２に対しタンパク質工学による改造を行った。具体的には、下記のとおりプライマーＦ２及びＲ３を設計し（下線部は変異部位に対応する）、当該シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ遺伝子２のアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３における３８６番目のセリン（Ｓｅｒ）に対し部位特異的変異導入による改造を行い、アスパラギン（Ａｓｎ）として突然変異させた。
フォワードプライマーＦ２：ＧＣＴＴＴＧＡＴＧＣＧＧＧＣＧＡＴＧＧＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＣＧＣＡＴＣＧＡＣＡＴＡＣＡＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２７）
リバースプライマーＲ２：ＧＴＴＧＣＣＡＴＣＧＣＣＣＧＣＡＴＣＡＡＡＧＣＣＧＧＴＣＧＣＧＣＡＡＡＴＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２８）
ＰＣＲプログラム設定：
９５℃初期変性３ｍｉｎ
９５℃、４５秒／５５℃、４５秒／７２℃、２ｍｉｎ  １８サイクル
７２℃、７ｍｉｎ。
【００３９】
本発明に係るシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ突然変異遺伝子３を得て、そのヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示されるとおりであり、対応するアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に示されるとおりである。
【００４０】
同様に、ＮＣＢＩにおいてシクロヘキサノン−１，２−モノオキシゲナーゼ遺伝子４を検索し（ＮＣＢＩ登録番号は２９６８４８３９７）、当該遺伝子断片を合成し（断片の両端にＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素断片を加える）、そのヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７に示されるとおりであり、それによってコードされるアミノ酸配列は、対応してＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８に示されるとおりである。
【００４１】
ＮＣＢＩにおいてシクロヘキサノン−１，２−モノオキシゲナーゼ遺伝子５（ＮＣＢＩ登録番号は１１０９６３７９０６）を検索し、当該遺伝子断片を合成し、（断片の両端にＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素断片を加える）、そのヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．９に示されるとおりであり、それによってコードされるアミノ酸配列は、対応してＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０に示されるとおりである。
【００４２】
ＮＣＢＩにおいてシクロヘキサノン−１，２−モノオキシゲナーゼ遺伝子６を検索し（ＮＣＢＩ登録番号は１０９９７６５０５５）、当該遺伝子断片を合成し、そのヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１１に示されるとおりであり、それによってコードされるアミノ酸配列は、対応してＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２に示されるとおりである。
【００４３】
実施例２：イソプロパノールデヒドロゲナーゼ遺伝子断片の合成
【００４４】
ＮＣＢＩにおいてイソプロパノールデヒドロゲナーゼ遺伝子１を検索し（ＮＣＢＩ登録番号は５７８０２６８２２）、当該遺伝子断片を合成し、そのヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１３に示されるとおりであり、それによってコードされるアミノ酸配列は、対応してＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１４に示されるとおりである。
【００４５】
ＮＣＢＩにおいてイソプロパノールデヒドロゲナーゼ遺伝子２を検索し（ＮＣＢＩ登録番号は９３８９９２１７８）、当該遺伝子断片を合成し、そのヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１５に示されるとおりであり、それによってコードされるアミノ酸配列は、対応してＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１６に示されるとおりである。
【００４６】
ＮＣＢＩにおいてイソプロパノールデヒドロゲナーゼ遺伝子３を検索し（ＮＣＢＩ登録番号は９３１１３９６１９）、当該遺伝子断片を合成し、そのヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１７に示されるとおりであり、それによってコードされるアミノ酸配列は、対応してＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１８に示されるとおりである。
【００４７】
ＮＣＢＩにおいてイソプロパノールデヒドロゲナーゼ遺伝子４を検索し（ＮＣＢＩ登録番号は２１２２５４２７）、当該遺伝子断片を合成し（断片の両端にＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ制限酵素断片を加える）、そのヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１９に示されるとおりであり、それによってコードされるアミノ酸配列は、対応してＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２０に示されるとおりである。
【００４８】
ＮＣＢＩにおいてイソプロパノールデヒドロゲナーゼ遺伝子５を検索し（ＮＣＢＩ登録番号は８７４５１０４７４）、当該遺伝子断片を合成し（断片の両端にＮｄｅＩ及びＫｐｎＩ制限酵素断片を加える）、そのヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２１に示されるとおりであり、それによってコードされるアミノ酸配列は、対応してＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２２に示されるとおりである。
【００４９】
ＮＣＢＩにおいてイソプロパノールデヒドロゲナーゼ遺伝子６を検索し（ＮＣＢＩ登録番号は１０８９５６８３６８）、当該遺伝子断片を合成し（断片の両端にＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ制限酵素断片を加える）、そのヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２３に示されるとおりであり、それによってコードされるアミノ酸配列は、対応してＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２４に示されるとおりである。
【００５０】
実施例３  組替え共発現ベクターの構築
【００５１】
「分子克隆実験指南」（第三版）（米Ｊ・サムブルック、Ｄ・Ｗ・ラッセル著、黄培堂等訳、科学出版社、北京２００２）を参照して、下記のように制限酵素切断、ライゲーション又はコンピテント細胞の調製、形質転換等試験を行った。
【００５２】
フォワードプライマーＦ３：ＧＧＣＣＡＴＡＴＧＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＡＴＧＡＧＴＡＣＣＡＡＧＡＴＧＧＡＴＴＴＴＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２９）
リバースプライマーＲ３：ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＧＣＡＴＴＡＧＣＣＴＧＣＴＧＴＴＴＧＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３０）
プライマーＦ３及びＲ３を設計し、ヌクレオチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５に示される３つのシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ遺伝子断片をそれぞれテンプレートとし、それぞれＰＣＲして前記シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ遺伝子断片を増幅させ（断片の両端にＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素断片を加える）、ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素部位を利用してこれら３つの遺伝子をｐＥＴ  ２１ａプラスミド、ｐＥＴ  ２８ａプラスミド又はｐＥＴ  ２２ｂプラスミドにそれぞれ挿入し、ライゲーションさせて得たベクターを大腸菌Ｔｒａｎｓ−Ｔ１コンピテント細胞に形質転換することにより、組換えプラスミドを構築し、プライマーＴ７／Ｒ３を用いてコロニーＰＣＲを行って検証し、当該組換えプラスミドを抽出し、配列決定により検証を行い、正確性が確認された組換えプラスミドを、ｐＥＴＣ−ｎと命名する。
【００５３】
フォワードプライマーＦ４：ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣＴＴＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＡＴＧＡＣＧＧＡＴＣＧＴＣＴＧＡＡＡＧＧＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３１）
リバースプライマーＲ４：ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＴＧＧＧＣＧＧＴＡＴＡＧＣＣＧＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３２）
プライマーＦ４及びＲ４を設計し、ヌクレオチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１５及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１７に示される３つのイソプロパノールデヒドロゲナーゼ遺伝子断片をそれぞれテンプレートとし、ＰＣＲして前記イソプロパノールデヒドロゲナーゼ遺伝子断片を増幅させ（断片の両端にＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ制限酵素断片を加える）、ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ制限酵素部位を利用して当該遺伝子を上記のように構築された組換えプラスミドｐＥＴＣ−ｎにそれぞれ挿入し、ライゲーションさせて得たベクターを大腸菌Ｔｒａｎｓ−Ｔ１コンピテント細胞に形質転換することにより、組換えプラスミドを構築し、プライマーＦ４／Ｔ７ｔｅｒｍを用いてコロニーＰＣＲを行って検証し、当該組換えプラスミドを抽出し、配列決定検証を行い、正確性が確認された組換え共発現ベクターを、ｐＥＴＣＫ−ｎと命名する。
【００５４】
なお、同様の方法により、ヌクレオチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．９及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１１に示される３つのシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ遺伝子断片をそれぞれテンプレートとし、ｐＥＴＤｕｅｔ  １プラスミド、ｐＲＳＦＤｕｅｔ  １プラスミド及びｐＡＣＹＣＤｕｅｔ  １プラスミドを使用して制限酵素切断して挿入することにより、組換えプラスミドｐＥＴＣ−ｍを構築した。
【００５５】
次に、ヌクレオチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２１及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２３に示される３つのイソプロパノールデヒドロゲナーゼ遺伝子断片をそれぞれテンプレートとし、上記同様の方法により、組換え共発現ベクターｐＥＴＣＫ−ｍを構築した。
【００５６】
各組換え発現ベクターの関連情報は表１に示されるとおりである。
【００５７】
表１：各組換え共発現ベクターの構築の関連情報
【００５８】
【表１】
2020513758.tif 000003
【００５９】
実施例４：遺伝子組換え菌の構築
【００６０】
実施例３で構築された各組換え共発現ベクターをコンピテント細胞Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳ又はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｓｔａｒ（ＴｒａｎｓＧｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社提供）にそれぞれ形質転換した。プライマーＴ７／Ｔ７ｔｅｒｍを用いてコロニーＰＣＲを行い、正確性が確認さると、本発明に係るシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼを共発現する遺伝子組換え菌を得て、ＢＬ２１（ＤＥ３）−ｐＥＴＣＫ−ｎと命名し、その構築の関連情報は表２に示されるとおりである。
【００６１】
表２：遺伝子組換え菌ＢＬ２１（ＤＥ３）−ｐＥＴＣＫ−ｎの構築の関連情報
【００６２】
【表２】
2020513758.tif 000004
【００６３】
実施例５：遺伝子組換え菌の振盪培養と誘導発現
【００６４】
上記のように構築された遺伝子組換え菌ＢＬ２１（ＤＥ３）−ｐＥＴＣＫ−ｎを相当の耐性を有する液体ＬＢ試験管培地３〜５ｍＬに接種し、３７℃で振盪培養して１２〜３６時間活性化させ、活性化して得た培養物を０．５〜５％（ｖ／ｖ）の接種量で発酵培地に移し、２５〜４０℃で１〜３時間発酵培養し、次に、誘導剤として最終濃度０．０５〜２ｇ／Ｌのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を加え、１５〜３５℃で２〜２４時間誘導発現させ、遠心、濾過又は限外濾過を行って菌泥を得ると、−８０℃で冷凍保存した。培養条件は表３に示されるとおりである。
【００６５】
表３：遺伝子組換え菌の振盪培養と誘導発現条件
【００６６】
【表３】
2020513758.tif 000005
【００６７】
図１は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで検出した各遺伝子組換え菌ＢＬ２１（ＤＥ３）−ｐＥＴＣＫ−ｎにおけるタンパク質発現状況である。
【００６８】
実施例６：酵素活性測定
【００６９】
下記方法により本発明に係る遺伝子組換え菌ＢＬ２１（ＤＥ３）−ｐＥＴＣＫ−ｎの酵素活性を測定した。
実施例５で得た遺伝子組換え菌の発酵液を各２ｍＬ取得し、遠心して菌体を收集し、上清液をデカントした。菌体にリン酸カリウム緩衝液（５０ｍｍｏｌ、ｐＨ＝８．０）１ｍＬ、０．２ｇ／Ｌ酸化型補酵素ＩＩ、１０ｍｍｏｌ／Ｌオメプラゾールスルフィド及び１０％イソプロパノールを加え、ボルテックスして均一に混合させた。３７℃で２００ｒｐｍに設定された振盪培養装置に入れて１時間振盪反応させ、ＨＰＬＣによりエソメプラゾールの生成量を検出し、酵素活性を算出した。
【００７０】
１ユニット当たりの酵素活性は、エソメプラゾール１μｍｏｌを触媒生成するのに１時間当たり必要な酵素量として定義される。
【００７１】
ＨＰＬＣによる検出方法は次のとおりである。島津液体クロマトグラフ、フェノメネクス社カラムを使用し、移動相は１０ｍＭのリン酸塩（ｐＨ＝７．６）：アセトニトリル（６０：４０）とし、流速は１ｍＬ／ｍｉｎとし、カラム温度は３５℃とし、紫外検出波長は３００ｎｍとし、検出時間１５ｍｉｎとした。保持時間は、産物３．８ｍｉｎ、基質８．２ｍｉｎとした。
【００７２】
酵素活性の検出結果は表４に示されるとおりである。表４から分かるように、遺伝子組換え菌ＢＬ２１（ＤＥ３）−ｐＥＴＣＫ−２の酵素活性が最も高く、次いで遺伝子組換え菌ＢＬ２１（ＤＥ３）−ｐＥＴＣＫ−３となり、二者の酵素活性はいずれも遺伝子組換え菌ＢＬ２１（ＤＥ３）−ｐＥＴＣＫ−１の酵素活性より高かった。これについて、当該２種の遺伝子組換え菌はシクロヘキサノン−１，２−モノオキシゲナーゼ遺伝子を突然変異させて構築したためとその原因を推測している。これに対し遺伝子組換え菌ＢＬ２１（ＤＥ３）−ｐＥＴＣＫ−４、ＢＬ２１（ＤＥ３）−ｐＥＴＣＫ−５、ＢＬ２１（ＤＥ３）−ｐＥＴＣＫ−６の酵素活性は低かった。
【００７３】
表４：本発明による遺伝子組換え菌の酵素活性
【００７４】
【表４】
2020513758.tif 000006
【００７５】
実施例７：酵素触媒によるエソメプラゾールの製造
【００７６】
実施例５で得た遺伝子組換え菌ＢＬ２１（ＤＥ３）−ｐＥＴＣＫ−１、ＢＬ２１（ＤＥ３）−ｐＥＴＣＫ−２、ＢＬ２１（ＤＥ３）−ｐＥＴＣＫ−３の発酵液を各１０ｇ秤量し、リン酸緩衝液（ｐＨ＝７．０〜１０．０）８０ｍＬを加えて均一に攪拌し、オメプラゾールスルフィド１ｇ、イソプロパノール２０ｍＬ、酸化型補酵素ＩＩ  ０．００６ｍｇを順に加え、酸素雰囲気の中で０〜４０℃に保温しながら２〜７２時間反応させ、液相中のオメプラゾールスルフィドの含有量が１ｗｔ％より小さくなるよう制御し、酢酸エチル２００ｍＬを加えて反応を停止させ、静置して分離させ、水層を除去し、飽和塩化ナトリウム溶液で酢酸エチルを２回洗浄し、乾燥させて遠心脱水し、ＨＰＬＣにより検出して、目的物質エソメプラゾールを得た。ｅｅ値は９８％より大きく、収率はいずれも８０％を超えた。
【００７７】
各遺伝子組換え菌の反応条件は、表５に示されるとおりである。
【００７８】
表５：遺伝子組換え菌の反応条件及び反応結果
【００７９】
【表５】
2020513758.tif 000007
【００８０】
上記実施例は、係る各発明を限定することなく説明するためのものに過ぎない。上記のとおり各実施例を参照して本発明を詳細に説明しているが、当業者ならば理解できるように、なおも前記各実施例に記載の各発明について修正を行ったり、又はその一部主旨において均等な置き換えを行ったりすることもでき、ただしこのような修正又は置き換えにより、該当する発明の主旨が本発明全体の主旨とその範囲から逸脱することはない。
【図１】
2020513758.tif 000008
【配列表】
2020513758000001.app
【国際調査報告】
2020513758.tif 000009
2020513758.tif 000010
2020513758.tif 000011
2020513758.tif 000012
2020513758.tif 000013
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