(57)【要約】  環状ポリペプチドと、環状ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとを共区画化する方法であって、a)環状ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む区画を形成するステップと、b)ポリヌクレオチドからポリペプチドを発現させるステップと、c)ポリペプチドを環化させるステップと、を備える方法。共区画化環状ポリペプチド及びコードするポリヌクレオチド。共区画化環状ポリペプチド及びコードするポリヌクレオチドのライブラリ。共区画化環状ポリペプチド及びコードするポリヌクレオチドのライブラリをスクリーニングする方法。このようなライブラリへの非標準の核酸の組み込み。【特許請求の範囲】
【請求項１】
環状ポリペプチドと前記環状ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとを共区画化する方法であって、
a)前記環状ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む区画を形成するステップと、
b)前記ポリヌクレオチドからポリペプチドを発現させるステップと、
c)前記ポリペプチドを環化させるステップと、を備える方法。
【請求項２】
環状ポリペプチドをソーティングする方法であって、請求項1のステップを備え、更に
c)前記環状ポリペプチドを活性についてスクリーニングするステップと、
d)所望の活性を示す前記環状ポリペプチドを選択するステップと、を備える方法。
【請求項３】
更に、前記ポリヌクレオチドを増幅するステップを備える、請求項1又は2記載の方法。
【請求項４】
前記区画は、更に、ゲル形成剤を含み、前記ゲル形成剤は、前記ポリヌクレオチドを増幅した後、固化させてゲルビーズにする、請求項3記載の方法。
【請求項５】
前記区画は、前記ゲル形成剤を固化させてゲルビーズにした後に、破壊される、請求項4記載の方法。
【請求項６】
前記ゲルビーズは、前記環状ポリペプチドを発現させるための条件下に置かれる、請求項5記載の方法。
【請求項７】
新たな区画が、前記ゲルビーズの周りに形成される、請求項5又は6記載の方法。
【請求項８】
前記ポリヌクレオチドは、N末端インテイン断片をコードする配列と、それに続く前記環状ポリペプチドをコードする配列と、それに続くC末端インテイン断片をコードする配列とを含む、先行請求項の何れかに記載の方法。
【請求項９】
前記区画は、水中油中水型(w/o/w)エマルションの液滴、小胞、又は区画である、先行請求項の何れかに記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリヌクレオチドから前記ポリペプチドを発現させることは、前記ポリヌクレオチドを、非天然アミノ酸をチャージした1つ以上のtRNAを含むIVTT混合物と接触させるステップを含む、先行請求項の何れかに記載の方法。
【請求項１１】
増幅は、容器内で実行され、熱は、前記容器を取り囲む表面積全体で均一且つ連続的に加えられる、請求項4乃至10の何れかに記載の方法。
【請求項１２】
a)N末端インテイン断片をコードする配列と、それに続く環状ポリペプチドをコードする配列と、それに続くC末端インテイン断片をコードする配列とを含むポリヌクレオチドと
b)前記環状ペプチドと、を備える区画。
【請求項１３】
請求項12記載の複数の区画を備える環状ポリペプチドのライブラリ。
【請求項１４】
a)マイクロ流体デバイスと、
b)N末端インテイン断片をコードするポリヌクレオチドと、
c)C末端インテイン断片をコードするポリヌクレオチドと、を備えるキット。
【請求項１５】
更に、カプセル形成材料を備える、請求項14記載のキット。
【請求項１６】
前記カプセル形成材料は、油、脂質、又は高分子電解質を含む、請求項15記載のキット。
【請求項１７】
更に、ゲル形成剤を備える、請求項14から16の何れか記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
1 技術分野
本発明は、環状ペプチドとそれをコードするポリヌクレオチドとの共区画化に関する。特に、本発明は、このような区画化環状ペプチドのライブラリ、及びこのようなライブラリから区画化環状ペプチドをスクリーニング、選択、及びソーティングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
2 発明の背景
油相に分散した水性の液滴内に個々の試料を区画化することは、化学及び生物学における高スループットアッセイにとって強力な方法となる。この場合、液滴は、試験管に相当する。液滴には、ライブラリ構成要素の特定の実験又はプロファイルを評価及び解読するために必要な全てのものが含まれている。バルクエマルション手法により生成された液滴は、サイズが均一ではなく、定量的な読み取りが必要な実験では複雑な問題が生じる。マイクロ流体デバイスにより、毎秒最大数千(数万)の頻度で、高単分散性の水性液滴を生成することができる。通常、直径は、10乃至200ミクロンで、0.5pL乃至4nLの体積に相当する。液滴の形成に加え、マイクロ流体形式では、液滴の分裂、融合、インキュベーション、分析、ソーティング等、他の多数の単位操作が可能となる。
【０００３】
液滴マイクロフルイディクスでは、単一の遺伝子、生物、及び細胞の区画化に特に適した、境界が明確で個別化された環境を提供する、ナノリットル乃至フェムトリットルのサイズの水中油型液滴の形成を扱う。特に、小型化には多くの利点があり、これには試料消費量の削減、分析性能の向上、内容物の迅速な混合、層流(流線流)が含まれる。
【０００４】
水性液滴は、それがもたらす区画化が自然界の細胞による区画化に似ていることから、遺伝子型を表現型に連結する。各人工区画では、単一の遺伝子が無細胞手段により転写及び翻訳され、それがコードするタンパク質の複数のコピーが得られる。このin vitro区画化(IVC)により、高スループットのライブラリ選択及び新規のペプチドに基づく生物製剤の同定に良く適した「モノクローナル単位」が生成される。遺伝子型と表現型の連結は、化学的な連結ではなく、共区画化であるため、様々な機能(酵素的、調節的、阻害的、結合的、構造的)を選択することができる。これは、結合相互作用のみに基づいて選択される既存のディスプレイ選択戦略(例えば、バクテリア、ウイルス、酵母、ファージディスプレイ)よりも有利となる。結合が阻害又は触媒作用と相関しないため、こうした戦略を使用すると、酵素表面に強く結合するが、その活性部位の外側にある弱い阻害剤が誤って選択される恐れがある。
【０００５】
乳化油中水型(w/o)液滴のin vitroタンパク質発現に関する研究では、概念実証として緑色蛍光タンパク質(GFP)が用いられることが多い。無細胞タンパク質合成区画化及びGFP発現用の微細構造デバイスの実現は、Dittrich et al.により最初に実証された。その後、Courtois et al.は、測定可能な量のin vitro発現GFPを含む液滴の保存及びオンライン検出用の統合チップ系の有用性について記述している。しかしながら、単一のテンプレートのみを単離しても、検出閾値に達するのに十分なタンパク質が生成されない場合がある。単一のlacZ遺伝子の場合のように、β-ガラクトシダーゼは、高い酵素活性にもかかわらず、発現が検出できなかった(kcat=187s-1、KM=150μM)。この問題は、DNAの等温増幅系との共カプセル化により克服することができる。Φ29DNAポリメラーゼによるオンチップ等温増幅により、μg量の二本鎖DNAが簡単に生成される。この前増幅ステップには、IVTT含有液滴と増幅DNAを含む液滴との協調的融合が含まれるが、しかしながら、多くの場合、DNA増幅、IVTT、及びその後の酵素アッセイに必要な最適条件は異なり、例えば、DNA増幅の成功に必要な成分は、IVTTを阻害する恐れがある。同様に、各プロセスを異なるpH値又は異なるバッファ組成で実行することが必要な場合もある。
【０００６】
異なる生化学反応同士の互換性は、油中水型液滴を扱う場合に問題となる。殆どの生化学プロトコルは、多段階プロセスであり、溶液の添加、試料の遠心分離、上清の除去、ペレットの洗浄等が行われる。このようなプロトコルを液滴に移し換えることは困難である。成分を追加及び/又は希釈するための液滴-液滴融合を特殊なマイクロ流体デバイスを用いて実行できたとしても、多数の液滴が関与し、追加のステップ(例えば、洗浄、バッファの交換、試薬の追加又は除去)が必要な場合、実際的には難しい。更に、液滴の融合は、液滴区画の制御状態での合体と化学的及び生物学的反応の開始にとって重要だが、そのプロセス自体は難しく、これは例えば、液滴が時間的及び空間的同期を共に達成することが融合の発生に必要であること、使用する界面活性剤の安定化効果を克服する必要があること、液滴が電界に従うことで合体(電気融合)が生じる能動的誘導には、電極等の特殊な機器の使用が必要であることが理由となる。このため、連続したワークフローにおいて液滴融合を実現することは困難又は不可能となる。
【０００７】
in vitroでの多段階区画化反応を実施するための代替手法には、マイクロ流体液滴におけるゲルビーズの使用がある。これらの手法は、高スループットスクリーニング、定方向進化、及び遺伝子タイピング法等の生化学プロセスに特に有用となる。
【０００８】
例えば、PCT出願番号PCT/GB2012/051106には、レポータ基質を検出可能なレポータに転換する際の活性について複数のポリペプチドをスクリーニングするための以下の方法を記載されている:
1)ポリヌクレオチド集団、レポータ基質、及びゲル形成剤を含む水性レポータ溶液を乳化して微小液滴とし、前記微小液滴内でレポータ基質を、検出可能なレポータに転換する産物を各ポリヌクレオチドがコードした状態にすること、
2)ゲル形成剤を微小液滴内で固化させ、ポリヌクレオチドと産物により生成された検出可能なレポータとを含むゲルビーズを生成すること、
3)水性微小液滴を解乳化し、水性検出溶液にビーズを再懸濁すること、
4)前記集団中の1個以上のビーズ内で検出可能なレポータを検出、決定、又は測定すること。
【０００９】
検出可能なレポータを含む又は検出可能なレポータを含まない水溶液から、1個以上のビーズを同定及び/又は単離することができる。1個以上の同定されたビーズからのポリヌクレオチドは、同定、増幅、クローン化、配列決定、又は他の形で精査し得る。ポリヌクレオチド又は核酸は、例えばプラスミド、ウイルス、又はPCR産物において単離してもよく、又は細胞或いはウイルス粒子に含まれてもよい。ポリヌクレオチドは、ゲルビーズ内に保持される。
【００１０】
単純な油中水型液滴とは対照的に、水中油中水型(w/o/w)ダブルエマルションは、生物学的成分を単離するための内部水性区画を、フローサイトメトリ分析用の水性キャリアと共に提供する。Tawfick and Griffithsは、以前、w/o/wダブルエマルションを、産物の蛍光の出現に基づいて潜在的な触媒の「ヒット」を特定するための定向タンパク質進化における遺伝子型-表現型連結の形成用の小型マイクロリアクタとして利用しており、所望の活性を示すライブラリの構成要素は、その後フローサイトメトリにより選択される。しかしながら、液滴を作成及び分類するために多数のマイクロ流体系が開発されてきたものの、必要な操作スキルのため、非専門家的な設定を容易に実現することが阻まれている。そのため、シングル(疎水性デバイス表面コーティング)及びダブルエマルション液滴形成(親水性デバイス表面コーティング)用に表面特性が異なる2つの独立したマイクロフルイディクスデバイスを使用する、Zinchenko et al.が記載したような2ステップ単分散ダブルエマルション液滴法を採用している。結果的に生じるダブルエマルション液滴は、蛍光活性化細胞ソーティング(fluorescence activated cell sorting(FACS))による定量分析及びソーティングに適したものとなる。
【００１１】
国際特許出願WO2000/036093A2は、環状ペプチドを生成し、ループ構造内のペプチドの中間体をスプライシングする方法を開示している。この方法は、スプリットインテインのトランススプライシング能力を利用して、スプリットインテインの2つの部分の間に挟まれた標的ペプチドを有する前駆体ペプチドから、ペプチドの環化を触媒する。スプリットインテインの2つの部分の相互作用により、触媒活性を有するインテインが形成され、インテイン部分の1つと標的ペプチドとの間の接合部において、標的ペプチドをアミノ酸のエステル異性体を安定化させるループ構成に強制する。次に、他のインテイン部分からのヘテロ原子がエステルと反応し、環状エステル中間体を形成する。活性インテインは、環化形態の標的ペプチドを遊離させるアミノスクシンイミドの形成を触媒し、これにより、自発的な再配列が生じ、熱力学的に好ましい骨格環状ペプチド生成物を形成する。
【００１２】
国際特許出願WO2012/156744A2は、インビトロで多段階区画化反応を行うためのマイクロ流体液滴中でのゲルビーズの使用を開示している。方法は、ポリヌクレオチド、レポータ基質、及びゲル形成剤を含む水性レポータ溶液を乳化して微小液滴することを含み得る。各ポリヌクレオチドは、微小液滴内でレポータ基質を、検出可能なレポータに転換する産物をコードする。次に、ゲル形成剤を微小液滴内で固化させ、ポリヌクレオチドと産物により生成された検出可能なレポータとの両方を含むゲルビーズを生成する。次に、水性微小液滴を解乳化し、水性検出溶液に再懸濁し、レポータは、集団中の1個以上のビーズ内で検出される。
【００１３】
Cui, Weitz, Chong, et al. (Scientific Reports 6, Article number: 22575)は、in vitroツーハイブリッド系(IVT2H)を、マイクロ流体液滴に導入し、ランダムDNAライブラリをスクリーニングするための合理化されたmix-and-read drop-IVT2H法を開発した。drop-IVT2Hは、相互作用する2つのタンパク質ドメインの結合親和性と蛍光レポータの転写活性化との相関に基づく。潜在的なペプチドバインダをコードするDNAライブラリは、単一のDNA分子が個々の液滴に分布するようにIVT2Hによりカプセル化された。
【００１４】
Brouzes et al. (PNAS 2009, 106:34, pp.14195-14200)は、単一哺乳動物細胞の高スループットスクリーニングを可能にする液滴に基づくマイクロ流体技術を提示し、アッセイ読み取り中に液滴組成の識別を可能にする光学的にコード化された液滴ライブラリを開発した。この統合液滴技術を用いて、U937細胞に対する細胞毒性効果について、薬物ライブラリがスクリーニングされた。
【００１５】
Thiele et al. (Lab on a chip, 2014, pages 2651-2652)は、無膜in vitro転写/翻訳用のヒアルロン酸ヒドロゲルビーズの使用を報告している。しかしながら、溶解しないヒアルロン酸ヒドロゲルは、タンパク質の収量を減らす可能性がある。
【００１６】
小型直鎖ペプチドは、幅広い生物活性を示し、固相合成及びコンビナトリアルケミストリにおける従来の手法を利用して、ほぼ無限に可変な配列で容易に合成可能であるため、様々な生理現象の精査に有用となる。また、これらの性質により、小型直鎖ペプチドは、新薬の特定及び開発にも特に有用となる。例えば、無数の異なる小型直鎖ペプチドの大きなライブラリを合成的に調製し、様々な生物学的アッセイにおいて特定の特性をスクリーニングすることができる。例:Scott, J. K. and G. P. Smith, Science 249:386, 1990、Devlin, J. J., et al., Science 24:404, 1990、Furka, A. et al., Int. J. Pept. Protein Res. 37:487, 1991、Lam, K. S., et al., Nature 354:82, 1991。特定の特性を示すライブラリ内のペプチドは、その後、単離し、更なる研究の候補とすることができる。配列決定を用いて、例えば関連するポリヌクレオチドにより、選択されたペプチドを特徴付けることができる。
【００１７】
これらの利点にもかかわらず、広く使用される医薬品として開発されたものは、僅かな小型直鎖ペプチドのみである。この理由の1つには、小型直鎖ペプチドは、通常、体内からの急速に除去されるため、治療的価値が得られないことがある。
【００１８】
閉環又は環化は、ペプチドが生体内で分解される速度を低下させることが可能であるため、薬物動態特性を劇的に改善する。無限可変アミノ酸配列の多数の異なるペプチドを生成する合成方法により、特定の環状ペプチドを新薬の候補として同定することが大いに促進される。
【００１９】
環状ペプチドを生成するための様々な方法が記述されている。例えば、米国特許第4,033,940号及び第4,102,877号に記載されているような化学反応プロトコルが、環状ペプチドを生成するために考案されている。他の手法では、生物学的方法と化学的方法とを組み合わせて環状ペプチドを生成する。こうした後者の方法には、最初に環状ペプチドの線状前駆体を発現させ、次にプロテアーゼ又は求核試薬等の外因性の物質を加えて、線状前駆体を化学的に環状ペプチドに転換することが含まれる。例えば、Camerero, J. A., and Muir, T. W., J. Am. Chem. Society. 121:5597 (1999)、Wu, H. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:9226 (1998)を参照されたい。
【００２０】
生成後、環状ペプチドは薬理活性についてスクリーニングすることができる。例えば、多数の異なる環状ペプチドを含むライブラリを調製し、特定の標的リガンドに結合する能力等、特定の特性についてスクリーニングすることができる。ライブラリは、標的リガンドと混合され、標的リガンドと結合するライブラリの構成要素は、関連するポリヌクレオチドを配列決定することにより単離及び同定することができる。同様に、環状ペプチドのライブラリを特定の生物活性のアッセイに追加することができる。生物学的活性を調整する環状ペプチドは、その後、配列決定により単離及び同定することができる。
【００２１】
環状ペプチドライブラリは、様々な困難な標的の阻害剤を同定するための高スループットスクリーニングにおける使用が増加している。このようなライブラリの生成方法は、2つに分けることが可能であり、一方は、遺伝的にコード化されたアプローチで、ファージディスプレイ又はSICLOPPS(Split-Intein Circular Ligation Of Peptides and Proteins:ペプチド及びタンパク質のスプリットインテイン環状ライゲーション)等であり、他方は、デコンボリューションコードによるタグ付けを要する化学合成ライブラリで、一般には、ライブラリの各構成要素を識別するために、一意(unique)の核酸(RNAやDNA等)コードが使用される。
【００２２】
分子生物学の最近の進歩により、幾つかの分子は、それらをコードする核酸と一緒に、特性に応じて共選択することができる。選択した核酸は、更に分析又は使用するために、その後クローン化することが可能であり、又は付加的な突然変異及び選択を繰り返すことができる。
【００２３】
これらの方法に共通するのは、大きな核酸ライブラリの確立である。所望の特性(活性)を有する分子は、所望の生化学的又は生物学的活性、例えば結合活性等、コードされたポリペプチドの所望の活性を選択する選択レジームを介して単離することができる。
【００２４】
ファージディスプレイ技術は、核酸とコードされたポリペプチドの活性との間に本質的な連結を提供することにより、表示されたタンパク質の選択を可能にする媒体を提供することに大いに成功している(Smith, 1985; Bass et al., 1990、McCafferty et al., 1990、レビューについてはClackson and Wells, 1994を参照)。繊維状ファージ粒子は、外側にタンパク質、内側にそれらをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子ディスプレイパッケージとして機能する。核酸とコードされたポリペプチドの活性との間の緊密なつながりは、バクテリア内のファージの組立ての結果である。個々のバクテリアが多重感染することはまれであるため、殆どの場合、個々のバクテリアから産生される全てのファージは、同じポリヌクレオチドを保有し、同じタンパク質を表示する。
【００２５】
しかしながら、ファージディスプレイは、バクテリアにおける生体内での核酸ライブラリの形成に依存している。したがって、ファージディスプレイ技術により可能なライブラリサイズの実際的な制限は、切除可能(excisable)な繊維状ファージレプリコンを有するλファージベクタを利用しても、107乃至1011程度である。この手法は、主に結合活性を有する分子の選択に適用されている。触媒活性を有する少数のタンパク質も、この手法を用いて単離されているが、しかしながら、選択は、直接的に所望の触媒活性に対するものではなく、遷移状態アナログへの結合(Widersten and Mannervik, 1995)又は自殺阻害剤との反応((Soumillion et al., 1994、Janda et al., 1997)の何れかに対するものとなっていた。最近では、産物の形成によるファージディスプレイを用いて選択された酵素の例が幾つか存在しているが(Atwell & Wells, 1999、Demartis et al., 1999、Jestin et al., 1999、Pederson, et al., 1998)、これら全てのケースにおいて、選択は、複数のターンオーバに対するものではなかった。
【００２６】
mRNAディスプレイにより、大きなライブラリを生成することは可能だが、こうしたライブラリは、親和性に基づくスクリーニングに限定され、ファージディスプレイと同じ欠点を有する。
【００２７】
mRNAディスプレイは、遺伝子型としてのmRNAと表現型としてのペプチド分子とを、無細胞翻訳系(in vitro転写/翻訳系)を用いて共有結合することにより、遺伝子型と表現型とを連結する手法であり、合成されたペプチド分子と、それをコードするmRNAとを、チロシルtRNAの3’末端の類似体であるピューロマイシンを介して結合することにより適用される。
【００２８】
mRNAディスプレイ(出典を明記することによりその開示内容全体を本願明細書の一部とするSzostak, J. W. and Roberts, R. W., U.S. Pat. No. 6,258,558を参照)において、ライブラリ内の各mRNA分子は、3’末端においてピューロマイシン様部分の共有結合的付加により修飾される。ピューロマイシン様部分は、ペプチジルアクセプタとして機能するアミノアシルtRNAアクセプタステム類似体であり、mRNAを翻訳するリボソームのペプチジルトランスフェラーゼ活性により成長中のポリペプチド鎖に付加することができる。in vitro翻訳中、mRNAとコードされたポリペプチドとは、ピューロマイシン様部分を介して共有結合され、RNA-ポリペプチド融合体を形成する。そのポリペプチド成分の標的との結合による(即ち、スクリーニングによる)融合分子の選択後、選択された融合分子のRNA成分をPCRにより増幅し、その後、特徴付けすることができる。ポリペプチドと、それをコードする核酸との間に物理的結合を生成して、選択及び増幅を促進するために、他の幾つかの方法が開発されている(それぞれ出典を明記することによりその開示内容全体を本願明細書の一部とするYanagawa, H., Nemoto, N., Miyamoto, E., and Husimi, Y., U.S. Pat. No. 6,361,943、Nemoto, H., Miyamoto-Sato, E., Husimi, H., and Yanagawa, H. (1997). FEBS Lett. 414:405-408、Gold, L., Tuerk, C., Pribnow, D., and Smith, J. D., U.S. Pat. Nos. 5,843,701 and 6,194,550、Williams, R. B., U.S. Pat. No. 6,962,781、Baskerville, S. and Bartel, D. P. (2002). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:9154-9159、Baskerville, D. S. and Bartel, D. P., U.S. Pat. No. 6,716,973、Sergeeva, A. et al. (2006). Adv. Drug Deliv. Rev. 58:1622-1654を参照)。
【００２９】
mRNAディスプレイは、大きなペプチドライブラリを形成するための特に有用な方法となる。
【００３０】
mRNAディスプレイでは、適切なリンカを介して3’末端に付着済みのピューロマイシンを含むmRNAを、無細胞翻訳系に導入して、mRNAからペプチドを合成し、リボソーム上でのペプチジル転移反応の基質として、ピューロマイシンが成長中のペプチド鎖のC末端に融合される。翻訳されたペプチド分子は、ピューロマイシン部分を介してmRNAに融合される。ピューロマイシンは、アミノアシルtRNAの3’末端とは異なり、エステル結合ではなく、新生ペプチドとのアミド結合を形成することを特徴とする。したがって、リボソーム上で互いに融合したピューロマイシンとペプチドとの結合体は、加水分解に耐性があり、安定している。
【００３１】
mRNAディスプレイでは、ピューロマイシンをmRNAの3’末端に付着させる必要がある。この付着は、最初に線状ポリマからなるスペーサを有するピューロマイシン結合リンカを調製し、次にリンカをmRNAの3’末端に融合させることにより生じ得る。付着は、最初にスペーサをmRNAの3’末端に結合させ、次にピューロマイシンを結合体に融合させることでも生じ得る。何れの方法においても、線状ポリマスペーサは、一般に、末端にリン酸基又はヌクレオチドを含み、mRNAの3’末端とリンカの5’末端との間の結合はmリン酸基を介した共有結合となる。この共有結合は、RNAリガーゼ又はDNAリガーゼを用いた反応、又は標準的な有機化学反応により形成される。
【００３２】
EP2492344A1では、「RAPID」として知られる改変mRNAディスプレイ法が開示されている。本発明のRAPIDディスプレイ法でのリンカは、公知のmRNAディスプレイ法と同じように、一端でmRNAの3’末端に、他端で新生ペプチドのC末端に結合することにより、mRNAと、そこから翻訳されるペプチドとを接続する。
【００３３】
しかしながら、RAPIDディスプレイ法のリンカは、公知のmRNAディスプレイ法に用いられるものと両端の構造が異なる。本明細書では、RAPIDディスプレイ法に用いられるリンカを「RAPIDリンカ」と呼ぶ場合がある。
【００３４】
ペプチドのC末端に結合するリンカの一端の領域は、本明細書では「ペプチジルアクセプタ」又は単に「アクセプタ」と呼ぶ場合がある。したがって、「ペプチジルアクセプタ」という用語は、リボソーム上のペプチジル転移反応により成長するペプチド(ペプチジルtRNA)に結合可能な構造を有する分子又は部分を示す。ペプチジルアクセプタは、リンカの末端に位置する領域を示す場合、又はリンカを含む構造全体を示す場合がある。例えば、公知のmRNAディスプレイ法におけるペプチジルアクセプタは、リンカの一端に位置するピューロマイシン、又はリンカを含む構造全体としてのピューロマイシン結合リンカである。
【００３５】
RAPIDリンカは、ペプチジルアクセプタの構造及び調製プロセスにより特徴付けられる。
【００３６】
RAPIDディスプレイ法において、4残基のリボヌクレオチドACCAからなる配列を有するリンカが3’末端において合成され、次に、アミノ酸が3’末端でアデノシンに付着することにより、ペプチジルアクセプタとしての構造がリンカに付与される。リボソームでのペプチド伸長反応中、リンカの末端に付着したアミノ酸は、ペプチジルtRNAのペプチドのC末端を受容し、ペプチドに結合する。アミノ酸がエステル結合を介してRNA配列ACCAに結合する構造は、本明細書において「ペプチジルアクセプタ領域」と呼ばれる。
【００３７】
公知のmRNAディスプレイ法におけるペプチジルアクセプタは、ピューロマイシンであり、アデノシン様部分のリボースとアミノ酸とがアミド結合を介して結合したアミノヌクレオシド構造を有する。しかしながら、RAPIDディスプレイ法では、アミノ酸は、エステル結合を介してリボースの3’-Oに結合する。言い換えれば、RAPIDディスプレイのペプチジルアクセプタは、天然のアミノアシルtRNAに類似したヌクレオシド構造を有する。ペプチジルアクセプタは、天然のアクセプタに近い構造を利用することにより、ピューロマイシンと同等以上の取り込み効率を示す。
【００３８】
ペプチジルアクセプタとペプチドのC末端との間の結合の形成は、リボソームにおける通常のペプチジル転移反応と同じように、A部位に組み込まれたペプチジルアクセプタのアミノ基が、P部位のペプチジルtRNAの付着ペプチドのC末端においてエステル結合に近接することにより生じると思われる。したがって、ペプチド鎖のC末端により形成される共有結合は、mRNAディスプレイと同様に、一般にアミド結合となる。D-アミノ酸又はβ(ベータ)-アミノ酸等の非天然(非標準/非自然/非タンパク質原性)アミノ酸を有するリンカも、リンカの合成に人工RNA触媒(フレキシザイム)を用いることにより、本発明のRAPIDディスプレイで使用可能であることに留意されたい。
【００３９】
RAPIDディスプレイ法において、リンカの5’末端及びmRNA分子の3’末端は、塩基対形成に基づくハイブリダイゼーションにより複合体を形成する。このRAPIDリンカの領域は、本明細書において「一本鎖構造領域」と呼ばれる。側鎖に核酸塩基を有する一本鎖構造の特定の例には、一本鎖DNA、一本鎖RNA、一本鎖PNA(ペプチド核酸)等が含まれる。結果的に生じた複合体は、mRNAライブラリからのペプチド選択中に安定状態を保つ必要がある。リンカの一本鎖構造領域のヌクレオチド配列とmRNA分子の3’末端の配列との間の相補性が増加すると、二本鎖形成の効率が増加し、安定性も増加する。安定性は、GC含有量、反応溶液の塩濃度、及び反応温度にも依存する。特に、この領域は、望ましくは高いGC含有量を有し、具体的には80％以上、好ましくは85％以上のGC含有量を有する。
【００４０】
両端を除くリンカの残りは、公知のmRNAディスプレイ法で用いられるリンカの構造と同様に、全体として側鎖が少ない、柔軟で親水性の単純な線形構造を有するように設計される。したがって、例えば、一本鎖又は二本鎖DNA又はRNA等のオリゴヌクレオチド、ポリエチレン等のポリアルキレン、ポリエチレングリコール等のポリアルキレングリコール、ポリスチレン、多糖類を含む線状ポリマ、又はそれらの組み合わせを、適切に選択して使用することができる。リンカは、好ましくは100オングストローム以上、より好ましくは約100乃至1000オングストロームの長さを有する。
【００４１】
RAPID系の利点は、ペプチジルアクセプタ領域とライブラリmRNAとの会合を、IVTT系によりin situで生じさせることが可能であり、即ち、例えば、ピューロマイシンとリンカとの間、又はリンカとmRNAとの間での予備的なライゲーションステップの必要がないことである。
【００４２】
更に、非天然(非標準)アミノ酸を、同じ翻訳系に組み込むことができる。例えば、異常ペプチドの構成単位である非タンパク質原性アミノ酸又はヒドロキシ酸をtRNAにチャージするためのアシル化反応は、人工RNA触媒(リボザイム)、例えば、フレキシザイムにより媒介し得る。
【００４３】
lacリプレッサLacIのC末端に連結された大きなペプチドライブラリを使用した親和性選択により、受容体への結合について特定のペプチドリガンドが選択されている(Cull et al., 1992)。大腸菌で発現させた場合、リプレッサタンパク質は、プラスミド上のlacオペレータ配列に結合することにより、コードするプラスミドにリガンドを物理的に連結する。
【００４４】
新生ペプチドが、それらをコードするRNAにリボソームを介して物理的に付着した、完全in vitroのポリソームディスプレイ系も報告されている(Mattheakis et al., 1994、Hanes and Pluckthun, 1997)。RNA-ペプチド融合を行うことにより遺伝子型を表現型に連結する代替の完全in vitro系も記述されている((Roberts and Szostak, 1997、Nemoto et al., 1997)。
【００４５】
しかしながら、上記の系の範囲では、結合以外の活性、例えば触媒又は調節活性等を直接選択することはできない。これらのアプローチの大部分は、親和性に基づくアッセイとのみ互換性を有する。しかしながら、医薬品アッセイの大部分は、機能アッセイであり、何れの場合においても、機能アッセイが優れており、単に化合物が標的タンパク質に結合するからといって、それが生物学的機能を有することを意味する訳ではない。
【００４６】
1つの例外は、SICLOPPS法であり、これは、親和性に基づくアッセイと機能アッセイの両方に連係する。しかしながら、今のところ、SICLOPPSは、細胞に基づくin vivo系でのみ実証されている。
【００４７】
SICLOPPS系では、環化されるべきペプチドをコードするヌクレオチド配列の一端にスプリット(又はトランス)インテイン(C-インテイン又はIC)のカルボキシ末端部分をコードするヌクレオチド配列、他端にスプリットインテイン(N-インテイン又はIN)のアミノ末端部分をコードするヌクレオチド配列が隣接するように、核酸分子を構築し得る。構築物の発現により、融合タンパク質の生成が生じる。次に、融合タンパク質の2つのスプリットインテイン成分(即ち、IC及びIN)が会合し、介在配列(intervening sequence)のアミノ及びカルボキシ末端を共にスプライスして骨格環状ペプチドを生成する活性酵素を形成する。化学反応を図14に示す。この方法は、所定の特性を有する環状ペプチドの選択又はスクリーニングを促進するように適応させることができる。
【００４８】
したがって、本発明は、スプリットインテインの第1の部分と、スプリットインテインの第2の部分と、スプリットインテインの第1の部分とスプリットインテインの第2の部分との間に挟まれた標的ペプチドとを有するポリペプチドをコードする非天然型核酸分子を特徴とし得る。核酸分子の発現により、自発的にスプライスして、標的ペプチドの環化形態、又は活性インテイン中間体、チオエステル中間体、又はラリアット中間体等の標的ペプチドの環化形態のスプライシング中間体を生じるポリペプチドが生成される。
【００４９】
スプリットインテインの第1の部分及びスプリットインテインの第2の部分は、共にSsp DnaE等の天然型スプリットインテインに由来する。他の変形例において、スプリットインテイン部分の一方又は両方は、RecA、DnaB、Psp Pol-1、及びPfuインテインに由来するもの等、非天然型スプリットインテインに由来する場合がある。
【００５０】
Tawfik and Griffiths (1998)及び国際特許出願PCT/GB98/01889には、分子レベルで遺伝子型と表現型を関連付けるためにマイクロカプセルの区画化を用いることで、上記の制限の多くを克服するin vitro進化用のシステムが記載されている。
【００５１】
Tawfik and Griffiths (1998)と、国際特許出願PCT/GB98/01889の幾つかの実施形態とでは、ポリペプチドの所望の活性は、それをコードする(及び同じマイクロカプセルに存在する)ポリヌクレオチドの修飾をもたらす。修飾されたポリヌクレオチドは、その後のステップで選択することができる。しかしながら、これらのアプローチは、環状ポリペプチドを考慮していない。
【００５２】
したがって、任意の医薬品アッセイに適合する環状ペプチドライブラリの生成及びタグ付けの方法が必要である。本発明は、医薬品アッセイ及びペプチドライブラリ生成に適合する形式において、環状ポリペプチドを、それをコードするポリヌクレオチドと共に共区画化した状態で提供することにより、この必要性に対処する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００５３】
【特許文献１】WO2012/156744A2
【特許文献２】WO2000/036093A2
【非特許文献】
【００５４】
【非特許文献１】Townend and Tavassoli, 2016, ACS Chemical Biology, 1624-1630
【非特許文献２】Tavassoli and Benkovic, 2007, Nature Protocols, 1126-1133
【発明の概要】
【００５５】
3 発明の概要
【００５６】
本発明は、任意の医薬品アッセイ、特に機能アッセイに連係させることが可能で、各ポリペプチドを容易且つ一意に同定することができる形式で環状ポリペプチドを提供するという利点を有する。
【００５７】
第1の態様では、環状ポリペプチドとその環状ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとを共区画化された状態で生成する方法であって、
a)環状ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む区画を形成するステップと、
b)ポリヌクレオチドからポリペプチドを発現させるステップと、
c)ポリペプチドを環化させるステップと、を備える方法が開示される。
【００５８】
実施形態において、ポリペプチドの環化は、受動的プロセスである。言い換えれば、ポリペプチドは、自己環化又は自動環化し得る。受動的プロセスは、「自動触媒」プロセスにし得る。例えば、ポリペプチドは、SICLOPPSポリペプチドにしてよい。このような場合、「(c)ポリペプチドを環化する」ステップは、例えば、適切な長さの時間に亘り反応を進行させることにより、単にポリペプチドを環化させることを含む。実施形態において、環化に適した時間の長さは、数秒となり得る。他の実施形態において、環化に適した時間の長さは、数分、数時間、又は数日となり得る。環化に必要な時間は、任意のポリペプチドに対して大きく変化し得る。しかしながら、所望の度合いまで環化させるのに適した時間の長さの決定は、当業者の範囲内にある。
【００５９】
又は、ポリペプチドは、化学的又は酵素的方法等、当該技術分野において公知の他の方法により環化させてもよい。これらの「非受動的」環化法では、環化に必要な成分をポリペプチドと接触させ、適切な時間に亘って必要な条件下で反応させ、所望の度合いの環化を引き起こす。実施形態において、環化に適した時間の長さは、数秒となり得る。他の実施形態において、環化に適した時間の長さは、数分、数時間、又は数日となり得る。環化に必要な時間は、任意のポリペプチドに対して大きく変化し得る。しかしながら、所望の度合いまで環化させるのに適した時間の長さの決定は、当業者の範囲内にある。
【００６０】
環状ポリペプチドの発現は区画内で生じるため、環状ペプチドをコードするポリヌクレオチドは、同じ区画内に含まれる。このため、共区画化ポリヌクレオチドを単離及び配列決定することにより、環状ポリペプチドを一意に同定することができる。更に、区画は、発現系の全ての成分、及び/又は他の反応成分を含むマイクロリアクタを形成する。
【００６１】
ポリヌクレオチドは、そのコードされた産物と非共有結合的に関連させてもよく、例えば、ポリヌクレオチドと、コードされた産物とは、同じビーズ、区画、細胞、又はウイルス粒子内に含まれてもよい。ポリヌクレオチドと、そのコードされた産物とは、非共有結合を介して直接的又は間接的に連結されてもよい。
【００６２】
代替又は追加として、ポリヌクレオチドは、例えば、mRNAディスプレイ系のピューロマイシン部分を介して、そのコードされた産物と共有結合的に関連させてもよい。
【００６３】
第2の態様では、環状ポリペプチドをソーティングする方法であって、
a)環状ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む区画を形成するステップと、
b)ポリヌクレオチドからポリペプチドを発現させるステップと、
c)ポリペプチドを環化させるステップと、
d)環状ポリペプチドを活性についてスクリーニングするステップと、
e)所望の活性を示す環状ポリペプチドを選択するステップと、を備える方法が開示される。
【００６４】
例えば、環状ポリペプチドを用いて、蛍光を誘導又は阻害し得る。次に、これに応じて、蛍光を示す又は示さないビーズ及び/又は区画を、蛍光活性化液滴ソーティング(Fluorescence Activated Droplet Sorting(FADS))等により、選択及び/又はソーティングすることができる。所望の特性を示す環状ペプチドは、関連するポリヌクレオチドを配列決定することにより、その後、同定することができる。
【００６５】
実施形態において、方法は、更に、例えば、本発明によりポリペプチドに関連するポリヌクレオチドを配列決定することにより、選択された環状ポリペプチドを同定するステップを備える。
【００６６】
一部の実施形態において、区画は、ポリヌクレオチドを含む溶液のマイクロ流体操作により得られる油中水型(w/o)又は水中油中水型(w/o/w)の液滴にし得る。
【００６７】
他の実施形態において、区画は、アルギン酸塩区画等、高分子電解質中のポリヌクレオチドの適切な溶液のバイオエレクトロスプレ又は噴射により得られるマイクロカプセルにし得る。
【００６８】
更に他の実施形態において、区画は、脂質小胞等の小胞にし得る。
【００６９】
この方法は、更に、ポリヌクレオチドを増幅するステップを含み得る。ポリヌクレオチドのコピー数の増加は、最終的に、環状ポリペプチドのより高い発現をもたらすことができる。これにより、その後の任意のアッセイにおいて環状ポリペプチドの検出が容易になるため、感度が向上する。
【００７０】
区画は、ゲル形成剤を含んでもよく、ゲル形成剤は、ポリヌクレオチドの増幅後、ゲルビーズとして固化(又は形成)される。増幅されたポリヌクレオチドは、ゲルマトリクスに捕捉(又は固定)されるため、単一のビーズ内に同一のポリヌクレオチドコピーが保持される。これにより、区画が後で破壊された場合に、ビーズからポリヌクレオチドの増幅コピーが失われるのが防止されるため、ビーズを一意に識別する能力が維持される。ゲル形成剤は、例えば、ゲルが形成される温度まで冷却することにより、ゲルを形成するように作成することができる。
【００７１】
増幅反応中、外部の熱源を利用し得る。これは、増幅が行われている反応槽又は反応容器、例えば、ガラスシリンジに熱を加えることにより達成し得る。これにより、増幅反応を刺激し得る。代替又は追加として、ゲル形成剤を利用する実施形態では、熱を加えることにより、ゲルが液相に維持される。
【００７２】
熱は、一定の温度で均一かつ連続的に容器に加えることが好ましい。「均一に」加えるとは、容器の実質的に全ての表面が同じ度合いの加熱を受けること、即ち、容器の表面の任意の点が、容器の表面の他の任意の点と同じ量の熱エネルギを受けることを意味する。実施形態において、容器の「実質的に全て」には、容器を横方向に取り囲む又は取り巻く容器のただ1つの表面、又は容器を共に横方向に取り囲む又は取り巻く複数の表面が含まれる。例えば、容器は、円形の断面を有するシリンジで、したがってシリンジを取り囲む単一の外側湾曲面(側面)に2つの円形表面(上面及び底面)でキャップした全体に円筒状の形態を有するシリンジにし得る。この例では、曲面(側面)の任意の点が曲面(側面)の他の任意の点と同じ量の熱エネルギを受ける場合、キャップ面(上面及び底面)の何れかが受ける熱エネルギに関係なく、熱が容器の表面に均一に加えられる。
【００７３】
外部熱源は、柔軟な加熱要素又はフィラメントを備え得る。熱源には、電子的に電力供給し得る。実施形態において、熱源は、市販の電子加熱パッドである。他の実施形態において、熱源は、加熱された流体、例えば水が、加熱された流体源から連続的に供給される流体充填ジャケットにし得る。実施形態において、外部熱源は、容器と一体的に形成し得る。
【００７４】
ゲルビーズの形成後、区画は、破壊し得る。これにより、ビーズが置かれる条件を変更することができる。例えば、緩衝液を、バッファ交換手順により変更できる。新しい緩衝液は、ゲルビーズに浸透し、ビーズ内に保持されているポリヌクレオチドコピー又は他の成分と相互作用することができる。これは、遺伝子発現等の新しいプロセスの活性化につながる場合がある。
【００７５】
各ゲルビーズは、機械的に安定した単位を意味し、同一の配列を有するポリヌクレオチドのリザーバ(貯蔵器)と見なすことができる。各ビーズは、個別に操作することができる。例えば、ビーズは、乳化用のマイクロ流体デバイスに供給することができる。
【００７６】
一部の実施形態において、ゲルビーズは、環状ポリペプチドを発現するための条件下に置くことができる。例えば、ゲルビーズは、in vitro転写及び翻訳(IVTT)系に接触させることができる。
【００７７】
環状ポリペプチドを発現させるための条件への接触後及び/又は接触中に、ゲルビーズの周囲に区画を形成し得る。言い換えると、ビーズは、再区画化され、これは、区画化されていないビーズの周囲に新しい区画が形成されることを意味する。この第2の区画化ステップは、上述した第1の区画化と同じ手順に従ってよい。又は、第2の区画化ステップは、異なる手順に従ってもよい。例えば、第1の区画化は、ゲルビーズを含むエマルションの液滴を形成するマイクロフルイディクスによるものとし、第2の区画化は、ゲルビーズを含む区画を形成する高分子電解質の噴射手順によるものにすることができる。他の例では、第1及び第2の区画化手順の両方が、ビーズを含むエマルションの液滴を形成するマイクロフルイディクスによるものとなる。
【００７８】
翻訳後、ビーズをアッセイすることができる。例えば、環状ペプチドは、比色アッセイ又は蛍光アッセイ等の光学アッセイにより、標的酵素を阻害する可能性について評価することができる。酵素が着色又は蛍光産物を生成する反応を触媒する場合、阻害性ポリペプチドを含むビーズは、非阻害剤を含む他のビーズと比較して、色又は蛍光の強度が低減される。ビーズは、例えば、蛍光活性化細胞ソーティング(FACS)又は蛍光活性化液滴ソーティング(FADS)により、高スループットでソーティングすることができる。実施形態において、ビーズは、エマルションの液滴内にある。FACS/FADSに適合させるため、エマルションの連続相は、水性にするべきである。
【００７９】
ポリヌクレオチドは、N末端インテイン断片をコードする配列、それに続く環状ポリペプチドをコードする配列、それに続くC末端インテイン断片をコードする配列を含み得る。ポリペプチドとして発現される場合、N末端インテイン断片は、C末端インテイン断片と結合する。これにより、所望の環状ポリペプチドを含む介在ポリペプチド(intervening polypeptide)は、ポリペプチドループを形成する。次に、インテインループ構造は、自発的にスプライシング反応を起こし、これにより遊離インテインと所望の環状ポリペプチドとが生成される。所望のポリヌクレオチドは、従来の分子クローニング手法により得ることができる。
【００８０】
任意の態様又は実施形態において、区画は、水中油中水型(w/o/w)のエマルション、小胞、又は区画にし得る。
【００８１】
第3の態様では、
a)N末端インテイン断片をコードするポリヌクレオチド、それに続く環状ペプチドをコードする配列、それに続くC末端インテイン断片をコードする配列と、
b)環状ポリペプチドと、を備える区画が開示される。
【００８２】
ポリヌクレオチドの発現により、N末端インテイン断片、介在環状ポリペプチド配列(intervening cyclic polypeptide sequence)、及びC末端インテイン断片を含む直鎖ポリペプチドが生成される。直鎖ペプチドでは、インテイン断片と環状ポリペプチド配列との間の接合部で自発的スプライシング反応が生じ、これにより、環状ポリペプチドと遊離インテイン部分が生成され得る。これは、環状ポリペプチドと、それをコードするポリヌクレオチドとの両方を含むように区画を作成可能な一方法である。このような区画化環状ポリペプチドは、アッセイすることができる。特に、区画化環状ポリペプチドは、機能アッセイを含む医薬品アッセイに適合する。これにより、例えば創薬において、有望な環状ポリペプチド候補化合物の高スループットなスクリーニング及び選択が可能になる。これは、本発明によるライブラリを使用する場合に特に当てはまる。
【００８３】
したがって、本発明は、スプリットインテインの第1の部分、スプリットインテインの第2の部分、及びスプリットインテインの第1の部分とスプリットインテインの第2の部分との間に挟まれた標的ペプチドを有するポリペプチドをコードする非天然型核酸分子を特徴とし得る。核酸分子の発現により、自発的にスプライスして、標的ペプチドの環化形態、又は活性インテイン中間体、チオエステル中間体、又はラリアット中間体等の標的ペプチドの環化形態のスプライシング中間体を生じるポリペプチドが生成される。
【００８４】
本発明は、非天然アミノ酸をロードした特定のtRNAを含むカスタムIVTT混合物と組み合わせて、再割り当てコドンセットを用いることにより、1つ以上の非天然アミノ酸を含む環状ポリペプチドをコードするために使用してよく、非天然アミノ酸をチャージしたtRNAは、以前に報告された方法を用いて容易に生成し得る。例えば、異常ペプチドの構成単位である非タンパク質原性アミノ酸又はヒドロキシ酸をtRNAにチャージするためのアシル化反応は、人工RNA触媒(リボザイム)、例えば、フレキシザイムにより媒介し得る。
【００８５】
スプリットインテインの第1の部分及びスプリットインテインの第2の部分は、共にNpu又はSsp DnaE等の天然型スプリットインテインに由来する。他の変形例において、スプリットインテイン部分の一方又は両方は、RecA、DnaB、Psp Pol-1、及びPfuインテインに由来するもの等、天然、人工、又は非天然型のスプリットインテインに由来する場合がある。
【００８６】
第4の態様では、環状ポリペプチドが、それをコードするポリヌクレオチドと共に共区画化されたライブラリが提供される。ライブラリは、このような区画を複数含み、少なくとも1つの区画のポリヌクレオチドは、少なくとも1つの他の区画(即ち、異なる区画)のポリヌクレオチドの配列と異なる(即ち、同一ではない)配列を含む。ライブラリは、例えば、蛍光又は比色アッセイを行い、これらの区画が、例えばFADSにより選択された所望のシグナルを示すことによりスクリーニングし得る。
【００８７】
他の態様では、
a)マイクロ流体デバイスと、
b)N末端インテイン断片をコードするポリヌクレオチドと、
c)C末端インテイン断片をコードするポリヌクレオチドと、を備えるキットが提供される。
【００８８】
実施形態において、キットは、カプセル形成材料を備える。カプセル形成材料は、油、脂質、又は高分子電解質にし得る。
【００８９】
一部の実施形態において、キットは、更に、ゲル形成剤を備える。
【００９０】
インテイン断片をコードするポリヌクレオチドを用いて、一端にN末端インテイン断片、他端にC末端インテイン断片が隣接する環状ポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチドを生成することができる。これは、従来の分子クローニング手法、例えば、インテインをコードする配列を、環状ポリペプチドをコードするヌクレオチドにライゲーションすることにより達成することができる。
【００９１】
4 図の簡単な説明
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】フェムトリットルサイズの液滴の生成と操作に使用されるマイクロ流体デバイス。(左)フェムト液滴を制御された状態で生成するためのスライドガラスに結合されたPDMSデバイス。(右)デバイス操作の写真-マイクロ流体チップのノズル(幅10μm×深さ5μm)で液滴形成が生じ、新たに生成された液滴が流路(幅100μm×深さ25μm)を移動する。4つの入口が、デバイスへの流体の注入及びこれによる導入用に設けられ、2つの外側ポートは、油用に使用され、中央の2ポートは水溶液用に使用される。スケールバー=50μm。
【図２】シングル油中水型エマルション液滴の寸法の分析。生成された液滴の直径を微細に制御する能力は、油/界面活性剤流量を10乃至60μL/h(それぞれA乃至F)に増やしつつ、10μL/hの一定の水溶液流量を維持することで決定した。各直径分布ヒストグラムの上の明視野写真は、各条件下での収集中に結果的に生じた液滴生成ストリームを表す。各実験について、3つの独立した画像を分析し、結果的に生じた液滴径をプロットして、直径ヒストグラムを得た。何れの場合も、y軸(液滴数)を正規化し、結果を小数として示した。ガウス正規分布は、何れの場合も、制約振幅1に合わせた。各写真の変動係数(C.V.)は、各セットの横に提示している。ビンサイズ=0.5μm。
【図３】シングルエマルション液滴の直径、体積、生産速度の分析。(左)シングルエマルション液滴生成の液滴径及び油流量。(右)10乃至60μl/hの油流量に対してプロットされたkHz単位の液滴生成速度及び平均体積。液滴体積の増加は、結果的な生産速度の減少に対応する。3つの別々の試料の3つの独立した写真を分析した平均(標準偏差)としてプロットされた値。
【図４】ダブルエマルション液滴を生成するための2チップに基づくマイクロ流体セットアップ。再乳化のためのシングルエマルション液滴は、直立位置のガラスシリンジ内に入っている。沈降後、エマルションは、より大きな流路寸法を有する第2のマイクロ流体デバイス(拡大クロップ)を通して駆動され、ダブルエマルション液滴形成が可能となる。
【図５】マイクロ流体デバイス接合部でのダブルエマルション生成を示す図。液滴は左から右に移動する。(A)チップにおけるシングル及びダブルエマルションの形成を示す図。(B)デバイスのオリフィスでのダブルエマルション液滴形成の明視野像。
【図６】制御可能且つ柔軟に行える高単分散性ダブルエマルション(w/o/w)液滴の生成。FC-40オイルシェル内の100μMフルオレセイン内部コア及び1％tris/tween80外相を含む水中油中水型(w/o/w)ダブルエマルション液滴。液滴は次の流量を用いて生成された:エマルション:4μl/h、FC-40スペーサオイル:15μl/h、及び1％tris/tween:60μl/h。倍率10倍の写真の顕著な球状構造は、鉱油の液滴を表す。矢印は、二重に充填されたダブルエマルション液滴を強調している。(左上)個別のダブルエマルション液滴の拡大画像を示す挿入画像であり、内部の水性コアの直径と全体的なダブルエマルションの直径とを示す(ID及びOD)。
【図７】ダブルエマルション液滴を含むFITCのフローサイトメトリ分析。(A)ダブルエマルション試料の側方散乱対前方散乱のログプロット、(B)緑色蛍光強度対前方散乱のログプロットであり、前方散乱(上)及び緑色蛍光強度(右)のヒストグラムも提示する。(C)プライマリエマルション不在下で、前の試料と同一の流量及び条件を用いて調整し、バックグラウンド蛍光のレベルを決定した水中油型シングルエマルション試料。(D)水中油型シングルエマルション液滴の蛍光対前方散乱。シングルエマルションの生成にはJUSデバイスを用い、ダブルエマルションの形成は、15×16μm(h×w)デバイスにより行った。水中油の生成に用いた流量及びデバイス設計は、FITCに基づくw/o/wエマルションの場合と同一にして、比較を可能にした。(A)及び(C)の挿入図は、所望の液滴集団のゲート領域を拡大したものを示す。
【図８】DNA充填アガロースビーズ及び3チップマイクロ流体系を使用した、トリプルエマルションIVTT含有液滴の形成を示す図。(A)フッ素化油、アガロース/DNA懸濁液、及びPhi29 DNAポリメラーゼを疎水性マイクロ流体フローフォーカシングデバイスに注入し、フローフォーカシング接合部からの単分散アガロース液滴の安定した流れが形成された際に収集する。(B)固化したアガロースビーズは、IVTT混合物と共に第2の疎水性マイクロ流体デバイスに再注入する。(C)IVTT/DNA含有液滴は、最終の3回目に再乳化され、フローサイトメトリ分析を可能にする水性外相が生じる。
【図９】単分散アガロースビーズを生成するためのマイクロ流体セットアップ。マイクロ流体デバイスを光学倒立顕微鏡に取り付けた。シリンジポンプは、レーザカットPMMAスタンドの上部で、デバイスのレベルまで持ち上げた。チューブを用いて、ガラスシリンジと微細加工マイクロ流体システムとを接続した。マイクロ波加熱した市販のヒートパッドをアガロースシリンジの上に置いて、デバイス操作中のアガロースの固化を防止した。その後、USB接続した電気加熱パッドを用いて、略40℃の一定温度を維持した。
【図１０】Phi29 DNA増幅プラスミドDNAを含むアガロースビーズの分析。(A)チップ上でのアガロース液滴形成のプロセス、挿入図は、増幅されたDNAを含む固化アガロースビーズの図を示す。(B)エマルションから分離後の4つの個別のアガロースビーズ写真の直径サイズ分布。(C)1×TAEバッファ中の未洗浄アガロースビーズの明視野像、蛍光二本鎖DNA結合色素と共にインキュベートしたアガロースビーズの蛍光画像。
【図１１】Phi29 DNAポリメラーゼ増幅プラスミドDNAを含む単分散1％アガロースビーズのフローサイトメトリ分析。分析と可視化を可能にするため、30℃でのインキュベーション後、単離されたアガロースビーズを蛍光ds-DNA結合により染色する。各条件では、開始DNA溶液を統計的に希釈して、ポアソン統計により液滴当たり平均(A)100、(B)10、(C)1、又は(D)0.1DNAコピー(λ値)を確保している。
【図１２】多分散バルクエマルションにおけるPhi29前増幅SICLOPPSライブラリプラスミドDNAを含むアガロースビーズからのin vitroタンパク質発現。DNA増幅後、アガロースビーズを単離し、6,500rpmでの3回の遠心分離により洗浄する。洗浄後、PURExpress IVTT成分及びQX200油/界面活性剤を含む溶液にビーズを再懸濁し、最後に10乃至15秒間ボルテックスして、多分散バルクエマルションを生成する。マイクロ流体デバイスによる単分散とは対照的に、多分散液滴の生成により、所望の生化学反応に適した条件を迅速に決定することができる。したがって、前増幅の存在下で、SICLOPPSプラスミド(SICLOPPSインテイン及びGFPをコードする)からのGFP媒介蛍光が明確に視認される。対照的に、DNA増幅の不在下では、GFP蛍光は観察されないため、液滴におけるIVTTの単一コピーからの増幅の重要性が明らかとなる。エマルション試料は、画像化前に、37℃で2時間インキュベートした。
【図１３】アガロースビーズ内のPhi29 DNAポリメラーゼ前増幅SICLOPPSライブラリプラスミドDNAからのGFPのIVTT。(A)平均100個の開始DNAコピー及びPhi29 DNA増幅成分と共にSICLOPPSプラスミドDNAを含むマイクロ流体的に生成したアガロースビーズを、30℃で16時間インキュベートし、フローサイトメトリを用いて分析した。DNAインターカレーティング色素により染色すると、対応する陰性対照と比較して、緑色蛍光強度シグナルの明確な増加が観察され、増幅の成功を示す。(B)IVTTの前に、固化したDNA封入アガロースビーズを6,500rpmの遠心分離により洗浄して増幅バッファを除去し、PURExpress IVTT成分と共に15×16μmの疎水性デバイスに注入した。37℃で2時間のインキュベーション後、親水性デバイスのフローサイトメトリ分析を用いてIVTT液滴を再乳化し、トリプルエマルション形式とした。前方対側方散布図では、2つの明確な液滴集団が観察され、高い方が水中油中IVTT中アガロース型液滴(agarose-in-IVTT-in-oil-in-aqueous droplets)に対応する。増幅DNA及びIVTTが不在の対照と比較して、明らかに異なるGFP媒介緑色蛍光が、IVTT混合物のバックグラウンド蛍光の約10倍の大きさで観察される。
【図１４】SICLOPPSポリペプチドのスプリットインテインにより触媒される自発的なポリペプチド環化。(A)アミノ及びカルボキシ末端インテイン断片からの活性インテインの形成は、(B)N-インテインと環化対象のペプチドとの間の接合部においてアミノ酸のエステル異性体を安定化する。(C)C-インテインからのヘテロ原子は、エステルを攻撃し、環状エステル中間体を生成する状態にある。(D)インテイン触媒アミノスクシンイミドの形成により、環状ペプチド(ラクトン型、図示せず)が遊離され、自然に再配列して熱力学的に好ましい骨格(ラクタム型)環状ペプチド生成物を形成する。(E)図示したシステインの1つ以上は、トレオニンに置換してもよく、即ち、チオール基をアルコール(OH)基に置換してもよい。エステル中間体の形成、求核攻撃、又は骨格の転位を妨げない限り、他のヘテロ原子により、図示したシステイン残基の硫黄原子を置換してもよい。
【図１５】環状ペプチドライブラリ生成用のpETDuet-1に基づくSICLOPPSベクタの構築を示す図。pDuetNpu-GFP発現ベクタの図、MCS1は、Npuインテインを有するSICLOPPSをエンコードし、MCS2は、GFPをエンコードする。「ライブラリ」は、ライブラリの可変ポリヌクレオチド配列の位置を示す。この配列は、第1の位置に求核性アミノ酸(例えば、システイン、セリン、又はトレオニン)を含む、本発明の環状ポリペプチドをコードする。2つのインテイン断片の間に位置するため、翻訳後にSICLOPPSポリペプチドからスプライシングされるエクステインをコードすることから、「エクステイン」配列とも呼ばれる場合もある。
【図１６】インビトロで環化されたポリペプチドCLLFVYをコードするpDuetNpu。バルク形式のIVTT後及びFACSソーティング後のベクタCSpDuetNpuHisCLLFVYの質量分析。(左)ベクタCSpDuetNpuHisCLLFVYの存在下で構築した標準PURExpress IVTT反応。(右)アガロースビーズにおけるベクタCSpDuetNpuHisCLLFVYの前増幅。モノクローナル増幅DNAを含む洗浄アガロースビーズを、IVTTと共に再カプセル化し、第3の乳化ステップの前にCLLFVYを発現させ、ダブルエマルションFACS適合液滴を生成した。FACSでソーティングした試料は、エマルションから分離し、質量分光分析を行った。何れの場合も、シクロCLLFVYを示すピークが明白となる。
【図１７】シクロTAFDR(Matisら)とのAB42-GFP融合のマイクロ流体液滴でのin vitro発現。ベクタCSpDuetNpuHisAB42-GFPを利用して、TAFDRをMCS1へクローニングした。その後、プラスミドDNAを等温DNA増幅反応成分と共にアガロース液滴にカプセル化し、一晩インキュベートした。前述したようにアガロースビーズを調製し、IVTTと共に再カプセル化した。最終乳化ステップを実行して、FACS適合ダブルエマルションを生成した。CA5が存在する状態の陰性対照ベクタを同様に構築し、シクロTAFDR AB42-GFPの凝集阻害を検証した。バッファのみ、IVTTのみ、及びシクロCA5データと比較して、シクロTAFDR発現時に緑色蛍光の正のシフトが観察された。
【図１８】ダブルエマルション液滴中のTX4 SICLOPPSライブラリのin vitro区画化及びFACSスクリーニング。MCS1にNpuHis TX4、MCS2にAB42-GFP融合を含むpETDuet-1ベクタのプラスミド構築。IVTTの前にモノクローナルDNA増幅を可能にするため、プラスミドDNAをTempliPhi等温DNA増幅成分と共にアガロースフェムト液滴にカプセル化した。エマルションからビーズを分離し、水相を抽出及び洗浄して、増幅バッファを除去した。次に、PURExpress IVTT系と共にビーズを高単分散性液滴にカプセル化した後、37℃で2時間インキュベートした。タンパク質の発現後、試料をダブルエマルション形式(水中油中IVTT中アガロースビーズ)に転換し、FACSスクリーニングを可能にした。ダブルエマルション集団を特定し、ゲートすることでライブラリのソーティングを可能にした(B)。IVTTバックグラウンドを超える蛍光測定値のみを、ダブルエマルション集団からゲートし、FL1-Hでソーティングした(GFP、A)。パーセンテージ+ve(潜在的陽性候補ペプチド)及び-veゲート粒子を、TX4ライブラリ試料のみについて示す(オレンジ色の線)。
【発明を実施するための形態】
【００９３】
好適な実施形態の詳細な説明
【００９４】
別の定義がされない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、ペプチド化学、マイクロフルイディクス、核酸化学、分子遺伝学及びクローニング、並びに生化学の分野等、当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。分子生物学、遺伝学、及び生化学的方法には、標準的な手法が用いられ(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY、Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4th ed., John Wiley & Sons, Inc.参照)、これらは出典を明記することにより本願明細書の一部とする。
【００９５】
「直鎖ポリペプチド」は、環状ではないペプチドであり、一般に、遊離カルボキシ末端を有するカルボキシ末端アミノ酸及び遊離アミノ末端を有するアミノ末端アミノ酸の両方を有する。
【００９６】
本明細書で使用される「インテイン」という用語は、タンパク質の翻訳後処理中にスプライシング反応を触媒することが可能な前駆体タンパク質内に埋め込まれた天然に存在する、又は人工的に構築された、ポリペプチド配列を意味する。公知のインテインの一部のリストは、http://www.inteins.comで公開されている。
【００９７】
「スプリットインテイン」は、互いに融合されていない2つ以上の別個の成分を有するインテインである。
【００９８】
本明細書で使用される「挟まれる(interposed)」又は「介在する(intervening)」という用語は、間に置かれることを意味する。したがって、第2及び第3の配列の間に挿入された第1配列(又は介在する第1の配列を有する第2及び第3の配列)を有するポリペプチドにおいて、第1の配列を構成するアミノ酸の鎖は、第2の配列を構成するアミノ酸の鎖と3番目第3の配列を構成するアミノ酸の鎖との間に物理的に位置する。
【００９９】
一方、「環状ポリペプチド」は「環状化」されたポリペプチドである。「環状」という用語は、環を形成する構成原子を有することを意味する。ペプチドについて、「環化」という用語は、ペプチドを環状又は「環化」形態にすることを意味する。したがって、例えば、その遊離アミノ末端が遊離カルボキシ末端に(即ち、ヘッドトゥーテール形式で)共有結合し、遊離カルボキシ末端とアミノ末端とがペプチドに残らない状態となる場合に、直鎖カルボキシペプチドは「環状化」される。
【０１００】
本明細書で使用される「自発的に」という用語は、説明される作用が外因性物質の添加無しに生じることを意味する。例えば、前駆体ポリペプチド又は前駆体ポリペプチドをコードする核酸分子以外に宿主系に何も添加しない場合に、前駆体ポリペプチドは、自発的にスプライスして環状ペプチドを生じる。一方、宿主系の外部の作用剤が環状ペプチドを生成するために必要な場合、宿主系内の前駆体ポリペプチドは、宿主系内で自発的にスプライスしない。
【０１０１】
本明細書で使用される「発現ベクタ」という語句は、適切なin vitro又はin vivo系での核酸分子の転写及び/又は翻訳を促進する媒体を意味する。発現ベクタを含む宿主系に外因性物質を添加することによりベクタが発現する場合(例えば、ベクタ内の核酸分子がmRNAに転写される)場合、発現ベクタは、「誘導性」である。
【０１０２】
本明細書で使用される「調節配列」という語句は、核酸分子の発現(例えば、転写)を調整するヌクレオチド配列を意味する。例えば、プロモータとエンハンサは調節配列である。
【０１０３】
本発明は、コードするポリペプチドとの共区画化により識別可能にタグ付け(又は標識)されたポリペプチド、特に環状ポリペプチドの生成に関連して、更に詳細に説明可能な新たな特徴及び付随する利点をもたらす。特に、本発明は、公知の遺伝子ライブラリでは達成不可能な遺伝子ライブラリの機能アッセイを実施するための新たな手段を提供する。ファージディスプレイライブラリ等の従来技術のライブラリは、親和性に基づくアッセイに適合するが、機能アッセイと効果的に連係しない。医薬品アッセイの大部分は、機能アッセイであり、これは、機能アッセイが生物学的(又は生理学的)活性を親和性アッセイよりも正確に示すことが理由の1つとなっている。したがって、遺伝子ライブラリの多様性及び高スループットと、機能アッセイと連係させる柔軟性とを組み合わせた技術に対する必要性は満たされていない。
【０１０４】
4.1 区画
【０１０５】
第1の態様において、本発明は、区画内で環状ポリペプチドを発現させる方法に関し、方法は、環状ポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチドを含んだ区画を形成するステップを備える。
【０１０６】
区画は、外部環境から分離された内部容積を画成する物理的境界からなる。実施形態において、区画は、実質的に球形である。区画は、溶液中の粒子、例えば、コロイド等の溶液中に懸濁した粒子、又はエマルション中の液滴にし得る。
【０１０７】
区画の内部容積は、少なくとも1つのポリヌクレオチド分子と1つの環状ポリペプチドを含むのに十分である必要がある。
【０１０８】
ポリヌクレオチド及びポリペプチドが区画間で拡散し得ない状態を確保するために、各区画の内容物は、周囲の区画の内容物から隔離され、実験の時間スケール全体に亘り区画間でポリヌクレオチド及びポリペプチドの行き来が全く又は殆ど無いようにすることが好ましい。
【０１０９】
区画の物理的境界は、封入されたポリヌクレオチド及び任意の関連するポリペプチドの区画からの退出を防止可能な任意の材料から形成し得る。区画は、半透性にすることにより、ポリヌクレオチド等の1成分の移動に対する障壁を形成する一方、バッファ構成要素又はヌクレオチドリン酸(例えばヌクレオチド三リン酸)等の他の成分の移動を可能にし得る。したがって、半透性区画の内部は、熱力学的に開放系であり、物質とエネルギとの両方が、選択的な形ではあるが、境界を越えることができる。又は、区画は、不透性として、水溶液、水、油等の媒体を含む全ての成分、種、及び部分の移動に対する障壁を形成しつつ、外部環境とのエネルギ交換は依然として可能な状態にし得る。
【０１１０】
区画化とは、区画が形成されるプロセスである。ある存在物(entity)が区画化されていると記載される場合、これは、その存在物が区画内に含まれていることを意味する。
【０１１１】
本明細書で使用される「区画化」という用語は、「カプセル化」と同義である。したがって、「区画」という用語は、「カプセル」と同義である。
【０１１２】
本発明の区画は、本発明の実施を可能にする適切な物理的特性を必要とする。区画の形成及び組成は、ポリヌクレオチドの発現又はポリペプチドの活性のための機構の機能を消失させないという利点を有する。当業者に明らかであるように、適切な(複数の)系は、本発明の各用途における要件の正確な性質に応じて変化し得る。
【０１１３】
適切な区画及び区画形成材料には、エマルションの液滴、脂質小胞、及びマイクロカプセルが含まれる。
【０１１４】
4.1.1 区画サイズ
【０１１５】
好ましい区画サイズは、本発明により実施されるべき個々の選択プロセスの正確な要件に応じて変化し得る。全ての場合において、ポリペプチドの効率的な発現及び反応性を達成するために、個々の区画における遺伝子ライブラリのサイズ、必要な濃縮、及び必要な成分濃度の間には最適なバランスがある。
【０１１６】
発現のプロセスは、本発明により提供される個別の区画それぞれの内部で生じる。ナノモル以下のDNA濃度では、in vitro転写及び共役転写-翻訳の両方の効率が低下する。限られた数のDNA分子のみが各区画に存在すべきであるという要件があるため、これにより可能な区画サイズの実用上の上限が設定される。好ましくは、区画の平均容積は、5.2×10-16m3未満である(直径10μm未満、より好ましくは6.5×10-17m3(直径5μm)未満、より好ましくは約4.2×10-18m3(直径2μm)、理想的には約9×10-18m3(直径2.6μm)の球状区画に対応する)。
【０１１７】
区画内の有効DNA又はRNA濃度は、当業者に周知の様々な方法により人為的に増加させることができる。これには、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)等の体積排除化学物質の添加及び様々な遺伝子増幅手法が含まれ、大腸菌等のバクテリア(Roberts, 1969、Blattner and Dahlberg, 1972、Roberts et al., 1975、Rosenberg et al. , 1975)、真核生物(Weil et al. , 1979、Manley et al., 1983)、及び T7、T3、SP6等のバクテリオファージ (Melton et al., 1984)由来のものを含めたRNAポリメラーゼを用いた転写、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)(Saiki et al., 1988)、Qbレプリカーゼ増幅(Miele et al., 1983、Cahill et al., 1991、Chetverin and Spirin, 1995、Katanaev et al., 1995)、リガーゼ連鎖反応(LCR)(Landegren et al., 1988; Barany, 1991)、並びに自家持続配列複製法系(Fahy et al., 1991)及び鎖置換増幅(Walker et al., 1992)が含まれる。エマルションとin vitro転写又は共役転写-翻訳系とが熱安定性である場合(例えば、Thermus aquaticus等の耐熱性生物から共役転写-翻訳系を作成できる場合)、PCR及びLCR等の熱サイクルを必要とする遺伝子増幅手法を使用し得る。
【０１１８】
有効局所核酸濃度を増加させると、より大きな区画を効果的に使用できる。これにより、好適な実用上の上限を約5.2×10-16m3(直径10μmの球体に相当)の区画容積にすることができる。
【０１１９】
区画のサイズは、区画内で発生する必要のある生化学反応に要する全ての成分を収容するのに十分な大きさであることが好ましい。例えば、in vitroでは、転写反応及び共役転写-翻訳反応の両方で、約2mMの総ヌクレオシド三リン酸濃度が必要となる。
【０１２０】
例えば、遺伝子を長さ500塩基の単一の短いRNA分子に転写するには、区画当たり最小500分子のヌクレオシド三リン酸(8.33×10-22モル)が必要となる。2mMの溶液を構成するために、この分子数は、4.17×10-19リットルの容積(4.17×10-22m3、球体の場合、直径93nm)の区画内に含まれる。
【０１２１】
更に、特に翻訳を伴う反応の場合、翻訳が生じるのに必要なリボソームは、それ自体の直径が略20nmであることに留意されたい。そのため、区画の好適な下限は、直径略0.1μm(100nm)である。
【０１２２】
したがって、区画容積は、好ましくは直径0.1μm乃至10μmの球に対応する5.2×10-22m3乃至5.2×10-16m3、より好ましくは約5.2×10-19m3乃至6.5×10-17m3(1μm及び5μm)程度である。約2.6μmの球径が最も有利となる。
【０１２３】
区画の好適な寸法(平均直径2.6μmの液滴)がバクテリアの寸法と非常に類似するのは偶然ではなく、例えば、大腸菌は、1.1乃至1.5×2.0乃至6.0μmの桿体であり、アゾトバクタは、直径1.5乃至2.0μmの卵形細胞である。最も単純な形式において、ダーウィン的進化は「1遺伝子型1表現型」のメカニズムに基づいている。単一の区画化遺伝子又はゲノムの濃度は、直径2μmの区画での0.4nMから、直径5μmの区画での25pMまで低下する。原核生物の転写/翻訳機構は、単一遺伝子が略ナノモル濃度となる直径約1乃至2μmの区画で動作するように進化している。直径2.6μmの区画内において、単一遺伝子の濃度は、0.2nMである。この遺伝子濃度は、効率的な翻訳にとって十分に高い。このような容積での区画化により、ポリペプチドの単一分子のみが形成される場合でも、約0.2nMで存在する状態が確保される。したがって、区画の容積は、ポリヌクレオチドの転写及び翻訳の要件を念頭に置いて選択される。
【０１２４】
エマルション区画のサイズは、選択系の要件に応じて、エマルションを形成するために用いるエマルション条件を調整するだけで変更し得る。最終的な制限要因は、区画のサイズであり、したがって単位体積当たりで可能な区画数であるため、区画サイズが大きくなると、所定のポリヌクレオチドライブラリを区画化するのに必要な体積が大きくなる。
【０１２５】
区画のサイズは、転写/翻訳系の要件だけでなく、ポリヌクレオチドに対して利用する選択系の要件も考慮して選択される。即ち、化学修飾系等の選択系の成分は、転写/翻訳に最適ではない反応体積及び/又は試薬濃度を必要とする場合がある。このような要件は、2次再カプセル化ステップにより対応し得る。最適な区画容積及び試薬濃度を経験的に決定することが好ましい。
【０１２６】
区画は、マイクロ流体スケールで得られることが好ましい。例えば、区画の最大直径(例えば、図6左上挿入図の「外径(Od)」)は、100μm以下にし得る。実施形態において、区画の最大直径は、直径0.1μm乃至100μm、好ましくは0.5μm乃至10μm、例えば0.5μm乃至5μm、又は1.0μm乃至4μmにし得る。実施形態において、区画の最大直径は、0.8μmにし得る。複数の区画が関与する場合、これらの測定値を、区画の最大直径の平均に適用する。これは、区画を含む試料の顕微鏡写真を取得し、顕微鏡写真の各区画の最大直径に適切な倍率を乗じたものを測定し、得られた測定値の平均を決定することにより決定することができる。
【０１２７】
様々な区画化手順が利用可能であり(Benita, 1996参照)、本発明により使用される区画を作成するために用いることができる。実際、200以上の区画化方法が文献で確認されている(Finch, 1993)。
【０１２８】
これには、脂質小胞(リポソーム)(New, 1990)及び非イオン性界面活性剤小胞(van Hal et al., 1996)等の膜で覆われた水性小胞が含まれる。これらは、非共有結合的に会合した分子の単一又は複数の二重層の閉じた膜性のカプセルであり、各二重層は水性区画により隣接層から分離されている。リポソームの場合、膜は、脂質分子により構成され、これらは通常リン脂質であるが、コレステロール等のステロールが膜に組み込まれる場合もある(New, 1990)。RNA及びDNA重合を含む様々な酵素触媒生化学反応を、リポソーム内で実行することができる(Chakrabarti et al., 1994、Oberholzer et al., 1995a、Oberholzer et al., 1995b、Walde et al., 1994、Wick & Luisi, 1996)。
【０１２９】
膜で覆われた小胞系では、水相の多くが小胞の外側にあるため、区画化されていない。反応が区画に限定されるように、この連続した水相は、除去するか、その内部の生物系を(例えば、DNase又はRNaseによる核酸の消化により)阻害又は破壊する(Luisi et al., 1987)。
【０１３０】
酵素触媒生化学反応は、他の様々な方法で生成された区画でも実証されている。多くの酵素は、AOT-イソオクタン-水系(Menger & Yamada, 1979)等の逆ミセル溶液中で活性を有する(Bru & Walde, 1991、Bru & Walde, 1993、Creagh et al., 1993、Haber et al., 1993、Kumar et al., 1989、Luisi & B., 1987、Mao & Walde, 1991、Mao et al., 1992、Perez et al., 1992、Walde et al., 1994、Walde et al., 1993、Walde et al., 1988)。
【０１３１】
区画は、界面重合及び界面複合体形成により生成することもできる(Whateley, 1996)。この種の区画は、剛性の不透性膜、又は半透性膜を有することができる。ニトロセルロース膜、ポリアミド膜、脂質ポリアミド膜に囲まれた半透性区画は、全て多酵素系を含む生化学反応をサポートすることができる(Chang, 1987、Chang, 1992、Lim, 1984)。アルギン酸塩/ポリリジン区画(Lim & Sun, 1980)は、非常に穏やかな条件下で形成可能であり、非常に生体適合性が高いことも証明されており、例えば、生細胞及び生組織をカプセル化する効果的な方法を提供する(Chang, 1992; Sun et al., 1992)。
【０１３２】
4.1.2 エマルション
【０１３３】
エマルション等のコロイド系における水性環境の相分配に基づく非膜性区画化系も使用し得る。
【０１３４】
好ましくは、本発明の区画は、エマルション、即ち一方の相が他方の相において分散した2つの不混和性液相の不均一系から形成され、顕微鏡的サイズ又はコロイドサイズの液滴となる(Becher, 1957、Sherman, 1968、Lissant, 1974、Lissant, 1984)。
【０１３５】
エマルションは、不混和性液体の任意の適切な組み合わせにより生成し得る。好ましくは、本発明のエマルションは、微細に分割された液滴の形態で存在する相(分散相、内部相、又は不連続相)としての(生化学成分を含む)水と、これらの液滴が懸濁するマトリクス(非分散相、連続相、又は外相)としての疎水性の不混和性液体(油)を有する。このようなエマルションは、「油中水型」(W/O)と呼ばれる。これには、生化学成分を含む水相全体が個別の液滴(内相)に区画化されるという利点がある。外相は、疎水性の油であり、一般に生化学成分を含まないため、不活性である。
【０１３６】
エマルションは、1つ以上の界面活性剤(surface-active agents / surfactants)の添加により安定化し得る。これらの界面活性剤は、乳化剤と呼ばれ、水/油界面で作用し、相の分離を防止する(又は少なくとも遅延させる)。油中水型エマルションの生成には、多くの油と多くの乳化剤とを使用することが可能であり、最近の編纂物では、16,000を超える界面活性剤が列挙されており、その多くは乳化剤として使用されている(Ash and Ash, 1993)。適切な油には、軽白色鉱油及び非イオン性界面活性剤(Schick, 1966)、例えばソルビタンモノオレアート(SpanTM80、ICI)及びポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート(TweenTM80、ICI)が含まれる。
【０１３７】
陰イオン性界面活性剤の使用も有益となり得る。適切な界面活性剤には、コール酸ナトリウム及びタウロコール酸ナトリウムが含まれる。デオキシコール酸ナトリウムが特に好ましく、0.5％w/v以下の濃度が好ましい。このような界面活性剤を含めることで、場合により、ポリヌクレオチドの発現及び/又はポリペプチドの活性を増加させることができる。一部の陰イオン界面活性剤を非乳化反応混合物へ添加すると、翻訳が完全に消失する。しかしながら、乳化中、界面活性剤は、水相から界面に移送され、活性が回復する。乳化対象の混合物に陰イオン性界面活性剤を添加することで、区画化後にのみ反応が進行する状態が確保される。
【０１３８】
エマルションの作成には、一般に、力学的エネルギを付与して相を強制的に一つにする必要がある。これを行う方法には様々なものがあり、攪拌機(磁気攪拌棒、プロペラ及びタービン攪拌機、パドル装置、泡立て器等)、ホモジナイザ(ロータ-ステータホモジナイザ、高圧バルブホモジナイザ、ジェットホモジナイザー等)、コロイドミル、超音波及び「膜乳化」装置を含む様々な機械装置が利用される(Becher, 1957、Dickinson, 1994)。好適な実施形態において、エマルションは、マイクロ流体プロセスにより作成される。最も好ましくは、マイクロ流体エマルションは、液滴ごとに取得され、一度に1つの液滴が生成される。
【０１３９】
油中水型エマルションにおいて形成された水性区画は、区画間でのポリヌクレオチド又はポリペプチドの行き来があるとしても僅かであり、一般に安定している。更に、生化学反応は、エマルション区画において進行する。更に、複雑な生化学プロセス、特に遺伝子転写及び翻訳も、エマルション区画において活性となる。この技術は、数千リットルの工業規模までの量でエマルションを作成するものとして存在する(Becher, 1957、Sherman, 1968、Lissant, 1974、Lissant, 1984))。
【０１４０】
実施形態において、区画は、一次エマルション(例えば、油中水(w/o))の液滴等、エマルションの液滴である。エマルションを含む実施形態において、分散(又は不連続)相の最外層と連続相との間の界面は、区画の境界の表面を構成する。実施形態において、液滴は、マイクロ流体液滴である。マイクロ流体液滴は、チップ上のマイクロ流体デバイス等のマイクロ流体デバイスを用いて得ることができる。油中水型エマルションのマイクロ流体液滴は、マイクロ流体デバイス、好ましくは疎水性マイクロ流体デバイスで得ることができる。これは、水相を第1の相(「分散」又は「内」相とも呼ばれる)として、非水相(例えば親油性)を第2の相(「連続」又は「外」相とも呼ばれる)として用いることで達成できる。
【０１４１】
「ダブル」エマルションの液滴も、マイクロ流体デバイスで得ることができる。例えば、水中油中水型(w/o/w)エマルションの液滴は、マイクロ流体デバイス、好ましくは親水性マイクロ流体デバイスで得ることができる。これは、油中水型エマルションを不連続相として、水相流体を連続相として用いることで達成できる。
【０１４２】
したがって、ダブルエマルションは2段階で製造することができる。第一に、シングルエマルションが得られ(油中水等)、第二に、シングルエマルションを自己乳化させてダブルエマルションを得る。第1及び第2の段階は、例えば、第1のマイクロ流体デバイスからの出力を第2のマイクロ流体デバイスの入力に接続することにより、相前後して実行することができる。この例は、マイクロ流体デバイスとして市販のものを入手できるため、プロセスに特殊な設備を必要としないことから、特に有利となる。又は、シングルエマルションを収集し、任意に、その後、第1のステップと第2のステップを実行した後で保存することができる。記載された形で相前後して動作する3つ、4つ、又はそれ以上のマイクロ流体デバイスを用いて、任意の数のエマルション層を取得し得る。
【０１４３】
4.2 ポリヌクレオチド
【０１４４】
本発明では、区画がポリヌクレオチドの周囲に形成されること、又はポリヌクレオチドが形成済みの区画に挿入されることが望ましい。本発明の方法では、区画毎に限られた数のポリヌクレオチドのみが存在する必要がある。これにより、個々のポリヌクレオチドのポリペプチドが、他のポリペプチドから分離された状態が確保される。したがって、ポリヌクレオチドとポリペプチドとの間の結合は、特異性が高い。濃縮係数は、区画当たり平均して1個以下のポリヌクレオチドの状態で最大となり、個々のポリヌクレオチドのポリペプチドが、他の全てのポリヌクレオチドの産物から分離されるため、核酸とコードされたポリペプチドの活性との間の連結が可能な限り緊密となる。しかしながら、区画当たり平均して単一のポリヌクレオチド以下となる理論上最適な状況が用いられなくとも、区画当たりのポリヌクレオチドの比率が5、10、50、100、又は1000以上であっても、大きなライブラリのソーティングに有益となり得る。異なるポリヌクレオチド分布を有する新たなカプセル化を含む、その後のソーティングの繰り返しにより、より厳密なポリヌクレオチドのソーティングが可能となる。好ましくは、区画毎に単一のポリヌクレオチド、又はそれより少ないポリヌクレオチドが存在する。
【０１４５】
区画は、単一のポリヌクレオチド(即ち、ポリヌクレオチドの単一分子)を含み得る。又は、区画は、複数のポリヌクレオチド(即ち、ポリヌクレオチドの2つ以上の分子、例えば、ポリヌクレオチドの2つの分子)を含み得る。好ましくは、区画が複数のポリヌクレオチドを含む場合、それら全てのポリヌクレオチドは、同一又は実質的に同一のポリヌクレオチド配列を有する。区画内の複数のポリヌクレオチドが実質的に同一の配列を有する場合、これは、区画内の1つのポリヌクレオチドの配列が、ポリヌクレオチドの合成に用いた方法の累積誤り率により決定されるものより大きく、同じ区画内の他のポリヌクレオチドの配列と異ならないことを意味する。
【０１４６】
区画内のポリヌクレオチドの数は、区画化ステップの前のポリヌクレオチドを含むバルク培地の適切な希釈により統計的に制御することができる。
【０１４７】
区画がエマルションの液滴である場合、ポリヌクレオチドは、乳化前に不連続相流体に含まれる。区画内のポリヌクレオチドの数は、不連続相流体の適切な希釈により統計的に制御される。例えば、単一の液滴中のポリヌクレオチドの平均数が1以下となるように、不連続相流体を希釈し得る。乳化後、このように希釈された不連続相は、エマルション液滴の内部容積を形成し、こうして生成された各液滴は、0又は1個のポリヌクレオチドを含むことになる。
【０１４８】
本発明のポリヌクレオチドは、環状ポリペプチドをコードする。発現時、直鎖ポリペプチドが、ポリヌクレオチドから生成され得る。その後、直鎖ポリペプチドには、所望の環状ポリペプチドを得るために環化のプロセスを施し得る。ポリペプチドの環化は、自発的に生じ得る、即ち、ポリペプチドは、自己環化する。最終的な環状ポリペプチドにおけるアミノ酸配列は、それが得られる直鎖ペプチドのアミノ酸配列と同じではない場合がある。例えば、環化のプロセスにより、直鎖ペプチドから1つ以上のN末端残基が切り取られる場合がある。又は、環化のプロセスにより、直鎖ポリペプチドから1つ以上のC末端残基が切り取られる場合がある。一部の実施形態では、環化のプロセスにより、直鎖ポリペプチドのN末端及びC末端の両方から1つ以上の残基が切り取られる場合がある。直鎖ポリペプチドは、「環状前」ポリペプチドと呼ばれることもある。環状ポリペプチドの配列とは、環状ポリペプチドを構成するアミノ酸の配列、又は環化後に環状ポリペプチドに含まれることになる直鎖ポリペプチド内に含まれるアミノ酸の配列を示す場合がある。環状ポリペプチドの配列は、直鎖ポリペプチド内に含まれる環状ポリペプチド配列のN末端残基であったアミノ酸残基で開始される。一部の実施形態において、環状ポリペプチドの配列は、直鎖ポリペプチドの配列と同じである。
【０１４９】
環状ポリペプチドをコードする配列とは、環化後に環状ポリペプチドに含まれることになる直鎖ポリペプチドの一部をコードするポリヌクレオチド中のヌクレオチドの配列を示す。
【０１５０】
ポリヌクレオチドは、DNA分子、RNA分子、合成塩基のみ又は天然塩基と合成塩基との混合物からなる部分的又は完全に人工の核酸分子、前述の何れかがポリペプチドに連結されたもの、及び前述の何れかが任意の他の分子群又は構築物からなる群から選択された分子又は構築物である。他の分子群又は構築物は、核酸、高分子物質、特にビーズ、例えばポリスチレンビーズ、及び磁性又は常磁性ビーズ等の磁性又は常磁性物質からなる群から選択することが有利となり得る。ポリヌクレオチドは、本明細書において「核酸」又は「核酸分子」と呼ばれる場合もある。
【０１５１】
ポリヌクレオチドの核酸部分は、ポリペプチドの効率的な発現に必要なもの等、適切な調節配列、例えばプロモータ、エンハンサ、翻訳開始配列、ポリアデニル化配列、スプライス部位等を含み得る。
【０１５２】
本発明内の核酸分子には、スプリットインテインの第一の部分、スプリットインテインの第二の部分、及びスプリットインテインの第一の部分とスプリットインテインの第二の部分との間に位置する標的ペプチドを有するポリペプチドをコードするものが含まれる。本発明の一実施形態において、核酸分子の発現は、自発的にスプライスして、標的ペプチドの環化形態を生じるポリペプチドをもたらす。
【０１５３】
本発明の他の実施形態において、核酸分子の発現は、標的ペプチドの環化形態のスプライシング中間体であるポリペプチドをもたらす。
【０１５４】
本発明の核酸は、当該技術分野において一般的に公知の核酸分子を調製及び操作する方法により調製することができる(例えば、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, New York: John Wiley & Sons, 1997、Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory Manual (2nd Edition), Cold Spring Harbor Press, 1989を参照。例えば、本発明内の核酸分子は、スプリットインテインの第一の部分をコードするポリヌクレオチドと、スプリットインテインの第二の部分をコードするポリヌクレオチドと、標的ペプチドをコードするポリヌクレオチドとを、別々に調製することにより作成することができる。3つのポリヌクレオチドを共にライゲーションして、スプリットインテインの第1の部分とスプリットインテインの第2の部分との間に挟まれた標的ペプチドを有するポリペプチドをコードする核酸分子を形成することができる。
【０１５５】
自然状態で分割されないインテイン(即ち、アミノ酸の1連続鎖として存在するもの)は、公知の手法を用いて人工的に分割することができる。例えば、このようなインテインの異なる部分をコードする2つ以上の核酸分子を作成し、それらの発現により2つ以上の人工的に分割されたインテイン成分が生じるようにすることができる。例えば、Evans et al, J. Biol. Chem. 274:18359, 1999、Mills et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:3543, 1998を参照されたい。そのような非天然型インテイン成分(部分)をコードする核酸を、本発明で使用することができる。同じ前駆体ポリペプチドと効率的に相互作用して環状ペプチド又はスプライシング中間体を生じる非天然型スプリットインテイン部分をコードする核酸分子が好適となる。
【０１５６】
このような核酸分子もたらすことが可能な非天然型スプリットインテインの例には、Psp Pol-l(Southworth, M.W., et al, The EMBO J. 17:918, 1998)、 結核菌RecAインテイン(Lew, B.M., et al, J. Biol. Chem. 273:15887, 1998、Shingledecker, K., et al, Gene 207:187, 1998、Mills, K.V., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:3543, 1998)、 Ssp DnaB/Mxe GyrA(Evans, T.C. et al, J. Biol. Chem. 274:18359, 1999)、及びPfu(Otomo et al, Biochemistry 38:16040, 1999、Yamazaki et al, J. Am. Chem. Soc.l20:5591, 1998)が含まれる。
【０１５７】
実施形態において、ポリヌクレオチドは、共有結合又は非共有結合等の結合によりポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドに関連し得る。非共有結合の例には、イオン結合、水素結合、及び誘導双極子相互作用(ファンデルワールス力とも呼ばれる)が含まれる。好適な実施形態において、結合は、共有結合である。これは、上述したmRNAディスプレイの方法により達成し得る。この実施形態において、ポリヌクレオチドは、ピューロマイシン部分又はアミノ酸部分等の3’ペプチジルアクセプタ領域を含む。このようなポリヌクレオチドが翻訳されると、末端アミノアシルトランスフェラーゼ反応により、新生ポリペプチドと3’ペプチジルアクセプタ領域との間に共有結合が生じる。好適な実施形態では、ポリヌクレオチドの3’末端に特異的にハイブリダイズする5’末端とペプチジルアクセプタ領域(又は部分)を含む3’末端とを含むリンカが提供される。
【０１５８】
また、本発明のポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド自身又はポリヌクレオチドによりコードされるmRNAの何れかにおいて、特定のコドンが所望の位置に配置されるように修飾又は操作し得る。これは、以下で更に詳細に説明するように、一部のtRNA(対応するアンチコドンを保有するもの)に非天然、例えば非タンパク質原性の残基がロードされている実施形態において有用となり得る(「再割り当てコドンセット」)。しかしながら、本発明のポリヌクレオチドにおけるコドンの操作は、このような非標準アシルtRNAを使用する実施形態が機能する上で必須ではない。
【０１５９】
4.3 発現ベクタ
【０１６０】
本発明の発現ベクタは、標的ペプチドをコードするポリヌクレオチドを、ポリヌクレオチドの発現を促進可能な任意の適切な発現ベクタに挿入することにより調製できる。このような適切なベクタには、プラスミド、バクテリオファージ、及びウイルスベクタが含まれる。これらの多くは、当該技術分野において公知であり、多くは市販されているか、科学団体から入手可能である。当業者は、例えば、選択された系のタイプ(例えば、インビトロ系、バクテリア等の原核細胞、及び酵母又は哺乳動物細胞等の真核細胞)及び選択された発現条件に基づいて、特定の用途で用いるのに適したベクタを選択することができる。
【０１６１】
本発明内の発現ベクタは、標的ポリペプチドをコードする一連のヌクレオチドと、ベクタ内のヌクレオチド配列の発現(例えば転写)を調整又は制御する調節ドメインとして動作する一連のヌクレオチドとを含むことができる。例えば、調節ドメインは、プロモータ又はエンハンサにすることができる。
【０１６２】
本発明内の発現ベクタは、特定の特性についての環化形態の標的ペプチド又はスプライシング中間体のスクリーニング(例えば、DNA結合ドメイン、キチン結合ドメイン又はビオチンタグ等のアフィニティタグ、着色又は発光ラベル、放射性タグ等)、又は環化形態の標的ペプチド又はスプライシング中間体の精製(例えば、キチン結合ドメイン、ビオチンタグ等の親和性タグ、着色又は発光ラベル、放射性タグ等)を促進するペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むことができる。
【０１６３】
好適な実施形態において、本発明内の発現ベクタは、多様な環化標的又はスプライシング中間体のクローニングを可能にする、スプリットインテイン部分をコードする核酸配列の間及び内部の制限部位により生成される。一部の実施形態において、本発明の発現ベクタは、アラビノース誘導性ベクタ等の誘導性発現ベクタにすることができる。誘導因子は、本発明の区画材料に浸透可能にし得る。
【０１６４】
4.4 ポリペプチド
【０１６５】
ポリペプチド環化の幾つかの方法は、当該技術分野において公知である。ポリペプチド環化は、2本の側鎖間、側鎖と末端基(即ち、N末端又はC末端)との間、又は2つの末端基間(即ち、「ヘッドトゥーテール」又は「骨格」環化)で実行することができる。こうした側鎖から側鎖への環化の方法の1つは、酵素的に実行することができる。ペプチド配列を環化する酵素は、多数存在する。例えば、トランスグルタミナーゼは、グルタミン側鎖とリジン側鎖との間のアミノトランスフェラーゼ反応を触媒し、2本の側鎖間に共有イソペプチド結合をもたらすことができる。グルタミンとリジンとが同じポリペプチド上にある場合、ポリペプチドは、この反応により環化される。骨格環化は、例えばスブチリシンでの処理により、同様に酵素的に引き起こすことができる。他の非限定的な例には、ProcM及びPatGがある。一般に、これらの方法は、ポリペプチド内のアミノ酸の「リーダ」配列の存在に依存している。リーダ配列は、酵素と特異的に相互作用することにより、同族の酵素の作用を動員し、方向付ける。各酵素は、特定のリーダ配列に特異的となり得る。特定の酵素のリーダ配列は、例えば、当業者の範囲内である従来の分子クローニング手法により、それをコードするポリヌクレオチドの操作を介して、本発明のポリペプチドに追加し得る。
【０１６６】
大環状化の方法は、Bashiruddin and Suga, Curr. Op. in Chem. Bio., vol. 24, pp.131-138により、特にmRNAディスプレイに関連して、詳細に解説されているが、当業者は、mRNAディスプレイ技術以外での、これらの方法の使用に精通しているであろう。翻訳機構を用いて大環状ペプチドを合成するために、最も基本的なアプローチは、システイン残基間のジスルフィド結合によるものである。しかしながら、細胞内環境で還元の影響を受けやすいため、一部の用途では望ましくない。そのため、単純な化学的翻訳後修飾による環化のために非還元性共有結合を形成する方法が考案されている。ジブロモキシレンを用いて、ジスクシンイミジルグルタラート又は2つのシステイン残基のスルフヒドリル基を使用してN末端とリジン側鎖との間に2つの一級アミンを架橋する方法を用いることで、大環状ペプチドの生成に成功している。3つのシステイン残基のチオエーテル架橋を介して二環式ペプチドを生成する同様の方法も報告されている(Heinis & Winter, Nat Chem Biol, 5 (2009), pp. 502-507)。これらの方法の利点は、標準的なタンパク質原性アミノ酸への適用性である。しかしながら、これらのライブラリのランダム領域に3つ以上の反応性残基が現れると、架橋パターンがスクランブルされ、こうした環化方法に基づいた選択の結果のデコンボリューションが困難になる可能性がある。
【０１６７】
上述したものより技術的に難しいが、大環状ペプチドの構築について遙かに信頼性の高い方法は、指定されたコドンを空にした後、非タンパク質原性アミノ酸に再割り当てする、遺伝子コード再プログラミングとして知られる遺伝子コード操作の概念に基づいている。これまでに2つの主要な方法論が報告されており、共にカスタムメイドの再構成翻訳系を利用している。
【０１６８】
一方の方法は、過剰量の非タンパク質原性アミノ酸の存在下でのアミノアシルtRNAシンテターゼのミスチャージ特性を利用して、対応するアミノアシルtRNAを生成する。Szostak et al.は、ペプチド鎖に4-セレナリジンを含むペプチドを生成した後、セレノ基の選択的な酸化及び同時除去を行い、デヒドロアラニン残基を生成する方法を報告した。その後、デヒドロアラニンは、マイケル付加を介してシステインのスルフヒドリル基と反応してチオエーテル結合を形成し、ランチオニン様大環状ペプチドが生じる。
【０１６９】
他方の方法は、Suga et al.により開発されたフレキシザイムとして知られる「フレキシブル」tRNAアシル化リボザイムを含み、これは無制限に近い選択肢で幅広い非タンパク質原性アミノアシルtRNAの調製を促進する。FIT(フレキシブルIn vitro翻訳)系と呼ばれる、カスタムメイドのin vitro翻訳系とフレキシザイムの組み合わせにより、他のタンパク質原性残基又は非タンパク質原性残基と架橋可能な非タンパク質原性アミノ酸を用いた大環状ペプチドのリボソーム合成が可能となる。FIT系は、様々な環化方法を可能にし、例えば、メチルランチオニン様大環状ペプチドは、システイン残基とのチオエーテル結合を形成可能なデヒドロブチリンへと熱的に異性化されるビニルグリシンの組み込みにより合成することができる(Y. Goto, K. Iwasaki, K. Torikai, H. Murakami, H. Suga; Chem Commun (Camb), 23 (2009), pp. 3419-3421)。N末端開始アミノ酸により指定されたベンジルアミン基と下流の5-ヒドロキシトリプトファンとを含むペプチドの翻訳は、蛍光性インドール結合を形成する温和な酸化大環状化の独特の方法となる(Y. Yamagishi, H. Ashigai, Y. Goto, H. Murakami, H. Suga; ChemBioChem, 10 (2009), pp. 1469-1472)。更に、ヘッドトゥーテールで連結されたペプチドのリボソーム合成は、C末端Cys-Pro-HOG(グリコール酸)配列又はC末端Cys-Pro配列を含むプログラムされたペプチジルtRNAドロップオフにより行うこともできる(T. Kawakami, Nat Chem Biol, 5 (2009), pp. 888-890; Y. Ohshiro, ChemBioChem, 12 (2011), pp. 1183-1187; T.J. Kang, Angew Chem Int Ed Engl, 50 (2011), pp. 2159-2161)。どちらの場合も、C末端エステル結合は、N→S移動の自己再配列を加速し、C末端ジケトピペラジンチオエステルを形成し、最終的に骨格環化単環式又はジスルフィド架橋二環式ペプチドを生成する。
【０１７０】
最も簡便且つ信頼性の高い環化方法は、下流のシステインと反応可能なN-クロロアセチル-アミノ酸イニシエータによるペプチドの翻訳によるものとされている(Y. Goto, A. Ohta, Y. Sako, Y. Yamagishi, H. Murakami, H. Suga; ACS Chem Biol, 3 (2008), pp. 120-129)。この方法の利点は、N末端のクロロアセチル基と最も近いシステイン残基のスルフヒドリル基との間の自発的且つ選択的なチオエーテル結合形成である。唯一の例外は、N-クロロアセチルアミノ酸に隣接するシステイン残基が環の制約のためにクロロアセチル基と反応できないため、この位置に遊離スルフヒドリル基が残ることである。しかしながら、この選択性は、N末端と第2のシステインとの間にチオエーテル(スルフィド)結合、第1及び第3のシステイン残基間にジスルフィド結合を有する、縮合二環式ペプチドを翻訳する簡便な方法となることが分かっている。重要な点として、FIT系は、D-アミノ酸、N-メチルアミノ酸、N-アルキルグリシン、及び非標準的な側鎖を有するものを含むペプチドの翻訳を促進することが実証されている。
【０１７１】
他の方法において、ポリペプチドの環化は、ポリペプチド内の分子内相互作用により自発的に達成することができる。これは、例えば、「インテイン」に由来する配列の所望の環状ポリペプチドとの融合により達成することができる。
【０１７２】
公知の又はランダムな配列のペプチドをコードする核酸を作成する多数の方法が、当該技術分野において知られている。例えば、所定の又はランダムな配列を有するポリヌクレオチドは、市販の設備及び試薬を用いた固相合成により化学的に調製することができる。ポリメラーゼ連鎖反応を用いて、公知の又はランダムな配列のポリヌクレオチドを調製することもできる。例えば、前掲のAusubel et al.を参照されたい。他の例として、制限エンドヌクレアーゼを用いて、より大きな核酸分子又は染色体DNA全体を酵素的に消化し、本発明の核酸分子の調製に使用可能な複数のより小さなポリヌクレオチド断片にすることができる。
【０１７３】
環化対象のペプチド配列をコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの一方の末端が、環化反応を促進するアスパラギン、セリン、システイン、又はスレオニン残基をコードするように調製されることが好ましい。同じ理由から、スプライシング中間体を生成するためのペプチド配列をコードするポリヌクレオチドは、末端がアスパラギン、セリン、システイン、又はスレオニン残基以外のアミノ酸をコードし、環化反応が防止されるように調製されることが好ましい。
【０１７４】
生成後、従来の方法を用いて、インテイン部分をコードする核酸分子を標的ペプチド(又はスプライシング中間体内のペプチド)をコードする核酸分子にライゲーションし、第1のインテイン部分-標的ペプチド-第2のインテイン部分の順序を有するポリペプチドをコードする、より大きな核酸分子を形成することができる。例えば、前掲のAusubel et al.を参照されたい。
【０１７５】
4.4.1 SICLOPPS
【０１７６】
スプリットインテインのトランススプライシング能力は、ループ構造においてペプチドをディスプレイする環状ペプチド及びスプライシング中間体を生成する一般的な方法を開発するために利用されている(PCT/US1999/030162)。この方法では、前駆体ポリペプチドのスプリットインテインの2つの部分の間に標的ペプチドが挿入される。スプリットインテインの2つの部分は物理的に一緒になり、更に標的ペプチドをループ構成に強制する構造の活性インテインを形成する。この構成では、インテイン部分の一方(例えば、IN)と標的ペプチドとの間の接合部のアミノ酸のエステル異性体が安定し、インテインの他の部分(例えば、IC)からのヘテロ原子は、エステルと反応して環状エステル中間体を形成することが可能となる。その後、活性インテインは、アミノスクシンイミドの形成を触媒し、これにより環化形態の標的ペプチド(即ち、ラクトン型)が遊離され、その後、自発的に再配列して熱力学的に好ましい骨格環状ペプチド生成物(即ち、ラクタム型)を形成する。
【０１７７】
環状ペプチドの遊離前に所定のポイントで反応を停止させることにより、ループ構成で標的ペプチドを保持するスプライシング中間体を生成することができる。このようなペプチドを生成するために、2つのインテイン部分の間に標的ペプチド配列が挟まれたポリペプチドをコードする核酸分子を構築することができる。これらの構築物の発現ベクタへの導入は、適切な発現系でポリペプチドを生成する方法を提供し、ここで、ポリペプチドは、環状ペプチド又はスプライシング中間体にスプライシングすることができる。この方法を用いることで、幾つかの異なる環状ペプチド又はスプライシング中間体を調製して、特定の特性についてスクリーニング可能な環状又は部分環状ペプチドのライブラリを生成することができる。
【０１７８】
インテインは、「タンパク質スプライシング」と呼ばれるプロセスにおいて、それ自体を切断し、残りの部分(エクステイン)をペプチド結合で結合可能なタンパク質のセグメントである。インテインを介したタンパク質のスプライシングは、インテインを含むmRNAがタンパク質に翻訳された後に生じる。この前駆体タンパク質には、3つのセグメントとしてNエクステインと、それに続くインテインと、それに続くCエクステインとが含まれている。スプライシングが起きた後、結果として生じるタンパク質は、Cエクステインに連結されたNエクステインを含む。場合により、前駆体タンパク質のインテインは、2つの遺伝子に由来する。この場合、インテインは、スプリットインテインと呼ばれる。1つの遺伝子によりコードされるインテイン部分(又は断片)は、他の遺伝子によりコードされるインテイン断片と相互作用して、触媒的に活性なインテインを生成し、このインテインは、次に、それ自体を切断して2つの遺伝子からのエクステインを共にスプライスする。
【０１７９】
2つのスプリットインテイン断片が、代わりに介在ポリペプチド配列の反対の2つの末端に位置する場合、スプライシング及び切断のプロセスにより、元の介在ポリペプチドの配列を有する環状ポリペプチドが生成される。これは、従来の分子遺伝学の手法、例えば、2つの相補的なスプリットインテイン断片をコードする配列を、所望の環状ポリペプチドをコードする配列を有するベクタにクローニングすることにより達成できる。3つのポリヌクレオチド配列は、発現時に得られるポリペプチドが、N末端インテイン断片と、それに続く環状ポリペプチド配列と、それに続くC末端インテイン断片とを有し、N末端及びC末端インテイン断片が会合して、環状ポリペプチドを生成するスプライシング反応を後に触媒する機能性インテインを形成することができるように、ベクタに配置される。言い換えると、ポリヌクレオチドは、N末端インテイン断片をコードする配列と、それに続く環状ポリペプチド配列をコードする配列と、それに続くC末端インテイン断片をコードする配列とを含む。このプロセスは、ペプチド及びタンパク質のスプリットインテイン環状ライゲーション(SICLOPPS)として知られている。
【０１８０】
ポリヌクレオチドからの発現は、ポリヌクレオチドからのポリペプチドの発現にすることができる。ポリヌクレオチドからの発現は、第1のポリヌクレオチドからの第2のポリヌクレオチドの発現にしてもよい。例えば、RNAポリヌクレオチドは、適切なRNAポリメラーゼによる転写プロセスにより、DNAポリヌクレオチドから発現され得る。ポリペプチドは、適切なリボソームによる翻訳プロセスにより、RNAポリヌクレオチドから発現され得る。一部の用法において、ポリヌクレオチドからの発現は、それをコードする遺伝物質からのポリペプチドの最終的な発現、即ち、RNAへの転写及びポリペプチドへの翻訳の両方を示す。意図する用法は、文脈から明らかとなる。
【０１８１】
適切なスプリットインテインの1つは、dnaEからのNpuスプリットインテインである。Npuスプリットインテインを含む本発明によるポリペプチドの例は、以下の配列を有し得る:
HHHHHHGENLYFKLQAMGMIKIATRKYLGKQNVYDIGVERYHNFALKNGFIASNX〜〜〜〜〜CLSYDTEILTVEYGILPIGKIVEKRIECTVYSVDNNGNIYTQPVAQWHDRGEQEVFEYCLEDGCLIRATKDHKFMTVDGQMMPIDEIFERELDLMRVDNLPNGTAANDENYALAA
ここで、X〜〜〜〜〜は、生成される環状ペプチドであり、Xは、C、S、T又は他の任意のアミノ酸であり、「〜」は、環状ペプチド配列のアミノ酸を示す。上記配列の「X」の後に任意の配列を挿入し得ることは、当業者には明らかであろう。配列は、1つ以上のアミノ酸の長さ、実施形態では少なくとも3つ以上のアミノ酸の長さ、好ましくは少なくとも6つのアミノ酸の長さを有し得る。
【０１８２】
上記配列は、次の構成要素を含む。
1:
HHHHHH
例えば、ニッケル-NTAカラム上での精製を支援するオプションのヘキサヒスチジンタグ。「FLAG-TAG」等の他の精製系が考えられ、この場合、ヘキサヒスチジンは、適切なタグ配列に置き換えられる。
2:
GENLYFKLQAMGMIKIATRKYLGKQNVYDIGVERYHNFALKNGFIASN
C末端インテイン断片を含む。
3:
X〜〜〜〜〜
環状ポリペプチド配列。
4:
CLSYDTEILTVEYGILPIGKIVEKRIECTVYSVDNNGNIYTQPVAQWHDRGEQEVFEYCLEDGCLIRATKDHKFMTVDGQMMPIDEIFERELDLMRVDNLPNGTAANDENYALAA
N末端インテイン断片を含む。
【０１８３】
4.5 区画の内容の修飾
【０１８４】
4.5.1 インビトロ転写及び翻訳
【０１８５】
環状ポリペプチドと、それをコードするポリヌクレオチドとを共区画化するために、ポリヌクレオチドからポリペプチドを発現させるための手段も区画内に封入し得る。このような手段には、インビトロ転写及び翻訳(IVTT)系が含まれ得る。IVTT系は、例えば、RNAポリメラーゼ、リボソーム、リン酸ヌクレオチド、アミノ酸がロードされたtRNA、並びに開始因子及び伸長因子等の翻訳因子を含み得る。適切なインビトロ転写/翻訳試薬は、当該技術分野において周知である(例えば、Isalan, M. et al (2005) PLoS Biol. 3 e64)。したがって、区画内でのポリヌクレオチドの発現により、ポリペプチドとポリヌクレオチドとは、同じ場所に配置される。区画がエマルションの液滴である場合、これは、乳化の前に不連続相(又は分散相、又は内相)流体にIVTT成分を含めることにより達成できる。
【０１８６】
更に、所望の非タンパク質原性アミノ酸(又はヒドロキシ酸)が事前にチャージされた(即ち、活性アミノ酸が結合された)アシル化tRNAを、限られた天然アミノ酸のみを含む再構成無細胞翻訳(IVTT)系に追加することができる。除外された天然アミノ酸のコドンを非タンパク質原性アミノ酸(又はヒドロキシ酸)によりアシル化されたtRNAのアンチコドンと相関させることにより、非タンパク質原性アミノ酸(又はヒドロキシ酸)を含むペプチドを、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるか又はこれを構成するmRNAの遺伝情報に基づくリボソームでの翻訳により合成することができる。又は、天然のアミノ酸を含まないペプチドは、非タンパク質原性アミノ酸(又はヒドロキシ酸)をチャージしたアシル化tRNAのみを、天然のアミノ酸を含まない再構成無細胞翻訳系に加えることで、翻訳により合成することもできる。
【０１８７】
非タンパク質原性アミノ酸(又はヒドロキシ酸)をチャージしたアシル化tRNAは、アミノアシルtRNA合成を触媒可能な人工RNA触媒「フレキシザイム」を用いて調製することができる。上記のように、これらの人工RNA触媒は、任意の側鎖を有するアミノ酸をチャージすることが可能であり、tRNAの3’末端をアシル化するためにtRNAの3’末端のコンセンサス配列5’-RCC-3’(R=A又はG)のみを認識する機能も有するため、異なるアンチコドンを有する任意のtRNAに作用することができる。更に、フレキシザイムは、L-アミノ酸だけでなくヒドロキシ酸(α位にヒドロキシル基を有する)、N-メチルアミノ酸(α位にN-メチルアミノ酸を有する)、N-アシルアミノ酸(α位にN-アシルアミノ基を有する)、D-アミノ酸等をtRNAをチャージすることもできる。詳細な説明は、出典を明記することによりその開示内容全体を本願明細書の一部とするY. Goto, H. Suga (2009) "Translation initiation with initiator tRNA charged with exotic peptides" Journal of the American Chemical Society, Vol. 131, No. 14, 5040-5041、WO2008/059823「N末端に非天然構造を有するポリペプチドの翻訳及び合成並びにその応用」、Goto et al., ACS Chem. Biol., 2008, 3, 120-129、WO2008/117833「環状ペプチド化合物の合成方法」に記載されている。
【０１８８】
フレキシザイムによりtRNAにライゲーション可能な他の非天然アミノ酸には、様々な側鎖を有するアミノ酸、β(ベータ)アミノ酸、γ(ガンマ)アミノ酸、及びδ(デルタ)アミノ酸、Dアミノ酸、及びアミノ酸骨格上のアミノ基又はカルボキシル基が置換された構造を有する誘導体が含まれる。更に、非天然アミノ酸を組み込むことにより得られる異常ペプチドは、通常のアミド結合以外の骨格構造を有し得る。例えば、異常ペプチドには、アミノ酸及びヒドロキシ酸からなるデプシペプチド、ヒドロキシ酸の連続縮合により生成されるポリエステル、N-メチルアミノ酸を導入することによりアミド結合の窒素原子においてメチル化されたペプチド、及びN末端に様々なアシル基(アセチル、ピログルタミン酸、脂肪酸等)を有するペプチドが含まれる。更に、反対の2つの末端で結合を形成可能な官能基対を有するアミノ酸配列からなる非環状ペプチドを環状化して得られる環状ペプチドも合成することができる(又は、N-メチルペプチドを用いる場合は環状N-メチルペプチドを得ることができる)。環状化は、クロロアセチル基とシステイン基とを反対の2つの末端に有するペプチド配列の翻訳/合成により得られるチオエーテル結合を介して環状化された環状ペプチドにより例示されるように、何らかの官能基対を有する無細胞翻訳(IVTT)系の条件下で発生し得る。
【０１８９】
4.5.2 ポリヌクレオチド増幅
【０１９０】
後続のアッセイにおいて検出可能なシグナルが得られるように、単一のポリヌクレオチドから十分なポリペプチドを生成することは困難な場合がある。実施形態では、ポリヌクレオチドの複数のコピーを区画内で生成する。これは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、又はPhi29ポリメラーゼの使用等、増幅プロセスにより達成することができる。増幅プロセスの成分がポリヌクレオチドと共に区画内に含まれる場合、熱サイクル又は加熱下でのインキュベーション等の必要な増幅条件下に区画を置くことにより、増幅を実行することができる。そのため、区画は、ポリヌクレオチドの転写及び翻訳に関して上述したものと類似する形で、自己充足型のマイクロリアクタとなる。区画は、ポリヌクレオチドの移動に対する障壁を形成するため、増幅されたポリヌクレオチドの全てのコピーが、この区画内に包含され分離される。したがって、区画は、モノクローナル単位、即ち、ポリヌクレオチドの同一又は実質的に同一のコピーの共局在化単位となる。
【０１９１】
区画がエマルションの液滴である場合、これは、乳化前に不連続相流体に増幅反応の成分を含めることにより達成される。次に、エマルションは、所望のコピー数まで増幅するために必要な条件下に置き得る。
【０１９２】
ポリヌクレオチドの所望の配列全体(「アンプリコン」)を増幅するように、PCR用のプライマを選択又は設計することができる。例えば、1つのプライマは、テンプレート鎖上の所望の配列の始まりにアニーリングするように設計し、第2のプライマは、コーディング鎖上の所望の配列の始まりにアニーリングするように設計することができる。
【０１９３】
ポリヌクレオチドがSICLOPPS自己スプライシングポリペプチドをコードする場合、例えば、第1のプライマはテンプレート(又はアンチセンス)鎖のN末端インテイン断片をコードする配列にアニーリングし、第2のプライマは、コーディング(又はセンス)鎖上のC末端インテイン断片をコードする配列にアニーリングし得る。
【０１９４】
又は、プライマをアニーリングするための特定の配列を含むように、ベクタを選択又は設計し得る。例えば、第1のプライマに相補的な配列を、ベクタのテンプレート鎖上の所望の配列の後(即ち、テンプレート鎖上の所望の配列の3’末端の後)に挿入し、第2のプライマに相補的な配列を、ベクタのコーディング鎖上の所望の配列の後(即ち、コーディング鎖上の所望の配列の3’末端の後)に挿入し得る。このオプションは、遺伝子ライブラリを構築するために、ランダム化されたポリヌクレオチドをベクタに挿入する場合等、増幅するべき所望の配列が未知の場合に特に適している。この場合、増幅されたポリヌクレオチドの翻訳時に、特定の特性を有するポリペプチド配列が生成されるように、プライマを選択又は設計することができる。例えば、1つのプライマは、N末端グルタミンドナー配列Ala-Leu-Glnをコードするように設計し、第2のプライマは、C末端領域リジンをトランスグルタミナーゼの基質としてコードするように設計することができる。
【０１９５】
好ましくは、増幅試薬は、等温増幅試薬である。アガロースゲルにおける等温増幅の手法は、当該技術分野において周知であり、増幅されたポリヌクレオチドのコピーを含む高分子量(40kb超)の高分岐産物を生成するPhi29 DNAポリメラーゼによる多重プライムRCA(multiply-primed RCA)を含む(Michikawa, Y.et al. (2008). Anal. Biochem., 383, 151-158)。増幅されたDNA、特に高分岐増幅DNAは、ビーズマトリクスから拡散することができない。
【０１９６】
ポリヌクレオチド及びコードされた産物が区画化なしで共局在化した状態を維持する場合、ビーズは、乳化せずに水性発現溶液に接触させ得る。ポリヌクレオチド及びコードされた産物が共局在した状態を維持する能力は、コードされた産物の濃度及び生物物理学的特性(例えばサイズ)に依存する。
【０１９７】
実施形態では、ポリヌクレオチドは、Phi29 DNAポリメラーゼにより増幅される。こうした実施形態において、プライマは、6ヌクレオチドのランダム配列を有するポリヌクレオチド六量体等のランダムプライマにし得る。又は、プライマは、上記のPCRの説明と同様の形で設計又は選択し得る。Phi29系による増幅の利点は、熱サイクルを必要としないことであり、増幅は、反応混合物の単純なインキュベーションにより、Phi29で実行することができる。
【０１９８】
実施形態において、Phi29増幅は、区画を1時間以上インキュベートすることにより実行される。好ましくは、増幅は、8時間以上行われる。最も好ましくは、増幅は、16時間以上行われる。Phi29増幅反応のインキュベーションは、1、2、若しくは3日間、又はそれ以上行ってもよい。
【０１９９】
実施形態において、Phi29増幅のインキュベーションは、室温条件下で実施し得る。又は、Phi29増幅は、20℃乃至50℃、最も好ましくは30℃乃至40℃、例えば37℃の加熱下でインキュベートしてもよい。
【０２００】
しかしながら、増幅反応を実行するために必要な条件は、IVTTと適合しない可能性がある。したがって、区画内の増幅ポリヌクレオチドに対してIVTTを実行するために、増幅完了後に区画を操作して内部環境を変更することを要する場合がある。Brouzes et al. (PNAS, 2009, 106:34, pp.14195-14200)の方法等、当該技術分野の方法は、液滴マージングのプロセスにより、マイクロ流体液滴内の条件を変更する。しかしながら、液滴マージングは、技術的に困難なプロセスであり、ある程度の信頼性をもって実行するには専門的な設備と専門知識とが必要となる。
【０２０１】
4.5.3 ゲル転移
【０２０２】
実施形態において、本発明は、WO2012/156744A2のようにして、区画内でゲル形成材料を利用することにより、液滴マージングに関連する欠点を回避する。ゲル形成材料は、増幅されたポリヌクレオチドを固定化するために、液相から固相又はゲル相への可逆転移を受けるように作成することができる。ゲルは、区画内で固化すると、固定化されたポリヌクレオチドを含むビーズを形成し得る。その後、区画は、ゲルに捕捉された増幅ポリヌクレオチドの単クローンの完全性に影響を与えることなく、破壊し得る。
【０２０３】
区画を破壊するプロセスは、使用する区画材料により異なる。一部の実施形態では、解乳化剤、例えば弱い界面活性剤をエマルションに添加して相を分離し、ビーズを含む水相を除去し得る。解乳化剤は、界面活性剤と油/水界面で競合して、これを崩壊させ、これは「エマルションの破壊」とも呼ばれる。適切な弱い界面活性剤には、フッ素化油を用いる場合、ペルフルオロオクタノール(PFO)及び小さな親水基を有する他のフルオラス化合物、又は鉱油を用いる場合には、SDS及びTritonを含むバッファ並びに片側に炭素鎖を有し、他方に小さな親水基を有する他の化合物が含まれる。解乳化剤をエマルションに加え、例えばピペットで混合物を攪拌してもよい。
【０２０４】
他の実施形態において、エマルションを遠心分離して相を分離し、ビーズを含む水相を除去してもよい。ゲルビーズの再乳化に適した手法は、当技術分野において公知である(Abate, A. R. et al (2009) Lab Chip, 9, 2628-2631)。
【０２０５】
解乳化後、ビーズを単離及び/又は洗浄して、緩衝液及び他の試薬を除去し得る。ビーズは、標準的な手法を用いた遠心分離又は濾過により単離及び/又は洗浄し得る。
【０２０６】
洗浄後、ビーズは、本明細書に記載の方法の他のステップを即座に施してもよく、或いは例えば室温で又は冷蔵若しくは冷凍で(好ましくはグリセロールの存在下で)保存してもよい。ビーズが生存細胞を含む実施形態において、ビーズは、公知の技術に従って凍結前にグリセロール等の防腐剤により処理し得る。
【０２０７】
脱区画化したゲルビーズは多孔質であり、ゲルの内部条件は、異なる培地に懸濁することで変更することができる。したがって、ビーズは、PCRを実行するための条件から取り出し、モノクローナル性を失うことなくIVTTを実行するのに適した条件に移される。ビーズ内の環境は、これによりポリヌクレオチドのIVTTに適したものとなる。
【０２０８】
ゲル形成剤は、例えば、加熱、冷却、又はpHの変更等の条件の変更により、液体からゲルに凝固することが可能な作用剤、例えば多糖類又はポリペプチド等のポリマである。
【０２０９】
適切なゲル形成剤には、アルギン酸塩、ゼラチン、及びアガロース、並びにマイクロ流体デバイスの流路を介して移動するのに十分に流動性のゾル相を有する他のゲルが含まれる。好ましくは、二糖(D-ガラクトース及び3,6-アンヒドロ-L-ガラクトピラノース)の繰り返し単位により構成される線状ポリマであるアガロースが使用される。ゲル形成剤は、任意の簡便な方法により、例えば条件を変えることにより、ビーズに固化させ得る。好ましくは、ヒドロゲル形成剤は、温度を変えることにより、例えば冷却することにより固化される。ヒアルロン酸は、本発明で使用し得る別のゲル形成剤となる。
【０２１０】
好適な実施形態において、ゲルは、相変化(又は転移)温度未満に冷却することにより、液体形態から固体形態への相変化を誘発し得る。例えば、作用剤がアガロースである場合、温度を下げることにより、例えば25℃未満、20℃未満、又は15℃未満で固化し得る。正確なゲル化温度は、アガロースの種類及び濃度に依存し、当業者が容易に決定し得る。例えば、0.5％乃至2％の超低融点アガロースType IX-A(Sigma)のゲル化点は、約17℃である。
【０２１１】
区画内の薬剤の固化により、固化したゲルがビーズの形状となる。固化したビーズの集団は、単分散にし得る。コードされた産物は、任意の簡便な方法によりビーズ内に保持し得る。例えば、産物は、ゲルマトリクス内に捕捉することにより、又は保持剤若しくはゲルマトリクス自体との共有結合若しくは非共有結合により、ビーズ内に保持し得る。
【０２１２】
ポリペプチド及びポリヌクレオチド等の分子は、そのサイズのため、ビーズ内に保持され得る。例えば、閾値サイズより大きい分子は、ゲルの細孔を介してビーズから拡散不能となり得、したがって、ビーズのゲルマトリクス内に捕捉され得る。例えば、プラスミド等のポリヌクレオチド及びポリヌクレオチドの増幅コピーをビーズ内に保持し得る。一部の実施形態において、ゲルは、50nm以上の直径を有する粒子を保持し得るが、正確な閾値は、ゲルの種類及び濃度を含む複数の要因に依存する。
【０２１３】
一部の実施形態において、ゲルビーズが乳化後に固化する際の水溶液、例えば、上述した水性発現及び/又は増幅溶液等のヒドロゲル形成剤を含む溶液は、例えば、ポリヌクレオチド又はコードされた産物に結合することにより、ポリヌクレオチド又はコードされた産物のビーズからの拡散を低減又は防止する1つ以上の保持剤を更に含み得る。
【０２１４】
他の実施形態において、基質及びコードされた産物等の区画成分は、ヒドロゲル足場を直接結合することにより保持し得る。例えば、足場は、液滴成分に結合してビーズ内に保持する1つ以上の結合部位を含むように操作し得る。
【０２１５】
他の実施形態において、ポリヌクレオチド及び/又はコードされた産物は、保持剤又はゲル足場への結合の必要なく、ビーズ内に十分に保持され得る。
【０２１６】
ゲル形成剤は、区画を破壊する前の任意の段階で区画に組み込んでよい。
【０２１７】
4.6 ライブラリ
【０２１８】
区画内の遺伝的にタグ付けされた環状ペプチドのライブラリを生成し得る。所望の長さのランダム化ポリヌクレオチドは、例えば上述した方法により、単一コピー内のベクタの区画化の前に、増幅及び発現のためにベクタにクローン化し得る。例えば、図15に示したベクタは、「ライブラリ」とラベル付けされた区画を有し、これは、この実施形態におけるランダム化ポリヌクレオチドの位置である。
【０２１９】
ベクタに挿入されるランダム化ポリヌクレオチドの長さは、当業者が決定し得る様々な要因に依存することになる。主に考慮されるのは、発現される最終的なポリペプチドのサイズである。好適な実施形態において、ポリペプチドは、6個のアミノ酸の長さを有する。したがって、適切なランダム化ポリヌクレオチドは、18個の核酸の長さを有する。環状ペプチドの形成では、ポリペプチドの長さが環化反応を進行させるのに十分か否か、即ち、その長さで閉じたペプチドサイクルの形成が可能か否かを考慮する必要がある。実施形態において、ペプチドは、任意の長さのリンカにより環化される。したがって、環状ポリペプチドは、2個のアミノ酸のみをコードすることにより達成される場合があり、この場合、ランダム化ポリヌクレオチドは、少なくとも6個の核酸の長さを有する。別の考慮事項は、ベクタ及び対応する複製系により許容される最大挿入サイズである。実施形態では、ランダム化配列は、更に長く、例えば、少なくとも9、30、60、90、180、300、600、900、1800、3,000、又はそれ以上の核酸の長さを有し得る。好適な実施形態において、ランダム化されたヌクレオチド配列は、6、9、12、15、18、21、24、27、又は30個のヌクレオチドの長さを有する。ランダム化配列は、ポリペプチドをコードするものだが、その長さは、必ずしも3の倍数とは限らない。例えば、7、8、10、11、13、14、16、17、19、20、22、23、25、26、28、又は29個のヌクレオチドの長さになり得る。ランダム化ポリヌクレオチド配列は、本明細書において可変配列と呼ばれる場合がある。実施形態において、「ランダム」又は「可変」配列の1つ以上の位置は、実際には固定し得る。例えば、SICLOPPS法による環化を達成する実施形態では、最初の位置は、不変のシステイン、セリン、又はトレオニン残基が占め、これに可変又はランダムアミノ酸配列が続いてもよい。
【０２２０】
本発明のライブラリが異なる長さのランダム化配列を有する構成要素を含み得ることも理解されよう。例えば、ある割合のライブラリ構成要素は、9ヌクレオチドの長さのランダム化配列を含んでもよく、別の割合の同じライブラリの構成要素は、19ヌクレオチドの長さのランダム化配列を含んでもよい。任意の数の異なる長さが、同じライブラリ内に存在し得る。
【０２２１】
その後、個々の区画は、例えば区画化の前にベクタ培地にPhi29増幅の成分を含めることにより、それぞれ増幅用のマイクロリアクタとして機能する。ゲルを利用する実施形態において、区画は、ゲルを固化させる条件下に置かれ、その時点で区画が破壊され、IVTTの培地条件が変化する場合がある。ゲルビーズは、任意で再区画化され、各ビーズは、固定化ポリヌクレオチドのIVTT用のマイクロリアクタとして機能するようになる。これにより、ライブラリが得られる。IVTTと同時に、又はこれに続いて、選択プロトコルを実行するために必要な成分の一部又は前部を、ビーズ及び/又はカプセルに導入し得る。
【０２２２】
ポリペプチドとコードするポリヌクレオチドとの間の会合の完全性は、本発明の区画及びゲル転移プロトコルにおいて上述したmRNAディスプレイ技術を利用することにより更に強化し得る。この実施形態において、ポリヌクレオチドは、翻訳のプロセスにより、結果的に生じたポリペプチドに連結されるように構造化されている。例えば、ポリヌクレオチドの3’末端は、ピューロマイシン部分又はアミノ酸部分等のペプチジルアクセプタ領域を含み得る。
【０２２３】
本明細書に記載のディスプレイ技術(例えば、mRNAディスプレイ、ファージディスプレイ、区画化ランダム化ポリヌクレオチド)は、必ずしも相互に排他的ではなく、同じ実施形態内で共に実現し得ることは理解されよう。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの翻訳の終了時に新生ペプチドへの共有結合を形成するペプチジルアクセプタ領域を含む一方で、SICLOPPSポリペプチドをコードし得る。
【０２２４】
更に、本明細書に記載の方法の何れかによるmRNAライブラリの区画化により、mRNAライブラリに対して機能アッセイを実施することが可能となり、これによりmRNAディスプレイ技術の主要な欠点の1つが克服される。
【０２２５】
4.7 選択
【０２２６】
本発明によるライブラリは、アッセイの条件下に置くことでスクリーニングしてよく、各ビーズ又は区画は、場合によりアッセイの陽性又は陰性の結果の特性を有するようになる。その後、ビーズ又は区画は、この特性に基づいて選択し得る。例えば、蛍光シグナルをFACS/FADSにより選択することができる。
【０２２７】
本明細書に開示される全てのレポータ、標識、及びタグは、本明細書に開示される任意の実施形態において使用し得る。
【０２２８】
4.7.1 親和性選択
【０２２９】
特異的リガンドに対する親和性を有するポリペプチドを選択する場合、ポリヌクレオチドは、リガンドを介してマイクロカプセル内のポリペプチドに連結させ得る。例えば、リガンドは、リガンドとポリヌクレオチドの3’-OH又は5’-リン酸との間の反応等を介して、ポリヌクレオチドに共有結合させ得る。本明細書での使用において、「リガンド」は、別の存在物に結合する、又は別の存在物により結合され得る任意の存在物を示し得る。例えば、リガンドは、受容体結合部位を含む別のポリペプチドにし得る。この形式では、本発明のペプチドは、リガンドポリペプチドとの相互作用の強度に基づいて、理想的には前記受容体結合部位を介して選択される。又は、リガンドは、小分子、他のポリヌクレオチド(例えば、アプタマ)、又はポリスチレンビーズ又は磁気ビーズ等のマクロスケールの物理的構造にし得る。これらの例は、限定を意図するものではない。
【０２３０】
リガンドに対する親和性を有するポリペプチドのみがポリヌクレオチドに結合し、リガンドを介して結合したポリペプチドを有するポリヌクレオチドのみが、選択ステップでの保持を可能にする変化した光学特性を獲得することになる。したがって、この実施形態において、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドに対するリガンドに連結されたポリペプチドをコードする核酸を含む。
【０２３１】
ポリペプチドのリガンドとの結合後のポリヌクレオチドの光学特性の変化は、以下を含む様々な形で誘導し得る:
(1)ポリペプチド自体が、特有の光学特性を有する場合があり、例えば、蛍光性である(例えば、緑色蛍光タンパク質(Lorenz et al., 1991))。
(2)ポリペプチドの光学特性が、リガンドとの結合時に修飾される場合があり、例えば、ポリペプチドの蛍光が、結合時に消失又は増強する((Guixe et al., 1998、Qi and Grabowski, 1998)。
(3)リガンドの光学特性が、ポリペプチドの結合時に変化する場合があり、例えば、リガンドの蛍光が、結合時に消失又は増強する(Voss, 1993、Masui and Kuramitsu, 1998)。
(4)リガンド及びポリペプチドの両方の光学特性が、結合時に修飾される場合があり、例えば、リガンドからポリペプチドへ(又はその逆)の蛍光共鳴エネルギ移動(FRET)があり、励起が「ドナー」吸収波長である場合に「アクセプタ」発光波長での発光が生じる(Heim & Tsien, 1996、Mahajan et al., 1998、Miyawaki et al., 1997)。
【０２３２】
この実施形態において、リガンドを介したポリペプチドのポリヌクレオチドとの結合は、光学特性の変化を直接的に誘導する必要はない。選択されるべき全てのポリペプチドは、選択の対象となる推定結合ドメインと、共通の特徴であるタグとを含むことができる。各マイクロカプセル内のポリヌクレオチドは、リガンドに物理的に連結される。ポリヌクレオチドから生成されたポリペプチドは、リガンドに対する親和性を有する場合、リガンドに結合し、ポリペプチドをコードしていた同じポリヌクレオチドに物理的にリンクされ、ポリヌクレオチドが「タグ付け」された状態となる。
【０２３３】
反応の終わりに、全てのマイクロカプセルを一緒にして、全てのポリヌクレオチド及びポリペプチドを1つの環境に共にプールしてもよい。所望の結合を示すポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、「タグ」に特異的に結合又は特異的に反応することにより、ポリヌクレオチドの光学特性の変化を誘導してソーティングを可能にする試薬を添加することにより、選択することができる。例えば、蛍光標識された抗「タグ」抗体を用いることが可能であり、又は抗「タグ」抗体に続いて、第1のものに結合する第2の蛍光標識抗体を用いることができる。
【０２３４】
他の実施形態では、リガンドに結合するポリペプチドが、例えば本来ならポリヌクレオチドの光学特性を修飾する他の結合パートナから、リガンドを単に隠すことに基づいて、ポリヌクレオチドをソーティングすることができる。この場合は、修飾されない光学特性を有するポリヌクレオチドが選択される。
【０２３５】
他の実施形態において、本発明は、ポリペプチドが、それをコードするポリヌクレオチドに結合する方法を提供する。その後、ポリペプチドは、付着したポリヌクレオチドと共に、所望の結合活性を有するポリペプチドへのリガンドの結合の結果としてソーティングされる。例えば、全てのポリペプチドは、ポリヌクレオチドに共有結合又は非共有結合する不変領域と、所望の結合活性を生成するために多様化した第2の領域とを含むことができる。
【０２３６】
他の実施形態において、ポリペプチドのリガンドは、それ自体がポリヌクレオチドによりコードされ、ポリヌクレオチドと結合する。言い換えると、ポリヌクレオチドは、2つ(又は実際にはそれ以上)のポリペプチドをコードし、そのうちの少なくとも1つはポリヌクレオチドと結合し、潜在的には互いに結合する可能性がある。ポリペプチドが区画内で相互作用する場合にのみ、ポリヌクレオチドは、そのソーティングを可能にする光学特性の変化を最終的にもたらす形で修飾される。この実施形態は、例えば、互いに結合するタンパク質のペアをコードする遺伝子のペアについて遺伝子ライブラリを検索するために用いられる。個々のポリペプチドは、個々のポリヌクレオチドによりコードされてもよい。
【０２３７】
Tyramide Signal Amplification(TSATM)増幅を用いて蛍光を強化し、ポリヌクレオチドを蛍光性にしてもよい。これには、ポリヌクレオチドに結合する(別のタンパク質に連結する)と共に、ポリヌクレオチドと(局所的に)反応するフリーラジカル形態へのフルオレセイン-チラミンの転換を触媒するペルオキシダーゼが関与する。TSAを行う方法は、当該技術分野において公知であり、キットは、NENから市販されている。
【０２３８】
TSAは、ポリヌクレオチドの蛍光の直接的な増加をもたらすように、又はリガンドが、第2の蛍光分子、若しくはその1つ以上が蛍光性である分子の配列に結合されるポリヌクレオチドに付着するように構成し得る。
【０２３９】
4.7.2 触媒選択
【０２４０】
選択が触媒作用に対するものである場合、各マイクロカプセル内のポリヌクレオチドは、反応の基質を含み得る。ポリヌクレオチドが触媒として作用することが可能なポリペプチドをコードする場合、ポリペプチドは、基質の産物への転換を触媒する。したがって、反応の終わりに、ポリヌクレオチドは、触媒反応の産物に物理的に連結される。
【０２４１】
場合により、基質がポリヌクレオチドの成分ではないことが望ましい場合もある。この場合、基質は、(例えば、「ケージド」ビオチン類似体(Sundberg et al., 1995、Pirrung and Huang, 1996)の)光活性化等の更なる活性化に必要な不活性な「タグ」を含む。その後、選択されるべき触媒は、基質を産物に転換する。その後、「タグ」が活性化され、「タグ付き」基質及び/又は産物が、核酸と複合体化したタグ結合分子(例えば、アビジン又はストレプトアビジン)に結合される。したがって、「タグ」を介して核酸に付着した産物に対する基質の比は、溶液中の基質及び産物の比を反映する。
【０２４２】
産物が付着し、所望の触媒活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの光学特性は、次の何れかにより修飾することができる。
(1)例えば、以下のため、基質-ポリヌクレオチド複合体には見られない特徴的な光学特性を有する産物-ポリヌクレオチド複合体。
(a)異なる光学特性を有する基質及び産物(多くの蛍光発生酵素基質が市販されており(例えば、Haugland, 1996参照)、グリコシダーゼ、ホスファターゼ、ペプチダーゼ、及びプロテアーゼの基質が含まれる(Craig et al., 1995、Huang et al., 1992、Brynes et al., 1982、Jones et al., 1997、Matayoshi et al., 1990、Wang et al., 1990))、又は
(b)類似する光学特性を有するが、基質ではなく産物のみがポリヌクレオチドに結合又は反応する基質及び産物。
(2)産物に特異的に結合又は反応し、これにより、ソーティングを可能にするポリヌクレオチドの光学特性の変化を誘導する試薬の追加(これらの試薬は、区画を破壊してポリヌクレオチドをプールする前又は後に添加することができる)。試薬は、
(a)基質及び産物の両方がポリヌクレオチドに付着している場合、基質ではなく産物に特異的に結合又は特異的に反応し、又は
(b)基質ではなく産物のみがポリヌクレオチドに結合又は反応する場合、基質及び産物の両方を任意に結合する。
【０２４３】
触媒分子をコードするプール済みポリヌクレオチドは、その後、修飾された光学特性を有するポリヌクレオチドを選択することで濃縮し得る。
【０２４４】
別の選択肢は、核酸を産物に特異的な抗体(又は他の産物に特異的な分子)に結合することである。この方式において、基質(又は基質の1つ)は、ポリヌクレオチドに連結されない各区画に存在するが、分子「タグ」(例えば、ビオチン、DIG若しくはDNP、又は蛍光基)を有する。選択されるべき触媒が基質を産物に転換すると、産物は「タグ」を保持し、その後、産物に特異的な抗体によりマイクロカプセルに捕捉される。このようにして、ポリヌクレオチドは、基質を産物に転換できる酵素をコード又は生成する場合にのみ「タグ」と関連する状態になる。全ての反応が停止すると、活性酵素をコードするポリヌクレオチドは、「タグ付き」となり、例えば「タグ」が蛍光基である場合、既に変化した光学特性を有し得る。又は、「タグ」に結合する蛍光標識リガンド(例えば、蛍光標識アビジン/ストレプトアビジン、蛍光性の抗「タグ」抗体、又は第2の蛍光標識抗体により検出可能な非蛍光性の抗「タグ」抗体)を添加することにより、「タグ付き」遺伝子の光学特性の変化を誘導することができる。
【０２４５】
又は、第1の反応を同じ区画で生じる後続の反応に共役させることにより、間接的に選択してもよい。これを実行し得る2つの一般的な方法が存在する。第1の実施形態において、第1の反応の産物は、第1の反応の基質と反応しない分子と反応又は結合する。第2の共役される反応は、第1の反応の産物の存在下でのみ進行する。次に、第2の反応の産物の特性を用いて、所望の活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを精製し、上述したようなポリヌクレオチドの光学特性の変化を誘導することができる。
【０２４６】
又は、選択される反応の産物を、第2の酵素触媒反応の基質又は補助因子にしてもよい。第二の反応を触媒する酵素は、マイクロカプセル内でin situで翻訳されるか、区画化の前に反応混合物に組み込まれる。最初の反応が進行する場合にのみ、結合した酵素は、上述したようなポリヌクレオチドの光学特性の変化を誘導するのに使用可能な産物を生成する。
【０２４７】
この共役の概念は、それぞれが前の反応の産物を基質として使用する複数の酵素を組み込むように構成することができる。これにより、固定化された基質と反応しない酵素の選択が可能となる。また、1つの反応の産物が、選択可能な産物に至る第2の反応又は一連の反応の触媒又は補助因子となる場合、信号増幅により感度を高めるように設計することもできる(例えば、Johannsson and Bates, 1988、Johannsson, 1991参照)。更に、酵素カスケード系は、酵素の活性化因子の生成又は酵素阻害剤の破壊に基づくものにすることができる(Mize et al., 1989参照)。結合には、同じ産物を生成する酵素のグループ全体に共通の選択系を使用することができるという利点もあり、単一のステップでは実行できない複雑な化学転換の選択が可能となる。
【０２４８】
したがって、このような結合の方法により、新規の「代謝経路」をin vitroで段階的に進化させ、最初に1つのステップ、その後、次のステップを選択及び改善することが可能となる。選択戦略は、経路の最終産物に基づいているため、反応の各ステップに対して新たな選択系を設定することなく、以前の全てのステップを独立して又は順に進化させることができる。
【０２４９】
別の形で表現すると、所望の触媒活性を有するポリペプチドをコードする1つ以上のポリヌクレオチドを単離する方法が提供され、方法は、
(1)ポリヌクレオチドを発現させて、それぞれのポリペプチドを得るステップと、
(2)直接選択可能であってもなくてもよい産物への基質の転換を、所望の活性に応じて、ポリペプチドに触媒させるステップと、
(3)任意に、最初の反応を1つ以上の後続の反応に結合するステップであり、各反応は、前の反応の産物により調整され、最終的な選択可能な産物の作成につながるステップと、
(4)触媒作用の選択可能な産物をポリヌクレオチドに連結するステップであり、
a)産物がポリヌクレオチドと会合するような形で、基質をポリヌクレオチドに結合すること、又は
b)産物上に残る基質に付着した適切な分子「タグ」により、選択可能な産物をポリヌクレオチドと反応又は結合させること、又は
c)産物との産物特異的な反応又は相互作用により、(基質ではなく)選択可能な産物をポリヌクレオチドに結合させること、の何れかにより行われるステップと、
(5)触媒作用の産物を、その特徴的な光学特性により、又は産物に特異的に結合又は特異的に反応し、これによりポリヌクレオチドの光学特性に変化を誘導する試薬を添加することにより、それが結合したポリヌクレオチドと共に選択するステップと、を備え、ここでステップ(1)乃至(4)において、各ポリヌクレオチド及びそれぞれのポリペプチドは、マイクロカプセル内に含まれる。
【０２５０】
本明細書に記載の全ての触媒方式は、ポリペプチド及び基質/阻害剤/産物/試薬の役割を逆にしても実行し得る。例えば、本発明のライブラリポリペプチドは、標的として酵素を提供することにより、基質活性又は調節活性についてスクリーニングし得る。調節活動による選択も以下で説明する。
【０２５１】
4.7.3 基質特異性/選択性
【０２５２】
基質特異性又は選択性を有する酵素をコードするポリヌクレオチドは、ある基質との反応について正の選択を行い、別の基質との反応について負の選択を行うことにより、特異的に濃縮することができる。このような正と負の選択圧力の組み合わせは、位置選択的酵素及び立体選択的酵素(例えば、同じ基質の2つのエナンチオマを区別可能な酵素)の分離に非常に重要なものとなるはずである。例えば、2つの基質(例えば、2つの異なるエナンチオマ)は、それぞれ異なるタグ(例えば、2つの異なるフルオロフォア)により標識され、タグが酵素触媒反応によりポリヌクレオチドに付着するようになる。2つのタグが異なる光学特性をポリヌクレオチドに付与する場合、酵素の基質特異性をポリヌクレオチドの光学特性により決定させることが可能であり、誤った特異性を有する(又は特異性がない)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを拒絶することができる。異なる光学特性を有するタグ特異的リガンドが添加されている場合(例えば、異なるフルオロフォアにより標識されたタグ特異的抗体)、光学活性に変化を与えないタグも使用することできる。
【０２５３】
4.7.4 調節
【０２５４】
類似する系を用いて、環状ポリペプチドの調節特性を選択することができる。
【０２５５】
生化学プロセスの活性化因子又は阻害因子として作用するレギュレータ分子を選択する場合、生化学プロセスの成分は、各区画でin situで翻訳すること、又は区画化の前に反応混合物に組み込むことが可能であり、例外として区画材料に浸透可能な成分を、区画化後に区画と接触させでもよい。選択されるポリヌクレオチドが活性化因子をコードするものである場合、触媒作用に関連して上述したように、調節された反応の産物について選択を行うことができる。阻害因子が望まれる場合は、選択は、調節された反応の基質に特異的な化学的性質、又は調節された反応の産物に特異的な化学的性質の欠如に対するものにすることができる。
【０２５６】
したがって、所望の調節活性を示すポリペプチドをコードする1つ以上のポリヌクレオチドをソーティングする方法が提供され、方法は、
(1)ポリヌクレオチドを発現させて、それぞれのポリペプチドを得るステップと、
(2)選択可能な分子の生成又は生存を可能にするような形で、所望の活性に応じて、ポリペプチドに生化学反応又は一連の共役反応を活性化又は阻害させるステップと、
(3)選択可能な分子をポリヌクレオチドに連結するステップであり、
a)選択可能な分子、又はそれが由来する基質を、ポリヌクレオチドに付着させること、又は
b)産物上に残る基質に付着した適切な分子「タグ」により、選択可能な産物をポリヌクレオチドに反応又は結合させること、又は
c)産物との産物特異的な反応又は相互作用により、(基質ではなく)触媒作用の産物をポリヌクレオチドに結合させること、又は
d)反応の成分と任意の産物とをゲル内に固定化すること(このモードにおいて、プロセスの開始時にカプセル化された反応成分にゲル形成剤を含める必要があり、ゲルは、例えば、反応をゲルの相変化温度まで冷却することにより形成され得る)、又は
e)反応成分と任意の産物とをマイクロカプセル内に維持すること、の何れかにより行われるステップと、
(4)選択可能な産物を、その特徴的な光学特性により、又は産物に特異的に結合又は特異的に反応し、これによりポリヌクレオチドの光学特性に変化を誘導する試薬を添加することにより、それが結合したポリヌクレオチドと共に選択するステップと、を備え、ここでステップ(1)乃至(3)において、各ポリヌクレオチド及びそれぞれのポリペプチドは、マイクロカプセル内に含まれる。
【０２５７】
ステップ(3)の選択肢(e)、及びステップ(4)の試薬の添加を含むモードでは、そのような任意の試薬を浸透させる半透性区画材料を選択するべきである。実施形態において、ソーティングの前に区画は破壊されない。
【０２５８】
一般に、生化学的活性のレギュレータ又はモジュレータ、例えば酵素の活性化因子又は阻害因子を選択する場合、候補レギュレータ(この場合は環状ポリペプチド)を調節の標的と接触させる。標的及び候補は、更に、活性が生じるために通常必要な(即ち、アッセイに干渉する恐れのあるレギュレータが全く存在しない状態で)他の全ての反応条件及び成分と接触させる。混合物を一定期間インキュベートした後、標的の活性又はその不在を評価する。
【０２５９】
レポータを反応に含めて、任意の活性の検出を容易にし得る。検出可能なレポータは、標準的な検出方法により検出可能な分子、原子、イオン、又は基である。例えば、レポータは、発色基質又は適切な励起波長の光との接触等の刺激に応答して、検出可能なシグナルを生成可能であってもよい。
【０２６０】
検出可能なレポータの存在又は量は、レポータにより生成されるシグナルを検出又は測定することにより決定し得る。適切な検出可能な標識には、蛍光レポータ、発色レポータ、メルカプトピリジン、チオフェノール(TP)、メルカプト安息香酸(MBA)、及びジチオビススクシンイミジルニトロベンゾアート(DNBA)等のラマン活性レポータ、質量分析レポータ、並びに画像解析による形状により特定可能な粒子が含まれ得る。
【０２６１】
適切な蛍光レポータには、O-メチル-フルオレセイン又はフルオレセインイソチオシアナート(FITC)等のフルオレセイン及びフルオレセイン誘導体、フィコエリトリン、ユウロピウム、TruRed、アロフィコシアニン(APC)、PerCP、リサミン、ローダミン、B X-ローダミン、TRITC、BODIPY-FL、FluorX、Red613、R-フィコエリトリン(PE)、NBD、ルシファーイエロー、カスケードブルー、メトキシクマリン、アミノクマリン、テキサスレッド、ヒドロキシクマリン、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、及びAlexa Fluor 700等のAlexa Fluor色素(Molecular Probes)、Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、及びCy7等のスルホンナートシアニン色素(AP Biotech)、IRD41 IRD700(Li-Cor、Inc.)、NIR-1(Dejindom、日本)、La Jolla Blue(Diatron)、DyLightTM405、488、549、633、649、680、及び800反応染料(Pierce/Thermo Fisher Scientific Inc)、又はIRDyeTM等のLI-CORTM色素(LI-CORTM Biosciences)が含まれる。
【０２６２】
レポータは、基質、産物、又は生化学プロセスの中間体にし得る。レポータは、調節の標的の直接の基質又は産物であってよい。他の実施形態において、レポータは、調節の標的の直接の基質又は産物ではなくてもよい。例えば、レポータは、生化学的活性の早いステップにおいて作用又は生成され得る。又は、レポータは、生化学的活性の遅いステップにおいて作用又は生成され得る。単純な酵素カスケードにおいて、レポータの蓄積は(環状ポリペプチドが欠如した対照と比較して)、レポータの生成に先行する任意のステップ(「上流」ステップ)での活性化及び/又はレポータの生成に続く任意のステップ(「下流」ステップ)の阻害を示す。逆に、レポータの不在は、レポータの生成に先行する任意のステップの阻害及び/又はレポータの生成に続く任意のステップの活性化を示す。又は、レポータは、調節の標的を含む生化学プロセスに共役された別個の生化学プロセスの基質又は産物である。
【０２６３】
特定の酵素の作用により検出可能なレポータに転換され得る適切なレポータ基質は、当該技術分野において周知である。例えば、レポータ基質フルオレセインジサルフェートは、アリールスルファターゼにより検出可能なレポータフルオレセインに転換し得る。同様に、リン酸フルオレセイン及び酢酸フルオレセインは、それぞれホスファターゼ及びアセチラーゼと共に使用し得る。
【０２６４】
多数のレポータ基質が市販されており(例えば、Molecular Probes Inc)、標準的な手順により合成し得る。
【０２６５】
好ましくは、検出可能なレポータは、ビーズ内に保持される。
【０２６６】
他の実施形態において、レポータは、生化学プロセスの成分に結合するリガンドにし得る。これにより、候補レギュレータは、レポータの結合活性を調整し得る。この場合、適切なレポータは、結合時に、検出可能な物理化学的変化を受ける。レポータは、調節の対象に直接的に結合し得る。他の実施形態において、レポータは、調節の標的に直接結合するのではなく、生化学的活性において調節の標的の上流又は下流にある別の成分に結合してもよい。しかしながら、何れの場合も、レポータの結合は、直接的か間接的かに係わらず、調節の標的の活性に依存する必要がある。候補レギュレータがレポータの結合を阻害する場合、結合していないレポータに関連するシグナルが優位になる(即ち、ポジティブコントロールに対して増加する)。逆に、候補レギュレータが結合を促進する場合、結合したレポータに関連するシグナルが優位になる(即ち、ネガティブコントロールに対して増加する)。
【０２６７】
他の形式は、当業者により容易に考慮されるであろう。例えば、調節の標的は、生化学的活性の別の成分がレポータに結合するのを妨げる阻害剤を生成する反応を触媒する酵素にし得る。何れの場合も、調節成分の存在と、そのレポータに対する影響との関係は、当業者により容易に確認されよう。
【０２６８】
実施形態において、レポータアッセイの成分は、IVTT系と同時に区画に組み込まれる。レポータアッセイの一部の成分は、環状ポリペプチドの発現に付随して、カプセル内のIVTT系により追加のポリヌクレオチドから転写されてもよい。
【０２６９】
一部の実施形態では、共固定化されたポリヌクレオチド及び環状ペプチドを含む区画/脱区画化ゲルビーズを、レポータアッセイの成分を含む培地と接触させ得る。
【０２７０】
一部の実施形態において、レポータアッセイの一部の成分、及び/又はレポータアッセイの成分をコードするポリヌクレオチドは、IVTT系と同時に区画に組み込まれる。この実施形態において、レポータアッセイの残りの成分は、後の段階で区画又は脱区画化ゲルビーズと接触させる。
【０２７１】
レポータアッセイ成分を区画と接触させる実施形態では、当初は区画の外部環境にのみ存在するレポータアッセイ成分が、区画の境界を越えて区画の内部容積に浸透できるように、区画材料を選択するべきである。
【０２７２】
4.7.5 タンパク質間相互作用
【０２７３】
タンパク質間相互作用(PPI)は、ライブラリと共にカプセル化される、又は後で液滴マージングを用いてマージされる、又はアッセイ培地において脱区画化ゲルビーズを再構成することにより組み込まれるアッセイ(例えば、FRETアッセイ又はHTRFアッセイ)によりモニタすることができる。
【０２７４】
アッセイを行うために、FRETドナー部分を相互作用する一対のタンパク質の一方に付着させ、FRETアクセプタ部分を相互作用する一対のタンパク質の他方に結合し得る。2つのタンパク質が相互作用している際の共鳴エネルギ移動のための十分な近接性を確保するドナー/アクセプタ部分の位置決めは、当業者の範囲内である。その後、FRET機能化タンパク質をライブラリのポリペプチドに接触させる。
【０２７５】
2つのタンパク質間の相互作用を阻害する、本発明によるポリペプチドの存在は、FRETではないとしても、不活性分子を含むものはFRETシグナルを表示する。これら2つの種は、FACSにより容易に分離することができる。
【０２７６】
アッセイは、2つのタンパク質間の相互作用を形成又は強化するポリペプチドを同定するために反対方向に実行してもよく、この場合、FRETの存在又は増加は、相互作用を促進するポリペプチドを示す。
【０２７７】
4.7.6 ポリペプチドの光学特性
【０２７８】
区画内で、例えばポリヌクレオチドの一部であるリガンドに結合するポリペプチドの共通要素を介して、ポリペプチドがポリヌクレオチドに再び結合する場合、ポリペプチドの固有の光学特性を選択することが可能となる。ポリヌクレオチドは、その後、結合したポリペプチドの光学特性を用いてソーティングすることができる。この実施形態は、例えば、改良された蛍光及び/又は新規の吸収及び発光スペクトルを有する緑色蛍光タンパク質(GFP)のバリアントを選択するために使用することができる(Cormack et al., 1996、Delagrave et al., 1995、Ehrig et al., 1995)。
【０２７９】
4.7.7 ポリヌクレオチド/ポリペプチドのフローソーティング
【０２８０】
本発明の好適な実施形態において、ビーズ、カプセル、ポリヌクレオチド、及び/又はポリペプチドは、フローサイトメトリによりソーティングされる。光散乱((Kerker, 1983)及び蛍光偏光(Rolland et al., 1985)を含め、様々な光学特性を用いてソーティングを行うことができる。非常に好適な実施形態において、ビーズ、カプセル、ポリヌクレオチド、及び/又はポリペプチドの光学特性の違いは、蛍光の違いであり、ビーズ、カプセル、ポリヌクレオチド、及び/又はポリペプチドは、蛍光活性化細胞ソータ(Norman, 1980; Mackenzie and Pinder, 1986)、又は同様のデバイスを用いてソーティングされる。特に好適な実施形態において、ビーズ、カプセル、ポリヌクレオチド、及び/又はポリペプチドは、直径0.6乃至1.0μmが最適となる非蛍光非磁性(例えば、ポリスチレン)又は常磁性マイクロビーズ(Fornusek and Vetvicka, 1986参照)を含み、これに蛍光シグナルの生成に関与する遺伝子及び基の両方を付着させ:
(1)定評のある製造業者(例えば、Becton-Dickinson、Coulter)の市販の蛍光活性化細胞ソーティング設備により、1時間当たり最大108個のビーズ、カプセル、ポリヌクレオチド、及び/又はポリペプチド(イベント)をソーティングすることが可能であり、
(2)各ビーズからの蛍光シグナルは、ビーズに付着した蛍光分子の数と緊密に対応しており、現在、粒子当たり僅か数百個の蛍光分子を定量的に検出可能であり、
(3)蛍光検出器の広いダイナミックレンジ(一般に4log単位)により、ソーティング手順のストリンジェンシを容易に設定できるため、開始プールから最適な数のビーズ、カプセル、ポリヌクレオチド、及び/又はポリペプチドを回収することが可能であり(ゲートは、蛍光の小さな差でビーズを分離するように、又は蛍光の大きな差でのみビーズを分離するように、実行される選択に応じて設定することが可能)、
(4)市販の蛍光活性化細胞ソーティング設備は、2種類までの異なる波長で同時励起を行い、4種類までの異なる波長で蛍光を検出することが可能であり(Shapiro, 1983)、2種類(以上)の異なる蛍光マーカを備えたビーズ、カプセル、ポリヌクレオチド、及び/又はポリペプチドの標識をモニタすることにより、正及び負の選択を同時に実行することができ、例えば、酵素の2種類の代替基質(例えば2つの異なるエナンチオマ)が異なる蛍光タグにより標識されている場合、ビーズ、カプセル、ポリヌクレオチド、及びポリペプチドは、使用される基質に応じて異なるフルオロフォアにより標識可能であり、エナンチオ選択性を有する酵素をコードする遺伝子のみが選択され、
(5)高均一性の誘導体化/非誘導体化非磁性/常磁性微粒子(ビーズ)は、多くの供給元(Sigma、Molecular Probes等)から市販されている(Fornusek and Vetvicka, 1986)。
【０２８１】
4.8 ポリヌクレオチドの単離
【０２８２】
1つ以上のビーズからのポリヌクレオチドは、単離、増幅、クローン化、配列決定、又は他の形で操作し得る。
【０２８３】
本明細書に記載の方法は、更に、候補環状ポリペプチドを含むものとして同定された1つ以上の区画又はビーズからポリヌクレオチドを同定及び/又は単離することを含み得る。
【０２８４】
1つ以上のビーズからのポリヌクレオチドは、単離、増幅、配列決定、クローン化、及び/又は他の形で精査し得る。例えば、ポリヌクレオチドに対しては、ゲル抽出カラム又はアガロース等の従来の手法を用いた抽出、及び/又は等温的な増幅(例えば、多重プライムRCA)、若しくはPCRによる増幅、若しくは両方による連続的な増幅を実行し得る。
【０２８５】
本明細書に記載の方法は、区画が、例えば、小胞又はアルギン酸マイクロカプセルである系に対しても援用することができる。これらの系を操作して、PCR、アガロースゲル化、IVTT用のマイクロリアクタを提供し、その後アッセイ及び高スループットのソーティングを実行することもできる。
【実施例】
【０２８６】
5 実施例
【０２８７】
5.1 実施例の序文
【０２８８】
一実施形態において、本発明は、SICLOPPSをマイクロ流体液滴に移植することにより、当該技術分野の制限を克服する。各液滴において個々のSICLOPPSライブラリ構成要素を発現させることが可能であるのに加え、これはin vitro転写/翻訳により達成されるため、各環状ペプチドのDNAコードも同じ液滴に含まれているため、PCR増幅及びDNA配列決定により、ヒットの特定も非常に簡便となる。このライブラリは、蛍光又は比色分析の出力(例えば、FRET、HTRF)を含む任意の医薬品アッセイと連係させることができる。この方法は、更に、数億の環状ペプチドのライブラリの生成を可能にし、非天然アミノ酸を含めることができる。
【０２８９】
液滴マージングの制限を克服するために、in vitroでのタンパク質発現の前に、高並列且つ高効率の単一分子DNA増幅のための油中アガロース型液滴に基づく方法を利用する。この方法は、Phi29 DNAポリメラーゼによる増幅前に単一のDNA分子を捕捉するために、アガロースの熱応答性ゾルゲルスイッチング特性を利用する。DNA増幅に続いて、アガロース液滴をゲル化(又は固化)してアガロースビーズを形成することにより、各マイクロリアクタ内の全てのアンプリコンを捕捉し、各液滴のモノクローナル性を保存する。
【０２９０】
単分散の油中アガロース型微小液滴の使用は、これまでゲル化したマイクロビーズ内の生化学反応を監視するために使用されてきた。前述したように、アガロース液滴から固化アガロース粒子への転移は、安定性を高め、操作を容易にする。固化後、アガロースビーズ内のみに対する等温増幅DNAの単離について説明する(即ち、前増幅されたDNAは外部に拡散しない)。したがって、結果的に生じた粒子は、エマルションを解乳化して回収し洗浄して、IVTT適合性バッファに再懸濁して、液滴マージングに関連する制約を効果的に回避することができる。IVTT適合性バッファに再懸濁した後、IVTT系の他の成分を添加してもよく、実施形態において、IVTTコンピテントアガロースビーズを再乳化し、IVTTマイクロリアクタを形成してもよい。
【０２９１】
開発された方法論は、効率的な単一分子DNA増幅による均一な液滴の高スループット生成を可能とするため、多くのシングルコピー遺伝子に基づく研究に有望なプラットフォームをもたらす。
【０２９２】
全体としては、フェムトリットルサイズの水性区画におけるSICLOPPS由来の環状ペプチドライブラリのin vitroでの区画化を介した、タンパク質間相互作用阻害剤の迅速な選択に使用可能であり、所望の表現型形質を示す液滴を選択的に回収するためにFACSを用いる、新規の超高スループットスクリーニングプラットフォームを実証している。
【０２９３】
DNA濃縮アガロース粒子の単離を可能にする、固化及び(PFOの添加を介した)その後のエマルションの解乳化による、単分散アガロース液滴における単分子DNA増幅の成功について説明する。増幅されたDNAは、蛍光dsDNAインターカレーティング色素により染色することで検出され、同時にフローサイトメトリによる検出が可能になる。側方対前方散乱図で単一の明確なアガロース粒子集団が観察され、Phi29 DNAポリメラーゼを含まない対照と比較して、緑色蛍光強度が顕著に増加している。
【０２９４】
IVTT含有液滴にアガロース粒子を導入する前に、アガロースビーズを洗浄して、未結合のDNAの除去を、不適合DNA増幅バッファの除去と共に行い、洗浄がされない場合、IVTTは阻害され、GFP発現は、観察されない。
【０２９５】
油中IVTT中アガロース(ダブルエマルション)形成の場合、アガロース粒子は、IVTT成分と共に、疎水性マイクロ流体デバイスに再導入される。37℃でのインキュベーション後、エマルションを氷上に置いてタンパク質発現を停止する。トリプルエマルション形成(水中油中IVTT中アガロース)の場合、ダブルエマルションの液滴を第3の最終親水性マイクロ流体デバイスに注入し、フローサイトメトリに適合した構成に再乳化する。
【０２９６】
最後に、GFPをコードするプラスミドからin vitroで発現したGFPを含むトリプルエマルションは、FACSを用いてソーティングすることができる。液滴は、毎秒1,000イベント、即ち毎分60,000イベント、又は毎時320万イベントを超える速度で注入及びソーティングされる。
【０２９７】
全体としては、マイクロ流体的に生成された液滴でのポリペプチドのin vitro発現のためのIVTTにおけるアガロース粒子の実装の成功を実証している。
【０２９８】
実施例1: フェムトリットルスケールでの単分散単一油中水型液滴の生成
【０２９９】
体積5乃至50fLの液滴を達成する能力を有するチップ上の10×5μm(幅×深さ)フローフォーカシングマイクロ流体デバイスを用いた水性フェムト液滴の生成を、図1に示しており、これにより2つの不混和性液体が4つの平行マイクロチャネルを介してデバイスに入り、連続的なHFE-7500に基づく相が外側の2チャネルから流入し、分散水相が内側の2チャネルから流入する。下流では、水性マイクロチャネルがオリフィスに入る前に合流する。Shim et al.において報告されているような液滴形成中のノズルオリフィスで最初に観察される固定された細長い水流は、滴下分断レジームによる液滴生成作用の「チップストリーミング」メカニズム、即ち、より小さな液滴(直径0.5μm程度)が放出される非常に鋭い先端を有する円錐液滴形状の形成を表している。1934年に最初に報告された、界面活性剤媒介マイクロスケールチップストリーミングは、フローフォーカシングジオメトリ内で生成される延伸的な流れの結果として生じる界面での界面活性剤の濃度勾配により、サブミクロンサイズの液滴を生成可能な流体力学的現象を表す。
【０３００】
SICLOPPSライブラリカプセル化用の単分散油中水型(w/o)フェムト液滴の十分に制御された生成を実証するため、1×TAE中(pH約7.5、FITC蛍光の放出は、周囲のpHに強く依存するため)に100μMフルオレセイン(FITC色素)を含む液滴を、5％Krytox 157 FSL Jeffamine ED-600二塩界面活性剤(JUS、市販されておらず)と事前に混合して油水界面での界面張力を低下させたハイドロフルオロエーテルHFE-7500中で形成した。フェムト液滴形成の頻度を精査し、これにより経時的に達成可能なカプセル化SICLOPPSライブラリバリアントの理論上の数を決定するために(単一分子カプセル化を想定)、体積流量が液滴径に及ぼす影響(油/水の流量比、R1/R2により規定)を、10μl/hの一定の水流を維持しながら、段階的(10乃至60μl/h)に油相流量を増加させることにより調べた。液滴形成の頻度は、液滴サイズの減少と共に増加すると予想され、理論的に次のように計算された:f=Qaq/Dv、ここで、fは、生成頻度(Hz)、Qaqは、水相流量(μl/s)、Vdは、最終液滴体積(μl)である。
【０３０１】
マイクロ流体的に生成されたエマルション液滴の直径を決定するために、使い捨てのFast-Read Counting Slideに試料をピペットで入れ、Olympus CKX41倒立顕微鏡又はZeiss Axio IIを用いて画像化し、QIClick CCDカメラを画像取り込みのために取り付け、オープンソースの顕微鏡ソフトウェア(Micro-Manager)を用いて制御した。分析のために、明視野及び蛍光写真を16ビットファイルとして保存し、ImageJソフトウェアにより処理し、「粒子分析」機能により液滴の直径及び体積の統計を作成した。これに応じて、指定した最小カットオフ(0.8)より大きい全ての対象について、ユーザ定義の閾値を超える真円度を測定し、データ処理のために集計した。結果として、各流量条件下での液滴径分布を図2に示す。
【０３０２】
油/界面活性剤の流量が増加すると、その後、全体の液滴径が減少する。同様に、図3に示したように、液滴体積の減少は、その生成頻度の増加と一致する。
【０３０３】
実施例2: フローサイトメトリ分析のための水中油中水型ダブルエマルション液滴の生成
【０３０４】
SICLOPPS封入エマルション試料のフローサイトメトリ分析のためには、2ステップの再乳化により生成されたダブルエマルション水中油中水型構成が適合性を確保する必要がある。したがって、10×5μmのマイクロ流体デバイスにより生成した一次FITC含有油中水型エマルションを、マイクロチャネル寸法15×16μmの第2の親水性フローフォーカシングチップを用いてダブルエマルション液滴に転換した。再乳化を可能にするために、一次エマルションをガラスシリンジ内において直立状態で保存し、フッ素化した鉱油溶液によりフレーク状にした。カプセル化中には、第2のFC-40充填シリンジを追加して、ダブルエマルション毎に単一の一次液滴を制御された形で容易に操作及びカプセル化できるようにした。同時に、1％tris/tween80界面活性剤を含む連続相を用いて、界面を安定化した。オンチップの2ステップ乳化プロセスを図4に示す。
【０３０５】
加えて、フローフォーカスマイクロ流体ジオメトリを用いたシングル及びダブルエマルション液滴生成のワークフローを図5に示す。
【０３０６】
結果的に生じた液滴内径は、平均約6.69μmとなる一方、ダブルエマルション外径は、約14.98μmとなり、したがって、これらの約1.76pLのダブルエマルションにより、約5.68×108液滴/mLが得られる。大部分(10枚の画像の平均で98.21％)は、単一の水性コアを含むことが観察されたが、僅かな割合(1.79％)で、二重に占有されていることが分かった(図6の矢印)。液滴の安定性及び構造の完全性は、4℃で1か月保存した後も維持された。
【０３０７】
その後、図6のダブルエマルション液滴は、BD Accuri C6フローサイトメータを用いて分析した。オンチップで生成したダブルエマルション液滴の密度プロットは、サイトメトリの前方及び側方散乱(図7のFSC及びSSC、)において2つの明確なクラスタを形成する。FSCは、サイズ(直径)に基づいて液滴を区別するが、SSCは、内部の複雑度(又は粒度)に基づいて液滴を区別するために使用される。結果として、内部水性コアを含むダブルエマルション液滴は、空の水中油型液滴よりも大きな側方散乱を示し、そのためSSC対FSC密度/散乱プロットにおいて、より高い位置を示す。単分散の液滴集団は、同様の前方散乱を示す。単独占有(内部フルオレセインコアを含む液滴)と及び未占有の液滴、即ち、オンチップ再乳化中に一次油中水型液滴をカプセル化できなかったものを、図7Aに示す。この区別は、図6Bに示すように、対応する緑色蛍光強度プロファイルにより更に裏付けられ、ここで、単独占有FITC含有液滴を表す高蛍光液滴集団は、蛍光のベースラインレベルを表す第2の低い位置にある集団(未占有の液滴)の蛍光信号よりも略3桁大きい蛍光信号を有する。
【０３０８】
バックグラウンド蛍光レベルは、前に使用されたものと全く同一の試薬及び条件で単純な水中油型液滴を調製することにより確認した。単一の蛍光ピーク及び液滴集団が、それぞれ結果的に得られた蛍光ヒストグラム及びSSC対FSCプロットから観察され、これらは図7A及び7Bのものに直接対応する。
【０３０９】
実施例3: 液滴内の320万個の環状ペプチドのライブラリの作成
【０３１０】
環状ペプチドを含む液滴の同定を容易にするために、SICLOIPPSインテイン及び蛍光タンパク質(GFP)の両方をコードする発現系を設計した。SICLOPPSプラスミドを含む液滴は、FACSを用いて、その蛍光に基づき容易に同定及びソーティング/分離することができる。SICLOPPS形式(IC-エクステイン-IN)でNpuスプリットインテインをコードするpETDuetに基づくプラスミドを、ベクタpARNpuHisSsrA-CX5からCX5 SICLOPPSライブラリを構築するために作成した(Townend and Tavassoli, 2016, ACS Chemical Biology, 1624-1630)。C-及びN-インテインをコードする領域は、ペプチドをコードする六量体と共に、それぞれEco RI及びHind III制限酵素をコードするフォワード及びリバースプライマを用いてPCR増幅し、リバースプライマは、SsrA分解タグを省略するように設計した。次に、この増幅産物を消化し、その後、ベクタpETDuet-1の第1の多重クローニング部位(MCS1)にクローニングした。GFPは、それぞれNde I及びEco RV制限酵素部位をコードするフォワード及びリバースプライマを用いて、コードする遺伝子ブロックからPCR増幅し、この構築物を同様にベクタpETDuet-1のMCS2にクローニングして、SICLOPPS及びGFPタンパク質の両方をコードするベクタを生成した。結果的に生じたプラスミドは、以後、SICLOPPS環状ペプチドライブラリ構築においてテンプレートとして利用した。
【０３１１】
5つの可変アミノ酸を含み、したがって3.2×106のライブラリ構成要素(X=任意のアミノ酸残基)を含む六量体ライブラリを、前述のように構築した(Tavassoli and Benkovic, 2007, Nature Protocols, 1126-1133)。ライブラリは、最初のシステイン残基に5つのランダム化された残基が続くpETDuet-1の第1の多重クローニング部位(MCS)内で環状ペプチド六量体をコードするように設計され、これは第1の位置の求核試薬が、インテインプロセシングのエステル交換ステップに必要であるためである(第1の位置の求核試薬を提供するのに適した他の残基には、セリン(S)及びトレオニン(T)が含まれる)。第2のMCSは、GFPを発現するように構築され、したがって環状ペプチド及び蛍光タンパク質の両方を同時に発現させ、環状ペプチド含有液滴の迅速且つ体系的な同定を可能にする。
【０３１２】
結果的に生じたプラスミドを図15に示す。
【０３１３】
以前に詳述したように(Tavassoli and Benkovic, 2007, Nature Protocols, 1126-1133)、ライブラリのランダムオリゴヌクレオチドが、ICの3’末端及びINの5’末端に結合する領域の間のフォワードプライマに組み込まれる、2ステップのPCRに基づく手法を用いた。可変セグメントは、NNSの形式でコードされ、Nは、4つのDNA塩基の何れか(A、C、G、又はT)を表し、Sは、C又はGを表す。NNS配列により、32のコドンが生じ、20種類の天然アミノ酸全てがコードされたが、オーカー(UAA)及びオパール(UGA)停止コドンは、ライブラリから除外された。標的ペプチド内のアミノ酸の数に制限はなく、様々なサイズの環状ペプチドを生成可能であることに留意されたい。
【０３１４】
最初の線状PCR産物の生成では、ライブラリの配列の複雑度のため、ランダムヌクレオチド領域にはミスマッチが生じる。そのため、C-インテインの3’末端に対応する「ジッパ」プライマを用いた2回目のPCRを使用して、全てのDNA配列を相補鎖へ確実にアニーリングした。結果的に生じたDNAライブラリは、標準的な分子生物学的手法を用いてSICLOPPSプラスミドに組み込み、所望のCX5ライブラリをベクタpDuetNpuHis-GFP内で生成した。
【０３１５】
ライゲーション後、SICLOPPS CX5ペプチドライブラリを、エレクトロコンピテントDH5α E.coli細胞に形質転換し、LB寒天培地に播種し、37℃で一晩培養した。培養後、結果的に生じたコロニをコロニのスクレイピングにより回収し、ミニプレップして、上述したような油中アガロース型液滴におけるカプセル化及びPhi29媒介前増幅の準備が整ったプラスミドライブラリを得た。
【０３１６】
実施例4: アガロースに基づく液滴マイクロフルイディクスを用いた生化学操作の小型化
【０３１７】
上記のプラスミドライブラリ(実施例3において生成)を以下の実験に用いた。ゲル化アガロースビーズにおけるアンプリコン捕捉及びDNA増幅のための油中アガロース型エマルション液滴の応用は、従来のPCR及びプライマ機能化マイクロビーズ法の課題に取り組むための強力なアプローチとして実現された。ここでは、アガロースの独特な熱応答性ゾル-ゲルスイッチング特性を利用して、直径6乃至7μmのフェムトリットルサイズのアガロースビーズにおいて単一DNAプラスミド分子を増幅するための高並列Phi29 DNAポリメラーゼ媒介プロトコルを説明する。共カプセル化された等温増幅試薬を、捕捉マトリクスとしてのアガロースと共に有する2水溶液入口式エマルション液滴ジェネレータを利用する。各産物のモノクローナル性は、結果として、各リザーバ/ビーズの堅牢且つ不活性な生化学的環境内に保存される。捕捉されたアンプリコンを封入する固化ビーズは、その後、図8に示すように、定められた反応体積でのタンパク質発現を研究するために、液滴マージングのない状態でin vitro転写翻訳(IVTT)系に共カプセル化される。結果として、遺伝子転写及び翻訳の無膜アガロース粒子への閉じ込めを実証しており、これにより、複雑な生物系の新しい研究を定量的に行うことを可能にすることにおける、この来たるべき技術の可能性を実証している。
【０３１８】
図9は、1％アガロース溶液を含む高均一性で単分散のフェムトリットルエマルション液滴の制御された生成のための微細加工された疎水性デバイス内での、Phi29 DNAポリメラーゼを用いた単一DNAプラスミド分子のカプセル化及び増幅に使用されるアガロース液滴マイクロ流体セットアップを示している。DNAテンプレート分子は、単一の液滴内の平均分子数が略1以下になるように、統計的に希釈された濃度で、アガロース溶液と共に液滴に導入される。37℃で流動性を保ち、転移ゲル化点が8乃至17℃である超低ゲル化温度のアガロースをカプセル化に用いて、デバイス操作中にアガロース液滴の容易な生成を可能にする。オフチップのインキュベーション及びDNA増幅に続いて、溶液を臨界ゲル化点以下に冷却することにより、アガロースマトリクスの固体ゲル相へのスイッチングが可能となる。固化すると、温度が上昇しない限り、ビーズは、固体状態を保つ。その結果、増幅されたDNAは、固化したアガロースマトリクス内に捕捉された状態を維持するため、外部の油相を除去した後も、液滴のモノクローナル性が保持される。
【０３１９】
液滴生成のために、結果的に生じたプラスミドライブラリをポアソン統計に従って統計的に希釈し、平均(λ)で、(i)単一分子カプセル化を表す0.1、又は(ii)平均100のライブラリコピー(原理証明として)が、110fLの油中アガロース型液滴にカプセル化される状態を確保した。結果的に生じたプラスミドライブラリは、Phi29 DNAポリメラーゼ媒介等温増幅試薬と共に、JUSデバイスに注入し、各水相で10μl/h、油/界面活性剤混合物QX200(液滴生成油)で30μl/hの水溶液流量を用いてカプセル化した。均一なアガロースエマルション液滴を生成するために、アガロースを1×TAEバッファと共に、QX200油/界面活性剤を連続相としてマイクロ流体デバイスにロードした。アガロースを液滴生成のための液体状態に維持するために、アガロースを充填する前及びデバイス操作中に、アガロースを含むシリンジを市販のマイクロ波加熱パックにより予熱した(図9A)。又は、市販の5V DC電源5×10cm加熱パッド(図9B)を購入し、標準の5V USBケーブルに手動で接続し、10分間の操作中略40℃の温度を発生させる機能を備えた、継続使用するための加熱素子を生成した。
【０３２０】
収集後(図10A)、Phi29 DNAポリメラーゼ増幅成分を有するDNAを含むアガロース液滴を、30℃で一晩インキュベートした。氷上でのインキュベーションによる固化とPFOを用いたビーズ抽出とを行い、所望のアガロースビーズ集団を単離した。結果として、DNAに結合する蛍光二本鎖DNAによりビーズが染色され、内部DNAの可視化が可能となった(図10C)。
【０３２１】
増幅前に平均で100、10、1、又は0.1の開始DNAコピー(λ値)(0.1は単一分子のカプセル化を表す)を含む染色アガロースビーズのフローサイトメトリ分析(図11)を、図13に示す。16時間の一晩のインキュベーション(1滴当たり略12,000の最終DNAコピーに相当)は、大量のDNAを生成する上で、4時間のインキュベーションと比較して好ましい。全ての場合において、DNAのみ又は空の(DNAの無い)アガロースビーズを含む陰性対照と比較して、明確なPhi29 DNAポリメラーゼ媒介DNA増幅が、各実験条件で観察される。
【０３２２】
DNA増幅に用いられるバッファ系は、液滴に基づくIVTTに適合しないことが知られているため、モノクローナル増幅プラスミドDNAを含むアガロースビーズは、固化させ、その後、遠心分離により洗浄して、IVTTに適合する溶液に再懸濁する。PURExpress系を使用したIVTTと我々のプラスミド含有アガロースビーズとの適合性を更に精査するために、洗浄したアガロースビーズをIVTT溶液にQX200油/界面活性剤と共に再懸濁し、ボルテックスしてバルク多分散液滴を素早く生成し、その明視野及び蛍光写真を図12に示す。興味深いことに、GFP媒介蛍光は、in vitroタンパク質発現成分を有するアガロースビーズにおいて、Phi29増幅DNAを含む試料から観察されるが、増幅がない場合、蛍光が観察されない。したがって、シングルコピーDNAカプセル化からの前増幅のステップの追加は、タンパク質構築物のin vitro媒介タンパク質発現の成功の基本となる。これは、我々の二重発現ベクタを用いた上記液滴におけるSICLOPPSライブラリ及びGFPの生成を実証している。
【０３２３】
PURExpress系を用いた、マイクロ流体的に生成された単分散液滴でのGFPのin vitro媒介タンパク質発現を実証するために、略100の開始プラスミドDNAコピーを含むアガロース液滴を、Phi29 DNA増幅(図13A)により前増幅し、前述したように洗浄した。その後、アガロースビーズをガラスシリンジに入れ、IVTT成分及び1％tris/tween80連続相と共に、疎水性15×16μmマイクロ流体デバイスに注入した。収集後、液滴を37℃で2時間インキュベートした後、15×25μmの親水性デバイスを介して乳化し、フローサイトメトリ分析用の外部水相を有するトリプルエマルション液滴とした。結果として、図13Bに示すように、in vitro GFP発現が、高単分散性のマイクロ流体的に生成された液滴において提供される。IVTT PURExpress系自体は、高レベルのバックグラウンド蛍光を示すことが観察されているものの、バックグラウンドレベルの略10倍以上の明確なGFP媒介蛍光が観察され、所望の表現型形質を回収するために、例えば蛍光活性化細胞ソーティング(FACS)を用いて、環状ペプチドを含む液滴を容易に選択することが可能となる。したがって、マイクロ流体液滴において、複雑な液滴マージング手順なしで、堅牢なアガロース及びIVTTプラットフォームを介したin vitroタンパク質発現が提供される。
【０３２４】
実施例5: 環状ペプチドの形成及びソーティング
【０３２５】
質量分析法により、エマルション内でのインテインスプライシングを介した環状ペプチドの形成を実証した。環状ペプチドは、エマルション液滴のFACSソーティング後も存在し続ける。
【０３２６】
実施例3のベクタを用いて、インテイン結合ヘキサペプチドCLLFVYをコードした。このベクタを用いて、次のように環状CLLFVYを生成した。
【０３２７】
標準的なPURExpress IVTT反応を、ベクタCSpDuetNpuHisCLLFVYの存在下で構築した。反応を、37℃で2時間インキュベートした後、質量分析を行った。結果を図16の左パネルに示す。
【０３２８】
第2の実験では、ベクタCSpDuetNpuHisCLLFVYを、30℃のTempliPhi増幅系により、高単分散性の約6μm 1％アガロースビーズにおいて一晩、前増幅した。酵素の熱不活性化後、ビーズをエマルションから分離し、diH2O中で約6,000rpmで3回遠心分離して洗浄し、(後続のIVTT操作に誤って干渉する)増幅バッファを効率的に除去した。次に、モノクローナル増幅DNAを含む洗浄済みアガロースビーズを、IVTTと共に再カプセル化してCLLFVYを発現させ、37℃で2時間インキュベート後、第3の乳化ステップを行い、ダブルエマルションFACS適合液滴を生成した。
【０３２９】
バックグラウンドを超えるGFP蛍光の増加を示すダブルエマルション集団(MCS2クローンGFP)をソーティングのために選択した。ソーティングした試料は、エマルションから分離し、質量分光分析を行った。図16の右側のパネルを参照されたい。
【０３３０】
何れの場合も、シクロCLLFVYを示すピークが明白となる。
【０３３１】
実施例6: シクロTAFDRとあわせたAB42-GFP融合のマイクロ流体液滴におけるin vitro発現
【０３３２】
環状ペプチドTAFDRは、GFPに融合したアルツハイマ病のタンパク質Aβ42の凝集を阻害することが明らかとなっているシクロペプチドである。GFPが凝集融合体として生成されると、その蛍光は失われるが、しかしながら、TAFDRにより凝集が破壊されると、GFPは、蛍光を発することができる。Mathis et al., Nature Biomedical Engineering volume 1, pages 838-852 (2017)を参照されたい。
【０３３３】
Aβ42凝集アッセイを使用して、本発明の系の性能を評価した。このアッセイは既にSICLOPPSスクリーニング(Mathis et al.)と組み合わされているため、シクロTAFDRは、検証済みの陽性環状ペプチド対照となる。図17は、この液滴中の対照ペプチドの発現が、Aβ GFP融合タンパク質と共に、Aβ凝集の破壊に関連する蛍光の有意な増加を引き起こすことを示している。
【０３３４】
ベクタCSpDuetNpuHisAB42-GFPを利用して、TAFDRをMCS1へクローニングした。その後、プラスミドDNAを等温DNA増幅反応成分と共に、高単分散性の1％アガロース液滴にカプセル化し、30℃で一晩インキュベートした。前述したようにアガロースビーズを調製し、IVTTと共に再カプセル化し、37℃で2時間インキュベートした。最終乳化ステップを実行して、FACS適合性ダブルエマルションを生成した。CA5が存在する状態の陰性対照ベクタを同様に構築し、シクロTAFDR AB42-GFP凝集阻害を検証した。バッファのみ、IVTTのみ、及びシクロCA5データと比較して、シクロTAFDR発現時に緑色蛍光の正のシフトが観察された。
【０３３５】
実施例7: ダブルエマルション液滴中のTX4 SICLOPPSライブラリのin vitro区画化及びFACSスクリーニング。
【０３３６】
実施例6の方法を使用して、TX4ライブラリでフルスクリーニングを実行した。図18は、潜在的に活性な化合物の明確なプールを示している(+ve13.1％と記載の領域)。
【０３３７】
実施例6と同様に、MCS1にNpuHis TX4、MCS2にAB42-GFP融合を含むpETDuet-1ベクタのプラスミドを構築する。IVTTの前にモノクローナルDNA増幅を可能にするため、プラスミドDNAをTempliPhi等温DNA増幅成分と共に高単分散性の約6μmのアガロースフェムト液滴にカプセル化した。試料を一晩(16時間)インキュベートして、30℃で最大増幅させた。Phi29 DNAポリメラーゼは、65℃で10分間熱失活させた。ビーズを氷上でインキュベートして、ゲル相への転換を促進し、等温増幅DNA産物を捕捉させた。エマルションからビーズを分離し、水相を抽出し、diH2O中で3回洗浄し(6,000rpm)、増幅バッファを除去した。次に、PURExpress IVTT系と共にビーズを高単分散性液滴にカプセル化した後、37℃で2時間インキュベートした。タンパク質の発現後、試料をダブルエマルション形式(水中油中IVTT中アガロースビーズ)に転換し、FACSスクリーニングを可能にした。ダブルエマルション集団を特定し、ゲートすることでライブラリのソーティングを可能にした(B)。IVTTバックグラウンドを超える蛍光測定値のみを、ダブルエマルション集団からゲートし、FL1-Hでソーティングした(GFP、A)。パーセンテージ+ve(潜在的陽性候補ペプチド)及び-veゲート粒子を、TX4ライブラリ試料のみについて示す(オレンジ色の線)。
【０３３８】
---
【０３３９】
上記明細書において言及した全ての刊行物は、出典を明記することにより本願明細書の一部とする。本発明に記載の態様及び実施形態の様々な変形及び変更は、本発明の範囲から逸脱することなく当業者に明らかとなろう。本発明を特定の好適な実施形態に関連して説明してきたが、請求される発明は、このような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解されたい。実際、当業者に明らかである、本発明を実施するための形態の様々な変形は、以下の特許請求の範囲内にあるものとする。
【符号の説明】
【０３４０】
[図1]
Aqueous: 水溶液
Oid/surfactant: 油/界面活性剤
Nozzel (5μm deep): ノズル(深さ5μm)
Flow channel (25μm deep): 流路(深さ25μm)
Femto-droplets: フェムト液滴
[図2A乃至2D]
Oid/surfactant: 油/界面活性剤
Femtodroplets: フェムト液滴
Nozzel, 5μm deep: ノズル(深さ5μm)
Flow channel, 25μm deep: 流路(深さ25μm)
Normalized droplet count: 正規化液滴数
μL/h oil: μL/h 油
Droptet diameter: 液滴径
[図3]
Droplet diameter: 液滴径
Oil flow rate: 油流量
Volume: 体積
Droplet generation rate: 液滴生成速度
[図4]
Emulsion filled syringe: エマルション充填シリンジ
Syringe needle: シリンジ針
Microfluidic device: マイクロ流体デバイス
[図5A]
Water-in-oil droplet generation: 油中水型液滴生成
Aq: 水溶液
Oil: 油
44,000 droplets per second: 毎秒44,000液滴
Collection: 収集
Agarose bead-in-water-in-oil droplet generation: 油中水中アガロース型液滴生成
Aqueout phase: 水相
[図5B]
Primary emulsion (water-in-oil) droplets: 一次エマルション(油中水型)液滴
Aqueous inner phase: 水性内相
External aqueous phase with surfactant: 界面活性剤を含む外部水性相
Hydrophilic channels: 親水性チャネル
Organic middle phase: 有機中相
Inlet: 入口
Outlet: 出口
Aqueous inlet: 水溶液入口
Debris filter: デブリフィルタ
Oil inlet: 油入口
Emulsion inlet: エマルション入口
Flow-focusing junction: フローフォーカシング接合部
Oil: 油
Aq: 水溶液
Emulsion: エマルション
OD=外形
ID=外形
[図7A乃至7D]
Side scatter: 側方散乱
Detection threshold: 検出閾値
Monodisperse droplets: 単分散液滴
Occupied: 占有
Unoccupied: 未占有
Forward scatter: 前方散乱
Green fluorecence intensity: 緑色蛍光強度
Monodisperse oil-in-water droplets: 単分散水中油型液滴
[図8A]
Agarose-in-oil droplet generation: 油中アガロース型液滴生成
2％ agarose & DNA: 2％アガロース及びDNA
Phi29 DNA polymerase: Phi2 DNAポリメラーゼ
Oil: 油
44,000 droplets per second: 毎秒44,000液滴
External Organic phase: 外部有機相
30 ℃ incubation: 30℃でインキュベーション
Break emulsion: 解乳化
Amplified DNA: 増幅DNA
Agarose bead: アガロースビーズ
Agarose bead with Phi29 DNA polymerase amplified DNA: Phi2 DNAポリメラーゼ増幅DNAを有するアガロースビーズ
[図8B及び8C]
Agarose-in-IVTT-in-oil droplet generation: 油中IVTT中アガロース型液滴生成
Agarose beads: アガロースビーズ
Oil: 油
4,000 droplets per second: 毎秒4,000液滴
IVTT phase: IVTT相
Surfactant layer: 界面活性剤層
External oil phase: 外部油層
Agarose-in-IVTT-in-oil-in-water droplet generation: 水中油中IVTT中アガロース型液滴生成
Aq: 水溶液
Agarose inner phase with amplified DNA: 増幅DNAを有するアガロース内相
Read out: 読み取り
Flow cytometry: フローサイトメトリ
Microscopy: 顕微鏡
Oil shell: オイルシェル
External aqueous phase: 外部水相
[図9A]
Microfluidic device: マイクロ流体デバイス
Fluidic tubing: 流体チューブ
Glass syringes: ガラスシリンジ
Heating pad: 過熱パッド
Syringe pumps: シリンジポンプ
[図9B]
Phi29 + hexamers: Phi29+六量体
Surfactant + oil: 界面活性剤+油
2 ％ agarose + DNA: 2％アガロース+DNA
Electric heater: 電気ヒータ
[図10A]
Phi29 + hexamers: Phi29+六量体
2％ agarose + DNA: 2％アガロース+DNA
Nozzel (5μm deep): ノズル(深さ5μm)
Femto-droplets: フェムト液滴
Flow channel (25μm deep): 流路(深さ25μm)
Agarose bead: アガロースビーズ
[図10B]
Normalized bead count: 正規化ビーズ数
Bead diameter: ビーズ径
[図10C]
Unwashed: 未洗浄
Fluorescence: 蛍光
Merge: 融合
[図11A乃至11D]
Count: カウント
Control: 対照
DNA alone: DNAのみ
Green fluorescence intensity: 緑色蛍光強度
Single-molecule encapsulation: 単一分子カプセル化
[図13A]
Phi29 DNA amplification of plasmid DNA in agarose beads: アガロースビーズにおけるプラスミドDNAのPhi29 DNA増幅
Side scatter: 側方散乱
Agarose beads: アガロースビーズ
Forward scatter: 前方散乱
Count: カウント
Negative control: 陰性対照
Green fluorescence intensity: 緑色蛍光強度
[図13B]
IVTT of GFP from Phi29 amplified DNA in droplets: 液滴におけるPhi29増幅DNAからのGFPのIVTT
Side scatter: 側方散乱
Singly occupied: 単一占有
Unoccupied droplets: 未占有液滴
Forward scatter: 前方散乱
Agarose beads: アガロースビーズ
TAE alone: TAEのみ
Green fluorescence intensity: 緑色蛍光強度
[図14]
SICLOPPS intein: SICLOPPSインテイン
active intein: 活性インテイン
cyclic peptide: 環状ペプチド
lariat: ラリアット
thioester: チオエステル
[図15]
LacI coding sequence: LacIコード配列
f1 origin: f1開始点
bla (Ap) coding sequence: bla (Ap) コード配列
pBR322 origin: ｐBR322開始点
C-intein: Cインテイン
Library: ライブラリ
N-intein: Nインテイン
[図16]
Intensity: 強度
CLLFVY in IVTT bulk: IVTTバルクにおけるCLLFVY
CLLFVY IVTT post FACS sorting: CLLFVY IVTT FACSソーティング後
[図17]
Mormalized to Mode: モードに正規化
Buffer alone: バッファのみ
IVTT alone: IVTTのみ
Green fluorescence intensity: 緑色蛍光強度
[図18A]
Normalized to Mode: モードに正規化
Single emulsion: シングルエマルション
Buffer alone: バッファのみ
IVTT alone: IVTTのみ
TX4 library: TX4ライブラリ
Green fluorescence intensity: 緑色蛍光強度
[図18B]
Side scatter: 側方散乱
Double emulsions: ダブルエマルション
Forwad scatter: 前方散乱
【図１】
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【図２ＡＢＣ】
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【図２ＤＥＦ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７ＡＢ】
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【図７ＣＤ】
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【図８Ａ】
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【図８ＢＣ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９ＣＤ】
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【図１０ＡＢ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１ＡＢＣＤ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６−１７】
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【図１８ＡＢ】
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【国際調査報告】
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