(57)【要約】骨髄性悪性腫瘍を処置するための化合物、ならびに方法および化合物の使用、ならびにそれらの医薬組成物が本明細書に記載される。特に、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄増殖性新生物（ＭＰＮ）、および／または骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）を処置するための化合物、ならびに方法および化合物の使用、ならびにそれらの医薬組成物が本明細書に記載される。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量の５−（２，３−ジメトキシ−６−メチル１，４−ベンゾキノイル）］−２−ノニル−２−プロペン酸（ＡＰＸ３３３０））またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を投与するステップを含む、それらを必要とする対象において骨髄性悪性腫瘍の進行を遅延させる方法。
【請求項２】
前記ＡＰＸ３３３０が、Ｒｅｆ−１レドックス機能の選択的阻害剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
約１０ｍｇ／ｋｇ〜約７５ｍｇ／ｋｇの５−（２，３−ジメトキシ−６−メチル１，４−ベンゾキノイル）］−２−ノニル−２−プロペン酸（ＡＰＸ３３３０））またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を投与するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記骨髄性悪性腫瘍が急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄増殖性新生物（ＭＰＮ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記骨髄性悪性腫瘍が急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
１つ以上の抗白血病化学療法剤または１つ以上の抗白血病酵素阻害剤またはそれらの組み合わせを投与するステップをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記１つ以上の抗白血病化学療法剤がデキサメタゾン、ビンクリスチン、ドキソルビシン、およびメトトレキサートからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
１つ以上の担体、希釈剤もしくは賦形剤、またはそれらの組み合わせを投与するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
１つ以上の抗炎症剤を投与するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ＳＨＰ０９９（６−（４−アミノ−４−メチル−１−ピペリジニル）−３−（２，３−ジクロロフェニル）−２−ピラジンアミン）を投与するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
有効量の５−（２，３−ジメトキシ−６−メチル１，４−ベンゾキノイル）］−２−ノニル−２−プロペン酸（ＡＰＸ３３３０））またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を投与するステップを含む、それらを必要とする対象において前白血病幹細胞生成を阻害する方法。
【請求項１２】
前記ＡＰＸ３３３０が、Ｒｅｆ−１レドックス機能の選択的阻害剤である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
約１０ｍｇ／ｋｇ〜約７５ｍｇ／ｋｇの５−（２，３−ジメトキシ−６−メチル１，４−ベンゾキノイル）］−２−ノニル−２−プロペン酸（ＡＰＸ３３３０））またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を投与するステップを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
有効量の５−（２，３−ジメトキシ−６−メチル１，４−ベンゾキノイル）］−２−ノニル−２−プロペン酸（ＡＰＸ３３３０））またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を投与するステップを含む、それらを必要とする対象においてｔｅｔメチルシトシンジオキシゲナーゼ２（ＴＥＴ２）を欠失している炎症性サイトカインの産生を阻害する方法。
【請求項１５】
前記ＡＰＸ３３３０がＲｅｆ−１レドックス機能の選択的阻害剤である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
約１０ｍｇ／ｋｇ〜約７５ｍｇ／ｋｇの５−（２，３−ジメトキシ−６−メチル１，４−ベンゾキノイル）］−２−ノニル−２−プロペン酸（ＡＰＸ３３３０））またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を投与するステップを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
有効量の５−（２，３−ジメトキシ−６−メチル１，４−ベンゾキノイル）］−２−ノニル−２−プロペン酸（ＡＰＸ３３３０））またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を投与するステップを含む、造血幹細胞に少なくとも１つの変異を有する対象において炎症を抑制する方法。
【請求項１８】
約１０ｍｇ／ｋｇ〜約７５ｍｇ／ｋｇの５−（２，３−ジメトキシ−６−メチル１，４−ベンゾキノイル）］−２−ノニル−２−プロペン酸（ＡＰＸ３３３０））またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を投与するステップを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記対象が糖尿病、慢性感染症および関節炎からなる群から選択される１つ以上の疾患または障害をさらに有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記対象が喫煙者である、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、２０１７年１月２５日に出願した米国仮特許出願第６２／４５０，１１１号の利益を主張するものである。
【０００２】
配列表を提出するためのサポートに関する供述
サイズが１０，５０９バイト（ＭＩＣＲＯＳＯＦＴ  ＷＩＮＤＯＷＳ（登録商標）  ＥＸＰＬＯＲＥＲで測定）である「ＩＵＲＴＣ＿２０１７−０５７−０２＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名称のファイルを含むコンピューター可読形式の配列表が本明細書で提供され、参照により本明細書に組み込まれる。この配列表は、配列番号１〜５６からなる。
【０００３】
本開示は、一般に、骨髄性悪性腫瘍、特に急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄増殖性疾患（ＡＰＮ）および骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）の進行および／または発症を遅延および／または防止するための化合物、ならびに方法および化合物の使用、ならびにそれらの医薬組成物に関する。特に、造血幹細胞（ＨＳＣ）に特定の変異を有する対象がＡＭＬを発症する可能性が高いことが見出された。本開示は、これらの対象におけるＡＭＬの進行および／または発症を遅延および／または防止し得る化合物、ならびに方法および化合物の使用、ならびにそれらの医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄増殖性新生物（ＭＰＮ）および骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）を含む骨髄性悪性腫瘍は、クローン性血液疾患である。ＡＭＬ関連遺伝子、例えば、Ｔｅｔ  メチルシトシンジオキシゲナーゼ２（ＴＥＴ２）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３アルファ（ＤＮＭＴ３Ａ）およびＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（内部縦列重複）（ＦＬＴ３−ＩＴＤ）に変異（１または複数）を有する造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）は、前白血病ＨＳＰＣとして一般的に定義されているものを表す（この種の前白血病ＨＳＰＣは、前白血病幹細胞（ＬＳＣ）とも呼ばれる）。前ＬＳＣクローンの選択および増殖は、ＡＭＬ疾患の出現率／発症に先行する。さらに、前ＬＳＣは、さらなる体細胞変異の連続的な獲得を介してＬＳＣへと経時的に形質転換していき、最も悪化したＡＭＬの発症に寄与する可能性がある。未解明であるのは、前ＬＳＣ状態からＬＳＣ状態への「スイッチ」に寄与し得る環境シグナルの性質である。
【０００５】
ヒト化Ｆｌｔ３−ＩＴＤノックイン対立遺伝子を保有するマウスモデル、またはＴｅｔ２もしくはＤｎｍｔ３ａの機能喪失対立遺伝子を有するマウスモデルは、より若齢の細胞表面マーカーＬｉｎｅａｇｅ−／Ｓｃａ−１＋／ｃ−Ｋｉｔ＋（ＬＳＫ）によって定義される造血幹細胞（ＨＳＣ）富化画分を含む、増大ＨＳＰＣプールを示す。これらの遺伝子組換えマウスのうちのいくつかは、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）またはＭＰＮを発症し続け、より老齢では浸透が中程度である。しかし、前白血病変異の大部分はそれ自体ではマウスにおけるＡＭＬを引き起こすのには不十分なようであり、このことは、上記の変異のうちの単一変異は前白血病状態を単に定義するのみであり、おそらくゲノムのさらなる協同変異（内因性因子）および／または環境上の／微環境上のドライバー（外因性因子）が、最も悪化した白血病を発症させるＬＳＣに対して前ＬＳＣについてのより有効な選択優位性を提供するのに必要であることを示唆している。
【０００６】
炎症は、固形組織における腫瘍誘導および形質転換にリンクしており、近年、がんおよびその悪性腫瘍を可能にする特徴として推測されている。環境曝露、感染、自己免疫、または老化によって引き起こされる炎症は、体細胞における変異およびゲノムの不安定性、ならびに腫瘍微細環境の再プログラミング（すなわち、血管新生ならびにサイトカインおよびケモカインの発現の調節による）をもたらし得る。先天性免疫細胞および適応性免疫細胞は両方ともＨＳＰＣから生成され、局所性および全身性の炎症過程の調節に関与していることを考慮すると、炎症と造血器悪性腫瘍との関係はより複雑であり、慎重な検査を必要とする。正常なＨＳＰＣに対する炎症性ストレスの影響が近年注目されているが、前白血病ＨＳＰＣが炎症にどのように応答するかについてはほとんど知られていない。成人期のＨＳＰＣは骨髄に存在し、成熟免疫細胞に囲まれているので、炎症性微細環境は、炎症促進性サイトカインおよびケモカインを産生することにより部分的にＨＳＰＣの成長および自己再生に影響を与えると思われる。この仮説を支持して、慢性炎症がＡＭＬ発症のトリガーとして作用する可能性があることを証明する疫学的研究がある。
【０００７】
最近の報告は、ＨＳＰＣニッチのＮｏｔｃｈシグナル伝達の喪失が核因子κＢ（ＮＦκＢ）シグナル伝達を活性化し、次にこれがサイトカイン／ケモカインの生成を促進し、マウスにおける致死性ＭＰＮ様表現型をモジュレートすることを示している。
【０００８】
前述に基づくと、前白血病幹細胞からＡＭＬへの進行をより完全に理解することは有益となる。さらに、それらのＨＳＰＣに特定の変異を有する対象における炎症、炎症性サイトカインの産生、および前白血病幹細胞生成を軽減および／または防止し、これらの対象における骨髄性悪性腫瘍、例えばＡＭＬの進行を遅延または防止するための手段を提供することは有利である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ＴＥＴ２欠損前白血病ＨＳＰＣがＮＦκＢ／ＩＬ−６シグナル伝達レベルを上昇させ、初代および二次の移植アッセイにおいてそれらの再生上の優位性を維持し、野生型対照よりも顕著に優れていることが本明細書で見出された。さらに、化合物、例えば、
【００１０】
【化１】
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−（５−（２，３−ジメトキシ−６−メチル１，４−ベンゾキノイル）］−２−ノニル−２−プロペン酸（ＡＰＸ３３３０））、およびそれらの類似体を使用して、それらのＨＳＰＣに変異を有する対象において抗炎症の利益を提供し、したがってこれらの対象における骨髄性悪性腫瘍（例えばＡＭＬ、ＭＰＮおよびＭＤ）の進行を遅延および／または防止することができることが本明細書で発見された。
【００１１】
理論に縛られることなく、薬理学的に、ＡＰＸ３３３０などの抗炎症薬は、ＬＰＳ誘発性緊急時顆粒球形成およびＬＳＫ増大を効果的に抑制することができると本明細書では考える。より重要なことには、ＡＰＸ３３３０は、老齢ナイーブＴｅｔ２−ＫＯマウスにおいて、白血球（ＷＢＣ）および赤血球（ＲＢＣ）数を変化させることも示されており、そのことは、実際に前白血病マウスに対して抗炎症効果を提供することができることを示唆している。これらの結果は、ＴＥＴ２欠損骨髄細胞が炎症ストレスに応答して優れた組織修復能力を有することを証明している。これらの所見は、長期ＴＥＴ２欠損前ＬＳＣがストレス状態で（単に老齢誘発性炎症であっても）クローン進化および骨髄性白血病誘発において選択優位性を供給することをさらに示唆している。ＴＥＴ２欠損前ＬＳＣのそのような内因性増殖の優位性は、骨髄中の成熟細胞（ＩＬ−６を供給）および未成熟細胞（ＩＬ−６に供給および応答）の両方におけるＮＦκＢおよびＩＬ−６シグナル伝達の増加に依存すると思われる。
【００１２】
本開示においては、ＴＥＴ２欠損骨髄細胞が、より速やかな緊急時顆粒球形成およびより良好な再増殖能力によって急性炎症に応答した優位性を有することが、さらに見出された。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
したがって、一態様において、本開示は、それらを必要とする対象において骨髄性悪性腫瘍の進行を遅延させる方法に関する。本方法は、有効量の５−（２，３−ジメトキシ−６−メチル１，４−ベンゾキノイル）］−２−ノニル−２−プロペン酸（ＡＰＸ３３３０））またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を投与するステップを含む。
【００１４】
別の態様において、本開示は、それらを必要とする対象において、前白血病幹細胞の産生を阻害する方法に関する。本方法は、有効量の５−（２，３−ジメトキシ−６−メチル１，４−ベンゾキノイル）］−２−ノニル−２−プロペン酸（ＡＰＸ３３３０））またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を投与するステップを含む。
【００１５】
別の態様において、本開示は、それらを必要とする対象において、ｔｅｔメチルシトシンジオキシゲナーゼ２（ＴＥＴ２）を欠失している炎症性サイトカインの産生を阻害する方法に関する。本方法は、有効量の５−（２，３−ジメトキシ−６−メチル１，４−ベンゾキノイル）］−２−ノニル−２−プロペン酸（ＡＰＸ３３３０））またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を投与するステップを含む。
【００１６】
さらに別の態様において、本開示は、造血幹細胞に少なくとも１つの変異を有する対象において炎症を抑制する方法に関する。本方法は、有効量の５−（２，３−ジメトキシ−６−メチル１，４−ベンゾキノイル）］−２−ノニル−２−プロペン酸（ＡＰＸ３３３０））またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を投与するステップを含む。
【００１７】
以下のそれらの詳細な説明を考慮する場合、本開示はよりいっそう理解され、上記に述べたもの以外の特徴、態様および有利性が明白になるであろう。そのような詳細な説明は、以下の図面を参照する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
図１Ａ〜図１Ｐは、ＴＥＴ２−ＫＯマウスが急性炎症チャレンジに応答した顆粒球形成の増大および脾腫を示したことを示す。
【図１Ａ】７日間にわたるＬＰＳ処置した野生型およびＴｅｔ２−ＫＯマウス（０．８ｍｇ／ｋｇ、１回用量、ｉ．ｐ．）の末梢血（ＰＢ）の血液学的変化を示す。
【図１Ｂ】７日間にわたるＬＰＳ処置した野生型およびＴｅｔ２−ＫＯマウス（０．８ｍｇ／ｋｇ、１回用量、ｉ．ｐ．）の末梢血（ＰＢ）の血液学的変化を示す。
【図１Ｃ】７日間にわたるＬＰＳ処置した野生型およびＴｅｔ２−ＫＯマウス（０．８ｍｇ／ｋｇ、１回用量、ｉ．ｐ．）の末梢血（ＰＢ）の血液学的変化を示す。２日目の野生型対照と比較した場合、Ｔｅｔ２−ＫＯマウスにおいては好中球の頻度（Ｆｒｅｑ．）が有意に増加し、リンパ球の頻度（Ｆｒｅｑ．）が有意に減少することに注意されたい（図１Ｃおよび図１Ｈ）。
【図１Ｄ】好酸球（ＥＯ）数および好塩基球（ＢＡ）数の定量化を示す。
【図１Ｅ】好酸球（ＥＯ）数および好塩基球（ＢＡ）数の定量化を示す。
【図１Ｆ】７日間にわたるＬＰＳ処置した野生型およびＴｅｔ２−ＫＯマウス（０．８ｍｇ／ｋｇ、１回用量、ｉ．ｐ．）の末梢血（ＰＢ）の血液学的変化を示す。
【図１Ｇ】７日間にわたるＬＰＳ処置した野生型およびＴｅｔ２−ＫＯマウス（０．８ｍｇ／ｋｇ、１回用量、ｉ．ｐ．）の末梢血（ＰＢ）の血液学的変化を示す。
【図１Ｈ】７日間にわたるＬＰＳ処置した野生型およびＴｅｔ２−ＫＯマウス（０．８ｍｇ／ｋｇ、１回用量、ｉ．ｐ．）の末梢血（ＰＢ）の血液学的変化を示す。２日目の野生型対照と比較した場合、Ｔｅｔ２−ＫＯマウスにおいては好中球の頻度（Ｆｒｅｑ．）が有意に増加し、リンパ球の頻度（Ｆｒｅｑ．）が有意に減少することに注意されたい。
【図１Ｉ】７日間にわたるＬＰＳ処置した野生型およびＴｅｔ２−ＫＯマウス（０．８ｍｇ／ｋｇ、１回用量、ｉ．ｐ．）の末梢血（ＰＢ）の血液学的変化を示す。
【図１Ｊ】７日間にわたるＬＰＳ処置した野生型およびＴｅｔ２−ＫＯマウス（０．８ｍｇ／ｋｇ、１回用量、ｉ．ｐ．）の末梢血（ＰＢ）の血液学的変化を示す。
【図１Ｋ】７日間にわたるＬＰＳ処置した野生型およびＴｅｔ２−ＫＯマウス（０．８ｍｇ／ｋｇ、１回用量、ｉ．ｐ．）の末梢血（ＰＢ）の血液学的変化を示す。
【図１Ｌ】ＬＰＳ誘発急性炎症中の脾臓重量の変化を示す。
【図１Ｍ】ＬＰＳ誘発急性炎症中の脾臓重量の変化を示す。
【図１Ｎ】ＬＰＳ誘発急性炎症中の脾臓重量の変化を示す。
【図１Ｏ】骨髄および脾臓における成熟細胞に対する影響を示す。
【図１Ｐ】ＬＰＳ処置前および処置後の骨髄および脾臓における変化を示す。データは、平均値±標準誤差として表す（各群につきｎ＝１０の生物学的反復）。実験は少なくとも３回繰り返した。Ｐ値：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。  図２Ａ〜図２Ｊは、炎症チャレンジに応答したＴｅｔ２−ＫＯマウスにおけるＨＳＰＣの回復の向上を示す。
【図２Ａ】ナイーブマウス（０日目）と比較した、１日目のＬＰＳ処置マウスにおけるＬＳＫ、ＨＳＣ、ＣＭＰ、ＧＭＰおよびＭＥＰ集団における変化を示す代表的なフローサイトメトリープロファイルを示す。ＬＳＫ区画は増大したが、ＣＭＰ区画は１日目に（日々の比較）縮小したことに注意されたい。さらに、Ｔｅｔ２−ＫＯマウスは、野生型対照と比較して、ＬＳＫおよびＣＭＰの頻度がより高いことを示している。ＨＳＣから成熟免疫細胞までの造血の概略図を、以下のサイトメトリープロファイルに示す。
【図２Ｂ】ＬＰＳ処置後０日目から７日目までの骨髄細胞型の変化（Ｎｏ．）を示す。ＬＰＳ処置後１日目および２日目の骨髄細胞型における急激な低下と、３日目から７日目の回復の遅延に注意されたい。野生型マウスとＴｅｔ２−ＫＯマウスとの間の骨髄細胞型における有意な差は、試験したいずれの時点においても観察されなかった。
【図２Ｃ】ＬＰＳ処置後０日目から７日目の間のＣＭＰ、ＧＭＰ、ＭＥＰ、ＬＳＫおよびＨＳＣの頻度（Ｆｒｅｑ．）および絶対細胞数（Ｎｏ．）の定量化を示す。
【図２Ｄ】ＬＰＳ処置後０日目から７日目の間のＣＭＰ、ＧＭＰ、ＭＥＰ、ＬＳＫおよびＨＳＣの頻度（Ｆｒｅｑ．）および絶対細胞数（Ｎｏ．）の定量化を示す。
【図２Ｅ】ＬＰＳ処置後０日目から７日目の間のＣＭＰ、ＧＭＰ、ＭＥＰ、ＬＳＫおよびＨＳＣの頻度（Ｆｒｅｑ．）および絶対細胞数（Ｎｏ．）の定量化を示す。
【図２Ｆ】ＬＰＳ処置後０日目から７日目の間のＣＭＰ、ＧＭＰ、ＭＥＰ、ＬＳＫおよびＨＳＣの頻度（Ｆｒｅｑ．）および絶対細胞数（Ｎｏ．）の定量化を示す。
【図２Ｇ】ＬＰＳ処置後０日目から７日目の間のＣＭＰ、ＧＭＰ、ＭＥＰ、ＬＳＫおよびＨＳＣの頻度（Ｆｒｅｑ．）および絶対細胞数（Ｎｏ．）の定量化を示す。
【図２Ｈ】ＬＰＳ処置後０日目から７日目の間のＬｉｎ陰性骨髄細胞におけるｃ−Ｋｉｔ＋およびＳｃａ−１＋細胞の頻度（Ｆｒｅｑ．）を示す。
【図２Ｉ】平均蛍光強度（ｍｅａｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）（ＭＦＩ）により測定されたＬｉｎ陰性骨髄細胞におけるｃ−ＫｉｔおよびＳｃａ−１の発現（Ｅｘｐｒ．）レベルを示す。
【図２Ｊ】若齢３〜４週齢の野生型およびＴｅｔ２−ＫＯマウスにおけるＬＰＳ処置後０日および２日目のＣＭＰ、ＬＳＫおよびＨＳＣの頻度（Ｆｒｅｑ．）および絶対細胞数（Ｎｏ．）の定量化を示す。  実験は少なくとも３回繰り返した。Ｐ値：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図３Ａ】ＣＬＰ、ＭＰＰおよび短期ＨＳＣ区画の定量化、ならびにｃ−ＫｉｔおよびＳｃａ−１マーカーを用いて分析したフローサイトメトリーの代表的なヒストグラムプロットを示す。
【図３Ｂ】ＣＬＰ、ＭＰＰおよび短期ＨＳＣ区画の定量化、ならびにｃ−ＫｉｔおよびＳｃａ−１マーカーを用いて分析したフローサイトメトリーの代表的なヒストグラムプロットを示す。
【図３Ｃ】ＣＬＰ、ＭＰＰおよび短期ＨＳＣ区画の定量化、ならびにｃ−ＫｉｔおよびＳｃａ−１マーカーを用いて分析したフローサイトメトリーの代表的なヒストグラムプロットを示す。
【図３Ｄ】ＣＬＰ、ＭＰＰおよび短期ＨＳＣ区画の定量化、ならびにｃ−ＫｉｔおよびＳｃａ−１マーカーを用いて分析したフローサイトメトリーの代表的なヒストグラムプロットを示す。  データは平均値±標準誤差として表す（各群につきｎ＝４の生物学的反復）。実験は少なくとも３回繰り返した。Ｐ値：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。  図４Ａ〜図４Ｊは、Ｔｅｔ２−ＫＯ造血前駆細胞が急性炎症チャレンジに応答してアポトーシスの減少、増殖の増大およびＤＮＡ損傷を示すことを示す。
【図４Ａ】アネキシン−Ｖ／７−ＡＡＤフローサイトメトリーによって評価した場合のＬＰＳ処置後（０日目から２日目）のＬｉｎ陰性細胞およびＬＳＫ細胞におけるアポトーシスのレベルを示す。
【図４Ｂ】ＬＰＳ処置後（０日目から２日目）の骨髄のＬｉｎ陰性画分またはＬＳＫ画分内のＫｉ−６７＋増殖細胞の存在を示す。
【図４Ｃ】γＨ２ＡＸ染色によって評価した場合の、骨髄のＬｉｎ陰性画分およびＬＳＫ画分内のＤＮＡ損傷の急激な変化を示す。γＨ２ＡＸの発現レベルは、ＭＦＩによって示す。
【図４Ｄ】γＨ２ＡＸ染色によって評価した場合の、骨髄のＬｉｎ陰性画分およびＬＳＫ画分内のＤＮＡ損傷の急激な変化を示す。γＨ２ＡＸの発現レベルは、ＭＦＩによって示す。
【図４Ｅ】代表的なアポトーシス促進遺伝子（Ｃａｓｐ１およびＢｃｌ２ｌ１１）、生存促進遺伝子（Ｂｃｌ２およびＭｏｒｒｂｉｄ）、細胞周期調節因子コード遺伝子（Ｃｃｎｅ１およびＣｃｎｄ１）ならびにＤＮＡ損傷応答調節因子（５３ｂｐｌおよびＲａｄ５１）またはＤＮＡ修復経路調節因子（Ｆａｎｃａ、Ｆａｎｃｄ２、Ｘｒｃｃ５およびＡｔｍ）をコードする遺伝子のｑＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。
【図４Ｆ】代表的なアポトーシス促進遺伝子（Ｃａｓｐ１およびＢｃｌ２ｌ１１）、生存促進遺伝子（Ｂｃｌ２およびＭｏｒｒｂｉｄ）、細胞周期調節因子コード遺伝子（Ｃｃｎｅ１およびＣｃｎｄ１）ならびにＤＮＡ損傷応答調節因子（５３ｂｐｌおよびＲａｄ５１）またはＤＮＡ修復経路調節因子（Ｆａｎｃａ、Ｆａｎｃｄ２、Ｘｒｃｃ５およびＡｔｍ）をコードする遺伝子のｑＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。
【図４Ｇ】代表的なアポトーシス促進遺伝子（Ｃａｓｐ１およびＢｃｌ２ｌ１１）、生存促進遺伝子（Ｂｃｌ２およびＭｏｒｒｂｉｄ）、細胞周期調節因子コード遺伝子（Ｃｃｎｅ１およびＣｃｎｄ１）ならびにＤＮＡ損傷応答調節因子（５３ｂｐｌおよびＲａｄ５１）またはＤＮＡ修復経路調節因子（Ｆａｎｃａ、Ｆａｎｃｄ２、Ｘｒｃｃ５およびＡｔｍ）をコードする遺伝子のｑＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。
【図４Ｈ】代表的なアポトーシス促進遺伝子（Ｃａｓｐ１およびＢｃｌ２ｌ１１）、生存促進遺伝子（Ｂｃｌ２およびＭｏｒｒｂｉｄ）、細胞周期調節因子コード遺伝子（Ｃｃｎｅ１およびＣｃｎｄ１）ならびにＤＮＡ損傷応答調節因子（５３ｂｐｌおよびＲａｄ５１）またはＤＮＡ修復経路調節因子（Ｆａｎｃａ、Ｆａｎｃｄ２、Ｘｒｃｃ５およびＡｔｍ）をコードする遺伝子のｑＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。
【図４Ｉ】代表的なアポトーシス促進遺伝子（Ｃａｓｐ１およびＢｃｌ２ｌ１１）、生存促進遺伝子（Ｂｃｌ２およびＭｏｒｒｂｉｄ）、細胞周期調節因子コード遺伝子（Ｃｃｎｅ１およびＣｃｎｄ１）ならびにＤＮＡ損傷応答調節因子（５３ｂｐｌおよびＲａｄ５１）またはＤＮＡ修復経路調節因子（Ｆａｎｃａ、Ｆａｎｃｄ２、Ｘｒｃｃ５およびＡｔｍ）をコードする遺伝子のｑＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。
【図４Ｊ】代表的なアポトーシス促進遺伝子（Ｃａｓｐ１およびＢｃｌ２ｌ１１）、生存促進遺伝子（Ｂｃｌ２およびＭｏｒｒｂｉｄ）、細胞周期調節因子コード遺伝子（Ｃｃｎｅ１およびＣｃｎｄ１）ならびにＤＮＡ損傷応答調節因子（５３ｂｐｌおよびＲａｄ５１）またはＤＮＡ修復経路調節因子（Ｆａｎｃａ、Ｆａｎｃｄ２、Ｘｒｃｃ５およびＡｔｍ）をコードする遺伝子のｑＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。データは平均値±標準誤差として表す（各群につきｎ＝４の生物学的反復）。実験は少なくとも２回繰り返した。Ｐ値：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図５Ａ】アネキシン−Ｖ／７−ＡＡＤ染色の代表的なフローサイトメトリープロットならびにＫｉ６７およびγＨ２ＡＸ染色のヒストグラムプロットを示す。
【図５Ｂ】アネキシン−Ｖ／７−ＡＡＤ染色の代表的なフローサイトメトリープロットならびにＫｉ６７およびγＨ２ＡＸ染色のヒストグラムプロットを示す。
【図５Ｃ】アネキシン−Ｖ／７−ＡＡＤ染色の代表的なフローサイトメトリープロットならびにＫｉ６７およびγＨ２ＡＸ染色のヒストグラムプロットを示す。
【図５Ｄ】アネキシン−Ｖ／７−ＡＡＤ染色の代表的なフローサイトメトリープロットならびにＫｉ６７およびγＨ２ＡＸ染色のヒストグラムプロットを示す。
【図５Ｅ】アネキシン−Ｖ／７−ＡＡＤ染色の代表的なフローサイトメトリープロットならびにＫｉ６７およびγＨ２ＡＸ染色のヒストグラムプロットを示す。  データは平均値±標準誤差として表す（各グループにつきｎ＝４の生物学的反復）。実験は少なくとも２回繰り返した。Ｐ値：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。  図６Ａ〜図６Ｊは、ＬＰＳストレスＴｅｔ２欠損骨髄細胞が再増殖の優位性を維持することを示す。
【図６Ａ】初代および二次競合的骨髄移植（ｃＢＭＴ）アッセイを説明する概略図である。初代ｃＢＭＴアッセイについては、ナイーブマウス（０日目、野生型もしくはＴｅｔ２−ＫＯ）またはＬＰＳ処置マウス（ＬＰＳ処置後１日目、２日目および３日目、野生型もしくはＴｅｔ２−ＫＯ）由来のドナー細胞（全てＣＤ４５．２＋）を、ナイーブＢｏｙＪマウス由来のドナー細胞（ＣＤ４５．１＋）と等しく混合し、放射線照射したレシピエント動物に移植した（ＣＤ４５．２＋／ＣＤ４５．１＋）。二次ｃＢＭＴアッセイについては、初代レシピエント由来のドナー細胞をナイーブＢｏｙＪマウス由来のドナー細胞と等しく混合し、放射線照射したレシピエント動物に移植した（ＣＤ４５．１＋／ＣＤ４５．２＋）。
【図６Ｂ】ＬＰＳ処置の有無にかかわらずＴｅｔ２欠損骨髄が、野生型対照と比較して、初代および二次レシピエントにおいてＣＤ４５．２細胞の生着が有意に高いことを証明することを示す。２日目のＬＰＳ処置野生型ＣＤ４５．２骨髄ドナー細胞は、未処置細胞および１日目のＬＰＳ処置細胞に対するそれらの正常な生着能を喪失していることに注意されたい。
【図６Ｃ】ＬＰＳ処置の有無にかかわらずＴｅｔ２欠損骨髄が、野生型対照と比較して、初代および二次レシピエントにおいてＣＤ４５．２細胞の生着が有意に高いことを証明することを示す。２日目のＬＰＳ処置野生型ＣＤ４５．２骨髄ドナー細胞は、未処置細胞および１日目のＬＰＳ処置細胞に対するそれらの正常な生着能を喪失していることに注意されたい。
【図６Ｄ】無ゲートの骨髄生存全細胞（ＢＭ＿Ｌｉｖｅ）、Ｌｉｎ陰性、ＬＳＫ細胞、骨髄細胞、Ｂ細胞およびＴ細胞におけるＣＤ４５．２＋ドナー細胞の定量化である。
【図６Ｅ】Ｔｅｔ２欠損骨髄ドナー細胞が、初代レシピエントマウスにおいて脾腫、骨髄細胞スキューイングおよび欠陥Ｂ細胞発生を誘導したことを示す。
【図６Ｆ】Ｔｅｔ２欠損骨髄ドナー細胞が、初代レシピエントマウスにおいて脾腫、骨髄細胞スキューイングおよび欠陥Ｂ細胞発生を誘導したことを示す。
【図６Ｇ】同数のＬＳＫ細胞をＬＰＳ処置前後の野生型マウスおよびＴｅｔ２−ＫＯマウスから精製し、それぞれｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＣＦＵアッセイ（図６Ｈ）およびｉｎ  ｖｉｖｏ  ｃＢＭＴ（図６Ｉ）アッセイに供したことを示す。移植実験は（図６Ｇ）に記載のように実施した。
【図６Ｈ】同数のＬＳＫ細胞をＬＰＳ処置前後の野生型マウスおよびＴｅｔ２−ＫＯマウスから精製し、それぞれｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＣＦＵアッセイ（図６Ｈ）およびｉｎ  ｖｉｖｏ  ｃＢＭＴ（図６Ｉ）アッセイに供したことを示す。移植実験は（図６Ｇ）に記載のように実施した。
【図６Ｉ】同数のＬＳＫ細胞をＬＰＳ処置前後の野生型マウスおよびＴｅｔ２−ＫＯマウスから精製し、それぞれｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＣＦＵアッセイ（図６Ｈ）およびｉｎ  ｖｉｖｏ  ｃＢＭＴ（図６Ｉ）アッセイに供したことを示す。移植実験は（図６Ｇ）に記載のように実施した。
【図６Ｊ】ＣＤ４５．２／ＣＤ４５．１キメラ現象の代表的なフローサイトメトリープロットを示す。初代レシピエントにおける移植後１６週間の種々の骨髄サブセットにおけるキメラ現象の定量的分析。データは平均値±標準誤差として表す（各ｃＢＭＴ実験についてｎ＝５）。初代ｃＢＭＴは２回繰り返した。二次ｃＢＭＴは、各群５匹のマウスで１回実施した。Ｐ値：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。  図７Ａ〜図７Ｇは、Ｔｅｔ２−ＫＯマウスが血清および様々な骨髄サブセットにおいてＩＬ−６の発現が増加したことを示す。
【図７Ａ】Ｔｅｔ２−ＫＯマウスにおけるＬＰＳに応答してＩＬ−６、ＣＣＬ２、ＣＣＬ４およびＴＮＦαを含む複数のサイトカインおよびケモカインの発現が増加したことを示す。ナイーブ状態（０日目）の野生型マウスにおける各サイトカインまたはケモカインの平均血清レベルは１倍と定義した。ＬＰＳ処置前のＴｅｔ２−ＫＯマウスまたはＬＰＳ処置後のマウスにおける血清サイトカイン／ケモカインレベルの倍数変化を算出し、それに応じてプロットした。
【図７Ｂ】全骨髄細胞ならびにＬＰＳ処置前後のＬｉｎ陰性骨髄細胞におけるＩＬ−６発現の細胞内フローサイトメトリー分析（ＩＣＦＣ）を示す。
【図７Ｃ】全骨髄細胞ならびにＬＰＳ処置前後のＬｉｎ陰性骨髄細胞におけるＩＬ−６発現の細胞内フローサイトメトリー分析（ＩＣＦＣ）を示す。
【図７Ｄ】フローサイトメトリーおよびＭＦＩ定量化によって評価した場合の、骨髄Ｌｉｎ陰性細胞におけるＩＬ−６、ＴＮＦα、ＩＬ−１βおよびＧＭ−ＣＳＦの発現を示す。
【図７Ｅ】骨髄Ｌｉｎ陰性細胞におけるＩＬ−６およびＣｃｌ２発現のＱＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。
【図７Ｆ】成体および若齢のＬＰＳ処置前後の野生型マウスおよびＴｅｔ２−ＫＯマウス由来の骨髄Ｌｉｎ陰性細胞におけるＩＬ−６、ＴＮＦα、Ｃｃｌ２、およびＣｃｌ４発現のＱＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。
【図７Ｇ】成体および若齢のＬＰＳ処置前後の野生型マウスおよびＴｅｔ２−ＫＯマウス由来の骨髄Ｌｉｎ陰性細胞におけるＩＬ−６、ＴＮＦα、Ｃｃｌ２、およびＣｃｌ４発現のＱＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。
【図８Ａ】ＴＮＦα、ＩＬ−１βおよびＧＭ−ＣＳＦに関する代表的なＩＦＣプロットを示す。
【図８Ｂ】ＴＮＦα、ＩＬ−１βおよびＧＭ−ＣＳＦに関する代表的なＩＦＣプロットを示す。
【図８Ｃ】ＴＮＦα、ＩＬ−１βおよびＧＭ−ＣＳＦに関する代表的なＩＦＣプロットを示す。
【図８Ｄ】ＴＮＦα、ＩＬ−１βおよびＧＭ−ＣＳＦに関する代表的なＩＦＣプロットを示す。
【図８Ｅ】ＴＮＦα、ＩＬ−１βおよびＧＭ−ＣＳＦに関する代表的なＩＦＣプロットを示す。
【図８Ｆ】ＴＮＦα、ＩＬ−１βおよびＧＭ−ＣＳＦに関する代表的なＩＦＣプロットを示す。  データは平均値±標準誤差として表す（各群につきｎ＝４の生物学的反復）。実験は少なくとも２回繰り返した。Ｐ値：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。  図９Ａ〜図９Ｊは、Ｔｅｔ２−ＫＯマウスがＴＬＲ４／ＮＦκＢ／ＩＬ−６経路の発現が増加していることを示す。
【図９Ａ】標準のＴＬＲ４／ＮＦκＢ／ＩＬ−６経路および推定上のＩＬ−６／Ｓｔａｔ１／Ｓｃａ−１経路の概略形を説明する図である。ＴＬＲ４の活性化は、（感染可能な場合には）ＬＰＳなどの外因性リガンドを介して、または（感染不可能な場合には）おそらくは内因性リガンドＳ１００Ａ８／Ｓ１００Ａ９を介して行われる。ＡＰＸ３３３０による経路の抑制は、Ａｐｅｌ−ＮＦκＢのレベル、または推定上Ａｐｅ１−Ｓｔａｔ３のレベルに作用する。
【図９Ｂ】野生型対照と比較した場合の、ナイーブＴｅｔ２−ＫＯマウス由来の骨髄細胞におけるＴＬＲ４＋細胞の頻度の増加、およびＴＬＲ４の発現の増加（フローサイトメトリーおよびＭＦＩによって算出）を示す。
【図９Ｃ】Ｔｌｒ４、Ｔｉｃａｍ１、Ｎｆｋｂ１、Ｎｆｋｂｉｚ、Ａｐｅｘ１、Ｓｔａｔ１、Ｓｔａｔ３およびＬｙ６ａに関する発現を分析するために野生型マウスおよびＴｅｔ２−ＫＯマウス由来の細胞に対して実施したｑＲＴ−ＰＣＲアッセイを示す。
【図９Ｄ】ＡＰＸ３３３０の短期処置が末梢血の緊急好中球産生を抑制し、野生型およびＴｅｔ２−ＫＯの両方において正常骨髄細胞性を維持したことを示す。さらに、ＡＰＸ３３３０は、野生型およびＴｅｔ２−ＫＯの両方で、骨髄におけるＬＳＫ細胞の増殖を抑制する。
【図９Ｅ】ＡＰＸ３３３０の短期処置が末梢血の緊急好中球産生を抑制し、野生型およびＴｅｔ２−ＫＯの両方において正常骨髄細胞性を維持したことを示す。さらに、ＡＰＸ３３３０は、野生型およびＴｅｔ２−ＫＯの両方で、骨髄におけるＬＳＫ細胞の増殖を抑制する。
【図９Ｆ】ＬＰＳチャレンジ前後のＴｅｔ２−ＫＯ  Ｌｉｎ陰性骨髄細胞におけるＮＦκＢ１およびｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓｔａｔ３の発現の増加を示す。
【図９Ｇ】Ｌｉｎ陰性骨髄細胞におけるＴｌｒ４、Ｔｉｃａｍ１、Ｎｆｋｂ１、Ｎｆｋｂｉｚ、およびＡｐｅｘ１の発現を示す、ナイーブ野生型マウスおよびＴｅｔ２−ＫＯマウス由来のＬｉｎ−細胞に対するｑＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。
【図９Ｈ】ＣＨＩＰ−ｑＰＣＲ分析によって明らかにした場合の、ＩＬ−６およびＴＬＲ４プロモーターへのＩκＢζの結合の増大を示す。
【図９Ｉ】ＣＨＩＰ−ｑＰＣＲアッセイにより明らかにした場合に、Ｔｅｔ２−ＫＯ  Ｌｉｎ陰性骨髄細胞のＥ３３３０またはＳＨＰ０９９処置が、初代および二次再プレーティングアッセイにおいてＴｅｔ２−ＫＯ細胞のコロニー形成能の増大を修正し、Ｍｏｒｒｉｂｉｄプロモーターに対するＩκＢζおよびＳｔａｔ３への結合の増大をレスキューすることを示す。
【図９Ｊ】ＣＨＩＰ−ｑＰＣＲアッセイにより明らかにした場合に、Ｔｅｔ２−ＫＯ  Ｌｉｎ陰性骨髄細胞のＥ３３３０またはＳＨＰ０９９処置が、初代および二次再プレーティングアッセイにおいてＴｅｔ２−ＫＯ細胞のコロニー形成能の増大を修正し、Ｍｏｒｒｉｂｉｄプロモーターに対するＩκＢζおよびＳｔａｔ３への結合の増大をレスキューすることを示す。  データは平均±標準誤差として表す（各群につきｎ＝３または４の生物学的反復）。実験は少なくとも２回繰り返した。Ｐ値：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図１０Ａ】骨髄細胞の様々な画分におけるＴＬＲ４およびＩＬ−６Ｒα標識の代表的なフローサイトメトリープロットである。
【図１０Ｂ】骨髄細胞の様々な画分におけるＴＬＲ４およびＩＬ−６Ｒα標識の代表的なフローサイトメトリープロットである。
【図１０Ｃ】骨髄細胞の様々な画分におけるＴＬＲ４およびＩＬ−６Ｒα標識の代表的なフローサイトメトリープロットである。  データは平均±標準誤差として表す（各群につきｎ＝３または４の生物学的反復）。実験は少なくとも２回繰り返した。Ｐ値：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。  図１１Ａ〜図１１Ｄは、ＡＰＸ３３３０が老齢Ｔｅｔ２−ＫＯマウスにおいてＭＰＮの初期徴候を逆転させることを示す。
【図１１Ａ】脾腫ならびに末梢血の好中球の数および頻度（Ｆｒｅｑ．）の増加によって示されるように、老齢Ｔｅｔ２−ＫＯマウス（６月齢）がＭＰＮの早期徴候を表すことを示す。
【図１１Ｂ】ＡＰＸ３３３０によるＴｅｔ２−ＫＯ老齢マウスの処置手順を説明する概略図である。
【図１１Ｃ】ＡＰＸ３３３０処置した老齢Ｔｅｔ２−ＫＯマウスにおける血液学的パラメータおよび脾臓重量を示す。ＡＰＸ３３３０は老齢Ｔｅｔ２−ＫＯにおいて脾腫を変化させることはなかったが、好中球の絶対数とパーセンテージの両方が対照と比較して著しく減少し、一方、赤血球（ＲＢＣ）数およびヘマトクリット（ＨＣＴ）は正常レベルにレスキューされることに注意されたい。
【図１１Ｄ】Ｔｅｔ２欠乏症および／または炎症性ストレスによって誘発される骨髄スキューイングおよびＨＳＣ活性の変化に関するモデルを示す。前白血病マウスにおけるＴｅｔ２の喪失は、正常マウスと比較して、ＴＬＲ４、ＩＬ−６およびＳｃａ−１タンパク質の基礎レベルの増加を維持する。炎症性ストレスの際、Ｔｅｔ２欠損マウスは、ＴＬＲ４、ＩＬ−６、およびＳｃａ−１の発現を部分的に調節することによって、緊急時顆粒球形成および造血（骨髄スキューイング）の増大を示した。野生型ＨＳＣは炎症性ストレスに対して感受性であるが、Ｔｅｔ２欠損ＨＳＣはそのようなストレスの形態に耐性があり、野生型細胞と比較して、自己再生および再増殖の優位性を維持した。  図１１Ａのデータは、平均値±標準誤差として表される。図１１Ｃのデータは、平均値±標準偏差として表される（各群につきｎ＝５の生物学的反復）。実験は少なくとも２回繰り返した。Ｐ値：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図１２】Ｔｅｔ２−ＫＯ造血前駆細胞が急性炎症チャレンジに応答して細胞生存の持続、増殖の増大およびＤＮＡ損傷を示したことを示す。特に図１２は、ＣＨＩＰ−ｑＰＣＲ富化アッセイにより明らかにされたように、Ｓｔａｔ３がＭｏｒｒｂｉｄ遺伝子座に結合することを示す。結合における相対的富化を示している。  図１３Ａ〜図１３Ｏは、Ｅ３３３０およびＳＨＰ０９９処置が老齢Ｔｅｔ２−ＫＯマウスにおけるＭＰＮの初期徴候を逆転させたことを示す。
【図１３Ａ】老齢Ｔｅｔ２−ＫＯマウスにおけるＥ３３３０またはＳＨＰ０９９による２週間の処置期間後のＰＢパラメータの変化を示す。図１３Ａは、ＬＰＳ処置前のＴｅｔ２−ＫＯマウスにおける薬物処置の戦略を示す概略図である
【図１３Ｂ】Ｅ３３３０またはＳＨＰ０９９によるＴｅｔ２−ＫＯマウスの前処置が、ＬＰＳ誘発緊急好中球産生およびＬＳＫ細胞増殖を抑制したことを示す。
【図１３Ｃ】Ｅ３３３０またはＳＨＰ０９９によるＴｅｔ２−ＫＯマウスの前処置が、ＬＰＳ誘発緊急好中球産生およびＬＳＫ細胞増殖を抑制したことを示す。
【図１３Ｄ】老齢Ｔｅｔ２−ＫＯマウスにおけるＥ３３３０またはＳＨＰ０９９による２週間の処置期間後のＰＢパラメータの変化を示す。図１３Ｄは、ＬＰＳおよび薬物処置後のＬＳＫ細胞の代表的なフローサイトメトリープロファイルである。
【図１３Ｅ】老齢Ｔｅｔ２−ＫＯマウスにおけるＥ３３３０またはＳＨＰ０９９による２週間の処置期間後のＰＢパラメータの変化を示す。図１３Ｅは、ＬＰＳおよび薬物処置後のＬＳＫ細胞の代表的なフローサイトメトリープロファイルである。
【図１３Ｆ】老齢Ｔｅｔ２−ＫＯマウスが脾腫、好中球増加症を発症し、血清ＩＬ−６レベルを増加させたことを示す。
【図１３Ｇ】老齢Ｔｅｔ２−ＫＯマウスが脾腫、好中球増加症を発症し、血清ＩＬ−６レベルを増加させたことを示す。
【図１３Ｈ】老齢Ｔｅｔ２−ＫＯマウスが脾腫、好中球増加症を発症し、血清ＩＬ−６レベルを増加させたことを示す。
【図１３Ｉ】老齢Ｔｅｔ２−ＫＯマウスにおけるＥ３３３０またはＳＨＰ０９９による２週間の処置期間後のＰＢパラメータの変化を示す。図１３Ｉは、老齢Ｔｅｔ２−ＫＯマウスにおける薬物処置戦略を示す概略図である。
【図１３Ｊ】Ｅ３３３０またはＳＨＰ０９９によって処置した老齢Ｔｅｔ２−ＫＯにおけるＰＢ好中球数、好中球頻度および血清ＩＬ−６レベルのレスキューを示す。
【図１３Ｋ】Ｅ３３３０またはＳＨＰ０９９によって処置した老齢Ｔｅｔ２−ＫＯにおけるＰＢ好中球数、好中球頻度および血清ＩＬ−６レベルのレスキューを示す。
【図１３Ｌ】老齢Ｔｅｔ２−ＫＯマウスにおけるＥ３３３０またはＳＨＰ０９９による２週間の処置期間後のＰＢパラメータの変化を示す。図１３Ｌは、Ｅ３３３０またはＳＨＰ０９９により１４日間処置した老齢Ｔｅｔ２−ＫＯマウスにおけるＰＢパラメータおよび脾臓重量の変化を示す。
【図１３Ｍ】老齢Ｔｅｔ２−ＫＯマウスにおけるＥ３３３０またはＳＨＰ０９９による２週間の処置期間後のＰＢパラメータの変化を示す。図１３Ｍは、Ｅ３３３０またはＳＨＰ０９９により１４日間処置した老齢Ｔｅｔ２−ＫＯマウスにおけるＰＢパラメータおよび脾臓重量の変化を示す。
【図１３Ｎ】Ｅ３３３０またはＳＨＰ０９９によって処置した老齢Ｔｅｔ２−ＫＯにおけるＰＢ好中球数、好中球頻度および血清ＩＬ−６レベルのレスキューを示す。
【図１３Ｏ】Ｅ３３３０またはＳＨＰ０９９によって処置した老齢Ｔｅｔ２−ＫＯにおけるＰＢ好中球数、好中球頻度および血清ＩＬ−６レベルのレスキューを示す。  データは平均±標準誤差である。実験は少なくとも２回繰り返した。Ｐ値：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄増殖性新生物（ＭＰＮ）および骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）を含む骨髄性悪性腫瘍は、クローン性血液障害である。より詳しくは、ＡＭＬは、骨髄および血液中の異常な白血球の急激な成長および蓄積を特徴とする骨髄細胞がんである。これらの悪性細胞は赤血球および血小板の正常な産生を妨げ、貧血および病的出血をもたらす。ＡＭＬは、細胞の成長および増殖の増加、ならびに成熟の障害をもたらす遺伝的変化、特に造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）の変異によって生じる。Ｔｅｔメチルシトシンジオキシゲナーゼ２（ＴＥＴ２）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３アルファ（ＤＮＭＴ３Ａ）およびＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（内部縦列重複）（ＦＬＴ３−ＩＴＤ）などのＡＭＬ関連遺伝子に１つ以上の変異を有する造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）は、ヒトにおいて前白血病クローンを示す（この種のプレコンディショニングされたＨＳＰＣは前白血病幹細胞、前ＬＳＣとも呼ばれる）。前ＬＳＣクローンは、細胞においてさらなる体細胞変異の経時的な連続獲得によって、より高悪性度の（クローンの選択および増大における優位性を有する）悪性腫瘍へと発展する可能性がある。
【００２０】
多くの状況において、前ＬＳＣから最も悪化したＡＭＬへの進行は、炎症によって引き起こされ得る。例えば、ＡＭＬは、他の炎症性疾患、障害および状態を有する対象において、特に老化、糖尿病、肥満、慢性感染症、喫煙、関節炎およびそれらの組み合わせに罹患している対象において、より顕著に発症することが分かっている。
【００２１】
用語「対象」とは、処置しようとする個体を示すために、「患者」と同義的に本明細書において使用する。対象は、哺乳動物（例えば、ヒト、ヒト以外の霊長類、ラット、マウス、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコなど）である。対象は、臨床患者、臨床試験ボランティア、コンパニオンアニマル、実験動物などであってよい。対象は、状態（例えば骨髄性悪性腫瘍（例えばＡＭＬ、ＭＰＮ、ＭＤＳ）など）に罹患しているか、または罹患するリスクがあることが疑われ得るか、あるいは状態（例えば、前白血病障害または状態）と診断され得る。対象はまた、骨髄性悪性腫瘍に罹患しているか、または罹患するリスクがあることが疑われ得る。一実施形態によれば、処置される対象はヒトである。
【００２２】
Ｔｅｔメチルシトシンジオキシゲナーゼ２（ＴＥＴ２）は、メチルシトシン（５−ｍｃ）の５−ヒドロキシメチルシトシン（５−ｈｍｃ）への５−ヒドロキシル化を触媒し、ヒトゲノムにとって必須のエピジェネティック制御因子である。ＴＥＴ２は、がん生物学における腫瘍抑制因子として認められたばかりで１０年もたっていない。ＴＥＴ２欠損ＬＳＫ／ＨＳＣ細胞がマウスを使用したｉｎ  ｖｉｖｏモデルで自己再生活性を増加させることが検証されたが、根底にある分子メカニズムの大部分は未知である。
【００２３】
野生型マウスおよびＴｅｔ２ノックアウト（Ｔｅｔ２−ＫＯ）マウスの両方の末梢血中の血液学的計数は、リポ多糖類（ＬＰＳ）誘発急性炎症チャレンジの後期段階で正常レベルに戻るが、顆粒球形成（好中球細胞計数によって示した場合）ならびに造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）の活性化は、Ｔｅｔ２−ＫＯマウスの初期段階中に頑健に増大したことが本明細書で見出された。理論に縛られることなく、この劇的な違いは、おそらく、前白血病マウスの血清中の炎症促進性サイトカインＩＬ−６の供給が有意に増加したことによるものと考えられる。さらに、ゲノムの不安定性および前駆細胞の生存率が、急性炎症ストレス中にＴｅｔ２−ＫＯにおいてより高いスケールで観察された。機能的には、競合的移植アッセイにより、さらに、ＬＰＳストレス付加Ｔｅｔ２欠損骨髄細胞が長期生着において野生型ドナー対照に対し再増殖の優位性を維持することが確認された。最後に、Ｔｅｔ２−ＫＯマウスは、ナイーブ状態において、またはＬＰＳストレス中に、高いＴＬＲ４／ＮＦκＢシグナル伝達を維持した。
【００２４】
前述に基づき、本開示の一実施形態では、それらを必要とする対象において骨髄性悪性腫瘍の進行を遅延させる方法が提供される。本明細書において使用される場合、「進行（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ）を遅延させる」または「進行（ｐｒｏｇｒｅｓｓ）を遅延させる」とは、５−（２，３−ジメトキシ−６−メチル１，４−ベンゾキノイル）］−２−ノニル−２−プロペン酸（ＡＰＸ３３３０））またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を投与しなかった患者と比較して、悪性腫瘍の発症を遅らせ、悪性腫瘍の増大およびステージを防止もしくは遅延させること、ならびに／または悪性腫瘍の合併症を低減することを指す。一実施形態では、骨髄性悪性腫瘍は急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。別の実施形態では、骨髄性悪性腫瘍は骨髄増殖性新生物（ＭＰＮ）である。さらに別の実施形態では、骨髄性悪性腫瘍は骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）である。
【００２５】
別の実施形態では、本開示は、それらを必要とする対象において、前白血病幹細胞生成を阻害する方法を提供する。また別の実施形態では、本開示は、それらを必要とする対象において、ｔｅｔメチルシトシンジオキシゲナーゼ２（ＴＥＴ２）を欠失する炎症性サイトカインの産生を阻害する方法を提供する。
【００２６】
別の実施形態では、本開示は、造血幹細胞に少なくとも１つの変異を有する対象において炎症を抑制する方法を提供する。一般に、炎症は、本明細書に記載した方法を使用して統計的に減少する。
【００２７】
一般に、本開示の方法において、有効量の５−（２，３−ジメトキシ−６−メチル１，４−ベンゾキノイル）］−２−ノニル−２−プロペン酸（ＡＰＸ３３３０））またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物が、それらを必要とする対象に投与される。ＡＰＸ３３３０がＴｅｔ２欠損マウスにおける拡張型炎症表現型を部分的に逆転したことが本明細書で見出された。より詳しくは、以下の実施例において示すように、ＡＰＸ３３３０は、ＬＰＳ誘発性緊急時顆粒球形成およびＬＳＫ増大を効果的に抑制した。より重要なことには、ＡＰＸ３３３０は、老齢ナイーブＴｅｔ２ＫＯマウスにおいて白血球（ＷＢＣ）および赤血球（ＲＢＣ）の計数を変化させることを示し、このことは実際、前白血病マウスに炎症処置効果を付与したことを示唆している。
【００２８】
３−［（５−（２，３−ジメトキシ−６−メチル１，４−ベンゾキノイル）］−２−ノニル−２−プロペン酸（これ以降、「Ｅ３３３０」または「３３３０」または「ＡＰＸ３３３０」という）は、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１のレドックス機能を選択的に阻害する。脱プリン／脱ピリミジンエンドヌクレアーゼ１レドックス因子１（ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１）は、発がん性転写因子の活性化に不可欠であることが近年見出された多機能タンパク質である。ＡＰＸ３３３０に関するさらなる詳しい情報は、本明細書と一致する範囲で参照により本明細書に組み込まれる、Ａｂｅら、米国特許第５，２１０，２３９号で見出すことができる。
【００２９】
【化２】
2020504164.tif 000004
−（５−（２，３−ジメトキシ−６−メチル１，４−ベンゾキノイル）］−２−ノニル−２−プロペン酸（ＡＰＸ３３３０））
【００３０】
対象の適用が特にヒトにおいて考えられる場合、目的の適用にとって適切な形態でＡＰＸ３３３０を含む医薬組成物を調製することが必要である。一般に、これは、対象に有害となり得る不純物を本質的に含まない組成物を調製することを要する。
【００３１】
化合物（すなわちＡＰＸ３３３０）および組成物は、対象の体重および疾患の進行の程度に基づいた用量で、経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、胸膜内投与または腹腔内投与することができ、１日に１回、２回、３回またはさらに４回投与することができる。例えば、いくつかの実施形態では、ＡＰＸ３３３０は、約１５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇを含み、約２５ｍｇ／ｋｇを含む、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約７５ｍｇ／ｋｇの範囲の量で投与される。
【００３２】
一般に、化合物が安定しているようにし、かつ標的細胞によって取り込まれるようにするために、適切な塩および緩衝液を使用することが望ましい。本開示の水性組成物は、薬学的に許容される担体または水性媒体に溶解または分散される有効量の化合物を含む。またそのような組成物は、無毒性であるとも呼ばれる。薬学的にまたは薬理学的に許容されるという句は、対象に投与された場合に有害反応、アレルギー反応、または他の好ましくない反応を生じることのない、分子実体および組成物を意味する。本明細書で使用される場合、薬学的に許容される担体は、任意の全ての溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。薬学的に活性な物質に対するそのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野において周知である。また補充の活性成分も組成物に組み入れることができる。
【００３３】
本開示で使用するための組成物は、古典的な医薬調製物を含んでいてもよい。本開示によるこれらの組成物の投与は、標的組織がその経路を介して利用可能である限り、任意の一般的経路を介してである。これには、経口、経鼻、口腔内、直腸内、膣内または局所投与が含まれる。あるいは、投与は、同所性注射、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射または静脈内注射によってでもよい。そのような組成物は、通常、本明細書に記載のように薬学的に許容される組成物として投与され得る。
【００３４】
例えば、本化合物は、一般的な賦形剤、希釈剤または担体を用いて製剤化し、錠剤、カプセル剤、懸濁剤、散剤などに剤形化することができる。そのような製剤に適した賦形剤、希釈剤、および担体の例としては、以下のものが挙げられる：充填剤および増量剤、例えばデンプン、糖、マンニトール、およびケイ酸誘導体；結合剤、例えばカルボキシメチルセルロースおよび他のセルロース誘導体、アルギン酸塩、ゼラチン、およびポリビニルピロリドン；保湿剤、例えばグリセロール；崩壊剤、例えば炭酸カルシウムおよび炭酸水素ナトリウム；溶解遅延剤、例えばパラフィン；吸収促進剤、例えば四級アンモニウム化合物；界面活性剤、例えばセチルアルコール、モノステアリン酸グリセロール；吸着性担体、例えばカオリンおよびベントナイト；ならびに滑沢剤、例えばタルク、カルシウムおよびステアリン酸マグネシウム、ならびに固体ポリエチルグリコール。
【００３５】
またＡＰＸ３３３０は、非経口的に、または腹腔内に投与することができる。遊離塩基または薬理学的に許容される塩としての活性化合物の溶液は、界面活性剤、例えばヒドロキシプロピルセルロースなどと適切に混合された水中で調製することができる。また分散液も、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中で、ならびに油中で調製することができる。通常の保存および使用の条件下では、これらの調製物は保存料を含んで、微生物の増殖を防止する。
【００３６】
注射による使用に適した医薬形態には、滅菌水溶液または分散液、および滅菌注射溶液または分散液の即時調製用の滅菌粉末が含まれる。いくつかの特に適切な実施形態では、その形態は滅菌されており、容易に注射ができる程度に流動性である。それは製造および貯蔵の条件下で安定的であり得、微生物、例えば細菌および真菌の汚染作用に対して保護することができる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、および植物油を含む、溶媒または分散媒体であってもよい。適切な流動性は、例えば、コーティング剤、例えばレシチンを使用することにより、分散液の場合には必要とされる粒径を維持することにより、また界面活性剤を使用することにより維持することができる。微生物の作用の防止は、各種抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによりもたらすことができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の持続性吸収は、組成物中に、吸収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを使用することによってもたらすことができる。
【００３７】
滅菌注射溶液は、必要量の活性化合物を適切な溶媒中に、必要に応じて上記で挙げた他の各種成分と共に包含させ、続いて濾過滅菌することにより調製される。一般に、分散液は、様々な滅菌活性成分を、基本分散媒および上記で挙げたものから必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に包含させることによって調製される。滅菌注射溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は真空乾燥および凍結乾燥技術であり、予め滅菌濾過したそれらの溶液から、活性成分プラス任意のさらなる所望の成分の粉末が得られる。
【００３８】
口腔投与については、本開示の化合物を賦形剤と混合し、摂取不可の洗口剤および歯磨剤の形態で使用することができる。洗口剤は、適切な溶媒、例えばホウ酸ナトリウム溶液（Ｄｏｂｅｌｌ’ｓ溶液）中に必要量の活性成分を混合して調製することができる。あるいは、活性成分は、ホウ酸ナトリウム、グリセリンおよび重炭酸カリウムを含有する殺菌洗浄剤に混合することができる。また活性成分は、ゲル、ペースト、粉末およびスラリーを含む歯磨剤中に分散させることもできる。活性成分は、水、結合剤、研磨剤、香味剤、発泡剤、および湿潤剤を含んでいてもよいペースト状歯磨剤に、治療有効量で加えることができる。
【００３９】
本開示における使用のための組成物は、中性または塩の形態で製剤化することができる。薬学的に許容される塩は、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基と形成される）を含み、それらは無機酸、例えば塩酸もしくはリン酸、または有機酸、例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などと形成される。また遊離カルボキシル基と形成される塩は、無機塩基、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化第二鉄、および有機塩基、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどからも誘導することができる。
【００４０】
製剤化の際、溶液は、投与製剤に適合する方法で、また治療上有効であるような量で投与される。製剤は、様々な剤形で、例えば注射用液剤、薬物放出カプセル剤などで容易に投与される。例えば、水溶液での非経口投与については、溶液は必要であれば適切に緩衝化すべきであり、液体希釈剤は最初に十分な食塩水またはグルコースで等張化される。これらの特定の水溶液は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与および腹腔内投与に特に適している。これに関連して、使用可能な滅菌水性媒体は、本開示を照らし合わせれば当業者には公知であろう。例えば、１回投与量を１ｍｌの等張ＮａＣｌ溶液に溶解し、１０００ｍｌの皮下注入液に加えるか、または提示の注入部位に注射することができる（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」第１５版、１０３５〜１０３８頁および１５７０〜１５８０頁を参照されたい）。投与量におけるいくらかの変動は、処置される対象の状態に応じて必然的に起こる。いずれにしても、投与責任者が、個別の対象にとって適切な用量を決定する。さらに、ヒトへの投与については、調製物は、ＦＤＡおよび外国の相当機関によって要求されているように、無菌性、一般的安全性、および純度の基準を満たすべきである。
【００４１】
本明細書中に記載されている方法は、１つ以上の抗白血病化学療法剤、または１つ以上の抗白血病酵素阻害剤、またはそれらとＡＰＸ３３３０との組み合わせを投与するステップをさらに含み得る。例えば、デキサメタゾン、ビンクリスチン、ドキソルビシン、およびメトトレキサートからなる群から選択される１つ以上の抗白血病化学療法剤をＡＰＸ３３３０と共に投与することができる。本開示の他の実施形態では、本方法は、ＡＰＸ３３３０と共に抗炎症剤、例えば抗ＩＬ６抗体および／またはＮＦκＢ阻害剤などの抗炎症剤を投与するステップをさらに含み得る。
【００４２】
本明細書に記載されている方法は、１つ以上の追加の治療剤を投与するステップをさらに含み得る。例示の追加の治療剤としては、シグナル伝達兼転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）の阻害剤（例えば、６−（４−アミノ−４−メチル−１−ピペリジニル）−３−（２，３−ジクロロフェニル）−２−ピラジンアミン（ＳＨＰ０９９）；２−ヒドロキシ−４−（（（４−メチルフェニル）スルホニルオキシ）アセチル）アミノ）−安息香酸／Ｓ３Ｉ−２０１、６−ニトロベンゾ［ｂ］チオフェン−１，１−ジオキシド／ｓｔａｔｔｉｃ、ＯＣＨＲＯＭＹＣＩＮＯＮＥ、４−（Ｎ−（４−シクロヘキシルベンジル）−２−（２，３，４，５，６−ペンタフルオロ−Ｎ−メチルフェニルスルホンアミド）アセトアミド）−２−ヒドロキシ安息香酸；ナパブカシン）が挙げられる。特定の一実施形態では、本方法は、ＡＰＸ３３３０をＳＨＰ０９９と共に投与するステップを含む。
【００４３】
以下の実施例および方法は、本発明の特定の実施形態をさらに説明する。しかし、以下の例示的な実施例は、決して本発明を限定するように解釈されないものとする。
【実施例】
【００４４】
実施例１
本実施例においては、ＴＥＴ２−ＫＯマウスが急性炎症にどのように応答するのかを試験することによって、ＴＥＴ２欠損ＨＳＰＣが生理学的ストレス中に白血病促進優位性を維持するか否かを分析した。
【００４５】
材料および方法
マウス、ＬＰＳ処置および末梢血分析。全てのマウスは、インディアナ大学医学部の動物施設で、特定の無病原体（ＳＰＦ）条件下で飼育し維持した。マウスによる実験は、インディアナ大学医学部のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）により承認された。Ｔｅｔ２ノックアウトマウス（Ｔｅｔ２−／−、またはＴｅｔ２−ＫＯ、ＣＤ４５．２）は、Ｃ５７ＢＬ／６遺伝的背景にあり、Ｌｉら、Ｂｌｏｏｄ  １１８、４５０９〜４５１８（２０１１）で既に記載されている。正常Ｃ５７ＢＬ／６（野生型、ＣＤ４５．２）マウスはＴｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入し、全ての実験の対照として使用した。出来る限り同腹仔を全ての実験の対照として使用した。
【００４６】
リポ多糖類（ＬＰＳ）をＳｉｇｍａ（カタログ番号Ｌ８６４３）から購入し、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解した後、マウスに１回用量のみ（０．８ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）投与した。溶液ストックを作製するため、ＡＰＸ３３３０（本明細書ではＥ３３３０ともいう）をＣｒｅｍｏｐｈｏｒ：ＥｔＯＨ（１：１）（ＣｒｅｍｏｐｈｏｒはＳｉｇｍａから購入、カタログ番号Ｃ５１３５）に溶解し、次いでＰＢＳで希釈した後、ＬＰＳ処置前またはＬＰＳ処置後に使用した（２０ｍｇ／ｋｇ、１日２回、ｉ．ｐ．）。ＳＨＰ０９９（Ｎｏｒｖａｒｔｉｓにより提供）は、０．５％メチルセルロース（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｍ０２６２）および０．１％Ｔｗｅｅｎ−８０（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＢＰ３３８−５００）に溶解し、胃管栄養によって動物に供給した（毎日、５０ｍｇ／ｋｇ）。ＬＰＳまたはＬＰＳプラスＡＰＸ３３３０の実験に、３〜４週齢（若齢マウス）または８〜１６週齢（成体マウス）の間のオスおよびメスのマウスを使用した。齢および性別が一致したマウスを、常にナイーブ（０日目）対照として使用した。図１１Ａ〜図１１ＤのＡＰＸ３３３０またはＳＨＰ０９９の処置には、老齢Ｔｅｔ２−ＫＯマウス（オスまたはメス、６〜８月齢）を使用した。
【００４７】
末梢血（ＰＢ、尾部血液由来）の血液学的分析は、自動細胞計数装置（Ｄｒｅｗ  Ｈｅｍａｖｅｔ  ９５０）により実施した。全骨髄（ＢＭ）細胞をマウス２匹の大腿骨および２匹の脛骨から採取し、５０μｍの滅菌フィルターで濾過した。ＢＭ細胞は常に氷上または冷蔵で維持し、分析前に２％ラット血清を含有する滅菌ブロッキング緩衝液に保存した。ＢＭ細胞充実性（生細胞数）は、自動細胞計数装置（Ｂｅｃｋｍａｎ、細胞生存率アナライザー用のＶｉ−ＣＥＬＬ（商標）細胞計数装置）によって分析した。
【００４８】
フローサイトメトリー。溶解していないＢＭ細胞を、赤血球系列および前駆細胞の分析に使用した（Ｔｅｒ１１９およびＣＤ７１染色）。残りのフローサイトメトリー分析は、溶解した骨髄細胞（Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ、ＢＤ、カタログ番号５５５８９９）において実施した。Ｔｅｒ１１９、Ｍａｃ１、Ｇｒ１、Ｂ２２０、ＣＤ３、ＣＤ４およびＣＤ８に対する抗体を、成熟細胞標識に使用した（系列標識）。前駆細胞を標識し、示したマーカーによって分析した。抗体標識ＢＭ細胞を、２つのレーザーおよび６つのフィルター構成のＢＤ  ＦＡＣＳ−ＣＡＮＴＯ  ＩＩ装置において実施した。適切に補正したフローデータを、Ｆｌｏｗ  Ｊｏソフトウェア（Ｖ１０．２）によって分析した。事象プロット、頻度および蛍光強度の平均（ＭＦＩ）の計算、ならびにヒストグラムオーバーレイは、Ｆｌｏｗ  Ｊｏソフトウェアにより分析した。染色スキーム、ゲーティング戦略および抗体の完全リストを、表１に示す。
【００４９】
表１：
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【００５０】
β−アクチンの発現は、フォワードプライマー、５’−ＧＡＣＧＧＣＣＡＧＧＴＣＡＴＣＡＣＴＡＴＴＧ−３’（配列番号４９）およびリバースプライマー、５’−ＡＧＧＡＡＧＧＣＴＧＧＡＡＡＡＧＡＧＣＣ−３’（配列番号５０）を用いて内部標準として使用した。
【００５１】
アネキシン−Ｖおよび７−ＡＡＤキット（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号６４０９２２）による染色は、アポトーシス分析用のメーカーの説明書に従って、ＬＳＫ細胞の標識と共に実施した。細胞内フローサイトメトリー（ＩＦＣ）については、ＢＭ細胞を提示した細胞表面マーカーで予め染色し、次いで、ＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（商標）キット（ＢＤ、カタログ番号５５４７１４）により固定した（メーカーの指示書に従って固定および洗浄を実施した）後、Ｋｉ−６７もしくはγＨ２ＡＸの抗体により染色する（細胞をこれらの２つのマーカーにより一晩染色する）か、またはサイトカインの抗体により染色した（ＩＬ−６、ＴＮＦα、ＩＬ−１βまたはＧＭ−ＣＳＦ；細胞はこれらのサイトカインマーカーにより３０分間染色した）。細胞内染色後に、細胞をＣｙｔｏｐｅｒｍ／洗浄緩衝液で３回洗浄し、その後フローサイトメトリーによって分析した。
【００５２】
多重サイトカインアッセイ。血清試料をＰＢ（尾採血）から調製し、滅菌ＰＢＳで希釈した（１〜２倍希釈）。３１個のサイトカインまたはケモカインを、ＢｉｏＰｌｅｘ  ２００の装置（Ｅｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍｏｕｓｅ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ａｒｒａｙ／Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  Ａｒｒａｙ  ３１−Ｐｌｅｘ、カタログ番号ＭＤ３１）を用いる多重免疫アッセイによって定量した。
【００５３】
Ｌｉｎ陰性ＢＭ細胞、ＬＳＫ細胞の単離、およびｑＲＴ−ＰＣＲアッセイ。Ｌｉｎ陰性ＢＭ細胞（約１×１０６個）を、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）マウス造血前駆細胞単離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ、カタログ番号１９８５６）によって、メーカーの指示書に従い精製した。ＬＳＫ細胞は、ｃ−ＫｉｔおよびＳｃａ−１に対する抗体で細胞を染色し、続いてそれらを選別する（蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）（ＢＤ  ＦＡＣＳＡＲＩＡ））ことによって、Ｌｉｎ陰性ＢＭ細胞から精製した。全ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  キット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号７４１０４）によってメーカーの指示書に従い、Ｌｉｎ陰性細胞から抽出した。単離したＲＮＡを分光光度法によって定量し、ＲＮＡ濃度を正規化した。ｃＤＮＡをＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１８０６４０１４）によって合成した。得られたｃＤＮＡを、ＶｉｉＡ７  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ装置上で提示したプライマーを用いて、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  マスターミックス（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号４３８５６１２）により分析した。β−アクチンの発現は、示した遺伝子の倍数変化を計算するため、内部標準（フォワード、５’−ＧＡＣＧＧＣＣＡＧＧＴＣＡＴＣＡＣＴＡＴＴＧ−３’（配列番号４９）およびリバース、５’−ＡＧＧＡＡＧＧＣＴＧＧＡＡＡＡＧＡＧＣＣ−３’（配列番号５０））として使用した。ｑＲＴ−ＰＣＲプライマーの完全リストを、表２に示す。
【００５４】
表２：フローサイトメトリー抗体
【表４】
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【表５】
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【００５５】
ＣＦＵアッセイ。骨髄Ｌｉｎ陰性細胞またはＬＳＫ細胞を上記のように単離し、ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ（商標）ＧＦ  Ｍ３４３４（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ）を使用したＣＦＵアッセイにおいてプレーティングした。コロニーを７日間培養した後に数えた。
【００５６】
ＣＨＩＰ−ｑＰＣＲアッセイ。ＢＭ  Ｌｉｎ陰性細胞を使用して、メーカーの指示に従い、ＭＡＧｎｉｆｙ（商標）クロマチン免疫沈降システム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いてクロマチンＤＮＡを抽出した。ＣＨＩＰ精製クロマチンＤＮＡおよびインプットＤＮＡは、ｑＰＣＲ検証および富化分析を行うため同一濃度に正規化した（１％富化のインプットレベルをユニット１と定義した）。以下の抗体をクロマチン沈殿に使用した：抗ＩκＢζおよび抗Ｓｔａｔ３（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。ＣＨＩＰ−ｑＰＣＲ分析用のプライマーは、表３に挙げている。
【００５７】
表３：図４および図９で使用したＣＨＩＰ−ｑＰＣＲプライマー
【表６】
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【００５８】
競合的骨髄移植（ｃＢＭＴ）。Ｂ６．ＳＪＬ−Ｐｔｐｒｃａ  Ｐｅｐｃｂ／Ｂｏｙ（ＢｏｙＪ、ＣＤ４５．１）を、Ｊａｃｋｓｏｎ研究所から購入した。レシピエント動物（Ｆ１、ＣＤ４５．２／ＣＤ４５．１）は、Ｃ５７ＢＬ／６（ＣＤ４５．２）をＢｏｙＪ（ＣＤ４５．１）と交配することによって得た。初代ｃＢＭＴについては、ナイーブマウスまたはＬＰＳ処置マウス由来のＣＤ４５．２ドナーＢＭ細胞を、ＢｏｙＪ  ＣＤ４５．１競合ＢＭドナー細胞（同数の生存可能な全細胞、５００Ｋ：５００Ｋ）と等しく混合した後、致死的照射を受けたＦ１  ＣＤ４５．２／ＣＤ４５．１レシピエント（７００ｃＧｙ  プラス４００ｃＧｙ）に対する静脈内（ｉ．ｖ．）尾注射を行った。二次ｃＢＭＴについては、初代ｃＢＭＴレシピエント由来のドナーＢＭ細胞を、ＢｏｙＪ  ＣＤ４５．１競合ＢＭ細胞（同数の生存全細胞）と混合した後、致死的照射を受けたＦ１  ＣＤ４５．２／ＣＤ４５．１レシピエント（７００ｃＧｙ  プラス４００ｃＧｙ）に対する静脈内（ｉ．ｖ．）尾注射を行った。ＬＳＫ細胞生着については、ＬＰＳ処置マウスまたは対照マウス由来の２０００個のＬＳＫ細胞を５００，０００（２Ｋ：５００Ｋ）のＢｏｙＪ  ＣＤ４５．１支持細胞と混合し、上記のようにＦ１マウスに注射した。プログレッシブ生着についてのキメラ現象分析は、ＢＭ移植後、毎月（４週間ごとの間隔で）ＰＢ試料に対して実施した。エンドポイントキメラ現象分析は、レシピエント由来のＢＭ細胞の各種画分に基づいた。
【００５９】
統計。実験的変動性を観察するため、Ｔｅｔ２−ＫＯ試料に対する全ての実験手順を、野生型対照（可能である場合には、性別および齢を一致させた同腹仔対照）と並行して実施した。群分けしたデータの分析は盲検ではなく、試料は除外されなかった。老齢Ｔｅｔ２−ＫＯマウスを、ＡＰＸ３３３０またはビヒクル、ＳＨＰ０９９またはビヒクルによる処置のため、無作為に２群に分けた（図１１Ａ〜図１１Ｄ）。２群の平均を比較するため、独立ｔ検定を使用してＰ値を計算した（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６．０）。図１〜図１０および図１１Ａのエラーバーは平均の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）を示し、一方、図１１Ｃのエラーバーは標準偏差（ｓ．ｄ．）を示す。二次ｃＢＭＴが各群に対して１回の独立した実験のみを実施したことを除き、他の全てのアッセイは、少なくとも合計３〜５回の生物学的複製を用いて少なくとも２回の独立実験で実施した。
【００６０】
結果
急性炎症（ＬＰＳ）チャレンジに応答したＴＥＴ２−ＫＯマウスにおける急速かつ長期の顆粒球形成。
【００６１】
前の研究と一致して、造血を含む発達上の欠陥は、ナイーブＴＥＴ２−ＫＯマウスにおいては、野生型と比較して、フローサイトメトリー分析により、または２〜３月齢の血液学的パラメータに関する血球計数により観察されなかった。Ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）／ＮＦκＢシグナル伝達の刺激により機能するリガンドのリポ多糖（ＬＰＳ）は、マウスにおいて急性炎症を誘発するための有効な化学薬剤として広く使用されている。Ｔｅｔ２欠損白血病前幹細胞、前駆細胞および成熟細胞が急性炎症に応答するか否かを試験するため、ＬＰＳをＴｅｔ２−ＫＯマウスおよびそれらの野生型相当マウスに注射し、これらのマウスを７日間追跡して、末梢血（ＰＢ）血液学的パラメータにおける変化を評価した。２日目（ＬＰＳ処置の４８時間後）に、Ｔｅｔ２−ＫＯにおいて、白血球細胞（ＷＢＣ）の有意に急速にかつ増大された回復が観察されたが、これは、好中球（ＮＥ）の絶対数ならびにパーセンテージの増加に最も起因すると考えられる（図１Ａ〜１Ｃ）。急性炎症への応答における野生型とＴＥＴ２−ＫＯとの違いは、ＷＢＣ中のＮＥのパーセンテージをＬＰＳ処置後２日目から４日目に試験した場合に、より顕著になる（図１Ｃ）。Ｔｅｔ２−ＫＯマウスにおける好中球パーセンテージの増加は、実施例の追跡期間中全体にわたって持続し、対照と比較して、ＬＰＳ処置したＴｅｔ２−ＫＯマウスにおける長期の「緊急時顆粒球形成」を証明した。単球（ＭＯ）ではない、好酸球（ＥＯ）および好塩基球（ＢＡ）の細胞数は、ＬＰＳ処置後２日目にＴＥＴ２−ＫＯにおいて上昇した（図１Ｄ〜図１Ｆ）。リンパ球（ＬＹ）、血小板（ＰＬ）および赤血球（ＲＢＣ）の細胞数は、野生型およびＴＥＴ２−ＫＯにおいて類似のパターンで有意差はなく変化し、一方、Ｔｅｔ２−ＫＯマウスにおけるリンパ球のパーセンテージは、ＬＰＳチャレンジ後２日目の対照と比較して有意に減少した（図１Ｇ〜図１Ｋ）。さらに、試験した全ての時点での対照と比較して、脾臓重量の有意な増加もＴｅｔ２−ＫＯマウスにおいて観察された（図１Ｌ〜図１Ｎ）。骨髄および脾臓の病理における総体的な変化はＬＰＳ処置後には認められなかったが、骨髄成熟細胞（Ｍａｃ１＋）の頻度は、対照と比較して、Ｔｅｔ２−ＫＯマウスにおいて増加した（図１Ｏおよび図１Ｐ）。まとめると、これらのデータは、Ｔｅｔ２−ＫＯマウスが急性炎症チャレンジに応答して増幅型および持続型の「緊急時顆粒球形成」を示すことを示唆している。
【００６２】
急性炎症チャレンジは、Ｔｅｔ２−ＫＯマウスにおいて骨髄前駆細胞および造血幹細胞の数の増加をもたらす。
【００６３】
感染は急性炎症を誘発し、病理学的保証に適応するように造血幹細胞（ＨＳＣ）および前駆細胞（ＨＰＣ）の両レベルで造血を活性化する。定常状態造血（ナイーブ、非感染）とは対照的に、骨髄における感染誘発造血は「緊急造血」として認識されている。ＬＰＳチャレンジ後、ＬＳＫ区画およびＨＳＣ区画（ＬＳＫ／ＣＤ４８−／ＣＤ１５０＋）を、一般的な骨髄前駆体（ＣＭＰ、Ｌｉｎ−／Ｓｃａ−１−／ｃＫｉｔ＋／ＣＤ１６−／ＣＤ３４＋）、一般的なリンパ球前駆体（ＣＬＰ、Ｌｉｎ−／Ｓｃａ−１ｄｉｍ／ｃ−Ｋｉｔｄｉｍ／ＣＤ１２７＋／ＣＤ３４−）、顆粒球−マクロファージ前駆体（ＧＭＰ、Ｌｉｎ−／Ｓｃａ−１−／ｃＫｉｔ＋／ＣＤ１６＋／ＣＤ３４＋）、巨核球−赤血球前駆体（ＭＥＰ、Ｌｉｎ−／Ｓｃａ−１−／ｃ−Ｋｉｔ＋／ＣＤ１６−／ＣＤ３４−）を含む様々な前駆細胞区画に加えて、フローサイトメトリーによって骨髄において分析した（図２Ａに示したゲーティング戦略）。全体的な骨髄細胞性の類似の低下が、ＬＰＳチャレンジ後の野生型（ＷＴ）マウスおよびＴｅｔ２−ＫＯマウスの両方において観察された（図２Ｂ）。ＬＰＳチャレンジに対する応答における野生型とＴｅｔ２変異体との間の全体的な骨髄細胞性の差の欠失とは対照的に、ＬＰＳ誘発急性炎症は、対照と比較して、１日目のＴｅｔ２−ＫＯマウスのＢＭにおける様々な前駆体の回復において有意差をもたらした（図２Ａに示した代表的フローサイトメトリープロット）。定量的には、Ｔｅｔ２−ＫＯマウスのＬＰＳチャレンジは、対照に対する頻度ならびに絶対数の両方に関して、ＣＭＰ、ＧＭＰおよびＣＬＰの回復の向上をもたらしたが、ＭＥＰの回復は向上しなかった（図２Ａ、図２Ｃ〜図２Ｅ、および図３Ａ）。この向上は、ＧＭＰ区画においてより顕著であった（図２Ｄ）。ＬＰＳ処置後、ＬＳＫの富化およびＨＳＣ頻度およびＢＭの数の有意な増加が、ＬＰＳ処置後１日目および２日目に、対照と比較してＴｅｔ２−ＫＯマウスにおいても観察された（図２Ａ、図２Ｆおよび図２Ｇ）。同様に、Ｔｅｔ２−ＫＯマウスは、ＬＰＳチャレンジの初期段階中、より高い計数の多能性前駆体（ＭＰＰ、ＬＳＫ／ＣＤ４８＋／ＣＤ１５０−により定義される）または短期ＨＳＣ（ＬＳＫ／ＣＤ４８＋／ＣＤ１５０＋により定義される）を示した（図３Ｂおよび図３Ｃ）。成体（１２〜１６週齢）のＴｅｔ２−ＫＯマウスは、対照と比較して、ＣＭＰ、ＬＳＫおよびＨＳＣの基礎（０日目、ＬＰＳチャレンジ前）レベルの上昇を示すので、野生型と類似のＣＭＰ、ＬＳＫおよびＨＳＣ頻度および計数を示すより若齢のＴｅｔ２−ＫＯマウスが、より老齢のＴｅｔ２−ＫＯマウスに類似の方法でＬＰＳチャレンジに応答するか否かを評価した。図２Ｊに示したように、若齢Ｔｅｔ２−ＫＯマウスはまた、対照と比較した場合、ＣＭＰ、ＬＳＫおよびＨＳＣを含む試験した全ての骨髄前駆体サブセットにおいて、ＬＰＳチャレンジに対する応答の増大を示す。ＬＰＳ処置後の日々の変化を試験した場合、Ｓｃａ−１＋の増大は見られたがｃ−Ｋｉｔ＋では見られず、系列陰性画分（Ｌｉｎ陰性またはＬｉｎ−）内の造血前駆体が、０日目と比較して１日目と３日目の間の野生型マウスおよびＴｅｔ２−ＫＯマウスの両方の骨髄において観察された（図２Ａ、図２Ｈおよび図３Ｄ）。フローサイトメトリーを使用する平均蛍光強度（ＭＦＩ）によってＳｃａ−１およびｃ−Ｋｉｔの発現を評価することにより、Ｓｃａ−１発現の増大が、野生型と比較して、Ｔｅｔ２−ＫＯマウスにおいて０日目から３日目までの全ての時点で一貫して観察された（図２Ｉ）。まとめると、これらのデータは、Ｔｅｔ２の欠損が緊急造血（ＨＳＰＣの活性化または回復およびそれらの成熟骨髄細胞への分化）を起こすより高い能力をもたらすことを示唆している。
【００６４】
Ｔｅｔ２を欠損した造血幹細胞・前駆細胞は、急性炎症に応答して細胞生存率、増殖の増加およびＤＮＡ損傷の増大を示した。
【００６５】
ＬＰＳチャレンジの際にＴｅｔ２の非存在下でＨＳＰＣの計数の増大（活性化または回復）が観察されたので、Ｔｅｔ２欠損ＨＳＰＣが、炎症チャレンジの際に、生存、成長およびＤＮＡ損傷に対して異なって応答をしたかどうかを判定した。ＨＳＰＣにおけるアポトーシスを、アネキシンＶプラス７−ＡＡＤ染色およびフローサイトメトリーによって試験した（図５Ａおよび図５Ｂ）。これらの細胞における増殖は、Ｋｉ６７＋細胞のパーセンテージを評価することによって判定した（細胞内染色およびフローサイトメトリー、ＩＦＣ）（図５Ｃおよび図５Ｄ）。ＬＰＳによって誘発される緊急造血中、Ｔｅｔ２欠損造血前駆細胞は、Ｌｉｎ陰性プールならびにＬｓｋプールの両方において、野生型対照と比較して、より低レベルのアポトーシス（アネキシンＶ＋／７−ＡＡＤ＋細胞のパーセンテージによって定義される）を維持した（図４Ａ、図５Ａおよび図５Ｂ）。骨髄のＬｉｎ陰性画分の循環細胞のパーセンテージに差は認められなかったが、ＬＳＫプール中のＫｉ６７＋細胞のパーセンテージは、ＬＰＳチャレンジ後２日目の野生型対照と比較してＴｅｔ２−ＫＯマウスにおいて有意に高かった（図４Ｂ、図５Ｃおよび図５Ｄ）。
【００６６】
近年の研究は、ＨＳＣのその休止状態からの活性化が、炎症またはストレスの条件下でＤＮＡ損傷を誘発し得ることを示唆している。Ｔｅｔ２欠損骨髄細胞がＬＰＳ刺激の際にＤＮＡ損傷に対してより感受性であるか否かを評価するため、ＤＮＡ損傷応答を、これらの細胞において、細胞内染色およびフローサイトメトリーを介してヒストンＨ２Ａ．Ｘリン酸化（γＨ２ＡＸ、ＤＮＡ損傷に関する感受性マーカー）を検出することによって分析した。緊急造血の初期段階のＨＳＰＣにおいて、γＨ２ＡＸ細胞のより高発現およびより高頻度のγＨ２ＡＸ＋細胞が観察された（図４Ｃ、図４Ｄおよび図５Ｅ）。細胞生存、増殖およびＤＮＡ損傷の増大に関する表現型の観察は、アポトーシス促進遺伝子（Ｃａｓｐ１、カスパーゼ１をコードしている、およびＢｃｌ２ｌ１１、Ｂｉｍをコードしており、Ｔｅｔ２欠損細胞において発現の低下を示す）、生存促進遺伝子（Ｂｃｌ２およびＭｏｒｒｂｉｄ、Ｔｅｔ２欠損細胞において発現の増加を示す；Ｍｏｒｒｂｉｄは、好中球を含む骨髄細胞の生存を特異的に促進する、長い非コードＲＮＡをコードする最近同定された遺伝子である）、細胞周期遺伝子（Ｃｃｎｅｌ、ＣｙｃｌｉｎＥ１をコードしており、Ｔｅｔ２欠損細胞において発現が増加していることを示す）、ＤＮＡ損傷応答遺伝子（５３ｂｐ１およびＲａｄ５１、Ｔｅｔ２欠損細胞において発現の増加を示す）、ならびにＤＮＡ修復経路の成分をコードする遺伝子（Ｆａｎｃａ、Ｆａｎｃｄ２、Ｘｒｃｃ５およびＡｔｍ、Ｔｅｔ２欠損細胞において発現の低下を示す）の発現における変化により支持された（図４Ｅ〜図４Ｊ）。Ｃｃｎｄ１（ＣｙｃｌｉｎＤ１をコードしている）、Ｃｄｋｎ１ｂ（細胞周期阻害剤ｐ２７をコードしている）およびＣｄｋｎ１ｃ（細胞周期阻害剤ｐ５７をコードしている）の発現は、この期間中、野生型細胞とＴｅｔ２欠損細胞との間で類似していた（図４Ｇおよびデータを示さず）。
【００６７】
骨髄細胞生存の調節におけるＭｏｒｂｂｉｄの新規な抗アポトーシスの役割と関係する最近の知見と合わせて、細胞アポトーシス関連遺伝子の発現が野生型細胞とＴｅｔ２−ＫＯ細胞との間で著しく異なっていたので、Ｍｏｒｂｂｉｄの発現は、Ｓｔａｔ３などの必須炎症調節因子によって直接調節されるようだと仮定される。Ｓｔａｔ３の活性化は、対照と比較して、ナイーブＴｅｔ２−ＫＯ  ＨＳＰＣにおいてアップレギュレートされる（図９Ｆ）。さらに、ＣＨＩＰ−ｑＰＣＲ分析によれば、対照と比較して、Ｔｅｔ２−ＫＯ  ＨＳＰＣにおいて、ＭｏｒｂｉｄプロモーターへのＳｔａｔ３の結合に有意な富化が明らかになった（図１２）。まとめると、これらのデータは、Ｔｅｔ２枯渇ＨＳＰＣがより高い生存率およびより高い増殖率を示し、また急性炎症チャレンジの際にＤＮＡ損傷の増加を有する可能性があることを示唆している。さらに、Ｔｅｔ２−ＫＯ  ＨＳＰＣの生存の増大は、Ｓｔａｔ３を介してＭｏｒｂｂｉｄのアップレギュレーションが増大され持続されることによると思われる。
【００６８】
正常対Ｔｅｔ２欠損の造血幹細胞の機能に対する急性炎症の差次的な影響。
【００６９】
最近の研究は、ＬＰＳチャレンジまたは細菌感染がＨＳＣ／ＬＳＫ集団を増大するだけでなく、ＨＳＣを枯渇させるかまたはそれらの自己再生能力を減じる潜在性があることを示した。また、ＬＰＳチャレンジしたＴｅｔ２欠損ＨＳＰＣが炎症性ストレスへの曝露後に幹細胞活性の低下を示すか否かについても分析した。これを評価するため、競合的再増殖アッセイを、骨髄生存全細胞を使用して実施した。競合的骨髄移植（ｃＢＭＴ）を実施するための概略図を図６Ａに示す。初代レシピエント由来の末梢血（ＰＢ）細胞のＣＤ４５．２＋画分およびＣＤ４５．１＋画分についてのポストｃＢＭＴキメラ現象分析によれば、ＬＰＳ処置後２日目のＷＴマウス由来のＣＤ４５．２ドナー細胞の再増殖活性（初代レシピエントにおけるＣＤ４５．２＋  ＷＴ＿Ｄａｙ２（％））は、ナイーブ野生型ドナー細胞（初代レシピエントにおけるＣＤ４５．２＋  ＷＴ＿Ｄａｙ０（％））と比較した場合に、有意に減少したことを示した（ＣＤ４５．２＋  ＷＴ＿Ｄａｙ０（％）対ＣＤ４５．２＋  ＷＴ＿Ｄａｙ２（％）、＊Ｐ＜０．０５、図６Ｂ）。対照的に、ＬＰＳストレス付加Ｔｅｔ２欠損ＣＤ４５．２ドナー細胞は、試験したＬＰＳ処置後のいずれの時点においても再増殖能力の低下を示さなかった（図６Ｂ）。さらに、試験した全ての時点で、Ｔｅｔ２欠損ＣＤ４５．２骨髄ドナー細胞は、ＷＴ  ＣＤ４５．２ドナー対照と比較してより高い再増殖能を示したが、最大の差は、ＬＰＳ処置後２日目のＣＤ４５．２ドナー細胞でプライミングしたＣＤ４５．２キメラ現象で観察された（すなわち、ＣＤ４５．２  ＿ＷＴ＿Ｄａｙ２（％）対ＣＤ４５．２＿Ｔｅｔ−ＫＯ＿Ｄａｙ２（％）、＊＊Ｐ＜０．０１、図６Ｂ）。さらに、二次ｃＢＭＴ実験により、ＬＰＳ処置後２日目のＷＴ  ＣＤ４５．２ドナー細胞は再増殖活性の低下を示すが、Ｔｅｔ２欠損ＣＤ４５．２ドナー細胞はＬＰＳストレスに対して耐性であり、頑健な再増殖および生着の優位性を維持することを確認した（図６Ｃ）。
【００７０】
初代ｃＢＭＴレシピエントの骨髄におけるＢＭ生存全細胞（ＢＭ＿Ｌｉｖｅ）、Ｌｉｎ陰性細胞、ＬＳＫ細胞、骨髄細胞（Ｍａｃ１で表示）、Ｂ細胞（ＣＤ１９で表示）およびＴ細胞（ＣＤ３で表示）を含むＢＭ集団の各種画分のキメラ解析もまた、Ｔｅｔ２欠損ドナーＨＳＰＣの再増殖が対照よりも有意に高いことを証明した（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、図６Ｃ）。さらに、Ｔｅｔ２−ＫＯ細胞を移植した初代ｃＢＭＴレシピエントは、骨髄において脾腫、骨髄系列スキューイングおよび欠陥Ｂ細胞発生を示し、このことは初期前白血病病理への誘導におけるＴｅｔ２欠損の細胞自己作用を示唆している（図６Ｄおよび図６Ｅ）。
【００７１】
さらに、野生型マウスおよびＴｅｔ２−ＫＯマウスにおけるＬＰＳ誘発炎症損傷後の幹細胞の再増殖活性を比較するため、ＬＰＳ処置前後の野生型マウスおよびＴｅｔ２−ＫＯマウス由来の同数のＬＳＫ細胞を選別し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのコロニー形成単位アッセイ（ＣＦＵアッセイ）、およびｉｎ  ｖｉｖｏでの骨髄移植アッセイに供した（図６Ｇ）。全骨髄細胞を利用するデータ（図６Ｂ）と一致して、ＬＰＳ処置２日後のマウス由来の精製野生型ＬＳＫ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのコロニー形成能の障害と、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＴｅｔ２欠損ＬＳＫ細胞と比較した再増殖活性の有意な低下を示したが、これは炎症性傷害に対して有意により耐性であった（図６Ｈ〜図６Ｊ）。まとめると、ｃＢＭＴおよびＣＦＵアッセイは、野生型ＨＳＰＣの再増殖活性がＬＰＳ誘発性炎症ストレスに応答して有意に減少しているが、ＬＰＳ処置したＴｅｔ２欠損ＨＳＰＣは、さらなる再増殖／生着を維持し、炎症ストレスに耐性であることを機能的に証明している。
【００７２】
Ｔｅｔ２−ＫＯマウスは、炎症促進性サイトカインの発現の増大を示す。
【００７３】
急性炎症チャレンジは、即時性および一過性のサイトカインストームを誘発し、緊急造血および顆粒球形成を調節する可能性がある。次に、炎症関連サイトカインおよびケモカインが、野生型対照マウスと比較した場合に、ＬＰＳストレスＴｅｔ２−ＫＯマウスにおいて差次的に刺激されるか否かを分析した。３１種のサイトカインまたはケモカインを定量し、血清中のそれらのレベルを評価した。１５種のサイトカインまたはケモカイン（Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＣＣＬ２、ＣＣＬ４、ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ５、ＴＮＦα、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＩＬ−１０、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、Ｍ−ＣＳＦ、ＩＬ−２）は、野生型またはＴｅｔ２−ＫＯマウスにおける０日目と比較して、１日目および２日目にＬＰＳによって血清中で刺激されることが見出された（図７Ａ）。しかし、Ｔｅｔ２の喪失は血清ＬＰＳ−６レベルの顕著な上昇をもたらすことが一貫して観察され、０日目だけでなく、ＬＰＳ処置後１日目および２日目にさらなる上昇が観察された（図７Ａ）。Ｃｃｌ２およびＣｃｌ４がＴｃｔ２−ＫＯマウスにおいて１日目および２日目に上昇したが、ＴＮＦαはＴｅｔ２−ＫＯマウスにおいて２日目にのみ上昇した（図７Ａ）。最近の研究により、ＬＰＳがＨＳＰＣにおいてＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦα産生を直接的に誘導し得ることが明らかになった。そのため、それらの発現を、細胞内染色、フローサイトメトリーおよびＭＦＩ計算によって試験した。ＩＬ−６はより成熟した骨髄細胞によって発現されることが見出され、また、野生型対照と比較して、ＬＰＳ処置した際、Ｔｅｔ２−ＫＯマウスの未熟骨髄細胞（ＨＳＰＣ）において高レベルで刺激された（図７Ｂ〜図７Ｄ）。ＴＮＦαは、Ｔｅｔ２−ＫＯマウス由来のＬｉｎ陰性骨髄細胞において、１日目により高レベルで発現されることが見出された（図７Ｄ、図８Ａおよび図８Ｄ）。ＩＬ−１αおよびＧＭ−ＣＳＦの発現はＬＰＳによって刺激されたが、野生型およびＴｅｔ２−ＫＯのＨＳＰＣにおいては同程度であった（図７Ｄ、図８Ｂ、図８Ｃ、図８Ｄおよび図８Ｆ）。Ｌｉｎ陰性骨髄細胞におけるｑＲＴ−ＰＣＲアッセイにより、ＩＬ−６  ｍＲＮＡが、対照と比較して、成体Ｔｅｔ２−ＫＯマウスにおいてＬＰＳ処置後０日目、１日目および２日目に有意に上昇したことを確認した（図７Ｆ）。同様に、血清ＩＬ−６およびＩＬ−６の発現が野生型細胞とＴｅｔ２−ＫＯ細胞との間で０日目に同程度であった若齢マウスにおいて、ＬＰＳチャレンジによって、Ｔｅｔ２−ＫＯマウス由来のＬｉｎ陰性細胞において、対照と比較して有意に高いＩＬ−６の発現が生じた（図７Ｇ）。興味深いことに、Ｃｃｌ２の発現はまた、対照と比較して、Ｔｅｔ２−ＫＯマウスにおけるＬＰＳ処置後１日目の血清中およびＬｉｎ陰性細胞中で増加した（図７Ａ、図７Ｆおよび図７Ｇ）。まとめると、これらの結果は、ＨＳＰＣにおけるＴｅｔ２の喪失が、ナイーブ条件下で血清および骨髄細胞におけるＩＬ−６レベルの上昇をもたらし、これが炎症性ストレスの際にさらに増大されることを示唆している。追加のサイトカインおよびケモカインでもＴｅｔ２−ＫＯマウスにおいて上昇したが、ＩＬ−６と同程度ではなかった。
【００７４】
Ｔｅｔ２の非存在下におけるＴＬＲ４／ＮＦκＢ経路成分の発現の変化およびＴＬＲ４／ＮＦＫＢ／ＩＬ−６／Ｍｏｒｒｂｉｄシグナル伝達が関与するフィード−フォワードループ。
【００７５】
ＬＰＳは標準のＴＬＲ４／ＮＦκＢシグナル伝達を活性化するが、それはＩＬ−６などの炎症性サイトカインの発現を誘導し、感染を解消しようとして緊急造血を誘導する（シグナル伝達経路の概略図を図９Ａに示す）。外因性病原体によって誘発される感染がなければ、ＴＬＲ４はＳ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９などの内因性リガンドによって連結され、類似の先天的免疫シグナル伝達経路を刺激することができる。前の研究と一致して、ＬＳＫ細胞およびＨＳＣの両方のかなりの画分がＴＬＲ４およびＩＬ−６受容体α（ＩＬ−６Ｒα）を発現することがフローサイトメトリーによって確認された（図９Ｂおよび図１０）。ＩＬ−６Ｒαの発現は、野生型マウスとＴｅｔ２−ＫＯナイーブマウスとの間で同程度であるが、ＴＬＲ４＋細胞の頻度およびＴｅｔ２−ＫＯ系列陰性細胞におけるＴＬＲ４の発現は、野生型対照と比較して有意に増加した（図９Ｂ）。ＬＰＳストレス付加の野生型およびＴｅｔ２−ＫＯマウスにおけるＴＬＲ４／ＮＦκＢおよびＩＬ−６シグナル伝達の関与をさらに評価するため、これらの経路の重要な成分をコードする複数の遺伝子の発現について、ナイーブ条件下（０日目）、およびＬＰＳ処置の２４時間後（１日目）または４８時間後（２日目）に分析した。Ｔｌｒ４、Ｔｒｉｃａｍ１（Ｔｒｉｆ、ＴＬＲ４シグナル伝達のための細胞内アダプターをコードしている）、Ｎｆｌｂ１（ＮＦκＢ１をコードしている、ｐ５０としても知られており、転写因子のＮＦκＢファミリーの主要サブユニットのうちの１つ）、およびＮｆｋｂｉｚ（ＩκＢζをコードしており、これはＩｌ６およびＣｃｌ２の転写を直接的に調節するためにＮＦκＢ１と結合する）の発現を、対照と比較してＴｅｔ２−ＫＯ  Ｌｉｎ−陰性細胞において観察した（図９Ｇ）。さらに、Ａｐｅｘ１（Ｒｅｆ−１としても知られている、アプリン酸／アピリミジン酸（Ａｐ）エンドヌクレアーゼ、Ａｐｅ１をコードしており、これはＤＮＡに結合するＮＦκＢ１およびＳｔａｔ３を含む複数の転写因子を補助する）は、対照と比較して、Ｔｅｔ２−ＫＯ  Ｌｉｎ−細胞において増加する（図９Ｇ）。また、Ｔｅｔ２−ＫＯ  Ｌｉｎ−陰性細胞におけるＮＦＫＢ１およびｐｈｏｓｈｏ−Ｓｔａｔ３の発現の増加も、フローサイトメトリーおよびＭＦＩ分析によって検証した（図９Ｆ）。要約すると、遺伝子およびタンパク質発現プロファイルは、ＩＬ−６の発現の増加に加えて、Ｔｅｔ２−ＫＯ  Ｌｉｎ−陰性細胞がナイーブ基本条件下で、ならびに炎症チャレンジの際に、ＴＬＲ４／ＮＦＫＢ経路のシグナル伝達プロファイルの増大を維持することを総体的に示唆している。ＮＦＫＢ１およびＳｔａｔ３は先天性免疫応答を調節するための必須転写因子であるので、ＴＬＲ４、ＩＬ−６およびＭｏｒｒｂｉｄの発現の増加はＴｅｔ２−ＫＯ  Ｌｉｎ−陰性細胞における転写のレベルでＮＦκＢ１およびＳｔａｔ３と機能的に連結していると仮定され、またフィードフォワードループがこれらの細胞におけるＴｅｔ２喪失の結果として樹立された可能性が高い。実際、ＣＨＩＰ−ｑＰＣＲ分析により、ＤＮＡ結合をモジュレートするためのＮＦＫＢ複合体の重要な成分であるＩκＢζが、対照と比較して、Ｔｅｔ２−ＫＯ  Ｌｉｎ−陰性細胞にお��てＴＬＲ４およびＩＬ−６の両遺伝子のプロモーター領域へのその結合で有意に富化していることが明らかであった（図９Ｈ）。
【００７６】
ＡＰＸ３３３０（（２Ｅ）−３−［５−（２，３−ジメトキシ−６−メチル−１，４−ベンゾキノイル）］−２−プロペン酸）は、よく研究されているＡｐｅ１レドックスシグナル伝達阻害剤であり、ＮＦκＢシグナル伝達ならびにＩＬ−６およびＴＮＦαを含む炎症性サイトカインの発現を抑制し、またがん細胞の成長を減じることが示されている。ＣＦＵアッセイにおいて、Ｔｅｔ２−ＫＯ細胞Ｌｉｎ−陰性細胞のＡＰＸ３３３０を用いた処置は、初代および二次の両プレーティング条件下でｉｎ  ｖｉｔｒｏでのコロニー形成を正常化し、これは、対照と比較して、Ｔｅｔ２−ＫＯ  Ｌｉｎ−陰性細胞においてＭｏｒｂｂｉｄプロモーターへのＩκＢζおよびＳｔａｔ３結合の低下と関連していた（図９Ｉおよび図９Ｊ）。同様に、特異的でアロステリックな阻害剤であるＳＨＰ２／Ｓｈｐ２、ＳＨＰ０９９（６−（４−アミノ−４−メチル−１−ピペリジニル）−３−（２，３−ジクロロフェニル）−２−ピラジンアミン）を用いたＴｅｔ２−ＫＯ  Ｌｉｎ−陰性細胞の処置もまた、ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓｔａｔ３の発現、ＣＦＵ形成、ＭｏｒｒｂｉｄプロモーターへのＩκＢζおよびＳｔａｔ３結合の低下をもたらした（図６Ｆ、図６Ｈおよびデータは示さず）。
【００７７】
【化３】
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【００７８】
まとめると、これらの結果は、Ｔｅｔ２欠損がＴＬＲ４／ＮＦκＢ／ＩＬ−６シグナル伝達成分の発現の増加をもたらすこと、ならびにＡＰＸ３３３０およびＳＨＰ０９９の両方がそのようなシグナル伝達を抑制することによってＴｅｔ２−ＫＯ  ＨＳＰＣのコロニー形成活性増大を阻止し得ることを証明している。
【００７９】
実施例２
この実施例においては、ＡＰＸ３３３０またはＳＨＰ０９９がＴＥＴ２−ＫＯマウスにおいて基礎炎症および緊急造血を抑制できるか否かについて分析した。
【００８０】
次に、ＡＰＸ３３３０またはＳＨＰ０９９がｉｎ  ｖｉｖｏでＴｅｔ２−ＫＯマウスにおいて炎症および「緊急造血」を抑制できるか否かを試験した。最初に、ＡＰＸ３３３０またはＳＨＰ０９９がＬＰＳ誘発急性炎症を正常化できるか否かを評価した。マウスにＬＰＳでチャレンジする前に、野生型マウスおよびＴｅｔ２−ＫＯマウスを２日間ＡＰＸ３３３０またはＳＨＰ０９９で予防的に処置した。ＬＰＳ処置した後、ＡＰＸ３３３０またはＳＨＰ０９９をこれらのマウスにさらに２日間連続注射した（図１３Ａ）。ＬＰＳ処置後の２日目に、マウスを絶命させ分析した。ＬＰＳプラスＡＰＸ３３３０またはＬＰＳプラスＳＨＰ０９９で処置したＴｅｔ２−ＫＯマウスは、ＬＰＳ単独で処置したマウスと比較して、好中球の産生の増加およびＬＳＫ細胞の増大において有意な補正を示したことが観察された（図１３Ｂ〜図１３Ｅ）。これらの結果は、ＡＰＸ３３３０またはＳＨＰ０９９がＬＰＳ誘発急性炎症と拮抗し、ｉｎ  ｖｉｖｏでの抗炎症作用に介在し、Ｔｅｔ２の非存在下で緊急時顆粒球形成および緊急造血を改善することができることを証明している。
【００８１】
２〜３月齢のＴｅｔ２−ＫＯマウスにおける比較的正常なＰＢ血液表現型とは対照的に、６月齢Ｔｅｔ２−ＫＯマウスは、野生型対照と比較して、脾腫を含むＭＰＮのより重篤な徴候、ＰＢにおける好中球数の有意な増加、およびＷＢＣにおける好中球のパーセンテージの有意な増加（ＭＰＮまたはＣＭＬの初期の徴候）を示した（図１３Ｆおよび図１３Ｇ）。さらに、老齢Ｔｅｔ２−ＫＯは、野生型マウスと比較して、より高レベルの血清ＩＬ−６を維持した（図１３Ｈ）。６月齢のＴｅｔ２−ＫＯマウスをＡＰＸ３３３０またはＳＨＰ０９９で処置し、より老齢のマウスにおけるこれら薬物の潜在的な治療上の利益について評価した（１４日間毎日処置、図１３Ｉ）。この短期間の処置計画においては、ＡＰＸ３３３０およびＳＨＰ０９９はＴｅｔ２−ＫＯマウスにおいてＬＳＫおよびＣＭＰの頻度を逆転させることができなかったが、これらの両薬物は、Ｔｅｔ２−ＫＯマウスにおける好中球、白血球（ＷＢＣ）負荷を大幅に減らし、赤血球（ＲＢＣ）および血小板数を含む貧血を回復させた（図１３Ｊ〜図１３Ｍ）。さらに、脾臓重量の減少もまた、薬物処置したＴｅｔ２−ＫＯマウスにおいて観察されたが、それは統計的有意性には到達しなかった。重要なことには、血清ＩＬ−６レベルもまた、Ｔｅｔ２−ＫＯマウスのＡＰＸ３３３０またはＳＨＰ０９９処置の際に低下した（図１３Ｎおよび図１３Ｏ）。これらの所見は、ＮＦκＢ／ＩＬ−６シグナル伝達軸の標的化阻害を介して、ＡＰＸ３３３０またはＳＨＰ０９９を用いた短期処置が老齢Ｔｅｔ２−ＫＯマウスにおいて抗炎症の利益を付与し、高レベルの血清ＩＬ−６、好中球および貧血の発症の反転をもたらすことを示唆している。
【００８２】
前述のデータに基づけば、Ｔｅｔ２欠損ＨＳＰＣは、炎症性ストレスに応答して特有の組織修復能力を示す。これらの所見は、Ｔｅｔ２欠損前白血病前ＨＳＣ／ＨＰＣが選択優位性によって強化されていることを示唆している。Ｔｅｔ２欠損前ＬＳＣにおいて見られる増殖上の優位性は、成熟細胞（ＩＬ−６の供給）および未成熟細胞（ＩＬ−６の供給およびそれへの応答）の両方におけるＮＦκＢおよびＩＬ−６シグナル伝達の上昇による可能性が高い。
【００８３】
ＩＬ−６は、血液中を循環する主要な炎症促進性サイトカインの１つであり、また局所的にも機能する。免疫の制御において本質的な役割を果たすことに加えて、ＩＬ−６はまた、造血細胞の発達および白血病形質転換も調節し得る。ＢＣＲ−ＡＢＬがん遺伝子変異によって誘発される慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）のマウスモデルを利用する近年の研究は、このモデルにおける白血病が炎症性サイトカインＩＬ−６のレベル上昇に依存することを示した。まとめると、報告されているＩＬ−６の機能に加えて、本所見は、炎症促進性サイトカインＩＬ−６レベルの上昇は、年齢と共にグレードまたは発生率が増加するＴｅｔ２−ＫＯマウスにおいて観察されるＭＰＮまたはさらにはＣＭＬ疾患の重要なトリガーであるという仮説を支持している（図１１Ａ）。ＩＬ−６に加えて、ＩＮＦα、ＩＮＦγ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１βおよびＴＮＦαもまた、ＨＳＣを直接活性化することができる。細胞内ＩＬ−６、ＴＮＦα、ＩＬ−１βおよびＧＭ−ＣＳＦのレベルのみが、定義した３つの時点で試験されたので、ＩＬ−１βまたはＧＭ−ＣＳＦの発現がこのプロセスにおいて役割を有している可能性を無視することはできない。
【００８４】
Ｔｅｔ２欠損細胞およびマウスにおけるＩＬ−６のレベルの上昇の観察に加えて、ＴＬＲ４およびＩＬ−６シグナル伝達経路における複数成分の発現が、ＬＳＫ細胞およびＨＳＣを含むＴｅｔ２欠損ＨＳＰＣにおいてアップレギュレートされていることも確認された。ＴＬＲ４およびＳｃａ−１は、ＬＰＳに応答した必須の細胞表面タンパク質のうちの１つであった。ＴＬＲ４はＬＰＳに特異的な主要なＴｏｌｌ様受容体であり、標準的なＴＬＲ→ＮＦκＢ／ＩκＢζ→サイトカインシグナル伝達経路を媒介する。ＬＰＳ刺激の有無にかかわらず、Ｔｅｔ２欠損ＨＳＰＣはＴＬＲ４の発現の一貫した増加を示すことが確認され、このことは、ＨＳＣにおけるＴｅｔ２の非存在下におけるＬＰＳに対する感受性の増加がＴＬＲ４の発現の増加の結果であり得る可能性を示唆している。この概念は、Ｔｅｔ２欠損ＨＳＣがＨＳＰＣにおけるＬＰＳ刺激に対してより良好に応答したという事実によって支持されている。興味深いことに、ＴＲＬ２およびＴＲＬ１２は、それぞれ２つのＡＭＬのマウスモデルにおいて、ＬＳＫ細胞でその発現が増加していることが見出された。さらに、ＭＤＳ患者由来のＣＤ３４＋前駆細胞において発現が増加した複数のＴＬＲが見出された。
【００８５】
ＴＬＲ４シグナル伝達がＴｅｔ２欠損によってモジュレートされ得るという知見をさらに支持するため、Ｎｆｋｂ１およびＮｆｋｂｉｚの発現が、基本条件下で、ならびにＬＰＳチャレンジの際に、Ｔｅｔ２−ＫＯマウスにおいてアップレギュレートされることが示された（図９Ｃ）。Ｔｅｔ２−ＫＯ系列陰性細胞における知見は、（それらのＲＮＡ−ｓｅｑデータシートからの）Ｎｆｋｂ１、Ｎｆｋｂ２、ＮｆｋｂｉａおよびＮｆｋｂｉｚを含むＴＬＲ４／ＮＦκＢシグナル伝達経路における遺伝子の発現の増加を証明する、ＬＰＳ処置Ｔｅｔ２−ＫＯマクロファージを利用した前の所見と一致した。
【００８６】
ＩＬ−６およびＴＬＲ４の発現の変化に加えて、Ｓｃａ−１発現の増加がＴｅｔ２欠損ＨＳＰＣにおいて一貫して確認された。Ｓｃａ−１は、造血幹細胞にとって必須の細胞表面マーカーである（図２Ａ）。ＨＳＣにおけるＳｃａ−１の喪失は、分化欠陥ならびにＨＳＣの再増殖能力における欠陥をもたらす。さらに、Ｓｃａ−１の喪失はまた、ＩＮＦα誘導緊急造血を遮断する。Ｔｅｔ２の喪失は、ＨＳＰＣにおけるＳｃａ−１の発現の増加およびＳｃａ−１＋細胞の割合の増加をもたらすことが示された（図２Ｈ、図２Ｉおよび図９Ｃ）。Ｓｃａ−１発現をおそらく調節し得る転写因子（ＴＦ）に関して、Ｓｔａｔ−１は推定上の候補である。Ｓｔａｔ１の発現増加はＴｅｔ２欠損ＨＳＰＣにおいては確認されなかったが、Ｓｔａｔ３発現は０日目に有意に増加した（図９Ｃ）。Ｔｅｔ２が必須のエピジェネティック調節因子であることを考慮すると、Ｔｅｔ２によるＳｃａ−１の抑制は、おそらく、ＩＬ−６の実働モデルという抑制がＴｅｔ２／ＨＤＡＣ６／ＩκＢζ複合体を介しているのと同様に、直接的機構を介して生じるか、またはＴＬＲｓ→ＮＦｋＢ→ＩＬ−６→ＩＬ６Ｒα→Ｓｔａｔ１／Ｓｔａｔ３→Ｓｃａ−１などの長い信号伝達に依存する間接的経路によって生じる。
【００８７】
急性炎症または老齢に伴う慢性炎症は、ゲノム安定性に関する感受性マーカーとして使用される、より高レベルのγＨ２ＡＸを誘発する可能性があると考えられてきた。フローサイトメトリーおよびＭＦＩ分析を使用する前の研究と一致して、γＨ２ＡＸの変化が野生型細胞とＴｅ２−ＫＯ細胞との間の日々の比較において容易に検出されることが本明細書において検証された。さらに、Ｔｅｔ２−ＫＯ細胞対野生型におけるγＨ２ＡＸのＭＦＩ値はより高く、Ｔｅｔ２−ＫＯ造血前駆細胞のゲノムにおける一過性のより高レベルのＤＮＡ損傷を示しており（図４Ｃおよび図４Ｄ）、これはＴｅｔ２がゲノム安定性を監視する直接的な役割を有し得ることを支持している。
【００８８】
固形腫瘍および白血病を含むがんの発生および悪性は、ダーウィンの自然選択で示されているのと同様の生態学的原則で、微細環境選択（外因性因子）に対する適合性を伴う後天性細胞変異（内因性因子）の適合優位性に依存する進化過程を経ることが一般に容認されている。初代および二次ｃＢＭＴアッセイによって、Ｔｅｔ２欠損ＨＳＰＣが常に野生型対照細胞よりも優れていることを本明細書で示した。本質的に、野生型ドナー細胞をＬＰＳストレス後２日目にそれらの内因性微細環境から単離した場合、それらは正常な再増殖活性を喪失していた（図６Ａ〜図６Ｇ）。さらに、前の知見と一致して、初代ｃＢＭＴがＴｅｔ２欠損骨髄ドナーの半分しか受け入れなかったにもかかわらず、レシピエント動物は依然としてＭＰＮまたはＣＭＬの早期徴候を発症しており、Ｔｅｔ２欠損が完全な成長のパッケージとＨＳＣへの優位な再構築を提供することを強く示唆している。
【００８９】
実施例の結果に基づけば、Ｔｅｔ２の喪失は、ＴＲＬ４、ＩＬ−６およびＳｃａ−１を含む重要なタンパク質のレベルにおける複数の変化をもたらし、骨髄スキューイングおよびＭＰＮまたはＣＭＬ様の老齢による疾患の発症を含むように変異ＨＳＣの自己複製、分化およびクローン進化を提供する。
【００９０】
Ｔｅｔ２−ＫＯ細胞におけるＮＦκＢ経路の過剰活性化を考慮して、ＮＦκＢのＡｐｅｌレドックスシグナル伝達活性化の標的化阻害剤、ＡＰＸ３３３０について、緊急造血への影響について試験した。結果は、ＡＰＸ３３３０およびＳＨＰ０９９の両方がＬＰＳ誘発緊急時顆粒球形成およびＬＳＫ増大を効果的に抑制することを示した。より重要なことには、結果は、ＡＰＸ３３３０およびＳＨＰ０９９処置が、老齢ナイーブＴｅｔ２−ＫＯマウスにおいてＷＢＣおよびＲＢＣの数および比率を回復させることを示し、このことは、これらの薬物が、Ａｐｅｌ−ＮＦκＢまたはＳｈｐ２−Ｓｔａｔ３に対するその特異的阻害を介して、クローン造血を有する健全な個体においてしばしば観察されるＡＭＬ関連エピジェネティック変異を有するマウスにおける抗炎症効果を提供することを示唆している。炎症が他の前白血病モデルにおいてこれらの薬物を試験するＭＰＮの病理学での原因となる役割を担う可能性が非常に高いことを新たな証拠が示唆していることを考えると、臨床的に有益であり得る。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図１Ｉ】
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【図１Ｊ】
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【図１Ｋ】
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【図１Ｌ】
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【図１Ｍ】
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【図１Ｎ】
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【図１Ｏ】
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【図１Ｐ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図２Ｉ】
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【図２Ｊ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図４Ｉ】
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【図４Ｊ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
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【図６Ｉ】
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【図６Ｊ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図９Ｇ】
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【図９Ｈ】
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【図９Ｉ】
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【図９Ｊ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【図１３Ｇ】
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【図１３Ｈ】
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【図１３Ｉ】
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【図１３Ｊ】
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【図１３Ｋ】
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【図１３Ｌ】
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【図１３Ｍ】
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【図１３Ｎ】
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【図１３Ｏ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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