(57)【要約】  本発明は、冠状動脈アテローム性硬化症及びその関連疾患に罹患しているか罹患した疑いがある、または冠状動脈アテローム性硬化症およびその関連疾患に罹患するリスクがある被験者に、予防及び／または治療に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、被験者の冠状動脈アテローム性硬化症およびその関連疾患を予防及び／または治療するための方法に関する。本発明はさらに、冠状動脈アテローム性硬化症およびその関連疾患を予防及び／または治療するための、プラスミノーゲンを含む薬物、薬物組成物、製品、キットに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
冠状動脈アテローム性硬化症およびその関連疾患に罹患しているか罹患した疑いがある、または冠状動脈アテローム性硬化症およびその関連疾患に罹患するリスクがある被験者に、予防及び／または治療に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、被験者の冠状動脈アテローム性硬化症およびその関連疾患を予防及び／または治療するための方法。
【請求項２】
前記冠状動脈アテローム性硬化症の関連疾患は、冠状動脈アテローム性硬化症によって引き起こされる冠状動脈性心臓病、狭心症、心筋梗塞、不整脈、心不全を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アテローム性動脈硬化症は糖尿病と合併して発症するアテローム性動脈硬化症である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記プラスミノーゲンは、被験者の血清の総コレステロールレベルを低下させることと、被験者の血清のトリグリセリドレベルを低下させることと、被験者の血清の低密度リポタンパク質レベルを低下させることと、被験者の血清の高密度リポタンパク質レベルを上昇させることとからなる群より選ばれる一つ以上によってアテローム性動脈硬化症を予防及び／または治療する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記プラスミノーゲンは、被験者の動脈管壁における脂質沈着を低減することによってアテローム性動脈硬化症を予防及び／または治療する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
肝臓の脂肪代謝を促進することと、肝臓の脂肪輸送を促進することと、被験者の肝臓における脂肪沈着を低減することとからなる群より選ばれる一つ以上によって冠状動脈アテローム性硬化症を予防及び／または治療する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、冠状動脈アテローム性硬化症による被験者の組織、器官虚血損傷及びその関連疾患を予防及び／または治療するための方法。
【請求項８】
前記被験者の組織、器官虚血損傷は、冠状動脈アテローム性硬化症による心筋損傷である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記関連疾患は、心臓供血不足によって引き起こされる冠状動脈性心臓病、狭心症、心筋梗塞、不整脈、または心不全である、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記組織、器官虚血損傷またはその関連疾患は、脳虚血損傷またはその関連疾患である、請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記疾患は、脳虚血、脳血栓、脳萎縮、脳出血、または脳塞栓である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記関連疾患は、腎機能不全、高血圧、糸球体繊維化、腎不全、または尿毒症である、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、冠状動脈アテローム性硬化症による被験者の冠状動脈血栓およびその関連疾患を予防及び／または治療するための方法。
【請求項１４】
前記疾患は、冠状動脈性心臓病と、狭心症と、心筋梗塞と、不整脈と、心不全と、脳虚血と、脳血栓と、脳萎縮と、脳出血と、脳塞栓と、脳梗塞と、腎機能不全と、高血圧と、糸球体繊維化と、腎不全と、尿毒症と、腸壊死と、間欠性跛行と、壊疽とを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、被験者の糖尿病と合併した冠状動脈アテローム性硬化症を予防及び／または治療するための方法。
【請求項１６】
被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、糖尿病被験者の冠状動脈心臓病、狭心症、心筋梗塞、不整脈、または心不全を予防及び／または治療するための方法。
【請求項１７】
被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、被験者のアテローム性動脈硬化症およびその関連疾患を予防及び／または治療するための方法。
【請求項１８】
前記アテローム性動脈硬化症は、アテローム性大動脈硬化症、冠状動脈アテローム性硬化症、脳動脈アテローム性硬化症、腎動脈アテローム性硬化症、腸間膜動脈アテローム性硬化症、下肢アテローム性動脈硬化症を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記アテローム性動脈硬化症の関連疾患は、アテローム性動脈硬化による組織、器官虚血によって引き起こされる関連疾患を含み、冠状動脈アテローム性硬化症によって引き起こされる冠状動脈性心臓病、狭心症、心筋梗塞、不整脈、心不全；脳動脈アテローム性硬化症によって引き起こされる脳虚血、脳血栓、脳萎縮、脳出血、脳塞栓；腎動脈アテローム性硬化症によって引き起こされる腎機能不全、高血圧、糸球体繊維化、腎不全、尿毒症；腸間膜動脈アテローム性硬化症によって引き起こされる満腹後の腹痛、消化不良、便秘、腸壁壊死、便血；下肢アテローム性動脈硬化症によって引き起こされる間欠性跛行、壊疽を含む、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記アテローム性動脈硬化症は、冠状動脈アテローム性硬化症と、脳動脈アテローム性硬化症と、腎動脈アテローム性硬化症とからなる群より選ばれる、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記アテローム性動脈硬化症は、糖尿病と合併したアテローム性動脈硬化症である、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記プラスミノーゲンは、被験者の血清の総コレステロールレベルを低下させることと、被験者の血清のトリグリセリドレベルを低下させることと、被験者の血清の低密度リポタンパク質レベルを低下させることと、被験者の血清の高密度リポタンパク質レベルを上昇させることとからなる群より選ばれる一つ以上によってアテローム性動脈硬化症を予防及び／または治療する、請求項１７〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記プラスミノーゲンは、被験者の動脈管壁における脂質沈着を低下させることによってアテローム性動脈硬化症を予防及び／または治療する、請求項１７〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記プラスミノーゲンは、肝臓の脂肪代謝を促進することと、肝臓の脂肪輸送を促進することと、被験者の肝臓における脂肪沈着を低減することとからなる群より選ばれる一つ以上によってアテローム性動脈硬化症を予防及び／または治療する、請求項１７〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、アテローム性動脈硬化症による被験者の組織、器官虚血損傷及びその関連疾患を予防及び／または治療するための方法。
【請求項２６】
前記被験者の組織、器官虚血損傷は心筋損傷、脳損傷または腎損傷である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記疾患は、冠状動脈性心臓病、狭心症、心筋梗塞、不整脈、心不全、脳虚血、脳血栓、脳萎縮、脳出血または脳塞栓、腎機能不全、高血圧、糸球体繊維化、腎不全または尿毒症である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、アテローム性動脈硬化症による被験者の動脈血栓およびその関連疾患を予防及び／または治療するための方法。
【請求項２９】
前記疾患は、冠状動脈性心臓病と、狭心症と、心筋梗塞と、不整脈と、心不全と、脳虚血と、脳血栓と、脳萎縮と、脳出血と、脳塞栓と、脳梗塞と、腎機能不全と、高血圧と、糸球体繊維化と、腎不全と、尿毒症と、腸壊死と、間欠性跛行と、壊疽とを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、被験者の糖尿病と合併したアテローム性動脈硬化症を予防及び／または治療するための方法。
【請求項３１】
前記アテローム性動脈硬化症は、アテローム性大動脈硬化症と、冠状動脈アテローム性硬化症と、脳動脈アテローム性硬化症と、腎動脈アテローム性硬化症と、腸間膜動脈アテローム性硬化症と、下肢アテローム性動脈硬化症とからなる群より選ばれる一つ以上である、請求項３０に記載の方法。
[請求項３１]
被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、糖尿病またはアテローム性動脈硬化症の被験者の高脂血症を治療するための方法。
【請求項３２】
前記被験者は、血清の総コレステロールレベルの上昇と、血清のトリグリセリドレベルの上昇と、血清の低密度リポタンパク質レベルの上昇と、血清の高密度リポタンパク質レベルの低下とからなる群より選ばれる一つ以上を有する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記高脂血症は、被験者の血清の総コレステロールレベルを低下させることと、被験者の血清のトリグリセリドレベルを低下させることと、被験者の血清の低密度リポタンパク質レベルを低下させることと、被験者の血清の高密度リポタンパク質レベルを上昇させることとからなる群より選ばれる一つ以上によって改善される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
アテローム性動脈硬化症に罹患しやすいかアテローム性動脈硬化症に罹患している被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、被験者の動脈管壁における脂質沈着を予防または低減するための方法。
【請求項３５】
前記アテローム性動脈硬化症に罹患しやすい被験者は、原発性または継発性の脂肪代謝障害に罹患している被験者である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記アテローム性動脈硬化症に罹患しやすい被験者は、肝臓疾患、腎臓疾患、肥満症、高脂血症または糖尿病に罹患している被験者である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記プラスミノーゲンは、被験者に必要な一種以上のその他の薬物または治療方法と併用することができる、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記その他の薬物は、脂質低下薬、抗血小板薬、血圧降下薬、血管拡張薬、血糖降下薬、抗凝固薬、血栓溶解薬、肝臓保護薬、抗不整脈薬、強心薬、利尿薬、抗感染薬、抗ウイルス薬、免疫調節薬、炎症調節薬、抗腫瘍薬、ホルモン薬、チロキシンを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記薬物は、スタチン系、フィブラート系、ニコチン酸、コレスチラミン、クロフィブラート、益壽寧や血脂平や心脈楽の不飽和脂肪酸、硫酸多糖類のような脂質低下薬；アスピリン、ペルサンチン、クロピドグレル、シロスタのような抗血小板薬；ヒドララジン、ニトログリセリンと硝酸イソソルビド、ニトロプルシドナトリウム、プラゾシンのようなα１受容体遮断薬、フェントラミンのようなα受容体遮断薬、サルブタモールのようなβ２受容体刺激薬、カプトプリル、エナラプリル、ニフェジピンやジルチアゼム、サルブタモール酸、ミノキシジル、プロスタグランジン、カルジオナトリンのような血管拡張薬；ウロキナーゼとストレプトキナーゼ、組織型プラスミノーゲン活性化剤、単鎖ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化剤、ＴＮＫ−組織型プラスミノーゲン活性化剤のような血栓溶解薬；ヘパリン、エノキサパリン、ナドロパリン、ビバリルジンのような抗凝固薬を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記プラスミノーゲンは配列２、６、８、１０または１２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ依然プラスミノーゲン活性を有するものである、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記プラスミノーゲンは配列２、６、８、１０または１２において、１−１００、１−９０、１−８０、１−７０、１−６０、１−５０、１−４５、１−４０、１−３５、１−３０、１−２５、１−２０、１−１５、１−１０、１−５、１−４、１−３、１−２、１個のアミノ酸を添加、削除及び／または置換したものであり、且つ依然プラスミノーゲン活性を有するタンパク質である、請求項１〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記プラスミノーゲンはプラスミノーゲン活性フラグメントを含有し、且つ依然プラスミノーゲン活性を有するタンパク質である、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記プラスミノーゲンは、Ｇｌｕ−プラスミノーゲン、Ｌｙｓ−プラスミノーゲン、ミニプラスミノーゲン、マイクロプラスミノーゲン、δ−プラスミノーゲンまたはそれらのプラスミノーゲン活性を保持した変異体である、請求項１〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記プラスミノーゲンは、天然または合成のヒトプラスミノーゲン、またはその依然プラスミノーゲン活性を保持した変異体若しくはフラグメントである、請求項１〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記プラスミノーゲンは、霊長類動物またはげっ歯類動物に由来するヒトプラスミノーゲンのオルソログ、またはその依然プラスミノーゲン活性を保持した変異体若しくはフラグメントである、請求項１〜４３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記プラスミノーゲンのアミノ酸配列は配列２、６、８、１０または１２に示される通りである、請求項１〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記プラスミノーゲンは、ヒト由来の天然プラスミノーゲンである、請求項１〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記被験者はヒトである、請求項１〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記被験者はプラスミノーゲンが不足、または欠乏している、請求項１〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記不足または欠乏は、先天的、継発的及び／または局所的である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
請求項１〜５０のいずれか１項に記載の方法に使用されるプラスミノーゲン。
【請求項５２】
薬学的に許容される担体及び請求項１〜５０のいずれか１項に記載の方法に使用されるプラスミノーゲンを含む薬物組成物。
【請求項５３】
（ｉ）請求項１〜５０のいずれか１項に記載の方法に使用されるプラスミノーゲンと、（ｉｉ）前記プラスミノーゲンを前記被験者に送達するための手段（ｍｅａｎｓ）とを含む、予防性または治療性キット。
【請求項５４】
前記手段はシリンジまたはバイアルである、請求項５３に記載のキット。
【請求項５５】
請求項１〜５０のいずれか１項に記載の方法を実施するように前記プラスミノーゲンを前記被験者に投与することを指示するラベルまたはプロトコルをさらに含む、請求項５３または５４に記載のキット。
【請求項５６】
ラベルを含む容器と、
（ｉ）請求項１〜５０のいずれか１項に記載の方法に使用されるプラスミノーゲン、またはプラスミノーゲンを含む薬物組成物とを含む製品であって、
前記ラベルは、請求項１〜５０のいずれか１項に記載の方法を実施するように前記プラスミノーゲンまたは組成物を前記被験者に投与することを指示する、製品。
【請求項５７】
その他の薬物を含む、もう一つ以上の部材または容器をさらに含む、請求項５３〜５５のいずれか１項に記載のキット、または請求項５６に記載の製品。
【請求項５８】
前記その他の薬物は、脂質低下薬、抗血小板薬、血圧降下薬、血管拡張薬、血糖降下薬、抗凝固薬、血栓溶解薬、肝臓保護薬、抗不整脈薬、強心薬、利尿薬、抗感染薬、抗ウイルス薬、免疫調節薬、炎症調節薬、抗腫瘍薬、ホルモン薬、チロキシンからなる群より選ばれる、請求項５７に記載のキットまたは製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アテローム性動脈硬化症およびその関連疾患の予防及び／または治療におけるプラスミノーゲンの作用に係り、さらにアテローム性動脈硬化症およびその関連疾患を予防及び／または治療するために全く新しい治療ステラテジーを提供する。
【背景技術】
【０００２】
アテローム性動脈硬化症（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，ＡＳ）は、冠状動脈性心臓病、脳梗塞、末梢血管疾患の主因である。脂質代謝障害はアテローム性動脈硬化症の病変基礎であり、その特徴として、係る動脈の病変は内膜から始まり、一般的にはまず脂質と複合糖類が蓄積され、出血して血栓が形成され、さらに繊維組織が増殖してカルシウム質が沈着し、しかも動脈中間層の段階的にな変質と石灰化があり、動脈壁が厚くなり硬くなり、血管腔が狭くなる。病変はよく大中筋性動脈に係り、一旦発展すると動脈腔を塞ぐまでに至り、該動脈により供給される組織または器官は虚血または壊死することになる。
【０００３】
アテローム性動脈硬化症は多くの心脳血管疾患の共通の病理的基礎であり、心血管系疾患の中で最もよく見られる疾患でもあり、人の健康に深刻な危害を及ぼす。アテローム性動脈硬化症の発生発展は、脂質の侵入、血小板の活性化、血栓の形成、内膜損傷、炎性反応、酸化ストレス、血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）活性化、選択的基質代謝、及び血管再建などを含む［１］。百年近くの研究を経て、多くの学者がＡＳ発症メカニズムについて、脂質滲入説、マクロファージ受容体欠落説、平滑筋変異説、損傷応答説、炎性反応説、血行動態学説および免疫学説などの異説を提出したが、いずれの学説で単独でＡＳの発生発展を全面的に解釈することができない。近年来、大量の細胞及び分子レベルの実験研究資料により、内皮細胞、ＶＳＭＣ、単核マクロファージおよび血小板の恒常性に対する認識は広げられ、それがＡＳの形成及び発症メカニズムにおける作用に対してもさらに認識できた。
【０００４】
１．血管内皮細胞損傷の作用
研究によると、アテローム性動脈硬化症プラークが現れる前の長い期間内に、内皮機能損傷はすでに形成されていた。Ｅｓｐｅｒら［２］によると、内皮細胞は双方向機能を持つ分子を大量に発生させ、促進と阻害効果を平衡にすることができる。内皮細胞がこの些細な平衡を維持する能力を失うと、脂質と白血球（主に単核細胞とＴリンパ細胞）は内皮に侵入して炎性反応及び脂質線条を引き起こす。内皮細胞の機能障害、活性化及び形態学的損傷は、血液中の単核細胞、血小板及び血管壁中膜ＶＳＭＣの変化を引き起こし、最終的にＡＳを形成する。その具体的なメカニズムは以下である。（１）内皮細胞の透過性の増加は、ＡＳの主要な開始段階であり、脂質が動脈壁の皮下に入る最も早い病理的変化である［３］；（２）血小板と単核細胞の接着を増加させる。Ｏｔｔら［４］によると、機能障害した内皮細胞は、その表面の細胞接着分子の発現が増加するため、単核細胞の接着を促進するかもしれないので、細菌を含む単核細胞が循環血からＡＳプラークに滲入することを促進する；（３）単球走化性タンパク質２１（ＭＰＣ２１）、線維芽細胞成長因子、形質転換成長因子（ＴＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）などの多くの成長因子を分泌して、単核細胞が凝集して内皮に接着し、内皮下の隙間に移動し、その表面の清掃者受容体、ＣＤ３６受容体及びＦＣ受容体の介在下で、内膜下に入った酸化された脂質を大量に摂取し、単核細胞由来の泡沫細胞を形成する。Ｂｏｏｓら［３］の研究によると、内皮損傷程度はある程度ではＡＳの発症インデクス及び厳重さの新しい指標とすることができる。
【０００５】
２．血小板の作用
動脈内皮細胞が損傷した後、損傷した内皮細胞上への血小板の接着を促進でき、さらにＰＤＧＦの放出を促進し、筋内膜細胞の持続増殖を引き起こして最終的にコラーゲンの合成を引き起こし、ＡＳプラークを形成する。ＡＳ血栓形成の最終段階において、血小板の接着、活性化及び凝集は、動脈閉塞と継発性虚血を引き起こし得る［５］。血小板は内皮細胞、結合組織と互いに作用して局所管壁のＡＳの発生に対して重要な意義がある。血小板がＡＳにおける作用は主に下記通りである。（１）いかなる形の内皮損傷は、血小板を大量に内皮局所に接着・凝集させ、凝血系を活性化させて血栓の形成を引き起こすことができる。（２）ＰＤＧＦ、血小板第４因子、βトロンボグロブリンなど、ＶＳＭＣ及び単核細胞に対して強い化学的走化性作用を有する多くの活性物質を分泌・放出し、ＶＳＭＣ遊出、増殖及び大動脈内膜の修飾に寄与し、単核細胞を吸引して内皮に接着させる。ＰＤＧＦが線維芽走化作用と、単核細胞が各自の抗原決定基を増殖することを促進する作用を有し、ＡＳを引き起こす過程において重要な役割を果たしていると学者は指摘した。（３）静脈内皮細胞は一酸化窒素とプロスタサイクリンを生成することができ、しかも肺内で持続的に放出し、血小板の機能を調節する。
【０００６】
３．アテローム性動脈硬化発生、発展における脂質の作用
ＡＳの病理的変化は、血脂レベル、特に血漿コレストロール及びトリアシルグリセロールレベルと密接に関連していると多くの研究により証明された［６］。脂質と脂肪酸の沈着は、内皮細胞機能障害及びＡＳ形成過程における重要な病理的メカニズムであると学者は指摘した。研究によると、正常動脈と比べ、ＡＳプラークを有する動脈アポリポタンパク質Ｃ１とアポリポタンパク質Ｅのタンパク質と遺伝子の発現はいずれも明らかに上昇しており、これは単なる結果ではなく、ＡＳの形成原因であるかもしれない［７］。すでに公認されているように、高脂血症がＡＳ発症における作用メカニズムは、内皮細胞損傷を直接に引き起こす他、主に内皮細胞の透過性を増加させることであり、これは、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の酸化修飾による酸化性低密度リポタンパク質（оｘ−ＬＤＬ）の生成に関係している。оｘ−ＬＤＬが損傷していない内皮を通過したとき、血漿ＬＤＬは内皮下の隙間に輸送されて酸化修飾される。ＬＤＬはマクロファージの除去反応および中間膜ＶＳＭＣの増殖を引き起こしてアテローム性プラークを形成する。以上の変化は最終的に動脈内膜脂質線条、線維プラークおよび／またはアテローム性プラークの形成を引き起こす可能性がある。
【０００７】
４．単核マクロファージの作用
研究によると、ＡＳプラークには、単核細胞、単核細胞由来のマクロファージ、оｘ−ＬＤＬ負荷のマクロファージ（すなわち、泡沫細胞）およびＴリンパ細胞などの炎性反応細胞の浸潤が含まれている［８］。単核−マクロファージがＡＳにおける作用は以下のようにまとめることができる。（１）食作用：病変早期の泡沫細胞は血の中の単核細胞から由来することが多く、後者は内皮下に入ってマクロファージに変え、その表面の特異性受容体はоｘ−ＬＤＬと結合することができるので、大量のコレステロールを摂取して泡沫細胞になる。（２）炎性反応と免疫反応に寄与すること：上記食過程は、細胞外基質へ炎性反応因子を放出することによって特有の炎性反応を誘発することができる。ＡＳ病巣内にＴリンパ細胞の浸潤が見えられるとともに、非破裂のプラークと比べ、破裂したＡＳプラークの線維皮膜にはより多くのマクロファージが含まれている。（３）増殖反応に寄与すること：マクロファージが活性化させられた後、多くの細胞因子と成長因子を放出して中間膜ＶＳＭＣの遷移および増殖を促進することができる。また、マクロファージは複数のメタロプロテアーゼとセリンプロテアーゼを発現し、細胞外基質を退化させ、プラークが不安定になり、甚だしきに至っては破裂の傾向がある［９］。
【０００８】
５．ＶＳＭＣの作用
近年の研究を経て、中間膜ＶＳＭＣの増殖、内膜への遊出および基質タンパク質の合成は、ＡＳの進行期間における病変形成の主要な一環であり、しかもＡＳと再狭窄の内膜肥厚において重要な役割をはたしていることは認識されてきた［１０］。ＡＳプラークと再狭窄の発症と進行は、血管壁細胞間の複雑な相互作用効果を含み、細胞因子、炎性反応、走化因子、成長因子はその中において重要な役割を果たしている。遊離したＶＳＭＣはその表面のＬＤＬ受容体の介在下で脂質を貪食し、ＶＳＭＣ由来泡沫細胞を形成し、病変の形成に寄与する。また、これらの増殖した内膜ＶＳＭＣはコラーゲン、エラスチン、糖タンパク質などを合成することができ、マクロファージがＬＤＬを貪食して遊離脂質を放出し、病変下内膜を厚くして硬くし、硬化プラークの形成を促進する。これについて、上記細胞の蓄積を抑制するように多くの努力はされ、しかもステント術後の再狭窄の面において大きな成果が遂げられた［１１］。
【０００９】
糖尿病はアテローム性動脈硬化症と密接な関係があり、糖尿病患者にアテローム性動脈硬化症が現れる時間が早く、程度が重く、予後が劣ることとして表され、アテローム性動脈硬化症は糖尿病患者の主要な死因である。
【００１０】
糖尿病患者の冠状動脈血管の病理的変化の特徴は主に、病変に係る血管が多く、冠状動脈の狭窄が重く、病変がより広くて深刻であると臨床に発見された。そのメカニズムは、血糖代謝異常によるアテローム性動脈硬化であると考えられるのが多いが、研究を深まるにつれて、より多くの結果により明らかなように、糖尿病によるアテローム性動脈硬化症は単一の要素によるものではなく、マクロファージの分極化、マクロファージ遊走阻止因子ルート、最終糖化産物ルート、清掃受容体の上昇、インスリン抵抗、ユビキチン・プロテアソーム系（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  ｓｙｓｔｅｍ，ＵＰＳ）の活性化、血小板由来成長因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ，ＰＤＧＦ）の活性化ルートなど、多くのルートおよび複雑なメカニズムでアテローム性動脈硬化症の発生及び進展を誘発・促進している［１２］。
【００１１】
２型糖尿病患者体内の白色脂肪などの組織には、マクロファージ分極化がのバランスが崩れることがあり、Ｍ１型マクロファージが増加することとして表される。Ｍ１型マクロファージはおもにＴＮＦ−α、ＩＬ−６、単核細胞走化タンパク質１などを分泌し、炎症を促進する役割を果たし、上記細胞因子はインスリン抵抗の発生を誘発するだけではなく、アテローム性動脈硬化症を促進する［１３］。
【００１２】
マクロファージ遊走阻止因子（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ，ＭＩＦ）は免疫と炎症反応に寄与する重要な因子である。糖尿病患者において、ＭＩＦの発現の増加は、糖尿病とアテローム性動脈硬化症との合併に関係するかもしれない［１４］。それがアテローム性動脈硬化症を引き起こすメカニズムは次のようである。（１）ＭＩＦにより、マクロファージが炎症部位に浸潤し活性化し、脂質の取り込みを加速し、泡沫細胞の発生を誘導する。マクロファージが酸化低密度リポタンパク質を摂取してＭＩＦを上昇させ、それと相応にＭＩＦが酸化低密度リポタンパク質の摂取を増加させて泡沫細胞の形成を促進できることは研究により発見された。（２）ＭＩＦは血管内皮細胞及び平滑筋細胞を活性化させることができ、それぞれ単核細胞走化タンパク質１と細胞間接着分子１を発現するようにさせ、単核マクロファージの走化遷移を増加させ、さらにアテローム性動脈硬化症を加速することができる。各動脈モデルにおいてＭＩＦ抗体を使用すると、内皮下マクロファージ、泡沫細胞、マクロファージ活性化を示すマーカーを弱めることができる。
【００１３】
糖尿病患者において、終末糖化産物（ａｄｖａｎｃｅｄ  ｇｌｙｃａｔｉｏｎ  ｅｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＡＧＥｓ）は、アテローム性動脈硬化症病変の発生及び発展を促進することができる。ＡＧＥｓは動脈壁内のグルコースとタンパク質およびリポタンパク質との非酵素糖化反応産物であり、対応する受容体と結合した後下記のメカニズムによりアテローム性動脈硬化症を加速することができる。（１）長期高血糖はＡＧＥｓの生成を増加させることができ、ＡＧＥｓはタンパク質、核酸および脂質を修飾して活性酸素種の生成を増加させ、酸化ストレスを増強でき、ＡＧＥｓは好中球の酸素ラジカルの生成を増加させるとともに好中球のＮＡＤＰＨ酸化酵素の活性を増加させ、血管の酸化ストレスを促進し、糖尿病患者の心血管疾患の発生率を高めることができる［１５］。（２）ＡＧＥｓは接着分子の発現を増加させ、骨髄系細胞と非骨髄系細胞の表面のＡＧＥｓ受容体は血管接着分子１の発現を増加して糖尿病に関連するアテローム性動脈硬化症を加速することができる［１６］。
【００１４】
インスリン抵抗（ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，ＩＲ）は、インスリンが作用するターゲット組織が外因性または内因性インスリンに対する感度および反応性の低下である。２型糖尿病はよくインスリン抵抗と合併する。インスリン抵抗は以下のメカニズムを通して糖尿病アテローム性動脈硬化症を加速することができる。（１）インスリン抵抗はマクロファージアポトーシスを加速すること：研究によると、糖尿病患者の進行期のアテローム性動脈硬化症のプラーク核心は、非糖尿病患者より明らかに増大した［１７］。糖尿病進行期のアテローム性動脈硬化症の病変の箇所には、マクロファージのインスリン抵抗のため、小胞体ストレスにより誘導される細胞アポトーシスは明らかに増え、プラーク核心の増大を促進する。（２）インスリン抵抗と代謝症候群患者において、ＣＸ３ＣＬ１／ＣＸ３ＣＬ１軸の活性化が明らかに増加し、アテローム性動脈硬化症の加速と正比例に相関していることは発見された。動物モデルにおいて、該軸の活性化によりプラークの不安定性が増えたことは発見された。インスリン抵抗は、ＣＸ３ＣＬ１／ＣＸ３ＣＬ１軸を活性化させることで血管平滑筋細胞のアポトーシスを誘導してアテローム性動脈硬化を加速する［１８］。マクロファージのビタミンＤ３受容体のノックアウトはインスリン抵抗を促進し、アテローム性動脈硬化症を加速する［１９］。
【００１５】
糖尿病患者の内因性酸化ストレスの増強により、マクロファージのＵＰＳは過剰に活性化される［２０］。ＵＰＳの過剰な活性化は、糖尿病炎症因子（例えば血管細胞接着因子１及び細胞間接着分子１）の発現と分泌を促進し、血管内皮細胞の不可逆性損傷を引き起こし、アテローム性動脈硬化症を引き起こす［２１］。
【００１６】
また、糖尿病患者のＡＧＥｓ、アンジオテンシンＩＩ、エンドセリン、炎症と高血脂状態は、ＰＤＧＦルートの活性を増加させ、ＰＤＧＦルートの活性の増加は、炎症反応を促進する作用がある。ＰＤＧＦは結合組織成長因子の発現を上昇させる作用があり、内皮細胞と繊維芽細胞の遷移、接着および増殖を促進し、アテローム性動脈硬化症の発生を促進する［２２］。
【００１７】
今までにアテローム性動脈硬化症を治療するための薬物として主に、脂質低下薬、抗血小板薬、血圧降下薬、血管拡張薬、血糖降下薬、抗凝固薬、血栓溶解薬が挙げられる。プラスミノーゲンは、動脈管壁における脂質の蓄積、沈着を低減し、繊維組織の増殖を低下し、アテローム性動脈硬化症による血管壁への損傷を修復し、アテローム性動脈硬化症による組織器官の虚血損傷及び組織器官の虚血による関連疾患を改善することができるということは研究において意外に発見された。
【発明の概要】
【００１８】
本発明は、被験者の冠状動脈アテローム性硬化症及びその関連疾患を予防及び／または治療することに係る。
【００１９】
一つの局面において、本発明は、冠状動脈アテローム性硬化症およびその関連疾患に罹患しているか罹患した疑いがある、または冠状動脈アテローム性硬化症およびその関連疾患に罹患するリスクがある被験者に、予防及び／または治療に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、被験者の冠状動脈アテローム性硬化症及びその関連疾患を予防及び／または治療するための方法に係る。本発明はさらに、被験者の冠状動脈アテローム性硬化症及びその関連疾患の予防及び／または治療におけるプラスミノーゲンの用途に係る。本発明はさらに、被験者の冠状動脈アテローム性硬化症及びその関連疾患を予防及び／または治療するための薬物、薬物組成物、製品、キットの製造におけるプラスミノーゲンの用途に係る。さらに、本発明は、被験者の冠状動脈アテローム性硬化症及びその関連疾患の予防及び／または治療に使用されるプラスミノーゲンに係る。本発明はさらに、被験者の冠状動脈アテローム性硬化症及びその関連疾患を予防及び／または治療するための、プラスミノーゲンを含む薬物、薬物組成物、製品、キットに係る。
【００２０】
一部の実施形態において、前記冠状動脈アテローム性硬化症の関連疾患は、冠状動脈アテローム性硬化症によって引き起こされる冠状動脈性心臓病、狭心症、心筋梗塞、不整脈、心不全を含む。一部の実施形態において、前記アテローム性動脈硬化症は糖尿病と合併して発症するアテローム性動脈硬化症である。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、被験者の血清の総コレステロールレベルを低下させることと、被験者の血清のトリグリセリドレベルを低下させることと、被験者の血清の低密度リポタンパク質レベルを低下させることと、被験者の血清の高密度リポタンパク質レベルを上昇させることとからなる群より選ばれる一つ以上によってアテローム性動脈硬化症を予防及び／または治療する。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、被験者の動脈管壁における脂質沈着を低減することによってアテローム性動脈硬化症を予防及び／または治療する。一部の実施形態において、肝臓の脂肪代謝を促進することと、肝臓の脂肪輸送を促進することと、被験者の肝臓における脂肪沈着を低減することとからなる群より選ばれる一つ以上によって冠状動脈アテローム性硬化症を予防及び／または治療する。
【００２１】
もう一つの局面において、本発明は、被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、冠状動脈アテローム性硬化症による被験者の組織、器官虚血損傷及びその関連疾患を予防及び／または治療するための方法に係る。本発明はさらに、冠状動脈アテローム性硬化症による被験者の組織、器官虚血損傷及びその関連疾患の予防及び／または治療におけるプラスミノーゲンの用途に係る。本発明はさらに、冠状動脈アテローム性硬化症による被験者の組織、器官虚血損傷及びその関連疾患を予防及び／または治療するための薬物、薬物組成物、製品、キットの製造におけるプラスミノーゲンの用途に係る。さらに、本発明は、冠状動脈アテローム性硬化症による被験者の組織、器官虚血損傷及びその関連疾患の予防及び／または治療に使用されるプラスミノーゲンに係る。本発明はさらに、冠状動脈アテローム性硬化症による被験者の組織、器官虚血損傷及びその関連疾患を予防及び／または治療するための、プラスミノーゲンを含む薬物、薬物組成物、製品、キットに係る。
【００２２】
一部の実施形態において、前記被験者の組織、器官虚血損傷は、冠状動脈アテローム性硬化症による心筋損傷である。一部の実施形態において、前記関連疾患は、心臓供血不足によって引き起こされる冠状動脈性心臓病、狭心症、心筋梗塞、不整脈、または心不全である。一部の実施形態において、前記組織、器官虚血損傷またはその関連疾患は、脳虚血損傷またはその関連疾患である。一部の実施形態において、前記疾患は、脳虚血、脳血栓、脳萎縮、脳出血、または脳塞栓である。一部の実施形態において、前記関連疾患は、腎機能不全、高血圧、糸球体繊維化、腎不全、または尿毒症である。
【００２３】
もう一つの局面において、本発明は、被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、冠状動脈アテローム性硬化症による被験者の冠状動脈血栓およびその関連疾患を予防及び／または治療するための方法。本発明はさらに、冠状動脈アテローム性硬化症による被験者の冠状動脈血栓及びその関連疾患の予防及び／または治療におけるプラスミノーゲンの用途に係る。本発明はさらに、冠状動脈アテローム性硬化症による被験者の冠状動脈血栓及びその関連疾患を予防及び／または治療するための薬物、薬物組成物、製品、キットの製造におけるプラスミノーゲンの用途に係る。さらに、本発明は、冠状動脈アテローム性硬化症による被験者の冠状動脈血栓及びその関連疾患の予防及び／または治療に使用されるプラスミノーゲンに係る。本発明はさらに、冠状動脈アテローム性硬化症による被験者の冠状動脈血栓及びその関連疾患を予防及び／または治療するための、プラスミノーゲンを含む薬物、薬物組成物、製品、キットに係る。
【００２４】
一部の実施形態において、前記疾患は、冠状動脈性心臓病と、狭心症と、心筋梗塞と、不整脈と、心不全と、脳虚血と、脳血栓と、脳萎縮と、脳出血と、脳塞栓と、脳梗塞と、腎機能不全と、高血圧と、糸球体繊維化と、腎不全と、尿毒症と、腸壊死と、間欠性跛行と、壊疽とを含む。
【００２５】
もう一つの局面において、本発明は、被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、被験者の糖尿病と合併した冠状動脈アテローム性硬化症を予防及び／または治療するための方法に係る。本発明はさらに、被験者の糖尿病と合併した冠状動脈アテローム性硬化症の予防及び／または治療におけるプラスミノーゲンの用途に係る。本発明はさらに、被験者の糖尿病と合併した冠状動脈アテローム性硬化症を予防及び／または治療するための薬物、薬物組成物、製品、キットの製造におけるプラスミノーゲンの用途に係る。さらに、本発明は、被験者の糖尿病と合併した冠状動脈アテローム性硬化症の予防及び／または治療に使用されるプラスミノーゲンに係る。本発明はさらに、被験者の糖尿病と合併した冠状動脈アテローム性硬化症を予防及び／または治療するための、プラスミノーゲンを含む薬物、薬物組成物、製品、キットに係る。
【００２６】
もう一つの局面において、本発明は、被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、被験者の糖尿病と合併した冠状動脈アテローム性硬化症を予防及び／または治療するための方法に係る。本発明はさらに、被験者の糖尿病と合併した冠状動脈アテローム性硬化症の予防及び／または治療におけるプラスミノーゲンの用途に係る。本発明はさらに、被験者の糖尿病と合併した冠状動脈アテローム性硬化症を予防及び／または治療するための薬物、薬物組成物、製品、キットの製造におけるプラスミノーゲンの用途に係る。さらに、本発明は、被験者の糖尿病と合併した冠状動脈アテローム性硬化症の予防及び／または治療に使用されるプラスミノーゲンに係る。本発明はさらに、被験者の糖尿病と合併した冠状動脈アテローム性硬化症を予防及び／または治療するための、プラスミノーゲンを含む薬物、薬物組成物、製品、キットに係る。
【００２７】
もう一つの局面において、本発明は、被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、糖尿病被験者の冠状動脈心臓病、狭心症、心筋梗塞、不整脈、または心不全を予防及び／または治療するための方法に係る。本発明はさらに、糖尿病被験者の冠状動脈心臓病、狭心症、心筋梗塞、不整脈、または心不全の予防及び／または治療におけるプラスミノーゲンの用途に係る。本発明はさらに、糖尿病被験者の冠状動脈心臓病、狭心症、心筋梗塞、不整脈、または心不全を予防及び／または治療するための薬物、薬物組成物、製品、キットの製造におけるプラスミノーゲンの用途に係る。さらに、本発明は、糖尿病被験者の冠状動脈心臓病、狭心症、心筋梗塞、不整脈、または心不全の予防及び／または治療に使用されるプラスミノーゲンに係る。本発明はさらに、糖尿病被験者の冠状動脈心臓病、狭心症、心筋梗塞、不整脈、または心不全を予防及び／または治療するための、プラスミノーゲンを含む薬物、薬物組成物、製品、キットに係る。
【００２８】
もう一つの局面において、本発明は、被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、被験者のアテローム性動脈硬化症およびその関連疾患を予防及び／または治療するための方法に係る。本発明はさらに、被験者のアテローム性動脈硬化症およびその関連疾患の予防及び／または治療におけるプラスミノーゲンの用途に係る。本発明はさらに、被験者のアテローム性動脈硬化症およびその関連疾患を予防及び／または治療するための薬物、薬物組成物、製品、キットの製造におけるプラスミノーゲンの用途に係る。さらに、本発明は、被験者のアテローム性動脈硬化症およびその関連疾患の予防及び／または治療に使用されるプラスミノーゲンに係る。本発明はさらに、被験者のアテローム性動脈硬化症およびその関連疾患を予防及び／または治療するための、プラスミノーゲンを含む薬物、薬物組成物、製品、キットに係る。
【００２９】
一部の実施形態において、前記アテローム性動脈硬化症は、アテローム性大動脈硬化症、冠状動脈アテローム性硬化症、脳動脈アテローム性硬化症、腎動脈アテローム性硬化症、腸間膜動脈アテローム性硬化症、下肢アテローム性動脈硬化症を含む。一部の実施形態において、前記アテローム性動脈硬化症の関連疾患は、アテローム性動脈硬化による組織、器官虚血によって引き起こされる関連疾患を含み、冠状動脈アテローム性硬化症によって引き起こされる冠状動脈性心臓病、狭心症、心筋梗塞、不整脈、心不全；脳動脈アテローム性硬化症によって引き起こされる脳虚血、脳血栓、脳萎縮、脳出血、脳塞栓；腎動脈アテローム性硬化症によって引き起こされる腎機能不全、高血圧、糸球体繊維化、腎不全、尿毒症；腸間膜動脈アテローム性硬化症によって引き起こされる満腹後の腹痛、消化不良、便秘、腸壁壊死、便血；下肢アテローム性動脈硬化症によって引き起こされる間欠性跛行、壊疽を含む。
【００３０】
一部の実施形態において、前記アテローム性動脈硬化症は、冠状動脈アテローム性硬化症と、脳動脈アテローム性硬化症と、腎動脈アテローム性硬化症とからなる群より選ばれる。一部の実施形態において、前記アテローム性動脈硬化症は、糖尿病と合併したアテローム性動脈硬化症である。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、被験者の血清の総コレステロールレベルを低下させることと、被験者の血清のトリグリセリドレベルを低下させることと、被験者の血清の低密度リポタンパク質レベルを低下させることと、被験者の血清の高密度リポタンパク質レベルを上昇させることとからなる群より選ばれる一つ以上によってアテローム性動脈硬化症を予防及び／または治療する。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、被験者の動脈管壁における脂質沈着を低下させることによってアテローム性動脈硬化症を予防及び／または治療する。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、肝臓の脂肪代謝を促進することと、肝臓の脂肪輸送を促進することと、被験者の肝臓における脂肪沈着を低減することとからなる群より選ばれる一つ以上によってアテローム性動脈硬化症を予防及び／または治療する。
【００３１】
もう一つの局面において、本発明は、被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、アテローム性動脈硬化症による被験者の組織、器官虚血損傷及びその関連疾患を予防及び／または治療するための方法に係る。本発明はさらに、アテローム性動脈硬化症による被験者の組織、器官虚血損傷およびその関連疾患の予防及び／または治療におけるプラスミノーゲンの用途に係る。本発明はさらに、アテローム性動脈硬化症による被験者の組織、器官虚血損傷およびその関連疾患を予防及び／または治療するための薬物、薬物組成物、製品、キットの製造におけるプラスミノーゲンの用途に係る。さらに、本発明は、アテローム性動脈硬化症による被験者の組織、器官虚血損傷およびその関連疾患の予防及び／または治療に使用されるプラスミノーゲンに係る。本発明はさらに、アテローム性動脈硬化症による被験者の組織、器官虚血損傷およびその関連疾患を予防及び／または治療するための、プラスミノーゲンを含む薬物、薬物組成物、製品、キットに係る。
【００３２】
一部の実施形態において、前記被験者の組織、器官虚血損傷は心筋損傷、脳損傷または腎損傷である。一部の実施形態において、前記疾患は、冠状動脈性心臓病、狭心症、心筋梗塞、不整脈、心不全、脳虚血、脳血栓、脳萎縮、脳出血または脳塞栓、腎機能不全、高血圧、糸球体繊維化、腎不全または尿毒症である。
【００３３】
もう一つの局面において、本発明は、被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、アテローム性動脈硬化症による被験者の動脈血栓およびその関連疾患を予防及び／または治療するための方法に係る。本発明はさらに、アテローム性動脈硬化症による被験者の動脈血栓およびその関連疾患の予防及び／または治療におけるプラスミノーゲンの用途に係る。本発明はさらに、アテローム性動脈硬化症による被験者の動脈血栓およびその関連疾患を予防及び／または治療するための薬物、薬物組成物、製品、キットの製造におけるプラスミノーゲンの用途に係る。さらに、本発明は、アテローム性動脈硬化症による被験者の動脈血栓およびその関連疾患の予防及び／または治療に使用されるプラスミノーゲンに係る。本発明はさらに、アテローム性動脈硬化症による被験者の動脈血栓およびその関連疾患を予防及び／または治療するための、プラスミノーゲンを含む薬物、薬物組成物、製品、キットに係る。
【００３４】
一部の実施形態において、前記疾患は、冠状動脈性心臓病と、狭心症と、心筋梗塞と、不整脈と、心不全と、脳虚血と、脳血栓と、脳萎縮と、脳出血と、脳塞栓と、脳梗塞と、腎機能不全と、高血圧と、糸球体繊維化と、腎不全と、尿毒症と、腸壊死と、間欠性跛行と、壊疽とを含む。
【００３５】
もう一つの局面において、本発明は、被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、被験者の糖尿病と合併したアテローム性動脈硬化症を予防及び／または治療するための方法に係る。本発明はさらに、被験者の糖尿病と合併したアテローム性動脈硬化症の予防及び／または治療におけるプラスミノーゲンの用途に係る。本発明はさらに、被験者の糖尿病と合併したアテローム性動脈硬化症を予防及び／または治療するための薬物、薬物組成物、製品、キットの製造におけるプラスミノーゲンの用途に係る。さらに、本発明は、被験者の糖尿病と合併したアテローム性動脈硬化症の予防及び／または治療に使用されるプラスミノーゲンに係る。本発明はさらに、被験者の糖尿病と合併したアテローム性動脈硬化症を予防及び／または治療するための、プラスミノーゲンを含む薬物、薬物組成物、製品、キットに係る。
【００３６】
一部の実施形態において、前記アテローム性動脈硬化症は、アテローム性大動脈硬化症と、冠状動脈アテローム性硬化症と、脳動脈アテローム性硬化症と、腎動脈アテローム性硬化症と、腸間膜動脈アテローム性硬化症と、下肢アテローム性動脈硬化症とからなる群より選ばれる一つ以上である。
【００３７】
もう一つの局面において、本発明は、被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、糖尿病またはアテローム性動脈硬化症の被験者の高脂血症を治療するための方法に係る。本発明はさらに、糖尿病またはアテローム性動脈硬化症の被験者の高脂血症の治療におけるプラスミノーゲンの用途に係る。本発明はさらに、糖尿病またはアテローム性動脈硬化症の被験者の高脂血症を治療するための薬物、薬物組成物、製品、キットの製造におけるプラスミノーゲンの用途に係る。さらに、本発明は、糖尿病またはアテローム性動脈硬化症の被験者の高脂血症の治療に使用されるプラスミノーゲンに係る。本発明はさらに、糖尿病またはアテローム性動脈硬化症の被験者の高脂血症を治療するための、プラスミノーゲンを含む薬物、薬物組成物、製品、キットに係る。
【００３８】
一部の実施形態において、前記被験者は、血清の総コレステロールレベルの上昇と、血清のトリグリセリドレベルの上昇と、血清の低密度リポタンパク質レベルの上昇と、血清の高密度リポタンパク質レベルの低下とからなる群より選ばれる一つ以上を有する。一部の実施形態において、前記高脂血症は、被験者の血清の総コレステロールレベルを低下させることと、被験者の血清のトリグリセリドレベルを低下させることと、被験者の血清の低密度リポタンパク質レベルを低下させることと、被験者の血清の高密度リポタンパク質レベルを上昇させることとからなる群より選ばれる一つ以上によって改善される。
【００３９】
もう一つの局面において、本発明は、アテローム性動脈硬化症に罹患しやすいかアテローム性動脈硬化症に罹患している被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、被験者の動脈管壁における脂質沈着を予防または低減するための方法に係る。本発明はさらに、被験者の動脈管壁における脂質沈着の予防または低減におけるプラスミノーゲンの用途に係る。本発明はさらに、被験者の動脈管壁における脂質沈着を予防または低減するための薬物、薬物組成物、製品、キットの製造におけるプラスミノーゲンの用途に係る。さらに、本発明は、被験者の動脈管壁における脂質沈着の予防または低減に使用されるプラスミノーゲンに係る。本発明はさらに、被験者の動脈管壁における脂質沈着を予防または低減するための、プラスミノーゲンを含む薬物、薬物組成物、製品、キットに係る。
【００４０】
一部の実施形態において、前記アテローム性動脈硬化症に罹患しやすい被験者は、原発性または継発性の脂肪代謝障害に罹患している被験者である。一部の実施形態において、前記アテローム性動脈硬化症に罹患しやすい被験者は、肝臓疾患、腎臓疾患、肥満症、高脂血症または糖尿病に罹患している被験者である。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、被験者に必要な一種以上のその他の薬物または治療方法と併用することができる。一部の実施形態において、前記その他の薬物は、脂質低下薬、抗血小板薬、血圧降下薬、血管拡張薬、血糖降下薬、抗凝固薬、血栓溶解薬、肝臓保護薬、抗不整脈薬、強心薬、利尿薬、抗感染薬、抗ウイルス薬、免疫調節薬、炎症調節薬、抗腫瘍薬、ホルモン薬、チロキシンを含む。一部の実施形態において、前記薬物は、スタチン系、フィブラート系、ニコチン酸、コレスチラミン、クロフィブラート、益壽寧や血脂平や心脈楽のような不飽和脂肪酸、硫酸多糖類（Poly Saccharide Sulphate、Alginic Sodium Diester）のような脂質低下薬；アスピリン、ペルサンチン、クロピドグレル、シロスタのような抗血小板薬；ヒドララジン、ニトログリセリンと硝酸イソソルビド、ニトロプルシドナトリウム、プラゾシンのようなα１受容体遮断薬、フェントラミンのようなα受容体遮断薬、サルブタモールのようなβ２受容体刺激薬、カプトプリル、エナラプリル、ニフェジピンやジルチアゼム、サルブタモール酸、ミノキシジル、プロスタグランジン、カルジオナトリンのような血管拡張薬；ウロキナーゼとストレプトキナーゼ、組織型プラスミノーゲン活性化剤、単鎖ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化剤、ＴＮＫ−組織型プラスミノーゲン活性化剤のような血栓溶解薬；ヘパリン、エノキサパリン、ナドロパリン、ビバリルジンのような抗凝固薬を含む。
【００４１】
一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは配列２、６、８、１０または１２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ依然プラスミノーゲン活性を有するものである。一部の実施形態において、プラスミノーゲンは配列２、６、８、１０または１２において、１−１００、１−９０、１−８０、１−７０、１−６０、１−５０、１−４５、１−４０、１−３５、１−３０、１−２５、１−２０、１−１５、１−１０、１−５、１−４、１−３、１−２、１個のアミノ酸を添加、削除及び／または置換したものであり、且つ依然プラスミノーゲン活性を有するタンパク質である。
【００４２】
一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンはプラスミノーゲン活性フラグメントを含有し、且つ依然プラスミノーゲン活性を有するタンパク質である。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、Ｇｌｕ−プラスミノーゲン、Ｌｙｓ−プラスミノーゲン、ミニプラスミノーゲン、マイクロプラスミノーゲン、δ−プラスミノーゲンまたはそれらのプラスミノーゲン活性を保持した変異体である。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、天然または合成のヒトプラスミノーゲン、またはその依然プラスミノーゲン活性を保持した変異体若しくはフラグメントである。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、霊長類動物またはげっ歯類動物に由来するヒトプラスミノーゲンのオルソログ、またはその依然プラスミノーゲン活性を保持した変異体若しくはフラグメントである。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンのアミノ酸配列は２、６、８、１０または１２に示される通りである。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンはヒト由来の天然プラスミノーゲンである。
【００４３】
一部の実施形態において、前記被験者はヒトである。一部の実施形態において、前記被験者はプラスミノーゲンが不足、または欠乏している。一部の実施形態において、前記不足または欠乏は、先天的、継発的及び／または局所的である。
【００４４】
一部の実施形態において、前記薬物組成物は、薬学的に許容される担体及び前記方法に使用されるプラスミノーゲンを含む。一部の実施形態において、前記キットは、（ｉ）前記方法に使用されるプラスミノーゲンと、（ｉｉ）前記プラスミノーゲンを前記被験者に送達するための手段（ｍｅａｎｓ）とを含む、予防性または治療性キットであってもよい。一部の実施形態において、前記手段はシリンジまたはバイアルである。一部の実施形態において、前記キットは、前記いずれかの方法を実施するように前記プラスミノーゲンを前記被験者に投与することを指示するラベルまたはプロトコルをさらに含む。
【００４５】
一部の実施形態において、前記製品は、ラベルを含む容器と；（ｉ）前記方法に使用されるプラスミノーゲン、またはプラスミノーゲンを含む薬物組成物とを含む製品であり、前記ラベルは、前記いずれかの方法を実施するように前記プラスミノーゲンまたは組成物を前記被験者に投与することを指示する。
【００４６】
一部の実施形態において、前記キットまたは製品は、その他の薬物を含む、もう一つ以上の部材または容器をさらに含む。一部の実施形態において、前記その他の薬物は、脂質低下薬、抗血小板薬、血圧降下薬、血管拡張薬、血糖降下薬、抗凝固薬、血栓溶解薬、肝臓保護薬、抗不整脈薬、強心薬、利尿薬、抗感染薬、抗ウイルス薬、免疫調節薬、炎症調節薬、抗腫瘍薬、ホルモン薬、チロキシンからなる群より選ばれる。
【００４７】
前記方法の一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは全身または局所投与により投与され、好ましくは、静脈内、筋肉内、皮下という経路により投与される。前記方法の一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは適切なポリペプチド担体または安定化剤と組み合わせて投与する。前記方法の一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは毎日０．０００１〜２０００ｍｇ／ｋｇ、０．００１〜８００ｍｇ／ｋｇ、０．０１〜６００ｍｇ／ｋｇ、０．１〜４００ｍｇ／ｋｇ、１〜２００ｍｇ／ｋｇ、１〜１００ｍｇ／ｋｇ、１０〜１００ｍｇ／ｋｇ（体重一キロあたりで計算）または０．０００１〜２０００ｍｇ／ｃｍ２、０．００１〜８００ｍｇ／ｃｍ２、０．０１〜６００ｍｇ／ｃｍ２、０．１〜４００ｍｇ／ｃｍ２、１〜２００ｍｇ／ｃｍ２、１〜１００ｍｇ／ｃｍ２、１０〜１００ｍｇ／ｃｍ２（体表面積平方センチメートルあたりで計算）の用量を投与し、好ましくは少なくとも一回繰り返し、好ましくは少なくとも毎日投与する。
【００４８】
本発明は、本発明に係る実施形態どうしの技術的特徴のすべての組み合わせを明確にカバーし、且つこれらの組み合わせた技術構成は前記実施形態が単独且つ明確に開示されているように、本出願で明確に開示されている。また、本発明はさらに各実施形態及び要素のすべてのサブの組み合わせを明確にカバーし、この組み合わせた技術構成は本明細書中において明確に開示されている。
[発明の詳細な説明]
【００４９】
「アテローム性動脈硬化症」は慢性的、進行性動脈疾患であり、発症時動脈に堆積した脂肪の一部またはすべては血流を塞ぐ。本来は滑らかで堅固な動脈内膜が粗くなって厚くなり、しかも脂肪、フィブリン、カルシウムおよび細胞破片により詰まられると、アテローム性動脈硬化症が現れる。アテローム性動脈硬化は進行性過程である。血液中の脂質濃度が大きくなると、動脈壁に沿って脂肪線条を形成する。これらの脂肪線条は脂肪とコレステロールの沈着をもたらし、これらの沈殿物は元々滑らかな動脈内膜上に付着して小節を形成する。これらの小節の下に続いて繊維化した瘢痕組織が生じてカルシウム沈着が引き起こされる。沈着したカルシウムはだんだん除去できない白亜質の硬い薄膜（アテローム性プラークという）に変化する。動脈内部のこの永久の薄膜は、動脈の正常な拡張と収縮を阻害し、動脈内の血流速度を緩め、血ぺいを形成しやすく、動脈を通る血液の流れを阻害または阻止することになる。
【００５０】
アテローム性動脈硬化症のみについていえば、何の症状も感じられない。体内のある重要な器官とつながっている動脈が塞がれた後しか、この疾患が発見されることができない。これは、該器官における動脈が塞がれて引き起こされる症状が目立つからである。例えば、心臓の供血動脈の部分は塞がれると、狭心症が感じられるが、完全にふさがれると、心臓病を引き起こす可能性がある（塞がれた動脈により供血される心臓組織が死亡した）。アテローム性動脈硬化症は脳部動脈を影響すると、めまいや視線のかすみや気絶が感じられ、甚だしきに至っては卒中（塞がれた動脈により供血される脳組織が死亡し、神経損傷を引き起こす；例えば、死亡した脳組織により制御される四肢体幹が麻痺状態になる）を引き起こす可能性がある。腎臓部への動脈が塞がれると、腎不全を引き起こす可能性がある。眼部への血管が塞がれると失明するおそれがある。四肢動脈が塞がれると、各四肢体幹の病変を引き起こす可能性がある。
【００５１】
プラスミンはプラスミノゲン活性化系（ＰＡ系）の重要な成分である。それは広スペクトルのプロテアーゼであり、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の幾つかの成分を加水分解することができ、これらの成分はフィブリン、ゼラチン、フィブロネクチン、ラミニン及びプロテオグリカンを含む［２３］。また、プラスミンは一部のプロマトリックスメタロプロテアーゼ（ｐｒｏ−ＭＭＰ）を活性化させて活性のあるマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）にすることができる。そのためプラスミンは細胞外タンパク加水分解作用の一つの重要な上流調節因子である［２４、２５］。プラスミンはプラスミノゲンが二種類の生理性のＰＡ：組織型プラスミノゲン活性化剤（ｔＰＡ）またはウロキナーゼプラスミノゲン活性化剤（ｕＰＡ）をタンパク質加水分解することで形成されるものである。プラスミノゲンは血漿及び他の体液中において、相対的レベルが比較的高く、従来的にはＰＡ系の調節は主にＰＡの合成及び活性レベルよって実現されると考えられている。ＰＡ系成分の合成は異なる要素によって厳密な制御を受け、例えばホルモン、成長因子及びサイトカインである。また、この他に、プラスミンとＰＡｓの特定の生理的阻害剤が存在する。プラスミンの主な阻害剤はα２−抗プラスミン（α２−ａｎｔｉｐｌａｓｍｉｎ、αプラスミン阻害剤）である。ＰＡｓの活性は、ｕＰＡとｔＰＡのプラスミノーゲン活性剤阻害剤−１（ＰＡＩ−１）に同時に阻害され、ｕＰＡを主に阻害するプラスミノーゲン活性剤阻害剤−２（ＰＡＩ−２）によって調節される。一部の細胞表面には直接加水分解する活性のあるｕＰＡ特異性細胞表面受容体（ｕＰＡＲ）がある［２６、２７］。
【００５２】
プラスミノゲンは単一鎖の糖タンパクであり、７９１個のアミノ酸からなり、分子量は約９２ｋＤａである［２８、２９］。プラスミノゲンは主に肝臓で合成され、大量に細胞外液に存在している。血漿中に含まれるプラスミノゲンの含有量は約２μＭである。そのためプラスミノゲンは組織及び体液中のタンパク質加水分解活性の大きな潜在的な由来である［３０、３１］。プラスミノゲンには二種類の分子の形が存在する：グルタミン酸−プラスミノゲン（Ｇｌｕ−ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）及びリジン−プラスミノゲン（Ｌｙｓ−ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）である。天然的に分泌されかつ分解していない形のプラスミノゲンは一つのアミノ基末端（Ｎ−末端）グルタミン酸を有し、そのためグルタミン酸−プラスミノゲンと称される。しかし、プラスミンが存在する場合、グルタミン酸−プラスミノゲンはＬｙｓ７６−Ｌｙｓ７７においてリジン−プラスミノゲンに加水分解される。グルタミン酸−プラスミノゲンと比較して、リジン−プラスミノゲンはフィブリンとより高い親和力を有し、さらにより高い速度でＰＡによって活性化されることができる。この二種類の形のプラスミノゲンのＡｒｇ５６０−Ｖａｌ５６１ペプチド結合はｕＰＡ  またはｔＰＡによって切断され、これによりジスルフィド結合によって接続された二重鎖プロテアーゼプラスミンの形成をもたらす［３２］。プラスミノゲンのアミノ基末端部分は五つの相同性三環を含み、即ちいわゆるｋｒｉｎｇｌｅｓであり、カルボキシル基末端部分はプロテアーゼドメインを含む。一部のＫｒｉｎｇｌｅｓはプラスミノゲンとフィブリン及びその阻害剤α２−ＡＰの特異的相互作用を介在するリジン結合部位を含む。最も新しく発見されたのは３８ｋＤａのフィブリンプラスミノゲンフラグメントであり、ｋｒｉｎｇｌｅｌ−４を含み、血管生成の有効的な阻害剤である。このフラグメントはアンジオスタチン（Angiostatin）と命名され、幾つかのプロテアーゼ加水分解プラスミノゲンから生成される。
【００５３】
プラスミンの主な基質はフィブリンであり、フィブリンの溶解は病理学的血栓の形成を予防するキーポイントである［３３］。プラスミンはさらにＥＣＭの幾つかの成分に対する基質特異性を有し、これらはラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン及びゼラチンを含み、これはプラスミンがＥＣＭ再建において重要な作用を有することを示している［２９、３４、３５］。間接的に、プラスミンはさらにいくつかのプロテアーゼ前駆体を活性プロテアーゼに変換することによりＥＣＭのその他の成分を分解し、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３及びＭＭＰ−９を含む。そのため、以下のように提唱する人がいる。プラスミンは細胞外タンパク加水分解の重要な上流調節因子である可能性がある［３６］。また、プラスミンはいくつかの潜在的な形の成長因子を活性化させる能力を有する［３７−３９］。体外において、プラスミンはさらに補体系の成分を加水分解させて走化性の補体フラグメントを放出することができる。
【００５４】
「プラスミン」は血液中に存在する非常に重要な酵素であり、フィブリン凝塊をフィブリン分解生成物及びＤ−二量体に加水分解する。
【００５５】
「プラスミノーゲン」はプラスミンの酵素前駆体の形であり、ｓｗｉｓｓ  ｐｒｏｔ中の配列に基づいて、シグナルペプチドのヒト由来の天然プラスミノーゲンのアミノ酸配列（配列４）は計算によれば８１０個のアミノ酸からなり、分子量は約９０ｋＤであり、主に肝臓において合成され且つ血液中で循環できる糖タンパク質であり、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列３に示される通りである。フルサイズのプラスミノーゲンは七つのドメインを含む：Ｃ末端に位置するセリンプロテアーゼドメイン、Ｎ末端に位置するＰａｎ  Ａｐｐｌｅ（ＰＡｐ）ドメイン及び５つのＫｒｉｎｇｌｅドメイン（Ｋｒｉｎｇｌｅ１−５）を含む。ｓｗｉｓｓ  ｐｒｏｔ中の配列を参照すれば、そのシグナルペプチドは残基Ｍｅｔ１−Ｇｌｙ１９を含み、Ｐａｐは残基Ｇｌｕ２０−Ｖａｌ９８を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ１は残基Ｃｙｓ１０３−Ｃｙｓ１８１を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ２は残基Ｇｌｕ１８４−Ｃｙｓ２６２を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ３は残基Ｃｙｓ２７５−Ｃｙｓ３５２を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ４は残基Ｃｙｓ３７７−Ｃｙｓ４５４を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ５は残基Ｃｙｓ４８１−Ｃｙｓ５６０を含む。ＮＣＢＩデータによれば、セリンプロテアーゼドメインは残基Ｖａｌ５８１−Ａｒｇ８０４を含む。
【００５６】
Ｇｌｕ−プラスミノーゲンは天然のフルサイズのプラスミノーゲンであり、７９１個のアミノ酸からなる（１９個のアミノ酸からなるシグナルペプチドを含まない）。該配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列１に示される通りであり、そのアミノ酸配列は配列２に示される通りである。体内において、さらにＧｌｕ−プラスミノーゲンの第７６−７７位のアミノ酸の位置で加水分解することにより形成されたＬｙｓ−プラスミノーゲンが存在し、例えば配列６に示されるものであり、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列５が示す通りである。δ−プラスミノーゲン（δ−ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）はフルサイズのプラスミノーゲンにＫｒｉｎｇｌｅ２−Ｋｒｉｎｇｌｅ５構造の欠損が生じているフラグメントであり、Ｋｒｉｎｇｌｅ１及びセリンプロテアーゼドメインしか含有せず［４０、４１］、δ−プラスミノーゲンのアミノ酸配列（配列８）を報告している文献があり［４１］、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は例えば配列７である。ミニプラスミノーゲン（Ｍｉｎｉ−ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）はＫｒｉｎｇｌｅ５及びセリンプロテアーゼドメインからなり、残基Ｖａｌ４４３−Ａｓｎ７９１（シグナルペプチドＧｌｕ−プラスミノーゲン配列を含まないＧｌｕ残基を開始アミノ酸とする）について文献が報告しており［４２］、そのアミノ酸配列は配列１０に示される通りであり、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列９が示す通りである。しかしマイクロプラスミノーゲン（Ｍｉｃｒｏ−ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）はセリンプロテアーゼドメインのみ含有し、そのアミノ酸配列は残基Ａｌａ５４３−Ａｓｎ７９１（シグナルペプチドを含まないＧｌｕ−プラスミノーゲン配列のＧｌｕ残基は開始アミノ酸である）と文献が報告し［４３］、特許文献ＣＮ１０２１５４２５３Ａはそれが残基Ｌｙｓ５３１−Ａｓｎ７９１を含むと開示し（シグナルペプチドを含まないＧｌｕ−プラスミノーゲン配列のＧｌｕ残基を開始アミノ酸とする）、本特許の配列は特許文献ＣＮ１０２１５４２５３Ａを参照でき、そのアミノ酸配列は配列１２に示される通りであり、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列１１に示される通りである。
【００５７】
本発明の「プラスミン」と「フィブリンプラスミン」、「繊維タンパクプラスミン」は互いに置き換えて使用でき、その意味は同じである。「プラスミノーゲン」と「フィブリンプラスミノーゲン」、「繊維タンパクプラスミノーゲン」は互いに置き換えて使用でき、その意味は同じである。
【００５８】
本願において、プラスミノーゲンの「欠乏」とは、被験者体内のプラスミノーゲンの含有量または活性が正常な人より低く、被験者の正常な生理学的機能に影響を及ぼすのに十分に低いことをいう。プラスミノーゲンの「欠乏」の意味は、被験者体内のプラスミノーゲンの含有量または活性が正常な人より明らかに低く、活性または発現が極微量であり、外部供給によってのみ正常な生理学的機能を維持できることである。
【００５９】
当業者は以下のように理解できる。本発明のプラスミノーゲンのすべての技術構成はプラスミンに適用でき、そのため、本発明に記載の技術構成はプラスミノーゲン及びプラスミンをカバーするものである。
【００６０】
循環プロセスにおいて、プラスミノーゲンは閉鎖した非活性コンフォメーションであるが、血栓または細胞表面に結合した際、プラスミノーゲン活性化剤（ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ，ＰＡ）の介在下において、開放性のコンフォメーションを有する活性プラスミンとなる。活性を有するプラスミンはさらにフィブリン凝塊をフィブリン分解生成物及びＤ−二量体に加水分解させ、これにより血栓を溶解させる。そのうちプラスミノーゲンのＰＡｐドメインはプラスミノーゲンを非活性閉鎖コンフォメーションにする重要なエピトープであり、しかしＫＲドメインは受容体及び基質上のリジン残基と結合できるものである。プラスミノーゲン活性化剤としての酵素は、既に複数種類知られ、以下を含む：組織プラスミノーゲン活性化剤（ｔＰＡ）、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化剤（ｕＰＡ）、カリクレイン及び血液凝固因子ＸＩＩ（ハーゲマン因子）などである。
【００６１】
「プラスミノーゲン活性フラグメント」とはプラスミノーゲンタンパク質において、基質中のターゲット配列と結合してタンパク質加水分解機能を発揮できる活性フラグメントである。本発明はプラスミノーゲンの技術構成に係り、プラスミノーゲン活性フラグメントでプラスミノーゲンの代替とする技術構成を含む。本発明に記載のプラスミノーゲン活性フラグメントはプラスミノーゲンのセリンプロテアーゼドメインを含むタンパク質であり、好ましくは、本発明に記載のプラスミノーゲン活性フラグメントは配列１４、配列１４と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性のアミノ酸配列を含有するタンパク質を含むものである。そのため、本発明に記載のプラスミノーゲンは該プラスミノーゲン活性フラグメントを含み、且つ依然として該プラスミノーゲン活性を有するタンパク質を含む。
【００６２】
現在、血液中のプラスミノーゲン及びその活性測定方法は以下を含む：組織フィブリンプラスミノーゲン活性化剤の活性に対する測定（ｔ−ＰＡＡ）、血漿組織プラスミノーゲン活性化剤抗原に対する測定（ｔ−ＰＡＡｇ）、血漿組織プラスミノーゲン活性に対する測定（ｐｌｇＡ）、血漿組織プラスミノーゲン抗原に対する測定（ｐｌｇＡｇ）、血漿組織プラスミノーゲン活性化剤の阻害物活性に対する測定、血漿組織プラスミノーゲン活性化剤の阻害物抗原に対する測定、血漿プラスミン−抗プラスミン複合体に対する測定（ＰＡＰ）。最もよく見られる測定方法は発色基質法である：測定対象(被験者)の血漿中にストレプトキナーゼ（ＳＫ）と発光基質を添加し、測定対象の血漿中のプラスミノーゲンはＳＫの作用下においてプラスミンとなり、後者は発光基質に作用し、それから分光光度計で測定し、吸光度の増加はプラスミノーゲンの活性と正比例の関係となる。この他にも免疫化学法、ゲル電気泳動法、免疫比濁法、放射免疫拡散法などを用いて血液中のフィブリンプラスミノーゲン活性に対して測定を行うことができる。
【００６３】
「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とは異なる種どうしのホモログであり、タンパク質の相同物もＤＮＡの相同物も含む。それは具体的に異なる種どうしの同じ祖先の遺伝子から進化して得られるタンパク質または遺伝子を言う。本発明のプラスミノーゲンはヒト由来の天然プラスミノーゲンを含み、さらには異なる種に由来する、プラスミノーゲン活性を有するプラスミノーゲンオルソログを含む。
【００６４】
「保存的置換バリアント」とはそのうちの一つの指定されたアミノ酸残基が改変されたがタンパク質または酵素の全体のコンフォメーション及び機能を変えないものであり、これは類似の特性（例えば酸性、塩基性、疎水性など）のアミノ酸でペアレントタンパク質中のアミノ酸配列中のアミノ酸を置換するものを含むがこれらに限られない。類似の性質を有するアミノ酸は知られている通りである。例えば、アルギニン、ヒスチジン及びリジンは親水性の塩基性アミノ酸であり且つ互いに置き換えることができる。同じように、イソロイシンは疎水アミノ酸であり、ロイシン、メチオニンまたはバリンによって置換されることができる。そのため、機能の類似する二つのタンパク質またはアミノ酸配列の類似性は異なる可能性もある。例えば、ＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づいて７０％〜９９％の類似性（同一性）を有する。「保存的置換バリアント」はさらにＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡアルゴリズムに基づいて６０％以上のアミノ酸同一性を有するポリペプチドまたは酵素を含み、、７５％以上に達すればさらによく、最も好ましくは８５％以上に達し、さらには９０％以上に達するのが最も好ましく、さらに天然またはペアレントタンパク質または酵素と比較して同じまたは基本的に類似する性質または機能を有する。
【００６５】
「分離された」プラスミノーゲンとは天然環境から分離及び／または回収されたプラスミノーゲンタンパク質である。いくつかの実施形態において、前記プラスミノーゲンは（１）９０％を超える、９５％を超える、または９８％を超える純度（重量で計算した場合）になるまで精製し、例えばＬｏｗｒｙ法によって決まるもので、例えば９９％（重量で計算した場合）を超えるまで精製する、（２）少なくともスピニングカップ配列分析装置によりＮ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５個の残基が得られる程度になる精製する、または（３）同質性になるまで精製する。該同質性はクマシーブリリアントブルーまたは銀染色により還元性または非還元性条件下のドデシル硫酸ナトリウムーポリアクリルアミノゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって決まるものである。分離されたプラスミノーゲンはバイオエンジニアリング技術により組み換え細胞から製造することができ、さらに少なくとも一つの精製ステップで分離されたプラスミノーゲンを含む。
【００６６】
用語の「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は本明細書において互いに置き換えて使用でき、いかなる長さのアミノ酸の重合体を指し、遺伝的にコードされた及び非遺伝的にコードされたアミノ酸、化学的または生化学的に修飾されまたは派生したアミノ酸、及び修飾されたペプチド主鎖を有するポリペプチドを含む。該用語は融合タンパク質を含み、異種性アミノ酸配列を有する融合タンパク質を含むがこれに限られず、異種性と同種性由来のリーダー配列（Ｎ端メチオニン残基を有するか有しない）を含む融合物；等々である。
【００６７】
参照ポリペプチド配列の「アミノ酸配列同一性パーセンテージ（％）」の定義は、必要に応じてギャップを導入することで最大のパーセンテージ配列の同一性を実現した後、如何なる保存的な置換も配列同一性の一部として見なさない場合、候補配列中における参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同じアミノ酸残基のパーセンテージである。パーセンテージのアミノ酸配列の同一性を測定することを目的とした比較は本分野の技術範囲における複数種類の方式によって実現でき、例えば公衆が入手できるコンピュータソフトウエア、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアによって実現できる。当業者は配列をアライメントするための適切なパラメータを決めることができ、比較対象の配列のフルサイズに対して最大比較の要求を実現するための如何なるアルゴリズムも含む。しかし、本発明の目的のために、アミノ酸配列の同一性パーセンテージは配列比較コンピュータソフトウエアＡＬＩＧＮ−２により得られるものである。
【００６８】
ＡＬＩＧＮ−２を用いることによりアミノ酸配列を比較する場合、所定のアミノ酸配列Ａの所定のアミノ酸配列Ｂに対するアミノ酸配列同一性％（または所定のアミノ酸配列Ｂに対して、と、またはについてのあるアミノ酸配列と同一性を有する又は含む所定のアミノ酸配列Ａともいう）は以下のように計算される：
分数Ｘ／Ｙ×１００
【００６９】
そのうちＸは配列アライメントプログラムＡＬＩＧＮ−２において該プログラムのＡ及びＢのアライメントにおいて同一でマッチングすると評価したアミノ酸残基の数であり、且つそのうちＹはＢにおけるアミノ酸残基の総数である。以下のように理解するべきである：アミノ酸配列Ａの長さとアミノ酸配列Ｂの長さが等しくない場合、ＡのＢに対するアミノ酸配列の同一性％は、ＢのＡに対するアミノ酸配列同一性％とは異なる。特に断りのない限り、本文中において使用するすべてのアミノ酸配列同一性値％は前記の段落に記載の通りであり、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムによって得られるものである。
【００７０】
本文において使用されているように、用語の「治療」及び「処理」は期待される薬理及び／または生理的効果が得られることを言う。前記効果は疾患またはその症状を完全または一部予防すること、及び／または疾患及び／またはその症状を一部または完全に治癒するものとすることができる。さらに以下を含む：（ａ）疾患が被験者の体内で発生することを予防し、前記被験者は疾患の要因を持っているが、該疾患を有すると診断されていない状況であること；（ｂ）疾患を抑制し、その形成を阻害すること；及び（ｃ）疾患及び／またはその症状を減軽し、即ち疾患及び／またはその症状を減退させること。
【００７１】
用語の「個体」、「被験者」及び「患者」は本明細書中において互いに置き換えて使用でき、哺乳動物を指し、ネズミ（ラット、マウス）、ヒト以外の霊長類、ヒト、イヌ、ネコ、有蹄動物（例えばウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ）などを含むがこれらに限られない。
【００７２】
「治療上有効量」または「有効量」とは、哺乳動物またはその他の被験者に投与して疾患の治療に用いられる際に疾患の前記予防及び／または治療を実現できるプラスミノーゲンの量である。「治療上有効量」は使用するプラスミノーゲン、治療しようとする被験者の疾患及び／または症状の重症度及び年齢、体重などに従って変化するものである。
【００７３】
本発明のプラスミノーゲンの調製
プラスミノーゲンは治療の用途に用いられるために、自然界から分離及び精製されるものでもよく、標準的な化学ペプチド合成技術によって合成することでもよい。化学的手法によりポリペプチドを合成する際、液相または固相で合成を行うことができる。固相ポリペプチド合成（ＳＰＰＳ）（配列のＣ末端アミノ酸を不溶性支持体に附着させ、順番に配列中の残りのアミノ酸を添加する）はプラスミノーゲンの化学的合成に適したものである。各種形式のＳＰＰＳ、例えばＦｍｏｃ及びＢｏｃは、プラスミノーゲンの合成に用いることができる。固相合成に用いられる技術は以下に記載されている：Ｂａｒａｎｙ及びＳｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；３−２８４ページ、Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ．第二巻：Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐａｒｔ  Ａ．，Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，ｔら  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９−２１５６（１９６３）；Ｓｔｅｗａｒｔら，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ  ｅｄ．Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．（１９８４）；及びＧａｎｅｓａｎ  Ａ．２００６Ｍｉｎｉ  Ｒｅｖ．Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．６：３−１０及びＣａｍａｒｅｒｏ  ＪＡら  ２００５Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｅｐｔ  Ｌｅｔｔ．１２：７２３−８。簡単に言えば、その上にペプチド鎖が構築されている機能性ユニットにより不溶性の多孔ビーズを処理する。カップリング／脱保護の繰り返し循環後に、附着した固相の遊離Ｎ末端アミンと単一のＮ保護を受けているアミノ酸ユニットをカップリングさせる。それから、該ユニットを脱保護し、他のアミノ酸と接続する新しいＮ末端アミンを露出させる。ペプチドを固相上に固定したままにし、それからそれを切除する。
【００７４】
標準的な組み換え方法により本発明のプラスミノーゲンを生産する。例えば、プラスミノーゲンをコードする核酸を発現ベクター中に挿入し、それと発現ベクター中の制御配列を操作可能に接続させる。発現制御配列はプロモーター（例えば天然に関連されているプロモーター、または異種由来のプロモーター）、シグナル配列、エンハンサーエレメント及び転写終了配列を含むが、これらに限られない。発現の制御はベクター中の真核プロモーターシステムとすることができ、前記ベクターは真核宿主細胞（例えばＣＯＳまたはＣＨＯ細胞）を形質転換またはトランスフェクションさせる。一旦ベクターを適切な宿主に導入すれば、ヌクレオチド配列の高レベル発現及びプラスミノーゲンの収集及び精製に適した条件下において宿主を維持する。
【００７５】
適切な発現ベクターは通常宿主体内において附加体または宿主染色体ＤＮＡの整合部分として複製される。通常、発現ベクターは選択マーカー（例えばアンピシリン耐性、ハイグロマイシン耐性、テトラサイクリン耐性、カナマイシン耐性またはネオマイシン耐性）を含み、インビトロで所望のＤＮＡ配列によって形質転換されたそれらの細胞に対して測定を行うことに有用である。
【００７６】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）は目的抗体をコードするポリヌクレオチドをクローンする原核宿主細胞の例である。その他の使用に適した微生物宿主は桿菌を含み、例えばバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びその他の腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、例えばサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、及び各種シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種である。これらの原核宿主において、発現ベクターを生成でき、通常は宿主細胞と相容する発現制御配列（例えば複製開始点）を含むものである。また、多くの公知のプロモーターが存在し、例えば乳糖プロモーターシステム、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステム、β−ラクタマーゼプロモーターシステム、またはファージλ由来のプロモーターシステムである。プロモーターは一般的に発現を制御し、必要に応じて遺伝子配列を制御する場合に、転写及び翻訳を起動するために、さらにリボソームの結合位置配列を有してもよい。
【００７７】
その他の微生物、例えば酵母も発現に用いることができる。酵母（例えばサッカロミセス（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））及びピキア（Ｐｉｃｈｉａ）が適した酵母宿主細胞の例であり、そのうちの適切な担体は必要に応じて発現制御配列（例えばプロモーター）、複製開始点、終止配列など含む。典型的なプロモーターは３−ホスホグリセリン酸キナーゼ及びその他の糖分解酵素を含む。誘導型酵母プロモーターはアルコール脱水素酵素、イソチトクロムＣ、及びマルトースとガラクトースの利用のための酵素のプロモーターを含む。
【００７８】
微生物以外に、哺乳動物細胞（例えば体外細胞培養物中において培養された哺乳動物細胞）も本発明のプラスミノーゲンの発現および生成に用いることができる（例えば目的抗−Ｔａｕ抗体をコードするポリヌクレオチド）。例えばＷｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎ．Ｙ．，Ｎ．Ｙ．（１９８７）参照。適した哺乳動物宿主細胞はＣＨＯ細胞系、各種Ｃｏｓ細胞系、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞系、及び形質転換されたＢ細胞またはハイブリドーマを含む。これらの細胞に用いられる発現ベクターは発現制御配列、例えば複製開始点、プロモーター、及びエンハンサー（Ｑｕｅｅｎら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．８９：４９（１９８６））、及び必要とされる加工情報位置、例えばリボソームの結合サイト、ＲＮＡの切断サイト、ポリアデノシン酸化サイト、及び転写ターミネーター配列を含むことができる。適切な発現制御配列の例はウサギ免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシ乳頭腫ウィルス、サイトメガロウイルスなどの派生のプロモーターである。Ｃｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１４９（１９９２）を参照すること。
【００７９】
一旦合成（化学または組み換え的に）されれば、本分野の標準的な手順、例えば硫酸アンモニウム沈殿、アフィニテイカラム、カラムクロマトグラフィー、高速液相クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ゲル電気泳動などにより本発明に記載のプラスミノーゲンを精製することができる。該プラスミノーゲンは基本的に純粋なものであり、例えば少なくとも約８０％から８５％の純度で、少なくとも約８５％〜９０％の純度で、少なくとも約９０％〜９５％の純度で、または９８％〜９９％の純度またはさらに純度が高いものであり、例えば汚染物を含まず、前記汚染物は例えば細胞砕片、目的抗体以外の大分子などである。
【００８０】
薬物配合剤
所望の純度のプラスミノーゲンと必要に応じた薬用担体、賦形剤、または安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版，Ｏｓｏｌ，Ａ．ｅｄ．（１９８０））を混合して凍結乾燥製剤または水溶液を形成して治療用の配合剤を得る。許容可能な担体、賦形剤、安定化剤は所要の用量及び濃度下において被験者に対して毒性がなく、さらに例えばリン酸塩、クエン酸塩及びその他の有機酸などの緩衝剤を含む。抗酸化剤はアスコルビン酸和メチオニンを含む；防腐剤（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメチレンジアミン；塩化ベンザルコニウム（ｂｅｎｚａｌｋｏｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブタノールまたはベンジルアルコール；アルキルパラヒドロキシ安息香酸エステル、例えばメチルまたはプロピルパラヒドロキシ安息香酸エステル；ピロカテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；ｍ-クレゾール）；低分子量ポリペプチド（少なくとも１０個の残基を有するもの）；タンパク質例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性重合体、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン酸、ヒスチジン、アルギニンまたはリシンである；単糖、二糖及びその他の炭水化物はグルコース、マンノース、またはデキストリンを含む；キレート剤は例えばＥＤＴＡである；糖類は例えばショ糖、マンニトール、フコースまたはソルビトールである；塩形成対イオン、例えばナトリウム；金属複合体（例えば亜鉛−タンパク複合体）；及び／または非イオン界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。好ましくは凍結乾燥された抗−ＶＥＧＦ抗体配合剤であり、ＷＯ  ９７／０４８０１に記載されているとおりであり、本明細書において参考とされるものである。
【００８１】
本発明の配合剤は治療を必要とする具体的な症状の必要とする一種類以上の活性化合物を含有してもよく、好ましくは活性が相補的で互いに副作用を有しないものである。例えば、血圧降下薬、抗不整脈薬、糖尿病治療薬等である。
【００８２】
本発明のプラスミノーゲンは例えば凝集技術または界面重合によって作られるマイクロカプセル中に内包ことができ、例えば、膠質薬物輸送系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン剤、ナノ粒子及びナノカプセル）中に入れまたは粗エマルジョン状液中のヒドロキシメチルセルロースまたはゲルーマイクロカプセル及びポリ―（メタアクリル酸メチル）マイクロカプセル中に入れることができる。これらの技術はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。
【００８３】
体内に投与することに用いられる本発明のプラスミノーゲンは必ず無菌である必要がある。これは凍結乾燥及び再度配合する前または後に除菌濾過膜で濾過することで容易に実現できる。
【００８４】
本発明のプラスミノーゲンは緩衝製剤を調製できる。緩衝製剤の適切な実例は一定の形状を有し且つ糖タンパクを含む固体の疎水性重合体の半透過マトリックスを含み、例えば膜またはマイクロカプセルである。緩衝基質の実例はポリエステル、水性ゲル（例えばポリ（２−ヒドロキシエチル−メタアクリル酸エステル）（Ｌａｎｇｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５：１６７−２７７（１９８１）；Ｌａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２：９８−１０５（１９８２））またはポリ（ビニールアルコール）、ポリラクチド（米国特許３７７３９１９，ＥＰ  ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタミン酸の共重合体（Ｓｉｄｍａｎ，ら，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：５４７（１９８３）），分解できないエチレン−ビニルアセテート（ｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｖｉｎｙｌ  ａｃｅｔａｔｅ）（Ｌａｎｇｅｒ，ら，出所は前記と同じ）、または分解可能な乳酸−ヒドロキシ酢酸共重合体、例えばＬｕｐｒｏｎ  ＤｅｐｏｔＴＭ（乳酸−ヒドロキシ酢酸共重合体及びリュープロレリン（ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ）酢酸エステルからなる注射可能なミクロスフェア体）、及びポリＤ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を含む。重合体、例えばエチレン−酢酸エチル及び乳酸−ヒドロキシ酢酸は、持続的に分子を１００日間以上放出することができ、しかしいくつかの水性ゲルがタンパク質を放出する時間は比較的短い。関連のメカニズムに応じてタンパク質を安定化させる合理的なストラテジーにより設計できる。例えば、凝集のメカニズムが硫化ジスルフィド結合の交換によって分子間Ｓ−Ｓ結合を形成するであれば、メルカプト基残基を修飾することにより、酸性溶液中から凍結乾燥させ、湿度を制御し、適切な添加剤を用いて、及び特定の重合体基質組成物を開発することで安定化を実現できる。
【００８５】
投与及び使用量
異なる方式、例えば静脈内、腹膜内、皮下、頭蓋骨内、髄腔内、動脈内（例えば頸動脈）、筋肉内投与により本発明の薬物組成物の投与を実現できる。
【００８６】
胃腸外での投与に用いられる製造物は無菌水性または非水性溶液、懸濁液及び乳剤を含む。非水性溶媒の例はプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、例えばオリーブオイルのような植物油、及び注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。水性担体は水、アルコール性／水性溶液、乳剤または懸濁液を含み、食塩水及び緩衝媒介を含む。胃腸外媒介物は塩化ナトリウム溶液、リンガ―デキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、または固定油である。静脈内媒介物は液体及び栄養補充物、電気分解補充物などを含む。されには防腐剤及びその他の添加剤、例えば抗微生物製剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなども存在してもよい。
【００８７】
医療関係者は各種臨床的要素により用量案を決めることができる。例えば医学分野で公知のように、任意の患者の用量は複数の要素によって決められ、これらの要素は患者の体型、体表面積、年齢、投与される具体的な化合物、性別、投与回数及び経路、全体の健康度、及び同時に投与するその他の薬物を含む。本発明が含有するプラスミノーゲンの薬物組成物の用量の範囲は例えば被験者体重に対して毎日約０．０００１〜２０００ｍｇ／ｋｇであり、または約０．００１〜５００ｍｇ／ｋｇ（例えば０．０２ｍｇ／ｋｇ，０．２５ｍｇ／ｋｇ，０．５ｍｇ／ｋｇ，０．７５ｍｇ／ｋｇ，１０ｍｇ／ｋｇ，５０ｍｇ／ｋｇなど）とすることができる。例えば、用量は１ｍｇ／ｋｇ体重または５０ｍｇ／ｋｇ体重または１−５０ｍｇ／ｋｇの範囲とすることができ、または少なくとも１ｍｇ／ｋｇである。この例示性の範囲より高いまたは低い用量もカバーされ、特に前記の要素を考慮した場合である。前記範囲中の中間用量も本発明の範囲内に含まれるものである。被験者は毎日、隔日、毎週または経験分析によって決められた任意のスケジュール表に従ってに従ってこのような用量を投与できる。例示的な用量のスケジュール表は連続数日１−１０ｍｇ／ｋｇ投与することである。本発明の薬物の投与過程において治療効果及び安全性はリアルタイムに評価すべきである。
【００８８】
製品または薬物キット
本発明の一つの実施形態は製品または薬物キットに係るものであり、糖尿病によって引き起こされる心血管疾患及びその関連疾患を治療するための本発明のプラスミノーゲンまたはプラスミンを含有する。前記製品は好ましくは一つの容器、ラベルまたはプロトコルを含む。適切な容器はボトル、バイアル、注射器などである。容器は各種材料例えばガラスまたはプラスチックから作られることができる。前記容器は組成物を含有し、前記組成物は本発明の疾患または症状を有効に治療し且つ無菌の入口を有する（例えば前記容器は静脈輸液用パックまたはバイアルであり、皮下注射針によって貫通される栓を含む）。前記組成物中の少なくとも一種類の活性化剤がプラスミノーゲン／プラスミンである。前記容器上にあるまたは添付されているラベルは前記組成物を本発明の前記糖尿病によって引き起こされる心血管疾患及びその関連疾患の治療に用いられると説明するものである。前記製品はさらに薬用緩衝液を含有する第二容器を含み、前記薬用緩衝液は例えばリン酸塩緩衝の食塩水、リンガー溶液及びグルコース溶液を含む。さらには商業及び使用者の角度から見ると必要とされるその他の物質、即ちその他の緩衝液、希釈剤、濾過物、針及び注射器を含むことができる。また、前記製品は使用説明を有するプロトコルを含み、これは例えば前記組成物の使用者にプラスミノーゲン組成物及び疾患の治療に伴うその他の薬物を患者に投与することを指示するものである。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】図１はＡｐｏＥアテローム性動脈硬化モデルマウスにプラスミノーゲンを１０日投与した後の大動脈のグロスオイルレッドＯ染色の写真を示すものである。その結果、プラスミノーゲン投与群マウスの大動脈弓、胸部大動脈及び腹部大動脈の脂質プラーク（矢印に表記される）の面積は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに小さく、溶媒ＰＢＳ投与対照群の脂質が血管の面積を占める割合は３６．０％であり、プラスミノーゲン投与群は２９．６％である。これは、プラスミノーゲンがＡｐｏＥアテローム性動脈硬化モデルマウスのアテローム性動脈プラークの沈着を減少させ、アテローム性動脈硬化症による血管壁の損傷の修復を促進することができることを示している。
【図２】図２はＡｐｏＥアテローム性動脈硬化モデルマウスにＰＢＳまたはプラスミノーゲンを２０日投与した後の大動脈のグロスオイルレッドＯ染色の写真を示すものである。その結果、プラスミノーゲン投与群マウスの大動脈弓、胸部大動脈及び腹部大動脈の脂質プラーク（矢印に表記される）の面積は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに小さく、溶媒ＰＢＳ投与対照群の脂質が血管の面積を占める割合は４８．１％であり、プラスミノーゲン投与群は３９．４％である。これは、プラスミノーゲンがＡｐｏＥアテローム性動脈硬化モデルマウスのアテローム性動脈プラークの沈着を減少させ、アテローム性動脈硬化症による血管壁の損傷の修復を促進することができることを示している。
【図３】図３はＡｐｏＥアテローム性動脈硬化モデルマウスにプラスミノーゲンを３０日投与した後の大動脈洞のオイルレッドＯ染色の代表的写真を示すものである。Ａは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｂはプラスミノーゲン投与群である。その結果、プラスミノーゲン投与群マウスの大動脈洞における脂肪沈着（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに少ない。これは、プラスミノーゲンが大動脈洞における脂肪沈着を改善できることを示している。
【図４】図４はＡｐｏＥアテローム性動脈硬化モデルマウスにプラスミノーゲンを３０日投与した後の大動脈弁のＨＥ染色の代表的写真を示すものである。ＡとＣは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、ＢとＤはプラスミノーゲン投与群である。その結果、プラスミノーゲン投与群（図４Ｂ、４Ｄ）マウスの大動脈弁におけるプラーク沈着（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群（図４Ａ、図４Ｃ）より明らかに少なく、しかも大動脈弁の融合程度では前者は後者より小さい。これは、プラスミノーゲンがアテローム性動脈硬化症モデルマウスの大動脈弁損傷を改善できることを示している。
【図５】図５はＡｐｏＥアテローム性動脈硬化モデルマウスにプラスミノーゲンを３０日投与した後の大動脈のオイルレッドＯ染色の代表的写真を示すものである。Ａは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｂはプラスミノーゲン投与群である。その結果、プラスミノーゲン投与群の大動脈のオイルレッドＯ着色面積（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに小さい。これは、プラスミノーゲンがアテローム性動脈硬化症モデルマウスの大動脈における脂質沈着を明らかに減少させ、大動脈内壁の損傷を改善することができることを示している。
【図６】図６は２６週齢の糖尿病マウスにプラスミノーゲンを３５日投与した後の血清中の高密度リポタンパク質コレストロール（ＨＤＬ−Ｃ）含有量の検出結果を示すものである。その結果、ヒトプラスミノーゲンを３５日間連続して注射した後、プラスミノーゲン投与群マウスの血清中のＨＤＬ−Ｃ含有量は溶媒ＰＢＳ投与対照群より有意に高く、しかもその差が統計学的に有意である（＊は、Ｐ＜０．０５を表す）。これは、プラスミノーゲン注射が血清におけるＨＤＬ−Ｃの含有量の上昇を促進できることを示している。
【図７】図７は２４〜２５週齢の糖尿病マウスにプラスミノーゲンを３１日投与した後の血清中の低密度リポタンパク質コレストロール（ＬＤＬ−Ｃ）含有量の検出結果を示すものである。その結果、糖尿病モデルマウスにヒトプラスミノーゲンを３１日間連続して注射した後、プラスミノーゲン投与群マウスの血清中のＬＤＬ−Ｃ含有量は溶媒ＰＢＳ投与対照群より低い。これは、プラスミノーゲンが血清におけるＬＤＬ−Ｃ含有量を低減できることを示している。
【図８】図８はＡｐｏＥアテローム性動脈硬化モデルマウスにプラスミノーゲンを３０日投与した後の体重の変化を示すものである。その結果、プラスミノーゲンを３０日投与した後のマウスの体重には明らかな変化はない。これは、投与処理はＡｐｏＥアテローム性動脈硬化モデルマウスの体重に対して明らかな影響はないことを示している。
【図９】図９はＡｐｏＥアテローム性動脈硬化モデルマウスにプラスミノーゲンを３０日投与した後の血清総コレステロールの検出結果を示すものである。その結果、プラスミノーゲン投与群マウスの総コレステロール濃度は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに低く、しかもその差が統計学的に有意である（＊は、Ｐ＜０．０５を表す）。これは、プラスミノーゲンがＡｐｏＥアテローム性動脈硬化モデルマウスの血清における総コレステロールの含有量を低下させることができることを示している。
【図１０】図１０はＡｐｏＥアテローム性動脈硬化モデルマウスにプラスミノーゲンを３０日投与した後の血清のトリグリセリドの検出結果を示すものである。その結果、プラスミノーゲン投与群マウスのトリグリセリド濃度は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに低く、しかもその差が統計学的に有意である（＊は、Ｐ＜０．０５を表す）。これは、プラスミノーゲンがＡｐｏＥアテローム性動脈硬化モデルマウスの血清におけるトリグリセリドの含有量を低下させることができることを示している。
【図１１】図１１はＡｐｏＥアテローム性動脈硬化モデルマウスにプラスミノーゲンを３０日投与した後の血清の低密度リポタンパク質コレストロール（ＬＤＬ−Ｃ）の検出結果を示すものである。その結果、プラスミノーゲン投与群マウスのＬＤＬ−Ｃ濃度は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに低く、しかもその差が統計学的に有意である（＊は、Ｐ＜０．０５を表す）。これは、プラスミノーゲンがＡｐｏＥアテローム性動脈硬化モデルマウスの血清におけるＬＤＬ−Ｃ含有量を低下させることができることを示している。
【図１２】図１２はＡｐｏＥアテローム性動脈硬化モデルマウスにプラスミノーゲンを３０日投与した後の心臓臓器係数（心係数）の統計結果を示すものである。その結果、プラスミノーゲン投与群マウスの心臓臓器係数は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに低い。これは、プラスミノーゲンがＡｐｏＥアテローム性動脈硬化モデルマウスの心臓損傷による心臓代償性肥大を改善できることを示している。
【図１３】図１３はＡｐｏＥアテローム性動脈硬化モデルマウスにプラスミノーゲンを３０日投与した後の肝臓のオイルレッドＯ染色の代表的写真を示すものである。Ａは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｂはプラスミノーゲン投与群であり、Ｃは定量分析結果である。その結果、プラスミノーゲン投与群マウスの肝臓における脂肪沈着（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに少なく、しかもその差が統計学的に有意である（＊は、Ｐ＜０．０５を表す）。これは、プラスミノーゲンがアテローム性動脈硬化モデルマウスの肝臓における脂肪沈着を改善することができることを示している。
【図１４】図１４はＡｐｏＥアテローム性動脈硬化モデルマウスにプラスミノーゲンを３０日投与した後の心臓のＩｇＭ免疫染色の代表的写真を示すものである。Ａは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｂはプラスミノーゲン投与群である。その結果、プラスミノーゲン投与群マウスの心臓のＩｇＭの陽性発現（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに少ない。これは、プラスミノーゲンがアテローム性動脈硬化症による心臓損傷の修復を促進することができることを示している。
【図１５】図１５はＡｐｏＥアテローム性動脈硬化モデルマウスにプラスミノーゲンを３０日投与した後の心臓のシリウスレッド染色の代表的写真を示すものである。Ａは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｂはプラスミノーゲン投与群である。その結果、プラスミノーゲン投与群のコラーゲン沈着（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに少ない。これは、プラスミノーゲンがＡｐｏＥアテローム性動脈硬化症モデルマウスの心臓繊維化を軽減することができることを示している。
【図１６】図１６は２６週齢の糖尿病マウスにプラスミノーゲンを３５日投与した後の心室のオイルレッドＯ染色の代表的写真である。Ａは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｂはプラスミノーゲン投与群である。その結果、プラスミノーゲン投与群マウスの心室における脂質沈着（矢印に示される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに少ない。これは、プラスミノーゲンが糖尿病マウスの心室における脂質沈着を減少させ、心室損傷の修復を促進することができることを示している。
【図１７】図１７はＡｐｏＥアテローム性動脈硬化モデルマウスにプラスミノーゲンを３０日投与した後の大動脈洞のシリウスレッド染色の代表的写真を示すものである。ＡとＣは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、ＢとＤはプラスミノーゲン投与群である。その結果、プラスミノーゲン投与群の大動脈洞の血管内壁におけるコラーゲン沈着（矢印に表記される）の面積は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに小さい。これは、プラスミノーゲンがアテローム性動脈硬化症モデルマウスの大動脈洞の繊維化レベルを低減できることを示している。
【図１８】図１８は２４〜２５週齢の糖尿病マウスにプラスミノーゲンを３１日投与した後の大動脈洞のＨＥ染色写真である。Ａは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｂはプラスミノーゲン投与群である。その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群の血管管壁には泡沫細胞沈着があり（矢印に表記される）、中間層弾性膜の配列が乱れ、管壁は凹凸して不均一である；プラスミノーゲン投与群の中間層弾性膜の構造は規則し、波状を呈する。これは、プラスミノーゲンが糖尿病による大動脈損傷に対して一定の修復作用を有することを示している。
【図１９】図１９は２４〜２５週齢の糖尿病マウスにプラスミノーゲンを３１日投与した後の血清中の心筋トロポニン含有量の検出結果を示すものである。その結果、プラスミノーゲン投与群の心筋トロポニンＩの濃度は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに低く、しかもその差が統計学的にとても有意である（＊＊は、Ｐ＜０．０１を表す）。これは、プラスミノーゲンが糖尿病後期のマウスの心筋損傷の修復を有意に促進できることを示している。
【図２０】図２０はプラスミノーゲンをそれぞれ１０日と２０日投与した後の３％コレステロール高脂血症モデルマウスの血清の高密度リポタンパク質コレストロールの検出結果を示すものである。その結果、プラスミノーゲンを投与した後のプラスミノーゲン投与群マウスのＨＤＬ−Ｃ濃度は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに高く、しかも両者は１０日と２０日投与した後の高密度リポタンパク質濃度の差が統計学的にとても有意である（＊＊は、Ｐ＜０．０１を表す）。これは、プラスミノーゲンが高脂血症モデルマウスの血清における高密度リポタンパク質コレストロールの含有量を効果的に高め、高脂血症モデルマウスの血脂障害を改善できることを示している。
【図２１】図２１はプラスミノーゲンを２０日投与した後の３％コレステロール高脂血症モデルマウスのアテローム性動脈硬化指数の計算結果を示すものである。計算した結果、プラスミノーゲン投与群マウスのアテローム性動脈硬化指数は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに低く、しかもその差が統計学的に有意である。これは、プラスミノーゲンが高脂血症モデルマウスにアテローム性動脈硬化症が発症するリスクを低めることができることを示している。
【図２２】図２２はプラスミノーゲンを２０日投与した後の３％コレステロール高脂血症モデルマウスの心臓リスク指数の計算結果を示すものである。その結果、プラスミノーゲン投与群のＣＲＩは溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに少なく、しかもその差が統計学的にとても有意である。これは、プラスミノーゲンが高脂血症モデルマウスに心臓疾患が発症するリスクを効果的に低めることができることを示している。
【発明を実施するための形態】
【００９０】
[実施例]
[実施例１]
実施例１は、プラスミノーゲンがＡｐｏＥアテローム性動脈硬化症マウスの大動脈における脂質プラーク沈着を改善することに関するものである。
６週齢のオスＡｐｏＥマウス１３匹に高脂肪高コレステロール食（南通トロフィー、ＴＰ２０３１）を１６週間給餌してアテローム性動脈硬化症モデルを誘発した［４７，４８］。モデル化後の各マウスから、投薬の３日前に５０μＬの血液を採取して総コレステロール（Ｔ−ＣＨＯ）含有量を測定し、モデルマウスをＴ−ＣＨＯ含有量によってランダムに二つの群に分け、溶媒ＰＢＳ投与対照群で７匹とプラスミノーゲン投与群で６匹とした。投薬し始めた日を１日目とし、プラスミノーゲン投与群マウスに１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与した。投与期間は１０日間であり、投与期間中に引き続き高脂肪高コレステロール食を与えた。１１日目に二群からランダムにマウスを一匹ずつ取って殺処分し、大動脈を取って４％パラホルムアルデヒド固定液において２４〜４８時間固定を行った。切り開いた後オイルドレッドＯでグロス染色して、大動脈を実体顕微鏡下で７倍にて観察して撮像した。
オイルレッドＯ染色は、脂質沈着を表し、損傷の厳重さを反映することができる［４９］。染色の結果（図１）、プラスミノーゲン投与群マウスの大動脈弓、胸部大動脈及び腹部大動脈の脂質プラーク（矢印に表記される）の面積は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに小さく、溶媒ＰＢＳ投与対照群の脂質が血管の面積を占める割合は３６．０％であり、プラスミノーゲン投与群は２９．６％である。この実験は、プラスミノーゲンがＡｐｏＥアテローム性動脈硬化モデルマウスのアテローム性動脈プラークの沈着を減少させ、アテローム性動脈硬化の修復を促進することができることを示している。
【００９１】
[実施例２]
実施例２は、プラスミノーゲンがＡｐｏＥアテローム性動脈硬化症マウスの大動脈における脂質プラーク沈着を減少させることに関するものである。
６週齢のオスＡｐｏＥマウス１３匹に高脂肪高コレステロール食（南通トロフィー、ＴＰ２０３１）を１６週間給餌してアテローム性動脈硬化症モデルを誘発した［４７，４８］。モデル化後の各マウスから、投薬の３日前に５０μＬの血液を採取して総コレステロール（Ｔ−ＣＨＯ）含有量を測定し、モデルマウスをＴ−ＣＨＯ含有量によってランダムに二つの群に分け、溶媒ＰＢＳ投与対照群で７匹とプラスミノーゲン投与群で６匹とした。投薬し始めた日を１日目とし、プラスミノーゲン投与群マウスに１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与した。投与期間は２０日間であり、投与期間中に引き続き高脂肪高コレステロール食を与えた。２１日目に二群からランダムにマウスを一匹ずつ取って殺処分し、大動脈を取って４％パラホルムアルデヒド固定液において２４〜４８時間固定を行った。切り開いた後オイルドレッドＯでグロス染色して、大動脈を実体顕微鏡下で７倍にて観察して撮像した。
プラスミノーゲン投与群マウスの大動脈弓、胸部大動脈及び腹部大動脈の脂質プラーク（矢印に表記される）の面積は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに小さく、溶媒ＰＢＳ投与対照群の脂質が血管の面積を占める割合は４８．１％であり、プラスミノーゲン投与群は３９．４％である（図２）。これは、プラスミノーゲンがＡｐｏＥアテローム性動脈硬化モデルマウスのアテローム性動脈プラークを減少させ、アテローム性動脈硬化の修復を促進することができることを示している。
【００９２】
[実施例３]
実施例３は、プラスミノーゲンがＡｐｏＥアテローム性動脈硬化症マウスの大動脈洞における脂質沈着を改善することに関するものである。
６週齢のオスＡｐｏＥマウス１３匹に高脂肪高コレステロール食（南通トロフィー、ＴＰ２０３１）を１６週間給餌してアテローム性動脈硬化症モデルを誘発した［４７，４８］。モデル化後の各マウスから、投薬の３日前に５０μＬの血液を採取して総コレステロール（Ｔ−ＣＨＯ）含有量を測定し、モデルマウスをＴ−ＣＨＯ含有量によってランダムに二つの群に分け、溶媒ＰＢＳ投与対照群で７匹とプラスミノーゲン投与群で６匹とした。投薬し始めた日を１日目とし、プラスミノーゲン投与群マウスに１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与した。３０日間投与し、３１日目にマウスを殺処分して心臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において２４〜４８時間固定を行った。それぞれ１５％、３０％スクロース中において４℃で終夜沈めさせ、ＯＣＴで包埋処理を行い、凍結切片の厚みは８μｍであり、オイルレッドＯで１５分間染色し、７５％アルコールで５秒間分別し、そしてヘマトキシリンで３０秒間核を染色し、グリセリンゼラチンに封入させた。切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
その結果、プラスミノーゲン投与群（図３Ｂ）マウスの大動脈洞における脂肪沈着（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群（図３Ａ）より明らかに少ない。これは、プラスミノーゲンがアテローム性動脈硬化症の大動脈洞における脂質沈着を改善できることを示している。
【００９３】
[実施例４]
実施例４は、プラスミノーゲンがＡｐｏＥアテローム性動脈硬化症マウスの大動脈洞損傷を改善することに関するものである。
６週齢のオスＡｐｏＥマウス１３匹に高脂肪高コレステロール食（南通トロフィー、ＴＰ２０３１）を１６週間給餌してアテローム性動脈硬化症モデルを誘発した［４７，４８］。モデル化後の各マウスから、投薬の３日前に５０μＬの血液を採取して総コレステロール（Ｔ−ＣＨＯ）含有量を測定し、モデルマウスをＴ−ＣＨＯ含有量によってランダムに二つの群に分け、溶媒ＰＢＳ投与対照群で７匹とプラスミノーゲン投与群で６匹とした。投薬し始めた日を１日目とし、プラスミノーゲン投与群マウスに１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与した。３０日間投与し、投与期間中に引き続き高脂肪高コレステロール食を与えた。３１日目にマウスを殺処分して心臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において２４〜４８時間固定を行った。固定後の組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。大動脈洞の組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせ、さらに浸水してヘマトキシリン及びエオシンで染色（ＨＥ染色）させ、１％塩酸エタノールで分別させ、アンモニア水でブルーイングさせ、さらにアルコールで段階的に脱水させて封入させ、切片を光学顕微鏡下で４０倍（図４Ａ、４Ｂ）、２００倍（図４Ｃ、４Ｄ）にて観察した。
染色の結果、プラスミノーゲン投与群（図４Ｂ、４Ｄ）マウスの大動脈洞における脂質プラーク沈着（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群（図４Ａ、４Ｃ）より明らかに少なく、しかも大動脈弁の融合程度では前者は後者より小さい。これは、プラスミノーゲンがアテローム性動脈硬化症における大動脈弁膜の損傷を改善できることを示している。
【００９４】
[実施例５]
実施例５は、プラスミノーゲンがＡｐｏＥアテローム性動脈硬化症マウスの大動脈における脂質沈着を低減することに関するものである。
６週齢のオスＡｐｏＥマウス１３匹に高脂肪高コレステロール食（南通トロフィー、ＴＰ２０３１）を１６週間給餌してアテローム性動脈硬化症モデルを誘発した［４７，４８］。モデル化後の各マウスから、投薬の３日前に５０μＬの血液を採取して総コレステロール（Ｔ−ＣＨＯ）含有量を測定し、モデルマウスをＴ−ＣＨＯ含有量によってランダムに二つの群に分け、溶媒ＰＢＳ投与対照群で７匹とプラスミノーゲン投与群で６匹とした。投薬し始めた日を１日目とし、プラスミノーゲン投与群マウスに１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与した。３０日間投与し、投与期間中に引き続き高脂肪高コレステロール食を与えた。３１日目にマウスを殺処分して大動脈を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において２４〜４８時間固定を行った。それぞれ１５％、３０％スクロース中において４℃で終夜沈めさせ、ＯＣＴで包埋処理を行い、凍結切片の厚みは８μｍであり、オイルレッドＯで１５分間染色し、７５％アルコールで５秒間分別し、そしてヘマトキシリンで３０秒間核を染色し、グリセリンゼラチンに封入させた。切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
染色の結果、プラスミノーゲン投与群（図５Ｂ）の大動脈のオイルドレッドＯ染色の沈着（矢印に表記される）面積は溶媒ＰＢＳ投与対照群（図５Ａ）より明らかに小さい。これは、プラスミノーゲンがＡｐｏＥアテローム性動脈硬化症モデルマウスの大動脈脂質が血管内壁における沈着を明らかに低減し、大動脈の損傷を改善できることを示している。
【００９５】
[実施例６]
実施例６は、プラスミノーゲンが糖尿病マウスの血清における高密度リポタンパク質コレストロールを上昇させることに関するものである。
２６週齢のｄｂ／ｄｂオスマウス２０匹を取ってランダムに群分けをし、プラスミノーゲン投与群で１１匹と溶媒ＰＢＳ投与対照群で９匹とした。プラスミノーゲン投与群マウスに２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与した。３５日連続して注射した後にマウスの眼球を摘出して全血を採血し、４℃で３５００ｒ／分で１０分間遠心分離して上澄み液を取り、高密度リポタンパク質コレストロール（ＨＤＬ−Ｃ）検出を行った。高密度リポタンパク質コレストロールの検出は、キット（南京建成生物工程研究所、品目番号Ａ１１２−１）を用いて該キットに記載する方法に従って行われた。
測定した結果、ｄｂ／ｄｂマウスに３５日連続してヒトプラスミノーゲンを注射した後、プラスミノーゲン投与群マウスの血清におけるＨＤＬ−Ｃ含有量は溶媒ＰＢＳ投与対照群（図６）より高く、しかもその差が統計学的に有意である。
糖尿病には通常心血管アテローム性動脈硬化症が伴われ［４５，４６］、高密度リポタンパク質はアテローム性動脈硬化症を防ぐ血漿リポタンパク質であり、冠状動脈性心臓病の保護因子であり、いわゆる「血管清掃者」である。この測定結果は、プラスミノーゲンが血清におけるＨＤＬ−Ｃレベルを高め、糖尿病マウスのアテローム性動脈硬化症改善に寄与できることを示している。
【００９６】
[実施例７]
実施例７は、プラスミノーゲンが糖尿病マウスの血清における低密度リポタンパク質コレストロールを低めることに関するものである。
２４〜２５週齢のｄｂ／ｄｂオスマウス１０匹を取ってランダムに群分けをし、プラスミノーゲン投与群と溶媒ＰＢＳ投与対照群で各５匹ずつとし、さらにｄｂ／ｍ３匹を取って正常対照群とした。プラスミノーゲン投与群マウスに２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、正常対照群マウスに対して何の処置もしなかった。投薬開始当日を０日目とし、３１日連続して注射した後、マウスの眼球を摘出して全血を採血し、４℃で３５００ｒ／分で１０分間遠心分離して上澄み液を取り、低密度リポタンパク質コレストロール（ＬＤＬ−Ｃ）検出を行った。低密度リポタンパク質コレストロールの検出は、キット（南京建成生物工程研究所、品目番号Ａ１１３−１）を用いて該キットに記載する方法に従って行われた。
検出の結果、ｄｂ／ｄｂマウスにヒトプラスミノーゲンを３１日間連続して注射した後、プラスミノーゲン投与群マウスの血清におけるＬＤＬ−Ｃ含有量は溶媒ＰＢＳ投与対照群より低い（図７）。
低密度リポタンパク質はコレステロールを末梢組織細胞に運ぶリポタンパク質粒子であり、酸化低密度リポタンパク質に酸化されることができる。低密度リポタンパク質、特に酸化修飾された低密度リポタンパク質（ＯＸ−ＬＤＬ）が過剰になると、それにより運ばれるコレステロールは動脈壁上に蓄積して動脈硬化を誘発してしまう。そのため、低密度リポタンパク質コレストロールは「悪いコレストロール」と呼ばれる［５２］。この実験の結果は、プラスミノーゲンが血清における低密度リポタンパク質コレストロールの含有量を低減でき、アテローム性動脈硬化症の制御に寄与することを示している。
【００９７】
[実施例８]
実施例８は、プラスミノーゲンがＡｐｏＥアテローム性動脈硬化症マウスの体重に対する影響に関するものである。
６週齢のオスＡｐｏＥマウス１３匹に高脂肪高コレステロール食（南通トロフィー、ＴＰ２０３１）を１６週間給餌してアテローム性動脈硬化症モデルを誘発した［４７，４８］。モデル化後の各マウスから、投薬の３日前に５０μＬの血液を採取して総コレステロール（Ｔ−ＣＨＯ）含有量を測定し、モデルマウスをＴ−ＣＨＯ含有量によってランダムに二つの群に分け、溶媒ＰＢＳ投与対照群で７匹とプラスミノーゲン投与群で６匹とした。投薬し始めた日を１日目とし、プラスミノーゲン投与群マウスに１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与した。投与期間は３０日間であり、投与期間中に引き続き高脂肪高コレステロール食を与えた。投与した１日目、３１日目にマウスの体重を測った。
その結果、プラスミノーゲンを３０日投与した後、マウスの体重には明らかな変化はない（図８）。これは、投薬処理はＡｐｏＥアテローム性動脈硬化症モデルマウスの体重に対して明らかな影響がないことを示している。
【００９８】
[実施例９]
実施例９は、プラスミノーゲンがＡｐｏＥアテローム性動脈硬化症マウスの血脂含有量を低めることに関するものである。
６週齢のオスＡｐｏＥマウス１３匹に高脂肪高コレステロール食（南通トロフィー、ＴＰ２０３１）を１６週間給餌してアテローム性動脈硬化症モデルを誘発した［４７，４８］。モデル化後の各マウスから、投薬の３日前に５０μＬの血液を採取して総コレステロール（Ｔ−ＣＨＯ）含有量を測定し、モデルマウスをＴ−ＣＨＯ含有量によってランダムに二つの群に分け、溶媒ＰＢＳ投与対照群で７匹とプラスミノーゲン投与群で６匹とした。投薬し始めた日を１日目とし、プラスミノーゲン投与群マウスに１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与した。投与期間は３０日間であり、投与期間中に引き続き高脂肪高コレステロール食を与えた。３０日目にマウスを１６時間禁食し、３１日目に眼球を摘出して採血し、遠心分離して上澄み液を取り、血清の総コレステロール（Ｔ−ＣＨＯ）、血清のトリグリセリド（ＴＧ）及び血清の低密度リポタンパク質コレストロール（ＬＤＬ−Ｃ）の含有量を検出した。
１．血清の総コレステロール含有量
検出キット（南京建成生物工程研究所、品目番号Ａ１１１−１）を用いて該検出キットに記載する方法に従って血清の総コレストロール含有量を検出した。
検出した結果、プラスミノーゲン投与群マウスの総コレステロール濃度は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに低く、しかもその差が統計学的に有意である（図９）。これは、プラスミノーゲンがＡｐｏＥアテローム性動脈硬化症モデルマウスの血清における総コレステロール含有量を低下させることができることを示している。
２．血清のトリグリセリド含有量
ＴＧ検出キット（南京建成生物工程研究所、品目番号Ａ１１０−１）を用いて該検出キットのプロトコルに従ってＣＯＤ−ＰＡＰ法により血清のＴＧ含有量を検出した。検出した結果、プラスミノーゲン投与群マウスのＴＧ濃度は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに低く、しかもその差が統計学的に有意である（図１０）。
３．血清の低密度リポタンパク質コレストロール含有量
低密度リポタンパク質コレストロール（ＬＤＬ−Ｃ）検出キット（南京建成生物工程研究所、品目番号Ａ１１３−１）を用いて該キットに記載する方法に従って血清の低密度リポタンパク質コレストロール含有量を検出した。
測定した結果、プラスミノーゲン投与群マウスのＬＤＬ−Ｃ濃度は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに低く、しかもその差が統計学的に有意である（図１１）。これは、プラスミノーゲンがＡｐｏＥアテローム性動脈硬化症モデルマウスの血清におけるＬＤＬ−Ｃ含有量を低下させ、アテローム性動脈硬化症を改善できることを示している。
上記結果によって、プラスミノーゲンがアテローム性動脈硬化症モデルマウスの血清の総コレステロール、トリグリセリド及び低密度リポタンパク質コレストロール含有量を有意に低め、アテローム性動脈硬化症を改善できることは証明された。また、血清の総コレステロール、トリグリセリド及び低密度リポタンパク質コレストロール含有量を低めることによって、アテローム性動脈硬化性心血管疾患のようなアテローム性動脈硬化症の合併症のリスクを低めることができることも証明された。
【００９９】
[実施例１０]
実施例１０は、プラスミノーゲンがＡｐｏＥアテローム性動脈硬化症マウスの心臓の代償性肥大を改善することに関するものである。
６週齢のオスＡｐｏＥマウス１３匹に高脂肪高コレステロール食（南通トロフィー、ＴＰ２０３１）を１６週間給餌してアテローム性動脈硬化症モデルを誘発した［４７，４８］。モデル化後の各マウスから、投薬の３日前に５０μＬの血液を採取して総コレステロール（Ｔ−ＣＨＯ）含有量を測定し、モデルマウスをＴ−ＣＨＯ含有量によってランダムに二つの群に分け、溶媒ＰＢＳ投与対照群で７匹とプラスミノーゲン投与群で６匹とした。投薬し始めた日を１日目とし、プラスミノーゲン投与群マウスに１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与した。投与期間は３０日間であり、投与期間中に引き続き高脂肪高コレステロール食を与えた。投与した３１日目に体重を測ってマウスを殺処分し、心臓を取って重量を測って、心係数を計算した。心係数（％）＝心臓重量／体重×１００。
その結果、プラスミノーゲン投与群マウスの心係数は溶媒ＰＢＳ投与対照群（図１２）より明らかに低い。これは、プラスミノーゲンがＡｐｏＥアテローム性動脈硬化症モデルマウスの心臓損傷による心臓の代償性肥大を軽減できることを示している。
【０１００】
[実施例１１]
実施例１１は、プラスミノーゲンがＡｐｏＥアテローム性動脈硬化症マウスの肝臓における脂質沈着を改善することに関するものである。
６週齢のオスＡｐｏＥマウス１３匹に高脂肪高コレステロール食（南通トロフィー、ＴＰ２０３１）を１６週間給餌してアテローム性動脈硬化症モデルを誘発した［４７，４８］。モデル化後の各マウスから、投薬の３日前に５０μＬの血液を採取して総コレステロール（Ｔ−ＣＨＯ）含有量を測定し、モデルマウスをＴ−ＣＨＯ含有量によってランダムに二つの群に分け、溶媒ＰＢＳ投与対照群で７匹とプラスミノーゲン投与群で６匹とした。投薬し始めた日を１日目とし、プラスミノーゲン投与群マウスに１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与した。３０日間投与し、投与期間中に引き続き高脂肪高コレステロール食を与えた。３１日目にマウスを殺処分して肝臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において２４〜４８時間固定を行った。それぞれ１５％、３０％スクロース中において４℃で終夜沈めさせ、ＯＣＴで包埋処理を行い、凍結切片の厚みは８μｍであり、オイルレッドＯで１５分間染色し、７５％アルコールで５秒間分別し、そしてヘマトキシリンで３０秒間核を染色し、グリセリンゼラチンに封入させた。切片を光学顕微鏡下で４００倍にて観察した。
染色の結果、プラスミノーゲン投与群（図１３Ｂ）の肝臓における脂肪沈着（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群（図１３Ａ）より明らかに少なく、しかもその定量分析の差は統計学的に有意である（図１３Ｃ）。これは、プラスミノーゲンがＡｐｏＥアテローム性動脈硬化症モデルマウスの肝臓における脂肪沈着を改善できることを示している。
【０１０１】
[実施例１２]
実施例１２は、プラスミノーゲンがＡｐｏＥアテローム性動脈硬化症マウスの心臓損傷を改善することに関するものである。
６週齢のオスＡｐｏＥマウス１３匹に高脂肪高コレステロール食（南通トロフィー、ＴＰ２０３１）を１６週間給餌してアテローム性動脈硬化症モデルを誘発した［４７，４８］。モデル化後の各マウスから、投薬の３日前に５０μＬの血液を採取して総コレステロール（Ｔ−ＣＨＯ）含有量を測定し、モデルマウスをＴ−ＣＨＯ含有量によってランダムに二つの群に分け、溶媒ＰＢＳ投与対照群で７匹とプラスミノーゲン投与群で６匹とした。投薬し始めた日を１日目とし、プラスミノーゲン投与群マウスに１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与した。３０日間投与し、投与期間中に引き続き高脂肪高コレステロール食を与えた。３１日目にマウスを殺処分して心臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において２４〜４８時間固定を行った。固定後の組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水してから１回水洗った。ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。５％の健常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングした；時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ヤギ抗マウスＩｇＭ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）を滴加して室温で１時間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒複染色して、流水で５分間流した。アルコールで段階的に脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。ＩｇＭ抗体は、アポトーシス細胞及び壊死細胞の排除において重要な役割を果たし、損傷した組織器官の局所ＩｇＭ抗体のレベルは、損傷の程度と正比例に相関している［５０，５１］。よって、検出した組織器官の局所ＩｇＭ抗体のレベルは該組織器官の損傷状況を反映することができる。実験の結果、プラスミノーゲン投与群マウス（図１４Ｂ）の心臓ＩｇＭ陽性発現は、溶媒ＰＢＳ投与対照群（図１４Ａ）より明らかに少ない。
これは、プラスミノーゲンがＡｐｏＥマウスの心筋損傷を明らかに改善できることを示している。
【０１０２】
[実施例１３]
実施例１３は、プラスミノーゲンがＡｐｏＥアテローム性動脈硬化症マウスの心臓繊維化レベルを低減することに関するものである。
６週齢のオスＡｐｏＥマウス１３匹に高脂肪高コレステロール食（南通トロフィー、ＴＰ２０３１）を１６週間給餌してアテローム性動脈硬化症モデルを誘発した［４７，４８］。モデル化後の各マウスから、投薬の３日前に５０μＬの血液を採取して総コレステロール（Ｔ−ＣＨＯ）含有量を測定し、モデルマウスをＴ−ＣＨＯ含有量によってランダムに二つの群に分け、溶媒ＰＢＳ投与対照群で７匹とプラスミノーゲン投与群で６匹とした。投薬し始めた日を１日目とし、プラスミノーゲン投与群マウスに１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与した。３０日間投与し、投与期間中に引き続き高脂肪高コレステロール食を与えた。３１日目にマウスを殺処分して心臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において２４〜４８時間固定を行った。固定後の組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水してから１回水で洗い、０．１％シリウスレッド飽和ピクリン酸で３０分間染色した後、流水で２分間流し、ヘマトキシリンで１分間染色してから流水で流し、１％塩酸エタノールで分別させてアンモニア水でブルーイングさせ、流水で流した。乾燥した後に中性ゴムに封入させ、光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
シリウスレッド染色は、コラーゲンを長期的に染色することができ、病理学的切片の特殊染色法として、シリウスレッド染色はコラーゲン組織を特異的に表示することができる。
染色の結果、プラスミノーゲン投与群（図１５Ｂ）のコラーゲン沈着（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群（図１５Ａ）より明らかに少ない。これは、プラスミノーゲンがアテローム性動脈硬化症モデルマウスの心臓組織におけるコラーゲンの沈着を低減し、心筋の繊維化を軽減できることを示している。
【０１０３】
[実施例１４]
実施例１４は、プラスミノーゲンが糖尿病マウスの心室における脂質沈着を低めることに関するものである。
糖尿病には通常心血管アテローム性動脈硬化症が伴われる［４５，４６］。心血管アテローム性動脈硬化症は心筋細胞の虚血損傷を引き起こし得る。オイルレッドＯ染色は、脂質沈着を表し、損傷の厳重さを反映することができる［４９］。
２６週齢のｄｂ／ｄｂオスマウス９匹を取ってランダムに二つの群に分け、プラスミノーゲン投与群で４匹と溶媒ＰＢＳ投与対照群で５匹とした。プラスミノーゲン投与群マウスに２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、３５日間投与した。３６日目にマウスを殺処分して心臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において２４〜４８時間固定を行った。それぞれ１５％、３０％スクロース中において４℃で終夜沈めさせ、ＯＣＴで包埋処理を行い、凍結切片の厚みは８μｍであり、オイルレッドＯで１５分間染色し、７５％アルコールで５秒間分別し、そしてヘマトキシリンで３０秒間核を染色し、グリセリンゼラチンに封入させた。切片を光学顕微鏡下で４００倍にて観察した。
その結果、プラスミノーゲン投与群マウス（図１６Ｂ）の心室における脂肪沈着（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群（図１６Ａ）より明らかに少ない。これは、プラスミノーゲンが糖尿病マウスの心室における脂質沈着を減少させ、心室損傷の修復を促進することができることを示している。
【０１０４】
[実施例１５]
実施例１５は、プラスミノーゲンがＡｐｏＥアテローム性動脈硬化症マウスの大動脈洞繊維化を改善することに関するものである。
６週齢のオスＡｐｏＥマウス１３匹に高脂肪高コレステロール食（南通トロフィー、ＴＰ２０３１）を１６週間給餌してアテローム性動脈硬化症モデルを誘発した［３１，３２］。モデル化後の各マウスから、投薬の３日前に５０μＬの血液を採取して総コレステロール（Ｔ−ＣＨＯ）含有量を測定し、モデルマウスをＴ−ＣＨＯ含有量によってランダムに二つの群に分け、溶媒ＰＢＳ投与対照群で７匹とプラスミノーゲン投与群で６匹とした。投薬し始めた日を１日目とし、プラスミノーゲン投与群マウスに１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与した。３０日間投与し、３１日目にマウスを殺処分して心臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において２４〜４８時間固定を行った。それぞれ１５％、３０％スクロース中において４℃で終夜沈めさせ、ＯＣＴで包埋処理を行い、凍結切片の厚みは８μｍであり、０．１％シリウスレッド飽和ピクリン酸で３０分間染色した後、流水で２分間流し、ヘマトキシリンで１分間染色してから流水で流し、１％塩酸エタノールで分別させてアンモニア水でブルーイングさせ、流水で流した。乾燥した後に中性ゴムに封入させ、光学顕微鏡下で４０倍にて観察した。図１７Ｃ、Ｄはそれぞれ、図１７Ａ、Ｂの黒枠領域の拡大図である。
その結果、プラスミノーゲン投与群（図１７Ｂ、１７Ｄ）のコラーゲン沈着（矢印に表記される）の面積は溶媒ＰＢＳ投与対照群（図１７Ａ、１７Ｃ）より明らかに小さい。これは、プラスミノーゲンがアテローム性動脈硬化症マウスの大動脈洞の繊維化レベルを軽減できることを示している。
【０１０５】
[実施例１６]
実施例１６は、プラスミノーゲンが糖尿病マウスの大動脈内壁の損傷に対する保護作用に関するものである。
２４〜２５週齢のｄｂ／ｄｂオスマウス１０匹を取り、実験開始当日を０日として体重を測って、体重によってランダムに二つの群に分け、溶媒ＰＢＳ投与対照群とプラスミノーゲン投与群で各群５匹ずつとした。１日目からプラスミノーゲンまたはＰＢＳ（ＰＢＳはリン酸緩衝液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓａｌｉｎｅ）であり、本文ではプラスミノーゲンの溶媒である）を投与し、連続して３１日間投与した。プラスミノーゲン投与群マウスに２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与した。３２日目にマウスを殺処分して大動脈を取り、１０％中性フルマリン固定液において２４時間固定を行った。固定後の組織サンプルをアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは５μｍであり、切片を脱パラフィンさせ、さらに浸水してヘマトキシリン及びエオシンで染色（ＨＥ染色）させ、１％塩酸エタノールで分別させ、アンモニア水でブルーイングさせ、さらにアルコールで段階的に脱水させて封入させ、切片を光学顕微鏡下で４００倍にて観察した。
ＨＥ染色の結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群の血管管壁には泡沫細胞沈着があり（矢印に表記される）、中間層弾性膜の配列が乱れ、管壁は凹凸して不均一である（図１８Ａ）；プラスミノーゲン投与群の中間層弾性膜の構造は規則し、波状を呈する（図１８Ｂ）。これは、プラスミノーゲン注射が糖尿病による大動脈管内壁の損傷に対して一定の修復作用を有することを示している。
【０１０６】
[実施例１７]
実施例１７は、プラスミノーゲンが糖尿病マウスの心筋損傷に対する保護作用に関するものである。
糖尿病には通常心血管アテローム性動脈硬化症が伴われる［４５，４６］。心血管アテローム性動脈硬化症は、心筋細胞の虚血損傷を引き起こし得る。心筋トロポニンＩ（Ｃａｒｄｉａｃ  ｔｒｏｐｏｎｉｎ  Ｉ，ＣＴＮＩ）は、心筋損傷の重要な指標であり、その血清における濃度は、心筋損傷の程度を反映することができる［４４］。本実験は、心筋トロポニンＩを検出することでプラスミノーゲンが心筋損傷に対する修復作用を観察する。
２４〜２５週齢のｄｂ／ｄｂオスマウス２８匹を取り、実験開始当日を０日として体重を測って、体重によってランダムに二つの群に分け、溶媒ＰＢＳ投与対照群で１２匹とプラスミノーゲン投与群で１６匹とした。群分けした次の日からプラスミノーゲンまたはＰＢＳを投与してその日を１日目とし、連続して３１日間投与した。プラスミノーゲン投与群マウスに２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与した。３２日目に眼球を摘出して採血し、３５００ｒ／分で１５〜２０分間遠心分離して上澄み液を取り、心筋トロポニンＩの濃度測定を行った。その結果、プラスミノーゲン投与群の心筋トロポニンＩの濃度は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに低く、しかもその差が統計学的にとても有意である（図１９）。これは、プラスミノーゲンが糖尿病マウスの心血管アテローム性動脈硬化症による心筋損傷の修復を有意に促進できることを示している。
【０１０７】
[実施例１８]
実施例１８は、プラスミノーゲンが３％コレステロール高脂血症モデルマウスの血清における高密度リポタンパク質コレストロール濃度を高めることに関するものである。
９週齢のオスＣ５７マウス１６匹に３％コレステロール高脂肪食（南通トロフィー）を４週間給餌して高脂血症を誘発し［５２，５３］、このモデルを３％コレステロール高脂血症モデルとし、モデル化後のマウスに引き続き３％コレステロール高脂肪食を与えた。投薬の３日前に各マウスから５０μＬの血液を採取し、総コレステロール（Ｔ−ＣＨＯ）を測定し、モデルマウスを総コレステロール濃度と体重によってランダムに二つの群に分け、各群で８匹ずつとした。投薬し始めた日を１日目とし、プラスミノーゲン投与群マウスに１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、２０日間投与した。１０日目、２０日目にマウスを１６時間禁食した後、１１日目、２１日目に眼窩静脈叢から５０μＬ採血して遠心分離して上澄み液を取り、血清の高密度リポタンパク質コレストロール（ＨＤＬ−Ｃ）を測定した。本文では、高密度リポタンパク質コレストロール含有量を、検出キット（南京建成生物工程研究所、品目番号Ａ１１２−１）に記載の方法でを測定した。
測定した結果、プラスミノーゲン投与群マウスの血清におけるＨＤＬ−Ｃ濃度は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに高く、しかも両者は１０日と２０日投与した後のＨＤＬ−Ｃ濃度の差が統計学的に有意である（図２０）。これは、プラスミノーゲンが高脂血症モデルマウスの血清における高密度リポタンパク質コレストロール含有量を高め、高脂血症マウスの血脂障害を改善できることを示している。
【０１０８】
[実施例１９]
プラスミノーゲンが３％コレステロール高脂血症モデルマウスのアテローム性動脈硬化症の形成リスクを低めることに関するものである。
９週齢のオスＣ５７マウス１６匹に３％コレステロール高脂肪食（南通トロフィー）を４週間給餌して高脂血症を誘発し［５２，５３］、このモデルを３％コレステロール高脂血症モデルとし、モデル化後のマウスに引き続き３％コレステロール高脂肪食を与えた。投薬の３日前に各マウスから５０μＬの血液を採取し、総コレステロール（Ｔ−ＣＨＯ）を測定し、モデルマウスを総コレステロール濃度と体重によってランダムに二つの群に分け、各群で８匹ずつとした。投薬し始めた日を１日目とし、プラスミノーゲン投与群マウスに１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与した。２０日目に投薬した後マウスを禁食し、１６時間禁食した後、２１日目に眼窩静脈叢から５０μＬ採血して遠心分離して上澄み液を取り、総コレステロール検出キット（南京建成生物工程研究所、品目番号Ａ１１１−１）を用いて総コレステロール含有量を測定し、高密度リポタンパク質コレストロール検出キット（南京建成生物工程研究所、品目番号Ａ１１２−１）を用いて高密度リポタンパク質コレストロール（ＨＤＬ−Ｃ）含有量を測定した。
アテローム性動脈硬化指数は、臨床上でアテローム性動脈硬化症を予測するための総合的指標であり、それが冠状動脈性心臓病のリスクを見積もる面における臨床的意義は、総コレステロール、トリグリセリド、高密度リポタンパク質と低密度リポタンパク質のいずれか一つより大きいと考えられている［５４］。アテローム性動脈硬化指数＝（Ｔ−ＣＨＯ−ＨＤＬ−Ｃ）／ＨＤＬ−Ｃ。
計算した結果、プラスミノーゲン投与群マウスのアテローム性動脈硬化指数は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに低く、しかもその差が統計学的にとても有意である（図２１）。これは、プラスミノーゲンが高脂血症モデルマウスのアテローム性動脈硬化症のリスクを低下させることができることを示している。
【０１０９】
[実施例２０]
実施例２０は、プラスミノーゲンが３％コレステロール高脂血症モデルマウスの心臓発症リスクを低めることに関するものである。
９週齢のオスＣ５７マウス１６匹に３％コレステロール高脂肪食（南通トロフィー）を４週間給餌して高脂血症を誘発し［５２，５３］、このモデルを３％コレステロール高脂血症モデルとし、モデル化後のマウスに引き続き３％コレステロール高脂肪食を与えた。投薬の３日前に各マウスから５０μＬの血液を採取し、総コレステロール（Ｔ−ＣＨＯ）を測定し、モデルマウスを総コレステロール濃度と体重によってランダムに二つの群に分け、各群で８匹ずつとした。投薬し始めた日を１日目とし、プラスミノーゲン投与群マウスに１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群に同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与した。２０日目に投与した後、マウスを１６時間禁食し、２１日目に眼窩静脈叢から５０μＬ採血して遠心分離して上澄み液を取り、総コレステロール検出キット（南京建成生物工程研究所、品目番号Ａ１１１−１）を用いて総コレステロール含有量を測定した。高密度リポタンパク質コレストロール検出キット（南京建成生物工程研究所、品目番号Ａ１１２−１）を用いて高密度リポタンパク質コレストロール含有量を測定した。心臓リスク指数＝Ｔ−ＣＨＯ／ＨＤＬ−Ｃ。
心臓リスク指数（ｃａｒｄｉａｃ  ｒｉｓｋ  ｉｎｄｅｘ，ＣＲＩ）は、血脂障害によって心臓疾患が誘発されるリスクを評価するためのものである［５４］。
その結果、プラスミノーゲン投与群のＣＲＩは溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに小さく、しかもその差が統計学的にとても有意である（図２２）。これは、プラスミノーゲンが高脂血症モデルマウスの心臓疾患の発症リスクを効果的に低めることができることを示している。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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