(57)【要約】  プロバイオティクス細菌バチルス・コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６の汚染防止効果を開示する。より具体的には、本発明は、ＵＶおよび様々な環境汚染物質の有害な作用に対する哺乳類の皮膚の保護における、プロバイオティクス細菌バチルス・コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６の使用を開示する。抗酸化物質、皮膚再生および洗浄剤としてのバチルス・コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６の使用も、開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＵＶ放射線および環境汚染物質の有害な作用に対して哺乳類の皮膚を保護するための、プロバイオティクス細菌バチルス・コアグランスを含有する組成物。
【請求項２】
プロバイオティクス細菌バチルス・コアグランスが、芽胞または生存桿菌の形態で存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
環境汚染物質が、限定されないが、微小粒子状物質、多環芳香族炭化水素（ＰＡＨ）、揮発性有機化合物（ＶＯＣ）、洗剤、窒素および硫黄酸化物、一酸化炭素、オゾンならびに重金属からなるリストから選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
プロバイオティクス細菌が、抗酸化物質のレベルを増大させ、ＲＯＳレベルを低減させることにより、皮膚保護を与える、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
バチルス・コアグランス株が、好ましくはバチルス・コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６である、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
組成物が、薬学的／薬用化粧品的に許容される賦形剤、アジュバント、基剤、希釈剤、担体、コンディショニング剤、バイオアベイラビリティ向上剤、および防腐剤とともに製剤化され、ならびに／または、皮膚ケア成分を含有する製剤中に組み込まれ、クリーム、ゲル、ローション、粉末、血清、油、懸濁液、軟膏、石けん、スクラブ、エマルションおよびコンパクトの形態で局所投与される、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
環境汚染物質およびＵＶ放射線に曝露した哺乳類の皮膚を洗浄し再生させる方法であって、プロバイオティクス細菌バチルス・コアグランスを含有する有効用量の組成物を、このような効果を必要とする哺乳類に投与するステップを含む、方法。
【請求項８】
プロバイオティクス細菌バチルス・コアグランスが、芽胞または生存桿菌の形態で存在する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
環境汚染物質が、限定されないが、微小粒子状物質、多環芳香族炭化水素（ＰＡＨ）、揮発性有機化合物（ＶＯＣ）、洗剤、窒素および硫黄酸化物、一酸化炭素、オゾンならびに重金属からなるリストから選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
プロバイオティクス細菌が、抗酸化物質のレベルを増大させ、ＲＯＳレベルを低減させることにより、皮膚を再生させる、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
バチルス・コアグランス株が、好ましくはバチルス・コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６である、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
組成物が、薬学的／薬用化粧品的に許容される賦形剤、アジュバント、基剤、希釈剤、担体、コンディショニング剤、バイオアベイラビリティ向上剤、および防腐剤とともに製剤化され、ならびに／または、皮膚ケア成分を含有する製剤中に組み込まれ、クリーム、ゲル、ローション、粉末、血清、油、懸濁液、軟膏、石けん、スクラブ、エマルションおよびコンパクトの形態で局所投与される、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
抗酸化物質としての使用のための、プロバイオティクス細菌バチルス・コアグランスを含有する組成物。
【請求項１４】
プロバイオティクス細菌バチルス・コアグランスを含有する組成物が、哺乳類の細胞の酸化ストレスの治療的な管理において使用される、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
プロバイオティクス細菌バチルス・コアグランスが、芽胞または生存桿菌の形態で存在する、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
バチルス・コアグランス株が、好ましくはバチルス・コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１７】
薬学的／薬用化粧品的に許容される賦形剤、アジュバント、基剤、希釈剤、担体、コンディショニング剤、バイオアベイラビリティ向上剤、および防腐剤とともに製剤化され、ならびに／または、皮膚ケア成分を含有する製剤中に組み込まれ、機能性食品、薬用化粧品およびニュートリコスメティクスの用途に適した、錠剤、カプセル剤、粉末、エマルション、溶液、クリーム、ゲル、ローション、粉末、血清、油、懸濁液、軟膏、石けん、スクラブ、エマルションおよびコンパクトの形態で、経口または局所投与される、請求項１３に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その詳細が参照により本明細書に組み込まれる、２０１７年８月３１日に出願されたインド仮特許出願第２０１７４１０３０８６７号に基づく優先権を主張する、ＰＣＴ出願である。
本発明は、プロバイオティクス組成物に関する。より具体的には、本発明は、汚染物質防止および皮膚再生／洗浄剤としての使用のための、プロバイオティクス微生物バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）  ＭＴＣＣ  ５８５６を含む組成物に関係する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳類の身体における最も大きな器官である皮膚は、機械的衝撃および圧力、温度の変動、微生物、放射線および化学物質に対する保護を与えることによって、障壁の役割を果たす。しかし、皮膚は様々な汚染物質に曝露されており、それにより、肌の早期老化、色素沈着斑もしくはにきびが引き起こされ、またはアトピー性皮膚炎、乾癬、さらには皮膚がんなどの、より重篤な皮膚科学的な問題がもたらされる（English, J.S., R.S.Dawe, and J. Ferguson, Environmental effects and skin disease.Br Med Bull, 2003.68: p. 129-42）。
ＷＨＯからの近年の報告では、汚染レベルの増大によってほぼ全員が影響を受けており、世界で３００万を超える人々がそれが原因で死亡していることが示されている。汚染の主要な発生源としては、微小粒子状物質、多環芳香族炭化水素（ＰＡＨ）、揮発性有機化合物（ＶＯＣ）、窒素および硫黄酸化物、一酸化炭素、オゾン、および重金属が挙げられる（Baudouin, C., et al., Environmental pollutants and skin cancer.Cell Biol Toxicol, 2002.18(5): p. 341-8）。有毒ガス（ＣＯ２、ＣＯ、ＳＯ２、ＮＯ、ＮＯ２）、低分子量炭化水素、残留性有機汚染物質（例えば、ダイオキシン）、重金属（例えば、鉛、水銀）および微小粒子状物質（ＰＭ）は、発生源から形成される、一次汚染物質を形成する。オゾン（Ｏ３）、ＮＯ２、ペルオキシアセチルナイトレート、過酸化水素およびアルデヒドが含まれる二次汚染物質は、一次汚染物質が関与する化学および光化学反応を介して、大気中で形成される（Kampa, M. and E. Castanas, Human health effects of air pollution.Environ Pollut, 2008.151(2): p. 362-7）。
【０００３】
皮膚に対する汚染の作用は、多種多様である。汚染物質の存在下では、皮膚の正常な微生物叢の組成が変化し、病原生物の定着につながる（Jo、J.H., E.A.Kennedy, and H.H.Kong, Topographical and physiological differences of the skin mycobiome in health and disease.Virulence, 2017.8(3): p. 324-333）。汚染は、活性酸素種（ＲＯＳ）の産生を促進し、皮膚中の抗酸化物質の含有量を枯渇させる。このことにより、酸化還元バランスの乱れが生じ、細胞へのストレスが引き起こされる。汚染物質が皮膚層に浸透するにつれて、汚染物質は、汚染物質の毒性作用を媒介するアリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）を活性化することがある。炎症性カスケードは、これらの変化により活性化し、インターロイキン（ＩＬ）−１またはＩＬ  ８などの炎症誘発性サイトカインの産生の増大をもたらし、皮膚病変および皮膚外観の劣化をもたらす（Mancebo, S.E. and S.Q.Wang, Recognizing the impact of ambient air pollution on skin health.J Eur Acad Dermatol Venereol, 2015.29(12): p. 2326-32）。
【０００４】
ＵＶＡ等の環境汚染物質は、マトリックスタンパク質のエラスチンおよびコラーゲンを分解する酵素である、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の形成を上方制御し、阻止されない場合、皮膚弾力性の著しい減少およびしわの増大をもたらすことがある（Risom, L., P. Moller, and S. Loft, Oxidative stress-induced DNA damage by particulate air pollution.Mutat Res, 2005.592(1-2): p. 119-37; Moller, P. and S. Loft, Oxidative damage to DNA and lipids as biomarkers of exposure to air pollution.Environ Health Perspect, 2010.118(8): p. 1126-36）。ＵＶＡは、ＵＶＢと比較して、皮膚のより深部に浸透することができ、光老化、光発癌および光線皮膚症の一因となり、皮膚のより深部にある線維芽細胞および細胞における酸化ストレスを増大させる。青色光（携帯、ＴＶ、ラップトップ／デスクトップスクリーンからの光）は、類似の作用を呈すると報告されている（Godley et al., Blue Light Induces Mitochondrial DNA Damage and Free Radical Production in Epithelial Cells, The Journal Of Biological Chemistry, 2005, 280(22):21061-21066）。
【０００５】
酸化ストレスは、（１）反応種の産生をもたらす異常な生化学的過程、（２）傷害物質（すなわち、環境汚染物質および放射線）への曝露または（３）内因性抗酸化系の能力の制限に起因する、細胞の環境の酸化還元特性における不均衡として定義される。酸化ストレス下で産生された活性酸素および窒素種（ＲＯＳ／ＲＮＳ）は、すべての細胞の生体分子（脂質、糖、タンパク質およびポリヌクレオチド）を傷害することが知られている。
以下の先行技術文献には、様々な疾患の病因であるＲＯＳ／ＲＮＳの役割が詳細に記載されている。
2020532530.tif 000002
非制御ＲＯＳの増大を阻止する細胞防御系は、非酵素的分子（グルタチオン、ビタミンＡ、Ｃ、およびＥ、ならびに食物中に存在する数種の抗酸化物質）ならびにＲＯＳの酵素スカベンジャーを含み、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、カタラーゼ（ＣＡＴ）およびグルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰＸ）は、最もよく知られている機構である。
【０００６】
このような細胞防御系に加えて、細胞の酸化還元平衡を制御する外来物質（ｅｘｔｒａｎｅｏｕｓ  ａｇｅｎｔ）も、当技術分野で既知である。Stancu CS et al, “Probiotics determine hypolipidemic and antioxidant effects in hyperlipidemic hamsters”, Mol Nutr Food Res.2014 Mar;58(3):559-68中では、組み合わせたプロバイオティクススキーム（例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓおよびＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｎｉｍａｌｉｓの組合せ）が、抗酸化物質であることが示されている。プロバイオティクスは、皮膚の健康を改善し、汚染防止効果を呈することも報告されている。
2020532530.tif 000003
しかし、プロバイオティクスの生物学的活性が株特異的であるという共通理解に起因して、プロバイオティクス微生物の治療的な目的での使用には、技術的な問題が存在する。生物学的活性における属−種−株特異的差異は、特定の健康への効果に対してプロバイオティクスを関連付け、Joint FAO/WHO Working Group Report on Drafting Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food London, Ontario, Canada, April 30 and May 1, 2002-See Section 3.1に示されているような正確な監視および疫学的試験を可能とするために、評価されることとなる。したがって、良好な汚染防止効果を呈し、皮膚を再生させることのできる優れたプロバイオティクスが、なお保証されている。本発明は、有効な汚染防止剤および良好な抗酸化物質としてのプロバイオティクス微生物バチルス・コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６の開示により、前述の技術的な問題を克服するものである。
【０００７】
プロバイオティクス微生物バチルス・コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６の汚染防止効果を開示し、皮膚再生／洗浄剤としての効果を開示することが、本発明の主な目的である。
バチルス・コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６の抗酸化特性を開示することが、本発明の別の目的である。
本発明は、前述の目的を実現し、さらなる関連する利点を提供する。
【０００８】
生物学的材料の寄託
本出願中で言及される、受託番号ＭＴＣＣ  ５８５６を有する生物学的材料バチルス・コアグランスの寄託は、２０１３年９月１９日に、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ＆  Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ  （ＭＴＣＣ）、ＣＳＩＲ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓｅｃｔｏｒ  ３９−Ａ、Ｃｈａｎｄｉｇａｒｈ−１６００３６、インドで行われている。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、哺乳類の皮膚に対する、プロバイオティクス細菌バチルス・コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６の汚染防止効果を開示する。より詳細には、本発明は、ＵＶおよび様々な環境汚染物質の有害な作用に対する皮膚の保護における、プロバイオティクス細菌バチルス・コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６の使用を開示する。抗酸化物質、皮膚再生および洗浄剤としてのバチルス・コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６の使用も、開示される。
本発明の他の特徴および利点は、例示として本発明の原理を説明する添付の図面と合わせ、以下のより詳細な説明から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１ａ】ＵＶ−Ａに曝露したマウスの線維芽細胞における、プロバイオティクス細菌バチルス・コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６によるＲＯＳ産生の低減を示すグラフ表示である。
【図１ｂ】ＵＶ−Ａに曝露したマウスの線維芽細胞における、プロバイオティクス細菌バチルス・コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６によるＲＯＳ除去のパーセンテージを示すグラフ表示である。
【図２ａ】ＵＶ−Ｂに曝露したヒト角化細胞における、プロバイオティクス細菌バチルス・コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６によるＲＯＳ産生の低減を示すグラフ表示である。
【図２ｂ】ＵＶ−Ｂに曝露したヒト角化細胞における、プロバイオティクス細菌バチルス・コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６によるＲＯＳ除去のパーセンテージを示すグラフ表示である。
【図３ａ】ラウリル硫酸ナトリウムに曝露したマウスの線維芽細胞における、プロバイオティクス細菌バチルス・コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６によるＲＯＳ産生の低減を示すグラフ表示である。
【図３ｂ】ラウリル硫酸ナトリウムに曝露したマウスの線維芽細胞における、プロバイオティクス細菌バチルス・コアグランス  コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６によるＲＯＳ除去のパーセンテージを示すグラフ表示である。
【図４ａ】重金属の混合物に曝露したヒト角化細胞における、プロバイオティクス細菌バチルス・コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６によるＲＯＳ産生の低減を示すグラフ表示である。
【図４ｂ】重金属の混合物に曝露したヒト角化細胞における、プロバイオティクス細菌バチルス・コアグランス  コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６によるＲＯＳ除去のパーセンテージを示すグラフ表示である。
【図５ａ】ベンツピレン（ＰＡＨ）およびＵＶ照射の混合に曝露したヒト角化細胞における、プロバイオティクス細菌バチルス・コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６による細胞生存の増大を示すグラフ表示である。
【図５ｂ】ベンツピレン（ＰＡＨ）およびＵＶ照射の混合に曝露したヒト角化細胞における、プロバイオティクス細菌バチルス・コアグランス  コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６による、細胞死に対する保護のパーセンテージを示すグラフ表示である。
【図６ａ】ＵＶ−Ａに曝露したヒト角化細胞における、プロバイオティクス細菌バチルス・コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６による細胞のグルタチオンレベルの増大を示すグラフ表示である。
【図６ｂ】ＵＶ−Ｂに曝露したヒト角化細胞における、プロバイオティクス細菌バチルス・コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６による細胞のグルタチオンレベルの増大を示すグラフ表示である。
【図７ａ】ＵＶ−Ａに曝露したヒト角化細胞における、プロバイオティクス細菌バチルス・コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６による細胞のスーパーオキシドジスムターゼ活性の増大を示すグラフ表示である。
【図７ｂ】ＵＶ−Ｂに曝露したヒト角化細胞における、プロバイオティクス細菌バチルス・コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６による細胞のスーパーオキシドジスムターゼ活性の増大を示すグラフ表示である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
最も好ましい実施形態では、本発明は、ＵＶ放射線および環境汚染物質の有害な作用に対して哺乳類の皮膚を保護するための、プロバイオティクス細菌バチルス・コアグランスを含有する組成物を開示する。関連する一実施形態では、プロバイオティクス細菌バチルス・コアグランスは、芽胞または生存桿菌の形態で存在する。別の関連する実施形態では、環境汚染物質は、限定されないが、微小粒子状物質、多環芳香族炭化水素（ＰＡＨ）、揮発性有機化合物（ＶＯＣ）、洗剤、窒素および硫黄酸化物、一酸化炭素、オゾンならびに重金属からなるリストから選択される。別の関連する実施形態では、プロバイオティクス細菌は、抗酸化物質のレベルを増大させ、ＲＯＳレベルを低減させることにより、皮膚保護を与える。関連する一実施形態では、バチルス・コアグランス株は、好ましくはバチルス・コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６である。なお別の関連する実施形態では、組成物は、薬学的／薬用化粧品的に許容される賦形剤、アジュバント、基剤、希釈剤、担体、コンディショニング剤、バイオアベイラビリティ向上剤、および防腐剤とともに製剤化され、ならびに／または、皮膚ケア成分を含有する製剤中に組み込まれ、クリーム、ゲル、ローション、粉末、血清、油、懸濁液、軟膏、石けん、スクラブ、エマルションおよびコンパクトの形態で局所投与される。
【００１２】
別の最も好ましい実施形態では、本発明は、環境汚染物質およびＵＶ放射線に曝露した哺乳類の皮膚を洗浄し再生させる方法であって、プロバイオティクス細菌バチルス・コアグランスを含有する有効用量の組成物を、このような効果を必要とする哺乳類に投与するステップを含む、方法を開示する。関連する一実施形態では、プロバイオティクス細菌バチルス・コアグランスは、芽胞または生存桿菌の形態で存在する。別の関連する実施形態では、環境汚染物質は、限定されないが、微小粒子状物質、多環芳香族炭化水素（ＰＡＨ）、揮発性有機化合物（ＶＯＣ）、洗剤、窒素および硫黄酸化物、一酸化炭素、オゾンならびに重金属からなるリストから選択される。別の関連する実施形態では、プロバイオティクス細菌は、抗酸化物質のレベルを増大させ、ＲＯＳレベルを低減させることにより、皮膚を再生させる。関連する一実施形態では、バチルス・コアグランス株は、好ましくはバチルス・コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６である。なお別の関連する実施形態では、組成物は、薬学的／薬用化粧品的に許容される賦形剤、アジュバント、基剤、希釈剤、担体、コンディショニング剤、バイオアベイラビリティ向上剤、および防腐剤とともに製剤化され、ならびに／または、皮膚ケア成分を含有する製剤中に組み込まれ、クリーム、ゲル、ローション、粉末、血清、油、懸濁液、軟膏、石けん、スクラブ、エマルションおよびコンパクトの形態で局所投与される。
なお別の好ましい実施形態では、本発明は、抗酸化物質としての使用のための、プロバイオティクス細菌バチルス・コアグランスを含有する組成物を開示する。関連する一実施形態では、プロバイオティクス細菌バチルス・コアグランスを含有する組成物は、哺乳類の細胞の酸化ストレスの治療的な管理において使用される。関連する一実施形態では、プロバイオティクス細菌バチルス・コアグランスは、芽胞または生存桿菌の形態で存在する。関連する一実施形態では、バチルス・コアグランス株は、好ましくはバチルス・コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６である。なお別の関連する実施形態では、組成物は、薬学的／薬用化粧品的に許容される賦形剤、アジュバント、基剤、希釈剤、担体、コンディショニング剤、バイオアベイラビリティ向上剤、および防腐剤とともに製剤化され、ならびに／または、皮膚ケア成分を含有する製剤中に組み込まれ、機能性食品、薬用化粧品およびニュートリコスメティクスの用途に適した、錠剤、カプセル剤、粉末、エマルション、溶液、クリーム、ゲル、ローション、粉末、血清、油、懸濁液、軟膏、石けん、スクラブ、エマルションおよびコンパクトの形態で、経口または局所投与される。
最も好ましい実施形態を言明する特定の例示的な例は、本明細書の以下に挙げられている。
【００１３】
インビトロの汚染防止検査は、実験室条件下でインビボ状態を反映するように設定された、細胞モデルに基づく。これらは、通常、角化細胞または線維芽細胞株を使用して実施される。皮膚細胞に対する汚染の影響および汚染防止処置の効果を、特定のマーカーおよび細胞パラメーターの定量により評価した。
１．細胞中のＲＯＳ蓄積を、ＲＯＳにより酸化され、蛍光化合物を生成する、前蛍光プローブ（Rosenkranz, A.R., et al., A microplate assay for the detection of oxidative products using 2',7'-dichlorofluorescin-diacetate.J Immunol Methods, 1992.156(1): p. 39-45）を使用して測定した。
２．汚染防止処置の効果は、皮膚の抗酸化能および抗酸化物質が有害物質を中和する能力に反映される。
３．汚染防止処置の効果は、細胞の抗酸化酵素の増大および炎症の低減としても反映される。
【００１４】
（実施例１）
バチルス・コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６の汚染防止効果
方法
ＲＯＳアッセイ：細胞透過性の非蛍光性色素である２’，７’−ジクロロフルオレセインジアセテート（ＤＣＦＨ−ＤＡ）を細胞に進入させ、ＤＣＦＨ−ＤＡ上のアセテート基を細胞のエステラーゼにより切断し、非蛍光性ＤＣＦＨを細胞中に取り込ませた。細胞中で硫酸第一鉄により生成された活性酸素種による、その後の酸化により、４８５／５２０  Ｅｘ：Ｅｍ波長で検出することができる蛍光ＤＣＦを得る。試料の除去活性は、抗酸化物質を用いない対照と比較した蛍光の低減により示される。
ＲＯＳによる酸化
ＤＣＦＨ−ＤＡ（非蛍光色素）→ＤＣＦ（蛍光色素）
【００１５】
ヒトＨａＣａＴ角化細胞／マウス線維芽細胞を、３７℃および５％  ＣＯ2で、抗生物質とともに１０％の熱失活したウシ胎児血清を含む、２５ｍＭグルコースを含有するＤＭＥＭ中で維持した。細胞が７０〜８０％コンフルエントであった場合、これらをトリプシン処理し、洗浄し、細胞１×１０4個／ウェルの密度で、９６ウェルプレートに播種した。２４時間、細胞を接着させ、単層を形成させた。細胞を、汚染物質に曝露させる前に、様々な非毒性濃度のバチルス・コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６で、６０分間ＰＢＳ中で前処理した。細胞を、以下の汚染物質に曝露させた。
６０分間の１５ジュール／ｍ2のＵＶＡ強度、洗浄し、６時間インキュベートした。
３０分間の４．６ジュール／ｍ2のＵＶ−Ｂ強度、洗浄し、６時間インキュベートした。
多環芳香族炭化水素（ベンゾ［ａ］ピレン（ＢａＰ）を、０．５ｍＭで使用した。
重金属（各々０．２５ｍｍの、塩化コバルト（Ｃｏｂａｌｔ  ｃｈｌｏｒｉｅ）および硝酸鉛（ＩＩ））
３７℃および５％  ＣＯ2でのインキュベーションの６時間後、細胞中ＲＯＳを決定した。
【００１６】
結果
ＵＶ−Ａ
マウス線維芽細胞を、様々な細胞数のバチルス・コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６で１時間前処理し、１５ジュール／ｍ２の強度でＵＶＡに３０分間曝露させ、活性酸素除去を記録した。結果は、バチルス・コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６が、細胞５００個／ウェルの濃度で効果的に、ＵＶ−Ａ放射線に対して保護を与えたことを示している（図１ａおよび１ｂ）。
ＵＶ−Ｂ
ヒト角化細胞を、４．５ジュール／ｍ２の強度でＵＶＢ照射に１０分間曝露させ、活性酸素除去を記録した。細胞５００個／ウェルの濃度のバチルス・コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６は、産生されたＲＯＳを１８％除去することにより最大の保護を与えた（図２ａおよび２ｂ）。
【００１７】
ラウリル硫酸ナトリウム
マウス線維芽細胞を、異なる細胞数のバチルス・コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６で１時間前処理し、３００μＭのラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）に６０分間曝露させ、活性酸素除去を記録した。バチルス・コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６は、用量依存様式で、洗剤により誘導されたＲＯＳの除去により、汚染防止効果を呈した（図３ａ）。最大ＲＯＳ除去（３０．６％）は、細胞１０3個／ウェルの細胞数で観察された（図３ｂ）。
重金属
ヒト角化細胞を、異なる細胞数のバチルス・コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６の存在下で、重金属（各々０．２５ｍｍの、塩化コバルトおよび硝酸鉛）に曝露させた。バチルス・コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６は、重金属により誘導されたＲＯＳの除去により、汚染防止効果を呈した（図４ａ）。１８％の最大ＲＯＳ除去は、細胞１０2個／ウェルの細胞密度で観察された（図４ｂ）。
【００１８】
ＵＶＡの存在下での、多環芳香族炭化水素に対する保護
多環芳香族炭化水素（ＰＡＨ）は、変異原性および腫瘍原性の環境汚染物群である。ＰＡＨは、天然材料の不完全燃焼およびタバコ煙から生成され、環境中に拡散する（Connell, D. W.; Hawker, D. W.; Warne, M. J.; Vowles, P. P.:Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs).In Introduction into Environmental Chemistry (McCombs, K., and Starkweather, A. W., eds), 1997, pp. 205-217, CRC Press LLC, Boca Raton, FL.2.Shaw, G. R.; Connell, D. W.:Prediction and monitoring of the carcinogenicity of polycyclic aromaticcompounds (PACs).Rev. Environ.Contam.Toxic., 1994, 135, 1-62.）。ＰＡＨ自体は、生物学的に不活性であり、遺伝毒性を呈するために代謝活性化を要する。ＰＡＨは、ＵＶＡ領域の光を吸収し、酸素または他の分子と反応して、反応中間体を生成する（Yu H, Xia Q, Yan J, et al.Photoirradiation of polycyclic aromatic hydrocarbons with UVA light - a pathway leading to the generation of reactive oxygen species, lipid peroxidation, and dna damage.Int J Environ Res Public Health.2006;3:348-354）。したがって、ＰＡＨは、光照射により「活性化」し、光誘導性の細胞毒性を引き起こすことがある。したがって、ＵＶＡ照射によるＰＡＨの光照射は、細胞毒性およびＤＮＡ傷害を引き起こす汚染源に相当する。
ヒトＨａＣａＴ角化細胞／マウス線維芽細胞を、細胞１×１０4個／ウェルの密度で、９６ウェルプレートに播種した。２４時間、細胞を接着させ、単層を形成させた。細胞を、異なる細胞密度のバチルス・コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６で６０分間前処理し、０．５ｍＭのベンツピレンａ  ＰＡＨの存在下で、１５ジュール／ｍ2の強度でＵＶＡに３０分間曝露させ、滅菌緩衝液で洗浄し、新鮮な培養培地（５％のＦＢＳ）を、それぞれの濃度のプロバイオティクス細菌バチルス・コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６とともに加え、続いて、３７℃で、ＣＯ2インキュベーター中で６時間インキュベートした。ニュートラルレッド（５０ｐｇ／ｍＬ）（３−アミノ−７−ジメチルアミノ−２−メチルフェナジン塩酸塩）を、３時間、細胞に加えた。細胞によるＮＲの取込みを、細胞を溶解し、分光光度計で５４０ｎｍでの吸収を読み取ることにより決定した（Guidelines, O., Genetic Toxicology:Bacterial Reverse Mutation Assay # 471.1997）。
バチルス・コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６は、用量依存様式で、ＵＶＡ照射によるＰＡＨの光照射により誘導された細胞の細胞毒性から角化細胞を保護することにより、汚染防止効果を呈した（図５ａ）。最大ＲＯＳ除去（３０．６％）は、細胞１０3個／ウェルの細胞数で観察された（図５ｂ）。
【００１９】
（実施例２）
細胞の抗酸化物質に対するバチルス・コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６の効果
方法
細胞の抗酸化物質は、汚染物質により枯渇する。細胞中でこれらの抗酸化酵素を増大させるバチルス・コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６の能力を、インビトロで試験した。細胞グルタチオン（ＧＳＨ）およびスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）レベルを、ヒト角化細胞において推定した（Peskin AV, Winterbourn CC.Assay of superoxide dismutase activity in a plate assay using WST-1.Free Radic Biol Med.2017;103:188-191.）。
【００２０】
ＳＯＤアッセイ。ＳＯＤの活性を、製造者の指示（Ｅｌａｂｓｃｉｅｎｃｅｓ）に従い、キットを使用して、ＷＳＴ−１方法により測定した。キサンチンオキシダーゼ（ＸＯ）は、ＷＳＴ−１のＯ2.-との反応を触媒して、水溶性のホルマザン色素を生成することができる。ＳＯＤはスーパーオキシドアニオンの不均化を触媒することができ、そのため、反応は、ＳＯＤにより阻害されることがあり、ＳＯＤの活性は、ホルマザン色素の量と負に相関する。したがって、ＳＯＤの活性は、ＷＳＴ−１生成物の比色分析により決定することができる。
グルタチオン（ＧＳＨ）の含有量：還元型グルタチオンを、Ｍｏｒｏｎ、Ｄｅｐｉｅｒｒｅの方法に基づき決定した。ＧＳＨを、ＤＴＮＢと反応させ、４１２ｎｍで最大吸収する黄色の複合体を得ることにより測定する。１００μｌの検査試料（ＣＥＬＬ  ＬＹＳＡＴＥ）を１０μｌの５０％  ＴＣＡと混合し、２０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離にかけた。３０μｌの上清を５０μｌの０．２Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）および２００μｌの新しく調製した０．６ｍＭ  ＤＴＮＢと混合し、黄色形成の強度を４１２ｎｍで測定した。標準グラフを、異なる濃度（１０００〜６２．５μＭ）のＧＳＨを用いて作成した。試料中のＧＳＨの含有量を、標準グラフから計算し、μｍｏｌ／ｍｇタンパク質として表した。
【００２１】
結果
結果は、バチルス・コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６が、用量依存様式で、グルタチオンの含有量を増大させたことを明らかにしている（図６ａおよび６ｂ）。ＳＯＤの活性は、用量依存様式で、バチルス・コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６で処理した細胞中でも増大し（図７ａおよび７ｂ）、バチルス・コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６が、有効な抗酸化物質であるだけでなく、細胞中の抗酸化物質の含有量を増大させることにより皮膚を再生させることも示している。
結論
全体として、バチルス・コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６は、ＵＶおよび他の汚染物質に対し、これらの汚染物質への曝露の結果として産生されたＲＯＳを除去することにより保護を与えることにより、汚染防止効果を呈したことが観察された。バチルス・コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６は、有効な抗酸化物質としても作用し、細胞中の抗酸化物質の含有量も増大させる。本発明は、バチルス・コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６は、様々な病原性状況の管理のための抗酸化物質としてだけでなく、汚染物質に対する保護を与え、抗酸化物質の含有量を増大させることにより、有効な皮膚再生および洗浄剤としても使用することができ、皮膚ケア／化粧品産業の用途の可能性を有することができることを報告する。
【００２２】
（実施例３）
皮膚ケアのための、バチルス・コアグランスを含有する製剤
バチルス・コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６を含有する組成物は、薬学的／薬用化粧品的に許容される賦形剤、アジュバント、基剤、希釈剤、担体、コンディショニング剤、バイオアベイラビリティ向上剤、抗酸化物質および防腐剤とともに製剤化されてもよく、ならびに／または、抗老化成分を含有する製剤中に組み込まれ、クリーム、ゲル、ローション、粉末、血清、油、懸濁液、軟膏、石けん、スクラブ、エマルションおよびコンパクトの形態で局所投与されてもよい。
【００２３】
関連する一態様では、１つまたは複数の皮膚ケア成分は、限定されないが、アルファリポ酸、オキシレスベラトロール、ビート根エキス、Ｂｏｓｗｅｌｌｉａ  ｓｅｒｒａｔａエキス、βボスウェリン酸、Ｂｏｓｗｅｌｌｉａ  ｓｅｒｒａｔａ油、Ｃｅｎｔｅｌｌａ  ａｓｉａｔｉｃａエキス、トリテルペン、Ｇａｒｃｉｎｉａ  ｉｎｄｉｃａエキス、アントシアニン、Ｃｏｃｏｓ  ｎｕｃｉｆｅｒａエキスおよびジュース、Ｃｏｌｅｕｓ  ｆｏｒｓｋｏｈｌｉｉエキス、ホルスコリン、Ｃｏｌｅｕｓ  ｆｏｒｓｋｏｈｌｉｉ油、テトラヒドロピペリン、エラグ酸、没食子エキス、ポリフェノール、Ｇａｌａｎｇａエキス、グリシルリチン酸、緑茶エキス、エピガロカテキンガレート、リコリスエキス、グリチルリチン酸一アンモニウム、リモノイド、オレアノール酸、化粧用ペプチド（Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒと結合したオレアノール酸、Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｙｓと結合したオレアノール酸）、オレウロペイン、Ｐｉｐｅｒ  ｌｏｎｇｕｍｉｎｅエキス、ピペリン、エラグ酸、ザクロエキス（水溶性）、プテロスチルベン、レスベラトロール、Ｐｔｅｒｏｃａｒｐｕｓ  ｓａｎｔａｌｉｎｕｓエキス、ローズマリーエキス、ロスマリン酸、アムラエキス、ベータグルコガリン、テトラヒドロクルクミン、Ｓａｌｖｉａ  Ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ（セージ）葉エキス、ウルソール酸、サポニン、Ｓｅｓａｍｕｍ  ｉｎｄｉｃｕｍ（ゴマ）種子エキス、セサミンおよびセサモリン、モリンガ油、モリンガ種子エキス、セイヨウトチノキエキス、ハマゴウ油、キシメニン酸、エチルアスコルビン酸、アルガン油、レモン果皮エキス、ターメリック油、大麦ベータグルカン、コエンザイムＱ１０、オリーブ油、アボカド油ならびにクランベリー油からなる群から選択される。
【００２４】
関連する別の態様では、１つまたは複数の抗酸化物質および抗炎症剤は、限定されないが、ビタミンＡ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｃ、Ｂ複合体、ロスマリン酸、アルファリポ酸、オキシレスベラトロール、エラグ酸、グリシルリチン酸、エピガロカテキンガレート、植物ポリフェノール、グラブリジン、モリンガ油、オレアノール酸、オレウロペイン、カルノシン酸、ウロカニン酸、フィトエン、脂質酸（ｌｉｐｏｉｄ  ａｃｉｄ）、リポアミド、フェリチン、デスフェラール、ビリルビン、ビリベルジン、メラニン、ユビキノン、ユビキノール、パルミチン酸アスコルビル、リン酸アスコルビルＭｇ、アスコルビルアセテート、トコフェロールおよび酢酸ビタミンＥのような誘導体、尿酸、α−グルコシルルチン、カタラーゼおよびスーパーオキシドジスムターゼ、グルタチオン、セレン化合物、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、ピロ亜硫酸ナトリウム（ＳＭＢ）、プロピルガレート（ＰＧ）ならびにアミノ酸システインからなる群から選択される。
【００２５】
関連する別の態様では、１つまたは複数のバイオアベイラビリティ向上剤は、限定されないが、ピペリン、テトラヒドロピペリン、ケルセチン、ニンニクエキス、ショウガエキスおよびナリンギンからなる群から選択される。
表１〜４は、バチルス・コアグランス  ＭＴＣＣ  ５８５６（ＬＡＣＴＯＳＰＯＲＥとして市販されている）を含有する皮膚ケア製剤の例示的な例を提供する。
【００２６】
【表１】
2020532530.tif 000004
【００２７】
【表２】
2020532530.tif 000005
【００２８】
【表３】
2020532530.tif 000006
【００２９】
【表４】
2020532530.tif 000007
【００３０】
（実施例５）
健康全般のための、バチルス・コアグランスを含有する製剤
表５および６は、抗酸化物質として、かつ細胞の酸化還元平衡を維持するための使用のための、バチルス・コアグランスを含有する製剤の例示的な例を提供する。
【００３１】
【表５】
2020532530.tif 000008
【００３２】
【表６】
2020532530.tif 000009
上記の製剤は、単に例示的な例であり、前記目的を意図した上記の活性成分を含有する任意の製剤は、同等と考えられる。
【００３３】
本発明の他の修正形態および変形形態は、前述の開示および教示から、当業者に明白であろう。したがって、本発明のある特定の実施形態のみが、本明細書に具体的に記載されているが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、これらへの無数の修正が行われてもよいことが明白であろう。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲と合わせてのみ解釈される。
【図１ａ】
2020532530.tif 000010
【図１ｂ】
2020532530.tif 000011
【図２ａ】
2020532530.tif 000012
【図２ｂ】
2020532530.tif 000013
【図３ａ】
2020532530.tif 000014
【図３ｂ】
2020532530.tif 000015
【図４ａ】
2020532530.tif 000016
【図４ｂ】
2020532530.tif 000017
【図５ａ】
2020532530.tif 000018
【図５ｂ】
2020532530.tif 000019
【図６ａ】
2020532530.tif 000020
【図６ｂ】
2020532530.tif 000021
【図７ａ】
2020532530.tif 000022
【図７ｂ】
2020532530.tif 000023
【国際調査報告】
2020532530.tif 000024