(57)【要約】哺乳動物細胞における転写を活性化するための方法および組成物が提供される。2020506948.tif 000092
2020506948.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物対象におけるハプロ不全疾患を処置する方法であって、該対象の細胞を、
(i）(a）該細胞の核内に存在する条件下でハプロ不全遺伝子の野生型コピーに機能的に連結されたプロモーター領域またはエンハンサー領域に特異的にハイブリダイズする、ターゲティング領域、および
(b）該細胞の核内に存在する条件下でCRISPRヌクレアーゼに特異的に結合するCRISPRヌクレアーゼ結合領域または該CRISPRヌクレアーゼ結合領域に特異的に結合する領域
を含むガイドRNA、ならびに
(ii）CRISPRヌクレアーゼ
を含む組成物と接触させる工程を含み、
接触させる工程により、ガイドRNAに結合したCRISPRヌクレアーゼを含む複合体が形成され、該複合体中のガイドRNAのターゲティング領域が、該プロモーターまたはエンハンサーにハイブリダイズされ、
該複合体は触媒的に不活性なCRISPRヌクレアーゼおよび転写活性化ドメインを含み、かつ
該複合体は、該対象におけるハプロ不全疾患を処置するのに十分な量でかつ十分な持続時間にわたって、ハプロ不全遺伝子の野生型コピーの転写を活性化する、
前記方法。
【請求項２】
接触させる工程が、ガイドRNAまたはCRISPRヌクレアーゼをコードするエピソーマルベクターと、前記細胞を接触させることを含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
接触させる工程が、ガイドRNAとCRISPRヌクレアーゼとをコードするエピソーマルベクターと、前記細胞を接触させることを含む、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
接触させる工程が、ガイドRNAをコードするエピソーマルベクターおよびCRISPRヌクレアーゼをコードする第2エピソーマルベクターと、前記細胞を接触させることを含む、請求項1または2記載の方法。
【請求項５】
エピソーマルベクターが非組込み型である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
エピソーマルベクターが非複製型である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
エピソーマルベクターがアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターである、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
エピソーマルベクターが、第1端および第2端を独立して含み、第1端および第2端が、AAV逆方向末端反復配列をそれぞれ独立して含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
CRISPRヌクレアーゼが、（i）ヌクレアーゼ活性およびニッキング活性を排除するように改変されたヌクレアーゼドメインと、（ii）転写活性化ドメインとを含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
前記改変が、化膿レンサ球菌（S.pyogenes）Cas9のD10およびH840に対応する位置に変異を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
CRISPRヌクレアーゼが、D10A,H840A化膿レンサ球菌dCas9を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
ガイドRNAがデッドガイド配列（dead guide sequence）を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
ガイドRNAが転写活性化結合ドメインを含み、転写活性化結合ドメインが、1つまたは複数の転写活性化ドメインを含む組成物に特異的に結合する、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
ガイドRNAに結合したCRISPRヌクレアーゼを含む複合体が、HSF1、VP16、VP64、p65、MyoD1、RTA、SET7/9、VPR、ヒストンアセチルトランスフェラーゼp300、TETファミリータンパク質のヒドロキシラーゼ触媒ドメイン（例えばTET1ヒドロキシラーゼ触媒ドメイン）、LSD1、CIB1、AD2、CR3、EKLF1、GATA4、PRVIE、p53、SP1、MEF2C、TAX、およびPPARγからなる群より選択される転写活性化ドメインをさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
CRISPRヌクレアーゼがCRISPRヌクレアーゼ-VP64融合ポリペプチドである、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
ガイドRNAがスキャフォールド領域を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
スキャフォールド領域が、ms2、f6、PP7、com、またはL7aリガンド配列を含む、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
前記複合体中のガイドRNAのスキャフォールド領域が、MCPポリペプチド、COMポリペプチド、PCPポリペプチド、またはL7aポリペプチドに融合された転写活性化ドメインに結合される、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
ハプロ不全遺伝子が、SIM1、レプチン、レプチン受容体、MC4R、SCN2A、SETD5、PAX6、PKD1、MC3R、POMC、STAT3、STAT5、SOCS3、GHR、NPY、NPY1R、NPY2R、NPY5R、PYY、AMPK（PRKAA1、PRKAA2、PRKAB1、PRKAB2、PRKAG1、PRKAG2、PRKAG3）、OXT、JAK2、SHP2、NOS3、NROB2、BRS3、CARTPT、FABP4、HTR2C、IL6、NHLH2、NMU、NPB、NPBWRI、PNPLA2、UCP3、ADIPOQ、APOA5、ARNT2、ASIP、C1QTNF2、C3AR1、CCK、CPT1B、CSF2、DGAT1、DGAT2、GHRL、GHSR、HSD11B1、HTR7、INSIG1、INSIG2、LIPC、NMURI、NMUR2、NPBWR2、NTS、PPARGC1A、PPY、RETN、SIRT1、TGFBR2、WDTC1、またはFOXO1である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
ガイドRNAのターゲティング領域が、
2020506948.tif 000080
によってコードされるか、またはそれに特異的にハイブリダイズする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
ガイドRNAのターゲティング領域が、
2020506948.tif 000081
によってコードされるか、またはそれに特異的にハイブリダイズする、請求項1〜19のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
ガイドRNAのターゲティング領域が、
2020506948.tif 000082
によってコードされるか、またはそれに特異的にハイブリダイズする、請求項1〜19のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３】
ガイドRNAのターゲティング領域が、
2020506948.tif 000083
によってコードされるか、またはそれに特異的にハイブリダイズする、請求項1〜19のいずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
ガイドRNAのターゲティング領域が、
2020506948.tif 000084
によってコードされるか、またはそれに特異的にハイブリダイズする、請求項1〜19のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５】
ガイドRNAのターゲティング領域が、
2020506948.tif 000085
によってコードされるか、またはそれに特異的にハイブリダイズする、請求項1〜19のいずれか一項記載の方法。
【請求項２６】
ガイドRNAのターゲティング領域が、
2020506948.tif 000086
によってコードされるか、またはそれに特異的にハイブリダイズする、請求項1〜19のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
ガイドRNAのターゲティング領域が、
2020506948.tif 000087
によってコードされるか、またはそれに特異的にハイブリダイズする、請求項1〜19のいずれか一項記載の方法。
【請求項２８】
ガイドRNAのターゲティング領域が、
2020506948.tif 000088
によってコードされるか、またはそれに特異的にハイブリダイズする、請求項1〜19のいずれか一項記載の方法。
【請求項２９】
ガイドRNAのターゲティング領域が、
2020506948.tif 000089
によってコードされるか、またはそれに特異的にハイブリダイズする、請求項1〜19のいずれか一項記載の方法。
【請求項３０】
ガイドRNAのターゲティング領域が、
2020506948.tif 000090
によってコードされるか、またはそれに特異的にハイブリダイズする、請求項1〜19のいずれか一項記載の方法。
【請求項３１】
ガイドRNAのターゲティング領域が、
2020506948.tif 000091
によってコードされるか、またはそれに特異的にハイブリダイズする、請求項1〜19のいずれか一項記載の方法。
【請求項３２】
前記細胞が非分裂細胞である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項３３】
前記細胞がニューロンである、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞が視床下部細胞である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項３５】
接触させる工程が、視床下部を含んでいる脳の領域への、ガイドRNAおよび/またはCRISPRヌクレアーゼをコードする核酸の注射を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項３６】
接触させる工程が、視床下部を含んでいる脳の領域への、ガイドRNAおよび/またはCRISPRヌクレアーゼをコードする核酸を含むアデノ随伴ウイルスベクターの注射を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項３７】
ハプロ不全疾患が、肥満、自閉症、てんかん、知的障害、無虹彩症、および多発性嚢胞腎からなる群より選択される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項３８】
ハプロ不全疾患が表1から選択される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項３９】
ハプロ不全疾患が肥満である、請求項37記載の方法。
【請求項４０】
（I.）標的遺伝子の少なくとも1つの機能的コピーを含むゲノムであって、該機能的コピーが、異種複合体による転写活性化の非存在下では、生物において野生型表現型をもたらすのに十分な対応する遺伝子産物を生産しない、ゲノム、ならびに
(II.）(a）(i.）標的遺伝子の機能的コピーに機能的に連結されたプロモーター領域またはエンハンサー領域に、細胞の核内に存在する条件下で、特異的にハイブリダイズするターゲティング領域と、
(ii.）細胞の核内に存在する条件下でCRISPRヌクレアーゼに特異的に結合するCRISPRヌクレアーゼ結合領域と
を含む、ガイドRNA、および
(b）CRISPRヌクレアーゼ
を含む、異種複合体
を含む、単離された哺乳動物宿主細胞であって、
ガイドRNAに結合したCRISPRヌクレアーゼを含む異種複合体のガイドRNAが、該プロモーターまたはエンハンサーにハイブリダイズされ、
CRISPRヌクレアーゼが触媒的に不活性であり、かつ
該複合体が、該宿主細胞が生物中に存在する場合に野生型表現型を生み出すのに十分な量でかつ十分な持続時間にわたって、標的遺伝子の機能的コピーの転写を活性化する、
前記単離された哺乳動物宿主細胞。
【請求項４１】
前記ゲノムが標的遺伝子の機能的コピーを1つだけ含む、請求項40記載の単離された哺乳動物宿主細胞。
【請求項４２】
標的遺伝子の1つだけの機能的コピーがハプロ不全遺伝子を含む、請求項41記載の単離された哺乳動物宿主細胞。
【請求項４３】
ハプロ不全遺伝子が、SIM1、レプチン、レプチン受容体、MC4R、SCN2A、SETD5、PAX6、PKD1、MC3R、POMC、STAT3、STAT5、SOCS3、GHR、NPY、NPY1R、NPY2R、NPY5R、PYY、AMPK（PRKAA1、PRKAA2、PRKAB1、PRKAB2、PRKAG1、PRKAG2、PRKAG3）、OXT、JAK2、SHP2、NOS3、NROB2、BRS3、CARTPT、FABP4、HTR2C、IL6、NHLH2、NMU、NPB、NPBWRI、PNPLA2、UCP3、ADIPOQ、APOA5、ARNT2、ASIP、C1QTNF2、C3AR1、CCK、CPT1B、CSF2、DGAT1、DGAT2、GHRL、GHSR、HSD11B1、HTR7、INSIG1、INSIG2、LIPC、NMURI、NMUR2、NPBWR2、NTS、PPARGC1A、PPY、RETN、SIRT1、TGFBR2、WDTC1、またはFOXO1である、請求項42記載の単離された哺乳動物宿主細胞。
【請求項４４】
ハプロ不全遺伝子が、表1から選択されるハプロ不全疾患を処置する、請求項43記載の単離された哺乳動物宿主細胞。
【請求項４５】
ハプロ不全疾患が、肥満、自閉症、てんかん、知的障害、無虹彩症、および多発性嚢胞腎から選択される、請求項44記載の単離された哺乳動物宿主細胞。
【請求項４６】
ハプロ不全疾患が肥満である、請求項45記載の単離された哺乳動物宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、2017年2月7日に出願された米国仮出願第62/455,988号に基づく優先権の恩典を主張し、その内容は、参照によりあらゆる目的でそのまま本明細書に組み入れられる。
【０００２】
連邦政府の後援による研究および開発の下になされた発明に対する権利に関する陳述
本発明は、米国国立衛生研究所によって交付された助成金番号R01 DK090382の下に、米国政府の支援を受けてなされた。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
配列表の提出への言及
本願は、2018年2月6日に作成された107キロバイトのテキストファイル、ファイル名「081906-224410PC-1072775＿SequenceListing.txt」として、配列表を含む。このテキストファイルに含まれているデータは参照によりあらゆる目的でそのまま本明細書に組み入れられる。
【０００４】
発明の分野
本開示は概して哺乳動物細胞における転写を活性化するための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００５】
発明の背景
1つまたは複数の遺伝子または遺伝子産物の転写または活性の低減をもたらすゲノム変化は、多種多様な哺乳動物疾患の原因因子である。そのようなゲノム変化の一つがハプロ不全である。ハプロ不全では、ある遺伝子の機能的コピーが1つしかなく、その唯一のコピーが、野生型表現型をもたらすのに十分な遺伝子産物を生産しない。別の疾患は、ある遺伝子の一方または両方のコピーにおけるゲノム変化であって、遺伝子産物が活性の排除ではなく活性の低減を呈するように遺伝子産物を変化させるゲノム変化によって引き起こされる。さらに別の疾患では、ゲノム変化が、ある遺伝子の一方または両方のコピーの転写を低減するか、その転写産物の安定性を低減し、その結果、遺伝子産物の存在量が野生型表現型を生み出すには不十分になる。転写または活性が低減している当該1つまたは複数の遺伝子の量または活性を増強することによってそのような疾患を処置するために、数多くのアプローチが試みられてきた。そのようなアプローチには、ゲノムへの当該1つまたは複数の遺伝子の野生型コピーの送達が含まれる。最近、ゲノムへの標的導入が、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）（CRISPR）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）（Urnov et al.,Nat.Rev.Genet.,11:636-646（2010）（特許文献1）参照）または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）（Joung and Sander,Nat.Rev.Mol.Cell Biol.,1:49-55（2013）（特許文献2）参照）に基づく方法および組成物を使って実証された。1つまたは複数の標的遺伝子の転写を増加させるための別のアプローチには、構成的スプライシングを促進するアンチセンスオリゴマーの使用が含まれる（US 2016/0298121（非特許文献1）参照）。しかし、標的遺伝子の転写、量または活性の低減によって引き起こされる疾患を処置するために、標的遺伝子の転写を増加させる代替的な方法および組成物は、今なお必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】Urnov et al.,Nat.Rev.Genet.,11:636-646（2010）
【特許文献２】Joung and Sander,Nat.Rev.Mol.Cell Biol.,1:49-55（2013）
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】US 2016/0298121
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、哺乳動物（例えばヒト）対象における標的遺伝子の転写を増加させるための方法および組成物に向けられる。本発明者らは、そのような転写の増加が、遺伝子のプロモーター領域またはエンハンサー領域を標的とする転写活性化ガイドRNA（gRNA）コンストラクト（例えばdCAS9/gRNA複合体の一部として）で達成されうることを発見した。さらにまた本発明者らは、疾患を処置するのに十分な量で十分な期間にわたる転写活性化が、非組込み型ベクターで達成されうることを発見した。場合により、転写活性化のための本方法および組成物は、エンドヌクレアーゼ切断、ニッキングおよび/または修復によって宿主哺乳動物のゲノムを共有結合的に改変しない。場合により、非組込み型ベクターは、アデノ随伴ウイルスベクターなどのエピソーマルベクターである。
【０００９】
一局面において、本発明は、哺乳動物対象におけるハプロ不全疾患を処置する方法を提供し、本方法は、該対象の細胞を、
（i）（a）該細胞の核内に存在する条件下でハプロ不全遺伝子の野生型コピーに機能的に連結されたプロモーター領域またはエンハンサー領域に特異的にハイブリダイズするターゲティング領域、および
（b）該細胞の核内に存在する条件下でCRISPRヌクレアーゼに特異的に結合するCRISPRヌクレアーゼ結合領域または前記CRISPRヌクレアーゼ結合領域に特異的に結合する領域
を含むガイドRNA、ならびに
（ii）CRISPRヌクレアーゼ
を含む組成物と、接触させる工程を含み、
接触させる工程により、ガイドRNAに結合したCRISPRヌクレアーゼを含む複合体が形成され、該複合体中のガイドRNAのターゲティング領域は該プロモーターまたはエンハンサーにハイブリダイズされ、
該複合体は触媒的に不活性なCRISPRヌクレアーゼおよび転写活性化ドメインを含み、かつ
該複合体は、対象におけるハプロ不全疾患を処置するのに十分な量で十分な持続時間にわたって、ハプロ不全遺伝子の野生型コピーの転写を活性化する。いくつかの態様において、哺乳動物対象は、その対象から得られた宿主細胞で処置される。一態様において、哺乳動物対象は、異なる（全く別の）哺乳動物対象から得られた宿主細胞で処置される。いくつかの態様において、宿主細胞は単離された哺乳動物宿主細胞である。別の一態様において、宿主細胞は、標的遺伝子の機能的コピーを1つ有する単離された哺乳動物宿主細胞を含む。
【００１０】
いくつかの態様において、接触させる工程は、ガイドRNAまたはCRISPRヌクレアーゼをコードするエピソーマルベクターと、前記細胞を接触させることを含む。いくつかの態様において、接触させる工程は、ガイドRNAとCRISPRヌクレアーゼとをコードするエピソーマルベクターと、前記細胞を接触させることを含む。いくつかの態様において、接触させる工程は、ガイドRNAをコードするエピソーマルベクターおよびCRISPRヌクレアーゼをコードする第2のエピソーマルベクターと、前記細胞を接触させることを含む。いくつかの態様において、エピソーマルベクターは非組込み型である。いくつかの態様において、エピソーマルベクターは非複製型である。いくつかの態様において、エピソーマルベクターはアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターである。いくつかの態様において、エピソーマルベクターは第1端および第2端を独立して含み、第1端および第2端はAAV逆方向末端反復配列をそれぞれ独立して含む。
【００１１】
いくつかの態様において、CRISPRヌクレアーゼは、（i）ヌクレアーゼ活性およびニッキング活性を排除するために改変されたヌクレアーゼドメインと（ii）転写活性化ドメインとを含む。いくつかの態様において、CRISPRヌクレアーゼはCas9ヌクレアーゼまたはCpf1ヌクレアーゼを含む。いくつかの態様において、前記改変は、化膿レンサ球菌（S.pyogenes）Cas9のD10およびH840に対応する位置に変異を含む。いくつかの態様において、CRISPRヌクレアーゼはD10A,H840A化膿レンサ球菌dCas9を含む。いくつかの態様において、CRISPRヌクレアーゼは、黄色ブドウ球菌（S.aureus）dCas9を含む。いくつかの態様において、黄色ブドウ球菌dCas9は、以下の残基のうちの1つに、1つまたは複数の変異を含む:E782、K929、N968、R1015。いくつかの態様において、ガイドRNAはデッドガイド配列（dead guide sequence）を含む。
【００１２】
いくつかの態様において、ガイドRNAは転写活性化結合ドメインを含み、転写活性化結合ドメインは、1つまたは複数の転写活性化ドメインを含む組成物に特異的に結合する。いくつかの態様において、ガイドRNAに結合したCRISPRヌクレアーゼを含む複合体は、HSF1、VP16、VP64、p65、MyoD1、RTA、SET7/9、VPR、ヒストンアセチルトランスフェラーゼp300、TETファミリータンパク質のヒドロキシラーゼ触媒ドメイン（例えばTET1ヒドロキシラーゼ触媒ドメイン）、LSD1、CIB1、AD2、CR3、EKLF1、GATA4、PRVIE、p53、SP1、MEF2C、TAXおよびPPARγからなる群より選択される転写活性化ドメインをさらに含む。いくつかの態様において、CRISPRヌクレアーゼはCRISPRヌクレアーゼ-VP64融合ポリペプチドである。
【００１３】
いくつかの態様において、ガイドRNAはスキャフォールド領域を含む。いくつかの態様において、スキャフォールド領域はms2、f6、PP7、comまたはL7aリガンド配列を含む。いくつかの態様において、複合体中のガイドRNAのスキャフォールド領域は、MCPポリペプチド、COMポリペプチド、PCPポリペプチドまたはL7aポリペプチドに融合された転写活性化ドメインに結合される。いくつかの態様において、ハプロ不全遺伝子は、SIM1、レプチン、レプチン受容体、MC4R、SCN2A、SETD5、PAX6、PKD1、MC3R、POMC、STAT3、STAT5、SOCS3、GHR、NPY、NPY1R、NPY2R、NPY5R、PYY、AMPK（PRKAA1、PRKAA2、PRKAB1、PRKAB2、PRKAG1、PRKAG2、PRKAG3）、OXT、JAK2、SHP2、NOS3、NROB2、BRS3、CARTPT、FABP4、HTR2C、IL6、NHLH2、NMU、NPB、NPBWRI、PNPLA2、UCP3、ADIPOQ、APOA5、ARNT2、ASIP、C1QTNF2、C3AR1、CCK、CPT1B、CSF2、DGAT1、DGAT2、GHRL、GHSR、HSD11B1、HTR7、INSIG1、INSIG2、LIPC、NMURI、NMUR2、NPBWR2、NTS、PPARGC1A、PPY、RETN、SIRT1、TGFBR2、WDTC1またはFOXO1である。
【００１４】
いくつかの態様において、ガイドRNAのターゲティング領域は、
2020506948.tif 000003
によってコードされるか、またはそれに特異的にハイブリダイズする。いくつかの態様において、ガイドRNAのターゲティング領域は、
2020506948.tif 000004
によってコードされるか、またはそれに特異的にハイブリダイズする。いくつかの態様において、ガイドRNAのターゲティング領域は、
2020506948.tif 000005
によってコードされるか、またはそれに特異的にハイブリダイズする。別の一態様において、ガイドRNAのターゲティング領域は、
2020506948.tif 000006
によってコードされるか、またはそれに特異的にハイブリダイズする。いくつかの態様において、ガイドRNAのターゲティング領域は、
2020506948.tif 000007
によってコードされるか、またはそれに特異的にハイブリダイズする。いくつかの態様において、ガイドRNAのターゲティング領域は、
2020506948.tif 000008
によってコードされるか、またはそれに特異的にハイブリダイズする。いくつかの態様において、ガイドRNAのターゲティング領域は、
2020506948.tif 000009
によってコードされるか、またはそれに特異的にハイブリダイズする。いくつかの態様において、ガイドRNAのターゲティング領域は、
2020506948.tif 000010
によってコードされるか、またはそれに特異的にハイブリダイズする。いくつかの態様において、ガイドRNAのターゲティング領域は、
2020506948.tif 000011
によってコードされるか、またはそれに特異的にハイブリダイズする。いくつかの態様において、ガイドRNAのターゲティング領域は、
2020506948.tif 000012
によってコードされるか、またはそれに特異的にハイブリダイズする。いくつかの態様において、ガイドRNAのターゲティング領域は、
2020506948.tif 000013
によってコードされるか、またはそれに特異的にハイブリダイズする。いくつかの態様において、ガイドRNAのターゲティング領域は、
2020506948.tif 000014
によってコードされるか、またはそれに特異的にハイブリダイズする。
【００１５】
いくつかの態様において、細胞は非分裂細胞である。いくつかの態様において、細胞はニューロンである。いくつかの態様において、細胞は視床下部細胞である。いくつかの態様において、接触させる工程は、視床下部を含んでいる脳の領域への、ガイドRNAおよび/またはCRISPRヌクレアーゼをコードする核酸の注射を含む。いくつかの態様において、接触させる工程は、視床下部を含んでいる脳の領域への、ガイドRNAおよび/またはCRISPRヌクレアーゼをコードする核酸を含むアデノ随伴ウイルスベクターの注射を含む。いくつかの態様において、ハプロ不全疾患は表1から選択される。いくつかの態様において、ハプロ不全疾患は、肥満、自閉症、てんかん、知的障害、無虹彩症および多発性嚢胞腎から選択される。いくつかの態様において、ハプロ不全疾患は肥満である。
【００１６】
別の一局面において、本発明は、
（I.）標的遺伝子の少なくとも1つの機能的コピーを含むゲノムであって、該機能的コピーが、異種複合体による転写活性化の非存在下では、生物において野生型表現型をもたらすのに十分な対応する遺伝子産物を生産しない、ゲノム、ならびに
（II.）（a）（i.）標的遺伝子の機能的コピーに機能的に連結されたプロモーター領域またはエンハンサー領域に、細胞の核内に存在する条件下で、特異的にハイブリダイズするターゲティング領域、および
（ii.）細胞の核内に存在する条件下でCRISPRヌクレアーゼに特異的に結合するCRISPRヌクレアーゼ結合領域
を含むガイドRNAと、
（b）CRISPRヌクレアーゼと
を含む、異種複合体
を含む、哺乳動物宿主細胞を提供し、
ガイドRNAに結合したCRISPRヌクレアーゼを含む異種複合体のガイドRNAは、該プロモーターまたはエンハンサーにハイブリダイズされ、CRISPRヌクレアーゼは触媒的に不活性であり、かつ該複合体は、その宿主細胞が生物中に存在する場合に野生型表現型を生み出すのに十分な量で十分な持続時間にわたって、標的遺伝子の機能的コピーの転写を活性化する。
【００１７】
いくつかの態様において、ゲノムは、標的遺伝子の機能的コピーを1つだけ含む。いくつかの態様において、標的遺伝子の1つだけの機能的コピーは、ハプロ不全遺伝子を含む。いくつかの態様において、ゲノムが含む標的遺伝子の機能的コピーは、2つ未満である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ】図1A〜F:インビトロおよびインビボでのトランスジェニックCRISPRa Sim1過剰発現。A、マウスSim1ゲノム座位の図解。B、Sim1プロモーター（Pr）またはエンハンサー（Enh）を標的とするNeuro-2A細胞中のCRISPRa。結果はΔΔCT法を使ってベータ-アクチンに標準化されたmRNA増加倍率として表す。3つの独立した実験から平均値±s.d.を得た。＊＝p値＜0.001、＊＊＊＝p値＜0.0005（ANOVA、チューキー検定）。C、さまざまなマウス系統およびマウストランスジェニックCRISPRaコンセプトを表す図解。D、野生型同腹仔、Sim1＋/-、H11PCAG-dCas9-VP64×ROSA26Sim1Pr-sgRNAおよびH11PCAG-dCas9-VP64×ROSA26SCE2En-sgRNAの週1回の重量測定。遺伝子型ごとに少なくとも10匹の雄および雌マウスを測定した。平均値±s.dを示す。E〜F、各遺伝子型Sim1＋/-、H11PCAG-dCas9-VP64×ROSA26Sim1Pr-sgRNAおよび野生型同腹仔（E）ならびにSim1＋/-、H11PCAG-dCas9-VP64×ROSA26SCE2En-sgRNAおよび野生型同腹仔（F）について、20週齢マウスを示す写真。各マウスの体長および重量をそれぞれ上および下に示す。
【図１Ｂ】図1Aに記載の通り。
【図１Ｃ】図1Aに記載の通り。
【図１Ｄ】図1Aに記載の通り。
【図１Ｅ】図1Aに記載の通り。
【図１Ｆ】図1Aに記載の通り。
【図２Ａ】図2A〜D:Sim1 CRISPRaトランスジェニックマウスの体組成および代謝分析。A、二重エネルギーX線吸収測定法（DEXA）またはEcho磁気共鳴イメージング（EchoMRI）によって決定された野生型同腹仔、Sim1＋/-、H11PCAG-dCas9-VP64×ROSA26Sim1Pr-sgRNA（PrmCRISPRa）およびH11PCAG-dCas9-VP64×ROSA26SCE2En-sgRNA（EnhCRISPRa）における推定脂肪率と、それらの対応する体重測定値。3匹の雌および3匹の雄から平均値±s.d.を得た。B、4つの遺伝子型すべてについて3匹の雄および3匹の雌で4日間にわたって決定された代謝チャンバーエネルギー消費分析。C、4日間にわたって決定された4つの遺伝子型すべてに関する食物摂取。3匹の雌および3匹の雄から平均値±s.d.を得た。＊＝p値＜0.001、＊＊＊＝p値＜0.0005、n.s＝有意性なし（ANOVA、チューキー検定）。D、3匹の雌および3匹の雄から得て、平均値±s.d.としてプロットした、4つの遺伝子型すべてに関する呼吸交換比（RER;VCO2/VO2）。
【図２Ｂ】図2Aに記載の通り。
【図２Ｃ】図2Aに記載の通り。
【図２Ｄ】図2Aに記載の通り。
【図３】図3A〜D:CRISPRaトランスジェニックマウスにおけるdCas9およびSim1 mRNA発現レベル。A、Sim1組織発現のヒートマップ。赤色および灰色で塗りつぶされた四角形は、本発明者らの野生型マウスにおける決定で、それぞれSim1が発現している組織とSim1が発現していない組織とを表している。B、4匹のSim1＋/-×H11PCAG-dCas9-VP64マウスからの視床下部、腎臓、肺および肝臓におけるdCas9 mRNA発現。ΔΔCT法を使用し、ベータ-アクチン（視床下部の場合）およびRpl38（腎臓、肺、肝臓の場合）に標準化されたmRNA増加倍率に基づいて、平均値±s.dを決定した。C〜D、2匹の雌（C）および2匹の雄（D）からの、以下の遺伝子型での、視床下部、腎臓、肺および肝臓におけるSim1 mRNA発現:野生型同腹仔、Sim1＋/-、H11PCAG-dCas9-VP64×ROSA26Sim1Pr-sgRNA（Prm-CRISPRa）およびH11PCAG-dCas9-VP64×ROSA26SCE2En-sgRNA（Enh-CRISPRa）。ΔΔCT法を使用し、ベータ-アクチンまたはRpl38に標準化して野生型同腹仔と比較したmRNA増加倍率に基づいて、平均値±s.dを決定した。B.D.L＝検出レベル未満。
【図４】図4A〜E:AAVを使ったインビトロおよびインビボでのCRISPRa Sim1過剰発現。A、pCMV-dCas9-VP64（dCas9-VP64）、pCMV-dCas9-VP64とpSim1Pr-mCherry（PrmCRIPSRa）およびpCMV-dCas9-VP64とpSCE2En-mCherry（EnhCRISPRa）を含有するウイルス粒子を使ったNeuro-2A細胞におけるAAV CRISPRa。結果はΔΔCT法を使ってベータ-アクチンに標準化されたmRNA増加倍率として表す。3回の独立した実験から平均値±s.d.を得た。＊＊＊＝p値＜0.0005（ANOVA、チューキー検定）。B、PVN注射領域を表す図解。C、PVNにおけるmCherry発現を示す、20週齢マウスからのpSim1Pr-mCherry注射視床下部の免疫組織化学。D〜E、注射を受けたマウスにおけるpCMV-dCas9-VP64（dCas9-VP64）、pCMV-dCas9-VP64＋pSim1Pr-mCherry（PrmCRIPSRa、n＝3）およびpCMV-dCas9-VP64＋pSCE2En-mCherry（EnhCRISPRa、n＝4）からのCas9（d）およびSim1（e）mRNA発現。ΔΔCT法を使用し、ベータ-アクチンに標準化してSim1＋/-マウスと比較したmRNA増加倍率に基づいて、平均値±s.dを決定した。
【図５】図5A〜C:PVNへのCRISPRa-AAV注射はSim1＋/-マウスにおける重量増加を低減する。A、PVNへのCRISPRa-AAV注射後の重量測定に関するタイムライン。B〜C、注射を受けていない野生型同腹仔およびSim1＋/-マウスと比較した、pCMV-dCas9-VP64（dCas9-VP64）、pCMV-dCas9-VP64＋pSim1Pr-mCherry（Prm-CRIPSRa）またはpCMV-dCas9-VP64＋pSCE2En-mCherry（Enh-CRISPRa）が注射されたSim1＋/-マウスにおける、7週間越しに決定された重量増加。3匹の雌（B）および3匹の雄（C）からの平均値±s.dを示す。＊＝p値＜0.001、＊＊＊＝p値＜0.0005、n.s＝有意性なし;（ANOVA、チューキー検定）。
【図６】CRISPRaハプロ不全レスキュー実験の図解。トランスジェニックアプローチと出生後AAVアプローチの両方を使って、Sim1プロモーターまたはエンハンサーのどちらかを標的とすることにより、Sim1＋/-マウスにおける肥満表現型を、CRISPRaによってレスキューした。
【図７Ａ】図7A〜7B:インビトロでのCRISPRa Sim1過剰発現。図7Aは、Neuro-2A（N2A）細胞へのさまざまなsgRNA（SEQ ID NO:38〜43）のトランスフェクションによる、Sim1プロモーター（Pr）を標的とする例示的黄色ブドウ球菌CRISPRaシステムを表す。結果を、Sa-dCas9-VP64に標準化されたmRNA増加倍率として表す。3つの独立した実験から平均値±s.d.を得た。
【図７Ｂ】図7A〜7B:インビトロでのCRISPRa Sim1過剰発現。図7Bは、選ばれたsgRNA（SEQ ID NO:38、40または42）を含有するAAVをN2A細胞に感染させた後の、Sim1プロモーター（Pr）を標的とする、N2A細胞中の例示的黄色ブドウ球菌CRISPRaを表す。結果を、VP64のみに標準化されたmRNA増加倍率として表す。3つの独立した実験から平均値±s.d.を得た。
【図８Ａ】図8A〜8B:インビトロでのCRISPRa Sim1過剰発現。図8Aは、N2A細胞へのさまざまなsgRNA（SEQ ID NO:44〜49）のトランスフェクションによる、Sim1 SCE2エンハンサー（Enh）を標的とする例示的黄色ブドウ球菌CRISPRaシステムを表す。結果を、Sa-dCas9-VP64に標準化されたmRNA増加倍率として表す。3つの独立した実験から平均値±s.d.を得た。
【図８Ｂ】図8A〜8B:インビトロでのCRISPRa Sim1過剰発現。図8Bは、選ばれたsgRNA（SEQ ID NO:45、46または47）を含有するAAVをN2A細胞に感染させた後の、Sim1 SCE2エンハンサー（Enh）を標的とする例示的黄色ブドウ球菌CRISPRaシステムを表す。結果を、VP64のみに標準化されたmRNA増加倍率として表す。3つの独立した実験から平均値±s.d.を得た。
【図９Ａ】図9A〜9B:インビトロでのCRISPRa Mc4r過剰発現。図9Aは、N2A細胞へのさまざまなsgRNA（SEQ ID NO:50〜54）のトランスフェクションによる、Mc4rプロモーター（Pr）を標的とする例示的黄色ブドウ球菌CRISPRaシステムを表す。結果を、VP64に標準化されたmRNA増加倍率として表す。3つの独立した実験から平均値±s.d.を得た。
【図９Ｂ】図9A〜9B:インビトロでのCRISPRa Mc4r過剰発現。図9Bは、選ばれたsgRNA（SEQ ID NO:51、52または54）を含有するAAVをN2A細胞に感染させた後の、Mc4rプロモーター（Pr）を標的とする例示的黄色ブドウ球菌CRISPRaシステムを表す。結果を、VP64に標準化されたmRNA増加倍率として表す。3つの独立した実験から平均値±s.d.を得た。
【図１０】インビトロでのCRISPRa PKD1過剰発現。ヒトHEK293T細胞へのヒトプロモーターsgRNA（SEQ ID NO:55〜64）のトランスフェクションによる、PKD1プロモーター（Pr）を標的とする例示的黄色ブドウ球菌CRISPRaシステム。結果を、dCas9-VP64に標準化されたmRNA増加倍率として表す。3つの独立した実験から平均値±s.d.を得た。
【図１１Ａ】図11A〜11B:インビトロでのCRISPRa SETD5過剰発現。図11Aは、ヒトHEK293T細胞へのヒトプロモーターsgRNA（SEQ ID NO:65〜74）のトランスフェクションによる、SETD5プロモーター（Pr）またはTHUMPD3を標的とする例示的黄色ブドウ球菌CRISPRaシステムを表す。HS MIXは、ヒトHEK293T細胞への、HS01〜HS10のそれぞれの等モル濃度のトランスフェクションを指す。結果を、VP64のみに標準化されたmRNA増加倍率として表す。3つの独立した実験から平均値±s.d.を得た。
【図１１Ｂ】図11A〜11B:インビトロでのCRISPRa SETD5過剰発現。図11Bは、マウスNeuro-2A細胞へのマウスプロモーターsgRNA（SEQ ID NO:75〜84）のトランスフェクションによる、SETD5プロモーター（Pr）またはROSA26を標的とする例示的黄色ブドウ球菌CRISPRaシステムを表す。MS MIXは、マウスNeuro-2A細胞への、MS01〜MS10のそれぞれの等モル濃度のトランスフェクションを指す。結果を、VP64のみに標準化されたmRNA増加倍率として表す。3つの独立した実験から平均値±s.d.を得た。
【図１２Ａ】図12A〜12B:インビトロでのCRISPRa Scn2A過剰発現。図12Aは、N2A細胞へのさまざまなsgRNA（SEQ ID NO:85〜91）のトランスフェクションによる、Scn2aプロモーター（Pr）を標的とする例示的化膿レンサ球菌（Sp）Cas9 CRISPRaシステムを表す。結果を、VP64のみに標準化されたmRNA増加倍率として表す。3つの独立した実験から平均値±s.d.を得た。
【図１２Ｂ】図12A〜12B:インビトロでのCRISPRa Scn2A過剰発現。図12Bは、選ばれたsgRNA（SEQ ID NO:92〜94）を含有するAAVをN2A細胞に感染させた後の、Scn2aプロモーター（Pr）を標的とする例示的黄色ブドウ球菌CRISPRaシステムを表す。2つの異なる感染多重度（MOI）、5,000ウイルスゲノムおよび1,250ウイルスゲノム（vg/ml）を使用した。結果を、VP64のみに標準化されたmRNA増加倍率として表す。3つの独立した実験から平均値±s.d.を得た。
【図１３】図13:インビトロでのCRISPRa PAX6過剰発現。これは、ニューロンに分化したヒトH1-ESC細胞へのヒトプロモーターsgRNA（SEQ ID NO:95）のレンチウイルス送達による、PAX6プロモーター（Pr）を標的とする例示的化膿レンサ球菌（Sp）Cas9 CRISPRaシステムを表す。結果をHPRTに対する相対発現として表す。3つの独立した実験から平均値±s.d.を得た。PAX6 CRISPRaがH1-ESCの神経誘導につながることを証明するために、さらなるニューロンマーカーが示されている。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
定義
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「a」、「an」および「the」は、文脈上そうでないことが明らかである場合を除き、複数の指示対象を包含する。
【００２０】
「処置（treating）」とは、疾患、状態または障害の処置または改善または防止の成功を示す何らかのしるしを指し、任意の客観的または主観的パラメータ、例えば軽快;寛解;症状の減少または疾患状態を患者が耐えやすくすること;変性または減退の速度を遅くすること;または変性の最終点の消耗性を減じることを含む。症状の処置または改善は、医師による検査の結果を含む、客観的パラメータまたは主観的パラメータに基づくことができる。したがって「処置」という用語は、本明細書に記載する疾患、状態または障害に関連する症状または状態を防止しもしくは遅延させ、緩和し、またはその発達を停止しもしくは抑制するための、本発明の化合物または作用物質の投与を含む。「治療効果」という用語は、対象における疾患、疾患の症状または疾患の副作用の低減、排除または防止を指す。本発明の方法を使った「処置」（treatingまたはtreatment）には、本明細書に記載する疾患、状態または障害に関連する疾患または障害のリスクが増大している可能性はあるが、まだ症状を体験したり呈したりしていない対象における発症を防止すること、疾患または障害の症状を抑制すること（その発達を遅らせまたは停止すること）、疾患の症状または副作用からの解放をもたらすこと（姑息的処置を含む）、および疾患の症状を取り除くこと（後退を引き起こすこと）が含まれる。処置は、予防的（発病を防止または遅延させること、またはその臨床症状もしくは前臨床症状の発現を防止すること）であることも、疾患または状態の症状発現後の症状の治療的抑止または緩和であることもできる。本明細書において使用する「処置」という用語は、防止的（例えば予防的）処置、治療的処置または姑息的処置を包含する。
【００２１】
「核酸」または「ポリヌクレオチド」という用語は、一本鎖型または二本鎖型のいずれかであるデオキシリボ核酸（DNA）またはリボ核酸（RNA）およびそれらのポリマーを指す。別段の具体的限定がある場合を除き、この用語は、リファレンス核酸と類似する結合特性を有し天然ヌクレオチドと同様に代謝される天然ヌクレオチドの公知の類似体を含有する核酸を包含する。別段の表示がある場合を除き、特定の核酸配列は、明示的に示された配列だけでなく、保存的に改変されたその変異体（例えば縮重コドン置換）、アレル、オルソログ、SNPおよび相補配列も、暗示的に包含する。具体的に述べると、縮重コドン置換は、1つまたは複数の選択された（またはすべての）コドンの3番目の位置が混合塩基および/またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成させることによって達成されうる（Batzer et al.,Nucleic Acid Res.19:5081（1991）、Ohtsuka et al.,J.Biol.Chem.260:2605-2608（1985）およびRossolini et al,Mol.Cell.Probes 8:91-98（1994））。核酸という用語は、遺伝子、cDNAおよび遺伝子によってコードされるmRNAと可換的に使用される。
【００２２】
「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖の生産に関与するDNAのセグメントを意味する。これには、コードセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）だけでなく、コード領域前後の領域（リーダーおよびトレイラー）も含まれうる。
【００２３】
「プロモーター」は、核酸の転写を指示する一連の核酸制御配列と定義される。本明細書おいて使用するプロモーターは、転写の開始部位に近い必須の核酸配列、例えばポリメラーゼII型プロモーターの場合であれば、TATA要素などを含む。プロモーターは、任意で、転写の開始部位から数千塩基対もの距離に位置する場合もある遠位のエンハンサー要素またはリプレッサー要素を含む。
【００２４】
「発現カセット」は、宿主細胞において特定のポリヌクレオチド配列の転写を可能にする一連の指定された核酸要素を持つ、組換え的または合成的に生成させた、核酸コンストラクトである。発現カセットはプラスミド、ウイルスゲノムまたは核酸フラグメントの一部でありうる。通例、発現カセットは、プロモーターに機能的に連結された転写されるべきポリヌクレオチドを含む。
【００２５】
「レポーター遺伝子」は、酵素活性または化学蛍光特性などといったそれらの生化学的特徴ゆえに容易に検出されうるタンパク質をコードする。そのようなレポーターの具体例の一つは緑色蛍光タンパク質である。このタンパク質から生成する蛍光は、さまざまな市販の蛍光検出システムで検出することができる。別のレポーターは染色によって検出することができる。レポーターは適当な基質と接触させたときに検出可能なシグナルを生成する酵素であることもできる。レポーターは検出可能な生成物の形成を触媒する酵素であることができる。適切な酵素として、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、リパーゼ、ホスファターゼおよびヒドロラーゼが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。レポーターは、その基質が実質的に真核細胞形質膜不透過性であって、それゆえにシグナル形成を緻密に制御することが可能になる酵素をコードすることができる。酵素をコードする適切なレポーター遺伝子の具体例として、CAT（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ;Alton and Vapnek（1979）Nature 282:864-869）、ルシフェラーゼ（lux）、β-ガラクトシダーゼ、LacZ、β.-グルクロニダーゼおよびアルカリホスファターゼ（Toh,et al.（1980）Eur.J.Biochem.182:231-238およびHall et al.（1983）J.Mol.Appl.Gen.2:101）が挙げられるが、それらに限定されるわけではなく、これらはそれぞれ参照により本明細書にそのまま組み入れられる。別の適切なレポーターとして、ある特定エピトープをコードし、そのエピトープを特異的に認識する標識抗体で検出することができるものも挙げられる。
【００２６】
「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸および合成アミノ酸ならびに天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸ミメティックを指す。天然アミノ酸は、遺伝暗号によってコードされているもの、および後から修飾されたアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタミン酸およびO-ホスホセリンである。アミノ酸類似体とは、天然アミノ酸と同じ基本的化学構造、すなわち水素、カルボキシル基、アミノ基およびR基に結合した炭素を有する化合物、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。そのような類似体は修飾されたR基（例えばノルロイシン）または修飾されたペプチド主鎖を有するが、天然アミノ酸と同じ基本的化学構造は保っている。「アミノ酸ミメティック」とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然アミノ酸と同様に機能する化学化合物を指す。
【００２７】
ポリペプチド鎖への非天然アミノ酸誘導体または類似体の部位特異的な組込みを可能にする方法は、当技術分野において種々知られている。例えばWO 02/086075を参照されたい。
【００２８】
本明細書では、一般に公知の三文字記号によって、またはIUPAC-IUB生化学命名委員会の勧告による一文字記号によって、アミノ酸に言及する場合がある。同様にヌクレオチドも一般に受け入れられている一文字コードによって言及する場合がある。
【００２９】
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書では、アミノ酸残基のポリマーを指すために可換的に使用される。3つの用語はいずれも、天然アミノ酸ポリマーおよび非天然アミノ酸ポリマーに適用されるだけでなく、1つまたは複数のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工的化学ミメティックであるアミノ酸ポリマーにも適用される。本明細書において使用する場合、これらの用語は、アミノ酸残基が共有ペプチド結合によって連結されている、完全長タンパク質を含む任意の長さのアミノ酸鎖を包含する。
【００３０】
「保存的に改変された変異体」はアミノ酸配列にも核酸配列にも適用される。特定の核酸配列に関して「保存的に改変された変異体」とは、同一または本質的に同一なアミノ酸配列をコードする核酸を指すか、核酸がアミノ酸配列をコードしていない場合には、本質的に同一な配列を指す。遺伝暗号は縮重しているので、任意の与えられたタンパク質は、機能的に同一な多数の核酸によってコードされる。例えばコドンGCA、GCC、GCGおよびGCUはいずれもアミノ酸アラニンをコードする。したがって、コドンによってアラニンが指定される位置ではどこでも、コードされるポリペプチドを変化させることなく、記載した対応コドンのいずれかに、コドンを変化させることができる。そのような核酸バリエーションは「サイレントバリエーション」であり、これは保存的に改変されたバリエーションの一種である。ポリペプチドをコードする本明細書における核酸配列はいずれも、その核酸の考えうるすべてのサイレントバリエーションを表す。核酸中の各コドン（通常は唯一のメチオニンコドンであるAUG、通常は唯一のトリプトファンコドンであるTGGを除く）を、機能的に同一な分子が得られるように改変できることは、当業者にはわかるであろう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレントバリエーションは、記載された各配列に暗に示されている。
【００３１】
アミノ酸配列に関して、核酸配列、ペプチド配列、ポリペプチド配列またはタンパク質配列における個々の置換、欠失または付加であって、コードされている配列中の単一のアミノ酸またはごく一部のアミノ酸を変化させ、付加し、または欠失させるものは、その変化が化学的に類似するアミノ酸によるアミノ酸の置換をもたらす場合、「保存的に改変された変異体」であることは、当業者にはわかるであろう。機能的に類似するアミノ酸を与える保存的置換表は、当技術分野において周知である。そのような保存的に改変された変異体は、多型変異体、種間ホモログおよび本発明のアレルに加えられ、それらを除外するものではない。場合により、Cas9などのCRISPRヌクレアーゼまたは低分子ガイドRNA（sgRNA）などのガイドRNAの保存的に改変された変異体は、WO 2016/011080に記載されているように、増加した安定性、アセンブリまたは活性を有しうる。WO 2016/011080の内容は、限定するわけではないがそこに記載されているsgRNA、sgRNAスキャフォールド、sgRNAライブラリーおよびsgRNA結合領域を含めて、参照によりあらゆる目的で本明細書にそのまま組み入れられる。
【００３２】
以下の8つのグループはそれぞれ、相互に保存的置換であるアミノ酸を含んでいる:
（1）アラニン（A）、グリシン（G）;
（2）アスパラギン酸（D）、グルタミン酸（E）;
（3）アスパラギン（N）、グルタミン（Q）;
（4）アルギニン（R）、リジン（K）;
（5）イソロイシン（I）、ロイシン（L）、メチオニン（M）、バリン（V）;
（6）フェニルアラニン（F）、チロシン（Y）、トリプトファン（W）;
（7）セリン（S）、スレオニン（T）;および
（8）システイン（C）、メチオニン（M）
（例えばCreighton,Protein,W.H.Freeman and Co.,N.Y.（1984）参照）。
【００３３】
本明細書では、一般に公知であるそれぞれの三文字記号によって、またはIUPAC-IUB生化学命名委員会の勧告による一文字記号によって、アミノ酸に言及する場合がある。同様にヌクレオチドも一般に受け入れられている一文字コードによって言及する場合がある。
【００３４】
本願では、無改変の野生型ポリペプチド配列中の左端の残基を1番とし、そこからのそれぞれの相対的位置に従って、アミノ酸残基に番号を付ける。
【００３５】
本明細書において使用する場合、2つ以上のポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列について述べる文脈において、「同一」または「同一性」パーセントという用語は、同じである2つ以上の配列または部分配列を指すか、指定されたパーセンテージの、同じであるアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する2つ以上の配列または部分配列を指す。例えば、sgRNA:ヌクレアーゼ複合体のアセンブリおよび活性を担うコア低分子ガイドRNA（sgRNA）配列は、比較ウインドウ全体または指定領域全体で比較して最大の一致が得られるようにアラインメントした場合に、下記の配列比較アルゴリズムのうちの一つを用いる測定で、または手作業でのアラインメントと目視検査とによる測定で、リファレンス配列に対して少なくとも80％の同一性、好ましくは85％、90％、91％、92％、93、94％、95％、96％、97％、98％、99％または100％の同一性を有する。
【００３６】
配列比較では、通例、一つの配列がリファレンス配列としての役割を果たし、テスト配列がそれと比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合は、テスト配列とリファレンス配列がコンピュータに入力され、必要であれば部分配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。デフォルトプログラムパラメータを使用すること、または代替パラメータを指定することができる。次に配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づき、リファレンス配列に対して、テスト配列の配列同一性パーセントを計算する。核酸およびタンパク質の配列比較には、BLASTおよびBLAST 2.0アルゴリズムならびに以下に述べるデフォルトパラメータが使用される。
【００３７】
本明細書おいて使用する「比較ウインドウ」は、20〜600、通常は約50〜約200、より通常は約100〜約150からなる群より選択される連続位置数のうちのいずれか一つのセグメントであって、そのセグメント内で、配列が、同じ連続位置数のリファレンス配列と、それら2つの配列を最適にアラインメントした後に比較されうるものへの言及を包含する。比較される配列のアラインメント方法は当技術分野において周知である。比較される配列の最適なアラインメントは、例えばSmith＆Waterman,Adv.Appl.Math.2:482（1981）のローカルホモロジーアルゴリズムによって、またはNeedleman＆Wunsch,J.Mol.Biol.48:443（1970）のホモロジーアラインメントアルゴリズムによって、またはPearson＆Lipman,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85:2444（1988）の類似性検索法（search for similarity method）によって、またはこれらのアルゴリズムのコンピュータへの実装（Wisconsin Genetics Software Package（Genetics Computer Group、ウィスコンシン州マディソン・サイエンスドライブ575）のGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA）によって、または手作業によるアラインメントと目視検査とによって、行うことができる（例えばCurrent Protocols in Molecular Biology（Ausubel et al.,eds.1995 supplement）参照）。
【００３８】
配列同一性パーセントおよび配列類似性パーセントを決定するのに適したアルゴリズムの例はBLASTおよびBLAST 2.0アルゴリズムであり、これらは、それぞれAltschul et al,（1990）J.Mol.Biol.215:403-410およびAltschul et al.（1977）Nucleic Acids Res.25:3389-3402に記載されている。BLAST解析を行うためのソフトウェアは国立バイオテクノロジー情報センターのウェブサイト、ncbi.nlm.nih.govにおいて公的に利用可能である。このアルゴリズムでは、まず、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインメントしたときに、何らかの正の値を持つ閾スコアTとマッチするか、またはそれを満たす、クエリ配列中の長さWの短いワードを同定することによって、高スコアリング配列ペア（high scoring sequence pair）（HSP）を同定する。Tは近隣ワードスコア閾（neighborhood word score threshold）と呼ばれる（Altschulら,前掲）。これらの初期近隣ワードヒットは、それらを含有するさらに長いHSPを見いだすための検索を開始するためのシードとしての役割を果たす。次に、このワードヒットは、累積アラインメントスコアを増加させることができる限り、各配列に沿って両方向に延長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列の場合は、パラメータM（マッチ残基のペアに対する報酬スコア;常に＞0）およびN（ミスマッチ残基に対するペナルティスコア;常に＜0）を使って算出される。アミノ酸配列の場合はスコアリングマトリックスを使って累積スコアを算出する。各方向へのワードヒットの伸長は、累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Xだけ低下したとき、または累積スコアが1つまたは複数の減点残基アラインメント（negative-scoring residue alignment）によってゼロ以下になったとき、またはどちらかの配列の末端に到達したときに、停止される。BLASTアルゴリズムパラメータW、TおよびXはアラインメントの感度および速さを決定する。BLASTNプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルト値として、ワードサイズ（W）28、期待値（E）10、M＝1、N＝-2および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列の場合、BLASTPプログラムは、デフォルト値として、ワードサイズ（W）3、期待値（E）10およびBLOSUM62スコアリング行列を使用する（Henikoff＆Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915（1989）参照）。
【００３９】
BLASTアルゴリズムは2つの配列間の類似性の統計解析も行う（例えばKarlin＆Altschul,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 90:5873-5787（1993）参照）。BLASTアルゴリズムによって与えられる類似性の尺度の一つは、2つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の間でマッチが偶然に起こる確率の指標を与える最小和確率（smallest sum probability）（P（N））である。例えば、テスト核酸とリファレンス核酸との比較における最小和確率が約0.2未満、より好ましくは約0.01未満、最も好ましくは約0.001未満である場合、その核酸はリファレンス配列と類似していると見なされる。
【００４０】
2つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であることの指標は、後述のように、第1核酸によってコードされるポリペプチドが、第2核酸によってコードされるポリペプチドに対して産生させた抗体と免疫学的に交差反応することである。したがって、例えば2つのポリペプチドの相違が保存的置換だけである場合、ポリペプチドは通例、第2のポリペプチドと実質的に同一である。2つの核酸配列が実質的に同一であることのもう一つの指標は、後述のように、それら2つの分子またはそれらの相補体が、ストリンジェントな条件下で、互いにハイブリダイズすることである。2つの核酸配列が実質的に同一であることのさらにもう一つの指標は、同じプライマーを使って配列を増幅できることである。2つのポリペプチドが実質的に同一であることのさらにもう一つの指標は、それら2つのポリペプチドが同一の活性または実質的に類似する活性を保っていることである。
【００４１】
「トランスロケーション配列」または「形質導入配列」とは、ある細胞内コンパートメントから別の細胞内コンパートメントへのタンパク質の移動または細胞外間隙から細胞膜もしくは形質膜を通って細胞内への移動を指示する、ペプチドまたはタンパク質（またはその活性フラグメントもしくはドメイン）配列を指す。細胞外間隙から細胞膜または形質膜を通って細胞内へのタンパク質の移動を指示するトランスロケーション配列は、「細胞透過ペプチド（cell penetration peptide）」である。細胞の核に局在化するトランスロケーション配列は「核局在化」配列、シグナル、ドメイン、ペプチドなどと呼ばれる。
【００４２】
トランスロケーション配列の例として、TAT形質導入ドメイン（例えばS.Schwarze et al,Science 285（Sep.3,1999）参照）;ペネトラチンまたはペネトラチンペプチド（D.Derossi et al,Trends in Cell Biol.8,84-87）;単純ヘルペスウイルス1型VP22（A.Phelan et al.,Nature Biotech.16,440-443（1998））およびポリカチオン性（例えばポリ-アルギニン）ペプチド（Cell Mol.Life Sci.62（2005）1839-1849）が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。当技術分野では他のトランスロケーション配列も公知である。トランスロケーションペプチドは、数ある目的のなかでも特に、標的細胞内に容易に進入しうるコンジュゲート化合物、または血液脳関門を通って標的細胞内に容易に進入しうるコンジュゲート化合物を生産するために、本発明の化合物に（例えばアミノ末端またはカルボキシル末端で）融合、コンジュゲートまたはカップリングすることができる。
【００４３】
本明細書において使用する用語「CRISPR」は、天然のクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat）システムもしくは同座位またはそれらの誘導体のいずれか一つを指す。CRISPR座位は多くの細菌および古細菌のゲノム中に見いだすことができる。4タイプのCRISPRシステム（例えばI型、II型、III型およびU型）がある。
【００４４】
CRISPR座位は、CRISPR関連遺伝子群（Cas）遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列を含む。Cas遺伝子は、crRNA機能のバイオジェネシス段階および/または干渉段階に関与しうる。Cas遺伝子はそれらが由来する生物に従って命名されうる。例えば表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）中のCas遺伝子はCsm型と呼ぶことができ、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）中のCas遺伝子Csn型と呼ぶことができ、パイロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）中のCas遺伝子はCmr型と呼ぶことができる。
【００４５】
本明細書において使用する用語CRISPRヌクレアーゼは、4タイプのCRISPR座位I型、II型、III型およびU型のうちのいずれか1つにコードされているヌクレアーゼのポリペプチドまたは前記ヌクレアーゼに由来するポリペプチドを指し、ここで、そのポリペプチドの天然配列は、RNA誘導型ヌクレアーゼ活性を呈する。CRISPRヌクレアーゼは触媒的に不活性であることができる。触媒的に不活性なCRISPRヌクレアーゼは、RNAガイドとの複合体を形成して、標的ドメインおよび一定の態様ではPAM配列を含有する核酸標的に結合したときに、ヌクレアーゼ活性もニッカーゼ活性も呈さない。触媒的に不活性なCRISPRヌクレアーゼが触媒的に不活性なである理由は、CRISPRヌクレアーゼポリペプチド配列の1つまたは複数の変異であるか、RNA誘導型ターゲティングを提供するには十分であるが触媒活性（すなわちヌクレアーゼ活性またはニッキング活性）をサポートするには不十分なガイドRNAとの複合体形成であることができる。例えばCRISPRヌクレアーゼは、デッドガイド配列との複合体を形成した野生型CRISPRヌクレアーゼ（例えばCas9またはCpf1ヌクレアーゼ）であることができる。例えばCpf1はクラスII CRISPR-Casシステムであり、Zetsche et al.,Cell,163:759-771（2015）に記載されている。デッドガイド配列とそれらの使用は、例えばWO 2016/094872にさらに記載されており、この文献は、デッドガイド配列、CRISPRヌクレアーゼとデッドガイド配列との間の複合体、ならびにそのようなデッドガイド配列およびそれらを含有する複合体を作製し使用するための方法および組成物を含めて、参照によりあらゆる目的で本明細書に組み入れられる。
【００４６】
一定の態様において、CRISPRヌクレアーゼは、以下の基準のうちの一方または両方を満たす:リファレンス配列、例えば天然CRISPRヌクレアーゼのアミノ酸配列と少なくとも20、30、40、50、55、60、65、70、75、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99または100％の相同性を有するか、リファレンス配列、例えば天然CRISPRヌクレアーゼのアミノ酸配列との相違が、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、35、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350または400アミノ酸残基未満である。さらなるCRISPRヌクレアーゼとして、WO 2016/154579に記載の1種または複数種のCRISPRヌクレアーゼが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
【００４７】
一定の態様において、CRISPRヌクレアーゼは1つまたは複数の追加ポリペプチドまたは核酸を含有する（すなわちそれらに共有結合的にまたは非共有結合的に連結されている）。例えばCRISPRヌクレアーゼは、アミノ末端またはカルボキシ末端において、1つまたは複数の転写活性化ドメインポリペプチド、1つまたは複数のDNA結合ポリペプチド、1つまたは複数のアフィニティータグ（例えばアフィニティータグリガンド-転写活性化ドメイン融合タンパク質など、1つまたは複数のアフィニティータグリガンドとの複合体を形成）、核局在化配列またはそれらの組合せに融合することができる。
【００４８】
例示的なDNA結合ポリペプチドとして、限定するわけではないが、Bolukbasi et al.,Nature Methods 12,1150-1156（2015）に記載のプログラマブルDNA結合ドメインが挙げられ、この文献の内容は、例えばそこに記載されているプログラマブルDNA結合ドメイン（pDBD）、Cas9変異体およびCas9-pDBDキメラを含めて、参照により本明細書にそのまま組み入れられる。例示的な転写活性化ドメインポリペプチドとして、限定するわけではないが、以下のポリペプチドのうちの1つまたは複数の活性化ドメインまたはそれら活性化ドメインの組合せが挙げられる:
・熱ショック転写因子1（HSF1）、例えば
2020506948.tif 000015
・ウイルスタンパク質16（VP16）、例えば
2020506948.tif 000016
・VP16四量体（VP64）、例えば
2020506948.tif 000017
・p65 NF-Kβトランス活性化サブユニット（p65）、例えば
2020506948.tif 000018
・MyoD1、例えば
2020506948.tif 000019
・RTA、例えば
2020506948.tif 000020
・SET7、例えば
2020506948.tif 000021
・VPR、例えば
2020506948.tif 000022
・ヒストンアセチルトランスフェラーゼp300、例えば
2020506948.tif 000023
・TETファミリータンパク質のヒドロキシラーゼ触媒ドメイン（例えばTET1ヒドロキシラーゼ触媒ドメイン）、例えば
2020506948.tif 000024
2020506948.tif 000025
・LSD1、例えば
2020506948.tif 000026
・CIB1、例えば
2020506948.tif 000027
・AD2、例えば
2020506948.tif 000028
・CR3、例えば
2020506948.tif 000029
・GATA4、例えば
2020506948.tif 000030
・p53、例えば
2020506948.tif 000031
・SP1、例えば
2020506948.tif 000032
・MEF2C、例えば
2020506948.tif 000033
・TAX、例えば
2020506948.tif 000034
・PPARγ、例えば
2020506948.tif 000035
または
・SET9、例えば
2020506948.tif 000036
または、Chavez et al.,Nat Methods.2015 Apr;12（4）:326-328（この文献は、限定するわけではないが活性化ドメインポリペプチドおよびそれをコードしているポリヌクレオチド、Cas9（例えばdCas9）ポリペプチドおよびそれをコードしているポリヌクレオチド、ならびにそれらの融合タンパク質および複合体（例えばsgRNAとの複合体）を含めて、参照により、ありとあらゆる目的で本明細書にそのまま組み入れられる）に記載の転写活性化ドメインのうちの1つもしくは複数。
【００４９】
場合により、CRISPRヌクレアーゼは1つまたは複数のアフィニティータグに融合される。例えばCRISPRヌクレアーゼはSunTagの一構成要素でありうる。例示的なSunTagまたはSunTag構成要素として、WO 2016/011070に記載のアフィニティータグ付きCRISPRヌクレアーゼまたはアフィニティータグリガンドおよびそれらの融合タンパク質のうちの1つまたは複数が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。一態様において、CRISPRヌクレアーゼは、1つまたは複数のリガンド-転写活性化ドメイン融合タンパク質に非共有結合的に結合した1つまたは複数アフィニティータグを含有する。そのような態様において、アフィニティータグリガンドに融合される転写活性化ドメインは、例えば、SEQ ID NO:13〜33の転写活性化ドメインなどといった本明細書に記載の転写活性化ドメイン、WO 2016/011070に記載の転写活性化ドメイン、またはそれらの組合せもしくは誘導体のうちの1つまたは複数であることができる。
【００５０】
本明細書において使用する用語「Cas9」、「Cas9分子」などは、Cas9ポリペプチドまたはCas9ポリペプチドをコードする核酸を指す。「Cas9ポリペプチド」は、ガイドRNA（gRNA）との複合体を形成して、標的ドメインと一定の態様ではPAM配列とを含有する核酸標的に結合することができるポリペプチドである。Cas9分子には、天然Cas9ポリペプチド配列を有するもの、およびリファレンス配列、例えば最も類似する天然Cas9分子とは、例えば少なくとも1つのアミノ酸残基が異なる、工学的に操作された（engineered）または変更された（altered）または改変された（modified）Cas9ポリペプチドが包含される。Cas9分子は、Cas9ポリペプチドまたはCas9ポリペプチドをコードする核酸でありうる。Cas9分子は、ヌクレアーゼ（二本鎖核酸の両方の鎖を切断する酵素）、ニッカーゼ（二本鎖核酸の一方の鎖を切断する酵素）または触媒的に不活性な（もしくはデッド）Cas9分子でありうる。ヌクレアーゼ活性またはニッカーゼ活性を有するCas9分子は「触媒的に活性なCas9分子」（「caCas9」分子）と呼ばれる。標的核酸を切断する能力も標的核酸にニックを入れる能力も欠くCas9分子を「触媒的に不活性なCas9分子」（「ciCas9」分子）または「デッドCas9」（「dCas9」）という。
【００５１】
一定の態様において、Cas9分子は、以下の基準のうちの一方または両方を満たす:リファレンス配列、例えば天然Cas9分子のアミノ酸配列と少なくとも20、30、40、50、55、60、65、70、75、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99または100％の相同性を有するか、リファレンス配列、例えば天然Cas9分子のアミノ酸配列との相違が、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、35、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350または400アミノ酸残基未満である。
【００５２】
いくつかの態様において、Cas9分子は化膿レンサ球菌Cas9（SpCas9）またはその変異体である。いくつかの態様において、Cas9分子は黄色ブドウ球菌Cas9（SaCas9）またはその変異体である（例えば本願の図7A〜11B参照）。いくつかの態様において、Cas9分子はカンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）Cas9（CjCas9）またはその変異体である（Kim et al.,Nat.Comm.,8,14500（2017）参照）。いくつかの態様において、Cas9分子は髄膜炎菌（Neisseria meningitides）Cas9（NmCas9）またはその変異体である（米国特許第9,074,199号参照）。いくつかの態様において、Cas9分子はストレプトコッカス・サーモフィルスCas9（StCas9）またはその変異体（例えばXu et al.,Cell Mol Life Sci.,72:383-99（2014）参照）。いくつかの態様において、Cas9分子はdCas9分子である。
【００５３】
一定の態様において、Cas9分子は化膿レンサ球菌Cas9変異体である。一定の態様において、前記Cas9変異体はEQR変異体である。一定の態様において、前記Cas9変異体はVRER変異体である。一定の態様において、dCas9分子は化膿レンサ球菌Cas9変異体である。一定の態様において、前記Cas9変異体はEQR変異体である。一定の態様において、前記Cas9変異体はVRER変異体である。一定の態様において、Cas9システムはCas9分子、例えば本明細書に記載のCas9分子、例えばCas9 EQR変異体またはCas9 VRER変異体を含む。
【００５４】
一定の態様において、Cas9分子は黄色ブドウ球菌Cas9変異体である。一定の態様において、前記Cas9変異体はKKH（E782K/N968K/R1015H）変異体（例えばKleinstiver et al.,Nature 523,481-485（23 July 2015）およびLeenay et al.Molecular Cell,Vol.62,Issue 1,2016,p.137参照）であり、これらの内容はすべて、参照により、明確に、とりわけCas（例えばCas9）変異体、例えばPAM特異性が変化しているものなどに関して、本明細書に組み入れられる。一定の態様において、前記Cas9変異体はE782K/K929R/R1015H変異体（例えばKleinstiver 2015参照）である。一定の態様において、前記Cas9変異体はE782K/K929R/N968K/R1015H変異体である（例えばKleinstiver 2015参照）。一定の態様において、前記Cas9変異体は以下の残基のうちの1つに1つまたは複数の変異を含む:E782、K929、N968、R1015。一定の態様において、前記Cas9変異体は以下の変異のうちの1つまたは複数を含む:E782K、K929R、N968K、R1015HおよびR1015Q（例えばKleinstiver 2015参照）。一定の態様において、Cas9システムは、Cas9分子、例えば本明細書に記載のCas9分子、例えばCas9 KKH変異体を含む。
【００５５】
本明細書において使用する用語「Cpf1」、「Cpf1分子」などは、Cpf1ポリペプチドまたはCpf1ポリペプチドをコードする核酸を指す。「Cpf1ポリペプチド」は、ガイドRNA（gRNA）との複合体を形成して、標的ドメインと一定の態様ではPAM配列とを含有する核酸標的に結合することができるポリペプチドである。Cpf1分子には、天然Cpf1ポリペプチド配列を有するもの、およびリファレンス配列、例えば最も類似する天然Cpf1分子とは、例えば少なくとも1つのアミノ酸残基が異なる、工学的に操作されたまたは変更されたまたは改変されたCpf1ポリペプチドが包含される。Cpf1分子は、Cpf1ポリペプチドまたはCpf1ポリペプチドをコードする核酸でありうる。例示的なCpf1ポリペプチドとして、プレボテラ属（Prevotella）、フランシセラ・ノビサイダ（Francisella novicida）（FnCpf1）、ラクノスピラ科（Lachnospiraceae）の細菌（LbCpf1）およびアシダミノコッカス属（Acidaminococcus sp.）（AsCpf1）（例えばToth et al.,Biology Direct,11:46（2016）参照）から単離されるものが挙げられる。
【００５６】
一定の態様において、Cpf1分子は、以下の基準のうちの一方または両方を満たす:リファレンス配列、例えば天然Cpf1分子のアミノ酸配列と少なくとも20、30、40、50、55、60、65、70、75、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99または100％の相同性を有するか、リファレンス配列、例えば天然Cpf1分子のアミノ酸配列との相違が、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、35、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350または400アミノ酸残基未満である。
【００５７】
本明細書において使用する用語「gRNA分子」または「gRNA」は、CRISPRヌクレアーゼを標的核酸にターゲティングする能力を有するガイドRNAを指す。一態様において、「gRNA分子」という用語はガイドリボ核酸を指す。別の一態様において、「gRNA分子」という用語はgRNAをコードする核酸を指す。一態様において、gRNA分子は非天然である。一態様において、gRNA分子は合成gRNA分子である。
【００５８】
ガイドRNAは、1つまたは複数のタンパク質または核酸リガンド（スキャフォールドRNAリガンド）に結合するスキャフォールドRNAであることができる。リガンドは転写活性化ドメインに融合されるか、他の形で、共有結合的または非共有結合的に連結されうる。代替的一態様において、スキャフォールドRNAは、それがCRISPRヌクレアーゼと特異的に会合しないという点で、ガイドRNAではない。例示的なスキャフォールドRNAおよびCRISPRヌクレアーゼ/スキャフォールドRNA複合体ならびにそれらの作製方法および使用方法は、例えばWO 2016/054106（CRISPR会合性（CRISPR-associating）スキャフォールドRNAおよびCRISPR非依存性（CRISPR independent）スキャフォールドRNAの記載がある）およびZhang et al.,Scientific Reports 5,Article No.16277（2015）、Konermann et al.,2015,Nature 517:583-8（CRISPR/gRNA指定（CRISPR/gRNA-directed）相乗的活性化メディエーター（SAM）の記載がある）に記載されている。
【００５９】
本明細書において使用する「対象」は、ヒトまたは非ヒト動物のどちらかを意味する。この用語は、哺乳動物（例えばヒト、他の霊長類、ブタ、齧歯類（例えばマウスおよびラットまたはハムスター）、ウサギ、モルモット、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、ヒツジおよびヤギ）を包含するが、それらに限定されるわけではない。一態様において、対象はヒトである。別の一態様において、対象は家禽である。別の一態様において、対象は魚類である。一定の態様において、対象はヒトであり、これらの態様の一部において、ヒトは乳児、幼児、若年成人または成人である。
【００６０】
本明細書において使用する用語「標的核酸」または「標的遺伝子」は、例えばガイドRNA、ガイドRNA、またはスキャフォールドRNAとの複合体を形成しているCRISPRヌクレアーゼなどによる結合の標的となっている核酸を指す。一定の態様において、標的核酸は1つの遺伝子を含むか、1つの遺伝子に機能的に連結されたプロモーターまたはエンハンサーを含む。一定の態様において、標的核酸は、1つまたは複数の遺伝子、例えば2つの遺伝子、3つの遺伝子、4つの遺伝子もしくは5つの遺伝子、または1つもしくは複数の遺伝子に機能的に連結されたプロモーターもしくはエンハンサーを含みうる。一態様において、標的核酸は、ある遺伝子のプロモーター領域または制御領域を含みうる。一態様において、標的核酸は、ある遺伝子のイントロンを含みうる。別の一態様において、標的核酸は、ある遺伝子のエクソンを含みうる。一態様において、標的核酸は、遺伝子のコード領域を含みうる。一態様において、標的核酸は、ある遺伝子の非コード領域を含みうる。いくつかの態様において、標的核酸は、本明細書の表1に列挙する遺伝子の制御領域、プロモーター、エンハンサー、イントロン、エクソン、転写開始部位、コード領域または非コード領域である。
【００６１】
いくつかの態様において、標的核酸は、本明細書の表1に列挙する遺伝子と同じパスウェイ中の遺伝子の制御領域、プロモーター、エンハンサー、イントロン、エクソン、転写開始部位、コード領域または非コード領域である。標的核酸は、例えば本明細書の表1に列挙する遺伝子と同じパスウェイ中で上流にある遺伝子の制御領域、プロモーター、エンハンサー、イントロン、エクソン、転写開始部位、コード領域または非コード領域であることができる。2つ以上の遺伝子または位置が標的となる場合は上記に加えて、または上記に代えて、標的核酸は、例えば本明細書の表1に列挙する遺伝子と同じパスウェイ中で下流にある遺伝子の制御領域、プロモーター、エンハンサー、イントロン、エクソン、転写開始部位、コード領域または非コード領域であることができる。2つ以上の遺伝子または位置が標的となる場合は上記に加えて、または上記に代えて、標的核酸は、例えば本明細書の表1に列挙する遺伝子と並行パスウェイ中の遺伝子の制御領域、プロモーター、エンハンサー、イントロン、エクソン、転写開始部位、コード領域または非コード領域であることができる。表1に列挙する遺伝子のうちの1つまたは複数と同じパスウェイ中または並行パスウェイ中の例示的遺伝子は、例えばKEGGパスウェイデータベース（www.genome.jp/kegg/pathway.htmlにおいて利用可能）に記載されている。
【００６２】
本明細書おいて使用する「標的位置」とは、ガイドRNA（例えばCRISPRヌクレアーゼとの複合体を形成しているもの）またはスキャフォールドRNAにハイブリダイズされる標的核酸上の部位を指す。最適化された標的位置として、WO 2016/011080に記載されている転写活性化のために最適化された1つまたは複数の標的位置が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
【００６３】
「エピソーマルベクター」または「エピソーム増殖型（episomally propagating）ベクター」とは、哺乳動物細胞中でエピソーム要素として存続または増殖するプラスミドまたはウイルスベクターを指す。本明細書に記載するエピソーマルベクターは、転写活性化によって疾患または状態（例えば表1の疾患または状態）を処置するための、1つまたは複数の構成要素（例えばCRISPRヌクレアーゼ、ガイドRNA、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、TALEN、TALエフェクター、スキャフォールドRNA、転写活性化因子、アフィニティー要素、またはそれらの組合せ）をコードすることができる。エピソーマルベクターとしては、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターおよびエプスタイン・バー・ウイルス（EBV）ベクターが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。適切なAAVベクターと、そのようなAAVベクターを作製し使用するための方法、例えば標的細胞中にベクターを送達するための方法は、Samulski Ret al.（1987）,J.Virol.61:3096-3101、Walsh et al.,Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204:289-300（1993）、Fisher K J et al.（1996）,J.Virol,70:520-532、Samulski Ret al.（1989）,J.Virol.63:3822-3826、米国特許第5,252,479号、米国特許第5,139,941号、米国特許第5,436,146号、国際特許出願WO 94/13788および国際特許出願WO 93/24641に記載されており、これらの開示はすべて参照により本明細書に組み入れられる。
【００６４】
本明細書において使用する用語「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」は、亜鉛イオンの配位によって安定化する構造を持つジンクフィンガー結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である1つまたは複数のジンクフィンガーによってDNAに配列特異的に結合するジンクフィンガーDNA結合タンパク質（またはより大きなタンパク質内のジンクフィンガーDNA結合ドメイン）を指す。ジンクフィンガーDNA結合タンパク質という用語は、しばしばジンクフィンガーヌクレアーゼまたはZFNと略記される。
【００６５】
本明細書において使用する用語「転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ」は、DNAに配列特異的に結合する、DNA切断ドメインに融合された転写活性化因子様エフェクターDNA結合ドメインを含むタンパク質を指す。転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼという用語は、しばしばTALENと略記される。
【００６６】
発明の詳細な説明
序論
本明細書には、遺伝子の転写の低減または遺伝子産物の量の低減または遺伝子産物の活性の低減に関連するかそれらによって増悪されるかそれらによって引き起こされる哺乳動物対象における疾患を、標的遺伝子の転写を増加させることによって処置するための方法および組成物が記載される。そのような方法および組成物は、例えば対象におけるハプロ不全疾患を処置するために役立ちうる。本明細書に記載する方法および組成物によって処置することができるハプロ不全疾患としては、表1に列挙する疾患のうちの1つまたは複数が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。表1に、national center for bioinformatics（NCBI）からのEntrez遺伝子ID（第2列）とヒトゲノム命名法委員会（HGNC）によって提供される対応遺伝子記号（第1列）、参考文献のpubmed ID（PMID）文献番号（第4列）および関連する障害の簡単な説明（第5列）を掲載する。この表は、Dang et al.,European Journal of Human Genetics（2008）16,1350-57のSupplementary Table 1ならびにClinVar（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar）およびClinGen（https://www.clinicalgenome.org）データベースからの翻案である。
【００６７】
ヌクレアーゼ
本明細書に記載する方法のいくつかの態様では、宿主細胞を1つまたは複数のヌクレアーゼと接触させる。いくつかの態様において、ヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼ、部位特異的リコンビナーゼ、トランスポザーゼ、トポイソメラーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、TALENであり、改変されたその誘導体および変異体を包含する。
【００６８】
いくつかの態様において、ヌクレアーゼは、標的部位内の指定されたヌクレオチドまたは領域を標的にする能力を有する。いくつかの態様において、ヌクレアーゼは、標的部位の5'領域と3'領域の間に位置する領域を標的にする能力を有する。別の一態様において、ヌクレアーゼは、標的部位の5'領域および3'領域の上流または下流（例えば転写開始部位（TSS）の上流または下流）に位置する領域を標的とする能力を有する。認識配列は、ヌクレアーゼによって特異的に認識されかつ/または結合されるポリヌクレオチド配列である。認識部位配列の長さはさまざまであることができ、例えば少なくとも10、12、14、16、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70ヌクレオチド長またはそれ以上の長さであるヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、認識配列は回分構造である。すなわち、一方のDNA鎖上の配列は、相補的DNA鎖上の反対方向と同じに読める。いくつかの態様において、ヌクレアーゼの標的部位は認識配列内にある。
【００６９】
ジンクフィンガーヌクレアーゼ
いくつかの態様において、ヌクレアーゼはジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）である。ZFNは、通例、ジンクフィンガーDNA結合ドメインとヌクレアーゼドメインとを含む。一般に、ZFNは、二量体化すると活性になる非特異的エンドヌクレアーゼの単一サブユニット、例えばFokI酵素のヌクレアーゼドメインに、それぞれが融合している2つのジンクフィンガーアレイ（ZFA）を含む。通例、単一のZFAは、それぞれが特異的ヌクレオチドトリプレット（GGC、GATなど）を認識するように設計された3つまたは4つのジンクフィンガードメインからなる。したがって、2つの「3フィンガー」ZFAから構成されるZFNは、18塩基対の標的部位（すなわち認識配列）を認識する能力を有する。18塩基対の認識配列は一般に、ヒトおよび植物のゲノムなどといった大きなゲノム内でさえ、ユニークである。2つのFokIヌクレアーゼモノマーの共局在および二量体化を指示することにより、ZFNは、特定座位（例えば遺伝子、プロモーターまたはエンハンサー）を標的とすることができる機能的な部位特異的エンドヌクレアーゼを生成させる。
【００７０】
本明細書に開示する方法において有用なジンクフィンガーヌクレアーゼとして、公知のもの、および本明細書に記載する1つまたは複数の標的部位（例えばプロモーターヌクレオチド配列またはエンハンサーヌクレオチド配列）に対する特異性を有するように工学的に操作されたZFNが挙げられる。ジンクフィンガードメインは、宿主細胞ゲノムの標的部位内の選択されたポリヌクレオチド認識配列に特異的に結合するポリペプチドの設計に対応できる。ZFNは、非特異的エンドヌクレアーゼドメイン、例えばHOまたはFokIなどのIIs型エンドヌクレアーゼのヌクレアーゼドメインに連結された、工学的に操作されたDNA結合ジンクフィンガードメインを含むことができる。いくつかの例では、ジンクフィンガーDNA結合ドメインを、部位特異的リコンビナーゼ、トランスポザーゼまたはその誘導体であってDNAニッキング活性および/もしくはDNA切断活性を保っているものに、融合することができる。
【００７１】
好ましい一態様では、限定するわけではないが転写活性化因子ドメイン（例えばVP16、VP48、VP64、VP160など）または転写リプレッサードメイン（KRABなど）などといったさらなる機能性を、ジンクフィンガー結合ドメインに融合することができる。一態様において、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、VP16、VP48、VP64またはVP160から選択される転写活性化因子ドメインを含むように工学的に操作される。一態様において、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、HSF1、VP16、VP64、p65、RTA、MyoD1、SET7、VPR、ヒストンアセチルトランスフェラーゼp300、TET1ヒドロキシラーゼ触媒ドメイン、LSD1、CIB1、AD2、CR3、GATA4、p53、SP1、MEF2C、TAX、PPAR-ガンマおよびSET9から選択される転写活性化因子ドメインを含むように工学的に操作される。例えば、ガンマ-グロブリン遺伝子のプロモーター領域と相互作用する工学的に操作されたジンクフィンガー転写活性化因子は、プライマー成人赤芽球（primer adult erythroblast）における胎児ヘモグロビン生産を強化することが示された（Wilber et al.,Blood,115（15）:3033-3041）。他のポリダクチル（polydactyl）ジンクフィンガー転写因子も、Beerli and Barbas（Nature Technology,（2002）20:135-141参照）に開示されているものを含めて、当技術分野では公知である。
【００７２】
各ジンクフィンガードメインは標的DNA中の3つの連続する塩基対を認識する。例えば3フィンガードメインは9個の連続するヌクレオチドの配列を認識し、ヌクレアーゼは二量体化を必要とするので、2セットのジンクフィンガートリプレットを使って、18個のヌクレオチド認識配列に結合する。有用なジンクフィンガーモジュールとして、さまざまなGNNトリプレットおよびANNトリプレットを認識するもの（Dreier et al.,（2001）J Biol Chem 276:29466-78、Dreier et al.,（2000）J Mol Biol 303:489-502、Liu et al.,（2002）J Biol Chem 277:3850-6）ならびにさまざまなCNNトリプレットまたはTNNトリプレットを認識するもの（Dreier et al.,（2005）J Biol Chem 280:35588-97、Jamieson et al.,（2003）Nature Rev Drug Discovery 2:361-8）が挙げられる。Durai et al.,（2005）Nucleic Acids Res 33:5978-90、Segal,（2002）Methods 26:76-83、Porteus and Carroll,（2005）Nat Biotechnology 23:967-73、Pabo et al.,（2001）Ann Rev Biochem 70:313-40、Wolfe et al.,（2000）Ann Rev Biophys Biomol Struct 29:183-212、Segal and Barbas（2001）Curr Opin Biotechnol 12:632-7、Segal et al.,（2003）Biochemistry 42:2137-48、Beerli and Barbas,（2002）Nat Biotechnol 20:135-41、Carroll et al.,（2006）Nature Protocols 1:1329、Ordiz et al.,（2002）Proc Natl Acad Sci USA 99:13290-5、Guan et al.,（2002）Proc Natl Acad Sci USA 99:13296-301、WO2002099084、WO00/42219、WO02/42459、WO2003062455、US20030059767、米国特許出願公開第2003/0108880号、米国特許第6,140,466号、同第6,511,808号および同第6,453,242号も参照されたい。有用なジンクフィンガーヌクレアーゼには、WO03/080809、WO05/014791、WO05/084190、WO08/021207、WO09/042186、WO09/054985およびWO10/065123に記載されているものも含まれる。
【００７３】
いくつかの態様において、ZFNは、工学的に操作されたジンクフィンガー結合ドメインに融合されたIIS型制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインを有する融合タンパク質を含み、ここでは結合ドメインが1つまたは複数の転写活性化因子をさらに含む。いくつかの態様において、IIS型制限エンドヌクレアーゼは、HOエンドヌクレアーゼまたはFokIエンドヌクレアーゼから選択される。いくつかの態様において、ジンクフィンガー結合ドメインは、3つ、4つ、5つまたは6つのジンクフィンガーを含む。別の一態様において、ジンクフィンガー結合ドメインは、本明細書に開示するプロモーターまたはエンハンサー（例えばSIM1、MC4R、PKD1、SETD5、THUMPD3、SCN2AおよびPAX6プロモーターまたはエンハンサー）に対応する認識配列に特異的に結合する。一態様において、1つまたは複数の転写活性化因子は、VP16、VP48、VP64またはVP160から選択される。一般に、ZFNのDNA結合ドメインは3〜6個の個別ジンクフィンガー反復配列を含有し、9〜18個の連続するヌクレオチドを認識することができる。各ZFNは宿主細胞ゲノム中の特異的標的部位、例えばプロモーター配列、エンハンサー配列または遺伝子内のエクソン/イントロンを標的とするように設計することができる。
【００７４】
TALEN
本方法のいくつかの態様において、ヌクレアーゼはTALENである。TALエフェクター（TALE）は、キサントモナス（Xanthomonas）細菌によって分泌されるタンパク質であって、宿主DNAに結合してエフェクター特異的宿主遺伝子を活性化することにより、疾患において、または防御機構のトリガリングにおいて、重要な役割を果たす。例えばGu et al.（2005）Nature 435:1122-5、Yang et al.,（2006）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103:10503-8、Kay et al.,（2007）Science 318:648-51、Sugio et al.,（2007）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 104:10720-5、Romer et al.,（2007）Science 318:645-8、Boch et al.,（2009）Science 326（5959）:1509-12およびMoscou and Bogdanove,（2009）326（5959）:1501参照。TALENは、DNA切断ドメインに融合されたTALエフェクターDNA結合ドメインを含む。DNA結合ドメインは1つまたは複数のタンデム反復配列ドメインによってDNAと配列特異的に相互作用する。繰り返し配列は通例、12番目と13番目のアミノ酸が異なる33〜34個の高度に保存されたアミノ酸を含む。反復可変二残基（Repeat Variable Diresidue）（RVD）と呼ばれるこれら2つの位置は高度に可変的であり、特異的ヌクレオチド認識と強い相関を示す（Boch et al.,（2009）Science 326（5959）:1509-12およびMoscou and Bogdanove,（2009）326（5959）:1501）。アミノ酸配列とDNA認識配列の間のこの関係は、適当なRVDを含有する反復セグメントの組合せを選択することによる特異的DNA結合ドメインの工学的作出を可能にする。
【００７５】
TAL-エフェクターDNA結合ドメインを、標的DNA配列に結合するように工学的に操作し、ヌクレアーゼドメイン、例えばFokIなどのIIS型制限エンドヌクレアーゼに融合することができる（例えばKim et al.（1996）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:1156-1160参照）。いくつかの態様において、ヌクレアーゼドメインは、切断特異性（Doyon et al.,（2011）Nature Methods,8（1）:74-9）および切断活性（Guo et al.,（2010）Journal of Molecular Biology,400（1）:96-107）を改良する1つまたは複数の変異（例えばFokI変異体）を含むことができる。ヌクレアーゼドメインとして使用することができる他の有用なエンドヌクレアーゼとして、HhaI、HindIII、Nod、BbvCI、EcoRI、BglIおよびAlwIが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。いくつかの態様において、TALENは、標的DNA中の特異的ヌクレオチド配列（すなわち認識配列）に結合する複数のTALエフェクター反復配列を含むTALエフェクターDNA結合ドメインを含むことができる。限定と解釈されるべきではないが、ここに提供される方法にとって有用なTALENとして、WO10/079430および米国特許出願公開第2011/0145940号に記載されているものが挙げられる。
【００７６】
いくつかの態様において、TALエフェクターDNA結合ドメインは、10個以上のDNA結合反復配列、好ましくは15個以上のDNA結合反復配列を含むことができる。いくつかの態様において、各DNA結合反復配列は、標的DNA中の塩基対の認識を決定するRVDを含み、各DNA結合反復配列は標的DNA中の1塩基対の認識を担う。いくつかの態様において、RVDは、Cを認識するためのHD;Tを認識するためのNG;Aを認識するためのNI;GまたはAを認識するためのNN;AまたはCまたはGまたはTを認識するためのNS;CまたはTを認識するためのN＊、ここで＊はRVDの第2位置におけるギャップを表す;Tを認識するためのHG;Tを認識するためのH＊、ここで＊はRVDの第2位置におけるギャップを表す;Tを認識するためのIG;Gを認識するためのNK;Cを認識するためのHA;Cを認識するためのND;Cを認識するためのHI;Gを認識するためのHN;Gを認識するためのNA;GまたはAを認識するためのSN;およびTを認識するYGのうちの1つまたは複数を含む。
【００７７】
好ましい一態様において、TALENは、TALエフェクターが1つまたは複数の転写活性化因子ドメイン（例えばVP16、VP48、VP64またはVP160）を含むように、工学的に操作される。例えば、TALエフェクターのc末端に転写活性化因子ドメインを有する工学的に操作されたTALエフェクターは、ヒト293FT細胞中のSox2およびKlf4遺伝子の転写を調整することが示された（Zhang et al.,Nature Biotechnology,29（2）:149-153（2011））。TALエフェクター転写因子（TALE-TF）を使ってヒト293T細胞におけるIL1RN、KLK3、CEACAM5およびERBB2遺伝子の調整を実証したPerez-Pineraら（Nature Methods,（2013）10（3）:239-242）に開示のものなど、他のTALE-TFも、当技術分野において公知である。いくつかの態様において、1つまたは複数の転写活性化因子ドメインは、TALエフェクターのC末端に存在する核局在化シグナル（NLS）に隣接して位置する。別の一態様において、TALE-TFは、標的遺伝子の転写開始部位（TSS）の上流または下流の近傍部位に結合することができる。一態様において、TALエフェクターは、VP16、VP48、VP64またはVP160から選択される転写活性化因子ドメインを含む。別の一態様において、TALエフェクターは、HSF1、VP16、VP64、p65、RTA、MyoD1、SET7、VPR、ヒストンアセチルトランスフェラーゼp300、TET1ヒドロキシラーゼ触媒ドメイン、LSD1、CIB1、AD2、CR3、GATA4、p53、SP1、MEF2C、TAX、PPAR-ガンマおよびSET9から選択される転写活性化因子ドメインを含む。
【００７８】
いくつかの態様において、TALENは、DNA切断ドメインに融合されたTALエフェクターDNA結合ドメインを含み、TALエフェクターは転写活性化因子を含む。いくつかの態様において、DNA切断ドメインは、HOエンドヌクレアーゼまたはFokIエンドヌクレアーゼから選択されるIIS型制限エンドヌクレアーゼのものである。いくつかの態様において、TALエフェクターDNA結合ドメインは、本明細書に開示するプロモーター領域またはエンハンサー領域（例えばSIM1、MC4R、PKD1、SETD5、THUMPD3、SCN2AおよびPAX6プロモーターまたはエンハンサー）に対応する認識配列に特異的に結合する。一般に、TALENのDNA結合ドメインは、宿主細胞中の特異的標的部位、例えばプロモーター配列またはエンハンサー配列を標的とするように設計される。
【００７９】
いくつかの態様において、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはTALENの標的部位は、宿主細胞ゲノム中のネイティブな座位など、宿主細胞にとって内在性である。いくつかの態様において、標的部位は、本方法において利用されるヌクレアーゼのタイプに応じて選択される。利用されるヌクレアーゼがジンクフィンガーヌクレアーゼである場合、最適な標的部位は、いくつかの公的に利用可能なオンライン情報源を使って選択することができる。例えば、参照により本明細書にそのまま組み入れられるReyon et al.,BMC Genomics 12:83（2011）を参照されたい。ジンクフィンガーヌクレアーゼを工学的に操作するための公的に利用可能な方法として、（1）Context-dependent Assembly（CoDA）、（2）Oligomerized Pool Engineering（OPEN）、（3）Modular Assembly、（4）ZiFiT（工学的に操作されたジンクフィンガーアレイを設計するための、インターネットでアクセス可能なソフトウェア）、（5）ZiFDB（ジンクフィンガーおよび工学的に操作されたジンクフィンガーアレイの、インターネットでアクセス可能なデータベース）および（6）ZFNGenomeが挙げられる。例えばOPENは、高い特異性およびインビボ機能性を持つジンクフィンガーアレイを工学的に作出するための公的に利用可能なプロトコールであり、植物、ゼブラフィッシュならびにヒトの体細胞および多能性幹細胞において効率よく機能するZFNを生成させるために使用されて成功を収めている。OPENは、候補ZFAの予め構築されたランダム化プールをスクリーニングすることで、所望の標的配列に対して高いアフィニティーおよび特異性を持つものを同定する、選択に基づく方法（selection-based method）である。さらにまた、ZFNGenomeは、OPENで生成させたZFNについて潜在的標的部位を同定し視覚化するためのGBrowseに基づくツール（GBrowse-based tool）である。ZFNGenomeは、モデル生物の配列決定された注釈付きゲノムにおける潜在的ZFN標的部位の一覧を与える。ZFNGenomeには、7つのモデル生物、サッカロミセス・セレビシア（S.cerevisiae）、コナミドリムシ（C.reinhardtii）、シロイヌナズナ（A.thaliana）、キイロショウジョウバエ（D.melanogaster）、ゼブラフィッシュ（D.rerio）、エレガンス線虫（C.elegans）およびヒト（H.sapiens）の全配列決定されたゲノム内にマッピングされた1100万を上回る潜在的ZFN標的部位が含まれている。ZFNGenomeは、各潜在的ZFN標的部位について、その染色体位置および転写開始部位に対する相対的位置を含む情報を提供する。ユーザーは、いくつかの異なる基準（例えば遺伝子ID、転写産物ID、標的部位配列）を使って、ZFNGenomeに問い合わせることができる。
【００８０】
いくつかの態様において、ヌクレアーゼがTALENである場合、最適な標的部位は、参照により本明細書にそのまま組み入れられるSanjana et al.,Nature Protocol,7:171-192（2012）に記載の方法に従って選択されうる。TALENは二量体として機能し、左TALENおよび右TALENと呼ばれる一対のTALENは、DNAの反対鎖上の配列を標的とする。TALENは、TALE DNA結合ドメインとFokI触媒ドメイン単量体との融合物として工学的に作出される。FokI二量体化を容易にするために、左右のTALEN標的部位は、一般的には、およそ14〜20塩基の間隔になるように選択される。
【００８１】
いくつかの態様において、本明細書に記載する方法に有用な1つまたは複数のヌクレアーゼは、精製タンパク質として提供、例えば宿主細胞中に送達される。いくつかの態様において、1つまたは複数のヌクレアーゼは、ヌクレアーゼをコードする核酸を含むポリヌクレオチドによって提供される。別の一態様では、1つまたは複数のヌクレアーゼを、宿主細胞核において直接翻訳されうる精製RNAとして、宿主細胞中に導入することができる。好ましい一態様において、ヌクレアーゼをコードする核酸を含むポリヌクレオチドは、宿主細胞内でのヌクレアーゼの発現を可能にする発現ベクターを含む。適切な発現ベクターとしてエピソーマルベクターが挙げられる。
【００８２】
例えばジンクフィンガーヌクレアーゼおよびTALENなど、ヌクレアーゼが各モノマーの別個の発現を必要とする二量体として機能するいくつかの態様では、二量体の各モノマーを、同じエピソーマルベクターまたは異なるエピソーマルベクターから発現させうる。異なる標的部位に二本鎖切断を導入するために複数のヌクレアーゼが細胞に導入される別の一態様において、ヌクレアーゼは、単一のエピソーマルベクター上または別々のエピソーマルベクター上にコードされうる。
【００８３】
一局面において、本発明は、哺乳動物対象におけるハプロ不全疾患を処置する方法を提供し、本方法は、該対象の細胞を、該細胞の核内に存在する条件下でプロモーター領域またはエンハンサー領域に特異的にハイブリダイズするジンクフィンガーヌクレアーゼまたはTALENを含む組成物と接触させる工程を含み、接触させる工程により、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはTALENのDNA結合ドメインと、プロモーター領域またはエンハンサー領域とを含む複合体が形成され、該複合体は、該対象におけるハプロ不全疾患を処置するのに十分な量で十分な持続時間にわたって、ハプロ不全遺伝子の野生型コピーの転写を活性化する。いくつかの態様において、プロモーター領域またはエンハンサー領域は、表1に列挙する遺伝子のいずれかのプロモーター領域またはエンハンサー領域（すなわち制御領域）に対応する。
【００８４】
いくつかの態様において、接触させる工程は、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはTALENをコードするエピソーマルベクターと、前記細胞を接触させることを含む。いくつかの態様において、エピソーマルベクターは非組込み型である。いくつかの態様において、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはTALENは、1つまたは複数の転写活性化ドメインを含むように改変されている。一態様において、1つまたは複数の転写活性化ドメインは、HSF1、VP16、VP64、p65、MyoD1、RTA、SET7/9、VPR、ヒストンアセチルトランスフェラーゼp300、TETファミリータンパク質のヒドロキシラーゼ触媒ドメイン（例えばTET1ヒドロキシラーゼ触媒ドメイン）、LSD1、CIB1、AD2、CR3、EKLF1、GATA4、PRVIE、p53、SP1、MEF2C、TAXおよびPPARγからなる群より選択される。いくつかの態様において、転写活性化ドメインはVP64である。いくつかの態様において、ハプロ不全遺伝子は、SIM1、レプチン、レプチン受容体、MC4R、SCN2A、SETD5、PAX6、PKD1、MC3R、POMC、STAT3、STAT5、SOCS3、GHR、NPY、NPY1R、NPY2R、NPY5R、PYY、AMPK（PRKAA1、PRKAA2、PRKAB1、PRKAB2、PRKAG1、PRKAG2、PRKAG3）、OXT、JAK2、SHP2、NOS3、NROB2、BRS3、CARTPT、FABP4、HTR2C、IL6、NHLH2、NMU、NPB、NPBWRI、PNPLA2、UCP3、ADIPOQ、APOA5、ARNT2、ASIP、C1QTNF2、C3AR1、CCK、CPT1B、CSF2、DGAT1、DGAT2、GHRL、GHSR、HSD11B1、HTR7、INSIG1、INSIG2、LIPC、NMURI、NMUR2、NPBWR2、NTS、PPARGC1A、PPY、RETN、SIRT1、TGFBR2、WDTC1またはFOXO1である。
【００８５】
（表１）ハプロ不全疾患に関連する遺伝子
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【００８６】
組成物
エピソーマルベクター
本明細書には、内在性遺伝子の転写を増加させ、それによって、遺伝子の転写の低減または遺伝子産物の量の低減または遺伝子産物の活性の低減に関連するかそれらによって増悪されるかそれらによって引き起こされる疾患または状態を処置するために、転写活性化ドメインを遺伝子制御要素にターゲティングするための構成要素として有用な組成物が記載される。前記構成要素としては、ガイドRNA、スキャフォールドRNA、スキャフォールドRNAリガンド、CRISPRヌクレアーゼ、転写活性化ドメイン、アフィニティータグ、アフィニティータグリガンド、それらのうちの1つまたは複数の融合タンパク質、およびそれらの組合せが挙げられる。前記構成要素としては、1つまたは複数のガイドRNA、スキャフォールドRNA、スキャフォールドRNAリガンド、CRISPRヌクレアーゼ、転写活性化ドメイン、アフィニティータグ、アフィニティータグリガンド、それらのうちの1つまたは複数の融合タンパク質、およびそれらの組合せをコードするエピソーマルベクターも挙げられる。エピソーマルベクターは、一本鎖または二本鎖DNA、一本鎖RNAまたは二本鎖RNAであることができる。
【００８７】
一態様では、触媒的に不活性なCRISPRヌクレアーゼなどのCRISPRヌクレアーゼをコードするエピソーマルベクターが提供される。場合により、エピソーマルベクターは、1つまたは複数の転写活性化ドメインに融合されたCRISPRヌクレアーゼをコードする。場合により、エピソーマルベクターは、1つまたは複数のアフィニティータグに融合されたCRISPRヌクレアーゼをコードする。場合により、エピソーマルベクターは、1つまたは複数のアフィニティータグおよび1つまたは複数の転写活性化ドメインに融合されたCRISPRヌクレアーゼをコードする。CRISPRヌクレアーゼ融合タンパク質は、CRISPRヌクレアーゼのアミノ末端、カルボキシ末端、またはそれらの組合せに融合された転写活性化因子ドメインおよび/またはアフィニティータグを含有することができる。上記に加えて、または上記に代えて、CRISPRヌクレアーゼは、表面ループ内での転写活性化因子ドメインおよび/またはアフィニティータグの挿入によって改変することもできる。エピソーマルベクター（例えばAAVベクター）は、CRISPRヌクレアーゼまたはCRISPRヌクレアーゼ融合タンパク質に機能的に連結されたプロモーターを含有することができる。プロモーターは、エピソーマルベクターの由来源であるウイルスにとって内在性のプロモーターであることができる。例えばエピソーマルベクターがAAVベクターである場合、プロモーターは内在性AAVプロモーターであることができる。上記に代えて、プロモーターは、エピソーマルベクターの由来源であるウイルスにとって異種のプロモーターであることもできる。例えばエピソーマルベクターがAAVベクターである場合、プロモーターは非AAVプロモーターであることができる。プロモーターは、転写活性化の標的となる遺伝子（例えば表1から選択される遺伝子）のプロモーターであるか、標的となる遺伝子にとって異種のプロモーターであることができる。プロモーターは、構成的プロモーター（例えばCMVプロモーター、CAGプロモーター、CBAプロモーター、EF1aプロモーター、PGKプロモーターなど）であるか、組織特異的プロモーター（例えばシナプシン、camKIIa、GFAP、RPE、ALB、TBG、MBP、MCK、TNTまたはaMHCプロモーターなど）であるか、誘導性プロモーター（例えばテトラサイクリン誘導性）であることができる。
【００８８】
一態様では、ジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするエピソーマルベクターが提供される。場合により、エピソーマルベクターは、1つまたは複数の転写活性化ドメインに融合されたジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする。場合により、エピソーマルベクターは、1つまたは複数のアフィニティータグに融合されたジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする。場合により、エピソーマルベクターは、1つまたは複数のアフィニティータグおよび1つまたは複数の転写活性化ドメインに融合されたジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする。ジンクフィンガーヌクレアーゼ融合タンパク質は、ジンクフィンガーヌクレアーゼのアミノ末端、カルボキシ末端、またはそれらの組合せに融合された転写活性化因子ドメインおよび/またはアフィニティータグを含有することができる。エピソーマルベクター（例えばAAVベクター）は、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはジンクフィンガーヌクレアーゼ融合タンパク質に機能的に連結されたプロモーターを含有することができる。プロモーターは、エピソーマルベクターの由来源であるウイルスにとって内在性のプロモーターであることができる。例えばエピソーマルベクターがAAVベクターである場合、プロモーターは内在性AAVプロモーターであることができる。上記に代えて、プロモーターは、エピソーマルベクターの由来源であるウイルスにとって異種のプロモーターであることもできる。例えばエピソーマルベクターがAAVベクターである場合、プロモーターは非AAVプロモーターであることができる。プロモーターは、転写活性化の標的となる遺伝子（例えば表1から選択される遺伝子）のプロモーターであるか、標的となる遺伝子にとって異種のプロモーターであることができる。プロモーターは、構成的プロモーター（例えばCMVプロモーター、CAGプロモーター、CBAプロモーター、EF1aプロモーター、PGKプロモーターなど）であるか、組織特異的プロモーター（例えばシナプシン、camKIIa、GFAP、RPE、ALB、TBG、MBP、MCK、TNTまたはaMHCプロモーターなど）であるか、誘導性プロモーター（例えばテトラサイクリン誘導性）であることができる。
【００８９】
一態様では、TALENをコードするエピソーマルベクターが提供される。場合により、エピソーマルベクターは、1つまたは複数の転写活性化ドメインに融合されたTALENをコードする。場合により、エピソーマルベクターは、1つまたは複数のアフィニティータグに融合されたTALENをコードする。場合により、エピソーマルベクターは、1つまたは複数のアフィニティータグおよび1つまたは複数の転写活性化ドメインに融合されたTALENをコードする。TALENは、アミノ末端、カルボキシ末端、またはそれらの組合せに融合された転写活性化因子ドメインおよび/またはアフィニティータグを含有することができる。エピソーマルベクター（例えばAAVベクター）はTALENに機能的に連結されたプロモーターを含有することができる。プロモーターは、エピソーマルベクターの由来源であるウイルスにとって内在性のプロモーターであることができる。例えばエピソーマルベクターがAAVベクターである場合、プロモーターは内在性AAVプロモーターであることができる。上記に代えて、プロモーターは、エピソーマルベクターの由来源であるウイルスにとって異種のプロモーターであることもできる。例えばエピソーマルベクターがAAVベクターである場合、プロモーターは非AAVプロモーターであることができる。プロモーターは、転写活性化の標的となる遺伝子（例えば表1から選択される遺伝子）のプロモーターであるか、標的となる遺伝子にとって異種のプロモーターであることができる。プロモーターは、構成的プロモーター（例えばCMVプロモーター、CAGプロモーター、CBAプロモーター、EF1aプロモーター、PGKプロモーターなど）であるか、組織特異的プロモーター（例えばシナプシン、camKIIa、GFAP、RPE、ALB、TBG、MBP、MCK、TNTまたはaMHCプロモーターなど）であるか、誘導性プロモーター（例えばテトラサイクリン誘導性）であることができる。
【００９０】
一態様では、ガイドRNAをコードするエピソーマルベクターが提供される。ガイドRNAは低分子ガイドRNAであることができる。ガイドRNAは相乗的活性化メディエーター（例えばZhang et al.,Scientific Reports 5,Article No.16277（2015）およびKonermann et al.,2015,Nature 517:583-8に記載されているもの）の構成要素であることができる。エピソーマルベクター（例えばAAVベクター）はガイドRNAに機能的に連結されたプロモーターを含有することができる。プロモーターは、エピソーマルベクターの由来源であるウイルスにとって内在性のプロモーターであることができる。例えばエピソーマルベクターがAAVベクターである場合、プロモーターは内在性AAVプロモーターであることができる。上記に代えて、プロモーターは、エピソーマルベクターの由来源であるウイルスにとって異種のプロモーターであることもできる。例えばエピソーマルベクターがAAVベクターである場合、プロモーターは非AAVプロモーターであることができる。プロモーターは、転写活性化の標的となる遺伝子（例えば表1から選択される遺伝子）のプロモーターであるか、標的となる遺伝子にとって異種のプロモーターであることができる。プロモーターは、構成的プロモーター（例えばCMVプロモーター、CAGプロモーター、CBAプロモーター、EF1aプロモーター、PGKプロモーターなど）であるか、組織特異的プロモーター（例えばシナプシン、camKIIa、GFAP、RPE、ALB、TBG、MBP、MCK、TNTまたはaMHCプロモーターなど）であるか、誘導性プロモーター（例えばテトラサイクリン誘導性）であることができる。
【００９１】
いくつかの態様において、エピソーマルベクターは、CRISPRヌクレアーゼとガイドRNAとの両方をコードする。場合により、CRISPRヌクレアーゼはプロモーターに機能的に連結され、ガイドRNAは異なるプロモーターに機能的に連結される。場合により、前記2つのプロモーターは同じである。場合により、前記2つのプロモーターは異なる。場合により、両プロモーターは誘導性である。場合により、両プロモーターは組織特異的である。場合により、両プロモーターは構成的である。場合により、一方のプロモーターは構成的であり、他方のプロモーターは組織特異的である。場合により、一方のプロモーターは構成的であり、他方のプロモーターは誘導性である。場合により、一方のプロモーターは組織特異的であり、他方は誘導性である。
【００９２】
いくつかの態様において、エピソーマルベクターは、スキャフォールドRNA、例えばWO 2016/054106に記載のスキャフォールドRNAをコードする。いくつかの態様において、エピソーマルベクターはCRISPRヌクレアーゼもコードする。上記に加えて、または上記に代えて、エピソーマルベクターは1つまたは複数の転写活性化ドメインもコードすることができる。場合により、転写活性化ドメインは、スキャフォールドRNAに結合する（例えばスキャフォールドRNAのms2、f6、PP7、comまたはL7a配列に結合する）結合要素に融合される。
【００９３】
いくつかの態様では、2つ以上の異なるエピソーマルベクターが提供される。例えばCRISPRヌクレアーゼをコードするエピソーマルベクターと、ガイドRNAをコードする別個のエピソーマルベクターとが提供されうる。あるいは、CRISPRヌクレアーゼとガイドRNAとをコードするエピソーマルベクターを提供すると共に、1つまたは複数の転写活性化ドメインをコードする別個のエピソーマルベクターを提供することもできる。場合により、前記1つまたは複数の転写活性化ドメインは、スキャフォールドRNA（例えばSAMのガイドRNA）に結合する結合要素に融合される。場合により、前記1つまたは複数の転写活性化ドメインは、CRISPRヌクレアーゼのアフィニティータグに結合する結合要素に融合される。いくつかの態様では、スキャフォールドRNAをコードするエピソーマルベクターが提供され、スキャフォールドRNAに結合する結合要素に融合された1つまたは複数の転写活性化ドメインをコードする別個のエピソーマルベクターが提供される。
【００９４】
いくつかの態様において、エピソーマルベクターは、表1に列挙する遺伝子または表1に列挙する遺伝子と同じパスウェイ中もしくは並行パスウェイ中の遺伝子にハイブリダイズするまたは（例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で）特異的にハイブリダイズするジンクフィンガーヌクレアーゼまたはTALENをコードする。場合により、エピソーマルベクターは、表1に列挙する遺伝子または表1に列挙する遺伝子と同じパスウェイ中もしくは並行パスウェイ中の遺伝子の制御領域（例えばプロモーター領域またはエンハンサー領域）にハイブリダイズするまたは（例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で）特異的にハイブリダイズするジンクフィンガーヌクレアーゼまたはTALENをコードする。
【００９５】
場合により、エピソーマルベクターは、SIM1、レプチン、レプチン受容体、MC4R、SCN2A、SETD5、PAX6、PKD1、MC3R、POMC、STAT3、STAT5、SOCS3、GHR、NPY、NPY1R、NPY2R、NPY5R、PYY、AMPK（PRKAA1、PRKAA2、PRKAB1、PRKAB2、PRKAG1、PRKAG2、PRKAG3）、OXT、JAK2、SHP2、NOS3、NROB2、BRS3、CARTPT、FABP4、HTR2C、IL6、NHLH2、NMU、NPB、NPBWRI、PNPLA2、UCP3、ADIPOQ、APOA5、ARNT2、ASIP、C1QTNF2、C3AR1、CCK、CPT1B、CSF2、DGAT1、DGAT2、GHRL、GHSR、HSD11B1、HTR7、INSIG1、INSIG2、LIPC、NMURI、NMUR2、NPBWR2、NTS、PPARGC1A、PPY、RETN、SIRT1、TGFBR2、WDTC1またはFOXO1にハイブリダイズするまたは（例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で）特異的にハイブリダイズするジンクフィンガーヌクレアーゼまたはTALENをコードする。
【００９６】
場合により、エピソーマルベクターは、SIM1、レプチン、レプチン受容体、MC4R、SCN2A、SETD5、PAX6、PKD1、MC3R、POMC、STAT3、STAT5、SOCS3、GHR、NPY、NPY1R、NPY2R、NPY5R、PYY、AMPK（PRKAA1、PRKAA2、PRKAB1、PRKAB2、PRKAG1、PRKAG2、PRKAG3）、OXT、JAK2、SHP2、NOS3、NROB2、BRS3、CARTPT、FABP4、HTR2C、IL6、NHLH2、NMU、NPB、NPBWRI、PNPLA2、UCP3、ADIPOQ、APOA5、ARNT2、ASIP、C1QTNF2、C3AR1、CCK、CPT1B、CSF2、DGAT1、DGAT2、GHRL、GHSR、HSD11B1、HTR7、INSIG1、INSIG2、LIPC、NMURI、NMUR2、NPBWR2、NTS、PPARGC1A、PPY、RETN、SIRT1、TGFBR2、WDTC1またはFOXO1の制御領域（例えばプロモーター領域またはエンハンサー領域）にハイブリダイズするまたは（例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で）特異的にハイブリダイズするジンクフィンガーヌクレアーゼまたはTALENをコードする。
【００９７】
場合により、エピソーマルベクターは、SIM1の制御領域（例えばプロモーター領域またはエンハンサー領域）にハイブリダイズするまたは（例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で）特異的にハイブリダイズするジンクフィンガーヌクレアーゼまたはTALENをコードする。場合により、エピソーマルベクターは、SIM1のプロモーター領域にハイブリダイズするまたは（例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で）特異的にハイブリダイズするジンクフィンガーヌクレアーゼまたはTALENをコードする。場合により、エピソーマルベクターは、SIM1のエンハンサー領域にハイブリダイズするまたは（例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で）特異的にハイブリダイズするジンクフィンガーヌクレアーゼまたはTALENをコードする。場合により、エピソーマルベクターは、MC4Rの制御領域（例えばプロモーター領域またはエンハンサー領域）にハイブリダイズするまたは（例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で）特異的にハイブリダイズするジンクフィンガーヌクレアーゼまたはTALENをコードする。場合により、エピソーマルベクターは、MC4Rのプロモーター領域にハイブリダイズするまたは（例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で）特異的にハイブリダイズするジンクフィンガーヌクレアーゼまたはTALENをコードする。場合により、エピソーマルベクターは、MC4Rのエンハンサー領域にハイブリダイズするまたは（例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で）特異的にハイブリダイズするジンクフィンガーヌクレアーゼまたはTALENをコードする。場合により、エピソーマルベクターは、PDK1の制御領域（例えばプロモーター領域またはエンハンサー領域）にハイブリダイズするまたは（例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で）特異的にハイブリダイズするジンクフィンガーヌクレアーゼまたはTALENをコードする。場合により、エピソーマルベクターは、PDK1のプロモーター領域にハイブリダイズするまたは（例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で）特異的にハイブリダイズするジンクフィンガーヌクレアーゼまたはTALENをコードする。場合により、エピソーマルベクターは、PDK1のエンハンサー領域にハイブリダイズするまたは（例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で）特異的にハイブリダイズするジンクフィンガーヌクレアーゼまたはTALENをコードする。場合により、エピソーマルベクターは、SETD5の制御領域（例えばプロモーター領域またはエンハンサー領域）にハイブリダイズするまたは（例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で）特異的にハイブリダイズするジンクフィンガーヌクレアーゼまたはTALENをコードする。場合により、エピソーマルベクターは、SETD5のプロモーター領域にハイブリダイズするまたは（例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で）特異的にハイブリダイズするジンクフィンガーヌクレアーゼまたはTALENをコードする。場合により、エピソーマルベクターは、SETD5のエンハンサー領域にハイブリダイズするまたは（例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で）特異的にハイブリダイズするジ��クフィンガーヌクレアーゼまたはTALENをコードする。場合により、エピソーマルベクターは、SCN2Aの制御領域（例えばプロモーター領域またはエンハンサー領域）にハイブリダイズするまたは（例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で）特異的にハイブリダイズするジンクフィンガーヌクレアーゼまたはTALENをコードする。場合により、エピソーマルベクターは、SCN2Aのプロモーター領域にハイブリダイズするまたは（例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で）特異的にハイブリダイズするジンクフィンガーヌクレアーゼまたはTALENをコードする。場合により、エピソーマルベクターは、SCN2Aのエンハンサー領域にハイブリダイズするまたは（例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で）特異的にハイブリダイズするジンクフィンガーヌクレアーゼまたはTALENをコードする。場合により、エピソーマルベクターは、PAX6の制御領域（例えばプロモーター領域またはエンハンサー領域）にハイブリダイズするまたは（例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で）特異的にハイブリダイズするジンクフィンガーヌクレアーゼまたはTALENをコードする。場合により、エピソーマルベクターは、PAX6のプロモーター領域にハイブリダイズするまたは（例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で）特異的にハイブリダイズするジンクフィンガーヌクレアーゼまたはTALENをコードする。場合により、エピソーマルベクターは、PAX6のエンハンサー領域にハイブリダイズするまたは（例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で）特異的にハイブリダイズするジンクフィンガーヌクレアーゼまたはTALENをコードする。
【００９８】
いくつかの態様において、エピソーマルベクターは、表1に列挙する遺伝子または表1に列挙する遺伝子と同じパスウェイ中もしくは並行パスウェイ中の遺伝子にハイブリダイズするまたは（例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で）特異的にハイブリダイズするガイドRNAまたはスキャフォールドRNAをコードする。場合により、エピソーマルベクターは、表1に列挙する遺伝子または表1に列挙する遺伝子と同じパスウェイ中もしくは並行パスウェイ中の遺伝子の制御領域（例えばプロモーター領域またはエンハンサー領域）にハイブリダイズするまたは（例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で）特異的にハイブリダイズするガイドRNAまたはスキャフォールドRNAをコードする。
【００９９】
場合により、エピソーマルベクターは、SIM1、レプチン、レプチン受容体、MC4R、SCN2A、SETD5、PAX6、PKD1、MC3R、POMC、STAT3、STAT5、SOCS3、GHR、NPY、NPY1R、NPY2R、NPY5R、PYY、AMPK（PRKAA1、PRKAA2、PRKAB1、PRKAB2、PRKAG1、PRKAG2、PRKAG3）、OXT、JAK2、SHP2、NOS3、NROB2、BRS3、CARTPT、FABP4、HTR2C、IL6、NHLH2、NMU、NPB、NPBWRI、PNPLA2、UCP3、ADIPOQ、APOA5、ARNT2、ASIP、C1QTNF2、C3AR1、CCK、CPT1B、CSF2、DGAT1、DGAT2、GHRL、GHSR、HSD11B1、HTR7、INSIG1、INSIG2、LIPC、NMURI、NMUR2、NPBWR2、NTS、PPARGC1A、PPY、RETN、SIRT1、TGFBR2、WDTC1またはFOXO1にハイブリダイズするまたは（例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で）特異的にハイブリダイズするガイドRNAまたはスキャフォールドRNAをコードする。
【０１００】
場合により、エピソーマルベクターは、SIM1、レプチン、レプチン受容体、MC4R、SCN2A、SETD5、PAX6、PKD1、MC3R、POMC、STAT3、STAT5、SOCS3、GHR、NPY、NPY1R、NPY2R、NPY5R、PYY、AMPK（PRKAA1、PRKAA2、PRKAB1、PRKAB2、PRKAG1、PRKAG2、PRKAG3）、OXT、JAK2、SHP2、NOS3、NROB2、BRS3、CARTPT、FABP4、HTR2C、IL6、NHLH2、NMU、NPB、NPBWRI、PNPLA2、UCP3、ADIPOQ、APOA5、ARNT2、ASIP、C1QTNF2、C3AR1、CCK、CPT1B、CSF2、DGAT1、DGAT2、GHRL、GHSR、HSD11B1、HTR7、INSIG1、INSIG2、LIPC、NMURI、NMUR2、NPBWR2、NTS、PPARGC1A、PPY、RETN、SIRT1、TGFBR2、WDTC1またはFOXO1の制御領域（例えばプロモーター領域またはエンハンサー領域）にハイブリダイズするまたは（例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で）特異的にハイブリダイズするガイドRNAまたはスキャフォールドRNAをコードする。
【０１０１】
場合により、エピソーマルベクターは、SIM1の制御領域（例えばプロモーター領域またはエンハンサー領域）にハイブリダイズするまたは（例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で）特異的にハイブリダイズするガイドRNAまたはスキャフォールドRNAをコードする。場合により、エピソーマルベクターは、SIM1のプロモーター領域にハイブリダイズするまたは（例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で）特異的にハイブリダイズするガイドRNAまたはスキャフォールドRNAをコードする。場合により、エピソーマルベクターは、SIM1のエンハンサー領域にハイブリダイズするまたは（例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で）特異的にハイブリダイズするガイドRNAまたはスキャフォールドRNAをコードする。場合により、エピソーマルベクターは、MC4Rの制御領域（例えばプロモーター領域またはエンハンサー領域）にハイブリダイズするまたは（例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で）特異的にハイブリダイズするガイドRNAまたはスキャフォールドRNAをコードする。場合により、エピソーマルベクターは、MC4Rのプロモーター領域にハイブリダイズするまたは（例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で）特異的にハイブリダイズするガイドRNAまたはスキャフォールドRNAをコードする。場合により、エピソーマルベクターは、MC4Rのエンハンサー領域にハイブリダイズするまたは（例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で）特異的にハイブリダイズするガイドRNAまたはスキャフォールドRNAをコードする。場合により、エピソーマルベクターは、PDK1の制御領域（例えばプロモーター領域またはエンハンサー領域）にハイブリダイズするまたは（例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で）特異的にハイブリダイズするガイドRNAまたはスキャフォールドRNAをコードする。場合により、エピソーマルベクターは、PDK1のプロモーター領域にハイブリダイズするまたは（例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で）特異的にハイブリダイズするガイドRNAまたはスキャフォールドRNAをコードする。場合により、エピソーマルベクターは、PDK1のエンハンサー領域にハイブリダイズするまたは（例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で）特異的にハイブリダイズするガイドRNAまたはスキャフォールドRNAをコードする。場合により、エピソーマルベクターは、SETD5の制御領域（例えばプロモーター領域またはエンハンサー領域）にハイブリダイズするまたは（例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で）特異的にハイブリダイズするガイドRNAまたはスキャフォールドRNAをコードする。場合により、エピソーマルベクターは、SETD5のプロモーター領域にハイブリダイズするまたは（例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で）特異的にハイブリダイズするガイドRNAまたはスキャフォールドRNAをコードする。場合により、エピソーマルベクターは、SETD5のエンハンサー領域にハイブリダイズするまたは（例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で）特異的にハイブリダイズするガイドRNAまたはスキャフォールドRNAをコードする。場合により、エピソーマルベクターは、SCN2Aの制御領域（例えばプロモーター領域またはエンハンサー領域）にハイブリダイズするまたは（例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で）特異的にハイブリダイズするガイドRNAまたはスキャフォールドRNAをコードする。場合により、エピソーマルベクターは、SCN2Aのプロモーター領域にハイブリダイズするまたは（例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で）特異的にハイブリダイズするガイドRNAまたはスキャフォールドRNAをコードする。場合により、エピソーマルベクターは、SCN2Aのエンハンサー領域にハイブリダイズするまたは（例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で）特異的にハイブリダイズするガイドRNAまたはスキャフォールドRNAをコードする。場合により、エピソーマルベクターは、PAX6の制御領域（例えばプロモーター領域またはエンハンサー領域）にハイブリダイズするまたは（例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で）特異的にハイブリダイズするガイドRNAまたはスキャフォールドRNAをコードする。場合により、エピソーマルベクターは、PAX6のプロモーター領域にハイブリダイズするまたは（例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で）特異的にハイブリダイズするガイドRNAまたはスキャフォールドRNAをコードする。場合により、エピソーマルベクターは、PAX6のエンハンサー領域にハイブリダイズするまたは（例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で）特異的にハイブリダイズするガイドRNAまたはスキャフォールドRNAをコードする。
【０１０２】
場合により、ガイドRNAのターゲティング領域は、以下の配列によってコードされるか、以下の配列に特異的にハイブリダイズするか、または以下の配列に対して完全に相補的である:
2020506948.tif 000065
。場合により、ガイドRNAのターゲティング領域は、以下の配列によってコードされるか、以下の配列に特異的にハイブリダイズするか、または以下の配列に対して完全に相補的である:
2020506948.tif 000066
。場合により、ガイドRNAのターゲティング領域は、以下の配列によってコードされるか、以下の配列に特異的にハイブリダイズするか、または以下の配列に対して完全に相補的である:
2020506948.tif 000067
。別の一態様において、ガイドRNAのターゲティング領域は、以下の配列によってコードされるか、以下の配列に特異的にハイブリダイズするか、または以下の配列に対して完全に相補的である:
2020506948.tif 000068
。いくつかの態様において、ガイドRNAのターゲティング領域は、以下の配列によってコードされるか、以下の配列に特異的にハイブリダイズするか、または以下の配列に対して完全に相補的である:
2020506948.tif 000069
。いくつかの態様において、ガイドRNAのターゲティング領域は、以下の配列によってコードされるか、以下の配列に特異的にハイブリダイズするか、または以下の配列に対して完全に相補的である:
2020506948.tif 000070
。いくつかの態様において、ガイドRNAのターゲティング領域は、以下の配列によってコードされるか、以下の配列に特異的にハイブリダイズするか、または以下の配列に対して完全に相補的である:
2020506948.tif 000071
。いくつかの態様において、ガイドRNAのターゲティング領域は、以下の配列によってコードされるか、以下の配列に特異的にハイブリダイズするか、または以下の配列に対して完全に相補的である:
2020506948.tif 000072
。いくつかの態様において、ガイドRNAのターゲティング領域は、以下の配列によってコードされるか、以下の配列に特異的にハイブリダイズする:
2020506948.tif 000073
。いくつかの態様において、ガイドRNAのターゲティング領域は、以下の配列によってコードされるか、以下の配列に特異的にハイブリダイズする:
2020506948.tif 000074
。いくつかの態様において、ガイドRNAのターゲティング領域は、以下の配列によってコードされるか、以下の配列に特異的にハイブリダイズするか、または以下の配列に対して完全に相補的である:
2020506948.tif 000075
。いくつかの態様において、ガイドRNAのターゲティング領域は、
2020506948.tif 000076
によってコードされるか、それに特異的にハイブリダイズするか、またはそれに対して完全に相補的である。
【０１０３】
場合により、ガイドRNAのターゲティング領域は、SEQ ID NO:1〜12または34〜95のうちの1つに対応する、またはそれらを含むsgRNAの標的となる、マウスまたはヒトゲノムの領域に対してオルソロガスおよび/またはホモロガスである配列によってコードされるか、それに特異的にハイブリダイズするか、またはそれに対して完全に相補的である。場合により、ガイドRNAは、SEQ ID NO:1〜12または34〜95のうちの1つと90％、95％または99％同一である配列、またはSEQ ID NO:1〜12または34〜95のうちの1つとは1、2または3個のヌクレオチドが異なっている配列、またはSEQ ID NO:1〜12または34〜95のうちの1つよりも5'および/または3'端において1、2または3ヌクレオチド長いもしくは短い配列によってコードされるか、それに特異的にハイブリダイズするか、またはそれに対して完全に相補的である。
【０１０４】
本明細書に記載するエピソーマルベクターのうちの1つまたは複数は、遺伝子の転写の低減または遺伝子産物の量の低減または遺伝子産物の活性の低減に関連するかそれらによって増悪されるかそれらによって引き起こされる哺乳動物対象の疾患を処置するためのキットとして提供することができる。例えば、CRISPRヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、TALEN、TALエフェクター、ガイドRNA、転写活性化ドメイン、スキャフォールドRNA、スキャフォールドRNAリガンド、アフィニティータグリガンド、それらのうちの1つまたは複数の融合タンパク質、またはそれらの組合せをコードするエピソーマルベクターは、エピソーマルベクターパッケージングプラスミド、細胞株もしくはヘルパーウイルス、またはそれらの組合せが入っているキットの一構成要素として提供することができる。
【０１０５】
場合により、コードされているポリペプチドおよび/またはRNAがAAV逆方向末端反復配列で挟まれているエピソーマルベクターを、エピソーマルベクターを機能的AAV粒子にパッケージングするための追加材料が入っているキットの一構成要素として提供する。そのような追加材料としては、AAVのrep遺伝子およびcap遺伝子をコードする1つまたは複数のプラスミド、アデノウイルスヘルパー因子E1A、E1B、E2A、E4ORF6およびVAをコードする1つまたは複数のプラスミド、アデノウイルス、またはそれらの組合せを挙げることができる。場合により、AAVパッケージングのためのトランス活性要素（trans-activing element）および/またはヘルパー要素が、キットの一構成要素として、安定細胞株に入った状態で提供される。
【０１０６】
いくつかの態様において、cap遺伝子は、AAV-DJ、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8またはAAV9 cap遺伝子である。いくつかの態様において、cap遺伝子は、AAV-DJ、AAV1、AAV2、AAV5、AAV7、AAV8またはAAV9 cap遺伝子である。いくつかの態様において、cap遺伝子はAAV2 cap遺伝子である。いくつかの態様において、cap遺伝子はAAV-DJ cap遺伝子である。いくつかの態様において、逆方向末端反復配列（ITR）は、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8またはAAV9 ITRである。いくつかの態様において、ITRは、AAV1、AAV2、AAV5、AAV7、AAV8またはAAV9 ITRである。いくつかの態様において、ITRはAAV2 ITRである。場合により、cap遺伝子によってコードされるキャプシドタンパク質は、ITRと同じ血清型である。例えばcap遺伝子はAAV2 cap遺伝子であり、ITRはAAV2 ITRであることができる。場合により、cap遺伝子によってコードされるキャプシドタンパク質は、ITRの血清型とは異なる血清型である。したがって、例えばcap遺伝子はAAV5 cap遺伝子であり、ITRはAAV2 ITRであることができる。別の一例として、cap遺伝子はAAV-DJ遺伝子であり、ITRはAAV2 ITRであることができる。
【０１０７】
場合により、エピソーマルベクターは、標的細胞中または標的組織の細胞中に存在しうる。場合により、標的細胞または標的組織の細胞は分裂細胞である。場合により、細胞は非分裂細胞である。場合により、細胞はニューロンである。場合により、細胞は視床下部の細胞である。場合により、標的細胞または標的組織の細胞は、標的遺伝子の機能的コピーを少なくとも1つは有するゲノムを含有する哺乳動物細胞であり、異種複合体による転写活性化の非存在下では、該機能的コピーは、生物における野生型表現型を生み出すのに十分な対応遺伝子産物を産生しない。場合により、哺乳動物細胞は、本明細書に記載するエピソーマルベクターによってコードされるスキャフォールドRNA、本明細書に記載するエピソーマルベクターによってコードされるガイドRNA、本明細書に記載するエピソーマルベクターによってコードされるCRISPRヌクレアーゼ、本明細書に記載する1つまたは複数のエピソーマルベクターによってコードされるSunTag、本明細書に記載する1つまたは複数のエピソーマルベクターによってコードされる相乗的活性化メディエーター（SAM）、本明細書に記載するエピソーマルベクターによってコードされる転写活性化ドメイン、本明細書に記載するエピソーマルベクターによってコードされるアフィニティータグリガンド、本明細書に記載するエピソーマルベクターによってコードされる本明細書に記載の1つまたは複数のポリペプチドの融合物、またはそれらの組合せをさらに含む。
【０１０８】
場合により、標的細胞中または標的組織の細胞中のエピソーマルベクターは、例えばITRなどの反復配列要素の組換えによって、環状型、環状コンカテマーまたは線状コンカテマーに変換される。場合により、標的細胞中または標的組織の細胞中のエピソーマルベクターは一本鎖DNAベクターから二本鎖DNAへと変換される。場合により、二本鎖DNAは、環状型、環状コンカテマーまたは線状コンカテマーに変換される。場合により、標的細胞中または標的組織の細胞中のエピソーマルベクターは、エピソーム要素として存続することで、持続的な導入遺伝子（例えばCRISPRヌクレアーゼ、転写活性化因子、ガイドRNA、スキャフォールドRNAなど）の発現をもたらす。場合により、エピソーム要素は、前述の環状型、環状コンカテマーまたは線状コンカテマーのうちの一つである。
【０１０９】
ウイルス粒子
前述のエピソーマルベクターのうちの1つまたは複数は、ウイルス粒子にパッケージングすることができる。例えばウイルス粒子は、CRISPRヌクレアーゼ、ガイドRNA、スキャフォールドRNA、転写活性化因子、アフィニティータグ、アフィニティータグリガンド、スキャフォールドRNAリガンド、それらのうちの1つまたは複数の融合タンパク質、またはそれらのうちの1つもしくは複数の組合せをコードするエピソーマルベクターを含有することができる。ウイルス粒子は、エピソーマルベクターが標的細胞の核または標的組織の細胞の核に進入し、細胞のゲノムには組み込まれないか、実質的に組み込まれないような形で、エピソーマルベクターを標的細胞または標的組織に送達する能力を有するウイルス粒子であることができる。
【０１１０】
場合により、ウイルス粒子はエピソーマルベクターを標的細胞または標的組織の細胞に送達し、エピソーマルベクターは、例えばITRなどの反復配列要素の組込みによって、環状型、環状コンカテマーまたは線状コンカテマーに変換される。場合により、ウイルス粒子によって送達されたエピソーマルベクターは、一本鎖DNAベクターから二本鎖DNAへと変換される。場合により、二本鎖DNAは、環状型、環状コンカテマーまたは線状コンカテマーに変換される。場合により、ウイルス粒子はエピソーマルベクターを標的細胞または標的組織の細胞に送達し、エピソーマルベクターがエピソーム要素として存続することで、持続的な導入遺伝子の発現をもたらす。
【０１１１】
ウイルス粒子はEBVまたはAAVウイルス粒子であることができる。場合により、ウイルス粒子はAAVウイルス粒子である。場合により、ウイルス粒子は、AAV-DJ、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8またはAAV9ウイルス粒子である。場合により、ウイルス粒子は、AAV-DJ、AAV1、AAV2、AAV5、AAV7、AAV8またはAAV9ウイルス粒子である。場合により、ウイルス粒子はAAV2ウイルス粒子である。場合により、ウイルス粒子はAAV-DJウイルス粒子である。ウイルス粒子にパッケージングされた、1つまたは複数の導入遺伝子をコードするゲノム（エピソーマルベクター）は、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8またはAAV9ゲノムであることができる。場合により、ゲノムはAAV1、AAV2、AAV5、AAV7、AAV8またはAAV9ゲノムである。場合により、ゲノムはAAV2ゲノムである。場合により、ゲノムは、それがパッケージングされるウイルス粒子と同じ血清型である。別の場合には、ゲノムとウイルス粒子とが異なる血清型である。例えばキャプシドはAAV5血清型であり、エピソーマルベクターはAAV2血清型であることができる。別の一例では、キャプシドはAAV-DJ血清型であり、エピソーマルベクターはAAV2血清型であることができる。
【０１１２】
本明細書に記載するウイルス粒子のうちの1つまたは複数は、遺伝子の転写の低減または遺伝子産物の量の低減または遺伝子産物の活性の低減に関連するかそれらによって増悪されるかそれらによって引き起こされる哺乳動物対象の疾患を処置するためのキットとして提供することができる。例えば、CRISPRヌクレアーゼ、ガイドRNA、転写活性化ドメイン、スキャフォールドRNA、スキャフォールドRNAリガンド、アフィニティータグリガンド、それらのうちの1つまたは複数の融合タンパク質またはそれらの組合せをコードするエピソーマルベクターを1つまたは複数のウイルス粒子にパッケージングして、対象に送達するための適切な薬学的賦形剤、担体、希釈剤またはバッファーが入っているキットの一構成要素として提供することができる。
【０１１３】
一態様において、ウイルス粒子は、対象に送達するための適切な薬学的賦形剤、担体、希釈剤またはバッファー中にある。そのような賦形剤、担体、希釈剤およびバッファーは、過度の毒性を伴わずに投与することができる任意の医薬剤を含みうる。薬学的に許容される賦形剤として、水、食塩水、グリセロールおよびエタノールなどの液状物が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。そこには、薬学的に許容される塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの鉱酸塩、および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸の塩が含まれうる。さらにまた、補助物質、例えば湿潤剤または乳化剤、pH緩衝物質なども、そのような媒体中に存在しうる。多種多様な薬学的に許容される賦形剤が当技術分野において公知であり、それらを本明細書で詳述する必要はない。薬学的に許容される賦形剤は、例えばA.Gennaro（2000）「Remington:The Science and Practice of Pharmacy」20th edition,Lippincott,Williams,＆Wilkins、Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems（1999）H.C.Ansel et al.,eds.,7th ed.,Lippincott,Williams,＆WilkinsおよびHandbook of Pharmaceutical Excipients（2000）A.H.Kibbe et al.,eds.,3rd ed.Amer.Pharmaceutical Assoc.を含むさまざまな刊行物に、詳しく記述されている。
【０１１４】
方法
本明細書には、遺伝子の転写の低減または遺伝子産物の量の低減または遺伝子産物の活性の低減に関連するかそれらによって増悪されるかそれらによって引き起こされる哺乳動物対象における疾患を、標的遺伝子の転写を増加させることによって処置するための方法が記載される。本方法は、一般に、標的細胞または標的組織の細胞を前述のエピソーマルベクターのうちの1つまたは複数と接触させる工程を含む。いくつかの態様において、エピソーマルベクターは非組込み型または実質上非組込み型である。いくつかの態様において、エピソーマルベクターはウイルス粒子にパッケージングされ、そのウイルス粒子を、標的細胞または標的組織の細胞と接触させる。場合により、接触させる工程はインビボで行われる。場合により、接触させる工程はインビトロで（例えば対象から得られた初代細胞を使って）行われ、接触させた細胞が対象に送達されるか、または任意で培養して、対象に送達される。
【０１１５】
エピソーマルベクター（例えばウイルス粒子にパッケージングされたもの）は、当技術分野において公知の任意の手段によって送達されうる。場合により、エピソーマルベクターを、全身性送達（例えば静脈内送達）によって、インビボの細胞と接触させる。場合により、エピソーマルベクター（例えばウイルス粒子にパッケージングされたもの）を、罹患細胞または罹患組織への部位特異的送達によって、インビボの細胞と接触させる。例えば、エピソーマルベクターがパッケージングされるウイルス粒子をパッケージングして、罹患細胞または罹患組織の部位に注射することができる。場合により、2つ以上のエピソーマルベクターは、各ウイルス粒子が2つ以上のエピソーマルベクターのうちの1つの単一コピーを含有するか、空になる（ゲノムを含有しないか、機能的導入遺伝子を欠くゲノムを含有する）ように、ウイルス粒子にパッケージングされる。そのようなウイルス粒子は混合物として送達するか、個別に送達することができる。場合により、それらの粒子は同時に送達される。場合により、それらの粒子は逐次的に送達される。通例、それらの粒子は、エピソーマルベクターがコードする送達された導入遺伝子が対象中で共発現して疾患が処置されるように送達される。
【０１１６】
一態様では、1つまたは複数の異なるウイルス粒子（例えば同じキャプシドを有するが、異なる導入遺伝子をコードするベクターを含有するウイルス粒子）が、対象の脳に注射される。場合により、1つまたは複数のウイルス粒子が対象の視床下部に注射される。ウイルス粒子は、視床下部の前側部分、視床下部の後側部分、視床下部の腹内側部分またはそれらの組合せに送達することができる。ウイルス粒子は、両側に（例えば対象の視床下部への両側注射によって）送達することができる。場合により、1つまたは複数のウイルス粒子が、対象のニューロンに送達される。場合により、1つまたは複数のウイルス粒子は定位注射によって送達される。
【０１１７】
対象に送達されるウイルス粒子の用量は、1×103ウイルス粒子/kg対象〜1×1020ウイルス粒子/kg対象であることができる。対象に送達されるエピソーマルベクターの用量は1×103ベクター分子/kg対象〜1×1020ベクター分子/kg対象であることができる。場合により、用量は1×104〜1×1018、1×105〜1×1016、1×106〜1×1015ウイルス粒子/kg対象またはベクター分子/kg対象である。場合により、用量は少なくとも1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014または1×1015ウイルス粒子/kg対象またはベクター分子/kg対象である。場合により、ベクター分子はウイルス粒子に入れて送達されるウイルスゲノムの形態にある。場合により、用量は、CRISPRヌクレアーゼ（例えば活性化ドメインに融合されたdCas9）およびガイドRNA（例えばsgRNA）をコードする、送達されるウイルスゲノム（例えばウイルス粒子中にパッケージングされたもの）の用量である。場合により、用量は、CRISPRヌクレアーゼ（例えば活性化ドメインに融合されたdCas9）をコードする、送達されるウイルスゲノム（例えばウイルス粒子中にパッケージングされたもの）の用量であり、第2用量、例えば前述の用量のうちの1つまたは複数は、ガイドRNA（例えばsgRNA）をコードする、送達されるウイルスゲノム（例えばウイルス粒子中にパッケージングされたもの）の用量である。
【０１１８】
場合により、全身性用量は処置されるべき組織または器官に直接的に適用される用量と比較して高くなる場合がある。例えば、視床下部組織または視床下部細胞においてハプロ不全sim1遺伝子による調節不全が起きている肥満を処置するには、全身性用量と比較して低い用量を視床下部に送達することができる。ヒトの場合、全身送達は例えば約6.7×1013〜2.0×1014ウイルスゲノム（vg）/kgであることができ（clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02122952参照）、神経外科的送達は例えば約7.5×1011〜8.8×1012vg/kgであることができる（clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01973543参照）。
【０１１９】
ある用量を1回または複数回投与することができる。場合により、その用量は、30日、60日、90日、120日または180日の期間内に少なくとも1回送達される。場合により、ある用量が、10週、20週、30週、40週、52週または75週または100週ごとに少なくとも1回送達される。場合により、ある用量が、6ヶ月、12ヶ月、18ヶ月、2年、3年、5年または10年ごとに少なくとも1回送達される。場合により、ハプロ不全によって引き起こされる疾患または状態の少なくとも1つの症状を数ヶ月間または数年間にわたって処置するために、単回投与または2回もしくは3回もしくは4回の投与が、処置しなければハプロ不全である標的遺伝子の持続的かつ十分な発現をもたらす。場合により、ある用量が投与され、標的ハプロ不全遺伝子（例えばsim1などの表1の遺伝子）の発現の十分性が（例えば視床下部などの標的組織において）評価され、必要に応じて同じ経路または異なる経路で、追加用量が送達される。場合により、本明細書に記載するウイルス粒子の1つまたは複数の用量が、標的遺伝子の転写を増加させ、それによって遺伝子の転写の低減または遺伝子産物の量の低減または遺伝子産物の活性の低減に関連するかそれらによって増悪されるかそれらによって引き起こされる疾患の少なくとも1つの症状を処置するのに十分な量で送達され、標的遺伝子の転写がその最大発現量から少なくとも10％、25％、50％、75％、90％またはそれ以上低減したら、さらに1つまたは複数の用量が再投与される。
【実施例】
【０１２０】
ハプロ不全が引き起こす肥満のレスキュー
I．序論
ハプロ不全ゆえにヒト疾患を引き起こすことが知られている遺伝子は300を超え（1、2）、それらはがん、神経学的疾患、発達障害、免疫学的疾患、代謝障害、不妊、腎臓疾患、肢奇形その他多くを含む広範囲にわたる表現型につながる（1）。大規模エクソーム配列決定解析により、合計3,230のヒト遺伝子がヘテロ接合機能喪失（LoF）不耐性でありうると見積もられている（3）。遺伝子治療は、突然変異遺伝子の1つまたは複数の機能的組換えコピーを挿入することによってハプロ不全疾患を矯正するのに極めて有望である。現在、遺伝子治療に関して合計2,300の臨床試験が進行中であり、それらの大部分は、アデノ随伴ウイルス（AAV）を使って組換え遺伝子を送達する（4）。AAVは、ゲノムに組み込まれることなくDNAを送達することができ、病原性を引き起こさず、長時間持続する導入遺伝子の遺伝子発現をもたらすので、好ましい遺伝子送達方法である（5）。しかし、AAVは4.7キロベース（kb）の最適パッケージング容量を有し、（その安定な発現に必要な追加の調節配列を考慮すると）3.5kbより長い遺伝子では、遺伝子治療におけるその使用が制限される。3,230種のヘテロ接合LoF遺伝子を解析すると、そのうちの715種（22％）は3.5kbより長いコード配列を有し、そのためにAAV遺伝子治療には適さないことがわかる。
【０１２１】
CRISPR遺伝子編集は、可能性としては、ハプロ不全変異を修復できるが、それには、変異ごとに編集戦略をカスタマイズすることが必要になるだろう。さらにまた、ヘテロ接合LoF微小欠失の場合、これは実行可能な治療法ではない。これらの難題に対処するために、本発明者らは、CRISPR活性化（CRISPRa）を使った新規なハプロ不全治療戦略を案出した。CRISPRaは、CRISPRのRNA誘導型ターゲティング能を利用して、ヌクレアーゼ欠損型Cas9（dCas9）を転写活性化因子と共に、特異的遺伝子の調節要素へと向かわせることで、その発現を増加させる（6〜10）。ここで本発明者らは、ハプロ不全疾患において疾患表現型をレスキューするために、変化を受けていない内在性遺伝子の転写を、このシステムを使って増加させることができるかどうかを検討した。
【０１２２】
SIM1は、発生中の腎臓および中枢神経系において発現する転写因子であり、視床下部の視索上核（SON）および室傍核（PVN）の形成にとって不可欠である（11）。これはレプチンパスウェイでも大きな役割を果たすと考えられている（12）。ヒトにおいて、染色体異常によるSIM1のハプロ不全（12、13）は過食性肥満（13）をもたらし、その多くが機能欠失型であるSIM1コーディング変異は、ヒトでは重度の肥満の主原因であると考えられている（14〜16）。Sim1ホモ接合型ヌルマウスは周産期に死亡するが、Sim1ヘテロ接合型マウス（Sim1＋/-）は生き残り、食欲過剰であって、身長成長（linear growth）の増加、高インスリン血症および高レプチン血症を伴う早発性肥満を発症する（17）。視床下部Sim1の出生後コンディショナルノックアウトは、ヘテロ接合型マウスにおいて類似する表現型につながることから（18）、Sim1はエネルギーホメオスタシスの重要な調節因子であることが示唆される。マウスにおけるヒト細菌人工染色体を使ったSIM1の過剰発現は、食餌誘発性肥満をレスキューし、食物摂取量を低減したことから（19）、肥満の一般的治療標的としてのSim1の潜在的役割が示唆される。ここで本発明者らは、本発明者らのCRISPRa治療戦略に関する本発明者らの概念実証モデルとして、Sim1を使用した。本発明者らは、Sim1＋/-マウスにおける肥満表現型をレスキューするCRISPRaの能力を、Sim1プロモーターまたはその視床下部特異的エンハンサーを標的とするトランスジェニックベースのアプローチとAAVベースのアプローチとの両方を使って試験した。本発明者らの結果は、ハプロ不全疾患または改変された遺伝子量が引き起こす他の疾患を処置するための新規な治療アプローチを提示する。
【０１２３】
II．結果
A．インビトロでのSim1のアップレギュレーション
本発明者らは、まず、本発明者らのCRISPRa条件をインビトロで最適化することに着手した。SIM1はよく特徴づけられたプロモーター（20）と、遠位視床下部エンハンサー（転写開始部位から約270kb）Sim1候補エンハンサー2（SCE2（21））とを有し、その両者がCRISPRaの標的として選ばれた（図1A）。本発明者らは、Sim1プロモーターまたはSim1エンハンサー（SCE2）に対するsgRNAを設計した。これらのガイドを使って、本発明者らは、VP16（単純ヘルペスウイルス1型転写因子）のタンデムコピーを4つ保持する転写活性化因子（22）であるVP64に融合されたdCas9（dCas9-VP64）が、マウス神経芽細胞腫細胞（Neuro-2a）においてSim1を過剰発現させうるかどうか試験した。この活性化因子を選んだ理由は、その活性化レベルが他の公知の活性化因子と比較して低いからである（23）。というのも、本発明者らは、野生型と類似するレベルの治療的Sim1量をインビボで得たかったからである。細胞にdCas9-VP64およびさまざまなガイドをトランスフェクトし、48時間後に、定量PCR（qPCR）を使ってSim1 mRNAレベルを測定した。本発明者らは、内在性Sim1をそれぞれ13倍および4倍過剰発現させることができるプロモーター用またはSCE2用のsgRNAを、1つずつ同定した（図1B）。加えて本発明者らは、内在性Sim1を4倍以上過剰発現させることができるSim1プロモーター用のsgRNAを4つ同定し（図7A）、内在性Sim1を2倍以上過剰発現させることができるSCE2用のsgRNAを少なくとも1つ同定した（図8A）。
【０１２４】
B．トランスジェニックCRISPRaは肥満をレスキューする
インビボでSim1を活性化する本発明者らのCRISPRaシステムの能力を試験するために、本発明者らは、TARGATT技術（24）を使って、マウスHipp11座位に挿入されたdCas9-VP64（H11PCAG-dCas9-VP64）と、Rosa26座位にSim1プロモーターを標的とするsgRNA（ROSA26Sim1Pr-sgRNA）またはSCE2を標的とするsgRNA（ROSA26SCE2En-sgRNA）のどちらか一方とを有するノックインマウス系統を生成させた（図1C）。次に本発明者らは、これらのマウスを、重度の肥満を発症させるSim1＋/-マウス（17）と交配させた。3つのアレルをすべて持つマウス（Sim1＋/-×H11PCAG-dCas9-VP64およびROSA26Sim1Pr-sgRNAまたはROSA26SCE2En-sgRNA）を飼育用飼料（breeders chow）（picodiet-5058）で飼育し、野生型同腹仔ならびにどちらも重度の肥満になるSim1＋/-×H11PCAG-dCas9-VP64マウスおよびSim1＋/-（陰性対照）と共に、16週まで週1回の頻度で体重を測定した。1つの条件につき少なくとも雌7匹および雄7匹を分析したところ、dCas9-VP64とSim1プロモーターsgRNAまたはSim1エンハンサーsgRNAのどちらか一方とを両方とも保持するSim1＋/-マウスは、Sim1＋/-×H11PCAG-dCas9-VP64およびSim1＋/-同腹仔と比較して体重の著しい低減があることが示された（図1D〜F）。
【０１２５】
C．CRISPRaはSim1＋/-代謝プロファイルを矯正する
体重低減を体組成および代謝パラメータと関連づけるために、本発明者らは次に、Sim1＋/-×H11PCAG-dCas9-VP64×ROSA26Sim1Pr-sgRNA（Prm CRISPRa）、Sim1＋/-×H11PCAG-dCas9-VP64×ROSA26SCE2En-sgRNA（Enh-CRISPRa）および本発明者らの他のマウス系統について、代謝プロファイリングを行った。各遺伝子型につき3匹のマウスを、肥満期のちょうど開始時、6〜8週齢において、体組成および代謝プロファイリングについて分析した。Prm-CRISPRaマウスとEnh-CRISPRaマウスはどちらも、Sim1＋/-と比較して、雌雄両方において、体脂肪含量の有意な低減を示した（図2A）。酸素消費量および食物摂取量などといったSim1＋/-肥満マウスの他の際立った特徴の代謝チャンバー分析は、Prm-CRISPRaマウスおよびEnh-CRISPRaマウスでは、野生型代謝パラメータへのシフトを示した（図2B〜C）。加えて、基礎代謝率を定義する間接的方法であるそれらの呼吸交換比（RER;VCO2/VO2）も、野生型同腹仔に似たパラメータを示した（図2D）。しかし本発明者らは個々のチャンバーにおけるそれらの身体活動には何ら有意差を観察しなかった。これらの結果は、総合すると、Prm-CRISPRaマウスとEnh-CRISPRaマウスはどちらも体脂肪が少なく、それらの総体重の低減に貢献する代謝パラメータの改善を呈することを示している。
【０１２６】
D．Sim1活性化は組織特異的である
本発明者らのマウスにおけるSim1活性化レベルおよび組織特異性について試験するために、本発明者らは、さまざまな組織におけるそのmRNA発現レベルを測定した。本発明者らは、Sim1を発現させることが知られている2つの組織、視床下部および腎臓と、Sim1を発現しない2つの組織、肺および肝臓を選択した（25）（図3A）。本発明者らはまずdCas9発現を測定して、それが予想どおり、4種の組織のすべてにおいて発現することを見いだした。というのも、本発明者らは、その発現を駆動するために、ユビキタスなCMVエンハンサーニワトリベータ-アクチン（CAG）プロモーターを使用したからである（図3B）。これに対し、Sim1については、本発明者らは、Sim1＋/-マウスと比較して有意に高いmRNAレベルを、Prm-CRISPRaマウスの視床下部および腎臓と、Enh-CRISPRaマウスの視床下部のみに観察した（図3C〜D）。本発明者らはPrm-CRISPRaマウスとEnh-CRISPRaマウスの肥満表現型に何ら有意差を観察しなかったので、Sim1＋/-肥満表現型をレスキューするには視床下部におけるSim1の活性化で十分であると推測することができた。興味深いことに、Sim1を発現しない組織（すなわち肝臓および肺）では、Cas9発現は観察したにもかかわらず、Prm-CRISPRaマウスでもEnh-CRISPRaマウスでも、Sim1発現を検出することはできなかった。これらの結果は、本発明者らの研究のインビボ条件では、dCas9-VP64は、その標的遺伝子のシス調節要素が活性である組織でしか、発現をアップレギュレートできなかったことを含意している。これは、CRISPRaの組織特異性を決めるために、シス調節要素を使用しうることを示唆している。
【０１２７】
E．CRISPRa AAVはSim1＋/-の体重増加を低減する
このアプローチをハプロ不全の治療戦略へとさらに橋渡しするために、本発明者らはAAVを利用して、Sim1＋/-マウスの視床下部にCRISPRaを送達した。本発明者らは以下の3種のAAVベクターを生成した: （1）サイトメガロウイルス（CMV）プロモーターによって駆動されるdCas9-VP64（pCMV-dCas9-VP64）、2）Sim1プロモーターsgRNAとmCherry（pU6-Sim1Pr-CMV-mCherry）、3）SCE2 sgRNAとmCherry（pU6-SCE2-CMV-mCherry）。pCMV-dCas9-VP64ベクターの場合、dCas9-VP64発現カセットのサイズゆえに、本発明者らは5.4kbのインサートを得た。このインサートサイズは4.7kbという制限を上回っているが、5kbを超えても、導入遺伝子の発現レベルは低減するものの、送達には依然として使用できることが示された（26）。これらのベクターは、複数の組織で高い発現レベルを達成することが示された2型、8型および9型のキメラであるAAV-DJ血清型（27）に、個別にパッケージングされた（図4A）。本発明者らは、pCMV-dCas9-VP64 AAVについて、低いものの使用可能なウイルス価を観察した（方法参照）。本発明者らはまず、本発明者らのAAV CRISPRaベクターがインビトロでSim1を過剰発現させうるかどうかを、Neuro-2a細胞で試験した。本発明者らは、プロモーターまたはエンハンサーを標的とした場合に、Sim1 mRNA発現のそれぞれ4倍および5倍のアップレギュレーションを観察した（図4A）。本発明者らは、さらなるsgRNA（SEQ ID NO:38、40または42）を使って、本発明者らのAAV CRISPRaベクターがSim1をインビトロで過剰発現させうることを、Neuro-2a細胞を使って観察した。本発明者らは、プロモーターを標的とした場合にSim1 mRNA発現の2倍〜6倍のアップレギュレーションを観察し（図7B）、エンハンサー（SCE2）を標的とした場合にSim1 mRNA発現の2倍〜4.5倍のアップレギュレーションを観察した（図8B）。
【０１２８】
次に本発明者らは、pCMV-dCas9-VP64とpU6-Sim1Pr-CMV-mCherry（Prm-CRISPRa-AAV）またはpU6-SCE2-CMV-mCherry（Enh-CRISPRa-AAV）のどちらか一方とを保持するウイルスを、Sim1＋/-マウスの視床下部のPVNに送達するために、マウスが肥満を発症し始める前に、4週齢の時点で、定位注射を行った。陰性対照として、本発明者らは、Sim1＋/-マウスに、pCMV-dCas9-VP64ウイルスのみの注射も行った。本発明者らは、注射マウスの視床下部で免疫染色を行うことによって、本発明者らのsgRNA-CMV-mCherryカセットの発現について試験し、それがPVNで発現していることを見いだした（図4B〜C）。Sim1＋/-マウスの視床下部にCRISPRa-AAVを送達することによってSim1発現レベルが増加するかどうか試験するために、本発明者らは、11週齢のAAV注射マウスから、dCas9とSim1の両方について、mRNA発現を測定した。dCas9は、本発明者らのpCMV-dCas9-VP64 AAV注射マウスのすべての視床下部において発現していることがわかった（図4D）。Sim1のアップレギュレーションは、Prm-CRISPRa-AAVを注射した視床下部でもEnh-CRISPRa-AAVを注射した視床下部でも観察されたが、pCMV-dCas9-VP64-AAVだけを注射したマウスでは観察されなかった（図4E）。注射マウスの体重を11週齢まで測定した（図5A）。本発明者らは、Prm-CRISPRa-AAV注射マウスまたはEnh-CRISPRa-AAV注射マウスにおいて、Sim1＋/-マウスまたはpCMV-dCas9-VP64-AAV注射Sim1＋/-マウスと比較して、有意な重量低減を観察した（図5B〜C）。これらの結果は、ハプロ不全を処置するための実行可能な遺伝子治療として、CRISPRa-AAV媒介アップレギュレーションを使用しうることを示している。
【０１２９】
F．インビトロでのMc4rのアップレギュレーション
遺伝的基礎を有する肥満の70％以上は、レプチン経路における欠陥によって引き起こされる。MC4Rはレプチンパスウェイの一部であり、そこでの変異は、肥満個体において最もよく見られる変異（1パーセンタイル肥満集団の約5％）である。これは下流因子であるため、MC4RおよびSIM1のアップレギュレーションは、これら他のレプチン経路遺伝子における変異によって引き起こされる肥満をおそらくレスキューすることができるだろう。ここで本発明者らは、MC4Rのプロモーターを標的とすることによってMC4Rをアップレギュレートできることを示し、SIM1のアップレギュレーションはMC4R発現を増加させうることも示した。本発明者らは、Mc4rヘテロ接合型マウスにおける肥満表現型をレスキューすることもできた（本質的に、上述したインビトロでのSim1のアップレギュレーションにおいて説明したように行った）。したがってMC4Rのアップレギュレーションは肥満の治療として使用することができるだろう。
【０１３０】
本発明者らはMc4rプロモーター用のsgRNAを設計した（SEQ ID NO:50〜54参照）。これらのガイドを使って、本発明者らは、VP64に融合されたdCas9（dCas9-VP64）がマウス神経芽細胞腫細胞（Neuro-2a）においてMc4rを過剰発現させることができるかどうか試験した。細胞にdCas9-VP64およびさまざまなガイドをトランスフェクトし、48時間後に、定量PCR（qPCR）を使ってMc4r mRNAレベルを測定した。本発明者らは、内在性Mc4rを7倍過剰発現させることができるMc4rプロモーター用のsgRNAを、1つ同定した（図9A）。
【０１３１】
G．CRISPRa AAVはMc4rのアップレギュレーションを誘発する
本発明者らは次に、sgRNA、SEQ ID NO:51、52または54を含有する本発明者らのAAV CRISPRaベクター（本質的に上記Sim1 CRISPRa AAVの項で説明したように調製したもの）が、Neuro-2a細胞においてインビトロでMc4rを過剰発現させうるかどうか試験した。本発明者らは、プロモーターを標的とした場合に、Mc4r mRNA発現の3.4倍〜6.6倍のアップレギュレーションを観察した（図9B）。
【０１３２】
H．インビトロでのSCN2Aのアップレギュレーション
SCN2A中の変異は、自閉症スペクトラム障害（ASD）およびてんかんを持つ個体において最もよく見られる変異である。変異の大部分は、ハプロ不全ゆえの、ASDにつながる機能欠失型である。ここで本発明者らは、SCN2Aのプロモーターを標的とすることによって、SCN2Aをアップレギュレートできることを示した。したがってSCN2AのアップレギュレーションはASDおよびてんかんの治療として使用することができるだろう。
【０１３３】
本発明者らはScn2aプロモーター用のsgRNAを設計した（SEQ ID NO:85〜91参照）。これらのガイドを使って、本発明者らは、VP64に融合されたdCas9（dCas9-VP64）がマウス神経芽細胞腫細胞（Neuro-2a）においてScn2aを過剰発現させることができるかどうか試験した。細胞にdCas9-VP64およびさまざまなガイドをトランスフェクトし、48時間後に、定量PCR（qPCR）を使ってScn2a mRNAレベルを測定した。本発明者らは、内在性Scn2aを2倍以上過剰発現させることができるScn2aプロモーター用のsgRNAを、4つ同定した（図12A）。
【０１３４】
I．CRISPRa AAVはScn2Aのアップレギュレーションを誘発する
本発明者らは次に、sgRNA、SEQ ID NO:92〜94を含有する本発明者らのAAV CRISPRaベクター（本質的に上記Sim1 CRISPRa AAVの項で説明したように調製したもの）が、Neuro-2a細胞においてインビトロでScn2aを過剰発現させうるかどうか試験した。2つの異なる感染多重度（MOI）、5,000ウイルスゲノムおよび1,750ウイルスゲノム（vg/ml）を使用した。本発明者らは、1mlあたり5,000ウイルスゲノムのMOIでプロモーターを標的とした場合に、Scn2a mRNA発現のわずかなアップレギュレーションを観察した（図12B）。
【０１３５】
J．インビトロでのSETD5のアップレギュレーション
SETD5中の変異は、知的障害および異形特徴を含む精神遅滞23（OMIM番号615761）につながる。ここで本発明者らは、SETD5のプロモーターを標的とすることによって、SETD5をアップレギュレートできることを示した。したがってSETD5のアップレギュレーションは知的障害の治療として使用することができるだろう。
【０１３６】
本発明者らはSetd5プロモーター用のsgRNAを設計した（SEQ ID NO:75〜84参照）。これらのガイドを使って、本発明者らは、VP64に融合されたdCas9（dCas9-VP64）がマウス神経芽細胞腫細胞（Neuro-2a）においてSetd5を過剰発現させることができるかどうか試験した。細胞にdCas9-VP64およびさまざまなガイドをトランスフェクトし、48時間後に、定量PCR（qPCR）を使ってSetd5 mRNAレベルを測定した。本発明者らは、内在性Setd5を1.5倍以上過剰発現させることができるSetd5プロモーター用のsgRNAを、2つ同定した（図11B）。
【０１３７】
次に本発明者らは、ヒトにおけるSETD5プロモーター用のsgRNAを設計した（SEQ ID NO:65〜74参照）。これらのガイドを使って、本発明者らは、VP64に融合されたdCas9（dCas9-VP64）がヒトHEK293T細胞においてSETD5を過剰発現させることができるかどうか試験した。細胞にdCas9-VP64およびさまざまなガイドをトランスフェクトし、48時間後に、定量PCR（qPCR）を使ってSETD5 mRNAレベルを測定した。本発明者らは、内在性SETD5を2.5倍以上過剰発現させることができるSETD5プロモーター用のsgRNAを、少なくとも1つ同定した（図11A）。
【０１３８】
K．インビトロでのPKD1のアップレギュレーション
PKD1中の変異は、400〜1000人に1人を冒す最も高頻度な遺伝性腎臓障害である常染色体優性多発性嚢胞腎（ADPKD;OMIM番号173900）につながる。ADPKDの85％は、PKD1中の変異によって引き起こされ、それらの変異の大部分は機能喪失型である。PKD1は13kb長であり、したがって標準的な遺伝子治療ベクターにパッケージングすることはできない。本明細書に開示するCRISPRa技術を使って、本発明者らは、PKD1のプロモーターを標的とすることによってPKD1をアップレギュレートできることを示した。したがってPKD1のアップレギュレーションは、常染色体優性多発性嚢胞腎の治療として使用することができるだろう。
【０１３９】
本発明者らは、ヒトにおけるPKD1プロモーター用のsgRNAを設計した（SEQ ID NO:55〜64参照）。これらのガイドを使って、本発明者らは、VP64に融合されたdCas9（dCas9-VP64）がヒトHEK293T細胞においてPKD1を過剰発現させることができるかどうか試験した。細胞にdCas9-VP64およびさまざまなガイドをトランスフェクトし、48時間後に、定量PCR（qPCR）を使ってPKD1 mRNAレベルを測定した。本発明者らは、内在性PKD1を2倍以上過剰発現させることができるPKD1プロモーター用のsgRNAを、少なくとも3つ同定した（図10）。
【０１４０】
L．インビトロでのPAX6のアップレギュレーション
PAX6中の機能喪失型変異は、ハプロ不全ゆえの無虹彩1（OMIM番号106210）につながる。ここで本発明者らは、PAX6のプロモーターを標的とすることによって、PAX6をアップレギュレートできることを示した。したがってPAX6のアップレギュレーションは無虹彩1の治療として使用することができるだろう。
【０１４１】
本発明者らはヒトにおけるPAX6プロモーター用のsgRNAを1つ設計した（SEQ ID NO:95）。このガイドを使って、本発明者らは、VP64に融合されたdCas9（化膿レンサ球菌）（dCas9-VP64）が、ニューロンに分化したヒトH1-ESC細胞においてPAX6を過剰発現させることができるかどうか試験した。ガイドを保持するレンチウイルスを細胞にトランスフェクトし、48時間後に、定量PCR（qPCR）を使って、PAX6 mRNAレベルを測定した。本発明者らの例示的なPAX6プロモーター用sgRNAは、内在性PAX6を6倍以上過剰発現させることができた（図13）。また図13は、他のニューロンマーカー（例えばNES）もH1-ESCの神経誘導能を持つことを示している。
【０１４２】
III．考察
CRISPRベースの遺伝子編集は、遺伝子変異を矯正するための有望な治療技術である。しかし現在のところ、これは、低い非相同末端結合（NHEJ）効率（すなわち細胞のごく一部しか編集されない）および個々の変異について特異的なガイドおよびドナー配列をカスタマイズする必要性による制約があるため、ハプロ不全のための実行可能な技術ではない。また、200を超える微小欠失が、主としてハプロ不全によって、ヒト疾患を引き起こすことが知られているが（28）、CRISPRベースの遺伝子編集は、微小欠失についても実行可能な治療戦略ではない。この研究において本発明者らは、新規なアプローチを使ってこれらの課題に取り組み、既存の機能的アレルからの転写アウトプットをCRISPRaで増加させることによってハプロ不全疾患を矯正しうることを示す。
【０１４３】
Sim1のプロモーターまたはエンハンサーのどちらか一方を標的とするCRISPRaを使って、本発明者らは、Sim1に関してハプロ不全であるマウスにおいて、肥満表現型を組織特異的にレスキューすることができた（図6）。この治療アプローチは既存の機能的アレルを利用するので、これには以下に挙げるいくつかの利点がある。（1）同じ遺伝子中の異なるハプロ不全原因変異ごとにCRISPR遺伝子編集アプローチをカスタマイズする必要がなくなる。（2）このアプローチは、可能性として、2つ以上の遺伝子を標的とするために使用することができるだろう。したがって、これは2つ以上の遺伝子のヘテロ接合LoFによって引き起こされる微小欠失関連疾患のための潜在的治療戦略と見ることもできるだろう。（3）CRISPRa-AAVは、その最適パッケージング容量より長い遺伝子によって引き起こされるハプロ不全疾患をレスキューするために使用することができるだろう。（4）CRISPRベースの治療は、シス調節要素を利用して、組織特異性をガイドすることができる。遺伝子調節要素の大規模な組織特異的マップを利用することができるので、この治療アプローチに使用するための候補は十分に得られるだろう。本発明者らは、本発明者らの研究において、Sim1の組織特異的活性化に明確な相違を観察したが、これは、さまざまな組織における当該座位のクロマチンアクセシビリティに帰することができる。以前の大規模なCas9およびdCas9細胞培養スクリーンでは、ヌクレオソーム占有率が低い領域に対するターゲティング優先性が示されている（29）。活性なプロモーターまたはエンハンサーはヌクレオソーム占有率が低く、したがってdCas9ターゲティングを受けやすいであろう。
【０１４４】
本発明者らのdCas9-VP64マウスおよびAAVベクターは、一定の組織/組織タイプにおいて特異的遺伝子を標的とするsgRNAを送達することによる、インビボでの標的遺伝子活性化のための有用なツールになりうる。このアプローチは、遺伝子-遺伝子相互作用を評価するために、またはインビボで特異的調節要素の標的遺伝子を活性化後のその発現レベルを測定することによって同定するために、使用することができるだろう。別の潜在的研究領域は神経回路操作であるだろう。急性的神経回路操作と慢性的神経回路操作との間で不一致が観察されているが（30）、これは、本発明者らのAAV-CRISPRa戦略およびトランスジェニックCRISPRa戦略によって、それぞれ対処することができる。
【０１４５】
Sim1のハプロ不全はマウス（17）でもヒト（13）でも肥満を引き起こす。これが、Sim1＋/-マウスに観察される発生中のPVNサイズの低減（17）によって引き起こされるのか、成体になってからエネルギーホメオスタシスが乱れることによって引き起こされるのかは、主要な研究の一分野であった。視床下部Sim1の出生後コンディショナルノックアウトにおいて観察された肥満表現型（18）により、Sim1は、後に成体になってからのエネルギーホメオスタシスに実際に役割を持つという仮説が補強された。4週齢マウスの視床下部へのCRISPRa AAV注射によって肥満表現型をレスキューできることは、この役割をさらに確証する。メラノコルチン4受容体（Mc4r）シグナリングの廃止は、大半の多遺伝子性および単一遺伝子性肥満表現型の際立った特徴である。Sim1のコンディショナルな出生後欠損はMc4rシグナリングのレベルの低下につながる。Sim1はレプチン-Mc4rパスウェイの不可欠な下流構成要素であることが示されているので（18）、Sim1 CRISPRaターゲティングは、レプチンシグナリングパスウェイを乱す状態の潜在的治療になりうる。
【０１４６】
CRISPRベースの治療的介入の技術的進歩にもかかわらず、インビボでのCRISPR発現の長期的副作用およびそのオフターゲット効果に関する我々の理解は、今なお大部分が不詳であり、それは、本発明者らの本研究についても言えることである。将来的には、抗CRISPR遺伝子（31）または本発明者らのCRISPRaシステムのコンディショナルな活性化もしくはサイレンシングによって、これらの懸念に対処することができるだろう。さらにまた、より高いまたはより低い活性化レベルが必要になるかもしれない一定の疾患に関して転写アウトプットを最適にすることができるように、遺伝子量を調整するためのCRISPRa/iツールを開発する必要もある。VP64は、正常なアレルが2つある場合と類似する遺伝子発現レベルを得るという本発明者らの必要と適合する弱い活性化能を持つことが知られているので（23）、この研究において本発明者らは、VP64を本発明者らの活性化因子として使用した。CRISPRaベースの遺伝子活性化は、融合された活性化因子（23）の性質、sgRNA標的（29）に依存し、CRISPRシステムおよび送達方法の最適化を必要としうる。
【０１４７】
この研究で実証されたとおり、CRISPRaは、遺伝子プロモーターを標的とすることによるだけでなく、エンハンサーなどの遠位シス調節要素を標的とすることによっても、遺伝子を活性化するために使用することができる。先の研究により、これらの要素は、実行可能な治療標的であることが示されている。例えば、グロビンエンハンサーを、クロマチンループ形成因子であるLIM domain binding 1（LDB1）遺伝子に融合されたジンクフィンガーヌクレアーゼの標的とすることによって、胎児ヘモグロビンの活性化がインビトロで達成された。これは鎌形血球症の潜在的治療になる（37）。別の研究では、胎児ヘモグロビンの再活性化が、そのリプレッサーであるB細胞CLL/リンパ腫11A（BCL11A）のエンハンサーをCRISPR遺伝子編集を使って失活させることによって達成された（38）。本発明者らの研究は、治療目的のために同様にシス調節要素を利用する新規なアプローチを提供する。CRISPRa治療で処置することができるであろう遺伝子量の低下によって引き起こされる疾患は数多く存在する。加えて、いくつかのヒト疾患は、類似する機能を持つ別の遺伝子の活性化によってレスキューできる可能性がある。これらには、例えばデュシェンヌ型筋ジストロフィーにとってのユートロフィン（39）、脊髄性筋萎縮症（SMA）にとってのsurvival of motor neuron 2（SMA2）（40）または鎌形血球症にとっての上記胎児グロビンを含めることができるだろう。この技術のさらなる発展により、これらの疾患に冒された患者のための実行可能な治療が得られるだろう。
【０１４８】
III．材料および方法
プラスミド
2つのC末端SV40 NLSおよびtagBFPにVP64ドメインと共に融合された哺乳動物コドン最適化化膿性レンサ球菌dCas9をコードするpMSCV-LTR-dCas9-VP64-BFPベクターと、U6-sgRNA-CMV-mCherry-T2A-Puroプラスミドとを、細胞株トランスフェクションに使用した（どちらもStanley Qi博士のご厚意により分譲されたもの）。sgRNAは、In-Fusion HD-クローニングキット（Clontech）を使用し、製造者のプロトコールに従って、BstXI部位とXhoI部位に、クローニングした。マウスノックインベクターは、dCas9-VP64発現カセットとU6-sgRNA-CMV-mCherry発現カセットとを上述のベクターからTARGATT（CAG＋ポリA）プラスミド（Applied StemCell）にクローニングすることによって生成させた。pcDNA-dCas9-VP64（Addgene 47107）およびU6-sgRNA-CMV-mCherry-WPREpAをpAAV-Ef1a-FAS-hChR2（H134R）-mCherry-WPRE-pA（Addgene 37090）のバックボーンにクローニングして、Ef1a-FAS-hChR2（H134R）-mCherry-WPRE-pAを本発明者らのU6-sgRNA-CMV-mCherry-WPREpAのそれで置き換えた。
【０１４９】
AAV生産
AAV DJ血清型粒子はStanford Neuroscienceウイルスベクターコアを使って生産された。パッケージングロード（packaging load）は、pCMV-dCas9-VP64の場合は5.4kb、pU6-Sim1Pr-CMV-mCherryおよびpU6-SCE2-CMV-mCherryの場合は2.5kbであった。ゲノム力価は、WPREおよびITRプローブによって、pCMV-dCas9-VP64については1.40E10ウイルスゲノム（vg）/ml、pU6-Sim1Pr-CMV-mCherryについては3.30E13vg/ml前後、そしてpU6-SCE2-CMV-mCherryについては2.20E13vg/mlであることが確かめられた。
【０１５０】
細胞培養
神経芽細胞腫2a細胞（Neuro-2a;ATCC（登録商標）CCL-131）はATCCガイドラインに従って成長させた。X-tremeGENE HP DNAトランスフェクション試薬（Roche）を使用し、製造者のプロトコールに従って、プラスミドをNeuro-2a細胞にトランスフェクトした。異なるMOIでAAV粒子をNeuro2a細胞に感染させた。トランスフェクションの48時間後および感染の5日後にNeuro2a細胞を収穫して、qRT-PCR用のRNAを単離した。
【０１５１】
ヒトHEK293T細胞はATCCガイドラインに従って成長させた。X-tremeGENE HP DNAトランスフェクション試薬（Roche）を使用し、製造者のプロトコールに従って、これらの細胞にプラスミドをトランスフェクトした。
【０１５２】
定量逆転写PCR
RNeasy Miniキット（Qiagen）を使用し、製造者のプロトコールに従って、RNAを細胞から単離した。マウスについては、動物を安楽死させ、組織を、RNeasy MiniキットのRNA溶解バッファー中に直接収穫した。Zivic Instruments製のマウスBrain Matrixおよびスライサーを使って、視床下部を切離した。SuperScript III第一鎖合成システム（Invitrogen）を使用し、DNaseI消化と共に製造者のプロトコールを使って、cDNAを調製した。qPCRはSsoFast EvaGreen Supermix（Biorad）を使って行った。結果を、ΔΔCT法により、ベータ-アクチン、Rpl38またはElf3発現のいずれかに標準化された関心対象の遺伝子の増加倍率mRNA発現として表し、次いで統計解析のためにANOVAおよびチューキー検定を行った。報告する値は、異なる日に行った3回の独立した実験（N＝3）の平均および平均の標準誤差であり、技術的複製物は実験ごとに平均した。
【０１５３】
マウス
混合遺伝背景を持つSim1＋/-マウス（17）は、Jacques Michaud博士研究室のご厚意により分譲された。これらのマウスにおいて、750bpの5'領域、開始コドンおよび塩基性ドメイン（最初の17アミノ酸）をコードする配列を含有する1kbフラグメントをPgk-neoカセットで置き換え、それを、KAPAマウス遺伝子タイピングキット（KAPA Biosystems）を用いる遺伝子タイピングに使用した。dCas9-VP64およびsgRNAマウスを生成させるために、本発明者らはTARGATT技術（24）を使用した。注射用のDNAを調製し、TARGATTトランスジェニックキットV6（Applied StemCell）を使って、ミニサークルとして精製した。注射用混合物は、3ng/μLのDNAおよび48ng/μLのインビトロ転写φC31o mRNAを、マイクロインジェクションTEバッファー（0.1mM EDTA、10 mMトリス、pH7.5）中に含有し、注射は標準的なマウストランスジェニックプロトコール（41）を使って行った。dCas9-VP64はマウスHipp11座位に挿入され、sgRNAはRosa26座位に挿入された。KAPAマウス遺伝子タイピングキットを使って、マウスの遺伝子タイピングを行った。（PMID:21464299）に記載のPCR7＋8、PCR1を、ベクター挿入特異的dCas9-VP64プライマーおよびmCherry特異的プライマーと共に使って、F0 TARGATTノックインを評価した。試験全体にわたって、すべてのマウスに、20％タンパク質、9％脂質、4％繊維を含有するPicolabマウス飼料20,5058を自由摂取させた。各成分によるカロリーは、タンパク質23.210％、脂質（エーテル抽出物）21.559％、糖質55.231％であった。すべての動物実験は、UCSF施設内動物実験委員会によって承認された。
【０１５４】
マウス体重測定
生殖細胞系伝達を評価するために、H11PCAG-dCas9-VP64、ROSA26Sim1Pr-sgRNAおよびROSA26SCE2En-sgRNAマウスを、3〜5世代にわたってFVBマウスと交配した。交配を設定するために、3つの独立した組込み体を各系統に使用した。H11PCAG-dCas9-VP64をSim1＋/-と交配し、次にSim1＋/-×H11PCAG-dCas9-VP64マウスをROSA26Sim1Pr-sgRNAまたはROSA26SCE2En-sgRNAのどちらか一方と交雑させることで、連鎖していない3つのアレルすべてを有するマウスを生成させた。研究の間はずっとマウスをPicodiet 5058で飼育し、すべての遺伝子型（野生型同腹仔、Sim1＋/-、Sim1＋/-×H11PCAG-dCas9-VP64、Sim1＋/-×H11PCAG-dCas9-VP64×ROSA26Sim1Pr-sgRNA、Sim1＋/-×H11PCAG-dCas9-VP64×ROSA26SCE2En-sgRNA）からの少なくとも雌6匹および雄6匹を、週1回の頻度で、4〜16週齢の間、それぞれの体重について測定した。
【０１５５】
マウス代謝プロファイリング
Columbus Instruments Comprehensive実験動物モニタリングシステム（CLAMS;Columbus Instruments）を使って、個々のマウスの代謝率を測定した。マウスを個別飼育し、代謝モニタリングを行う前に3〜4日間、粉末picodiet 5058で馴化させた。本発明者らは、マウスをCLAMSユニット中で個別飼育し、4〜5日間にわたって測定を実行した。温度を22℃に維持し、酸素および二酸化炭素を、20.901および0.0049に設定された「空気リファレンス（Air reference）」で較正した。各遺伝子型、野生型同腹仔、Sim1＋/-、Sim1＋/-×H11PCAG-dCas9-VP64×ROSA26Sim1Pr-sgRNA、Sim1＋/-×H11PCAG-dCas9-VP64×ROSA26SCE2En-sgRNAからの雄3匹および雌3匹を、代謝パラメータ（VCO2、VO2、RER、食物摂取量および活動モニタリング）で測定した。CLAXサポートソフトウェア（Columbus Instruments）を使って代謝データを分析した。
【０１５６】
体組成分析
二重エネルギーX線吸収測定法（DEXA）またはEcho磁気共鳴イメージング（Echo Magnetic Resonance Imaging）（EchoMRI;Echo Medical System）のどちらかを使って体組成を測定した。DEXAの場合は、イソフルランを使って麻酔したマウスを、Lunar PIXImusを使って、骨塩密度および組織組成（脂肪量および除脂肪量）について測定した。麻酔や鎮静を必要とせずに生きているマウスにおける総体脂肪、除脂肪量、体液および体内総水分量などの全身組成パラメータを測定するために、EchoMRI（Echo Medical System）を使用した。
【０１５７】
定位注射
体重22〜26gの4週齢Sim1＋/-雄または雌を、外科的介入の少なくとも2日前に、個別にケージに収容した。100mg/kgアベルチンの腹腔内注射でマウスを麻酔した。頭蓋を定位装置（David Kopf Instruments）に固定した。PVNに注射するための定位座標は、ブレグマから尾側0.80mm、正中線上0mm、頭蓋表面の5.2mm下であった。手に持ったDumont 5-45ピンセット（Fine Science Tools）を使って円運動によって1.5mmの孔を頭蓋に開けた。31ゲージ1μlハミルトンマイクロシリンジを使って、用量0.5×107vg/mlのsgRNA-AAVを2.5×106vg/kgのdCas-VP64-AAVと共に、1匹あたり1μlの総注射液量で、10分かけて、PVNに一側注射した。AAV送達後20分間は逆流を防ぐために針をその場に残し、10分かけて数段階でゆっくり引き抜いた。マウスには手術前と手術の24時間後にブプレノルフィン（100mg/kg）を2回投与した。数匹のマウスにおいて注射の2〜12週間後に、後述するmCherryの免疫染色を使ってPVN注射座標を検証した。マウスをpicodiet 5058で飼育し、週1回の頻度で体重を測定した。
【０１５８】
免疫染色
免疫染色のために、ペントバルビタール（7.5mg/0.15ml,i.p.）でマウスを麻酔し、まず10mlのヘパリン加生理食塩水（10U/ml、2ml/分）で、次に10mlのリン酸緩衝4％パラホルムアルデヒド（PFA）で、経心的に灌流した。脳を取り出し、4％PFA中で24時間にわたって後固定してから、PBS中の30％スクロースにおいて72時間平衡化した。脳を滑走式ミクロトーム（Leica SM 2000R）で冠状に薄切した（免疫染色用は35ミクロン、ステレオロジー用は50m）。免疫組織化学は以前に記述されているように行った（19、42、43）。4℃のPBSに保存しておいた冠状脳切片を透過処理し、3％正常ヤギ血清/0.3％Triton X-100中で1時間ブロッキングし、1:500希釈のmCherry抗体（Abcam ab167453）を使って、4℃で一晩インキュベートした。切片を4,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）（0.2g/ml;236276;Roche）に10分間入れておき、次にplusコートスライドにマウントし、Vectashield（H-1000;Vector Laboratories）を使ってカバーガラスを装着した。PVNを含んでいる切片の画像をZeiss Apotomeでキャプチャした。
【０１５９】
参考文献
2020506948.tif 000077
2020506948.tif 000078
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【０１６０】
明解に理解できるように図解と実施例を挙げて、前述の発明をいくらか詳細に説明したが、本願請求項の範囲内で一定の変更および改変を実施できることは、当業者には理解されるであろう。本願において言及した特許、特許出願および他の刊行物は、GenBankアクセッション番号、Entrez遺伝子IDおよびpubmed ID（PMID）によって言及した刊行物を含めて、参照により、あらゆる目的で本明細書にそのまま組み入れられる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2020506948.tif 000094
【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２Ａ】
2020506948.tif 000099
【図２Ｂ】
2020506948.tif 000100
【図２Ｃ】
2020506948.tif 000101
【図２Ｄ】
2020506948.tif 000102
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
2020506948.tif 000110
【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2020506948.tif 000133
2020506948.tif 000134
2020506948.tif 000135
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