(57)【要約】  本明細書に記載されるテクノロジーは、修飾されたＴ細胞及び免疫療法におけるその使用に関する。様々な例において、Ｔ細胞は、ＣＤ３ζ、ＴＲＡＣ、及び／若しくはＴＲＢＣ発現を減少するか、又は除去するように修飾されている。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ３ζ、Ｔ細胞受容体アルファ鎖（ＴＲＡＣ）、及び／若しくはＴ細胞受容体ベータ鎖（ＴＲＢＣ）遺伝子の低減した又は除去された発現に起因して、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の低減した又は除去された発現を有するよう修飾された、単離されたＴリンパ球。
【請求項２】
ＣＤ３ζ、ＴＲＡＣ及び／若しくはＴＲＢＣ遺伝子、制御配列、コード配列、エクソン、又はその部分が変異し、低減した、ヌル、又は非機能的ＣＤ３ζ、ＣＤ３エータ、ＣＤ３シータ、ＴＲＡＣ及び／又はＴＲＢＣ発現を生じるゲノムを含む、請求項１に記載の単離されたＴリンパ球。
【請求項３】
変異が、欠損及び／又はフレームシフト変異である、請求項２に記載の単離されたＴリンパ球。
【請求項４】
変異が、Ｔ細胞受容体又はＣＤ３ζシグナル伝達のアセンブリを破壊する、請求項２に記載の単離されたＴリンパ球。
【請求項５】
ＣＤ３ζ、ＴＲＡＣ、及び／又はＴＲＢＣ遺伝子が欠損しているゲノムを含む、請求項１に記載の単離されたＴリンパ球。
【請求項６】
ＣＤ３ζ、ＴＲＡＣ、及び／又はＴＲＢＣ遺伝子の２個の対立遺伝子が欠損しているゲノムを含む、請求項５に記載の単離されたＴリンパ球。
【請求項７】
ＣＤ３ζ、ＴＲＡＣ、及び／又はＴＲＢＣ遺伝子の低減した発現が、ヌル発現である、請求項１に記載の単離されたＴリンパ球。
【請求項８】
ＣＤ３エータ又はＣＤ３シータの低減した発現を有する、請求項１に記載の単離されたＴリンパ球。
【請求項９】
ＨＬＡ遺伝子座、又はその部分が、欠損している、請求項１に記載の単離されたＴリンパ球。
【請求項１０】
ＨＬＡ遺伝子座が、染色体６上にある、請求項９に記載の単離されたＴリンパ球。
【請求項１１】
減少したＨＬＡクラスＩ発現をさらに有する、請求項１に記載の単離されたＴリンパ球。
【請求項１２】
単離されたＴリンパ球が、ＨＬＡ−Ｇを発現するようさらに修飾された、請求項１に記載の単離されたＴリンパ球。
【請求項１３】
Ｔリンパ球が投与される宿主からの免疫攻撃の回避においてＴリンパ球を促進する異種性タンパク質をコードする遺伝子をさらに含む、請求項１に記載の単離されたＴリンパ球。
【請求項１４】
異種性タンパク質が、Ｔ細胞又はＮＫ介在性拒絶の回避を促進する、請求項１３に記載の単離されたＴリンパ球。
【請求項１５】
異種性タンパク質が、ウイルスタンパク質である、請求項１３に記載の単離されたＴリンパ球。
【請求項１６】
ウイルスタンパク質が、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、及びウシヘルペスウイルス−１（ＢｏＨＶ−１）からなる群から選択されるウイルス由来である、請求項１５に記載の単離されたＴリンパ球。
【請求項１７】
ウイルスタンパク質が、ＣＭＶ由来であり、ＵＳ６、ＵＬ４０、及びＵＬ１８からなる群から選択される、請求項１６に記載の単離されたＴリンパ球。
【請求項１８】
ウイルスタンパク質が、抗原プロセシングと関連する輸送体（ＴＡＰ）を阻害する、請求項１６に記載の単離されたＴリンパ球。
【請求項１９】
ウイルスタンパク質が、ＣＭＶ  ＵＳ６、ＨＳＶ  ＩＣＰ４７、ＢｏＨＶ−１  ＵＬ４９．５、及びＥＢＶ  ＢＮＬＦ２ａからなる群から選択される、請求項１８に記載の単離されたＴリンパ球。
【請求項２０】
レポーター遺伝子をコードする遺伝子をさらに含む、請求項１に記載の単離されたＴリンパ球。
【請求項２１】
レポーター遺伝子が、切断型上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）遺伝子、切断型前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、切断型低親和性神経成長因子受容体（ＬＮＧＦＲ）、切断型ＣＤ１９を含む、請求項２０に記載の単離されたＴリンパ球。
【請求項２２】
治療タンパク質をコードする遺伝子をさらに含む、請求項１に記載の単離されたＴリンパ球。
【請求項２３】
治療タンパク質が、抗原受容体を含む、請求項２２に記載の単離されたＴリンパ球。
【請求項２４】
抗原受容体が、選択された標的抗原に対する特異性を付与する、請求項２３に記載の単離されたＴリンパ球。
【請求項２５】
抗原受容体が、選択されたリガンドに対する特異性を付与する、請求項２３に記載の単離されたＴリンパ球。
【請求項２６】
抗原受容体が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、請求項２３に記載の単離されたＴリンパ球。
【請求項２７】
ＣＡＲが、細胞外ドメイン、膜貫通型領域ドメイン、及び細胞内領域ドメインを含む、請求項２６に記載の単離されたＴリンパ球。
【請求項２８】
細胞外ドメインが、１本鎖抗体を含み、細胞内ドメインが、Ｔ細胞活性化ドメインを含む、請求項２７に記載の単離されたＴリンパ球。
【請求項２９】
細胞死を誘導する遺伝子をさらに含む、請求項１に記載の単離されたＴリンパ球。
【請求項３０】
遺伝子が、活性化可能な自殺遺伝子である、請求項２９に記載の単離されたＴリンパ球。
【請求項３１】
自殺遺伝子が、薬物により活性化される、請求項３０に記載の単離されたＴリンパ球。
【請求項３２】
自殺遺伝子が、カスパーゼ９アポトーシス促進分子に融合されたＦＫ５０６結合ドメインを発現する、請求項３１に記載の単離されたＴリンパ球。
【請求項３３】
修飾されたＴリンパ球を生成する方法であって、Ｔリンパ球においてＣＤ３ζ、ＴＲＡＣ、及び／又はＴＲＢＣ遺伝子を不活性化することを含む方法。
【請求項３４】
ＣＤ３ζ、ＴＲＡＣ、及び／又はＴＲＢＣ遺伝子の不活性化が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ９系）の群から選択されるヌクレアーゼ又は系を使用して行われる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
修飾されたＴリンパ球が、請求項１に記載の修飾されたＴリンパ球である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
疾患について対象を処置する方法であって、対象に、請求項１に記載の単離されたＴリンパ球を投与することを含む方法。
【請求項３７】
疾患が、がん、感染性疾患、及び移植手法から生じる徴候からなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
対象において免疫原性反応を低減する方法であって、対象に、請求項１に記載のＴリンパ球を投与することを含む方法。
【請求項３９】
Ｔリンパ球が、導入遺伝子を発現する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
Ｔリンパ球が、内在性Ｔ細胞受容体シグナル伝達分子との低減した競合を有する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
Ｔリンパ球が、対象に関して自家である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
Ｔリンパ球が、対象に関して同種である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４３】
修飾されたＴリンパ球が、インビボで拡大される、請求項３６に記載の方法。
【請求項４４】
修飾されたＴリンパ球が、対象の血液において拡大される、請求項３６に記載の方法。
【請求項４５】
修飾されたＴリンパ球が、投与に先立ち、インビトロで拡大される、請求項３６に記載の方法。
【請求項４６】
治療タンパク質及び免疫系回避を促進する異種性タンパク質をコードする遺伝子を含むベクター。
【請求項４７】
異種性タンパク質が、ウイルスタンパク質である、請求項４６に記載のベクター。
【請求項４８】
ウイルスタンパク質が、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、及びウシヘルペスウイルス−１（ＢｏＨＶ−１）からなる群から選択されるウイルス由来である、請求項４７に記載のベクター。
【請求項４９】
ウイルスタンパク質が、ＣＭＶ由来であり、ＵＳ６、ＵＬ４０、及びＵＬ１８からなる群から選択される、請求項４８に記載のベクター。
【請求項５０】
ウイルスタンパク質が、抗原プロセシングと関連する輸送体（ＴＡＰ）を阻害する、請求項４８に記載のベクター。
【請求項５１】
ウイルスタンパク質が、ＣＭＶ  ＵＳ６、ＨＳＶ  ＩＣＰ４７、ＢｏＨＶ−１  ＵＬ４９．５、及びＥＢＶ  ＢＮＬＦ２ａからなる群から選択される、請求項５０に記載のベクター。
【請求項５２】
治療タンパク質が、ＣＡＲである、請求項４６に記載のベクター。
【請求項５３】
請求項４６に記載のベクターをＴリンパ球に形質導入する方法。
【請求項５４】
請求項３３に記載の方法により作製された修飾されたＴリンパ球若しくは細胞株、又はその継代培養物。
【請求項５５】
請求項１に記載の少なくとも１個の修飾されたＴリンパ球を含む薬学的組成物。
【請求項５６】
（ａ）請求項３３に記載の方法により修飾されたＴリンパ球の集団を調製する工程、及び（ｂ）修飾されたＴリンパ球を対象に投与する工程を含む、対象を処置する方法。
【請求項５７】
Ｔリンパ球が、処置されるべき対象に由来する、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
Ｔリンパ球が、健常ドナーに由来する、請求項５６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書に記載されるテクノロジーは、修飾されたＴ細胞及び免疫療法におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
養子Ｔ細胞療法は、がん、感染性疾患、及び自己免疫疾患を含む疾患を処置するための抗原特異的Ｔ細胞の投与を含む。本療法において使用されるＴ細胞は、対象から単離され、所望の既存の特異性について選択され得る。一例として、腫瘍浸潤Ｔリンパ球は、対象から単離され、エクスビボで拡大され、次に、対象におけるがんを処置するために投与され得る。他のアプローチにおいて、Ｔ細胞をエクスビボで修飾して、新たな特異性を有し得る。かかるアプローチの１つの例において、Ｔ細胞をエクスビボで遺伝子的に修飾して、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現させる。ＣＡＲは、選択された標的抗原、ほとんどの場合、腫瘍抗原又は腫瘍関連抗原を発現する標的細胞へと、細胞傷害性Ｔ細胞応答を指向化させる方法をもたらす。ＣＡＲは、抗原結合ドメインが、標的抗原に特異的に結合する抗体の抗原結合ドメインで置き換えられている、Ｔ細胞受容体の適応である。Ｔ細胞上で発現されたＣＡＲ（「ＣＡＲ  Ｔ細胞」又は「ＣＡＲ−Ｔ」）による標的細胞の表面上での標的抗原の結合は、標的細胞の殺傷を促進する。別の例において、Ｔ細胞をエクスビボで遺伝子的に修飾して、新たなＴ細胞受容体を発現させる。
【０００３】
養子Ｔ細胞療法への現在のアプローチは、一般に、自家細胞、すなわち、それらが後に投与されるべきである対象から単離される細胞を利用する。このアプローチは、レシピエントによる投与された細胞の拒絶の可能性を最小にすることに関して有益であり得る。しかしながら、このアプローチの欠点は、専門職員及び設備の必要性、並びに完全に病気であり得る患者から細胞を得て、次に、患者に細胞の処理を待たせることを必要とすることに関連する複雑さを含む。これらの課題を考慮して、養子Ｔ細胞療法においてレシピエントと同じ種の遺伝的に同一でないドナーから得られた同種細胞を使用することが望ましい。これは、必要とされるときに使用するための「普遍的な」Ｔ細胞の生成、保存、及び検証を可能にする。しかしながら、このアプローチは、供与された細胞に対するレシピエントの免疫反応に起因する、それ自体の課題を提示し、それが、細胞の低残留性、免疫適格性の対象における宿主対移植片の作用、及び免疫不全状態の対象における移植片対宿主の作用を含む課題を導き得る。
【０００４】
上で示されたもののような、養子Ｔ細胞療法の既存の方法により提案される課題を解決するための新規アプローチの必要がある。
【発明の概要】
【０００５】
１つの態様において、本発明は、例えば、ＣＤ３ζ、Ｔ細胞受容体アルファ鎖（ＴＲＡＣ）、及び／若しくはＴ細胞受容体ベータ鎖（ＴＲＢＣ）遺伝子の低減した又は除去された発現に起因して、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の低減した或いは除去された発現を有するように修飾された単離されたＴリンパ球を提供する。
【０００６】
１つの実施態様において、単離されたＴリンパ球は、ＣＤ３ζ、ＴＲＡＣ、及び／又はＴＲＢＣ遺伝子、制御配列、コード配列、エクソン、或いはその部分が変異し、低減した、ヌル、若しくは非機能的ＣＤ３ζ、ＣＤ３エータ、ＣＤ３シータ、ＴＲＡＣ、及び／若しくはＴＲＢＣ発現を生じるゲノムを含む（例えば、フレームシフト変異のような、欠損を含む）。
【０００７】
１つの実施態様において、変異は、Ｔ細胞受容体又はＣＤ３ζシグナル伝達のアセンブリを破壊する。
【０００８】
１つの実施態様において、単離されたＴリンパ球は、ＣＤ３ζ、ＴＲＡＣ、及び／又はＴＲＢＣ遺伝子が欠損されている、ゲノムを有する。
【０００９】
１つの実施態様において、単離されたＴリンパ球は、ＣＤ３ζ、ＴＲＡＣ、及び／又はＴＲＢＣ遺伝子のうちの２個の対立遺伝子が、欠損されている、ゲノムを有する。
【００１０】
１つの実施態様において、ＣＤ３ζ、ＴＲＡＣ、及び／又はＴＲＢＣ遺伝子の低減した発現は、ヌル発現である。
【００１１】
１つの実施態様において、単離されたＴリンパ球は、低減した発現のＣＤ３エータ又はＣＤ３シータをさらに有する。
【００１２】
１つの実施態様において、単離されたＴリンパ球は、ＨＬＡ遺伝子座（例えば、ヒトにおいて、例えば、染色体６上のＨＬＡ遺伝子座）若しくはその部分の欠損又は変異をさらに有する。
【００１３】
１つの実施態様において、単離されたＴリンパ球は、減少したＨＬＡクラスＩ発現をさらに有する。
【００１４】
１つの実施態様において、単離されたＴリンパ球は、ＨＬＡ−Ｇを発現するようにさらに修飾されている。
【００１５】
１つの実施態様において、単離されたＴリンパ球は、Ｔリンパ球が投与される宿主からの免疫攻撃（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ介在性拒絶）の回避においてＴリンパ球を促進する異種性タンパク質をコードする遺伝子をさらに含む。
【００１６】
１つの実施態様において、異種性タンパク質は、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、及びウシヘルペスウイルス−１（ＢｏＨＶ−１）からなる群から選択されるウイルス由来のウイルスタンパク質である。
【００１７】
１つの実施態様において、ウイルスタンパク質は、ＣＭＶ由来であり、ＵＳ６、ＵＬ４０、及びＵＬ１８からなる群から選択される。
【００１８】
１つの実施態様において、ウイルスタンパク質は、抗原プロセシングと関連する輸送体（ＴＡＰ）を阻害し、任意選択的に、ＣＭＶ  ＵＳ６、ＨＳＶ  ＩＣＰ４７、ＢｏＨＶ−１  ＵＬ４９．５、及びＥＢＶ  ＢＮＬＦ２ａからなる群から選択される。
【００１９】
１つの実施態様において、単離されたＴリンパ球は、レポーター遺伝子、例えば、切断型上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）遺伝子、切断型前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、切断型低親和性神経成長因子受容体（ＬＮＧＦＲ）、切断型ＣＤ１９を含むレポーター遺伝子をコードする遺伝子をさらに含む。
【００２０】
１つの実施態様において、単離されたＴリンパ球は、治療タンパク質（例えば、任意選択的に、選択された標的抗原又はリガンドに特異性を付与する、抗原受容体）をコードする遺伝子をさらに含む。
【００２１】
１つの実施態様において、抗原受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であり、それは、任意選択的に、細胞外ドメイン、膜貫通型領域ドメイン、及び細胞内領域ドメインを含む。
【００２２】
１つの実施態様において、細胞外ドメインは、１本鎖抗体を含み、任意選択的に、細胞内ドメインは、Ｔ細胞活性化ドメインを含む。
【００２３】
１つの実施態様において、単離されたＴリンパ球は、細胞死を誘導する遺伝子、例えば、活性化可能な自殺遺伝子（例えば、薬物により活性化される自殺遺伝子）である遺伝子をさらに含む。
【００２４】
１つの実施態様において、自殺遺伝子は、カスパーゼ９アポトーシス促進分子に融合されたＦＫ５０６結合ドメインを発現する。
【００２５】
別の態様において、本発明は、修飾されたＴリンパ球（例えば、機能的ＴＣＲの発現を欠くか、又は低減した発現を有するＴリンパ球を生成する方法であって、Ｔリンパ球においてＣＤ３ζ、ＴＲＡＣ、及び／又はＴＲＢＣ遺伝子を不活性化することを含む方法を提供する。
【００２６】
１つの実施態様において、ＣＤ３ζ、ＴＲＡＣ、及び／又はＴＲＢＣ遺伝子の不活性化は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ９系）の群から選択されるヌクレアーゼ又は系を使用して行われる。
【００２７】
１つの実施態様において、修飾されたＴリンパ球は、上で挙げられた実施態様の何れかにおいて記載された修飾されたＴリンパ球である。
【００２８】
別の態様において、本発明は、疾患について対象を処置する方法であって、対象に、上で挙げられた実施態様の何れか一又は複数の単離されたＴリンパ球を投与することを含む方法を提供する。
【００２９】
１つの実施態様において、疾患は、がん、感染性疾患、及び移植手法から生じる徴候からなる群から選択される。
【００３０】
別の態様において、本発明は、対象において免疫原性反応を低減する方法であって、対象に、上で挙げられた実施態様の何れか一又は複数によるＴリンパ球を投与することを含む方法を提供する。
【００３１】
１つの実施態様において、Ｔリンパ球は、導入遺伝子を発現する。
【００３２】
１つの実施態様において、Ｔリンパ球は、内在性Ｔ細胞受容体シグナル伝達分子との低減された競合を有する。
【００３３】
１つの実施態様において、Ｔリンパ球は、対象に関して自家である。
【００３４】
１つの実施態様において、Ｔリンパ球は、対象に関して同種である。
【００３５】
１つの実施態様において、修飾されたＴリンパ球は、インビボで拡大される。
【００３６】
１つの実施態様において、修飾されたＴリンパ球は、対象の血液において拡大される。
【００３７】
１つの実施態様において、修飾されたＴリンパ球は、投与に先立ち、インビトロで拡大される。
【００３８】
別の態様において、本発明は、免疫系回避を促進する治療タンパク質及び異種性タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを提供する。
【００３９】
１つの態様において、異種性タンパク質は、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、及びウシヘルペスウイルス−１（ＢｏＨＶ−１）からなる群から選択されるウイルス由来のウイルスタンパク質である。
【００４０】
１つの実施態様において、ウイルスタンパク質は、ＣＭＶ由来であり、ＵＳ６、ＵＬ４０、及びＵＬ１８からなる群から選択される。
【００４１】
１つの実施態様において、ウイルスタンパク質は、抗原プロセシングと関連する輸送体（ＴＡＰ）を阻害し、例えば、ＣＭＶ  ＵＳ６、ＨＳＶ  ＩＣＰ４７、ＢｏＨＶ−１  ＵＬ４９．５、及びＥＢＶ  ＢＮＬＦ２ａからなる群から選択される。
【００４２】
１つの実施態様において、治療タンパク質は、ＣＡＲである。
【００４３】
別の態様において、本発明は、上で説明された実施態様の一若しくは複数の請求項のベクターの一又は複数をＴリンパ球に形質導入する方法を提供する。
【００４４】
別の態様において、本発明は、上で説明された実施態様の何れか１つの方法により作製された修飾されたＴリンパ球若しくは細胞株、又はその継代培養物を提供する。
【００４５】
別の態様において、本発明は、上で説明された実施態様の何れか一又は複数の少なくとも１つの修飾されたＴリンパ球を含む薬学的組成物を提供する。
【００４６】
別の態様において、本発明は、（ａ）上で説明された実施態様の何れか一又は複数の方法による修飾されたＴリンパ球の集団を調製する工程、及び（ｂ）修飾されたＴリンパ球を対象に投与する工程を含む、対象を処置する方法を提供する。
【００４７】
１つの実施態様において、Ｔリンパ球は、処置されるべき対象由来である。
【００４８】
１つの実施態様において、Ｔリンパ球は、健常ドナー由来である。
【００４９】
本発明はまた、例えば、本明細書に記載される方法（例えば、治療方法）を含む方法において本明細書に記載される修飾されたＴリンパ球の使用、並びに例えば、本明細書に記載される方法において使用するための医薬の調製のための修飾されたＴリンパ球の使用を含む。
【００５０】
上で挙げられた様々な実施態様は、当業者により適当であると決定された、任意の組合せで、互いに組み合わされ得る。
【００５１】
定義
便宜上、明細書、実施例、及び添付の請求の範囲において使用されるいくつかの用語並びに語句の意味が、以下で提供される。別段示されないか、又は文脈から暗に示されていない限り、次の用語及び語句は、以下で提供される意味を含む。定義は、特定の実施態様を記載するのに役立つよう提供され、テクノロジーの範囲は、請求項によってのみ制限されるので、請求されたテクノロジーを制限することは意図されない。別段定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、本テクノロジーが属する当該技術分野における当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。当該技術分野における用語の使用と本明細書におけるその定義の間に明らかな食い違いが存在するなら、明細書内で提供される定義が優先する。
【００５２】
免疫学及び分子生物学における一般的な用語の定義は、Ｍｅｒｃｋ  Ｓｈａｒｐ  ＆  Ｄｏｈｍｅ  Ｃｏｒｐ．により２０１１年に出版された、Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ、第１９編（ＩＳＢＮ  ９７８−０−９１１９１０−１９−３）；Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．により１９９９−２０１２年に出版された、Ｒｏｂｅｒｔ  Ｓ．  Ｐｏｒｔｅｒ等（編）、Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＩＳＢＮ９７８３５２７６００９０８）；及びＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．により１９９５年に出版された、Ｒｏｂｅｒｔ  Ａ．  Ｍｅｙｅｒｓ（編）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（ＩＳＢＮ１−５６０８１−５６９−８）；Ｅｌｓｅｖｉｅｒにより２００６年に出版された、Ｗｅｒｎｅｒ  ＬｕｔｔｍａｎｎによるＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｋｅｎｎｅｔｈ  Ｍｕｒｐｈｙ、Ａｌｌａｎ  Ｍｏｗａｔ、Ｃａｓｅｙ  Ｗｅａｖｅｒ（編）、Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、２０１４年（ＩＳＢＮ  ０８１５３４５３０５、９７８０８１５３４５３０５）；Ｊｏｎｅｓ  ＆  Ｂａｒｔｌｅｔｔ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓにより２０１４年に出版されたＬｅｗｉｎ’ｓ  Ｇｅｎｅｓ  ＸＩ（ＩＳＢＮ−１４４９６５９０５５）；Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｇｒｅｅｎ及びＪｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第４編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、ＵＳＡ（２０１２年）（ＩＳＢＮ１９３６１１３４１４）；Ｄａｖｉｓ等、Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、米国（２０１２年）（ＩＳＢＮ０４４４６０１４９Ｘ）；Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ、Ｊｏｎ  Ｌｏｒｓｃｈ（編）Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、２０１３年（ＩＳＢＮ０１２４１９９５４２）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＣＰＭＢ）、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌ（編）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、２０１４年（ＩＳＢＮ０４７１５０３３８Ｘ、９７８０４７１５０３３８５）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＣＰＰＳ）、Ｊｏｈｎ  Ｅ．  Ｃｏｌｉｇａｎ（編）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、２００５年；並びにＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（ＣＰＩ）（Ｊｏｈｎ  Ｅ．  Ｃｏｌｉｇａｎ、ＡＤＡ  Ｍ  Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ、Ｄａｖｉｄ  Ｈ  Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ、Ｅｔｈａｎ  Ｍ  Ｓｈｅｖａｃｈ、Ｗａｒｒｅｎ  Ｓｔｒｏｂｅ（編）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、２００３年（ＩＳＢＮ０４７１１４２７３５、９７８０４７１１４２７３７）において見られ、それらの内容は、それらの全体が出典明示により本明細書に全て援用される。
【００５３】
用語「減少する」、「低減した」、「低減」、又は「阻害する」は、全て、統計上有意な量での減少を意味するために本明細書において使用される。いくつかの実施態様において、「低減する」、「低減」又は「減少する」又は「阻害する」は、典型的には、参照レベル（例えば、規定の処置、薬剤、変異、又は欠損の不存在）と比較して少なくとも１０％での減少を意味し、例えば、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％以上での減少を含み得る。本明細書において使用される、「低減」又は「阻害」は、参照レベルと比較して完全な阻害又は低減を包含しない。「完全な阻害」は、参照レベルと比較して１００％の阻害である。適用できる場合、減少は、好ましくは、規定の障害を有さない個体についての正常な範囲内として許容されるレベルまで下げられ得る。
【００５４】
用語「増大した」、「増大させる」、「増強する」、又は「活性化する」は、全て、統計上有意な量での増大を意味するために本明細書において使用される。いくつかの実施態様において、用語「増大した」、「増大させる」、「増強する」、又は「活性化する」は、参照レベルと比較して少なくとも１０％の増大、例えば、参照レベルと比較して少なくとも約２０％、若しくは少なくとも約３０％、若しくは少なくとも約４０％、若しくは少なくとも約５０％、若しくは少なくとも約６０％、若しくは少なくとも約７０％、若しくは少なくとも約８０％、若しくは少なくとも約９０％の増大、又は１００％以下の増大若しくは１０−１００％の任意の増大、或いは参照レベルと比較して少なくとも約２倍、若しくは少なくとも約３倍、若しくは少なくとも約４倍、若しくは少なくとも約５倍、若しくは少なくとも約１０倍の増大、又は２倍から１０倍以上の任意の増大を意味し得る。マーカー又は症状の文脈において、「増大」は、かかるレベルにおける統計上有意な増大である。
【００５５】
本明細書において使用される、「対象」は、ヒト又は動物を意味する。通常、動物は、霊長類、げっ歯類、家畜又は狩猟動物のような脊椎動物である。霊長類は、例えば、チンパンジー、カニクイザル、クモザル、及びマカク、例えば、アカゲザルを含む。げっ歯類は、例えば、マウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、ウサギ及びハムスターを含む。家畜又は狩猟動物は、例えば、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、バッファロー、ネコ種、例えば、飼育ネコ、イヌ種、例えば、イヌ、キツネ、オオカミ、トリ種、例えば、ニワトリ、エミュー、オーストリッチ、並びに魚、例えば、マス、ナマズ及びサケを含む。いくつかの実施態様において、対象は、哺乳類、例えば、霊長類、例えば、ヒトである。用語「個体」、「患者」及び「対象」は、本明細書において互換的に使用される。
【００５６】
好ましくは、対象は、哺乳類である。哺乳類は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、又はウシであり得るが、これらの例に限定されない。ヒト以外の哺乳類は、疾患、例えば、がんの動物モデルを表す対象として有利に使用され得る。対象は、オス又はメスであることができ、小児又は成人であることができる。
【００５７】
対象は、既に、処置の必要な状態（例えば、白血病又は別の種類のがん、とりわけ、例えば、感染性疾患、自己免疫疾患、若しくは移植の作用）又はかかる状態に関連する一若しくは複数の合併症に罹患しているか或いは有すると診断されたか、或いは同定されたもの、及び任意選択的に、状態又は状態と関連する一若しくは複数の合併症のための処置を既に経験したものであり得る。或いは、対象はまた、かかる状態又は関連する合併症を有すると以前に診断されていないものであり得る。例えば、対象は、状態又は状態と関連する一若しくは複数の合併症についての一或いは複数のリスク因子を示すもの、或いはリスク因子を示さない対象であり得る。
【００５８】
特定の状態のための処置を「必要とする対象」は、その状態を有する、その状態を有すると診断された、又はその状態を発症するリスクのある対象であり得る。
【００５９】
「疾患」は、動物が、ホメオスタシスを維持することができず、疾患が改善されないなら、次に、動物の健康が悪化し続ける、動物、例えば、ヒトの健康状態である。対照的に、動物における「障害」は、動物がホメオスタシスを維持できるが、動物の健康状態が、障害の非存在下にあるよりあまり好ましくない、健康状態である。未処置のままでいると、障害は、必ずしも、動物の健康状態においてさらなる減少を引き起こさない。
【００６０】
本明細書において使用される、用語「腫瘍抗原」及び「がん抗原」を互換的に使用して、がん細胞により異なって発現され、それにより、がん細胞を標的にするために利用され得る抗原を指す。がん抗原は、潜在的に、腫瘍特異的な免疫応答を明らかに刺激し得る抗原である。これらの抗原のいくつかは、正常細胞により必ずしも発現されないが、正常細胞によりコードされる。これらの抗原は、正常細胞において通常サイレントである（すなわち、発現されない）もの、分化のある特定のステージでのみ発現されもの並びに胚及び胎児抗原のような、一時的に発現されるものとして特徴付けられ得る。他のがん抗原は、がん遺伝子（例えば、活性化されたｒａｓがん遺伝子）のような変異細胞遺伝子、抑制遺伝子（例えば、変異ｐ５３）、及び内部の欠損又は染色体転座から生じる融合タンパク質によりコードされる。さらに他のがん抗原は、ＲＮＡ及びＤＮＡ腫瘍ウイルス上に担持されるもののような、ウイルス遺伝子によりコードされ得る。多くの腫瘍抗原は、複数の固形腫瘍：免疫により定義されるＭＡＧＥ１、２、及び３；ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ｇｐ１００、がん胎児抗原（ＣＥＡ）、ＨＥＲ２、ムチン（すなわち、ＭＵＣ−１）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、並びに前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）に関して同定された。加えて、肝炎Ｂ（ＨＢＶ）、エプスタイン・バー（ＥＢＶ）、及びヒトパピローマ（ＨＰＶ）によりコードされるいくつかのようなウイルスタンパク質は、それぞれ、肝細胞癌、リンパ腫、及び子宮頚がんの発症において重要であると示されている。
【００６１】
本明細書において使用される、用語「キメラ」は、少なくとも２種以上の異なるポリヌクレオチド分子の部分の融合の産物を指す。１つの実施態様において、用語「キメラ」は、公知のエレメント又は他のポリヌクレオチド分子の操作を通じて産生される遺伝子発現エレメントを指す。
【００６２】
いくつかの実施態様において、「活性化」は、検出可能な細胞増殖を誘導するために十分に刺激されたＴ細胞の状態を指すことができる。いくつかの実施態様において、活性化は、誘導されたサイトカイン産生を指すことができる。他の実施態様において、活性化は、検出可能なエフェクター機能を指すことができる。少なくとも、本明細書において使用される「活性化されたＴ細胞」は、増殖性Ｔ細胞である。
【００６３】
本明細書において使用される、用語「特異的な結合」及び「特異的に結合する」は、第１の実体が、第２の、標的、実体に、標的でない第３の実体に結合するより高い特異性及び親和性で結合する、２種の分子、化合物、細胞、並びに／又は粒子間の物理的相互作用を指す。いくつかの実施態様において、特異的な結合は、同じ状態下で第３の非標的実体についての親和性より少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍、又はそれ以上高い、第２の標的、実体についての第１の実体の親和性を指すことができる。規定の標的に特異的な試薬は、利用されるアッセイ条件下でその標的についての特異的な結合を示すものである。非限定的な例は、コグネート結合パートナー（例えば、Ｔ細胞上に存在する刺激及び／若しくは共刺激分子）タンパク質を認識し、結合する、抗体、又はリガンドを含む。
【００６４】
本明細書において使用される「刺激リガンド」は、抗原提示細胞（ＡＰＣ、例えば、マクロファージ、樹状細胞、Ｂ細胞、人工ＡＰＣ等）上に存在するとき、Ｔ細胞上のコグネート結合パートナー（本明細書において「刺激分子」又は「共刺激分子」として言及される）と特異的に結合し、これにより、増殖、活性化、免疫応答の開始等を含むが、これらに限定されない、Ｔ細胞による一次応答を仲介し得るリガンドを指す。刺激リガンドは、当該技術分野において周知であり、とりわけ、ペプチド、抗ＣＤ３抗体、スーパーアゴニスト抗ＣＤ２８抗体、及びスーパーアゴニスト抗ＣＤ２抗体をロードされたＭＨＣクラスＩ分子を包含する。
【００６５】
本明細書において使用される用語としての「刺激分子」は、抗原提示細胞上に存在するコグネート刺激リガンドと特異的に結合するＴ細胞上の分子を意味する。
【００６６】
本明細書において使用される用語としての「共刺激リガンド」は、Ｔ細胞上のコグネート共刺激分子に特異的に結合し、これにより、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体のペプチドをロードされたＭＨＣ分子との結合によりもたらされる一次シグナルに加えて、増殖、活性化、分化等を含むが、これらに限定されない、Ｔ細胞応答を仲介する、ＡＰＣ上の分子を含む。共刺激リガンドは、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、誘導可能な共刺激リガンド（ＩＣＯＳ−Ｌ）、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８３、ＨＬＡ−Ｇ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＨＶＥＭ、リンホトキシンベータ受容体、３／ＴＲ６、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、ＨＶＥＭ、Ｔｏｌｌ様受容体に結合するアゴニスト又は抗体、及びＢ７−Ｈ３と特異的に結合するリガンドを含み得るが、これらに限定されない。共刺激リガンドはまた、非限定的に、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、及びＣＤ８３と特異的に結合するリガンドのような、Ｔ細胞上に存在する共刺激分子と特異的に結合する抗体を含み得るが、これに限定されない。
【００６７】
「共刺激分子」は、共刺激リガンドと特異的に結合し、これにより、非限定的に増殖のような、Ｔ細胞による共刺激応答を仲介する、Ｔ細胞上のコグネート結合パートナーを指す。共刺激分子は、ＭＨＣクラスＩ分子、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌ様受容体、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、及びＣＤ８３を含むが、これらに限定されない。
【００６８】
１つの実施態様において、本明細書において使用される用語「修飾された」、「操作された」及びそれらの文法上同等なものは、核酸、例えば、生物のゲノム内の核酸の一又は複数のヒトにより設計された変化を指すことができる。別の態様において、操作されたは、遺伝子の変化、付加、及び／又は欠損を指すことができる。「修飾された細胞」又は「操作された細胞」は、付加された、欠損した及び／又は変化した遺伝子を有する細胞を指すことができる。本明細書において使用される用語「細胞」、「修飾された細胞」又は「操作された細胞」及びそれらの文法上同等なものは、ヒト又は非ヒト動物起源の細胞を指すことができる。
【００６９】
本明細書において使用される、用語「作用可能に連結された」は、ポリヌクレオチド分子が、第２のポリヌクレオチド分子の機能に影響するよう配置されている、目的の遺伝子のような第２の転写可能なポリヌクレオチド分子と結び付けられた、プロモーターのような第１のポリヌクレオチド分子を指す。２種のポリヌクレオチド分子は、単一の連続するポリヌクレオチド分子の一部であっても、又はなくてもよいし、隣接するものであっても、又はなくてもよい。例えば、プロモーターが、細胞において目的の遺伝子の転写を制御するか、又は仲介するなら、プロモーターは、目的の遺伝子に作用可能に連結されている。
【００７０】
本明細書に記載される様々な実施態様において、記載される特定のポリペプチドの何れかのバリアント（天然に存在する又はそれ以外）、対立遺伝子、相同体、保存的に修飾されたバリアント、及び／又は保存的置換バリアントが包含されることが、さらに企図される。アミノ酸配列に関して、当業者は、コードされた配列中の単一のアミノ酸若しくは低いパーセンテージのアミノ酸を変化させる、核酸、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質配列に対する個々の置換、欠損或いは付加は、変化が化学的に同様のアミノ酸でのアミノ酸の置換をもたらし、ポリペプチドの所望の活性を保持する「保存的に修飾されたバリアント」であることを認識する。かかる保存的に修飾されたバリアントは、開示と一致する多型バリアント、種間相同体、及び対立遺伝子に加えるものであり、それらを排除しない。
【００７１】
規定のアミノ酸は、同様の生理化学的特徴を有する残基、例えば、ある脂肪族残基を別のもの（例えば、互いにＩｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、若しくはＡｌａ）と置換すること又はある極性残基の別のものとの置換（例えば、ＬｙｓとＡｒｇ；ＧｌｕとＡｓｐ；若しくはＧｌｎとＡｓｎ）により置換され得る。他のかかる保存的置換、例えば、同様の疎水性特徴を有する全領域の置換は、周知である。保存的アミノ酸置換を含むポリペプチドを、本明細書に記載されるアッセイの何れか１つにおいて試験して、天然又は参照ポリペプチドの所望の活性、例えば、リガンドにより仲介される受容体活性及び特異性を保持するのを確認し得る。
【００７２】
アミノ酸は、それらの側鎖の特性における類似性に従いグループ化され得る（A. L. Lehninger、Biochemistry、第2編、p73-75、Worth Publishers、New York(1975年)における）：（１）非極性：Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）；（２）無電荷の極性：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）；（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）；（４）塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）。或いは、天然に存在する残基は、一般的な側鎖特性に基づきグループに分けることができる：（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；（５）鎖配向性に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；（６）芳香族性：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。非保存的置換は、これらの種類の１つのメンバーの別の種類への交換を伴う。特定の保存的置換は、例えば；ＡｌａからＧｌｙ若しくはＳｅｒ；ＡｒｇからＬｙｓ；ＡｓｎからＧｌｎ若しくはＨｉｓ；ＡｓｐからＧｌｕ；ＣｙｓからＳｅｒ；ＧｌｎからＡｓｎ；ＧｌｕからＡｓｐ；ＧｌｙからＡｌａ若しくはＰｒｏ；ＨｉｓからＡｓｎ若しくはＧｌｎ；ＩｌｅからＬｅｕ若しくはＶａｌ；ＬｅｕからＩｌｅ若しくはＶａｌ；ＬｙｓからＡｒｇ、Ｇｌｎ若しくはＧｌｕ；ＭｅｔからＬｅｕ、Ｔｙｒ若しくはＩｌｅ；ＰｈｅからＭｅｔ、Ｌｅｕ若しくはＴｙｒ；ＳｅｒからＴｈｒ；ＴｈｒからＳｅｒ；ＴｒｐからＴｙｒ；ＴｙｒからＴｒｐ；及び／又はＰｈｅからＶａｌ、Ｉｌｅ若しくはＬｅｕを含む。
【００７３】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載されるポリペプチド（又はかかるポリペプチドをコードする核酸）は、本明細書に記載されるアミノ酸配列の１つの機能的フラグメントであり得る。本明細書において使用される、「機能的フラグメント」は、当該技術分野において公知又は本明細書において以下で記載されるアッセイに従い、野生型参照ポリペプチドの活性の少なくとも５０％を保持する、ペプチドのフラグメント又はセグメントである。機能的フラグメントは、本明細書において開示される配列の保存的置換を含み得る。
【００７４】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載されるポリペプチドは、本明細書に記載されるポリペプチド又は分子のバリアントであり得る。いくつかの実施態様において、バリアントは、保存的に修飾されたバリアントである。保存的置換バリアントは、天然のヌクレオチド配列等の変異により得ることができる。本明細書において言及される「バリアント」は、天然又は参照ポリペプチドと実質的に相同なポリペプチドであるが、一又は複数の欠損、挿入若しくは置換のため、天然或いは参照ポリペプチドのものと異なるアミノ酸配列を有する。バリアントポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、天然若しくは参照ＤＮＡ配列と比較したとき、ヌクレオチドの一若しくは複数の付加、欠損、又は置換を含むが、非バリアントポリペプチドの活性を保持するバリアントタンパク質又はそのフラグメントをコードする配列を包含する。多種多様なＰＣＲベースの部位特異的変異アプローチが、当該技術分野において公知であり、当業者により適用され得る。
【００７５】
バリアントアミノ酸又はＤＮＡ配列は、天然又は参照配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％以上同一であり得る。天然配列と変異配列の間の相同性（パーセント同一性）の程度は、例えば、ワールド・ワイド・ウェブ上のこの目的のため通常利用される無料で入手可能なコンピュータープログラム（例えば、デフォルト設定を有するＢＬＡＳＴｐ又はＢＬＡＳＴｎ）を使用して２つの配列を比較することにより、決定することができる。
【００７６】
天然のアミノ酸配列の変化は、当業者に公知の多数の技術の何れかにより成し遂げることができる。変異は、例えば、特定の遺伝子座で、天然の配列のフラグメントへのライゲーションを可能にする制限酵素部位に隣接する変異体配列を含有するオリゴヌクレオチドを合成することにより導入することができる。ライゲーション後、生じた再構築された配列は、所望のアミノ酸挿入、置換、又は欠損を有するアナログをコードする。或いは、オリゴヌクレオチド定方向部位特異的変異手法を利用して、要求される置換、欠損、又は挿入により変化した特定のコドンを有する変化したヌクレオチド配列をもたらし得る。かかる変化を作る技術は、十分に確立されており、例えば、Ｗａｌｄｅｒ等（Gene42:133、1986年）；Ｂａｕｅｒ等（Gene37:73、1985年）；Ｃｒａｉｋ（BioTechniques、1985年1月、12-19）；Ｓｍｉｔｈ等（Genetic Engineering:Principles and Methods、Plenum Press、1981年）；並びに米国特許第４５１８５８４号及び第４７３７４６２号により開示されるものを含み、それらは、それらの全体が出典明示により本明細書に援用される。ポリペプチドの適切な立体構造を維持するのに関与しない任意のシステイン残基をまた、一般に、セリンで置換して、分子の酸化的安定性を改善し、異常な架橋結合を妨げ得る。逆に、システイン結合を、ポリペプチドに加えて、その安定性を改善するか、又はオリゴマー形成を促進し得る。
【００７７】
本明細書において使用される、用語「ＤＮＡ」は、デオキシリボ核酸として定義される。用語「ポリヌクレオチド」を、「核酸」と互換的に本明細書において使用して、ヌクレオシドのポリマーを示す。典型的には、ポリヌクレオチドは、ホスホジエステル結合により結び付けられたＤＮＡ又はＲＮＡにおいて天然に見られるヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、及びデオキシシチジン）から構成される。しかしながら、用語は、天然に存在する核酸において見られるかどうかにかかわらず、化学的若しくは生物学的に修飾された塩基、修飾された骨格等を含有するヌクレオシド又はヌクレオシドアナログを含む分子を包含し、かかる分子は、ある特定の適用に好ましいことがある。この適用が、ポリヌクレオチドを指す場合、１本鎖と２本鎖形態（及びそれぞれの１本鎖分子の相補鎖）の両方の場合のＤＮＡ、ＲＮＡの両方が提供されることは理解される。本明細書において使用される「ポリヌクレオチド配列」は、ポリヌクレオチド物質自体及び／又は特定の核酸を生化学的に特徴付ける配列情報（すなわち、塩基についての略語として使用される文字の連続）を指すことができる。本明細書において提示されるポリヌクレオチド配列は、別段示されない限り、５’から３’方向で提示される。
【００７８】
本明細書において使用される用語「ポリペプチド」は、アミノ酸のポリマーを指す。用語「タンパク質」及び「ポリペプチド」は、本明細書において互換的に使用される。ペプチドは、比較的に短いポリペプチドであり、典型的には、約２から６０個のアミノ酸長である。本明細書において使用されるポリペプチドは、典型的には、タンパク質において最も一般的に見られる２０個のＬ−アミノ酸のようなアミノ酸を含有する。しかしながら、他のアミノ酸及び／又は当該技術分野において公知のアミノ酸アナログを使用することができる。ポリペプチド中のアミノ酸の一又は複数は、例えば、炭水化物群、リン酸塩群、脂肪酸群、結合、機能付与のためのリンカー等のような化学実体の付加により修飾されてもよい。共有結合又は非共有結合で結び付けられた非ポリペプチド部分を有するポリペプチドは、依然、「ポリペプチド」とみなされる。典型的な修飾は、グリコシル化及びパラミトイル化を含む。ポリペプチドは、天然の供給源から精製され、組換えＤＮＡテクノロジーを使用して生成されるか、又は従来の固相ペプチド合成のような化学的手段を通じて合成され得る。本明細書において使用される用語「ポリペプチド配列」又は「アミノ酸配列」は、ポリペプチド物質自体及び／又はポリペプチドを生化学的に特徴付ける配列情報（すなわち、アミノ酸名についての略語として使用される文字若しくは３文字コードの連続）を指すことができる。本明細書において提示されるポリペプチド配列は、別段示されない限り、Ｎ末端からＣ末端方向で提示される。
【００７９】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載されるポリペプチド（例えば、免疫監視回避を促進するタンパク質（例えば、ＴＡＰ阻害剤若しくはＨＬＡ相同体）、マーカー、自殺タンパク質、又は治療タンパク質（例えば、ＣＡＲポリペプチド））をコードする核酸は、ベクター内に含まれる。本明細書に記載される態様のいくつかにおいて、本明細書に記載される規定のポリペプチドをコードする核酸配列、又は任意のそのモジュールは、ベクターに作用可能に連結されている。本明細書において使用される用語「ベクター」は、宿主細胞へのデリバリー又は異なる宿主細胞間の移動のため設計された核酸コンストラクトを指す。本明細書において使用される、ベクターは、ウイルス又は非ウイルスであり得る。用語「ベクター」は、適切な制御エレメントと関連するとき、複製する能力があり、遺伝子配列を細胞に移し得る任意の遺伝子エレメントを包含する。ベクターは、クローニングベクター、発現ベクター、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、人工染色体、ウイルス、ビリオン等を含み得るが、これらに限定されない。
【００８０】
本明細書において使用される、用語「発現ベクター」は、ベクター上の転写制御配列に結合された配列からのＲＮＡ又はポリペプチドの発現を指示するベクターを指す。発現された配列は、しばしば細胞にとって異種性であるが、必ずしも、細胞にとって異種性でない。発現ベクターは、追加のエレメントを含んでもよく、例えば、発現ベクターは、２種の複製システムを有し、これにより、それが、２種類の生物、例えば、発現のためのヒト細胞において並びにクローニング及び増幅のため原核生物の宿主において維持されることを可能にしてもよい。用語「発現」は、ＲＮＡ及びタンパク質の産生、並びに適用可能な場合、例えば、転写、転写プロセシング、翻訳及びタンパク質フォールディング、修飾並びにプロセシングを含むが、これらに限定されない、適当な分泌タンパク質として関与する細胞プロセスを指す。「発現産物」は、遺伝子から転写されたＲＮＡ、及び遺伝子から転写されたｍＲＮＡの翻訳により得られるポリペプチドを含む。用語「遺伝子」は、適当な制御配列に作用可能に連結されたとき、インビトロ又はインビボで（ＤＮＡ）からＲＮＡに転写される核酸配列を意味する。遺伝子は、コード領域前及び後の領域、例えば、５’非翻訳（５’ＵＴＲ）又は「リーダー」配列及び３’ＵＴＲ又は「トレーラー」配列、並びに個々のコードセグメント（エクソン）間の間にある配列（イントロン）を含んでもよいし、又は含まなくてもよい。
【００８１】
本明細書において使用される、用語「ウイルスベクター」は、ウイルス起源の少なくとも１つのエレメントを含み、ウイルスベクター粒子にパッケージングされる能力を有する核酸ベクターコンストラクトを指す。ウイルスベクターは、必須でないウイルス遺伝子の代わりに、本明細書に記載されるポリペプチドをコードする核酸を含有し得る。ベクター及び／又は粒子は、インビトロ又はインビボの何れかで核酸を細胞に移動させる目的のため利用され得る。多数の形態のウイルスベクターが、当該技術分野において公知である。
【００８２】
「組換えベクター」により、異種性核酸配列、又はインビボで発現する能力がある「導入遺伝子」を含むベクターを意味する。本明細書に記載されるベクターが、いくつかの実施態様において、他の適した組成物及び療法と組合すことができることは理解されるべきである。いくつかの実施態様において、ベクターは、エピソームである。適したエピソームベクターの使用は、対象において目的のヌクレオチドを大きなコピー数の染色体外ＤＮＡで維持し、それにより、染色体組込みの可能性のある作用を除去する手段をもたらす。
【００８３】
任意選択的に、本明細書に記載されるベクターは、発現のための複数の遺伝子を含む、マルチシストロンコンストラクトを含み得る。これらのコンストラクトは、生成されたポリタンパク質の切断を促進する、異なるコード配列を分離するリンカーを含み得る。様々な例において、リンカーは、ウイルス２Ａタンパク質（例えば、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、及びＦ２Ａ）であるか、又はそれを含む。
【００８４】
本明細書において使用される、用語「処置する」、「処置」、「処置すること」又は「改善」は、目的が、疾患或いは障害、例えば、急性リンパ芽球性白血病若しくは他のがん、疾患、又は障害と関連する状態の進行或いは重症度を好転させること、緩和すること、改善すること、阻害すること、遅延させること、又は停止することである、治療処置を指す。用語「処置すること」は、少なくとも１種の副作用又は状態、疾患若しくは障害の症状を低減すること或いは緩和することを含む。一若しくは複数の症状又は臨床マーカーが、低減されるなら、処置は、一般に「有効」である。或いは、疾患の進行が低減されるか、又は停止されるなら、処置は、「有効」である。すなわち、「処置」は、症状又はマーカーの改善ばかりでなく、処置の非存在下で予測されるものと比較して症状の進行若しくは悪化の休止、又は少なくとも遅延も含む。有益又は所望の臨床結果は、検出可能若しくは検出可能でないかにかかわらず、一又は複数の症状の緩和、疾患の程度の減少、疾患の安定化した（すなわち、悪化しない）状態、疾患の進行の遅延又は遅くすること、疾患状態の改善又は緩和、寛解（部分的又は総合的の何れか）、及び／或いは減少した死亡率を含むが、これらに限定されない。用語、疾患の「処置」はまた、疾患の症状又は副作用からの解放（対症療法を含む）をもたらすことを含む。
【００８５】
本明細書において使用される、用語「薬学的組成物」は、薬学的に許容される担体、例えば、医薬産業において一般に使用される担体と組み合わせた有効な剤を指す。語句「薬学的に許容される」を、本明細書において利用して、合理的な恩恵／リスクの比と釣り合った過剰な毒性、刺激、アレルギー応答、又は他の問題若しくは合併症なく、ヒト及び動物の組織と接触して使用するのに、正当な医療判断の範囲内で適当である化合物、物質、組成物、並びに／或いは投薬形態を指す。態様の何れかのいくつかの実施態様において、薬学的に許容される担体は、水以外の担体であり得る。態様の何れかのいくつかの実施態様において、薬学的に許容される担体は、クリーム、エマルジョン、ジェル、リポソーム、ナノ粒子、及び／又は軟膏であり得る。態様の何れかのいくつかの実施態様において、薬学的に許容される担体は、人工又は操作された担体、例えば、有効成分が天然で生じることが見出されていない担体であり得る。
【００８６】
本明細書において使用される、用語「投与すること」は、所望の部位での薬剤の少なくとも部分的なデリバリーをもたらす方法若しくは経路による、対象への本明細書において開示される治療又は薬学的組成物の配置を指す。本明細書に記載される薬剤を含む薬学的組成物は、対象において有効な処置をもたらす任意の適当な経路により投与され得る。
【００８７】
「Ｔ細胞」又は「Ｔリンパ球」は、細胞介在性免疫において中心的な役割を果たす、リンパ球の種類（白血球のサブタイプ）である。Ｔ細胞は、細胞表面Ｔ細胞受容体の発現に起因して、Ｂ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のような、他のリンパ球から区別され得る。Ｔ細胞は、例えば、ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、及びエフェクターメモリーＴ細胞を含む。本明細書において言及される「修飾されたＴ細胞」又は「修飾されたＴリンパ球」（これらの用語は、本明細書において互換的に使用される）は、例えば、ＣＤ３ζ、ＴＲＡＣ、及び／若しくはＴＲＢＣの欠損又は変異（例えば、フレームシフト変異）、或いは他のノックダウン又はノックアウトに起因して、低減した或いは除去された（すなわち、ヌル）ＴＣＲ発現或いは活性を有するように修飾されている（例えば、遺伝子修飾されている）Ｔ細胞である。「修飾されたＴ細胞」をさらに修飾して、ＣＤ３ζ、ＴＲＡＣ、及び／若しくはＴＲＢＣ関連修飾を含む、ＣＡＲ−Ｔ細胞であるとして「修飾されたＴ細胞」を与える、例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のような、治療タンパク質を発現させることができる。「修飾されたＴ細胞」をまた、任意選択的に、修飾して、以下でさらに記載される、宿主免疫監視回避を促進する一又若しくは複数のタンパク質、例えば、ＴＡＰ又はＨＬＡ相同体の阻害剤を発現させることができる。付加、任意選択的な修飾は、ＨＬＡ発現、並びにＨＬＡ−Ｇ及び／若しくはＨＬＡ−Ｅの発現に影響する変異又は欠損（例えば、染色体６上のＨＬＡ遺伝子座の変異若しくは欠損）を含む。
【００８８】
用語「統計学的に有意な」又は「有意に」は、統計学的な有意を指し、一般に、２標準偏差（２ＳＤ）又はそれ以上の差を意味する。
【００８９】
操作例において以外、又は別段示されない場合、本明細書において使用される成分の量又は反応条件を表す全ての数は、用語「約」により全ての場合で修飾されると理解されるべきである。パーセンテージと関連して使用されるときの用語「約」は、±１％を意味し得る。
【００９０】
本明細書において使用される、用語「含むこと」は、他のエレメントがまた、提示された所望のエレメントに加えて存在し得ることを意味する。「含むこと」の使用は、制限よりむしろ包含を示す。
【００９１】
用語「からなる」は、本明細書に記載される組成物、方法、及びそれらのそれぞれの構成要素を指し、それらは、実施態様のその記載において列挙されない任意のエレメントを除外する。
【００９２】
本明細書において使用される、用語「本質的にからなる」は、規定の実施態様について要求されるそれらのエレメントを指す。用語は、テクノロジーのその実施態様の基本的かつ新規又は機能的特徴に物質上影響しない追加のエレメントの存在を可能にする。
【００９３】
単数の用語「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が別段明らかに示さない限り、複数の参照物を含む。同様に、単語「又は」は、文脈が別段明らかに示さない限り、「及び」を含むことが意図される。本明細書において記載されるものと同様又は同等の方法及び物質を、本開示の実施又は試験において使用することができるが、適した方法及び物質が以下で記載される。略語「例えば」は、ラテン語の例を挙げると、に由来し、本明細書において使用して、非限定的な例を示す。したがって、略語「例えば」は、用語「例えば」と同義である。
【００９４】
態様の何れかのいくつかの実施態様において、本明細書に記載される開示は、ヒトをクローニングするプロセス、ヒトの生殖系列の遺伝的同一性を修飾するプロセス、産業上若しくは市販目的のヒト胚の使用、又はヒト若しくは動物への実質的な医薬恩恵なく恐らくそれらを罹患させる動物の遺伝的同一性を修飾するプロセス、及びかかるプロセスから得られた動物に関係しない。
【００９５】
他の用語は、本明細書において以下及び他の場所で説明されるテクノロジーの様々な態様並びに実施態様の記載内で定義される。
【００９６】
本発明は、いくつかの利点をもたらす。例えば、ＣＤ３ζなしでは、Ｔ細胞受容体シグナル伝達は起きえないので、本発明のある特定の態様による、ＣＤ３ζ発現の除去は、ＧｖＨ疾患のリスクを除去する。それは、内在性Ｔ細胞受容体シグナル伝達分子との新規受容体分子間の競合を除去するので、これはまた、新規受容体分子（例えば、ＣＡＲ）を発現するよう修飾されたＴ細胞の状況において有利である。
【００９７】
加えて、先の方法（例えば、ＴＲＡＣ配列の欠損を含む方法）において、修飾されたＴ細胞は、継続して、それらの同種のＨＬＡ対立遺伝子を発現するので、レシピエントにより素早く拒絶される。この問題は、拒絶の発生率を低減し得る、異種性タンパク質（例えば、ウイルスタンパク質）を発現するという選択肢を含む、本発明により対処される。したがって、本発明は、共に、天然のＴ細胞受容体発現を欠き、並びに細胞のレシピエントの免疫系により仲介される拒絶を回避し得る、修飾されたＴ細胞をもたらすことにより、養子Ｔ細胞療法を促進する。したがって、生じた細胞は、使用するのにより安全であり、並びに長続きする。
【００９８】
本発明の追加の特性及び利点は、以下の詳細な説明、請求項及び図面から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】図１は、ＣＤ３ζ又はＴＲＡＣを、ＣＲＩＳＰＲを使用してノックアウトした、ジャーカットＴ細胞のフローサイトメトリー解析の結果を示す。
【図２】図２は、ＣＤ３ζ又はＴＲＡＣを、ＣＲＩＳＰＲを使用してノックアウトした、初代Ｔ細胞のフローサイトメトリー解析の結果を示す。
【図３】図３は、ＣＤ３ζに対して指向化された様々なｇＲＮＡの有効性を試験するＴ７Ｅ１破壊アッセイの結果を示す。
【図４】図４は、ＣＤ３ｅ負の選択後の細胞のフローサイトメトリー解析の結果を示す。
【図５】図５は、親ジャーカット細胞、並びにＣＤ３ｅ枯渇後、ＣＤ３ζを、ｇＲＮＡ（２）を使用してノックアウトした細胞の単一細胞ソーティングの結果を示す。
【図６】図６は、ソーティング後の単一細胞クローンの拡大の結果を示す。
【図７】図７は、ＣＡＲでの親及びＣＤ３ζノックアウト細胞の形質導入効率の解析結果を示す。
【図８】図８は、ＣＡＲを形質導入した親及びＣＤ３ζノックアウト細胞の活性化の解析の結果を示す。
【図９】図９は、キメラ抗原受容体及び免疫拒絶を減少する異種性タンパク質を発現させるためにＴ細胞を修飾するために使用し得る、ヌンチャク（ｐＭＧＨ８１）並びにニンジャ（ｐＭＧＨ８２）として設計したベクターの模式図である。
【図１０】図１０は、ニンジャベクター（ｐＭＧＨ８２）を安定的に形質導入したジャーカットＴ細胞のフローサイトメトリー解析の結果を示す。
【図１１】図１１は、ヌンチャクベクター（ｐＭＧＨ８１）を安定的に形質導入したラージ腫瘍細胞のフローサイトメトリー解析の結果を示す。
【図１２】図１２は、ヌンチャクベクター（ｐＭＧＨ８１）を安定的に形質導入したソートしたラージ腫瘍細胞のフローサイトメトリー解析の結果を示す。
【図１３】図１３は、ＨＬＡクラスＩ上での初代ヒトＴ細胞におけるＴＡＰ阻害剤（ＢｏＨＶ１  ＵＬ４９．５、ＣＭＶ  ＵＳ６、ＥＢＶ  ＢＮＬＦ２ａ、及びＨＳＶ  ＩＣＰ４７）発現の解析の結果を示す。
【図１４】図１４は、初代Ｔ細胞におけるＴＣＲの細胞表面発現上のＴＲＡＣ又はＣＤ３ζノックアウトの解析の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１００】
本発明は、ＣＤ３ζ、Ｔ細胞受容体アルファ鎖（ＴＲＡＣ）、及び／若しくはＴ細胞受容体ベータ鎖（ＴＲＢＣ）配列の変異又は欠損に起因して、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の低減した発現（例えば、発現における部分的な低減又は発現の完全な阻害）を有するよう修飾されたＴ細胞を提供する。１つの例において、ＣＤ３ζ遺伝子の発現の部分的又は完全な阻害は、例えば、ＣＤ３ζ配列の変異又は欠損に起因して、達成される。ＣＤ３ζの非存在下で、Ｔ細胞受容体複合体は、形成され得ない。
【０１０１】
したがって、本発明の修飾されたＴ細胞は、例えば、養子Ｔ細胞療法の状況において「普遍的な」Ｔ細胞として使用され得る。以下でさらに記載される、１つの例において、修飾されたＴ細胞は、例えば、がん関連抗原に対して指向化されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする配列を形質導入され、次に、例えば、がんを処置するために患者に投与される。他の例において、修飾された細胞は、感染性疾患又は臓器移植の状況において使用される。
【０１０２】
任意選択的に、修飾されたＴ細胞は、患者に投与されたとき、細胞の拒絶の発生を回避するか、又は低減するように、さらに修飾されている。これらのさらなる修飾は、同種Ｔ細胞療法の状況において特に有利であるが、また、自家アプローチにおいて、例えば、異種性タンパク質が、自家の修飾されたＴ細胞により発現されるとき、有用であり得る。
【０１０３】
修飾されたＴ細胞に加えて、本発明はまた、修飾されたＴ細胞、並びに関連する組成物及びキットを使用する方法も提供する。本発明の修飾されたＴ細胞、方法、組成物、及びキットは、以下で、典型的な方法で、より詳細に記載される。
【０１０４】
Ｔ細胞
本発明において使用され得るＴ細胞（例えば、ヒトＴ細胞）は、エクスビボでの修飾及び拡大後、後に投与されるべきである対象から得られた自家細胞を含む。例えば、Ｔ細胞は、がん、感染性疾患、自己免疫疾患、若しくは形質細胞障害を有するか、又は有すると診断された個体から得ることができる。Ｔ細胞は、細胞の意図されるレシピエントと同じ種の遺伝子的に同一でない個体である、同種ドナーから得ることもできる。Ｔ細胞は、典型的には、例えば、静脈穿刺又は移植されたポート若しくはカテーテルを通じた回収により、対象から収集される末梢血から得られる。任意選択的に、血液は、白血球が、対象の血液から得られ、一方、他の血液成分が、対象に戻される、白血球除去を含むプロセスにより得ることができる。血液又は白血球除去産物（新鮮若しくは凍結保存）を処理して、当該技術分野において公知の方法を使用して、Ｔ細胞について濃縮する。したがって、例えば、密度勾配遠心分離（例えば、フィコールを使用して）及び／又はカウンターフロー遠心水簸を行い、単核細胞（Ｔ細胞を含む）について濃縮することができる。例えば、磁気ビーズ上にコーティングされたＣＤ３／ＣＤ２８抗体又は例えば、細胞表面に結合した抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体フラグメントを発現する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）（以下を参照）を利用するＴ細胞刺激工程は、Ｔ細胞を刺激し、他の細胞、例えば、Ｂ細胞を枯渇させるためにさらに行われ得る。次に、濃縮されたＴ細胞調製物のＴ細胞は、遺伝子修飾の対象にされ得る。末梢血の代替として、骨髄、リンパ節、脾臓、及び腫瘍を含む組織は、Ｔ細胞についての供給源として使用することができる。Ｔ細胞は、ヒト、霊長類、ハムスター、ウサギ、げっ歯類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ヤギ、イヌ又はネコ起源のものであり得るが、任意の他の哺乳類細胞が使用されてもよい。任意の態様のある特定の実施態様において、Ｔ細胞は、ヒトである。
【０１０５】
Ｔ細胞の修飾
Ｔ細胞を、本発明により、いくつかの方法で修飾して、治療方法（例えば、養子Ｔ細胞療法）においてそれらの使用を増強することができる。これらの修飾は、（ｉ）例えば、ＣＤ３ζ、ＴＲＡＣ、及び／若しくはＴＲＢＣ配列の欠損／変異（例えば、フレームシフト変異）による低減したＣＤ３ζ、ＴＲＡＣ、並びに／又はＴＲＢＣ発現、（ｉｉ）免疫監視回避を促進する一又は複数のタンパク質（例えば、ＴＡＰ阻害剤若しくはＨＬＡ相同体）の発現（若しくはＨＬＡクラスＩの欠損及びＨＬＡ−Ｇの発現）、（ｉｉｉ）マーカー及び／又は自殺遺伝子の発現、並びに／或いは（ｉｖ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又は異種性Ｔ細胞受容体のような、治療タンパク質の発現を含む。これらの種類の修飾のそれぞれの例が、以下で提供される。
【０１０６】
ＣＤ３ζ、ＴＲＡＣ、又はＴＲＢＣ変異及び欠損
Ｔ細胞受容体複合体は、可変のＴ細胞受容体α及びβ鎖、並びに３種のダイマーシグナル伝達分子：ＣＤ３δ／ε、ＣＤ３γ／ε、及びＣＤ３ζ／ζを含む。本発明により、ＣＤ３ζ（本明細書において「ＣＤ３ｚ」若しくは「ＣＤ３ゼータ」としても言及される）、ＴＲＡＣ、及び／又はＴＲＢＣ遺伝子の発現は、低減されるか、又は除去される。これは、当該技術分野において公知の多数の方法の何れかを使用して達成され得る。１つの例において、ＣＤ３ζ配列（例えば、コード若しくは制御配列；例えば、２０１８年１月１０日の、ＥＮＳＥＭＢＬ  ＩＤ  ＥＮＳＧ０００００１９８８２１を参照）、ＴＲＡＣ配列（例えば、コード若しくは制御配列）、及び／又はＴＲＢＣ（例えば、コード若しくは制御配列）は、例えば、遺伝子編集方法を使用して、Ｔ細胞のゲノムから変異されるか、又は欠損される。したがって、例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡガイドエンドヌクレアーゼ（例えば、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、及びアルゴノート）、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）ヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、又はメガヌクレアーゼを利用するアプローチは、本発明での使用に適合され得る。さらに、所望の配列特異性を達成するために、本発明において使用され得る、ヌクレアーゼの操作方法は、例えば、Ｋｉｍ（２０１４年）；Ｋｉｍ（２０１２年）；Ｂｅｌｈａｊ等（２０１３年）；Ｕｒｎｏｖ等（２０１０年）；Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ等（２０１１年）；Ｊｉｎｅｋ等（２０１２年）、Ｓｉｌｖａ等（２０１１年）；Ｒａｎ等（２０１３年）；Ｃａｒｌｓｏｎ等（２０１２年）；Ｇｕｅｒｔｓ等（２００９年）；Ｔａｋｓｕ等（２０１０年）；及びＷａｔａｎａｂｅ等（２０１２年）において記載され、それらのそれぞれを、その全体が、出典明示により援用される。
【０１０７】
様々な例において、挿入又は欠損は、遺伝子ノックアウト（すなわち、機能的遺伝子産物の発現の欠如）を導く、フレームシフト変異を引き起こすための遺伝子編集によりなされる。ある特定の例において、かかる変異は、破壊を最大にし、低レベルのタンパク質発現の可能性を最小にするために、タンパク質のＮ末端に近い、早期のコード配列を標的にするためになされる。様々な例において、任意のエクソンは、フレームシフトの生成の標的にされ得る（例えば、エクソンコード配列）。特定の例として、より近位のエクソンが、標的にされてもよい。
【０１０８】
ＣＤ３ζの状況において本発明において使用されるプロトコールの特定の例は、（ｉ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを有するＣＤ３ζを標的にするガイドＲＮＡのエレクトロポレーション、（ｉｉ）前複合体ガイドＲＮＡとｃａｓ９エンドヌクレアーゼタンパク質を作り上げるリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）のエレクトロポレーション、及び（ｉｉｉ）ｃａｓ９タンパク質又はｍＲＮＡのエレクトロポレーションでＣＡＲレンチウイルス骨格においてコードされたヒトＲＮＡポリメラーゼプロモーターを使用したガイドＲＮＡの発現を含む。
【０１０９】
或いは、ＣＤ３ζ、ＴＲＡＣ、及び／若しくはＴＲＢＣ発現の低減又は除去は、阻害核酸の使用により達成することができる。本明細書において使用される、「阻害核酸」は、標的遺伝子又はｍＲＮＡの発現を阻害し得る核酸分子を指し、例えば、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、阻害ＲＮＡ（ｉＲＮＡ）等を含む。阻害核酸テクノロジーは、例えば、Ｗｉｌｓｏｎ，ＲＣ、及びＤｏｕｄｎａ，ＪＡ、（２０１３年）、Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ、４２（２１７−２３９）並びにそこで引用される参考文献においてより完全に記載される。
【０１１０】
免疫監視の回避を促進するタンパク質の発現
機能的ＴＣＲの低減した又は除去された発現（例えば、ＣＤ３ζ、ＴＲＡＣ、及び／若しくはＴＲＢＣ遺伝子欠損、例えば、フレームシフト変異に起因する）により特徴付けられる修飾されたＴ細胞は、本明細書に記載されるもののような、養子Ｔ細胞療法の状況において有利に使用され得る。以下でさらに記載される通り、これらの修飾されたＴ細胞をさらに修飾して、修飾されたＴ細胞を標的細胞（例えば、腫瘍細胞）に指向化させるために、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現させることができる。しかしながら、修飾されたＴ細胞の機能は、特に、同種遺伝子導入方法の状況において、一又は複数の追加の遺伝子修飾により、さらに改善され得る。より詳細には、内在性Ｔ細胞受容体の発現を欠く（例えば、本明細書に記載されるＣＤ３ζ、ＴＲＡＣ、及び／若しくはＴＲＢＣ遺伝子欠損又は変異に起因する）遺伝子修飾されたＴ細胞は、それらが投与される対象の免疫系（Ｔ細胞及びＮＫ介在性拒絶）による攻撃を受けやすい。この攻撃の回避は、修飾されたＴ細胞におけるある特定の異種性タンパク質の発現により達成され得る。したがって、これらのタンパク質の発現を使用して、投与される、修飾されたＴ細胞の持続性を増加させることができる。この状況において使用され得る異種性タンパク質は、例えば、免疫回避を促進するウイルスタンパク質を含む。これらのタンパク質の例は、次に記載され、例えば、抗原プロセシングと関連する輸送体（ＴＡＰ）阻害剤及びＨＬＡ相同体を含む。これらのタンパク質の発現はまた、発現した導入遺伝子に対する低減した免疫応答が望ましいことがある、自家設定において適用可能であり得る。
【０１１１】
したがって、１つの例において、ＴＡＰのウイルス阻害剤は、本発明の修飾されたＴ細胞において発現され得る。ＴＡＰは、抗原プロセシング、特に、ＭＨＣ提示のための小胞体（ＥＲ）への輸送において中心的な役割を果たす。有効なＴＡＰ輸送なしで、細胞は、ＨＬＡクラスＩ分子を負荷し、発現することができず、したがって、ＴＡＰの阻害は、免疫回避を促進し得る。本発明において使用され得るＴＡＰのウイルス性阻害剤は、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のウイルスタンパク質ＵＳ６、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のウイルスタンパク質ＩＣＰ４７、ウシヘルペスウイルス−１（ＢｏＨＶ−１）タンパク質ＵＬ４９．５、及びエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）タンパク質ＢＮＬＦ２ａを含む。
【０１１２】
別の例において、完全又は部分的（シグナルペプチド）ＣＭＶ  ＵＬ４０タンパク質は、本発明の修飾されたＴ細胞において発現される。ＵＬ４０は、ＨＬＡクラスＩと相同性を有し、ＥＲへの輸送のためＴＡＰに依存した提示を要求しない。輸送後、ＵＬ４０ペプチドは、非古典的ＨＬＡ−Ｅに結合し、表面発現を促進することができる。発現されるとき、ＨＬＡ−Ｅは、阻害性受容体ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを介してＮＫ介在性拒絶を阻害する。この方法において、ＵＬ４０の発現は、宿主免疫系攻撃からの修飾されたＴ細胞に対する保護をもたらす。
【０１１３】
さらなる例において、ＣＭＶ  ＵＬ１８は、本発明の修飾されたＴ細胞において発現される。ＵＬ１８は、発現されたとき、ＬＩＲ＋ＮＫ介在性拒絶を阻害することができる、ウイルスＨＬＡ相同体である。ＵＬ１８は、細胞表面発現にベータ−２ミクログロブリンを要求し、ＵＬ４０の同時発現により増大し得る。本発明において使用され得るＨＬＡ相同体の別の例は、ＵＬ１４２である。
【０１１４】
免疫監視回避を促進するタンパク質をコードする遺伝子を付加することの代替として（又は加えて）、本発明の修飾されたＴ細胞は、染色体６上の内在性ＨＬＡ遺伝子座を欠損するようにさらに修飾され得る。別の例において、Ｂ２Ｍ遺伝子座が、標的にされる（２０１８年１月１０日の、アンサンブル番号ＥＮＳＧ０００００１６６７１０）。かかる欠損がなされるなら、Ｔ細胞は、ＮＫ介在性溶解を受けやすい。これと反対に、普遍的ＨＬＡ分子ＨＬＡ−Ｇ或いは完全若しくは部分的ＵＬ４０、又はＵＬ１８のような細胞表面上でのＨＬＡ−Ｅの発現を増大させるタンパク質、或いは部分を発現するように細胞に形質導入することができる。
【０１１５】
ある特定の実施態様において、免疫監視回避を促進するタンパク質を発現する個々の遺伝子は、本発明の修飾されたＴ細胞において発現される。他の実施態様において、かかるタンパク質の組合せが、かかる細胞において発現される。特定の例において、ＵＬ４０、ＵＳ６、及びＵＬ１８は、例えば、本明細書に記載されるマルチシストロンベクターを使用して一緒に発現される。
【０１１６】
免疫監視の回避を促進することと関連して発現され得る典型的なタンパク質の配列は、以下で挙げられるもの、並びにその機能的バリアントを含む。
2020513775.tif 000002
【０１１７】
レポーター又は自殺遺伝子の発現
本発明の修飾されたＴ細胞になされ得る追加の修飾は、例えば、一又は複数のレポーター遺伝子の発現を含む。例えば、細胞内シグナル伝達ドメインを欠く、切断型上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）は、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体を使用して、例えば、毒性の場合にはインビボでの枯渇のため使用され得る。
【０１１８】
別の典型的な修飾は、本発明の修飾されたＴ細胞における自殺遺伝子の発現を含む。これを行い、投与された細胞の外部の薬物により仲介される制御を促進し得る。例えば、自殺遺伝子の使用により、修飾された細胞は、例えば、有害事象の場合には、患者から枯渇させることができる。１つの例において、ＦＫ５０６結合ドメインは、カスパーゼ９アポトーシス促進分子に融合される。この方法で操作されたＴ細胞は、免疫抑制性の薬物タクロリムスに感受性にされる。自殺遺伝子の他の例は、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、ＣＤ２０、チミジル酸キナーゼ、切断型前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、切断型低親和性神経成長因子受容体（ＬＮＧＦＲ）、切断型ＣＤ１９、及び修飾されたＦａｓであり、それらは、特定の分子（例えば、ＴＫ＋細胞に対するガンシクロビル）又は抗体若しくは抗体と薬物の結合体の投与により、条件的な切除のため発動され得る。
【０１１９】
治療タンパク質−キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の発現
上で修飾されたＣＤ３ζ、ＴＲＡＣ、及び／又はＴＲＢＣ遺伝子、並びに上で記載された追加の任意選択的な修飾に加えて、本発明のＴ細胞をさらに任意選択的に修飾して、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のような、治療タンパク質を発現することができる。本明細書において使用される用語「キメラ抗原受容体」又は「ＣＡＲ」又は「ＣＡＲ（複数形）」は、Ｔ細胞（例えば、ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、若しくはその組合せ）にリガンド又は抗原特異性を移植する、操作されたＴ細胞受容体を指す。ＣＡＲは、人工Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、又はキメラ免疫受容体としても知られている。
【０１２０】
ＣＡＲは、標的に特異的に結合するキメラ細胞外標的結合ドメイン、例えば、膜貫通型ドメインを含む、コンストラクト上にＴ細胞応答について標的にされるべき細胞の表面上で発現されたポリペプチド、及びＴ細胞受容体分子の細胞内ドメインを配置する。１つの実施態様において、キメラ細胞外標的結合ドメインは、Ｔ細胞応答のため標的にされるべき細胞上で発現された抗原に特異的に結合する抗体の抗原結合ドメイン（例えば、１本鎖抗体）を含む。ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインの特性は、当該技術分野において公知であり、本明細書において開示される通り変動し得るが、キメラ標的／抗原結合ドメインは、キメラ標的／抗原結合ドメインが、標的細胞の表面上の標的／抗原に結合するとき、シグナル伝達活性化に受容体感受性を与え得る。
【０１２１】
細胞内シグナル伝達ドメインに関して、いわゆる「第１世代の」ＣＡＲは、抗原結合の際にＣＤ３ζをもっぱらもたらすものを含む。いわゆる「第２世代の」ＣＡＲは、共刺激（例えば、ＣＤ２８又はＣＤ１３７）と活性化（ＣＤ３ζ）ドメインの両方を提供するものを含み、いわゆる「第３世代の」ＣＡＲは、複数の共刺激（例えば、ＣＤ２８及びＣＤ１３７）ドメイン並びに活性化ドメイン（例えば、ＣＤ３ζ）を提供するものを含む。様々な実施態様において、標的／抗原について高い親和性又は結合活性を有するＣＡＲが選択され、例えば、抗体由来標的又は抗原結合ドメインは、一般に、天然に生じるＴ細胞受容体より、標的抗原について高い親和性及び／又は結合活性を有する。人が、抗体について選択し得る高い特異性と組み合わせた、この特性は、ＣＡＲ  Ｔ細胞による高度に特異的なＴ細胞標的化をもたらす。
【０１２２】
本明細書において使用される、「ＣＡＲ  Ｔ細胞」又は「ＣＡＲ−Ｔ」は、ＣＡＲを発現するＴ細胞を指す。Ｔ細胞において発現されるとき、ＣＡＲは、非ＭＨＣ拘束性の方法で選択された標的に向けてＴ細胞特異性及び反応性を再指向化させ、モノクローナル抗体の抗原結合特性を活用する能力を有する。非ＭＨＣ拘束性抗原認識は、ＣＡＲを発現するＴ細胞に、抗原プロセシングに独立して抗原を認識し、これにより、腫瘍回避の主要な機序を迂回する能力を与える。本発明のＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＣＡＲに加えて、本明細書に記載される、さらなる修飾（すなわち、本明細書に記載されるＣＤ３ζ、ＴＲＡＣ、及び／若しくはＴＲＢＣ配列の変異又は欠損に起因する、減少或いは除去されたＴＣＲ発現をもたらす修飾）を含む。これらの修飾は、任意選択的に、例えば、上で示された、免疫監視回避（例えば、ＴＡＰ阻害剤若しくはＨＬＡ相同体）、自殺遺伝子、及び／又はマーカー遺伝子を促進する一或いは複数のタンパク質の発現を含む、一或いは複数のさらなる修飾と組合せである。免疫監視回避を促進するタンパク質の発現の代替として、細胞は、染色体６上のＨＬＡ遺伝子座の発現について枯渇され、上で説明された、ＨＬＡ−Ｇをさらに任意選択的に発現させることができる。
【０１２３】
本明細書において使用される、用語「細胞外標的結合ドメイン」は、標的への結合を促進するのに十分である、細胞の外側において見られるポリペプチドを指す。細胞外標的結合ドメインは、その結合パートナー、すなわち、標的に特異的に結合する。非限定的な例として、細胞外標的結合ドメインは、抗体の抗原結合ドメイン、又はコグネート結合パートナー（例えば、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、又はＣＤ３７）タンパク質を認識し、結合するリガンドを含み得る。この文脈において、リガンドは、タンパク質及び／又は受容体の部分に特異的に結合する分子である。本明細書に記載される方法及び組成物において有用なリガンドのコグネート結合パートナーは、一般に、細胞の表面上で見出され得る。リガンドとコグネートパートナーの結合は、リガンドにより生じる受容体の変化をもたらすか、又は生理学的応答、例えば、シグナル伝達経路を活性化し得る。１つの実施態様において、リガンドは、ゲノムに対して非天然であり得る。任意選択的に、リガンドは、少なくとも２つの種にわたり保存された機能を有する。１つの実施態様において、細胞外標的結合ドメインは、非抗体リガンド（例えば、増殖を誘導するリガンド（ＡＰＲＩＬ））を含む。
【０１２４】
抗体試薬
様々な実施態様において、本明細書に記載されるＣＡＲは、抗体試薬又は細胞外標的結合ドメインとしてのその抗原結合ドメインを含む。
【０１２５】
本明細書において使用される、用語「抗体試薬」は、少なくとも１個の免疫グロブリン可変ドメイン又は免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、規定の抗原に特異的に結合するポリペプチドを指す。抗体試薬は、抗体の抗原結合ドメインを含む抗体又はポリペプチドを含み得る。態様の何れかのいくつかの実施態様において、抗体試薬は、モノクローナル抗体又はモノクローナル抗体の抗原結合ドメインを含むポリペプチドを含み得る。例えば、抗体は、重（Ｈ）鎖可変領域（本明細書においてＶＨと略される）、及び軽（Ｌ）鎖可変領域（本明細書においてＶＬと略される）を含み得る。別の例では、抗体は、２つの重（Ｈ）鎖可変領域及び２つの軽（Ｌ）鎖可変領域を含む。用語「抗体試薬」は、抗体の抗原結合フラグメント（例えば、１本鎖抗体、Ｆａｂ及びｓＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄフラグメント、Ｆｖフラグメント、ｓｃＦｖ、ＣＤＲ、並びにドメイン抗体（ｄＡｂ）フラグメント（例えば、de Wildt等、Eur J. Immunol、1996年;26(3):629-39；それは、その全体が出典明示により本明細書に援用される））並びに完全抗体を包含する。抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、又はＩｇＭ（並びにそのサブタイプ及び組合せ）の構造特性を有し得る。抗体は、マウス、ウサギ、ブタ、ラット、及び霊長類（ヒト及び非ヒト霊長類）を含む、任意の供給源由来であり、霊長類化抗体であり得る。抗体はまた、ミディボディ、ヒト化抗体、キメラ抗体等を含む。完全ヒト抗体結合ドメインは、例えば、ファージディスプレイライブラリーから、当業者に公知の方法を使用して選択され得る。
【０１２６】
ＶＨ及びＶＬ領域は、相補性決定領域（「ＣＤＲ」）と呼ばれる、高頻度可変性の領域、フレームワーク領域（「ＦＲ」）と呼ばれる、より保存されている領域が分散する領域にさらに分けることができる。フレームワーク領域及びＣＤＲの程度は、正確に定義されている（Kabat, E. A.等、(1991年)、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5編、U.S. Department of Health and Human Services、NIH公開番号第91-3242、及びChothia, C.等、(1987年)、J. Mol. Biol. 196:901-917を参照し、それらは、それらの全体が出典明示により本明細書に援用される）。それぞれのＶＨ及びＶＬは、典型的には、アミノ末端からカルボキシ末端に以下の順：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４で配置された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成される。
【０１２７】
１つの実施態様において、抗体又は抗体試薬は、ヒト抗体又は抗体試薬ではない（例えば、抗体若しくは抗体試薬は、マウスである）が、ヒト化されている。「ヒト化抗体又は抗体試薬」は、ヒトにおいて天然で産生される抗体若しくは抗体試薬バリアントに対するその類似性を増大するためにタンパク質配列レベルで修飾されている非ヒト抗体又は抗体試薬を指す。抗体をヒト化する１つのアプローチは、マウス又は他の非ヒトＣＤＲのヒト抗体フレームワークへの移植を利用する。
【０１２８】
１つの実施態様において、ＣＡＲの細胞外標的結合ドメインは、可動性のリンカーペプチドを介して、抗体、一般に、モノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬドメインを融合することにより作製された、１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントを含むか、又は本質的にからなる。様々な実施態様において、ｓｃＦｖは、膜貫通型ドメイン及びＴ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、本明細書に記載される操作された細胞内シグナル伝達ドメインに融合される。
【０１２９】
１つの実施態様において、本明細書に記載されるテクノロジーにおいて有用なＣＡＲは少なくとも２個の抗原特異的標的領域、細胞外ドメイン、膜貫通型ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む。かかる実施態様において、２個以上の抗原特異的標的領域は、少なくとも２個の異なる抗原を標的にし、タンデムに配置され、リンカー配列により分けられ得る。別の実施態様において、ＣＡＲは、二重特異性ＣＡＲである。二重特異性ＣＡＲは、２個の異なる抗原に特異的である。
【０１３０】
標的／抗原
任意の細胞表面部分は、ＣＡＲにより標的にされ得る。最も頻繁には、標的は、人が、Ｔ細胞応答について標的化することを望む細胞上で異なって又は優先的に発現される細胞表面ポリペプチドである。これに関して、腫瘍抗原又は腫瘍関連抗原は、魅力的な標的をもたらし、これが、非腫瘍細胞若しくは組織への二次的な損傷を回避するか、又は少なくとも制限しながら、腫瘍細胞を標的にする手段をもたらす。腫瘍抗原又は腫瘍関連抗原の非限定的な例は、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ３７、ＣＥＡ、未成熟ラミニン受容体、ＴＡＧ−７２、ＨＰＶ  Ｅ６及びＥ７、ＢＩＮＧ−４、カルシウムにより活性化されたクロライドチャネル２、サイクリンＢ１、９Ｄ７、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＥｐｈＡ３、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、テロメラーゼ、メソセリウン、ＳＡＰ−１、サバイビン、ＢＡＧＥファミリー、ＣＡＧＥファミリー、ＧＡＧＥファミリー、ＭＡＧＥファミリー、ＳＡＧＥファミリー、ＸＡＧＥファミリー、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１、ＰＲＡＭＥ、ＳＳＸ−２、メランＡ／ＭＡＲＴ−１、Ｇｐ１００／ｐｍｅｌ１７、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１／−２、ＭＣ１Ｒ、ＢＲＣＡ１／２、ＣＤＫ４、ＭＡＲＴ−２、ｐ５３、Ｒａｓ、ＭＵＣ１、並びにＴＧＦ−βＲＩＩを含む。
【０１３１】
１つの実施態様において、標的は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１７（ＴＮＦＲＳＦ１７）としても知られる、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）である。ＢＣＭＡは、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）を特異的に認識する成熟Ｂリンパ球上で優先的に発現される細胞表面受容体である。ＢＣＭＡ配列は、多数の種について公知であり、例えば、ヒトＢＣＭＡ（ＮＣＢＩ遺伝子番号：６０８）ポリペプチド（例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１１８３．２）及びｍＲＮＡ（例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００１１９２．２）である。ＢＣＭＡは、その天然に存在するバリアント、分子、及び対立遺伝子を含む、ヒトＢＣＭＡを指すことができる。態様の何れかのいくつかの実施態様において、例えば、獣医適用において、ＢＣＭＡは、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ等のＢＣＭＡを指すことができる。ヒトＢＣＭＡの相同体及び／又はオルソログは、例えば、ＮＣＢＩオルソログ検索機能を使用して、又は参照ＢＣＭＡ配列に対する配列類似性について規定の種についての入手可能な配列データを検索して、当業者により、かかる種について容易に同定される。
【０１３２】
１つの実施態様において、ＢＣＭＡ結合配列は、ＢＣＭＡのリガンド又はＢＣＭＡに特異的に結合する抗体試薬を含む。１つの実施態様において、ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体試薬は、ヒト化抗ＢＣＭＡ  ｍマウス抗体由来のｓｃＦｖである。ヒト化マウス抗体由来１本鎖可変フラグメントの配向性は、ＶＬ−ＶＨ又はＶＨ−ＶＬであり得る。
【０１３３】
１つの実施態様において、標的は、ＣＤ３７である。ＣＤ３７は、４種の疎水性膜貫通型ドメインを含有する細胞表面タンパク質である。ＣＤ３７は、免疫細胞上でもっぱら発現され、ＣＤ３７は、成熟Ｂ細胞上で高度に発現され、Ｔ細胞及び骨髄細胞上で中度に発現される。ＣＤ３７配列は、多数の種について公知であり、例えば、ヒトＣＤ３７（ＮＣＢＩ遺伝子番号：９５１）ポリペプチド（例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１０３５１２０．１）及びｍＲＮＡ（例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿ＮＭ＿００１０４００３１．１）である。ＣＤ３７は、その天然に存在するバリアント、分子、及び対立遺伝子を含む、ヒトＣＤ３７を指すことができる。態様の何れかのいくつかの実施態様において、例えば、獣医適用において、ＣＤ３７は、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ等のＣＤ３７を指すことができる。ヒトＣＤ３７の相同体及び／又はオルソログは、例えば、ＮＣＢＩオルソログ検索機能を使用して、又は参照ＣＤ３７配列に対する配列類似性について規定の種についての入手可能な配列データを検索して、当業者により、かかる種について容易に同定される。１つの実施態様において、ＣＤ３７結合配列は、ＣＤ３７のリガンド又はＣＤ３７に特異的に結合する抗体試薬を含む。
【０１３４】
膜貫通型ドメイン
本明細書に記載されるそれぞれのＣＡＲは、必ず、細胞外標的結合ドメインを細胞内シグナル伝達ドメインに結び付ける膜貫通型ドメインを含む。
【０１３５】
本明細書において使用される、「膜貫通型ドメイン」（ＴＭドメイン）は、細胞の細胞膜にわたるＣＡＲの一般的な疎水性領域を指す。ＴＭドメインは、膜貫通型タンパク質（例えば、Ｉ型膜貫通型タンパク質若しくは他の膜貫通型タンパク質）、人工疎水性配列、又はその組合せの膜貫通型領域或いはそのフラグメントであり得る。具体例が本明細書において提供される一方、他の膜貫通型ドメインは、当業者にとって明らかであり、代替の実施態様のテクノロジーと関連して使用され得る。選択された膜貫通型領域又はそのフラグメントは、好ましくは、ＣＡＲの意図される機能と干渉しない。タンパク質又はポリペプチドの膜貫通型ドメインと関連して使用される、「そのフラグメント」は、タンパク質を細胞表面に固定するか、又は結合させるのに十分である膜貫通型ドメインの部分を指す。
【０１３６】
１つの実施態様において、ＣＡＲの膜貫通型ドメイン又はそのフラグメントは、ＣＤ８の膜貫通型ドメイン由来であるか、又は含む。任意の態様の代替の実施態様において、本明細書に記載されるＣＡＲの膜貫通型ドメイン又はそのフラグメントは、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータ若しくはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ−１（ＣＤｌ  ｌａ、ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦｌ）、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒａ、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤｌ  ｌｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤｌ  ｌａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤｌ  ｌｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤｌ  ｌｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（タクチル）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴ  ＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙｌ０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、及び／又はＮＫＧ２Ｃの膜貫通型ドメインから選択される膜貫通型ドメインを含む。
【０１３７】
ＣＤ８は、細胞傷害性Ｔリンパ球の細胞表面上で優先的に見られる抗原である。ＣＤ８は、免疫系内で細胞と細胞の相互作用を仲介し、Ｔ細胞共受容体として働く。ＣＤ８は、アルファ（ＣＤ８α）及びベータ（ＣＤ８β）鎖からなる。ＣＤ８ａ配列は、多数の種について公知であり、例えば、ヒトＣＤ８ａ、（ＮＣＢＩ遺伝子番号：９２５）ポリペプチド（例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１１３９３４５．１）及びｍＲＮＡ（例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０００００２．１２）である。ＣＤ８は、その天然に存在するバリアント、分子、及び対立遺伝子を含む、ヒトＣＤ８を指すことができる。態様の何れかのいくつかの実施態様において、例えば、獣医適用において、ＣＤ８は、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ等のＣＤ８を指すことができる。ヒトＣＤ８の相同体及び／又はオルソログは、例えば、ＮＣＢＩオルソログ検索機能を使用して、又は参照ＣＤ８配列に対する配列類似性について規定の種についての入手可能な配列データを検索して、当業者により、かかる種について容易に同定される。
【０１３８】
共刺激ドメイン
本明細書に記載されるそれぞれのＣＡＲは、共刺激分子の細胞内ドメイン、又は共刺激ドメインを含み得る。本明細書において使用される、用語「共刺激ドメイン」は、共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインを指す。共刺激分子は、抗原への結合の際にＴリンパ球の効率的な活性化及び機能に要求される第２のシグナルをもたらす抗原受容体又はＦｃ受容体以外の細胞表面分子である。かかる共刺激分子の実例は、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭＦ１）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ３）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７３（ＰＤ−Ｌ２）、ＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ  ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、及びＺＡＰ７０を含む。１つの実施態様において、細胞内ドメインは、４−１ＢＢの細胞内ドメインである。
【０１３９】
４−１ＢＢＬは、ＴＮＦスーパーファミリーに属する２型膜貫通型糖タンパク質である。４−１ＢＢＬは、活性化されたＴリンパ球上で発現される。４−１ＢＢＬ配列は、多数の種について公知であり、例えば、ヒト４−１ＢＢＬであり、ＴＮＦＳＦ９（ＮＣＢＩ遺伝子番号：８７４４）ポリペプチド（例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００３８０２．１）及びｍＲＮＡ（例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００３８１１．３）としても知られている。４−１ＢＢＬは、その天然に存在するバリアント、分子、及び対立遺伝子を含む、ヒト４−１ＢＢＬを指すことができる。態様の何れかのいくつかの実施態様において、例えば、獣医適用において、４−１ＢＢＬは、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ等の４−１ＢＢＬを指すことができる。ヒト４−１ＢＢＬの相同体及び／又はオルソログは、例えば、ＮＣＢＩオルソログ検索機能を使用して、又は参照４−１ＢＢＬ配列に対する配列類似性について規定の種についての入手可能な配列データを検索して、当業者により、かかる種について容易に同定される。
【０１４０】
細胞内シグナル伝達ドメイン
本明細書に記載されるＣＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、標的抗原への有効なＣＡＲ結合のメッセージを免疫エフェクター細胞の内部に移動して、エフェクター細胞機能、例えば、ＣＡＲが結合した標的細胞への細胞傷害性因子の放出を含む、活性化、サイトカイン産生、増殖及び細胞傷害性活性、又は抗原の細胞外ＣＡＲドメインへの結合後に誘発された他の細胞応答を誘発する際に関与するＣＡＲポリペプチドの一部を指す。
【０１４１】
上で示された通り、ＣＤ３は、適当な共刺激（例えば、共刺激分子の結合）と同時に関わるとき、Ｔリンパ球活性化を促進するＴ細胞同時受容体である。ＣＤ３複合体は、４つの異なる鎖からなり、哺乳類ＣＤ３は、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、及び２つのＣＤ３ε鎖からなる。これらの鎖は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及びＣＤ３ζとして公知の分子と関連して、Ｔリンパ球において活性化シグナルを生じる。完全なＴＣＲ複合体は、ＴＣＲ、ＣＤ３ζ、及び完全なＣＤ３複合体を含む。
【０１４２】
任意の態様のいくつかの実施態様において、本明細書に記載されるＣＡＲポリペプチドは、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）由来の免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ又はＩＴＡＭを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む。任意の態様のいくつかの実施態様において、ＩＴＡＭは、ＣＤ３ζ（ＩＴＡＭ３）のＩＴＡＭの３つのモチーフを含む。任意の態様のいくつかの実施態様において、ＣＤ３ζのＩＴＡＭの３つのモチーフは、変異している。
【０１４３】
ＩＴＡＭは、刺激性の方法、又は阻害性の方法の何れかで、ＴＣＲ複合体の一次活性化を調節する一次シグナル伝達ドメインとして知られている。刺激性の方法で作用する一次シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ又はＩＴＡＭとして知られているシグナル伝達モチーフを含有してもよい。テクノロジーにおける特定の使用である細胞内シグナル伝達ドメインを含有するＩＴＡＭの非限定的な例は、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３θ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄに由来するものを含む。
【０１４４】
当業者は、標準的な技術を使用して、変異を遺伝子又は遺伝子産物、例えば、ＩＴＡＭの核酸配列に導入する能力がある。例えば、点変異は、部位特異的点変異誘発、ＰＣＲ技術を介して導入され得る。部位特異的変異誘発キットは、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡを通じて市販されている。点変異を遺伝子又は遺伝子産物の核酸配列に導入する代替の方法の非限定的な例は、カセット変異誘発又は全プラスミド変異誘発を含む。
【０１４５】
１つの実施態様において、ＣＡＲにおいて利用されるＩＴＡＭは、ＣＤ３ζ（３つのＩＴＡＭモチーフを含有する）由来の変異したＩＴＡＭを含むＣＤ３ζの代替物、ＣＤ３ζ、及びＣＤ３ε、ＣＤ３θとして公知の代替のスプライスバリアントのトランケーション、並びにＣＤ３ε又はＣＤ３θとＣＤ３ζ間での融合物を発現するよう操作された人工コンストラクトに基づく。
【０１４６】
１つの実施態様において、ＣＤ３ζＩＴＡＭ３配列は、配列番号９の配列に対応するか、又は配列番号９の配列を含むか、又は配列番号９の配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％以上の配列同一性を有する配列を含む。
【０１４７】
１つの実施態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号９、１０、１１、又は１２から選択されるＣＤ３  ＩＴＡＭ３を含む。１つの実施態様において、チロシン残基は、フェニルアラニン残基に変異し、それにより、天然のチロシン残基のリン酸化を阻害する。変異され得る典型的なチロシン残基は含む、チロシン残基が、チロシンリン酸化の阻害をもたらす任意の残基に変異され得ることが企図されている。任意の態様の別の態様において、チロシンは、少なくとも１個、少なくとも２個、又は全３個のＩＴＡＭ（例えば、ＩＴＡＭ  Ｉ、ＩＩ、及びＩＩＩ）において変異される。
【０１４８】
１つの実施態様において、Ｔ細胞細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３エータ（ＣＤ３ε）、ＣＤ３シータ（ＣＤ３θ、又はＣＤ３ζのＩＴＡＭを含む。１つの実施態様において、Ｔ細胞細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３エータ（ＣＤ３ε）、ＣＤ３シータ（ＣＤ３θ、又はＣＤ３ζのＩＴＡＭである。
【０１４９】
１つの実施態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号９のＣＤ３  ＩＴＡＭ３配列に関連する欠損を含むＣＤ３  ＩＴＡＭ３配列を含む。
【０１５０】
配列番号９の配列が、以下で提供され、続いて、配列番号１０、１１、及び１２に関する追加の情報が提供される。
ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号９）
【０１５１】
ＣＤ３ζ−ｍｕｔＩＴＡＭ１（配列番号１０）。本明細書に記載される、ある特定の残基を、ＣＤ３ζ−ＩＴＡＭ３において変異して、ＣＤ３ζ−ＩＴＡＭ３、すなわち、Ｙ２１及びＹ３２の機能を阻害する。これらの残基の位置を、以下で太字で描写する。
ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＦＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＦＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号１０）
【０１５２】
ＣＤ３ζ−ｍｕｔＩＴＡＭ１及びｍｕｔＩＴＡＭ２（配列番号１１）。本明細書に記載される、ある特定の残基を、ＣＤ３ζ−ＩＴＡＭ３において変異して、ＣＤ３ζ−ＩＴＡＭ３、すなわち、Ｙ２１、Ｙ３２、Ｙ５９及びＹ７１の機能を阻害する。これらの残基の位置を、以下で太字で描写する。
ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＦＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＦＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＦＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＦＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号１１）
【０１５３】
ＣＤ３ζ−ｍｕｔＩＴＡＭ１及びｍｕｔＩＴＡＭ３（配列番号１２）。本明細書に記載される、ある特定の残基を、ＣＤ３ζ−ＩＴＡＭ３において変異して、ＣＤ３ζ−ＩＴＡＭ３、すなわち、Ｙ２１、Ｙ３２、Ｙ９０及びＹ１００の機能を阻害する。これらの残基の位置を、以下で太字で描写する。
ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＦＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＦＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＦＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＦＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号１２）
【０１５４】
ＣＤ３ζ  ＩＴＡＭ３配列に関連する欠損は、当該技術分野において周知の技術、例えば、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ、又はＺＦＮテクノロジーを使用して、行われ得る（上記も参照）。所望の配列特異性を達成するためのヌクレアーゼを操作する方法は、当該技術分野において公知であり、例えば、上で引用された参考文献において記載される。
【０１５５】
本発明における使用に適合され得る、ＣＡＲ及びＣＡＲ  Ｔ細胞のより詳細な記載は、例えば、Ｍａｕｓ等、Ｂｌｏｏｄ、２０１４年、１２３：２６２４−３５；Ｒｅａｒｄｏｎ等、Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、２０１４年、１６：１４４１−１４５８；Ｈｏｙｏｓ等、Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ、２０１２年、９７：１６２２；Ｂｙｒｄ等、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ、２０１４年、３２：３０３９−４７；Ｍａｈｅｒ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、２００９年、６９：４５５９−４５６２；及びＴａｍａｄａ等、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、２０１２年、１８：６４３６−６４４５において見ることができ、それらのそれぞれは、その全体が本明細書に出典明示により援用される。
【０１５６】
１つの実施態様において、ＣＡＲは、リンカードメインをさらに含む。本明細書において使用される、「リンカードメイン」は、本明細書に記載されるＣＡＲのドメイン／領域の何れと一緒に結合する、約２から１００個のアミノ酸長のオリゴペプチド又はポリペプチド領域を指す。いくつかの実施態様において、リンカーは、隣接する、結合したタンパク質ドメインが、互いに関連して動くのが自由であるように、グリシン及びセリンのような可動性の残基を含むか、又はから構成される。より長いリンカーは、立体的に互いに干渉しない２つの隣接するドメインを確実にすることを望むとき、使用され得る。リンカーは、切断可能であっても、又は切断可能でなくてもよい。切断可能なリンカーの例は、２Ａリンカー（例えば、Ｔ２Ａ）、２Ａ様リンカー又はその機能的同等物及びその組合せを含む。１つの実施態様において、リンカー領域は、ゾセア・アシグナ（Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａ）ウイルス由来のＴ２Ａである。本テクノロジーにおいて使用され得るリンカーの非限定的な例は、Ｐ２Ａ及びＦ２Ａを含む。ＣＡＲの状況における使用に加えて、これらの切断可能なリンカーは、本明細書に記載されるマルチシストロンベクターにおいても使用され得る。
【０１５７】
１つの実施態様において、本明細書に記載されるＣＡＲは、例えば、非侵襲性画像化（例えば、ポジトロン放出断層撮影ＰＥＴスキャン）を可能にするためのレポーター分子をさらに含む。レポーター分子を含む二重特異性ＣＡＲにおいて、第１の細胞外結合ドメイン及び第２の細胞外結合ドメインは、異なる又は同じレポーター分子を含み得る。二重特異性ＣＡＲ  Ｔ細胞において、第１のＣＡＲ及び第２のＣＡＲは、異なる又は同じレポーター分子を発現し得る。別の実施態様において、本明細書に記載されるＣＡＲは、単独又は基質若しくは化学物質（例えば、９−［４−［１８Ｆ］フルオロ−３−（ヒドロキシメチル）ブチル］グアニン（［１８Ｆ］ＦＨＢＧ））と組み合わせて画像化され得るレポーター分子（例えば、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｈ））をさらに含む。別の実施態様において、本明細書に記載されるＣＡＲは、非侵襲性技術（例えば、６４Ｃｕ２＋で機能化された金ナノ粒子（ＧＮＰ））を使用して容易に画像化され得るナノ粒子をさらに含む。非侵襲性の画像化のためのＣＡＲ  Ｔ細胞の標識は、例えば、Ｂｈａｔｎａｇａｒ  Ｐ等、Ｉｎｔｅｇｒ  Ｂｉｏｌ、（Ｃａｍｂ）、２０１３年１月；５（１）：２３１−２３８、及びＫｅｕ  ＫＶ等、Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ、２０１７年１月、１８；９（３７３）において概説され、それらは、それらの全体が出典明示により本明細書に援用される。
【０１５８】
ＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙは、Ｔ細胞（例えば、ＣＡＲ  Ｔ細胞）上で発現されたＣＡＲを画像化するのに有用な蛍光タグとして本明細書において示される。当該技術分野において公知の本質的に任意の蛍光タンパク質が、この目的のための蛍光タグとして使用され得ることが予測される。臨床適用のため、ＣＡＲは、蛍光タグ又は蛍光タンパク質を含む必要はない。
【０１５９】
コンストラクト、ベクター、及び発現
本発明はまた、本明細書に記載される、修飾されたＴ細胞の生成において使用するためのコンストラクト及びベクターを提供する。様々な例において、本発明は、それぞれが、本発明の修飾されたＴ細胞において発現されるべき複数のタンパク質についての別々のコード配列を含む、コンストラクトを提供する。これらの別々のコード配列は、本明細書に記載される切断可能なリンカー配列により互いに分けられ得る。例えば、ウイルス２Ａタンパク質（例えば、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、及びＦ２Ａ）をコードする配列は、別々の遺伝子の間に置かれ、転写されたとき、生成されたポリタンパク質の切断を指示することができる。上で示された通り、本発明のコンストラクト及びベクターは、多数の異なる組合せの配列の何れかを含み得る。例えば、本発明のコンストラクト又はベクターは、任意選択的に、ＣＡＲとの組合せで、ＵＬ４０、ＵＳ６、ＵＬ１８、ＨＬＡ−Ｅ、及びＨＬＡ−Ｇの一若しくは複数の全長又は部分配列（例えば、それぞれ）をコードする配列を含み得る。
【０１６０】
本発明の修飾されたＴ細胞における発現のためのタンパク質をコードする配列を含むコンストラクトは、ベクター内に含まれ、それもまた、本発明により提供される。様々な例において、ベクターは、レトロウイルスベクターである。レンチウイルスのようなレトロウイルスは、目的の遺伝子、又はキメラ遺伝子をコードする核酸配列のデリバリーのための好適なプラットフォームをもたらす。選択された核酸配列は、ベクターに挿入され、当該技術分野において公知の技術を使用してレトロウイルス粒子にパッケージングされ得る。次に、組換えウイルスは、単離され、例えば、インビトロ又はエクスビボで細胞にデリバリーされ得る。レトロウイルスシステムは、当該技術分野において周知であり、例えば、米国特許第５２１９７４０号；Ｋｕｒｔｈ及びＢａｎｎｅｒｔ、（２０１０年）、「Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ：  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ」、Ｃａｌｓｔｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（ＩＳＢＮ：９７８−１−９０４５５−５５−４）；並びにＨｕ及びＰａｔｈａｋ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、２０００年、５２：４９３−５１２において記載され、それらは、それらの全体が出典明示により本明細書に援用される。効率的なＤＮＡデリバリーのためのレンチウイルスシステムは、ＯｒｉＧｅｎｅ；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤから購入することができる。様々な実施態様において、タンパク質は、当該技術分野において公知であるベクター及び方法を使用する、タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターのトランスフェクション又はエレクトロポレーションにより、Ｔ細胞において発現される。
【０１６１】
本明細書に記載される修飾されたＴ細胞におけるタンパク質の効率的な発現は、タンパク質をコードする核酸のｍＲＮＡ、ＤＮＡ、又は遺伝子産物を検出する標準的なアッセイを使用して評価され得る。例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ＦＡＣＳ、ノーザンブロッティング、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、又は免疫組織化学が使用され得る。様々な実施態様において、本明細書に記載されるタンパク質は、恒常的に発現される。他の実施態様において、タンパク質は、組換え核酸配列によりコードされる。
【０１６２】
治療方法、組成物、及びキット
本発明は、それを必要とする対象（例えば、疾患若しくは状態を有するか、又は有すると診断された対象）において、例えば、がん、感染性疾患、自己免疫疾患或いは障害、形質細胞疾患或いは障害、或いは移植に関連する状態を含む、疾患及び状態の処置並びに予防において使用するための方法並びに組成物を提供する。これらの方法は、本明細書に記載される方法でＴ細胞を修飾すること、次に、修飾されたＴ細胞を対象に投与することを含む。態様の何れかのいくつかの実施態様において、修飾されたＴ細胞（例えば、本明細書に記載される一又は複数の追加の修飾を含むＣＡＲ−Ｔ細胞）は、対象への投与に先立ち、刺激され、及び／又は活性化される。
【０１６３】
本明細書において使用される、「状態」は、がん、感染性疾患、自己免疫疾患若しくは障害、形質細胞疾患若しくは障害、又は移植に関連する状態を含む。疾患又は状態を有する対象は、疾患又は状態を診断する現在の方法を使用して医師により同定され得る。これらの状態を特徴付け、診断に役立つ、疾患若しくは状態の症状及び／又は合併症は、当該技術分野において周知であり、疲労、持続感染、及び持続性出血を含むが、これらに限定されない。例えば、疾患又は状態の診断に役立ち得る試験は、血液スクリーニング及び骨髄試験を含むが、これらに限定されず、規定の状態について当該技術分野において公知である。疾患若しくは状態の家族歴、又は疾患若しくは状態のリスク因子への曝露もまた、対象が、疾患若しくは状態を有しそうであるかどうかの決定、又は疾患若しくは状態の診断をなすのに役立ち得る。
【０１６４】
本明細書において使用される「がん」は、固有の形質、正常な細胞制御の喪失が、未調節の成長、分化の欠如、局所組織浸潤、及び転移をもたらす細胞の過剰増殖を指すことができ、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、又は固形腫瘍であり得る。白血病の非限定的な例は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、及び慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を含む。１つの実施態様において、がんは、ＡＬＬ又はＣＬＬである。リンパ腫の非限定的な例は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、辺縁帯リンパ腫、バーキットリンパ腫、ヘアリーセル白血病（ＨＣＬ）を含む。１つの実施態様において、がんは、ＤＬＢＣＬ又は濾胞性リンパ腫である。固形腫瘍の非限定的な例は、副腎皮質腫瘍、胞状軟部肉腫、癌、軟骨肉腫、結腸直腸癌、類腱腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、内分泌腫瘍、卵黄嚢腫瘍、類上皮血管内皮腫、ユーイング肉腫、胚細胞性腫瘍（固形腫瘍）、骨及び軟組織の巨細胞腫、肝芽腫、肝細胞がん、メラノーマ、腎腫瘍、ニューロブラストーマ、非横紋筋肉腫軟部肉腫（ＮＲＳＴＳ）、骨肉腫、傍脊柱肉腫、腎細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、滑膜肉腫、及びウィルムス腫瘍を含む。固形腫瘍は、骨、筋肉、組織、又は器官において見ることができ、肉腫又は癌であり得る。本明細書に記載されるテクノロジーの任意の態様を使用して、即時適用において挙げられていないがんを含む、全ての種類のがんを処置することができることが企図される。本明細書において使用される、用語「腫瘍」は、細胞又は組織の、例えば、悪性型若しくは良性型の異常な成長を指す。
【０１６５】
本明細書において使用される、「自己免疫疾患又は障害」は、人の免疫系が、外来細胞と健常な細胞を区別できないことにより、特徴付けられる。これは、人の健常な細胞をプログラム細胞死に標的化する人の免疫系をもたらす。自己免疫疾患又は障害の非限定的な例は、炎症性関節炎、１型糖尿病、多発性硬化症（ＭＳ）、乾癬、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、脈管炎、アレルギー性喘息、アトピー性皮膚炎、及び接触過敏症のようなアレルギー性炎症を含む。自己免疫関連疾患又は障害の他の例は、関節リウマチ、グレーヴス病（甲状腺機能亢進）、橋本甲状腺炎（甲状腺機能不全）、セリアック病、クローン病、潰瘍性大腸炎、ギランバレー症候群、原発性胆汁性硬化症／肝硬変、硬化性胆管炎、自己免疫性肝炎、レイノー現象、強皮症、シェーグレン症候群、グッドパスチャー症候群、ウェゲナー肉芽腫症、リウマチ性多発筋痛症、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、慢性疲労性症候群（ＣＦＳ）、自己免疫アジソン病、強直性脊椎炎、急性散在性脳脊髄炎、抗リン脂質抗体症候群、再生不良性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、重症筋無力症、眼球クローヌス・ミオクローヌス運動失調、視神経炎、オード甲状腺炎、天疱瘡、悪性貧血、イヌでの多発性関節炎、ライター症候群、高安動脈炎、温式自己免疫性溶血性貧血、ウェゲナー肉芽腫症並びに線維筋痛症（ＦＭ）を含むが、これらに限定されない。
【０１６６】
１つの実施態様において、哺乳類Ｔ細胞は、外来細胞（すなわち、ウイルス若しくは細菌細胞）と闘う人の能力を障害する、異常に低い活性の免疫系をもたらす免疫系障害、又は免疫不全障害を有する患者について得られる。
【０１６７】
形質細胞は、感染症と闘うために必要とされる抗体を生成し、放出するために機能するＢリンパ球から生成された白血球である。本明細書において使用される、「形質細胞障害又は疾患」は、形質細胞の異常な増殖により特徴付けられる。異常な形質細胞は、ウイルス又は細菌細胞のような、外来の対象と闘う減少した能力をもたらす、健常な形質細胞を「クラウディングアウト」する能力がある。形質細胞障害の非限定的な例は、アミロイドーシス、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、骨硬化性骨髄腫（ＰＯＥＭＳ症候群）、意義不明の単クローン性γグロブリン血症（ＭＧＵＳ）、及び形質細胞骨髄腫を含む。
【０１６８】
本明細書に記載される組成物（以下を参照）は、疾患若しくは状態を有するか、又は疾患若しくは状態を有すると診断された対象に投与され得る。いくつかの実施態様において、本明細書に記載される方法は、状態の症状を緩和するために、有効量の本明細書に記載される修飾されたＴ細胞（例えば、活性化されたＣＡＲ  Ｔ細胞）を対象に投与することを含む。本明細書において使用される、「状態の症状を緩和すること」は、任意の状態又は状態と関連する症状を改善することである。同等の未処置のコントロールと比較して、かかる低減は、任意の標準的技術により測定された少なくとも５％、１０％、２０％、４０％、５０％、６０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上である。本明細書に記載される組成物を対象に投与する様々な手段は、当業者に知られている。１つの実施態様において、本明細書に記載される組成物は、全身又は局所投与される。別の実施態様において、本明細書に記載される組成物は、静脈内投与される。別の実施態様において、本明細書に記載される組成物は、腫瘍の部位で投与される。
【０１６９】
本明細書において使用される用語「有効量」は、疾患若しくは障害の少なくとも一又は複数の症状を緩和するために必要とされる修飾されたＴ細胞（例えば、活性化されたＣＡＲ  Ｔ細胞）の量を指し、所望の効果をもたらすための細胞調製物又は組成物の十分な量に関する。用語、その「治療上有効量」は、典型的な対象に投与されるとき、特定の抗疾患又は状態効果をもたらすのに十分である修飾されたＴ細胞（例えば、活性化されたＣＡＲ  Ｔ細胞）の量を指す。様々な文脈において、本明細書において使用される有効量はまた、疾患の症状の発症を遅延させる、症状疾患の経過を変化させる（例えば、非限定的に、疾患又は状態の進行を遅くすること）か、又は状態の症状を好転させるのに十分な量も含む。したがって、正確な「有効量」を特定することは、一般に、実行可能ではない。しかしながら、任意の所定の場合について、適当な「有効量」は、日常的な実験のみを使用して当業者により決定され得る。
【０１７０】
有効量、毒性、及び治療有効性は、細胞培養物又は実験動物において標準的な医薬手法により、評価することができる。投薬量は、利用される投薬形態及び利用される投薬経路に依存して変動し得る。毒性と治療効果の間の用量比は、治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。大きな治療指数を示す組成物及び方法が好ましい。治療上有効な用量は、細胞培養アッセイからまず推定され得る。また、用量は、細胞培養、又は適当な動物モデルにおいて決定されるＩＣ５０（すなわち、症状の半分の最大阻害を達成する、修飾されたＴ細胞の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するために、動物モデルにおいて処方され得る。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。任意の特定の投薬量の効果は、適したバイオアッセイ、例えば、とりわけ、骨髄試験のためのアッセイによりモニターされ得る。投薬量は、医師により決定され、必要に応じて、処置の観察された効果に合うよう調整され得る。
【０１７１】
１つの態様において、本明細書に記載されるテクノロジーは、本明細書に記載される修飾されたＴ細胞、及び任意選択的に、薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物に関する。薬学的組成物の有効成分は、少なくとも、本明細書に記載される修飾されたＴ細胞を含む。いくつかの実施態様において、薬学的組成物の有効成分は、本質的に、本明細書に記載される修飾されたＴ細胞からなる。いくつかの実施態様において、薬学的組成物の有効成分は、本明細書に記載される修飾されたＴ細胞からなる。細胞ベースの治療製剤のための薬学的に許容される担体は、食塩水及び水性バッファー溶液、リンゲル液、並びに血清アルブミン、ＨＤＬ及びＬＤＬのような、血清成分を含む。「賦形剤」、「担体」、「薬学的に許容される担体」等のような用語は、本明細書において互換的に使用される。
【０１７２】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載される修飾されたＴ細胞を含む薬学的組成物は、非経口投与形態であり得る。非経口投薬形態の投与は、典型的には、混入物に対する患者の天然の防御を迂回するので、修飾されたＴ細胞自体以外の成分は、無菌であるか、又は患者への投与に先立ち無菌化される能力がある。非経口投薬形態の例は、注射する準備が整った溶液、注射用の薬学的に許容されるビークルにおいて溶解されるか、又は懸濁される準備が整った乾燥製品、注射する準備が整った懸濁液、及びエマルジョンを含むが、これらに限定されない。これらの何れかを、投与に先立ち、修飾されたＴ細胞調製物に加えることができる。
【０１７３】
本明細書に開示される修飾されたＴ細胞の非経口投薬形態をもたらすために使用され得る適当なビークルは、当業者に周知である。例は、非限定的に、食塩水溶液；グルコース溶液；塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、デキストロース注射液、デキストロース及び塩化ナトリウム注射液を含むが、これらに限定されない水性ビークル；非限定的に、エチルアルコール、ポリエチレングリコール、及びプロピレングリコールのような水混和性ビークル；並びに非限定的に、コーン油、ココナッツ油、ピーナッツ油、ゴマ油、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、及び安息香酸ベンジルのような非水性ビークルを含む。
【０１７４】
本発明はさらに、本発明の方法の実施において使用するためのキットをさらに含む。したがって、キットは、任意選択的に、修飾されたＴ細胞を作製するための一或いは複数の試薬（例えば、遺伝子配列の欠損及び／若しくは付加を行うために使用される核酸分子並びに／又は酵素）を含み得る。キットは、本発明の方法により生成された「普遍的な」Ｔ細胞をさらに含み、患者処置のための治療材料の「棚からの」供給源であるとして使用され得る。キットは、修飾されたＴ細胞を投与するために使用され得る指示書又は装置、並びに任意選択的に、本発明の組成物及び方法の使用についての指示書をさらに含み得る。
【０１７５】
投薬量
本明細書において使用される用語としての「単位投薬形態」は、適当な１回の投与のための投薬量を指す。例示の目的で、単位投薬形態は、デリバリー装置、例えば、シリンジ又は静脈内ドリップバックに配置した治療剤の量であり得る。１つの実施態様において、単位投薬形態は、単一の投与において投与される。別の実施態様において、１回より多い単位投薬形態は、同時に投与することができる。
【０１７６】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載される修飾されたＴ細胞は、単独療法として投与される、すなわち、状態のための別の処置は、対象に同時に投与されない。
【０１７７】
本明細書に記載される修飾されたＴ細胞を含む薬学的組成物は、一般に、体重１ｋｇ当たり１０４から１０９個の細胞、ある場合では、その範囲内の全ての整数値を含む、体重１ｋｇ当たり１０５から１０６個の細胞の投薬量で投与され得る。必要なら、修飾されたＴ細胞組成物はまた、これらの投薬量で複数回投与され得る。細胞は、免疫療法において一般に知られている注入技術を使用することにより、投与され得る（例えば、Rosenberg等、New Eng. J. of Med、319:1676、1988年を参照）。
【０１７８】
ある特定の態様において、修飾されたＴ細胞を対象に投与し、次に、血液を続いて再度抜き（又は除去療法を行い）、本明細書に記載されるそれ由来のＴ細胞を活性化し、患者にこれらの活性化され、拡大されたＴ細胞を再度注入することが望ましいことがある。このプロセスは、数週間毎に複数回行われ得る。ある特定の態様において、Ｔ細胞は、ｌ０ｃｃから４００ｃｃの抜かれた血液から活性化され得る。ある特定の態様において、Ｔ細胞は、２０ｃｃ、３０ｃｃ、４０ｃｃ、５０ｃｃ、６０ｃｃ、７０ｃｃ、８０ｃｃ、９０ｃｃ、又はｌ００ｃｃの抜かれた血液から活性化される。
【０１７９】
投与様式は、例えば、静脈内（ｉ．ｖ．）注射又は注入を含み得る。本明細書に記載される組成物は、患者に経動脈、腫瘍内、節間、又は髄内投与され得る。いくつかの実施態様において、修飾されたＴ細胞の組成物は、腫瘍、リンパ節、又は感染の部位に直接注射されてもよい。１つの実施態様において、本明細書に記載される組成物は、体腔又は体液（例えば、腹水（ascite）、胸膜液、腹水（peritoneal fluid）、若しくは脳脊髄液）に投与される。
【０１８０】
特定の典型的な態様において、上で記載された通り、対象は、白血球を集めるか、濃縮するか、若しくはエクスビボで枯渇させて、目的の細胞、例えば、Ｔ細胞を選択し、及び／又は単離する、白血球除去を経験してもよい。このプロセスは、標準的な方法、例えば、ＣＤ３及びＣＤ２８に対する抗体でコーティングされた磁気ビーズの使用による刺激を含み得る。或いは、Ｔ細胞は、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）との接触により拡大され得る。これらの細胞を操作して、キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）を発現させ、任意選択的に、細胞は、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）発現のノックダウン又は不活性化により修飾される。ＣＳＲそれぞれは、（ｉ）Ｔ細胞共刺激受容体（例えば、特に、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＯＸ４０、若しくは４−１ＢＢ）又はＴ細胞受容体についての抗体試薬或いは天然のリガンド；（ｉｉ）リンカードメイン、及び（ｉｉｉ）膜貫通型ドメインを含む。１つの例において、ａＡＰＣを操作して、ＣＤ３及びＣＤ２８に対してＣＳＲを発現させる。抗体試薬、リンカードメイン、及び膜貫通型ドメインは、例えば、本明細書において他の所で記載される。ａＡＰＣを作製するために使用され得る細胞は、例えば、赤骨髄細胞（例えば、Ｋ５６２細胞）、骨髄細胞、又はＨＬＡ発現若しくは機能的ＨＬＡを欠くように操作された細胞のような、例えば、ヒト細胞を含む。したがって、Ｔ細胞単離物は、本明細書に記載されるａＡＰＣ（例えば、本明細書に記載される抗ＣＤ２８及び抗ＣＤ３ＣＤＲを発現するａＡＰＣ）と接触させることにより拡大され、テクノロジーの一又は複数のＣＡＲコンストラクトが、導入され得るように、処理され、これにより、ＣＡＲ  Ｔ細胞を生じ得る。それを必要とする対象は、続いて、高い用量の化学療法での標準的処置、続いて、末梢血幹細胞移植を経験し得る。移植後又は移植と同時に、対象は、拡大されたＣＡＲ  Ｔ細胞の注入を受けることができる。１つの実施態様において、拡大された細胞は、外科手術の前又は後に投与される。
【０１８１】
いくつかの実施態様において、リンパ球枯渇は、本明細書に記載される一又は複数の修飾されたＴ細胞の投与に先立ち、対象において行われる。かかる実施態様において、リンパ球枯渇は、メルファラン、シトキサン、シクロホスファミド、及びフルダラビンの一又は複数を投与することを含み得る。
【０１８２】
患者に投与されるべき上記の処置の投薬量は、処置される状態及び処置のレシピエントの正確な性質と共に変動する。ヒト投与のための投薬量の計量は、当該技術分野で許容される習慣に従い行われ得る。
【０１８３】
いくつかの実施態様において、単一の処置計画が要求される。他方、一又は複数の続く用量又は処置計画の投与は、行われ得る。例えば、３か月間の隔週での処置後、処置は、１か月当たり１回、６か月又は１年以上の間繰り返され得る。いくつかの実施態様において、最初の処置の後、追加の処置は投与されない。
【０１８４】
本明細書に記載される組成物の投薬量は、医師により決定され、必要に応じて、処置の観察された効果に合うよう調整され得る。処置の持続時間及び頻度に関して、熟練した臨床医は、処置が治療効果をもたらすときを決定するために対象をモニターするか、さらなる細胞を投与するかどうかを決定するか、処置を中止するか、処置を再開するか、又は処置計画に他の変更を加えることは、典型的である。投薬量は、サイトカイン放出症候群のような、有害な副作用を引き起こすほど多いべきではない。一般に、投薬量は、患者の年齢、状態、及び性別と共に変動し、当業者により決定され得る。投薬量はまた、任意の合併症の現象において個々の医師により調節され得る。
【０１８５】
併用療法
本明細書に記載される修飾されたＴ細胞（例えば、活性化されたＣＡＲ  Ｔ細胞）は、他の公知の薬剤及び療法と組合されて使用され得る。本明細書において使用される「組み合わせて」投与されるは、２種（又はそれ以上の）異なる処置が、障害（例えば、疾患又は状態）に伴う対象の苦痛の経過中対象にデリバリーされること、例えば、２種以上の処置が、対象が、障害と診断された後、かつ障害が、治癒していないか、若しくは除去されていないか、又は処置が、他の理由のため中止される前に、デリバリーされることを意味する。いくつかの実施態様において、投与に関して重複が存在するように、１種の処置のデリバリーは、第２のデリバリーが始まるときに依然として生じている。これは、時に、本明細書において「同時」又は「並行デリバリー」として言及される。他の実施態様において、他方の処置のデリバリーが始まる前に、一方の処置のデリバリーが終わる。何れかの場合のいくつかの実施態様において、処置は、併用された投与のため、より有効である。例えば、第２の処置は、第１の処置の非存在下で投与されたなら観察されるものより、より有効である、例えば、同等の効果が、第２の処置を少なくして観察されるか、若しくは第２の処置は、第２の処置が、より高い程度に症状を低減するか、又は類似の状況が、第１の処置に関しても観察される。いくつかの実施態様において、デリバリーは、症状における低減、又は障害と関連する他のパラメーターが、他方の非存在下でデリバリーされた一方の処置で観察されるものより大きくなるようなデリバリーである。２種の処置の効果は、部分的に相加、全体的に相加、又は相加より大きくあり得る。デリバリーは、デリバリーされる第１の処置の効果が、第２がデリバリーされるとき、依然として検出可能であるようなデリバリーであり得る。本明細書に記載される修飾されたＴ細胞（例えば、活性化されたＣＡＲ  Ｔ細胞）及び少なくとも１種の追加の治療剤は、同じ組成物において、又は別々の組成物において、同時に、又は連続して投与され得る。連続投与について、本明細書に記載される修飾されたＴ細胞（例えば、ＣＡＲを発現する細胞）が、最初に投与され、追加の薬剤が、２番目に投与され得るか、又は投与の順が、逆であることもできる。ＣＡＲ  Ｔ療法及び／又は他の治療剤、手法若しくはモダリティは、活発な障害の期間中、又は寛解若しくはあまり活発でない疾患の期間中に、投与され得る。修飾されたＴ細胞療法は、別の処置前、処置と同時、処置後、又は障害の寛解中に、投与され得る。
【０１８６】
組合せで投与されるとき、修飾されたＴ細胞及び追加の薬剤（例えば、第２若しくは第３の薬剤）、又は全てが、例えば、単独療法として、個々に使用されるそれぞれの薬剤の量若しくは投薬量より多い、少ない、又は同じである量又は用量で投与され得る。ある特定の実施態様において、修飾されたＴ細胞、追加の薬剤（例えば、第２若しくは第３の薬剤）、又は全ての投与される量或いは投薬量は、個々に使用されるそれぞれの薬剤の量又は投薬量より少ない（例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、若しくは少なくとも５０％）。他の実施態様において、所望の効果（例えば、がんの処置）をもたらす、修飾されたＴ細胞、追加の薬剤（例えば、第２若しくは第３の薬剤）、若しくは全ての量又は投薬量は、同じ治療効果を達成するために個々に要求されるそれぞれの薬剤の量又は投薬量より少ない（例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、又は少なくとも５０％少ない）。さらなる実施態様において、本明細書に記載される修飾されたＴ細胞は、外科手術、化学療法、放射線、及びｍＴＯＲ経路阻害剤、サイクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸塩、及びＦＫ５０６のような免疫抑制剤、抗体、又はＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体若しくは他の抗体療法のような他の免疫除去剤、サイトキシン、フルダラビン、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカイン、又はＩｚｕｍｏｔｏ等、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ、１０８：９６３−９７１、２００８年に記載されるもののようなペプチドワクチンと組み合わせた処置計画において使用され得る。
【０１８７】
１つの実施態様において、本明細書に記載される修飾されたＴ細胞は、チェックポイント阻害剤と組み合わせて使用され得る。典型的なチェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ−１阻害剤（ニボルマブ、ＭＫ−３４７５、ペムブロリズマブ、ピディリズマブ、ＡＭＰ−２２４、ＡＭＰ−５１４）、抗ＣＴＬＡ４阻害剤（イピリムマブ及びトレメリムマブ）、抗ＰＤＬ１阻害剤（アテゾリズマブ、アベロマブ、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ、ＭＥＤＩ４７３６、及びＭＰＤＬ３２８０Ａ）、並びに抗ＴＩＭ３阻害剤を含む。
【０１８８】
１つの実施態様において、本明細書に記載される修飾されたＴ細胞は、化学療法剤と組み合わせて使用され得る。典型的な化学療法剤は、アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシン（例えば、リポソーマルドキソルビシンン））、ビンカアルカロイド（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン）、アルキル化剤（例えば、シクロホスファミド、デカルバジン、メルファラン、イホスファミド、テモゾロミド）、免疫細胞抗体（例えば、アレムツザマブ、ゲムツズマブ、リツキシマブ、トシツモマブ）、代謝拮抗物質（例えば、葉酸アンタゴニスト、ピリミジンアナログ、プリンアナログ及びアデノシンデアミナーゼ阻害剤（例えば、フルダラビン）を含む）、ｍＴＯＲ阻害剤、ＴＮＦＲグルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連タンパク質（ＧＩＴＲ）アゴニスト、プロテアソーム阻害剤（例えば、アクラシノマイシンＡ、グリオトキシン又はボルテゾミブ）、サリドマイド又はサリドマイド誘導体（例えば、レナリドミド）のような免疫調節物質を含む。併用療法での使用が考慮される一般的な化学療法剤は、アナストロゾール（Ａｒｉｍｉｄｅｘ（登録商標））、ビカルタミド（Ｃａｓｏｄｅｘ（登録商標））、硫酸ブレオマイシン（Ｂｌｅｎｏｘａｎｅ（登録商標））、ブスルファン（Ｍｙｌｅｒａｎ（登録商標））、ブスルファン注射液（Ｂｕｓｕｌｆｅｘ（登録商標））、カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標））、Ｎ４−ペントキシカルボニル−５−デオキシ−５−フルオロシチジン、カルボプラチン（Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ（登録商標））、カルムスチン（ＢｉＣＮＵ（登録商標））、クロラムブチル（Ｌｅｕｋｅｒａｎ（登録商標））、シスプラチン（Ｐｌａｔｉｎｏｌ（登録商標））、クラドリビン（Ｌｅｕｓｔａｔｉｎ（登録商標））、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）又はＮｅｏｓａｒ（登録商標））、シタラビン、シトシンアラビノシド（Ｃｙｔｏｓａｒ−Ｕ（登録商標））、シタラビンリポソーム注射液（ＤｅｐｏＣｙｔ（登録商標））、ダカルバジン（ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ（登録商標））、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ、コスメガン）、ダウノルビシン塩酸塩（Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ（登録商標））、ダウノルビシンクエン酸塩リポソーム注射液（ＤａｕｎｏＸｏｍｅ（登録商標））、デキサメタゾン、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））、ドキソルビシン塩酸塩（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標）、Ｒｕｂｅｘ（登録商標））、エトポシド（Ｖｅｐｅｓｉｄ（登録商標））、フルダラビンリン酸塩（Ｆｌｕｄａｒａ（登録商標））、５−フルオロウラシル（Ａｄｒｕｃｉｌ（登録商標）、Ｅｆｕｄｅｘ（登録商標））、フルタミド（Ｅｕｌｅｘｉｎ（登録商標））、テザシチジビン、ゲムシタビン（ジフルオロデオキシシチジン）、ヒドロキシウレア（Ｈｙｄｒｅａ（登録商標））、イダルビシン（Ｉｄａｍｙｃｉｎ（登録商標））、イホスファミド（ＩＦＥＸ（登録商標））、イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（登録商標））、Ｌ−アスパラギナーゼ（ＥＬＳＰＡＲ（登録商標））、ロイコボリンカルシウム、メルファラン（Ａｌｋｅｒａｎ（登録商標））、６−メルカプトプリン（Ｐｕｒｉｎｅｔｈｏｌ（登録商標））、メトトレキサート（Ｆｏｌｅｘ（登録商標））、ミトキサントロン（Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ（登録商標））、マイロターグ、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））、フェニックス（Ｙｔｔｒｉｕｍ９０／ＭＸ−ＤＴＰＡ）、ペントスタチン、カルムスチンインプラントを含むポリフェプロザン２０（Ｇｌｉａｄｅｌ（登録商標））、タモキシフェンクエン酸塩（Ｎｏｌｖａｄｅｘ（登録商標））、テニポシド（Ｖｕｍｏｎ（登録商標））、６−チオグアニン、チオテパ、チラパザミン（Ｔｉｒａｚｏｎｅ（登録商標））、注射用塩酸トポテカン（Ｈｙｃａｍｐｔｉｎ（登録商標））、ビンブラスチン（Ｖｅｌｂａｎ（登録商標））、ビンクリスチン（Ｏｎｃｏｖｉｎ（登録商標））、及びビノレルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標））を含む。典型的なアルキル化剤は、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、スルホン酸アルキル、ニトロソウレア及びトリアゼン）：ウラシルマスタード（Ａｍｉｎｏｕｒａｃｉｌ  Ｍｕｓｔａｒｄ（登録商標）、Ｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎａｃｉｌ（登録商標）、Ｄｅｍｅｔｈｙｌｄｏｐａｎ（登録商標）、Ｄｅｓｍｅｔｈｙｌｄｏｐａｎ（登録商標）、Ｈａｅｍａｎｔｈａｍｉｎｅ（登録商標）、Ｎｏｒｄｏｐａｎ（登録商標）、Ｕｒａｃｉｌ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｍｕｓｔａｒｄ（登録商標）、Ｕｒａｃｉｌｌｏｓｔ（登録商標）、Ｕｒａｃｉｌｍｏｓｔａｚａ（登録商標）、Ｕｒａｍｕｓｔｉｎ（登録商標）、Ｕｒａｍｕｓｔｉｎｅ（登録商標））、クロルメチン（Ｍｕｓｔａｒｇｅｎ（登録商標））、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）、Ｎｅｏｓａｒ（登録商標）、Ｃｌａｆｅｎ（登録商標）、Ｅｎｄｏｘａｎ（登録商標）、Ｐｒｏｃｙｔｏｘ（登録商標）、Ｒｅｖｉｍｍｕｎｅ（商標））、イホスファミド（Ｍｉｔｏｘａｎａ（登録商標））、メルファラン（Ａｌｋｅｒａｎ（登録商標））、クロラムブチル（Ｌｅｕｋｅｒａｎ（登録商標））、ピポブロマン（Ａｍｅｄｅｌ（登録商標）、Ｖｅｒｃｙｔｅ（登録商標））、トリエチレンメラミン（Ｈｅｍｅｌ（登録商標）、Ｈｅｘａｌｅｎ（登録商標）、Ｈｅｘａｓｔａｔ（登録商標））、トリエチレンチオホスホルアミン、テモゾロミド（Ｔｅｍｏｄａｒ（登録商標））、チオテパ（Ｔｈｉｏｐｌｅｘ（登録商標））、ブスルファン（Ｂｕｓｉｌｖｅｘ（登録商標）、Ｍｙｌｅｒａｎ（登録商標））、カルムスチン（ＢｉＣＮＵ（登録商標））、ロムスチン（ＣｅｅＮＵ（登録商標））、ストレプトゾシン（Ｚａｎｏｓａｒ（登録商標））、並びにダカルバジン（ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ（登録商標））を含むが、これらに限定されない。追加の典型的なアルキル化剤は、オキサリプラチン（Ｅｌｏｘａｔｉｎ（登録商標））；テモゾロミド（Ｔｅｍｏｄａｒ（登録商標）及びＴｅｍｏｄａｌ（登録商標））；ダクチノマイシン（アクチノマイシン−Ｄとしても知られる、Ｃｏｓｍｅｇｅｎ（登録商標））；メルファラン（Ｌ−ＰＡＭとしても知られる、Ｌ−サルコリシン、及びフェニルアラニンマスタード、Ａｌｋｅｒａｎ（登録商標））；アルトレタミン（ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ）としても知られる、Ｈｅｘａｌｅｎ（登録商標））；カルムスチン（ＢｉＣＮＵ（登録商標））；ベンダムスチン（Ｔｒｅａｎｄａ（登録商標））；ブスルファン（Ｂｕｓｕｌｆｅｘ（登録商標）及びＭｙｌｅｒａｎ（登録商標））；カルボプラチン（Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ（登録商標））；ロムスチン（ＣＣＮＵとしても知られる、ＣｅｅＮＵ（登録商標））；シスプラチン（ＣＤＤＰとしても知られる、Ｐｌａｔｉｎｏｌ（登録商標）及びＰｌａｔｉｎｏｌ（登録商標）−ＡＱ）；クロラムブチル（Ｌｅｕｋｅｒａｎ（登録商標））；シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）及びＮｅｏｓａｒ（登録商標））；ダカルバジン（ＤＴＩＣ、ＤＩＣ及びイミダゾールカルボキサミドとしても知られる、ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ（登録商標））；アルトレタミン（ヘキサメチラミン（ＨＭＭ）としても知られる、Ｈｅｘａｌｅｎ（登録商標））；イホスファミド（Ｉｆｅｘ（登録商標））；プレドヌマスチン；プロカルバジン（Ｍａｔｕｌａｎｅ（登録商標））；メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード、ムスチン及び塩酸メクロエタミンとしても知られる、Ｍｕｓｔａｒｇｅｎ（登録商標））；ストレプトゾシン（Ｚａｎｏｓａｒ（登録商標））；チオテパ（チオホスホアミド、ＴＥＳＰＡ及びＴＳＰＡとしても知られる、Ｔｈｉｏｐｌｅｘ（登録商標））；シクロホスファミド（Ｅｎｄｏｘａｎ（登録商標）、Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）、Ｎｅｏｓａｒ（登録商標）、Ｐｒｏｃｙｔｏｘ（登録商標）、Ｒｅｖｉｍｍｕｎｅ（登録商標））；並びにベンダムスチンＨＣ１（Ｔｒｅａｎｄａ（登録商標））を含むが、これらに限定されない。典型的なｍＴＯＲ阻害剤は、例えば、テムシロリムス；リダフォロリムス（公式には、デフェロリムスとして知られる、
ＡＰ２３５７３及びＭＫ８６６９としても知られ、ＰＣＴ公開第０３／０６４３８３号に記載される（ｌＲ，２Ｒ，４５）−４−［（２Ｒ）−２［（１Ｒ，９５，１２５，１５Ｒ，１６Ｅ，１８Ｒ，１９Ｒ，２１Ｒ，２３５，２４Ｅ，２６Ｅ，２８Ｚ，３０５，３２５，３５Ｒ）−ｌ，１８−ジヒドロキシ−１９，３０−ジメトキシ−１５，１７，２１，２３、２９，３５−ヘキサメチル−２，３，１０，１４，２０−ペンタオキソ−ｌｌ，３６−ジオキサ−４−アザトリシクロ［３０．３．１．０４’９］ヘキサトリアコンタ−１６，２４，２６，２８−テトラエン−１２−イル］プロピル］−２−メトキシシクロヘキシルジメチルホスフィネート）；エベロリムス（Ａｆｉｎｉｔｏｒ（登録商標）又はＲＡＤＯＯｌ）；ラパマイシン（ＡＹ２２９８９、Ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ（登録商標））；シマピモド（ＣＡＳ１６４３０１−５１−３）；エムシロリムス、（５−｛２，４−ビス［（３５，）−３−メチルモルホリン−４−イル］ピリド［２，３−（ｉ］ピリミジン−７−イル｝−２−メトキシフェニル）メタノール（ＡＺＤ８０５５）；２−アミノ−８−［イラウ５，−４−（２−ヒドロキシエトキシ）シクロヘキシル］−６−（６−メトキシ−３−ピリジニル）−４−メチル−ピリド［２，３−ＪＪピリミジン−７（８Ｈ）−オン（ＰＦ０４６９１５０２、ＣＡＳ１０１３１０１−３６−４）；並びにＮ２−［ｌ，４−ジオキソ−４−［［４−（４−オキソ−８−フェニル−４Ｈ−ｌ−ベンゾピラン−２−イル）モルホリニウム−４−イル］メトキシ］ブチル］−Ｌ−アルギニルグリシル−Ｌ−ａ−アスパルチルＬ−セリン−、分子内塩（ＳＦ１１２６、ＣＡＳ９３６４８７−６７−１）、並びにＸＬ７６５を含む。典型的な免疫調節物質は、例えば、アフツズマブ（Ｒｏｃｈｅ（登録商標）から入手可能）；ペグフィルグラスチム（Ｎｅｕｌａｓｔａ（登録商標））；レナリドミド（ＣＣ−５０１３、Ｒｅｖｌｉｍｉｄ（登録商標））；サリドマイド（Ｔｈａｌｏｍｉｄ（登録商標））、アクチミド（ＣＣ４０４７）；並びにＩＲＸ−２（インターロイキン１、インターロイキン２、及びインターフェロンγを含むヒトサイトカインの混合物、ＣＡＳ９５１２０９−７１−５、ＩＲＸ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓから入手可能）を含む。典型的なアントラサイクリンは、例えば、ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標）及びＲｕｂｅｘ（登録商標））；ブレオマイシン（ｌｅｎｏｘａｎｅ（登録商標））；ダウノルビシン（ダウノルビシン塩酸塩、ダウノマイシン、及びルビドマイシン塩酸塩、Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ（登録商標））；ダウノルビシンリポソーム（ダウノルビシンクエン酸リポソーム、ＤａｕｎｏＸｏｍｅ（登録商標））；ミトキサントロン（ＤＨＡＤ、Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ（登録商標））；エピルビシン（Ｅｌｌｅｎｃｅ（商標））；イダルビシン（Ｉｄａｍｙｃｉｎ（登録商標）、Ｉｄａｍｙｃｉｎ  ＰＦＳ（登録商標））；マイトマイシンＣ（Ｍｕｔａｍｙｃｉｎ（登録商標））；ゲルダナマイシン；ハービマイシン；ラビドマイシン；並びにデスアセチルラビドマイシンを含む。典型的なビンカアルカロイドは、例えば、ビノレルビン酒石酸塩（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標））、ビンクリスチン（Ｏｎｃｏｖｉｎ（登録商標））、及びビンデシン（Ｅｌｄｉｓｉｎｅ（登録商標）））；ビンブラスチン（ビンブラスチン硫酸塩、ビンカロイコブラスチン及びＶＬＢとしても知られる、Ａｌｋａｂａｎ−ＡＱ（登録商標）及びＶｅｌｂａｎ（登録商標））；並びにビノレルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標））を含む。典型的なプロテオソーム阻害剤は、ボルテゾミブ（Ｖｅｌｃａｄｅ（登録商標））；カルフィルゾミブ（ＰＸ−１７１−００７、（５）−４−メチル−Ｎ−（（５）−ｌ−（（（５）−４−メチル−ｌ−（（Ｒ）−２−メチルオキシラン−２−イル）−ｌ−オキソペンタン−２−イル）アミノ）−ｌ−オキソ−３−フェニルプロパン−２−イル）−２−（（５，）−２−（２−モルホリノアセタミド）−４−フェニルブタンアミド）−ペンタンアミド）；マリゾミブ（ＮＰＴ００５２）；イキサゾミブクエン酸エステル（ＭＬＮ−９７０８）；デランゾミブ（ＣＥＰ−１８７７０）；並びにＯ−メチル−Ｎ−［（２−メチル−５−チアゾリル）カルボニル］−Ｌ−セリル−Ｏ−メチル−Ｎ−［（ｌｌＳ’）−２−［（２Ｒ）−２−メチル−２−オキシラニル］−２−オキソ−ｌ−（フェニルメチル）エチル］−Ｌ−セリンアミド（ＯＮＸ−０９１２）を含む。
【０１８９】
当業者は、使用の化学療法剤を容易に同定することができる（例えば、Physicians' Cancer Chemotherapy Drug Manual、2014年、Edward Chu、Vincent T. DeVita Jr.、Jones & Bartlett Learning;Principles of Cancer Therapy、Harrison's Principles of Internal Medicine、第18編の第85章;Therapeutic Targeting of Cancer Cells:Era of Molecularly Targeted Agents and Cancer Pharmacology、Abeloff's Clinical Oncology、2013年、ElsevierのChs.28-29;及びFischer D S(編):The Cancer Chemotherapy Handbook、第4編、St.Louis、Mosby-Year Book、2003年を参照）。
【０１９０】
１つの例において、本明細書に記載される修飾されたＴ細胞は、ＧＩＴＲを標的とする分子及び／若しくはＧＩＴＲ機能を調節する分子のレベル並びに／又は活性を減少する分子、制御性Ｔ細胞集団を減少する分子、ｍＴＯＲ阻害剤、ＧＩＴＲアゴニスト、キナーゼ阻害剤、非受容体チロシンキナーゼ阻害剤、ＣＤＫ４阻害剤、並びに／或いはＢＴＫ阻害剤と組み合わせて対象に投与される。
【０１９１】
有効性
例えば、本明細書に記載される状態の処置における、又は本明細書に記載される応答（例えば、がん細胞における低減）を誘導するための修飾されたＴ細胞（例えば、活性化されたＣＡＲ  Ｔ細胞）の有効性は、熟練した臨床医により決定され得る。しかしながら、本明細書に記載される状態の徴候若しくは症状の一又は複数が、有益な様式で変更されるか、他の臨床上許容される症状が、改善されるか、若しくは向上されるか、又は所望の応答が、本明細書に記載される方法による処置後、例えば、少なくとも１０％誘導されるなら、処置は、本明細書において使用される用語「有効な処置」であるとみなされる。有効性は、例えば、本明細書に記載される方法に従い処置される状態のマーカー、指標、症状、及び／若しくは発生率、又は任意の他の適当な測定可能なパラメーターを測定することにより、評価され得る。本明細書に記載される方法は、マーカーのレベル若しくは状態の症状を、例えば、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％以上減少し得る。
【０１９２】
有効性はまた、入院により評価される、又は医療行為に必要とされる、悪化するという個体の失敗により測定され得る（すなわち、疾患の進行が、停止される）。これらの指標を測定する方法は、当業者に公知であり、及び／又は本明細書に記載される。
【０１９３】
処置は、個体又は動物における疾患の任意の処置を含み（いくつかの非限定的な例は、ヒト若しくは動物を含む）、（１）疾患を阻害すること、例えば、症状（例えば、疼痛若しくは炎症）の悪化を予防すること；又は（２）疾患の重症度を軽減すること、例えば、症状の後退を引き起こすことを含む。疾患の処置についての有効量は、それを必要とする対象に投与されたとき、その疾患について、その用語が、本明細書において定義された有効な処置をもたらすのに十分である量を意味する。薬剤の有効性は、状態の身体的指標又は所望の応答を評価することにより、決定され得る。かかるパラメーターの任意の１つ、若しくはパラメーターの任意の組合せを測定することにより、投与及び／又は処置の有効性をモニターすることは、十分に、当業者の能力内である。規定のアプローチの有効性は、本明細書に記載される状態の動物モデル、例えば、ＡＬＬの処置において評価され得る。実験動物モデルを使用するとき、マーカーにおける統計上有意な変化が観察されるとき、処置の有効性が証明される。
【０１９４】
本出願を通じて引用される、参照文献、取得された特許、公開された特許出願、及び係属中の特許出願を含む全ての特許及び他の刊行物は、例えば、本明細書に記載されるテクノロジーと関連して使用され得るかかる刊行物において記載される方法論を記載し、開示する目的で、出典明示により本明細書に明白に援用される。これらの刊行物は、本出願の出願日より前の開示について、もっぱら提供される。これに関して何れも、本発明者らが、先行テクノロジーの理由で、又は任意の他の理由のため、かかる開示に先行する権利がないという承認とみなされるべきではない。日付についての全ての宣誓、又はこれらの文書の内容についての表明は、出願人が入手可能な情報に基づき、日付の正確性又はこれらの文書の内容についての承認を構成しない。
【０１９５】
本開示の実施態様の説明は、包括的であるか、又は開示を開示される正確な形態に制限することを意図されない。開示の特定の実施態様、及び開示についての実施例は、説明の目的で本明細書において記載される一方、当業者は、容易に認識するので、開示の範囲内で様々な同等の修飾が可能である。例えば、方法の工程又は機能は、規定の順で提示される一方、代替の実施態様は、異なる順で機能してもよいか、又は機能は、実質的に同時に行われてもよい。本明細書において提供される開示の教示は、必要に応じて他の手法又は方法に適用され得る。本明細書に記載される様々な実施態様を組み合わせて、さらなる実施態様を提供し得る。開示の態様を、必要なら、修飾して、上記の参考文献及び出願の組成物、機能及び概念を利用して、開示のなおさらなる実施態様を提供し得る。さらに、生物学的な機能等価の考慮に起因し、いくつかの変更が、種類若しくは量において生物学的又は化学的作用に影響することなく、タンパク質構造において、なされ得る。これら及び他の変更は、詳細な説明に照らして、開示になされ得る。かかる修飾の全ては、添付の請求の範囲内に含まれることが意図される。
【０１９６】
前述の実施態様の何れかの特定の構成要素は、他の実施態様における構成要素のため組合されるか、又は置き換えられ得る。さらに、開示のある特定の実施態様と関連する利点が、これらの実施態様の文脈で記載される一方、他の実施態様はまた、かかる利点を示してもよく、全ての実施態様が、開示の範囲内にあるかかる利点を必ずしも示す必要がない。
【０１９７】
本明細書に記載されるテクノロジーは、以下の実施例によりさらに説明され、それらは、決して、さらなる制限と解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１９８】
実施例１：  ジャーカットＴ細胞及び初代Ｔ細胞におけるＣＤ３ζのノックアウト、並びにＣＡＲでのＣＤ３ζノックアウト細胞の形質導入
ＣＲＩＳＰＲを使用して遺伝子ノックアウトを達成するために、発現の非存在下でフレームシフト変異を導く、標的ゲノム配列における挿入及び／又は欠損の生成によるＣＲＩＳＰＲ介在性遺伝子破壊を目的に、ＣＤ３ζの様々なコード配列を標的とするガイドを開発した。
【０１９９】
ＣＲＩＳＰＲを使用して、ジャーカット細胞においてＣＤ３ζ又はＴ細胞受容体アルファ鎖（ＴＲＡＣ）をノックアウトした（図１）。ＣＤ３ｚ  ＫＯのため使用した２種の特定のガイド配列は、（ｉ）ＣＡＧＴＴＧＣＣＧＡＴＴＡＣＡＧＧＴＡ及び（ｉｉ）ＧＴＧＧＡＡＧＧＣＧＣＴＴＴＴＣＡＣＣＧである。生じた細胞をフローサイトメトリーにより解析して、ＣＤ３／Ｔ細胞受容体複合体の発現に対するノックアウトの効果を示した。両方のノックアウトが、これらの細胞におけるＣＤ３／Ｔ細胞受容体の発現を除去し、これは、偽エレクトロポレーションした（ＥＰ）細胞と比較し、ＥＰの７日後に抗ＣＤ３ｅ抗体の使用により決定した。ＣＲＩＳＰＲも使用して、初代Ｔ細胞においてＣＤ３ζ又はＴＲＡＣをノックアウトした（図２）。抗ＣＤ３ｅ抗体を使用した、Ｅｐの８日後／刺激の１２日後のフローサイトメトリー解析は、ノックアウトそれぞれが、これらの細胞においてＣＤ３／Ｔ細胞受容体複合体の発現を除去することを示した。
【０２００】
化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）を使用したＴ７Ｅ１破壊アッセイを行い、ジャーカットＴ細胞株並びに初代ヒトＴ細胞においてＣＤ３ζに対して指向化させた様々なｇＲＮＡを使用して得たパーセント遺伝子破壊についてスクリーニングした（図３）。エクソン／イントロン１部位に対して指向化させたｇＲＮＡ（２）、及びＣＤ３ｚのエクソン１を標的にする追加のガイドＧＴＧＧＡＡＧＧＣＧＣＴＴＴＴＣＡＣＣＧを使用して、最大破壊を得た。
【０２０１】
磁気ビーズを使用したＣＤ３ｅの負の選択により、ｇＲＮＡ（２）を使用してＣＲＩＳＰＲによりＣＤ３ζについてノックアウトしたジャーカット細胞を濃縮した（図４）。ＣＤ３ｅ及びＴＣＲａ／ｂに対する抗体での染色により、Ｔ細胞受容体ノックアウトを確認した。負の選択により、およそ５０％ＴＣＲ（−）細胞に濃縮した。
【０２０２】
親の修飾していないジャーカット細胞、並びにｇＲＮＡ（２）を使用してＣＤ３ζについてノックアウトし、ＣＤ３ｅについての負の選択により濃縮した細胞を、単一細胞ソーティングの対象にした（図５）。ＴＣＲａ／ｂ及びＣＤ３ｅに対する抗体を使用して得た結果は、これらの細胞において、Ｔ細胞受容体発現を除去したことを示す。
【０２０３】
ソーティング後、単一細胞クローン（ｎ＝２４）を拡大し、ＣＤ３ζ及びＣＤ３ｅ染色について評価した（図６）。親コントロールと比較して、Ｔ細胞受容体発現の除去を示す、クローン５を、機能アッセイにおける使用のため選択した。
【０２０４】
親の修飾していない細胞及び上で記載した、ＣＲＩＳＰＲを使用してＣＤ３ζについてノックアウトした細胞に、複数の細胞内シグナル伝達ドメインを利用してＣＤ１９に対して指向化させた様々なＣＡＲをコードするベクターを形質導入した。形質導入後、様々なＣＡＲコンストラクトと組み合わせたＣＤ３ｅにより、Ｔ細胞受容体発現について、細胞を解析した（図７）。
【０２０５】
プレートに結合したＯＫＴ３（抗ＣＤ３）又はＮａｌｍ６（２：１）の何れかで、ＣＤ１９ＣＡＲを形質導入したＴ細胞を一晩刺激した（図８）。ＮＦＡＴルシフェラーゼ活性化を評価した。ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ｈＣＤ１９に特異的であり、＞９５％で形質導入された。ＣＤ３ζノックアウトジャーカット株において、ＴＣＲ特異的ＣＤ３ｅに応答したＮＦＡＴ活性化の欠如が存在した。しかしながら、ＣＤ３ζノックアウトジャーカット株は、Ｎａｌｍ６に対するＣＡＲ特異的活性化を維持する。１条件当たりＮ＝３で、実験を３回繰り返した。
【０２０６】
実施例２：  拒絶を低減するためのＣＤ３ζノックアウトＴ細胞の修飾
Ｔ細胞の形質導入において使用するため、レンチウイルスベクターを構築した（図９）。ヌンチャク（ｐＭＧＨ８１）は、３種の全長ＣＭＶタンパク質（ＵＬ４０、ＵＳ６、及びＵＬ１８）、コメツキムシ緑色ルシフェラーゼ（ＣＢＧ；細胞殺傷アッセイ及びインビボ画像化において使用するため）、増強した緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ；下流の蛍光ソーティングのため）、並びにウイルス２Ａタンパク質（Ｔ２ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、及びＦ２Ａ；コードされたポリタンパク質の切断を指示するため）を発現するコンストラクトである。ＣＭＶタンパク質は、上で説明した通り、Ｔ細胞を投与したレシピエントの免疫攻撃の回避を促進するよう機能する。
【０２０７】
ニンジャ（ｐＭＧＨ８２）は、修飾した抗ヒトＣＤ１９＿ＢＢｚキメラ抗原受容体、並びにＣＭＶ  ＵＬ４０  ＣＭＶウイルスタンパク質及びシグナルペプチドを発現するコンストラクトである。シグナルペプチドを、発現したとき、ＮＫ細胞殺傷阻害を助ける、非古典的ＨＬＡ−Ｅに負荷する。ＣＭＶ  ＵＳ６及びＵＬ１８も含み、並びにｍＣｈｅｒｒｙも、導入遺伝子発現のためのレポーター遺伝子として含む。上で示した通り、コードされたポリタンパク質の切断を指示するためのウイルス２Ａエレメント（Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、及びＥ２Ａ）を含む。
【０２０８】
ニンジャベクターによりコードされるウイルスで、ジャーカット及び初代ヒトＴ細胞に形質導入した（図１０）。データは、コードされたタンパク質が細胞において発現することを示す。ヌンチャクベクター（ｐＭＧＨ８１）によりコードされるウイルスで、ラージ腫瘍細胞株に形質導入した（図１１）。導入遺伝子陽性ラージ細胞を、コンストラクト２Ａエレメントから発現したＧＦＰで標識した。ＧＦＰ（＋）細胞は、ＧＦＰ（＋）、ＨＬＡ低／陰性細胞集団において示す通り、ＨＬＡクラスＩタンパク質の発現を減少させた。形質導入していない細胞を、コントロールとして使用した。上で考察した通り、減少したＨＬＡ発現は、同種Ｔ細胞産物融合後、親による拒絶から同種Ｔ細胞産物を保護する。図１２は、ｐＭＧＨ８１を発現するソーティングされたラージ腫瘍細胞は、ＨＬＡクラスＩ発現を減少させたことを示す。
【０２０９】
図１３は、初代ヒトＴ細胞におけるＴＡＰ阻害剤（ＢｏＨＶ１  ＵＬ４９．５、ＣＭＶ  ＵＳ６、ＥＢＶ  ＢＮＬＦ２ａ、及びＨＳＶ  ＩＣＰ４７）発現並びに得られたＨＬＡクラスＩダウンレギュレーション／ノックアウトを示す。導入遺伝子（ＧＦＰ）陽性＝ＨＬＡクラスＩ陰性。
【０２１０】
実施例３：  細胞受容体アルファ鎖（ＴＲＡＣ）のノックアウト
ＣＤ３ζと関連して上で記載したものと同様の方法を使用して、ＴＲＡＣを標的にした。ＴＲＡＣについて使用した特定のｇＲＮＡは、ＡＧＡＧＴＣＴＣＴＣＡＧＣＴＧＧＴＡＣＡであった。図１４において示す通り、エレクトロポレーションの８日後／刺激の１２日後の初代Ｔ細胞において、ＴＲＡＣ（ＡＧＡＧＴＣＴＣＴＣＡＧＣＴＧＧＴＡＣＡ）又はＣＤ３ζ（ＧＴＧＧＡＡＧＧＣＧＣＴＴＴＴＣＡＣＣＧ）のノックアウトは、ＴＣＲの細胞表面発現のノックアウトを引き起こす。
【０２１１】
本発明の様々な態様は、次の番号を付けられたパラグラフに記載される。
１．ＣＤ３ζ、Ｔ細胞受容体アルファ鎖（ＴＲＡＣ）、及び／若しくはＴ細胞受容体ベータ鎖（ＴＲＢＣ）遺伝子の低減した又は除去された発現に起因して、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の低減した又は除去された発現を有するよう修飾された、単離されたＴリンパ球。
２．ＣＤ３ζ、ＴＲＡＣ及び／若しくはＴＲＢＣ遺伝子、制御配列、コード配列、エクソン、又はその部分が変異し、低減した、ヌル、又は非機能的ＣＤ３ζ、ＣＤ３エータ、ＣＤ３シータ、ＴＲＡＣ及び／又はＴＲＢＣ発現を生じるゲノムを含む、パラグラフ１の単離されたＴリンパ球。
３．変異が欠損である、パラグラフ２の単離されたＴリンパ球。変異は、任意選択的に、フレームシフト変異又は欠損であり得る。
４．変異が、Ｔ細胞受容体又はＣＤ３ζシグナル伝達のアセンブリを破壊する、パラグラフ２又は３の単離されたＴリンパ球。
５．ＣＤ３ζ、ＴＲＡＣ、及び／又はＴＲＢＣ遺伝子が欠損しているゲノムを含む、パラグラフ１から４の何れか１つの単離されたＴリンパ球。
６．ＣＤ３ζ、ＴＲＡＣ、及び／又はＴＲＢＣ遺伝子のうちの２個の対立遺伝子が欠損しているゲノムを含む、パラグラフ５の単離されたＴリンパ球。
７．ＣＤ３ζ、ＴＲＡＣ、及び／又はＴＲＢＣ遺伝子の低減した発現が、ヌル発現である、パラグラフ１から６の何れか１つの単離されたＴリンパ球。
８．ＣＤ３エータ又はＣＤ３シータの低減した発現を有する、パラグラフ１から７の何れか１つの単離されたＴリンパ球。
９．ＨＬＡ遺伝子座、又はその部分が、欠損している、パラグラフ１から８の何れか１つの単離されたＴリンパ球。
１０．ＨＬＡ遺伝子座が、染色体６上にある、パラグラフ９の単離されたＴリンパ球。
１１．減少したＨＬＡクラスＩ発現をさらに有する、パラグラフ１から１０の何れか１つの単離されたＴリンパ球。
１２．単離されたＴリンパ球が、ＨＬＡ−Ｇを発現するようさらに修飾された、パラグラフ１から１１の何れか１つの単離されたＴリンパ球。
１３．Ｔリンパ球が投与される宿主からの免疫攻撃の回避においてＴリンパ球を促進する異種性タンパク質をコードする遺伝子をさらに含む、パラグラフ１から１２の何れか１つの単離されたＴリンパ球。
１４．異種性タンパク質が、Ｔ細胞又はＮＫ介在性拒絶の回避を促進する、パラグラフ１３の単離されたＴリンパ球。
１５．異種性タンパク質が、ウイルスタンパク質である、パラグラフ１３又は１４の単離されたＴリンパ球。
１６．ウイルスタンパク質が、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、及びウシヘルペスウイルス−１（ＢｏＨＶ−１）からなる群から選択されるウイルス由来である、パラグラフ１５の単離されたＴリンパ球。
１７．ウイルスタンパク質が、ＣＭＶ由来であり、ＵＳ６、ＵＬ４０、及びＵＬ１８からなる群から選択される、パラグラフ１６の単離されたＴリンパ球。
１８．ウイルスタンパク質が、抗原プロセシングと関連する輸送体（ＴＡＰ）を阻害する、パラグラフ１６の単離されたＴリンパ球。
１９．ウイルスタンパク質が、ＣＭＶ  ＵＳ６、ＨＳＶ  ＩＣＰ４７、ＢｏＨＶ−１  ＵＬ４９．５、及びＥＢＶ  ＢＮＬＦ２ａからなる群から選択される、パラグラフ１８の単離されたＴリンパ球。
２０．レポーター遺伝子をコードする遺伝子をさらに含む、パラグラフ１から１９の何れか１つの単離されたＴリンパ球。
２１．レポーター遺伝子が、切断型上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）遺伝子、切断型前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、切断型低親和性神経成長因子受容体（ＬＮＧＦＲ）、切断型ＣＤ１９を含む、パラグラフ２０の単離されたＴリンパ球。
２２．治療タンパク質をコードする遺伝子をさらに含む、パラグラフ１から２１の何れか１つの単離されたＴリンパ球。
２３．治療タンパク質が、抗原受容体を含む、パラグラフ２２の単離されたＴリンパ球。
２４．抗原受容体が、選択された標的抗原に対する特異性を付与する、パラグラフ２３の単離されたＴリンパ球。
２５．抗原受容体が、選択されたリガンドに対する特異性を付与する、パラグラフ２３の単離されたＴリンパ球。
２６．抗原受容体が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、パラグラフ２３の単離されたＴリンパ球。
２７．ＣＡＲが、細胞外ドメイン、膜貫通型領域ドメイン、及び細胞内領域ドメインを含む、パラグラフ２６の単離されたＴリンパ球。
２８．細胞外ドメインが、１本鎖抗体を含み、細胞内ドメインが、Ｔ細胞活性化ドメインを含む、パラグラフ２７の単離されたＴリンパ球。
２９．細胞死を誘導する遺伝子をさらに含む、パラグラフ１から２８の何れか１つの単離されたＴリンパ球。
３０．遺伝子が、活性化可能な自殺遺伝子である、パラグラフ２９の単離されたＴリンパ球。
３１．自殺遺伝子が、薬物により活性化される、パラグラフ３０の単離されたＴリンパ球。
３２．自殺遺伝子が、カスパーゼ９アポトーシス促進分子に融合されたＦＫ５０６結合ドメインを発現する、パラグラフ３１の単離されたＴリンパ球。
３３．修飾されたＴリンパ球を生成する方法であって、Ｔリンパ球においてＣＤ３ζ、ＴＲＡＣ、及び／又はＴＲＢＣ遺伝子を不活性化することを含む方法。
３４．ＣＤ３ζ、ＴＲＡＣ、及び／又はＴＲＢＣ遺伝子の不活性化が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ９系）の群から選択されるヌクレアーゼ又は系を使用して行われる、パラグラフ３３の方法。
３５．修飾されたＴリンパ球が、パラグラフ１から３２の何れか１つの修飾されたＴリンパ球である、パラグラフ３３又は３４の方法。
３６．疾患について対象を処置する方法であって、対象に、パラグラフ１から３２の何れか１つの単離されたＴリンパ球を投与することを含む方法。
３７．疾患が、がん、感染性疾患、及び移植手法から生じる徴候からなる群から選択される、パラグラフ３６の方法。
３８．対象において免疫原性反応を低減する方法であって、対象に、パラグラフ１から３２の何れか１つに記載のＴリンパ球を投与することを含む方法。
３９．Ｔリンパ球が、導入遺伝子を発現する、パラグラフ３８の方法。
４０．Ｔリンパ球が、内在性Ｔ細胞受容体シグナル伝達分子との低減した競合を有する、パラグラフ３８の方法。
４１．Ｔリンパ球が、対象に関して自家である、パラグラフ３６から４０の何れか１つの方法。
４２．Ｔリンパ球が、対象に関して異種である、パラグラフ３６から４０の何れか１つの方法。
４３．修飾されたＴリンパ球が、インビボで拡大される、パラグラフ３６から４２の何れか１つの方法。
４４．修飾されたＴリンパ球が、対象の血液において拡大される、パラグラフ３６から４３の何れか１つの方法。
４５．修飾されたＴリンパ球が、投与に先立ち、インビトロで拡大される、パラグラフ３６から４４の何れか１つの方法。
４６．治療タンパク質及び免疫系回避を促進する異種性タンパク質をコードする遺伝子を含むベクター。
４７．異種性タンパク質が、ウイルスタンパク質である、パラグラフ４６のベクター。
４８．ウイルスタンパク質が、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、及びウシヘルペスウイルス−１（ＢｏＨＶ−１）からなる群から選択されるウイルス由来である、パラグラフ４７のベクター。
４９．ウイルスタンパク質が、ＣＭＶ由来であり、ＵＳ６、ＵＬ４０、及びＵＬ１８からなる群から選択される、パラグラフ４８のベクター。
５０．ウイルスタンパク質が、抗原プロセシングと関連する輸送体（ＴＡＰ）を阻害する、パラグラフ４８のベクター。
５１．ウイルスタンパク質が、ＣＭＶ  ＵＳ６、ＨＳＶ  ＩＣＰ４７、ＢｏＨＶ−１  ＵＬ４９．５、及びＥＢＶ  ＢＮＬＦ２ａからなる群から選択される、パラグラフ５０のベクター。
５２．治療タンパク質がＣＡＲである、パラグラフパラグラフ４６から５１の何れか１つのベクター。
５３．パラグラフ４６から５２のベクターの一又は複数をＴリンパ球に形質導入する方法。
５４．パラグラフ３３から３５又は５３の何れか１つの方法により作製された修飾されたＴリンパ球若しくは細胞株、又はその継代培養物。
５５．パラグラフ１から３２の何れか１つの少なくとも１個の修飾されたＴリンパ球を含む薬学的組成物。
５６．（ａ）パラグラフ３３から３５又は５３の何れか１つの方法により修飾されたＴリンパ球の集団を調製する工程、及び（ｂ）修飾されたＴリンパ球を対象に投与する工程を含む、対象を処置する方法。
５７．Ｔリンパ球が、処置されるべき対象に由来する、パラグラフ５６の方法。
５８．Ｔリンパ球が、健常ドナーに由来する、パラグラフ５６の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2020513775.tif 000015
【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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