(57)【要約】  本発明は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ溶血素Ａ毒素に結合する抗体、および使用方法を提供する。本発明の特定の実施形態によると、抗体は、溶血素Ａに結合する完全ヒト抗体である。本発明の抗体は、溶血素Ａ活性を阻害または中和するのに有用であり、したがって、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染症などの溶血素Ａ関連疾患または障害を予防または治療する手段を提供する。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染症の少なくとも１つの症状または合併症の治療に使用される。【選択図】図７ａ
2020504759.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶血素Ａに特異的に結合する単離されたヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、前記抗体または抗原結合断片が、
（ａ）表面プラズモン共鳴によって測定して約８０ｎＭ未満の結合解離平衡定数（ＫＤ）による３７℃での野生型溶血素Ａへの結合と、
（ｂ）表面プラズモン共鳴によって測定して約０．５分超の解離半減期（ｔ１／２）による３７℃での野生型溶血素Ａへの結合と、
（ｃ）表面プラズモン共鳴によって測定して約３０ｎＭ未満のＫＤによる２５℃での野生型溶血素Ａへの結合と、
（ｄ）表面プラズモン共鳴によって測定して約１．５分超のｔ１／２による２５℃での野生型溶血素Ａへの結合と、
（ｅ）表面プラズモン共鳴によって測定して約２０ｎＭ未満の結合解離平衡定数（ＫＤ）による３７℃での修飾溶血素Ａへの結合と、
（ｆ）表面プラズモン共鳴によって測定して約０．５分超の解離半減期（ｔ１／２）による３７℃での修飾溶血素Ａへの結合と、
（ｇ）表面プラズモン共鳴によって測定して約１０ｎＭ未満のＫＤによる２５℃での修飾溶血素Ａへの結合と、
（ｈ）表面プラズモン共鳴によって測定して約１．５分超のｔ１／２による２５℃での修飾溶血素Ａへの結合と、
（ｉ）ＧＡ２０１、ＣＡ−１２７、ＴＣＨ１５１６、ＧＡ２２９、８：０３、２７−０５、９４：１０１３、および７０３１からなる群から選択される、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ株による溶血素Ａ媒介ウサギ赤血球溶血の阻害と、
（ｊ）溶血素ＡとＡＤＡＭ１０との間の相互作用の遮断と、からなる群から選択される１つ以上の特性を表す、単離されたヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
溶血素Ａに特異的に結合する単離されたヒト抗体またはその抗原結合断片であって、配列番号２、２２、４２、６２、８２、１０２、１２２、１４２、１６２、１８２、２０２、２２２、２４２、２６２、および２８２からなる群から選択される重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）配列のうちのいずれか１つの内部に含有される３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）と、配列番号１０、３０、５０、７０、９０、１１０、１３０、１５０、１７０、１９０、２１０、２３０、２５０、および２７０からなる群から選択される軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）配列のうちのいずれか１つの内部に含有される３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）と、を含む、単離されたヒト抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３】
配列番号２、２２、４２、６２、８２、１０２、１２２、１４２、１６２、１８２、２０２、２２２、２４２、２６２、および２８２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲを含む、請求項１または２に記載の単離されたヒト抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４】
配列番号１０、３０、５０、７０、９０、１１０、１３０、１５０、１７０、１９０、２１０、２３０、２５０、および２７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離されたヒト抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５】
（ａ）配列番号２、２２、４２、６２、８２、１０２、１２２、１４２、１６２、１８２、２０２、２２２、２４２、２６２、および２８２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲと、（ｂ）配列番号１０、３０、５０、７０、９０、１１０、１３０、１５０、１７０、１９０、２１０、２３０、２５０、および２７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲと、を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離されたヒト抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６】
（ａ）配列番号４、２４、４４、６４、８４、１０４、１２４、１４４、１６４、１８４、２０４、２２４、２４４、２６４、および２８４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１ドメイン、
（ｂ）配列番号６、２６、４６、６６、８６、１０６、１２６、１４６、１６６、１８６、２０６、２２６、２４６、２６６、および２８６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２ドメイン、
（ｃ）配列番号８、２８、４８、６８、８８、１０８、１２８、１４８、１６８、１８８、２０８、２２８、２４８、２６８、および２８８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３ドメイン、
（ｄ）配列番号１２、３２、５２、７２、９２、１１２、１３２、１５２、１７２、１９２、２１２、２３２、２５２、および２７２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１ドメイン、
（ｅ）配列番号１４、３４、５４、７４、９４、１１４、１３４、１５４、１７４、１９４、２１４、２３４、２５４、および２７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２ドメイン、ならびに／または
（ｆ）配列番号１６、３６、５６、７６、９６、１１６、１３６、１５６、１７６、１９６、２１６、２３６、２５６、および２７６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３ドメイン、を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離されたヒト抗体またはその抗原結合断片。
【請求項７】
配列番号２／１０、２２／３０、４２／５０、６２／７０、８２／９０、１０２／１１０、１２２／１３０、１４２／１５０、１６２／１７０、１８２／１９０、２０２／２１０、２２２／２３０、２４２／２５０、２６２／２７０、および２８２／２７０からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離されたヒト抗体または抗原結合断片。
【請求項８】
（ｉ）配列番号２０に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖免疫グロブリン、および
配列番号１８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖免疫グロブリン、
（ｉｉ）配列番号４０に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖免疫グロブリン、および
配列番号３８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖免疫グロブリン、
（ｉｉｉ）配列番号６０に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖免疫グロブリン、および
配列番号５８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖免疫グロブリン、
（ｉｖ）配列番号８０に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖免疫グロブリン、および
配列番号７８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖免疫グロブリン、
（ｖ）配列番号１００に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖免疫グロブリン、および
配列番号９８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖免疫グロブリン、
（ｖｉ）配列番号１２０に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖免疫グロブリン、および
配列番号１１８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖免疫グロブリン、
（ｖｉｉ）配列番号１４０に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖免疫グロブリン、および
配列番号１３８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖免疫グロブリン、
（ｖｉｉｉ）配列番号１６０に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖免疫グロブリン、および
配列番号１５８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖免疫グロブリン、
（ｉｘ）配列番号１８０に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖免疫グロブリン、および
配列番号１７８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖免疫グロブリン、
（ｘ）配列番号２００に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖免疫グロブリン、および
配列番号１９８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖免疫グロブリン、
（ｘｉ）配列番号２２０に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖免疫グロブリン、および
配列番号２１８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖免疫グロブリン、
（ｘｉｉ）配列番号２４０に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖免疫グロブリン、および
配列番号２３８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖免疫グロブリン、
（ｘｉｉｉ）配列番号２６０に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖免疫グロブリン、および
配列番号２５８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖免疫グロブリン、
（ｘｉｖ）配列番号２８０に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖免疫グロブリン、および
配列番号２７８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖免疫グロブリン、ならびに／または
（ｘｖ）配列番号２８０に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖免疫グロブリン、および
配列番号２９０に記載のアミノ酸配列を含む重鎖免疫グロブリン、を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離されたヒト抗体または抗原結合断片。
【請求項９】
Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、またはｄＡｂ断片である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗原結合断片。
【請求項１０】
配列番号２、２２、４２、６２、８２、１０２、１２２、１４２、１６２、１８２、２０２、２２２、２４２、２６２、および２８２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号１０、３０、５０、７０、９０、１１０、１３０、１５０、１７０、１９０、２１０、２３０、２５０、および２７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）のＣＤＲと、を含む参照抗体と同じ溶血素Ａのエピトープに結合する、単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１１】
配列番号２、２２、４２、６２、８２、１０２、１２２、１４２、１６２、１８２、２０２、２２２、２４２、２６２、および２８２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、ならびに配列番号１０、３０、５０、７０、９０、１１０、１３０、１５０、１７０、１９０、２１０、２３０、２５０、および２７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む参照抗体と、溶血素Ａへの結合について競合する、単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１２】
（ｉ）前記抗体または断片の免疫グロブリン軽鎖および前記抗体または断片の免疫グロブリン重鎖をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入することと、
（ｉｉ）前記ポリヌクレオチド（複数可）の発現に有利な条件下で増殖培地において前記宿主細胞を培養することと、ならびに
（ｉｉｉ）任意選択的に、前記宿主細胞および／または前記宿主細胞が増殖される培地から前記抗体または断片を単離することと、を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片を作製するための方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法の生成物である、抗体または抗原結合断片。
【請求項１４】
請求項１〜１１および１３のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片を含む、注射デバイスまたは容器。
【請求項１５】
請求項１〜１１および１３のいずれか一項に記載の溶血素Ａに結合する単離されたヒト抗体またはその抗原結合断片と、薬学的に許容される担体または希釈剤と、任意選択的に、１つ以上の追加の治療薬と、を含む、医薬組成物。
【請求項１６】
抗生物質、ＮＳＡＩＤ、コルチコステロイド、ＬＣ１０、ＬＴＭ１４、および／またはプレドニゾンである前記追加の治療薬を含む、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ感染症の予防または治療を、それを必要とする患者において行うための方法であって、請求項１〜１１および１３のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片の有効量、または請求項１５もしくは１６に記載の医薬組成物を前記患者に投与することを含む、方法。
【請求項１８】
前記抗体またはその抗原結合断片が、皮下に、静脈内に、皮内に、経口で、または筋肉内に投与される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ感染症により、皮膚壊死、皮膚および軟組織感染症、膿瘍、手術部位感染症、人工関節感染症、菌血症、敗血症、敗血症性関節炎、髄膜炎、骨髄炎、心内膜炎、肺炎、中毒性ショック症候群、乳房炎、せつ腫症、カルブンケル症、吹出物からなる群から選択される状態が生じ、
前記抗体または抗原結合断片の投与により、前記状態が治療されるか、または前記状態の１つ以上の症状の重症度が低減される、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ感染症を有する患者の治療に使用するための、請求項１〜１１および１３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２１】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ感染症の治療に使用するための、請求項１〜１１および１３のいずれか一項に記載の１つ以上の抗体またはその抗原結合断片を含む、組成物。
【請求項２２】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ感染症を有する患者を治療するための薬剤の製造における、請求項１〜１１および１３のいずれかに一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ溶血素Ａ毒素に特異的に結合するヒト抗体およびそれらの抗原結合断片、ならびにそのような抗体および断片を使用する治療的および診断的方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓは、グラム陽性の通性好気性細菌であり、健康な個人の皮膚および鼻に定着することが多い。この細菌は、日和見病原体と考えられており、多くの身体部位でさまざまな疾患／状態を引き起こす可能性がある。これは、血流、皮膚、および軟組織、ならびに世界中の呼吸器感染症の主な原因である。Ｓ．ａｕｒｅｕｓによって引き起こされるヘルスケアおよびコミュニティ関連感染症の頻度は増加しており、これらの感染症と闘うための努力は、薬物耐性株、特にメチシリン耐性またはＭＲＳＡ株の出現によって妨げられてきた。
【０００３】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓは、宿主における細菌の侵入および播種を助ける、いくつかの毒性因子（細胞表面発現および分泌の両方）を発現する。分泌された毒性因子の中には、いくつかの毒素があり、そのうち最も顕著なものは、孔形成毒素である溶血素Ａである。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ溶血素Ａは、宿主細胞の膜内で七量体構造へとオリゴマー化して、細胞溶解、上皮関門破壊、炎症、および組織損傷につながる孔を形成する、３３ｋＤａ分泌単量体である（非特許文献１）。
【０００４】
血小板、単球、内皮細胞、および上皮細胞を含む複数の哺乳動物細胞型が、溶血素Ａによって溶解される。ヒトＲＢＣは、高濃度の溶血素Ａに曝露された場合にのみ溶解しやすいため、これらの細胞型のうちの１つ以上が、赤血球（ＲＢＣ）よりもむしろ溶血素Ａの生理学的に適切な標的であると提唱されている（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）。
【０００５】
溶血素Ａは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染症の動物モデルでは、肺炎、皮膚壊死、心内膜炎、および敗血症において役割を果たすことが示されている（非特許文献５；非特許文献６）。Ｓ．ａｕｒｅｕｓは、皮膚および軟組織感染症の主な原因であり（非特許文献７）、蜂巣炎および皮膚膿瘍を引き起こすことが多い。マウスモデルでは、非毒素化型溶血素Ａによる能動免疫、または溶血素Ａ特異的抗血清もしくはモノクローナル抗体（ｍＡｂ）による受動免疫によって、皮膚病変のサイズが大幅に減少し、溶血素Ａ産生Ｓ．ａｕｒｅｕｓ株によって引き起こされる皮膚壊死が予防される（非特許文献８；非特許文献９）。Ｓ．ａｕｒｅｕｓはまた、入院患者の肺炎の主な原因であり（非特許文献１０）；（非特許文献１１）、肺感染症のマウスモデルにおいて役割を果たすことが示されている（非特許文献１２）。非毒素化型溶血素Ａによる能動免疫または溶血素Ａ特異的抗血清もしくはｍＡｂにより受動免疫は、肺炎のマウスモデルにおける罹患率および死亡率を大幅に減少させる（非特許文献１３；非特許文献１４）。
【０００６】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓは、病院およびコミュニティにおける感染症の主な原因である。標準タイプの抗生物質による治療がより困難である、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）などのＳ．ａｕｒｅｕｓの抗生物質耐性株の出現は、臨床医学における現在の問題であり、抗菌予防および治療に対する新たなアプローチの開発を必要とする（非特許文献１５）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｂｅｒｕｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１３），Ｔｏｘｉｎｓ  ５：１１４０−１１６６
【非特許文献２】Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１７１９５−１７２００
【非特許文献３】Ｗｉｌｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１０），Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ  Ｓ  Ａ  １０７：１３４７３−１３４７８
【非特許文献４】Ｂｅｒｕｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１３），Ｔｏｘｉｎｓ  ５：１１４０−１１６６
【非特許文献５】Ｔｋａｃｚｙｋ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）、Ｃｌｉｎ．Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：３７７−３８５，
【非特許文献６】Ｋｅｎｎｅｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１０），Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２０２：１０５０−１０５８
【非特許文献７】Ｍｏｒａｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００６），Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５５：６６６−６７４
【非特許文献８】Ｋｅｎｎｅｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１０），Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２０２：１０５０−１０５８
【非特許文献９】Ｔｋａｃｚｙｋ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１２），Ｃｌｉｎ．Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：３７７−３８５
【非特許文献１０】Ｋｏｌｌｅｆ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５），Ｃｈｅｓｔ  １２８：３８５４−３８６２Ｅｒｒａｔｕｍ  ｉｎ  Ｃｈｅｓｔ  １２９：８３１
【非特許文献１１】Ｓｈｏｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６），Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  １０：Ｒ９７
【非特許文献１２】Ｂｕｂｅｃｋ  Ｗａｒｄｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７），Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７５：１０４０−１０４４
【非特許文献１３】Ｂｕｂｅｃｋ  Ｗａｒｄｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｓｃｈｎｅｅｗｉｎｄ，（２００８），Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０５：２８７−２９４
【非特許文献１４】Ｈｕａ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１４），Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．５８：１１０８−１１１７
【非特許文献１５】Ｋｅｎｎｅｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１０），Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２０２：１０５０−１０５８
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ溶血素Ａに特異的に結合する完全ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）およびその抗原結合断片を提供する。このような抗体は、溶血素Ａの活性を中和するのに有用であり得る。抗体は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染症を予防し、その進行を食い止め、もしくはその重症度を軽減するか、または感染再発の数、期間、もしくは重症度を低減するか、または感染症に関連する少なくとも１つの症状を改善するように作用し得る。いくつかの場合では、抗体は、例えば、皮膚壊死、皮膚および軟組織感染症（膿瘍を含む）、手術部位感染症、人工関節感染症、菌血症、敗血症、敗血症性関節炎、髄膜炎、骨髄炎、心内膜炎、肺炎、中毒性ショック症候群、乳房炎、ならびにせつ腫症およびカルブンケル症（吹出物）などのＳ．ａｕｒｅｕｓ感染症に関連する状態もしくは兆候を予防または治療するために使用され得る。そのような抗体は、単独で、またはＳ．ａｕｒｅｕｓ感染症を治療するのに有用な第２の薬剤と併用して使用することができる。特定の実施形態では、溶血素Ａに特異的な抗体は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染症の重症度を軽減するため、または感染再発の数、期間、もしくは重症度を低減するため、またはＳ．ａｕｒｅｕｓ感染症に関連する少なくとも１つの症状を改善するために、第２の薬剤と併用して治療的に与えられ得る。いくつかの場合では、併用療法を使用して、皮膚壊死、皮膚および軟組織感染症（膿瘍を含む）、手術部位感染症、人工関節感染症、菌血症、敗血症、敗血症性関節炎、髄膜炎、骨髄炎、心内膜炎、肺炎、中毒性ショック症候群、乳房炎、ならびにせつ腫症およびカルブンケル症（吹出物）などのＳ．ａｕｒｅｕｓ感染症に関連する状態または兆候を治療することができる。特定の実施形態では、抗体は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染症を発症するリスクがある患者を保護するために、独立型の治療として予防的に使用することができる。例えば、高齢患者、免疫系が弱まった患者、術後患者などの院内感染のリスクが高い患者を含む、特定の患者集団は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染症を発症するリスクがある場合がある。これらの患者集団のうちのいずれも、単独でまたは第２の薬剤と併用して投与された場合に、本発明の抗体による治療から利益を得ることができる。
【０００９】
本発明の抗体を使用して、患者におけるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ感染症を治療することができる。抗体は、完全長（例えば、ＩｇＧ１抗体もしくはＩｇＧ４抗体）であってもよく、または抗原結合部分（例えば、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、もしくはｓｃＦｖ断片）のみを含んでいてもよく、かつ機能性に影響するように、例えば、残存するエフェクター機能を排除するように（Ｒｅｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：１９２５−１９３３）、あるいはｍＡｂ半減期を増加させるように（Ｚａｌｅｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１０），Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２８：１５７−１５９）、修飾されていてもよい。本発明は、ガンマ（例えば、ガンマ−１、ガンマ−２、ガンマ−３、もしくはガンマ−４）、デルタ、アルファ、ミュー、もしくはイプシロンなどの重鎖定常領域（例えば、ヒト定常領域）に連結された本明細書で特定されるＶＨ領域、および／またはラムダもしくはカッパなどの軽鎖定常領域（例えば、ヒト定常領域）に連結された本明細書で特定される任意のＶＬ領域のうちのいずれかを含む、任意の抗体もしくはその抗原結合断片を含む。
【００１０】
したがって、第１の態様では、本発明は、溶血素Ａに特異的に結合する単離された完全ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００１１】
いくつかの場合では、ヒトモノクローナル抗体は、野生型溶血素Ａ（配列番号２９１）または修飾溶血素Ａ（配列番号２９５）に結合する。
【００１２】
一実施形態では、単離されたヒト抗体またはその抗原結合断片は、表面プラズモン共鳴によって測定して１０−７Ｍ以下のＫＤにより溶血素Ａに結合する。
【００１３】
いくつかの態様では、単離された抗体またはその抗原結合断片は、（ａ）表面プラズモン共鳴によって測定して約８０ｎＭ未満の結合解離平衡定数（ＫＤ）による３７℃での野生型溶血素Ａへの結合と、（ｂ）表面プラズモン共鳴によって測定して約０．５分超の解離半減期（ｔ１／２）による３７℃での野生型溶血素Ａへの結合と、（ｃ）表面プラズモン共鳴によって測定して約３０ｎＭ未満のＫＤによる２５℃での野生型溶血素Ａへの結合と、（ｄ）表面プラズモン共鳴によって測定して約１．５分超のｔ１／２による２５℃での野生型溶血素Ａへの結合と、（ｅ）表面プラズモン共鳴によって測定して約２０ｎＭ未満の結合解離平衡定数（ＫＤ）による３７℃での修飾溶血素Ａへの結合と、（ｆ）表面プラズモン共鳴によって測定して約０．５分超の解離半減期（ｔ１／２）による３７℃での修飾溶血素Ａへの結合と、（ｇ）表面プラズモン共鳴によって測定して約１０ｎＭ未満のＫＤによる２５℃での修飾溶血素Ａへの結合と、（ｈ）表面プラズモン共鳴によって測定して約１．５分超のｔ１／２による２５℃での修飾溶血素Ａへの結合と、からなる群から選択される１つ以上の特性を表す。
【００１４】
いくつかの場合では、溶血素Ａに結合する単離されたヒト抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２、２２、４２、６２、８２、１０２、１２２、１４２、１６２、１８２、２０２、２２２、２４２、２６２、および２８２からなる群から選択される重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）配列のうちのいずれか１つの内部に含有される３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）、ならびに／または、配列番号１０、３０、５０、７０、９０、１１０、１３０、１５０、１７０、１９０、２１０、２３０、２５０、および２７０からなる群から選択される軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）配列のうちのいずれか１つの内部に含有される３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）を含む。ＨＣＶＲアミノ酸配列およびＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを同定するための方法および技術は、当該技術分野においてよく知られており、それらを使用して、本明細書に開示される同定された重鎖可変領域（複数可）（ＨＣＶＲ）および／または軽鎖可変領域（複数可）（ＬＣＶＲ）アミノ酸配列内のＣＤＲを同定することができる。ＣＤＲの境界を同定するために使用することができる例示的な規則は、例えば、Ｋａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、およびＡｂＭ定義を含む。一般的にいえば、Ｋａｂａｔ定義は、配列の可変性に基づいており、Ｃｈｏｔｈｉａ定義は、構造ループ領域の位置に基づいており、ＡｂＭ定義は、ＫａｂａｔのアプローチとＣｈｏｔｈｉａのアプローチとの間の折衷案である。例えば、Ｋａｂａｔ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）；Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７−９４８；およびＭａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：９２６８−９２７２を参照されたい。抗体内のＣＤＲ配列を同定するために、公開データベースも利用可能である。
【００１５】
いくつかの実施形態では、溶血素Ａに結合する単離されたヒト抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２、２２、４２、６２、８２、１０２、１２２、１４２、１６２、１８２、２０２、２２２、２４２、２６２、および２８２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲを含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、溶血素Ａに結合する単離されたヒト抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１０、３０、５０、７０、９０、１１０、１３０、１５０、１７０、１９０、２１０、２３０、２５０、および２７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む。
【００１７】
いくつかの場合では、溶血素Ａに結合する単離されたヒト抗体またはその抗原結合断片は、（ａ）配列番号２、２２、４２、６２、８２、１０２、１２２、１４２、１６２、１８２、２０２、２２２、２４２、２６２、および２８２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲと、（ｂ）配列番号１０、３０、５０、７０、９０、１１０、１３０、１５０、１７０、１９０、２１０、２３０、２５０、および２７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲと、を含む。
【００１８】
一実施形態では、溶血素Ａに結合する単離されたヒト抗体またはその抗原結合断片は、
（ａ）配列番号４、２４、４４、６４、８４、１０４、１２４、１４４、１６４、１８４、２０４、２２４、２４４、２６４、および２８４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１ドメインと、
（ｂ）配列番号６、２６、４６、６６、８６、１０６、１２６、１４６、１６６、１８６、２０６、２２６、２４６、２６６、および２８６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２ドメインと、
（ｃ）配列番号８、２８、４８、６８、８８、１０８、１２８、１４８、１６８、１８８、２０８、２２８、２４８、２６８、および２８８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３ドメインと、
（ｄ）配列番号１２、３２、５２、７２、９２、１１２、１３２、１５２、１７２、１９２、２１２、２３２、２５２、および２７２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１ドメインと、
（ｅ）配列番号１４、３４、５４、７４、９４、１１４，１３４、１５４、１７４、１９４、２１４、２３４、２５４、および２７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２ドメインと、
（ｆ）配列番号１６、３６、５６、７６、９６、１１６、１３６、１５６、１７６、１９６、２１６、２３６、２５６、および２７６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３ドメインと、を含む。
【００１９】
様々な実施形態では、本発明は、溶血素Ａに結合する完全ヒトモノクローナル抗体もしくはその抗原結合断片であって、以下の特徴：（ｉ）配列番号２、２２、４２、６２、８２、１０２、１２２、１４２、１６２、１８２、２０２、２２２、２４２、２６２、および２８２からなる群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそれらの実質的に類似の配列を有するＨＣＶＲを含むこと、（ｉｉ）配列番号１０、３０、５０、７０、９０、１１０、１３０、１５０、１７０、１９０、２１０、２３０、２５０、および２７０からなる群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそれらの実質的に類似の配列を有するＬＣＶＲを含むこと、（ｉｉｉ）配列番号８、２８、４８、６８、８８、１０８、１２８、１４８、１６８、１８８、２０８、２２８、２４８、２６８、および２８８、５３６、５５２、５６８、および５８４からなる群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそれらの実質的に類似の配列を有するＨＣＤＲ３ドメイン、ならびに配列番号１６、３６、５６、７６、９６、１１６、１３６、１５６、１７６、１９６、２１６、２３６、２５６、および２７６からなる群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそれらの実質的に類似の配列を有するＬＣＤＲ３ドメインを含むこと、（ｉｖ）配列番号４、２４、４４、６４、８４、１０４、１２４、１４４、１６４、１８４、２０４、２２４、２４４、２６４、および２８４からなる群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそれらの実質的に類似の配列を有するＨＣＤＲ１ドメイン、配列番号６、２６、４６、６６、８６、１０６、１２６、１４６、１６６、１８６、２０６、２２６、２４６、２６６、および２８６からなる群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそれらの実質的に類似の配列を有するＨＣＤＲ２ドメイン、配列番号１２、３２、５２、７２、９２、１１２、１３２、１５２、１７２、１９２、２１２、２３２、２５２、および２７２からなる群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそれらの実質的に類似の配列を有するＬＣＤＲ１ドメイン、ならびに配列番号１４、３４、５４、７４、９４、１１４、１３４、１５４、１７４、１９４、２１４、２３４、２５４、および２７４からなる群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそれらの実質的に類似の配列を有するＬＣＤＲ２ドメインを含むこと、ならびに／または（ｖ）表面プラズモン共鳴によって測定して１０−７Ｍ以下のＫＤによる溶血素Ａとの結合のうちの１つ以上を表す、完全ヒトモノクローナル抗体もしくはその抗原結合断片を提供する。
【００２０】
別の態様では、本発明は、配列番号２、２２、４２、６２、８２、１０２、１２２、１４２、１６２、１８２、２０２、２２２、２４２、２６２、および２８２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）、ならびに配列番号１０、３０、５０、７０、９０、１１０、１３０、１５０、１７０、１９０、２１０、２３０、２５０、および２７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）のＣＤＲを含む参照抗原または抗原結合断片と、溶血素Ａへの結合について競合する単離された抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００２１】
別の態様では、本発明は、配列番号２、２２、４２、６２、８２、１０２、１２２、１４２、１６２、１８２、２０２、２２２、２４２、２６２、および２８２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）のＣＤＲ、ならびに配列番号１０、３０、５０、７０、９０、１１０、１３０、１５０、１７０、１９０、２１０、２３０、２５０、および２７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）のＣＤＲを含む参照抗体または抗原結合断片と同じ溶血素Ａのエピトープに結合する単離された抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００２２】
いくつかの実施形態では、本発明は、溶血素Ａに結合する単離されたヒト抗体またはその抗原結合断片であって、配列番号２／１０、２２／３０、４２／５０、６２／７０、８２／９０、１０２／１１０、１２２／１３０、１４２／１５０、１６２／１７０、１８２／１９０、２０２／２１０、２２２／２３０、２４２／２５０、２６２／２７０、および２８２／２７０からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、単離されたヒト抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００２３】
別の態様では、本発明は、抗溶血素Ａ抗体またはそれらの断片をコードする核酸分子を提供する。本発明の核酸を保有する組換え発現ベクター、およびそのようなベクターが導入された宿主細胞もまた、抗体の産生を可能にする条件下で宿主細胞を培養することによって、および産生された抗体を回収することによって、抗体を産生する方法と同様に本発明に含まれる。
【００２４】
いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号１、２１、４１、６１、８１、１０１、１２１、１４１、１６１、１８１、２０１、２２１、２４１、２６１、および２８１からなる群から選択される核酸配列、またはそれらと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の相同性を有する実質的に同一の配列によってコードされるＨＣＶＲを含む、抗体もしくはその断片を提供する。
【００２５】
いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号９、２９、４９、６９、８９、１０９、１２９、１４９、１６９、１８９、２０９、２２９、２４９、および２６９からなる群から選択される核酸配列、またはそれらと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の相同性を有する実質的に同一の配列によってコードされるＬＣＶＲをさらに含む。
【００２６】
いくつかの場合では、本発明は、配列番号７、２７、４７、６７、８７、１０７、１２７、１４７、１６７、１８７、２０７、２２７、２４７、２６７、および２８７からなる群から選択されるヌクレオチド配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそれらの実質的に類似の配列によってコードされるＨＣＤＲ３ドメイン、ならびに配列番号１５、３５、５５、７５、９５、１１５、１３５、１５５、１７５、１９５、２１５、２３５、２５５、および２７５からなる群から選択されるヌクレオチド配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそれらの実質的に類似の配列によってコードされるＬＣＤＲ３ドメインを含む抗体もしくは抗体の抗原結合断片を提供する。
【００２７】
いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号３、２３、４３、６３、８３、１０３、１２３、１４３、１６３、１８３、２０３、２２３、２４３、２６３、および２８３、５６３、および５７９からなる群から選択されるヌクレオチド配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそれらの実質的に類似の配列によってコードされるＨＣＤＲ１ドメイン、配列番号５、２５、４５、６５、８５、１０５、１２５、１４５、１６５、１８５、２０５、２２５、２４５、２６５、および２８５からなる群から選択されるヌクレオチド配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそれらの実質的に類似の配列によってコードされるＨＣＤＲ２ドメイン、配列番号１１、３１、５１、７１、９１、１１１、１３１、１５１、１７１、１９１、２１１、２３１、２５１、および２７１からなる群から選択されるヌクレオチド配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそれらの実質的に類似の配列によってコードされるＬＣＤＲ１ドメイン、ならびに配列番号１３、３３、５３、７３、９３、１１３、１３３、１５３、１７３、１９３、２１３、２３３、２５３、および２７３からなる群から選択されるヌクレオチド配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそれらの実質的に類似の配列によってコードされるＬＣＤＲ２ドメインをさらに含む抗体もしくはその断片を提供する。
【００２８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるように、溶血素Ａに結合する抗体またはその抗原結合断片は、放射性核種標識またはＭＲＩ検出可能な標識などの検出可能な標識に連結され得る。
【００２９】
別の態様では、本発明は、上記または本明細書に記載されるように、溶血素Ａに結合する単離された完全ヒトモノクローナル抗体もしくはその抗原結合断片、および薬学的に許容される担体もしくは希釈剤を含む医薬組成物を提供する。
【００３０】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、上記または本明細書に記載される特徴のうちのいずれか１つ以上を有する溶血素Ａに結合する完全ヒトモノクローナル抗体を含む。一実施形態では、抗体は、１０−７Ｍ以下のＫＤにより溶血素Ａに結合する。様々な実施形態では、組成物は、溶血素Ａに結合し、かつ配列番号２／１０、２２／３０、４２／５０、６２／７０、８２／９０、１０２／１１０、１２２／１３０、１４２／１５０、１６２／１７０、１８２／１９０、２０２／２１０、２２２／２３０、２４２／２５０、２６２／２７０、および２８２／２７０からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を有する抗体を含む。本発明はまた、単離されたヒト抗体もしくは抗原結合断片であって、（ｉ）配列番号２０に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖免疫グロブリン、および配列番号１８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖免疫グロブリン、（ｉｉ）配列番号４０に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖免疫グロブリン、および配列番号３８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖免疫グロブリン、（ｉｉｉ）配列番号６０に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖免疫グロブリン、および配列番号５８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖免疫グロブリン、（ｉｖ）配列番号８０に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖免疫グロブリン、および配列番号７８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖免疫グロブリン、（ｖ）配列番号１００に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖免疫グロブリン、および配列番号９８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖免疫グロブリン、（ｖｉ）配列番号１２０に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖免疫グロブリン、および配列番号１１８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖免疫グロブリン、（ｖｉｉ）配列番号１４０に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖免疫グロブリン、および配列番号１３８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖免疫グロブリン、（ｖｉｉｉ）配列番号１６０に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖免疫グロブリン、および配列番号１５８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖免疫グロブリン、（ｉｘ）配列番号１８０に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖免疫グロブリン、および配列番号１７８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖免疫グロブリン、（ｘ）配列番号２００に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖免疫グロブリン、および配列番号１９８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖免疫グロブリン、（ｘｉ）配列番号２２０に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖免疫グロブリン、および配列番号２１８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖免疫グロブリン、（ｘｉｉ）配列番号２４０に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖免疫グロブリン、および配列番号２３８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖免疫グロブリン、（ｘｉｉｉ）配列番号２６０に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖免疫グロブリン、および配列番号２５８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖免疫グロブリン、（ｘｉｖ）配列番号２８０に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖免疫グロブリン、および配列番号２７８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖免疫グロブリン、または（ｘｖ）配列番号２８０に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖免疫グロブリン、および配列番号２９０に記載のアミノ酸配列を含む重鎖免疫グロブリンを含む。
【００３１】
いくつかの場合では、本発明は、本発明の抗体または抗体の抗原結合断片と第２の治療薬との組み合わせである組成物を特徴とする。第２の治療剤は、小分子薬物、タンパク質／ポリペプチド、抗体、そのようなアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはｓｉＲＮＡなどの核酸分子であり得る。第２の治療剤は、合成であっても天然由来であってもよい。第２の治療剤は、本発明の抗体またはその断片と有利に組み合わされる任意の薬剤であり得る。
【００３２】
特定の実施形態では、第２の治療剤は、本発明の抗体または抗体の抗原結合断片に関連する何らかの起こり得る副作用（複数可）が生じるであろう場合、そのような副作用（複数可）を抑制または低減するのを助ける薬剤であり得る。
【００３３】
また、本発明の抗体および薬学的に許容される組成物は、併用療法において用いることができること、すなわち、抗体および薬学的に許容される組成物は、１つ以上の他の所望の治療薬もしくは医療処置と同時に、その前に、またはそれに続いて投与され得ることも理解されるであろう。併用レジメンで用いる治療（治療薬または処置）の特定の組み合わせは、所望の治療薬および／または処置の適合性ならびに達成されるべき所望の治療効果を考慮したものであろう。用いられる治療は、同じ障害に対して所望の効果を達成し得る（例えば、抗体は、同じ障害を治療するために使用される別の薬剤と同時に投与され得る）か、またはそれらが異なる効果を達成し得る（例えば、有害作用）ことも理解されるであろう。本明細書で使用されるように、特定の疾患または状態を治療または予防するために通常投与される追加の治療薬は、治療される疾患または状態に適している。関連技術分野で認識されるように、複数の治療薬を同時投与する場合、用量は、それに応じて調整することができる。
【００３４】
別の態様では、本発明は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓによって引き起こされる一次感染症を予防、治療、または管理し、かつＳ．ａｕｒｅｕｓ感染症の再発を低減、排除、または予防するための方法を提供する。いくつかの場合では、本発明は、皮膚壊死、皮膚および軟組織感染症（膿瘍を含む）、手術部位感染症、人工関節感染症、菌血症、敗血症、敗血症性関節炎、髄膜炎、骨髄炎、心内膜炎、肺炎、中毒性ショック症候群、乳房炎、ならびにせつ腫症およびカルブンケル症（吹出物）などのＳ．ａｕｒｅｕｓ感染症に関連する疾患もしくは障害を予防および／または治療するための方法を含む。特定の実施形態では、本発明は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染症を罹患している患者を治療するため、またはＳ．ａｕｒｅｕｓ感染症に関連する少なくとも１つの症状もしくは合併症を治療するか、またはＳ．ａｕｒｅｕｓ感染症の進行を食い止めるための方法を提供し、本方法は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ感染症関連状態もしくは疾患が予防されるか、またはその重症度および／もしくは期間が軽減されるか、あるいは状態もしくは疾患に関連する少なくとも１つの症状もしくは合併症が予防または改善されるか、あるいはＳ．ａｕｒｅｕｓ感染症の頻度および／もしくは期間もしくは重症度が低減されるように、溶血素Ａに結合する抗体もしくはその抗原結合断片の有効量、または溶血素Ａに結合する抗体もしくはその抗原結合断片の有効量を含む医薬組成物を患者に投与することを含む。上記に考察される方法の様々な実施形態では、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの細菌は、抗生物質治療の１つ以上のタイプに対して耐性であり得る。一実施形態では、細菌は、メチシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）である。
【００３５】
方法のいくつかの実施形態では、本発明の抗体を含む医薬組成物は、第２の治療薬と組み合わせて患者に投与される。
【００３６】
本発明の実施形態では、抗体もしくはその抗原結合断片または抗体を含む医薬組成物は、皮下に、静脈内に、皮内に、経口的に、もしくは筋肉内に投与される。
【００３７】
関連する実施形態では、本発明は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染症もしくは溶血素Ａ毒素の存在に関連するか、またはそれらによって引き起こされる疾患もしくは障害の予防または治療のための薬剤の製造における、本発明の単離された抗溶血素Ａ抗体もしくは抗体の抗原結合部分の使用を含む。本発明はまた、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染症または溶血素Ａ毒素の存在に関連するか、またはそれらによって引き起こされる疾患もしくは障害を予防または治療するための、単離された抗溶血素Ａ抗体もしくはその抗原結合部分の使用を含む。様々な実施形態では、これらの疾患または障害は、皮膚壊死、皮膚および軟組織感染症（膿瘍を含む）、手術部位感染症、人工関節感染症、菌血症、敗血症、敗血症性関節炎、髄膜炎、骨髄炎、心内膜炎、肺炎、中毒性ショック症候群、乳腺炎、ならびにせつ腫瘍症およびカルブンケル症（吹出物）を含む。一実施形態では、本発明は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染症の治療用の薬剤の製造における、単離された抗溶血素Ａ抗体またはその抗原結合断片の使用を含む。いくつかの場合では、本発明は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ感染症を離間しているか、または発症するリスクのある患者を治療するための、上記もしくは本明細書で考察されるような抗溶血素Ａ抗体もしくはその抗原結合断片の使用を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、皮膚壊死、皮膚および軟組織感染症（膿瘍を含む）、手術部位感染症、人工関節感染症、菌血症、敗血症、敗血症性関節炎、髄膜炎、骨髄炎、心内膜炎、肺炎、中毒性ショック症候群、乳房炎、ならびにせつ腫症およびカルブンケル症（吹出物）を罹患している患者を治療するための、上記もしくは本明細書で考察されるような抗溶血素Ａ抗体もしくはその抗原結合断片の使用を含む。
【００３８】
他の実施形態は、後述の詳細な説明の総説から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】Ｓ．ａｕｒｅｕｓ溶血素Ａへの抗溶血素Ａ抗体の結合を示す。
【図２ａ】Ｓ．ａｕｒｅｕｓ二成分毒素のＦサブユニットへの抗溶血素Ａ抗体の結合を示し、図２ａは、ＬｕｋＦへの結合を示す。
【図２ｂ】Ｓ．ａｕｒｅｕｓ二成分毒素のＦサブユニットへの抗溶血素Ａ抗体の結合を示し、図２ｂは、ＬｕｋＤへの結合を示す。
【図２ｃ】Ｓ．ａｕｒｅｕｓ二成分毒素のＦサブユニットへの抗溶血素Ａ抗体の結合を示し、図２ｃは、ＨＩｇＢへの結合を示す。
【図３ａ】Ｓ．ａｕｒｅｕｓ二成分毒素の成分への抗溶血素Ａ抗体Ｈ１Ｈ１５３８１Ｐの結合を示し、図３ａは、ＬｕｋＦ、ＬｕｋＳ、およびＬｕｋＥへの結合を示す。
【図３ｂ】Ｓ．ａｕｒｅｕｓ二成分毒素の成分への抗溶血素Ａ抗体Ｈ１Ｈ１５３８１Ｐの結合を示し、図３ｂは、ＨｌｇＡおよびＨｌｇＣへの結合を示す。
【図３ｃ】Ｓ．ａｕｒｅｕｓ二成分毒素の成分への抗溶血素Ａ抗体Ｈ１Ｈ１５３８１Ｐの結合を示し、図３ｃは、デルタ毒素への結合を示す。
【図４ａ】図４ａは、抗溶血素Ａ抗体Ｈ１Ｈ１５３７７Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３８１Ｐ、またはＨ１Ｈ１５３９９Ｐによる毒素誘発ＡＤＡＭ１０活性の遮断を示す。
【図４ｂ】図４ｂは、抗溶血素Ａ抗体Ｈ１Ｈ１５３７７またはＨ１Ｈ１５３９９による、ウサギ赤血球膜への溶血素Ａの結合の防止を示す。
【図５ａ】Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＣＡ−１２７を感染させ、様々な抗体（Ｈ１Ｈ１５３７７Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３８１Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３９９Ｐ、ＬＴＭ１４、ＬＣ１０、または対照抗体）で治療したマウスにおける皮膚壊死病変のサイズを、５、０．５、または０．１２５ｍｇ／ｋｇで示す。
【図５ｂ】Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＣＡ−１２７を感染させ、様々な抗体（Ｈ１Ｈ１５３７７Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３８１Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３９９Ｐ、ＬＴＭ１４、ＬＣ１０、または対照抗体）で治療したマウスにおける皮膚壊死病変のサイズを、５、０．５、または０．１２５ｍｇ／ｋｇで示す。
【図５ｃ】Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＣＡ−１２７を感染させ、様々な抗体（Ｈ１Ｈ１５３７７Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３８１Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３９９Ｐ、ＬＴＭ１４、ＬＣ１０、または対照抗体）で治療したマウスにおける皮膚壊死病変のサイズを、５、０．５、または０．１２５ｍｇ／ｋｇで示す。
【図６ａ】Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  Ｎｅｗｍａｎを感染させ、様々な抗体（Ｈ１Ｈ１５３７７Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３８１Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３９９Ｐ、ＬＴＭ１４、ＬＣ１０、または対照抗体）で治療したマウスにおける皮膚壊死病変のサイズを、５、０．５、または０．１２５ｍｇ／ｋｇで示す。
【図６ｂ】Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  Ｎｅｗｍａｎを感染させ、様々な抗体（Ｈ１Ｈ１５３７７Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３８１Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３９９Ｐ、ＬＴＭ１４、ＬＣ１０、または対照抗体）で治療したマウスにおける皮膚壊死病変のサイズを、５、０．５、または０．１２５ｍｇ／ｋｇで示す。
【図６ｃ】Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  Ｎｅｗｍａｎを感染させ、様々な抗体（Ｈ１Ｈ１５３７７Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３８１Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３９９Ｐ、ＬＴＭ１４、ＬＣ１０、または対照抗体）で治療したマウスにおける皮膚壊死病変のサイズを、５、０．５、または０．１２５ｍｇ／ｋｇで示す。
【図７ａ】様々な抗溶血素Ａ  ｍＡｂ（Ｈ１Ｈ１５３７７Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３８１Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３９９Ｐ、ＬＴＭ１４、ＬＣ１０、または対照抗体）を投与したマウスの皮膚におけるＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＣＡ−１２７（ＭＲＳＡ）またはＳ．ａｕｒｅｕｓ  Ｎｅｗｍａｎ（ＭＳＳＡ）細菌数を示す。
【図７ｂ】様々な抗溶血素Ａ  ｍＡｂ（Ｈ１Ｈ１５３７７Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３８１Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３９９Ｐ、ＬＴＭ１４、ＬＣ１０、または対照抗体）を投与したマウスの皮膚におけるＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＣＡ−１２７（ＭＲＳＡ）またはＳ．ａｕｒｅｕｓ  Ｎｅｗｍａｎ（ＭＳＳＡ）細菌数を示す。
【図８ａ】様々な抗体（Ｈ１Ｈ１５３７７Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３８１Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３９９Ｐ、ＬＴＭ１４、ＬＣ１０、または対照抗体）で治療したＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＣＡ−１２７を感染させたマウスの肺における細菌負荷を、１．２５または０．３２５ｍｇ／ｋｇで示す。
【図８ｂ】様々な抗体（Ｈ１Ｈ１５３７７Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３８１Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３９９Ｐ、ＬＴＭ１４、ＬＣ１０、または対照抗体）で治療したＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＣＡ−１２７を感染させたマウスの肺における細菌負荷を、１．２５または０．３２５ｍｇ／ｋｇで示す。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
本発明の方法を説明する前に、本発明は、特定の方法および説明される実験条件が変わり得るので、このような方法および条件に限定されないことが理解されるべきである。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、本発明の範囲が添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、限定することを企図するものではないことも理解されるべきである。
【００４１】
別段定義されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は全て、本発明の属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に説明されるものと類似のまたは等価の何らかの方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法および材料をこれより説明する。本明細書で言及される全ての出版物は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００４２】
定義
「溶血素Ａ」および「溶血素Ａ毒素」という用語は、宿主細胞の膜内の七量体構造にオリゴマー化して細胞溶解、炎症、および組織損傷を引き起こす孔を形成する、Ｓ．ａｕｒｅｕｓによって分泌される３３ｋＤａの単量体タンパク質を互換的に指す。野生型溶血素Ａのアミノ酸配列は、配列番号２９１に示されている。修飾溶血素Ａ（Ｈ３５Ｌ変異体）のアミノ酸配列は、配列番号２９５に示されている。別段留意されない限り、溶血素Ａへの言及は、野生型形態を指す。ＨｌａＨ３５Ｌは、３５位のヒスチジンがロイシンに変化された溶血素Ａである。これにより、毒素が孔形成前段階まで宿主細胞膜上に集合することが可能になるが、完全に機能的な孔は形成されない。これにより、溶血素Ａは無毒になる。
【００４３】
本明細書で使用される「抗体」という用語は、４つのポリペプチド鎖、すなわちジスルフィド結合によって相互接続された２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖から構成される免疫グロブリン分子（すなわち、「完全抗体分子」）、ならびにこれらの多量体（例えば、ＩｇＭ）またはその抗原結合断片を指すことが企図される。各重鎖は、重鎖可変領域（「ＨＣＶＲ」または「ＶＨ」）および重鎖定常領域（ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインから構成される）から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（「ＬＣＶＲまたは「ＶＬ」）および軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成される。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域が点在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域へとさらに細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、以下：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順でアミノ末端からカルボキシ末端へと配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される。本発明の特定の実施形態では、抗体（またはその抗原結合断片）のＦＲは、ヒト生殖系列配列と同一であり得るか、または天然にもしくは人工的に修飾され得る。アミノ酸コンセンサス配列は、２つ以上のＣＤＲの並列分析に基づいて定義され得る。
【００４４】
１つ以上のＣＤＲ残基の置換または１つ以上のＣＤＲの省略も可能である。抗体は、１つまたは２つのＣＤＲが結合のために省かれる場合がある科学文献に記載されている。Ｐａｄｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．（ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１９９５，９：１３３−１３９）は、公開された結晶構造に基づいて、抗体とこれらの抗原との間の接触領域を分析し、ＣＤＲ残基の約１／５〜１／３のみが実際に抗原と接触すると結論付けた。Ｐａｄｌａｎは、１つまたは２つのＣＤＲが抗原と接触しているアミノ酸を有さない多くの抗体も発見した（Ｖａｊｄｏｓ  ｅｔ  ａｌ．２００２  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３２０：４１５−４２８も参照されたい）。
【００４５】
抗原と接触していないＣＤＲ残基は、先行研究（例えば、ＣＤＲＨ２中の残基Ｈ６０〜Ｈ６５は必要とされないことが多い）に基づいて、ＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲの外側にあるＫａｂａｔのＣＤＲの領域から、分子モデリングによって、かつ／または演繹的に識別することができる。ＣＤＲまたはその残基（複数可）が省略される場合、そのＣＤＲもしくはその残基（複数可）は、通常、別のヒト抗体配列もしくはこのような配列のコンセンサスにおける対応する位置を占有するアミノ酸と置換される。ＣＤＲ内の置換のための位置および置換すべきアミノ酸も演繹的に選択することができる。演繹的な置換は、保存的置換または非保存的置換であり得る。    
【００４６】
本明細書に開示される完全ヒト抗溶血素Ａモノクローナル抗体は、対応する生殖系列配列と比較して、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのフレームワークおよび／またはＣＤＲ領域に１つ以上のアミノ酸置換、挿入、および／または欠失を含み得る。このような変異は、本明細書に開示されるアミノ酸配列を、例えば、公共の抗体配列データベースから入手可能な生殖系列配列と比較することによって容易に確認することができる。本発明は、本明細書に開示するアミノ酸配列のいずれかに由来する抗体およびその抗原結合断片を含み、１つ以上のフレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内の１つ以上のアミノ酸は、抗体が由来した生殖系列配列の対応する残基（複数可）へ、または別のヒト生殖系列配列の対応する残基（複数可）へ、または対応する生殖系列残基（複数可）の保存的アミノ酸置換へ変異する（このような配列変化はまとめて、「生殖系列変異」と本明細書で呼ばれる）。当業者であれば、本明細書に開示される重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列から出発して、１つ以上の個々の生殖系列変異またはこれらの組み合わせを含む多数の抗体および抗体結合断片を容易に産生することができる。特定の実施形態では、ＶＨおよび／もしくはＶＬドメイン内のフレームワークおよび／もしくはＣＤＲ残基のうちの全てが、抗体が由来した元の生殖系列配列において見出される残基へと再び変異する。他の実施形態では、特定の残基のみが元の生殖系列配列へと変異し戻され、例えば、変異した残基は、ＦＲ１の最初の８つのアミノ酸内に、もしくはＦＲ４の最後の８つのアミノ酸内に見出されるか、または変異した残基は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、もしくはＣＤＲ３内にのみ見出される。他の実施形態では、フレームワークおよび／またはＣＤＲ残基（複数可）のうちの１つ以上は、異なる生殖系列配列（すなわち、抗体が本来由来した生殖系列配列とは異なる生殖系列配列）の対応する残基（複数可）へ変異する。さらに、本発明の抗体は、フレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内に２つ以上の生殖系列変異の任意の組み合わせを含有してもよく、例えば、特定の個々の残基は、特定の生殖系列配列の対応する残基へ変異するのに対し、元の生殖系列配列とは異なる特定の他の残基は、維持されるか、または異なる生殖系列配列の対応する残基へ変異する。いったん得られれば、１つ以上の生殖系列変異を含有する抗体および抗体結合断片は、結合特異性の改善、結合親和性の増加、アンタゴニストもしくはアゴニストの生物学的特性の改善もしくは増強（場合によって）、免疫原性の低下などの１つ以上の所望の特性について容易に試験することができる。この一般的な方法で得られる抗体および抗体結合断片は、本発明の範囲内に包含される。
【００４７】
本発明は、１つ以上の保存的置換を有する本明細書に開示されるＨＣＶＲアミノ酸配列、ＬＣＶＲアミノ酸配列、および／またはＣＤＲアミノ酸配列のうちのいずれかの変異体を含む完全ヒト抗溶血素Ａモノクローナル抗体も含む。例えば、本発明は、本明細書に開示されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列のうちのいずれかに関連する、例えば１０個以下、８つ以下、６つ以下、または４つ以下などの保存的アミノ酸置換を有するＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列を有する抗溶血素Ａ抗体を含む。
【００４８】
「ヒト抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を含むことが企図される。本発明のヒトｍＡｂは、例えば、ＣＤＲ、特にＣＤＲ３における、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的変異誘発によって、またはインビボでの体細胞突変異によって導入された変異）によってコードされないアミノ酸残基を含み得る。しかしながら、「ヒト抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、別の哺乳動物種（例えば、マウス）の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトＦＲ配列へと移植されたｍＡｂを含むことは企図されない。
【００４９】
「〜を特異的に結合する」もしくは「〜へ特異的に結合する」という用語、またはこれらに類するものは、抗体もしくはその抗原結合断片が、生理学的条件下で比較的安定的である抗原と複合体を形成することを意味する。特異的結合は、少なくとも約１×１０−６Ｍ以下の平衡解離定数を特徴とし得る（例えば、より小さなＫＤは、より緊密な結合を示す）。２つの分子が特異的に結合するかどうかを決定するための方法は、当該技術分野でよく知られており、例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴、およびこれらに類するものを含む。本明細書に記載されるように、溶血素Ａに特異的に結合する抗体は、表面プラズモン共鳴、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）によって識別されている。そのうえ、溶血素Ａにおける１つのドメインおよび１つ以上のさらなる抗原に結合する多重特異性抗体、または溶血素Ａの２つの異なる領域に結合する二重特異性は、それにもかかわらず、本明細書で使用されるような「特異的に結合する」抗体とみなされる。
【００５０】
「高親和性」抗体という用語は、表面プラズモン共鳴、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）または溶液親和性ＥＬＩＳＡによって測定して、少なくとも１０−７Ｍ、好ましくは１０−８Ｍ、より好ましくは１０−９Ｍ、さらにより好ましくは１０−１０Ｍ、さらにより好ましくは１０−１１ＭのＫＤとして表される溶血素Ａに対する結合親和性を有するｍＡｂを指す。
【００５１】
「緩徐なオフ速度」、「Ｋｏｆｆ」、または「ｋｄ」という用語は、表面プラズモン共鳴、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）によって測定して、１×１０−３秒−１以下、好ましくは１×１０−４秒−１以下の速度定数で溶血素Ａから解離する抗体を記載することを意味する。
【００５２】
抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合断片」という用語、およびこれらに類するものは、本明細書で使用される場合、任意の天然に生じる、酵素処理で入手可能な、合成の、または遺伝子操作された、抗原を特異的に結合して複合体を形成するポリペプチドもしくは糖タンパク質を含む。抗体の「抗原結合断片」または「抗体断片」という用語は、本明細書で使用される場合、溶血素Ａに結合する能力を保持する抗体の１つ以上の断片を指す。
【００５３】
特定の実施形態では、本発明の抗体もしくは抗体断片は、抗生物質、第２の抗溶血素Ａ抗体、もしくはＩＬ−１、ＩＬ−６、もしくはＴＧＦ−βなどのサイトカインに対する抗体などの治療部分（「免疫抱合体」）、またはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ感染症、皮膚および軟組織感染症（膿瘍を含む）、手術部位感染症、人工関節感染症、菌血症、敗血症、敗血症性関節炎、髄膜炎、骨髄炎、心内膜炎、肺炎、中毒性ショック症候群、乳房炎、ならびにせつ腫症およびカルブンケル症（吹出物）を含む疾患もしくは状態を治療するのに有用な任意の他の治療部分に接合され得る。
【００５４】
「単離された抗体」は、本明細書で使用される場合、異なる抗原特異性を有する他の抗体（Ａｂ）を実質的に含まない抗体を指すことが企図される（例えば、溶血素Ａを特異的に結合する単離された抗体またはその断片は、溶血素Ａ以外の抗原を特異的に結合するＡｂを実質的に含まない）。
【００５５】
「表面プラズモン共鳴」という用語は、本明細書で使用される場合、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）システム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ、スウェーデン国ウプサラ市および米国ニュージャージー州ピスカタウェイ郡区）を使用して、バイオセンサマトリックス内のタンパク質濃度の変化の検出によって実時間での生体分子相互作用の分析を可能にする光学現象を指す。
【００５６】
「ＫＤ」という用語は、本明細書で使用される場合、特定の抗体・抗原相互作用の平衡解離定数を指すことが企図される。
【００５７】
「エピトープ」という用語は、パラトープとして知られる抗体分子の可変領域における特異的抗原結合部位と相互作用する抗原決定基を指す。単一の抗原は、１つ超のエピトープを有し得る。したがって、異なる抗体は、抗原上の異なる領域に結合し得、かつ異なる生物学的効果を有し得る。「エピトープ」という用語は、Ｂ細胞および／またはＴ細胞が応答する抗原上の部位も指す。この用語は、抗体が結合する抗原の領域も指す。エピトープは、構造的または機能的と定義され得る。機能的エピトープは、概して、構造エピトープのサブセットであり、相互作用の親和性に直接寄与する残基を有する。エピトープは、立体配座的でもあり得、すなわち、非線形アミノ酸から構成され得る。特定の実施形態では、エピトープは、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基、またはスルホニル基などの分子の化学的に活性のある表面群である決定基を含み得、特定の実施形態では、特異的三次元構造特徴および／または比電荷特徴を有し得る。
【００５８】
「実質的な同一性」または「実質的に同一である」という用語は、核酸またはその断片を指す場合、別の核酸（またはその相補鎖）との適切なヌクレオチド挿入または欠失と最適に整列したときに、以下に考察されるように、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、またはＧＡＰなど、配列同一性の任意の周知であるアルゴリズムによって測定して、ヌクレオチド塩基の少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のヌクレオチド配列同一性があることを示す。参照核酸分子と実質的な同一性を有する核酸分子は、特定の場合では、参照核酸分子によってコードされるポリペプチドと同じまたは実質的に類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。
ポリペプチドに適用される場合、「実質的な類似性」または「実質的に類似の」という用語は、２つのペプチド配列が、既定のギャップ重みを使用してプログラムＧＡＰもしくはＢＥＳＴＦＩＴなどによって最適に整列された場合、少なくとも９０％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％、９８％、または９９％の配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換だけ異なる。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を備えた側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換されたものである。概して、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させないであろう。２つ以上のアミノ酸配列が保存的置換だけ互いに異なる場合、相同性の百分率または程度は、置換の保存的性質を補正するために上向きに調整してもよい。この調整を行うための手段は、当業者によく知られている。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７−３３１を参照されたい。類似の化学的特性を備えた側鎖を有するアミノ酸基の例としては、１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン、２）脂肪族−ヒドロキシル側鎖：セリンおよびトレオニン、３）アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン、４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン、５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、およびヒスチジン、６）酸性側鎖：アスパラギン酸およびグルタミン酸、ならびに７）含硫側鎖：システインおよびメチオニンが挙げられる。好ましい保存的アミノ酸置換基は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、およびアスパラギン−グルタミンである。代替的に、保存的置換とは、参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｏｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１４４３  ４５に開示されるＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて正の値を有する任意の変化である。「適度に保存的な」置換とは、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて負以外の値を有する任意の変化である。
【００５９】
ポリペプチドについての配列類似性は、典型的には、配列解析ソフトウェアを使用して測定される。タンパク質解析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む様々な置換、欠失、および他の修飾に割り当てられた類似性の測定値を使用して類似の配列と一致させる。例えば、ＧＣＧソフトウェアは、異なる種の生物由来の相同ポリペプチドのような密接に関連するポリペプチド間の、または野生型タンパク質とその変異タンパク質の間の配列相同性もしくは配列同一性を決定するための既定パラメータとともに使用することができるＧＡＰおよびＢＥＳＴＦＩＴなどのプログラムを含有する。例えば、ＧＣＧ第６．１版を参照されたい。ポリペプチド配列は、ＧＣＧ第６．１版におけるプログラムである、既定パラメータまたは推奨パラメータを備えたＦＡＳＴＡを使用して比較することもできる。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３）は、問い合わせ配列と検索配列の間の最良重複の領域の整列およびパーセント配列同一性を提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ（２０００）上述）。本発明の配列を、異なる生物由来の多数の配列を含有するデータベースと比較する場合の別の好ましいアルゴリズムは、既定パラメータを使用するコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ、特にＢＬＡＳＴＰまたはＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０および（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（これらの各々が、参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【００６０】
特定の実施形態では、本発明の方法において使用するための抗体または抗体断片は、単一特異性、二重特異性、または多重特異性であり得る。多重特異性抗体は、１つの標的ポリペプチドの異なるエピトープに特異的であり得るか、または１つ超の標的ポリペプチドのエピトープに特異的な抗原結合ドメインを含有し得る。本発明の背景において使用することができる例示的な二重特異性抗体フォーマットは、第１の免疫グロブリン（Ｉｇ）ＣＨ３ドメインおよび第２のＩｇＣＨ３ドメインの使用を包含し、第１および第２のＩｇＣＨ３ドメインは、少なくとも１つのアミノ酸だけ互いに異なっており、少なくとも１つのアミノ酸の相違は、このアミノ酸の相違を欠失する二重特異性抗体と比較して、タンパク質Ａへの二重特異性抗体の結合を低減させる。一実施形態では、第１のＩｇＣＨ３ドメインは、タンパク質Ａに結合し、第２のＩｇＣＨ３ドメインは、Ｈ９５Ｒ修飾（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる、ＥＵ番号付けによるＨ４３５Ｒ）などのタンパク質Ａ結合を低減または消失させる変異を含有する。第２のＣＨ３は、さらに、Ｙ９６Ｆ修飾（ＩＭＧＴによる、ＥＵによるＹ４３６Ｆ）を含み得る。第２のＣＨ３の内部に見出され得るさらなる修飾には、ＩｇＧ１  ｍＡｂの場合、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる、ＥＵによるＤ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、およびＶ４２２Ｉ）、ＩｇＧ２  ｍＡｂの場合、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ、ＥＵによるＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、およびＶ４２２Ｉ）、ならびにＩｇＧ４  ｍＡｂの場合、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる、ＥＵによるＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、およびＶ４２２Ｉ）が含まれる。上記に記載される二重特異性抗体フォーマットの変形は、本発明の範囲内で熟慮される。
【００６１】
「治療有効量」という語句は、所望の効果のために投与されて所望の効果を生じる量を意味する。正確な量は、治療の目的によることになっており、既知の技術を使用して当業者によって確認できるであろう（例えば、Ｌｌｏｙｄ（１９９９）Ｔｈｅ  Ａｒｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇを参照されたい）。
【００６２】
一般的な説明
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ溶血素Ａ毒素は、３３ｋＤａの分泌型単量体タンパク質であり、宿主細胞の膜内で七量体構造にオリゴマー化して、細胞溶解、炎症、および組織損傷につながる孔を形成する。溶血素Ａは、肺炎、皮膚壊死、心内膜炎、および敗血症において役割を果たすことが示されている。
【００６３】
本明細書に記載される抗体は、溶血素Ａへの特異的な結合を実証しており、いくつかの実施形態では、、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染症を罹患している患者を治療するか、またはそのような感染症を予防するのに有用であり得る。そのような抗体の使用は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染症を罹患している患者を治療する有効な手段であってもよいし、またはＳ．ａｕｒｅｕｓ感染症の症状の重症度を軽減するために使用されてもよい。これらは、単独で、または限定されないが、抗生物質、非ステロイド性抗炎症薬物（ＮＳＩＡＤ）（または他の緩和療法）、もしくはプレドニゾンなどのコルチコステロイドなどのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ感染症を治療するための当該技術分野で知られている他の治療部分もしくは様式との補助療法として使用され得る。それらは、溶血素Ａ以外の抗原に特異的なさらなる抗体と併用して使用され得るか、または他のタイプの治療と組み合わされ得る。
【００６４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗体は、皮膚壊死、皮膚および軟組織感染症（膿瘍を含む）、手術部位感染症、人工関節感染症、菌血症、敗血症、敗血症性関節炎、髄膜炎、骨髄炎、心内膜炎、肺炎、中毒性ショック症候群、乳房炎、ならびにせつ腫症およびカルブンケル症（吹出物）を含むがこれらに限定されない、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ感染症の疾患もしくは状態の予防、治療、または管理に有用であり得る。
【００６５】
特定の実施形態では、本発明の抗体は、天然の全長溶血素Ａ（配列番号２９１）などの一次免疫原、または修飾形態の溶血素Ａ（配列番号２９５）もしくは溶血素Ａ断片で免疫され、続いて二次免疫原、または溶血素Ａの免疫原的に活性な断片で免疫されたマウスから得られる。
【００６６】
免疫原は、溶血素Ａの免疫原性断片またはその断片をコードするＤＮＡであり得る。免疫原は、ヒスチジンタグおよび／または抗体のＦｃ領域の断片に連結された溶血素Ａであり得る。
【００６７】
全長溶血素Ａのアミノ酸配列は、配列番号２９１として示されている。修飾溶血素Ａの全長アミノ酸配列は、配列番号２９５として示されている。
【００６８】
特定の実施形態では、溶血素Ａに特異的に結合する抗体は、上記の領域の断片、または本明細書に記載される領域のＮもしくはＣ末端のいずれかもしくは両方から約５〜約２０個のアミノ酸残基だけ指定領域を超えて延在するペプチドを使用して調製され得る。特定の実施形態では、上記の領域またはその断片の任意の組み合わせを、溶血素Ａ特異性抗体の調製において使用され得る。特定の実施形態では、溶血素Ａの上記の領域のうちの任意の１つ以上、またはその断片は、単一特異性抗体、二重特異性抗体、または多重特異性抗体を調製するために使用され得る。
【００６９】
抗体の抗原結合断片
別段具体的に示されない限り、「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、２つの免疫グロブリン重鎖および２つの免疫グロブリン軽鎖を含む抗体分子（すなわち、「完全抗体分子」）ならびにその抗原結合断片を包含すると理解されるものとする。抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合断片」という用語、およびこれらに類するものは、本明細書で使用される場合、任意の天然に生じる、酵素処理で入手可能な、合成の、または遺伝子操作された、抗原を特異的に結合して複合体を形成するポリペプチドもしくは糖タンパク質を含む。抗体の「抗原結合断片」または「抗体断片」という用語は、本明細書で使用される場合、溶血素Ａに特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の断片を指す。抗体断片は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ｄＡｂ断片、ＣＤＲを含有する断片、または単離されたＣＤＲを含み得る。抗体の抗原結合断片は、例えば、ＤＮＡコード抗体可変ドメインおよび（任意選択的に）定常ドメインの操作および発現を包含するタンパク質消化技術または組換え遺伝子操作技術などの任意の好適な標準的技術を使用した完全抗体分子に由来し得る。このようなＤＮＡは、知られており、かつ／または例えば、市販の供給源、ＤＮＡライブラリー（例えば、ファージ抗体ライブラリーを含む）から容易に入手可能であるか、あるいは合成することができる。ＤＮＡは、例えば、１つ以上の可変ドメインおよび／もしくは定常ドメインを好適な配置へと配置するか、またはコドンを導入し、システイン残基を創造し、アミノ酸を修飾、付加、もしくは欠失などするために、化学的に、または分子生物学技術を使用することによって配列決定および操作され得る。
【００７０】
抗体結合断片の非限定例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、（ｉｉｉ）Ｆｄ断片、（ｉｖ）Ｆｖ断片、（ｖ）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、（ｖｉ）ｄＡｂ断片、および（ｖｉｉ）抗体の超可変領域（例えば、ＣＤＲ３ペプチドなどの単離された相補性決定領域（ＣＤＲ））を模倣するアミノ酸残基、または拘束ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４ペプチドからなる最小認識単位が挙げられる。ドメイン特異性抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ナノボディ（例えば、一価ナノボディ、二価ナノボディなど）、小モジュラー免疫薬（ＳＭＩＰ）、およびサメ可変ＩｇＮＡＲドメインなどの他の工学操作された分子もまた、本明細書で使用されるような「抗原結合断片」の表現内に包含される。
【００７１】
抗体の抗原結合断片は、典型的には、少なくとも１つの可変ドメインを含むであろう。可変ドメインは、任意のサイズまたはアミノ酸組成物であり得、概して、１つ以上のフレームワーク配列に隣接しているか、または１つ以上のフレームワーク配列とともにインフレームである、少なくとも１つのＣＤＲを含むであろう。ＶＬドメインに関連するＶＨドメインを有する抗体結合断片において、ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、任意の好適な配置で互いに対して位置付けられ得る。例えば、可変領域は、二量体であり、かつＶＨ−ＶＨ、ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＬ二量体を含有し得る。代替的に、抗体の抗原結合断片は、単量体のＶＨドメインまたはＶＬドメインを含有し得る。
【００７２】
特定の実施形態では、抗体の抗原結合断片は、少なくとも１つの定常ドメインに共有結合された少なくとも１つの可変ドメインを含有し得る。本発明の抗体の抗原結合断片の内部に見出すことができる可変ドメインおよび定常ドメインの非限定的で例示的な配置には、（ｉ）ＶＨ−ＣＨ１、（ｉｉ）ＶＨ−ＣＨ２、（ｉｉｉ）ＶＨ−ＣＨ３、（ｉｖ）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２、（ｖ）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３、（ｖｉ）ＶＨ−ＣＨ２−ＣＨ３、（ｖｉｉ）ＶＨ−ＣＬ、（ｖｉｉｉ）ＶＬ−ＣＨ１、（ｉｘ）ＶＬ−ＣＨ２、（ｘ）ＶＬ−ＣＨ３、（ｘｉ）ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２、（ｘｉｉ）ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３、（ｘｉｉｉ）ＶＬ−ＣＨ２−ＣＨ３、ならびに（ｘｉｖ）ＶＬ−ＣＬが含まれる。先に列挙した例示的な配置のうちのいずれかを含む、可変ドメインおよび定常ドメインの任意の配置では、可変ドメインおよび定常ドメインは、互いに直接連結され得るか、または完全ヒンジ領域もしくは部分的ヒンジ領域もしくはリンカー領域によって連結され得るかのいずれかであり得る。ヒンジ領域は、単一のポリペプチド分子において隣接する可変ドメインおよび／または定常ドメイン間の可撓性または半可撓性の結合をもたらす少なくとも２つの（例えば、５、１０、１５、２０、４０、６０またはそれより多数の）アミノ酸からなり得る。そのうえ、本発明の抗体の抗原結合断片は、互いとおよび／または１つ以上の単量体ＶＨドメインもしくはＶＬドメインと非共有結合性会合している（例えば、ジスルフィド結合（複数可）によって）、先に列挙した可変ドメイン配置および定常ドメイン配置のいずれかのホモ二量体またはヘテロ二量体（または他の多量体）を含み得る。
【００７３】
完全抗体分子と同様に、抗原結合断片は、単一特異性または多重特異性（例えば、二重特異性）であり得る。抗体の多重特異性抗原結合断片は、典型的には、少なくとも２つの異なる可変ドメインを含むことになっており、各可変ドメインは、別個の抗原へまたは同じ抗原上の異なるエピトープに特異的に結合することができる。本明細書に開示される例示的な二重特異性抗体フォーマットを含む、任意の多重特異性抗体フォーマットは、当該技術分野で利用可能な通例の技術を使用して、本発明の抗体の抗原結合断片という背景における使用に適合され得る。
【００７４】
本発明は、抗溶血素Ａ抗体、および本明細書に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン鎖を有する抗原結合断片、ならびに細胞性および／またはインビトロの翻訳後修飾を有する変異体を含む。例えば、本発明は、本明細書に記載の重鎖および／または軽鎖アミノ酸配列（例えば、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、および／またはＣＤＲ−Ｌ３）を含む溶血素Ａに特異的に結合する抗体およびその抗原結合断片、ならびに１つ以上のアミノ酸残基がグリコシル化されている抗体および断片、１つ以上のＡｓｎ残基が脱アミド化されている抗体および断片、１つ以上の残基（例えば、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、および／またはＨｉｓ）が酸化されている抗体および断片、Ｎ末端Ｇｌｎがピログルタメート（ｐｙｒｏＥ）である抗体および断片、ならびに／またはＣ末端リジンが欠けている抗体および断片を含む。
【００７５】
本発明は、本発明の抗溶血素Ａ抗体もしくはその抗原結合断片、またはその免疫グロブリン鎖を作製するための組換え方法を含み、（ｉ）当該抗体もしくは抗原結合断片の軽鎖および／または重鎖免疫グロブリン鎖（例えば、重鎖もしくはそのＶＨ、またはそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む免疫グロブリン、ならびに／またはその軽鎖もしくはそのＶＬ、またはそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む免疫グロブリン）をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを導入することであって、例えば、ポリヌクレオチドがベクター内にあり、かつ／またはプロモーターに動作可能に連結されている、１つ以上のポリヌクレオチドを導入することと、（ｉｉ）ポリヌクレオチド（複数可）の発現に好ましい条件下で宿主細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはＰｉｃｈｉａ細胞またはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞）を培養することと、（ｉｉｉ）任意選択的に、宿主細胞および／または宿主細胞が増殖する培地から抗体または断片または鎖を単離することと、を含む。１つ超の免疫グロブリン鎖を含む抗体または抗原結合断片、例えば、２つの重鎖免疫グロブリンおよび２つの軽鎖免疫グロブリンを含む抗体を作製する場合、単一の宿主細胞における鎖の同時発現が、例えば、そのような鎖が分泌される場合、細胞内または細胞表面上または細胞外に、抗体もしくは抗原結合断片分子を形成するように、鎖の会合をもたらす。本方法は、重鎖免疫グロブリンのみまたは軽鎖免疫グロブリンのみ（例えば、成熟断片および／またはその可変ドメインを含む本明細書で考察されたもののうちのいずれか）が発現されるものを含む。そのような鎖は、例えば、そのような鎖を含む抗体または抗原結合断片の発現における中間体として有用である。本発明は、そのような発現方法の生成物（例えば、抗体、抗原結合断片、ＶＨ、またはＶＬ）を含む。
【００７６】
ヒト抗体の調製
トランスジェニックマウスにおいてヒト抗体を生成するための方法は、当該技術分野で知られている。溶血素Ａに特異的に結合するヒト抗体を作製するために、何らかのこのような既知の方法を本発明の背景において使用することができる。
【００７７】
モノクローナル抗体を生成するためにＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（商標）技術（例えば、ＵＳ６，５９６，５４１，Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）を参照されたい）または何らかの他の既知の方法を使用して、ヒト可変領域およびマウス定常領域を有する溶血素Ａに対する高親和性キメラ抗体を最初に単離する。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）技術は、マウスが抗原刺激に対する応答においてヒト可変領域とマウス定常領域とを含む抗体を産生するように、ヒト重鎖可変領域とヒト軽鎖可変領域とを含むゲノムが内在性マウス定常領域座に動作可能に連結されたトランスジェニックマウスの生成を包含する。抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを単離し、ヒト重鎖定常領域およびヒト軽鎖定常領域をコードするＤＮＡに動作可能に連結する。次に、完全ヒト抗体を発現することができる細胞においてＤＮＡを発現させる。
【００７８】
概して、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスに関心対象の抗原を負荷し、抗体を発現するマウスからリンパ細胞（Ｂ細胞など）を回収する。リンパ細胞を骨髄腫細胞株と融合させて不死化ハイブリドーマ細胞株を調製し得、関心対象の抗原に特異的な抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定するためにこのようなハイブリドーマ細胞株をスクリーニングおよび選択する。重鎖および軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを単離し得、重鎖および軽鎖の望ましいアイソタイプ定常領域へ連結することができる。このような抗体タンパク質は、ＣＨＯ細胞などの細胞において産生され得る。代替的に、抗原特異的キメラ抗体または軽鎖および重鎖の可変ドメインをコードするＤＮＡを抗原特異的リンパ球から直接単離することができる。
【００７９】
最初に、ヒト可変領域とマウス定常領域とを有する高親和性キメラ抗体を単離する。以下の実験の節と同様に、抗体は、親和性、選択性、エピトープなどを含む望ましい特徴について特徴付けられ、かつ選択される。本発明の完全ヒト抗体、例えば野生型または修飾ＩｇＧ１もしくはＩｇＧ４を生成するために、マウス定常領域を所望のヒト定常領域と置換する。選択された定常領域は特異的用途に応じて変化し得るが、高親和性抗原結合特徴および標的特異性特徴は、可変領域に存在する。
【００８０】
概して、本発明の抗体は、固相または液相のいずれかに固定化された抗原への結合によって測定された場合、非常に高い親和性を有し、典型的には、約１０−１２〜約１０−７ＭのＫＤを保有する。マウス定常領域を所望のヒト定常領域と置換して、本発明の完全ヒト抗体を生成する。選択された定常領域は特異的用途に応じて変化し得るが、高親和性抗原結合特徴および標的特異性特徴は、可変領域に存在する。
【００８１】
生物学的等価物
本発明の抗溶血素Ａ抗体および抗体断片は、記載される抗体のものとは異なるアミノ酸配列を有するが、溶血素Ａに結合する能力を保持しているタンパク質を包含する。そのような変異抗体および抗体断片は、親配列と比較して、アミノ酸の１つ以上の付加、欠失、または置換を含むが、記載される抗体のものと本質的に同等である生物学的活性を示す。同様に、本発明の抗体コードＤＮＡ配列は、開示された配列と比較して、ヌクレオチドの１つ以上の付加、欠失、または置換を含むが、本発明の抗体または抗体断片と本質的に生物学的に等価である抗体または抗体断片をコードする配列を包含する。
【００８２】
２つの抗原結合タンパク質または抗体は、例えば、それらが類似の実験条件下で単回用量または複数回用量のいずれかで同じモル用量で投与された場合に、吸収速度および吸収の程度が有意差を示さない医薬的等価物または医薬的選択肢である場合、生物学的等価物とみなされる。いくつかの抗体は、これらの吸収の程度において等価であるが、吸収速度は等価ではなく、また吸収速度のこのような差が意図的であり、かつ標識する際に反映されているので生物学的に等価とみなされ得る場合、等価物または医薬代替物とみなされることになっており、例えば長期使用に及ぼす有効な身体薬物濃度の達成に必須ではなく、かつ研究される特定の薬物生成物にとって医学的に有意ではないとみなされる。
【００８３】
一実施形態では、２つの抗原結合タンパク質は、これらの安全性、純度、または有効性において臨床的に有意性のある差がない場合、生物学的に等価である。
【００８４】
一実施形態では、２つの抗原結合タンパク質は、免疫原性の臨床的に有意な変化または有効性の減退を含む有害作用のリスクの期待される上昇なしで参照生成物と生物学的生成物の間での切り替えなしで持続される療法と比較して、患者が１回以上切り替えられることができる場合、生物学的に等価である。
【００８５】
一実施形態では、２つの抗原結合タンパク質は、これらが両方とも、条件または使用条件についての共通の機序または作用機序によって、このような機序が既知である程度まで作用する場合、生物学的に等価である。
【００８６】
生物学的等価性は、インビボおよび／またはインビトロの方法によって実証され得る。生物学的等価性測定法には、例えば、（ａ）抗体またはその代謝産物の濃度を、血液、血漿、血清または他の生物学的流体中で時間の関数として測定する、ヒトまたは他の哺乳動物におけるインビボでの試験、（ｂ）ヒトインビボ生物学的利用能データと相関し、このデータの十分な予測となるインビトロ試験、（ｃ）抗体（またはその標的）の適切な急性薬理学的効果を時間の関数として測定する、ヒトまたは他の哺乳類におけるインビボ試験、および（ｄ）抗体の安全性、有効性、または生物学的利用能もしくは生物学的等価性を確立する、よく管理された臨床試験が含まれる。
【００８７】
本発明の抗体の生物学的に等価な変異体は、例えば、残基もしくは配列の様々な置換を生じさせること、または生物活性に必要とされない末端もしくは内部の残基もしくは配列を欠失させることによって構築され得る。例えば、生物学的活性にとって必須ではないシステイン残基は、再生の際の不必要または不正確な分子内ジスルフィド架橋の形成を防止するために、欠失または他のアミノ酸で置換することができる。他の背景では、生物学的に等価の抗体には、抗体のグリコシル化特徴を修飾するアミノ酸変化、例えばグリコシル化を排除または除去する変異を含む、抗体変異体が含まれ得る。
【００８８】
Ｆｃ変異体を含む抗溶血素Ａ抗体
本発明の特定の実施形態によると、例えば、中性ｐＨと比較して酸性ｐＨで、ＦｃＲｎ受容体への抗体結合を増強または減少させる１つ以上の突然変異を含むＦｃドメインを含む、抗溶血素Ａ抗体が提供される。例えば、本発明は、ＦｃドメインのＣＨ２またはＣＨ３領域に変異を含む抗溶血素Ａ抗体を含み、変異（複数可）は、酸性環境において（例えば、ｐＨが約５．５〜約６．０の範囲のエンドソームにおいて）ＦｃＲｎに対するＦｃドメインの親和性を増加させる。そのような突然変異は、動物に投与されたときに抗体の血清半減期の増加をもたらし得る。そのようなＦｃ修飾の非限定的な例には、例えば、２５０位（例えば、ＥまたはＱ）、２５０位および４２８位（例えば、ＬまたはＦ）、２５２位（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／ＷまたはＴ）、２５４位（例えば、ＳまたはＴ）、および２５６位（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤまたはＴ）での修飾、または４２８位および／もしくは４３３位（例えば、Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／ＱまたはＫ）および／もしくは４３４位（例えば、Ａ、Ｗ、Ｈ、Ｆ、またはＹ［Ｎ４３４Ａ、Ｎ４３４Ｗ、Ｎ４３４Ｈ、Ｎ４３４Ｆ、またはＮ４３４Ｙ］）での修飾、あるいは２５０位および／もしくは４２８位の修飾、あるいは３０７位もしくは３０８位（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）、および４３４位での修飾が含まれる。一実施形態では、修飾は、４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８Ｌ）および４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）修飾、４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２５９Ｉ）、および３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）修飾、４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）および４３４（例えば、４３４Ｙ）修飾、２５２、２５４、および２５６（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅ）修飾、２５０Ｑおよび４２８Ｌ修飾（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ４２８Ｌ）、ならびに３０７および／または３０８修飾（複数可）（例えば、３０８Ｆおよび／または３０８Ｐ）を含む。さらに別の実施形態では、修飾は、２６５Ａ（例えば、Ｄ２６５Ａ）および／または２９７Ａ（例えば、Ｎ２９７Ａ）修飾を含む。
【００８９】
例えば、本発明は、２５０Ｑおよび２４８Ｌ（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ２４８Ｌ）、２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅ（例えば、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、およびＴ２５６Ｅ）、４２８Ｌおよび４３４Ｓ（例えば、Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓ）、２５７Ｉおよび３１１Ｉ（例えば、Ｐ２５７ＩおよびＱ３１１Ｉ）、２５７Ｉおよび４３４Ｈ（例えば、Ｐ２５７ＩおよびＮ４３４Ｈ）、３７６Ｖおよび４３４Ｈ（例えば、Ｄ３７６ＶおよびＮ４３４Ｈ）、３０７Ａ、３８０Ａ、および４３４Ａ（例えば、Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０Ａ、およびＮ４３４Ａ）、ならびに４３３Ｋおよび４３４Ｆ（例えば、Ｈ４３３ＫおよびＮ４３４Ｆ）からなる群から選択される１つ以上の変異対または変異群を含む、Ｆｃドメインを含む抗溶血素Ａ抗体を含む。前述のＦｃドメイン変異、および本明細書に開示される抗体可変ドメイン内の他の変異の全ての可能な組み合わせが、本発明の範囲内で熟慮される。
【００９０】
一実施形態では、本発明はまた、キメラ重鎖定常（ＣＨ）領域を含む抗溶血素Ａ抗体を含み、キメラＣＨ領域は、１つ超の免疫グロブリンアイソタイプのＣＨ領域に由来するセグメントを含む。例えば、本発明の抗体は、ヒトＩｇＧ１分子、ヒトＩｇＧ２分子、またはヒトＩｇＧ４分子に由来するＣＨ３ドメインの一部または全部と組み合わされた、ヒトＩｇＧ１分子、ヒトＩｇＧ２分子、またはヒトＩｇＧ４分子に由来するＣＨ２ドメインの一部または全部を含む、キメラＣＨ領域を含み得る。特定の実施形態によると、本発明の抗体は、キメラヒンジ領域を有するキメラＣＨ領域を含む。例えば、キメラヒンジは、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域、ヒトＩｇＧ２ヒンジ領域、またはヒトＩｇＧ４ヒンジ領域に由来する「下部ヒンジ」配列（ＥＵ番号付けによる位置２２８〜２３６のアミノ酸残基）と組み合わされた、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域、ヒトＩｇＧ２ヒンジ領域、またはヒトＩｇＧ４ヒンジ領域に由来する「上部ヒンジ」アミノ酸配列（ＥＵ番号付けによる位置２１６〜２２７のアミノ酸残基）を含み得る。特定の実施形態によると、キメラヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４上部ヒンジに由来するアミノ酸残基と、ヒトＩｇＧ２下部ヒンジに由来するアミノ酸残基と、を含む。本明細書に記載されるようなキメラＣＨ領域を含む抗体は、特定の実施形態では、抗体の治療特性または薬物動態学的特性に悪影響を与えることなく、修飾Ｆｃエフェクター機能を呈し得る。（例えば、２０１３年２月１日に出願された、米国仮特許出願第６１／７５９，５７８号（その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。）
【００９１】
本発明はまた、タンパク質Ａの結合を妨害する１つ以上の置換（例えば、変異）が導入されている修飾重鎖定常（ＣＨ）領域を含む抗溶血素Ａ抗体も含む。例えば、いくつかの実施形態では、本発明の抗溶血素Ａ抗体は、Ｈｉｓ４３５がＡｒｇに変異されているＩｇＧ１定常領域を有する。重鎖定常領域におけるこの点突然変異では、本発明の抗溶血素Ａ抗体は、タンパク質Ａに結合しないであろう。本発明の他の実施形態では、抗溶血素Ａ抗体は、タンパク質Ａ結合を無効にするための重鎖定常領域におけるジペプチド変異、Ｈ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆ（ＥＵ番号付け、ＩＭＧＴによるＨ９５Ｒ／Ｙ９６Ｆ）を含有する。（例えば、２０１０年６月２５日に出願された、米国特許第８，５８６，７１３号（その開示は、その全体が参照により本明細書により組み込まれる）を参照されたい。）
【００９２】
抗体の生物学的特徴
概して、本発明の抗体は、溶血素Ａに結合することによって機能し得る。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、別の抗原に結合し得る（交差反応性抗体）。
【００９３】
特定の実施形態では、本発明の抗体は、溶血素Ａに加えて他の細菌毒素または毒素サブユニットに結合し得る。本発明の抗体が結合し得るＳ．ａｕｒｅｕｓのさらなる毒素または毒素サブユニットは、二成分孔形成白血球毒素（例えば、ロイコシジンまたはガンマ溶血素）および／またはこれらの毒素のＳもしくはＦサブユニット（例えば、ＬｕｋＦ、ＬｕｋＤ、および／またはＨｌｇＢ）を含む。特定の実施形態では、本発明の抗体は、溶血素Ａへの有意な結合のみを示す。特定の実施形態では、本発明の抗体は、溶血素Ａに検出可能な程度にのみ結合する。
【００９４】
特定の実施形態では、本発明の抗体は、二重特異性抗体であり得る。本発明の二重特異性抗体は、１つのドメイン中の１つのエピトープに結合し得、かつ溶血素Ａの第２のドメイン中の１つのエピトープにも結合し得る。特定の実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、同じドメイン中の２つの異なるエピトープに結合し得る。
【００９５】
一実施形態では、本発明は、溶血素Ａに結合する完全ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、以下の特徴：（ｉ）配列番号２、２２、４２、６２、８２、１０２、１２２、１４２、１６２、１８２、２０２、２２２、２４２、２６２、および２８２からなる群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそれらの実質的に類似の配列を有するＨＣＶＲを含むこと、（ｉｉ）配列番号１０、３０、５０、７０、９０、１１０、１３０、１５０、１７０、１９０、２１０、２３０、２５０、および２７０からなる群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそれらの実質的に類似の配列を有するＬＣＶＲを含むこと、（ｉｉｉ）配列番号８、２８、４８、６８、８８、１０８、１２８、１４８、１６８、１８８、２０８、２２８、２４８、２６８、および２８８からなる群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそれらの実質的に類似の配列を有するＨＣＤＲ３ドメイン、ならびに配列番号１６、３６、５６、７６、９６、１１６、１３６、１５６、１７６、１９６、２１６、２３６、２５６、および２７６からなる群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそれらの実質的に類似の配列を有するＬＣＤＲ３ドメインを含むこと、（ｉｖ）配列番号４、２４、４４、６４、８４、１０４、１２４、１４４、１６４、１８４、２０４、２２４、２４４、２６４、および２８４からなる群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそれらの実質的に類似の配列を有するＨＣＤＲ１ドメイン、配列番号６、２６、４６、６６、８６、１０６、１２６、１４６、１６６、１８６、２０６、２２６、２４６、２６６、および２８６からなる群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそれらの実質的に類似の配列を有するＨＣＤＲ２ドメイン、配列番号１２、３２、５２、７２、９２、１１２、１３２、１５２、１７２、１９２、２１２、２３２、２５２、および２７２からなる群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそれらの実質的に類似の配列を有するＬＣＤＲ１ドメイン、ならびに配列番号１４、３４、５４、７４、９４、１１４、１３４、１５４、１７４、１９４、２１４、２３４、２５４、および２７４からなる群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそれらの実質的に類似の配列を有するＬＣＤＲ２ドメインを含むこと、ならびに（ｖ）１０−７以下のＫＤによる溶血素Ａとの結合のうちの１つ以上を表す、完全ヒトモノクローナル抗体もしくはその抗原結合断片を提供する。
【００９６】
本発明の特定の抗溶血素Ａ抗体は、インビトロアッセイまたはインビボアッセイによって決定されるように、溶血素Ａに結合して、その活性を中和することができる。本発明の抗体が溶血素Ａに結合してその活性を中和する能力は、本明細書に説明されるように、結合アッセイまたは活性アッセイを含む、当業者に知られている任意の標準的な方法を使用して測定され得る。
【００９７】
結合活性を測定するための非限定的で例示的なインビトロアッセイは、本明細書の実施例３および４に例示されている。実施例６では、ヒト抗溶血素Ａ抗体の結合親和性および速度定数は、表面プラズモン共鳴によって決定され、この測定は、Ｔ２００  Ｂｉａｃｏｒｅ機器で行われた。実施例５は、溶血素Ａ特異性抗体を使用したＳ．ａｕｒｅｕｓ溶血素Ａの中和を記載する。
【００９８】
本発明はまた、抗溶血素Ａ抗体およびその抗原結合断片を含み、これらは、以下のタンパク質もしくはペプチド：配列番号２９１（完全長野生型溶血素Ａ）、もしくは配列番号２９５（溶血素Ａの修飾形態）のうちのいずれかの少なくとも１つの生物学的に活性な断片に結合する。本明細書に記載される溶血素Ａペプチド、またはそれらの断片のうちのいずれも、抗溶血素Ａ抗体を生成するために使用され得る。
【００９９】
ペプチドは、タグ付けのために、またはＫＬＨなどの担体分子への接合の目的のために、特定の残基の付加または置換を含むように修飾され得る。例えば、システインは、ペプチドのＮ末端もしくはＣ末端のいずれかに付加されてもよく、またはリンカー配列を付加して、例えば、免疫化のためのＫＬＨへの接合のためのペプチドを調製してもよい。
【０１００】
溶血素Ａに特異的な抗体は、追加の標識もしくは部分を全く含有していなくてもよいか、またはＮ末端もしくはＣ末端の標識もしくは部分を含有していてもよい。一実施形態では、標識または部分は、ビオチンである。結合アッセイでは、標識（存在する場合）の位置は、ペプチドが結合された表面に対するペプチドの向きを決定し得る。例えば、表面がアビジンで被覆されている場合、Ｎ末端ビオチンを含有するペプチドは、ペプチドのＣ末端部分が表面から遠位になるように配向されるであろう。一実施形態では、標識は、放射性核種、蛍光色素、またはＭＲＩ検出可能な標識であり得る。特定の実施形態では、このような標識された抗体は、撮像アッセイを含む診断アッセイにおいて使用され得る。
【０１０１】
エピトープマッピングおよび関連技術
本発明は、溶血素Ａの１つ以上の領域の内部に見出される１つ以上のアミノ酸と相互作用する抗溶血素Ａ抗体を含む。抗体が結合するエピトープは、溶血素Ａ分子の前述の領域（例えば、ドメイン中の直線状エピトープ）のうちのいずれかの内部に位置する、３つ以上（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上）のアミノ酸の単一の連続配列からなり得る。代替的に、エピトープは、溶血素Ａ分子の前述の領域（例えば、立体配座エピトープ）のうちの一方または両方の内部に位置する複数の非隣接アミノ酸（またはアミノ酸配列）からなり得る。
【０１０２】
当業者に知られている様々な技術を使用して、抗体がポリペプチドまたはタンパク質の内部にある「１つ以上のアミノ酸と相互作用する」かどうかを判定することができる。例示的な技術としては、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、米国ニューヨーク州）に記載されているような通例の交差遮断アッセイが挙げられる。他の方法には、アラニン走査変異分析、ペプチドブロット分析（Ｒｅｉｎｅｋｅ（２００４）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２４８：４４３−６３）、ペプチド切断分析、結晶学的研究、およびＮＭＲ分析が含まれる。加えて、エピトープ切除、エピトープ抽出、および抗原の化学修飾などの方法を用いることができる（Ｔｏｍｅｒ（２０００）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ９：４８７−４９６）。抗体が相互作用するポリペプチドの内部にあるアミノ酸を同定するために使用することができる別の方法は、質量分析によって検出される水素／重水素交換である。一般的にいえば、水素／重水素交換法は、関心対象のタンパク質を重水素標識した後、抗体を重水素標識タンパク質へ結合させることを包含する。次に、タンパク質／抗体複合体を水に移し、抗体複合体によって保護されたアミノ酸の内部にある交換可能なプロトンは、界面の一部ではないアミノ酸の内部にある交換可能なプロトンよりも低速で重水素から水素への逆交換を受ける。結果として、タンパク質／抗体界面の一部を形成するアミノ酸は、重水素を保持することができ、それゆえ、界面に含まれないアミノ酸と比較して相対的に大きな質量を呈する。抗体の解離後、標的タンパク質をプロテアーゼ切断および質量分析に供し、それにより、抗体が相互作用する特定のアミノ酸を含有する重水素標識残基を含有するペプチドを明らかにする。例えば、Ｅｈｒｉｎｇ（１９９９）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６７（２）：２５２−２５９、Ｅｎｇｅｎ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ（２００１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：２５６Ａ−２６５Ａを参照されたい。
【０１０３】
「エピトープ」という用語は、Ｂ細胞および／またはＴ細胞が応答する抗原上の部位を指す。Ｂ細胞エピトープは、タンパク質の三次元折り畳みによって並置された連続的なアミノ酸または非連続的なアミノ酸の両方から形成されることができる。連続的なアミノ酸から形成されたエピトープは、典型的には、変性溶媒への曝露の際に保持されるのに対し、三次元折り畳みによって形成されたエピトープは、典型的には、変性溶媒を用いた処理の際に失われる。エピトープは、典型的には、独特の空間的立体配座で少なくとも３個、より通常は少なくとも５個または８〜１０個のアミノ酸を含む。
【０１０４】
抗原構造ベースの抗体プロファイリング（ＡＳＡＰ）としても知られている修飾支援プロファイリング（ＭＡＰ）とは、化学的にまたは酵素により修飾された抗原表面に対する各抗体の結合特性の類似性により、同じ抗原に対する多数のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）をカテゴリー分類する方法である（その全体が参照により本明細書に具体的に組み込まれるＵＳ２００４／０１０１９２０を参照されたい）。各カテゴリーは、別のカテゴリーによって表されるエピトープとは明確に異なるか、または部分的に重複するかのいずれかの独特のエピトープを反映し得る。この技術は、特徴付けが遺伝的に異なる抗体に的を絞ることができるように、遺伝的に同一の抗体の迅速なフィルタリングを可能にする。ハイブリドーマスクリーニングへ適用する場合、ＭＡＰは、所望の特徴を有するｍＡｂを産生する稀なハイブリドーマクローンの識別を容易にし得る。ＭＡＰを使用して、本発明の抗体を、異なるエピトープに結合する抗体の群に選別することができる。
【０１０５】
特定の実施形態では、抗溶血素Ａ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２９１に例示されるような野生型溶血素Ａに例示される領域、または配列番号２９５に例示されるような修飾溶血素Ａのうちのいずれか１つ以上の領域内のエピトープ、またはその断片に結合する。
【０１０６】
本発明は、本明細書に記載される特定の例示的な抗体のうちのいずれかと同じエピトープ、もしくはエピトープの一部分に結合するヒト抗溶血素Ａ抗体、または本明細書に記載される例示的な抗体のうちのいずれかのＣＤＲ配列を有する抗体を含む。同様に、本発明はまた、本明細書に記載される特定の例示的な抗体のうちのいずれかと溶血素Ａもしくは溶血素Ａ断片への結合について競合する抗溶血素Ａ抗体、または本明細書に記載される例示的な抗体のうちのいずれかのＣＤＲ配列を有する抗体を含む。
【０１０７】
当該技術分野で知られている通例の方法を使用することによって、抗体が参照抗溶血素Ａ抗体と同じエピトープに結合するか、または結合について参照抗溶血素Ａ抗体と競合するかを容易に決定することができる。例えば、試験抗体が本発明の参照抗溶血素Ａ抗体と同じエピトープに結合するかどうかを決定するために、参照抗体を飽和条件下で溶血素Ａタンパク質またはペプチドに結合させておく。次に、溶血素Ａ分子に結合する試験抗体の能力を評価する。試験抗体が、参照抗溶血素Ａ抗体との飽和結合後に溶血素Ａに結合することができる場合、この試験抗体は、参照抗溶血素Ａ抗体とは異なるエピトープに結合すると結論付けることができる。その一方で、試験抗体が、参照抗溶血素Ａ抗体との飽和結合後に溶血素Ａタンパク質に結合することができない場合、試験抗体は、本発明の参照抗溶血素Ａ抗体によって結合されたエピトープと同じエピトープに結合し得る。
【０１０８】
抗体が参照抗溶血素Ａ抗体と結合について競合するかどうかを決定するために、上記に記載される結合方法論を２つの向きで実施する。第１の向きでは、参照抗体を飽和条件下で溶血素Ａタンパク質に結合させておいた後、溶血素Ａ分子への試験抗体の結合を評価する。第２の向きでは、試験抗体を飽和条件下で溶血素Ａ分子に結合させておいた後、溶血素Ａ分子への参照抗体の結合を評価する。両方の向きで、第１の（飽和）抗体のみが溶血素Ａ分子に結合することができる場合、試験抗体および参照抗体は、溶血素Ａへの結合について競合すると結論付けられる。当業者によって認識されるであろうように、参照抗体との結合について競合する抗体は、必ずしも参照抗体と同一のエピトープに結合する必要はない場合があるが、重複しているまたは隣接しているエピトープに結合することによって、参照抗体の結合を立体的に遮断する可能性がある。
【０１０９】
２つの抗体は、それぞれが抗原へのその他の結合を競合的に阻害する（遮断する）場合、同じかまたは重複するエピトープに結合する。すなわち、１倍、５倍、１０倍、２０倍、または１００倍過剰量の一方の抗体は、競合的結合アッセイにおいて測定して、少なくとも５０％、しかし好ましくは７５％、９０％、またはさらには９９％、もう一方の抗体の結合を阻害する（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９０  ５０：１４９５−１５０２を参照されたい）。代替的に、一方の抗体の結合を低減または排除する抗原における本質的に全てのアミノ酸変異が、もう一方の抗体の結合を低減または排除する場合、２つの抗体は、同じエピトープを有する。一方の抗体の結合を低減または排除するいくつかのアミノ酸変異がもう一方の結合を低減または排除する場合、２つの抗体は重複しているエピトープを有する。
【０１１０】
次に、試験抗体の結合の観察された欠失が、実際に、参照抗体と同じエピトープへの結合によるものであるか、それとも立体遮断（または別の現象）が、観察された結合の欠失の原因であるのかを確認するために、さらなる通例の実験（例えば、ペプチド変異および結合分析）を実施することができる。この種の実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、表面プラズモン共鳴、フローサイトメトリーまたは当該技術分野で利用可能な任意の他の定量的または定性的な抗体結合アッセイを使用して実施することができる。
【０１１１】
免疫抱合体
本発明は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ感染症の重症度を低減することができるか、またはＳ．ａｕｒｅｕｓ感染症もしくはその重症度に関連する少なくとも１つの症状を改善することができる薬剤など、治療的部分（「免疫抱合体」）に接合されたヒト溶血素Ａモノクローナル抗体を包含する。本明細書で使用される場合、「免疫抱合体」という用語は、放射性物質、サイトカイン、インターフェロン、標的部分もしくはレポーター部分、酵素、毒素、または治療剤に化学的に、もしくは生物学的に連結された抗体を指す。抗体は、その標的に結合することができる限り、分子に沿った任意の位置で、放射性物質、サイトカイン、インターフェロン、標的部分もしくはレポーター部分、酵素、毒素、または治療剤に連結され得る。免疫抱合体の例は、抗体薬物抱合体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、溶血素Ａに、またはそのようなＩＬ−１、ＩＬ−６などのサイトカイン、もしくはＴＧＦ−βなどのケモカインに対する第２の異なる抗体であり得る。抗溶血素Ａ抗体に接合され得る治療部分のタイプは、治療されるべき状態および達成されるべき所望の治療効果を考慮したものであろう。免疫抱合体を形成するのに好適な薬剤の例は、当該技術分野で知られており、例えば、ＷＯ０５／１０３０８１を参照されたい。免疫抱合体および免疫毒素の調製は、当該技術分野において一般的によく知られている（例えば、米国特許第４３４０５３５号を参照されたい）。免疫複合体は、例えば、ＵＳ７２５０４９２、ＵＳ７４２００４０、およびＵＳ７４１１０４６に詳細に記載されており、これらの各々は、その全体が本明細書に組み込まれる。
【０１１２】
多重特異性抗体
本発明の抗体は、単一特異性、二重特異性、または多重特異性であり得る。多重特異性抗体は、１つの標的ポリペプチドの異なるエピトープに特異的であり得るか、または２つ以上の標的ポリペプチドに特異的な抗原結合ドメインを含有し得る。例えば、Ｔｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０−６９；Ｋｕｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：２３８−２４４を参照されたい。本発明の抗体は、別の機能性分子、例えば、別のペプチドもしくはタンパク質に連結するか、またはそれと同時発現させることができる。例えば、抗体またはその断片は、別の抗体または抗体断片などの１つ以上の他の分子実体に（例えば、化学結合、遺伝的融合、非共有結合性会合などによって）機能的に連結されて、第２の結合特異性を有する二重特異性または多重特異性抗体を産生することができる。例えば、本発明は、免疫グロブリンの一方の腕が、溶血素Ａもしくはその断片のＮ末端領域に対して特異的であり、かつ免疫グロブリンの他方の腕が、溶血素Ａもしくは第２の治療標的のＣ末端領域に対して特異的であるか、または治療部分に接合された、二重特異性抗体を含む。本発明の背景において使用することができる例示的な二重特異性抗体フォーマットは、第１の免疫グロブリン（Ｉｇ）ＣＨ３ドメインおよび第２のＩｇＣＨ３ドメインの使用を包含し、第１および第２のＩｇＣＨ３ドメインは、少なくとも１つのアミノ酸だけ互いに異なっており、少なくとも１つのアミノ酸の相違は、このアミノ酸の相違を欠失する二重特異性抗体と比較して、タンパク質Ａへの二重特異性抗体の結合を低減させる。一実施形態では、第１のＩｇＣＨ３ドメインは、タンパク質Ａに結合し、第２のＩｇＣＨ３ドメインは、Ｈ９５Ｒ修飾（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる、ＥＵ番号付けによるＨ４３５Ｒ）などのタンパク質Ａ結合を低減または消失させる変異を含有する。第２のＣＨ３は、Ｙ９６Ｆ修飾（ＩＭＧＴによる、ＥＵによるＹ４３６Ｆ）をさらに含み得る。第２のＣＨ３の内部に見出され得るさらなる修飾には、ＩｇＧ１抗体の場合、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる、ＥＵによるＤ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、およびＶ４２２Ｉ）、ＩｇＧ２抗体の場合、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ、ＥＵによるＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、およびＶ４２２Ｉ）、ならびにＩｇＧ４抗体の場合、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる、ＥＵによるＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、およびＶ４２２Ｉ）が含まれる。上記に記載される二重特異性抗体フォーマットの変形は、本発明の範囲内で熟慮される。
【０１１３】
本発明の背景において使用することができる他の例示的な二重特異性フォーマットには、例えば、ｓｃＦｖ系フォーマットまたはダイアボディ二重特異性フォーマット、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ融合、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）−Ｉｇ、Ｑｕａｄｒｏｍａ、ノブズ−イントゥ−ホールズ（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）、共通の軽鎖（例えば、ノブズ−イントゥ−ホールズを有する共通の軽鎖など）、ＣｒｏｓｓＭａｂ、ＣｒｏｓｓＦａｂ、（ＳＥＥＤ）ボディ、ロイシンジッパー、Ｄｕｏｂｏｄｙ、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２、二重作用型Ｆａｂ（ＤＡＦ）−ＩｇＧ、およびＭａｂ２二重特異性フォーマットが含まれるが、これらに限定されない（上述のフォーマットの総説については、例えば、Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１２，ｍＡｂｓ  ４：６，１−１１、およびそこに引用されている参考文献を参照されたい）。二重特異性抗体はまた、ペプチド／核酸接合を使用して構築することもでき、例えば、直交化学反応性を有する非天然アミノ酸を使用して、部位特異性抗体−オリゴヌクレオチド抱合体を生成し、これが次に、定義される組成物、原子価、および幾何学的形状を有する多量体複合体へと自己集合する。（例えば、Ｋａｚａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．［Ｅｐｕｂ：Ｄｅｃ．４，２０１２］を参照されたい）。
【０１１４】
治療用投与および製剤
本発明は、本明細書で考察されるような抗溶血素Ａ抗体またはその抗原結合断片を含む治療用組成物を提供する。本発明による治療用組成物は、改善された移動、送達、寛容、およびこれらに類するものを提供するために、製剤へと組み込まれた好適な担体、賦形剤、および他の薬剤とともに投与することができる。多くの適切な製剤を、製薬化学者全員に知られている処方集：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，米国ペンシルバニア州において見出すことができる。これらの製剤には、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質、脂質（カチオン性またはアニオン性）含有ベシクル（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）など）、ＤＮＡ抱合体、無水吸収ペースト、水中油エマルションおよび油中水エマルション、エマルションカーボワックス（様々な分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、ならびにカーボワックスを含有する半固体混合物が含まれる。Ｐｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．「Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ」ＰＤＡ（１９９８）Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  ５２：２３８−３１１を参照されたい。
【０１１５】
抗体の用量は、投与されることになっている対象の年齢およびサイズ、標的疾患、容態、投与経路、ならびにこれらに類するものによって変わり得る。本発明の抗体が、成人患者における、皮膚壊死、皮膚および軟組織感染症（膿瘍を含む）、手術部位感染症、人工関節感染症、菌血症、敗血症、敗血症性関節炎、髄膜炎、骨髄炎、心内膜炎、肺炎、中毒性ショック症候群、乳房炎、またはせつ腫症およびカルブンケル症（吹出物）を予防または治療するため、またはＳ．ａｕｒｅｕｓ感染症の予防もしくは治療のために使用されている場合、通常、約０．１〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約５〜約１００、約１０〜約９０、または約２０〜約７０ｍｇ／ｋｇ体重の単回用量で、本発明の抗体を静脈内投与することが有益である。状態の重症度に応じて、治療の頻度および期間を調整することができる。特定の実施形態では、本発明の抗体もしくはその抗原結合断片を、少なくとも約０．１ｍｇ〜約８００ｍｇ、約１〜約５００ｍｇ、約５〜約３００ｍｇ、または約１０〜約２００ｍｇ、〜約１００ｍｇ、または〜約５０ｍｇの一次用量として投与することができる。特定の実施形態では、この一次用量に続いて、およそ一次投与と同じか、もしくはそれ未満であり得る量で、抗体またはその抗原結合断片の第２のもしくは複数のその後の用量が投与され得、その後の用量は、少なくとも１日間〜３日間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも７週間、少なくとも８週間、少なくとも９週間、少なくとも１０週間、少なくとも１２週間、または少なくとも１４週間離れている。
【０１１６】
様々な送達システムが知られており、本発明の医薬組成物を投与するために使用することができ、例えば、リポソーム封入、マイクロ粒子、マイクロカプセル、変異ウイルスを発現することができる組換え細胞、受容体媒介エンドサイトーシスである（例えば、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２を参照されたい）。導入方法には、皮内経路、経皮経路、筋肉内経路、腹腔内経路、静脈内経路、皮下経路、鼻腔内経路、硬膜外経路、および経口経路が含まれるが、これらに限定されない。組成物は、任意の好都合な経路によって、例えば、注入もしくはボーラス注射によって、上皮もしくは粘膜皮膚内層（ｌｉｎｉｎｇｓ）（例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜など）を介した吸収によって投与することができ、かつ他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与することができる。投与は、全身または局所であり得る。医薬組成物を、ベシクル、特にリポソーム中で送達することもできる（例えば、Ｌａｎｇｅｒ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３を参照されたい）。
【０１１７】
本発明の抗体を送達するためのナノ粒子の使用もまた、本明細書において熟慮される。抗体結合ナノ粒子は、治療用途および診断用途の両方に使用され得る。抗体接合ナノ粒子ならびに調製方法および使用方法は、参照により本明細書に組み込まれる、Ａｒｒｕｅｂｏ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．２００９（“Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”ｉｎ  Ｊ．Ｎａｎｏｍａｔ．Ｖｏｌｕｍｅ  ２００９，Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ４３９３８９，２４  ｐａｇｅｓ，ｄｏｉ：１０．１１５５／２００９／４３９３８９）によって詳細に記載されている。薬物送達のためのナノ粒子は、例えば、各々その全体が本明細書に組み込まれる、ＵＳ８２７７８１２、ＵＳ８２５８２５６、ＵＳ８２５７７４０、ＵＳ８２４６９９５、ＵＳ８２３６３３０にも記載されている。
【０１１８】
特定の状況では、薬学的組成物は、徐放系で送達することができる。一実施形態では、ポンプを使用することができる。別の実施形態では、ポリマー材料を使用することができる。さらに別の実施形態では、徐放系を組成物の標的の近傍に配置することができ、したがって全身用量のほんの一部しか必要としない。
【０１１９】
注射可能な調製物には、静脈内注射、皮下注射、皮内注射および筋肉内注射、点滴注入などのための剤形が含まれ得る。これらの注射可能な調製物は、公的に既知の方法によって調製され得る。例えば、注射可能な調製物は、例えば、注射用に従来通り使用される滅菌水性媒体もしくは油性媒体中に上記に記載される抗体もしくはその塩を溶解、懸濁、または乳化させることによって調製され得る。注射用水性媒体としては、例えば、生理食塩水、グルコース含有等張液、および他の補助剤などがあり、これらは、アルコール（例えば、エタノール）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤［例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（水素化ヒマシ油のポリオキシエチレン（５０モル）付加物）］などの適切な可溶化剤と組み合わせて使用してよい。油性媒体としては、例えば、ゴマ油、ダイズ油などが用いられ、ベンジルベンゾエート、ベンジルアルコールなどの可溶化剤と組み合わせて使用してよい。このように調製された注射は、好ましくは適切なアンプルに充填される。
【０１２０】
本発明の医薬組成物は、標準的な針および注射器を用いて皮下にまたは静脈内に送達することができる。加えて、皮下送達に関して、ペン送達デバイスは、本発明の医薬組成物を送達する上での適用を容易に有する。このようなペン送達デバイスは、再利用可能または使い捨て可能であり得る。再利用可能なペン送達デバイスは、概して、医薬組成物を含有する交換可能なカートリッジを利用する。いったん、カートリッジ内の薬学的組成物が全て投与され、カートリッジが空になると、この空のカートリッジは容易に廃棄することができ、薬学的組成物を含有する新しいカートリッジと容易に交換することができる。次に、ペン送達デバイスは再利用することができる。使い捨てペン送達デバイスでは、交換可能なカートリッジはない。むしろ、使い捨てペン送達デバイスは、このデバイス内の貯蔵器の中に保持された医薬組成物が事前に充填されている。いったん貯蔵器が医薬組成物に関して空になると、デバイス全体が廃棄される。
【０１２１】
数多くの再利用可能なペン送達デバイスおよび自動注射送達デバイスは、本発明の医薬組成物の皮下送達における用途を有する。例としては、ほんの数例にすぎないが、ＡＵＴＯＰＥＮ（商標）（Ｏｗｅｎ  Ｍｕｍｆｏｒｄ，Ｉｎｃ．、英国ウッドストック町）、ＤＩＳＥＴＲＯＮＩＣ（商標）ペン（Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、スイス国ブルクドルフ市）、ＨＵＭＡＬＯＧ  ＭＩＸ７５／２５（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＯＧ（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＩＮ  ７０／３０（商標）ペン（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏ．、米国インディアナ州インディアナポリス市）、ＮＯＶＯＰＥＮ（商標）Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ、デンマーク国コペンハーゲン市）、ＮＯＶＯＰＥＮ  ＪＵＮＩＯＲ（商標）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ、デンマーク国コペンハーゲン市）、ＢＤ（商標）ペン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、米国ニュージャージー州フランクリンレイク地区）、ＯＰＴＩＰＥＮ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ  ＰＲＯ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ  ＳＴＡＲＬＥＴ（商標）、およびＯＰＴＩＣＬＩＫ（商標）（Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ、ドイツ国フランクフルト市）が挙げられるものの、間違いなくこれらに限定されない。本発明の医薬組成物の皮下送達における用途を有する使い捨てペン送達デバイスの例としては、ほんの数例にすぎないが、ＳＯＬＯＳＴＡＲ（商標）ペン（Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）、ＦＬＥＸＰＥＮ（商標）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）、およびＫＷＩＫＰＥＮ（商標）（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、ＳＵＲＥＣＬＩＣＫ（商標）自動注射装置（Ａｍｇｅｎ、米国カリフォルニア州サウザンドオークス市）、ＰＥＮＬＥＴ（商標）（Ｈａｓｅｌｍｅｉｅｒ、ドイツ国シュトゥットガルト市）、ＥＰＩＰＥＮ（Ｄｅｙ，Ｌ．Ｐ．）およびＨＵＭＩＲＡ（商標）ペン（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｓ、米国イリノイ州アボットパーク地区）が挙げられるものの、間違いなくこれらに限定されない。
【０１２２】
有益なことに、上記に記載される経口または非経口での使用のための医薬組成物は、有効成分の用量に適合するのに適した単位用量の剤形へと調製される。このような単位用量の剤形には、例えば、錠剤、ピル、カプセル、注射（アンプル）、坐薬などが含まれる。前述の含有される抗体の量は、概して、単位用量の剤形あたり約５〜約５００ｍｇであり、特に注射の形態では、前述の抗体は、約５〜約１００ｍｇで、他の剤形については約１０〜約２５０ｍｇで含有されることが好ましい。本発明は、本発明の抗体もしくは抗原結合断片、または薬学的に許容される担体を含むその医薬組成物を含む注射デバイス（例えば、事前充填型シリンジまたは事前充填型自動注射器）またはバイアル（例えば、ガラスまたはプラスチックバイアル）を含む。
【０１２３】
抗体の治療的使用
本発明の特定の実施形態では、本抗体は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ感染症、またはＳ．ａｕｒｅｕｓ感染症に関連する少なくとも１つの症状を治療するのに有用である。いくつかの実施形態では、抗体は、皮膚壊死、皮膚および軟組織感染症（膿瘍を含む）、手術部位感染症、人工関節感染症、菌血症、敗血症、敗血症性関節炎、髄膜炎、骨髄炎、心内膜炎、肺炎、中毒性ショック症候群、乳房炎、またはせつ腫症およびカルブンケル症（吹出物）の状態もしくは症状を治療するのに有用であり得る。本発明の抗体はまた、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染症を発症するリスクのある患者における予防的使用のために熟慮される。これらの患者は、高齢者、または疾患もしくは免疫抑制治療薬による治療のために免疫不全状態にある患者、または術後の患者など院内感染のより大きなリスクがある患者を含む。上記に考察される治療用途の様々な実施形態では、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ細菌は、抗生物質治療の１つ以上のタイプに対して耐性があり得る。一実施形態では、細菌は、メチシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）である。本発明の抗体は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染症を治療するため、またはＳ．ａｕｒｅｕｓ感染症に関連する少なくとも１つの症状もしくは合併症を緩和するために、単独で、または第２の薬剤もしくは第３の薬剤と併用して使用され得ることが熟慮される。第２または第３の薬剤は、本発明の抗体と同時に送達され得るか、またはそれらは、本発明の抗体の前もしくは後のいずれかに別々に投与され得る。本発明の抗体もしくは抗原結合断片またはその医薬組成物を投与され得る患者には、例えば、ヒト（例えば、６５歳以上の高齢のヒト）、ウサギ、マウス、ラット、ウシ、ブタ、イヌ、霊長類、ウマ、またはヒツジなどの哺乳動物などの動物が含まれる。
【０１２４】
特定の実施形態では、本抗体は、個体または個体の特定の組織もしくは器官におけるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ細菌の数を減少させるのに有用である。いくつかの実施形態では、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ細菌は、１つ以上のタイプの抗生物質治療に対して耐性であり得る。一実施形態では、細菌は、メチシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）である。特定の実施形態では、本抗体は、感染症によって生じる症状を軽減し、かつ他の医薬品および／または患者の免疫系が感染症を制御することを可能にする、個体におけるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ細菌によって産生される溶血素Ａの毒性活性を低減するのに有用である。
【０１２５】
本発明のさらなる態様では、本抗体は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ感染症、またはＳ．ａｕｒｅｕｓ感染症と関連する症状を罹患している患者を治療するための医薬組成物の調製のために使用される。
【０１２６】
併用療法
併用療法には、本発明の抗溶血素Ａ抗体、および本発明の抗体と、または本発明の抗体の生物学的に活性のある断片と有益に組み合わされ得る任意の追加の治療剤（複数可）が含まれ得る。
【０１２７】
抗体は、抗生物質「ＮＳＡＩＤ」、抗体ＬＴＭ１４、抗体ＬＣ１０、コルチコステロイドまたはプレドニゾンなどの他の治療と併用して使用することができる。
【０１２８】
追加の治療的に活性な成分（複数可）は、本発明の抗溶血素Ａ抗体の投与前、同時、または後に投与され得る。本開示の目的のために、そのような投与レジメンは、１つ以上の追加の治療的に活性である成分（複数可）「と組み合わせた」抗溶血素Ａ抗体の投与であると考えられる。
【０１２９】
抗体の診断用の使用
本発明の抗溶血素Ａ抗体はまた、例えば診断目的のために、試料中の溶血素Ａを検出および／または測定するために使用され得る。本発明の抗体のうちのいずれか１つ以上を使用して、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ感染症の存在および重症度を検出することができると想定される。溶血素Ａについての例示的な診断アッセイは、例えば、患者から得られた試料を、本発明の抗溶血素Ａ抗体と接触させることを含み得、抗溶血素Ａ抗体は、検出可能な標識もしくはレポーター分子で標識されるか、または患者試料から溶血素Ａを選択的に単離するために捕捉リガンドとして使用される。代替的に、標識されていない抗溶血素Ａ抗体は、それ自体が検出可能に標識された二次抗体と組み合わせて診断用途に使用することができる。検出可能な標識もしくはレポーター分子は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、もしくは１２５Ｉなどの放射性同位体、フルオレセインイソチオシアナートもしくはローダミンなどの蛍光部分もしくは化学発光部分、またはアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、もしくはルシフェラーゼなどの酵素であり得る。試料中の溶血素Ａを検出または測定するために使用することができる具体的な例示的アッセイには、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、および蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）が含まれる。
【０１３０】
本発明による溶血素Ａ診断アッセイにおいて使用することができる試料には、正常条件もしくは病理学的条件下で、検出可能な量の溶血素Ａもしくはその断片のいずれかを含有する、患者から得ることのできる任意の組織もしくは体液試料が含まれる。概して、健康な患者（例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ感染症を罹患していない患者）から得られた特定の試料中の溶血素Ａのレベルは、ベースライン、または標準の溶血素Ａのレベルを最初に確立するために測定されるであろう。次に、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染症に関連する状態、またはそのような状態に関連する症状を有することが疑われる個体から得られた試料において測定された溶血素Ａのレベルと比較することができる。
【０１３１】
溶血素Ａに特異的な抗体は、追加の標識もしくは部分を全く含有していなくてもよいか、またはＮ末端もしくはＣ末端の標識もしくは部分を含有していてもよい。一実施形態では、標識または部分は、ビオチンである。結合アッセイでは、標識（存在する場合）の位置は、ペプチドが結合された表面に対するペプチドの向きを決定し得る。例えば、表面がアビジンで被覆されている場合、Ｎ末端ビオチンを含有するペプチドは、ペプチドのＣ末端部分が表面から遠位になるように配向されるであろう。いくつかの実施形態では、標識は、放射性核種、蛍光色素、またはＭＲＩ検出可能な標識などの検出可能な標識であり得る。検出可能な標識は、抗体に連結されてもよく、そのような抗体は、撮像アッセイにおいて使用され得る。
【実施例】
【０１３２】
以下の実施例は、本発明の方法および組成物をどのように作製および使用するかに関する完全な開示および説明を当業者に提供するために提示されており、本発明者らが本発明とみなすことの範囲を限定することを企図するものではない。別段示されない限り、部分は重量部分であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏度であり、圧力は大気圧またはそれに近い圧力である。
【０１３３】
実施例１溶血素Ａに対するヒト抗体の生成
２つの免疫原：シグナル配列（アミノ酸２７〜３９１）を有しない完全長野生型溶血素Ａ（Ｈｌａ）、および完全長非毒性溶血素Ａ（Ｈｌａ−Ｈ３５Ｌ）を使用してマウスを免疫し、両方ともＥ．ｃｏｌｉで発現され、精製された組換えＨｉｓタグ化タンパク質であった。
特定の実施形態では、溶血素Ａに特異的に結合する抗体は、上記の領域の断片、または指定の領域を超えて、本明細書に記載される領域のＮ末端もしくはＣ末端のいずれかもしくは両方から約５〜約２０個のアミノ酸残基だけ延在するペプチドを使用して調製され得る。特定の実施形態では、上記の領域またはそれらの断片の任意の組み合わせを、溶血素Ａ特異性抗体の調製において使用することができる。特定の実施形態では、溶血素Ａまたはその断片の上記のドメインのうちの任意の１つ以上が、単一特異性抗体、二重特異性抗体、または多重特異性抗体を調製するために使用され得る。Ｈ１Ｈ１５３７５Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７６Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７７Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７８Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７９Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３８０Ｐ、およびＨ１Ｈ１５４１８Ｐ２を、無毒の溶血素Ａで免疫することによって産生し、Ｈ１Ｈ１５３８１Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３９９Ｐ、Ｈ１Ｈ１５４０４Ｐ、Ｈ１Ｈ１５４０５Ｐ、Ｈ１Ｈ１５４０８Ｐ、Ｈ１Ｈ１５４１０Ｐ、Ｈ１Ｈ１５４１４Ｐ、Ｈ１Ｈ１５４２０Ｐ２を、野生型溶血素Ａで免疫することによって産生した。
【０１３４】
上記のように、免疫原として使用された完全長タンパク質、またはそれらの断片を、アジュバントとともに、ＤＮＡコードするヒト免疫グロブリン重鎖およびカッパ軽鎖可変領域を含むＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスに直接投与して、免疫応答を刺激した。抗体の免疫応答を、溶血素Ａ特異的免疫測定法によって監視した。所望の免疫応答が達成されたときに、その全体が参照により本明細書に具体的に組み込まれるＵＳ２００７／０２８０９４５Ａ１に記載されているように、抗溶血素Ａ抗体を、骨髄腫細胞に融合することなく、抗原陽性Ｂ細胞から直接単離した。この方法を使用して、いくつかの完全ヒト抗溶血素Ａ抗体（すなわち、ヒト可変ドメインとヒト定常ドメインとを有する抗体）を得、この様式で生成された例示的な抗体を、以下のように：Ｈ１Ｈ１５３７５Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７６Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７７Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７８Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７９Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３８０Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３８１Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３９９Ｐ、Ｈ１Ｈ１５４０４Ｐ、Ｈ１Ｈ１５４０５Ｐ、Ｈ１Ｈ１５４０８Ｐ、Ｈ１Ｈ１５４１０Ｐ、Ｈ１Ｈ１５４１４Ｐ、Ｈ１Ｈ１５４１８Ｐ２、およびＨ１Ｈ１５４２０Ｐ２と指定した。
【０１３５】
この実施例の方法により生成された例示的な抗体の生物学的特性を、以下に記載の実施例において詳細に記載する。
【０１３６】
実施例２重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列
表１は、選択された溶血素Ａに特異的な抗体およびそれらの対応する抗体識別子の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列対を記載する。抗体は、典型的には、以下の命名法により本明細書で言及される：Ｆｃ接頭語（例えば、「Ｈ４Ｈ」、「Ｈ１Ｍ」、または「Ｈ２Ｍ」）、続いて数値識別子（例えば、表１に示されるような「５３７５」）、続いて「Ｐ」または「Ｎ」接尾語。したがって、この命名法によると、抗体は、例えば「Ｈ１Ｈ５３７５」と呼ばれ得る。本明細書で使用される抗体指定上のＨ４Ｈ、Ｈ１Ｍ、およびＨ２Ｍという接頭語は、抗体の特定のＦｃ領域を示す。例えば、「Ｈ２Ｍ」抗体は、マウスＩｇＧ２  Ｆｃを有するのに対し、「Ｈ４Ｈ」抗体は、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃを有する。当業者には理解されるように、Ｈ１ＭまたはＨ２Ｍ抗体は、Ｈ４Ｈ抗体に変換することができ、逆もまた同様であるが、いずれの場合も、表１に示されている数値識別子によって示された可変ドメイン（ＣＤＲを含む）は、同じままであろう。同じ数字抗体の指定を有するが、Ｎ、Ｂ、またはＰの文字の接尾語が異なる抗体は、ＣＤＲ配列の外にある領域において（すなわち、フレームワーク領域において）同一のＣＤＲ配列を有するが、配列変異を有する、重鎖および軽鎖を有する抗体を指す。したがって、特定の抗体のＮ、Ｂ、およびＰ変異体は、それらの重鎖および軽鎖可変領域内に同一のＣＤＲ配列を有するが、それらのフレームワーク領域内では互いに異なる。
【０１３７】
【表１】
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【０１３８】
実施例３Ｓ．ａｕｒｅｕｓ溶血素Ａ毒素へのヒトモノクローナル抗体の結合
本発明の抗体が溶血素Ａ単量体に結合することができたかどうかを決定するために、精製された抗体（Ｈ１Ｈ１５３７５Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７６Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７７Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７８Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７９Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３８０Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３８１Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３９９Ｐ、Ｈ１Ｈ１５４０４Ｐ、Ｈ１Ｈ１５４０５Ｐ、Ｈ１Ｈ１５４０８Ｐ、Ｈ１Ｈ１５４１０Ｐ、Ｈ１Ｈ１５４１４Ｐ、Ｈ１Ｈ１５４１８Ｐ２、およびＨ１Ｈ１５４２０Ｐ２）をＥＬＩＳＡにより試験した。ＭａｘｉＳｏｒｐマイクロタイタープレートを、１ウェルあたり１０μｇ／ｍＬの精製されたＳ．ａｕｒｅｕｓ溶血素Ａで一晩被覆した。本発明の抗体およびアイソタイプ一致対照抗体（１：３の連続希釈で５０μＭ〜１ｐＭの範囲）の滴定を、毒素含有ウェルに添加し、２５℃で１時間インキュベートした。ウェルを３回洗浄した後、ウェルあたり１００ｎｇ／ｍＬの抗ヒトＨＲＰ二次抗体とともに２５℃で１時間インキュベートした。次に、１００μＬのＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  ＥＬＩＳＡ  Ｐｉｃｏ化学発光基質（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を各ウェルに添加し、シグナルを検出した（Ｖｉｃｔｏｒ  Ｘ３プレートリーダー、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）。発光値を、１２点反応曲線（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ）上の３パラメータロジスティック方程式によって分析した。
【０１３９】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ溶血素Ａ毒素への結合について、抗溶血素Ａ抗体のナノモル以下のＥＣ５０結合を観察した。（表２および図１）。
【０１４０】
【表２】
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【０１４１】
実施例４Ｓ．ａｕｒｅｕｓ溶血素ＡへのヒトｍＡｂの二成分毒素への結合
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ株は、さらなる孔形成毒素、ロイコシジンおよびガンマ溶血素（Ｈｌｇ）を産生することができ、これらも機能的孔を形成するためにオリゴマー化を必要とする。溶血素Ａとは異なり、ロイコシジンおよびＨｌｇは、２つのサブユニット、Ｓサブユニット、およびＦサブユニットから構成される二成分毒素である。現在、５つのＳサブユニット（ＬｕｋＡ、ＬｕｋＥ、ＬｕｋＳ−ＰＶ、ＨｌｇＡ、およびＨｌｇＣ）および４つのＦサブユニット（ＬｕｋＢ、ＬｕｋＤ、ＬｕｋＦ−ＰＶ、およびＨｌｇＢ）が同定されており、結果として５つの機能的毒素（ＬｕｋＡＢ、ＬｕｋＥＤ、ＰＶＬ、ＨｌｇＡＢ、およびＨｌｇＣＢ）を生じる。ＳサブユニットおよびＦサブユニットと溶血素Ａとの間に低い配列同一性が観察されるが（Ａｍａｎ  ＭＪ  ａｎｄ  Ａｄｈｉｋａａｒｉ  ＲＰ，（２０１４）Ｔｏｘｉｎｓ６：９５０−９７２）、全ての成分は、溶血素Ａと構造的相同性を示す。
【０１４２】
本発明の抗溶血素Ａ抗体か他の毒素に交差結合するかどうかを決定するために、精製された抗体（Ｈ１Ｈ１５３７５Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７６Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７７Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７８Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７９Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３８０Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３８１Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３９９Ｐ、Ｈ１Ｈ１５４０４Ｐ、Ｈ１Ｈ１５４０５Ｐ、Ｈ１Ｈ１５４０８Ｐ、Ｈ１Ｈ１５４１０Ｐ、Ｈ１Ｈ１５４１４Ｐ、Ｈ１Ｈ１５４１８Ｐ２、およびＨ１Ｈ１５４２０Ｐ２）を、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ二成分毒素に対する交差反応性についてＥＬＩＳＡにより試験した。ＭａｘｉＳｏｒｐマイクロタイタープレートを、ウェルあたり１０μｇ／ｍＬのＳ．ａｕｒｅｕｓ二成分毒素の個々のＦ成分で一晩被覆した。組換え毒素成分は、ＩＢＴ  ＢｉｏＳｅｒｖｉｃｅｓ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、米国メリーランド州）から入手するか、またはＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ  Ｔｏｗｎｓｈｉｐ、米国ニュージャージー州）によって生成されるかのいずれかであった。本発明の抗体およびアイソタイプ一致対照抗体（１：３希釈で５０μＭ〜１００ｐＭの範囲）の滴定を毒素含有ウェルに添加し、２５℃で１時間インキュベートした。ウェルを３回洗浄した後、１ウェルあたり１００ｎｇ／ｍＬの抗ヒトＨＲＰ二次抗体とともに２５℃で１時間インキュベートした。１００μＬのＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  ＥＬＩＳＡ  Ｐｉｃｏ化学発光基質（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をウェルに添加し、シグナルを検出した（Ｖｉｃｔｏｒ  Ｘ３プレートリーダー、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）。発光値を、１１点反応曲線（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ）上の３パラメータロジスティック方程式によって分析した。アイソタイプ一致無関係対照抗体およびＳ．ａｕｒｅｕｓデルタ毒素を対照として含めた。
【０１４３】
二成分毒素に対する交差反応性についての本発明における１５個の抗体の試験は、溶血素Ａで見られるものよりも親和性が２対数または３対数低いものではあるが、Ｆ成分のＬｕｋＦ、ＬｕｋＤ、およびＨｌｇＢへの結合を示す１つのｍＡｂ、Ｈ１Ｈ１５３８１Ｐを明らかにした（表３および図２ａ〜ｃ）。Ｈ１Ｈ１５３８１ＰがＳ成分のＬｕｋＳ、ＬｕｋＥ、ＨｌｇＡ、およびＨｌｇＣに対する交差反応性について試験した場合、結合親和性は、Ｆ成分への結合と比較して有意に低かった（図３ａ〜ｃ）。Ｈ１Ｈ１５３８１Ｐ結合は、溶血素Ａに特異的であり、二成分毒素は、それがＳ．ａｕｒｅｕｓデルタ毒素アイソタイプ一致対照抗体への結合を実証しなかったので、二成分毒素成分へのいかなる結合も実証しなかった。
【０１４４】
【表３】
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【０１４５】
実施例５ＴＨＰ−１細胞毒性アッセイにおけるＳ．ａｕｒｅｕｓ溶血素Ａの中和
溶血素Ａ媒介性溶解を防止するための精製されたｍＡｂの能力を、ヒト単球細胞株であるＴＨＰ−１を使用して試験した。ＲＰＭＩ中の合計２．５×１０５ＴＨＰ−１細胞（１％熱不活性化ＦＢＳ、Ｌ−グルタミン、および非必須アミノ酸を補充した）を、９６ウェルの透明底黒色組織培養処理されたプレートに播種し、５％ＣＯ２とともに３７℃で１時間インキュベートした。精製された抗体（Ｈ１Ｈ１５３７５Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７６Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７７Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７８Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７９Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３８０Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３８１Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３９９Ｐ、Ｈ１Ｈ１５４０４Ｐ、Ｈ１Ｈ１５４０５Ｐ、Ｈ１Ｈ１５４０８Ｐ、Ｈ１Ｈ１５４１０Ｐ、Ｈ１Ｈ１５４１４Ｐ、Ｈ１Ｈ１５４１８Ｐ２、およびＨ１Ｈ１５４２０Ｐ２）の滴定、またはアイソタイプ一致対照抗体（培地中に１：３の連続希釈で１０〜０μＭの範囲）を、播種細胞に添加する前に、９６ウェルプレート中に１０ｎＭの精製された溶血素Ａとともに振とう器上で２５℃で３０分間インキュベートした。抗体を含まない精製された溶血素Ａ（１：３の希釈で１．５〜０μＭ）の滴定も、細胞のみでインキュベートした。
【０１４６】
次に、毒素：抗体または毒素のみを含む細胞を、３時間インキュベートし（３７℃、５％ＣＯ２）、細胞死を、ＣｙｔｏＴｏｘ−Ｇｌｏアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して測定した。プレートリーダー（Ｖｉｃｔｏｒ  Ｘ３、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して、発光を検出した。本発明の全ての抗体は、溶血素Ａに対して同様の中和活性を示したが、アイソタイプ一致抗体は、溶血素Ａに対していかなる中和活性も示さなかった。表４を参照されたい。
【０１４７】
【表４】
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【０１４８】
実施例６ウサギＲＢＣ溶血アッセイを使用した培養上清中のＳ．ａｕｒｅｕｓ溶血素Ａの中和
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ培養上清を使用した精製されたｍＡｂの溶血素Ａ中和有効性を、ウサギ赤血球（ｒＲＢＣ）を使用して評価した。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ株（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、米国バージニア州マナッサス）をＴＳＢ中に１６時間３７Ｃで（振とうしながら）インキュベートし、遠心分離により細菌を除去し、毒素含有培地を濾過することによって、培養上清を得た。精製された抗体Ｈ１Ｈ１５３９９Ｐまたはアイソタイプ一致対照抗体（１Ｘ  ＰＢＳ中に１：２の連続希釈で１０〜０μＭの範囲）の滴定を、滅菌濾過されたＳ．ａｕｒｅｕｓ培養上清とともに（結果として８０％の≧細胞溶解を生じるであろう）９６ウェルプレート中で３０分間２５℃で振とう器上でインキュベートした。３０分のインキュベーション後、１００μｌの培養上清：ｍＡｂ混合物を、１×ＰＢＳ中の１００μｌの４％ｒＲＢＣ（Ｃｏｌｏｒａｄｏ  Ｓｅｒｕｍ  Ｃｏｍｐａｎｙ、米国コロラド州デンバー）を含有する９６ウェルの丸底プレートに添加した。３７°Ｃで１時間のインキュベーション後、プレートを５分間遠心分離し、１００μｌの上清を、新しいマイクロタイタープレートに穏やかに除去し、発光を、プレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ｉ３ｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して読み取った。アイソタイプ一致抗体は、溶血素Ａに対していかなる中和活性を示さなかったが、本発明の全ての抗体は、溶血素Ａに対して同様の中和活性を示した。表５を参照されたい。
【０１４９】
【表５】
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【０１５０】
実施例７ヒト抗溶血素Ａモノクローナル抗体のＢｉａｃｏｒｅ結合親和性および速度定数
抗溶血素Ａ抗体に結合する、野生型および変異型（Ｈｌａ−Ｈ３５Ｌ）溶血素Ａについての結合会合および解離速度定数（それぞれ、ｋａおよびｋｄ）、平衡解離定数および解離半減期（それぞれ、ＫＤおよびｔ１／２）を、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００機器での実時間表面プラズモン共鳴バイオセンサアッセイを使用して決定した。Ｂｉａｃｏｒｅセンサ表面を、モノクローナルマウス抗ヒトＦｃ抗体（ＢＲ−１００８−３９、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で誘導体化して、ヒトＦｃで発現されたおよそ１５０〜３６０ＲＵの抗溶血素Ａモノクローナル抗体を捕捉した。１００ｎＭ〜１．５６ｎＭの範囲の異なる濃度の溶血素Ａ毒素を、抗溶血素Ａモノクローナル抗体捕捉表面上に、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００上で５０μＬ／分の流速で注射した。２５℃および３７℃での溶血素Ａ毒素の捕捉モノクローナル抗体への結合を、４分間監視し、抗体からの解離を、ランニング緩衝材としてＨＢＳ−ＥＴ（ｐＨ７．４の０．０１ＭのＨＥＰＥＳ、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％ｖ／ｖの界面活性剤Ｐ２０）で１０分間監視した。
【０１５１】
Ｓｃｒｕｂｂｅｒ  ２．０ｃ曲線適合ソフトウェアを使用してデータを処理し、データを１：１結合モデルにあてはめることによって、動的結合（ｋａ）および動的解離（ｋｄ）速度定数を決定した。次に、結合解離平衡定数（ＫＤ）および解離半減期（ｔ１／２）を、動的速度定数から以下のように計算した：ＫＤ（Ｍ）＝ｋｄ／ｋａおよびｔ１／２（分）＝［ｌｎ２／（６０＊ｋｄ）］。
【０１５２】
２５℃および３７℃での異なる抗溶血素Ａモノクローナル抗体への野生型溶血素Ａおよび変異型溶血素Ａの結合についての結合動力学パラメータを、表６〜９にまとめた。表６に示されるように、２５℃で、本発明の全ての抗溶血素Ａ抗体は、１７１ｐＭ〜２６．２ｎＭの範囲のＫＤ値で野生型溶血素Ａに結合した。表７に示されるように、３７℃で、本発明の全ての抗溶血素Ａ抗体は、２６０ｐＭ〜７６．３ｎＭの範囲のＫＤ値で溶血素Ａに結合した。表８に示されるように、２５℃で、本発明の全ての抗溶血素Ａ抗体は、５２．３ｐＭ〜８．８９ｎＭの範囲のＫＤ値で変異型溶血素Ａに結合した。表９に示されるように、３７℃で、本発明の全ての抗溶血素Ａ抗体は、７４．７ｐＭ〜１８．７ｎＭの範囲のＫＤ値で変異型溶血素Ａに結合した。
【０１５３】
【表６】
2020504759.tif 000008
【０１５４】
【表７】
2020504759.tif 000009
【０１５５】
【表８】
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【０１５６】
【表９】
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【０１５７】
実施例８抗溶血素Ａ  ｍＡｂ遮断作用の機序
溶血素Ａ  ｍＡｂが毒素とその特異的受容体であるＡＤＡＭ１０との相互作用を遮断することによってそれらの機能を発揮するかどうかを決定するために、溶血素ＡとともにインキュベートしたＡ５４９細胞を使用する蛍光ペプチド基質アッセイを使用して、宿主細胞関連メタロプロテアーゼ活性を測定した。ＨａｍのＦ−１２Ｋ中の２．５×１０４個のＡ５４９細胞を含有する９６ウェルプレート（１０％の熱不活性化ＦＢＳおよびＬグルタミンを補った）に添加する前に、ｍＡｂ（Ｈ１Ｈ１５３７７Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３８１ＰおよびＨ１Ｈ１５３９９Ｐ）を、３７℃で１５分間３ｎＭの精製された溶血素Ａとともに予めプレインキュベートした。３７℃での６０分間のインキュベートの後、５μＭの蛍光発生ペプチド基質（Ｍｃａ−ＰＬＡＶＱ−Ｄｐａ−ＲＳＳＳＲ−ＮＨ２、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、、米国ミネソタ州ミネアポリス）を添加し、３７℃で１５分間インキュベートし、プレートリーダー（３２０ｎＭの励起フィルタおよび４０５ｎＭの発光フィルタ、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ｉ３ｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して強蛍光度を読み取り、相対蛍光単位として表した。アイソタイプ一致抗体は、毒素誘発増加ＡＤＡＭ１０活性（図４ａ）にはいかなる影響も示さなかったが、本発明の抗体は、ＡＤＡＭ１０活性の毒素誘発性増加を遮断した。これは、本発明の抗体が溶血素Ａとその受容体との相互作用を遮断することを示唆した。
【０１５８】
溶血素Ａ  ｍＡｂが宿主細胞膜への毒素の結合を防止することをさらに実証するために、ウサギＲＢＣ（ｒＲＢＣ）を使用して溶血素Ａ  ｍＡｂの存在下で、膜結合実験を実施し、毒素とｒＲＢＣ膜との会合を、ウエスタンブロット分析によって検出した。ｒＲＢＣの溶解を回避するために、結合実験を、４℃で実施した。溶血素Ａ  ｍＡｂ（Ｈ１Ｈ１５３７７ＰおよびＨ１Ｈ１５３９９Ｐ）の滴定を、洗浄されたｒＲＢＣへの添加（２５０μｌのＰＢＳ中に１０％）の前に、３７℃で１５分間１０ｎＭの溶血素Ａにより予めインキュベートし、かつ４℃で６０分間インキュベートした。ｒＲＢＣをペレット化し、上清を除去し、１ｍｌのｄｄＨ２Ｏ中の再懸濁、２５℃での１０分間のインキュベーション、および１６，１００ｘｇでの遠心分離の３つのサイクルによって、細胞を溶解した。ｐＨ７．４の１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％トリトンＸ−１００、および１％デオキシコール酸ナトリウム中で、膜を可溶化した。可溶化された試料を、ＰＶＤＦ膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州カールズバッド）に転写された４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州カールズバッド）上で還元、煮沸、および分離し、溶血素Ａ単量体を、ｐＡｂ（ＩＢＴ  ＢｉｏＳｅｒｖｉｃｅｓ、米国メリーランド州ロックビル）により検出した。アイソタイプ一致抗体はいかなる効果も示さなかったが、本発明の抗体は、ｒＲＢＣへの溶血素Ａの結合を防止する（図４ｂ）。
【０１５９】
実施例９皮膚壊死マウスモデルにおいて予防的に投与されたヒト抗溶血素Ａ  ｍＡｂのインビボ有効性
本発明の抗溶血素Ａ  ｍＡｂがＳ．ａｕｒｅｕｓ誘発性皮膚病変を減少または予防することができるかどうかを判定するために、精製抗体を、雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝３〜５）を使用したインビボ皮膚壊死モデルにおいて予防的に試験した（Ｂｕｂｅｃｋ  Ｗａｒｄｅｎｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，（２００８）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１９８：１１６６−１１７０）。感染の２日前に、毛皮を剃毛し、脱毛ローションを適用することによって、腹部領域から除去した。感染の１日前に、マウスの腹部の左側に、５ｍｇ／ｋｇまたは０．５ｍｇ／ｋｇのいずれかの個々の抗体の単回用量：Ｈ１Ｈ１５３７５Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７６Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７７Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７８Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７９Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３８０Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３８１Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３９９Ｐ、Ｈ１Ｈ１５４０４Ｐ、Ｈ１Ｈ１５４０５Ｐ、Ｈ１Ｈ１５４０８Ｐ、Ｈ１Ｈ１５４１０Ｐ、Ｈ１Ｈ１５４１４Ｐ、Ｈ１Ｈ１５４１８Ｐ２、Ｈ１Ｈ１５４２０Ｐ２、またはアイソタイプ一致対照抗体を腹腔内注射した。感染の日に、３７℃のＴＳＢ中で対数期（ＯＤ６００≦１）まで増殖させ、ＰＢＳ中に懸濁した５０μｌのＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＣＡ−１２７（約１〜２×１０８ＣＦＵ／マウス）を腹部の右側に皮下投与した。感染後２日目に、マウスの病変をデジタルノギスで測定した。
【０１６０】
本発明の全ての抗体は、両方の試験用量で有効であった。５ｍｇ／ｋｇで投与された場合、全ての抗体が同様の有効性を示し、アイソタイプ一致対照抗体と比較して、皮膚壊死性病変を８０〜９０％減少させた（表１０）。同様に、０．５ｍｇ／ｋｇで動物に投与された場合、本発明の全ての抗体（Ｈ１Ｈ１５４１０Ｐを除く）は、アイソタイプ一致抗体で治療されたものと比較して、病変サイズの減少を示した（表１０）。しかしながら、病変サイズの減少は、４０〜８０％の範囲であり、Ｈ１Ｈ１５４１０Ｐは、この用量では効果を示さなかった。抗体Ｈ１Ｈ１５３８０Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３８１Ｐ、Ｈ１Ｈ１５４０５Ｐ、およびＨ１Ｈ１５４１４Ｐは、０．５ｍｇ／ｋｇで投与された場合に最も有効であり、病変サイズは、＞８０％減少した。５ｍｇ／ｋｇ群と０．５ｍｇ／ｋｇ群との比較は、用量依存的効果を示した：５ｍｇ／ｋｇ用量で抗体を投与されたマウスは、０．５ｍｇ／ｋｇ用量で同じ抗体を投与されたマウスと比較して、より小さい病変を有した。
【０１６１】
【表１０】
2020504759.tif 000012
【０１６２】
抗溶血素Ａ  ｍＡｂの病変サイズを減少させる能力をさらに調べるために、ｍＡｂを３つの異なる用量で予防的に投与し、２つの他の抗溶血素Ａ  ｍＡｂ、ＬＴＭ１４（例えば、米国特許第８７１５６７３号の配列番号：１および２；またはＦｏｌｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  Ａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ａ  Ｈｕｍａｎ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓα-Ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２５：１６４１−１６５４  （２０１３）を参照されたい）およびＬＣ１０（例えば、ＷＯ２０１２／１０９２８５の配列番号：５７および５８を参照されたい）と比較した。感染の約２日前に、上記に記載されるように雌ＢＡＬＢ／ｃマウスから毛皮を除去した。感染の１日前に、マウス（１群あたりｎ＝５）の腹部の左側に、５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、または０．１２５ｍｇ／ｋｇの各個々の抗体：Ｈ１Ｈ１５３７７Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３８１Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３９９Ｐ、ＬＴＭ１４、ＬＣ１０、またはアイソタイプ一致対照抗体の単回用量を腹腔内注射した。感染の日に、マウスの腹部の右側に、ＴＳＢ中に３７℃で対数期（ＯＤ６００≦１）まで増殖させ、ＰＢＳ中に懸濁した、５０μｌのＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＣＡ−１２７（ＭＲＳＡ株、２．５×１０８ＣＦＵ／マウス）またはＳ．ａｕｒｅｕｓ  Ｎｅｗｍａｎ（ＭＳＳＡ株、２．５×１０８ＣＦＵ／マウス）を皮下投与した。感染後２日目に、マウスの病変をデジタルノギスで測定した。
【０１６３】
本発明の全ての抗体は、ＭＲＳＡおよびＭＳＳＡのＳ．ａｕｒｅｕｓ株の両方を使用した３つの試験用量全てにおいて有効であった。５ｍｇ／ｋｇで投与された場合、ＬＣ１０およびＬＴＭ１４を含む全ての抗体は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＣＡ−１２７（図５ａ）およびＮｅｗｍａｎ（図６ａ）の両方に対して同様の有効性を示し、アイソタイプ一致対照抗体と比較して、病変を≧８５％減少させた。同様に、０．５ｍｇ／ｋｇでマウスに投与された場合、全ての抗体は、アイソタイプ一致抗体で治療されたものと比較して、病巣サイズにおいて５０〜６０％の同様の減少を示した（図５ｂおよび６ｂ）。しかしながら、病変サイズの減少は、アイソタイプ一致抗体で治療されたものと比較して、３０〜４０％の範囲のＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＣＡ−１２７（図５ｃ）およびＮｅｗｍａｎ（図６ｃ）の両方を使用して０．１２５ｍｇ／ｋｇで投与された場合、Ｈ１Ｈ１５３８１Ｐ、ＬＣ１０、およびＬＴＭ１４と比較して、Ｈ１Ｈ１５３７７ＰおよびＨ１Ｈ１５３９９Ｐでより大きかった。全ての抗体について、５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、および０．１２５ｍｇ／ｋｇの群の比較は、用量依存性効果を示した：より高い濃度で抗体を投与されたマウスは、より小さな病変（５ｍｇ／ｋｇ用量の病変＜０．５ｍｇ／ｋｇ用量の病変＜０．１２５ｍｇ／ｋｇ用量の病変）を有した。
【０１６４】
実施例１０抗溶血素Ａ  ｍＡｂを予防的に投与したマウスの皮膚中の細菌数。
本発明の３つの精製された抗体、Ｈ１Ｈ１５３７７Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３８１Ｐ、およびＨ１Ｈ１５３９９Ｐを皮膚壊死モデルにおいて試験して、抗体で予防的に治療されたマウスの皮膚における細菌負荷に何らかの変化が観察されたかどうかを決定した。本発明の抗体を、他の２つの抗溶血素Ａ  ｍＡｂ、ＬＣ１０、およびＬＴＭ１４とも比較した。感染の２日前に、毛皮を剃毛し、脱毛ローションを適用することによって、雌のＢＡＬＢ／ｃマウスの腹部領域から毛皮を除去した。感染の１日前に、マウスの腹部の左側に、５ｍｇ／ｋｇの各個々の抗体：Ｈ１Ｈ１５３７７Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３８１Ｐ、およびＨ１Ｈ１５３９９Ｐ、ＬＴＭ１４、ＬＣ１０、またはアイソタイプ一致対照抗体の単回用量を腹腔内注射した。感染の日に、マウス（１群あたりｎ＝５）の腹部の右側に、ＴＳＢ中に３７℃で対数期（ＯＤ６００≦１）まで増殖させ、洗浄し、ＰＢＳ中に懸濁した、５０μｌのＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＣＡ−１２７（ＭＲＳＡ株、２．５×１０８ＣＦＵ／マウス）またはＮｅｗｍａｎ（ＭＳＳＡ株、２．９×１０８ＣＦＵ／マウス）を皮下投与した。感染後２日目に、マウスを麻酔で安楽死させ、８ｍｍの皮膚生検パンチを使用して、病変領域（および周囲の皮膚）を切除し、均質化した。皮膚溶解物の連続希釈物をＴＳＡプレートに播種した。プレートを３７℃で一晩（１６〜１８時間）インキュベートし、翌日、細菌コロニーを細菌負荷の決定のために計数した。
【０１６５】
抗体Ｈ１Ｈ１５３７７ＰおよびＨ１Ｈ１５３９９Ｐは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＣＡ−１２７（図７ａ）およびＮｅｗｍａｎ（図７ｂ）の両方に感染させたマウスの皮膚における細菌負荷を減少させ、具体的には、５ｍｇ／ｋｇのいずれかの抗体は、結果として、アイソタイプ一致対照抗体で治療された動物について決定された細菌負荷のレベルと比較して、皮膚細菌負荷の１〜１．５対数減少をもたらした。同じ用量のＨ１Ｈ１５３８１Ｐ、ＬＴＭ１４、またはＬＣ１０は、結果として、皮膚の細菌負荷を０〜０．５対数減少させた。結果は、Ｈ１Ｈ１５３７７ＰおよびＨ１Ｈ１５３９９Ｐが感染したマウスの皮膚における細菌負荷を減少させるのに最も有効であることを示す。
【０１６６】
実施例１１治療的に投与された抗溶血素Ａ  ｍＡｂのインビボ有効性
本発明のｍＡｂが感染後に投与された場合にも病変サイズを減少させることができるかどうかを決定するために、精製された抗体を、雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを使用してインビボ皮膚壊死モデルにおいて治療的に試験した（ｎ＝５）。感染の２日前に、毛皮を剃毛し、脱毛ローションを適用することによって、腹部領域から除去した。感染の日に、マウスの腹部の右側に、ＴＢＳ中に３７℃で対数期（ＯＤ６００≦１）まで増殖させ、洗浄し、ＰＢＳ中に懸濁した、５０μｌのＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＣＡ−１２７（約１〜２×１０８ＣＦＵ／マウス）を皮下投与した。感染の２時間後、マウスの腹部の左側に、０．５ｍｇ／ｋｇの各個々の抗体：Ｈ１Ｈ１５３７５Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７６Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７７Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７８Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７９Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３８０Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３８１Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３９９Ｐ、Ｈ１Ｈ１５４０４Ｐ、Ｈ１Ｈ１５４０５Ｐ、Ｈ１Ｈ１５４０８Ｐ、Ｈ１Ｈ１５４１０Ｐ、Ｈ１Ｈ１５４１４Ｐ、Ｈ１Ｈ１５４１８Ｐ２、Ｈ１Ｈ１５４２０Ｐ２、またはアイソタイプ一致対照抗体の単回用量を腹腔内注射した。感染後２日目に、マウスの病変をデジタルノギスで測定した。
【０１６７】
本発明の全ての抗体は、感染の２時間後に０．５ｍｇ／ｋｇで動物に投与された場合に病変サイズを減少させるのに有効であった（表１１）。皮膚壊死性病変サイズの減少は、５０〜８３％の範囲であった。抗体のうちの８つ（Ｈ１Ｈ１５３７６Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７７Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７８Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７９Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３８０Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３９９Ｐ、Ｈ１Ｈ１５４１８Ｐ２、および  Ｈ１Ｈ１５４２０Ｐ２）は、病変サイズにおいて＞７０％の減少を示した。
【０１６８】
【表１１】
2020504759.tif 000013
【０１６９】
実施例１２メチシリン感受性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＳＳＡ）株を使用した急性肺炎モデルにおける抗溶血素Ａ  ｍＡｂのインビボ有効性
５ｍｇ／ｋｇの抗体を予防的に投与したマウスの生存。予防的に投与された場合のＭＳＳＡ株に対するｍＡｂの有効性を決定するために、以下の抗体Ｈ１Ｈ１５３７５Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７６Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７７Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７８Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７９Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３８０Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３８１Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３９９Ｐ、およびＨ１Ｈ１５４１４Ｐを、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  Ｎｅｗｍａｎを使用した急性肺炎モデルにおける研究のために選択した（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｂｕｂｅｃｋ  Ｗａｒｄｅｎｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７５：１０４０−１０４４）。雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５）に、５ｍｇ／ｋｇの単回用量のＨ１Ｈ１５３７５Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７６Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７７Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７８Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７９Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３８０Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３８１Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３９９Ｐ、Ｈ１Ｈ１５４１４Ｐ、またはアイソタイプ一致対照抗体を腹腔内注射した。ｍＡｂの注射後１日目に、マウスに、ＴＳＢ中に３７℃で対数期（ＯＤ６００≦１）まで増殖させ、洗浄し、ＰＢＳ中に懸濁した、５０μｌのＳ．ａｕｒｅｕｓ  Ｎｅｗｍａｎ（１．７×１０８ＣＦＵ／マウス）でマウスを気管内投与した。感染後合計６日間生存率についてマウスを監視した。
【０１７０】
表１２に見られるように、抗体Ｈ１Ｈ１５３７５Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７６Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７８Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７９Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３８０Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３８１Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３９９Ｐ、またはＨ１Ｈ１５４１４Ｐの投与は、結果として１００％の生存率をもたらした。Ｈ１Ｈ１５３７７Ｐの投与は、結果として６日目までに８０％の生存率をもたらした。本発明の全ての抗体は、感染症の急性肺炎モデルにおいて５ｍｇ／ｋｇで予防的に与えられた場合にＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＳＳＡ株に感染したマウスの生存を増加させた。
【０１７１】
【表１２】
2020504759.tif 000014
【０１７２】
２．５ｍｇ／ｋｇで抗体を予防的に投与したマウスの生存。抗体がＭＳＳＡ株に対して急性肺炎モデルにおいてより低い用量でも有効であるかどうかを決定するために、Ｃ５７ＢＬ／６雌マウス（ｎ＝５）に、２．５ｍｇ／ｋｇのＨ１Ｈ１５３７５Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７７Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７８Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７９Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３８０Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３８１Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３９９Ｐ、Ｈ１Ｈ１５４１４Ｐ、またはアイソタイプ一致抗体の単回用量を腹腔内注射した。ｍＡｂの注射後１日目に、ＴＳＢ中に３７℃で対数期（ＯＤ６００≦１）まで増殖させ、洗浄し、ＰＢＳ中に再懸濁した、５０μｌのＳ．ａｕｒｅｕｓ  Ｎｅｗｍａｎ（７．５×１０７ＣＦＵ／マウス）を気管内投与した。感染後合計６日間生存率についてマウスを監視した。
【０１７３】
表１２に見られるように、抗体Ｈ１Ｈ１５３７６Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７７Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７９Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３８１Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３９９Ｐ、またはＨ１Ｈ１５４１４Ｐの投与は、６日目まで１００％の生存率をもたらしたが、抗体Ｈ１Ｈ１５３７８ＰまたはＨ１Ｈ１５３８０Ｐの投与は、８０％の生存率をもたらした。抗体Ｈ１Ｈ１５３７５Ｐは他の抗体と比較して有効性が低く、６０％の防御しか提供しなかった（表１３）。
【０１７４】
結果は、抗体Ｈ１Ｈ１５３７５Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７６Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７８Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７９Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３８０Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３８１Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３９９Ｐ、Ｈ１Ｈ１５４１４Ｐ、およびＨ１Ｈ１５３７７Ｐが、溶血素Ａの細胞毒性効果において有効であり、ｍＡｂがより低容量で投与された場合であっても、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＳＳＡ株を使用したマウスの急性肺炎モデルにおいて生存を増加させていることを示す。
【０１７５】
【表１３】
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【０１７６】
実施例１３メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）株を使用した急性肺炎モデルにおける抗溶血素Ａ  ｍＡｂのインビボ有効性
５ｍｇ／ｋｇの抗体を予防的に投与したマウスの生存。ＭＲＳＡ株に対するｍＡｂの有効性を試験するために、以下の抗体Ｈ１Ｈ１５３７５Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７６Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７７Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７８Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７９Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３８０Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３８１Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３９９Ｐ、およびＨ１Ｈ１５４１４Ｐを、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＣＡ−１２７を使用した予防的急性肺炎モデルにおける研究のために選択した。雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５）に、５ｍｇ／ｋｇのＨ１Ｈ１５３７５Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７６Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７７Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７８Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７９Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３８０Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３８１Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３９９Ｐ、Ｈ１Ｈ１５４１４Ｐ、またはアイソタイプ一致対照抗体の単回用量を腹腔内注射した。ｍＡｂの注射後１日目に、マウスに、ＴＳＢ中に３７℃で対数期（ＯＤ６００≦１）まで増殖させ、洗浄し、ＰＢＳ中に再懸濁した、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＣＡ−１２７の２．２×１０８ＣＦＵ（低接種物）または４．８×１０８ＣＦＵ（高接種物）のいずれかを含有する５０μｌを気管内投与した。感染後合計６日間、生存率についてマウスを監視した。
【０１７７】
９つの発明抗体のうちの８つは、マウスに低接種物を投与した場合に有効性を示した。具体的には、抗体Ｈ１Ｈ１５３７５Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７７Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７８Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７９Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３８０Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３８１Ｐ、およびＨ１Ｈ１５３９９Ｐは、等しく有効であり、結果として、６日目まで１００％の生存率をもたらした（表１４）。抗体Ｈ１Ｈ１５４１４Ｐの投与は、８０％の生存率をもたらした。この抗体を投与されたマウスは６日目まで生存しなかったので、Ｈ１Ｈ１５３７６Ｐは、防御を実証しなかった。アイソタイプ一致抗体で治療された動物のうちのいずれも、６日目まで生存しなかった（表１３）。
【０１７８】
より高い接種物では、本発明の抗体間の有効性のより大きな差が観察された。表１３に見られるように、抗体Ｈ１Ｈ１５３７７ＰおよびＨ１Ｈ１５３９９Ｐが、試験された抗体の中で最も有効であり、結果として、６日目まで１００％の生存率をもたらした。抗体Ｈ１Ｈ１５４１４Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７８Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７９Ｐ、およびＨ１Ｈ１５３８１Ｐの投与は、６日目まで６０％の生存率をもたらしたが、アイソタイプ一致対照抗体で治療された群の動物のうちのいずれも、６日目まで生存しなかった。抗体Ｈ１Ｈ１５３７５Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７６Ｐ、およびＨ１Ｈ１５３８０Ｐは、試験された他の本発明抗体よりも低い有効性を有し、それぞれ６日目までに２０％、０％、または４０％の生存率をもたらした（表１３）。
【０１７９】
結果は、Ｈ１Ｈ１５３７５Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７７Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７８Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７９Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３８０Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３８１Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３９９Ｐ、およびＨ１Ｈ１５４１４Ｐは、溶血素Ａの細胞毒性効果を減少させるのに有効であり、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＲＳＡ株の低接種物を急性肺炎モデルにおいて５ｍｇ／ｋｇで予防的に与えられた場合に生存率を増加させるのに有効であることを示す。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＲＳＡ株のより高い接種物をこのモデルに使用した場合、２つの抗体、Ｈ１Ｈ１５３７７ＰおよびＨ１Ｈ１５３９９Ｐもまた、１００％有効であった。
【０１８０】
【表１４】
2020504759.tif 000016
【０１８１】
２．５ｍｇ／ｋｇで抗体を予防的に投与したマウスの生存。抗体が急性肺炎モデルにおいてＭＲＳＡ株に対してより低い用量でも有効であるかどうかを決定するために、雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５）に、２．５ｍｇ／ｋｇのＨ１Ｈ１５３７５Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７６Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７７Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７８Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７９Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３８０Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３８１Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３９９Ｐ、Ｈ１Ｈ１５４１４Ｐ、またはアイソタイプ一致対照抗体の単回用量を腹腔内注射した。ｍＡｂの注射後１日目に、マウスに、ＴＳＢ中に３７℃で対数期（ＯＤ６００≦１）まで増殖させ、洗浄し、ＰＢＳ中に再懸濁した、５０μｌのＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＣＡ−１２７（３．０×１０８ＣＦＵ／マウス）を気管内投与した。感染後合計６日間、生存率についてマウスを監視した。
【０１８２】
試験された全ての発明抗体（Ｈ１Ｈ１５３７５Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７７Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７８Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７９Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３８０Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３８１Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３９９Ｐ、またはＨ１Ｈ１５４１４Ｐ）は、等しく有効であり、結果として６日目まで１００％の生存率をもたらしたが、アイソタイプ一致対照抗体で治療された群の動物のうちのいずれも、６日目まで生存しなかった（表１５）。結果は、Ｈ１Ｈ１５３７５Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７７Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７８Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３７９Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３８０Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３８１Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３９９Ｐ、およびＨ１Ｈ１５４１４Ｐが、溶血素Ａの細胞毒性効果を減少させるのに有効であり、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＲＳＡ株による感染の急性肺炎モデルにおいて２．５ｍｇ／ｋｇで予防的に与えられた場合の生存率を増加させることに有効であることを示す。
【０１８３】
【表１５】
2020504759.tif 000017
【０１８４】
Ｈ１Ｈ１５３９９ＰおよびＨ１Ｈ１５３７６Ｐを予防的に投与したマウスの肺中の細菌数。本発明の２つの精製された抗体、Ｈ１Ｈ１５３９９ＰおよびＨ１Ｈ１５３７６Ｐを、急性肺炎研究において試験して、抗体で予防的に治療されたマウスの肺における細菌負荷の何らかの変化が観察されたかどうかを決定した。雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５）の群に、３つの用量のＨ１Ｈ１５３９９Ｐ、単回用量のＨ１Ｈ１５３７６Ｐ、またはアイソタイプ一致対照抗体（５ｍｇ／ｋｇ）のうちの１つを腹腔内注射した。注射後１日目、マウスに、ＴＳＢ中に３７℃で対数期（ＯＤ６００≦１）まで増殖させ、洗浄し、ＰＢＳ中に再懸濁した、５０μｌのＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＣＡ−１２７（１．６×１０８ＣＦＵ／マウス）を気管内投与した。感染の１８時間後に、マウスを麻酔で安楽死させ、肺を摘出して均質化した。肺溶解物の連続希釈物をＴＳＡプレートに播種した。プレートを３７℃で一晩（１６〜１８時間）インキュベートし、翌日、細菌コロニーを細菌負荷の決定のために計数した。
【０１８５】
抗体Ｈ１Ｈ１５３９９Ｐは、感染されたマウスの肺における細菌負荷を減少させ（表１６）、具体的には、試験された３つの用量のＨ１Ｈ１５３９９Ｐのうちの全てが、アイソタイプ一致対照抗体で治療された動物について決定された細菌負荷のレベルと比較して、肺細菌負荷の１〜１．５対数減少をもたらした。加えて、肺の細菌負荷のこの減少は、用量依存的であった。抗体Ｈ１Ｈ１５３７６Ｐは、このモデルにおいていかなる有効性も示さず、アイソタイプ一致抗体と同様の肺細菌性肺負荷を示した。結果は、Ｈ１Ｈ１５３９９Ｐが、感染されたマウスの肺における細菌負荷を減少させることができたことを示す。
【０１８６】
【表１６】
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【０１８７】
抗溶血素Ａ  ｍＡｂが肺内の細菌負荷を減少させる能力をさらに調べるために、生存率の増加が実証された３つのｍＡｂ（Ｈ１Ｈ１５３７７Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３８１Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３９９Ｐ）を２つの異なる用量で予防的に投与し、２つの他の抗溶血素Ａ  ｍＡｂであるＬＣ１０およびＬＴＭ１４と比較した。雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスの群（ｎ＝５）に、各個々の抗体：Ｈ１Ｈ１５３７７Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３８１Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３９９Ｐ、ＬＴＭ１４、ＬＣ１０、またはアイソタイプ一致を対照抗体の１．２５ｍｇ／ｋｇまたは０．３２５ｍｇ／ｋｇの単回用量を腹腔内注射した。注射後１日目、マウスに、ＴＳＢ中に３７℃対数期（ＯＤ６００≦１）まで増殖させ、洗浄し、ＰＢＳ中に再懸濁した、５０μｌのＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＣＡ−１２７（１．３×１０８ＣＦＵ／マウス）を気管内投与した。感染の１８時間後に、マウスを麻酔で安楽死させ、肺を摘出して均質化した。肺溶解物の連続希釈物をＴＳＡプレートに播種した。プレートを３７℃で一晩（１６〜１８時間）インキュベートし、翌日、細菌コロニーを細菌負荷の決定のために計数した。
【０１８８】
試験された本発明の３つの抗体は全て、ＬＴＭ１４、ＬＣ１０、およびアイソタイプ一致対照抗体と比較して１．２５ｍｇ／ｋｇで投与された場合に有効であり、肺における細菌負荷を１対数だけ減少させた（図８ａ）。０．３２５ｍｇ／ｋｇで投与された場合、Ｈ１Ｈ１５３９９Ｐは、細菌量の減少にも有効であった（図８ｂ）。試験された他の全ての溶血素Ａ  ｍＡｂは、このより低い用量ではマウスの肺中の細菌を有意に減少させなかった（図８ｂ）。
【０１８９】
実施例１４プレ複合方法を使用した、異なる抗溶血素Ａモノクローナル抗体間オクテット交差競合
２つの抗体が溶血素Ａ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓから精製された）上でエピトープに結合するために互いに競合するかどうかを評価するために、抗溶血素Ａモノクローナル抗体間の結合競合を、Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ３８４バイオセンサ（Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｃｏｒｐ．）上の実時間の無標識生体層干渉法を使用して決定した。実験全体を、ｐＨ７．４の０．０１ＭのＨＥＰＥＳ、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ−２０、１．０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ（Ｏｃｔｅｔ  ＨＢＳ−ＥＴ緩衝液）中に２５℃で、プレートを１０００ｒｐｍの速度で振とうしながら実施した。約１．５〜２．５ｎｍの抗溶血素Ａモノクローナル抗体を、抗ｈＦｃ抗体被覆Ｏｃｔｅｔバイオセンサチップ（Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｃｏｒｐ．、＃１８〜５０６０）上に、抗溶血素Ａモノクローナル抗体（ｍＡｂ−１）の５０μｇ／ｍＬ溶液を含有するウェルに２分間浸すことによって、最初に捕捉した。次に、抗体捕捉バイオセンサチップを、遮断ｍＡｂの１００μｇ／ｍＬ溶液を含有するウェルに３分間浸漬することによって、遮断Ｈ４Ｈアイソタイプ対照モノクローナル抗体（遮断ｍＡｂ）で飽和させた。次に、バイオセンサチップを、１μＭの第２の抗溶血素Ａモノクローナル抗体（ｍＡｂ−２）とともに２時間予めインキュベートされた１００ｎＭの溶血素Ａを含有するウェルに４分間浸した。実験の各工程の間に、バイオセンサチップをＯｃｔｅｔ  ＨＢＳ−ＥＴ緩衝液中で洗浄した。実時間の結合応答を、実験の過程の間監視し、各工程の終了時の結合応答を記録した。ｍＡｂ−１への溶血素Ａプレ複合体化ｍＡｂ−２結合の応答を、バックグラウンド結合について補正し、比較し、異なる抗溶血素Ａモノクローナル抗体の競合的／非競合的挙動を決定した。表１７は、結合の桁数とは独立して、両方向で競合する抗体の関連性を明白に定義する。
【０１９０】
【表１７】
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【表１８】
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【０１９１】
本発明は、本明細書に記載された特定の実施形態によって範囲が限定されるべきではない。実際、本明細書に記載されたものに加えて本発明の様々な修正は、前述の記載および添付の図から当業者には明らかであろう。そのような修正は、添付の特許請求の範囲の範囲内に該当することが企図されている。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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