(57)【要約】  本発明は、化学物質、ペプチド、核酸、又はインサイチューで細胞若しくはウイルス粒子から放出されるタンパク質などのような抗原に対するハイスループットなイムノブロット解析の方法及び装置に関する。前記方法は非常に高感度で正確な結果をもたらし、細胞及び組織溶解物由来の抗原を含む複雑なシステムを解析することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原を特徴付ける方法であって、
（ａ）抗原を複数の膜ユニットに結合させるステップであって、各前記膜ユニットは複数の支持体のうちの１つに固定されるステップと、
（ｂ）前記抗原と相互作用する一次抗体を選択するステップと、
（ｃ）前記一次抗体を前記抗原に結合させて免疫複合体を形成し、その結果、前記複数の膜ユニットのそれぞれに免疫複合体が結合するステップと、
（ｄ）前記免疫複合体に信号を放出させるステップと、
（ｅ）前記複数の膜ユニットのそれぞれに結合された前記免疫複合体から放出される信号の強度を検出するステップと、
（ｆ）前記免疫複合体から放出された複数の信号強度を前記抗原の複数の量と相関付ける使用量曲線を作成するステップと、  
（ｇ）前記免疫複合体から放出された前記信号強度を前記使用量曲線とマッチングさせることによって、前記複数の膜ユニットのそれぞれにおける前記抗原の量を得るステップとを含む、方法。
【請求項２】
前記免疫複合体は、レポーター酵素（ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｅｎｚｙｍｅ）、放射性同位体、ＤＮＡレポーター、蛍光標識物、電気化学発光タグ、及びそれらの混合物からなる群から選ばれる標識物質で標識されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記レポーター酵素が西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）又はブドウ糖酸化酵素を含み、且つ前記蛍光標識物がフィコエリトリンを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記標識物質は、一次抗体と直接にコンジュゲートしているか、又は一次抗体に対する二次抗体と間接的にコンジュゲートしている、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記一次抗体、前記二次抗体、又はその両方は、前記標識物質で予め標識されている、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記免疫複合体から放出される信号が光子又は放射線である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記複数の膜ユニットのそれぞれにおける前記免疫複合体から放出される信号は、前記信号の強度に対応する数値として取得される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記信号の前記強度は画像から変換されたものではない、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記複数の支持体のそれぞれは、連結部材を介して平面構造に取り付けられ、
前記連結部材は、第１の端部と第２の端部とを含み、前記第１の端部は前記平面構造に取り付けられ、
前記複数の支持体のうちの１つは、前記連結部材の前記第２の端部に取り付けられ、又は、前記連結部材の前記第１の端部と前記第２の端部との間を介して取り付けられる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記膜ユニットは、ニトロセルロース膜若しくはＰＶＤＦ膜、又は表面上のニトロセルロースのコーティング若しくはＰＶＤＦのコーティングである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記前記光子は、前記標識物質の比色反応、前記標識物質の化学発光反応、又は前記標識物質からの蛍光発光によって生成される、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
前記複数の膜ユニットのうちの１つからの前記信号は、他の膜ユニットからの信号から分離されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ａ）〜（ｅ）を利用して使用量曲線を構築するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
使用量曲線は、抗原からの信号の強度が実質的にサンプルの量と直線的に相関する線形範囲を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記サンプルは、前記抗原又は前記抗原の標準物質を含有する溶解物である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記溶解物の使用量曲線の前記線形範囲内にある所定量の前記溶解物中の前記抗原からの信号強度を測定するステップをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記溶解物中の抗原の量を得るために、測定された信号強度と、前記抗原の標準使用量曲線の線形範囲における前記抗原の量とを相関付けるステップをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
イムノブロット解析方法であって、
それぞれ膜を含む互いに離間している膜ユニットを複数備えるマルチユニットプレートを提供するステップと、
抗原を含む溶解物を、複数の膜ユニットの１つ以上に導入するステップと、
前記抗原と相互作用する一次抗体を選択するステップと、
前記一次抗体を前記抗原に結合させて前記複数の膜ユニットの１つ以上に固定された免疫複合体を形成し、ここで前記一次抗体は、レポーター酵素と直接的に結合し、又は１つ以上の二次抗体を介してレポーター酵素と間接的に結合するステップと、
前記免疫複合体における前記レポーター酵素から放出される信号を１つ以上の膜ユニットから検出するステップとを含む、
イムノブロット解析方法。
【請求項１９】
１つ又は複数の前記膜ユニットのそれぞれから放出される前記信号を取得し、前記信号の強度を数値に変換するステップとをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記信号の強度は、前記信号からなる画像に基づいて測定されていないことである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記膜ユニットは、ニトロセルロース膜若しくはＰＶＤＦ膜、又は基板上のニトロセルロースのコーティング若しくはＰＶＤＦのコーティングである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記溶解物の使用量曲線を決定するステップをさらに含み、前記複数の膜ユニットのうちの１つ以上に導入される溶解物の量が使用量曲線の線形範囲内にある、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原に対するハイスループットなイムノブロット解析の装置及び方法に関する。具体的には、本発明は、マルチユニットプレートを利用し、改善された速度及び精度で免疫ブロット分析を達成するための装置及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質分析は、現代の生物学的研究の基盤である。それは、様々な医学的及び実験的条件下で標的抗原の発現レベルを測定するための抗原−抗体相互作用に基づいている。抗原は、その定義によれば、体内に導入された場合に免疫系による抗体の産生をトリガーする外来分子である。抗体は、特異的抗原に対する特異性が高いため、臨床的、薬学的及び生物医学的研究における強力なツールとなっている。
【０００３】
抗原は、化合物、ペプチド、タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ、細胞（インサイチュー（ｉｎ  ｓｉｔｕ）で放出されるタンパク質）、又はウイルス粒子（インサイチューで放出されるタンパク質）が含まれるが、これらに限定されない。抗原分子は、全体として又は部分的に、ロバ、ヤギ、又はウサギなどの宿主動物に導入して、この導入された標的抗原に対する抗体を大量に生成することができる。さらに、上記の導入された抗原又は抗原の一部は、１つ以上のエピトープを有し得るので、標的抗原に対する特異的抗体を、エピトープの数に対応して１つ以上生成することができる。
【０００４】
典型的な免疫測定プロセスは、以下の３つの主要なステップを有する。第１のステップは、サンプルアプリケーション（スポッティング）であり、ここで調製した標的抗原含有サンプル（試料）を最初にニトロセルロース、ＰＶＤＦ膜、又はタンパク質結合能を持つマルチウェルプレートのような他の固相のような表面に結合させる。第２のステップは、標的抗原−抗体複合体（すなわち、免疫複合体）を形成し標識することである。該ステップには、ブロッキング、インキュベーション及び洗浄のサブステップを含む。ブロッキングサブステップにおいて、膜上の非特異的タンパク質結合部位は、それらを非特異的タンパク質から遮蔽するためにブロッキング緩衝液（ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）を用いてブロックされている。ブロッキング後、インキュベーションサブステップにおいて、前記膜は、標的抗原に対する抗体と共にインキュベートされて膜結合抗原−抗体複合体を形成しており、未結合抗体は洗い流される。ここで使用される抗体は、通常市販されている予め標識された抗体である。インサイチューで１つの標識サブステップを実施することもできる。いずれの場合においても、抗体は、レポーター（標識物質）、例えばレポーター酵素（ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｅｎｚｙｍｅ）で直接標識されるか、又はレポーターと結合した二次抗体を用いて間接的に標識されるものとする。  
第３のステップは、検出である。レポーター酵素から放出される信号を検出し記録し、膜上に結合された免疫複合体の量又は質に関連した情報を取得する。ドットブロット分析及びウェスタンブロット分析の両方において、免疫分析の最終結果は、デンシトメトリー分析によりさらに間接的に定量化することができる。
【０００５】
前記検出プロセスにおいて、各ステップには、実際上、多くの変化があり得る。例えば、第１のステップのサンプルアプリケーション（スポッティング）は、ドットブロット分析において膜上に直接サンプルアプリケーションすること、ウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ：ＷＢ）分析において組織切片をスライド上に配置こと、サンプルをゲルから膜片に転写すること、又は免疫ブロット分析（ＥＬＩＳＡ）においてマイクロプレートのウェルにサンプルのコーティングを含む多くの変化を有する。免疫複合体を形成する第２のステップには、より多くの変化を有し、膜上に形成された免疫複合体を維持すると共に、膜上に直接結合抗体の量を最小化するために様々な処理及び異なるバッファー組成物の変化を含む。ほとんどの場合、一次抗体（ｐｒｉｍａｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）はレポーター酵素で直接標識されていない。レポーター酵素と直接又は間接的に結合された、一次抗体に対する二次抗体は、膜の表面に標的抗原に結合した一次抗体を標識するために使用されている。二次抗体（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）は、ビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）のような小分子でさらに標識することができ、例えば、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）結合ＨＲＰは、信号をさらに増強するために使用することができる。
【０００６】
次に抗体を標識する異なる方法は、それぞれ対応する検出方法を必要とする。例えば、第３のステップの検出は、目視検査による発色反応、又はスキャナー、Ｘ線フィルム若しくはマイクロプレートリーダーなどを介して検出可能な化学発光信号であってもよい。また、検出プロセスにおいて、抗体は蛍光で標識され、スキャナーを介して検出されてもよい。
【０００７】
従来のイムノブロット解析では、標識された免疫複合体から放出された信号は、最初にＸ線フィルム又はスキャナーを通して画像（例えば、暗いバンド又はドット）として取得される。免疫複合体の量を示す画像を読み取るためには、画像処理装置（例えば、デンシトメータ）又は／及び画像処理ソフトウェア（例えばＩｍａｇｅＪ）、或いは単に免疫組織化学（ＩＨＣ）において裸眼で判断する必要とされている。
【０００８】
利用可能なイムノブロット解析法、例えばドットブロット、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学（ＩＨＣ）、ウエスタンブロット（ＷＢ）、逆相タンパク質マイクロアレイのうち、ウエスタンブロットは、おそらく基礎的な研究室での研究で最も一般的に使用されている。ウエスタンブロット分析では、標的抗原を含む調製サンプルがまずゲル電気泳動により分子量で分離され、そして分離されたタンパク質をエレクトロブロッティングステップによりニトロセルロース膜及びＰＶＤＦ膜のいずれかに転写する。
【０００９】
後続の免疫測定プロセスにおいて、調製されたサンプル中の標的抗原のレベルは、典型的なレポーター酵素に基づく反応においてそのインサイチューで検出され、そしてデンシトメトリー分析を通して間接的に定量化される。例えば、ＩｍａｇｅＪを使用して、ウエスタンブロット分析におけるゲル画像中のバンドを手動で選択し、そしてソフトウェアを使用して各バンドを定量化する。このプロセスにおいて、免疫測定の特異性は、抗原抗体相互作用及び標的抗原の予想される分子量の両方によって検証され、これはドットブロット分析において一般的に観察される偽信号を排除する。
【００１０】
ＥＬＩＳＡアッセイは、マルチウェルプレートフォーマットにおける信号で直接定量化を可能にする。しかしながら、ＥＬＩＳＡプレートのタンパク質結合能力は、通常１μｇ／ｃｍ２未満である。これに対して、従来のイムノブロット解析のための典型的な膜は、ニトロセルロース又はＰＶＤＦ膜にかかわらず、１００〜２００μｇ／ｃｍ２のタンパク質結合能力を有している。ＥＬＩＳＡの低い結合能力は、実験室での使用を制限している。
【００１１】
典型的なイムノブロット解析では、抗原は、ウェスタンブロット分析のように、変性形態であってもよく、或いは、酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）アッセイ又は免疫組織化学（ＩＨＣ）分析のように、非変性形態であってもよい。
【００１２】
要するに、複雑なアッセイで抗原を分析するための新しい改良方法が必要とされている。適切な方法としては、使用し易くて安価で、アッセイ開発が高速であるべきであり、且つ、溶解物（溶解液）における抗原量を測定する際にウエスタンブロット分析とに匹敵するか、それよりも良い結果が得られるべきである。
【発明の概要】
【００１３】
本発明によれば、ハイスループット形式でサンプル中の抗原に対して迅速で正確な定量化を可能にするＱＤＢ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｄｏｔ  Ｂｌｏｔ：定量的ドットブロット）分析方法を提供する。ＱＤＢ分析は、ウエスタンブロット分析におけるゲル電気泳動のステップを除去する。これは、既存のドットブロットよりも良好な感度と信頼性を持っており、且つＥＬＩＳＡアッセイよりも優れた柔軟性、より広い応用範囲を持っている。
【００１４】
本発明に係るＱＤＢ法の一実施形態において、抗原は複数の膜ユニットに結合されている。各膜ユニットは、複数の支持体（ｓｕｐｐｏｒｔ）のうちの１つに固定されている。抗原と相互作用する一次抗体が選択され、一次抗体は抗原に結合して膜表面上に複数の免疫複合体を形成する。
【００１５】
複数の膜ユニットに結合された免疫複合体は、標識物質で標識されている。標識された免疫複合体は、信号、例えば、光子又は放射線を放出する。さらに、標識された免疫複合体から放出される信号は、機器を使用して検出される。
【００１６】
いくつかの実施形態において、標識物質（ｒｅｐｏｒｔｅｒ：レポーター）は、レポーター酵素（ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｅｎｚｙｍｅｓ）、放射性同位体（ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  ｉｓｏｔｏｐｅｓ）、ＤＮＡレポーター（ＤＮＡ  ｒｅｐｏｒｔｅｒｓ）、蛍光標識物（ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｔｉｃ  ｒｅｐｏｒｔｅｒｓ：蛍光発生レポーター）、電気化学発光タグ（ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｔａｇ）、又はそれらの混合物であり、その中で、レポーター酵素は西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、又はブドウ糖酸化酵素であってもよく、蛍光標識物はフィコエリトリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）であってもよい。また、標識物質は、一次抗体とコンジュゲートされるか、又は一次抗体に結合した二次抗体とコンジュゲートされる。
【００１７】
さらに他の実施形態において、複数の支持体は、ＱＤＢ分析を容易にするためにプレート（以下、「ＱＤＢプレート」または「Ｚｅｓｔｅｒｎプレート」と呼ぶ）の一部である。ＱＤＢプレートは平面構造を有しており、且つ複数の支持体は平面構造の平面から突出するように離間されている。支持体は、例えば一枚の膜を保持して該膜が支持体と溶液中に浸漬される場合、該膜が溶液に露出されることを可能にさせる限り、任意の構造であってもよい。したがって、支持体は、中空の中心部を有するリングとすることができる。前記膜は、前記リングに取り付けられている。各支持体は、柱、壁の一部などのようなものであってもよい。或いは、前記膜は、固体表面上にコーティングされ、又は支持されてもよい。ＱＤＢプレートの例は、米国特許出願番号１４／７２１，２０５に記載されている。
【００１８】
さらなる実施形態において、各支持体とその接続した膜及び連結部材（単数又は複数）から膜ユニットを構成しており、このようなＱＤＢプレートは、マルチユニットプレートとも呼ばれてもよい。ＱＤＢプレートは、アセンブリプレートを形成するために、マルチウェルプレートに挿入可能である。このアセンブリプレートでは、ＱＤＢプレートにおける膜ユニットは、マルチウェルプレートの対応するウェルに挿入される。
【００１９】
さらに他の実施形態において、マルチウェルプレート内の各ウェルが溶液（例えば、緩衝液）を保持することにより、対応する膜ユニットにおける膜が溶液に露出され可能にさせる。
【００２０】
標識された免疫複合体から放出される信号は、画像化されても画像化されなくてもよい。信号が画像化される場合、画像は永久的な媒体（例えば、写真用フィルム）を用いて捕捉することができる。永久的な媒体上の画像は、次にデンシトメータにより画像処理ソフトウェアを使用して信号強度の測定値を読み取る。
【００２１】
本発明の実施形態において、各膜ユニットのそれぞれから放出された信号は、まず画像として記録されずに読み取ることができる。例えば、膜からの光信号（すなわち、光子）は、光電子増倍管を有するマイクロプレートリーダーによって受信され、該マイクロプレートリーダーは受信した信号の合計量を数値で直接読み出す。膜ユニットは、互いから離間されているため、異なる膜ユニットから放出された信号を個別に取得することができる。各膜ユニットからの信号は、その特定の膜ユニットに取り付けられた標識免疫複合体から放出される信号強度に対応する数値に直接変換される。さらなる実施形態において、信号の画像化（イメージング）及び数値化（画像化しないままで直接読み取り）は同時に行うことができる。
【００２２】
上述した実施形態において、１つの膜ユニットからの信号を効果的に独立して他の膜ユニットからの信号より分離することができる。例えば、膜ユニットが存在するウェルは、隣接するウェル内における膜ユニットからの信号を物理的にブロックすることができる。結果として、信号対雑音比（Ｓ／Ｎ比）は、従来の免疫ブロット法よりも高くなる。
【００２３】
他の一実施形態において、本発明は、それぞれ膜を含む複数の膜ユニットが互いに離間しているマルチユニットプレートを提供するステップと、前記抗原を複数の膜ユニットのうちの１つ以上に結合するステップと、前記抗原と相互作用する一次抗体を選択するステップと、前記一次抗体を前記抗原に結合して複数の膜ユニットのうちの１つ以上に固定された免疫複合体を形成するステップであって、前記一次抗体がレポーター酵素と直接的にコンジュゲートされ、又は１つ以上の二次抗体を介したレポーター酵素と間接的にコンジュゲートされる、ステップと、前記膜ユニットのうちの１つ以上のそれぞれに取り付けられた免疫複合体におけるレポーター酵素から放出された光信号を、膜ユニットのうちの１つ以上のから検出するステップとを含むイムノブロット解析方法を提供する。
【００２４】
本発明に係るイムノブロット法及び装置は、各膜ユニットのそれぞれから放出された信号を互いに独立可能にさせて背景雑音を低減し、信号対雑音比を向上させる。その一方、従来のドットブロット解析において、１個のドットからの信号がその隣接ドットからの信号から十分に分離することができなく、このように、検出された信号は、相互干渉で正確ではない。本発明のいくつかの実施形態において、各膜ユニットから放出された信号（例えば、光）は、膜ユニット間のバリアによって互いに分離されている。バリアは、マルチウェルプレート中のウェル（壁）であってもよい。したがって、それぞれの膜ユニットから得られる信号は、より正確にそのウェルにおける溶解物中の抗原量に相当している。或いは、膜ユニット自体の支持体は、光信号にバリアを形成することができる。いくつかの追加的な実施形態において、この目的を果たす他の形態を有する可能性があり、このような変形は、本発明の範囲内に依然として包含される。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明のＱＤＢプロセスの一実施形態を示す図である。
【図２】抗体の特異性を調べる例を示している図であり、ウサギ抗チュブリン抗体を用いＱＤＢ分析において前記抗体の使用量曲線を確立する。
【図３】７匹のマウス肝臓におけるチュブリン（Ｔｕｂｕｌｉｎ）の含有量を測定するために、ウサギ抗チュブリン抗体を用いＱＤＢ分析結果を示している図である。
【図４】ＱＤＢ分析を用いて細胞レベルで特定タンパク質分子含有量の大規模解析の一例を示している図である。
【図５】ウエスタンブロット解析を基準とし、動物組織中の特定タンパク質分子の含有量のＱＤＢ分析の一例を示している図である。
【図６】ＱＤＢ分析を用いて、動物組織中の特定タンパク質分子含有量の大規模解析の一例を示しており、且つそれらの結果はどのように異なる角度から解析可能であるかを示している図である。
【図７】ＱＤＢプレートの異なる構成によりＱＤＢ分析結果に対する影響を示している図である。
【図８】ＱＤＢ分析が抗体に依存性の高いものであることを示すために、いくつかの検出抗体の使用量曲線を示している図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
特に定義されない限り、本明細書で用いる全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を指す。
【００２７】
図１は、本発明のＱＤＢ分析のステップ及び装置を示している。このプロセスの最初のステップでは、検出抗体の特異性を検証することである。図１Ｂは、ウェスタンブロット解析により抗体を検証する非限定的な例を示す図である。特異的抗体に対して、ウエスタンブロット解析では、適当な分子量の位置に１つだけのバンドを示すべきである。ウエスタンブロット解析で２つ以上のバンドを検出した任意の抗体は、非特異的なものである。特異的抗体のみは、ＱＤＢ分析に適している。
【００２８】
さらに、使用量曲線（すなわち、用量応答曲線）は、アッセイの線形範囲を決定するように構成されている。一般的には、サンプルを連続希釈し、信号対既知投与量を示す曲線、すなわち、使用量曲線（図１Ｃ）をプロットする。使用量曲線の線形範囲は、ＱＤＢ分析が行われる場合にサンプル量（ロード量）の範囲を提示している。異なる方法、異なる機器で試験した場合、同じ溶解物サンプルは、異なる線形範囲を有することができる。同じ機器及び方法を用いて使用量曲線を構築して被検サンプルを解析する必要がある。
【００２９】
特異的抗体（例えば、図１Ｂ）が同定された場合、及び使用量曲線の線形範囲が確立された場合（例えば、図１Ｃ）、免疫測定解析のための被検サンプル（例えば、細胞培養、動物研究、腫瘍研究）を調製した後、容器（図１Ｄ）に配置される。サンプルの非限定的な例としては、化学物質、ペプチド分子、タンパク質分子、ＲＮＡ分子、ＤＮＡ分子、２つの重鎖及び２つの軽鎖を含む伝統的な抗体、組換え抗体及びその断片、細菌細胞、ウイルス粒子、細胞、粒子、或いは上記任意の２つ以上が架橋によって連結されたものを含む製品が挙げられる。次いで、サンプルを特定マルチユニットプレート（ＱＤＢプレートとも呼ばれる）（図１Ｅ）上にスポッティングされる。
【００３０】
図１Ａには、９６ウェル（ユニット）ＱＤＢプレートの実施形態の詳細が示されている。一実施形態において、該ＱＤＢプレートには平面を備え、この平面に複数の開口（この実施形態では９６個の開口）を設置する。各開口は平面から離れるように延びるウェル（図面１Ａから見ると、上の平面から下方へ突起して延びっているもの）に対応している。ウェルの「底部」は、ニトロセルロース膜片であるか、又はニトロセルロースでコーティングされた表面である。この実施形態において、ウェルの「壁」はプレート平面からウェルの底に延びる垂直開口を持っている。図１Ａに示すように、「壁」における開口は、液体が少ない障害でウェルに流入したり流出したりすることを可能にしており、該開口の間のセクションはプレート平面と膜とを接続している。実際上、ＱＤＢプレートは、膜を支持しながら、支持された膜と平面とに接続する構造とすることができる。例えば、膜は、支持構造（例えば、リング、板）上に支持するができると共に、支持された膜と板平面とが１つ以上のポストを介してリンクしてもよい。
【００３１】
サンプルが膜上にスポッティングされた後、ＱＤＢプレートを乾燥させ、例えば、室温で１５分間、又は３７℃で１時間乾燥させる。その後、ＱＤＢプレートは、マルチウェルプレート（本実施形態では９６ウェル）に挿入されてプレートアセンブリを形成する（図１Ｆ）。
【００３２】
図１Ｇは、以下に例示されるように、ブロッキング及び標識のステップを示す。マルチウェルプレートには、ブロッキング緩衝液（５％脱脂乳含有ＴＢＳＴ緩衝液）がロードされる。ＱＤＢプレートの膜を、通常のウェルプレートに挿入してブロッキング緩衝液中に１時間浸漬してインキュベートした後洗浄する。その後、ＱＤＢプレートは、一次抗体（一抗）と共に４℃で一晩又は室温で２時間インキュベートした後、ＱＤＢプレートをＴＢＳＴで５分間毎に３回洗浄する。洗浄後、ＱＤＢプレートは、ＨＲＰで予め標識した二次抗体（二抗）と共に１：１０００の割合で１時間インキュベートする。
【００３３】
測定（定量化）ステップにおいて、ＱＤＢプレートをＴＢＳＴ緩衝液で再度５分間毎に３回洗浄した後、ＥＣＬ基質を装填した９６ウェルプレートに入れて１分間放置した（図１Ｈ）。その後、ＱＤＢプレートは、白色の９６ウェルプレートに移し、「カバー付きプレート（ｐｌａｔｅ  ｗｉｔｈ  ｃｏｖｅｒ）」というオプションが選択されたマイクロプレートリーダーで直接定量される（図１Ｉ）。リーダーによって得られた信号は、データとしてコンパイルされて解析される（図１Ｊ）。
【００３４】
ブロッキングステップ、抗体インキュベーションステップ、及び洗浄ステップは複数の変化（代替法）を有してもよく、例えば、図１Ｇにおいて、１種の一次抗体のみが使用される場合、図１Ｇで説明したステップを１つの容器中で実行することができる。
【００３５】
いくつかの実施形態において、ブロッキング緩衝液は、５％脱脂乳又は３％ＢＳＡを含むＰＢＳ又はＴＢＳ緩衝液のいずれかに０．１％のＴｗｅｅｎ  ２０を補充したものであってもよい。膜を室温で風乾してもよく、換気加熱場所でこのプロセスを促進してもよい。
【００３６】
信号の標識又は検出は、抗体若しくは分子の酵素的カップリング、抗体への放射標識、又は抗体若しくは分子の蛍光色素での標識を含んでもよく、その検出結果の読み出しは、呈色反応における目視検査を介して、又は抗体が放射性物質若しくはレポーター酵素で標識されている際にＸ線フィルムを介して取得することができる。
【００３７】
ＱＤＢプロセスの実施形態において、ＱＤＢプレート内の個々のユニット（ｓｕｂｕｎｉｔ）内の膜は互いに分離されている可能であるため、ＱＤＢプレートは同時に異なるサンプルを収容することができる。さらに、そのような個々のサンプルは、標識された後、他のサンプルとは独立して個別に定量することができる。
【００３８】
さらなる実施形態において、抗体を最初に西洋ワサビペルオキシダーゼで標識し、これがＥＣＬ基質を化学発光信号に変換する。信号強度は、化学発光感受性フィルム、又はスキャナを用いて示され、そしてデンシトメトリー解析を介して間接的に定量される。ＱＤＢ分析は、マイクロプレートリーダーを使用して各サンプル（試料）からの信号を直接読み取る。信号強度は、最初にフィルム又はスキャナを用いて画像として信号を記録することなく直接デジタル化することができる。
【００３９】
これに対して、ドットブロット解析及びウエスタンブロット解析の両方において、信号検出はフィルム及びスキャナーを使用して取得された画像に基づいている。画像のデジタルへの変換処理後に解析の線形範囲を正確に確立することは困難である。ＱＢＤ解析では、使用量曲線を最初に確立する必要であり、操作者はそれによって使用量曲線の線形範囲内のサンプル量をスポッティングするように確保することができる。
【００４０】
それでも、ブロット解析及びウエスタンブロット解析では、解析に使用されるサンプルの量は主に研究者の経験に基づいている。ほとんどの場合、サンプルあたり少なくとも２０μｇから１００μｇが必要である。これに対して、ＱＤＢプロセスでは、感度が増加したため、サンプルあたり１０μｇ未満、例えば０．１μｇから３μｇで正確な結果を得るのに十分である。
【００４１】
典型的には、１μｇ／ｃｍ２未満のタンパク質結合能を有するＥＬＩＳＡと比較して、ＱＤＢ分析では、ニトロセルロース膜を使用するため、はるかに良好な結合能、例えば約１００〜２００μｇ／ｃｍ２を有する。さらに、ＱＤＢプレートの際立った特徴の１つは、その個々のサブユニットが、サブユニット内の膜がＥＬＩＳＡの閉鎖ウェル内よりも徹底的に洗浄されるように、そのサブユニットに緩衝液が容易に出入りできることである。このように、膜の効果的な洗浄を可能にし、検出ステップにおける背景雑音を減少させる。
【００４２】
その中で使用されているように、「膜」は、その最も広い文脈に解釈されるべきである。膜は、ＰＶＤＦやニトロセルロース膜と同程度の結合能と、検出抗体による接近を可能にするのに十分な表面多孔性と、抗原に結合するのに適した表面親和性とを有する任意の材料であってもよい。膜は、その片面が基材と接触するように、基材の平面又は曲線状表面上に被覆又は支持されていてもよい。膜は、膜の両面が露出されて抗体と容易に接近可能となるように、中空支持体（構造）上に支持されてもよい。これらの材料はすべて、フィルム、シート、又は板などのような適切な形状で使用することができる。或いは、それらは、紙、ガラス、プラスチック材料又は布地などのような適切なインサートキャリア上にコーティングされるか、又はそれらに接着又は積層されてもよい。例えば、膜は、ニトロセルロース膜又はＰＶＤＦ膜であってもよいが、これらに限定されない。
【００４３】
膜の形状及び構造には、膜が抗原に対する結合表面を提供する限り、物理的な制限がない。各膜ユニット内の膜は、連続的又は不連続的であってもよい。個々の膜ユニット内で同じサンプルに結合する限り、それは一体になっていても、複数の部材（断片）になっていてもよい。
【００４４】
本明細書に記載の「レポーター酵素」は、その最も広い文脈で解釈されるべきである。レポーター酵素は、抗体の検出を補助するために、免疫アッセイにおける抗体に対する任意の修飾することができる。例えば、レポート酵素は、ヨウ化物１２５のような放射性同位体で直接標識された抗体、又はアルカリホスファターゼ若しくは西洋ワサビペルオキシダーゼのようなレポーター酵素であってもよいが、これらに限定されない。抗体に関連されたレポーター酵素量は、検出反応におけるレポーター酵素量の読み出しとしての検出可能な生成物の形成により検出されている。かかる生成物は、放射性、発光性、蛍光性、又は可視若しくは可視範囲以外の特徴的な吸光度や反射スペクトルを有する生成物であってもよい。結合した抗原ー抗体複合体を検出するために補体を使用する場合、それは上記方法のいずれかで標識するか、又は特異的な抗補体抗体（ａｎｔｉ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）によって順に検出することができる。
【００４５】
レポート酵素は、ヨウ化物１２５のような放射性同位体で間接的に標識された抗体、又はアルカリホスファターゼ若しくは西洋ワサビペルオキシダーゼのようなレポーター酵素であってもよいが、これらに限定されない。抗体は、二次抗体を介して間接的に標識されてもく、かつ二次抗体は、ヨウ化物１２５のような放射性同位体、又はアルカリホスファターゼ若しくは西洋ワサビペルオキシダーゼのようなレポーター酵素で直接的又は間接的に標識されてもよい。一実施形態において、二次抗体はビオチンで標識され、西洋ワサビペルオキシダーゼを介してストレプトアビジン分子で間接的にさらに標識される。
【００４６】
本明細書に記載の「抗原」及び「抗体」は、その最も広い文脈で解釈されるべきである。「抗原」は、分子、細胞、ウイルス、又は粒子であってもよい。用語「抗原」とは、化合物、ペプチド、タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ、細胞（ｉｎ  ｓｉｔｕで放出されるタンパク質）、又はウイルス粒子（ｉｎ  ｓｉｔｕで放出されるタンパク質）、又は宿主動物（ヒトを含む）によって一つ以上の抗体の産生を誘発し得る任意の分子を意味する。また、抗原は任意の２つ以上の上記分子又はその一部が互いに架橋されたものを含む生成物であってもよい。抗原は純粋な形態で存在することも、混合物として存在することもできる。抗原は、修飾形態（例えば、化学物質（ｃｈｅｍｉｃａｌ）によって修飾された形態）又は未修飾形態であってもよい。
【００４７】
抗原は、変性形態であってもよいか、又は非変性形態であってもよい。非変性形態はそれらの最も広い文脈でと理解されるべきである。それは、ネイティブ形態であってもよく、或いは、抗原が還元剤（例えば、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）又はβ−メルカプトエタノール）にさらされていないか、又は抗原を完全に変性させるのに十分な量の還元試薬にさらされていない状態を指す。
【００４８】
本明細書に記載の「抗体」とは、その最も広い文脈で解釈されるべきである。「抗体」は、「抗原」に結合するポリペプチドである。抗体は、従来の抗体、抗原結合部位含有従来の抗体断片、抗原結合部位含有組換え抗体、抗原に結合するタンパク質、又は上記のいずれか２つ以上から架橋結合している生成物が挙げられるが、これらに限定されない。抗体は、純粋な形態で存在することも、混合物として存在することもできる。抗体は、修飾形態（例えば、化学物質によって修飾された形態）、又は非修飾形態であってもよい。
【００４９】
実験方法
本発明は、以下の非限定的な実施例に示されている。本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、実施例の修正や変更を行うことができる。
【００５０】
組織培養の関連作業のための一般的な試薬は、細胞培養培地及び培養皿などと共に、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｓ（米国マサチューセッツ州ウォルサム）から購入した。ＨＥＫ２９３細胞は、中国科学院細胞バンク（中国、上海市）から購入した。ＱＤＢプレートは、中国煙台載通生物技術有限公司  （ＱＤＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  Ｃｏ．  Ｌｔｄ．、中国、煙台市）から入手した。プロテアーゼ阻害剤は、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社（米国ミズーリ州セントルイス）から購入した。他の全ての化学物質は、中国北京国薬集団化学試剤有限公司（Ｓｉｎｏｐｈａｒｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、中国、北京市）から購入した。
【００５１】
マウス系ＴＲＡＭＰマウス及びそれらの野生型同腹仔は、ジャクソン研究所（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ｗｗｗ．ｊａｘ．ｏｒｇ）から購入した。これらのマウスは、Ｃ５７ＢＬ／６起源からのもので、Ｃ５７−ｘＣ５７との交配から得られた。これらのマウスは、自然の飲み物と食物を用いて１２／１２時間の明暗周期の条件下で飼育された。全ての動物処理手順は、浜州医学院（Ｂｉｎｚｈｏｕ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）倫理審査委員会（ＥＲ＃２０１６−１９）によって承認された。動物の遺伝子型及び腫瘍形成の確認は、他の文献に記載されていた。
【００５２】
抗体：ウサギ抗チュブリン（ＹＴ−０１８３）、ウサギ抗ＡｐｏＥ（ＹＴ−  ０２７３）抗体は、中国蘇州のＩｍｍｕｎｏｗａｙ社から購入し、ウサギ抗ｐ６５（ＳＣ  −  ３７２、Ｃ２０、Ｆ０４１４）、ウサギ抗ＣＤＫ４（ｓｃ−  ２６０、ｃ２２、Ａ０３１４）は、米国カリフォルニア州サンタクルーズ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．）から購入した。ウサギ抗ＣＡＰＧ（１４２１３−Ｔ５２）抗体は、Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃ  Ｉｎｃ．（中国、北京）から購入した。
【００５３】
安定なクローンのスクリーニング：構成的発現ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）構築物を構築するために、システム・バイオサイエンス社（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．、米国カリフォルニア州パロアルト）からのｐＧｒｅｅｎｐｕｒｏプラスミドを利用し、製造元の取り扱い説明書にしたがって、ｐ６５に対する標的配列の５’ＧＧＡＣＡＴＡＴＧＡＧＡＣＣＴＴＣＡＡＧＡ３’に対してＳｈＲＮＡ−ｐ６５プラスミドを作製し、又はルシフェラーゼに対する標的配列の５’ＧＴＧＣＧＴＴＧＴＴＡＧＴＡＣＴＡＡＴＣＣＴＡＴＴＴ３’に対してＳｈＲＮＡ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（ルシフェラーゼプラスミド）を作製した。製造元の取り扱い説明書にしたがって、Ｆｕｇｅｎｅ  ６トランスフェクション試薬を用いて、ＳｈＲＮＡ−ｐ６５及びＳｈＲＮＡ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅを用いて、それぞれ２つの６０ｍｍ培養皿に５×１０５／皿でＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトした。細胞を増殖培地（１０％ウシ胎児血清を補充したＤＭＥＭ培地）中で２日間増殖させた後、それらを新鮮な選択培地（５μｇ／ｍＬのピューロマイシン（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）を補充した増殖培地）に変えた。
【００５４】
選択プロセスは、肉眼で見えるクローンが現れるまで、選択培地を３〜４日ごとに交換することによって続けて行った。個々のクローンを、Ｓｉｇｍａからのクローニングシリンダーを使用してトリプシン消化によりピックアップし、且つ１：９の比で２つの平行な２４ウェルプレートに移し、そしてより多くの細胞を有する２４ウェルプレートのプレートＡ、及びより少ない細胞を有するプレートＢに対して同じクローン番号で標識した。プレートＡがコンフルエント（集密）に達するまで、細胞を選択培地中で連続的に増殖させた。
【００５５】
プレートＡ中に、プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤（１００ｍＭ  ＮａＦ、０．１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド、５μｇ／ｍＬペプスタチン、１０μｇ／ｍＬロイペプチン、５μｇ／ｍＬアプロチニン）を直接補充した溶解緩衝液（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  Ｎａ２Ｐ２Ｏ７、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘー１００、１０％グリセロール）によって、全細胞溶解物（ｔｏｔａｌ  ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅｓ）を調製した。全細胞溶解物は、５分間遠心分離してから上清を回収し、上清にサンプル緩衝液を直接添加してＱＤＢ分析に用いた。
【００５６】
プレートＢについては、プレートＡのＱＤＢ分析からの結果に基づく代表的クローンを、２×１０５／皿で２つの６０ｍｍ培養皿に移し、細胞を選択培地中で２日間増殖させた後、それらを回収して全細胞溶解物を調製してタンパク質濃度を測定する（次の部分を参照）か、又は体窒素中で貯蔵する。
【００５７】
細胞及び組織の抽出：
ＨＥＫ２９３細胞については、細胞を採取して溶解緩衝液中に溶解させるように、自動ピペットで５０回上下にピペッティングした。８０００×ｇで５分間遠心分離した後、上清を収集してＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社からのＰｉｅｒｃｅ  ＢＣＡタンパク質アッセイキットを使用してタンパク質濃度を測定し、その後、ウエスタンブロット解析用のサンプル緩衝液中に再懸濁した。マウス肝臓及び前立腺から組織溶解物を調製するために、組織をスライスして、プロテアーゼ阻害剤を含む溶解緩衝液３００ｍＬで予め分注した微量遠心管に入れた。組織を手持ち式組織ホモジナイザーで１分間粉砕した後、微量遠心管により８０００×ｇで５分間遠心分離した。各チューブからの上澄み液を集めて、Ｔｈｅｒｍｏ  ＦｉｓｈｅｒからのＰｉｅｒｃｅ  ＢＣＡタンパク質アッセイキットを用い、タンパク質含有量の測定及びウエスタンブロット解析に用いられる。
【００５８】
ＱＤＢプロセス：解析に使用される抗体の使用量曲線に基づいて、０．１μｇ〜４μｇ／ユニットの範囲に調製された全溶解物サンプルをＱＤＢプレートの個々の膜に直接スポッティングした。膜を完全に乾燥させるように、ＱＤＢプレートを３７℃で１５分間又は室温で４５分間放置した後、それをトランスファー緩衝液（ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｂｕｆｆｅｒ：トランスファーバッファ）に短時間浸漬した。ＱＤＢプレートをＴＢＳＴ（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭトリス、ｐＨ７．４、及び０．１％Ｔｗｅｅｎ‐２０）で３回洗浄し、１つの容器においてブロッキング緩衝液（ＴＢＳＴに５％脱脂乳を加えた）でブロットした。ＱＤＢプレートを一次抗体と共に４℃で一晩、又は室温で２時間インキュベートし、その中で、プレート全体を同じ抗体でブロッティングした場合、１つの大きな容器中でインキュベートし、又は異なるウェル内に異なる一次抗体を含む９６ウェルプレート中でインキュベートした。ＱＤＢプレートをＴＢＳＴで３回洗浄し、そして二次抗体と共に２時間再度インキュベートした後、プレートを再度ＴＢＳＴで３回洗浄した。ＱＤＢプレートを、１００μＬ／ウェルのＥＣＬ基質溶液をスポッティングした９６ウェルプレートに１分間挿入した後、白色９６ウェルプレートに入れてＴｅｃａｎ  Ｐ２００型マイクロプレートリーダーを用いて化学発光信号を定量した。測定プロセス中に上昇した複合プレートによる計器との不適合を避けるために、コンコントロールパネル上の「カバー付きプレート」オプションを選択した。
【００５９】
統計的解析：
データは平均値±標準誤差（ｍｅａｎ±ＳＥＭ）として表し、そして２群間の両側スチューデントｔ検定で解析した。ｑ−ｑプロットは、ＳＰＳＳｖ２２．０（ＩＢＭ、シカゴ、ＩＬ）を用いて実施した。
【実施例】
【００６０】
実施例１：
実験方法に記載したようにマウス肝臓溶解物を調製し、全細胞溶解物を４×ＳＤＳサンプル緩衝液（Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液）に再懸濁し、７５℃で５分間加熱した。ＨＥＫ２９３細胞及びマウス肝臓溶解物を４０μｇ／レーンでスポッティングし、ウサギ抗チュブリン抗体を用いてウエスタンブロット解析を行った。図２Ａでは、β−チュブリンに対応する、予想されるサイズのただ１つのバンドが膜上にあったことを示している。
【００６１】
マウス肝臓溶解物を希釈して０．１ｍｇ／ユニットから１２ｍｇ／ユニットのサンプルを得た。１つのユニット当たり３μＬのサンプルを、図１Ａに示すものと同じタイプのＱＤＢプレートの各ユニットのニトロセルロース膜の底にスポッティングした。その後、サンプルを加えたプレートを室温で完全に乾燥させるように４５分間放置した。
サンプルを加えたＱＤＢプレートをブロッキング緩衝液（０．１％のＴｗｅｅｎ２０を補充した５％の脱脂乳のトリス緩衝食塩水（一般に「ＴＢＳＴ」として知られている））で１時間ブロッキングしてから、サンプルをウサギ抗チュブリン抗体の１：２０００希釈でのブロッキング緩衝液に一晩インキュベートした。
【００６２】
ＴＢＳＴ緩衝液で３回×５分間洗浄した後、ＱＤＢプレートを、西洋ワサビペルオキシダーゼで予め標識されたロバ抗ウサギ二次抗体と共に１時間インキュベートした。さらにＴＢＳＴ緩衝液で３回×５分間洗浄した後、ＱＤＢプレートを９６ウェルプレートに挿入し、そして製造元の取り扱い説明書にしたがって１００μＬ／ウェルの化学発光基質混合物を加えた。ＱＤＢプレートを９６ウェルプレートの溶液に１分間放置した後、それを白色９６ウェルプレートに移した後、Ｔｅｃａｎマイクロプレートリーダーを用いて定量した。
【００６３】
図２Ｂは、肝臓溶解物と抗チュブリン抗体とを用いた２つの使用量曲線を示す。各データ点は３回測定よる平均値と標準誤差（ＳＥＭ）である。白丸はＱＤＢプロセスで得られた信号（「ＱＤＢ信号」）を表し、一方、黒丸はウエスタンブロッティングを用いて得られた信号（「ＷＢ信号」）を表す。図２Ｂの挿入図では、０から１μｇの範囲のＱＤＢ使用量曲線において化学発光信号と溶解物量との間の変動係数（相関係数）（Ｒ２）０．９９９を有する直線関係を呈することを示す。ＱＤＢ信号は１μｇから１２μｇまで徐々に飽和に近づき、そしてＱＤＢ使用量曲線はもはや直線関係を呈しない。
【００６４】
同量の溶解物をウエスタンブロッティングに使用した。ＷＢ信号は、図２Ｃに示しており、Ｌｉ−  Ｃｏｒ社（米国ノースカロライナ州リンカーン）のＩｍａｇｅ  Ｓｔｕｄｉｏ  Ｄｉｇｉｔを使用してデジタル変換し、図２Ｂに黒丸としてプロットした。しかしながら、ＷＢの使用量曲線は変動係数Ｒ２＝０．９０７で不規則に見える。ＷＢ使用量曲線において、信頼性のある線形範囲を決定することは困難である。これに対し、ＱＤＢ分析では精度（Ｒ２＝０．９９９）が非常に高い解析の線形適用範囲を決定した。
この実施例では、如何に検出抗体の特異性を確立する方法、及び如何に特異的抗体で被検サンプルに基づくＱＤＢ分析の線形範囲を確立する方法を実証する。同じ実験条件下で同じサンプルを用いたＱＤＢ分析とウエスタンブロット解析とを比較することにより、実験ではＱＤＢ分析の定量とウエスタンブロット解析の半定量との間に本質の相違を示した。
【００６５】
実施例２
この実験では、材料及び方法の部分に記載されているように、７匹のマウスからのほぼ同じ大きさの肝臓切片を調製し、均質化した。各マウスの肝臓溶解物から等量の総タンパク質（２０μＬ、４０μｇ／レーンを表す）を取ってウエスタンブロット解析に使用した。図３Ａは、これらのマウス７匹の肝臓溶解物におけるα−チュブリン含有量のウエスタンブロット解析の結果を示した。図３Ａに使用したのと同じマウス肝臓溶解物を、０．５μＬ、約１μｇの総タンパク質／ユニットで３回繰り返し、ＱＤＢプレートの個々の膜ユニットにスポッティングした。結果は、各マウスからの三連の平均値±ＳＥＭである。図３Ｂは、α−チュブリン含有量についてのＱＤＢ信号解析の結果を示す。同じマウスからの溶解物を用いたウエスタンブロット解析及びＱＤＢ分析の結果は、比較のために互いに整列させた。図３Ｃは、ＱＤＢ分析に対してＷＢ信号（Ｉｍａｇｅ  Ｓｔｕｄｉｏ  Ｄｉｇｉｔｓを使用してデジタル化された）をプロットする。解析結果に対して単回帰解析を行ったところ、変動係数（Ｒ２）は０．８５であった。マウス番号は、記録保持のために個々のマウスの規定番号を指す。
実施例２は、実施例１と一緒に、ウエスタンブロット解析でベンチマークされたＱＤＢ分析の完全なプロセスを示した。
【００６６】
実施例３
図４Ａは、ウサギ抗ｐ６５抗体を用いたＨＥＫ−２９３全細胞溶解物中のＷＢ信号解析の結果を示す。実験方法の部分に記載の通りに、ＨＥＫ２９３全細胞溶解物を調製した。Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃからのウサギ抗ｐ６５抗体を使用して、５０μｇ／レーンの全細胞溶解物を、ウエスタンブロット解析に使用した。膜全体をＬｉ−Ｃｏｒ社からのブロットスキャナーを使用してスキャンした。
【００６７】
使用量曲線を作成するために、ＨＥＫ２９３全細胞溶解物を段階希釈し、ＱＤＢプレート中の複数の膜ユニットに三回繰り返して（三重）スポッティングした。実験方法の部分に記載したように、スポッティングしたＱＤＢプレートを処理し、そしてＴｅｃａｎマイクロプレートリーダーを使用してＥＣＬ反応によって定量した。図４ＢはＱＤＢ使用量曲線を示す。単回帰解析では、０から９μｇの範囲内に変動係数が０．９９２であることを見出した。
【００６８】
Ｆｕｇｅｎｅ  ６トランスフェクション試薬を用いてＳｈＲＮＡ−ｐ６５及びＳｈＲＮＡ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（ルシフェラーゼプラスミド）を、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。安定なクローンは、それらが肉眼で可視になるまでＳｈＲＮＡ−ｐ６５（ｐ６５クローン）及びＳｈＲＮＡ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（ルシフェラーゼクローン）でトランスフェクトされた細胞から、５μｇ／ｍＬのピューロマイシンを用いて選択された。
クローンを選択し、そして２つの２４ウェルプレート（プレートＡ及びプレートＢ）に１：９の比で移した。ルシフェラーゼクローンはＬ１からＬ５と標識され、一方ｐ６５クローンは順次標識された。
【００６９】
大部分の細胞を含む２４ウェルプレート（プレートＡ）を、細胞が個々のウェル内でコンフルエントに達するまで毎日モニターした。実験方法の部分に記載したように、これらの細胞を集めて細胞溶解物を調製した。個々のクローンからの全細胞溶解物をＱＤＢ分析に使用してチュブリン及びｐ６５のレベル（含有量）を解析した。ｐ６５の相対レベル（すなわち、チュブリンレベルに対するｐ６５レベルの比）を使用して、ルシフェラーゼクローンにおけるｐ６５発現レベルの平均値を１として、各クローンにおける内因性ｐ６５発現レベルを比較した。結果は図４Ｃに示されており、各データ点は３回の独立した実験における３回繰り返し（三重反復）の平均値である。
【００７０】
図４Ｄは、ルシフェラーゼクローンとｐ６５クローンとの間のｐ６５相対レベルを比較する。ｐ６５クローン及びルシフェラーゼクローンは、最初に、実験方法の部分に記載されているように単離した。個々のクローンからｐ６５の相対レベルを計算し、そして平均値を取ってルシフェラーゼクローンとｐ６５クローンとの間の内因性ｐ６５レベルを、集団レベルで比較した。比較のために、５つのルシフェラーゼクローンの平均値を１として任意に設定した。＊：  ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定を用いる。ｐ６５の相対レベルは約０．８である。
【００７１】
一方では、図４Ｃに示される結果に基づいて、より少ない細胞を有する２４ウェルプレート（プレートＢ）から代表的なクローンをピックアップし、そして６０ｍｍのディッシュに移した。細胞が十分な数に達すると、それらは、抗ｐ６５及び抗チュブリン抗体を用いたウエスタンブロット解析に使用した。図４Ｅの下側のパネルは、それぞれｐ６５及びチュブリンについてのＷＢ信号の解析結果を示す。図４Ｄの同じ細胞のＱＤＢ分析からの結果は、図４Ｅの上部パネルに再プロットされている。細胞レベルで安定なクローンをスクリーニングすることは、生物学的研究において一般的な方法である。
【００７２】
この実施例では、ＱＤＢ分析を利用して細胞レベルで行うことが可能であると実証するように、ＲＮＡｉプラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞から安定クローンをスクリーニングするプロセスを実施した。
【００７３】
実施例４
この実験群は、マウス前立腺組織中のＣＡＰＧタンパク質の相対含有量を評価した。ＨＥＫ２９３細胞及びマウス前立腺組織のいずれかから調製した溶解物を、５０μｇ／レーンでウサギ抗ＣＡＰＧ抗体を用いたウエスタンブロットに使用した。膜全体を、Ｌｉ−Ｃｏｒ社製のブロットスキャナーを使用してスキャンした。図５Ａの挿入図は、抗体検証からのＷＢ信号（ウエスタンブロット解析によって抗体特異性を検証した結果）を示す。
図５Ａは、ＱＤＢ信号解析結果に基づく使用量曲線である。マウス前立腺組織から調製した混合溶解物を０．１μｇから４．８μｇまで段階希釈し、これをウサギ抗ＣＡＰＧ抗体を用いたＱＤＢ分析に使用した。
【００７４】
ウエスタンブロット解析によるＣＡＰＧ相対レベル（相対含有量）のＱＤＢ分析をベンチマークする。前立腺組織は、個々の規定番号で示されるマウスから収集した。ＱＤＢ分析の間に、前立腺組織溶解物２μＬ（サンプルあたり約１μｇの総タンパク質溶解物）を３回繰り返して（三重反復）、個々のマウスにおけるチュブリン及びＣＡＰＧの両方の含有量レベル、並びに個々のマウスのＣＡＰＧ相対レベル（相対含有量）の測定に使用された。ＣＡＰＧ相対レベル（相対含有量）は、図５Ｂの上側パネルに示される、チュブリンレベルに対するＣＡＰＧレベルの比として表される。一方、ウエスタンブロット解析に使用する各サンプルの溶解物の量は、これらのサンプルのチュブリンレベルのＱＤＢ分析の結果に基づいて、等量ローディングを可能にするように調整した。続いて、これらのサンプル中のＣＡＰＧレベルをウエスタンブロット解析を用いて調べた。マウス＃４４（番号）から調製した溶解物については、約３０μｇの全組織溶解物を使用した。ＷＢ信号は図５Ｂの下側のパネルに示した。ＷＢの信号は、Ｌｉ−Ｃｏｒ社のソフトウェアＩｍａｇｅ  Ｓｔｕｄｉｏ  Ｄｉｇｉｔｓを使用してデジタル化した。図５Ｃは、０．９６の変動係数（Ｒ２）を有する、ＷＢ信号とＱＤＢ信号との間の良好な相関関係を示す。
この実施例は、ウエスタンブロット解析でベンチマークされた、異なるマウス前立腺組織におけるＣＡＰＧ含有量の評価により、ＱＤＢ法の信頼性を実証した。
【００７５】
実施例５
この実験群は、野生型（ＷＴ）及びＴＲＡＭＰ（マウス前立腺癌のトランスジェニック腺癌）マウスの前立腺組織におけるＣＡＰＧ相対発現レベルを比較した。前立腺組織は、ＷＴ及びＴＲＡＭＰマウスから採取した。全組織溶解物を調製し、ＱＤＢ分析に用いてＣＡＰＧ及びチュブリンの発現レベルを測定した。チュブリンレベルに対するＣＡＰＧレベルの比として表されるＣＡＰＧ相対レベルを計算し、遺伝子型によって群分けて平均値を計算した。結果は、独立した実験で３回の結果の平均値であり、各実験において各サンプルを３回繰り返して（三重反復）測定した（ｐ＝０．６７２３、スチューデントｔ検定に基づく）。図６Ａに示すように、ＷＴマウス及びＴＲＡＭＰマウスのＣＡＰＧ相対レベルは、それぞれ８．２４３±０．３７２ａ．ｕ及び１１．８３５±０．２３８ａ．ｕである（ａ．ｕ．：任意単位）。
【００７６】
図６Ｂに示すように、同じＱＤＢの結果をそれらの年齢及び表現型に対して再プロットした。
ＷＴマウス及びＴＲＡＭＰマウスにおける年齢によるＣＡＰＧ相対レベルの層別解析を図６Ｃに示す。左側の２つの群のデータは、１２週（齢）のマウスのうち１９匹のＷＴマウス及び１９匹のＴＲＡＭＰマウスの平均値であり、一方では、右側の２つの群は１５〜１８週のマウスのうち１８匹のＷＴマウス及び１３匹のＴＲＡＭＰマウスの平均値である。＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、スチューデントｔ検定に基づく。
【００７７】
結果は、マウス１２週でのＣＡＰＧ平均レベルが、ＷＴ：０．６４３±０．０８２、ＴＲＡＭＰ：０．９６３±０．１０７であり、そしてマウス１５〜１８週でのが、ＷＴ：０．６８５±０．１３３、及びＴＲＡＭＰ：０．２５０±０．０２５であることを示した。
この実施例では、ＱＤＢ分析により動物組織中の特定のタンパク質分子を大規模に解析可能なの例を示す。図６Ｂ及び図６Ｃでは、どのように異なる方法で図６Ａに示されたデータをさらに解析できるかを実証した。
【００７８】
実施例６
この研究では、２種類のＱＤＢプレート（Ａ型プレート及びＢ型プレート）を使用した。Ａ型プレートは、図１Ａに示すように、膜を囲む垂直方向のリング（鉛直リング）に２つの開口（ノッチ）を備える。Ｂ型プレートは、膜を囲む垂直方向のリングに開口がない他、Ａ型プレートと同じ構造を持っている。このように、Ａ型プレートは、流体が垂直リングの開口を通って容易に出入りすることを可能にし、膜の洗浄を容易にする。他方、Ｂ型プレートは、垂直リングの内側に蓄積する流体の薄層を有し、膜表面と洗浄液との間に液の自由な交換を妨げる。
【００７９】
抗ｉｋＢ抗体は、用量反応を研究するのに使用した。Ａ型プレート及びＢ型プレートのそれぞれは４８個の膜ユニットを有し、そのため両方とも９６ウェルプレートに適合している。マウス肝臓溶解物は、Ｚｈａｎｇ  Ｊ．  ２００７に記載されている細胞溶解物の製法のように、プロテアーゼ阻害剤を含む溶解緩衝液中で、ハンドヘルドホモジナイザーを用いて凍結組織から調製した。タンパク質濃度は、ＢＣＡ法を用いて測定した。全細胞溶解物を４×ＳＤＳサンプル緩衝液（Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液）中に再懸濁し、そして７５℃で５分間加熱した。マウス肝臓溶解物を段階希釈し、Ａ型及びＢ型プレート両方の各膜ユニットにスポッティングした。サンプルを室温で４５分間乾燥させた。２種類のプレートをブロッキング緩衝液（０．１％のＴｗｅｅｎ２０を補充した５％無脂肪ミルクのトリス緩衝食塩水（一般に「ＴＢＳＴ」として知られる））で１時間ブロッキングした後、サンプルをウサギ抗チュブリン抗体の１：２０００希釈でのブロッキング緩衝液に４℃で一晩インキュベートした。続いてＴＢＳＴ緩衝液で３×５分間洗浄した後、ＱＤＢプレートを、西洋ワサビペルオキシダーゼで予め標識されたロバ抗ウサギ二次抗体と共にインキュベートした。
【００８０】
ＴＢＳＴ緩衝液でさらに３×５分間洗浄した後、Ａ型プレートとＢ型プレートの両方を９６ウェルプレートに挿入した。製造元の取り扱い説明書にしたがって、化学発光（ＥＣＬ）基質混合物１００μＬを加えた。それらのプレートを９６ウェルプレート中に１分間放置した後、それらを白色９６ウェルプレートに移した。組み合わせたプレートをＴｅｃａｎマイクロプレートリーダーに配置し、該マイクロプレートリーダーの操作メニュー上のオプション「カバー付きプレート（ｐｌａｔｅ  ｗｉｔｈ  ｃｏｖｅｒ）」を選択して定量化する。
【００８１】
使用量曲線を図７に示す。Ａ型プレートを用いた使用量曲線は、Ｂ型プレートを用いた使用量曲線に比べて２倍を超える信号強度を示す。Ａ型プレートは、またより良好な直線性（Ａ型のＲ２＝０．９９４１、Ｂ型のＲ２＝０．９８３）を有する信号を生成した。この効果は、Ａ型プレートがより効果的に洗浄可能であるため、その膜をよりきれいにし、そして背景雑音を減少させることをもたらす。
この実験群では、徹底的な洗浄がデータ品質を改善することを実証している。
【００８２】
実施例７
この実験群では、ＱＤＢ分析において異なる抗体の線形範囲を調査する。図８Ａは、抗ＡＮＸＡ６抗体を用いたマウス前立腺溶解物についての全体のＱＤＢ使用量曲線（０μｇから４μｇ）及びその線形範囲（０μｇから１μｇ）を並べて示す。この線形範囲内の使用量曲線は、変動係数Ｒ２＝０．９９６を有する。同様に、図８Ｂは、抗Ａｃｔｉｎ（アクチン）抗体を用いたマウス肝臓溶解物の全体のＱＤＢ使用量曲線及びその線形範囲を示す。信号はビオチンーストレプトアビジン系とのカップリングにより増強された。この場合、線形範囲は０μｇから０．５μｇであり、変動係数Ｒ２＝０．９９６を有し、ＱＤＢ分析におけるサンプルサイズを小さくすることができる。
【００８３】
図８Ｃは、抗ＣＡＬＲ抗体を用いたマウス肝臓溶解物の全体のＱＤＢ使用量曲線（０μｇから１μｇ）及びその線形範囲（０μｇから０．２５μｇ）を示す。線形範囲は、変動係数Ｒ２＝０．９９８を有する。
【００８４】
本発明者らの結果は、検出抗体によってその使用量曲線が互いに異なることを示している。大規模ＱＤＢ分析の前に、検出抗体の評価及び検出抗体の使用量曲線の確立は必要である。
【００８５】
実施形態の変形例は可能である。例えば、現在のＱＤＢ法は酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を実行するために使用することができる。このようなプロセスでは、等量の抗体Ａを最初にＱＤＢプレートの個々の膜ユニットの底部にスポッティングして膜に結合させる。次にＱＤＢプレートをブロッキング緩衝液でブロックするブロッキングステップの後、１種以上の被検サンプルをＱＤＢプレートの個々の膜ユニットにスポッティングする。洗浄後、レポーター酵素で直接又は間接的に標識された等量の抗体ＢをＱＤＢプレートの個々の膜ユニットにスポッティングする。プレートを再度洗浄する。ＱＤＢプレートの各膜ユニットに形成された免疫複合体は、検出試薬を用いて直接的又は間接的に測定される。
【００８６】
本発明の実施形態において、ＨＲＰ、ＡＰ又はブドウ糖酸化酵素などの酵素標識に加えて、放射性同位元素、ＤＮＡレポーター（例えば、リアルタイム免疫定量的ＰＣＲ）、蛍光標識物（例えば、フィコエリトリン）、電気化学発光タグなどを含む、任意の利用可能な免疫学的検定標識を使用することができる。
【００８７】
本発明の実施形態は、任意の市販のマイクロプレートリーダーを使用することができる。マイクロプレートリーダーは、信号検出のために、例えば吸光度、蛍光、化学発光、時間分解蛍光（ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）、蛍光偏光などの異なる検出技術を使用することができる。
【００８８】
本明細書に記載の例示的な実施形態は、従来の周知の又は好ましい実施形態であるため、説明的な意図のみで限定の目的ではないと理解されるべきである。各実施形態における特徴又は状況についての説明は、他の実施形態における他の特徴又は状況に利用可能なものとする典型的な代表として理解すべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年9月13日(2019.9.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原を検出する方法であって、
（ａ）抗原を複数の膜ユニットに結合させるステップであって、各前記膜ユニットは複数の支持体のうちの１つに固定されるステップと、
（ｂ）前記抗原と相互作用する一次抗体を選択するステップと、
（ｃ）前記一次抗体を前記抗原に結合させて免疫複合体を形成し、その結果、前記複数の膜ユニットのそれぞれに免疫複合体が結合するステップと、
（ｄ）前記免疫複合体に信号を放出させるステップと、
（ｅ）前記複数の膜ユニットのそれぞれに結合された前記免疫複合体から放出される信号の強度を検出するステップと、
（ｆ）前記免疫複合体から放出された複数の信号強度を前記抗原の複数の量と相関付ける使用量曲線を作成するステップと、
（ｇ）前記免疫複合体から放出された前記信号強度を前記使用量曲線とマッチングさせることによって、前記複数の膜ユニットのそれぞれにおける前記抗原の量を得るステップとを含む、方法。
【請求項２】
前記免疫複合体は、レポーター酵素（ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｅｎｚｙｍｅ）、放射性同位体、ＤＮＡレポーター、蛍光標識物、電気化学発光タグ、及びそれらの混合物からなる群から選ばれる標識物質で標識されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記レポーター酵素が西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）又はブドウ糖酸化酵素を含み、且つ前記蛍光標識物がフィコエリトリンを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記標識物質は、一次抗体と直接にコンジュゲートしているか、又は一次抗体に対する二次抗体と間接的にコンジュゲートしている、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記一次抗体、前記二次抗体、又はその両方は、前記標識物質で予め標識されている、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記免疫複合体から放出される信号が光子又は放射線である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記複数の膜ユニットのそれぞれにおける前記免疫複合体から放出される信号は、前記信号の強度に対応する数値として取得される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記信号の前記強度は画像から変換されたものではない、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記複数の支持体のそれぞれは、連結部材を介して平面構造に取り付けられ、
前記連結部材は、第１の端部と第２の端部とを含み、前記第１の端部は前記平面構造に取り付けられ、
前記複数の支持体のうちの１つは、前記連結部材の前記第２の端部に取り付けられ、又は、前記連結部材の前記第１の端部と前記第２の端部との間を介して取り付けられる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記膜ユニットは、ニトロセルロース膜若しくはＰＶＤＦ膜、又は表面上のニトロセルロースのコーティング若しくはＰＶＤＦのコーティングである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記光子は、前記標識物質の比色反応、前記標識物質の化学発光反応、又は前記標識物質からの蛍光発光によって生成される、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
前記複数の膜ユニットのうちの１つからの前記信号は、他の膜ユニットからの信号から分離されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ａ）〜（ｅ）を利用して使用量曲線を構築するステップをさらに含み、その中で、前記使用量曲線は、前記抗原からの前記信号の強度とサンプルの量とを相関付け、
前記抗原からの前記信号は、前記抗原を含む免疫複合体から放出される信号である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
使用量曲線は、抗原からの信号の強度が実質的にサンプルの量と直線的に相関する線形範囲を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記サンプルは、前記抗原又は前記抗原の標準物質を含有する溶解物である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記溶解物の使用量曲線の前記線形範囲内にある所定量の前記溶解物中の前記抗原からの信号強度を測定するステップをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記溶解物中の抗原の量を得るために、測定された信号強度と、前記抗原の標準使用量曲線の線形範囲における前記抗原の量とを相関付けるステップをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記溶解物の使用量曲線を決定するステップをさらに含み、前記複数の膜ユニットのうちの１つ以上に導入される溶解物の量が使用量曲線の線形範囲内にある、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
イムノブロット解析方法であって、
それぞれ膜を含む互いに離間している膜ユニットを複数備えるマルチユニットプレートを提供するステップと、
抗原を含む溶解物を、複数の膜ユニットの１つ以上に導入するステップと、
前記抗原と相互作用する一次抗体を選択するステップと、
前記一次抗体を前記抗原に結合させて前記複数の膜ユニットの１つ以上に固定された免疫複合体を形成し、ここで前記一次抗体は、レポーター酵素と直接的に結合し、又は１つ以上の二次抗体を介してレポーター酵素と間接的に結合するステップと、
前記免疫複合体における前記レポーター酵素から放出される信号を１つ以上の膜ユニットから検出するステップとを含む、
イムノブロット解析方法。
【請求項２０】
１つ又は複数の前記膜ユニットのそれぞれから放出される前記信号を取得し、前記信号の強度を数値に変換するステップとをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記信号の強度は、前記信号からなる画像に基づいて測定されていない、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記膜ユニットは、ニトロセルロース膜若しくはＰＶＤＦ膜、又は基板上のニトロセルロースのコーティング若しくはＰＶＤＦのコーティングである、請求項１９に記載の方法。
【国際調査報告】
2020511669.tif 000011