(57)【要約】  提供されるのは、キシロースからのキシリトールの生産において使用するための、カナダ国際寄託当局（ＩＤ  ＡＣ）アクセッション番号０８１１１６−０１に指定されたメチニコビア種、及びそれに由来し、少なくとも１つのキシロースレダクターゼ、少なくとも１つのキシローストランスポーターを発現し、かつキシリトールデヒドロゲナーゼを減弱させる遺伝子修飾を含む株、並びにそれからのキシリトールの生産のための組成物及び方法である。【選択図】図１
2020501595.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたメチニコビア種であって:(a)キシロースレダクターゼをコードする少なくとも1つの外因性核酸又は該単離されたメチニコビア種のキシロースレダクターゼの過剰発現をもたらす少なくとも1つの外因性核酸;及び(b)該単離されたメチニコビア種のキシリトールデヒドロゲナーゼを減弱させるか又は不活化する遺伝子修飾を含む、前記単離されたメチニコビア種。
【請求項２】
前記単離されたメチニコビア種が、培養したとき、少なくとも0.50g/L/h、少なくとも0.60g/L/h、少なくとも0.70g/L/h、少なくとも0.80g/L/h、少なくとも0.90g/L/h、少なくとも1.00g/L/h、少なくとも1.50g/L/h、少なくとも2.00g/L/h、少なくとも2.50g/L/h、少なくとも3.00g/L/h、少なくとも3.50g/L/h、少なくとも4.00g/L/h、少なくとも5.00g/L/h、少なくとも6.00g/L/h、少なくとも7.00g/L/h、少なくとも8.00g/L/h、少なくとも9.00g/L/h、又は少なくとも10.00g/L/hのキシリトールをキシロースから生産する、請求項1記載の単離されたメチニコビア種。
【請求項３】
前記単離されたメチニコビア種が、培養したとき、少なくとも75g/L、少なくとも80g/L、少なくとも85g/L、少なくとも90g/L、少なくとも95g/L、少なくとも100g/L、少なくとも110g/L、少なくとも120g/L、少なくとも130g/L、少なくとも140g/L、少なくとも150g/L、少なくとも160g/L、少なくとも170g/L、少なくとも180g/L、少なくとも190g/L、少なくとも200g/L、少なくとも250g/L、少なくとも300g/Lのキシリトールをキシロースから生産する、請求項1記載の単離されたメチニコビア種。
【請求項４】
前記単離されたメチニコビア種が、メチニコビア・プルケリマ、メチニコビア・フルクティコラ、メチニコビア・クリソペルラエ、メチニコビア・ロイカウフィイ、メチニコビア・アンダウエンシス、メチニコビア・シャンキシエンシス、メチニコビア・シネンシス、メチニコビア・ジジフィコラ、メチニコビア・ビクスピダータ、メチニコビア・ルナータ、メチニコビア・ゾベルリイ、メチニコビア・アウストラリス、メチニコビア・アガウェアエ、メチニコビア・グルエスシイ、メチニコビア・ハワイエンシス、メチニコビア・クリスシイ、メチニコビア属種株NS-O-85、及びメチニコビア属種株NS-O-89からなる群から選択される、請求項1〜3のいずれか一項記載の単離されたメチニコビア種。
【請求項５】
前記単離されたメチニコビア種が、ブダペスト条約の条項の下で、2016年11月8日に、国際寄託当局であるカナダ国際寄託当局(International Depositary Authority of Canada)に寄託された、アクセッション番号081116-01に指定されたメチニコビア種である、請求項1〜3のいずれか一項記載の単離されたメチニコビア種。
【請求項６】
前記キシロースレダクターゼをコードする少なくとも1つの外因性核酸が異種核酸である、請求項1〜5のいずれか一項記載の単離されたメチニコビア種。
【請求項７】
前記キシロースレダクターゼが配列番号11〜18からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1〜5のいずれか一項記載の単離されたメチニコビア種。
【請求項８】
前記キシロースレダクターゼが配列番号11のアミノ酸配列又は配列番号11と少なくとも95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1〜5のいずれか一項記載の単離されたメチニコビア種。
【請求項９】
前記遺伝子修飾が前記単離されたメチニコビア種のキシリトールデヒドロゲナーゼ又はその部分をコードする少なくとも1つのアレルの欠失を含む、請求項1〜8のいずれか一項記載の単離されたメチニコビア種。
【請求項１０】
前記遺伝子修飾が前記単離されたメチニコビア種のキシリトールデヒドロゲナーゼ又はその部分をコードする両方のアレルの欠失を含む、請求項1〜8のいずれか一項記載の単離されたメチニコビア種。
【請求項１１】
前記単離されたメチニコビア種がキシローストランスポーターをコードする少なくとも1つの外因性核酸又は該単離されたメチニコビア種のキシローストランスポーターの過剰発現をもたらす少なくとも1つの外因性核酸をさらに含む、請求項1〜10のいずれか一項記載の単離されたメチニコビア種。
【請求項１２】
前記キシローストランスポーターが配列番号27〜40からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項11記載の単離されたメチニコビア種。
【請求項１３】
前記キシローストランスポーターが配列番号27〜36のいずれか1つのアミノ酸配列又は配列番号27〜36のいずれか1つと少なくとも30％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項11記載の単離されたメチニコビア種。
【請求項１４】
キシリトールを生産する方法であって、請求項1〜13のいずれか一項記載の単離されたメチニコビア種を、キシロースからキシリトールを生産するための条件下で、かつそれに十分な期間培養することを含む、前記方法。
【請求項１５】
前記条件が、前記単離されたメチニコビア種を、キシロース及びC3炭素源、C4炭素源、C5炭素源、C6炭素源、又はこれらの組合せを含む培地中で培養することを含む、請求項14の方法。
【請求項１６】
前記条件が、前記単離されたメチニコビア種を、キシロース並びにセロビオース、ガラクトース、グルコース、エタノール、アセテート、アラビトール、ソルビトール、及びグリセロール、又はこれらの組合せからなる群から選択される共基質を含む培地中で培養することを含む、請求項14記載の方法。
【請求項１７】
前記共基質がグルコースである、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
前記培地がキシロースとセロビオースの組合せを含む、請求項16記載の方法。
【請求項１９】
前記培地がキシロースとガラクトースの組合せを含む、請求項16記載の方法。
【請求項２０】
前記培地がキシロースとグリセロールの組合せを含む、請求項16記載の方法。
【請求項２１】
前記培養することが好気的培養条件を含む、請求項14〜20のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
前記培養することが、回分培養、流加培養、又は連続培養を含む、請求項14〜21のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３】
前記キシリトールを前記培養物中の他の成分から分離することをさらに含む、請求項14〜22のいずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
前記分離することが、抽出、連続液液抽出、浸透気化、膜濾過、膜分離、逆浸透、電気透析、蒸留、結晶化、遠心分離、抽出濾過、イオン交換クロマトグラフィー、吸収クロマトグラフィー、又は限外濾過を含む、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
請求項14〜24のいずれか一項記載の方法によって生産される生物由来キシリトール。
【請求項２６】
請求項1〜13のいずれか一項記載の単離されたメチニコビア種もしくは請求項25記載の生物由来キシリトールを含む、組成物。
【請求項２７】
キシロースを含む培養培地である、請求項26記載の組成物。
【請求項２８】
請求項1〜13のいずれか一項記載の単離されたメチニコビア種が除去されている培養培地である、請求項26記載の組成物。
【請求項２９】
グリセロール、アラビトール、C7糖アルコール、又はこれらの組合せを、請求項14〜24のいずれか一項記載の方法からの不純物として含む、請求項26〜28のいずれか一項記載の組成物。
【請求項３０】
前記C7糖アルコールがボレミトール又はその異性体である、請求項29記載の組成物。
【請求項３１】
グリセロールもしくはアラビトール、又はその両方の量が、請求項1〜13のいずれか一項記載の単離されたメチニコビア種以外の微生物によって生産されるそれぞれのグリセロールもしくはアラビトール、又はその両方の量よりも少なくとも10％、20％、30％、又は40％多い、請求項29記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
(関連出願の相互参照)
本出願は、その内容が引用により本明細書中に完全に組み込まれる、2016年12月21日に出願された米国仮出願第62/437,606号の優先権の恩典を主張する。
【０００２】
(分野)
本発明は、分子生物学及び微生物学の分野に関する。本明細書に提供されるのは、培養したときにキシロースからキシリトールを生産するメチニコビア種、並びにこれらのメチニコビア種を作製及び使用する方法である。
【０００３】
(配列表の参照)
本出願は、ASCII形式でEFS-Web経由で提出され、かつ引用により本明細書中に完全に組み込まれる配列表を含有する。2017年12月19日に作成された該ASCIIコピーは、14305-001-228_Sequence_Listing.txtという名称であり、サイズが170,340バイトである。
【背景技術】
【０００４】
(背景)
キシロースは、生物由来化学物質を生産するための再生可能原料であるリグノセルロース系バイオマス中に存在する豊富な糖である。しかしながら、リグノセルロース系バイオマスの使用及び生物由来化学物質の生産は、微生物中でのもともと低いキシロース取込みによって制限される。それゆえ、キシロースを用いて、キシリトールなどの生物由来化合物を生産することができる微生物は、満たされていないニーズである。
【０００５】
キシリトールは、糖の低カロリー、低炭水化物代用品として広く使用される五炭糖アルコールである(Druckerらの文献、Arch of Oral Biol. 24:965-970(1979))。キシリトールは、スクロースとほぼ同じ甘さであるが、33％低いカロリーを有する。キシリトールは、糖尿病の人々及び高血糖症の個人のインスリンレベルに影響を及ぼさないと報告されている。キシリトールの消費は、口腔衛生に有益であり、虫歯の発生率を低下させるとも報告されている。例えば、チューインガム中のキシリトールは、ストレプトコックス・ミュータンスの成長を阻害すること(Haresakuらの文献、Caries Res. 41:198-203(2007))、及び急性中耳炎の発生率を低下させること(Azarpazhoohらの文献、Cochrane Database of Systematic Reviews 11:CD007095(2011))が報告されている。さらに、キシリトールは、健康な歯のエナメル質の脱灰を阻害すること及び損傷した歯のエナメル質を再石灰化することが報告されている(Steinbergらの文献、Clinical Preventive Dentistry 14:31-34(1992); Maguireらの文献、British Dental J. 194:429-436(2003); Grillaudらの文献、Arch of Pediatrics and Adolescent Medicine 12:1180-1186(2005))。
【０００６】
商業的に、キシリトールは、キシロースの化学的還元によって生産することができるが、これは、加水分解物からのキシロース又はキシリトールの分離及び精製に付随する困難を示すことがある。キシリトールの生産用の微生物系が記載されている(Sirisansaneeyakulらの文献、J. Ferment. Bioeng. 80:565-570(1995); Onishiらの文献、Agric. Biol. Chem. 30:1139-1144(1966); Barbosaらの文献、J. Ind. Microbiol. 3:241-251(1988); Gongらの文献、Biotechnol. Lett. 3:125-130(1981); Vandeskaらの文献、World J. Microbiol. Biotechnol. 11:213-218(1995); Dahiyaらの文献、Cabdirect.org  292-303(1990); Gongらの文献、Biotechnol. Bioeng. 25:85-102(1983))。例えば、カンジダ属由来の酵母は、キシリトール生産に有用であると記載されている。しかしながら、カンジダ属種は日和見病原体であり得るので、食品生産物に関連するプロセスにおけるこれらの生物の使用は望ましくない。
【０００７】
本明細書に提供されるメチニコビア種、方法、及び組成物は、これらのニーズを満たし、他の関連する利点を提供する。
【発明の概要】
【０００８】
(発明の概要)
本明細書に提供されるのは、キシリトール経路を有する単離されたメチニコビア種である。そのようなメチニコビア種は、キシロースを有する培地中で培養したとき、キシロースからキシリトールを生産することができる。いくつかの実施態様において、本明細書に記載されるキシリトール経路は、キシロースをキシリトールに変換するキシロースレダクターゼを含む。さらに、いくつかの実施態様において、単離されたメチニコビア種は、通常であればキシリトールをキシルロースに変換するキシリトールデヒドロゲナーゼに対する遺伝子修飾を含む。したがって、いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、キシロースレダクターゼをコードする少なくとも1つの外因性核酸、又はその代わりにもしくはそれに加えて、単離されたメチニコビア種のキシロースレダクターゼの過剰発現をもたらす少なくとも1つの外因性核酸を有する単離されたメチニコビア種である。いくつかの実施態様において、また本明細書に提供されるのは、単離されたメチニコビア種のキシリトールデヒドロゲナーゼを減弱させるか又は不活化する遺伝子修飾を有する単離されたメチニコビア種である。いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは:(a)キシロースレダクターゼをコードする少なくとも1つの外因性核酸又は単離されたメチニコビア種のキシロースレダクターゼの過剰発現をもたらす少なくとも1つの外因性核酸;及び(b)単離されたメチニコビア種のキシリトールデヒドロゲナーゼを減弱させるか又は不活化する遺伝子修飾を有する単離されたメチニコビア種である。
【０００９】
また本明細書に提供されるのは、特定の速度でキシロースからキシリトールを生産することができる単離されたメチニコビア種である。例えば、いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくとも0.50g/L/h、少なくとも0.60g/L/h、少なくとも0.70g/L/h、少なくとも0.80g/L/h、少なくとも0.90g/L/h、少なくとも1.00g/L/h、少なくとも1.50g/L/h、少なくとも2.00g/L/h、少なくとも2.50g/L/h、少なくとも3.00g/L/h、少なくとも3.50g/L/h、少なくとも4.00g/L/h、少なくとも5.00g/L/h、少なくとも6.00g/L/h、少なくとも7.00g/L/h、少なくとも8.00g/L/h、少なくとも9.00g/L/h、又は少なくとも10.00g/L/hのキシリトールをキシロースから生産する。
【００１０】
またさらに本明細書に提供されるのは、特定の濃度でキシロースからキシリトールを生産することができる単離されたメチニコビア種である。例えば、いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくとも75g/L、少なくとも80g/L、少なくとも85g/L、少なくとも90g/L、少なくとも95g/L、少なくとも100g/L、少なくとも110g/L、少なくとも120g/L、少なくとも130g/L、少なくとも140g/L、少なくとも150g/L、少なくとも160g/L、少なくとも170g/L、少なくとも180g/L、少なくとも190g/L、少なくとも200g/L、少なくとも250g/L、又は少なくとも300g/Lのキシリトールをキシロースから生産する。
【００１１】
本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、メチニコビア・プルケリマ(Metschnikowia pulcherrima)、メチニコビア・フルクティコラ(Metschnikowia fructicola)、メチニコビア・クリソペルラエ(Metschnikowia chrysoperlae)、メチニコビア・レウカウフィイ(Metschnikowia reukaufii)、メチニコビア・アンダウエンシス(Metschnikowia andauensis)、メチニコビア・シャンキシエンシス(Metschnikowia shanxiensis)、メチニコビア・シネンシス(Metschnikowia sinensis)、メチニコビア・ジジフィコラ(Metschnikowia zizyphicola)、メチニコビア・ビクスピダータ(Metschnikowia bicuspidata)、メチニコビア・ルナータ(Metschnikowia lunata)、メチニコビア・ゾベルリイ(Metschnikowia zobellii)、メチニコビア・アウストラリス(Metschnikowia australis)、メチニコビア・アガウェアエ(Metschnikowia agaveae)、メチニコビア・グルエッシイ(Metschnikowia gruessii)、メチニコビア・ハワイエンシス(Metschnikowia hawaiiensis)、メチニコビア・クリッシイ(Metschnikowia krissii)、メチニコビア属種株NS-O-85、及びメチニコビア属種株NS-O-89から選択されるメチニコビア種であることができる。特定の実施態様において、該単離されたメチニコビア種は、ブダペスト条約の条項の下で、2016年11月8日に、国際寄託当局であるカナダ国際寄託当局(International Depositary Authority of Canada)に寄託された、アクセッション番号081116-01に指定されたメチニコビア種である。
【００１２】
いくつかの実施態様において、該単離されたメチニコビア種に導入されるキシロースレダクターゼをコードする少なくとも1つの外因性核酸は、異種核酸である。
【００１３】
いくつかの実施態様において、該キシロースレダクターゼは、配列番号11〜18から選択されるアミノ酸配列を有する。特定の実施態様において、該キシロースレダクターゼは、配列番号11のアミノ酸配列又は配列番号11と少なくとも95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００１４】
いくつかの態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、遺伝子修飾を含み、ここで、該遺伝子修飾は、該単離されたメチニコビア種のキシリトールデヒドロゲナーゼ又はその部分をコードする少なくとも1つのアレルの欠失を含む。特定の実施態様において、該遺伝子修飾は、該単離されたメチニコビア種のキシリトールデヒドロゲナーゼ又はその部分をコードする両方のアレルの欠失を含む。
【００１５】
いくつかの態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、キシローストランスポーターをコードする少なくとも1つの外因性核酸又は単離されたメチニコビア種のキシローストランスポーターの過剰発現をもたらす少なくとも1つの外因性核酸をさらに含む。該キシローストランスポーターは、いくつかの実施態様において、配列番号27〜40から選択されるアミノ酸配列を有する。特定の実施態様において、該キシローストランスポーターは、配列番号27〜36のいずれか1つのアミノ酸配列又は配列番号27〜36のいずれか1つと少なくとも30％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００１６】
いくつかの態様において、本明細書に提供されるのは、キシリトールを生産する方法である。いくつかの実施態様において、本方法は、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種を、キシロースからキシリトールを生産するための条件下で、かつそれに十分な期間培養することを含む。本方法は、該単離されたメチニコビア種を、キシロース及びC3炭素源、C4炭素源、C5炭素源、C6炭素源、又はこれらの組合せを含む培地中で培養することを含むことができる。いくつかの実施態様において、該条件は、該単離されたメチニコビア種を、キシロース並びにセロビオース、ガラクトース、グルコース、エタノール、アセテート、アラビノース、アラビトール、ソルビトール、及びグリセロール、又はこれらの組合せから選択される共基質を含む培地中で培養することを含む。特定の実施態様において、該共基質はグルコースである。また別の特定の実施態様において、該培地は、キシロースとセロビオースの組合せ、又はキシロースとガラクトースの組合せ、又はキシロースとグリセロールの組合せを含む。培養条件は、好気的培養条件を含むこともできる。培養は、回分培養、流加培養、又は連続培養を含むことができる。いくつかの実施態様において、本方法は、例えば、抽出、連続液液抽出、浸透気化、膜濾過、膜分離、逆浸透、電気透析、蒸留、結晶化、遠心分離、抽出濾過、イオン交換クロマトグラフィー、吸収クロマトグラフィー、又は限外濾過を用いて、キシリトールを培養物中の他の成分から分離することを含む。
【００１７】
いくつかの態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に提供される方法によって生産される生物由来キシリトールである。
【００１８】
いくつかの態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種を有する組成物である。それに加えて又はその代わりに、また本明細書に提供されるのは、本明細書に提供される生物由来キシリトールを有する組成物である。該組成物は、いくつかの実施態様において、キシロースを含む培養培地である。特定の実施態様において、該組成物は、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種が除去されている培養培地である。
【００１９】
いくつかの実施態様において、該組成物は、グリセロール、アラビトール、C7糖アルコール、又はこれらの組合せを、本明細書に記載される方法からの不純物として含む。特定の実施態様において、C7糖アルコールは、ボレミトール又はその異性体である。いくつかの実施態様において、グリセロールもしくはアラビトール、又はその両方の量は、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種以外の微生物によって生産されるそれぞれのグリセロールもしくはアラビトール、又はその両方の量よりも少なくとも10％、20％、30％、又は40％多い。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
(図面の簡単な説明)
【図１】図1は、野生型H0メチニコビア属種及び出芽酵母(Saccharomyces. cerevisiae) M2株についてのキシロースからのキシリトールの生産を示している。YP＋4％キシロースは、4％キシロースを有する酵母抽出物ペプトン培地を示している。YP＋10％キシロースは、10％キシロースを有する酵母抽出物ペプトン培地を示している。
【００２１】
【図２】図2は、キシロースからの生産のための例示的なキシリトール経路を示している。キシロースからキシリトールへの還元は、キシロースレダクターゼ(XR)によって行われ、キシリトールからキシルロースへの変換は、キシリトールデヒドロゲナーゼ(XDH)をコードするXYL2遺伝子の欠失によって妨げられる。キシローストランスポーター(XT)及びキシロースレダクターゼ(XR)の過剰発現は、キシリトールの生産を増強する。共基質の使用は細胞の代謝を支持し、キシロースレダクターゼのための酸化還元バランスを供給する。
【００２２】
【図３】図3は、H0メチニコビア属種のゲノム組込みのための耐性マーカー遺伝子発現カセットの略図を示している。
【００２３】
【図４】図4は、XYL2遺伝子の欠失のための例示的な戦略を示している。
【００２４】
【図５】図5は、H0メチニコビア属種のXYL2欠失株におけるXYL1過剰発現のための例示的な構築戦略を示している。
【００２５】
【図６】図6A〜6Cは、様々な濃度のキシロース(X、≦10％)及びセロビオース(C)中で培養したときの、野生型H0メチニコビア属種(H0)、xyl2欠失H0メチニコビア属種株(xyl2Δ/xyl2Δ)、及びXYL1の過剰発現をxyl2欠失と併せたH0メチニコビア属種株(xyl2Δ::XYL1↑/xyl2Δ::XYL1↑)についての、キシロースの消費(図6A)、キシロースからのキシリトールの生産(図6B)、及びセロビオースの利用(図6C)を示している。
【００２６】
【図７】図7は、8％(w/v)キシロース及び2.5％(w/v)セロビオース中で培養したときの、野生型H0メチニコビア属種(H0)、xyl2欠失H0メチニコビア属種株(xyl2Δ/xyl2Δ)、及びXYL1の過剰発現をxyl2欠失と併せたH0メチニコビア属種株(xyl2Δ::XYL1↑/xyl2Δ::XYL1↑)についての、キシロースの消費(図6A)、キシロースからのキシリトールの生産(図6B)、及びセロビオースの利用(図6C)を示している。
【００２７】
【図８】図8は、様々な濃度のキシロース(10％≦X≦20％))及びガラクトース中で培養したときの、野生型H0メチニコビア属種(H0)、欠失H0メチニコビア属種株(H091:xyl2Δ/xyl2Δ)、及びXYL1の過剰発現をxyl2欠失と併せたもの(H4316:xyl2Δ::XYL1↑/xyl2Δ::XYL1↑)についての、キシロースからのキシリトールの生産を示している。
【００２８】
【図９】図9は、ガラクトースを共基質として用いる12％(w/v)キシロースからの組換えH0メチニコビア属種によるキシリトール生産を示している。H091＝xyl2欠失株; H4316＝xyl2欠失＋XYL1過剰発現株。
【００２９】
【図１０】図10A〜10Cは、組換えH0メチニコビア属種H0＝野生型; H091＝xyl2欠失株; H4316＝xyl2欠失＋XYL1過剰発現株によるキシロース消費(図10A)、キシリトール生産(図10B)、及びガラクトース利用(図10C)を示している。
【００３０】
【図１１】図11は、固形キシロースを5回再補給したときのキシロース消費及びキシリトール生産を示している。
【００３１】
【図１２】図12A〜12Cは、ガラクトースを共基質として用いる方法(図12A)、セロビオースを共基質として用いる方法(図12B)、又はグリセロールを共基質として用いる方法(図12C)におけるキシリトール経路とキシローストランスポーターの過剰発現とを有するH0メチニコビア属種によるキシロース消費及びキシリトール生産を示している。H0＝野生型; H091＝xyl2欠失株; H016＝1コピーのXYL2がGXF1及びXYL1過剰発現カセットと置き換えられている株; H016-21＝xyl2欠失＋GXF1及びXYL1過剰発現株。
【００３２】
【図１３】図13は、ガラクトースを共基質として用いる方法におけるキシリトール経路とキシローストランスポーターの過剰発現とを有するH0メチニコビア属種によるキシロース消費及びキシリトール生産を示している。H0＝野生型; H091＝xyl2欠失株; H2-2＝1コピーのXYL2がGXF2及びXYL1過剰発現カセットに置き換えられている株; 2c1d3＝xyl2欠失＋GXF2及びXYL1過剰発現株。
【００３３】
【図１４】図14A及び14Bは、様々な補給培地及び通気速度を用いる流加発酵を用いるxyl2欠失＋GXF1及びXYL1過剰発現株によるキシロース及びガラクトース消費並びにキシリトール生産を示している。図14Aは、36％キシロース、12％ガラクトース、1.5％グルコース、1.5％ペプトン、0.075％酵母抽出物、0.075％KH2PO4、0.075％MgSO4、及び0.075％(NH4)2SO4を有する補給培地を使用している。通気速度は、溶存酸素(DO)を50％飽和に維持するように自動調整した。図14Bは、36％キシロース、12％ガラクトース、3％グルコース、3％ペプトン、1.5％酵母抽出物、0.075％KH2PO4、0.075％MgSO4、及び0.075％(NH4)2SO4を有する補給培地を使用している。追加の固形培地化合物を10日目に添加して、キシロース濃度を7％まで増大させた。通気速度は、溶存酸素(DO)を70％飽和に維持するように自動調整した。
【００３４】
【図１５】図15A〜15Dは、様々な培地中で培養されたH0メチニコビア属種及びFL株の細胞成長曲線を示している。図15Aは、4％グルコースを含むYNB培地(YNBG)である。図15Bは、4％キシロースを含むYNB培地(YNBX)である。図15Cは、2％グルコース及び2％キシロースを含むYNB培地(YNBGX)である。図15Dは、4％キシロースを含むYPD培地(YPDX)である。
【００３５】
【図１６】図16A及び16Bは、YNBG培地、YNBGX培地、及びYPDX培地中でH0メチニコビア属種及びFL株によって生産されたグリセロール及びエタノールを示している。
【００３６】
【図１７】図17A〜17Dは、YNBG培地(図17A)、YNBX培地(図17B)、YNBGX培地(図17C)、及びYPDX培地(図17D)中でH0メチニコビア属種及びメチニコビア・プルケリマフラウィア(FL)株の成長の間に生産されたアラビトールレベルを示している。
【００３７】
【図１８】図18A〜18Cは、YNBX培地(図18A)、YNBGX培地(図18B)、及びYPDX培地(図18C)中でH0メチニコビア属種及びFL株の成長の間に生産されたキシリトールレベルを示している。
【００３８】
【図１９】図19A〜19Dは、YNBG培地(図19A)、YNBX培地(図19B)、YNBGX培地(図19C)、及びYPDX培地(図19D)中でH0メチニコビア属種及びFL株によって生産された様々な揮発性化合物のピーク比生産を示している。
【００３９】
【図２０】図20は、メチニコビア・プルケリマクレードのメンバーと比較したときのH0メチニコビア属種の例示的な成長曲線を示している。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
(詳細な説明)
本明細書に提供される組成物及び方法は、メチニコビア属内の新規の酵母種の発見、単離、及び特徴解析に一部基づいている。本明細書において「H0」又は「H0メチニコビア属種」と呼ばれる、この新規のメチニコビア種の分離及び特徴解析により、キシロースをキシリトールの生産に利用する能力をメチニコビア種に提供する、新規の遺伝子及びタンパク質、特に、新規のキシロースレダクターゼ及び新規のキシローストランスポーターが明らかになった。これらの新規の遺伝子及びタンパク質の使用には、例えば、メチニコビア種におけるキシリトール経路酵素及びタンパク質、例えば、キシロースレダクターゼ又はキシロース輸送の過剰発現をもたらす外因性核酸の導入、並びにメチニコビア種のキシリトールデヒドロゲナーゼを減弱させるか又は不活化する遺伝子修飾の導入が含まれる。本明細書に記載されるH0メチニコビア属種を含む、メチニコビア種へのそのような修飾の導入は、キシリトール生産の顕著な増加をもたらすことができる。したがって、本明細書に記載されるメチニコビア種は、キシロースをキシリトールの生産のための炭素源として有する培地中でメチニコビア種を培養することにより、キシリトールを生産する方法において使用することができる。また本明細書に提供されるのは、本明細書に記載される組換えメチニコビア種を用いて、キシリトールを生産する方法によって生産されるキシリトールを有する組成物である。またさらに本明細書に提供されるのは、H0メチニコビア属種の新規タンパク質に関する単離されたポリペプチド及びH0メチニコビア属種の新規遺伝子に関する単離された核酸、並びにそのような核酸を含む宿主細胞である。
【００４１】
本明細書で使用される場合、培養又は成長条件に関して使用されるときの「好気的」という用語は、遊離酸素(O2)が培養又は成長条件下で利用可能であることを意味することが意図される。これには、液体培地中の溶存酸素が50％飽和を上回る場合が含まれる。
【００４２】
本明細書で使用される場合、培養又は成長条件に関して使用されるときの「嫌気的」という用語は、培養又は成長条件が遊離酸素(O2)を欠くことを意味することが意図される。
【００４３】
本明細書で使用される場合、「減弱させる」という用語又はその文法的同等物は、酵素又はタンパク質の活性又は量を低下させるか、低減させるか、又は減少させることを意味することが意図される。酵素又はタンパク質の活性又は量の減弱は、該減弱によって、該活性又は量が、所与の経路が機能するのに必要とされる臨界レベルを下回るようになる場合、完全な破壊を模倣することができる。しかしながら、ある経路の完全な破壊を模倣する酵素又はタンパク質の活性又は量の減弱は、依然として、別の経路が機能し続けるのに十分であることができる。例えば、内在性酵素又はタンパク質の減弱は、特定の化合物(例えば、キシリトール)の生産のための同じ酵素又はタンパク質の完全な破壊を模倣するのに十分であることができるが、酵素又はタンパク質の残存する活性又は量は、依然として、他の経路又は反応、例えば、宿主メチニコビア種が生存し、生殖し、又は成長するのに極めて重要である経路を維持するのに十分であり得る。酵素又はタンパク質の減弱は、酵素又はタンパク質の活性又は量を、キシリトールの収率を増加させるのに十分である量で低下させるか、低減させるか、又は減少させることでもあり得るが、酵素又はタンパク質の完全な破壊を必ずしも模倣するものではない。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「生物ベース」という用語は、全体として又は部分的に、生物由来化合物から構成されている生成物を意味する。生物ベース又は生物由来の生成物は、石油由来生成物と対照的であり、ここで、そのような生成物は、石油もしくは石油化学原料に由来するか、又は石油もしくは石油化学原料から合成される。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「生物由来」という用語は、生物に由来するか又は生物によって合成されることを意味し、生物によって生産されることができるので、再生可能資源とみなすことができる。そのような生物、特に、本明細書に開示されるメチニコビア種は、糖(例えば、キシロース、グルコース、フルクトース、ガラクトース(例えば、海洋植物バイオマス由来のガラクトース)、スクロース、及びアラビノース)、農業、植物、細菌、又は動物の源から得られる炭水化物、並びにグリセロール(例えば、バイオディーゼル製造からの廃グリセロール副生成物)などの、原料又はバイオマスを利用することができる。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「炭素源」という用語は、限定されないが、本明細書に記載される生物由来化合物を含む、その有機分子の合成用の生物によって使用される任意の炭素含有分子を指す。これには、様々な量の炭素原子を有する分子が含まれる。具体的な例としては、C3炭素源、C4炭素源、C5炭素源、及びC6炭素源が挙げられる。「C3炭素源」は、3個の炭素原子を含有する炭素源、例えば、グリセロールを指す。「C4炭素源」は、4個の炭素原子を含有する炭素源、例えば、エリトロース又はトレオースを指す。「C5炭素源」は、5個の炭素原子を含有する炭素源、例えば、キシロース、アラビノース、アラビトール、リボース、又はリキソースを指す。「C6炭素源」は、6個の炭素原子を含有する炭素源、例えば、グルコース、ガラクトース、マンノース、アロース、アルトース、グロース、又はイドースを指す。
【００４７】
「外因性」という用語は、それが本明細書で使用されるとき、言及された分子又は言及された活性が本明細書に記載されるメチニコビア種に導入されることを意味することが意図される。該分子は、例えば、宿主染色体への組込みなどによる、宿主メチニコビア種の遺伝物質へのコード核酸の導入によって、又はプラスミドなどの非染色体遺伝物質として導入することができる。その代わりに又はそれに加えて、導入される分子は、例えば、コード核酸の発現を調節する(例えば、増大させる、減少させる、もしくは構成的にする)非コード核酸、例えば、プロモーターもしくはエンハンサーであることができるか、又はこれらを含むことができる。それゆえ、この用語は、それがコード核酸の発現に関連して使用されるとき、宿主メチニコビア種への発現可能な形態のコード核酸の導入及び/又は宿主メチニコビア種のコード核酸の発現を増大させる(例えば、過剰発現する)核酸の導入を指す。生合成活性に関連して使用されるとき、この用語は、宿主メチニコビア種に導入される活性を指す。供給源は、例えば、メチニコビア種への導入後に言及された活性を発現する相同又は異種コード核酸であることができる。それゆえ、「内在性」という用語は、宿主メチニコビア種に存在する言及された分子又は活性を指す。同様に、コード核酸の発現に関連して使用される場合のこの用語は、微生物に含まれるコード核酸の発現を指す。「異種」という用語が、言及されたメチニコビア種以外の源に由来する分子又は活性を指すのに対し、「相同」は、宿主メチニコビア種に由来する分子又は活性を指す。したがって、本明細書に開示されるコード核酸の外因性発現は、異種又は相同コード核酸のいずれか又は両方を利用することができる。
【００４８】
複数の外因性核酸がメチニコビア種に含まれるとき、該複数の外因性核酸は、上で論じられたような、言及されたコード核酸又は生合成活性を指すことが理解される。微生物は1コピー又は多コピーの同じ外因性核酸を有することができることも理解される。本明細書に開示されるように、そのような複数の外因性核酸は、別の核酸分子上で、ポリシストロン性核酸分子上で、又はこれらの組合せで、宿主メチニコビア種に導入され、それでも、複数の外因性核酸とみなされることがさらに理解される。例えば、本明細書に開示されるように、微生物を、所望の経路酵素又はタンパク質をコードする2以上の外因性核酸を発現するように改変することができる。所望の活性をコードする2つの外因性核酸が宿主メチニコビア種に導入される場合、この2つの外因性核酸は、例えば、単一のプラスミド上で単一の核酸として導入されることができ、別々のプラスミド上で導入されることができ、単一の部位又は複数の部位で宿主染色体に組み込まれることができ、それでも、2つの外因性核酸とみなされることが理解される。同様に、3以上の外因性核酸は、任意の所望の組合せで、例えば、単一のプラスミド上で、別々のプラスミド上で、宿主生物に導入されることができ、単一の部位又は複数の部位で宿主染色体に組み込まれることができ、それでも、2以上の外因性核酸、例えば、3つの外因性核酸とみなされることが理解される。したがって、言及される外因性核酸又は生合成活性の数は、宿主生物に導入される別々の核酸の数ではなく、コード核酸の数又は生合成活性の数を指す。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「遺伝子修飾」、「遺伝子破壊」という用語、又はその文法的同等物は、コード遺伝子産物を機能的に不活性状態にするか、又は活性はあるが、減弱した状態にする遺伝子改変を意味することが意図される。遺伝子改変は、例えば、全遺伝子の欠失、転写もしくは翻訳に必要とされる調節配列の欠失、切断された遺伝子産物をもたらす遺伝子の一部の欠失、又は当技術分野で周知のコード遺伝子産物を不活化するか又は減弱させる様々な突然変異戦略のいずれかによるものであることができる。遺伝子破壊の1つの特に有用な方法は、完全な遺伝子欠失であるが、それは、該方法が本明細書に提供されるメチニコビア種における遺伝的復帰の発生を低下又は消失させるからである。遺伝子破壊には、ヌル突然変異も含まれ、これは、遺伝子又はRNAに転写されない及び/もしくは機能的遺伝子産物に翻訳されない遺伝子を生じる遺伝子を含有する領域内の突然変異を指す。そのようなヌル突然変異は、例えば、不活化点突然変異、遺伝子の一部の欠失、全遺伝子欠失、又は染色体セグメントの欠失を含む、多くのタイプの突然変異から生じることができる。
【００５０】
本明細書で使用される場合、「不活化する」という用語又はその文法的同等物は、酵素又はタンパク質の活性を停止することを意味することが意図される。そのような不活化は、酵素又はタンパク質をコードする全核酸配列の欠失によって達成することができる。不活化は、核酸配列によってコードされる得られる酵素又はタンパク質が全長酵素又はタンパク質の活性を有さないような酵素又はタンパク質をコードする核酸配列の一部の欠失によって達成することもできる。さらに、酵素又はタンパク質の不活化は、欠失との組合せを含む、酵素又はタンパク質をコードする核酸配列への置換又は挿入によって達成することができる。挿入は、異種核酸、例えば、本明細書に記載されるものを含むことができる。
【００５１】
本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、本明細書に記載されるメチニコビア種に関連して使用されるとき、言及された微生物が天然に見出されるときの少なくとも1つの成分を実質的に含まない生物を意味することが意図される。この用語は、それがその天然の環境において見出されるときのいくつかの又は全ての成分から取り出されているメチニコビア種を含む。この用語は、該微生物が非天然の環境において見出されるときのいくつかの又は全ての成分から取り出されている微生物も含む。それゆえ、単離されたメチニコビア種は、それが天然に見出されるときの又はそれが非天然の環境において成長している、保存されている、もしくは生存しているときの他の物質から部分的に又は完全に分離されている。単離されたメチニコビア種の具体的な例としては、部分的に純粋な微生物、実質的に純粋な微生物、及び非天然の培地中で培養された微生物が挙げられる。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「培地」、「培養培地」、「成長培地」という用語、又はこれらの文法的同等物は、本明細書に記載されるメチニコビア種などの任意の微生物を含む、細胞の成長を支持する栄養素を含有する液体又は固体(例えば、ゼラチン状)物質を指す。成長を支持する栄養素としては:限定されないが、キシロース、セロビオース、ガラクトース、グルコース、エタノール、アセテート、アラビノース、アラビトール、ソルビトール、及びグリセロールなどの、炭素を供給する物質;マグネシウム、窒素、リン、及び硫黄を含む、必須元素を提供する塩;ペプトン又はトリプトンなどの、アミノ酸の供給源;並びに酵母抽出物などの、ビタミン内容物の供給源が挙げられる。本方法において及び本明細書に記載されるメチニコビア種の特徴解析において有用な培地の具体的な例としては、限定されないが、キシロース、グルコース、セロビオース、ガラクトース、もしくはグリセロール、又はこれらの組合せなどの炭素源を有する酵母抽出物ペプトン(YEP)培地及び酵母窒素塩基(YNB)培地が挙げられる。YEP及びYNB培地の製剤は、当技術分野で周知である。例えば、4％キシロースを有するYEP培地は、限定されないが、酵母抽出物1.0g、ペプトン2.0g、キシロース4.0g、及び水100mlを含む。別の例として、2％グルコース及び2％キシロースを有するYNB培地は、限定されないが、ビオチン2μg、パントテン酸カルシウム400μg、葉酸2μg、イノシトール2000μg、ナイアシン400μg、p-アミノ安息香酸200μg、塩酸ピリドキシン400μg、リボフラビン200μg、塩酸チアミン400μg、ホウ酸500μg、硫酸銅40μg、ヨウ化カリウム100μg、塩化第二鉄200μg、硫酸マンガン400μg、モリブデン酸ナトリウム200μg、硫酸亜鉛400μg、第一リン酸カリウム1g、硫酸マグネシウム500mg、塩化ナトリウム100mg、塩化カルシウム100mg、グルコース20g、キシロース20g、及び水1Lを含む。培地中の炭素源の量は、当業者によって容易に決定されることができる。炭素を供給する複数の基質が培地中に存在するとき、これらは「共基質」と呼ばれる。培地は、成長に必要とされる栄養素以外の物質、例えば、選択培地中に一般に見られる、選択された細胞が成長することだけを可能にする物質(例えば、抗生物質もしくは抗真菌薬)又は示差もしくは指標培地中に一般に見られる、同じ培地中で成長したときにある微生物の分化を別のものよりも優先して可能にする物質も含むことができる。そのような物質は、当業者に周知である。
【００５３】
本明細書で使用される場合、「メチニコビア種」という用語は、メチニコビア属に含まれる酵母の任意の種を指す。例示的なメチニコビア種としては、メチニコビア・プルケリマ、メチニコビア・フルクティコラ、メチニコビア・クリソペルラエ、メチニコビア・レウカウフィイ、メチニコビア・アンダウエンシス、メチニコビア・シャンキシエンシス、メチニコビア・シネンシス、メチニコビア・ジジフィコラ、メチニコビア・ビクスピダータ、メチニコビア・ルナータ、メチニコビア・ゾベルリイ、メチニコビア・アウストラリス、メチニコビア・アガウェアエ、メチニコビア・グルエッシイ、メチニコビア・ハワイエンシス、メチニコビア・クリッシイ、メチニコビア属種の株NS-O-85、メチニコビア属種の株NS-O-89、及び本明細書に記載される独特のメチニコビア種であるメチニコビア属種H0、別名、「H0メチニコビア属種」が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載されるメチニコビア種、すなわち、「H0メチニコビア属種」は、新たに発見された種であり、これは、アクセッション番号081116-01に指定されており、かつブダペスト条約の条項の下で、2016年11月8日に、R3E 3R2カナダマニトバ州ウィニペグアーリントン通り1015番地(1015 Arlington Street, Winnipeg, Manitoba, Canada R3E 3R2)の住所にある国際寄託当局であるカナダ国際寄託当局(「IDAC」)に寄託された。H0メチニコビア属種の提案された学名は、メチニコビア・ウィニフィコラ(Metschnikowia vinificola)である(ウィニフィ:ウィニフェラ(ワイン用ブドウの種)に由来する;コラ:住人を意味するラテン語の「インコラ」に由来する)。したがって、ウィニフィコラ(ウィニフェラの住人)という種名は、ワイン用ブドウからの基準株の単離を指す。
【００５４】
さらに、本明細書で言及されるメチニコビア種は、「非天然」又は「組換え」メチニコビア種を含むことができる。そのような生物は、言及された種の野生型株を含む、天然のメチニコビア種に通常は見られない少なくとも1つの遺伝子改変を有するメチニコビア種を意味することが意図される。遺伝子改変には、例えば、代謝的ポリペプチドをコードする発現可能な核酸を導入する修飾、他の核酸付加、核酸欠失、及び/又は微生物の遺伝物質の他の遺伝子破壊が含まれる。そのような修飾には、例えば、言及された種の異種ポリペプチド、相同ポリペプチド、又は異種ポリペプチドと相同ポリペプチドの両方のコード領域及びその機能的断片が含まれる。さらなる修飾には、例えば、修飾が遺伝子又はオペロンの発現を変化させる非コード調節性領域が含まれる。例示的な代謝的ポリペプチドには、本明細書に記載される代謝経路(例えば、キシリトール経路)内の酵素又はタンパク質が含まれる。
【００５５】
代謝的修飾は、その天然の状態から変化させる生化学的反応を指す。それゆえ、本明細書に記載されるメチニコビア種は、代謝的ポリペプチド又はその機能的断片をコードする1以上の核酸配列に対する遺伝子修飾を有することができ、これにより、異化又は同化反応並びに基礎代謝を含む、代謝的ポリペプチドが触媒する生化学的反応が変化する。例示的な代謝的修飾が本明細書に開示されている。
【００５６】
本明細書で使用される場合、「過剰発現」という用語又はその文法的同等物は、宿主メチニコビア種にとって普通であるよりも大きい量での、又は野生型発現の時間もしくは場所とは異なる宿主メチニコビア種内の時間もしくは場所での遺伝子産物(例えば、リボ核酸(RNA)、タンパク質、又は酵素)の発現を意味することが意図される。
【００５７】
本明細書で使用される場合、「配列同一性」又は「配列相同性」という用語は、核酸配列又はアミノ酸配列に関連して使用される場合、2以上の核酸分子間又は2以上のポリペプチド間の類似性を指す。同一性は、比較目的で整列させることができる各々の配列における位置を比較することにより決定することができる。比較される配列の位置が同じ塩基又はアミノ酸によって占められている場合、これらの分子は、その位置で同一である。配列間の同一性の程度は、該配列によって共有される一致する又は相同な位置の数の関数である。そのパーセント配列同一性を決定するための2つの配列のアラインメントは、例えば、Ausubelらの文献、分子生物学の最新プロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)、John Wiley and Sons, Baltimore, MD(1999)に記載されているものなどの当技術分野で公知のソフトウェアプログラムを用いて行うことができる。好ましくは、デフォルトパラメータがアラインメントに使用される。使用することができる当技術分野で周知の1つのアラインメントプログラムは、デフォルトパラメータに設定されているBLASTである。特に、プログラムは、以下のデフォルトパラメータ:遺伝コード＝標準;フィルター＝なし;鎖＝両方;カットオフ＝60;期待＝10;マトリクス＝BLOSUM62;記載＝50配列;選別方法＝高得点;データベース＝非冗長、GenBank＋EMBL＋DDBJ＋PDB＋GenBank CDS翻訳＋SwissProtein＋SPupdate＋PIRを用いるBLASTN及びBLASTPである。これらのプログラムの詳細は、国立生物工学情報センター(National Center for Biotechnology Information)において見出すことができる。
【００５８】
本明細書で使用される場合、「実質的に嫌気的」という用語は、培養又は成長条件に関連して使用される場合、液体培地中の溶存酸素の量が約10％飽和未満であることを意味することが意図される。この用語は、液体又は固体培地を含む約1％未満の酸素の雰囲気で維持される密閉チャンバーを含むことも意図される。
【００５９】
本明細書で使用される場合、「糖アルコール」という用語は、糖のアルデヒド又はケトンの還元によって生産されるアルコールを指す。したがって、「C7糖アルコール」は、7個の炭素原子を有する糖のアルデヒド又はケトンの還元によって生産されるアルコール、例えば、ボレミトール又はその異性体を指す。
【００６０】
本明細書で使用される場合、「キシリトール」という用語は、C5H12O5という化学式、152.15g/molというモル質量、及び(2R,3r,4S)-ペンタン-1,2,3,4,5-ペントール[(2S,4R)-ペンタン-1,2,3,4,5-ペントール]という1つのIUPAC名を有するペントース糖アルコールを指す。キシリトールは、糖尿病の人及び高血糖症の個人のインスリンレベルに影響を及ぼさない、糖の低カロリー、低炭水化物代用品として一般に使用されている。
【００６１】
本明細書で使用される場合、「キシリトールデヒドロゲナーゼ」という用語は、キシルロースを生産するためのキシリトールの酸化を触媒する酵素を指す。そのようなキシリトールの酸化は、共因子NADを使用する酵素を含む。例示的なキシリトールデヒドロゲナーゼとしては、E.C.1.1.1.9又はE.C.1.1.1.B19に分類される酵素が挙げられる。「メチニコビアキシリトールデヒドロゲナーゼ」という用語又はその文法的等価物は、メチニコビア種由来のキシリトールデヒドロゲナーゼを指す。表1は、例示的なキシリトールデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列と核酸配列の両方を提供している。
(表1)
【表１】
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【００６２】
本明細書で使用される場合、「キシロース」という用語は、C5H10O5という化学式、150.13g/molというモル質量、及び(3R,4S,5R)-オキサン-2,3,4,5-テトロールという1つのIUPAC名を有するホルミル官能基を有する五炭素単糖を指す。キシロースは、当技術分野において、D-キシロース、D-キシロピラノース、キシロシド、d-(+)-キシロース、キシロピラノース、木糖、キシロメド、及びD-キシロペントースとしても知られている。
【００６３】
本明細書で使用される場合、「キシロースレダクターゼ」という用語は、キシリトールを生産するためのキシロースの還元を触媒する酵素を指す。そのようなキシロースの還元は、NADH又はNADPHを共因子として用いる酵素を含む。例示的なキシロースレダクターゼとしては、E.C.1.1.1.307に分類される酵素が挙げられる。「メチニコビアのキシロースレダクターゼ」という用語又はその文法的等価物は、メチニコビア種由来のキシロースレダクターゼを指す。表2は、例示的なキシロースレダクターゼのアミノ酸配列と核酸配列の両方を提供している。
(表2)
【表２】
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【００６４】
本明細書で使用される場合、「キシローストランスポーター」という用語は、キシロースの細胞膜通過を容易にする膜タンパク質を指す。「メチニコビアのキシローストランスポーター」という用語又はその文法的等価物は、メチニコビア種由来のキシローストランスポーターを指す。表3は、例示的な キシローストランスポーターのアミノ酸配列と核酸配列の両方を提供している。
(表3)
【表３】
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2020501595.tif 000025
【００６５】
本明細書に提供されるのは、キシリトール経路を有する新規の単離されたメチニコビア種である。そのようなメチニコビア種は、キシロースを有する培地中で培養したとき、キシロースからキシリトールを生産することができる。いくつかの実施態様において、本明細書に記載されるキシリトール経路は、キシロースをキシリトールに変換するキシロースレダクターゼを含む。さらに、いくつかの実施態様において、該単離されたメチニコビア種は、通常であればキシリトールをキシルロースに変換するキシリトールデヒドロゲナーゼに対する遺伝子修飾を含む。したがって、いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、キシロースレダクターゼをコードする少なくとも1つの外因性核酸を有する単離されたメチニコビア種、又はその代わりにもしくはそれに加えて、単離されたメチニコビア種のキシロースレダクターゼの過剰発現をもたらす少なくとも1つの外因性核酸を有する単離されたメチニコビア種である。いくつかの実施態様において、また本明細書に提供されるのは、単離されたメチニコビア種のキシリトールデヒドロゲナーゼを減弱させるか又は不活化する遺伝子修飾を有する単離されたメチニコビア種である。いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは:(a)キシロースレダクターゼをコードする少なくとも1つの外因性核酸又は該単離されたメチニコビア種のキシロースレダクターゼの過剰発現をもたらす少なくとも1つの外因性核酸;及び(b)単離されたメチニコビア種のキシリトールデヒドロゲナーゼを減弱させるか又は不活化する遺伝子修飾を有する単離されたメチニコビア種である。
【００６６】
本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、特定の速度でキシロースからキシリトールを生産することができる。例えば、いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビアは、培養したとき、少なくとも0.50g/L/h、少なくとも0.60g/L/h、少なくとも0.70g/L/h、少なくとも0.80g/L/h、少なくとも0.90g/L/h、少なくとも1.00g/L/h、少なくとも1.50g/L/h、少なくとも2.00g/L/h、少なくとも2.50g/L/h、少なくとも3.00g/L/h、少なくとも3.50g/L/h、少なくとも4.00g/L/h、少なくとも5.00g/L/h、少なくとも6.00g/L/h、少なくとも7.00g/L/h、少なくとも8.00g/L/h、少なくとも9.00g/L/h、又は少なくとも10.00g/L/hのキシリトールをキシロースから生産する。したがって、いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくとも0.50g/L/hのキシリトールをキシロースから生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくとも0.60g/L/hのキシリトールをキシロースから生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくとも0.70g/L/hのキシリトールをキシロースから生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくとも0.80g/L/hのキシリトールをキシロースから生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくとも0.90g/L/hのキシリトールをキシロースから生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくとも1.00g/L/hのキシリトールをキシロースから生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくとも1.50g/L/hのキシリトールをキシロースから生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくとも2.00g/L/hのキシリトールをキシロースから生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくとも2.50g/L/hのキシリトールをキシロースから生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくとも3.00g/L/hのキシリトールをキシロースから生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくとも3.50g/L/hのキシリトールをキシロースから生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくとも4.00g/L/hのキシリトールをキシロースから生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくとも5.00g/L/hのキシリトールをキシロースから生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくとも6.00g/L/hのキシリトールをキシロースから生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくとも7.00g/L/hのキシリトールをキシロースから生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくとも8.00g/L/hのキシリトールをキシロースから生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくとも9.00g/L/hのキシリトールをキシロースから生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくとも10.00g/L/hのキシリトールをキシロースから生産する。
【００６７】
本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、特定の濃度でキシロースからキシリトールを生産することができる。例えば、いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくとも75g/L、少なくとも80g/L、少なくとも85g/L、少なくとも90g/L、少なくとも95g/L、少なくとも100g/L、少なくとも110g/L、少なくとも120g/L、少なくとも130g/L、少なくとも140g/L、少なくとも150g/L、少なくとも160g/L、少なくとも170g/L、少なくとも180g/L、少なくとも190g/L、少なくとも200g/L、少なくとも250g/L、又は少なくとも300g/Lのキシリトールをキシロースから生産する。したがって、いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくとも75g/Lのキシリトールをキシロースから生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくとも80g/Lのキシリトールをキシロースから生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくとも90g/Lのキシリトールをキシロースから生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくとも95g/Lのキシリトールをキシロースから生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくとも100g/Lのキシリトールをキシロースから生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくとも110g/Lのキシリトールをキシロースから生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくとも120g/Lのキシリトールをキシロースから生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくとも130g/Lのキシリトールをキシロースから生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくとも140g/Lのキシリトールをキシロースから生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくとも150g/Lのキシリトールをキシロースから生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくとも160g/Lのキシリトールをキシロースから生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくとも170g/Lのキシリトールをキシロースから生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくとも180g/Lのキシリトールをキシロースから生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくとも190g/Lのキシリトールをキシロースから生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくとも200g/Lのキシリトールをキシロースから生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくとも250g/Lのキシリトールをキシロースから生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、培養したとき、少なくとも300g/Lのキシリトールをキシロースから生産する。
【００６８】
本明細書に記載されるキシリトール経路は、当技術分野で公知の任意のメチニコビア種に導入することができる。本明細書に記載されるキシリトール経路を有することができる例示的で非限定的なメチニコビア種としては、メチニコビア・プルケリマ、メチニコビア・フルクティコラ、メチニコビア・クリソペルラエ、メチニコビア・ロイカウフィイ、メチニコビア・アンダウエンシス、メチニコビア・シャンキシエンシス、メチニコビア・シネンシス、メチニコビア・ジジフィコラ、メチニコビア・ビクスピダータ、メチニコビア・ルナータ、メチニコビア・ゾベルリイ、メチニコビア・アウストラリス、メチニコビア・アガウェアエ、メチニコビア・グルエスシイ、メチニコビア・ハワイエンシス、メチニコビア・クリスシイ、メチニコビア属種株NS-O-85、及びメチニコビア属種株NS-O-89が挙げられる。特定の実施態様において、本明細書に記載されるキシリトール経路は、ブダペスト条約の条項の下で、2016年11月8日に、国際寄託当局であるカナダ国際寄託当局(International Depositary Authority of Canada)に寄託された、アクセッション番号081116-01に指定されたメチニコビア種に導入することができる。
【００６９】
当業者に理解されることができるように、本明細書に提供されるメチニコビア種は当業者に公知の任意のメチニコビア種であることができるので、本明細書に記載されるキシロースレダクターゼをコードする外因性核酸は、いくつかの実施態様において、該外因性核酸が導入される宿主メチニコビア種と比較したとき、異種核酸である。言い換えると、いくつかの実施態様において、キシロースレダクターゼをコードする少なくとも1つの外因性核酸は、異種核酸である。
【００７０】
いくつかの実施態様において、キシロースレダクターゼをコードする外因性核酸、又は該外因性核酸の導入によって過剰発現されるキシロースレダクターゼは、本明細書に記載される例示的なキシロースレダクターゼのうちの1つである。例えば、いくつかの実施態様において、キシロースレダクターゼは、配列番号11〜18のいずれか1つから選択されるアミノ酸配列を有する。したがって、いくつかの実施態様において、キシロースレダクターゼは、配列番号11のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様において、キシロースレダクターゼは、配列番号12のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様において、キシロースレダクターゼは、配列番号13のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様において、キシロースレダクターゼは、配列番号14のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様において、キシロースレダクターゼは、配列番号15のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様において、キシロースレダクターゼは、配列番号16のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様において、キシロースレダクターゼは、配列番号17のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様において、キシロースレダクターゼは、配列番号18のアミノ酸配列を有する。
【００７１】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載される単離されたメチニコビア種に導入されるキシロースレダクターゼは、本明細書に記載されるキシロースレダクターゼの変異体である。そのような変異体は、依然として、該キシロースレダクターゼの機能的活性を保持する。例えば、いくつかの実施態様において、該キシロースレダクターゼは、配列番号11〜18のいずれか1つのアミノ酸配列を有し、ここで、該アミノ酸配列は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、又は25個のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を含む。本明細書に提供されるキシロースレダクターゼの変異体は、例えば、参照ポリペプチド配列と比較したとき、欠失、融合、又は切断も含む。したがって、いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるキシロースレダクターゼは、配列番号11〜18のいずれか1つと少なくとも95.0％、少なくとも95.1％、少なくとも95.2％、少なくとも95.3％、少なくとも95.4％、少なくとも95.5％、少なくとも95.6％、少なくとも95.7％、少なくとも95.8％、少なくとも95.9％、少なくとも96.0％、少なくとも96.1％、少なくとも96.2％、少なくとも96.3％、少なくとも96.4％、少なくとも96.5％、少なくとも96.6％、少なくとも96.7％、少なくとも96.8％、少なくとも96.9％、少なくとも97.0％、少なくとも97.1％、少なくとも97.2％、少なくとも97.3％、少なくとも97.4％、少なくとも97.5％、少なくとも97.6％、少なくとも97.7％、少なくとも97.8％、少なくとも97.9％、少なくとも98.0％、少なくとも98.1％、少なくとも98.2％、少なくとも98.3％、少なくとも98.4％、少なくとも98.5％、少なくとも98.6％、少なくとも98.7％、少なくとも98.8％、少なくとも98.9％、少なくとも99.0％、少なくとも99.1％、少なくとも99.2％、少なくとも99.3％、少なくとも99.4％、少なくとも99.5％、少なくとも99.6％、少なくとも99.7％、又は少なくとも99.8％同一であるアミノ酸配列を有する。具体的な実施態様において、該キシロースレダクターゼは、配列番号11のアミノ酸配列又は配列番号11と少なくとも95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００７２】
また本明細書に提供されるのは、本明細書に記載される単離されたメチニコビア種であり、ここで、該単離されたメチニコビア種のキシリトールデヒドロゲナーゼを減弱させるか又は不活化する遺伝子修飾には、該単離されたメチニコビア種のキシリトールデヒドロゲナーゼ又はその部分をコードする1つ又は両方のアレルの欠失が含まれる。したがって、いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、該単離されたメチニコビア種のキシリトールデヒドロゲナーゼ又はその部分をコードする少なくとも1つのアレルの欠失を含む。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、単離されたメチニコビア種のキシリトールデヒドロゲナーゼ又はその部分をコードする両方のアレルの欠失を含む。
【００７３】
また本明細書に提供されるのは、キシローストランスポーターの過剰発現を含むキシリトール経路を有する単離されたメチニコビア種である。そのようなメチニコビア種は、キシロースを有する培地中で培養したとき、キシローストランスポーターを有さないメチニコビア種と比較して、キシロースからのキシリトールの生産を増大させることができる。したがって、いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、キシローストランスポーターをコードする少なくとも1つの外因性核酸、又はその代わりにもしくはそれに加えて、単離されたメチニコビア種のキシローストランスポーターの過剰発現をもたらす少なくとも1つの外因性核酸を有する単離されたメチニコビア種である。いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは:(a)キシロースレダクターゼをコードする少なくとも1つの外因性核酸又は該単離されたメチニコビア種のキシロースレダクターゼの過剰発現をもたらす少なくとも1つの外因性核酸;(b)単離されたメチニコビア種のキシリトールデヒドロゲナーゼを減弱させるか又は不活化する遺伝子修飾;及び(c)キシローストランスポーターをコードする少なくとも1つの外因性核酸又は単離されたメチニコビア種のキシローストランスポーターの過剰発現をもたらす少なくとも1つの外因性核酸を有する単離されたメチニコビア種である。
【００７４】
いくつかの実施態様において、キシローストランスポーターをコードする外因性核酸又は該外因性核酸の導入によって過剰発現されるキシローストランスポーターは、本明細書に記載される例示的なキシローストランスポーターのうちの1つである。例えば、いくつかの実施態様において、該キシローストランスポーターは、配列番号27〜40のいずれか1つから選択されるアミノ酸配列を有する。したがって、いくつかの実施態様において、キシロースレダクターゼは、配列番号27のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様において、キシロースレダクターゼは、配列番号28のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様において、キシロースレダクターゼは、配列番号29のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様において、キシロースレダクターゼは、配列番号30のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様において、キシロースレダクターゼは、配列番号31のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様において、キシロースレダクターゼは、配列番号32のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様において、キシロースレダクターゼは、配列番号33のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様において、キシロースレダクターゼは、配列番号34のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様において、キシロースレダクターゼは、配列番号35のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様において、キシロースレダクターゼは、配列番号36のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様において、キシロースレダクターゼは、配列番号37のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様において、キシロースレダクターゼは、配列番号38のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様において、キシロースレダクターゼは、配列番号39のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様において、キシロースレダクターゼは、配列番号40のアミノ酸配列を有する。
【００７５】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載される単離されたメチニコビア種に導入されるキシローストランスポーターは、本明細書に記載されるキシローストランスポーターの変異体である。そのような変異体は、依然として、該キシローストランスポーターの機能的活性を保持する。例えば、いくつかの実施態様において、該キシローストランスポーターは、配列番号27〜40のいずれか1つのアミノ酸配列を有し、ここで、該アミノ酸配列は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、又は25個のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を含む。本明細書に提供されるキシローストランスポーターの変異体は、例えば、参照ポリペプチド配列と比較したとき、欠失、融合、又は切断も含む。したがって、いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるキシローストランスポーターは、配列番号27〜40のいずれか1つと少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも71％、少なくとも72％、少なくとも73％、少なくとも74％、少なくとも75％、少なくとも76％、少なくとも77％、少なくとも78％、少なくとも79％、少なくとも80％、少なくとも81％、少なくとも82％、少なくとも83％、少なくとも84％、少なくとも85％、少なくとも86％、少なくとも87％、少なくとも88％、少なくとも89％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有する。具体的な実施態様において、該キシローストランスポーターは、配列番号27〜36のいずれか1つのアミノ酸配列又は配列番号27〜36のいずれか1つと少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも71％、少なくとも72％、少なくとも73％、少なくとも74％、少なくとも75％、少なくとも76％、少なくとも77％、少なくとも78％、少なくとも79％、少なくとも80％、少なくとも81％、少なくとも82％、少なくとも83％、少なくとも84％、少なくとも85％、少なくとも86％、少なくとも87％、少なくとも88％、少なくとも89％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、もしくは100％同一であるアミノ酸配列を有する。
【００７６】
本明細書に提供されるキシロースレダクターゼ及びキシローストランスポーターは、それぞれ、本明細書に示されるアミノ酸配列を有するH0メチニコビア属種に由来するものを含む、メチニコビアキシロースレダクターゼ又はメチニコビアトランスポーター、及びそのそれぞれの機能(例えば、キシロースからキシリトールへの変換又はキシロース輸送)を保持するその変異体であることができる。例えば、本明細書に提供されるのは、配列番号11のアミノ酸配列を有するH0メチニコビア属種由来のXyl1、及びXyl1の酵素機能を保持するのその変異体である。Xyl1の酵素機能には、限定されないが、キシロースからキシリトールへの変換を触媒することが含まれ、これは、例えば、該変異体を本明細書に記載されているか又はそれ以外の形で当技術分野で公知のアッセイに供することにより決定することができる。別の例として、本明細書に提供されるのは、配列番号27のアミノ酸配列を有するH0メチニコビア属種由来のXyt1、及びXyt1のトランスポーター機能を保持するその変異体である。Xyt1のトランスポーター機能には、限定されないが、細胞壁及び/又は細胞膜内外へのキシロースの輸送が含まれ、これは、例えば、該変異体を本明細書に記載されているか又はそれ以外の形で当技術分野で公知のトランスポーターアッセイに供することにより決定することができる。
【００７７】
キシロースレダクターゼ機能は、例えば、キシロースレダクターゼをメチニコビア種で発現させ、該メチニコビア種によるキシリトール生産の増加を測定することにより決定することができる。同様に、キシローストランスポーター機能は、例えば、該トランスポーターをメチニコビア種で発現させ、該メチニコビア種によるキシロース取込みの増加を測定することにより決定することができる。例示的なアッセイにおいて、キシロースレダクターゼ及び/又はキシローストランスポーターをコードする内在性核酸を過剰発現するメチニコビア種をキシロース含有培地中で培養し、培養培地中のキシロースの減少及び/又は該培地中のキシリトールの増加を高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により測定することができる。別の例示的なアッセイにおいて、キシロースレダクターゼ及び/又はキシローストランスポーターを発現する野生型及び組換えメチニコビア種のスターター培養物を、グルコース及びキシロースの量(％; w/v)が制御されたYEP塩基培地中で成長させることができる。接種されていない培地を所与のサンプリング時間の間の参照として使用し;該培地は、0時間の時点での100％の出発キシロース又はキシロースを示す。24時間の間隔で、300〜1000μLの容量の試料を培養物から無菌的に除去し、0.2μmシリンジフィルターに通して濾過し、培地と酵母を物理的に分離することができる。培地をガラスバイアルに移すことができ、キシロース及びキシリトール含有量をHPLCによって調べることができる。キシロースレダクターゼ及び/又はキシローストランスポーターを発現する組換えメチニコビア種は、その野生型対応物よりも高速でキシロースを消費し、かつキシリトールを生産することができ、野生型メチニコビア種と組換えメチニコビア種の違いは、変異体のキシロースレダクターゼ及び/又はキシローストランスポーター機能を示すことができる。
【００７８】
本明細書に記載されるように、提供される組換えメチニコビア種は、キシロースからキシリトールを生産することができるキシリトール経路を含むように修飾することができる。その修飾が該キシリトール経路の少なくとも1つの酵素をコードする異種外因性核酸配列の導入を含む場合、該酵素のコード配列は、宿主のコドン利用に従って修飾することができる。標準的な遺伝コードは、例えば、Osawaらの文献、Microbiol Rev. 56(1):229-64(1992)に概説されているように、当技術分野で周知である。限定されないが、出芽酵母、カンジダ・アジマ(Candida azyma)、カンジダ・ジベルサ(Candida diversa)、カンジダ・マグノリアエ(Candida magnoliae)、カンジダ・ルゴペリクローサ(Candida rugopelliculosa)、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)、及びジゴアスクス・ヘレニクス(Zygoascus hellenicus)を含む、酵母種は、標準的なコードを使用する。ある種の酵母種は別のコードを使用する。例えば、「Leu」に対する標準的なコードである「CUG」は、「CUG」クレード種、例えば、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・シリンドラセア(Candida cylindracea)、カンジダ・メリビオシカ(Candida melibiosica)、カンジダ・パラプシローシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・ルゴセ(Candida rugose)、ピキア・スティピティス(Pichia stipitis)、及びメチニコビア種では、「Ser」をコードする。H0メチニコビア属種のDNAコドン表が、本明細書に提供されている。非「CUG」クレード種由来の外来遺伝子におけるDNAコドンCTGは、メチニコビア種におけるタンパク質の機能的発現のために、TTG、CTT、CTC、TTA、又はCTAに変更される必要がある。他のコドン最適化は、メチニコビア種における外来遺伝子のタンパク質発現の増大をもたらすことができる。コドン最適化の方法は、当技術分野で周知であり(例えば、Chungらの文献、BMC Syst Biol. 6:134(2012); Chinらの文献、Bioinfomatics 30(15):2210-12(2014))、様々なツールが利用可能である(例えば、https://www.dna20.com/services/genegpsのDNA2.0;及びhttp://genomes.urv.es/OPTIMIZERのOPTIMIZER)。
【００７９】
いくつかの実施態様において、単離されたメチニコビア種は、本明細書に記載される1コピー以上の外因性核酸を有することができる。いくつかの実施態様において、該メチニコビア種は、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、又はそれより多くのコピーの外因性核酸を有する。本明細書に記載される複数の外因性核酸の発現は、メチニコビア種へのキシロース取込み及び/又はキシロースからキシリトールへの変換をさらに改善することができる。したがって、該メチニコビア種は、各々キシローストランスポーター及び/又はキシロースレダクターゼをコードする、少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、又は少なくとも10の外因性核酸を有することができる。いくつかの実施態様において、該メチニコビア種は、各々キシローストランスポーター及び/又はキシロースレダクターゼをコードする少なくとも2つの外因性核酸を有する。いくつかの実施態様において、該メチニコビア種は、各々キシローストランスポーター及び/又はキシロースレダクターゼをコードする少なくとも3つの外因性核酸を有する。いくつかの実施態様において、該メチニコビア種は、各々キシローストランスポーター及び/又はキシロースレダクターゼをコードする少なくとも4つの外因性核酸を有する。いくつかの実施態様において、該メチニコビア種は、各々キシローストランスポーター及び/又はキシロースレダクターゼをコードする少なくとも5つの外因性核酸を有する。いくつかの実施態様において、該メチニコビア種は、各々キシローストランスポーター及び/又はキシロースレダクターゼをコードする少なくとも6つの外因性核酸を有する。いくつかの実施態様において、該メチニコビア種は、各々キシローストランスポーター及び/又はキシロースレダクターゼをコードする少なくとも7つの外因性核酸を有する。いくつかの実施態様において、該メチニコビア種は、各々キシローストランスポーターをコードする少なくとも8つの外因性核酸を有する。いくつかの実施態様において、該メチニコビア種は、各々キシローストランスポーター及び/又はキシロースレダクターゼをコードする少なくとも9つの外因性核酸を有する。いくつかの実施態様において、該メチニコビア種は、各々キシローストランスポーター及び/又はキシロースレダクターゼをコードする少なくとも10の外因性核酸を有する。
【００８０】
いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種は、キシロースからキシリトールを生産するための1以上のキシリトール経路を有することができる。該キシリトール経路は、内在性経路又は外因性経路であることができる。本明細書に提供されるメチニコビア種は、キシリトールの生産のための1以上のキシリトール経路に関与する酵素又はタンパク質のうちの1つ又は複数をコードする発現可能な核酸をさらに有することができる。どの酵素又はタンパク質がメチニコビア種にとって内在性であるかに応じて、特定のキシリトール経路のいくつか又は全てのための核酸を発現させることができる。いくつかの実施態様において、該メチニコビア種は、キシロースからキシリトールを生産し、かつキシリトールを天然に生産するためのキシリトール経路の全ての酵素の内在性発現を有することができ、これは、キシリトール経路の酵素又はタンパク質(例えば、キシローストランスポーター又はキシロースレダクターゼ)の発現をさらに修飾し又は増大させることにより改善することができる。いくつかの実施態様において、該メチニコビア種は、所望のキシリトール経路のための1以上の酵素又はタンパク質が欠損している可能性があり、その場合、欠損している酵素又はタンパク質に代わる発現可能な核酸が後続の外因性発現のためにメチニコビア種に導入される。或いは、該メチニコビア種がいくつかの経路遺伝子の内在性発現を示すが、その他のものが欠損している場合、キシリトールの生合成を達成するために、欠損している酵素又はタンパク質の代わりにコード核酸が必要とされる。したがって、組換えメチニコビア種は、所望のキシリトール経路を得るための外因性酵素もしくはタンパク質活性をさらに含むことができるか、又は1以上の内在性酵素もしくはタンパク質と一緒に、キシリトールを生産する1以上の外因性酵素もしくはタンパク質活性を導入することにより、所望のキシリトール経路を得ることができる。
【００８１】
本明細書に提供されるメチニコビア種は、安定な遺伝子改変を含有することができ、これは、該改変を失うことなく、5世代よりも長い間培養することができる微生物を指す。通常、安定な遺伝子改変には、10世代よりも長く持続する修飾が含まれ、特に安定な修飾は、約25世代よりも長く持続し、より具体的には、遺伝子修飾は、無限を含めて、50世代よりも長いものである。
【００８２】
酵素又はタンパク質を減弱させるか又は不活化する遺伝子修飾の場合、特に有用で安定な遺伝子改変は遺伝子欠失である。安定な遺伝子改変を導入するための遺伝子欠失の使用は、遺伝子改変前の表現型の復帰の可能性を低下させるために特に有用である。例えば、安定な成長と連動したキシリトールの生産は、例えば、キシリトールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の欠失によって達成することができる。安定な成長と連動したキシリトールの生産の安定性は、各々の破壊された活性について起こる複数の代償性復帰の可能性を顕著に低下させる複数の欠失(例えば、所与の遺伝子の両方のアレルの欠失)によってさらに強化することができる。
【００８３】
当業者は、本明細書に例示される代謝的修飾を含む遺伝子改変が、好適な宿主生物、例えば、本明細書に提供されるメチニコビア種及びその対応する代謝反応又は所望の遺伝物質、例えば、所望の代謝経路の遺伝子のための好適な供給源生物を参照して説明されていることを理解するであろう。しかしながら、多種多様な生物の完全なゲノムシークエンシング及びゲノミクスの領域における高度な技術を考慮して、当業者は、本明細書に提供される教示及び指針を本質的に全ての他の生物に容易に適用することができるであろう。例えば、本明細書に例示される代謝的改変は、言及された種以外の種由来の同じ又は類似のコード化核酸を組み込むことにより、他の種に容易に適用することができる。そのような遺伝子改変には、例えば、種ホモログ一般、特に、オーソログ、パラログの遺伝子改変、又は非オーソロガス遺伝子置換が含まれる。
【００８４】
オーソログは、垂直血統によって関連付けられ、異なる生物において実質的に同じ又は同一の機能に関与している遺伝子(単数又は複数)である。例えば、マウスエポキシドヒドロラーゼとヒトエポキシドヒドロラーゼは、エポキシドの加水分解の生物学的機能についてオーソログとみなすことができる。遺伝子は、例えば、それらが相同であるか、又は共通の祖先からの進化によって関連することを示すのに十分な量の配列類似性を共有する場合に垂直血統によって関連付けられる。遺伝子はまた、3次元構造を共有するが、一次配列類似性が確認できない程度に共通の祖先から進化していることを示すのに十分な量の配列類似性を必ずしも共有しない場合、オーソログとみなすことができる。オーソロガスである遺伝子は、約25％〜100％のアミノ酸配列同一性の配列類似性を有するタンパク質をコードすることができる。25％未満のアミノ酸類似性を共有するタンパク質をコードする遺伝子は、それらの3次元構造も類似性を示す場合に、垂直血統によって生じたとみなすこともできる。組織プラスミノーゲン活性化因子及びエラスターゼを含む、セリンプロテアーゼファミリーの酵素のメンバーは、共通の祖先からの垂直血統によって生じたとみなされる。
【００８５】
オーソログには、例えば、進化を通じて、構造又は全体的な活性が分岐した遺伝子又はそのコードされた遺伝子産物が含まれる。例えば、1つの種が2つの機能を示す遺伝子産物をコードする場合及びそのような機能が第二の種において異なる遺伝子に分離している場合、これら3つの遺伝子及びその対応する産物は、オーソログとみなされる。生化学的化合物の生産のために、当業者は、導入又は破壊されるべき代謝活性を保有するオーソロガス遺伝子が本明細書に提供されるメチニコビア種の構築のために選択されることになることを理解しているであろう。分離可能な活性を示すオーソログの例は、異なる活性が2以上の種間で又は単一の種内で異なる遺伝子産物に分離している場合である。具体的な例は、エラスターゼタンパク質分解及びプラスミノーゲンタンパク質分解という2種類のセリンプロテアーゼ活性がプラスミノーゲン活性化因子及びエラスターゼとして異なる分子に分離していることである。第二の例は、マイコプラズマ5'-3'エキソヌクレアーゼ及びドロソフィラ(Drosophila)DNAポリメラーゼIII活性の分離である。第一の種由来のDNAポリメラーゼを第二の種由来のエキソヌクレアーゼもしくはポリメラーゼのどちらか又はその両方に対するオーソログとみなすことができ、そしてその逆も同様である。
【００８６】
対照的に、パラログは、例えば、重複とその後の進化的分岐によって関連付けられるホモログであり、類似又は共通しているが、同一ではない機能を有する。パラログは、例えば、同じ種もしくは異なる種に由来するか又はこれらから派生することができる。例えば、ミクロソームエポキシドヒドロラーゼ(エポキシドヒドロラーゼI)と可溶性エポキシドヒドロラーゼ(エポキシドヒドロラーゼII)は、異なる反応を触媒し、かつ同じ種において異なる機能を有する、共通の祖先から共進化した2つの異なる酵素を表すので、パラログとみなすことができる。パラログは、互いに顕著な配列類似性を有する同じ種由来のタンパク質であり、それが相同であるか、又は共通の祖先からの共進化によって関連付けられることを示唆している。パラロガスなタンパク質ファミリーの群としては、HipAホモログ、ルシフェラーゼ遺伝子、ペプチーダーゼ、及びその他のものが挙げられる。
【００８７】
非オーソロガス遺伝子置換は、異なる種における言及された遺伝子機能と置き換わることができる1つの種由来の非オーソロガス遺伝子である。置換は、例えば、異なる種における言及された機能と比較して起源の種において実質的に同じ又は同様の機能を果たすことができることを含む。通常、非オーソロガス遺伝子置換は、言及された機能をコードする既知の遺伝子と構造的に関連があるものとして同定可能であるが、構造的にあまり関連はないが、機能的に類似している遺伝子及びその対応する遺伝子産物もやはり、それが使用される場合の用語の意味に含まれる。機能的類似性は、例えば、置換しようとする機能をコードする遺伝子と比較して非オーソロガス遺伝子産物の活性部位又は結合領域における少なくともある程度の構造的類似性を必要とする。それゆえ、非オーソロガス遺伝子には、例えば、パラログ又は無関係な遺伝子が含まれる。
【００８８】
それゆえ、生合成能力を有する本明細書に提供されるメチニコビア種を同定及び構築する際に、当業者は、本明細書に提供される教示及び指針を特定の種に適用して、代謝的修飾の同定がオーソログの同定及び包含又は不活化を含むことができるということを理解するであろう。パラログ及び/又は非オーソロガス遺伝子置換が同様の又は実質的に同様の代謝反応を触媒する酵素をコードする言及された微生物に存在する限りにおいて、当業者は、これらの進化的に関連のある遺伝子を利用することもできる。遺伝子破壊についても同様に、進化的に関連する遺伝子を宿主微生物おいて破壊するか又は欠失させて、破壊の標的とされる酵素活性の機能的冗長性を低下又は消失させることができる。
【００８９】
オーソログ、パラログ、及び非オーソロガス遺伝子置換は、当業者に周知の方法によって決定することができる。例えば、2つのポリペプチドについての核酸又はアミノ酸配列の調査により、比較された配列間の配列同一性及び類似性が明らかになるであろう。そのような類似性に基づいて、当業者は、これらのタンパク質が共通の祖先からの進化によって関連付けられることを示すほど類似性が十分に高いかどうかを決定することができる。当業者に周知のアルゴリズム、例えば、Align、BLAST、Clustal W、及びその他のものは、未加工の配列の類似性又は同一性を比較及び決定し、また、加重又はスコアを割り当てることができる配列中のギャップの存在又は重要性を決定する。そのようなアルゴリズムも当技術分野で公知であり、ヌクレオチド配列の類似性又は同一性を決定するために同様に適用される。関連性を決定するための十分な類似性のパラメータは、統計的類似性、又はランダムなポリペプチドにおける類似の一致を発見する見込み、及び決定された一致の有意性を計算するための周知の方法に基づいて計算される。2以上の配列のコンピュータ比較は、望ましい場合、当業者によって視覚的に最適化されることもできる。関連する遺伝子産物又はタンパク質は、高い類似性、例えば、25％〜100％の配列同一性を有すると考えることができる。関連のないタンパク質は、十分なサイズのデータベースをスキャンしても、偶然に起こると考えられるもの(約5％)と本質的に同じである同一性を有することがある。5％〜24％の配列は、比較された配列が関連しているという結論を下すのに十分な相同性を表す場合もあるし、表さない場合もある。データセットのサイズを考慮して、そのような一致の有意性を決定するためのさらなる統計解析を実施して、これらの配列の関連性を決定することができる。
【００９０】
例えば、BLASTアルゴリズムを用いて2以上の配列の関連性を決定するための例示的なパラメータは、以下に記載されているようなものであることができる。簡潔に述べると、アミノ酸配列アラインメントは、BLASTPバージョン2.0.8(Jan-05-1999)及び以下のパラメータ:マトリクス: 0 BLOSUM62;ギャップ開始: 11;ギャップ伸長: 1; x_dropoff: 50;期待: 10.0;文字サイズ: 3;フィルター:オンを用いて実施することができる。核酸配列アラインメントは、BLASTNバージョン2.0.6(Sept-16-1998)及び以下のパラメータ:マッチ: 1;ミスマッチ: -2;ギャップ開始: 5;ギャップ伸長: 2; x_dropoff: 50;期待: 10.0;文字サイズ: 11;フィルター:オフを用いて実施することができる。当業者は、例えば、比較のストリンジェンシーを増加又は減少させて、2以上の配列の関連性を決定するために、どの修正を上記のパラメータに対して行うことができるかを知っているであろう。
【００９１】
本明細書に提供されるのは、本明細書に記載される単離されたメチニコビア種を用いてキシリトールを生産する方法である。そのような方法は、キシリトールを生産するためのキシリトール経路を有する単離されたメチニコビア種を、キシロースからキシリトールを生産するための条件下で、かつそれに十分な期間培養することを含むことができる。したがって、いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、キシリトールを生産する方法であって:(a)キシロースレダクターゼをコードする少なくとも1つの外因性核酸又は単離されたメチニコビア種のキシロースレダクターゼの過剰発現をもたらす少なくとも1つの外因性核酸;及び(b)単離されたメチニコビア種のキシリトールデヒドロゲナーゼを減弱させるか又は不活化する遺伝子修飾を有する単離されたメチニコビア種を、キシロースからキシリトールを生産するための条件下で、かつそれに十分な期間培養することを含む、方法である。
【００９２】
本明細書に提供される方法は、特定の速度及び/又は濃度でのキシリトールの生産を含む。したがって、いくつかの実施態様において、本明細書に提供される方法は、少なくとも0.50g/L/hの速度でキシロースからキシリトールを生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される方法は、少なくとも0.60g/L/hの速度でキシロースからキシリトールを生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される方法は、少なくとも0.70g/L/hの速度でキシロースからキシリトールを生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される方法は、少なくとも0.80g/L/hの速度でキシロースからキシリトールを生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される方法は、少なくとも0.90g/L/hの速度でキシロースからキシリトールを生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される方法は、少なくとも1.00g/L/hの速度でキシロースからキシリトールを生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される方法は、少なくとも1.50g/L/hの速度でキシロースからキシリトールを生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される方法は、少なくとも2.00g/L/hの速度でキシロースからキシリトールを生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される方法は、少なくとも2.50g/L/hの速度でキシロースからキシリトールを生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される方法は、少なくとも3.00g/L/hの速度でキシロースからキシリトールを生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される方法は、少なくとも3.50g/L/hの速度でキシロースからキシリトールを生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される方法は、少なくとも4.00g/L/hの速度でキシロースからキシリトールを生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される方法は、少なくとも5.00g/L/hの速度でキシロースからキシリトールを生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される方法は、少なくとも6.00g/L/hの速度でキシロースからキシリトールを生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される方法は、少なくとも7.00g/L/hの速度でキシロースからキシリトールを生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される方法は、少なくとも8.00g/L/hの速度でキシロースからキシリトールを生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される方法は、少なくとも9.00g/L/hの速度でキシロースからキシリトールを生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される方法は、少なくとも10.00g/L/hの速度でキシロースからキシリトールを生産する。
【００９３】
いくつかの実施態様において、本明細書に提供される方法は、少なくとも75g/Lの濃度でキシロースからキシリトールを生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される方法は、少なくとも80g/Lの濃度でキシロースからキシリトールを生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される方法は、少なくとも85g/Lの濃度でキシロースからキシリトールを生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される方法は、少なくとも90g/Lの濃度でキシロースからキシリトールを生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される方法は、少なくとも95g/Lの濃度でキシロースからキシリトールを生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される方法は、少なくとも100g/Lの濃度でキシロースからキシリトールを生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される方法は、少なくとも110g/Lの濃度でキシロースからキシリトールを生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される方法は、少なくとも120g/Lの濃度でキシロースからキシリトールを生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される方法は、少なくとも130g/Lの濃度でキシロースからキシリトールを生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される方法は、少なくとも140g/Lの濃度でキシロースからキシリトールを生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される方法は、少なくとも150g/Lの濃度でキシロースからキシリトールを生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される方法は、少なくとも160g/Lの濃度でキシロースからキシリトールを生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される方法は、少なくとも170g/Lの濃度でキシロースからキシリトールを生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される方法は、少なくとも180g/Lの濃度でキシロースからキシリトールを生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される方法は、少なくとも190g/Lの濃度でキシロースからキシリトールを生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される方法は、少なくとも200g/Lの濃度でキシロースからキシリトールを生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される方法は、少なくとも250g/Lの濃度でキシロースからキシリトールを生産する。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される方法は、少なくとも300g/Lの濃度でキシロースからキシリトールを生産する。
【００９４】
本明細書に記載されるメチニコビア種のいずれかを、キシリトールを生産及び/又は分泌するように培養することができる。例えば、本明細書に提供されるメチニコビア種は、キシリトールの生合成的生産のために培養することができる。したがって、いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、キシリトールを含有する培養培地である。いくつかの態様において、該培養培地は、キシリトールを生産したメチニコビア種から分離することもできる。培養培地から微生物を分離する方法は、当技術分野で周知である。例示的な方法としては、濾過、綿状沈殿、沈殿、遠心分離、沈降などが挙げられる。
【００９５】
キシリトールの生産のために、本明細書に提供されるメチニコビア種は、炭素源及び他の必須栄養素を含む培地中で培養される。いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるメチニコビア種は、好気的培養培地中で培養される。好気的培養は、回分培養、流加培養、又は連続培養であることができ、ここで、培地中の溶存酸素は50％飽和を上回る。いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるメチニコビア種は、実質的に嫌気的な培養培地中で培養される。本明細書に記載されるように、キシリトールの生合成を達成するための1つの例示的な成長条件には、嫌気的培養又は発酵条件が含まれる。ある実施態様において、本明細書に提供されるメチニコビア種は、嫌気的又は実質的に嫌気的な条件下で維持し、培養し、又は発酵させることができる。簡潔に述べると、嫌気的条件は、酸素がない環境を指す。実質的に嫌気的な条件には、例えば、培地中の溶存酸素濃度が0〜10％飽和であり続けるような培養、回分発酵、又は連続発酵が含まれる。実質的に嫌気的な条件には、細胞を1％酸素未満の雰囲気で維持された密閉チャンバー内部の液体培地中又は固形寒天上で成長又は休止させることも含まれる。酸素のパーセントは、例えば、培養物に、N2/CO2混合物又は他の好適な非酸素ガス(単数又は複数)をスパージすることにより維持することができる。
【００９６】
全工程の費用を低下させるために、発酵槽中の嫌気的条件を維持することが望ましい場合がある。そのような条件は、例えば、まず培地に窒素をスパージし、その後、フラスコをセプタム及びクリンプキャップで密閉することにより得ることができる。嫌気的には成長が観察されない株については、セプタムに制限通気用の小さい穴を開けることにより、微好気的又は実質的に嫌気的な条件を適用することができる。例示的な嫌気的条件は、以前に記載されており、かつ当技術分野で周知である。例示的な好気的及び嫌気的条件は、例えば、2007年8月10日に出願された米国公開第2009/0047719号に記載されている。発酵は、本明細書に開示されているように、回分的に、流加的に、又は連続的に実施することができる。発酵は、望ましい場合、2段階で実施することもできる。第一段階を好気的にして、高成長、したがって、高生産性を可能にし、その後、高収率の嫌気的段階にすることができる。
【００９７】
望ましい場合、塩基、例えば、NaOHもしくは他の塩基、又は酸を必要に応じて添加して、培養培地を所望のpHに維持することにより、培地のpHを、約5.5〜6.5のpHなどの所望のpHに維持する。成長速度は、分光光度計(600nm)を用いて光学密度を測定することにより決定することができ、キシロース取込み速度は、炭素源枯渇を経時的にモニタリングすることにより決定することができる。
【００９８】
本明細書に提供されるメチニコビア種のための培養培地は、唯一の炭素源として又は本明細書に記載されるもしくは当技術分野で公知の1以上の共基質と組み合わせて、キシロースを含むことができる。該培養培地は、他の栄養補助剤、例えば、酵母抽出物及び/又はペプトンをさらに含むことができる。該培養培地は、例えば、炭素源をメチニコビア種に供給することができる任意の他の炭水化物源をさらに含むことができる。そのような源としては、例えば:他の糖、例えば、セロビオース、ガラクトース、グルコース、エタノール、アセテート、アラビトール、ソルビトール、及びグリセロールが挙げられる。したがって、該培養培地は、キシロース及び共基質のグルコースを含むことができる。該培養培地は、キシロース及び共基質のセロビオースを含むことができる。該培養培地は、キシロース及び共基質のガラクトースを含むことができる。該培養培地は、キシロース及び共基質のグリセロールを含むことができる。該培養培地は、グルコースとキシロースとセロビオースの組合せを含むことができる。該培養培地は、グルコースとキシロースとガラクトースの組合せを含むことができる。該培養培地は、グルコースとキシロースとグリセロールの組合せを含むことができる。該培養培地は、キシロースとセロビオースとガラクトースとグリセロールの組合せを含むことができる。
【００９９】
培養培地は、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、又はそれより多くの量の炭素源(w/v)を有することができる。いくつかの実施態様において、培養培地は、2％の炭素源を有することができる。いくつかの実施態様において、培養培地は、4％の炭素源を有することができる。いくつかの実施態様において、培養培地は、10％の炭素源を有することができる。いくつかの実施態様において、培養培地は、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、又はそれより多くの量のキシロース(w/v)を有することができる。培養培地は、1％のキシロースを有することができる。培養培地は、2％のキシロースを有することができる。培養培地は、3％のキシロースを有することができる。培養培地は、4％のキシロースを有することができる。培養培地は、5％のキシロースを有することができる。培養培地は、6％のキシロースを有することができる。培養培地は、7％のキシロースを有することができる。培養培地は、8％のキシロースを有することができる。培養培地は、9％のキシロースを有することができる。培養培地は、10％のキシロースを有することができる。培養培地は、11％のキシロースを有することができる。培養培地は、12％のキシロースを有することができる。培養培地は、13％のキシロースを有することができる。培養培地は、14％のキシロースを有することができる。培養培地は、15％のキシロースを有することができる。培養培地は、16％のキシロースを有することができる。培養培地は、17％のキシロースを有することができる。培養培地は、18％のキシロースを有することができる。培養培地は、19％のキシロースを有することができる。培養培地は、20％のキシロースを有することができる。
【０１００】
いくつかの実施態様において、キシロースは、唯一の炭素源ではない。例えば、いくつかの実施態様において、培地は、キシロース及びC3炭素源、C4炭素源、C5炭素源、C6炭素源、又はこれらの組合せを含む。したがって、いくつかの実施態様において、培地は、キシロース及びC3炭素源(例えば、グリセロール)を含む。いくつかの実施態様において、培地は、キシロース及びC4炭素源(例えば、エリトロース又はトレオース)を含む。いくつかの実施態様において、培地は、キシロース及びC5炭素源(例えば、アラビトール、リボース、又はリキソース)を含む。いくつかの実施態様において、培地は、キシロース及びC6炭素源(例えば、グルコース、ガラクトース、マンノース、アロース、アルトース、グロース、及びイドース)を含む。その代わりに又はそれに加えて、いくつかの実施態様において、培地は、キシロース並びにセロビオース、ガラクトース、グルコース、アラビトール、ソルビトール、及びグリセロール、又はこれらの組合せを含む。具体的な実施態様において、培地は、キシロース及びグルコースを含む。培地中の2以上の炭素源の量は、独立に、1％〜20％(例えば、1％〜20％キシロース及び1％〜20％グルコース)、又はその代わりに、2％〜14％(例えば、2％〜14％キシロース及び2％〜14％グルコース)、又はその代わりに、4％〜10％(例えば、4％〜10％キシロース及び4％〜10％)の範囲であることができる。具体的な実施態様において、炭素源の各々の量は、2％(例えば、2％キシロース及び2％グルコース)である。
【０１０１】
培養培地は、五炭素糖(例えば、キシロース)を主要炭素源として含む、C5が豊富な培地であることができる。培養培地は、C6糖(六炭素糖)も有することができる。いくつかの実施態様において、培養培地は、C6糖を主要炭素源として有する。いくつかの実施態様において、C6糖はグルコースである。培養物は、C6糖とC5糖の両方を炭素源として有することができ、かつ様々な比で存在するC6糖及びC5糖を有することができる。いくつかの実施態様において、培養培地中のC6糖の量とC5糖の量の比(C6:C5比)は、約10:1〜約1:20である。例えば、培養培地中のC6:C5比は、約10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、又は1:20であることができる。いくつかの実施態様において、培養培地中のC6:C5比は、約3:1である。いくつかの実施態様において、培養培地中のC6:C5比は、約1:1である。いくつかの実施態様において、培養培地中のC6:C5比は、約1:5である。いくつかの実施態様において、培養培地中のC6:C5比は、約1:10である。C5糖はキシロースであることができ、C6糖はグルコースであることができる。いくつかの実施態様において、培養培地中のグルコースの量とキシロースの量の比(グルコース:キシロース比)は、約20:1〜約1:10である。例えば、培養培地中のグルコース:キシロース比は、約20:1、19:1、18:1、17:1、16:1、15:1、14:1、13:1、12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、又は1:10であることができる。いくつかの実施態様において、培養培地中のグルコース:キシロース比は、約3:1である。いくつかの実施態様において、培養培地中のグルコース:キシロース比は、約1:1である。いくつかの実施態様において、培養培地中のグルコース:キシロース比は、約1:5である。いくつかの実施態様において、培養培地中のグルコース:キシロース比は、約1:10である。
【０１０２】
炭水化物の他の源としては、例えば、再生可能原料及びバイオマスが挙げられる。本明細書に提供される方法における原料として用いることができる例示的なタイプのバイオマスとしては、セルロース系バイオマス及びヘミセルロース系バイオマスの原料又は原料部分が挙げられる。そのようなバイオマス原料は、例えば、炭素源として有用な炭水化物基質、例えば、キシロース、グルコース、アラビノース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、及びデンプンを含有する。本明細書に提供される教示及び指針を考慮すると、当業者は、上で例示されたもの以外の再生可能原料及びバイオマスも、キシリトールの生産用の本明細書に提供される微生物を培養するために使用することができることを理解するであろう。
【０１０３】
したがって、本明細書に提供される教示及び指針を考慮すると、当業者は、炭素源としてのキシロース上で成長させたときにキシリトールを分泌するメチニコビア種を作製することができることを理解するであろう。必要なのは、必要とされる酵素又はタンパク質活性の1つ又は複数を操作して、例えば、キシリトールを生産するための生合成経路のいくつか又は全ての包含を含めて、キシリトールの生合成を達成することだけである。さらに、遺伝子修飾を操作して、キシリトールから別の化合物への変換をさらに触媒する酵素、例えば、キシリトールデヒドロゲナーゼを減弱させるか又は不活化するメチニコビア種にすることができる。したがって、本明細書に提供されるのは、炭水化物、例えば、キシロース、又は他の炭素源上で成長させたときにキシリトールを生産及び/又は分泌するメチニコビア種である。
【０１０４】
本明細書に提供されるメチニコビア種を、本明細書に例示される当技術分野で周知の方法を用いて構築して、本明細書に記載されるキシリトール経路の酵素又はタンパク質をコードする少なくとも1つの核酸をキシロースからキシリトールを生産するのに十分な量で外因性に発現させることができる。本明細書に提供されるメチニコビア種は、キシリトールを生産するのに十分な条件下で培養されることが理解される。本明細書に提供される教示及び指針に従って、本明細書に提供されるメチニコビア種は、所望の化合物の生合成を達成し、約0.1〜200mM又はそれを上回る細胞内濃度を生じることができる。通常、所望の化合物の細胞内濃度は、約3〜150mM、特に、約5〜125mM、より特には、約10mM、20mM、50mM、80mM、又はそれを上回るものを含む、約8〜100mMである。これらの例示的な範囲の各々の間及びそれを上回る細胞内濃度も、本明細書に提供されるメチニコビア種から達成することができる。
【０１０５】
いくつかの実施態様において、培養条件には、嫌気的又は実質的に嫌気的な成長又は維持条件が含まれる。例示的な嫌気的条件は以前に記載されており、かつ当技術分野で周知である。発酵プロセスの例示的な嫌気的条件は本明細書に記載されており、かつ例えば、米国公開第2009/0047719号に記載されている。これらの条件のいずれかを、メチニコビア種及び当技術分野で周知の他の嫌気的条件とともに利用することができる。そのような嫌気的又は実質的に嫌気的な条件下において、生産者株は、5〜10mM又はそれを上回る細胞内濃度及び本明細書に例示される他の全ての濃度で所望の化合物を合成することができる。上の説明は細胞内濃度に言及しているにもかかわらず、生産微生物は、所望の化合物を細胞内で生産し、かつ/又は該化合物を培養培地中に分泌することができることが理解される。
【０１０６】
本明細書に提供される方法は、当技術分野で周知の任意の培養プロセス、例えば、回分培養、流加培養、又は連続培養を含むことができる。そのようなプロセスは、発酵を含むことができる。例示的な発酵プロセスは、限定されないが、流加発酵と回分分離;流加発酵と連続分離;及び連続発酵と連続分離を含む。例示的な回分発酵プロトコルにおいて、生産生物を、適当なガスがスパージされた好適なサイズのバイオリアクターで成長させる。嫌気的条件下では、培養物に、不活性ガス又はガスの組合せ、例えば、窒素、N2/CO2混合物、アルゴン、ヘリウムなどをスパージする。細胞が成長し、炭素源を利用するにつれて、炭素源及び/又は栄養素の消費とほぼ見合うようにする速度で、追加の炭素源及び/又は他の栄養素をバイオリアクターに供給する。バイオリアクターの温度は、所望の温度、通常、22〜37℃の範囲で維持するが、生産生物の成長特性及び/又は発酵プロセスのための所望の条件に応じて、この温度をより高い又はより低い温度で維持することができる。成長は、所望の期間続いて、発酵槽中での培養物の所望の特性、例えば、細胞密度、化合物濃度などを達成する。回分発酵プロセスにおいて、発酵の期間は、所望の培養条件に応じて、通常、数時間から数日間の範囲、例えば、8〜24時間、又は1、2、3、4、もしくは5日間、又は最大1週間である。pHは、所望により、制御しても制御しなくてもよく、その場合、pHが制御されない培養物は、通常、連続運転の終わりまでに、pH 5〜6まで増加又は減少する。培養期間の終了時に、発酵槽の内容物を、細胞分離ユニット、例えば、遠心分離器、濾過ユニットなどに通して、細胞及び細胞残渣を除去することができる。所望の化合物を細胞内で発現させる場合、さらなる化合物を放出させるために、細胞を、所望により、発酵ブロスから細胞を分離する前又は後に、酵素的に又は化学的に溶解又は破壊することができる。発酵ブロスを化合物分離ユニットに移すことができる。化合物の単離を当技術分野で利用される標準的な分離手順によって行い、所望の化合物を希釈水溶液から分離する。そのような方法としては、発酵プロセスの化合物の化学的特性に応じて、水不混和性有機溶媒(例えば、トルエン又は限定されないが、ジエチルエーテル、酢酸エチル、テトラヒドロフラン(THF)、塩化メチレン、クロロホルム、ベンゼン、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、石油エーテル、メチル3級ブチルエーテル(MTBE)、ジオキサン、ジメチルホルムアミド(DMF)、ジメチルスルホキシド(DMSO)などを含む、他の好適な溶媒)を用いて、化合物の有機溶液を提供する液液抽出、適切な場合、標準的な蒸留法などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０７】
例示的な完全連続発酵プロトコルにおいて、所望の細胞密度を達成するために、生産生物を、通常は、まず回分モードで成長させる。炭素源及び/又は他の栄養素が使い尽くされたとき、同じ組成のフィード培地を所望の速度で連続的に供給し、発酵液を同じ速度で回収する。そのような条件下では、バイオリアクター中の化合物濃度及び細胞密度は、通常、一定のままである。上で論じられているように、発酵槽の温度を所望の温度で維持する。連続発酵段階では、通常、最適化された生産のために好適なpH範囲を維持することが望ましい。所望のpH範囲を維持するための好適な酸又は塩基の添加を含む、ルーチンの方法を用いて、pHをモニタリング及び維持することができる。バイオリアクターを、長期間、通常、必要に応じてかつ所望により、少なくとも1週間から数週間、及び最大1カ月、又はそれより長い間、連続的に操作する。発酵液及び/又は培養物を、所望により、最大毎日のサンプリングを含め、定期的にモニタリングして、化合物濃度及び/又は細胞密度の不変性を保証する。連続モードでは、新しいフィード培地が供給されるときに、発酵槽の内容物を常に除去する。細胞を含有する出口ストリーム、培地、及び生成物を、通常、連続的な化合物分離手順に供し、所望により、細胞及び細胞残渣の除去を伴う又は伴わない。当技術分野で利用される連続分離法を用いて、希釈水溶液から化合物を分離することができ、該連続分離法には、水不混和性有機溶媒(例えば、トルエン又は限定されないが、ジエチルエーテル、酢酸エチル、テトラヒドロフラン(THF)、塩化メチレン、クロロホルム、ベンゼン、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、石油エーテル、メチル3級ブチルエーテル(MTBE)、ジオキサン、ジメチルホルムアミド(DMF)、ジメチルスルホキシド(DMSO)などを含む、他の好適な溶媒)を用いる連続液液抽出、標準的な連続蒸留法など、又は当技術分野で周知の他の方法が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０８】
本明細書に開示される培養及び発酵条件に加えて、所望の化合物の生合成を達成するための成長条件は、培養条件への浸透圧保護剤の追加を含むことができる。ある実施態様において、本明細書に提供されるメチニコビア種を、浸透圧保護剤の存在下で、本明細書に記載されている通りに維持し、培養し、又は発酵させることができる。簡潔に述べると、浸透圧保護剤は、オスモライトとして作用し、かつ本明細書に記載される微生物が浸透圧ストレスを切り抜けるのを助ける化合物を指す。浸透圧保護剤としては、ベタイン、アミノ酸、及び糖トレハロースが挙げられるが、これらに限定されない。そのようなものの非限定的な例は、グリシンベタイン、プラリン(praline)ベタイン、ジメチルテチン、ジメチルスルホニオプロプリオネート(dimethylslfonioproprionate)、3-ジメチルスルホニオ-2-メチルプロプリオネート、ピペコリン酸、ジメチルスルホニオアセテート、コリン、L-カルニチン、及びエクトインである。一態様において、浸透圧保護剤は、グリシンベタインである。本明細書に記載される微生物を浸透圧ストレスから保護するのに好適な浸透圧保護剤の量及び種類は、使用される微生物によって決まることが当業者に理解される。培養条件下の浸透圧保護剤の量は、例えば、約0.1mM以下、約0.5mM以下、約1.0mM以下、約1.5mM以下、約2.0mM以下、約2.5mM以下、約3.0mM以下、約5.0mM以下、約7.0mM以下、約10mM以下、約50mM以下、約100mM以下、又は約500mM以下であることができる。
【０１０９】
培養条件は、例えば、液体培養法並びに発酵及び他の大規模培養法を含むことができる。本明細書に記載されるように、生合成生成物の特に有用な収率を、好気的、嫌気的、又は実質的に嫌気的な培養条件下で得ることができる。
【０１１０】
本明細書に記載される培養条件を所望の化合物の製造のためにスケールアップし、連続的に成長させることができる。例示的な成長法は、例えば、流加発酵と回分分離;流加発酵と連続分離、又は連続発酵と連続分離を含む。これらのプロセスは全て、当技術分野で周知である。発酵法は、商業量の所望の生成物の生合成的生産に特に有用である。一般に、かつ非連続培養法の場合、連続的及び/又はほぼ連続的な生産は、本明細書に提供される微生物を、対数期における成長を持続及び/又はほぼ持続させるのに十分な栄養素及び培地中で培養することを含む。そのような条件下の連続培養は、例えば、1日、2日、3日、4日、5日、6日、もしくは7日間、又はそれより長い間の成長又は培養を含むことができる。さらに、連続培養は、1週間、2週間、3週間、4週間、もしくは5週間、又はそれより長い週間、及び最大数カ月間というより長い期間を含むことができる。或いは、特定の用途に好適である場合、本明細書に提供される生物を数時間培養することができる。連続的及び/又はほぼ連続的な培養条件は、これらの例示的な期間の中間の全ての時間間隔も含むことができることが理解されるべきである。本明細書に提供される微生物の培養時間は、所望の目的のために十分な量の化合物を生産するのに十分な期間であることがさらに理解される。
【０１１１】
相当な量のキシリトールの連続生産を用いる本明細書に提供されるメチニコビア種を用いる上記の発酵法に加えて、生物由来化合物を、例えば、化学合成法及び/もしくは酵素法に同時に供して、キシリトールを他の化合物に変換することもでき、又は望ましい場合、生物由来キシリトールを発酵培養物から分離して、順次、化学的変換及び/又は酵素的変換に供して、キシリトールを他の化合物に変換することができる。
【０１１２】
より優れた生産者を作製するために、代謝モデリングを利用して、成長条件を最適化することができる。モデリングを用いて、経路の利用をさらに最適化する遺伝子ノックアウトを設計することもできる(例えば、米国特許公開US 2002/0012939号、US 2003/0224363号、US 2004/0029149号、US 2004/0072723号、US 2003/0059792号、US 2002/0168654号、及びUS 2004/0009466号、並びに米国特許第7,127,379号を参照)。モデリング解析は、細胞成長に対するより効率的な所望の生成物の生産への代謝の移行の効果の確実な予測を可能にする。
【０１１３】
いくつかの実施態様において、生物由来キシリトールを生産するための本明細書に提供される方法は、当技術分野で周知の種々の方法を用いて、生物由来キシリトールを培養物中の他の成分から分離することをさらに含む。そのような分離方法としては、例えば、抽出法、並びに連続液液抽出、浸透気化、膜濾過、膜分離、逆浸透、電気透析、蒸留、結晶化、遠心分離、抽出濾過、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、限外濾過、活性炭吸着、pH調節、及び沈殿、又は上に列挙された1以上の方法の組合せを含む方法が挙げられる。上記の方法は全て、当技術分野で周知である。
【０１１４】
本明細書に提供されるのは、本明細書に記載される生物由来キシリトールである。そのような生物由来キシリトールは、いくつかの実施態様において本明細書に記載されるメチニコビア種によって生産される。また、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載されるメチニコビア種によって生産される生物由来キシリトール、及び追加成分を有する組成物である。該生物由来化合物以外の成分は、細胞性部分、例えば、培養培地の微量の細胞性部分であることができるか、或いは本明細書に提供されるメチニコビア種の存在下で生産される発酵ブロスもしくは培養培地又はその精製もしくは部分精製画分であることができる。したがって、いくつかの実施態様において、該組成物は培養培地である。いくつかの実施態様において、培養培地は、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種が除去された培養培地であることができる。該組成物は、例えば、本明細書に提供されるメチニコビア種によって生産されるとき、低レベルの副生成物を有することができる。該組成物は、例えば、生物由来キシリトール及び本明細書に提供されるメチニコビア種の細胞溶解物又は培養上清を有することができる。追加成分は、副生成物又は不純物、例えば、グリセロール、アラビトール、C7糖アルコール、又はこれらの組合せであることができる。副生成物は、グリセロールであることができる。副生成物は、アラビトールであることができる。副生成物は、C7糖アルコール(例えば、ボレミトール又はその異性体)であることができる。いくつかの実施態様において、副生成物又は不純物(例えば、グリセロールもしくはアラビトール、又はその両方)は、本明細書に提供される単離されたメチニコビア種以外の微生物によって生産されるそれぞれの副生成物又は不純物の量よりも少なくとも10％、20％、30％、又は40％多い。
【０１１５】
いくつかの実施態様において、本明細書に提供される組成物は、生物由来キシリトール及び追加成分を有することができる。追加成分は、発酵ブロス又は培養培地であることができる。追加成分は、発酵ブロス又は培養培地の上清であることができる。追加成分は、発酵ブロス又は培養培地の細胞性部分であることができる。追加成分は、本明細書に提供されるメチニコビア種であることができる。追加成分は、本明細書に提供されるメチニコビア種の細胞溶解物であることができる。追加成分は、副生成物、例えば、グリセロール、アラビトール、C7糖アルコール、又はこれらの組合せであることができる。
【０１１６】
いくつかの実施態様において、炭素原料及び他の細胞取込み源、例えば、ホスフェート、アンモニア、スルフェート、塩化物、及び他のハロゲンを選んで、本明細書に提供される微生物によって生産される生物由来キシリトール中に存在する原子の同位体分布を変化させることができる。様々な炭素原料及び上に列挙された他の取込み源は、本明細書において、「取込み源」と総称される。取込み源は、本明細書に提供される微生物によって生産される生物由来キシリトール中に、又は副生成物もしくは不純物中に存在する任意の原子の同位体濃縮をもたらすことができる。同位体濃縮は、例えば、炭素、水素、酸素、窒素、硫黄、リン、塩化物又は他のハロゲンを含む、任意の標的原子について達成することもできる。
【０１１７】
いくつかの実施態様において、取込み源を選択して、炭素-12、炭素-13、及び炭素-14比を変化させることができる。いくつかの実施態様において、取込み源を選択して、酸素-16、酸素-17、及び酸素-18比を変化させることができる。いくつかの実施態様において、取込み源を選択して、水素、重水素、及び三重水素比を変化させることができる。いくつかの実施態様において、取込み源を選択して、窒素-14及び窒素-15比を変化させることができる。いくつかの実施態様において、取込み源を選択して、硫黄-32、硫黄-33、硫黄-34、及び硫黄-35比を変化させることができる。いくつかの実施態様において、取込み源を選択して、リン-31、リン-32、及びリン-33比を変化させることができる。いくつかの実施態様において、取込み源を選択して、塩素-35、塩素-36、及び塩素-37比を変化させることができる。
【０１１８】
いくつかの実施態様において、1以上の取込み源を選択することにより、標的原子の同位体比を所望の比まで変化させることができる。取込み源は、自然界に見られるような天然源に、又は人工源に由来することができ、当業者は、天然源、人工源、又はこれらの組合せを選択して、標的原子の所望の同位体比を達成することができる。人工取込み源の例としては、例えば、少なくとも部分的に化学合成反応に由来する取込み源が挙げられる。そのような同位体濃縮取込み源を市販で購入するかもしくは実験室で調製し、かつ/又は任意に取込み源の天然源と混合して、所望の同位体比を達成することができる。いくつかの実施態様において、取込み源の標的原子同位体比は、自然界に見られる取込み源の所望の源を選択することにより達成することができる。例えば、本明細書で論じられているように、天然源は、生物に由来するかもしくは生物によって合成される生物ベースのもの、又は石油系生成物もしくは大気などの源であることができる。いくつかのそのような実施態様において、炭素の源を、例えば、化石燃料由来の炭素源(これは、炭素-14が相対的に枯渇している可能性がある)、又はCO2などの環境もしくは大気の炭素源(これは、その石油由来の対応物よりも多くの量の炭素-14を保有する可能性がある)から選択することができる。
【０１１９】
不安定な炭素同位体である炭素-14又は放射性炭素は、地球の大気中の炭素原子の約1012個に1個を構成し、かつ約5700年の半減期を有する。炭素のストックは、高層大気中で、宇宙線及び通常の窒素(14N)が関与する核反応によって補充される。炭素-14は、ずっと以前に崩壊したので、化石燃料は、炭素-14を含有しない。化石燃料の燃焼は、大気の炭素-14の割合を低下させる(いわゆる、「スース効果」)。
【０１２０】
化合物中の原子の同位体比を決定する方法は、当業者に周知である。同位体濃縮は、当技術分野で公知の技法を用いる質量分析、例えば、加速質量分析(AMS)、安定同位体比質量分析(SIRMS)、及び核磁気共鳴による位置特異的天然同位体分画(SNIF-NMR)によって容易に評価される。そのような質量スペクトル法を、例えば、液体クロマトグラフィー(LC)、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、及び/又はガスクロマトグラフィーなどの分離法と統合することができる。
【０１２１】
炭素の場合、ASTM D6866は、米国材料試験協会(American Society for Testing and Materials)(ASTM)インターナショナルによる放射性炭素年代測定を用いて、固体、液体、及び気体試料の生物ベースの含有量を決定する標準的な分析方法として米国で開発された。標準は、生成物の生物ベースの含有量の決定への放射性炭素年代測定の使用に基づいている。ASTM D6866は、2004年に最初に発表され、この標準の現在活用されているバージョンは、ASTM D6866-11である(2011年4月1日に有効となった)。本明細書に記載されているものを含めて、放射性炭素年代測定法は、当業者に周知である。
【０１２２】
化合物の生物ベースの含有量は、炭素-14(14C)と炭素-12(12C)の比によって推定される。具体的には、現在の割合(Fm)は、式: Fm=(S-B)/(M-B)(式中、B、S、及びMは、それぞれ、ブランク、試料、及び現在の参照物質の14C/12C比を表す)から計算される。現在の割合は、「現在」からの試料の14C/12C比の偏差の測定値である。現在は、δ13CVPDB=-19/milに対して標準化された、米国規格基準局(National Bureau of Standards)(NBS)シュウ酸I(すなわち、標準参照物質(SRM) 4990b)の(AD 1950年の)放射性炭素濃度の95％と定義される(Olssonの文献、標準物質としてのシュウ酸の使用(The use of Oxalic acid as a Standard)、放射性炭素による偏差及び絶対年代(Radiocarbon Variations and Absolute Chronology)、ノーベル財団シンポジウム、第12回議事録(Nobel Symposium, 12th Proc.)、John Wiley & Sons, New York(1970)に所収)。例えば、ASMにより測定された質量分析の結果は、δ13CVPDB=-19/milに対して標準化されたNBSシュウ酸I(SRM 4990b)の比放射能の0.95倍という国際的に合意された定義を用いて計算される。これは、1.176±0.010×10-12の絶対的な(AD 1950年の)14C/12Cの比と同等である(Karlenらの文献、Arkiv Geofysik, 4:465-471(1968))。標準的な計算には、ある同位体の別の同位体に関する示差取込み、例えば、12C＞13C＞14Cという生物学的系における優先的な取込みが考慮に入れられており、これらの補正は、δ13について補正されたFmとして反映されている。
【０１２３】
シュウ酸標準物質(SRM 4990b又はHOx1)は、1955年のサトウダイコンの作物から作製された。1000ポンドが作製されたが、このシュウ酸標準物質はもはや市販されていない。シュウ酸II標準物質(HOx2; N.I.S.T表記SRM 4990C)は、1977年のフランス甜菜(French beet)の作物の糖蜜から作製された。1980年代初期に、12の研究室のグループが、2つの標準物質の比を測定した。シュウ酸II対1の放射能の比は、1.2933±0.001(加重平均)である。HOxIIの同位体比は、-17.8/milである。ASTM D6866-11は、現在の標準物質に、入手可能なシュウ酸II標準物質SRM 4990C(Hox2)の使用を提案している(Mannの文献、Radiocarbon, 25(2):519-527(1983)中のもとのシュウ酸標準物質対現在入手可能なシュウ酸標準物質の考察を参照)。Fm=0％は、材料中に炭素-14原子が完全に欠けていることを表し、したがって、化石(例えば、石油系)炭素源を示す。1950年以降の核爆弾実験による大気中への炭素-14の注入について補正した後のFm=100％は、完全に現在の炭素源を示す。本明細書に記載されるように、そのような「現在の」源には、生物ベースの源が含まれる。
【０１２４】
ASTM D6866に記載されているように、現在の炭素のパーセント(pMC)が100％よりも大きくなることがある。これは、ASTM D6866-11に記載されているような大気中の炭素-14の相当な濃縮をもたらした1950年代の核実験プログラムの効果が減少しているものの持続しているからである。全ての試料の炭素-14放射能が「爆弾前」の標準物質を基準とするので、及びほとんど全ての新しい生物ベースの生成物が爆弾後の環境中に生成されるので、試料の本当の生物ベースの含有量をより良好に反映するために、(同位体割合について補正した後の)全てのpMC値に0.95(2010年時点)を乗じなければならない。103％よりも大きい生物ベースの含有量は、分析誤差が生じているか、又は生物ベースの炭素の源が数年以上古いものであるかのいずれかであることを示唆している。
【０１２５】
ASTM D6866により、材料の全有機含有量と比べた生物ベースの含有量が定量され、存在する無機炭素及び他の非炭素含有物質は考慮されない。例えば、50％がデンプン系材料であり、かつ50％が水である生成物であれば、ASTM D6866に基づいて、生物ベースの含有量＝100％(100％生物ベースである50％有機含有量)を有するとみなされる。別の例では、50％がデンプン系材料であり、25％が石油系であり、25％が水である生成物であれば、生物ベースの含有量＝66.7％を有する(75％有機含有量であるが、生成物の50％しか生物ベースでない)。別の例では、50％が有機炭素であり、かつ石油系生成物である生成物であれば、生物ベースの含有量＝0％を有するとみなされる(50％有機炭素であるが、化石源由来である)。したがって、化合物又は材料の生物ベースの含有量を決定するための周知の方法及び既知の標準物質に基づいて、当業者は、生物ベースの含有量を容易に決定すること、及び/又は所望の生物ベースの含有量を有する本明細書に提供されるものを利用する下流の生成物を調製することができる。
【０１２６】
材料の生物ベースの含有量を定量するための炭素-14年代測定法の適用は、当技術分野で公知である(Currieらの文献、Nuclear Instruments and Methods in Physics Research B, 172:281-287(2000))。例えば、炭素-14年代測定を用いて、テレフタレート含有材料中の生物ベースの含有量が定量されている(Colonnaらの文献、Green Chemistry, 13:2543-2548(2011))。とりわけ、再生可能な1,3-プロパンジオール及び石油由来テレフタル酸から誘導されたポリプロピレンテレフタレート(PPT)ポリマーからは、30％に近いFm値が得られた(すなわち、ポリマー炭素の3/11が再生可能な1,3-プロパンジオールに由来し、8/11が化石の端成分であるテレフタル酸に由来するため)(Currieらの文献、上記、2000))。対照的に、再生可能な1,4-ブタンジオールと再生可能なテレフタル酸の両方から誘導されたポリブチレンテレフタレートポリマーからは、90％を超える生物ベースの含有量が得られた(Colonnaらの文献、上記、2011)。
【０１２７】
したがって、いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、環境の炭素とも呼ばれる、大気中の炭素の取込み源を反映する炭素-12、炭素-13、及び炭素-14の比を有する生物由来キシリトールである。例えば、いくつかの態様において、該生物由来キシリトールは、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、又は100％と同程度のFm値を有することができる。いくつかのそのような実施態様において、該取込み源はCO2である。いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、石油系炭素取込み源を反映する炭素-12、炭素-13、及び炭素-14の比を有する生物由来キシリトールである。この態様において、本明細書に提供される生物由来キシリトールは、95％未満、90％未満、85％未満、80％未満、75％未満、70％未満、65％未満、60％未満、55％未満、50％未満、45％未満、40％未満、35％未満、30％未満、25％未満、20％未満、15％未満、10％未満、5％未満、2％未満、又は1％未満のFm値を有することができる。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される生物由来キシリトールは、大気中の炭素の取込み源と石油系取込み源との組合せによって得られる炭素-12、炭素-13、及び炭素-14の比を有することができる。そのような取込み源の組合せの使用は、炭素-12、炭素-13、及び炭素-14の比を変動させることができる1つの方法であり、それぞれの比は、取込み源の割合を反映している。
【０１２８】
さらに、本明細書に提供されるのは、生物由来キシリトールに由来する生成物でもあり、ここで、該生物由来キシリトールは、環境中に生じるCO2とほぼ同じ値の炭素-12、炭素-13、及び炭素-14同位体比を有する。例えば、いくつかの態様において、本明細書に提供されるのは、環境中に生じるCO2とほぼ同じ値の炭素-12対炭素-13対炭素-14同位体比、又は本明細書に開示される他の比のいずれかを有する本明細書に記載される生物由来キシリトールを有する生物ベースの生成物である。本明細書に開示されるように、生成物は、環境中に生じるCO2とほぼ同じ値の炭素-12対炭素-13対炭素-14同位体比、又は本明細書に開示される比のいずれかを有することができることが理解され、ここで、該生成物は、本明細書に開示される生物由来キシリトールから生成され、ここで、該生物由来キシリトールは、最終生成物を生成させるために化学修飾される。本明細書に記載されるように、所望の生成物を生成させるために生物由来キシリトールを化学修飾する方法は、当業者に周知である。
【０１２９】
また本明細書に提供されるのは、本明細書に記載されるメチニコビア種によって生産されるか又は本明細書に記載される方法を用いて生産される生物由来キシリトールを有する生物ベースの生成物である。いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載される生物由来キシリトールを用いて生産される生物ベースの生成物である。そのような製造は、生物由来化合物を化学反応させて(例えば、化学的変換、化学的官能化、化学的カップリング、酸化、還元、重合、共重合など)、最終生成物にすることを含むことができる。いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載される生物由来キシリトールを有する生物ベースの生成物である。いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に開示される少なくとも2％、少なくとも3％、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、又は100％生物由来キシリトールを有する生物ベースの生成物である。
【０１３０】
本明細書に提供されるのは、H0メチニコビア属種のキシロースレダクターゼ(Xyl1タンパク質)に関する単離されたポリペプチド及びH0メチニコビア属種のXYL1遺伝子に関する単離された核酸、並びにそのような核酸を含む宿主細胞である。メチニコビア種におけるこの核酸の存在は、本明細書に記載されるようなキシロースからキシリトールを生産することができるメチニコビア種を生じさせることができる。したがって、本明細書に提供されるのは、Xyl1タンパク質又はその変異体のアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチド; Xyl1タンパク質又はその変異体をコードする核酸配列を有する単離された核酸; XYL1の遺伝子の核酸配列を有する単離された核酸;並びにそのような核酸配列を有する及び/又はそのようなタンパク質を発現する宿主細胞である。
【０１３１】
いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、配列番号11のアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチドである。また本明細書に提供されるのは、本明細書に記載されるH0メチニコビア属種のXyl1タンパク質に対する変異体となるアミノ酸配列を有するが、該ポリペプチドの機能的活性を依然として保持する単離されたポリペプチドである。例えば、いくつかの実施態様において、単離されたポリペプチドは、配列番号11のアミノ酸配列を有し、ここで、該アミノ酸配列は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、又は25個のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を含む。本明細書に提供されるタンパク質の変異体は、参照ポリペプチド配列と比較したとき、例えば、欠失、融合、又は切断も含む。したがって、いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単離されたポリペプチドは、配列番号37、40、42、44、46、51、52、55、及び56のいずれか1つと少なくとも95.0％、少なくとも95.1％、少なくとも95.2％、少なくとも95.3％、少なくとも95.4％、少なくとも95.5％、少なくとも95.6％、少なくとも95.7％、少なくとも95.8％、少なくとも95.9％、少なくとも96.0％、少なくとも96.1％、少なくとも96.2％、少なくとも96.3％、少なくとも96.4％、少なくとも96.5％、少なくとも96.6％、少なくとも96.7％、少なくとも96.8％、少なくとも96.9％、少なくとも97.0％、少なくとも97.1％、少なくとも97.2％、少なくとも97.3％、少なくとも97.4％、少なくとも97.5％、少なくとも97.6％、少なくとも97.7％、少なくとも97.8％、少なくとも97.9％、少なくとも98.0％、少なくとも98.1％、少なくとも98.2％、少なくとも98.3％、少なくとも98.4％、少なくとも98.5％、少なくとも98.6％、少なくとも98.7％、少なくとも98.8％、少なくとも98.9％、少なくとも99.0％、少なくとも99.1％、少なくとも99.2％、少なくとも99.3％、少なくとも99.4％、少なくとも99.5％、少なくとも99.6％、少なくとも99.7％、又は少なくとも99.8％同一であるアミノ酸配列を有する。
【０１３２】
本明細書に記載されるXyl1タンパク質の変異体は、保存的アミノ酸置換を含有することもでき、つまり、1以上のアミノ酸をタンパク質の二次及び/又は三次構造を変化させないアミノ酸に置き換えることができる。そのような置換としては、同様の物理化学的特性を有する残基によるアミノ酸の置換、例えば、ある脂肪族残基(Ile、Val、Leu、もしくはAla)の別の残基への置換、又は塩基性残基LysとArgの間、酸性残基GluとAspの間、アミド残基GlnとAsnの間、ヒドロキシル残基SerとTyrの間、又は芳香族残基PheとTyrの間の置換を挙げることができる。表現型に影響しないアミノ酸交換は、Bowieらの文献、Science 247:1306-10(1990)により完全に記載されている。さらに、本明細書に記載されるタンパク質の変異体は、置換、欠失、又は付加が、結果として得られるポリペプチドの機能に影響を及ぼさない限り、タンパク質の機能的領域の外側にアミノ酸配列に対するアミノ酸置換、欠失、又は付加を有するものを含む。これらの置換及び欠失を作製するための技法は、当技術分野で周知であり、例えば、部位特異的突然変異誘発を含む。
【０１３３】
本明細書に提供される単離されたポリペプチドは、その機能を保持する本明細書に記載されるXyl1タンパク質の機能的断片も含む。いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載されるXyl1タンパク質の機能的断片である単離されたポリペプチドである。いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載されるXyl1タンパク質の機能的断片であるポリペプチドをコードする単離された核酸である。いくつかの実施態様において、該単離されたポリペプチドは、該タンパク質の機能を保持する、Xyl1タンパク質(配列番号11)の断片であることができる。
【０１３４】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載されるXyl1タンパク質の変異体は、他の化学的部分、例えば、グリコシル基、ポリエチレングリコール(PEG)基、脂質、ホスフェート、アセチル基などとの共有結合的修飾又は凝集的コンジュゲーションを含む。いくつかの実施態様において、本明細書に記載されるXyl1タンパク質の変異体は、例えば、本明細書に記載されるタンパク質及び別のポリペプチドから形成された融合タンパク質をさらに含む。該融合タンパク質を構築するための付加されるポリペプチドには、本明細書に記載されるタンパク質の精製もしくはオリゴマー化を容易にするもの、又は本明細書に記載されるXyl1タンパク質の安定性及び/もしくは機能を増強するものが含まれる。
【０１３５】
本明細書に記載されるXyl1タンパク質を異種ポリペプチドに融合して、精製を容易にすることができる。多くの利用可能な異種ペプチド(ペプチドタグ)は、融合タンパク質の結合パートナーへの選択的結合を可能にする。ペプチドタグの非限定的な例としては、6-His、チオレドキシン、ヘマグルチニン、GST、及びOmpAシグナル配列タグが挙げられる。異種ペプチドタグを認識し、それに結合する結合パートナーは、金属イオン(例えば、金属親和性カラム)、抗体、抗体断片、又は異種ペプチドに選択的にもしくは特異的に結合して、融合タンパク質の精製を可能にする任意のタンパク質もしくはペプチドを含む、任意の分子又は化合物であることができる。
【０１３６】
本明細書に記載されるXyl1タンパク質を修飾して、オリゴマーの形成を容易にすることもできる。例えば、本明細書に記載されるタンパク質を、オリゴマー化を促進するペプチド部分、例えば、ロイシンジッパー、及び特定の抗体断片ポリペプチド、例えば、Fcポリペプチドと融合することができる。これらの融合タンパク質を調製する技法は公知であり、例えば、WO 99/31241号及びCosmanらの文献、Immunity 14:123-133(2001)に記載されている。Fcポリペプチドとの融合は、プロテインA又はプロテインGカラムでの親和性クロマトグラフィーによる精製を容易にするさらなる利点を提供する。ロイシン-ジッパー(LZ)、例えば、4又は5個のロイシン残基が他のアミノ酸とともに散在することが多い反復ヘプタッドリピートとの融合は、Landschulzらの文献、Science 240:1759-64(1988)に記載されている。
【０１３７】
本明細書に記載されるXyl1タンパク質は、単離された形態で、又は実質的に精製された形態で提供することができる。ポリペプチドは、例えば、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、及びレクチンクロマトグラフィーを含む、既知の方法によって、組換え細胞培養物から回収又は精製することができる。いくつかの実施態様において、タンパク質クロマトグラフィーを精製に利用する。
【０１３８】
いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載されるXyl1タンパク質をコードする外因性核酸を有する組換え微生物である。いくつかの実施態様において、該組換え微生物は、本明細書に記載されるXyl1タンパク質をコードする外因性核酸を有し、ここで、該タンパク質は、1〜25個、1〜20個、1〜15個、1〜10個、又は1〜5個のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を有する。いくつかの実施態様において、該Xyl1タンパク質は、配列番号11のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様において、該Xyl1タンパク質は、配列番号11の1〜10個のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を有し、かつ該タンパク質の機能を保持する。いくつかの実施態様において、該Xyl1タンパク質は、配列番号11の1〜5個のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を有し、かつ該タンパク質の機能を保持する。該組換え微生物は、限定されないが、本明細書に記載されるH0メチニコビア属種を含む、メチニコビア種であることができる。
【０１３９】
本明細書に記載されるXyl1タンパク質は、好適な宿主によって組換え発現させることができる。該タンパク質の異種発現が望ましい場合、特定の遺伝子のコード配列を宿主のコドン使用に従って修飾することができる。標準的な遺伝コードは、例えば、Osawaらの文献、Microbiol Rev. 56(1):229-64(1992)に概説されているように、当技術分野で周知である。限定されないが、出芽酵母、カンジダ・アジマ、カンジダ・ジベルサ、カンジダ・マグノリアエ、カンジダ・ルゴペリクローサ、ヤロウィア・リポリティカ、及びジゴアスクス・ヘレニクスを含む、酵母種は、標準的なコードを使用している。ある種の酵母種は、別のコードを使用している。例えば、「Leu」の標準的なコドンである「CUG」は、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・シリンドラセア、カンジダ・メリビオシカ、カンジダ・パラプシローシス、カンジダ・ルゴセ、ピキア・スティピティス、及びメチニコビア種などの種では、「Ser」をコードする。H0メチニコビア属種をコドン表は、本明細書に提供されている。
【０１４０】
さらに、宿主は、同じ種類のタンパク質の複数の形態が同じ細胞内で発現されるように同じカテゴリーのタンパク質の他の形態を同時に生産することができる。例えば、宿主は、オリゴマーを形成して、同じ糖を輸送することができる異なるキシロースレダクターゼを同時に生産することができる。
【０１４１】
本明細書に記載されるXyl1タンパク質の変異体は、当技術分野で公知の従来の方法により、例えば、オリゴヌクレオチド指向性部位特異的突然変異誘発によって特定の位置に突然変異を導入することにより作製することができる。部位特異的突然変異誘発は、タンパク質工学への情報提供アプローチと考えられており、特定のアミノ酸変化を標的タンパク質の高解像度結晶構造に頼ることができる(Van Den Burgらの文献、PNAS 95:2056-60(1998))。種々のタンパク質工学対象物の部位特異的変化を同定するための計算方法も、当技術分野で公知である(Hellingaの文献、Nature Structural Biology 5:525-27(1998))。
【０１４２】
当技術分野で公知の他の技法としては、非情報提供突然変異誘発法(一般に、「有向進化」と呼ばれる)が挙げられるが、これらに限定されない。有向進化は、ハイスループットスクリーニングと併せて、タンパク質立体構造における統計的に意味のあるバリエーションの試験を可能にする(Arnoldの文献、1998)。有向進化技術としては、Crameriらの文献、Nature 391:288-91(1998)に記載されているものと同様の多様化法、部位飽和突然変異誘発、互い違い伸長プロセス(StEP)(Zhaoらの文献、Nature Biotechnology 16:258-61(1998))、及びDNA合成/再集合(米国特許第5,965,408号)を挙げることができる。
【０１４３】
本明細書に開示されるように、本明細書に記載されるXyl1タンパク質をコードする核酸を宿主生物に導入することができる。場合により、タンパク質の活性を修飾して、所望の生成物の生産を増大させることが望ましいこともある。例えば、タンパク質の活性を増大させる既知の突然変異をコード核酸分子に導入することができる。さらに、最適化の方法を適用して、タンパク質の活性を増大させ、かつ/又は阻害活性を減少させる、例えば、負の調節因子の活性を減少させることができる。
【０１４４】
1つのそのような最適化の方法は、有向進化である。有向進化は、酵素の特性を改善及び/又は改変するために特定の遺伝子を標的とする突然変異の導入を伴う強力なアプローチである。改善及び/又は改変された酵素は、多くの酵素変異体(例えば、＞104個)の自動化スクリーニングを可能にする感度の高いハイスループットスクリーニングアッセイの開発及び実行を通して同定することができる。典型的には、突然変異誘発とスクリーニングの反復ラウンドを実施して、最適化された特性を有する酵素を得る。突然変異誘発のための遺伝子の領域を特定するの支援することができる計算アルゴリズムも開発されており、これは、作製及びスクリーニングされる必要がある酵素変異体の数を顕著に低下させることができる。多様な変異体ライブラリーを作出するのに有効である数多くの有向進化の技術が開発されており(総説については、Hibbertらの文献、Biomol.Eng 22:11-19(2005); Huisman及びLalondeの文献、製薬及びバイオテクノロジー産業における生体触媒作用(Biocatalysis in the pharmaceutical and biotechnology industries)、717〜742ページ(2007)、Patel(編)、CRC Press所収; Otten and Quaxの文献、Biomol.Eng 22:1-9(2005).;並びにSenらの文献、Appl Biochem.Biotechnol 143:212-223(2007)を参照)、これらの方法は、多くの酵素クラスにわたる広範囲の特性の改善に首尾よく適用されている。有向進化の技術によって改善及び/又は改変されている酵素特性としては、例えば:非天然の基質の変換のための選択性/特異性;激しい高温処理のための温度安定性;より低い又はより高いpH条件下におけるバイオプロセシングのためのpH安定性;高い生成物力価を達成することができるような基質又は生成物の公差;非天然の基質を含めるための基質結合性の拡大を含む、結合(Km);生成物、基質、又は主要な中間体による阻害を除去するための阻害(Ki);所望のフラックスを達成するように酵素反応速度を増大させる活性(kcat);タンパク質収率及び全経路フラックスを増大させる発現レベル;好気的な条件下における空気感受性酵素の作動のための酸素安定性;並びに酸素の非存在下における好気的酵素の作動のための嫌気的活性が挙げられる。
【０１４５】
特異的酵素の所望の特性を標的とする遺伝子の突然変異誘発及び多様化のためのいくつかの例示的な方法が開発されている。そのような方法は当業者に周知である。これらのいずれかを用いて、本明細書に記載されるタンパク質の活性を改変及び/又は最適化することができる。そのような方法としては、PCR反応におけるDNAポリメラーゼの忠実度を低下させることにより、ランダムな点突然変異を導入する、EpPCR(Pritchardらの文献、J Theor.Biol. 234:497-509(2005));完全環状プラスミドを鋳型として使用し、最後の2つのヌクレオチドにエキソヌクレアーゼ耐性チオリン酸結合を有するランダムヘキサマーを該プラスミドを増幅させるために使用し、その後、細胞に形質転換し、該細胞内で該プラスミドがタンデムリピートにおいて再環状化されることを除き、epPCRと同様である、エラープローンローリングサイクル増幅(epRCA)(Fujiiらの文献、Nucleic Acids Res. 32:e145(2004);及びFujiiらの文献、Nat. Protoc. 1:2493-2497(2006));典型的には、DnアーゼI又はEndoVなどのヌクレアーゼで2以上の変異体遺伝子を消化して、DNAポリメラーゼの存在下でのアニーリングと伸長のサイクルによって再集合するランダム断片のプールを生成させて、キメラ遺伝子のライブラリーを作出することを伴う、DNA又はファミリーシャフリング(Stemmerの文献、Proc Natl Acad Sci USA 91:10747-10751(1994);及びStemmerの文献、Nature 370:389-391(1994));鋳型プライミングと、その後の変性及び非常に短い期間のアニーリング/伸長(5秒程度の短時間)を含む2段階PCRの反復サイクルを伴う、互い違い伸長(StEP)(Zhaoらの文献、Nat. Biotechnol. 16:258-261(1998));ランダム配列プライマーを用いて、鋳型の異なるセグメントに相補的な多くの短いDNA断片を生成させる、ランダムプライミング組換え(RPR)(Shaoらの文献、Nucleic Acids Res 26:681-683(1998))が挙げられるが、これに限定されない。
【０１４６】
さらなる方法としては、線状化プラスミドDNAを用いて、ミスマッチ修復によって修復されるヘテロ二本鎖を形成する、ヘテロ二本鎖組換え(Volkovの文献、Nucleic Acids Res. 27:e18(1999);及びVolkovらの文献、Methods Enzymol. 328:456-463(2000)); DnアーゼI断片化及び一本鎖DNA(ssDNA)のサイズ分画を利用する、一過性の鋳型上でのランダムなキメラ生成(RACHITT)(Cocoらの文献、Nat. Biotechnol. 19:354-359(2001));鋳型のプールとして使用される一方向のssDNA断片の存在下で、プライマーから一方向に成長する鎖の鋳型スイッチングを伴う、切断された鋳型上での組換え伸長(RETT)(Leeらの文献、J. Molec. Catalysis 26:119-129(2003));縮重プライマー用いて、分子間の組換えを制御する、縮重オリゴヌクレオチド遺伝子シャッフリング(DOGS);(Bergquist及びGibbsの文献、Methods Mol.Biol 352:191-204(2007); Bergquistらの文献、Biomol.Eng 22:63-72(2005); Gibbsらの文献、Gene 271:13-20(2001));対象となる遺伝子又は遺伝子断片の1塩基対の欠失を有するコンビナトリアルライブラリーを作出する、ハイブリッド酵素の作出のための漸増的切断(ITCHY)(Ostermeierらの文献、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:3562-3567(1999);及びOstermeierらの文献、Nat. Biotechnol. 17:1205-1209(1999));ホスホチオエートdNTPを用いて切断を生成させることを除き、ITCHYと同様である、ハイブリッド酵素の作出のためのチオ-漸増的切断(THIO-ITCHY)(Lutzらの文献、Nucleic Acids Res 29:E16(2001)); 2つの遺伝子組換え法であるITCHYとDNAシャッフリングを組み合わせたものである、SCRATCHY(Lutzらの文献、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:11248-11253(2001)); epPCRによって作られた突然変異を、使用可能な活性を保持しているものについてスクリーニング/選択によって追跡する、ランダムドリフト突然変異誘発(RNDM)(Bergquistらの文献、Biomol. Eng. 22:63-72(2005));ホスホチオエートヌクレオチドのランダム組込み及び切断を用いてランダムな長さの断片のプールを作製し、これを鋳型として用いて、イノシンなどの「ユニバーサル」塩基の存在下で伸長させ、イノシン含有相補鎖の複製によって、ランダムな塩基の組込み、及びその結果として、突然変異誘発をもたらすランダム突然変異誘発法である、配列飽和突然変異誘発(SeSaM)(Wongらの文献、Biotechnol. J. 3:74-82(2008); Wongらの文献、Nucleic Acids Res. 32:e26(2004);及びWongらの文献、Anal. Biochem. 341:187-189(2005));「標的の全ての遺伝的多様性」をコードするように設計されたオーバーラップオリゴヌクレオチドを使用し、シャッフルされた子孫について非常に高い多様性を可能にする、合成シャッフリング(Nessらの文献、Nat. Biotechnol. 20:1251-1255(2002)); dUTPの組込みに次ぐ、ウラシルDNAグリコシラーゼ及びその後のピペリジンによる処理との組合せを利用して、エンドポイントDNA断片化を行う、ヌクレオチド交換及び切除技術NexT(Mullerらの文献、Nucleic Acids Res. 33:e117(2005))が挙げられる。
【０１４７】
さらなる方法としては、リンカーを用いて、2つの遠縁の又は関連のない遺伝子間の融合を容易にし、この2つの遺伝子間の様々なキメラを作製して、単一交差ハイブリッドのライブラリーを生じさせる、配列相同性非依存的タンパク質組換え(SHIPREC)(Sieberらの文献、Nat. Biotechnol. 19:456-460(2001));出発材料が、挿入を含有するスーパーコイル二本鎖DNA(dsDNA)プラスミドと所望の突然変異部位で縮重している2つのプライマーとを含む、遺伝子部位飽和突然変異誘発(商標)(GSSM(商標))(Kretzらの文献、Methods Enzymol. 388:3-11(2004));限定された領域を多数の考えられるアミノ酸配列改変で置き換えるための短鎖オリゴヌクレオチドカセットの使用を伴う、コンビナトリアルカセット突然変異誘発(CCM)(Reidhaar-Olsonらの文献、Methods Enzymol. 208:564-586(1991);及びReidhaar-Olsonらの文献、Science 241:53-57(1988));本質的にCCMと同様であり、高い突然変異率のepPCRを用いて、多発点及び多発領域を特定し、その後、CMCMによる伸長を用いて、規定のタンパク質配列空間領域を網羅する、コンビナトリアル多重カセット突然変異誘発(CMCM)(Reetzらの文献、Angew. Chem. Int. Ed Engl. 40:3589-3591(2001)); DNAポリメラーゼIIIの突然変異体サブユニットをコードするmutD5遺伝子を利用する、条件付きts突然変異誘発遺伝子プラスミドにより、選択の間に、ランダムな及び自然の突然変異の頻度の20〜4000倍の増大が可能になり、選択が必要とされない場合は有害な突然変異の蓄積が阻止される、突然変異誘発遺伝子株(Mutator Strains)の技法(Selifonovaらの文献、Appl. Environ. Microbiol. 67:3645-3649(2001)); Lowらの文献、J. Mol. Biol. 260:359-3680(1996))が挙げられる。
【０１４８】
さらなる例示的な方法としては、選択されたアミノ酸のコンビナトリアル突然変異を評価及び最適化する多次元突然変異誘発法である、ルックスルー突然変異誘発(LTM)(Rajpalらの文献、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:8466-8471(2005));遺伝子を一度に多重化するか、又は単一の遺伝子のキメラ(多重突然変異)の大きなライブラリーを作出するために適用することができるDNAシャッフリング法である、遺伝子再集合(Verenium Corporationによって供給されるTunable GeneReassembly(商標)(TGR(商標))技術)、特定のフォールドを有する構造的に規定されタンパク質骨格を固定し、かつ該フォールド及びタンパク質全体のエネルギー性を安定化することができるアミノ酸置換のための配列空間を検索する最適化アルゴリズムであり、通常、既知の3次元構造を有するタンパク質に対して最も効果的に作用する、インシリコタンパク質設計自動化(PDA)(Hayesらの文献、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:15926-15931(2002));並びに構造/機能の知識を用いて、酵素の改良に適した部位を選択すること、Stratagene QuikChange(Stratagene; San Diego CA)などの突然変異誘発法を用いて選択された部位における飽和突然変異誘発を実施すること、所望の特性についてスクリーニング/選択すること、及び改良されたクローンを使用し、別の部位でやり直し、所望の活性が得られるまで反復を継続することを伴う、反復飽和突然変異誘発(ISM)(Reetzらの文献、Nat. Protoc. 2:891-903(2007);及びReetzらの文献、Angew. Chem. Int. Ed Engl. 45:7745-7751(2006))が挙げられる。
【０１４９】
前述の突然変異誘発方法のいずれかを単独又は任意の組合せで使用することができる。さらに、有向進化の方法のいずれか1つ又は組合せを、本明細書に記載されているか又はその他の形で当技術分野で公知の適応進化法と併せて使用することができる。
【０１５０】
本明細書に提供されるのは、本明細書に記載されるXyl1タンパク質をコードする核酸配列及び本明細書に記載されるXYL1遺伝子の特定のコード核酸配列を有する単離された核酸である。本明細書に提供される核酸には、配列表に提供されている核酸配列を有するもの;高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件(例えば、42℃で2.5時間、6×SCC、0.1％SDS)の下で、配列表に提供されている核酸配列にハイブリダイズするもの;及び配列表に提供されている核酸配列と実質的な核酸配列同一性を有するものが含まれる。本明細書に提供される核酸は、翻訳されて、同じアミノ酸配列を産生することができるコドンの等価置換も包含する。また本明細書に提供されるのは、本明細書に記載される核酸を含むベクターである。該ベクターは、宿主微生物での発現に好適な発現ベクターであることができる。該ベクターは、ウイルスベクターであることができる。
【０１５１】
本明細書に提供される核酸には、本明細書に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするもの、及びその機能を保持するその変異体が含まれる。本明細書に提供される核酸は、cDNA、化学合成DNA、PCRによって増幅されるDNA、RNA、又はこれらの組合せであることができる。遺伝コードの縮重のために、2つのDNA配列は、異なっているが、それでも同一のアミノ酸配列をコードすることができる。
【０１５２】
また本明細書に提供されるのは、本明細書に記載されるタンパク質をコードする核酸の有用な断片であり、これには、プローブ及びプライマーが含まれる。そのようなプローブ及びプライマーを、例えば、PCR法で用いて、本明細書に記載されるタンパク質をコードする核酸を増幅するか、又はその存在を、インビトロで並びに解析用のサザンブロット及びノーザンブロットで検出することができる。本明細書に記載されるタンパク質を発現する細胞も、そのようなプローブの使用により同定することができる。そのようなプライマー及びプローブの作製及び使用方法は周知である。
【０１５３】
また本明細書に提供されるのは、本明細書に記載されるタンパク質又は核酸配列の標的mRNA又はDNA配列に結合することができる一本鎖核酸を有するアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドである本明細書に記載されるタンパク質をコードする核酸の断片である。
【０１５４】
本明細書に記載されるタンパク質をコードする核酸は、配列番号によって本明細書に開示される核酸にハイブリダイズする核酸又は配列番号によって本明細書に開示されるアミノ酸配列をコードする核酸分子にハイブリダイズする核酸分子を含むことができる。ハイブリダイゼーション条件は、当業者に周知である極めてストリンジェントな、中等度にストリンジェントな、又は低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件、例えば、本明細書に記載されるものを含むことができる。
【０１５５】
ストリンジェントなハイブリダイゼーションは、ハイブリダイズしたポリヌクレオチドが安定である条件を指す。当業者に知られているように、ハイブリダイズしたポリヌクレオチドの安定性は、ハイブリッドの融点(Tm)に反映される。一般に、ハイブリダイズしたポリヌクレオチドの安定性は、塩濃度、例えば、ナトリウムイオン濃度と温度の関数である。ハイブリダイゼーション反応をより低いストリンジェンシーの条件下で実施し、その後、様々な、しかし、より高いストリンジェンシーで洗浄することができる。ハイブリダイゼーションストリンジェンシーへの言及は、そのような洗浄条件に関連する。極めてストリンジェントなハイブリダイゼーションは、0.018M NaCl中、65℃でハイブリダイズした安定なポリヌクレオチドを形成する核酸配列のみのハイブリダイゼーションを許容する条件を含み、例えば、ハイブリッドが、0.018M NaCl中、65℃で安定でない場合、それは、本明細書で企図されるような、高ストリンジェンシー条件下で安定でない。高ストリンジェンシー条件は、例えば、50％ホルムアミド、5×デンハルト溶液、5×SSPE、0.2％SDS中、42℃でのハイブリダイゼーションと、その後の0.1×SSPE及び0.1％SDS中、65℃での洗浄によって提供されることができる。極めてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件以外のハイブリダイゼーション条件を用いて、本明細書に開示される核酸配列を説明することもできる。例えば、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーションという語句は、50％ホルムアミド、5×デンハルト溶液、5×SSPE、0.2％SDS中、42℃でのハイブリダイゼーションと、その後の0.2×SSPE、0.2％SDS中、42℃での洗浄と同等の条件を指す。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションという語句は、10％ホルムアミド、5×デンハルト溶液、6×SSPE、0.2％SDS中、22℃でのハイブリダイゼーションと、その後の1×SSPE、0.2％SDS中、37℃での洗浄と同等の条件を指す。デンハルト溶液は、1％フィコール、1％ポリビニルピロリドン、及び1％ウシ血清アルブミン(BSA)を含有する。20×SSPE(塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、エチレンジアミド四酢酸(EDTA))は、3M塩化ナトリウム、0.2Mリン酸ナトリウム、及び0.025M(EDTA)を含有する。他の好適な低、中等度、及び高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションバッファー及び条件は、当業者に周知であり、例えば、Sambrookらの文献、分子クローニング:実験室マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)、第3版、Cold Spring Harbor Laboratory, New York(2001);及びAusubelらの文献、分子生物学の最新プロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)、John Wiley and Sons, Baltimore, MD(1999)に記載されている。
【０１５６】
本明細書に提供されるタンパク質をコードする核酸には、配列番号によって本明細書に開示される核酸配列に対する特定のパーセント配列同一性を有するものが含まれる。例えば、核酸分子は、配列番号11から選択される配列に対する少なくとも95.0％、少なくとも95.1％、少なくとも95.2％、少なくとも95.3％、少なくとも95.4％、少なくとも95.5％、少なくとも95.6％、少なくとも95.7％、少なくとも95.8％、少なくとも95.9％、少なくとも96.0％、少なくとも96.1％、少なくとも96.2％、少なくとも96.3％、少なくとも96.4％、少なくとも96.5％、少なくとも96.6％、少なくとも96.7％、少なくとも96.8％、少なくとも96.9％、少なくとも97.0％、少なくとも97.1％、少なくとも97.2％、少なくとも97.3％、少なくとも97.4％、少なくとも97.5％、少なくとも97.6％、少なくとも97.7％、少なくとも97.8％、少なくとも97.9％、少なくとも98.0％、少なくとも98.1％、少なくとも98.2％、少なくとも98.3％、少なくとも98.4％、少なくとも98.5％、少なくとも98.6％、少なくとも98.7％、少なくとも98.8％、少なくとも98.9％、少なくとも99.0％、少なくとも99.1％、少なくとも99.2％、少なくとも99.3％、少なくとも99.4％、少なくとも99.5％、少なくとも99.6％、少なくとも99.7％、もしくは少なくとも99.8％の配列同一性を有することができるか、又は配列番号11から選択される配列と同一である。
【０１５７】
したがって、いくつかの実施態様において、本明細書に提供される単離された核酸は、本明細書に開示されるH0メチニコビア属種のXYL1遺伝子の核酸配列を有する。したがって、いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、XYL1の核酸配列(配列番号11)を有する単離された核酸である。
【０１５８】
また本明細書に提供されるのは、メチニコビア種(例えば、H0メチニコビア属種)でポリペプチドを発現させる方法であり、ここで、該ポリペプチドは、ロイシン(Leu; L)を含む。そのような方法は、ポリペプチドをコードする外因性核酸配列を、該ポリペプチドの発現を可能にする条件下で、メチニコビア種に導入することを含み、ここで、該外因性核酸配列は、本明細書に例示されるように、ロイシンに対するCTGコドンの代わりに、CTT、CTG、CTA、TTA、又はTTGコドンを有する。特定の実施態様において、CTGコドンの代わりのコドンは、TTGである。コード核酸配列に対するそのような修飾を行う方法は、当技術分野で周知である。
【０１５９】
また本明細書に提供されるのは、外因性核酸をメチニコビア種(例えば、H0メチニコビア属種)に導入する方法である。そのような方法は、実施例Iに例示されているような改変された酢酸リチウムプロトコル又はエレクトロポレーションプロトコルである。
【０１６０】
本発明の様々な実施態様の活性に実質的に影響を及ぼさない修飾も本明細書に提供される本発明の定義内に提供されることが理解される。したがって、以下の実施例は、本発明を例示するが、限定しないことが意図される。本出願の全体を通して、様々な刊行物が参照されている。GenBank及びGI番号の公開を含む、これらの刊行物のその全体としての開示は、本発明が関係する技術分野の現状をより完全に説明するために、本出願において、引用により本明細書中に組み込まれる。
【実施例】
【０１６１】
(実施例I)
(H0メチニコビア属種のキシロースからのキシリトールの生産)
本実施例は、キシロースを含有するYEP培地中で培養したとき、H0メチニコビア属種がキシロースからキシリトールを生産することを示している。
【０１６２】
キシロースからのキシリトールの生産を、H0メチニコビア属種について、4％w/v又は10％w/vキシロースが補充された酵母抽出物ペプトン(YEP)培地中でアッセイした。対照として、出芽酵母のワイン酵母M2もアッセイした。
【０１６３】
H0メチニコビア属種の細胞を125mlフラスコ中の50mlのYEP＋4％w/v又は10％w/vキシロース培地中に接種し、120rpmで振盪させながら、30℃インキュベーターで成長させた。1mlの試料を培養物から採取し、細胞を遠心分離により除去した。上清を0.22μmナイロンシリンジフィルターに通して、HPLC試料バイアル中に濾過した。上清中のキシリトール含有量を、水を移動相として0.6ml/分の速度で用いる80℃でのRezex RPM-単糖Pb＋2カラム(Phenomenex)上でのHPLCにより解析した。Agilent G1362A示差屈折率検出器(Agilent)でピークを検出した。
【０１６４】
H0メチニコビア属種は、キシロース依存的経路を介してキシリトールを生産した。例えば、4％キシロース培地中で、H0メチニコビア属種は、5日間で約13.8g/Lのキシリトールを40g/Lのキシロースから生産したのに対し、10％キシロース中では、それは、10日間で約23g/Lのキシリトールを100g/Lのキシロースから生産した(図1)。キシロースが使い果たされたとき、H0メチニコビア属種は、培地中のキシリトールを消費し始めた(図1)。両方の培地中で、出芽酵母M2種は、キシリトールを生産しなかった(図1)。
【０１６５】
(実施例II)
(キシリトール経路を有する組換えメチニコビア種の構築)
実施例Iに例示されているH0メチニコビア属種によるキシリトールの収率及び生産性を増大させるために、キシリトール生産経路をH0メチニコビア属種ゲノム中で修飾した。この修飾には、キシリトールデヒドロゲナーゼ(XDH; 配列番号1)をコードするXYL2遺伝子(配列番号6)を欠失させること、及びキシロースレダクターゼ(XR; 配列番号11)をコードするXYL1遺伝子(配列番号19)を過剰発現させること、及びいくつかの実験においては、キシローストランスポーター(GXF1;配列番号42、又はGXF2  配列番号44)を過剰発現させることが含まれた(図2)。細胞の代謝を支持し、キシロースレダクターゼのための酸化還元バランスを供給するために、共基質を供給した(図2)。
【０１６６】
H0メチニコビア属種のキシリトール経路を改変するために、遺伝子操作用の選択マーカーとして使用可能な抗真菌薬耐性遺伝子を同定する必要があった。まず、既知の様々な抗真菌薬に対するH0メチニコビア属種の感受性を試験した。単一の酵母コロニーを、様々な濃度の抗生物質(50ug/mL、100ug/mL、150ug/mL、200ug/mL、250ug/mL、300ug/mL、350ug/mL、400ug/mL、450ug/mL)を含有する5mlのYPDブロスに接種した。培養物を30℃で2日間好気的に成長させ、600nmにおける培養物の光学密度をアッセイすることにより、成長をモニタリングした。H0メチニコビア属種は、それぞれ、100ug/mLのノーセオスリシン(cloNAT)、300ug/mLのハイグロマイシン、200ug/mLのフレオマイシン、及び400ug/mlのジェネティシンに感受性があると決定された。
【０１６７】
この感受性プロファイルに基づいて、出芽酵母で耐性を提供することが知られている遺伝子−それぞれ、通常、ノーセオスリシン及びハイグロマイシンに対する耐性を提供するnatMX及びhphMX遺伝子をH0メチニコビア属種に導入した。しかしながら、natMX及びhphMX遺伝子の導入は、生存可能なコロニーを生じさせなかった。H0メチニコビア属種は真菌CTGクレード種に属する可能性があると仮定された。このクレード種では、近縁種のC.ルシタニアエ(C.lusitaniae)と同じように(Youngらの文献、2000, Genetics, 155:17-29)、普遍的なロイシンCUGコドンが主にセリンとして翻訳され、ロイシンとしては稀にしか翻訳されない(Santosらの文献、2011, C.R. Bio., 334:607-611)。CTGコドンをロイシンコード化のためにTTGに変更し(表4参照)、H0メチニコビア属種の全ゲノムアノテーションが利用可能でないため、複数のH0メチニコビア属種オープンリーディングフレームから予測されたコドン選好に基づいて、他のコドンを最適化した。
(表4: H0メチニコビア属種のコドン)
【表４】
2020501595.tif 000026
【０１６８】
コドンが最適化された抗生物質の遺伝子配列は、次の通りであった:
【化１】
2020501595.tif 000027
2020501595.tif 000028
2020501595.tif 000029
【０１６９】
改変された酢酸リチウムプロトコル(以下で論じられている)を用いて、PGK1、ADH1、及びTEFプロモーター並びにPGK1ターミネーターの制御下の新しい抗ノーセオスリシン遺伝子(メチニコビアnatMX4を表す、MeNATと命名)(図3)をH0メチニコビア属種に入れて高効率で形質転換し、ノーセオスリシン耐性コロニーを生じさせることに成功した。同じプロトコルを用いて、様々なプロモーター及びターミネーターの制御下のコドン最適化された抗ハイグロマイシン遺伝子(MeHPH)、抗ジェネティシン遺伝子(MeKAN)、及び抗フレオマイシン遺伝子(MeBLE)(図3)を作製し、H0メチニコビア属種に入れて形質転換し、対応する耐性コロニーを生じさせることに成功した。マーカー遺伝子発現カセットの両側には、相同組換えによる特異的なゲノム組込みのためのH0メチニコビア属種遺伝子配列が配置されていた(図3)。隣接する配列の長さは、組込みの効率に影響を及ぼした。H0メチニコビア属種における相同組換えには、少なくとも200塩基のヌクレオチドが必要とされる。
【０１７０】
H0メチニコビア属種を形質転換するために、改変された酢酸リチウムプロトコル及びエレクトロポレーションプロトコルを開発した。改変された酢酸リチウムプロトコルは、以下の工程を含んだ:
1.単一のコロニーをYPDブロスに接種し、30℃で一晩成長させる。
2.酵母細胞をOD600＝0.4までYPDに希釈し、OD600＝1.5〜1.8まで、もう2世代の間(5〜6時間)、成長させる。
3.各々の形質転換について、5〜10 ODの細胞を収集し、それを200μlの前処理溶液(0.1M酢酸リチウム、1×TE pH7.5、及び10mM DTT)に再懸濁させる。細胞を振盪させながら30℃で1時間インキュベートする。
4.細胞を13000rpmで1.5分間の遠心分離によって収集する。細胞を500μlの冷滅菌水で洗浄し、細胞を13000rpmで1.5分間の遠心分離によって収集する。このとき、細胞は形質転換の準備が整っており、4℃で数時間保存することができる。
5.各々の形質転換について、以下の混合物を調製し、細胞に添加する:
50％PEG:                           240μl
1M酢酸リチウム:                    36μl
形質転換されるDNA:                 1〜4μg
10mg/ml精子DNA                     10μl
滅菌H2Oを添加する:                 360μl
6. 1分間ボルテックス処理することにより、細胞を激しく混合する。
7.細胞を、振盪させないで、30℃で30分間インキュベートする。
8.細胞に、42℃で20〜25分間、熱ショックを与える。
9.細胞を収集し、それを1mlのYPDブロスに再懸濁させる。
10.細胞を振盪させながら30℃で1時間インキュベートする(その後、工程11〜14が続く)か、又は細胞を振盪させながら30℃で6時間インキュベートし、細胞を収集し、それを200μlのdH2Oに再懸濁させ、100μlの細胞を選択プレートに直接プレーティングし、30℃で2〜3日間インキュベートする。
11.細胞を収集し、200μlのdH2Oに再懸濁させる。
12. 100μlの細胞をYPDプレートにプレーティングし、30℃で一晩インキュベートする。(必要ならば、2回目のプレーティングのために、残りの100μlの細胞を4℃で取っておく)。
13.細胞を選択プレートにレプリカプレーティングする。
14. 30℃で2〜3日間インキュベートする。
15.複数の抗生物質遺伝子カセットを形質転換する場合、選択プレートは、YPD＋100ug/mLノーセオスリシン(cloNAT)、又は300ug/mLハイグロマイシン、又は200ug/mLフレオマイシン、又は400ug/mlジェネティシン、又はこれらの抗生物質の組合せであることができる。
【０１７１】
エレクトロポレーションプロトコルは、以下の工程を含んだ:
1.単一のコロニーをYPDブロスに接種し、30℃で一晩成長させる。
2.酵母細胞をOD600＝0.4までYPDに希釈し、OD600＝1.5〜1.8まで、もう2世代の間(5〜6時間)、成長させる。
3. 5〜10 ODの細胞を収集し、水で洗浄し、細胞を200μlのLiAC-TE-DTT溶液(0.1M酢酸リチウム、1×TE pH7.5、及び10mM DTT)で処理する。細胞を振盪させながら30℃で1時間インキュベートする。
4.細胞を200μlの1M冷ソルビトールで洗浄し、それを50μlの1M冷ソルビトールに再懸濁させる。
5.細胞を5μl DNA(1〜3μg)と混合する。
6.該混合物を0.2cmの冷えたエレクトロポレーションキュベットの底に添加する。細胞を1.8kV、25μF、200Ωでエレクトロポレートする。
7.直後に、1Mソルビトールを含有する1mlの冷YPDブロスを添加する。30℃で1時間回復させる。
8.細胞を収集し、それを200μlの1Mソルビトールに再懸濁させる。
9. 100μlの細胞をYPD寒天プレートにプレーティングし、該プレートを30℃で一晩インキュベートする。(必要ならば、2回目のプレーティングのために、残りの100μlの細胞を4℃で取っておく)。
10.細胞を選択プレートにレプリカ処理し、30℃で2〜3日間インキュベートする。
【０１７２】
次に、XYL2遺伝子の欠失を実施した。例示的な欠失戦略は、図4に示されている。簡潔に述べると、XYL2のオープンリーディングフレーム(ORF)の最初の309ntを、XYL2の上流及び下流配列に相同な配列が両側に配置された抗真菌薬耐性遺伝子カセットに置き換えた。
【０１７３】
その後、XYL1遺伝子の過剰発現をxyl2欠失株に導入した。H0メチニコビア属種由来のキシロースレダクターゼ遺伝子(XYL1)ORF(配列番号19)をPGK1プロモーター及びターミネーターに連結させた。このXYL1発現カセットを上で論じられているXYL2欠失カセットに挿入した(図5)。
【０１７４】
全てのH0メチニコビア属種遺伝子配列を、New England Biolabs製のQ5高忠実度DNAポリメラーゼを使用することにより、H0メチニコビア属種の酵母ゲノムDNAからPCRによって増幅させた。プライマーを、M.フルクチコラ277の全ゲノムショットガンコンティグ(ANFW01000000)及びH0メチニコビア属種の全ゲノムショットガンコンティグを用いる配列相同性検索によって設計した。H0メチニコビア属種のゲノムから増幅され、かつ上で論じられ、図3〜5に示された欠失及び過剰発現カセット構築のために使用された配列は、次の通りであった:
【化２】
2020501595.tif 000030
2020501595.tif 000031
2020501595.tif 000032
2020501595.tif 000033
【０１７５】
TEFプロモーター及びターミネーター配列は、プラスミドpUG6から増幅された(Guldenerらの文献、1996, Nucleic Acids res., 24:2519-2524)。
【０１７６】
(実施例III)
(セロビオースを共基質として用いる組換えメチニコビア種によるキシロースからのキシリトールの生産)
本実施例は、キシリトール経路を有する組換えメチニコビア種が、キシロース及びセロビオースとともに培養したとき、キシロースからのキシリトールの生産を増大させることを示している。
【０１７７】
キシリトールデヒドロゲナーゼ不活化株は、キシロースを唯一の炭素源として有する培地中で成長することができない(データは示さない)。それゆえに、いくつかの異なる共基質をスクリーニングし、セロビオースが共基質として良好に作用することが分かった(データは示さない)。
【０１７８】
野生型H0メチニコビア属種、xyl2欠失株、及びxyl2欠失＋XYL1過剰発現株を、OD600＝〜10まで、YPD中、30℃で予め成長させた。細胞(120 OD)を収集し、15mlの試験管中の6mlのキシロース＋セロビオース培地溶液に再度接種し、150rpm/分のスピードのローテーターで30℃でインキュベートした。培地は、それぞれ、4％、6％、8％、及び10％(w/v)のキシロース＋半分の量のセルビオース(cellubiose)を含有していた。600μLの試料を解析用に毎回採取し、酵母細胞を遠心分離によって除去した。上清を2μmシリンジフィルターを用いて濾過し、4μlをHPLCによって解析して、キシロース、セロビオース、及びキシリトールを定量した。
【０１７９】
3つの株は全て、若干のキシロースを消費したが、xyl2欠失株(xyl2Δ/xyl2Δ)は、最小量のキシロースを消費し、XYL1の過剰発現をxyl2欠失と併せると(xyl2Δ::XYL1↑/xyl2Δ::XYL1↑)、H0メチニコビア属種が8％キシロース及び4％セロビオースで最も効率的にキシロースを消費するようになった(図6A)。
【０１８０】
野生型H0メチニコビア属種については、キシリトール濃度が増加し、その後、時間経過に沿って減少した。これは、野生型H0メチニコビア属種が、キシロースレダクターゼによってキシロースをキシリトールに変換し、同時にキシリトールデヒドロゲナーゼによってキシリトールからキシルロースへと脱水素した証拠である(図6B)。H0メチニコビア属種の野生型酵母によって生産されたキシリトールの最大量は、4％キシロースから3日間で1.45％、6％キシロースから4日間で2.76％、8％キシロースから5日間で4.23％、及び10％から6日間で5.63％であった(図6A及び6B)。xyl2欠失株によって8日間で生産されたキシリトールの最大量は、4％キシロースから4％、6％キシロースから4.4％、8％キシロースから2.35％、及び10％キシロースから1.25％であり、一方、XYL1の過剰発現をxyl2欠失と併せた株によって8日間で生産されたキシリトールの最大量は、4％キシロースから4％、6％キシロースから6％、8％キシロースから8％、及び10％キシロースから5.1％であった。
【０１８１】
理論によって束縛されるものではないが、高すぎる濃度のキシロースは、キシロースからのキシリトールの生産を阻害するように思われた。例えば、xyl2欠失株は、4％キシロース培地中で全てのキシロースをキシリトールに変換したが、6％キシロースから4.4％、8％キシロースから2.35％、及び10％キシロースから1.25％しか、キシリトールに変換しなかった(図6A及び6B)。また、XYL1の過剰発現をxyl2欠失と併せたものは、80g/Lのキシロースから6日間で79.5g/Lのキシリトールを生産し、そのため、変換率は、0.99gキシリトール/gキシロースであり、容量生産性は0.55g/L/hであった(図6B)。しかしながら、10％キシロース培地では、同じ株が6日間で半分の量のキシロースをキシリトール(5.1％)に変換するに過ぎなかった。したがって、XYL1の過剰発現をxyl2欠失と併せると、H0メチニコビア属種が、セロビオースを共基質として用いて、最大8％のキシロースでキシリトール生産において良好に作用するようになった(図6B)。
【０１８２】
セロビオース代謝は、野生型H0メチニコビア属種で抑制されたが、他の組換えH0メチニコビア属種株によって、キシロースレダクターゼの活性を支持するために利用された(図6C)。培地中にセロビオースが残っていることから、添加されるセロビオースが多すぎたことが示される。
【０１８３】
セロビオースとキシロースの比を1:2から1:3及び1:4に低下させ、1:3(8％キシロースにつき2.4％セロビオース)でより良好に作用することが分かった。これらの実験を50ml培養物中の8％キシロース＋2.4％セロビオース中で繰り返した。XYL1の過剰発現をxyl2欠失と併せたH0メチニコビア属種株は、5日間で80g/Lのキシロースから77.7g/Lのキシリトールを生産し、0.97g/gのキシロースのキシリトール収率及び0.65g/L/hの生産性であった(図7)。
【０１８４】
したがって、H0メチニコビア属種におけるXYL2遺伝子の欠失及びXYL1遺伝子の過剰発現は、セロビオースを共基質として用いて、キシリトールの生産を0.97〜0.99g/gのキシロースの収率及び0.55〜0.65g/L/hの生産性まで増大させた。XYL2遺伝子の欠失及びXYL1遺伝子の過剰発現を有する組換えH0メチニコビア属種を使用することの1つのさらなる利点は、生産用培地がキシロースとセロビオースと水のみからなっていることであり、これにより、簡単な精製及び費用効率の高い生産が可能になる。
【０１８５】
(実施例IV)
(ガラクトースを共基質として用いる組換えメチニコビア種によるキシロースからのキシリトールの生産)
本実施例は、共基質としてのガラクトースの使用がキシリトール経路を有する組換えメチニコビア種におけるキシリトールの生産を顕著に増強することを示している。
【０１８６】
野生型H0メチニコビア属種、xyl2欠失株、及びxyl2欠失＋XYL1過剰発現株を、YPD中、30℃で、OD600＝〜10まで予め成長させた。細胞(120 OD)を収集し、15mlの試験管中の6mlの培地に再度接種し、150rpm/分のスピードのローテーターで30℃で成長させた。培地は、それぞれ、10％、12％、14％、16％、18％、及び20％(w/v)のキシロース＋5分の1量のガラクトースを含有していた。600μLの試料を毎日採取し、細胞を遠心分離によって除去した。上清を2μmシリンジフィルターによって濾過し、4μlをHPLCに適用して、キシロース、セロビオース、及びキシリトールを定量した。
【０１８７】
ガラクトースを共基質として用いることにより、10日以内に、生産されたキシリトールの最大量は、xyl2欠失＋XYL1過剰発現によって、12％キシロース培地から得られた(図8、H0＝野生型; H091＝xyl2Δ/xyl2Δ; H4316＝xyl2Δ::XYL1↑/xyl2Δ::XYL1↑)。xyl2欠失＋XYL1過剰発現株(H4316)は、200g/Lを超えるキシリトールを生産し、0.98g/gの収率及び0.53g/L/hの生産性であった。
【０１８８】
12％キシロース＋4％ガラクトースを用いるさらなる実験は、xyl2欠失株(H091)が6日間で7.6％のキシリトールを生産し、一方、xyl2欠失＋XYL1過剰発現株(H4316)が6日間で120gのキシロースから113gのキシリトールを生産したことを示し(図9)、これは、セロビオースを共基質として用いる改変出芽酵母株による以前に報告された93g/Lのキシリトール生産を超えた(Ohらの文献、2013, Metab. Eng., 15:226-234)。
【０１８９】
キシロースからのキシリトールの生産は、流加法での改変培地の使用によってさらに増大した。野生型H0メチニコビア属種、xyl2欠失株、及びxyl2欠失＋XYL1過剰発現株を、YPD中、30℃で一晩、前培養し、細胞(30 OD)を収集し、15mlの試験管中の4ml H2Oに懸濁させた。2mlの培地(24％キシロース、8％ガラクトース、0.5％酵母抽出物、1％ペプトン、0.05％KH2PO4、0.05％MgSO4、0.05％(NH4)2SO4、及び1％グルコース)を添加し、試験管を30℃で150rpmのスピードの回転ドラムでインキュベートした。500μlの試料をHPLC分析用に採取した。2日目から始めて10日目まで、500μlの生産用培地をサンプリング後に毎日添加した。以前の研究に準拠して、8％キシロースを培地中の初期濃度として使用し、0.5mlの培地を2日目〜10日目まで毎日添加して(流加)、キシロースレベルを3％超かつ8％未満に維持した。
【０１９０】
上記の実験は、少量のグルコース及び他の栄養素の添加により、野生型H0メチニコビア属種及び両方の組換えH0メチニコビア属種株が、キシロースを連続的に消費し、キシリトールを生産することができることを示した(図10A〜10C)。野生型H0メチニコビア属種は、16日間で8.1％のキシリトールを生産し、一方、xyl2欠失突然変異体(H091)は、16日間で20.3％キシリトールを生産し、0.98g/gの収率及び0.53g/L/hの生産性であった。XYL1の過剰発現＋xyl2欠失(H4316)は、xyl2欠失突然変異体と同様のキシリトール生産を示した。17日後、約0.8％のキシロースと1.3％のガラクトースがxyl2欠失株によって培地中に残されており、このことは、ガラクトースをさらに低下させることができることを示している。
【０１９１】
キシロースからのキシリトールの生産は、固形キシロースの再補給によってさらに増大した。野生型H0メチニコビア属種及びxyl2欠失株を、YPD中、30℃で一晩、前培養し、細胞(30 OD)を収集し、125mlフラスコ中の20mlの水に懸濁させた。10mlの培地(24％キシロース、8％ガラクトース、0.5％酵母抽出物、1％ペプトン、0.05％KH2PO4、0.05％MgSO4、0.05％(NH4)2SO4、及び1％グルコース)を添加し、フラスコを、120rpmで振盪させながら、30℃インキュベーター中でインキュベートした。600μlの試料をHPLC分析用に採取して、培地中のキシロース含有量をモニタリングした。上記の培地と同じ比率のキシロース粉末及び他の栄養素を5回フラスコに添加して、キシロース濃度を2％〜10％に維持した。
【０１９２】
上記の実験は、固形キシロースを培地に添加すると、野生型H0メチニコビア属種及びxyl2欠失株がキシロースを連続的に消費し、20日間で、それぞれ、17％(w/v)及び27％(w/v)を超えるキシリトールを生産することができることをを示した(図11)。
【０１９３】
上記のことに基づいて、ガラクトースを共基質として用いて、さらなるキシロースを含む栄養素を添加して、XYL2欠失H0メチニコビア属種を用いることにより、27％を上回るキシリトールが0.56g/L/hの生産性で得られた。
【０１９４】
ガラクトースは、海洋バイオマス、とりわけ、紅海藻に最も豊富に存在する糖のうちの1つである。したがって、海洋バイオマスは、キシリトールの生産のための魅力的な再生可能源である。したがって、本実施例に記載されている方法を用いて、海洋バイオマスを利用して、キシロースをキシリトールに変換するキシリトール経路を有する組換えメチニコビア種により、キシリトールを生産することができる。
【０１９５】
(実施例V)
(キシローストランスポーターを過剰発現することによるキシロースからのキシリトールの生産の増大)
本実施例は、キシリトール経路を有する組換えメチニコビア種へのキシロースの輸送を増大させることが、キシリトールの生産のスピードを上げることができることを示している。
【０１９６】
この株は、H0メチニコビア属種の野生型株のXYL2の一方のコピーをGXF1-XYl1過剰発現カセット(XYL2p-MeHPH-TEF1t-TPIp-GXF1-DIT1t-UBI4p-XYL1-XYL2t)又はGXF2-XYL1過剰発現カセット((XYL2p-MeHPH-TEF1t-TPIp-GXF1-DIT1t-UBI4p-XYL1-XYL2t)と置き換えることにより構築された。XYL2のもう一方のコピーは、野生型のまま保持するか又はADH1p-MeNAT-PGK1tカセットに置き換えた。
【０１９７】
H0メチニコビア属種の野生型株、xyl2欠失株、及びトランスポーター-キシロースレダクターゼ過剰発現をxyl2欠失と併せた株をYPD培地中で予め成長させた。酵母細胞を収集し、6mlのYPキシロース(8％)培地＋共基質としての4％ガラクトース又は4％セロビオース又は4％グリセロールに再懸濁させた。600μlの試料をHPLC分析用に採取して、キシロースの消費及びキシリトールの生産を測定した。
【０１９８】
上記の実験は、キシロース及び共基質のガラクトース(図12A)又はセロビオース(図12B)もしくはグリセロール(図12C)を有する培地中で培養したとき、xyl2欠失＋XYL1過剰発現株におけるGXF1キシローストランスポーターの過剰発現により、xyl2欠失株と比較して、約5％〜10％速いキシリトールの生産が得られるが、共基質のセロビオースの使用により、改変された株でキシリトール生産が改善されないことを示した(図12A〜12C、H0＝野生型; H091＝xyl2欠失株; H016＝1コピーのXYL2がGXF1及びXYL1過剰発現に置き換えられている株; H016-21＝xyl2欠失＋GXF1及びXYL1過剰発現株)。さらに、キシロース及びガラクトースを共基質として有する培地中で培養したとき、xyl2欠失＋XYL1過剰発現株におけるGXF2キシローストランスポーターの過剰発現により、約5％〜10％速いキシリトールの生産が得られた(図13、H0＝野生型; H091＝xyl2欠失株; H2-2＝1コピーのXYL2がGXF2及びXYL1過剰発現に置き換えられている株; 2c1D3＝xyl2欠失＋GXF2及びXYL1過剰発現株)。
【０１９９】
上記のことに基づいて、キシローストランスポーターの過剰発現は、キシリトールがキシリトール経路を有する組換えメチニコビア種によって生産されることができるスピードを改善することができる。
【０２００】
(実施例VI)
(3Lバイオリアクターにおける流加発酵)
本実施例は、流加発酵法を用いて、キシロースからのキシリトールの生産を少なくとも30％キシリトールまで増大させることができることを示している。
【０２０１】
組換えメチニコビア種株H016-21(1コピーのTPI1p-GXF1-DIT1t-UBI4p-XYL1を含むxyl2欠失株)を用いて、2Lの流加発酵を3Lのバイオリアクター(Applikon Biotechnology)中で実施した。2つの独立した実験を実施した。
【０２０２】
第一の流加発酵の手順は、以下の通りである:酵母細胞を、50mlのYPD中、30℃で一晩成長させ、500mlのYPDに移した。その後、167mlの培養物を50mlの40％キシロース及び33mlの20％ガラクトースと混合し、3L容器中の750mlのYPDに移し、最終的な接種材料をOD600＝2.0とした。該容器の培地に、大気又は酸素をスパージした。最小撹拌速度は300rpmであり、溶存酸素(DO)レベルを50％飽和に維持するように自動調整した。pHを5.5〜6.0に維持した。補給ストックは、36％キシロース、12％ガラクトース、1.5％グルコース、1.5％ペプトン、0.75％酵母抽出物、0.075％KH2PO4、0.075％MgSO4.7H2O、0.075％(NH4)2SO4を含有している。補給スピードは、6％より低いキシロースレベルを維持するように調整した。1Lのストック培地を7日間で添加し、発酵をさらに3日間継続して、培地中の残りのキシロースを消費させた。発酵全体は10日間持続し、20％のキシリトールが2Lの容量で生産された(図14A)。これは、過去の最も良好な結果よりも3日短い。
【０２０３】
第二の流加発酵では、生産性を向上させるために、プロセスを改変した:細胞を、10mlのYPD中、30℃で20時間成長させ、400mlのYPD＋4％キシロース及び2％ガラクトースに移した。培養物を150rpmで振盪させながら30℃で24時間成長させた。前培養物を、680mlの培地(YPD＋4％キシロース＋2％ガラクトース)を含有する3Lのバイオリアクター容器にポンプで入れて、最終的な接種材料をOD600＝3.0とした。補給ストックは、36％キシロース、12％ガラクトース、3％グルコース、3％ペプトン、1.5％酵母抽出物、0.075％KH2PO4、0.075％MgSO4.7H2O、0.075％(NH4)2SO4を含有していた。補給スピードは、6ml/hrであった。通気速度は、DOを70％飽和に維持するように自動調整した。1Lのストック培地を7日間で添加し、発酵をキシロースがほぼ使い尽くされるまで継続した。追加の固形培地化合物を10日目に添加して、キシロース濃度を7％にまで増大させた。発酵全体は18日間持続した。キシリトール収率は8日目で20％に達した。これは、先の流加発酵よりも2日短い。より多くのキシロースを添加することにより、30.5％のキシリトールが18日目に生産された。これは、本発明者らがこれまでに達成した最大の量である(図14B)。
【０２０４】
上記のことに基づいて、流加発酵法の使用は、キシリトール経路を有する組換えメチニコビア種によって生産されるキシリトールの割合及び全体の濃度を改善することができる。
【０２０５】
(実施例VII)
(成長及びH0メチニコビア属種に特異的な代謝物の生産)
本実施例は、近縁のメチニコビア種(メチニコビア・プルケリマフラウィア)と比較したとき、H0メチニコビア属種が異なる形で成長し、かつ異なる代謝物を生産することを示している。
【０２０６】
H0メチニコビア属種及びメチニコビア・プルケリマフラウィア(FL)の3つの単一コロニーを、それぞれ、5mlの酵母抽出物ペプトンデキストロース(YEPD)培地中に接種し、30℃で一晩成長させた。培養物を100ml YEPDに移し、30℃で4時間成長させた。細胞を収集し、OD600＝1.0を有する500mlフラスコ中の200mlの培地中に接種した。4つの異なる培地のタイプ: 1)YNBG: 4％グルコースを含む酵母窒素塩基、2)YNBX: 4％キシロースを含む酵母窒素塩基、3)YNBGX: 2％グルコース及び2％キシロースを含む酵母窒素塩基、並びに4) YPDX: 2％デキストロース及び2％キシロースを含むYEPを使用した。培養物を、180rpmで振盪させながら、30℃で成長させた。試料を毎日採取して、OD600により測定される成長及び高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により測定される代謝物含有量をモニタリングした。H0メチニコビア属種及びFLによって生産される揮発性化合物をヘッドスペースGC-MSにより測定した。OD600及びHPLCデータは、3つの生物学的複製物の平均である。標準偏差も計算した。GC-MSデータをピーク高さによって大まかに比較した。
【０２０７】
試験した全ての培地中でのH0メチニコビア属種とFL株の成長速度に違いが認められた。具体的には、H0メチニコビア属種は、FLよりも速く成長する(図15A〜15D)。例えば、3日目に、FLと比べたH0メチニコビア属種のOD600の比は、YNBG中で1.17(図15A)、YNBX中で1.30(図15B)、YNBGX中で1.26(図15C)、及びYPDX中で1.19(図15D)であった。
【０２０８】
グリセロール及びエタノールは、1日目に、YNBG培地、YNBGX培地、及びYPDX培地中で検出された。これらの濃度は、YNBG及びYNBGX培地中では、両株間で同様であった(図16A及び16B)。しかしながら、YPDX培地中では、H0メチニコビア属種は、FLよりも45％多いグリセロールを生産した(905mg/L対624mg/L;図16A)。
【０２０９】
H0メチニコビア属種とFLは両方とも、全ての成長培地中でアラビトールを生産した(図17A〜17D)。しかしながら、YNBG培地中では、H0メチニコビア属種は、1日目に、異なる量のアラビトールを生産し−H0メチニコビア属種は、FLよりも60mg/L多いアラビトールを生産した(図17A)。最も劇的には、YNBGX培地中で、H0メチニコビア属種は、1日目、2日目、及び3日目に、顕著により多い量のアラビトールを生産し−H0メチニコビア属種は、FLよりも約40mg/L多いアラビトールを生産した(図17C)。YNBX及びYPDX培地中では、アラビトールレベルは、これら2つの種間で同様であった(図17B及び17D)。
【０２１０】
H0メチニコビア属種は、最大量のキシリトールを、YNBX培地中では3日目に(1.61g/L)、YNBGX培地中では2日目に(1.43g/L)、及びYPDX培地中では4日目に(21.5g/L)生産したが、FLは、最大のキシリトールを、YNBX中では6日目に(2.33g/L)、YNBGX中では2日目に(0.73g/L)、及びYPDX中では4日目に(21.9g/L)生産した(図18A〜18C)。H0メチニコビア属種とFLの間での3日目のキシリトール含有量の比は、YNBX中で4.39、YNBGX中で5.43、及びYPDX中で0.87であった。
【０２１１】
それぞれ、YNBG中で1日間、並びにYNBX、YNBGX、及びYPDX中で3日間成長させた後の培地中の揮発性化合物をヘッドスペースGC-MSにより測定した。ピーク高さの比を計算し、FLとH0メチニコビア属種の間で比較した。この解析により、FLがH0メチニコビア属種よりも多くの揮発性化合物を生産することが示された(図19A〜19D)。具体的には、FLは、YNBG培地中でより多くのアセトアルデヒド、酢酸エチル、アセタール、1-(1-エトキシエトキシ)ペンタン、及びフェニルエチルアルコール(図19A); YNBX培地中でより多くの酢酸イソアミル、2-メチル-1-ブタノール、及び3-メチル-1-ブタノール(図19B); YNBGX培地中でより多くの酢酸エチル、エチルプロパノエート、酢酸イソアミル、2-メチル-1-ブタノール、3-メチル-1-ブタノール、及びフェニルエチルアルコール(図19C)、並びにYPDX培地中でより多くのアセトアルデヒド、イソブタノール、酢酸イソアミル、3-メチル-1-ブタノール、エチルノナノエート、及びフェニルエチルアルコール(図19D)を生産した。
【０２１２】
上の結果に基づいて、H0メチニコビア属種とメチニコビア・プルケリマフラウィア種の間の成長及び分泌された代謝物のプロファイルは、成長速度並びに様々な培地中での成長時のいくつかの代謝産物の含有量及び動態の違いを示している。
【０２１３】
(実施例VIII)
(メチニコビア種によるキシロースの代謝)
本実施例は、メチニコビア種がキシロースを炭素源として消費し、代謝すること、並びにH0メチニコビア属種及びメチニコビア・ジジフィコラがキシリトール経路を用いるキシロースからのキシリトールの生産のための特に有用な宿主種であることを示している。
【０２１４】
いくつかの既知のメチニコビア・プルケリマクレード種(メチニコビア・プルケリマ、メチニコビア・アンダウエンシス、メチニコビア・クリソペルラエ、メチニコビア・シネンシス、メチニコビア・シャンキシエンシス、及びメチニコビア・ジジフィコラ)並びに本明細書に記載される新しいH0メチニコビア属種を、2％キシロースを有するYP培地上で長時間成長させ、ここで、細胞培養物の成長を、10、13、16、19、34、及び41時間でのOD600をアッセイすることによりモニタリングした。
【０２１５】
これらの実験は、アッセイした全ての種が成長のためにキシロースを消費することを示した(図20)。H0メチニコビア属種は、その成長によって、ほとんどのメチニコビア・プルケリマクレード種から区別され、これは、後期(41時間)に、初期の0.03のOD600から、約25のOD600に達した(図20)。メチニコビア・ジジフィコラ培養物とH0メチニコビア属種培養物のOD600も類似しており、どちらも、アッセイした他の種の培養物のOD600よりもずっと高かった(図20)。
【図１】
2020501595.tif 000034
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2020501595.tif 000046
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年11月12日(2019.11.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2020501595000001.app
【国際調査報告】
2020501595.tif 000054
2020501595.tif 000055