(57)【要約】  モノクローナル抗ＰＨＦ−タウ抗体及びその抗原結合断片が記載されている。抗体をコードする核酸、抗体を含む組成物、並びに抗体の製造方法、及びタウ異常症などの状態を治療又は予防するための、抗体の使用方法についてもまた、記載されている。
2020513804.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン酸化エピトープにおいてリン酸化タウタンパク質に結合する、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合断片であって、
（ａ）前記タウタンパク質のリン酸化Ｔ２１２及びリン酸化Ｔ２１７、並びに配列番号：４８のアミノ酸配列を有する、又はその中にある前記リン酸化エピトープ；
（ｂ）前記タウタンパク質のリン酸化Ｔ２１７、及び配列番号：５２のアミノ酸配列を有する、又はその中にある前記リン酸化エピトープ；又は
（ｃ）前記タウタンパク質のリン酸化Ｔ２１２、及び配列番号：５４のアミノ酸配列を有する、又はその中にある前記リン酸化エピトープ；
を含む、前記単離モノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２】
前記モノクローナル抗体が、配列番号：１、４、７、１０、７１、８０のいずれかのＨＣＤＲ１；配列番号：２、５、８、１１、７２、８１のいずれかのＨＣＤＲ２；配列番号：３、６、９、１２、７３のいずれかのＨＣＤＲ３；配列番号：１３、１６、１９、２２、７０のいずれかのＬＣＤＲ１；配列番号：１４、１７、２０、２３のいずれかのＬＣＤＲ２；配列番号：１５、１８、２１、２４のいずれかのＬＣＤＲ３を含む、請求項１に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項３】
（ａ）それぞれ配列番号：７、８、及び９のポリペプチド配列を有する免疫グロブリン重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに、それぞれ配列番号：１９、２０、及び２１のポリペプチド配列を有する免疫グロブリン軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；
（ｂ）それぞれ配列番号：１、２、及び３のポリペプチド配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに、それぞれ配列番号：１３、１４、及び１５のポリペプチド配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；
（ｃ）それぞれ配列番号：４、５、及び６のポリペプチド配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに、それぞれ配列番号：１６、１７、及び１８のポリペプチド配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；
（ｄ）それぞれ配列番号：１０、１１、及び１２のポリペプチド配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに、それぞれ配列番号：２２、２３、及び２４のポリペプチド配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；
（ｅ）それぞれ配列番号：８０、８１、及び９のポリペプチド配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに、それぞれ配列番号：７０、２０、及び２１のポリペプチド配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；
（ｆ）それぞれ配列番号：７１、７２、７３のポリペプチド配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに、それぞれ配列番号：７０、２０、及び２１のポリペプチド配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；
（ｇ）それぞれ配列番号：７１、７２、及び７３のポリペプチド配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに、それぞれ配列番号：１９、２０、及び２１のポリペプチド配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；
（ｈ）配列番号：２６のポリペプチド配列を有するＶＨ領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに、配列番号：３１のポリペプチド配列を有するＶＬ領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；
（ｉ）配列番号：２８のポリペプチド配列を有するＶＨ領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに、配列番号：３４のポリペプチド配列を有するＶＬ領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；
（ｊ）配列番号：２６のポリペプチド配列を有するＶＨ領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号：３４のポリペプチド配列を有するＶＬ領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；又は
（ｋ）配列番号：２８のポリペプチド配列を有するＶＨ領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに、配列番号：３１のポリペプチド配列を有するＶＬ領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；
を含み、前記抗体又が、その抗原結合断片はＰＨＦ−タウに結合している、請求項２に記載の単離モノクローナル抗体又は抗原結合断片。
【請求項４】
配列番号：２６、２７、２８、及び２９のいずれか１つと少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、並びに、配列番号：３１、３２、３３、及び３４のいずれか１つと少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む、請求項３に記載の単離モノクローナル抗体又は抗原結合断片。
【請求項５】
配列番号：２６、２７、２８、及び２９のいずれかのポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、並びに、配列番号：３１、３２、３３、及び３４のいずれかのポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む、請求項４に記載の単離モノクローナル抗体又は抗原結合断片。
【請求項６】
配列番号：４５、７４、７６、及び７８のいずれかのポリペプチド配列を有する重鎖に由来するＶＨと少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、並びに、配列番号：３１、７５、７７、７９のいずれかの軽鎖に由来するＶＬと少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む、請求項３に記載の単離モノクローナル抗体又は抗原結合断片。
【請求項７】
配列番号：４５、７４、７６、及び７８のいずれかのポリペプチド配列を有する重鎖に由来するＶＨのポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、並びに、配列番号：３１、７５、７７、７９のいずれかの軽鎖に由来するＶＬのポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む、請求項６に記載の単離モノクローナル抗体又は抗原結合断片。
【請求項８】
（ａ）配列番号：２６のポリペプチド配列を有するＶＨ、及び配列番号：３１のポリペプチド配列を有するＶＬ；
（ｂ）配列番号：２８のポリペプチド配列を有するＶＨ、及び配列番号：３４のポリペプチド配列を有するＶＬ；
（ｃ）配列番号：２６のポリペプチド配列を有するＶＨ、及び配列番号：３４のポリペプチド配列を有するＶＬ；
（ｄ）配列番号：２８のポリペプチド配列を有するＶＨ、及び配列番号：３１のポリペプチド配列を有するＶＬ；
（ｅ）配列番号：２７のポリペプチド配列を有するＶＨ、及び配列番号：３１のポリペプチド配列を有するＶＬ；
（ｆ）配列番号：７４の重鎖に由来するＶＨ、及び配列番号：７５の軽鎖に由来するＶＬ；
（ｇ）配列番号：７６の重鎖に由来するＶＨ、及び配列番号：７７の軽鎖に由来するＶＬ；又は
（ｈ）配列番号：７８の重鎖に由来するＶＨ、及び配列番号：７９の軽鎖に由来するＶＬ；
を含む、請求項３に記載の単離モノクローナル抗体又は抗原結合断片。
【請求項９】
配列番号：４５、７４、７６、及び７８のいずれかと少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチド配列を有する重鎖、並びに、配列番号：４６、７５、７７、及び７９のいずれかと少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチド配列を有する軽鎖を含む、請求項８に記載の単離モノクローナル抗体又は抗原結合断片。
【請求項１０】
配列番号：４５、７４、７６、及び７８のいずれかのポリペプチド配列を有する重鎖、並びに、配列番号：４６、７５、７７、及び７９のいずれかのポリペプチド配列を有する軽鎖を含む、請求項９に記載の単離モノクローナル抗体又は抗原結合断片。
【請求項１１】
（ａ）配列番号：４５の重鎖、及び配列番号：４６の軽鎖；
（ｂ）配列番号：７４の重鎖、及び配列番号：７５の軽鎖；
（ｃ）配列番号：７６の重鎖、及び配列番号：７７の軽鎖；又は
（ｄ）配列番号：７８の重鎖、及び配列番号：７９の軽鎖；
を含む、請求項１０に記載の単離モノクローナル抗体又は抗原結合断片。
【請求項１２】
ヒト重鎖ＩｇＧ１定常領域及びヒト軽鎖κ定常領域を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体又は抗原結合断片。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又は抗原結合断片をコードする、単離核酸。
【請求項１４】
請求項１３に記載の単離核酸を含む、ベクター。
【請求項１５】
請求項１４に記載の核酸を含む、宿主細胞。
【請求項１６】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体又は抗原結合断片、及び医薬上許容できる担体を含む、医薬組成物。
【請求項１７】
病理学的タウ凝集の低減、又はタウ異常症の拡大の低減を必要とする対象における、病理学的タウ凝集の低減、又はタウ異常症の拡大の低減方法であって、前記対象に、請求項１６に記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項１８】
タウ異常症の治療を必要とする対象における、タウ異常症の治療方法であって、前記対象に、請求項１６に記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項１９】
前記タウ異常症は、家族性アルツハイマー病、散発的アルツハイマー病、染色体１７（ＦＴＤＰ−１７）に関連したパーキンソン症候群による前頭側頭型認知症、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、ピック病、進行性皮質下神経膠症、線維変化優位型認知症、石灰化によるび漫性神経原線維濃縮、嗜銀顆粒性認知症、筋萎縮性側索硬化症・パーキンソン症候群認知症合併症、ダウン症、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、ハラーフォルデン−シュパッツ病、封入体筋炎、クロイツフェルト・ヤコブ病、多系統萎縮症、Ｃ型ニーマン・ピック病、プリオンタンパク質大脳アミロイド血管障害、亜急性硬化性全脳炎、筋強直性ジストロフィー、神経原線維濃縮による非ガマニアン（Guamanian）運動ニューロン疾患、脳炎後パーキンソン症候群、慢性外傷性脳症、及び拳闘家認知症（ボクサー病）からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗体又は抗原結合断片を製造する条件下において、前記抗体又は抗原結合断片をコードする核酸を含む細胞を培養することと、前記細胞又は細胞培養液から前記抗体又は抗原結合断片を回収することとを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又は抗原結合断片の製造方法。
【請求項２１】
対象の生体サンプルにおけるＰＨＦ−タウの存在の検出方法であって、前記生体サンプルを、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合断片と接触させることと、前記対象の前記サンプルにおいて、前記抗体又は抗原結合断片のＰＨＦ−タウへの結合を検出することとを含む、前記方法。
【請求項２２】
前記生体サンプルが、血液、血清、血漿、間質液、又は大脳脊髄液サンプルである、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ＰＨＦ−タウ抗体、抗体をコードする核酸及び発現ベクター、ベクターを含有する組み換え細胞、並びに抗体を含む組成物に関する。抗体の作製方法、タウ異常症を含む状態を治療するための抗体の使用方法、及び、タウ異常症などの疾病を診断するための、抗体の使用方法もまた提供する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、徐々に激しい精神機能低下を導き、最終的には死に至らしめる、記憶、認知、論理的思考、判断力、及び情動安定性の進行性喪失を臨床的特徴とする、退行性脳障害である。ＡＤは、高齢者の進行性精神機能不全（認知症）の非常に一般的な原因であり、米国では４番目に多い医学的死亡原因を表すと考えられている。ＡＤは、世界中の民族で観察され、現在及び未来の、主たる公衆の健康上の問題を提示する。
【０００３】
ＡＤ個体の脳は、老人性（又はアミロイド）斑、アミロイド血管症（血管におけるアミロイド沈着）及び神経原線維変化と呼ばれる特徴的な病変を呈する。これら病変の大多数、特にアミロイド斑及び対らせん状細線維の神経原線維変化は、一般にＡＤ患者の記憶及び認知機能に重要なヒトの脳のいくつかの領域で見られる。
【０００４】
現在のＡＤ治療の状況には、認知症を患う患者における認知症状を治療するために認可された治療法のみが含まれる。ＡＤの進行を改変又は遅延させる、認可済みの治療法は存在しない。潜在的な疾病改変剤としては、軽度のＡＤを患う患者用の、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙヒト化抗−Ａβモノクローナルソラネズマブ、及び、軽度〜中度のＡＤを患う患者用の、Ｍｅｒｃｋ小分子ＢＡＣＥ阻害剤であるベルべセスタットが挙げられる。これらの治療法、及び次の十年で発売され得る、大部分の他の潜在的な疾患改変剤は、Ａβ（ＡＤの「特徴」的な２つの病理学的兆候のうちの１つである、アミロイドプラークの本質的構成成分）を標的にする。
【０００５】
ＡＤの第２の特徴的な病理学的兆候である神経原線維濃縮体は主に、過剰リン酸化タウタンパク質のアグリゲートで構成される。タウの主な生理学的機能は、微小管の重合及び安定化である。タウの微小管への結合は、タウの微小管結合領域における正電荷と、微小管格子における負電荷とのイオン性相互作用により発生する（Ｂｕｔｎｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｒｓｃｈｎｅｒ，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１５（３）：７１７−３０，１９９１）。タウタンパク質は、８５個の可能なリン酸化反応部位を含有し、これらの部位の多くにおけるリン酸化反応が、タウの一次機能を妨げる。軸索の微小管格子に結合したタウは、擬リン酸化状態にあるが、ＡＤ内で凝集したタウは過剰リン酸化状態にあり、タウの生理学的に活性なプールとは異なる独自のエピトープをもたらす。
【０００６】
タウ異常症の伝播及び拡大仮説が説明されており、これは、ヒトの脳におけるタウ異常症進行のＢｒａａｋ段階、及びタウ凝集の、前臨床タウモデルへの注射後のタウ異常症の拡大に基づいている（Ｆｒｏｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２８４：１２８４５−５２，２００９；Ｃｌａｖａｇｕｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１：９０９−１３，２００９）。
【０００７】
タウの凝集を予防又は一掃するための治療薬の開発は長年関心が持たれており、抗凝集化合物及びキナーゼ阻害剤を含む候補薬剤が、臨床試験に導入されてきた（Ｂｒｕｎｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．８：７８３−９３，２００９）。トランスジェニックマウスにおける、能動タウ免疫付与及び受動タウ免疫付与の両方の、有益な治療効果を示す、複数の研究が刊行されている（Ｃｈａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２８６：３４４５７−６７，２０１１；Ｂｏｕｔａｊａｎｇｏｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．１１８：６５８−６７，２０１１；Ｂｏｕｔａｊａｎｇｏｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３０：１６５５９−６６，２０１０；Ａｓｕｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２７：９１１５−２９，２００７）。ホスホ特異的及び非ホスホ特異的抗体の両方において、活性が報告されている（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１１（１）：９−２５，２０１６）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
当該技術分野における進展にもかかわらず、タウ凝集及びタウ異常症の進行を予防して、ＡＤ及び他の神経変性病などのタウ異常症を治療するのに効果的な治療薬が依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、対らせん状細線維（ＰＨＦ）−タウに対して高い結合親和性を有し、リン酸化タウに対して選択的である抗ＰＨＦ−タウ抗体又はその抗原結合断片を提供することによりこの必要性を満たす。マウスＰＨＦ−タウ特異的抗体の、ヒトフレームワークへの適応（ＨＦＡ）により、本発明の抗体は生成された。リン酸化タウに対する抗体の選択性により、通常のタウ機能を妨げずに病原性タウに対する効能が可能となると考えられる。本発明は、抗体をコードする核酸、抗体を含む組成物、並びに抗体の製造方法及び抗体の使用方法もまた提供する。本発明の抗ＰＨＦ−タウ抗体、又はその抗原結合断片は、ＨＥＫ細胞可溶化物に由来する、又は変異体タウトランスジェニックマウスの脊髄溶解物に由来するタウシードを使用する細胞アッセイにより測定されるように、タウシードを阻害する。更に、本発明の抗ＰＨＦ−タウ抗体の可変領域及びマウスＩｇ定常領域（例えばマウスＩｇＧ２ａ定常領域）を有するキメラ抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの変異体タウトランスジェニックマウスにおいてシーディング活性をブロックした。
【００１０】
ＡＤ脳におけるタウ異常症の進行は、異なる特殊な拡大パターンに従う。前臨床モデルにおいては、細胞外ホスホ−タウシードがニューロンでのタウ異常症を誘発し得ることが示されている（Ｃｌａｖａｇｕｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  １１０（２３）：９５３５−４０，２０１３）。それ故、タウ異常症はある脳の領域から次の領域に、プリオンのように拡大し得ると考えられている。この拡大プロセスには、近くのニューロンにより取り込まれることができ、更なるタウ異常症を引き起こし得るタウシードの外在化が伴う。理論に束縛されるものではないが、本発明の抗ＰＨＦ−タウ抗体又はその抗原結合断片は、脳内でホスホ−タウシードと相互作用することにより、タウ凝集又はタウ異常症の拡大を予防すると考えられている。
【００１１】
一般的な一態様において、本発明は、ＰＨＦ−タウに結合する単離モノクローナル抗体又はその抗原結合断片に関する。特定の実施形態では、抗体はヒト化モノクローナル抗体である。
【００１２】
特定の態様に従うと、本発明は、タウタンパク質のプロリンリッチなドメインにおけるリン酸化エピトープにおいてリン酸化タウタンパク質に結合する、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合断片に関する。より具体的な態様において、リン酸化エピトープは、タウタンパク質のリン酸化Ｔ２１２及び／又はリン酸化Ｔ２１７、並びに、配列番号：４８、５２、及び５４のアミノ酸配列のいずれかを有する、又はこれらのいずれかの中にあるリン酸化エピトープを含む。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、タウタンパク質のリン酸化Ｔ２１２及びリン酸化Ｔ２１７を含むリン酸化エピトープに結合する。
【００１３】
特定の態様に従うと、本発明は、
（１）それぞれ配列番号：４、５、及び６のポリペプチド配列を有する免疫グロブリン重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに、それぞれ配列番号：１６、１７、及び１８のポリペプチド配列を有する免疫グロブリン軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；
（２）それぞれ配列番号：１、２、及び３のポリペプチド配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに、それぞれ配列番号：１３、１４、及び１５のポリペプチド配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；
（３）それぞれ配列番号：７、８、及び９のポリペプチド配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに、それぞれ配列番号：１９、２０、及び２１のポリペプチド配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；
（４）それぞれ配列番号：１０、１１、及び１２のポリペプチド配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに、それぞれ配列番号：２２、２３、及び２４のポリペプチド配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；
（５）それぞれ配列番号：８０、８１、及び９のポリペプチド配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに、それぞれ配列番号：７０、２０、及び２１のポリペプチド配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；
（６）それぞれ配列番号：７１、７２、７３のポリペプチド配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに、それぞれ配列番号：７０、２０、及び２１のポリペプチド配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；
（７）それぞれ配列番号：７１、７２、及び７３のポリペプチド配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに、それぞれ配列番号：１９、２０、及び２１のポリペプチド配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；
（８）配列番号：２６のポリペプチド配列を有するＶＨ領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに、配列番号：３１のポリペプチド配列を有するＶＬ領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；
（９）配列番号：２８のポリペプチド配列を有するＶＨ領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに、配列番号：３４のポリペプチド配列を有するＶＬ領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；
（１０）配列番号：２６のポリペプチド配列を有するＶＨ領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに、配列番号：３４のポリペプチド配列を有するＶＬ領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；又は
（１１）配列番号：２８のポリペプチド配列を有するＶＨ領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに、配列番号：３１のポリペプチド配列を有するＶＬ領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；
を含み、
抗体又はその抗原結合断片が、ＰＨＦ−タウ、好ましくはヒトＰＨＦ−タウに結合している、
単離モノクローナル抗体又はその抗原結合断片に関する。
【００１４】
より具体的な態様において、重鎖可変領域ドメインのフレームワーク領域及び軽鎖可変領域ドメインのフレームワーク領域は、ヒト免疫グロブリンからのアミノ酸配列を含む。
【００１５】
別の具体的な態様に従うと、本発明は、配列番号：２６、２７、２８、及び２９のいずれか１つと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の同一性を有し、最も好ましくは１００％の同一性を有するポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、若しくは配列番号：７４、７６、及び７８のいずれか１つの任意の重鎖のＶＨ領域、又は、配列番号：３１、３２、３３、及び３４のいずれか１つと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の同一性を有し、最も好ましくは１００％の同一性を有するポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、若しくは配列番号：７５、７７、及び７９の軽鎖のいずれか１つのＶＬ領域を含む、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合断片に関する。
【００１６】
別の具体的な態様に従うと、本発明は、配列番号：４５、７４、７６、及び７８のいずれか１つと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の同一性を有し、最も好ましくは１００％の同一性を有するポリペプチド配列を有する重鎖；並びに、配列番号：４６、７５、７７、及び７９のいずれか１つと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の同一性を有し、最も好ましくは１００％の同一性を有するポリペプチド配列を有する軽鎖を含む、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合断片に関する。
【００１７】
別の具体的な態様に従うと、本発明の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、定常領域、例えばヒト又はマウス重鎖ＩｇＧ定常領域、及びヒト又はマウス抗体軽鎖κ又はλ定常領域を更に含む。
【００１８】
別の一般的な態様において、本発明は、本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片をコードする単離核酸に関する。
【００１９】
別の一般的な態様において、本発明は、本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片をコードする単離核酸を含むベクターに関する。
【００２０】
別の一般的な態様において、本発明は、本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片をコードする単離核酸を含む宿主細胞に関する。
【００２１】
別の一般的な態様において、本発明は、本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片、及び医薬上許容できる担体を含む医薬組成物に関する。
【００２２】
別の一般的な態様において、本発明は、病理学的タウ凝集の低下又はタウ異常症の拡大の低下を必要とする対象における、病理学的タウ凝集の低下又はタウ異常症の拡大の低下方法であって、対象に本発明の医薬組成物を投与することを含む、方法に関する。
【００２３】
別の一般的な態様において、本発明は、タウ異常症の治療を必要とする対象におけるタウ異常症の治療方法であって、対象に本発明の医薬組成物を投与することを含む方法に関する。タウ異常症としては、家族性アルツハイマー病、散発的アルツハイマー病、染色体１７（ＦＴＤＰ−１７）に関連したパーキンソン症候群による前頭側頭型認知症、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、ピック病、進行性皮質下神経膠症、線維変化優位型認知症、石灰化によるび漫性神経原線維濃縮、嗜銀顆粒性認知症、筋萎縮性側索硬化症・パーキンソン症候群認知症合併症、ダウン症、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、ハラーフォルデン−シュパッツ病、封入体筋炎、クロイツフェルト・ヤコブ病、多系統萎縮症、Ｃ型ニーマン・ピック病、プリオンタンパク質大脳アミロイド血管障害、亜急性硬化性全脳炎、筋強直性ジストロフィー、神経原線維濃縮による非ガマニアン（Guamanian）運動ニューロン疾患、脳炎後パーキンソン症候群、慢性外傷性脳症、及び拳闘家認知症（ボクサー病）からなる群から選択される１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２４】
別の一般的な態様において、本発明は、本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片の製造方法であって、モノクローナル抗体又は抗原結合断片をコードする核酸を含む細胞を、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片を製造する条件下にて培養することと、細胞又は細胞培養液からモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を回収することとを含む、方法に関する。
【００２５】
別の一般的な態様において、本発明は、本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を含む医薬組成物の製造方法であって、医薬組成物を得るために、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片を医薬上許容できる担体と組み合わせることを含む、方法に関する。
【００２６】
別の一般的な態様において、本発明は、本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を用いて、対象におけるリン酸化ＰＨＦ−タウの存在を検出する方法、又は、対象においてＰＨＦ−タウの存在を検出することにより、対象のタウ異常症を診断する方法に関する。
【００２７】
本発明の他の態様、特徴、及び利点は、発明の詳細な説明、並びにその好ましい実施形態及び添付の特許請求の範囲を含む以下の開示より明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
上述の「課題を解決するための手段」及び以降の「発明を実施するための形態」は、添付の図面と併せて読むことでより良好に理解されるであろう。本発明は、図面に示される実施形態そのものに限定されない点は理解されるべきである。
【図１】組み換えにより発現したＰＴ３（「Ｒ３７８８」）、及びハイブリドーマにより発現したＰＴ３（「ｈｙｂ」）の、ＰＨＦ−タウ及び可溶性タウへの結合を示す図である。
【図２】通常の組み換えヒトタウ（「ＮＴ」）及びサルコシル不溶性ＰＨＦ−タウ（「ＰＴ」）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の、マウス抗タウモノクローナル抗体のウェスタンブロット分析を示す図である。
【図３Ａ】抗アミロイド４Ｇ８陽性であるＡＤ海馬組織における、ＰＴ３の免疫組織化学分析を示す図である。使用したモノクローナル抗体は、（Ａ）ＰＴ１、（Ｂ）ＰＴ２、（Ｃ）ＰＴ３、（Ｄ）ＡＴ８、及び（Ｅ）ＨＴ７であった。
【図３Ｂ】抗アミロイド４Ｇ８陽性であるＡＤ海馬組織における、ＰＴ３の免疫組織化学分析を示す図である。使用したモノクローナル抗体は、（Ａ）ＰＴ１、（Ｂ）ＰＴ２、（Ｃ）ＰＴ３、（Ｄ）ＡＴ８、及び（Ｅ）ＨＴ７であった。
【図３Ｃ】抗アミロイド４Ｇ８陽性であるＡＤ海馬組織における、ＰＴ３の免疫組織化学分析を示す図である。使用したモノクローナル抗体は、（Ａ）ＰＴ１、（Ｂ）ＰＴ２、（Ｃ）ＰＴ３、（Ｄ）ＡＴ８、及び（Ｅ）ＨＴ７であった。
【図３Ｄ】抗アミロイド４Ｇ８陽性であるＡＤ海馬組織における、ＰＴ３の免疫組織化学分析を示す図である。使用したモノクローナル抗体は、（Ａ）ＰＴ１、（Ｂ）ＰＴ２、（Ｃ）ＰＴ３、（Ｄ）ＡＴ８、及び（Ｅ）ＨＴ７であった。
【図３Ｅ】抗アミロイド４Ｇ８陽性であるＡＤ海馬組織における、ＰＴ３の免疫組織化学分析を示す図である。使用したモノクローナル抗体は、（Ａ）ＰＴ１、（Ｂ）ＰＴ２、（Ｃ）ＰＴ３、（Ｄ）ＡＴ８、及び（Ｅ）ＨＴ７であった。
【図４Ａ】抗アミロイド４Ｇ８陰性である対照海馬組織における、ＰＴ３の免疫組織化学分析を示す図である。使用したモノクローナル抗体は、（Ａ）ＰＴ１、（Ｂ）ＰＴ２、（Ｃ）ＰＴ３、（Ｄ）ＡＴ８、及び（Ｅ）ＨＴ７であった。
【図４Ｂ】抗アミロイド４Ｇ８陰性である対照海馬組織における、ＰＴ３の免疫組織化学分析を示す図である。使用したモノクローナル抗体は、（Ａ）ＰＴ１、（Ｂ）ＰＴ２、（Ｃ）ＰＴ３、（Ｄ）ＡＴ８、及び（Ｅ）ＨＴ７であった。
【図４Ｃ】抗アミロイド４Ｇ８陰性である対照海馬組織における、ＰＴ３の免疫組織化学分析を示す図である。使用したモノクローナル抗体は、（Ａ）ＰＴ１、（Ｂ）ＰＴ２、（Ｃ）ＰＴ３、（Ｄ）ＡＴ８、及び（Ｅ）ＨＴ７であった。
【図４Ｄ】抗アミロイド４Ｇ８陰性である対照海馬組織における、ＰＴ３の免疫組織化学分析を示す図である。使用したモノクローナル抗体は、（Ａ）ＰＴ１、（Ｂ）ＰＴ２、（Ｃ）ＰＴ３、（Ｄ）ＡＴ８、及び（Ｅ）ＨＴ７であった。
【図４Ｅ】抗アミロイド４Ｇ８陰性である対照海馬組織における、ＰＴ３の免疫組織化学分析を示す図である。使用したモノクローナル抗体は、（Ａ）ＰＴ１、（Ｂ）ＰＴ２、（Ｃ）ＰＴ３、（Ｄ）ＡＴ８、及び（Ｅ）ＨＴ７であった。
【図５Ａ】（Ａ）タウノックアウト又は（Ｂ）野生型マウスの脳における、ＰＴ３のホスホ−タウ特異的染色パターンを示す図である。
【図５Ｂ】（Ａ）タウノックアウト又は（Ｂ）野生型マウスの脳における、ＰＴ３のホスホ−タウ特異的染色パターンを示す図である。
【図６Ａ】（Ａ）タウノックアウト又は（Ｂ）野生型マウスの脳における、タウ−１の非ホスホ−タウ特異的染色パターンを示す図である。
【図６Ｂ】（Ａ）タウノックアウト又は（Ｂ）野生型マウスの脳における、タウ−１の非ホスホ−タウ特異的染色パターンを示す図である。
【図７】ＰＴ３  Ｆａｂ＋ｐＴ２１２／ｐＴ２１７−タウペプチド複合体の結晶構造を示す図であり、ＰＴ３  Ｆａｂを、空間を塗りつぶす表示（ライトグレー）で示し、タウペプチドを棒状（黒）の表示で示す。
【図８】ＰＴ３  Ｆａｂ＋ｐＴ２１２／ｐＴ２１７−タウペプチド複合体の結晶構造を示す図であり、ＰＴ３をリボン状（ライトグレー）で示し、そのパラトープ残基を棒状の表示で示し、タウペプチドを棒状（黒）の表示で示す。
【図９】ＰＴ３  Ｆａｂ＋ｐＴ２１２／ｐＴ２１７タウペプチド構造の相互作用図を示す図であり、ペプチド残基を、白色でレタリングした黒の箱で示し、ＶＨ残基をダークグレーで示し、ＶＬ残基をライトグレーで示し、点線は水素結合を示して、実線はファン・デル・ワールス接触を示す。
【図１０】ＨＦＡ  ＰＴ３重鎖及び軽鎖可変領域の配列を示す図であり、ＨＦＡ多様体がＰＴ３マウス親Ｖ領域（ＶＨ１０及びＶＬ７）にアラインメントされており、ヒトＦＲへ転写された親ＣＤＲには下線を引いており、残基付番は連続している。
【図１１】Ｂ３２４＋ｐＴ２１２／ｐＴ２１７−タウペプチド複合体の結晶構造を示す図であり、Ｂ３２４を、空間を塗りつぶす表示（ライトグレー）で示し、タウペプチドを棒状（黒）の表示で示す。
【図１２】Ｂ３２４＋ｐＴ２１２／ｐＴ２１７タウペプチド複合体の結晶構造を示す図であり、Ｂ３２４をリボン状（ライトグレー）で示し、そのパラトープ残基を棒状の表示で示し、タウペプチドを棒状（黒）の表示で示す。ただし、Ｄ９２（Ｌ）及びＥ９３（Ｌ）はＣγ及び側鎖のカルボキシレート原子に対して電子密度を有していない。
【図１３】Ｂ３２４＋ｐＴ２１２／ｐＴ２１７タウペプチド構造の相互作用図を示す図であり、ペプチド残基を、白色でレタリングした黒の箱で示し、ＶＨ残基をダークグレーで示し、ＶＬ残基をライトグレーで示し、点線は水素結合を示して、実線はファン・デル・ワールス接触を示す。
【図１４】ＦＲＥＴバイオセンサセルモデルの概略図である。
【図１５】ＢＲＥＴアッセイを使用して測定した、ＧＦＰ−タウＰ３０１Ｌアグリゲートを含有するＨＥＫ細胞ホモジェネートによりシードされた、ＰＴ３によるＫ１８アグリゲート導入の阻害を示す図である。
【図１６】ＦＲＥＴアッセイを使用して測定した、ＴｇＰ３０１Ｓ脊髄ホモジェネートによりシードされた、ＰＴ３によるＫ１８アグリゲート導入の阻害を示す図である。
【図１７】２つの独立した実験のデータを用いた、マウスＴｇＰ３０１Ｓ脊髄抽出物の免疫枯渇アッセイの結果を示す図である。
【図１８】２つの実験のデータを用いた、ヒトＡＤ脳抽出物免疫枯渇アッセイの結果を示す図である（ｎ＝１である、ＨＴ７及びＡＴ８の場合を除く）。ＦＲＥＴアッセイを用いて測定すると、ＰＴ３はタウシーディングを阻害する。
【図１９−１】変異体ヒトＰ３０１Ｌタウを発現するトランスジェニックマウスにおける、注射モデルの概略図を示す図である。ＩＨＣ画像は、注射後３ヶ月の対照抽出物（Ａ〜Ｂ）を有するマウス、注射後１ヶ月のＡＤ脳由来のｅＰＨＦ−タウ（Ｃ〜Ｄ）を有するマウス、注射後３ヶ月のＡＤ脳由来のｅＰＨＦタウ（Ｅ〜Ｆ）を有するマウスからの、注射済み半球の代表的なＡＴ８染色を示す。
【図１９−２】変異体ヒトＰ３０１Ｌタウを発現するトランスジェニックマウスにおける、注射モデルの概略図を示す図である。（Ｇ）ヒストグラムは、ｅＰＨＦの量を増加させて治療したマウスの代表的な生化学データを示す。
【図２０】ＰＴ３の末梢投与（ＩＰ）に続いての変異体ヒトＰ３０１Ｌタウを発現するトランスジェニックマウスにおけるＡＤ脳由来のＰＨＦ−タウによるシーディングの、タウ凝集における効果を示す図である。
【図２１】ＰＴ３の用量を低下させた同時注射に続いての変異体ヒトＰ３０１Ｌタウを発現するトランスジェニックマウスにおけるＡＤ脳由来のＰＨＦ−タウによりシーディングの、タウ凝集における効果を示す図である。
【図２２Ａ】ＰＴ３アイソタイプのＩＰ末梢投与と組み合わせた同時投与に続いての変異体ヒトＰ３０１Ｌタウを発現するトランスジェニックマウスにおけるＡＤ脳由来のＰＨＦ−タウにおけるシーディングの、タウ凝集における効果を示す図である。（Ａ）に従い治療したマウスは、（Ｂ）注射済み半球、及び（Ｃ）非注射半球において効果を示す。
【図２２Ｂ】ＰＴ３アイソタイプのＩＰ末梢投与と組み合わせた同時投与に続いての変異体ヒトＰ３０１Ｌタウを発現するトランスジェニックマウスにおけるＡＤ脳由来のＰＨＦ−タウにおけるシーディングの、タウ凝集における効果を示す図である。（Ａ）に従い治療したマウスは、（Ｂ）注射済み半球、及び（Ｃ）非注射半球において効果を示す。
【図２２Ｃ】ＰＴ３アイソタイプのＩＰ末梢投与と組み合わせた同時投与に続いての変異体ヒトＰ３０１Ｌタウを発現するトランスジェニックマウスにおけるＡＤ脳由来のＰＨＦ−タウにおけるシーディングの、タウ凝集における効果を示す図である。（Ａ）に従い治療したマウスは、（Ｂ）注射済み半球、及び（Ｃ）非注射半球において効果を示す。
【図２３Ａ】ＡＤ患者に由来する脳ホモジェネートの濃度と比較した、ＰＳＰ患者由来の脳ホモジェネートにおける凝集タウの濃度を示す図である。使用したモノクローナル抗体は（Ａ）ＡＴ８及び（Ｂ）ＰＴ３であった。
【図２３Ｂ】ＡＤ患者に由来する脳ホモジェネートの濃度と比較した、ＰＳＰ患者由来の脳ホモジェネートにおける凝集タウの濃度を示す図である。使用したモノクローナル抗体は（Ａ）ＡＴ８及び（Ｂ）ＰＴ３であった。
【図２４】Ａ〜Ｊは、（Ａ、Ｄ）ＡＤ患者、又は（Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ）ＰＳＰ患者の脳組織の凍結切片を、（Ａ〜Ｃ）ＡＴ８、又は（Ｄ〜Ｆ）ＰＴ３抗体で染色すると、ＰＳＰの影響を受けた解剖学領域において染色を示したことを示す図である。（Ｇ〜Ｊ）対照は染色を示さなかった。
【図２５】Ａ〜Ｈは、ＰＨＦ−タウを有する親和性成熟ｍＡｂ、及びこれらのＦａｂに関する、ＳＰＲ結合のセンサーグラムを示す図である。実線（灰色）は、二価の結合モデル（ｍＡｂ）又は１：１ラングミュアモデル（Ｆａｂ）を用いる、反応速度の合致を示す。（Ａ）Ｂ２９６  ｍＡｂ、（Ｂ）Ｂ７１１  ｍＡｂ、（Ｃ）Ｂ８０９  ｍＡｂ、（Ｄ）Ｂ３３３  ｍＡｂ、（Ｅ）Ｂ２９６のＢ３２４  Ｆａｂ、（Ｆ）Ｂ７１１のＢ３３０  Ｆａｂ、（Ｇ）Ｂ８０９のＢ３３２  Ｆａｂ、（Ｈ）Ｂ３３３のＢ３３１  Ｆａｂ。
【図２６Ａ】（Ａ）ｍＡｂ、又は（Ｂ）Ｆａｂを用いる直接ＥＬＩＳＡ実験における、ＰＴ３−ＨＦＡ及び親和性成熟多様体の、ｐＴ２１２／ｐＴ２１７ペプチドへの結合を示す図である。
【図２６Ｂ】（Ａ）ｍＡｂ、又は（Ｂ）Ｆａｂを用いる直接ＥＬＩＳＡ実験における、ＰＴ３−ＨＦＡ及び親和性成熟多様体の、ｐＴ２１２／ｐＴ２１７ペプチドへの結合を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
発明の背景において、また、本明細書全体を通じて各種刊行物、論文及び特許を引用又は記載する。これら参照文献の各々はその全容が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に含まれる文書、操作、材料、デバイス、物品などの考察は、本発明のコンテキストを与えるためのものである。かかる考察は、これらの事物のいずれか又は全てが、開示又は特許請求されるいかなる発明に対しても先行技術の一部を構成することを容認するものではない。
【００３０】
定義
別の定義がなされない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。そうでない場合、本明細書で使用される特定の用語は、本明細書に記載される意味を有するものである。本明細書に引用する全ての特許、公開された特許出願及び刊行物は、参照によって恰もその全体が本明細書に記載されているものと同様にして組み込まれる。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、特に文脈上明らかでない限り、複数の指示対象物を含むことに留意すべきである。
【００３１】
特に断らない限り、本明細書に記載される濃度又は濃度範囲などのあらゆる数値は、全ての場合において、「約」なる語によって修飾されているものとして理解されるべきである。したがって、数値は、典型的には、記載される値の±１０％を含む。例えば、１ｍｇ／ｍＬの濃度は０．９ｍｇ／ｍＬ〜１．１ｍｇ／ｍＬを含む。同様に、１％〜１０％（ｗ／ｖ）の濃度範囲は０．９％（ｗ／ｖ）〜１１％（ｗ／ｖ）を含む。本明細書で使用する場合、数値範囲の使用は、文脈上そうでない旨が明確に示されない限り、その範囲内の整数及び値の分数を含む、全ての可能な部分範囲、その範囲内の全ての個々の数値を明示的に含む。
【００３２】
本明細書で使用するところの「単離された」なる用語は、生物学的構成成分（例えば、核酸、ペプチド、又はタンパク質）が、これらの構成成分が天然に生じる生物の他の生物学的構成成分（すなわち、他の染色体及び染色体外ＤＮＡ及びＲＮＡ、並びにタンパク質）から実質的に分離されたか、これらの他の成分とは別に生成されたか、又はこれらの他の成分から精製されたものであることを意味する。このため、「単離」された核酸、ペプチド、及びタンパク質は、標準的な精製法により精製された核酸及びタンパク質を含む。「単離された」核酸、ペプチド、及びタンパク質は、組成物の一部であることができ、このような組成物が核酸、ペプチド、又はタンパク質の本来の環境の一部ではない場合であっても単離されている。また、この用語は、宿主細胞中での組み換え発現により調製された核酸、ペプチド、及びタンパク質、並びに化学合成された核酸も包含する。
【００３３】
本明細書で使用する場合、用語「抗体」又は「免疫グロブリン」は広い意味で用いられ、ポリクローナル抗体を含む免疫グロブリン又は抗体分子、マウス、ヒト、ヒト適合、ヒト化、及びキメラモノクローナル抗体及び抗体断片を含むモノクローナル抗体を含む。
【００３４】
一般に抗体とは、特定の抗原に対する結合特異性を示すタンパク質又はペプチド鎖である。抗体の構造は、公知である。免疫グロブリンは、重鎖定常ドメインのアミノ酸配列に応じて５つの主なクラス、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭに割り当てることができる。ＩｇＡ及びＩｇＧは、アイソタイプのＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４として更に細分類される。したがって、本発明の抗体は、５つの主要なクラス又は対応する下位クラスのいずれかのものであることができる。本発明の抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４であることが好ましい。本発明の抗体としては、半減期の延び、ＡＤＣＣ又はＣＤＣの増減、及びサイレンシングされたＦｃエフェクター機能が挙げられるがこれらに限定されない、野生型Ｆｃ領域と比較して変化した特性を有するように、Ｆｃ領域に多様性を有するものが挙げられる。いずれの脊椎動物種の抗体軽鎖も、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて２つの明確に異なるタイプ、すなわちκ及びλのうちの一方に割り当てることができる。したがって、本発明の抗体は、κ又はλ軽鎖定常ドメインを含有することができる。特定の実施形態に従うと、本発明の抗体は、マウス抗体又はヒト抗体の重鎖及び／又は軽鎖定常領域を含む。
【００３５】
重鎖及び軽鎖定常領域に加えて、抗体は軽鎖及び重鎖可変領域を含有する。免疫グロブリン軽鎖又は重鎖可変領域は、「抗原結合部位」が割り込んだ「フレームワーク」領域からなる。抗原結合部位は、以下のとおり様々な用語及び符番スキームを用いて定義される：
（ｉ）Ｋａｂａｔ：「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」は、配列の変動性に基づく（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｋａｂａｔ，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１３２：２１１−５０，１９７０）。一般に、抗原結合部位は、各可変領域に３つのＣＤＲ（例えば、重鎖可変領域（ＶＨ）にＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに軽鎖可変領域（ＶＬ）にＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３）を有する。
（ｉｉ）Ｃｈｏｔｈｉａ：用語「超可変領域」、「ＨＶＲ」、又は「ＨＶ」は、Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−１７，１９８７）により定義されているように、構造中で超可変性である抗体可変ドメインの領域を意味する。一般的に、抗原結合部位は、各ＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）及びＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）に３つの超可変領域を有する。符番システム、並びにＣＤＲ及びＨＶのアノテーションは、Ａｂｈｉｎａｎｄａｎ及びＭａｒｔｉｎ（Ａｂｈｉｎａｎｄａｎ  ａｎｄ  Ｍａｒｔｉｎ，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５：３８３２−９，２００８）により改訂されている。
（ｉｉｉ）ＩＭＧＴ：抗原結合部位を形成する領域の別の定義が、免疫グロブリン及びＴ細胞受容体のＶドメインの比較に基づいて、Ｌｅｆｒａｎｃ（Ｌｅｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ  Ｃｏｍｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：５５−７７，２００３）により提案されている。Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）データベースが、標準化したこれらの領域の符番及び定義を提供している。ＣＤＲ、ＨＶ、及びＩＭＧＴの描写の対応は、Ｌｅｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｉｄに記載されている。
（ｉｖ）ＡｂＭ：Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの符番スキームの妥協点は、Ｍａｒｔｉｎ（Ｍａｒｔｉｎ  ＡＣＲ（２０１０）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｅｄｓ  Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  Ｒ，Ｄｕｂｅｌ  Ｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ），Ｖｏｌ  ２，ｐｐ  ３３−５１）に記載されている、ＡｂＭ符番の取り決めである。
（ｖ）抗原結合部位は、「Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｒｅｓｉｄｕｅ  Ｕｓａｇｅ」（ＳＤＲＵ）（Ａｌｍａｇｒｏ，Ｍｏｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１７：１３２−４３，２００４）に基づいてもまた描写されることができ、ここでは、ＳＤＲは、抗原接触に直接関与する免疫グロブリンのアミノ酸残基を意味する。
【００３６】
「フレームワーク」又は「フレームワーク配列」は、抗原結合部位の配列であると定義されるもの以外の、抗体の可変領域内の残りの配列である。抗原結合部位の正確な定義は、上述したような様々な描写により決定され得るため、正確なフレームワーク配列は、抗原結合部位の定義に依存する。フレームワーク領域（ＦＲ）は、より高度に保存された可変ドメインの部分である。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは各々、３つの超可変ループにより接続された、βシート構成を一般的に用いる４つのＦＲ（それぞれＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４）を含む。各鎖の超可変ループはＦＲにより互いに緊密に折りたたまれ、他の鎖の超可変ループと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。抗体の構造分析により、相補性決定領域により形成される、配列と結合部位の形状との関係が明らかとなった（Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７９９−８１７，１９９２；Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：１７５−１８２，１９９０）。これらの高い配列変動性にもかかわらず、６つのループのうち５つだけが、「標準構造」と言われる、小さなレパートリーの主鎖構造を採用する。これらの構造はまず、ループの長さにより決定され、次に、折りたたみ、水素結合、又は異常な主鎖構造を推定する能力により構造が決定される、ループ及びフレームワーク領域の特定の位置における鍵となる残基の存在により決定される。
【００３７】
本明細書で使用するとき、用語「抗原結合断片」は、例えば、ダイアボディ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ジスルフィド安定化Ｆｖ断片（ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）２、二重特異性ｄｓＦｖ（ｄｓＦｖ−ｄｓＦｖ’）、ジスルフィド安定化ダイアボディ（ｄｓダイアボディ）、単鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（ｓｄａｂ）、ｓｃＦｖ二量体（二価ダイアボディ）、１つ以上のＣＤＲを含む抗体の一部分から形成される多重特異的抗体、ラクダ化単一ドメイン抗体、ナノボディ、ドメイン抗体、二価ドメイン抗体、又は抗原に結合するが完全な抗体構造を含まない任意の他の抗体断片などの抗体断片を指す。抗原結合断片は、親抗体又は親抗体断片が結合する同じ抗原に結合することができる。特定の実施形態に従うと、抗原結合断片は、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域、及び重鎖の定常領域のＦｄセグメントを含む。他の特定の実施形態に従うと、抗原結合断片はＦａｂ及びＦ（ａｂ’）を含む。
【００３８】
本明細書で使用する場合、用語「ヒト化抗体」とは、抗体の抗原結合特性が保持されるが、人体における抗原の抗原性が低下するように、改変により配列相同性をヒト抗体のそれに対して増加させた非ヒト抗体を意味する。
【００３９】
本明細書で使用する場合、用語「エピトープ」とは、免疫グロブリン、抗体又はその抗原結合断片が特異的に結合する、抗原上の部位を意味する。エピトープは、タンパク質の三次折りたたみにより並置された連続アミノ酸から、又は非連続アミノ酸からの両方で形成することができる。連続アミノ酸から形成したエピトープは、典型的には、変性溶媒にさらして保持されるが、三次折りたたみにより形成したエピトープは、典型的には、変性溶媒による処理で喪失される。エピトープは、典型的には、独自な空間構造の中に、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個のアミノ酸を含む。エピトープの空間構造を決定する方法としては、例えば、ｘ線結晶構造解析、及び２次元核磁気共鳴が挙げられる。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６，Ｇ．Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｅｄ．（１９９６）を参照のこと。
【００４０】
本明細書で使用する場合、用語「タウ」又は「タウタンパク質」とは、複数のアイソフォームを有する、多くある中枢神経系及び末梢神経系のタンパク質を意味する。ヒト中枢神経系（ＣＮＳ）において、長さが３５２〜４４１個のアミノ酸のサイズの範囲となる、６つの主要なタウアイソフォームが、選択的スプライシングにより存在する（Ｈａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．１５：１１２−９，２００９）。アイソフォームは、０〜２個のＮ末端挿入、及び、３又は４個の一列に配列した微小管結合反復を制御して含めることにより互いに異なり、０Ｎ３Ｒ（配列番号：６４）、１Ｎ３Ｒ（配列番号：６５）、２Ｎ３Ｒ（配列番号：６６）、０Ｎ４Ｒ（配列番号：６７）、１Ｎ４Ｒ（配列番号：６８）、及び２Ｎ４Ｒ（配列番号：６９）と呼ばれる。本明細書で使用する場合、用語「対照タウ」とは、リン酸化反応及び他の翻訳後修飾を欠いている、配列番号：６９のタウアイソフォームを意味する。本明細書で使用する場合、用語「タウ」は、完全長野生型タウの変異（例えば点変異、フラグメント、挿入、欠失、及びスプライスバリアント）を含むタンパク質を含む。用語「タウ」はまた、タウアミノ酸配列の翻訳後修飾を包含する。翻訳後修飾としては、リン酸化が挙げられるが、これに限定されない。
【００４１】
タウは、微小管に結合しており、タウのリン酸化によって調節され得るプロセスである、細胞を通じたカーゴの輸送を制御する。ＡＤ及び関連する疾患においては、タウの異常リン酸化が広く生じ、これは、タウの対らせん状細線維（ＰＨＦ）と呼ばれる原線維への凝集の前に生じ、及び／又はその凝集を誘発すると考えられる。ＰＨＦの主要構成成分は、過剰リン酸化タウである。本明細書で使用する場合、用語「対らせん状細線維−タウ」又は「ＰＨＦ−タウ」とは、対らせん状細線維中のタウのアグリゲートを意味する。ＰＨＦ構造における２つの主要な領域は電子顕微鏡、ファジーコート、及びコア細線維により明らかであり、ファジーコートはタンパク質分解に敏感であり、細線維の外側に位置し、細線維のプロテアーゼ耐性コアは、ＰＨＦの主鎖を形成する（Ｗｉｓｃｈｉｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．８５：４８８４−８，１９８８）。
【００４２】
本明細書で使用する場合、「ＰＨＦ−タウに結合する単離ヒト化抗体」、又は「単離ヒト化抗ＰＨＦ−タウ抗体」とは、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない、ヒト化抗ＰＨＦ−タウ抗体を意味することを意図する（例えば、単離ヒト化抗ＰＨＦ−タウ抗体はＰＨＦ−タウ以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかし、単離ヒト化抗ＰＨＦ−タウ抗体は、例えば他の種（ＰＨＦ−タウ種のホモログなど）の他の関連抗原に対して交差反応性を有する。
【００４３】
本明細書で使用する場合、用語「特異的に結合する（「ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｂｉｎｄｓ」又は「ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ」）とは、本発明の抗ＰＨＦ−タウ抗体が、約１×１０−６Ｍか、又はそれよりタイトな、例えば、約１×１０−７Ｍ以下、約１×１０−８Ｍ以下、約１×１０−９Ｍ以下、約１×１０Ｍ−１０以下、約１×１０−１１Ｍ以下、約１×１０−１２Ｍ以下、若しくは約１×１０−１３Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）にて、所定の標的に結合する能力を意味する。ＫＤは、Ｋａに対するＫｄの比率（すなわち、Ｋｄ／Ｋａ）から得られ、モル濃度（Ｍ）として表される。抗体のＫＤ値は、本開示を考慮して当該技術分野における方法を用いて決定することができる。例えば、抗ＰＨＦ−タウ抗体のＫＤ値は、表面プラズモン共鳴を用いることにより、バイオセンサシステム、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システム、Ｐｒｏｔｅｏｎ機器（ＢｉｏＲａｄ）、ＫｉｎＥｘＡ機器（Ｓａｐｉｄｙｎｅ）、ＥＬＩＳＡ、又は当業者に知られている競合結合アッセイを用いることなどにより、決定することができる。典型的には、抗ＰＨＦ−タウ抗体は、例えばＰｒｏｔｅＯｎ機器（ＢｉｏＲａｄ）を使用した表面プラズモン共鳴によって測定した場合に、非特異的標的に対するＫＤよりも少なくとも１０倍低いＫＤで所定の標的（すなわち、ＰＨＦ−タウ）に結合する。しかし、ＰＨＦ−タウに特異的に結合する抗ＰＨＦ−タウ抗体は、他の関連標的、例えば他の種（ホモログ）の所定の同一標的に対する交差反応性を有することができる。
【００４４】
本明細書で使用するところの「ポリヌクレオチド」なる用語は、同義的に、「核酸分子」、「ヌクレオチド」、又は「核酸」とも称され、非修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡ又は修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡであってよい、任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドを指す。「ポリヌクレオチド」としては、これらに限定されるものではないが、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖の領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ、並びに一本鎖及び二本鎖の領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖又はより典型的には二本鎖又は一本鎖及び二本鎖の領域の混合物であってよいＤＮＡ及びＲＮＡを含むハイブリッド分子が挙げられる。加えて、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡ若しくはＤＮＡ又はＲＮＡ及びＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を指す。用語、ポリヌクレオチドには、１つ以上の修飾塩基を含有するＤＮＡ又はＲＮＡ、及び安定性若しくは他の理由により修飾された主鎖を有するＤＮＡ又はＲＮＡも含まれる。「修飾」塩基は、例えば、トリチル化塩基及び異常な塩基、例えば、イノシンを含む。様々な修飾をＤＮＡ及びＲＮＡに行うことができる。したがって、「ポリヌクレオチド」は、典型的に天然に認められるポリヌクレオチドの化学的、酵素的又は代謝的に修飾された形態、並びにウイルス及び細胞のＤＮＡ及びＲＮＡの特徴を有する化学的形態を包含する。「ポリヌクレオチド」はまた、比較的短い核酸鎖（多くの場合、オリゴヌクレオチドと呼ばれる）も包含する。
【００４５】
本明細書で使用するところの「ベクター」なる用語は、別の核酸セグメントを機能的に挿入することによってそのセグメントの複製又は発現を行うことができるレプリコンのことである。
【００４６】
本明細書で使用するところの「宿主細胞」なる用語は、本発明の核酸分子を含む細胞を指す。「宿主細胞」は、例えば、初代細胞、培養中の細胞、又は細胞株由来の細胞のいずれのタイプの細胞であってもよい。一実施形態では、「宿主細胞」は、本発明の核酸分子をトランスフェクトした細胞である。別の実施形態では、「宿主細胞」は、かかるトランスフェクトされた細胞の子孫又は潜在的な子孫である。ある細胞の子孫は、例えば、後続の世代で生じ得る変異若しくは環境の影響、又は宿主細胞ゲノムへの核酸分子の組み込みによって、親細胞との同一性を有していない場合がある。
【００４７】
本明細書で使用するところの「発現」なる用語は、遺伝子産物の生合成を指す。かかる用語には、遺伝子のＲＮＡへの転写が含まれる。また、かかる用語には、ＲＮＡの１つ以上のポリペプチドへの翻訳も含まれ、全ての天然に生じる転写後及び翻訳後修飾も更に含まれる。ＰＨＦ−タウに結合する、発現したヒト化抗体又はその抗原結合断片は、宿主細胞の細胞質内に存在することができ、細胞培養液の増殖培地などの細胞外環境に入ることができ、又は細胞膜に固着することができる。
【００４８】
本明細書で使用するところの「担体」なる用語は、あらゆる賦形剤、希釈剤、充填剤、塩、バッファー、安定剤、可溶化剤、油、脂質、脂質含有小胞、ミクロスフェア、リポソーム封入体、又は医薬製剤で使用するための当該技術分野では公知の他の材料を指す。担体、賦形剤又は希釈剤の特性は、特定の用途の投与経路によって決まる点は理解されよう。本明細書で使用するころの「医薬上許容できる担体」なる用語は、本発明による組成物の効果又は本発明による組成物の生物活性を妨げない無毒性材料を指す。特定の実施形態によると、本開示を考慮して、抗体の医薬組成物での使用に好適ないずれの医薬上許容できる担体も、本発明において使用することができる。
【００４９】
本明細書で使用するところの「対象」なる用語は、動物、好ましくは哺乳動物を指す。特定の実施形態によれば、対象は、非霊長類（例えば、ラクダ、ロバ、シマウマ、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ラット、ウサギ、モルモット又はマウス）、又は霊長類（例えば、サル、チンパンジー、又はヒト）を含む哺乳動物である。特定の実施形態では、対象はヒトである。
【００５０】
本明細書で使用するところの「治療的有効量」なる用語は、対象に所望の生物学的又は薬理的応答を誘導する活性成分又は構成成分の量を指す。治療有効量は、記載される目的に対して経験的かつ一般的な方法で決定することができる。例えば、インビトロアッセイを任意選択的に用いて、最適な用量範囲を特定することができる。具体的な有効量の選択は、治療又は予防される疾病、伴う症状、患者の体重、患者の免疫状態、及び当業者が知っている他の因子を含むいくつかの因子の考慮に基づいて、当業者によって（例えば、臨床試験により）決定することができる。また、製剤に用いられる正確な用量は、投与経路及び疾患の重症度に応じて決まり、医師の判断及び各患者の状況に従って決定されるべきである。有効量は、インビトロ又は動物モデル試験系から導かれる用量応答曲線から推定することができる。
【００５１】
本明細書で使用する場合、用語「治療する（treat）」、「治療する（treating）」、及び「治療（treatment）」は全て、タウ異常症に関連した少なくとも１つの測定可能な物理的パラメータの改善又は逆転を指すものであり、これは対象において必ずしも認識されるとは限らないが、対象において認識可能な場合もある。「治療する（treat）」、「治療する（treating）」、及び「治療（treatment）」なる用語はまた、疾患、障害、又は病態の退縮を生じる、その進行を防止する、又は少なくともその進行を遅らせることを指す場合もある。特定の実施形態では、「治療する（treat）」、「治療する（treating）」、及び「治療（treatment）」は、タウ異常症に関連する１つ以上の症状の緩和、進展若しくは発症の予防、又はその期間の短縮を指す。特定の実施形態では、「治療する」、「治療する」、及び「治療」は、疾患、障害、又は病態の再発の防止を指す。特定の実施形態では、「治療する」、「治療する」、及び「治療」は、疾患、障害、又は病態を有する対象の生存率の向上を指す。特定の実施形態では、「治療する」、「治療する」、及び「治療」は、対象における疾患、障害、又は病態の消失を指す。
【００５２】
本明細書で使用するとき、「タウ異常症」は、脳内のタウの病理学的凝集を伴う任意の神経変性疾患を包含する。家族性及び特発性ＡＤに加えて、他の例示的なタウ異常症は、染色体１７（ＦＴＤＰ−１７）に関連したパーキンソン症候群による前頭側頭型認知症、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、ピック病、進行性皮質下神経膠症、線維濃縮変化優位型認知症、石灰化によるび漫性神経原線維濃縮、嗜銀顆粒性認知症、筋萎縮性側索硬化症・パーキンソン症候群認知症合併症、ダウン症、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、ハラーフォルデン−シュパッツ病、封入体筋炎、クロイツフェルト・ヤコブ病、多系統萎縮症、Ｃ型ニーマン・ピック病、プリオンタンパク質大脳アミロイド血管障害、亜急性硬化性全脳炎、筋強直性ジストロフィー、神経原線維濃縮による非ガマニアン（Guamanian）運動ニューロン疾患、脳炎後パーキンソン症候群、及び、拳闘家認知症（ボクサー病）などの慢性外傷性脳症である（Ｍｏｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ，７０：４１０−２６，２０１１）。
【００５３】
本明細書で使用するところの「併用される」なる用語は、対象への２種以上の治療薬の投与との関連において、複数の治療の使用を指す。「併用される」なる用語の使用は、治療が対象に投与される順序を限定しない。例えば、第１の治療（例えば、本明細書に記載される組成物）を、対象への第２の治療の投与の前（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、１６時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、又は１２週間前）、同時に、又はその後（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、１６時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、又は１２週間後）に投与することができる。
【００５４】
抗ＰＨＦ−タウ抗体
一般的な一態様において、本発明は、ＰＨＦ−タウに結合する単離モノクローナル抗体又はその抗原結合断片に関する。このような抗ＰＨＦ−タウ抗体は、ＰＨＦ−タウにてリン酸化エピトープを結合させる特性、又はＰＨＦ−タウにて非リン酸化エピトープを結合させる特性を有することができる。抗ＰＨＦ−タウ抗体は治療薬として有用である場合があり、また、例えば組織又は細胞中での、生体サンプルにおけるＰＨＦ−タウを検出するための調査又は診断試薬としても有用である場合がある。
【００５５】
特定の態様に従うと、本発明は、タウタンパク質のプロリンリッチなドメインにおけるエピトープにおいてリン酸化タウタンパク質に結合する単離ヒト化抗体又はその抗原結合断片に関する。より具体的な態様において、本発明は、リン酸化Ｔ２１２及び／又はＴ２１７残基を含むエピトープにおいてリン酸化タウタンパク質に結合する単離ヒト化抗体又はその抗原結合断片に関する。より具体的な態様において、本発明は、配列番号：４８、５２、及び５４のいずれかのリン酸化エピトープに結合する単離モノクローナル抗体又はその抗原結合断片に関する。また更に具体的な態様において、本発明は、配列番号：４８のリン酸化エピトープに結合する単離モノクローナル抗体又はその抗原結合断片に関する。本発明の抗体は、ヒト化抗体であることができる。
【００５６】
表１は、配列番号によりホスホ−タウに結合する、５個のヒト化ｍＡｂの重鎖及び軽鎖可変領域を示す。重鎖及び軽鎖配列は、ヒト化ｍＡｂ  Ｂ２９６についてもまた示されている。このｍＡｂは、親和性成熟していた（表３を参照）。
【００５７】
表２は、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡＢＭ、Ｋａｂａｔ、及びＩＭＧＴ符番スキームに従い定義される、本発明の例示的抗体の抗原結合部位残基（すなわち、ＣＤＲ領域）を示す。例示的な重鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号：２６〜２９に示し、例示的な軽鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号：３１〜３４に示す。
【００５８】
表３は、Ｂ２９６から生成した、親和性成熟モノクローナル抗体（すなわち、Ｂ３３３、Ｂ７１１、及びＢ８０９）の配列を示す。可変領域配列は重鎖及び軽鎖配列中で下線を引いている。親和性成熟モノクローナル抗体のＣＤＲ中の太字のアミノ酸は、Ｂ２９６ＣＤＲ配列と比較した際の置換を示す。ＣＤＲ配列はＫａｂａｔ符番スキームにより決定される。
【００５９】
【表１】
2020513804.tif 000003
【００６０】
【表２】
2020513804.tif 000004
【００６１】
【表３−１】
2020513804.tif 000005
【００６２】
【表３−２】
2020513804.tif 000006
【００６３】
ヒト化抗体は、実質的にヒト抗体からの可変領域フレームワーク残基（「アクセプター抗体」と呼ばれる）、及び、実質的に非ヒト抗体（すなわち、マウス抗体）からの相補性決定領域（ドナー免疫グロブリンと呼ばれる）を有する。Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８６：１００２９−１００３３，１９８９、国際公開第９０／０７８６１号、米国特許第５６９３７６２号、同第５６９３７６１号、同第５５８５０８９号、同第５５３０１０１号、及び同第５２２５５３９号を参照のこと。存在する場合、定常領域もまた実質的に、又は全体的にヒト免疫グロブリンに由来する。ヒト可変ドメインは通常、フレームワーク配列が、ＣＤＲが由来するマウス可変領域ドメインと高度な配列同一性を示す、ヒト抗体から選択される。重鎖及び軽鎖可変領域フレームワーク残基は、同一の又は異なるヒト抗体配列に由来することができる。ヒト抗体配列は、自然に生じるヒト抗体の配列であることができる、又は、いくつかのヒト抗体のコンセンサス配列であることができる。国際公開第９２／２２６５３号を参照されたい。ＣＤＲ構造及び／又は抗原への結合に対する有り得る影響に基づいて、ヒト可変領域フレームワーク残基からの特定のアミノ酸が、置換のために選択される。このような有り得る影響の調査は、モデリング、特定の位置におけるアミノ酸特性の検査、又は、特定のアミノ酸の置換若しくは変異誘発の影響についての実験的観察によるものである。
【００６４】
例えば、アミノ酸の、マウス可変領域フレームワーク残基と選択されたヒト可変領域フレームワーク残基とが異なる場合、アミノ酸が、（１）抗原に直接非共有結合する、（２）ＣＤＲ領域に隣接する、（３）別様においてはＣＤＲ領域と相互作用する（例えば、約６オングストロームのＣＤＲ領域の中に存在する）、又は（４）ＶＬ−ＶＨ界面に関与することが合理的に予想されるのであれば、ヒトフレームワークアミノ酸は通常、マウス抗体の等価なフレームワークアミノ酸により置換されるべきである。
【００６５】
置換の他の候補は、その位置におけるヒト免疫グロブリンにとっては通常のものではない、アクセプターヒトフレームワークアミノ酸である。これらのアミノ酸は、マウスドナー抗体の等価な位置のアミノ酸、又は、より典型的なヒト免疫グロブリンの等価な位置のアミノ酸で置換することができる。置換の他の候補は、その位置におけるヒト免疫グロブリンにとっては通常のものではない、アクセプターヒトフレームワークアミノ酸である。ヒト化免疫グロブリンの可変領域フレームワークは通常、ヒト可変領域フレームワーク配列、又はそのようなコンセンサス配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を示す。
【００６６】
抗体のヒト化は、公知の方法、例えば特異性決定残基のリサーフェシング（ＳＤＲＲ）（米国特許公開第２０１０／０２６１６２０号）、リサーフェシング（Ｐａｄｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９−９８，１９９１）、スーパーヒト化（国際公開第０４／００６９５５号）、及びヒトのストリング内容物の最適化（米国特許第７６５７３８０号）を用いて達成することができる。グラフト化又はヒト化に有用なヒトフレームワーク配列は、当業者であれば関連するデータベースから選択することができる。選択したフレームワークを、Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｉｄに開示されているような技術により更に改変し、結合親和性を保存又は向上させることができる。特定の実施形態に従うと、マウス親抗体の抗ＰＨＦ−タウ抗体をヒト化する方法としては、以下の実施例４に記載されているものが挙げられる。
【００６７】
本発明の抗体は様々な技術により、例えばハイブリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ．２５６：４９５−７，１９７５）により製造することができる。ドナー抗体（典型的にはマウス）に由来する軽鎖及び重鎖可変領域と共に、アクセプター抗体（典型的にはヒトなどの別の哺乳類種）に由来する軽鎖及び重鎖定常領域を含有するキメラモノクローナル抗体を、米国特許第４８１６５６７号に記載されている方法により調製することができる。非ヒトドナー免疫グロブリン（典型的にはマウス）に由来するＣＤＲを有し、分子の残りの、免疫グロブリンに由来する部分は１種以上のヒト免疫グロブリンに由来する、ＣＤＲグラフトモノクローナル抗体を、例えば米国特許第５２２５５３９号に開示されている、当業者に知られている技術により調製することができる。非ヒト配列を全く欠いている完全ヒトモノクローナル抗体を、（Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．３６８：８５６−９，１９９４；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８４５−５１，１９９６；Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．１５：１４６−５６，１９９７）を参照する技術により、ヒト免疫グロブリントランスジェニックマウスから調製することができる。ヒトモノクローナル抗体はまた、ファージディスプレイライブラリーから調製及び最適化することができる（Ｋｎａｐｐｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２９６：５７−８６，２０００；Ｋｒｅｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２５４：６７−８４，２００１；Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．３９７：３８５−９６，２０１０）。
【００６８】
本発明のモノクローナル抗体は、配列番号：１、４、７、１０、７１、８０のいずれかのＨＣＤＲ１；配列番号：２、５、８、１１、７２、８１のいずれかのＨＣＤＲ２；配列番号：３、６、９、１２、７３のいずれかのＨＣＤＲ３；配列番号：１３、１６、１９、２２、７０のいずれかのＬＣＤＲ１；配列番号：１４、１７、２０、２３のいずれかのＬＣＤＲ２；配列番号：１５、１８、２１、２４のいずれかのＬＣＤＲ３を有する抗体を含む。本発明は、配列番号：１、４、７、１０、７１、８０のいずれかのＨＣＤＲ１；配列番号：２、５、８、１１、７２、８１のいずれかのＨＣＤＲ２；配列番号：３、６、９、１２、７３のいずれかのＨＣＤＲ３；配列番号：１３、１６、１９、２２、７０のいずれかのＬＣＤＲ１；配列番号：１４、１７、２０、２３のいずれかのＬＣＤＲ２；配列番号：１５、１８、２１、２４のいずれかのＬＣＤＲ３と少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の同一性を有し、より好ましくは少なくとも９９％の同一性を有するＣＤＲ配列を有するモノクローナル抗体もまた包含する。
【００６９】
特定の態様に従うと、本発明は、
（１）それぞれ配列番号：４、５、及び６のポリペプチド配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、それぞれ配列番号：１６、１７、及び１８のポリペプチド配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；
（２）それぞれ配列番号：１、２、及び３のポリペプチド配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに、それぞれ配列番号：１３、１４、及び１５のポリペプチド配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；
（３）それぞれ配列番号：７、８、及び９のポリペプチド配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに、それぞれ配列番号：１９、２０、及び２１のポリペプチド配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；
（４）それぞれ配列番号：１０、１１、及び１２のポリペプチド配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに、それぞれ配列番号：２２、２３、及び２４のポリペプチド配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；
（５）それぞれ配列番号：８０、８１、及び９のポリペプチド配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに、それぞれ配列番号：７０、２０、及び２１のポリペプチド配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；
（６）それぞれ配列番号：７１、７２、７３のポリペプチド配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに、それぞれ配列番号：７０、２０、及び２１のポリペプチド配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；
（７）それぞれ配列番号：７１、７２、及び７３のポリペプチド配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに、それぞれ配列番号：１９、２０、及び２１のポリペプチド配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；
（８）配列番号：２６のポリペプチド配列を有するＶＨ領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに、配列番号：３１のポリペプチド配列を有するＶＬ領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；
（９）配列番号：２８のポリペプチド配列を有するＶＨ領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに、配列番号：３４のポリペプチド配列を有するＶＬ領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；
（１０）配列番号：２６のポリペプチド配列を有するＶＨ領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに、配列番号：３４のポリペプチド配列を有するＶＬ領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；又は
（１１）配列番号：２８のポリペプチド配列を有するＶＨ領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに、配列番号：３１のポリペプチド配列を有するＶＬ領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；
を含み、
抗体又はその抗原結合断片が、ＰＨＦ−タウ、好ましくはヒトＰＨＦ−タウに結合しており、重鎖可変領域ドメインのフレームワーク領域、及び軽鎖可変領域ドメインのフレームワーク領域は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を含む、
単離ヒト化抗体又はその抗原結合断片に関する。
【００７０】
別の具体的な態様に従うと、本発明は、配列番号：２６、２７、２８、若しくは２９と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の同一性を有し、最も好ましくは１００％の同一性を有するポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、又は、配列番号：３１、３２、３３、若しくは３４と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の同一性を有し、最も好ましくは１００％の同一性を有するポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む、単離ヒト化抗体又はその抗原結合断片に関する。
【００７１】
別の具体的な態様に従うと、本発明は、配列番号：７４、７６、及び７８の重鎖の可変領域と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の同一性を有し、最も好ましくは１００％の同一性を有するポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、又は、配列番号：７５、７７、及び７９のいずれかの軽鎖の可変領域と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の同一性を有し、最も好ましくは１００％の同一性を有するポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む、単離ヒト化抗体又はその抗原結合断片に関する。
【００７２】
別の具体的な態様に従うと、本発明は、配列番号：２６と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の同一性を有し、最も好ましくは１００％の同一性を有するポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、及び、配列番号：３１と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の同一性を有し、最も好ましくは１００％の同一性を有するポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む、単離ヒト化抗体又はその抗原結合断片に関する。
【００７３】
別の具体的な態様に従うと、本発明は、配列番号：２８と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の同一性を有し、最も好ましくは１００％の同一性を有するポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、及び、配列番号：３４と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の同一性を有し、最も好ましくは１００％の同一性を有するポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む、単離ヒト化抗体又はその抗原結合断片に関する。
【００７４】
別の具体的な態様に従うと、本発明は、配列番号：２６と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の同一性を有し、最も好ましくは１００％の同一性を有するポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、及び、配列番号：３４と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の同一性を有し、最も好ましくは１００％の同一性を有するポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む、単離ヒト化抗体又はその抗原結合断片に関する。
【００７５】
別の具体的な態様に従うと、本発明は、配列番号：２８と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の同一性を有し、最も好ましくは１００％の同一性を有するポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、及び、配列番号：３１と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の同一性を有し、最も好ましくは１００％の同一性を有するポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む、単離ヒト化抗体又はその抗原結合断片に関する。
【００７６】
別の具体的な態様に従うと、本発明は、配列番号：２７と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の同一性を有し、最も好ましくは１００％の同一性を有するポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、及び、配列番号：３１と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の同一性を有し、最も好ましくは１００％の同一性を有するポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む、単離ヒト化抗体又はその抗原結合断片に関する。
【００７７】
別の具体的な態様に従うと、本発明は、配列番号：７４の重鎖の可変領域と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の同一性を有し、最も好ましくは１００％の同一性を有するポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、及び、配列番号：７５の軽鎖の可変領域と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の同一性を有し、最も好ましくは１００％の同一性を有するポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む、単離ヒト化抗体又はその抗原結合断片に関する。
【００７８】
別の具体的な態様に従うと、本発明は、配列番号：７６の重鎖の可変領域と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の同一性を有し、最も好ましくは１００％の同一性を有するポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、及び、配列番号：７７の軽鎖の可変領域と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の同一性を有し、最も好ましくは１００％の同一性を有するポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む、単離ヒト化抗体又はその抗原結合断片に関する。
【００７９】
別の具体的な態様に従うと、本発明は、配列番号：７８の重鎖の可変領域と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の同一性を有し、最も好ましくは１００％の同一性を有するポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、及び、配列番号：７９の軽鎖の可変領域と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の同一性を有し、最も好ましくは１００％の同一性を有するポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む、単離ヒト化抗体又はその抗原結合断片に関する。
【００８０】
別の具体的な態様に従うと、本発明は、配列番号：４５と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の同一性を有し、最も好ましくは１００％の同一性を有するポリペプチド配列を有する重鎖、及び、配列番号：４６と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の同一性を有し、最も好ましくは１００％の同一性を有するポリペプチド配列を有する軽鎖を含む、単離ヒト化抗体又はその抗原結合断片に関する。別の具体的な態様に従うと、本発明は、配列番号：４５のポリペプチド配列を有する重鎖、及び配列番号：４６のポリペプチド配列を有する軽鎖を含む、単離ヒト化抗体又はその抗原結合断片に関する。
【００８１】
別の具体的な態様に従うと、本発明は、配列番号：７４と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の同一性を有し、最も好ましくは１００％の同一性を有するポリペプチド配列を有する重鎖、及び、配列番号：７５と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の同一性を有し、最も好ましくは１００％の同一性を有するポリペプチド配列を有する軽鎖を含む、単離ヒト化抗体又はその抗原結合断片に関する。別の具体的な態様に従うと、本発明は、配列番号：７４のポリペプチド配列を有する重鎖、及び配列番号：７５のポリペプチド配列を有する軽鎖を含む、単離ヒト化抗体又はその抗原結合断片に関する。
【００８２】
別の具体的な態様に従うと、本発明は、配列番号：７６と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の同一性を有し、最も好ましくは１００％の同一性を有するポリペプチド配列を有する重鎖、及び、配列番号：７７と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の同一性を有し、最も好ましくは１００％の同一性を有するポリペプチド配列を有する軽鎖を含む、単離ヒト化抗体又はその抗原結合断片に関する。別の具体的な態様に従うと、本発明は、配列番号：７６のポリペプチド配列を有する重鎖、及び配列番号：７７のポリペプチド配列を有する軽鎖を含む、単離ヒト化抗体又はその抗原結合断片に関する。
【００８３】
別の具体的な態様に従うと、本発明は、配列番号：７８と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の同一性を有し、最も好ましくは１００％の同一性を有するポリペプチド配列を有する重鎖、及び、配列番号：７９と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の同一性を有し、最も好ましくは１００％の同一性を有するポリペプチド配列を有する軽鎖を含む、単離ヒト化抗体又はその抗原結合断片に関する。別の具体的な態様に従うと、本発明は、配列番号：７８のポリペプチド配列を有する重鎖、及び配列番号：７９のポリペプチド配列を有する軽鎖を含む、単離ヒト化抗体又はその抗原結合断片に関する。
【００８４】
別の具体的な態様に従うと、本発明は、ヒト重鎖ＩｇＧ１定常領域及びヒト軽鎖κ定常領域を含む、単離ヒト化抗体又はその抗原結合断片に関する。
【００８５】
別の具体的な態様に従うと、本発明は、単離ヒト化抗体又はその抗原結合断片に関し、抗体又は抗原結合断片はヒトＰＨＦ−タウに、５×１０−９Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）、好ましくは１×１０−９Ｍ以下、又は１×１０−１０Ｍ以下のＫＤで結合しており、ＫＤは、Ｂｉａｃｏｒｅ又はＰｒｏｔｅＯｎシステムを用いるなどの、表面プラズモン共鳴分析により測定される。
【００８６】
ＰＨＦ−タウに結合するヒト化抗体及びその抗原結合断片の機能活性は、当該技術分野において既知の方法により、そして本明細書に記載のとおりに特性決定することができる。ＰＨＦ−タウに結合する抗体及びその抗原結合断片の特性決定方法としては、Ｂｉａｃｏｒｅ、ＥＬＩＳＡ、及びＦＡＣＳ分析を含む親和性及び特異性アッセイ；免疫組織化学分析；タウシーディングの阻害における抗体の効能を測定するための、インビトロ細胞アッセイ及びインビボ注射アッセイ；抗体の、抗体依存性細胞介在性傷害（ＡＤＣＣ）、及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性の存在を検出するための細胞傷害性アッセイ；等が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態に従うと、ＰＨＦ−タウに結合する抗体及びその抗原結合断片の特性決定方法としては、以下の実施例５、６、８、及び９に記載するものが挙げられる。対照タウではなくＰＨＦ−タウに結合するヒト化抗体の、例示的なマウス親抗体は抗体ＰＴ３であり、これは配列番号：２５の重鎖可変領域、及び配列番号：３０の軽鎖可変領域を有する（例えば、米国特許第９，３７１，３７６号を参照のこと。この全容が参照により組み込まれる）。
【００８７】
いくつかの公知の方法を用いて本発明の抗体の結合エピトープを決定することができる。例えば、両方の個別の構成成分の構造が知られている場合、インシリコでタンパク質−タンパク質ドッキングを行って、適合する相互作用部位を特定することができる。抗原抗体複合体を用いて水素−重水素（Ｈ／Ｄ）交換を行うことによって、抗体が結合する抗原の領域をマッピングすることができる。抗原のセグメント及び点変異誘導を用いることにより、抗体の結合に重要なアミノ酸の位置を特定することができる。抗体−抗原複合体の共結晶構造を使用して、エピトープ及びパラトープに寄与する残基を特定することができる。特定の実施形態に従うと、本発明の抗体の結合エピトープの決定方法としては、以下の実施例２、３、及び７に記載するものが挙げられる。
【００８８】
本発明の抗体は、二重特異的又は多重特異的であってよい。例示的な二重特異的抗体は、ＰＨＦ−タウの２つの異なるエピトープに結合することができるか、又はＰＨＦ−タウ及びアミロイドベータ（Ａβ）に結合することができる。別の例示的な二重特異的抗体は、ＰＨＦ−タウと、インスリン受容体、トランスフェリン受容体、インスリン様成長因子−１受容体、及びリポタンパク質受容体等の内因性血液脳関門トランスサイトーシス受容体とに結合することができる。例示的な抗体は、ＩｇＧ１タイプである。
【００８９】
本発明の抗体の免疫エフェクターの特性は、当業者には既知の技術により、Ｆｃ修飾によって強化又はサイレンシングすることが可能である。例えば、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、貧食、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ））の下方制御などのＦｃエフェクター機能は、これらの活性を担うＦｃの残基を修飾することによって提供及び／又は制御され得る。薬物動態学特性は、抗体の半減期を延ばすＦｃドメイン内で残基を変異させることによってもまた向上することができる（Ｓｔｒｏｈｌ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：６８５−９１，２００９）。
【００９０】
更に、本発明の抗体は、グリコシル化、異性化、脱グリコシル化、又はポリエチレングリコール部分の付加及び脂質化等の自然界では生じない共有結合修飾等のプロセスによって、翻訳後修飾してもよい。このような修飾はインビボ又はインビトロで行われ得る。例えば、本発明の抗体はポリエチレングリコールと接合（コンジュゲート）（ＰＥＧ化）することによって薬物動態的なプロファイルを向上させることができる。接合（コンジュゲーション）は、当業者に既知の方法によって行うことができる。治療用抗体のＰＥＧとのコンジュゲーションは、機能を妨げずに医薬動態を向上させることが示されている（Ｋｎｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ．１５：４０９−１８，２００４；Ｌｅｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ．１６：１０６−１９，２００１；Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１６：７６１−７０，２００３）。
【００９１】
別の一般的な態様において、本発明は、本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片をコードする単離ポリヌクレオチドに関する。タンパク質のアミノ酸配列を変えることなく、タンパク質のコード配列を変える（例えば置換する、欠失する、挿入するなど）ことができることが、当業者には理解されよう。したがって、本発明のヒト化抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸配列は、タンパク質のアミノ酸配列を変えることなく変更することができることが当業者には理解されよう。例示的な単離ポリヌクレオチドは、それぞれ配列番号：４、５、及び６に示す免疫グロブリン重鎖ＣＤＲ  ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含むポリペプチド、又は、それぞれ配列番号：１６、１７、及び１８に示す免疫グロブリン軽鎖ＣＤＲ  ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含むポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドである。他の例示的な単離ポリヌクレオチドは、本発明の抗体の可変領域をコードする、配列番号：３６〜３９、又は４１〜４４に示す配列を有するポリヌクレオチドである。遺伝コードの縮重又は所与の発現系におけるコドンの選好性を考慮すると、本発明の抗体をコードする他のポリヌクレオチドも本発明の範囲内に含まれる。本発明の単離核酸は、公知の組み換え又は合成技術を用いて作製することができる。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、当該技術分野において公知の方法を用いて容易に単離され、配列決定される。ハイブリドーマが生成される場合、そのような細胞はそれらのＤＮＡの供給源として機能することができる。あるいは、コード配列と翻訳生成物が結合したディスプレイ技術、例えばファージ又はリボソームディスプレイライブラリーを使用することができる。
【００９２】
別の一般的な態様において、本発明は、本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片をコードする単離ポリヌクレオチドを含むベクターに関する。プラスミド、コスミド、ファージベクター、又はウイルスベクターなどの、本開示の観点から当業者に公知の任意のベクターも使用することができる。いくつかの実施形態では、ベクターは、プラスミドなどの組み換え発現ベクターである。ベクターは、例えば、プロモーター、リボソーム結合エレメント、ターミネーター、エンハンサー、選択マーカー、及び複製起点という、発現ベクターの従来の機能を確立するための任意のエレメントを含むことができる。プロモーターは、常時発現型、誘導型、又は再形成可能なプロモーターであり得る。細胞に核酸を送達することができる多数の発現ベクターが当技術分野において知られており、細胞内で抗体又はその抗原結合断片を製造するために、本明細書で使用することができる。従来のクローニング技術、又は人工遺伝子合成を使用して、本発明の実施形態に従った組み換え発現ベクターを生成することができる。
【００９３】
別の一般的な態様において、本発明は、本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片をコードする単離ポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関する。本開示の観点から、当業者に知られている任意の宿主細胞を、本発明の抗体又は抗原結合断片の組み換え発現に使用することができる。そのような宿主細胞は、真核細胞、細菌細胞、植物細胞又は古細菌細胞であってよい。例示的な真核細胞は、哺乳動物、昆虫、鳥類、又は他の動物由来のものであってもよい。哺乳類真核細胞としては、ＳＰ２／０（アメリカ培養コレクション（ＡＴＣＣ）、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ、ＣＲＬ−１５８１）、ＮＳ０（ヨーロッパ細胞培養コレクション（ＥＣＡＣＣ）、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ、Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ、ＵＫ、ＥＣＡＣＣ  Ｎｏ．８５１１０５０３）、ＦＯ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６４６）及びＡｇ６５３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８０）ネズミ細胞株などといった、ハイブリドーマ又は骨髄腫の細胞株などの不死化細胞株が挙げられる。例示的なヒト骨髄腫細胞株は、Ｕ２６６（ＡＴＴＣ  ＣＲＬ−ＴＩＢ−１９６）である。他の有用な細胞株としては、ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−６１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、又はＤＧ４４などのチャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞に由来するものが挙げられる。
【００９４】
別の一般的な態様において、本発明は、本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片の製造方法であって、本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を製造する条件下において、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドを含む細胞を培養することと、細胞又は細胞培養液から（例えば上清から）、抗体又はその抗原結合断片を回収することとを含む、方法に関する。発現した抗体又はその抗原結合断片を細胞から回収して、当該技術分野において通常的な技術に従い精製することができる。
【００９５】
医薬組成物及び治療方法
本発明の抗ＰＨＦ−タウ抗体、又は本発明のその断片は、脳内でのタウの病理学的凝集を伴う神経変性病、又はタウ異常症を有する患者、例えばＡＤを患う患者における症状の治療、低減、又は予防に使用することができる。
【００９６】
したがって、別の一般的な態様において、本発明は、本発明の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合断片、及び医薬上許容できる担体を含む、医薬組成物に関する。
【００９７】
別の一般的な態様において、本発明は、タウ異常症などの病気、疾患又は状態の症状の治療又は低減を必要とする対象における、タウ異常症などの病気、疾患又は状態の症状の治療又は低減方法であって、対象に本発明の医薬組成物を投与することを含む、方法に関する。
【００９８】
別の一般的な態様において、本発明は、病理学的タウ凝集の低下又はタウ異常症の拡大の低下を必要とする対象における、病理学的タウ凝集の低下又はタウ異常症の拡大の低下方法であって、対象に本発明の医薬組成物を投与することを含む、方法に関する。
【００９９】
本発明の実施形態に従うと、医薬組成物は、治療有効量のモノクローナル抗ＰＨＦ−タウ抗体又はその抗原結合断片を含む。ヒト化抗ＰＨＦ−タウ抗体又はその抗原結合断片に言及して本明細書で用いられる場合、「治療有効量」とは、病気、疾患又は状態の治療をもたらす；病気、疾患又は状態の進行を予防する若しくは遅延させる；又は、免疫による病気、疾患又は状態に関連する症状を低減する若しくは完全に緩和する、モノクローナル抗ＰＨＦ−タウ抗体又はその抗原結合断片の量を意味する。
【０１００】
特定の実施形態によれば、治療有効量は、以下の効果のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、又はそれ以上を達成するのに十分な治療の量を指す：（ｉ）治療される疾患、障害若しくは病態又はそれに関連する症状の重症度を低下又は改善すること、（ｉｉ）治療される疾患、障害若しくは病態、又はそれに関連する症状の期間を短縮すること、（ｉｉｉ）治療される疾患、障害若しくは病態、又はそれに関連する症状の進行を防止すること、（ｉｖ）治療される疾患、障害若しくは状態、又はそれに関連する症状の退縮を生じさせること、（ｖ）治療される疾患、障害又は病態、又はそれに関連する症状の進展又は発症を予防すること、（ｖｉ）治療される疾患、障害又は病態、又はそれに関連する症状の再発を防止すること、（ｖｉｉ）治療される疾患、障害、若しくは状態、又はそれに関連する症状を有する対象の入院を減少させること、（ｖｉｉｉ）治療される疾患、障害若しくは状態、又はそれに関連する症状を有する対象の入院期間を短縮させること、（ｉｘ）治療される疾患、障害又は病態、又はそれに関連する症状を有する対象の生存率を高めること、（ｘｉ）治療される対象の疾患、障害若しくは状態、又はそれに関連する症状を阻害又は軽減すること、及び／又は（ｘｉｉ）別の治療の予防又は治療効果を強化又は改善すること。
【０１０１】
特定の実施形態に従うと、治療される病気、疾患又は状態はタウ異常症である。より具体的な実施形態に従うと、治療される病気、疾患又は状態としては、家族性アルツハイマー病、散発的アルツハイマー病、染色体１７（ＦＴＤＰ−１７）に関連したパーキンソン症候群による前頭側頭型認知症、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、ピック病、進行性皮質下神経膠症、線維変化優位型認知症、石灰化によるび漫性神経原線維濃縮、嗜銀顆粒性認知症、筋萎縮性側索硬化症・パーキンソン症候群認知症合併症、ダウン症、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、ハラーフォルデン−シュパッツ病、封入体筋炎、クロイツフェルト・ヤコブ病、多系統萎縮症、Ｃ型ニーマン・ピック病、プリオンタンパク質大脳アミロイド血管障害、亜急性硬化性全脳炎、筋強直性ジストロフィー、神経原線維濃縮による非ガマニアン（Guamanian）運動ニューロン疾患、脳炎後パーキンソン症候群、慢性外傷性脳症、又は拳闘家認知症（ボクサー病）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０２】
タウ異常症に関連する行動的表現型としては、認知障害、初期人格変化及び脱抑制、感情鈍麻、無為症、無言症、失行症、反復症、常同運動／挙動、口愛過度、混乱、連続タスクを計画又は組織化する能力の欠如、利己的行動／無神経、反社会的特徴、共感の欠如、言葉のつかえ、錯誤的誤りは頻繁にあるが比較的理解力は保たれている失文症的な話し方、理解障害及び換語欠陥、緩徐進行性歩行不安定性、後方突進、すくみ、頻繁な転倒、非レボドパ反応性軸剛性、核上性注視麻痺、方形波痙攣、緩徐な垂直断続性運動、仮性球麻痺、四肢失行症、筋緊張異常、皮質性感覚消失、及び振戦が挙げられる。
【０１０３】
治療を受けやすい患者としては、ＡＤ又は他のタウ異常症のリスクがある無症候性の個体、及び現在症状を示している患者が挙げられるが、これらに限定されない。治療の影響を受けやすい患者としては、ＡＤの家族歴又はゲノムにおける遺伝的リスク因子の存在等、ＡＤの公知の遺伝的リスクを有する個体が挙げられる。例示的なリスク因子は、特に、位置７１７、並びに位置６７０及び６７１におけるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の変異（それぞれ、Ｈａｒｄｙ及びＳｗｅｄｉｓｈ変異）である。他のリスク因子は、プレセニリン遺伝子ＰＳ１及びＰＳ２、並びにＡｐｏＥ４における変異、高コレステロール血症又はアテローム性動脈硬化症の家族歴である。現在ＡＤに罹患している個体は、上記リスク因子の存在によって特徴的な認知症から認識することができる。更に、ＡＤを有する個体を特定するために、多数の診断試験が利用可能である。これらとしては、脳脊髄液のタウ濃度及びＡβ４２濃度の測定が挙げられる。タウ濃度の上昇及びＡβ４２濃度の低下は、ＡＤの存在を表す。また、ＡＤに罹患している個体は、ＡＤ及び関連障害の協会の基準によって診断することもできる。
【０１０４】
本発明の抗ＰＨＦ−タウ抗体は、ＡＤ又は他のタウ異常症等、タウの病理学的凝集を伴う神経変性疾患を治療又は予防するための治療剤及び予防剤の両方に好適である。無症候性患者では、治療は何歳から開始してもよい（例えば、約１０、１５、２０、２５、３０歳）。しかし、通常、患者が約４０、５０、６０、又は７０歳に達するまで治療を始める必要はない。治療は、典型的には、ある期間にわたる複数回投与を伴う。治療は、経時的に治療剤に対する抗体、又は活性化Ｔ細胞若しくはＢ細胞の応答を評価することによってモニタリングしてもよい。応答（反応）が低下した場合、追加用量を指示してよい。
【０１０５】
予防用途では、医薬組成物又は薬剤は、疾患の生化学的、組織学的、及び／又は挙動的症状、その合併症、並びに疾患の発現中に提示される中間病理学的表現型を含む、疾患のリスクをなくす又は低減する、重症度を低下させる、又は疾患の発症を遅らせるのに十分な量で、ＡＤに罹患しやすいか又はそうでなければＡＤのリスクを有する患者に投与される。治療用途では、組成物又は薬剤は、疾患の症状（生化学的、組織学的、及び／又は挙動的）のいずれかを低減、阻止、又は遅延させるのに十分な量で、かかる疾患が疑われるか又は既に罹患している患者に投与される。治療薬の投与により、特徴的なアルツハイマー病状を未だ発現していない患者における軽度の認知障害を低減又はなくすことができる。
【０１０６】
治療有効量又は用量は、治療される疾患、障害又は病態、投与手段、標的部位、対象の生理学的状態（例えば、年齢、体重、健康状態を含む）、対象がヒトであるか動物であるか、投与される他の薬剤、及び、治療が予防的なものであるか治療的なものであるか、などの様々な因子によって異なり得る。治療用量は、安全性及び効能を最適化するために最適に漸増される。
【０１０７】
本発明の抗体は、医薬上許容できる担体内の活性成分として、治療有効量の抗体を含有する医薬組成物として調製することができる。担体は、液体、例えば水、及び落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油等の、石油、動物、植物、又は合成起源のものを含む油であってよい。例えば、０．４％生理食塩水及び０．３％グリシンを用いることができる。これらの溶液は滅菌され、一般には粒子状物質を含まない。これらは、従来から公知の滅菌技術（例えば、濾過）によって滅菌することができる。組成物は、生理学的条件に近似させるのに必要な医薬上許容できる補助物質、例えばｐＨ調節剤、並びに緩衝剤、安定化剤、増粘剤、潤滑剤、及び着色剤などを含有することができる。このような医薬配合物における本発明の抗体の濃度は広い範囲で、すなわち約０．５重量％未満から、通常は約１重量％又は少なくとも約１重量％から、最大１５又は２０重量％まで変えることができ、主に必要とされる用量、液の体積、粘度などに基づいて、選択される特定の投与様式に従って選択される。
【０１０８】
本発明の抗体を治療的に使用するための投与様式は、薬剤を宿主に送達する任意の好適な経路であってもよい。例えば、本明細書に記載する組成物は、非経口的投与、例えば皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻孔内、若しくは頭蓋内投与に好適であるように配合することができ、又は、脳若しくは脊椎の脳脊髄液内に投与することができる。
【０１０９】
治療は、単回投与スケジュール、又は複数回投与スケジュールで行ってもよく、複数回投与計画では、一次治療過程が１〜１０回の別個の投与と、応答を維持しかつ／又は強化するのに必要な後続の時間間隔で他の投与とを行い、例えば第２の投与を、１〜４ヶ月で行い、また必要であれば、次の投与を数ヶ月後に行う。好適な治療スケジュールの例としては、（ｉ）０、１ヶ月及び６ヶ月、（ｉｉ）０、７日及び１ヶ月、（ｉｉｉ）０及び１ヶ月、（ｉｖ）０及び６ヶ月、又は疾病の症候を軽減し、若しくは疾病の重症度を低下させることが期待される、所望の応答を誘発するのに十分な他のスケジュールが挙げられる。
【０１１０】
本発明の抗体は、保存のために凍結乾燥させ、使用前に好適な担体に溶解させることができる。この技術は、抗体及び他のタンパク質調製物に効果的であることが示されており、当該技術分野において公知の凍結乾燥及び溶解技術を用いることができる。
【０１１１】
特定の実施形態に従うと、タウ異常症の治療で使用される組成物を、関係する神経変性病の治療に効果的な他の作用物質と組み合わせて使用することができる。ＡＤの場合、本発明の抗体は、アミロイドベータ（Ａβ）の沈着を低減又は予防する作用物質と組み合わせて投与することができる。ＰＨＦ−タウ及びＡβの病理は相乗的である可能性がある。したがって、ＰＨＦ−タウ、並びにＡβ及びＡβ関連病理の両方のクリアランスを同時に標的とする併用療法は、各々を個々に標的とするよりも効果的である場合がある。パーキンソン病及び関連する神経変性疾患の場合、α−シヌクレインタンパク質の凝集形態をクリアランスするための免疫修飾も新たに開発された治療法である。タウ及びα−シヌクレインタンパク質のクリアランスを同時に標的とする併用療法は、いずれかのタンパク質を個々に標的とするよりも効果的であり得る。
【０１１２】
別の一般的な態様において、本発明は、本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を含む医薬組成物の製造方法であって、医薬組成物を得るために、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片を医薬上許容できる担体と組み合わせることを含む、方法に関する。
【０１１３】
診断方法及びキット
本発明のモノクローナル抗ＰＨＦ−タウ抗体を、対象におけるＡＤ又は他のタウ異常症の診断方法において使用することができる。
【０１１４】
したがって、別の一般的な態様において、本発明は、対象にＰＨＦ−タウが存在することを検出する方法、及び、本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を使用して対象にＰＨＦ−タウが存在することを検出することにより、タウ異常症を診断する方法に関する。
【０１１５】
生体サンプルを診断抗体試薬と接触させ、対象のサンプルにおいて、診断抗体試薬のリン酸化タウへの結合を検出することにより、対象の生体サンプル（例えば血清、血漿、間質液、又は大脳脊髄液サンプル）においてリン酸化タウを検出することができる。検出を実施するためのアッセイとしては、公知の方法、例えばＥＬＩＳＡ、免疫組織化学法、ウェスタンブロット、又はインビトロイメージングが挙げられる。例示的な診断抗体は、本発明の抗体ＰＴ３である。
【０１１６】
診断抗体又は同様の試薬は、患者の体内に静脈内注射により投与することができ、又は作用物質を宿主に送達する任意の好適な経路により脳内に直接投与することができる。抗体の用量は、治療方法と同じ範囲内であるべきである。典型的には、抗体は標識されるが、いくつかの方法において、リン酸化タウに対して親和性を有する一次抗体は未標識であり、二次標識剤が、一次抗体に結合させるために用いられる。標識の選択は、検出手段に依存する。例えば、蛍光標識は、光学検出に好適である。常磁性標識の使用は、外科的介入のないトモグラフィー検出に好適である。また、放射標識は、ＰＥＴ又はＳＰＥＣＴを用いて検出され得る。
【０１１７】
診断は、対象由来のサンプル又は対象における、標識ＰＨＦ−タウ、タウ凝集体、及び／又は神経原線維変化の数、大きさ、及び／又は強度を対応するベースライン値と比較することによって行われる。ベースライン値は、健全な個体の集団における平均レベルを表し得る。また、ベースライン値は、同じ対象において決定された以前の値を表す。
【０１１８】
また、上記の診断方法は、治療前、治療中、又は治療後の対象におけるリン酸化タウの存在を検出することによって治療に対する対象の応答をモニタリングするために用いることもできる。ベースラインに対する値の減少は、治療に対する陽性応答を示す。また、値は、病理学的タウが脳からクリアランスされたとき、生物学的流体において一時的に増加する場合がある。
【０１１９】
本発明は、更に、上記診断及びモニタリング方法を実施するためのキットに関する。典型的には、このようなキットには、本発明の抗体等の診断試薬と、任意選択的に検出可能な標識とが入っている。診断抗体自体は、直接検出可能であるか又は二次反応（例えば、ストレプトアビジンとの反応）を介して検出可能である、検出可能な標識（例えば、蛍光標識、ビオチン等）を含有してもよい。あるいは、検出可能な標識を含有する第２の試薬を使用してもよく、この場合、第２の試薬は、一次抗体に対する結合特異性を有する。生物学的サンプルにおけるＰＨＦ−タウを測定するのに好適な診断キットでは、キットの抗体は、マイクロタイターディッシュのウェル等の固相に予め結合して供給され得る。
【０１２０】
本出願全体で引用した全ての引用参考文献（論文参考文献、交付済み特許、公開された特許出願、及び同時係属の特許出願を含む）の内容は、参照により本明細書に明白に組み込まれる。
【０１２１】
実施形態
本発明は以下の非限定的な実施形態も提供する。
【０１２２】
実施形態１は、タウタンパク質のプロリンリッチなドメインにおけるリン酸化エピトープにおいてリン酸化タウタンパク質に結合する、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合断片である。
【０１２３】
実施形態２は、タウタンパク質のリン酸化Ｔ２１２を含むリン酸化エピトープにおいてリン酸化タウタンパク質に結合する単離モノクローナル抗体又はその抗原結合断片であり、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、配列番号：５４のアミノ酸配列を有する、又はその中のリン酸化エピトープに結合するのが好ましい。
【０１２４】
実施形態３は、タウタンパク質のリン酸化Ｔ２１７を含むリン酸化エピトープにおいてリン酸化タウタンパク質に結合する単離モノクローナル抗体又はその抗原結合断片であり、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、配列番号：５２のアミノ酸配列を有する、又はその中のリン酸化エピトープに結合するのが好ましい。
【０１２５】
実施形態４は、タウタンパク質のリン酸化Ｔ２１２及びリン酸化Ｔ２１７を含むリン酸化エピトープにおいてリン酸化タウタンパク質に結合する単離モノクローナル抗体又はその抗原結合断片であり、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、配列番号：４８のアミノ酸配列を有する、又はその中にあるリン酸化エピトープに結合するのが好ましい。
【０１２６】
実施形態５は、
（１）それぞれ配列番号：４、５、及び６のポリペプチド配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、それぞれ配列番号：１６、１７、及び１８のポリペプチド配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；
（２）それぞれ配列番号：１、２、及び３のポリペプチド配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに、それぞれ配列番号：１３、１４、及び１５のポリペプチド配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；
（３）それぞれ配列番号：７、８、及び９のポリペプチド配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに、それぞれ配列番号：１９、２０、及び２１のポリペプチド配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；
（４）それぞれ配列番号：１０、１１、及び１２のポリペプチド配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに、それぞれ配列番号：２２、２３、及び２４のポリペプチド配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；
（５）それぞれ配列番号：８０、８１、及び９のポリペプチド配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに、それぞれ配列番号：７０、２０、及び２１のポリペプチド配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；
（６）それぞれ配列番号：７１、７２、７３のポリペプチド配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに、それぞれ配列番号：７０、２０、及び２１のポリペプチド配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；
（７）それぞれ配列番号：７１、７２、及び７３のポリペプチド配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに、それぞれ配列番号：１９、２０、及び２１のポリペプチド配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；
（８）配列番号：２６のポリペプチド配列を有するＶＨ領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに、配列番号：３１のポリペプチド配列を有するＶＬ領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；
（９）配列番号：２８のポリペプチド配列を有するＶＨ領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに、配列番号：３４のポリペプチド配列を有するＶＬ領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；
（１０）配列番号：２６のポリペプチド配列を有するＶＨ領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに、配列番号：３４のポリペプチド配列を有するＶＬ領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；又は
（１１）配列番号：２８のポリペプチド配列を有するＶＨ領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに、配列番号：３１のポリペプチド配列を有するＶＬ領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３；
を含み、
抗体又はその抗原結合断片が、ＰＨＦ−タウと結合しており、
重鎖可変領域ドメイン及び軽鎖可変領域ドメインのフレームワーク領域が、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を含む、
単離モノクローナル抗体又は抗原結合断片である。
【０１２７】
実施形態６は、配列番号：２６、２７、２８、若しくは２９と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の同一性を有し、最も好ましくは１００％の同一性を有するポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、又は、配列番号：３１、３２、３３、若しくは３４と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の同一性を有し、最も好ましくは１００％の同一性を有するポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む、単離モノクローナル抗体又は抗原結合断片である。
【０１２８】
実施形態７は、配列番号：７４、７６、及び７８の重鎖の可変領域と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の同一性を有し、最も好ましくは１００％の同一性を有するポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、又は、配列番号：７５、７７、及び７９のいずれかの軽鎖の可変領域と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の同一性を有し、最も好ましくは１００％の同一性を有するポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む、単離モノクローナル抗体又は抗原結合断片である。
【０１２９】
実施形態８は、
（１）配列番号：２６のポリペプチド配列を有するＶＨ、及び配列番号：３１のポリペプチド配列を有するＶＬ；
（２）配列番号：２８のポリペプチド配列を有するＶＨ、及び配列番号：３４のポリペプチド配列を有するＶＬ；
（３）配列番号：２６のポリペプチド配列を有するＶＨ、及び配列番号：３４のポリペプチド配列を有するＶＬ；
（４）配列番号：２８のポリペプチド配列を有するＶＨ、及び配列番号：３１のポリペプチド配列を有するＶＬ；
（５）配列番号：２７のポリペプチド配列を有するＶＨ、及び配列番号：３１のポリペプチド配列を有するＶＬ；
（６）配列番号：７４の重鎖のポリペプチド配列を有するＶＨ、及び配列番号：７５の軽鎖のポリペプチド配列を有するＶＬ；
（７）配列番号：７６の重鎖のポリペプチド配列を有するＶＨ、及び配列番号：７７の軽鎖のポリペプチド配列を有するＶＬ；又は
（８）配列番号：７８の重鎖のポリペプチド配列を有するＶＨ、及び配列番号：７９の軽鎖のポリペプチド配列を有するＶＬ；
を含む、単離モノクローナル抗体又は抗原結合断片である。
【０１３０】
実施形態９は、配列番号：４５と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の同一性を有し、最も好ましくは１００％の同一性を有するポリペプチド配列を有する重鎖、及び、配列番号：４６と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の同一性を有し、最も好ましくは１００％の同一性を有するポリペプチド配列を有する軽鎖を含む、単離モノクローナル抗体又は抗原結合断片である。
【０１３１】
実施形態１０は、ヒト重鎖ＩｇＧ１定常領域及びヒト軽鎖κ定常領域を含む、実施形態１〜９のいずれか１つに記載の単離モノクローナル抗体又は抗原結合断片である。
【０１３２】
実施形態１１は、抗体又は抗原結合断片が、５×１０−９Ｍ以下のＫＤ、好ましくは１×１０−９Ｍ以下、又は１×１０−１０Ｍ以下のＫＤでヒトＰＨＦ−タウに結合しており、ＫＤは、Ｂｉａｃｏｒｅシステムを用いるなどにより、表面プラズモン共鳴分析により測定される、実施形態１〜１０のいずれかの単離モノクローナル抗体又は抗原結合断片である。
【０１３３】
実施形態１２は、実施形態１〜１２のいずれか１つに記載のモノクローナル抗体又は抗原結合断片をコードする、単離核酸である。
【０１３４】
実施形態１３は、実施形態１２に記載の単離核酸を含む、ベクターである。
【０１３５】
実施形態１４は、実施形態１３に記載の核酸を含む、宿主細胞である。
【０１３６】
実施形態１５は、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載の単離モノクローナル抗体又は抗原結合断片、及び医薬上許容できる担体を含む、医薬組成物である。
【０１３７】
実施形態１６は、病理学的タウ凝集の低減、又はタウ異常症の拡大の低減を必要とする対象における、病理学的タウ凝集の低減、又はタウ異常症の拡大の低減方法であって、対象に、実施形態１５に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法である。
【０１３８】
実施形態１７は、タウ異常症の治療を必要とする対象におけるタウ異常症の治療方法であって、対象に、実施形態１５に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法である。
【０１３９】
実施形態１８は、タウ異常症の治療を必要とする対象において、対象に、タウ異常症を治療するための追加の作用物質を投与することを更に含む、実施形態１７に記載の方法である。
【０１４０】
実施形態１９は、タウ異常症の治療を必要とする対象におけるタウ異常症の治療方法であって、対象に実施形態１５に記載の医薬組成物を投与することを含み、タウ異常症は、家族性アルツハイマー病、散発的アルツハイマー病、染色体１７（ＦＴＤＰ−１７）に関連したパーキンソン症候群による前頭側頭型認知症、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、ピック病、進行性皮質下神経膠症、線維変化優位型認知症、石灰化によるび漫性神経原線維濃縮、嗜銀顆粒性認知症、筋萎縮性側索硬化症・パーキンソン症候群認知症合併症、ダウン症、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、ハラーフォルデン−シュパッツ病、封入体筋炎、クロイツフェルト・ヤコブ病、多系統萎縮症、Ｃ型ニーマン・ピック病、プリオンタンパク質大脳アミロイド血管障害、亜急性硬化性全脳炎、筋強直性ジストロフィー、神経原線維濃縮による非ガマニアン（Guamanian）運動ニューロン疾患、脳炎後パーキンソン症候群、慢性外傷性脳症、及び拳闘家認知症（ボクサー病）からなる群から選択される、方法である。
【０１４１】
実施形態２０は、タウ異常症の治療を必要とする対象において、対象に、タウ異常症を治療するための追加の作用物質を投与することを更に含む、実施形態１９に記載の方法である。
【０１４２】
実施形態２１は、抗体又は抗原結合断片を製造する条件下において、抗体又は抗原結合断片をコードする核酸を含む細胞を培養することと、細胞又は細胞培養液から抗体又は抗原結合断片を回収することとを含む、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載のモノクローナル抗体又は抗原結合断片の製造方法である。
【０１４３】
実施形態２２は、医薬組成物を得るために、抗体又は抗原結合断片を医薬上許容できる担体と組み合わせることを含む、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載のモノクローナル抗体又は抗原結合断片を含む、医薬組成物の製造方法である。
【０１４４】
実施形態２３は、タウ異常症の治療を必要とする対象において、タウ異常症の治療に使用するための、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載の単離モノクローナル抗体又は抗原結合断片である。
【０１４５】
実施形態２４は、タウ異常症の治療を必要とする対象における、家族性アルツハイマー病、散発的アルツハイマー病、染色体１７（ＦＴＤＰ−１７）に関連したパーキンソン症候群による前頭側頭型認知症、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、ピック病、進行性皮質下神経膠症、線維変化優位型認知症、石灰化によるび漫性神経原線維濃縮、嗜銀顆粒性認知症、筋萎縮性側索硬化症・パーキンソン症候群認知症合併症、ダウン症、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、ハラーフォルデン−シュパッツ病、封入体筋炎、クロイツフェルト・ヤコブ病、多系統萎縮症、Ｃ型ニーマン・ピック病、プリオンタンパク質大脳アミロイド血管障害、亜急性硬化性全脳炎、筋強直性ジストロフィー、神経原線維濃縮による非ガマニアン（Guamanian）運動ニューロン疾患、脳炎後パーキンソン症候群、慢性外傷性脳症、又は拳闘家認知症（ボクサー病）などの、タウ異常症の治療に使用するための、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載の単離モノクローナル抗体又は抗原結合断片、又は実施形態１５に記載の医薬組成物である。
【０１４６】
実施形態２５は、タウ異常症の治療を必要とする対象における、タウ異常症の治療における薬剤を製造するための、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載の単離モノクローナル抗体又は抗原結合断片の使用である。
【０１４７】
実施形態２６は、タウ異常症の治療を必要とする対象における、家族性アルツハイマー病、散発的アルツハイマー病、染色体１７（ＦＴＤＰ−１７）に関連したパーキンソン症候群による前頭側頭型認知症、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、ピック病、進行性皮質下神経膠症、線維変化優位型認知症、石灰化によるび漫性神経原線維濃縮、嗜銀顆粒性認知症、筋萎縮性側索硬化症・パーキンソン症候群認知症合併症、ダウン症、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、ハラーフォルデン−シュパッツ病、封入体筋炎、クロイツフェルト・ヤコブ病、多系統萎縮症、Ｃ型ニーマン・ピック病、プリオンタンパク質大脳アミロイド血管障害、亜急性硬化性全脳炎、筋強直性ジストロフィー、神経原線維濃縮による非ガマニアン（Guamanian）運動ニューロン疾患、脳炎後パーキンソン症候群、慢性外傷性脳症、又は拳闘家認知症（ボクサー病）などの、タウ異常症の治療用薬剤を製造するための、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載の単離モノクローナル抗体又は抗原結合断片の使用である。
【０１４８】
実施形態２７は、対象の生体サンプルにおけるリン酸化タウの存在を検出する方法であって、生体サンプルを、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合断片と接触させることと、対象のサンプルにおいて、抗体又は抗原結合断片のＰＨＦ−タウへの結合を検出することとを含む、方法である。
【０１４９】
実施形態２８は、生体サンプルが血液、血清、血漿、間質液、又は大脳脊髄液サンプルである、実施形態２７に記載の方法である。
【０１５０】
実施形態２９は、対象における、対象の生体サンプルでのリン酸化タウの存在を検出することによる、タウ異常症の診断方法であって、生体サンプルを、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合断片と接触させることと、対象のサンプルにおいて、抗体又は抗原結合断片のＰＨＦ−タウへの結合を検出することとを含む、方法である。
【実施例】
【０１５１】
以下の本発明の実施例は、本発明の本質を更に説明するためのものである。以下の実施例は本発明を限定するものではなく、本発明の範囲は添付の請求項によって定められる点を理解されたい。
【０１５２】
実施例１：抗体の特性決定
ＰＴ３、及びＡＤ脳からの、ＰＨＦ−タウが富化した（ｅＰＨＦ−タウ）のＢａｌｂ／ｃマウスの免疫付与に由来する１組の抗体を、直接酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、及び免疫組織化学（ＩＨＣ）で、ホスホ−タウ対非ホスホ−タウでの標的選択性について試験した。ＰＴ３は、配列番号：２５の重鎖可変領域アミノ酸配列、及び配列番号：３０の軽鎖可変領域アミノ酸配列を有するマウス−ハイブリドーマ由来の抗体である。ＰＴ３のＶＨ及びＶＬドメインについてのＣＤＲ配列は、米国特許第９，３７１，３７６号に示されている。ヒトフレームワーク適応（ＨＦＡ）法（実施例４を参照）を用いてＰＴ３をヒト化し、本発明のヒト化抗−ホスホ−タウ抗体を生成した（表１及び２を参照）。ヒト化Ｂ２９６は、ＰＴ３と同じＣＤＲ配列を有する。ヒト化ｍＡｂ  Ｂ２９６は親和性成熟しており、本発明の更なる抗体を生成した（表３を参照）。
【０１５３】
ＥＬＩＳＡ
マウスＩｇＧ１（ｍＩｇＧ１）としての組み換えＰＴ３を、ＥＬＩＳＡフォーマットにおいて、富化ＰＨＦ−タウ及び組み換えヒト野生型タウへの結合について評価した。この組み換えに由来するＰＴ３を、ハイブリドーマ由来の精製ＰＴ３と比較した。結果は、精製ハイブリドーマ由来のＰＴ３抗体バッチ、及び組み換え由来のＰＴ３抗体のバッチの両方の間で相当の結合力価曲線を示した（図１）。強力な結合がＰＨＦ−タウには存在し、最小の結合がより高濃度にて可溶性タウに存在した。
【０１５４】
ウェスタンブロット
ＰＴ３を用いて、精製非リン酸化組み換えヒトタウ、及びＡＤ脳から調製したサルコシル不溶性ＰＨＦ−タウに対してウェスタンブロット分析を実施した。ＰＴ３は、ホスホ選択性参照抗体ＡＴ８  ｐＳ２０２／ｐＴ２０５／ｐＳ２０８と同様に、ＰＨＦ−タウとの選択交差性を示した（Ｍｅｒｃｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．８４（３）：２６５−７２，１９９２；Ｍａｌｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．８４：４２７−４３４，２０１６）ａｎｄ  ＡＴ１００  ｐＴ２１２／ｐＳ２１４（Ｍｅｒｃｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｉｄ．；Ｈｏｆｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３６（２６）：８１１４−２４，１９９７）（図２）。ホスホとは無関係の参照抗体ＨＴ７（Ｍｅｒｃｋｅｎ，Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ：Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ａｎｔｗｅｒｐ，Ｗｉｌｒｉｊｋ−Ａｎｔｗｅｒｐ，１９９１）を、組み換えタウ及びＰＨＦ−タウの両方と反応させた。ホスホ選択性であるエピトープに向けられるＢＴ２は、Ｓ１９９／Ｓ２０２においてリン酸化タウではなく、組み換えタウのみと反応した（Ｍｅｒｃｋｅｎ，１９９１，Ｉｄ．）。他のウェスタンブロット実験では、ＰＴ３は、より高濃度にてブロットした際でも、組み換えタウとは弱い反応性を示した。
【０１５５】
ヒト脳における免疫組織化学法
ＡＤ及び対照脳の、ホルマリン固定したパラフィン埋め込み切片で免疫組織化学分析を実施し、ｉｎ  ｓｉｔｕでタウ異常症との反応性を確認した。ＰＴ３は、参照タウ異常症特異的診断抗体陽性対照ＡＴ８と同様の、しかしより強力な反応性パターンを示した（図３）。これらの実験条件下においては、対照脳の通常のタウとは、有意な反応が検出されなかった（図４）。
【０１５６】
野生型及びタウノックアウトマウスでの免疫組織化学法
ＩＨＣ分析を、野生型及びノックアウトマウス脳のＰＴ３で実施した。野生型マウス脳のＰＴ３でのＩＨＣ分析では、最適なエピトープ保存条件下にて、野生型タウの選択的プールとの反応性を観察することが可能であることが示される。ＰＴ３の染色パターンにより、細胞体樹状突起の局在性（図５、矢印）が明らかとなり、ラット及びヒト生検由来組織の抗ホスホ−タウ抗体について、文献に記載された染色が想起される（Ｍａｔｓｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ．１３（４）：９８９−１００２，１９９４）。タウ−１抗体で観察された、タウの典型的な非ホスホ軸索染色パターン（図６、矢印）は存在せず、これは、ＰＴ３が微小管結合タウの生理学的に重要なプールとは限定的な反応性を有することを示している。タウノックアウト動物での反応性の欠如により、ＰＴ３染色パターンのタウ特異性が確認される。
【０１５７】
野生型マウス脳のＰＴ３エピトープ（ｐＴ２１２／ｐＴ２１７、実施例２を参照）におけるリン酸化反応の存在は、Ｍｏｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８（８）：１１８３−９，２０１５）による、質量分光分析における、Ｔ２１２及びＴ２１７のマウスホモログにおいてリン酸化が検出されることにより支持される。ＰＴ３エピトープは、タウリン酸化及びアグリゲート形成の初期段階にもまた存在することが示唆され、このことは、治療用抗体エピトープに対して好ましい。
【０１５８】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による結合評価
ＰＴ１及びＰＴ３抗ＰＨＦ−タウ抗体について、ＰｒｏｔｅＯｎ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）及びＢｉａｃｏｒｅ（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）機器にてＳＰＲを行うことにより、ＰＨＦ−タウ及び組み換えタウとの相互作用を評価した。全てのタウ抗体ＨＴ７を陽性対照として試験し、ＡＴ８を参照抗ＰＨＦ−タウ抗体として試験した。
【０１５９】
表４及び５は、ＰＨＦ−タウ及び組み換えタウとの、抗体の親和性評価の代表的な結果を示す。ＰＴ３モノクローナル抗体は、ＰＨＦ−タウに対して非常に強力な結合を示した（表４）。
【０１６０】
【表４】
2020513804.tif 000007
ｎ≧３の複製物に関しては、標準偏差を報告する；
ｈｙｂ、ハイブリドーマにより発現したｍＡｂ；ｒｅｃ、組み換えｍＡｂ；
括弧内のａＫＤ値は、７５ｎＭの注射したｍＡｂ濃度を除外することにより得られた。
【０１６１】
組み換えＰＴ３−ｍＧ２ａの見かけの結合親和性（ＫＤ）は、１６ｐＭに等しいか又はこれより強く、非常に遅い解離速度を有した。組み換えタウへの非常に弱い結合のみが、４つの複製物のうちの１つにおける、ハイブリドーマにより発現したＰＴ３に関して観察された（表５）。
【０１６２】
【表５】
2020513804.tif 000008
ｈｙｂ、ハイブリドーマにより発現したｍＡｂ；ｒｅｃ、組み換え：
ａ  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）製の組み換えタウ（５倍希釈液にて０．１２〜７５ｎＭ）によりＰｒｏｔｅＯｎにて試験をし、その後凝集したと判断した。他の全ての試験サンプルについて、インハウスで生成した組み換えタウをＢｉａｃｏｒｅで使用した。
【０１６３】
エピトープの複数のコピーを有するＰＨＦ−タウの多重結合／凝集性質、及び、ＩｇＧの二価の性質のために、モノクローナル抗体の親和性が、本研究フォーマットの結合活性により影響を受けた。Ｆａｂの親和性は、抗体の固有親和性についての情報をもたらす。ＰＴ３  Ｆａｂは、ＰＨＦ−タウへの強力な固有結合親和性（ＫＤ＝６３ｐＭ）、及び遅い解離速度を示した（表４）。Ｂｉａｃｏｒｅ  ＳＰＲにおける、組み換えタウとのＦａｂの反応性は、分析条件下において検出限界を下回っていた（表５）。
【０１６４】
特性決定研究により、ＰＴ３はＰＨＦ−タウに選択的に結合し、ＡＤ脳に由来するＰＨＦ−タウに対して高親和性を有することが示された。
【０１６５】
実施例２−ＰＴ３のエピトープマッピング
表６に示すホスホペプチドのパネルを用いた表面プラズモン共鳴（ＰｒｏｔｅＯｎ）により、ＰＴ３のエピトープを決定した。
【０１６６】
材料及び方法。ＰＴ３  Ｆａｂ（Ｂ１８７）を、マウス可変領域及びヒトＩｇＧ１／κ定常領域を有するキメラ版として作製し、重鎖のＣ末端に６ｘＨｉｓタグが存在する（ＶＨ１０、配列番号：２５及びＶＬ７、配列番号：３０）。ＦａｂをＨＥＫ  ２９３細胞での一時的発現により作製し、Ｎｉ−アフィニティクロマトグラフィーにより精製し、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４、５０ｎＭのＮａＣｌ）（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）に透析した。
【０１６７】
表６に示す１４個のタウホスホペプチドの各々に対する、ＰＴ３  Ｆａｂの結合親和性を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６を使用して表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により評価した。短鎖ビオチン、及びＮ末端のＰＥＧ４部分を用いる標準的な化学的方法により、ペプチド（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ）を合成した。ビオチン化ペプチドを、ニュートラアビジンでコーティングしたＮＬＣバイオセンサチップ上で捕捉し、ＰＴ３  Ｆａｂを表面に流して反応速度論的パラメータを測定した。
【０１６８】
全ての実験は、２５℃にて、ランニング緩衝液及びサンプル希釈緩衝液の両方としてリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４、０．００５％  Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ））を使用して実施した。サンプルをランニングする前に、チップ表面にＰＢＳＴを１時間ランニングすることにより、ＮＬＣチップをコンディショニングした。ペプチドをＰＢＳＴ中で１０ｎｇ／ｍＬまで希釈し、３０μＬ／分にて１００秒流路上に注入することにより、約５〜１０ＲＵのペプチドをチップ表面上に捕捉した。ＰＴ３  Ｆａｂの連続希釈液（１．１〜９０ｎＭ）を分析し、ペプチド−８を除いて、各濃度を重複して測定した。ペプチドの捕捉後、抗体滴定には、緩衝液のみを、６０μＬ／分にて３分間（会合段階）、続いて３００秒間、注入した（解離段階）。
【０１６９】
スポット間の応答を差し引くことによりデータを二重参照し、緩衝液のみを注入することにより、曲線を生成した。３０μＬ／分で１００秒の接触時間にわたり、０．８５％リン酸を一度注入し、続いて、次の抗体滴定注入の前にランニング緩衝液を４回注入することで、チップ表面を再生した。データ処理及び反応速度論的解析を、機器ソフトウェアを使用して行った。単純なラングミュア１：１結合モデルを用いてデータを分析した。
【０１７０】
結果。ＰＴ３  Ｆａｂの反応速度論的速度定数及び平衡結合親和性を表６に示す。
【０１７１】
【表６】
2020513804.tif 000009
ｎ＝２について、範囲を報告する；
＊ペプチド−３について、ｎ＝３であり、標準偏差を報告する；
＊＊ペプチド−８について、ｎ＝１であり、平均又は範囲は報告されない；
＊＊＊注記しない限り、全てのペプチドはタウ残基２０４〜２２５を含み（アイソフォーム２Ｎ４Ｒ）、Ｎ末端に短鎖ビオチン部位（ＳＣＢｉｏｔ）及びｄＰＥＧ４、並びにＣ末端にアミドを含有する。
＃ペプチド−１１は、タウ残基２０２〜２２０を含む（アイソフォーム２Ｎ４Ｒ）。
【０１７２】
ＰＴ３  Ｆａｂは、Ｔ２１２又はＴ２１７がリン酸化したペプチドにナノ分子結合したことを示し、ＰＴ３  Ｆａｂの結合は、Ｔ２１２及びＴ２１７の両方がリン酸化した際に向上した。ＰＴ３  Ｆａｂは、ｐＴ２１２及び／又はｐＴ２１７を含有するペプチドに最も良く結合した。ＰＴ３  Ｆａｂは、Ｔ２１２／Ｔ２１７がリン酸化したタウペプチド（ペプチド−２）、及びＴ２１２／Ｓ２１４／Ｔ２１７がリン酸化したタウペプチド（ペプチド−１）に、同様の親和性で結合し、このことは、Ｓ２１４における追加のリン酸化が、ＰＴ３  Ｆａｂの結合を向上させないことを示している。ＰＴ３  Ｆａｂは、ｐＳ２１４−タウペプチド（ペプチド−９）に非常に弱い結合のみを有した。Ｓ２１０が単独で、又は他のリン酸化残基と組み合わせてリン酸化された場合、結合はほとんど、ないしは全く観察されなかった。Ｔ２２０のリン酸化は、ＰＴ３  Ｆａｂに対する結合活性の喪失に寄与するようであった（ペプチド−９対ペプチド−１３）。非リン酸化タウペプチド（ペプチド−Ｃ）に対して、ＰＴ３  Ｆａｂの結合活性は検出されなかった。ＰＴ３はタウのプロリンリッチなドメイン内のホスホエピトープに結合する。
【０１７３】
結合の検討は、ＰＴ３エピトープがｐＴ２１２及びｐＴ２１７を含むこと、並びに、ＰＴ３の最大結合エピトープが、二重リン酸化したｐＴ２１２／ｐＴ２１７−タウを含むことを示唆している。ＰＴ３のエピトープは、ホスホ依存性の抗タウ抗体用の、報告されている他のエピトープ、例えばＡＴ８（ｐＳ２０２／ｐＴ２０５／ｐＳ２０８；Ｍａｌｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６  Ｉｄ．）、ＡＴ１８０（ｐＴ２３１；Ｇｏｅｄｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊ．３０１（Ｐｔ３）：８７１−８７７）、ＡＴ２７０（ｐＴ１８１；Ｇｏｅｄｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｄ．）、ＰＨＦ１（ｐＳ３９６／ｐＳ４０４；Ｏｔｖｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ．３９（６）：６６９−７３，１９９４）、１２Ｅ８（ｐＳ２６２；Ｓｅｕｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７０（３２）：１８９１７−２２，１９９５）、抗タウｐＳ４２２抗体（Ｃｏｌｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒａｉｎ．１３７（Ｐｔ  １０）：２８３４−４６，２０１４）、及び抗タウｐＳ４０９抗体（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．１６（６）：１６９０−７００，２０１６）とは異なる。
【０１７４】
実施例３−ＰＴ３  Ｆａｂ＋ｐＴ２１２／ｐＴ２１７−タウペプチド複合体の結晶構造
Ｘ線結晶構造解析により、２つのタウホスホペプチドを有するＰＴ３  Ｆａｂ（Ｂ１８７）の共構造を測定し、これにより、タウエピトープ及びＰＴ３パラトープの同定を行った。
【０１７５】
サンプル調製及び結晶化。Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓにより結晶化用のペプチドを合成した。これは、以下の配列を有した：残基Ｔ２１２、Ｓ２１４、及びＴ２１７がリン酸化した、タウ−４４１（２Ｎ４Ｒアイソフォーム）の残基２０７〜２２０に対応する、Ａｃ−ＧＳＲＳＲ（ｐＴ）Ｐ（ｐＳ）ＬＰ（ｐＴ）ＰＰＴ−ＯＨ（配列番号：６１）（ｐＴ２１２／ｐＳ２１４／ｐＴ２１７−タウペプチド）、並びに、Ｔ２１２及びＴ２１７がリン酸化した、残基２１０〜２２２に対応するＡｃ−ＳＲ（ｐＴ）ＰＳＬＰ（ｐＴ）ＰＰＴＲＥ−ＯＨ（配列番号：６２）（ｐＴ２１２／ｐＴ２１７−タウペプチド）。凍結乾燥したペプチドを１００ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．５、約５５ｍｇ／ｍＬ）に溶解させた。
【０１７６】
ＰＴ３  Ｆａｂを１９．６４ｍｇ／ｍＬ又は１７．７６ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、１０．７モル過剰、又は９．３モル過剰のｐＴ２１２／ｐＳ２１４／ｐＴ２１７−タウペプチド、又はｐＴ２１２／ｐＴ２１７ペプチドと混合し、それぞれ、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）中で１６．９ｍｇ／ｍＬ、及び１００ｍＭ又は５０ｍＭのＮａＣｌ中で１６．７ｍｇ／ｍＬの最終複合体濃度にした。Ｍｏｓｑｕｉｔｏ結晶化ロボットを使用し、１５０ｎＬの複合体及び１５０ｎＬのリザーバ溶液を混合して、インハウススクリーン及びＰＥＧ（Ｑｉａｇｅｎ）により、結晶化を実施した。回折用結晶を、以下の条件で入手した：０．１Ｍのアセテート（ｐＨ４．５）、１８％のＰＥＧ３３５０、０．２のＭｇＣｌ２中の、ＰＴ３  Ｆａｂ＋ｐＴ２１２／ｐＳ２１４／ｐＴ２１７−タウペプチド複合体、及び２０％のＰＥＧ３３５０、０．２Ｍのリン酸アンモニウム（一塩基性）中のＰＴ３  Ｆａｂ＋ｐＴ２１２／ｐＴ２１７−タウペプチド複合体。
【０１７７】
データ収集及び構造測定。ＰＴ３  Ｆａｂ＋ｐＴ２１２／ｐＳ２１４／ｐＴ２１７−タウペプチド複合体の結晶を、０．１Ｍのアセテート（ｐＨ４．５）、１８％のＰＥＧ３３５０、０．２ＭのＭｇＣｌ２（母液）から回収し、２０％グリセロールを補充した母液からなる凍害防止溶液と混合した。液体窒素中で結晶を急速冷却し、ＯｓｍｉｃＴＭ  ＶａｒｉＭａｘ（商標）共焦点光学素子、Ｓａｔｕｒｎ  ９４４  ＣＣＤ検出器、及びＸ−ｓｔｒｅａｍ（商標）２０００凍結冷却システム（リガク）を装着した、Ｒｉｇａｋｕ  ＭｉｃｒｏＭａｘＴＭ−００７ＨＦ微焦点Ｘ線発生器でデータを収集した。
【０１７８】
データをＸＤＳ（Ｋａｂｓｃｈ，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．６６（Ｐｔ  ２）：１２５−３２，２０１０）で処理した。Ｆａｂ  Ｈ３−２３：Ｌ１−３９（ＰＤＢ  ＩＤ：５Ｉ１９）Ｆａｂを研究モデルとして使用し、ＰＨＥＮＩＸスイートのプログラム（Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．６６（Ｐｔ  ２）：２１３−２１，２０１０）にて、フェーザー（ＭｃＣｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．４０（Ｐｔ  ４）：６５８−６７４，２００７）を用いて分子交換を実施した。Ｐｈｅｎｉｘ．ｘｔｒｉａｇｅにより、７％双晶画分による結晶中で、擬欠面双晶を同定した。大多数のモデルビルディングについて双晶精密化を用いて、精密化を実施した。モデルビルディングにはＣｏｏｔ（Ｅｍｓｌｅｙ  ａｎｄ  Ｃｏｗｔａｎ，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．６０（Ｐｔ  １２  Ｐｔ  １）：２１２６−３２，２００４）を用い、精密化にはｐｈｅｎｉｘ．ｒｅｆｉｎｅ（Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｉｄ．）を用いた。双晶精密化はマップを改善しなかったことが後で判明したため、精密化の最終段階では、双晶精密化を用いなかった。データ及び精密化の統計を表７に示す。
【０１７９】
【表７】
2020513804.tif 000010
最高の解像度シェルについての値を、括弧内に示す。
【０１８０】
ＰＴ３  Ｆａｂ＋ｐＴ２１２／ｐＴ２１７−タウペプチド複合体の単結晶を、結晶化液滴から取り出し、２０％グリセロールを補充したリザーバ溶液（２０％のＰＥＧ３３５００、２Ｍリン酸アンモニウム（一塩基性））中に数秒間浸漬させ、液体窒素中で急速冷却した。Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ（Ａｒｇｏｎｎｅ，ＩＬ）ＩＭＣＡ−ＣＡＴビームライン１７−ＩＤ−Ｂにて、１００Ｋでデータを収集した。画像半度当たり０．５秒の曝露時間で、１８０°回転でＰｉｌａｔｕｓ  ６Ｍ検出器にて回折強度を収集した。ＸＤＳ（Ｋａｂｓｃｈ，２０１０，Ｉｄ．）でデータを、２．０Åの最大解像度まで処理した。調査モデルとしてＰＴ３  Ｆａｂ＋ｐＴ２１２／ｐＳ２１４／ｐＴ２１７−タウペプチド構造を使用して、プログラムフェーザー（ＭｃＣｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｉｄ．）での分子交換により、構造を決定した。ＮＣＳ（Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｉｄ．）を使用して、ｐｈｅｎｉｘ．ｒｅｆｉｎｅにより構造精密化を行った。プログラムＣｏｏｔ（Ｅｍｓｌｅｙ及びＣｏｗｔａｎ，２００４，Ｉｄ．）を使用して、モデル調節を実施した。Ｘ線データ収集及び精密化の統計を、表７に示す。４．０Åの距離カットオフを用いて、ＣＯＮＴＡＣＴ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｊｅｃｔ，Ｎｕｍｂｅｒ  ４，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．５０（Ｐｔ  ５）：７６０−３，１９９４）により分子間接触距離を計算し、Ｐｙｍｏｌにより目視検査した。
【０１８１】
構造分析。ｐＴ２１２／ｐＳ２１４／ｐＴ２１７−タウペプチドを有するＰＴ３  Ｆａｂの構造を、２．５Åの解像度で測定した。ＰＴ３  Ｆａｂ＋ｐＴ２１２／ｐＴ２１７−タウペプチド構造について以下で記載するように、非対称ユニット当たり、複合体の３つのコピーが存在する。Ｔ２１２及びＴ２１７もまたリン酸化された場合に、ＰＴ３はｐＳ２１４のホスフェートとは相互作用しない（データは図示せず）ことが、構造により示され、このことは、ＰｒｏｔｅＯｎによるホスホペプチドマッピングにより支持される（実施例２）。
【０１８２】
ｐＴ２１２／ｐＴ２１７−タウペプチドを有するＰＴ３  Ｆａｂの構造を、２．０Åの解像度にてＸ線結晶構造解析により決定した（図７）。非対称ユニット中には複合体の３つのコピー（コピー１：鎖Ａ、Ｃ、Ｅ；コピー２：鎖Ｂ、Ｄ、Ｆ；コピー３：鎖Ｈ、Ｌ、Ｐ）が存在し、これらは重鎖Ａ、Ｃ、及びＨ、軽鎖Ｂ、Ｄ、及びＬ、並びにペプチド鎖Ｅ、Ｆ、及びＰからなる。３つのコピーは非常に類似しており、可変領域は０．３Åｒｍｓｄ以内にあった。図７〜８は、コピー３（鎖Ｈ、Ｌ、Ｐ）のものである。図７に示すように、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖は浅い結合ポケットを形成し、ペプチドがＦａｂを横切って配置される。タウホスホペプチドは、ポリプロリン−ＩＩヘリックス二次構造に一致する特徴を有する、延びた構造の中にある。
【０１８３】
相互作用海面を含む、ＰＴ３  Ｆａｂパラトープ及びｐＴ２１２／ｐＴ２１７−タウペプチドエピトープ残基を、図８及び９、並びに表８に示す。ＰＴ３とそのエピトープペプチドとの界面はファン・デル・ワールス及び静電相互作用で構成され、ペプチド残基２１１から２２１まで延びる。ｐＴ２１２／ｐＴ２１７−タウペプチドとの複合体中のＰＴ３  Ｆａｂの構造は、エピトープがｐＴ２１２及びｐＴ２１７のホスフェートを含むことを示す。重鎖Ｙ３２ヒドロキシル基は、ｐＴ２１２のホスフェート酸素と重要な水素結合を形成する。Ｔ２８（ＶＨ）の側鎖のヒドロキシル基もまた、ｐＴ２１２のホスフェート酸素と水素結合を形成する。重鎖Ｋ５３は、鍵となる塩橋相互作用をｐＴ２１７と形成する。重鎖Ｗ９９は、ペプチドのＬ２１５及びＰ２１６の側鎖残基と疎水性相互作用を形成する。重鎖残基Ｗ１０４は、ペプチドと広範囲にわたる相互作用を有し、また、ＶＨ／ＶＬ界面の一部を形成する。軽鎖Ｙ３２は、Ｐ２１９と疎水性相互作用を形成する。ｐＴ２１２及びｐＴ２１７のホスフェートとの静電相互作用は、ホスホ−タウに対するＰＴ３の選択性に決定的なものであり、疎水性相互作用は更に、ｐＴ２１２／ｐＴ２１７−タウ（実施例５）並びにＰＨＦ−タウ（実施例１及び６）に対する、ＰＴ３の高親和性に寄与する。
【０１８４】
表８：ＰＴ３  Ｆａｂ＋ｐＴ２１２／ｐＴ２１７−タウペプチドのエピトープ及びパラトープ。ｐＴ２１２／ｐＴ２１７−タウペプチド残基と相互作用するＰＴ３Ｆａｂ  ＶＨ又はＶＬからの残基が示される。水素結合相互作用を太字の活字で示す。
【０１８５】
【表８】
2020513804.tif 000011
【０１８６】
実施例４−ＰＴ３に対するヒトフレームワーク適合
ヒトフレームワーク適合（ＨＦＡ）法（Ｆｒａｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．３９８（２）：２１４−３１，２０１０）を使用して、抗タウマウス抗体ＰＴ３をヒト化した。Ｍａｒｔｉｎ（Ｍａｒｔｉｎ  ａｎｄ  Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２６３（５）：８００−１５，１９９６）に従い、ヒトフレームワーク適合のため、ＣＤＲを規定した。ヒト化ＨＣ及びＬＣの最も良い組み合わせを発見するために、いくつかのヒト重鎖Ｖ領域配列及び軽鎖Ｖ領域配列を試験のために選択した。４つのヒトフレームワーク適合ＰＴ３重鎖可変領域、及び４つのヒトフレームワーク適合ＰＴ３軽鎖可変領域を設計し、完全ヒト重鎖ＩｇＧ１及びヒト軽鎖κ分子として生成した（図１０）。フレームワーク領域（ＦＲ）のみの中のマウスＰＴ３  ＶＨ及びＶＬに対する配列類似性に基づいて、ヒト生殖細胞系Ｖ遺伝子（ＶＨに関して４つ：ＩＧＨＶ３−２３＊０１、ＩＧＨＶ３−３３＊０１、ＩＧＨＶ３−１１＊０１、及びＩＧＨＶ１−３＊０１；ＶＬに関して４つ：ＩＧＶＫ１−１６＊０１、ＩＧＶＫ１−１６＊０１＋、ＩＧＫＶ１−３９＊０１、及びＩＧＫＶ２−２４＊０１）を、ヒトフレームワーク適合ＶＨ及びＶＬ多様体を製造するために選択した。ＶＬ７８（ＩＧＶＫ１−１６＊０１＋）はＶＬ７７（ＩＧＶＫ１−１６＊０１）の単一点変異体であり、潜在的な異性化のリスクを排除するために、Ｄ５６Ｓ変異を含有する。４つのＨＦＡ  ＨＣ及び４つのＨＦＡ  ＬＣ分子を組み合わせて得られる、１６個のＨＦＡ多様体モノクローナル抗体の名称を、表９に示す。
【０１８７】
表９：ＨＦＡ−ＰＴ３多様体。Ｂ２３４はマウス親可変領域を含有し、陽性対照として含められた。対応するヒト生殖細胞系遺伝子を括弧の中に示す。ＶＬ７８（ＩＧＶＫ１−１６＊０１＋）はＶＬ７７（ＩＧＶＫ１−１６＊０１）単一点変異を含有する。
【０１８８】
【表９】
2020513804.tif 000012
【０１８９】
１６個のＨＦＡ−ＰＴ３（ｈＩｇＧ１／κ）多様体のパネルに対するクローニング及びＤＮＡ合成を、標準的な方法により実施した。標準的な手順によりＤＮＡをＨＥＫ（Ｅｘｐｉ２９３）細胞にトランスフェクションし、細胞の上清を、培養液中で５日後に収集した。１×ｄＰＢＳ（ｐＨ７．２）中にて予備平衡化したＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ樹脂上でＩｇＧを捕捉することにより、高スループットの並行精製用Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＢｉｏＳｏｌｕｔｉｏｎｓ  ＰｒｏｔｅｉｎＭａｋｅｒ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用して、透明にした上清を精製した。１×ｄＰＢＳ（ｐＨ７．２）でカラムを洗浄した後、０．１Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）を使用してモノクローナル抗体を溶出した。２．５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）を、２０体積％まで添加して溶出画分を中和し、最終的なタンパク質の配合物は、０．０８Ｍの酢酸ナトリウム、０．５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．１）であった。
【０１９０】
ＨＦＡパネルの最初の評価は、精製収率、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）プロファイル、ＥＬＩＳＡ結合アッセイでのＰＨＦ−タウへの結合、及び生物物理学的特性決定に基づいた。
【０１９１】
対応するモノクローナル抗体のＨＣ及びＬＣ可変領域を、重鎖のＣ末端にてヒトＩｇＧ１／κ定常領域及び６ｘＨｉｓタグと対形成することより、Ｂ２９６のＦａｂ（Ｂ３２４）及びＢ２５２のＦａｂ（Ｂ３２６）もまた生成した。Ｂ３２４及びＢ３２６はＨＥＫ（Ｅｘｐｉ２９３）細胞内で発現し、記載したものと類似の方法（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ．６７（２）：１８２−９，２００９）により精製した。
【０１９２】
実施例５−ホスホペプチドでのＳＰＲによる、ＨＦＡ−ＰＴ３抗体の特性決定
生物物理学的特性決定、及びＰＨＦへのＥＬＩＳＡ結合に基づいて選択したＨＦＡ−ＰＴ３モノクローナル抗体多様体のサブセットを、以下のホスホペプチド：ｐＴ２１２／ｐＴ２１７−タウペプチド（ペプチド−２、配列番号：４８）及びｐＴ２１２−タウペプチド（ペプチド−８、配列番号：５４）への結合に関して、ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６で表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により分析した。全ての実験は、２５℃にて、ランニング緩衝液及びサンプル希釈緩衝液の両方としてＰＢＳＴ（ｐＨ７．４）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  カタログ番号１７６−２７２０）を用いて実施した。
【０１９３】
モノクローナル抗体／ペプチド結合。ＰＢＳＴで予めコンディショニングした後、抗ヒトＦｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  １０９−００５−０９８）でＢｉｏｒａｄ  ＧＬＣチップを約６５００ＲＵの密度までコーティングすることにより、バイオセンサ表面を調製した。ＥＤＣ／ＮＨＳを使用して、抗ヒトＩｇＧをチップ表面にアミンカップリングさせ、次いでエタノールアミンで洗浄した。抗体をＰＢＳＴ中に２μｇ／ｍＬまで希釈し、３０μＬ／分にて５分間、表面上に注入して９００〜１０００ＲＵの最大密度を達成した。ペプチドを検体として、６０μＬ／分にて３分間注入し、続いて５分間解離させた。ペプチド−２をＰＢＳＴに希釈させて、３倍希釈系列（０〜３０ｎＭ）を生成し、二重に測定した。ペプチド−８へのモノクローナル抗体結合の一度の測定を、０〜１００ｎＭの濃度範囲にわたり記録した。
【０１９４】
Ｆａｂ／ペプチド結合。ビオチン化ペプチドを、ＰＢＳＴで予めコンディショニングした、ニュートラアビジンによりコーティングしたＮＬＣバイオセンサで捕捉し、Ｆａｂを表面上で流し、反応速度論的パラメータを測定した。ＰＢＳＴ中にペプチドを１０ｎｇ／ｍＬまで希釈し、３０μＬ／分にて１００秒間、流路に注入することにより、チップ表面上で約５〜１０ＲＵのペプチドを捕捉した。ＰＴ３  Ｆａｂの連続希釈液（１．１ｎＭ〜９０ｎＭ）には、緩衝液のみを、６０μＬ／分で３分間（会合段階）、続いて３００秒間注入した（解離段階）。
【０１９５】
スポット間の応答を差し引くことによりデータを二重参照し、緩衝液のみの注入により、曲線を作成した。０．８５％のリン酸によりチップ表面を再生し、続いて、次の抗体滴定注入の前にＰＢＳＴを注入した。データ処理及び分析を、機器のソフトウェアを用いて実施した。単純なラングミュア１：１結合モデルを使用してデータを合致させた。
【０１９６】
ペプチド−８に対するＨＦＡ−ＰＴ３  ＩｇＧの反応速度論的速度定数及び平衡結合親和性を、表１０に示す。Ｂ２３４は、マウスＰＴ３可変領域及びヒトＩｇＧ１／κ定常領域を含有する。ヒト化多様体の中でも、Ｂ２９６が、ペプチド−８に対して最も強力な結合を示した（ｐＴ２１２−タウ）。
【０１９７】
【表１０】
2020513804.tif 000013
全ての抗体について、ｎ＝２
【０１９８】
ペプチド−２に対する、ＨＦＡ−ＰＴ３  ＩｇＧの反応速度論的速度定数及び平衡結合親和性を、表１１に示す。Ｂ２５２及びＢ２９６は、それぞれ１７２ｐＭ及び１９０ｐＭの平均ＫＤ値を有して、ペプチド−２（ｐＴ２１２／ｐＴ２１７−タウ）に対して最も強力な結合を示した。
【０１９９】
【表１１】
2020513804.tif 000014
全ての抗体について、ｎ＝２
【０２００】
Ｂ２９６及びＢ２５２のＦａｂの親和性を、ＰｒｏｔｅＯｎによりｐＴ２１２／ｐＴ２１７−タウペプチド（ペプチド−２）にて測定し、マウス親Ｆａｂ  Ｂ１８７と比較した（表１２）。親マウスＦａｂと比較して、解離速度は２．７〜５．１倍増加し、ＨＦＡ  Ｆａｂに対するＫＤ値は３．５〜５．６倍増加した。Ｂ２９６のＦａｂ（Ｂ３２４）は、Ｂ２５２のＦａｂ（Ｂ３２６）よりも、ｐＴ２１２／ｐＴ２１７−タウペプチドに対して強い親和性を、かつ、遅い解離速度を示した。
【０２０１】
【表１２】
2020513804.tif 000015
全てのＦａｂについて、ｎ＝２
【０２０２】
実施例６−ＰＨＦ−タウ及び組み換えタウにおけるＳＰＲによる、ＨＦＡ−ＰＴ３抗体の特性決定
アルツハイマー病の脳から単離したＰＨＦ−タウに対する結合について、ＨＦＡ−ＰＴ３モノクローナル抗体のサブセットを試験した。３ｍＭのＥＤＴＡ、及び０．００５％のＴｗｅｅｎ２０を補充したＰＢＳ（ｐＨ７．４）をランニング又はシステム緩衝液として使用して、２５℃にて全ての相互作用を検討した。マウス抗タウ抗体であるＨＴ７（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号ＭＮ１０００）を陽性対照として使用した。
【０２０３】
ＨＴ７を捕捉試薬として使用する、ＰＨＦ−タウの捕捉カップリングにより調製したバイオセンサ表面を使用して、ＰｒｏｔｅＯｎにより、ＰＨＦ−タウを有する抗タウモノクローナル抗体の相互作用を分析した。５０００ｘｇ、５℃にて１０分間の遠心分離を２回行いＰＨＦ−タウを調製し、次に、２回目の遠心分離での上清をランニング緩衝液に、１／４０に希釈した。チップを調製するために、アミンカップリング化学についての、メーカーの取扱説明書を使用して、ＨＴ７をＧＬＣ（ＰｒｏｔｅＯｎ）センサチップの表面に共有結合により固定化した（約５０００個の応答単位（ＲＵ））。カップリング用緩衝液は、１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）であった。ＨＴ７の固定化の後、ＰＨＦ−タウを注入し、ＨＴ７により捕捉した（約３００ＲＵ）。捕捉後、アミンカップリング化学についてのメーカーの取扱説明書に従って、チップの活性化によってＰＨＦ−タウをセンサチップに共有結合で固定化した。エタノールアミンを注入することによって、残りの反応部位をブロックした。ＰＨＦ−タウ修飾表面及び参照表面（抗原を含有しない）の調製及び安定化後、抗ＰＨＦ−タウ抗体をランニング緩衝液で希釈し、溶液中に注入した（０．１２〜７５ｎＭ、５倍希釈）。３分間会合をモニタリングした（４０μｇ／分で１２０μＬを注入）。解離を１５分間モニタリングした。１０ｍＭのＧｌｙ（ｐＨ２．０）を用いてセンサ表面を再生した。見かけの親和性（ＫＤ）をｋｏｆｆ／ｋｏｎの比率として報告した、二価の結合モデルを使用して、モノクローナル抗体用のデータを合致させた。Ｆａｂの反応速度分析のために、ラングミュア１：１結合モデルを使用した。
【０２０４】
大部分のＨＦＡモノクローナル抗体は、２７ｐＭ〜１６５ｐＭの範囲で、マウス親ＰＴ３モノクローナル抗体と同様の強力な結合を保持した（表１３）。２つのトップのＨＦＡモノクローナル抗体であるＢ２５２及びＢ２９６はそれぞれ、３２ｐＭ及び２７ｐＭの親和性を有した。Ｂ２３５は、このパネルでは最も弱いモノクローナル抗体親和性（１６５ｐＭ）を示した。Ｂ３２４（Ｂ２９６のＦａｂ）及びＢ３２６（Ｂ２５２のＦａｂ）を、ＰＨＦ−タウの結合について評価すると、それぞれ、マウスＰＴ３親ＦａｂＢ１８７よりも２．５倍、及び３．３倍弱いＫＤを示した。Ｂ３２４は、Ｂ３２６よりも１．３倍強い親和性（ＫＤ）、及び１．７倍遅い解離速度を示した。Ｆａｂの親和性は、対応するモノクローナル抗体よりも弱く、これは、ＰＨＦ−タウに対してモノクローナル抗体が結合活性を有することを示唆している。同じ可変領域を有する、Ｂ２９６のＩｇＧ４多様体であるＢ３５２を、ＰＨＦ−タウへの結合についてもまた試験した。親和性（４３ｐＭ）は、Ｂ２９６の親和性の２倍以内であった（表１１）。
【０２０５】
【表１３】
2020513804.tif 000016
ｍＡｂ：各実験において３つの複製物、ｎ＝２
Ｆａｂ：各実験において２つの複製物、ｎ＝２
Ｂ３５２：各実験において４つの複製物、ｎ＝２
【０２０６】
抗タウモノクローナル抗体と、組み換えにより発現した対照タウ（ヒトタウアイソフォーム２Ｎ４Ｒ  ４４１ａａ、Ｎ末端６ｘＨｉｓタグ、配列番号：６３）を有するＦａｂとの相互作用を、ＢｉａｃｏｒｅＴ２００により検討した。アミンカップリング化学についてのメーカーの取扱説明書を用いて、抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ特異的抗体（Ａｂ）、又は抗Ｆｄを、ＣＭ５センサチップの表面にカップリングさせることにより、バイオセンサ表面を調製した（約６５００応答単位（ＲＵ））。カップリング用緩衝液は、１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）であった。抗タウ抗体をランニング緩衝液に希釈し、注入して少なくとも５ＲＵの捕捉を得た。抗タウモノクローナル抗体又はＦａｂの捕捉に続いて、組み換えにより発現した対照タウの溶液（０．１２〜７５ｎＭ、５倍希釈）を注入した。会合を３分間モニタリングした（５０μＬ／分にて１５０μＬを注入した）。合理的な解離速度測定に関して少なくとも５％のシグナル低下が観察されるまで、解離をモニタリングした。センサ表面の再生を、０．８５％のリン酸、続いて５０ｍＭのＮａＯＨにより行った。結合が観察された場合、モノクローナル抗体及びＦａｂの両方についてのデータを、１：１ラングミュア結合モデルを使用して合致させた。
【０２０７】
Ｂ３２４及びＢ３２６のいずれも、対照タウに対する有意な結合を示さなかった。Ｂ２９６もまた、対照タウに対して結合を示さなかった。
【０２０８】
実施例７−Ｂ３２４＋ｐＴ２１２／ｐＴ２１７タウペプチド複合体の結晶構造
Ｘ線結晶構造解析により、ｐＴ２１２／ｐＴ２１７−タウペプチド（配列番号：６２）を有するＢ３２４の共構造を決定し、これにより、タウエピトープ並びにＢ３２４（及びＢ２９６）パラトープの同定を行った。
【０２０９】
サンプル調製及び結晶化。ＨＥＫ  ２９３細胞内での一時的発現により、ＶＨ９２及びＶＬ７７を有するＢ２９６のＦａｂであるＢ３２４を製造し、Ｎｉアフィニティクロマトグラフィー、ＳＥＣ、及び２０ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ６．０）、０．２ＭのＮａＣｌの最終緩衝液中でのイオン交換により精製した。実施例３で記載したように、ｐＴ２１２／ｐＴ２１７−タウペプチド（配列番号：６２）を共結晶化のために使用した。Ｂ３２４  Ｆａｂ＋ｐＴ２１２／ｐＴ２１７−タウペプチド複合体の調製のために、１０倍モル過剰のペプチドを添加した。
【０２１０】
Ｂ３２４  Ｆａｂ＋ｐＴ２１２／ｐＴ２１７−タウペプチドの結晶化を、２０ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ６．０）、０．２ＭのＮａＣｌ中で９〜１８ｍｇ／ｍＬにて実施した。２つのインハウススクリーン及びＰＥＧ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、２０℃にてシッティングドロップ蒸気拡散法により、Ｍｏｓｑｕｉｔｏ結晶化ロボットで最初の結晶化スクリーニングを実施した。結晶は０．１Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．６）、２０％のＰＥＧ  １０Ｋから現れ、更なる最適化スクリーニングに使用するために、Ｓｅｅｄ  Ｂｅａｄキット（Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いた機械的均質化により、シードを作製した。
【０２１１】
データ収集及び構造測定。結晶は０．１Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）、３７％のＰＥＧ２００から現れ、これを回収して、Ｘ線回折データ収集のために、冷凍保護することなく液体窒素内で急速冷却した。１００Ｋにて、ＩＭＣＡ−ＣＡＴビームライン１７−ＩＤ−Ｂ上でＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ（Ａｒｇｏｎｎｅ，ＩＬ）にて、結晶構造解析データを収集した。画像半度当たり０．５秒の曝露で、１８０°回転でＰｉｌａｔｕｓ  ６Ｍ検出器にて回折強度を収集した。ＸＤＳ（Ｋａｂｓｃｈ，２０１０，Ｉｄ．）でデータを、２．６Åの最大解像度まで処理した。ｐＴ２１２／ｐＴ２１７−タウペプチドと複合体化したＢ３２４のＸ線結晶構造を、関連するＦａｂ構造を調査モデルとして用いて、Ｐｈａｓｅｒ（ＭｃＣｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｉｄ．）で分子交換により解像し、Ｒｅｆｍａｃ（Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．５３（Ｐｔ  ３）：２４０−５５，１９９７）により精密化した（表１４）。４．０Åの距離カットオフを使用して、ＣＯＮＴＡＣＴ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｊｅｃｔ，１９９４，Ｉｄ．）により分子間の接触距離を計算し、Ｐｙｍｏｌで目視検査した。
【０２１２】
【表１４】
2020513804.tif 000017
【０２１３】
構造分析。Ｂ３２４＋ｐＴ２１２／ｐＴ２１７タウペプチド相互作用の全体的な構造を図１１に示す。ｐＴ２１２／ｐＴ２１７−タウペプチドは、Ｂ３２４  ＶＨ及びＶＬの界面に形成した溝に合致する。Ｂ３２４とｐＴ２１２／ｐＴ２１７タウペプチドとの界面には、ファン・デル・ワールス及び静電相互作用が含まれ、これらはペプチド残基２１１から２２１まで延びる（図１２）。以下のＣＤＲが、ｐＴ２１２／ｐＴ２１７−タウペプチドへの直接結合に関与する：ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ３。ｐＴ２１２／ｐＴ２１７タウペプチドと複合体化したＢ３２４の構造は、エピトープが、ｐＴ２１２及びｐＴ２１７のホスフェートを含むことを示す。Ｂ３２４  Ｆａｂ残基と、ｐＴ２１２／ｐＴ２１７−タウペプチド残基との相互作用図を、図１３に示す。鍵となる相互作用のいくつかは、以下のとおりである：ＶＨ  Ｙ３２ヒドロキシル基と、ＶＨ  Ｔ２８ヒドロキシル基とが、各々、ｐＴ２１２の異なるホスフェート酸素と水素結合を形成する；ＶＨ  Ｙ３２とＶＨ  Ｗ９９の側鎖からは、タウペプチドのＬ２１５のメチル基に疎水性相互作用が存在する；ＶＨ  Ｋ５３は、タウペプチドの残基ｐＴ２１７と塩橋相互作用を形成する；ＶＨ  Ｗ１０４の側鎖は、ｐＴ２１７のメチル基と疎水性相互作用を、及びＰ２１８とＣＨ−πスタッキング相互作用を形成し、ＶＨ／ＶＬ界面の一部を形成する；ＶＨ  Ｗ１０４のインドールアミドは、Ｔ２２０の側鎖ヒドロキシルと水素結合を形成する；ＶＬ  Ｙ３２の側鎖とＰ２１９との間には、疎水性相互作用が存在する；ＶＬ  Ｌ９６と、Ｔ２２０のメチル基との間には、疎水性相互作用が存在する；並びに、ＶＬ  Ｆ９４の側鎖とＴ２２０のメチル基とにより疎水性相互作用が形成される。ｐＴ２１２及びｐＴ２１７のホスフェートとの静電相互作用は、ホスホ−タウに対するＢ３２４の選択性に決定的なものであり、疎水性相互作用は更に、ｐＴ２１２／ｐＴ２１７−タウペプチド（実施例５）及びＰＨＦ−タウ（実施例６）に対するＢ３２４の高親和性に寄与する。マウスＰＴ３とＢ３２４との、エピトープ及びパラトープは非常に類似しており、このことは、エピトープ及びパラトープのいずれもが、ヒト化の後に有意に変化していないことを示す（図９及び図１３、表８及び表１５）。
【０２１４】
表１５：Ｂ３２４＋ｐＴ２１２／ｐＴ２１７−タウペプチドのエピトープ及びパラトープ。ｐＴ２１２／ｐＴ２１７−タウペプチド残基と相互作用するＢ３２４  ＶＨ又はＶＬの残基を示す。水素結合相互作用を太字の活字で示す。
【０２１５】
【表１５】
2020513804.tif 000018
【０２１６】
実施例８−細胞アッセイにおける機能試験
２種類の細胞アッセイ：同時培養アッセイ及び枯渇アッセイにおける、タウシーディングの阻害についてＰＴ３を試験した。両方のアッセイ種において、例えば凝集により非常に近接した際にシグナルを生成する、２つの発色団タグＫ１８タウフラグメントを発現するＨＥＫ細胞を使用する。細胞を、凝集してリン酸化した、異なる源由来の完全長タウのシードで処理した場合、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）比の変化（すなわち、ＢＲＥＴアッセイ）により、又は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を用いた、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）陽性細胞の数を数えること（すなわち、ＦＲＥＴアッセイ；図１４）により、定量化可能なＫ１８アグリゲートが生じる（Ｈｏｌｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，ＰＮＡＳ  １１１（４１）：Ｅ４３７６−８５）。
【０２１７】
ＨＥＫ細胞ホモジェネート同時培養アッセイ（ＢＲＥＴアッセイ）
同時培養用のタウシードを含有するホモジェネートを、Ｋ１８により誘発された、凝集ＧＦＰタグ完全長タウを含有する安定したＧＦＰ−タウＰ３０１Ｌ過剰発現ＨＥＫ細胞株から生成した。レシピエント細胞は、Ｋ１８／Ｐ３０１Ｌ−ＮａｎｏＬｕｃ及びＫ１８／Ｐ３０１Ｌ−ＨａｌｏＴａｇを安定して発現するＨＥＫ細胞であった。タウシードを、試験抗体、及び受容する発色団−Ｋ１８含有ＨＥＫ細胞と、７２時間同時培養した。Ｋ１８アグリゲート形成を、ＢＲＥＴ比（５９０ｎｍ／４５０ｎｍ）の変化により測定した。ＰＴ３は、凝集の誘発を３００ｎＭにおいて４６．９７％、３０ｎＭにおいて１８．０２％、及び３ｎＭにおいて１２．５７％ブロックした（図１５）。
【０２１８】
脊髄同時培養アッセイ（ＦＲＥＴアッセイ）
凝集トランスジェニックヒトタウを含有する、週齢２２〜２３のＰ３０１Ｓの脊髄から、同時培養用のタウシードを含有するホモジェネートを生成した。感度の増加のために、このアッセイで使用したレシピエント細胞は、Ｋ１８／Ｐ３０１Ｓ−ＹＦＰ及びＫ１８／Ｐ３０１Ｓ−ＣＦＰを安定して発現するＨＥＫ細胞であった。タウシードを、試験抗体、及び受容する発色団−Ｋ１８含有ＨＥＫ細胞と、７２時間同時培養した。Ｋ１８アグリゲート形成を、ＦＡＣＳによりＦＲＥＴ陽性細胞の数を数えることにより測定した。ＰＴ３は、凝集の誘発を３００ｎＭにおいて３４．０３％、３０ｎＭにおいて３７．０２％、及び３ｎＭにおいて３０．６８％ブロックした（図１６）。
【０２１９】
免疫枯渇細胞アッセイ
最大阻害割合（％）の値が、シードのエピトープの密度、又はＰＴ３エピトープを含有するシードの数に関係するか否かを調査するために、免疫枯渇アッセイを実施した。免疫枯渇アッセイにおいて、タウシードを試験抗体により培養（インキュベーション）し、Ｇタンパク質のビーズを用いて溶液から除去した。枯渇した上清を、発色団−Ｋ１８含有ＨＥＫ細胞内での残留シーディング能力について試験し、上述したようにＦＡＣＳにより分析した（Ｈｏｌｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１１１（４１）：Ｅ４３７６−８５，２０１４）。
【０２２０】
免疫枯渇のためのタウシードを含有するホモジェネートを、週齢２２〜２３のＰ３０１Ｓトランスジェニック動物の脊髄から（図１７）、又は、冷凍保護したヒトＡＤ脳組織から（図１８）生成した。ヒトＡＤ脳免疫枯渇アッセイにおいて、トランスフェクション試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００の存在下において、枯渇後に上清を試験紙、許容されるアッセイウィンドウを得た。脊髄抽出物、及びヒトＡＤ脳の全ホモジェネートの両方において、ＰＴ３を用いてタウシーディングをほぼ完全に（＞９０％）枯渇することができた（図１７及び１８）。
【０２２１】
結果
ＰＴ３は、ＨＥＫ細胞可溶化物、及びＴｇＰ３０１Ｓ脊髄溶解物の両方に由来するタウシードを阻害した。アッセイで得た最大阻害は、異なる抗ホスホ−タウ抗体において、及び異なるシードにおいて変化した（表１６）。観察された、３００ｎＭにおけるＰＴ３に対する阻害値は、ＨＥＫ細胞シードに対しては４６．９７±５．８７％であり、ＴｇＰ３０１Ｓ脊髄抽出物に対しては３４．０３±２．０５％であった。異なる細胞アッセイにおける、ホスホ−タウ抗体に対する異なる最大阻害値により、使用したタウシードのリン酸化状態の違いを示すことができる。ＴｇＰ３０１Ｓ脊髄で生成したタウシードは神経細胞由来のものであり、ＨＥＫ細胞由来のタウシードよりもＰＨＦ−タウに対して類似性が高いことが予想される。このことにより、脊髄抽出物対ＨＥＫ細胞可溶化物に対するホスホ−タウ抗体で観察された、全般的に高い効能を説明することができる。
【０２２２】
脊髄抽出物、及びヒトＡＤ脳の全ホモジェネートの両方において、ＰＴ３によりタウシーディングをほぼ完全に枯渇させることができた。この結果は、脊髄シーディング材料を用いた同時培養実験における完全阻害の欠如が、ＰＴ３エピトープを欠くシードが存在することにより生じたのではなく、シードにおける限定的なエピトープの密度により生じたことを示唆している。
【０２２３】
【表１６】
2020513804.tif 000019
単位は陰性対照の％（パーセント）、異なる実験の平均であり、ａ１６６．６７ｎＭにおける阻害、及びｂ８９．９９ｎＭにおける阻害を除いて、全てのアッセイにおける抗体濃度は３００ｎＭであった。
【０２２４】
タウ抗体治療の作用機序は依然として議論の主題であり、複数の機序が提示されている。小膠細胞による、抗体が媒介する細胞外シードのクリアランスは、１つの優位な作用機序として近年示唆されている（Ｆｕｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２９０（３５）：２１６５２−６２，２０１５  ａｎｄ  ＭｃＥｗａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７，ＰＮＡＳ  １１４：５７４−９）。本文脈では、ヒトの脳に由来するシーディング材料の免疫枯渇が、最も並進的な細胞の結果であると考えることができ、この種の細胞アッセイにおける親マウス抗体ＰＴ３の高い効能は、ＰＴ３のＨＦＡ版が効果的な治療薬であることを示唆している。
【０２２５】
実施例９−ｅＰＨＦ注入モデルにおけるマウスＰＴ３のｉｎ  ｖｉｖｏでの効能
インビボでのタウ抗体の効能を評価するために、脳でタウの病状を示すマウスを、必須のモデルシステムとする（Ｊｕｌｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．８４９：４７３−９１，２０１２）。これらのモデルのいくつかが記載されており、これらは一般的に、３つの群に分けることができる：１）株に応じて、５〜９ヶ月後に重篤な病状を示す変異体により、ＷＴ又は変異体（例えば、Ｐ３０１Ｌ若しくはＰ３０１Ｓ）を過剰発現するタウトランスジェニックマウス（Ａｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２２（２１）：９３４０−５１，２００２；Ｓｃａｔｔｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｅｈａｖ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．２０８（１）：２５０−７，２０１０；Ｔｅｒｗｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２８０（５）：３９６３−７３，２００５；Ｙｏｓｈｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ．５３（３）：３３７−５１，２００７）；２）変異体タウ（例えば、Ｐ３０１Ｌ）を空間時間的に制御して発現するマウス（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒａｉｎ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｂｅｈａｖ．６（４）：６１０−２０，２０１２）、又は凝集後フラグメント（例えば、Ｋ１８）を有するマウス（Ｍｏｃａｎｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２８（３）：７３７−４８，２００８）；並びに３）プラーク及びタウの病状の両方を示す、変異体タウ及びＡＰＰの両方を発現するマウス（Ｏｄｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．１０２（４）：１０５３−６３，２００７）。
【０２２６】
変異体タウを発現するマウスが強い病状を発現する一方で、病状の開始は動物によって変化する可能性があり、検討において変動性を引き起こす。また、細胞の自律神経によるタウ凝集、及び全体のタウ凝集シグナルへの拡散の相対的寄与は、はっきりとしていない。したがって、タウのシーディング及び拡散を効果的に検討するために使用可能なモデル（例えば、ｄｅ  Ｃａｌｉｇｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｎｅｕｒｏｎ．７３（４）：６８５−９７，２０１２；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｄ．）は、価値が高い。ＡＬＺ１７マウス（通常のヒトタウを発現する株）に、異なるタウ異常症に由来する脳のホモジェネートを注射することにより、ヒトの脳におけるタウ異常症に類似するモルホロジーを有して、タウが含まれる形成を誘発することの発見により、このようなモデルの並進的価値は更に強化される。例えば、マウスに、嗜銀顆粒性認知症サンプルの材料を注射することにより、疾病そのものに回転楕円体又はコンマ様構造の特徴を有する沈着がもたらされ、ＡＤ様のタウ病状が、ＡＤ材料を注射したマウスで観察された（Ｃｌａｖａｇｕｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，ＰＮＡＳ  １１０（２３）：９５３５−４０）。
【０２２７】
したがって、タウの凝集後フラグメント、例えば合成Ｋ１８原線維（Ｌｉ  ａｎｄ  Ｌｅｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．４５（５１）：１５６９２−７０１，２００６）、又はヒトＡＤ脳に由来するＰＦＨ−タウシードを、細胞の自律神経による凝集が始まっていない年齢のＰ３０１Ｌトランスジェニックマウスモデルにおける、皮質又は海馬領域に注入した、トランスジェニックＰ３０１Ｌマウス注入モデルが確立された。注入モデルは、タウ拡散の決定的な細胞外シーディング構成成分を再現することを目的としている。注入されるＫ１８又はＰＨＦ−タウシードは、注入部位にてタウ異常症を誘発し、また、接続した反対側の領域において、より軽度に、タウ異常症を誘発する（Ｐｅｅｒａｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ｄｉｓ．７３：８３−９５，２０１５）。このモデルにより、ＡＤ脳由来のＰＨＦ−タウシード又はＫ１８原線維と同時注入した際に、本発明の抗タウ抗体などの抗体の、抗シーディング能力の試験が可能となる（Ｉｂａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３３（３）：１０２４−３７，２０１３；Ｉｂａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．１３０（３）：３４９−６２）。
【０２２８】
トランスジェニックＰ３０１Ｌマウス注射モデルの概略図を図１９に示す。手短かに言えば、死後のＡＤ脳への、サルコシル不溶性画分の皮質注射により、タウ凝集のゆっくりと進行する増加が誘発される。注射された半球では、注射の１ヶ月後に最初のシグナルが測定され、注射の更に３ヶ月後まで進行する。注射の５ヶ月後に、いくつかの動物では、Ｐ３０１Ｌ変異により引き起こされる濃縮の形成が開始される（Ｔｅｒｗｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｉｄ．）。ＡＴ８の染色レベルは、１ヶ月と３ヶ月との間で増加する（図１９Ｃ〜図１９Ｄ、及び図１９Ｅ〜図１９Ｆ）ため、抗体の効能実験を、同時注射の２ヶ月後に分析する。更に、死後のＡＤ脳への、サルコシル不溶性画分の海馬注射が、注射した半球のサルコシル不溶性画分をＭｅｓｏＳｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｉｅｓ（ＭＳＤ）により分析することで測定した、用量依存的なタウ凝集の増加の進行が誘発される（図１９Ｇ）。
【０２２９】
動物治療及び頭蓋内注射
注射の検討のために、Ｐ３０１Ｌ変異を有する最長のヒトタウアイソフォーム（タウ−４Ｒ／２Ｎ−Ｐ３０１Ｌ）（Ｔｅｒｗｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｉｄ．）を発現するトランスジェニックタウ−Ｐ３０１Ｌマウスを、月齢３ヶ月にて手術に使用した。現地の倫理委員会が認可した手順を遵守して、全ての実験を実施した。定位的手術のために、マウスは、モノクローナル抗体の存在下又は不存在下にて、毛皮質（ＡＰ＋２．０、前頂からＭＬ＋２．０、ＤＶ、硬膜から２．７ｍｍ）、又は海馬（ＡＰ−２．０、ＭＬ＋２．０（前頂から）、ＤＶ  １．８ｍｍ（硬膜から））に、３μＬ（速度：０．２５μＬ／分）で、死後ＡＤ組織（富化した対らせん状細線維、ｅＰＨＦ）からサルコシル不溶性ｐｒｅｐの一側性（右半球）注射を受けた。抗体又は生理食塩水の腹腔内（ＩＰ）注射の場合、治療（２０ｍｇ／ｋｇ、２×／週）は頭蓋内注射の１週間前に開始し、マウスを解離のために犠牲にする（頭蓋内注射の２ヶ月後）まで継続した。
【０２３０】
抽出手順
注射した半球のマウス組織の重量を測定し、６体積の均質化緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ７．６））中で均質化した。２７０００×ｇにて２０分間、ホモジェネートを遠心分離にかけ、得られた上清（全ホモジェネート）からアリコートを取り出した後、１％のＮ−ラウロイルサルコシンを添加した。９０分後（９００ｒｐｍ、３７℃）、溶液を再び、１８４０００×ｇにて１時間遠心分離にかけた。上清はサルコシル可溶性画分として保持したが、サルコシル不溶性材料を含有するペレットは、均質化緩衝液中に懸濁させた。
【０２３１】
生化学的分析
被覆抗体（抗ＡＴ８又は全タウ抗体のいずれか）をＰＢＳに希釈（１μｇ／ｍＬ）し、ＭＳＤプレート（ウェル当たり３０μＬ）（Ｌ１５ＸＡ，Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｉｅｓ）にアリコートとし、これらを終夜４℃でインキュベーションした。５×２００μＬのＰＢＳ／０．５％のＴｗｅｅｎ−２０で洗浄した後、プレートをＰＢＳ中の０．１％のカゼインでブロックし、５×２００μＬのＰＢＳ／０．５％のＴｗｅｅｎ−２０で再び洗浄した。サンプル及び標準（共に、ＰＢＳ中の０．１％のカゼインに希釈）を添加した後、プレートを終夜４℃でインキュベーションした。その後、プレートを５×２００μＬのＰＢＳ／０．５％のＴｗｅｅｎ−２０で洗浄し、ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ（商標）がコンジュゲートした検出抗体（ＰＢＳ中の０．１％のカゼイン中）を添加し、６００ｒｐｍで振盪しながら室温で２時間インキュベーションした。最後の洗浄（５×２００μＬのＰＢＳ／０．５％のＴｗｅｅｎ−２０）の後、１５０μＬの２×緩衝液Ｔを添加し、プレートをＭＳＤイメージャで読み取った。死後のＡＤ脳（ｅＰＨＦ）のサルコシル不溶性ｐｒｅｐの１６個の希釈物からなる検量線に対してそのままのシグナルを正規化し、任意の単位（ＡＵ）ｅＰＨＦとして表した。統計分析（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後テストと合わせたＡＮＯＶＡ）を、ＧｒａｐｈＰａｄプリズムソフトウェアで行った。
【０２３２】
結果
皮質同時注射モデルにおけるマウスＰＴ３の活性（図１９）が、４つの独立した検討にて確認された。マウスを表１７に従い末梢投与し、結果を図２０に示す。モデルの更なる改善（図１９Ｄ）により、表１８に示すように、ｅＰＨＦ−タウの用量及び同時注射される抗体の用量の低下が可能となった（結果を図２１に示す）。ｅＰＨＦ−タウのこの低下させた用量を用いることにより、末梢投与した際に、ＰＴ３は凝集したタウを低下させる有意な効果を有することもまた、発見された（Ｐ＜０．０００１；図２１）。
【０２３３】
【表１７】
2020513804.tif 000020
【０２３４】
【表１８】
2020513804.tif 000021
【０２３５】
図１９Ａのレイアウトに従い、ＰＴ３ーＨＦＡ  ＩｇＧ２ａ多様体（ｍＩｇＧ２ａ／κ定常領域に、可変領域ＶＨ９２（配列番号：２７）及びＶＬ７７（配列番号：３１）を含有する）を含む、ｅＰＨＦ及びＰＴ３アイソタイプの同時注射により、Ｐ３０１Ｌマウスにおける、ｅＰＨＦにより誘発されたタウ凝集が弱まった（図２２）。毛皮質に注射を行った。（海馬ではない）。注射を受けた半球（生化学データ、図２２Ｂ）、及び注射を受けていない半球（ＩＨＣＡＴ１００染色、図２２Ｃ）において、効果を観察した。ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ１アイソタイプでは共に、ＡＤ脳由来のＰＨＦ−タウを同時注射したとき、タウ異常症の誘発が有意に低下した（ｐ＜０．０００１）。結果により、反対側の半球にてＩＨＣが確認された。
【０２３６】
以上、本発明を詳細に、かつその具体的な実施形態を参照して説明したが、当業者には、発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、本発明に様々な変更及び改変を行い得る点は明らかであろう。
【０２３７】
実施例１０−ＰＳＰタウとＡＤタウとの比較
進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）は、パーキンソン症候群、体位の不安定性及び転倒、核上性注視麻痺、並びに認知症を特徴とする、希少かつ致死性の神経変性疾患である（Ｓｔｅｅｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９６４，Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  １０：３３３−３５９）。病理学的には、脳幹及び大脳基底核、並びに他の脳領域に、４リピート（４Ｒ）タウの選択的蓄積が存在する（Ｄｉｃｋｓｏｎ  ＤＷ．Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ２００８；８９：４８７−４９１；Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｌｅｅｓ，２００９，Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ８：２７０−２７９）。アミロイドなどの他の病状の不存在を考慮すると、ＰＳＰは一次性タウ異常症であると考えられ、動物モデルデータは、ＰＳＰタウが、ＡＤにて生じていると仮説が立てられているものに類似しているシーディングを受け得ることを示唆している（Ｃｌａｖａｇｕｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．．２０１３，ＰＮＡＳ  １１０：９５３５−９５４０；Ｓａｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｎｅｕｒｏｎ  ８２：１２７１−１２８８）。そのため、ＰＳＰは本発明の抗体で治療することができる。一連の実験を行い、ＰＳＰタウとＡＤ  ＰＨＦタウとの類似性を特性決定した。
【０２３８】
方法
ヒト脳組織：臨床診断を受けたＰＳＰ（ｎ＝５）患者（核尾状核＝ＣＡＵ、及び被殻＝ＰＵＴ）の、典型的には非常に影響を受けている２つの脳領域、並びに、さほど影響を受けていない脳領域（上前頭回＝ＧＦＳ）、並びに、２つの対照（＝タウ異常症を有しない）患者の同一の脳領域の凍結保存組織を、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄ  Ｂｒａｉｎ  Ｂａｎｋから入手した。後述する凝集アッセイ及び免疫組織化学染色の両方を用いる分析のために、組織を使用した。９名の散発性ＡＤ患者の凍結保存組織をＵｎｉｖｕｌｅｒｓｈｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａから入手し、凝集アッセイを用いる分析のために使用した。１名のＡＤ患者の凍結保存組織をＵｎｉｖｕｌｅｒｓｈｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｅｗｃａｓｔｌｅから入手し、免疫組織化学染色に使用した。
【０２３９】
脳組織の均質化：凍結保存組織を、１０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．４）、フィルターで均質化し、０，２２μｍ＋ＣｏｍｐｌｅｔｅミニＥＤＴＡ非含有プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１１  ８３６  １７０  ００１）を、ダウンス型ホモジナイザーで１０００ｒｐｍにて１０ストロークし、１０％  ｗ／ｖのホモジェネートを得た。ホモジェネートを２７．０００×ｇ、１０分、４℃にて遠心分離にかけ、上清を、使用するまでー８０℃でアリコートに保管した。
【０２４０】
凝集アッセイ：ホスホ−タウ抗体ＡＴ８及びＰＴ３を捕捉及び検出抗体として使用する、凝集特異的サンドイッチＭＳＤイムノアッセイを実施した。被覆抗体をＰＢＳ（１μｇ／ｍＬ）に希釈し、ＭＳＤプレート（ウェル当たり３０μＬ）（Ｌ１５ＸＡ，Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｉｅｓ）にアリコートとし、４℃にてインキュベーションした。５×２００μＬのＰＢＳ／０．５％のＴｗｅｅｎ−２０で洗浄した後、プレートをＰＢＳ中の０．１％のカゼインでブロックし、５×２００μＬのＰＢＳ／０．５％のＴｗｅｅｎ−２０で再び洗浄した。サンプル及び標準（共に、ＰＢＳ中の０．１％のカゼインに希釈）を添加した後、プレートを４℃にてインキュベーションした。その後、プレートを５×２００μＬのＰＢＳ／０．５％のＴｗｅｅｎ−２０で洗浄し、ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ（商標）がコンジュゲートした検出抗体（ＰＢＳ中の０．１％のカゼイン中）を添加し、６００ｒｐｍで振盪しながら室温で２時間インキュベーションした。最後の洗浄（５×２００μＬのＰＢＳ／０．５％のＴｗｅｅｎ−２０）の後、１５０μＬの２×緩衝液Ｔを添加し、プレートをＭＳＤイメージャで読み取る。そのままのシグナルを、１つのＡＤ全脳ホモジェネートの７つの希釈物からなる検量線に対して正規化し、この検量の補間値として、割合（％）で表す。
【０２４１】
免疫組織化学法：凍結保存したヒト脳組織を冷凍切片（２０μｍの厚さ）にスライスし、使用前に−８０℃で保管した。切片を乾燥させ、続いてホルマリン固定、内因性ペルオキシダーゼの３％過酸化水素（ＤＡＫＯ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ，Ｓ２０２３）でのブロッキング、及びＰＢＳ１ｘ＋０．３％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００での１時間の易透化を続けた。一次抗体（０．４μｇのＰＴ３／ｍＬ；０．４μｇ／ｍＬのＡＴ８）を、バックグラウンドの還元構成成分（ＤＡＫＯ，Ｓ３０２２）で抗体希釈液に希釈し、切片に１時間適用した。広範囲を洗浄した後、ＨＲＰがコンジュゲートした抗マウス二次抗体（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ，ＤＡＫＯ，Ｋ４０００）、続いて色原体ＤＡＢ標識（ＤＡＫＯ，Ｋ４３６８）により、スライドをインキュベーションした。スライドをヘマトキシリンで対比染色し、無水化して有機固定培地（Ｖｅｃｔａｍｏｕｎｔ，Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ，ＵＳＡ，Ｈ−５０００）で固定した。イメージングを、Ｈａｍａｍａｔｓｕ  ＮａｎｏＺｏｏｍｅｒ  ２．０  ｒｓ（浜松ホトニクス（静岡））で実施した。
【０２４２】
結果
凝集アッセイ：凝集アッセイを実施して、ＰＳＰタウのリン酸化度を特定決定した。ＰＴ３反応性アグリゲートはＰＳＰ脳の中に存在したが、凝集度はＡＤ脳よりも低かった（図２３）。参照抗体ＡＴ８を用いて得た結果は、ＰＴ３を用いて観察されたものに類似していた。これらの結果は、様々なホスホ−タウ抗体を使用して評価した全てのリン酸化部位がＰＳＰタウに存在するものの、ＡＤと比較して、ＰＳＰにはよりわずかしかタウ凝集が存在していないことを示唆している。
【０２４３】
免疫組織化学法：ＡＤ又はＰＳＰ脳の凍結切片にて、ＰＴ３抗体により染色することによって、解剖学的領域（すなわち、尾状核及び被殻）における染色は、ＰＳＰに影響を与えたことを示した（図２４）。タウ＋ニューロン及び房飾星状細胞を含むＰＳＰの、神経病理学的特徴は、ホスホ−タウ抗体ＰＴ３により検出された。ＡＴ８を用いて得られた結果は、ＰＴ３を用いて観察されたものに類似していた。
【０２４４】
結論
利用可能なデータは、ＰＴ３がＰＳＰのタウに結合することを示唆している。
【０２４５】
実施例１１−ＰＴ３−ＨＦＡの親和性成熟
親和性成熟した抗体の，ＰＨＦ−タウへのＳＰＲ結合の特性決定
親和性成熟したモノクローナル抗体を、アルツハイマー病の脳から単離したＰＨＦ−タウへの結合について試験した。３ｍＭのＥＤＴＡ、及び０．００５％のＴｗｅｅｎ  ２０をランニング又はシステム緩衝液として補充したＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いて、２５℃にてＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６  ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して、結合反応速度及び親和性検討を実施した。
【０２４６】
アミンカップリング化学用の、供給元が推奨する手順を用いて、マウス抗タウ抗体であるＨＴ７（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，カタログ番号ＭＮ１０００）により、ＧＬＣセンサチップを共有結合により固定化した（約５０００応答単位（ＲＵ））。カップリング緩衝液は１０ｍＭ（ｐＨ４．５）の酢酸ナトリウムであった。ＰＨＦ−タウを、５０００×ｇにて５℃で１０分間、２回遠心分離することにより調製した。２回目の遠心分離での上清をランニング緩衝液に希釈させ（１／１２５）、ＨＴ７固定化表面に捕捉カップリングした（約３００ＲＵ）。捕捉カップリングの後、表面を活性化及び不活性化して、抗体結合検討用の均質なＰＨＦ−タウ表面を生成した。抗タウ抗体及びこれらのＦａｂ（ランニング緩衝液にて調製、０．０２４〜７５ｎＭ、５倍希釈）を、ＰＨＦ−タウ表面にわたり５０μＬ／分で注入し、結合を測定した。会合及び解離プロファイルをそれぞれ、４分間及び２時間モニタリングした。解離後、１０ｍＭのグリシン（ｐＨ２．０）及びランニング緩衝液の複数回注入を用いて、センサチップを再生した。参照表面（ＰＨＦ−タウを全く有しない）を使用して、注入したｍＡｂ又はＦａｂの非特異的結合をモニタリングした。ＨＴ７抗体を陽性対照として使用した。ｍＡｂに対する結合のセンサーグラムを、二価の結合モデルを使用して合致させ、ここでは、見かけの親和性又は結合活性により引き起こされる結合（ＫＤ）は、解離速度と会合速度との比（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）として報告された。１：１ラングミュア結合モデルを、Ｆａｂの反応速度論的分析に使用した。
【０２４７】
親ヒト抗体（Ｂ２９６）は、ＰＨＦ−タウに対して強力な結合（ＫＤ＝６．２ｐＭ）を示し、非常に遅い解離速度が支配的であり、ｍＡｂの５％以下の解離が２時間にわたって観察された（表１９、図２５）。親和性成熟した抗体は、１．８〜２．５ｐＭの範囲で親和性を有してＰＨＦ−タウに結合するという改善を示した。Ｂ７１１及びＢ８０９は、親抗体と比較して会合速度に３倍の改善を示したが、解離速度は、全ての抗体においての目視での区別はできなかった（図２５）。Ｆａｂは全体的に、対応するｍＡｂと比較してＰＨＦ−タウに対して桁違いに弱い結合を示し、このことにより、ｍＡｂのＰＨＦ−タウへの、結合活性により引き起こされる結合が示唆された。Ｂ３２４（親ｍＡｂであるＢ２９６のＦａｂ）は、６３．２ｐＭの固有の親和性でＰＨＦ−タウに結合した。親和性成熟したｍＡｂのＦａｂは、１５．６ｐＭ〜３１ｐＭの範囲の値を有し、同様に親和性の改善を示した。２つのＦａｂであるＢ３３０（Ｂ７１１のＦａｂ）、及びＢ３３２（８０９のＦａｂ）は更に、会合速度において、対応するｍＡｂと同様の、３〜４倍の改善を示した。
【０２４８】
【表１９】
2020513804.tif 000022
１実験において、Ｎ＝２〜３の複製物。値は平均±ＳＤ（又は範囲）として報告した
【０２４９】
ＥＬＩＳＡによるホスホペプチドへの結合
ペプチド（１０ｎｇ／ｍＬ）をプレートに終夜直接コーティングしたＥＬＩＳＡにより、タウホスホペプチドの結合を分析した。プレートを洗浄し、ＰＢＳ中の０．１％のカゼインでブロックした後、異なる濃度のＨＦＡ−ＰＴ３（Ｂ２９６）並びにＨＦＡ−ＰＴ３の親和性成熟多様体（Ｂ８０９、Ｂ３３３、及びＢ７１１）ｍＡｂで、プレートをインキュベーションした（図２６Ａ）。抗体とのインキュベーションの後、プレートを洗浄して、ウェル当たり５０μＬのＨＲＰＯで、抗Ｆａｂ抗体を標識した（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（ブロッキング緩衝液中に１：１００００に希釈）。別の洗浄ステップの後、メーカーの取扱説明書に従い、「ワンステップ」ＴＭＢ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、検出を実施した。ＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）２１０２  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）でプレートを分析した。結合曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ７．０ソフトウェアを使用して生成した。図２６Ａの結合曲線から、Ｂ２９６は最も低い親和性を示した一方で、Ｂ７１１はＢ２９６と、またＢ３３３及びＢ８０９とも比較して、最も強い結合を示したことを知ることができる。これにより、Ｂ７１１は、ｐＴ２１７ペプチドに対して最も強い親和性を有するヒト化ＰＴ３であることが示唆される。Ｆａｂを用いる同様の実験（図２６Ｂ）により、Ｍ３３３（Ｂ７１１のＦａｂ）は、親ＰＴ３分子のＦａｂであるＢ１８７と比較して、同様のペプチド結合を有したことが示された。ここでも、Ｍ３２４（Ｂ２９６のＦａｂ、ＨＦＡ−ＰＴ３）は、ＰＴ３−ＨＦＡの親Ｆａｂ及び親和性成熟した多様体と比較して弱い結合を示した。
【０２５０】
【表２０】
2020513804.tif 000023
少なくとも２つの実験にて、Ｎ＝２の複製物である。値は平均±ＳＤとして報告した。
【０２５１】
参考文献
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Ｃｌａｖａｇｕｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１１０（２３）：９５３５−４０，２０１３
Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｊｅｃｔ，Ｎｕｍｂｅｒ  ４，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．５０（Ｐｔ  ５）：７６０−３，１９９４
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Ｅｍｓｌｅｙ  ａｎｄ  Ｃｏｗｔａｎ，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．６０（Ｐｔ  １２  Ｐｔ  １）：２１２６−３２，２００４
Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６，Ｇ．Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｅｄ．（１９９６）
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Ｇｏｅｄｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊ．３０１（Ｐｔ３）：８７１−８７７
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Ｋｒｅｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２５４：６７−８４，２００１
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Ｏｔｖｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ．３９（６）：６６９−７３，１９９４
Ｐａｄｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９−９８，１９９１
Ｐｅｅｒａｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ｄｉｓ．７３：８３−９５，２０１５
Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．８６：１００２９−３３，１９８９
Ｓｃａｔｔｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｅｈａｖ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．２０８（１）：２５０−７，２０１０
Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１１（１）：９−２５，２０１６
Ｓｅｕｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７０（３２）：１８９１７−２２，１９９５
Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．３９７：３８５−９６，２０１０
Ｓｔｒｏｈｌ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：６８５−９１，２００９
Ｔｅｒｗｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２８０（５）：３９６３−７３，２００５
Ｗｉｓｃｈｉｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．８５：４８８４−８，１９８８
Ｗｕ  ａｎｄ  Ｋａｂａｔ，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１３２：２１１−５０，１９７０
Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１６：７６１−７０，２００３
Ｙｏｓｈｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ．５３（３）：３３７−５１，２００７
Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ．６７（２）：１８２−９，２００９
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年10月21日(2019.10.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
【表２】
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【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
2020513804.tif 000066
2020513804.tif 000067
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