(57)【要約】本開示は、組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子、およびこれらの分子を使用して標的組織におけるＷｎｔシグナル伝達を増加させる関連方法を提供する。一実施形態では、本発明は、組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子、またはその薬学的に許容される塩であって、ＺＮＲＦ３およびＲＮＦ４３から選択される１つ以上の膜貫通型Ｅ３ユビキチンリガーゼに特異的に結合する第１のドメインと、組織特異的細胞表面分子に特異的に結合する第２のドメインとを含み、該分子が、該組織特異的細胞表面分子を含む組織においてＷｎｔシグナル伝達を増加させる、組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子、またはその薬学的に許容される塩を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織特異的Ｗｎｔ（「ウィングレス関連統合部位」または「ウィングレスおよびＩｎｔ−１」または「ウィングレス−Ｉｎｔ」）シグナル増強分子、またはその薬学的に許容される塩であって、ジンクリングフィンガー３（ＺＮＲＦ３）およびリングフィンガータンパク質４３（ＲＮＦ４３）から選択される１つ以上の膜貫通型Ｅ３ユビキチンリガーゼに特異的に結合する第１のドメインと、組織特異的細胞表面分子に特異的に結合する第２のドメインとを含み、前記化合物が、前記組織特異的細胞表面分子を含む前記組織においてＷｎｔシグナル伝達を増加させる、組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項２】
前記組織が、骨組織、肝臓組織、皮膚組織、胃組織、腸管組織、口腔粘膜組織、腎臓組織、中枢神経系組織、乳腺組織、味蕾組織、卵巣組織、内耳組織（蝸牛および前庭組織を含む）、毛包、膵臓組織、網膜組織、角膜組織、心臓組織および肺組織からなる群から選択される、請求項１に記載の分子。
【請求項３】
前記第１のドメインが、第１のポリペプチド配列を含み、かつ／または前記第２のドメインが、第２のポリペプチド配列を含む、請求項１または請求項２に記載の分子。
【請求項４】
前記化合物が、前記第１のポリペプチド配列および前記第２のポリペプチド配列を含む融合タンパク質または抗体である、請求項３に記載の分子。
【請求項５】
前記第１のポリペプチド配列が、
ａ）Ｒ−スポンジンポリペプチド配列であって、前記Ｒ−スポンジンが、場合により、Ｒ−スポンジン−１、Ｒ−スポンジン−２、Ｒ−スポンジン−３、またはＲ−スポンジン−４である、Ｒ−スポンジンポリペプチド配列またはその断片もしくはバリアント、あるいは
ｂ）Ｒ−スポンジンフリンドメイン１配列および、場合により、野生型もしくは変異型フリンドメイン２またはそれらの断片もしくはバリアントを含み、前記第１のポリペプチド配列は、場合により、全長Ｒ−スポンジンと比較してロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役受容体４〜６（ＬＧＲ４〜６）への結合が減少している、請求項３または請求項４に記載の分子。
【請求項６】
前記Ｒ−スポンジンフリンドメイン１が、配列番号１〜４に存在するフリン１ドメインのうちのいずれかと少なくとも９０％の同一性を有する、請求項５に記載の分子。
【請求項７】
前記第２のポリペプチド配列が、ペプチド、ポリペプチド、抗体もしくはその断片、あるいはリガンドまたはその断片もしくはバリアントである、請求項３〜６のいずれかに記載の分子。
【請求項８】
ａ）前記組織が、骨組織であり、前記細胞表面分子が、副甲状腺ホルモン受容体１（ＰＴＨ１Ｒ）であるか、
ｂ）前記組織が、肝臓組織であり、前記細胞表面分子が、アシアロ糖タンパク質受容体１（ＡＳＧＲ１）、アシアロ糖タンパク質受容体２（ＡＳＧＲ２）、トランスフェリン受容体２（ＴＦＲ２）もしくは溶質キャリアファミリー１０メンバー１（ＳＬＣ１０Ａ１）であるか、または
ｃ）前記組織が、口腔粘膜であり、前記細胞表面分子が、Ｌｙ６／ＰＬＡＵＲドメイン含有３（ＬＹＰＤ３）もしくはデスモグレイン（ＤＳＧ３）である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の分子。
【請求項９】
ａ）前記細胞表面分子が、副甲状腺ホルモン受容体１（ＰＴＨ１Ｒ）であり、前記第２のポリペプチド配列が、ＰＴＨ１Ｒに特異的に結合するか、
ｂ）前記細胞表面分子が、アシアロ糖タンパク質受容体１（ＡＳＧＲ１）であり、前記第２のポリペプチド配列が、ＡＳＧＲ１に特異的に結合するか、
ｃ）前記細胞表面分子が、アシアロ糖タンパク質受容体２（ＡＳＧＲ２）であり、前記第２のポリペプチド配列が、ＡＳＧＲ２に特異的に結合するか、
ｄ）前記細胞表面分子が、溶質キャリアファミリー１０メンバー１（ＳＬＣ１０Ａ１）であり、前記第２のポリペプチド配列が、溶質キャリアファミリー１０メンバー１（ＳＬＣ１０Ａ１）に特異的に結合するか、
ｅ）前記細胞表面分子が、トランスフェリン受容体２（ＴＦＲ２）であり、前記第２のポリペプチド配列が、ＴＦＲ２に特異的に結合するか、
ｆ）前記細胞表面分子が、Ｌｙ６／ＰＬＡＵＲドメイン含有３（ＬＹＰＤ３）であり、前記第２のポリペプチド配列が、ＬＹＰＤ３に特異的に結合するか、または
ｇ）前記細胞表面分子が、デスモグレイン（ＤＳＧ３）であり、前記第２のポリペプチド配列が、ＤＳＧ３に特異的に結合し、
前記第２のポリペプチドが、抗体もしくはその断片または抗体とは異なるペプチドもしくはポリペプチド、低分子、あるいは前記細胞表面分子のリガンドまたはその断片もしくはバリアントである、請求項３〜８のいずれかに記載の分子。
【請求項１０】
前記第１のドメインおよび前記第２のドメインが、リンカー部分によって結合している、請求項１〜９のいずれかに記載の分子。
【請求項１１】
前記リンカー部分が、ペプチジルリンカー配列である、請求項１０に記載の分子。
【請求項１２】
前記リンカー配列が、グリシン、アスパラギン、セリン、トレオニンおよびアラニンからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸を含む、請求項１１に記載の分子。
【請求項１３】
請求項４〜１２のいずれかに記載の融合タンパク質をコードする核酸配列。
【請求項１４】
前記核酸配列が、ＤＮＡまたはｍＲＮＡである、請求項１３に記載の核酸配列。
【請求項１５】
請求項１３に記載の核酸配列を含むベクター。
【請求項１６】
前記ベクターが、前記核酸配列に機能的に連結されたプロモーター配列を含む発現ベクターである、請求項１５に記載のベクター。
【請求項１７】
前記ベクターが、前記核酸配列に機能的に連結されたプロモーター配列を含むウイルスである、請求項１５に記載のベクター。
【請求項１８】
請求項１６に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１９】
請求項４〜１２のいずれかに記載の融合ポリペプチドを生成するための方法であって、前記融合ポリペプチドが前記発現ベクターによって発現される条件下で請求項１８に記載の宿主細胞を培養することを含む、方法。
【請求項２０】
生成された前記融合ポリペプチドを単離する工程をさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
（ｉ）有効量の、請求項１〜１２のいずれかに記載の分子、請求項１３〜１４のいずれかに記載の核酸配列、請求項１５〜１７のいずれかに記載のベクター、または請求項１８に記載の宿主細胞と、
（ｉｉ）薬学的に許容される希釈剤、アジュバントまたは担体と、を含む、薬学的組成物。
【請求項２２】
有効量の請求項１〜１２のいずれかに記載の分子と、有効量のＷｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチド、またはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子とを含む、請求項２１に記載の薬学的組成物。
【請求項２３】
有効量の請求項１３〜１４のいずれかに記載の核酸配列と、Ｗｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチド、またはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする有効量の核酸配列とを含み、前記Ｗｎｔポリペプチド、前記ノリンポリペプチド、または前記Ｗｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする前記核酸配列が、場合によりＤＮＡまたはｍＲＮＡである、請求項２１に記載の薬学的組成物。
【請求項２４】
請求項１３〜１４のいずれかに記載の核酸配列および／または前記Ｗｎｔポリペプチド、前記ノリンポリペプチド、もしくは前記Ｗｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする前記核酸配列が、修飾ｍＲＮＡである、請求項２３に記載の薬学的組成物。
【請求項２５】
有効量の請求項１５〜１７のいずれかに記載のベクターと、Ｗｎｔポリペプチド、ポリペプチド、またはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする核酸配列を含む有効量のベクターとを含み、ノリン前記Ｗｎｔポリペプチド、前記ノリンポリペプチド、または前記Ｗｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする前記核酸配列を含む前記ベクターが、場合により発現ベクターである、請求項２２に記載の薬学的組成物。
【請求項２６】
（ｉ）Ｗｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチド、またはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする有効量の核酸と、
（ｉｉ）薬学的に許容される希釈剤、アジュバントまたは担体と、を含む、薬学的組成物。
【請求項２７】
前記核酸が、ＤＮＡまたはｍＲＮＡ、場合により修飾ｍＲＮＡである、請求項２６に記載の薬学的組成物。
【請求項２８】
前記核酸が、発現ベクター、場合によりウイルスベクター中に存在する、請求項２６に記載の薬学的組成物。
【請求項２９】
前記Ｗｎｔポリペプチドが、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２Ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３Ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５Ａ、Ｗｎｔ５Ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７Ａ、Ｗｎｔ７Ｂ、Ｗｎｔ８Ａ、Ｗｎｔ８Ｂ、Ｗｎｔ９Ａ、Ｗｎｔ９Ｂ、Ａｎｔ１０Ａ、Ｗｎｔ１０Ｂ、Ｗｎｔ１１、およびＷｎｔ１６、ならびにこれらのうちのいずれかの機能的バリアントおよび断片から選択される哺乳動物Ｗｎｔポリペプチドである、請求項２２〜２８のいずれかに記載の薬学的組成物。
【請求項３０】
前記ノリンポリペプチドが、哺乳動物ノリンポリペプチドまたはその機能的バリアントもしくは断片である、請求項２２〜２８のいずれかに記載の薬学的組成物。
【請求項３１】
前記Ｗｎｔシグナル伝達アゴニスト分子が、フリズルド（Ｆｚｄ）受容体をＬｒｐ５／６と二量体化させる水溶性Ｗｎｔシグナル伝達アゴニストである、請求項２２〜２８のいずれかに記載の薬学的組成物。
【請求項３２】
前記Ｗｎｔシグナル伝達アゴニスト分子が、ポリペプチドを含む、請求項３１に記載の薬学的組成物。
【請求項３３】
前記ポリペプチドが、１つ以上のＦｚｄタンパク質に対して高い親和性を有する結合ドメインと、Ｌｒｐ５／Ｌｒｐ６タンパク質に対して高い親和性を有する結合ドメインとを含み、前記結合ドメインが、場合により、直接結合しているか、またはリンカーにより結合している、請求項３２に記載の薬学的組成物。
【請求項３４】
標的組織においてＷｎｔ（「ウィングレス関連統合部位」または「ウィングレスおよびＩｎｔ−１」または「ウィングレス−Ｉｎｔ」）シグナル伝達を増加させるための方法であって、前記標的組織を、
ａ）請求項１〜１２のいずれかに記載の分子、請求項１３〜１４のいずれかに記載の核酸、請求項１５〜１７のいずれかに記載のベクター、または請求項１８に記載の宿主細胞であって、前記第２のドメインが前記標的組織上の細胞特異的表面分子に特異的に結合し、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の分子が前記標的組織に結合して、前記標的組織におけるジンクリングフィンガー３（ＺＮＲＦ３）およびリングフィンガータンパク質４３（ＲＮＦ４３）から選択される１つ以上の膜貫通型Ｅ３ユビキチンリガーゼを隔離またはそのエンドサイトーシスを増加させるもの、および／または
ｂ）Ｗｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチド、もしくはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子；Ｗｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチド、もしくはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする核酸配列；Ｗｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチド、もしくはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする核酸配列を含むベクター；またはＷｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチド、もしくはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする核酸配列を含む発現ベクターを含む宿主細胞であって、前記Ｗｎｔポリペプチド、前記ノリンポリペプチド、または前記Ｗｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする前記核酸配列が、場合によりＤＮＡまたはｍＲＮＡ、場合により修飾ｍＲＮＡであるもの、と接触させることを含む、方法。
【請求項３５】
前記標的組織を請求項１〜１２のいずれかに記載の分子と接触させることを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記標的組織を請求項１３〜１４のいずれかに記載の核酸と接触させることを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記標的組織を請求項１５〜１７のいずれかに記載のベクターと接触させることを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記標的組織を、前記Ｗｎｔポリペプチド、前記ノリンポリペプチド、または前記Ｗｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする前記核酸配列と接触させることを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
ａ）前記組織が、骨組織であり、前記細胞表面分子が、副甲状腺ホルモン受容体１（ＰＴＨ１Ｒ）であるか、
ｂ）前記組織が、肝臓組織であり、前記細胞表面分子が、アシアロ糖タンパク質受容体１（ＡＳＧＲ１）、アシアロ糖タンパク質受容体２（ＡＳＧＲ２）、トランスフェリン受容体２（ＴＦＲ２）、もしくは溶質キャリアファミリー１０メンバー１（ＳＬＣ１０Ａ１）であるか、または
ｃ）前記組織が、口腔粘膜組織であり、前記細胞表面分子が、Ｌｙ６／ＰＬＡＵＲドメイン含有３（ＬＹＰＤ３）もしくはデスモグレイン（ＤＳＧ３）である、請求項３４〜３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
疾患または状態の治療または予防を必要とする対象においてそれを行うための方法であって、前記疾患または障害が、Ｗｎｔ（「ウィングレス関連統合部位」または「ウィングレスおよびＩｎｔ−１」または「ウィングレス−Ｉｎｔ」）シグナル伝達の減少と関連しているか、またはＷｎｔシグナル伝達の増加による恩恵を受けるであろうものであり、有効量の請求項２１〜３３のいずれかに記載の薬学的組成物を前記対象に提供することを含む、方法。
【請求項４１】
薬学的に許容される希釈剤、アジュバントまたは担体と、有効量の、
（ａ）Ｗｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチド、もしくはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子、
（ｂ）Ｗｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチド、もしくはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする核酸配列であって、場合によりＤＮＡもしくはｍＲＮＡである、前記Ｗｎｔポリペプチド、前記ノリンポリペプチド、もしくは前記Ｗｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする核酸配列、
（ｃ）Ｗｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチド、もしくはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする核酸配列を含むベクターであって、場合により発現ベクターである、前記Ｗｎｔポリペプチド、前記ノリンポリペプチド、もしくは前記Ｗｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする前記核酸配列を含むベクター、または
（ｄ）Ｗｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチド、もしくはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする核酸を含む発現ベクターを含む宿主細胞と、を含む薬学的組成物を前記対象に提供することをさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
有効量の請求項１〜１２のいずれかに記載の分子を含む薬学的組成物と、有効量のＷｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチド、またはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子を含む薬学的組成物とを前記対象に提供することを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
有効量の請求項１３〜１４のいずれかに記載の核酸配列を含む薬学的組成物と、Ｗｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチド、またはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする有効量の核酸配列を含む薬学的組成物とを前記対象に提供することを含み、前記核酸配列のうちの一方または両方が、場合によりＤＮＡまたはｍＲＮＡ、場合により修飾ｍＲＮＡである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
有効量の請求項１５〜１７のいずれかに記載のベクターを含む薬学的組成物と、Ｗｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチド、またはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする核酸配列を含む有効量のベクターを含む薬学的組成物とを前記対象に提供することを含み、前記ベクターのうちの一方または両方が、場合により発現ベクターまたはウイルスベクターである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
疾患または状態の治療または予防を必要とする対象においてそれを行うための方法であって、前記疾患または障害が、Ｗｎｔ（「ウィングレス関連統合部位」または「ウィングレスおよびＩｎｔ−１」または「ウィングレス−Ｉｎｔ」）シグナル伝達の減少と関連しているか、またはＷｎｔシグナル伝達の増加による恩恵を受けるであろうものであり、薬学的に許容される希釈剤、アジュバントまたは担体と、有効量の、
ａ）Ｗｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチド、もしくはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする核酸配列であって、場合によりＤＮＡもしくはｍＲＮＡ、場合により修飾ｍＲＮＡである、前記Ｗｎｔポリペプチド、前記ノリンポリペプチド、もしくは前記Ｗｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする核酸配列、
ｂ）Ｗｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチド、もしくはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする核酸配列を含むベクターであって、場合により発現ベクターである、前記Ｗｎｔポリペプチド、前記ノリンポリペプチド、もしくは前記Ｗｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする前記核酸配列を含むベクター、または
ｃ）Ｗｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチド、もしくはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする核酸を含む発現ベクターを含む宿主細胞と、を含む薬学的組成物を前記対象に提供することを含む、方法。
【請求項４６】
前記Ｗｎｔポリペプチドが、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２Ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３Ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５Ａ、Ｗｎｔ５Ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７Ａ、Ｗｎｔ７Ｂ、Ｗｎｔ８Ａ、Ｗｎｔ８Ｂ、Ｗｎｔ９Ａ、Ｗｎｔ９Ｂ、Ａｎｔ１０Ａ、Ｗｎｔ１０Ｂ、Ｗｎｔ１１、およびＷｎｔ１６、ならびにこれらのうちのいずれかの機能的バリアントおよび断片から選択される哺乳動物Ｗｎｔポリペプチドである、請求項４１〜４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
前記ノリンポリペプチドが、哺乳動物ノリンポリペプチドまたはその機能的バリアントもしくは断片である、請求項４１〜４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】
前記Ｗｎｔシグナル伝達アゴニスト分子が、フリズルド（Ｆｚｄ）受容体をＬｒｐ５／６と二量体化させる水溶性Ｗｎｔシグナル伝達アゴニストである、請求項４１〜４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】
前記Ｗｎｔシグナル伝達アゴニスト分子が、ポリペプチドを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項５０】
前記ポリペプチドが、１つ以上のＦｚｄタンパク質に対して高い親和性を有する結合ドメインと、Ｌｒｐ５／Ｌｒｐ６タンパク質に対して高い親和性を有する結合ドメインとを含み、前記結合ドメインが、場合により、直接結合しているか、またはリンカーにより結合している、請求項４２に記載の方法。
【請求項５１】
前記疾患または障害が、骨組織、肝臓組織、皮膚組織、胃組織、腸管組織、口腔粘膜組織、腎臓組織、中枢神経系組織、乳腺組織、味蕾組織、卵巣組織、内耳組織（蝸牛および前庭組織を含む）、毛包、膵臓組織、網膜組織、角膜組織、心臓組織および肺組織からなる群から選択される組織の疾患または障害である、請求項４０〜５０のいずれかに記載の方法。
【請求項５２】
前記疾患または障害が、
ａ）骨組織の疾患または障害であり、細胞表面受容体が、副甲状腺ホルモン受容体１（ＰＴＨ１Ｒ）であるか、
ｂ）肝臓組織の疾患または障害であり、細胞表面受容体が、アシアロ糖タンパク質受容体１（ＡＳＧＲ１）、アシアロ糖タンパク質受容体２（ＡＳＧＲ２）、トランスフェリン受容体２（ＴＦＲ２）、もしくは溶質キャリアファミリー１０メンバー１（ＳＬＣ１０Ａ１）であるか、あるいは
ｃ）口腔粘膜組織の疾患または障害であり、細胞表面受容体が、Ｌｙ６／ＰＬＡＵＲドメイン含有３（ＬＹＰＤ３）またはデスモグレイン（ＤＳＧ３）である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記疾患または状態が、骨折、骨粗鬆症、骨粗鬆症性骨折、脊椎固定術、整形外科用装置の骨結合、腱と骨の統合、歯の成長と再生、歯科インプラント術、歯周病、顎顔面再建、顎骨壊死、脱毛症、難聴、前庭機能低下、黄斑変性、硝子体網膜症、網膜変性症、フックスジストロフィー、脳卒中、外傷性脳損傷、アルツハイマー病、多発性硬化症、脊髄損傷、口腔粘膜炎、短腸症候群、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、メタボリックシンドローム、糖尿病、膵炎、外分泌膵機能不全、創傷治癒、糖尿病性足部潰瘍、冠状動脈疾患、急性腎臓病、慢性腎臓病、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、急性肝不全、急性アルコール性肝障害、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）による慢性肝疾患、ＨＣＶ患者の抗ウイルス薬治療後、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）による慢性肝疾患、ＨＢＶ患者の抗ウイルス薬治療後、慢性アルコール性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝疾患および非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、ならびにあらゆる原因による慢性肝不全からなる群から選択される、請求項４０〜５０のいずれかに記載の方法。
【請求項５４】
前記薬学的組成物が、非経口的に、経口的に、筋肉内に、局所的に、または局部的に提供される、請求項４０〜５３のいずれかに記載の方法。
【請求項５５】
前記対象が、哺乳動物、場合によりヒトである、請求項４０〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年１月２６日に出願された米国仮特許出願第６２／４５０，８０４号、および２０１７年４月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／４８７，１３５号の優先権を主張し、その各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表に関する記載
本出願に関連する配列表は、紙のコピーの代わりにテキストフォーマットで提供され、参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名前は、ＳＲＺＮ＿００３＿０２ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。テキストファイルは４５４ＫＢで、２０１８年１月２６日に作成され、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に送信されている。
【０００２】
本開示は、Ｅ３ユビキチンリガーゼ、ＺＮＲＦ３またはＲＮＦ４３と結合するドメイン、および組織特異的細胞表面受容体結合ドメインを含む、組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子、例えば、融合タンパク質、ならびにその組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子を使用して、Ｅ３リガーゼ、ＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３の組織特異的内在化または隔離を媒介し、したがってＷｎｔ受容体を安定化し、組織特異的様式でＷｎｔシグナル伝達を増強し、かつ種々の疾患および障害を治療および予防する関連方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
Ｗｎｔ（「ウィングレス関連統合部位」または「ウィングレスおよびＩｎｔ−１」または「ウィングレス−Ｉｎｔ」）リガンドおよびそれらのシグナルは、骨、肝臓、皮膚、胃、腸、腎臓、中枢神経系、乳腺、味蕾、卵巣、蝸牛および他の多くの組織を含む、多くの重要な器官および組織の発達、恒常性および再生の制御において重要な役割を果たす（例えば、Ｃｌｅｖｅｒｓ、Ｌｏｈ  ａｎｄ  Ｎｕｓｓｅ、２０１４；３４６：１２４８０１２により概説されている）。Ｗｎｔシグナル伝達経路の調節は、変性疾患および組織損傷の治療の可能性を有する。この目的を達成するために、望ましくない効果を回避するために組織特異的または細胞型特異的な様式でＷｎｔシグナル伝達活性を調節するための戦略を開発することが望ましい。治療薬としてＷｎｔシグナル伝達を調節するための課題の１つは、複数のＷｎｔリガンドおよびＷｎｔ受容体、フリズルド１〜１０（Ｆｚｄ１〜１０）の存在であり、多くの組織が、複数の重複するＦｚｄを発現している。標準的なＷｎｔシグナルはまた、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体関連タンパク質５（ＬＲＰ５）または低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体関連タンパク質６（ＬＲＰ６）が共受容体として関与し、Ｆｚｄｓに加えて、それらは様々な組織において広く発現している。
【０００４】
Ｒ−スポンジン１〜４は、Ｗｎｔシグナルを増幅するリガンドのファミリーである。それぞれのＲ−スポンジンは、一方の端にジンクリングフィンガー３（ＺＮＲＦ３）またはリングフィンガータンパク質４３（ＲＮＦ４３）と他方にロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役型受容体４〜６（ＬＧＲ４〜６）とを含む受容体複合体を通して作用する（例えば、Ｋｎｉｇｈｔ  ａｎｄ  Ｈａｎｋｅｎｓｏｎ  ２０１４，Ｍａｔｒｉｘ  Ｂｉｏｌｏｇｙ；３７：１５７−１６１により概説されている）。Ｒ−スポンジンはまた、追加の作用機序を通して作用する可能性がある。ＺＮＲＦ３およびＲＮＦ４３は、分解のためにＷｎｔ受容体（Ｆｚｄ１−１０およびＬＲＰ５またはＬＲＰ６）を特異的に標的とする２つの膜結合Ｅ３リガーゼである。Ｒ−スポンジンのＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３およびＬＧＲ４〜６への結合は、三元複合体のクリアランスまたは隔離を引き起こし、それはＷｎｔ受容体からＥ３リガーゼを除去し、Ｗｎｔ受容体を安定化し、その結果Ｗｎｔシグナルが増強する。各Ｒスポンジンは、２つのフリンドメイン（１および２）を含み、ＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３に結合するフリンドメイン１、およびＬＧＲ４〜６に結合するフリンドメイン２を有する。フリンドメイン１および２を含むＲ−スポンジンの断片は、Ｗｎｔシグナル伝達を増幅するのに十分である。Ｒ−スポンジン効果は、Ｗｎｔシグナルに依存するが、ＬＧＲ４〜６およびＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３は両方とも様々な組織において広く発現しているので、Ｒ−スポンジンの効果は組織特異的ではない。
【０００５】
当技術分野において、特定の疾患および障害の治療および予防のための組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子が明らかに必要である。本発明は、組織特異的様式でＷｎｔ活性を増強するのに有用な組成物および方法を提供することによって、この必要性に対処する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｋｎｉｇｈｔ  ａｎｄ  Ｈａｎｋｅｎｓｏｎ  ２０１４，Ｍａｔｒｉｘ  Ｂｉｏｌｏｇｙ；３７：１５７−１６１
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子、ならびに例えば、標的組織におけるＷｎｔシグナル伝達を増大させること、およびＷｎｔシグナル伝達の増加による恩恵を受けるであろう疾患および状態を治療することにおけるその使用に関する。
【０００８】
一実施形態では、本発明は、組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子、またはその薬学的に許容される塩であって、ＺＮＲＦ３およびＲＮＦ４３から選択される１つ以上の膜貫通型Ｅ３ユビキチンリガーゼに特異的に結合する第１のドメインと、組織特異的細胞表面分子に特異的に結合する第２のドメインとを含み、該分子が、該組織特異的細胞表面分子を含む組織においてＷｎｔシグナル伝達を増加させる、組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子、またはその薬学的に許容される塩を提供する。特定の実施形態では、組織は、骨組織、肝臓組織、皮膚組織、胃組織、腸管組織、口腔粘膜組織、腎臓組織、中枢神経系組織、乳腺組織、味蕾組織、卵巣組織、内耳組織（蝸牛および前庭組織を含む）、毛包、膵臓組織、網膜組織、血管組織、角膜組織、心臓組織および肺組織からなる群から選択される。様々な実施形態では、第１のドメインおよび第２のドメインのいずれかまたは両方は、ポリペプチド、抗体、低分子、天然リガンド、非天然リガンド、またはそれらのバリアントである。
【０００９】
Ｗｎｔシグナル増強分子の特定の実施形態では、第１のドメインは、第１のポリペプチド配列を含み、かつ／または第２のドメインは、第２のポリペプチド配列を含む。特定の実施形態では、分子は、第１のポリペプチド配列と第２のポリペプチド配列とを含む融合タンパク質である。特定の実施形態では、第１のポリペプチド配列は、Ｒ−スポンジン配列またはその断片もしくはバリアントを含む。特定の実施形態では、Ｒ−スポンジンは、Ｒ−スポンジン−１、Ｒ−スポンジン−２、Ｒ−スポンジン−３、またはＲ−スポンジン−４、例えば、ヒトＲ−スポンジン１〜４である。特定の実施形態では、第１のポリペプチド配列は、Ｒ−スポンジンフリンドメイン１またはその断片もしくはバリアントを含む。特定の実施形態では、第１のポリペプチド配列は、野生型配列または修飾配列である。加えて、第１のポリペプチド配列は、対応する天然全長Ｒ−スポンジンと比較して、ＬＧＲ４〜６への結合が増加、同等、または減少している可能性がある。いくつかの実施形態では、Ｒ−スポンジンまたはＲ−スポンジンフリンドメイン１は、配列番号１〜４に存在するＲ−スポンジンまたはＲ−スポンジンフリン１ドメインのいずれかと少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有する。特定の実施形態では、第２のポリペプチド配列は、ポリペプチド、抗体もしくはその断片もしくはバリアント、またはリガンドもしくはその断片もしくはバリアントである。
【００１０】
本明細書に開示される組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子の特定の例示的実施形態では、組織は骨組織であり、細胞表面受容体は副甲状腺ホルモン受容体１（ＰＴＨ１Ｒ）であるか、組織は肝臓組織であり、細胞表面受容体はアシアロ糖タンパク質受容体１（ＡＳＧＲ１）、アシアロ糖タンパク質受容体２（ＡＳＧＲ２）、トランスフェリン受容体２（ＴＦＲ２）、もしくは溶質キャリアファミリー１０メンバー１（ＳＬＣ１０Ａ１）であるか、または組織は口腔粘膜組織であり、細胞表面受容体はＬＹ６／ＰＬＡＵＲドメイン含有３（ＬＹＰＤ３）もしくはデスモグレイン３（ＤＳＧ３）である。
【００１１】
本明細書で開示される組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子の特定の例示的な実施形態では、細胞表面分子はＰＴＨ１であり、第２のポリペプチド配列はＰＴＨ１Ｒに特異的に結合するか、細胞表面分子はＡＳＧＲ１であり、第２のポリペプチド配列はＡＳＧＲ１に特異的に結合するか、細胞表面分子はＡＳＧＲ２であり、第２のポリペプチド配列はＡＳＧＲ２に特異的に結合するか、細胞表面分子はＳＬＣ１０Ａ１であり、第２のポリペプチド配列はＳＬＣ１０Ａ１に特異的に結合するか、細胞表面分子はＴＦＲ２であり、第２のポリペプチド配列はＴＦＲ２に特異的に結合するか、細胞表面分子はＬＹＰＤ３であり、第２のポリペプチド配列はＬＹＰＤ３に特異的に結合するか、または細胞表面分子はＤＳＧ３であり、第２のポリペプチド配列は、ＤＳＧ３に特異的に結合し、ここで、第２のポリペプチドは、抗体もしくはその断片、低分子、または細胞表面分子のリガンドもしくはその断片もしくはバリアントである。
【００１２】
本明細書に記載の組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子の特定の実施形態では、第１のドメインおよび第２のドメインは、リンカー部分によって連結されている。特定の実施形態では、リンカー部分は、ペプチジルリンカー配列である。特定の実施形態では、ペプチジルリンカー配列は、グリシン、アスパラギン、セリン、トレオニンおよびアラニンからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸を含む。
【００１３】
特定の実施形態では、本明細書に記載の組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子は、単一のポリペプチド、例えば、第１のドメインおよび第２のドメインを含む融合タンパク質からなる。特定の実施形態では、本明細書に記載の組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子は、それぞれ第１のドメインおよび第２のドメインを含む２つ以上の融合タンパク質を含む二量体または多量体などの２つ以上のポリペプチドを含み、ここで、２つ以上のポリペプチドは、例えば、リンカー部分を通して、または２つ以上のポリペプチドのそれぞれにおけるアミノ酸残基間の結合、例えばシステイン残基間の分子間ジスルフィド結合を介して結合している。特定の実施形態では、本明細書に記載の組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子は、２つ以上のポリペプチド配列を含む。例えば、組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子は、第１のドメインまたは第２のドメインのいずれかを構成する抗体重鎖および軽鎖（またはその抗原結合断片）を含み得、ここで、もう一方のドメイン（すなわち、第２のドメインまたは第１のドメイン）は、融合タンパク質として、またはリンカー部分を介して、抗体重鎖または軽鎖に結合している。特定の実施形態では、もう一方のドメインは、重鎖のＮ末端、重鎖のＣ末端、軽鎖のＮ末端、または軽鎖のＣ末端に結合している。そのような構造は、本明細書では付加ＩｇＧスキャフォールドまたはフォーマットと呼ばれ得る。
【００１４】
関連する実施形態では、本発明は、本明細書に開示の組織特異的Ｗｎｔシグナル増強融合タンパク質またはそのサブユニット、例えば、付加または融合した第１のドメインまたは第２のドメインを有する抗体重鎖または軽鎖をコードする核酸配列を含む。さらなる関連実施形態では、本発明は、核酸配列を含むベクターを含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、例えば、細菌細胞または真核細胞における発現に適した様式で核酸配列に機能的に連結されたプロモーター配列を含む発現ベクターである。別の実施形態では、ベクターは、機能的ｍＲＮＡのインビトロ翻訳および修飾のために操作される。さらなる関連実施形態では、本発明は、ベクターを含む宿主細胞を含む。さらに別の関連実施形態では、本発明は、融合ポリペプチドが発現ベクターによって発現される条件下で宿主細胞を培養することを含む、本明細書に記載の組織特異的Ｗｎｔシグナル増強融合タンパク質の生成方法を含む。いくつかの実施形態では、方法は、生成される融合ポリペプチドを単離する工程をさらに含む。
【００１５】
別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子またはその薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される希釈剤、アジュバントまたは担体と、を含む薬学的組成物を提供する。
【００１６】
別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子またはその薬学的に許容される塩をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドと、薬学的に許容される希釈剤、アジュバントまたは担体と、を含む薬学的組成物を提供する。特定の実施形態では、核酸配列は、ＤＮＡまたはｍＲＮＡ、場合により修飾ｍＲＮＡを含む。
【００１７】
別の実施形態では、本発明は、組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子またはその薬学的に許容される塩をコードする核酸配列を含むベクターと、薬学的に許容される希釈剤、アジュバントまたは担体と、を含む薬学的組成物を提供する。特定の実施形態では、ベクターは、組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子の発現を駆動する、核酸配列に機能的に連結されたプロモーターを含む。特定の実施形態では、ベクターは、発現ベクターまたはウイルスベクターである。
【００１８】
別の実施形態では、本発明は、Ｗｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチド、もしくはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト（例えば、天然もしくは操作された）、またはそれらの薬学的に許容される塩をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドと、薬学的に許容される希釈剤、アジュバントまたは担体と、を含む薬学的組成物を提供する。特定の実施形態では、核酸配列は、ＤＮＡまたはｍＲＮＡ、場合により修飾ｍＲＮＡを含む。
【００１９】
別の実施形態では、本発明は、Ｗｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチド、もしくはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト（例えば、天然もしくは操作された）、またはそれらの薬学的に許容される塩をコードする核酸配列を含むベクターと、薬学的に許容される希釈剤、アジュバントまたは担体と、を含む薬学的組成物を提供する。特定の実施形態では、ベクターは、Ｗｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチド、またはＷｎｔシグナル伝達アゴニストの発現を駆動する、核酸配列に機能的に連結されたプロモーターを含む。特定の実施形態では、ベクターは、発現ベクターまたはウイルスベクターである。
【００２０】
別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子またはその薬学的に許容される塩と、Ｗｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチド、もしくはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト、またはそれらの薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される希釈剤、アジュバントまたは担体と、を含む薬学的組成物を提供する。
【００２１】
別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子またはその薬学的に許容される塩をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドと、Ｗｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチド、もしくはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト、またはそれらの薬学的に許容される塩をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドと、薬学的に許容される希釈剤、アジュバントまたは担体と、を含む薬学的組成物を提供する。特定の実施形態では、核酸配列は、ＤＮＡまたはｍＲＮＡ、場合により修飾ｍＲＮＡを含む。
【００２２】
別の実施形態では、本発明は、組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子またはその薬学的に許容される塩をコードする核酸配列を含むベクターと、Ｗｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチド、もしくはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト、またはそれらの薬学的に許容される塩をコードする核酸配列を含むベクターと、薬学的に許容される希釈剤、アジュバントまたは担体と、を含む薬学的組成物を提供する。特定の実施形態では、ベクターは、組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子の発現を駆動する、核酸配列に機能的に連結されたプロモーターを含む。特定の実施形態では、ベクターは、発現ベクターまたはウイルスベクターである。
【００２３】
さらなる実施形態では、本発明は、標的組織を本明細書に記載の組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子と接触させることを含む、標的組織におけるＷｎｔシグナル伝達を増加させるための方法であって、第２のドメインが標的組織上の細胞特異的表面分子に特異的に結合し、組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子が標的組織に結合し、標的組織におけるＺＮＲＦ３およびＲＮＦ４３から選択される１つ以上の膜貫通型Ｅ３ユビキチンリガーゼを隔離またはそのエンドサイトーシスを増加させる、方法を含む。
【００２４】
本明細書に記載のいずれかの方法の特定の実施形態では、組織は骨組織であり、細胞表面分子はＰＴＨ１Ｒであるか、組織は肝臓組織であり、細胞表面分子はＡＳＧＲ１、ＡＳＧＲ２、ＴＦＲ２、もしくはＳＬＣ１０Ａ１であるか、または組織は口腔粘膜組織であり、細胞表面受容体はＬＹＰＤ３もしくはＤＳＧ３である。特定の実施形態では、標的組織または細胞を、組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド、または組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子をコードする核酸配列を含むベクター、例えば、発現ベクターもしくはウイルスベクターと接触させる。
【００２５】
さらなる実施形態では、本発明は、標的組織におけるＷｎｔシグナル伝達を増加させるための方法であって、標的組織を、Ｗｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチド、もしくはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト、またはそれらの薬学的に許容される塩と接触させることを含む、方法を含む。特定の実施形態では、標的組織または細胞を、Ｗｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチド、もしくはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト、もしくはそれらの薬学的に許容される塩をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド、またはＷｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチド、もしくはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト、もしくはそれらの薬学的に許容される塩をコードする核酸配列を含むベクターと接触させる。
【００２６】
さらなる実施形態では、本発明は、標的組織を、第２のドメインが標的組織上の細胞特異的表面分子に特異的に結合し、組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子が標的組織に結合し、標的組織におけるＺＮＲＦ３およびＲＮＦ４３から選択される１つ以上の膜貫通型Ｅ３ユビキチンリガーゼを隔離またはそのエンドサイトーシスを増加させる、本明細書に記載の組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子、およびＷｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチド、もしくはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト、またはそれらの薬学的に許容される塩と接触させることを含む、標的組織におけるＷｎｔシグナル伝達を増加させるための方法を含む。特定の実施形態では、標的組織または細胞を、組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドおよびＷｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチド、またはＷｎｔシグナル伝達アゴニストをコードする核酸と接触させる。他の実施形態では、標的組織または細胞を、組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子をコードする核酸配列を含むベクターおよびＷｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチド、またはＷｎｔシグナル伝達アゴニストをコードするベクターと接触させる。
【００２７】
さらに別の関連実施形態では、本発明は、疾患または状態の治療または予防を必要とする対象においてそれを行うための方法であって、疾患または状態が、Ｗｎｔシグナル伝達の減少と関連しているか、またはＷｎｔシグナル伝達の増加から恩恵を受け、組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子またはその薬学的に許容される塩を、単独で、またはＷｎｔ、ノリン、もしくはＷｎｔ活性化／模倣分子と組み合わせてかのいずれかで含む有効量の薬学的組成物を対象に提供することを含む、方法を含む。特定の実施形態では、方法は、組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡもしくはｍＲＮＡ）、または組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子をコードする核酸配列を含むベクター（例えば、発現ベクターもしくはウイルスベクター）を含む薬学的組成物を、単独で、またはＷｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチド、またはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡもしくはｍＲＮＡ）、またはＷｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチド、またはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする核酸配列を含むベクター（例えば、発現ベクターもしくはウイルスベクター）を含む薬学的組成物と組み合わせて使用して行われる。
【００２８】
さらに別の関連実施形態では、本発明は、疾患または状態の治療または予防を必要とする対象においてそれを行うための方法であって、疾患または状態が、Ｗｎｔシグナル伝達の減少と関連しているか、またはＷｎｔシグナル伝達の増加恩恵を受け、Ｗｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチド、またはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子を含む有効量の薬学的組成物を対象に提供することを含む、方法を含む。特定の実施形態では、方法は、Ｗｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチド、またはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡもしくはｍＲＮＡ）、またはＷｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチド、またはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする核酸配列を含むベクター（例えば、発現ベクターもしくはウイルスベクター）を含む薬学的組成物を使用して行われる。
【００２９】
本明細書に記載の治療方法のいずれかの特定の実施形態では、疾患または障害は、骨組織、肝臓組織、皮膚組織、胃組織、腸管組織、口腔粘膜組織、腎臓組織、中枢神経系組織、乳腺組織、味蕾組織、卵巣組織、内耳組織（蝸牛および前庭組織を含む）、毛包、膵臓組織、網膜組織、血管組織、角膜組織、心臓組織および肺組織からなる群から選択される組織の疾患または障害である。特定の例示的な実施形態では、疾患または障害は、骨組織の疾患または障害であり、細胞表面受容体は、ＰＴＨ１Ｒであるか、肝臓組織の疾患または障害であり、細胞表面受容体は、ＡＳＧＲ１、ＡＳＧＲ２、ＴＦＲ２、またはＳＬＣ１０Ａ１であるか、または口腔粘膜組織の疾患または障害であり、細胞表面受容体は、ＬＹＰＤ３またはＤＳＧ３である。特定の例示的な実施形態では、疾患または状態は、骨折、骨粗鬆症、骨粗鬆症性骨折、脊椎固定術、整形外科用装置の骨結合、腱と骨の統合、歯の成長と再生、歯科インプラント術、歯周病、顎顔面再建、顎骨壊死、脱毛症、難聴、前庭機能低下、黄斑変性、硝子体網膜症、網膜変性症、糖尿病性網膜症、フックスジストロフィー、脳卒中、外傷性脳損傷、アルツハイマー病、多発性硬化症、脊髄損傷、口腔粘膜炎、腸粘膜炎、短腸症候群、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、メタボリックシンドローム、糖尿病、膵炎、外分泌膵機能不全、創傷治癒、糖尿病性足部潰瘍、冠状動脈疾患、急性腎臓病、慢性腎臓病、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、特発性肺線維症、急性肝不全、急性アルコール性肝障害、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）による慢性肝疾患、ＨＣＶ患者の抗ウイルス薬治療後、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）による慢性肝疾患、ＨＢＶ患者の抗ウイルス薬治療後、慢性アルコール性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝疾患および非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、ならびにあらゆる原因による慢性肝不全からなる群から選択される。本明細書に記載のいずれかの治療または予防の方法の特定の実施形態では、薬学的組成物は、全身的に、非経口的に、経口的に、筋肉内に、局所的に、または局部的に提供される。特定の実施形態では、対象は、哺乳動物、場合によりヒトである。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
本開示の特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に記載されている。本発明の特徴および利点のよりよい理解は、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を説明する以下の詳細な説明、および添付の図面を参照することによって得られるであろう。
【００３１】
【図１】Ｒ−スポンジンのＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３およびＬＧＲ４〜６への結合を表す図を提供する。左側の図は、ＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３およびＬＧＲ４〜６の両方に結合する野生型Ｒ−スポンジンを示し、右側の図は、ＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３に結合することができるが、ＬＧＲ４〜６に結合することが不可能であるか、または妥協されているフリンドメイン２を欠く（またはフリンドメイン２が変異した）不活性Ｒ−スポンジン変異体を示す。
【図２】本明細書に開示される組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子の一実施形態の概略図を提供する。分子は、限定されないが、組織特異的細胞表面タンパク質に結合する「標的ドメイン」と、ＺＮＲＦ３および／またはＲＮＦ４３に結合することができる「作用ドメイン」と、を含む融合タンパク質を含む複合分子である。
【図３】本明細書に記載の組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子の効果を例示し、分子が標的組織に優先的に結合することを示す図を提供する。特異的標的細胞表面受容体を欠く非標的組織において、組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子は、ＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３に結合してもしなくてもよく、Ｅ３リガーゼを内在化または除去せず、非標的組織において本質的に不活性である（上図）。特異的標的細胞表面受容体を有する標的組織において、組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子は、その標的ドメインを介して標的組織に結合し、作用ドメインは標的組織上のＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３に結合し、標的組織におけるＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３の隔離またはエンドサイトーシスを誘発する（下図）。
【図４】４つ全てのヒトＲ−スポンジンタンパク質（Ｒｓｐｏ１（配列番号１）；Ｒｓｐｏ２（配列番号２）；Ｒｓｐｏ３（配列番号３）；およびＲｓｐｏ４（配列番号４））のアラインメントを示し、フリンドメイン１（Ｆｕ１）および２（Ｆｕ２）にそれぞれ明暗の陰影を付けた。Ｆｕ１ドメインは、一般に、配列番号１の約アミノ酸残基３８〜９４、配列番号２の約アミノ酸残基３７〜９３、配列番号３の約アミノ酸残基３９〜９５、および配列番号４の約アミノ酸残基３２〜８８に対応する。Ｆｕ２ドメインは、一般に、配列番号１の約アミノ酸残基９７〜１４４、配列番号２の約アミノ酸残基９６〜１４３、配列番号３の約アミノ酸残基９８〜１４４、および配列番号４の約アミノ酸残基９１〜１３７に対応する。
【図５】例示的な組織特異的Ｗｎｔシグナル増強融合タンパク質による、Ｗｎｔシグナル伝達の細胞特異的アップレギュレーションを実証する。図５Ａは、試験した３つの構築物のスキームを提供する。上から下まで：（１）野生型Ｆｕ１およびＦｕ２ドメイン（アミノ酸残基３７〜１４３）を含む機能的ヒトＲｓｐｏ２断片（配列番号６；配列番号５に提供されるＤＮＡをコードする）に融合した抗ＧＦＰ、（２）ＬＧＲタンパク質への結合を排除する、Ｆｕ２ドメイン（Ｆ１０５Ａ／Ｆ１０９Ａ）に点変異を有するヒトＲｓｐｏ２に融合した抗ＧＦＰ（配列番号８；配列番号７に提供されるＤＮＡをコードする）、（３）同じＲｓｐｏ２変異体構築物に融合した、ヒト肝臓／肝細胞特異的表面受容体ＡＳＧＲ１に結合する１つの抗体（配列番号１０；配列番号９に提供されるＤＮＡをコードする）。図５Ｂは、それぞれ肝臓および非肝臓細胞を表す、ヒト肝臓癌Ｈｕｈ−７細胞およびヒト類表皮癌Ａ４３１細胞におけるＡＳＧＲ１／２およびＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３発現の定量的ＰＣＲ分析を示す。上のグラフは、同じ細胞株におけるＧＡＰＤＨ対照と比較した関連発現レベルを示す。下のグラフは、１として設定されたＨｕｈ−７の相対レベルとの比較を示す。図５Ｃは、Ｈｕｈ−７細胞におけるＷｎｔ増強活性をモニターするレポーターアッセイの結果を示す。グラフは、Ｗｎｔシグナル伝達活性をモニターするスーパートップフラッシュ（ＳＴＦ）レポーターアッセイの結果を示す。細胞は、Ｗｎｔ応答性プロモーターによって制御されるルシフェラーゼ遺伝子を含んでいた。指定されたように設計された融合タンパク質を発現するプラスミドによって細胞を一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションの３時間後に、Ｗｎｔ３ａ馴化培地を添加して、全培地体積の１０％を構成した。トランスフェクションの４０時間後、細胞をルシフェラーゼ活性についてアッセイした。ルシフェラーゼ活性を偽トランスフェクション（ＤＮＡなし）に対して正規化した。図の下部は、融合タンパク質のウエスタンブロットを示す。全ての融合タンパク質は、分泌のためにＮ末端にシグナルペプチド（タンパク質成熟の過程で切断された）および検出のためにＣ末端にＦＬＡＧタグを含んでいた。抗体は、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の形態であった。１０μｌの培養上清を、ルシフェラーゼアッセイの直前に採取した培養上清を用いて、抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体Ｍ２を用いてウエスタンブロットにより分析した。図５Ｄは、Ａ４３１細胞におけるＷｎｔ増強活性をモニターするレポーターアッセイの結果を示す。実験設定は、細胞がヒトＴＦＲ２またはヒトＡＳＧＲ１のいずれかを発現するベクターで同時トランスフェクトされたことを除いて、図５Ｃに記載のものと同じである。
【図６】Ｒｓｐｏ２変異の追加の組み合わせが基礎活性および標的活性に及ぼす影響を示すグラフを提供する。図６Ａは、Ｒｓｐｏ２とＥ３リガーゼとの相互作用に重要なＦｕ１ドメイン内のいくつかの示された残基に焦点を合わせ、Ｆ１０５Ａ／Ｆ１０９Ａ二重変異と組み合わせたこれらの変異の効果を示す。図６Ｂは、ＬＧＲ結合Ｆｕ２ドメインにおける二重変異を示された一点変異に緩和した効果を示す。図６Ｃは、ＬＧＲタンパク質との相互作用を減少させるための方法として、Ｆ１０５Ａ／Ｆ１０９Ａ二重変異の代替としての、Ｆｕ２ドメインのフェニルアミン１０５（Ｆ１０５Ｒ）残基におけるさらなる変異の例を提供する。図６Ａ〜６Ｃに示されるように、Ｆ１０５Ｒ変異は、Ｆ１０９Ａ変異と一緒に、標的活性を有意に損なうことなく基礎レベルを低下させ得る。図６Ｃにおいて、標的ドメインは、抗ヒトＴＦＲ１であり、これは図７Ａおよび７Ｂにさらに記載されている。Ｈｕｈ−７細胞を特定の構築物でトランスフェクトし、図５Ａ〜５Ｄの説明に記載のようにアッセイした。
【図７】第２の受容体、ヒトＴＦＲ１を標的とすることによる別の例を提供する。図７Ａは、Ｈｕｈ−７細胞の一過性トランスフェクションに基づくレポーターアッセイを示す。図７Ｂは、Ａ４３１細胞における同じアッセイを示す。ウエスタンブロットは、融合タンパク質のＦＬＡＧタグを検出する同じ膜からの画像である。さらなる手順の詳細は、図５Ａ〜５Ｄの説明に見出すことができる。
【図８−１】変異型Ｒｓｐｏ２をｓｃＦｖ形態の標的化（抗ＡＳＧＲ１または抗ＴＦＲ１）または非標的化（対照、抗ＧＦＰ）ドメインに融合させた精製タンパク質によるＷｎｔシグナル伝達活性の増強を示す。図８Ａは、特定の標的ドメインおよび作用ドメインとしての変異体Ｒｓｐｏ２からなるタンパク質のクマシー染色ゲル画像を示す。左はタンパク質標準のｋＤである。図８Ｂは、Ｈｕｈ−７細胞における、ＡＳＧＲ１−標的化Ｒｓｐｏ２（Ｆ１０５Ａ／Ｆ１０９Ａ）または（Ｆ１０９）変異体融合タンパク質のＳＴＦ活性を陰性対照（抗ＧＦＰ構築物；左）および陽性対照（Ｒｓｐｏ２、右）と比較し、これは、Ｃ末端にＨｉｓタグを有する、ヒトＲｓｐｏ２  Ｆｕ１およびＦｕ２ドメイン（Ｓ３６〜Ｅ１４３）に対応する。図８Ｃは、３つの異なる細胞株：ヒト肝癌Ｈｕｈ−７、ヒト結腸直腸腺癌ＨＴ２９、およびマウス正常肝臓ＦＬ８３Ｂにおける３つの標的タンパク質とＲｓｐｏ２陽性対照との比較を提供する。ＴＦＲ１抗体は、ヒト特異的であるが、ＡＳＧＲ１抗体は、マウスＡＳＧＲ１と交差反応し得る。３つ全ての細胞株は、レポーター遺伝子が組み込まれており、１０％Ｗｎｔ３ａ馴化培地の存在下で約１８時間、特定の濃度のタンパク質によって処理された。試験した各投与量について、Ｈｕｈ−７細胞からのデータは左側にあり、ＨＴ２９細胞からのデータは中央にあり、ＦＬ８３Ｂ細胞からのデータは右側にある。
【図８−２】変異型Ｒｓｐｏ２をｓｃＦｖ形態の標的化（抗ＡＳＧＲ１または抗ＴＦＲ１）または非標的化（対照、抗ＧＦＰ）ドメインに融合させた精製タンパク質によるＷｎｔシグナル伝達活性の増強を示す。図８Ａは、特定の標的ドメインおよび作用ドメインとしての変異体Ｒｓｐｏ２からなるタンパク質のクマシー染色ゲル画像を示す。左はタンパク質標準のｋＤである。図８Ｂは、Ｈｕｈ−７細胞における、ＡＳＧＲ１−標的化Ｒｓｐｏ２（Ｆ１０５Ａ／Ｆ１０９Ａ）または（Ｆ１０９）変異体融合タンパク質のＳＴＦ活性を陰性対照（抗ＧＦＰ構築物；左）および陽性対照（Ｒｓｐｏ２、右）と比較し、これは、Ｃ末端にＨｉｓタグを有する、ヒトＲｓｐｏ２  Ｆｕ１およびＦｕ２ドメイン（Ｓ３６〜Ｅ１４３）に対応する。図８Ｃは、３つの異なる細胞株：ヒト肝癌Ｈｕｈ−７、ヒト結腸直腸腺癌ＨＴ２９、およびマウス正常肝臓ＦＬ８３Ｂにおける３つの標的タンパク質とＲｓｐｏ２陽性対照との比較を提供する。ＴＦＲ１抗体は、ヒト特異的であるが、ＡＳＧＲ１抗体は、マウスＡＳＧＲ１と交差反応し得る。３つ全ての細胞株は、レポーター遺伝子が組み込まれており、１０％Ｗｎｔ３ａ馴化培地の存在下で約１８時間、特定の濃度のタンパク質によって処理された。試験した各投与量について、Ｈｕｈ−７細胞からのデータは左側にあり、ＨＴ２９細胞からのデータは中央にあり、ＦＬ８３Ｂ細胞からのデータは右側にある。
【図９】完全ＩｇＧの形態の標的ドメインを有する構築物の標的Ｗｎｔシグナル増強活性を示す。上部には、付加ＩｇＧ構築物の図がある。上の図は、ＧＦＰまたはヒトＴＦＲ１受容体のいずれかに対するヒトＩｇＧ２重鎖のＮ末端に付加されたＲｓｐｏ２  Ｆ１０５Ｒ／Ｆ１０９Ａ変異体を示す。下の図は、ＧＦＰまたはヒトＴＦＲ１受容体のいずれかに対するヒトＩｇＧ２軽鎖のＮ末端に付加されたＲｓｐｏ２  Ｆ１０５Ｒ／Ｆ１０９Ａ変異体を示す。Ｒｓｐｏ２  Ｆ１０５Ｒ／Ｆ１０９Ａ変異体に融合したＴＦＲ１一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）と共にこれらの構築物（それぞれ軽鎖および重鎖を有する）を、ルシフェラーゼレポーターを用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＴＦＲ１受容体を発現する）に一過性にトランスフェクトした。下部には、トランスフェクションの４０時間後のＳＴＦアッセイの図式的な概要がある。トランスフェクション後、１０％Ｗｎｔ３ａ馴化培地を培養物に添加した。ＳＴＦアッセイは、図５Ａ〜５Ｄの説明に記載されているように実施した。
【図１０】ＬＧＲタンパク質との相互作用を減少させ、標的ドメインに融合したときに標的Ｗｎｔ増強活性を支持する方法として、Ｒｓｐｏ２変異のさらなる組み合わせで得られた結果を示すグラフを提供する。特定の構築物を一過性トランスフェクションによりＨｕｈ−７細胞に導入した。さらなる手順の詳細は、図５Ａ〜５Ｄの説明に見出すことができる。
【図１１】Ｈｕｈ−７細胞における、ＴＦＲ１を標的とするＲｓｐｏ２（Ｆ１０５Ｒ／Ｆ１０９Ａ）変異体融合タンパク質のＳＴＦ活性を陰性対照（抗ＧＦＰ構築物）および陽性対照（Ｒｓｐｏ２）と比較する。ルシフェラーゼ活性は、任意の単位である。さらなる手順の詳細は、図８Ａ〜８Ｃの説明に見出すことができる。
【図１２】トランスフェクション時の抗ＡＳＧＲ１−Ｒｓｐｏ２（Ｆ１０５Ａ／Ｆ１０９Ａ）融合タンパク質に応答した非ＡＳＧＲ１発現細胞株Ａ４３１と、ＡＳＧＲ１（左）またはＴＦＲ２（右、対照として使用）のいずれかを過剰発現するプラスミドとの比較を提供する。全ての細胞株は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子が組み込まれており、最初に特定の受容体プラスミドによってトランスフェクトされた。２４時間後、細胞を、１０％Ｗｎｔ３ａ馴化培地の存在下で約１８時間、特定の濃度のタンパク質で処理し、次いでルシフェラーゼ活性についてアッセイした。
【図１３】ヒトＴＦＲ１受容体を標的とする精製付加ＩｇＧタンパク質のＷｎｔシグナル刺激活性を示す。ＴＦＲ１に対するＩｇＧ２の重鎖のＮ末端に融合したＦ１０５Ｒ／Ｆ１０９Ａ  Ｒｓｐｏ２変異体を、Ｒｓｐｏ２陽性対照を用いた抗ＧＦＰとの融合と比較した。ＳＴＦアッセイを、ＳＴＦレポーターを含む、２つの細胞株、左側にＨｕｈ−７、右側にＨＥＫ２９３Ｔで実施した。両方の細胞株は、標的受容体ＴＦＲ１を発現する。ルシフェラーゼ活性は、任意の単位である。
【図１４−１】付加ＩｇＧの例示的な足場を用いて得られた結果を示す。変異体Ｒｓｐｏ２は、図１４Ａの右側の図のように、重鎖のＮ末端（Ｎ−ＨＣ）、軽鎖のＮ末端（Ｎ−ＬＣ）、または軽鎖のＣ末端（Ｃ−ＬＣ）に共有結合していた。２種類のＩｇＧを分析した。ＩｇＧ２（野生型、図１４Ａ〜Ｃ）またはＩｇＧ１（Ｎ２９７Ｇ「エフェクターなし」変異を有する、図１４Ｄ〜Ｅ）。標的化抗体は、抗ヒトＡＳＧＲ１およびＴＦＲ１であり、対照抗体は、抗ＧＦＰであった。精製タンパク質のＳＴＦ活性を、３０％Ｗｎｔ３ａ馴化培地の存在下で、Ｈｕｈ−７（ｈＡＳＧＲ１＋／ｈＴＦＲ１＋；図１４Ａおよび図１４Ｄ）、２９３（ｈＡＳＧＲ１−／ｈＴＦＲ１＋；図１４Ｂおよび図１４Ｅ）、およびＦＬ８３Ｂ（マウス細胞株、ｈＡＳＧＲ１−／ｈＴＦＲ１−；図１４Ｃ）細胞株において試験した。Ｒｓｐｏ２を陽性対照として使用した。陰性対照は、３０％Ｗｎｔ３ａ馴化培地のみ（「Ｗｎｔのみ」）による処理であった。
【図１４−２】付加ＩｇＧの例示的な足場を用いて得られた結果を示す。変異体Ｒｓｐｏ２は、図１４Ａの右側の図のように、重鎖のＮ末端（Ｎ−ＨＣ）、軽鎖のＮ末端（Ｎ−ＬＣ）、または軽鎖のＣ末端（Ｃ−ＬＣ）に共有結合していた。２種類のＩｇＧを分析した。ＩｇＧ２（野生型、図１４Ａ〜Ｃ）またはＩｇＧ１（Ｎ２９７Ｇ「エフェクターなし」変異を有する、図１４Ｄ〜Ｅ）。標的化抗体は、抗ヒトＡＳＧＲ１およびＴＦＲ１であり、対照抗体は、抗ＧＦＰであった。精製タンパク質のＳＴＦ活性を、３０％Ｗｎｔ３ａ馴化培地の存在下で、Ｈｕｈ−７（ｈＡＳＧＲ１＋／ｈＴＦＲ１＋；図１４Ａおよび図１４Ｄ）、２９３（ｈＡＳＧＲ１−／ｈＴＦＲ１＋；図１４Ｂおよび図１４Ｅ）、およびＦＬ８３Ｂ（マウス細胞株、ｈＡＳＧＲ１−／ｈＴＦＲ１−；図１４Ｃ）細胞株において試験した。Ｒｓｐｏ２を陽性対照として使用した。陰性対照は、３０％Ｗｎｔ３ａ馴化培地のみ（「Ｗｎｔのみ」）による処理であった。
【図１５】選択された細胞株における標的Ｗｎｔシグナル増強活性を示す、４つ全てのヒトＲ−スポンジンの比較からの結果を提供する。図１５Ａは、ヒトＨｕｈ−７（左）またはＨＥＫ２９３Ｔ（右）細胞における、抗ＧＦＰ（ｓｃＦｖフォーマット）に融合した野生型ヒトＲｓｐｏ１〜４のＦｕ１−Ｆｕ２ドメインのＷｎｔシグナル増強活性を比較する。図１５Ｂは、基礎的な非標的活性のための対照として抗ＧＦＰへの融合を用いて、Ｈｕｈ−７（ｈＡＳＧＲ１＋／ｈＴＦＲ１＋）またはＨＥＫ２９３Ｔ（ｈＡＳＧＲ１−／ｈＴＦＲ１＋）細胞における、抗ＡＳＧＲ１または抗ＴＦＲ１と融合した場合のヒトＲｓｐｏ２変異体（Ｆ１０５Ａ／Ｆ１０９Ａ、「ＡＡ」、またはＦ１０５Ｒ／Ｆ１０９Ａ、「ＲＡ」）の（標的化）活性の増強を示す。図１５Ｃは、抗ＧＦＰ融合対照とは対照的に、Ｈｕｈ−７またはＨＥＫ２９３Ｔ細胞における、抗ＡＳＧＲ１または抗ＴＦＲ１に融合した場合のヒトＲｓｐｏ３変異体の（標的化）活性の増強を示す。３０％Ｗｎｔ３ａ馴化培地をＳＴＦアッセイに供給した。Ｒｓｐｏ２を陽性対照として使用した。陰性対照は、３０％Ｗｎｔ３ａ馴化培地のみ（「Ｗｎｔのみ」）による処理であった。
【図１６】組織特異的Ｗｎｔシグナル伝達増強物を構築するために使用され得るＲｓｐｏ３変異の非限定的な例を提供する。図１６Ａは、試験された変異を列挙する。これらの変異体Ｒｓｐｏ３（Ｆｕ１−Ｆｕ２）ドメインを抗ＡＳＧＲ１または抗ＧＦＰ  ｓｃＦｖに融合し、精製タンパク質の活性を、３０％Ｗｎｔ３ａ馴化培地の存在下でＳＴＦアッセイによりＨｕｈ−７細胞において試験した。結果を図１６Ｂ（抗ＧＦＰ対照用）および図１６Ｃ（抗ＡＳＧＲ１標的化構築物用）にまとめた。抗ＧＦＰに融合したＲｓｐｏ２および野生型Ｒｓｐｏ３（Ｆｕ１−Ｆｕ２ドメイン）を、アッセイにおける陽性対照として使用した。
【図１７】作用ドメインがＲｓｐｏ足場とは構造的に独立しているＥ３リガーゼ結合剤からなるＷｎｔシグナル増強分子設計の例を示す。図１７Ａは、試験した機能性分子の構造を示し、それはヒトＡＳＧＲ１またはＴＦＲ１に対するＩｇＧ２の重鎖のＮ末端に共有結合したヒトＺＮＲＦ３に対するＦａｂ（または陰性対照としての抗ＧＦＰ）からなる。図１７Ｂは、ヒト肝臓Ｈｕｈ−７細胞を用いたＳＴＦの結果を示す。アッセイは、３０％Ｗｎｔ馴化培地の存在下で行い、Ｒｓｐｏ２を陽性対照として用いた。
【図１８】組織特異的Ｗｎｔシグナル増強デザインを他の標的組織、特定の細胞表面受容体を介した口腔粘膜に適用する例を示す。図１８Ａは、３つの異なる細胞株におけるＬＹＰＤ３、ＤＳＧ３、ＺＮＲＦ３およびＲＮＦ４３遺伝子発現のＱ−ＰＣＲ分析を示す。ＣＡＬ２７およびＳＣＣ２５は、もともとヒト舌由来の扁平上皮癌細胞株であり、Ａ４３１は、ヒト皮膚由来の類表皮癌細胞株である。上のグラフは、ＡＣＴＢ遺伝子対照と比較した各遺伝子の相対的発現レベルを示し、下のグラフは、１としたＣＡＬ２７中の各遺伝子の相対的レベルとの比較を示す。図１８Ｂは、３０％Ｗｎｔ３ａ馴化培地の存在下で１６〜１８時間処理した後の、特定のタンパク質のＣＡＬ２７、ＳＣＣ２５およびＡ４３１細胞におけるＷｎｔシグナル増強活性をモニターするＳＴＦレポーターアッセイの結果を示す。タンパク質は、ヒトＬＹＰＤ３、ヒトＤＳＧ３、およびＧＦＰに対するモノクローナル抗体の重鎖のＮ末端にＲｓｐｏ２（Ｆ１０５Ｒ／Ｆ１０９Ａ）変異体を融合することによって構築された。Ｒｓｐｏ２を対照として使用した。
【図１９】例示的な肝臓特異的Ｗｎｔシグナル増強分子のインビボ機能を示す。図１９Ａは実験スキームを示す。肝臓にｈＡＳＧＲ１の異所性発現を導入するために、８週齢のマウスにｈＡＳＧＲ１コード配列を含むＡＡＶベクターを最初に注射した。７日後、マウスを、８つの群に分けて試験および対照タンパク質で処置した。８時間後、マウスを安楽死させ、肝臓試料を遺伝子発現の定量的ＰＣＲ分析のために採取した。図１９Ｂは、マウス肝臓における異所性ｈＡＳＧＲ１の発現レベルを示す。処置の用量は、抗ＧＦＰ（１ｍｇ／ｋｇ）、Ｒｓｐｏ２（０．４６ｍｇ／ｋｇ）、抗ＧＦＰ−Ｒｓｐｏ２（Ｆ１０５Ｒ／Ｆ１０９Ａ）（１ｍｇ／ｋｇ）、または抗ＡＳＧＲ１−Ｒｓｐｏ２（Ｆ１０５Ｒ／Ｆ１０９Ａ）（１ｍｇ／ｋｇ）で、それぞれ単独（左の４つの群）または３ｍｇ／ｋｇのＷｎｔアゴニストタンパク質（１８Ｒ５−Ｄｋｋ１ｃ，Ｊａｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７  Ｎａｔｕｒｅ）との組み合わせのいずれか（右の４つの群）であった。図１９Ｃは、処置に応答したＷｎｔシグナル伝達標的遺伝子Ａｘｉｎ２の誘導を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本開示は、組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子を提供し、特定の実施形態では、分子は、１）組織特異的または細胞特異的な細胞表面受容体に選択的に結合し、２）標的組織または細胞型におけるＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３の内在化または隔離を媒介し、３）組織特異的様式でＷｎｔシグナル伝達を増強する。特定の実施形態では、分子は、融合タンパク質である。特定の実施形態では、分子は、追加の付加結合ドメインを有する抗体である。例えば、疾患または障害の治療または予防のために、標的組織または細胞型におけるＷｎｔシグナル伝達を増強する、すなわち増加させるための、本明細書に開示される薬学的組成物およびいずれかの組成物の使用のための方法も提供される。本発明のこれらおよび他の目的、利点ならびに特徴は、以下により十分に記載されるような組成物および方法の詳細を読むことで当業者には明らかになるであろう。
【００３３】
定義
本明細書で使用される「ベクター」は、ポリヌクレオチドを含むかまたはそれと会合し、細胞へのポリヌクレオチドの送達を媒介するために使用することができる巨大分子または巨大分子の会合を指す。例示的なベクターには、例えば、プラスミド、ウイルスベクター、リポソーム、および他の遺伝子送達媒体が含まれる。
【００３４】
用語「ポリヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはそれらの類似体を含む、任意の長さのポリマー形態のヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体などの修飾ヌクレオチドを含み得、非ヌクレオチド成分によって中断され得る。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーの組み立ての前または後に与えられてもよい。本明細書で使用されるポリヌクレオチドという用語は、二本鎖および一本鎖分子を互換的に指す。別段の指定または要求がない限り、ポリヌクレオチドである本明細書に記載の本発明の任意の実施形態は、二本鎖形態と二本鎖形態を構成することが知られているか、または予測される２つの相補的一本鎖形態のそれぞれの両方を包含する。
【００３５】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、別のポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対して特定のパーセントの「配列同一性」を有し、これは、整列させた場合、２つの配列を比較した場合に、その割合の塩基またはアミノ酸が同じであることを意味する。配列類似性は、いくつかの異なる方法で決定することができる。配列同一性を決定するために、ワールドワイドウェブ上でｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／で入手可能なＢＬＡＳＴを含む方法およびコンピュータープログラムを用いて配列を整列させることができる。別のアラインメントアルゴリズムは、米国ウィスコンシン州マディソン、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｉｎｃ．の完全所有子会社からＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）パッケージで入手可能なＦＡＳＴＡである。アラインメントのための他の技術は、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２６６：Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（１９９６），ｅｄ．Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ａ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｈａｒｃｏｕｒｔ  Ｂｒａｃｅ  ＆  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡに記載されている。特に興味深いのは、配列中のギャップを許容するアラインメントプログラムである。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎは、配列アラインメントにおけるギャップを許容するアルゴリズムの一種である。Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７０：１７３−１８７（１９９７）を参照。また、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈアラインメント法を用いたＧＡＰプログラムを利用して配列を整列させることができる。Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０）を参照。
【００３６】
興味深いのは、配列同一性を決定するためにＳｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズムを使用するＢｅｓｔＦｉｔプログラム（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２−４８９（１９８１））である。ギャップ生成ペナルティは、一般に、１〜５、通常２〜４の範囲であり、多くの実施形態では３である。ギャップ延長ペナルティは、一般に、約０．０１〜０．２０の範囲であり、多くの場合は０．１０である。プログラムは、比較されるために入力された配列によって決定されるデフォルトパラメーターを有する。好ましくは、配列同一性は、プログラムにより決定されたデフォルトパラメーターを用いて決定される。このプログラムは、米国ウィスコンシン州マディソンのＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）パッケージからも入手可能である。
【００３７】
興味のある他のプログラムは、ＦａｓｔＤＢアルゴリズムである。ＦａｓｔＤＢは、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．１２７−１４９，１９８８，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．に記載されている。パーセント配列同一性は、以下のパラメーター：ミスマッチペナルティ：１．００、ギャップペナルティ：１．００、ギャップサイズペナルティ：０．３３、および参加ペナルティ：３０．０に基づいてＦａｓｔＤＢによって計算される。
【００３８】
ポリヌクレオチドに適用される「組換え」は、ポリヌクレオチドがクローニング、制限または連結工程、および天然に見出されるポリヌクレオチドとは異なる構築物をもたらす他の手順の種々の組み合わせの生成物であることを意味する。
【００３９】
「制御要素」または「制御配列」は、ポリヌクレオチドの複製、複製、転写、スプライシング、翻訳、または分解を含む、ポリヌクレオチドの機能的調節に寄与する分子の相互作用に関与するヌクレオチド配列である。調節は、プロセスの頻度、速度、または特異性に影響を及ぼし得、本質的に増強または抑制的であり得る。当技術分野において既知の制御要素には、例えば、プロモーターおよびエンハンサーなどの転写調節配列が含まれる。プロモーターは、特定の条件下でＲＮＡポリメラーゼに結合し、通常、プロモーターの下流（３’方向）に位置するコード領域の転写を開始することができるＤＮＡ領域である。
【００４０】
「機能的に連結された」または「作動可能に連結された」は、遺伝的要素の並置を意味し、ここで、要素はそれらが期待される方法で機能することを可能にする関係にある。例えば、プロモーターがコード配列の転写の開始を助ける場合、プロモーターはコード領域に機能的に連結されている。この機能的関係が維持される限り、プロモーターとコード領域との間に介在残基があってもよい。
【００４１】
「発現ベクター」は、目的の遺伝子産物をコードする領域を含むベクターであり、意図される標的細胞において遺伝子産物の発現をもたらすために使用される。発現ベクターはまた、標的における遺伝子産物の発現を容易にするためにコード領域に機能的に連結された制御要素を含む。制御要素と遺伝子または発現のために作動可能に連結されている遺伝子との組み合わせは、「発現カセット」と呼ばれることがあり、その多くは当技術分野において既知であり入手可能であるか、または当技術分野において入手可能な要素から容易に構築することができる。
【００４２】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。この用語はまた、修飾されたアミノ酸ポリマーも包含する。例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、リン酸化、または標識成分との結合を含む。
【００４３】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、抗原性エピトープに特異的に結合するために必要な可変領域配列を含む単離されたまたは組換えの結合剤を意味する。したがって、抗体は、所望の生物学的活性、例えば、特異的標的抗原への結合を示す任意の形態の抗体またはその断片である。したがって、それは最も広い意味で使用され、特にモノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ナノ抗体、ダイアボディ、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、および所望の生物学的活性を示す限り、限定されないが、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、およびＦａｂ２を含む抗体断片を包含する。
【００４４】
「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部、例えば、インタクトな抗体の抗原結合領域または可変領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片、ダイアボディ、線状抗体（例えば、Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５））、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）、ならびに抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれる。抗体のパパイン消化は、それぞれ単一の抗原結合部位を有する「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片と、容易に結晶化する能力を反映した名称の「Ｆｃ」断片とを生じる。ペプシン処理は、２つの抗原結合部位を有し、なお抗原を架橋することができるＦ（ａｂ’）２断片を生じる。
【００４５】
「含む」とは、列挙された要素が、例えば、組成物、方法、キットなどに必要とされるが、例えば、組成物、方法、キットなどを形成するために、特許請求の範囲の範囲内で、他の要素が含まれ得ることを意味する。例えば、プロモーターに作動可能に連結した治療用ポリペプチドをコードする遺伝子を「含む」発現カセットは、遺伝子およびプロモーターに加えて、他の要素、例えば、ポリ−アデニル化配列、エンハンサー要素、他の遺伝子、リンカードメインなどを含み得る発現カセットである。
【００４６】
「から本質的になる」とは、記載されている、例えば、組成物、方法、キットなどの範囲が、例えば、組成物、方法、キットなどの基本的な特性および新規の特性に実質的な影響を及ぼさない指定の材料または工程に限定されることを意味する。例えば、プロモーターに作動可能に連結した治療用ポリペプチドをコードする遺伝子およびポリアデニル化配列「から本質的になる」発現カセットは、遺伝子の転写または翻訳に実質的な影響を及ぼさない限りは、追加的な配列、例えば、リンカー配列を含んでもよい。別の例として、列挙された配列「から本質的になる」バリアント、または変異体、ポリペプチド断片は、それが由来する全長のナイーブなポリペプチドに基づいて配列の境界に、列挙された配列のアミノ酸配列プラスまたはマイナス約１０アミノ酸残基、例えば、列挙された結合アミノ酸残基よりも１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１残基少ない、または列挙された結合アミノ酸残基よりも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０残基多いアミノ酸残基を有する。
【００４７】
「からなる」とは、組成物、方法、またはキットから、特許請求の範囲において指定されていないあらゆる要素、工程、または成分が排除されることを意味する。例えば、列挙された配列「からなる」ポリペプチドまたはポリペプチドドメインは、列挙された配列のみを含む。
【００４８】
「発現ベクター」とは、本明細書で使用される場合、目的の遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドを含む上記のまたは当技術分野で既知のベクター、例えば、プラスミド、ミニサークル、ウイルスベクター、リポソームなどを包含し、意図された標的細胞において遺伝子産物の発現をもたらすために使用されるものである。発現ベクターはまた、標的における遺伝子産物の発現を容易にするためにコード領域に機能的に連結された制御要素を含む。制御要素、例えば、プロモーター、エンハンサー、ＵＴＲ、ｍｉＲＮＡ標的配列などと、発現のために作動可能に連結した遺伝子（複数可）の組合せは、時には、「発現カセット」と称される。そのような制御要素は多くが既知であり、当技術分野において入手可能であるか、または当技術分野において入手可能な構成要素から容易に構築することができる。
【００４９】
「プロモーター」とは、本明細書で使用される場合、ＲＮＡポリメラーゼの結合を導き、それにより、ＲＮＡ合成を促進するＤＮＡ配列、すなわち、転写を導くために十分な最小の配列を包含する。プロモーターおよび対応するタンパク質またはポリペプチドの発現は、遍在する、つまり、広範囲の細胞、組織および種において強力に活性なものであってもよく、細胞型特異的、組織特異的、または種特異的なものであってもよい。プロモーターは、「構成的」、つまり、継続的に活性なものであってもよく、「誘導性」、つまり、生物要因または非生物要因の有無によって活性化または非活性化されるものであってもよい。プロモーター配列と連続していてもしてなくてもよいエンハンサー配列も本発明の核酸構築物またはベクターに含まれる。エンハンサー配列は、プロモーター依存性遺伝子発現に影響を及ぼすものであり、天然遺伝子の５’領域または３’領域に位置してもよい。
【００５０】
本明細書で使用される「天然」または「野生型」という用語は、野生型の細胞、組織、器官または生物に存在するヌクレオチド配列、例えば遺伝子、または遺伝子産物、例えばＲＮＡまたはタンパク質を指す。「バリアント」という用語は、本明細書で使用される場合、参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列、例えば、天然ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の変異体、すなわち、参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に対して１００％未満の配列同一性を有するものを指す。言い換えると、バリアントは、参照ポリヌクレオチド配列、例えば、天然ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に対して少なくとも１つのアミノ酸の差異（例えば、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失）を含む。例えば、バリアントは、全長の天然ポリヌクレオチド配列に対して５０％以上、６０％以上、または７０％以上の配列同一性、全長の天然ポリヌクレオチド配列に対して、例えば、７５％または８０％以上の同一性、例えば、８５％、９０％、または９５％以上、例えば、９８％または９９％の同一性を有するポリヌクレオチドであってもよい。別の例として、バリアントは、全長の天然ポリペプチド配列に対して７０％以上の配列同一性、例えば、７５％または８０％以上、例えば、８５％、９０％、または９５％以上の同一性など、例えば、全長の天然ポリペプチド配列に対して９８％または９９％の同一性を有するポリペプチドであってもよい。バリアントは、参照、例えば、天然配列の断片と７０％以上例えば、天然配列と７５％または８０％以上、例えば、８５％、９０％、または９５％以上、例えば、９８％または９９％の同一性などの配列同一性を共有する参照、例えば、天然配列のバリアント断片も含み得る。
【００５１】
本明細書で使用される場合、「生物活性」および「生物学的に活性な」という用語は、細胞内の特定の生物学的要素に帰する活性を指す。例えば、Ｒ−スポンジン、またはその断片もしくはバリアントの「生物活性」とは、Ｗｎｔシグナルを増強する能力を指す。別の例として、ポリペプチドまたはその機能性断片もしくはバリアントの生物活性とは、ポリペプチドまたはその機能性断片もしくはバリアントの、例えば、結合、酵素活性などのネイティブな機能を行う能力を指す。第３の例として、遺伝子調節エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサー、コザック配列などの生物活性とは、調節エレメントまたはその機能性断片もしくはバリアントの、それぞれ、作動可能に連結した遺伝子の発現の翻訳を調節する、すなわち、促進する、増強する、または活性化する能力を指す。
【００５２】
本明細書で使用される「投与する」または「導入する」または「提供する」という用語は、組成物を、細胞に、対象の細胞、組織および／もしくは器官に、または対象に送達することを指す。そのような投与または導入は、インビボ、インビトロまたはエクスビボで行うことができる。
【００５３】
「治療」、「治療すること」などの用語は、本明細書において、一般に、所望の薬理的効果および／または生理的効果を得ることを意味するように使用される。効果は、疾患またはその症状を完全にまたは部分的に防止すること、例えば、対象において疾患またはその症状が起こる可能性を低減させることに関して予防的なものであってもよく、かつ／または、疾患および／もしくは疾患に起因する有害作用に対する部分的なまたは完全な治癒に関して治療的であってもよい。「治療」とは、本明細書で使用される場合、哺乳動物における疾患の任意の治療を包含し、（ａ）疾患の素因があり得るが、今のところはまだそれを有すると診断されていない対象において疾患が生じることを防止すること；（ｂ）疾患を阻害すること、すなわち、その発症を阻止すること；または（ｃ）疾患を軽減すること、すなわち、疾患の退縮を引き起こすことを含む。治療剤は、疾患または傷害の発生の前、その間、またはその後に投与することができる。治療により患者の望ましくない臨床症状が安定化するまたは低減するような、進行中の疾患の治療が特に興味深い。そのような治療は、罹患組織が完全に機能喪失する前に行うことが望ましい。主題の療法は、疾患の症候性の段階において、いくつかの場合には疾患の症候性の段階の後に施されることが望ましい。
【００５４】
「個体」、「宿主」、「対象」および「患者」という用語は、本明細書では互換的に使用され、これだけに限定されないが、サルおよびヒトを含めたヒトおよび非ヒト霊長類；哺乳動物の競技動物（例えば、ウマ）；哺乳動物の農場動物（例えば、ヒツジ、ヤギなど）；哺乳動物の愛玩動物（イヌ、ネコなど）；およびげっ歯類（例えば、マウス、ラットなど）を含めた哺乳動物を指す。
【００５５】
本発明の種々の組成物および方法が下に記載されている。本明細書には特定の組成物および方法が例示されているが、いくつもの代替的な組成物および方法が本発明の実施の使用に適用可能であり、適切であることが理解される。本発明の発現構築物および方法の評価は、当技術分野において標準の手順を使用して行うことができることも理解されよう。
【００５６】
本発明の実施では、別段の指定のない限り、当業者の技術の範囲内に入る、細胞生物学、分子生物学（組換え技法を含む）、微生物学、生化学および免疫学の従来の技法を用いる。そのような技法は、それらのそれぞれが参照により本明細書に明白に組み込まれる、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年）；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４年）；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８７年）；「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ＆  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編）；「Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ」（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ  ＆  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７年）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７年）；「ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ」（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４年）；および「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、１９９１年）などの文献において十分に説明されている。
【００５７】
本発明のいくつかの態様が例示のために適用の例を参照して下に記載されている。多数の特定の詳細、関係、および方法は、本発明の完全な理解をもたらすために記載されていることを理解されるべきである。しかし、本発明は、特定の詳細のうちの１つ以上を伴わずにまたは他の方法を用いて実施できることは関連分野の当業者には容易に理解されよう。本発明は、例示されている行為または事象の順序に限定されず、いくつかの行為は他の行為または事象と異なる順序で、かつ／またはそれと同時になされ得る。さらに、例示された行為または事象の全てが本発明による方法体系を実行するために必要であるとは限らない。
【００５８】
本明細書において使用される用語法は、特定の実施形態を説明するためだけのものであり、本発明を限定するものではない。本明細書で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈によりそうでないことが明白に示されない限り、複数の形態も同様に含むものとする。さらに、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｗｉｔｈ）」という用語またはその変形が発明の詳細な説明および／または特許請求の範囲のいずれかにおいて使用されている限りでは、そのような用語は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語と同様に、包括的なものとする。
【００５９】
「約」または「およそ」という用語は、当業者により決定される特定の値に対する許容される誤差範囲内に入ることを意味し、許容される誤差範囲は、一部において、どのように値を測定または決定するか、つまり、測定システムの限界に依存する。例えば、「約」とは、当技術分野における実施に従って、１または１超の標準偏差の範囲内を意味し得る。あるいは、「約」とは、所与の値の２０％まで、好ましくは１０％まで、より好ましくは５％まで、およびより好ましくはさらに１％までの範囲を意味し得る。あるいは、特に生物系または生物学的プロセスに関して、この用語は、一桁内である値の好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内であることを意味し得る。特定の値が本出願および特許請求の範囲に記載されている場合、特に明記しない限り、特定の値に対する許容可能な誤差範囲内を意味する「約」という用語を想定すべきである。
【００６０】
本明細書で言及される全ての公開物は、公開物が引用されるものとの関連で方法および／または材料を開示および記載するために、参照により本明細書に組み込まれる。本開示は、矛盾が存在する限り、組み込まれた公開物のいかなる開示にも優先することが理解される。
【００６１】
特許請求の範囲は任意の要素を排除するように作成されてもよいことにさらに留意されたい。したがって、この記述は、特許請求の要素の列挙に関連して「専ら」、「唯一の」などのような排他的な用語の使用または「否定的な」制限の使用のための先行基準としての役割を果たすことを意図している。
【００６２】
別段の指定のない限り、本明細書で使用される用語は全て、当業者にとっての意味と同じ意味を有し、本発明の実施では、当業者の知見の範囲内に入る微生物学および組換えＤＮＡ技術の従来の技法を用いる。
【００６３】
組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子
特定の態様では、本開示は、組織特異的または細胞特異的様式でＷｎｔ活性を増強することができる新規の組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子を提供する。特定の実施形態では、組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子は、１つ以上のＺＮＲＦ３および／またはＲＮＦ４３リガーゼに結合する第１のドメインと、１つ以上の標的組織または細胞型に組織特異的または細胞特異的様式で結合する第２のドメインと、を含む二機能性分子である。第１のドメインおよび第２のドメインはそれぞれ、リガーゼ複合体または標的組織もしくは細胞にそれぞれ結合することができる任意の部分であり得る。例えば、第１のドメインおよび第２のドメインのそれぞれは、限定されないが、ポリペプチド（例えば、抗体もしくはその抗原結合断片、または抗体とは異なるペプチドもしくはポリペプチド）、低分子、および天然のリガンドまたはそのバリアント、断片もしくは誘導体から選択される部分であり得る。特定の実施形態では、天然リガンドは、ポリペプチド、小分子、イオン、アミノ酸、脂質、または糖分子である。第１のドメインおよび第２のドメインは、互いに同じ種類の部分であってもよく、または異なる種類の部分であってもよい。特定の実施形態では、組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子は、組織特異的または細胞特異的な細胞表面受容体に結合する。特定の実施形態では、組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子は、例えば、ネガティブコントロールと比較して、Ｗｎｔシグナル伝達を、少なくとも５０％、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、または少なくとも５０倍増加または増強させる。
【００６４】
特定の実施形態では、組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子は、ＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３に結合する第１のポリペプチド配列および１つ以上の標的組織または細胞型に組織または細胞特異的様式で結合する第２のポリペプチド配列を含む融合タンパク質である。特定の実施形態では、組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子は、それぞれ第１のドメインおよび第２のドメインを含む２つ以上の融合タンパク質を含む二量体または多量体などの２つ以上のポリペプチドを含み、ここで、２つ以上のポリペプチドは、例えば、リンカー部分を通して、または２つ以上のポリペプチドのそれぞれにおけるアミノ酸残基間の結合、例えばシステイン残基間の分子間ジスルフィド結合を介して結合している。特定の実施形態では、組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子は、第１のドメインまたは第２のドメインのいずれかを構成する抗体重鎖および軽鎖を含む抗体（またはその抗原結合断片）であり、ここで、もう一方のドメイン（すなわち、第２のドメインまたは第１のドメイン）は、融合タンパク質として、またはリンカー部分を介してのいずれかで、抗体重鎖または軽鎖に結合している。特定の実施形態では、もう一方のドメインは、重鎖のＮ末端、重鎖のＣ末端、軽鎖のＮ末端、または軽鎖のＣ末端に結合している。そのような構造は、本明細書では付加ＩｇＧスキャフォールドまたはフォーマットと呼ばれ得る。例えば、組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子は、ＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３に結合する抗体であり得、ここで、組織または細胞特異的受容体に結合する結合ドメインが、ＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３に結合する抗体の重鎖または軽鎖のいずれかに融合または付加されている。別の例では、組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子は、組織または細胞特異的受容体に結合する抗体であり得、ここで、ＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３に結合する結合ドメインが、組織または細胞特異的受容体に結合する抗体の重鎖または軽鎖のいずれかに融合または付加されている。
【００６５】
特定の実施形態では、組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子は、ＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３に結合する第１のドメイン（「作用ドメイン」）および組織特異的または細胞特異的受容体に結合する、例えば高い親和性を有する第２のドメイン（「標的ドメイン」）を含む。特定の実施形態では、これら２つのドメインのそれぞれは、それ自体ではＷｎｔシグナルを増強するのに実質的に低い活性を有するかまたは不活性である。しかしながら、組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子が組織特異的受容体を発現する標的組織と結合すると、Ｅ３リガーゼＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３は組織特異的受容体と三元複合体に動員され、それらは受容体を介したエンドサイトーシスによって細胞表面から隔離され、かつ／または除去される。その結果、組織特異的様式でＷｎｔシグナルが増強される。
【００６６】
特定の実施形態では、作用ドメインは、ＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３Ｅ３リガーゼへの結合剤であり、それは、Ｒ−スポンジン、例えば、限定されるものではないが、ヒトＲ−スポンジン１〜４を含むＲ−スポンジン１〜４に基づいて設計することができる。特定の実施形態では、作用ドメインは、Ｒ−スポンジン、例えば野生型Ｒ−スポンジン１〜４、場合によりヒトＲ−スポンジン１〜４、またはそれらのバリアントもしくは断片である。特定の実施形態では、それは、対応する野生型Ｒ−スポンジン１〜４配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するＲ−スポンジン１〜４のいずれかのバリアントである。特定の実施形態では、作用ドメインは、ＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３に結合する、Ｒ−スポンジン、例えばＲ−スポンジン１〜４のいずれかのフリンドメイン１を含むかまたはそれからなる。ＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３に特異的に結合することができる、フリンドメイン１の拡張バージョン（限定されないが、もはやＬＧＲ４〜６に結合しないかまたはＬＧＲ４〜６への結合が減少した変異フリンドメイン２を有するものを含む）、または操作された抗体もしくは任意の他の誘導体もしくは抗体とは異なる任意の操作されたポリペプチドも使用することができる。特定の実施形態では、作用ドメインは、Ｒ−スポンジンの１つ以上のフリンドメイン１を含む。特定の実施形態では、それは、Ｒ−スポンジンのフリンドメイン２を含まないか、またはそれは、Ｒ−スポンジンの改変型またはバリアントフリンドメイン２、例えば野生型フリンドメイン２と比較して活性が低いフリンドメイン２を含む。特定の実施形態では、作用ドメインは、フリンドメイン１を含むが、Ｒ−スポンジンのフリンドメイン２を含まない。特定の実施形態では、作用ドメインは、２つ以上のフリンドメイン１またはフリンドメイン１の多量体を含む。作用ドメインは、Ｒ−スポンジンの１つ以上の野生型フリンドメイン１を含み得る。特定の実施形態では、作用ドメインは、野生型フリンドメイン１と比較して、活性、例えばＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３への結合が増大しているＲ−スポンジンの改変型またはバリアントフリンドメイン１を含む。ＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３への結合が増加したバリアントは、例えば、Ｒ−スポンジンフリンドメイン１のバリアントを含むファージまたは酵母ディスプレイライブラリーをスクリーニングすることによって同定することができる。Ｒ−スポンジンフリンドメイン１とは無関係であるがＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３への結合が増加しているペプチドまたはポリペプチドもまたスクリーニングによって同定することができる。作用ドメインは、さらなる部分またはポリペプチド配列、例えばそれが存在する作用ドメインまたは組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子の構造を安定化させるためのさらなるアミノ酸残基をさらに含み得る。
【００６７】
特定の実施形態では、標的ドメインは、細胞特異的表面分子、例えば細胞特異的表面受容体に特異的に結合し、例えば天然リガンド、抗体、または合成化学物質であり得る。特定の実施形態では、細胞特異的表面分子は、標的器官、組織または細胞型、例えば、Ｗｎｔシグナル伝達を増強することが望ましい器官、組織または細胞型で優先的に発現される。特定の実施形態では、細胞特異的表面分子は、標的器官、組織または細胞型、例えば、１つ以上の他の非標的器官、組織または細胞型と比較したときに例えば、疾患または障害を治療または予防するためにＷｎｔシグナル伝達を増強することが望ましい器官、組織または細胞型で発現が増加または増強している。特定の実施形態では、細胞特異的表面分子は、それぞれ１つ以上の他の器官、組織または細胞型と比較して、標的器官、組織または細胞型の表面に優先的に発現される。例えば、特定の実施形態では、細胞表面受容体は、それが１つ以上、５つ以上、他の全ての器官、組織もしくは細胞、またはそれぞれ他の全ての器官、組織もしくは細胞の平均で発現されるよりも、標的器官、組織または細胞において、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、または少なくとも１０００倍高いレベルで発現されている場合、組織特異的または細胞特異的細胞表面分子であると見なされる。特定の実施形態では、組織特異的または細胞特異的細胞表面分子は、細胞表面受容体、例えば、細胞表面膜内に位置する領域と標的ドメインが結合することができる細胞外領域とを含むポリペプチド受容体である。様々な実施形態では、本明細書に記載の方法は、標的組織または標的組織を含む組織のサブセット上でのみ発現される細胞表面分子を特異的に標的化することによって、または全ての、ほとんどの、またはかなりの数の他の組織と比較した場合に標的組織上でより高いレベルの発現を有する、例えば、少なくとも２、少なくとも５、少なくとも１０、または少なくとも２０の他の組織よりも標的組織における発現がより高い細胞表面分子を特異的に標的化することによって実施され得る。
【００６８】
組織特異的および細胞特異的な細胞表面受容体は、当技術分野において既知である。組織特異的および細胞特異的な表面受容体の例には、限定されないが、ＡＳＧＲ１（肝臓特異的）、ＡＳＧＲ２（肝臓特異的）、ＴＦＲ２（肝臓特異的）、ＳＬＣ１０Ａ１（肝臓特異的）、ＰＴＨ１Ｒ（骨および腎臓特異的）、ＬＹＰＤ３（口腔粘膜特異的）、ＤＳＧ３（口腔粘膜特異的）などが含まれる（図２参照）。肝臓送達のためのさらなる受容体は、例えば、Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｕｍｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１５；３６：５５−６７に記載されている。
【００６９】
特定の細胞表面ポリペプチドまたは受容体に「特異的に結合する」または「特異的な」作用ドメインまたは標的ドメイン、例えば抗体またはその抗原結合断片は、他のポリペプチドまたはポリペプチドエピトープに実質的に結合することなくその特定のポリペプチドまたは受容体に結合するものである。いくつかの実施形態では、本開示の作用ドメインおよび標的ドメインは、ＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３または組織特異的細胞表面分子（例えば受容体）に、それぞれ、約４℃、２５℃、３７℃または４２℃の温度で測定した場合に、１０００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、０．０１ｎＭ以下、０．００５ｎＭ以下、０．００１ｎＭ以下、または０．０００５ｎＭ以下の解離定数（Ｋｄ）で特異的に結合する。結合剤、例えば抗体の親和性は、従来の技術、例えばＳｃａｔｃｈａｒｄらによって記載されたものを用いて容易に決定することができる（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ５１：６６０（１９４９），ＥＬＩＳＡ  ａｓｓａｙｓ，ｂｉｏｌａｙｅｒ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ（ＢＬＩ）  ａｓｓａｙｓ，ａｎｄ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ（ＳＰＲ）  ａｓｓａｙｓ）。抗原、その細胞または組織への抗体の結合特性は、一般に、例えば免疫組織化学（ＩＨＣ）および／または蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）などの免疫蛍光に基づくアッセイを含む免疫検出法を使用して決定および評価することができる。
【００７０】
特定の実施形態では、組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子の作用ドメインおよび／または標的ドメインはポリペプチドであり、他の実施形態では、組織特異的Ｗｎｔシグナル伝達分子の作用ドメインおよび／または標的ドメインは有機小分子である。特定の実施形態では、組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子の作用ドメインと標的ドメインは互いに共有結合している。特定の実施形態では、組織特異的Ｗｎｔシグナル増強融合分子の作用ドメインと標的ドメインは互いに非共有結合している。特定の実施形態では、組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子の作用ドメインと標的ドメインは同じ融合タンパク質内に存在する。他の実施形態では、作用ドメインは第１の結合ドメインをさらに含む第１のポリペプチド内に存在し、標的ドメインは第２の結合ドメインをさらに含む第２のポリペプチド内に存在し、ここで第１および第２の結合ドメインは互いに結合する。いくつかの実施形態では、第１および第２の結合ドメインは、例えばＦｃポリペプチドなど、同じかまたはそのバリアントである。いくつかの実施形態では、第１および第２の結合ドメインは互いに異なる。特定の実施形態では、本発明は、参照分子の機能的断片またはバリアントを含む、本明細書に記載の任意の標的ドメインまたは作用ドメインの断片またはバリアントの使用を含む。
【００７１】
特定の実施形態では、組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子（例えば、融合タンパク質）は、Ｒ１−Ｌ−Ｒ２、およびＲ２−Ｌ−Ｒ１から選択される式を有し、ここで、Ｒ１はＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３に結合する作用ドメインであり、Ｒ２は組織特異的細胞表面受容体に結合する標的ドメインであり、Ｌはリンカーであり、Ｌは存在しても存在しなくてもよい。Ｒ１およびＲ２のそれぞれは、それぞれ、本明細書に記載の様々な作用ドメインおよび標的ドメインのうちのいずれかであり得る。Ｒ１およびＲ２のそれぞれは、１つ以上のＥ３リガーゼ（ＺＮＲＦ３またはＲＮＦ４３）、またはそれぞれ標的組織または細胞に結合することができる任意の部分であり得る。例えば、Ｒ１およびＲ２のそれぞれは、限定されないが、ポリペプチド（例えば、抗体もしくはその抗原結合断片、または抗体とは異なるペプチドもしくはポリペプチド）、低分子、および天然のリガンドまたはそのバリアント、断片もしくは誘導体から選択される部分であり得る。特定の実施形態では、天然リガンドは、ポリペプチド、小分子、イオン、アミノ酸、脂質、または糖分子である。作用ドメインおよび標的ドメイン（すなわち、Ｒ１およびＲ２）は、互いに同じ種類の部分であり得るか、またはそれらは異なる種類の部分であり得る。特定の実施形態では、Ｒ２はその抗原結合断片の抗体であり、特定の実施形態では、Ｒ２はＦｃタンパク質またはその類似体を含む。
【００７２】
特定の実施形態では、組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子は単一分子（例えばポリペプチド）を含み、他の実施形態ではＷｎｔシグナル増強融合分子は互いに結合した、例えば、互いに非共有結合した２つ以上の分子（例えばポリペプチド）を含む。例えば、一実施形態では、組織特異的Ｗｎｔシグナル増強融合は、式Ｒ３−Ｌ１およびＲ４−Ｌ２をそれぞれ有する２つの分子を含み、ここで、Ｒ３は作用ドメインであり、Ｒ４は標的ドメインであり、Ｌ１およびＬ２基は、例えば二量体を形成するために互いに結合する。様々な実施形態では、Ｌ１およびＬ２基は、互いに同一であるかまたは互いに異なる。Ｌ１またはＬ２基の一例は、Ｆｃ配列、例えばマウスＦｃ２ｂまたはヒトＦｃ１であり、これらはそれぞれ当技術分野において既知である。Ｒ３およびＲ４のそれぞれは、本明細書にそれぞれ記載されている様々な作用ドメインおよび標的ドメインのいずれかであり得る。Ｒ３およびＲ４のそれぞれは、１つ以上のＥ３リガーゼ（ＺＮＲＦ３および／またはＲＮＦ４３）、またはそれぞれ標的組織または細胞に結合することができる任意の部分であり得る。特定の実施形態では、組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子は、１つ以上のＥ３リガーゼ（ＺＮＲＦ３および／またはＲＮＦ４３）に結合する抗体またはその結合断片を含み、ここで、抗体重鎖および／または抗体軽鎖は、標的組織または細胞に結合する付加結合ドメインを含む。特定の実施形態において、組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子は、標的組織または細胞に結合する抗体またはその結合断片を含み、ここで、抗体重鎖および／または抗体軽鎖は、１つ以上のＥ３リガーゼ（ＺＮＲＦ３および／またはＲＮＦ４３）に結合する付加された結合ドメインを含む。付加された結合ドメインは、例えば重鎖または軽鎖融合タンパク質として抗体のＮ末端またはＣ末端に直接融合されてもよく、またはリンカー部分を介して、例えば、重鎖もしくは軽鎖のＮ末端、Ｃ末端、または内部アミノ酸に対して、重鎖または軽鎖に付加されてもよい。ある態様において、抗体はＩｇＧである。
【００７３】
特定の実施形態において、組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子（例えば、融合タンパク質）は、融合タンパク質と接触した標的組織または細胞型におけるＷｎｔシグナル伝達を増加させる。特定の実施形態では、標的組織または細胞型におけるＷｎｔシグナル伝達は、少なくとも５０％、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、または少なくとも１０倍増加する。
【００７４】
組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子は、当技術分野において既知であり利用可能な有機合成および分子生物学の標準的な方法によって産生することができる。例えば、組織特異的Ｗｎｔシグナル増強融合タンパク質は、標的ドメイン（例えば、ＡＳＧＲ１に結合する抗体）を、アミノ酸に対応する作用ドメイン（例えば、ヒトＲ−スポンジン２フューリンドメイン１単独）に融合することによって生成され得る。ＬＧＲタンパク質とのフリンドメイン２の相互作用は、点変異、例えばＦ１０５ＡおよびＦ１０９Ａによって、単独でまたは組み合わせて廃止または損なわれている）。特定の実施形態では、標的ドメインおよび作用ドメインは、組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子のＮ末端に位置するいずれかのドメインと、リンカー、例えばグリシン−セリンリンカーによって融合される。特定の実施形態において、標的ドメインおよび作用ドメインは、タンパク質リンカー（例えば、アルブミン）によって融合されている。標的ドメインを作用ドメインと「融合する」さらなる方法は、例えば、「ノブインホール」またはロイシンジッパー媒介二量体化を含むが、これらに限定されない。標的ドメイン、作用ドメイン（および場合によってはリンカー）をコードするＤＮＡ配列は、所望の融合タンパク質をコードするように遺伝子操作することができる。
【００７５】
抗体重鎖および軽鎖を含む組織特異的Ｗｎｔシグナル増強融合分子については、融合タンパク質の異なる部分をコードするＤＮＡ配列を、標準的な分子クローニング技術を用いて細菌または真核生物発現ベクターに挿入し、適切な宿主細胞で発現させる。発現された融合タンパク質は、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、およびサイズ排除クロマトグラフィーなどのタンパク質科学における標準的な技術を用いて均質になるまで精製され得る。本開示はまた、本明細書に記載の作用ドメイン、標的ドメイン、または融合タンパク質と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％のポリペプチド配列同一性を有するバリアントを含む、本明細書に記載のポリペプチド作用ドメイン、標的ドメイン、および融合タンパク質のいずれかの機能的断片およびバリアントを含む。そのようなバリアントは、本明細書に開示されている配列のいずれかと比較して１つ以上のアミノ酸修飾、例えば、１つ以上のアミノ酸欠失、挿入または置換を含み得る。特定の実施形態では、組織特異的Ｗｎｔシグナル増強融合タンパク質の機能的断片およびバリアントは、由来する組織特異的Ｗｎｔシグナル増強融合タンパク質と比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％またはそれ以上のＷｎｔシグナル増強活性を有する。特定の実施形態では、ポリペプチド作用ドメインの機能的断片およびバリアントは、（全組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子との関連で測定した場合）由来する作用ドメインと比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％またはそれ以上のＷｎｔシグナル増強活性を有する。特定の実施形態では、標的ドメインの機能的断片およびバリアントは、由来する標的ドメインと比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％またはそれ以上の結合活性を有する。
【００７６】
本開示はまた、１つ以上の組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子またはその構成要素、例えば、本明細書に記載の融合タンパク質またはそのバリアントをコードするポリヌクレオチドまたは核酸配列、ならびに発現ベクターを含む、これらのポリヌクレオチドを含むベクター、およびこれらのベクターを含む細胞を含む。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドまたは核酸配列はＤＮＡまたはＲＮＡである。特定の実施形態では、ＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。特定の実施形態では、ＲＮＡは、１つ以上の修飾ヌクレオシドを含む修飾ｍＲＮＡである。１つ以上の修飾ヌクレオシドを含む修飾ｍＲＮＡは、安定性の向上、より高い発現レベルおよび免疫原性の低下を含む、未修飾ｍＲＮＡを超える利点を有すると記載されている。本発明に従って使用され得る修飾ｍＲＮＡの非限定的な例は、例えば、ＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ２０１１／１３０６２４号、同第ＷＯ２０１２／１３８４５３号、同第ＷＯ２０１３１５１６６６号、同第ＷＯ２０１３／０７１０４７号、同第ＷＯ２０１３／０７８１９９号、同第ＷＯ２０１２０４５０７５号、同第ＷＯ２０１４０８１５０７号、同第ＷＯ２０１４０９３９２４号、同第ＷＯ２０１４１６４２５３号、米国特許第８，２７８，０３６号（シュードウリジンを含む修飾ｍＲＮＡを記載する）、同第８，６９１，９６６号（シュードウリジンおよび／またはＮ１−メチルプスドリジンを含む改変ｍＲＮＡを記載する）、同第８，８３５，１０８号（５−メチルシチジンを含む修飾ｍＲＮＡを記載する）、同第８，７４８，０８９号（シュードウリジンまたは１−メチルプスドリジンを含む修飾ｍＲＮＡを記載する）に記載されている。特定の実施形態では、組織特異的Ｗｎｔシグナル増強ポリペプチドをコードする修飾ｍＲＮＡ配列は、未修飾Ａ、Ｇ、ＵまたはＣリボヌクレオシドと比較して少なくとも１つの修飾を含む。特定の実施形態では、少なくとも１つの修飾ヌクレオシドには、Ｎ１−メチルプスドリジンおよび／または５−メチルシチジンが含まれる。特定の実施形態では、修飾ｍＲＮＡは、５’末端キャップ配列と、それに続く組織特異的Ｗｎｔシグナル増強ポリペプチドをコードする配列と、それに続くポリＡまたはポリＡ−Ｇ配列などの３’テーリング配列とを含む。
【００７７】
特定の実施形態では、ポリヌクレオチドはベクター、例えば発現ベクターであり、発現ベクターは組織特異的Ｗｎｔシグナル増強融合分子（例えば融合タンパク質または付加抗体の一方もしくは両方の鎖）をコードするポリヌクレオチド配列を含む。本明細書に記載のプロモーター配列、例えば、細胞内でポリヌクレオチドの発現を駆動するプロモーター配列に作動可能に連結されている。特定の実施形態では、ベクターはウイルスベクター、例えば組織特異的Ｗｎｔシグナル増強ポリペプチドをコードするＤＮＡまたはＲＮＡ配列に機能的に連結されたプロモーターを含む発現カセットを含むポリヌクレオチドを含むウイルスである。特定の実施形態では、発現カセットは５’および／または３’の細胞性もしくはウイルス性ＵＴＲまたはそれらの誘導体を含む。
【００７８】
本開示はまた、本明細書に記載のポリヌクレオチドと少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％のポリヌクレオチド配列同一性を有するバリアントを含む、本明細書に記載のポリヌクレオチドの機能的断片およびバリアントを含む。そのようなバリアントは、本明細書に開示されている任意の配列と比較して、１つ以上のヌクレオチドまたはヌクレオシド修飾、例えば１つ以上のヌクレオチド欠失、挿入または置換を含むことができる。特定の実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、例えば宿主細胞中のコードされたポリペプチドの発現を増強するためにコドン最適化されている。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドバリアントは１つ以上の修飾ヌクレオチドまたはヌクレオシドを含む。
【００７９】
本開示はまた、本明細書に記載の組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子、例えば融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはベクターを含む細胞を含む。特定の実施形態において、細胞は、組織特異的Ｗｎｔシグナル増強融合タンパク質を産生するために使用され得る、例えばＨＥＫ２９３細胞などの宿主細胞である。本組成物を調製する際には、例えば、哺乳動物細胞（例えば、２９３細胞）、昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）、微生物および酵母を含むがこれらに限定されない、任意の宿主細胞を用いることができる。特定の実施形態では、細胞は、本明細書に記載の組織特異的Ｗｎｔシグナル増強ポリペプチドで治療された対象に対して異種または自己由来である。特定の実施形態では、細胞は対象から得られ、本明細書に記載のウイルスベクターで形質導入された。特定の実施形態では、形質導入細胞は治療のために対象に送達される。
【００８０】
本開示はまた、１つ以上の組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子（例えば、融合タンパク質）、または組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子をコードする配列を含む１つ以上のポリヌクレオチドもしくはベクターを含む薬学的組成物を含む。
【００８１】
Ｗｎｔシグナル伝達は、当技術分野において既知であり利用可能な技術およびアッセイを用いて測定され得る。特定の実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達の増加は、標的組織または細胞型に対応する細胞株を用いて決定される。特定の実施形態では、細胞株は、Ｗｎｔシグナル応答性プロモーターの制御下にあるマーカー遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ遺伝子）を含むレポータープラスミドを含む。Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ３ａ馴化培地、またはＷｎｔ３ａの組換え供給源に応答して、フリンドメイン１を単独で（またはフリンドメイン２と一緒に、Ｆ１０５Ａおよび／またはＦ１０９Ａ点変異を伴って）添加することによる細胞のレポーター活性の増強。陽性対照としての陰性対照または機能的Ｒ−スポンジン（全長またはフリンドメイン１および２）を決定することができる。組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子に応答したレポーター活性はまた、レポーター細胞株を組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子と接触させることによって決定され得る。ネガティブコントロールはレポーター活性について実質的に、有意に、または完全にネガティブであり得、組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子およびポジティブコントロールはレポーター活性の増加としてＷｎｔシグナル伝達応答の増加を示すはずである。追加の対照は、抗ＡＳＧＲ１抗体単独（陰性）、抗ＡＳＧＲ１抗体の代わりに抗ＧＦＰ抗体が使用される融合タンパク質（陰性）、およびインタクトフリンドメイン１−フリンドメイン２タンパク質（陽性）を含み得る。組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子の組織特異性は、標的化されたもの以外の細胞型または組織における組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子での処置に応答してレポーター活性を同様に測定することによって決定され得る。特定の実施形態では、レポーター活性は、非標的組織と比較して、組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子によって結合された標的組織において高く、例えば、少なくとも５０％、少なくとも２倍、少なくとも３倍である。少なくとも４倍、少なくとも５倍、または少なくとも１０倍高い。
【００８２】
特定の実施形態では、組織特異的Ｗｎｔシグナル増強ポリペプチドは、本明細書に記載の任意の作用ドメインおよび標的ドメインの任意の組み合わせを含む、作用ドメインおよび標的ドメインの任意の組み合わせを含む。特定の実施形態では、それらはリンカー、例えばアルブミン（例えばヒト血清アルブミン）、ペプチジルリンカー、または非ペプチジルリンカーによって結合されており、ここで標的ドメインおよび作用ドメインはそれらのＮ末端およびＣ末端にある。リンカー、例えばＦｃもしくはアルブミン、ペプチジルリンカー、または非ペプチジルリンカー。
【００８３】
組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子はまた、インビボでの安定性を増強するために当該分野で既知のように、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｆｃ、アルブミンなどのような部分に結合され得る。
【００８４】
組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子の例示的で非限定的な例は、以下：
【００８５】
ａ）Ｗｎｔシグナル伝達を増強する能力が低下したＲ−スポンジン（例えば、ヒトＲ−スポンジン２）のバリアントまたは断片を含む作用ドメインとＰＴＨ１Ｒに特異的に結合する標的ドメインとを含む骨組織特異的Ｗｎｔシグナル増強ポリペプチドであって、該組織特異的Ｗｎｔシグナル増強ポリペプチドが、骨組織においてＷｎｔシグナル伝達を増加させ、骨組織の疾患または状態を治療するために使用され得る、骨組織特異的Ｗｎｔシグナル増強ポリペプチド；
【００８６】
ｂ）Ｗｎｔシグナル伝達を増強する能力が低下したＲ−スポンジン（例えばヒトＲ−スポンジン２）のバリアントまたは断片を含む作用ドメインおよびＡＳＧＲ１、ＡＳＧＲ２、ＴＦＲ２またはＳＬＣ１０Ａ１に特異的に結合する標的ドメインを含む肝組織特異的Ｗｎｔシグナル増強ポリペプチド；ここで、組織特異的Ｗｎｔシグナル増強ポリペプチドは、肝臓組織におけるＷｎｔシグナル伝達を増加させ、肝臓組織の疾患または状態を処置するために使用され得る；または、
【００８７】
ｃ）Ｗｎｔシグナル伝達を増強する能力が低下したＲ−スポンジン（例えば、ヒトＲ−スポンジン２）のバリアントまたは断片を含む作用ドメインとＬＹＰＤＳ３またはＤＳＧ３に特異的に結合する標的ドメインとを含む口腔粘膜組織特異的Ｗｎｔシグナル増強ポリペプチドであって、該組織特異的Ｗｎｔシグナル増強ポリペプチドが、口腔粘膜組織においてＷｎｔシグナル伝達を増加させ、口腔粘膜組織の疾患または状態を治療するために使用され得る、口腔粘膜組織特異的Ｗｎｔシグナル増強ポリペプチドを含む。
【００８８】
組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子の例示的で非限定的な例には、添付の実施例に記載のもの、および表１に記載のものを含むがこれらに限定されない配列が含まれる。特定の実施形態では、組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子は、本明細書に開示されている２つ以上のポリペプチド配列を、例えば添付のＩｇＧまたは抗体のフォーマットで含む。本明細書に開示されているポリペプチドは、配列番号１〜４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、または１５８に記載の配列、およびこれらの断片のいずれかと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むか、またはそれからなるポリペプチドを含むが、これらに限定されない。特定の実施形態では、ポリペプチドは機能ドメインおよび／または標的ドメインとしての活性を有する。
【００８９】
本明細書に開示されるポリヌクレオチドの例示的、非限定的な例には、上記のものを含む、本明細書に記載されるポリペプチド、バリアントおよび断片のいずれかをコードするものが含まれる。本明細書に開示されているポリヌクレオチドは、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５、１５５、および１５７に記載の配列、ならびにこれらの断片のいずれかと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むか、またはそれからなるポリヌクレオチドを含むが、これらに限定されない。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、機能的ドメインおよび／または標的ドメインとしての活性を有するポリペプチドをコードする。
【００９０】
作用ドメイン
ＲスポンジンはＷｎｔシグナルを増幅することができる。Ｒ−スポンジンの最小機能単位は、２つのフリンドメイン、ＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３Ｅ３リガーゼに結合するフリンドメイン１、およびＲ−スポンジン、ＬＧＲ、およびＥ３リガーゼの三元複合体をまとめる、ＬＧＲ４〜６に結合するフリンドメイン２から構成される。これは、複合体全体の内在化をもたらし、かつＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３をこれらの破壊の標的から離して除去する。フリンドメイン１単独では機能的ではないが、それはＺＮＲＦ３およびＲＮＦ４３の両方に結合することができる（図１参照）。
【００９１】
本明細書に記載の組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子の作用ドメインは、ＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３リガーゼに結合することができる任意の機能的部分、例えばポリペプチドまたは有機化学物質であり得るが、これらに限定されない（図２参照）。特定の実施形態では、作用ドメイン、例えば単独でまたは標的ドメインと共にかのいずれかでＲ−スポンジンのフリンドメイン１を含むポリペプチドは、潜在的なオフターゲット効果を最小限に抑えるために、非ターゲット組織において実質的に不活性である。作用ドメインは、組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子との関連で標的ドメインに融合または結合し、組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子が組織特異的受容体を発現する標的組織と係合すると、Ｅ３リガーゼＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３は組織特異的受容体と三元複合体に動員され、それらは細胞表面上に再配置され、隔離され、および／または細胞表面から除去される（図３参照）。
【００９２】
特定の実施形態では、作用ドメインは、Ｒ−スポンジンポリペプチド（例えば、Ｒ−スポンジン１〜４のいずれか）の断片もしくはバリアント、またはその機能的断片もしくはバリアントを含む。特定の実施形態では、作用ドメインは、野生型Ｒ−スポンジンの断片を含み、他の実施形態では、作用ドメインは１つ以上のアミノ酸修飾を含むＲ−スポンジンの断片を含む。Ｒ−スポンジンは、ヒトＲ−スポンジンなどの哺乳動物種を含むがこれらに限定されない、任意の動物種由来のＲ−スポンジンを含む、当技術分野において既知の任意のＲ−スポンジンまたはそのホモログであり得る。Ｒ−スポンジンは同定され記載されており、それらのポリペプチドおよびそれをコードするポリヌクレオチド配列は既知であり当該分野で利用可能である。特定の実施形態では、Ｒ−スポンジンポリペプチドは、ヒトのＲ−スポンジン、または他の脊椎動物もしくは非脊椎動物に見られるホモログ、例えばマウスのＲ−スポンジンである。ヒトＲ−スポンジン１、ヒトＲ−スポンジン２、ヒトＲ−スポンジン３、およびヒトＲ−スポンジン４のアミノ酸配列、ならびにそれらのフリンドメイン１を図４および配列番号１〜４にそれぞれ提供する。それらの同族体およびバリアントは、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｄｏｔ．ｎｃｂｉ．ｄｏｔ．ｎｌｍ．ｄｏｔ．ｎｉｈ．ｄｏｔ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ／などの一般的なデータベース検索から入手できる。本発明は、これらまたは他のＲ−スポンジンのいずれかの断片およびバリアントを含むかまたはそれらからなる作用ドメインを含む（しかしこれらに限定されない）。種々の実施形態では、任意のＲ−スポンジンポリペプチドおよびその断片のバリアントは、野生型Ｒ−スポンジンポリペプチドと比較して、１つ以上のアミノ酸修飾、例えば欠失、付加、または置換を含む。修飾は、フリンドメイン１および／またはフリンドメイン２を含むがこれらに限定されない、Ｒ−スポンジンのバリアントまたはその断片の任意の領域に存在し得る。フリンドメイン１またはフリンドメイン２の外側のアミノ酸修飾は、得られたバリアントが野生型Ｒ−スポンジンまたはその断片と比較して減少したＬＧＲ４−６結合活性を有するように、得られたバリアントを改変し得ることが理解される。
【００９３】
特定の実施形態では、作用ドメインは、Ｒ−スポンジン配列、例えば、全長または野生型のＲ−スポンジン−１、−２、−３、もしくは−４、場合によりヒトＲ−スポンジン−１、−２、−３、もしくは−４、またはそれらのバリアントもしくは断片を含むか、またはそれからなる。特定の実施形態では、それは、対応する野生型Ｒ−スポンジン１〜４配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するＲ−スポンジン１〜４のいずれかのバリアントである。特定の実施形態では、作用ドメインは、本明細書に開示されたもののいずれかを含むがこれらに限定されない、１つ以上のアミノ酸修飾を含む全長Ｒ−スポンジン（例えば、Ｒ−スポンジン−１〜４のいずれか）を含むまたはそれからなる。特定の実施形態では、作用ドメインは野生型または修飾Ｒ−スポンジン（例えば、Ｒ−スポンジン−１〜４のいずれか）の断片を含むかまたはそれからなる。特定の実施形態では、この断片はＺＮＲＦ３および／またはＲＮＦ４３に結合することができる。特定の実施形態では、作用ドメインは、Ｒ−スポンジンタンパク質のフリンドメイン１、またはＲ−スポンジンタンパク質の断片もしくはバリアントを含む。特定の実施形態では、作用ドメインは、１つ以上（例えば、１つ、２つもしくは３つ以上の、Ｒ−スポンジンタンパク質（例えば、Ｒ−スポンジン１〜４）のフリンドメイン１、またはＲ−スポンジンフリンドメイン１と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するそれらのバリアントを含むか、またはそれらからなる。特定の実施形態では、作用ドメインは、Ｒ−スポンジンフリン１ドメインまたはそのバリアントもしくは断片、およびＲ−スポンジンフリン２ドメインもしくはそのバリアントもしくは断片を含む。特定の実施形態では、作用ドメインは、ＺＮＲＦ３  ／  ＲＮＦ４３に結合する抗体またはその抗原結合断片を含む。特定の実施形態では、作用ドメインはＺＮＲＦ３またはＲＮＦ４３のいずれかに特異的に結合する。
【００９４】
特定の実施形態において、作用ドメインは、Ｒ−スポンジンの１つ以上のフリンドメイン１、例えば、ヒトＲ−スポンジン１もしくはヒトＲ−スポンジン２、またはそれらのバリアントを含む。特定の実施形態において、作用ドメインは、Ｒ−スポンジンの１つ以上のフリンドメイン１を含むが、それはＲ−スポンジンのフリンドメイン２を含まない。特定の実施形態において、作用ドメインは、Ｒ−スポンジンの１つ以上のフリンドメイン１を含み、それは、Ｒ−スポンジンの改変型またはバリアントフリンドメイン２、例えば野生型フリンドメイン２と比較して活性が低いフリンドメイン２を含む。特定の実施形態において、作用ドメインは、Ｒ−スポンジンの改変型またはバリアントフリンドメイン２を有するＲ−スポンジンタンパク質、例えば野生型フリンドメイン２と比較して活性が低下したフリンドメイン２を含む。特定の実施形態では、作用ドメインは、２つ以上のフリンドメイン１もしくはそのバリアント、またはフリンドメイン１もしくはそのバリアントの多量体を含む。特定の実施形態において、作用ドメインは、例えば、ヒトＲ−スポンジン２のＫ５８、Ｈ７６、Ｓ７７、Ｒ８６、Ｎ９１に対応するアミノ酸残基に、１つ以上の点変異を含むバリアントＲ−スポンジンフリン１ドメインを含む。特定の実施形態では、作用ドメインは、野生型フリンドメイン１と比較して、活性、例えばＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３への結合が増大しているＲ−スポンジンの改変型またはバリアントフリンドメイン１を含む。作用ドメインは、さらなる部分またはポリペプチド配列、例えばそれが存在する作用ドメインまたは組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子の構造を安定化させるためのさらなるアミノ酸残基をさらに含み得る。特定の実施形態では、作用ドメインは、Ｒ−スポンジンに対して明らかな／強い配列相同性を有さないペプチドまたはポリペプチドを含むが、ＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３に対するＲ−スポンジンの結合親和性と同等またはそれ以上の結合親和性を有する。
【００９５】
特定の実施形態では、作用ドメインは、Ｒ−スポンジンポリペプチド（例えば、ヒトＲ−スポンジン）のフリンドメイン１、またはその機能的断片もしくはバリアントと、Ｒ−スポンジンポリペプチドの修飾もしくはバリアントフリンドメイン２とを含み、ここで、修飾フリンドメイン２は、対応する野生型フリンドメイン２と比較して、ＬＧＲ４〜６への結合親和性が低い（図５〜７参照）。特定の実施形態において、フリンドメイン２は、例えば、ヒトＲ−スポンジン２のＦ１０５および／またはＦ１０９に対応するアミノ酸残基に、１つ以上の点変異を含む。当業者は、それらのアミノ酸配列をヒトＲ−スポンジン２と比較することによって、他のＲ−スポンジンポリペプチド中の対応するアミノ酸残基を容易に決定することができる。特定の実施形態において、作用ドメインは、フリンドメイン１またはそのバリアントおよびフリンドメイン２またはそのバリアントを含み、ここでフリンドメイン１および／またはフリンドメイン２は１つ以上の点変異を含む。（対応する野生型Ｒ−スポンジン配列と比較した）作用ドメイン内の１つ以上の点変異は、例えば、アミノ酸残基Ｋ５８、Ｈ７６、Ｓ７７、Ｒ８６、Ｎ９１、Ｆ１０５、Ｆ１０９、またはＫ１２１、およびＬＧＲ４−６への結合親和性を低下させるために修飾することができる他の残基を含むがこれらに限定されないフリンドメイン１および／またはフリンドメイン２内の任意のアミノ酸残基で起こり得る。その機能活性にとって重要であるヒトＲ−スポンジン１のフリンドメイン１およびフリンドメイン２の領域が同定されており、これには、保存された親水性残基Ｓ４８、Ｎ５１、Ｒ６６、Ｒ７０およびＱ７１、ならびにＥ３リガーゼへの結合に重要であるあまり保存されていない疎水性残基Ｌ４６、Ｌ５４、Ｉ６２およびＬ６４が含まれ、これらはＥ３リガーゼへの結合にとって重要である。。さらに、ヒトＲ−スポンジン１フリンドメイン１において、アミノ酸残基Ｋ５９、Ｓ７８、Ｄ８５、Ｒ８７、Ｎ８８およびＮ９２は、ＬＧＲ５と親水性相互作用表面を形成し、ＦＳＨＮＦアミノ酸配列は、疎水性表面のために重要なループとして同定されている。特定の実施形態では、Ｒ−スポンジンフリンドメイン１および／またはフリンドメイン２を含む作用ドメインは、これらの領域、表面またはアミノ酸残基のいずれか内に１つ以上の変異を含み得る。特定の実施形態では、Ｒ−スポンジンフリンドメイン１および／またはフリンドメイン２を含む作用ドメインは、結合表面の構造および／または安定性に影響を及ぼすことによってＬＧＲ４〜６結合を間接的に損なう、これらの領域、表面またはアミノ酸残基を超える１つ以上の変異または他の変化を含み得る。特定の実施形態において、Ｒ−スポンジンフリンドメイン１および／またはフリンドメイン２を含む作用ドメインは、添付の実施例に示されるもののうちのいずれかを含むがこれらに限定されない、任意のアミノ酸残基に１つ以上の変異を含み得る。特定の実施形態では、修飾フリンドメイン２は、例えば全長Ｒ−スポンジンタンパク質の文脈において、対応する野生型フリンドメイン２の結合の８０％未満、５０％未満、２０％未満、または１０％未満のＬＧＲ４〜６への結合親和性を有する。
【００９６】
特定の実施形態では、作用ドメインは、Ｒ−スポンジンポリペプチド（例えば、ヒトＲ−スポンジン）のフリンドメイン１、またはその機能的断片もしくはバリアント、およびＲ−スポンジンポリペプチド（例えば、ヒトＲ−スポンジン）の未修飾フリンドメイン２を含む。特定の実施形態では、対応する野生型フリンドメイン２と比較してＬＧＲ４−６への結合親和性が低い修飾フリンドメイン２は、組織標的化の特異性を高めるためにより望ましいが、特定の実施形態では、非修飾フリンドメイン２を組み合わせる。標的ドメインを用いると、標的ドメインを用いずに野生型Ｒ−スポンジンよりも組織ターゲッティングが改善され、特定の状況において有用性を有する。
【００９７】
特定の実施形態において、作用ドメインは、例えばＲ−スポンジン−１、−２、−３、−４のいずれかに由来する野生型または修飾型のＲ−スポンジンフリンドメイン１、場合によりヒトＲ−スポンジン−１、−２、−３または−４  を含む。特定の実施形態では、作用ドメインは、Ｒ−スポンジンフリン１ドメインおよび野生型または修飾型Ｒ−スポンジンフューリン２ドメイン、例えば、Ｒ−スポンジン−１、−２、−３、−４のいずれかに由来する、場合により  ヒトＲ−スポンジン−１、−２、−３または−４を含む。特定の実施形態では、作用ドメインは、第１のＲ−スポンジンフリン１ドメインおよび第２の野生型または修飾Ｒ−スポンジンフリン１ドメイン、例えば、Ｒ−スポンジン−１、−２、−３、−４のいずれかに由来する、場合によりヒトＲ−スポンジン−１、−２、−３または−４を含む。特定の実施形態では、修飾フリンドメイン２は、例えば全長Ｒ−スポンジンタンパク質の文脈において、対応する野生型フリンドメイン２の結合と同等のＬＧＲ４〜６への結合親和性、またはその８０％未満、５０％未満、２０％未満、もしくは１０％未満のＬＧＲ４〜６への結合親和性を有する。
【００９８】
標的ドメイン
特定の細胞型および特定の組織内の細胞は、細胞表面受容体などの１つ以上の細胞または組織特異的表面分子を含み得る（図２参照）。本明細書で使用される場合、１つ以上の他の細胞もしくは組織型、または任意の他の細胞もしくは組織型と比較して、より多くの分子が特定の細胞または組織型に存在する場合、分子は、細胞または組織特異的であると言われる。特定の実施形態では、より多い量は、１つ以上の他の細胞もしくは組織型、または任意の他の細胞もしくは組織型における量と比較して、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍である。特定の実施形態では、細胞特異的表面分子は、標的器官、組織または細胞型、例えば、１つ以上の他の非標的器官、組織または細胞型と比較したときに例えば、疾患または障害を治療または予防するためにＷｎｔシグナル伝達を増強することが望ましい器官、組織または細胞型で発現が増加または増強している。特定の実施形態では、細胞特異的表面分子は、それぞれ１つ以上の他の器官、組織または細胞型と比較して、標的器官、組織または細胞型の表面に優先的に発現される。例えば、特定の実施形態では、細胞表面受容体は、それが１つ以上、５つ以上、他の全ての器官、組織もしくは細胞、またはそれぞれ他の全ての器官、組織もしくは細胞の平均で発現されるよりも、標的器官、組織または細胞において、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、または少なくとも１０００倍高いレベルで発現されている場合、組織特異的または細胞特異的細胞表面分子であると見なされる。特定の実施形態では、組織特異的または細胞特異的細胞表面分子は、細胞表面受容体、例えば、細胞表面膜内に位置する領域と標的ドメインが結合することができる細胞外領域とを含むポリペプチド受容体である。様々な実施形態では、本明細書に記載の方法は、標的組織または標的組織を含む組織のサブセット上でのみ発現される細胞表面分子を特異的に標的化することによって、または全ての、ほとんどの、またはかなりの数の他の組織と比較した場合に標的組織上でより高いレベルの発現を有する、例えば、少なくとも２、少なくとも５、少なくとも１０、または少なくとも２０の他の組織よりも標的組織における発現がより高い細胞表面分子を特異的に標的化することによって実施され得る。
【００９９】
特定の態様において、標的ドメインは、目的の標的細胞または組織型、すなわちＷｎｔシグナル伝達活性を増強または増加させることが望まれる細胞型または組織型で発現される組織特異的表面分子に結合する。各組織特異的表面分子に結合する標的ドメインは、抗体またはその抗原結合断片、ペプチド、組織特異的もしくは細胞特異的受容体の天然リガンド、またはそれらの誘導体、および合成小分子などであり得るが、これらに限定されない。
【０１００】
標的ドメインによって結合された標的組織は、任意の組織、例えば任意の哺乳動物組織または細胞型であり得る。特定の実施形態では、標的組織は任意の臓器に存在し得る。特定の実施形態では、標的組織は、骨組織、肝臓組織、皮膚組織、胃組織、腸組織、口腔粘膜組織、腎臓組織、中枢神経系組織、乳腺組織、味蕾組織、卵巣組織、内耳組織（蝸牛および前庭組織を含む）、毛包、膵臓組織、網膜組織、角膜組織、心臓組織または肺組織であり、標的ドメインは、それぞれ骨組織、肝臓組織、皮膚組織、胃組織、腸組織、口腔粘膜組織、腎臓組織、中枢神経系組織、乳腺組織、味蕾組織、卵巣組織、内耳組織（蝸牛および前庭組織を含む）、毛包、膵臓組織、網膜組織、角膜組織、心臓組織または肺組織に優先的に発現する組織特異的細胞表面分子（例えば、細胞表面受容体）に結合する。
【０１０１】
標的ドメインは、任意の細胞型、例えば、限定されるものではないがヒトなどの哺乳動物を含む任意の組織、器官または動物内の任意の細胞に結合することができる。特定の実施形態では、組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子は特定の細胞型、例えば標的組織に関連する特定の細胞型に結合する。例えば、肝組織において、標的ドメインは、肝細胞、肝細胞の前駆体および幹細胞、胆道細胞、および／または内皮細胞もしくは他の血管細胞に結合し得る。例えば、骨組織において、標的ドメインは、骨芽細胞、骨芽細胞の前駆体、間葉系幹細胞、幹細胞および骨、軟骨および／または骨組織中に存在する他の細胞を生じる前駆細胞に結合し得る。本明細書に記載の組織を含むがこれらに限定されない様々な組織に存在する細胞型は当技術分野において既知であり、様々な実施形態において、本明細書に記載の組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子はそれらのいずれとも結合し得る。
【０１０２】
様々な実施形態において、組織特異的表面分子は組織特異的細胞表面受容体である。肝臓の場合、これらには、ＡＳＧＲ１、ＡＳＧＲ２、ＴＦＲ２、ＳＬＣ１０Ａ１などが含まれるが、これらに限定されるわけではない。特定の実施形態では、標的ドメインは天然リガンド、またはその機能的バリアント体もしくは断片、または抗体もしくはその抗原結合断片である。それらは、ＡＳＧＲ１、ＡＳＧＲ２、ＴＦＲ２、ＳＬＣ１０Ａ１、ＬＹＰＤ３、またはＤＳＧ３に結合する。骨または腎臓の場合、そのような組織特異的細胞表面受容体には、副甲状腺ホルモン受容体１（ＰＴＨ１Ｒ）などが含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、標的ドメインは、ＰＴＨ１Ｒに結合する、天然リガンド、またはその機能的バリアントもしくは断片、あるいは抗体またはその抗原結合断片である。口腔粘膜については、そのような組織特異的細胞表面受容体には、ＬＹＰＤ  ３およびＤＳＧ  ３が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、標的ドメインは、ＬＹＰＤ３またはＤＳＧ３に結合する天然のリガンド、またはその機能的バリアントもしくは断片、あるいは抗体もしくはその抗原結合断片である。
【０１０３】
アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）は、ＡＳＧＲ１およびＡＳＧＲ２からなる（例えば、Ｓｔｏｃｋｅｒｔ、ＭｏｒｅｌｌおよびＡｓｈｗｅｌｌ、１９９１、Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４：４１−６４によって概説されている）。この受容体は、露出した末端ガラクトースまたはＮ−アセチルガラクトサミン残基を有する糖タンパク質のエンドサイトーシスおよびリソソーム分解を媒介することによって血清糖タンパク質恒常性において重要な役割を果たす膜貫通タンパク質である。したがって、ＡＧＰＲの天然および合成リガンドには、ガラクトシル化コリンエステラーゼ、ガラクトース（Ｇａｌ）およびＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、ＧａｌＮＡｃ終結糖タンパク質などのＧａｌＮＡｃ含有分子、ならびに単糖類、オリゴ糖類、または多糖類含有分子またはナノ粒子が含まれるがこれらに限定されない（例えば、Ｄ’Ｓｏｕｚａ  ａｎｄ  Ｄｅｖａｒａｊａｎ  ２０１５，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，２０３：１２６−１３９によって概説されている）。
【０１０４】
ＳＬＣ１０ファミリーは、胆汁酸、硫酸化溶質、およびその他の生体異物をナトリウム依存的に輸送する。設立メンバーであるＳＬＣ１０Ａ１（ＮＴＣＰ）とＳＬＣ１０Ａ２（ＡＳＢＴ）は、胆汁酸の腸肝循環を維持するように機能する。ＳＬＣ１０Ａの天然および合成リガンドの例には、コール酸、Ｎａ（＋）／胆汁酸、Ｎａ（＋）／タウロコール酸、およびＢ型肝炎ウイルスのｐｒｅＳ１ドメインならびにそれらの断片またはバリアントが含まれるが、これらに限定されない（例えば、Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．、２０１２  ｅＬｉｆｅ、１：ｅ０００４９に報告されている）。
【０１０５】
トランスフェリン受容体２（ＴＦＲ２）は、トランスフェリン受容体１（ＴＦＲ１）、二量体トランスフェリン（Ｆｅ２ＴＦ）の受容体媒介エンドサイトーシスを介して鉄を細胞に送達するタンパク質の相同体である。ＴＦＲ２もＦｅ２ＴＦに結合するが、それは主に全身性鉄恒常性の調節において機能すると思われる（例えば、Ｗｏｒｔｈｅｎ  ａｎｄ  Ｅｎｎｓ、２０１４、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ５：３４によって概説されている）。ＴＦＲ２の天然および合成リガンドならびに結合パートナーの例には、二量体トランスフェリンなどのトランスフェリン、ならびにヘモクロマトーシス（ＨＦＥ）タンパク質ならびにそれらの断片およびバリアントが含まれるが、これらに限定されない。
【０１０６】
副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）およびＰＴＨ関連ペプチド（ＰＴＨｒＰ）の１型受容体（ＰＴＨ１Ｒ）は骨および腎臓において高度に発現される（例えば、Ｍａｎｎｓｔａｄｔ，Ｊｕｐｐｎｅｒ，ａｎｄ  Ｇａｒｄｅｌｌａ，１９９９，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ２７７：Ｆ６６５−Ｆ６７５により概説されている）。副甲状腺ホルモン受容体１（ＰＴＨ１Ｒ）の天然および合成リガンドには、ＰＴＨ、ＰＴＨｒＰ、ならびにそれらの断片およびバリアントが含まれるが、これらに限定されない。
【０１０７】
Ｌｙ６  ／  ＰＬＡＵＲドメイン含有タンパク質３（ＬＹＰＤ３）は、口腔粘膜、皮膚、食道などの組織に見られる重層扁平上皮において高度に特異的な発現を示すＧＰＩアンカー型タンパク質である。ＬＹＰＤ３発現はまた、創傷治癒中の移動性ケラチノサイトおよび様々な癌において上方制御されることが見られた（例えば、Ｊａｃｏｂｓｅｎ、Ｋｒｉｅｇｂａｕｍ、Ｓａｎｔｏｎｉ−ＲｕｇｉｕおよびＰｌｏｕｇ、２０１４、Ｗｏｒｌｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、５（４）：６２１−３２に概説される）。ＬＹＰＤ３発現が報告されているにもかかわらず、ＬＹＰＤ３遺伝子を欠く動物は生存可能で、繁殖力があり、扁平上皮の発生に明らかな欠陥がないので、その正確な機能は不明のままである。様々な分子がＬＹＰＤ３の結合パートナーとして同定されている。ラミニン１、ラミニン５、およびガレクチン−３はＬＹＰＤ３と会合して細胞遊走を促進する（Ｐａｒｅｔ、Ｂｏｕｒｏｕｂａ、Ｂｅｅｒ、Ｍｉｙａｚａｋｉ、Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ、ＦｉｅｄｌｅｒおよびＺｏｌｌｅｒ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ．２００５  Ｊｕｌ  １０；１１５（５）：７２４−３３）。前方勾配２、ＡＧＲ２は、ＬＹＰＤ３と相互作用し、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）における癌の増殖、転移および治療に対する抵抗性を促進する（Ａｒｕｍｕｇａｍ、Ｄｅｎｇ、Ｂｏｖｅｒ、Ｗａｎｇ、ＬｏｇｓｄｏｎおよびＲａｍａｃｈａｎｄｒａｎ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．２０１５  Ａｐｒ；１４（４）：９４１−５１）。低酸素条件下では、ＬＹＰＤ  ３はα６β４インテグリンおよびマトリックスメタロプロテイナーゼ１４（ＭＭＰ１４）と複合体を形成し、これは限局性ラミニン３３２分解を通して癌細胞の運動性を促進する。（Ｎｇｏｒａ，Ｇａｌｌｉ，Ｍｉｙａｚａｋｉ  ａｎｄ  Ｚｏｌｌｅｒ．Ｎｅｏｐｌａｓｉａ．２０１２  Ｆｅｂ；１４（２）：９５−１０７）。
【０１０８】
デスモグレイン３（ＤＳＧ３）は、タンパク質のカドヘリン細胞接着分子スーパーファミリーのメンバーであるカルシウム結合膜貫通糖タンパク質をコードしている。ＤＳＧ３は、上皮および粘膜においてデスモソーム、細胞間接着のための特別な構造で発現される。ＤＳＧ３は、ＤＳＧ３細胞間相互作用に必要とされるＣａ２＋結合部位を含む５つの細胞外カドヘリンドメイン（ＥＣＤ）を有する（例えば、Ｔｈｏｍａｓｏｎ、Ｓｃｏｔｈｅｒｎ、ＭｃＨａｒｇおよびＧａｒｒｏｄ、２０１０、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ、４２９（３）：４１９−４３３によって概説される）。ＤＳＧ３細胞間相互作用は、それらのＮ末端付近のトランス同種親和性相互作用によって媒介される。動物におけるＤＳＧ３の喪失は、口腔粘膜の非常に深刻な侵食および離乳時の脱毛を引き起こし、これらの組織における上皮細胞の完全性にとってこの遺伝子がいかに重要であるかを示している。単分子原子間力顕微鏡実験は、細胞外カドヘリンドメインを介した同種親和性トランスＤＳＧ３結合を示した（Ｈｅｕｐｅｌ，Ｚｉｌｌｉｋｅｎｓ，Ｄｒｅｎｃｋｈａｈｎ  ａｎｄ  Ｗａｓｃｈｋｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ａｕｇｕｓｔ  １，２００８，１８１（３）  １８２５−１８３４）。
【０１０９】
組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子の例示的で非限定的な例には、１）Ｒ−スポンジンフリンドメイン１またはそのバリアントを含む第１ドメイン、およびＡＳＧＲ１またはＡＳＧＲ２に特異的に結合する抗体またはその断片を含む第２ドメインを含む融合タンパク質；２）Ｒ−スポンジンフリンドメイン１またはそのバリアントを含む第１ドメイン、およびＳＬＣ１０Ａ１に特異的に結合する抗体またはその断片を含む第２ドメインを含む融合タンパク質；３）Ｒ−スポンジンフリンドメイン１またはそのバリアントを含む第１ドメイン、およびＴＦＲ２に特異的に結合する抗体またはその断片を含む第２ドメインを含む融合タンパク質；４）Ｒ−スポンジンフリンドメイン１またはそのバリアントを含む第１ドメイン、およびＰＴＨ１Ｒに特異的に結合するリガンド誘導体、抗体またはその断片を含む第２ドメインを含む融合タンパク質；５）Ｒ−スポンジンフリンドメイン１またはそのバリアントを含む第１ドメイン、およびＬＹＰＤ３に特異的に結合するリガンド誘導体、抗体またはその断片を含む第２ドメインを含む融合タンパク質；６）Ｒ−スポンジンフリンドメイン１またはそのバリアントを含む第１ドメイン、およびＤＳＧ３に特異的に結合するリガンド誘導体、抗体またはその断片を含む第２ドメインを含む融合タンパク質；および７）Ｒ−スポンジンフリンドメイン１またはそのバリアントを含む第１ドメイン、およびＴＦＲ１に特異的に結合するリガンド誘導体、抗体またはその断片を含む第２ドメインを含む融合タンパク質が含まれる。特定の実施形態では、２つのドメインはリンカー、例えばポリペプチドリンカーを介して結合している。特定の実施形態では、リンカーはアルブミン、例えばヒト血清アルブミンであり、標的化ドメインおよび作用ドメインはアルブミンのＮ末端およびＣ末端にある。特定の実施形態において、組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子は、抗体重鎖および抗体重鎖（またはいずれかもしくは両方の鎖のその断片もしくはバリアント）を含む付加抗体（例えば、ＩｇＧ）フォーマットを有する。１つ以上のさらなる結合ドメインをさらに含む。特定の実施形態では、組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子は付加抗体（例えばＩｇＧ）フォーマットを有し、第２のドメインは抗体重鎖および抗体軽鎖（またはそのいずれかもしくは両方の鎖の断片もしくはバリアント）を含み、Ｒ−スポンジンフリンドメイン１またはバリアントを含む第１ドメインは、抗体重鎖および／または軽鎖の一方または両方に、例えば、いずれかまたは両方の鎖のＮ末端および／またはＣ末端のいずれかまたは両方に付加される。特定の実施形態では、第１のドメインは、例えばＮ末端またはＣ末端のいずれかで重鎖に付加または融合されている。特定の実施形態では、第１のドメインは、例えばＮ末端またはＣ末端のいずれかで軽鎖に付加または融合されている。
【０１１０】
リンカー
特定の実施形態では、標的ドメインおよび作用ドメインは互いに直接結合または融合しているが、他の実施形態では、それらはリンカー、例えばポリペプチドリンカー、または非ペプチジルリンカーなどで隔てられている。例えば、リンカーはＦｃリンカー、例えば、例えば１つ以上のジスルフィド結合を介して他のＦｃリンカーと二量体化することができる抗体Ｆｃドメインの領域である。別の特定の実施形態では、リンカーはアルブミン、例えばヒト血清アルブミンであり、ここで標的ドメインおよび作用ドメインはアルブミンのＮ末端およびＣ末端にある。
【０１１１】
特定の実施形態において、特に２つのポリペプチドを結合するとき、リンカーはペプチド結合によって互いに結合したアミノ酸からなる。特定の実施形態では、リンカーは、長さが１から約４０までのアミノ酸残基、１から約２０までのアミノ酸残基、または１から約１０までのアミノ酸残基を含む。特定の実施形態では、リンカー中のアミノ酸残基は、２０個の標準アミノ酸の中からであり、特定の実施形態では、システイン、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、および／またはセリンから選択される。特定の実施形態では、リンカーは１つ以上の非天然アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ペプチジルリンカーは、ペプチド結合によって結合されたグリシン、セリン、およびアラニンなどの立体障害のない大多数のアミノ酸から構成される。特定のリンカーには、ポリグリシン、ポリセリン、およびポリアラニン、あるいはこれらのいずれかの組み合わせが含まれる。いくつかの例示的なペプチジルリンカーは、ポリ（Ｇｌｙ）１−８（配列番号１５９〜１６３、特に（Ｇｌｙ）３、（Ｇｌｙ）４（配列番号１５９）、（Ｇｌｙ）５（配列番号１６０））である。および（Ｇｌｙ）７（配列番号１６２）、ならびにポリ（Ｇｌｙ）４  Ｓｅｒ（配列番号１６４）、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）２−４（配列番号１６５〜１６７）、およびポリ（Ａｌａ）１−８（配列番号１６８〜１７２）。ペプチジルリンカーの他の具体例には、（Ｇｌｙ）５  Ｌｙｓ（配列番号１７３）、および（Ｇｌｙ）５  ＬｙｓＡｒｇ（配列番号１７４）が含まれる。上記の命名法を説明するために、例えば、（Ｇｌｙ）３  Ｌｙｓ（Ｇｌｙ）４（配列番号１７５）は、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号１７５）を意味する。ＧｌｙとＡｌａの他の組み合わせもまた有用である。さらに、ペプチジルリンカーは、式−−ＣＨ２−−ＣＨ２−−ＣＨ２−−ＣＨ２−−ＣＨ２−−ＣＨ２−−の６炭素脂肪族分子などの非ペプチジルセグメントも含み得る。ペプチジルリンカーは、本明細書に記載のように誘導体を形成するように改変することができる。
【０１１２】
例示的な非ペプチジルリンカーとしては、例えば、−−ＮＨ−−（ＣＨ２）ｓ−−Ｃ（Ｏ）−−（式中、ｓ＝２〜２０）のようなアルキルリンカーが挙げられる。これらのアルキルリンカーは、低級アルキル（例えば、Ｃ１〜Ｃ６）低級アシル、ハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ）、ＣＮ、ＮＨ２、フェニルなどのような任意の非立体障害基によってさらに置換されていてもよい。非ペプチドリンカーまたは非ペプチド半減期延長部分などの本発明の組成物は、従来の有機化学反応によって合成することができる。結合ドメインを連結するのに使用される化学基には、当技術分野において既知のように、カルバメート；アミド（アミン＋カルボン酸）；エステル（アルコール＋カルボン酸）、チオエーテル（ハロアルカン＋スルフヒドリル；マレイミド＋スルフヒドリル）、シッフ塩基（アミン＋アルデヒド）、尿素（アミン＋イソシアネート）、チオ尿素（アミン＋イソチオシアネート）、スルホンアミド（アミン＋塩化スルホニル）、ジスルフィド；ヒドラゾン、脂質などが含まれる。
【０１１３】
ドメイン間の連結は、直鎖状または分岐状、通常は直鎖状であり得、１つ以上の不飽和結合を含み得る、スペーサー、例えばアルキルスペーサーを含み得、通常は、１〜約３００個の炭素原子を有し、さらに通常は、約１〜２５個の炭素原子を有し、約３〜１２個の炭素原子であり得る。この種のスペーサーはまた、アミン、エーテル、ホスホジエステルなどを含むヘテロ原子または官能基を含み得る。対象となる具体的な構造は次の通りである：（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ、ここでｎは１〜約１２であり、（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎ、ここでｎは１〜約１２であり、［（ＣＨ２）ｎ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｍ］ｚ、ここでｎおよびｍは１〜約６であり、ｚは１〜約１０であり、［（ＣＨ２）ｎＯＰＯ３（ＣＨ２）ｍ］ｚ式中、ｎおよびｍは１〜約６であり、ｚは１〜約１０である。そのようなリンカーは、直鎖状または分岐状であり得るポリエチレングリコールを含み得る。
【０１１４】
特定の実施形態では、ドメインは、ホモまたはヘテロ二官能性リンカーを介して結合されてもよい。例示的な同一性には以下が含まれる：アジドベンゾイルヒドラジド、Ｎ−［４−（ｐ−アジドサリチルアミノ）ブチル］−３’−［２’−ピリジルジチオ］プロピオンアミド）、ビス−スルホスクシンイミジルスベレート、ジメチルアジピミデート、ジスクシンイミジルタートレート、Ｎ−γ−マレイミドブチリルオキシスクシンイミドヒドロキシスルホスクシンイミジル−４−アジドベンゾエート、Ｎ−スクシンイミジル［４−アジドフェニル］−１，３’−ジチオプロピオネート、Ｎ−スクシンイミジル［４−ヨードアセチル］アミノベンゾエート、グルタルアルデヒド、ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＭＡＬ；スクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート；３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＰＤＰ）；Ｎ、Ｎ’−（１，３−フェニレン）ビスマレイミド；Ｎ、Ｎ’−エチレン−ビス−（ヨードアセトアミド）；４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＭＣＣ）；ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、およびＭＢＳの延長鎖類似体であるスクシンイミド４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）。特定の実施形態では、これらの架橋剤のスクシンイミジル基は第一級アミンと反応し、チオール反応性マレイミドはシステイン残基のチオールと共有結合を形成する。
【０１１５】
有用な他の試薬には以下が含まれる：ビスマレイミドヘキサン（「ＢＭＨ」）を含むホモ二官能性架橋試薬；ｐ、ｐ’−ジフルオロ−ｍ、ｍ’−ジニトロジフェニルスルホン（アミノ基およびフェノール基と不可逆的な架橋を形成する）；アジピン酸ジメチル（アミノ基に特異的）；フェノール−１，４−ジスルホニルクロリド（これは主にアミノ基と反応する）；ヘキサメチレンジイソシアネートもしくはジイソチオシアネート、またはアゾフェニル−ｐ−ジイソシアネート（これは主にアミノ基と反応する）；ジジアゾベンジジン（これは主にチロシンおよびヒスチジンと反応する）；Ｏ−ベンゾトリアゾリルオキシテトラメチルアンモニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド、ブロモ−トリス（ピロリジノ）ホスホニウムブロマイド（ＰｙＢｒｏＰ）；Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）；４−ピロリジノピリジン；Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾールなど。
【０１１６】
Ｗｎｔ分子、ノリン分子、およびＷｎｔシグナル増強分子
本開示はさらに、Ｗｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチド、およびＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子、ならびにＷｎｔシグナル伝達を増強し、本明細書中に記載されるものを含むＷｎｔ関連疾患または障害を治療または予防するためのそれらの使用に関する。特定の実施形態において、Ｗｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチドおよびＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子は、単独でまたは本明細書に記載の１つ以上の組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子と組み合わせて対象に提供される。
【０１１７】
ＷｎｔポリペプチドおよびＷｎｔをコードするポリヌクレオチド配列は当技術分野において既知であり、哺乳動物Ｗｎｔポリペプチドおよびポリヌクレオチド、例えばヒトＷｎｔポリペプチドおよびポリヌクレオチドを含むあらゆる種類のものを含むあらゆるすべてのＷｎｔポリペプチドまたはポリヌクレオチドを含む。例示的なＷｎｔポリペプチドには、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２Ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３Ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５Ａ、Ｗｎｔ５Ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７Ａ、Ｗｎｔ７Ｂ、Ｗｎｔ８Ａ、Ｗｎｔ８Ｂ、Ｗｎｔ９Ａ、Ｗｎｔ９Ｂ、Ｗｎｔ１０Ａ、Ｗｎｔ１０Ｂ、Ｗｎｔ１１およびＷｎｔ１６、ならびに上記のいずれかの機能的バリアントおよび断片が含まれる。Ｗｎｔポリペプチドは、天然のＷｎｔポリペプチド、Ｗｎｔポリペプチドバリアント、Ｗｎｔポリペプチド断片およびキメラＷｎｔポリペプチドを包含する。特定の実施形態では、Ｗｎｔポリペプチドは天然のヒト全長成熟Ｗｎｔタンパク質である。
【０１１８】
例えば、本出願において目的のヒト天然配列Ｗｎｔタンパク質としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない。Ｗｎｔ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００５４３０）；Ｗｎｔ−２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００３３９１）；Ｗｎｔ２Ｂ（Ｗｎｔ−１３）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００４１８５（アイソフォーム１）、ＮＭ＿０２４４９４．２（アイソフォーム２））、Ｗｎｔ３（参照配列：ＮＭ＿０３０７５３）、Ｗｎｔ３Ａ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３３１３１）、Ｗｎｔ４（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３０７６１）、Ｗｎｔ５Ａ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３３９２）、Ｗｎｔ５Ｂ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３２６４２）、Ｗｎｔ６（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３２６４２）  ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００４６２５）、Ｗｎｔ７Ｂ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０５８２３８）、Ｗｎｔ８Ａ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０５８２４４）、Ｗｎｔ８Ｂ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３３９３）、Ｗｎｔ９Ａ（Ｗｎｔ−１４）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３３９５）  Ｗｎｔ１５）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３３９６）、Ｗｎｔ１０Ａ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０２５２１６）、Ｗｎｔ１０Ｂ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３３９４）、Ｗｎｔ１１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００４６２６）、Ｗｎｔ１６（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１６０８７）。各メンバーはファミリーと様々な程度の配列同一性を有するが、その全てが、その間隔が高度に保存されている２３〜２４の保存されたシステイン残基を含む、小さい（すなわち３９〜４６ｋＤ）、アシル化、パルミトイル化、分泌糖タンパク質をコードする（ＭｃＭａｈｏｎ、ＡＰ  ｅｔ  ａｌ）、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１９９２；８：２３６〜２４２；Ｍｉｌｌｅｒ、Ｊ．Ｒ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．２００２；３（１）：３００１．１〜３００１．１５）。関心のある他の天然配列Ｗｎｔポリペプチドは、家畜および家畜動物を含む任意の哺乳動物、ならびにイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギ、ラットなどの動物または実験動物またはペット動物由来の上記のオルソログを含む。マウス、カエル、シマウマ、ミバエ、ワームなど
【０１１９】
ノリンポリペプチドおよびノリンコードポリヌクレオチド配列もまた当該分野で既知であり、哺乳動物ノリンポリペプチドおよびポリヌクレオチド、例えばヒトノリンポリペプチドおよびポリヌクレオチド、ならびにそれらの機能的バリアントおよび断片を含むあらゆる種類のノリンポリペプチドまたはポリヌクレオチドを含む。
【０１２０】
Ｗｎｔシグナル伝達アゴニスト分子は、Ｗｎｔシグナル伝達を刺激する任意の種類の分子を含む。特定の実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達アゴニスト分子は、ＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ  ２０１６／０４０８９５号に記載されている。Ｗｎｔシグナル伝達アゴニストは、１つ以上のＦｚｄタンパク質およびＬｒｐ５／６への結合を介して標準的なＷｎｔシグナル伝達を直接活性化する、特定の実施形態では水溶性の任意の分子、例えばタンパク質または医薬（例えば小有機分子）であり得る。特定の実施形態では、それらは小分子であり、これは約１５Ｋｄ未満であり得る。他の実施形態では、それらはポリペプチドである。さらに、特定のｗｎｔシグナル伝達アゴニストは、ポリペプチド領域またはドメインと非ポリペプチド領域またはドメインの両方を含み得る。
【０１２１】
本発明のいくつかの実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達アゴニスト分子はポリペプチドであり、これはＦｚｄおよびＬｒｐ５／６のための別々のまたは連続した結合ドメインまたは要素を含むことができる。ポリペプチドＷｎｔシグナル伝達アゴニストは、単鎖、二量体、またはより高次の多量体であり得る。Ｆｚｄ結合ドメイン／要素およびＬｒｐ５／６結合ドメイン／要素は直接結合されていてもよく、またはリンカー、例えばポリペプチドリンカー、または非ペプチドリンカーなどによって分離されていてもよい。
【０１２２】
ポリペプチドの実施形態では、Ｆｚｄ結合ドメインは、高親和性、例えば、少なくとも約１×１０−７Ｍ、少なくとも約１×１０−８Ｍ、少なくとも約１×１０−９Ｍ、または少なくとも約１×１０−１０ＭのＫＤでＦｚｄに結合する任意のドメインから選択され得る。適切なＦｚｄ結合ドメインには、限定されないが、新規に設計されたＦｚｄ結合タンパク質、１つ以上のＦｚｄタンパク質に特異的に結合する抗体由来結合タンパク質、例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂなど、および抗体の他の部分、ナノボディ由来結合ドメイン。ノッチンベースの人工足場、ノリンおよびそれに由来する操作された結合断片、天然に存在するＦｚｄ結合ドメインなどが含まれる。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、Ｆｚｄ結合ドメインは、１、２、３、４、５、またはそれ以上の異なるフリズルドタンパク質、例えば１つ以上のヒトフリズルドタンパク質Ｆｚ１、Ｆｚ２、Ｆｚ３、Ｆｚ４、Ｆｚ５、Ｆｚ６、Ｆｚ７、Ｆｚ８、Ｆｚ９、Ｆｚ１０に結合する。いくつかの実施形態では、抗体に基づくシグナル伝達アゴニストは、Ｆｚ１、Ｆｚ２、Ｆｚ５、Ｆｚ７およびＦｚ８に結合する。他の実施形態では、フリズルド結合部分は、１つ以上の目的のフリズルドタンパク質に対して選択的であり、例えば、他のフリズルドタンパク質に比べて少なくとも１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、２００倍以上の１つ以上の所望のフリズルドタンパク質に対して特異性を有する。
【０１２４】
特定の実施形態では、フリズルド結合ドメインは、汎特異的フリズルド抗体ＯＭＰ−１８Ｒ５（ヴァンティクマブ）の６つのＣＤＲ領域を含む。特定の実施形態では、フリズルド結合ドメインは、汎特異的フリズルド抗体ＯＭＰ−１８Ｒ５（ヴァンティクツマブ）の６つのＣＤＲ領域を含むｓｃＦｖである。例えば、参照により本明細書に具体的に組み入れられる米国特許第８５０７４４２号を参照されたい。例えば、ＯＭＰ−１８Ｒ５のＣＤＲ配列は、ＧＦＴＦＳＨＹＴＬＳを含む重鎖ＣＤＲ１（配列番号１７６）、ＶＩＳＧＤＧＳＹＴＹＹＡＤＳＶＫＧを含む重鎖ＣＤＲ２（配列番号１７７）、およびＮＦＩＫＹＶＦＡＮを含む重鎖ＣＤＲ３（配列番号１７８）を含み、（ｉｉ）ＳＧＤＫＬＧＫＫＹＡＳ（配列番号１７９）またはＳＧＤＮＩＧＳＦＹＶＨ（配列番号１８０）を含む軽鎖ＣＤＲ２、ＥＫＤＮＲＰＳＧ（配列番号１８１）またはＤＫＳＮＲＰＳＧ（配列番号１８２）を含む軽鎖ＣＤＲ２、およびＳＳＦＡＧＮＳＬＥ（配列番号１８３）またはＱＳＹＡＮＴＬＳＬ（配列番号１８４）を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、フリズルド結合ドメインは、限定されないが、ＳｃＦｖ、ミニボディ、ナノボディ、および配列番号１７６〜１８４のＣＤＲ配列を含む様々な抗体模倣物を含む、抗体またはその誘導体である。特定の実施形態では、これらのＣＤＲ配列は、配列番号１７６〜１８４と比較して１つ以上のアミノ酸修飾を含む。
【０１２５】
他の態様において、Ｆｚｄ結合ドメインは、当技術分野において既知であり市販されているか、または新規に生成することができる、任意の多数のフリズルド特異的抗体由来の可変領域配列またはそのＣＤＲを含む。フリズルドポリペプチドのいずれも、免疫原として、または抗体を開発するためのスクリーニングアッセイにおいて使用することができる。「Ｆｚ」、「Ｆｚタンパク質」および「Ｆｚ受容体」は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体ファミリーのタンパク質を指すために本明細書で使用される。これらのタンパク質は、ＣＲＤドメインを含む７回膜貫通型タンパク質である（Ｉｎｇｈａｍ，Ｐ．Ｗ．（１９９６）  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１２：３８２−３８４；Ｙａｎｇ−Ｓｎｙｄｅｒ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）  Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：１３０２−１３０６；Ｂｈａｎｏｔ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）  Ｎａｔｕｒｅ  ３８２：２２５−２３０）。Ｆｚファミリーには１０の既知のメンバー（Ｆｚ１からＦｚ１０）があり、そのうちのどれでもＷｎｔｓのレセプターとして機能することができる。ヒトｆｒｉｚｚｌｅｄ参照配列のＧｅｎｂａｎｋ登録番号は以下の通りである：ＦＺＤ１（ＮＭ＿００３５０５）、ＦＺＤ２（ＮＭ＿００１４６６）、ＦＺＤ３（ＮＭ＿１４５８６６）、ＦＺＤ４（ＮＭ＿０１２１９３）、ＦＺＤ５（ＮＭ＿００３４６８）、ＦＺＤ６（ＮＭ＿００３５０６）、ＦＺＤ７（ＮＭ＿００３５０７）、ＦＺＤ８（ＮＭ＿０３１８６６）、ＦＺＤ９（ＮＭ＿００３５０８）、ＦＺＤ１０（ＮＭ＿００７１９７）。［００７６］フリズルド結合ドメインの非限定的な例には、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄから入手可能な抗体、例えば、ヒトフリズルド４に特異的なクローンＣＨ３Ａ４Ａ７（ＣＤ３４４）、ヒトＦｚ９に特異的なクローンＷ３Ｃ４Ｅ１１（ＣＤ３４９）、Ａｂｅａｍから入手可能な抗体、例えば、Ｆｚ７に特異的なａｂ６４６３６、ヒトＦｚ４に特異的なａｂ８３０４２、ヒトＦｚ７に特異的なａｂ７７３７９、ヒトＦｚ８に特異的なａｂ７５２３５、ヒトＦｚ９に特異的なａｂ１０２９５６などが含まれる。適切な抗体の他の例は、とりわけ、米国特許出願第２０１４０１０５９１７号、米国特許出願第２０１３０２３０５２１号、米国特許出願第２００８０２６７９５５号、米国特許出願第２００８００３８２７２号、米国特許出願第２００３００４４４０９号に記載されている。
【０１２６】
代用物のフリズルド結合部分は、Ｗｎｔタンパク質のフリズルド結合領域に対する構造的相同性について選択された人工タンパク質であり得る。そのようなタンパク質は、相同性について構造データベースをスクリーニングすることによって同定することができる。このようにして最初のタンパク質、例えば微生物のＢｈ１４７８タンパク質が、同定された。次いで、天然タンパク質は、親和性を増大させるアミノ酸置換を提供するように操作され、所望のフリズルドタンパク質への結合における親和性および選択性の増大のための親和性成熟によってさらに選択され得る。フリズルド結合部分の非限定的な例には、ＰＣＴ特許出願公開第２０１６／０４０８９５号の図１に示されているＦｚ２７およびＦｚ２７−Ｂ１２タンパク質が含まれる。
【０１２７】
特定のポリペプチドの実施形態では、Ｌｒｐ５／６結合ドメインまたはエレメントは、高親和性、例えば、少なくとも約１×１０”７Ｍ、少なくとも約１×１０”８Ｍ、少なくとも約１×１０”９Ｍ、少なくとも約１×１０”１０ＭのＫＤでＬｒｐ５／６に結合する任意のドメインから選択され得る。適切なＬｒｐ５／６結合ドメインには、限定されないが、新規に設計されたＬｒｐ５／６結合タンパク質、１つ以上のＦｚｄタンパク質に特異的に結合する抗体由来結合タンパク質、例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂなど、および抗体の他の部分、ナノボディ由来結合ドメイン、ノッチンベースの人工足場、ノリン、ＤＫＫ１、ＤＫＫ２、ＤＫＫ３、ＤＫＫ４、スクレロスチンを含むが、これらに限定されない、天然に存在するＬｒｐ５／６結合タンパク質またはポリペプチドなどが含まれる。特定の実施形態では、Ｌｒｐ５／６結合ドメインはＤＫＫ１のＣ末端部分である。
【０１２８】
［００７９］Ｌｒｐ５／６結合ドメインは、例えば少なくとも約１×１０”７Ｍ、少なくとも約１×１０”８Ｍ、少なくとも約１×１０”９Ｍ、少なくとも約１×１０”１０Ｍ１のＫＤを有する高親和性でＬｒｐ５またはＬｒｐ６に結合する任意のドメインから選択され得る。「ＬＲＰ」、「ＬＲＰタンパク質」および「ＬＲＰ受容体」は、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質ファミリーのタンパク質を指すために本明細書中で使用される。これらの受容体は、受容体媒介エンドサイトーシスのプロセスにおいてリガンドと結合し、それを内在化させるシングルパス膜貫通タンパク質である。ＬＲＰタンパク質ＬＲＰ５（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ  ００２３３５．２）およびＬＲＰ６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ００２３３６．２）は、Ｗｎｔ受容体複合体に含まれる。
【０１２９】
［００８０］適切なＬｒｐ５／６結合ドメインには、限定されないが、新規に設計されたＬｒｐ５／６結合タンパク質、１つ以上のＦｚｄタンパク質に特異的に結合する抗体由来結合タンパク質、例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂなど、および抗体の他の部分；；ナノボディ由来結合ドメイン；ノッチンベースの人工足場；ＤＫＫ１、ＤＫＫ２、ＤＫＫ３、ＤＫＫ４、スクレロスチンを含むが、これらに限定されない、天然に存在するＬｒｐ５／６；Ｗｉｓｅ；上記のいずれかを含む融合タンパク質；上記のいずれかの誘導体；上記のいずれかのバリアント；ならびに上記のいずれかの生物学的に活性な断片などが含まれる。Ｌｒｐ５／６結合ドメインは、結合を増強するために親和性選択され得る。
【０１３０】
［００８１］Ｄｉｃｋｋｏｐｆ（Ｄｋｋ）遺伝子ファミリーのメンバー（Ｋｒｕｐｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｇｅｎｅ  ２３８（２）：３０１−１３参照）には、Ｄｋｋ−１、Ｄｋｋ−２、Ｄｋｋ−３、およびＤｋｋ−４、ならびにＤｋｋ−３関連タンパク質Ｓｏｇｇｙ（Ｓｇｙ）が含まれる。ｈＤｋｋ１〜４は、１０個のシステイン残基の位置が家族間で高度に保存されている２つの異なるシステインリッチドメインを含む。ヒトＤｋｋ遺伝子およびタンパク質の例示的な配列は公的に入手可能であり、例えばＧｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿０１４４１９（ｓｏｇｇｙ−１）、ＮＭ＿０１４４２０（ＤＫＫ４）、ＡＦ１７７３９４（ＤＫＫ−１）、ＡＦ１７７３９５（ＤＫＫ−２）、ＮＭ＿０１５８８１（ＤＫＫ３）、およびＮＭ＿０１４４２１（ＤＫＫ２）である。本発明のいくつかの実施形態では、Ｌｒｐ６結合部分は、ヒトＤＫＫ１のＣ末端ドメインを含むがこれに限定されないＤＫＫ１ペプチドである。図５に示すように、Ｃ末端ドメインは、配列ＫＭＹＨＴＫＧＱＥＧＳＶＣＬＲＳＳＤＣＡＳＧＬＣＣＡＲＨＦＷＳＫＩＣＫＴＫＨＲＲＫＧＳＨＧＬＥＩＦＱＲＣ  ＹＣＧＥＧＬＳＣＲＩＱＫＤＨＨＱＡＳＮＳＲＬＨＴＣＱＲＨ（配列番号１８５）（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号  ＮＰ＿０３６３７４を参照のこと）またはその生物学的に活性な断片を含み得る。
【０１３１】
［００８２］ＤＫＫタンパク質のＬＲＰ５／６への結合は、例えば、Ｂｒｏｔｔ  ａｎｄ  Ｓｏｋｏｌ  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２２（１７），６１００−６１１０（２００２）、およびＬｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（８），５９７７−５９８１（２００２）に記載されており、それぞれ参照により本明細書に具体的に組み込まれる。ヒトＤＫＫ２の対応する領域（Ｇｅｎｂａｎｋ参照番号ＮＰ＿０５５２３６）は、配列ＫＭＳＨＩＫＧＨＥＧＤＰＣＬＲＳＳＤＣＩＥＧＦＣＣＡＲＨＦＷＴＫＩＣＫＰＶＱＲＫＫＧＳＨＧＬＥＩＦＱＲＣＤ  ＣＡＫＧＬＳＣＫＶＷＫＤＡＴＹＳＳＫＡＲＬＨＶＣＱＫ（配列番号１８６）またはその生物学的に活性な断片）を含み得る。
【０１３２】
［００８３］  Ｌｒｐ５またはＬｒｐ６に特異的に結合する抗体は当該分野で既知であり市販されているか、または新規に生成することができる。Ｌｒｐ５、Ｌｒｐ６またはそれらの断片は、免疫原として、または抗体を開発するためのスクリーニングアッセイにおいて使用され得る。既知の抗体の例としては、限定されないが、Ｇｏｎｇら（２０１０）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．５（９）：ｅ１２６８２；Ｅｔｔｅｎｂｅｒｇら（２０１０）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．１０７（３５）：１５４７３〜８；ヒト起源の合成ＬＲＰ５／６に対して作製され、マウスおよびヒト起源のＬＲＰ６およびＬＲＰ５の全長およびタンパク質分解性断片の両方に結合する、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚバイオテクノロジー抗体クローン１Ａ１２から市販されているもの；モノクローナル抗体２Ｂ１１；ＬＲＰ５（Ｄ８０Ｆ２）に特異的なＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ抗体、カタログ番号５７３１等が挙げられる。
【０１３３】
ポリペプチドおよび結合ドメインはまた、上記のポリペプチドの誘導体、バリアント、および生物学的に活性な断片を含み得る。「バリアント」ポリペプチドは、提供された配列と１００％未満の配列同一性を有する、以下に定義されるような生物学的に活性なポリペプチドを意味する。そのようなバリアントには、提供された配列と比較して、１つ以上のアミノ酸修飾、たとえば挿入、欠失または置換を含むポリペプチドを含み、たとえば１つ以上のアミノ酸残基がＮ末端またはＣ末端、またはその中に付加されるもの、ネイティブ配列；約１〜４０個のアミノ酸残基が欠失され、場合により１個以上のアミノ酸残基により置換されるもの；および得られた生成物が天然に存在しないアミノ酸を有するようにアミノ酸残基が共有結合的に修飾されている、上記ポリペプチドの誘導体が挙げられる。特定の実施形態では、生物学的に活性なバリアントは、天然配列ポリペプチドと少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有するであろう。配列の「機能的バリアント」は、初期配列と共通の定性的生物学的性質を有する化合物である。「機能的バリアント」は、それらが共通の生物学的活性を有するという条件で、配列の断片および配列のバリアントを含むが、これらに限定されない。用語「バリアント」は、ポリペプチドのアミノ酸配列バリアントおよびその共有結合修飾の両方を包含する。
【０１３４】
Ｆｚｄ結合ドメインおよびＬｒｐ５／６結合ドメインは、１つの球状ドメイン内で隣接していてもよく、または本明細書に記載されるもののいずれかを含むがこれに限定されないポリペプチドリンカーなどのリンカーまたは非ペプチドリンカーなどによって分離されてもよい。リンカーの長さ、したがって結合ドメイン間の間隔は、シグナル強度を調節するために使用することができ、Ｗｎｔシグナル伝達アゴニストの所望の用途に応じて選択することができる。結合ドメイン間の強制距離は変動し得るが、特定の実施形態では、約１００オングストローム未満、約９０オングストローム未満、約８０オングストローム未満、約７０オングストローム未満、約６０オングストローム未満、または約５０オングストローム未満であり得る。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、リンカーは剛性リンカーであり、他の実施形態では、リンカーは可撓性リンカーである。リンカーがペプチドリンカーである場合、特定の実施形態では、それは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０以上のアミノ酸長であり、結合ドメイン間の距離を強制するのに十分な長さおよびアミノ酸組成のものである。いくつかの実施形態では、リンカーは、１つ以上のグリシンおよび／またはセリン残基を含むかまたはそれからなる。
【０１３６】
本開示はまた、１つ以上のＷｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチド、またはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードするポリヌクレオチドまたは核酸配列、ならびに発現ベクターを含むこれらのポリヌクレオチドを含むベクター、およびこれらのベクターを含む細胞を含む。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドまたは核酸配列はＤＮＡまたはＲＮＡである。特定の実施形態では、ＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。特定の実施形態では、ＲＮＡは、１つ以上の修飾ヌクレオシドを含む修飾ｍＲＮＡである。１つ以上の修飾ヌクレオシドを含む修飾ｍＲＮＡは、安定性の向上、より高い発現レベルおよび免疫原性の低下を含む、未修飾ｍＲＮＡを超える利点を有すると記載されている。本発明に従って使用され得る修飾ｍＲＮＡの非限定的な例は、例えば、ＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ２０１１／１３０６２４号、同第ＷＯ２０１２／１３８４５３号、同第ＷＯ２０１３１５１６６６号、同第ＷＯ２０１３／０７１０４７号、同第ＷＯ２０１３／０７８１９９号、同第ＷＯ２０１２０４５０７５号、同第ＷＯ２０１４０８１５０７号、同第ＷＯ２０１４０９３９２４号、同第ＷＯ２０１４１６４２５３号、米国特許第８，２７８，０３６号（シュードウリジンを含む修飾ｍＲＮＡを記載する）、同第第８，６９１，９６６号（シュードウリジンおよび／またはＮ１−メチルプスドリジンを含む改変ｍＲＮＡを記載する）、同第第８，８３５，１０８号（５−メチルシチジンを含む修飾ｍＲＮＡを記載する）、同第８，７４８，０８９号（シュードウリジンまたは１−メチルプスドリジンを含む修飾ｍＲＮＡを記載する）に記載されている。特定の実施形態では、Ｗｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチド、またはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする修飾ｍＲＮＡ配列は、非修飾Ａ、Ｇ、ＵまたはＣリボヌクレオシドと比較して少なくとも１つの修飾を含む。特定の実施形態では、少なくとも１つの修飾ヌクレオシドには、Ｎ１−メチルプスドリジンおよび／または５−メチルシチジンが含まれる。特定の実施形態において、修飾ｍＲＮＡは、５’末端キャップ配列と、それに続くＷｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチド、またはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする配列と、それに続くポリＡまたはポリＡ−Ｇ配列などの３’テーリング配列とを含む。
【０１３７】
特定の実施形態では、ポリヌクレオチドはベクター、例えば発現ベクターであり、発現ベクターはプロモーター配列、例えばプロモーターに作動可能に連結された本明細書に記載のＷｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチド、またはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードするポリヌクレオチド配列を含む。細胞内でポリヌクレオチドの発現を駆動する配列。ある態様において、ベクターはウイルスベクター、例えば、Ｗｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチド、またはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードするＤＮＡまたはＲＮＡ配列に作動可能に連結したプロモーターを含む発現カセットを含むポリヌクレオチドを含むウイルスである。特定の実施形態では、発現カセットは５’および／または３’の細胞性またはウイルス性ＵＴＲを含む。
【０１３８】
本開示はまた、本明細書に記載のポリヌクレオチドと少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％のポリヌクレオチド配列同一性を有するバリアントを含む、本明細書に記載のポリヌクレオチドの機能的断片およびバリアントを含む。そのようなバリアントは、本明細書に開示されている任意の配列と比較して、１つ以上のヌクレオチドまたはヌクレオシド修飾、例えば１つ以上のヌクレオチド欠失、挿入または置換を含むことができる。特定の実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、例えば宿主細胞中のコードされたポリペプチドの発現を増強するためにコドン最適化されている。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドバリアントは１つ以上の修飾ヌクレオチドまたはヌクレオシドを含む。
【０１３９】
本開示はまた、本明細書に記載のＷｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチド、またはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードするポリヌクレオチドまたはベクターを含む細胞を含む。特定の実施形態において、細胞は、Ｗｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチド、またはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子を産生するために使用され得る、例えばＨＥＫ２９３細胞などの宿主細胞である。本組成物を調製する際には、例えば、哺乳動物細胞（例えば、２９３細胞）、昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）、微生物および酵母を含むがこれらに限定されない、任意の宿主細胞を用いることができる。特定の実施形態では、細胞は、本明細書に記載のＷｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチド、またはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子で治療された対象に対して異種または自己由来である。特定の実施形態では、細胞は対象から得られ、本明細書に記載のウイルスベクターで形質導入された。特定の実施形態では、形質導入細胞は治療のために対象に送達される。本開示はまた、１つ以上のＷｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチド、またはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子、またはＷｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチド、またはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする配列を含む１つ以上のポリヌクレオチドまたはベクターを含む薬学的組成物を含む。
【０１４０】
薬学的組成物
本明細書に記載の組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子および１つ以上の薬学的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤を含む薬学的組成物も開示されている。特定の実施形態では、薬学的組成物は、本明細書に記載の１つ以上のＷｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチドまたはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をさらに含む。
【０１４１】
さらなる実施形態では、本明細書に記載の組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドおよび１つ以上の薬学的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤を含む薬学的組成物も開示される。特定の実施形態では、薬学的組成物は、本明細書に記載のＷｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチドまたはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする核酸配列を含む１つ以上のポリヌクレオチドをさらに含む。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドはＤＮＡまたはｍＲＮＡ、例えば修飾ｍＲＮＡである。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、５’キャップ配列および／または３’テーリング配列、例えばポリＡテールをさらに含む修飾ｍＲＮＡである。他の実施形態において、ポリヌクレオチドは、コード配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットである。特定の実施形態では、組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子をコードする核酸配列およびＷｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチドまたはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする核酸配列は同じポリヌクレオチド中に存在する。
【０１４２】
さらなる実施形態では、本明細書に記載の組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドおよび１つ以上の薬学的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤を含む発現ベクター、例えばウイルスベクターを含む薬学的組成物もまた開示される。特定の実施形態では、薬学的組成物は、本明細書に記載のＷｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチドまたはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、例えばウイルスベクターをさらに含む。組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子をコードする配列およびＷｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチドまたはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする核酸配列は、同じポリヌクレオチド、例えば発現カセットに存在する。
【０１４３】
本発明はさらに、本明細書に記載の組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子をコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む細胞および１つ以上の薬学的に許容される希釈剤、担体または賦形剤を含む細胞を含む薬学的組成物を企図する特定の実施形態では、薬学的組成物は、本明細書に記載のＷｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチドまたはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする核酸配列に機能的に連結されたプロモーターを含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む細胞をさらに含む。特定の実施形態では、組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子をコードする核酸配列およびＷｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチドまたはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする核酸配列は、同じポリヌクレオチド、例えば発現カセットおよび／または同じ細胞に存在する。特定の実施形態において、細胞は、治療されるべき対象から得られた異種細胞または自己細胞である。特定の実施形態では、細胞は幹細胞、例えば脂肪由来幹細胞または造血幹細胞である。
【０１４４】
本開示は、第１の活性剤として組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子を送達するための第１の分子と、第２の活性剤としてＷｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチドまたはＷｎｔシグナル伝達アゴニストを送達するための第２の分子とを含む薬学的組成物を企図する。第１および第２の分子は、同じ種類の分子でも異なる種類の分子でもよい。例えば、特定の実施形態において、第１および第２の分子はそれぞれ、以下の種類の分子から独立して選択され得る：ポリペプチド、有機小分子、第１または第２の活性剤をコードする核酸（任意にＤＮＡまたはｍＲＮＡ、任意に修飾ＲＮＡ）。第１または第２の活性剤をコードする核酸配列を含むベクター（任意で発現ベクターまたはウイルスベクター）、および第１または第２の活性剤をコードする核酸配列を含む（任意で発現カセット）細胞。
【０１４５】
本分子は、単独でまたは組み合わせて、一般に安全、無毒、および望ましい製剤を調製するのに有用な医薬上許容される担体、希釈剤および試薬と組み合わせることができ、哺乳動物、例えばヒトに許容される賦形剤を含む。または霊長類、使用してください。そのような賦形剤は、固体、液体、半固体、またはエアロゾル組成物の場合には気体であり得る。そのような担体または希釈剤の例としては、水、食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。補助的な活性化合物も製剤に組み入れることができる。製剤に使用される溶液または懸濁液は、注射用水、食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌化合物；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの酸化防止剤；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート化合物；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などの緩衝液；凝集を防ぐためのＴｗｅｅｎ  ２０などの洗剤；塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの等張化のための化合物を含み得る。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調整することができる。特定の実施形態では、薬学的組成物は無菌である。
【０１４６】
薬学的組成物は、滅菌水溶液または分散液、および滅菌注射用溶液または分散液の即時調製用の滅菌粉末をさらに含み得る。静脈内投与の場合、適切な担体には、生理食塩水、静菌水、またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。いくつかの場合において、組成物は無菌であり、容易な注射可能性が存在する程度まで流動性であるべきである。特定の実施形態では、それは製造および保存の条件下で安定であり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されている。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えばレシチンのようなコーティングの使用により、分散液の場合には必要な粒径の維持により界面活性剤の使用により維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成することができる。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。内部組成物の長期吸収は、組成物中に吸収を遅らせる物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含めることによってもたらすことができる。
【０１４７】
滅菌溶液は、必要に応じて上記に列挙した成分の１つまたは組み合わせと共に適切な溶媒中に必要量の組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子を組み入れ、続いて濾過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散液は、活性化合物を、塩基性分散媒および上記に列挙したものからの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。無菌注射用溶液を調製するための無菌粉末の場合、調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これは、その前に無菌濾過した溶液から活性成分に加えて任意の追加の所望成分を加えた粉末をもたらす。
【０１４８】
一実施形態では、薬学的組成物は、インプラントおよびマイクロカプセル化送達システムを含む制御放出製剤など、融合タンパク質を身体からの急速な排除から保護する担体と共に調製される。エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーを使用することができる。そのような製剤の調製方法は当業者に明らかであろう。材料は商業的に入手することもできる。リポソーム懸濁液も薬学的に許容される担体として使用することができる。これらは当業者に知られている方法に従って調製することができる。
【０１４９】
投与の容易さおよび投薬量の均一性のために、薬学的組成物を投薬単位形態に処方することが有利であり得る。本明細書で使用される投与量単位形態は、治療される対象のための単位投与量として適した物理的に別々の単位を指す。各単位は、必要な薬学的担体と共に所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性化合物を含む。本発明の投与単位形態の詳細は、活性化合物の独特の特徴および達成されるべき特定の治療効果、ならびに個々の治療のためのそのような活性化合物を調合する技術分野に固有の制限によって決定され、直接左右される。
【０１５０】
薬学的組成物は、投与のための説明書と共に、容器、パック、またはディスペンサー、例えばシリンジ、例えばプレフィルドシリンジに含めることができる。
【０１５１】
本発明の薬学的組成物は、任意の薬学的に許容される塩、エステル、またはそのようなエステルの塩、またはヒトを含む動物への投与時に生物学的に活性な組織特異性を提供することができる任意の他の化合物を包含する。Ｗｎｔシグナル増強分子。
【０１５２】
本発明は、本明細書に記載の組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子の薬学的に許容される塩を含む。「薬学的に許容される塩」という用語は、本発明の化合物の生理学的および薬学的に許容される塩、すなわち親化合物の所望の生物学的活性を保持し、それに望ましくない毒性作用を与えない塩を指す。様々な薬学的に許容される塩が当該分野で既知であり、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、第１７版、Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｒ．例えば、“Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”、第３版、Ｊａｍｅｓ  Ｓｗａｒｂｒｉｃｋ（Ｅｄ．）、Ｉｎｆｏｒｍａ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＵＳＡ（Ｉｎｃ．）、ＮＹ、ＵＳＡ、２００７、およびＪ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：２（１９７７）。また、適切な塩に関する総説については、Ｓｔａｈｌ  ａｎｄ  Ｗｅｒｍｕｔｈによる「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ：特性、選択、および使用」（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、２００２年）を参照。
【０１５３】
薬学的に許容される塩基付加塩は、アルカリ金属およびアルカリ土類金属または有機アミンなどの金属またはアミンを用いて形成される。カチオンとして使用される金属は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどを含む。アミンは、Ｎ−Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、およびプロカインを含む（例えば、Ｂｅｒｇｅら、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ」、Ｊ．Ｐｈａｒｍａ  Ｓｃｉ．、１９７７、６６、１１９を参照のこと）。該酸性化合物の塩基付加塩は、従来の方法で遊離酸形態を十分量の所望の塩基と接触させて塩を生成することによって調製される。遊離酸形態は、塩形態を酸と接触させ、従来の方法で遊離酸を単離することによって再生することができる。遊離酸形態は、極性溶媒への溶解度などの特定の物理的性質においてそれらのそれぞれの塩形態といくらか異なるが、それ以外の点では、塩は本発明の目的のためのそれらのそれぞれの遊離酸と等価である。
【０１５４】
いくつかの実施形態において、本明細書に提供される薬学的組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤および／または賦形剤、例えば食塩水、リン酸緩衝食塩水、リン酸およびアミノ酸、ポリマー、ポリオール、糖、緩衝液、保存剤、および他のタンパク質と混合した、治療有効量の本明細書に記載の組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子を含む。例示的なアミノ酸、ポリマーおよび糖などは、オクチルフェノキシポリエトキシエタノール化合物、ポリエチレングリコールモノステアレート化合物、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、スクロース、フルクトース、デキストロース、マルトース、グルコース、マンニトール、デキストラン、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール、キシリトール、ラクトース、トレハロース、ウシまたはヒト血清アルブミン、クエン酸塩、酢酸塩、リンゲル液およびハンク液、システイン、アルギニン、カルニチン、アラニン、グリシン、リジン、バリン、ロイシン、ポリビニルピロリドン、ポリエチレンおよびグリコールである。好ましくは、この製剤は４℃で少なくとも６ヶ月間安定である。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される薬学的組成物は、緩衝液、例えば、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）またはリン酸ナトリウム／硫酸ナトリウム、トリス緩衝液、グリシン緩衝液、滅菌水、および当業者に既知の他の緩衝液、例えばＧｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９６６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５：４６７に記載されるものを含む。緩衝液のｐＨは、６．５〜７．７５、好ましくは７〜７．５、最も好ましくは７．２〜７．４の範囲であり得る。
【０１５６】
細胞内のＷｎｔ活性を増加させるための方法
融合タンパク質に関して本明細書に例示される組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子は、標的組織または細胞型におけるＷｎｔシグナル伝達を増加させるために使用され得る。特定の実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達は標準Ｗｎｔシグナル伝達である。したがって、いくつかの態様では、本発明は、標的組織または細胞におけるＷｎｔ増加またはＷｎｔシグナル伝達の増強方法であって、標的組織または細胞を有効量の本発明の組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子と接触させることを含み、該分子は、標的組織または細胞上の細胞表面受容体に組織特異的または細胞特異的様式で結合する標的ドメインを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、接触はインビトロ、エクスビボ、またはインビボで起こり、例えば、対象の組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子が対象に投与または提供される。特定の実施形態では、細胞は培養細胞であり、接触はインビトロで起こる。
【０１５７】
特定の実施形態では、方法は、標的組織または細胞を、本明細書に記載の１つ以上のＷｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチドまたはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子とさらに接触させることを含む。本開示は、標的組織または細胞を、第１の活性剤としての組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子の送達のための第１の分子および第２の活性剤としてのＷｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチドまたはＷｎｔシグナル伝達アゴニストの送達のための第２の分子と接触させることを企図する。第１および第２の分子は、同じ種類の分子でも異なる種類の分子でもよい。例えば、特定の実施形態において、第１および第２の分子はそれぞれ、以下の種類の分子から独立して選択され得る：ポリペプチド、有機小分子、第１または第２の活性剤をコードする核酸（任意にＤＮＡまたはｍＲＮＡ、任意に修飾ＲＮＡ）、第１または第２の活性剤をコードする核酸配列を含むベクター（任意で発現ベクターまたはウイルスベクター）、および第１または第２の活性剤をコードする核酸配列を含む（任意で発現カセット）細胞。
【０１５８】
関連する態様において、本発明は、標的組織または細胞におけるＷｎｔシグナル伝達を増加させる方法であって、標的組織または細胞を、組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子をコードする核酸配列を含む有効量のポリヌクレオチドと接触させることを含み、該分子は、標的組織または細胞上の細胞表面受容体に組織特異的または細胞特異的様式で結合する標的ドメインを含む、方法を提供する。特定の実施形態では、標的組織または細胞はまた、Ｗｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチドまたはＷｎｔシグナル伝達アゴニストをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドと接触させる。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドはＤＮＡまたはｍＲＮＡ、例えば修飾ｍＲＮＡである。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、５’キャップ配列および／または３’テーリング配列、例えばポリＡテールをさらに含む修飾ｍＲＮＡである。他の実施形態において、ポリヌクレオチドは、コード配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットである。特定の実施形態では、組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子をコードする核酸配列およびＷｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチドまたはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする核酸配列は同じポリヌクレオチド中に存在する。
【０１５９】
関連する態様において、本発明は、標的組織または細胞におけるＷｎｔシグナル伝達を増加させる方法であって、標的組織または細胞を、組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子をコードする核酸配列を含む有効量のベクターと接触させることを含み、該分子は、標的組織または細胞上の細胞表面受容体に組織特異的または細胞特異的様式で結合する標的ドメインを含む、方法を提供する。特定の実施形態では、標的組織または細胞はまた、Ｗｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチドまたはＷｎｔシグナル伝達アゴニストをコードする核酸配列を含むベクターと接触させる。特定の実施形態では、ベクターは発現ベクターであり、核酸配列に機能的に連結されたプロモーターを含み得る。特定の実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。特定の実施形態では、組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子をコードする核酸配列およびＷｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチドまたはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする核酸配列は、同じベクター中、例えば同じ発現カセット中に存在する。
【０１６０】
関連する態様において、本発明は、標的組織におけるＷｎｔシグナル伝達を増加させる方法であって、標的組織を、本発明の組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子をコードする核酸配列を含む有効量の細胞と接触させることを含み、該分子は、標的組織または細胞上の細胞表面受容体に組織特異的または細胞特異的様式で結合する標的ドメインを含む、方法を提供する。特定の実施形態では、標的組織はまた、Ｗｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチドまたはＷｎｔシグナル伝達アゴニストをコードする核酸配列を含む細胞と接触させる。特定の実施形態では、組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子をコードする核酸配列と、Ｗｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチドまたはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする核酸配列とが同じ細胞中に存在する。特定の実施形態において、細胞は、治療されるべき対象から得られた異種細胞または自己細胞である。特定の実施形態において、細胞は、組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子またはＷｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチドまたはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする発現カセットを含むベクターで形質導入された。特定の実施形態では、細胞は幹細胞、例えば脂肪由来幹細胞または造血幹細胞である。
【０１６１】
病気や障害を治療するための方法
本明細書中で融合タンパク質に関して例示される組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子は、例えば標的細胞、組織または器官におけるＷｎｔシグナル伝達を増加させることによって、疾患、障害または状態を処置するために使用され得る。したがって、いくつかの態様では、本発明は、それを必要とする対象における疾患または状態、例えばＷｎｔシグナル伝達の低下に関連するか、またはＷｎｔシグナル伝達の増加が治療上の恩恵をもたらすであろう疾患または障害を治療するための方法であって、対象を有効量の本開示の組成物と接触させることを含む、方法を提供する。特定の実施形態では、組成物は、以下のいずれかを含む薬学的組成物である：組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子、例えば、小分子またはポリペプチド；組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子、例えばＤＮＡまたはｍＲＮＡ、必要に応じて修飾ｍＲＮＡをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド；組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子をコードする核酸配列を含むベクター；例えば発現ベクターまたはウイルスベクター；または組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子をコードする核酸配列を含む細胞、例えば、組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子をコードする発現ベクターまたはウイルスベクターで形質導入された細胞。特定の実施形態では、疾患または状態は病的な疾患または障害、または損傷、例えば創傷から生じる損傷である。特定の実施形態では、創傷は別の治療的処置の結果であり得る。特定の実施形態では、疾患または状態は、組織修復の障害、治癒または再生を含むか、または組織修復の増加、治癒または再生の恩恵を受けるであろう。いくつかの実施形態では、接触はインビボで起こる、すなわち、対象組成物は対象に投与される。
【０１６２】
特定の実施形態では、方法は、本明細書に記載の１つ以上のＷｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチドまたはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子を含む薬学的組成物と対象をさらに接触させることを含む。本開示は、第１の活性剤としての組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子の送達のための第１の分子および第２の活性剤としてのＷｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチドまたはＷｎｔシグナル伝達アゴニストの送達のための第２の分子と対象との接触を企図する。第１および第２の分子は、同じ種類の分子でも異なる種類の分子でもよい。例えば、特定の実施形態において、第１および第２の分子はそれぞれ、以下の種類の分子から独立して選択され得る：ポリペプチド、有機小分子、第１または第２の活性剤をコードする核酸（任意にＤＮＡまたはｍＲＮＡ、任意に修飾ＲＮＡ）、第１または第２の活性剤をコードする核酸配列を含むベクター（任意で発現ベクターまたはウイルスベクター）、および第１または第２の活性剤をコードする核酸配列を含む（任意で発現カセット）細胞。
【０１６３】
関連する態様において、本発明は、疾患または状態、例えばＷｎｔシグナル伝達の減少に関連するか、またはＷｎｔシグナル伝達の増加が治療上の恩恵をもたらすであろう疾患または障害を治療する方法であって、対象を、本発明の組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む有効量の薬学的組成物と接触させることを含み、該分子は、標的組織または細胞上の細胞表面受容体に組織特異的または細胞特異的な様式で結合する標的ドメインを含む、方法を提供する。ある態様において、対象はまた、Ｗｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチドまたはＷｎｔシグナル伝達アゴニストをコードする核酸配列を含む有効量のポリヌクレオチドを含む薬学的組成物と接触させられる。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドはＤＮＡまたはｍＲＮＡ、例えば修飾ｍＲＮＡである。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、５’キャップ配列および／または３’テーリング配列、例えばポリＡテールをさらに含む修飾ｍＲＮＡである。他の実施形態において、ポリヌクレオチドは、コード配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットである。特定の実施形態では、組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子をコードする核酸配列およびＷｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチドまたはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする核酸配列は同じポリヌクレオチド中に存在する。
【０１６４】
関連する態様において、本発明は、疾患または状態、例えばＷｎｔシグナル伝達の減少に関連するか、またはＷｎｔシグナル伝達の増加が治療上の恩恵をもたらすであろう疾患または障害を治療する方法であって、それを必要とする対象を、本発明の組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子をコードする核酸配列を含む有効量のベクターを含む薬学的組成物と接触させることを含み、該分子は、標的組織または細胞内の細胞表面受容体に組織特異的または細胞特異的様式で結合する標的ドメインを含む、方法を提供する。特定の実施形態では、対象はまた、Ｗｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチドまたはＷｎｔシグナル伝達アゴニストをコードする核酸配列を含む有効量のベクターを含む薬学的組成物と接触させられる。特定の実施形態では、ベクターは発現ベクターであり、核酸配列に機能的に連結されたプロモーターを含み得る。特定の実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。特定の実施形態では、組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子をコードする核酸配列およびＷｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチドまたはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする核酸配列は、同じベクター中、例えば同じ発現カセット中に存在する。
【０１６５】
関連する態様において、本発明は、疾患または状態、例えばＷｎｔシグナル伝達の減少に関連するか、またはＷｎｔシグナル伝達の増加が治療上の恩恵をもたらすであろう疾患または障害を治療する方法であって、それを必要とする対象を、本発明の組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子をコードする核酸配列を含む有効量の細胞を含む薬学的組成物と接触させることを含み、該分子は、標的組織または細胞内の細胞表面受容体に組織特異的または細胞特異的様式で結合する標的ドメインを含む、方法を提供する。特定の実施形態では、対象はまた、Ｗｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチドまたはＷｎｔシグナル伝達アゴニストをコードする核酸配列を含む細胞と接触させる。特定の実施形態では、組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子をコードする核酸配列と、Ｗｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチドまたはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする核酸配列とが同じ細胞中に存在する。特定の実施形態において、細胞は、治療されるべき対象から得られた異種細胞または自己細胞である。特定の実施形態において、細胞は、組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子またはＷｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチドまたはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする発現カセットを含むベクターで形質導入された。特定の実施形態では、細胞は幹細胞、例えば脂肪由来幹細胞または造血幹細胞である。
【０１６６】
他の態様において、本発明は、Ｗｎｔシグナル伝達の減少に関連するか、またはＷｎｔシグナル伝達の増加が治療上の恩恵をもたらすであろう疾患または状態の治療方法であって、それを必要とする対象を、Ｗｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチドまたはＷｎｔシグナル伝達アゴニストをコードする核酸配列を含む有効量のポリヌクレオチドを含む薬学的組成物と接触させることを含む、方法を提供する。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドはＤＮＡまたはｍＲＮＡ、例えば修飾ｍＲＮＡである。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、５’キャップ配列および／または３’テーリング配列、例えばポリＡテールをさらに含む修飾ｍＲＮＡである。他の実施形態において、ポリヌクレオチドは、コード配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットである。
【０１６７】
関連する態様において、本発明は、疾患または状態、例えばＷｎｔシグナル伝達の減少に関連するか、またはＷｎｔシグナル伝達の増加が治療上の恩恵をもたらすであろう疾患または障害を治療するための方法であって、それを必要とする対象を、Ｗｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチドまたはＷｎｔシグナル伝達アゴニストをコードする核酸配列を含む有効量のベクターを含む薬学的組成物と接触させることを含む、方法を提供する。特定の実施形態では、ベクターは発現ベクターであり、核酸配列に機能的に連結されたプロモーターを含み得る。特定の実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。
【０１６８】
関連する態様において、本発明は、疾患または状態、例えばＷｎｔシグナル伝達の減少に関連するか、またはＷｎｔシグナル伝達の増加が治療上の恩恵をもたらすであろう疾患または障害を治療するための方法であって、それを必要とする対象を、Ｗｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチドまたはＷｎｔシグナル伝達アゴニストをコードする核酸配列を含む有効量の細胞を含む薬学的組成物と接触させることを含む、方法を提供する。特定の実施形態において、細胞は、治療されるべき対象から得られた異種細胞または自己細胞である。特定の実施形態では、細胞に、Ｗｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチドまたはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする発現カセットを含むベクターを形質導入した。特定の実施形態では、細胞は幹細胞、例えば脂肪由来幹細胞または造血幹細胞である。
【０１６９】
Ｗｎｔシグナル伝達は、幹細胞の発生プロセスおよび維持において重要な役割を果たす。Ｗｎｔシグナルの再活性化は、傷害および疾患後のほとんどの組織の再生および修復と関連している。組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子は、傷害および疾患に応答して治癒および組織修復の恩恵を提供し得る。組織の損傷および喪失の原因には、老化、変性、遺伝的状態、感染および炎症、外傷、毒素／代謝誘発毒性、または他の病的状態が含まれるがこれらに限定されない。ＷｎｔシグナルおよびＷｎｔシグナルのエンハンサーは、成体の組織内在幹細胞を活性化することが示されている。いくつかの実施形態において、本発明の化合物は、罹患組織または損傷組織の治療における使用のため、組織再生における使用のため、ならびに細胞の成長および増殖における使用のため、および／または組織工学における使用のために投与される。
【０１７０】
Ｗｎｔ経路の変異に関連するヒトの疾患は、疾患の治療および予防におけるＷｎｔシグナルの増強についての強力な証拠を提供する。前臨床のインビボおよびインビトロの研究は、多くの病状におけるＷｎｔシグナルの関与のさらなる証拠を提供し、さらに様々なヒトの疾患における組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子の利用を支持する。例えば、本発明の組成物は、骨の成長または再生、骨移植、骨折の治癒、骨粗鬆症および骨粗鬆症性骨折の治療、脊椎固定術、整形外科用装置の骨統合、腱−骨統合、歯の成長を促進または増加させるために使用できる。再生、歯の移植、歯周病、顎顔面再建、および顎骨壊死。脱毛症の治療にも使用できる。感覚臓器の再生の促進、例えば、難聴の治療、前庭機能低下の治療、黄斑変性症の治療、硝子体網膜症の治療、糖尿病性網膜症、または他の網膜変性疾患、フックスジストロフィー、他の角膜疾患など。脳卒中、外傷性脳損傷、アルツハイマー病、多発性硬化症および血液脳関門に影響を与えるその他の症状の治療。脊髄損傷、その他の脊髄疾患の治療。本発明の組成物はまた、口腔粘膜炎、腸粘膜炎、短腸症候群、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、他の胃腸障害の治療にも使用できる。メタボリックシンドロームの治療糖尿病の治療、膵炎の治療、膵外分泌組織または内分泌膵臓組織が損傷している状態。表皮再生の増強が望まれる状態、例えば、表皮創傷治癒、糖尿病性足部潰瘍の治療、歯を含む症候群、爪、または真皮形成不全など、血管新生が有益である状態。心筋梗塞、冠状動脈疾患、心不全の治療。造血細胞の増殖の促進、例えば骨髄からの造血幹細胞移植の促進、動員末梢血、免疫不全の治療、移植片対宿主病など。急性腎障害、慢性腎臓病の治療肺疾患の治療、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、特発性肺線維症、肺組織の再生の促進。本発明の組成物はまた、肝細胞の再生増強、例えば肝再生、肝硬変の治療、肝移植の増強、急性肝不全の治療、Ｃ型肝炎もしくはＢ型肝炎ウイルス感染を伴う慢性肝疾患の治療、または抗ウイルス薬療法の後、アルコール性肝疾患、脂肪症または脂肪性肝炎を伴う非アルコール性肝疾患などに使用することができる。
【０１７１】
Ｗｎｔシグナル伝達成分における機能喪失または機能獲得変異を含むヒト遺伝学は、骨成長のためのＷｎｔシグナルの増強を支持する強力な証拠を示す。骨成長の促進が望まれる状態には、骨折、移植片、人工装具周囲の内方成長、骨粗鬆症、骨粗鬆症性骨折、脊椎固定術、顎骨壊死、歯の移植、歯周病、顎顔面再建などが含まれるがこれらに限定されない。組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子は、骨再生を促進するのに重要なＷｎｔシグナルを増強および促進する。骨組織の再生方法は、全身的または局所的であり得る本発明の化合物の投与から恩恵を受ける。いくつかの実施形態において、骨髄細胞は、その骨髄内の幹細胞が活性化されるように、本発明の分子に曝露される。
【０１７２】
いくつかの実施形態において、骨再生は、応答性細胞集団、例えば骨髄、骨前駆細胞、骨幹細胞などを有効量の本発明の分子と接触させることによって増強される。骨組織の再生方法は、全身的または局所的であり得る本発明の化合物の投与から恩恵を受ける。いくつかのそのような態様において、接触はインビボで行われる。他のそのような態様において、接触はエクスビボで行われる。分子は、例えば、任意選択で生分解性であり、任意選択で活性剤の持続放出をもたらすマトリックス上に負荷することによって、作用部位に局在化させることができる。マトリックス担体は、吸収性コラーゲンスポンジ、セラミック、ヒドロゲル、ポリマーミクロスフェア、ナノ粒子、骨セメントなどを含むが、これらに限定されない。
【０１７３】
本発明の１つ以上の分子を含む組成物は、骨格組織欠損症のインビボ治療に使用することができる。「骨格組織欠損症」とは、たとえ欠損がどのような原因であったとしても（例えば外科的介入の結果として）、骨または結合組織を修復することが望まれる任意の部位における骨または他の骨格結合組織の欠損を意味する。腫瘍の除去、潰瘍形成、インプラント、骨折、またはその他の外傷性または変性性の状態。本発明の組成物は、軟骨機能を結合組織に回復させるためのレジメンの一部として、変性摩耗および関節炎などの軟骨組織の欠陥または損傷、組織への外傷、断裂した半月板の置換のために使用することができる。半月板切除術、靭帯の裂傷による関節の弛緩、関節の不整列、骨折、または遺伝性疾患による。
【０１７４】
本発明の組成物はまた、歯周病の治療にも使用され得る。歯周病は歯の喪失の主な原因であり、複数の全身状態に関連している。いくつかの実施形態では、歯またはその下の骨の再生は、応答性細胞集団と接触することによって増強される。いくつかのそのような態様において、接触はインビボで行われる。他のそのような態様において、接触はエクスビボで行われ、続いて活性化幹細胞または前駆細胞の移植が行われる。分子は、例えば、任意選択で生分解性であり、任意選択で活性剤の持続放出をもたらすマトリックス上に負荷することによって、作用部位に局在化させることができる。マトリックス担体としては、吸収性コラーゲンスポンジ、セラミック、ヒドロゲル、骨セメント、ポリマーミクロスフェア、ナノ粒子などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７５】
研究は、Ｗｎｔシグナル伝達およびＲ−スポンジンの生物学が、損傷、加齢、または変性の後の内耳における感覚有毛細胞の再生を促進することができることを示した。聴覚障害または前庭機能低下に関与する内耳における感覚有毛細胞の喪失もまた、本発明の組成物から恩恵を受ける可能性がある。内耳には、聴覚器官が音の振動を電気的インパルスに変換するのに必要な機械感受性の有毛細胞を収容している。半規管（ＳＳＣ）、卵形嚢、および嚢からなる前庭器官も、頭部の位置と動きを検出するために感覚有毛細胞を含む。本発明の組成物は、例えば注入に使用することができる。マトリックスまたは他のデポシステムで。または聴覚再生の強化のための耳への他の局所適用。
【０１７６】
本発明の組成物はまた、網膜組織の再生においても使用され得る。成体哺乳動物網膜において、ミュラーグリア細胞は、例えばインビボでの神経毒性損傷後に、光受容体を含む網膜細胞を再生することができる。Ｗｎｔシグナル伝達およびＷｎｔシグナルのエンハンサーは、損傷後または変性中に、ミュラーグリア由来網膜前駆細胞の増殖を促進することができる。本発明の組成物はまた、眼内の組織および他の細胞型の再生にも使用され得る。例えば、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、他の網膜変性疾患、角膜疾患、フックスジストロフィー、硝子体網膜症、遺伝性疾患などが本発明の組成物から恩恵を受けることができる。ＡＭＤは、次第に減少する中心視力および視力を特徴とする。フックスジストロフィーは、角膜内皮細胞の進行性の喪失を特徴としている。ＷｎｔシグナルおよびＷｎｔシグナルの増強は、眼組織における角膜内皮、網膜上皮などの再生を促進することができる。他の実施形態では、本発明の組成物は、例えば、注入；マトリックスまたは他のデポシステム；または網膜再生および黄斑変性の治療のための眼への他の局所適用に使用することができる。
【０１７７】
肝細胞の恒常的再生のための増殖細胞の特定の集団、例えば中心周辺領域のＡｘｉｎ２陽性細胞が系統追跡研究を通して同定されている。系統追跡研究はまた、Ｌｇｒ陽性細胞を含むがこれに限定されない追加の潜在的肝臓前駆細胞を同定した。Ｌｇｒ５陽性細胞およびＡｘｉｎ２陽性細胞を含む自己再生性肝細胞および他の潜在的前駆細胞集団は、傷害後のＷｎｔシグナルおよび／またはＲスポンジンに応答して再生することができると同定されている。急性肝障害および失敗ならびに慢性肝疾患の多数の前臨床モデルは、Ｗｎｔシグナルを増強することから肝細胞の回復および再生が有益であることを示した。本発明の組成物は、急性肝不全、急性アルコール性肝障害、Ｃ型またはＢ型肝炎ウイルス感染を伴う慢性肝疾患の治療または抗ウイルス薬治療、慢性アルコール性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝疾患の治療に使用できる。非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変の治療、あらゆる原因による重度の慢性肝疾患、肝細胞の再生促進。肝組織の再生方法は、全身的または局所的であり得る本発明の化合物の投与から恩恵を受ける。これらには、全身投与方法および局所投与方法、例えば肝臓組織への注入、静脈または肝臓への血管への注入、徐放性製剤の移植などが含まれるがこれらに限定されない。
【０１７８】
Ｗｎｔシグナルは様々な上皮組織の再生において重要な役割を果たす。様々な表皮状態が本発明の化合物による治療から恩恵を受ける。粘膜炎は、胃腸管の内側を覆っている急速に分裂した上皮細胞の崩壊があるときに起こり、粘膜組織を潰瘍形成および感染に対して開いたままにする。口腔粘膜と呼ばれる、口を覆う上皮内層の部分は、体の最も敏感な部分の１つであり、化学療法や放射線に対して特に脆弱である。口腔粘膜炎は、おそらく最も一般的で衰弱させる癌治療、特に化学療法と放射線療法の合併症である。さらに、本発明の組成物はまた、腸粘膜炎、短腸症候群、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、または他の胃腸障害の治療にも有益であり得る。他の表皮状態には、表皮創傷治癒、糖尿病性足部潰瘍、歯を含む症候群、爪、または真皮形成不全などが含まれる。本発明の分子は、再生細胞を本発明の化合物と接触させるこれら全ての条件において使用することができる。上皮組織の再生方法は、全身的または局所的であり得る本発明の化合物の投与から恩恵を受ける。接触は、例えば、皮内、皮下、ゲル中、ローション、クリームなど、局所的に適用することができる。
【０１７９】
皮膚および胃腸管に加えて、ＷｎｔシグナルならびにＷｎｔシグナルの増強および促進もまた、前臨床モデルにおける膵臓、腎臓、および肺を含む組織の修復および再生において重要な役割を果たす。組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子は、外分泌および内分泌膵臓、腎臓、または肺を含む様々な病状に恩恵をもたらし得る。本発明の組成物は、メタボリックシンドロームの治療、糖尿病の治療、急性または慢性膵炎の治療、膵外分泌機能不全、急性腎障害の治療、慢性腎臓病、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、特発性肺線維症、肺上皮組織の損失を引き起こす他の症状を含むがこれらに限定されない肺疾患の治療に使用することができる。これらの組織の再生方法は、全身的または局所的であり得る本発明の化合物の投与から恩恵を受ける。
【０１８０】
表皮Ｗｎｔシグナル伝達は、他の発生因子を介するシグナル伝達と協調して、成体毛包再生に重要である。脱毛は一般的な問題であり、男性型脱毛症と呼ばれることが多い男性型脱毛症は、男性の脱毛の最も一般的な形態である。いくつかの実施形態において、毛包の再生は、応答性細胞集団を本発明の分子と接触させることによって増強される。いくつかのそのような態様において、接触はインビボで行われる。他のそのような態様において、接触はエクスビボで行われる。分子は作用部位、例えば局所用ローション、ゲル、クリームなどに局在していてもよい。
【０１８１】
脳卒中、外傷性脳損傷、アルツハイマー病、多発性硬化症、および血液脳関門（ＢＢＢ）に影響を及ぼす他の状態は、本発明の組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子で治療することができる。血管新生は、体内の多くの組織への酸素および栄養素の供給を確実にするために重要であり、神経組織は低酸素および虚血に非常に敏感であるので、ＣＮＳにとって特に重要である。ＢＢＢを形成するＣＮＳ内皮細胞は、それらが密着結合によって一緒に保持され特異的輸送体を発現する高度に極性化された細胞であるという点で、非神経組織における内皮細胞とは異なる。Ｗｎｔシグナル伝達は、ＣＮＳ血管形成および／または機能を調節する。ＢＢＢが危険にさらされる条件は、全身的または局所的であり得る本発明の化合物の投与、例えば直接注射、髄腔内投与、徐放性製剤の移植などから恩恵を受けることができる。さらに、Ｗｎｔシグナルは神経発生に積極的に関与しており、損傷後の神経保護の役割を果たす。本発明の組成物は、脊髄損傷、他の脊髄疾患、脳卒中、外傷性脳損傷などの治療にも使用することができる。
【０１８２】
Ｗｎｔシグナルはまた血管形成において役割を果たす。組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子は、血管形成が有益である状態、心筋梗塞、冠状動脈疾患、心不全などの治療、および遺伝性疾患からの状態に有益であり得る。これらの組織の再生方法は、全身的または局所的であり得る本発明の化合物の投与から恩恵を受ける。
【０１８３】
特定の実施形態では、本発明の方法は、例えば損傷を受けた組織、または組織もしくは細胞の減少もしくは喪失にさらされている組織において、組織再生を促進する。喪失または損傷は、疾患または傷害を含む、細胞数を減少させるものなら何でもあり得る。例えば、事故、自己免疫障害、治療上の副作用または病状は、外傷を構成し得る。組織再生は組織内の細胞数を増加させ、好ましくは組織の細胞間の結合を再確立することを可能にし、より好ましくは組織の機能性を回復させることを可能にする。
【０１８４】
特定の実施形態では、組成物は、非経口投与、例えば静脈内投与、経口投与、直腸投与、または注射によって投与される。いくつかの実施形態では、それは局所的に、例えば局所的または筋肉内に投与される。いくつかの実施形態において、組成物は、標的組織、例えば、骨、関節、耳組織、眼組織、胃腸管、皮膚、創傷部位または脊髄に投与される。本発明の方法はインビボまたはエクスビボで実施することができる。いくつかの実施形態では、標的細胞または組織と組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子との接触は、その後の細胞または組織（例えば、活性化幹細胞または前駆細胞）の対象への移植と共に、エクスビボで行われる。当業者は、治療されている疾患または障害に基づいて適切な投与部位および投与経路を決定することができる。
【０１８５】
用量および投与計画は、疾患または障害の性質、対象の特徴、および対象の病歴など、医師によって容易に決定される様々な要因に依存し得る。特定の実施形態では、対象に投与または提供される組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子、たとえば融合タンパク質の量は、対象の体重の約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ、または約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの範囲である。
【０１８６】
特定の実施形態において、対象は、任意の哺乳動物、例えば、ヒト、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、スナネズミ）、ウサギ、ネコ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシ、または霊長類であり得る。
【０１８７】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、治療上の恩恵、例えば、障害の発症の防止、障害の進行の停止、障害の進行の逆転などをもたらす。いくつかの実施形態において、本方法は、治療上の恩恵が達成されたことを検出する工程を含む。当業者は、そのような治療有効性の測定値が、修正されている特定の疾患に適用可能であり、治療有効性を測定するために使用するのに適切な検出方法を認識するであろう。
【０１８８】
特定の実施形態では、本開示は、Ｗｎｔシグナル伝達の低下に関連するか、または骨組織におけるＷｎｔシグナル伝達活性の増加から恩恵を受けるであろう疾患または障害、例えば骨成長が望ましい本明細書に開示される状態のいずれかなどを治療または予防する方法であって、それを必要とする対象に、骨組織に結合する標的ドメイン、例えばＰＴＨ１Ｒに特異的に結合する標的ドメインを含むＷｎｔシグナル増強分子を含む薬学的組成物を提供することを含み、Ｗｎｔシグナル増強分子が、対象の骨組織におけるシグナル伝達を増加または増強する、方法を提供する。特定の実施形態において、薬学的組成物は経口的または全身的に、例えば非経口的に投与される。特定の実施形態では、Ｗｎｔシグナル増強分子は、Ｒ−スポンジンフリンドメイン１またはその断片もしくはバリアントを含む作用ドメイン、および任意に変異フリンドメイン２もしくはその断片もしくはバリアントを含む。
【０１８９】
特定の実施形態では、本開示は、Ｗｎｔシグナル伝達の減少に関連するか、または肝臓組織におけるＷｎｔシグナル伝達活性の増加から恩恵を受けるであろう疾患または障害、例えば肝再生から恩恵を得るであろう、本明細書に開示される疾患または障害のいずれかなどを治療または予防する方法であって、それを必要とする対象に、肝臓組織に結合する標的ドメイン、例えばＡＳＧＲ１、ＡＳＧＲ２、ＴＦＲ２またはＳＬＣ１０Ａ１に特異的に結合する標的ドメインを含むＷｎｔシグナル増強分子を含む薬学的組成物を提供することを含み、Ｗｎｔシグナル増強分子が、対象の肝臓組織におけるＷｎｔシグナル伝達を増加または増強する、方法を提供する。特定の実施形態において、薬学的組成物は経口的または全身的に、例えば非経口的に投与される。特定の実施形態では、Ｗｎｔシグナル増強分子は、Ｒ−スポンジンフリンドメイン１またはその断片もしくはバリアントを含む作用ドメイン、および任意に変異フリンドメイン２もしくはその断片もしくはバリアントを含む。
【０１９０】
特定の実施形態では、本開示は、Ｗｎｔシグナル伝達の低下に関連するか、または口腔粘膜組織（例えば口腔粘膜炎など）におけるＷｎｔシグナル伝達活性の増加から恩恵を受けるであろう疾患または障害を治療または予防する方法であって、それを必要とする対象に、口腔粘膜組織に結合する標的ドメイン、例えばＬＹＰＤ３またはＤＳＧ３に特異的に結合する標的ドメインを含むＷｎｔシグナル増強分子を含む薬学的組成物を提供することを含み、Ｗｎｔシグナル増強分子が、対象の口腔粘膜組織内のＷｎｔシグナル伝達を増加または増強する、方法を提供する。特定の実施形態において、薬学的組成物は経口的または全身的に、例えば非経口的に投与される。特定の実施形態では、Ｗｎｔシグナル増強分子は、Ｒ−スポンジンフリンドメイン１またはその断片もしくはバリアントを含む作用ドメイン、および任意に変異フリンドメイン２もしくはその断片もしくはバリアントを含む。
【０１９１】
本明細書で言及され、かつ／または出願データシートに記載されている上記の米国特許、米国特許出願公報、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許公報は全て、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１９２】
以上の説明から、本発明の特定の実施形態を例示の目的で説明したが、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく様々な変更を加えることができることが理解されよう。したがって、本発明は添付の特許請求の範囲による以外には限定されない。
【実施例】
【０１９３】
以下の実施例は、当業者に本発明の製造方法および使用方法の完全な開示および説明を提供するために提示されるものであり、発明者らが本発明と見なすものの範囲を限定することを意図せず、以下の実験が実施された全てまたは唯一の実験であることを表すことも意図しない。使用される数字（例えば、量、温度など）に関して正確さを確実にするための努力がなされてきたが、いくつかの実験誤差および偏差が考慮されるべきである。特記しない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧力は大気圧または大気圧付近である。
【０１９４】
分子生物学、細胞生物学および生化学における一般的な方法は、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄ」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２００１）、「Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  Ｅｄ．」（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９９９）、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」（Ｂｏｌｌａｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９９６）、「Ｎｏｎｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ」（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９９）、「Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ」（Ｋａｐｌｉｆｔ  ＆  Ｌｏｅｗｙ  ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）、「Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ」（Ｉ．Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ  ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９７）、および「Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」（Ｄｏｙｌｅ  ＆  Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９９８）などの標準的な教科書に見出すことができ、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。本開示において言及される試薬、クローニングベクター、および遺伝子操作のためのキットは、ＢｉｏＲａｄ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、およびＣｌｏｎＴｅｃｈなどの市販業者から入手可能である。
【０１９５】
以下の実施例において、Ｆｕ１およびＦｕ２ドメインを含む断片（Ｓ３６−Ｅ１４３）からなる組換えヒトＲｓｐｏ２調製物を陽性対照として用いた。ｓｃＦｖのフォーマット（図８、１１、１２、１５、および１６）のＷｎｔシグナルエンハンサーについては、単量体型のＲｓｐｏ２を使用した（タンパク質精製を補助するための短いタグを付けて、配列番号３３および３４によって特定される）。添付のＩｇＧのフォーマットのＷｎｔシグナルエンハンサー（図１３、１４、１７、１８、および１９）については、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ断片とインフレームの同じＲｓｐｏ２  Ｆｕ１およびＦｕ２ドメインの融合物を使用した。同じ実験条件下で並行して試験した場合、これら２つの形態の間でインビトロで有意な差は観察されなかったので、どちらも一般的にさらなる指定なしにＲｓｐｏ２陽性対照と呼ばれる。
【０１９６】
実施例および添付の図面に記載されている様々な構築物および配列の簡単な要約を以下の表１に提供する。
【表１−１】
2020506701.tif 000003
【表１−２】
2020506701.tif 000004
【表１−３】
2020506701.tif 000005
【表１−４】
2020506701.tif 000006
【表１−５】
2020506701.tif 000007
【表１−６】
2020506701.tif 000008
【表１−７】
2020506701.tif 000009
【表１−８】
2020506701.tif 000010
【０１９７】
実施例１
ＳＣＦＶフォーマットにおけるＷＮＴシグナリングのＡＳＧＲ１特有の強化
Ｗｎｔシグナル伝達の組織特異的増強は、変異型ヒトＲｓｐｏ２（アミノ酸残基）に融合したヒトＡＳＧＲ１に対するｓｃＦｖ抗体（特許ＷＯ２０１４／０２３７０９Ａ１に基づいて設計された、クローン４Ｆ３）を含む組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子を用いて初めて実証された。２つの点変異（Ｆ１０５ＡおよびＦ１０９Ａ）を有する（α−ＡＳＧＲ−ｍｔＲｓｐｏ２）。ヒトＲｓｐｏ２におけるこれらの変異は、図１に図解されるように、ＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３との相互作用を妥協することなくＬＧＲ４−６への結合を減少／廃止し、図２に図解されるようにＲｓｐｏ２を作用ドメインとして機能させる。標的ドメインに対する陰性対照として（図２参照）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に対するｓｃＦｖ抗体を同じ変異型ヒトＲｓｐｏ２（α−ＧＦＰ−ｍｔＲｓｐｏ２）に融合した。Ｗｎｔシグナル増強活性についての陽性対照として、ＧＦＰ抗体を野生型ヒトＲｓｐｏ２（アミノ酸残基３７〜１４３）（α−ＧＦＰ−Ｒｓｐｏ２）に融合した。これらの構築物を図５Ａに図示し、それらのアミノ酸配列およびそれをコードするポリヌクレオチド配列を以下の通りに示す：α−ＧＦＰ−ｍｔＲｓｐｏ２（それぞれ配列番号８および７）、α−ＡＳＧＲ−ｍｔ−Ｒｓｐｏ２（それぞれ配列番号１０および９）。これらの組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子はまた、分泌のためにＮ末端にシグナリングペプチドを、検出のためにＣ末端にＦＬＡＧタグを含み、続いてアフィニティー精製のために（Ｈｉｓ）８タグを含んだ。組織特異的Ｗｎｔシグナル増強融合タンパク質および対照をコードする発現構築物を標準的な分子クローニング技術によって作製した。
【０１９８】
Ｗｎｔ応答性プロモーター（Ｓｕｐｅｒ  Ｔｏｐ  Ｆｌａｓｈレポーターアッセイ、ＳＴＦ）によって制御されるルシフェラーゼ遺伝子、ヒト肝癌Ｈｕｈ−７およびヒト類表皮癌Ａ４３１細胞を含む２つの細胞株を用いて、Ｗｎｔシグナル伝達活性を測定した。図５Ｂに示される定量的ＰＣＲ分析によって実証されるように、両方の細胞株はＲ−スポンジンによって標的化されたＥ３リガーゼを発現したが、肝臓特異的遺伝子ＡＳＧＲ１／２発現はＨｕｈ−７においてのみ検出された。
【０１９９】
Ｈｕｈ−７レポーター細胞中のＡＳＧＲを標的とする構築物の活性を試験するための販売元推奨手順に従って、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて一過性トランスフェクションを行った。Ｗｎｔ３ａ馴化培地（ＡＴＣＣ  Ｌ−Ｗｎｔ−３Ａ細胞株で販売元推奨手順を用いて調製）を、トランスフェクションの３時間後に全培地容量の１０％を構成するように加えた。トランスフェクションの４０時間後、細胞溶解、その後のルシフェラーゼ基質、ルシフェリンの添加を含む、標準ルシフェラーゼアッセイ−読み出しプロトコル（例えば、Ｓｔｏｐ  ａｎｄ  Ｇｌｏ  Ｄｕａｌ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を使用して、細胞をルシフェラーゼ活性についてアッセイした。ルシフェリン基質のオキシルシフェリンへのルシフェラーゼ媒介変換は発光をもたらし、それをプレートリーダーによって読み取り、発光を定量化した。結果を図５Ｃに示す。偽トランスフェクション対照（「ＤＮＡなし」）と比較して、変異体Ｒｓｐｏ２に融合した抗ＡＳＧＲ１抗体を発現する構築物は、同じ変異体に融合した抗ＧＦＰよりもはるかに高いルシフェラーゼ活性の約２０倍の増加を示した。これは、構築物のＡＳＧＲ１抗体部分（標的ドメイン）が活性の増加の原因であることを示唆した。
【０２００】
実験条件下で種々の融合タンパク質の発現および安定性を確認するためにウエスタンブロット分析を行った。トランスフェクションの４０時間後（ルシフェラーゼ活性を測定したのと同じ時点）の１０μｌの培養上清を、抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体、Ｍ２（Ｓｉｇｍａ＿Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて分析した。図５Ｃに示すように、全てのタンパク質が同程度のレベルで検出可能であった。したがって、試験された構築物間のＷｎｔシグナル増強活性の違いは、タンパク質の活性を反映したものであり、発現レベルやタンパク質の安定性ではないと考えられる。
【０２０１】
Ａ４３１細胞を用いて抗ＡＳＧＲ１ベースの構築物のＡＳＧＲ１依存性を試験した。抗ＡＳＧＲ１変異型Ｒｓｐｏ２構築物を、野生型または変異型Ｒｓｐｏ２との抗ＧＦＰ融合と並行して、Ａ４３１細胞にヒトＴＦＲ２またはヒトＡＳＧＲ１と同時トランスフェクトした。トランスフェクション後に１０％Ｗｎｔ３ａ馴化培地を補充し、トランスフェクションの４０時間後にルシフェラーゼ活性をアッセイした。同じ細胞からの上清をウエスタンブロットのために採取した。図５Ｄに示すように、ＡＳＧＲ１コトランスフェクションでは、抗ＡＳＧＲ１構築物は陰性対照より数倍高い活性を示した。この効果はＴＦＲ２コトランスフェクションでは観察されなかった。これは、ここで観察された特異的Ｗｎｔ増強活性が融合分子の設計によって標的とされている特異的受容体の存在に依存していることを示唆した。これらの結果は、ＡＳＧＲおよびＴＦＲ２標的化構築物が、それらが発現される肝臓などの組織へのＷｎｔシグナル増強分子の特異的標的化のために使用され得ることを実証する。
【０２０２】
実施例２
行動領域のメカニズムと行動の動的範囲の変調
組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子の融合構築物設計の作用機序を検証するために、追加の変異をＲｓｐｏ２（これは作用ドメインとして機能する）に導入し、これらの構築物の活性を、実施例１に記載したのと同じ一過性トランスフェクションに基づくレポーターアッセイにおいてＨｕｈ−７細胞中で分析した。ＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３相互作用の役割は、Ｓ４７、Ｎ５０、Ｒ６５、Ｒ６９、およびＱ７０などのＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３に結合することが知られているＲｓｐｏ２内の残基に（Ｆ１０５ＡおよびＦ１０９Ａ変異に加えて）点変異を導入することによって最初に試験された。Ｆ１０５Ａ／Ｆ１０９Ａ／Ｓ４７Ａ／Ｎ５０Ａ変異を含むα−ＧＦＰ−ｍｔＲｓｐｏ２のアミノ酸配列を配列番号１２に提供し、コードポリヌクレオチド配列を配列番号１１に提供する。Ｆ１０５Ａ／Ｆ１０９Ａ／Ｓ４７Ａ／Ｎ５０Ａ変異を含むα−ＡＳＧＲ１−ｍｔＲｓｐｏ２のアミノ酸配列は配列番号１４に提供され、コードポリヌクレオチド配列は配列番号１３に提供される。Ｆ１０５Ａ／Ｆ１０９Ａ／Ｒ６５Ａ／Ｒ６９Ａ／Ｑ７０Ａ変異を含むα−ＧＦＰ−ｍｔＲｓｐｏ２のアミノ酸配列は配列番号１６に提供され、コードポリヌクレオチド配列は配列番号１５に提供される。Ｆ１０５Ａ／Ｆ１０９Ａ／Ｒ６５Ａ／Ｒ６９Ａ／Ｑ７０Ａ変異を含むα−ＡＳＧＲ１−ｍｔＲｓｐｏ２のアミノ酸配列は配列番号１８に提供され、コードポリヌクレオチド配列は配列番号１７に提供される。図６Ａに示すように、Ｓ４７Ａ／Ｎ５０ＡまたはＲ６５Ａ／Ｒ６９Ａ／Ｑ７０Ａの変異の導入は、抗ＧＦＰおよび抗ＡＳＧＲ１構築物の両方のＷｎｔシグナル増強活性を無効にした。これらの結果は、これらの２つのＥ３リガーゼが作用ドメインによって標的とされるというメカニズムと一致している。
【０２０３】
変異体Ｒｓｐｏ２の活性を増加させる可能性を試験するために、変異を最初のＦ１０５Ａ／Ｆ１０９Ａ二重変異の代わりに単一アミノ酸残基Ｆ１０５ＡまたはＦ１０９Ａに限定することによってＬＧＲ相互作用における欠陥を軽減する試みがなされた。Ｆ１０５Ａ変異のみを含むα−ＧＦＰ−ｍｔＲｓｐｏ２のアミノ酸配列を配列番号２０に提供し、コードポリヌクレオチド配列を配列番号１９に提供する。Ｆ１０５Ａ変異のみを含むα−ＡＳＧＲ１−ｍｔＲｓｐｏ２のアミノ酸配列を配列番号２２に提供し、コードポリヌクレオチド配列を配列番号２１に提供する。Ｆ１０９Ａ変異のみを含むα−ＧＦＰ−ｍｔＲｓｐｏ２のアミノ酸配列を配列番号２４に提供し、コードポリヌクレオチド配列を配列番号２３に提供する。Ｆ１０９Ａ変異のみを含むα−ＡＳＧＲ１−ｍｔＲｓｐｏ２のアミノ酸配列を配列番号２６に提供し、コードポリヌクレオチド配列を配列番号２５に提供する。これらの構築物を、一過性トランスフェクションアッセイによりＨｕｈ−７レポーター細胞中で試験した。図６Ｂに示すように、Ｆ１０９Ａ単一変異体は、二重変異体よりも高い活性を有した。これは抗ＧＦＰ対照におけるより高い基礎活性を犠牲にしているが、このアプローチは、融合構築物の活性のダイナミックレンジが、Ｒ−スポンジン−ＬＧＲ相互作用に影響を及ぼす変異によって微調整され得ることを示唆した。
【０２０４】
アラニン（「Ａ」）に加えて、他のアミノ酸残基もまた、ＬＧＲタンパク質相互作用にとって重要な残基を置換するための変異として使用され得る。一例として、図６Ｃは、作用ドメインとしてのＲｓｐｏ２  Ｆ１０６Ｒ／Ｆ１０９Ａ変異体の使用を実証した。このＲｓｐｏ２変異体の抗ＴＦＲ１標的ドメインへの融合は、一過性トランスフェクションに基づくＳＴＦアッセイ（１０％Ｗｎｔ３ａ条件培地の存在下）でのＨｕｈ−７細胞において、対応する抗ＧＦＰ対照と比較して明らかなＷｎｔシグナル増強活性をもたらした。Ｆ１０５Ａ／Ｆ１０９Ａ変異を含むα−ＴＦＲ１−ｍｔＲｓｐｏ２のアミノ酸配列は配列番号２８に提供され、コードポリヌクレオチド配列は配列番号２７に提供される。Ｆ１０５Ｒ／Ｆ１０９Ａ変異を含むα−ＧＦＰ−ｍｔＲｓｐｏ２のアミノ酸配列は配列番号３０に提供され、コードポリヌクレオチド配列は配列番号２９に提供される。Ｆ１０５Ｒ／Ｆ１０９Ａ変異を含むα−ＴＦＲ１−ｍｔＲｓｐｏ２のアミノ酸配列は配列番号３２に提供され、コードポリヌクレオチド配列は配列番号３１に提供される。
【０２０５】
実施例３
他の細胞表面受容体を用いた標的化戦略の検証
組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子の抗ＡＳＧＲ１に基づく設計が単なる特定の場合ではなく、むしろ一般原則を表す例であることを検証するために、変異体（Ｆ１０５Ａ／Ｆ１０９Ａ）Ｒｓｐｏ２断片（アミノ酸残基３７〜１４３）を、他の細胞表面受容体、ヒトトランスフェリン受容体１（ＴＦＲ１）（特許ＷＯ２０１６／０８１６４０、クローン７Ａ４に基づいて設計されている）に対するｓｃＦｖ抗体に融合した。構築物のアミノ酸配列は、配列番号２８に提供されている。実施例１に記載の一過性トランスフェクションおよびレポーターアッセイを使用して、この新しい構築物は、野生型Ｒｓｐｏ２に融合したポジティブコントロール抗ＧＦＰ（配列番号６、図７Ａおよび７Ｂ）の活性と同等またはそれを超える活性を有することが実証された。これは、標的戦略の一般化を支持するだけでなく、適切な細胞表面受容体を認識する標的ドメインが使用される限り、特異的Ｗｎｔシグナル増強活性を有意に増強するこのアプローチの十分な可能性を証明した。ＴＦＲ１受容体の広範な分布はまた、このＷｎｔシグナル増強戦略に感受性のある組織／細胞についてスクリーニングするためにこの融合構築物を使用する機会を提供した。
【０２０６】
実施例４
組織／細胞特異的ＷＮＴエンハンサーとしての精製融合タンパク質（ＳＣＦＶフォーマット）
設計された融合タンパク質の活性を直接試験するために、構築物をバキュロウイルストランスファーベクターｐＡｃＧＰ６７−Ａにサブクローニングし、以前に記載されたように（Ｊａｎｄａら、２０１７  Ｎａｔｕｒｅ）発現させＳＦ９／ｈｉ５細胞から精製した。発現されたタンパク質を、ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｈｉｓタグ精製樹脂（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して、販売元推奨手順に従ってＨｉｓタグを介して精製し、次いでサイズ排除カラム（Ｓ２００、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）分画によってさらに精製した。図８Ａは、表示された標的ドメインおよび作用ドメインを有する精製融合タンパク質（サイズ排除カラムによって抗ＴＦＲ１構築物はさらに精製されなかった）のクマシー染色ゲル画像の代表例を示し、推定純度は＞９０％である。
【０２０７】
図８Ｂ（左のグラフ）は、標的とされたＨｕｈ−７細胞上の、抗ＡＳＧＲ１構築物（Ｒｓｐｏ２を有するＦ１０５Ａ／Ｆ１０９Ａ二重変異体（配列番号１０）およびＲｓｐｏ２を有するＦ１０９Ａ単一変異体（配列番号２６））と抗ＧＦＰ陰性対照（Ｆ１０５Ａ／Ｆ１０９Ａ二重変異体（配列番号８））との比較を示す。１０μＭの最終濃度でＲｓｐｏ２二重変異体に融合した抗ＡＳＧＲ１は、１００μＭの濃度で抗ＧＦＰ対照より約３倍活性が高く、特異的抗体による活性の特異的増強を明らかに実証した。一過性トランスフェクションアッセイの結果と一致して、Ｒｓｐｏ２単一Ｆ１０９Ａ変異体（配列番号２６）を含有する融合タンパク質はさらに活性であった。図８Ｂ（右のグラフ）は、ＡＳＧＲ１標的化融合物と、同じ手順により精製されたｈｉｓタグ付きＲｓｐｏ２構築物（アミノ酸残基Ｓ３６〜Ｅ１４３を含む）（配列番号３４、および配列番号３３に提供されるコードポリヌクレオチド配列）との最大有効性（Ｅｍａｘ）の比較を示す。結果は、標的Ｒｓｐｏ２二重変異体が機能的Ｒｓｐｏ２タンパク質に匹敵するＥｍａｘに達することができる一方で、標的Ｒｓｐｏ２単一変異体Ｅｍａｘの活性はさらに高くなり得ることを示唆する。Ｒｓｐｏ２タンパク質についての１〜３μＭとは対照的に、より高い濃度（１０〜１００μＭ）がＥｍａｘに達するために必要とされたが、これらの濃度では、陰性対照（図８Ｂの抗ＧＦＰ融合、左パネル）はほとんど活性を有さなかった。
【０２０８】
組織／細胞標的の特異性を検証するために、精製融合タンパク質の活性を３つの細胞株、すなわちヒト肝臓Ｈｕｈ−７細胞、ヒト結腸直腸腺癌ＨＴ２９細胞、およびマウス肝臓ＦＬ８３Ｂ細胞において比較した。Ｗｎｔシグナル伝達のためのルシフェラーゼレポーター（図８Ｃの左から右に示す）。肝臓および腸管／直腸管の上皮細胞は、Ｒ−スポンジンを介したＷｎｔシグナル伝達のアップレギュレーションに敏感であることが知られており、Ｒｓｐｏタンパク質はマウスとヒトの間で高度に保存されている。当然のことながら、３つの細胞株全てがＲｓｐｏ２によく反応しました。抗ＡＳＧＲ１ベースの融合タンパク質からの有意な活性がＨｕｈ−７細胞上で観察されたが、ＨＴ２９細胞上ではほとんど活性がなかった。腸管上皮細胞はＲｓｐｏタンパク質に最も敏感であった。ＡＳＧＲ１を標的とする融合タンパク質によるＨＴ２９細胞への刺激の欠如は、それらがインビボで適用された場合、それらが標的外効果の可能性がはるかに低い可能性があることの良い指標である。対照的に、ＴＦＲ１を標的とする融合タンパク質は、非常に低い０．１μＭ濃度でさえもはるかに活性が高く、このタンパク質の効力および有効性をさらに実証した。このヒトＴＦＲ１標的化構築物はマウスＦＬ８３Ｂ細胞に対して活性を示さなかったので、この活性はおそらく受容体の存在に特異的に依存しており、標的化結合剤がヒト受容体に特異的であることを示している。ヒトＡＳＧＲ１を標的とする融合タンパク質に対するいくらかの応答がマウス肝細胞で観察され、これは抗体の種間反応性を示唆している。
【０２０９】
実施例５
一過性トランスフェクションによって実証された全長ＩＧＧフォーマットにおけるアクティブＷＮＴ信号エンハンサー
完全ＩｇＧフォーマットの抗体は、他の利点の中でも、優れた薬物動態学的特性および安定性と関連している。先の実施例に記載の組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子が完全ＩｇＧフォーマットで活性であることを実証するために、これらの組織特異的Ｗｎｔシグナル増強融合タンパク質を完全ＩｇＧフォーマットに変換した。ＴＦＲ１結合剤は、本出願の先の例からのその最高の活性のために、ＩｇＧフォーマットのＷｎｔシグナル増強分子のための概念実証として選択された。図９Ａの図に示すように、変異体（Ｆ１０５Ｒ／Ｆ１０９Ａ）Ｒｓｐｏ２をＴＦＲ１抗体（または陰性対照としてのＧＦＰ抗体、両方ともＩｇＧ２として）の軽鎖または重鎖のＮ末端に融合させた。これらの分子の活性は、Ｗｎｔシグナル伝達に応答するレポーターを用いた２９３細胞への一過性トランスフェクションによって決定された。α−ＧＦＰ  ＩｇＧの重鎖のＮ末端に付加されたＲｓｐｏ２（Ｆ１０５Ｒ／Ｆ１０９Ａ）ドメインを有する構築物については、α−ＧＦＰ軽鎖のアミノ酸配列を配列番号３６に提供し、そのコードポリヌクレオチド配列は配列番号３５に提供され、Ｒｓｐｏ２（Ｆ１０５Ｒ／Ｆ１０９Ａ）、α−ＧＦＰ重鎖ＩｇＧ２のアミノ酸配列は配列番号３８に提供され、そのコードポリヌクレオチド配列は配列番号３７に提供される。α−ＴＦＲ１  ＩｇＧの重鎖のＮ末端に付加されたＲｓｐｏ２（Ｆ１０５Ｒ／Ｆ１０９Ａ）ドメインを有する構築物については、α−ＴＦＲ１軽鎖のアミノ酸配列を配列番号４０に提供し、そのコードポリヌクレオチド配列は配列番号３９に提供され、Ｒｓｐｏ２（Ｆ１０５Ｒ／Ｆ１０９Ａ）、α−ＴＦＲ１重鎖ＩｇＧ２のアミノ酸配列は配列番号４２に提供され、そのコードポリヌクレオチド配列は配列番号４１に提供される。α−ＧＦＰ  ＩｇＧの軽鎖のＮ末端に付加されたＲｓｐｏ２（Ｆ１０５Ｒ／Ｆ１０９Ａ）ドメインを有する構築物については、α−ＧＦＰ二本鎖ＩｇＧ２のアミノ酸配列を配列番号４６に提供し、そのコード化ポリヌクレオチド配列は配列番号４５に提供され、Ｒｓｐｏ２（Ｆ１０５Ｒ／Ｆ１０９Ａ）、α−ＧＦＰ軽鎖のアミノ酸配列は配列番号４４に提供され、そのコード化ポリヌクレオチド配列は配列番号４３に提供される。α−ＴＦＲ１  ＩｇＧの軽鎖のＮ末端に付加されたＲｓｐｏ２（Ｆ１０５Ｒ／Ｆ１０９Ａ）ドメインを有する構築物については、α−ＴＦＲ１二本鎖ＩｇＧ２のアミノ酸配列を配列番号５０に提供し、そのコードポリヌクレオチド配列は配列番号４９に提供され、Ｒｓｐｏ２（Ｆ１０５Ｒ／Ｆ１０９Ａ）、α−ＴＦＲ１軽鎖のアミノ酸配列は配列番号４８に提供され、そのコード化ポリヌクレオチド配列は配列番号４７に提供される。
【０２１０】
図９Ｂに示されるように、完全ＩｇＧフォーマットは、特にＲｓｐｏ２変異体が重鎖に融合された場合に、ｓｃＦｖフォーマットで観察された強力なＷｎｔシグナル増強活性を保持していた。これらの結果は、受容体標的Ｗｎｔエンハンサーの設計を他の足場にどのように適用するかの１つの実行可能な例を示した。
【０２１１】
実施例６
対象となるＷＮＴ信号強化活動をサポートするための追加のＲＳＰＯ変異体
ＲｓｐｏとＬＧＲタンパク質との間の相互作用にとって最も重要であることが知られている２つの疎水性残基（ヒトＲｓｐｏ２の場合はＦ１０５およびＦ１０９）に加えて、さらなる残基も相互作用に寄与し得る。これらの残基には、例えば、Ｒｓｐｏ２のＫ５８、Ｈ７６、Ｓ７７、Ｒ８６、Ｎ９１、およびＲ１２１が含まれる。これらの残基における変異は、Ｆｓ１０５／Ｆ１０９変異と組み合わせて使用されて、ＲｓｐｏとＬＧＲタンパク質との相互作用を廃止／妥協することができる。種々の構築物のアミノ酸配列およびそれをコードするポリヌクレオチド配列は以下の通り提供される：抗ＡＳＧＲ１、Ｒｓｐｏ２（Ｆ１０５Ｒ／Ｆ１０９Ａ）、配列番号５２および５１；抗ＧＦＰ、Ｒｓｐｏ２（Ｒ８６Ｅ／Ｆ１０５Ｒ／Ｆ１０９Ａ）、配列番号５４および５３；抗ＡＳＧＲ１、Ｒｓｐｏ２（Ｒ８６Ｅ／Ｆ１０５Ｒ／Ｆ１０９Ａ）、配列番号５６および５５；抗ＴＦＲ１、Ｒｓｐｏ２（Ｒ８６Ｅ／Ｆ１０５Ｒ／Ｆ１０９Ａ）、配列番号５８および５７；抗ＧＦＰ、Ｒｓｐｏ２（Ｒ８６Ｅ／Ｆ１０５Ｒ／Ｆ１０９Ａ／Ｒ１２１Ｅ）、配列番号６０および５９；抗ＡＳＧＲ１、Ｒｓｐｏ２（Ｒ８６Ｅ／Ｆ１０５Ｒ／Ｆ１０９Ａ／Ｒ１２１Ｅ）、配列番号６２および６１；抗ＴＦＲ１、Ｒｓｐｏ２（Ｒ８６Ｅ／Ｆ１０５Ｒ／Ｆ１０９Ａ／Ｒ１２１Ｅ）、配列番号６４および６３；抗ＧＦＰ、Ｒｓｐｏ２（Ｋ５８Ｅ／Ｒ８６Ｅ／Ｆ１０５Ｒ／Ｆ１０９Ａ／Ｒ１２１Ｅ）、配列番号６６および６５；抗ＡＳＧＲ１、Ｒｓｐｏ２（Ｋ５８Ｅ／Ｒ８６Ｅ／Ｆ１０５Ｒ／Ｆ１０９Ａ／Ｒ１２１Ｅ）、配列番号６８および６７；抗ＴＦＲ１、Ｒｓｐｏ２（Ｋ５８Ｅ／Ｒ８６Ｅ／Ｆ１０５Ｒ／Ｆ１０９Ａ／Ｒ１２１Ｅ）、配列番号７０および６９。
【０２１２】
図１０に示されるように、１０％Ｗｎｔ３ａ馴化培地の存在下でのＨｕｈ−７細胞における一過性トランスフェクションに基づくＳＴＦアッセイにおいて、これらのＬＧＲ相互作用残基における変異を様々な組み合わせで用いてＷｎｔシグナル増強活性を支持する作用ドメインを作製し得る。
【０２１３】
実施例７
ＳＣＦＶフォーマットにおける追加組換えタンパク質のＷＮＴシグナル増強活性
一過性トランスフェクション実験によって観察されたｓｃＦｖ抗ＴＦＲ１ベースの構築物のＷｎｔシグナル増強活性（図６Ｃ）は、精製タンパク質を用いてさらに検証された。抗ｈＴＦＲ１−Ｒｓｐｏ２（Ｆ１０５Ｒ／Ｆ１０９Ａ）および抗ＧＦＰ対照（それぞれ配列番号３０および３２）の融合タンパク質をコードするプラスミドベクターをＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にトランスフェクトし、販売元推奨手順に従って、ｃＯｍｐｌｅｔｅ  ｈｉｓタグ精製樹脂（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて精製した。図１１Ａは、精製タンパク質のクマシー染色ゲル画像を示す。図１１Ｂに示すように、ＴＦＲ１標的組換えタンパク質は、抗ＧＦＰ融合対照よりはるかに強力な活性を示した。さらに、この標的分子のＥｍａｘは、Ｒｓｐｏ２陽性対照のものと同等である。
【０２１４】
実施例８
精製タンパク質で実証された細胞表面受容体依存性
設計したＷｎｔシグナル増強分子の特異的細胞表面受容体の存在への依存性をさらに実証するために、ヒトＡＳＧＲ１標的分子（抗ＡＳＧＲ１−Ｒｓｐｏ２（Ｆ１０５Ａ／Ｆ１０９Ａ）；配列番号１０）をＡＳＧＲ１レセプターを天然には発現しないＡ４３１細胞上でＳＴＦアッセイで試験した。細胞を最初に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してヒトＡＳＧＲ１またはヒトＴＦＲ２のいずれかを発現するベクターで、販売元推奨手順に従って９６ウェルプレート中で一過性にトランスフェクトした。２４時間後、トランスフェクトされた細胞を、陽性対照としてのＲｓｐｏ２と共に、ｈＡＳＧＲ１標的融合タンパク質で処理した。ＡＳＧＲ１発現ベクターによる一過性トランスフェクションはＡ４３１細胞を応答性にすることが見出されたが、ＴＦＲ２発現ベクターによるコントロールトランスフェクションはＷｎｔシグナル増強分子に応答しなかった（図１２）。
【０２１５】
実施例９
添付ＩＧＧフォーマットにおける精製タンパク質のＷＮＴシグナル増強活性
一過性トランスフェクション実験（図９）によって実証されたＴＦＲ１標的付加ＩｇＧ分子のＷｎｔシグナル増強活性をさらに検証するために、これらの分子をＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて組換えタンパク質として発現させた。組換えタンパク質を最初にプロテインＡアフィニティー樹脂（標準的手法）によって精製し、次いでサイズ排除カラム（Ｓ２００、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）分画によって磨いた。精製タンパク質をＳＴＦアッセイを用いてＨｕｈ−７および２９３Ｔ細胞上で直接試験した。これらは両方ともヒトＴＦＲ１受容体を発現する。図１３に示すように、ＴＦＲ１を標的とした分子は、抗ＧＦＰ融合対照よりも３〜４桁優れた効力およびより高いＥｍａｘを示した。
【０２１６】
実施例１０
追加ＩＧＧスキャフォールドの構造活性相関解析
完全長ＩｇＧのフォーマットの標的ドメインを用いて、作用ドメインを結合する複数の方法を比較した。試験した様々なＩｇＧ２足場の活性の要約を図１４Ａ〜１４Ｂに示し、ここで変異体Ｒｓｐｏ２（Ｆ１０５Ｒ／Ｆ１０９Ａ）は重鎖のＮ末端、軽鎖のＮ末端に結合している。標的ドメインとして抗ＡＳＧＲ１または抗ＴＦＲ１のいずれかの軽鎖のＣ末端、または対照抗体として抗ＧＦＰまで。使用したいくつかの構築物は実施例５に記載されており、試験した追加の構築物は以下を含んでいた：α−ＡＳＧＲ１  ＩｇＧの重鎖のＮ末端に付加されたＲｓｐｏ２（Ｆ１０５Ｒ／Ｆ１０９Ａ）ドメイン；軽鎖は配列番号７２で提供され、そのコードポリヌクレオチド配列は配列番号７１で提供され、Ｒｓｐｏ２（Ｆ１０５Ｒ／Ｆ１０９Ａ）のアミノ酸配列α−ＡＳＧＲ１重鎖ＩｇＧは配列番号７４で提供されおよびそのコードポリヌクレオチド配列は、配列番号７３に提供され；α−ＧＦＰ  ＩｇＧ２の軽鎖のＣ末端に付加されたＲｓｐｏ２（Ｆ１０５Ｒ／Ｆ１０９Ａ）ドメイン（ここで、α−ＧＦＰ重鎖ＩｇＧ２のアミノ酸配列は配列番号４６に提供されている）およびそのコード化ポリヌクレオチド配列は配列番号４５に提供され、Ｒｓｐｏ２（Ｆ１０５Ｒ／Ｆ１０９Ａ）、α−ＧＦＰ軽鎖のアミノ酸配列は配列番号７６に提供され、そのコードポリヌクレオチド配列は配列番号７６に提供され；α−ＡＳＧＲ１  ＩｇＧ２の軽鎖のＣ末端に付加されたＲｓｐｏ２（Ｆ１０５Ｒ／Ｆ１０９Ａ）ドメイン（ここで、α−ＡＳＧＲ１二本鎖ＩｇＧ２のアミノ酸配列は、配列番号８０に提供される）およびそのコード化ポリヌクレオチド配列は配列番号７９に提供され、Ｒｓｐｏ２（Ｆ１０５Ｒ／Ｆ１０９Ａ）、α−ＡＳＧＲ１軽鎖のアミノ酸配列は配列番号７８に提供され、そのコードポリヌクレオチド配列は配列番号７８に提供され；α−ＴＦＲ１  ＩｇＧ２の軽鎖のＣ末端に付加されたＲｓｐｏ２（Ｆ１０５Ｒ／Ｆ１０９Ａ）ドメイン（ここで、α−ＴＦＲ１二本鎖ＩｇＧ２のアミノ酸配列は配列番号５０に提供される）およびそのコード化ポリヌクレオチド配列は、配列番号４９に提供されている；Ｒｓｐｏ２のアミノ酸配列（Ｆ１０５Ｒ／Ｆ１０９Ａ）、α−ＴＦＲ１軽鎖は配列番号８２に提供され、そのコードポリヌクレオチド配列は配列番号８１に提供される。
【０２１７】
これらのタンパク質は、一過性トランスフェクションによってＥｘｐｉ１９３Ｔ細胞において過剰発現され、プロテインＡアフィニティー樹脂、続いてサイズ排除クロマトグラフィーによって精製された。Ｈｕｈ−７細胞（図１４Ａ）において、全ての標的分子は、対応する抗ＧＦＰ融合対照より明らかに良好な活性を示した。抗ＴＦＲ１融合構築物は一般に抗ＡＳＧＲ１融合タンパク質よりも活性であり、これはこれらの標的ドメインがｓｃＦｖフォーマットであるという観察と一致する（図８Ｃ）。ダイナミックレンジ（同じフォーマットにおける標的分子と対照分子との間の効力およびＥｍａｘの差）は、Ｃ末端の軽鎖付着分子よりもＮ末端重鎖およびＮ末端軽鎖付着分子の方が全体的に大きい。複数のフォーマットがさらなる開発に適している間、いくつかのフォーマットがより好ましいかもしれないことを示唆している。これらの分子のＳＴＦ活性はまた、ＴＦＲ１のみを発現しＡＳＧＲ１受容体を発現しないヒト２９３Ｔ細胞において比較された（図１４Ｂ）。予想通り、抗ＴＦＲ１融合タンパク質のみが抗ＧＡＳ融合対照より有意に強力なままであり、設計分子の特異的Ｗｎｔシグナル増強活性はＩｇＧフォーマットでは存在に依存したままであることを示唆した。特異的細胞表面レセプターこの概念は、ヒトＡＳＧＲ１もヒトＴＦＲ１も発現しないマウスＦＬ８３Ｂ細胞を用いてさらに検証された（図１４Ｃ）。ＦＬ８３Ｂ細胞では、標的分子と抗ＧＦＰ対照融合タンパク質との間に違いは観察されなかった。Ｒｓｐｏ変異体の付着位置はまた、ＩｇＧ重鎖のＣ末端にあってもよい（データは示さず）。
【０２１８】
ＩｇＧ１は、治療用抗体開発に頻繁に使用される他の免疫グロブリンアイソタイプである。変異体Ｒｓｐｏ２作用ドメインをＩｇＧ１のＮ２９７Ｇエフェクターのない変異体形態の異なる末端に結合する複数の方法（Ｊａｃｏｂｓｅｎ  ＦＷら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０１７、２９２：１８６５）を比較した。使用したいくつかの構築物は実施例５に記載されており、試験した追加の構築物は以下を含んでいた：抗ＧＦＰ  ＩｇＧ１の重鎖のＮ末端に付加されたＲｓｐｏ２（Ｆ１０５Ｒ／Ｆ１０９Ａ）ドメイン（抗ＧＦＰ軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号３６に提供され、そのコードポリヌクレオチド配列は、配列番号３５に提供され、Ｒｓｐｏ２（Ｆ１０５Ｒ／Ｆ１０９Ａ）、抗ＧＦＰ重鎖のアミノ酸配列は、配列番号８４に提供され、そのコードポリヌクレオチド配列は、配列番号８３に提供される）；抗ＡＳＧＲ１  ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ｇ）の重鎖のＮ末端に付加されたＲｓｐｏ２（Ｆ１０５Ｒ／Ｆ１０９Ａ）ドメイン（抗ＡＳＧＲ１軽鎖のアミノ酸配列が、配列番号７２に提供され、そのコードポリヌクレオチド配列が、配列番号７１に記載され、Ｒｓｐｏ２（Ｆ１０５Ｒ／Ｆ１０９Ａ）、抗ＡＳＧＲ１重鎖のアミノ酸配列が、配列番号８６に提供され、そのコードポリヌクレオチド配列は配列番号８５に提供される）；抗ＴＦＲ１  ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ｇ）の重鎖のＮ末端に付加されたＲｓｐｏ２（Ｆ１０５Ｒ／Ｆ１０９Ａ）ドメイン（抗ＴＦＲ１軽鎖のアミノ酸配列が、配列番号４０に提供され、そのコードポリヌクレオチド配列が、配列番号３９に提供され、Ｒｓｐｏ２（Ｆ１０５Ｒ／Ｆ１０９Ａ）、抗ＴＦＲ１重鎖のアミノ酸配列が、配列番号８８に提供され、そのコードポリヌクレオチド配列が、配列番号８７に提供される）；抗ＧＦＰ  ＩｇＧ１の軽鎖（Ｎ２９７Ｇ）のＮ末端に付加されたＲｓｐｏ２（Ｆ１０５Ｒ／Ｆ１０９Ａ）ドメイン（抗ＧＦＰ重鎖のアミノ酸配列が、配列番号９０に提供され、そのコードポリヌクレオチド配列が、配列番号８９に提供され、Ｒｓｐｏ２（Ｆ１０５Ｒ／Ｆ１０９Ａ）、抗ＧＦＰ軽鎖のアミノ酸配列が、配列番号４４に提供され、そのコードポリヌクレオチド配列が、配列番号４３に提供される）；抗ＴＦＲ１  ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ｇ）の軽鎖のＮ末端に付加されたＲｓｐｏ２（Ｆ１０５Ｒ／Ｆ１０９Ａ）ドメイン（抗ＴＦＲ１重鎖のアミノ酸配列が、配列番号９２に提供され、そのコードポリヌクレオチド配列が、配列番号９１に提供され、Ｒｓｐｏ２（Ｆ１０５Ｒ／Ｆ１０９Ａ）、抗ＴＦＲ１軽鎖のアミノ酸配列が、配列番号４８に提供され、そのコードポリヌクレオチド配列が、配列番号４７に提供される）；抗ＡＳＧＲ１  ＩｇＧ１の軽鎖のＣ末端に付加されたＲｓｐｏ２（Ｆ１０５Ｒ／Ｆ１０９Ａ）ドメイン（抗ＡＳＧＲ１重鎖のアミノ酸配列が、配列番号９４に提供され、そのコードポリヌクレオチド配列が、配列番号９３に提供され、Ｒｓｐｏ２（Ｆ１０５Ｒ／Ｆ１０９Ａ）、抗ＡＳＧＲ１軽鎖のアミノ酸配列が、配列番号７８に提供され、そのコードポリヌクレオチド配列が、配列番号７７に提供される）。
【０２１９】
添付のＩｇＧ２タンパク質について記載したのと同じタンパク質精製および活性試験の手順に従って、抗ＡＳＧＲ１または抗ＴＦＲ１の重鎖または軽鎖のＮ末端に結合した作用ドメイン（変異体Ｒｓｐｏ２）を有することが見出された。ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ｇ）アイソタイプにおけるα１βは、対応する抗ＧＦＰ対照とは対照的に、Ｈｕｈ−７細胞における特異的Ｗｎｔシグナル増強活性も支持した（図１４Ｄ）。このような比活性は、抗ＡＳＧＲ１融合物を有する２９３Ｔ細胞では失われたが、抗ＴＦＲ１融合物を用いて保存され、標的受容体の存在に対する予想される依存性と一致した（図１４Ｅ）。したがって、作用ドメインの付着のための複数の部位を有する複数の免疫グロブリンアイソタイプは、組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子にとって適切なフォーマットであることが実証された。
【０２２０】
実施例１１
行動領域としての４つのＲスポンジンの構造活性相関解析
ヒトは、特にフリンドメイン内に、高い配列相同性を有する４つのＲ−スポンジンタンパク質を有する（図４）。インビトロでのＷｎｔシグナル伝達の増強におけるそれらの能力を直接比較するために、４つのヒトＲ−スポンジンの各々のＦｕ１−Ｆｕ２ドメインを、一過性トランスフェクションによるＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞におけるＡＳＧＲ１、ＴＦＲ１およびＧＦＰへのｓｃＦｖバインダーのＣ末端への融合として発現させた。標準的なＨｉｓタグおよびサイズ排除クロマトグラフィー精製手順。抗ＧＦＰ、Ｒｓｐｏ１野生型融合タンパク質のアミノ酸配列およびコードポリヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号９６および９５に提供されている。抗ＧＦＰ、Ｒｓｐｏ２野生型融合タンパク質のアミノ酸配列およびコードポリヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号６および５に提供されている。抗ＧＦＰ、Ｒｓｐｏ３野生型融合タンパク質のアミノ酸配列およびコードポリヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号９８および９７に提供されている。抗ＧＦＰ、Ｒｓｐｏ４野生型融合タンパク質のアミノ酸配列およびコードポリヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号１００および９９に提供されている。次に精製タンパク質を、Ｗｎｔ３ａ馴化培地の存在下でＨｕｈ−７および２９３Ｔ細胞中でＳＴＦアッセイにより試験した。図１５Ａに示すように、Ｒｓｐｏ２および３は、Ｒｓｐｏ４および１よりも強力であり、以前の報告と一致していた。
【０２２１】
Ｒ−スポンジン分子間の構造的および機能的保存を考えると、Ｒｓｐｏ２だけでなく他のＲｓｐｏ分子も組織特異的Ｗｎｔシグナル増強タンパク質の作用ドメインの構築をサポートするのに適している可能性がある。図１５Ｂ〜図１５Ｃに示されるのは、Ｈｕｈ−７細胞およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＳＴＦアッセイにおいて試験された一連のヒトＲｓｐｏ２およびＲｓｐｏ３に基づく構築物の並列比較である。これらの構築物は、配列番号８、１０、２８、３０、３２、および５２に開示されているポリペプチドを含む。さらに、試験した構築物はまた、以下を含んでいた（それらのアミノ酸配列に対応し、ポリヌクレオチド配列をコードする配列番号で示される）：抗ＧＦＰ、Ｒｓｐｏ３（Ｆ１０６Ａ／Ｆ１１０Ａ）、配列番号１０２および１０１；抗ＧＦＰ、Ｒｓｐｏ３（Ｆ１０６Ｒ／Ｆ１１０Ａ）、配列番号１０４および１０３；抗ＡＳＧＲ１、Ｒｓｐｏ３（Ｆ１０６Ａ／Ｆ１１０Ａ）、配列番号１０６および１０５；抗ＡＳＧＲ１、Ｒｓｐｏ３（Ｆ１０６Ｒ／Ｆ１１０Ａ）、配列番号１０８および１０７；抗ＴＦＲ１、Ｒｓｐｏ３（Ｆ１０６Ａ／Ｆ１１０Ａ）、配列番号１１０および１０９；抗ＴＦＲ１、Ｒｓｐｏ３（Ｆ１０６Ｒ／Ｆ１１０Ａ）、配列番号１１２および１１１。
【０２２２】
ここで使用される特定の組織標的結合剤への特異的融合の文脈では、Ｒｓｐｏ３変異体が最も高い有効性を示し、一方他のＲｓｐｏバリアントも有意な組織標的化を示した。
【０２２３】
実施例１２
追加されたＩＧＧフォーマットにおける特定のＷＮＴ信号強化活動をサポートする多様なＲＳＰＯ変異体
Ｗｎｔシグナル増強分子の構築を支持し得る変異の多様性およびそれらの組み合わせをさらに実証するために、抗ＧＦＰまたは抗ＡＳＧＲ１に融合した一連の追加のＲｓｐｏ３変異体に基づく分子を作製し、それらの活性をＨｕｈ−７細胞において試験した。ＳＴＦアッセイを使用する。これらの変異は、Ｆ１０６Ｒ／Ｆ１１０Ａ（ＲＡ）、Ｆ１０６Ｒ／Ｆ１１０Ｒ（ＲＲ）、Ｆ１０６Ｅ／Ｆ１１０Ｅ（ＥＥ）、Ｆ１０６Ｒ／Ｆ１１０Ａ（ＲＥ）、Ｆ１０６Ｅ／Ｆ１１０Ａ（ＥＡ）、Ｒ６０Ｅ／Ｒ８８Ｅ／Ｎ９３Ａ／Ｆ１０６Ｒ／Ｆ１１０Ａ（ＥＥＡＲＡ）を含んだ。Ｒ６０、Ｒ８８、およびＮ９３は、他のＲｓｐｏタンパク質との相同性に基づいて、ＬＧＲ相互作用に関与している残基である（図１６Ａ）。これらの構築物のアミノ酸およびコードポリヌクレオチド配列は以下の通りである：抗ＧＦＰ  Ｒｓｐｏ３野生型、配列番号９８および９７；抗ＧＦＰ  Ｒｓｐｏ３  ＲＡ、配列番号１０４および１０３；抗ＧＦＰ  Ｒｓｐｏ３  ＲＲ、配列番号１１４および１１３；抗ＧＦＰ  Ｒｓｐｏ３  ＥＥ、配列番号１１６および１１５；  抗ＧＦＰ  Ｒｓｐｏ３  ＲＥ、配列番号１１８および１１７；抗ＧＦＰ  Ｒｓｐｏ３  ＥＡ、配列番号１２０および１１９；抗ＧＦＰ  Ｒｓｐｏ３  ＥＥＡＲＡ、配列番号１２２および１２１；  抗ＡＳＧＲ１  Ｒｓｐｏ３  ＲＡ、配列番号１０８および１０７；抗ＡＳＧＲ１  Ｒｓｐｏ３  ＲＲ、配列番号１２４および１２３；抗ＡＳＧＲ１  Ｒｓｐｏ３  ＥＥ、配列番号１２６および１２５；抗ＡＳＧＲ１  Ｒｓｐｏ３  ＲＥ、配列番号１２８および１２７；抗ＡＳＧＲ１  Ｒｓｐｏ３  ＥＡ、配列番号１３０および１２９；抗ＡＳＧＲ１  Ｒｓｐｏ３  ＥＥＡＲＡ、配列番号１３２および１３１。
【０２２４】
図１６Ｂに示されるように、これらの組み合わせの全ては、抗ＧＦＰ対照に融合した野生型Ｒｓｐｏ３と比較してタンパク質の活性を有意に低下させ、それらのＲｓｐｏ−ＬＧＲ相互作用の破壊と一致した。抗ＡＳＧＲ１標的ドメインに融合させると、ダイナミックレンジ（標的活性と抗ＧＦＰ対照融合タンパク質のそれとの差）は選択された特定の変異によって変化したが、全ての変異体は増強された活性を示した。それらは全て、組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子設計に関する構築を支持する（図１６Ｃ）。
【０２２５】
実施例１３
非ＲＳＰＯベースの作用ドメイン
作用ドメインとして非Ｒｓｐｏベースの構造を使用することの実現可能性を実証するために、抗ヒトＺＮＲＦ３  ｍＡｂのＦａｂ断片（特許ＷＯ２０１３０５４３０７Ａ２からのＡｂ２）を抗ＡＳＧＲ１、抗ＴＦＲ１、または抗ＧＦＰのＩｇＧに融合した「Ｆａｂ−ＩｇＧ」融合タンパク質を設計した（図１７Ａ）。抗ＺＮＲＦ３抗ＧＦＰ構築物は、示されたポリペプチド配列およびコードポリヌクレオチド配列を有する以下のポリペプチドを含んでいた：抗ＧＦＰ軽鎖（Ｓ１７６Ｋ）（配列番号１３４および１３３）、抗ＺＮＲＦ３軽鎖（Ｓ１７６Ｅ）（配列番号１３６および１３５）、ならびに抗ＺＮＲＦ３−抗ＧＦＰ融合重鎖（配列番号１３８および１３７）。抗ＺＮＲＦ３−抗ＡＳＧＲ１構築物は、示されたポリペプチド配列およびコードポリヌクレオチド配列を有する以下のポリペプチドを含んでいた：抗ＡＳＧＲ１軽鎖（Ｓ１７６Ｋ）（配列番号１４０および１３９）、抗ＺＮＲＦ３軽鎖（Ｓ１７６Ｅ）（配列番号１３６および１３５）、ならびに抗ＺＮＲＦ３−抗ＡＳＧＲ１融合重鎖（配列番号１４２および１４１）。抗ＺＮＲＦ３−抗ＴＦＲ１構築物は、示されたポリペプチド配列およびコードポリヌクレオチド配列を有する以下のポリペプチドを含んでいた：抗ＴＦＲ１軽鎖（Ｓ１７６Ｋ）（配列番号１４４および１４３）、抗ＺＮＲＦ３軽鎖（Ｓ１７６Ｅ）（配列番号１１３６および１３５）、ならびに抗ＺＮＲＦ３−抗ＴＦＲ１融合重鎖（配列番号１４６および１４５）。
【０２２６】
これらのタンパク質をＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞に一過性にトランスフェクトし、プロテインＡアフィニティー樹脂、続いてサイズ排除クロマトグラフィーにより精製し、次いで３０％Ｗｎｔ３ａ馴化培地の存在下でＳＴＦアッセイによりＨｕｈ−７細胞中で試験した。図１７Ｂに示すように、抗ＡＳＧＲ１および抗ＴＦＲ１「標的化」抗ＺＮＲＦ３モジュールは両方とも、抗ＧＦＰ融合タンパク質の活性を超える活性を示し、Ｒｓｐｏ構造とは無関係のＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３  Ｅ３リガーゼに対する純粋な結合剤を用いて組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子を構築する可能性を検証した。
【０２２７】
実施例１４
肝臓を標的としたＷＮＴエンハンサーに加えて、組織を標的としたＷＮＴエンハンサー
上記に提供された例は、様々な用途のために肝臓を標的とする能力を有するＷｎｔシグナル伝達増強分子を生成するためにＡＳＧＲ１結合剤を利用した。ＴＦＲ１結合剤はまた、肝臓、ならびにそれが発現されるより広範囲の組織を標的とし得る。肝臓を超えた組織標的を提供するために、公共の遺伝子発現データベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｉｎａｔｌａｓ．ｏｒｇ／）を検索することによって、追加の組織特異的細胞表面分子を同定した。ＬＹＰＤ３、Ｌｙ６／ＰＬＡＵＲドメイン含有タンパク質３、およびＤＳＧ３、デスモグレイン３は、それらが口腔粘膜、皮膚および扁桃腺由来の粘膜上皮細胞において非常に豊富かつ特異的に発現されるので、標的分子として選択された。さらに、それらの特異的抗体配列は以前に公開されていた（ＵＳ２０１７０１５８７７５Ａ１、ｍＡｂクローンＭ３１−Ｂ０１がＬＹＰＤ３結合剤として選択され；ＵＳ２０１０００９２４５７Ａ１、ｍＡｂクローンＤＦ３６４ｃがＤＳＧ３結合剤として選択された）。
【０２２８】
粘膜上皮細胞特異的ＷＮＴエンハンサーを得るために、Ｒｓｐｏ２（Ｆ１０５Ｒ／Ｆ１０９Ａ）変異体を、「エフェクターレス」ＩｇＧ１（Ｌｏ  Ｍら、２０１７  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２９２）の形で抗ＬＹＰＤ３または抗ＤＳＧ３のいずれかの重鎖のＮ末端に融合した。抗ＧＦＰ  Ｒｓｐｏ２（Ｆ１０５Ｒ／Ｆ１０９Ａ）構築物は、示されたポリペプチド配列を有しポリヌクレオチド配列をコードする以下のポリペプチドを含んでいた：抗ＧＦＰ軽鎖（配列番号３６および３５）およびＲｓｐｏ２（Ｆ１０５Ｒ／Ｆ１０９Ａ）、抗ＧＦＰ重鎖ＩｇＧ２（配列番号３８および３７）。抗ＬＹＰＤ３  Ｒｓｐｏ２（Ｆ１０５Ｒ／Ｆ１０９Ａ）構築物は、示されたポリペプチド配列およびそれをコードするポリヌクレオチド配列を有する以下のポリペプチドを含んでいた：抗ＬＹＰＤ３軽鎖（配列番号１４８および１４７）およびＲｓｐｏ２（Ｆ１０５Ｒ／Ｆ１０９Ａ）、抗ＬＹＰＤ３重鎖ＬＡＬＡ−ＰＧ（配列番号１５０および１４９）。抗ＤＳＧ３  Ｒｓｐｏ２（Ｆ１０５Ｒ／Ｆ１０９Ａ）構築物は、示されたポリペプチド配列を有しポリヌクレオチド配列をコードする以下のポリペプチドを含んでいた：抗ＤＳＧ３軽鎖（配列番号１５２および１５１）、ならびにＲｓｐｏ２（Ｆ１０５Ｒ／Ｆ１０９Ａ）、抗ＤＳＧ３重鎖ＬＡＬＡ−ＰＧ（配列番号１５４および１５３）。
【０２２９】
融合タンパク質をＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）から発現させ、プロテインＡ樹脂、続いてサイズ排除カラム（Ｓ２００、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）分画を用いて精製し、典型的な推定純度は＞９０％であった。これらのタンパク質のＷｎｔシグナル増強活性を、２つの口腔粘膜細胞株ＣＡＬ２７およびＳＣＣ２５、ならびに対照Ａ４３１細胞株で試験した。
【０２３０】
図１８Ａに示されるように、ＬＹＰＤ３およびＤＳＧ３遺伝子は、ＣＡＬ２７およびＳＣＣ２５細胞において高度に発現されたが、Ａ４３１細胞においては非常に低い発現が観察された。ＬＹＰＤ  ３およびＤＳＧ  ３を標的としたＲｓｐｏ  ２変異体融合タンパク質はどちらも、ＣＡＬ２７細胞において抗ＧＦＰ対照よりはるかに強力な活性を示した。ＳＣＣ２５細胞において、ＤＳＧ３標的化分子は抗ＧＦＰ対照よりもはるかに活性であり、一方ＬＹＰＤ３標的化タンパク質のそれはそれほど顕著ではなかった。これはＳＣＣ２５細胞上のより低いＬＹＰＤ３受容体レベルの反映であり得る。これらの結果は、標的ドメインとして使用された場合、組織特異的抗体が標的細胞に対するＲｓｐｏ変異体活性を増強し得ることを確認する。対照的に、ＬＹＰＤ  ３およびＤＳＧ  ３標的化分子の活性は、ＬＹＰＤ  ３およびＤＳＧ  ３の発現を欠くＡ４３１細胞における抗ＧＦＰ対照融合タンパク質と区別できず、細胞表面受容体への特異的結合が活性の増強に必要であることを明らかに示した。組織特異的活性の増強に加えて、抗ＬＹＰＤ３および抗ＤＳＧ３融合タンパク質は、標的ＣＡＬ１７細胞においてＲｓｐｏ２陽性対照よりも強力であり、より良いＥＣ５０およびＲｓｐｏ２陽性対照に対してより良好または同等のＥｍａｘを示した。
【０２３１】
実施例１５
組織特異的ＷＮＴシグナルエンハンサーによるＷＮＴ応答遺伝子のインビボ誘導
設計したＷｎｔシグナルエンハンサーのインビボ活性を調べるために、Ｗｎｔ応答遺伝子であるＡｘｉｎ２の誘導を調べた。図１９Ａに示したように、ＡＡＶ−ｈＡＳＧＲ１を最初に動物当たり１Ｅ１１の力価で８週齢のオスのマウスに静脈内注射した。これはマウス肝臓におけるヒトＡＳＧＲ１遺伝子発現をもたらした。７日後、精製したタンパク質を特定の用量で８つの群に分けて静脈内注射した。単独で、またはＷｎｔシグナルと組み合わせてのいずれかで、０．４６ｍｇ／ｋｇのＲｓｐｏ２陽性対照、１ｍｇ／ｋｇの抗ＧＦＰ−Ｒｓｐｏ２（Ｆ１０５Ｒ／Ｆ１０９Ａ）、および１ｍｇ／ｋｇの抗ＡＳＧＲ１−Ｒｓｐｏ２（Ｆ１０５Ｒ／Ｆ１０９Ａ）３ｍｇ／ｋｇのアゴニスト１８Ｒ５−Ｄｋｋ１ｃ（Ｊａｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．、２０１７  Ｎａｔｕｒｅ）。８時間後、マウスを安楽死させ、肝臓サンプルを遺伝子発現の定量的ＰＣＲ分析のために採取した。抗ＧＦＰ構築物は、示されたポリペプチドおよびコードポリヌクレオチド配列を有する以下のポリペプチドを含んでいた：抗ＧＦＰ軽鎖（配列番号３６および３５）および抗ＧＦＰ重鎖ＩｇＧ１（ＬＡＬＡ−ＰＧ）（配列番号１５６および１５５）。抗ＧＦＰ  Ｒｓｐｏ２（Ｆ１０５Ｒ／Ｆ１０９Ａ）、Ｎ−ＨＣ構築物は、配列番号３５〜３８に提供されるポリペプチドを含んでいた。抗ＡＳＧＲ１  ＩｇＧ２  Ｎ−ＨＣ構築物は、配列番号７１〜７４に提供されるポリペプチドを含んでいた。１８Ｒ５−Ｄｋｋ１ｃ構築物は、配列番号１５８に開示されているポリペプチド配列を有し、配列番号１５７に開示されているポリヌクレオチド配列によってコードされていた。
【０２３２】
図１９Ｂは、マウス肝臓における異所性ｈＡＳＧＲ１の発現レベルを示し、これは全ての実験群にわたって同等であった。Ｒｓｐｏ２陽性対照タンパク質単独でマウスを処置すると、Ｒｓｐｏタンパク質のインビボ機能と一致して、中程度だが統計的に有意なＡｘｉｎ２遺伝子発現の誘導が誘導された（図１９Ｃ、左）。興味深いことに、抗ＡＳＧＲ１−Ｒｓｐｏ２（Ｆ１０５／Ｆ１０９）単独での処理もまた、対照抗ＧＦＰ融合タンパク質では観察されなかったＡｘｉｎ２レベルの傾向的増加を誘導した。１８Ｒ５−Ｄｋｋ１ｃはＷｎｔの代理である。３ｍｇ／ｋｇでは、それだけではＡｘｉｎ２遺伝子の発現に有意な変化は生じなかった。しかしながら、Ｒｓｐｏ２と１８Ｒ５−Ｄｋｋ１ｃとの間に明らかな相乗作用が観察され（図１９Ｃ、右）、これはＲｓｐｏタンパク質のＷｎｔシグナル増強活性と一致する。このような相乗作用は抗ＡＳＧＲ１融合タンパク質でも観察されたが、抗ＧＦＰ対照では観察されず、マウス肝臓におけるＷｎｔシグナル増強を表すＡｘｉｎ２の誘導が抗ＡＳＧＲ１標的ドメインに特異的に依存することを示唆する。
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Ｗｏｒｔｈｅｎ  ＣＡ  ａｎｄ  Ｅｎｎｓ  ＣＡ．２０１４，Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｒｏｎ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｏｄｙ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ５：３４
Ｍａｎｎｓｔａｄｔ  Ｍ，Ｊｕｐｐｎｅｒ  Ｈ，ａｎｄ  Ｇａｒｄｅｌｌａ  ＴＪ．１９９９，Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ＰＴＨ  ａｎｄ  ＰＴＨｒＰ：ｔｈｅｉｒ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ２７７：Ｆ６６５−Ｆ６７５．
Ｊａｎｄａ  ＣＹ，Ｄａｎｇ  ＬＴ，Ｙｏｕ  Ｃ，Ｃｈａｎｇ  Ｊ，ｄｅ  Ｌａｕ  Ｗ，Ｚｈｏｎｇ  ＺＡ，Ｙａｎ  ＫＳ，Ｍａｒｅｃｉｃ  Ｏ，Ｓｉｅｐｅ  Ｄ，Ｌｉ  Ｘ，Ｍｏｏｄｙ  ＪＤ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＢＯ，Ｃｌｅｖｅｒｓ  Ｈ，Ｐｉｅｈｌｅｒ  Ｊ，Ｂａｋｅｒ  Ｄ，Ｋｕｏ  ＣＪ，ａｎｄ  Ｇａｒｃｉａ  ＫＣ．２０１７，Ｓｕｒｒｏｇａｔｅ  Ｗｎｔ  ａｇｏｎｉｓｔｓ  ｔｈａｔ  ｐｈｅｎｏｃｏｐｙ  ｃａｎｏｎｉｃａｌ  Ｗｎｔ  ａｎｄ  β−ｃａｔｅｎｉｎ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ  ５４５：２３４−２３７．
Ｌｏ  Ｍ，Ｋｉｍ  ＨＳ，Ｔｏｎｇ  ＲＫ，Ｂａｉｎｂｒｉｄｇｅ  ＴＷ，Ｖｅｒｎｅｓ  ＪＭ，Ｚｈａｎｇ  Ｙ，Ｌｉｎ  ＹＬ，Ｃｈｕｎｇ  Ｓ，Ｄｅｎｎｉｓ  ＭＳ，Ｚｕｃｈｅｒｏ  ＹＪ，Ｗａｔｔｓ  ＲＪ，Ｃｏｕｃｈ  ＪＡ，Ｍｅｎｇ  ＹＧ，Ａｔｗａｌ  ＪＫ，Ｂｒｅｚｓｋｉ  ＲＪ，Ｓｐｉｅｓｓ  Ｃ，Ｅｒｎｓｔ  ＪＡ．２０１７，Ｅｆｆｅｃｔｏｒ−ａｔｔｅｎｕａｔｉｎｇ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ  Ｔｈａｔ  Ｍａｉｎｔａｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｒｅｄｕｃｅ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ．Ｊ  ＢｉｏｌＣｈｅｍ．２９２：３９００−３９０８．
Ｊａｃｏｂｓｅｎ  ＦＷ，Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ  Ｒ，Ｌｉ  Ｃ，Ｓａｌｉｍｉ−Ｍｏｏｓａｖｉ  Ｈ，Ｌｉｕ  Ｌ，Ｗｅｎ  Ｊ，Ｌｕｏ  Ｑ，Ｄａｒｉｓ  Ｋ，Ｂｕｃｋ  Ｌ，Ｍｉｌｌｅｒ  Ｓ，Ｈｏ  ＳＹ，Ｗａｎｇ  Ｗ，Ｃｈｅｎ  Ｑ，Ｗａｌｋｅｒ  Ｋ，Ｗｙｐｙｃｈ  Ｊ，Ｎａｒｈｉ  Ｌ，Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ  Ｋ．２０１７  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎ  ＩｇＧ  Ｓｃａｆｆｏｌｄ  Ｌａｃｋｉｎｇ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐａｂｉｌｉｔｙ．Ｊ  ＢｉｏｌＣｈｅｍ．２９２：１８６５−１８７５．
Ｐａｒｅｔ  Ｃ，Ｂｏｕｒｏｕｂａ  Ｍ，Ｂｅｅｒ  Ａ，Ｍｉｙａｚａｋｉ  Ｋ，Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ  Ｍ，Ｆｉｅｄｌｅｒ  Ｓ，Ｚｏｌｌｅｒ  Ｍ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ．２００５  Ｊｕｌ  １０；１１５（５）：７２４−３３．Ｌｙ６  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  Ｃ４．４Ａ  ｂｉｎｄｓ  ｌａｍｉｎｉｎｓ  １  ａｎｄ  ５，ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｇａｌｅｃｔｉｎ−３  ａｎｄ  ｓｕｐｐｏｒｔｓ  ｃｅｌｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ．
Ａｒｕｍｕｇａｍ  Ｔ，Ｄｅｎｇ  Ｄ，Ｂｏｖｅｒ  Ｌ，Ｗａｎｇ  Ｈ，Ｌｏｇｓｄｏｎ  ＣＤ，Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ  Ｖ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．２０１５  Ａｐｒ；１４（４）：９４１−５１．Ｎｅｗ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｎｏｖｅｌ  ＡＧＲ２−Ｃ４．４Ａ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ｒｅｄｕｃｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｏｆ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｔｕｍｏｒｓ  ａｎｄ  Ｉｎｃｒｅａｓｅ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ．
Ｎｇｏｒａ  Ｈ１，Ｇａｌｌｉ  ＵＭ，Ｍｉｙａｚａｋｉ  Ｋ，Ｚｏｌｌｅｒ  Ｍ．Ｎｅｏｐｌａｓｉａ．２０１２  Ｆｅｂ；１４（２）：９５−１０７．Ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂｏｕｎｄ  ａｎｄ  ｅｘｏｓｏｍａｌ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｃ４．４Ａ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  α（６）β（４）  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｎｄ  ＭＴ１−ＭＭＰ．
Ｗｏｌｆｇａｎｇ−Ｍｏｒｉｔｚ  Ｈｅｕｐｅｌ，Ｄｅｔｌｅｆ  Ｚｉｌｌｉｋｅｎｓ，Ｄｅｔｌｅｖ  Ｄｒｅｎｃｋｈａｈｎ  ａｎｄ  Ｊｅｎｓ  Ｗａｓｃｈｋｅ  Ｐｅｍｐｈｉｇｕｓ．Ｖｕｌｇａｒｉｓ  ＩｇＧ  Ｄｉｒｅｃｔｌｙ  Ｉｎｈｉｂｉｔ  Ｄｅｓｍｏｇｌｅｉｎ  ３−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｔｒａｎｓｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ａｕｇｕｓｔ  １，２００８，１８１（３）１８２５−１８３４．
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年9月27日(2019.9.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
本明細書に記載の治療方法のいずれかの特定の実施形態では、疾患または障害は、骨組織、肝臓組織、皮膚組織、胃組織、腸管組織、口腔粘膜組織、腎臓組織、中枢神経系組織、乳腺組織、味蕾組織、卵巣組織、内耳組織（蝸牛および前庭組織を含む）、毛包、膵臓組織、網膜組織、血管組織、角膜組織、心臓組織および肺組織からなる群から選択される組織の疾患または障害である。特定の例示的な実施形態では、疾患または障害は、骨組織の疾患または障害であり、細胞表面受容体は、ＰＴＨ１Ｒであるか、肝臓組織の疾患または障害であり、細胞表面受容体は、ＡＳＧＲ１、ＡＳＧＲ２、ＴＦＲ２、またはＳＬＣ１０Ａ１であるか、または口腔粘膜組織の疾患または障害であり、細胞表面受容体は、ＬＹＰＤ３またはＤＳＧ３である。特定の例示的な実施形態では、疾患または状態は、骨折、骨粗鬆症、骨粗鬆症性骨折、脊椎固定術、整形外科用装置の骨結合、腱と骨の統合、歯の成長と再生、歯科インプラント術、歯周病、顎顔面再建、顎骨壊死、脱毛症、難聴、前庭機能低下、黄斑変性、硝子体網膜症、網膜変性症、糖尿病性網膜症、フックスジストロフィー、脳卒中、外傷性脳損傷、アルツハイマー病、多発性硬化症、脊髄損傷、口腔粘膜炎、腸粘膜炎、短腸症候群、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、メタボリックシンドローム、糖尿病、膵炎、外分泌膵機能不全、創傷治癒、糖尿病性足部潰瘍、冠状動脈疾患、急性腎臓病、慢性腎臓病、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、特発性肺線維症、急性肝不全、急性アルコール性肝障害、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）による慢性肝疾患、ＨＣＶ患者の抗ウイルス薬治療後、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）による慢性肝疾患、ＨＢＶ患者の抗ウイルス薬治療後、慢性アルコール性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝疾患および非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、ならびにあらゆる原因による慢性肝不全からなる群から選択される。本明細書に記載のいずれかの治療または予防の方法の特定の実施形態では、薬学的組成物は、全身的に、非経口的に、経口的に、筋肉内に、局所的に、または局部的に提供される。特定の実施形態では、対象は、哺乳動物、場合によりヒトである。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
組織特異的Ｗｎｔ（「ウィングレス関連統合部位」または「ウィングレスおよびＩｎｔ−１」または「ウィングレス−Ｉｎｔ」）シグナル増強分子、またはその薬学的に許容される塩であって、ジンクリングフィンガー３（ＺＮＲＦ３）およびリングフィンガータンパク質４３（ＲＮＦ４３）から選択される１つ以上の膜貫通型Ｅ３ユビキチンリガーゼに特異的に結合する第１のドメインと、組織特異的細胞表面分子に特異的に結合する第２のドメインとを含み、前記化合物が、前記組織特異的細胞表面分子を含む前記組織においてＷｎｔシグナル伝達を増加させる、組織特異的Ｗｎｔシグナル増強分子、またはその薬学的に許容される塩。
（項目２）
前記組織が、骨組織、肝臓組織、皮膚組織、胃組織、腸管組織、口腔粘膜組織、腎臓組織、中枢神経系組織、乳腺組織、味蕾組織、卵巣組織、内耳組織（蝸牛および前庭組織を含む）、毛包、膵臓組織、網膜組織、角膜組織、心臓組織および肺組織からなる群から選択される、項目１に記載の分子。
（項目３）
前記第１のドメインが、第１のポリペプチド配列を含み、かつ／または前記第２のドメインが、第２のポリペプチド配列を含む、項目１または項目２に記載の分子。
（項目４）
前記化合物が、前記第１のポリペプチド配列および前記第２のポリペプチド配列を含む融合タンパク質または抗体である、項目３に記載の分子。
（項目５）
前記第１のポリペプチド配列が、
ａ）Ｒ−スポンジンポリペプチド配列であって、前記Ｒ−スポンジンが、場合により、Ｒ−スポンジン−１、Ｒ−スポンジン−２、Ｒ−スポンジン−３、またはＲ−スポンジン−４である、Ｒ−スポンジンポリペプチド配列またはその断片もしくはバリアント、あるいは
ｂ）Ｒ−スポンジンフリンドメイン１配列および、場合により、野生型もしくは変異型フリンドメイン２またはそれらの断片もしくはバリアントを含み、前記第１のポリペプチド配列は、場合により、全長Ｒ−スポンジンと比較してロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役受容体４〜６（ＬＧＲ４〜６）への結合が減少している、項目３または項目４に記載の分子。
（項目６）
前記Ｒ−スポンジンフリンドメイン１が、配列番号１〜４に存在するフリン１ドメインのうちのいずれかと少なくとも９０％の同一性を有する、項目５に記載の分子。
（項目７）
前記第２のポリペプチド配列が、ペプチド、ポリペプチド、抗体もしくはその断片、あるいはリガンドまたはその断片もしくはバリアントである、項目３〜６のいずれかに記載の分子。
（項目８）
ａ）前記組織が、骨組織であり、前記細胞表面分子が、副甲状腺ホルモン受容体１（ＰＴＨ１Ｒ）であるか、
ｂ）前記組織が、肝臓組織であり、前記細胞表面分子が、アシアロ糖タンパク質受容体１（ＡＳＧＲ１）、アシアロ糖タンパク質受容体２（ＡＳＧＲ２）、トランスフェリン受容体２（ＴＦＲ２）もしくは溶質キャリアファミリー１０メンバー１（ＳＬＣ１０Ａ１）であるか、または
ｃ）前記組織が、口腔粘膜であり、前記細胞表面分子が、Ｌｙ６／ＰＬＡＵＲドメイン含有３（ＬＹＰＤ３）もしくはデスモグレイン（ＤＳＧ３）である、項目１〜７のいずれか一項に記載の分子。
（項目９）
ａ）前記細胞表面分子が、副甲状腺ホルモン受容体１（ＰＴＨ１Ｒ）であり、前記第２のポリペプチド配列が、ＰＴＨ１Ｒに特異的に結合するか、
ｂ）前記細胞表面分子が、アシアロ糖タンパク質受容体１（ＡＳＧＲ１）であり、前記第２のポリペプチド配列が、ＡＳＧＲ１に特異的に結合するか、
ｃ）前記細胞表面分子が、アシアロ糖タンパク質受容体２（ＡＳＧＲ２）であり、前記第２のポリペプチド配列が、ＡＳＧＲ２に特異的に結合するか、
ｄ）前記細胞表面分子が、溶質キャリアファミリー１０メンバー１（ＳＬＣ１０Ａ１）であり、前記第２のポリペプチド配列が、溶質キャリアファミリー１０メンバー１（ＳＬＣ１０Ａ１）に特異的に結合するか、
ｅ）前記細胞表面分子が、トランスフェリン受容体２（ＴＦＲ２）であり、前記第２のポリペプチド配列が、ＴＦＲ２に特異的に結合するか、
ｆ）前記細胞表面分子が、Ｌｙ６／ＰＬＡＵＲドメイン含有３（ＬＹＰＤ３）であり、前記第２のポリペプチド配列が、ＬＹＰＤ３に特異的に結合するか、または
ｇ）前記細胞表面分子が、デスモグレイン（ＤＳＧ３）であり、前記第２のポリペプチド配列が、ＤＳＧ３に特異的に結合し、
前記第２のポリペプチドが、抗体もしくはその断片または抗体とは異なるペプチドもしくはポリペプチド、低分子、あるいは前記細胞表面分子のリガンドまたはその断片もしくはバリアントである、項目３〜８のいずれかに記載の分子。
（項目１０）
前記第１のドメインおよび前記第２のドメインが、リンカー部分によって結合している、項目１〜９のいずれかに記載の分子。
（項目１１）
前記リンカー部分が、ペプチジルリンカー配列である、項目１０に記載の分子。
（項目１２）
前記リンカー配列が、グリシン、アスパラギン、セリン、トレオニンおよびアラニンからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸を含む、項目１１に記載の分子。
（項目１３）
項目４〜１２のいずれかに記載の融合タンパク質をコードする核酸配列。
（項目１４）
前記核酸配列が、ＤＮＡまたはｍＲＮＡである、項目１３に記載の核酸配列。
（項目１５）
項目１３に記載の核酸配列を含むベクター。
（項目１６）
前記ベクターが、前記核酸配列に機能的に連結されたプロモーター配列を含む発現ベクターである、項目１５に記載のベクター。
（項目１７）
前記ベクターが、前記核酸配列に機能的に連結されたプロモーター配列を含むウイルスである、項目１５に記載のベクター。
（項目１８）
項目１６に記載のベクターを含む宿主細胞。
（項目１９）
項目４〜１２のいずれかに記載の融合ポリペプチドを生成するための方法であって、前記融合ポリペプチドが前記発現ベクターによって発現される条件下で項目１８に記載の宿主細胞を培養することを含む、方法。
（項目２０）
生成された前記融合ポリペプチドを単離する工程をさらに含む、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
（ｉ）有効量の、項目１〜１２のいずれかに記載の分子、項目１３〜１４のいずれかに記載の核酸配列、項目１５〜１７のいずれかに記載のベクター、または項目１８に記載の宿主細胞と、
（ｉｉ）薬学的に許容される希釈剤、アジュバントまたは担体と、を含む、薬学的組成物。
（項目２２）
有効量の項目１〜１２のいずれかに記載の分子と、有効量のＷｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチド、またはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子とを含む、項目２１に記載の薬学的組成物。
（項目２３）
有効量の項目１３〜１４のいずれかに記載の核酸配列と、Ｗｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチド、またはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする有効量の核酸配列とを含み、前記Ｗｎｔポリペプチド、前記ノリンポリペプチド、または前記Ｗｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする前記核酸配列が、場合によりＤＮＡまたはｍＲＮＡである、項目２１に記載の薬学的組成物。
（項目２４）
項目１３〜１４のいずれかに記載の核酸配列および／または前記Ｗｎｔポリペプチド、前記ノリンポリペプチド、もしくは前記Ｗｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする前記核酸配列が、修飾ｍＲＮＡである、項目２３に記載の薬学的組成物。
（項目２５）
有効量の項目１５〜１７のいずれかに記載のベクターと、Ｗｎｔポリペプチド、ポリペプチド、またはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする核酸配列を含む有効量のベクターとを含み、ノリン前記Ｗｎｔポリペプチド、前記ノリンポリペプチド、または前記Ｗｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする前記核酸配列を含む前記ベクターが、場合により発現ベクターである、項目２２に記載の薬学的組成物。
（項目２６）
（ｉ）Ｗｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチド、またはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする有効量の核酸と、
（ｉｉ）薬学的に許容される希釈剤、アジュバントまたは担体と、を含む、薬学的組成物。
（項目２７）
前記核酸が、ＤＮＡまたはｍＲＮＡ、場合により修飾ｍＲＮＡである、項目２６に記載の薬学的組成物。
（項目２８）
前記核酸が、発現ベクター、場合によりウイルスベクター中に存在する、項目２６に記載の薬学的組成物。
（項目２９）
前記Ｗｎｔポリペプチドが、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２Ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３Ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５Ａ、Ｗｎｔ５Ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７Ａ、Ｗｎｔ７Ｂ、Ｗｎｔ８Ａ、Ｗｎｔ８Ｂ、Ｗｎｔ９Ａ、Ｗｎｔ９Ｂ、Ａｎｔ１０Ａ、Ｗｎｔ１０Ｂ、Ｗｎｔ１１、およびＷｎｔ１６、ならびにこれらのうちのいずれかの機能的バリアントおよび断片から選択される哺乳動物Ｗｎｔポリペプチドである、項目２２〜２８のいずれかに記載の薬学的組成物。
（項目３０）
前記ノリンポリペプチドが、哺乳動物ノリンポリペプチドまたはその機能的バリアントもしくは断片である、項目２２〜２８のいずれかに記載の薬学的組成物。
（項目３１）
前記Ｗｎｔシグナル伝達アゴニスト分子が、フリズルド（Ｆｚｄ）受容体をＬｒｐ５／６と二量体化させる水溶性Ｗｎｔシグナル伝達アゴニストである、項目２２〜２８のいずれかに記載の薬学的組成物。
（項目３２）
前記Ｗｎｔシグナル伝達アゴニスト分子が、ポリペプチドを含む、項目３１に記載の薬学的組成物。
（項目３３）
前記ポリペプチドが、１つ以上のＦｚｄタンパク質に対して高い親和性を有する結合ドメインと、Ｌｒｐ５／Ｌｒｐ６タンパク質に対して高い親和性を有する結合ドメインとを含み、前記結合ドメインが、場合により、直接結合しているか、またはリンカーにより結合している、項目３２に記載の薬学的組成物。
（項目３４）
標的組織においてＷｎｔ（「ウィングレス関連統合部位」または「ウィングレスおよびＩｎｔ−１」または「ウィングレス−Ｉｎｔ」）シグナル伝達を増加させるための方法であって、前記標的組織を、
ａ）項目１〜１２のいずれかに記載の分子、項目１３〜１４のいずれかに記載の核酸、項目１５〜１７のいずれかに記載のベクター、または項目１８に記載の宿主細胞であって、前記第２のドメインが前記標的組織上の細胞特異的表面分子に特異的に結合し、項目１〜１２のいずれか一項に記載の分子が前記標的組織に結合して、前記標的組織におけるジンクリングフィンガー３（ＺＮＲＦ３）およびリングフィンガータンパク質４３（ＲＮＦ４３）から選択される１つ以上の膜貫通型Ｅ３ユビキチンリガーゼを隔離またはそのエンドサイトーシスを増加させるもの、および／または
ｂ）Ｗｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチド、もしくはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子；Ｗｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチド、もしくはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする核酸配列；Ｗｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチド、もしくはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする核酸配列を含むベクター；またはＷｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチド、もしくはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする核酸配列を含む発現ベクターを含む宿主細胞であって、前記Ｗｎｔポリペプチド、前記ノリンポリペプチド、または前記Ｗｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする前記核酸配列が、場合によりＤＮＡまたはｍＲＮＡ、場合により修飾ｍＲＮＡであるもの、と接触させることを含む、方法。
（項目３５）
前記標的組織を項目１〜１２のいずれかに記載の分子と接触させることを含む、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記標的組織を項目１３〜１４のいずれかに記載の核酸と接触させることを含む、項目３４に記載の方法。
（項目３７）
前記標的組織を項目１５〜１７のいずれかに記載のベクターと接触させることを含む、項目３４に記載の方法。
（項目３８）
前記標的組織を、前記Ｗｎｔポリペプチド、前記ノリンポリペプチド、または前記Ｗｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする前記核酸配列と接触させることを含む、項目３４に記載の方法。
（項目３９）
ａ）前記組織が、骨組織であり、前記細胞表面分子が、副甲状腺ホルモン受容体１（ＰＴＨ１Ｒ）であるか、
ｂ）前記組織が、肝臓組織であり、前記細胞表面分子が、アシアロ糖タンパク質受容体１（ＡＳＧＲ１）、アシアロ糖タンパク質受容体２（ＡＳＧＲ２）、トランスフェリン受容体２（ＴＦＲ２）、もしくは溶質キャリアファミリー１０メンバー１（ＳＬＣ１０Ａ１）であるか、または
ｃ）前記組織が、口腔粘膜組織であり、前記細胞表面分子が、Ｌｙ６／ＰＬＡＵＲドメイン含有３（ＬＹＰＤ３）もしくはデスモグレイン（ＤＳＧ３）である、項目３４〜３９のいずれかに記載の方法。
（項目４０）
疾患または状態の治療または予防を必要とする対象においてそれを行うための方法であって、前記疾患または障害が、Ｗｎｔ（「ウィングレス関連統合部位」または「ウィングレスおよびＩｎｔ−１」または「ウィングレス−Ｉｎｔ」）シグナル伝達の減少と関連しているか、またはＷｎｔシグナル伝達の増加による恩恵を受けるであろうものであり、有効量の項目２１〜３３のいずれかに記載の薬学的組成物を前記対象に提供することを含む、方法。
（項目４１）
薬学的に許容される希釈剤、アジュバントまたは担体と、有効量の、
（ａ）Ｗｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチド、もしくはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子、
（ｂ）Ｗｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチド、もしくはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする核酸配列であって、場合によりＤＮＡもしくはｍＲＮＡである、前記Ｗｎｔポリペプチド、前記ノリンポリペプチド、もしくは前記Ｗｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする核酸配列、
（ｃ）Ｗｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチド、もしくはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする核酸配列を含むベクターであって、場合により発現ベクターである、前記Ｗｎｔポリペプチド、前記ノリンポリペプチド、もしくは前記Ｗｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする前記核酸配列を含むベクター、または
（ｄ）Ｗｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチド、もしくはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする核酸を含む発現ベクターを含む宿主細胞と、を含む薬学的組成物を前記対象に提供することをさらに含む、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
有効量の項目１〜１２のいずれかに記載の分子を含む薬学的組成物と、有効量のＷｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチド、またはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子を含む薬学的組成物とを前記対象に提供することを含む、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
有効量の項目１３〜１４のいずれかに記載の核酸配列を含む薬学的組成物と、Ｗｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチド、またはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする有効量の核酸配列を含む薬学的組成物とを前記対象に提供することを含み、前記核酸配列のうちの一方または両方が、場合によりＤＮＡまたはｍＲＮＡ、場合により修飾ｍＲＮＡである、項目４１に記載の方法。
（項目４４）
有効量の項目１５〜１７のいずれかに記載のベクターを含む薬学的組成物と、Ｗｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチド、またはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする核酸配列を含む有効量のベクターを含む薬学的組成物とを前記対象に提供することを含み、前記ベクターのうちの一方または両方が、場合により発現ベクターまたはウイルスベクターである、項目４１に記載の方法。
（項目４５）
疾患または状態の治療または予防を必要とする対象においてそれを行うための方法であって、前記疾患または障害が、Ｗｎｔ（「ウィングレス関連統合部位」または「ウィングレスおよびＩｎｔ−１」または「ウィングレス−Ｉｎｔ」）シグナル伝達の減少と関連しているか、またはＷｎｔシグナル伝達の増加による恩恵を受けるであろうものであり、薬学的に許容される希釈剤、アジュバントまたは担体と、有効量の、
ａ）Ｗｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチド、もしくはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする核酸配列であって、場合によりＤＮＡもしくはｍＲＮＡ、場合により修飾ｍＲＮＡである、前記Ｗｎｔポリペプチド、前記ノリンポリペプチド、もしくは前記Ｗｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする核酸配列、
ｂ）Ｗｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチド、もしくはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする核酸配列を含むベクターであって、場合により発現ベクターである、前記Ｗｎｔポリペプチド、前記ノリンポリペプチド、もしくは前記Ｗｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする前記核酸配列を含むベクター、または
ｃ）Ｗｎｔポリペプチド、ノリンポリペプチド、もしくはＷｎｔシグナル伝達アゴニスト分子をコードする核酸を含む発現ベクターを含む宿主細胞と、を含む薬学的組成物を前記対象に提供することを含む、方法。
（項目４６）
前記Ｗｎｔポリペプチドが、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２Ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３Ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５Ａ、Ｗｎｔ５Ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７Ａ、Ｗｎｔ７Ｂ、Ｗｎｔ８Ａ、Ｗｎｔ８Ｂ、Ｗｎｔ９Ａ、Ｗｎｔ９Ｂ、Ａｎｔ１０Ａ、Ｗｎｔ１０Ｂ、Ｗｎｔ１１、およびＷｎｔ１６、ならびにこれらのうちのいずれかの機能的バリアントおよび断片から選択される哺乳動物Ｗｎｔポリペプチドである、項目４１〜４５のいずれかに記載の方法。
（項目４７）
前記ノリンポリペプチドが、哺乳動物ノリンポリペプチドまたはその機能的バリアントもしくは断片である、項目４１〜４５のいずれかに記載の方法。
（項目４８）
前記Ｗｎｔシグナル伝達アゴニスト分子が、フリズルド（Ｆｚｄ）受容体をＬｒｐ５／６と二量体化させる水溶性Ｗｎｔシグナル伝達アゴニストである、項目４１〜４５のいずれかに記載の方法。
（項目４９）
前記Ｗｎｔシグナル伝達アゴニスト分子が、ポリペプチドを含む、項目４１に記載の方法。
（項目５０）
前記ポリペプチドが、１つ以上のＦｚｄタンパク質に対して高い親和性を有する結合ドメインと、Ｌｒｐ５／Ｌｒｐ６タンパク質に対して高い親和性を有する結合ドメインとを含み、前記結合ドメインが、場合により、直接結合しているか、またはリンカーにより結合している、項目４２に記載の方法。
（項目５１）
前記疾患または障害が、骨組織、肝臓組織、皮膚組織、胃組織、腸管組織、口腔粘膜組織、腎臓組織、中枢神経系組織、乳腺組織、味蕾組織、卵巣組織、内耳組織（蝸牛および前庭組織を含む）、毛包、膵臓組織、網膜組織、角膜組織、心臓組織および肺組織からなる群から選択される組織の疾患または障害である、項目４０〜５０のいずれかに記載の方法。
（項目５２）
前記疾患または障害が、
ａ）骨組織の疾患または障害であり、細胞表面受容体が、副甲状腺ホルモン受容体１（ＰＴＨ１Ｒ）であるか、
ｂ）肝臓組織の疾患または障害であり、細胞表面受容体が、アシアロ糖タンパク質受容体１（ＡＳＧＲ１）、アシアロ糖タンパク質受容体２（ＡＳＧＲ２）、トランスフェリン受容体２（ＴＦＲ２）、もしくは溶質キャリアファミリー１０メンバー１（ＳＬＣ１０Ａ１）であるか、あるいは
ｃ）口腔粘膜組織の疾患または障害であり、細胞表面受容体が、Ｌｙ６／ＰＬＡＵＲドメイン含有３（ＬＹＰＤ３）またはデスモグレイン（ＤＳＧ３）である、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
前記疾患または状態が、骨折、骨粗鬆症、骨粗鬆症性骨折、脊椎固定術、整形外科用装置の骨結合、腱と骨の統合、歯の成長と再生、歯科インプラント術、歯周病、顎顔面再建、顎骨壊死、脱毛症、難聴、前庭機能低下、黄斑変性、硝子体網膜症、網膜変性症、フックスジストロフィー、脳卒中、外傷性脳損傷、アルツハイマー病、多発性硬化症、脊髄損傷、口腔粘膜炎、短腸症候群、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、メタボリックシンドローム、糖尿病、膵炎、外分泌膵機能不全、創傷治癒、糖尿病性足部潰瘍、冠状動脈疾患、急性腎臓病、慢性腎臓病、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、急性肝不全、急性アルコール性肝障害、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）による慢性肝疾患、ＨＣＶ患者の抗ウイルス薬治療後、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）による慢性肝疾患、ＨＢＶ患者の抗ウイルス薬治療後、慢性アルコール性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝疾患および非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、ならびにあらゆる原因による慢性肝不全からなる群から選択される、項目４０〜５０のいずれかに記載の方法。
（項目５４）
前記薬学的組成物が、非経口的に、経口的に、筋肉内に、局所的に、または局部的に提供される、項目４０〜５３のいずれかに記載の方法。
（項目５５）
前記対象が、哺乳動物、場合によりヒトである、項目４０〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2020506701000001.app
【国際調査報告】
2020506701.tif 000032
2020506701.tif 000033