(57)【要約】  本発明は、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体及び４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニスト、特に抗原結合分子を含む４−１ＢＢＬ三量体を用いる併用療法、がんの治療のためのこのような併用療法の使用、並びに本併用療法の使用方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニストと組み合わせて使用される、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
【請求項２】
ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニストと組み合わせて使用される、請求項１に記載のがんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
【請求項３】
抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体及び４−１ＢＢアゴニストが、単一の組成物中において一緒に投与されるか、又は二つ以上の異なる組成物中において別々に投与される、請求項１又は２に記載の方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
【請求項４】
４−１ＢＢアゴニストが４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
【請求項５】
４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む分子であり、４−１ＢＢＬのエクトドメインが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群より選択されたアミノ酸配列、特に配列番号１又は配列番号５のアミノ酸配列を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
【請求項６】
４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
【請求項７】
４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子が、ＣＤ１９発現Ｂ細胞によって内部移行することがない、請求項６に記載の方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
【請求項８】
４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの部分とを含む抗原結合分子であり、ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインが、
（ａ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、並びに（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、並びに（ｉｖ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）
を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
【請求項９】
４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子であり、ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインが、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）と、配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）とを含むか、又はＣＤ１９に対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインが、配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）と、配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）とを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
【請求項１０】
４−１ＢＢアゴニストが、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、具体的にはＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む抗原結合分子である、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
【請求項１１】
４−１ＢＢアゴニストが、Ｆｃ受容体への結合を低減若しくは排除する及び／又はエフェクター機能を低下させる若しくは排除する一又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む抗原結合分子である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
【請求項１２】
４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であり、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドが、４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
【請求項１３】
４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）と配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）又は配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）と配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）を含む、ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であって、第１のポリペプチドが、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１及び配列番号３２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むこと、並びに第２のポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むこと
を特徴とする抗原結合分子である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
【請求項１４】
４−１ＢＢアゴニストが、
ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３４のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号３５のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３６のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｂ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３４のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号３７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｃ）配列番号３４のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖、配列番号３９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号４０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む分子；
ｄ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３４のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号４１のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号４２のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｅ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３４のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号４３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号４４のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｆ）配列番号３４のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖、配列番号４５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号４６のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む分子；
ｇ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号３５のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３６のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｈ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号３７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｉ）配列番号４８のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖、配列番号４９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号５０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む分子；
ｊ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号４１のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号４２のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｋ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号４３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号４４のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；並びに
ｌ）配列番号４８のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖、配列番号５１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号５２のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む分子
からなる群より選択される抗原結合分子である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
【請求項１５】
４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ペプチドリンカーによって互いに接続する４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチド
を含む抗原結合分子である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
【請求項１６】
４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ペプチドリンカーにより互いに接続する４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチド、及び
（ｃ）安定に会合することのできる第１及び第２のサブユニットを含むＦｃドメイン
を含む抗原結合分子であり、ペプチドリンカーにより互いに接続する４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチドが、任意選択的にペプチドリンカーを介して、Ｆｃドメインの二つのサブユニットの一方のＮ又はＣ末端アミノ酸に融合する、請求項１から１１のいずれか一項又は請求項１５に記載の方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
【請求項１７】
４−１ＢＢアゴニストが抗ＣＤ１９／抗４−１ＢＢ二重特異性抗体である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
【請求項１８】
重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）及び軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインと、重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２０）及び軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２０）を含む第２の抗原結合ドメインとを含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
【請求項１９】
第１の抗原結合ドメインが、配列番号５６のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号５７のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号５８のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）；及び／又は配列番号５９のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号６０のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号６１のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
【請求項２０】
第１の抗原結合ドメインが、配列番号６２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）及び／又は配列番号６３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
【請求項２１】
第２の抗原結合ドメインが、配列番号６４のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号６５のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号６６のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２０）、及び／又は配列番号６７のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号６８のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号６９のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２０）を含む、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
【請求項２２】
第２の抗原結合ドメインが、配列番号７０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２０）及び／又は配列番号７１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２０）を含む、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
【請求項２３】
ＣＤ２０に結合する第３の抗原結合ドメインを含む、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
【請求項２４】
Ｆｃ受容体への結合を低減する及び／又はエフェクター機能を低下させる一又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
【請求項２５】
抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体が、ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニストと組み合わせて使用され、前記組み合わせが約一週間から三週間の間隔で投与される、請求項１から２４のいずれか一項に記載の方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
【請求項２６】
ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体、好ましくはオビヌツズマブを用いた前処置が、併用療法に先立って実施され、前処置と併用療法との間の期間が、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体、好ましくはオビヌツズマブに応答して個体のＢ細胞が減少するために十分である、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
【請求項２７】
疾患、特にがんの、連続又は同時の併用療法における使用のための、（Ａ）活性成分としての抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体と、薬学的に許容される担体とを含む第１の組成物；及び（Ｂ）活性成分としての、ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストと、薬学的に許容される担体とを含む第２の組成物を含む医薬製品。
【請求項２８】
抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体及び薬学的に許容される担体と、ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストを含む第２の医薬とを含む薬学的組成物。
【請求項２９】
Ｂ細胞増殖性疾患、特に非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）及びホジキンリンパ腫（ＨＬ）からなる群より選択される疾患の治療における使用のための、請求項２８に記載の薬学的組成物。
【請求項３０】
増殖性疾患、特にがんを治療するため又は増殖性疾患、特にがんの進行を遅らせるための医薬の製造における、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体と、ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストとの組み合わせの使用。
【請求項３１】
対象に対し、有効量の、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３抗体及びＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストを投与することを含む、対象におけるがんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法。
【請求項３２】
抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体と、ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストとが、単一の組成物中において一緒に投与されるか又は二つ以上の異なる組成物中において別々に投与される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体と、ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニストとが静脈内又は皮下投与される、請求項３１又は３２に記載の方法。
【請求項３４】
抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体が、ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストと同時に、同アゴニストに先立ち、又は同アゴニストの後で投与される、請求項３１から３３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体及び４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニスト、特に抗原結合分子を含む４−１ＢＢＬ三量体を用いる併用療法、がんの治療のためのこのような併用療法の使用、並びに本併用療法の使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ細胞増殖性疾患は、白血病とリンパ腫の両方を含む悪性腫瘍の異種群を表す。リンパ腫は、リンパ細胞から生じ、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）及び非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）という二つの主要カテゴリを含む。米国では、Ｂ細胞起源のリンパ腫は非ホジキンリンパ腫症例の約８０〜８５％を構成し、Ｂ細胞サブセット内には、起源のＢ細胞における遺伝子型及び表現型の発現パターンに基づくと、大きな不均一性がある。例えば、Ｂ細胞リンパ腫  サブセットは、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）又は慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）といった成長の遅い無痛性及び難治性疾患と、それよりも攻撃的なサブタイプ、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）及びびまん性大Ｂ細胞型リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）を含む。Ｂ細胞増殖性疾患の治療のために様々な薬剤が利用可能であるものの、患者の寛解を延長し且つ治癒率を向上させる、安全で効果的な治療法の開発が引き続き必要とされている。
【０００３】
抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、Ｂ細胞に発現されるＣＤ２０と、Ｔ細胞上に存在するＣＤ３エプシロン鎖（ＣＤ３ε）とを標的とする分子である。同時結合は、Ｔ細胞活性化とＴ細胞媒介性のＢ細胞の殺傷をもたらす。ＣＤ２０＋Ｂ細胞の存在下では、循環しているか組織に常駐しているかに関係なく、薬理学的に活性な用量の抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、Ｔ細胞活性化それに関連するサイトカイン放出を引き起こすであろう。末梢血中のＢ細胞の枯渇と並行して、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、初回投与後２４時間以内の末梢血中の一過性のＴ細胞減少と、サイトカイン放出のピークを招き、続いて７２時間以内に急速なＴ細胞の回復とサイトカインレベルのベースラインへの回帰が起こる。したがって、腫瘍細胞の完全な排除を達成するために、Ｔ細胞活性化を保存し、がん細胞に対する永続的な免疫応答をもたらすさらなる薬剤が必要である。
【０００４】
ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーである４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）は、最初、活性化Ｔ細胞によって発現される誘導性分子として同定された（Kwon and Weissman, 1989）。その後の研究により、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、ＮＫＴ細胞、単球、好中球、マスト細胞、樹状細胞（ＤＣ）及び内皮細胞及び平滑筋細胞といった非造血性起源の細胞を含む他の多くの免疫細胞も４−１ＢＢを発現することが実証された（Vinay and Kwon, 2011）。様々な細胞型の４−１ＢＢの発現は、多くが誘導性であり、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又はＢ細胞受容体トリガーといった様々な刺激シグナル、並びに炎症性サイトカインの共刺激分子又は受容体を通して誘導されるシグナル伝達によって駆動される（Diehl et al., 2002; Zhang et al., 2010）。
【０００５】
４−１ＢＢリガンド（４−１ＢＢＬ又はＣＤ１３７Ｌ）は、１９９３年に同定された（Goodwin et al., 1993）。４−１ＢＢＬの発現が、Ｂ細胞、ＤＣ及びマクロファージといったプロフェッショナルな抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に制限されることが示された。４−１ＢＢＬの誘導性発現は、αβ及びγδ両方のＴ細胞サブセットを含むＴ細胞、並びに内皮細胞に特徴的である（Shao and Schwarz, 2011）。
【０００６】
４−１ＢＢ受容体を通した共刺激（例えば４−１ＢＢＬのライゲーションによる）は、Ｔ細胞（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋サブセットの両方）内部において複数のシグナル伝達カスケードを活性化させ、Ｔ細胞活性化を強力に増大させる（Bartkowiak and Curran, 2015）。ＴＣＲトリガーとの組み合わせにおいて、アゴニスト４−１ＢＢ特異性抗体は、Ｔ細胞の増殖を亢進し、リンホカインの分泌を刺激し、活性化により誘導された細胞死に対するＴリンパ球の感受性を低下させる（Snell et al., 2011）。このような機序は、がん免疫療法における概念の最初の証明としてさらに進歩した。前臨床モデルでは、腫瘍を有するマウスにおける４−１ＢＢに対するアゴニスト抗体の投与は、強力な抗腫瘍効果をもたらした（Melero et al., 1997）。その後、蓄積された証拠により、４−１ＢＢは通常、他の免疫調節化合物、化学療法剤、腫瘍特異性ワクチン接種又は放射線療法と組み合わせて投与されたときにのみ、抗腫瘍剤としてのその能力を呈することが示唆された（Bartkowiak and Curran, 2015）。
【０００７】
ＴＮＦＲスーパーファミリーのシグナル伝達は、受容体と係合するために三量体化リガンドの架橋を必要とし、野生型Ｆｃ結合を必要とする４−１ＢＢアゴニスト抗体も同様である（Li and Ravetch, 2011）。しかしながら、機能的に活性のＦｃドメインを有する４−１ＢＢ特異性アゴニスト抗体の全身投与は、結果として肝臓毒性に関連付けられるＣＤ８＋  Ｔ細胞の流入を生じさせ（Dubrot et al., 2010）、それはマウスにおいて機能的Ｆｃ受容体の非存在下で消滅するか又は有意に改善される。臨床現場において、Ｆｃコンピテント４−１ＢＢアゴニストＡｂ（ＢＭＳ−６６３５１３）（ＮＣＴ００６１２６６４）は、グレード４の肝炎を生じさせ、治験を終了に至らしめた（Simeone and Ascierto, 2012）。したがって、効果的で安全な４−１ＢＢアゴニストが必要とされている。
【０００８】
４−１ＢＢリガンドの一つの細胞外ドメイン及び単鎖抗体断片（Hornig et al., 2012; Muller et al., 2008）、又は重鎖のＣ末端に融合した単一の４−１ＢＢリガンド（Zhang et al., 2007）を含む融合タンパク質が作製された。国際公開第２０１０／０１００５１号には、互いに結合し且つ一つの抗体部分に融合した三つのＴＮＦリガンドのエクトドメインからなる融合タンパク質の生成が開示されている。本発明では、三量体、即ち生物学的に活性な４−１ＢＢリガンド及び腫瘍抗原ＣＤ１９に特異性の抗原結合ドメイン及びＦｃ非活性ドメインを含む抗原結合分子が、特に安定で頑強であることが示される（本明細書においてＣＤ１９−４−１ＢＢＬと命名する）。これらコンストラクトは、国際公開第２０１６／０７５２７８号に開示されており、Ｆｃ媒介性の毒性の原因である非特異性のＦｃγＲ媒介性の架橋を、ＣＤ１９標的化Ｂ細胞特異性架橋により置き換える。
【０００９】
ＣＤ１９は、Ｂ細胞の表面に発現され、これら細胞にほとんど特異性であるため、Ｂ細胞悪性腫瘍の免疫療法のための理想的な標的である。ＣＤ１９は、Ｂ細胞発生の間に、Ｂ細胞上においてＣＤ２０よりも広く発現されるため、一般的にＣＤ２０陽性細胞もＣＤ１９を発現するだろう。Ｂ細胞が形質細胞（抗体分泌細胞）へと分化する間に、Ｂ細胞はＣＤ２０の発現を下方制御する。時に、Ｂ細胞リンパ腫もＣＤ２０の発現を下方制御するが、ＣＤ１９については陽性のままである。したがって、ＣＤ１９及びＣＤ２０の両方を標的とすることは、リンパ腫中の罹患Ｂ細胞を広くカバーし、また選択圧をＣＤ２０からＣＤ１９及びＣＤ２０の両方へと偏向させる。ＣＤ１９がＢ細胞の発癌に直接寄与するかどうかは不明であるが、その発現は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）及びＢ細胞リンパ腫といった多くのＢ細胞腫瘍において高度に保存される。急性白血病ＣＤ１９は、ほとんどすべてのサブタイプに安定的に且つ継続的に発現されるが、少数の白血病のみがＣＤ２０を発現する。
【００１０】
ＣＤ１９標的化４−１ＢＢＬ抗原結合分子を抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体、即ちＣＤ２０Ｔ細胞二重特性抗体と組み合わせるとき、４−１ＢＢアゴニズムの最大の抗腫瘍効果が達成されることが分かった。Ｔ細胞二重特異性抗体は、Ｔ細胞に最初のＴＣＲ活性化シグナル伝達を与え、次いでＣＤ１９−４−１ＢＢＬとの組み合わせは抗腫瘍Ｔ細胞免疫のさらなる増強をもたらす。したがって、本発明者らはここに、Ｂ細胞悪性腫瘍を含むがんのための新規の併用療法を記載する。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体と、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるため、さらに詳細にはＢ細胞増殖性疾患を治療するため又はＢ細胞増殖性疾患の進行を遅らせるための方法における、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニスト、特にＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニスト、特に抗原結合分子を含む４−１ＢＢＬ三量体と組み合わせたその使用とに関する。本明細書に記載される併用療法は、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体のみでの治療より、腫瘍増殖の阻害及び腫瘍細胞の排除に効果的であることが分かった。
【００１２】
一態様において、本発明は、ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニスト、特に４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片とＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインとを含む４−１ＢＢアゴニストと組み合わせて使用される、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体を提供する。
【００１３】
特に、４−１ＢＢアゴニストは、ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む抗原結合分子である。一態様では、４−１ＢＢアゴニストはＦｃドメインを含む抗原結合分子である。特定の一態様では、１ＢＢアゴニストは、Ｆｃγ受容体の結合を低減するか好ましくは排除する及び／又はエフェクター機能を低下させるか好ましくは除去する修飾を有するＦｃドメインを含む抗原結合分子である。
【００１４】
さらなる一態様では、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体とＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストとが、単一の組成物中において一緒に投与されるか又は二つ以上の異なる組成物中において別々に投与される、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体が提供される。
【００１５】
別の態様では、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体が、ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストと同時に、それに先立ち、又はその後で投与される、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体が提供される。
【００１６】
一態様において、本発明は、４−１ＢＢアゴニストが４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体を提供する。さらなる一態様では、４−１ＢＢアゴニストが４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む分子であり、４−１ＢＢＬのエクトドメインが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号  ６、配列番号７及び配列番号８からなる群より選択されたアミノ酸配列、特に配列番号１又は配列番号５のアミノ酸配列を含む、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体が提供される。さらに詳細には、４−１ＢＢＬのエクトドメインは配列番号５のアミノ酸配列を含む。
【００１７】
さらなる一態様では、４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片とＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子である、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体が提供される。一態様において、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片とＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子は、ＣＤ１９発現Ｂ細胞によって内部移行しないであろう。別の態様では、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体が提供され、４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの部分とを含む抗原結合分子であり、ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインは、
（ａ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、並びに（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、並びに（ｉｖ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）
を含む。
【００１８】
特定の態様では、４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインとを有する抗原結合分子であり、ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインが、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）と、配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）とを含むか、又はＣＤ１９に対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインは、配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）と、配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）とを含む、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体が提供される。特定の態様では、ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインは、配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）及び配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）を含む。
【００１９】
一態様において、ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストが、安定に会合することのできる第１及び第２のサブユニットを含むＦｃドメインをさらに含む抗原結合分子である、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体が提供される。特に、４−１ＢＢアゴニストは、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、特にＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む抗原結合分子である。さらに詳細には、４−１ＢＢアゴニストは、Ｆｃ受容体への結合を低減する及び／又はエフェクター機能を低下させる一又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む抗原結合分子である。特定の一態様では、４−１ＢＢアゴニストは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む。
【００２０】
本発明の別の態様では、４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であり、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドが、４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含む、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体が提供される。
【００２１】
別の態様では、本発明は、４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であって、
（ｉ）第１のポリペプチドがＣＨ１又はＣＬドメインを、第２のポリペプチドがＣＬ又はＣＨ１ドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ１又はＣＬドメインに接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＬ又はＣＨ１ドメインにペプチドリンカーを介して接続する４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉ）第１のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、第２のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、それぞれ含み、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ３ドメインのＣ末端に接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＨ３ドメインのＣ末端にペプチドリンカーを介して接続する４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉｉ）第１のポリペプチドがＶＨ−ＣＬ又はＶＬ−ＣＨ１ドメインを、第２のポリペプチドがＶＬ−ＣＨ１ドメイン又はＶＨ−ＣＬドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＶＨ又はＶＬに接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＶＬ又はＶＨにペプチドリンカーを介して接続する４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含むこと
を特徴とする抗原結合分子である、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体を提供する。
【００２２】
一態様においては、４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）と配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）又は配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）と配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）を含むＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であって、
第１のポリペプチドが、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１及び配列番号３２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むこと、並びに第２のポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むこと
を特徴とする抗原結合分子である、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体が提供される。
【００２３】
特定の態様では、４−１ＢＢアゴニストが、
ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３４のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号３５のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３６のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｂ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３４のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号３７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｃ）配列番号３４のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖、配列番号３９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖及び配列番号４０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む分子；
ｄ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３４のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号４１のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号４２のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｅ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３４のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号４３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号４４のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｆ）配列番号３４のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖、配列番号４５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖及び配列番号４６のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む分子；
ｇ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号３５のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３６のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｈ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号３７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｉ）配列番号４８のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖、配列番号４９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖及び配列番号５０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む分子；
ｊ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号４１のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号４２のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｋ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号４３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号４４のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；並びに
ｌ）配列番号４８のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖、配列番号５１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖及び配列番号５２のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む分子
からなる群より選択される抗原結合分子である、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体が提供される。
【００２４】
別の態様では、本発明は、４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ペプチドリンカーにより互いに接続する４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチド
を含む抗原結合分子である、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体を提供する。
【００２５】
一態様においては、４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ペプチドリンカーにより互いに接続する４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチド、及び  
（ｃ）安定に会合することのできる第１及び第２のサブユニットを含むＦｃドメイン
を含む抗原結合分子であり、ペプチドリンカーにより互いに接続する４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチドが、任意選択的にペプチドリンカーを通して、Ｆｃドメインの二つのサブユニットの一方のＮ又はＣ末端アミノ酸に融合する、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体が提供される。
【００２６】
特定の態様では、４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含む分子、
（ｂ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、配列番号４８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含む分子；
（ｃ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、及び配列番号５４のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含む分子、並びに
（ｄ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、配列番号４８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、及び配列番号５５のアミノ酸配列を含む融合タンパク質
からなる群より選択される抗原結合分子である、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体が提供される。
【００２７】
別の態様では、本発明は、４−１ＢＢアゴニストが抗ＣＤ１９／抗４−１ＢＢ二重特異性抗体である、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体を提供する。
【００２８】
これらすべての態様において、本発明は、ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメイン、及びＣＤ２０に結合する第２の抗原結合ドメインを含む、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体をさらに提供する。特に、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）及び軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインと、重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２０）及び軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２０）を含む第２の抗原結合ドメインとを含む。一態様において、第１の抗原結合ドメインは、配列番号５６のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号５７のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号５８のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）；及び／又は配列番号５９のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号６０のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号６１のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む。さらに詳細には、第１の抗原結合ドメインは、配列番号６２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）及び／又は配列番号６３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む。別の態様では、第２の抗原結合ドメインは、配列番号６４のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号６５のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号６６のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２０）、及び／又は配列番号６７のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号６８のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号６９のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２０）を含む。さらに詳細には、第２の抗原結合ドメインは、配列番号７０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２０）及び／又は配列番号７１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２０）を含む。
【００２９】
別の態様では、本発明は、ＣＤ２０に結合する第３の抗原結合ドメインをさらに含む、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体をさらに提供する。特に、第３の抗原結合ドメインは、配列番号６４のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号６５のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号６６のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２０）；及び／又は配列番号６７のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号６８のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号６９のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２０）を含む。さらに詳細には、第３の抗原結合ドメインは、配列番号７０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２０）及び／又は配列番号７１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２０）を含む。
【００３０】
さらなる一態様では、第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖と軽鎖の可変ドメイン又は定常ドメインが交換されているクロスＦａｂ分子であり、第２の抗原結合ドメイン及び存在する場合は第３の抗原結合ドメインが従来のＦａｂ分子である、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体が提供される。
【００３１】
さらなる態様では、（ｉ）第２の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第１の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しており、且つ第３の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合しているか、又は（ｉｉ）第１の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端において第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第２の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しており、且つ第３の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合している、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体が提供される。
【００３２】
さらなる一態様では、本発明は、Ｆｃ受容体への結合を低減する及び／又はエフェクター機能を低下させる一又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体を提供する。さらに詳細には、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む。
【００３３】
別の態様では、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体が、ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニストと組み合わせて使用され、この組み合わせが約一週間から三週間の間隔で投与される、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体が提供される。
【００３４】
別の態様では、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体が、ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニストと組み合わせて使用され、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体、好ましくはオビヌツズマブを用いた前処置が、併用療法に先立って実施され、前処置と併用療法との間の期間は、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体、好ましくはオビヌツズマブに応答して個体のＢ細胞が減少するために十分である、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体が提供される。
【００３５】
別の態様では、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体が、ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニストと組み合わせて使用され、さらにＰＤ１又はＰＤ−Ｌ１抗体、好ましくはアテゾリズマブが投与される、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体が提供される。
【００３６】
さらなる一態様では、本発明は、疾患の連続又は同時の併用療法、特にがんの治療における使用のための、（Ａ）活性成分としての抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体と薬学的に許容される担体とを含む第１の組成物；及び（Ｂ）活性成分としてのＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストと薬学的に許容される担体とを含む第２の組成物を含む医薬製品を提供する。
【００３７】
別の態様では、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体とＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストとを含む薬学的組成物が提供される。特に、この薬学的組成物は、Ｂ細胞増殖性疾患、特に非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）及びホジキンリンパ腫（ＨＬ）からなる群より選択される疾患の治療における使用を目的としている。
【００３８】
追加の態様では、本発明は、（Ａ）活性成分としての抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体と薬学的に許容される担体とを含む第１の組成物；（Ｂ）ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む、活性成分としての４−１ＢＢアゴニストと、薬学的に許容される担体とを含む第２の組成物、並びに（Ｃ）併用療法における前記組成物の使用説明書を含むパッケージを含む、対象におけるがんを治療するため又はがんの進行を遅らせるためのキットを提供する。
【００３９】
さらなる一態様では、本発明は、増殖性疾患、特にがんを治療するため又は増殖性疾患、特にがんの進行を遅らせるための医薬の製造における、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体とＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストとの組み合わせの使用に関する。
【００４０】
特に、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）及びホジキンリンパ腫（ＨＬ）からなる群より選択される疾患を治療するための医薬の製造における、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体とＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストとの組み合わせの使用が提供される。
【００４１】
別の態様では、本発明は、対象に対し、有効量の抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３抗体及びＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストを投与することを含む、対象におけるがんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法を提供する。特に、本発明は、４−１ＢＢアゴニストがＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む抗原結合分子である、対象におけるがんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法に関する。一態様では、４−１ＢＢアゴニストはＦｃドメインを含む抗原結合分子である。特定の一態様では、−１ＢＢアゴニストは、Ｆｃγ受容体の結合を低減する及び／又はエフェクター機能を低下させる修飾を有するＦｃドメインを含む抗原結合分子である。特定の態様では、ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む抗原結合分子である。さらに詳細には、４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子である。
【００４２】
さらなる一態様では、本発明は、対象に対し、有効量の抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３抗体とＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストとを投与することを含む、対象におけるがんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法を提供し、この場合、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体及びＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストは、単一の組成物中において一緒に投与されるか又は二つ以上の異なる組成物中において別々に投与される。特に、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体及びＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニストは、静脈内又は皮下投与される。さらなる一態様では、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストと同時に、同アゴニストに先立ち、又は同アゴニストの後で投与される。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】実施例に使用された特定のＣＤ１９−４−１ＢＢＬ抗原結合分子と特定の抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体を示している。これら分子は、実施例１及び２においてそれぞれさらに詳細に記載される。黒い点はノブ・イントゥー・ホール修飾を表している。＊は、ＣＨ１及びＣＬドメインにおけるアミノ酸修飾を表す記号である（いわゆる荷電残基）。１Ａは、４−１ＢＢＬ二量体及び４−１ＢＢＬ単量体に隣接するＣＨ１及びＣＬドメインに修飾を有する抗原結合分子を含む一価のＣＤ１９  ４−１ＢＢＬ−三量体を示している。これはＣＤ１９バインダー８Ｂ８−０１８を含んでいたため、本明細書においてｍｏｎｏ  ＣＤ１９（０１８）−４−１ＢＢＬと命名した。１Ｂに示すコンストラクトは、ＣＤ１９バインダー８Ｂ８−２Ｂ１１を含むという点で１Ａとは異なり、したがってｍｏｎｏ  ＣＤ１９（２Ｂ１１）−４−１ＢＢＬと命名した。１Ｃは、ｂｉ  ＣＤ１９（０１８）−４−１ＢＢＬと命名されたバインダーＣＤ１９（０１８）を含む二価のコンストラクトを示している。１Ｄには、２＋１フォーマットの例示的な二重特異性抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３抗体が示されている（ＣＤ２０  ＴＣＢと呼ぶ）。１Ｅ及び１Ｆは、非標的化コントロール分子を示している（ＣＤ１９バインダーが非結合ＤＰ４７  Ｆａｂによって置き換えられている）。
【図２】２Ａには、ヒトＦｃに対する二次抗体によって検出される、ｍｏｎｏ  ＣＤ１９（０１８）−４−１ＢＢＬのＣＤ１９＋  ヒトＢ細胞に対する結合が示されている。非標的化コンストラクトと比較して、ｍｏｎｏ  ＣＤ１９（０１８）−４−１ＢＢＬは、用量依存性の、ＣＤ１９＋  ヒトＢ細胞に対する強い結合を呈する。ｍｏｎｏ  ＣＤ１９（０１８）−４−１ＢＢＬによる結合後の、Ｂ細胞上のＣＤ１９発現の低減を２Ｂに示す。これは、結合がＣＤ１９特異性であることを示している。２Ｃは、ヒトＦｃに対する二次抗体によって検出される、様々なＣＤ１９−４−１ＢＢＬコンストラクトのＣＤ１９＋  ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞株に対する結合を示している。これは、一価のＣＤ１９−４−１ＢＢＬコンストラクトが、二価のＣＤ１９−４−１ＢＢＬ  コンストラクトより、細胞に対するよりよい結合を実証したことを示している。
【図３】３Ａ及び３Ｂは、活性化ＣＤ４Ｔ細胞（３Ａ）又は活性化ＣＤ８Ｔ細胞（３Ｂ）に対するｍｏｎｏ及びｂｉ  ＣＤ１９（０１８）−４−１ＢＢＬから４−１ＢＢＬの結合を示している。全ヒトＰＢＭＣを、Ｔ細胞（ＣＤ４及びＣＤ８）上のＴＣＲに係合させるために抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８  ミクロビーズにより事前活性化した。活性化Ｔ細胞は４−１ＢＢを上方制御した。二日後、Ｔ細胞上の４−１ＢＢへの結合のために、細胞を回収し、氷上において滴定濃度のＣＤ１９−４−１ＢＢＬを用いて共インキュベートした。ヒトＩｇＧ  Ｆｃに対する二次抗体により、特異的結合が検出された。
【図４】ｍｏｎｏ又はｂｉ  ＣＤ１９（０１８）−４−１ＢＢＬにより生じた活性化ＰＢＭＣによるＩＦＮ−γの放出を示している。全ヒトＰＢＭＣを、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８ミクロビーズを用いて、並びに滴定濃度のＣＤ１９−４−１ＢＢＬを用いて、インキュベートした。二日後、上清を、ＥＬＩＳＡによるＩＦＮ−γの測定のために収集した。
【図５Ａ】蛍光共焦点顕微鏡による動的抗体局在化の可視化を示している。経時的な分析により、腫瘍細胞と接触しているＴ細胞の三つの異なる時点におけるスナップショットに示されるように、ＣＤ１９−４１ＢＢＬ分子（白で示す）が、５００ｎｇ／ｍｌのＣＤ２０  ＣＤ３  ＴＣＢの存在下において、Ｔ細胞／腫瘍細胞の相互作用部位に向かって分極し、５ｎｇ／ｍｌのＣＤ２０  ＣＤ３  ＴＣＢが使用されたときには分極しないことが示された。
【図５Ｂ】蛍光共焦点顕微鏡による動的抗体局在化の可視化を示している。標識ＣＤ１９−４１ＢＢＬを経時的に定量化したところ、相互作用部位においてＣＤ１９−４１ＢＢＬの用量依存性の安定な局在化が示された。
【図６】ＷＳＵ腫瘍細胞によるＣＤ１９−４−１ＢＢＬコンストラクトの内部移行に関する。ＣＤ１９抗体クローンＢＵ１２は腫瘍細胞内に急速に内部移行したが、ＣＤ１９−４−１ＢＢＬは腫瘍細胞中へ内部移行せず、したがって腫瘍の微小環境と相互作用する能力を維持する。
【図７】免疫不全ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ／ＩＬ−２Ｒγヌル（ＮＯＧ）マウスにおける、ｍｏｎｏ及びｂｉ  ＣＤ１９（０１８）−４−１ＢＢＬと、ｍｏｎｏ  ＣＤ１９（２Ｂ１１）−４−１ＢＢＬの、単回用量の薬物動態プロファイル（ＳＤＰＫ）を示している。グラフに見ることができるように、すべての分子が安定なＩｇＧ様ＰＫプロファイルを示した。
【図８】ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２−保有完全ヒト化ＮＯＧマウスにおける、ＣＤ２０  ＴＣＢと組み合わせたｍｏｎｏ対ｂｉ  ＣＤ１９（０１８）−４−１ＢＢＬコンストラクトのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性試験のプロトコールを示している。下の表に、異なる組み合わせ及び用量が投与されるマウスのサブグループが規定されている。この実験は、実施例５ｂに記載する。
【図９】図８の試験の結果を示している。ＣＤ２０  ＴＣＢと組み合わせたｍｏｎｏ  ＣＤ１９（０１８）−４−１ＢＢＬの組み合わせは、ＣＤ２０  ＴＣＢを用いる単剤療法と比較して、より強くより速い腫瘍増殖の阻害を誘導しただけでなく、試験したすべての用量において、ｂｉ  ＣＤ１９（０１８）−４−１ＢＢＬ又はｍｏｎｏ非標的化４−１ＢＢＬとＣＤ２０  ＴＣＢとの組み合わせよりも優れていた。９Ｂに示すように、試験終了時点の腫瘍重量は、これら発見を確認するものであったが、腫瘍増殖の阻害における際立った差異は、特に早期の時点での腫瘍増殖の動態学に見られる（９Ａ）。このデータは、ＣＤ２０  ＴＣＢと組み合わせたとき、ＣＤ１９（ｍｏｎｏ  ＣＤ１９（０１８）−４−１ＢＢＬ）への一価の結合が、腫瘍増殖の阻害という点で二価の結合より優れていることを示唆するものである。
【図１０】ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２保有完全ヒト化ＮＯＧマウスにおける、ＣＤ２０  ＴＣＢと組み合わせたｍｏｎｏ  ＣＤ１９（０１８）−４−１ＢＢＬ対ｍｏｎｏ  ＣＤ１９（２Ｂ１１）−４−１ＢＢＬコンストラクトのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性の比較を示している。図にはこの試験のプロトコールが示されており、下の表には、異なる組み合わせが投与されるマウスのサブグループが規定されている。
【図１１】図１０の試験の結果を示している。共に、ＣＤ２０  ＴＣＢと組み合わせたｍｏｎｏ  ＣＤ１９（０１８）−４−１ＢＢＬ又はｍｏｎｏ  ＣＤ１９（２Ｂ１１）−４−１ＢＢＬの組み合わせは、ＣＤ２０  ＴＣＢの単剤療法と比較して、より強くより速い腫瘍増殖の阻害を誘導した。しかしながら、ＣＤ１９バインダーの二つのクローン間には差が観察されなかった。両方の分子は、ＣＤ２０  ＴＣＢ媒介性腫瘍増殖阻害の増強において同等である。
【図１２】試験２０日目に屠殺された動物（スカウト）由来の腫瘍の免疫薬力学（ＰＤ）データが示されている。このデータにより、ＣＤ２０  ＴＣＢのみ又はビヒクル腫瘍と比較して、両組み合わせ群において、腫瘍内ヒトＴ細胞浸潤（１２Ａ）、ＣＤ８／ＣＤ４比（１２Ｂ）及びＣＤ８／Ｔｒｅｇ比（１２Ｃ）のＣＤ８細胞へのシフトの増強が明らかになった。しかしながら、ＣＤ２０  ＴＣＢとｍｏｎｏ  ＣＤ１９（０１８）−４−１ＢＢＬ又はｍｏｎｏ  ＣＤ１９（２Ｂ１１）−４−１ＢＢＬとの組み合わせに関する二つの群の間に、差は観察されなかった。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
定義
特に定義しない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野において一般的に使用されるものと同じ意味を有する。本明細書の説明のために、以下の定義を適用し、適切な場合はいつでも、単数形で用いられる用語は複数形を含み、その逆も同じである。
【００４５】
本明細書において使用される用語「抗原結合分子」は、その最も広い意味において、抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。抗原結合分子の例は、抗体、抗体断片及び足場抗原結合タンパク質である。
【００４６】
本明細書における用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、種々の抗体構造を包含し、限定されるものではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単一特異性及び多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、並びに、所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含む。
【００４７】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味し、 即ち、例えば、天然に生じる変異を含むか又はモノクローナル抗体調製物の製造時に発生し、一般的に少量で存在している可能性のある変異体抗体を除き、集団を構成する個々の抗体は同一であり、及び／又は同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を通常含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。
【００４８】
本明細書で使用される用語「単一特異性」抗体は、それぞれが同一の抗原の同一のエピトープに結合する一又は複数の結合部位を有する抗体を意味する。用語「二重特異性」とは、抗原結合分子が少なくとも二つの異なる抗原決定基に特異的に結合することができることを意味する。一般的に、二重特異性抗原結合分子は、各々が異なる抗原決定基に特異的な二つの抗原結合部位を含む。特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、二つの抗原決定基、特に二つの別個の細胞上に発現した二つの抗原決定基に同時に結合することができる。
【００４９】
本願内で使用される用語「価」は、抗原結合分子における特定数の結合部位の存在を意味する。このように、用語「二価」、「四価」及び「六価」は、抗原結合分子中、それぞれ二つの結合部位、四つの結合部位及び六つの結合部位の存在を意味する。
【００５０】
用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」は、本明細書中で互換的に使用され、天然型抗体構造と実質的に類似の構造を有する抗体を指す。「天然型抗体」は、様々な構造を有する天然に生じる免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然型ＩｇＧクラスの抗体は、ジスルフィド結合している二つの軽鎖と二つの重鎖からなる約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端に、各重鎖は可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）を有し、その後に重鎖定常領域とも呼ばれる３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）が続いている。同様に、Ｎ末端からＣ末端に、各軽鎖は可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）を有し、その後に軽鎖定常領域とも呼ばれる軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）が続いている。抗体の重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）、又はμ（ＩｇＭ）と呼ばれる五つのタイプのうちの一つに割り当てることができ、それらのいくつかはさらにサブタイプ、例えばγ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）及びα２（ＩｇＡ２）に分けられる。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる、二つのタイプのいずれかに割り当てることができる。
【００５１】
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部分を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、クロスＦａｂ断片；直鎖状抗体、単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；及び単一ドメイン抗体が含まれる。特定の抗体断片の総説については、Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134(2003)を参照されたい。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えば、Pluckthun、in The Pharmacology of モノクローナル抗体、vol. 113、Rosenburg and Moore eds.,(Springer-Verlag、New York)、pp. 269-315(1994)を参照；また、国際公開第９３／１６１８５号；及び米国特許第５５７１８９４号及び  第５５８７４５８号を参照。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、且つｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を増加させたＦａｂ及びＦ（ａｂ  ’）２断片の議論については、米国特許第５８６９０４６号を参照のこと。ダイアボディは、二価又は二重特異性でありうる二つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、ＥＰ４０４０９７；国際公開第１９９３／０１１６１号；Hudson et al.、Nat Med 9、129-134(2003);及びHollinger et al., Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448(1993)を参照のこと。トリアボディ及びテトラボディもHudson et al.、Nat. Med. 9:129-134(2003)に記載されている。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインのすべて又は一部、或いは軽鎖可変ドメインのすべて又は一部を含む抗体断片である。特定の実施態様では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；例えば、米国特許第６２４８５１６号参照）。抗体断片は様々な技術で作成することができ、限定されないが、本明細書に記載されるように、インタクトな抗体のタンパク分解、並びに組み換え宿主細胞（例えば、大腸菌又はファージ）による生産を含む。
【００５２】
インタクトな抗体のパパイン消化は、各々が重鎖及び軽鎖可変ドメインと、さらには軽鎖の定常ドメインと重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）とを含む、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる二つ同一の抗原結合断片を生成する。したがって、本明細書において使用される用語「Ｆａｂ断片」は、軽鎖（ＣＬ）のＶＬドメイン及び定常ドメインと、重鎖のＶＨドメイン及び第１の定常ドメイン（ＣＨ１）とを含む軽鎖断片を含む抗体断片を指す。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に数個の残基が付加されている点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を持つＦａｂ’断片である。ペプシン処理は、二つの抗原結合部位（二つのＦａｂ断片）とＦｃ領域の一部とを有するＦ（ａｂ’）２  断片を生成する。
【００５３】
用語「クロスＦａｂ断片」又は「ｘＦａｂ断片」又は「クロスオーバーＦａｂ断片」はＦａｂ断片を指し、重鎖と軽鎖の可変領域又は定常領域は交換可能である。クロスオーバーＦａｂ分子の二つの異なる鎖組成が可能であり、本発明の二重特異性抗体に含まれる。対して、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変領域は交換されており、即ち、クロスオーバーＦａｂ分子は、軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖定常領域（ＣＨ１）からなるペプチド鎖、及び重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）からなるペプチド鎖を含んでいる。このクロスオーバーＦａｂ分子は、ＣｒｏｓｓＦａｂ（ＶＬＶＨ）とも呼ばれる。対して、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の定常領域が交換されている場合、クロスオーバーＦａｂ分子は、重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）からなるペプチド鎖、及び軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖定常領域（ＣＨ１）からなるペプチド鎖を含んでいる。このクロスオーバー分子は、ＣｒｏｓｓＦａｂ（ＣＬＣＨ１）とも呼ばれる。
【００５４】
「単鎖Ｆａｂ断片」又は「ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーからなるポリペプチドであり、ここで、前記抗体ドメイン及び前記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端方向に、以下：ａ）ＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＬ、ｂ）ＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１、ｃ）ＶＨ−ＣＬ−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１又はｄ）ＶＬ−ＣＨ１−リンカー−ＶＨ−ＣＬのうちの一つを有し；ここで、前記リンカーは、少なくとも３０のアミノ酸、好ましくは３２から５０の間のアミノ酸のポリペプチドである。前記単鎖Ｆａｂ断片は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間の天然ジスルフィド結合を介して安定化されている。加えて、これら単鎖Ｆａｂ分子は、システイン残基（例えばカバット番号付けによる可変重鎖の４４位及び可変軽鎖の１００位）の挿入を介した鎖間ジスルフィド結合の生成により、さらに安定化されることがある。
【００５５】
「クロスオーバー単鎖Ｆａｂ断片」又は「ｘ−ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーからなるポリペプチドであり、前記抗体ドメイン及び前記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端方向に、ａ）ＶＨ−ＣＬ−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１及びｂ）ＶＬ−ＣＨ１−リンカー−ＶＨ−ＣＬのうちの一つを有し、ＶＨとＶＬは一緒に、特に抗原に結合する抗原結合部位を形成し、前記リンカーは少なくとも３０個のアミノ酸のポリペプチドである。加えて、これらｘ−ｓｃＦａｂ分子は、システイン残基（例えばカバット番号付けによる可変重鎖の４４位及び可変軽鎖の１００位）の挿入を介した鎖間ジスルフィド結合の生成により、さらに安定化されることがある。
【００５６】
「単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）」は、１０から約２５のアミノ酸の短いリンカーペプチドにより接続した、抗体の重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である。リンカーは通常、柔軟性のためにグリシンに、並びに溶解度のためにセリン又はスレオニンに富み、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端に接続することができるか、又はその逆が可能である。このタンパク質は、定常領域の除去及びリンカーの導入にも関わらず、元の抗体の特異性を保持している。ｓｃＦｖ抗体は、例えばHouston, J.S., Methods in Enzymol. 203(1991)46-96に記載されている。加えて、抗体断片は、ＶＨドメインの特性を有する、つまり、機能性抗原結合部位へとＶＬドメインと一緒に集合することのできる、又はＶＬドメインの特性を有する、つまり機能性抗原結合部位へとＶＨドメインと一緒に集合することのできる一本鎖ポリペプチドを含み、それにより完全長抗体の抗原結合特性を提供する。
【００５７】
「足場抗原結合タンパク質」は当技術分野で既知であり、例えば、フィブロネクチン及び設計アンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）が、抗原結合ドメインの代替的な足場として使用されている。例えば、Gebauer and Skerra、Engineered protein scaffolds as next-generation antibody therapeutics. Curr Opin Chem Biol 13:245-255(2009) and Stumpp et al., Darpins:A new generation of protein therapeutics. Drug Discovery Today 13:695-701(2008)を参照されたい。本発明の一態様において、足場抗原結合タンパク質は、ＣＴＬＡ−４（Ｅｖｉｂｏｄｙ）、リポカリン（Ａｎｔｉｃａｌｉｎ）、プロテインＡに由来する分子、例えばプロテインＡのＺドメイン（Ａｆｆｉｂｏｄｙ），Ａドメイン（Ａｖｉｍｅｒ／Ｍａｘｉｂｏｄｙ）、血清トランスフェリン（トランス体）；設計アンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）、抗体軽鎖又は重鎖の可変ドメイン（単一ドメイン抗体、ｓｄＡｂ）、抗体重鎖の可変ドメイン（ナノボディ、ａＶＨ）、ＶＮＡＲ断片、フィブロネクチン（ＡｄＮｅｃｔｉｎ）、Ｃ型レクチンドメイン（Ｔｅｔｒａｎｅｃｔｉｎ）；新規抗原受容体ベータ−ラクタマーゼの可変ドメイン（ＶＮＡＲ断片）、ヒトガンマ−クリスタリン又はユビキチン（Ａｆｆｉｌｉｎ分子）；ヒトプロテアーゼ阻害剤のクーニッツ型ドメイン、ミクロボディ、例えばノッチンファミリー由来のタンパク質、ペプチドアプタマー及びフィブロネクチン（ａｄｎｅｃｔｉｎ）からなる群より選択される。
【００５８】
リポカリンは、ステロイド、ビリン、レチノイド及び脂質といった疎水性の小分子を運搬する細胞外タンパク質のファミリーである。これは、異なる標的抗原に結合するように操作することのできる螺旋構造の開放端に多数のループを有する剛性のベータ−シート二次構造を有する。Ａｎｔｉｃａｌｉｎは１６０〜１８０のアミノ酸の大きさであり、リポカリンに由来する。さらなる詳細については、Biochim Biophys Acta 1482:337-350(2000)、米国特許第７２５０２９７号及び同第２００７０２２４６３３号を参照されたい。
【００５９】
設計アンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）は、細胞骨格に対する内在性膜タンパク質の付着を媒介するタンパク質のファミリーであるＡｎｋｙｒｉｎに由来する。単一のアンキリン反復は、二つのアルファ螺旋とベータ−ターンからなる３３残基のモチーフである。これらは、各反復の第１のアルファ螺旋とベータ−ターンの残基を無作為化することにより、異なる標的抗原に結合するように操作することができる。これらの結合面は、モジュールの数を増加せることにより増大させることができる（親和性成熟の方法）。さらなる詳細については、J. Mol. Biol. 332、489-503(2003), PNAS 100(4)、1700-1705(2003)及びJ. Mol. Biol. 369, 1015-1028(2007)及び米国特許出願公開第２００４０１３２０２８号を参照のこと。
【００６０】
単一ドメイン抗体は、単一の単量体可変抗体ドメインからなる抗体断片である。第１の単一ドメインは、ラクダ科の抗体重鎖の可変ドメインに由来するものであった（ＶＨＨ断片のナノボディ）。さらに、単一ドメイン抗体という用語は、サメに由来する自律性ヒト重鎖可変ドメイン（ａＶＨ）又はＶＮＡＲ断片を含む。
【００６１】
参照分子と「同じエピトープに結合する抗原結合分子」とは、競合アッセイにおいてその抗原に対する参照分子の結合を５０％以上ブロックする抗原結合分子を指し、逆に、参照分子は競合アッセイにおいてその抗原に対する抗原結合分子の結合を５０％以上ブロックする。
【００６２】
用語「抗原結合ドメイン」は、抗原の一部又は全部に特異的に結合し、且つ抗原の一部又は全部に相補的な領域を含む抗体結合分子の部分を指す。抗原が大きい場合、抗原結合分子は、エピトープと呼ばれる抗原の特定部分にのみ結合しうる。抗原結合ドメインは、例えば、一又は複数の可変ドメイン（可変領域とも呼ばれる）により提供されうる。好ましくは、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
【００６３】
本明細書において使用される用語「抗原決定基」は、「抗原」及び「エピトープ」と同義であり、抗原結合部分が結合し、抗原結合部分−抗原複合体を形成するポリペプチド巨大分子上の部位（例えば、アミノ酸の連続的広がり又は非連続的アミノ酸の異なる領域から形成される立体配座構造）を指す。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面に、ウイルス感染細胞の表面に、他の疾患細胞の表面に、免疫細胞の表面に、血清中に遊離した状態で、及び／又は細胞外基質（ＥＣＭ）に見出すことができる。特に断らない限り、本明細書において抗原として有用なタンパク質は、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来のタンパク質の任意の天然型を指す。特定の実施態様では、抗原はヒトタンパク質である。本明細書において特定のタンパク質が言及される場合、その用語は「完全長」の未処理のタンパク質と、細胞内でのプロセシングにより得られる任意の形態のタンパク質とを包含する。その用語はまた、天然に存在するタンパク質の変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体を包含する。
【００６４】
「特異的結合」とは、結合が、抗原について選択的であり、望ましくない相互作用又は非特異的相互作用とは区別可能であることを意味する。抗原結合分子の、特定の抗原への結合能は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られた他の技術、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（ＢＩＡｃｏｒｅ計器上での解析）（Liljeblad et al., Glyco J 17、323-329(2000)）、及び古典的結合アッセイ（Heeley, Endocr Res 28、217-229(2002)）により測定することができる。一実施態様では、抗原結合分子の無関係なタンパク質への結合の程度は、例えばＳＰＲによって測定した場合、抗原結合分子の抗原への結合の約１０％未満である。特定の実施態様では、抗原に結合する分子は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。
【００６５】
「親和性」又は「結合親和性」は、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合相互作用の総和の強度を指す。本明細書で使用する場合、特に断らない限り、「結合親和性」は、結合対（例えば抗体と抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映する本質的な結合親和性を指す。分子Ｘの、そのパートナーＹに対する親和性は、通常、解離定数（ＫＤ）によって表され、この解離定数（Ｋｄ）は、解離速度定数と会合速度定数（それぞれ、ｋｏｆｆ及びｋｏｎ）の比である。したがって、等価な親和性は、速度定数の比が同じままである限り、異なる速度定数を含みうる。親和性は、本明細書中に記載のものを含む当技術分野で既知の一般的な方法により測定することができる。親和性を測定するための特定の方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。
【００６６】
本明細書において使用される「Ｂ細胞抗原」は、Ｂリンパ球、特に悪性Ｂリンパ球の表面上に存在する抗原決定基を指す（この場合、抗原は「悪性Ｂ細胞抗原」とも呼ばれる）。
【００６７】
特に断らない限り、用語「ＣＤ１９」は、Ｂリンパ球表面抗原Ｂ４又はＴ細胞表面抗原Ｌｅｕ−１２としても知られるＢリンパ球抗原ＣＤ１９を指し、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）といった哺乳動物を含むあらゆる脊椎動物源由来のいずれかの天然型ＣＤ１９を含む。ヒトＣＤ１９のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ｐ１５３９１（バージョン１６０、配列番号８０）に示されている。この用語は、「完全長」の未処理ヒトＣＤ１９並びに細胞内でのプロセシングから生じた任意の形態のヒトＣＤ１９を、本明細書に報告される抗体がそれに結合する限りにおいて包含する。ＣＤ１９は、ヒトＢ細胞の表面に発現する構造的に異なる細胞表面受容体であり、これには、限定されないが、プレＢ細胞、早期発達期のＢ細胞（即ち、未成熟Ｂ細胞）、形質細胞への終末分化を経た成熟Ｂ細胞、及び悪性Ｂ細胞が含まれる。ＣＤ１９は、殆どのプレＢ急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ球性白血病、ヘアリー細胞白血病、一般的な急性リンパ球性白血病、及び一部のＮｕｌｌ細胞型急性リンパ芽球性白血病によって発現される。形質細胞におけるＣＤ１９の発現は、それが多発性骨髄腫といった分化したＢ細胞腫瘍に発現されうることをさらに示唆するものである。したがって、ＣＤ１９抗原は、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球性白血病及び／又は急性リンパ芽球性白血病の治療において免疫療法の標的である。
【００６８】
特に断らない限り、「ＣＤ２０」は、Ｂリンパ球表面抗原Ｂ１又は白血球表面抗原Ｌｅｕ−１６としても知られるＢリンパ球抗原ＣＤ２０を指し、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）といった哺乳動物を含むあらゆる脊椎動物源由来のいずれかの天然型ＣＤ２０を含む。ヒトＣＤ２０のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ｐ１１８３６（バージョン１４９、配列番号８１）に示されている。ＣＤ２０は、プレＢ及び成熟Ｂリンパ球に発現される、約３５ｋＤの分子量を有する疎水性膜貫通タンパク質である。対応するヒト遺伝子は、膜貫通４ドメイン、サブファミリーＡ、メンバー１であり、ＭＳ４Ａ１としても知られる。この遺伝子は、膜貫通４Ａ遺伝子ファミリーのメンバーをコードする。この新生タンパク質ファミリーのメンバーは、共通の構造的特徴及び類似のイントロン／エクソンのスプライス境界により特徴づけられ、造血細胞及び非リンパ系組織の中に固有の発現パターンを示す。この遺伝子は、Ｂ細胞の形質細胞への発達及び分化に参画するＢリンパ球表面分子をコードする。このファミリーメンバーは、ファミリーメンバーのクラスターの中でも１１ｑ１２に局在する。本遺伝子の選択的スプライシングは、同じタンパク質をコードする二の転写変異体を生じる。用語「ＣＤ２０」は、「完全長」の、未処理のＣＤ２０並びに細胞内でのプロセシングから生じた任意の形態のＣＤ２０を包含する。この用語は、天然に存在するＣＤ２０の変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体も包含する。
【００６９】
用語「抗ＣＤ２０抗体」及び「ＣＤ２０に結合する抗体」は、ＣＤ２０を標的とする際に診断薬及び／又は治療剤として抗体が有用であるように、十分な親和性でＣＤ２０に結合可能な抗体を指す。一実施態様において、抗ＣＤ２０抗体の、無関係な、非ＣＤ２０タンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定される場合、抗体のＣＤ２０への結合の約１０％未満である。特定の実施態様では、ＣＤ２０に結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。特定の実施態様では、抗ＣＤ２０抗体は、異なる種由来のＣＤ２０間で保存されているＣＤ２０のエピトープに結合する。
【００７０】
「ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体」は、Cragg et al., Blood 103 （2004） 2738-2743; Cragg et al., Blood 101 （2003） 1045-1052, Klein et al., mAbs 5 （2013）, 22-33に記載され、以下の表１にまとめられたＩＩ型抗ＣＤ２０抗体の結合特性及び生物活性を有する抗ＣＤ２０抗体を意味する。
【００７１】
2020504723.tif 000002
【００７２】
例示的ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体には、例えば、オビヌツズマブ（ＧＡ１０１）、トシツモマブ（Ｂ１）、ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体ＩｇＧ１（国際公開２００５／０４４８５９号に開示されるようなキメラヒト化ＩｇＧ１抗体）、１１Ｂ８  ＩｇＧ１（国際公開２００４／０３５６０７号に開示）及びＡＴ８０  ＩｇＧ１が含まれる。
【００７３】
一態様において、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体は、配列番号７０の重鎖可変領域配列（ＶＨＣＤ２０）と、配列番号７１の軽鎖可変領域配列（ＶＬＣＤ２０）とを含む。別の態様では、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体は、非改変抗体と比較してＦｃ領域に増加した非フコシル化オリゴ糖の部分を有するように改変される。一態様においては、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体のＦｃ領域において少なくとも約４０％のＮ結合型オリゴ糖が非フコシル化される。
【００７４】
特定の態様では、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体はオビヌツズマブである（WHO Drug Information, Vol. 26, No. 4, 2012, p. 453で推奨のINN）。本明細書で使用される場合、オビヌツズマブは、ＧＡ１０１の同義語である。商品名は、ＧＡＺＹＶＡ（登録商標）又はＧＡＺＹＶＡＲＯ（登録商標）である。これは、全ての旧版を差し替え（例えばVol. 25, No. 1, 2011, p.75-76）、元はアフツズマブとして知られていたものである（WHO Drug Information, Vol. 23, No. 2, 2009, p. 176;Vol. 22, No. 2, 2008, p. 124で推奨されるINN）。一実施態様において、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体は、配列番号１０の重鎖可変領域配列と、配列番号１１の軽鎖可変領域配列とを含む。一態様では、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体はトシツモマブである。
【００７５】
Ｉ型抗ＣＤ２０抗体の例には、例えばリツキシマブ、オファツムマブ、ベルツズマブ、オカラツズマブ、オクレリズマブ、ＰＲＯ１３１９２１、ｕｂｌｉｔｕｘｉｍａｂ、ＨＩ４７  ＩｇＧ３（ＥＣＡＣＣ、ハイブリドーマ）、２Ｃ６  ＩｇＧ１（国際公開第２００５／１０３０８１号に開示）、２Ｆ２  ＩｇＧ１（国際公開第２００４／０３５６０７号及び同第２００５／１０３０８１号に開示）及び２Ｈ７  ＩｇＧ１（国際公開第２００４／０５６３１２号に開示）が含まれる。
【００７６】
用語「ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体」は、ＩｇＧ１由来のヒト定常ドメインとのキメラ化及びその後のヒト化によって、マウスモノクローナル抗ＣＤ２０抗体Ｂ−Ｌｙ１（マウス重鎖の可変領域（ＶＨ）：配列番号８２；マウス軽鎖の可変領域（ＶＬ）：配列番号８３）（Poppema, S. and Visser, L., Biotest Bulletin 3 （1987） 131-139参照）から得られた、国際公開第２００５／０４４８５９号及び国際公開第２００７／０３１８７５号に開示されているようなヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体を指す（国際公開第２００５／０４４８５９号及び国際公開第２００７／０３１８７５号参照）。これらの「ヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体」は、国際公開第２００５／０４４８５９号及び国際公開第２００７／０３１８７５号に詳細に開示されている。
【００７７】
用語「減少／低減（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）」（及びその文法的変形、例えば「減少する／低減する（ｒｅｄｕｃｅ／ｒｅｄｕｃｉｎｇ）」）、例えばＢ細胞の数の減少又はサイトカイン放出の低減は、当技術分野において既知の適切な方法によって測定される、それぞれの量の減少を指す。明確に示すために、用語はゼロ（又は分析方法の検出限界を下回る値）への減少、即ち完全な消失又は排除も含む。逆に、「増加／増大した（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ）とは、それぞれの量の増加を指す。
【００７８】
本明細書において使用される「Ｔ細胞抗原」は、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の表面に提示される抗原決定基を指す。
【００７９】
本明細書において使用される「Ｔ細胞活性化治療剤」は、対象にＴ細胞活性化を誘導することのできる治療剤、特に対象にＴ細胞活性化を誘導するために設計された治療剤を指す。Ｔ細胞活性化治療剤の例には、ＣＤ３などの活性化Ｔ細胞抗原、及びＣＤ２０又はＣＤ１９などの標的細胞抗原に特異的に結合する二重特異性抗体が含まれる。さらなる例には、Ｔ細胞活性化ドメインと、ＣＤ２０又はＣＤ１９といった標的細胞抗原に特異的に結合する抗原結合部分とを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が含まれる。
【００８０】
本明細書において使用される「活性化Ｔ細胞抗原」は、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球によって発現される抗原決定基を指し、抗原結合分子との相互作用時にＴ細胞活性化を誘導又は増強することができる。具体的には、抗原結合分子とＴ細胞活性化抗原との相互作用は、Ｔ細胞受容体複合体のシグナル伝達カスケードをトリガーすることによりＴ細胞活性化を誘導することができる。例示的な活性化Ｔ細胞抗原はＣＤ３である。
【００８１】
特に断らない限り、用語「ＣＤ３」は、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）といった哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来のいずれかの天然型ＣＤ３を指す。用語は、「完全長」の、未処理のＣＤ３並びに細胞内でのプロセシングから生じた任意の形態のＣＤ３を包含する。この用語は、天然に存在するＣＤ３の変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体も包含する。一実施態様では、ＣＤ３は、ヒトＣＤ３、特にヒトＣＤ３のエプシロンサブユニット（ＣＤ３ε）である。ヒトＣＤ３のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）の登録番号Ｐ０７７６６（バージョン１４４）、又はＮＣＢＩ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）ＲｅｆＳｅｑ  ＮＰ＿０００７２４．１に示されている。配列番号８４も参照のこと。カニクイザル［Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ］ＣＤ３εのアミノ酸配列が、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ  ｎｏ．  ＢＡＢ７１８４９．１に示されている。配列番号８５も参照のこと。
【００８２】
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗原結合分子の抗原への結合に関与する抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然型抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は一般に、各々が四つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と三つの超可変領域（ＨＶＲ）とを含む、類似の構造を有する。例えば、Kindt et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 （2007）を参照されたい。単一のＶＨ又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分でありうる。
【００８３】
本明細書で使用される用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」は、配列が超可変であるか、及び／又は構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの各領域を指す。一般的に、天然型４鎖抗体は、ＶＨに三つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、及びＶＬに三つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）、計六つのＨＶＲを含む。ＨＶＲは、一般的に超可変ループ由来及び／又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を含み、後者は、最高の配列可変性を有し、及び／又は抗原認識に関与している。例示的な超可変ループは、アミノ酸残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、９１〜９６（Ｌ３）、２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）、及び９６〜１０１（Ｈ３）に生じる（Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 （1987））。例示的なＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３）は、アミノ酸残基Ｌ１の２４−３４、Ｌ２の５０−５６、Ｌ３の８９−９７、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−６５、及びＨ３の９５−１０２に生じる。（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD （1991）。）超可変領域（ＨＶＲ）は、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも呼ばれ、これらの用語は、抗原結合領域を形成する可変領域の部分に関連して本明細書では交換可能に使用される。このような特定の領域は、Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, 「Sequences of Proteins of Immunological Interest」（1983） 及びChothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 （1987）により記載されており、その定義には、互いに比較されたときのアミノ酸残基の重複又はサブセットが含まれる。それでも、抗体又はその変異体のＣＤＲに言及するためにいずれかの定義が適用される場合、本明細書において定義及び使用される用語の範囲に含まれることが意図されている。上記文献の各々により定義されるＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基は、比較として以下の表Ｂに明記される。特定のＣＤＲを包含する正確な残基数は、ＣＤＲの配列及び大きさに応じて変化するであろう。当業者であれば、抗体の可変領域のアミノ酸配列を前提に、いずれの残基が特定のＣＤＲを含むかを、常套的に決定することができる。
【００８４】
2020504723.tif 000003
１  表ＡのすべてのＣＤＲの定義の番号付けは、Ｋａｂａｔら（以下参照）によって規定された番号付けの慣習に従っている。
２  表Ａにおいて使用されている小文字の「ｂ」を含む「ＡｂＭ」は、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒの「ＡｂＭ」抗体モデル化ソフトウェアによって定義されるＣＤＲを指す。
【００８５】
Ｋａｂａｔらは、あらゆる抗体に適用可能な可変領域配列の番号付けシステムも定義した。当業者であれば、配列自体を超える実験データに頼らなくとも、この「Ｋａｂａｔ番号付け」のシステムをあらゆる可変領域配列に明確に割り当てることができる。ここで使用される「カバット番号付け」は、Kabat et al., U.S. Dept. of Health and ヒトServices, “Sequence of Proteins of Immunological Interest”（1983）によって規定された番号付けシステムを指す。特に断らない限り、抗体可変領域内における特定のアミノ酸残基の位置の番号付けへの言及は、カバット番号付けシステムに従っている。
【００８６】
ＶＨのＣＤＲ１を除いて、ＣＤＲは一般的に超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。ＣＤＲは、抗原に接触する残基である「特異性決定残基」又は「ＳＤＲ」を含む。ＳＤＲは、略称（ａｂｂｒｅｖｉａｔｅｄ−）ＣＤＲ、又はａ−ＣＤＲと呼ばれるＣＤＲの領域内に含まれている。例示的なａ−ＣＤＲ（ａ−ＣＤＲ−Ｌ１、ａ−ＣＤＲ−Ｌ２、ａ−ＣＤＲ−Ｌ３、ａ−ＣＤＲ−Ｈ１、ａ−ＣＤＲ−Ｈ２、及びａ−ＣＤＲ−Ｈ３）は、アミノ酸残基Ｌ１の３１−３４、Ｌ２の５０−５５、Ｌ３の８９−９６、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−５８、及びＨ３の９５−１０２に生じる。（Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 （2008）参照。）特に断らない限り、可変ドメイン内のＨＶＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書では、上掲のKabat et al.に従って番号付けされる。
【００８７】
本明細書において抗原結合分子（例えば抗体）の文脈で使用される用語「親和性成熟」は、参照抗原結合分子に由来し、例えば変異により、参照抗体と同じ抗原に、好ましくは同じエピトープに結合し、抗原に対して、参照抗原結合分子より高い親和性を有す抗原結合分子を指す。親和性成熟は通常、抗原結合分子の一又は複数のＣＤＲにおいて一又は複数のアミノ酸残基の修飾を伴う。典型的には、親和性成熟抗原結合分子は、最初の参照抗原結合分子と同じエピトープに結合する。
【００８８】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般に四つのＦＲのドメイン、即ちＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４で構成される。したがって、ＨＶＲ及びＦＲ配列は一般にＶＨ（又はＶＬ）の以下の配列に現れる：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。
【００８９】
本明細書における目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」は、下記に定義されるように、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークから得られる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含有するフレームワークである。ヒト免疫グロブリンのフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同一のアミノ酸配列を含んでもよく、又はアミノ酸配列の変化を含んでもよい。いくつかの実施態様において、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。いくつかの実施態様において、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンのフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列が同一である。
【００９０】
用語「キメラ」抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が特定の起源又は種に由来し、重鎖及び／又は軽鎖の残りが異なる起源又は種に由来する抗体を指す。
【００９１】
抗体の「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域の種類を指す。抗体には５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、これらのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２に、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩＧＡ１、及びＩｇＡ２に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
【００９２】
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基、及びヒトＦＲ由来アミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。特定の実施態様において、ヒト化抗体は、少なくとも一つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）のすべて又は実質的にすべてが、 非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲのすべて又は実質的にすべてが、ヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意選択的に、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。抗体の「ヒト化型」、例えば、非ヒト抗体は、ヒト化を遂げた抗体を指す。本発明により包含される「ヒト化抗体」の他の形態は、特にＣ１ｑ結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合に関して本発明による特性を産むように定常領域が追加的に修飾されているもの又は元の抗体から変更されているものである。
【００９３】
「ヒト抗体」は、ヒト又はヒト細胞により産生されるか、又はヒト抗体のレパートリーや他のヒト抗体をコードする配列を利用した非ヒト起源に由来する抗体のそれに対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。
【００９４】
本明細書の用語「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む、抗体重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域と変異型Ｆｃ領域を含む。ＩｇＧ  Ｆｃ領域は、ＩｇＧ  ＣＨ２及びＩｇＧ  ＣＨ３ドメインを含む。ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」は通常、約２３１位のアミノ酸残基から約３４０位のアミノ酸残基まで延びる。一実施態様において、糖（炭水化物）鎖がＣＨ２ドメインに付着している。本明細書のＣＨ２ドメインは、天然型配列のＣＨ２ドメインでも変異体のＣＨ２ドメインでもよい。「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域においてＣ末端からＣＨ２ドメインに一連の残基を含む（即ちＩｇＧの約３４１位のアミノ酸残基から約４４７位のアミノ酸残基まで）。ここでＣＨ３領域は、天然型配列ＣＨ３ドメインでも変異型ＣＨ３ドメイン（例えばその一つの鎖に導入された「隆起」（「ノブ」）と、その他の鎖に導入された対応する「空洞」（「ホール」）とを有するＣＨ３ドメイン、ここで参照することにより本明細書に明示的に包含される米国特許第５８２１３３３号参照）でもよい。このような変異型ＣＨ３ドメインは、本明細書に記載されるように、二つの非同一の抗体重鎖のヘテロ二量体化を促進するために使用することができる。一実施態様において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域はＣｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端まで延びる。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在しても、存在しなくてもよい。本明細書に別途指定のない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。
【００９５】
「ノブ−イントゥ−ホール」技術は、例えば、米国特許第５７３１１６８号；同第７６９５９３６号；Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 （1996）及びCarter, J Immunol Meth 248, 7-15 （2001）に記載されている。通常、この方法は、隆起がそれに対応する空洞内に位置できるように、第１のポリペプチドの接触面に隆起（「ノブ」）を、及び第２のポリペプチドの接触面に対応する空洞を、それぞれ導入することにより、ヘテロダイマー形成を促進し、且つホモ二量体形成を妨害することを伴う。隆起は、第１のポリペプチドの接触面由来の小さなアミノ酸側鎖を大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）で置き換えることにより構築される。隆起と同じか又は同様のサイズの相補的空洞は、大きなアミノ酸側鎖をそれよりも小さなもの（例えばアラニン又はスレオニン）で置き換えることにより、第２のポリペプチドの接触面に作り出される。隆起と空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を、例えば部位特異的突然変異誘発により、又はペプチド合成により、変化させることにより作り出すことができる。特定の実施態様では、ノブ修飾は、Ｆｃドメインの二つのサブユニットの一方にアミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含み、ホール修飾は、Ｆｃドメインの二つのサブユニットの他方にアミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含む。さらなる特定の実施態様では、ノブ修飾を含むＦｃドメインのサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃをさらに含み、ホール修飾を含むＦｃドメインのサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃをさらに含む。これら二つのシステイン残基の導入により、Ｆｃ領域の二つのサブユニット間にジスルフィド架橋が形成され、したがって二量体をさらに安定させる（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 （2001））。
【００９６】
「免疫グロブリンのＦｃ領域に相当する領域」は、免疫グロブリンのＦｃ領域の天然に存在する対立遺伝子変異体、並びに置換、付加、又は欠失を生成するが、免疫グロブリンのエフェクター機能（例えば抗体依存性細胞傷害性）の媒介能を実質的に低下させない変更を有する変異体を含むことを意図している。例えば、一又は複数のアミノ酸は、生物学的機能を実質的に損なうことなく、免疫グロブリンのＦｃ領域のＮ末端又はＣ末端から削除することができる。このような変異体は、活性に対する影響を最小化するために、当技術分野において既知の一般則に従って選択することができる（例えば、Bowie, J. U. et al., Science 247:1306-10 （1990）参照）。
【００９７】
用語「エフェクター機能」は、抗体のアイソタイプにより変わる、抗体のＦｃ領域に起因しうる生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例には：Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）；サイトカイン分泌；抗原提示細胞による免疫複合体媒介抗原取り込み；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御；及びＢ細胞の活性化が含まれる。
【００９８】
「活性化Ｆｃ受容体」は、抗体のＦｃ領域の結合に続いて、エフェクター機能を実行するように受容体保有細胞を刺激するシグナル伝達現象を生じさせるＦｃ受容体である。活性化Ｆｃ受容体には、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）、及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）が含まれる。特定の活性化Ｆｃ受容体はヒトＦｃγＲＩＩＩａ（ＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ｐ０８６３７、バージョン１４１参照）。
【００９９】
本明細書において使用される用語「エフェクター細胞」は、エフェクター部分受容体、例えばサイトカイン受容体、及び／又はＦｃ受容体を表面上に発現し、それによりエフェクター部分、例えばサイトカイン、及び／又は抗体のＦｃ領域に結合して標的細胞、例えば腫瘍細胞の破壊に貢献するリンパ球の集団を指す。エフェクター細胞は、例えば細胞傷害性又は食作用効果を媒介する。エフェクター細胞には、限定されないが、エフェクターＴ細胞、例えばＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、γδＴ細胞、ＮＫ細胞、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞及びマクロファージ／単球が含まれる。
【０１００】
「エクトドメイン」は、細胞外空間（即ち標的細胞外の空間）中に延びる膜タンパク質のドメインである。エクトドメインは通常、表面との接触を開始するタンパク質の部分であり、シグナル伝達をもたらす。したがって、本明細書に定義される４−１ＢＢＬのエクトドメインは、細胞外空間（細胞外ドメイン）中に延びる４−１ＢＢＬの一部を指すが、三量体化及び対応する受容体４−１ＢＢへの結合を担う、そのより短い部分又は断片も含む。したがって、用語「４−１ＢＢＬのエクトドメイン又はその断片」は、細胞外ドメインを形成する４−１ＢＢＬの細胞外ドメイン又は依然受容体に結合できるその部分（受容体結合ドメイン）を指す。
【０１０１】
「４−１ＢＢＬ」又は「４−１ＢＢリガンド」又は「ＣＤ１３７Ｌ」は、Ｔ細胞の増殖とサイトカイン生成を同時刺激することができる同時刺激性ＴＮＦリガンドのファミリーメンバーである。同時刺激性ＴＮＦファミリーリガンドは、対応するＴＮＦ受容体と相互作用すると、ＴＣＲ  シグナルを同時刺激することができ、その受容体との相互作用はＴＮＦＲ関連因子（ＴＲＡＦ）の動員をもたらし、それによりシグナル伝達カスケードが開始されてＴ細胞活性化を招く。４−１ＢＢＬはＩＩ型膜貫通タンパク質である。配列番号８６のアミノ酸配列を有する完全又は完全長４−１ＢＢＬは、細胞の表面上に三量体を形成することが記載されている。三量体の形成は、４−１ＢＢＬのエクトドメインの特定の動機により可能になる。前記動機は、本明細書では、「三量体化領域」と命名される。ヒト４−１ＢＢＬ配列（配列番号８７）のアミノ酸５０〜２５４は、４−１ＢＢＬの細胞外ドメインを形成するが、その断片も三量体を形成することができる。本発明の特定の実施態様では、用語「４−１ＢＢＬのエクトドメイン又はその断片」は、配列番号４（ヒト４−１ＢＢＬのアミノ酸５２−２５４）、配列番号１（ヒト４−１ＢＢＬのアミノ酸７１−２５４）、配列番号３（ヒト４−１ＢＢＬのアミノ酸８０−２５４）、配列番号２（ヒト４−１ＢＢＬのアミノ酸８５−２５４）、配列番号５（ヒト４−１ＢＢＬのアミノ酸７１−２４８）、配列番号６（ヒト４−１ＢＢＬのアミノ酸８５−２４８）、配列番号７（ヒト４−１ＢＢＬアミノ酸８０−２４８）及び配列番号８（ヒト４−１ＢＢＬのアミノ酸５２−２４８）から選択されるアミノ酸を有するポリペプチドを指すが、本明細書には三量体化能を有するエクトドメインの他の断片も含まれる。
【０１０２】
特に断らない限り、本明細書で使用される用語「４−１ＢＢ」又は「ＣＤ１３７」は、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス、ラット）などの哺乳動物を含むあらゆる脊椎動物源由来のいずれかの天然型４−１ＢＢを指す。用語は、「完全長」の、未処理の４−１ＢＢ並びに細胞内でのプロセシングから生じた任意の形態の４−１ＢＢを包含する。この用語は、天然に存在する４−１ＢＢの変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体も包含する。例示的なヒト４−１ＢＢのアミノ酸配列は、配列番号８８（ＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ｑ０７０１１）に示されており、例示的なマウスの４−１ＢＢのアミノ酸配列は配列番号８９（ＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ｐ２０３３４）に示されており、例示的なカニクイザル４−１ＢＢのアミノ酸配列（アカゲザル由来）は配列番号９０（ＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ｆ６Ｗ５Ｇ６）に示されている。
【０１０３】
用語「抗４−１ＢＢ抗体」、「抗４−１ＢＢ」、「４−１ＢＢ抗体」及び「４−１ＢＢに特異的に結合する抗体」は、４−１ＢＢを標的とする際に診断薬及び／又は治療剤として抗体が有用であるように、十分な親和性で４−１ＢＢに結合可能な抗体を指す。一実施態様において、抗４−１ＢＢ抗体の、無関係な、非４−１ＢＢタンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又はフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって測定される場合、抗体の４−１ＢＢへの結合の約１０％未満である。特定の実施態様では、４−１ＢＢに結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−６Ｍ以下、例えば１０−６８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば、１０−８Ｍから１０−１０Ｍ）の解離定数（ＫＤ）を有する。
【０１０４】
用語「ペプチドリンカー」は、一又は複数のアミノ酸、典型的には約２から２０のアミノ酸を含むペプチドを指す。ペプチドリンカーは当技術分野において既知であるか、又は本願明細書に記載される。適切な非免疫原性リンカーペプチドは、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎ又はＧ４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーであり、ここで「ｎ」は通常１から１０、典型的には２から４、特に２の数であり、即ちＧＧＧＧＳ（配列番号９１）ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９２）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号９３）及びＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号９４）からなる群より選択されるペプチドであるが、配列ＧＳＰＧＳＳＳＳＧＳ（配列番号９５）、（Ｇ４Ｓ）３（配列番号９６）、（Ｇ４Ｓ）４（配列番号９７）、ＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号９８）、ＧＳＧＳＧＮＧＳ（配列番号９９）、ＧＧＳＧＳＧＳＧ（配列番号１００）、ＧＧＳＧＳＧ（配列番号１０１）、ＧＧＳＧ（配列番号１０２）、ＧＧＳＧＮＧＳＧ（配列番号１０３）、ＧＧＮＧＳＧＳＧ（配列番号１０４）及びＧＧＮＧＳＧ（配列番号１０５）も含む。特に興味深いペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）（配列番号９１）、（Ｇ４Ｓ）２及びＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９２）である。
【０１０５】
本願内で使用される場合、用語「アミノ酸」は、アラニン（３文字コード：ａｌａ、１文字コード：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）、及びバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む天然に存在するカルボキシα−アミノ酸の群を意味する。
【０１０６】
「融合した」又は「接続した」とは、成分（例えば４−１ＢＢＬのエクトドメイン及びポリペプチド）が、ペプチド結合により、直接又は一又は複数のペプチドリンカーを介して結合していることを意味する。
【０１０７】
参照ポリペプチド（タンパク質）配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入した後、いかなる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした場合の、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当分野の技術の範囲内にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＳＡＷＩ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公的に入手可能なコンピューターソフトウェアを使用して達成することができる。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大の整列を達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列を整列させるための適切なパラメーターを決定することができる。しかしながら、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性の値は、配列比較コンピュータープログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータープログラムはジェネンテック社によって作製され、ソースコードは米国著作権庁、ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２は、ジェネンテック社（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から公的に入手可能であり、又はそのソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸのＶ４．０Ｄを含む、ＵＮＩＸオペレーティングシステム上での使用のためにコンパイルされるべきである。すべての配列比較パラメーターは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され変動しない。アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ−２が用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Ａの、所与のアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（或いは、所与のアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して特定の％アミノ酸配列同一性を有する又は含む所与のアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
１００  ×  分率Ｘ／Ｙ
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２により、ＡとＢのそのプログラムのアラインメントにおいて同マッチとしてスコア化されるアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に断らない限り、本明細書で使用されるすべての％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータープログラムを使用して、前段落で説明したように得られる。
【０１０８】
特定の実施態様では、本明細書に提供される抗原結合分子のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、抗原結合分子の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望まれる。抗原結合分子のアミノ酸配列変異体は、分子をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入することにより、又はペプチド合成により調製されうる。このような修飾は、例えば抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／又はそれへの挿入、及び／又はそれの置換を含む。最終コンストラクトが所望の特性、例えば、抗原結合を有していることを条件として、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせを、最終構築物に到達させるために作ることができる。置換突然変異の対象となる部位は、ＨＶＲとフレームワーク（ＦＲ）を含む。保存的置換を表Ｃの「好ましい置換」という項目に示し、アミノ酸側鎖クラス（１）から（６）を参照してさらに後述する。アミノ酸置換は、目的の分子に導入することができ、その産物は、所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の低下、又はＡＤＣＣ若しくはＣＤＣの改善についてスクリーニングされる。
【０１０９】
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【０１１０】
アミノ酸は共通の側鎖特性に従ってグループ化することができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ
【０１１１】
非保存的置換は、これらのクラスの一つのメンバーを他のクラスと交換することを必要とするであろう。
【０１１２】
用語「アミノ酸配列変異体」は、親抗原結合分子の一又は複数の超可変領域残基中にアミノ酸置換が存在する実質的変異体を含む（例えばヒト化又はヒト抗体）。一般的には、結果として得られ、さらなる研究のために選択された変異体は、親抗原結合分子と比較して、特定の生物学的特性に修飾（例えば、改善）（例えば、親和性の向上、免疫原性の低下）を有する、及び／又は親抗原結合分子の特定の生物学的特性を実質的に保持しているであろう。例示的な置換型変異体は、親和性成熟抗体であり、例えば、本明細書に記載されるようなファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を用いて、簡便に生成することができる。簡潔に言えば、一又は複数のＣＤＲ残基が変異し、変異型抗原結合分子は、ファージ上に表示され、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。特定の実施態様では、置換、挿入又は削除は、 これらの改変が抗原に対する抗原結合分子の結合能を実質的に低下させない限り、一又は複数のＣＤＲ内で生じうる。例えば、実質的に結合親和性を低下させない保存的変更（例えば本明細書において提供される保存的置換）をＣＤＲ内で行うことができる。突然変異誘発のために標的とすることができる抗体の残基又は領域を同定するための有用な方法は、Cunningham and Wells （1989） Science, 244:1081-1085により記載されているように、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。この方法では、標的残基の一つの残基又はグループ（例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、及びＧｌｕなどの荷電残基）が同定され、抗原と抗体との相互作用が影響を受けるかどうかを決定するために、中性又は負に帯電したアミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）により置き換えられる。さらなる置換が、最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸の位置に導入されうる。代替的に又は追加的に、抗体と抗原の接点を同定するための抗原−抗原結合分子複合体の結晶構造。そのような接触残基及び隣接残基は、置換の候補として標的とされる又は排除される。変異体は、それらが所望の特性を含むかどうかを決定するためにスクリーニングされる。
【０１１３】
アミノ酸配列挿入は、 一残基から、百以上の残基を含有するポリペプチドの長さにわたるアミノ及び／又はカルボキシル末端融合、 並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗原結合分子が含まれる。分子の他の挿入変異体は、抗原結合分子の血清半減期を延ばすポリペプチドに対するＮ末端又はＣ末端への融合物を含む。
【０１１４】
特定の実施態様では、本明細書に提供される抗原結合分子は、抗体がグリコシル化される程度を上昇又は低下させるように改変される。分子のグリコシル化変異体は、簡便には、一又は複数のグリコシル化部位が生成又は除去されるようにアミノ酸配列を改変することにより得られる。抗原結合分子がＦｃ領域を含む場合、それに付着する糖（炭水化物）が改変されうる。哺乳動物細胞によって生成された天然抗体は、典型的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にＮ結合により一般に付着した分岐状の二分岐オリゴ糖を含む。例えばWright et al. TIBTECH 15:26-32 （1997）を参照。オリゴ糖は、様々な炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸、並びに二分岐糖鎖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合したフコースを含む。いくつかの実施態様では、抗原結合分子中のオリゴ糖の修飾は、特定の改善された特性を有する変異体を作成するためになされうる。一態様において、Ｆｃ領域に（直接的又は間接的に）付着するフコースを欠く糖鎖（炭水化物）構造を有する抗原結合分子の変異体が提供される。このようなフコシル化変異体は、改善されたＡＤＣＣ機能を有しうる。例えば米国特許出願公開番号第２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）又は同２００４／００９３６２１号（Ｋｙｏｗａ  Ｈａｋｋｏ  Ｋｏｇｙｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を参照のこと。本発明の抗原結合分子のさらなる変異体は、二分されたオリゴ糖を含むもの、例えば、Ｆｃ領域に付着する二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃにより二分されているものを含む。このような変異体は、低下したフコシル化及び／又は改善されたＡＤＣＣ機能を有しうる。例えば国際公開第２００３／０１１８７８号（Jean-Mairet et al.）；米国特許第６６０２６８４号（Umana et al.）；及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号（Umana et al.）を参照のこと。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖内に少なくとも１つのガラクトース残基を持つ変異体も提供される。このような抗体変異体は、改善されたＣＤＣ機能を有し、例えば、国際公開第１９９７／３００８７号（Patel et al.）；国際公開第１９９８／５８９６４号（Raju, S.）；及び国際公開第１９９９／２２７６４（Raju, S.）に記載されている。
【０１１５】
特に接頭語「グリコ」を伴う「操作」、並びに用語「グリコシル化操作」は、細胞内で発現される糖タンパク質のグリコシル化の変化を達成するためのオリゴ糖合成経路の遺伝子操作を含む、細胞のグリコシル化機構の代謝操作を含む。さらに、グリコシル化操作は、グリコシル化の変異及び細胞環境の影響を含む。一実施態様では、グリコシル化操作は、グリコシルトランスフェラーゼ活性の改変である。特定の実施態様では、操作は、グルコサミニルトランスフェラーゼ活性及び／又はフコシルトランスフェラーゼ活性の改変をもたらす。グリコシル化操作を使用して、「増大したＧｎＴＩＩＩ活性を有する宿主細胞」（例えばβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ  ＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）活性を有する上昇したレベルの一又は複数のポリペプチドを発現するように操作された宿主細胞），「増大したＭａｎＩＩ活性を有する宿主細胞」（例えばα−マンノシダーゼ  ＩＩ（ＭａｎＩＩ）活性を有する上昇したレベルの一又は複数のポリペプチドを発現するように操作された宿主細胞）、又は「低減したα（１，６）フコシルトランスフェラーゼ活性を有する宿主細胞」（例えば低下したレベルのα（１，６）フコシルトランスフェラーゼを発現するように操作された宿主細胞）を得ることができる。
【０１１６】
本明細書において使用される用語「ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチド」は、Ｎ結合型オリゴ糖のトリマンノシルコアのβ結合型マンノシドへのβ−１，４の結合中のＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基の付加を触媒できるポリペプチドを指す。これには、特定の生物学的アッセイで測定した場合に、用量依存性あり又はなしで、Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＮＣ−ＩＵＢＭＢ）によればβ−１，４−マンノシル−糖タンパク質  ４−ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニル−トランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．１．１４４）としても知られる、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩの活性に必ずしも同一ではないが類似の酵素活性を呈する融合ポリペプチドが含まれる。用量依存性が存在する場合には、ＧｎＴＩＩＩのものと同一である必要はなく、むしろＧｎＴＩＩＩと比較したとき、所与の活性おける用量依存性と実質的に類似している必要がある（即ち候補ポリペプチドは、より大きな活性を呈するか又はＧｎＴＩＩＩの約２５分の１以下、好ましくは約１０分の１以下、最も好ましくは約３分の１以下の活性を呈するであろう）。
【０１１７】
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）は、免疫エフェクター細胞により抗体でコートされた標的細胞の溶解を招く免疫機構である。標的細胞は、Ｆｃ領域を含む抗体又はその断片が通常Ｆｃ領域に対するＮ末端であるタンパク質部分を介して特異的に結合する細胞である。本明細書で使用される用語「増加した／減少したＡＤＣＣ」は、標的細胞を囲む媒質中の所定の抗体濃度において、上記に定義したＡＤＣＣの機構により所定の時間内に溶解する標的細胞数の増加／減少、及び／又はＡＤＣＣの機構により所定の時間内に所定の数の標的細胞を溶解させるために必要な、標的細胞を囲む媒質中の抗体濃度の低下／上昇のいずれかと定義される。増加した／減少したＡＤＣＣは、同じ標準的な生成、精製、製剤化、及び貯蔵方法（当業者に既知の）を用いて、但し改変されていない、同じ型の宿主細胞により生成される同じ抗体により媒介されるＡＤＣＣと相対的なものである。例えば、本明細書に記載される方法により改変されたグリコシル化パターン（例えばグリコシルトランスフェラーゼ、ＧｎＴＩＩＩ、又はその他のグリコシルトランスフェラーゼ）を有するように操作された宿主細胞により生成される抗体が媒介するＡＤＣＣの増加は、同じ種類の非操作宿主細胞により生成された同じ抗体によって媒介されるＡＤＣＣに対するものである。
【０１１８】
特定の態様では、本発明は、すべてではないがいくつかのエフェクター機能を有し、それにより、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗体の半減期が重要であるが、特定のエフェクター機能（例えば補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）及び抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ））が不要又は有害である用途のための望ましい候補となる、抗体変異体を意図している。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏ細胞傷害性アッセイを、ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣの活性の低下／枯渇を確認するために実施することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを実施して、抗体が、ＦｃγＲ結合を欠く（したがっておそらくＡＤＣＣ活性を欠く）がＦｃＲｎ結合能力を保持することを確かめることができる。ＡＤＣＣを媒介するための初代細胞であるＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現が、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞におけるＦｃＲの発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 （1991）の４６４ページの表３に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの非限定的な例は、米国特許第５５００３６２号（例えば、Hellstrom, I. et al.のProc. Nat’l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 （1986）を参照）及びHellstrom, I et al.、Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 （1985）；同第５８２１３３７号（Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 （1987）を参照）に記載されている。或いは、非放射性アッセイ法を用いることができる（例えば、フローサイトメトリー用のＡＣＴＩＴＭ非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）；及びＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。或いは、又は加えて、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Clynes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:652-656 （1998）に開示されているような動物モデルにおいて、ｉｎ  ｖｉｖｏで評価されうる。また、Ｃ１ｑ結合アッセイを、抗体が体Ｃ１ｑを結合することができないこと、したがって、ＣＤＣ活性を欠くことを確認するために実施することができる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを実施することができる（例えば、Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 （1996）; Cragg, M.S. et al.、Blood 101:1045-1052 （2003）;及びCragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 （2004）を参照）。ＦｃＲｎ結合、及びｉｎ  ｖｉｖｏでのクリアランス／半減期の決定も、当分野で既知の方法を用いて行うことができる（例えば、Petkova, S.B. et al., Int’l. Immunol. 18（12）:1759-1769 （2006）；国際公開第２０１３／１２０９２９号を参照）。
【０１１９】
エフェクター機能が低下した抗体は、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、及び３２９のうちの一又は複数の置換を伴うものを含む（米国特許第６７３７０５６号）。そのようなＦｃ変異体は、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有するいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ突然変異体を含め、アミノ酸位２６５、２６９、２７０、２９７、及び３２７のうちの二つ以上に置換を有するＦｃ変異を含む（米国特許第７３３２５８１号）。ＦｃＲへの改善又は減少した結合を有する特定の抗体変異体が記載されている。（例えば、米国特許第６７３７０５６号；国際公開第２００４／０５６３１２号、及びShields et al., J. Biol. Chem. 9（2）: 6591-6604 （2001）を参照）。特定の実施態様では、抗体変異体は、ＡＤＣＣを改善する一又は複数のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の２９８位、３３３位，及び／又は３３４位（残基のＥＵ番号付け）における置換を含むＦｃ領域を含む。
【０１２０】
特定の態様では、抗体変異体は、ＦｃγＲ結合を縮小する一又は複数のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の２３４位及び２３５位（残基のＥＵ番号付け）における置換を含むＦｃ領域を含む。一態様において、置換はＬ２３４ＡとＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）である。特定の態様では、抗体変異体は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域内にＤ２６５Ａ及び／又はＰ３２９Ｇをさらに含む。一態様において、置換は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域内のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＬＡＬＡ−ＰＧ）である。（例えば、国際公開第２０１２／１３０８３１を参照のこと。）別の態様では、置換は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域内のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＤ２６５Ａ（ＬＡＬＡ−ＤＡ）である。
【０１２１】
いくつかの実施態様では、例えば、米国特許第６１９４５５１号、国際公開第９９／５１６４２号、及びIdusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 （2000）に記載されるような、改変された（即ち改善又は低減された）Ｃ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を生じる、Ｆｃ領域における改変がなされる。
【０１２２】
半減期が延長され、胎児への母性ＩｇＧの移動を担う（Guyer et al., J. Immunol. 117:587 （1976）及びKim et al., J. Immunol. 24:249 （1994））新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合性が改善された抗体が、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４号（Hinton et al.）に記述されている。これら抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善する一又は複数の置換を伴うＦｃ領域を含む。このようなＦｃ変異体は、Ｆｃ領域残基：２３８、２５２、２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４又は４３４のうちの一又は複数における置換、例えば、Ｆｃ領域残基４３４の置換を含むものを含む（例えば、米国特許第７３７１８２６号；Dall’Acqua, W.F., et al. J. Biol. Chem. 281 （2006） 23514-23524）。
【０１２３】
特定の態様では、抗体変異体は、ＦｃＲｎ結合を低減する一又は複数のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の２５３位、及び／又は３１０位、及び／又は４３５位（残基のＥＵ番号付け）における置換を含むＦｃ領域を含む。特定の態様では、抗体変異体は、２５３位、３１０位及び４３５位にアミノ酸置換を有するＦｃ領域を含む。一態様において、置換は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域内のＩ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａである。例えば、Grevys, A., et al., J. Immunol. 194 （2015） 5497-5508を参照されたい。
【０１２４】
別の態様では、抗体変異体は、ＦｃＲｎ結合を低減する一又は複数のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の３１０位、及び／又は４３３位、及び／又は４３６位（残基のＥＵ番号付け）における置換を含むＦｃ領域を含む。特定の態様では、抗体変異体は、３１０位、４３３位及び４３６位にアミノ酸置換を有するＦｃ領域を含む。一態様において、置換は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域内のＨ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ及びＹ４３６Ａである。例えば、国際公開第２０１４／１７７４６０を参照のこと。
【０１２５】
特定の態様では、抗体変異体は、ＦｃＲｎ結合を増大させる一又は複数のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の２５２位、及び／又は２５４位、及び／又は２５６位（残基のＥＵ番号付け）における置換を含むＦｃ領域を含む。特定の実施態様では、抗体変異体は、２５２位、２５４位及び２５６位にアミノ酸置換を有するＦｃ領域を含む。一実施態様では、置換は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域内のＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅである（Duncan & Winter, Nature 322:738-40 （1988）；米国特許第５６４８２６０号；同第５６２４８２１号；及びＦｃ領域変異体の他の例については国際公開第９４／２９３５１号も参照のこと）。
【０１２６】
特定の実施態様では、本発明の抗原結合分子のシステイン操作変異体、例えば、分子の一又は複数の残基がシステイン残基で置換されている「チオＭａｂ」を作成することが望ましい。特定の実施態様において、置換される残基が分子の到達可能な部位で生じる。これらの残基をシステインで置換することによって、反応性チオール基が抗体の到達可能な部位に配置され、抗体を他の部分、例えば薬物部分又はリンカー−薬剤部分にコンジュゲートさせ、免疫コンジュゲートを作るために使用することができる。特定の実施態様では、以下の残基のうちのいずれかの一又は複数がシステイン：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔの番号付け）；重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）で置換される。システイン操作抗原結合分子は、例えば米国特許第７５２１５４１号に記載されているように生成されうる。
【０１２７】
特定の態様では、本明細書に提供される抗原結合分子は、当技術分野で知られ、容易に入手可能な追加の非タンパク質部分を含むようにさらに修飾することができる。抗体の誘導体化に適した部分は、限定しないが、水溶性ポリマーを含む。水溶性ポリマーの非限定的な例は、限定しないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムコポリマー）及びデキストラン又はポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレン（ｐｒｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）オキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール並びにこれらの混合物を含む。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドはその水中での安定性のために製造上の利点を有し得る。ポリマーは任意の分子量のものであってよく、分枝鎖又は未分枝鎖であってよい。抗体に付着するポリマーの数は変化してよく、一を超えるポリマーが付着する場合、それらは同じ分子でも又は異なる分子でもよい。一般的に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又は種類は、改善されるべき抗体の特定の特性又は機能、二重特異性抗体誘導体が限定条件下での治療に使用されるかどうかなどを含むが、これらに限定されない考慮事項に基づいて決定することができる。別の態様では、放射線への曝露により選択的に加熱することのできる抗体と非タンパク質部分のコンジュゲートが提供される。一実施態様では、非タンパク質部分はカーボンナノチューブである（Kam, N.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 （2005） 11600-11605）。放射線は、任意の波長であってよく、限定しないが、通常の細胞に害を与えないが抗体−非タンパク質部分の近位細胞を死滅させる温度に非タンパク質部分を加熱する波長を含む。別の態様では、本明細書に提供される４−１ＢＢＬ含有抗原結合分子のイムノコンジュゲートが得られる。「イムノコンジュゲート」は、細胞傷害性剤を含むがそれに限定されない、一又は複数の異種分子にコンジュゲートした抗体である。
【０１２８】
用語「ポリヌクレオチド」は、単離された核酸分子又はコンストラクト、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ウイルス由来のＲＮＡ、又はプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、一般的なホスホジエステル結合又は非一般的結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見られるようなアミド結合）を含みうる。用語「核酸分子」は、ポリヌクレオチド中に存在する、任意の一又は複数の核酸セグメント、例えばＤＮＡ又はＲＮＡ断片を指す。
【０１２９】
「単離された」核酸分子又はポリヌクレオチドは、その天然環境から除去された目的の核酸分子、ＤＮＡ又はＲＮＡである。例えば、ベクターに含有されるポリペプチドをコードする組み換えポリヌクレオチドを、本発明の目的のために単離することが考慮される。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例には、異種宿主細胞内に維持される組み換えポリヌクレオチド、又は溶液中の精製された（部分的に又は実質的に）ポリヌクレオチドが含まれる。単離されたポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド分子を通常含む細胞に含まれるポリヌクレオチド分子を含むが、そのポリヌクレオチド分子は、染色体外又はその自然の染色体上の位置とは異なる染色体位置に存在している。単離されたＲＮＡ分子は、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏの本発明のＲＮＡ転写物、並びにポジティブ及びネガティブな鎖形式、及び二重鎖形式を含む。本発明の単離されたポリヌクレオチド又は核酸は、さらに、合成により生成されたそのような分子を含む。加えて、ポリヌクレオチド又は核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、又は転写ターミネーターといった制御要素を含んでも含まなくてもよい。
【０１３０】
本発明の参照ヌクレオチド配列と少なくとも例えば９５％「同一」であるヌクレオチド配列を有する核酸又はポリヌクレオチドと言うとき、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と、ポリヌクレオチド配列が参照ヌクレオチド配列のそれぞれ１００のヌクレオチドにつき最大５ポイントの変異を含んでよいという点以外は同一であることが意図される。換言すれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列中最大５％のヌクレオチドが削除されるか又は別のヌクレオチドで置換されてよいか、或いは参照配列に含まれるすべてのヌクレオチドの最大５％の数のヌクレオチドが参照配列に挿入されてよい。参照配列のこのような変更は、参照ヌクレオチド配列の５’又は３’末端の位置で、又はこれら末端の間のいずれかで、参照配列に含まれる残基中において個々に散在して、又は参照配列内部の一又は複数の連続する群において、発生してよい。特定の事項として、いずれか特定のポリヌクレオチド配列が、本発明のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるかどうかは、ポリペプチドについて上述したもの（例えばＡＬＩＧＮ−２）などの既知のコンピュータープログラムを用いて常套的に決定することができる。
【０１３１】
用語「発現カセット」は、組み換えにより又は合成により、標的細胞内の特定の核酸の転写を許可する一連の特定の核酸要素を用いて生成されたポリヌクレオチドを指す。組み換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス、又は核酸断片中に取り込むことができる。典型的には、発現ベクターの組み換え発現カセット部分には、他の配列の中でも、転写される核酸配列及びプロモーターが含まれる。特定の実施態様では、本発明の発現カセットは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む。
【０１３２】
用語「ベクター」又は「発現ベクター」は、「発現コンストラクト」と同義であり、標的細胞内においてそれが作動可能に結合する特定の遺伝子の発現を導入及び方向付けするために使用されるＤＮＡ分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、並びに導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。本発明の発現ベクターは、発現カセットを含む。発現ベクターは、大量の安定なｍＲＮＡの転写を可能にする。発現ベクターが標的細胞内部に入ると、遺伝子によってコードされるリボ核酸分子又はタンパク質が、細胞転写及び／又は翻訳機械により生成される。一実施態様では、本発明の発現ベクターは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む発現カセットを含む。
【０１３３】
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養物」は、互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、それには、継代の数に関係なく、それに由来する一次形質転換細胞及び子孫が含まれる。子孫は親細胞と核酸含量が完全に同一ではないかもしれず、突然変異が含まれる場合がある。本明細書には、最初に形質転換された細胞においてスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する変異型子孫が含まれる。宿主細胞は、本発明の二重特異性抗原結合分子を生成するために使用することができるいずれかの種類の細胞系である。宿主細胞は、培養細胞、例えばいくつか例を挙げると、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、又はハイブリドーマ細胞といった哺乳動物の培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、及び植物細胞を含み、更には、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物、又は培養された植物若しくは動物組織内部に含まれる細胞も含む。
【０１３４】
「有効量の」薬剤は、それが投与される細胞又は組織中に生理的変化をもたらすために必要な量を指す。
【０１３５】
薬剤、例えば、薬学的組成物の「治療的有効量」とは、所望の治療的又予防的結果を達成するために必要な用量及び期間での、有効な量を指す。治療的有効量の薬剤は、疾患の有害作用を、例えば、排除する、低下させる、遅延させる、最小化する、又は防止する。
【０１３６】
「個体」又は「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物には、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えば、ヒト、及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）が含まれる。特に、個体又は対象はヒトである。
【０１３７】
用語「薬学的組成物」は、その中に有効で含有される活性成分の生物学的活性を許容するような形態であって、製剤が投与される対象にとって許容できない毒性を有する他の成分を含まない調製物を指す。
【０１３８】
「薬学的に許容される担体」は、対象に非毒性である、有効成分以外の薬学的組成物の成分を指す。薬学的に許容される添加物には、限定されないが、バッファー、安定剤又は保存剤が含まれる。
【０１３９】
「添付文書」という用語は、治療製品の商品包装に通例含まれる説明書を指すのに用いられ、そのような治療製品の適応症、用法、用量、投与、併用療法、使用に関する禁忌及び／又は注意事項についての情報を含む。
【０１４０】
本明細書において用いられる場合、「治療」（及び「治療する（ｔｒｅａｔ）」又は「治療している（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」などの文法的変形）は、治療されている個体の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のために、又は臨床病理の過程において実行できる。治療の望ましい効果には、限定されないが、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患の直接的又は間接的な病理学的帰結の縮小、転移を予防すること、疾患の進行の速度を遅らせること、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善が含まれる。いくつかの実施態様において、本発明の分子は、疾患の発症を遅延させるか又は疾患の進行を遅くするために使用される。
【０１４１】
本明細書において用いられる用語「がん」は、リンパ腫又はリンパ球性白血病、又は黒色腫といった増殖性疾患を指す。
【０１４２】
「Ｂ細胞増殖性疾患」とは、患者のＢ細胞の数が健常者のＢ細胞の数と比較して増加する疾患、特にＢ細胞数の増加が疾患の原因又は証明である疾患を意味する。「ＣＤ２０陽性Ｂ細胞増殖性疾患」は、Ｂ細胞、特に悪性Ｂ細胞（通常のＢ細胞に加えて）がＣＤ２０を発現するＢ細胞増殖性疾患である。例示的なＢ細胞増殖障害には、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）、並びにいくつかの種類の多発性骨髄腫（ＭＭ）及びホジキンリンパ腫（ＨＬ）が含まれる。
【０１４３】
本発明における使用のための例示的抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体
本発明は、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体及び４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニストと組み合わせたその使用、特にがんを治療するため又はがんの進行を遅らせるため、さらに詳細にはＢ細胞増殖性疾患を治療するため又はＢ細胞増殖性疾患の進行を遅らせるための方法におけるその使用に関する。本明細書において使用される抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＣＤ２０に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体である。
【０１４４】
したがって、本明細書において使用される抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）及び軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインと、重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２０）及び軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２０）を含む第２の抗原結合ドメインとを含む。
【０１４５】
特定の一態様では、組み合わせにおける使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号５６のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号５７のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号５８のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）；及び／又は配列番号５９のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号６０のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号６１のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインを含む。さらに詳細には、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性は、配列番号６２のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）及び／又は配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインを含む。さらなる一態様では、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号６２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）及び／又は配列番号６３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む。
【０１４６】
一態様では、ＣＤ３に特異的に結合する抗体は完全長抗体である。一態様では、ＣＤ３に特異的に結合する抗体は、ヒトＩｇＧクラスの抗体、特にヒトＩｇＧ１クラスの抗体である。一態様では、ＣＤ３に特異的に結合する抗体は、抗体断片、特にＦａｂ分子又はｓｃＦｖ分子、さらに詳細にはＦａｂ分子である。特定の一態様では、ＣＤ３に特異的に結合する抗体は、Ｆａｂ重鎖と軽鎖の可変ドメイン又は定常ドメインが交換されている（即ち互いによって置き換えられている）クロスオーバーＦａｂ分子である。一態様では、ＣＤ３に特異的に結合する抗体は、ヒト化抗体である。
【０１４７】
別の様態では、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号６４のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号６５のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号６６のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２０）、及び／又は配列番号６７のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号６８のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号６９のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２０）を含む第２の抗原結合ドメインを含む。さらに詳細には、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性は、配列番号７０のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２０）及び／又は配列番号７１のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２０）を含む第２の抗原結合ドメインを含む。さらなる一態様では、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性は、配列番号７０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２０）及び／又は配列番号７１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２０）を含む第２の抗原結合ドメインを含む。
【０１４８】
別の特定の態様では、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、ＣＤ２０に結合する第３の抗原結合ドメインを含む。特に、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号６４のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号６５のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号６６のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２０）、及び／又は配列番号６７のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号６８のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号６９のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２０）を含む第３の抗原結合ドメインを含む。さらに詳細には、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性は、配列番号７０のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２０）及び／又は配列番号７１のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２０）を含む第３の抗原結合ドメインを含む。さらなる一態様では、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性は、配列番号７０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２０）及び／又は配列番号７１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２０）を含む第３の抗原結合ドメインを含む。
【０１４９】
さらなる一態様では、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、第１の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖と軽鎖の可変ドメイン又は定常ドメインが交換されているクロスＦａｂ分子であり、第２の抗原結合ドメイン及び存在する場合は第３の抗原結合ドメインが従来のＦａｂ分子である二重特異性抗体である。
【０１５０】
別の態様では、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、（ｉ）第２の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第１の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しており、且つ第３の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合しているか、又は（ｉｉ）第１の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端において第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第２の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しており、且つ第３の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合している二重特異性抗体である。
【０１５１】
Ｆａｂ分子は、Ｆｃドメインに対して、又は互いに、直接又はペプチドリンカーを介して融合していてよく、一又は複数のアミノ酸、典型的には約２〜２０のアミノ酸を含む。ペプチドリンカーは当技術分野において既知であり、本願明細書に記載される。適切な非免疫原性ペプチドリンカーには、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎ、（Ｇ４Ｓ）ｎ又は４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーが含まれる。「ｎ」は通常１から１０、典型的には２から４の整数である。一実施態様では、前記ペプチドリンカーは、少なくとも５のアミノ酸長を、一実施態様では５から１００、さらなる実施態様では１０から５０のアミノ酸長を有する。一実施態様では、前記ペプチドリンカーは、（ＧｘＳ）ｎ又は（ＧｘＳ）ｎＧｍ［式中、Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリン、（ｘ＝３、ｎ＝３、４、５又は６、ｍ＝０、１、２又は３）又は（ｘ＝４、ｎ＝２、３、４又は５、ｍ＝０、１、２又は３）］であり、一実施態様では、ｘ＝４、ｎ＝２又は３であり、さらなる実施態様ではｘ＝４、ｎ＝２である。一実施態様では、前記ペプチドリンカーは（Ｇ４Ｓ）２である。第１及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖を互いに融合させるための特定の適切なペプチドリンカーは（Ｇ４Ｓ）２である。第１及び第２のＦａｂ断片のＦａｂ重鎖を接続するために適した例示的ペプチドリンカーは配列（Ｄ）−（Ｇ４Ｓ）２を含む。別の適切なこのようなリンカーは、配列（Ｇ４Ｓ）４を含む。加えて、リンカーは免疫グロブリンヒンジ領域（の一部）を含むことができる。特にＦａｂ分子は、ＦｃドメインのサブユニットのＮ末端に融合している場合には、免疫グロブリンヒンジ領域又はその一部を介して、追加のペプチドリンカーを用いて又は用いずに、融合することができる。
【０１５２】
さらなる一態様では、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、Ｆｃ受容体への結合を低減する及び／又はエフェクター機能を低下させる一又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む。特に、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む。
【０１５３】
特定の一態様では、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号７６の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチド、配列番号７７の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチド、配列番号７８の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチド、及び配列番号７９の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチドを含む。さらなる特定の実施態様では、二重特異性抗体は、配列番号７６のポリペプチド配列、配列番号７７のポリペプチド配列、配列番号７８のポリペプチド配列、及び配列番号７９のポリペプチド配列を含む（ＣＤ２０  ＴＣＢ）。
【０１５４】
特定の二重特異性抗体は、国際公開第２０１６／０２０３０９号又は同第２０１６／０２０３０９号に記載されている。
【０１５５】
さらなる一態様では、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は二重特異性Ｔ細胞誘導（ＢｉＴＥ（登録商標））も含む。さらなる一態様では、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体はＸｍＡｂ（登録商標）１３６７６である。別の態様では、二重特異性抗体はＲＥＧＮ１９７９である。別の態様では、二重特異性抗体はＦＢＴＡ０５（Ｌｙｍｐｈｏｍｕｎ）である。
【０１５６】
本発明における使用のための例示的４−１ＢＢアゴニスト
特に、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせて使用される、ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢＬを含む分子である。特に、本発明に使用される４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む。
【０１５７】
特定の一態様では、４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む分子であり、４−１ＢＢＬのエクトドメインは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群より選択されるアミノ酸配列、特に配列番号１又は配列番号５のアミノ酸配列を含む。
【０１５８】
本明細書において、ここまで、４−１ＢＢアゴニストが、腫瘍標的、特にＢ細胞上の標的に特異的な抗原結合ドメインを含む場合に特に有用であることが示された。したがって、別の態様では、４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子である。
【０１５９】
本明細書ではさらに、ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストが、ＣＤ１９によりＢ細胞中に内部移行することがなく、したがって腫瘍の微小環境と相互作用する能力を失わなかったことが示された。さらなる一態様では、Ｂ細胞に内部移行せず、したがってその活性を維持する４−１ＢＢアゴニストが提供される。
【０１６０】
別の態様では、４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの部分とを含む抗原結合分子であり、ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインは、ｃｙｎｏ−交差反応性であり、即ち、ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインは、ヒト及びカニクイザルＣＤ１９に特異的に結合する。
【０１６１】
さらなる一態様では、４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの部分とを含む抗原結合分子であり、ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインは、
（ａ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、並びに（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、並びに（ｉｖ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン
を含む。
【０１６２】
特定の一態様では、ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインは、（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｉｖ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。
【０１６３】
さらなる一態様では、４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子であり、ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインは、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）と、配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）とを含むか、又はＣＤ１９に対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインは、配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）と、配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）を含む。さらに詳細には、ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインは、配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）及び配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）を含む。
【０１６４】
別の態様では、４−１ＢＢアゴニストは、安定に会合することのできる第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインをさらに含む抗原結合分子である。一態様では、４−１ＢＢアゴニストは、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、具体的にはＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む抗原結合分子である。特に、４−１ＢＢアゴニストは、Ｆｃ受容体への結合を低減する及び／又はエフェクター機能を低下させる一又は複数のアミノ酸置換を含む  Ｆｃドメインを含む抗原結合分子である。特定の一態様では、４−１ＢＢアゴニストは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む抗原結合分子である。
【０１６５】
一態様では、４−１ＢＢアゴニストは、
（ａ）ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であり、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含む。
【０１６６】
特定の一態様では、４−１ＢＢアゴニストは、
（ａ）ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド、
を含む抗原結合分子であり、この抗原結合分子は、
（ｉ）第１のポリペプチドがＣＨ１又はＣＬドメインを、第２のポリペプチドがＣＬ又はＣＨ１ドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ１又はＣＬドメインに接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＬ又はＣＨ１ドメインにペプチドリンカーを介して接続する４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉ）第１のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、第２のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、それぞれ含み、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ３ドメインのＣ末端に接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＨ３ドメインのＣ末端にペプチドリンカーを介して接続する４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉｉ）第１のポリペプチドがＶＨ−ＣＬ又はＶＬ−ＣＨ１ドメインを、第２のポリペプチドがＶＬ−ＣＨ１ドメイン又はＶＨ−ＣＬドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＶＨ又はＶＬに接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＶＬ又はＶＨにペプチドリンカーを介して接続する４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含むこと
を特徴とする抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの方法。
【０１６７】
別の態様では、４−１ＢＢアゴニストは、
（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）と配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）又は配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）と配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）を含むＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であり、この抗原結合分子は、第１のポリペプチドが、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１及び配列番号３２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むこと、並びに第２のポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
【０１６８】
特定の一態様では、４−１ＢＢアゴニストは、
ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３４のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号３５のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３６のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｂ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３４のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号３７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｃ）配列番号３４のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖、配列番号３９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖及び配列番号４０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む分子；
ｄ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３４のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号４１のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号４２のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｅ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３４のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号４３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号４４のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｆ）配列番号３４のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖、配列番号４５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖及び配列番号４６のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む分子；
ｇ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号３５のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３６のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｈ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号３７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｉ）配列番号４８のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖、配列番号４９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖及び配列番号５０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む分子；
ｊ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号４１のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号４２のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｋ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号４３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号４４のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；並びに
ｌ）配列番号４８のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖、配列番号５１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖及び配列番号５２のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む分子
からなる群より選択される抗原結合分子である。
【０１６９】
別の態様では、４−１ＢＢアゴニストは、
（ａ）ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ペプチドリンカーによって互いに接続する４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチド
を含む抗原結合分子である。
【０１７０】
一態様では、４−１ＢＢアゴニストは、
（ａ）ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ペプチドリンカーにより互いに接続する４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチド、及び
（ｃ）安定に会合することのできる第１及び第２のサブユニットを含むＦｃドメイン
を含む抗原結合分子であり、ペプチドリンカーにより互いに接続する４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチドは、任意選択的にペプチドリンカーを通して、Ｆｃドメインの二つのサブユニットの一方のＮ又はＣ末端アミノ酸に融合する。
【０１７１】
特定の態様では、４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含む分子、
（ｂ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、配列番号４８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含む分子；
（ｃ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、及び配列番号５４のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含む分子、並びに
（ｄ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、配列番号４８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、及び配列番号５５のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含む分子
からなる群より選択される抗原結合分子である。
【０１７２】
さらなる一態様では、４−１ＢＢアゴニストは抗ＣＤ１９／抗４−１ＢＢ二重特異性抗体である。
【０１７３】
本発明における使用のための二重特異性抗体の調製
特定の態様では、組み合わせで使用される治療剤は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体を含む。多重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる部位に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。特定の態様では、結合特異性は異なる抗原に対するものである。特定の態様では、結合特異性は、同じ抗原上の異なるエピトープに対するものである。二重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体断片として調製することができる。
【０１７４】
多重特異性抗体を作製するための技術には、限定されないが、異なる特異性を有する二つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の組み換え共発現（Milstein and Cuello, Nature 305: 537 （1983）、国際公開第９３／０８８２９号、及びTraunecker et al., EMBO J. 10: 3655 （1991）を参照）及び「ｋｎｏｂ−ｉｎ−ｈｏｌｅ」エンジニアリング（例えば、米国特許第  ５，７３１，１６８号を参照）が含まれる。多重特異抗体はまた、抗体のＦｃ−ヘテロ二量体分子を作成するための静電ステアリング効果を操作すること（国際公開第２００９／０８９００４号）；二つ以上の抗体又は断片を架橋すること（例えば米国特許第４６７６９８０号、及びBrennan et al., Science, 229: 81 （1985）を参照）；二重特異性抗体を生成するためにロイシンジッパーを使用すること（例えば、Kostelny et al., J. Immunol., 148（5）:1547-1553 （1992）を参照）；二重特異性抗体断片を作製するため、「ダイアボディ」技術を使用すること（例えば、Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 （1993）を参照）；単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーを使用すること（例えば、Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 （1994）を参照）；及び、例えば、Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 （1991）に記載されているように、三重特異性抗体を調製することによって作成することができる。
【０１７５】
「オクトパス抗体（Ｏｃｔｏｐｕｓ抗体）」を含む三又はそれ以上の機能的抗原結合部位を有する操作抗体も本明細書に含まれる（例えば、米国特許第２００６／００２５５７６号を参照）。
【０１７６】
本明細書における抗体又は断片は、二つの異なる抗原に結合する抗原結合部位を含む「二重作用性ＦＡｂ」又は「ＤＡＦ」も含む（例えば米国特許出願公開第２００８／００６９８２０号参照）。本明細書には「Ｃｒｏｓｓｍａｂ」抗体も含まれる（例えば国際公開第２００９／０８０２５１号、国際公開第２００９／０８０２５２号、国際公開第２００９／０８０２５３号、又は国際公開第２００９／０８０２５４号参照）。
【０１７７】
二重特異性抗体断片を作製するための別の技術は、「二重特異性Ｔ細胞誘導」又はＢｉＴＥ（登録商標）手法である（例えば、国際公開第２００４／１０６３８１号、同第２００５／０６１５４７号、同第２００７／０４２２６１、及び同第ＷＯ２００８／１１９５６７号参照）。この手法は、単一のポリペプチド上に配置される二つの抗体可変ドメインを利用する。例えば、単一ポリペプチド鎖は、各々が、二つのドメイン間の分子内会合を可能にするために十分な長さのポリペプチドリンカーにより分離された可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）ドメインを有する、二つの短鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片を含む。この単一ポリペプチドは、二つのｓｃＦｖ  断片の間にポリペプチドスペーサー配列をさらに含む。各ｓｃＦｖは異なるエピトープを認識し、各ｓｃＦｖがその同族エピトープと結合するときに二つの異なる細胞型の細胞が近接するか又は繋がるように、これらエピトープは異なる細胞型について特異的でありうる。この手法の一の特定の実施態様には、悪性細胞又は腫瘍細胞といった標的細胞によって発現される細胞表面抗原を認識する別のｓｃＦｖに結合した、Ｔ細胞上のＣＤ３ポリペプチドといった免疫細胞によって発現される細胞表面抗原を認識するｓｃＦｖが含まれる。
【０１７８】
単一ポリペプチドであるので、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーは、当技術分野で既知のいずれかの原核細胞又は真核細胞発現系、例えば、ＣＨＯ細胞株を用いて発現されうる。しかしながら、モノマーの意図された活性以外の生物活性を有しうる、単量体の二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーを他の多量体種から分離するために、特定の精製技術（例えば、ＥＰ１６９１８３３参照）が必要なこともある。一の例示的な精製スキームでは、分泌されたポリペプチドを含有する溶液を、まず金属アフィニティークロマトグラフィーに供し、イミダゾール濃度の勾配を用いてポリペプチドを溶出する。この溶出液は、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いてさらに精製され、ポリペプチドが、塩化ナトリウム濃度の勾配を用いて溶出される。最後に、この溶出液をサイズ排除クロマトグラフィーに供し、多量体種から単量体を分離する。一態様では、本発明に使用される二重特異性抗体は、ペプチドリンカーにより互いに対して融合した二つの単鎖ＦＶ  断片（ｓｃＦＶ）を含む単一ポリペプチド鎖を含む。
【０１７９】
Ｆｃ受容体の結合を低減する及び／又はエフェクター機能を低下させるＦｃドメインの修飾
本発明の抗原結合分子のＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の重鎖ドメインを含む一対のポリペプチド鎖からなる。例えば、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子のＦｃドメインは二量体であり、その各サブユニットはＣＨ２及びＣＨ３  ＩｇＧ重鎖定常ドメインを含む。Ｆｃドメインの二つのサブユニットは、互いに安定に会合することができる。
【０１８０】
Ｆｃドメインは、本発明の抗原結合分子に望ましい薬物動態特性を付与し、そのような薬物動態特性には、標的組織中への良好な蓄積に貢献する長い血清半減期、及び望ましい組織−血液分布比が含まれる。しかしながら、同時に、Ｆｃドメインは、好ましい抗原保有細胞ではなく、Ｆｃ受容体を発現する細胞に対する、本発明の二重特性抗体の望ましくない標的化の原因となることがある。したがって、特定の態様では、本発明の抗原結合分子のＦｃドメインは、天然型ＩｇＧ１のＦｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低下及び／又はエフェクター機能の低下を呈する。一態様では、Ｆｃは、Ｆｃ受容体に実質的に結合しない及び／又はエフェクター機能を誘導しない。特定の一態様では、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である。一態様では、Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体である。特定の一態様では、Ｆｃ受容体は活性化ヒトＦｃγ受容体であり、さらに詳細にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａ、さらに詳細にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。一態様では、Ｆｃドメインはエフェクター機能を誘導しない。エフェクター機能の低下は、限定しないが、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の低減、抗体依存性Ｔ細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の低減、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）の低減、サイトカイン分泌の低減、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込みの低減、ＮＫ細胞に対する結合の低減、マクロファージに対する結合の低減、単球に対する結合の低減、多形核細胞に対する結合の低減、アポトーシスを誘導する直接的シグナル伝達の低減、樹状細胞成熟の低減、又はＴ細胞プライミングの低減のうちの一又は複数を含むことができる。
【０１８１】
特定の態様において、一又は複数のアミノ酸修飾を、本明細書で提供される抗体のＦｃ領域に導入し、それによりＦｃ領域変異体を生成することができる。Ｆｃ領域変異体は、一又は複数のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４  Ｆｃ領域）を含みうる。
【０１８２】
特定の一態様では、本発明は、Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体、特にＦｃγ受容体に対する結合を低減する一又は複数のアミノ酸置換を含む抗体を提供する。
【０１８３】
一態様において、本発明の抗体のＦｃドメインは、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる一又は複数のアミノ酸変異を含む。典型的には、同じ一又は複数のアミノ酸変異がＦｃドメインの二つのサブユニットの各々に存在する。特に、Ｆｃドメインは、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１及びＰ３２９（ＥＵ番号付け）の位置にアミノ酸置換を含む。特に、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ重鎖の２３４及び２３５（ＥＵ番号付け）及び／又は３２９（ＥＵ番号付け）の位置にアミノ酸置換を含む。さらに詳細には、本発明により、ＩｇＧ重鎖にアミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（「Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ」、ＥＵ番号付け）を有するＦｃドメインを含む抗体が提供される。アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａは、いわゆるＬＡＬＡ変異を指す。アミノ酸置換の「Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ」組み合わせは、ヒトＩｇＧ１  ＦｃドメインのＦｃγ受容体結合をほぼ完全に消失させるもので、国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載があり、同文献には、このような変異Ｆｃドメインを調製する方法、及びＦｃ受容体結合又はエフェクター機能といったその特性を決定するための方法も記載されている。
【０１８４】
Ｆｃ受容体の結合が低減した及び／又はエフェクター機能が低下したＦｃドメインは、Ｆｃドメイン残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、及び３２９のうちの一又は複数の置換を伴うものも含む（米国特許第６７３７０５６号）。そのようなＦｃ変異体は、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有するいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ突然変異体を含め、アミノ酸位２６５、２６９、２７０、２９７、及び３２７のうちの二つ以上に置換を有するＦｃ変異を含む（米国特許第７３３２５８１号）。
【０１８５】
別の態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。ＩｇＧ４抗体は、ＩｇＧ１抗体と比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低減及びエフェクター機能の低下を呈する。さらに詳細な態様では、Ｆｃドメインは、Ｓ２２８位（カバット番号付け）にアミノ酸置換を、特にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含むＩｇＧ４のＦｃドメインである。具体的な態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３５Ｅ及びＳ２２８Ｐ及びＰ３２９Ｇ（ＥＵ番号付け）を含むＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。このようなＩｇＧ４  Ｆｃドメイン変異及びそのＦｃγ受容体結合特性は、国際公開第２０１２／１３０８３１号にも記載されている。
【０１８６】
変異Ｆｃドメインは、当技術分野で周知の遺伝学的又は化学的方法を用いたアミノ酸の削除、置換、挿入、又は修飾により調製することができる。遺伝学的方法は、コード化ＤＮＡ配列の部位特異的突然変異、ＰＣＲ、遺伝子合成などを含みうる。正確なヌクレオチドの変化は、例えば配列決定により検証することができる。
【０１８７】
Ｆｃ受容体に対する結合は、例えばＥＬＩＳＡにより、又はＢＩＡｃｏｒｅ器具（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のような標準の器具類を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により容易に決定することができ、このようなＦｃ受容体は組み換え発現により得ることができる。代替的に、Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインを含む分子のＦｃ受容体に対する結合親和性は、特定のＦｃ受容体を発現することが知られている細胞株、例えばＦｃγＩＩＩａ受容体を発現するヒトＮＫ細胞を用いて評価してもよい。
【０１８８】
Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインを含む本発明の抗体のエフェクター機能は、当技術分野で既知の方法により測定することができる。ＡＤＣＣを測定するための適切なアッセイは本明細書に記載される。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの他の例が、米国特許第５５００３６２号；Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 （1986） 及びHellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 （1985）；米国特許第５８２１３３７号；Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 （1987）に記載されている。或いは、非放射性アッセイ法を用いることができる（例えば、フローサイトメトリー用のＡＣＴＩＴＭ非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）；及びＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。或いは又は加えて、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、Clynes et al., PNAS USA 95:652-656 （1998）に開示されるように、例えば動物モデルにおいて、ｉｎ  ｖｉｖｏで評価することができる。
【０１８９】
いくつかの態様では、補体成分に対するＦｃドメインの結合、特にＣ１ｑに対する結合が低減する。したがって、Ｆｃドメインがエフェクター機能が低下するように改変されているいくつかの実施態様では、前記エフェクター機能の低下はＣＤＣの低下を含む。Ｃ１ｑ結合アッセイを実施して、本発明の二重特異性抗原結合分子がＣ１ｑに結合できるか、及びしたがってＣＤＣ活性を有しうるかを決定することができる（例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号におけるＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照）。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行うことができる（例えば、Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 （1996）; Cragg, et al., Blood 101:1045-1052 （2003）;及びCragg, and Glennie, Blood 103:2738-2743 （2004）を参照）。
【０１９０】
ヘテロ二量体化を促すＦｃドメインの修飾
本発明の二重特異性抗原結合分子は、Ｆｃドメインの二つのサブユニットの一方又は他方に融合した異なる抗原結合部位を含み、したがってＦｃドメインの二つのサブユニットは、二つの非同一なポリペプチド鎖に含まれていることがある。これらポリペプチドの組み換え共発現とそれに続く二量体化は、二つのポリペプチドの複数の可能な組合わせをもたらす。したがって、組み換え生成において本発明の二重特異性抗体の収率及び純度を高めるために、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインに、所望のポリペプチドの会合を促す修飾を含めることが有利であろう。
【０１９１】
したがって、特に本発明の態様は、（ａ）ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの部分、（ｂ）ジスルフィド結合により互いに対して結合する第１及び第２のポリペプチドを含み、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続されたＴＮＦリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はそれらの二つの断片を含むこと、及び第２のポリペプチドが前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメイン又はその断片を一つだけ含むことを特徴とする二重特異性抗原結合分子に関し、この抗原結合分子はさらに（ｃ）安定に会合することのできる第１及び第２のサブユニットを含むＦｃドメインを含み、このＦｃドメインは、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットの会合を促進する修飾を含む。ヒトＩｇＧのＦｃドメインの二つのサブユニット間においてタンパク質−タンパク質相互作用が最大である部位は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインである。したがって、一態様では、前記修飾はＦｃドメインのＣＨ３ドメイン内で行われる。
【０１９２】
特定の一態様では、前記修飾はいわゆる「ノブ−イントゥ−ホール（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）」修飾であり、Ｆｃドメインの二つのサブユニットの一方に「ノブ」修飾を、Ｆｃドメインの二つのサブユニットの他方に「ホール」修飾を、それぞれ含んでいる。したがって、本発明は、（ａ）ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの部分、（ｂ）ジスルフィド結合により互いに対して結合する第１及び第２のポリペプチドを含み、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続されたＴＮＦリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はそれらの二つの断片を含むこと、及び第２のポリペプチドが前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメイン又はその断片を一つだけ含むことを特徴とする抗原結合分子に関し、この抗原結合分子はさらに（ｃ）安定に会合することのできる第１及び第２のサブユニットを含むＦｃドメインを含み、ノブ−イントゥ−ホール技術に従って、Ｆｃドメインの第１のサブユニットはノブを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットはホールを含む。特定の一態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（ＥＵ番号付け）を含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、及びＹ４０７Ｖを含む（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１９３】
ノブ−イントゥ−ホール技術は、例えば、米国特許第５７３１１６８号；同第７６９５９３６号；Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 （1996） and Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 （2001）に記載されている。通常、方法は、隆起がそれに対応する空洞内に位置できるように、第１のポリペプチドの接触面に隆起（「ノブ」）を、及び第２のポリペプチドの接触面に対応する空洞を、それぞれ導入することにより、ヘテロ二量体形成を促進し、且つホモ二量体形成を妨害することを含む。隆起は、第１のポリペプチドの接触面由来の小さなアミノ酸側鎖を大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）で置き換えることにより構築される。隆起と同じか又は同様のサイズの相補的空洞は、大きなアミノ酸側鎖をそれよりも小さなもの（例えばアラニン又はスレオニン）で置き換えることにより、第２のポリペプチドの接触面に作り出される。
【０１９４】
このように、一態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基がそれよりも大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それにより、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の空洞内に配置可能な隆起が生成され、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基がそれよりも小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それにより、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の隆起を配置可能な空洞が生成される。隆起と空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を、例えば部位特異的突然変異誘発により、又はペプチド合成により、変化させることにより作り出すことができる。特定の態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、３６６位のスレオニン残基がトリプトファン残基で置き換えられ（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、４０７位のチロシン残基がバリン残基で置き換えられる（Ｙ４０７Ｖ）。一態様では、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいてさらに、３６６位のスレオニン残基がセリン残基で置き換えられ（Ｔ３６６Ｓ）、３６８位のロイシン残基がアラニン残基で置き換えられる（Ｌ３６８Ａ）。
【０１９５】
またさらなる態様ではＦｃドメインの第１のサブユニットにおいて更に、３５４の位置のセリン残基がシステイン残基で置き換えられ（Ｓ３５４Ｃ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて更に、３４９の位置のチロシン残基がシステイン残基で置き換えられる（Ｙ３４９Ｃ）。これら二つのシステイン残基の導入により、Ｆｃドメインの二つのサブユニット間にジスルフィド架橋が形成され、さらに二量体を安定させる（Carter （2001）, J Immunol Methods 248, 7-15）。特定の一態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（ＥＵ番号付け）を含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、及びＹ４０７Ｖを含む（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０１９６】
代替的な一態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットの会合を促す修飾は、例えば、国際公開第２００９／０８９００４号に記載されているような静電ステアリング効果を媒介する修飾を含む。通常、この方法は、ホモ二量体形成が静電的に望ましくなくなり、ヘテロ二量体化が静電的に望ましくなるような、荷電アミノ酸残基による二つのＦｃドメインサブユニットの接触面における一又は複数のアミノ酸残基の置き換えを伴う。
【０１９７】
本明細書に報告される二重特異性抗体の重鎖のＣ末端は、アミノ酸残基ＰＧＫで終端する完全なＣ末端でありうる。重鎖のＣ末端は、Ｃ末端のアミノ酸残基のうちの一つ又は二つが除去されている、短縮されたＣ末端でありうる。好ましい一態様では、重鎖のＣ末端は、ＰＧで終端する短縮されたＣ末端である。本明細書に報告されるすべての態様のうちの一態様において、Ｃ末端ＣＨ３ドメインを含む重鎖を含む二重特異性抗体は、Ｃ末端グリシン−リジンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。本明細書に報告されるすべての態様のうちの一態様において、Ｃ末端ＣＨ３ドメインを含む重鎖を含む二重特異性抗体は、本明細書に特定されるように、Ｃ末端グリシン残基（Ｇ４４６、Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。
【０１９８】
Ｆａｂドメインにおける修飾
一態様において、本発明は、（ａ）ＣＤ１９に対する特異的結合能を有するＦａｂ断片、（ｂ）ジスルフィド結合により互いに対して結合する第１及び第２のポリペプチドを含み、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続された４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの二つの断片を含むこと、及び第２のポリペプチドが４−１ＢＢＬのエクトドメイン又はその断片を一つだけ含むことを特徴とする４−１ＢＢＬ含有抗原結合分子に関し、この抗原結合分子はさらに（ｃ）安定に会合することのできる第１及び第２のサブユニットを含むＦｃドメインを含み、Ｆｃ断片のうちの一つにおいて、可変ドメインＶＨとＶＬ、又は定常ドメインＣＨ１とＣＬが交換されている。二重特異性抗体は、Ｃｒｏｓｓｍａｂ技術に従って調製される。
【０１９９】
一つの結合アームにドメインの置き換え／交換を有する多重特異性抗体（ＣｒｏｓｓＭａｂＶＨ−ＶＬ又はＣｒｏｓｓＭａｂＣＨ−ＣＬ）は、国際公開第２００９／０８０２５２号及びSchaefer, W. et al, PNAS, 108 （2011） 11187-1191に詳細に記載されている。それら抗体は、第１の抗原に対する軽鎖と第２の抗原に対する不適切な重鎖との不一致により生じる副産物を明らかに低減する（このようなドメイン交換が行われない手法と比較して）。
【０２００】
一態様では、本発明は、（ａ）ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する第１のＦａｂ断片、（ｂ）ジスルフィド結合により互いに対して結合する第１及び第２のポリペプチドを含み、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続された４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの二つの断片を含むこと、及び第２のポリペプチドが４−１ＢＢＬのエクトドメイン又はその断片を一つだけ含み、それらの各々がＣＨ１又はＣＬドメインに結合することを特徴とする二重特性抗原結合分子に関し、この抗原結合分子はさらに（ｃ）安定に会合することのできる第１及び第２のサブユニットを含むＦｃドメインを含み、ＣＨ１ドメインが軽鎖の一部となり、ＣＬドメインが重鎖の一部となるように、４−１ＢＢＬに隣接する定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いによって置き換えられている。
【０２０１】
別の態様では、本発明は、（ａ）共刺激性ＴＮＦ受容体ファミリーメンバー及びＦｃドメインに対する特異的結合能を有する二つのＦａｂ断片を含む抗体の二つの軽鎖及び二つの重鎖、並びに（ｂ）標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する二つの追加のＦａｂ断片を含む二重特異性抗原結合分子に関し、前記追加のＦａｂ断片は、各々が（ａ）の重鎖のＣ末端にペプチドリンカーを介して接続する。特定の一態様では、追加のＦａｂ断片は、ＶＨドメインが軽鎖の一部となり、ＶＬドメインが重鎖の一部となるように、可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ断片である。
【０２０２】
別の態様において、正確なペアリングをさらに改善するために、（ａ）ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する第１のＦａｂ断片、（ｂ）ジスルフィド結合により互いに対して結合する第１及び第２のポリペプチドを含み、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続された４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの二つの断片を含むこと、及び第２のポリペプチドが４−１ＢＢＬのエクトドメイン又はその断片を一つだけ含み、それらの各々がＣＨ１又はＣＬドメインに結合することを特徴とし、さらに（ｃ）安定に会合することのできる第１及び第２のサブユニットを含むＦｃドメインを含む二重特性抗原結合分子は、異なる荷電アミノ酸置換（いわゆる「荷電残基」）を含むことができる。これら修飾は、交差又は非交差のＣＨ１及びＣＬドメインに導入される。特定の一態様では、本発明は、ＣＬドメインの一つにおいて位置１２３（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がアルギニン（Ｒ）によって、位置１２４（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がリジン（Ｋ）によってそれぞれ置き換えられており、ＣＨ１ドメインの一つにおいて位置１４７（ＥＵ番号付け）及び位置２１３（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されている二重特異性抗原結合分子に関する。
【０２０３】
さらに詳細には、本発明は、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーに隣接するＣＬドメインにおいて位置１２３（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がアルギニン（Ｒ）によって、位置１２４（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がリジン（Ｋ）によってそれぞれ置き換えられており、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーに隣接するＣＨ１ドメインにおいて位置１４７（ＥＵ番号付け）及び位置２１３（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されている、Ｆａｂを含む二重特異性抗原結合分子に関する。
【０２０４】
ポリヌクレオチド
本発明は、本明細書に記載される二重特異性抗体又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドをさらに提供する。
【０２０５】
本発明の抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドは、抗原結合分子全体をコードする単一のポリヌクレオチドとして、又は共発現される複数の（例えば、二つ以上の）ポリヌクレオチとして発現されうる。共発現されるポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドは、例えばジスルフィド結合又は他の手段を介して会合し、機能的抗原結合分子を形成することができる。例えば、免疫グロブリンの軽鎖部分は、免疫グロブリンの重鎖部分とは別個のポリヌクレオチドによってコードされる。共発現されるとき、重鎖ポリペプチドは軽鎖ポリペプチドと会合して免疫グロブリンを形成する。
【０２０６】
いくつかの態様では、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書に記載される本発明による抗体全体をコードする。他の実施態様では、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書に記載される本発明による抗体に含まれるポリペプチドをコードする。
【０２０７】
特定の実施態様では、ポリヌクレオチド又は核酸はＤＮＡである。他の実施態様では、本発明のポリヌクレオチドは、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態の、ＲＮＡである。本発明のＲＮＡは単鎖又は二本鎖である。
【０２０８】
組み換え法
本発明に使用される二重特異性抗体は、例えば、固相ペプチド合成（例えばメリフィールド固相合成）又は組み換え生成によって得ることができる。組み換え生成のために、例えば上述したように、抗体又はそのポリペプチド断片をコードする一又は複数のポリヌクレオチドが単離され、宿主細胞内でのさらなるクローニング及び／又は発現のために一又は複数のベクターに挿入される。このようなポリヌクレオチドは、一般的な手順を使用して容易に単離され配列決定されうる。本発明の一態様において、本発明のポリヌクレオチドの一又は複数を含むベクター、好ましくは発現ベクターが提供される。当業者に周知の方法を使用して、適切な転写／翻訳制御シグナルとともに、抗体（断片）のコード配列を含む発現ベクターを構築することができる。これら方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの組換えＤＮＡ技術、合成技術及びｉｎ  ｖｉｖｏでの組換え／遺伝子組換えを含む。例えば、Maniatis et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. （1989）; and Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. （1989）に記載される技術を参照。発現ベクターはプラスミド、又はウイルスの一部とすることができるか、又は核酸断片でよい。発現ベクターは、抗体をコードするポリヌクレオチド又はそのポリペプチド断片（即ち、コード化領域）が、プロモーター及び／又は他の転写若しくは翻訳制御エレメントと動作可能に結合するようにクローニングされる発現カセットを含む。本発明で使用される場合、「コード化領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、又はＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないが、存在する場合にはコード化領域の一部と考えられ、しかし、任意の隣接配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、５’及び３’非翻訳領域などはコード化領域の一部ではない。二以上のコード化領域が、単一のポリヌクレオチドコンストラクト、例えば単一のベクター上に、又は別々のポリヌクレオチドコンストラクトの中、例えば別の（異なる）ベクター上に存在することができる。さらに、任意のベクターは、単一のコード化領域を含んでいてもよいし、二以上のコード化領域を含んでいてもよく、例えば本発明のベクターは、タンパク質分解性切断を介して、翻訳後又は翻訳と同時に最終タンパク質中に分離された一又は複数のポリペプチドをコードしてもよい。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、又は核酸は、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチド若しくはそのポリペプチド断片、又はその変異体若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドに融合した又は融合していない異種コード化領域をコードしうる。異種コード化領域は、限定しないが、特殊化要素又はモチーフ、例えば分泌シグナルペプチド又は異種機能ドメインを含む。作動可能に結合とは、ポリペプチドなどの遺伝子産物のコード化領域が、調節配列の影響下又は制御下において遺伝子産物の発現を配置するように、一又は複数の調節配列と結合するときである。（ポリペプチドコード化領域及びそれに結合するプロモーターのような）二つのＤＮＡ断片は、プロモーター機能の誘導が所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写をもたらす場合、及び二つのＤＮＡ断片間の連結の性質が、遺伝子産物の発現を導く発現調節配列の能力を妨げないか又は転写されるべきＤＮＡ鋳型の能力を妨げない場合、「作動可能に結合している」。したがって、プロモーター領域は、プロモーターがその核酸の転写をもたらすことができる場合に、ポリペプチドをコードする核酸に作動可能に結合されるといえる。プロモーターは所定の細胞においてのみＤＮＡの実質的な転写を導く細胞特異的プロモーターであってもよい。プロモーターの他に他の転写制御エレメント、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー、及び転写終結シグナルが、細胞特異的転写を導くポリヌクレオチドと作動可能に結合することができる。
【０２０９】
適切なプロモーター及び他の転写制御領域は本明細書に開示されている。種々の転写制御領域が当業者に知られている。これらには、限定されないが、脊椎動物細胞において機能する転写制御領域、例えば、限定されないが、サイトメガロウイルス由来のプロモーター及びエンハンサーセグメント（例えばイントロン−Ａと連動した即初期プロモーター）、サルウイルス４０（例えば初期プロモーター）、及びレトロウイルス（例えばラウス肉腫ウイルスなど）が含まれる。他の転写制御領域は、脊椎動物の遺伝子由来のもの、例えばアクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギ−αグロビン、並びに、真核細胞における遺伝子発現を制御することができる他の配列を含む。さらなる適切な転写制御領域は、組織特異的プロモーター及びエンハンサー並びに誘導性プロモーター（例えば、プロモーター誘導性テトラサイクリン）を含む。同様に、種々の翻訳制御エレメントが当業者に知られている。これらには、限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び終結コドン、並びにウイルス系由来の要素（特に、配列内リボソーム進入部位、又はＣＩＴＥ配列とも呼ばれるＩＲＥＳ）が含まれる。発現カセットは、例えば、複製起点、及び／又はレトロウイルスの長い末端反復配列（ＬＴＲ）又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の末端反転型配列（ＩＴＲ）などの染色体組み込み要素といった他の特徴を含んでいてもよい。
【０２１０】
本発明のポリヌクレオチド及び核酸コード化領域は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指示する分泌ペプチド又はシグナルペプチドをコードするさらなるコード化領域と結合させることができる。例えば、抗体又はそのポリペプチド断片の分泌が望まれる場合、シグナル配列をコードするＤＮＡが、本発明の抗体又はそのポリペプチド断片をコードする核酸の上流に配置される。シグナル仮説によると、哺乳類細胞によって分泌されるタンパク質はシグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有し、これは粗面小胞体上で成長するタンパク質鎖の排出が開始されると成熟タンパク質から切断される。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドが通常、ポリペプチドの分泌型又は「成熟」型を生成するために翻訳されたポリペプチドから切断されるポリペプチドのＮ末端に融合されたシグナルペプチドを有することを認識している。特定の実施態様では、天然のシグナルペプチド、例えば免疫グロブリン重鎖又は軽鎖シグナルペプチド又は作動可能に結合しているポリペプチドの分泌を指示する能力を保持するその配列の機能的誘導体が使用される。或いは、異種哺乳動物シグナルペプチド、又はその機能的誘導体が使用されうる。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）又はマウスβ−グルクロニダーゼのリーダー配列で置換されてもよい。
【０２１１】
後の精製を容易にするため（例えばヒスチジンタグ）又は融合タンパク質の標識化の補助のために使用されうる短タンパク質配列をコードするＤＮＡは、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチド又はそのポリペプチド断片の中又は末端に含まれうる。
【０２１２】
本発明のさらなる態様では、本発明の一又は複数のポリヌクレオチドを含む宿主細胞が提供される。特定の実施態様では、本発明の一又は複数のベクターを含む宿主細胞が提供される。ポリヌクレオチド及びベクターは、ポリヌクレオチド及びベクターそれぞれに関連して本明細書に記載される特徴のいずれかを単独で又は組み合わせて組み込むことができる。一態様では、宿主細胞は、本発明の抗体（の一部）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む（例えばそのようなベクターで形質転換又はトランスフェクトされている）。本明細書で使用される場合、「宿主細胞」なる用語は、本発明の融合タンパク質又はその断片を生成するよう操作できるいずれかの種類の細胞系を指す。抗原結合分子の複製及び発現の補助に適切な宿主細胞は当分野でよく知られている。このような細胞は特定の発現ベクターで適切にトランスフェクト又は形質導入することができ、大量のベクター含有細胞を、臨床利用のための十分な量の抗原結合分子を得るために、大規模発酵槽での播種用に増殖させることができる。適切な宿主細胞は、原核生物微生物、例えば大腸菌、又は様々な真核生物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、昆虫細胞などを含む。例えば、特に、グリコシル化が必要でない場合には、ポリペプチドは細菌中で生成することができる。発現の後、ポリペプチドは可溶性画分において細菌細胞のペーストから単離することができ、さらに精製することができる。原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、菌類や酵母菌株を含むポリペプチドコード化ベクターのための適切なクローニング宿主又は発現宿主であり、そのグリコシル化経路は「ヒト化」されており、部分的又は完全なヒトのグリコシル化パターンを有するポリペプチドの生成をもたらす。Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 （2004）,及びLi et al., Nat Biotech 24, 210-215 （2006）を参照。
【０２１３】
（グリコシル化）ポリペプチドの発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物と脊椎動物）から派生している。無脊椎動物細胞の例には、植物及び昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウイルス株が同定されており、これらは特にスポドプテラ・フルギペルダ細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と組み合わせて使用することができる。植物細胞培養を宿主として利用することもできる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、第６０４０４９８号、第６４２０５４８号、第７１２５９７８号及び第６４１７４２９号（トランスジェニック植物における抗体生成に関するＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術を記載）を参照。脊椎動物細胞も宿主として用いることができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適合された哺乳動物細胞株は有用でありうる。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株、ヒト胚腎臓株（Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 （1977）に記載された２９３細胞又は２９３Ｔ細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスのセルトリ細胞（例えば、Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 （1980）に記載されるＴＭ４細胞）、サル腎細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）、マウス乳腺腫瘍細胞（ＭＭＴ０６０５６２）、（例えばMather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 （1982）に記載される）ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 （1980））；及びＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株を含む。タンパク質生成に適した特定の哺乳動物宿主細胞系の総説については、例えば、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 （B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ）, pp. 255-268 （2003）を参照。宿主細胞は、培養細胞、例えばいくつか挙げると、哺乳動物の培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞及び植物細胞を含み、さらにはトランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物又は動物組織内部に含まれる細胞を含む。一実施態様において、宿主細胞は、真核生物細胞、好ましくは哺乳動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞、又はリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。これらの系において外来遺伝子を発現する標準的な技術が当技術分野で知られている。免疫グロブリンの重鎖又は軽鎖を含むポリペプチドを発現する細胞は、発現された生成物が重鎖及び軽鎖の両方を有する免疫グロブリンであるように、免疫グロブリン鎖の他方も発現するように操作することができる。
【０２１４】
一態様では、本発明の抗体又はそのポリペプチド断片を生成する方法が提供され、この方法は、本発明の抗体又はそのポリペプチド断片の発現に適した条件下で、本明細書に提供される本発明の抗体又はそのポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養すること、及び本発明の抗体又はそのポリペプチド断片を宿主細胞（又は宿主細胞培地）から回収することを含む。
【０２１５】
特定の実施態様では、抗原結合分子の一部を形成する、標的細胞抗原（例えばＦａｂ断片）に対する特異的結合能を有する部分は、少なくとも、抗原に結合することのできる免疫グロブリン可変領域を含む。可変領域は、天然に又は非天然に存在する抗体及びその断片の一部を形成することができ、且つそのような抗体及び断片から誘導することができる。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を生成する方法は、当技術分野で周知である（例えば、Harlow and Lane, 「Antibodies, a laboratory manual」, Cold Spring 担持する Laboratory, 1988参照）。非天然に存在する抗体は、固体相−ペプチド合成を使用して構築されるか、組み換え的に生成されるか（例えば米国特許第４１８６５６７号に記載のように）、又は例えば可変重鎖及び可変軽鎖を含むコンビナトリアルライブラリーのスクリーニング（例えばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙの米国特許第５９６９１０８号を参照）によって得ることができる。
【０２１６】
あらゆる動物種の免疫グロブリンを本発明に使用することができる。本発明において有用な非限定的免疫グロブリンは、マウス、霊長類、又はヒト起源のものでありうる。融合タンパク質がヒトへの使用を意図している場合、免疫グロブリンの定常領域がヒト由来である免疫グロブリンのキメラ形態を使用することができる。ヒト化又は完全ヒト形態の免疫グロブリンも、当分野でよく知られている方法に従って調製されうる（例えばＷｉｎｔｅｒの米国特許第５５６５３３２号を参照）。ヒト化は、様々な方法によって達成することができ、それら方法には、限定されないが、（ａ）非ヒト（例えば、ドナー抗体）のＣＤＲを、重要なフレームワーク残基（例えば、良好な抗原結合親和性又は抗体機能を維持するために重要であるもの）の保持を伴う又は伴わないヒト（例えば、レシピエント抗体）のフレームワーク領域及び定常領域の上に移植すること、（ｂ）非ヒト特異性決定領域（ＳＤＲ又はａ−ＣＤＲ；抗体−抗原相互作用に重要な残基）のみをヒトフレームワーク領域及び定常領域上に移植すること、又は（ｃ）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置き換えによってヒト様切片で「覆い隠す（ｃｌｏａｋｉｎｇ）」ことが含まれる。ヒト化抗体及びそれらの製造方法は、例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 （2008）に総説され、さらに、例えばRiechmann et al., Nature 332, 323-329 （1988）; Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033 （1989）；米国特許第５８２１３３７号、同第７５２７７９１号、同第６９８２３２１号、及び同第７０８７４０９号；Jones et al., Nature 321, 522-525 （1986）; Morrison et al., Proc Natl Acad Sci 81, 6851-6855 （1984）; Morrison and Oi, Adv Immunol 44, 65-92 （1988）; Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536 （1988）; Padlan, Molec Immun 31（3）, 169-217 （1994）; Kashmiri et al., Methods 36, 25-34 （2005） （SDR （a-CDR） 移植術について記載）; Padlan, Mol Immunol 28, 489-498 （1991） （ 「リサーフェイシング」について記載）; Dall’Acqua et al., Methods 36, 43-60 （2005） （「ＦＲシャフリング」について記載）; 及びOsbourn et al., Methods 36, 61-68 （2005） 及びKlimka et al., Br J Cancer 83, 252-260 （2000）（ＦＲシャフリングに対する「ガイド付き選択」アプローチについて記載）に概説がある。本発明による特定の免疫グロブリンはヒト免疫グロブリンである。ヒト抗体及びヒト可変領域は、当技術分野において既知の様々な技術を用いて生産することができる。ヒト抗体は一般的にvan Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 （2001） 及びLonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 （2008）に記載されている。ヒト可変領域は、ハイブリドーマ法によって作製されたヒトモノクローナル抗体の一部を形成することができ、且つそのような抗体から誘導することができる（例えば、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 （Marcel Dekker, Inc., New York, 1987）を参照）。ヒト抗体及びヒト可変領域は、抗原チャレンジに応答して、インタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を持つインタクトな抗体を生成するように修飾されたトランスジェニック動物に、免疫原を投与することによっても調製することができる（例えば、Lonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 （2005）を参照）。ヒト抗体及びヒト可変領域はまた、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択されたＦｖクロ���ン可変領域配列を単離することによって生成することができる（例えば、Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178, 1-37 （O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001）;及びMcCafferty et al., Nature 348, 552-554; Clackson et al., Nature 352, 624-628 （1991）参照）。ファージは、通常、抗体断片を、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、又はＦａｂ断片として表示する。
【０２１７】
特定の態様では、抗体は、例えば、国際公開第２０１２／０２０００６号（親和性成熟に関連する実施例）又は米国特許出願公開第２００４／０１３２０６６号に開示される方法により亢進された結合親和性を有するように操作される。特定の抗原決定基に対する本発明の抗原結合分子の結合能は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られている他の技術、例えば表面プラズモン共鳴技術（Liljeblad,et al.,Glyco.J.17:323-329（2000））及び古典的な結合アッセイ（Heeley,R.P.,Endocr.Res.28:217-229（2002））によって測定することができる。競合アッセイは、特定の抗原への結合について参照抗体と競合する抗原結合分子を同定するために使用されうる。特定の実施態様では、このような競合抗原結合分子は、参照抗原結合分子によって結合される同じエピトープ（例えば直鎖状又は立体構造エピトープ）に結合する。抗原結合分子が結合するエピトープをマッピングするための例示的な方法の詳細が、Morris （1996）“Epitope Mapping Protocols,” in Methods in Molecular Biology vol. 66 （Humana Press, Totowa, NJ）に提供されている。例示的競合アッセイでは、抗原に結合する第１の標識抗原結合分子と、抗原への結合について第１の抗原結合分子と競合するその能力について試験されている第２の非標識抗原結合分子とを含む溶液中において、固定化された抗原がインキュベートされる。第２の抗原結合分子はハイブリドーマ上清中に存在してもよい。コントロールとして、固定化抗原が、第１の標識抗原結合分子を含むが第２の非標識抗原結合分子を含まない溶液中でインキュベートされる。第一の抗体の抗原への結合を許容する条件下でインキュベートした後、過剰な未結合抗体が除去され、固定化された抗原に結合した標識の量が測定される。固定化抗原に結合した標識の量が、コントロール試料と比較して試験試料中で実質的に減少している場合、それは、第二の抗原結合分子が、抗原への結合について第一の抗原結合分子と競合していることを示している。Harlow and Lane （1988） Antibodies:  A Laboratory Manual ch.14 （Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY）を参照。
【０２１８】
本明細書に記載されるように調製された本発明の抗体は、当分野で知られている技術、例えば高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなどによって精製されうる。特定のタンパク質を精製するために使用される実際の条件は、一部には正味荷電、疎水性、親水性などの因子に依存し、当業者に明瞭であろう。アフィニティークロマトグラフィー精製では、抗原結合分子が結合する抗体、リガンド、受容体又は抗原が使用されうる。例えば、本発明の融合タンパク質のアフィニティークロマトグラフィー精製では、プロテインＡ又はプロテインＧを含むマトリックスが使用されうる。逐次的なプロテインＡ又はＧアフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーが、基本的に実施例に記載されるように、抗原結合分子を単離するために使用されうる。抗原結合分子又はその断片の純度は、ゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラフィーなどを含む様々な周知の分析方法のいずれかによって決定されうる。例えば、実施例に記載されるように発現される４−１ＢＢＬ含有抗原結合分子は、還元型及び非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより実証されるように、インタクトであり、且つ適切に集合することが示された。
【０２１９】
アッセイ
本明細書で提供される抗原結合分子は、当技術分野で既知の様々なアッセイによって、その物理的／化学的性質及び／又は生物学的活性について同定、スクリーニング、又は特徴付けされうる。
【０２２０】
１．アフィニティーアッセイ
対応する受容体に対する、本明細書に提供される二重特異性抗原結合分子の親和性を、実施例に規定される方法に従い、ＢＩＡｃｏｒｅ機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のような標準的器具類と、組み換え発現により得られるような受容体又は標的タンパク質とを用いて、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により決定することができる。また、標的細胞抗原に対する二重特異性抗原結合分子の親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅ機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のような標準的器具類と、組み換え発現により得られるような受容体又は標的タンパク質とを用いて、プラズモン共鳴アッセイ（ＳＰＲ）により決定することができる。ＣＤ１９−４−１ＢＢＬ抗原結合分子に関して、本方法は、国際公開第２０１６／０７５２７８号にさらに詳細に記載されている。一態様によれば、ＫＤは、２５ ℃でＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００マシン（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いる表面プラズモン共鳴により測定される。
【０２２１】
２．結合アッセイ及びその他のアッセイ
一態様において、本明細書に報告されるＣＤ１９−４−１ＢＢＬ抗原結合分子は、実施例３ａにさらに詳細に記載されるように、その抗原結合活性について試験される。
【０２２２】
３．活性のアッセイ
一態様において、ＣＤ１９−４−１ＢＢＬ抗原結合分子の生物活性を同定するためのアッセイが提供される。生物活性は、例えば、Ｂ細胞増殖の阻害又はＢ細胞の殺傷を含む。また、ｉｎ  ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｔｒｏでこのような生物活性を有する抗体が提供される。
【０２２３】
特定の実施態様では、本明細書に報告される抗体は、そのような生物活性について試験される。
【０２２４】
薬学的組成物、製剤及び投与経路
さらなる一態様では、本発明は、例えば、以下の治療方法のいずれかにおける使用のための、本明細書に提供される４−１ＢＢアゴニストと抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３抗体とを含む薬学的組成物を提供する。一実施態様において、薬学的組成物は、本明細書に提供される抗体と、少なくとも一つの薬学的に許容される添加物とを含む。別の実施態様では、薬学的組成物は、本明細書に提供される抗体と、例えば以下に記載される、少なくとも一つの追加の治療剤とを含む。
【０２２５】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される添加物中に溶解又は分散された一又は複数の二重特異性抗体の治療的有効量を含む。「薬学的に許容される又は薬理学的に許容される」という表現は、用いられる用量及び濃度においてレシピエントに概して非毒性であり、即ち、例えばヒトなどの動物に必要に応じて投与されたとき、副作用、アレルギー反応、又は他の望ましくない応答を生じさせない分子的実態及び組成物を指す。少なくとも一つの抗体と、任意選択的に追加的な活性成分とを含む薬学的組成物の調製物は、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed.Mack Printing Company, 1990（参照により本明細書に包含される）によって例示されているように、本開示内容の見地から当業者には既知であろう。特に、組成物は、凍結乾燥製剤又は水溶液である。本明細書に使用される「薬学的に許容される添加物」には、当業者に既知であるように、いずれか及びすべての溶媒、バッファー、分散媒、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、防腐剤（例えば抗細菌剤、抗真菌剤）、等張化剤、塩、安定剤及びこれらの組み合わせが含まれる。
【０２２６】
非経口組成物には、注射による投与、例えば皮下、皮内、病巣内、静脈内、動脈内  筋肉内、髄腔内又は腹腔内への注射用に考案されたものが含まれる。注射の場合、本発明の抗原結合分子は、水溶液、好ましくはハンクス液、リンゲル液、又は生理食塩水バッファーといった生理的に適合性のバッファー中において製剤化されうる。溶液は、懸濁化剤、安定剤、及び／又は分散剤といった製剤関連薬剤を含有することができる。代替的には、融合タンパク質は、使用前は、適切なビヒクル、例えば滅菌ピロゲンを含まない水を用いた組成に適した粉末形態であってもよい。無菌の注射可能な溶液は、必要量の本発明の融合タンパク質を、必要に応じて以下に列挙する他の様々な成分を含む適切な溶媒中に取り込むことにより調製される。無菌状態は、例えば、滅菌濾過膜を通して濾過することにより、達成することができる。通常、分散液は、基本的な分散媒体及び／又は他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に、滅菌された様々な活性成分を取り込むことにより調製される。無菌の注射可能な溶液、懸濁液、又は乳濁液を調製するための無菌の粉末の場合、好ましい調製方法は、その直前の滅菌濾過された液体媒質から活性成分の粉末と任意の所望の追加的成分とを生む真空乾燥又は凍結乾燥技術である。液体媒質は、必要であれば適切にバッファーリングされなければならず、十分な食塩水又はグルコースを注射される前に、液体はまず希釈されて等張性にされる。組成物は、製造及び貯蔵条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌といった微生物の汚染作用から保護されなければならない。エンドトキシンの汚染は、安全レベル、例えばタンパク質１ｍｇあたり０．５ｎｇ未満で最小限に保たれなければならない。薬学的に許容される適切な添加物には、限定されないが；リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸のようなバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチオルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン；マンノサッカライド、ジサッカライド、及びグルコース、マンノース又はデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が含まれる。水性注射懸濁液には、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、デキストランなどの懸濁液の粘度を上昇させる化合物が含有されていてよい。任意選択的に、懸濁液は、適切な安定剤、又は化合物の溶解度���上昇させて高濃度の溶液の調製を可能にする薬剤も含有することができる。加えて、活性化合物の懸濁液は、適切な油性注射懸濁液として調製することができる。適切な親油性溶媒又はビヒクルには、ごま油のような脂肪油、又はエチルクリート若しくはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、又はリポソームが含まれる。
【０２２７】
活性成分は、例えばコアセルベーション技術又は界面重合法によって調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセル又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））マイクロカプセルに、コロイド薬物送達システム（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）に、又はマクロエマルジョンに封入することができる。これらの技術は、Remington’s Pharmaceutical Sciences（18th Ed. Mack Printing Company, 1990）に開示されている。徐放性製剤が調製されてもよい。徐放性製剤の適切な例は、ポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリックスは、成形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。特定の実施態様では、注射可能な組成物の吸収を、例えばモノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン、又はそれらの組合せといった吸収を遅延させる薬剤を組成物に使用することにより持続させることができる。
【０２２８】
本明細書における例示的な薬学的に許容される添加物は、介在性薬物分散剤、例えば水溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ｒｈｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標））、Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｃ．）などのヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質を更に含む。特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用法は、ｒＨｕＰＨ２０を含み、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び同第２００６／０１０４９６８に記載されている。一態様において、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼなどの一又は複数のさらなるグリコサミノグリカナーゼと組み合わせられる。
【０２２９】
例示的な凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第６２６７９５８号に記載されている。水性抗体製剤は、米国特許第６１７１５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されているものを含み、後者の製剤はヒスチジン−酢酸緩衝液を含む。
【０２３０】
上記の組成物に加えて、二重特異性抗体は、デポー製剤として製剤化することもできる。このような長時間作用型の製剤は、植込（ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）（例えば、皮下又は筋肉内）により、又は筋肉内注射により投与することができる。したがって、例えば、融合タンパク質は、適切なポリマー性又は疎水性物質（例えば、許容可能なオイル中の乳濁液としての）又はイオン交換樹脂を用いて、又は難溶性の誘導体として、例えば難溶性の塩として製剤化することができる。
【０２３１】
本発明の二重特異性抗原結合分子を含む薬学的組成物は、一般的な混合、溶解、乳化、カプセル化、封入、又は凍結乾燥方法により製造することができる。薬学的組成物は、一又は複数の生理的に許容される担体、希釈材、添加物、又は薬学的に使用可能な調製物へのタンパク質の処理を容易にする補助剤を用いる一般的な方法で製剤化することができる。適当な製剤は、選択される投与経路によって決定する。
【０２３２】
本発明の二重特異性抗体は、遊離酸又は遊離塩基の、天然又は塩の形態の組成物に製剤化することができる。薬学的に許容される塩は、遊離酸又は遊離塩基の生物活性を実質的に保持する塩である。これらには、酸付加塩、例えばタンパク質性組成物の遊離アミノ基で形成されたもの、又は例えば塩酸若しくはリン酸といった無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸若しくはマンデル酸といった有機酸で形成されたものが含まれる。また、遊離カルボキシル基で形成される塩は、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、又は水酸化第二鉄といった無機塩基；又はイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、又はプロカインといった有機塩基から誘導することができる。薬学的塩は、対応する遊離塩基形態より、水性及び他のプロトン性溶媒に溶け易い。
【０２３３】
本明細書の組成物は治療される特定の徴候に必要な一を超える活性成分、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するのも含有しうる。そのような活性成分は、適切には、意図する目的に有効な量の組み合わせで存在する。
【０２３４】
一態様において、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体及び薬学的に許容される担体と、本明細書に記載されるＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストを含む第２の医薬とを含む、薬学的組成物が提供される。特定の態様では、薬学的組成物は、Ｂ細胞増殖性疾患、特に非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）及びホジキンリンパ腫（ＨＬ）からなる群より選択される疾患の治療における使用を目的としている。
【０２３５】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に使用される製剤は、一般的に無菌である。滅菌状態は、例えば、滅菌濾過膜を通して濾過することにより、容易に達成される。
【０２３６】
抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体及び４−１ＢＢアゴニストの投与
抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体及び４−１ＢＢアゴニストの両方（本明細書ではどちらも物質と呼ぶ）は、非経口、肺内、及び鼻腔内、並びに局所治療に望ましい場合は病巣内投与を含む任意の適切な手段により投与することができる。しかしながら、本発明の方法は、非経口、特に静脈内点滴により投与される治療剤に関して、特に有用である。
【０２３７】
非経口注入は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与を含む。投薬は、その投与が短期か又は長期かに部分的に依存して、任意の適切な経路、例えば、静脈内又は皮下注射などの注射により行うことができる。限定されないが、様々な時間点にわたる、単一又は複数回投与、ボーラス投与、パルス注入を含む様々な投薬スケジュールが本明細書において考慮される。一実施態様において、治療剤は、非経口的に、特に静脈内に投与される。特定の実施態様では、物質はは静脈内注入により投与される。別の態様では、物質は皮下投与される。
【０２３８】
抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体及び４−１ＢＢアゴニストの両方は、医学行動規範に準拠する方式で、製剤化、分量、及び投与される。この観点において考慮すべき因子には、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤送達部位、投与方法、投与日程及び医療従事者に既知である他の因子が含まれる。抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体及び４−１ＢＢアゴニストの両方は、必ずしもそうである必要はないが、任意選択的に、問題の障害を予防又は治療するために現在使用されている一又は複数の薬剤と一緒に製剤化される。このような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する治療剤の量、疾患又は治療の種類、及び上記以外の因子によって決まる。これらは一般的には本明細書に記載されるのと同じ投薬量及び投与経路において、又は、本明細書に記載された用量の１％から９９％で、又は経験的に／臨床的に妥当であると決定された任意の投薬量及び任意の経路により、使用される。
【０２３９】
疾患の予防又は治療のために、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体、及び４−１ＢＢアゴニストの適切な用量は（それらの組み合わせで、又は一又は複数の他の追加的治療剤と共に使用されるとき）、治療される疾患の種類、４−１ＢＢ剤の種類、疾患の重症度及び経過、両薬剤が予防目的で又は治療目的で投与されるのか、治療歴、患者の病歴及び治療剤に対する応答、並びに主治医の判断に依拠するであろう。各物質は、患者に対して、単回、又は一連の治療にわたって適切に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば一又は複数回の個別投与によるか、又は連続注入によるかに関わらず、約１μｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ）の物質が対象への投与のための初期候補用量となりうる。一つの典型的な一日当たりの用量は、上記因子に応じて約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲である。数日間以上にわたる反復投与の場合には、状態に応じて、治療は疾患症状の望まれる抑制が起こるまで持続されるであろう。各物質の一つの例示的投薬量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇであろう。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの一又は複数の用量（又はこれらのいずれかの組み合わせ）を対象に投与してよい。このような用量は断続的に、例えば毎週、二週毎、又は三週毎（例えば対象が約２から約２０、例えば治療剤の約６用量を受けるように）投与してよい。より高い初回負荷用量と、それに続く一又は複数のより低い用量、又はより低い初回用量と、それに続く一又は複数のより高い用量が投与されうる。例示的投与レジメンは、約１０ｍｇの初回用量に続き、隔週約２０ｍｇの治療剤を投与することを含む。しかしながら、他の用量レジメンも有用でありうる。この治療法の進行は、従来の技術及びアッセイにより容易に監視される。
【０２４０】
一態様において、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体及び４−１ＢＢアゴニスト両方の投与は単会投与である。特定の態様では、治療剤の投与は複数回投与である。このような一態様では、物質は、毎週、二週毎、又は三週毎、特に二週毎に投与される。一態様において、物質は治療的有効量で投与される。一態様では、物質は、約５０μｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ、約２００μｇ／ｋｇ、約３００μｇ／ｋｇ、約４００μｇ／ｋｇ、約５００μｇ／ｋｇ、約６００μｇ／ｋｇ、約７００μｇ／ｋｇ、約８００μｇ／ｋｇ、約９００μｇ／ｋｇ又は約１０００μｇ／ｋｇの用量で投与される。一実施態様において、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、４−１ＢＢアゴニストを投与しない対応する治療レジメンにおいて、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体の用量より高い用量で投与される。一態様において、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体の投与は、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体の第１の用量の初回投与と、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体の第２の用量の一又は複数のその後の投与を含み、第２の用量は第１の用量より高い。一態様において、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体の投与は、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体の第１の用量の初回投与と、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体の第２の用量の一又は複数のその後の投与を含み、第１の用量は第２の用量を下回らない。
【０２４１】
一態様において、本発明による治療レジメンにおける抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体の投与は、対象に対する抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体の初回投与である（少なくとも同じ治療の過程内で）。一態様において、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体の投与前には対象に対して４−１ＢＢアゴニストの投与は行われない。別の態様では、４−１ＢＢアゴニストは抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体の投与前に投与される。
【０２４２】
別の態様では、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニストとの組み合わせでの使用を目的としており、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体、好ましくはオビヌツズマブを用いた前処置は、併用療法に先立って実施され、前処置と併用療法との間の期間は、ＩＩ型抗ＣＤ２０抗体、好ましくはオビヌツズマブに応答して個体のＢ細胞が減少するために十分である。
【０２４３】
Ｔ細胞の活性化は、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）を引き起こすことがある。ＴｅＧｅｎｅｒｏによって実施された第１相試験（Suntharalingam et al., N Engl J Med （2006） 355,1018-1028）では、６名の健常なボランティア全員が、不適切に投与されたＴ細胞刺激性スーパーアゴニスト抗ＣＤ２８モノクローナル抗体の点滴後すぐに、ほとんど致命的な重症のサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）を経験した。抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体といったＴ細胞活性化治療剤の対象への投与に関連付けられるサイトカイン放出は、オビヌツズマブなどのＩＩ型抗ＣＤ２０抗体を用いた前記対象の前処置により有意に低減しうる。ＧＡＺＹＶＡ（登録商標）による前処置（Ｇｐｔ）は、投薬開始から腫瘍細胞の排除を媒介するために十分に高いＴ細胞活性化治療剤の曝露レベルをサポートすると同時に、Ｔ細胞活性化治療剤（例えばＣＲＳ）による強い全身性Ｔ細胞活性化に由来する関連性の高い有害事象（ＡＥ）の危険性が低下するように、末梢血及び二次リンパ器官両方におけるＢ細胞の急速な枯渇を助けるであろう。現在まで、進行中のオビヌツズマブ臨床治験において、何百人もの患者でオビヌツズマブの安全性プロファイル（サイトカイン放出を含む）が評価及び管理されてきた。最後に、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体などのＴ細胞活性化治療剤の安全性プロファイルをサポートすることに加えて、Ｇｐｔは、これら特有の分子への抗薬剤抗体（ＡＤＡ）の形成の防止にも有用であろう。
【０２４４】
本発明では、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体と４−１ＢＢアゴニストとの組み合わせは、治療法において一又は複数のさらなる薬剤との組み合わせで使用することができる。例えば、少なくとも一つの追加の治療剤は、共投与される。特定の態様では、追加の治療剤は、免疫療法剤である。
【０２４５】
本発明の一態様において、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体が、ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニストと組み合わせて使用され、さらにそれらがＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤と組み合わせられる、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用を目的としている。ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤は、ＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニスト又はＰＤ−１結合アンタゴニストである。特に、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体又は抗ＰＤ−１抗体である。
【０２４６】
一態様では、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤は抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。ＣＤ２７４又はＢ７−Ｈ１としても知られる「ＰＤ−Ｌ１」という用語は、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）といった哺乳動物を含むあらゆる脊椎動物源由来のいずれかの天然型ＰＤ−Ｌ１、特に「ヒトＰＤ−Ｌ１」を指す。完全ヒトＰＤ−Ｌ１のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）登録番号Ｑ９ＮＺＱ７（配列番号１０６）において示される。用語「ＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニスト」は、ＰＤ−Ｌ１と、ＰＤ−１、Ｂ７−１といったその結合パートナーのいずれか一又は複数との相互作用に起因するシグナル伝達を、低減、ブロック、阻害、抑止、又は妨害する分子を指す。いくつかの実施態様では、ＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニストは、ＰＤ−Ｌ１のその結合パートナーに対する結合を阻害する分子である。特定の態様では、ＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニストは、ＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１及び／又はＢ７−１に対する結合を阻害する。いくつかの実施態様では、ＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニストは、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、オリゴペプチド及びＰＤ−Ｌ１と、ＰＤ−１、Ｂ７−１といったその結合パートナーの一又は複数との相互作用に起因するシグナル伝達を、低減、ブロック、阻害、抑止、又は妨害する他の分子を含む。一実施態様では、ＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニストは、ＰＤ−Ｌ１を介したＴリンパ球媒介性シグナル伝達に発現される細胞表面タンパク質により又は同タンパク質を介して媒介される陰性の共刺激シグナルを低減し、機能障害性のＴ細胞の機能障害性を低下させる（例えば、抗原認識に対するエフェクター応答を増強する）。特に、ＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニストは抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。用語「抗ＰＤ−Ｌ１抗体」又は「ヒトＰＤ−Ｌ１に結合する抗体」又は「ヒトＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する抗体」又は「アゴニスト抗ＰＤ−Ｌ１」は、１．０×１０−８ｍｏｌ／ｌ以下のＫＤ値、一態様では１．０ｘ１０−９ｍｏｌ／ｌ以下のＫＤ値の結合親和性でヒトＰＤ−Ｌ１抗原に特異的に結合する抗体を指す。結合親和性は、例えば表面プラズモン共鳴法（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）、スウェーデン、ウプサラ、ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの標準的な結合アッセイにより決定される。
【０２４７】
特定の一態様では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、アテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＲＧ７４４６）、デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６）、アベルマブ（ＭＳＢ００１０７１８Ｃ）及びＭＤＸ−１１０５からなる群より選択される。特定の態様では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、本明細書に記載されるＹＷ２４３．５５．Ｓ７０である。別の特定の態様では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、本明細書に記載されるＭＤＸ−１１０５である。また別の特定の態様では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体はＭＥＤＩ４７３６（デュルバルマブ）である。さらなる態様では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体はＭＳＢ００１０７１８Ｃ（アベルマブ）である。さらに詳細には、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤はアテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０Ａ）である。別の態様では、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤は、配列番号１０８の重鎖可変ドメインＶＨ（ＰＤＬ−１）及び配列番号１０９の軽鎖可変ドメインＶＬ（ＰＤＬ−１）を含む抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。別の態様では、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤は、配列番号１１０の重鎖可変ドメインＶＨ（ＰＤＬ−１）及び配列番号１１１の軽鎖可変ドメインＶＬ（ＰＤＬ−１）を含む抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。
【０２４８】
ＣＤ２７９、ＰＤ１又はプログラム細胞死タンパク質１としても知られる「ＰＤ−１」という用語は、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）といった哺乳動物を含むあらゆる脊椎動物源由来のいずれかの天然型ＰＤ−Ｌ１、特にＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）登録番号Ｑ１５１１６（配列番号１０７）に示されるアミノ酸配列を有するヒトタンパク質ＰＤ−１を指す。用語「ＰＤ−１結合アンタゴニスト」は、そのリガンド結合パートナーに対するＰＤ−１の結合を阻害する分子を指す。いくつかの実施態様では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１に対する結合を阻害する。いくつかの実施態様では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ２に対する結合を阻害する。いくつかの実施態様では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２両方に対する結合を阻害する。特に、ＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニストは抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。用語「抗ＰＤ−１抗体」又は「ヒトＰＤ−１に結合する抗体」又は「ヒトＰＤ−１に特異的に結合する抗体」又は「アンタゴニスト抗ＰＤ−１」は、１．０×１０−８ｍｏｌ／ｌ以下のＫＤ値、一態様では１．０ｘ１０−９ｍｏｌ／ｌ以下のＫＤ値の結合親和性でヒトＰＤ１抗原に特異的に結合する抗体を指す。結合親和性は、例えば表面プラズモン共鳴法（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）、スウェーデン、ウプサラ、ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの標準的な結合アッセイにより決定される。
【０２４９】
一態様では、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤は抗ＰＤ−１抗体である。特定の一態様では、抗ＰＤ−１抗体は、ＭＤＸ  １１０６（ニボルマブ）、ＭＫ−３４７５（ペンブロリズマブ）、ＣＴ−０１１（ｐｉｄｉｌｉｚｕｍａｂ）、ＭＥＤＩ−０６８０（ＡＭＰ−５１４）、ＰＤＲ００１、ＲＥＧＮ２８１０、及びＢＧＢ−１０８からなる群より選択され、特にペンブロリズマブ及びニボルマブから選択される。別の態様では、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤は、配列番号１１２の重鎖可変ドメインＶＨ（ＰＤ−１）及び配列番号１１３の軽鎖可変ドメインＶＬ（ＰＤ−１）を含む抗ＰＤ−１抗体である。別の態様では、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用遮断剤は、配列番号１１４の重鎖可変ドメインＶＨ（ＰＤ−１）及び配列番号１１５の軽鎖可変ドメインＶＬ（ＰＤ−１）を含む抗ＰＤ−１抗体である。
【０２５０】
上記のこのような併用療法は、併用投与（二つ以上の治療剤が同一又は別々の製剤に含まれている）と、治療剤の投与が、一又は複数の追加的な治療剤の投与の前、投与と同時、及び／又は投与の後に起こりうる個別投与とを包含する。一実施態様において、治療剤の投与及び追加の治療剤の投与は、互いに、約１か月以内又は約１、２、若しくは３週間以内、又は１、２、３、４、５、若しくは６日間以内に行われる。
【０２５１】
治療方法及び組成物
ＣＤ２０及びＣＤ１９は、幹細胞及び形質細胞を例外として大部分のＢ細胞に発現され（ｐａｎ−Ｂ細胞マーカー）、例えば非ホジキンリンパ腫及び急性リンパ芽球性白血病において、多発性骨髄腫を除くリンパ腫及び白血病といった大部分のヒトＢ細胞悪性腫瘍（腫瘍関連抗原）に頻繁に発現される。
【０２５２】
異なる細胞集団に二つの細胞表面タンパク質を認識する二重特異性抗体は、病原性の標的細胞の破壊のために細胞傷害性免疫細胞を再度方向付けする見込みを保持している。
【０２５３】
一態様では、対象に対し、有効量の抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３抗体及びＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストを投与することを含む、対象におけるがんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法が提供される。
【０２５４】
このような一態様では、方法は、有効量の少なくとも一つの追加の治療剤を対象に投与することをさらに含む。さらなる実施態様において、本明細書には、対象に対し、有効量の抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３抗体及びＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストを投与することを含む、Ｂ細胞を枯渇させるための方法が提供される。上記のいずれの態様に記載の「個体」又は「対象」も、好ましくはヒトである。
【０２５５】
さらなる態様では、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体とＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストとを含む、がんの免疫療法における使用のための組成物が提供される。特定の実施態様では、がんの免疫療法の方法における使用のための、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３抗体とＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストとを含む組成物が提供される。
【０２５６】
さらなる一態様では、本明細書において、医薬の製造又は調製における、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３抗体とＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストとを含む組成物の使用が提供される。一実施態様では、医薬は、Ｂ細胞増殖性疾患の治療を目的とする。さらなる実施態様において、本医薬は、Ｂ細胞増殖性疾患を有する個体に対し、医薬の有効量を投与することを含む、Ｂ細胞増殖性疾患を治療する方法における使用を目的としている。このような一実施態様では、方法は、少なくとも一つの追加の治療剤の有効量を個体に投与することをさらに含む。さらなる一実施態様では、医薬はＢ細胞を枯渇させるためのものである。Ｂ細胞増殖性疾患は、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）及びホジキンリンパ腫（ＨＬ）からなる群より選択される。特定の一態様では、Ｂ細胞がんは非ホジキンリンパ腫又は急性リンパ芽球性白血病である。
【０２５７】
さらなる態様において、本明細書では、Ｂ細胞がんを治療するための方法が提供される。一実施態様において、本方法は、そのようなＢ細胞がんを有する個体に対し、抗ヒトＣＤ１９抗体の有効量を投与することを含む。このような一実施態様では、方法は更に、個体に対し、後述するような少なくとも一の追加的な治療剤の有効量を投与することを含む。上記実施態様のいずれかによる「個体」は、ヒトである。Ｂ細胞がんは、一実施態様ではＢ細胞リンパ腫又はＢ細胞白血病である。一実施態様では、Ｂ細胞がんは、非ホジキンリンパ腫又は急性リンパ芽球性白血病である。
【０２５８】
上記の併用療法は、併用投与（二つ以上の治療剤が同一又は別々の製剤に含まれている）と、本明細書に報告される抗体の投与が、一又は複数の追加の治療剤の投与の前、投与と同時、及び／又は投与の後に起こりうる個別投与とを包含する。一実施態様において、抗ヒトＣＤ１９抗体の投与と追加の治療剤の投与とは、互いから約１か月以内又は約１、２、若しくは３週間以内、又は１、２、３、４、５、若しくは６日間以内に行われる。
【０２５９】
本明細書に報告される抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体及び４−１ＢＢアゴニストの両方（及びいずれかの追加の治療剤）は、非経口、肺内、及び鼻腔内、並びに局所治療に望ましい場合は病巣内投与を含む任意の適切な手段により投与することができる。非経口注入は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与を含む。投薬は、その投与が短期か又は長期かに部分的に依存して、任意の適切な経路、例えば、静脈内又は皮下注射などの注射により行うことができる。限定されないが、様々な時間点にわたる、単一又は複数回投与、ボーラス投与、パルス注入を含む様々な投薬スケジュールが本明細書において考慮される。
【０２６０】
本明細書に報告される抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体及び４−１ＢＢアゴニストの両方は、医学行動規範に準拠する方式で、製剤化、分量、及び投与される。この観点において考慮すべき因子は、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤送達部位、投与方法、投与日程及び医療従事者が知る他の因子を包含する。この抗体は、必ずしも必須ではないが任意選択的に、問題の障害を予防又は治療するために目下使用されている一又は複数の薬剤と共に製剤化される。このような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する抗体の量、障害又は治療の種類、及び上記他の因子によって決まる。これらは一般的には本明細書に記載されるのと同じ投薬量で及び投与経路において、又は、本明細書に記載された用量の１％から９９％で、又は経験的に／臨床的に妥当であると決定された任意の投薬量及び任意の経路により、使用される。
【０２６１】
その他の薬剤及び治療
本発明の抗原結合分子は、療法において、一又は複数の他の薬剤との組み合わせで投与されうる。例えば、本発明の融合タンパク質は、少なくとも１の付加的治療剤と共投与されうる。用語「治療剤」は、そのような治療を必要とする個体の症状又は疾患を治療するために投与されうるあらゆる薬剤を包含する。このような追加的な治療剤は、治療される特定の兆候に適したあらゆる活性成分、好ましくは、互いに打ち消し合うことのない相補的活性を有する活性成分を含む。特定の実施態様では、追加の治療剤は別の抗がん剤である。
【０２６２】
このような他の薬剤は、意図した目的に有効な量で組み合わされて適切に存在する。このような他の薬剤の有効量は、使用される融合タンパク質の量、障害又は治療の種類、及び上記他の因子によって決まる。抗原結合分子は、一般的に、本明細書に記載されるものと同じ用量及び投与経路において、又は本明細書に記載された投与量の１％〜９９％で、又は経験的に／臨床的に妥当であると決定された任意の投与量で任意の経路により使用される。
【０２６３】
上記のこうした併用療法は、併用投与（二以上の治療剤が、同一又は別々の組成物に含まれている）、及び本発明の抗原結合分子の投与が、追加の治療剤及び／又はアジュバントの投与の前、投与と同時、及び／又は投与の後に起こりうる分離投与を包含する。
【０２６４】
製造品（キット）
本発明の別の態様では、上述した障害の治療、予防、及び／又は診断に有用な材料を含有するキットが提供される。このキットは、少なくとも一つの容器、容器上の又は容器に付随するラベル又は添付文書を含む。適切な容器は、例としてボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ輸液バッグなどを含む。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成されうる。容器は、状態の治療、予防、及び／又は診断に有効な、単独の又はその他の組成物と併用される化合物を収容し、無菌のアクセスポートを有することができる（例えば、容器は皮下注射針により穿孔可能なストッパーを有する静脈内溶液のバッグ又はバイアルであってよい）。キット中の少なくとも二つの活性の薬剤は、本発明の抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体と、ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストである。
【０２６５】
特定の態様では、（Ａ）活性成分としての抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体と薬学的に許容される担体とを含む第１の組成物；（Ｂ）ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合分子を含む、活性成分としての４−１ＢＢアゴニストと、薬学的に許容される担体とを含む第２の組成物、並びに（Ｃ）併用療法における前記組成物の使用説明書を含むパッケージを含む、対象におけるがんを治療するため又はがんの進行を遅らせるためのキットが提供される。
【０２６６】
ラベル又は添付文書は、選択状態を治療するために組成物がどのように使用されるかを示し、併用療法において組成物を使用するための指示を提供する。さらに、キットは、（ａ）本発明の抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体を含む組成物を中に収容する第１の容器；及び（ｂ）本発明のＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢアゴニストを含む組成物を中に収容する第２の容器を備えることができる。加えて、キットは、組み合わせて使用することのできるさらなる活性成分を含む一又は複数のさらなる容器を備えてもよい。本発明の本実施態様における製造品は、組成物が特定の状態を治療するために使用できることを示す添付文書をさらに含んでもよい。
【０２６７】
代替的に又は追加的に、キットは、薬学的に許容されるバッファー、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液及びデキストロース溶液を含む第２の（又は第３の）容器をさらに備えてもよい。それは、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業的な及び使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含んでもよい。
【０２６８】
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【０２６９】
ヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般情報は以下に与えられている：Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD （1991）。抗体鎖のアミノ酸は、上記に定義されるように、Kabat（Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD （1991））による番号付けシステムに従って番号付け及び参照される。
【０２７０】
本発明の態様
以下に、本発明の態様のいくつかを列挙する。
１．４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニストと組み合わせて使用される、がんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
２．抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体及び４−１ＢＢアゴニストが、単一の組成物中において一緒に投与されるか、又は二つ以上の異なる組成物中において別々に投与される、態様１の方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
３．４−１ＢＢアゴニストと同時に、４−１ＢＢアゴニストに先立ち、又は４−１ＢＢアゴニストの後で投与される、態様１又は２の方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
４．４−１ＢＢアゴニストが４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む、前記態様のいずれか一つの方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
５．４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む分子であり、４−１ＢＢＬのエクトドメインが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群より選択されたアミノ酸配列、特に配列番号１又は配列番号５のアミノ酸配列を含む、前記態様のいずれか一つの方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
６．４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
７．４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片とＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子が、ＣＤ１９発現Ｂ細胞によって内部移行することがない、前記態様のいずれか一つの方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
８．４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの部分とを含む抗原結合分子であり、ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインが、
（ａ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、並びに（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｉｖ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン
を含む、前記態様のいずれか一つの方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
９．４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインとを有する抗原結合分子であり、ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインが、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）と、配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）とを含むか、又はＣＤ１９に対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインが、配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）と、配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）とを含む、前記態様のいずれか一つの方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
１０．４−１ＢＢアゴニストが、安定に会合することのできる第１及び第２のサブユニットを含むＦｃドメインをさらに含む抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
１１．４−１ＢＢアゴニストが、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、具体的にはＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
１２．４−１ＢＢアゴニストが、Ｆｃ受容体への結合を低減若しくは排除する及び／又はエフェクター機能を低下させる若しくは排除する一又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
１３．４−１ＢＢアゴニストが、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
１４．４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であり、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドが、４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含む、前記態様のいずれか一つの方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
１５．４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド、
を含む抗原結合分子であって、
（ｉ）第１のポリペプチドがＣＨ１又はＣＬドメインを、第２のポリペプチドがＣＬ又はＣＨ１ドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ１又はＣＬドメインに接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＬ又はＣＨ１ドメインにペプチドリンカーを介して接続する４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉ）第１のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、第２のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、それぞれ含み、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ３ドメインのＣ末端に接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＨ３ドメインのＣ末端にペプチドリンカーを介して接続する４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉｉ）第１のポリペプチドがＶＨ−ＣＬ又はＶＬ−ＣＨ１ドメインを、第２のポリペプチドがＶＬ−ＣＨ１ドメイン又はＶＨ−ＣＬドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＶＨ又はＶＬに接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＶＬ又はＶＨにペプチドリンカーを介して接続する４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含むこと
を特徴とする抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
１６．４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）と配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）又は配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）と配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）を含むＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であって、第１のポリペプチドが、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１及び配列番号３２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むこと、並びに第２のポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むこと
を特徴とする抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
１７．４−１ＢＢアゴニストが、
ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３４のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号３５のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３６のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｂ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３４のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号３７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｃ）配列番号３４のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖、配列番号３９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖及び配列番号４０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む分子；
ｄ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３４のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号４１のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号４２のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｅ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３４のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号４３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号４４のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｆ）配列番号３４のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖、配列番号４５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖及び配列番号４６のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む分子；
ｇ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号３５のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３６のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｈ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号３７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｉ）配列番号４８のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖、配列番号４９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖及び配列番号５０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む分子；
ｊ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号４１のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号４２のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｋ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号４３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号４４のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；並びに
ｌ）配列番号４８のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖、配列番号５１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖及び配列番号５２のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む分子
からなる群より選択される抗原結合分子である、前記態様のいずれか一つの方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
１８．４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ペプチドリンカーによって互いに接続する４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチド
を含む抗原結合分子である、態様１から１３のいずれか一つの方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
１９．４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ペプチドリンカーにより互いに接続する４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチド、及び
（ｃ）安定に会合することのできる第１及び第２のサブユニットを含むＦｃドメイン
を含む抗原結合分子であり、ペプチドリンカーにより互いに接続する４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチドが、任意選択的にペプチドリンカーを通して、Ｆｃドメインの二つのサブユニットの一方のＮ又はＣ末端アミノ酸に融合する、態様１から１３のいずれか一つ又は態様１８の方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
２０．４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含む分子、
（ｂ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、配列番号４８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含む分子；
（ｃ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、及び配列番号５４のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含む分子、並びに
（ｄ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、配列番号４８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、及び配列番号５５のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含む分子
からなる群より選択される抗原結合分子である、態様１から１３のいずれか一つ、又は態様１８、又は態様１９の方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
２１．４−１ＢＢアゴニストが抗ＣＤ１９／抗４−１ＢＢ二重特異性抗体である、態様１から３のいずれか一つの方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
２２．ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメイン、及びＣＤ２０に結合する第２の抗原結合ドメインを含む、前記態様のいずれか一つの方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
２３．重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）及び軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインと、重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２０）及び軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２０）を含む第２の抗原結合ドメインとを含む、前記態様のいずれか一つの方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
２４．第１の抗原結合ドメインが、配列番号５６のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号５７のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号５８のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）；及び／又は配列番号５９のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号６０のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号６１のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む、前記態様のいずれか一つの方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
２５．第１の抗原結合ドメインが、配列番号６２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）及び／又は配列番号６３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む、前記態様のいずれか一つの方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
２６．第２の抗原結合ドメインが、配列番号６４のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号６５のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号６６のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２０）、及び／又は配列番号６７のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号６８のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号６９のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２０）を含む、前記態様のいずれか一つの方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
２７．第２の抗原結合ドメインが、配列番号７０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２０）及び／又は配列番号７１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２０）を含む、前記態様のいずれか一つの方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
２８．ＣＤ２０に結合する第３の抗原結合ドメインを含む、前記態様のいずれか一つの方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
２９．第３の抗原結合ドメインが、配列番号６４のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号６５のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号６６のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２０）；及び／又は配列番号６７のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号６８のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号６９のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２０）を含む、前記態様のいずれか一つの方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
３０．第３の抗原結合ドメインが、配列番号７０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２０）及び／又は配列番号７１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２０）を含む、前記態様のいずれか一つの方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
３１．第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖と軽鎖の可変ドメイン又は定常ドメインが交換されているクロスＦａｂ分子であり、第２の抗原結合ドメイン及び存在する場合は第３の抗原結合ドメインが従来のＦａｂ分子である、前記態様のいずれか一つの方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
３２．（ｉ）第２の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第１の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しており、且つ第３の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合しているか、又は（ｉｉ）第１の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端において第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第２の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しており、且つ第３の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合している、前記態様のいずれか一つの方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
３３．Ｆｃ受容体への結合を低減する及び／又はエフェクター機能を低下させる一又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む、前記態様のいずれか一つの方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
３４．アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む、前記態様のいずれか一つの方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
３５．４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニストと組み合わせて使用され、前記組み合わせが、約一週から三週の間隔で投与される、前記態様のいずれか一つの方法における使用のための抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体。
３６．（Ａ）活性成分としての抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体と薬学的に許容される担体とを含む第１の組成物；及び（Ｂ）活性成分としての４−１ＢＢアゴニストと薬学的に許容される担体とを含む第２の組成物を含む、疾患、特にがんの連続又は同時の併用療法における使用のための、医薬製品。
３７．Ｂ細胞増殖性疾患、特に非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）及びホジキンリンパ腫（ＨＬ）からなる群より選択される疾患の治療における使用のための、態様３６の医薬製品。
３７．抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体及び４−１ＢＢアゴニストを含む薬学的組成物。
３８．抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体及び４−１ＢＢアゴニストが、単一の組成物中において一緒に投与されるか又は二つ以上の異なる組成物中において別々に投与される、態様３７の薬学的組成物。
３９．抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体が４−１ＢＢアゴニストと同時に、４−１ＢＢアゴニストに先立ち、又は４−１ＢＢアゴニストの後で投与される、態様３７又は３８の薬学的組成物。
４０．４−１ＢＢアゴニストが４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む、態様３７から３９のいずれか一つの薬学的組成物。
４１．４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む分子であり、４−１ＢＢＬのエクトドメインが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群より選択されるアミノ酸配列、特に配列番号１又は配列番号５のアミノ酸配列を含む、態様３７から４０のいずれか一つの薬学的組成物。
４２．４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子である、態様３７から４１のいずれか一つの薬学的組成物。
４３．４−１ＢＢアゴニストがＢ細胞内に内部移行することがない、態様３７から４２のいずれか一つの薬学的組成物。
４４．４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの部分とを含む抗原結合分子であり、ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインが、
（ａ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、並びに（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｉｖ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン
を含む、態様３７から４３のいずれか一つの薬学的組成物。
４５．４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインとを有する抗原結合分子であり、ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインが、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）と、配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）とを含むか、又はＣＤ１９に対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインが、配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）と、配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）を含む、態様３７から４４のいずれか一つの薬学的組成物。
４６．４−１ＢＢアゴニストが、安定に会合することのできる第１及び第２のサブユニットを含むＦｃドメインをさらに含む抗原結合分子である、態様３７から４５のいずれか一つの薬学的組成物。
４７．４−１ＢＢアゴニストが、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、具体的にはＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む抗原結合分子である、態様３７から４５のいずれか一つの薬学的組成物。
４８．４−１ＢＢアゴニストが、Ｆｃ受容体への結合を低減する及び／又はエフェクター機能を低下させる一又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む抗原結合分子である、態様３７から４７のいずれか一つの薬学的組成物。
４９．４−１ＢＢアゴニストが、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む抗原結合分子である、態様３７から４８のいずれか一つの薬学的組成物。
５０．４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であり、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドが、４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含む、態様３７から４９のいずれか一つの薬学的組成物。
５１．４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド、
を含む抗原結合分子であって、
（ｉ）第１のポリペプチドがＣＨ１又はＣＬドメインを、第２のポリペプチドがＣＬ又はＣＨ１ドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ１又はＣＬドメインに接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＬ又はＣＨ１ドメインにペプチドリンカーを介して接続する４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉ）第１のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、第２のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、それぞれ含み、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ３ドメインのＣ末端に接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＨ３ドメインのＣ末端にペプチドリンカーを介して接続する４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉｉ）第１のポリペプチドがＶＨ−ＣＬ又はＶＬ−ＣＨ１ドメインを、第２のポリペプチドがＶＬ−ＣＨ１ドメイン又はＶＨ−ＣＬドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＶＨ又はＶＬに接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＶＬ又はＶＨにペプチドリンカーを介して接続する４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含むこと
を特徴とする抗原結合分子である、態様３７から５０のいずれか一つの薬学的組成物。
５２．４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）と配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）又は配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）と配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）を含むＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であって、第１のポリペプチドが、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１及び配列番号３２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むこと、並びに第２のポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする抗原結合分子である、態様３７から５１のいずれか一つの薬学的組成物。
５３．４−１ＢＢアゴニストが、
ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３４のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号３５のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３６のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｂ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３４のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号３７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｃ）配列番号３４のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖、配列番号３９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖及び配列番号４０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む分子；
ｄ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３４のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号４１のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号４２のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｅ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３４のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号４３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号４４のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｆ）配列番号３４のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖、配列番号４５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖及び配列番号４６のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む分子；
ｇ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号３５のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３６のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｈ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号３７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｉ）配列番号４８のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖、配列番号４９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖及び配列番号５０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む分子；
ｊ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号４１のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号４２のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｋ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号４３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号４４のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；並びに
ｌ）配列番号４８のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖、配列番号５１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖及び配列番号５２のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む分子
からなる群より選択される抗原結合分子である、態様３７から５２のいずれか一つの薬学的組成物。
５４．４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ペプチドリンカーによって互いに接続する４−１ＢＢＬのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチド
を含む抗原結合分子である、態様３７から４９のいずれか一つの薬学的組成物。
５５．４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ペプチドリンカーにより互いに接続する４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチド、及び
（ｃ）安定に会合することのできる第１及び第２のサブユニットを含むＦｃドメイン
を含む抗原結合分子であり、ペプチドリンカーにより互いに接続する４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチドが、任意選択的にペプチドリンカーを通して、Ｆｃドメインの二つのサブユニットの一方のＮ又はＣ末端アミノ酸に融合する、態様３７から４９のいずれか一つ又は態様５４の薬学的組成物。
５６．４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含む分子、
（ｂ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、配列番号４８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含む分子；
（ｃ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、及び配列番号５４のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含む分子、並びに
（ｄ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、配列番号４８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、及び配列番号５５のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含む分子
からなる群より選択される抗原結合分子である、態様３７から４９のいずれか一つ、又は態様５４、又は態様５５の薬学的組成物。
５７．４−１ＢＢアゴニストが抗ＣＤ１９／抗４−１ＢＢ二重特異性抗体である、態様３７から３９のいずれか一つの薬学的組成物。
５８．抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体が、ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメイン、及びＣＤ２０に結合する第２の抗原結合ドメインを含む、態様３７から５７のいずれか一つの薬学的組成物。
５９．抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体が、重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）及び軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインと、重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２０）及び軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２０）を含む第２の抗原結合ドメインとを含む、態様３７から５８のいずれか一つの薬学的組成物。
６０．第１の抗原結合ドメインが、配列番号５６のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号５７のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号５８のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）；及び／又は配列番号５９のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号６０のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号６１のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む、態様３７から５９のいずれか一つの薬学的組成物。
６１．第１の抗原結合ドメインが、配列番号６２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）及び／又は配列番号６３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む、態様３７から６０のいずれか一つの薬学的組成物。
６２．第２の抗原結合ドメインが、配列番号６４のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号６５のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号６６のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２０）；及び／又は配列番号６７のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号６８のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号６９のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２０）を含む、態様３７から６１のいずれか一つの薬学的組成物。
６３．第２の抗原結合ドメインが、配列番号７０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２０）及び／又は配列番号７１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２０）を含む、態様３７から６２のいずれか一つの薬学的組成物。
６４．抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体が、ＣＤ２０に結合する第３の抗原結合ドメインを含む、態様３７から６３のいずれか一つの薬学的組成物。
６５．第３の抗原結合ドメインが、配列番号６４のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号６５のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号６６のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２０）；及び／又は配列番号６７のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号６８のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号６９のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２０）を含む、態様３７から６４のいずれか一つの薬学的組成物。
６６．第３の抗原結合ドメインが、配列番号７０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２０）及び／又は配列番号７１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２０）を含む、態様３７から６５のいずれか一つの薬学的組成物。
６７．第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖と軽鎖の可変ドメイン又は定常ドメインが交換されているｃｒｏｓｓ−Ｆａｂ分子であり、第２の抗原結合ドメイン及び存在する場合は第３の抗原結合ドメインが従来のＦａｂ分子である、態様３７から６６のいずれか一つの薬学的組成物。
６８．（ｉ）第２の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第１の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しており、且つ第３の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合しているか、又は（ｉｉ）第１の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端において第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第２の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しており、且つ第３の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合している、態様３７から６７のいずれか一つの薬学的組成物。
６９．抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体が、Ｆｃ受容体への結合を低減する及び／又はエフェクター機能を低下させる一又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む、態様３７から６８のいずれか一つの薬学的組成物。
７０．抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体が、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む、態様３７から６８のいずれか一つの薬学的組成物。
７１．抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体が４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニストと組み合わせて使用され、前記組み合わせが、約一週から三週の間隔で投与される、態様３７から７０のいずれか一つの薬学的組成物。
７２．増殖性疾患、特にがんを治療すること、又は増殖性疾患、特にがんの進行を遅らせることにおける使用のための、態様３７から７１のいずれか一つの薬学的組成物。
７３．Ｂ細胞増殖性疾患、特に非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）及びホジキンリンパ腫（ＨＬ）からなる群より選択される疾患の治療における使用のための、態様３７から７１２のいずれか一つの薬学的組成物。
７４．（Ａ）活性成分としての抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体と薬学的に許容される担体とを含む第１の組成物；（Ｂ）活性成分としての４−１ＢＢアゴニストと薬学的に許容される担体とを含む第２の組成物、並びに（Ｃ）併用療法における前記組成物の使用説明書を含むパッケージを含む、対象におけるがんを治療するため又はがんの進行を遅らせるためのキット。
７５．増殖性疾患、特にがんを治療するため、又は増殖性疾患、特にがんの進行を遅らせるための医薬の製造における、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体と４−１ＢＢアゴニストとの組み合わせの使用。
７６．Ｂ細胞増殖性疾患、特に非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）及びホジキンリンパ腫（ＨＬ）からなる群より選択される疾患を治療するための医薬の製造における、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体と４−１ＢＢアゴニストとの組み合わせの使用。
７７．対象に対し、有効量の抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３抗体及び４−１ＢＢアゴニストを投与することを含む、対象におけるがんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法。
７８．対象に対し、有効量の抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３抗体及び４−１ＢＢアゴニストを投与することを含む、対象におけるがんを治療するため又はがんの進行を遅らせるための方法であって、４−１ＢＢアゴニストが抗原結合分子である、方法。
７９．４−１ＢＢアゴニストがＦｃドメインを含む抗原結合分子である、態様７７又は７８の方法。
８０．４−１ＢＢアゴニストが、Ｆｃγ受容体の結合を低減する及び／又はエフェクター機能を低下させる修飾を有するＦｃドメインを含む抗原結合分子である、態様７７から７９のいずれか一つの方法。
８１．４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む抗原結合分子である、態様７７から８０のいずれか一つの方法。
８２．１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインとを含む抗原結合分子である、態様７７から８１のいずれか一つの方法。
８３．４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む分子であり、４−１ＢＢＬのエクトドメインが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群より選択されるアミノ酸配列、特に配列番号１又は配列番号５のアミノ酸配列を含む、態様７７から８２のいずれか一つの方法。
８４．４−１ＢＢアゴニストがＢ細胞内に内部移行することがない、態様７７から８３のいずれか一つの方法。
８５．４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの部分とを含む抗原結合分子であり、ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインが、
（ａ）（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、並びに（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｉｖ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン
を含む、態様７７から８４のいずれか一つの方法。
８６．４−１ＢＢアゴニストが、４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片と、ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメインとを有する抗原結合分子であり、ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインが、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）と、配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）とを含むか、又はＣＤ１９に対する特異的結合能を有する抗原結合ドメインが、配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）と、配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）を含む、態様７７から８５のいずれか一つの方法。
８７．４−１ＢＢアゴニストが、安定に会合することのできる第１及び第２のサブユニットを含むＦｃドメインをさらに含む抗原結合分子である、態様７７から８６のいずれか一つの方法。
８８．４−１ＢＢアゴニストが、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、具体的にはＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインを含む抗原結合分子である、態様７７から８７のいずれか一つの方法。
８９．４−１ＢＢアゴニストが、Ｆｃ受容体への結合を低減する及び／又はエフェクター機能を低下させる一又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む抗原結合分子である、態様７７から８８のいずれか一つの方法。
９０．４−１ＢＢアゴニストが、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む抗原結合分子である、態様７７から８９のいずれか一つの方法。
９１．４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であり、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドが、４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含む、態様７７から９０のいずれか一つの方法。
９２．４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド、
を含む抗原結合分子であって、
（ｉ）第１のポリペプチドがＣＨ１又はＣＬドメインを、第２のポリペプチドがＣＬ又はＣＨ１ドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ１又はＣＬドメインに接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＬ又はＣＨ１ドメインにペプチドリンカーを介して接続する４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉ）第１のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、第２のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、それぞれ含み、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ３ドメインのＣ末端に接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＣＨ３ドメインのＣ末端にペプチドリンカーを介して接続する４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉｉ）第１のポリペプチドがＶＨ−ＣＬ又はＶＬ−ＣＨ１ドメインを、第２のポリペプチドがＶＬ−ＣＨ１ドメイン又はＶＨ−ＣＬドメインを、それぞれ含み、第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーにより互いに及びＶＨ又はＶＬに接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前記ポリペプチドのＶＬ又はＶＨにペプチドリンカーを介して接続する４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含むこと
を特徴とする抗原結合分子である、態様７７から９１のいずれか一つの方法。
９３．４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）と配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）又は配列番号２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）と配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）を含むＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つのＦａｂドメイン、及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含む抗原結合分子であって、第１のポリペプチドが、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１及び配列番号３２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むこと、並びに第２のポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする抗原結合分子である、態様７７から９２のいずれか一つの方法。
９４．４−１ＢＢアゴニストが、
ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３４のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号３５のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３６のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｂ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３４のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号３７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｃ）配列番号３４のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖、配列番号３９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖及び配列番号４０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む分子；
ｄ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３４のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号４１のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号４２のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｅ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３４のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号４３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号４４のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｆ）配列番号３４のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖、配列番号４５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖及び配列番号４６のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む分子；
ｇ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号３５のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３６のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｈ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号３７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｉ）配列番号４８のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖、配列番号４９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖及び配列番号５０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む分子；
ｊ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号４１のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号４２のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｋ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号４３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号４４のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；並びに
ｌ）配列番号４８のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖、配列番号５１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖及び配列番号５２のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む分子
からなる群より選択される抗原結合分子である、態様７７から９３のいずれか一つの方法。
９５．４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ペプチドリンカーによって互いに接続する４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチド
を含む抗原結合分子である、態様７７から９０のいずれか一つの方法。
９６．４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの抗原結合ドメイン、
（ｂ）ペプチドリンカーにより互いに接続する４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチド、及び
（ｃ）安定に会合することのできる第１及び第２のサブユニットを含むＦｃドメイン
を含む抗原結合分子であり、ペプチドリンカーにより互いに接続する４−１ＢＢＬの三つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチドが、任意選択的にペプチドリンカーを通して、Ｆｃドメインの二つのサブユニットの一方のＮ又はＣ末端アミノ酸に融合する、態様７７から９０のいずれか一つ又は態様９５の方法。
９７．４−１ＢＢアゴニストが、
（ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含む分子、
（ｂ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、配列番号４８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）及び配列番号５３のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含む分子；
（ｃ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、及び配列番号５４のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含む分子、並びに
（ｄ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ１９）、配列番号４８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ１９）、及び配列番号５５のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含む分子
からなる群より選択される抗原結合分子である、態様７７から９０のいずれか一つ、又は態様９５、又は態様９６の方法。
９８．４−１ＢＢアゴニストが抗ＣＤ１９／抗４−１ＢＢ二重特異性抗体である、態様７７から８０のいずれか一つの方法。
９９．抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体が、ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメイン、及びＣＤ２０に結合する第２の抗原結合ドメインを含む、態様７７から９８のいずれか一つの方法。
１００．抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体が、重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）及び軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインと、重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２０）及び軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２０）を含む第２の抗原結合ドメインとを含む、態様７７から９９のいずれか一つの方法。
１０１．第１の抗原結合ドメインが、配列番号５６のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号５７のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号５８のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）；及び／又は配列番号５９のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号６０のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号６１のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む、態様７７から１００のいずれか一つの方法。
１０２．第１の抗原結合ドメインが、配列番号６２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）及び／又は配列番号６３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む、態様７７から１０１のいずれか一つの方法。
１０３．第２の抗原結合ドメインが、配列番号６４のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号６５のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号６６のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２０）；及び／又は配列番号６７のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号６８のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号６９のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２０）を含む、態様７７から１０２のいずれか一つの方法。
１０４．第２の抗原結合ドメインが、配列番号７０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２０）及び／又は配列番号７１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２０）を含む、態様７７から１０３のいずれか一つの方法。
１０５．抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体が、ＣＤ２０に結合する第３の抗原結合ドメインを含む、態様７７から１０４のいずれか一つの方法。
１０６．第３の抗原結合ドメインが、配列番号６４のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号６５のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号６６のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２０）；及び／又は配列番号６７のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号６８のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号６９のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２０）を含む、態様７７から１０５のいずれか一つの方法。
１０７．第３の抗原結合ドメインが、配列番号７０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２０）及び／又は配列番号７１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２０）を含む、態様７７から１０６のいずれか一つの方法。
１０８．第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖と軽鎖の可変ドメイン又は定常ドメインが交換されているｃｒｏｓｓ−Ｆａｂ分子であり、第２の抗原結合ドメイン及び存在する場合は第３の抗原結合ドメインが従来のＦａｂ分子である、態様７７から１０７のいずれか一つの方法。
１０９．（ｉ）第２の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第１の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しており、且つ第３の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合しているか、又は（ｉｉ）第１の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端において第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第２の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しており、且つ第３の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合している、態様７７から１０８のいずれか一つの方法。
１１０．抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体が、Ｆｃ受容体への結合を低減する及び／又はエフェクター機能を低下させる一又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む、態様７７から１０９のいずれか一つの方法。
１１１．抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体が、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む、態様７７から１１０のいずれか一つの方法。
１１２．抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体が４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニストと組み合わせて使用され、前記組み合わせが、約一週から三週の間隔で投与される、態様７７から１１１のいずれか一つの方法。
１１３．抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体及び４−１ＢＢアゴニストが、単一の組成物中において一緒に投与されるか、又は二つ以上の異なる組成物中において別々に投与される、態様７７から１１２のいずれか一つの方法。
１１４．抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体及び４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニストが、静脈内投与又は皮下投与される、態様７７から１１３のいずれか一つの方法。
１１５．抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体が４−１ＢＢアゴニストと同時に、４−１ＢＢアゴニストに先立ち、又は４−１ＢＢアゴニストの後で投与される、態様７７から１１４のいずれか一つの方法。
【実施例】
【０２７１】
以下は本発明の方法及び組成物の実施例である。上に提供された一般的な説明を前提として、他の様々な実施態様が実施されうることが理解される。
【０２７２】
組み換えＤＮＡ技術
標準的な方法を使用して、Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載されているようにＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬を、製造元の指示に従って使用した。ヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般情報は以下に与えられている：Kabat, E.A. et al., （1991） Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No 91-3242。
【０２７３】
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列は、二本鎖配列決定により決定された。
【０２７４】
遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントを、適切なテンプレートを用いてＰＣＲによって生成するか、又は自動化された遺伝子合成による合成オリゴヌクレオチド及びＰＣＲ生成物からＧｅｎｅａｒｔ  ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により合成した。正確な遺伝子配列が入手可能でない場合、最も近いホモログ由来の配列に基づいてオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、適切な組織を起源とするＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによって遺伝子を単離した。特異な制限エンドヌクレアーゼ切断部位に隣接する遺伝子セグメントを、標準のクローニング／シーケンシングベクター中にクローニングした。形質転換した細菌からプラスミドＤＮＡを精製し、ＵＶ分光法により濃度を決定した。サブクローニングされた遺伝子断片のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。遺伝子セグメントは、それぞれの発現ベクター中へのサブクローニングを可能にする適切な制限部位を用いて設計された。すべてのコンストラクトは、真核細胞内の分泌のためにタンパク質を標的とするリーダーペプチドをコードする５’末端ＤＮＡ配列を含むように設計された。
【０２７５】
細胞培養技術
Current Protocols in Cell Biology （2000）, Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. and Yamada, K.M. （eds.）, John Wiley & Sons, Inc.に記載されているように、標準的な細胞培養技術を使用した。
【０２７６】
タンパク質の精製
標準的なプロトコールを参照して、濾過された細胞培養上清からタンパク質を精製した。簡潔には、抗体を、プロテインＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用し、ＰＢＳで洗浄した。抗体の溶出をｐＨ２．８で行い、その直後に試料を中和した。凝集したタンパク質を、サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により、ＰＢＳ又は２０ｍＭのヒスチジン（１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０）中の単量体抗体から分離させた。単量体抗体画分をプールし、例えばＭＩＬＬＩＰＯＲＥ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ（３０  ＭＷＣＯ）遠心濃縮機を使用して濃縮し（必要な場合）、−２０℃又は−８０℃で冷凍し、保存した。試料の一部が、その後のタンパク質分析、及び例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）又は質量分析による分析的特徴付けのために提供された。
【０２７７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
製造元の指示に従って、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｐｒｅ−Ｃａｓｔゲルシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。特に、１０％又は４〜１２％のＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ビス−ＴＲＩＳ  Ｐｒｅ−Ｃａｓｔゲル（ｐＨ６．４）及びＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＭＥＳ（還元ゲル、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）抗酸化剤ランニングバッファー添加剤を含む）又はＭＯＰＳ（非還元ゲル）ランニングバッファーを使用した。
【０２７８】
分析的サイズ排除クロマトグラフィー
抗体の凝集及びオリゴマー状態の決定のためのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を、ＨＰＬＣクロマトグラフィーによって実施した。簡潔には、プロテインＡ精製抗体を、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣ  １１００システム上、３００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．５）中のＴｏｓｏｈ  ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷカラムに、又はＤｉｏｎｅｘ  ＨＰＬＣ−システム上、２倍のＰＢＳ中のＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用した。ＵＶ吸光度により、及びピークエリアの統合により、溶出したタンパク質を定量化した。ＢｉｏＲａｄ  ゲル濾過  Ｓｔａｎｄａｒｄ  １５１-１９０１が標準として機能した。
【０２７９】
質量分析
このセクションでは、正確な集合に重きを置いて、ＶＨ／ＶＬ交換を含む多重特異性抗体（ＶＨ／ＶＬ  ＣｒｏｓｓＭａｂｓ）の特徴を説明する。予測される一次抗体を、脱グリコシル化されたインタクトなＣｒｏｓｓＭａｂの、及び脱グリコシル化／プラスミン消化された、又は別の方法で脱グリコシル化／限定されたＬｙｓＣ消化ＣｒｏｓｓＭａｂのエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）により分析した。
【０２８０】
ＶＨ／ＶＬ  ＣｒｏｓｓＭａｂを、３７℃で最大１７時間、１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で、リン酸又はＴｒｉｓバッファー中Ｎ−ＧグリコシダーゼＦで脱グリコシル化した。プラスミン又は限定ＬｙｓＣ（Ｒｏｃｈｅ）消化を、Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ８）中１００μｇの脱グリコシル化ＶＨ／ＶＬ  ＣｒｏｓｓＭａｂで、それぞれ室温で１２０時間、及び３７℃で４０分間、行った。質量分析の前に、セファデックスＧ２５カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上のＨＰＬＣを介して、試料を脱塩した。ＴｒｉＶｅｒｓａ  ＮａｎｏＭａｔｅ源（Ａｄｖｉｏｎ）を備えたｍａＸｉｓ  ４Ｇ  ＵＨＲ−ＱＴＯＦ  ＭＳシステム（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｋ）上のＥＳＩ−ＭＳを介して、総質量を決定した。
【０２８１】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）（ＢＩＡＣＯＲＥ）を用いた、対応抗原に対する多重特異性抗体の結合及び結合親和性の決定
生成された抗体の、対応抗原に対する結合が、ＢＩＡＣＯＲＥ機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いる表面プラズモン共鳴により調査される。簡潔には、親和性の測定のために、Ｇｏａｔ−Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ、ＪＩＲ  １０９−００５−０９８抗体を、対応抗原に対する抗体の提示のためのアミンカップリングを介してＣＭ５チップ上に固定化する。結合は、ＨＢＳバッファー（ＨＢＳ−Ｐ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、ｐｈ７．４）中において、２５℃（又は代替的に３７℃）で測定される。抗原（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ又は社内精製）は、溶液中様々な濃度で加えた。８０秒から３分の抗原注入により会合を測定し；３〜１０分間にわたりＨＢＳバッファーでチップ表面を洗浄することにより解離を測定し、ラングミュア１：１結合モデルを用いてＫＤ値を測定した。システム固有のベースラインドリフトを補正するため及びノイズシグナル低減のために、ネガティブコントロールデータ（例えば緩衝曲線）が試料曲線から差し引かれる。センサーグラムの分析のため及び親和性データの計算のために、それぞれのＢｉａｃｏｒｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅが使用される。
【０２８２】
実施例１
ＣＤ１９−４１ＢＢＬ抗原結合分子の調製、精製及び特徴づけ
ＣＤ１９標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子を、国際公開第２０１６／０７５２７８号に記載されるように調製した。
【０２８３】
特に、以下の分子を作製した。
ａ）一価のＣＤ１９標的化及び非標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子
【０２８４】
ヒトＣＬドメインに融合した二量体４−１ＢＢリガンドをコードするポリペプチドを、ノブ上にヒトＩｇＧ１重鎖ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含むフレーム内でサブクローニングした（Merchant, Zhu et al. 1998）。４−１ＢＢリガンドの一つのエクトドメインを含むポリペプチドを、ヒトＩｇＧ１−ＣＨ１ドメインに融合させた。コンストラクト３．４において、正確なペアリングを向上させるために、以下の変異を交差ＣＨ−ＣＬに追加的に導入した（荷電変異体）。ヒトＣＬに融合した二量体４−１ＢＢリガンドにおいて、Ｅ１２３Ｒ及びＱ１２４Ｋ、ヒトＣＨ１に融合した単量体４−１ＢＢリガンドにおいて、Ｋ１４７Ｅ及びＫ２１３Ｅ。
【０２８５】
ＣＤ１９に特異的なバインダーをコードする重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域、クローン８Ｂ８−０１８又はクローン８Ｂ８−２Ｂ１１を、ホールの定常重鎖又はヒトＩｇＧ１の定常軽鎖を用いてフレーム内でサブクローニングした。国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載される方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を抑止するため、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異を、ノブ及びホール重鎖の定常領域に導入した。Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異を含む二量体リガンド−Ｆｃノブ鎖、単量体ＣＨ１融合、Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異を含む標的化抗ＣＤ１９−Ｆｃホール鎖及び抗ＣＤ１９軽鎖の組み合わせにより、集合した三量体４−１ＢＢリガンド及びＣＤ１９結合Ｆａｂを含むヘテロダイマーが生成される（図１Ａ及び１Ｂ）。これに基づき、生殖系列ＤＰ４７によってＣＤ１９バインダーを置き換えることにより非標的化バージョンが調製された（図１Ｅ）。
【０２８６】
2020504723.tif 000029
【０２８７】
ａ）二価のＣＤ１９標的化及び非標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子
ＣＤ１９に特異的なバインダーに特異的な重鎖及び軽鎖の重鎖及び軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ配列、クローン８Ｂ８−０１８又はクローン８Ｂ８−２Ｂ１１を、ホールの定常重鎖、ノブ又はヒトＩｇＧ１の定常軽鎖を用いてフレーム内でサブクローニングした。国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載される方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を抑止するために、ノブ及びホール重鎖の定常領域にＰｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異を導入した。さらに、４−１ＢＢリガンドの二つのエクトドメインを含むポリペプチドを、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃホール鎖のＣ末端に融合させ、４−１ＢＢリガンドの一つのエクトドメインを含むポリペプチドを、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃノブ鎖のＣ末端に融合させた。Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異を含む抗ＣＤ１９  ｈｕＩｇＧ１ホール二量体リガンド重鎖、Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異を含む抗ＣＤ１９  ｈｕＩｇＧ１ノブ単量体リガンド重鎖及び抗ＣＤ１９軽鎖の組み合わせにより、集合した三量体４−１ＢＢリガンド及び二つのＣＤ１９結合Ｆａｂを含むヘテロダイマーが生成された（図１Ｃ）。これに基づき、生殖系列ＤＰ４７によってＣＤ１９バインダーを置き換えることにより非標的化バージョンが調製された（図１Ｆ）。
【０２８８】
2020504723.tif 000030
【０２８９】
ＣＤ１９標的化及び非標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子の生成及び特徴づけは、それぞれ国際公開第２０１６／０７５２７８号、実施例７．４及び実施例８から１１に詳細に記載されている。
【０２９０】
実施例２
Ｔ細胞二重特異性（ＴＣＢ）抗体の調製、精製及び特徴づけ
ＴＣＢ分子が、国際公開第２０１６／０２０３０９号に記載されている方法に従って調製された。
【０２９１】
実験で使用した抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体（ＣＤ２０  ＣＤ３  ＴＣＢ又はＣＤ２０  ＴＣＢ）は、国際公開第２０１６／０２０３０９号の実施例１に記載される分子Ｂに対応する。分子Ｂは、「２＋１  ＩｇＧ  ＣｒｏｓｓＦａｂ」抗体であり、二つの異なる重鎖と二つの異なる軽鎖とを含む。ＣＨ３ドメインにおける点突然変異（「ノブ・イントゥ・ホール」）を、二つの異なる重鎖の集合を促すために導入した。ＣＤ３結合ＦａｂにおけるＶＨドメインとＶＬドメインの交換と、ＣＤ２０結合ＦａｂにおけるＣＨドメイン及びＣＬドメイン内の点突然変異を、二つの異なる軽鎖の正確な集合を促すために行った。２＋とは、分子が、ＣＤ２０に特異的な二つの抗原結合ドメインと、ＣＤ３に特異的な一つの抗原結合ドメインとを有することを意味する。
【０２９２】
ＣＤ２０  ＴＣＢは、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８及び配列番号７９のアミノ酸配列を含む。２＋１フォーマットの二重特異性抗体の図式的スキームを図１Ｄに示す。
【０２９３】
この分子はさらに、国際公開第２０１６／０２０３０９号の実施例１において特徴づけられている。
【０２９４】
実施例３
ＣＤ１９−４−１ＢＢＬ抗原結合分子（コンストラクト）の特性
ａ）ＣＤ１９−４−１ＢＢＬはＣＤ１９に結合する
ＣＤ１９に対するＣＤ１９−４−１ＢＢＬの結合能を、一次ヒトＢ細胞又はＣＤ１９陽性腫瘍細胞株（ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞、ＤＳＭＺ  Ｎｏ．ＡＣＣ  ５７５）上で測定した。簡潔には、新鮮な末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を健常なドナーのバフィーコートから精製した。ＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１４１９０  ３２６）中に再懸濁した細胞を、丸底懸濁細胞９６ウェルプレート（ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ、ｃｅｌｌｓｔａｒ、Ｃａｔ．Ｎｏ．６５０１８５）の各ウェルに加えた。細胞を、２００μＬのＤＰＢＳで一回洗浄した。細胞を、１：５０００に希釈したＦｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ  ｅＦｌｕｏｒ  ６６０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃａｔ．Ｎｏ．６５−０８６４−１８）を含む１００μＬ／ウェルの４℃の冷たいＤＰＢＳバッファーに再懸濁し、プレートを３０分間４℃でインキュベートした。細胞を、２００μＬ／ウェルの４℃の冷たいＤＰＢＳバッファーで一回洗浄し、一連の濃度のコンストラクト（ｍｏｎｏ  ＣＤ１９（０１８）−４−１ＢＢＬ、ｂｉ  ＣＤ１９（０１８）−４−１ＢＢＬ、ｍｏｎｏ  ＣＤ１９（２Ｂ１１）−４−１ＢＢＬ、ｍｏｎｏ非標的化４−１ＢＢＬ及び／又はｂｉ非標的化４−１ＢＢＬ）を含む５０μＬ／ウェルの４℃の冷たいＦＡＣＳバッファー（２％のＦＢＳ、５ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８）（Ａｍｒｅｓｃｏ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｅ１７７）及び７．５ｍＭのアジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｓ２００２）を供給したＤＰＢＳ）に再懸濁し、続いて１時間４℃でインキュベートした。
【０２９５】
よく洗浄した後、細胞をさらに、５μｇ／ｍＬのＰＥコンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２−断片特異性ヤギＦ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１０９  １１６  ０９８）を含む５０μＬ／ウェルの４℃の冷たいＦＡＣＳバッファーと、ＡＰＣ−Ｈ７コンジュゲートＣＤ２０抗体（ＢＤ、Ｃａｔ．Ｎｏ．５６０７３４）、及びＡＰＣコンジュゲート抗ＣＤ３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｃａｔ．Ｎｏ．３００３１２）、及び／又はＦＩＴＣコンジュゲート抗ＣＤ１９抗体（ＢＤ）で３０分間４℃で染色した。細胞を、２００μＬ／ウェルの４℃のＦＡＣＳバッファーで二回洗浄し、細胞を、１％のホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ、ＨＴ５０１３２０−９．５Ｌ）を含む５０μＬ／ウェルのＤＰＢＳ中において固定した。細胞を１００μＬ／ウェルのＦＡＣＳ−バッファーに再懸濁し、ＦＡＣＳ  ＬＳＲ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて獲得した。データを、ＦｌｏｗＪｏ  Ｖ１０（ＦｌｏｗＪｏ，ＬＬＣ）及びＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６．０４（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ）を用いて分析した。
【０２９６】
ＣＤ３−ＣＤ２０＋生存集団に細胞のゲート設定をし、ＰＥコンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ  ＩｇＧ  Ｆｃγ断片特異性ヤギＦ（ａｂ’）２断片の蛍光強度の相乗（ｇｅｏ）平均を、滴定濃度のコンストラクトに対してプロットした。図２Ａに示すように、ＣＤ１９−４−１ＢＢＬは用量依存性にヒトＢ細胞に結合し、一方非標的化４−１ＢＢＬはヒトＰＢＭＣ中のＢ細胞に結合しなかった。図２Ｂは、Ｂ細胞上のＣＤ１９発現がＣＤ１９−４−１ＢＢＬの結合後に低減する様子を示しており、これは、ＣＤ１９−４−１ＢＢＬがＣＤ１９に特異的に結合することを示している。同様に、ＣＤ１９−４−１ＢＢＬコンストラクトはＣＤ１９＋  ＷＳＵ腫瘍細胞に結合し、結合親和性は二価より一価のコンストラクト中においてはるかに高い（図２Ｃ）。
【０２９７】
ｂ）ＣＤ１９−４−１ＢＢＬは活性化Ｔ細胞上の４−１ＢＢに結合する
４−１ＢＢＬの、４−１ＢＢ発現Ｔ細胞に対する結合をチェックするために、Ｔ細胞上の４−１ＢＢの上方制御のためにＴＣＲ刺激によりヒトＰＢＭＣを４８時間事前活性化した。精製したＰＢＭＣを、２．８×１０６／ｍｌの濃度に希釈し、ＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ  Ｎｏ．７２４００−０５４）＋１０％のＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ  Ｎｏ．２００１２−０６８）及び１％のペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ  Ｎｏ．１５０７０−０６３）及び５０μＭの２−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ  Ｎｏ．３１３５０−０１０）に再懸濁した。９０μｌの細胞を、丸底９６ウェルプレート（ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ、ｃｅｌｌｓｔａｒ、Ｃａｔ．Ｎｏ．６５０１８５）の各ウェルに加えた。次いで、５０μｌの抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８ミクロビーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ  Ｎｏ．１１１３１Ｄ）を８×１０５ビーズ／ｍｌでウェルに追加した。二日後、細胞を冷たいＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、２００１２−０６８）で一回洗浄し、９０μｌの冷たいＰＢＳを用いて再懸濁し、コンストラクト（一価のＣＤ１９（０１８）−４−１ＢＢＬ、二価のＣＤ１９（０１８）−４−１ＢＢＬ、及び一価の非標的化４−１ＢＢＬ）を含む１０μｌの溶液と共に１時間４℃でインキュベートした。よく洗浄した後、細胞をさらに、５μｇ／ｍＬのＰＥコンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２−断片特異性ヤギＦ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１０９  １１６  ０９８）を含む５０μＬ／ウェルの冷たいＦＡＣＳバッファーで染色し、さらに抗ヒトＣＤ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｃａｔ  Ｎｏ．３００３１２）、ＣＤ４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｃａｔ  Ｎｏ．３１７４３４）及びＣＤ８（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｃａｔ  Ｎｏ．３４４７１０）抗体で３０分間４℃で染色した。細胞を、２００μＬ／ウェルの４℃のＦＡＣＳバッファーで二回洗浄し、細胞を、１％のホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ、ＨＴ５０１３２０−９．５Ｌ）を含む５０μＬ／ウェルのＤＰＢＳで固定した。細胞を１００μＬ／ウェルのＦＡＣＳ−バッファーに再懸濁し、ＦＡＣＳ  ＬＳＲ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて獲得した。データを、ＦｌｏｗＪｏ  Ｖ１０（ＦｌｏｗＪｏ、ＬＬＣ）及びＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６．０４（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ）を用いて解析した。
【０２９８】
特異的結合を、活性化ＣＤ４及びＣＤ８細胞の純粋な集団上にゲート設定した。すべてのコンストラクトは、４−１ＢＢ発現ＣＤ４又はＣＤ８Ｔ細胞に対し、同様の用量依存性の結合特性を示した（図３Ａ及び３Ｂ）。
【０２９９】
ｃ）ＣＤ１９−４−１ＢＢＬは生物活性を示す
生理的設定における生物活性を測定するために、活性化ヒトＰＢＭＣを用いて、Ｔ細胞及びＮＫ細胞を共刺激することによるエフェクター機能分子ＩＦＮ−γの放出をチェックした。簡潔には、コンストラクト（一価のＣＤ１９（０１８）−４−１ＢＢＬ、二価のＣＤ１９（０１８）−４−１ＢＢＬ、一価のＣＤ１９（２Ｂ１１）−４−１ＢＢＬ、及び一価の非標的化４−１ＢＢＬ）を用いて共培養した精製ＰＢＭＣを、一連の濃度でウェルに加え、５０μｌの抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８ミクロビーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ  Ｎｏ．１１１３１Ｄ）を８×１０５ビーズ／ｍｌで加えた。４８時間のインキュベーション後、上清を、ＥＬＩＳＡ（ＤｕｏＳｅｔ  ヒトＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡキット、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ  Ｎｏ．ＤＹ２８５）によるＩＦＮ−γの測定のために収集した。図４は、一価及び二価両方のコンストラクトがＰＢＭＣを刺激して同等の量のＩＦＮ−γを生成し、一方、陰性の非標的化４−１ＢＢＬコンストラクトが架橋の非存在によりＴ細胞もＮＫ細胞も活性化しなかったことを示している。
【０３００】
実施例４
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＣＤ１９−４−１ＢＢＬとＣＤ２０  ＴＣＢの併用療法の機序
ａ）ＣＤ２０  ＴＣＢはＴ細胞上におけるＣＤ１９−４−１ＢＢＬの再分配を媒介する
ＣＤ１９−４−１ＢＢＬとＣＤ２０  ＴＣＢの併用療法に対する本発明者らの仮説は、腫瘍抗原ＣＤ２０の結合を通してＣＤ２０  ＴＣＢが最初のＴ細胞活性化をトリガーし、活性化Ｔ細胞上の４−１ＢＢの上方制御をもたらし、したがってＣＤ１９−４−１ＢＢＬが４−１ＢＢを共刺激し、それによりＴ細胞エフェクター機能を増強するであろうという過程に基づいていた。この併用療法の作用のこのようなモードを理解及び確認するために、本発明者らは、微速度共焦点顕微鏡を利用して、活性化Ｔ細胞上における免疫学的シナプス形成をモニターした。ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞を、Ｂｌｕｅ  ＣＭＡＣ色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で染色し、８ウェルの「ｉｂｉＴｒｅａｔ」スライド（ｉｂｉｄｉ）上において３７℃で一晩蒔き、付着させた。細胞を、２４時間後に洗浄し、培地で置き換えた後、ＣＭＦＤＡ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で染色した活性化ＣＤ８陽性Ｔ細胞を加えた。Ａｌｅｘａ  Ｆ６４７（１０μｇ／ｍｌ）及びＣＤ２０  ＣＤ３  ＴＣＢ（５ｎｇ／ｍｌ又は５００ｎｇ／ｍｌ）で標識したＣＤ１９−４１ＢＢＬを、増殖培地に直接追加した。次いでイメージングスライドを、温度及びＣＯ２の制御ステージを備えた共焦点顕微鏡（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ＬＳＭ  ７００，Ｚｅｉｓｓ）に移し、１５分以内に顕微鏡インキュベーター内部の温度に平衡化し、その後６０倍の油浸対物レンズを用いてライブ映像を取得した。映像は、顕微鏡に連結されたＺｅｎソフトウェア（Ｚｅｉｓｓ）を用いて収集し、相互作用部位におけるＣＤ１９−４１ＢＢＬ強度の分析をＩｍａｒｉｓ（Ｂｉｔｐｌａｎｅ；Ｏｘｆｏｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて実施した。定量化が、ＩＭＡＲＩＳ表面−表面接触面積アルゴリズムを用いて実施された。このアルゴリズムは、二次表面（Ｔ細胞）によって覆われるエリア内において、一次表面（腫瘍細胞）上に１ボクセル厚の表面オブジェクトを生成するものである。次いで、結果として得られた接触表面内部においてＣＤ１９−４１ＢＢＬシグナルの総強度が測定され、経時的に定量化される。
【０３０１】
図５Ａは、ＣＤ２０  ＣＤ３  ＴＣＢ媒介性のＴ細胞と腫瘍細胞の架橋の間の、ＣＤ１９−４１ＢＢＬの動的局在化を示している。局在化は、ＣＤ２０  ＣＤ３  ＴＣＢの用量に依存して、交差部位に集中していた。この相互作用は、まずＣＤ２０  ＣＤ３  ＴＣＢの架橋により開始され、続いてＣＤ２０（バインダーはＩＩ型抗体に由来、オビヌツズマブ）への結合により誘引された脂質ラフトにより媒介されうる免疫学的シナプスへのＣＤ１９−４１ＢＢＬの再分配が起こる。Ｔ細胞及び腫瘍細胞のシナプスにおけるＣＤ１９−４１ＢＢＬの偏向は、ＣＤ２０  ＣＤ３  ＴＣＢ濃度（図５Ｂ）の閾値を局在化させ、４１ＢＢ共刺激シグナルを保持することができ、早期ＣＤ３活性化シグナルと相乗効果を呈する、可能な組み合わせ作用機序を示唆するものである。このような相乗効果は、Ｔ細胞活性化誘導性の細胞死を防止するための４１ＢＢカスケードシグナルをトリガーすることができ、ｉｎ  ｖｉｖｏでの有効性実験における組織学的分析により観察するところ、腫瘍微小環境内により頑強なＴ細胞集団をもたらす可能性がある。
【０３０２】
ｂ）ＣＤ１９−４−１ＢＢＬは、Ｂ細胞上のＣＤ１９によって内部移行しない
ＣＤ１９−４−１ＢＢＬ分子の細胞下の局在化は、その機能性及びＣＤ２０  ＴＣＢ二重特異性抗体とのその相乗作用の臨界パラメーターである。ＣＤ１９−４−１ＢＢＬ分子は、ＣＤ１９発現腫瘍細胞を標的としなければならないだけでなく、４−１ＢＢＬを介した４−１ＢＢアゴニズムがＣＤ１９上において抗体の架橋を必要とする際に内部移行してはならない。非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）細胞を含むＢ細胞により多くのＣＤ１９抗体が急速に内部移行しうることが報告されている（Ingle et al, 2008）。したがって、本発明者らは、自身のコンストラクトを共焦点顕微鏡により試験して、ＮＨＬ細胞株ＷＳＵ  ＤＬＣＬ２細胞によってそれらが内部移行しうるかどうかを検証した。これを行うために、ＣＤ１９−４−１ＢＢＬコンストラクトを、ＷＳＵ細胞と共に３７℃でインキュベートする前にまずＡｌｅｘａ−６４７で標識し、次いで相互作用を異なる時点（１５分、１時間、及び３時間）で固定し、ＣＤ１９−４−１ＢＢＬの局在化（細胞内又は膜における）を、共焦点顕微鏡により評価した。画像中央のＺスタックを見ると、ＣＤ１９−４−１ＢＢＬ−Ａｌｅｘａ−６４７分子の大部分が３時間の間ずっと膜に位置していることが観察されうる（図６）。対照的に、抗ＣＤ１９抗体（クローンＢｕ１２）のポジティブコントロールは、急速に内部移行し、腫瘍細胞の表面上への露出が減少している。
【０３０３】
実施例５
ｉｎ  ｖｉｖｏでのＣＤ１９−４−１ＢＢＬとＣＤ２０  ＴＣＢの併用療法による強力な抗腫瘍効果
ａ）免疫不全ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ／ＩＬ−２Ｒγヌル（ＮＯＧ）マウスにおけるＣＤ１９−４−１ＢＢＬコンストラクトのＳＤＰＫ
ｉｎ  ｖｉｖｏでの有効性試験に先立ち、本発明者らはまず、単回用量薬力学（ＳＤＰＫ）試験を実施した。実験開始時に週齢６〜７の雌のＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ／ＩＬ−２Ｒγヌル（ＮＯＧ）マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ、Ｄｅｎｍａｒｋで飼育）を、関連するガイドライン（ＧＶ−Ｓｏｌａｓ；Ｆｅｌａｓａ；ＴｉｅｒｓｃｈＧ）に従い、毎日、１２時間明所／１２時間暗所のサイクルで、特定病原体感液防止条件下に維持した。実験研究プロトコールが地方自治体により審査及び承認された（ＺＨ１９３／２０１４）。動物は、到着後１週間、新しい環境への馴致及び観察のために保持された。継続的な健康モニタリングが定期的に実施された。
【０３０４】
マウスに５０μｇ／マウス（２．５ｍｇ／ｋｇ）の三つの異なる４−１−ＢＢＬコンストラクト（表３の組成物参照）を腹腔内注射し、一群及び一時点につき３匹のマウスから採血した。すべてのマウスに総量２００μｌの適切な溶液を注射した。２００μｌにつき適当量のコンストラクトを得るために、保存溶液を必要に応じてＰＢＳで希釈した。血清試料を、治療の注射から１０分、１時間、３時間、８時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間及び１６８時間後に収集した。図７に示すように、すべての分子が安定なＩｇＧ様のＰＫプロファイルを示している。
【０３０５】
2020504723.tif 000031
【０３０６】
ｂ）二価のコンストラクトとの比較において優れた、ＣＤ２０  ＴＣＢと組み合わせた一価のＣＤ１９−４−１ＢＢＬコンストラクトの抗腫瘍活性化
ＣＤ２０  ＴＣＢとＣＤ１９−４−１ＢＢＬの組み合わせに関するコンセプトの最初の証明を、完全ヒト化ＮＯＧマウスにおける腫瘍縮小という観点でのＣＤ１９−４−１ＢＢＬコンストラクトの最良の形式（ＣＤ１９に対する一価の結合対二価の結合、クローン  ０１８）を選択するために試みた。
【０３０７】
ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞（ヒトびまん性大Ｂ細胞型リンパ腫）は、もともとＥＣＡＣＣ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ）より入手し、増殖後にＲｏｃｈｅ  Ｇｌｙｃａｒｔの社内細胞バンクに寄託された。細胞を、１０％のＦＣＳ及び１×Ｇｌｕｔａｍａｘを含むＲＰＭＩにおいて培養した。この細胞は、５％ＣＯ２の水飽和雰囲気下で３７℃で培養した。動物１匹当たり１．５ｘ１０６個の細胞（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ継代１８）を、ＲＰＭＩ細胞培地（Ｇｉｂｃｏ）及びＧＦＲマトリゲル（１：１、総量１００ｕｌ）中において、生存率＞９５．０％で動物の右脇腹に皮下注射した。
【０３０８】
実験開始時に週齢４〜５（Ｔａｃｏｎｉｃ、Ｄｅｎｍａｒｋで飼育）の雌ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ／ＩＬ−２Ｒγヌル（ＮＯＧ）マウスを、関連するガイドライン（ＧＶ−Ｓｏｌａｓ；Ｆｅｌａｓａ；ＴｉｅｒｓｃｈＧ）に従い、毎日、１２時間明所／１２時間暗所のサイクルで、特定病原体感液防止条件下に維持した。実験研究プロトコールが審査され、地方自治体により承認された（Ｐ  ２０１１１２８）。動物は、到着後１週間、新しい環境への馴致及び観察のために保持された。継続的な健康モニタリングが定期的に実施された。
【０３０９】
プロトコール（図８）に従い、雌ＮＯＧマウスに１５ｍｇ／ｋｇのブスルファンを腹腔内注射し、続いて翌日臍帯血から単離された１ｘ１０５個のヒト造血幹細胞を静脈内注射した。幹細胞の注射の１４〜１６週後、マウスの舌下から採血し、血液を、ヒト化の成功についてフローサイトメトリーにより分析した。効率的に移植されたマウスを、それらのヒトＴ細胞頻度に従って異なる治療群に無作為化した（図８、ｎ＝１０／群）。この時、上述のようにマウスに腫瘍細胞を皮下注射し、化合物又はＰＢＳ（ビヒクル）で週一回治療したところ、腫瘍サイズが約４５０ｍｍ３に到達した。すべてのマウスに２００μｌの適切な溶液を静脈内注射した。２００μｌにつき適当量の化合物を得るために、保存溶液（表４）を必要に応じてＰＢＳで希釈した。
【０３１０】
2020504723.tif 000032
【０３１１】
ＣＤ２０  ＴＣＢとの併用療法（動物群ＥからＩ、図８の表参照）のために、ＣＤ１９−４−１ＢＢＬコンストラクトを同時に注射した。腫瘍増殖をノギスを使用して週に二回測定し、腫瘍体積を以下のように計算した：
Ｔｖ：（Ｗ２／２）×Ｌ（Ｗ：幅、Ｌ：長さ）
【０３１２】
化合物を四回注射した後、試験を終了してすべてのマウスを屠殺し（腫瘍細胞注射後３７日目）、腫瘍を外植して重量を測定した。図９Ａは、すべての治療群における腫瘍増殖の動態（中央値）と、試験終了時点での腫瘍重量とを示している。ｍｏｎｏ及びｂｉ  ＣＤ１９（０１８）−４−１ＢＢＬの単剤療法はいずれも腫瘍増殖の阻害をまったく示さなかったが、単剤としてのＣＤ２０  ＴＣＢは強い腫瘍増殖の阻害を誘発した。しかしながら、ｍｏｎｏ  ＣＤ１９（０１８）−４−１ＢＢＬとＣＤ２０  ＴＣＢの組み合わせは、ＣＤ２０  ＴＣＢの単剤療法と比較して、より強くより速い腫瘍増殖の阻害を誘導しただけでなく、試験したすべての用量において、二価のＣＤ１９（０１８）−４−１ＢＢＬ又は一価の非標的化４−１ＢＢＬとＣＤ２０  ＴＣＢとの組み合わせよりも優れていた。図９Ｂにも同様に示すように、試験終了時点の腫瘍重量は、これら発見を確認するものであったが、腫瘍増殖の阻害における際立った差異は、特に早期の時点での腫瘍増殖の動態学に見られる（図９Ａ）。このデータは、ＣＤ２０  ＴＣＢと組み合わせたとき、ＣＤ１９（ｍｏｎｏ  ＣＤ１９（０１８）−４−１ＢＢＬ）への一価の結合が、腫瘍増殖の阻害という観点から優れていることを示唆するものである。
【０３１３】
ｃ）ＣＤ１９−４−１ＢＢＬとＣＤ２０  ＴＣＢの組み合わせは、腫瘍への大規模なＴ細胞浸潤を誘導するうえで相乗的に作用する
ＣＤ１９−４−１ＢＢＬとＣＤ２０  ＴＣＢの組み合わせの作用モードを理解するために、新規の試験を実施して、これらマウスにおける免疫応答の薬物動態を試験した。実験は、上記試験に記載したものと類似の方法で設計された（図１０）。本試験には、ＣＤ１９バインダーの二つのクローンが含まれた（クローン０１８対クローン２Ｂ１１）（表５）。
【０３１４】
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【０３１５】
図１１Ａは、すべての治療群における腫瘍増殖の動態（中央値）と、試験終了時点での腫瘍重量とを示している。前の試験で示されたように（図９Ａ）、単剤としてのＣＤ２０  ＴＣＢは、強い腫瘍増殖の阻害を誘発した。ＣＤ２０  ＴＣＢと組み合わせたｍｏｎｏ  ＣＤ１９（０１８）−４−１ＢＢＬ又はｍｏｎｏ  ＣＤ１９（２Ｂ１１）−４−１ＢＢＬの組み合わせは、ＣＤ２０  ＴＣＢの単剤療法と比較して、より強くより速い腫瘍増殖の阻害を誘導した。しかしながら、両方の分子は、ＣＤ２０  ＴＣＢ媒介性腫瘍増殖阻害の増強において同等である。図１１Ｂにも示されているように、試験終了時の腫瘍重量はこれらの所見を確認するものであった。
【０３１６】
試験２０日目に屠殺された動物由来の腫瘍の解析により、ＣＤ２０  ＴＣＢのみ又はビヒクル処置と比較して、両組み合わせ群における腫瘍内ヒトＴ−細胞浸潤（図１２Ａ）と、ＣＤ８／ＣＤ４及びＣＤ８／Ｔｒｅｇ比のＣＤ８細胞へのシフト（図１２Ｂ及び１２Ｃ）の増大が示された。したがって、本発明者らは、ＣＤ１９−４−１ＢＢＬとＣＤ２０  ＴＣＢが相乗作用して腫瘍中のＴ細胞を強化することにより腫瘍を根絶する新規の併用療法を確認した。
【０３１７】
参照文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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