(57)【要約】  本明細書で提供されるテクノロジーは、標的タンパク質収量における増加のためおよび／または無細胞タンパク質合成系におけるより低い鋳型濃度の使用を可能にするための、新規プロモーター構築物、方法および系に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的ポリペプチドの効率的な無細胞タンパク質合成に適したＤＮＡプロモーター構築物であって、５’−３’方向で、
ａ）ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターエレメント、
ｂ）転写開始部位を含む少なくとも６つ連続するヌクレオチドの増強エレメントであって、配列ＧＧＧＡＧＡ、ＧＣＡＡＧＡまたはＧＧＡＡＧＡを含む、増強エレメント、
ｃ）５’ＵＴＲ配列エレメント、および
ｄ）翻訳開始部位
を含む、プロモーター構築物。
【請求項２】
前記５’ＵＴＲ配列エレメントが、タバコモザイクウイルス（Tobacco mosaic virus）（ＴＭＶ）由来のオメガ５’ＵＴＲ配列である、請求項１に記載のプロモーター構築物。
【請求項３】
ＲＮＡポリメラーゼの前記プロモーターエレメントが、Ｔ７プロモーターエレメントである、請求項１または２のいずれか一項に記載のプロモーター構築物。
【請求項４】
前記ＤＮＡプロモーター構築物が、
ａ）配列番号３に示される核酸配列、および
ｂ）ａ）と少なくとも８５％の配列同一性を有する核酸配列
からなる群から選択される配列を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のプロモーター構築物。
【請求項５】
無細胞タンパク質合成のためのｍＲＮＡを効率的に合成するための転写鋳型であって、請求項１〜４のいずれか一項に記載のプロモーター構築物を含み、目的のポリヌクレオチドおよび／または遺伝子が、前記翻訳開始部位に連結されている、転写鋳型。
【請求項６】
ａ）請求項１〜４のいずれか一項に記載のＤＮＡプロモーター構築物、
ｂ）前記プロモーター構築物に連結された目的のポリヌクレオチドおよび／または遺伝子、ならびに
ｃ）任意選択で、転写終結部位ポリアデニル化シグナル
を含む、発現カセット。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のＤＮＡプロモーター構築物を含む核酸ベクター。
【請求項８】
クローニングベクターおよび／または発現ベクターである、請求項７に記載の核酸ベクター。
【請求項９】
タンパク質合成に適した無細胞タンパク質合成系であって、
ａ）原核細胞溶解物または真核細胞溶解物、
ｂ）反応緩衝液、ならびに
ｃ）請求項５〜８のいずれか一項に記載の転写鋳型および／または発現カセットおよび／または核酸ベクター
を含み、前記真核細胞溶解物がタバコＢＹ−２細胞溶解物である、無細胞タンパク質合成系。
【請求項１０】
無細胞タンパク質合成のための方法であって、請求項９に記載の無細胞タンパク質合成系を使用することによって、タンパク質をｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成するステップを含む、方法。
【請求項１１】
請求項９に記載の無細胞タンパク質合成系を含む、タンパク質スクリーニングおよび／または産生プラットホーム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明のテクノロジーは、標的タンパク質収量における増加のためおよび／または無細胞タンパク質合成系におけるより低い鋳型濃度の使用を可能にするための、プロモーター構築物、方法および系に関する。
【背景技術】
【０００２】
新たな治療的タンパク質、技術的酵素、タンパク質操作および機能ゲノミクスに対する需要の増加は、迅速かつ効率的なタンパク質産生およびスクリーニングプラットホームを必要とする。
【０００３】
無細胞タンパク質合成（ＣＦＰＳ）の新興のテクノロジーは、この需要を満たす助けになり得る（Carlson et al., 2012）。粗製溶解物に基づくＣＦＰＳ系は、ｉｎ  ｖｉｖｏの系を超えるいくつかの利点を提供し、タンパク質操作、バイオ医薬品製品開発およびポストゲノム研究における広い適用を提供する。
【０００４】
細胞ベースの発現と比較して、ＣＦＰＳは、より短い処理時間ならびに反応条件の直接的な制御およびモニタリングなどの利点を提供する。ＰＣＲ産物は、労力を要するクローニングおよび形質転換ステップなしの複数のタンパク質の同時発現のために直接使用され得る。ＣＦＰＳプラットホームは、タンパク質フォールディングまたは非天然アミノ酸の取込みを促進するアクセサリー因子の付加を可能にする（Albayrak and Swartz, 2013；White et al., 2013）。これらは、生きた細胞中では産生できない細胞毒性タンパク質の発現も促進する。
【０００５】
粗製溶解物は、翻訳、タンパク質フォールディングおよびエネルギー代謝のために必要な成分を含み、従って、それらにアミノ酸、エネルギー基質、ヌクレオチドおよび塩を提供することは、ＲＮＡ鋳型によってコードされるほとんど全てのタンパク質が合成されるのを可能にする。適切なＲＮＡポリメラーゼがさらに補充されたカップリングされた転写／翻訳系では、ＤＮＡ鋳型もまた使用され得る。
【０００６】
上述のように、伝統的な細胞ベースの発現方法とは対照的に、ＣＦＰＳは、より短い処理時間、限定的なタンパク質加水分解、および毒性タンパク質、または規定された位置において特定の化学基もしくは非天然アミノ酸を含むタンパク質を発現する能力を提供する。さらに、この系のわかりやすい性質により、反応を直接制御およびモニタリングすることが可能になる。化学合成は、＜４０残基長のペプチドの迅速かつ制御された合成を可能にするが、これは、より大きいポリペプチドの産生のためには、経済的に実行可能な方法ではない。
【０００７】
最も広く使用される無細胞系は、大腸菌（Escherichia coli）抽出物（ＥＣＥ）、コムギ胚芽抽出物（ＷＧＥ）、ウサギ網状赤血球溶解物（ＲＬＬ）および昆虫細胞抽出物（ＩＣＥ）に基づく。これらは、タンパク質の発現、フォールディングおよび改変を異なる方法で増強する多様な細胞成分および補因子を含む。従って、最も適切な系は、標的タンパク質の起源および生化学的性質に依存する。ＥＣＥの調製は、単純かつ安価であり、一般に、標的タンパク質に依存して、バッチ反応において、１ミリリットル当たり数百マイクログラム〜ミリグラムという最も高いタンパク質収量を達成する。
【０００８】
対照的に、真核生物系は、あまり生産的ではなく、抽出物調製はより労力を要するが、複雑なタンパク質はより効率的に産生され得、拡張された翻訳後改変は支持される。ＷＧＥは通常、タンパク質および反応形式に依存して、１ミリリットル当たり数十マイクログラム〜ミリグラムの組換えタンパク質を生じるが、抽出物調製には４〜５日かかり、コムギ種子からの抽出物の収量は低い。ＲＬＬ系の収量は、典型的には、ＷＧＥよりも規模が２オーダー低く、ヨトウガ（Spodoptera frugiperda）から調製されたＩＣＥは、最大で５０μｇ／ｍＬの収量を達成できる。
【０００９】
最近、ＣＨＯ細胞および出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）に基づく２つのさらなる真核生物系が記載されている。ＣＨＯ抽出物は、最大で５０μｇ／ｍＬの活性ホタルルシフェラーゼを生じるが、発酵培地は非常に高価である。対照的に、酵母抽出物の調製は安価であるが、この系は、８μｇ／ｍＬの活性ホタルルシフェラーゼという低い標的タンパク質レベルのみを産生する。従って、現在の無細胞系の欠点は、大量に迅速に調製され得る高度に生産的な真核生物無細胞系に対する需要を生み出している。
【００１０】
タバコＢＹ−２細胞に基づくカップリングされていないＣＦＰＳ系は、文献中に記載されている（Buntru et al. Buntru et al. BMC Biotechnology 2014, 14:37）。さらに、タバコＢＹ−２細胞溶解物（ＢＹＬ）に基づく高度に効率的なカップリングされた無細胞転写−翻訳系は、先行技術にも記載された（Buntru et al, Biotechnology and Bioengineering, Vol. 112, No. 5, 2015, 867-878）。
【００１１】
いくつかの試みが、例えば、異なるプロモーターならびに／または５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を使用することによる鋳型の最適化によって無細胞系における標的タンパク質収量を増加させることが、これまでに記載されてきた。タバコモザイクウイルス（Tobacco mosaic virus）（ＴＭＶ）由来のオメガ５’ＵＴＲは、無細胞コムギ胚芽抽出物（ＷＧＥ）において高い標的タンパク質レベルを生じると同定されており、ウサギ網状赤血球溶解物（ＲＬＬ）および大腸菌（Escherichia coli）抽出物（ＥＣＥ）などの他の無細胞翻訳系においても機能的である（Gallie et al., 1987；Gallie and Walbot, 1992）。さらに、Sawasaki et al. (2002)および米国特許第７９８１６１７号明細書は、ＷＧＥにおける標的タンパク質収量を増加させるオメガ配列の上流の転写開始点としての、特定のトリプレット（ＧＡＡ）の使用を記載している。しかし、無細胞ｉｎ  ｖｉｔｒｏタンパク質合成のさらなる改善が、なおも必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
従って、改善された無細胞ｉｎ  ｖｉｔｒｏタンパク質合成のための方法および構築物を提供することが、本開示の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本開示は一般に、無細胞タンパク質合成（ｉｎ  ｖｉｔｒｏタンパク質合成または略記してＣＦＰＳとも呼ばれる）の分野に関する。より具体的には、本開示は、標的タンパク質収量における増加のためおよび／または無細胞タンパク質合成系におけるより低い鋳型濃度の使用を可能にするための、プロモーター構築物、方法および系に関する。
【００１４】
第１の態様では、本開示は、標的ポリペプチドの効率的な無細胞タンパク質合成に適した新規ＤＮＡプロモーター構築物であって、５’−３’方向で、
ａ）ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターエレメント、
ｂ）転写開始部位（transcription start site）を含む少なくとも６つ連続するヌクレオチドの増強エレメント（enhancing element）であって、配列ＧＧＧＡＧＡ、ＧＣＡＡＧＡまたはＧＧＡＡＧＡを含む、増強エレメント、
ｃ）５’ＵＴＲ配列エレメント、および
ｄ）翻訳開始部位（translation initiation start site）
を含む、プロモーター構築物に関する。
【００１５】
本開示は、第２の態様では、無細胞タンパク質合成のためのｍＲＮＡを効率的に合成するための転写鋳型であって、本開示に従うプロモーター構築物を含み、目的のポリヌクレオチドおよび／または遺伝子が、翻訳開始部位に連結されている、転写鋳型に関する。
【００１６】
第３の態様では、本開示は、
ａ）本開示に従うＤＮＡプロモーター構築物、
ｂ）前記プロモーター構築物に連結された目的のポリヌクレオチドおよび／または遺伝子、ならびに
ｃ）任意選択で、転写終結部位ポリアデニル化シグナル
を含む、発現カセットに関する。
【００１７】
第３の態様では、本開示は、無細胞タンパク質合成のための方法であって、無細胞タンパク質合成系において本開示に従う転写鋳型および／または本開示に従う発現カセットを使用することによって、タンパク質をｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成するステップを含む、方法に関する。
【００１８】
第４の態様では、本開示は、本開示に従うプロモーター構築物、本開示に従う転写鋳型または本開示に従う発現カセットを含む核酸ベクターに関する。
【００１９】
第５の態様では、本開示は、タンパク質合成に適した無細胞タンパク質合成系であって、
ａ）原核細胞溶解物または真核細胞溶解物、
ｂ）反応緩衝液、ならびに
ｃ）本開示に従う転写鋳型および／または発現カセットおよび／または核酸ベクター
を含む、無細胞タンパク質合成系に関する。
【００２０】
さらに、本開示は、本開示に従う無細胞タンパク質合成系、ならびに／または本開示に従うプロモーター構築物および／もしくは転写鋳型および／もしくは発現カセットおよび／もしくは核酸ベクターを含む、タンパク質スクリーニングおよび／または産生プラットホームに関する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、本開示に従うＤＮＡプロモーター構築物の有利な実施形態（配列番号３）を示す。Ａ：Ｔ７プロモーターエレメント、Ｂ：転写開始部位を含む増強エレメント、Ｃ：オメガ５’ＵＴＲ配列エレメント、ここで、最後の３’ヌクレオチドは、クローニング（目的の遺伝子の組込み）を促進するために、（天然オメガ配列と比較して）ＡからＣに変化している、Ｄ：翻訳開始部位。
【図２】図２は、８つの異なる鋳型濃度での異なるバリアントのベクターｐＩＶＥＸ＿Ｏｍｅｇａ＋非ベクター対照を使用した、Ｓｔｒｅｐ−ｅＹＦＰの発現を示す図である。これらのバリアントは、オメガ５’非翻訳領域の上流の転写開始点において、異なるヌクレオチド（図１の増強エレメントおよび図３の転写開始部位（ｔｃ  ｓ）を参照のこと）を含む。
【図３】図３は、オメガ５’非翻訳領域（ＵＴＲ）の上流の転写開始点としての、異なるバリアントのヌクレオチド（エンハンサーエレメント、ｔｃ  ｓ）のＤＮＡ配列を示す。Ｔ７プロモーター、転写開始部位（ｔｃ  ｓ）、オメガ５’ＵＴＲおよび翻訳開始（ｔｌ  ｓ）の位置が示されている。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本開示は、発現される目的の標的タンパク質の収量を増加させるための新規エンハンサーエレメントを含むＤＮＡプロモーター構築物を使用することによって、無細胞タンパク質合成のための新規構築物、方法および系、特に、タバコＢＹ−２細胞溶解物におけるタンパク質合成に適した無細胞タンパク質合成系に関する。
【００２３】
本開示の有利な実施形態は、標的ポリペプチドの効率的な無細胞タンパク質合成に適したＤＮＡプロモーター構築物であって、５’−３’方向で、
ａ）ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターエレメント、
ｂ）転写開始部位を含む少なくとも６つ連続するヌクレオチドの増強エレメントであって、配列ＧＧＧＡＧＡ、ＧＣＡＡＧＡまたはＧＧＡＡＧＡを含む、増強エレメント、
ｃ）５’ＵＴＲ配列エレメント、および
ｄ）翻訳開始部位
を含む、プロモーター構築物に関する。
【００２４】
新規ＤＮＡプロモーター構築物に起因して、特に、プロモーター構築物中に、ＴＭＶ由来のオメガ５’ＵＴＲ配列などの５’ＵＴＲエレメントの上流に余分なヌクレオチドを含むエンハンサーエレメントを添加することによって、目的のタンパク質の発現を、特に無細胞ＢＹＬ系を使用することによって、極端に増加させることができる。転写開始部位にエンハンサーエレメントのさらなるヌクレオチドを有さない元のオメガ配列は、検出可能な標的タンパク質産生をほとんどもたらさなかった。
【００２５】
さらに、本開示に従う新規ＤＮＡプロモーター構築物、無細胞タンパク質合成系、発現カセット、方法および転写鋳型は、少なくとも大規模アプローチにおいて、重要なコストおよび効率的因子である非常に低い鋳型濃度の使用を可能にする。小規模のスクリーニングアプローチでは、例えば、微量のＤＮＡのみが存在する微少流体ベースの方法によって、新規構築物および系は、タンパク質の生産性を増加させ、検出可能な量の標的タンパク質を生じ得る。新たなプロモーター構築物はまた、ＢＹＬよりも、他の無細胞のカップリングされた転写−翻訳系において、増加した標的タンパク質収量をもたらす可能性が最も高い。
【００２６】
一部の有利な実施形態では、本開示に従うＤＮＡプロモーター構築物、ベクター、発現カセットおよび／または転写鋳型は、単離および／または精製される。本明細書で使用する場合、用語「単離された」とは、言及された材料が、その天然の環境、例えば細胞から取り出されていることを意味する。従って、単離された生物学的材料は、一部のまたは全ての細胞成分、即ち、天然の材料が天然に存在する細胞の成分（例えば、細胞質または膜成分）を含まなくてもよい。材料は、細胞抽出物または上清中に存在する場合、単離されたとみなすべきである。核酸分子の場合、単離された核酸には、ＰＣＲ産物、単離されたｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたは制限断片が含まれる。別の実施形態では、単離された核酸は、好ましくは、それが見出され得る染色体から切り出され、より好ましくは、もはや、非コード領域に接続されてもおらず非コード領域に対して近位でもなく（しかし、その天然の調節領域またはその部分には接続されていてもよい）、または染色体中に見出される場合に単離された核酸分子によって含まれる遺伝子の上流もしくは下流に位置する他の遺伝子に接続されてもおらずかかる他の遺伝子に対して近位でもない。なお別の実施形態では、単離された核酸は、１つまたは複数のイントロンを欠く。単離された核酸分子には、プラスミド、コスミド、人工染色体などの中に挿入された配列、即ち、それがキメラ組換え核酸構築物の一部を形成する場合が含まれる。従って、具体的な実施形態では、組換え核酸は、単離された核酸である。単離されたタンパク質は、細胞中でそれが会合している他のタンパク質もしくは核酸またはその両方と会合していてもよく、あるいは、それが膜会合タンパク質である場合には細胞膜と会合していてもよい。単離されたオルガネラ、細胞または組織は、それが生物中で見出される解剖学的部位から取り出されている。単離された材料は、精製されていてもよいが、精製されている必要はない。
【００２７】
用語「精製された」とは、本明細書で使用する場合、無関係の材料、即ち、材料がそこから取得される天然の材料を含む混入物の存在を低減または排除する条件下で単離された材料を指す。
【００２８】
上述のように、本開示に従うＤＮＡプロモーター構築物は、効率的な無細胞タンパク質合成に適切である。無細胞タンパク質合成（ｉｎ  ｖｉｔｒｏタンパク質合成または略記してＣＦＰＳとも呼ばれる）は、生きた細胞を使用せずに生物学的機構を使用するタンパク質の産生である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏタンパク質合成環境は、細胞生存度を維持するために必要な細胞壁または恒常性条件によって束縛されない。従って、ＣＦＰＳは、翻訳環境の直接的なアクセスおよび制御を可能にし、これは、タンパク質合成、非天然アミノ酸の取込み、ハイスループットスクリーニングおよび合成生物学を研究するために、タンパク質産生の最適化、タンパク質複合体の最適化を含むいくつかの適用にとって有益である。
【００２９】
「プロモーターエレメント」は、細胞においてＲＮＡポリメラーゼに結合すること、および配列の転写を開始することが可能なＤＮＡ調節領域である。本発明を定義することを目的として、ｃＤＮＡの上流に位置するプロモーター配列は、その３’末端において転写開始部位によって境界され、背景を上回って検出可能なレベルで転写を開始するために必要な最小数の塩基またはエレメントを含むように上流（５’方向）に延びる。ｃＤＮＡの下流に位置するプロモーター配列（（−）ＲＮＡを発現するため）は、その５’末端において転写開始部位によって境界され、背景を上回って検出可能なレベルで転写を開始するために必要な最小数の塩基またはエレメントを含むように下流（３’方向）に延びる。
【００３０】
本明細書に記載されるＤＮＡプロモーター構築物は、好ましくは、コード鎖、即ち、その塩基配列が、産生されるＲＮＡ転写物（チミンがウラシルによって置き換えられているが）の塩基配列に対応するＤＮＡ鎖である。この鎖はコドンを含むが、非コード鎖はアンチコドンを含む。転写の間、ＲＮＡポリメラーゼＩＩは、非コード鎖に結合し、アンチコドンを読み取り、それらの配列を転写して、相補的塩基を有するＲＮＡ転写物を合成する。慣習により、コード鎖は、ＤＮＡ配列を示す場合に使用される鎖である。これは、５’から３’の方向で提示される。
【００３１】
本開示は、特に、新規ＤＮＡプロモーター構築物に関し、このプロモーター構築物は、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターエレメントを含む。プロモーターまたはプロモーターエレメントは、構造遺伝子の転写を指示するＤＮＡ配列である。典型的には、プロモーターは、構造遺伝子（または目的のポリヌクレオチドおよび／もしくは遺伝子）の転写開始部位に対して近位の、遺伝子の５’領域中に位置する。
【００３２】
用語「ＲＮＡポリメラーゼ」は、遺伝子中のプロモーター領域を同定しそれに結合して転写を開始するために特異的ＤＮＡ配列またはエレメントを使用するＤＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡ  Ｐｏｌ）を含む。特定のＲＮＡ  Ｐｏｌは、１つのサブユニット（例えば、Ｔ３およびＴ７などのバクテリオファージ、ならびにミトコンドリア由来のもの）のみを有するが、細菌および真核生物由来の他のＲＮＡ  Ｐｏｌは、効率的な転写のためにさらなるタンパク質因子を必要とするマルチサブユニット酵素である。
【００３３】
マルチマー酵素は、精製されたサブユニットから再構成するのが困難である。対照的に、バクテリオファージ由来のより小さいモノマーＲＮＡ  Ｐｏｌは、さらなるタンパク質因子の助けなしに、終結およびＤＮＡ鋳型からの転写物の放出を含め、転写を実施できる。これらの特色により、バクテリオファージＲＮＡ  Ｐｏｌは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応のための優れたツールになる。
【００３４】
一部の実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターエレメントは、コアプロモーターエレメント、即ち、例えばＴＡＴＡボックスおよび転写開始点を含む、作動可能に連結されたコード配列の発現のために必須のヌクレオチド配列を含むミニマルプロモーターまたはプロモーターエレメントである。この定義によって、コアプロモーターは、活性を増強し得るまたは組織特異的活性を付与し得る特定の配列の非存在下で、検出可能な活性を有しても有さなくてもよい。
【００３５】
例えば、別個のＤＮＡ配列特異性を有する以下の異なるファージＲＮＡ  Ｐｏｌが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写のために市販されている：
【表１】
2020505951.tif 000002
【００３６】
上に列挙した配列は、その３’末端に転写開始部位（ｔｃ  ｓ）を含む（太字でマークした）。
【００３７】
従って、有利な実施形態では、本開示のＤＮＡプロモーター構築物は、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターエレメントを含み、このＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼおよびＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼからなる群から選択される。
【００３８】
特に、元の転写開始部位を有さないＲＮＡポリメラーゼのプロモーターエレメントが含まれる。従って、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターエレメントは、例えば、
・ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ（配列番号６）−Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列
・ＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡ（配列番号７）−Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列
・ＡＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡ（配列番号８）−ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列
・ＡＡＴＴＡＧＧＧＣＡＣＡＣＴＡＴＡ（配列番号９）−Ｋ１１  ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列
・ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＡＴ（配列番号１０）−ＢＡ１４  ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列
の群から選択される。
【００３９】
有利な実施形態では、プロモーターエレメントは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼに由来し、特に、プロモーターエレメントは、配列番号１３の配列を含むまたはそれからなる。
【００４０】
本開示に従うＤＮＡプロモーター構築物は、少なくとも６つ連続するヌクレオチドの増強エレメントをさらに含む。増強エレメント内には、転写開始部位（簡便には、例えば、ヌクレアーゼＳ１を用いてマッピングすることによって規定される）が見出される。転写開始部位は、遺伝子配列の５’末端の、転写が開始する位置である。
【００４１】
「核酸分子」とは、一本鎖形態または二本鎖らせんのいずれかの、リン酸エステルポリマー形態のリボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジン；「ＲＮＡ分子」）もしくはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジンまたはデオキシシチジン；「ＤＮＡ分子」）、またはそれらの任意のホスホエステルアナログ、例えば、ホスホロチオエート（phosphorothioate）およびチオエステルを指す。
【００４２】
「ポリヌクレオチド」または「ヌクレオチド配列」は、ＤＮＡおよびＲＮＡ中の一連のヌクレオチド塩基（「ヌクレオチド」とも呼ばれる）であり、２つ以上のヌクレオチドの任意の鎖を意味する。ヌクレオチド配列は、典型的には、タンパク質を作製するために細胞機構によって使用される情報を含む遺伝情報を保有する。
【００４３】
前記増強エレメントは、プロモーターエレメントと以下の５’ＵＴＲ配列エレメントとの間に位置し、例えば、有利な実施形態では、増強エレメントの配列は、プロモーターエレメントの最後の３’ヌクレオチドの後で始まり、５’ＵＴＲ配列エレメントの最初の５’ヌクレオチドの前で終わる。一部のさらなる有利な実施形態では、前記プロモーターエレメントと５’ＵＴＲエレメントとの間の前記増強エレメントの５’末端における最初のヌクレオチドは、グアニン（Ｇ）であり、前記増強エレメントの３’末端の６番目のヌクレオチドは、アデニン（Ａ）である。
【００４４】
増強エレメントの有利な実施形態は、配列ＧＧＧＡＧＡ、ＧＣＡＡＧＡまたはＧＧＡＡＧＡからなる。さらなる有利な実施形態では、増強エレメントは、配列ＧＡＡＧＡＡ、ＧＴＡＡＧＡもしくはＧＣＡＡＧＡを含むまたはそれからなる。
【００４５】
上述のように、増強エレメントは、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターエレメントと５’ＵＴＲ配列エレメントとの間に位置する。５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）（リーダー配列またはリーダーＲＮＡとしても公知）は、それぞれ、翻訳開始コドンおよびコード配列のすぐ上流のｍＲＮＡの領域である。５’ＵＴＲ配列エレメントは、転写されるｍＲＮＡ上の５’非翻訳領域をコードするＤＮＡ配列である。５’ＵＴＲ内には、リボソームが結合し翻訳を開始するのを可能にする、リボソームによって認識される配列が存在する（Mignone et al., 2002によって概説される）。翻訳開始の機構は、原核生物および真核生物において異なる。
【００４６】
一部の有利な実施形態では、５’ＵＴＲ配列エレメントは、タバコモザイクウイルス（Tobacco mosaic virus）（ＴＭＶ）由来のオメガ５’ＵＴＲ配列をコードするＤＮＡ配列である。５’ＵＴＲ配列エレメントの他の好ましい例は、タバコエッチウイルス（Tobacco etch virus）（ＴＥＶ）の５’ＵＴＲをコードするＤＮＡ配列である。タバコモザイクウイルス（Tobacco mosaic virus）由来の５’ＵＴＲ配列の例は、配列番号１４に示され、タバコエッチウイルス（Tobacco etch virus）由来の５’ＵＴＲ配列の例は、配列番号１５に示される。
【００４７】
５’ＵＴＲ配列エレメントのすぐ後に、翻訳開始部位をコードするＤＮＡトリプレットが位置する。翻訳開始部位または開始コドンは、リボソームによって翻訳されるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写物の最初のコドンである。開始コドンは通常、真核生物ではメチオニンをコードし、原核生物では改変型Ｍｅｔ（ｆＭｅｔ）をコードする。最も一般的な開始コドンはＡＵＧである。
【００４８】
一部の有利な実施形態では、標的ポリペプチドの効率的な無細胞タンパク質合成に適したＤＮＡプロモーター構築物は、５’−３’方向で、
ａ）特に、配列番号１２を含む、ＲＮＡポリメラーゼのＴ７プロモーターエレメント、
ｂ）特に、ＧＧＧＡＧＡ、ＧＣＡＡＧＡまたはＧＧＡＡＧＡを有する、転写開始部位を含む少なくとも６つ連続するヌクレオチドの増強エレメント、
ｃ）特に、配列番号１４を有する、タバコモザイクウイルス（Tobacco mosaic virus）（ＴＭＶ）由来のオメガ５’ＵＴＲ配列、および
ｄ）翻訳開始部位
を含む。
【００４９】
従って、有利な実施形態では、本開示に従うプロモーター構築物は、
ａ）配列番号３に示される核酸配列、および
ｂ）ａ）と少なくとも８５％の配列同一性を有する核酸配列
からなる群から選択される配列を含む。
【００５０】
本開示に従うプロモーター構築物のさらに有利な実施形態は、
ａ）配列番号４に示される核酸配列、および
ｂ）ａ）と少なくとも８５％の配列同一性を有する核酸配列
からなる群から選択される配列を含む。
【００５１】
「パーセント配列同一性」とは、２つのアミノ酸またはポリヌクレオチド配列に関して、それらの配列を最適にアラインした場合に、２つの配列において同一である残基の百分率を指す。従って、８５％のアミノ酸配列同一性は、２つの最適にアラインされたポリペプチド配列中のアミノ酸の８５％が同一であることを意味する。パーセント同一性は、例えば、配列をアラインし、２つのアラインされた配列間の一致の正確な数を計数し、短い方の配列の長さによって除算し、結果に１００を乗算することによる、２つの分子間の配列情報の直接的な比較によって、決定され得る。容易に入手可能なコンピュータープログラム、例えば、ペプチド分析のためにＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズムを適応させるＡＬＩＧＮ１４、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＤＣが、分析を補助するために使用され得る。１５。ヌクレオチド配列同一性を決定するためのプログラムは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムにこれもまた依存する、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＧＡＰプログラムなど、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩから入手可能）において入手可能である。これらのプログラムは、製造業者によって推奨され、上で言及されたＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅに記載されるデフォルトパラメーター５を用いて容易に利用される。配列類似性を決定するために適切なアルゴリズムの例は、以前に記載されたＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を通じて公に入手可能である。同様に、パーセント相同性を決定するためのコンピュータープログラムもまた、容易に入手可能である。
【００５２】
さらに、本開示は、無細胞タンパク質合成のためのｍＲＮＡを効率的に合成するための転写鋳型であって、本開示に従うプロモーター構築物を含み、目的の構造遺伝子、ポリヌクレオチドまたは遺伝子が、翻訳開始部位に連結されている、転写鋳型に関する。
【００５３】
本明細書の開示に記載される転写鋳型構築物は、好ましくは、コード鎖、即ち、その塩基配列が、産生されるＲＮＡ転写物（チミンがウラシルによって置き換えられているが）の塩基配列に対応するＤＮＡ鎖である。この鎖はコドンを含むが、非コード鎖はアンチコドンを含む。転写の間、ＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩは、非コード鎖に結合し、アンチコドンを読み取り、それらの配列を転写して、相補的塩基を有するＲＮＡ転写物を合成する。慣習により、コード鎖は、ＤＮＡ配列を示す場合に使用される鎖である。これは、５’から３’の方向で提示される。
【００５４】
しかし、記載されたプロモーター構築物とは対照的に、本開示に従う転写鋳型は、翻訳開始部位に連結された目的の構造遺伝子および／またはポリヌクレオチドおよび／または遺伝子を含む。
【００５５】
構造遺伝子（または目的のポリヌクレオチドおよび／もしくは遺伝子）は、次いで特定のポリペプチドに特徴的なアミノ酸の配列へと翻訳されるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）へと転写されるＤＮＡ配列である。
【００５６】
さらに、本開示は、
ａ）本開示に従うＤＮＡプロモーター構築物、
ｂ）前記プロモーター構築物に連結された目的のポリヌクレオチドおよび／または遺伝子、ならびに
ｃ）任意選択で、転写終結部位ポリアデニル化シグナル
を含む、発現カセットに関する。
【００５７】
本発明によれば、当業者の技術範囲内の慣習的な分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡの技術が使用され得る。かかる技術は、文献中に完全に説明されている。例えば、Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. （本明細書で「Sambrook et al., 1989」）；DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (D. N. Glover ed. 1985)；Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984)；Nucleic Acid Hybridization [B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1985)]；Transcription And Translation [B. D. Hames & S. J. Higgins, eds. (1984)]；Animal Cell Culture [R. I. Freshney, ed. (1986)]；Immobilized Cells And Enzymes [IRL Press, (1986)]；B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984)；F. M. Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)を参照のこと。
【００５８】
「発現カセット」とは、規定された制限部位においてベクター中に挿入され得る発現産物をコードするＤＮＡコード配列またはＤＮＡのセグメントを指す。カセットの制限部位は、適切なリーディングフレームでのカセットの挿入を確実にするように設計される。一般に、外来ＤＮＡは、ベクターＤＮＡの１つまたは複数の制限部位において挿入され、次いで、伝播性のベクターＤＮＡと共に宿主細胞中にベクターによって運搬される。発現ベクターなどの、ＤＮＡが挿入または付加されたＤＮＡのセグメントまたは配列は、「ＤＮＡ構築物」とも呼ばれ得る。一般的な型のベクターは、「プラスミド」であり、これは一般に、さらなる（外来）ＤＮＡを容易に受容でき、適切な宿主細胞中に容易に導入され得る、通常は細菌起源の、二本鎖ＤＮＡの自己充足型の分子である。プラスミドベクターは、コードＤＮＡおよびプロモーターＤＮＡを含み、外来ＤＮＡを挿入するのに適切な１つまたは複数の制限部位を有する場合が多い。コードＤＮＡは、特定のタンパク質または酵素の特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列である。プロモーターＤＮＡは、コードＤＮＡの発現を開始、調節または他の方法で媒介もしくは制御するＤＮＡ配列である。プロモーターＤＮＡおよびコードＤＮＡは、同じ遺伝子または異なる遺伝子由来であり得、同じまたは異なる生物由来であり得る。組換えクローニングベクターは、クローニングまたは発現のための１つまたは複数の複製系、宿主における選択のための１つまたは複数のマーカー、例えば、抗生物質耐性、および１つまたは複数の発現カセットを含む場合が多い。
【００５９】
用語「標的ポリペプチドの合成」または「発現」とは、遺伝子産物の生合成を指す。構造遺伝子の場合、発現／合成には、ｍＲＮＡへの構造遺伝子の転写、および次いで、１つまたは複数のポリペプチドへのｍＲＮＡの翻訳が関与する。
【００６０】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」または「タンパク質」は、隣接残基のアルファ−アミノ基とカルボキシル基との間のペプチド結合によって互いに接続された一連の直鎖アミノ酸残基を指すために、本明細書で相互交換可能に使用される。アミノ酸残基は、好ましくは、天然の「Ｌ」異性体形態である。しかし、所望の機能的特性がポリペプチドによって保持される限り、「Ｄ」異性体形態の残基で任意のＬ−アミノ酸残基を置換し得る。さらに、アミノ酸には、２０種の「標準的な」アミノ酸に加えて、改変型および異常なアミノ酸が含まれる。
【００６１】
「連結された」とは、２つ以上の分子間の非共有結合または共有結合を指す。連結は、直接的または間接的であり得る。２つの分子は、それら２つの分子が接続分子（リンカー）を介して連結される場合、間接的に連結されている。２つの分子は、それらを連結する介在分子が存在しない場合、直接的に連結されている。上述のように、目的のポリヌクレオチドおよび／または遺伝子ならびに前記プロモーター構築物は、好ましくは、互いに直接的に連結される。
【００６２】
プロモーター、ターミネーターまたはポリアデニル化シグナルは、遺伝子の開始点（例えば、最初のコドン）に対して近位であり、遺伝子の終結点（例えば、最後のコドン）に対して遠位である場合、遺伝子の「上流」である。プロモーター、ターミネーターまたはポリアデニル化シグナルは、遺伝子の終結点に対して近位であり、遺伝子の開始点に対して遠位である場合、遺伝子の「下流」である。遺伝子と機能的に関連する、本発明のプラスミド中のプロモーターは、遺伝子のセンス鎖またはアンチセンス鎖の転写を促進するような配向にされる。
【００６３】
上述のように、ＤＮＡプロモーター構築物は、例えば、翻訳可能なＲＮＡ産物の発現を駆動することが可能なＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターまたはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含み得る。例えば、発現カセットは、任意選択で、転写されるＲＮＡの３’末端においてポリアデニル化シグナルを含み得る。
【００６４】
本開示は、本開示に従うＤＮＡプロモーター構築物、転写鋳型または発現カセットを含む核酸ベクターにも関する。核酸ベクターは、クローニングベクターおよび／または発現ベクターであり得る。
【００６５】
用語「ベクター」には、それが連結された別の核酸を輸送することが可能な核酸分子が含まれる。１つの型のベクターは、「プラスミド」であり、これは、さらなるＤＮＡセグメントがその中にライゲーションされ得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別の型のベクターは、さらなるＤＮＡセグメントがウイルスゲノム中にライゲーションされ得るウイルスベクターである。特定のベクターは、それが導入される宿主細胞における自律的複製が可能である（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクター、およびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞中への導入の際に宿主細胞のゲノム中に組み込まれ得、それにより、宿主ゲノムと一緒に複製される。さらに、特定のベクターは、それが作動可能に連結された遺伝子の発現を指示することが可能である。かかるベクターは、本明細書で「発現系」と呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ技術において利用される発現ベクターは、プラスミドの形態である場合が多い。プラスミドは、ベクターの最も一般に使用されている形態であるので、本明細書では、「プラスミド」および「ベクター」は、相互交換可能に使用され得る。しかし、本開示は、等価な機能を果たすかかる他の形態の発現ベクター、例えば、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）を含む意図である。
【００６６】
本開示は、タンパク質合成に適した無細胞タンパク質合成系であって、
ａ）原核細胞溶解物または真核細胞溶解物、
ｂ）反応緩衝液、ならびに
ｃ）前記請求項のいずれか一項に記載の転写鋳型および／または発現カセットおよび／または核酸ベクター
を含む、無細胞タンパク質合成系にも関する。
【００６７】
一部の有利な実施形態では、真核細胞溶解物は、タバコＢＹ−２細胞溶解物である。
【００６８】
２つの基本的な成分が、かかるｉｎ  ｖｉｔｒｏタンパク質発現を達成するために必要である：（１）標的タンパク質をコードする遺伝子鋳型（ｍＲＮＡまたはＤＮＡ）、ならびに（２）必要な転写および翻訳の分子機構を含む反応溶液。細胞抽出物（または無細胞タンパク質合成（ＣＦＰＳ）系）は、
・ｍＲＮＡ転写のためのＲＮＡポリメラーゼ、
・ポリペプチド翻訳のためのリボソーム、
・ｔＲＮＡおよびアミノ酸、
・酵素補因子およびエネルギー源、
・適切なタンパク質フォールディングに必須の細胞成分
を含む、反応溶液の分子の全てまたはほとんどを供給する。
【００６９】
無細胞ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写のための鋳型ＤＮＡは、直鎖、環状プラスミドまたはＰＣＲ断片であり得る。しかし、ＤＮＡは、転写される遺伝子の上流にプロモーター配列を含まなくてはならない。
【００７０】
細胞溶解物は、酵素の正確な組成および割合、ならびに翻訳に必要な構成要素を提供する（通常、エネルギー源およびアミノ酸も、合成を持続させるために添加する必要がある）。細胞膜は、細胞のサイトゾルおよびオルガネラ成分のみを残して除去される（従って、用語「無細胞抽出物／溶解物」）。無細胞タンパク質発現のために開発された最初の型の溶解物は、原核生物に由来した。より最近、昆虫細胞、哺乳動物細胞およびヒト細胞由来の抽出物に基づく系が開発され、市販されている。
【００７１】
本開示に従う無細胞タンパク質合成系は、原核細胞溶解物または真核細胞溶解物などの生物学的抽出物／溶解物を含む。タンパク質の転写／翻訳のための反応ミックスは、高分子、例えば、ＤＮＡ、ｍＲＮＡなどの産生のための鋳型；合成される高分子のためのモノマー、例えば、アミノ酸、ヌクレオチドなど、ならびに合成に必要なそのような補因子、酵素および他の試薬、例えば、リボソーム、ｔＲＮＡ、ポリメラーゼ、転写因子およびエネルギー再生系、例えば、クレアチンリン酸／クレアチンキナーゼなどを含む。かかる合成反応系は、当該分野で周知であり、文献中に記載されている。ポリペプチド合成のためのいくつかの反応化学が、本発明の方法において使用され得る。例えば、反応化学は、２００２年１月８日に発行された米国特許第６，３３７，１９１号明細書および１月２日に発行された米国特許第６，１６８，９３１号明細書に記載されている。
【００７２】
無細胞発現系は、ＤＮＡ鋳型からのタンパク質合成（転写および翻訳）またはｍＲＮＡ鋳型からのタンパク質合成（翻訳のみ）を支持し得る。原理上、無細胞発現系は、２つの別々の逐次的反応（カップリングされていない）として、または同時的に１つの反応（カップリングされた）として、転写ステップおよび翻訳ステップを達成するように設計され得る。
【００７３】
原核生物大腸菌（Escherichia coli）抽出物ベースの無細胞系は、急速に開発された（総説については、Carlson, E. D. et al. "Cell-free protein synthesis: Applications come of age," Biotechnol. Adv. 30, 1185-1194, (2012)を参照のこと）。本発明の目的のために、任意の原核細胞溶解物または真核細胞溶解物が、無細胞タンパク質合成系として使用され得る。無細胞タンパク質合成系としての原核細胞溶解物として、大腸菌（E. coli）Ｓ３０無細胞抽出物が、Zubay, G. (1973, Ann. Rev. Genet. Vol 7, p. 267）によって記載された。これらは、発現される遺伝子が、適切な原核生物調節配列、例えば、プロモーターおよびリボソーム結合部位を含むベクター中にクローニングされている場合に使用され得る。
【００７４】
無細胞系は、転写および翻訳が、抽出物へのＤＮＡの添加後に同時に起こる場合、「カップリングされた」とみなされる。一部の有利な実施形態では、本開示に従う無細胞タンパク質合成系は、カップリングされた無細胞タンパク質合成系である。
【００７５】
しかし、真核生物無細胞溶解物は、種々の翻訳後プロセシング活性を保持することに少なくとも部分的に起因して、多くの理由のために好ましい発現系である。例えば、イヌミクロソーム膜を無細胞コムギ胚芽抽出物に添加することで、シグナルペプチド切断およびコアグリコシル化などのプロセシング事象が試験され得る。真核細胞溶解物はまた、幅広い種類のウイルスおよび他の原核生物ＲＮＡ、ならびに真核生物ｍＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳を支持する。
【００７６】
以前に開発された主要な真核生物ＣＦＰＳプラットホームには、コムギ胚芽抽出物（ＷＧＥ）（Goshima, N. et al. "Human protein factory for converting the transcriptome into an in vitro-expressed proteome," Nat. Methods 5, 1011-1017 (2008)；Hoffmann, M. et al. in Biotechnol Annu Rev Vol. 10, 1-30 (Elsevier, 2004)；Takai et al. (2010)）、ウサギ網状赤血球溶解物（ＲＲＬ）（Jackson, R. J. et al. in Methods Enzymol Vol. Vol. 96 (eds. Becca Fleischer, Sidney Fleischer) Ch. 4, 50-74 (Academic Press, 1983)）；昆虫細胞抽出物（ＩＣＥ）（Ezure, T et al. "A cell-free protein synthesis system from insect cells," Methods Mol. Biol. 607, 31-42 (2010)；Kubick, S et al. in Current Topics in Membranes, Vol. 63 (ed. Larry DeLucas) 25-49 (Academic Press, 2009)；Tarui, H. et al. "Establishment and characterization of cell-free translation/glycosylation in insect cell (Spodoptera frugiperda 21) extract prepared with high pressure treatment," Appl. Microbiol. Biotechnol. 55, 446-453 (2001)）；リーシュマニア・タレントラエ（Leishmania tarentolae）抽出物（Kovtun, O. et al. "Towards the construction of expressed proteomes using a Leishmania tarentolae based cell-free expression system," PLoS One 5, el4388 (2010)；Mureev, S. et al. "Species-independent translational leaders facilitate cell-free expression," Nat. Biotechnol. 27, 747-752 (2009)）；ならびにＨｅＬａおよびハイブリドーマ細胞抽出物（Mikami, S. et al. in Cell-Free Protein Production Vol. 607 Methods in Molecular Biology (eds. Yaeta Endo, Kazuyuki Takai, & Takuya Ueda) Ch. 5, 43-52 (Humana Press, 2010)）から作製された系が含まれる。これらの真核生物溶解物は全て、研究者の間で一般的であり、広く入手可能である。
【００７７】
本開示によれば、無細胞タンパク質合成系として使用される細胞抽出物は、細胞溶解、高速遠心分離（３０，０００ＲＣＦ）、事前インキュベーション、透析および低速遠心分離（４，０００ＲＣＦ）の逐次的ステップを含む方法によって調製され得る。本開示で使用される細胞は、好ましくは、大腸菌（E. coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）、コムギ胚芽、イネ胚芽、オオムギ胚芽、ＣＨＯ細胞、ハイブリドーマ細胞および網状赤血球からなる群から選択されるが、これらに限定されない。
【００７８】
本開示の有利な実施形態では、タバコＢＹ−２細胞溶解物が好ましい。このタバコＢＹ−２細胞溶解物は、例えば、Buntru et al. BMC Biotechnology 2014, 14:37およびBuntru et al, Biotechnology and Bioengineering, Vol. 112, No. 5, 2015, 867-878によって記載される方法によって調製され得る（実施例を参照のこと）。
【００７９】
表１には、本開示に従うＤＮＡプロモーター構築物中に含まれる増強エレメントの一部の有利な実施形態が列挙される（図３を参照のこと）。エンハンサーエレメントＶ９は、先行技術（Buntru et al., 2015）の公知のエンハンサーエレメントである。先行技術で公知のエンハンサーエレメントとは対照的に、特に、エンハンサーエレメントＶ４、Ｖ５およびＶ８を含むプロモーター構築物は、驚くべきことに、非常に低い濃度で使用することができ、このことは、スクリーニングアッセイおよび／またはタンパク質スクリーニングおよび／または産生プラットホームにおけるそれらの使用にとって重要である。従って、本開示の一部の有利な実施形態では、本開示に従うプロモーター構築物および／またはタンパク質発現のための鋳型は、０．０２５μｇと０．５μｇとの間の濃度で、無細胞タンパク質合成系において、または方法および／もしくはタンパク質スクリーニングおよび／もしくは産生プラットホームにおいて使用される。
【００８０】
【表２】
2020505951.tif 000003
【００８１】
表２には、本開示に従うＤＮＡプロモーター構築物の有利な実施形態が示される（配列番号３）。配列番号４は、プロモーター構築物のさらなる実施形態であり、配列番号５は、先行技術に開示されたプロモーター構築物である。配列番号１は、Ｔ７プロモーターエレメントと５’ＵＴＲ配列エレメントとの間に増強エレメントを有さないプロモーター構築物の核酸配列であり、配列番号２は、Ｔ７プロモーターエレメントと５’ＵＴＲ配列エレメントとの間に３つの核酸のみを有するプロモーター構築物の核酸配列である。配列番号６〜１０は、元の転写開始部位を有さないＲＮＡポリメラーゼのプロモーターエレメントの例である。配列番号１１〜１３は、元の転写開始部位を有さないＲＮＡポリメラーゼのプロモーターエレメントの例である。配列番号１４は、タバコモザイクウイルス（Tobacco mosaic virus）（ＴＭＶ）由来のオメガ５’ＵＴＲ配列の例であり、配列番号１５は、タバコエッチウイルス（Tobacco etch virus）由来のオメガ５’ＵＴＲ配列の例である。
【００８２】
【表３】
2020505951.tif 000004
【００８３】
本明細書で使用する場合、「発現鋳型」または「核酸鋳型」とは、ポリペプチドまたはタンパク質へと翻訳され得る少なくとも１つのＲＮＡを転写するための基質として機能する核酸を指す。発現鋳型には、ＤＮＡまたはＲＮＡから構成される核酸が含まれる。発現鋳型のための核酸として使用するためのＤＮＡの適切な供給源には、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、およびｃＤＮＡへと変換され得るＲＮＡが含まれる。ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびＲＮＡは、任意の生物学的供給源、例えば、とりわけ、組織サンプル、生検、スワブ、痰、血液サンプル、便サンプル、尿サンプル、剥離物由来であり得る。ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびＲＮＡは、宿主細胞またはウイルス起源由来であり得、現存生物および絶滅生物を含む任意の種由来であり得る。本明細書で使用する場合、「発現鋳型」、「核酸鋳型」および「転写鋳型」は、同じ意味を有し、相互交換可能に使用される。
【００８４】
本明細書で使用する場合、「翻訳鋳型」とは、ポリペプチドまたはタンパク質を合成するためにリボソームによって使用され得る発現鋳型からの転写のＲＮＡ産物を指す。用語「核酸」および「オリゴヌクレオチド」とは、本明細書で使用する場合、ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含む）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含む）、およびプリンまたはピリミジン塩基のＮ−グリコシドである任意の他の型のポリヌクレオチドを指す。用語「核酸」、「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」の間には、長さの区別は意図されず、これらの用語は、相互交換可能に使用される。これらの用語は、分子の一次構造のみを指す。従って、これらの用語は、二本鎖および一本鎖ＤＮＡ、ならびに二本鎖および一本鎖ＲＮＡを含む。本発明での使用のために、オリゴヌクレオチドは、塩基、糖またはリン酸骨格が改変されたヌクレオチドアナログ、ならびに非プリンまたは非ピリミジンヌクレオチドアナログもまた含み得る。
【００８５】
一部の有利な実施形態では、本開示に従う無細胞タンパク質合成系および方法では、タンパク質合成は、反応緩衝液の存在下で実現される。用語「反応緩衝液」または「反応混合物」とは、本明細書で使用する場合、無細胞タンパク質合成／発現を実施するために必要な試薬を含む溶液を指す。
【００８６】
ＤＮＡ転写鋳型（またはＲＮＡ翻訳鋳型）からの無細胞タンパク質合成を促進するための反応緩衝液は、さらなるＮＴＰを含み得、二価カチオン補因子もまた含まれ得る。反応混合物は、無細胞タンパク質合成を可能にするために必要な全ての試薬を含む場合、完全と言われる。
【００８７】
反応成分が、簡便さ、貯蔵安定性を理由として、または成分濃度の適用依存的な調整を可能にするために、成分全体のサブセットを各々が含む別々の溶液として慣用的に貯蔵されること、および反応成分が、完全な反応混合物を創出するために反応前に組み合わされることが、当業者に理解される。さらに、反応成分が、商業化のために別々に包装されること、および有用な市販のキットが、本発明の反応成分の任意のサブセットを含み得ることが、当業者に理解される。
【００８８】
前記無細胞タンパク質合成系を使用することによってタンパク質をｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成するための典型的な設定は、以下に記載される。溶解物アリコートは、−８０℃での貯蔵から取られ、室温で解凍される。タンパク質発現を開始させるために、核酸鋳型（カップリングされた転写−翻訳反応の場合にはＤＮＡ、カップリングされていない転写−翻訳反応の場合にはｍＲＮＡ）が、溶解物に添加され、さらにＨＥＰＥＳ緩衝液、グルタミン酸マグネシウム、グルタミン酸カリウム、ＮＴＰ（カップリングされた転写−翻訳反応についてはＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰおよびＵＴＰ、カップリングされていない転写−翻訳反応についてはＡＴＰおよびＧＴＰ）、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、およびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（カップリングされた転写−翻訳反応についてのみ）から構成される反応混合物が添加される。カップリングされた転写−翻訳反応およびカップリングされていない転写−翻訳反応の両方は、サーモミキサー中で２５℃および７００ｒｐｍで１８時間実施される。標的タンパク質の性質に基づいて、合成されたタンパク質は、異なる方法、例えば、蛍光測定、酵素アッセイおよびＳＤＳ  ＰＡＧＥによって分析され得る。
【実施例】
【００８９】
タバコＢＹ−２溶解物（ＢＹＬ）の調製
脱液胞化（evacuolated）ＢＹ−２プロトプラストからの溶解物の調製を、顕著な改変を伴って、Komoda et al. (2004)およびGursinsky et al. (2009)に記載されたとおりに実施した。プロトプラストを、細胞を発酵培地中で３．５％（ｖ／ｖ）Ｒｏｈａｍｅｎｔ  ＣＬおよび０．２％（ｖ／ｖ）Ｒｏｈａｐｅｃｔ  ＵＦ（共にＡＢ  Ｅｎｚｙｍｅｓ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙから）で直接処理することによって、連続発酵の指数増殖期にある細胞から調製した。培地のモル浸透圧濃度を、３６０ｍＭマンニトールの添加によって調整した。得られたプロトプラストを、０．７Ｍマンニトール、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および５ｍＭ  ＰＩＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．０）中（下から上に）７０％（ｖ／ｖ、３ｍｌ）、４０％（ｖ／ｖ、５ｍｌ）、３０％（ｖ／ｖ、３ｍｌ）、１５％（ｖ／ｖ、３ｍｌ）および０％（３ｍｌ）のＰｅｒｃｏｌｌ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を含む不連続Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配上に層状化した。スウィングバケットローター中で２５℃で１時間の６，８００ｇでの遠心分離後、脱液胞化プロトプラストを、４０〜７０％（ｖ／ｖ）のＰｅｒｃｏｌｌ溶液界面から回収した。脱液胞化プロトプラストを、５０ｍｌのＣｏｍｐｌｅｔｅ  ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）当たり１錠を補充した３容積のＴＲ緩衝液（３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）、６０ｍＭグルタミン酸カリウム、０．５ｍＭグルタミン酸マグネシウム、２ｍＭ  ＤＴＴ）中に懸濁し、Ｄｏｕｎｃｅ組織グラインダー（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、ＵＳＡ）を３０ストロークで使用して破壊した。核および非破壊細胞を、４℃で１０分間の５００ｇでの遠心分離によって除去した。次いで、上清を、−８０℃で１ｍＬアリコート中で凍結した。
【００９０】
バッチ反応におけるＢＹＬのｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳活性
ＢＹＬの性能を、プラスミドｐＩＶＥＸ＿ＧＡＡＡＧＡ＿Ｏｍｅｇａ＿Ｓｔｒｅｐ−ｅＹＦＰを鋳型として使用してレポータータンパク質ｅＹＦＰを産生することによって調査した。カップリングされた転写−翻訳反応を、インキュベーターシェーカー（Ｋｕｅｈｎｅｒ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中で２５℃および５００ｒｐｍで１６時間、５０μｌアリコート中で実施した。標準的な反応は、４０％（ｖ／ｖ）ＢＹＬ、４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．８）、８．５ｍＭグルタミン酸マグネシウム、３ｍＭ  ＡＴＰ、１．２ｍＭ  ＧＴＰ、１．２ｍＭ  ＣＴＰ、１．２ｍＭ  ＵＴＰ、３０ｍＭクレアチンリン酸、０．１μｇ／μＬクレアチンキナーゼ、８０ｎｇ／μｌベクターＤＮＡおよび５０ｎｇ／μｌ自家製Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを含んだ。
【００９１】
ｅＹＦＰからの蛍光シグナルを、４８５／２０ｎｍ励起フィルターおよび５２８／２０ｎｍ発光フィルターを備えたＳｙｎｅｒｇｙ  ＨＴ  Ｍｕｌｔｉ−Ｍｏｄｅ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ、Ｂａｄ  Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈｓｈａｌｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して定量化した。ｅＹＦＰの量を、ＤＮＡ鋳型なしのＢＹＬ転写−翻訳反応における異なる濃度のｅＹＦＰに基づく検量線を生成することによって決定した。ｅＹＦＰ標準を、ＢＹＬ転写−翻訳系を使用して産生し、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ（登録商標）Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）によって精製した。精製されたｅＹＦＰの濃度を、比色アッセイ（Bradford, 1976）を使用して決定した。
【００９２】
鋳型ベクターの設計および試験
ベクターｐＩＶＥＸ＿Ｏｍｅｇａ＿Ｓｔｒｅｐ−ｅＹＦＰ中の転写開始部位（ｔｃ  ｓ）を、オメガ５’ＵＴＲ配列の上流の異なるヌクレオチドの付加によって改変した。合計で９つの異なるバリアントを設計し、ｐＩＶＥＸ＿Ｏｍｅｇａ＿Ｓｔｒｅｐ−ｅＹＦＰベクター中に取り込んだ。ここで、バリアント１（Ｖ１）は、転写開始部位にさらなるヌクレオチドを有さない元の配列に対応し、Ｖ２〜Ｖ９は、８つの改変された配列を示す（図３）。
【００９３】
異なるベクターバリアント（Ｖ１〜Ｖ９）を、タバコＢＹ２細胞から調製した無細胞ＢＹ−２溶解物（ＢＹＬ）を使用するカップリングされた転写−翻訳系において比較した（Buntru et al., 2015）。Ｎ末端Ｓｔｒｅｐ−タグを含むモデルタンパク質ｅＹＦＰ（Ｓｔｒｅｐ−ｅＹＦＰ）の産生のために、５０μｌの反応容積当たり０．０６２５、０．０１２５、０．０２５、０．５、１、２、４および８μｇの８つの異なる鋳型濃度のベクター（Ｖ１〜Ｖ９）を使用し、１サンプル当たり各々３つの独立した反応を調製した（図２）。転写開始部位にさらなるヌクレオチドを有さない元のオメガ配列（Ｖ１）は、全ての鋳型濃度においてｅＹＦＰ蓄積をほとんどもたらさなかった。さらなるＧＡＡトリプレットを有するオメガ配列（Ｖ２）は、５０μｌの反応当たり４または８μｇのプラスミドの高い鋳型濃度でのみ、ｅＹＦＰ蓄積をもたらした。対照的に、バリアントＶ４、Ｖ５およびＶ８は、５０μｌのＩＶＴＴ反応当たり０．２５μｇの低い鋳型濃度において最も高いｅＹＦＰ収量を生じた。全体的な最も高いｅＹＦＰ収量は、バリアントＶ４およびＶ７を使用して達成された。最も低い鋳型濃度における最も高いｅＹＦＰ収量は、バリアントＶ４を使用して達成された。５０μｌの反応当たり０．０６２５μｇの低い鋳型プラスミドが、溶解物１ｍＬ当たりおよそ１μｇのｅＹＦＰの検出可能なｅＹＦＰシグナルをもたらした。
【００９４】
結果
図２は、８つの異なる鋳型濃度（５０μｌの反応容積当たり０．０６２５、０．０１２５、０．０２５、０．５、１、２、４および８μｇのベクター（Ｖ１〜Ｖ９））で異なるバリアントのベクターｐＩＶＥＸ＿Ｏｍｅｇａを使用した、Ｓｔｒｅｐ−ｅＹＦＰの発現を示す。これらのバリアントは、オメガ５’非翻訳領域の上流の転写開始点において異なるヌクレオチドを含む。反応を、２５℃および５００ｒｐｍで１６時間、５０μｌスケールで実施した。ｅＹＦＰからの蛍光シグナルを、４８５／２０ｎｍ励起フィルターおよび５２８／２０ｎｍ発光フィルターを備えた蛍光リーダーを使用して定量化した。ｅＹＦＰの量を、ＤＮＡ鋳型なしのＢＹＬ転写−翻訳反応における異なる濃度のｅＹＦＰに基づく検量線を生成することによって決定した。ｅＹＦＰ標準を、ＢＹＬ転写−翻訳系を使用して産生し、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ（登録商標）Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）によって精製した。精製されたｅＹＦＰの濃度を、比色アッセイを使用して決定した。データは、各々３つの独立した転写−翻訳実験の平均および標準偏差を示す。
【００９５】
先行技術で公知のエンハンサーエレメントとは対照的に、特に、エンハンサーエレメントＶ４、Ｖ５およびＶ８を含むプロモーター構築物は、驚くべきことに、スクリーニングアッセイおよび／またはタンパク質スクリーニングおよび／または産生プラットホームにおけるそれらの使用にとって重要な非常に低い濃度で使用され得る。
【００９６】
参考文献
【００９７】
【表４】
2020505951.tif 000005
【図１】
2020505951.tif 000006
【図２】
2020505951.tif 000007
【図３】
2020505951.tif 000008
【配列表】
2020505951000001.app
【国際調査報告】
2020505951.tif 000009
2020505951.tif 000010
2020505951.tif 000011
2020505951.tif 000012