(57)【要約】本開示は、タバコ植物における増大した窒素利用効率表現型を追跡するための、ならびに、増大した窒素利用効率表現型をタバコ植物に遺伝子移入するための、代謝シグネチャーおよび遺伝マーカーを提供する。本開示はまた、窒素利用効率の増大したタバコ植物および窒素利用効率の増大したタバコ植物の産出のための方法を提供する。本開示はまた、改変されたタバコ植物における窒素利用効率を増大させるための組換えポリヌクレオチドおよびポリペプチドを提供し、また、これらの提供される組換えポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含むタバコ植物を提供する。2020532299.tif 000016
2020532299.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、増大した窒素利用効率（NUE）形質を含むタバコ植物を生産する方法：
（a）増大したNUE形質を含むタバコ植物の第一の集団を提供する工程；
（b）SEQ ID NO：57、58、59、60、61、62、63、および64からなる群より選択されるSNPマーカーの20cM内に位置する1つまたは複数の分子マーカーの存在について、タバコ植物の第一の集団をジェノタイピングする工程；
（c）該1つまたは複数の分子マーカーを含むタバコ植物を選択する工程；
（d）工程（c）において選択されたタバコ植物を第二のタバコ植物と交雑させる工程；ならびに
（e）工程（d）の交雑体から子孫種子を得る工程であって、該子孫種子から生育させた植物が、増大したNUE形質を含む、工程。
【請求項２】
前記増大したNUE形質が、該増大したNUE形質を欠くタバコ植物を同じ条件で生育させた場合と比べて増加した部分要素生産性（PFP）、増加した農学的効率（AE）、増加した回収効率（RE）、増加した生理学的効率（PE）、および増加した内部効率（IE）からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
タバコ植物の第一の集団が、MD609、MD601、バンケット（Banket）A1、K326、K346、K358、K394、K399、K730、NC196、NC37NF、NC471、NC55、NC92、NC2326、NC95、およびNC925からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
第二のタバコ植物がバーレータバコ品種である、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
第二のタバコ植物が、TN86、TN86LC、TN90、TN90LC、TN97、およびTN97LCからなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
前記1つまたは複数の分子マーカーが前記SNPマーカーの10cM内にある、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
前記1つまたは複数の分子マーカーが前記SNPマーカーの5cM内にある、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
以下の工程を含む、増大したNUE形質を含むタバコ植物を生産する方法：
（a）増大したNUE形質を含むタバコ植物の第一の集団を提供する工程；
（b）SEQ ID NO：9、10、11、12、13、14、15、および16からなる群より選択される配列を有する増大したNUE遺伝子座の20cM内に位置する1つまたは複数の分子マーカーの存在について、タバコ植物の第一の集団をジェノタイピングする工程；
（c）該1つまたは複数の分子マーカーを含むタバコ植物を選択する工程；
（d）工程（c）において選択されたタバコ植物を第二のタバコ植物と交雑させる工程；ならびに
（e）工程（d）の交雑体から子孫種子を得る工程であって、該子孫種子から生育させた植物が、増大したNUE形質を含む、工程。
【請求項９】
前記増大したNUE形質が、該増大したNUE形質を欠くタバコ植物を同じ条件で生育させた場合と比べて増加した部分要素生産性（PFP）、増加した農学的効率（AE）、増加した回収効率（RE）、増加した生理学的効率（PE）、および増加した内部効率（IE）からなる群より選択される、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
タバコ植物の第一の集団が、MD609、MD601、バンケットA1、K326、K346、K358、K394、K399、K730、NC196、NC37NF、NC471、NC55、NC92、NC2326、NC95、およびNC925からなる群より選択される、請求項8に記載の方法。
【請求項１１】
第二のタバコ植物がバーレータバコ品種である、請求項8に記載の方法。
【請求項１２】
第二のタバコ植物が、TN86、TN86LC、TN90、TN90LC、TN97、およびTN97LCからなる群より選択される、請求項8に記載の方法。
【請求項１３】
前記1つまたは複数の分子マーカーが前記遺伝子座の10cM内にある、請求項8に記載の方法。
【請求項１４】
前記1つまたは複数の分子マーカーが前記遺伝子座の5cM内にある、請求項8に記載の方法。
【請求項１５】
コーディング領域に機能的に連結された異種プロモーターを含むシスジェニックポリヌクレオチドを含む、改変されたタバコ種子またはそれから生育させたタバコ植物であって、
該コーディング領域が、SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、および8からなる群より選択される配列と少なくとも80％の配列同一性を含むポリペプチドをコードし、かつ、
該改変されたタバコ植物が、該シスジェニックポリヌクレオチドを欠く改変されていない対照タバコ植物を同じ条件下で生育させた場合と比べて増大したNUE形質を含む、
前記改変されたタバコ種子またはそれから生育させたタバコ植物。
【請求項１６】
前記増大したNUE形質が、該増大したNUE形質を欠くタバコ植物を同じ条件で生育させた場合と比べて増加した部分要素生産性（PFP）、増加した農学的効率（AE）、増加した回収効率（RE）、増加した生理学的効率（PE）、および増加した内部効率（IE）からなる群より選択される、請求項15に記載の改変されたタバコ種子またはそれから生育させたタバコ植物。
【請求項１７】
異種プロモーターが、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、組織優先プロモーター、および組織特異的プロモーターからなる群より選択される、請求項15に記載の改変されたタバコ種子またはそれから生育させたタバコ植物。
【請求項１８】
組織優先プロモーターが、SEQ ID NO：17、18、および19からなる群より選択される配列と少なくとも90％の配列同一性または相補性を有する配列を含む葉優先プロモーターである、請求項15に記載の改変されたタバコ種子またはそれから生育させたタバコ植物。
【請求項１９】
組織優先プロモーターが、SEQ ID NO：20、21、22、23、および24からなる群より選択される配列と少なくとも90％の配列同一性または相補性を有する配列を含む根優先プロモーターである、請求項15に記載の改変されたタバコ種子またはそれから生育させたタバコ植物。
【請求項２０】
コーディング領域が、SEQ ID NO：9、10、11、12、13、14、15、および16からなる群より選択される配列と少なくとも90％の配列同一性を含む、請求項15に記載の改変されたタバコ種子またはそれから生育させたタバコ植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、2017年9月1日に出願された米国仮出願第62/553,501号に対する優先権を主張するものであり、その全体は参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
配列表の組み込み
本願は、2018年8月31日に作成された188,432バイトサイズ（MS-Windows（登録商標）にて測定）の「P34523WO00_SL.txt」という名称のファイルを含む、電子形式で共に提出された配列表を含み、その全体は参照により本明細書に組み入れられる。
【０００３】
分野
本開示は、育種、トランスジェニックアプローチおよびシスジェニックアプローチを介した、窒素利用効率の改善されたタバコ植物を製造および特定するために有用な組成物および方法を提供する。
【背景技術】
【０００４】
背景
肥料は、タバコ栽培者にとって主要なコストであり、施肥の増加は、植物組織中のアルカロイドおよびタバコ特異的ニトロソアミン（TSNA）のより高いレベルと関係している。タバコの品種が異なれば、最大収量を達成するために品種毎に異なるレベルの窒素肥料投入が必要となる。例えば、メリーランドタバコ品種は、典型的には、最大収量を達成するために、バーレータバコ品種と比べておよそ25％少ない窒素投入で済む。
【０００５】
タバコにおける窒素利用効率（NUE）を改善することは、投入窒素肥料単位当たりのタバコの収穫可能量を増加させるだろう。窒素利用効率の改善はまた、農場投入コストの減少、窒素肥料生産に必要な再生不能エネルギー源の使用および依存度の減少を可能にし、かつ、窒素肥料の製造および農業利用の環境への影響を低減する。
【０００６】
タバコの窒素利用効率を改善するための方法および組成物が本明細書に提供される。
【発明の概要】
【０００７】
概要
一局面において、本開示は、タバコ系統のタバコ植物から少なくとも1つの代謝物を得る工程、得られた代謝物の量を決定する工程、および特定された代謝物の量に基づいてタバコ系統のNUEを決定する工程を含む、タバコ系統のNUEを決定する方法を提供し、かつ、それを含む。
【０００８】
一局面において、本明細書は、タバコ系統のタバコ植物から代謝物シグネチャーを単離する工程、代謝物シグネチャーを含む各代謝物の量を決定する工程、および、その代謝物シグネチャーを既知のNUEを含む対照タバコ系統由来の対照代謝物シグネチャーと比較することによってタバコ系統のNUEを決定する工程を含む、代謝物シグネチャーを使用したタバコ系統のNUEを決定する方法を提供し、かつ、それを含む。
【０００９】
一局面において、本明細書は、第一のタバコ系統由来の第一のタバコ植物の代謝物シグネチャーを決定する工程であって、第一のタバコ植物が、代謝物シグネチャーを欠く対照タバコ植物と比べて増大したNUEを含む、工程と、第一の植物を第二のタバコ系統の第二の植物と交雑させる工程と、交雑体から少なくとも1つの子孫種子を得る工程であって、少なくとも1つの子孫種子から生育させた子孫植物が代謝物シグネチャーを含み、かつ、子孫植物が、代謝物シグネチャーを欠く対照植物と比べて増大したNUEを含む、工程とを含む、増大したNUEに関連する代謝物シグネチャーを含むタバコ系統を育種する方法を提供し、かつ、それを含む。
【００１０】
一局面において、本明細書は、タバコ植物の集団を得る工程、タバコ植物の集団由来の少なくとも1つのタバコ植物から増大したNUEに関連する少なくとも1つの代謝物を単離する工程、および、対照タバコ植物と比べてより多くの量の少なくとも1つの代謝物を含む少なくとも1つのタバコ植物を選択する工程を含む、タバコ植物を選択する方法を提供し、かつ、それを含む。この方法のあるさらなる局面において、選択されるタバコ植物は、対照タバコ植物と比べて増大したNUEを含む。
【００１１】
一局面において、本明細書は、タバコ植物の集団を得る工程、タバコ植物の集団由来の少なくとも1つのタバコ植物から増大したNUEに関連する少なくとも1つの代謝物を単離する工程、および、対照タバコ植物と比べてより少ない量の少なくとも1つの代謝物を含む少なくとも1つのタバコ植物を選択する工程を含む、タバコ植物を選択する方法を提供し、かつ、それを含む。
【００１２】
一局面において、本明細書は、タバコ植物から増大したNUEに関連する第一の代謝物シグネチャーを単離する工程、その第一の代謝物シグネチャーを含む少なくとも1つの代謝物の量を決定する工程、第一の代謝物シグネチャーを既知のNUEを含む対照タバコ植物の第二の代謝物シグネチャーと比較する工程、および第一の代謝物シグネチャーが増大したNUEに関連するかどうかを決定する工程を含む、増大したNUEに関連する第一の代謝物シグネチャーについてタバコ植物をスクリーニングする方法を提供し、かつ、それを含む。
【００１３】
一局面において、本明細書は、コーディング領域に機能的に連結された異種プロモーターを含むシスジェニックポリヌクレオチドを含む改変されたタバコ種子またはそれから生育させたタバコ植物であって、改変されたタバコ植物が、シスジェニックポリヌクレオチドを欠く改変されていない対照タバコ植物を同じ条件下で生育させた場合と比べて増大した窒素利用効率を含む、改変されたタバコ種子またはそれから生育させたタバコ植物を提供し、かつ、それを含む。
【００１４】
一局面において、本明細書は、SEQ ID NO：1〜8からなる群より選択されるポリペプチドと少なくとも70％同一または類似したポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結された異種プロモーターを含む組換えDNA構築物を提供し、かつ、それを含む。
【００１５】
一局面において、本明細書は、コーディング領域に機能的に連結された異種プロモーターを含むシスジェニックポリヌクレオチドを含むタバコ植物から製造される、乾燥タバコ材料または乾燥タバコ材料を含むタバコ製品であって、改変されたタバコ植物が、シスジェニックポリヌクレオチドを欠く改変されていない対照タバコ植物を同じ条件下で生育させた場合と比べて増大した窒素利用効率を含む、乾燥タバコ材料または乾燥タバコ材料を含むタバコ製品を提供し、かつ、それを含む。
【００１６】
一局面において、本明細書は、本明細書に開示される改変されたタバコ種子または植物を含む温室、生育箱または圃場を提供し、かつ、それを含む。
【００１７】
一局面において、本明細書は、SEQ ID NO：25〜40からなる群より選択されるポリペプチドをコードする少なくとも1つの変異を内在性遺伝子座に含む、改変されたタバコ種子またはそれから生育させたタバコ植物であって、少なくとも1つの変異を欠く改変されていない対照タバコ植物を同じ条件下で生育させた場合と比べて増大した窒素利用効率を含む、改変されたタバコ種子またはタバコ植物を提供し、かつ、それを含む。
【００１８】
一局面において、本明細書は、SEQ ID NO：25〜40からなる群より選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと同一または相補的である少なくとも18の連続したヌクレオチドを含むガイドRNAに機能的に連結された異種プロモーターを含む組換えDNA構築物を提供し、かつ、それを含む。
【００１９】
一局面において、本明細書は、SEQ ID NO：25〜40からなる群より選択されるポリペプチドをコードする少なくとも1つの変異を内在性遺伝子座に含むタバコ植物から製造される、乾燥タバコ材料または乾燥タバコ材料を含むタバコ製品であって、改変されたタバコ種子またはタバコ植物が、少なくとも1つの変異を欠く改変されていない対照タバコ植物を同じ条件下で生育させた場合と比べて増大したNUEを含む、乾燥タバコ材料または乾燥タバコ材料を含むタバコ製品を提供し、かつ、それを含む。
【００２０】
一局面において、本明細書は、SEQ ID NO：41〜56からなる群より選択されるポリヌクレオチドと少なくとも85％同一または相補的である低分子RNA（sRNA）をコードするポリヌクレオチドに機能的に連結された異種プロモーターを含むシスジェニックポリヌクレオチドを含む、改変されたタバコ種子またはそれから生育させたタバコ植物であって、シスジェニックポリヌクレオチドを欠く改変されていない対照タバコ植物を同じ条件下で生育させた場合と比べて増大したNUEを含む、改変されたタバコ種子またはタバコ植物を提供し、かつ、それを含む。
【００２１】
一局面において、本明細書は、SEQ ID NO：41〜56からなる群より選択されるポリヌクレオチドと少なくとも85％同一または相補的である低分子RNA（sRNA）をコードするポリヌクレオチドに機能的に連結された異種プロモーターを含む組換えDNA構築物を提供し、かつ、それを含む。
【００２２】
一局面において、本明細書は、SEQ ID NO：41〜56からなる群より選択されるポリヌクレオチドと少なくとも85％同一または相補的であるsRNAをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結された異種プロモーターを含むシスジェニックポリヌクレオチドを含むタバコ植物から製造される、乾燥タバコ材料または乾燥タバコ材料を含むタバコ製品であって、改変されたタバコ種子またはタバコ植物が、シスジェニックポリヌクレオチドを欠く改変されていない対照タバコ植物を同じ条件下で生育させた場合と比べて増大したNUEを含む、乾燥タバコ材料または乾燥タバコ材料を含むタバコ製品を提供し、かつ、それを含む。
【００２３】
一局面において、本明細書は、シスジェニック核酸分子をタバコ細胞に導入する工程と、そのタバコ細胞から改変タバコ植物を再生させる工程であって、改変タバコ植物が、シスジェニック核酸分子を欠くタバコ植物と比べて増大したNUEを含む、工程とを含む、タバコ植物のNUEを増大させる方法を提供し、かつ、それを含む。
【００２４】
一局面において、本明細書は、SEQ ID NO：41〜56からなる群より選択される配列を有する遺伝子をコードする核酸分子に対する改変をタバコ細胞に導入する工程と、タバコ細胞から改変タバコ植物を再生させる工程であって、改変タバコ植物が、その改変を欠くタバコ植物と比べて増大したNUEを含む、工程とを含む、タバコ植物のNUEを増大させる方法を提供し、かつ、それを含む。
【００２５】
一局面において、本明細書は、SEQ ID NO：41〜56からなる群より選択される配列を有する遺伝子をコードする核酸分子の少なくとも18の連続した核酸に相同な低分子RNA（sRNA）をコードする核酸をタバコ細胞に導入する工程と、そのタバコ細胞から改変タバコ植物を再生させる工程であって、改変タバコ植物がそのsRNAを欠くタバコ植物と比べて増大したNUEを含む、工程とを含む、タバコ植物のNUEを増大させる方法を提供し、かつ、それを含む。
【００２６】
一局面において、本明細書は、増大したNUEを含むタバコ植物の第一の集団を提供する工程、増大したNUE遺伝子座の20cM内の分子マーカーの存在についてタバコ植物の第一の集団をジェノタイピングする工程、およびジェノタイピングされてその分子マーカーを含むことが判明した1つまたは複数のタバコ植物を選択する工程を含む、方法を提供し、かつ、それを含む。
【００２７】
一局面において、本明細書は、タバコ植物の第一の集団を提供する工程、SEQ ID NO：9〜16からなる群より選択される配列によってコードされる遺伝子座の増大したNUEアレルの存在についてタバコ植物の第一の集団をジェノタイピングする工程、および増大したNUEアレルを含む1つまたは複数のジェノタイピングされたタバコ植物を選択する工程を含む、方法を提供し、かつ、それを含む。
【００２８】
一局面において、本明細書は、増大した窒素利用効率形質を含む第一のタバコ品種を、増大した窒素利用効率形質を欠く第二のタバコ品種と交雑させる工程と、交雑体から子孫種子を得る工程と、少なくとも1つの子孫種子を、増大した窒素利用効率形質に関係する分子マーカーについてジェノタイピングする工程であって、分子マーカーが、SEQ ID NO：9〜16からなる群より選択される配列を有する遺伝子座の20cM内にある、工程と、増大した窒素利用効率形質を含む子孫種子を選択する工程とを含む、増大したNUE形質をタバコ品種に遺伝子移入する方法を提供し、かつ、それを含む。
【００２９】
一局面において、本明細書は、タバコ生殖質の収集物から核酸を単離する工程、単離した核酸を、SEQ ID NO：9〜16からなる群より選択される遺伝子座の20cM内に位置する1つまたは複数のマーカーについてアッセイする工程、および増大したNUE形質を含むタバコ植物を選択する工程を含む、増大したNUE形質を有するタバコ植物を選択する方法を提供し、かつ、それを含む。
【００３０】
一局面において、本明細書は、タバコ生殖質の収集物から核酸を単離する工程、単離した核酸を、SEQ ID NO：57〜64からなる群より選択されるマーカーの20cM内に位置する1つまたは複数のマーカーについてアッセイする工程、および増大したNUE形質を含むタバコ植物を選択する工程を含む、増大したNUE形質を有するタバコ植物を選択する方法を提供し、かつ、それを含む。
【００３１】
配列の簡単な説明
SEQ ID NO：1〜8は、根組織、葉組織または両方における増大したNUEと正に相関している遺伝子のアミノ酸配列である。
【００３２】
SEQ ID NO：9〜16は、根組織、葉組織または両方における増大したNUEと正に相関している遺伝子のヌクレオチド配列である。
【００３３】
SEQ ID NO：17〜19は、葉優先発現を有する遺伝子についてのプロモーター領域のヌクレオチド配列である。
【００３４】
SEQ ID NO：20〜24は、根優先発現を有する遺伝子についてのプロモーター領域のヌクレオチド配列である。
【００３５】
SEQ ID NO：25〜40は、根組織、葉組織または両方における増大したNUEと負に相関している遺伝子のアミノ酸配列である。
【００３６】
SEQ ID NO：41〜56は、根組織、葉組織または両方における増大したNUEと負に相関している遺伝子のヌクレオチド配列である。
【００３７】
SEQ ID NO：57〜64は、増大したNUEに関連する多型を含むSNPマーカーのヌクレオチド配列である。
【００３８】
SEQ ID NO：65は、発現ベクターp45-2-7についての骨格配列である。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】タバコゲノム内のNUEに関連する4つの遺伝子クラスターを描写する。NUE代謝物フィンガープリントを有する、植物において低窒素条件と正常窒素条件との間で差次的に発現された遺伝子を表示する（相関遺伝子）。また、NUE代謝物フィンガープリンティングにかかわらず、差次的に発現された遺伝子（DEG）の総数も、表示する。
【図２】スーパースキャフォールド1にカバーされた、タバコの第11番染色体の2メガ塩基領域を描写する。スーパースキャフォールド1は、スキャフォールドAおよびスキャフォールドBのコンティグである。この領域に位置する79の発現遺伝子のうち、56の遺伝子が差次的に発現される。
【図３】タバコの第11番染色体上のNUEと相関している遺伝子座での、23のバーレー品種および6のメリーランド品種についてのアレル構成を描写する。系統1、2および3は、SEQ ID NO：58に好ましいメリーランドアレルを含有するバーレー系統であり、系統4は、SEQ ID NO：58に好ましくないバーレーアレルを含有する標準バーレー系統である。
【図４】図3に記載の系統1〜4およびMD609対照（C）についてのクロロフィル喪失、生育および収量を描写する。系統1、2および3は、SEQ ID NO：58に好ましいメリーランドアレルを含有するバーレー系統であり、系統4は、SEQ ID NO：58に好ましくないバーレーアレルを含有する標準バーレー系統である。
【図５】窒素ストレス下での増加した収量と正に相関している遺伝子を過剰発現する、温室で生育させたT1植物の1植物当たりの収量（新鮮重量グラム単位）を描写する。1試料当たり9の植物に基づく平均と標準偏差を表示する。
【図６】独立した圃場で生育させた2種類のF4系統、NUE-2およびNUE-3についての収穫後の1エーカー当たりの収量（ポンド単位）を描写する。試験系統は、記載した通りMD609のバーレーTN90への交雑体から作出される。平均と標準偏差は、対照のTN90バーレータバコと比べて提供される。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
詳細な説明
別途定義のない限り、本明細書において使用される技術用語および科学用語は、当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。当業者は、多くの方法を本開示の実施において使用できることを認識するだろう。実際に、本開示は、記載の方法および材料に決して限定されない。本開示の目的のために、以下の用語が下記に定義される。
【００４１】
別途定義のない限り、使用される技術用語および科学用語は全て、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。用語が単数形で提供される場合、本発明者らは、その用語の複数形によって記載される本開示の局面も想定している。参照により組み入れられる参考文献において使用される用語および定義に相違がある場合、本願に使用される用語は、本明細書に与えられる定義を有するものとする。使用される他の技術用語は、様々な専門用語辞典、例えば、「The American Heritage（登録商標）Science Dictionary」（Editors of the American Heritage Dictionaries, 2011, Houghton Mifflin Harcourt, Boston and New York）、「McGraw-Hill Dictionary of Scientific and Technical Terms」（6th edition, 2002, McGraw-Hill, New York）、または「Oxford Dictionary of Biology」（6th edition, 2008, Oxford University Press, Oxford and New York）に例示されるように、それらが使用される技術分野における一般的な意味を有する。本発明者らは、作用の機序または様式に限定されることを意図していない。それらへの参照は、例証を目的としてのみ提供される。
【００４２】
本開示の実施は、別途指示のない限り、当技術分野の技能の範囲内にある、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノム科学、生物工学、メタボロミクス、植物育種および遺伝学の従来技術を含む。例えば、Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th edition (2012); Current Protocols In Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al. eds., (1987)); Plant Breeding Methodology (N.F. Jensen, Wiley-Interscience (1988)); the series Methods In Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M. J. MacPherson, B. D. Hames and G. R. Taylor eds. (1995)); Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual; Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed. (1987)); Recombinant Protein Purification: Principles And Methods, 18-1142-75, GE Healthcare Life Sciences; C. N. Stewart, A. Touraev, V. Citovsky, T. Tzfira eds. (2011) Plant Transformation Technologies (Wiley-Blackwell)；およびR. H. Smith (2013) Plant Tissue Culture: Techniques and Experiments (Academic Press, Inc.)を参照されたい。
【００４３】
本明細書に引用されるいずれの参考文献（例えば、全ての特許、公開特許出願および非特許刊行物を含む）も、その全体が参照により組み入れられる。
【００４４】
本明細書において使用される場合、単数形（a, an, the）は、文脈がそうではないことを明確に示す場合を除き、複数形の指示対象を含む。例えば、用語「1つの化合物」または「少なくとも1つの化合物」は、複数の化合物（その混合物を含む）を含んでよい。
【００４５】
本明細書において使用される場合、用語「配列同一性」または「同一性」は、2つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の文脈において、特定された比較ウィンドウ上で最大の対応となるよう整列させたときに同じである、2つの配列中の残基について言及する。配列同一性の割合がタンパク質に関して使用されるとき、同一でない残基位置はしばしば、保存的アミノ酸置換（アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基に置換されるため、分子の機能的特性を変化させない）によって異なることが認識される。配列が保存的置換で異なるとき、配列同一性パーセントは、置換の保存的性質を修正するように上方調整され得る。そのような保存的置換によって異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有すると言われる。2以上の配列のアラインメントは、任意の好適なコンピュータープログラムを使用して実施し得る。例えば、配列アラインメントを実施するための広く使用されておりかつ受け入れられているコンピュータープログラムは、CLUSTALW v1.6（Thompson, et al. (1994) Nucl. Acids Res., 22: 4673-4680）である。
【００４６】
本明細書において使用される場合、核酸分子に関する用語「相補的」は、アデニンがチミンまたはウラシルに相補的であり、グアニンがシトシンに相補的であるというような、ヌクレオチド塩基の対合を指す。2つの相補的核酸分子は、互いにハイブリダイズすることができる。一例として、二本鎖DNAの2つの鎖は、互いに相補的である。
【００４７】
少なくとも3ヌクレオチド長の特定のポリヌクレオチドは、「オリゴヌクレオチド」と呼ばれ得る。本明細書に提供される核酸分子は、デオキシリボ核酸（DNA）およびリボ核酸（RNA）ならびにそれらの機能的類似体、例えば相補的DNA（cDNA）を含む。本明細書に提供される核酸分子は、一本鎖または二本鎖であることができる。核酸分子は、ヌクレオチド塩基アデニン（A）、グアニン（G）、チミン（T）、シトシン（C）を含む。ウラシル（U）は、RNA分子においてチミンと置き換わる。記号「R」は、プリン（例えば、AまたはG）ヌクレオチド塩基を表すために使用できる。記号「Y」は、ピリミジン（例えば、CまたはT）ヌクレオチド塩基を表すために使用できる。記号「W」は、AまたはTヌクレオチド塩基を表すために使用できる。Sという記号は、GまたはCヌクレオチド塩基を表すために使用できる。記号「M」は、AまたはCヌクレオチド塩基を表すために使用できる。記号「K」は、GまたはTヌクレオチド塩基を表すために使用できる。記号「B」は、G、CまたはTヌクレオチド塩基を表すために使用できる。記号「H」は、A、CまたはTヌクレオチド塩基を表すために使用できる。記号「D」は、A、GまたはTヌクレオチド塩基を表すために使用できる。記号「V」は、A、GまたはCヌクレオチド塩基を表すために使用できる。記号「N」は、任意のヌクレオチド塩基（例えば、A、G、C、TまたはU）を表すために使用できる。
【００４８】
用語「ポリヌクレオチド」の使用は、本開示がDNAを含むポリヌクレオチドに限定されることを意図していない。ポリヌクレオチドおよび核酸分子は、リボヌクレオチド、およびリボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドの組み合わせを含むことができることを、当業者は認識するだろう。そのようなデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドは、天然に存在する分子と合成類似体の両方を含む。本開示のポリヌクレオチドはまた、一本鎖形態、二本鎖形態、ヘアピン、ステム・ループ構造などを非限定的に含めた、全ての配列形態を包含する。
【００４９】
本明細書において使用される場合、用語「ポリペプチド」は、少なくとも2つの共有連結されたアミノ酸の鎖を指す。ポリペプチドは、本明細書に提供されるポリヌクレオチドによってコードされることができる。
【００５０】
本明細書に提供される核酸分子、ポリペプチドまたはタンパク質を、単離するかまたは実質的に精製することができる。「単離した」または「精製した」核酸分子、ポリペプチド、タンパク質またはそれらの生物学的に活性な部分は、その天然環境に見られるようなポリヌクレオチドまたはタンパク質に通常付随するまたはそれと相互作用する成分を実質的にまたは本質的に含まない。例えば、単離したまたは精製したポリヌクレオチドまたはタンパク質は、組換え技術によって生産されたときには他の細胞物質もしくは培養培地を実質的に含まず、または、化学的に合成されたときには化学前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない。一局面において、本明細書に提供される単離したポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが由来する細胞のゲノムDNA中でポリヌクレオチドに天然に隣接した、10000未満のヌクレオチド、5000未満のヌクレオチド、4000未満のヌクレオチド、3000未満のヌクレオチド、2000未満のヌクレオチド、1000未満のヌクレオチド、500未満のヌクレオチド、または100未満のヌクレオチドの核酸配列を含有することができる。一局面において、本明細書に提供される単離したポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが由来する細胞のゲノムDNA中でポリヌクレオチドに天然に隣接した、100〜10000ヌクレオチド、500〜10000ヌクレオチド、1000〜10000ヌクレオチド、2000〜10000ヌクレオチド、3000〜10000ヌクレオチド、4000〜10000ヌクレオチド、1〜500ヌクレオチド、1〜1000ヌクレオチド、1〜2000ヌクレオチド、1〜3000ヌクレオチド、1〜4000ヌクレオチド、1〜5000ヌクレオチド、1〜10000ヌクレオチド、100〜500ヌクレオチド、100〜1000ヌクレオチド、100〜2000ヌクレオチド、100〜3000ヌクレオチド、または100〜4000ヌクレオチドの核酸配列を含有することができる。別の局面において、本明細書に提供される単離したポリペプチドは、化学前駆体または関心対象のタンパク質ではない化学物質を（乾燥重量で）30％未満、20％未満、10％未満、5％未満または1％未満有する調製物中、細胞物質を実質的に含まない。開示されるポリヌクレオチドおよびそれによってコードされるポリペプチドの断片もまた、本発明によって包含される。ポリヌクレオチドの断片は、ネイティブポリペプチドの生物学的活性を保持するポリペプチド断片をコードし得る。あるいは、当技術分野において公知の方法を使用したハイブリダイゼーションプローブまたはPCRプライマーとして有用なポリヌクレオチドの断片は、一般に、生物学的活性を保持する断片ポリペプチドをコードしない。本明細書に提供されるポリヌクレオチドの断片は、所望の結果に応じて、本発明のポリペプチドをコードする、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも50ヌクレオチド、少なくとも70ヌクレオチド、少なくとも100ヌクレオチド、少なくとも150ヌクレオチド、少なくとも200ヌクレオチド、少なくとも250ヌクレオチド、少なくとも300ヌクレオチド、および完全長ポリヌクレオチドまでの範囲であることができる。
【００５１】
核酸は、当技術分野におけるルーチン技術を使用して単離することができる。例えば、核酸は、非限定的に組換え核酸技術および／またはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を含む任意の方法を使用して単離することができる。一般的なPCR技術は、例えば、PCR Primer: A Laboratory Manual, Dieffenbach & Dveksler, Eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995に記載されている。組換え核酸技術は、例えば、核酸を単離するために使用できる、制限酵素消化およびライゲーションを含む。単離核酸はまた、単一核酸分子としてまたは一連のオリゴヌクレオチドとしてのいずれかで、化学的に合成することもできる。ポリペプチドは、天然源（例えば、生物学的試料）から、DEAEイオン交換、ゲル濾過およびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどの公知の方法によって精製することができる。ポリペプチドはまた、例えば、発現ベクター内の核酸を発現させることによって精製することもできる。加えて、精製ポリペプチドを化学合成によって得ることもできる。ポリペプチドの純度の程度は、任意の適切な方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはHPLC解析を使用して測定できる。
【００５２】
一局面において、本開示は、植物細胞における組換え核酸およびポリペプチドを検出する方法を提供する。限定されるわけではないが、核酸はまた、ハイブリダイゼーションを使用して検出することもできる。核酸間のハイブリダイゼーションは、Sambrook et al. （1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY）において詳細に考察されている。
【００５３】
ポリペプチドは、抗体を使用して検出することができる。抗体を使用してポリペプチドを検出するための技術は、酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）、ウェスタンブロット、免疫沈降および免疫蛍光法を含む。本明細書に提供される抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であることができる。本明細書に提供されるポリペプチドに特異的な結合親和性を有する抗体を、当技術分野において周知の方法を使用して作製することができる。本明細書に提供される抗体を、当技術分野において公知の方法を使用して、マイクロタイタープレートなどの固体支持体に付着させることができる。
【００５４】
検出（例えば、増幅産物の、ハイブリダイゼーション複合体の、ポリペプチドの）は、検出可能な標識を使用して達成することができる。用語「標識」は、直接標識の使用も間接標識の使用も包含することを意図している。検出可能な標識は、酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質および放射性物質を含む。
【００５５】
本明細書において使用される場合、語句「に関連する」または「に関係する」は、2つの実体間の認識可能かつ／またはアッセイ可能な関係性を指す。例えば、語句「増大したNUEに関連する」は、植物またはその関心対象の部分が増大したNUE形質を有する程度、度合いおよび／または比率に影響を及ぼし得る、形質、遺伝子座、遺伝子、アレル、マーカー、表現型など、またはそれらの発現、存在または非存在を指す。よって、マーカーが形質に関係しているとき、ならびに、マーカーの存在が、そのマーカーを含む植物／生殖質において所望の形質または形質形態が生じるか否かおよび／またはそれがどの程度であるかの指標であるときに、マーカーは、形質「に関連する」。同様に、マーカーがアレルに関係しているとき、ならびに、マーカーの存在が、そのマーカーを含む植物／生殖質中にアレルが存在するか否かの指標であるときに、マーカーは、アレル「に関連する」。例えば、「増大したNUEアレルに関連するマーカー」は、植物が増大したNUE表現型を呈するか否かおよびそれがどの程度であるかを、その存在または非存在を使用することで予測することができる、マーカーを指す。
【００５６】
本明細書において使用される場合、「センチモルガン」（cM）は、2つの遺伝子座間の組換え頻度および遺伝距離の測定単位である。1cMは、1つの遺伝子座にあるマーカーが一世代の交雑により第二の遺伝子座にあるマーカーから分離される可能性が1％であることに等しい。
【００５７】
本明細書において使用される場合、「密接に関係する」は、マーカーまたは遺伝子座が、別のマーカーまたは遺伝子座の約20cM、15cM、10cM、5cM、4cM、3cM、2cM、1cM、0.5cM、または0.5cM未満内にあることを意味する。例えば、20cMは、マーカーと遺伝子座との間で組換えが約20％以下の頻度で起こることを意味する。
【００５８】
本明細書において使用される場合、「植物」は、植物全体を指す。植物から得られる細胞または組織培養物は、任意の植物成分もしくは植物器官（例えば、葉、茎、根など）、植物組織、種子、植物細胞、および／またはそれらの子孫を含むことができる。子孫植物は、任意の雑種世代、例えば、F1、F2、F3、F4、F5、F6、F7などに由来するものであることができる。植物細胞は、植物から採取された、または植物から採取された細胞からの培養を通じて得られた、植物の生体細胞である。
【００５９】
本明細書において使用される場合、タバコ植物は、ニコチアナ・タバクム・タバクム（Nicotiana tabacum tabacum）；ニコチアナ・タバクム・アンプレキシカウリス（Nicotiana tabacum amplexicaulis）PI 271989;ニコチアナ・タバクム・ベンタミアナ（Nicotiana tabacum benthamiana）PI 555478；ニコチアナ・タバクム・ビゲロヴィイ（Nicotiana tabacum bigelovii）PI 555485;ニコチアナ・タバクム・デブネイイ（Nicotiana tabacum debneyi）；ニコチアナ・タバクム・エクセルシア（Nicotiana tabacum excelsior）PI 224063；ニコチアナ・タバクム・グルチノサ（Nicotiana tabacum glutinosa）PI 555507；ニコチアナ・タバクム・グードスペーディイ（Nicotiana tabacum goodspeedii）PI 241012；ニコチアナ・タバクム・ゴッセイ（Nicotiana tabacum gossei）PI 230953；ニコチアナ・タバクム・ヘスペリス（Nicotiana tabacum hesperis）PI 271991；ニコチアナ・タバクム・クナイチアナ（Nicotiana tabacum knightiana）PI 555527；ニコチアナ・タバクム・マリチマ（Nicotiana tabacum maritima）PI 555535；ニコチアナ・タバクム・メガロスピフォン（Nicotiana tabacum megalosiphon）PI 555536；ニコチアナ・タバクム・ヌーディカウリス（Nicotiana tabacum nudicaulis）PI 555540；ニコチアナ・タバクム・パニクラタ（Nicotiana tabacum paniculata）PI 555545；ニコチアナ・タバクム・プルムバギニフォリア（Nicotiana tabacum plumbaginifolia）PI 555548；ニコチアナ・タバクム・レパンダ（Nicotiana tabacum repanda）PI 555552；ニコチアナ・タバクム・ルスチカ（Nicotiana tabacum rustica）；ニコチアナ・タバクム・スアベオレンス（Nicotiana tabacum suaveolens）PI 230960；ニコチアナ・タバクム・シルベストリス（Nicotiana tabacum sylvestris）PI 555569；ニコチアナ・タバクム・トメントサ（Nicotiana tabacum tomentosa）PI 266379；ニコチアナ・タバクム・トメントシフォルミス（Nicotiana tabacum tomentosiformis）；およびニコチアナ・タバクム・トリゴノフィラ（Nicotiana tabacum trigonophylla）PI 555572を非限定的に含む、ニコチアナ・タバクム（Nicotiana tabacum）属からの任意の植物に由来するものであることができる。
【００６０】
一局面において、本明細書に提供される植物成分は、葉、茎、根、種子、花、花粉、葯、胚珠、小花柄、果実、分裂組織、子葉、胚軸、鞘、胚、胚乳、外植体、カルス、組織培養物、芽、細胞およびプロトプラストを含むが、それらに限定されない。さらなる局面において、本開示は、生殖材料ではなくかつ植物の自然生殖を媒介しない、タバコ植物細胞、組織および器官を提供する。別の局面において、本開示はまた、生殖材料でありかつ植物の自然生殖を媒介する、タバコ植物細胞、組織および器官を提供する。別の局面において、本開示は、光合成を介してそれら自体を維持することができない、タバコ植物細胞、組織および器官を提供する。別の局面において、本開示は、タバコ植物の体細胞を提供する。体細胞は、生殖細胞とは対照的に、植物の生殖を媒介しない。
【００６１】
提供される細胞、組織および器官は、種子、果実、葉、子葉、胚軸、分裂組織、胚、胚乳、根、芽、茎、鞘、花、花序、柄、小花柄、花柱、柱頭、花托、花弁、萼片、花粉、葯、花糸、子房、胚珠、果皮、師部および維管束組織に由来するものであることができる。別の局面において、本開示は、タバコ植物葉緑体を提供する。あるさらなる局面において、本開示は、表皮細胞、ストーマ細胞、葉毛（毛状突起）、根毛または貯蔵根を提供する。別の局面において、本開示は、タバコプロトプラストを提供する。
【００６２】
当業者は、タバコ植物が、無性生殖または栄養繁殖を介するのではなく、種子を介して自然生殖することを理解する。一局面において、本開示は、タバコ胚乳を提供する。別の局面において、本開示は、タバコ胚乳細胞を提供する。あるさらなる局面において、本開示は、ヒトの介入がなければ生殖できない雄性または雌性の不稔タバコ植物を提供する。
【００６３】
一局面において、本開示は、改変されたタバコ植物、種子、植物成分、植物細胞、ならびに改変されたタバコ植物、種子、植物部分および植物細胞から製造される製品に関する方法および組成物を提供する。一局面において、本明細書に提供される改変された種子は、本明細書に提供される改変された植物を生じる。一局面において、本明細書に提供される改変された植物、種子、植物成分、植物細胞または植物ゲノムは、本明細書に提供される組換えDNA構築物を含む。別の局面において、本明細書に提供される乾燥タバコ材料またはタバコ製品は、本明細書に提供される改変されたタバコ植物、植物成分、植物細胞または植物ゲノムを含む。
【００６４】
本明細書において使用される場合、「改変された」は、変異誘発、ゲノム編集、遺伝形質転換またはそれらの組み合わせを受けた、植物、種子、植物成分、植物細胞および植物ゲノムを指す。
【００６５】
本明細書において使用される場合、「シスジェネシス」または「シスジェニック」は、全ての成分（例えば、プロモーター、ドナー核酸、選択遺伝子）が植物起源のみを有する（例えば、植物起源以外の成分は使用されない）、植物、植物細胞または植物ゲノムの遺伝子改変を指す。一局面において、本明細書に提供される改変された植物、植物細胞または植物ゲノムは、シスジェニックである。本明細書に提供されるシスジェニック植物、植物細胞および植物ゲノムは、すぐに使えるタバコ系統を導くことができる。別の局面において、本明細書に提供される改変されたタバコ植物は、タバコ以外の遺伝物質または配列を含まない。
【００６６】
本明細書において使用される場合、「機能的断片」または「その機能的断片」は、それが指す完全長配列の機能を保持する任意のサイズのヌクレオチドまたはアミノ酸配列を指す。ある局面において、機能的断片は、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも25、少なくとも50、少なくとも75、少なくとも100、少なくとも150、少なくとも200、少なくとも250、少なくとも300、少なくとも400、少なくとも500、少なくとも600、少なくとも700、少なくとも800、少なくとも900、少なくとも1000、少なくとも2000、少なくとも3000、少なくとも4000、少なくとも5000、または5000を超えるヌクレオチド長であることができる。ある局面において、機能的断片は、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも25、少なくとも50、少なくとも75、少なくとも100、少なくとも150、少なくとも200、少なくとも250、少なくとも300、少なくとも400、少なくとも500、少なくとも600、少なくとも700、少なくとも800、少なくとも900、少なくとも1000、少なくとも2000、または2000を超えるアミノ酸長であることができる。ある局面において、機能的断片は、5〜5000の間のヌクレオチド、10〜4000の間のヌクレオチド、25〜3000の間のヌクレオチド、50〜2000の間のヌクレオチド、75〜1000の間のヌクレオチド、100〜900の間のヌクレオチド、150〜800の間のヌクレオチド、200〜700の間のヌクレオチド、250〜600の間のヌクレオチド、または300〜500の間のヌクレオチド長であることができる。ある局面において、機能的断片は、5〜2000の間のアミノ酸、10〜1000の間のアミノ酸、25〜900の間のアミノ酸、50〜800の間のアミノ酸、50〜800の間のアミノ酸、75〜700の間のアミノ酸、100〜600の間のアミノ酸、150〜500の間のアミノ酸、200〜400の間のアミノ酸、または250〜300の間のアミノ酸長であることができる。あるさらなる局面において、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、その全体としておよびその任意の機能的断片として想定される。あるさらなる局面において、本明細書に記載のポリペプチドは、その全体としておよびその任意の機能的断片として想定される。あるさらなる局面において、SEQ ID NO：9〜24および41〜56の配列を有するポリヌクレオチドは、その全体としておよびその任意の機能的断片として想定される。あるさらなる局面において、SEQ ID NO：1〜8および25〜40の配列を有するポリペプチドは、その全体としておよびその任意の機能的断片として想定される。
【００６７】
本明細書において使用される場合、用語「窒素利用効率」（NUE）は、窒素を吸収、同化および／または使用する（例えば、土壌、水および／または窒素肥料から）、植物の能力を指す。NUE遺伝子は、収量に影響を及ぼし、作物植物における窒素の使用を改善するための有用性を有する。増大した窒素利用効率は、改善された窒素肥料の取り込みおよび同化ならびに／または後続の蓄積した窒素貯蔵の再移動および再利用からだけでなく、低窒素環境などのストレス状況に対する植物の耐容性の増加からももたらされ得る。NUE遺伝子を使用して、植物の遺伝子構成を変化させることで、現行の施肥標準で植物をより生産性にすることもでき、大幅に低減された肥料もしくは低減された窒素利用可能性でその生産率を維持することもできる。
【００６８】
NUEは、様々な様式で定義されているが、土壌で利用可能な窒素単位当たりの収量が、作物品種の適応性を評価するための全ての重要なパラメーターを統合しており、それがNUEの共通尺度である。例えば、Ladha et al. 2005. Advances in Agronomy, 87:85-156（その全体が本明細書に組み入れられる）を参照されたい。この指標は、「農業的NUE」と呼ばれることもある。NUEの別の尺度として、植物における地上窒素に対する植物生産物（例えば、タバコ葉組織）の比を決定することができる（「生理学的NUE」と呼ばれることもある）。増大したNUEは、3つの重要な構成要素に関する：1）100％正常窒素含有量で生育させた植物と比べて25％正常窒素含有量で生育させたときに収量が大幅に異なることはない；2）増大したNUEを有さない植物と比べてクロロフィル喪失率が低減されている；および3）100％正常窒素含有量で生育させた植物と比べて25％正常窒素含有量で生育させたときに乾燥葉品質が大幅に異なることはない。ある好ましい局面において、増大したNUEを有する植物は、100％の正常なバーレー施肥率下で生育させたバーレー植物と比べて、25％のバーレー施肥率下で生育させたときに類似した収量および葉品質をもたらすことができる。
【００６９】
NUEの少なくとも5つのアプローチおよび指数が当技術分野において使用されており、下で考察する。
【００７０】
（1）施用窒素（N）からの部分要素生産性（PFP）は、施用された各窒素単位当たりどれほど多くの収量が生産されるかの尺度である：
PFPN=収量のキログラム／施用されたNのキログラム
PFPN=Y+N/FN
式中、Y+Nは、収量（キログラム／ヘクタール；kg/ha）であり、FNは、施用された肥料の量（kg/ha）である。
【００７１】
（2）施用窒素（N）の農学的効率（AE）は、施用された各窒素単位当たりどれほど多くの追加の収量が生産されるかの尺度である:
AEN=収量増加のキログラム／施用されたNのキログラム
AEN=(Y+N-Y0N)/FN
式中、Y+Nは、Nの施用による処理での収量（kg/ha）であり；Y0Nは、Nの施用なしの対照処理での収量（kg/ha）であり；FNは、施用されたN肥料の量（kg/ha）である。
【００７２】
（3）施用窒素（N）の回収効率（RE）は、施用された窒素のどれほど多くが作物によって回収されかつ取り込まれるかの尺度である。
REN=取り込まれたNのキログラム／施用されたNのキログラム
REN=(UN+N-UN0N)/FN
式中、UN+Nは、施用NをFNの割合（kg/ha）で受けた区画における、生理学的成熟時の地上バイオマスで測定された植物の総N取り込み（kg/ha）であり；UN0Nは、Nの添加なしの対照区画の総N取り込みである。
【００７３】
（4）施用窒素（N）の生理学的効率（PE）は、追加の窒素取り込み単位当たりどれほど多くの追加の収量が生産されるかの尺度である。
PEN=収量増加のキログラム／取り込まれた肥料Nのキログラム
PEN=(Y+N-Y0N)/(UN+N-UN0N)
式中、Y+Nは、Nの施用による処理での収量（kg/ha）であり；Y0Nは、Nの施用なしの対照処理での収量（kg/ha）であり；UN+Nは、肥料Nの施用を受ける処理での総N取り込み（kg/ha）であり；UN0Nは、肥料Nの施用なしの処理での総N取り込み（kg/ha）である。
【００７４】
（5）窒素（N）の内部効率（IE）は、肥料と常在（例えば、土壌）栄養源の両方から取り込まれたN単位当たりどれほど多くの収量が生産されるかに向けられる：
IEN=収量のキログラム／取り込まれたNのキログラム
IEN=Y/UN
式中、Yは、収量（kg/ha）であり；UNは、総N取り込み（kg/ha）である。
【００７５】
窒素は、有機形態および／または無機形態を含む任意の形態であることができる。限定されるわけではないが、窒素の形態は、硝酸塩（例えば、硝酸アンモニウム、硝酸カルシウム、硝酸カリウム）、亜硝酸塩、アンモニア、アンモニア水、無水アンモニア、硫酸アンモニウム、リン酸二アンモニウム、低圧窒素溶液、常圧窒素溶液、尿素、および尿素-硝酸アンモニウム（UAN）を含む。ある局面において、窒素は、植物がすぐに利用可能な形態（例えば、アンモニアおよび／または硝酸塩）であり、かつ／または、植物が利用可能である形態に容易に変換できる形態（例えば、尿素）である。
【００７６】
ある局面において、本明細書に提供される増大したNUEを含む改変されたタバコ植物は、対照タバコ植物と比べて増加した窒素取り込みを含む。別の局面において、本明細書に提供される増大したNUEを含む改変されたタバコ植物は、対照タバコ植物と比べて増加した窒素同化を含む。あるさらなる局面において、本明細書に提供される増大したNUEを含む改変されたタバコ植物は、対照タバコ植物と比べて増加した収量を含む。さらに別の局面において、本明細書に提供される増大したNUEを含む改変されたタバコ植物は、対照タバコ植物と比べて低窒素条件下で増加した収量を含む。ある好ましい局面において、圃場において使用されるような低窒素条件は、当業者によって典型的に使用されるレベルと比べておよそ25％の窒素である。別の局面において、圃場において使用されるような低窒素条件は、当業者によって典型的に使用されるレベルと比べておよそ5％〜50％の間の窒素であることができる。温室環境では、低窒素条件は、およそ25百万分率（ppm）であり、そして、正常窒素条件は、およそ100ppmである。別の局面において、温室において使用されるような低窒素条件は、5ppm〜50ppmの間であることができる。
【００７７】
ある局面において、本明細書に提供される増大したNUEを含む改変されたタバコ植物は、類似の生育条件下で生育させた対照タバコ植物と比べて、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも100％、少なくとも110％、少なくとも120％、少なくとも130％、少なくとも140％、少なくとも150％、少なくとも200％、少なくとも300％、少なくとも400％、または少なくとも500％の収量増加を含む。ある局面において、本明細書に提供される増大したNUEを含む改変されたタバコ植物は、類似の生育条件下で生育させた対照タバコ植物と比べて、5％〜100％の間、10％〜100％の間、20％〜100％の間、30％〜100％の間、40％〜100％の間、50％〜100％の間、60％〜100％の間、70％〜100％の間、80％〜100％の間、90％〜100％の間、10％〜200％の間、10％〜300％の間、10％〜400％の間、10％〜500％の間、または5％〜500％の間の収量増加を含む。
【００７８】
ある局面において、本明細書に提供される増大したNUEを含む改変されたタバコ植物の集団は、類似の生育条件下で生育させた対照タバコ植物の集団と比べて、少なくとも0.25kg/ha、少なくとも0.5kg/ha、少なくとも0.75kg/ha、少なくとも1kg/ha、少なくとも2kg/ha、少なくとも3kg/ha、少なくとも4kg/ha、少なくとも5kg/ha、少なくとも6kg/ha、少なくとも7kg/ha、少なくとも8kg/ha、少なくとも9kg/ha、少なくとも10kg/ha、少なくとも15kg/ha、少なくとも20kg/ha、少なくとも25kg/ha、少なくとも30kg/ha、少なくとも35kg/ha、少なくとも40kg/ha、少なくとも45kg/ha、少なくとも50kg/ha、少なくとも75kg/ha、少なくとも100kg/ha、少なくとも200kg/ha、少なくとも300kg/ha、少なくとも400kg/ha、または少なくとも500kg/haの収量増加を含む。別の局面において、本明細書に提供される増大したNUEを含む改変されたタバコ植物の集団は、類似の生育条件下で生育させたときの対照タバコ植物の集団と比べて、0.25kg/ha〜100kg/haの間、0.5kg/ha〜100kg/haの間、0.75kg/ha〜100kg/haの間、1kg/ha〜100kg/haの間、2kg/ha〜100kg/haの間、3kg/ha〜100kg/haの間、4kg/ha〜100kg/haの間、5kg/ha〜100kg/haの間、6kg/ha〜100kg/haの間、7kg/ha〜100kg/haの間、8kg/ha〜100kg/haの間、9kg/ha〜100kg/haの間、10kg/ha〜100kg/haの間、15kg/ha〜100kg/haの間、20kg/ha〜100kg/haの間、30kg/ha〜100kg/haの間、40kg/ha〜100kg/haの間、50kg/ha〜100kg/haの間、75kg/ha〜100kg/haの間、100kg/ha〜500kg/haの間、100kg/ha〜400kg/haの間、100〜300kg/haの間、または100kg/ha〜200kg/haの間の収量増加を含む。本明細書において使用される場合、タバコ植物の「集団」は、任意のサイズ、例えば、5、10、15、20、25、30、35、40、50、100、500、1000、5000、10000、25000、50000、100000、500000またはより多くのものであることができる。集団は、単一の品種、栽培種または系統に由来するものであることができる。集団は、当技術分野において公知の任意の育種技術を使用して産出することができる。
【００７９】
ある局面において、本明細書に提供される増大したNUEを含む改変されたタバコ植物は、類似の生育条件下で生育させた対照タバコ植物と比べて、葉を少なくとも1枚、少なくとも2枚、少なくとも3枚、少なくとも4枚、少なくとも5枚、少なくとも6枚、少なくとも7枚、少なくとも8枚、少なくとも9枚、少なくとも10枚、少なくとも11枚、少なくとも12枚、少なくとも13枚、少なくとも14枚、少なくとも15枚、少なくとも20枚、または少なくとも25枚多く含む。別の局面において、本明細書に提供される増大したNUEを含む改変されたタバコ植物は、類似の生育条件下で生育させた対照タバコ植物と比べて、葉を1〜25枚の間、2〜25枚の間、3〜25枚の間、4〜25枚の間、5〜25枚の間、6〜25枚の間、7〜25枚の間、8〜25枚の間、9〜25枚の間、10〜25枚の間、11〜25枚の間、12〜25枚の間、13〜25枚の間、14〜25枚の間、15〜25枚の間、または20〜25枚の間の枚数多く含む。
【００８０】
本明細書において使用される場合、「同等な条件」、「類似の条件」または「類似の生育条件」は、環境条件も農耕法（乾燥プロセスを含む）も2以上の植物遺伝子型間で観察される差に一切寄与することもその説明ともならないような、タバコを生育または乾燥させて2以上の植物遺伝子型間で有意義な比較を行うことに関する類似の環境条件、農耕法および／または乾燥プロセスを指す。環境条件は、例えば、光、温度、水、湿度および栄養（例えば、窒素およびリン）を含む。農耕法は、例えば、播種、刈込み、下部切取り、植付け、摘心、株分けおよび乾燥を含む。Chapters 4B and 4C of Tobacco, Production, Chemistry and Technology, Davis & Nielsen, eds., Blackwell Publishing, Oxford (1999), pp. 70-103を参照されたい。
【００８１】
一局面において、本明細書に提供される改変された植物、種子、植物部分または植物細胞は、1つまたは複数の天然に存在しない変異を含む。一局面において、本明細書に提供される変異は、植物における窒素利用効率を改善する。本明細書に提供される変異のタイプは、例えば、置換（点変異）、欠失、挿入、重複および逆位を含む。そのような変異は、望ましくは、遺伝子のコーディング領域中に存在する；しかしながら、プロモーターもしくは他の調節領域、イントロン、イントロン-エクソン境界、または遺伝子の非翻訳領域における変異もまた望ましい場合がある。
【００８２】
一局面において、本明細書に提供される方法は、対照タバコ植物と比べて増大した窒素利用効率を有するタバコ植物を生産することができる。変異誘発法は、非限定的に、化学的変異誘発、例えば、メチル硫酸エチル（EMS）による種子の処理（Hildering and Verkerk, In, The use of induced mutations in plant breeding. Pergamon Press, pp. 317-320, 1965）；またはUV照射、X線、電子ビーム、イオンビーム（例えば、炭素イオンビーム、ヘリウムイオンビーム、ネオンイオンビーム）、および高速中性子照射（例えば、Verkerk, Neth. J. Agric. Sci. 19:197-203, 1971; Poehlman, Breeding Field Crops, Van Nostrand Reinhold, New York (3.sup.rd ed.), 1987；およびTanaka, J. Radiat. Res. 51:223-233, 2010を参照のこと）；トランスポゾンタッギング（Fedoroff et al., 1984；米国特許第4,732,856号および米国特許第5,013,658号）；ならびにT-DNA挿入方法論（Hoekema et al., 1983；米国特許第5,149,645号）を含む。EMS誘導変異誘発は、ゲノム長にわたってランダム点変異を化学的に誘導することからなる。高速中性子変異誘発は、二本鎖DNA切断を通じて大きな欠失を引き起こす中性子衝撃に種子を曝露させることからなる。トランスポゾンタッギングは、内因性遺伝子内にトランスポゾンを挿入して遺伝子の発現を低減または排除することを含む。
【００８３】
加えて、選択されたPCR産物の変性高速液体クロマトグラフィー（HPLC）または選択的エンドヌクレアーゼ消化を使用した、化学的に誘導した変異の迅速かつ自動化可能なスクリーニング法、すなわち、TILLING（Targeting Induced Local Lesions In Genomes）も、本開示に適用可能である。McCallum et al. (2000) Nat. Biotechnol. 18:455-457を参照されたい。本明細書に提供される遺伝子の遺伝子発現に影響を及ぼすまたはその機能に干渉する変異は、当技術分野において周知である方法を使用して決定することができる。遺伝子エクソンにおける挿入変異は、通常、ヌル変異体をもたらす。保存残基における変異は、タンパク質の機能を阻害する際に特に有効であり得る。
【００８４】
変異誘発したタバコ植物のスクリーニングおよび選択は、当業者に公知の任意の方法論によるものであることができる。スクリーニングおよび選択方法論の例は、サザンブロット、ポリヌクレオチドの検出のためのPCR増幅、ノザンブロット、RNase保護、プライマー伸長、RNA転写物を検出するためのRT-PCR増幅、サンガーシーケンシング、次世代シーケンシング技術（例えば、Illumina, PacBio, Ion Torrent, 454）、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの酵素またはリボザイム活性を検出するための酵素アッセイ;ならびにタンパク質ゲル電気泳動、ウェスタンブロット、免疫沈降、およびポリペプチドを検出するための酵素結合免疫測定法を含むが、それらに限定されない。また、インサイチューハイブリダイゼーション、酵素染色および免疫染色などの他の技術を使用して、ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドの存在または発現を検出することもできる。言及した技術全ての実施方法が当技術分野において公知である。
【００８５】
一局面において、本明細書に提供される植物ゲノムは、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、CRISPR/Cas9ヌクレアーゼ、CRISPR/Cpf1またはCRISPR/Cmx1ヌクレアーゼからなる群より選択されるヌクレアーゼによって変異される（編集される）。別の局面において、本明細書に提供される植物ゲノムは、CRISPR/CasXまたはCRISPR/CasYヌクレアーゼによって変異される。本明細書において使用される場合、「編集」または「ゲノム編集」は、内因性植物ゲノム核酸配列の少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、もしくは少なくとも10ヌクレオチドの標的指向変異誘発、または内因性植物ゲノム核酸配列の除去もしくは置き換えを指す。
【００８６】
また、当技術分野において公知の任意の好適な形質転換法を使用した、本明細書に記載の組換え構築物または発現カセットによるタバコ植物の形質転換も本明細書に提供される。タバコ植物にポリヌクレオチド配列を導入するための方法は、当技術分野において公知であり、これらは、安定的形質転換法、一過性形質転換法およびウイルス媒介法を含むが、それらに限定されない。「安定的形質転換」は、植物に導入される関心対象のヌクレオチド構築物が植物細胞のゲノムに組み込まれ、その子孫によって継承されることができる形質転換を指す。「一過性形質転換」は、ある配列が、植物または植物細胞に導入され、その植物または植物細胞において単に一時的に発現されることまたは単に一過性に存在することを意味する意図がある。
【００８７】
一局面において、本明細書に提供される方法および組成物は、1つまたは複数の植物細胞への1つまたは複数のポリヌクレオチドの導入を含む。一局面において、本明細書に提供される植物ゲノムは、導入されたポリヌクレオチドまたは組換えDNA構築物を含むように改変される。本明細書において使用される場合、「植物ゲノム」は、植物細胞の核ゲノム、ミトコンドリアゲノム、または色素体（例えば、葉緑体）ゲノムを指す。別の局面において、本明細書に提供されるポリヌクレオチドが人工染色体に組み込まれる。一局面において、本明細書に提供されるポリヌクレオチドを含む人工染色体が植物細胞に組み込まれる。
【００８８】
一局面において、本明細書に提供される改変された植物、種子、植物成分、植物細胞または植物ゲノムは、1つまたは複数の導入遺伝子を含む。一局面において、本明細書に提供される導入遺伝子は、タバコ植物における窒素利用効率を改善する。本明細書において使用される場合、「導入遺伝子」は、当技術分野において公知の任意の方法によってゲノムに移入されたポリヌクレオチドを指す。一局面において、導入遺伝子は、外因性ポリヌクレオチドである。一局面において、導入遺伝子は、それが通常見られない新たなゲノム遺伝子座に組み込まれる内因性ポリヌクレオチドである。それ故、導入遺伝子はまた、適切な状況下のシス遺伝子であることもできる。
【００８９】
一局面において、本明細書に提供される導入遺伝子は、組換えDNA構築物を含む。一局面において、本明細書に提供される組換えDNA構築物または発現カセットは、トランスジェニック細胞の選択のための選択可能マーカー遺伝子を含むことができる。選択可能マーカー遺伝子は、抗生物質耐性をコードする遺伝子、例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼII（NPTII）およびハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（HPT）をコードするものだけでなく、グルホシネートアンモニウム、ブロモキシニル、イミダゾリノン類、トリアゾロピリミジン類、スルホニル尿素（例えば、クロルスルフロンおよびスルホメツロンメチル）および2,4-ジクロロフェノキシアセタート（2,4-D）などの除草活性化合物に対する耐性を付与する遺伝子も含むが、それらに限定されない。追加の選択可能マーカーは、表現型マーカー、例えば、β-ガラクトシダーゼおよび緑色蛍光タンパク質（GFP）などの蛍光タンパク質を含む。
【００９０】
一局面において、本明細書に提供される方法および組成物は、ベクターを含む。本明細書において使用される場合、用語「ベクター」または「プラスミド」は、互換的に使用され、染色体DNAから物理的に分離されている環状の二本鎖DNA分子を指す。一局面において、本明細書において使用されるプラスミドまたはベクターは、インビボで複製することができる。「形質転換ベクター」は、本明細書において使用される場合、植物細胞を形質転換することができるプラスミドである。ある局面において、本明細書に提供されるプラスミドは、細菌プラスミドである。別の局面において、本明細書に提供されるプラスミドは、アグロバクテリウムTiプラスミドであるかまたはアグロバクテリウムTiプラスミドに由来する。さらに別の局面において、本明細書に提供されるベクターは、ウイルスベクターである。
【００９１】
一局面において、本明細書に提供されるプラスミドまたはベクターは、組換えベクターである。本明細書において使用される場合、用語「組換えベクター」は、分子クローニングなどの遺伝子組換えの検査室手法によって形成されるベクターを指す。別の局面において、本明細書に提供されるプラスミドは、合成プラスミドである。本明細書において使用される場合、「合成プラスミド」は、天然プラスミド（例えば、Tiプラスミド）と同じ機能（例えば、複製）を発揮することができる、人工的に作られたプラスミドである。限定されることはないが、当業者は、個々のヌクレオチドによってプラスミドを合成することを介して、または異なる既存のプラスミドから核酸分子を一緒にスプライシングすることによって、デノボで合成プラスミドを作ることができる。
【００９２】
ベクターは、市販されているかまたは当技術分野におけるルーチンの組換えDNA技術によって生産することができる。一局面において、本明細書に提供されるベクターは、SEQ ID NO：65の全てまたは一部を含む。核酸を含有するベクターは、そのような核酸に機能的に連結された発現エレメントを有することができ、さらに、選択可能マーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子）をコードするような配列を含むことができる。核酸を含有するベクターは、キメラまたは融合ポリペプチド（すなわち、ポリペプチドのN末端またはC末端のいずれかに存在することができる異種ポリペプチドに機能的に連結されたポリペプチド）をコードすることができる。代表的な異種ポリペプチドは、コードされたポリペプチドの精製に使用できるものである（例えば、6×Hisタグ、グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST））。
【００９３】
本開示の植物細胞にポリヌクレオチド（例えば、導入遺伝子、組換えベクター、組換えDNA構築物、発現構築物）を導入する好適な方法は、マイクロインジェクション（Crossway et al. (1986) Biotechniques 4:320-334)、エレクトロポレーション(Shillito et al. (1987) Meth. Enzymol. 153:313-336; Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5602-5606）、アグロバクテリウム媒介形質転換（米国特許第5,104,310号、第5,149,645号、第5,177,010号、第5,231,019号、第5,463,174号、第5,464,763号、第5,469,976号、第4,762,785号、第5,004,863号、第5,159,135号、第5,563,055号および第5,981,840号）、直接遺伝子移入（Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3:2717-2722）、および弾道粒子加速（例えば、米国特許第4,945,050号、第5,141,131号、第5,886,244号、第5,879,918号および第5,932,782号；Tomes et al. (1995) in Plant Cell, Tissue, and Organ Culture Fundamental Methods, ed. Gamborg and Phillips (Springer-Verlag, Berlin); McCabe et al. (1988) Biotechnology 6:923-926を参照のこと）を含む。また、Weissinger et al. (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477; Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87:671-674 (ダイズ); McCabe et al. (1988) Bio/Technology 6:923-926 (ダイズ); Finer and McMullen (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P: 175-182 (ダイズ); Singh et al. (1998) Theor. Appl. Genet. 96:319-324 (ダイズ); De Wet et al. (1985) in The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman et al. (Longman, N.Y.), pp. 197-209 (花粉); Kaeppler et al. （1990） Plant Cell Reports 9:415-418 および Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560-566 (ウィスカー媒介形質転換); D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (エレクトロポレーション)も参照されたい。一局面において、本明細書に提供される細菌細胞は、本明細書に提供される組換えDNA構築物または組換えベクターを含む。多くの異なる種の細菌細胞が、組換えDNA構築物または組換えベクターを含むことができると認められる。限定されないが、例えば、本明細書に提供される組換えDNA構築物または組換えベクターを含む、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）、大腸菌（Escherichia coli）、酵母細胞（例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae））も提供される。
【００９４】
別の局面において、本明細書に提供される組換え構築物または発現カセットは、植物をウイルスまたはウイルス核酸と接触させることによって、植物に導入し得る。一般に、そのような方法は、本開示の発現カセットをウイルスDNAまたはRNA分子内に組み込むことを伴う。本明細書に提供される発現カセットで使用するためのプロモーターがまた、ウイルスRNAポリメラーゼによる転写に利用されるプロモーターも包含することが認識される。植物にポリヌクレオチドを導入してその中にコードされるタンパク質（ウイルスDNAまたはRNA分子を伴う）を発現させるための方法は、当技術分野において公知である。例えば、米国特許第5,889,191号、第5,889,190号、第5,866,785号、第5,589,367号、第5,316,931号、およびPorta et al. (1996) Molecular Biotechnology 5:209-221を参照されたい。
【００９５】
クローン法（器官形成によるか胚形成によるかを問わず）を使用してその後に増殖させることができる任意の植物組織を、本明細書に提供される組換え構築物または発現カセットを用いて形質転換し得る。「器官形成」とは、芽および根が分裂組織中心から連続して発生するプロセスを意図している。「胚形成」とは、芽および根が、体細胞からか配偶子からかを問わず、協奏的に（連続的ではなく）一緒に発生するプロセスを意図している。本明細書に記載の様々な形質転換プロトコルに適した例示的な組織は、カルス組織、既存の分裂組織（例えば、頂端分裂組織、腋芽および根分裂組織）および誘導される分裂組織（例えば、子葉分裂組織および胚軸分裂組織）、胚軸、子葉、葉ディスク、花粉、胚などを含むが、それらに限定されない。
【００９６】
当技術分野において一般に理解されている通り、用語「プロモーター」は、一般に、RNAポリメラーゼ結合部位、転写開始部位および／またはTATAボックスを含有し、かつ、関連する転写可能なポリヌクレオチド配列および／または遺伝子（または導入遺伝子）の転写および発現を支援または促進する、DNA配列を指し得る。プロモーターは、合成によって生産されても、変更されても、既知もしくは天然に存在するプロモーター配列もしくは他のプロモーター配列（例えば、本明細書に提供される通りの）に由来してもよい。プロモーターはまた、2以上の異種配列の組み合わせを含むキメラプロモーターを含んでもよい。したがって、本発明のプロモーターは、組成は類似しているが既知または本明細書に提供される他のプロモーター配列と同一でないかまたはそれに相補的でない、プロモーター配列のバリアントを含み得る。本明細書において使用される場合、「異種プロモーター」は、DNA構築物の文脈において、以下のいずれかを指す：（i）機能的に連結された構造遺伝子もしくはコーディング領域と異なる供給源に由来するプロモーター、または（ii）機能的に連結された構造遺伝子またはコーディング領域と同じ供給源に由来するプロモーターであって、その配列がその元々の形態から改変されているプロモーター。本明細書において使用される場合、用語「機能的に連結された」は、プロモーターまたは他の調節エレメントと遺伝子（または導入遺伝子）の関連する転写可能なポリヌクレオチド配列またはコーディング配列との間の機能的連結であって、それによって、プロモーターなどが、関連するコーディング配列または転写可能なポリヌクレオチド配列の転写および発現を、少なくとも特定の組織、発生段階でかつ／またはある種の条件下で、開始、支援、作用、誘発および／または促進するように作動する、機能的連結を指す。「植物発現可能プロモーター」は、プロモーターに機能的に連結された関連するコーディング配列、導入遺伝子または転写可能なポリヌクレオチド配列を植物、植物細胞および／または植物組織において発現させるために使用し得るプロモーターを指す。
【００９７】
プロモーターは、プロモーターに機能的に連結されたコーディング配列または遺伝子（導入遺伝子を含む）の発現パターンに関する多種多様な基準に従って分類してよい（例えば、構成的、発生的、組織特異的、誘導性など）。植物の全てまたはほとんどの組織において転写を開始するプロモーターは、「構成的」プロモーターと呼ばれる。発生のある期間または段階の間に転写を開始するプロモーターは、「発生的」プロモーターと呼ばれる。その発現が植物のある種の組織において他の植物組織に比べ増強されるプロモーターは、「組織増強」または「組織優先」プロモーターと呼ばれる。したがって、「組織優先」プロモーターは、植物の特定の組織において比較的高いまたは優先的な発現を引き起こすが、植物の他の組織における発現レベルは低い。植物の特定の組織内で発現するが他の植物組織ではほとんどまたは全く発現しないプロモーターは、「組織特異的」プロモーターと呼ばれる。植物のある種の細胞タイプにおいて発現するプロモーターは、「細胞タイプ特異的」プロモーターと呼ばれる。「誘導性」プロモーターは、寒冷、日照りもしくは光などの環境刺激または創傷もしくは化学物質の適用などの他の刺激に応答して転写を開始するプロモーターである。プロモーターはまた、異種、同種、キメラ、合成であるなどその起源の観点から分類してもよい。「異種」プロモーターは、その関連する転写可能な配列、コーディング配列もしくは遺伝子（もしくは導入遺伝子）に対して異なる起源を有し、かつ／または、形質転換される植物種において天然に存在しない、プロモーター配列である。用語「異種」は、より広範に、2以上のDNA分子または配列の組み合わせを指し得る（そのような組み合わせが天然において通常見られないとき）。例えば、2以上のDNA分子または配列は、これらが異なるゲノムにもしくは同じゲノム内の異なる遺伝子座に通常見られる場合、またはこれらが天然において同一に組み合わされることのない場合、互いに異種である。
【００９８】
例示的な構成的プロモーターは、Rsyn7プロモーターのコアプロモーターおよび米国特許第6,072,050号に開示されている他の構成的プロモーター；コアCaMV 35Sプロモーター（Odell et al. (1985) Nature 313:810-812）；ユビキチン（Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632 および Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689）；pEMU（Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588）；MAS（Velten et al. (1984) EMBO J 3:2723-2730）；ALSプロモーター（米国特許第5,659,026号）などを含む。
【００９９】
例示的な化学物質誘導性プロモーターは、サリチル酸によって活性化されるタバコPR-1aプロモーターを含む。関心対象の他の化学物質誘導性プロモーターは、ステロイド応答性プロモーター（例えば、Schena et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10421-10425 および McNellis et al. (1998) Plant J. 14(2):247-257におけるグルココルチコイド誘導性プロモーターを参照のこと）およびテトラサイクリン誘導性プロモーター（例えば、Gatz et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229-237、ならびに米国特許第5,814,618号および第5,789,156号を参照のこと）を含む。本明細書において使用できる追加の例示的なプロモーターは、熱調節遺伝子発現、光調節遺伝子発現（例えば、エンドウ豆rbcS-3A；トウモロコシrbcSプロモーター；エンドウ豆に見られるクロロフィルalb結合タンパク質遺伝子；またはArabssuプロモーター）、ホルモン調節遺伝子発現（例えば、コムギのEm遺伝子由来のアブシシン酸（ABA）応答性配列；オオムギおよびアラビドプシスのABA誘導性HVA1およびHVA22、ならびにrd29Aプロモーター；ならびに創傷誘導遺伝子発現（例えば、wunlの）、器官特異的遺伝子発現（例えば、塊茎特異的貯蔵タンパク質遺伝子の；記載のトウモロコシ由来の23-kDaのゼイン遺伝子；またはフレンチビーン（β-ファセオリン遺伝子）に応答性のもの、または病原体誘導性プロモーター（例えば、PR-1、prp-1またはβ-1,3 グルカナーゼプロモーター、コムギの真菌誘導性wirlaプロモーター、および線虫誘導性プロモーター、タバコおよびパセリのそれぞれTobRB7-5AおよびHmg-1）である。
【０１００】
本明細書において使用される場合、「葉」プロモーターは、その関連する遺伝子、導入遺伝子または転写可能なDNA配列の転写または発現を植物の任意の部分に由来する葉組織で開始、誘発、駆動などする、任意のプロモーターを含む。そのような「葉」プロモーターは、その関連する遺伝子／導入遺伝子または転写可能なDNA配列の転写または発現を1つまたは複数の花組織などの植物の1つまたは複数の組織で開始、誘発、駆動などするとしてさらに定義され得る。そのような「葉」プロモーターは、その関連する遺伝子、導入遺伝子または転写可能なDNA配列の転写または発現を植物の任意の部分に由来する葉組織（花組織と対比して）で少なくとも優先的にまたは主に（それだけではないにせよ）開始、誘発、駆動などする「葉優先」プロモーターとしてさらに定義され得る。しかしながら、「葉」および「葉優先」プロモーターは、各々がまた、その関連する遺伝子、導入遺伝子または転写可能なDNA配列の転写または発現を1つまたは複数の栄養または生殖組織などの植物の1つまたは複数の細胞または組織で発生の生殖期または段階の間に許可、可能、誘発、駆動などし得る。実際、「葉」プロモーターは、その関連する遺伝子、導入遺伝子または転写可能なDNA配列の転写または発現を葉組織におけるよりも大きなレベルまたは範囲で1つまたは複数の生殖または栄養組織において開始、誘発、駆動などさえし得る。
【０１０１】
本明細書において使用される場合、「根」プロモーターは、その関連する遺伝子、導入遺伝子または転写可能なDNA配列の転写または発現を植物の任意の部分に由来する根組織で開始、誘発、駆動などする、任意のプロモーターを含む。そのような「根」プロモーターは、その関連する遺伝子／導入遺伝子または転写可能なDNA配列の転写または発現を1つまたは複数の花組織などの植物の1つまたは複数の組織で開始、誘発、駆動などするとしてさらに定義され得る。そのような「根」プロモーターは、その関連する遺伝子、導入遺伝子または転写可能なDNA配列の転写または発現を植物の任意の部分に由来する根組織（花組織と対比して）で少なくとも優先的にまたは主に（それだけではないにせよ）開始、誘発、駆動などする「根優先」プロモーターとしてさらに定義され得る。しかしながら、「根」および「根優先」プロモーターは、各々がまた、その関連する遺伝子、導入遺伝子または転写可能なDNA配列の転写または発現を1つまたは複数の栄養または生殖組織などの植物の1つまたは複数の細胞または組織で発生の生殖期または段階の間に許可、可能、誘発、駆動などし得る。実際、「根」プロモーターは、その関連する遺伝子、導入遺伝子または転写可能なDNA配列の転写または発現を根組織におけるよりも大きなレベルまたは範囲で1つまたは複数の生殖または栄養組織で開始、誘発、駆動などさえし得る。
【０１０２】
追加の例示的な組織優先プロモーターは、Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12(2):255-265; Kawamata et al. (1997) Plant Cell Physiol. 38(7):792-803; Hansen et al. (1997) Mol. Gen. Genet. 254(3):337-343; Russell et al. (1997) Transgenic Res. 6(2):157-168; Rinehart et al. (1996) Plant Physiol. 112(3):1331-1341; Van Camp et al. (1996) Plant Physiol. 112(2):525-535; Canevascini et al. (1996) Plant Physiol. 112(2):513-524; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778; Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:181-196; Orozco et al. (1993) Plant Mol. Biol. 23(6):1129-1138; Matsuoka et al. (1993) Proc Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590；およびGuevara-Garcia et al. (1993) Plant J. 4(3):495-505に開示されているものを含む。
【０１０３】
本明細書において使用される場合、「機能的に連結された」は、2以上のエレメント間の機能的連結を指す。例えば、関心対象のポリヌクレオチドと調節配列（例えば、プロモーター）との間の機能的な連結は、関心対象のポリヌクレオチドの発現を可能にする機能的な関係性である。機能的に連結されたエレメントは、連続的であっても非連続的であってもよい。
【０１０４】
本明細書において使用される場合、「異種」は、外来種を起源とする配列、または、同じ種に由来する場合には、意図的なヒトの介入によって組成および／もしくはゲノム遺伝子座がそのネイティブ形態から実質的に改変された配列を指す。この用語はまた、本明細書において「ポリヌクレオチド構築物」または「ヌクレオチド構築物」とも呼ばれる核酸構築物にも適用される。このように、「異種」核酸構築物は、外来種を起源とする構築物、または、同じ種に由来する場合には、意図的なヒトの介入によって組成および／もしくはゲノム遺伝子座がそのネイティブ形態から実質的に改変された構築物を意味することを意図している。異種核酸構築物は、植物またはその植物部分に、例えば、形質転換法またはその後のトランスジェニック植物と関心対象の別の植物との交配を介して導入されている、組換えヌクレオチド構築物を含むが、それらに限定されない。
【０１０５】
一局面において、本明細書に提供される1つまたは複数のポリペプチドの発現の阻害を、本明細書に提供されるポリヌクレオチドの発現によるRNA干渉（RNAi）によって得てよい。一局面において、RNAiは、非コーディングRNAを発現させることを含む。本明細書において使用される場合、「非コーディングRNA」は、マイクロRNA（miRNA）、低分子干渉RNA（siRNA）、トランス作用siRNA（ta-siRNA）、トランスファーRNA（tRNA）、リボソームRNA（rRNA）、イントロン、ヘアピンRNA（hpRNA）、イントロン含有ヘアピンRNA（ihpRNA）、およびガイドRNAからなる群より選択される。一局面において、本明細書に提供される単一の非コーディングRNAは、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、または10を超えるポリペプチドの発現を阻害する。一局面において、本明細書に提供される非コーディングRNAは、植物ゲノムに安定に形質転換される。別の局面において、本明細書に提供される非コーディングRNAは、植物ゲノムに一過性に形質転換される。
【０１０６】
本明細書において使用される場合、用語「ダウンレギュレーションする」、「抑制する」、「阻害する」、「阻害」および「阻害すること」は、関心対象の遺伝子産物（例えば、mRNA、タンパク質、非コーディングRNA）の発現または機能を減少させる、当技術分野において公知または本明細書に記載の任意の方法として定義される。「阻害」は、2つの植物間の、例えば、改変された植物と対照植物との比較に関するものであり得る。あるいは、標的遺伝子産物の発現または機能の阻害は植物細胞、オルガネラ、器官、組織または植物成分間の、同じ植物内のまたは異なる植物間の比較に関するものであり得、また、発生的段階もしくは一時的段階間の、同じ植物もしくは植物成分内のまたは植物もしくは植物成分間の比較を含む。「阻害」は、関心対象の遺伝子産物の機能または産生の、その遺伝子産物の機能または産生の完全な排除までの（完全な排除を含む）任意の相対的低下を含む。用語「阻害」は、標的遺伝子産物の翻訳および／もしくは転写または標的遺伝子産物の機能的活性をダウンレギュレーションする、任意の方法または組成物を包含する。
【０１０７】
用語「阻害性配列」は、植物における遺伝子の発現または機能を阻害することができる任意のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列、例えば、完全長ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列、短縮型ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の断片、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列のバリアント、センス配向ヌクレオチド配列、アンチセンス配向ヌクレオチド配列、センスまたはアンチセンス配向ヌクレオチド配列の相補体、ヌクレオチド配列の逆位領域、ヌクレオチド配列のヘアピン、二本鎖ヌクレオチド配列、一本鎖ヌクレオチド配列、それらの組み合わせなどを包含する。用語「ポリヌクレオチド配列」は、RNA、DNA、化学的に修飾された核酸、核酸類似体、それらの組み合わせなどの配列を含む。
【０１０８】
語句「阻害することができる」がポリヌクレオチド阻害性配列の文脈において使用されるとき、阻害性配列それ自体が阻害性効果を発揮することを意味するか;または、阻害性配列が阻害性ヌクレオチド分子（例えば、ヘアピンRNA、miRNAまたは二本鎖RNAポリヌクレオチド）をコードするかもしくは阻害性ポリペプチド（例えば、標的遺伝子産物の発現または機能を阻害するポリペプチド）をコードする場合に、その転写（例えば、ヘアピンRNA、miRNAまたは二本鎖RNAポリヌクレオチドをコードする阻害性配列の場合）またはその転写および翻訳（阻害性ポリペプチドをコードする阻害性配列の場合）に続いて、転写産物または翻訳産物がそれぞれ標的遺伝子産物に対して阻害性効果を発揮する（例えば、標的遺伝子産物の発現または機能を阻害する）ことを意味する意図がある。
【０１０９】
本明細書に提供される阻害性配列は、センス抑制／同時抑制、アンチセンス抑制、二本鎖RNA（dsRNA）干渉、ヘアピンRNA干渉およびイントロン含有ヘアピンRNA干渉、アンプリコン媒介干渉、リボザイム、低分子干渉RNA、人工または合成マイクロRNA、ならびに人工のトランス作用siRNAを非限定的に含む当技術分野において公知の任意のサイレンシング経路または機序を介して、遺伝子サイレンシングを引き起こす配列であることができる。阻害性配列は、所望の結果に応じて、本開示のタンパク質をコードする、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも50ヌクレオチド、少なくとも70ヌクレオチド、少なくとも100ヌクレオチド、少なくとも150ヌクレオチド、少なくとも200ヌクレオチド、少なくとも250ヌクレオチド、少なくとも300ヌクレオチド、少なくとも350ヌクレオチド、少なくとも400ヌクレオチド、および完全長ポリヌクレオチドまでの範囲であってよい。一局面において、阻害性配列は、50〜400の間のヌクレオチド、70〜350の間のヌクレオチド、90〜325の間のヌクレオチド、90〜300の間のヌクレオチド、90〜275の間のヌクレオチド、100〜400の間のヌクレオチド、100〜350の間のヌクレオチド、100〜325の間のヌクレオチド、100〜300の間のヌクレオチド、125〜300の間のヌクレオチド、または125〜275の間のヌクレオチド長の断片であることができる。
【０１１０】
マイクロRNA（miRNA）は、標的転写物のトランスでの切断をガイドして、様々な調節経路および発生経路に関与する遺伝子の発現を負に調節する、一般に19〜25ヌクレオチド（通常、植物において20〜24ヌクレオチド）の非タンパク質コーディングRNAである（Bartel (2004) Cell, 116:281-297）。いくつかの場合に、miRNAは、siRNA一次転写物のインフェーズプロセシングをガイドするのに役立つ（Allen et al. (2005) Cell, 121:207-221を参照のこと）。
【０１１１】
多くのマイクロRNA遺伝子（MIR遺伝子）が、特定されており、データベースにおいて公的に利用可能である（「miRBase」、microrna.sanger.ac.uk/sequencesにてオンラインで利用可能；またGriffiths-Jones et al. (2003) Nucleic Acids Res., 31:439-441も参照のこと）。MIR遺伝子は、遺伝子間領域に、ゲノム内に単独およびクラスターの両方で生じていることが報告されているが、他の遺伝子（タンパク質コーディングと非タンパク質コーディングの両方）のイントロン内に全体的または部分的にも位置し得る。MIR遺伝子の転写は、少なくともいくつかの場合に、MIR遺伝子自体のプロモーターの促進性制御下にあり得る。「pri-miRNA」と称される一次転写物は、極めて大きく（数キロベース）かつポリシストロン性であり得、1つまたは複数のpre-miRNA（成熟miRNAにプロセシングされるステム-ループ配置を含有する折り返し構造）とともにmRNAの通常の5'「キャップ」およびポリアデニル化テールを含有する。
【０１１２】
成熟miRNAのその対応する前駆体（pri-miRNAおよびpre-miRNA）からの成熟は、動物と植物との間で大きく異なる。例えば、植物細胞では、マイクロRNA前駆体分子は、大部分が核内で完全に成熟miRNAにプロセシングされると考えられるが、一方、動物細胞では、pri-miRNA転写物は、動物特異的酵素Droshaによって核内でプロセシングされ、続いてpre-miRNAは細胞質に輸送され、そこで、成熟miRNAにさらにプロセシングされる。植物における成熟miRNAは、典型的には、21ヌクレオチド長である。
【０１１３】
miRNA（天然に存在する配列か人工配列を問わず）のトランスジェニック発現を用いて、miRNAの1つまたは複数の標的遺伝子の発現を調節することができる。トランスジェニック発現された転写物内へのmiRNA認識部位の包含も、転写物の発現を調節する際に有用である;例えば、Parizotto et al. (2004) Genes Dev., 18:2237-2242を参照されたい。miRNAの認識部位は、5'非翻訳領域、コーディング領域および3'非翻訳領域を含めmRNAの全ての領域において検証されており、コーディング配列に対するmiRNA標的部位の位置は、必ずしも抑制に影響を及ぼすことはないと示唆されている。miRNAは、真核生物における重要な調節エレメントであるので、miRNAのトランスジェニック抑制は、生物学的経路および応答を操作するために有用である。最後に、MIR遺伝子のプロモーターは、非常に特異的な発現パターン（例えば、細胞特異的、組織特異的、時間特異的または誘導性）を有することができ、したがって、組換え構築物において、機能的に連結されているDNA配列のそのような特異的転写を誘導するのに有用である。miRNA、それらの前駆体、それらの認識部位およびそれらのプロモーターの様々な利用が公知である。これらの利用の非限定例は、（1）標的遺伝子を抑制するためのネイティブmiRNAまたはmiRNA前駆体配列の発現；（2）標的遺伝子を抑制するための人工miRNAまたはmiRNA前駆体配列の発現；（3）miRNA認識部位を有する導入遺伝子の発現（この場合、成熟miRNAが発現されると導入遺伝子は抑制される）;（4）miRNAプロモーターによって駆動される導入遺伝子の発現を含む。
【０１１４】
人工のmiRNA配列を設計することは、miRNA前駆体のmiRNAステム領域中のヌクレオチドを、意図する標的に相補的な配列に置換するという簡単さであり得る。操作されたmiRNA前駆体を生産するためにネイティブmiRNA配列のヌクレオチド変化を決定する一般的方法の1つの非限定的な例は、以下の工程を含む:（a）標的遺伝子に特異的な少なくとも18ヌクレオチドの固有の標的配列を、例えば、BLAST（登録商標）（例えば、Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol., 215:403-410; Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res., 25:3389-3402を参照のこと）などの配列アラインメントツール（例えば、タバコのcDNAデータベースとゲノムDNAデータベースの両方の）を使用することによって選択し、標的転写物オルソログおよび無関係な遺伝子との任意の潜在的なマッチを特定し、それによって、非標的配列の意図しないサイレンシングを回避する工程；（b）望ましくない配列（例えば、非標的種由来の配列にマッチする）について標的遺伝子を分析し、GC含有量、Reynoldsスコア（Reynolds et al. (2004) Nature Biotechnol., 22:326-330を参照のこと）、および自由エネルギーの差が負であることによって特徴付けられる機能的非対称（「.DELTA..DELTA.G」または「ΔΔG」）について各々の潜在的な19-merセグメントを採点する工程［好ましくは、以下の特徴の全てまたは大部分を有する19-merが選択される：（1）Reynoldsスコア>4、（2）GC含有量が40％〜60％の間、（3）負のΔΔG、（4）末端がアデノシン、（5）同じヌクレオチドが4以上連続しないこと；（6）標的遺伝子の3'末端近くに位置すること；（7）miRNA前駆体転写物との相違が最小限であること。siRNAにおける3ヌクレオチド毎の位置は、RNAiの有効性への影響に関して特に重要であると報告されており、アルゴリズム「siExplorer」が、rna.chem.t.u-tokyo.ac.jp/siexplorer.htmにて公的に利用可能である］；（c）選択された19-merの逆相補体を決定して、改変された成熟miRNAを製造する際に使用する工程（20位にある追加のヌクレオチドは、好ましくは、選択された標的配列にマッチし、21位にあるヌクレオチドは、好ましくは、標的転写物でのサイレンシングの拡大を防ぐために対合しないように選択されるか、または標的転写物でのサイレンシングの拡大を促進するために標的配列と対合するように選択される）；ならびに（d）人工miRNAで植物を形質転換する工程。
【０１１５】
一局面において、本明細書に提供される人工miRNAは、標的遺伝子のRNA転写またはタンパク質翻訳を低減または排除する。
【０１１６】
一局面において、本明細書に提供されるmiRNAまたは人工miRNAは、組織特異的プロモーターの制御下にある。あるさらなる局面において、本明細書に提供されるmiRNAまたは人工miRNAは、組織優先プロモーターの制御下にある。あるさらなる局面において、本明細書に提供されるmiRNAまたは人工miRNAは、構成的プロモーターの制御下にある。
【０１１７】
本開示の改変されたタバコ系統、品種またはハイブリッドから得られたタバコ材料を使用して、タバコ製品を製造することができる。本明細書において使用される場合、「タバコ製品」は、ヒトによる使用または消費を意図した、タバコから製造または得られる任意の製品として定義される。ある局面において、本明細書に提供されるタバコ製品は、本明細書に提供される改変されたタバコ植物由来の乾燥成分を含む。別の局面において、本明細書に提供されるタバコ製品は、本明細書に提供される改変されたタバコ植物由来の乾燥タバコ葉を含む。
【０１１８】
本明細書に提供されるタバコ製品は、非限定的に、シガレット製品（例えば、紙巻タバコ、ビディシガレット、クレテック）、シガー製品（例えば、葉巻タバコ、シガー包装タバコ、シガリロ）、パイプタバコ製品、タバコ由来製品、タバコ由来ニコチン製品、無煙タバコ製品（例えば、モイストスナッフ、ドライスナッフ、噛みタバコ、モイスト無煙タバコ、ファインカット噛みタバコ、ロングカット噛みタバコ、ポーチ入り噛みタバコ）、フィルム、チュアブル（例えば、ガム）、トローチ、溶解ストリップ、タブ、タブレット、シェイプドパーツ、ゲル、コンシューマブルユニット、不溶性マトリックス、中空形状物、再構成タバコ、膨張タバコなどを含む。例えば、米国特許公開第US 2006/0191548号を参照されたい。
【０１１９】
本明細書において使用される場合、「シガレット」は、「棒状部」および「充填材」を有するタバコ製品を指す。シガレットの「棒状部」は、シガレット紙、フィルター、プラグラップ（濾過材料を収納するために使用される）、フィルターにシガレット紙（充填材を含む）を保持するチッピング紙、およびこれら成分を一緒に保持する全ての接着剤を含む。「充填材」は、（1）全てのタバコ（再構成タバコおよび膨張タバコを含むが、それらに限定されない）、（2）非タバコ代替物（ハーブ、非タバコ植物材料およびシガレット紙に巻かれるタバコに付随し得る他のスパイスを含むが、それらに限定されない）、（3）ケーシング、（4）香料、および（5）全ての他の添加物（タバコおよび代替物に混合され、シガレット中に巻かれる）を含む。
【０１２０】
一局面において、本開示は、本明細書に提供される改変されたタバコ植物に由来するニコチン、および製品において使用するための本明細書に提供される改変されたタバコ植物からニコチンを生産する方法を提供する。
【０１２１】
本開示の植物に由来するタバコ製品はまた、シガレットおよび他の喫煙物品、特にフィルターエレメントを含む喫煙物品を含み、この場合、喫煙可能材料の棒状部は、タバコブレンド内に乾燥タバコを含む。ある局面において、本開示のタバコ製品は、シガリロ、ノンベンチレーションリセスフィルターシガレット、ベンチレーションリセスフィルターシガレット、ビディシガレット、シガー、スナッフ、パイプタバコ、シガータバコ、シガレットタバコ、噛みタバコ、葉タバコ、水タバコ、刻みタバコ、およびカットタバコからなる群より選択される。別の局面において、本開示のタバコ製品は、無煙タバコ製品である。無煙タバコ製品は、燃焼せず、噛みタバコ、モイスト無煙タバコ、スヌースおよびドライスナッフを含むが、それらに限定されない。噛みタバコは、粗く分割されたタバコ葉であり、典型的には大きなポーチ様パッケージに包装されて、塊またはねじった状態で使用される。モイスト無煙タバコは、湿り気を有するより細かく分割されたタバコであり、ばらばらの形態または袋の形態で提供され、典型的には、円形缶に包装され、一つまみとしてまたは袋状で成人タバコ消費者の頬と歯茎の間に入れて使用される。スヌースは、加熱処理された無煙タバコである。ドライスナッフは、細かく粉末にされたタバコであり、口内に置くかまたは経鼻使用される。あるさらなる局面において、本開示のタバコ製品は、ルーズリーフ噛みタバコ、塊噛みタバコ、モイストスナッフおよび鼻用スナッフからなる群より選択される。なお別の局面において、本開示のタバコ製品は、電子加熱シガレット、e-シガレット、電子式気化デバイスからなる群より選択される。一局面において、本明細書に提供される方法は、本明細書に提供される改変されたタバコ植物由来の乾燥タバコ葉を使用してタバコ製品を調製することを含む。
【０１２２】
本明細書において使用される場合、「再構成タバコ」は、シート状に加工されてタバコに似せて細片にカットされた、タバコダストおよび他のタバコスクラップ材料から製造されたタバコ充填材の1種を指す。コスト削減に加えて、再構成タバコは、アンモニアと糖の反応を使用した香りの発生を処理することからシガレットの味へのその寄与に非常に重要である。
【０１２３】
本明細書において使用される場合、「膨張タバコ」は、タバコを「膨らませて」密度の低減およびより大きな充填性能を生じるように、適切な気体の膨張を通じて加工されているタバコ充填材の1種を指す。膨張タバコは、シガレットで使用されるタバコの重量を低減する。
【０１２４】
また、本明細書に提供されるタバコ植物または植物成分から製造された乾燥タバコ材料が本明細書に提供される。「乾燥」は、水分を低下させてクロロフィルの破壊を招くことで、タバコ葉を金色にし、それによってデンプンを糖に変換する、熟成プロセスである。それ故、乾燥タバコは、収穫した緑色の葉と比べて還元糖含有量が高く、デンプン含有量が低い。一局面において、本明細書に提供されるタバコ植物または植物成分は、従来の手段、例えば、熱風乾燥、倉庫乾燥、火力乾燥、空気乾燥または天日乾燥を使用して乾燥させることができる。異なるタイプの乾燥方法の説明については、例えば、Tso（1999, Chapter 1 in Tobacco, Production, Chemistry and Technology, Davis & Nielsen, eds., Blackwell Publishing, Oxford）を参照されたい。乾燥タバコは、通常、木製ドラム（例えば、大樽）または厚紙カートン内で、圧縮条件で数年間（例えば、2〜5年）、10％〜約25％の範囲の水分含有量で熟成される。米国特許第4,516,590号および第5,372,149号を参照されたい。乾燥および熟成させたタバコを、その後さらに加工することができる。更なる加工は、様々な温度で蒸気を導入してまたは導入しないで真空下でタバコを調整すること、低温殺菌、および発酵を含む。発酵は、典型的には、高い初期水分含有量、熱発生および乾燥重量の10〜20％の喪失によって特徴付けられる。例えば、米国特許第4,528,993号、第4,660,577号、第4,848,373号、第5,372,149号;米国公開第2005/0178398号；およびTso（1999, Chapter 1 in Tobacco, Production, Chemistry and Technology, Davis & Nielsen, eds., Blackwell Publishing, Oxford）を参照されたい。乾燥、熟成および発酵させたタバコをさらに加工することができる（例えば、カット、細断、膨張またはブレンド）。例えば、米国特許第4,528,993号；第4,660,577号；および第4,987,907号を参照されたい。一局面において、本開示の乾燥タバコ材料は、熱風乾燥、天日乾燥、空気乾燥または火力乾燥される。
【０１２５】
本開示はさらに、本明細書に提供されるタバコ植物由来のタバコ材料を含むタバコ製品を製造する方法を提供する。一局面において、本明細書に提供される方法は、本明細書に提供されるタバコ植物から製造された熟成させたタバコ材料を、その水分含有量を12.5％と13.5％の間から21％に増加させるように調整すること、調整されたタバコ材料をブレンドして所望のブレンドを生産することを含む。一局面において、本明細書に提供されるタバコ製品を製造する方法はさらに、ブレンドをケーシングまたは香り付けすることを含む。一般には、ケーシングプロセスの間、ケーシングまたはソース材料がブレンドに添加され、化学組成のバランスをとることによってそれらの品質が高められ、特定の望ましい香り特性を発現させる。ケーシングプロセスについてのさらなる詳細は、Tobacco Production, Chemistry and Technology, Edited by L. Davis and M. Nielsen, Blackwell Science, 1999に見いだすことができる。
【０１２６】
本明細書に提供されるタバコ材料をまた、加熱処理（例えば、加熱調理、トースト）、香り付け、酵素処理、膨張および／または乾燥を非限定的に含む方法を使用して、加工することもできる。発酵タバコと非発酵タバコの両方をこれらの技術を使用して加工することができる。好適な加工タバコの例は、暗色空気乾燥、暗色火力乾燥、バーレー、熱風乾燥、およびシガーフィラーまたはラッパーだけでなく、全葉ステミング操作からの製品も含む。一局面において、タバコ繊維は、新鮮重量基準で70％までのダークタバコを含む。例えば、米国公開第2004/0118422号または第2005/0178398号に記載されているような加熱、浸出および／または低温殺菌工程によって、タバコを調整することができる。
【０１２７】
本明細書に提供されるタバコ材料を発酵に供することができる。発酵することは、典型的には、高い初期水分含有量、熱発生および乾燥重量の10〜20％の喪失によって特徴付けられる。例えば、米国特許第4,528,993号；第4,660,577号；第4,848,373号；および第5,372,149号を参照されたい。葉の芳香を改変することに加えて、発酵は、葉の色および手触りの一方または両方を変化させることができる。また、発酵プロセスの間に、ガス発生が起こり、酸素が取り込まれ、pHが変化し、保持される水の量が変化し得る。例えば、米国公開第2005/0178398号およびTso（1999, Chapter 1 in Tobacco, Production, Chemistry and Technology, Davis & Nielsen, eds., Blackwell Publishing, Oxford）を参照されたい。乾燥させたタバコまたは乾燥および発酵させたタバコは、口腔製品に組み込む前にさらに加工することができる（例えば、カット、膨張、ブレンド、すり潰しまたは粉砕）。タバコは、いくつかの場合に、コポリマーおよび場合により香料および他の添加物と混合する前に48〜50重量パーセントのオーブン揮発成分含有量を有する、ロングカット発酵乾燥モイストタバコである。
【０１２８】
一局面において、本明細書に提供されるタバコ材料を所望のサイズに加工することができる。ある種の局面において、タバコ繊維を、200マイクロメーター未満の平均繊維サイズを有するように加工することができる。一局面において、タバコ繊維は、75〜125マイクロメーターである。別の局面において、タバコ繊維は、75マイクロメーター以下のサイズを有するように加工される。一局面において、タバコ繊維は、10カット／インチ〜110カット／インチまでの幅および0.1インチ〜1インチまでの長さにカットまたは刻むことができるロングカットタバコを含む。ダブルカットタバコ繊維は、ダブルカットタバコ繊維の70％が-20メッシュ〜80メッシュの間のメッシュサイズになるような粒子サイズの範囲を有することができる。
【０１２９】
本明細書に提供されるタバコ材料を、10重量％以上；20重量％以上；40重量％以上；15重量％〜25重量％；20重量％〜30重量％；30重量％〜50重量％；45重量％〜65重量％；または50重量％〜60重量％の総オーブン揮発成分含有量を有するように加工することができる。当業者は、「モイスト」タバコが、典型的には、40重量％〜60重量％の間（例えば、45重量％〜55重量％、または50重量％）のオーブン揮発成分含有量を有するタバコを指すことを理解するだろう。本明細書において使用される場合、「オーブン揮発成分」は、予熱した110℃の強制通風オーブンで3.25時間試料を乾燥させた後で、試料の重量喪失の割合を計算することによって決定される。口腔製品は、口腔製品を製造するために使用されるタバコ繊維のオーブン揮発成分含有量と異なる全体的オーブン揮発成分含有量を有することができる。本明細書に記載の加工工程は、オーブン揮発成分含有量を低減また増加させることができる。
【０１３０】
一局面において、本明細書に提供されるタバコ植物、種子、植物成分、植物細胞および植物ゲノムは、熱風乾燥タバコ、天日乾燥タバコ、空気乾燥タバコ、暗色空気乾燥タバコおよび暗色火力乾燥タバコからなる群より選択されるタバコタイプに由来するものである。別の局面において、本明細書に提供されるタバコ植物、種子、植物成分、植物細胞および植物ゲノムは、バーレータバコ、メリーランドタバコ、ブライトタバコ、バージニアタバコ、オリエンタルタバコ、トルコタバコおよびガルパオタバコからなる群より選択されるタバコタイプに由来するものである。一局面において、本明細書に提供されるタバコ植物または種子は、ハイブリッド植物または種子である。本明細書において使用される場合、「ハイブリッド」は、子孫がそれぞれの親由来の遺伝物質を含むように、異なる品種または種由来の2つの植物を交雑させることによって産出される。当業者は、より高次のハイブリッドも同様に作出できることを認識する。例えば、第一のハイブリッドは、品種Cを品種Dと交雑してC×Dハイブリッドを産出させることによって製造することができ、第二のハイブリッドは、品種Eを品種Fと交雑してE×Fハイブリッドを産出させることによって製造することができる。第一および第二のハイブリッドをさらに交雑して、4つの親品種の全ての遺伝情報を含むより高次のハイブリッド（C×D）×（E×F）を産出させることができる。
【０１３１】
熱風乾燥タバコ（ブライトバージニアタバコとも呼ばれる）は、世界のタバコ生産のおよそ40％を占める。熱風乾燥タバコはまた、乾燥の間に到達する金色を帯びた黄色〜濃いオレンジ色のため、「ブライトタバコ」と呼ばれることが多い。熱風乾燥タバコは、軽快で華やかな芳香および味覚を有する。熱風乾燥タバコは、一般に、糖分が高く油分は低い。主要な熱風乾燥タバコの栽培国は、アルゼンチン、ブラジル、中国、インド、タンザニアおよび米国である。一局面において、本明細書に提供される改変されたタバコ植物または種子は、CC 13、CC 27、CC 33、CC35、CC 37、CC 65、CC 67、CC 700、GF 318、GL 338、GL 368、GL 939、K 346、K 399、K326、NC 102、NC 196、NC 291、NC 297、NC 299、NC 471、NC 55、NC 606、NC 71、NC 72、NC 92、PVH 1118、PVH 1452、PVH 2110、スペイト（SPEIGHT）168、スペイト220、スペイト225、スペイト227、スペイト236、および前述の品種のいずれか1つに本質的に由来する任意の品種からなる群より選択される熱風乾燥タバコバックグラウンドのものである。別の局面において、本明細書に提供される改変されたタバコ植物または種子は、コーカー（Coker）48、コーカー176、コーカー371-ゴールド（Gold）、コーカー319、コーカー347、GL 939、K 149、K326、K 340、K 346、K 358、K 394、K 399、K 730、NC 27NF、NC 37NF、NC 55、NC 60、NC 71、NC 72、NC 82、NC 95、NC 297、NC 606、NC 729、NC 2326、マクネア（McNair）373、マクネア944、Ox 207、Ox 414 NF、リームス（Reams）126、リームス713、リームス744、RG 8、RG 11、RG 13、RG 17、RG 22、RG 81、RG H4、RG H51、スペイト（Speight）H-20、スペイトG-28、スペイトG-58、スペイトG-70、スペイトG-108、スペイトG-l11、スペイトG-l17、スペイト168、スペイト179、スペイトNF-3、Va 116、Va 182、および前述の品種のいずれか1つに本質的に由来する任意の品種からなる群より選択される熱風乾燥タバコバックグラウンドのものである。WO 2004/041006 A1を参照されたい。さらなる局面において、本明細書に提供される改変されたタバコ植物、種子、ハイブリッド、品種または系統は、K326、K346およびNC196からなる群より選択される任意の熱風乾燥バックグラウンドのものである。
【０１３２】
空気乾燥タバコは、バーレー、メリーランドおよびダークタバコを含む。共通の要件は、乾燥に主として人工的な熱源および水分源を伴わないことである。バーレータバコは、色が淡褐色〜暗褐色であり、油分が高く、糖分が低い。バーレータバコは、倉庫で空気乾燥される。主要なバーレー栽培国は、アルゼンチン、ブラジル、イタリア、マラウイおよび米国である。メリーランドタバコは、極めて柔らかく、良好な燃焼性、低ニコチンおよびニュートラルな芳香を有する。主要なメリーランド栽培国は、米国およびイタリアを含む。一局面において、本明細書に提供される改変されたタバコ植物または種子は、クレー（Clay）402、クレー403、クレー502、Ky 14、Ky 907、Ky 910、Ky 8959、NC 2、NC 3、NC 4、NC 5、NC 2000、TN 86、TN 90、TN 97、R 610、R 630、R 711、R 712、NCBH 129、HB4488PLC、PD 7319LC、Bu 21×Ky 10、HB04P、Ky 14×L 8、Kt 200、ニュートン（Newton）98、ペディゴ（Pedigo）561、Pf561およびVa 509からなる群より選択されるバーレータバコバックグラウンドのものである。さらなる局面において、本明細書に提供される改変されたタバコ植物、種子、ハイブリッド、品種または系統は、TN 90、KT 209、KT 206、KT212およびHB 4488からなる群より選択される任意のバーレーバックグラウンドのものである。別の局面において、本明細書に提供される改変されたタバコ植物または種子は、Md 10、Md 40、Md 201、Md 609、Md 872およびMd 341からなる群より選択されるメリーランドタバコバックグラウンドのものである。
【０１３３】
暗色空気乾燥タバコは、主にその中褐色〜暗褐色および異なる芳香を暗色空気乾燥タバコに与えるその乾燥プロセスによって、他のタイプと区別される。暗色空気乾燥タバコは、主に、噛みタバコおよびスナッフの生産において使用される。一局面において、本明細書に提供される改変されたタバコ植物または種子は、スマトラ（Sumatra）、ジャティム（Jatim）、ドミニカンキューバノ（Dominican Cubano）、ベスキ（Besuki）、ワンサッカー（One sucker）、グリーンリバー（Green River）、天日乾燥バージニア（Virginia）およびパラグアンパッサード（Paraguan Passado）からなる群より選択される暗色空気乾燥タバコバックグラウンドのものである。
【０１３４】
暗色火力乾燥タバコは、一般に、密閉された乾燥倉庫の床にて、低燃焼木材の火で乾燥させる。暗色火力乾燥タバコは、パイプブレンド、シガレット、噛みタバコ、スナッフおよび濃い味のするシガーを製造するために使用される。暗色火力乾燥タバコの主要な栽培地域は、米国のテネシー州、ケンタッキー州およびバージニア州である。一局面において、本明細書に提供される改変されたタバコ植物または種子は、細葉マドール（Narrow Leaf Madole）、改良マドール（Improved Madole）、トムロッソンマドール（Tom Rosson Madole）、ニュートンのVHマドール（Newton's VH Madole）、リトルクリッテンデン（Little Crittenden）、グリーンウッド（Green Wood）、リトルウッド（Little Wood）、スモールストークブラックマンモス（Small Stalk Black Mammoth）、DT 508、DT 518、DT 592、KY 171、DF 911、DF 485、TN D94、TN D950、VA 309およびVA 359からなる群より選択される暗色火力乾燥タバコバックグラウンドのものである。
【０１３５】
オリエンタルタバコはまた、典型的にはトルコ、ギリシャ、ブルガリア、マケドニア、シリア、レバノン、イタリアおよびルーマニアなどの東地中海地方で栽培されていることから、ギリシャ・アロマ・トルコタバコとも呼ばれている。今日のオリエンタル品種に特徴的な小さな植物および葉サイズ、ならびにその固有の芳香特性は、痩せた土壌およびストレスの多い気候条件の中で過去何世紀にもわたり進化してきたその植物の適応の結果である。一局面において、本明細書に提供される改変されたタバコ植物または種子は、イズマー（Izmir）、カテリニ（Katerini）、サムソン（Samsun）、バスマアンドクルモフグラド（Basma and Krumovgrad）、トラブゾン（Trabzon）、テサリアン（Thesalian）、タソバ（Tasova）、シノップ（Sinop）、イズミット（Izmit）、ヘンデク（Hendek）、エダーン（Edirne）、セムジンリ（Semdinli）、アジヤンマン（Adiyanman）、ヤイラダグ（Yayladag）、イスケンダルン（Iskenderun）、ダズス（Duzce）、マケドニアン（Macedonian）、マブラ（Mavra）、プリレプ（Prilep）、バフラ（Bafra）、ブルサ（Bursa）、ブカク（Bucak）、ビトリス（Bitlis）、バリケサー（Balikesir）、および前述の品種のいずれか1つに本質的に由来する任意の品種からなる群より選択されるオリエンタルタバコバックグラウンドのものである。
【０１３６】
一局面において、本明細書に提供される改変されたタバコ植物、種子、ハイブリッド、品種または系統は、BU 64、CC 101、CC 200、CC 13、CC 27、CC 33、CC 35、CC 37、CC 65、CC 67、CC 301、CC 400、CC 500、CC 600、CC 700、CC 800、CC 900、CC 1063、コーカー176、コーカー319、コーカー371ゴールド、コーカー48、CU 263、DF911、ガルパオ（Galpao）、GL 26H、GL 338、GL 350、GL 395、GL 600、GL 737、GL 939、GL 973、GF 157、GF 318、RJR 901、HB 04P、K 149、K 326、K 346、K 358、K394、K 399、K 730、NC 196、NC 37NF、NC 471、NC 55、NC 92、NC2326、NC 95、NC 925、PVH 1118、PVH 1452、PVH 2110、PVH 2254、PVH 2275、VA 116、VA 119、KDH 959、KT 200、KT204LC、KY 10、KY 14、KY 160、KY 17、KY 171、KY 907、KY 907LC、KTY14×L8 LC、リトルクリッテンデン、マクネア373、マクネア944、雄性不稔KY 14×L8、細葉マドール、MS KY171、細葉マドール（phph）、MS細葉マドール、MS TND950、 PD 7302LC、PD 7305LC、PD 7309LC、PD 7312LC、PD 7318LC、PD 7319LC、MSTKS 2002、TKF 2002、TKF 6400、TKF 4028、TKF 4024、KT206LC、KT209LC、KT210LC、KT212LC、NC 100、NC 102、NC 2000、NC 291、NC 297、NC 299、NC 3、NC 4、NC 5、NC 6、NC7、NC 606、NC 71、NC 72、NC 810、NC BH 129、NC 2002、ニールスミスマドール（Neal Smith Madole）、OXFORD 207、「ペリケ（Perique）」、PVH03、PVH09、PVH19、PVH50、PVH51、R 610、R 630、R 7-11、R 7-12、RG 17、RG 81、RG H51、RGH 4、RGH 51、RS 1410、スペイト168、スペイト172、スペイト179、スペイト210、スペイト220、スペイト225、スペイト227、スペイト234、スペイトG-28、スペイトG-70、スペイトH-6、スペイトH20、スペイトNF3、TI 1406、TI 1269、TN 86、TN86LC、TN 90、TN90LC、TN 97、TN97LC、TN D94、TN D950、TR（トムロッソン（Tom Rosson））マドール、VA 309、VA 359、または当技術分野において公知の標準的なタバコ育種技術による任意の市販のタバコ品種に本質的に由来するかまたはその遺伝的バックグラウンドのものである。
【０１３７】
暗色空気乾燥、バーレー、メリーランド、暗色火力乾燥またはオリエンタルタイプの前述の特定の品種は全て、例示的な目的にのみ列記される。任意のさらなる暗色空気乾燥、バーレー、メリーランド、暗色火力乾燥、オリエンタル品種も、本願において想定される。
【０１３８】
また、本明細書に記載のタバコ植物の集団も、本明細書に提供される。一局面において、本明細書に提供されるタバコ植物の集団は、1エーカー当たり植物5,000〜8000の間、5,000〜7,600の間、5,000〜7,200の間、5,000〜6,800の間、5,000〜6,400の間、5,000〜6,000の間、5,000〜5,600の間、5,000〜5,200の間、5,200〜8,000の間、5,600〜8,000の間、6,000〜8,000の間、6,400〜8,000の間、6,800〜8,000の間、7,200〜8,000の間、または7,600〜8,000の間の栽植密度を有する。
【０１３９】
また、本明細書に記載のタバコ植物由来の種子の容器も本明細書に提供される。本開示のタバコ種子の容器は、任意の数、重量または体積の種子を含有してよい。例えば、容器は、少なくとも10もしくは10超の種子；少なくとも25もしくは25超の種子；少なくとも50もしくは50超の種子；少なくとも100もしくは100超の種子；少なくとも200もしくは200超の種子；少なくとも300もしくは300超の種子；少なくとも400もしくは400超の種子；少なくとも500もしくは500超の種子；少なくとも600もしくは600超の種子；少なくとも700もしくは700超の種子；少なくとも800もしくは800超の種子；少なくとも900もしくは900超の種子；少なくとも1000もしくは1000超の種子；少なくとも1500もしくは1500超の種子；少なくとも2000もしくは2000超の種子；少なくとも2500もしくは2500超の種子；少なくとも3000もしくは3000超の種子；少なくとも3500もしくは3500超の種子；少なくとも4000もしくは4000超の種子；または少なくとも5000もしくは5000超の種子を含有することができる。あるいは、容器は、少なくとも1オンスもしくは1オンス超の種子；少なくとも5グラムもしくは5グラム超の種子；少なくとも10グラムもしくは10グラム超の種子；少なくとも30グラムもしくは30グラム超の種子；少なくとも50グラムもしくは50グラム超の種子；少なくとも100グラムもしくは100グラム超の種子；少なくとも500グラムもしくは500グラム超の種子；少なくとも1キログラムもしくは1キログラム超の種子；少なくとも1.5キログラムもしくは1.5キログラム超の種子；少なくとも2キログラムもしくは2キログラム超の種子；少なくとも5キログラムもしくは5キログラム超の種子；または少なくとも10キログラムもしくは10キログラム超の種子を含有することができる。タバコ種子の容器は、当技術分野において利用可能な任意の容器であってよい。非限定的な例として、容器は、ボックス、バッグ、パケット、ポーチ、テープロール、チューブまたはボトルであり得る。
【０１４０】
一局面において、本開示は、1つまたは複数のTSNAの低減されたレベルを含む改変されたタバコ植物由来の乾燥葉を提供する。一局面において、低減された1つまたは複数のTSNAは、N'-ニトロソノルニコチン（NNN）、4-メチルニトロソアミノ-l-(3-ピリジル)-l-ブタノン（NNK）、N'-ニトロソアナタビン（NAT）、N'-ニトロソアナバシン（NAB）、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。一局面において、総TSNAまたは個々のTSNAのレベルは、タンデム質量分光法を用いた液体クロマトグラフ（LC/MS/MS）を使用してフリーズドライ乾燥葉試料に対して測定される。
【０１４１】
一局面において、本開示は、1つまたは複数のアルカロイドの低減されたレベルを含む改変されたタバコ植物由来の乾燥葉を提供する。一局面において、低減された1つまたは複数のアルカロイドは、ニコチン、ノルニコチン、アナバシン、アナタビンからなる群より選択される。
【０１４２】
本開示はまた、増大した窒素利用効率を含むタバコ系統、栽培種または品種を育種するための方法を提供する。育種は、任意の公知の手順を介して行うことができる。DNAフィンガープリンティング、SNPマッピング、ハプロタイプマッピングまたは類似の技術をマーカー支援選択（MAS）育種プログラムに使用して、望ましい形質またはアレルをタバコ植物に伝達または交配してよい。例えば、育種家は、本明細書に提供されるF1ハイブリッド植物を使用してまたはF1ハイブリッド植物を農学的に望ましい遺伝子型を有する他のドナー植物とさらに交雑して、F2または戻し交雑世代の分離集団を産出することができる。F2または戻し交雑世代の植物を、当技術分野において公知または本明細書に列記される技術の1つを使用して、所望の農学的形質または望ましい化学プロファイルについてスクリーニングすることができる。予想される継承パターンまたは使用されるMAS技術に応じて、所望の個々の植物の特定を援助するために各戻し交雑サイクルの前に選択植物の自家受粉を実施することができる。反復親の所望の表現型が回復されるまで、戻し交雑または他の育種手順を繰り返すことができる。一局面において、本開示における反復親は、熱風乾燥品種、バーレー品種、暗色空気乾燥品種、暗色火力乾燥品種またはオリエンタル品種であることができる。別の局面において、反復親は、改変されたタバコ植物、系統または品種であることができる。一局面において、本明細書に提供される反復親は、TN90である。別の局面において、本明細書に提供される反復親は、MD609である。他の育種技術は、例えば、Wernsman, E. A., and Rufty, R. C. 1987. Chapter Seventeen. Tobacco. Pages 669-698 In: Cultivar Development. Crop Species. W. H. Fehr (ed.), MacMillan Publishing Go., Inc., New York, N.Y.に見いだすことができ、それらの全体は、参照により本明細書に組み入れられる。
【０１４３】
本明細書に記載の改変されたタバコ植物を使用した植物育種プログラムの結果は、本開示の有用な系統、栽培種、品種、子孫、同系繁殖体およびハイブリッドを含む。本明細書において使用される場合、用語「品種」は、同じ種の他の植物からそれらを分ける恒常的な特性を共有する植物の集団を指す。品種は、必ずではないが、多くの場合、市販されている。1つまたは複数の独特の形質を保有しつつ、品種は、その品種内の個体間での非常に小さな全体的変動によってさらに特徴付けられる。「純系統」品種は、数世代の自家受粉および選択によって、または組織もしくは細胞培養技術を使用した単一の親からの栄養繁殖によって産出させ得る。品種は、別の系統または品種に本質的に由来することができる。International Convention for the Protection of New Varieties of Plants （1961年12月2日、ジュネーブで1972年11月10日；1978年10月23日；および1991年3月19日に改正された）によって定義されるように、品種は、a）それが、原品種の遺伝子型または遺伝子型の組み合わせから生じる本質的な特性の発現を保持しつつ、原品種に優位に由来するか、または原品種に優位に由来する品種由来である；b）それが原品種と明確に区別される；およびc）派生行為から生じる差異を除いて、それが、原品種の遺伝子型または遺伝子型の組み合わせから生じる本質的な特性の発現で原品種に合致する場合に、原品種に「本質的に由来する」。本質的に由来する品種を、例えば、自然または誘導変異体、ソマクローンバリアント、原品種の植物からのバリアント個体の選択、戻し交雑または形質転換によって得ることができる。第一のタバコ品種および第一の品種が本質的に由来する第二のタバコ品種は、本質的に同一の遺伝的バックグラウンドを有すると見なされる。品種と区別される「系統」はほとんどの場合、非商業的に、例えば植物の研究において使用されている植物の一群を示す。系統は、典型的には、関心対象の1つまたは複数の形質について個体間で全体的変動をほとんど呈さないが、他の形質について個体間でいくらかの変動がある可能性がある。
【０１４４】
一局面において、本開示は、第一のタバコ品種の少なくとも1つのタバコ植物を第二のタバコ品種の少なくとも1つのタバコ植物と交雑させる工程であって、第一のタバコ品種の少なくとも1つのタバコ植物が、同等な条件下で生育させた同じ品種の対照タバコ植物と比べて増大した窒素利用効率を示す、工程；および同等な条件下で生育させた同じ交雑体の対照タバコ植物と比べて増大した窒素利用効率を示す子孫タバコ植物を選択する工程を含む、タバコ植物を生産する方法を提供する。一局面において、本明細書に提供される第一のタバコ品種は、改変されたタバコ植物を含む。別の局面において、本明細書に提供される第二のタバコ品種は、改変されたタバコ植物を含む。一局面において、第一または第二のタバコ品種は、雄性不稔である。別の局面において、第一または第二のタバコ品種は、細胞質性の雄性不稔である。別の局面において、第一または第二のタバコ品種は、雌性不稔である。一局面において、第一または第二のタバコ品種は、優良品種である。別の局面において、第一または第二のタバコ品種は、ハイブリッドである。
【０１４５】
一局面において、本開示は、タバコ品種に1つまたは複数の導入遺伝子を遺伝子移入する方法であって、（a）1つまたは複数の導入遺伝子を含む第一のタバコ品種を1つまたは複数の導入遺伝子を含まない第二のタバコ品種と交雑して、1つまたは複数の子孫タバコ植物を生産する工程；（b）1つまたは複数の導入遺伝子について1つまたは複数の子孫タバコ植物をジェノタイピングする工程；および（c）1つまたは複数の導入遺伝子を含む子孫タバコ植物を選択する工程を含む方法を提供する。別の局面において、これらの方法はさらに、選択された子孫タバコ植物を第二のタバコ品種と戻し交雑させる工程を含む。さらなる局面において、これらの方法はさらに、（d）選択された子孫植物をそれ自体または第二のタバコ品種と交雑して、1つまたは複数のさらなる子孫タバコ植物を生産する工程；および（e）1つまたは複数の導入遺伝子を含むさらなる子孫タバコ植物を選択する工程を含む。一局面において、第二のタバコ品種は、優良品種である。
【０１４６】
一局面において、本開示は、タバコ品種に1つまたは複数の変異を遺伝子移入する方法であって、（a）1つまたは複数の変異を含む第一のタバコ品種を1つまたは複数の変異を含まない第二のタバコ品種と交雑して、1つまたは複数の子孫タバコ植物を生産する工程；（b）1つまたは複数の変異について1つまたは複数の子孫タバコ植物をジェノタイピングする工程;および（c）1つまたは複数の変異を含む子孫タバコ植物を選択する工程を含む方法を提供する。別の局面において、これらの方法はさらに、選択された子孫タバコ植物を第二のタバコ品種と戻し交雑させる工程を含む。さらなる局面において、これらの方法はさらに、（d）選択された子孫植物をそれ自体または第二のタバコ品種と交雑して、1つまたは複数のさらなる子孫タバコ植物を生産する工程；および（e）1つまたは複数の変異を含むさらなる子孫タバコ植物を選択する工程を含む。一局面において、第二のタバコ品種は、優良品種である。
【０１４７】
一局面において、本開示は、増大した窒素利用効率を含む改変されたタバコ植物の集団を生育させる方法であって、1つまたは複数の変異、1つまたは複数の導入遺伝子、または両方を含むタバコ種子の集団を栽植することを含み、1つまたは複数の改変されたタバコ植物が、同等な条件下で生育させたときの同じ品種の対照タバコ植物と比べて増大した窒素利用効率を示す、方法を提供する。
【０１４８】
一局面において、本開示は、本明細書に提供される組換えDNA構築物を植物細胞に導入する工程；組換えDNA構築物について植物細胞の集団をスクリーニングする工程；その集団から1つまたは複数の植物細胞を選択する工程；1つまたは複数の植物細胞から1つまたは複数の改変された植物を作出する工程；および1つまたは複数の改変された植物から1つまたは複数の改変された種子を収穫する工程を含む、改変された種子を製造するための方法を提供する。
【０１４９】
本明細書において使用される場合、「遺伝子座」は、多型核酸、形質決定因子、遺伝子またはマーカーが位置する、染色体領域である。本開示の遺伝子座は、一集団において1つまたは複数の多型を含む；例えば、代替アレルが一部の個体に存在する。本明細書において使用される場合、「アレル」は、特定の遺伝子座にある代替核酸配列を指す。アレルの長さは、1ヌクレオチド塩基という小ささもあり得るが、典型的にはより大きい。例えば、第一のアレルは、1つの染色体上に生じ得るが、第二のアレルは、第二の同種染色体上に生じる（例えば、ヘテロ接合型個体の異なる染色体について生じるか、または一集団において異なるホモ接合型個体間もしくはヘテロ接合型個体間で生じるように）。本明細書において使用される場合、二倍体植物の染色体は、遺伝子座が1コピーだけ存在する場合に「ヘミ接合型」である。例えば、挿入される導入遺伝子は、それが1つの姉妹染色体に挿入される場合にヘミ接合型である（例えば、第二の姉妹染色体は、挿入された導入遺伝子を含有しない）。
【０１５０】
一局面において、改変された植物、種子、植物成分、植物細胞または植物ゲノムは、本明細書に提供される導入遺伝子に対してホモ接合型である。別の局面において、改変された植物、種子、植物成分、植物細胞または植物ゲノムは、本明細書に提供される導入遺伝子に対してヘテロ接合型である。一局面において、改変された植物、種子、植物成分、植物細胞または植物ゲノムは、本明細書に提供される導入遺伝子に対してヘミ接合型である。一局面において、改変された植物、種子、植物成分、植物細胞または植物ゲノムは、本明細書に提供される変異に対してホモ接合型である。別の局面において、改変された植物、種子、植物成分、植物細胞または植物ゲノムは、本明細書に提供される変異に対してヘテロ接合型である。一局面において、改変された植物、種子、植物成分、植物細胞または植物ゲノムは、本明細書に提供される変異に対してヘミ接合型である。
【０１５１】
本明細書において使用される場合、「遺伝子移入」または「遺伝子移入する」は、一方の遺伝的バックグラウンドからもう一方の遺伝的バックグラウンドへの遺伝子座の所望のアレルの伝達を指す。
【０１５２】
本明細書において使用される場合、「交雑された」または「交雑する」は、受精を介して子孫（例えば、細胞、種子または植物）を生産することを意味し、異なる植物間の交雑（有性）および自己受精（自殖）を含む。
【０１５３】
本明細書において使用される場合、「戻し交雑」および「戻し交雑する」は、子孫植物をその親の一方に繰り返し戻し交雑させるプロセスを指す。戻し交雑スキームでは、「ドナー」親は、遺伝子移入される所望の遺伝子または遺伝子座を有する親植物を指す。「レシピエント」親（1回または複数回使用される）または「反復」親（2回以上使用される）は、遺伝子または遺伝子座が遺伝子移入される親植物を指す。初期交雑体は、F1世代を生じる。用語「BC1」は、反復親の2回目の使用を指し、「BC2」は、反復親の3回目の使用を指す（以下同様）。一局面において、戻し交雑は、各々の連続した戻し交雑世代の子孫個体それ自体を同じ親遺伝子型に戻し交雑させて、繰り返し実施される。
【０１５４】
本明細書において使用される場合、「優良品種」は、優れた農学的性能についての育種および選択からもたらされた任意の品種を意味する。
【０１５５】
本明細書において使用される場合、「選択すること」または「選択」は、育種の文脈において、所望の個体を、通常は集団から、ある種の所定の基準に基づいて、取り出すまたは選び出す行為を指す。
【０１５６】
一局面において、本明細書に提供されるタバコ植物は、ハイブリッド植物である。ハイブリッドは、第一の品種の雌性親植物（例えば、種子親）の自家受粉を防止し、第二の品種の雄性親植物由来の花粉を雌性親植物に受精させ、そして、雌性植物でF1ハイブリッド種子が形成するのを可能にすることよって、生産させることができる。雌性植物の自家受粉は、花の発生初期に花を除雄することによって、防止することができる。あるいは、雄性不稔性の形態を使用して、雌性親植物に対して花粉形成を防止することができる。例えば、雄性不稔性は、雄性不稔性（MS）、または導入遺伝子が小胞子形成および／もしくは花粉形成を阻害するトランスジェニック雄性不稔性、または自家不和合性によって生産させることができる。MSを含有する雌性親植物が特に有用である。雌性親植物がMSである局面において、花粉を雄性稔性植物から収穫し、手作業でMS雌性親植物の柱頭に塗布してよく、得られたF1種子を収穫する。追加で、雌性不稔植物を使用して、自己受精を防止することもできる。
【０１５７】
植物を使用して、単交雑タバコF1ハイブリッドを作ることができる。雄性親植物由来の花粉を、除雄した雌性親植物または雄性不稔である雌性親植物に手作業で移して、F1種子を形成する。あるいは、単交雑F1ハイブリッドを雌性親として使用して異なる雄性親と交雑させる、三系交雑を行うことができる。またあるいは、2つの異なる単交雑体のF1子孫それ自体を交雑させる二重交雑ハイブリッドを産出することができる。自家不和合性を使用することで、二重交雑ハイブリッドを作るときの雌性親の自家受粉の防止に特定の利益をもたらすことができる。
【０１５８】
一局面において、本明細書に提供されるタバコ品種は、雄性不稔である。別の局面において、本明細書に提供されるタバコ品種は、細胞質雄性不稔（CMS）である。雄性不稔タバコ植物は、当技術分野において公知の任意の方法によって生産してよい。雄性不稔タバコを生産する方法は、Wernsman, E. A., and Rufty, R. C. 1987. Chapter Seventeen. Tobacco. Pages 669-698 In: Cultivar Development. Crop Species. W. H. Fehr (ed.), MacMillan Publishing Go., Inc., New York, N.Y. 761 ppに記載されている。別の局面において、本明細書に提供されるタバコ品種は、雌性不稔である。非限定例として、雌性不稔植物は、STIG1遺伝子を変異させることによって製造することができる。例えば、Goldman et al. 1994, EMBO Journal 13:2976-2984を参照されたい。
【０１５９】
一局面において、本開示は、タバコ系統のタバコ植物から少なくとも1つの代謝物を得る工程、少なくとも1つの得られた代謝物の量を決定する工程、および決定された少なくとも1つの代謝物の量に基づいてタバコ系統のNUEを決定する工程を含む、タバコ系統のNUEを決定する方法を提供し、かつ、それを含む。あるさらなる局面において、少なくとも1つの代謝物は、根組織、葉組織、花組織、分裂組織および茎組織からなる群より選択される植物組織から得られる。この方法のあるさらなる局面において、少なくとも2つの代謝物が得られる。この方法のあるさらなる局面において、少なくとも3つの代謝物が得られる。この方法のあるさらなる局面において、少なくとも4つの代謝物が得られる。この方法のあるさらなる局面において、少なくとも5つの代謝物が得られる。この方法のあるさらなる局面において、少なくとも6つの代謝物が得られる。この方法のあるさらなる局面において、少なくとも7つの代謝物が得られる。この方法のあるさらなる局面において、少なくとも8つの代謝物が得られる。この方法のあるさらなる局面において、少なくとも9つの代謝物が得られる。この方法のあるさらなる局面において、少なくとも10の代謝物が得られる。この方法のあるさらなる局面において、少なくとも2つの代謝物の量が決定される。この方法のあるさらなる局面において、少なくとも3つの代謝物の量が決定される。この方法のあるさらなる局面において、少なくとも4つの代謝物の量が決定される。この方法のあるさらなる局面において、少なくとも5つの代謝物の量が決定される。この方法のあるさらなる局面において、少なくとも6つの代謝物の量が決定される。この方法のあるさらなる局面において、少なくとも7つの代謝物の量が決定される。この方法のあるさらなる局面において、少なくとも8つの代謝物の量が決定される。この方法のあるさらなる局面において、少なくとも9つの代謝物の量が決定される。この方法のあるさらなる局面において、少なくとも10の代謝物の量が決定される。
【０１６０】
本明細書に提供される方法の別の局面において、X-2357、N-アセチルムラマート、X-23319、X-23852、X-23330、アルファ-ケトグルタラート、X-21756、4-ヒドロキシ-2-オキソグルタル酸、D-23937、X-23937、X-23916、1-メチルアデニン、4-グアニジノブタノアート、シリンガアルデヒド、チアミン、p-ヒドロキシベンズアルデヒド、X-23453、X-11429、X-21796、N'-メチルニコチンアミド、コチニン、X-23389、N-アセチルアルギニン、X-23366、N-アセチルフェニルアラニン、ナリンゲニン、X-23454、X-23580およびX-23852からなる群より選択される代謝物の量が決定される。
【０１６１】
本明細書に提供される方法の別の局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、より少ない量の少なくとも1つの代謝物を少なくとも1つの組織に含むタバコ植物と比べて増大したNUEを含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、より少ない量の少なくとも2つの代謝物を少なくとも1つの組織に含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、より少ない量の少なくとも3つの代謝物を少なくとも1つの組織に含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、より少ない量の少なくとも4つの代謝物を少なくとも1つの組織に含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、より少ない量の少なくとも5つの代謝物を少なくとも1つの組織に含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、2つの組織に、より少ない量の少なくとも1つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも2つの組織に、より少ない量の少なくとも2つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも2つの組織に、より少ない量の少なくとも3つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも2つの組織に、より少ない量の少なくとも4つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも2つの組織に、より少ない量の少なくとも5つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、3つの組織に、より少ない量の少なくとも1つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも3つの組織に、より少ない量の少なくとも2つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも3つの組織に、より少ない量の少なくとも3つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも3つの組織に、より少ない量の少なくとも4つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも3つの組織に、より少ない量の少なくとも5つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、4つの組織に、より少ない量の少なくとも1つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも4つの組織に、より少ない量の少なくとも2つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも4つの組織に、より少ない量の少なくとも3つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも4つの組織に、より少ない量の少なくとも4つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも4つの組織に、より少ない量の少なくとも5つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、5つの組織に、より少ない量の少なくとも1つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも5つの組織に、より少ない量の少なくとも2つの代謝物を含む。あるさらなる局���において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも5つの組織に、より少ない量の少なくとも3つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも5つの組織に、より少ない量の少なくとも4つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも5つの組織に、より少ない量の少なくとも5つの代謝物を含む。
【０１６２】
本明細書に提供される方法の別の局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、より多い量の少なくとも1つの代謝物を少なくとも1つの組織に含むタバコ系統と比べて増大したNUEを含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、より多い量の少なくとも2つの代謝物を少なくとも1つの組織に含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、より多い量の少なくとも3つの代謝物を少なくとも1つの組織に含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、より多い量の少なくとも4つの代謝物を少なくとも1つの組織に含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、より多い量の少なくとも5つの代謝物を少なくとも1つの組織に含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、2つの組織に、より多い量の少なくとも1つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも2つの組織に、より多い量の少なくとも2つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも2つの組織に、より多い量の少なくとも3つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも2つの組織に、より多い量の少なくとも4つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも2つの組織に、より多い量の少なくとも5つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、3つの組織に、より多い量の少なくとも1つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも3つの組織に、より多い量の少なくとも2つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも3つの組織に、より多い量の少なくとも3つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも3つの組織に、より多い量の少なくとも4つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも3つの組織に、より多い量の少なくとも5つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、4つの組織に、より多い量の少なくとも1つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも4つの組織に、より多い量の少なくとも2つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも4つの組織に、より多い量の少なくとも3つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも4つの組織に、より多い量の少なくとも4つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも4つの組織に、より多い量の少なくとも5つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、5つの組織に、より多い量の少なくとも1つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも5つの組織に、より多い量の少なくとも2つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、���なくとも5つの組織に、より多い量の少なくとも3つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも5つの組織に、より多い量の少なくとも4つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも5つの組織に、より多い量の少なくとも5つの代謝物を含む。
【０１６３】
本明細書に提供される方法の別の局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも1つの組織に等量の少なくとも1つの代謝物を含むタバコ系統と比べて増大したNUEを含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも1つの組織に等量の少なくとも2つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも1つの組織に等量の少なくとも3つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも1つの組織に等量の少なくとも4つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも1つの組織に等量の少なくとも5つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、2つの組織に等量の少なくとも1つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも2つの組織に等量の少なくとも2つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも2つの組織に等量の少なくとも3つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも2つの組織に等量の少なくとも4つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも2つの組織に等量の少なくとも5つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、3つの組織に等量の少なくとも1つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも3つの組織に等量の少なくとも2つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも3つの組織に等量の少なくとも3つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも3つの組織に等量の少なくとも4つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも3つの組織に等量の少なくとも5つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、4つの組織に等量の少なくとも1つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも4つの組織に等量の少なくとも2つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも4つの組織に等量の少なくとも3つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも4つの組織に等量の少なくとも4つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも4つの組織に等量の少なくとも5つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、5つの組織に等量の少なくとも1つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも5つの組織に等量の少なくとも2つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも5つの組織に等量の少なくとも3つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも5つの組織に等量の少なくとも4つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも5つの組織に等量の少なくとも5つの代謝物を含む。
【０１６４】
本明細書に提供される方法の別の局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、より少ない量の少なくとも1つの代謝物を少なくとも1つの組織に含むタバコ系統と比べて減少したNUEを含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、より少ない量の少なくとも2つの代謝物を少なくとも1つの組織に含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、より少ない量の少なくとも3つの代謝物を少なくとも1つの組織に含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、より少ない量の少なくとも4つの代謝物を少なくとも1つの組織に含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、より少ない量の少なくとも5つの代謝物を少なくとも1つの組織に含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、2つの組織に、より少ない量の少なくとも1つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも2つの組織に、より少ない量の少なくとも2つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも2つの組織に、より少ない量の少なくとも3つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも2つの組織に、より少ない量の少なくとも4つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも2つの組織に、より少ない量の少なくとも5つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、3つの組織に、より少ない量の少なくとも1つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも3つの組織に、より少ない量の少なくとも2つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも3つの組織に、より少ない量の少なくとも3つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも3つの組織に、より少ない量の少なくとも4つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも3つの組織に、より少ない量の少なくとも5つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、4つの組織に、より少ない量の少なくとも1つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも4つの組織に、より少ない量の少なくとも2つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも4つの組織に、より少ない量の少なくとも3つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも4つの組織に、より少ない量の少なくとも4つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも4つの組織に、より少ない量の少なくとも5つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、5つの組織に、より少ない量の少なくとも1つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも5つの組織に、より少ない量の少なくとも2つの代謝物を含む。あるさらなる局���において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも5つの組織に、より少ない量の少なくとも3つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも5つの組織に、より少ない量の少なくとも4つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも5つの組織に、より少ない量の少なくとも5つの代謝物を含む。
【０１６５】
本明細書に提供される方法の別の局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、より多い量の少なくとも1つの代謝物を少なくとも1つの組織に含むタバコ系統と比べて減少したNUEを含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、より多い量の少なくとも2つの代謝物を少なくとも1つの組織に含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、より多い量の少なくとも3つの代謝物を少なくとも1つの組織に含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、より多い量の少なくとも4つの代謝物を少なくとも1つの組織に含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、より多い量の少なくとも5つの代謝物を少なくとも1つの組織に含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、2つの組織に、より多い量の少なくとも1つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも2つの組織に、より多い量の少なくとも2つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも2つの組織に、より多い量の少なくとも3つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも2つの組織に、より多い量の少なくとも4つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも2つの組織に、より多い量の少なくとも5つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、3つの組織に、より多い量の少なくとも1つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも3つの組織に、より多い量の少なくとも2つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも3つの組織に、より多い量の少なくとも3つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも3つの組織に、より多い量の少なくとも4つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも3つの組織に、より多い量の少なくとも5つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、4つの組織に、より多い量の少なくとも1つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも4つの組織に、より多い量の少なくとも2つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも4つの組織に、より多い量の少なくとも3つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも4つの組織に、より多い量の少なくとも4つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも4つの組織に、より多い量の少なくとも5つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、5つの組織に、より多い量の少なくとも1つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも5つの組織に、より多い量の少なくとも2つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、���なくとも5つの組織に、より多い量の少なくとも3つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも5つの組織に、より多い量の少なくとも4つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも5つの組織に、より多い量の少なくとも5つの代謝物を含む。
【０１６６】
本明細書に提供される方法の別の局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも1つの組織に等量の少なくとも1つの代謝物を含むタバコ系統と比べて減少したNUEを含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも1つの組織に等量の少なくとも2つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも1つの組織に等量の少なくとも3つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも1つの組織に等量の少なくとも4つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも1つの組織に等量の少なくとも5つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、2つの組織に等量の少なくとも1つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも2つの組織に等量の少なくとも2つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも2つの組織に等量の少なくとも3つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも2つの組織に等量の少なくとも4つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも2つの組織に等量の少なくとも5つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、3つの組織に等量の少なくとも1つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも3つの組織に等量の少なくとも2つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも3つの組織に等量の少なくとも3つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも3つの組織に等量の少なくとも4つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも3つの組織に等量の少なくとも5つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、4つの組織に等量の少なくとも1つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも4つの組織に等量の少なくとも2つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも4つの組織に等量の少なくとも3つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも4つの組織に等量の少なくとも4つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも4つの組織に等量の少なくとも5つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、5つの組織に等量の少なくとも1つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも5つの組織に等量の少なくとも2つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも5つの組織に等量の少なくとも3つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも5つの組織に等量の少なくとも4つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEを有するタバコ植物は、少なくとも5つの組織に等量の少なくとも5つの代謝物を含む。
【０１６７】
別の局面において、本明細書に提供される方法は、液体クロマトグラフィー／質量分光法（LC/MS）、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、ウルトラHPLC（UHPLC）、質量分光法（MS）、タンデム質量分光法（MS/MS）、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分光法（MALDI-MS）、蛍光X線分光法（XRF）、イオンクロマトグラフィー（IC）、ガスククロマトグラフィー（GC）、ガスククロマトグラフィー／質量分光法（GC/MS）、キャピラリー電気泳動／質量分光法（CE-MS）、イオン移動度分光法/質量分光法（IMS/MS）、X線回折、核磁気共鳴（NMR）、発光分光分析、ポーラログラフィー、紫外-可視分光法、赤外分光法、および薄層クロマトグラフィーからなる群より選択される方法を使用して代謝物の量を決定する工程を含む。
【０１６８】
一局面において、本明細書は、タバコ系統のタバコ植物から代謝物シグネチャーを単離する工程、代謝物シグネチャーを含む各代謝物の量を決定する工程、および、その代謝物シグネチャーを既知のNUEを含む対照タバコ系統由来の対照代謝物シグネチャーと比較することによってタバコ系統のNUEを決定する工程を含む、代謝物シグネチャーを使用したタバコ系統のNUEを決定する方法を提供し、かつ、それを含む。この方法のあるさらなる局面において、NUEは、対照タバコ系統と比べて増大したNUEを含む。この方法の別の局面において、代謝物シグネチャーは、根組織、葉組織、花組織、分裂組織および茎組織からなる群より選択される植物組織から単離される。
【０１６９】
本明細書に提供される方法のある局面において、代謝物シグネチャーは、少なくとも2つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、代謝物シグネチャーは、少なくとも3つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、代謝物シグネチャーは、少なくとも4つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、代謝物シグネチャーは、少なくとも5つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、代謝物シグネチャーは、少なくとも6つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、代謝物シグネチャーは、少なくとも7つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、代謝物シグネチャーは、少なくとも8つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、代謝物シグネチャーは、少なくとも9つの代謝物を含む。あるさらなる局面において、代謝物シグネチャーは、少なくとも10の代謝物を含む。あるさらなる局面において、代謝物シグネチャーは、少なくとも11の代謝物を含む。あるさらなる局面において、代謝物シグネチャーは、少なくとも12の代謝物を含む。あるさらなる局面において、代謝物シグネチャーは、少なくとも13の代謝物を含む。あるさらなる局面において、代謝物シグネチャーは、少なくとも14の代謝物を含む。あるさらなる局面において、代謝物シグネチャーは、少なくとも15の代謝物を含む。あるさらなる局面において、代謝物シグネチャーは、少なくとも20の代謝物を含む。あるさらなる局面において、代謝物シグネチャーは、少なくとも25の代謝物を含む。あるさらなる局面において、代謝物シグネチャーは、少なくとも30の代謝物を含む。あるさらなる局面において、代謝物シグネチャーは、少なくとも35の代謝物を含む。あるさらなる局面において、代謝物シグネチャーは、少なくとも40の代謝物を含む。あるさらなる局面において、代謝物シグネチャーは、少なくとも45の代謝物を含む。あるさらなる局面において、代謝物シグネチャーは、少なくとも50の代謝物を含む。あるさらなる局面において、代謝物シグネチャーは、2〜50の間の代謝物を含む。あるさらなる局面において、代謝物シグネチャーは、3〜45の間の代謝物を含む。あるさらなる局面において、代謝物シグネチャーは、3〜40の間の代謝物を含む。あるさらなる局面において、代謝物シグネチャーは、4〜35の間の代謝物を含む。あるさらなる局面において、代謝物シグネチャーは、5〜30の間の代謝物を含む。あるさらなる局面において、代謝物シグネチャーは、6〜25の間の代謝物を含む。あるさらなる局面において、代謝物シグネチャーは、7〜20の間の代謝物を含む。あるさらなる局面において、代謝物シグネチャーは、8〜15の間の代謝物を含む。あるさらなる局面において、代謝物シグネチャーは、9〜14の間の代謝物を含む。あるさらなる局面において、代謝物シグネチャーは、10〜13の間の代謝物を含む。あるさらなる局面において、代謝物シグネチャーは、10〜12の間の代謝物を含む。
【０１７０】
一局面において、本明細書は、第一のタバコ系統由来の第一のタバコ植物の代謝物シグネチャーを決定する工程であって、第一のタバコ植物が代謝物シグネチャーを欠く対照タバコ植物と比べて増大したNUEを含む、工程と、第一の植物を第二のタバコ系統の第二の植物と交雑させる工程と、交雑体から少なくとも1つの子孫種子を得る工程であって、少なくとも1つの子孫種子から生育させた子孫植物が代謝物シグネチャーを含み、かつ、子孫植物が代謝物シグネチャーを欠く対照植物と比べて増大したNUEを含む、工程とを含む、増大したNUEに関連する代謝物シグネチャーを含むタバコ系統を育種する方法を提供し、かつ、それを含む。この方法のあるさらなる局面において、子孫植物を、第一のタバコ系統由来の第三の植物に交雑させる。別の局面において、第一のタバコ系統は、MD609、MD601、バンケット（Banket）A1、K326、K346、K358、K394、K399、K730、NC196、NC37NF、NC471、NC55、NC92、NC2326、NC95、NC925からなる群より選択される。別の局面において、第二のタバコ系統は、TN86、TN86LC、TN90、TN90LC、TN97、TN97LCからなる群より選択される。あるさらなる局面において、代謝物シグネチャーは、葉代謝物シグネチャーを含む。あるさらなる局面において、代謝物シグネチャーは、根代謝物シグネチャーを含む。別の局面において、代謝物シグネチャーは、対照タバコ植物の代謝物シグネチャーと比べてより多い量の4-グアニジノブタノアート、シリンガアルデヒド、チアミン、p-ヒドロキシベンズアルデヒド、X-23454、X-23580、X-23852、またはそれらの任意の組み合わせを含む。別の局面において、代謝物シグネチャーは、対照タバコ植物の代謝物シグネチャーと比べてより少ない量のX-2357、N-アセチルムラマート、X-23319、X-23852、X-23330、アルファ-ケトグルタラート、X-21756、4-ヒドロキシ-2-オキソグルタル酸、X-23937、X-23916、1-メチルアデニン、X-23453、X-11429、X-21796、N'-メチルニコチンアミド、コチニン、X-23389、N-アセチルアルギニン、N-23366、N-アセチルフェニルアラニン、ナリンゲニン、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【０１７１】
別の局面において、本明細書に提供される方法は、増大したNUEが、同じ条件で生育させた増大したNUEを欠くタバコ植物と比べて増加した部分要素生産性（PFP）を含む、増大したNUEを含むタバコ植物を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEは、同じ条件で生育させた増大したNUEを欠くタバコ植物と比べて増加した農学的効率（AE）を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEは、同じ条件で生育させた増大したNUEを欠くタバコ植物と比べて増加した回収効率（RE）を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEは、同じ条件で生育させた前記の増大したNUEを欠くタバコ植物と比べて増加した生理学的効率（PE）を含む。あるさらなる局面において、増大したNUEは、同じ条件で生育させた前記の増大したNUEを欠くタバコ植物と比べて増加した内部効率（IE）を含む。
【０１７２】
一局面において、本明細書は、タバコ植物の集団を得る工程、タバコ植物の集団由来の少なくとも1つのタバコ植物から増大したNUEに関連する少なくとも1つの代謝物を単離する工程、および、対照タバコ植物と比べてより多くの量の少なくとも1つの代謝物を含む少なくとも1つのタバコ植物を選択する工程を含む、タバコ植物を選択する方法を提供し、かつ、それを含む。この方法のあるさらなる局面において、選択されるタバコ植物は、対照タバコ植物と比べて増大したNUEを含む。この方法のあるさらなる局面において、少なくとも1つの代謝物は、4-グアニジノブタノアート、シリンガアルデヒド、チアミン、p-ヒドロキシベンズアルデヒド、X-23454、X-23580、X-23852、またはそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。この方法のあるさらなる局面において、代謝物は、根組織、葉組織、花組織、分裂組織および茎組織からなる群より選択される植物組織から単離される。
【０１７３】
一局面において、本明細書は、タバコ植物の集団を得る工程、タバコ植物の集団由来の少なくとも1つのタバコ植物から増大したNUEに関連する少なくとも1つの代謝物を単離する工程、および、対照タバコ植物と比べてより少ない量の少なくとも1つの代謝物を含む少なくとも1つのタバコ植物を選択する工程を含む、タバコ植物を選択する方法を提供し、かつ、それを含む。この方法のあるさらなる局面において、選択されるタバコ植物は、対照タバコ植物と比べて増大したNUEを含む。この方法のあるさらなる局面において、少なくとも1つの代謝物は、X-2357、N-アセチルムラマート、X-23319、X-23852、X-23330、アルファ-ケトグルタラート、X-21756、4-ヒドロキシ-2-オキソグルタル酸、X-23937、X-23916、1-メチルアデニン、X-23453、X-11429、X-21796、N'-メチルニコチンアミド、コチニン、X-23389、N-アセチルアルギニン、N-23366、N-アセチルフェニルアラニン、ナリンゲニン、またはそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。この方法のあるさらなる局面において、代謝物は、根組織、葉組織、花組織、分裂組織および茎組織からなる群より選択される植物組織から単離される。
【０１７４】
一局面において、本明細書は、タバコ植物から第一の代謝物シグネチャーを単離する工程、その第一の代謝物シグネチャーを含む少なくとも1つの代謝物の量を決定する工程、第一の代謝物シグネチャーを既知のNUEを含む対照タバコ植物の第二の代謝物シグネチャーと比較する工程、および第一の代謝物シグネチャーが増大したNUEに関連するかどうかを決定する工程を含む、増大したNUEに関連する第一の代謝物シグネチャーについてタバコ植物をスクリーニングする方法を提供し、かつ、それを含む。
【０１７５】
一局面において、本明細書は、コーディング領域に機能的に連結された異種プロモーターを含むシスジェニックポリヌクレオチドを含む改変されたタバコ種子またはそれから生育させたタバコ植物であって、改変されたタバコ植物が、同じ条件下で生育させたときのシスジェニックポリヌクレオチドを欠く改変されていない対照タバコ植物と比べて増大した窒素利用効率を含む、改変されたタバコ種子またはそれから生育させたタバコ植物を提供し、かつ、それを含む。あるさらなる局面において、改変されたタバコ種子またはタバコ植物は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、組織優先プロモーター、および組織特異的プロモーターからなる群より選択される異種プロモーターを含む。別の局面において、異種プロモーターは、タバコゲノム由来のポリヌクレオチド配列を含む。別の局面において、異種プロモーターは、植物ゲノム由来のポリヌクレオチド配列を含む。別の局面において、組織優先プロモーターは、葉優先プロモーターである。別の局面において、組織優先プロモーターは、根優先プロモーターである。あるさらなる局面において、改変されたタバコ種子またはタバコ植物は、バーレー品種のものである。
【０１７６】
あるさらなる局面において、本明細書の改変されたタバコ種子またはタバコ植物は、同じ条件下で生育させたときのシスジェニックポリヌクレオチドを欠く改変されていないタバコ植物と比べてより少ない量のTSNAを含む。あるさらなる局面において、改変されたタバコ種子またはタバコ植物は、同じ条件下で生育させたときのシスジェニックポリヌクレオチドを欠く改変されていないタバコ植物と比べてより少ない量のN'-ニトロソノルニコチン（NNN）を含む。あるさらなる局面において、改変されたタバコ種子またはタバコ植物は、同じ条件下で生育させたときのシスジェニックポリヌクレオチドを欠く改変されていないタバコ植物と比べてより少ない量の4-メチルニトロソアミノ-l-（3-ピリジル）-l-ブタノン（NNK）を含む。あるさらなる局面において、改変されたタバコ種子またはタバコ植物は、同じ条件下で生育させたときのシスジェニックポリヌクレオチドを欠く改変されていないタバコ植物と比べてより少ない量のN'-ニトロソアナタビン（NAT）を含む。あるさらなる局面において、改変されたタバコ種子またはタバコ植物は、同じ条件下で生育させたときのシスジェニックポリヌクレオチドを欠く改変されていないタバコ植物と比べてより少ない量のN'-ニトロソアナバシン（NAB）を含む。あるさらなる局面において、改変されたタバコ種子またはタバコ植物は、同じ条件下で生育させたときのシスジェニックポリヌクレオチドを欠く改変されていないタバコ植物と比べてより少ない量のアルカロイドを含む。あるさらなる局面において、改変されたタバコ種子またはタバコ植物は、同じ条件下で生育させたときのシスジェニックポリヌクレオチドを欠く改変されていないタバコ植物と比べてより少ない量のニコチンを含む。あるさらなる局面において、改変されたタバコ種子またはタバコ植物は、同じ条件下で生育させたときのシスジェニックポリヌクレオチドを欠く改変されていないタバコ植物と比べてより少ない量のノルニコチンを含む。あるさらなる局面において、改変されたタバコ種子またはタバコ植物は、同じ条件下で生育させたときのシスジェニックポリヌクレオチドを欠く改変されていないタバコ植物と比べてより少ない量のアナバシンを含む。あるさらなる局面において、改変されたタバコ種子またはタバコ植物は、同じ条件下で生育させたときのシスジェニックポリヌクレオチドを欠く改変されていないタバコ植物と比べてより少ない量のアナタビンを含む。
【０１７７】
あるさらなる局面において、本明細書の改変されたタバコ種子またはタバコ植物は、SEQ ID NO：1〜8からなる群より選択される配列と少なくとも70％同一または類似したポリペプチドをコードするコーディング領域を含む。あるさらなる局面において、改変されたタバコ種子またはタバコ植物は、SEQ ID NO：1〜8からなる群より選択される配列と少なくとも75％同一または類似したポリペプチドをコードするコーディング領域を含む。あるさらなる局面において、改変されたタバコ種子またはタバコ植物は、SEQ ID NO：1〜8からなる群より選択される配列と少なくとも80％同一または類似したポリペプチドをコードするコーディング領域を含む。あるさらなる局面において、改変されたタバコ種子またはタバコ植物は、SEQ ID NO：1〜8からなる群より選択される配列と少なくとも85％同一または類似したポリペプチドをコードするコーディング領域を含む。あるさらなる局面において、改変されたタバコ種子またはタバコ植物は、SEQ ID NO：1〜8からなる群より選択される配列と少なくとも90％同一または類似したポリペプチドをコードするコーディング領域を含む。あるさらなる局面において、改変されたタバコ種子またはタバコ植物は、SEQ ID NO：1〜8からなる群より選択される配列と少なくとも95％同一または類似したポリペプチドをコードするコーディング領域を含む。あるさらなる局面において、改変されたタバコ種子またはタバコ植物は、SEQ ID NO：1〜8からなる群より選択される配列と少なくとも96％同一または類似したポリペプチドをコードするコーディング領域を含む。あるさらなる局面において、改変されたタバコ種子またはタバコ植物は、SEQ ID NO：1〜8からなる群より選択される配列と少なくとも97％同一または類似したポリペプチドをコードするコーディング領域を含む。あるさらなる局面において、改変されたタバコ種子またはタバコ植物は、SEQ ID NO：1〜8からなる群より選択される配列と少なくとも98％同一または類似したポリペプチドをコードするコーディング領域を含む。あるさらなる局面において、改変されたタバコ種子またはタバコ植物は、SEQ ID NO：1〜8からなる群より選択される配列と少なくとも99％同一または類似したポリペプチドをコードするコーディング領域を含む。あるさらなる局面において、改変されたタバコ種子またはタバコ植物は、SEQ ID NO：1〜8からなる群より選択される配列と100％同一であるポリペプチドをコードするコーディング領域を含む。
【０１７８】
あるさらなる局面において、本明細書の改変されたタバコ種子またはタバコ植物は、SEQ ID NO：9〜16からなる群より選択される配列と少なくとも70％同一または類似したポリヌクレオチドをコードするコーディング領域を含む。あるさらなる局面において、改変されたタバコ種子またはタバコ植物は、SEQ ID NO：9〜16からなる群より選択される配列と少なくとも75％同一または類似したポリヌクレオチドをコードするコーディング領域を含む。あるさらなる局面において、改変されたタバコ種子またはタバコ植物は、SEQ ID NO：9〜16からなる群より選択される配列と少なくとも80％同一または類似したポリヌクレオチドをコードするコーディング領域を含む。あるさらなる局面において、改変されたタバコ種子またはタバコ植物は、SEQ ID NO：9〜16からなる群より選択される配列と少なくとも85％同一または類似したポリヌクレオチドをコードするコーディング領域を含む。あるさらなる局面において、改変されたタバコ種子またはタバコ植物は、SEQ ID NO：9〜16からなる群より選択される配列と少なくとも90％同一または類似したポリヌクレオチドをコードするコーディング領域を含む。あるさらなる局面において、改変されたタバコ種子またはタバコ植物は、SEQ ID NO：9〜16からなる群より選択される配列と少なくとも95％同一または類似したポリヌクレオチドをコードするコーディング領域を含む。あるさらなる局面において、改変されたタバコ種子またはタバコ植物は、SEQ ID NO：9〜16からなる群より選択される配列と少なくとも96％同一または類似したポリヌクレオチドをコードするコーディング領域を含む。あるさらなる局面において、改変されたタバコ種子またはタバコ植物は、SEQ ID NO：9〜16からなる群より選択される配列と少なくとも97％同一または類似したポリヌクレオチドをコードするコーディング領域を含む。あるさらなる局面において、改変されたタバコ種子またはタバコ植物は、SEQ ID NO：9〜16からなる群より選択される配列と少なくとも98％同一または類似したポリヌクレオチドをコードするコーディング領域を含む。あるさらなる局面において、改変されたタバコ種子またはタバコ植物は、SEQ ID NO：9〜16からなる群より選択される配列と少なくとも99％同一または類似したポリヌクレオチドをコードするコーディング領域を含む。あるさらなる局面において、改変されたタバコ種子またはタバコ植物は、SEQ ID NO：9〜16からなる群より選択される配列と同一であるポリヌクレオチドをコードするコーディング領域を含む。
【０１７９】
あるさらなる局面において、改変されたタバコ種子またはタバコ植物は、SEQ ID NO：17〜19からなる群より選択される配列またはその機能的断片と少なくとも70％同一である配列によってコードされる葉優先プロモーターを含む。あるさらなる局面において、葉優先プロモーターは、SEQ ID NO：17〜19からなる群より選択される配列またはその機能的断片と少なくとも75％同一である配列によってコードされる。あるさらなる局面において、葉優先プロモーターは、SEQ ID NO：17〜19からなる群より選択される配列またはその機能的断片と少なくとも80％同一である配列によってコードされる。あるさらなる局面において、葉優先プロモーターは、SEQ ID NO：17〜19からなる群より選択される配列またはその機能的断片と少なくとも85％同一である配列によってコードされる。あるさらなる局面において、葉優先プロモーターは、SEQ ID NO：17〜19からなる群より選択される配列またはその機能的断片と少なくとも90％同一である配列によってコードされる。あるさらなる局面において、葉優先プロモーターは、SEQ ID NO：17〜19からなる群より選択される配列またはその機能的断片と少なくとも95％同一である配列によってコードされる。あるさらなる局面において、葉優先プロモーターは、SEQ ID NO：17〜19からなる群より選択される配列またはその機能的断片と少なくとも96％同一である配列によってコードされる。あるさらなる局面において、葉優先プロモーターは、SEQ ID NO：17〜19からなる群より選択される配列またはその機能的断片と少なくとも97％同一である配列によってコードされる。あるさらなる局面において、葉優先プロモーターは、SEQ ID NO：17〜19からなる群より選択される配列またはその機能的断片と少なくとも98％同一である配列によってコードされる。あるさらなる局面において、葉優先プロモーターは、SEQ ID NO：17〜19からなる群より選択される配列またはその機能的断片と少なくとも99％同一である配列によってコードされる。あるさらなる局面において、葉優先プロモーターは、SEQ ID NO：17〜19からなる群より選択される配列またはその機能的断片によってコードされる。
【０１８０】
あるさらなる局面において、改変されたタバコ種子またはタバコ植物は、SEQ ID NO：20〜24からなる群より選択される配列またはその機能的断片と少なくとも70％同一である配列によってコードされる根優先プロモーターを含む。あるさらなる局面において、葉優先プロモーターは、SEQ ID NO：20〜24からなる群より選択される配列またはその機能的断片と少なくとも75％同一である配列によってコードされる。あるさらなる局面において、葉優先プロモーターは、SEQ ID NO：20〜24からなる群より選択される配列またはその機能的断片と少なくとも80％同一である配列によってコードされる。あるさらなる局面において、葉優先プロモーターは、SEQ ID NO：20〜24からなる群より選択される配列またはその機能的断片と少なくとも85％同一である配列によってコードされる。あるさらなる局面において、葉優先プロモーターは、SEQ ID NO：20〜24からなる群より選択される配列またはその機能的断片と少なくとも90％同一である配列によってコードされる。あるさらなる局面において、葉優先プロモーターは、SEQ ID NO：20〜24からなる群より選択される配列またはその機能的断片と少なくとも95％同一である配列によってコードされる。あるさらなる局面において、葉優先プロモーターは、SEQ ID NO：20〜24からなる群より選択される配列またはその機能的断片と少なくとも96％同一である配列によってコードされる。あるさらなる局面において、葉優先プロモーターは、SEQ ID NO：20〜24からなる群より選択される配列またはその機能的断片と少なくとも97％同一である配列によってコードされる。あるさらなる局面において、葉優先プロモーターは、SEQ ID NO：20〜24からなる群より選択される配列またはその機能的断片と少なくとも98％同一である配列によってコードされる。あるさらなる局面において、葉優先プロモーターは、SEQ ID NO：20〜24からなる群より選択される配列またはその機能的断片と少なくとも99％同一である配列によってコードされる。あるさらなる局面において、葉優先プロモーターは、SEQ ID NO：20〜24からなる群より選択される配列またはその機能的断片によってコードされる。
【０１８１】
あるさらなる局面において、シスジェニックポリヌクレオチドを含む本明細書の改変されたタバコ植物は、同じ条件下で生育させたときのシスジェニックポリヌクレオチドを欠く改変されていないタバコ植物と比べてより高いレベルの4-グアニジノブタノアート、シリンガアルデヒド、チアミンおよびp-ヒドロキシベンズアルデヒドからなる群より選択される代謝物を根組織に含む。
【０１８２】
あるさらなる局面において、シスジェニックポリヌクレオチドを含む本明細書の改変されたタバコ植物は、同じ条件下で生育させたときのシスジェニックポリヌクレオチドを欠く改変されていないタバコ植物と比べてより高いレベルの4-グアニジノブタノアート、X-23454、X-23580およびX-23852からなる群より選択される代謝物を葉組織に含む。
【０１８３】
あるさらなる局面において、シスジェニックポリヌクレオチドを含む本明細書の改変されたタバコ植物は、同じ条件下で生育させたときのシスジェニックポリヌクレオチドを欠く改変されていないタバコ植物と比べてより低いレベルのX-2357、N-アセチルムラマート、X-23319、X-23852、X-23330、アルファ-ケトグルタラート、X-21756、4-ヒドロキシ-2-オキソグルタル酸、X-23937、X-23916および1-メチルアデニンからなる群より選択される代謝物を根組織に含む。
【０１８４】
あるさらなる局面において、シスジェニックポリヌクレオチドを含む本明細書の改変されたタバコ植物は、同じ条件下で生育させたときのシスジェニックポリヌクレオチドを欠く改変されていないタバコ植物と比べてより低いレベルのX-23453、X-21756、X-11429、X-21796、N'-メチルニコチンアミド、コチニン、X-23389、N-アセチルアルギニン、N-23366、N-アセチルフェニルアラニンおよびナリンゲニンからなる群より選択される代謝物を葉組織に含む。
【０１８５】
一局面において、本明細書は、SEQ ID NO：1〜8からなる群より選択されるポリペプチドと少なくとも70％同一または類似したポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結された異種プロモーターを含む組換えDNA構築物を提供し、かつ、それを含む。あるさらなる局面において、組換えDNA構築物は、SEQ ID NO：1〜8からなる群より選択されるポリペプチドと少なくとも75％同一または類似したポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。あるさらなる局面において、組換えDNA構築物は、SEQ ID NO：1〜8からなる群より選択されるポリペプチドと少なくとも80％同一または類似したポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。あるさらなる局面において、組換えDNA構築物は、SEQ ID NO：1〜8からなる群より選択されるポリペプチドと少なくとも85％同一または類似したポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。あるさらなる局面において、組換えDNA構築物は、SEQ ID NO：1〜8からなる群より選択されるポリペプチドと少なくとも90％同一または類似したポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。あるさらなる局面において、組換えDNA構築物は、SEQ ID NO：1〜8からなる群より選択されるポリペプチドと少なくとも95％同一または類似したポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。あるさらなる局面において、組換えDNA構築物は、SEQ ID NO：1〜8からなる群より選択されるポリペプチドと少なくとも96％同一または類似したポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。あるさらなる局面において、組換えDNA構築物は、SEQ ID NO：1〜8からなる群より選択されるポリペプチドと少なくとも97％同一または類似したポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。あるさらなる局面において、組換えDNA構築物は、SEQ ID NO：1〜8からなる群より選択されるポリペプチドと少なくとも98％同一または類似したポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。あるさらなる局面において、組換えDNA構築物は、SEQ ID NO：1〜8からなる群より選択されるポリペプチドと少なくとも99％同一または類似したポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。あるさらなる局面において、組換えDNA構築物は、SEQ ID NO：1〜8からなる群より選択されるポリペプチドと100％同一であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
【０１８６】
一局面において、本明細書は、コーディング領域に機能的に連結された異種プロモーターを含むシスジェニックポリヌクレオチドを含むタバコ植物から製造される、乾燥タバコ材料または乾燥タバコ材料を含むタバコ製品であって、改変されたタバコ植物が、同じ条件下で生育させたときのシスジェニックポリヌクレオチドを欠く改変されていない対照タバコ植物と比べて増大した窒素利用効率を含む、乾燥タバコ材料または乾燥タバコ材料を含むタバコ製品を提供し、かつ、それを含む。
【０１８７】
一局面において、本明細書は、本明細書に開示される改変されたタバコ種子または植物を含む温室、生育箱または圃場を提供し、かつ、それを含む。一局面において、本明細書は、本明細書のタバコ植物を温室、生育箱または圃場で生育させる方法を提供し、かつ、それを含む。
【０１８８】
一局面において、本明細書は、SEQ ID NO：25〜40からなる群より選択されるポリペプチドをコードする少なくとも1つの変異を内在性遺伝子座に含む、改変されたタバコ種子またはそれから生育させたタバコ植物であって、同じ条件下で生育させたときの少なくとも1つの変異を欠く改変されていない対照タバコ植物と比べて増大した窒素利用効率を含む、改変されたタバコ種子またはタバコ植物を提供し、かつ、それを含む。あるさらなる局面において、内在性遺伝子座内の変異は、挿入、欠失、置換および逆位からなる群より選択される。別の局面において、内在性遺伝子座内の変異は、サイレント変異、非サイレント変異またはヌル変異である。あるさらなる局面において、改変されたタバコ種子または改変されたタバコ植物は、バーレー品種のものである。
【０１８９】
あるさらなる局面において、改変されたタバコ植物は、同じ条件下で生育させたときの改変されていないタバコ植物と比べてより高いレベルの4-グアニジノブタノアート、シリンガアルデヒド、チアミンおよびp-ヒドロキシベンズアルデヒドからなる群より選択される代謝物を根組織に含む。あるさらなる局面において、改変されたタバコ植物は、同じ条件下で生育させたときの改変されていないタバコ植物と比べてより高いレベルの4-グアニジノブタノアート、X-23454、X-23580およびX-23852からなる群より選択される代謝物を葉組織に含む。あるさらなる局面において、改変されたタバコ植物は、同じ条件下で生育させたときの改変されていないタバコ植物と比べてより低いレベルのX-2357、N-アセチルムラマート、X-23319、X-23852、X-23330、アルファ-ケトグルタラート、X-21756、4-ヒドロキシ-2-オキソグルタル酸、X-23937、X-23916および1-メチルアデニンからなる群より選択される代謝物を根組織に含む。あるさらなる局面において、改変されたタバコ植物は、同じ条件下で生育させたときの改変されていないタバコ植物と比べてより低いレベルのX-23453、X-21756、X-11429、X-21796、N'-メチルニコチンアミド、コチニン、X-23389、N-アセチルアルギニン、N-23366、N-アセチルフェニルアラニンおよびナリンゲニンからなる群より選択される代謝物を葉組織に含む。
【０１９０】
一局面において、本明細書は、SEQ ID NO：25〜40からなる群より選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと同一または相補的である少なくとも18の連続したヌクレオチドを含むガイドRNAに機能的に連結された異種プロモーターを含む組換えDNA構築物を提供し、かつ、それを含む。あるさらなる局面において、ガイドRNAは、SEQ ID NO：25〜40からなる群より選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと同一または相補的である少なくとも19の連続したヌクレオチドを含む。あるさらなる局面において、ガイドRNAは、SEQ ID NO：25〜40からなる群より選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと同一または相補的である少なくとも20の連続したヌクレオチドを含む。あるさらなる局面において、ガイドRNAは、SEQ ID NO：25〜40からなる群より選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと同一または相補的である少なくとも21の連続したヌクレオチドを含む。あるさらなる局面において、ガイドRNAは、SEQ ID NO：25〜40からなる群より選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと同一または相補的である少なくとも22の連続したヌクレオチドを含む。あるさらなる局面において、ガイドRNAは、SEQ ID NO：25〜40からなる群より選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと同一または相補的である少なくとも23の連続したヌクレオチドを含む。あるさらなる局面において、ガイドRNAは、SEQ ID NO：25〜40からなる群より選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと同一または相補的である少なくとも24の連続したヌクレオチドを含む。あるさらなる局面において、ガイドRNAは、SEQ ID NO：25〜40からなる群より選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと同一または相補的である少なくとも25の連続したヌクレオチドを含む。あるさらなる局面において、ガイドRNAは、SEQ ID NO：25〜40からなる群より選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと同一または相補的である少なくとも26の連続したヌクレオチドを含む。あるさらなる局面において、ガイドRNAは、SEQ ID NO：25〜40からなる群より選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと同一または相補的である少なくとも27の連続したヌクレオチドを含む。あるさらなる局面において、ガイドRNAは、SEQ ID NO：25〜40からなる群より選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと100％同一または相補的である少なくとも28の連続したヌクレオチドを含む。
【０１９１】
一局面において、本明細書は、SEQ ID NO：25〜40からなる群より選択されるポリペプチドをコードする少なくとも1つの変異を内在性遺伝子座に含むタバコ植物から製造される、乾燥タバコ材料または乾燥タバコ材料を含むタバコ製品であって、改変されたタバコ種子またはタバコ植物が、同じ条件下で生育させたときの少なくとも1つの変異を欠く改変されていない対照タバコ植物と比べて増大したNUEを含む、乾燥タバコ材料または乾燥タバコ材料を含むタバコ製品を提供し、かつ、それを含む。あるさらなる局面において、タバコ植物は、SEQ ID NO：25〜40からなる群より選択されるポリペプチドをコードする少なくとも2つの変異を内在性遺伝子座に含む。あるさらなる局面において、タバコ植物は、SEQ ID NO：25〜40からなる群より選択されるポリペプチドをコードする少なくとも3つの変異を内在性遺伝子座に含む。あるさらなる局面において、タバコ植物は、SEQ ID NO：25〜40からなる群より選択されるポリペプチドをコードする少なくとも4つの変異を内在性遺伝子座に含む。あるさらなる局面において、タバコ植物は、SEQ ID NO：25〜40からなる群より選択されるポリペプチドをコードする少なくとも5つの変異を内在性遺伝子座に含む。あるさらなる局面において、タバコ植物は、SEQ ID NO：25〜40からなる群より選択されるポリペプチドをコードする少なくとも6つの変異を内在性遺伝子座に含む。あるさらなる局面において、タバコ植物は、SEQ ID NO：25〜40からなる群より選択されるポリペプチドをコードする少なくとも7つの変異を内在性遺伝子座に含む。あるさらなる局面において、タバコ植物は、SEQ ID NO：25〜40からなる群より選択されるポリペプチドをコードする少なくとも8つの変異を内在性遺伝子座に含む。あるさらなる局面において、タバコ植物は、SEQ ID NO：25〜40からなる群より選択されるポリペプチドをコードする少なくとも9つの変異を内在性遺伝子座に含む。あるさらなる局面において、タバコ植物は、SEQ ID NO：25〜40からなる群より選択されるポリペプチドをコードする少なくとも10の変異を内在性遺伝子座に含む。
【０１９２】
一局面において、本明細書は、SEQ ID NO：41〜56からなる群より選択されるポリヌクレオチドと少なくとも85％同一または相補的である低分子RNA（sRNA）をコードするポリヌクレオチドに機能的に連結された異種プロモーターを含むシスジェニックポリヌクレオチドを含む、改変されたタバコ種子またはそれから生育させたタバコ植物であって、同じ条件下で生育させたときのシスジェニックポリヌクレオチドを欠く改変されていない対照タバコ植物と比べて増大したNUEを含む、改変されたタバコ種子またはタバコ植物を提供し、かつ、それを含む。あるさらなる局面において、シスジェニックポリヌクレオチドは、SEQ ID NO：41〜56からなる群より選択されるポリヌクレオチドと少なくとも90％同一または相補的であるsRNAをコードするポリヌクレオチドを含む。あるさらなる局面において、シスジェニックポリヌクレオチドは、SEQ ID NO：41〜56からなる群より選択されるポリヌクレオチドと少なくとも91％同一または相補的であるsRNAをコードするポリヌクレオチドを含む。あるさらなる局面において、シスジェニックポリヌクレオチドは、SEQ ID NO：41〜56からなる群より選択されるポリヌクレオチドと少なくとも92％同一または相補的であるsRNAをコードするポリヌクレオチドを含む。あるさらなる局面において、シスジェニックポリヌクレオチドは、SEQ ID NO：41〜56からなる群より選択されるポリヌクレオチドと少なくとも93％同一または相補的であるsRNAをコードするポリヌクレオチドを含む。あるさらなる局面において、シスジェニックポリヌクレオチドは、SEQ ID NO：41〜56からなる群より選択されるポリヌクレオチドと少なくとも94％同一または相補的であるsRNAをコードするポリヌクレオチドを含む。あるさらなる局面において、シスジェニックポリヌクレオチドは、SEQ ID NO：41〜56からなる群より選択されるポリヌクレオチドと少なくとも95％同一または相補的であるsRNAをコードするポリヌクレオチドを含む。あるさらなる局面において、シスジェニックポリヌクレオチドは、SEQ ID NO：41〜56からなる群より選択されるポリヌクレオチドと少なくとも96％同一または相補的であるsRNAをコードするポリヌクレオチドを含む。あるさらなる局面において、シスジェニックポリヌクレオチドは、SEQ ID NO：41〜56からなる群より選択されるポリヌクレオチドと少なくとも97％同一または相補的であるsRNAをコードするポリヌクレオチドを含む。あるさらなる局面において、シスジェニックポリヌクレオチドは、SEQ ID NO：41〜56からなる群より選択されるポリヌクレオチドと少なくとも98％同一または相補的であるsRNAをコードするポリヌクレオチドを含む。あるさらなる局面において、シスジェニックポリヌクレオチドは、SEQ ID NO：41〜56からなる群より選択されるポリヌクレオチドと少なくとも99％同一または相補的であるsRNAをコードするポリヌクレオチドを含む。あるさらなる局面において、シスジェニックポリヌクレオチドは、SEQ ID NO：41〜56からなる群より選択されるポリヌクレオチドと100％同一または相補的であるsRNAをコードするポリヌクレオチドを含む。あるさらなる局面において、異種プロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、組織優先プロモーター、および組織特異的プロモーターからなる群より選択される。あるさらなる��面において、組織優先プロモーターは、葉優先プロモーターである。あるさらなる局面において、組織優先プロモーターは、根優先プロモーターである。
【０１９３】
あるさらなる局面において、sRNAは、少なくとも18ヌクレオチドを有する。あるさらなる局面において、sRNAは、少なくとも19ヌクレオチドを含む。あるさらなる局面において、sRNAは、少なくとも20ヌクレオチドを含む。あるさらなる局面において、sRNAは、少なくとも21ヌクレオチドを含む。あるさらなる局面において、sRNAは、少なくとも22ヌクレオチドを含む。あるさらなる局面において、sRNAは、少なくとも23ヌクレオチドを含む。あるさらなる局面において、sRNAは、少なくとも24ヌクレオチドを含む。あるさらなる局面において、sRNAは、少なくとも25ヌクレオチドを含む。あるさらなる局面において、sRNAは、少なくとも26ヌクレオチドを含む。あるさらなる局面において、sRNAは、少なくとも27ヌクレオチドを含む。あるさらなる局面において、sRNAは、少なくとも28ヌクレオチドを含む。あるさらなる局面において、sRNAは、マイクロRNA、低分子干渉RNA（siRNA）、トランス作用siRNAおよびそれらの前駆体からなる群より選択される。あるさらなる局面において、sRNAは、SEQ ID NO：41〜56からなる群より選択されるポリヌクレオチドの発現または翻訳をダウンレギュレーションする。
【０１９４】
一局面において、本明細書は、SEQ ID NO：41〜56からなる群より選択されるポリヌクレオチドと少なくとも85％同一または相補的である低分子RNA（sRNA）をコードするポリヌクレオチドに機能的に連結された異種プロモーターを含む組換えDNA構築物を提供し、かつ、それを含む。あるさらなる局面において、組換えDNA構築物は、SEQ ID NO：41〜56からなる群より選択されるポリヌクレオチドと少なくとも90％同一または相補的であるsRNAをコードするポリヌクレオチドを含む。あるさらなる局面において、組換えDNA構築物は、SEQ ID NO：41〜56からなる群より選択されるポリヌクレオチドと少なくとも91％同一または相補的であるsRNAをコードするポリヌクレオチドを含む。あるさらなる局面において、組換えDNA構築物は、SEQ ID NO：41〜56からなる群より選択されるポリヌクレオチドと少なくとも92％同一または相補的であるsRNAをコードするポリヌクレオチドを含む。あるさらなる局面において、組換えDNA構築物は、SEQ ID NO：41〜56からなる群より選択されるポリヌクレオチドと少なくとも93％同一または相補的であるsRNAをコードするポリヌクレオチドを含む。あるさらなる局面において、組換えDNA構築物は、SEQ ID NO：41〜56からなる群より選択されるポリヌクレオチドと少なくとも94％同一または相補的であるsRNAをコードするポリヌクレオチドを含む。あるさらなる局面において、組換えDNA構築物は、SEQ ID NO：41〜56からなる群より選択されるポリヌクレオチドと少なくとも95％同一または相補的であるsRNAをコードするポリヌクレオチドを含む。あるさらなる局面において、組換えDNA構築物は、SEQ ID NO：41〜56からなる群より選択されるポリヌクレオチドと少なくとも96％同一または相補的であるsRNAをコードするポリヌクレオチドを含む。あるさらなる局面において、組換えDNA構築物は、SEQ ID NO：41〜56からなる群より選択されるポリヌクレオチドと少なくとも97％同一または相補的であるsRNAをコードするポリヌクレオチドを含む。あるさらなる局面において、組換えDNA構築物は、SEQ ID NO：41〜56からなる群より選択されるポリヌクレオチドと少なくとも98％同一または相補的であるsRNAをコードするポリヌクレオチドを含む。あるさらなる局面において、組換えDNA構築物は、SEQ ID NO：41〜56からなる群より選択されるポリヌクレオチドと少なくとも99％同一または相補的であるsRNAをコードするポリヌクレオチドを含む。あるさらなる局面において、組換えDNA構築物は、SEQ ID NO：41〜56からなる群より選択されるポリヌクレオチドと100％同一または相補的であるsRNAをコードするポリヌクレオチドを含む。
【０１９５】
一局面において、本明細書は、SEQ ID NO：41〜56からなる群より選択されるポリヌクレオチドと少なくとも85％同一または相補的であるsRNAをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結された異種プロモーターを含むシスジェニックポリヌクレオチドを含むタバコ植物から製造される、乾燥タバコ材料または乾燥タバコ材料を含むタバコ製品であって、改変されたタバコ種子またはタバコ植物が、同じ条件下で生育させたときのシスジェニックポリヌクレオチドを欠く改変されていない対照タバコ植物と比べて増大したNUEを含む、乾燥タバコ材料または乾燥タバコ材料を含むタバコ製品を提供し、かつ、それを含む。あるさらなる局面において、シスジェニックポリヌクレオチドは、SEQ ID NO：41〜56からなる群より選択されるポリヌクレオチドと少なくとも90％同一または相補的であるsRNAをコードする。あるさらなる局面において、シスジェニックポリヌクレオチドは、SEQ ID NO：41〜56からなる群より選択されるポリヌクレオチドと少なくとも91％同一または相補的であるsRNAをコードする。あるさらなる局面において、シスジェニックポリヌクレオチドは、SEQ ID NO：41〜56からなる群より選択されるポリヌクレオチドと少なくとも92％同一または相補的であるsRNAをコードする。あるさらなる局面において、シスジェニックポリヌクレオチドは、SEQ ID NO：41〜56からなる群より選択されるポリヌクレオチドと少なくとも93％同一または相補的であるsRNAをコードする。あるさらなる局面において、シスジェニックポリヌクレオチドは、SEQ ID NO：41〜56からなる群より選択されるポリヌクレオチドと少なくとも94％同一または相補的であるsRNAをコードする。あるさらなる局面において、シスジェニックポリヌクレオチドは、SEQ ID NO：41〜56からなる群より選択されるポリヌクレオチドと少なくとも95％同一または相補的であるsRNAをコードする。あるさらなる局面において、シスジェニックポリヌクレオチドは、SEQ ID NO：41〜56からなる群より選択されるポリヌクレオチドと少なくとも96％同一または相補的であるsRNAをコードする。あるさらなる局面において、シスジェニックポリヌクレオチドは、SEQ ID NO：41〜56からなる群より選択されるポリヌクレオチドと少なくとも97％同一または相補的であるsRNAをコードする。あるさらなる局面において、シスジェニックポリヌクレオチドは、SEQ ID NO：41〜56からなる群より選択されるポリヌクレオチドと少なくとも98％同一または相補的であるsRNAをコードする。あるさらなる局面において、シスジェニックポリヌクレオチドは、SEQ ID NO：41〜56からなる群より選択されるポリヌクレオチドと少なくとも99％同一または相補的であるsRNAをコードする。あるさらなる局面において、シスジェニックポリヌクレオチドは、SEQ ID NO：41〜56からなる群より選択されるポリヌクレオチドと100％同一または相補的であるsRNAをコードする。
【０１９６】
一局面において、本明細書は、シスジェニック核酸分子をタバコ細胞に導入する工程と、そのタバコ細胞から改変タバコ植物を再生させる工程であって、改変タバコ植物が、シスジェニック核酸分子を欠くタバコ植物と比べて増大したNUEを含む、工程とを含む、タバコ植物のNUEを増大させる方法を提供し、かつ、それを含む。別の局面において、該方法はさらに、改変タバコ植物を第二のタバコ植物と交雑させる工程または改変タバコ植物を自家受粉させる工程を含む。
【０１９７】
一局面において、本明細書は、SEQ ID NO：41〜56からなる群より選択される配列を有する遺伝子をコードする核酸分子に対する改変をタバコ細胞に導入する工程と、タバコ細胞から改変タバコ植物を再生させる工程であって、改変タバコ植物が、その改変を欠くタバコ植物と比べて増大したNUEを含む、工程とを含む、タバコ植物のNUEを増大させる方法を提供し、かつ、それを含む。別の局面において、該方法はさらに、改変タバコ植物を第二のタバコ植物と交雑させる工程または改変タバコ植物を自家受粉させる工程を含む。あるさらなる局面において、改変は、RNAガイドヌクレアーゼの使用を含む方法を介して導入される。あるさらなる局面において、RNAガイドヌクレアーゼは、Cas9ヌクレアーゼ、Cpf1ヌクレアーゼ、CasXヌクレアーゼ、CasYヌクレアーゼ、およびそれらの機能的ホモログからなる群より選択される。あるさらなる局面において、改変は、挿入、置換、逆位および欠失からなる群より選択される。
【０１９８】
一局面において、本明細書は、SEQ ID NO：41〜56からなる群より選択される配列を有する遺伝子をコードする核酸分子の少なくとも18の連続した核酸に相同な低分子RNA（sRNA）をコードする核酸をタバコ細胞に導入する工程と、そのタバコ細胞から改変タバコ植物を再生させる工程であって、改変タバコ植物が、そのsRNAを欠くタバコ植物と比べて増大したNUEを含む、工程とを含む、タバコ植物のNUEを増大させる方法を提供し、かつ、それを含む。別の局面において、該方法はさらに、改変タバコ植物を第二のタバコ植物と交雑させる工程または改変タバコ植物を自家受粉させる工程を含む。あるさらなる局面において、該方法は、マイクロRNA、低分子干渉RNA（siRNA）、トランス作用siRNAおよびそれらの前駆体からなる群より選択されるsRNAを導入する工程を含む。
【０１９９】
一局面において、本明細書は、増大したNUEを含むタバコ植物の第一の集団を提供する工程、増大したNUE遺伝子座の20cM内の分子マーカーの存在についてタバコ植物の第一の集団をジェノタイピングする工程;およびジェノタイピングされてその分子マーカーを含むことが判明した1つまたは複数のタバコ植物を選択する工程を含む、方法を提供し、かつ、それを含む。あるさらなる局面において、本明細書に開示される方法は、増大したNUE遺伝子座の15cM内の分子マーカーの存在についてタバコ植物の第一の集団をジェノタイピングする工程を含む。あるさらなる局面において、本明細書に開示される方法は、増大したNUE遺伝子座の10cM内の分子マーカーの存在についてタバコ植物の第一の集団をジェノタイピングする工程を含む。あるさらなる局面において、本明細書に開示される方法は、増大したNUE遺伝子座の9cM内の分子マーカーの存在についてタバコ植物の第一の集団をジェノタイピングする工程を含む。あるさらなる局面において、本明細書に開示される方法は、増大したNUE遺伝子座の8cM内の分子マーカーの存在についてタバコ植物の第一の集団をジェノタイピングする工程を含む。あるさらなる局面において、本明細書に開示される方法は、増大したNUE遺伝子座の7cM内の分子マーカーの存在についてタバコ植物の第一の集団をジェノタイピングする工程を含む。あるさらなる局面において、本明細書に開示される方法は、増大したNUE遺伝子座の6cM内の分子マーカーの存在についてタバコ植物の第一の集団をジェノタイピングする工程を含む。あるさらなる局面において、本明細書に開示される方法は、増大したNUE遺伝子座の5cM内の分子マーカーの存在についてタバコ植物の第一の集団をジェノタイピングする工程を含む。あるさらなる局面において、本明細書に開示される方法は、増大したNUE遺伝子座の4cM内の分子マーカーの存在についてタバコ植物の第一の集団をジェノタイピングする工程を含む。あるさらなる局面において、本明細書に開示される方法は、増大したNUE遺伝子座の3cM内の分子マーカーの存在についてタバコ植物の第一の集団をジェノタイピングする工程を含む。あるさらなる局面において、本明細書に開示される方法は、増大したNUE遺伝子座の2cM内の分子マーカーの存在についてタバコ植物の第一の集団をジェノタイピングする工程を含む。あるさらなる局面において、本明細書に開示される方法は、増大したNUE遺伝子座の1cM内の分子マーカーの存在についてタバコ植物の第一の集団をジェノタイピングする工程を含む。あるさらなる局面において、本明細書に開示される方法は、増大したNUE遺伝子座の0.5cM内の分子マーカーの存在についてタバコ植物の第一の集団をジェノタイピングする工程を含む。あるさらなる局面において、該方法は、1つまたは複数の選択されたタバコ植物を第二のタバコ植物に交雑させる工程；およびその交雑体から子孫種子を得る工程を含む。あるさらなる局面において、分子マーカーは、SNPマーカー、INDELマーカー、RFLPマーカー、SSRマーカー、AFLPマーカーおよびRAPDマーカーからなる群より選択される。
【０２００】
あるさらなる局面において、本明細書に提供される方法は、SEQ ID NO：1〜8からなる群より選択されるポリペプチドと少なくとも70％同一または類似したポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む増大したNUE遺伝子座を含むタバコ植物を含む。あるさらなる局面において、ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO：1〜8からなる群より選択されるポリペプチドと少なくとも75％同一または類似したポリペプチドをコードする。あるさらなる局面において、ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO：1〜8からなる群より選択されるポリペプチドと少なくとも80％同一または類似したポリペプチドをコードする。あるさらなる局面において、ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO：1〜8からなる群より選択されるポリペプチドと少なくとも85％同一または類似したポリペプチドをコードする。あるさらなる局面において、ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO：1〜8からなる群より選択されるポリペプチドと少なくとも90％同一または類似したポリペプチドをコードする。あるさらなる局面において、ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO：1〜8からなる群より選択されるポリペプチドと少なくとも95％同一または類似したポリペプチドをコードする。あるさらなる局面において、ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO：1〜8からなる群より選択されるポリペプチドと少なくとも96％同一または類似したポリペプチドをコードする。あるさらなる局面において、ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO：1〜8からなる群より選択されるポリペプチドと少なくとも97％同一または類似したポリペプチドをコードする。あるさらなる局面において、ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO：1〜8からなる群より選択されるポリペプチドと少なくとも98％同一または類似したポリペプチドをコードする。あるさらなる局面において、ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO：1〜8からなる群より選択されるポリペプチドと少なくとも99％同一または類似したポリペプチドをコードする。あるさらなる局面において、ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO：1〜8からなる群より選択されるポリペプチドと100％同一であるポリペプチドをコードする。あるさらなる局面において、増大したNUE遺伝子座は、SEQ ID NO：57〜64からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列に遺伝的に関係している。別の局面において、増大したNUE遺伝子座は、SEQ ID NO：58の57位にあるGヌクレオチドに遺伝的に関係している。別の局面において、増大したNUE遺伝子座は、SEQ ID NO：58の117位にあるCヌクレオチドに遺伝的に関係している。別の局面において、増大したNUE遺伝子座は、SEQ ID NO：58の57位にあるGヌクレオチドおよび117位にあるCヌクレオチドに遺伝的に関係している。別の局面において、増大したNUE遺伝子座は、SEQ ID NO：57の147位にあるTヌクレオチドに遺伝的に関係している。別の局面において、増大したNUE遺伝子座は、SEQ ID NO：59の162位にあるGヌクレオチドに遺伝的に関係している。別の局面において、増大したNUE遺伝子座は、SEQ ID NO：60の36位にあるCヌクレオチドに遺伝的に関係している。別の局面において、増大したNUE遺伝子座は、SEQ ID NO：61の36位にあるTヌクレオチドに遺伝的に関係している。別の局面において、増大したNUE遺伝子座は、SEQ ID NO：62の36位にあるTヌクレオチドに遺伝的に関係している。別の局面において、増大したNUE遺伝子座は、SEQ ID NO：63の36位にあ��Gヌクレオチドに遺伝的に関係している。別の局面において、増大したNUE遺伝子座は、SEQ ID NO：64の36位にあるTヌクレオチドに遺伝的に関係している。
【０２０１】
本明細書に提供される方法のあるさらなる局面において、タバコ植物の第一の集団は、メリーランド品種のものである。あるさらなる局面において、本明細書に提供される方法は、MD609、MD601、バンケットA1、K326、K346、K358、K394、K399、K730、NC196、NC37NF、NC471、NC55、NC92、NC2326、NC95、NC925からなる群より選択される品種のタバコ植物の第一の集団を含む。あるさらなる局面において、本明細書に提供される方法は、バーレー品種のタバコ植物の第二の集団を含む。あるさらなる局面において、本明細書に提供される方法は、TN86、TN86LC、TN90、TN90LC、TN97、TN97LCからなる群より選択される品種のタバコ植物の第二の集団を含む。
【０２０２】
あるさらなる局面において、本明細書に提供される方法は、分子マーカーを含む子孫種子を含む。あるさらなる局面において、本明細書に提供される方法は、増大したNUEを含む子孫種子を含む。あるさらなる局面において、本明細書に提供される方法は、本明細書に提供される増大したNUE効率遺伝子座の20cM内に分子マーカーを含む子孫種子を含む。あるさらなる局面において、本明細書に提供される方法は、本明細書に提供される増大したNUE効率遺伝子座の15cM内に分子マーカーを含む子孫種子を含む。あるさらなる局面において、本明細書に提供される方法は、本明細書に提供される増大したNUE効率遺伝子座の10cM内に分子マーカーを含む子孫種子を含む。あるさらなる局面において、本明細書に提供される方法は、本明細書に提供される増大したNUE効率遺伝子座の9cM内に分子マーカーを含む子孫種子を含む。あるさらなる局面において、本明細書に提供される方法は、本明細書に提供される増大したNUE効率遺伝子座の8cM内に分子マーカーを含む子孫種子を含む。あるさらなる局面において、本明細書に提供される方法は、本明細書に提供される増大したNUE効率遺伝子座の7cM内に分子マーカーを含む子孫種子を含む。あるさらなる局面において、本明細書に提供される方法は、本明細書に提供される増大したNUE効率遺伝子座の6cM内に分子マーカーを含む子孫種子を含む。あるさらなる局面において、本明細書に提供される方法は、本明細書に提供される増大したNUE効率遺伝子座の5cM内に分子マーカーを含む子孫種子を含む。あるさらなる局面において、本明細書に提供される方法は、本明細書に提供される増大したNUE効率遺伝子座の4cM内に分子マーカーを含む子孫種子を含む。あるさらなる局面において、本明細書に提供される方法は、本明細書に提供される増大したNUE効率遺伝子座の3cM内に分子マーカーを含む子孫種子を含む。あるさらなる局面において、本明細書に提供される方法は、本明細書に提供される増大したNUE効率遺伝子座の2cM内に分子マーカーを含む子孫種子を含む。あるさらなる局面において、本明細書に提供される方法は、本明細書に提供される増大したNUE効率遺伝子座の1cM内に分子マーカーを含む子孫種子を含む。あるさらなる局面において、本明細書に提供される方法は、本明細書に提供される増大したNUE効率遺伝子座の0.5cM内に分子マーカーを含む子孫種子を含む。
【０２０３】
一局面において、本明細書は、タバコ植物の第一の集団を提供する工程、SEQ ID NO：9〜16からなる群より選択される配列によってコードされる遺伝子座の増大したNUEアレルの存在についてタバコ植物の第一の集団をジェノタイピングする工程;および増大したNUEアレルを含む1つまたは複数のジェノタイピングされたタバコ植物を選択する工程を含む、方法を提供し、かつ、それを含む。あるさらなる局面において、該方法はさらに、1つまたは複数の選択されたタバコ植物を第二のタバコ植物に交雑させる工程;および交雑体から子孫種子を得る工程を含む。
【０２０４】
一局面において、本明細書は、増大した窒素利用効率形質を含む第一のタバコ品種を増大した窒素利用効率形質を欠く第二のタバコ品種と交雑させる工程と、交雑体から子孫種子を得る工程と、増大した窒素利用効率形質に関係する分子マーカーについて少なくとも1つの子孫種子をジェノタイピングする工程であって、分子マーカーが、SEQ ID NO：9〜16からなる群より選択される配列を有する遺伝子座の20cM内にある、工程と、増大した窒素利用効率形質を含む子孫種子を選択する工程とを含む、増大したNUE形質をタバコ品種に遺伝子移入する方法を提供し、かつ、それを含む。
【０２０５】
一局面において、本明細書は、タバコ生殖質の収集物から核酸を単離する工程、単離した核酸を、SEQ ID NO：9〜16からなる群より選択される配列を有する遺伝子座の20cM内に位置する1つまたは複数のマーカーについてアッセイする工程、および増大したNUE形質を含むタバコ植物を選択する工程を含む、増大したNUE形質を有するタバコ植物を選択する方法を提供し、かつ、それを含む。あるさらなる局面において、該方法はさらに、1つまたは複数の選択されたタバコ植物を第二のタバコ植物に交雑させる工程;および交雑体から子孫種子を得る工程を含む。
【０２０６】
一局面において、本明細書は、タバコ生殖質の収集物から核酸を単離する工程、単離した核酸を、SEQ ID NO：57〜64からなる群より選択されるマーカーの20cM内に位置する1つまたは複数のマーカーについてアッセイする工程、および増大したNUE形質を含むタバコ植物を選択する工程を含む、増大したNUE形質を有するタバコ植物を選択する方法を提供し、かつ、それを含む。あるさらなる局面において、本明細書に開示される方法は、SEQ ID NO：58からなる群より選択されるマーカーの15cM内に位置する1つまたは複数のマーカーについて単離した核酸をアッセイする工程を含む。あるさらなる局面において、本明細書に開示される方法は、SEQ ID NO：57〜64からなる群より選択されるマーカーの10cM内に位置する1つまたは複数のマーカーについて単離した核酸をアッセイする工程を含む。あるさらなる局面において、本明細書に開示される方法は、SEQ ID NO：57〜64からなる群より選択されるマーカーの9cM内に位置する1つまたは複数のマーカーについて単離した核酸をアッセイする工程を含む。あるさらなる局面において、本明細書に開示される方法は、SEQ ID NO：57〜64からなる群より選択されるマーカーの8cM内に位置する1つまたは複数のマーカーについて単離した核酸をアッセイする工程を含む。あるさらなる局面において、本明細書に開示される方法は、SEQ ID NO：57〜64からなる群より選択されるマーカーの7cM内に位置する1つまたは複数のマーカーについて単離した核酸をアッセイする工程を含む。あるさらなる局面において、本明細書に開示される方法は、SEQ ID NO：57〜64からなる群より選択されるマーカーの6cM内に位置する1つまたは複数のマーカーについて単離した核酸をアッセイする工程を含む。あるさらなる局面において、本明細書に開示される方法は、SEQ ID NO：57〜64からなる群より選択されるマーカーの5cM内に位置する1つまたは複数のマーカーについて単離した核酸をアッセイする工程を含む。あるさらなる局面において、本明細書に開示される方法は、SEQ ID NO：57〜64からなる群より選択されるマーカーの4cM内に位置する1つまたは複数のマーカーについて単離した核酸をアッセイする工程を含む。あるさらなる局面において、本明細書に開示される方法は、SEQ ID NO：57〜64からなる群より選択されるマーカーの3cM内に位置する1つまたは複数のマーカーについて単離した核酸をアッセイする工程を含む。あるさらなる局面において、本明細書に開示される方法は、SEQ ID NO：57〜64からなる群より選択されるマーカーの2cM内に位置する1つまたは複数のマーカーについて単離した核酸をアッセイする工程を含む。あるさらなる局面において、本明細書に開示される方法は、SEQ ID NO：57〜64からなる群より選択されるマーカーの1cM内に位置する1つまたは複数のマーカーについて単離した核酸をアッセイする工程を含む。あるさらなる局面において、本明細書に開示される方法は、SEQ ID NO：57〜64からなる群より選択されるマーカーの0.5cM内に位置する1つまたは複数のマーカーについて単離した核酸をアッセイする工程を含む。あるさらなる局面において、本明細書に開示される方法は、SEQ ID NO：57〜64からなる群より選択されるマーカーについて単離した核酸をアッセイする工程を含む。別の局面において、増大したNUEに関連するアレルは、SEQ ID NO：58の57位にGヌクレオチドを含む。別の局面において、増大したNUEに関連するアレルは、SEQ ID NO：58の117位にCヌクレオチドを含む。別の局面において、増大したNUEに関連するアレルは、SEQ ID NO：58の57位にGヌクレオチドおよび117位にCヌクレオチドを含む。別の局面において、増大したNUEに関連するアレルは、SEQ ID NO：57の147位にTヌクレオチドを含む。別の局面において、増大したNUEに関連するアレルは、SEQ ID NO：59の162位にGヌクレオチドを含む。別の局面において、増大したNUEに関連するアレルは、SEQ ID NO：60の36位にCヌクレオチドを含む。別の局面において、増大したNUEに関連するアレルは、SEQ ID NO：61の36位にTヌクレオチドを含む。別の局面において、増大したNUEに関連するアレルは、SEQ ID NO：62の36位にTヌクレオチドを含む。別の局面において、増大したNUEに関連するアレルは、SEQ ID NO：63の36位にGヌクレオチドを含む。別の局面において、増大したNUEに関連するアレルは、SEQ ID NO：64の36位にTヌクレオチドを含む。あるさらなる局面において、本明細書に開示される増大したNUEに関連するアレルの任意の組み合わせを含むタバコ植物を選択することができる。
【０２０７】
以下は、例示的な態様である。
【０２０８】
態様1. タバコ系統の窒素利用効率（NUE）を決定する方法であって、以下の工程を含む方法：
a. 前記タバコ系統のタバコ植物から少なくとも1つの代謝物を得る工程；
b. 前記少なくとも1つの代謝物の量を決定する工程；および
c. 工程（b）で特定された前記少なくとも1つの代謝物の量に基づいて前記タバコ系統の窒素利用効率を決定する工程。
【０２０９】
態様2. 少なくとも1つの代謝物が、根組織、葉組織、花組織、分裂組織および茎組織からなる群より選択される植物組織から得られる、態様1の方法。
【０２１０】
態様3. 植物組織が葉組織を含む、態様1または2の方法。
【０２１１】
態様4. 植物組織が根組織を含む、態様1〜3のいずれかの方法。
【０２１２】
態様5. 少なくとも1つの代謝物が、X-2357、N-アセチルムラマート、X-23319、X-23852、X-23330、アルファ-ケトグルタラート、X-21756、4-ヒドロキシ-2-オキソグルタル酸、D-23937、X-23937、X-23916、1-メチルアデニン、4-グアニジノブタノアート、シリンガアルデヒド、チアミン、p-ヒドロキシベンズアルデヒド、X-23453、X-11429、X-21796、N'-メチルニコチンアミド、コチニン、X-23389、N-アセチルアルギニン、X-23366、N-アセチルフェニルアラニン、ナリンゲニン、X-23454、X-23580およびX-23852からなる群より選択される、態様1〜4のいずれかの方法。
【０２１３】
態様6. NUEが、より少ない量の少なくとも1つの代謝物を少なくとも1つの組織に含むタバコ系統と比べて増大したNUEを含む、態様1〜5のいずれかの方法。
【０２１４】
態様7. NUEが、少なくとも1つの組織に等量の少なくとも1つの代謝物を含むタバコ系統と比べて増大したNUEを含む、態様1〜6のいずれかの方法。
【０２１５】
態様8. NUEが、少なくとも1つの組織に等量の少なくとも1つの代謝物を含むタバコ系統と比べて増大したNUEを含む、態様1〜7のいずれかの方法。
【０２１６】
態様9. NUEが、より少ない量の少なくとも1つの代謝物を少なくとも1つの組織に含むタバコ系統と比べて減少したNUEを含む、態様1〜8のいずれかの方法。
【０２１７】
態様10. NUEが、少なくとも1つの組織に等量の少なくとも1つの代謝物を含むタバコ系統と比べて減少したNUEを含む、態様1〜9のいずれかの方法。
【０２１８】
態様11. NUEが、少なくとも1つの組織に等量の少なくとも1つの代謝物を含むタバコ系統と比べて減少したNUEを含む、態様1〜10のいずれかの方法。
【０２１９】
態様12. 少なくとも1つの代謝物の量を決定する工程が、液体クロマトグラフィー／質量分光法（LC/MS）、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、ウルトラHPLC（UHPLC）、質量分光法（MS）、タンデム質量分光法（MS/MS）、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分光法（MALDI-MS）、蛍光X線分光法（XRF）、イオンクロマトグラフィー（IC）、ガスククロマトグラフィー（GC）、ガスククロマトグラフィー／質量分光法（GC/MS）、キャピラリー電気泳動／質量分光法（CE-MS）、イオン移動度分光法／質量分光法（IMS/MS）、X線回折、核磁気共鳴（NMR）、発光分光分析、ポーラログラフィー、紫外−可視分光法、赤外分光法、薄層クロマトグラフィーからなる群より選択される方法を含む、態様1〜11のいずれかの方法。
【０２２０】
態様13. 少なくとも1つの代謝物が、少なくとも2つの代謝物を含む、態様1〜12のいずれかの方法。
【０２２１】
態様14. 少なくとも1つの代謝物が、少なくとも5つの代謝物を含む、態様1〜13のいずれかの方法。
【０２２２】
態様15. 少なくとも1つの代謝物が、少なくとも10の代謝物を含む、態様1〜14のいずれかの方法。
【０２２３】
態様16. 代謝物シグネチャーを使用したタバコ系統の窒素利用効率（NUE）を決定する方法であって、以下の工程を含む方法：
a. 前記タバコ系統のタバコ植物から代謝物シグネチャーを単離する工程；
b. 前記代謝物シグネチャーを含む各代謝物の量を決定する工程；
c. 前記代謝物シグネチャーを既知のNUEを含む対照タバコ系統由来の対照代謝物シグネチャーと比較することによって、前記タバコ系統のNUEを決定する工程。
【０２２４】
態様17. 代謝物シグネチャーが、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、または少なくとも50の代謝物を含む、態様16の方法。
【０２２５】
態様18. NUEが、対照タバコ系統と比べて増大したNUEを含む、態様16または17の方法。
【０２２６】
態様19. NUEが、対照タバコ系統と比べて低減したNUEを含む、態様16〜18のいずれかの方法。
【０２２７】
態様20. 代謝物シグネチャーが、根組織、葉組織、花組織、分裂組織および茎組織からなる群より選択される植物組織から単離される、態様16〜19のいずれかの方法。
【０２２８】
態様21. 増大した窒素利用効率（NUE）に関連する代謝物シグネチャーを含むタバコ系統を育種する方法であって、以下の工程を含む方法：
a. 第一のタバコ系統由来の第一のタバコ植物の代謝物シグネチャーを決定する工程であって、前記第一のタバコ植物が、前記代謝物シグネチャーを欠く対照タバコ植物と比べて増大したNUEを含む、工程；
b. 前記第一の植物を第二のタバコ系統の第二の植物と交雑させる工程；および
c. 工程（a）の交雑体から少なくとも1つの子孫種子を得る工程であって、前記少なくとも1つの子孫種子から生育させた子孫植物が前記代謝物シグネチャーを含み、かつ、前記子孫植物が前記代謝物シグネチャーを欠く対照植物と比べて増大したNUEを含む、工程。
【０２２９】
態様22. 以下の工程をさらに含む、態様21の方法：
d. 子孫植物を第一のタバコ系統由来のタバコ植物に交雑させる工程。
【０２３０】
態様23. 第一のタバコ系統が、MD609、MD601、バンケットA1、K326、K346、K358、K394、K399、K730、NC196、NC37NF、NC471、NC55、NC92、NC2326、NC95、NC925からなる群より選択される、態様21または22の方法。
【０２３１】
態様24. 第二のタバコ系統が、TN86、TN86LC、TN90、TN90LC、TN97、TN97LCからなる群より選択される、態様21〜23のいずれかの方法。
【０２３２】
態様25. 代謝物シグネチャーが、葉代謝物シグネチャーを含む、態様21〜24のいずれかの方法。
【０２３３】
態様26. 代謝物シグネチャーが、根代謝物シグネチャーを含む、態様21〜25のいずれかの方法。
【０２３４】
態様27. 増大したNUEが、同じ条件で生育させた増大したNUEを欠くタバコ植物と比べて増加した部分要素生産性（PFP）を含む、態様21〜26のいずれかの方法。
【０２３５】
態様28. 増大したNUEが、同じ条件で生育させた増大したNUEを欠くタバコ植物と比べて増加した農学的効率（AE）を含む、態様21〜27のいずれかの方法。
【０２３６】
態様29. 増大したNUEが、同じ条件で生育させた増大したNUEを欠くタバコ植物と比べて増加した回収効率（RE）を含む、態様21〜28のいずれかの方法。
【０２３７】
態様30. 増大したNUEが、同じ条件で生育させた増大したNUEを欠くタバコ植物と比べて増加した生理学的効率（PE）を含む、態様21〜29のいずれかの方法。
【０２３８】
態様31. 増大したNUEが、同じ条件で生育させた増大したNUEを欠くタバコ植物と比べて増加した内部効率（IE）を含む、態様21〜30のいずれかの方法。
【０２３９】
態様32. 代謝物シグネチャーが、対照タバコ植物の代謝物シグネチャーと比べて等量の4-グアニジノブタノアート、シリンガアルデヒド、チアミン、p-ヒドロキシベンズアルデヒド、X-23454、X-23580、X-23852、またはそれらの任意の組み合わせを含む、態様21〜31のいずれかの方法。
【０２４０】
態様33. 代謝物シグネチャーが、対照タバコ植物の代謝物シグネチャーと比べてより少ない量のX-2357、N-アセチルムラマート、X-23319、X-23852、X-23330、アルファ-ケトグルタラート、X-21756、4-ヒドロキシ-2-オキソグルタル酸、X-23937、X-23916、1-メチルアデニン、X-23453、X-11429、X-21796、N'-メチルニコチンアミド、コチニン、X-23389、N-アセチルアルギニン、N-23366、N-アセチルフェニルアラニン、ナリンゲニン、またはそれらの任意の組み合わせを含む、態様21〜32のいずれかの方法。
【０２４１】
態様34. 代謝物シグネチャーが、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、または少なくとも50の代謝物を含む、態様21〜33のいずれかの方法。
【０２４２】
態様35. タバコ植物を選択する方法であって、以下の工程を含む方法：
a. タバコ植物の集団を得る工程；
b. 前記タバコ植物の集団の少なくとも1つのタバコ植物から増大した窒素利用効率（NUE）に関連する少なくとも1つの代謝物を単離する工程；
c. 対照タバコ植物と比べて等量の前記少なくとも1つの代謝物を含む少なくとも1つのタバコ植物を選択する工程。
【０２４３】
態様36. 工程（c）で選択されたタバコ植物が、対照タバコ植物と比べて等しいNUEを含む、態様35の方法。
【０２４４】
態様37. 増大したNUEが、同じ条件で生育させた増大したNUEを欠くタバコ植物と比べて増加した部分要素生産性（PFP）を含む、態様35または36の方法。
【０２４５】
態様38. 増大したNUEが、同じ条件で生育させた増大したNUEを欠くタバコ植物と比べて増加した農学的効率（AE）を含む、態様35〜37のいずれかの方法。
【０２４６】
態様39. 増大したNUEが、同じ条件で生育させた増大したNUEを欠くタバコ植物と比べて増加した回収効率（RE）を含む、態様35〜38のいずれかの方法。
【０２４７】
態様40. 増大したNUEが、同じ条件で生育させた増大したNUEを欠くタバコ植物と比べて増加した生理学的効率（PE）を含む、態様35〜39のいずれかの方法。
【０２４８】
態様41. 増大したNUEが、同じ条件で生育させた増大したNUEを欠くタバコ植物と比べて増加した内部効率（IE）を含む、態様35〜40のいずれかの方法。
【０２４９】
態様42. 少なくとも1つの代謝物が、4-グアニジノブタノアート、シリンガアルデヒド、チアミン、p-ヒドロキシベンズアルデヒド、X-23454、X-23580、X-23852、またはそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、態様35〜41のいずれかの方法。
【０２５０】
態様43. 少なくとも1つの代謝物が、葉組織または根組織から単離される、態様35〜42のいずれかの方法。
【０２５１】
態様44. 少なくとも1つの代謝物が、根組織、葉組織、花組織、分裂組織および茎組織からなる群より選択される植物組織から単離される、態様35〜43のいずれかの方法。
【０２５２】
態様45. タバコ植物を選択する方法であって、以下の工程を含む方法：
a. タバコ植物の集団を得る工程；
b. 前記タバコ植物の集団の少なくとも1つのタバコ植物から増大した窒素利用効率（NUE）に関連する少なくとも1つの代謝物を単離する工程；
c. 対照タバコ植物と比べてより少ない量の前記少なくとも1つの代謝物を含む少なくとも1つのタバコ植物を選択する工程。
【０２５３】
態様46. 工程（c）で選択されたタバコ植物が、対照タバコ植物と比べて等しいNUEを含む、態様45の方法。
【０２５４】
態様47. 増大したNUEが、同じ条件で生育させた増大したNUEを欠くタバコ植物と比べて増加した部分要素生産性（PFP）を含む、態様45または46の方法。
【０２５５】
態様48. 増大したNUEが、同じ条件で生育させた増大したNUEを欠くタバコ植物と比べて増加した農学的効率（AE）を含む、態様45〜47のいずれかの方法。
【０２５６】
態様49. 増大したNUEが、同じ条件で生育させた増大したNUEを欠くタバコ植物と比べて増加した回収効率（RE）を含む、態様45〜48のいずれかの方法。
【０２５７】
態様50. 増大したNUEが、同じ条件で生育させた増大したNUEを欠くタバコ植物と比べて増加した生理学的効率（PE）を含む、態様45〜49のいずれかの方法。
【０２５８】
態様51. 増大したNUEが、同じ条件で生育させた増大したNUEを欠くタバコ植物と比べて増加した内部効率（IE）を含む、態様45〜50のいずれかの方法。
【０２５９】
態様52. 少なくとも1つの代謝物が、X-2357、N-アセチルムラマート、X-23319、X-23852、X-23330、アルファ-ケトグルタラート、X-21756、4-ヒドロキシ-2-オキソグルタル酸、X-23937、X-23916、1-メチルアデニン、X-23453、X-11429、X-21796、N'-メチルニコチンアミド、コチニン、X-23389、N-アセチルアルギニン、N-23366、N-アセチルフェニルアラニン、ナリンゲニン、またはそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、態様45〜51のいずれかの方法。
【０２６０】
態様53. 少なくとも1つの代謝物が、葉組織または根組織から単離される、態様45〜52のいずれかの方法。
【０２６１】
態様54. 少なくとも1つの代謝物が、根組織、葉組織、花組織、分裂組織および茎組織からなる群より選択される植物組織から単離される、態様45〜53のいずれかの方法。
【０２６２】
態様55. 増大した窒素利用効率（NUE）に関連する代謝物シグネチャーについてタバコ植物をスクリーニングする方法であって、以下の工程を含む方法：
a. 前記タバコ植物から増大したNUEに関連する第一の代謝物シグネチャーを単離する工程；
b. 前記第一の代謝物シグネチャーを含む少なくとも1つの代謝物の量を決定する工程；
c. 前記第一の代謝物シグネチャーを既知のNUEを含む対照タバコ植物の第二の代謝物シグネチャーを比較する工程；および
d. 前記第一の代謝物シグネチャーが増大したNUEに関連するかどうかを決定する工程。
【０２６３】
態様56. 増大したNUEが、同じ条件で生育させた増大したNUEを欠くタバコ植物と比べて増加した部分要素生産性（PFP）を含む、態様55の方法。
【０２６４】
態様57. 増大したNUEが、同じ条件で生育させた増大したNUEを欠くタバコ植物と比べて増加した農学的効率（AE）を含む、態様55または56の方法。
【０２６５】
態様58. 増大したNUEが、同じ条件で生育させた増大したNUEを欠くタバコ植物と比べて増加した回収効率（RE）を含む、態様55〜57のいずれかの方法。
【０２６６】
態様59. 増大したNUEが、同じ条件で生育させた増大したNUEを欠くタバコ植物と比べて増加した生理学的効率（PE）を含む、態様55〜58のいずれかの方法。
【０２６７】
態様60. 増大したNUEが、同じ条件で生育させた増大したNUEを欠くタバコ植物と比べて増加した内部効率（IE）を含む、態様55〜59のいずれかの方法。
【０２６８】
態様61. コーディング領域に機能的に連結された異種プロモーターを含むシスジェニックポリヌクレオチドを含む改変されたタバコ種子またはそれから生育させたタバコ植物であって、同じ条件下で生育させたときのシスジェニックポリヌクレオチドを欠く改変されていない対照タバコ植物と比べて増大した窒素利用効率を含む、改変されたタバコ種子またはそれから生育させたタバコ植物。
【０２６９】
態様62. コーディング領域が、SEQ ID NO：1〜8からなる群より選択される配列と少なくとも70％同一または類似したポリペプチドをコードする、態様61の改変されたタバコ種子またはタバコ植物。
【０２７０】
態様63. コーディング領域が、SEQ ID NO：9〜16からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列と少なくとも70％同一または相補的であるポリヌクレオチド配列を含む、態様61または62の改変されたタバコ種子またはタバコ植物。
【０２７１】
態様64. 異種プロモーターが、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、組織優先プロモーター、および組織特異的プロモーターからなる群より選択される、態様61〜63のいずれかの改変されたタバコ種子またはタバコ植物。
【０２７２】
態様65. 異種プロモーターが、タバコゲノム由来のポリヌクレオチド配列を含む、態様61〜64のいずれかの改変されたタバコ種子またはタバコ植物。
【０２７３】
態様66. 異種プロモーターが、植物ゲノム由来のポリヌクレオチド配列を含む、態様61〜65のいずれかの改変されたタバコ種子またはタバコ植物。
【０２７４】
態様67. 組織優先プロモーターが葉優先プロモーターである、態様61〜66のいずれかの改変されたタバコ種子またはタバコ植物。
【０２７５】
態様68. 組織優先プロモーターが根優先プロモーターである、態様61〜67のいずれかの改変されたタバコ種子またはタバコ植物。
【０２７６】
態様69. 葉優先プロモーターが、SEQ ID NO：17〜19からなる群より選択される配列またはその機能的断片と少なくとも70％同一または相補的である配列によってコードされる、態様61〜68のいずれかの改変されたタバコ種子またはタバコ植物。
【０２７７】
態様70. 根優先プロモーターが、SEQ ID NO：20〜24からなる群より選択される配列またはその機能的断片と少なくとも70％同一または相補的である配列によってコードされる、態様61〜69のいずれかの改変されたタバコ種子またはタバコ植物。
【０２７８】
態様71. 同じ条件下で生育させたときのシスジェニックポリヌクレオチドを欠く改変されていないタバコ植物と比べて等しいレベルの4-グアニジノブタノアート、シリンガアルデヒド、チアミンおよびp-ヒドロキシベンズアルデヒドからなる群より選択される代謝物を根組織に含む、態様61〜70のいずれかの改変されたタバコ植物。
【０２７９】
態様72. 同じ条件下で生育させたときのシスジェニックポリヌクレオチドを欠く改変されていないタバコ植物と比べて等しいレベルの4-グアニジノブタノアート、X-23454、X-23580およびX-23852からなる群より選択される代謝物を葉組織に含む、態様61〜71のいずれかの改変されたタバコ植物。
【０２８０】
態様73. 同じ条件下で生育させたときのシスジェニックポリヌクレオチドを欠く改変されていないタバコ植物と比べてより低いレベルのX-2357、N-アセチルムラマート、X-23319、X-23852、X-23330、アルファ-ケトグルタラート、X-21756、4-ヒドロキシ-2-オキソグルタル酸、X-23937、X-23916および1-メチルアデニンからなる群より選択される代謝物を根組織に含む、態様61〜72のいずれかの改変されたタバコ植物。
【０２８１】
態様74. 同じ条件下で生育させたときのシスジェニックポリヌクレオチドを欠く改変されていないタバコ植物と比べてより低いレベルのX-23453、X-21756、X-11429、X-21796、N'-メチルニコチンアミド、コチニン、X-23389、N-アセチルアルギニン、N-23366、N-アセチルフェニルアラニンおよびナリンゲニンからなる群より選択される代謝物を葉組織に含む、態様61〜73のいずれかの改変されたタバコ植物。
【０２８２】
態様75. バーレー品種のものである、態様61〜74のいずれかの改変されたタバコ種子または植物。
【０２８３】
態様76. 同じ条件下で生育させたときのシスジェニックポリヌクレオチドを欠く改変されていないタバコ植物と比べてより少ない量のTSNAを含む、態様61〜75のいずれかの改変されたタバコ種子または植物。
【０２８４】
態様77. SEQ ID NO：1〜8からなる群より選択されるポリペプチドと少なくとも70％同一または類似したポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結された異種プロモーターを含む、組換えDNA構築物。
【０２８５】
態様78. コーディング領域に機能的に連結された異種プロモーターを含むシスジェニックポリヌクレオチドを含むタバコ植物から製造される、乾燥タバコ材料または乾燥タバコ材料を含むタバコ製品であって、改変されたタバコ植物が、同じ条件下で生育させたときの前記シスジェニックポリヌクレオチドを欠く改変されていない対照タバコ植物と比べて増大した窒素利用効率を含む、乾燥タバコ材料または乾燥タバコ材料を含むタバコ製品。
【０２８６】
態様79. 態様61〜76のいずれかの改変されたタバコ種子または植物を含む、温室、生育箱または圃場。
【０２８７】
態様80. SEQ ID NO：25〜40からなる群より選択されるポリペプチドをコードする少なくとも1つの変異を内在性遺伝子座に含む、改変されたタバコ種子またはそれから生育させたタバコ植物であって、同じ条件下で生育させたときの前記少なくとも1つの変異を欠く改変されていない対照タバコ植物と比べて増大した窒素利用効率を含む、改変されたタバコ種子またはタバコ植物。
【０２８８】
態様81. 少なくとも1つの変異が、挿入、欠失、置換および逆位からなる群より選択される、態様80の改変されたタバコ種子またはタバコ植物。
【０２８９】
態様82. 少なくとも1つの変異がヌル変異である、態様80または81の改変されたタバコ種子またはタバコ植物。
【０２９０】
態様83. 同じ条件下で生育させたときの少なくとも1つの変異を欠く改変されていないタバコ植物と比べて等しいレベルの4-グアニジノブタノアート、シリンガアルデヒド、チアミンおよびp-ヒドロキシベンズアルデヒドからなる群より選択される代謝物を根組織に含む、態様80〜82のいずれかの改変されたタバコ植物。
【０２９１】
態様84. 同じ条件下で生育させたときの少なくとも1つの変異を欠く改変されていないタバコ植物と比べて等しいレベルの4-グアニジノブタノアート、X-23454、X-23580およびX-23852からなる群より選択される代謝物を葉組織に含む、態様80〜83のいずれかの改変されたタバコ植物。
【０２９２】
態様85. 同じ条件下で生育させたときの少なくとも1つの変異を欠く改変されていないタバコ植物と比べてより低いレベルのX-2357、N-アセチルムラマート、X-23319、X-23852、X-23330、アルファ-ケトグルタラート、X-21756、4-ヒドロキシ-2-オキソグルタル酸、X-23937、X-23916および1-メチルアデニンからなる群より選択される代謝物を根組織に含む、態様80〜84のいずれかの改変されたタバコ植物。
【０２９３】
態様86. 同じ条件下で生育させたときの少なくとも1つの変異を欠く改変されていないタバコ植物と比べてより低いレベルのX-23453、X-21756、X-11429、X-21796、N'-メチルニコチンアミド、コチニン、X-23389、N-アセチルアルギニン、N-23366、N-アセチルフェニルアラニンおよびナリンゲニンからなる群より選択される代謝物を葉組織に含む、態様80〜85のいずれかの改変されたタバコ植物。
【０２９４】
態様87. バーレー品種のものである、態様80〜86のいずれかの改変されたタバコ種子または植物。
【０２９５】
態様88. 同じ条件下で生育させたときの少なくとも1つの変異を欠く改変されていないタバコ植物と比べてより少ない量のTSNAを含む、態様80〜87のいずれかの改変されたタバコ種子または植物。
【０２９６】
態様89. SEQ ID NO：25〜40からなる群より選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと同一または相補的である少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも26、少なくとも27、または少なくとも28の連続したヌクレオチドを含むガイドRNAに機能的に連結された異種プロモーターを含む、組換えDNA構築物。
【０２９７】
態様90. SEQ ID NO：25〜40からなる群より選択されるポリペプチドをコードする少なくとも1つの変異を内在性遺伝子座に含むタバコ植物から製造される、乾燥タバコ材料または乾燥タバコ材料を含むタバコ製品であって、改変されたタバコ種子またはタバコ植物が、同じ条件下で生育させたときの前記少なくとも1つの変異を欠く改変されていない対照タバコ植物と比べて増大した窒素利用効率を含む、乾燥タバコ材料または乾燥タバコ材料を含むタバコ製品。
【０２９８】
態様91. SEQ ID NO：41〜56からなる群より選択されるポリヌクレオチドと少なくとも85％同一または相補的である低分子RNA（sRNA）をコードするポリヌクレオチドに機能的に連結された異種プロモーターを含むシスジェニックポリヌクレオチドを含む、改変されたタバコ種子またはそれから生育させたタバコ植物であって、同じ条件下で生育させたときの前記シスジェニックポリヌクレオチドを欠く改変されていない対照タバコ植物と比べて増大した窒素利用効率を含む、改変されたタバコ種子またはタバコ植物。
【０２９９】
態様92. sRNAが、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも26、少なくとも27、または少なくとも28ヌクレオチドを含む、態様91の改変されたタバコ種子またはタバコ植物。
【０３００】
態様93. sRNAが、マイクロRNA、低分子干渉RNA（siRNA）、トランス作用siRNAおよびそれらの前駆体からなる群より選択される、態様91または92の改変されたタバコ種子またはタバコ植物。
【０３０１】
態様94. sRNAが、SEQ ID NO：41〜56からなる群より選択されるポリヌクレオチドの発現または翻訳をダウンレギュレーションする、態様91〜93のいずれかの改変されたタバコ種子またはタバコ植物。
【０３０２】
態様95. 異種プロモーターが、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、組織優先プロモーター、および組織特異的プロモーターからなる群より選択される、態様91〜94のいずれかの改変されたタバコ種子またはタバコ植物。
【０３０３】
態様96. 組織優先プロモーターが葉優先プロモーターである、態様91〜95のいずれかの改変されたタバコ種子またはタバコ植物。
【０３０４】
態様97. 組織優先プロモーターが根優先プロモーターである、態様91〜96のいずれかの改変されたタバコ種子またはタバコ植物。
【０３０５】
態様98. 葉優先プロモーターが、SEQ ID NO：17〜19からなる群より選択される配列またはその機能的断片と少なくとも70％同一または相補的である配列によってコードされる、態様91〜97のいずれかの改変されたタバコ種子またはタバコ植物。
【０３０６】
態様99. 根優先プロモーターが、SEQ ID NO：20〜24からなる群より選択される配列またはその機能的断片と少なくとも70％同一または相補的である配列によってコードされる、態様91〜98のいずれかの改変されたタバコ種子またはタバコ植物。
【０３０７】
態様100. 異種プロモーターが、タバコゲノム由来のポリヌクレオチド配列を含む、態様91〜99のいずれかの改変されたタバコ種子またはタバコ植物。
【０３０８】
態様101. 異種プロモーターが、植物ゲノム由来のポリヌクレオチド配列を含む、態様91〜100のいずれかの改変されたタバコ種子またはタバコ植物。
【０３０９】
態様102. 同じ条件下で生育させたときのシスジェニックポリヌクレオチドを欠く改変されていないタバコ植物と比べて等しいレベルの4-グアニジノブタノアート、シリンガアルデヒド、チアミンおよびp-ヒドロキシベンズアルデヒドからなる群より選択される代謝物を根組織に含む、態様91〜101のいずれかの改変されたタバコ植物。
【０３１０】
態様103. 同じ条件下で生育させたときのシスジェニックポリヌクレオチドを欠く改変されていないタバコ植物と比べて等しいレベルの4-グアニジノブタノアート、X-23454、X-23580およびX-23852からなる群より選択される代謝物を葉組織に含む、態様91〜102のいずれかの改変されたタバコ植物。
【０３１１】
態様104. 同じ条件下で生育させたときのシスジェニックポリヌクレオチドを欠く改変されていないタバコ植物と比べてより低いレベルのX-2357、N-アセチルムラマート、X-23319、X-23852、X-23330、アルファ-ケトグルタラート、X-21756、4-ヒドロキシ-2-オキソグルタル酸、X-23937、X-23916および1-メチルアデニンからなる群より選択される代謝物を根組織に含む、態様91〜103のいずれかの改変されたタバコ植物。
【０３１２】
態様105. 同じ条件下で生育させたときのシスジェニックポリヌクレオチドを欠く改変されていないタバコ植物と比べてより低いレベルのX-23453、X-21756、X-11429、X-21796、N'-メチルニコチンアミド、コチニン、X-23389、N-アセチルアルギニン、N-23366、N-アセチルフェニルアラニンおよびナリンゲニンからなる群より選択される代謝物を葉組織に含む、態様91〜104のいずれかの改変されたタバコ植物。
【０３１３】
態様106. バーレー品種のものである、態様91〜105のいずれかの改変されたタバコ種子または植物。
【０３１４】
態様107. 同じ条件下で生育させたときのシスジェニックポリヌクレオチドを欠く改変されていないタバコ植物と比べてより少ない量のTSNAを含む、態様91〜106のいずれかの改変されたタバコ種子または植物。
【０３１５】
態様108. SEQ ID NO：41〜56からなる群より選択されるポリヌクレオチドと少なくとも85％同一または相補的である低分子RNA（sRNA）をコードするポリヌクレオチドに機能的に連結された異種プロモーターを含む、組換えDNA構築物。
【０３１６】
態様109. SEQ ID NO：41〜56からなる群より選択されるポリヌクレオチドと少なくとも85％同一または相補的である低分子RNA（sRNA）をコードするポリヌクレオチドに機能的に連結された異種プロモーターを含むシスジェニックポリヌクレオチドを含むタバコ植物から製造される、乾燥タバコ材料または乾燥タバコ材料を含むタバコ製品であって、改変されたタバコ種子またはタバコ植物が、同じ条件下で生育させたときの前記シスジェニックポリヌクレオチドを欠く改変されていない対照タバコ植物と比べて増大した窒素利用効率を含む、乾燥タバコ材料または乾燥タバコ材料を含むタバコ製品。
【０３１７】
態様110. タバコ植物の窒素利用効率（NUE）を増大させる方法であって、以下の工程を含む方法：
a. シスジェニック核酸分子をタバコ細胞に導入する工程;および
b. 前記タバコ細胞から改変タバコ植物を再生させる工程であって、前記改変タバコ植物が、前記シスジェニック核酸分子を欠くタバコ植物と比べて増大したNUEを含む、工程。
【０３１８】
態様111. 以下の工程をさらに含む、態様110の方法：
c. 改変されたタバコ植物を第二のタバコ植物と交雑させる工程または改変されたタバコ植物を自家受粉させる工程。
【０３１９】
態様112. 増大したNUEが、同じ条件で生育させた増大したNUEを欠くタバコ植物と比べて増加した部分要素生産性（PFP）を含む、態様110または111の方法。
【０３２０】
態様113. 増大したNUEが、同じ条件で生育させた増大したNUEを欠くタバコ植物と比べて増加した農学的効率（AE）を含む、態様110〜112のいずれかの方法。
【０３２１】
態様114. 増大したNUEが、同じ条件で生育させた増大したNUEを欠くタバコ植物と比べて増加した回収効率（RE）を含む、態様110〜113のいずれかの方法。
【０３２２】
態様115. 増大したNUEが、同じ条件で生育させた増大したNUEを欠くタバコ植物と比べて増加した生理学的効率（PE）を含む、態様110〜114のいずれかの方法。
【０３２３】
態様116. 増大したNUEが、同じ条件で生育させた増大したNUEを欠くタバコ植物と比べて増加した内部効率（IE）を含む、態様110〜115のいずれかの方法。
【０３２４】
態様117. タバコ植物の窒素利用効率（NUE）を増大させる方法であって、以下の工程を含む方法：
a. SEQ ID NO：41〜56からなる群より選択される配列を有する遺伝子をコードする核酸分子に対する改変をタバコ細胞に導入する工程；
b. 前記タバコ細胞から改変タバコ植物を再生させる工程であって、前記改変タバコ植物が、前記改変を欠くタバコ植物と比べて増大したNUEを含む、工程。
【０３２５】
態様118. 導入が、RNAガイドヌクレアーゼの使用を含む、態様117の方法。
【０３２６】
態様119. RNAガイドヌクレアーゼが、Cas9ヌクレアーゼ、Cpf1ヌクレアーゼ、CasXヌクレアーゼ、CasYヌクレアーゼ、およびそれらの機能的ホモログからなる群より選択される、態様117または118の方法。
【０３２７】
態様120. 改変が、挿入、置換、逆位および欠失からなる群より選択される、態様117〜119のいずれかの方法。
【０３２８】
態様121. 増大したNUEが、同じ条件で生育させた増大したNUEを欠くタバコ植物と比べて増加した部分要素生産性（PFP）を含む、態様117〜120のいずれかの方法。
【０３２９】
態様122. 増大したNUEが、同じ条件で生育させた増大したNUEを欠くタバコ植物と比べて増加した農学的効率（AE）を含む、態様117〜121のいずれかの方法。
【０３３０】
態様123. 増大したNUEが、同じ条件で生育させた増大したNUEを欠くタバコ植物と比べて増加した回収効率（RE）を含む、態様117〜122のいずれかの方法。
【０３３１】
態様124. 増大したNUEが、同じ条件で生育させた増大したNUEを欠くタバコ植物と比べて増加した生理学的効率（PE）を含む、態様117〜123のいずれかの方法。
【０３３２】
態様125. 増大したNUEが、同じ条件で生育させた増大したNUEを欠くタバコ植物と比べて増加した内部効率（IE）を含む、態様117〜124のいずれかの方法。
【０３３３】
態様126. 以下の工程をさらに含む、態様117〜125のいずれかの方法：
c. 改変されたタバコ植物を第二のタバコ植物と交雑させる工程または改変されたタバコ植物を自家受粉させる工程。
【０３３４】
態様127. タバコ植物の窒素利用効率（NUE）を増大させる方法であって、以下の工程を含む方法：
a. SEQ ID NO：41〜56からなる群より選択される配列を有する遺伝子をコードする核酸分子の少なくとも18の連続した核酸に相同な低分子RNA（sRNA）をコードする核酸をタバコ細胞に導入する工程；
b. 前記タバコ細胞から改変タバコ植物を再生させる工程であって、前記改変タバコ植物が、前記sRNAを欠くタバコ植物と比べて増大したNUEを含む、工程。
【０３３５】
態様128. sRNAが、マイクロRNA、低分子干渉RNA（siRNA）、トランス作用siRNAおよびそれらの前駆体からなる群より選択される、態様127の方法。
【０３３６】
態様129. 増大したNUEが、同じ条件で生育させた増大したNUEを欠くタバコ植物と比べて増加した部分要素生産性（PFP）を含む、態様127または128の方法。
【０３３７】
態様130. 増大したNUEが、同じ条件で生育させた増大したNUEを欠くタバコ植物と比べて増加した農学的効率（AE）を含む、態様127〜129のいずれかの方法。
【０３３８】
態様131. 増大したNUEが、同じ条件で生育させた増大したNUEを欠くタバコ植物と比べて増加した回収効率（RE）を含む、態様127〜130のいずれかの方法。
【０３３９】
態様132. 増大したNUEが、同じ条件で生育させた増大したNUEを欠くタバコ植物と比べて増加した生理学的効率（PE）を含む、態様127〜131のいずれかの方法。
【０３４０】
態様133. 増大したNUEが、同じ条件で生育させた増大したNUEを欠くタバコ植物と比べて増加した内部効率（IE）を含む、態様127〜132のいずれかの方法。
【０３４１】
態様134. 以下の工程をさらに含む、態様127〜133のいずれかの方法：
c. 改変されたタバコ植物を第二のタバコ植物と交雑させる工程または改変されたタバコ植物を自家受粉させる工程。
【０３４２】
態様135. 以下の工程を含む、方法：
a. 増大した窒素利用効率を含むタバコ植物の第一の集団を提供する工程；
b. 増大した窒素利用効率遺伝子座の20cM内の分子マーカーの存在について前記タバコ植物の第一の集団をジェノタイピングする工程；および
c. 前記分子マーカーを含む、工程（b）においてジェノタイピングされた1つまたは複数のタバコ植物を選択する工程。
【０３４３】
態様136. 以下の工程をさらに含む、態様135の方法：
d. 工程（c）において選択された1つまたは複数のタバコ植物を第二のタバコ植物に交雑させる工程；および
e. 工程（d）の交雑体から子孫種子を得る工程。
【０３４４】
態様137. 分子マーカーが、SNPマーカー、INDELマーカー、RFLPマーカー、SSRマーカー、AFLPマーカーおよびRAPDマーカーからなる群より選択される、態様135または136の方法。
【０３４５】
態様138. 増大した窒素利用効率遺伝子座が、SEQ ID NO：1〜8からなる群より選択されるポリペプチドと少なくとも70％同一または類似したポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、態様135〜137のいずれかの方法。
【０３４６】
態様139. 増大した窒素利用効率遺伝子座が、SEQ ID NO：9〜16からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む、態様135〜138のいずれかの方法。
【０３４７】
態様140. 分子マーカーが、SEQ ID NO：57〜64からなる群より選択される、態様135〜139のいずれかの方法。
【０３４８】
態様141. 分子マーカーが、SEQ ID NO：58の57位にGヌクレオチドを含む、態様135〜140のいずれかの方法。
【０３４９】
態様142. 分子マーカーが、SEQ ID NO：58の117位にCヌクレオチドを含む、態様135〜141のいずれかの方法。
【０３５０】
態様143. 分子マーカーが、SEQ ID NO：58の57位にGヌクレオチドおよび117位にCヌクレオチドを含む、態様135〜142のいずれかの方法。
【０３５１】
態様144. 分子マーカーが、SEQ ID NO：57の14位にTヌクレオチドを含む、態様135〜143のいずれかの方法。
【０３５２】
態様145. 分子マーカーが、SEQ ID NO：59の162位にGヌクレオチドを含む、態様135〜144のいずれかの方法。
【０３５３】
態様146. 分子マーカーが、SEQ ID NO：60の36位にCヌクレオチドを含む、態様135〜145のいずれかの方法。
【０３５４】
態様147. 分子マーカーが、SEQ ID NO：61の36位にTヌクレオチドを含む、態様135〜146のいずれかの方法。
【０３５５】
態様148. 分子マーカーが、SEQ ID NO：62の36位にTヌクレオチドを含む、態様135〜147のいずれかの方法。
【０３５６】
態様149. 分子マーカーが、SEQ ID NO：63の36位にGヌクレオチドを含む、態様135〜148のいずれかの方法。
【０３５７】
態様150. 分子マーカーが、SEQ ID NO：64の36位にTヌクレオチドを含む、態様135〜149のいずれかの方法。
【０３５８】
態様151. タバコ植物の第一の集団が、メリーランド品種のものである、態様135〜150のいずれかの方法。
【０３５９】
態様152. タバコ植物の第一の集団が、MD609、MD601、バンケットA1、K326、K346、K358、K394、K399、K730、NC196、NC37NF、NC471、NC55、NC92、NC2326、NC95、NC925からなる群より選択される品種のものである、態様135〜151のいずれかの方法。
【０３６０】
態様153. 第二のタバコ植物が、TN86、TN86LC、TN90、TN90LC、TN97、TN97LCからなる群より選択される品種のものである、態様135〜152のいずれかの方法。
【０３６１】
態様154. 子孫種子が前記分子マーカーを含む、態様135〜153のいずれかの方法。
【０３６２】
態様155. 子孫種子が、増大した窒素利用効率を含む、態様135〜154のいずれかの方法。
【０３６３】
態様156. 前記分子マーカーが、増大した窒素利用効率遺伝子座の15cM以内にある、態様135〜155のいずれかの方法。
【０３６４】
態様157. 前記分子マーカーが、増大した窒素利用効率遺伝子座の10cM以内にある、態様135〜156のいずれかの方法。
【０３６５】
態様158. 前記分子マーカーが、増大した窒素利用効率遺伝子座の5cM以内にある、態様135〜157のいずれかの方法。
【０３６６】
態様159. 前記分子マーカーが、増大した窒素利用効率遺伝子座の2cM以内にある、態様135〜158のいずれかの方法。
【０３６７】
態様160. 前記分子マーカーが、増大した窒素利用効率遺伝子座の1cM以内にある、態様135〜159のいずれかの方法。
【０３６８】
態様161. 前記分子マーカーが、増大した窒素利用効率遺伝子座の0.5cM以内にある、態様135〜160のいずれかの方法。
【０３６９】
態様162. 以下の工程を含む、方法：
a. タバコ植物の第一の集団を提供する工程；
b. SEQ ID NO：9〜16からなる群より選択される配列によってコードされる遺伝子座の増大した窒素利用効率アレルの存在について前記タバコ植物の第一の集団をジェノタイピングする工程；および
c. 前記増大した窒素利用効率アレルを含む、工程（b）においてジェノタイピングされた1つまたは複数のタバコ植物を選択する工程。
【０３７０】
態様163. 以下の工程をさらに含む、態様161または162の方法：
d. 工程（c）において選択された1つまたは複数のタバコ植物を第二のタバコ植物に交雑させる工程；および
e. 工程（d）の交雑体から子孫種子を得る工程。
【０３７１】
態様164. タバコ植物の第一の集団が、メリーランド品種のものである、態様161〜163のいずれかの方法。
【０３７２】
態様165. タバコ植物の第一の集団が、MD609、MD601、バンケットA1、K326、K346、K358、K394、K399、K730、NC196、NC37NF、NC471、NC55、NC92、NC2326、NC95、NC925からなる群より選択される品種のものである、態様161〜164のいずれかの方法。
【０３７３】
態様166. 第二のタバコ植物が、TN86、TN86LC、TN90、TN90LC、TN97、TN97LCからなる群より選択される品種のものである、態様161〜165のいずれかの方法。
【０３７４】
態様167. 子孫種子が前記分子マーカーを含む、態様161〜166のいずれかの方法。
【０３７５】
態様168. 子孫種子が、増大した窒素利用効率を含む、態様161〜167のいずれかの方法。
【０３７６】
態様169. タバコ品種に増大した窒素利用効率形質を遺伝子移入する方法であって、以下の工程を含む方法：
a. 前記増大した窒素利用効率形質を含む第一のタバコ品種を前記増大した窒素利用効率形質を欠く第二のタバコ品種と交雑させる工程；
b. 工程（a）の交雑体から子孫種子を得る工程；
c. 前記増大した窒素利用効率形質に関係する分子マーカーについて工程（b）において得られた前記子孫種子の少なくとも1つをジェノタイピングする工程であって、前記分子マーカーが、SEQ ID NO：9〜16からなる群より選択される遺伝子座の20cM内にある、工程；および
d. 前記増大した窒素利用効率形質を含む子孫種子を選択する工程。
【０３７７】
態様170. 第一のタバコ品種がメリーランドタバコ品種である、態様169の方法。
【０３７８】
態様171. 第一のタバコ品種が、MD609、MD601、バンケットA1、K326、K346、K358、K394、K399、K730、NC196、NC37NF、NC471、NC55、NC92、NC2326、NC95、NC925からなる群より選択される、態様169または170の方法。
【０３７９】
態様172. 第二のタバコ品種がバーレータバコ品種である、態様169〜171のいずれかの方法。
【０３８０】
態様173. 第二のタバコ品種が、TN86、TN86LC、TN90、TN90LC、TN97、TN97LCからなる群より選択される、態様169〜172のいずれかの方法。
【０３８１】
態様174. 増大したNUEが、同じ条件で生育させた増大したNUEを欠くタバコ植物と比べて増加した部分要素生産性（PFP）を含む、態様169〜173のいずれかの方法。
【０３８２】
態様175. 増大したNUEが、同じ条件で生育させた増大したNUEを欠くタバコ植物と比べて増加した農学的効率（AE）を含む、態様169〜174のいずれかの方法。
【０３８３】
態様176. 増大したNUEが、同じ条件で生育させた増大したNUEを欠くタバコ植物と比べて増加した回収効率（RE）を含む、態様169〜175のいずれかの方法。
【０３８４】
態様177. 増大したNUEが、同じ条件で生育させた増大したNUEを欠くタバコ植物と比べて増加した生理学的効率（PE）を含む、態様169〜176のいずれかの方法。
【０３８５】
態様178. 増大したNUEが、同じ条件で生育させた増大したNUEを欠くタバコ植物と比べて増加した内部効率（IE）を含む、態様169〜177のいずれかの方法。
【０３８６】
態様179. 前記分子マーカーが前記遺伝子座の15cM以内にある、態様169〜178のいずれかの方法。
【０３８７】
態様180. 前記分子マーカーが前記遺伝子座の10cM以内にある、態様169〜179のいずれかの方法。
【０３８８】
態様181. 前記分子マーカーが前記遺伝子座の5cM以内にある、態様169〜180のいずれかの方法。
【０３８９】
態様182. 前記分子マーカーが前記遺伝子座の2cM以内にある、態様169〜181のいずれかの方法。
【０３９０】
態様183. 前記分子マーカーが前記遺伝子座の1cM以内にある、態様169〜182のいずれかの方法。
【０３９１】
態様184. 前記分子マーカーが前記遺伝子座の0.5cM以内にある、態様169〜183のいずれかの方法。
【０３９２】
態様185. 増大した窒素利用効率形質を含むタバコ植物を選択する方法であって、以下の工程を含む方法：
a. タバコ生殖質の収集物から核酸を単離する工程；
b. SEQ ID NO：9〜16からなる群より選択される遺伝子座の20cM内に位置する1つまたは複数のマーカーについて前記核酸をアッセイする工程；および
c. 増大した窒素利用効率形質を含むタバコ植物を選択する工程。
【０３９３】
態様186. 以下の工程をさらに含む、態様185の方法：
d. 工程（c）において選択されたタバコ植物を第二のタバコ植物と交雑させる工程；および
e. 工程（d）の交雑体から子孫種子を得る工程。
【０３９４】
態様187. 前記分子マーカーが前記遺伝子座の15cM以内にある、態様185または186の方法。
【０３９５】
態様188. 前記分子マーカーが前記遺伝子座の10cM以内にある、態様185〜187のいずれかの方法。
【０３９６】
態様189. 前記分子マーカーが前記遺伝子座の5cM以内にある、態様185〜188のいずれかの方法。
【０３９７】
態様190. 前記分子マーカーが前記遺伝子座の2cM以内にある、態様185〜189のいずれかの方法。
【０３９８】
態様191. 前記分子マーカーが前記遺伝子座の1cM以内にある、態様185〜190のいずれかの方法。
【０３９９】
態様192. 前記分子マーカーが前記遺伝子座の0.5cM以内にある、態様185〜191のいずれかの方法。
【０４００】
態様193. 増大した窒素利用効率形質を含むタバコ植物を選択する方法であって、以下の工程を含む方法：
a. タバコ生殖質の収集物から核酸を単離する工程；
b. SEQ ID NO：57〜64からなる群より選択されるSNPマーカーの20cM内に位置する1つまたは複数のマーカーについて前記核酸をアッセイする工程；および
c. 増大した窒素利用効率形質を含むタバコ植物を選択する工程。
【０４０１】
態様194. アッセイする工程が、SEQ ID NO：58の57位にあるGヌクレオチドについてアッセイすることを含む、態様193の方法。
【０４０２】
態様195. アッセイする工程が、SEQ ID NO：58の117位にあるCヌクレオチドについてアッセイすることを含む、態様193または194の方法。
【０４０３】
態様196. アッセイする工程が、SEQ ID NO：58の57位にあるGヌクレオチドおよび117位にあるCヌクレオチドについてアッセイすることを含む、態様193〜195のいずれかの方法。
【０４０４】
態様197. アッセイする工程が、SEQ ID NO：57の14位にあるTヌクレオチドについてアッセイすることを含む、態様193〜196の方法。
【０４０５】
態様198. アッセイする工程が、SEQ ID NO：59の162位にあるGヌクレオチドについてアッセイすることを含む、態様193〜197のいずれかの方法。
【０４０６】
態様199. アッセイする工程が、SEQ ID NO：60の36位にあるCヌクレオチドについてアッセイすることを含む、態様193〜198のいずれかの方法。
【０４０７】
態様200. アッセイする工程が、SEQ ID NO：61の36位にあるTヌクレオチドについてアッセイすることを含む、態様193〜199のいずれかの方法。
【０４０８】
態様201. アッセイする工程が、SEQ ID NO：62の36位にあるTヌクレオチドについてアッセイすることを含む、態様193〜200のいずれかの方法。
【０４０９】
態様202. アッセイする工程が、SEQ ID NO：63の36位にあるGヌクレオチドについてアッセイすることを含む、態様193〜201のいずれかの方法。
【０４１０】
態様203. アッセイする工程が、SEQ ID NO：64の36位にあるTヌクレオチドについてアッセイすることを含む、態様193〜202のいずれかの方法。
【実施例】
【０４１１】
実施例1. 圃場生産実施法
圃場で生育させるタバコ植物は、標準的な圃場生産実施法を使用して作出する。各試験区画は、最大40列の植付け実生を含む。植付け前に実生を温室で発芽させる。NUE形質を試験するために、試験区画には、1エーカー当たり窒素60ポンドの窒素率を施用する。試験区画中の植物の50％が細長い蕾の段階に達したときに、標準的な手順を使用して植物の摘心を行う。農薬施用は、標準的なプロトコルに従う。葉は、成熟時に収穫し、植物5本で乾燥用スティック1つとし、1区画当たり3つのスティックに仕分けする。伐採（takedown）／抜根段階にスティックから葉を採取する。1試料当たり15枚の葉にするために1実験品種当たり3つの異なるスティックから5枚の葉を収穫する。各植物の上から四番目の葉の葉身半分を試料採取用に収穫する。アルカロイド、TSNAおよびNO3の解析的分析は、当技術分野において公知のルーチン法を使用して行う。
【０４１２】
実施例2. 増大した窒素利用効率に関連する代謝物の特定
メリーランドタバコ品種は、バーレータバコ品種と比べておよそ25％少ない窒素肥料投入で済む。高窒素効率タバコ品種（メリーランド）および低窒素効率タバコ品種（バーレー）に関連する代謝物を特定するために、代謝物レベルの差をメリーランドタバコ品種MD609およびバーレータバコ品種TN90で調べた。
【０４１３】
MD609実生およびTN90実生を種子から発芽させ、窒素を添加しないで6週間生育させた。6週間後、各品種由来の実生を2つの群に分割した：A群は、100百万分率の窒素すなわち正常温室施肥で提供された植物を含み；B群は、25ppmすなわち25％正常温室施肥率で提供された植物を含んだ。播種後10週目および14週目に、メタノールを使用して根葉組織から代謝物を抽出した。
【０４１４】
単離した代謝物を、3つの異なるLC/MSアプローチ（UHPLC-MS/MS（+ESI）、UHPLC-MS/MS(-ESI)およびGC-MS(+EI)）を使用して解析し、個々の代謝物を分離および特定した。得られた質量スペクトルを標準スペクトルデータベース（Metabolon Inc, Morrisville, NC）と比較することによって代謝物を特定した。曲線下面積を使用してピークを定量した。中央値を1（1.00）に等しくし、各データ点を比例的に正規化することによって、各化合物をスケール調整した（「部分補正」と呼ばれる）。未知の代謝物の分子質量を表1に提供する。識別代謝物を、スケール調整した各試料の測定値と共に以下の表2〜5に示す。全ての時点を考慮に入れてTN90とMD609との間のスチューデントのt検定比較によって、識別代謝物を決定した。0.01未満のp値を有する代謝物を解析に含めた。
【０４１５】
（表１）未知の代謝物化合物の分子質量（キロダルトン単位）
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【０４１６】
（表２）播種後10週目および14週目のMD609タバコ系統とTN90タバコ系統とを比較したときの根組織において特定された増大した窒素効率と負に相関している代謝物
2020532299.tif 000004
【０４１７】
（表３）MD609タバコ系統とTN90タバコ系統とを比較したときの根組織において特定された増大した窒素効率と正に相関している代謝物
2020532299.tif 000005
【０４１８】
（表４）MD609タバコ系統とTN90タバコ系統とを比較したときの葉組織において特定された増大した窒素効率と負に相関している代謝物
2020532299.tif 000006
【０４１９】
（表５）MD609タバコ系統とTN90タバコ系統とを比較したときの葉組織において特定された増大した窒素効率と正に相関している代謝物
2020532299.tif 000007
【０４２０】
実施例3. 増大した窒素利用効率に関連する遺伝子発現の特定
実施例1で使用した同じ植物をまた、RNAseqに使用するためにRNA抽出に供する。播種後10週目および14週目に葉および根組織からRNAを抽出し、これをIlluminaシーケンシングに使用する。RNAseqデータを当技術分野において標準的な方法に従って解析した。候補遺伝子をその後検証する。
【０４２１】
17個の遺伝子（表6および7）が、MD609の増大した窒素利用効率表現型と負に相関していることが分かり、7個の遺伝子（表8および9）が、MD609の増大した窒素利用効率表現型と正に相関していることが分かった。負に相関している遺伝子は、バーレータバコ品種におけるダウンレギュレーション（変異誘発、シスジェニック形質転換またはトランスジェニック形質転換を介した）の候補であり、正に相関している遺伝子は、窒素利用効率を改善するバーレータバコ品種における過剰発現の候補である。関連する一塩基多型（SNP）マーカーを、各候補遺伝子を追跡するために提供する（表6〜10）。MD609アレルに関連した多型、よって増大したNUEにとって好ましい多型を提供する（表10）。
【０４２２】
相関遺伝子の各々についてのゲノム位置の特定は、タバコゲノムにおける増大したNUEに関連する遺伝子の4つのクラスターを特定する（図1）。7個の遺伝子が第1番染色体上に同じく位置し、4個の遺伝子が第11番染色体上に同じく位置し、3個の遺伝子が第14番染色体上に同じく位置し、5つの遺伝子が第20番染色体上に同じく位置する（図1）。これらの4つの位置はまた、低窒素条件と正常窒素条件との間で差次的に発現された遺伝子のホットスポットでもある（図1）。これらの位置の各々に特異的なMD609多型、ひいては増大したNUE多型を特定するためにSNPマーカーを作る（表6〜10）。第11番染色体上の領域をさらに特徴付けると、合計79個の発現遺伝子を含有しており、これらの遺伝子のうちの46個は、低窒素条件下で差次的に発現された遺伝子である（図2）。
【０４２３】
（表６）根組織において増大した窒素利用効率と負に相関しているとして特定された遺伝子
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【０４２４】
（表７）葉組織において増大した窒素利用効率と負に相関しているとして特定された遺伝子 
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【０４２５】
（表８）根組織において増大した窒素利用効率と正に相関しているとして特定された遺伝子
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【０４２６】
（表９）葉組織において増大した窒素利用効率と正に相関しているとして特定された遺伝子
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【０４２７】
（表１０）増大したNUEに関連する多型を含むSNPマーカー
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【０４２８】
実施例4. タバコの葉優先プロモーターおよび根優先プロモーターの特定
4週齢のTN90タバコ植物由来のRNA試料を、10種の組織タイプ（摘心前の腋芽；摘心の2時間後の腋芽；摘心の6時間後の腋芽；摘心の24時間後の腋芽；摘心の72時間後の腋芽；摘心前の根；摘心の24時間後の根；摘心の72時間後の根；摘心時の若葉；および茎頂端分裂組織）から得る。得られたRNA試料（組織タイプ毎に3種の独立して収集された試料）を、Illumina 1×100bpシーケンシングの出発材料として使用する。
【０４２９】
Illumina読み取り値をマッピングし、これを使用して高い根発現または葉発現を示す候補遺伝子のリストを特定する。表11および12は、葉優先発現または根優先発現を有するとして特定された遺伝子のRPKM発現値を提供する。これらの遺伝子は、それぞれ、葉優先プロモーターまたは根優先プロモーターを保有する候補である。
【０４３０】
（表１１）葉優先発現を有する遺伝子
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【０４３１】
（表１２）根優先発現を有する遺伝子
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【０４３２】
実施例5. 改変された植物の開発
発現ベクターp45-2-7（SEQ ID NO：65）を骨格として使用して、複数の形質転換ベクターを作製する（実施例X〜Yを参照）。p45-2-7は、CsVMVプロモーター、NOSターミネーター、ならびにアクチン2プロモーターおよびNOSターミネーターに機能的に連結されたカナマイシン選択マーカー（NPT II）を含むカセットを含有する。関心対象の導入遺伝子を含む核酸ベクターを、アグロバクテリウム形質転換を介してタバコ葉ディスクに導入する。例えば、Mayo et al., 2006, Nat Protoc. 1:1105-11 and Horsch et al., 1985, Science 227:1229-1231を参照されたい。
【０４３３】
TN90タバコ植物をMagenta（商標）GA-7ボックス内で生育させ、葉ディスクをカットしてペトリ皿に入れる。50mLの遠心分離チューブ中の20mLの細胞懸濁液を3500 RPMで10分間遠心分離することによって、形質転換ベクターを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンス細胞を収集する。上清を取り除き、アグロバクテリウム・ツメファシエンス細胞ペレットを40mLの液体再懸濁培地に再懸濁する。中肋を避けてタバコ葉を#15カミソリ刃で8つの0.6cmのディスクにカットし、上下逆にしてペトリ皿に入れる。B5ビタミン液体再懸濁培地を含むムラシゲスクーグ（Murashige & Skoog）の薄層をペトリ皿に加え、葉ディスクを先が細い針で均一に突く。およそ25mLのアグロバクテリウム・ツメファシエンス懸濁液をペトリ皿に加え、葉ディスクを懸濁液中で10分間インキュベートする。
【０４３４】
葉ディスクを共栽培ペトリ皿（1/2 MS培地）に移し、ディスクを上下逆にして共栽培TOM培地（20g/L スクロース；1mg/L インドール-3-酢酸；および2.5mg/L 6-ベンジルアミノプリン（BAP）を含むMS培地）上に敷いたフィルター紙と接触させる。ペトリ皿をパラフィルムで密閉した後、薄明かり（60〜80mE/ms）にてセ氏24度で18時間点灯と6時間消灯の光周期で3日間インキュベーションする。インキュベーション後、葉ディスクを再生/選択TOM K培地ペトリ皿（TOM培地＋300mg/Lカナマイシン）に移す。葉ディスクを、2週間に1回、芽が切り取り可能となるまで薄明かりにてセ氏24度で18時間点灯と6時間消灯の光周期で、新鮮TOM K培地に継代培養する。葉からの芽を鉗子で取り除き、100mg/L カナマイシンを含むMS基礎培地に挿入する。100mg/L カナマイシンを含むMS基礎培地上の芽を、高輝度照明（6080 mE/ms）にてセ氏24度で18時間点灯と6時間消灯の光周期でインキュベートして、発根を誘導する。
【０４３５】
芽と根の両方を含有する小植物体を十分に大きく生育させたら（例えば、Magenta（商標）GA-7ボックスの高さのおよそ半分に達するまで）、これらを土壌に移す。根付いた実生を、さらなる解析のためおよび種子をつけさせるために温室に移す。改変された植物（T0、T1、T2またはより後期の世代）および対照植物を生育させることによって、増大した窒素利用効率表現型の評価を行う。対照植物は、形質転換されていないNLM植物または空のp45-2-7ベクターで形質転換されたNLM植物のいずれかである。
【０４３６】
増大した窒素利用効率についての表現型スクリーニングを、温室で、ゼロ百万分率（ppm）の窒素（窒素なし）、25ppmの窒素（低窒素）および100ppmの窒素（正常窒素）を使用して行う。初期スクリーニングを温室でT1植物を用いて始める。次いで、ホモ接合型T2集団を、圃場で、1エーカー当たり60ポンドの肥料（バーレータバコに対する推奨率の約25％）を使用して評価する。実生生育、クロロフィル喪失および最終収量を測定し、正常窒素レベルで生育させた対照植物と比較する。
【０４３７】
T1世代では、G20580を過剰発現する植物（2つの独立した形質転換体）、G42290を過剰発現する植物（4つの独立した形質転換体）、G41446を過剰発現する植物（4つの独立した形質転換体）、G53261を過剰発現する植物（2つの独立した形質転換体）およびG30999を過剰発現する植物（3つの独立した形質転換体）を、温室で、対照と共に、1エーカー当たり窒素60ポンドに相当する窒素制限条件下で生育させる。1形質転換体当たり9つの植物を採取し、G41446を過剰発現する系統の1つが、対照と比べて収量の統計的に有意な増加（1植物当たりの新鮮重量グラム単位）を示す（図5を参照のこと）。
【０４３８】
実施例6. 増大した窒素利用効率を有するシスジェニックタバコ植物の産出
実施例2において差次的に発現されるとして特定された遺伝子が関与する遺伝子の発現を改変することによって、窒素利用効率を改善することができる。同様に、実施例1において特定された代謝物の生合成または分解に関与する遺伝子を調節して、窒素利用効率を改善することができる。増大した窒素利用効率に正に関連する遺伝子を一般的な過剰発現プロモーターまたは組織優先プロモーターを使用して過剰発現させ、所望の組織においてその遺伝子を過剰発現させることができる。
【０４３９】
増大した窒素利用効率に正に関連するタンパク質を過剰発現するように形質転換ベクターを作る。SEQ ID NO：9〜16の1つを含む別々の形質転換ベクターをp45-2-7形質転換ベクターに組み込む。追加で、SEQ ID NO：9〜16の1つを含む形質転換ベクターを作る。
【０４４０】
これらの形質転換ベクターを使用して、実施例4に従って、改変されたタバコ植物を作出する。次いで、改変されたタバコ植物（T1世代）および対照タバコ植物を、実施例4に記載の通り、表現型に関して評価する。改変されたタバコ植物は、同じ条件下で生育させた対照タバコ植物と比べて増大した窒素利用効率を示す。
【０４４１】
実施例7. 増大した窒素利用効率を有するトランスジェニックタバコ植物の産出
また、実施例2において窒素利用効率に負に関連しているとして特定された遺伝子の発現をダウンレギュレーションすることによっても窒素利用効率を増大させることができる。
【０４４２】
実施例2においてその発現が窒素利用効率に負に関連しているタバコ遺伝子を阻害するように、RNAi構築物を含む形質転換ベクターを設計する。SEQ ID NO：41〜56の1つを含む別々の形質転換ベクターをp45-2-7形質転換ベクターに組み込む。SEQ ID NO：41〜56の1つを含む追加の形質転換ベクターを作る。
【０４４３】
これらの形質転換ベクターを使用して、実施例4に従って、改変されたタバコ植物を作出する。次いで、改変されたタバコ植物（T1世代）および対照タバコ植物を、実施例4に記載の通り、表現型に関して評価する。改変されたタバコ植物は、同じ条件下で生育させた対照タバコ植物と比べて増大した窒素利用効率を示す。
【０４４４】
実施例8. 遺伝子編集技術を使用した窒素利用効率を改善する追加の方法
CRISPR/Cas9、CRISPR/Cpf1、CRISPR/CasX、CRISPR/CasY、CRISPR/Csm1、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）などの遺伝子編集技術を使用して、増大した窒素利用効率に負に関連する遺伝子のコーディング領域を、該遺伝子が非機能的なタンパク質またはより低く機能するタンパク質をコードするように改変する。また、これらの遺伝子編集技術を使用して、その同族タンパク質発現を組織葉または根組織のいずれかで駆動するように内因性プロモーター配列を編集または置き換えることで、窒素利用効率を改善する。例えば、内因性G64360を、該遺伝子が葉組織においてのみ発現され、そこで、該遺伝子が植物の窒素利用効率を改善するように働くことができるように、編集または置き換える。
【０４４５】
SEQ ID NO：9〜40のそれぞれ1つのプロモーター配列を認識してそれにハイブリダイズするように、別々のCRISPR/Cas9ガイドRNAまたはCRISPR/Cpf1ガイドRNAを構築する。操作されたガイドRNAおよびSEQ ID NO：17〜24からなる群より選択されるプロモーターを含むドナーポリヌクレオチドがタバコ植物に提供されると、選択されたプロモーターが選択された遺伝子の内因性プロモーターと置き換わり、内因性の発現を望み通り葉組織または根組織のいずれかに制限させることが可能となる。編集されたタバコ植物は、類似の条件下で生育させた対照タバコ植物と比べて増大した窒素利用効率を示す。
【０４４６】
実施例9. ランダム変異誘発を介した窒素利用効率を改善するための新規変異の開発
メタンスルホン酸エチル（EMS）変異誘発または高速中性子衝撃を使用して、タバコ植物のランダム変異誘発を実施する。EMS変異誘発は、ランダム点変異を化学的に誘導することからなる。高速中性子変異誘発は、二本鎖DNA切断を通じて大きな欠失を引き起こす中性子衝撃に種子を曝露させることからなる。
【０４４７】
EMS変異誘発のために、1グラム（およそ10,000の種子）のバーレータバコ品種TN90種子を0.1％ Tween中で15分間洗浄し、次いで、30mLのddH2O中に2時間浸漬する。次いで、150μLの0.5％ EMS（Sigma, Catalogue No. M-0880）を種子／ddH2O溶液中に混合し、フード下にて室温（RT;およそ20℃）で8〜12時間（30 R.P.M.で回転させながら）インキュベートする。次いで、種子から液体を取り除き、除染および廃棄のために1M NaOH中に一晩混合する。次いで、種子を、ddH2O 100mLで2〜4時間かけて2回洗浄する。次いで、洗浄した種子を0.1％寒天溶液に懸濁する。
【０４４８】
寒天溶液中のEMS処理した種子を、平箱に約2000種子／平箱で、水に浸漬したCarolina’s Choice Tobacco Mix（Carolina Soil Company, Kinston, NC）上に均等に広げる。次いで、平箱をラップで覆い、生育箱に入れる。土壌から実生が出現すると、ラップに穴を開けて、湿度を徐々に減退させる。2週間後にラップを完全に取り除く。平箱を温室に移動させ、NPK肥料を施用する。実生を浮遊トレイに植え込んで、植え替えサイズまで生育させる。その後、植物を圃場に植え替える。生育の間、植物を自家受粉させてM1種子を形成する。成熟段階において、さく果5個を各植物から収穫し、各植物由来の種子の組に個々の名称を与える。これはM1集団を形成する。各M0植物由来のM1種子の混合物を生育させて、増大した窒素効率について実施例4に記載の通り表現型に関して植物を評価する。増大した窒素効率を示すM1植物を選択し、当技術分野において公知のDNAシーケンシングおよび遺伝子マッピング技術を使用して変異についてスクリーニングする。
【０４４９】
実施例10. 増大した窒素利用効率を有するタバコ植物を産出するための育種の使用
従来の育種技術を使用して、本明細書に提供されるNUEの好ましいアレルを任意のタバコ品種に導入して、NUEを増大させることができる。少なくとも1つの好ましいNUEアレル（表10を参照のこと）を有するタバコ植物をその好ましいアレルを欠くタバコ植物に交雑することによって、タバコ植物の集団を産出することができる。マーカー支援選択、または当技術分野において公知の他の技術（例えば、直接シーケンシング）を、F1世代における好ましいアレルの遺伝子移入を追跡するために使用でき、後続の世代におけるヘテロ接合性またはホモ接合性を決定するために使用できる。当技術分野において公知のまたは上記の方法を使用して、子孫植物の増大したNUEを決定することができる。複数の異なるNUEの好ましいアレルを単一の系統に組み合わせることができる。代謝物シグネチャーによって決定されるような分子表現型を使用して、育種の間に増大したNUEを追跡することができる。上記の方法を使用して、子孫植物の代謝物シグネチャーを決定することができる。増大したNUEを有する親植物の代謝物シグネチャーを有する子孫植物を交雑させて、増大したNUEを有するタバコ植物の後続の集団を産出させる。
【０４５０】
市販のバーレー品種へのメリーランド609遺伝子座の導入を記載の通り実施して、増大したNUEを有するバーレー系統を開発することができる。23種類のバーレー系統および6種類のMD609系統のスクリーニングは、SNPマーカーS451（SEQ ID NO：58）にMD609アレルを含有する3種類のバーレー系統を特定した（図3）。MD609アレルを有する3種類のバーレー系統を、窒素制限条件下でクロロフィル喪失、生育および収量について試験し、対照TN90バーレー系統および対照MD609系統（SNPマーカーS451にMD609アレルを有するMD609）と比較した（図4）。MD609アレルを有するバーレー系統は、メリーランド対照とより類似したクロロフィル喪失、生育および収量を示す（図4）。TN90バーレー対照は、MD609対照と比べて増加したクロロフィル喪失、減少した生育および減少した収量を示す（図4）。これらの結果は、SNPマーカーS451でのMD609アレルの導入がNUEを増大させることができることを示す。
【０４５１】
バーレーにMD609アレルを導入するために、MD609をバーレーと交雑させた。この交雑体からのF1子孫を選択し、その後、自家受粉させてF2種子を生産させた。F2およびF3植物を生育させて、自家受粉させてF4種子を作出した。NUE-2系統およびNUE-3系統として特定された2つの独立した交雑スキームからの大量のF4種子を圃場で生育および収穫する。NUE-2系統とNUE-3系統の両方のF4種子についてSNPマーカーS451、S317、S12385、S238、S3894およびS2237の遺伝子型を決定する（表13を参照のこと）。実施例1に記載の低減させた窒素生産実施法を使用して、F4植物を生育させる。NUE-2系統とNUE-3系統は共に、バーレー対照TN90と比べて増加した1エーカー当たりの収量（ポンド単位）を示す（図6を参照のこと）。
【０４５２】
あるいは、増大したNUE表現型を含む改変されたタバコ植物を、本明細書に記載の方法を使用して産出し、改変されていないタバコ植物に交雑させて、その改変を後続の世代に伝達させることができる。遺伝子改変についての選択を、当技術分野において公知の適切な技術を使用して追跡することができる。子孫植物の増大したNUEを、当技術分野において公知のまたは上記の方法を使用して決定することができる。
【０４５３】
（表１３）F4 NUE-2系統およびNUE-3系統およびTN90由来の圃場で生育させた植物の遺伝子型。MDはMD609アレルを表し、バーレーはバーレーアレルを表し、HETはヘテロ接合型MD609／バーレーを表す。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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