(57)【要約】  中枢神経系（ＣＮＳ）においてプロテアーゼＫＬＫ６によって選択的に活性化され得る抗体プロドラッグには、前記ＣＮＳにおいて疾患または障害を治療するための抗体、抗体の重鎖および／または軽鎖のＮ末端に融合したＫＬＫ６切断可能ペプチド、およびＫＬＫ６切断可能ペプチドのＮ末端に融合したブロッカーが含まれる。前記疾患または障害は、癌、炎症性疾患、自己免疫疾患、感染症、またはニューロン変性疾患である。
2020504123.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
中枢神経系（ＣＮＳ）においてプロテアーゼＫＬＫ６によって選択的に活性化され得る抗体プロドラッグであって、
前記ＣＮＳにおいて疾患または障害を治療するための、抗体、またはその結合フラグメント、
前記抗体の重鎖および／または軽鎖のＮ末端に融合したＫＬＫ６切断可能ペプチド、および
前記ＫＬＫ６切断可能ペプチドのＮ末端に融合したブロッカーを含む、
抗体プロドラッグ。
【請求項２】
前記ブロッカーが、タンパク質、タンパク質ドメイン、またはペプチドを含む、
請求項１に記載の抗体プロドラッグ。
【請求項３】
前記ＫＬＫ６切断可能ペプチドが、天然のＫＬＫ６基質、ペプチドファージライブラリー、合成ペプチドライブラリー、またはＫＬＫ６によって切断され得るペプチド配列に由来する、
請求項１または２に記載の抗体プロドラッグ。
【請求項４】
前記抗体が、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、または抗体薬物複合体（ＡＤＣ）である、
請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体プロドラッグ。
【請求項５】
前記抗体薬物複合体が、免疫サイトカイン、免疫ホルモン、または免疫毒素である、
請求項４に記載の抗体プロドラッグ。
【請求項６】
前記抗体が他の抗体関連用途で使用され得る、
請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体プロドラッグ。
【請求項７】
前記抗体関連用途が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞のためのものである、
請求項６に記載の抗体プロドラッグ。
【請求項８】
前記疾患または障害が、癌、炎症性疾患、自己免疫疾患、感染症、またはニューロン変性疾患である、
請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体プロドラッグ。
【請求項９】
前記抗体が、ネズミ抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である、
請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体プロドラッグ。
【請求項１０】
前記抗体が抗ＶＥＧＦ抗体または抗ＰＤ−１抗体である、
請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体プロドラッグ。
【請求項１１】
ＣＮＳにおける疾患または障害を治療する方法であって、
有効量の請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体プロドラッグを、それを必要とする対象に投与することを含む、
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般にＣＮＳ関連疾患の治療のための抗体に基づく分子に関する。
【背景技術】
【０００２】
治療は、しばしば有害作用に関連している。有害作用を最小減に抑えるために、治療薬の特異性、すなわち疾患剤または細胞／組織だけを攻撃することを改善する必要がある。しかし、そのような選択性を有することが常に可能とは限らない。例えば、抗体は、それらの標的抗原に対して高い親和性で非常に特異的であり、一部の疾患では治療的または診断的適用について承認されている。しかし、標的抗原発現は、必ずしも疾患特異的ではない。そのため、大部分の治療用抗体は、疾患病変を標的とすることに加えて、正常組織も標的とすることがあり、それによって有害作用を引き起こすことがある。
【０００３】
有害作用を減らすためのもう一つのアプローチは、治療薬を標的部位だけで活性化されるプロドラッグとして送達することである。多くのプロドラッグが望ましくない副作用を低減させるのに効果的であることが示されている。しかし、大部分のプロドラッグは小分子である。
【０００４】
中枢神経系（ＣＮＳ）は、治療薬を特異的に標的化することに特有の課題を提示する。そのため、ＣＮＳ疾患または障害の治療へのより良好なアプローチが依然として必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の実施形態は、抗原認識機能の低下したプロドラッグ抗体（プロ抗体）を製造するために抗体のＮ末端と融合するＫＬＫ６基質を含有する組換えタンパク質またはペプチドの使用に関する。これらのプロ抗体は、高濃度のＫＬＫ６プロテアーゼを有する組織、例えばＣＮＳなどにおいて活性化させることができる。
【０００６】
本発明の発明者らは、プロ抗体中のＫＬＫ６基質配列が、血清中のＫＬＫ６の濃度が低いために血清中でＫＬＫ６によって切断されないことを見出した。対照的に、プロ抗体は、ＣＮＳ中のＫＬＫ６の濃度が高いために、ＣＮＳにおいてＫＬＫ６によって切断される。そのため、抗体の機能は、有害作用を防ぎ、末梢組織における抗体の消耗を最小減に抑えるために、末梢血中で抑制され得る。これらのプロ抗体は、ＣＮＳに入った後に、活性化してＣＮＳ関連疾患または障害を標的化できる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一態様では、本発明の実施形態は、中枢神経系（ＣＮＳ）においてプロテアーゼＫＬＫ６によって選択的に活性化され得る抗体プロドラッグに関する。本発明の一実施形態による抗体プロドラッグには、ＣＮＳにおいて疾患または障害を治療するための抗体、またはその結合フラグメント、抗体の重鎖および／または軽鎖のＮ末端に融合したＫＬＫ６切断可能ペプチド、およびＫＬＫ６切断可能ペプチドのＮ末端に融合したブロッカーが含まれる。
【０００８】
本発明の実施形態によれば、中枢神経系（ＣＮＳ）における疾患または障害は、癌、炎症性疾患、自己免疫疾患、感染症、またはニューロン変性疾患であり得る。
【０００９】
本発明の実施形態によれば、ブロッカーは、タンパク質、タンパク質ドメイン、またはペプチドを含む。本発明の実施形態によれば、ＫＬＫ６切断可能ペプチドは、天然のＫＬＫ６基質、ペプチドファージライブラリー、合成ペプチドライブラリー、またはＫＬＫ６によって切断され得るペプチド配列に由来する。
【００１０】
本発明の実施形態によれば、抗体は、モノクローナル抗体もしくはその結合フラグメント、二重特異性抗体、多重特異性抗体、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）、免疫サイトカイン、免疫ホルモン、または免疫毒素である。抗体は、ネズミ抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体であり得る。本発明の実施形態によれば、抗体は任意の適した抗体、例えば抗ＶＥＧＦ抗体または抗ＰＤ−１抗体であり得る。
【００１１】
本発明のもう一つの態様では、本発明の実施形態は、ＣＮＳにおける疾患または障害を治療するための方法に関する。本発明の一実施形態による方法は、有効量の本発明の抗体プロドラッグ（すなわちプロ抗体）を、それを必要とする対象に投与することを含む。
【００１２】
有効量は、望ましい治療効果を達成できる量である。当業者は、有効量が病状、投与経路、患者の状態（例えば、年齢、体重、性別等）に依存することを理解し、当業者は過度の実験を行うことなく有効量を決定することが可能であろう。例えば、本発明の実施形態によれば、有効量は、患者の体重に基づいて０．１μｇ／Ｋｇ〜１０ｍｇ／Ｋｇ、好ましくは１μｇ／Ｋｇ〜１ｍｇ／Ｋｇ、より好ましくは１μｇ／Ｋｇ〜０．１ｍｇ／Ｋｇの範囲であり得る。
【００１３】
本発明のその他の態様および利点は、以下の説明および添付される特許請求の範囲によって明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＫＬＫ６に媒介されるＣＮＳ特異的抗体プロドラッグ作用の戦略を示す図である。
【００１５】
【図２（Ａ）】タンパク質バンドのクーマシー染色による、ＫＬＫ６基質（ＫＬＫ６ｓ）含有タンパク質融合抗体ＦａｂのインビトロＫＬＫ６切断の結果を示す図である。
【図２（Ｂ）】ウエスタンブロットによる、ＫＬＫ６基質（ＫＬＫ６ｓ）含有タンパク質融合抗体ＦａｂのインビトロＫＬＫ６切断の結果を示す図である。
【００１６】
【図３（Ａ）】ＫＬＫ６消化の前後のＫＬＫ６基質（ＫＬＫ６ｓ）含有タンパク質融合抗体Ｆａｂの抗原認識能を示す図であり、表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）によって測定した抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂ（Ｌｕｃｅｎｔｉｃｓ（登録商標））対照の結合を示す図である。
【図３（Ｂ）】ＫＬＫ６消化の前後のＫＬＫ６基質（ＫＬＫ６ｓ）含有タンパク質融合抗体Ｆａｂの抗原認識能を示す図であり、プロ抗体が抗原に結合できなかったことを示す図である。
【図３（Ｃ）】ＫＬＫ６消化の前後のＫＬＫ６基質（ＫＬＫ６ｓ）含有タンパク質融合抗体Ｆａｂの抗原認識能を示す図であり、ＫＬＫ６消化後に、プロ抗体が活性化されて抗原との結合を明らかにしたことを示す図である。
【００１７】
【図４】抗体に融合したＫＬＫ６基質（ＫＬＫ６ｓ）含有ペプチドのインビトロＫＬＫ６切断の結果を示す図である。
【００１８】
【図５（Ａ）】ＫＬＫ６消化の前後のＫＬＫ６基質（ＫＬＫ６ｓ）含有ペプチド融合抗体の抗原認識能を示す図であり、アバスチン対照の結合を示す図である。
【図５（Ｂ）】ＫＬＫ６消化の無いアバスチン−ＫＬＫ６ｓ−レプチンに融合したＦＲ１ペプチド−ＫＬＫ６ｓが、その抗原ＶＥＧＦとの結合親和性の低下を示したことを示す図である（ＫＬＫ６消化の０時間）。ＫＬＫ６消化時間の増加とともに、アバスチン−ＫＬＫ６ｓ−レプチンに融合したＦＲ１ペプチド−ＫＬＫ６ｓはＶＥＧＦ結合に対して次第に活性化された。
【図５（Ｃ）】ＫＬＫ６消化の無いアバスチン−ＫＬＫ６ｓ−レプチンに融合したＦＲ１ペプチド−ＫＬＫ６ｓが、その抗原ＶＥＧＦとの結合親和性の低下を示したことを示す図である（ＫＬＫ６消化後６時間）。
【図５（Ｄ）】ＫＬＫ６消化の無いアバスチン−ＫＬＫ６ｓ−レプチンに融合したＦＲ１ペプチド−ＫＬＫ６ｓが、その抗原ＶＥＧＦとの結合親和性の低下を示したことを示す図である（ＫＬＫ６消化後２４時間）。
【図５（Ｅ）】ＫＬＫ６消化の無いアバスチン−ＫＬＫ６ｓ−レプチンに融合したＦＲ１ペプチド−ＫＬＫ６ｓが、その抗原ＶＥＧＦとの結合親和性の低下を示したことを示す図である（ＫＬＫ６消化後４８時間）。
【００１９】
【図６（Ａ）】ＣＢＲ染色によって明らかにされる、インビトロＫＬＫ６切断の結果を示す図である。
【図６（Ｂ）】ＣＢＲ染色によって明らかにされる、インビトロＫＬＫ６切断の結果を示す図である。
【図６（Ｃ）】異なるペプチドブロッカーおよびＫＬＫ６基質によるアバスチンプロドラッグのＫＬＫ６消化の前後の抗原認識能の結果を示す図である。
【００２０】
【図７（Ａ）】インビトロＫＬＫ６切断の結果を示す図である。
【図７（Ｂ）】抗ＰＤ−１  ｍＡｂオプジーボプロドラッグのＫＬＫ６消化の前後の抗原認識能を示す図である。
【００２１】
【図８】マウスにおけるＫＬＫ６基質（ＫＬＫ６ｓ）含有ペプチド融合抗体のインビボ抗体活性化の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
定義
本明細書において、用語「抗体」とは、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、または抗体薬物複合体（ＡＤＣ）をさす。「抗体薬物複合体」は、免疫サイトカイン、免疫ホルモン、または免疫毒素であり得る。用語「免疫サイトカイン」とは、組換え抗体−サイトカイン融合タンパク質をさす。用語「免疫ホルモン」とは、組換え抗体−ホルモン融合タンパク質をさす。免疫ホルモンの一例は、抗体−レプチン融合タンパク質である。用語「免疫毒素」とは、組換え抗体−毒素複合体をさす。抗体の結合フラグメントは、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、またはＦ（ａｂ’）２であり得る。
【００２３】
用語「タンパク質のＮ末端に融合した」とは、タンパク質のＮ末端で融合タンパク質を形成することをさす。用語「ブロッカー」とは、抗体の活性を低下または遮断するために、すなわち抗体をプロドラッグに変換するために使用されるペプチドまたはタンパク質をさす。その上、ブロッカーを用いてＣＮＳ系への送達を促進することができる、例えば、Ｙｕ，Ｙ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｂｏｏｓｔｉｎｇ  ｂｒａｉｎ  ｕｐｔａｋｅ  ｏｆ  ａ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｂｙ  ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ｉｔｓ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｆｏｒ  ａ  ｔｒａｎｓｃｙｔｏｓｉｓ  ｔａｒｇｅｔ，”Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓ．Ｍｅｄ．３，８４ｒａ４４（２０１１）を参照されたい。
【００２４】
用語「ＫＬＫ６切断可能ペプチド」とは、トリプシン様プロテアーゼであるＫＬＫ６によって切断され得るペプチドをさす。多様なＫＬＫ６切断可能ペプチド配列が当技術分野で公知であり、当業者は特定の配列が過度の実験を行うことなくＫＬＫ６によって切断され得るかどうかを容易に決定することができる。
【００２５】
本発明の実施形態は、中枢神経系（ＣＮＳ）における疾患または障害の治療のための治療用抗体に関する。これらの抗体は、プロドラッグ（プロ抗体）の形態であり、これには、抗体と標的抗原の結合を遮断するために抗体の可変ドメインのＮ末端に結合したペプチドフラグメント（ブロッキングペプチド、またはブロッカー）が含まれる。ブロッキングペプチドは、特定のプロ酵素のプロペプチドに類似している。選択的プロテアーゼによるブロッキングペプチドの切断により、活性抗体が放出される。
【００２６】
本発明の実施形態は、プロ抗体の特異的活性化をカリクレイン−６（ＫＬＫ−６）に頼る。具体的には、本発明の実施形態は、ＫＬＫ６基質を含有する組換えタンパク質またはペプチドを用いて抗体のＮ末端と融合する。ＫＬＫ６基質含有組換えタンパク質またはペプチドは、プロペプチドのように機能して、抗体の抗原認識機能を遮断するかまたは低下させる。
【００２７】
ＫＬＫ６基質は、末梢血中の血清中のＫＬＫ６の濃度が低いために、血液循環中のＫＬＫ６によって認識される程度には切断されないであろう。しかし、ＫＬＫ６基質含有組換えタンパク質またはペプチドは、ＣＮＳ中で見出される濃度のＫＬＫ６によって効率的に切断され得る。そのため、抗体の機能を末梢血中で遮断または最小化して、有害作用を防ぎ、抗体の不要な消耗を減らすことができる。これらのプロ抗体は、ＣＮＳに入った後に、活性化してＣＮＳ関連疾患を標的化できる。
【００２８】
ヒトカリクレイン（ＫＬＫ）ファミリーには、様々な組織で発現する１５の分泌セリンプロテアーゼが含まれる。これらの中で、ＫＬＫ６は、ＣＮＳにおいて高度に発現することが見出されており、乳癌および卵巣癌組織においても過剰発現する。ザイム、プロテアーゼＭ、およびニューロシンとしても公知であるＫＬＫ６は、トリプシン様セリンプロテアーゼである。ＫＬＫ６はＣＮＳの乏突起神経膠細胞で構成的に発現し、その発現は脊髄損傷（ＳＣＩ）後および活動性多発性硬化症（ＭＳ）病変で増強される。ヒトミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、βアミロイドペプチド（Ａβ）、プラスミノゲン、ミエリン、およびα−シヌクレイン等を含む、多くのタンパク質がＫＬＫ６によって切断されることが示されている。
【００２９】
様々なヒトの体液中のＫＬＫ６レベルが決定されており、ＫＬＫ６は、血液循環と比較して、脳脊髄液（ＣＳＦ）において有意に濃縮されていることが見出されている。この発現レベルの差異が、ＣＮＳでのプロドラッグ活性化の機会を可能にする。
【００３０】
本発明の実施形態によれば、望ましくない副作用を減らすために、末梢血での機能が低下した抗体プロドラッグが開発された。これらの抗体プロドラッグは、中枢神経系でＫＬＫ６によって活性化される。本発明は、様々なＣＮＳ関連疾患、例えば、癌、炎症性疾患、自己免疫疾患、感染症、またはニューロン変性疾患に適用できる。
【００３１】
図１は、ＫＬＫ６に媒介されるＣＮＳ特異的抗体プロドラッグ作用の戦略を示す。本発明の実施形態によれば、抗体の軽鎖および／または重鎖のＮ末端をブロッカー（ブロッキングペプチド）と融合させて抗体をプロドラッグ（すなわちプロ抗体）に変換することができる。ブロッカーは、抗体の抗原認識を低下させる。ブロッカーはＫＬＫ６によって切断され得るペプチド配列を含む。ペプチド配列はＫＬＫ６基質（ＫＬＫ６ｓ）として機能する。
【００３２】
本発明の一部の実施形態によれば、軽鎖Ｎ末端だけがブロッカーを含む。本発明のその他の実施形態によれば、重鎖Ｎ末端だけがブロッカーを含む。抗原−抗体結合は重鎖と軽鎖の両方の可変ドメインを伴うので、重鎖または軽鎖のいずれかのＮ末端を遮断すれば抗原−抗体結合を妨害するのに十分となろう。
【００３３】
本発明の一部の実施形態によれば、軽鎖Ｎ末端と重鎖Ｎ末端の両方がそれぞれブロッカーを含む。重鎖と軽鎖の両方の可変領域を二重に遮断することにより、抗原−抗体相互作用のより良好な遮断を生成することができる。
【００３４】
本発明の実施形態によれば、ブロッカーは、活性抗体が特定の濃度を超えるＫＬＫ６を有する環境においてのみ放出されるように、ＫＬＫ６基質を含有するタンパク質、タンパク質ドメイン、またはペプチドを含む。ＫＬＫ６は、トリプシン様プロテアーゼであることが示されており、アルギニン残基のカルボキシル側で切断することを好む。Ｌｉらは、ＫＬＫ６が、Ｐ１位がＡｒｇによって占められ、ＳｅｒがＰ１’で強く優先されるペプチド基質を好むことを見出した。（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．，１７（４）：６６４−６７２（２００８））。Ｍａｇｋｌａｌｒａら（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３０７（４）：９４８−５５（２００３））も、ＫＬＫ６はＬｙｓよりもＡｒｇの後ではるかに高い効率で切断し、Ｐ２位ではＳｅｒまたはＰｒｏが優先されることを見出した。この情報に基づいて、ＫＬＫ６によって効率的に切断されるペプチド配列を設計することができる。当業者は、多くのペプチド配列がこれらの基準を満たし、本発明の実施形態がこの説明に使用される特定の例に限定されないことを理解するであろう。そのようなペプチドは、本明細書において一般にＫＬＫ６基質（またはＫＬＫ６ｓ）と呼ばれる。
【００３５】
本発明の実施形態は、ＫＬＫ６が末梢血よりもはるかに高い濃度でＣＮＳに存在するという知見に基づく。末梢血中のＫＬＫ６の濃度は０〜１２．６μｇ／Ｌの範囲であるが、ＣＮＳ中のＫＬＫ６の濃度は４１〜２０５３μｇ／Ｌの範囲である。末梢血とＣＮＳとの間のこのＫＬＫ６濃度の有意な違いによって、本発明のブロッカー融合抗体（プロ抗体）は、末梢血中ではその低い活性を維持して有害作用を防ぐことができるが、ＣＮＳ中ではその治療機能のためにＫＬＫ６によって活性化され得る。
【００３６】
以下の説明は、本発明の実施形態を説明するために具体例を使用する。当業者は、これらの例が例示のためだけのものであり、本発明の範囲から逸脱することなくその他の変形および変更が可能であるので本発明の範囲を限定するものではないことを理解するであろう。
【００３７】
以下の例では、様々な融合タンパク質が、所望の配列を含有する発現ベクター構築することによって調製される。当技術分野で公知の任意の適したベクターが使用されてよい。以下の例では、ＫＬＫ６ｓ含有ペプチド／タンパク質融合抗体を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって構築し、ｐＴＣＡＥ８ベクター（プラスミド）の多重クローニング部位にクローニングした。これらのタンパク質およびベクターの特定のｃＤＮＡ配列は当技術分野で公知であり、容易に入手可能である。使用される方法は従来のものである。様々なベクターおよび試薬は、商業的供給源から入手することができる。したがって、当業者はこれらの試薬を入手し、過度の実験を行うことなく記載される実験を行うことが可能であろう。
【００３８】
実施例１：プロ抗体からのブロックタンパク質の特異的切断
この実施例では、アバスチンＦａｂに融合したレプチン−ＫＬＫ６ｓをプロ抗体として使用して、アバスチンＦａｂを放出するＫＬＫ６の能力を試験する。融合タンパク質（プロ抗体）を、それぞれ血清濃度、ＣＳＦ濃度、１μＭ、または２μＭのＫＬＫ６とともに２４時間インキュベートする。図２は、ＫＬＫ６基質（ＫＬＫ６ｓ）含有タンパク質融合抗体ＦａｂのインビトロＫＬＫ６切断の結果を示す。この実施例では、ＫＬＫ６ｓ（ＫＬＫ６基質配列）は、好ましいＫＬＫ６切断部位−Ｒ−Ｓ−を含むＹＭＴＲＳＡＭＧ（配列番号１）の配列を有するオクタペプチドである。
【００３９】
タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、クーマシーブリリアントブルーＲ−２５０（ＣＢＲ）で染色するか（図２Ａ）またはウエスタンブロットによって分析した（図２Ｂ）。対照（レーン１、２、および３）と比較して、血清濃度のＫＬＫ６は、ブロッカーの切断に効果がなかったが（レーン４）、ＣＳＦ濃度またはそれよりも高濃度のＫＬＫ６は、矢印によって示される切断タンパク質（レーン５、６、および７）から明らかなように、効率的な切断を示した。
【００４０】
これらの結果は、本発明の実施形態によるプロ抗体が末梢血中に残存し、ＣＮＳ中で一度効率的に活性化され得ることを示す。
【００４１】
実施例２：プロ抗体および再活性化抗体による抗原結合
この実施例では、抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂ（Ｌｕｃｅｎｔｉｃｓ（登録商標）；ラニビズマブ）またはアバスチンＦａｂに融合したレプチン−ＫＬＫ６ｓの結合速度を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）（ＢＩＡｃｏｒｅ）によって求める。図３は、ＫＬＫ６消化の前後のＫＬＫ６基質（ＫＬＫ６ｓ）含有タンパク質融合抗体Ｆａｂの抗原認識能を示す。Ｌｕｃｅｎｔｉｃｓ（登録商標）対照と比較して（図３Ａ）、ＫＬＫ６消化の無いアバスチンＦａｂに融合したレプチン−ＫＬＫ６ｓは、その抗原ＶＥＧＦに対する結合親和性を示さなかった（図３Ｂ）。対照的に、ＫＬＫ６消化後のアバスチンＦａｂに融合したレプチン−ＫＬＫ６ｓは、ＶＥＧＦに対して良好な結合親和性を示した（図３Ｃ）。
【００４２】
これらの結果は、ブロッキングペプチド／タンパク質がプロ抗体のその抗原との結合を防止するのに有効であること、そしてブロッカー（プロペプチドまたはプロタンパク質）の切断後に、活性抗体が放出されてその標的に特異的に結合できたことを示す。これらの結果は本発明のアプローチの正当性を立証する。
【００４３】
実施例３：プロペプチドのＫＬＫ６切断の効率
この実施例では、アバスチン−ＫＬＫ６ｓ−レプチンに融合したＦＲ１ペプチド−ＫＬＫ６ｓをＣＳＦ濃度のＫＬＫ６とともにそれぞれ６、２４、または４８時間インキュベートした。ここで、ＦＲ１ペプチドはアバスチンのフレームワーク領域１である。次に、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ＣＢＲで染色した。図４は、抗体に融合したＫＬＫ６基質（ＫＬＫ６ｓ）含有ペプチドのインビトロＫＬＫ６切断の結果を示す。対照（レーン１）と比較して、異なる時点のＣＳＦ濃度のＫＬＫ６は、矢印で示されるように切断されたタンパク質を示した。６時間で切断は実質的に終了し、切断が極めて効率的であることを示している。
【００４４】
実施例４：ＫＬＫ６によるブロッカーの時間依存的切断
この実施例では、抗ＶＥＧＦ抗体（アバスチン）、またはアバスチン−ＫＬＫ６ｓ−レプチンに融合したＦＲ１ペプチド−ＫＬＫ６ｓの結合速度をＳＰＲ（ＢＩＡｃｏｒｅ）によって求める。図５は、ＫＬＫ６消化の前後の、抗体に融合したＫＬＫ６基質（ＫＬＫ６ｓ）含有ペプチドの抗原認識能の結果を示す。アバスチン対照（図５Ａ）と比較して、ＫＬＫ６消化の無いアバスチン−ＫＬＫ６ｓ−レプチンに融合したＦＲ１ペプチド−ＫＬＫ６ｓは、その抗原ＶＥＧＦとの結合親和性の低下を示した（図５Ｂの０時）が、ＫＬＫ６消化時間の増加とともに、アバスチン−ＫＬＫ６ｓ−レプチンに融合したＦＲ１ペプチド−ＫＬＫ６ｓはＶＥＧＦ結合のために再活性化された（それぞれ、図５Ｃ、５Ｄ、および５Ｅの６、２４、および４８時間）。これらの結果は、本発明の実施形態がＫＬＫ６によって活性化され得ることを裏付ける。
【００４５】
実施例５：異なるペプチドブロッカーおよびＫＬＫ６基質によるプロ抗体のＫＬＫ６媒介性ブロッカー切断
この実施例では、アバスチンと融合した異なるＫＬＫ６ｓ含有ペプチドブロッカーを、ＣＳＦ濃度のＫＬＫ６とともに２４時間インキュベートする。図６は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析され、ＣＢＲで染色された、ＫＬＫ６ｓ含有ペプチド融合アバスチンのインビトロＫＬＫ６切断の結果を示す（図６Ａおよび６Ｂ）。アバスチンと融合したブロッカーを含有する全てのＫＬＫ６切断可能ペプチドは、ＫＬＫ６によって切断され得る。ＫＬＫ６消化の前後のＶＥＧＦとアバスチンまたはアバスチン誘導体との相互作用は、ＳＰＲ（ＢＩＡｃｏｒｅ）によって決定される（図６Ｃ）。
【００４６】
アバスチン対照と比較して、ＫＬＫ６消化無しではアバスチンに融合したブロッカーを含有する異なるＫＬＫ６切断可能ペプチドは、応答の低下を示したが、ＫＬＫ６消化有りでは、アバスチンに融合したブロッカーを含有する異なるＫＬＫ６切断可能ペプチドはＶＥＧＦ結合のために再活性化された。切断不能なリンカー配列（ＳＳＹＩＳＮＹＧ；配列番号１３）を有するアバスチンと融合したペプチドブロッカーにおいて、アバスチンと融合したペプチドブロッカーのＶＥＧＦ結合能は、ＫＬＫ６消化の前後で応答単位の低下を示した。これらの結果は、異なるブロッカー配列またはＫＬＫ６基質配列を有する本発明の実施形態が、ＫＬＫ６によって活性化され得ることを実証した。この例では、ペプチドブロッカー配列およびＫＬＫ６ｓ配列が表１に記載される。示されるように、ペプチドブロッカー配列には、ＫＬＫ６基質配列を抗体配列から分離するためのスペーサーとして機能する特定のアミノ酸が含まれ得る。スペーサーは、ＫＬＫ６が切断配列にアクセスできることを確実にするように機能する。切断配列のＮ末端側へのペプチドブロッカー配列は、任意のタンパク質または任意のペプチド配列であり得る。
【表１】
2020504123.tif 000003
【００４７】
実施例６：オプジーボ（登録商標）のプロ抗体からのペプチドブロッカーの特異的切断
この実施例では、抗ＰＤ−１ｍＡｂｓ（ニボルマブ；オプジーボ（登録商標））のＮ末端に融合したＫＬＫ６ｓ含有ペプチドブロッカーを、ＣＳＦ濃度のＫＬＫ６とともに２４時間インキュベートする。図７Ａは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析され、ＣＢＲで染色された、ＫＬＫ６ｓ含有ペプチド融合オプジーボ（登録商標）のインビトロＫＬＫ６切断の結果を示す図である。ＫＬＫ６ｓ含有ペプチド融合オプジーボ（登録商標）は、ＫＬＫ６によって切断され得る。ＫＬＫ６消化の前後のＰＤ−１と抗ＰＤ−１  ｍＡｂ（オプジーボ（登録商標））またはオプジーボ（登録商標）誘導体との相互作用は、ＳＰＲ（ＢＩＡｃｏｒｅ）によって決定される（図７Ｂ）。オプジーボ（登録商標）対照と比較して、ＫＬＫ６消化無しではオプジーボ（登録商標）に融合したＫＬＫ６ｓ含有ペプチドブロッカーは、応答の低下を示したが、ＫＬＫ６消化有りではオプジーボ（登録商標）に融合したＫＬＫ６ｓ含有ペプチドブロッカーはＰＤ−１結合のために再活性化された。これらの結果は、異なる抗体に適用される本発明の実施形態が、ＫＬＫ６によっても活性化され得ることを裏付ける。この例では、ペプチドブロッカー配列およびＫＬＫ６ｓ配列が表２に記載される。
【表２】
2020504123.tif 000004
【００４８】
実施例７：プロ抗体活性化のインビトロ試験
この実施例では、アバスチン−ＫＬＫ６ｓ−レプチンに融合したＦＲ１ペプチド−ＫＬＫ６ｓを静脈注射によってＢＡＬＢ／ｃマウスに注射した。血清試料および脳試料をそれぞれ注射後０．０８、２、４、および８時間に回収した。活性抗体および総抗体濃度をＥＬＩＳＡによって決定した。
【００４９】
図８は、マウスにおけるＫＬＫ６基質（ＫＬＫ６ｓ）含有ペプチド融合抗体のインビボ抗体活性化の結果を示す。血漿において、アバスチン−ＫＬＫ６ｓ−レプチンに融合した活性ＦＲ１ペプチド−ＫＬＫ６ｓの割合は低下したレベルに維持されたが、脳においてアバスチン−ＫＬＫ６ｓ−レプチンに融合したＦＲ１ペプチド−ＫＬＫ６ｓは活性抗体の割合の増加を示した。これらの結果は、ブロッカー−ＫＬＫ６ｓ融合抗体がＣＮＳにおいてインビボで再活性化され得ることを示す。
【００５０】
本発明の一部の実施形態は、ＣＮＳ疾患を治療するための方法に関する。本発明の一実施形態による方法は、有効量の本発明のプロ抗体をそれを必要とする対象に投与することを含む。プロ抗体は、抗体またはその結合フラグメントの重鎖および／または軽鎖のＮ末端と結合したブロッキングペプチドを含む。抗体の結合フラグメントは、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、またはＦ（ａｂ’）２等であり得る。
【００５１】
本発明を限られた数の実施形態に関して説明してきたが、本開示の恩恵を受ける当業者であれば、本明細書に開示した本発明の範囲から逸脱しないその他の実施形態が考案され得ることを理解するであろう。例えば、他の抗体をこれらの例に示した抗体の代わりに使用してもよい。同様に、ブロッキングペプチドフラグメントには、ＫＬＫ６基質配列によって抗体に連結された任意のタンパク質またはペプチドが含まれ得る。したがって、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるべきである。
【図１】
2020504123.tif 000005
【図２（Ａ）】
2020504123.tif 000006
【図２（Ｂ）】
2020504123.tif 000007
【図３（Ａ）】
2020504123.tif 000008
【図３（Ｂ）】
2020504123.tif 000009
【図３（Ｃ）】
2020504123.tif 000010
【図４】
2020504123.tif 000011
【図５（Ａ）】
2020504123.tif 000012
【図５（Ｂ）】
2020504123.tif 000013
【図５（Ｃ）】
2020504123.tif 000014
【図５（Ｄ）】
2020504123.tif 000015
【図５（Ｅ）】
2020504123.tif 000016
【図６（Ａ）】
2020504123.tif 000017
【図６（Ｂ）】
2020504123.tif 000018
【図６（Ｃ）】
2020504123.tif 000019
【図７（Ａ）】
2020504123.tif 000020
【図７（Ｂ）】
2020504123.tif 000021
【図８】
2020504123.tif 000022
【配列表】
2020504123000001.app
【国際調査報告】
2020504123.tif 000023
2020504123.tif 000024
2020504123.tif 000025