(57)【要約】  非天然アミノ酸を含有する免疫原性組成物の生成のための方法を開示する。非天然アミノ酸は、免疫原性接合体を作製するための、細菌莢膜多糖などの抗原の付着のための部位であり得る。非天然アミノ酸に組み込まれるバイオ直交性付着化学により、免疫系に対するより効率的で強力な抗原の提示、精製の単純化、およびこれらの半合成免疫原のより明確に定義された構造が可能になる。
2020504760.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドおよび抗原を含む接合体であって、前記ポリペプチドが、少なくとも１つのＴ細胞活性化エピトープおよび少なくとも２つの非天然アミノ酸（「ｎｎＡＡ」）残基を含む担体タンパク質であり、（ｉ）前記担体タンパク質が、コリネバクテリウム・ジフテリア菌毒素、破傷風菌テタノスパスミン、ヘモフィルス・インフルエンザ菌タンパク質Ｄ、およびＣＲＭ１９７からなる群から選択されるタンパク質由来の少なくとも１つのＴ細胞活性化エピトープを含み、（ｉｉ）前記抗原が、前記ｎｎＡＡ残基と接合している、接合体。
【請求項２】
前記担体タンパク質が、４〜９個のｎｎＡＡ残基を含む、請求項１に記載の接合体。
【請求項３】
少なくとも１つのｎｎＡＡが、天然担体タンパク質中のリジンと置換される、請求項１または２に記載の接合体。
【請求項４】
前記担体タンパク質が、配列番号１と少なくとも８０％の配列同一性を有する、請求項１〜３のいずれかに記載の接合体。
【請求項５】
少なくとも１つのｎｎＡＡが、配列番号１のＫ２５、Ｋ３４、Ｋ３８、Ｋ４０、Ｋ２１３、Ｋ２１５、Ｋ２２８、Ｋ２４５、Ｋ２６５、Ｋ３８６、Ｋ５２３、またはＫ５２７と置換される、請求項４に記載の接合体。
【請求項６】
前記担体タンパク質が、配列番号９のアミノ酸配列を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の接合体。
【請求項７】
前記少なくとも１つのｎｎＡＡが、２位のアミノ置換基と、３位のアジド含有置換基、１，２，４，５−テトラジニル置換基、またはエチニル含有置換基とを持つ２，３−二置換プロパン酸である、請求項１〜６のいずれかに記載の接合体。
【請求項８】
前記ｎｎＡＡが、２−アミノ−３−（４−アジドフェニル）プロパン酸（ｐＡＦ）、２−アミノ−３−（４−（アジドメチル）フェニル）プロパン酸（ｐＡＭＦ）、２−アミノ−３−（５−（アジドメチル）ピリジン−２−イル）プロパン酸、２−アミノ−３−（４−（アジドメチル）ピリジン−２−イル）プロパン酸、２−アミノ−３−（６−（アジドメチル）ピリジン−３−イル）プロパン酸、２−アミノ−５−アジドペンタン酸、および２−アミノ−３−（４−（アジドメチル）フェニル）プロパン酸、またはそれらの任意の組み合わせから選択される、請求項１〜７のいずれかに記載の接合体。
【請求項９】
前記抗原が、トリアゾール連結部分を介して前記ｎｎＡＡと接合している、請求項１〜８のいずれかに記載の接合体。
【請求項１０】
ポリペプチドおよび抗原を含む接合体であって、前記ポリペプチドが、少なくとも１つのＴ細胞活性化エピトープおよび少なくとも１つの非天然アミノ酸（ｎｎＡＡ）を含む担体タンパク質であり、前記抗原が、前記ｎｎＡＡと接合し、さらに、前記少なくとも１つのｎｎＡＡ残基が、式ＸＩＩの構造を有するアミノ酸に対応し、
【化１】
2020504760.tif 000151
式中、Ａｒが、任意選択的に少なくとも１つのヘテロ原子を含有する５員または６員芳香族環を含み、Ｗ５が、Ｃ１〜Ｃ１０アルキレン、−ＮＨ−、−Ｏ−、および−Ｓ−から選択され、Ｑ１が、ゼロまたは１であり、Ｗ６が、アジド、任意選択的に低級アルキル基とＣ置換される１，２，４，５−テトラジニル、およびエチニルから選択され、その結果、前記ポリペプチド中の前記ｎｎＡＡ残基が、式ＸＩＩＩの構造を有し、
【化２】
2020504760.tif 000152
式中、Ｒ３が、ＯＨまたは前記担体タンパク質のアミノ酸残基であり、Ｒ４が、Ｈまたは前記担体タンパク質のアミノ酸残基である、接合体。
【請求項１１】
Ｗ６がアジドであり、Ａｒがフェニレンであり、またはＡｒが、窒素ヘテロ原子および任意選択的に、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つの追加のヘテロ原子を含有し、Ｑ１が１であり、かつ／またはＷ５が低級アルキレンである、請求項１０に記載の接合体。
【請求項１２】
前記抗原が、式ＸＩまたはＸＩａによる前記担体タンパク質に連結され、
【化３】
2020504760.tif 000153
式中、
Ｒ１が、Ｈ、ホルミル、または前記担体タンパク質の少なくとも１つのアミノ酸であり、
Ｒ２が、ＯＨまたは前記担体タンパク質の少なくとも１つのアミノ酸であり、
Ｗが、ＣまたはＮであり、
ｙが、少なくとも１であり、
ｎが、少なくとも１であり、
Ｘが、莢膜多糖の少なくとも１つのポリオールである、請求項１〜１１のいずれかに記載の接合体。
【請求項１３】
前記抗原が、細菌莢膜多糖、例えば、肺炎連鎖球菌、髄膜炎菌、ヘモフィルス・インフルエンザ菌、化膿連鎖球菌、ストレプトコッカス・アガラクチア、およびポルフィロモナス・ジンジバリスからなる群から選択される細菌由来の莢膜多糖である、請求項１〜１２のいずれかに記載の接合体。
【請求項１４】
前記抗原が、１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１３、１４、１５Ｂ、１６、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１、および３３Ｆからなる群から選択される肺炎連鎖球菌血清型の莢膜多糖である、請求項１２に記載の接合体。
【請求項１５】
多糖類と担体タンパク質との比率（ｗ／ｗ）が、１を上回る、請求項１〜１４のいずれかに記載の接合体。
【請求項１６】
前記ポリペプチドが、３つ以上のｎｎＡＡ残基を含み、前記接合体が、少なくとも５００ｋＤａの分子量を有する、請求項１〜１５のいずれかに記載の接合体。
【請求項１７】
前記ポリペプチドが、（ａ）ＣＲＭ１９７であるか、または配列番号１と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、（ｂ）３〜９つのｎｎＡＡ残基を含む、請求項１５に記載の接合体。
【請求項１８】
前記接合体が、タンパク質−抗原−タンパク質連結を通して架橋される、請求項１〜１７のいずれかに記載の接合体。
【請求項１９】
前記接合体が、少なくとも９００ｋＤａの分子量を有する、請求項１〜１８のいずれかに記載の接合体。
【請求項２０】
分子量が９００ｋＤａ〜５ＭＤａである、請求項１９に記載の接合体。
【請求項２１】
接合体を生成するための方法であって、
ａ．非天然アミノ酸（「ｎｎＡＡ」）の第２の化学ハンドルに接合することができる第１の化学ハンドルを含む複数の官能基を含む活性化抗原を提供することと、
ｂ．前記第１および第２の化学ハンドルが反応して抗原−ポリペプチド接合体を形成する条件下で、前記ｎｎＡＡのうちの少なくとも１つを含むポリペプチドと前記活性化抗原を組み合わせることであって、前記ポリペプチドが、少なくとも１つのＴ細胞活性化エピトープを含む、組み合わせることと、
ｃ．前記接合体を含む組成物を回収することと、を含む、方法。
【請求項２２】
前記第１の化学ハンドルが、アルキン基を含み、かつ／または前記第２の化学ハンドルがアジド基を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記抗原が、プロパルギル、ＤＩＦＯ、ＤＢＣＯ、ＤＢＣＯ−ＮＨ２、およびＤＢＣＯ（ＰＥＧ）ｎ−ＮＨ２からなる群から選択される官能基を含む第２の試薬と反応されている、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
（ｉ）前記抗原が、式Ｖ、式ＶＩ、もしくは式ＶＩａの構造を含み、
【化４】
2020504760.tif 000154
式中、Ｌ１が、結合、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ（Ｌ１２）−、−Ｏ（Ｌ１２）−、もしくは−Ｓ（Ｌ１２）−であり、
Ｌ２が、結合、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｓ（＝Ｏ）２−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｌ１２−、−Ｓ（＝Ｏ）２Ｌ１２であり、
Ｌ１２が、Ｌ２２もしくはＬ２２ＮＨ−であり、
Ｌ２２が、Ｃ１−１０アルキルまたは−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）１−１０−であり、
Ｕ１が、前記抗原の少なくとも１つの部分であるか、
または（ｉｉ）前記抗原が、式ＶＩＩもしくは式ＶＩＩａの構造を含み、
【化５】
2020504760.tif 000155
式中、Ｘが、多糖類の少なくとも１つのポリオールであり、
ｎが少なくとも１であるか、
または（ｉｉｉ）前記抗原が、式ＶＩＩｂもしくは式ＶＩＩｃの構造を含み、
【化６】
2020504760.tif 000156
式中、Ｘが、多糖類の少なくとも１つのアミノ糖のアミンであり、
ｎが少なくとも１であるか、
または（ｉｖ）前記抗原が、構造Ａ−Ｘのｚ部分を含み、式中、
Ａが、
【化７】
2020504760.tif 000157
であり、
Ｘが、多糖類の少なくとも１つのポリオールであり、
ｎが、少なくとも１であり、
ｚが１を上回るか、
または（ｖ）前記抗原が式ＶＩＩＩの構造を含み、
【化８】
2020504760.tif 000158
式中、Ｌ２２が、結合、アルキル、またはポリ（アルキルオキシ）であり、
Ｕ１が、抗原の少なくとも１つの部分であるか、
または（ｖｉ）前記抗原が、式ＩＸの構造を含み、
【化９】
2020504760.tif 000159
式中、Ｕ１が、抗原の少なくとも１つの部分であるか、
または（ｖｉｉ）前記抗原が、式ＩＸａの構造を含み、
【化１０】
2020504760.tif 000160
式中、Ｌ２２が、Ｃ１−１０アルキルまたは−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）１−１０−であり、
Ｕ１が、抗原の少なくとも１つの部分であるか、請求項２１または請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１〜２０のいずれかに記載の接合体を生成するための、請求項２１〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
抗原がＴ細胞依存性免疫反応を提供する担体タンパク質と接合している、タンパク質−接合体ワクチンを作製する改善された方法であって、前記改善が、少なくとも１つの非天然アミノ酸を含むポリペプチドを前記担体タンパク質として用いることを含み、前記非天然アミノ酸が、バイオ直交性反応性部分を含み、それを通じて前記抗原が前記ポリペプチドに接合される、改善された方法。
【請求項２７】
少なくとも１つのＴ細胞活性化エピトープおよび少なくとも２つの非天然アミノ酸（「ｎｎＡＡ」）残基を含む担体タンパク質であって、（ｉ）前記担体タンパク質が、コリネバクテリウム・ジフテリア菌毒素、破傷風菌テタノスパスミン、ヘモフィルス・インフルエンザ菌タンパク質Ｄ、およびＣＲＭ１９７からなる群から選択されるタンパク質由来の少なくとも１つのＴ細胞活性化エピトープを含む、担体タンパク質。
【請求項２８】
配列番号１と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ配列番号１内に天然に生じるアミノ酸と置換される少なくとも１つのｎｎＡＡを含む、担体タンパク質であって、前記少なくとも１つのｎｎＡＡが、配列番号１のＫ２５、Ｋ３４、Ｋ３８、Ｋ４０、Ｋ２１３、Ｋ２１５、Ｋ２２８、Ｋ２４５、Ｋ２６５、Ｋ３８６、Ｋ５２３、またはＫ５２７と置換され、前記ｎｎＡＡが、連結部分を含む、担体タンパク質。
【請求項２９】
免疫原性多糖類−タンパク質接合体を調製するための担体タンパク質であって、前記タンパク質が、（ｉ）少なくとも１つのＴ細胞活性化エピトープを含み、（ｉｉ）少なくとも１つのｎｎＡＡを含み、かつ（ｉｉｉ）ｐＨ７．４のトリス緩衝液中、２０℃で少なくとも５０ｍｇ／Ｌの溶解度を有する、担体タンパク質。
【請求項３０】
請求項２６〜２８のいずれかに記載の担体タンパク質を生成するためのプロセスであって、
（ａ）前記担体タンパク質をコードする核酸であって、複数の抑制コドンを含む、核酸を提供することと、
（ｂ）前記非天然アミノ酸、前記抑制コドンに相補的であるｔＲＮＡ、およびアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を含む無細胞抽出物と前記核酸を組み合わせることによって反応混合物を作出することと、
（ｃ）前記担体タンパク質中の各抑制コドンに対応する部位に前記非天然アミノ酸を選択的に組み込むのに十分な条件下で、前記（ｂ）の前記反応混合物を培養することと、を含む、プロセス。
【請求項３１】
前記非天然アミノ酸が、４−アジドメチル−フェニルアラニン（ｐＡＭＦ）であり、前記（ｂ）のｔＲＮＡが、ｐＡＭＦで荷電されることができる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
約１０℃〜約３０℃の温度で維持された無細胞発現混合物中に少なくとも２つのｎｎＡＡを含むポリペプチドの合成のための方法であって、生成された前記ポリペプチドが、可溶性画分および不溶性画分の両方を含み、前記可溶性画分と前記不溶性画分との比率が、少なくとも３０％（ｗ／ｗ）である、方法。
【請求項３３】
前記温度が、（ｉ）約２０℃を上回るか、または（ｉｉ）約２０℃を下回り、例えば、前記温度が、約１４℃〜約１８℃である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
請求項１〜１９に記載の複数の接合体を含む組成物であって、前記複数の接合体の各々が、異なる抗原を含む、組成物。
【請求項３５】
血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１３、１４、１５Ｂ、１６、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１、および３３Ｆからなる群から選択される２つ以上の異なる肺炎球菌血清型由来の莢膜多糖の接合体、
血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１３、１４、１５Ｂ、１６、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１、および３３Ｆからなる群から選択される１４個以上の異なる肺炎球菌血清型由来の莢膜多糖の接合体、
血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１３、１４、１５Ｂ、１６、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１、および３３Ｆからなる群から選択される１５個以上の異なる肺炎球菌血清型由来の莢膜多糖の接合体、
血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１３、１４、１５Ｂ、１６、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１、および３３Ｆからなる群から選択される２０個以上の異なる肺炎球菌血清型由来の莢膜多糖の接合体、
血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１３、１４、１５Ｂ、１６、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１、および３３Ｆからなる群から選択される２１個以上の異なる肺炎球菌血清型由来の莢膜多糖の接合体、
血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１３、１４、１５Ｂ、１６、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１、および３３Ｆからなる群から選択される２４個以上の異なる肺炎球菌血清型由来の莢膜多糖の接合体、
血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１３、１４、１５Ｂ、１６、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１、および３３Ｆからなる群から選択される２５個以上の異なる肺炎球菌血清型由来の莢膜多糖の接合体、
血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、Ｘ、およびＹからなる群から選択される４つ以上の異なる髄膜炎菌血清群由来の莢膜多糖の接合体、または
血清型Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３、Ｋ４、Ｋ５、およびＫ６からなる群から選択される２つ以上の異なるポルフィロモナス・ジンジバリス血清型由来の莢膜多糖の接合体を含む、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
対象における抗原に対する免疫防御性抗体反応を誘発する方法であって、非経口投与に好適な賦形剤で、請求項１〜２０のいずれかに記載の接合体または請求項３４もしくは請求項３５に記載の組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
この出願は、２０１６年１２月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／４４１，１１５号、２０１７年７月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／５３０，８０３号、２０１７年１０月４日に出願された米国仮特許出願第６２／５６８，２０１号、および２０１７年１１月２７日に出願された米国仮特許出願第６２／５９１，１６０号の利益を主張し、それらの各々は、それらの全体が参照により組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
単離された抗原性高分子ベースのワクチン（例えば、第１世代髄膜炎菌、肺炎球菌、およびへモフィルス多糖類ワクチン）は、生の弱毒化または不活性化微生物ワクチンを中心としたより以前のワクチン製剤を越える著しい改善を示した。
【０００３】
精製された高分子は、製造が著しく容易であり、改善された安全特性を有し、より生産的な特異的免疫反応を発生させ得る（例えば、それらは、より保存されるか、または発病原因について重要である抗原を対象とし得る）。さらに、それらは、免疫反応が単に適切な免疫原を提供することによって特定の部位または特定の微生物を対象とすることができる、ワクチン生成に対する単純化された鋳型を提供する。しかしながら、この方策は、あらゆる高分子が強い免疫反応を発生させるわけではないという不都合な事実を抱えている。多くの脂質、多糖類、および特定のタンパク質抗原（および大部分の小分子）は、特定の患者集団（例としては、幼児または高齢者を含む）において本質的に弱く、一時的であり、かつ／または正常に機能しない免疫反応を発生させる。こうした弱い免疫反応は、主にＢ細胞を活性化するか、または別様に、免疫記憶および抗体成熟に関わるＴ細胞依存経路を活性化しない抗原構造から生じると考えられる。
【発明の概要】
【０００４】
本開示は、非天然アミノ酸を含有する免疫原性組成物の生成のための方法、組成物、および技術を対象とする。非天然アミノ酸に組み込まれるバイオ直交性付着化学により、免疫系に対するより効率的で強力な抗原の提示、単純化された精製、およびこれらの半合成免疫原のより明確に定義された構造が可能になる。
【０００５】
一実施形態では、本開示は、ポリペプチドおよび抗原を含む接合体であって、ポリペプチドが、少なくとも１つのＴ細胞活性化エピトープおよび少なくとも１つの非天然アミノ酸、すなわち「ｎｎＡＡ」を含む担体タンパク質であり、抗原がｎｎＡＡと接合している、接合体を提供する。別の実施形態では、担体タンパク質は、コリネバクテリウム・ジフテリア菌毒素、破傷風菌テタノスパスミン（破傷風毒素としても知られる）、ヘモフィルス・インフルエンザ菌タンパク質Ｄ（ＰＤ、ＨｉＤ）、血清群Ｂ髄膜炎菌（ＯＭＰＣ）の外膜タンパク質複合体、およびＣＲＭ１９７からなる群から選択されるタンパク質由来の少なくとも１つのＴ細胞活性化エピトープを含む。別の実施形態では、担体タンパク質は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、または少なくとも９つのｎｎＡＡを含む。別の実施形態では、少なくとも１つのｎｎＡＡは、天然担体タンパク質中のリジンと交換される。例えば、担体タンパク質は、天然ＣＲＭ１９７中の３９個のうちの少なくとも２（例えば、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、または少なくとも６）つのリジン残基がｎｎＡＡによって交換されている、ＣＲＭ１９７を含む。別の実施形態では、少なくとも１つのｎｎＡＡは、天然担体タンパク質中のフェニルアラニンと交換される。別の実施形態では、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、または少なくとも９つのｎｎＡＡは、天然担体タンパク質中のリジンと交換される。別の実施形態では、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、または少なくとも９つのｎｎＡＡは、天然担体タンパク質中のフェニルアラニンと交換される。別の実施形態では、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、または少なくとも９つのｎｎＡＡは、天然担体タンパク質中のリジン、フェニルアラニン、またはリジンおよびフェニルアラニンの両方と交換される。別の実施形態では、ｎｎＡＡは、２−アミノ−３−（４−アジドフェニル）プロパン酸（ｐＡＦ）、２−アミノ−３−（４−（アジドメチル）フェニル）プロパン酸（ｐＡＭＦ）、２−アミノ−３−（５−（アジドメチル）ピリジン−２−イル）プロパン酸、２−アミノ−３−（４−（アジドメチル）ピリジン−２−イル）プロパン酸、２−アミノ−３−（６−（アジドメチル）ピリジン−３−イル）プロパン酸、２−アミノ−５−アジドペンタン酸、および２−アミノ−３−（４−（アジドメチル）フェニル）プロパン酸、またはそれらの任意の組み合わせから選択される。別の実施形態では、担体タンパク質は、ジフテリア毒素（ＤＴ）、破傷風毒素（ＴＴ）、ヘモフィルス・インフルエンザ菌タンパク質Ｄ（ＰＤ）、およびＣＲＭ１９７からなる群から選択されるタンパク質と少なくとも８０％の配列同一性を有する。別の実施形態では、担体タンパク質は、配列番号１と少なくとも８０％の配列同一性を有する。別の実施形態では、少なくとも１つのＴ細胞活性化エピトープは、配列番号１によるＣＲＭ１９７由来のものである。別の実施形態では、少なくとも１つのｎｎＡＡは、配列番号１のＫ２５、Ｋ３４、Ｋ３８、Ｋ４０、Ｋ２１３、Ｋ２１５、Ｋ２２８、Ｋ２４５、Ｋ２６５、Ｋ３８６、Ｋ５２３、またはＫ５２７と交換される。別の実施形態では、少なくとも１つのｎｎＡＡは、配列番号１のＦ１３、Ｆ５４、Ｆ１２４、Ｆ１２８、Ｆ１４１、Ｆ１６８、Ｆ２５１、Ｆ３９０、Ｆ５３１、またはＦ５３２と交換される。別の実施形態では、少なくとも２つのｎｎＡＡは、配列番号１のＫ２５、Ｋ３４、Ｋ３８、Ｋ４０、Ｋ２１３、Ｋ２１５、Ｋ２２８、Ｋ２４５、Ｋ２６５、Ｋ３８６、Ｋ５２３、Ｋ５２７、Ｆ１３、Ｆ５４、Ｆ１２４、Ｆ１２８、Ｆ１４１、Ｆ１６８、Ｆ２５１、Ｆ３９０、Ｆ５３１、またはＦ５３２と交換される。別の実施形態では、少なくとも１つのｎｎＡＡは、配列番号１のＫ２６５と交換される。別の実施形態では、少なくとも１つのｎｎＡＡは、配列番号１のＫ３８６と交換される。別の実施形態では、少なくとも１つのｎｎＡＡは、配列番号１のＫ２６５およびＫ３８６と交換される。別の実施形態では、ｎｎＡＡは、２−アミノ−３−（４−アジドフェニル）プロパン酸（ｐＡＦ）、２−アミノ−３−（４−（アジドメチル）フェニル）プロパン酸（ｐＡＭＦ）、２−アミノ−３−（５−（アジドメチル）ピリジン−２−イル）プロパン酸、２−アミノ−３−（４−（アジドメチル）ピリジン−２−イル）プロパン酸、２−アミノ−３−（６−（アジドメチル）ピリジン−３−イル）プロパン酸、２−アミノ−５−アジドペンタン酸、および２−アミノ−３−（４−（アジドメチル）フェニル）プロパン酸、またはそれらの任意の組み合わせから選択される。別の実施形態では、抗原は、トリアゾール連結部分を介してｎｎＡＡと接合している。別の実施形態では、抗原は、多糖類である。別の実施形態では、抗原は、肺炎連鎖球菌、髄膜炎菌、ヘモフィルス・インフルエンザ菌（具体的には、ｂ型、すなわちＨｉｂ）、化膿連鎖球菌、またはストレプトコッカス・アガラクチアの莢膜多糖である。別の実施形態では、抗原は、１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１３、１４、１５Ｂ、１６、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１、および３３Ｆ、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される肺炎連鎖球菌血清型の莢膜多糖である。別の実施形態では、抗原は、ポルフィロモナス・ジンジバリスの６つの血清型（例えば、Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３、Ｋ４、Ｋ５および／またはＫ６）のうちの１つに由来する莢膜多糖である。
【０００６】
関連する実施形態では、接合体は、ポリペプチドおよび抗原を含み、ポリペプチドは、少なくとも１つのＴ細胞活性化エピトープ、ならびに少なくとも１つ、および好ましくは少なくとも２つのｎｎＡＡを含む担体タンパク質であり、抗原は、少なくとも１つのｎｎＡＡと接合し、さらに、少なくとも１つのｎｎＡＡは、２位のアミノ置換基と、３位のアジド含有置換基、１，２，４，５−テトラジニル含有置換基、またはエチニル含有置換基とを持つ、２，３−二置換プロパン酸である。
【０００７】
別の関連する実施形態では、接合体は、ポリペプチドおよび抗原を含み、ポリペプチドは、少なくとも１つのＴ細胞活性化エピトープ、ならびに少なくとも１つ、および好ましくは少なくとも２つのｎｎＡＡ残基を含む担体タンパク質であり、抗原は、ｎｎＡＡと接合し、さらに、ｎｎＡＡ残基は、式ＸＩＩの構造を有するアミノ酸に対応し、
【化１】
2020504760.tif 000003
式中、
Ａｒは、任意選択的に、少なくとも１つのヘテロ原子を含有する５員または６員芳香族環を含み、
Ｗ５は、Ｃ１〜Ｃ１０アルキレン、−ＮＨ−、−Ｏ−、および−Ｓ−から選択され、
Ｑ１は、ゼロまたは１であり、
Ｗ６は、アジド、任意選択的に低級アルキル基とＣ置換される１，２，４，５−テトラジニル、およびエチニルから選択され、
その結果、ポリペプチド中のｎｎＡＡ残基は、式ＸＩＩＩの構造を有し、
【化２】
2020504760.tif 000004
式中、Ｒ３は、ＯＨまたは担体タンパク質のアミノ酸残基であり、Ｒ４は、Ｈまたは担体タンパク質のアミノ酸残基である。
【０００８】
一実施形態では、本開示は、配列番号１による天然ポリペプチド内に天然に生じるアミノ酸と交換される少なくとも１つのｎｎＡＡを含むポリペプチドであって、少なくとも１つのｎｎＡＡが、配列番号１のＫ２５、Ｋ３４、Ｋ３８、Ｋ４０、Ｋ２１３、Ｋ２１５、Ｋ２２８、Ｋ２４５、Ｋ２６５、Ｋ３８６、Ｋ５２３、またはＫ５２７と交換され、ｎｎＡＡが連結部分を含む、ポリペプチドを提供する。別の実施形態では、本開示は、配列番号１による天然ポリペプチド内に天然に生じるアミノ酸と交換される少なくとも１つのｎｎＡＡを含むポリペプチドであって、少なくとも１つのｎｎＡＡが、配列番号１のＦ１３、Ｆ５４、Ｆ１２４、Ｆ１２８、Ｆ１４１、Ｆ１６８、Ｆ２５１、Ｆ３９０、Ｆ５３１、またはＦ５３２と交換され、ｎｎＡＡが連結部分を含む、ポリペプチドを提供する。別の実施形態では、本開示は、配列番号１による天然ポリペプチド内に天然に生じるアミノ酸と交換される少なくとも２つのｎｎＡＡを含むポリペプチドであって、少なくとも１つのｎｎＡＡが、配列番号１のＫ２５、Ｋ３４、Ｋ３８、Ｋ４０、Ｋ２１３、Ｋ２１５、Ｋ２２８、Ｋ２４５、Ｋ２６５、Ｋ３８６、Ｋ５２３、Ｋ５２７、Ｆ１３、Ｆ５４、Ｆ１２４、Ｆ１２８、Ｆ１４１、Ｆ１６８、Ｆ２５１、Ｆ３９０、Ｆ５３１、またはＦ５３２と交換され、ｎｎＡＡが連結部分を含む、ポリペプチドを提供する。別の実施形態では、ｎｎＡＡは、２−アミノ−３−（４−アジドフェニル）プロパン酸（ｐＡＦ）、２−アミノ−３−（４−（アジドメチル）フェニル）プロパン酸（ｐＡＭＦ）、２−アミノ−３−（５−（アジドメチル）ピリジン−２−イル）プロパン酸、２−アミノ−３−（４−（アジドメチル）ピリジン−２−イル）プロパン酸、２−アミノ−３−（６−（アジドメチル）ピリジン−３−イル）プロパン酸、２−アミノ−５−アジドペンタン酸、および２−アミノ−３−（４−（アジドメチル）フェニル）プロパン酸、またはそれらの任意の組み合わせから選択される。別の実施形態では、配列番号１のＫ２６５が交換される。別の実施形態では、配列番号１のＫ３８６が交換される。別の実施形態では、配列番号１のＫ２６５およびＫ３８６が交換される。別の実施形態では、ポリペプチドは、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、または少なくとも９つのｎｎＡＡを含む。別の実施形態では、ｎｎＡＡは、２−アミノ−３−（４−アジドフェニル）プロパン酸（ｐＡＦ）、２−アミノ−３−（４−（アジドメチル）フェニル）プロパン酸（ｐＡＭＦ）、２−アミノ−３−（５−（アジドメチル）ピリジン−２−イル）プロパン酸、２−アミノ−３−（４−（アジドメチル）ピリジン−２−イル）プロパン酸、２−アミノ−３−（６−（アジドメチル）ピリジン−３−イル）プロパン酸、２−アミノ−５−アジドペンタン酸、および２−アミノ−３−（４−（アジドメチル）フェニル）プロパン酸、またはそれらの任意の組み合わせから選択される。
【０００９】
関連する実施形態では、ポリペプチド中の少なくとも１つ、および好ましくは少なくとも２つのｎｎＡＡは、２位のアミノ置換基と、３位のアジド含有置換基、１，２，４，５−テトラジニル含有置換基、またはエチニル含有置換基とを持つ、２，３−二置換プロパン酸である。
【００１０】
別の関連する実施形態では、ポリペプチド中の少なくとも１つ、および好ましくは少なくとも２つのｎｎＡＡは、式ＸＩＩの構造を有し、
【化３】
2020504760.tif 000005
式中、
Ａｒは、任意選択的に、少なくとも１つのヘテロ原子を含有する５員または６員芳香族環を含み、
Ｗ５は、Ｃ１〜Ｃ１０アルキレン、−ＮＨ−、−Ｏ−、および−Ｓ−から選択され、
Ｑ１は、ゼロまたは１であり、
Ｗ６は、アジド、任意選択的に低級アルキル基とＣ置換される１，２，４，５−テトラジニル、およびエチニルから選択される。
【００１１】
一実施形態では、本開示は、ポリペプチド抗原接合体を含む組成物であって、ポリペプチドが、少なくとも１つのＴ細胞活性化エピトープおよび少なくとも１つのｎｎＡＡを含む担体タンパク質であり、抗原がｎｎＡＡと接合している、組成物を提供する。別の実施形態では、ポリペプチド抗原接合体は、タンパク質−抗原−タンパク質連結を通して架橋される。別の実施形態では、組成物は、複数の担体−タンパク質抗原接合体を含み、各接合体は、異なる抗原（例えば、異なる肺炎球菌血清型由来の莢膜多糖）を含む。別の実施形態では、抗原は、同じ微生物の異なる血清型（例えば、肺炎球菌について）または血清群（例えば、髄膜炎菌について）由来のものである。別の実施形態では、抗原は、多糖類である。別の実施形態では、抗原は、肺炎連鎖球菌、髄膜炎菌、ヘモフィルス・インフルエンザ菌（例えばＨｉｂ）、化膿連鎖球菌、またはストレプトコッカス・アガラクチアの莢膜多糖である。別の実施形態では、抗原は、ポルフィロモナス・ジンジバリスの６つの血清型（例えば、Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３、Ｋ４、Ｋ５および／またはＫ６）のうちの１つに由来する莢膜多糖である。別の実施形態では、抗原は、１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１３、１４、１５Ｂ、１６、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１、および３３Ｆ、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される肺炎連鎖球菌血清型の莢膜多糖である。別の実施形態では、組成物は、少なくとも１４、２０、２１、２４、または２５個の異なる担体タンパク質−莢膜多糖接合体があり、各接合体が、１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１３、１４、１５Ｂ、１６、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１、および３３Ｆからなる群から選択される肺炎連鎖球菌血清型の異なる莢膜多糖を含む、本明細書に記載されるようなタンパク質担体−抗原接合体を含む。別の実施形態では、多糖類と担体タンパク質との比率（ｗ／ｗ）は、１を上回る。別の実施形態では、担体タンパク質は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、または少なくとも９つのｎｎＡＡを含む。別の実施形態では、ｎｎＡＡは、２−アミノ−３−（４−アジドフェニル）プロパン酸（ｐＡＦ）、２−アミノ−３−（４−（アジドメチル）フェニル）プロパン酸（ｐＡＭＦ）、２−アミノ−３−（５−（アジドメチル）ピリジン−２−イル）プロパン酸、２−アミノ−３−（４−（アジドメチル）ピリジン−２−イル）プロパン酸、２−アミノ−３−（６−（アジドメチル）ピリジン−３−イル）プロパン酸、２−アミノ−５−アジドペンタン酸、および２−アミノ−３−（４−（アジドメチル）フェニル）プロパン酸、またはそれらの任意の組み合わせから選択される。別の実施形態では、担体タンパク質は、ジフテリア毒素（ＤＴ）、破傷風毒素（ＴＴ）、へモフィルスタンパク質Ｄ（ＰＤ）、血清群Ｂ髄膜炎菌（ＯＭＰＣ）の外膜タンパク質複合体、およびＣＲＭ１９７から選択されるタンパク質と少なくとも８０％の配列同一性を有する。別の実施形態では、担体タンパク質は、ＣＲＭ１９７と少なくとも８０％の配列同一性を有する。別の実施形態では、担体タンパク質は、配列番号１と少なくとも８０％の配列同一性を有する。別の実施形態では、担体タンパク質は、配列番号１と少なくとも８０％の配列同一性を有し、さらに、少なくとも１つのｎｎＡＡは、内部に天然に生じるアミノ酸を交換する。別の実施形態では、少なくとも１つのｎｎＡＡは、配列番号１のＫ２５、Ｋ３４、Ｋ３８、Ｋ４０、Ｋ２１３、Ｋ２１５、Ｋ２２８、Ｋ２４５、Ｋ２６５、Ｋ３８６、Ｋ５２３、またはＫ５２７からなる群から選択されるアミノ酸を交換する。別の実施形態では、少なくとも１つ、および好ましくは少なくとも２つのｎｎＡＡは、配列番号１のＦ１３、Ｆ５４、Ｆ１２４、Ｆ１２８、Ｆ１４１、Ｆ１６８、Ｆ２５１、Ｆ３９０、Ｆ５３１、またはＦ５３２からなる群から選択されるアミノ酸を交換する。別の実施形態では、少なくとも１つ、および好ましくは少なくとも２つのｎｎＡＡは、配列番号１のＫ２５、Ｋ３４、Ｋ３８、Ｋ４０、Ｋ２１３、Ｋ２１５、Ｋ２２８、Ｋ２４５、Ｋ２６５、Ｋ３８６、Ｋ５２３、Ｋ５２７、Ｆ１３、Ｆ５４、Ｆ１２４、Ｆ１２８、Ｆ１４１、Ｆ１６８、Ｆ２５１、Ｆ３９０、Ｆ５３１、またはＦ５３２からなる群から選択されるアミノ酸を交換する。別の実施形態では、抗原は、連結部分を介してｎｎＡＡに接合される。別の実施形態では、抗原は、トリアゾール連結部分を介してｎｎＡＡに接合される。
【００１２】
関連する実施形態では、組成物中のポリペプチド抗原接合体は、少なくとも１つのＴ細胞活性化エピトープ、ならびに少なくとも１つ、および好ましくは少なくとも２つのｎｎＡＡを含む担体タンパク質をポリペプチドとして含み、抗原はｎｎＡＡと接合し、さらに、少なくとも１つのｎｎＡＡは、２位のアミノ置換基と、３位のアジド含有置換基、１，２，４，５−テトラジニル含有置換基、またはエチニル含有置換基とを持つ、２，３−二置換プロパン酸である。
【００１３】
別の関連する実施形態では、組成物中のポリペプチド抗原接合体は、少なくとも１つのＴ細胞活性化エピトープ、ならびに少なくとも１つ、および好ましくは少なくとも２つのｎｎＡＡを含む担体タンパク質をポリペプチドとして含み、抗原はｎｎＡＡと接合し、さらに、ポリペプチド中の少なくとも１つのｎｎＡＡは、式ＸＩＩの構造を有し、
【化４】
2020504760.tif 000006
式中、
Ａｒは、任意選択的に、少なくとも１つのヘテロ原子を含有する５員または６員芳香族環を含み、
Ｗ５は、Ｃ１〜Ｃ１０アルキレン、−ＮＨ−、−Ｏ−、および−Ｓ−から選択され、
Ｑ１は、ゼロまたは１であり、
Ｗ６は、アジド、任意選択的に低級アルキル基とＣ置換される１，２，４，５−テトラジニル、およびエチニルから選択される。
【００１４】
一実施形態では、本開示は、接合体を生成するための方法であって、（ａ）ｎｎＡＡの第２の化学ハンドルに接合することができる第１の化学ハンドルを含む複数の官能基を含む活性化抗原を提供することと、（ｂ）第１および第２の化学ハンドルが反応して抗原−ポリペプチド接合体を形成する条件下で、ｎｎＡＡのうちの少なくとも１つを含むポリペプチドと活性化抗原を組み合わせることであって、ポリペプチドが、少なくとも１つのＴ細胞活性化エピトープを含む、組み合わせることと、（ｃ）接合体を含む組成物を回収することと、を含む、方法を提供する。別の実施形態では、抗原は、多糖類である。別の実施形態では、抗原は、肺炎連鎖球菌、髄膜炎菌、ヘモフィルス・インフルエンザ菌（例えばＨｉｂ）、化膿連鎖球菌、またはストレプトコッカス・アガラクチアの莢膜多糖である。別の実施形態では、抗原は、１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１３、１４、１５Ｂ、１６、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１、および３３Ｆ、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される肺炎連鎖球菌血清型の莢膜多糖である。別の実施形態では、抗原は、ポルフィロモナス・ジンジバリスの６つの血清型（例えば、Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３、Ｋ４、Ｋ５および／またはＫ６）のうちの１つに由来する莢膜多糖である。別の実施形態では、抗原を、活性化抗原の生成において、ＣＤＡＰ、ＣＤＩ、または過ヨウ素酸塩からなる群から選択される第１の試薬と反応させた。別の実施形態では、第１の試薬は、１Ｍ未満の過ヨウ素酸塩である。別の実施形態では、複数の官能基は、水酸基を含む。別の実施形態では、複数の官能基は、アルデヒド基を含む。別の実施形態では、抗原を、プロパルギル、ＤＩＦＯ、ＤＢＣＯ、およびＤＢＣＯ（ＰＥＧ）ｎ−ＮＨ２からなる群から選択される官能基を含む第２の試薬と反応させた。別の実施形態では、抗原を、ＤＢＣＯ−ＮＨ２を含む第２の試薬と反応させた。別の実施形態では、第１の化学ハンドルは、アルキン基を含む。別の実施形態では、第２の化学ハンドルは、アジド基を含む。別の実施形態では、組成物（ｗ／ｗ）中の接合体の抗原とポリペプチドとの比率は、１を上回る。
【００１５】
関連する実施形態では、接合体を生成するための方法は、（ａ）抗原を活性化して、少なくとも１つの第１の化学ハンドルを内部に組み込むことであって、第１の化学ハンドルが、ポリペプチド中のｎｎＡＡの第２の化学ハンドルに接合することができる、組み込むことと、（ｂ）第１および第２の化学ハンドルが反応して抗原−ポリペプチド接合体を形成する条件下でｎｎＡＡのうちの少なくとも１つを含むポリペプチドと活性化抗原を組み合わせることであって、ポリペプチドが、少なくとも１つのＴ細胞活性化エピトープを含む、組み合わせることと、（ｃ）接合体を含む組成物を回収することと、を含む。この実施形態の一態様では、抗原の活性化は、少なくとも１つのアルキニル基を第１の化学ハンドルとして抗原に組み込むことを含む。
【００１６】
別の関連する実施形態では、ポリペプチド抗原接合体を生成するための方法であって、少なくとも１つのアルキニル基を第１の化学ハンドルとして内部に組み込み、第２の化学ハンドルとしてアジド基を持つ、少なくとも１つのｎｎＡＡ、および好ましくは少なくとも２つのｎｎＡＡを含むポリペプチドと抗原を反応させることによって抗原を活性化し、それによってポリペプチドと抗原との間の非触媒共有結合生体接合反応を可能にすることを含む、方法を提供する。好ましい実施形態では、アルキニル基を拘束して、例えば、ジアリール歪みシクロオクタンなどの環構造において、反応性を増加させる。
【００１７】
一実施形態では、本開示は、対象における抗原に対する免疫防御性抗体反応を誘発する方法であって、非経口投与に好適な賦形剤で、本明細書に記載されるような接合体を対象に投与することを含む、方法を提供する。
【００１８】
一実施形態では、本開示は、対象における抗原に対する免疫防御性抗体反応を誘発する方法であって、非経口投与に好適な賦形剤で、本明細書に記載されるような組成物を対象に投与することを含む、方法を提供する。
【００１９】
一実施形態では、本開示は、セ氏約１０度〜セ氏約約３０度の温度で維持された無細胞発現混合物中に少なくとも２つの非天然アミノ酸（ｎｎＡＡ）を含むポリペプチドの合成のための方法であって、生成されたポリペプチドが、可溶性画分および不溶性画分の両方を含み、可溶性画分と不溶性画分との比率が、少なくとも３０％（ｗ／ｗ）である、方法を提供する。例えば、１００ｇの総ポリペプチドについて、不溶性画分は、７０ｇ以下であり、可溶性画分は、３０ｇ以上であろう。別の実施形態では、温度は、セ氏約２０度を上回る。別の実施形態では、温度は、セ氏約２０度を下回る。別の実施形態では、温度は、セ氏約１４度〜セ氏約１８度である。別の実施形態では、ポリペプチドは、抑制コドンを含む核酸によってコードされる。別の実施形態では、無細胞発現混合物は、ｎｎＡＡに対して特異的な直交性ｔＲＮＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素対を含む。別の実施形態では、ｔＲＮＡの濃度は、少なくとも２０μＭ（すなわち、直交性ｔＲＮＡの濃度）である。別の実施形態では、ｎｎＡＡの濃度は、約２ｍＭ未満であり、アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素の濃度は、約５μＭ未満である（すなわち、直交性合成酵素の濃度）。別の実施形態では、本方法は、ポリペプチドを活性部分に接合させることを含む。別の実施形態では、活性部分は、ハプテン、細菌抗原、ウィルス抗原、ペプチド毒素、マクロライド、ポリエーテル、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。別の実施形態では、発現混合物は、大腸菌、小麦胚芽、またはウサギの網状赤血球の細胞抽出物を含む。別の実施形態では、発現混合物は、少なくとも３０％細胞抽出物を含む。別の実施形態では、ポリペプチドは、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、または少なくとも９つのｎｎＡＡを含む。別の実施形態では、ｎｎＡＡは、２−アミノ−３−（４−アジドフェニル）プロパン酸（ｐＡＦ）、２−アミノ−３−（４−（アジドメチル）フェニル）プロパン酸（ｐＡＭＦ）、２−アミノ−３−（５−（アジドメチル）ピリジン−２−イル）プロパン酸、２−アミノ−３−（４−（アジドメチル）ピリジン−２−イル）プロパン酸、２−アミノ−３−（６−（アジドメチル）ピリジン−３−イル）プロパン酸、２−アミノ−５−アジドペンタン酸、２−アミノ−３−（４−（アジドメチル）フェニル）プロパン酸、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。別の実施形態では、生成されたポリペプチドは、可溶性画分および不溶性画分の両方を含み、可溶性画分と不溶性画分との比率は、少なくとも６０％（ｗ／ｗ）である。別の実施形態では、生成されたポリペプチドは、可溶性画分および不溶性画分の両方を含み、可溶性画分と不溶性画分との比率は、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）である。例えば、１００ｇの総ポリペプチドについて、不溶性画分は、２０ｇ以下であり、可溶性画分は、８０ｇ以上であろう。
【００２０】
一実施形態では、本開示は、タンパク質−接合体ワクチンを作製する改善された方法であって、抗原が、Ｔ細胞依存性免疫反応を提供する担体タンパク質と接合し、改善が、少なくとも１つの非天然アミノ酸を含むポリペプチドを担体タンパク質として用いることを含み、非天然アミノ酸が、バイオ直交性反応性部分を含み、それを通じて抗原がポリペプチドに接合される、方法を提供する。別の実施形態では、抗原は、細菌多糖類である。別の実施形態では、ポリペプチドは、バイオ直交性反応性部分を含み、それを通じて抗原がポリペプチドに接合される、少なくとも２つの非天然アミノ酸を含む。別の実施形態では、ポリペプチドは、バイオ直交性反応性部分を含み、それを通じて抗原がポリペプチドに接合される、非天然アミノ酸を含まない少なくとも１つのＴ細胞活性化エピトープを含む。別の実施形態では、Ｔ細胞活性化エピトープは、コリネバクテリウム・ジフテリア菌毒素、破傷風菌テタノスパスミン、ヘモフィルス・インフルエンザ菌タンパク質Ｄ（ＰＤ、ＨｉＤ）、血清群Ｂ髄膜炎菌（ＯＭＰＣ）の外膜タンパク質複合体、およびＣＲＭ１９７からなる群から選択されるタンパク質由来のものである。別の実施形態では、抗原は、細菌多糖類であり、細菌は、肺炎連鎖球菌、髄膜炎菌、ヘモフィルス・インフルエンザ菌（例えばＨｉｂ）、化膿連鎖球菌、およびストレプトコッカス・アガラクチアからなる群から選択される。別の実施形態では、非天然アミノ酸のうちの少なくとも１つは、２−アミノ−３−（４−アジドフェニル）プロパン酸（ｐＡＦ）、２−アミノ−３−（４−（アジドメチル）フェニル）プロパン酸（ｐＡＭＦ）、２−アミノ−３−（５−（アジドメチル）ピリジン−２−イル）プロパン酸、２−アミノ−３−（４−（アジドメチル）ピリジン−２−イル）プロパン酸、２−アミノ−３−（６−（アジドメチル）ピリジン−３−イル）プロパン酸、２−アミノ−５−アジドペンタン酸、および２−アミノ−３−（４−（アジドメチル）フェニル）プロパン酸からなる群から選択される。
【００２１】
一実施形態では、本開示は、複数の非天然アミノ酸をその構造中に組み込む担体タンパク質を生成するための方法であって、（ａ）担体タンパク質をコードする核酸であって、複数の抑制コドンを含む、核酸を提供することと、（ｂ）非天然アミノ酸、抑制コドンに相補的であるｔＲＮＡ、およびアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を含む無細胞細菌抽出物と核酸を組み合わせることによって反応混合物を作出することと、（ｃ）担体タンパク質中の各抑制コドンに対応する部位で非天然アミノ酸を選択的に組み込むのに十分な条件下で、（ｂ）の反応混合物を培養することと、を含む、方法を提供する。別の実施形態では、非天然アミノ酸は、４−アジドメチルフェニルアラニン（ｐＡＭＦ）である。別の実施形態では、工程（ｃ）は、セ氏２０度未満で反応混合物を培養することを含む。別の実施形態では、本方法は、追加的に、（ｃ）の直後に担体タンパク質を精製することを含む。別の実施形態では、抑制コドンは、配列番号２のコドン２５、３４、３８、４０、２１３、２１５、２２８、２４５、２６５、３８６、５２３、または５２７と選択的に置換される。別の実施形態では、（ｂ）の反応混合物は、タンパク質合成に必要な生体成分をさらに含む。別の実施形態では、（ｂ）のｔＲＮＡを、ｐＡＭＦで荷電することができる。別の実施形態では、（ｂ）のアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、２０個の天然アミノ酸と比較して、ｐＡＭＦでｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する。
【００２２】
別の実施形態では、本開示は、少なくとも１４、２０、２１、２４、または２５個の別個の担体タンパク質−抗原接合体を含む組成物であって、抗原が、莢膜多糖であり、（ａ）各別個の担体タンパク質−抗原接合体中の莢膜多糖が、肺炎連鎖球菌の異なる血清型由来のものであり、（ｂ）担体タンパク質−抗原接合体の担体タンパク質が、少なくとも１つのＴ細胞活性化エピトープおよび少なくとも２つの非天然アミノ酸（ｎｎＡＡ）を含むポリペプチドを含み、（ｃ）莢膜多糖がｎｎＡＡと接合している、組成物を提供する。この実施形態の好ましい型では、少なくとも１つのＴ細胞活性化エピトープは、配列番号１によるＣＲＭ１９７由来のものであり、ポリペプチドは、配列番号１と少なくとも８０％または９５％の配列同一性を有し、（ｉ）ポリペプチドは、２〜９つのｎｎＡＡを含み、（ｉｉ）ポリペプチドは、４〜６つのｎｎＡＡを含み、かつ／または（ｉｉｉ）少なくとも１つのｎｎＡＡは、（ａ）ＣＲＭ１９７のＫ２５、Ｋ３４、Ｋ３８、Ｋ４０、Ｋ２１３、Ｋ２１５、Ｋ２２８、Ｋ２４５、Ｋ２６５、Ｋ３８６、Ｋ５２３、Ｋ５２７、（ｂ）配列番号１のＦ１３、Ｆ５４、Ｆ１２４、Ｆ１２８、Ｆ１４１、Ｆ１６８、Ｆ２５１、Ｆ３９０、Ｆ５３１、もしくはＦ５３２、または（ｃ）配列番号１のＫ２５、Ｋ３４、Ｋ３８、Ｋ４０、Ｋ２１３、Ｋ２１５、Ｋ２２８、Ｋ２４５、Ｋ２６５、Ｋ３８６、Ｋ５２３、Ｋ５２７、Ｆ１３、Ｆ５４、Ｆ１２４、Ｆ１２８、Ｆ１４１、Ｆ１６８、Ｆ２５１、Ｆ３９０、Ｆ５３１、もしくはＦ５３２からなる群から選択されるアミノ酸産機と置換される。先の実施形態の好ましい型は、少なくとも１４、２０、２１、２４、または２５個の別個の担体タンパク質−抗原接合体を含む組成物を含み、各別個の担体タンパク質−抗原接合体は、血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１３、１４、１５Ｂ、１６、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１、および３３Ｆからなる群から選択される肺炎連鎖球菌血清型の莢膜多糖から個別に選択される抗原、別個の担体タンパク質−抗原接合体のうちの２４個の莢膜多糖が、肺炎連鎖球菌血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆ由来のものである少なくとも２４個の別個の担体タンパク質−抗原接合体の組成物、別個の担体タンパク質−抗原接合体のうちの少なくとも１つの莢膜多糖が、６Ｃ、７Ｃ、１３、１５Ａ、１５Ｃ、１６、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１、３４、３５Ｂ、３３Ｆ、３５Ｆ、３７、および３８からなる群から選択される肺炎連鎖球菌血清型由来のものである少なくとも２５個の別個の担体タンパク質−抗原接合体を含む組成物、ならびに別個の担体タンパク質−抗原接合体のうちの少なくとも１つの莢膜多糖が、１５Ａおよび３５Ｂ、または代替的に、２０Ａ、２０Ｂ、および２４Ｂからなる群から選択される肺炎連鎖球菌血清型由来のものである少なくとも２５個の別個の担体タンパク質−抗原接合体を含む組成物を含む。
【００２３】
一実施形態では、本開示は、少なくとも１４、２０、２１、２４、または２５個の別個の担体タンパク質−抗原接合体を含む組成物であって、抗原が、肺炎連鎖球菌の莢膜多糖であり、（ａ）各別個の担体タンパク質−抗原接合体中の莢膜多糖が、肺炎連鎖球菌の異なる血清型由来のものであり、（ｂ）担体タンパク質−抗原接合体の担体タンパク質が、少なくとも１つのＴ細胞活性化エピトープおよび少なくとも２つの非天然アミノ酸（ｎｎＡＡ）を含むポリペプチドであり、莢膜多糖がｎｎＡＡと接合し、（ｃ）肺炎連鎖球菌血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、および２３Ｆの各々に対する莢膜多糖を含む別個の担体タンパク質−抗原接合体があり、（ｄ）血清型２、６Ｃ、８、９Ｎ、１０Ａ、１２Ｆ、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、２０、２０Ａ、２０Ｂ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、２４Ｂ、３１、３３Ｆ、３４、３５Ｂ、３５Ｆ、および３８からなる群から選択される肺炎連鎖球菌血清型由来の莢膜多糖を含む少なくとも１つの追加の別個の担体タンパク質−抗原接合体がある、組成物を提供する。例えば、組成物は、（ｉ）肺炎連鎖球菌血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆの各々に対する接合体を含む、少なくとも２０もしくは２１個の別個の担体タンパク質−抗原接合体、または（ｉｉ）肺炎連鎖球菌血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆの各々に対する莢膜多糖を含む別個の担体タンパク質−抗原接合体がある、少なくとも２４個の別個の担体タンパク質−抗原接合体を含み得る。
【００２４】
一実施形態では、本開示は、ポリペプチド抗原接合体であって、ポリペプチドが、３つ以上のｎｎＡＡ残基を含み、接合体が、少なくとも５００ｋＤａの分子量を有する、ポリペプチド抗原接合体を提供する。ポリペプチドは、３つ以上のｎｎＡＡ残基（例えば、３〜９つ、または３〜８つ、または３〜７つ、または３〜６つのｎｎＡＡ残基）を含有する、ＣＲＭ１９７（例えば、以下の５ａ節で考察されるように、配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む）であり得る。抗原は、肺炎球菌莢膜多糖などの細菌多糖類であり得る。接合体は、少なくとも６００ｋＤａ、少なくとも８００ｋＤａ、少なくとも９００ｋＤａ、または少なくとも１ＭＤａ、例えば、１〜５ＭＤａの分子量を有し得る。本明細書でさらに考察されるように、各調製が異なる肺炎連鎖球菌血清型由来の肺炎球菌莢膜多糖で作製される、そのような接合体の複数の調製を、多価ワクチンとして有用である本発明の組成物に組み込むことができる。そのような接合体で表される肺炎連鎖球菌血清型の好ましい選択も、本明細書でさらに考察する。
【００２５】
一実施形態では、本開示は、ポリペプチド抗原接合体であって、ポリペプチドが４つ以上のｎｎＡＡ残基を含む、ポリペプチド抗原接合体を提供する。ポリペプチドは、４つ以上のｎｎＡＡ残基（例えば、４〜９つ、または４〜８つ、または４〜７つ、または４〜６つのｎｎＡＡ残基）を含有するＣＲＭ１９７（例えば、以下の５ａ節で考察されるように、配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む）であり得る。抗原は、肺炎球菌莢膜多糖などの細菌多糖類であり得る。接合体は、少なくとも５００ｋＤａ（例えば、少なくとも６００ｋＤａ、少なくとも８００ｋＤａ、少なくとも９００ｋＤａ、または少なくとも１ＭＤａ、例えば、１〜５ＭＤａ）の分子量を有し得る。本明細書でさらに考察されるように、各調製が異なる肺炎連鎖球菌血清型由来の肺炎球菌莢膜多糖で作製される、そのような接合体の複数の調製を、多価ワクチンとして有用である本発明の組成物に組み込むことができる。そのような接合体で表される肺炎連鎖球菌血清型の好ましい選択も、本明細書でさらに考察する。
【００２６】
一実施形態では、本開示は、免疫原性多糖類−タンパク質接合体を調製するのに好適なタンパク質であって、タンパク質が、（ｉ）少なくとも１つのｎｎＡＡを含み、（ｉｉ）ｐＨ７．４のトリス緩衝液中、２０℃で少なくとも５０ｍｇ／Ｌの溶解度を有する、タンパク質を提供する。ポリペプチドは、少なくとも１つのＴ細胞活性化エピトープ（上記に考察されるような）を含み、例えば、それは、２つ以上のｎｎＡＡ残基、例えば、３〜９つ、または４〜９つ、または３〜８つ、または４〜８つ、または３〜７つ、または４〜７つ、または３〜６つ、または４〜６つのｎｎＡＡ残基を含有するＣＲＭ１９７（例えば、以下の５ａ節で考察されるように、配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む）であり得る。タンパク質は、肺炎球菌莢膜多糖などの細菌多糖類と接合して、接合体を作製し得る。溶解度は、少なくとも１００ｍｇ／Ｌ、少なくとも２００ｍｇ／Ｌ、またはさらには少なくとも２５０ｍｇ／Ｌであり得る。本明細書でさらに考察されるように、各調製が異なる肺炎連鎖球菌血清型由来の肺炎球菌莢膜多糖で作製される、そのような接合体の複数の調製を、多価ワクチンとして有用である本発明の組成物に組み込むことができる。そのような接合体で表される肺炎連鎖球菌血清型の好ましい選択も、本明細書でさらに考察する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
本明細書に記載される実施形態の特徴および利点を、例示的な実施形態を説明する、以下の詳細な記載および添付の図面を参照することによってさらに説明する。
【００２８】
【図１】任意選択的に、ｔＲＮＡ（ｏｔＲＮＡ）またはｎｎＡＡ／ａａＲＳ合成酵素（ｎｎＡＡ）の増加量を補足された、ＣＦＰＳ反応におけるセ氏３０、２５、または２０度で生成された６つのｎｎＡＡ含有ｅＣＲＭの収率を示す。各列に、総収率および可溶性収率の両方を表す、２つの棒を示す。
【図２】合成タンパク質（２Ａ）の相対収率、および無細胞タンパク質合成（ＣＦＰＳ）反応において生成された一部位ｅＣＲＭについてＤＢＣＯ−フルオレセイン（２Ｂ）と反応するためのｅＣＲＭに組み込まれたｐＡＭＦの能力を実証する、クマシー（２Ａ）および蛍光（２Ｂ）ゲル画像を示す。図２Ａでは、はしごは、上から下に、１０、１５、２０、２５、３７、５０、７５、１００、１５０、および２５０ｋＤａを示す。図２Ｂでは、蛍光マーカーは、２５および７５ｋＤａである。レーンは以下のとおりである。Ｌ＝はしご、Ｗ＝野生型、Ｃ＝Ｃ末端ＴＡＧ、次に、レーン１〜１２は、それぞれ、１１、２５、３４、３８、４０、５２、６０、７７、８３、９１、９６、および１０３位でＬｙｓを交換するためのＴＡＧを有する。
【図３】マウス中の一価肺炎球菌多糖類−ｅＣＲＭ接合体の投与後のオプソニン食作用（ＯＰＡ）活性（ＧＭＴ）を示す。血清型がＸ軸上に示される。白い棒は、アジュバント化多糖類であり、黒い棒は、アジュバント化接合体である。
【図４】マウス中の一価肺炎球菌多糖類−ｅＣＲＭ接合体の投与後のＩｇＧ応答（ＧＭＴ）を示す。血清型がＸ軸上に示される。白い棒は、アジュバント化されているが、接合されていない多糖類であり、黒い棒は、アジュバント化接合体である。
【図５】ウサギ中の多価肺炎球菌ワクチンの投与後のＩｇＧ応答（ＧＭＴ）を示す。各血清型（Ｘ軸）は、本発明の２４価の接合体ワクチン（左）、Ｐｒｅｖｎａｒ−１３（商標）（中間）、および２４価の非接合体ワクチン（右）についてのデータを有する。データは、平均＋／−９５％の信頼区間である。
【図６】図５と類似しているが、ＯＰＡ応答（ＧＭＴ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
タンパク質−接合体ワクチンでは、「弱い」抗原に対する免疫反応は、既知の「強い」タンパク質抗原への付着によって増幅される。これらの半合成生体分子では、強く長寿命のＴ細胞依存性免疫反応（「Ｔ細胞依存性抗原」）を精製するタンパク質は、典型的には、非特異的酸化／還元化学によって「弱い」抗原に付着される。これらの免疫原性タンパク質に対するＴ細胞活性化特徴は、ヘルパーＴ細胞を、付着された弱い抗原を認識するＢ細胞に補充し、そのため、別様に弱免疫原性分子に対する強く長寿命の免疫反応を可能にする。
【００３０】
タンパク質−接合体ワクチン生成のために使用される現在の方法および構成単位は、疾患の治療および予防のための接合体ワクチンのより広範の適用を妨げる。第１に、比較的少ない強いタンパク質抗原は、化学的に耐性があり、非毒性であり、かつ接合体ワクチンにおいて担体として使用されるのに十分拡張可能である。第２に、接合体ワクチン生成のために一般に使用される酸化／還元化学が、最大免疫原性のために必要とされる担体および抗原に対するエピトープを保存することを困難にしている。第３に、これらの酸化／還元反応の比較的低い効率が、特に商業規模での品質制御および精製を複雑にしている。
【００３１】
組み換えタンパク質の生成は、担体タンパク質の抗原性および非毒性の最適化を可能にするが、既存の担体タンパク質は、組み換え細胞中に生成することが困難であり、完全に操作されたタンパク質は、高収率で生成することが困難である。より緩やかな接合反応は、担体および抗原エピトープの変性／閉塞を最小限に抑えるが、これらの反応のより低い効率が、担体タンパク質に対する抗原のより低い荷重およびより複雑な精製スキームをもたらす。重要なことに、担体に対する比較的低い抗原が、担体タンパク質自体に対する抗体反応、または担体誘発性エピトープ抑制の認識された現象による免疫「干渉」のより高い可能性をもたらす。
【００３２】
したがって、より高い免疫原性のより容易に製造される接合体ワクチンを生成するためのこれらの技術の組み合わせを可能にする方策および試薬に対する必要性が特定されている。したがって、とりわけ、（１）非天然アミノ酸を含む増強された担体タンパク質を含むポリペプチド、（２）非天然アミノ酸を含む増強された担体タンパク質を含むポリペプチドに接合するのに好適な抗原、（３）非天然アミノ酸を含む増強された担体タンパク質と接合している抗原を含む、（１）および（２）のポリペプチド抗原接合体、（４）前述のものを含むワクチン組成物、ならびに（５）前述のものを作製および使用する方法を本明細書に記載する。
【００３３】
１．定義
「抑制コドン」という用語は、所定の場所でポリヌクレオチド内に導入されるヌクレオチドトリプレットを指し、終止コドン（例えば、アンバー、オークル、またはオパール終止コドン）を認識することができる特異的ｔＲＮＡによって認識され、翻訳がコドンを読み取ってタンパク質を生成し、それによって終止コドンを抑制することを可能にする。
【００３４】
「非天然アミノ酸」（ｎｎＡＡ）とは、２０個の一般的なアミノ酸またはピロリジンもしくはセレノシステインのうちの１つではないアミノ酸を指し、「非天然アミノ酸」という用語と同義的に使用される他の用語は、「非天然にコードされたアミノ酸」、「非天然アミノ酸」、「非天然に生じるアミノ酸」、およびそれらの様々にハイフンでつながれた型およびハイフンでつながれない型である。バイオ直交性反応性化学的側鎖を有する非天然アミノ酸は、タンパク質中の不連続な部位に様々なペイロードを接合するための化学「ハンドル」として使用することができる。
【００３５】
２つ以上の核酸もしくはポリペプチド配列の文脈における、「配列同一性」もしくは「パーセント同一性」という用語は、配列比較アルゴリズム（例えば、アミノ酸配列についてのＢＬＡＳＴＰ）を使用して測定されるように、比較ウィンドウにわたる最大対応について比較および整列されたとき、同じであるか、または同じであるアミノ酸残基もしくはヌクレオチドの特定された百分率を有する、２つ以上の配列を指す。この文書の目的のために、パーセント同一性は、配列番号１に説明される基準配列などの全長配列にわたって判定される。本明細書に提供されるような配列同一性を計算するための方法は、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２採点マトリクスで設定されたその初期値を有するＢＬＡＳＴＰプログラムである（例えば、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，１９８９，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：１０９１５を参照されたい）。例えば、ＷＷＷ  ａｔ  ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉまたはその他で入手可能なＢＬＡＳＴ整列ツールを参照されたい。
【００３６】
「抗原」という用語は、適応免疫系の高度に可変的な抗原受容体（Ｂ細胞受容体、Ｔ細胞受容体、または両方）によって認識されることができる、任意の分子または線状分子断片を指す。抗原の非制限例には、多糖類またはグリカン（例えば、細菌莢膜多糖）、ポリヌクレオチド、ポリアミノ酸、脂質、および小分子（例えば、ハプテン、乱用薬物）が含まれる。
【００３７】
「Ｔ細胞活性化エピトープ」という用語は、Ｔ細胞免疫を誘発することができる分子構造の構造単位を指す。Ｔ細胞活性化エピトープを含む担体タンパク質の機能は、接合体についてよく知られており、かつ文書化されている。理論に縛られることは望まないが、担体タンパク質中のＴ細胞活性化エピトープは、共有結合された抗原が、抗原提示細胞によって処理され、かつ抗原に対する免疫記憶を誘発するためにＣＤ４＋ｖｅＴ細胞に提示されることを可能にする。
【００３８】
「Ｂ細胞エピトープ」という用語は、概して、Ｂ細胞応答を誘発することができる高分子構造のこうした特徴を指す。Ｔ細胞エピトープとは対照的に、Ｂ細胞エピトープは、抗原提示細胞による処理およびＭＨＣのペプチド結合クレフトへの荷重が、Ｂ細胞活性化について必要とされないため、ペプチドを含む必要がない。
【００３９】
本明細書で使用される場合、「担体タンパク質」とは、対象において接合された抗原に対する液性応答反応を増強するために、抗原（例えば、多糖類）に付着されることができるＴ細胞活性化エピトープを含有する非毒性または無毒化ポリペプチドを指す。本用語は、ＦＤＡに承認されたワクチンにおけるエピトープ担体として使用される細菌タンパク質のうちのいずれかを含む。いくつかの実施形態では、担体タンパク質は、コリネバクテリウム・ジフテリア菌毒素、破傷風菌テタノスパスミン、ヘモフィルス・インフルエンザ菌タンパク質Ｄ（ＰＤ、ＨｉＤ）、血清群Ｂ髄膜炎菌（ＯＭＰＣ）の外膜タンパク質複合体、ＣＲＭ１９７、またはマラリアオーキネート特異的表面タンパク質Ｐｆｓ２５である。別の実施形態では、担体タンパク質は、連鎖球菌株Ｇ１４８のＧタンパク質由来のＢＢである。「天然担体タンパク質」は、天然にのみ生じるアミノ酸を有する。「増強された担体タンパク質」は、担体タンパク質中に天然に生じるアミノ酸と交換される少なくとも１つの非天然アミノ酸を有する。
【００４０】
本明細書で使用される場合、「免疫原性ポリペプチド」という用語は、少なくとも１つのＴ細胞活性化エピトープを含むポリペプチドを指し、ここで、Ｔ細胞エピトープは、動物における免疫記憶を誘発することができるタンパク質由来のものである。
【００４１】
本明細書で相互変換可能に使用されるような「ｅＣＲＭ」または「増強されたＣＲＭ」という用語は、ジフテリア毒素のＧ５２Ｅコドン変異形の改変型を指し、ここで、天然アミノ酸残基の少なくとも１つは、非天然アミノ酸と置換され、ポリペプチドは、少なくとも１つのＴ細胞活性化エピトープを保持する。
【００４２】
本明細書で使用される場合、「改変される」、「交換される」、「増強される」、および「置換される」という用語は、ポリペプチドの残基を記載するために使用される場合に同義とみなされ、すべての場合において、ポリペプチド鎖内の天然に生じるアミノ酸との非天然アミノ酸の交換を指す。
【００４３】
本明細書で使用される場合、「Ｔ非依存性抗原」という用語は、Ｂ細胞媒介性免疫の特徴を誘発するか、またはアイソタイプ・スィッチングもしくは免疫記憶などのヘルパーＴ細胞媒介性免疫と関連するプロセスを誘発しない、抗原を指す。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「多糖類」という用語は、制限されないが、５０個以上の繰り返し単位を有する多糖類、および５０個以下の繰り返し単位を有するオリゴ糖を含むが限定されない、複数の繰り返し単位を含む糖類を含む、その通常の意味で使用される。典型的には、多糖類は、約５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または９５個の繰り返し単位〜約２，０００個以上の繰り返し単位、および任意選択的に、約１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００個の繰り返し単位〜約１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、または１９００個の繰り返し単位を有する。オリゴ糖は、典型的には、約６、７、８、９、または１０個の繰り返し単位〜約１５、２０、２５、３０、または３５〜約４０または４５個の繰り返し単位を有する。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「グリカン」という用語は、グリコシド連結によって互いと接合している単糖類（例えば、グルコース）残基からなる任意の線状または分岐ポリマーを指す。グリカンの例としては、グリコーゲン、デンプン、ヒアルロン酸、およびセルロースが挙げられる。「グリカン」の他の例には、細菌莢膜多糖が含まれる。
【００４６】
本明細書で使用される場合、多糖類または担体タンパク質−多糖類接合体の「分子量」という用語は、多角的レーザー光散乱（ＭＡＬＳ）と組み合わされたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって計算される分子量を指す。
【００４７】
本明細書で使用される場合、別段の定めがない限り、「低級アルキル」という用語は、１〜６つの炭素原子、すなわち、Ｃ１〜Ｃ６アルキルを有する直鎖飽和型または分岐炭化水素を指す。特定の実施形態では、低級アルキル基は、第１級、第２級、または第３級炭化水素である。本用語は、置換部分および非置換部分の両方を含む。ＵＳ２０１４／００６６５９８も参照されたい。「低級アルキレン」という用語は、低級アルキルのアルキレン基を指す。
【００４８】
１つ以上の不斉中心を含み、絶対立体化学に関して、アミノ酸に対する（Ｒ）もしくは（Ｓ）として、または（Ｄ）もしくは（Ｌ）として定義される、鏡像異性体、ジアステレオマー、および他の異性立体形態を生じる、本明細書に開示される様々な実施形態の化合物、またはそれらの薬学的に許容可能な塩。本開示は、すべてのそのような異性体、ならびにそれらのラセミ形態および任意選択的に純粋な形態を含むことが意図される。本明細書で使用されるｎｎＡＡは、概して、一般的に、α−炭素にキラル中心を有するα−アミノ酸であり、それらは、好ましくは（Ｌ）異性体である。
【００４９】
本明細書で使用される化学的名前付けプロトコルおよび構造図は、ＡＣＤ／Ｎａｍｅ型９．０７ソフトウェアプログラムおよび／またはＣｈｅｍＤｒａｗ  Ｕｌｔｒａ型１１．０．１ソフトウェア名前付けプログラム（ＣａｍｂｒｉｄｇｅＳｏｆｔ）を使用した、Ｉ．Ｕ．Ｐ．Ａ．Ｃ．命名法の改変形態である。以下に記載されるものを除いて、原子価を完成させるのに十分な水素原子と接合していると想定される、いくつかの炭素原子上のすべての結合を除く、すべての結合が、本明細書の化学構造図で同定される。
【００５０】
２．一般的な方法
別段の定めがない限り、本明細書で使用されるすべての技術的かつ科学的用語は、一般に理解される意味を有する。開業医には、定義および用語について参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｒｅｅｎ＆Ｓａｍｂｒｏｏｋ（ｅｄｓ．）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２０１２）、およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ９９），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２０１２）、ならびにＰｌｏｔｋｉｎ，Ｓ．Ａ．，Ｏｒｅｎｓｔｅｉｎ，Ｗ．Ａ．，＆  Ｏｆｆｉｔ，Ｐ．Ａ．，Ｖａｃｃｉｎｅｓ，６  ｅｄ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｌｏｎｄｏｎ（２０１３）が特に案内される。標準的な方法はまた、ＲＮＡ操作および分析について詳細な方法を記載し、参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｉｎｄｅｒｅｉｆ，Ｓｃｈｏｎ，＆Ｗｅｓｔｈｏｆ（２００５）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ＲＮＡ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙにも記載されている。組み換え核酸を発生させるための適切な分子技術、および多くのクローニング運動の指示の例は、参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｒｅｅｎ＆Ｓａｍｂｒｏｏｋ（Ｉｄ．）、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（Ｉｄ．）、Ｂｅｒｇｅｒ＆Ｋｉｍｍｅｌ，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｖｏｌｕｍｅ  １５２  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．１９８７）、およびＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．１９９０）に見出される。化学ハンドルにより生体分子を活性化および誘導体化するための適切な生物有機技術、およびそのような剛性を設計するための指示の例は、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｌｏｎｄｏｎ（２００８）に見出される。本明細書に記載される生体分子の非経口投与に必要な技術および成分の例について、開業医には、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ（２０１２）が案内される。タンパク質精製、クロマトグラフィー、電気泳動、遠心分離、および結晶化のための方法は、Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されている。無細胞合成のための方法は、Ｓｐｉｒｉｎ＆Ｓｗａｒｔｚ（２００８）Ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙに���載されている。無細胞合成を使用した非天然アミノ酸のタンパク質への組み込みのための方法は、Ｓｈｉｍｉｚｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）ＦＥＢＳ  Ｊｏｕｒｎａｌ，２７３，４１３３−４１４０、およびＣｈｏｎｇ（２０１４）Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１０８：１６．３０．１−１１にも記載されている。
【００５１】
ＰＣＲ増幅方法は、例えば、Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，１９９０  ａｎｄ  Ｄｏｍｉｎｇｕｅｓ（ｅｄ．）ＰＣＲ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ＩＳＢＮ  １４９３９７０５９３（２０１７）に記載されている。増幅反応は、典型的には、増幅されるべきＤＮＡ、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、２つのオリゴヌクレオチドプライマー、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、反応緩衝液、およびマグネシウムを含む。典型的には、熱サイクルの望ましい数は、１〜２５である。ＰＣＲ条件のプライマーの設計および最適化のための方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ，２００２、およびＩｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９０に見出される。コンピュータプログラムは、必要とされる特異性および最適な増幅特性（例えば、Ｏｌｉｇｏ型５．０（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））を有するプライマーの設計において有用である。いくつかの実施形態では、ＰＣＲプライマーは、追加的に、増幅ＤＮＡ断片のベクター中の特異的制限酵素部位への挿入を容易にするための、制限エンドヌクレアーゼに対する認識部位を含有する。制限部位がＰＣＲプライマーの５’末端に加えられるべき場合、酵素によるより効率的な開裂を可能にするために、いくつかの（例えば、２つまたは３つの）余分の５′塩基を含むことが好ましい。いくつかの実施形態では、ＰＣＲプライマーはまた、その後のインビトロ転写を可能にするために、Ｔ７またはＳＰ６などのＲＮＡポリメラーゼプロモーター部位を含有する。インビトロ転写のための方法は、Ｖａｎ  Ｇｅｌｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：１６６３−１６６７，１９９０、Ｅｂｅｒｗｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：３０１０−３０１４，１９９２などの供給源に見出される。
【００５２】
多糖類または担体タンパク質−多糖類接合体の分子量は、多角的レーザー光散乱（ＭＡＬＳ）と組み合わされたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって測定される。ＳＥＣ  ＭＡＬＳ−ＵＶ−ＲＩ設定は、溶出種の検出のための、ＤＡＷＮ−ＨＥＬＥＯＳ多角度レーザー光散乱検出器およびＯｐｔｉｌａｂ  Ｔ−ｒＥＸ示差屈折干渉計（米国カリフォルニア州サンタバーバラ、Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に従った、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣ  １１００（脱気剤、第４級ポンプ、温度制御オートサンプラー、温度制御カラム区画、およびＵＶ−ＶＩＳダイオードアレイ検出器を含む）からなる。以下の一連のカラムは、このシステムに取り付けられる。ＴＳＫｇｅｌ  Ｇｕａｒｄ  ＰＷＸＬ  ６．０ｍｍ  ＩＤ×４．０ｃｍ長、１２μｍ粒子、ＴＳＫｇｅｌ  ６０００  ＰＷＸＬ  ７．８ｍｍ  ＩＤ×３０ｃｍ長、１３μｍ粒子、およびＴＳＫｇｅｌ  ３０００  ＰＷＸＬ  ７．８ｍｍ  ＩＤ×３０ｃｍ長、７μｍ粒子。カラム区画は、２５℃に設定され、試料区画は、４℃に設定される。５％ｖ／ｖアセトニトリルで０．２μｍ濾過された１×ＰＢＳからなる移動相が、０．５ｍＬ／分の流量で使用される。試料は、０．２〜１．５ｍｇ／ｍＬの濃度範囲の多糖類内に注入され、注入される容量は、３０〜４０μｇの相注入質量を生じるように調節される。Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｏｐｅｎ  Ｌａｂソフトウェアを使用は、ＨＰＬＣを制御するために使用され、Ｗｙａｔｔ  Ａｓｔｒａ  ７ソフトウェアは、データの回収および分析のために使用される。本技術は、試料中の接合体についての絶対分子量の分布を明らかにし、および個体数についての結果は、平均値として表現される。
【００５３】
いくつかの実施形態では、肺炎連鎖球菌が単離された莢膜多糖は、当業者に知られている単離手順を使用して細菌から直接得られる（例えば、米国特許出願公開第２００６／０２２８３８０、２００６／０２２８３８１、２００７／０１８４０７１、２００７／０１８４０７２、２００７／０２３１３４０、および２００８／０１０２４９８、ならびにＷＯ２００８／１１８７５２に開示される方法を参照されたい）。他の実施形態では、肺炎連鎖球菌が単離された莢膜多糖は、商業的供給源（例えば、ＡＴＣＣ）から得られる。
【００５４】
３．ポリペプチド
少なくとも１つのｎｎＡＡ残基を含むポリペプチドを本明細書に開示する。好適なポリペプチドは、任意の生物学的活性ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、免疫原性ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ｎｎＡＡ残基は、特異的ポリペプチドの天然残基と置換される。他の実施形態では、ｎｎＡＡ残基は、特異的ポリペプチドの配列前に添加され、その後に添加されるか、またはその内部に挿入される。さらなる実施形態では、ポリペプチドは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、または少なくとも９つのｎｎＡＡ残基を含む。別の実施形態では、ポリペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、または９つのｎｎＡＡ残基を含む。別の実施形態では、ポリペプチドは、２〜９つのｎｎＡＡ残基を含み、および好ましくは４〜６つのｎｎＡＡ残基を含む。またさらなる実施形態では、ポリペプチドは、化学的に異なる２つ以上のｎｎＡＡ残基を含む。
【００５５】
一実施形態では、本開示は、ｎｎＡＡ残基を含む免疫原性ポリペプチドを提供する。別の実施形態では、ポリペプチドは、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、または少なくとも９つのｎｎＡＡ残基を含む。別の実施形態では、少なくとも２つの非天然アミノ酸残基は、少なくとも２つの異なる非天然アミノ酸を含む。別の実施形態では、少なくとも２つの異なる非天然アミノ酸は、２−アミノ−３−（４−アジドフェニル）プロパン酸（ｐＡＦ）、２−アミノ−３−（４−（アジドメチル）フェニル）プロパン酸（ｐＡＭＦ）、２−アミノ−３−（５−（アジドメチル）ピリジン−２−イル）プロパン酸、２−アミノ−３−（４−（アジドメチル）ピリジン−２−イル）プロパン酸、２−アミノ−３−（６−（アジドメチル）ピリジン−３−イル）プロパン酸、２−アミノ−５−アジドペンタン酸、または２−アミノ−３−（４−（アジドメチル）フェニル）プロパン酸、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。別の実施形態では、ポリペプチドは、担体タンパク質のＴ細胞活性化エピトープを含む。別の実施形態では、ポリペプチドは、担体タンパク質である。別の実施形態では、ｎｎＡＡは、担体タンパク質のＴ細胞活性化エピトープではない。別の実施形態では、ｎｎＡＡは、リジン残基と置換される。別の実施形態では、ポリペプチドは、抗原と接合している。別の実施形態では、抗原は、ｎｎＡＡと接合している。別の実施形態では、抗原は、ハプテン、細菌莢膜多糖、細菌リポ多糖類、または腫瘍由来のグリカンからなる群から選択されるＴ細胞非依存性抗原を含む。別の実施形態では、抗原は、エキソ多糖類、例えば、黄色ブドウ球菌のエキソ多糖類などの細菌非莢膜多糖を含む。
【００５６】
一実施形態では、本開示は、ｎｎＡＡ残基を含む担体タンパク質を提供する。別の実施形態では、担体タンパク質は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、または少なくとも９つのｎｎＡＡ残基を含む。別の実施形態では、非天然アミノ酸は、２−アミノ−３−（４−アジドフェニル）プロパン酸（ｐＡＦ）、２−アミノ−３−（４−（アジドメチル）フェニル）プロパン酸（ｐＡＭＦ）、２−アミノ−３−（５−（アジドメチル）ピリジン−２−イル）プロパン酸、２−アミノ−３−（４−（アジドメチル）ピリジン−２−イル）プロパン酸、２−アミノ−３−（６−（アジドメチル）ピリジン−３−イル）プロパン酸、２−アミノ−５−アジドペンタン酸、または２−アミノ−３−（４−（アジドメチル）フェニル）プロパン酸、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。別の実施形態では、ｎｎＡＡは、リジン残基と置換される。別の実施形態では、ｎｎＡＡ残基は、担体タンパク質のＴ細胞活性化エピトープ中にではない位置にある。別の実施形態では、置換は、配列番号１のＫ２５、Ｋ３４、Ｋ３８、Ｋ４０、Ｋ２１３、Ｋ２１５、Ｋ２２８、Ｋ２６５、Ｋ３８６、Ｋ５２３、およびＫ５２７、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。別の実施形態では、置換は、配列番号１のＫ２５、Ｋ２１３、Ｋ２４５、Ｋ２６５、Ｋ３８６、およびＫ５２３の組み合わせを含む。別の実施形態では、担体タンパク質は、抗原を含む。別の実施形態では、抗原は、ハプテン、細菌莢膜多糖、細菌リポ多糖類、または腫瘍由来のグリカンからなる群から選択されるＴ非依存性抗原を含む。別の実施形態では、抗原は、多糖類である。別の実施形態では、多糖類は、１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１３、１４、１５Ｂ、１６、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１、および３３Ｆ、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される肺炎連鎖球菌血清型の莢膜多糖である。別の実施形態では、ポリペプチドは、Ｔ細胞依存性免疫反応を発生させることができる。
【００５７】
一実施形態では、本開示は、担体タンパク質のアミノ酸残基と接合している抗原を含むタンパク質であって、抗原が担体タンパク質の天然アミノ酸残基と接合しない、タンパク質を提供する。別の実施形態では、抗原は、担体タンパク質のリジン残基と接合しない。別の実施形態では、アミノ酸は、担体タンパク質のＴ細胞活性化エピトープ中にない。別の実施形態では、抗原は、ハプテン、細菌莢膜多糖、細菌リポ多糖類、または腫瘍由来のグリカンからなる群から選択されるＴ非依存性抗原を含む。別の実施形態では、抗原は、多糖類である。別の実施形態では、多糖類は、１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１３、１４、１５Ｂ、１６、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１、および３３Ｆ、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される肺炎連鎖球菌血清型の莢膜多糖である。
【００５８】
理想的には、担体タンパク質は、無細胞タンパク質合成システムにおいて発現されたときに、少なくとも５０ｍｇ／Ｌ（例えば少なくとも１００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも２００ｍｇ／Ｌ、または少なくとも２５０ｍｇ／Ｌ）の溶解度を有するべきである。
【００５９】
担体が１つ超のｎｎＡＡ残基を含む場合、単一種のみのｎｎＡＡを含む（例えば、担体中のｎｎＡＡのみが、ｐＡＭＦである）ことが好ましい。これにより、同じ接合化学を各ｎｎＡＡで同時に使用することが可能になる。２つの異なる抗原を単一の担体分子に付着させることが望まれる場合、これは、単一の担体内の異なるｎｎＡＡ種を使用し、かつ各抗原を異なるｎｎＡＡに接合することによって達成され得るが、担体中の単一種のｎｎＡＡに対する接合が好ましい。さらに、組成物が複数の異なる接合体（例えば、異なる肺炎球菌血清型）を含む場合、各接合体が同じ単一種のｎｎＡＡを含むことが好ましい。さらに、組成物が複数の異なる接合体（例えば、異なる肺炎球菌血清型）を含む場合、各接合体が同じ担体タンパク質を含むことが好ましい。
【００６０】
別の実施形態では、本開示は、本明細書に記載されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。別の実施形態では、本開示は、本明細書に記載されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。別の実施形態では、本開示は、発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００６１】
４．非天然アミノ酸
ｎｎＡＡ残基は、任意選択的に、この出願、または細胞ベースの、または無細胞タンパク質合成と互換性があるものとして同定されている他の出願に記載されている非天然アミノ酸のうちのいずれかを含む（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｃｈｕｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１０；７９：４１３−４４  ｐａｒｔｉｃｕｌａｒｌｙ  ｐｐ．４１８−４２０、およびＣｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１４；８３：５．１−５．３０を参照されたい）。
【００６２】
本実施形態の方法において使用され得る非天然アミノ酸の例としては、チロシンアミノ酸の非天然アナログ；グルタミンアミノ酸の非天然アナログ；フェニルアラニンアミノ酸の非天然アナログ；セリンアミノ酸の非天然アナログ；トレオニンアミノ酸の非天然アナログ；アルキル、アリール、アシル、アジド、シアノ、ハロー、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシル、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオール、スルホニル、セレノ、エステル、チオ酸、ホウ酸、ボロン酸、リン酸、ホスホノ、ホスフィン、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、ヒドロキシルアミン、ケト、またはアミノ置換アミノ酸、またはそれらの任意の組み合わせ；光励起性架橋剤を含むアミノ酸；スピン標識アミノ酸；蛍光アミノ酸；新規官能基を含むアミノ酸；別の分子と共有結合的に、もしくは非共有結合的に相互作用するアミノ酸；金属結合アミノ酸；金属含有アミノ酸；放射性アミノ酸；光ケージおよび／もしくは光異性化アミノ酸；アミノ酸を含有するビオチンもしくはビオチン−アナログ；グリコシル化もしくは炭水化物改変アミノ酸；アミノ酸を含有するケト；ポリエチレングリコールもしくはポリエーテルを含むアミノ酸；重原子置換アミノ酸；化学的に開裂可能な、もしくは光分解性アミノ酸；細長い側鎖を有するアミノ酸；毒性基を含有するアミノ酸；糖置換アミノ酸、例えば、糖置換セリンなど；炭素連結糖含有アミノ酸；レドックス活性アミノ酸；α−ヒドロキシ含有酸；アミノチオ酸含有アミノ酸；α，α二置換アミノ酸；β−アミノ酸；プロリン以外の環状アミノ酸などが挙げられる。
【００６３】
本発明で使用するのに特に好ましいｎｎＡＡは、翻訳中に（細胞または無細胞系に）組み込まれ得、かつ２０個の天然に生じるアミノ酸のうちのいずれにも見出されない官能基を提供するものである。そのようなアミノ酸をポリペプチドに組み込むための様々な技術が知られており、例えば、Ｙｏｕｎｇ＆Ｓｃｈｕｌｔｚ（２０１０）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８５：１１０３９−４４，Ｍａｚａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ．２６：１８８４−９、およびＺｉｍｍｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ．２５：３５１−６１を参照されたい。
【００６４】
具体的には、ｎｎＡＡ残基は、任意選択的に、別個の抗原分子またはハプテンの対応する基との「クリック」化学反応に好適な化学基を含む。「クリック」化学に好適な化学基には、アジド（Ｎ３）基、アルキン（Ｃ≡Ｃ）基、アルケン（Ｃ＝Ｃ）基、および１，２，４，５−テトラジン（
【化５】
2020504760.tif 000007
）基を含むがこれらに限定されない。
【００６５】
接合体は、ポリペプチドおよび抗原を含み、ポリペプチドは、少なくとも１つのＴ細胞活性化エピトープおよび少なくとも１つのｎｎＡＡ、好ましくは少なくとも２つのｎｎＡＡを含む担体タンパク質であり、抗原は、少なくとも１つのｎｎＡＡと接合している。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのｎｎＡＡは、２位のアミノ置換基と、３位のアジド含有置換基、１，２，４，５−テトラジニル含有置換基、またはエチニル含有置換基とを持つ２，３−二置換プロパン酸である。
【００６６】
別の関連する実施形態では、接合体は、ポリペプチドおよび抗原を含み、ポリペプチドは、少なくとも１つのＴ細胞活性化エピトープおよび少なくとも１つのｎｎＡＡ残基を含む担体タンパク質であり、抗原は、ｎｎＡＡと接合しており、さらに、ｎｎＡＡ残基は、式ＸＩＩの構造を有するアミノ酸に対応し、
【化６】
2020504760.tif 000008
式中、
Ａｒは、任意選択的に、少なくとも１つのヘテロ原子を含有する５員または６員芳香族環を含み、
Ｗ５は、Ｃ１〜Ｃ１０アルキレン、−ＮＨ−、−Ｏ−、および−Ｓ−から選択され、
Ｑ１は、ゼロまたは１であり、
Ｗ６は、アジド、任意選択的に低級アルキル基とＣ置換される１，２，４，５−テトラジニル、およびエチニルから選択され、
その結果、ポリペプチド中のｎｎＡＡ残基は、式ＸＩＩＩの構造を有し、
【化７】
2020504760.tif 000009
式中、Ｒ３は、ＯＨまたは担体タンパク質のアミノ酸残基であり、Ｒ４は、Ｈまたは担体タンパク質のアミノ酸残基である。
【００６７】
一実施形態では、本開示は、配列番号１による天然ポリペプチド内に天然に生じるアミノ酸と交換される少なくとも１つのｎｎＡＡを含むポリペプチドであって、少なくとも１つのｎｎＡＡが、配列番号１のＫ２５、Ｋ３４、Ｋ３８、Ｋ４０、Ｋ２１３、Ｋ２１５、Ｋ２２８、Ｋ２４５、Ｋ２６５、Ｋ３８６、Ｋ５２３、またはＫ５２７と交換され、ｎｎＡＡが連結部分を含む、ポリペプチドを提供する。別の実施形態では、ｎｎＡＡは、２−アミノ−３−（４−アジドフェニル）プロパン酸（ｐＡＦ）、２−アミノ−３−（４−（アジドメチル）フェニル）プロパン酸（ｐＡＭＦ）、２−アミノ−３−（５−（アジドメチル）ピリジン−２−イル）プロパン酸、２−アミノ−３−（４−（アジドメチル）ピリジン−２−イル）プロパン酸、２−アミノ−３−（６−（アジドメチル）ピリジン−３−イル）プロパン酸、２−アミノ−５−アジドペンタン酸、および２−アミノ−３−（４−（アジドメチル）フェニル）プロパン酸、またはそれらの任意の組み合わせから選択される。別の実施形態では、配列番号１のＫ２６５が交換される。別の実施形態では、配列番号１のＫ３８６が交換される。別の実施形態では、配列番号１のＫ２６５およびＫ３８６が交換される。別の実施形態では、ポリペプチドは、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、または少なくとも９つのｎｎＡＡを含む。別の実施形態では、ｎｎＡＡは、２−アミノ−３−（４−アジドフェニル）プロパン酸（ｐＡＦ）、２−アミノ−３−（４−（アジドメチル）フェニル）プロパン酸（ｐＡＭＦ）、２−アミノ−３−（５−（アジドメチル）ピリジン−２−イル）プロパン酸、２−アミノ−３−（４−（アジドメチル）ピリジン−２−イル）プロパン酸、２−アミノ−３−（６−（アジドメチル）ピリジン−３−イル）プロパン酸、２−アミノ−５−アジドペンタン酸、および２−アミノ−３−（４−（アジドメチル）フェニル）プロパン酸、またはそれらの任意の組み合わせから選択される。
【００６８】
別の実施形態では、ポリペプチド中のｎｎＡＡは、２位のアミノ置換基と、３位のアジド含有置換基、１，２，４，５−テトラジニル含有置換基、またはエチニル含有置換基とを持つ２，３−二置換プロパン酸である。好ましい実施形態では、３位の置換基は、アジド含有置換基であり、より好ましい実施形態では、アジド含有置換基は、連結基を通じて３位の炭素原子に結合される末端アジド基を含む。例えば、連結基は、任意選択的に置換され、任意選択的にヘテロ原子含有である、アリーレン部分を含み得る。例えば、連結基は、０〜４つのヘテロ原子および０〜４つの非水素環置換基を含有する、５員または６員アリーレン部分を含み得る。
【００６９】
より好ましい実施形態では、ｎｎＡＡは、式ＸＩＩの構造を有し、
【化８】
2020504760.tif 000010
式中、
Ａｒは、任意選択的に、少なくとも１つのヘテロ原子を含有する５員または６員芳香族環を含み、
Ｗ５は、Ｃ１〜Ｃ１０アルキレン、−ＮＨ−、−Ｏ−、および−Ｓ−から選択され、
Ｑ１は、ゼロまたは１であり、
Ｗ６は、アジド、任意選択的に低級アルキル基とＣ置換される１，２，４，５−テトラジニル、およびエチニルから選択される。
【００７０】
この場合、ポリペプチド中の対応するｎｎＡＡ残基は、式ＸＩＩＩの構造を有し、
【化９】
2020504760.tif 000011
式中、Ｒ３は、ＯＨまたは担体タンパク質のアミノ酸残基であり、Ｒ４は、Ｈまたは担体タンパク質のアミノ酸残基であることが理解されるであろう。
【００７１】
いくつかの実施形態では、Ａｒは、任意のヘテロ原子を含有せず、この場合、好ましいリンカーは、非置換フェニレン基である（すなわち、Ａｒは、−Ｃ６Ｈ４−である）。他の実施形態では、Ａｒは、窒素ヘテロ原子と、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つの追加のヘテロ原子とを含有する。例示的な窒素複素環は、以下に記載されており、Ａｒは、例えば、ピリジンまたはピリダジンであり得る。特に好ましい実施形態では、Ｑ１は１であり、Ｗ５は低級アルキレンであり、Ｗ６はアジドである。
【００７２】
アジド含有アミノ酸
いくつかの実施形態では、ｎｎＡＡ残基は、アジド含有ｎｎＡＡを含む。特定の実施形態では、ｎｎＡＡ残基は、式Ｉのアジド含有ｎｎＡＡを含み、
【化１０】
2020504760.tif 000012
式中、
Ｄは、−Ａｒ−Ｗ３−または−Ｗ１−Ｙ１−Ｃ（Ｏ）−Ｙ２−Ｗ２−であり、
Ａｒは、
【化１１】
2020504760.tif 000013
であり、
Ｗ１、Ｗ２、およびＷ３の各々は、独立して、単一の結合または低級アルキレンであり、
各Ｘ１は、独立して、−ＮＨ−、−Ｏ−、または−Ｓ−であり、
各Ｙ１は、独立して、単一の結合、−ＮＨ−、または−Ｏ−であり、
各Ｙ２は、独立して、単一の結合、−ＮＨ−、−Ｏ−、またはＮ連結もしくはＣ連結ピロリジンイレンであり、
Ｚ１、Ｚ２、およびＺ３のうちの１つは、−Ｎ−であり、Ｚ１、Ｚ２、およびＺ３のうちの他のものは、独立して、−ＣＨ−である。
【００７３】
他の実施形態では、ｎｎＡＡ残基は、式ＩＩのアジド含有アミノ酸を含み、
【化１２】
2020504760.tif 000014
式中、
Ｗ４は、Ｃ１〜Ｃ１０アルキレンである。
【００７４】
一実施形態では、ｎｎＡＡ残基は、２−アミノ−３−（４−アジドフェニル）プロパン酸（ｐＡＦ）、２−アミノ−３−（４−（アジドメチル）フェニル）プロパン酸（ｐＡＭＦ）、２−アミノ−３−（５−（アジドメチル）ピリジン−２−イル）プロパン酸、２−アミノ−３−（４−（アジドメチル）ピリジン−２−イル）プロパン酸、２−アミノ−３−（６−（アジドメチル）ピリジン−３−イル）プロパン酸、２−アミノ−５−アジドペンタン酸、または２−アミノ−３−（４−（アジドメチル）フェニル）プロパン酸、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアジド含有アミノ酸を含む。さらなる実施形態では、ｎｎＡＡ残基は、２−アミノ−３−（４−（アジドメチル）フェニル）プロパン酸（ｐＡＭＦ）を含む。ｐＡＭＦは、接合体を生成するための非常に好ましい反応速度論を提供する（例えば、ＳＰＡＡＣ法でアルキン含有炭水化物抗原と反応するときに、ｐＡＦを使用するよりもはるかに迅速である）。
【００７５】
式ＩおよびＩＩによるアジド含有アミノ酸の調製は、例えば、参照により組み込まれる、Ｓｔａｆｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．ＵＳ２０１４−００６６５９８Ａ１、特に段落［０３３１］〜［０３３３］に見出される。本プロセスは、塩化チオニルを使用した対応するアリールアミノ酸の誘導体の塩化物との水酸基の置換、続いて塩化物のアジドとの求核置換を伴う。好適なアミノ酸を含有するアリール側鎖がまた、市販で入手される。
【００７６】
１，２，４，５−テトラジニル含有アミノ酸
いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸残基は、ｎｎＡＡを含有する１，２，４，５−テトラジンを含む。特定の実施形態では、非天然アミノ酸は、式ＩＩＩのｎｎＡＡを含有する１，２，４，５−テトラジンを含み、
【化１３】
2020504760.tif 000015
式中、
Ａｒは、
【化１４】
2020504760.tif 000016
であり、
Ｖは、単一の結合、低級アルキレン、または−Ｗ１−Ｗ２−であり、
Ｗ１およびＷ２の一方は、不存在であるか、または低級アルキレンであり、他方は、−ＮＨ−、−Ｏ−、または−Ｓ−であり、
Ｚ１、Ｚ２、およびＺ３のうちの各１つは、−ＣＨ−または−Ｎ−であり、Ｚ１、Ｚ２、およびＺ３のうちの他のものは、各々独立して、−ＣＨ−であり、Ｘ１は、独立して、−ＮＨ−、−Ｏ−、または−Ｓ−であり、
Ｒは低級アルキルであり、
任意選択的に、Ａｒが
【化１５】
2020504760.tif 000017
であり、Ｖが−ＮＨ−である場合、Ｚ１、Ｚ２、およびＺ３のうちの１つは、非天然アミノ酸が
【化１６】
2020504760.tif 000018
でないという条件で、−Ｎ−である。
【００７７】
式ＩＩＩによる１，２，４，５−テトラジン含有アミノ酸の調製は、例えば、参照により組み込まれる、Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．ＵＳ２０１６−０２５１３３６Ａ１、特に段落［０３４１］〜［０３７７］に見出される。本プロセスは、Ａｒを導入するためのアミノピリジル臭化物との（Ｒ）−２−アミノ−３−ヨードプロパン酸のアミノ／カルボキシル保護誘導体の根岸カップリング、続いてテトラジン部分をアミノ酸に導入するためのメチルチオ−１，２，４，５−テトラジン誘導体との反応を伴う。
【００７８】
アルキン含有アミノ酸
いくつかの実施形態では、ｎｎＡＡ残基は、アルキン含有ｎｎＡＡを含む。一実施形態では、これは、プロパルギル基である。様々なプロパルギル含有アミノ酸であって、その合成を含む、プロパルギル含有アミノ酸は、Ｂｅａｔｔｙ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００６，４５，７３６４−７；Ｂｅａｔｔｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００５（１２７）：１４１５０−１；Ｎｇｕｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．２００９（１３１）：８７２０−１に見出される。そのようなプロパルギル含有アミノ酸は、細胞ベースのシステムを使用した、ｎｎＡＡとしてのタンパク質への組み込みに好適である。いくつかの実施形態では、ｎｎＡＡ残基は、ホモプロパルギルグリシン、エチニルフェニルアラニン、およびＮ６−［（２−プロピニルオキシ）カルボニル］−Ｌ−リジンからなる群から選択されるプロパルギル含有ｎｎＡＡを含む。
【００７９】
５．改変担体タンパク質
一態様では、少なくとも１つのｎｎＡＡ残基を含むポリペプチドは、天然担体タンパク質（例えば、ｅＣＲＭ）、または天然担体タンパク質の１つもしくは複数のＴ細胞活性化エピトープを含むポリペプチドの改変型である。そのような改変に好適な担体タンパク質は、コリネバクテリウム・ジフテリア菌毒素、破傷風菌テタノスパスミン、ヘモフィルス・インフルエンザ菌タンパク質Ｄ（ＰＤ、ＨｉＤ）、血清群Ｂ髄膜炎菌（ＯＭＰＣ）の外膜タンパク質複合体、またはＣＲＭ１９７などの接合体ワクチンにおいて使用されるタンパク質を含むがこれらに限定されない。
【００８０】
多くの天然担体タンパク質のアミノ酸および核酸配列は、公的に入手可能である。しかしながら、上記のように、そのような非改変（または天然）担体タンパク質は、任意の表面露出アミノ酸に対する非識別的抗原接合を含む、限界を有する。結果として、Ｔ細胞活性化エピトープは、抗原接合が生じる部位であることが多い。本開示の好ましい実施形態では、免疫原性ポリペプチドは、接合の部位として使用するための少なくとも１つのｎｎＡＡ残基の包含によって改変された担体タンパク質である。上記に考察されるように、ｎｎＡＡは、天然残基と置換され得るか、またはポリペプチドの配列前に添加し、その後に添加するか、またはその内部に挿入することによってポリペプチドに加えられ得る。本明細書に記載されるように、非天然アミノ酸の使用は、接合のための非天然アミノ酸の選択的配置を可能にし、結果として、抗原接合における増強された担体タンパク質のＴ細胞活性化エピトープが回避され得る。
【００８１】
表１は、例示的な天然担体タンパク質：ＣＲＭ１９７のアミノ酸および核酸配列（配列番号１および２）を示す。当業者であれば、コリネバクテリウム・ジフテリア菌の発酵によって生成される従来のＣＲＭ１９７のアミノ酸配列に対するＮ末端メチオニンの追加、および結果として生じる、従来のアミノ酸残基の位置番号付けに対する１の追加を認識するであろう。メチオニンは、これらの担体を生成するのに使用されている無細胞タンパク質の合成方法における開始コドンが本明細書に含まれるので、存在する。いくつかの態様では、ｎｎＡＡ残基を含む増強された担体タンパク質は、接合体ワクチンにおいて使用される同種の天然もしくは非毒性担体タンパク質と少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、または少なくとも９５％の配列同一性を有する。
【００８２】
配列番号１（ＣＲＭ１９７）と配列同一性を有する担体タンパク質は、接合体中に担体タンパク質として使用されてもいる、非毒性Ｋ５１Ｅ／Ｅ１４８Ｋ二重変異体などの他の変異体ジフテリア毒素タンパク質を含む（Ｐｅｃｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．２０１６  Ｖａｃｃｉｎｅ  ３４：１４０５−１１）。配列番号１のこれらの変異形のうちのすべてにおいて、野生型ジフテリア毒素の天然毒性は不存在である（ＣＲＭ１９７中のＧ５２Ｅ変異、またはＰｅｃｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．のＫ５１Ｅ／Ｅ１４８Ｋ変異を介して
【００８３】
表１はまた、へモフィルス・インフルエンザ菌由来のタンパク質Ｄ（配列番号８）のアミノ酸配列を示す。ｎｎＡＡ残基を含む増強された担体タンパク質は、配列番号８と少なくとも８０％の配列同一性を有し得る。配列番号８の少なくとも１つのＬｙｓ残基は、ｎｎＡＡによって交換され得る。配列番号８内に３６個のＬｙｓ残基があるので、いくつかは、ｎｎＡＡによって交換され得、次に接合のために使用され得る。
【００８４】
ジフテリアもしくは破傷風毒素に関する配列同一性が判定される場合、それは、処理済みの重鎖配列に関して、例えば、Ｐ００５８８−１のアミノ酸２２６−５６７、またはＰ０４９５８−１のアミノ酸４５８−１３１５（ＵｎｉＰｒｏｔ配列）に関して、判定されるべきである。
【００８５】
いくつかの実施形態では、ｎｎＡＡ残基を含む増強された担体タンパク質は、担体タンパク質の完全未満の天然配列を含むか、代わりに、コリネバクテリウム・ジフテリア菌毒素、破傷風菌テタノスパスミン、ヘモフィルス・インフルエンザ菌タンパク質Ｄ（ＰＤ、ＨｉＤ）、血清群Ｂ髄膜炎菌（ＯＭＰＣ）の外膜タンパク質複合体、ＣＲＭ１９７、Ｐｆｓ２５、または別の好適な天然もしくは非毒性担体タンパク質湯体の少なくとも１つもしくは複数のＴ細胞活性化エピトープを含む。いくつかの実施形態では、増強された担体タンパク質の毒性は、パラホルムアルデヒドでの処理に（またはホルムアルデヒドもしくはグルタルアルデヒドでの処理に）、続いて焼入冷却剤での処理に限定される。一実施形態では、ｎｎＡＡ残基を含む増強された担体タンパク質は、天然ＣＲＭ１９７の複数のＴ細胞活性化エピトープを含むポリペプチドである。
【表１】
2020504760.tif 000019
【００８６】
５ａ．ｎｎＡＡ含有ＣＲＭ１９７
前述のように、表１は、ＣＲＭ１９７のアミノ酸配列（配列番号１）を示す。ＣＲＭ１９７（「交差反応物質１９７」、ＣＲＭ１９７としても知られている）は、多くの承認された複合糖質ワクチンにおいて使用されるジフテリア毒素の非毒性変異体である（例えば、Ｂｒｏｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  ３９：１９５−２０４を参照されたい）。本明細書で使用するのに好ましい担体タンパク質は、配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、担体タンパク質は、１つ以上のｎｎＡＡ（配列番号１内に挿入され得るか、または配列番号１内の１つ以上のアミノ酸残基と置換され得る、例えば、Ｌｙｓおよび／もしくはＰｈｅと置換され得る）の存在を除いて、配列番号１のアミノ酸配列を含み得る。
【００８７】
いくつかの実施形態では、配列番号１の少なくとも１つのＬｙｓおよび／または少なくとも１つのＰｈｅ残基は、ｎｎＡＡ残基によって置換される。ｎｎＡＡを有する配列番号１の１つ超の残基を置換することが好ましく、理想的には、配列番号１の残基の１つのみの種が、ｎｎＡＡによって置換され、例えば、Ｌｙｓ残基のみが置換される。配列番号１の１つ超の残基がｎｎＡＡと置換される場合、同じｎｎＡＡが、各位置で、例えば、各置換位置のｐＡＭＦで使用されることが好ましい。
【００８８】
配列番号１内に２〜９つのｎｎＡＡ残基を有する担体タンパク質が好ましく、理想的には、４〜９つ、４〜８つ、もしくは４〜６つのｎｎＡＡ残基、例えば４、５、もしくは６つのｎｎＡＡ残基を有する。これにより、単一のｎｎＡＡを使用するよりも抗体への抗原のより広範囲の付着が可能になり、それによって不溶性をもたらし得る天然の配列および構造の過度の破砕を回避しながら、抗原：担体比率を増す。
【００８９】
ＣＲＭ１９７の研究は、残基Ｐ２７２−Ｄ２９１、Ｖ３２２−Ｇ３８４、およびＱ４１２−Ｉ４５８内のＴ細胞エピトープを同定した。したがって、配列番号１のこれらの領域内へのｎｎＡＡの導入を回避することが好ましい。これらの領域は、Ｆ２７４、Ｆ３５６、Ｆ３６１、Ｆ３６９、Ｋ４２０、Ｋ４４１、Ｋ４４６、Ｋ４４８、およびＫ４５７を含むため、これらは、ＣＲＭ１９７中のｎｎＡＡ置換により好ましくない、Ｐｈｅ残基およびＬｙｓ残基である。配列番号１のｎｎＡＡによる置換に好ましいＬｙｓ残基は、Ｋ２５、Ｋ３４、Ｋ３８、Ｋ４０、Ｋ２１３、Ｋ２１５、Ｋ２２８、Ｋ２４５、Ｋ２６５、Ｋ３８６、Ｋ５２３、またはＫ５２７である。ｎｎＡＡによる置換に有用な他のＬｙｓ残基は、Ｋ１１、Ｋ３８、Ｋ８３、Ｋ１０４、Ｋ１０５、Ｋ１２６、Ｋ１５８、Ｋ１７３、Ｋ２２２、Ｋ２３７、Ｋ２４３、Ｋ４７５、およびＫ４９９である。ｎｎＡＡによる置換に好ましいＰｈｅ残基は、Ｆ１３、Ｆ５４、Ｆ１２４、Ｆ１２８、Ｆ１４１、Ｆ１６８、Ｆ２５１、Ｆ３９０、Ｆ５３１、またはＦ５３２である。
【００９０】
ＣＲＭ１９７の構造の研究は、２つの一般的な３Ｄ領域を明らかにしている：第１の領域は、Ｎ末端〜Ａｓｎ−３７４に及び、第２の領域は、Ｓｅｒ−３７５〜Ｃ末端に及ぶ。理想的には、本発明で使用される担体は、第１の領域の少なくとも１つのｎｎＡＡおよび第２の領域の少なくとも１つのｎｎＡＡ、例えば、各領域の少なくとも２つのｎｎＡＡ、または各領域の少なくとも３つのｎｎＡＡを含む。これにより、担体に付着されたときに接合された抗原を空間的に離間させることが可能になる。第１の領域に３つのｎｎＡＡを有し、第２の領域に３つのｎｎＡＡを有する担体が有用である。
【００９１】
第１の領域は、２７個のＬｙｓ残基を含有し、第２の領域は、１２個のＬｙｓ残基を含有する。したがって、配列番号１のＮ末端の３７４個のアミノ酸内の１つ以上の（例えば３つの）Ｌｙｓ残基、およびＣ末端の１６２個のアミノ酸内の１つ以上の（例えば３つの）Ｌｙｓ残基が、ｎｎＡＡにより、例えば、ｐＡＭＦ内で置換され得る。
【００９２】
ＣＲＭ１９７に基づくｎｎＡＡ含有担体の好ましい実施形態は、配列番号１のアミノ酸配列を有し、残基Ｋ２５、Ｋ３４、Ｋ３８、Ｋ４０、Ｋ２１３、Ｋ２１５、Ｋ２２８、Ｋ２４５、Ｋ２６５、Ｋ３８６、Ｋ５２３、および／またはＫ５２７のうちの１つ以上が、ｎｎＡＡであり／によって交換される。１つのそのような配列は、配列番号９であり、各Ｘは、ｎｎＡＡ（好ましくは、ｐＡＭＦなどの同じｎｎＡＡ）を表す。
【化１７】
2020504760.tif 000020
【００９３】
この担体タンパク質は、肺炎球菌莢膜多糖に接合されたときに、良好な溶解度を維持し、かつ良好な免疫原性応答を提供しながら、無細胞タンパク質合成システムにおいて非常に良好に発現されることが見出された。
【００９４】
本発明はまた、複数の異なる接合体（例えば、異なる肺炎球菌血清型）であって、各接合体が、配列番号９のアミノ酸配列を有する担体タンパク質を含む（理想的には、各Ｘ残基は、同じｎｎＡＡ、好ましくはｐＡＭＦである）複数の異なる接合体を含む組成物を提供する。
【００９５】
配列番号１は、野生型ＣＲＭ１９７中には存在しないが、天然リーダー配列全体を必要とせずに、翻訳を開始するために含まれる、Ｎ末端メチオニン（典型的には、ホルミル化されるであろう）を有する。いくつかの実施形態では、本明細書で使用される担体タンパク質は、Ｎ末端メチオニンが欠落しており、例えば、配列番号１または配列番号９のＮ末端メチオニンが不存在であり得る。いくつかの実施形態では、ＣＲＭ１９７に基づく担体タンパク質は、配列番号１のＮ末端の上流または配列番号１のＣ末端の下流に天然アミノ酸を含まない（およびより好ましくは、アミノ酸を含まない）。
【００９６】
これらのｎｎＡＡ含有ＣＲＭ１９７担体タンパク質は、肺炎球菌莢膜多糖に接合するのに特に有用である。これらの接合体を組み合わせて、本明細書のどこかで考察されるような多価組成物を形成することができる。
【００９７】
本発明はまた、免疫原性多糖類−タンパク質接合体を調製するためのタンパク質であって、タンパク質が、配列番号１と少なくとも８０％の配列同一性（例えば少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％）を有するアミノ酸配列を有し、かつ少なくとも１つのｎｎＡＡを含み、タンパク質がＮ末端メチオニンを有する、タンパク質を提供する。本発明はまた、タンパク質中の少なくとも１つのｎｎＡＡに多糖類を接合させることによって調製される免疫原性多糖類−タンパク質接合体を提供する。
【００９８】
本発明はまた、免疫原性多糖類−タンパク質接合体を調製するためのタンパク質であって、タンパク質が、少なくとも１つの（例えば２〜９つの）リジン残基がｎｎＡＡであることを除いて、配列番号１のアミノ酸配列を含む、タンパク質を提供する。ｎｎＡＡは、理想的には、アジド含有ｎｎＡＡ（好ましいｐＡＭＦなど）、１，２，４，５−テトラジニル含有ｎｎＡＡ、またはアルケニル含有ｎｎＡＡである。本発明はまた、接合体であって、そのｎｎＡＡのうちの少なくとも１つを介して多糖類抗原に接合されるタンパク質を含む、接合体を提供する。
【００９９】
本発明はまた、免疫原性多糖類−タンパク質接合体であって、タンパク質が、Ｎ末端メチオニンを有するＣＲＭ１９７である、免疫原性多糖類−タンパク質接合体を提供する。
【０１００】
ｎｎＡＡ含有ＣＲＭ１９７担体は、典型的には、ＣＲＭ１９７多量体を形成するために、他のＣＲＭ１９７サブユニットと関連しているのではなく、接合体を調製するために使用されたときに、単量体形態で存在する。
【０１０１】
６．担体タンパク質の生成方法
ポリペプチド生成のための一般的な方法
増強された担体タンパク質は、ポリペプチドの生成について記載される任意の方法によって生成される。ポリペプチドの生成に好適な方法は、固相化学ペプチド合成、細胞ベースの組み換えタンパク質発現（大腸菌または天然宿主中の）、および無細胞タンパク質発現、ならびにそれらの任意の組み合わせ（例えば、合成成分と組み換えペプチド成分との組み合わせを使用した発現タンパク質結紮）を含むがこれらに限定されない。
【０１０２】
増強された担体タンパク質生成方法の一実施形態では、ｎｎＡＡを持つ増強された担体タンパク質は、「コドン再割り当て」を含む方法によって生成される。この実施形態の１つの変形例では、２０個の標準的なアミノ酸（例えばホモアリルグリシン、フッ素化ロイシン、アジドホモアラニン）の近い構造的アナログである、ｎｎＡＡを使用する。ｎｎＡＡは、野生型アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を使用して、その対応するｔＲＮＡに荷重され、ｎｎＡＡは、鋳型ＤＮＡ配列において特定された２０個の標準的なアミノ酸のうちの１つを完全に交換する。天然アミノ酸による干渉を防止するために、これは、一般的に、交換される天然アミノ酸について栄養要求性である細菌発現株の使用を必要とする。この方策は、特定の型のすべてのＡＡ残基がｎｎＡＡにより交換されるため、残基特異的ではないアミノ酸である。
【０１０３】
増強された担体タンパク質生成方法の別の実施形態では、ｎｎＡＡを持つ増強された担体タンパク質は、「ナンセンス抑制」を含む方策によって生成される。このアプローチでは、非天然アミノ酸は、通常、天然ではアミノ酸を同定しない、まれなまたは「ナンセンス」コドンによって、鋳型ＤＮＡ配列中に同定される。ナンセンス抑制アプローチの１つの変形例は、Ｓｃｈｕｌｔｚ（Ｎｏｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９８９（２４４）：１８２−１８８．）およびＣｈａｍｂｅｒｌｉｎ（Ｂａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．１９８９（１１１）：８０１３−８０１４．）によって先駆的に実施されており、部位特異的な方法でｎｎＡＡをポリペプチドに組み込むために、そのｔＲＮＡおよびその対応するアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素（ａａＲＳ）と共に、まれな終止コドンＴＡＧ（「アンバー」コドン、ＲＮＡコードにおけるＵＡＧ）の使用を伴う。
【０１０４】
一実施形態では、「ナンセンス抑制」アプローチは、ｔＲＮＡ／ａａＲＳ対の単離、直交性コドン（例えば、アンバーコドンＴＡＧ、オパールコドンＴＧＡ、または翻訳においてアミノ酸を同定するために一般的に使用されない別のコドンもしくは塩基配列）を認識するための抗コドンループでのｔＲＮＡの改変、およびアミノアシル−ｔＲＮＡ天然アミノ酸よりもｎｎＡＡを優先するためのａａＲＳの改変を伴う。この実施形態のいくつかの変形例では、ｔＲＮＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素対は、ポリペプチドの合成のために使用される翻訳機構と同じ微生物由来のモノである。他の実施形態では、ｔＲＮＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素対は、ポリペプチドの合成のために使用される翻訳機構とは異なる種由来のモノである。ｔＲＮＡ抗コドンループおよびａａＲＳ活性部位を改変するための方法は、操作された直交性ｔＲＮＡ／ａａＲＳ対の例であるように記載されている。
【０１０５】
「ナンセンス抑制」アプローチの別の実施形態では、増強された担体タンパク質の生成は、操作されたアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素の使用を伴わない。この実施形態では、直交性ｔＲＮＡのみが、直交性コドン（例えば、アンバーコドンＴＡＧ、または翻訳においてアミノ酸を同定するために一般的に使用されない別のコドンもしくは塩基配列）を認識するために、抗コドンで単離および改変される。次に、直交性操作ｔＲＮＡは、好適な化学方法（例えば、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼおよび変異体ｔＲＮＡＰｈｅの使用を伴う、Ｈｅｃｋｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９８４  Ｍａｒ  ２７；２３（７）：１４６８−７３の方法）によってインビトロでアシル化され、かつ無細胞タンパク質合成抽出物中に補足される。この実施形態は、化学的にアシル化されたｔＲＮＡを使用するため、無細胞のタンパク質合成方法とのみ互換性がある。
【０１０６】
無細胞タンパク質合成
ｎｎＡＡ含有担体タンパク質を生成するのに特に有用な技術は、無細胞タンパク質合成を使用する。いくつかの無細胞タンパク質発現技術は、当該技術分野で知られており、様々なｎｎＡＡを、ｎｎＡＡの潜在的な細胞傷害効果を回避しながら、この方法で組み込むことができる（例えば、Ｑｕａｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５８９：１７０３−１２の表１を参照されたい）。いくつかの実施形態では、増強された担体タンパク質は、無細胞抽出物ベースのタンパク質合成によって生成される。いくつかの実施形態では、無細胞抽出物は、ウサギ網状赤血球、小麦胚芽、または大腸菌の抽出物を含む。さらなる実施形態では、無細胞抽出物に、アミノ酸、エネルギー源、エネルギー再発生システム、または陽イオン補助因子、およびそれらの任意の組み合わせを補足する。いくつかの実施形態では、抽出物は、外因的に補足された変異体ｔＲＮＡまたは変異体ａａＲＳ（アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素）、およびそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、抽出物は、変異体ｔＲＮＡまたは変異体ａａＲＳを遺伝子的にコードする大腸菌株由来の溶解物、およびそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、溶解物のために使用される大腸菌株は、ＲＦ−１弱毒化株である。互換性がある無細胞タンパク質合成システムは、式Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩの組み換えポリペプチドへの挿入について記載されている（例えば、ＵＳ８７１５９５８Ｂ２、ＵＳ２０１６／０２５７９４６Ａ１、およびＵＳ２０１６／０２５７９４５Ａ１）。
【０１０７】
一例では、ＵＳ８７１５９５８Ｂ２は、メタノコッカス・ヤナシイ（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２（５５１６）：４９８−５００）由来のｔＲＮＡＴｙｒ／チロシン−合成酵素対を使用して、非天然アミノ酸ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン（ｐＡＦ）を、組み換えクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＴｅｔＡに導入する、再発生無細胞大腸菌ベースのシステムを実証している。このシステムを使用して、ｔＲＮＡ／合成酵素対は、抽出物内に補足されるか、または抽出物を作製するために使用される細菌へと形質変換されるかのいずれかである。
【０１０８】
別の例では、ＵＳ２０１６／０２５７９４６Ａ１は、（ａ）ｐ−アジドメチル−Ｌ−フェニルアラニン（ｐＡＭＦ）をアンバー認識ｔＲＮＡに優先的に荷重するように、変異原性を使用して上記のメタノコッカス・ヤナシイチロシン−合成酵素を適応させる方法、および（ｂ）改変された合成酵素／ｔＲＮＡ対を含む無細胞合成システムを使用して、ｐＡＭＦをトラスツズマブなどの抗体に選択的に組み込む方法を実証している。
【０１０９】
さらなる例では、ＵＳ２０１６／０２５７９４５Ａ１は、（ａ）（Ｓ）−２−アミノ−３−（５−（（６−メチル−１，２，４，５−テトラジン−３−イルアミノ）メチル）ピリジン−２−イル）プロパン酸（ピリジルテトラジンアミノ酸誘導体）をアンバー認識ｔＲＮＡに優先的に荷重するように、変異原性を使用して上記のメタノコッカス・ヤナシイチロシン−合成酵素を適応させる方法、および（ｂ）改変された合成酵素／ｔＲＮＡ対を含む無細胞合成システムを使用して、（Ｓ）−２−アミノ−３−（５−（（６−メチル−１，２，４，５−テトラジン−３−イルアミノ）メチル）ピリジン−２−イル）プロパン酸を組み換えＧＦＰに選択的に組み込む方法を実証している。
【０１１０】
さらなる実施形態では、本開示は、２つ以上の非天然アミノ酸を含有する無細胞抽出物中にポリペプチドを生成する方法を提供する。この実施形態では、ポリペプチドはまた、天然タンパク質に匹敵する生物活性を有する。他の実施形態では、ポリペプチドは、天然タンパク質に匹敵する改善または増強された生物活性を有する。
【０１１１】
任意選択的に、機能的アッセイにおいて活性のレベルを判定し、非機能的アッセイにおいて存在するタンパク質の量を定量化し（例えば、免疫染色、ＥＬＩＳＡ、クマシーまたは銀染色ゲルでの定量化など）、かつ生物学的活性タンパク質または非凝集タンパク質と総タンパク質との比率を判定することによって、組成物中のタンパク質の比活性度を判定する。一般的に、そのように定義されるような比活性度は、天然タンパク質の少なくとも約５％の比活性度であり、通常、天然タンパク質の少なくとも約１０％の比活性度であり、任意選択的に、約２０％、約４０％、約６０％以上である。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、ｎｎＡＡ含有ポリペプチドを生成する方法は、ｎｎＡＡ特異的ｔＲＮＡ、ｎｎＡＡ特異的合成酵素、ｎｎＡＡ自体の濃度、または翻訳温度、およびそれらの任意の組み合わせの変更を伴う。そのような条件は、任意選択的に、翻訳エラーの減少、ｎｎＡＡの組み込みの改善された割合、ｎｎＡＡの組み込むによるタンパク質折り畳みのために必要なシャペロンの活性の改善、ｎｎＡＡ組み込みに干渉する細胞因子の活性の低下、または前述の機構の任意の組み合わせを可能にする。
【０１１３】
増強されたポリペプチド生成方法のいくつかの実施形態では、ｎｎＡＡ特異的ｔＲＮＡ濃度は、約２０μＭを超える濃度まで増加され、可溶性または活性ポリペプチドの画分の増加をもたらす。この実施形態のさらなる変形例では、ｔＲＮＡ濃度は増加され、ｎｎＡＡ濃度は、約２ｍＭ未満に保たれ、ｎｎＡＡ合成酵素は、約５μＭ未満に維持される。
【０１１４】
増強されたポリペプチド生成方法のいくつかの実施形態では、翻訳混合物の培養温度は、セ氏２０フ度〜３０度、セ氏約２０度、またはセ氏２０度未満である。いくつかの変形例では、これらの温度の改変は、独立して、先行する段落に記載されている、ｎｎＡＡ特異的ｔＲＮＡ濃度、ｎｎＡＡ濃度、またはｎｎＡＡ合成酵素濃度と組み合わされる。
【０１１５】
７．配列変異体
本開示の改善された担体タンパク質は、ポリペプチドの１つ以上のＴ細胞エピトープの免疫原性機構が保存される限り、ポリペプチド内の任意の位置で置換される１つ以上のｎｎＡＡを含む。改善された担体タンパク質を既知の担体に基づかせる場合、通常、担体の特性に悪影響を与える機械を最小限に抑えるために、ｎｎＡＡのうちのいくつかまたはすべてを既知の担体における既存の天然に生じるアミノ酸と置換することが好ましい。しかしながら、ｎｎＡＡは、開始担体配列への追加として内部に、または終端に挿入され得ることが理解される。いくつかの実施形態では、改善された担体タンパク質（例えば、ｅＣＲＭ）中の少なくとも１つのｎｎＡＡは、Ｔ細胞エピトープを含むタンパク質の１つ以上の領域内に存在しない。別の実施形態では、増強された免疫原性ポリペプチド中のｎｎＡＡは、Ｔ細胞エピトープを含むタンパク質の１つ以上の領域内に存在しない。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、ｎｎＡＡ残基は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンを含む、２０個の天然にコードされるアミノ酸のうちの１つ以上と置換される。いくつかの他の実施形態では、ｎｎＡＡ残基は、脂肪族、芳香族、酸性、塩基、ヒドロキシル、硫黄含有、またはアミド（アミド基を含有する）などの、特定の種類の天然アミノ酸残基のうちの１つ以上と置換される。いくつかの場合では、１つのみの特異的アミノ酸（例えば、リジン）が、１つ以上の位置でポリペプチド内のｎｎＡＡと置換される。他の場合では、２つ以上の異なるアミノ酸（例えば、リジン、フェニルアラニンなど）は、２つ以上の位置でポリペプチド内のｎｎＡＡと置換される。リジンおよびフェニルアラニンは、（ｉ）既存の担体タンパク質への接合のためにリジンが使用されることが多く、そのためｎｎＡＡ含有担体が同じ付着部位に維持され得、かつ（ｉｉ）多くの有用なｎｎＡＡがフェニルアラニンベースであり、そのためｎｎＡＡを有する担体が、天然配列と比較して最小限の構造的改変を有し得るという理由で、ｎｎＡＡによる置換について好ましい。単一種のみのアミノ酸がｎｎＡＡと置換される、例えば、残基のみが置換される、ポリペプチドが好ましい。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、ｎｎＡＡ残基は、担体タンパク質の少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、または少なくとも１５個の天然アミノ酸残基と置換される。いくつかの実施形態では、ｎｎＡＡ残基は、担体タンパク質の少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、または少なくとも１５個の天然アミノ酸残基と置換される。いくつかの実施形態では、ｎｎＡＡ残基は、配列番号１の少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、または少なくとも１５個の天然アミノ酸残基と置換される。
【０１１８】
さらなる態様では、ｎｎＡＡは、担体タンパク質内の１つ以上のアミノ酸残基と置換される。本明細書に記載される単一または複数置換ｎｎＡＡ変異形を作出するために選択される特異的アミノ酸残基は、任意選択的に、タンパク質をサブドメインに分割し、かつ互いを立体的に遮らない（例えば、置換部位間にマルチオングストローム距離があるように）単一のアミノ酸またはアミノ酸残基のセットを置換のために選択することによって判定される。ＣＲＭ１９７の２つの構造的領域への分割を以下に考察する。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、ｎｎＡＡは、荷電したアミノ酸残基と置換される。したがって、ｎｎＡＡは、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、またはヒスチジンアミノ酸残基と置換され得る。いくつかの実施形態では、ｎｎＡＡは、負に荷電したアミノ酸残基、例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸残基と置換される。いくつかの実施形態では、ｎｎＡＡは、正に荷電したアミノ酸残基、例えば、リジン、アルギニン、またはヒスチジン残基と置換される。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、ｎｎＡＡは、免疫原性ポリペプチド内の１つ以上のリジン残基と置換される。例えば、配列番号１の増強された型は、以下の方法、１）Ｋ２５、Ｋ３４、Ｋ３８、およびＫ４０からなる群由来の１つの残基、２）Ｋ２１３およびＫ２１５からなる群から選択される１つの残基、ならびに３）Ｋ２２８、Ｋ２４５、Ｋ２６５、Ｋ３８６、Ｋ５２３、およびＫ５２７からなる群から選択される２〜４つの残基で、ｎｎＡＡをリジンと置換することによって発生される。またさらなる実施形態では、置換された特定の種類の天然アミノ酸残基のうちの１つ以上は、配列番号１のＫ２５、Ｋ３４、Ｋ３８、Ｋ４０、Ｋ２１３、Ｋ２１５、Ｋ２２８、Ｋ２６５、Ｋ３８６、Ｋ５２３、およびＫ５２７、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。他の実施形態では、配列番号１のｎｎＡＡ置換は、Ｋ２５、Ｋ３４、Ｋ３８、Ｋ４０、Ｋ２１３、Ｋ２１５、Ｋ２２８、Ｋ２４５、Ｋ２６５、Ｋ３８６、Ｋ５２３、およびＫ５２７のうちの１つ以上から選択される。一実施形態では、ｎｎＡＡ置換は、配列番号１のＫ２５、Ｋ２１５、Ｋ２２８、Ｋ２６５、Ｋ３８６、およびＫ５２３からなる６つの残基を含む。いくつかの実施形態では、配列番号１のｎｎＡＡ置換は、Ｋ２６５を含む。他の実施形態では、配列番号１のｎｎＡＡ置換は、Ｋ３８６を含む。別の実施形態では、配列番号１のｎｎＡＡ置換は、Ｋ２６５およびＫ３８６を含む。さらなる実施形態では、ｎｎＡＡは、フェニルアラニンと置換される。置換に好ましいフェニルアラニンは、配列番号１のＦ１３、Ｆ５４、Ｆ１２４、Ｆ１２８、Ｆ１４１、Ｆ１６８、Ｆ２５１、Ｆ３９０、Ｆ５３１、またはＦ５３２を含む。それらの近接性のために、一般的に、Ｆ５３１およびＦ５３２の両方で置換しないことが好ましい。
【０１２１】
試験された大多数の対象によって認識されたジフテリア毒素へのヒトＣＤ４＋細胞に対する結合エピトープは、残基２７１−２９０、３２１−３４０、３３１−３５０、３５１−３７０、４１１−４３０、または４３１−４５０を包含する（Ｒａｊｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９５  Ｄｅｃ；２５（１２）：３２０７−１４を参照されたい）。したがって、いくつかの実施形態では、置換された１つ以上のｎｎＡＡは、配列番号１の残基２７１−２９０、３２１−３４０、３３１−３５０、３５１−３７０、４１１−４３０、および／または４３１−４５０内にない。一実施形態では、置換された１つ以上のｎｎＡＡは、配列番号１の残基３３１−３５０内にない。別の実施形態では、置換された１つ以上のｎｎＡＡは、配列番号１の残基３２１−３４０内にない。また別の実施形態では、置換された１つ以上のｎｎＡＡは、配列番号１の残基４３１−４５０内にない。
【０１２２】
試験されたすべての対象によって認識された破傷風毒素へのヒトＣＤ４＋細胞に対する結合エピトープは、重鎖残基Ｈ１７６−１９５、ＩＤＫＩＳＤＶＳＴＩＶＰＹＩＧＰＡＬＮＩ［配列番号３］、およびＨ４９１−５１０、ＮＮＦＴＶＳＦＷＬＲＶＰＫＶＳＡＳＨＬＥ［配列番号４］を包含する（Ｄｉｅｔｈｅｌｍ−Ｏｋｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．１９９７  Ｆｅｂ；１７５（２）：３８２−９１を参照されたい）。したがって、いくつかの実施形態では、置換された１つ以上のｎｎＡＡは、破傷風毒素の前駆体タンパク質の重鎖ペプチド成分の残基１７６−１９５および／または４９１−５１０内にない。別の実施形態では、置換された１つ以上のｎｎＡＡは、破傷風毒素の前駆体タンパク質の重鎖ペプチド成分の残基１７６−１９５内にない。また別の実施形態では、置換された１つ以上のｎｎＡＡは、破傷風毒素の前駆体タンパク質の重鎖ペプチド成分の残基４９１−５１０内にない。
【０１２３】
試験された大多数の対象によって認識された髄膜炎菌外膜タンパク質（ＯＭＰまたはＰｏｒＡ）へのヒトＣＤ４＋細胞に対する結合エピトープは、大部分が可変領域の外側に位置し、異なる髄膜球菌（および淋菌）株の中に保存される、例えば、ＯＭＰの保存される推定トランス膜領域に対応する、免疫優性Ｔ細胞エピトープを包含する（Ｗｉｅｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１９９２；１７６（１）：７９−８８）。したがって、いくつかの実施形態では、置換された１つ以上のｎｎＡＡは、ＯＭＰの保存された領域内ににない。
【０１２４】
試験された大多数の対象によって認識された連鎖球菌株Ｇ１４８のＧタンパク質由来の担体タンパク質であるＢＢへのヒトＣＤ４＋細胞に対する結合エピトープは、ＢＢ配列における、アミノ酸２５−４０（ＶＳＤＹＹＫＮＬＩＮＮＡＫＴＶＥ［配列番号５］）、６３−７８（ＤＧＬＳＤＦＬＫＳＱＴＰＡＥＤＴ［配列番号６］）、および７４−８９（ＡＥＤＴＶＫＳＩＥＬＡＥＡＫＶＬ［配列番号７］）を包含する（Ｇｏｅｔｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｄｉａｇｎ  Ｌａｂ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３  Ｊａｎ；１０（１）：１２５−３２）。したがって、いくつかの実施形態では、置換された１つ以上のｎｎＡＡは、ＢＢ配列の残基２５−４０、６３−７８、および／または７４−８９内にない。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの非天然アミノ酸残基を含む免疫原性ポリペプチドは、少なくとも１つの抗原をさらに含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの非天然アミノ酸を含む免疫原性ポリペプチドは、増強された担体タンパク質であり、かつ少なくとも１つの抗原をさらに含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの非天然アミノ酸を含む免疫原性ポリペプチドは、増強された担体タンパク質であり、かつ少なくとも１つの抗原をさらに含む。
【０１２６】
８．Ｔ細胞エピトープ
担体タンパク質のＴ細胞エピトープは、任意選択的に、既知の方法のうちのいずれかによって判定される。本開示の改善された担体タンパク質の設計における支援として、タンパク質中のＴ細胞結合エピトープは、タンパク質の両親媒性プロファイル、配列モチーフ、定量化マトリクス（ＱＭ）、人工神経ネットワーク（ＡＮＮ）、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）、定量化構造活性関係（ＱＳＡＲ）、および分子ドッキングシミュレーションなどの様々な要因を考慮するアルゴリズムを使用して予測される（Ｄｅｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２０１４；１１８４：３３３−６４を参照されたい）。例えば、ジフテリア毒素／ＣＲＭにおけるＴ細胞結合エピトープは、ＤｅＬｉｓｉ＆Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙアルゴリズムを使用して予測されている（Ｂｉｘｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ＷＯ８９／０６９７４  ａｎｄ  ＰＮＡＳ  ８２：７８４８，１９８５を参照されたい）。予測されたＴ細胞エピトープを、実験的に確認することができる。例えば、対象となる免疫原性ポリペプチドのＴ細胞エピトープは、免疫原性ポリペプチド（または予測された領域）の完全な配列に対応する部分的に重複するペプチド断片を合成し、かつ各断片の存在下でのＣＤ４＋細胞株（例えば、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ））の増殖アッセイを実行することによって、実験的に判定され得る。この一般的なアプローチは、ジフテリア毒素（Ｒａｊｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９５  Ｄｅｃ；２５（１２）：３２０７−１４）、破傷風毒素（Ｄｉｅｔｈｅｌｍ−Ｏｋｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．１９９７  Ｆｅｂ；１７５（２）：３８２−９１）、髄膜炎菌の外膜タンパク質（ＯＭＰ）（Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１９９２  Ｊｕｌ  １；１７６（１）：７９−８８）、および連鎖球菌株Ｇ１４８のＧタンパク質由来の担体タンパク質であるＢＢ（Ｇｏｅｔｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｄｉａｇｎ  Ｌａｂ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３  Ｊａｎ；１０（１）：１２５−３２）におけるＴ細胞エピトープをマップ化するために用いられている。１つ以上のｎｎＡＡの存在によって不活性化されていないＴ細胞エピトープの存在を構築するために、ＣＤ４＋細胞増殖および／またはサイトカイン応答に対して本開示の改善された担体タンパク質を直接スクリーニングすることができる。
【０１２７】
９．接合体の生成方法
一実施形態では、本開示は、セ氏約１０度〜セ氏約３０度の温度で維持された無細胞発現混合物中にｎｎＡＡを含むポリペプチドの合成のための方法を提供する。別の実施形態では、温度は、セ氏約２０度を上回る。別の実施形態では、温度は、セ氏約２０度を下回る。別の実施形態では、温度は、セ氏約１４度〜セ氏約１８度である。別の実施形態では、ポリペプチドは、抑制コドンを含む核酸によってコードされる。別の実施形態では、無細胞発現混合物は、ｎｎＡＡに対して特異的な直交性ｔＲＮＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素対を含む。別の実施形態では、ｔＲＮＡの濃度は、少なくとも２０μＭである。別の実施形態では、ｎｎＡＡの濃度は、約２ｍＭ未満であり、アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素の濃度は、約５μＭ未満である。別の実施形態では、本方法は、ポリペプチドを活性部分に接合させることを含む。別の実施形態では、活性部分は、ハプテン、細菌抗原、ウィルス抗原、腫瘍由来のグリカン、ペプチド毒素、マクロライド、ポリエーテル、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。別の実施形態では、ポリペプチドは、成長ホルモン、凝固因子、プラズマタンパク質、インターロイキン、Ｔ細胞受容体の細胞外ドメイン、成長因子の細胞外ドメイン、細菌抗原、ウィルス抗原、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。別の実施形態では、発現混合物は、大腸菌、小麦胚芽、またはウサギの網状赤血球の細胞抽出物を含む。別の実施形態では、発現混合物は、少なくとも３０％細胞抽出物を含む。別の実施形態では、ポリペプチドは、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、または少なくとも９つのｎｎＡＡを含む。別の実施形態では、ｎｎＡＡは、２−アミノ−３−（４−アジドフェニル）プロパン酸（ｐＡＦ）、２−アミノ−３−（４−（アジドメチル）フェニル）プロパン酸（ｐＡＭＦ）、２−アミノ−３−（５−（アジドメチル）ピリジン−２−イル）プロパン酸、２−アミノ−３−（４−（アジドメチル）ピリジン−２−イル）プロパン酸、２−アミノ−３−（６−（アジドメチル）ピリジン−３−イル）プロパン酸、２−アミノ−５−アジドペンタン酸、２−アミノ−３−（４−（アジドメチル）フェニル）プロパン酸、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。別の実施形態では、生成されたポリペプチドは、可溶性画分および不溶性画分の両方を含み、可溶性画分と不溶性画分との比率は、少なくとも４０％（ｗ／ｗ）である。別の実施形態では、生成されたポリペプチドは、可溶性画分および不溶性画分の両方を含み、可溶性画分と不溶性画分との比率は、少なくとも６０％（ｗ／ｗ）である。一実施形態では、無細胞発現によって生成されたポリペプチドは、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、または少なくとも９つのｎｎＡＡを含み、可溶性画分と不溶性画分との比率は、少なくとも少なくとも２０％（ｗ／ｗ）、少なくとも３０％（ｗ／ｗ）、少なくとも４０％（ｗ／ｗ）、少なくとも５０％（ｗ／ｗ）、６０％（ｗ／ｗ）、少なくとも７０％（ｗ／ｗ）、少なくとも８０��（ｗ／ｗ）、少なくとも９０％（ｗ／ｗ）である。
【０１２８】
抗原
任意選択的に、増強された担体タンパク質への付着を促進するために、化学ハンドルでさらに誘導体化された免疫原性抗原を本明細書に記載する。一実施形態では、抗原は、任意の精製された天然、合成、もしくは組み換え生成された高分子またはその断片である。例としては、脂質、多糖類、核酸、またはポリペプチド、およびそれらの任意の組み合わせ（例えば、糖タンパク質、グライコリポタンパク質、糖脂質）を含むがこれらに限定されない。例えば、糖脂質は、任意選択的に、グリコシルホスファチジルイノシトールである。別の実施形態では、抗原は、細菌多糖類、細菌リポ多糖類、腫瘍由来のグリカン、もしくはハプテンからなる群から選択されるＴ非依存性もしくはＴ活性化抗原（通常、弱いＴ活性化抗原）である。
【０１２９】
細菌由来の多糖類いくつかの実施形態では、多糖類を含む抗原は、莢膜多糖などの細菌由来の多糖類を含む。そのような莢膜多糖は、免疫反応に対して微生物を保護する機能を果たす、グラム陽性またはグラム陰性細菌の高分子質量のポリマーであり、そのように、目標が中和抗体の生成である場合に、魅力的なワクチン標的を表す。そのような莢膜多糖は、一般的に、透析濾過、タンパク質除去、エタノール沈殿、核酸除去、および凍結乾燥を伴うプロセスを介して、対応する細菌の全体的な細胞溶解物または培養上清から調製される。例としては、Ｍｅｒｉｅｕｘプロトコル（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｍｅｒｉｅｕｘ（１９８０）Ｂｒｅｖｅｔ  Ｂｅｌｇｅ  ８０：２６３２０）およびＹａｖｏｒｄｉｏｓプロトコル（Ｙａｖｏｒｄｉｏｓ  ｅｔ  ａｌ．ＥＰ００７１５１５Ａ１（１９８３））を含むがこれらに限定されない。
【０１３０】
肺炎連鎖球菌の莢膜多糖いくつかの実施形態では、莢膜多糖は、肺炎連鎖球菌由来の莢膜多糖を含む。肺炎連鎖球菌は、肺炎、細菌感染症、および髄膜炎を引き起こし得る、被包されたグラム陽性細菌である。血清型特異的繰り返し単位構造を有する莢膜多糖を持つ、肺炎連鎖球菌の９０個の別個の文書化された（例えば、Ｋａｌｉｎ，Ｍ．Ｔｈｏｒａｘ  １９９８；５３：１５９−１６２に概説された）血清型がある。したがって、いくつかの場合、抗原は、１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、８、９Ａ、９Ｌ、９Ｎ、９Ｖ、１０Ｆ、１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１１Ｆ、１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、１１Ｄ、１２Ｆ、１２Ａ、１２Ｂ、１３、１４、１５Ｆ、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１６Ａ、１７Ｆ、１７Ａ、１８Ｆ、１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｃ、１９Ｆ、１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、２０、２１、２２Ｆ、２２Ａ、２３Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、２４Ａ、２４Ｂ、２５Ｆ、２５Ａ、２７、２８Ｆ、２８Ａ、２９、３１、３２Ｆ、３２Ａ、３３Ｆ、３３Ａ、３３Ｂ、３３Ｃ、３３Ｄ、３４、３５Ｆ、３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｃ、３６、３７、３８、３９、４０、４１Ｆ、４１Ａ、４２、４３、４４、４５、４６、４７Ｆ、４７Ａ、および４８（Ｈｅｎｒｉｃｈｓｅｎ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １９９５；３３：２７５９−２７６２）から選択される肺炎連鎖球菌の莢膜多糖である。しかしながら、これらの血清型のサブセットのみが、一般に、血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１３、１４、１５Ｂ、１６、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１、および３３Ｆを含む、細菌感染の原因となる。血清型６Ｃ、７Ｃ、１５Ａ、１５Ｃ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、３１、３４、３５Ｂ、３５Ｆ、３７、および３８も、血清型２０Ａ、２０Ｂ、および２４Ｂを有するように、臨床的に懸念になっている。別の実施形態では、抗原は、血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１３、１４、１５Ｂ、１６、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１、および３３Ｆから選択される肺炎連鎖球菌の莢膜多糖である。別の実施形態では、抗原は、血清型６Ｃ、７Ｃ、１５Ａ、１５Ｃ、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、３１、３４、３５Ｂ、３５Ｆ、３７、および３８から選択される肺炎連鎖球菌の莢膜多糖である。本明細書に記載される実施形態はまた、追加的に、血清型２０Ａ、２０Ｂ、および２４Ｂから選択される肺炎連鎖球菌の莢膜多糖のうちの１つ以上を含み得る。
【０１３１】
前述のように、本発明の組成物は、少なくとも１４、１５、２０、２１、２４、または２５個の異なる肺炎球菌血清型由来の莢膜多糖の接合体を含み得る。組成物が１４個以上の血清型を含む場合、これらは、好ましくは、１３個の血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、および２３Ｆを含む。これらの１３個の血清型に加えて、組成物は、好ましくは、血清型２、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｂ、１７Ｆ、２０、２２Ｆ、および／または３３Ｆのうちの１つ以上を含む。代替的に、上記１３個の血清型に加えて、組成物は、好ましくは、１つ以上の血清型２、６Ｃ、８、９Ｎ、１０Ａ、１２Ｆ、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、２０、２０Ａ、２０Ｂ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、２４Ｂ、３１、３３Ｆ、３４、３５Ｂ、３５Ｆ、および３８を含む。１５個以上の（例えば、１６個以上の）血清型の有用な組み合わせは、血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆの各々を含み、かつ血清型８も含み得る。２０個以上の（例えば２１個以上の）血清型の有用な組み合わせは、血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆの各々を含む。２４個以上の血清型の有用な組み合わせは、血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆの各々を含む。
【０１３２】
一般的な肺炎連鎖球菌の血清型莢膜多糖の繰り返し単位の構造は、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊｏｎｅｓ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎ  Ａｃａｄ  Ｂｒａｓ  Ｃｉｅｎｃ．２００５  Ｊｕｎ；７７（２）：２９３−３２４）に記載されている。
１型
［→３）−Ｄ−ＡＡＴ−α−Ｇａｌｐ−（１→４）−α−Ｄ−ＧａｌｐＡ（２／３ＯＡｃ）−（１→３）−α−Ｄ−ＧａｌｐＡ−（１→］
２型
［→４）−β−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→３）−［α−Ｄ−ＧｌｃｐＡ−（１→６）−α−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→２）］−α−Ｌ−Ｒｈａｐ−（１→３）−α−Ｌ−Ｒｈａｐ−（１→３）β−Ｌ−Ｒｈａｐ−（１→］
３型
［→３）−β−Ｄ−ＧｌｃＡ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→］
４型
［→３）−β−Ｄ−ＭａｎｐＮＡｃ−（１→３）−α−Ｌ−ＦｕｃｐＮＡｃ−（１→３）−α−Ｄ−ＧａｌｐＮＡｃ−（１→４）−α−Ｄ−Ｇａｌｐ２，３（Ｓ）Ｐｙ−（１→］
５型
［→４）−β−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→４）−［α−Ｌ−ＰｎｅｐＮＡｃ−（１→２）−β−Ｄ−ＧｌｃｐＡ−（１→３）］−α−Ｌ−ＦｕｃｐＮＡｃ−（１→３）−β−Ｄ−Ｓｕｇｐ−（１→］
６Ｂ型
［→２）−α−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→３）−α−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→３）−α−Ｌ−Ｒｈａｐ−（１→４）−Ｄ−Ｒｉｂ−ｏｌ−（５→Ｐ→］
９Ｎ型
［→４）−α−Ｄ−ＧｌｃｐＡ−（１→３）−α−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→３）−β−Ｄ−ＭａｎｐＮＡｃ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→４）−α−Ｄ−ＧｌｃｐＮＡｃ−（１→］
９Ｖ型
［→４）−α−Ｄ−ＧｌｃｐＡ（２／３ＯＡｃ）−（１→３）−α−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→３）−β−Ｄ−ＭａｎｐＮＡｃ（４／６ＯＡｃ）−（１→４）−β−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→４）−α−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→］
１２Ｆ型
［→４）−［α−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→３）］α−Ｌ−ＦｕｃｐＮＡｃ−（１→３）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→４）−［α−Ｄ−Ｇｌｃ−（１→２）−α−Ｄ−Ｇｌｃ−（１→３）］−β−Ｄ−ＭａｎＮＡｃＡ−（→］
１４型
［→４）−β−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→６）−［β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→４）］−β−Ｄ−ＧｌｃｐＮＡｃ−（１→３）−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→］
１８Ｃ型
［→４）−β−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→４）−［α−Ｄ−Ｇｌｃｐ（６ＯＡｃ）（１→２）］［Ｇｒｏ−（１→Ｐ→３）］−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→４）−α−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→３）−β−Ｌ−Ｒｈａｐ−（１→］
１９Ｆ型
［→４）−β−Ｄ−ＭａｎｐＮＡｃ−（１→４）−α−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→２）−α−Ｌ−Ｒｈａｐ−（１→Ｐ→］
２３Ｆ型
［→４）−β−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→４）−［α−Ｌ−Ｒｈａｐ−（１→２）］−［Ｇｒｏ−（２→Ｐ→３）］−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→４）−β−Ｌ−Ｒｈａｐ−（１→］
【０１３３】
多糖類のより広範囲の考察は、Ｇｅｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．２８：８７１−９９に見出され、ここで表１は、９７個の既知の血清型についての構造を示す。この表はまた、アセチル化が完全でないときにアセチル化される単糖類の残基の比率を開示する。
【０１３４】
莢膜多糖は、任意選択的に、Ｏ−アセチル化される。いくつかの実施形態では、血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１３、１４、１５Ｂ、１６、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１、および３３Ｆ由来の莢膜多糖は、１０〜１００％、２０〜１００％、３０〜１００％、４０〜１００％、５０〜１００％、６０〜１００％、７０〜１００％、７５〜１００％、８０〜１００％、９０〜１００％、５０〜９０％、６０〜９０％、７０〜９０％、または８０〜９０％のＯ−アセチル化の程度を有する単糖類を含む。他の実施形態では、Ｏ−アセチル化の程度は、１０％超、２０％超、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、または約１００％である。多糖類のＯ−アセチル化の程度は、任意選択的に、例えば、プロトンＮＭＲによって判定される（例えば、Ｌｅｍｅｒｃｉｎｉｅｒ＆Ｊｏｎｅｓ（１９９６）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２９６：８３−９６；Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ３０：１２３３−１２４７を参照されたい）。いくつかの実施形態では、Ｏ−アセチル基の存在は、イオン−ＨＰＬＣ分析によって判定される。通常、接合体中の多糖類は、細菌から精製された開始多糖類中に見られるＯ−アセチル化レベルを保持するだろう。
【０１３５】
実施形態では、血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１３、１４、１５Ｂ、１６、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１、および３３Ｆ由来の莢膜多糖は、１０ｋＤａ〜４，０００ｋＤａの分子量を有する。他のそのような実施形態では、多糖類は、５０ｋＤａ〜４，０００ｋＤａの分子量を有する。他のそのような実施形態では、多糖類は、５０ｋＤａ〜１，４００ｋＤａの分子量を有する。さらなるそのような実施形態では、多糖類は、５０ｋＤａ〜３，５００ｋＤａ、５０ｋＤａ〜３，０００ｋＤａ、５０ｋＤａ〜２，５００ｋＤａ、５０ｋＤａ〜２，０００ｋＤａ、５０ｋＤａ〜１，７５０ｋＤａ、５０ｋＤａ〜１，５００ｋＤａ、５０ｋＤａ〜１，２５０ｋＤａ、５０ｋＤａ〜１，０００ｋＤａ、５０ｋＤａ〜７５０ｋＤａ、５０ｋＤａ〜５００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜４，０００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜３，５００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜３，０００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜２，５００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜２，０００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜２，０００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜１，７５０ｋＤａ、１００ｋＤａ〜１，５００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜１，２５０ｋＤａ、１００ｋＤａ〜１，０００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜７５０ｋＤａ、１００ｋＤａ〜５００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜４，０００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜３，５００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜３，０００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜２，５００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜２，０００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜２，０００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜１，７５０ｋＤａ、２００ｋＤａ〜１，５００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜１，２５０ｋＤａ、２００ｋＤａ〜１，０００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜７５０ｋＤａ、または２００ｋＤａ〜５００ｋＤａの分子量を有する。上記範囲のうちのいずれか内の任意の整数は、本開示の実施形態と考えられる。
【０１３６】
莢膜多糖は、任意選択的に、天然に見られる莢膜多糖に対して化学的に改変される。例えば、多糖類は、任意選択的に、脱Ｏ−アセチル化（部分的にまたは完全に）、脱Ｎ−アセチル化（部分的にまたは完全に）、Ｎ−プロピオン化（部分的にまたは完全に）などされている。脱アセチル化は、任意選択的に、化学ハンドルもしくはポリペプチドへの接合前、中、または後に生じるが、典型的には、接合前に生じる。
【０１３７】
化膿連鎖球菌の多糖類いくつかの実施形態では、多糖類を含む抗原は、化膿連鎖球菌由来の多糖類を含む。化膿連鎖球菌は、咽頭炎、扁桃腺炎、猩紅熱、蜂窩織炎、丹毒、リウマチ熱、連鎖球菌感染後糸球体腎炎、壊疽性筋膜炎、筋壊死、およびリンパ管炎を含む、ヒトにおける多様な感染の原因となるグラム陽性細菌（Ａ群連鎖球菌、すなわち「ＧＡＳ」としても知られる）である。実施形態では、多糖類は、化膿連鎖球菌の莢膜多糖である。化膿連鎖球菌の莢膜多糖は、繰り返し単位が、以下の構造を有する高分子ポリマーである、ヒアルロン酸から構成され：
［→４）−β−Ｄ−ＧｌｃＵＡｐ−（１４３）−β−Ｄ−ＧｌｃｐＮＡｃ−（→］
これは、化膿連鎖球菌の血清型間で不変であるように思われる。
【０１３８】
実施形態では、化膿連鎖球菌由来の莢膜多糖は、１０ｋＤａ〜４，０００ｋＤａの分子量を有する。他のそのような実施形態では、多糖類は、５０ｋＤａ〜４，０００ｋＤａの分子量を有する。さらなるそのような実施形態では、多糖類は、５０ｋＤａ〜３，５００ｋＤａ、５０ｋＤａ〜３，０００ｋＤａ、５０ｋＤａ〜２，５００ｋＤａ、５０ｋＤａ〜２，０００ｋＤａ、５０ｋＤａ〜１，７５０ｋＤａ、５０ｋＤａ〜１，５００ｋＤａ、５０ｋＤａ〜１，２５０ｋＤａ、５０ｋＤａ〜１，０００ｋＤａ、５０ｋＤａ〜７５０ｋＤａ、５０ｋＤａ〜５００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜４，０００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜３，５００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜３，０００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜２，５００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜２，０００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜２，０００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜１，７５０ｋＤａ、１００ｋＤａ〜１，５００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜１，２５０ｋＤａ、１００ｋＤａ〜１，０００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜７５０ｋＤａ、１００ｋＤａ〜５００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜４，０００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜３，５００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜３，０００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜２，５００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜２，０００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜２，０００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜１，７５０ｋＤａ、２００ｋＤａ〜１，５００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜１，２５０ｋＤａ、２００ｋＤａ〜１，０００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜７５０ｋＤａ、または２００ｋＤａ〜５００ｋＤａの分子量を有する。上記範囲のうちのいずれか内の任意の整数は、本開示の実施形態と考えられる。
【０１３９】
別の実施形態では、多糖類は、化膿連鎖球菌由来の非莢膜多糖である。非莢膜多糖は、α−Ｌ−（１→３）およびα−Ｌ−（１→２）連結を交互にすることによって接続されたポリ−Ｌ−ラムノピラノシル単位の骨格を含み、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコースアミン残基が、ラムノース骨格の３位に付着される、Ａ群連鎖球菌の細胞壁多糖類を含む。
【０１４０】
実施形態では、化膿連鎖球菌由来のＡ群連鎖球菌の細胞壁多糖類は、１０ｋＤａ〜４，０００ｋＤａの分子量を有する。他のそのような実施形態では、多糖類は、５０ｋＤａ〜４，０００ｋＤａの分子量を有する。さらなるそのような実施形態では、多糖類は、５０ｋＤａ〜３，５００ｋＤａ、５０ｋＤａ〜３，０００ｋＤａ、５０ｋＤａ〜２，５００ｋＤａ、５０ｋＤａ〜２，０００ｋＤａ、５０ｋＤａ〜１，７５０ｋＤａ、５０ｋＤａ〜１，５００ｋＤａ、５０ｋＤａ〜１，２５０ｋＤａ、５０ｋＤａ〜１，０００ｋＤａ、５０ｋＤａ〜７５０ｋＤａ、５０ｋＤａ〜５００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜４，０００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜３，５００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜３，０００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜２，５００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜２，０００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜２，０００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜１，７５０ｋＤａ、１００ｋＤａ〜１，５００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜１，２５０ｋＤａ、１００ｋＤａ〜１，０００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜７５０ｋＤａ、１００ｋＤａ〜５００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜４，０００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜３，５００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜３，０００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜２，５００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜２，０００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜２，０００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜１，７５０ｋＤａ、２００ｋＤａ〜１，５００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜１，２５０ｋＤａ、２００ｋＤａ〜１，０００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜７５０ｋＤａ、または２００ｋＤａ〜５００ｋＤａの分子量を有する。上記範囲のうちのいずれか内の任意の整数は、本開示の実施形態と考えられる。
【０１４１】
ストレプトコッカス・アガラクチアの莢膜多糖いくつかの実施形態では、多糖類を含む抗原は、ストレプトコッカス・アガラクチア由来の莢膜多糖を含む。ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｂ群連鎖球菌、すなわちＧＢＳとも呼ばれる）は、免疫学的に脆弱なヒトにおける敗血症、肺炎、および髄膜炎、ならびに乳牛におけるウシの乳房炎を引き起こす、哺乳動物と一般的に片利共生的なグラム陽性細菌である。別個の莢膜多糖の繰り返し単位（Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ−ＩＸ）を有する少なくとも１０個のストレプトコッカス・アガラクチアの血清型があるが、血清型のサブセットのみが、一般に、疾患の原因となっている。これらは、血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＶを含み、これらの血清型由来の莢膜多糖の接合体を調製することができる。一般的なストレプトコッカス・アガラクチアの血清型の莢膜多糖の繰り返し単位についての構造は、決定されており、以下のとおりである。
Ｉａ型
【化１８】
2020504760.tif 000021
【０１４２】
Ｉｂ型
【化１９】
2020504760.tif 000022
【０１４３】
ＩＩ型
【化２０】
2020504760.tif 000023
【０１４４】
Ｖ型
【化２１】
2020504760.tif 000024
【０１４５】
ヘモフィルス・インフルエンザ菌の莢膜多糖いくつかの実施形態では、多糖類を含む抗原は、へモフィルス・インフルエンザ菌由来の莢膜多糖を含む。へモフィルス・インフルエンザ菌は、肺炎、細菌感染症、髄膜炎、喉頭蓋炎、蜂窩織炎、および感染性関節炎を含む、広範囲の局所的かつ浸潤性感染の原因となる、グラム陰性の嫌気性病原菌である。別個の莢膜多糖の化学構造（ａ〜ｆ型）を有するヘモフィルス・インフルエンザ菌の少なくとも６つの血清型がある。しかしながら、ａ型およびｂ型のみが、へモフィルス・インフルエンザ菌の「高病原性」株と考えられ、小児期感染症の大部分が、ｂ型によって引き起こされると考えられ（Ｊｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．Ｊｕｎｅ  ２００７  ｖｏｌ．７５  ｎｏ．６  ２６５０−２６５４）、これはしたがって、本発明で使用するためのへモフィルス・インフルエンザ菌の多糖類の好ましい型である。ｂ型の莢膜多糖の繰り返し単位の構造は、決定されており、以下のとおりである。
［→３）−β−Ｄ−Ｒｉｂｆ−（１→１）−Ｄ−Ｒｉｂｉｔｏｌ−（５→ＯＰＯ３−→］
【０１４６】
髄膜炎菌の莢膜多糖いくつかの実施形態では、多糖類を含む抗原は、髄膜球菌由来の莢膜多糖を含む。髄膜球菌は、髄膜炎および髄膜炎菌敗血症性感染の主要な原因病原体であるグラム陰性細菌である。別個の莢膜多糖の化学構造（血清群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅ−２９、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｗ−１３５、Ｘ、Ｙ、Ｚ、およびＺ’（２９Ｅ））を有する髄膜球菌の少なくとも１３個の血清群がある。しかしながら、６つのみの血清群（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｗ−１３５、Ｘ、Ｙ）が、生命を脅かす疾患を引き起こすと考えられる。接合体の調製について対象となる５つの主な生命を脅かす血清群についての莢膜多糖の繰り返し単位の構造は、決定されており、以下のとおりである。
Ａ型
［→６）−α−Ｄ−ＭａｎｐＮＡｃ（３／４ＯＡｃ）−（１→ＯＰＯ３→］
Ｃ型
［→９）−α−Ｄ−Ｎｅｕｐ５Ａｃ（７／８ＯＡｃ）−（２→］
Ｗ−１３５型
［→６）−α−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→４）−α−Ｄ−Ｎｅｕｐ５Ａｃ（９ＯＡｃ）−α−（２→］
Ｘ型
［→４）−α−Ｄ−ＧｌｃｐＮＡｃ−（１→ＯＰＯ３→］
Ｙ型
［→６）−α−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→４）−α−Ｄ−Ｎｅｕｐ５Ａｃ（９ＯＡｃ）−α−（２→］
【０１４７】
ポルフィロモナス・ジンジバリスの莢膜多糖別の実施形態では、抗原は、ポルフィロモナス・ジンジバリスの６つの血清型（例えば、Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３、Ｋ４、Ｋ５および／またはＫ６）のうちの１つに由来する莢膜多糖である。Ｖａｎ  Ｗｉｎｋｅｌｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｏｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：２５９−２６５、およびＬａｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ  Ｒｅｓ．３１：２７８−８４を参照されたい。
【０１４８】
サルモネラ・チフス菌の莢膜多糖別の実施形態では、抗原は、Ｖｉ多糖類である。Ｖｉは、サルモネラ・チフス菌の莢膜多糖（以前は種自体として分類されていたが、現在ではサルモネラ属のチフス血清型とも呼ばれている）である。Ｖｉはまた、サルモネラ菌の他の血清型（サルモネラ属血清型パラチフスＣまたは血清型ダブリンなど）および他の細菌では、シトロバクター属（例えばＣ．ｆｒｅｕｎｄｉｉおよびＣ．ｙｏｕｎｇａｅ）などにも見られ得る。Ｖｉ多糖類は、Ｃ−３位で６０〜９０％アセチル化されたα１，４−Ｎ−アセチルガラクトース−アミノウロン酸である、ヘキソサミンウロン酸の線状ホモポリマーである。Ｖｉに対するＯ−アセチル置換は、防御的免疫反応を誘発するその能力における因子である。Ｖｉの免疫原性は、Ｏ−アセチル化のその程度に密接に関連している。部分的な脱Ｏ−アセチル化は、免疫原性をわずかに増加させ得、完全な脱Ｏ−アセチル化は、Ｖｉの免疫原性を取り除く。本発明で使用されるＶｉ多糖類は、天然に見られるような莢膜多糖に対して化学的に改変され得る。例えば、Ｖｉ多糖類は、部分的に脱Ｏ−アセチル化、脱Ｎ−アセチル化（部分的にまたは完全に）、Ｎ−プロピオン化（部分的にまたは完全に）などされ得る。脱アセチル化は、接合の前、中、または後に生じ得るが、好ましくは、接合の前に生じる。脱アセチル化などの効果は、定常アッセイによって評価され得る。
【０１４９】
黄色ブドウ球菌の糖類別の実施形態では、抗原は、黄色ブドウ球菌由来の多糖類である。多糖類は、ポリ−Ｎ−アセチルグルコースアミン（ＰＮＡＧ）である黄色ブドウ球菌のエキソ多糖類、または例えば、５型、８型、もしくは３３６型である黄色ブドウ球菌の莢膜多糖であり得る。
【０１５０】
クロストリジウム・ディフィシルの表面多糖類別の実施形態では、抗原は、ＰＳ−ＩまたはＰＳ−ＩＩなどのクロストリジウム・ディフィシル由来の表面グリカンである。
【０１５１】
グルカン別の実施形態では、抗原は、β−１，３−連結および／またはβ−１，６−連結を含むグルカンである。これらの接合されたグルカンは、例えばカンジダアルビカンスに対して抗真菌性免疫反応を高めるのに有用であり得る。グルカンは、とりわけ真菌細胞壁に見られるグルコース含有多糖類である。β−グルカンは、グルコースサブユニット間の１つ以上のβ−連結を含む。本発明により使用されるグルカンは、β−連結を含み、かつβ−連結のみを含み得る（すなわち、α連結がない）。グルカンは、１つ以上のβ−１，３−連結および／または１つ以上のβ−１，６−連結を含み得る。それは、１つ以上のβ−１，２−連結および／またはβ−１，４−連結も含み得るが、通常、そのβ連結のみが、β−１，３−連結および／またはβ−１，６−連結であろう。グルカンは、分岐状または直鎖であり得る。グルカンは、真菌性グルカンであり得る。「真菌性グルカン」は、一般的に、真菌から得られるが、特定のグルカン構造は、真菌および非真菌の両方（例えば、細菌中では、下等植物または藻類）に見られ、次に、非真菌性微生物は、代替源として使用され得る。したがって、グルカンは、カンジダアルビカンスなどのカンジダ菌の細胞壁由来のものであり得、またはコクシジオイデス・イミチス、トリコフィトン・ベルコースム、ブラストマイセス・デルマチチジス、クリプトコッカス・ネオフォーマンス、ヒストプラズマ・カプスラーツム、サッカロマイセス・セレビシエ、パラコクシジオイデス・ブラジリエンジス、またはピシウム菌由来のものであり得る。真菌性β−グルカンの様々な供給源がある。例えば、純粋なβ−グルカンは、市販されており、例えば、プスチュラン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）は、Ｕｍｂｉｌｉｃａｒｉａ  ｐａｐｕｌｌｏｓａから精製されたβ−１，６−グルカンである。β−グルカンは、真菌細胞壁から様々な方法で精製され得る。いくつかの実施形態では、グルカンは、例えば、ラミナリン中に見られるような、何らかのβ−１，６分岐を有するβ−１，３グルカンである。ラミナリンは、褐藻類および海藻中に見られる。ラミナリンのβ（１−３）：β（１−６）比率は、異なる供給源間で変化し、例えば、アラメのラミナリン中では３：２ほどの低さであるが、コンブのラミナリン中では７：１の高さである。したがって、本明細書で使用されるグルカンは、１．５：１〜７．５：１、例えば、約２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、または７：１のβ（１−３）：β（１−６）比率を有し得る。他の実施形態では、グルカンは、独占的にまたは主に、カードラン中に見られるような、β−１，３連結を有する。したがって、グルカンは、β−１，３−連結グルコース残基（例えば、独占的に１，３連結を有する線状β−Ｄ−グルコピラノース）のみから作製され得る。しかしながら、任意選択的に、グルカンは、β−１，３−連結グルコース残基ではない単糖類残基を含み得、例えば、β−１，６−連結グルコース残基を含み得る。β−１，３−連結グルコース残基とこれらの他の残基との比率は、少なくとも８：１（例えば、≧９：１、≧１０：１、≧１１：１、≧１２：１、≧１３：１、≧１４：１、≧１５：１、≧１６：１、≧１７：１、≧１８：１、≧１９：１、≧２０：１���≧２５：１、≧３０：１、≧３５：１、≧４０：１、≧４５：１、≧５０：１、≧７５：１、≧１００：１など）であるべきである。
【０１５２】
腫瘍由来のグリカンいくつかの実施形態では、多糖類を含む抗原は、腫瘍細胞の発生的に不適切な細胞表面グリカン特性を含む。他の中でも特に、ダニシェフスキージェン（Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ．２００９（１０）：１３９９−１４１３に概説される）は、特定のオリゴ糖モチーフ（時期特異的胚抗原、ＳＳＥＡ）が、胚形成中の細胞表面に元々発現され、大人の腫瘍中に「再活性化」されることを発見した。これらは短い多糖類であるので、それらは主に、化学合成（上記のＺｈｕに概説される）を介してアクセスされる。これらのオリゴ糖の中で、発癌（例えば、前立腺癌および乳癌）と最も明確に関連するのは、グロボ−Ｈ、Ｌｅｙ、ＳＴｎ、ＴＦ、およびＴｎである。
【０１５３】
ハプテンいくつかの実施形態では、抗原は、ハプテン：１，０００Ｄａ未満の分子量の非ポリマー合成部分を含む。治療的タンパク質接合体でのハプテンの用途は、乱用薬物、例えば、ニコチンまたはコカインを模倣するハプテンである（例えば、Ｂｅｒｋｏｗｉｔｚ＆Ｓｐｅｃｔｏｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９７２（１７８）：１２９０−１２９２  ｆｏｒ  ｍｏｒｐｈｉｎｅ、Ｋｏｓｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ．２００２（２０）：１１９６−１２０４  ｆｏｒ  ｃｏｃａｉｎｅ、およびＨａｔｓｕｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００５（７８）：４５６−４６７を参照されたい）。別様に、免疫原性ポリペプチドに対して十分に免疫原性でない小分子の接合は、薬物特異的抗体を高めることを可能にし、これにより乱用薬物を中枢神経系から隔離する。
【０１５４】
結果として生じる、抗原および組成物についての誘導体化および調製の方法
本明細書の先に記載されるようなポリペプチドの非天然アミノ酸に導入された対応する基と反応することができる化学ハンドルを含有する抗原を本明細書に記載する。いくつかの実施形態では、化学ハンドルは、ポリペプチドへの対応する基との「クリック」化学反応に好適な基を含む。「クリック」化学に好適な化学基は、アジド（−Ｎ３）基、アルキン（Ｃ≡Ｃ）基、ホスフィン（例えば、−Ｐ（Ｐｈ）２）基、アルケン（Ｃ＝Ｃ）基、および１，２，４，５−テトラジン（
【化２２】
2020504760.tif 000025
）基を含むがこれらに限定されない。
【０１５５】
化学ハンドルは、３つの工程：（ａ）抗原の活性化、（ｂ）任意選択的に、通常、抗原中に存在しない反応性を導入するためのリンカーまたは求核性基との抗原の反応、および（ｃ）抗原の化学ハンドルへの接合を含む、一般的なプロセスを介して導入される。いくつかの実施形態では、工程（ａ）〜（ｃ）のうちの２つ以上は、化学ハンドルがＮ−ヒドロキシスクシンイミドなどの反応性部分の追加によって改変された場合などに、同時に起こる。いくつかの実施形態では、工程（ａ）〜（ｃ）のうちの２つ以上は、工程間の抗原の任意選択的な精製により、分離的である。いくつかの実施形態では、工程（ａ）は、追加的に、特定の官能基（例えばヒドロキシル、アミン、チオール）が活性化によりアクセス可能であるように、抗原の保護基を除去するための工程を含む。
【０１５６】
化学ハンドルは、任意選択的に、抗原に対する様々な場所に導入される。いくつかの実施形態では、化学ハンドルは、終端（例えば、多糖類の還元末端および非還元末端、ポリペプチドのＮ末端およびＣ末端、またはグリセリドのアシル鎖の末端）に導入される。いくつかの実施形態では、化学ハンドルは、内部場所（例えば、ポリペプチドの内部アミノ酸、または内部ヒドロキシル、アミン、または多糖類の活性化ヒドロキシル）に導入される。いくつかの実施形態では、化学ハンドルは、内部場所に加えて１つ以上の末端に導入される。抗原のために使用される活性化の特定の方法は、接合のために活性化された場所、したがって抗原の接合された化学ハンドルの最終的な場所に影響を与えるだろう。担体との複数の連結を達成し得るように、抗原に複数の化学ハンドルを導入することが好ましい。
【０１５７】
好ましい実施形態では、化学ハンドルを介してポリペプチドを抗原に接合するための方法は、以下のとおりである。抗原は、少なくとも１つの第１の化学ハンドルを内部に組み込むように活性化され、ここで第１の化学ハンドルは、ポリペプチド中のｎｎＡＡの第２の化学ハンドルに接合することができる。活性化抗原は、第１および第２の化学ハンドルが抗原−ポリペプチド接合体を形成するように反応する条件下で、第２のハンドルを持つ少なくとも１つのｎｎＡＡを含有するポリペプチドと組み合わされる。そのように可能にされる反応は、非触媒共有結合生体接合反応である。「第１の化学ハンドル」として機能する抗原の反応性部位は、好ましくはアルキニル基であり、アルキニル基は、反応性を増加させる分子環境に組み込まれ得る。例えば、アルキニル基は、環、例えば、ジアリール歪みシクロオクタンなどのシクロオクチニル環に組み込まれ得る。ｎｎＡＡ残基によって提供されるポリペプチド中の好ましい反応性部位、すなわち、「第２の化学ハンドル」は、アジド基である。当該技術分野で知られているように、この場合の反応は、以下でさらに詳細に考察される、「歪み促進アジド−アルキン負荷環化」（ＳＰＡＡＣ）として当該技術分野で参照される［３＋２］負荷環化である。
【０１５８】
抗原の活性化
抗原は、任意選択的に、生体接合体の生成について記載される任意の化学方法を使用して活性化される。そのような方法は、過ヨウ素酸塩酸化、固有のアルデヒド（例えば、多糖類の還元末端）の脱マスキング、１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロホウ酸（ＣＤＡＰ）の活性化、または１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）とのヒドロキシルの活性化、その後の求核付加を含むがこれらに限定されない。単糖類誘導体化のさらなる化学方策は、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇｒｅｇ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（２００８））に記載されている。活性化には、シアン化試薬（ｐ−ニトロフェニルシアネート、ＣＤＡＰ、またはＮ−シアノトリエチルアンモニウムテトラフルオロホウ酸など）、活性エステル、カルボジイミド、ヒドラジド、ノルボルネン、ｐ−ニトロ安息香酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｓ−ＮＨＳ、ＥＤＣ、ＴＳＴＵなどを使用することができる。
【０１５９】
本発明は、以下に考察される化学のうちのいずれかにより活性化される抗原（具体的には、肺炎球菌莢膜多糖抗原などの本明細書に開示されるような多糖類抗原）、例えば、抗原と以下に考察される１つ以上のＤＢＣＯ基およびＤＩＦＯ基との反応の生成物を提供する。
【０１６０】
過ヨウ素酸塩の活性化
いくつかの実施形態では、抗原は、過ヨウ素酸塩酸化により活性化される。いくつかの実施形態では、過ヨウ素酸塩酸化は、アルデヒド基を抗原に導入するために使用され、かつ１）多糖類、および２）活性化抗原を生成するためのポリペプチドのＮ末端残基へのアルデヒドの付加に有用である。過ヨウ素酸塩は、第１級もしくは第２級ヒドロキシルまたはアミンをいずれかの末端に保持する炭素−炭素結合を開裂し、そのため、隣接するヒドロキシルを持つ炭水化物糖残基、または２−アミノアルコール部分を含有するアミノ酸（Ｎ−末端トレオニンまたはセリン残基）を活性化する。アルデヒド部分は長半減期を有するため、この方法によって活性化された抗原は、任意選択的に、活性化後にクロマトグラフィーにより精製および／または凍結乾燥される。
【０１６１】
抗原の過ヨウ素酸塩酸化について、（ａ）抗原を溶液中に溶解し、（ｂ）過ヨウ素酸塩の供給源を濃縮された原液から抗原に加えて、酸化混合物を形成し、（ｃ）反応混合物を培養し、かつ（ｄ）（任意選択的な）過度の過ヨウ素酸塩を除去する。
【０１６２】
脱イオン水または好適な緩衝液は、任意選択的に、酸化反応のために使用される。いくつかの実施形態では、工程（ａ）の溶液は脱イオン水である。いくつかの実施形態では、工程（ａ）の溶液は、略生理的ｐＨのｐＫａを有する緩衝液の有効量を含む。いくつかの実施形態では、工程（ａ）の溶液は、略生理的ｐＨのｐＫａを有する緩衝液の有効量を含み、緩衝液は、アミン基を含まない。非アミン系緩衝液の例は、酢酸、ギ酸、およびリン酸を含むがこれらに限定されない。
【０１６３】
工程（ｂ）の過ヨウ素酸塩源は、任意選択的に、水溶液中で適切な安定性を有する任意の過ヨウ素酸塩源から選択される。過ヨウ素酸塩源の例は、過ヨウ素酸ナトリウム、過ヨウ素酸カリウム、テトラブチルアンモニウム（メタ）過ヨウ素酸塩、過ヨウ素酸バリウム、過ヨウ素酸水素ナトリウム、（パラ）過ヨウ素酸ナトリウム、および（メタ）過ヨウ素酸テトラエチルアンモニウムを含むがこれらに限定されない。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、過ヨウ素酸塩の付加および反応条件のレベルは、多糖類のすべての入手可能なジオールをアルデヒドに変換するように調節される。例えば、室温での培養と組み合わせた、過ヨウ素酸ナトリウムの大幅な超過（多糖類のモル濃度に関して、＞１０００ｘの超過、または１０ｍＭ溶液の過ヨウ素酸ナトリウム）は、アルデヒドよりもジオールの総変換が好ましい。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、過ヨウ素酸塩の付加および反応条件のレベルは、低量の酸化／アルデヒド形成を多糖類鎖に導入するように調節される。化学反応における化学量論量未満の過ヨウ素酸ナトリウム（例えば、＜１．０当量）は、低量の多糖類鎖酸化が好ましい。例えば、細菌単糖類は、０．００１〜０．７、０．００５〜０．５、０．０１〜０．５、０．１〜１．２、０．１〜０．５、０．１〜０．２、０．５〜０．８、０．１〜０．８、０．３〜１．０、または０．４〜０．９モル当量の過ヨウ素酸塩によって活性化される（ＷＯ２０１１／１１０５３１を参照されたい）。別の実施形態では、０．４モル当量の過ヨウ素酸塩が、肺炎球菌莢膜多糖を含有するｐＨ６．０溶液に加えられ、かつ２５℃で１７時間の間培養される（ＷＯ２０１１／１１０５３１を参照されたい）。
【０１６６】
一実施形態では、細菌単糖類のビシナルジオールの０．００１％、０．０１％、０．１％、０．５％、１％、２％、５％、１０％、３０％、５０％未満、例えば、５〜１０％が、過ヨウ素酸塩の活性化中に酸化される（ＷＯ２０１１／１１０５３１を参照されたい）。低い反応温度はまた、より低量の多糖類鎖酸化が好ましい。いくつかの実施形態では、肺炎連鎖球菌１９Ｆなどの特定の莢膜多糖の多糖類鎖酸化を最小限に抑えるために、低い過ヨウ素酸塩濃度（＜０．１当量）を、４℃での一晩の反応と組み合わせる。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、過ヨウ素酸塩の付加および反応条件のレベルは、選択的な糖類および多糖類鎖に開裂を方向付けるように調節される。例えば、セ氏４度での１ｍＭのＮａＩＯ４は、文献中、炭素７、８、または９のシアル酸残基を選択的に酸化するために使用され、室温での１０ｍＭのＮａＩＯ４は、シアル酸、ガラクトース、およびマンノース残基を含む、多種多様な糖残基を酸化するために使用されている。
【０１６８】
タンパク質抗原中のＮ−末端セリンまたはメチオニン残基の酸化について、より温和な酸化条件（低い過ヨウ素酸塩濃度および反応時間）が、一般に、抗原の内部側鎖に対する酸化的損傷を回避するために使用される。実施形態では、工程（ｂ）は、２．５ｍＭの最終濃度まで過ヨウ素酸ナトリウムを加えることを含み、工程（ｃ）は、反応混合物をセ氏２５度で３分間培養することを含む。
【０１６９】
過度の未反応過ヨウ素酸塩は、抗原中に免疫原性部分に対する望ましいものよりも高い酸化レベルまたは損傷を引き起こし得るため、過度の過ヨウ素酸塩は、任意選択的に、工程（ｄ）で除去される。大きい抗原（＞１０ｋＤａ）について、過度の過ヨウ素酸塩は、いくつかの実施形態では、好適な分子量の分画もしくは排除限界を有する培地を使用する水もしくは緩衝溶液に対してサイズ排除、透析、または透析濾過によって除去される。小さい抗原については、サイズベースの精製は、不都合であり（短鎖ペプチドまたはオリゴ糖）、工程（ｄ）の過ヨウ素酸塩の除去は、焼入冷却剤を加えることを含む。過度の過ヨウ素酸塩は、任意選択的に、グリセロールの付加（１０％（ｖ／ｖ））、モル過剰の亜硫酸ナトリウムの付加、またはモル過剰のＮ−アセチルメチオニンの付加によってクエンチされる。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、多糖類もしくはタンパク質抗原は、過ヨウ素酸塩の活性化のためのヒドロキシルもしくはアミン基の近接性を増すように脱保護される。一実施形態では、多糖類のＯ−アセチルまたはＮ−アセチル基は、隣接するヒドロキシルの過ヨウ素酸塩に対する反応性を増すために除去される。多糖類の抗原について、脱Ｏ−アセチル化もしくは脱Ｎ−アセチル化は、任意選択的に、弱酸性（例えば、低濃度のＨＣｌ）もしくはアルカリ性（例えば、重炭酸ナトリウム）溶液中での培養、続いて任意選択的な加熱、および生理的ｐＨに戻す調節によって達成される。いくつかの実施形態では、弱酸性処理（＜０．１ＭのＨＣｌまたは＜０．２ＭのＡｃＯＨ）、続いて加熱および中和を使用して、高分子量の多糖類を部分的に加水分解（「サイズ決め」）する。いくつかの実施形態では、弱酸性処理（例えば＜０．１ＭのＨＣｌまたは＜０．２ＭのＡｃＯＨ）、続いて加熱（４５〜９５℃）および中和（ｐＨ５．５〜６．０まで）を使用して、同時に、高分子量の多糖類を部分的に加水分解（「サイズ決め」）し、かつ多糖類を脱保護する。いくつかの実施形態では、血清型３、４、１８Ｃ、および１１Ａは、多糖類を脱保護し、多糖類をサイズ決めし、またはそれらの両方を行うために、そのような酸／加熱／中和プロセスによって処理される。一実施形態では、肺炎連鎖球菌の血清型３多糖類は、０．１８Ｍの酢酸、続いて８５℃で１時間の加熱により処理される。一実施形態では、肺炎連鎖球菌の血清型４多糖類は、０．０１ＭのＨＣｌ、続いて４５℃で１時間の加熱により処理される。一実施形態では、肺炎連鎖球菌の１８Ｃ多糖類は、０．１８Ｍの酢酸、続いて９５℃で４０分間の加熱により処理される。一実施形態では、肺炎連鎖球菌血清型１１Ａ多糖類は、０．１８Ｍの酢酸、続いて８０℃で１時間の加熱によって処理される。
【０１７１】
別の実施形態では、脱イオン水または生理的ｐＨ緩衝液中のホルミル−Ｌ−メチオニルペプチドアミドヒドロラーゼによる処理によって、精製されたタンパク質のＮ−ホルミル基は除去され／アミン基は脱ホルミル化される。また別の実施形態では、精製されたタンパク質のＮ−ホルミル基は、−５℃での無水ヒドラジン蒸気による凍結乾燥タンパク質の処理によって除去される（Ｍｉｙａｔａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１２，７８５−７８９（１９９３））。
【０１７２】
ＣＤＡＰの活性化
いくつかの実施形態では、抗原は、シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロホウ酸（ＣＤＡＰ）による一時的な付加物を形成することによって活性化される（例えば、ＷＯ２０１１／１１０５３１およびＵＳ２０１２／０３２１６５８を参照されたい）。いくつかの実施形態では、タンパク質もしくは多糖類抗原の水酸基が、ＣＤＡＰとの反応によって活性化され、一時的なシアナト（−ＯＣＮ）付加物を形成し、次に、化学ハンドルもしくはリンカーの好適な求核試薬と反応されて、カルバミミデート連結を形成する。この実施形態では、抗原のＣ−Ｃ結合は、開裂されない（過ヨウ素酸塩の活性化とは対照的に）。いくつかの実施形態では、特定の莢膜多糖が、ＣＤＡＰを使用して優先的に活性化される。特定の実施形態では、肺炎連鎖球菌血清型３、７Ｆ、または１０Ａの莢膜多糖が、ＣＤＡＰを使用して活性化される。
【０１７３】
抗原のＣＤＡＰ活性化について、（ａ）抗原が好適な溶媒中に溶解され、（ｂ）ＣＤＡＰが原液から抗原に加えられ、（ｃ）緩衝剤が加えられる。
【０１７４】
ＣＤＡＰ活性化は、任意選択的に、任意の好適な溶媒中で行われる。いくつかの実施形態では、（ａ）の溶媒は、蒸留水を含む。さらなる実施形態では、（ａ）の溶媒は、追加的に、ＤＭＳＯまたはアセトニトリルなどの有機溶媒を含む。特定の実施形態では、肺炎連鎖球菌血清型３、７Ｆ、または１０Ａの莢膜多糖が、水中で活性化される。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、超または亜化学量論的（多糖類に関して）量のＣＤＡＰが、活性化のために使用される。いくつかの実施形態では、約０．１〜約３当量のＣＤＡＰが、多糖類の活性化のために使用される。いくつかの実施形態では、約０．２〜０．８当量のＣＤＡＰが、多糖類の活性化のために使用される。一実施形態では、肺炎連鎖球菌血清型３の莢膜多糖が、２．０当量のＣＤＡＰを使用して活性化される。一実施形態では、肺炎連鎖球菌血清型１０Ａの莢膜多糖が、０．８当量のＣＤＡＰを使用して活性化される。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、（ｃ）の緩衝剤の付加を使用して、ＣＤＡＰ活性化の効率が劇的に増加される（Ｌｅｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ．１９９６（１４）：１９０−１９８）。いくつかの実施形態では、（ｃ）の緩衝剤は、トリエタノールアミン（ＴＥＡ）である。いくつかの実施形態では、約１〜約４当量のＴＥＡ（多糖類に関して）が、緩衝剤として使用される。一実施形態では、約１〜約４当量のＴＥＡが、肺炎連鎖球菌血清型７Ｆの多糖類を伴う、ＣＤＡＰ活性化反応に対する緩衝剤として使用される。いくつかの実施形態では、２．５当量のＴＥＡが、緩衝剤として使用される。一実施形態では、２．５当量のＴＥＡが、肺炎連鎖球菌血清型７Ｆの多糖類を伴う、ＣＤＡＰ活性化反応に対する緩衝剤として使用される。いくつかの実施形態では、緩衝剤は、ホウ酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、または水酸化ナトリウム、およびそれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、緩衝剤は、約８．０〜約１１．０のｐＫａを有するか、または緩衝剤を使用して、約８．０〜約１１．０に対する反応溶液のｐＨを調節する。いくつかの実施形態では、緩衝剤は、約９．０〜約９．５のｐＫａを有するか、または緩衝剤を使用して、約９．０〜約９．５の反応溶液のｐＨを調節する。一実施形態では、ｐＨの９．５への水酸化ナトリウムの調節が、肺炎連鎖球菌血清型３の多糖類を伴うＣＤＡＰ活性化反応のために使用される。一実施形態では、ｐＨの９．５への水酸化ナトリウムの調節が、肺炎連鎖球菌血清型１０Ａの多糖類を伴うＣＤＡＰ活性化反応のために使用される。
【０１７７】
カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）／カルボニルジトリアゾール（ＣＤＴ）の活性化
いくつかの実施形態では、抗原は、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）またはカルボニルジトリアゾール（ＣＤＴ）により活性化される。ＣＤＡＰのようなＣＤＩおよびＣＤＴは、抗原の水酸基を活性化して、一時的な反応性部分を形成することができ、この場合、それは、不安定なカルバメート（ＣＤＩについて
【化２３】
2020504760.tif 000026
およびＣＤＴについて
【化２４】
2020504760.tif 000027
）であり、これが次に、任意選択的に、化学ハンドルもしくはリンカーのアミンもしくはチオールと反応されて、カルバメートもしくはカルボノチオエート連結を形成する。活性化は、乾燥有機溶媒中で行われるべきである。いくつかの実施形態では、ＣＤＩ／ＣＤＴ活性化は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で行われる。いくつかの実施形態では、ＣＤＩ／ＣＤＴ活性化は、抗原に関してＣＤＩ／ＣＤＴのモル過剰を加えることによって行われる。他の実施形態では、ＣＤＩ／ＣＤＴ活性化は、抗原のモル量に略等しいＣＤＩ／ＣＤＴのモル量を加えることによって行われる。
【０１７８】
化学活性化なし
いくつかの実施形態では、天然に存在するか、もしくは脱保護工程の結果であるかのいずれかの（例えば上記に考察されるように）内在性アミンもしくは他の求核性部分（例えば、第１級アミン）を使用して、化学ハンドルもしくは担体タンパク質に所与の多糖類を接合させる。そのような求核性部分は、好都合なことに、コハク酸誘導体のような様々な一般的な求電子接合試薬（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）またはスルホ−ＮＨＳエステル）と反応され得る。そのような実施形態では、肺炎連鎖球菌のＣ−多糖類のような抗原汚染部室の分解を促進するための（ｉ）におけるような過ヨウ素酸塩プロトコルにより処理することが有益な場合がある。この実施形態では、過ヨウ素酸塩の処理に続いて、任意の化学的に導入されたアルデヒド基をクエンチするために、膨大に過剰な水素化ホウ素ナトリウムにより処理される。一実施形態では、肺炎連鎖球菌血清型１の多糖類は、室温で約１２〜約１４時間、約０．０５〜約０．２５当量の過ヨウ素酸ナトリウムで処理され、続いて約５当量〜約１５当量の水素化ホウ素ナトリウムで処理される。一実施形態では、肺炎連鎖球菌血清型１の多糖類は、室温で１８時間、０．１５当量の過ヨウ素酸ナトリウムで処理され、続いて１０当量の水素化ホウ素ナトリウムで処理される。
【０１７９】
化学ハンドルに対する接合
いくつかの実施形態では、抗原は、上記に記載される活性化方法（「抗原の活性化」）と互換性がある任意の化学方法を使用して化学ハンドルに接合される。そのような方法は、合成抗原アルデヒドによるシッフ塩基形成、続いて還元的アミノ化、ヒドラゾン形成、オキシム形成、直接求核付加、および天然抗原アルデヒドによるシッフ塩基形成、続いて還元的アミノ化を含むがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、化学ハンドルとの接合反応における絶対多糖類濃度は、多糖類の凝集または交差反応性を最小限に抑えるために重要である。いくつかの実施形態では、ＤＢＣＯ（ジベンゾシクロ−オクチン）もしくはＤＢＣＯ誘導体との接合反応における絶対多糖類／抗原濃度は、過ヨウ素酸塩もしくはＣＤＡＰによる多糖類の活性化にとって重要である。いくつかの実施形態では、ＤＢＣＯ／ＤＢＣＯ−誘導体の接合反応における多糖類濃度は、２未満、５未満、７未満、１０未満、１５未満、１７．５未満、または２０μモル／ｍＬ未満である。いくつかの実施形態では、ＤＢＣＯ／ＤＢＣＯ−誘導体の接合反応における多糖類濃度は、約１．５〜約１７．５μモル／ｍＬである。
【０１８０】
過ヨウ素酸塩活性化抗原との反応
いくつかの実施形態では、化学ハンドルは、上記のように過ヨウ素酸塩により活性化された（「抗原の活性化」）ポリペプチドまたは多糖類の抗原に接合される。これらの実施形態では、アルデヒドとの安定的または準安定的付加物を形成する官能基を含む化学ハンドルが、過ヨウ素酸塩活性化抗原と組み合わされ、続いて任意選択的な還元と組み合わされて、準安定的付加物を安定的付加物に変換する（例えば、ＷＯ２０１４／１１１３４４；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ３１（２０１３）：５６２３−２６２６；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００８を参照されたい）。これらの実施形態のいくつかの変形例では、化学ハンドルは、活性化抗原のアルデヒド基に関する大きいモル過剰で加えられ、その結果、すべてのアルデヒドが、化学ハンドル／抗原接合反応において消費される。これらの実施形態の他の変形例では、化学ハンドルは、活性化抗原のアルデヒド基に関してより低いモル比率で加えられ、活性化抗原の過度の未反応アルデヒドは、過度の安価なアルデヒド−反応性求核試薬（例えば、エタノールアミン）によるさらなる反応によって、またはアルデヒドを水酸基に還元するのに十分強い還元剤（例えば、ＮａＢＨ４）による処理によって消費される。
【０１８１】
一実施形態では、化学ハンドルは、合成抗原アルデヒドによるシッフ塩基形成、続いて還元的アミノ化によって抗原に接合される。この実施形態は、化学ハンドルと抗原との間の第２級アミン連結：化学ハンドルのアミンと抗原の炭素原子との間の直接のＮ−Ｃ結合を有する最終生成物をもたらす。この実施形態では、化学ハンドルはアミンを含む。この実施形態では、接合方法は、ＤＭＳＯを含有するＤＩ水または緩衝液中の過ヨウ素酸塩活性化抗原とアミン含有ハンドルを組み合わせることと、培養してシッフ塩基を形成することと、シアノ水酸化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ３ＣＮ）を使用して、シッフ塩基を第２級アミンに還元することと、任意選択的に、未反応アルデヒドをＮａＢＨ４によりクエンチすることと、を含む。この方法のいくつかの実施形態では、化学ハンドルおよび抗原は、１：１のまたはその近くの化学量論で組み合わされる。この方法のいくつかの実施形態では、化学ハンドルおよび抗原は、モル過剰の化学ハンドルと組み合わされる。この方法のいくつかの実施形態では、化学ハンドルおよび抗原は、モル過剰の抗原と組み合わされる。いくつかの実施形態では、シアノ水酸化ホウ素ナトリウムは、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウムなどのＣ＝Ｎ結合を還元するための同様の選択により別の還元剤と置換される。
【０１８２】
一実施形態では、化学ハンドルは、ヒドラゾン形成を介して抗原に接合される。この実施形態では、化学ハンドルは、ヒドラジド（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＮＨ２）基を含む。この実施形態は、化学ハンドルと抗原炭素との間にヒドラゾン（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｎ＝Ｃ−）またはＮ’−アルキルヒドラジド（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＮＨ−Ｃ−）連結を有する最終生成物をもたらす。この実施形態では、接合方法は、ｐＨ６．０〜８．５の溶液中でモル過剰のヒドラジド含有化学ハンドルを抗原と組み合わせることと、培養してヒドラゾン（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｎ＝Ｃ−）を形成することと、を含む。この方法のいくつかのさらなる実施形態では、シアノ水酸化ホウ素ナトリウムまたはトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウムを反応混合物中に含めてＮ＝Ｃ結合を還元し、これにより、Ｎ’−アルキルヒドラジド（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＮＨ−Ｃ−）が生成される。
【０１８３】
一実施形態では、化学ハンドルは、オキシム形成によって抗原に接合される。この実施形態では、化学ハンドルは、アミノオキシ（−Ｏ−ＮＨ２）基を含む。この実施形態は、化学ハンドルと抗原炭素との間にオキシム（−Ｏ−Ｎ＝Ｃ−）連結を有する最終生成物をもたらす。この実施形態では、接合方法は、ｐＨ６．０〜８．５の溶液中でモル過剰のアミノオキシ含有化学ハンドルを抗原と組み合わせることと、オキシム連結（−Ｏ−Ｎ＝Ｃ−）を形成することと、を含む。この方法のいくつかのさらなる実施形態では、シアノ水酸化ホウ素ナトリウムまたはトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウムを反応混合物中に含めて、Ｎ＝Ｃ結合を還元し、安定性を改善し、これにより、Ｎ’−アルキルヒドロキシルアミン連結（−Ｏ−Ｎ−Ｃ−）が生成される。
【０１８４】
ＣＤＡＰ活性化抗原との反応
いくつかの実施形態では、化学ハンドルは、上記に記載されるようにＣＤＡＰにより活性化された（「ＣＤＡＰ活性化」）ポリペプチドまたは多糖類の抗原に接合される。これらの実施形態では、ＣＤＡＰ活性化を介して生成された一時的なシアナト（−ＯＣＮ）基が、アミン含有化学ハンドルとさらに反応されて、化学ハンドルと抗原炭素との間にカルバミミデート連結（−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ）−Ｏ−）を生成する。
【０１８５】
化学ハンドルのＣＤＡＰ接合について、抗原の水酸基は、上記に記載されるように活性化され（「ＣＤＡＰ活性化」）、アミンを含む化学ハンドルは、追加的に、活性化混合物に加えられる。シアナト基が不安定であるため、化学ハンドルは、一般的に、抗原の活性化のすぐ後（数分以内）に加えられる。いくつかの実施形態では、抗原は、ＣＤＡＰが導入された２．５分後に加えられる。いくつかの実施形態では、抗原の活性化水産基に関して大きくモル過剰のアミン含有化学ハンドルが加えられる。他の実施形態では、化学ハンドルは、抗原の活性化水酸基に関して１：１のモル比率により近い濃度で加えられ、過度の未反応シアナト基は、過度の安価なアミン（例えば、エタノールアミンまたはヘキサンジアミン）の付加によって低減される。
【０１８６】
ＣＤＩ／ＣＤＴ活性化抗原との反応
いくつかの実施形態では、化学ハンドルは、上記に記載されるようにＣＤＩ／ＣＤＴにより活性化された（「カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）／カルボニルジトリアゾール（ＣＤＴ）活性化」）ポリペプチドまたは多糖類の抗原に接合される。これらの実施形態では、抗原水酸基のＣＤＩ／ＣＤＴ活性化（ＣＤＩについて
【化２５】
2020504760.tif 000028
およびＣＤＴについて
【化２６】
2020504760.tif 000029
）によって生成された不安定なカルバメートは、第１級アミンとさらに反応して、安定的カルバメート（−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−）連結を生成するか、または第１級チオールとさらに反応して、化学ハンドルと抗原炭素との間に安定的カルボノチオエート（−Ｓ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−）連結を生成する。いくつかの実施形態では、抗原の活性化水酸基に関して大きくモル過剰のアミン／チオール含有化学ハンドルが加えられる。他の実施形態では、化学ハンドルは、抗原の活性化水酸基に関して１：１のモル比率に近い濃度で加えられる。またさらなる実施形態では、反応における残留ＣＤＩ／ＣＤＴは、四ホウ酸ナトリウムによる処理によってさらに不活性化される。
【０１８７】
非活性化抗原との反応
いくつかの実施形態では、化学ハンドルは、上記に記載されるようなポリペプチドもしくは多糖類の抗原由来の、天然に存在するか、もしくは脱保護工程の結果であるかのいずれかの、内在性アミンもしくは他の求核性部分（例えば、第１級アミン）に接合される。この一実施形態では、化学ハンドルの求電子基（例えば、ＮＨＳまたはスルホ−ＮＨＳエステル）は、抗原の第１級アミン基と反応されて、化学ハンドルと抗原アミンとの間にアミド連結（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）を生成する。別の実施形態では、化学ハンドルのカルボン酸基は、標準的なペプチドカップリング試薬および条件の存在下で、第１級アミン基と反応されて、化学ハンドルと抗原アミンとの間にアミドを生成する。
【０１８８】
アルキン含有ハンドル
いくつかの実施形態では、化学ハンドルは、ポリペプチドのｎｎＡＡ残基の対応する基との「クリック」化学反応を可能にする部分を含む。１つのそのような部分は、アジド基を含むｎｎＡＡ基と反応することができるアルキン基である。最も単純な実施形態では、これはプロパルギル基であり、そのため、抗原のアルキン基は、式ＩＶの構造を含み、
【化２７】
2020504760.tif 000030
式中、
Ｌ２２は、Ｃ１〜Ｃ１０アルキルであり、
Ｕ１は、抗原の少なくとも１つの部分である。
【０１８９】
他の実施形態では、抗原のアルキン基は、式ＩＶａの構造を含み、
【化２８】
2020504760.tif 000031
式中、
Ｌ２２は、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）１−１０−であり、
Ｕ１は、抗原の少なくとも１つの部分である。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、アルキン基は、アルキンのアジド基との反応を促進または容易にする追加の特徴をさらに含む。１つのそのような特徴の例は、８員環構造（例えば、シクロ−オクチン）であり、そのため、抗原のアルキン基は、ＤＩＦＯ基またはＤＢＣＯ基をさらに含む。いくつかの実施形態では、抗原のアルキン基は、式Ｖ、式ＶＩ、またはＶＩａの構造を含み、
【化２９】
2020504760.tif 000032
式中、
Ｌ１は、独立して、結合、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ（Ｌ１２）−、−Ｏ（Ｌ１２）−、または−Ｓ（Ｌ１２）−であり、
Ｌ２は、独立して、結合、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｓ（＝Ｏ）２−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｌ１２−、−Ｓ（＝Ｏ）２Ｌ１２であり、
Ｌ１２は、独立して、Ｌ２２またはＬ２２ＮＨ−であり、
Ｌ２２は、独立して、Ｃ１−１０アルキルまたは−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）１−１０−であり、
Ｕ１は、独立して、抗原の少なくとも１つの部分である。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、式ＶおよびＶＩａの構造は、好都合なことに、求核性基（例えば、第１級アミン）ならびに構造ＶおよびＶＩａの対応するＤＩＦＯもしくはＤＢＣＯカルボン酸のＮＨＳもしくはスルホ−ＮＨＳエステルを含む抗原から形成される。いくつかの実施形態では、式ＶＩの構造は、好都合なことに、活性化抗原、およびＤＢＣＯ−ＮＨ２またはＤＢＣＯ−ＰＥＧｎ−ＮＨ２などのＤＢＣＯ誘導体から形成される。いくつかの実施形態では、ＤＢＣＯ−ＰＥＧｎ−ＮＨ２は、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ＮＨ２である。
【化３０】
2020504760.tif 000033
【０１９２】
「ＰＥＧｎ」における「ｎ」の値は、例えば、上記に示される構造中の、または式ＶＩＩ、式ＶＩＩｂ、式ＸＩ、もしくは部分「Ａ」内の、またはＬ２２のポリ（アルキルオキシ）内のオキシエチレンの繰り返し単位の数を表す。ｎの値は、１〜２０の範囲内、例えば、２〜１８、３〜１６、または４〜１４内である。したがって、ｎは、例えば、４、５、１１、１２、または１３のうちのいずれかであり得る。
【０１９３】
式ＩＶ、Ｖ、またはＶＩのいくつかの実施形態では、Ｕ１の部分は、多糖類の少なくとも１つのポリオールである。いくつかの実施形態では、Ｕ１の部分は、リポ多糖類の少なくとも１つのポリオールである。いくつかの実施形態では、Ｕ１の部分は、抗原ポリペプチドの少なくとも１つのアミノ酸である。
【０１９４】
さらなる実施形態では、アルキンを含む抗原は、式ＶＩＩまたはＶＩＩａの構造を含み、
【化３１】
2020504760.tif 000034
式中、
Ｘは、独立して、多糖類の少なくとも１つのポリオールであり、
ｎは、少なくとも１である。
【０１９５】
基（例えば、Ｘ、Ｙ、またはＵ１）がポリオールであるものと記載されている場合、これは、多糖類内のポリオールへの（例えば、単糖類がポリオールである多糖類内の単糖類への）化学付着を指し得る。付着自体は、任意の好適な官能基への（例えば、ビシナルジオールの酸化から生じ得るアルデヒドへの）付着であり得る。
【０１９６】
さらなる実施形態では、アルキンを含む抗原は、式ＶＩＩｂまたはＶＩＩｃの構造を含み、
【化３２】
2020504760.tif 000035
式中、
Ｘは、独立して、多糖類の少なくとも１つのアミノ糖のアミンであり、
ｎは、少なくとも１である。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、アルキンを含む抗原は、（Ａ−Ｘ）ｚ−Ｙによる多糖類を含み、式中、
Ａは、
【化３３】
2020504760.tif 000036
であり、
Ｘは、独立して、少なくとも１つのポリオールであり、
Ｙは、独立して、多糖類の少なくとも１つのポリオールであり、
ｎは、少なくとも１であり、
ｚは、１を上回る。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、抗原は、少なくとも１．５％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％、少なくとも１９％、または少なくとも２０％（ｗ／ｗ）の共有結合的に付着されたＤＢＣＯを含む多糖類を含む、ＤＢＣＯ基をさらに含む多糖類を含む。いくつかの実施形態では、抗原は、約１．５％（ｗ／ｗ）を上回るＤＢＣＯを含む。いくつかの実施形態では、抗原は、３％（ｗ／ｗ）を上回るＤＢＣＯを含む。いくつかの実施形態では、抗原は、最大でも２０％最大でも１９％、最大でも１８％、最大でも１７％、最大でも１６％、最大でも１５％、最大でも１４％、最大でも１３％、最大でも１２％、最大でも１１％、最大でも１０％、最大でも９％、最大でも８％、最大でも７％、最大でも６％、最大でも５％、最大でも４％、最大でも３．５％、最大でも３．０％、最大でも２．５％、最大でも２．０％、または最大でも約１．７％（ｗ／ｗ）の共有結合的に付着されたＤＢＣＯを含む。いくつかの実施形態では、抗原は、２０％（ｗ／ｗ）未満の共有結合的に付着されたＤＢＣＯを含む。他の実施形態では、抗原は、１０％（ｗ／ｗ）未満の共有結合的に付着されたＤＢＣＯを含む。いくつかの実施形態では、抗原は、約１．５〜２０％、３％〜２０％、３％〜１８％、３％〜１６％、３％〜１４％、３％〜１２％、３％〜１０％、３％〜８％、３％〜６％、または３％〜４％、または１．５〜９％（ｗ／ｗ）の共有結合的に付着されたＤＢＣＯを含む。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、抗原は、１００個の多糖類の繰り返し単位当たり、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％、少なくとも１９％、または少なくとも２０％のＤＢＣＯ分子を含む、ＤＢＣＯ基をさらに含む多糖類を含む。いくつかの実施形態では、抗原は、１００個の多糖類の繰り返し単位当たり、３％を上回るＤＢＣＯ分子を含む。いくつかの実施形態では、抗原は、１００個の多糖類の繰り返し単位当たり、最大でも２０％最大でも１９％、最大でも１８％、最大でも１７％、最大でも１６％、最大でも１５％、最大でも１４％、最大でも１３％、最大でも１２％、最大でも１１％、最大でも１０％、最大でも９％、最大でも８％、最大でも７％、最大でも６％、最大でも５％、最大でも４％、または最大でも３．５％の共有結合的に付着されたＤＢＣＯ分子を含む。いくつかの実施形態では、抗原は、多糖類の繰り返し単位当たり、２０％未満の共有結合的に付着されたＤＢＣＯを含む。他の実施形態では、抗原は、１００個の多糖類の繰り返し単位当たり、１０％未満の共有結合的に付着されたＤＢＣＯ分子を含む。いくつかの実施形態では、抗原は、１００個の多糖類の繰り返し単位当たり、約３％〜２０％、３％〜１８％、３％〜１６％、３％〜１４％、３％〜１２％、３％〜１０％、３％〜８％、３％〜６％、または３％〜４％の共有結合的に付着されたＤＢＣＯ分子を含む。
【０２００】
実施形態では、多糖類を含む抗原は、任意選択的に、オリゴ糖である。オリゴ糖は、少数の繰り返し単位（典型的には、５〜１５個の繰り返し単位）を有し、典型的には、合成的に、またはより高い分子量の多糖類の加水分解によって得られる。
【０２０１】
実施形態では、多糖類を含む抗原は、約１０ｋＤａ〜約１０，０００ｋＤａの分子量を有する。他のそのような実施形態では、多糖類は、５０ｋＤａ〜１０，０００ｋＤａの分子量を有する。さらなるそのような実施形態では、多糖類は、５０ｋＤａ〜１０，０００ｋＤａ、５０ｋＤａ〜９，５００ｋＤａ、５０ｋＤａ〜９，０００ｋＤａ、５０ｋＤａ〜８，５００ｋＤａ、５０ｋＤａ〜８，０００ｋＤａ、５０ｋＤａ〜７，５００ｋＤａ、５０ｋＤａ〜７，０００ｋＤａ、５０ｋＤａ〜６，５００ｋＤａ、５０ｋＤａ〜６，０００ｋＤａ、５０ｋＤａ〜５，５００ｋＤａ、５０ｋＤａ〜５，０００ｋＤａ、５０ｋＤａ〜４，５００ｋＤａ、５０ｋＤａ〜４，０００ｋＤａ、５０ｋＤａ〜３，５００ｋＤａ、５０ｋＤａ〜３，０００ｋＤａ、５０ｋＤａ〜２，５００ｋＤａ、５０ｋＤａ〜２，０００ｋＤａ、５０ｋＤａ〜１，７５０ｋＤａ、５０ｋＤａ〜１，５００ｋＤａ、５０ｋＤａ〜１，２５０ｋＤａ、５０ｋＤａ〜１，０００ｋＤａ、５０ｋＤａ〜７５０ｋＤａ、５０ｋＤａ〜５００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜１０，０００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜９，５００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜９，０００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜８，５００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜８，０００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜７，５００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜７，０００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜６，５００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜６，０００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜５，５００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜５，０００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜４，５００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜４，０００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜３，５００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜３，０００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜２，５００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜２，０００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜２，０００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜１，７５０ｋＤａ、１００ｋＤａ〜１，５００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜１，２５０ｋＤａ、１００ｋＤａ〜１，０００ｋＤａ、１００ｋＤａ〜７５０ｋＤａ、１００ｋＤａ〜５００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜１０，０００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜９，５００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜９，０００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜８，５００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜８，０００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜７，５００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜７，０００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜６，５００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜６，０００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜５，５００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜５，０００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜４，５００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜４，０００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜３，５００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜３，０００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜２，５００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜２，０００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜２，０００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜１，７５０ｋＤａ、２００ｋＤａ〜１，５００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜１，２５０ｋＤａ、２００ｋＤａ〜１，０００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜７５０ｋＤａ、または２００ｋＤａ〜５００ｋＤａの分子量を有する。上記範囲のうちのいずれか内の任意の整数は、本開示の実施形態と考えられる。
【０２０２】
実施形態では、多糖類を含む抗原は、約５０ｋＤａ〜約１，４００ｋＤａの分子量を有する。実施形態では、多糖類を含む抗原は、約５００ｋＤａ〜約３，０００ｋＤａの分子量を有する。
【０２０３】
アジド含有ハンドル
いくつかの実施形態では、化学ハンドルは、ポリペプチドのｎｎＡＡ残基の対応する基との「クリック」化学反応を可能にする部分を含む。１つのそのような部分は、ポリペプチドのアルキン基またはホスフィンを含むｎｎＡＡ残基と反応することができるアジド基である。いくつかの実施形態では、抗原のアジド基は、式ＶＩＩＩの構造を含み、
【化３４】
2020504760.tif 000037
Ｌ２２は、結合、アルキル、またはポリ（アルキルオキシ）であり、
Ｕ１は、独立して、抗原の少なくとも１つの部分である。
【０２０４】
アルケン含有ハンドル
いくつかの実施形態では、化学ハンドルは、ポリペプチドのｎｎＡＡ残基の対応する基との「クリック」化学反応を可能にする部分を含む。１つのそのような部分は、１，２，４，５−テトラジン基を含むｎｎＡＡ残基と反応することができるアルケン基である。最も単純な実施形態では、これはビニル基である。１つのそのような実施形態では、抗原のアルケン基は、式ＩＸの構造を含み、
【化３５】
2020504760.tif 000038
式中、
Ｕ１は、独立して、抗原の少なくとも１つの部分である。
【０２０５】
他の実施形態では、抗原のアルケン基は、式ＩＸａの構造を含み、
【化３６】
2020504760.tif 000039
式中、
Ｌ２２は、Ｃ１−１０アルキルまたは−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）１−１０−であり、
Ｕ１は、独立して、抗原の少なくとも１つの部分である。
【０２０６】
一実施形態では、本開示は、複合糖質を生成するための方法であって、（ａ）担体タンパク質をコードする核酸であって、抑制コドンを含む、核酸を提供することと、（ｂ）４−アジドメチルフェニルアラニン（ｐＡＭＦ）、抑制コドンと相補的であるｔＲＮＡ、およびアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を含む無細胞細菌抽出物と核酸を組み合わせることによって反応混合物を作出することと、（ｃ）担体タンパク質中の抑制コドンに対応する部位にｐＡＭＦを選択的に組み込むのに十分な条件下で（ｂ）の反応混合物を培養することと、（ｄ）［２＋３］負荷環化によってｐＡＭＦを多糖類に接合することと、を含む、方法を提供する。別の実施形態では、［２＋３］負荷環化は、アジドとアルキン基との間の反応を含む。別の実施形態では、工程（ｃ）は、セ氏２０度未満で反応混合物を培養することを含む。別の実施形態では、本方法は、追加的に、（ｃ）の直後に担体タンパク質を精製することを含む。別の実施形態では、抑制コドンは、配列番号２のコドン２５、３４、３８、４０、２１３、２１５、２２８、２４５、２６５、３８６、５２３、または５２７と選択的に置換される。別の実施形態では、（ｂ）の反応混合物は、タンパク質合成に必要な生体成分をさらに含む。別の実施形態では、（ｂ）のｔＲＮＡを、ｐＡＭＦで荷電することができる。別の実施形態では、（ｂ）のアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、２０個の天然アミノ酸と比較して、ｐＡＭＦでｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する。別の実施形態では、アルキン基は、多糖類に接合されたＤＢＣＯ部分を含む。別の実施形態では、多糖類は、肺炎連鎖球菌、髄膜炎菌、ヘモフィルス・インフルエンザ菌、化膿連鎖球菌、またはストレプトコッカス・アガラクチアの莢膜多糖である。別の実施形態では、多糖類は、１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１３、１４、１５Ｂ、１６、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１、および３３Ｆ、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される肺炎連鎖球菌血清型の莢膜多糖である。別の実施形態では、抗原は、ポルフィロモナス・ジンジバリスの６つの血清型（例えば、Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３、Ｋ４、Ｋ５および／またはＫ６）のうちの１つに由来する莢膜多糖である。別の実施形態では、本開示は、工程（ａ）〜（ｄ）を含むプロセスによって調製された複合糖質を提供する。別の実施形態では、ｐＡＭＦは、式Ｘ、Ｘａ、ＸＩ、またはＸＩａの接合体を発生させるために多糖類に接合される。一実施形態では、本開示は、工程（ａ）〜（ｄ）によって調製された複合糖質を含むワクチンを提供する。
【０２０７】
ポリペプチド抗原接合体
上記に記載されるような免疫原性ポリペプチドと上記に記載されるような抗原との間に形成され得るポリペプチド抗原接合体を本明細書に記載する。いくつかの実施形態では、ポリペプチド抗原接合体は、増強された担体タンパク質および抗原を含み、ここで抗原は、増強された担体タンパク質中のｎｎＡＡに連結される。一実施形態では、抗原は、免疫原性ポリペプチドの天然アミノ酸に連結されない。別の実施形態では、抗原は、免疫原性ポリペプチド内のリジンに連結されない。例えば、抗原は、配列番号１のリジンに連結されない。別の実施形態では、抗原は、免疫原性ポリペプチドの１つ以上のｎｎＡＡにのみ連結される。１つ以上のｎｎＡＡは、任意選択的に、Ｎ末端、Ｃ末端、または免疫原性ポリペプチドのＮ末端とＣ末端との間のどこかに位置する。いくつかの場合では、抗原は、免疫原性ポリペプチド中の１つ以上のｐＡＭＦにのみ連結される。例えば、抗原は、配列番号１の１つ以上のｐＡＭＦにのみ連結される。
【０２０８】
別の実施形態では、少なくとも１つの抗原は、免疫原性ポリペプチのＴ細胞エピトープの外側に位置するアミノ酸に連結される。別の実施形態では、抗原は、免疫原性ポリペプチドのＴ細胞エピトープ内に位置するアミノ酸に連結されない。
【０２０９】
免疫原性ポリペプチド内で接合するために選択されるアミノ酸は、任意選択的に、ポリペプチドの結晶構造（またはＮＭＲ構造などの他の３Ｄ構造）に基づく１つ以上の表面アクセス可能な残基を含む。追加的または代替的に、接合についてのポリペプチドの特異的部位の効能を評価するために、ｎｎＡＡとの天然アミノ酸の包括的な交換が、免疫原性ポリペプチドで行われ、続いて接合が行われる。
【０２１０】
一実施形態では、抗原は、（例えば、最初に、増強された担体タンパク質もしくは抗原を反応性リンカーと組み合わせ、次に、増強された担体タンパク質−リンカーもしくは抗原−リンカー付加物を、それぞれ抗原もしくは増強された担体タンパク質と組み合わせることによって）間接的に増強された担体タンパク質に接合される。別の実施形態では、抗原は、（例えば、増強された担体タンパク質および抗原を含む２つの成分を１つの反応で一緒に組み合わせることによって）直接増強された担体タンパク質に接合される。接合体がリンカーを含む場合、任意の好適な基を使用することができる。例えば、接合体は、アジピン酸、アジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）、β−プロピオンアミド、ニトロフェニル−エチルアミン、ハローアシルハロゲン化物、グリコシド連結、６−アミノカプロン酸、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオン酸（ＳＰＤＰ）、Ｃ４〜Ｃ１２部分などから選択されるリンカーを含み得る。例えば、ジアリールシクロオクテンなどのジアリールシクロオクタン部分の残基を含む、上記で考察されるＤＢＣＯ基およびＤＩＦＯ基から生じるリンカーはまた、使用され得る。リンカーは、一般的に、担体に付着されるのではなく、接合のために抗原に付着されるであろう。
【０２１１】
抗原−ポリペプチド接合体は大きい架橋複合体から形成され得るため、いくつかまたはすべての接合の正確な場所および他の物理的特徴を直接測定または判定するための利用可能な分析方法によってはできない場合がある。しかしながら、そのような場所または物理的特徴は、その期待値と一致する合成スキーム、その期待される生成物、および分析結果の設計から信頼可能に推論され得ることが理解される。
【０２１２】
抗原−ポリペプチド接合反応
いくつかの実施形態では、抗原は、本明細書に記載される非天然アミノ酸および化学ハンドルを接合するのに好適な任意の化学方法を使用して増強された担体タンパク質に接合される。そのような方法は、銅（Ｉ）触媒アルキン−アジド負荷環化（ＣｕＡＡＣ）、歪み促進アジド−アルキン負荷環化（ＳＰＡＡＣ）、およびテトラジン−アルケン結紮を含むがこれらに限定されない。「クリック」反応として、これらの反応のうちのすべてを、水溶液中で行うことができる。ホスフィンとアジドとの間のシュタウディンガー結紮も使用することができる。
【０２１３】
ＣｕＡＡＣいくつかの実施形態では、抗原は、銅（Ｉ）触媒アルキン−アジド負荷環化（ＣｕＡＡＣ）によって増強された担体タンパク質に接合される。この実施形態の１つの変形例では、増強された担体タンパク質はプロパルギル含有ｎｎＡＡを含み、抗原はアジド基を含む。この実施形態の別の変形例では、増強された担体タンパク質はアジド含有ｎｎＡＡを含み、抗原はプロパルギル基を含む。生体分子のＣｕＡＡＣ接合に好適な条件は、例えば、Ｐｒｅｓｏｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．２０１１；３（４）：１５３−１６２に見出され、それらのすべてが、Ｃｕ２＋の付加を伴う。いくつかの実施形態では、反応は、ＴＨＰＡなどのＣｕ配位リガンドの付加によって加速される。いくつかの実施形態では、反応は、Ｃｕ２＋の酸化状態を維持するために還元剤の付加によって加速される。好適な還元剤は、アスコルビン酸ナトリウム、ＤＴＴ、またはＴＣＥＰを含む。
【０２１４】
ＳＰＡＡＣいくつかの実施形態では、抗原は、歪み促進アジド−アルキン負荷環化（ＳＰＡＡＣ）によって増強された担体タンパク質に接合される。これらの実施形態の１つの変形例では、増強された担体タンパク質はアジド含有ｎｎＡＡを含み、抗原はシクロオクタン基を含む。これらの実施形態の別の変形例では、増強された担体タンパク質はシクロオクタン含有ｎｎＡＡを含み、抗原はアジド基を含む。ＳＰＡＡＣは追加の触媒または補助因子を必要としないため、この反応は、蒸留水、０．９％生理食塩水、ＰＢＳ、または生理的緩衝液中で行うことができる。一実施形態では、増強された担体タンパク質および抗原は、１．２０：１（ｗ／ｗ）の質量比率で組み合わされる。
【０２１５】
いくつかの実施形態では、抗原は、式ＸまたはＸａの構造を介して増強された担体タンパク質中のアジド含有ｎｎＡＡに連結され、
【化３７】
2020504760.tif 000040
式中、
Ｒ１は、独立して、Ｈ、ホルミル、または増強された担体タンパク質の少なくとも１つのアミノ酸であり、
Ｒ２は、独立して、ＯＨまたは増強された担体タンパク質の少なくとも１つのアミノ酸であり、
Ｄは、−Ａｒ−Ｗ３−または−Ｗ１−Ｙ１−Ｃ（Ｏ）−Ｙ２−Ｗ２−であり、
Ａｒは、
【化３８】
2020504760.tif 000041
であり、
Ｗ１、Ｗ２、およびＷ３の各々は、独立して、単一の結合または低級アルキレンであり、
各Ｘ１は、独立して、−ＮＨ−、−Ｏ−、または−Ｓ−であり、
各Ｙ１は、独立して、単一の結合、−ＮＨ−、または−Ｏ−であり、
各Ｙ２は、独立して、単一の結合、−ＮＨ−、−Ｏ−、またはＮ連結もしくはＣ連結ピロリジンイレンであり、
Ｚ１、Ｚ２、およびＺ３のうちの１つは−Ｎ−であり、Ｚ１、Ｚ２、およびＺ３のうちの他のものは、独立して−ＣＨ−であり、
Ｌ２２は、独立して、結合、アルキル、またはポリ（アルキルオキシ）であり、
Ｘは、多糖類の少なくとも１つのポリオールである。
【０２１６】
いくつかの実施形態では、抗原は、式ＸＩまたはＸＩａの構造を介して増強された担体タンパク質中のアジド含有ｎｎＡＡに連結され、
【化３９】
2020504760.tif 000042
式中、
Ｒ１は、独立して、Ｈ、ホルミル、または増強された担体タンパク質の少なくとも１つのアミノ酸であり、
Ｒ２は、独立して、ＯＨまたは増強された担体タンパク質の少なくとも１つのアミノ酸であり、
Ｗは、ＣまたはＮであり、
ｙは、少なくとも１であり、
ｎは、少なくとも１であり、
Ｘは、独立して、莢膜多糖の少なくとも１つのポリオールである。
【０２１７】
「ｎ」の値は、「ＰＥＧｎ」に関連して上記に考察される。「ｙ」の値は、式ＸＩＩに従って１〜１０の範囲にあり、好ましくは、低級アルキレン、例えば、Ｃ１〜Ｃ４アルキレンである。
【０２１８】
テトラジン−アルキン結紮
いくつかの実施形態では、抗原は、テトラジン−アルキン結紮によって増強された担体タンパク質に接合される。これらの実施形態の１つの変形例では、増強された担体タンパク質は、１，２，４，５−テトラジン含有ｎｎＡＡを含み、抗原はアルケン基を含む。ＳＰＡＡＣ反応と同様に、テトラジン−アルキン結紮は、補助因子の付加なしで進み、これおよびこの反応は、蒸留水、０．９％生理食塩水、ＰＢＳ、または生理的緩衝液中で行うことができる。
【０２１９】
接合体の特性評価
方法（サイズ排除、透析濾過、透析）接合反応に続いて、対象となる抗原が増強された担体タンパク質接合体は、任意選択的に、略純粋な接合体を得るための、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、疎水性相互作用、およびサイズ排除）、分子サイズ排除（透析、透析濾過、接線流濾過、深層濾過）電気泳動手順（例えば、分取等電点電気泳動）、示差的溶解度（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、またはＳＤＳ−ＰＡＧＥ（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｊ．Ｃ．Ｊａｎｓｏｎ＆Ｌａｒｓ  Ｒｙｄｅｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９を参照されたい）を含むがこれらに限定されない方法によって精製される。
【０２２０】
対象となる接合タンパク質は、任意選択的に、マイクロ流体電気泳動、ゲル電気泳動、ウエスタンブロット法、免疫測定法（例えば、ＥＬＩＳＡ）、および接合タンパク質の活性を評価するための他のアッセイを含むがこれらに限定されない方法により定量化される。
【０２２１】
例示的な物理的パラメータ
抗原が増強された担体タンパク質接合体についての１つの重要なパラメータは、接合体の分子量である。接合体は、任意選択的に、各タンパク質分子に接合された可変数の抗原分子、ならびに可変のより高次の架橋（例えば、タンパク質−抗原−タンパク質連結）を含むため、接合体の出力分子量は、増強された担体タンパク質および抗原の投入分子量から必ずしも予測可能ではない膨大な文献（例えば、Ｈｏｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１９７１（２１）：５３５−５４５およびＫａｂａｔ＆Ｂｅｚｅｒ．Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．１９５８（７８）３０６−１８）は、抗原粒子径が免疫原性に対する重要な効果を有することを示唆している。Ｗｅｓｓｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６６：２１８６−９２は、接合体のサイズおよび架橋が、ＧＢＳのＩＩＩ型接合体の免疫原性および防御的有効性に影響を与え得ることを報告している。
【０２２２】
一般的な用語において、接合体は、抗原当たり、１つまたは複数のいずれかのハンドルを有する抗原に担体タンパク質を連結することによって形成され得る。抗原当たり、複数のハンドルを有する、タンパク質−抗原−タンパク質連結を伴う、架橋接合体が形成され得る。抗原当たり、単一のハンドルを有する（例えば、多糖類中の末端基）、この種の接合体格子は、単一の抗原が複数の担体タンパク質分子に結合することができないため、形成されない。より高い分子量が所望され、したがって複数のハンドルを有する抗原が好ましい、架橋接合体が本明細書では好ましい（特に肺炎球菌について）
【０２２３】
いくつかの実施形態では、抗原が増強された担体タンパク質接合体は、約７５０ｋＤａ、約１，０００ｋＤａ、約１，５００ｋＤａ、約２，０００ｋＤａ、約２，５００ｋＤａ、約３，０００ｋＤａ、約３，５００ｋＤａ、約４，０００ｋＤａ、約４，５００ｋＤａ、約５，０００ｋＤａ、約５，５００ｋＤａ、約６，０００ｋＤａ、約６，５００ｋＤａ、約７，０００ｋＤａ、約７，５００ｋＤａ、または約８，０００ｋＤａの分子量を有する。いくつかの実施形態では、抗原が増強された担体タンパク質接合体は、少なくとも約７５０ｋＤａ、少なくとも約１，０００ｋＤａ、または少なくとも約１，５００ｋＤａの分子量を有し、いくつかの実施形態では、抗原が増強された担体タンパク質接合体は、約７５０ｋＤａ〜約２，８００ｋＤａの分子量を有する。いくつかの実施形態では、抗原が増強された担体タンパク質接合体は、約８００ｋＤａ〜約２，８００ｋＤａの分子量を有する。いくつかの実施形態では、抗原が増強された担体タンパク質接合体は、約８５０ｋＤａ〜約２，８００ｋＤａの分子量を有する。いくつかの実施形態では、抗原が増強された担体タンパク質接合体は、約９００ｋＤａ〜約２，８００ｋＤａの分子量を有する。いくつかの実施形態では、抗原が増強された担体タンパク質接合体は、約９５０ｋＤａ〜約２，８００ｋＤａの分子量を有する。いくつかの実施形態では、抗原が増強された担体タンパク質接合体は、約１，０００ｋＤａ〜約２，８００ｋＤａの分子量を有する。
【０２２４】
本開示の接合体ワクチンについての別の重要なパラメータは、抗原（例えば、多糖類）と免疫原性ポリペプチド担体（例えば、本開示の担体タンパク質）との比率である。多糖類−担体タンパク質接合体を一般的な原則の例示として使用すると、精製された接合体の多糖類とタンパク質との（ＰＳ：ＰＣ）比率は、一般的に、重量−重量（ｗ／ｗ）比率に関して表現される。そのような比率は、慣習的に、個々の複合糖質と共に精製された任意の遊離多糖類を含むものと表現される。多糖類−担体タンパク質接合体のより高いＰＳ：ＰＣ比率により、より多くの多糖類抗原をより低量の増強された担体タンパク質と共に送達することが可能になる。肺炎球菌接合体ワクチンについて、この比率は、典型的には、０．３〜３．０の範囲内にあるが、これは、血清型および接合化学の態様により変化し得る（添付書類２：Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｖａｃｃｉｎｅｓ；ＷＨＯ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ  Ｓｅｒｉｅｓ，Ｎｏ．９２７，２００５）。市販のワクチンであるＰｒｅｖｎａｒ−１３の比率は、０．９であり（Ｐｒｅｖｎａｒ  １３  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｉｎｓｅｒｔ，Ｍ／２０１６  Ｒｅｖｉｓｉｏｎ，ｐｇ．２４；ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｄｏｗｎｌｏａｄｓ／ｂｉｏｌｏｇｉｃｓｂｌｏｏｄｖａｃｃｉｎｅｓ／ｖａｃｃｉｎｅｓ／ａｐｐｒｏｖｅｄｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｕｃｍ２０１６６９．ｐｄｆを参照されたい）、１．０〜３．０の好ましい範囲を示唆している。１３個を上回る血清型によりワクチンを処方するとき、１．５〜３．０の比率を達成することが好ましい場合があり、約１．５〜約２．０の比率を用いることが特に好ましい場合がある。これは、すべての個々の接合体がこの比率を有することを確実にすることによって、または片側のこの範囲外の任意の接合体が反対側のこの範囲外の接合体によって均衡が保たれることを確実にすることによって達成され得る、組成物中のすべての接合体についての平均比率であり得る。
【０２２５】
別の実施形態では、多糖類が増強された担体タンパク質接合体中の多糖類と増強された担体タンパク質との比率（重量単位）は、０．５〜４．０（例えば、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、約１．０、約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９、約２．０、約２．１、約２．２、約２．３、約２．４、約２．５、約２．６、約２．７、約２．８、約２．９、約３．０、約３．１、約３．２、約３．３、約３．４、約３．５、約３．６、約３．７、約３．８、約３．９、または約４．０）である。別の実施形態では、担体タンパク質接合体中の（ｗ／ｗ）ＰＳ：ＰＣ比率は、０．７〜２．８である。別の実施形態では、担体タンパク質接合体中の（ｗ／ｗ）ＰＳ：ＰＣ比率は、１．０〜２．８である。別の実施形態では、担体タンパク質接合体中の（ｗ／ｗ）ＰＳ：ＰＣ比率は、少なくとも０．８、少なくとも０．９、少なくとも１．０、少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．３、少なくとも１．４、または少なくとも１．５である。別の実施形態では、多糖類が増強された担体タンパク質接合体中の多糖類と増強された担体タンパク質との比率は、０．９（ｗ／ｗ）を上回る。別の実施形態では、多糖類が増強された担体タンパク質接合体中の多糖類と増強された担体タンパク質との比率は、約０．９〜約３．０（ｗ／ｗ）である。そのようなＰＳ：ＰＣ比率による個々の混合体の混合は、所望の全体的なＰＳ：ＰＣ比率を有する組み合わせを生じ得る。
【０２２６】
汚染物質（遊離多糖類、Ｃ−ポリ）の存在多糖類が増強された担体タンパク質接合体についての重要なパラメータは、増強された担体タンパク質に共有結合的に接合されないが、それにもかかわらず接合体組成物中に存在する遊離多糖類のレベルである。例えば、特定の例では、遊離多糖類は、多糖類が増強された担体タンパク質接合体に非共有結合的に関連付けられる（すなわち、非共有結合的に結合され、これに吸着されるか、またはこれ内もしくはこれと共に取り込まれる）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される多糖類が増強された担体タンパク質接合体は、多糖類の総量と比較して、約５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、または１０％未満の遊離多糖類を含む。別の実施形態では、本明細書に記載される多糖類が増強された担体タンパク質は、多糖類の総量と比較して、約１０％未満の遊離多糖類を含む。別の実施形態では、本明細書に記載される多糖類が増強された担体タンパク質は、多糖類の総量と比較して、約２５％未満の遊離多糖類を含む。別の実施形態では、本明細書に記載される多糖類が増強された担体タンパク質は、多糖類の総量と比較して、約３０％未満の遊離多糖類を含む。別の実施形態では、本明細書に記載される多糖類が増強された担体タンパク質は、多糖類の総量と比較して、約１５％未満の遊離多糖類を含む。遊離多糖類は、任意選択的に、多糖類のプールを区別するためのＨＣｌ／デオキシコール酸ベースの沈殿方法を使用する、Ｌｅｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ（Ｂａｓｅｌ）．２０００：１０３：２５９−６４）の方法を含む任意の好適な方法によって測定される。好ましい組成物では、非接合細菌多糖類の量は、組成物中の細菌多糖類の総量の５重量％未満である。複数の肺炎球菌接合体を含む組成物では、各血清型に対する非接合細菌多糖類の量は、組成物中のその血清型の細菌多糖類の総量の５重量％未満であることが好ましい。
【０２２７】
肺炎球菌莢膜多糖−増強された担体タンパク質接合体についての重要なパラメータは、接合体の調製において存在するＣ−多糖類の汚染物質のレベルである。Ｃ−多糖類は、免疫学的に非生産的であるが、多くの肺炎球菌莢膜多糖の調製方法において「沿って動く」肺炎連鎖球菌の高度に免疫原性の細胞壁成分である。Ｃ−多糖類の免疫反応は、一般的に、中和抗体を生成しないため、Ｃ−多糖類による汚染は、動物に投与されたときの抗原が増強された担体タンパク質接合体の有効性の適切な評価に干渉し得る。
【０２２８】
Ｃ−多糖類のレベルは、任意選択的に、多糖類接合体調製の総酸加水分解、加水分解物のクロマトグラフィー、およびコリンの電気伝導率検出によって示される。代替的に、非加水分解多糖類は、コリンのためのＮＭＲによって分析される。ＮＭＲ技術は、Ｃ−多糖類の含有量を計算するためのコリン信号とラムノースメチル信号との比率（ラムノースを含有する莢膜多糖について；他の莢膜多糖についての異なる信号）を使用する。クロマトグラフィー方法は、Ｃ−多糖類含有量を計算するための電気伝導度アッセイによって判定された多糖類含有量、または莢膜多糖の成分ピークのうちの１つのいずれかとコリン信号との比率を使用する。いずれかの方法では、コリンの既知の濃度の基準により、Ｃ−多糖類の理論的繰り返し構造［Ｈｅｒｍａｎｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｃｌ．Ｔｒａｖ．Ｃｈｉｍ．Ｐａｙｓ−Ｂａｓ，１０７，６００（１９８８）］を使用して、いったんコリン濃度が分かり、多糖類の調製におけるＣ−多糖類の濃度が分かると、多糖類の調製において存在するコリンのレベルの直接の計算が可能になる。
【０２２９】
多糖類が増強された担体タンパク質接合体試料の多糖類の濃度は、任意選択的に、様々な技術によって測定され、例えば、総多糖類の濃度は、任意選択的に、多糖類の総加水分解および特定の単糖類の濃度の素測定によって判定される。Ｃ−多糖類の濃度を総多糖類の濃度と比較することによって、Ｃ−多糖類の汚染の程度（ｗ／ｗ）を判定する。総多糖類の３％（ｗ／ｗ）未満のＣ−多糖類のレベルは、許容可能であるとみなされる。いくつかの実施形態では、Ｃ−多糖類のレベルは、１％未満である。
【０２３０】
一実施形態では、本開示は、担体タンパク質および抗原を含む接合体であって、抗原が担体タンパク質中のｎｎＡＡに連結される、接合体を提供する。別の実施形態では、担体タンパク質は、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ヘモフィルス・インフルエンザ菌タンパク質Ｄ（ＰＤ）、血清群Ｂ髄膜炎菌（ＯＭＰＣ）の外膜タンパク質複合体、またはＣＲＭ１９７のＴ細胞結合エピトープを保持する。別の実施形態では、ｎｎＡＡは、２−アミノ−３−（４−アジドフェニル）プロパン酸（ｐＡＦ）、２−アミノ−３−（４−（アジドメチル）フェニル）プロパン酸（ｐＡＭＦ）、２−アミノ−３−（５−（アジドメチル）ピリジン−２−イル）プロパン酸、２−アミノ−３−（４−（アジドメチル）ピリジン−２−イル）プロパン酸、２−アミノ−３−（６−（アジドメチル）ピリジン−３−イル）プロパン酸、２−アミノ−５−アジドペンタン酸、または２−アミノ−３−（４−（アジドメチル）フェニル）プロパン酸、およびそれらの任意の組み合わせである。別の実施形態では、ｎｎＡＡは、担体タンパク質のＴ細胞活性化エピトープではない。別の実施形態では、ｎｎＡＡは、担体タンパク質中の１つ以上のリジン残基と置換される。別の実施形態では、接合体のみかけ分子量は、約９００ｋＤａ〜約５ＭＤａである。別の実施形態では、置換される１つ以上のリジン残基は、配列番号１のＫ２５、Ｋ３４、Ｋ３８、Ｋ４０、Ｋ２１３、Ｋ２１５、Ｋ２２８、Ｋ２６５、Ｋ３８６、Ｋ５２３、およびＫ５２７、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。別の実施形態では、ｎｎＡＡは、担体タンパク質のＴ細胞活性化エピトープではない。別の実施形態では、抗原は、式ＸＩまたはＸＩａによる担体タンパク質に連結され、
【化４０】
2020504760.tif 000043
式中、
Ｒ１は、独立して、Ｈ、ホルミル、または担体タンパク質の少なくとも１つのアミノ酸であり、
Ｒ２は、独立して、ＯＨ、または担体タンパク質の少なくとも１つのアミノ酸であり、
Ｗは、ＣまたはＮであり、
ｙは、少なくとも１であり、
ｎは、少なくとも１であり、
Ｘは、独立して、莢膜多糖の少なくとも１つのポリオールである。
【０２３１】
別の実施形態では、抗原は、多糖類である。別の実施形態では、多糖類は、肺炎連鎖球菌、髄膜炎菌、ヘモフィルス・インフルエンザ菌、化膿連鎖球菌、またはストレプトコッカス・アガラクチアの莢膜多糖である。別の実施形態では、多糖類は、１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１３、１４、１５Ｂ、１６、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１、および３３Ｆ、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される肺炎連鎖球菌血清型の莢膜多糖である。別の実施形態では、抗原は、ポルフィロモナス・ジンジバリスの６つの血清型（例えば、Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３、Ｋ４、Ｋ５および／またはＫ６）のうちの１つに由来する莢膜多糖である。
【０２３２】
一実施形態では、本開示は、ｉ）担体タンパク質中にｎｎＡＡ置換を導入することと、ｉｉ）多糖類をｎｎＡＡに接合させて、複合糖質を形成することと、ｉｉｉ）複合糖質のみかけ分子量を測定することと、を含む、宿主の免疫反応を改善するために担体タンパク質の抗原の最適な配置を同定するための方法を提供する。別の実施形態では、ｎｎＡＡ置換は、担体タンパク質のＴ細胞活性化エピトープ中にはない。別の実施形態では、担体タンパク質は、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ヘモフィルス・インフルエンザ菌タンパク質Ｄ（ＰＤ）、血清群Ｂ髄膜炎菌（ＯＭＰＣ）の外膜タンパク質複合体、またはＣＲＭ１９７のＴ細胞結合エピトープを保持する。別の実施形態では、抗原は、多糖類である。別の実施形態では、少なくとも１つ以上の多糖類は、式ＸＩまたはＸＩａによる担体タンパク質に接合され、
【化４１】
2020504760.tif 000044
式中、
Ｒ１は、独立して、Ｈ、ホルミル、または担体タンパク質の少なくとも１つのアミノ酸であり、
Ｒ２は、独立して、ＯＨ、または担体タンパク質の少なくとも１つのアミノ酸であり、
Ｘは、独立して、莢膜多糖の少なくとも１つのポリオールである。
【０２３３】
別の実施形態では、置換される少なくとも１つ以上の非天然アミノ酸は、ｐＡＭＦである。別の実施形態では、本開示は、ｉ）〜ｉｉｉ）のプロセスによって同定される抗原の最適な配置を有する担体タンパク質を提供する。別の実施形態では、置換は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、または少なくとも９回、導入される。別の実施形態では、多糖類は、細菌の莢膜多糖である。別の実施形態では、細菌は、肺炎連鎖球菌、髄膜炎菌、ヘモフィルス・インフルエンザ菌、化膿連鎖球菌、またはストレプトコッカス・アガラクチアである。別の実施形態では、細菌は、肺炎連鎖球菌である。別の実施形態では、多糖類は、１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１３、１４、１５Ｂ、１６、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１、および３３Ｆ、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される肺炎連鎖球菌血清型の莢膜多糖である。別の実施形態では、抗原は、ポルフィロモナス・ジンジバリスの６つの血清型（例えば、Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３、Ｋ４、Ｋ５および／またはＫ６）のうちの１つに由来する莢膜多糖である。
【０２３４】
改変ポリペプチドおよび多糖類
一実施形態では、本開示は、式ＸＩまたはＸＩａを含む、少なくとも１つの化合物、またはその塩を含む、改変ポリペプチドであって、
【化４２】
2020504760.tif 000045
式中、
Ｒ１は、独立して、Ｈ、ホルミル、または担体タンパク質の少なくとも１つのアミノ酸であり、
Ｒ２は、独立して、ＯＨ、または担体タンパク質の少なくとも１つのアミノ酸であり、
Ｘは、独立して、多糖類の少なくとも１つのポリオールである、改変ポリペプチドを提供する。
【０２３５】
別の実施形態では、担体タンパク質は、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）、へモフィルスタンパク質Ｄ（ＰＤ）、血清群Ｂ髄膜炎菌（ＯＭＰＣ）の外膜タンパク質複合体、またはＣＲＭ１９７のＴ細胞結合エピトープを保持する。別の実施形態では、多糖類は、細菌種の莢膜多糖である。別の実施形態では、細菌種は、肺炎連鎖球菌である。別の実施形態では、細菌種は、肺炎連鎖球菌、髄膜炎菌、ヘモフィルス・インフルエンザ菌、化膿連鎖球菌、またはストレプトコッカス・アガラクチアである。別の実施形態では、多糖類は、１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１３、１４、１５Ｂ、１６、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１、および３３Ｆ、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される群から選択される肺炎連鎖球菌血清型の莢膜多糖である。別の実施形態では、Ｒ１およびＲ２は、担体タンパク質のＴ細胞エピトープ中に生じるアミノ酸ではない。別の実施形態では、抗原は、ポルフィロモナス・ジンジバリスの６つの血清型（例えば、Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３、Ｋ４、Ｋ５および／またはＫ６）のうちの１つに由来する莢膜多糖である。
【０２３６】
一実施形態では、本開示は、式ＶＩＩまたはＶＩＩａを含む、少なくとも１つの化合物、またはその塩を含む、改変多糖類であって、
【化４３】
2020504760.tif 000046
式中、
Ｘは、独立して、莢膜多糖の少なくとも１つのポリオールであり、
ｎは、少なくとも１である、改変多糖類を提供する。
【０２３７】
別の実施形態では、式ＶＩＩの改変多糖類は、少なくとも１つのｎｎＡＡを含む担体タンパク質にさらに接合される。別の実施形態では、改変多糖類は、［２＋３］負荷環化によって接合される。別の実施形態では、多糖類は、細菌種由来のものである。別の実施形態では、細菌種は、肺炎連鎖球菌である。別の実施形態では、細菌種は、肺炎連鎖球菌、髄膜炎菌、ヘモフィルス・インフルエンザ菌、化膿連鎖球菌、またはストレプトコッカス・アガラクチアである。別の実施形態では、多糖類は、細菌莢膜多糖である。別の実施形態では、ＤＢＣＯと莢膜多糖の繰り返し単位とのモル比率は、１を上回る。別の実施形態では、莢膜多糖は、１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１３、１４、１５Ｂ、１６、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１、および３３Ｆ、およびそれらの任意の組み合わせを含む肺炎連鎖球菌血清型のものである。別の実施形態では、抗原は、ポルフィロモナス・ジンジバリスの６つの血清型（例えば、Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３、Ｋ４、Ｋ５および／またはＫ６）のうちの１つに由来する莢膜多糖である。
【０２３８】
一実施形態では、本開示は、（Ａ−Ｘ）ｚ−Ｙによる改変多糖類を提供し、
式中、
Ａは、
【化４４】
2020504760.tif 000047
であり、
Ｘは、独立して、少なくとも１つのポリオールであり、
Ｙは、独立して、多糖類の少なくとも１つのポリオールであり、
ｎは、少なくとも１であり、
ｚは、１を上回る。
【０２３９】
別の実施形態では、多糖類は、細菌種由来のものである。別の実施形態では、細菌種は、肺炎連鎖球菌である。別の実施形態では、細菌種は、肺炎連鎖球菌、髄膜炎菌、ヘモフィルス・インフルエンザ菌、化膿連鎖球菌、またはストレプトコッカス・アガラクチアである。別の実施形態では、多糖類は、細菌莢膜多糖である。別の実施形態では、莢膜多糖は、１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１３、１４、１５Ｂ、１６、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１、および３３Ｆ、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される肺炎連鎖球菌血清型の莢膜多糖である。別の実施形態では、抗原は、ポルフィロモナス・ジンジバリスの６つの血清型（例えば、Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３、Ｋ４、Ｋ５および／またはＫ６）のうちの１つに由来する莢膜多糖である。別の実施形態では、多糖類は、担体タンパク質にさらに接合される。別の実施形態では、多糖類は、式ＩＩの連結を介して担体タンパク質に接合される。別の実施形態では、担体タンパク質は、ＣＲＭ１９７のＴ細胞結合エピトープを保持する。別の実施形態では、多糖類は、［２＋３］負荷環化によって接合される。別の実施形態では、担体タンパク質は、１つ以上の非天然アミノ酸を含む。別の実施形態では、担体タンパク質は、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ヘモフィルス・インフルエンザ菌タンパク質Ｄ（ＰＤ）、血清群Ｂ髄膜炎菌（ＯＭＰＣ）の外膜タンパク質複合体、またはＣＲＭ１９７のＴ細胞結合エピトープを保持する。別の実施形態では、担体タンパク質は、抗原にさらに接合される。別の実施形態では、担体タンパク質、式ＩＩの連結を介して抗原に接合される。別の実施形態では、多糖類と担体タンパク質（ＰＳ：ＰＣ）との比率（ｗ／ｗ）は、約１．５〜約４である。
【０２４０】
ポリペプチド抗原接合体の組成物
少なくとも１つの賦形剤と一緒に少なくとも１つの増強された担体タンパク質−抗原接合体を含む免疫原性組成物であって、抗原が増強された担体タンパク質中のｎｎＡＡ残基を介してポリペプチドに接合される、免疫原性組成物を本明細書に記載する。一実施形態では、本開示は、本明細書に記載される複合糖質を含むワクチン組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるような少なくとも１つの増強された担体タンパク質−抗原接合体を含む接合体ワクチン組成物は、天然担体タンパク質を含む接合体ワクチン組成物と比較して、対象中の担体抑制の低減を誘発する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるような少なくとも１つの増強された担体タンパク質−抗原接合体を含む接合体ワクチン組成物は、全体的な免疫反応を改善し、かつ／または天然担体タンパク質を含む接合体ワクチン組成物と比較して、対象中のＴ細胞依存性応答を増加させる。
【０２４１】
いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、単一の担体−タンパク質−抗原接合体（例えば、肺炎球菌の単一の血清型）を含む。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、複数の担体−タンパク質抗原接合体（例えば、肺炎球菌の複数の血清型）を含む。さらなる実施形態では、複数の担体−タンパク質抗原接合体は、任意選択的に、（ａ）般的な増強された担体タンパク質に接合された複数の抗原、または（ｂ）異なる増強された担体タンパク質に接合された複数の抗原を含む。さらなる実施形態では、複数の増強された担体タンパク質抗原接合体は、同じ微生物（例えば、肺炎連鎖球菌）の異なる血清型由来の抗原を含む。組成物が複数の異なる抗原（例えば、肺炎球菌の複数の血清型由来の莢膜多糖、または髄膜炎菌の複数の血清群由来の莢膜多糖）を含む場合、各抗原について同じ型の担体タンパク質が使用されることが好ましく、例えば、各抗原が、同じｎｎＡＡ含有ＣＲＭ１９７変異形に個別に接合され、次に、個々の抗原−タンパク質接合体が、多抗原組成物を与えるために組み合わされることが好ましい。
【０２４２】
いくつかの実施形態では、多価血清型多糖類接合体組成物中のすべての血清型多糖類と担体タンパク質（ＰＳ：ＰＣ）との全体的な（重量単位）比率は、特定の範囲内にある。別の実施形態では、多糖類が増強された担体タンパク質接合体中の（または全体的な多価組成物中の）多糖類と増強された担体タンパク質との比率（重量単位）は、０．５〜４．０（例えば、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、約１．０、約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９、約２．０、約２．１、約２．２、約２．３、約２．４、約２．５、約２．６、約２．７、約２．８、約２．９、約３．０、約３．１、約３．２、約３．３、約３．４、約３．５、約３．６、約３．７、約３．８、約３．９、または約４．０）である。別の実施形態では、担体タンパク質接合体中の（または全体的な多価組成物中の）（ｗ／ｗ）ＰＳ：ＰＣ比率は、０．７〜２．８である。別の実施形態では、担体タンパク質接合体中の（または全体的な多価組成物中の）（ｗ／ｗ）ＰＳ：ＰＣ比率は、１．０〜２．８である。別の実施形態では、担体タンパク質接合体中の（または全体的な多価組成物中の）（ｗ／ｗ）ＰＳ：ＰＣ比率は、少なくとも０．８、少なくとも０．９、少なくとも１．０、少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．３、少なくとも１．４、または少なくとも１．５（ｗ／ｗ）である。別の実施形態では、多糖類が増強された担体タンパク質接合体中の（または全体的な多価組成物中の）多糖類と増強された担体タンパク質との比率は、０．９（ｗ／ｗ）を上回る。別の実施形態では、多糖類が増強された担体タンパク質接合体中の（または全体的な多価組成物中の）多糖類と増強された担体タンパク質との比率は、約０．９〜約３．０（ｗ／ｗ）である。好ましい組成物は、タンパク質に対して全体的に質量過度の多糖類、例えば、１：１．１〜１：２（ｗ／ｗ）、例えば、１：１．５〜１：１．９のタンパク質：多糖類比率を有する、複数の肺炎球菌血清型由来の莢膜多糖のタンパク質−単糖類接合体を含む。
【０２４３】
いくつかの実施形態では、多価血清型多糖類−担体タンパク質接合体組成物中のすべての血清型多糖類−担体タンパク質接合体の全体的な分子量範囲は、特定の範囲内にある。いくつかの実施形態では、抗原が増強された担体タンパク質接合体は、約７５０ｋＤａ、約１，０００ｋＤａ、約１，５００ｋＤａ、約２，０００ｋＤａ、約２，５００ｋＤａ、約３，０００ｋＤａ、約３，５００ｋＤａ、約４，０００ｋＤａ、約４，５００ｋＤａ、約５，０００ｋＤａ、約５，５００ｋＤａ、約６，０００ｋＤａ、約６，５００ｋＤａ、約７，０００ｋＤａ、約７，５００ｋＤａ、または約８，０００ｋＤａの分子量を有する。いくつかの実施形態では、抗原が増強された担体タンパク質接合体は、少なくとも約７５０ｋＤａ、少なくとも約１，０００ｋＤａ、または少なくとも約１，５００ｋＤａの分子量を有し、いくつかの実施形態では、抗原が増強された担体タンパク質接合体は、約７５０ｋＤａ〜約２，８００ｋＤａの分子量を有する。いくつかの実施形態では、抗原が増強された担体タンパク質接合体は、約８００ｋＤａ〜約２，８００ｋＤａの分子量を有する。いくつかの実施形態では、抗原が増強された担体タンパク質接合体は、約８５０ｋＤａ〜約２，８００ｋＤａの分子量を有する。いくつかの実施形態では、抗原が増強された担体タンパク質接合体は、約９００ｋＤａ〜約２，８００ｋＤａの分子量を有する。いくつかの実施形態では、抗原が増強された担体タンパク質接合体は、約９５０ｋＤａ〜約２，８００ｋＤａの分子量を有する。いくつかの実施形態では、抗原が増強された担体タンパク質接合体は、約１，０００ｋＤａ〜約２，８００ｋＤａの分子量を有する。
【０２４４】
さらなる実施形態では、免疫原性組成物は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、または少なくとも３０個の別個の増強された担体タンパク質−抗原接合体を含む。
【０２４５】
複数の接合体（例えば、複数の肺炎球菌血清型の各々に対する接合体）を含む任意の組成物において、いくつかの例では、各接合体中の担体タンパク質が同一であることが好ましい可能性があるだろう。複数の接合体を有するそのような組成物の代替的な実施形態では、１つ超の担体を使用することが好ましい場合がある。各抗原（例えば、異なる肺炎球菌血清型由来の莢膜多糖）が異なる担体に接合され得ることが可能であるが、典型的には、そのような組成物中の個々の接合体の中で代表される２〜４（例えば、２または３）個のみの異なる担体があるであろう。例示の方法により、限定の方法ではなく、各接合体が異なる肺炎球菌血清型由来の莢膜多糖を含む、２４個の異なる接合体の組成物中、２４個の接合体のうちのいくつかであるがすべてではない接合体が、第１の担体タンパク質（例えば、ＣＲＭ１９７に基づく）を含み、２４個の接合体のうちの残りが、第２のタンパク質担体（例えば、ＨｉＤに基づく）を含む。したがって、再び例示の方法により、限定の方法ではなく、２４個の接合体のうちの１２、１３、１５、または２０個の接合体は、第１の担体タンパク質を含む可能性があり、それぞれ、１２、１１、９、または４個の残りの接合体は、第２の担体タンパク質を含む可能性があるであろう。
【０２４６】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの賦形剤は、非経口投与に好適な成分を含む。
【０２４７】
さらなる実施形態では、少なくとも１つの賦形剤は、任意選択的に、緩衝液またはｐＨ調節剤を含む。特定の実施形態では、緩衝液またはｐＨ調節剤は、ホウ酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、またはコハク酸エステル、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。好適な緩衝液の他の例には、酢酸、ホウ酸、クエン酸、乳酸、リン酸、塩酸などの酸；水酸化ナトリウム、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、およびトリス−ヒドロキシメチルアミノメタンなどの塩基；ならびにクエン酸／ブドウ糖、重炭酸ナトリウム、および塩化アンモニウムなどの緩衝液が含まれる。ヒスチジン緩衝液はまた、免疫原性組成物において有用である。
【０２４８】
さらなる実施形態では、少なくとも１つの賦形剤は、任意選択的に、組成物のオスモル濃度を許容可能な範囲にもたらすための等張化剤を含む。特定の実施形態では、等張化剤は、塩化ナトリウム、ブドウ糖、およびグリセリン、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。非経口投与に好適な緩衝液の他の例としては、ナトリウム、カリウム、もしくはアンモニウムの陽イオンおよび塩化物を有する塩、クエン酸、アスコルビン酸、ホウ酸、リン酸、重炭酸、硫酸、チオ硫酸、もしくは亜硫酸水素の陰イオンが挙げられ、好適な塩としては、カリウム塩化物、チオ硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、および硫酸アンモニウムが挙げられる。
【０２４９】
さらなる実施形態では、少なくとも１つの賦形剤は、任意選択的に、表面活性剤（界面活性剤）を含む。特定の実施形態では、表面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ポリソルベート２０または「Ｔｗｅｅｎ２０」）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ポリソルベート８０または「Ｔｗｅｅｎ８０」）、Ｂｒｉｊ３５、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１０、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７、またはドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である。いくつかの実施形態では、表面活性剤は、０．０００３％〜０．３％（ｗ／ｗ）の濃度で存在する。
【０２５０】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの賦形剤は、任意選択的に、抗原提示（デポ製剤、送達システム）を増強することによって、かつ／または共刺激信号（免疫刺激剤）を提供することによって、免疫系の刺激を増加させる薬剤である、アジュバントを含む。この実施形態のいくつかの変形例では、アジュバントは、アルミニウム塩ベースのものである。特定の実施形態では、アジュバントは、リン酸アルミニウムカリウム、硫酸アルミニウムヒドロキシリン酸、水酸化アルミニウム、またはリン酸アルミニウム、およびそれらの任意の組み合わせである。他の変形例では、アジュバントは、水中油型乳剤である。特定の実施形態では、アジュバントは、ＡＳ０３、ＭＦ５９、またはＡＦ０３、およびそれらの任意の組み合わせである。また他の変形例では、アジュバントは、ＴＬＲ４−アゴニストである。特定の実施形態では、アジュバントは、ＲＣ５２９である。本発明で使用するのに好ましいアジュバントは、リン酸アルミニウムアジュバント（例えば、ヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバント）などのアルミニウム塩である。組成物がアルミニウム塩アジュバントを含む場合、組成物中のＡｌ３＋の濃度が、用量当たり、≦１．２５ｍｇ、例えば０．５ｍｌ当たり、≦１．２５ｍｇ、および理想的には用量当たり、≦０．８５ｍｇであることが好ましい。組成物内の接合体は、アルミニウム塩アジュバントに吸着され得る。混合された組成物について、接合体は、個別にアルミニウム塩に吸着され得、次に混合され得るか、または逐次吸着を達成するためにアルミニウム塩中に加えられ得、それによって混合された接合体組成物を形成し得る。
【０２５１】
好ましい組成物は、（ｉ）本明細書で定義されるような１つ以上の接合体、例えば、ｎｎＡＡ含有担体タンパク質に接合された複数の肺炎球菌血清型由来の莢膜多糖、および（ｉｉ）リン酸アルミニウムアジュバントを含む。
【０２５２】
一実施形態では、本開示は、免疫原性組成物の多糖類とタンパク質担体との比率（ｗ／ｗ）（ＰＳ：ＰＣ）を増加させるための方法であって、（ａ）１つ以上のｎｎＡＡ置換を担体タンパク質に導入することと、（ｂ）１つ以上の非天然アミノ酸置換を介して多糖類を担体タンパク質に接合させることと、を含む、方法を提供する。別の実施形態では、１つ以上の置換は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、または少なくとも９つの置換を含む。別の実施形態では、ｎｎＡＡ置換は、担体タンパク質のＴ細胞活性化エピトープ中にない。別の実施形態では、ｎｎＡＡは、ｐＡＭＦである。別の実施形態では、担体タンパク質は、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）、へモフィルスタンパク質Ｄ（ＰＤ）、血清群Ｂ髄膜炎菌（ＯＭＰＣ）の外膜タンパク質複合体、またはＣＲＭ１９７のＴ細胞結合エピトープを保持する。別の実施形態では、非天然アミノ酸置換は、リジン残基で発生する。別の実施形態では、リジン残基は、配列番号１のＫ２５、Ｋ３４、Ｋ３８、Ｋ４０、Ｋ２１３、Ｋ２１５、Ｋ２２８、Ｋ２６５、Ｋ３８６、Ｋ５２３、およびＫ５２７、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。別の実施形態では、多糖類は、式ＸＩまたはＸＩａの連結を介して担体タンパク質に接合され、
【化４５】
2020504760.tif 000048
式中、
Ｒ１は、独立して、Ｈ、ホルミル、または担体タンパク質の少なくとも１つのアミノ酸であり、
Ｒ２は、独立して、ＯＨ、または担体タンパク質の少なくとも１つのアミノ酸であり、
Ｘは、独立して、莢膜多糖の少なくとも１つのポリオールである。
【０２５３】
別の実施形態では、ＰＳ：ＰＣ比率は、約１．５〜約４である。別の実施形態では、多糖類は、１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１３、１４、１５Ｂ、１６、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１、および３３Ｆ、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される肺炎連鎖球菌血清型の莢膜多糖である。別の実施形態では、抗原は、ポルフィロモナス・ジンジバリスの６つの血清型（例えば、Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３、Ｋ４、Ｋ５および／またはＫ６）のうちの１つに由来する莢膜多糖である。別の実施形態では、多糖類は、肺炎連鎖球菌、髄膜炎菌、ヘモフィルス・インフルエンザ菌、化膿連鎖球菌、またはストレプトコッカス・アガラクチアの莢膜多糖である。別の実施形態では、本開示は、工程（ａ）〜（ｂ）を含むプロセスによって調製される糖たんぱく質を提供する。
【０２５４】
１０．免疫反応の上昇
本明細書に記載されるような接合体または組成物を対象に投与することによって、対象における抗原に対する免疫防御性抗体反応を誘発する方法を本明細書に提供する。接合体または組成物は、典型的には、非経口投与に好適な賦形剤と組み合わされるであろう。
【０２５５】
抗原に対する免疫防御性抗体反応を誘発する際に使用するための接合体および組成物も提供する。抗原に対する免疫防御性抗体反応を誘発するための薬剤の製造のための接合体および組成物の使用も提供する。
【０２５６】
免疫防御性抗体反応は、接合体および組成物を使用して、例えば、肺炎連鎖球菌によって引き起こされる浸潤性疾患の予防のため、肺炎連鎖球菌によって引き起こされる中耳炎の予防のため、肺炎連鎖球菌によって引き起こされる肺炎の予防のための能動免疫化、浸潤性疾患を予防するために髄膜球菌に曝露される危険のある対象の能動免疫化などを提供することができることを意味している。
【０２５７】
本発明を以下の実施例に例示する。材料、方法、および例は、例示のみであり、限定することを意図していない。多数の変形、変更、および置換は、本発明から逸脱することなく、当業者であれば生じるであろう。実施例は、別様に詳細に記載された場合を除いて、当業者によく知られており、かつ定常の技術を使用して実行される。
【実施例】
【０２５８】
実施例１：一部位ｅＣＲＭ部分である、Ｋ１１ＴＡＧ、Ｋ２５ＴＡＧ、Ｋ３４ＴＡＧ、Ｋ３８ＴＡＧ、Ｋ４０ＴＡＧ、Ｋ５２ＴＡＧ、Ｋ６０ＴＡＧ、Ｋ７７ＴＡＧ、Ｋ８３ＴＡＧ、Ｋ９１ＴＡＧ、Ｋ９６ＴＡＧ、およびＫ１０３ＴＡＧの合成
ｅＣＲＭは、Ｓｕｔｒｏ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａ，Ｉｎｃ．（米国カリフォルニア州サウスサンフランシスコ）によって提供される無細胞タンパク質合成（ＣＦＰＳ）抽出物中に発現された。そのような抽出物の特徴および調製は、他の公報に記載されており、この場合、抽出物は、一般に、ＵＳ２０１６／０２５７９４６からの以下の改変を有する、Ｚａｗａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１０８（７），１５７０−１５７８に記載されるように調製された。（１）大腸菌ＤｓｂＣを過剰発現させるように操作されたＯｍｐＴ感受性ＲＦ−１弱毒化株から、無細胞抽出物を調製し、（２）アンバー終止コドンで非天然アミノ酸を挿入するための直交性ＣＵＡコード化ｔＲＮＡを生成するように操作された同様のＲＦ−１弱毒化大腸菌株から、無細胞抽出物を調製し、（３）（１）および（２）由来の無細胞抽出物を、混成し（８５：１５の比率で）、室温（２０℃）で３０分間５０μＭのヨードアセトアミドで処理し、（４）混成された抽出物を、ｅＣＲＭをコードするＤＮＡを除く、無細胞タンパク質合成システムのすべての他の成分を含有する予混合物に加えた。無細胞タンパク質合成反応の最終濃度は、３０％（容量当たり）の細胞抽出物、２ｍＭのパラ−メチルアジド−Ｌ−フェニルアラニン（ｐＡＭＦ）（マサチューセッツ州シャーリーＲＳＰ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ）、５μＭのｐＡＭＦ特異的ｔＲＮＡ合成酵素（「ＲＳ」）、２ｍＭのＧＳＳＧ（酸化型グルタチオン）、８ｍＭのグルタミン酸マグネシウム、１０ｍＭのグルタミン酸アンモニウム、１３０ｍＭのグルタミン酸カリウム、３５ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１．２ｍＭのＡＭＰ、ＧＭＰ、ＵＭＰ、およびＣＭＰの各々０．８６ｍＭ、２ｍＭのアミノ酸（チロシンおよびフェニルアラニンについての０．５ｍＭを除く）、４ｍＭのシュウ酸ナトリウム、１ｍＭのプトレシン、１．５ｍＭのスペルミジン、１５ｍＭのリン酸カリウム、１００ｎＭのＴ７  ＲＮＡＰ、およびｎｎＡＡ変異形をコードする２．５μＭのｅＣＲＭプラズミドであった。無細胞合成反応は、ｅＣＲＭをコードするプラズミドＤＮＡの付加によって開始された。
【０２５９】
４８ウェルの花皿（ｍ２ｐ−ｌａｂｓ＃ＭＴＰ−４８−Ｂ）中に６５０ｒｐｍの撹拌器で１４時間、反応物を培養した。培養期間後、精製または分析のために処理されるまで、反応物を４℃に保持した。無細胞タンパク質合成反応に続いて、ｐＡＭＦ−ｅＣＲＭを含有する混合物を、９６ウェルの皿（ＤｙＮａ  Ｂｌｏｃｋ（商標）、２ｍＬ；Ｌａｂｎｅｔ，Ｅｄｉｓｏｎ，Ｎ．Ｊ．）に移し、４０℃で１５分間、５０００×ｇで遠心分離した。
【０２６０】
最初に、ｅＣＲＭのＣＦＰＳ生成のための最良の温度および添加剤を評価するために、最適化実験を行った。３つの温度の各々でのＣＵＡコード化ｔＲＮＡの追加の補足（０、１、２、４、８、１２％ｖ／ｖ）およびｎｎＡＡ／合成酵素混合物（５０、１００、１５０、２００μｇ／ｍｌ）を含む、ＣＦＰＳ反応をセ氏３０、２５、および２０度で行った。遠心分離前および後のＣＦＰＳ混合物の試料を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって分析し、濃度測定によって塊を定量化して、各条件で生成された総タンパク質（遠心分離前の試料）の可溶性タンパク質（遠心分離後の試料）の量を評価した。
【０２６１】
図１は、定量化濃度測定によって評価されるような各条件で生成されたｎｎＡＡ−ｅＣＲＭの収率を示す。３０度でのＣＦＰＳ反応は、比較的小さい画分の可溶性タンパク質（全条件の中で、合計の最大約０．３３）を生成したが、可溶性タンパク質の収率は、２５度で増強され（全条件の中で、＞約０．４０の可溶性／合計）、２０度でさらに増強された（全条件の中で、＞約０．６０の可溶性／合計）。「低い」温度条件の両方で、可溶性タンパク質の収率は、ｔＲＮＡ濃度の増加によってさらに増強され（１〜１２ｘは、収率の増加を示す）、ｎｎＡＡ／合成酵素濃度の増加は、可溶性収率に対して有害な影響から影響なしであった。
【０２６２】
図１の実験に基づいて、２０度未満の温度および少なくとも２０μＭのｔＲＮＡ濃度を、Ｋ１１ＴＡＧ、Ｋ２５ＴＡＧ、Ｋ３４ＴＡＧ、Ｋ３８ＴＡＧ、Ｋ４０ＴＡＧ、Ｋ５２ＴＡＧ、Ｋ６０ＴＡＧ、Ｋ７７ＴＡＧ、Ｋ８３ＴＡＧ、Ｋ９１ＴＡＧ、Ｋ９６ＴＡＧ、およびＫ１０３ＴＡＧ変異形の合成のために選択した。
【０２６３】
ＣＦＰＳ反応を上記のように行った。これらの予備実験における精製の利便性のために、ヒスチジン標識（ＧＳＧＨＨＨＨＨＨ、配列番号１０）を、発現ベクターを介して担体タンパク質配列のＣ末端に融合させ、遠心分離後の上清からのｅＣＲＭ変異形の精製を、４０μＬの樹脂を含有するＩＭＡＣ  Ｐｈｙｔｉｐｓ（米国カリフォルニア州サンノゼ、Ｐｈｙｎｅｘｕｓ）を使用することによって実行した。樹脂床を、ＩＭＡＣ平衡緩衝液（１×ＰＢＳおよび１０ｍＭのイミダゾール）中で予め平衡化し、清澄化された上清を、４．２μＬ／分の流量で平衡化されたＩＭＡＣ  Ｐｈｙｔｉｐｓを通して１０回ピペットで移した。結合タンパク質を、ＩＭＡＣ平衡緩衝液で洗浄し、次に、１２５μＬのＩＭＡＣ溶出緩衝液（１×ＰＢＳおよび０．５Ｍのイミダゾール）で溶出させた。ヒスチジン標識は必須ではなく、大規模な精製のために省略される。
【０２６４】
ｎｎＡＡの組み込みおよび反応性を、ＤＢＣＯ−フルオレセインとの反応後に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび蛍光分析によって評価した（図２）。２〜１２μＭのｅＣＲＭを、５０μＭのＤＢＣＯ−フルオレセインで１６時間培養し、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、クマシーブルー（可視光）およびＳｙｐｒｏ−ｒｕｂｙフィルタセット（蛍光、フルオレセイン）で可視化した。図２は、ｅＣＲＭに組み込まれてＤＢＣＯと反応するｐＡＭＦの能力を示す、対応するクマシー（左）および蛍光（右）ゲル画像を示す。Ｋ２５、Ｋ３４、Ｋ３８、およびＫ４０のアンバー置換は、高い発現および接合効率を示し、他のものは、それらを示さない。
【０２６５】
実施例２：複数のｎｎＡＡ  ｅＣＲＭの設計
複数のｎｎＡＡ  ｅＣＲＭ変異形を、上記の詳細な記載において記載されるように選択した。変異体を、ＣＦＰＳを介して合成し、実施例１に沿って試験した。
【表２】
2020504760.tif 000049
【０２６６】
異なる数のＬｙｓ→ｐＡＭＦ置換を含むさらなる変形例を調製した。一般的には、より高い数の置換は、より高いＭＷ接合体に導く担体を与える（例えば、血清型１４について、２つの置換による９９８ｋＤａから、３つの置換による１２３８ｋＤａまで、４つの置換による１７８９ｋＤａまで、かつ５つの置換による２５４７ｋＤａまで上昇する）が、担体はより低い溶解度を有することが見出された。６つのｐＡＭＦ残基を有する担体は、一般に、良好な溶解度（＞＞５０ｍｇ／ｍＬ）および免疫原性の両方を提供した。高い溶解度は、疎水性ｐＡＭＦ残基を有する天然配列中の荷電したＬｙｓ残基の交換が、タンパク質であって、その疎水性がその溶解度に影響を与えることがすでに報告されている（Ｏｒｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９９  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６７：４２９０−４）タンパク質である、ＣＲＭ１９７の疎水性を増加させたため、驚くべきことであった。したがって、これらの結果は、荷電した残基が失われたときに不溶性を生じることなく、既知のＣＲＭ１９７接合体（すなわち、Ｌｙｓ残基）において使用された同じ付着部位を維持することが可能であることを示す。
【０２６７】
ＣＲＭ１９７の研究により、配列番号１の残基Ｐ２７２−Ｄ２９１、Ｖ３２２−Ｇ３８４、およびＱ４１２−Ｉ４５８内のＴ細胞エピトープが同定された。これらのエピトープ領域は、Ｌｙｓ残基Ｋ４２０、Ｋ４４１、Ｋ４４６、Ｋ４４８、およびＫ４５７を含み、そのため、これらのリジン残基の置換は、ＣＲＭ１９７の活性を支持するＴ細胞エピトープを破砕し得るであろう。配列番号１のｎｎＡＡによる置換に好ましいＬｙｓ残基は、したがって、上記の表２に示されるように、Ｋ２５、Ｋ３４、Ｋ３８、Ｋ４０、Ｋ２１３、Ｋ２１５、Ｋ２２８、Ｋ２４５、Ｋ２６５、Ｋ３８６、Ｋ５２３、およびＫ５２７である。
【０２６８】
接合された多糖類が、ＣＲＭ１９７表面の１つの領域に過度に強固に局所化されないことが望ましい。したがって、密集した残基内で、（ｉ）Ｋ２５、Ｋ３４、Ｋ３８、およびＫ４０のうちの１つのみ、および（ｉｉ）Ｋ２１３またはＫ２１５のいずれかを採取することが好ましい。さらに、その第１級構造を越えて、ＣＲＭ１９７の３Ｄ構造の研究により、２つの一般的な領域（Ａｓｎ−３７４への第１の走行およびＳｅｒ−３７５からの第２の走行）が同定され、そのため、これらの領域の両方において残基を採取する、例えば、６つの置換について、各領域において３つを採取することも好ましい。この一般的な誘導により、ＣＲＭ１９７担体に付着されたときに、多糖類を空間的に離間させることが可能になる。
【０２６９】
肺炎球菌接合体の作出に特に有用である１つの配列は、Ｋ３４、Ｋ２１３、Ｋ２４５、Ｋ２６５、Ｋ３８６、およびＫ５２７がｎｎＡＡによって交換される、表２の変異形１２である。このタンパク質は、各ＸがｐＡＭＦ（好ましいｎｎＡＡ）である配列番号９のアミノ酸配列を有する。このタンパク質は、以下に記載される接合体を調製するために使用される。
【０２７０】
リジン残基は、既知のＣＲＭ１９７接合体において使用されているアミノ酸であるため有用であり、そのため、これらの位置でのｎｎＡＡは、ＣＲＭ１９７と互換性があるとすでに知られているものと同じ部位に接合が生じすることを可能にする。しかしながら、前述のように、荷電したリジンの損失が、構造的変化、疎水性の増加、およびより低い溶解度を生じ得る。フェニルアラニン残基のフェニルアラニンベースのｎｎＡＡへの改変（パラ−アジド−Ｐｈｅ、パラ−アジド−メチル−Ｐｈｅ、パラ−フルオロ−Ｐｈｅ、パラ−アセチル−Ｐｈｅ、またはパラ−ベンゾイル−Ｐｈｅなど）は、これらの変化の危険性を低減するであろう。したがって、残基Ｆ１３、Ｆ５４、Ｆ１２４、Ｆ１２８、Ｆ１４１、Ｆ１６８、Ｆ２５１、Ｆ３９０、Ｆ５３１、またはＦ５３２がまた、単独でかつ組み合わせて、置換のために選択される。最大５つのＰｈｅ残基のｐＡＭＦによる置換が試験され、可溶性接合体を提供するが、同じ数の複数のＬｙｓ置換により達成されるよりも低いＭＷ接合体に対する傾向で提供される。
【０２７１】
ＣＲＭ１９７内でアミノ酸を置換するのではなく、ＣＲＭ１９７配列内にｎｎＡＡを挿入することも可能である。例えば、ｐＡＭＦをコードするＴＡＧコドンは、個別に（６つの点挿入を作出するために）または組み合わせて（２、３、４、５、または６個のｎｎＡＡを挿入する）のいずれかで、リジン残基Ｋ３４、Ｋ２１３、Ｋ２４５、Ｋ２６５、Ｋ３８６、およびＫ５２７の下流に直接挿入される。これらのように挿入されたｎｎＡＡを有する担体は、上記に記載されるような接合体および多価組成物を作製するのに有用である。
【０２７２】
実施例３：Ｐｆｓ２５におけるＴ細胞エピトープの同定
マラリアオーキネート特異的表面タンパク質Ｐｆｓ２５のＴ細胞活性化エピトープは、例えば、Ｄｉｅｔｈｅｌｍ−Ｏｋｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．１９９７  Ｆｅｂ；１７５（２）：３８２−９１に記載された方法に沿って実験的に判定される。簡潔に言うと、２０個のアミノ酸のペプチド断片および５個のアミノ酸による重複は、Ｐｆｓ２５の完全に発現された配列に対応する合成である。ＣＤ８＋が減損され、かつＣＤ４＋が豊富なヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）は、複数の対象から得られる。ＰＢＬは、３重にめっきされ、実験的刺激として機能するＰｆｓ２５配列にわたる個々の合成ペプチドで培養される。各ペプチド断片に応答するＰＢＬの増殖が、培養物を［３Ｈ］−チミジンで脈動させることによって測定され、これが異なる個体から発生する培養物にわたって比較される。増殖を刺激するＰｆｓ２５断片は、Ｔ細胞エピトープを含むように同定される。複数またはすべての対象からのＰＢＬの増殖を刺激する断片は、Ｐｆｓ２５中に汎用または免疫優性Ｔ細胞エピトープを含むものとして分類される。
【０２７３】
実施例４：メタ過ヨウ素酸ナトリウムによる多糖類の活性化についての一般的なプロトコル
血清型多糖類（約３０μモル）を、水溶液（１０ｍＭのＨＣｌ）中に溶解した。次に、溶液を４５℃で３０分間加熱し、次に冷却し、そのときｐＨを６．７０に調節するために、ＮａＯＨ溶液を加えた。ＨＰＬＣ等級水に対してＡＭＩＣＯＮ超遠心分離機（３０ｋＤａ  ＭＷＣＯ）を使用して、反応混合物を透析した。上清を５０ｍＬのファルコンチューブに移し、酢酸緩衝液（ｐＨ５．３５）を２５ｍＭまで加え、かつ０．５当量のＮａＩＯ４を加えた。混合物を、２５℃で１７時間攪拌し、その後、酸化試料を、任意選択的に、過度の水素化ホウ素ナトリウム（１０当量）で処理し、ＨＰＬＣ等級水のいくつかの変化に対してＡＭＩＣＯＮ超遠心分離機（３０ｋＤａ  ＭＷＣＯ）を使用して精製して、酸化多糖類溶液を得た。
【０２７４】
実施例５：ＤＢＣＯによる過ヨウ素酸塩−酸化多糖類の誘導体化のための一般的な手順
酸化多糖類（約３０μモル）を、１６％ＤＭＳＯを含有する、ｐＨ６．７９の７２ｍＭリン酸ナトリウム中のＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ＮＨ２（約３０μモル）またはＤＢＣＯ−ＮＨ２（約３０μモル）と２５℃で合わせた。次に、反応混合物を、２５℃で３０分間攪拌し、その後、シアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液（水中に１６ｍｇ／ｍｌの溶液、５９．５４μモル、２０当量）を加え、２５℃で２晩の間攪拌し続けた。次に、反応混合物を、エチル酢酸で３ｘ洗浄し、ＡＭＩＣＯＮ超遠心分離機（３０ｋＤａ  ＭＷＣＯ）に移し、次に、水中での２０％エタノールの６回の交換、続いて水との３回の交換を使用して透析し、多糖類−ＤＢＣＯ誘導体型の溶液を得た。次に、多糖類−ＤＢＣＯ誘導体を、１０：１（ｗ／ｗ）のショ糖で調合し、凍結乾燥して、次の接合反応で使用するための白色粉末を得た。
【０２７５】
実施例６：ＣＤＡＰによる多糖類の活性化のための一般的なプロトコル
莢膜多糖（３０ｍｇ）（ＰＳ  ３）を、水溶液（１．５ｍＬの２Ｍの酢酸を含む１３．５ｍＬのＨ２Ｏ）中に溶解した。混合物を、８５℃で１時間加熱し、周囲温度まで冷却した後、過度のマグネシウム塩化物を、１Ｍの溶液から加えた。結果として得られた多糖類を、水の６回の交換を使用したＡｍｉｃｏｎ遠心３０ｋＤａ  ＭＷＣＯの透析を使用して精製した。
【０２７６】
次に、調製された多糖類を、ｐＨ７．０の水中に溶解し、シアン化試薬ＣＤＡＰ（アセトニトリル中の１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロホウ酸）を加えた。次に、溶液をｐＨ９．５に調節するか、またはトリメチルアミン（２．５当量）を加えた。次に、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ＮＨ２またはＤＢＣＯ−ＮＨ２を溶液に加えた。溶液を５％ＤＭＳＯに調節し、２５℃で一晩攪拌した。溶液を、２０ｍＬのエチル酢酸で３ｘ洗浄し、３％ＤＭＳＯ、２０％エタノール、０．９％塩化ナトリウムとの７回の交換および水との３回の交換を使用したＡｍｉｃｏｎ  ３０ｋＤａ  ＭＷＣＯ透析ユニットを使用して精製した。次に、多糖類−ＤＢＣＯ誘導体を、ショ糖と１０：１（ｗ／ｗ）で調合し、凍結乾燥した。
【０２７７】
実施例７：ｅＣＲＭとの多糖類−ＤＢＣＯの接合のための一般的な手順
凍結乾燥され、１０：１ｗ／ｗのショ糖で調合された（実施例４または５の手順によって調製された）多糖類−ＤＢＣＯ試料を、０．９％ＮａＣｌ中に溶解し、溶液中でｅＣＲＭと混合して、１：１（ｗ／ｗ）のＰＳ：ｅＣＲＭ投入質量比率を得た。反応混合物を、手で緩やかに混合し、その後、室温（２０℃）で１８時間環状撹拌器で緩やかに混合した。クリック反応を、過度のアジ化ナトリウム溶液の付加によりクエンチした。接合されたＰＳ−ｅＣＲＭ混合物を、予め洗浄された透析チューブ（ＳｐｅｃｔｒｕｍＬａｂ  Ｆｌｏａｔ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｇ２，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｇ２３５０６０，３００Ｋ  ＭＷＣＯ）に移し、次に、２４時間にわたる０．９％塩化ナトリウム溶液の５回の交換に対して透析した。透析された溶液を、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＰ（０．２２μｍ、３３ｍｍのポリエーテルスルホン）を通して濾過し、ＰＳ−ｅＣＲＭ接合体溶液を得た。
【０２７８】
実施例８：表２からのｅＣＲＭへの肺炎球菌ＰＳ血清型１接合体の調製
１．酸化
１型ＰＳの純度：８０％（ウロン）
分子量：６２５ｇモル−１（繰り返し単位当たり）
反応手順
天然多糖類（１９．７ｍｇ、８０％に修正、１５．８ｍｇ、２５．２μモル）を、９．８５ｍＬの水溶液（７．０ｍＬの水および２．８５ｍＬの酢酸緩衝液、２００ｍＭ、ｐＨ５．５）中に溶解した。この溶液に、３００μＬの過ヨウ素酸ナトリウム溶液（１０４μｇ、３．７８μモル、０．１５当量）を加えた。混合物を、２５℃で１８時間攪拌し、その後、大きくモル過剰の水素化ホウ素ナトリウム（１０モル当量）を加えた。酸化ＰＳを、水による少なくとも６回の交換を使用したＡｍｉｃｏｎ遠心３０ｋＤａ  ＭＷＣＯ透析を使用して精製し、精製されたＰＳ−１溶液を得た。
【表３】
2020504760.tif 000050
【０２７９】
２．ＤＢＣＯ誘導体化
反応手順
ＰＳ１−ＯＸ（１５．８ｍｇ、２５．２μモル）を、リン酸緩衝液（３．６ｍＬ、５０ｍＭ、ｐＨ７．０）中に溶解し、これに、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ＮＨＳエステル（１．０当量、ＤＭＳＯ中に６４９．１ｇモル−１、０．３５ｍＬ）を加えた。反応混合物を、３７℃で２日間サーモスタット浴槽中で攪拌し、続いて、エチル酢酸（３×２０ｍＬ）で抽出した。ＤＢＣＯ誘導体を、水中での２０％エタノールとの６回の交換、続いて、水との３回の交換（各々１２ｍＬ）を使用して遠心透析ユニット（Ａｍｉｃｏｎ  ３０ｋＤａ  ＭＷＣＯ）によって精製し、１−ＤＢＣＯ誘導体型を得た。この溶液（２．２０ｍＬ、９．５９ｍｇ）に、ショ糖溶液（１ｍＬの水中に９６ｍｇ）を加えた。合わされた溶液を、３つの等しい部分に分割し、各々凍結乾燥して、白色粉末の３つの試料を得た。各試料は、次の接合反応で使用するために、３．１８ｍｇの１  ＤＢＣＯおよび３２ｍｇのショ糖を含有した。
【表４】
2020504760.tif 000051
【０２８０】
３．ｅＣＲＭとのＰＳ  １−ＤＢＣＯ誘導体の接合
ＰＳ  １−ＤＢＣＯ３．１８ｍｇ（３２ｍｇのショ糖を含む）の凍結乾燥粉末
ＤＢＣＯ（％）：１．６７％
ＣＲＭ濃度：６．５ｍｇ／ｍＬの溶液
ＰＳ：ＣＲＭ（投入比率）：１：１
反応手順
１−ＤＢＣＯを、アジド官能化ｅＣＲＭ溶液（０．５１ｍＬ）中に溶解して、１：１（ｗ／ｗ）のＰＳ１：ＣＲＭ投入質量比率を得た。ゲル形成を軽減するために、１．０ｍｇ  ｍＬ−１への０．９％塩化ナトリウム溶液によるさらなる希釈（０．２２μｍに濾過）が必要であった。溶液を、手で非常に緩やかに混合し、その後、室温（２０℃）で１８時間、環状撹拌器で緩やかに混合した。クリック反応を、アジ化ナトリウム溶液（１０ｍｇ／ｍＬ、５０μＬ）の付加によってクエンチした。ＣＲＭ接合体を、２つの予め洗浄された透析チューブ（ＳｐｅｃｔｒｕｍＬａｂ  Ｆｌｏａｔ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｇ２，３００Ｋ  ＭＷＣＯ）に移し、次に、０．９％塩化ナトリウム溶液で２４時間透析した（３回の交換、各々８００ｍｌ）。透析された溶液を、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＰ注射器フィルタ（０．２２μｍ、３３ｍｍのポリエーテルスルホン）を通して濾過し、１−ＣＲＭ接合体溶液を得た。
【表５】
2020504760.tif 000052
＊ＣＪＤ＝透析された接合体
【０２８１】
実施例９：表２からのｅＣＲＭへの肺炎球菌ＰＳ血清型２接合体の調製
１．酸化
２型ＰＳの純度：８０％
分子量：９６０．８４ｇモル−１
反応手順
天然多糖類（２５．５ｍｇ、２６．５μモル）を、１２．７５ｍＬの水溶液（９．２４ｍＬの水および３．５１ｍＬの酢酸緩衝液、２００ｍＭ、ｐＨ５．５）中に溶解した。この溶液に、２１６μＬの過ヨウ素酸ナトリウム溶液（５．２６ｍｇ／ｍｌ、０．２０当量）を加えた。混合物を、ＮａＩＯ４に対して２２２ｎｍでのＵＶ吸収によって監視しながら、２５℃で１８時間攪拌した。酸化ＰＳを、水との少なくとも６回の交換を使用したＡｍｉｃｏｎ遠心１００ｋＤａ  ＭＷＣＯ透析を使用して精製し、精製されたＰＳ−２溶液を得た。
【表６】
2020504760.tif 000053
【０２８２】
２．ＤＢＣＯ誘導体化
反応手順
２．１４ｍＬの水中のＰＳ２−ＯＸ（１８．１ｍｇ、１８．８μモル）を、リン酸緩衝液（１．９５ｍＬ、２００ｍＭ、ｐＨ６．０）で希釈し、これに、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ＮＨ２（９．８５ｍｇ、１当量、ＤＭＳＯ中、０．１９７ｍＬ）を加えた。２５分後、ＮａＣＮＢＨ３（２．３６ｍｇ、２当量Ｈ２Ｏ中の溶液から５９μＬ）を加えた。反応混合物を、サーモスタット浴槽中に２５℃で２日間攪拌し、続いて、リン酸緩衝液（０．５ｍＬの２００ｍＭ、ｐＨ＝６）を加えた。これに、ＮａＢＨ４（６０μＬの１０ｍｇ／ｍＬ水溶液、１当量）を加えた。３０分間の攪拌後、混合物を、エチル酢酸（４×５ｍＬ）で抽出した。残留エチル酢酸を、窒素ガスでバブリングすることによって除去し、混合物を、１００ｋＤａ  ＭＷＣＯ  Ａｍｉｃｏｎ遠心分離機フィルタに移した。ＤＢＣＯ誘導体を、水の１回の交換、続いて水中の２０％エタノールとの６回の交換、続いて水との３回の交換（各々１２ｍＬ）を使用して、遠心透析によって精製し、２−ＤＢＣＯ誘導体型を得た。この溶液（２．１４ｍＬ、１４．３ｍｇ）に、ショ糖溶液（１ｍＬの水中に１００ｍｇ）を加えた。合わされた溶液を、３つの略等しい部分に分割し、各々凍結乾燥して、白色粉末の３つの試料（４．９６ｍｇ、４．９６ｍｇ、および４．４ｍｇ）を得た。
【表７】
2020504760.tif 000054
【０２８３】
３．ｅＣＲＭとのＰＳ  ２−ＤＢＣＯ誘導体の接合
ＰＳ  ２−ＤＢＣＯ：４．４ｍｇ（３２ｍｇのショ糖を含む）の凍結乾燥粉末
％ＤＢＣＯ：４．０３％
ＣＲＭ濃度：３．１８ｍｇ／ｍＬの溶液
ＰＳ：ＣＲＭ（投入比率）：１．５：１
反応手順
ＰＳ２−ＤＢＣＯを、０．９％ＮａＣｌ（３．０１ｍＬ）中に溶解し、ＤＭＳＯ（０．４４ｍＬ）を加えた。次に、アジド官能化ｅＣＲＭ溶液（０．９５ｍＬ）を加えて、１．５：１（ｗ／ｗ）のＰＳ２：ＣＲＭ投入質量比率を得た。溶液を、手で非常に緩やかに混合し、その後、室温（２０℃）で１８時間、環状撹拌器で緩やかに混合した。クリック反応を、アジ化ナトリウム溶液（１０ｍｇ／ｍＬ、１００μＬ）の付加によってクエンチした。ＣＲＭ接合体を、２つの予め洗浄された透析チューブ（ＳｐｅｃｔｒｕｍＬａｂ  Ｆｌｏａｔ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｇ２，３００Ｋ  ＭＷＣＯ）に移し、次に、０．９％の塩化ナトリウム溶液で２４時間（５回の交換、各々１０００ｍｌ）透析した。透析された溶液を、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＰ注射器フィルタ（０．２２μｍ、３３ｍｍのポリエーテルスルホン）を通して濾過し、２−ＣＲＭ接合体溶液を得た。
【表８】
2020504760.tif 000055
【０２８４】
実施例１０：表２からのｅＣＲＭへの肺炎球菌ＰＳ血清型３接合体の調製
１．加水分解
３型ＰＳの純度：８６％（アントロン）
分子量：３６０．３ｇモル−１
反応手順
天然多糖類３（３０．０ｍｇ）を、１５．０ｍＬの水溶液（１３．５ｍＬの水および１．５ｍＬの酢酸、２Ｍ）中に溶解した。混合物を、８５℃で１時間加熱し、その後、周囲温度に対して冷却した後、塩化マグネシウム溶液（１．５ｍＬ、１Ｍ）を加えた。加水分解されたＰＳを、水との少なくとも６回の交換を使用したＡｍｉｃｏｎ遠心３０ｋＤａ  ＭＷＣＯ透析を使用して精製し、精製されたＰＳ−３溶液を得、次にこれを、２つの等しい分割量で凍結乾燥した。
【表９】
2020504760.tif 000056
【０２８５】
２．ＤＢＣＯ誘導体化
反応手順
加水分解されたＰＳ３（１２．７５ｍｇ、３５．４μモル）を、水（６．４ｍＬ）中に溶解し、水酸化ナトリウム溶液（０．２Ｍ、１００μＬ）でｐＨ７．０に調節した。次に、シアン化試薬ＣＤＡＰを、滴下（アセトニトリル中に０．４２６Ｍ、０．２当量、１６．７μＬ）で加えた。９０秒後、溶液を、水酸化ナトリウム溶液（０．２Ｍ、３００μＬ）でｐＨ９．５に迅速に調節した。ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ＮＨ２（ＤＭＳＯ中に０．０３２Ｍ、０．１当量、５２３ｇモル−１、０．１１０ｍＬ）を、すぐに滴下で加えた。追加のＤＭＳＯを加えて、５％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯ（０．３２０ｍＬ）を得た。反応混合物を、サーモスタット浴槽中に２５℃で一晩攪拌し、続いて、０．２２μｍのＰＥＳ注射器フィルタを通して濾過した。濾液をエチル酢酸（３×２０ｍＬ）で抽出した。ＤＢＣＯ誘導体を、３％ＤＭＳＯ、水中の２０％エタノール、０．９％塩化ナトリウムとの合計７回の交換、続いて、水との３回の交換（各々１２ｍＬ）を使用した遠心透析ユニット（Ａｍｉｃｏｎ  ３０ｋＤａ  ＭＷＣＯ）によって精製し、３−ＤＢＣＯ誘導体型を得た。次に、水溶液を、０．４５μｍのＰＶＤＦ注射器フィルタを通して濾過した。この溶液（３．８４ｍＬ、８．５２ｍｇ）に、１０倍の質量の過度のショ糖（０．８５ｍＬの水中に８５ｍｇ）を加えた。合わされた溶液を、凍結乾燥された３つの部分に分解して、白色粉末の３つの試料を得た。２つの試料は、合計３つについて残りの試料中に８．５ｍｇを有する、次の接合反応で使用するための５．０ｍｇの３−ＤＢＣＯおよび５０ｍｇのショ糖を含有した。
【表１０】
2020504760.tif 000057
【０２８６】
３．ｅＣＲＭとのＰＳ  ３−ＤＢＣＯ誘導体の接合
ＰＳ  ３−ＤＢＣＯ：５．０ｍｇ（５０ｍｇのショ糖を含む）の凍結乾燥粉末
ＤＢＣＯ割合（％）：５．０％
ＣＲＭ濃度：４．０ｍｇ／ｍＬの溶液
ＰＳ：ＣＲＭ（投入比率）：１：１
反応手順
３−ＤＢＣＯを、０．９％塩化ナトリウム溶液（６．３９ｍＬ、０．２２μｍに濾過）、リン酸緩衝液（ｐＨ７．０、０．５Ｍ、０．３３３ｍＬ）、およびＤＭＳＯ（０．８３３ｍＬ）中に溶解した。アジド官能化ｅＣＲＭ溶液（０．７７０ｍＬ）を、滴下で加えて、１：１（ｗ／ｗ）のＰＳ３：ＣＲＭ投入質量比率を得た。溶液を、手で非常に緩やかに混合し、その後、室温（２０℃）で１８時間、環状撹拌器で緩やかに混合した。クリック反応を、アジ化ナトリウム溶液（１０ｍｇ／ｍＬ、５０μＬ）の付加によってクエンチした。ＣＲＭ接合体を、予め洗浄された透析チューブ（ＳｐｅｃｔｒｕｍＬａｂ  Ｆｌｏａｔ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｇ２，３００Ｋ  ＭＷＣＯ）に移し、次に、０．９％塩化ナトリウム溶液で４８時間（４回の交換、各々１Ｌ）透析した。透析された溶液を、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＰ注射器フィルタ（０．２２μｍ、３３ｍｍのポリエーテルスルホン）を通して濾過し、３−ＣＲＭ接合体溶液を得た。
【表１１】
2020504760.tif 000058
＊ＣＪＦ＝透析および濾過された接合体
【０２８７】
実施例１１：表２からのｅＣＲＭへの肺炎球菌ＰＳ血清型３接合体の調製
１．酸化
３型ＰＳの純度：８６％（アントロン）
分子量：３６０．３ｇモル−１
反応手順
天然多糖類３（１４．４ｍｇ、８６％に修正、１２．４ｍｇ、３４．４μモル）を、７．２ｍＬの水溶液（５．９ｍＬの水および１．３ｍＬの酢酸緩衝液、２００ｍＭ、ｐＨ５．５）中に溶解した。この溶液に、３００μＬの過ヨウ素酸ナトリウム溶液（１．１０ｍｇ、５．１６μモル、０．１５当量）を加えた。混合物を、２５℃で１８時間攪拌した。酸化ＰＳを、水との少なくとも６回の交換を使用したＡｍｉｃｏｎ遠心３０ｋＤａ  ＭＷＣＯ透析を使用して精製し、精製されたＰＳ３−ＯＸ溶液を得た。
【表１２】
2020504760.tif 000059
【０２８８】
２．ＤＢＣＯ誘導体化
反応手順
ＰＳ３−ＯＸ（９．０５ｍｇ、２５．１μモル）を、リン酸緩衝液（２．１１ｍＬ、５０ｍＭ、ｐＨ６．７）中に溶解し、これに、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ＮＨ２（１．０当量、ＤＭＳＯ中に５２３ｇモル−１、０．４０ｍＬ）を加えた。反応混合物を、２５℃で２５分間攪拌し、その後、シアノ水酸化ホウ素ナトリウムの溶液（２当量、４４．５ｍｇ／ｍＬ、３５μＬ）を加えて、２日間攪拌した。この時点で、反応混合物を、エチル酢酸（３×２０ｍＬ）で抽出した。ＤＢＣＯ誘導体を、水中の２０％エタノールとの６回の交換、続いて、水との３回の交換（各々１２ｍＬ）を使用した遠心透析ユニット（Ａｍｉｃｏｎ  ３０ｋＤａ  ＭＷＣＯ）によって精製し、３−ＤＢＣＯ誘導体型を得た。この溶液（３．２０ｍＬ、８．６０ｍｇ）に、１０倍の質量の過度のショ糖（０．８６ｍＬの水中に８６ｍｇ）を加えた。合わされた溶液を、４つの部分に分割し、各々凍結乾燥して、白色粉末の３つの試料を得た。３つの試料は、合計４つについて、残りの試料中に２．６ｍｇを有する、次の接合反応で使用するための２．０ｍｇの３−ＤＢＣＯおよび２０ｍｇのショ糖を含有した。
【表１３】
2020504760.tif 000060
【０２８９】
３．ｅＣＲＭとのＰＳ  ３−ＤＢＣＯ誘導体の接合
ＰＳ  ３−ＤＢＣＯ：２．０ｍｇ（２０ｍｇのショ糖を含む）の凍結乾燥粉末
ＤＢＣＯ割合（％）：２．３％
ＣＲＭ濃度：４．０ｍｇ／ｍＬの溶液
ＰＳ：ＣＲＭ（投入比率）：１：１
反応手順
３−ＤＢＣＯを、０．９％塩化ナトリウム溶液（０．４００ｍＬ、０．２２μｍに濾過）およびＤＭＳＯ（０．１００ｍＬ）中に溶解した。アジド官能化ｅＣＲＭ溶液（０．３３０ｍＬ）を、滴下で加えて、１：１（ｗ／ｗ）のＰＳ３：ＣＲＭ投入質量比率を得た。溶液を、手で非常に緩やかに混合し、その後、室温（２０℃）で４８時間環状撹拌器で緩やかに混合した。クリック反応を、アジ化ナトリウム溶液（１０ｍｇ／ｍＬ、５０μＬ）の付加によってクエンチした。ＣＲＭ接合体を、２つの予め洗浄された透析チューブ（ＳｐｅｃｔｒｕｍＬａｂ  Ｆｌｏａｔ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｇ２，３００Ｋ  ＭＷＣＯ）に移し、次に、０．９％塩化ナトリウム溶液で４８時間（４回の交換、各々１Ｌ）透析した。透析された溶液を、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＰ注射器フィルタ（０．２２μｍ、３３ｍｍのポリエーテルスルホン）を通して濾過し、３−ＣＲＭ接合体溶液を得た。
【表１４】
2020504760.tif 000061
【０２９０】
実施例１２：表２からのｅＣＲＭへの肺炎球菌ＰＳ血清型４接合体の調製
１．酸化
４型ＰＳの純度：８０％（アントロン）
分子量：８２５．７８
反応手順
４型ＰＳ（２７．５ｍｇ、３３．３０μモル）粉末を、１３．７５ｍＬの水溶液（１２．３８ｍＬの水および１．３７ｍＬの０．１ＭのＨＣｌ）中に溶解した。次に、溶液を、４５℃で３０分間加熱し、次に、冷却し、そのとき、ＮａＯＨ溶液（０．１Ｍ、１．３７ｍＬ）を加えて、ｐＨを６．７０に調節した。反応混合物を、ＨＰＬＣ等級水との３回の交換（各々１２ｍＬ）によってＡＭＩＣＯＮ超遠心分離機（３０ｋＤａ  ＭＷＣＯが６〜１２ｍＬ）を使用して透析した。上清を、９．８４ｍＬの水を含む５０ｍＬのファルコンチューブに移した。この溶液に、３．４３ｍＬの２００ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．３５）および６３２μＬのＮａＩＯ４溶液（３．５６ｍｇ、１６．６５μモル、０．５当量）を加えた。混合物を、２５℃で１７時間攪拌し、その後、酸化試料を、ＨＰＬＣ等級水のＡＭＩＣＯＮ超遠心分離機（３０ｋＤａ  ＭＷＣＯが６〜１２ｍＬ）の６回の交換（１２ｍＬ）を使用して精製し、酸化ＰＳ−４溶液を得た。
【表１５】
2020504760.tif 000062
【０２９１】
２．ＤＢＣＯ誘導体化
反応手順
酸化（１０％の酸化レベルを想定）４型ＰＳ溶液（２４．５８ｍｇ、２９．７７μモル、２．４ｍＬの水）に、緩衝溶液（１．８ｍＬの２００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ＝６．７９）、ＤＭＳＯ（０．６ｍＬ）、およびＤＢＣＯ−ＰＥＧ−４−ＮＨ２の溶液（２００μＬのＤＭＳＯ中に１５ｍｇ、２８．６５μモル、９．６当量）をすべて２５℃で加えた。次に、反応混合物を、２５℃で３０分間攪拌し、その後、２２４μＬのシアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液（３００μＬの水中に５．０ｍｇ、５９．５４μモル、２０当量）を加え、２日間２５℃で攪拌し続けた。反応混合物を、リン酸緩衝液（５００μＬの２００ｍＭ溶液、ｐＨ＝６）で希釈し、その後、２２５μＬの水素化ホウ素ナトリウム溶液（０．０１ｍｇ／μＬ、１０当量）を水中に加えた。３０分間の攪拌後、反応混合物を、エチル酢酸（３×２０ｍＬのエチル酢酸）で抽出し、次に、ＡＭＩＣＯＮ超遠心分離機（３０ｋＤａ  ＭＷＣＯが６〜１２ｍＬ）に移し、次に、水中の２０％エタノールとの６回の交換、続いて、水との３回の交換（各々１２ｍＬ）を使用して透析し、４  ＤＢＣＯ誘導体型の溶液を得た。この溶液（４．７５ｍＬ、１５．２５ｍｇ）に、ショ糖溶液（１ｍＬの水中に１５３ｍｇ）を加えた。合わされた溶液を、３つの部分に分割し、各々凍結乾燥して、白色粉末の３つの試料を得た。２つの試料は、５．３５ｍｇの４ＤＢＣＯおよび５４ｍｇのショ糖を含有し、１つの試料は、次の接合反応で使用するための４．５５ｍｇの４ＤＢＣＯおよび４５ｍｇのショ糖を含有した。
【表１６】
2020504760.tif 000063
【０２９２】
３．ｅＣＲＭとのＰＳ  ４−ＤＢＣＯ誘導体の接合
ＰＳ  ４−ＤＢＣＯ：５．３５ｍｇ（５４ｍｇのショ糖を含む）の白色粉末
ＤＢＣＯ割合（％）：３．５２％
ＣＲＭ濃度：４ｍｇ／ｍＬの溶液
ＰＳ：ＣＲＭ（投入比率）：１．２０：１
反応手順
４型ＤＢＣＯ試料（５４ｍｇのショ糖を含む５．３５ｍｇの白色粉末）を、０．６７ｍＬの０．９％のＮａＣｌ溶液中に溶解し、次に、アジド官能化ｅＣＲＭ溶液（０．７４ｍＬ）を加えた。１０分後、アジド官能化ｅＣＲＭの別の部分（０．３７ｍＬ）を加えて、１．２０：１（ｗ／ｗ）のＰＳ４：ＣＲＭ質量比率を得た。反応混合物を、手で緩やかに混合し、その後、室温（２０℃）で２日間環状撹拌器で緩やかに混合した。接合されたＰＳ−ＣＲＭ混合物を、予め洗浄された透析チューブ（ＳｐｅｃｔｒｕｍＬａｂ  Ｆｌｏａｔ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｇ２，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｇ２３５０６０，３００Ｋ  ＭＷＣＯ）に移し、その後、０．９％塩化ナトリウム溶液で２４時間（５回の交換、各々８００ｍｌ）透析した。透析された溶液を、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＰ（０．２２μｍ、３３ｍｍのポリエーテルスルホン）を通して濾過し、４型ＰＳ−ＣＲＭ接合体溶液を得た。
【表１７】
2020504760.tif 000064
【０２９３】
実施例１３：表２からのｅＣＲＭへの肺炎球菌ＰＳ血清型５接合体の調製
１．酸化
５型ＰＳの純度：８９％（ウロン酸）
分子量：９１９．３２
反応手順
５型ＰＳ（２２．８ｍｇ、２４．３６μモル）粉末を、８．２６ｍＬの水および３．１４ｍＬの２００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．２６）および１６３μＬのＮａＩＯ４溶液（１．３ｍｇ、６．１μモル、０．２５当量）中に溶解した。混合物を、２５℃で１８時間攪拌し、その後、酸化試料を、ＨＰＬＣ等級水のＡＭＩＣＯＮ超遠心分離機（１００ｋＤａ  ＭＷＣＯが６〜１２ｍＬ）の６回の交換（１２ｍＬ）を使用して精製し、酸化ＰＳ−５溶液を得た。
【表１８】
2020504760.tif 000065
【０２９４】
２．ＤＢＣＯ誘導体化
反応手順
酸化（１０％の酸化レベルを想定）５型ＰＳ溶液（６．２５ｍｇ、６．６８μモル、０．９９２ｍＬの水）に、緩衝溶液（０．０６３ｍＬの２００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ＝６．７４）、ＤＭＳＯ（２５μＬ）、およびＤＢＣＯ−ＰＥＧ−４−ＮＨ２の溶液（１００μＬのＤＭＳＯ中に３．５ｍｇ、６．６８μモル、１０当量）をすべて２５℃で加えた。次に、反応混合物を、３７℃で３０分間攪拌し、その後、８４μＬのシアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液（８４μＬの水中に０．８４ｍｇ、１３．３６μモル、２０当量）を加え、３７℃で２４時間攪拌し続けた。反応混合物を、エチル酢酸（６×１０ｍＬ）で抽出した。抽出物を、ＡＭＩＣＯＮ超遠心分離機フィルタ（３０ｋＤａ  ＭＷＣＯが６〜１２ｍＬ）に移し、次に、水中の２０％エタノールとの８回の交換（各々１２ｍＬ）、続いて、水との３回の交換（各々１２ｍＬ）を使用して透析し、５  ＤＢＣＯ誘導体型を得た。この溶液（５．３５ｍＬ、６．０ｍｇ）に、ショ糖溶液（０．６ｍＬの水中に６０ｍｇ）を加えた。合わされた溶液を、２つの等しい部分に分割し、各々凍結乾燥して、白色粉末の２つの試料を得た。各試料は、次の接合反応で使用するための３．０ｍｇの５ＤＢＣＯおよび３０ｍｇのショ糖を含有した。
【表１９】
2020504760.tif 000066
【０２９５】
３．ｅＣＲＭとのＰＳ  ５−ＤＢＣＯ誘導体の接合
ＰＳ  ５−ＤＢＣＯ：３．０ｍｇ（３０ｍｇのショ糖を含む）の白色粉末
ＤＢＣＯ割合（％）：５．１７％
ＣＲＭ濃度：３．２５ｍｇ／ｍＬの溶液
ＰＳ：ＣＲＭ（投入比率）：１：１
反応手順
５−ＤＢＣＯ誘導体（３０ｍｇのショ糖を含む３．０ｍｇの白色粉末）を、０．９％塩化ナトリウム溶液（４．４８ｍＬ）およびＤＭＳＯ（０．６ｍＬ）中に溶解した。アジド官能化ｅＣＲＭ溶液（０．９２ｍＬ）を加えて、１：１（ｗ／ｗ）のＰＳ５：ＣＲＭ質量比率を得た。反応混合物を、緩やかに混合し、その後、室温（２０℃）で５時間環状撹拌器で緩やかに混合した。アジ化ナトリウム溶液（２０μＬ、水中で１０ｍｇ／ｍＬ）を加えた。３０分後、接合されたＰＳ−ＣＲＭ混合物を、予め洗浄された透析デバイス（ＳｐｅｃｔｒｕｍＬａｂ  Ｆｌｏａｔ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｇ２，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｇ２３５０６０，３００Ｋ  ＭＷＣＯ）に移し、その後、０．９％塩化ナトリウム溶液で２４時間（５回の交換、各々８００ｍｌ）透析した。透析された溶液を、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＰ（０．２２μｍ、３３ｍｍのポリエーテルスルホン）を通して濾過し、５ＰＳ−ＣＲＭ接合体溶液を得た。
【表２０】
2020504760.tif 000067
【０２９６】
実施例１４：表２からのｅＣＲＭへの肺炎球菌ＰＳ血清型６Ａ接合体の調製
１．酸化
６Ａ型ＰＳの分子量：７０６
水中のＮａＩＯ４溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）
【０２９７】
反応手順
ＰＳ−６Ａ（１５ｍｇ、２１．２μモル）粉末を、７．５ｍＬの水溶液（１０ｍＭの酢酸ナトリウム溶液、ＰＨ４．５）中に溶解した。この溶液に、３６．３μＬのＮａＩＯ４溶液（０．３６３ｍｇ、１．６９μモル、０．０８当量）を加えた。混合物を、４℃で１８時間攪拌し、その後、酸化試料を、予め洗浄された透析チューブ（ＳｐｅｃｔｒｕｍＬａｂ  Ｆｌｏａｔ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｇ２，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｇ２３５０５７、２０Ｋ  ＭＷＣＯ）に移し、次に、ＰＨ６．８の５０ｍｍのＰＢ緩衝液で２４時間（４回の交換、各々６００ｍｌ）透析し、酸化ＰＳ−６Ａ溶液を得た。透析後、ＤＭＳＯを加えて、ＰＨ６．８の５０ｍｍのＰＢ緩衝液で１０％ＤＭＳＯにＰＳ−６Ａを作製する。
【表２１】
2020504760.tif 000068
【０２９８】
２．ＤＢＣＯ誘導体化
ＰＳの最終濃度：３．３７ｍｇ／ｍｌ
緩衝液の最終濃度：５０ｍＭのＰＢ（ｐＨ６．８）中に１０％ＤＭＳＯ
反応手順
酸化６Ａ型ＰＳ溶液（１３．５ｍｇ、１９．１μモル、１０％ＤＭＳＯ中に４ｍＬ、５０ＭｍのＰＢ、ＰＨ６．８）に、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ＮＨ２の溶液（１００．１μＬのＤＭＳＯ中に１０．０１ｍｇ、１９．１μモル、１０当量）を２５℃で加えた。次に、反応混合物を、２５℃で６０分間攪拌し、その後、シアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液（１２０μＬの水中に１．２ｍｇ、１９．１μモル、１０当量）を加え、２５℃で２４時間攪拌し続けた。次に、反応混合物を、予め洗浄された透析チューブ（ＳｐｅｃｔｒｕｍＬａｂ  Ｆｌｏａｔ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｇ２，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｇ２３５０５７、２０Ｋ  ＭＷＣＯ）に移し、次に、５０ｍＭのＰＢ緩衝液中の２０％エタノールとの４回の交換、続いて、５０ｍＭのＰＢ緩衝液との３回の交換を使用して透析し、６Ａ  ＤＢＣＯ誘導体型を得た。
【表２２】
2020504760.tif 000069
【０２９９】
３．ｅＣＲＭとのＰＳ  ６Ａ−ＤＢＣＯ誘導体の接合
ＰＳ  ６Ａ−ＤＢＣＯ：７．１ｍｇ（７１ｍｇのショ糖を含む）の白色粉末
ＤＢＣＯ：９％
ＣＲＭ濃度：２．６１７ｍｇ／ｍＬの溶液
ＰＳ：ＣＲＭ（投入比率）：２：１
ＰＳの最終濃度：５．２ｍｇ／ｍｌ
反応手順
アジド官能化ｅＣＲＭ溶液（１．４ｍＬ）を、６Ａ  ＤＢＣＯ誘導体（７１ｍｇのショ糖を含む７．１ｍｇの白色粉末）を加えて、２：１（ｗ／ｗ）のＰＳ  ６Ａ：ＣＲＭ質量比率を得た。反応混合物を、手で緩やかに混合し、その後、室温（２３℃）で１７時間環状撹拌器で緩やかに混合した。次に、混合物を、培養器（３７℃）中に３時間置いた。反応後、混合物を、０．９％塩化ナトリウム溶液によって２倍に希釈し、水素化ホウ素ナトリウム（１９１μＬの水中に１．９ｍｇ、５０．２μモル、５０当量）によって３時間還元した。接合されたＰＳ−ＣＲＭ混合物を、予め洗浄された透析チューブ（ＳｐｅｃｔｒｕｍＬａｂ  Ｆｌｏａｔ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｇ２，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｇ２３５０７２，３００Ｋ  ＭＷＣＯ）に移し、次に、ＰＨ７のＰＢＳで２４時間（３回の交換、各々１０００ｍｌ）透析した。透析された溶液を、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＰ（０．２２μｍ、３３ｍｍのポリエーテルスルホン）を通して濾過し、６Ａ  ＰＳ−ＣＲＭ接合体溶液を得た。
【表２３】
2020504760.tif 000070
【０３００】
実施例１５：表２からのｅＣＲＭへの肺炎球菌ＰＳ血清型６Ｂ接合体の調製
１．酸化
６Ｂ型ＰＳの純度：８０％（アントロン）
分子量：７０６．１８
水中のＮａＩＯ４溶液（５．４５ｍｇ／ｍＬ）
反応手順
ＰＳ−６Ｂ（２７．２８ｍｇ、８０％に修正、２１．８２ｍｇ、３０．９μモル）粉末を、１４ｍＬの水溶液（９．５ｍＬの水および４．５ｍＬの０．２Ｍの酢酸緩衝液、ｐＨ＝５．５）中に溶解した。この溶液に、１４５μＬのＮａＩＯ４溶液（０．７９ｍｇ、３．７１μモル、０．１２当量）を加えた。混合物を、２５℃で１８時間攪拌し、その後、酸化試料を、ＨＰＬＣ等級水のＡＭＩＣＯＮ超遠心デバイス（３０ｋＤａ  ＭＷＣＯが６〜１２ｍＬ）の６回の交換（１２ｍＬ）を使用して精製し、酸化ＰＳ−６Ｂ溶液を得た。
【表２４】
2020504760.tif 000071
【０３０１】
２．ＤＢＣＯ誘導体化
ＰＳの最終濃度：３．５ｍｇ／ｍｌ
緩衝液の最終濃度：５３μＭ（ｐＨ６．０）
反応手順
酸化（１０％の酸化レベルを想定）６Ｂ型ＰＳ溶液（１８．４ｍｇ、２７．６μモル、３．３５ｍＬの水）に、緩衝溶液（１．４ｍＬの２００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ＝６．０１）、ＤＭＳＯ（７００μＬ）、およびＤＢＣＯ−ＰＥＧ−４−ＮＨ２の溶液（２９５μＬのＤＭＳＯ中に１４．４３ｍｇ、２７．６μモル、１０当量）をすべて２５℃で加えた。次に、反応混合物を、２５℃で３０分間攪拌し、その後、７５μＬのシアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液（２００μＬの水中に９．３９ｍｇ、５５．６μモル、２０当量）を加え、２日間２５℃で攪拌し続けた。反応混合物を、リン酸緩衝液（５００μＬの２００ｍＭ溶液、ｐＨ＝６）で希釈し、その後、１０４μＬの水素化ホウ素ナトリウムの溶液（０．０１ｍｇ／μＬ、１０当量）を水中に加えた。３０分間攪拌した後、反応混合物を、エチル酢酸（３×２０ｍＬのエチル酢酸）で抽出し、その後、ＡＭＩＣＯＮ超遠心分離機（３０ｋＤａ  ＭＷＣＯが６〜１２ｍＬ）に移し、次に、水中の２０％エタノールとの６回の交換、続いて、水との３回の交換（各々１２ｍＬ）を使用して透析し、６Ｂ  ＤＢＣＯ誘導体型の溶液を得た。この溶液（２．９６ｍＬ、２０．１ｍｇ）に、ショ糖溶液（１ｍＬの水中に２００ｍｇ）を加えた。合わされた溶液を、３つの等しい部分に分割し、各々凍結乾燥して、白色粉末の３つの試料を得た。各試料は、次の接合反応で使用するための６．７ｍｇの６Ｂ  ＤＢＣＯおよび６７ｍｇのショ糖を含有した。
【表２５】
2020504760.tif 000072
【０３０２】
３．ｅＣＲＭとのＰＳ  ６Ｂ−ＤＢＣＯ誘導体の接合
ＰＳ  ６Ｂ−ＤＢＣＯ：６．７ｍｇ（６７ｍｇのショ糖を含む）の白色粉末
ＤＢＣＯ割合（％）：３．２％
ＣＲＭ濃度：２．６１７ｍｇ／ｍＬの溶液
ＰＳ：ＣＲＭ（投入比率）：２：１
ＰＳの最終濃度：５．２３ｍｇ／ｍｌ
反応手順
アジド官能化ｅＣＲＭ溶液（１．２８ｍＬ）を、６Ｂ−ＤＢＣＯ誘導体（６７ｍｇのショ糖を含む６．７０ｍｇの白色粉末）に加えて、２：１（ｗ／ｗ）のＰＳ６Ｂ：ＣＲＭ質量比率を得た。反応混合物を、手で緩やかに混合し、その後、室温（２０℃）で１７時間環状撹拌器で緩やかに混合した。次に、混合物を、オーブン（３７℃）中に２時間置いた。接合されたＰＳ−ＣＲＭ混合物を、予め洗浄された透析チューブ（ＳｐｅｃｔｒｕｍＬａｂ  Ｆｌｏａｔ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｇ２，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｇ２３５０７１、１００Ｋ  ＭＷＣＯ）に移し、次に、０．９％塩化ナトリウム溶液で２４時間（３回の交換、各々８００ｍｌ）透析した。透析された溶液を、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＰ（０．２２μｍ、３３ｍｍのポリエーテルスルホン）を通して濾過し、６Ｂ  ＰＳ−ＣＲＭ接合体溶液を得た。
【表２６】
2020504760.tif 000073
【０３０３】
実施例１６：表２からのｅＣＲＭへの肺炎球菌ＰＳ血清型７Ｆ接合体の調製
１．ＣＤＡＰ活性化およびＤＢＣＯ架橋
ＰＳ  ７Ｆを精製：ｎ．ｄ．％（アントロン）−１００％を想定
【０３０４】
分子量：１２２７ｇモル−１（繰り返し単位）
【０３０５】
反応手順
ＰＳ７Ｆ（６．２ｍｇ、５．１μモル）を、水（３．１ｍＬ）中に溶解し、これに、ＣＤＡＰ（２．０当量、アセトニトリル中に１００ｍｇ／ｍＬ、２４μＬ）を加えた。反応混合物を、室温（室温）で３０秒間攪拌した。この時点で、トリエチルアミン（ＴＥＡ、２．５当量、０．２Ｍ、６３μＬ）を加え、反応混合物を１２０秒間攪拌した。ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ＮＨ２（１．０当量、ＤＭＳＯ中に２８．７μモル／ｍＬ、１８０μＬ）を、ホウ酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ８．５、１．０ｍＬ）と共に加え、室温で一晩攪拌した。ＤＢＣＯ−誘導体化ＰＳ７Ｆを、エタノール沈殿によって、かつ水との３回の交換を使用した遠心透析（Ａｍｉｃｏｎ  １００ｋＤａ  ＭＷＣＯ）によって精製した。ＵＶ吸収分光法、アントロンアッセイ、およびＳＥＣによる分析後、この溶液（３．６１ｍＬ、３．０５ｍｇ）を、ショ糖溶液（１０倍の質量含有量、１００ｍｇ／ｍＬ）で希釈し、白色粉末に凍結乾燥した。
【表２７】
2020504760.tif 000074
【０３０６】
２．ｅＣＲＭとのＰＳ  ７Ｆ−ＤＢＣＯ誘導体の接合
ＰＳ  ７Ｆ−ＤＢＣＯ：２．６２ｍｇ（２６．２ｍｇのショ糖を含む）の凍結乾燥粉末
【０３０７】
ＤＢＣＯ割合（％）：８．１％
【０３０８】
ＣＲＭ：ＰＢＳ緩衝液中に５．０ｍｇ／ｍＬ
【０３０９】
ＰＳ：ＣＲＭ（投入質量比率）：１．７３：１
【０３１０】
反応手順
凍結乾燥された７Ｆ−ＤＢＣＯを、塩水（０．９％（ｗ／ｖ）、０．９３８ｍＬ）、リン酸緩衝液（０．５Ｍ、ｐＨ７．０、５８μＬ）、およびＤＭＳＯ（１４４μＬ）中に溶解し、これに、ｅＣＲＭ溶液（０．３００ｍＬ）を加えて、１．７３：１．００（ｗ／ｗ）のＰＳ７Ｆ：ＣＲＭ投入質量比率を得た。溶液を、手で非常に緩やかに混合し、その後、室温（２０℃）で１７時間環状撹拌器で緩やかに混合した。ＣＲＭ接合体を、２つの予め洗浄された透析チューブ（ＳｐｅｃｔｒｕｍＬａｂ  Ｆｌｏａｔ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｇ２，３００Ｋ  ＭＷＣＯ）に移し、その後、０．９％塩化ナトリウム溶液で２４時間（３回の交換、各々８００ｍｌ）透析した。透析された溶液を、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＰ注射器フィルタ（０．２２μｍ、３３ｍｍのポリエーテルスルホン）を通して滅菌濾過し、７Ｆ−ＣＲＭ接合体溶液を得た。
【表２８】
2020504760.tif 000075
【０３１１】
実施例１７：表２からのｅＣＲＭへの肺炎球菌ＰＳ血清型８接合体の調製
１．酸化
８型ＰＳの純度  ８４％
分子量：６８４．５４ｇモル−１
反応手順
天然多糖類（４２ｍｇ、６１．３μモル）を、２１ｍＬの水溶液（１４．７ｍＬの水および６．３ｍＬの酢酸緩衝液、２００ｍＭ、ｐＨ５．５）中に溶解した。この溶液に、過ヨウ素酸ナトリウム溶液（２．６３ｍｇに対して計算される、０．２０当量）に加えた。混合物を、ＮａＩＯ４に対して２２２ｎｍでのＵＶ吸収によって監視しながら、２５℃で１８時間攪拌した。酸化ＰＳを、水との少なくとも６回の交換を使用したＡｍｉｃｏｎ遠心３０ｋＤａ  ＭＷＣＯ透析を使用して精製し、精製されたＰＳ−８溶液を得た。
【表２９】
2020504760.tif 000076
【０３１２】
２．ＤＢＣＯ誘導体化
反応手順
３．１４ｍＬの水中のＰＳ８−ＯＸ（３３．８ｍｇ、４９．４μモル）を、リン酸緩衝液（７８９μＬ、０．５Ｍ、ｐＨ６．０）、１ｍＬのＨ２Ｏ、およびＤＭＳＯ（３１３μＬ）で希釈し、これに、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ＮＨ２（２５ｍｇ、１当量、ＤＭＳＯ中、２５０μＬ）を加えた。１０分後、ＮａＣＮＢＨ３（６．２ｍｇ、２当量（２００μＬのＨ２Ｏ中の９．４３ｍｇから１３２μＬを添加することによる））を加えた。反応混合物を、サーモスタット浴槽中に２５℃で２日間攪拌し、続いて、リン酸緩衝液（０．５ｍＬの２００ｍＭ、ｐＨ＝６）を加えた。これに、ＮａＢＨ４（１当量）を加えた。３０分間の攪拌後、混合物を、エチル酢酸（３×５ｍＬ）で抽出した。残留エチル酢酸を、窒素ガスでバブリングすることによって除去し、混合物を、１００ｋＤａ  ＭＷＣＯ  Ａｍｉｃｏｎ遠心分離機フィルタに移した。ＤＢＣＯ誘導体を、２０％ＥｔＯＨとの６回の交換、および水との３回の交換（各々１２ｍＬ）を使用した遠心透析によって精製し、８−ＤＢＣＯ誘導体型を得た。この溶液（５．６３ｍＬ、２５ｍｇ）にショ糖溶液を加え、凍結乾燥した。
【表３０】
2020504760.tif 000077
【０３１３】
３．ｅＣＲＭとのＰＳ  ８−ＤＢＣＯ誘導体の接合
ＰＳ  ８−ＤＢＣＯ：３．７７ｍｇ（３８ｍｇのショ糖を含む）の凍結乾燥粉末
ＤＢＣＯ割合（％）：３．５７％
ＣＲＭ濃度：５．９６６ｍｇ／ｍＬの溶液
ＰＳ：ＣＲＭ（投入比率）：１．５：１
反応手順
ＰＳ８−ＤＢＣＯを、０．９％ＮａＣｌ（２．２８ｍＬ）、リン酸緩衝液（０．１２６ｍＬ、０．５Ｍ、ｐＨ７．０）、およびＤＭＳＯ（０．３１４ｍＬ）中に溶解した。次に、アジド官能化ｅＣＲＭ溶液（０．４２ｍＬ）を加えて、１．５：１（ｗ／ｗ）のＰＳ８：ＣＲＭ投入質量比率を得た。溶液を、手で非常に緩やかに混合し、その後、室温（２０℃）で１時間環状撹拌器で緩やかに混合し、次に、３７℃で一晩オーブン中に置いた。クリック反応を、アジ化ナトリウム溶液（１０ｍｇ／ｍＬ、１００μＬ）の付加によってクエンチした。ＣＲＭ接合体を、予め洗浄された透析チューブ（ＳｐｅｃｔｒｕｍＬａｂ  Ｆｌｏａｔ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｇ２，３００Ｋ  ＭＷＣＯ）に移し、次に、０．９％塩化ナトリウム溶液で４８時間（８回の交換、各々１０００ｍｌ）透析した。透析された溶液を、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＰ注射器フィルタ（０．２２μｍ、３３ｍｍのポリエーテルスルホン）を通して濾過し、８−ＣＲＭ接合体溶液を得た。
【表３１】
2020504760.tif 000078
【０３１４】
実施例１８：表２からのｅＣＲＭへの肺炎球菌ＰＳ血清型９Ｎ接合体の接合
１．酸化
９Ｎ型ＰＳの純度：７５％
分子量：９２８．２９ｇモル−１
反応手順
天然多糖類（１９．０ｍｇ、２０．４μモル）を、９．４９ｍＬの水溶液（７．１２ｍＬの水および２．３７ｍＬの酢酸緩衝液、２００ｍＭ、ｐＨ５．５）中に溶解した。この溶液に、過ヨウ素酸ナトリウム溶液（１．３１ｍｇ、０．３０当量、１．０ｍＬの水溶液中に２３．６５ｍｇからの５６μＬ）を加えた。混合物を、ＮａＩＯ４に対して２２２ｎｍでのＵＶ吸収によって監視しながら、２５℃で１８時間攪拌した。酸化ＰＳを、水との４回の交換を使用したＡｍｉｃｏｎ遠心３０ｋＤａ  ＭＷＣＯ透析を使用して精製し、精製されたＰＳ−９溶液を得た。
【表３２】
2020504760.tif 000079
【０３１５】
２．ＤＢＣＯ誘導体化
反応手順
１．６４３ｍＬの水中のＰＳ９Ｎ−ＯＸ（１２．６ｍｇ、１３．６μモル）を、リン酸緩衝液（０．９４５ｍＬ、９４．５ｍｇのショ糖を含有するｐＨ６．０の２００ｍＭ）およびＤＭＳＯ（０．３３ｍＬ）で希釈し、これに、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ＮＨ２（７．２ｍｇ、１当量、ＤＭＳＯ中、０．１４２ｍＬ）を加えた。１０分後、ＮａＣＮＢＨ３（１．７１ｍｇ、２当量（２００μＬのＨ２Ｏ中の７．３６ｍｇから４７μＬを添加することによる））を加えた。反応混合物を、２５℃で２日間サーモスタット浴槽中で攪拌し、続いて、リン酸緩衝液（０．４ｍＬの２００ｍＭ、ｐＨ＝６）を加えた。これに、ＮａＢＨ４（０．５１ｍｇ、１当量）を加えた。３０分間の攪拌後、混合物を、エチル酢酸（５×５ｍＬ）で抽出した。残留エチル酢酸を、窒素ガスでバブリングすることによって除去し、混合物を、３０ｋＤａ  ＭＷＣＯ  Ａｍｉｃｏｎ遠心分離機フィルタに移した。ＤＢＣＯ誘導体を、水との３回の交換（各々１２ｍＬ）、続いて、２０％の水性エタノールとの６回の交換（各々１２ｍＬ）、最後に、水との３回の交換（各々１２ｍＬ）を使用した遠心分析によって精製し、９Ｎ−ＤＢＣＯ誘導体型を得た。この溶液（２．３８８ｍＬ、９．０５ｍｇ）にショ糖溶液を加え、凍結乾燥した。
【表３３】
2020504760.tif 000080
【０３１６】
３．ｅＣＲＭとのＰＳ  ９Ｎ−ＤＢＣＯ誘導体の接合
ＰＳ  ９Ｎ−ＤＢＣＯ：４．５ｍｇ（４５ｍｇのショ糖を含む）の凍結乾燥粉末
ＤＢＣＯ割合（％）：４．９％
ＣＲＭ濃度：３．０ｍｇ／ｍＬの溶液
ＰＳ：ＣＲＭ（投入比率）：１．５：１
反応手順
ＰＳ９Ｎ−ＤＢＣＯを、ｐＨ＝７のリン酸緩衝液（９６μＬの０．５Ｍ）と共に０．９％ＮａＣｌ（１．３０ｍＬ）中に溶解し、ＤＭＳＯ（０．２４ｍＬ）を加えた。次に、アジド官能化ｅＣＲＭ溶液（０．６０ｍＬ）を加えて、１．５：１（ｗ／ｗ）のＰＳ：ＣＲＭ投入質量比率を得た。溶液を、手で非常に緩やかに混合し、その後、室温（２０℃）で１８時間、環状撹拌器で緩やかに混合した。クリック反応を、アジ化ナトリウム溶液（１０ｍｇ／ｍＬ、１００μＬ）の付加によってクエンチした。ＣＲＭ接合体を、２つの予め洗浄された透析チューブ（ＳｐｅｃｔｒｕｍＬａｂ  Ｆｌｏａｔ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｇ２，３００Ｋ  ＭＷＣＯ）に移し、次に、これに加えられた３ｍＬのｐＨ＝７の緩衝液を含む０．９％塩化ナトリウム溶液で２４時間（７回の交換、各々１０００ｍｌ）透析した。透析された溶液を、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＰ注射器フィルタ（０．２２μｍ、３３ｍｍのポリエーテルスルホン）を通して濾過し、９Ｎ−ＣＲＭ接合体溶液を得た。
【表３４】
2020504760.tif 000081
【０３１７】
実施例１９：表２からのｅＣＲＭへの肺炎球菌ＰＳ血清型９Ｖ接合体の調製
１．酸化
９Ｖ型ＰＳの純度：８５％（アントロン）
分子量：７０４ｋＤａ（繰り返し単位＝９７１．８ｇ／モル）
反応手順
９Ｖ型ＰＳ（３５．９０ｍｇ、３７．８０μモル）粉末を、攪拌子により５０ｍＬのポリスチレン試料チューブ中の１７．９５ｍＬの水溶液（１２．５６５ｍＬの水および５．３８５ｍＬの０．２Ｍの酢酸緩衝液、ｐＨ５．５）中に溶解した。いったんＰＳが可溶化されると、８５２μＬのＮａＩＯ４溶液（２．８３ｍｇ、１３．２３μモル、０．３５モル当量）を加えた。反応チューブをホイルで包み、２４℃の水槽中に置いた。混合物を２４℃で攪拌した。１８時間後、反応混合物を、ＨＰＬＣ−等級水との４回の交換（各々１５ｍＬ）による３つのＡＭＩＣＯＮ（登録商標）Ｕｌｔｒａ−１５遠心フィルタデバイス（３０ｋＤａ  ＭＷＣＯ、１５ｍＬ）を使用して透析し、酸化ＰＳ−９Ｖ溶液を得た。
【表３５】
2020504760.tif 000082
【０３１８】
２．ＤＢＣＯ誘導体化
反応手順
酸化９Ｖ型ＰＳ溶液（２１．６４ｍｇ、２２．７８μモル、４．２７ｍＬ）に、緩衝溶液（０．５４１ｍＬの０．５Ｍのリン酸緩衝液、ｐＨ６．０）、ＤＭＳＯ（６６μＬ）、およびＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ＮＨ２溶液（４７５μＬのＤＭＳＯ中に１１．９ｍｇ、２２．７８μモル、１モル当量）を加えた。反応混合物を、２５℃で３０分間攪拌し、その後、１４０μＬのシアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液（１４０μＬの水中に２．８６ｍｇ、４５．５６μモル、２モル当量）を加えた。反応混合物を、アルミニウムホイルで包み、２５℃に設定された水槽中で２日間攪拌し続けた。２日目に、１６３μＬの水素化ホウ素ナトリウム溶液（１６３μＬの水中に１．７２ｍｇ、４５．５６μモル、２モル当量）を加えることよって、反応を中断させた。３０分間攪拌した後（観察可能なバブリングが停止したとき）、反応混合物を、エチル酢酸（２×１０ｍＬ）、続いてジクロロメタン（２×１０ｍＬ）で抽出した。抽出物を、２０分間Ｎ２でバブリングして、残留ジクロロメタンを除去し、次に、２  ＡＭＩＣＯＮ（登録商標）Ｕｌｔｒａ−１５遠心フィルタデバイス（５０ｋＤａ  ＭＷＣＯ、１５ｍＬ）に移した。透析を、３％ＤＭＳＯ溶液との３回の交換（各々１５ｍＬ）、２０％エタノール溶液との３回の交換（各々１５ｍＬ）、およびＨＰＬＣ−等級水との２回の交換（各々１５ｍＬ）を行うことによって実行し、９Ｖ  ＤＢＣＯ誘導体を得た。この溶液（４．４０ｍＬ、１２．１４４ｍｇ）に、ショ糖溶液（１２１．４４ｍｇ、１．２１４ｍＬの水）に加えた。この合わされた溶液を、３つの画分（２×５ｍｇおよび１×２．１４ｍｇ）に分割し、各々凍結乾燥して、微細な白色粉末を得た。すべての画分を、接合反応のために必要とされるまで、４℃で保存した。
【表３６】
2020504760.tif 000083
【０３１９】
３．ｅＣＲＭとのＰＳ  ９Ｖ−ＤＢＣＯ誘導体の接合
ＰＳ  ９Ｖ−ＤＢＣＯ：５ｍｇ（５０ｍｇのショ糖を含む）の白色粉末
ＤＢＣＯ割合（％）：３．０％
ＣＲＭ濃度：６．００９ｍｇ／ｍＬの溶液
ＰＳ：ＣＲＭ（投入比率）：１．５：１
反応手順
９Ｖ  ＤＢＣＯ誘導体（５０ｍｇのショ糖を含む５．０ｍｇの白色粉末）を、０．９％塩化ナトリウム溶液（０．８８１ｍＬ）、ｐＨ７のリン酸緩衝液（０．０６７ｍＬ、０．５Ｍ）、およびＤＭＳＯ（０．１６７ｍＬ）中に溶解した。アジド官能化ｅＣＲＭ溶液（０．５５５ｍＬの溶液）を加えて、１．５：１（ｗ／ｗ）のＰＳ９Ｖ：ＣＲＭ質量比率を得た。反応混合物を、室温（２０℃）で１８時間環状撹拌器で、次にさらに２時間３７℃で緩やかに混合した。総反応時間後、ある容量のアジ化ナトリウムを、接合混合物（０．３３ｍｇ、５．１５μモル）に加えた。次に、反応混合物を、０．９％塩化ナトリウム溶液（２．８３ｍＬ）で希釈し、予め洗浄された透析デバイス（ＳｐｅｃｔｒｕｍＬａｂ  Ｆｌｏａｔ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｇ２，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｇ２３５０６０，３００Ｋ  ＭＷＣＯ）に移した。試料は、０．９％塩化ナトリウム溶液中で４８時間透析を受けた（８回の交換、各々８００ｍｌ）。透析された溶液を、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＰ（０．２２μｍ、３３ｍｍのポリエーテルスルホン）を通して濾過し、９Ｖ  ＰＳ−ＣＲＭ接合体溶液を得た。
【表３７】
2020504760.tif 000084
【０３２０】
実施例２０：表２からのｅＣＲＭへの肺炎球菌ＰＳ血清型９Ｖ接合体の調製
１．酸化
９Ｖ型ＰＳの純度：８１％（アントロン）
分子量：９４９．８３
水中のＮａＩＯ４溶液（５．４１ｍｇ／ｍＬ）
反応手順
ＰＳ−９Ｖ（２１．１５ｍｇ、８１％に修正、１７．１３ｍｇ、１８．０４μモル）粉末を、１０．５７ｍＬの水溶液（７．４ｍＬの水および３．１７ｍＬの０．２Ｍの酢酸緩衝液、ｐＨ＝５．５）中に溶解した。この溶液に、２１４μＬのＮａＩＯ４溶液（１．１６ｍｇ、５．４１μモル、０．３当量）を加えた。混合物を、２５℃で２０時間攪拌した。酸化試料を、ＨＰＬＣ等級水の６回の交換（１２ｍＬ）を使用したＡＭＩＣＯＮ超遠心分離機フィルタ（３０ｋＤａ  ＭＷＣＯが６〜１２ｍＬ）を介して精製し、酸化ＰＳ−９Ｖ溶液を得た。
【表３８】
2020504760.tif 000085
【０３２１】
２．ＤＢＣＯ誘導体化
反応手順
酸化（１０％の酸化レベルを想定）９Ｖ型ＰＳ（１５．３６ｍｇ、１６．１７μモル、２．２０ｍＬの水）の溶液に、緩衝溶液（１．４ｍＬの２００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ＝６．０１）、ＤＭＳＯ（５００μＬ）およびＤＢＣＯ−ＰＥＧ−４−ＮＨ２（１３１μＬのＤＭＳＯ中に８．４６ｍｇ、１６．１７μモル、１０当量）の溶液をすべて２５℃で加えた。次に、反応混合物を、２５℃で３０分間攪拌し、その後、４１μＬのシアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液（２００μＬの水中に１５．５ｍｇ、３２．３４μモル、２０当量）を加え、２５℃で２日間攪拌し続けた。反応混合物を、リン酸緩衝液（５００μＬの２００ｍＭ溶液、ｐＨ＝６）で希釈し、その後、６２μＬの水素化ホウ素ナトリウム溶液（０．０１ｍｇ／μＬ、１０当量）を水中に加えた。３０分間攪拌した後、反応混合物を、エチル酢酸（３×２０ｍＬ）で抽出した。抽出物を、ＡＭＩＣＯＮ超遠心分離機フィルタ（３０ｋＤａ  ＭＷＣＯが６〜１２ｍＬ）に移し、次に、水中の２０％エタノールとの６回の交換（各々１２ｍＬ）、続いて水との３回の交換（各々１２ｍＬ）を使用して透析し、９Ｖ  ＤＢＣＯ誘導体型を得た。この溶液（４．０ｍＬ、１０．０８ｍｇ）に、ショ糖溶液（１ｍＬの水中に１００ｍｇ）を加えた。合わされた溶液を、２つの等しい部分に分割し、各々凍結乾燥して、白色粉末の３つの試料を得た。各試料は、次の接合反応で使用するための５．０４ｍｇの９Ｖ  ＤＢＣＯおよび５０ｍｇのショ糖を含有した。
【表３９】
2020504760.tif 000086
【０３２２】
３．ｅＣＲＭとのＰＳ  ９Ｖ−ＤＢＣＯ誘導体の接合
ＰＳ  ９Ｖ−ＤＢＣＯ：５．０４ｍｇ（５０ｍｇのショ糖を含む）の白色粉末
ＤＢＣＯ割合（％）：３．４２％
ＣＲＭ濃度：３．９２３ｍｇ／ｍＬの溶液
ＰＳ：ＣＲＭ（投入比率）：１．１１：１
反応手順
アジド官能化ｅＣＲＭ溶液（０．１．１５６ｍＬの溶液中のＣＲＭ）を、９Ｖ  ＤＢＣＯ誘導体（５０ｍｇのショ糖を含む５．０４ｍｇの白色粉末）に加えて、１．１１：１（ｗ／ｗ）のＰＳ９Ｖ：ＣＲＭ質量比率を得た。反応混合物を、手で緩やかに混合し、その後、室温（２０℃）で１８時間環状撹拌器で緩やかに混合した。接合されたＰＳ−ＣＲＭ混合物を、予め洗浄された透析デバイス（ＳｐｅｃｔｒｕｍＬａｂ  Ｆｌｏａｔ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｇ２，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｇ２３５０６０，３００Ｋ  ＭＷＣＯ）に移し、その後、０．９％塩化ナトリウム溶液で２４時間（５回の交換、各々８００ｍｌ）透析した。透析された溶液を、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＰ（０．２２μｍ、３３ｍｍのポリエーテルスルホン）を通して濾過し、９Ｖ  ＰＳ−ＣＲＭ接合体溶液を得た。
【表４０】
2020504760.tif 000087
【０３２３】
実施例２１：表２からのｅＣＲＭへの肺炎球菌ＰＳ血清型１０Ａ接合体の調製
１．ＣＤＡＰ活性化およびＤＢＣＯ架橋
ＰＳ  １０Ａの純度：７７％（アントロン）
分子量：１２２７ｇモル−１（繰り返し単位）
反応手順
ＰＳ１０Ａ（１８．７ｍｇ、１５．２μモル）を、水（７．９ｍＬ）中に溶解し、これに、ＣＤＡＰ（０．８当量、アセトニトリル中に１００ｍｇ／ｍＬ、３０μＬ）を加えた。反応混合物を、室温（室温）で３０秒間攪拌した。この時点で、水酸化ナトリウム溶液（０．２Ｍ、２００μＬ）を加えて、ｐＨ９．５を達成し、反応混合物を１５０秒間攪拌した。次に、ＤＭＳＯ（１．２ｍＬ）、続いてＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ＮＨ２（０．５当量、ＤＭＳＯ中に３２．０μモル／ｍＬ、２３８μＬ）を加え、室温で一晩攪拌した。ＤＢＣＯ−誘導体化ＰＳ１０Ａを、溶媒抽出によって、かつ３％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯの３回の交換、０．９％（ｖ／ｖ）塩水との２回の交換、および水との３回の交換を使用した遠心透析（Ａｍｉｃｏｎ  ３０ｋＤａ  ＭＷＣＯ）によって精製した。ＵＶ吸収分光法、アントロンアッセイ、およびＳＥＣによる分析後、この溶液（３．１８ｍＬ、１３．５ｍｇ）を、ショ糖溶液（１０倍の質量含有量、１００ｍｇ／ｍＬ）で希釈し、白色粉末に凍結乾燥した。
【表４１】
2020504760.tif 000088
【０３２４】
２．ｅＣＲＭとのＰＳ１０Ａ−ＤＢＣＯ誘導体の接合
ＰＳ  １０Ａ−ＤＢＣＯ：５．００ｍｇ（５０．０ｍｇのショ糖を含む）の凍結乾燥粉末
ＤＢＣＯ割合（％）：８．８％
ＣＲＭ：ＰＢＳ緩衝液中に５．０ｍｇ／ｍＬ
ＰＳ：ＣＲＭ（投入質量比率）：１．７５：１
反応手順
凍結乾燥された１０Ａ−ＤＢＣＯを、塩水（０．９％（ｗ／ｖ）、３．７５９ｍｌ）、リン酸緩衝液（０．５Ｍ、ｐＨ７．０、２００μＬ）、およびＤＭＳＯ（５００μＬ）中に溶解し、これに、ｅＣＲＭ溶液（０．５４１ｍＬ）を加えて、１．７５：１．００（ｗ／ｗ）のＰＳ１０Ａ：ＣＲＭ投入質量比率を得た。溶液を、手で非常に緩やかに混合し、その後、室温（２０℃）で１７時間環状撹拌器で緩やかに混合した。ＣＲＭ接合体を、２つの予め洗浄された透析チューブ（ＳｐｅｃｔｒｕｍＬａｂ  Ｆｌｏａｔ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｇ２，３００Ｋ  ＭＷＣＯ）に移し、その後、０．９％塩化ナトリウム溶液で２４時間（３回の交換、各々８００ｍｌ）透析した。透析された溶液を、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＰ注射器フィルタ（０．２２μｍ、３３ｍｍのポリエーテルスルホン）を通して滅菌濾過して、１０Ａ−ＣＲＭ接合体溶液を得た。
【表４２】
2020504760.tif 000089
【０３２５】
実施例２２：表２からのへのｅＣＲＭ肺炎球菌ＰＳ血清型１１Ａ接合体の調製
１．加水分解
１１Ａ型ＰＳの純度：６９％（アントロン）
分子量：９０８．７ｇモル−１
反応手順
天然多糖類１１Ａ（３５．０ｍｇ）を、１７．５ｍＬの水溶液（１５．７５ｍＬの水および１．７５ｍＬの酢酸、２Ｍ）中に溶解した。混合物を、８０℃で１時間加熱し、その後、周囲温度まで冷却した後、水酸化ナトリウム溶液を、ｐＨ５．５（３．２ｍＬ、１Ｍ）まで加えた。加水分解されたＰＳを、水との少なくとも６回の交換を使用したＡｍｉｃｏｎ遠心３０ｋＤａ  ＭＷＣＯ透析を使用して精製し、精製されたＰＳ−３溶液を得、次に、これを１つの分割量として凍結乾燥した。
【表４３】
2020504760.tif 000090
【０３２６】
２．酸化
反応手順
加水分解された多糖類溶液（５．０２７ｍＬ、２８．７５ｍｇ、３１．６μモル）に、水（５．７５ｍＬ）および酢酸緩衝液（０．２Ｍ、ｐＨ５．５、３．６ｍＬ）をさらに加えた。この溶液に、１３５μＬの過ヨウ素酸ナトリウム溶液（１．３５ｍｇ、６．３２μモル、０．２０当量）を滴下で加えた。混合物を、２５℃で８時間攪拌した。酸化ＰＳを、水との少なくとも６回の交換を使用したＡｍｉｃｏｎ遠心１００ｋＤａ  ＭＷＣＯ透析を使用して精製し、精製されたＰＳ−１１Ａ−ＯＸ溶液を得た。
【表４４】
2020504760.tif 000091
【０３２７】
３．ＤＢＣＯ誘導体化
反応手順
ＰＳ１１Ａ−ＯＸ（２２．０ｍｇ、２４．２μモル、２．２３５ｍＬ）を、リン酸緩衝液（１．３７ｍＬ、２００ｍＭ、ｐＨ６．０）に加え、これに、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ＮＨ２（１．０当量、ＤＭＳＯ中に５２３ｇモル−１、１００ｍｇ／ｍＬ、１２７μＬ）および追加量のＤＭＳＯ（５６０μＬ）を加えた。反応混合物を、２５℃で２５分間攪拌し、その後、シアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液（２当量、４４．５ｍｇ／ｍＬ、６８μＬ）を加えて、２日間攪拌した。反応混合物を、エチル酢酸（３×２０ｍＬ）で抽出し、０．４５μｍの注射器フィルタを通して濾過した。ＤＢＣＯ誘導体を、水中の２０％エタノールとの７回の交換、続いて、水との３回の交換（各々１２ｍＬ）を使用した遠心透析ユニット（Ａｍｉｃｏｎ  １００ｋＤａ  ＭＷＣＯ）によって精製し、１１Ａ−ＤＢＣＯ誘導体型を得た。この溶液（２．５３５ｍＬ、１５．００ｍｇ）に、ショ糖溶液（１．５ｍＬの水中に１５０ｍｇ）を加えた。合わされた溶液を、３つの等しい部分に分割し、各々凍結乾燥して、白色粉末の３つの試料を得た。各試料は、次の接合反応で使用するための５．００ｍｇの１１Ａ−ＤＢＣＯおよび５０ｍｇのショ糖を含有した。
【表４５】
2020504760.tif 000092
【０３２８】
４．ｅＣＲＭとのＰＳ  １１Ａ−ＤＢＣＯ誘導体の接合
ＰＳ  １１Ａ−ＤＢＣＯ：５．０ｍｇ（５０ｍｇのショ糖を含む）の凍結乾燥粉末
ＤＢＣＯ割合（％）：５．７７％
ＣＲＭ濃度：５．４２ｍｇ／ｍＬの溶液
ＰＳ：ＣＲＭ（投入比率）：１．５：１
反応手順
１１Ａ−ＤＢＣＯを、０．９％塩化ナトリウム溶液（７．６５６ｍＬ、０．２２μｍに濾過）、リン酸緩衝液（ｐＨ７．０、０．５Ｍ、０．３８５ｍＬ）、およびＤＭＳＯ（０．９６２ｍＬ）中に溶解した。アジド官能化ｅＣＲＭ溶液（５．４２ｍｇ／ｍＬ、０．６１７ｍＬ）を滴下で加えて、１．５：１（ｗ／ｗ）のＰＳ１１Ａ：ＣＲＭ投入質量比率を得た。溶液を、手で非常に緩やかに混合し、その後、室温（２０℃）で１７時間環状撹拌器で緩やかに混合した。クリック反応を、アジ化ナトリウム溶液（１０ｍｇ／ｍＬ、５０μＬ）の付加によってクエンチした。ＣＲＭ接合体を、予め洗浄された透析チューブ（ＳｐｅｃｔｒｕｍＬａｂ  Ｆｌｏａｔ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｇ２，３００Ｋ  ＭＷＣＯ）に移し、次に、０．９％塩化ナトリウム溶液で４８時間（４回の交換、各々１Ｌ）透析した。透析された溶液を、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＰ注射器フィルタ（０．２２μｍ、３３ｍｍのポリエーテルスルホン）を通して濾過し、１１Ａ−ＣＲＭ接合体溶液を得た。
【表４６】
2020504760.tif 000093
【０３２９】
実施例２３：表２からのｅＣＲＭへの肺炎球菌ＰＳ血清型１２Ｆ接合体の調製
１．酸化
１２Ｆ型ＰＳの純度：８２％（アントロン）
分子量：１０９４ｇモル−１
反応手順
１２Ｆ型ＰＳ（２１．８ｍｇ、２０μモル）粉末を、攪拌子により５０ｍＬのポリスチレン試料チューブ中の１０．９ｍＬの水溶液（８．１７５ｍＬの水および２．７２５ｍＬの０．２Ｍの酢酸緩衝液、ｐＨ５．５）中に溶解した。いったんＰＳが可溶化されると、１６０μＬのＮａＩＯ４溶液（０．６４ｍｇ、３μモル、０．１５モル当量）を加えた。反応チューブをホイルで包み、２５℃の水槽中に置いた。混合物を２５℃で攪拌した。１８時間後、反応混合物を、ＨＰＬＣ−等級水との６回の交換（各々１５ｍＬ）による２つのＡＭＩＣＯＮ（登録商標）Ｕｌｔｒａ−１５遠心フィルタデバイス（３０ｋＤａ  ＭＷＣＯ、１５ｍＬ）を使用して透析し、酸化ＰＳ−１２Ｆ溶液を得た。
【表４７】
2020504760.tif 000094
【０３３０】
２．ＤＢＣＯ誘導体化
反応手順
ＰＳ１２Ｆ−ＯＸ（１３．１ｍｇ、１２μモル、２．６８ｍＬ）を、リン酸緩衝液（１．００ｍＬ、２００ｍＭ、ｐＨ６．０）に加え、これに、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ＮＨ２（１．０当量、ＤＭＳＯ中に５２３ｇモル−１、３３ｍｇ／ｍＬ、１９９μＬ）および追加量のＤＭＳＯ（５００μＬ）を加えた。反応混合物を、２５℃で２５分間攪拌し、その後、シアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液（２当量、５２．５ｍｇ／ｍＬ、２９μＬ）を加えて、２日間攪拌した。反応混合物を、エチル酢酸（３×２０ｍＬ）で抽出し、溶媒なしでバブリングした。ＤＢＣＯ誘導体を、水中の２０％エタノールとの６回の交換、続いて、毎回の水との３回の交換（各々１２ｍＬ）を使用した２回の遠心透析ユニット（Ａｍｉｃｏｎ  ３０ｋＤａ  ＭＷＣＯ）によって精製し、１２Ｆ−ＤＢＣＯ誘導体を得た。この溶液（２．２ｍＬ、１０．４５ｍｇ）に、ショ糖溶液（１．０５ｍＬの水中に１０４．５ｍｇ）を加えた。合わされた溶液を、２つの等しい部分に分割し、各々凍結乾燥して、白色粉末の３つの試料を得た。各試料は、接合反応で使用するための５．０ｍｇの１２Ｆ−ＤＢＣＯおよび５０ｍｇのショ糖を含有した。
【表４８】
2020504760.tif 000095
【０３３１】
３．ｅＣＲＭとのＰＳ  １２Ｆ−ＤＢＣＯ誘導体の接合
ＰＳ  １２Ｆ−ＤＢＣＯ：５．０ｍｇ（５０ｍｇのショ糖を含む）の凍結乾燥粉末
ＤＢＣＯ割合（％）：２．０％
ＣＲＭ濃度：５．２９ｍｇ／ｍＬの溶液
ＰＳ：ＣＲＭ（投入比率）：１．５：１
反応手順
１２Ｆ−ＤＢＣＯを、０．９％塩化ナトリウム溶液（６．５４２ｍＬ、０．２２μｍに濾過）、リン酸緩衝液（ｐＨ７．０、０．５Ｍ、０．３３４ｍＬ）、およびＤＭＳＯ（０．８３４ｍＬ）中に溶解した。アジド官能化ｅＣＲＭ溶液（５．２９ｍｇ／ｍＬ、０．６３０ｍＬ）を、滴下で加えて、１．５：１（ｗ／ｗ）のＰＳ１２Ｆ：ＣＲＭ投入比率を得た。溶液を、手で非常に緩やかに混合し、その後、室温（２０℃）で１７時間環状撹拌器で緩やかに混合した。クリック反応を、アジ化ナトリウム溶液（１０ｍｇ／ｍＬ、５０μＬ）の付加によってクエンチした。ＣＲＭ接合体を、予め洗浄された透析チューブ（ＳｐｅｃｔｒｕｍＬａｂ  Ｆｌｏａｔ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｇ２，３００Ｋ  ＭＷＣＯ）に移し、次に、０．９％塩化ナトリウム溶液で４８時間（４回の交換、各々１Ｌ）透析した。透析された溶液を、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＰ注射器フィルタ（０．２２μｍ、３３ｍｍのポリエーテルスルホン）を通して濾過し、無菌の１２Ｆ−ＣＲＭ接合体溶液を得た。
【表４９】
2020504760.tif 000096
【０３３２】
実施例２４：表２からのｅＣＲＭへの肺炎球菌ＰＳ血清型１４接合体の調製
１．酸化
１４型ＰＳの純度：９１％（アントロン）
分子量：６８９．２５
水中のＮａＩＯ４溶液（７．８ｍｇ／ｍＬ）
反応手順
ＰＳ−１４（２８．３ｍｇ、８０％に修正、２５．７５ｍｇ、３７．３６μモル）粉末を、１４ｍＬの水溶液（１０ｍＬの水および４ｍＬの０．２Ｍの酢酸緩衝液、ｐＨ＝５．５）中に溶解した。この溶液に、１１０μＬのＮａＩＯ４溶液（０．８６ｍｇ、４．０５μモル、０．１３当量）を加えた。混合物を、２５℃で３時間攪拌し、その後、酸化試料を、ＨＰＬＣ等級水のＡＭＩＣＯＮ超遠心分離機（３０ｋＤａ  ＭＷＣＯが６〜１２ｍＬ）の６回の交換（１２ｍＬ）を使用して精製し、酸化ＰＳ−１４溶液を得た。
【表５０】
2020504760.tif 000097
【０３３３】
２．ＤＢＣＯ誘導体化
反応手順
酸化（１０％の酸化レベルを想定）１４型ＰＳ（２０．５ｍｇ、２９．７４μモル、２．９２ｍＬの水）の溶液に、緩衝溶液（１．３ｍＬの２００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ＝６．８）、ＤＭＳＯ（５５０μＬ）、およびＤＢＣＯ−ＰＥＧ−４−ＮＨ２の溶液（１５０μＬのＤＭＳＯ中に１１．６８ｍｇ、２２．３μモル、０．７５当量）をすべて２５℃で加えた。次に、反応混合物を、２５℃で３０分間攪拌し、その後、７０μＬのシアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液（１２０μＬの水中に６．３９ｍｇ、５９．４８μモル、２０当量）を加え、２５℃で２日間攪拌し続けた。反応混合物を、リン酸緩衝液（５００μＬの２００ｍＭ溶液、ｐＨ＝６）で希釈し、その後、１００μＬ溶液の水素化ホウ素ナトリウム（１．１３ｍｇ、１０当量）を水中に加えた。３０分間攪拌した後、反応混合物を、エチル酢酸（３×２０ｍＬのエチル酢酸）で抽出し、次に、ＡＭＩＣＯＮ超遠心分離機（３０ｋＤａ  ＭＷＣＯが６〜１２ｍＬ）に移し、次に、水中の２０％エタノールとの７回の交換（各々１２ｍＬ）、続いて、水との３回の交換（各々１２ｍＬ）を使用して透析し、１４ＤＢＣＯ誘導体型を得た。この溶液（３．７８ｍＬ、１７．７ｍｇ）に、ショ糖溶液（１．１７ｍＬの水中に１７７ｍｇ）を加えた。合わされた溶液を、３つの等しい部分に分割し、各々凍結乾燥して、白色粉末の３つの試料を得た。各試料は、次の接合反応で使用するための５．９ｍｇの１４ＤＢＣＯおよび５９ｍｇのショ糖を含有した。
【表５１】
2020504760.tif 000098
【０３３４】
３．ｅＣＲＭとのＰＳ  １４−ＤＢＣＯ誘導体の接合
ＰＳ  ６Ｂ−ＤＢＣＯ：５．９ｍｇ（５９ｍｇのショ糖を含む）の白色粉末
ＤＢＣＯ割合（％）：３．５％
ＣＲＭ濃度：５．０６ｍｇ／ｍＬの溶液
ＰＳ：ＣＲＭ（投入比率）：１．５：１
反応手順
アジド官能化ｅＣＲＭ溶液（０．７７９ｍＬ）を、１４ＤＢＣＯ誘導体（５９ｍｇのショ糖を含む５．９ｍｇの白色粉末）に加えて、１．５：１（ｗ／ｗ）のＰＳ１４：ＣＲＭ質量比率を得た。反応混合物を、手で緩やかに混合し、その後、室温（２０℃）で１８時間環状撹拌器で緩やかに混合した。接合されたＰＳ−ＣＲＭ混合物を、予め洗浄された透析チューブ（ＳｐｅｃｔｒｕｍＬａｂ  Ｆｌｏａｔ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｇ２，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｇ２３５０７１、１００Ｋ  ＭＷＣＯ）に移し、次に、０．９％塩化ナトリウム溶液で４８時間（８回の交換、各々８００ｍｌ）透析した。透析された溶液を、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＰ（０．２２μｍ、３３ｍｍのポリエーテルスルホン）を通して濾過し、１４  ＰＳ−ＣＲＭ接合体溶液を得た。
【表５２】
2020504760.tif 000099
【０３３５】
実施例２５：表２からのｅＣＲＭへの肺炎球菌ＰＳ血清型１４接合体の調製
１．酸化
１４型ＰＳの純度：９１％（アントロン）
分子量：６８９．２５
水中のＮａＩＯ４溶液（１０．１９ｍｇ／ｍＬ）
反応手順
ＰＳ−１４（２３．５ｍｇ、８０％に修正、２１．３８ｍｇ、３１．０２μモル）粉末を、１１．７５ｍＬの水溶液（８．２ｍＬの水および３．５５ｍＬの０．２Ｍの酢酸緩衝液、ｐＨ＝５．５）中に溶解した。この溶液に、９７μＬのＮａＩＯ４溶液（０．９５ｍｇ、４．０３μモル、０．１３当量）を加えた。混合物を、２５℃で１８時間攪拌し、その後、酸化試料を、ＨＰＬＣ等級水のＡＭＩＣＯＮ超遠心分離機（３０ｋＤａ  ＭＷＣＯが６〜１２ｍＬ）の６回の交換（１２ｍＬ）を使用して精製し、酸化ＰＳ−１４溶液を得た。
【表５３】
2020504760.tif 000100
【０３３６】
２．ＤＢＣＯ誘導体化
反応手順
酸化（１０％の酸化レベルを想定）１４型ＰＳ（１４．３ｍｇ、２０．７５μモル、３．４６ｍＬの水）の溶液に、緩衝溶液（１．３ｍＬの２００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ＝６．８）、ＤＭＳＯ（６３７μＬ）、およびＤＢＣＯ−ＰＥＧ−４−ＮＨ２の溶液（２６３μＬのＤＭＳＯ中に１０．８６ｍｇ、２０．７５μモル、１０当量）をすべて２５℃で加えた。次に、反応混合物を、２５℃で３０分間攪拌し、その後、５１μＬのシアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液（２００μＬの水中に１０．２ｍｇ、４１．５０μモル、２０当量）を加え、２５℃で２日間攪拌し続けた。反応混合物を、リン酸緩衝液（５００μＬの２００ｍＭ溶液、ｐＨ＝６）で希釈し、その後、７８μＬの水素化ホウ素ナトリウム溶液（０．０１ｍｇ／μＬ、１０当量）を水中に加えた。３０分間攪拌した後、反応混合物を、エチル酢酸（３×２０ｍＬのエチル酢酸）で抽出し、次に、ＡＭＩＣＯＮ超遠心分離機（３０ｋＤａ  ＭＷＣＯが６〜１２ｍＬ）に移し、次に、水中の２０％エタノールとの６回の交換（各々１２ｍＬ）、続いて、水との３回の交換（各々１２ｍＬ）を使用して透析し、１４ＤＢＣＯ誘導体型を得た。この溶液（４．１２ｍＬ、１２．２４ｍｇ）に、ショ糖溶液（１ｍＬの水中に１２ｍｇ）を加えた。合わされた溶液を、３つの等しい部分に分割し、各々凍結乾燥して、白色粉末の３つの試料を得た。各試料は、次の接合反応で使用するための６．１２ｍｇの１４ＤＢＣＯおよび６ｍｇのショ糖を含有した。
【表５４】
2020504760.tif 000101
【０３３７】
３．ｅＣＲＭとのＰＳ  １４−ＤＢＣＯ誘導体の接合
ＰＳ  ６Ｂ−ＤＢＣＯ：６．１２ｍｇ（６２ｍｇのショ糖を含む）の白色粉末
ＤＢＣＯ割合（％）：４．４２％
ＣＲＭ濃度：２．６１７ｍｇ／ｍＬの溶液
ＰＳ：ＣＲＭ（投入比率）：１．８：１
反応手順
アジド官能化ｅＣＲＭ溶液（１．３ｍＬ）を、１４ＤＢＣＯ誘導体（６２ｍｇのショ糖を含む６．１２ｍｇの白色粉末）を加え、１．８：１（ｗ／ｗ）のＰＳ１４：ＣＲＭ質量比率を得た。反応混合物を、手で緩やかに混合し、その後、室温（２０℃）で１７時間環状撹拌器で緩やかに混合した。接合されたＰＳ−ＣＲＭ混合物を、予め洗浄された透析チューブ（ＳｐｅｃｔｒｕｍＬａｂ  Ｆｌｏａｔ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｇ２，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｇ２３５０７１、１００Ｋ  ＭＷＣＯ）に移し、次に、０．９％塩化ナトリウム溶液で２４時間（３回の交換、各々８００ｍｌ）透析した。透析された溶液（１．５ｍＬ）を、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＰ（０．２２μｍ、３３ｍｍのポリエーテルスルホン）を通して濾過し、１４  ＰＳ−ＣＲＭ接合体溶液を得た。
【表５５】
2020504760.tif 000102
【０３３８】
実施例２６：表２からのｅＣＲＭへの肺炎球菌ＰＳ血清型１５Ｂ接合体の調製
１．酸化
１５Ｂ型ＰＳの純度：７１％（アントロン）
分子量：１１８５ｋＤａ（繰り返し単位＝１０６９．８０ｇ／モル）
反応手順
１５Ｂ型ＰＳ（１４．６ｍｇ、１３．６５μモル）粉末を、攪拌子により５０ｍＬのポリスチレン試料チューブ中の７．３０ｍＬの水溶液（５．１ｍＬの水および２．２ｍＬの０．２Ｍの酢酸緩衝液、ｐＨ５．５）中に溶解した。いったんＰＳが可溶化されると、１６０μＬのＮａＩＯ４溶液（０．５９ｍｇ、２．７５μモル、０．２０モル当量）を加えた。反応チューブをホイルで包み、水槽中に置いて、２４℃で攪拌する。３．５時間後、反応混合物を、ＨＰＬＣ−等級水との６回の交換（各々１５ｍＬ）による１つのＡＭＩＣＯＮ（登録商標）Ｕｌｔｒａ−１５遠心フィルタデバイス（３０ｋＤａ  ＭＷＣＯ、１５ｍＬ）を使用して透析し、酸化ＰＳ−１５Ｂ溶液を得た。
【表５６】
2020504760.tif 000103
【０３３９】
２．ＤＢＣＯ誘導体化
反応手順
酸化１５Ｂ型ＰＳ溶液（７．５６ｍｇ、７．０７μモル、１．２７１ｍＬ）に、緩衝溶液（０．６４０ｍＬの０．５Ｍのリン酸緩衝液、ｐＨ６．０）、ＤＭＳＯ（０．０６３ｍＬ）、およびＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ＮＨ２溶液（２２１μＬのＤＭＳＯ中に１７ｍｇ、７．０７μモル、１モル当量）を加えた。反応混合物を、２５℃で３０分間攪拌し、その後、３５０μＬのシアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液（３５０μＬの水中に０．９０ｍｇ、２モル当量）を加えた。反応混合物を、アルミニウムホイルで包み、２５℃に設定された水槽中で２日間攪拌し続けた。２日目に、１６３μＬの水素化ホウ素ナトリウム溶液（０．２７ｍｇ、７．０７μモル、２モル当量）を加えることによって、反応を中断させた。３０分間攪拌した後、反応混合物を、ジクロロメタン（３×１５ｍＬ）で抽出した。抽出物を、Ｎ２で２０分間バブリングして、残留ジクロロメタンを除去し、次に、１つのＡＭＩＣＯＮ（登録商標）Ｕｌｔｒａ−１５遠心フィルタデバイス（３０ｋＤａ  ＭＷＣＯ、１５ｍＬ）に移した。３％ＤＭＳＯ溶液との３回の交換（各々１５ｍＬ）、２０％エタノール溶液との３回の交換（１５ｍＬ）、およびＨＰＬＣ−等級水との３回の交換（各々１５ｍＬ）を行うことによって、透析を実行し、１５Ｂ  ＤＢＣＯ誘導体を得た。この溶液（１．９８２ｍＬ、６．８６ｍｇ）に、ショ糖溶液（０．６８６ｍＬの水中に６８．６ｍｇ）を加えた。この合わされた溶液を、２つの画分に分割し、各々凍結乾燥して、微細な白色粉末を得た。すべての画分を、接合反応のために必要とされるまで、乾燥するまで凍結乾燥した後、４℃で保存した。
【表５７】
2020504760.tif 000104
【０３４０】
３．ｅＣＲＭとのＰＳ  １５Ｂ−ＤＢＣＯ誘導体の接合
ＰＳ  １５Ｂ−ＤＢＣＯ：３．８５ｍｇ（３８．５ｍｇのショ糖を含む）の白色粉末
ＤＢＣＯ割合（％）：５．９％
ＣＲＭ濃度：６．００９ｍｇ／ｍＬの溶液
ＰＳ：ＣＲＭ（投入比率）：１．５：１
反応手順
１５Ｂ  ＤＢＣＯ誘導体（３８．５ｍｇのショ糖を含む３．８５ｍｇの白色粉末）を、０．９％塩化ナトリウム溶液（４．３０２ｍＬ）、ｐＨ７のリン酸緩衝液（０．２２０ｍＬ、０．５Ｍ）、およびＤＭＳＯ（０．５５０ｍＬ）中に溶解した。アジド官能化ｅＣＲＭ溶液（０．４６７ｍＬの溶液）を加えて、１．５：１（ｗ／ｗ）のＰＳ１５Ｂ：ＣＲＭ質量比率を得た。反応混合物を、環状撹拌器で室温（２０℃）で１８時間、次にさらに２時間３７℃で緩やかに混合した。アジ化ナトリウム（０．２３ｍｇ、３．６０μモル）の付加により、接合反応を終了させた。次に、反応混合物を、０．９％塩化ナトリウム溶液で７ｍＬの最終容量まで希釈し、予め洗浄された透析デバイス（ＳｐｅｃｔｒｕｍＬａｂ  Ｆｌｏａｔ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｇ２，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｇ２３５０６０，３００Ｋ  ＭＷＣＯ）に移した。試料は、０．９％塩化ナトリウム溶液中で４８時間透析を受けた（８回の交換、各々８００ｍｌ）。透析された溶液を、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＰ（０．２２μｍ、３３ｍｍのポリエーテルスルホン）を通して濾過し、１５Ｂ  ＰＳ−ＣＲＭ接合体溶液を得た。
【表５８】
2020504760.tif 000105
【０３４１】
実施例２７：表２からのｅＣＲＭへの肺炎球菌ＰＳ血清型１７Ｆ接合体の調製
１．酸化
１７Ｆ型ＰＳの純度：８４％（アントロン）
分子量：１２７４ｋＤａ（繰り返し単位＝１２０３．００ｇ／モル）
反応手順
１７Ｆ型ＰＳ（２８．５０ｍｇ、２３．６９μモル）粉末を、攪拌子により５０ｍＬのポリスチレン試料チューブ中の１４．２５ｍＬの水溶液（９．９２５ｍＬの水および４．２７５ｍＬの０．２Ｍの酢酸緩衝液、ｐＨ５．５）中に溶解した。いったんＰＳが可溶化されると、５３．８μＬのＮａＩＯ４溶液（０．６５ｍｇ、３．０３μモル、０．１２８モル当量）を加えた。反応チューブをホイルで包み、水槽中に置いて、２４℃で攪拌する。１時間後、反応混合物を、ＨＰＬＣ−等級水との５回の交換（各々１５ｍＬ）による２つのＡＭＩＣＯＮ（登録商標）Ｕｌｔｒａ−１５遠心フィルタデバイス（３０ｋＤａ  ＭＷＣＯ、１５ｍＬ）を使用して透析し、酸化ＰＳ−１７Ｆ溶液を得た。
【表５９】
2020504760.tif 000106
【０３４２】
２．ＤＢＣＯ誘導体化
反応手順
酸化１７Ｆ型ＰＳ溶液（２２．０ｍｇ、１８．２９μモル、２．４８ｍＬ）に、緩衝溶液（１．３１ｍＬの０．５Ｍのリン酸緩衝液、ｐＨ６．０）、およびＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ＮＨ２の溶液（９５．８μＬのＤＭＳＯ中に９．５８ｍｇ、１８．２９μモル、１モル当量）を加えた。反応混合物を、２５℃で３０分間攪拌し、その後、シアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液（２００μＬの水中に２．３０ｍｇ；３６．６０μモル、２モル当量）を加えた。反応混合物を、アルミニウムホイルで包み、２５℃に設定された水槽中で２日間攪拌し続けた。２日目に、水素化ホウ素ナトリウム溶液（０．４８ｍｇ、１８．２９μモル、１モル当量）を加えることよって、反応を中断させた。３０分間攪拌した後、反応混合物を、ジクロロメタン（３×１５ｍＬ）で抽出した。抽出物を、Ｎ２で２０分間バブリングして、残留ジクロロメタンを除去し、次に、１つのＡＭＩＣＯＮ（登録商標）Ｕｌｔｒａ−１５遠心フィルタデバイス（３０ｋＤａ  ＭＷＣＯ、１５ｍＬ）に移した。２０％エタノール溶液との５回の交換（１５ｍＬ）およびＨＰＬＣ−等級水との３回の交換（各々１５ｍＬ）を行うことによって、透析を実行し、１７Ｆ  ＤＢＣＯ誘導体を得た。この溶液（３．２７ｍＬ、１１．５８ｍｇ）に、ショ糖溶液（１．１５８ｍＬの水中の１１５．８ｍｇ）を加えた。この合わされた溶液を、３つの画分（２×５ｍｇ、１×１．５８ｍｇ）に分割し、各々凍結乾燥して、微細な白色粉末を得た。すべての画分を、接合反応のために必要とされるまで、乾燥するまで凍結乾燥した後、４℃で保存した。
【表６０】
2020504760.tif 000107
【０３４３】
３．ｅＣＲＭとのＰＳ  １７Ｆ−ＤＢＣＯ誘導体の接合
ＰＳ  １７Ｆ−ＤＢＣＯ：５ｍｇ（５０ｍｇのショ糖を含む）の白色粉末
ＤＢＣＯ割合（％）：３．１％
ＣＲＭ濃度：５．９９６ｍｇ／ｍＬの溶液
ＰＳ：ＣＲＭ（投入比率）：１．５：１
反応手順
１７Ｆ  ＤＢＣＯ誘導体（５０ｍｇのショ糖を含む５ｍｇの白色粉末）を、０．９％塩化ナトリウム溶液（３．７４２ｍＬ）、ｐＨ７のリン酸緩衝液（０．２００ｍＬ、０．５Ｍ）、およびＤＭＳＯ（０．５００ｍＬ）中に溶解した。アジド官能化ｅＣＲＭ溶液（０．５５８ｍＬの溶液）を加えて、１．５：１（ｗ／ｗ）のＰＳ１７Ｆ：ＣＲＭ質量比率を得た。反応混合物を、室温（２０℃）で１９時間環状撹拌器で緩やかに混合した。アジ化ナトリウム（０．２７ｍｇ、４．１６μモル、１モル当量）の付加により、接合反応を終了させた。次に、反応混合物を、０．９％塩化ナトリウム溶液で８ｍＬの最終容量まで希釈し、予め洗浄された透析デバイス（ＳｐｅｃｔｒｕｍＬａｂ  Ｆｌｏａｔ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｇ２，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｇ２３５０６０，３００Ｋ  ＭＷＣＯ）に移した。試料は、０．９％塩化ナトリウム溶液中で４８時間透析を受けた（８回の交換、各々８００ｍｌ）。透析された溶液を、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＰ（０．２２μｍ、３３ｍｍのポリエーテルスルホン）を通して濾過し、１７Ｆ  ＰＳ−ＣＲＭ接合体溶液を得た。
【表６１】
2020504760.tif 000108
【０３４４】
実施例２８：表２からのｅＣＲＭへの肺炎球菌ＰＳ血清型１８Ｃ接合体の調製
１．酸化
１８Ｃ型ＰＳの純度：７２％（アントロン）
分子量：９７０．７６
水中のＮａＩＯ４溶液（５．４１ｍｇ／ｍＬ）
反応手順
１８Ｃ型ＰＳ（６１ｍｇ、６２．８４μモル）粉末を、３０．５ｍＬの水溶液（２７．４５ｍＬの水および３．０５ｍＬの２Ｍの酢酸）中に溶解した。次に、溶液を、９５℃で４０分間加熱し、次に冷却し、そのとき、ＮａＯＨ溶液（１Ｎ、５．２ｍＬ）を加えて、ｐＨを６．０に調節した。反応混合物を、ＨＰＬＣ等級水との３回の交換（各々１２ｍＬ）によるＡＭＩＣＯＮ超遠心分離機（１００ｋＤａ  ＭＷＣＯが６〜１２ｍＬ）を使用して透析した。上清を、１２．４ｍＬの水を含む５０ｍＬのファルコンチューブに移した。この溶液に、５．１５ｍＬの水および５．８ｍＬの２００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．３５）および１５３μＬのＮａＩＯ４溶液（１．５３ｍｇ、７．１７５μモル、０．１５当量）を加えた。混合物を、２５℃で３時間攪拌し、その後、酸化試料を、ＨＰＬＣ等級水のＡＭＩＣＯＮ超遠心分離機（１００ｋＤａ  ＭＷＣＯが６〜１２ｍＬ）の６回の交換（１２ｍＬ）を使用して精製し、酸化ＰＳ−１８Ｃ溶液を得た。
【表６２】
2020504760.tif 000109
【０３４５】
２．ＤＢＣＯ誘導体化
反応手順
酸化（１０％の酸化レベルを想定）１８Ｃ型ＰＳ溶液（１０．０ｍｇ、１０．３μモル、１．５５ｍＬの水）に、緩衝溶液（０．２１１ｍＬの２００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ＝６．７４）、ＤＭＳＯ（１４１μＬ）、およびＤＢＣＯ−ＰＥＧ−４−ＮＨ２溶液（５４μＬのＤＭＳＯ中に５．４ｍｇ、１６．１７μモル、１０当量）をすべて２５℃で加えた。次に、反応混合物を、２５℃で３０分間攪拌し、その後、１３０μＬのシアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液（１３０μＬの水中に１．３ｍｇ、２０．６μモル、２０当量）を加え、３７℃で２日間攪拌し続けた。反応混合物を、リン酸緩衝液（５００μＬの２００ｍＭ溶液、ｐＨ＝６）で希釈し、その後、８０μＬの水素化ホウ素ナトリウム溶液（０．０１ｍｇ／μＬ、１０当量）を水中に加えた。３０分間攪拌した後、反応混合物を、ジクロロメタン（２×１０ｍＬ）、続いてエチル酢酸（１０ｍＬ）で抽出した。抽出物を、ＡＭＩＣＯＮ超遠心分離機フィルタ（１００ｋＤａ  ＭＷＣＯが６〜１２ｍＬ）に移し、次に、水中の２０％エタノールとの４回の交換（各々１２ｍＬ）、続いて水との３回の交換（各々１２ｍＬ）を使用して透析し、１８Ｃ  ＤＢＣＯ誘導体型を得た。この溶液（１．３１ｍＬ、７．０ｍｇ）に、ショ糖溶液（０．７ｍＬの水中に７０ｍｇ）を加えた。合わされた溶液を、２つの等しい部分に分割し、各々凍結乾燥して、白色粉末の２つの試料を得た。各試料は、次の接合反応で使用するための３．５ｍｇの１８Ｃ  ＤＢＣＯおよび３５ｍｇのショ糖を含有した。
【表６３】
2020504760.tif 000110
【０３４６】
３．ｅＣＲＭとのＰＳ  １８Ｃ−ＤＢＣＯ誘導体の接合
ＰＳ  １８Ｃ−ＤＢＣＯ：３．５ｍｇ（３５ｍｇのショ糖を含む）の白色粉末
ＤＢＣＯ割合（％）：５．３２％
ＣＲＭ濃度：２．７６ｍｇ／ｍＬの溶液
【０３４７】
ＰＳ：ＣＲＭ（投入比率）：１．５：１
反応手順
１８Ｃ  ＤＢＣＯ誘導体（３５ｍｇのショ糖を含む３．５ｍｇの白色粉末）を、０．９％塩化ナトリウム溶液（０．６６１ｍＬ）、ｐＨ７のリン酸緩衝液（０．０７ｍＬ、０．５Ｍ）、およびＤＭＳＯ（０．１７５ｍＬ）中に溶解した。アジド官能化ｅＣＲＭ溶液（０．８４４ｍＬの溶液）を加えて、１．５：１（ｗ／ｗ）のＰＳ１８Ｃ：ＣＲＭ質量比率を得た。反応混合物を緩やかに混合し、その後、室温（２０℃）で２時間環状撹拌器で緩やかに混合した。次に、反応混合物を、０．９％塩化ナトリウム溶液（０．６６１ｍＬ）、ｐＨ７のリン酸緩衝液（０．０７ｍＬ、０．５Ｍ）、およびＤＭＳＯ（０．１７５ｍＬ）で希釈して、ＰＳ−１８の最終濃度を１ｍｇ／ｍＬにし、１８時間反応させた。アジ化ナトリウム溶液（２３μＬ、水中に１０ｍｇ／ｍＬ）を加えた。３０分後、接合されたＰＳ−ＣＲＭ混合物を、予め洗浄された透析デバイス（ＳｐｅｃｔｒｕｍＬａｂ  Ｆｌｏａｔ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｇ２，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｇ２３５０６０，３００Ｋ  ＭＷＣＯ）に移し、次に、０．９％塩化ナトリウム溶液で４８時間（８回の交換、各々８００ｍｌ）透析した。透析された溶液を、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＰ（０．２２μｍ、３３ｍｍのポリエーテルスルホン）を通して濾過し、１８Ｃ  ＰＳ−ＣＲＭ接合体溶液を得た。
【表６４】
2020504760.tif 000111
【０３４８】
実施例２９：表２からのｅＣＲＭへの肺炎球菌ＰＳ血清型１８Ｃ接合体の調製
１．酸化
１８Ｃ型ＰＳの繰り返し単位の分子量：１０１２
水中のＮａＩＯ４溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）
反応手順
ＰＳ−１８Ｃ（２０ｍｇ、１９．７６μモル）粉末を、３ｍＬの水溶液（１０ｍＭの酢酸ナトリウム溶液、ＰＨ４．５）中に溶解した。この溶液に、６３．４μＬのＮａＩＯ４溶液（０．６３４ｍｇ、２．９６μモル、０．１５当量）を加えた。混合物を、２３℃で１８時間攪拌し、その後、酸化試料を、予め洗浄された透析チューブ（ＳｐｅｃｔｒｕｍＬａｂ  Ｆｌｏａｔ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｇ２，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｇ２３５０５７、２０Ｋ  ＭＷＣＯ）に移し、次に、ＰＨ６．８の５０ｍｍのＰＢ緩衝液で２４時間（４回の交換、各々６００ｍｌ）透析して、酸化ＰＳ−１８Ｃ溶液を得た。透析後、ＤＭＳＯを加えて、ＰＨ６．８の５０ｍｍのＰＢ緩衝液を含む１０％ＤＭＳＯ中にＰＳ−１８Ｃを作製する。
【表６５】
2020504760.tif 000112
【０３４９】
２．ＤＢＣＯ誘導体化
ＰＳの最終濃度：３．７５ｍｇ／ｍｌ
緩衝液の最終濃度：５０ｍＭのＰＢ（ｐＨ６．８）中に１０％ＤＭＳＯ
反応手順
酸化１８Ｃ型ＰＳ溶液（１５ｍｇ、１４．８μモル、１０％ＤＭＳＯ中に４．４ｍＬ、５０ｍＭのＰＢ、ＰＨ６．８）に、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ＮＨ２溶液（７７．６μＬのＤＭＳＯ中に７．７６ｍｇ、１４．８μモル、１０当量）を２５℃で加えた。次に、反応混合物を、２５℃で６０分間攪拌し、その後、シアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液（９３μＬの水中に０．９３ｍｇ、１４．８μモル、１０当量）を加え、２５℃で２４時間攪拌し続けた。次に、反応混合物を、予め洗浄された透析チューブ（ＳｐｅｃｔｒｕｍＬａｂ  Ｆｌｏａｔ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｇ２，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｇ２３５０５７、２０Ｋ  ＭＷＣＯ）に移し、次に、５０ｍＭのＰＢ緩衝液中の２０％エタノールとの４回の交換、続いて、５０ｍＭのＰＢ緩衝液との３回の交換を使用して透析し、１８Ｃ  ＤＢＣＯ誘導体型を得た。
【表６６】
2020504760.tif 000113
【０３５０】
３．ｅＣＲＭとのＰＳ  １８Ｃ−ＤＢＣＯ誘導体の接合
ＰＳ  １８Ｃ−ＤＢＣＯ：６ｍｇ（６０ｍｇのショ糖を含む）の白色粉末
ＤＢＣＯ：３％
ｅＣＲＭ濃度：６．５ｍｇ／ｍＬ
ＰＳ：ＣＲＭ（投入比率）：１．５：１
ＰＳの最終濃度：２ｍｇ／ｍｌ
反応手順
アジド官能化ｅＣＲＭ溶液（０．６１５ｍＬ）を、１８Ｃ  ＤＢＣＯ誘導体（３ｍＬの水中に予め溶解された６ｍｇの白色粉末、５．９μモル）に加え、１．５：１（ｗ／ｗ）のＰＳ  １８Ｃ：ＣＲＭ質量比率を得た。反応混合物を、手で緩やかに混合し、その後、室温（２３℃）で１７時間環状撹拌器で緩やかに混合した。次に、混合物を、培養器（３７℃）中に３時間置いた。反応後、混合物を、０．９％塩化ナトリウム溶液によって２倍に希釈し、水素化ホウ素ナトリウム（１１２μＬの水中に１．１２ｍｇ、２９．６４μモル、５０当量）によって３時間還元した。接合されたＰＳ−ＣＲＭ混合物を、予め洗浄された透析チューブ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂ  Ｆｌｏａｔ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｇ２，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｇ２３５０７２，３００Ｋ  ＭＷＣＯ）に移し、次に、ＰＨ７のＰＢＳで２４時間（３回の交換、各々１０００ｍｌ）透析した。透析された溶液を、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＰ（０．４５μｍおよび０．２２μｍ、３３ｍｍのポリエーテルスルホン）を通して濾過し、１８Ｃ  ＰＳ−ＣＲＭ接合体溶液を得た。
【表６７】
2020504760.tif 000114
【０３５１】
実施例３０：表２からのｅＣＲＭへの肺炎球菌ＰＳ血清型１９Ａ接合体の調製
１．酸化
１９Ａ型ＰＳの純度：９０％（アントロン）
分子量：６１４．４４
水中のＮａＩＯ４溶液（５．６９ｍｇ／ｍＬ）
反応手順
ＰＳ−１９Ａ（２２．１０ｍｇ、９０％に修正、１９．８９ｍｇ、３２．３７μモル）粉末を、１１．０５ｍＬの水溶液（７．７３ｍＬの水および３．３２ｍＬの０．２Ｍの酢酸緩衝液；ｐＨ＝５．５）中に溶解した。この溶液に、３０４μＬのＮａＩＯ４溶液（１．７３ｍｇ、８．０９μモル、０．２５当量）を加えた。混合物を、２５℃で１８時間攪拌し、その後、酸化試料を、ＨＰＬＣ等級水のＡＭＩＣＯＮ超遠心分離機（３０ｋＤａ  ＭＷＣＯが６〜１２ｍＬ）の６回の交換（１０ｍＬ）を使用して精製し、酸化ＰＳ−１９Ａ溶液を得た。
【表６８】
2020504760.tif 000115
【０３５２】
２．ＤＢＣＯ誘導体化
反応手順
酸化（１０％の酸化レベルを想定）１９Ａ型ＰＳ溶液（１７．１４ｍｇ、２７．９μモル、２．５０ｍＬの水）に、緩衝溶液（１．０ｍＬの２００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ＝６．０１）、ＤＭＳＯ（０．４ｍＬ）、およびＤＢＣＯ−ＰＥＧ−４−ＮＨ２溶液（１９０μＬのＤＭＳＯ中に１４．６１ｍｇ、２７．９μモル、１０当量）をすべて２５℃で加えた。次に、反応混合物を、２５℃で３０分間攪拌し、その後、７０．２μＬのシアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液（３１３μＬの水中に１５．６ｍｇ、５５．８μモル、２０当量）を加え、２５℃で２日間攪拌し続けた。反応混合物を、リン酸緩衝液（５００μＬの２００ｍＭ溶液、ｐＨ＝６）で希釈し、その後、１０５μＬの水素化ホウ素ナトリウム溶液（０．０１ｍｇ／μＬ、１０当量）を水中に加えた。３０分間攪拌した後、反応混合物を、エチル酢酸（３×２０ｍＬのエチル酢酸）で抽出し、次に、ＡＭＩＣＯＮ超遠心分離機（３０ｋＤａ  ＭＷＣＯが６〜１２ｍＬ）に移し、次に、水中の２０％エタノールとの６回の交換、続いて、水との３回の交換（各々１２ｍＬ）を使用して透析し、１９Ａ  ＤＢＣＯ誘導体型を得た。この溶液（３．１２ｍＬ、１１．４ｍｇ）に、ショ糖溶液（１ｍＬの水中に１１４ｍｇ）を加えた。合わされた溶液を、２つの等しい部分に分割し、各々凍結乾燥して、白色粉末の２つの試料を得た。各試料は、次の接合反応で使用するための５．７０ｍｇの１９Ａ  ＤＢＣＯおよび５７ｍｇのショ糖を含有した。
【表６９】
2020504760.tif 000116
【０３５３】
３．ｅＣＲＭとのＰＳ  １９Ａ−ＤＢＣＯ誘導体の接合
ＰＳ  １９Ａ−ＤＢＣＯ：５．７ｍｇ（５７ｍｇのショ糖を含む）の白色粉末
ＤＢＣＯ割合（％）：３．３１％
ＣＲＭ濃度：６．５ｍｇ／ｍＬの溶液
ＰＳ：ＣＲＭ（投入比率）：１．８：１
反応手順
アジド官能化ｅＣＲＭ溶液（０．４９ｍＬ）を、１９Ａ  ＤＢＣＯ誘導体（５７ｍｇのショ糖を含む５．７ｍｇの白色粉末）に加えて、１．８：１（ｗ／ｗ）のＰＳ１９Ａ：ＣＲＭ質量比率を得た。反応混合物を、手で緩やかに混合し、その後、室温（２０℃）で１８時間環状撹拌器で緩やかに混合した。接合されたＰＳ−ＣＲＭ混合物を、予め洗浄された透析チューブ（ＳｐｅｃｔｒｕｍＬａｂ  Ｆｌｏａｔ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｇ２，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｇ２３５０６０，３００Ｋ  ＭＷＣＯ）に移し、次に、０．９％塩化ナトリウム溶液で２４時間（３回の交換、各々８００ｍｌ）透析した。透析された溶液を、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＰ（０．２２μｍ、３３ｍｍのポリエーテルスルホン）を通して濾過し、１９Ａ  ＰＳ−ＣＲＭ接合体溶液を得た。
【表７０】
2020504760.tif 000117
【０３５４】
実施例３１：表２からのｅＣＲＭへの肺炎球菌ＰＳ血清型１９Ａ接合体の調製
１．酸化
１９Ａ型ＰＳの純度：９０％（アントロン）
分子量：６１４．４４
水中のＮａＩＯ４溶液（５．４５ｍｇ／ｍＬ）
反応手順
ＰＳ−１９Ａ（２０．８３ｍｇ、９０％に修正、１８．７５ｍｇ、３０．５μモル）粉末を、９．５ｍＬの水溶液（６．５ｍＬの水および３ｍＬの０．２Ｍの酢酸緩衝液、ｐＨ＝５．５）中に溶解した。この溶液に、３０５μＬのＮａＩＯ４溶液（１．６３ｍｇ、７．６２μモル、０．２５当量）を加えた。混合物を、２５℃で１８時間攪拌し、その後、酸化試料を、ＨＰＬＣ等級水のＡＭＩＣＯＮ超遠心分離機（３０ｋＤａ  ＭＷＣＯが６〜１２ｍＬ）の６回の交換（１０ｍＬ）を使用して精製し、酸化ＰＳ−１９Ａ溶液を得た。
【表７１】
2020504760.tif 000118
【０３５５】
２．ＤＢＣＯ誘導体化
反応手順
酸化（１０％の酸化レベルを想定）１９Ａ型ＰＳ溶液（１７．５７ｍｇ、２８．５９μモル、２．９０ｍＬの水）に、緩衝溶液（０．８７ｍＬの２００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ＝６．０１）、ＤＭＳＯ（０．７ｍＬ）、およびＤＢＣＯ−ＰＥＧ−４−ＮＨ２溶液（３０６μＬのＤＭＳＯ中に１４．９７ｍｇ、２８．５９μモル、１０当量）をすべて２５℃で加えた。次に、反応混合物を、２５℃で３０分間攪拌し、その後、７９μＬのシアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液（２００μＬの水中に９．３９ｍｇ、５７．２μモル、２０当量）を加えて、２５℃で２日間攪拌した。反応混合物を、リン酸緩衝液（５００μＬの２００ｍＭ溶液、ｐＨ＝６）で希釈し、その後、１１０μＬの水素化ホウ素ナトリウム溶液（０．０１ｍｇ／μＬ、１０当量）を水中に加えた。３０分間攪拌した後、反応混合物を、エチル酢酸（３×２０ｍＬのエチル酢酸）で抽出し、次に、ＡＭＩＣＯＮ超遠心分離機（３０ｋＤａ  ＭＷＣＯが６〜１２ｍＬ）に移し、次に、水中の２０％エタノールとの６回の交換、続いて、水との３回の交換（各々１２ｍＬ）を使用して透析し、１９Ａ  ＤＢＣＯ誘導体型を得た。この溶液（３．５６ｍＬ、１１．９ｍｇ）に、ショ糖溶液（１ｍＬの水中に１２０ｍｇ）を加えた。合わされた溶液を、２つの等しい部分に分割し、各々凍結乾燥して、白色粉末の２つの試料を得た。各試料は、次の接合反応で使用するための５．９５ｍｇの１９Ａ  ＤＢＣＯおよび６０ｍｇのショ糖を含有した。
【表７２】
2020504760.tif 000119
【０３５６】
３．ｅＣＲＭとのＰＳ  １９Ａ−ＤＢＣＯ誘導体の接合
ＰＳ  １９Ａ−ＤＢＣＯ：５．９５ｍｇ（６０ｍｇのショ糖を含む）の白色粉末
ＤＢＣＯ割合（％）：４．６８％
ＣＲＭ濃度：６．５ｍｇ／ｍＬの溶液
ＰＳ：ＣＲＭ（投入比率）：１．８：１
反応手順
アジド官能化ｅＣＲＭ溶液（０．５１ｍＬ）を、１９Ａ  ＤＢＣＯ誘導体（６０ｍｇのショ糖を含む５．９５ｍｇの白色粉末）に加えて、１．８：１（ｗ／ｗ）のＰＳ１９Ａ：ＣＲＭ質量比率を得た。反応混合物を、手で緩やかに混合し、その後、室温（２０℃）で１８時間環状撹拌器で緩やかに混合した。次に、混合物を、オーブン（３７℃）中に２時間置いた。接合されたＰＳ−ＣＲＭ混合物を、予め洗浄された透析チューブ（ＳｐｅｃｔｒｕｍＬａｂ  Ｆｌｏａｔ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｇ２，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｇ２３５０７１、１００Ｋ  ＭＷＣＯ）に移し、次に、０．９％塩化ナトリウム溶液で２４時間（３回の交換、各々８００ｍｌ）透析した。透析された溶液を、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＰ（０．２２μｍ、３３ｍｍのポリエーテルスルホン）を通して濾過し、１９Ａ  ＰＳ−ＣＲＭ接合体溶液を得た。
【表７３】
2020504760.tif 000120
【０３５７】
実施例３２：表２からのｅＣＲＭへの肺炎球菌ＰＳ血清型１９Ｆ接合体の調製
１．酸化
１９Ｆ型ＰＳの純度：９０．７％（アントロン）
分子量：６１４．４４
水中のＮａＩＯ４溶液（５．２１ｍｇ／ｍＬ）
反応手順
ＰＳ−１９Ｆ（２２．０ｍｇ、３５．８μモル）粉末を、１３．７５ｍＬの水溶液（１１ｍＬの水および２．７５ｍＬの０．２Ｍの酢酸緩衝液、ｐＨ＝５．５）中に溶解した。この溶液に、１１７μＬのＮａＩＯ４溶液（０．６１ｍｇ、２．８６μモル、０．０８当量）に加えた。混合物を、冷蔵庫で１７時間４℃で攪拌し、その後、酸化試料を、ｐＨ６．７の１０ｍＭリン酸緩衝液のＡＭＩＣＯＮ超遠心分離機（３０ｋＤａ  ＭＷＣＯが６〜１２ｍＬ）の６回の交換（１２ｍＬ）を使用して精製し、酸化ＰＳ−１９Ｆ溶液を得た。
【表７４】
2020504760.tif 000121
【０３５８】
２．ＤＢＣＯ誘導体化
反応手順
酸化（１０％の酸化レベルを想定）１９Ｆ型ＰＳ溶液（１３．７ｍｇ、２２．３μモル、２．５０ｍＬの水）に、緩衝溶液（１．０ｍＬの２００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ＝６．０）、ＤＭＳＯ（０．４８３ｍＬ）、およびＤＢＣＯ−ＰＥＧ−４−ＮＨ２溶液（１１７μＬのＤＭＳＯ中に１１．６８ｍｇ、２２．３μモル、１０当量）すべて２５℃を加えた。次に、反応混合物を、２５℃で３０分間攪拌し、その後、７０．２μＬのシアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液（２８０μＬの水中に２．８ｍｇ、４４．６μモル、２０当量）を加えて、２５℃で一晩攪拌し続けた。反応混合物を、リン酸緩衝液（５００μＬの２００ｍＭ溶液、ｐＨ＝６）で希釈し、その後、８４μＬの水素化ホウ素ナトリウム溶液（０．０１ｍｇ／μＬ、１０当量）を水中に加えた。３０分間攪拌した後、反応混合物を、エチル酢酸（５×１２ｍＬのエチル酢酸）で抽出し、次に、ＡＭＩＣＯＮ超遠心分離機（３０ｋＤａ  ＭＷＣＯが６〜１２ｍＬ）に移し、次に、水中の２０％エタノールとの５回の交換、続いて、ｐＨ７．０の５ｍＭリン酸緩衝液との３回の交換（各々１２ｍＬ）を使用して透析し、１９Ｆ  ＤＢＣＯ誘導体型を得た。この溶液（１．１１ｍＬ、７．０ｍｇ）に、ショ糖溶液（１ｍＬの水中に７０ｍｇ）を加えた。合わされた溶液を、各々４ｍｇおよび３ｍｇの２つの部分に分割し、凍結乾燥して、白色粉末の２つの試料を得た。これらの１９Ｆ  ＤＢＣＯの凍結乾燥された試料を、次の接合反応で使用した。
【表７５】
2020504760.tif 000122
【０３５９】
３．ｅＣＲＭとのＰＳ  １９Ｆ−ＤＢＣＯ誘導体の接合
ＰＳ  １９Ｆ−ＤＢＣＯ：４．０ｍｇ（４０ｍｇのショ糖を含む）の白色粉末
ＤＢＣＯ割合（％）：５．１４％
ＣＲＭ濃度：５．０ｍｇ／ｍＬの溶液
ＰＳ：ＣＲＭ（投入比率）：１．６：１
反応手順
アジド官能化ｅＣＲＭ溶液（０．５ｍＬ）に、１９Ｆ  ＤＢＣＯ誘導体（４０ｍｇのショ糖を含む４．０ｍｇの白色粉末）を加えて、１．６：１（ｗ／ｗ）のＰＳ１９Ｆ：ＣＲＭ質量比率を得た。反応混合物を、手で緩やかに混合し、その後、環状撹拌器で室温（２０℃）で１８時間、続いて３７℃で１時間緩やかに混合した。４２μＬのアジ化ナトリウム（０．４２ｍｇ、１当量）を加えた。３０分後、接合されたＰＳ−ＣＲＭ混合物を、予め洗浄された透析チューブ（ＳｐｅｃｔｒｕｍＬａｂ  Ｆｌｏａｔ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｇ２，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｇ２３５０６０，３００Ｋ  ＭＷＣＯ）に移し、次に、０．９％塩化ナトリウム溶液で２日間（８回の交換、各々８００ｍｌ）透析した。透析された溶液を、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＰ（０．２２μｍ、３３ｍｍのポリエーテルスルホン）を通して濾過し、１９Ｆ  ＰＳ−ＣＲＭ接合体溶液を得た。
【表７６】
2020504760.tif 000123
【０３６０】
実施例３３：表２からのｅＣＲＭへの肺炎球菌ＰＳ血清型１９Ｆ接合体の調製
１．酸化
１９Ｆ型ＰＳ分子量：６１３
水中のＮａＩＯ４溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）
反応手順
ＰＳ−１９Ｆ（１０ｍｇ、１６．３１μモル）粉末を、２ｍＬの水溶液（１０ｍＭの酢酸ナトリウム溶液、ＰＨ４．５）中に溶解した。この溶液に、３４．９μＬのＮａＩＯ４溶液（０．３４９ｍｇ、１．６３μモル、０．１当量）を加えた。混合物を、４℃で１８時間攪拌し、その後、酸化試料を、予め洗浄された透析チューブ（ＳｐｅｃｔｒｕｍＬａｂ  Ｆｌｏａｔ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｇ２，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｇ２３５０５７、２０Ｋ  ＭＷＣＯ）に移し、次に、ＰＨ６．８の５０ｍｍのＰＢ緩衝液で２４時間（４回の交換、各々６００ｍｌ）透析して、酸化ＰＳ−１９Ｆ溶液を得た。透析後、ＤＭＳＯを加えて、ＰＨ６．８の５０ｍｍのＰＢ緩衝液を含む１０％ＤＭＳＯ中にＰＳ−１９Ｆを作製する。
【表７７】
2020504760.tif 000124
【０３６１】
２．ＤＢＣＯ誘導体化
ＰＳの最終濃度：３．３２ｍｇ／ｍｌ
緩衝液の最終濃度：５０ｍＭのＰＢ（ｐＨ６．８）中に１０％ＤＭＳＯ
反応手順
酸化１９Ｆ型ＰＳ溶液（８．３ｍｇ、１３．５３μモル、１０％ＤＭＳＯ中に２．５ｍＬ、５０ＭｍのＰＢ、ＰＨ６．８）、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ＮＨ２溶液（７０．８４μＬのＤＭＳＯ中に７．０８ｍｇ、１３．５３μモル、１０当量）を２５℃で加えた。次に、反応混合物を、２５℃で６０分間攪拌し、その後、シアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液（８５μＬの水中に０．８５ｍｇ、１３．５３μモル、１０当量）を加え、２５℃で２４時間攪拌し続けた。次に、反応混合物を、予め洗浄された透析チューブ（ＳｐｅｃｔｒｕｍＬａｂ  Ｆｌｏａｔ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｇ２，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｇ２３５０５７、２０Ｋ  ＭＷＣＯ）に移し、次に、５０ｍＭのＰＢ緩衝液中の２０％エタノールとの４回の交換、続いて、５０ｍＭのＰＢ緩衝液との３回の交換を使用して透析し、１９Ｆ  ＤＢＣＯ誘導体型を得た。
【表７８】
2020504760.tif 000125
【０３６２】
３．ｅＣＲＭとのＰＳ  １９Ｆ−ＤＢＣＯ誘導体の接合
ＰＳ  １９Ｆ−ＤＢＣＯ：６ｍｇ（６０ｍｇのショ糖を含む）の白色粉末
ＤＢＣＯ：７％
ＣＲＭ濃度：２．６１７ｍｇ／ｍＬの溶液
ＰＳ：ＣＲＭ（投入比率）：２：１
ＰＳの最終濃度：５．２ｍｇ／ｍｌ
反応手順
アジド官能化ｅＣＲＭ溶液（１．１５ｍＬ）を、１９Ｆ  ＤＢＣＯ誘導体（６０ｍｇのショ糖を含む６ｍｇの白色粉末、９．７μモル）に加え、２：１（ｗ／ｗ）のＰＳ  １９Ｆ：ＣＲＭ質量比率を得た。反応混合物を、手で緩やかに混合し、その後、環状撹拌器で室温（２３℃）で１７時間緩やかに混合した。次に、混合物を、培養器（３７℃）中に３時間置いた。反応後、混合物を、０．９％塩化ナトリウム溶液によって２倍に希釈し、水素化ホウ素ナトリウム（１８４．９μＬの水中に１．８４９ｍｇ、４８．９μモル、５０当量）によって３時間還元した。接合されたＰＳ−ＣＲＭ混合物を、予め洗浄された透析チューブ（ＳｐｅｃｔｒｕｍＬａｂ  Ｆｌｏａｔ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｇ２，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｇ２３５０７１、１００Ｋ  ＭＷＣＯ）に移し、次に、ＰＨ７のＰＢＳで２４時間（３回の交換、各々１０００ｍｌ）透析した。透析された溶液を、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＰ（０．２２μｍ、３３ｍｍのポリエーテルスルホン）を通して濾過し、１９Ｆ  ＰＳ−ＣＲＭ接合体溶液を得た。
【表７９】
2020504760.tif 000126
【０３６３】
実施例３４：表２からのｅＣＲＭへの肺炎球菌ＰＳ血清型２０接合体の調製
１．酸化
２０型ＰＳの純度：６８％（アントロン）
分子量：１１５７．９ｇモル−１
反応手順
２０型ＰＳ（３０．１ｍｇ、２６μモル）粉末を、攪拌子により５０ｍＬのポリスチレン試料チューブ中の１５．００ｍＬの水溶液（１１．２５ｍＬの水および３．７５ｍＬの０．２Ｍの酢酸緩衝液、ｐＨ５．５）中に溶解した。いったんＰＳが可溶化されると、１６０μＬのＮａＩＯ４溶液（１．１１ｍｇ、５．２μモル、０．２０モル当量）を加えた。反応チューブをホイルで包み、２５℃の水槽中に置いた。混合物を２５℃で攪拌した。１８時間後、反応混合物を、ＨＰＬＣ−等級水（各々１５ｍＬ）との５回の交換による３つのＡＭＩＣＯＮ（登録商標）Ｕｌｔｒａ−１５遠心フィルタデバイス（３０ｋＤａ  ＭＷＣＯ、１５ｍＬ）を使用して透析し、酸化ＰＳ−２０溶液を得た。
【表８０】
2020504760.tif 000127
【０３６４】
２．ＤＢＣＯ誘導体化
反応手順
ＰＳ２０−ＯＸ（１１．７ｍｇ、１０．１μモル、１．６１ｍＬ）を、リン酸緩衝液（０．６００ｍＬ、２００ｍＭ、ｐＨ６．０）に加え、これに、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ＮＨ２（１．０当量、ＤＭＳＯ中に５２３ｇモル−１、３３ｍｇ／ｍＬ、１６０μＬ）および追加量のＤＭＳＯ（２０７μＬ）を加えた。反応混合物を、２５℃で２５分間攪拌し、その後、シアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液（２当量、５２．５ｍｇ／ｍＬ、２４μＬ）を加えて、１日間攪拌した。１当量の水素化ホウ素ナトリウム溶液でキャッピングした後、反応混合物を、エチル酢酸（３×２０ｍＬ）で抽出し、溶媒を含まずバブリングした。ＤＢＣＯ誘導体を、水中の２０％エタノールとの５回の交換、続いて、毎回水との３回の交換（各々１２ｍＬ）を使用した遠心透析ユニット（Ａｍｉｃｏｎ  ３０ｋＤａ  ＭＷＣＯ）によって２回精製し、２０−ＤＢＣＯ誘導体を得た。この溶液（２．０９ｍＬ、１３．６５ｍｇ）に、ショ糖溶液（１．３７ｍＬの水中に１３６．５ｍｇ）を加えた。合わされた溶液を、２つの等しい部分に分割し、各々凍結乾燥して、白色粉末の３つの試料を得た。各試料は、接合反応で使用するための６．０ｍｇの２０−ＤＢＣＯおよび６０ｍｇのショ糖を含有した。
【表８１】
2020504760.tif 000128
【０３６５】
３．ｅＣＲＭとのＰＳ  ２０−ＤＢＣＯ誘導体の接合
ＰＳ  ２０−ＤＢＣＯ：５．０ｍｇ（５０ｍｇのショ糖を含む）の凍結乾燥粉末
ＤＢＣＯ割合（％）：２．０％
ＣＲＭ濃度：５．２９ｍｇ／ｍＬの溶液
ＰＳ：ＣＲＭ（投入比率）：１．５：１
反応手順
２０−ＤＢＣＯを、０．９％塩化ナトリウム溶液（２．６８４ｍＬ、０．２２μｍに濾過）、リン酸緩衝液（ｐＨ７．０、０．５Ｍ、０．１６０ｍＬ）、およびＤＭＳＯ（０．４００ｍＬ）中に溶解した。アジド−ＣＲＭ溶液（５．２９ｍｇ／ｍＬ、０．７５６ｍＬ）を、滴下で加えて、１．５：１（ｗ／ｗ）のＰＳ２０：ＣＲＭ投入比率を得た。溶液を、手で非常に緩やかに混合し、その後、環状撹拌器で室温（２０℃）で３６時間緩やかに混合した。クリック反応を、アジ化ナトリウム溶液（１０ｍｇ／ｍＬ、５０μＬ）の付加によってクエンチした。ＣＲＭ接合体を、予め洗浄された透析チューブ（ＳｐｅｃｔｒｕｍＬａｂ  Ｆｌｏａｔ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｇ２，３００Ｋ  ＭＷＣＯ）に移し、次に、０．９％塩化ナトリウム溶液で４８時間（４回の交換、各々１Ｌ）透析した。透析された溶液を、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＰ注射器フィルタ（０．２２μｍ、３３ｍｍのポリエーテルスルホン）を通して濾過し、無菌の２０−ＣＲＭ接合体溶液を得た。
【表８２】
2020504760.tif 000129
【０３６６】
実施例３５：表２からのｅＣＲＭへの肺炎球菌ＰＳ血清型２２Ｆ接合体の調製
１．酸化
２２Ｆ型ＰＳの純度：８９％（アントロン）
分子量：９９６．８８
水中のＮａＩＯ４溶液（５ｍｇ／ｍＬ）
反応手順
２２Ｆ型ＰＳ（３０．２ｍｇ、３０．３μモル）粉末を、１０．５ｍＬの水および４．５ｍＬの２００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．２６）および１３２μＬのＮａＩＯ４溶液（０．６５ｍｇ、３．０３μモル、０．１当量）中に溶解した。混合物を、２５℃で１８時間攪拌し、その後、酸化試料を、ＨＰＬＣ等級水のＡＭＩＣＯＮ超遠心分離機（１００ｋＤａ  ＭＷＣＯが６〜１２ｍＬ）の６回の交換（１２ｍＬ）を使用して精製し、酸化ＰＳ−２２Ｆ溶液を得た。
【表８３】
2020504760.tif 000130
【０３６７】
２．ＤＢＣＯ誘導体化
反応手順
酸化（１０％の酸化レベルを想定）２２Ｆ型ＰＳ溶液（７．０ｍｇ、７．０２μモル、０．９５６ｍＬの水）に、緩衝溶液（０．５２５ｍＬの２００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ＝６．０）、ＤＭＳＯ（１５１μＬ）、およびＤＢＣＯ−ＰＥＧ−４−ＮＨ２溶液（１１２μＬのＤＭＳＯ中に３．６７ｍｇ、７．０２μモル、１０当量）をすべて２５℃で加えた。次に、反応混合物を、２５℃で３０分間攪拌し、その後、１７μＬのシアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液（１７μＬの水中に０．８８ｍｇ、１４．０６μモル、２０当量）を加えて、２５℃で２日間攪拌し続けた。反応混合物を、リン酸緩衝液（２５０μＬの２００ｍＭ溶液、ｐＨ＝６）で希釈し、その後、９μＬの水素化ホウ素ナトリウム溶液（３１ｍｇ／ｍＬ、１０当量）を水中に加えた。３０分後、反応混合物を、エチル酢酸（４×５ｍＬ）で抽出した。抽出物を、ＡＭＩＣＯＮ超遠心分離機フィルタ（１００ｋＤａ  ＭＷＣＯが６〜１２ｍＬ）に移し、次に、水中の２０％エタノールとの６回の交換（各々１２ｍＬ）、続いて水との３回の交換（各々１２ｍＬ）を使用して透析した。ＳＥＣ−ＨＰＬＣは、遊離ＤＢＣＯを示すため、試料を、水中の２０％エタノールとの３回の交換（各々１２ｍＬ）、続いて、水との３回の交換（各々１２ｍＬ）を使用して再透析し、２２Ｆ  ＤＢＣＯ誘導体型を得た。この溶液（２．３５ｍＬ、５．２ｍｇ）に、ショ糖溶液（０．５２０ｍＬの水中に５２ｍｇ）を加えた。合わされた溶液を、２つの部分に分割し、各々凍結乾燥して、白色粉末の２つの試料を得た。試料は、次の接合反応で使用するための、それぞれ、２．４ｍｇおよび２．８ｍｇの２２Ｆ  ＤＢＣＯ、ならびに２４ｍｇおよび２８ｍｇのショ糖を含有した。
【表８４】
2020504760.tif 000131
【０３６８】
３．ｅＣＲＭとのＰＳ  ２２Ｆ−ＤＢＣＯ誘導体の接合
ＰＳ  ２２Ｆ−ＤＢＣＯ：２．４ｍｇ（２４ｍｇのショ糖を含む）の白色粉末
ＤＢＣＯ割合（％）：１．２４％
ＣＲＭ濃度：４ｍｇ／ｍＬの溶液
ＰＳ：ＣＲＭ（投入比率）：１．４：１
反応手順
２２Ｆ  ＤＢＣＯ誘導体（２４ｍｇのショ糖を含む２．４ｍｇの白色粉末）を、０．９％塩化ナトリウム溶液（０．０７５ｍＬ）中に溶解した。アジド官能化ｅＣＲＭ溶液（０．１４２ｍＬの溶液）を加えて、１．４：１（ｗ／ｗ）のＰＳ２２Ｆ：ＣＲＭ質量比率を得た。反応混合物を緩やかに混合し、その後、環状撹拌器で室温（２０℃）で４８時間緩やかに混合した。アジ化ナトリウム溶液（１６μＬ、水中に１０ｍｇ／ｍＬ）を加えた。３０分後、接合されたＰＳ−ＣＲＭ混合物を、予め洗浄された透析デバイス（ＳｐｅｃｔｒｕｍＬａｂ  Ｆｌｏａｔ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｇ２，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｇ２３５０６０，３００Ｋ  ＭＷＣＯ）に移し、その後、０．９％塩化ナトリウム溶液で２４時間（５回の交換、各々８００ｍｌ）透析した。透析された溶液を、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＰ（０．２２μｍ、３３ｍｍのポリエーテルスルホン）を通して濾過し、２２Ｆ  ＰＳ−ＣＲＭ接合体溶液を得た。
【表８５】
2020504760.tif 000132
【０３６９】
実施例３６：表２からのｅＣＲＭへの肺炎球菌ＰＳ血清型２３Ｆ接合体の調製
１．酸化
２３Ｆ型ＰＳの純度：８５％（アントロン）
分子量：７９２．６２
水中のＮａＩＯ４溶液（５．８６ｍｇ／ｍＬ）
反応手順
ＰＳ−２３Ｆ（２０．２１ｍｇ、８５％に修正、１７．１８ｍｇ、２６．７μモル）粉末を、１０ｍＬの水溶液（７．５ｍＬの水および２．５ｍＬの０．２Ｍの酢酸緩衝液、ｐＨ＝５．５）中に溶解した。この溶液に、１１９μＬのＮａＩＯ４溶液（０．６９５ｍｇ、４．０μモル、０．１５当量）を加えた。混合物を、２５℃で４時間攪拌した。次に、酸化試料を、ＨＰＬＣ等級水のＡＭＩＣＯＮ超遠心分離機フィルタ（３０ｋＤａ  ＭＷＣＯが６〜１２ｍＬ）の６回の交換（１２ｍＬ）を使用して精製し、酸化ＰＳ−２３Ｆ溶液を得た。
【表８６】
2020504760.tif 000133
【０３７０】
２．ＤＢＣＯ誘導体化
反応手順
（１０％の酸化レベルを想定）２３Ｆ型ＰＳ溶液（１３．５１ｍｇ、１７．０μモル、２．１４ｍＬの水）に、緩衝溶液（０．８５ｍＬの２００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ＝６．０１）、ＤＭＳＯ（３１０μＬ）、およびＤＢＣＯ−ＰＥＧ−４−ＮＨ２溶液（１７０μＬのＤＭＳＯ中に８．９３ｍｇ、１７．０μモル、１０当量）をすべて２５℃で加えた。次に、反応混合物を、２５℃で３０分間攪拌し、その後、４２μＬのシアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液（１２０μＬの水中に６．１ｍｇ、３４．０μモル、２０当量）を加えて、２５℃で２日間攪拌し続けた。反応混合物を、エチル酢酸（３×２０ｍＬのエチル酢酸）で抽出し、次に、ＡＭＩＣＯＮ超遠心分離機フィルタ（３０ｋＤａ  ＭＷＣＯが６〜１２ｍＬ）に移し、次に、水中の２０％エタノールとの６回の交換（各々１２ｍｌ）、続いて、水との３回の交換（各々１２ｍＬ）を使用して透析し、２３Ｆ  ＤＢＣＯ誘導体型を得た。この溶液（７．５８ｍＬ、１３．８ｍｇ）に、ショ糖溶液（１ｍＬの水中に１３８ｍｇ）を加えた。合わされた溶液を、２つの等しい部分に分割し、各々凍結乾燥して、白色粉末の３つの試料を得た。各試料は、次の接合反応で使用するための６．９ｍｇの２３Ｆ  ＤＢＣＯおよび６９ｍｇのショ糖を含有した。
【表８７】
2020504760.tif 000134
【０３７１】
３．ｅＣＲＭとのＰＳ  ２３Ｆ−ＤＢＣＯ誘導体の接合
ＰＳ  ２３Ｆ−ＤＢＣＯ：６９ｍｇのショ糖を含む６．９０ｍｇの白色粉末
ＤＢＣＯ割合（％）：５．１％
ＣＲＭ濃度：２．６１７ｍｇ／ｍＬの溶液
ＰＳ：ＣＲＭ（投入比率）：２：１
反応手順
アジド官能化ｅＣＲＭ溶液（１．３２ｍＬの溶液）を、２３Ｆ  ＤＢＣＯ誘導体（６９ｍｇのショ糖を含む６．９０ｍｇの白色粉末）に加えて、２：１（ｗ／ｗ）のＰＳ２３Ｆ：ＣＲＭ質量比率を得た。反応混合物を、手で緩やかに混合し、その後、環状撹拌器で室温（２０℃）で１７時間緩やかに混合した。次に、混合物を、オーブン（３７℃）中に３時間置いた。接合されたＰＳ−ＣＲＭ混合物を、予め洗浄された透析フィルタ（ＳｐｅｃｔｒｕｍＬａｂ  Ｆｌｏａｔ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｇ２，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｇ２３５０７１、１００Ｋ  ＭＷＣＯ）に移し、次に、０．９％塩化ナトリウム溶液で２４時間（３回の交換、各々８００ｍｌ）透析した。透析された溶液を、Ｍｉｌｌｅｘ−ＨＶフィルタ（０．４５μｍ、３３ｍｍのポリエーテルスルホン）を通して濾過し、２３Ｆ  ＰＳ−ＣＲＭ接合体溶液を得た。
【表８８】
2020504760.tif 000135
【０３７２】
実施例３７：表２からのｅＣＲＭへの肺炎球菌ＰＳ血清型３３Ｆ接合体の調製
１．酸化
３３Ｆ  ＰＳ型の純度：７５％（アントロン）
分子量：９７３
反応手順
３３Ｆ  ＰＳ型（３４．０ｍｇ、３５．０μモル）粉末を、攪拌子により５０ｍＬのポリスチレン試料チューブ中の１７．０ｍＬの水溶液（１２．０ｍＬの水および５．０ｍＬの０．２Ｍの酢酸緩衝液、ｐＨ５．５）中に溶解した。いったんＰＳが可溶化されると、５９μＬのＮａＩＯ４溶液（１．４９ｍｇ、７．０μモル、０．２０モル当量）を加えた。反応チューブをホイルで包み、４℃の水槽中に置いた。混合物を４℃で攪拌した。１８時間後、反応混合物を、ＨＰＬＣ−等級水との４回の交換（各々１５ｍＬ）による３つのＡＭＩＣＯＮ（登録商標）Ｕｌｔｒａ−１５遠心フィルタデバイス（１００ｋＤａ  ＭＷＣＯ、１５ｍＬ）を使用して透析し、酸化ＰＳ−３３Ｆ溶液を得た。
【表８９】
2020504760.tif 000136
【０３７３】
２．ＤＢＣＯ誘導体化
反応手順
酸化３３Ｆ  ＰＳ型溶液（１１．２ｍｇ、１１．５１μモル、２．４９ｍＬ）に、緩衝溶液（０．１１４ｍＬの０．５Ｍのリン酸緩衝液、ｐＨ６．０）、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ＮＨ２溶液（２００μＬのＤＭＳＯ中に６．０３９ｍｇ、６．３３μモル、０．５５当量）を加えた。反応混合物を、２５℃で３０分間攪拌し、その後、６３μＬのシアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液（１００μＬの水中に４．５ｍｇ、３４．５４μモル、２．０当量）を加えた。反応混合物を、アルミニウムホイルで包み、２５℃に設定された水槽中で２日間攪拌し続けた。２日目に、４４μＬの水素化ホウ素ナトリウム溶液（３１２μＬの水中に３．１２ｍｇ、１１．５１μモル、１．０当量）を加えることによって、反応を中断させた。３０分間攪拌した後、反応混合物を、ジクロロメタン（３×１０ｍＬ）、続いてエチル酢酸（３×１０ｍＬ）で抽出した。抽出物を、Ｎ２で２０分間バブリングして、残留エチル酢酸を除去し、次に、２  ＡＭＩＣＯＮ（登録商標）Ｕｌｔｒａ−１５遠心フィルタデバイス（１００ｋＤａ  ＭＷＣＯ、１５ｍＬ）に移した。３％ＤＭＳＯ溶液との３回の交換（各々１５ｍＬ）、２０％エタノール溶液との６回の交換（各々１５ｍＬ）、およびＨＰＬＣ−等級水との３回の交換（各々１５ｍＬ）を行うことによって、透析を実行し、３３Ｆ  ＤＢＣＯ誘導体を得た。この溶液（１．２３ｍＬ、４．０ｍｇ）に、ショ糖溶液（４０ｍｇの０．４ｍＬの水）を加えた。この合わされた溶液を凍結乾燥して、微細な白色粉末を得た。ＰＳ３３Ｆ  ＤＢ試料を、接合反応のために必要とされるまで４℃で保存した。
【表９０】
2020504760.tif 000137
【０３７４】
３．ｅＣＲＭとのＰＳ  ３３Ｆ−ＤＢＣＯ誘導体の接合
ＰＳ  ３３Ｆ−ＤＢＣＯ：４ｍｇ（４０ｍｇのショ糖を含む）の白色粉末
ＤＢＣＯ割合（％）：３．０％
ＣＲＭ濃度：６．００９ｍｇ／ｍＬの溶液
ＰＳ：ＣＲＭ（投入比率）：１．５：１
反応手順
３３Ｆ  ＤＢＣＯ誘導体（４０ｍｇのショ糖を含む４．０ｍｇの白色粉末）を、０．９％塩化ナトリウム溶液（５．３２ｍＬ）、ｐＨ７のリン酸緩衝液（０．２６７ｍＬ、０．５Ｍ）、およびＤＭＳＯ（０．６６７ｍＬ）中に溶解した。アジド官能化ｅＣＲＭ溶液（０．４４５ｍＬの溶液）を加えて、１．５：１（ｗ／ｗ）のＰＳ３３Ｆ：ＣＲＭ質量比率を得た。反応混合物を、環状撹拌器で室温（２０℃）で１９時間緩やかに混合した。クリック反応を、アジ化ナトリウム溶液（１０ｍｇ／ｍＬ、５０μＬ）の付加によってクエンチした。次に、反応混合物を、０．９％塩化ナトリウム溶液（７．０ｍＬ）で希釈し、予め洗浄された透析デバイス（ＳｐｅｃｔｒｕｍＬａｂ  Ｆｌｏａｔ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｇ２，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｇ２３５０６０，３００Ｋ  ＭＷＣＯ）に移した。試料は、０．９％塩化ナトリウム溶液中で４８時間透析を受けた（８回の交換、各々８００ｍｌ）。透析された溶液を、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＰ（０．２２μｍ、３３ｍｍのポリエーテルスルホン）を通して濾過し、３３Ｆ  ＰＳ−ＣＲＭ接合体溶液を得た。
【表９１】
2020504760.tif 000138
【０３７５】
実施例３８：表２からのｅＣＲＭへの肺炎球菌ＰＳ血清型７Ｆ接合体の調製
１．酸化
７Ｆ  ＰＳ型の純度：８６％（アントロン、ＣＲＢ−２１−２０）
分子量：１２２７ｇモル−１
反応手順
天然多糖類（１９．５ｍｇ、８６％に修正、１６．８ｍｇ、１３．７μモル）を、３．９ｍＬの水中に溶解した。この溶液に、４．５８ｍＬの水および０．２９３ｍＬの酢酸ナトリウム緩衝液（１．５Ｍ、ｐＨ５．４）を加えた。次に、３０μＬの過ヨウ素酸ナトリウム溶液（３００μｇ、１．４μモル、０．１当量）を攪拌溶液に加えた。反応物を２２℃で３時間攪拌した。次に、酸化ＰＳを、回転濃縮器（Ａｍｉｃｏｎ  ３０ｋＤａ  ＭＷＣＯ）を使用して、２倍に濃縮した。次に、濃縮されたＰＳを、ゲル濾過塔（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＰＤ−１０、回転方法）を使用して水に緩衝液交換した。
【表９２】
2020504760.tif 000139
【０３７６】
２．ＤＢＣＯ誘導体化
反応手順
７Ｆ−ＯＸ（１．９ｍＬの４．０ｍｇ／ｍＬ、７．６ｍｇ、６．２μモル）に、０．１５ｍＬのリン酸ナトリウム（１Ｍ、ｐＨ６．３）を加えた。次に、０．２３ｍＬのＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ＮＨ２（ＤＭＳＯ中に２７．１ｍＭ、ロット１７３０、６．２μモル、１．０当量）を攪拌溶液に加えた。５分攪拌した後、０．０３９ｍＬのＮａＣＮＢＨ３（水中に２０ｍｇ／ｍＬ、１２．４μモル、２．０当量）を攪拌溶液に加えた。反応物を２２℃で４０時間攪拌した。次に、溶液に、０．０２４ｍＬ水素化ホウ素ナトリウム（水中に１０ｍｇ／ｍＬ、６．３μモル、１．０当量）を加えた。１５分攪拌した後、ゲル濾過塔（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｚｅｂａ  Ｃｏｌｕｍｎｓ，４０ｋＤａ  ＭＷＣＯ）を介した水への緩衝液交換によって、ＰＳを精製した。
【表９３】
2020504760.tif 000140
【０３７７】
３．ｅＣＲＭとのＰＳ  ７Ｆ−ＤＢＣＯ誘導体の接合
ＰＳ  ７Ｆ−ＤＢＣＯ：２．８ｍｇ（水中に２．８ｍｇ／ｍＬ）
ＤＢＣＯ割合（％）：４．８％
ＣＲＭ濃度：４．７ｍｇ／ｍＬの溶液
ＰＳ：ＣＲＭ（投入比率）：１．６：１
反応手順
５ｍＬの遠心分離機チューブ中の７Ｆ−ＤＢＣＯ（水中に１ｍＬの２．８ｍｇ／ｍＬ）に、０．１２８ｍＬのリン酸カリウム（０．５Ｍ、ｐＨ７．５）を加えた。次に、この溶液に、０．３７２ｍＬのアジド官能化ｅＣＲＭ（ｐＨ７．１の２０ｍＭリン酸カリウム中に４．７ｍｇ／ｍＬ、７．５％のショ糖）を加えることによって、１．６：１（ｗ／ｗ）の投入質量比率を得た。溶液を、環状ロッカー上に置き、（溶液がチューブの端から端へと動くように）２２℃で１６時間揺り動かした。次に、接合体を、１時間後および４時間後の透析液の変化（５００ｍＬ）を含む、４８時間３００ｋＤａの透析膜（ＳｐｅｃｔｒｕｍＬａｂ  Ｆｌｏａｔ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｇ２、１ｍＬ）を使用して０．９％塩化ナトリウムに透析した。透析された溶液を、注射器フィルタ（Ｐａｌｌ  Ａｃｒｏｄｉｓｃ  Ｓｕｐｏｒ、０．２２μｍ、直径１３ｍｍ）を通して濾過し、７Ｆ−ＣＲＭ接合体溶液を得た。
【０３７８】
実施例３９：表２からのｅＣＲＭへの肺炎球菌ＰＳ血清型１接合体の調製
１．酸化
１型ＰＳの純度：８０％（ウロン酸アッセイ）
分子量：６２５ｇモル−１
反応手順
天然多糖類（２０．２ｍｇ、３２．３２μモル）を、９．５ｍＬの水溶液（７．０ｍＬの水および２．５ｍＬの酢酸緩衝液、２００ｍＭ、ｐＨ５．２４）中に溶解した。この溶液に、４９２μＬの過ヨウ素酸ナトリウム溶液（３．４５ｍｇ、１６．１６μモル、０．５当量）を加えた。混合物を２５℃で８時間攪拌した。酸化ＰＳを、水との６回の交換を使用したＡｍｉｃｏｎ遠心３０ｋＤａ  ＭＷＣＯ透析を使用して精製し、精製されたＰＳ−１溶液を得た。
【表９４】
2020504760.tif 000141
【０３７９】
２．ＤＢＣＯ誘導体化
反応手順
酸化（１０％の酸化レベルを想定）１型ＰＳ溶液（１６ｍｇ、２５．６μモル、２．４ｍＬの水）に、緩衝溶液（０．４２４ｍＬの５００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ＝６．７４）、ＤＭＳＯ（５７２μＬ）、およびＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ＮＨ２溶液（１３４μＬのＤＭＳＯ中に１３．４ｍｇ、２５．６μモル、１０当量）を加えた。次に、反応混合物を２５℃で３０分間攪拌し、その後、３２μＬのシアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液（３２μＬの水中に３．２ｍｇ、５１．２μモル、２０当量）を加え、２５℃で３日間攪拌し続けた。緩衝溶液（０．３００ｍＬの２００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ＝６．０）、続いて水素化ホウ素ナトリウム（１００μＬ中に０．９７ｍｇ、２５．６μモル、１０当量）を加え、２５℃で３０分間攪拌した。反応混合物を、ジクロロメタン（４×５ｍＬ）で抽出した。水性抽出物を、２つのＡＭＩＣＯＮ超遠心分離機フィルタ（３０ｋＤａ  ＭＷＣＯが６〜１２ｍＬ）に移し、次に、水中の２０％エタノールとの５回の交換（各々１２ｍＬ）、続いて、水中の３％ＤＭＳＯとの３回の交換（各々１２ｍＬ）、０．９％塩化ナトリウムとの３回の交換、および水との３回の交換を使用して透析し、１  ＤＢＣＯ誘導体型を得た。この溶液（１．３７ｍＬ、１０．０ｍｇ）に、ショ糖溶液（１ｍＬの水中に１００ｍｇ）を加えた。合わされた溶液を、２つの等しい部分に分割し、各々凍結乾燥して、白色粉末の２つの試料を得た。各試料は、次の接合反応で使用するための５．０ｍｇの１−ＤＢＣＯおよび５０ｍｇのショ糖を含有した。
【表９５】
2020504760.tif 000142
【０３８０】
３．ｅＣＲＭとのＰＳ  １−ＤＢＣＯ誘導体の接合
ＰＳ  １−ＤＢＣＯ５．０ｍｇ（５０ｍｇのショ糖を含む）の凍結乾燥粉末
ＤＢＣＯ割合（％）：２．５％
ＣＲＭ濃度：４．８６ｍｇ／ｍＬの溶液
ＰＳ：ＣＲＭ（投入比率）：１．７：１
反応手順
凍結乾燥された１−ＤＢＣＯ型粉末（５ｍｇ）を、濾過された０．９％塩化ナトリウム溶液（５．３９ｍＬ）およびリン酸緩衝液（２５０μＬ、０．５Ｍ、ｐＨ７．０）中に溶解した。アジド官能化ｅＣＲＭ溶液（０．４７ｍＬ）を加えて、１．７：１（ｗ／ｗ）のＰＳ−１：ＣＲＭ投入質量比率を得た。溶液を、手で非常に緩やかに混合し、その後、室温（２０℃）で１８時間、環状撹拌器で緩やかに混合した。クリック反応を、アジ化ナトリウム溶液（１０ｍｇ／ｍＬ、５２μＬ）の付加によってクエンチした。ＣＲＭ接合体を、予め洗浄された透析チューブ（ＳｐｅｃｔｒｕｍＬａｂ  Ｆｌｏａｔ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｇ２，３００Ｋ  ＭＷＣＯ、１０ｍＬ）に移し、次に、０．９％塩化ナトリウム溶液で４８時間（８回の交換、各々８００ｍｌ）透析した。透析された溶液を、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＰ注射器フィルタ（０．２２μｍ、３３ｍｍのポリエーテルスルホン）を通して濾過し、１−ＣＲＭ接合体溶液を得た。
【表９６】
2020504760.tif 000143
【０３８１】
実施例４０：表２からのｅＣＲＭへの肺炎球菌ＰＳ血清型１０Ａ接合体の調製
１．酸化
ＰＳ血清型１０Ａ  ロット＃：６３６６２３０２（ＡＴＣＣ）
ＰＳ  １０Ａの純度：７７％（アントロン）
分子量：１０１３ｋＤａ（繰り返し単位＝１２２７ｇ／モル）
反応手順
１０Ａ型ＰＳ（２５．９９ｍｇ、２１．１８μモル）粉末を、攪拌子により５０ｍＬのポリスチレン試料チューブ中の１２．９９５ｍＬの水溶液（９．７４６ｍＬの水および３．２４９ｍＬの０．２Ｍ酢酸緩衝液、ｐＨ５．５）中に溶解した。いったんＰＳが可溶化されると、１３５μＬのＮａＩＯ４溶液（０．２７ｍｇ、１．２６μモル、０．０６モル当量）を加えた。反応チューブをホイルで包み、冷蔵庫中に置いて、４℃で攪拌した。４５分後、反応混合物を、ＨＰＬＣ−等級水との６回の交換（各々１５ｍＬ）による３つのＡＭＩＣＯＮ（登録商標）Ｕｌｔｒａ−１５遠心フィルタデバイス（３０ｋＤａ  ＭＷＣＯ、１５ｍＬ）を使用して透析し、酸化ＰＳ−１０Ａ溶液を得た。
【表９７】
2020504760.tif 000144
【０３８２】
２．ＤＢＣＯ誘導体化
反応手順
酸化１０Ａ型ＰＳ溶液（１８．１５ｍｇ、１４．７９μモル、３．３７１ｍＬ）に、緩衝溶液（０．２５９ｍＬの０．５Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６．０）、ＤＭＳＯ（０．１４５ｍＬ）、およびＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ＮＨ２溶液（１５４μＬのＤＭＳＯ中に７．７ｍｇ、１４．７９μモル、１モル当量）を加えた。反応混合物を４℃で３０分間攪拌し、その後、１０１μＬのシアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液（１０１μＬの水中に１．９ｍｇ、２モル当量）を加えた。反応混合物をアルミニウムホイルで包み、４℃の冷蔵庫で２日間攪拌し続けた。２日目に、８５μＬの水素化ホウ素ナトリウム溶液（０．５６ｍｇ、１４．７９μモル、１モル当量）を加えることによって、反応を中断させた。３０分間攪拌した後、反応混合物を、ジクロロメタン（３×１５ｍＬ）で抽出した。抽出物を、Ｎ２で１５分間バブリングして、残留ジクロロメタンを除去し、次に、１つのＡＭＩＣＯＮ（登録商標）Ｕｌｔｒａ−１５遠心フィルタデバイス（３０ｋＤａ  ＭＷＣＯ、１５ｍＬ）に移した。３％ＤＭＳＯ溶液との３回の交換（各々１５ｍＬ）、２０％エタノール溶液との３回の交換（１５ｍＬ）、０．９％塩化ナトリウム溶液との２回の交換、およびＨＰＬＣ−等級水との２回の交換（各々１５ｍＬ）を行うことによって、透析を実行し、１０Ａ  ＤＢＣＯ誘導体を得た。この溶液（３．３７１ｍＬ、１５．０６ｍｇ）に、ショ糖溶液（１．５０６ｍＬの水中に１５０．６ｍｇ）を加えた。この合わされた溶液を、３つの等しい画分に分割し、各々凍結乾燥して、微細な白色粉末を得た。凍結乾燥後、すべての画分を、接合反応のために必要とされるまで４℃で保存した。
【表９８】
2020504760.tif 000145
【０３８３】
３．ｅＣＲＭとのＰＳ  １０Ａ−ＤＢＣＯ誘導体の接合
ＰＳ  １０Ａ−ＤＢＣＯ：５．２０ｍｇ（５２．０ｍｇのショ糖を含む）の凍結乾燥粉末
ＤＢＣＯ割合（％）：２．１％
ＣＲＭ：ｐＨ７．１の２０ｍＭヒスチジン中に４．９６２ｍｇ／ｍＬ（７．５％のショ糖）
ＰＳ：ＣＲＭ（投入質量比率）：１．２５：１
反応手順
１０Ａ  ＤＢＣＯ誘導体（５２．０ｍｇのショ糖を含む５．２ｍｇの白色粉末）を、０．９％塩化ナトリウム溶液（１．５０２ｍＬ）、ｐＨ７のリン酸緩衝液（０．１０４ｍＬ、０．５Ｍ）、およびＤＭＳＯ（０．１５６ｍＬ）中に溶解した。アジド官能化ｅＣＲＭ溶液（０．８３８ｍＬの溶液）を加えて、１．２５：１（ｗ／ｗ）のＰＳ１０Ａ：ＣＲＭ質量比率を得た。２．０ｍｇ／ｍＬのＰＳの濃度の反応混合物を、環状撹拌器で室温（２２℃）で２時間緩やかに混合した。次に、反応混合物を、１．０ｍｇ／ｍＬに希釈し、さらに２０時間２２°Ｃで攪拌し続けた。アジ化ナトリウム（７．５ｍｇ、１１５μモル）の付加により、接合反応を終了させた。次に、反応混合物を、０．９％塩化ナトリウム溶液で７ｍＬの最終容量まで希釈し、予め洗浄された透析デバイス（ＳｐｅｃｔｒｕｍＬａｂ  Ｆｌｏａｔ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｇ２，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｇ２３５０６０，３００Ｋ  ＭＷＣＯ）に移した。試料は、０．９％塩化ナトリウム溶液中で４８時間（２回の交換、各々１Ｌ、１回の交換、４Ｌ）透析を受けた。透析された溶液を、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＰ（０．２２μｍ、３３ｍｍのポリエーテルスルホン）を通して濾過し、１０Ａ  ＰＳ−ＣＲＭ接合体溶液を得た。
【表９９】
2020504760.tif 000146
【０３８４】
実施例４１：肺炎球菌多糖類へのＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−アミンおよびＤＢＣＯ−アミンの組み込みの評価
様々な肺炎球菌多糖類を、上記に記載されるように酸化し、同じ条件下でＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−アミン（ＤＢＣＯもしくはＤＢ）またはＤＢＣＯ−アミン（ＤＢＣＡもしくはＤＡ）と反応させて、組み込み効率に対するリンカーの効果を判定した。以下の表は、試験された血清型のうちの１つを除いてすべてにおいて、ＤＢＣＯ−アミンが、１００個の多糖類の繰り返し単位当たり、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−アミンと比較して、より高い効率で組み込まれることを示す。
【表１００】
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【表１０１】
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【０３８５】
実施例４２：ｅＣＲＭへのＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−アミンおよびＤＢＣＯ−アミンの接合の比較
ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−アミン（ＤＢ）またはＤＢＣＯ−アミン（ＤＡ）に連結された肺炎球菌多糖類を、上記の実施例に沿って同一の反応条件下で表２からの同じｅＣＲＭに接合させて、接合効率に対するリンカーの効果を評価した。以下の表は、ＤＢＣＯ−アミンに連結された多糖類と共に形成された接合体が、一般に、より少ない遊離多糖類およびより大きい接合体サイズをもたらすことを示す。
【表１０２】
2020504760.tif 000149
【０３８６】
実施例４３：肺炎球菌ＰＳ血清型−ｅＣＲＭ接合体の免疫原性
本開示により生成された様々な一価肺炎球菌多糖類−ｅＣＲＭ接合体の投与後の、マウスまたはウサギにおける総ＩｇＧおよび機能的ＯＰＡ抗体反応を判定するための実験を行った。Ｏｐｓｏｎｏ食細胞活性（ＯＰＡ）アッセイを使用して、様々な肺炎連鎖球菌の血清型に特異的なネズミの血清中の機能的抗体を測定した。ＯＰＡ測定は、Ｍｏｏｎ  Ｈ．Ｎａｈｍ＆Ｒｏｂｅｒｔ  Ｌ．Ｂｕｒｔｏｎ，“Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｆｏｒ  ｏｐｓｏｎｏｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ  ｋｉｌｌｉｎｇ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｇｒｏｕｐ  Ｂ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  （ＵＡＢ  ＧＢＳ  ＯＰＡ），”  Ｖｅｒｓｉｏｎ  Ｂ．０４，Ｍａｒｃｈ  ２０１６（Ｏｒｉｇｉｎａｌ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  Ａ．０１  ｐｏｓｔｅｄ  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２０１１）（ｗｗｗ．ｖａｃｃｉｎｅ．ｕａｂ．ｅｄｕ／ｕｐｌｏａｄｓ／ｍｄｏｃｓ／ＵＡＢ−ＧＢＳ−ＯＰＡ．ｐｄｆ）ａｎｄ  “Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  ｏｐｓｏｎｏｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ  ｋｉｌｌｉｎｇ  ａｓｓａｙ（ＵＡＢ−ＭＯＰＡ）ｆｏｒ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ”Ｖｅｒｓｉｏｎ  Ｅ．０２，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２０１４（ｗｗｗ．ｖａｃｃｉｎｅ．ｕａｂ．ｅｄｕ／ｕｐｌｏａｄｓ／ｍｄｏｃｓ／ＵＡＢ−ＭＯＰＡ．ｐｄｆ）に基づく。図３は、マウスにおける一価肺炎球菌多糖類−ｅＣＲＭ接合体の投与後のオプソニン食作用（ＯＰＡ）活性を示す。Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ａｎｄ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  Ｓｅｒｏｔｙｐｉｎｇ  Ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，”Ｃｌｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１１，１８（１１）：１９００−７に記載されている方法に従って、各肺炎球菌多糖類に特異的な総多糖類結合抗体（ＩｇＧ）も測定した。図４は、マウスにおける一価肺炎球菌多糖類−ｅＣＲＭ接合体の投与後のＩｇＧ応答を示す。
【０３８７】
以下の表に要約されるように、試験されたすべての接合体が、図３および図４に示されるＯＰＡおよびＩｇＧの結果に匹敵するか、またはそれより優れたＩｇＧおよび機能的抗体反応をマウスまたはウサギにおいて誘発した。
【表１０３】
2020504760.tif 000150
【０３８８】
２４個の肺炎球菌血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆの各々に対する接合体の組み合わせを、各接合体中の担体として配列番号９のＣＲＭ１９７誘導体を使用して調製した。この組成物の免疫原性を、７匹ウサギの群における３つの投与計画を使用して試験した。接合された１３価のＰｒｅｖｎａｒ（商標）ワクチン、および比較を助けるために非接合血清型６Ａ多糖類を加えた、非接合２３価のＰｎｅｕｍｏｖａｘ（商標）ワクチンとも比較した。３つの組成物は、Ｐｒｅｖｎａｒ（商標）およびＰｎｅｕｍｏｖａｘ（商標）を希釈することを伴う、血清型当たり当量の多糖類用量（Ｐｒｅｖｎａｒ（商標）が２倍の投与量を含む、６Ｂを除く）を有した。すべての３つの組成物は、アジュバントをＰｎｅｕｍｏｖａｘ（商標）に加えることを伴う、用量当たり６０μｇのリン酸アルミニウムアジュバントを含んだ。
【０３８９】
本明細書に開示される接合技術は、１１個の追加の血清型由来の莢膜多糖も含む、承認されたＰｒｅｖｎａｒ−１３（商標）ワクチン中よりも低量のＣＲＭ１９７担体を含む組成物をもたらした。接合された２４価の組成物中の莢膜多糖とＣＲＭ１９７との全体的な重量比率は、１３価のＰｒｅｖｎａｒ（商標）中に見られるものの約２倍であった。
【０３９０】
第３の用量後の応答を、図５（ＩｇＧ応答）および図６（ＯＰＡ応答）に示す。期待されるように、２つの接合されたワクチンを使用した応答は、非接合体ワクチンによるよりもはるかに大きかった。さらに、２４価のワクチンを使用したＩｇＧおよびＯＰＡ応答は、承認されたワクチンが適用される血清型においてＰｒｅｖｎａｒ−１３（商標）を使用することによって達成されるものに匹敵したが、加えて、Ｐｒｅｖｎａｒ−１３に含まれない１１個の血清型よりも優れていた。驚くべきことに、担体誘発されたエピトープ抑制の証拠はなかった。
【０３９１】
実施例４４：歯周炎のための接合体ワクチンの調製
ポルフィロモナス・ジンジバリスに対するワクチンを、以下のとおりに、ポルフィロモナス・ジンジバリス血清型Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３、Ｋ４、Ｋ５、および／またはＫ６由来の莢膜多糖（ＣＰＳ）をｅＣＲＭ担体タンパク質に接合させることによって調製する。
【０３９２】
ポルフィロモナス・ジンジバリスを増殖させ、任意の好適な方法によって取り扱う。例えば、Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｏｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３０：４３８−５０（２０１５）を参照されたい。ＣＰＳを、最適な任意の方法によって精製する。例えば、Ｇｏｎｚａｌｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７１：２２８３−２２８７（２００３）、Ｓｃｈｉｆｆｅｒｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：３０３５−３０４２（１９８９）、Ｐａｎｔｏｓｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５９：２０７５−２０８２（１９９１）を参照されたい。簡潔に言うと、ポルフィロモナス・ジンジバリスを遠心分離によって回収し、生理食塩水ですすぎ洗い、水に懸濁し、加熱フェノール水抽出に供した。水相を回収し、エーテルで抽出し、除菌濾過水に対して透析した。水性材料をｐＨ５．５に調節し、デオキシリボヌクレアーゼＩおよびリボヌクレアーゼＡ（シグマ）からなるヌクレアーゼカクテルで一晩消化した。ｐＨを中性に調節し、タンパク質分解酵素Ｋ（１ｍｇ／ｍｌ、シグマ）を試料に加え、３７℃で一晩緩やかな振とうで培養した。次に、第２のタンパク質分解酵素Ｋの消化を実行し、結果として生じた炭水化物を、１０，０００分子量分画膜を使用して濃縮した。ＣＰＳを低温エタノールで凝結させ、デオキシコール酸緩衝液に懸濁し、Ｓ−４００ゲル濾過塔（スウェーデン国ウプサラＰｈａｒｍａｃｉａ）を使用して単離した。高分子質量のＣＰＳを含有する画分（ＳＥＣ−ＭＡＬＳを介して）をプールし、ＬＰＳを含有する画分を廃棄する。プールされた画分を濃縮し、凝結させ、透析し、凍結乾燥する。
【０３９３】
緩衝化された多糖類溶液に、１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロホウ酸（ＣＤＡＰ、アセトニトリル中の１００ｍｇ／ｍＬの溶液由来）のＸモル当量（多糖類の繰り返し単位まで、Ｘはスクリーニングによって判定される）を、激しく攪拌しながら加える。ＣＤＡＰを加えた５分後に、０．５モル当量のジベンゾシクロオクタン−アミンリンカー（ＤＭＳＯ原液由来の）を加えた。さらに１時間後、グリシンを加えて、任意の未反応シアン酸エステルをクエンチする。代替的に、過ヨウ素酸塩またはＴＥＭＰＯ／ＮＣＳ化学を使用して、ＣＰＳを改変し得る。次に、誘導体化された多糖類を、透析またはＵＦ／ＤＦを介して精製する。アントロン比色分析を使用して、多糖類の濃度を測定し、３０９ｎｍでの吸光度を使用して、ジベンゾシクロオクタンの濃度を測定する。これらの２つの値を組み合わせて、ジベンジシクロオクタン官能基で誘導体化された多糖類の百分率の推定値を得ることができる。
【０３９４】
表２のものなど、最適なｅＣＲＭタンパク質と誘導体化された多糖類とを混合することによって、接合体を調製した。１８時間の培養後、１モル当量のアジ化ナトリウムを加え、任意の未反応ジベンゾシクロオクタン官能基をクエンチする。次に、透析またはＵＦ／ＤＦを介して接合体を精製し、未反応ｅＣＲＭタンパク質を除去する。次に、接合体を分析して、多糖類の濃度（比色分析）、タンパク質の濃度（比色分析）を判定し、遊離／非接合単糖類百分率を計算する。ＳＥＣ−ＭＡＬＳを使用して、分子量を測定する。
【０３９５】
１％デオキシコール酸溶液（ｐＨ６．８）の付加および３０分間の氷上での培養によって、多糖類：タンパク質接合体を凝結させた。培養後、１ＭのＨＣｌを加え、混合物を、２０分間１０，０００ｒｐｍで遠心分離する。残りの上清は、非接合多糖類を含有している。多糖類の濃度を判定するために、硫酸中に溶解したアントロンを試料に加え、１０分間９５℃まで加熱する。混合物を冷却し、６２０ｎｍでの吸光度を測定する。多糖類の単糖類成分の標準的な曲線を使用して、濃度を計算する。
【０３９６】
本明細書に記載される実施形態は、例示のみの方法によって提供され、実施形態に対する様々な代替例は、本明細書に記載される実施形態を実践する際に除外されない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2020504760.tif 000166
【配列表】
2020504760000001.app
【国際調査報告】
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