(57)【要約】  向上した生着活性を有する造血幹細胞（ＨＳＣ）を調製するための方法であって、例えば、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤およびＨＩＦ−１α安定化剤の存在下でＨＳＣを接触させることによる、方法が、本出願で提供される。【選択図】図２
2020506696.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
向上した生着活性を有する造血幹細胞（ＨＳＣ）を調製するための方法であって、
（ｉ）ＨＳＣを提供することと、
（ｉｉ）有効量のｐ３８マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）阻害剤および有効量の低酸素誘導因子−１α（ＨＩＦ−１α）安定化剤の存在下で前記ＨＳＣを培養することと、
を含む、方法。
【請求項２】
前記ＨＳＣが、ＤＮＡ二本鎖切断を誘導する遺伝子操作を受けている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記遺伝子操作が、組み込みベクターの形質導入を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記組み込みベクターが、ウイルスベクターである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記遺伝子操作が、ゲノム編集を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
前記ＨＳＣが、分裂ＨＳＣである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＨＳＣが、対象から得られる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記対象が、ヒト対象である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＨＳＣが、前記ヒト対象の骨髄または末梢血細胞から得られる成体ＨＳＣである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＨＳＣが、前記ヒト対象の臍帯血細胞から得られる、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＭＡＰＫ阻害剤が、ドラマピモド、ラリメチニブ、ｐ３８ＭＡＰＫのアミノピリジンベースのＡＴＰ競合阻害剤、またはピリジニルイミダゾール阻害剤である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＨＩＦ−１α安定化剤が、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）または１６−１６ジメチルプロスタグランジンＥ２（ｄｍＰＧＥ２）である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
（ｉｉｉ）それを必要とする対象に、ステップ（ｉｉ）から得られたＨＳＣを投与することをさらに含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
約５０，０００〜約５００，０００個のＨＳＣの用量が、前記対象に投与される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
約５０，０００〜約１００，０００個のＨＳＣの用量が、前記対象に投与される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記対象が、前記ＨＳＣが得られた同じ対象である、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
ステップ（ｉｉ）が、１〜７日間行われる、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年１月２７日に出願された米国仮出願第６２／４５１，５９４号の米国特許法１１９（ｅ）条に基づく利益を主張し、その内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
向上した生着活性を有する幹細胞（例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ））を調製するための方法が、本明細書で提供される。
【背景技術】
【０００３】
造血幹細胞（ＨＳＣ）は、造血系全体を再構成し、それらの集団の維持のために自己再生する能力を有する、独特で稀な細胞集団である。遺伝子をＨＳＣに導入すること、またはＨＳＣの遺伝子を編集することを含む遺伝子療法（ＧＴ）は、単一遺伝子障害または造血障害を治癒するための魅力的な治療戦略を提供する。それはまた、適切な移植ドナーがいないそれを必要とする患者を治癒するための同種造血幹細胞移植の魅力的な代替を提供する。しかしながら、ＧＴは、ＨＳＣのエクスビボ操作および培養を必要とし、それはそれらが老化してそれらのリンパ性表現型を喪失するにつれて大量のＨＳＣ喪失をもたらす。
【０００４】
現在、自家移植後に再増殖するヒトＨＳＣの数が、効果的な遺伝子導入の大きな限界となっている。したがって、骨髄破壊的前処置が、常在ＨＳＣを破壊し、エクスビボ操作後の限られた数の遺伝子操作ＨＳＣの生着を有利にするためにしばしば必要とされる。
【０００５】
したがって、エクスビボ遺伝子操作および／または細胞培養中にＨＳＣの幹細胞性を維持し、それによってそれらの生着活性、およびひいては遺伝子療法の治療成功を増大させる方法の開発が必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
本開示は、少なくとも部分的には、例えば、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）などのＨＩＦ−１α安定化剤を使用して、低酸素誘導因子−１α（ＨＩＦ−１α）を安定させると同時に、例えば、ドラマピモドなどのｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤を使用して、幹細胞におけるｐ３８マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）の活性化を阻害することが、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤またはＨＩＦ−１α安定化剤単独での単独処理と比較して、インビトロまたはエクスビボ培養中の幹細胞（例えば、分裂ＨＳＣなどの分裂幹細胞）の喪失をうまく減少させたという予想外の発見に基づく。したがって、幹細胞（例えば、分裂ＨＳＣなどの分裂幹細胞）とｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤およびＨＩＦ−１α安定化剤との併用処理は、インビボでの培養幹細胞の生着を予想外に増加させた。
【０００７】
したがって、本開示の一態様は、向上した生着活性を有する造血幹細胞（ＨＳＣ）などの幹細胞を調製するための方法を特徴とする。方法は、有効量のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤および有効量のＨＩＦ−１α安定化剤の存在下で幹細胞（例えば、ＨＳＣ）を培養することを含む。いくつかの実施形態では、ＨＳＣは、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤およびＨＩＦ−１α安定化剤の両方を含有する培養培地中で培養されてもよい。本明細書に記載の方法に適している幹細胞は、ＤＮＡ二本鎖切断（例えば、組み込みベクターの形質導入またはゲノム編集）を誘導する遺伝子操作に供することができる。いくつかの例では、幹細胞は、（例えば、Ｓ−Ｇ２Ｍ期にある）周期または分裂幹細胞であり得る。
【０００８】
本明細書に記載の方法のいずれも、培養ステップの前に、幹細胞を遺伝子操作することをさらに含み得る。遺伝子操作は、細胞周期非依存的または細胞周期依存的に行うことができる。いくつかの例では、遺伝子操作は、細胞分裂周期中に行われ得る。遺伝子操作は、幹細胞を組み込みベクターで形質導入することを含み得る。組み込みベクターの例としては、レトロウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）などのウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。あるいはまたは加えて、遺伝子操作は、幹細胞においてゲノム編集を行うことを含み得る。ゲノム編集は、例えば、これらに限定されないが、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ホーミングエンドヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、および／または転写アクチベーター様エフェクターベースのヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）の使用を含み得る。
【０００９】
本明細書に記載の方法のいずれも、それを必要とする対象に、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤およびＨＩＦ−１α安定化剤の存在下で培養されたＨＳＣを投与または移植することをさらに含み得る。例えば、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤およびＨＩＦ−１α安定化剤の存在下で培養された約５０，０００〜約５００，０００個のＨＳＣの用量（またはさらに約５０，０００〜約１００，０００個のＨＳＣなどのより低い用量）が対象に投与され得る。幹細胞（例えば、ＨＳＣ）は、同種幹細胞（例えば、ＨＳＣ）または自己幹細胞（例えば、ＨＳＣ）であり得る。ＨＳＣは、それらの投与または対象への移植の前に１〜７日間培養され得る。いくつかの例では、レシピエント対象は、骨髄破壊的化学療法前処置、またはＨＳＣの投与もしくは移植の前に、レシピエント対象における常在ＨＳＣを破壊することができる任意の他の同等の方法を行っていない。
【００１０】
本明細書に記載される任意の方法では、幹細胞（例えば、ＨＳＣ）は、成体幹細胞であり得、これは適切な供給源（例えば、ヒト）の骨髄および／または末梢血細胞に由来し得る。あるいは、幹細胞は、適切な供給源（例えば、ヒト）の臍帯血に由来し得る。
【００１１】
本明細書に記載の任意の態様では、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、タンパク質、核酸、小分子、またはそれらの組み合わせであり得る。いくつかの例では、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、ｐ３８ＭＡＰＫ遮断剤（例えば、ｐ３８−αに結合してｐ３８ＭＡＰＫシグナル伝達を遮断する小分子）であり得る。ｐ３９ＭＡＰＫ阻害剤の例としては、ドラマピモド（例えば、ＢＩＲＢ−７９６）、ラリメチニブ（例えば、ＬＹ２２２８８２０ジメシレート）、アミノピリジンベースの、ｐ３８ＭＡＰＫのＡＴＰ競合阻害剤（例えば、Ｖｘ７０２）、ピリジニルイミダゾール阻害剤（例えば、ＳＢ２０３５８０）、およびそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１２】
本明細書に記載の方法のいずれにおいても、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤の量は、Ｇ０静止期における幹細胞（例えば、ＨＳＣ）の割合を増加させるため、および最初の細胞分裂周期前のＳ−Ｇ２−Ｍ期（例えば、２４時間）における幹細胞（例えば、ＨＳＣ）の割合を減少させるため、幹細胞のＧ０静止期からＳ期への移行を遅らせるため、ならびに／または細胞培養および／もしくは遺伝子操作に関連する幹細胞におけるＤＮＡ損傷応答および修復（ＤＤＲ）を減少させるため（例えば、γＨ２ＡＸレベルを減少させるため）に有効であり得る。いくつかの例では、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤の量は、他の非特異的阻害を最小限に抑えるか、または全く伴わずに、幹細胞におけるｐ３８リン酸化を特異的に減少させるように選択される。
【００１３】
本明細書に記載の任意の態様では、ＨＩＦ−１α安定化剤は、タンパク質、核酸、小分子、またはそれらの組み合わせであり得る。いくつかの例では、ＨＩＦ−１α安定化剤は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に影響を及ぼすことなくＨＩＦ−１αタンパク質および／または転写活性を安定化することができる。いくつかの例では、ＨＩＦ−１α安定化剤は、ＨＩＦ−１α遺伝子発現を増加させることができる。ＨＩＦ−１α安定化剤の例としては、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）およびその類似体、例えば、１６−１６ジメチルＰＧＥ２（ｄｍＰＥＧ２）、フマル酸ジエチル（ＤＥＦ）、およびジメチルオキサリグリシン（ＤＭＯＧ、別名Ｎ−（メトキシオキソアセチル）−グリシン）、ならびにそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１４】
本明細書に記載の方法のいずれにおいても、ＨＩＦ−１α安定化剤の量は、幹細胞（例えば、周期または分裂ＨＳＣなどのＨＳＣ）におけるＨＩＦ−１αタンパク質および／もしくは転写活性を安定させるため、ならびに／または幹細胞（例えば、周期または分裂ＨＳＣなどのＨＳＣ）においてＣＸＣＲ４を上方調節するために有効であり得る。
【００１５】
本明細書に記載の方法のいずれにおいても、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤とＨＩＦ−１α安定化剤との組み合わされた量は、細胞周期のＧ２Ｍ期における幹細胞（例えば、周期または分裂ＨＳＣなどのＨＳＣ）の蓄積を減少させるため、幹細胞における長期再増殖能（ＬＴＲＰ）の喪失を減少させるため、幹細胞の骨髄性歪み表現型を減少させるため、および／または対象に移植されたＨＳＣの生着を促進するために有効であり得る。
【００１６】
いくつかの例では、幹細胞（例えば、周期または分裂ＨＳＣなどのＨＳＣ）のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤およびＨＩＦ−１α安定化剤での併用処理の効果（複数可）は相乗的であり得る。例えば、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤とＨＩＦ−１α安定化剤との組み合わせは、インビトロまたはエクスビボ操作（例えば、細胞培養および／または遺伝子操作）を受けた周期または分裂幹細胞のインビボ生着を向上させるが、いずれかの分子の不在はそうすることができない。
【００１７】
本明細書に記載の方法のいずれにおいても、対象は、ヒト対象であり得る。いくつかの実施形態では、対象は、造血障害を有するヒト患者である。いくつかの実施形態では、対象は、単一遺伝子障害を有するヒト患者である。
【００１８】
幹細胞（例えば、ＨＳＣ）移植を必要としている対象において幹細胞（例えば、ＨＳＣ）の生着を促進するのに使用するための組成物もまた本開示の範囲内である。組成物は、（ｉ）本明細書に記載のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤のいずれかと、（ｉｉ）本明細書に記載のＨＩＦ−１α安定化剤のうちのいずれかと、（ｉｉｉ）造血幹細胞などの幹細胞と、を含む。組成物は、細胞培養培地をさらに含み得る。対象は、造血障害または単一遺伝子障害を有するヒト患者であり得る。
【００１９】
開示の１つ以上の実施形態の詳細を、以下の説明に記載する。本開示の他の特徴または利点は、以下の図面およびいくつかの実施形態の詳細な説明から、ならびにまた添付の特許請求の範囲から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本開示の特定の態様をさらに実証するために含まれており、それらは、本明細書に提示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせてこれらの図面の１つ以上を参照することによってよりよく理解され得る。
【００２１】
【図１−１】成体造血幹細胞のヒト異種移植モデルを示す。新たに単離されたヒト動員末梢血（ＭＰＢ）由来ＣＤ３４＋細胞（１００万細胞／マウス）を、１８時間以内にレンチウイルスベクター（ＬＶ）で形質導入し、照射されたＮＳＧマウスに注射した。一次ヒト生着を６週のマウスで、骨髄（ＢＭ）（パネルＡ）および同時に末梢血（ＰＢ）（パネルＢ）において分析した。各記号は個々のマウスを表し、線は平均±ＳＥＭを示す。（ＢＭ０時間についてｎ＝１３、１８〜２４時間ｎ＝１４、３６〜４２時間ｎ＝１５、ＰＢ：０時間についてｎ＝６、１８〜２４時間ｎ＝７、３６〜４２時間ｎ＝８マウス）。パネルＣ：一次移植（１Ｔ）後６、１２、および２４週に、フローサイトメトリーによってＢＭを異なるヒト細胞集団について分析した。一次移植（１Ｔ）後２４週のＧＦＰ＋（形質導入）対ＧＦＰ−（未形質導入）細胞についてゲーティングされたヒトＣＤ４５＋細胞を示す代表的なＦＡＣＳプロット。ＧＦＰ−およびＧＦＰ＋ヒトＣＤ４５＋集団から、ＣＤ１９について陰性であったヒトＣＤ３３＋骨髄性細胞、ヒトＣＤ１９＋Ｂ−リンパ性およびＣＤ３＋Ｔ−リンパ性細胞ならびにヒトＣＤ３４＋ＨＳＰＣを示す。パネルＤ：未培養ＭＰＢ由来ＣＤ３４＋細胞の１Ｔ後６、１２、および２４週で分析された多系統生着パーセンテージを示す。データを平均±ＳＥＭとしてプロットした（６週についてｎ＝２０、１２週ｎ＝１２、２４週ｎ＝１０マウス）。
【図１−２】同上。
【図１−３】同上。
【図２】成体ヒトＨＳＣエクスビボ操作および遺伝子導入ならびにＬＴＲＰに対するその効果を研究するための前臨床モデルを示す。パネルＡ：新たに単離または解凍された動員末梢血（ＭＰＢ）由来ＣＤ３４＋細胞を研究に利用した。指示された時点でレンチウイルスベクター（ＬＶ）またはγ−レトロウイルスベクター（ＲＶ）媒介遺伝子導入が行われた研究に２つの異なるプロトコルを利用した。０時間、１８〜２４時間、３６〜４２時間、および７２〜９６時間は、ＮＳＧマウスへの注射前のＣＤ３４＋細胞単離後にエクスビボ培養において細胞が曝露された時間の総量を示す。パネルＢ：培養および形質導入における指示された時間後、全身照射後のＮＳＧマウスあたり１００万個のＣＤ３４＋開始同等細胞を静脈内移植した（一次移植＝１Ｔ）。一次ヒト生着および多系統再構成を、左右の大腿骨から６および１２週の骨髄採取後、ならびに全ての骨から２４週の犠死後の指定された時間でマウスにおいて分析した。細胞の一部分をＦＡＣＳについて分析し、残りはマウスＣＤ４５＋細胞が枯渇し、二次マウスに一対一で移植した（二次移植＝２Ｔ）。
【図３−１】２４時間超にわたるヒトＣＤ３４＋ＨＳＰＣにおけるエクスビボ操作および遺伝子導入を示し、ＬＴＲＰの有意な喪失および骨髄性歪み遺伝子修飾子孫をもたらす。パネルＡ：新たに単離または解凍されたヒト動員末梢血由来ＣＤ３４＋細胞を培養し、指示された時間にわたってレンチウイルスベクター（ＬＶ）またはγ−レトロウイルスベクター（ＲＶ）で形質導入した。照射されたＮＳＧマウスあたり１００万個のＣＤ３４＋細胞に相当する投入量を注射した。指示された時点での一次ＮＳＧマウスの骨髄（ＢＭ）中のヒトＣＤ４５＋細胞のパーセンテージを示す。ｘ軸は一次移植（１Ｔ）後の週数を示す。データは平均±ＳＥＭを表し、合計５８マウスに対して０時間について模擬ｎ＝１０、１８〜２４時間についてｎ＝２０、３６〜４２時間についてｎ＝９、７２〜９６時間についてｎ＝１９マウス。パネルＢ：一次ＮＳＧマウスのＢＭ中の全ヒト細胞を、照射された二次マウスに１対１で移植した。二次移植（２Ｔ）後６週の骨髄におけるヒト生着（Ｙ軸）を示す（合計４０マウスに対して０時間について模擬ｎ＝７、１８〜２４時間についてｎ＝５、３６〜４２時間についてｎ＝１４、７２〜９６時間についてｎ＝１４。多系統再構成を１Ｔ後２４週で分析した。未形質導入（ＧＦＰ−）および形質導入（ＧＦＰ＋）両方のヒトＣＤ３３＋骨髄性集団（パネルＣおよびＤ）、ヒトＣＤ１９＋Ｂ−リンパ性（パネルＥおよびＦ）、ヒトＣＤ３＋Ｔ−リンパ性（パネルＧおよびＨ）、およびヒトＣＤ３４＋ＨＳＰＣ集団（パネルＩおよびＪ）を示す。データは平均±ＳＥＭとして表し、ｎ＝図３、パネルＡと同じ統計：マン・ホイットニーＵ検定、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５。
【図３−２】同上。
【図４】インビトロおよびインビボでのＧＦＰマーキングを示す。ヒトＭＰＢ  ＣＤ３４＋細胞を培養し、図２、パネルＡに記載される指示された時間（ｈｒｓ）ＬＶまたはＲＶでおよび形質導入し、コロニー形成単位細胞（ＣＦＵｃ）を少ない割合のＣＤ３４＋細胞上に播種し、残り（１００万開始等価物）をＮＳＧマウスに静脈内移植した。ＢＭは左右の大腿骨から６および１２週に吸引し、マウスは２４週に犠死させ、ＢＭはＧＦＰ＋ｈＣＤ４５＋細胞について６、１２、および２４週に分析し（合計３６マウスに対して１８〜２４時間についてｎ＝２０、３６〜４２時間についてｎ＝９、および７２〜９６時間についてｎ＝７、データは平均±ＳＥＭとして表した）。
【図５−１】ＮＳＧマウスにおけるエクスビボ操作および培養ＭＰＢ由来ｈＣＤ３４＋細胞の多系統生着を示す。ヒト動員末梢血（ＭＰＢ）ＣＤ３４＋細胞を指示された時間（Ｘ軸）培養し、形質導入細胞のマーカーとして増強した緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするレンチウイルスベクター（ＬＶ）またはγ−レトロウイルスベクター（ＲＶ）で形質導入し、その後照射された（２８０ｃＧｙ）ＮＳＧマウスあたり１００万個のＣＤ３４＋細胞の等価投入量を注射した。一次移植後６週（パネルＡ、Ｃ、Ｅ、およびＧ）および１２週（パネルＢ、Ｄ、Ｆ、およびＨ）で骨髄（ＢＭ）を多系統再構成について分析した。未形質導入（ＧＦＰ−）および形質導入（ＧＦＰ＋）両方のヒトＣＤ３３＋骨髄性集団（パネルＡおよびＢ）、ヒトＣＤ１９＋Ｂ−リンパ性（パネルＣおよびＤ）、ヒトＣＤ３＋Ｔ−リンパ性（パネルＥおよびＦ）、およびヒトＣＤ３４＋ＨＳＰＣ集団（パネルＧおよびＨ）を示す。データは平均±ＳＥＭとして表した。合計５０ＮＳＧマウスに対して０時間についてｎ＝１２、１８〜２４時間についてｎ＝７、３６〜４２時間についてｎ＝１１、７２〜９６時間についてｎ＝２０。統計：マン・ホイットニー検定、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図５−２】同上。
【図６−１】ＬＶおよびＲＶの両方がヒトＨＰＣおよびＨＳＣを同等に形質導入することを示す。４２時間のＬＶ形質導入後の様々な造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）サブセット（パネルＡ、左）および定量化（パネルＡ、右）（ｎ＝４の独立した実験）、７２時間のＬＶまたはＲＶ形質導入後のヒトＣＤ３４＋ＨＳＰＣ対ＣＤ３４＋３８−９０＋４５ＲＡ−４９ｆ＋ＨＳＣ（左）および定量化（右）（ｎ＝３の独立した実験）（パネルＢ）、ならびにそれぞれの群の定量化（パネルＤおよびＦ）を伴う７２時間のＬＶ（パネルＣ）またはＲＶ（パネルＥ）形質導入後のＣＤ３４＋３８−９０−４５ＲＡ−ＭＰＰ対ＨＳＣにおける、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）マーカー発現を示す代表的な蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）プロットを、平均±ＳＥＭでの棒グラフ（ｎ＝３の独立した実験）として示す。
【図６−２】同上。
【図７−１】エクスビボ操作がＨＳＣの生存率またはアポトーシスの低減とは関連していないが、ＲＯＳがより高い表現型ＨＳＣの増加とは関連し、ＲＯＳの低減が遺伝子導入を減少させることを示す。ヒトＣＤ３４＋細胞を培養し、指示された時点についてＬＶまたはＲＶで形質導入した。パネルＡ：採取後の全細胞生存率をトリパンブルー排除方法によって決定した。パネルＢ：エクスビボ培養後のアネキシンＶ＋（アポトーシス）ＣＤ３４＋３８−９０＋細胞をフローサイトメトリーにより検出した。パネルＣ：表現型ヒトＨＳＣ（ＣＤ３４＋３８−９０＋４５ＲＡ−４９ｆ＋細胞）の倍率増加をフローサイトメトリー分析後に計算した（ｎ＝５）。統計：対応のあるｔ検定。パネルＤ：ＥｄＵ取り込みアッセイにおいてＥｄＵ＋ＨＳＰＣおよびＨＳＣの割合によって決定されたエクスビボ培養中のヒトＣＤ３４＋ＨＳＰＣ対ＣＤ３４＋３８−９０＋ＨＳＣ富化集団の増殖状態（Ｎ＝３）。パネルＥ：総細胞内ＲＯＳレベルをＣＭ−Ｈ２ＤＣＦＤＡ蛍光を用いて決定し、ＬＶおよびＲＶ形質導入ヒト（ＣＤ３４＋３８−９０＋）ＨＳＣにおけるＤＣＦＤＡ  ＭＦＩの倍率変化を±ＳＥＭの平均として示す（ｎ＝３）。統計：スチューデントのｔ検定、＊ｐ＜０．０５。パネルＦ：２４時間対７２時間培養されたヒトＣＤ３４＋３８−９０＋ＨＳＣにおけるミトコンドリア特異的ＲＯＳの測定のためのＭｉｔｏＳＯＸを示す代表的なヒストグラムプロット。数字はＭＦＩを表す。ＣＤ３４＋３８−９０＋ＨＳＣ中の増加する用量の抗酸化剤Ｎ−アセチルシステインアミド（ＮＡＣＡ）での陽性セルリアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）％（パネルＨ）に関するＭｉｔｏＳＯＸレベル（パネルＧ）および形質導入効率を示すヒストグラムプロット（ｎ＝１実験）。
【図７−２】同上。
【図８−１】培養時間の増加がＨＳＣにおいてｐ３８ＭＡＰＫを活性化することを示す。ヒトＭＰＢ由来ＣＤ３４＋細胞を培養し、図４に記載のように形質導入した。フローサイトメトリーによるヒト（ＣＤ３４＋３８−９０＋）ＨＳＣ富化におけるホスホ−ＥＲＫ（ｐ−ＥＲＫ）（パネルＡ）、ホスホＪＮＫ（ｐ−ＪＮＫ）（パネルＢ）、およびホスホ−ｐ３８ＭＡＰＫ（ｐ−ｐ３８）（パネルＣ）レベルを示す代表的なヒストグラムプロット。指示された時間でのＨＳＣ中のｐ−ＥＲＫ（パネルＤ）、ｐ−ＪＮＫ（パネルＥ）、およびｐ−ｐ３８（パネルＦ）の平均蛍光強度（ＭＦＩ）の定量的倍率変化を示す。データは３人の異なるＭＰＢドナーを用いた３つの独立した実験からの平均±ＳＥＭとして表した。統計：スチューデントのｔ検定、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。パネルＧ：（細胞周期のＧ０−Ｇ１期の）非周期ＨＳＣ対（細胞周期のＳ−Ｇ２−Ｍ期の）周期ＨＳＣにおけるｐ−ｐ３８レベルの代表的なヒストグラムプロット。ヘキストを用いて周期を決定した。数字はＭＦＩを示す。３つの独立した実験からの周期対非周期（パネルＨ）および未形質導入（ＧＦＰ−）対形質導入（ＧＦＰ＋）ＨＳＣ（パネルＩ）におけるｐ−ｐ３８ＭＦＩの定量的倍率変化を平均±ＳＥＭとして示す。統計：スチューデントのｔ検定、＊ｐ＜０．０５。パネルＪおよびＫ：ヒトＭＰＢ由来ＣＤ３４＋細胞を様々なｐ３８阻害剤（Ｂ＝Ｂｉｒｂ７９６、Ｖｘ＝ＶＸ７４５、およびＬｙ＝Ｌｙ２２２８８２０）ありまたはなしで培養し、７２時間レトロウイルス（ＲＶ）で形質導入した。ヒト（ＣＤ３４＋３８−９０＋）ＨＳＣにおけるｐ−ｐ３８レベルの代表的なヒストグラムプロットを示す（パネルＪ）。未操作（０時間）ＨＳＣと比較した７２時間培養ヒトＨＳＣにおけるｐ−ｐ３８平均蛍光強度（ＭＦＩ）の定量的倍率変化を示す（パネルＫ）。データは７人の異なるＭＰＢドナーを用いる７つの独立した実験からの平均±ＳＥＭとして表す。統計：スチューデントのｔ検定、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図８−２】同上。
【図９−１】エクスビボ培養中のｐ３８ＭＡＰＫの阻害がＨＳＣの長期再増殖能（ＬＴＲＰ）を救済し、骨髄性歪み表現型を部分的に元に戻すことを示す。ヒトＣＤ３４＋細胞を培養し、指示された時点について緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するレンチウイルスベクター（ＬＶ）またはγ−レトロウイルスベクター（ＲＶ）で形質導入した。ｐ３８阻害剤（ｐ３８ｉ）ありまたはなしでのＣＤ３４＋３８−９０＋４５ＲＡ−４９ｆ＋ＨＳＣにおけるｐ−ｐ３８ＭＡＰＫ平均蛍光強度（ＭＦＩ）（パネルＡ）、およびＨＳＣにおけるｐ−ｐ３８ＭＡＰＫ  ＭＦＩの定量的倍率変化（パネルＢ）の代表的なフローサイトメトリーヒストグラムプロット。データは３つの独立した実験からの平均±ＳＥＭとして表した。１Ｔ後２４週後のｐ３８阻害剤あり（縞模様のバー）またはなし（無地のバー）でのＮＳＧマウスにおけるヒトＣＤ４５＋生着（パネルＣ）、および２Ｔ後６週後のｐ３８ｉありまたはなしでのＮＳＧマウスにおけるヒト生着（パネルＤ）。移植された全マウスに対する非生着マウス（全ＢＭ中の＜０．０１％ＣＤ４５＋細胞）をパーセンテージとして示す。統計：パネルＤについて、フィッシャーの正確確率検定を行った。移植後２４週の１Ｔマウスにおけるｐ３８ｉありまたはなしでのヒトＣＤ３３＋骨髄性（パネルＥおよびＦ）、ＣＤ１９＋Ｂ−リンパ性（パネルＧおよびＨ）、およびＣＤ３４＋ＨＳＰＣ（パネルＩおよびＪ）再構成（パネルＥ、Ｇ、およびＩ：ＧＦＰ−未形質導入、パネルＦ、Ｈ、およびＪ：ＧＦＰ＋形質導入）。データは５つの独立した実験からの平均±ＳＥＭとして表した（パネルＣおよびＥ〜Ｊ）。合計１３９マウスに対して０時間について：ｎ＝１５マウス、１８〜２４時間処理なし（Φ）ｎ＝１９マウス、１８〜２４時間ｐ３８ｉ  ｎ＝２１マウス、３６〜４２時間Φ  ｎ＝１７マウス、３６〜４２時間ｐ３８ｉ  ｎ＝１４マウス、７２〜９６ＬＶΦ  ｎ＝１２マウス  ７２〜９６ＬＶ  ｐ３８ｉ  ｎ＝７マウス、７２〜９６時間ＲＶΦ  ｎ＝１７マウス、７２〜９６時間ＲＶ  ｐ３８ｉ  ｎ＝１７マウス。統計：マン・ホイットニーＵ検定（パネルＣおよびＥ〜Ｊ）、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊  Ｐ＜０．００１。
【図９−２】同上。
【図１０】エクスビボ培養中のｐ３８ＭＡＰＫの阻害が二次移植ＮＳＧマウスにおいてヒト生着を保持することを示す。二次移植の６週後のＢｉｒｂ  ７９６ありまたはなしでのＮＳＧマウスにおけるヒト生着を調査した。生着マウス（全骨髄中の＞０．０１％ＣＤ４５＋細胞）を中央のバーの上に示し、生着／総マウス数を横に示す。中抜き三角は対照であり、塗りつぶし三角はｐ３８ｉで処理される。各記号は個々のマウスを表す。データは５つの独立した実験からの平均±ＳＥＭとして表した（０時間についてｎ＝１６、１８〜２４時間ＬＶ対照についてｎ＝２５、１８〜２４時間ＬＶｐ３８ｉについてｎ＝１１、３６〜４２時間ＬＶ対照についてｎ＝１７、３６〜４２時間ＬＶｐ３８ｉについてｎ＝９、７２〜９６時間ＬＶ対照についてｎ＝１２、７２〜９６時間ＬＶｐ３８ｉについてｎ＝７、７２〜９６時間ＲＶ対照についてｎ＝２９、および７２〜９６時間ＲＶｐ３８ｉについてｎ＝１６）統計：マン・ホイットニーＵ検定、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図１１】ＮＳＧマウスの骨髄におけるＧＦＰマーキングを示す。ヒトＣＤ３４＋細胞を図９に記載のように培養し、ＮＳＧマウスに移植した。全ヒトＧＦＰ＋細胞を、移植前にインビトロで（パネルＡ）、ならびに一次移植後（１Ｔ）６週（パネルＢ）および２４週（パネルＣ）にインビボで分析した。パネルＡでは、１８〜２４時間はＧＦＰ発現を測定するのに十分な時間ではなかったので示さなかった。データは５つの独立した実験からの平均±ＳＥＭとして表した（各群ｎ＝１２〜２１マウス）。統計：対応のあるｔ検定、＊＊ｐ＜０．０１。
【図１２】ｐ３８阻害が、総ＣＤ３４＋細胞数／生存率、アポトーシス、形質導入効率、およびＲＯＳレベルを変化させず、表現型ＨＳＣのパーセンテージを保持し得ることを示す。ヒトＣＤ３４＋細胞を培養し、図９、パネルＡに記載のように形質導入した。採取された細胞を生存率についてトリパンブルーで染色し、ヒトＣＤ３４＋３８−９０＋４５ＲＡ−４９ｆ＋（ＨＳＣ）パーセント（パネルＡ）（ｎ＝６）、アネキシンＶ＋（アポトーシス）ＣＤ３４＋３８−９０＋細胞パーセント（パネルＢ）（ｎ＝３）の倍率変化、総生存ＣＤ３４＋細胞数（パネルＣ）の倍率変化、未処理ＣＤ３４＋３８−９０＋細胞に対する（ＧＦＰマーカーパーセンテージに基づく）形質導入効率の倍率変化（パネルＤ）（ｎ＝５）、およびＣＤ３４＋３８−９０＋細胞におけるＭｉｔｏＳＯＸ  ＭＦＩの倍率変化（パネルＥ）（ｎ＝３）示す。データは平均±ＳＥＭを表す。統計：対応のあるｔ検定、＊ｐ＜０．０５。
【図１３−１】ｐ３８ＭＡＰＫ阻害がエクスビボ培養中にＤＮＡ損傷応答（ＤＤＲ）を低減することを示す。ヒトＣＤ３４＋細胞を培養し、指示された時点について緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するレンチウイルスベクター（ＬＶ）またはγ−レトロウイルスベクター（ＲＶ）で形質導入した。抗γＨ２ＡＸおよび５３ＢＰ１で染色された７２時間ｐ３８ｉを伴ってまたは伴わないで処理された選別されたヒト（ＣＤ３４＋３８−９０＋）ＨＳＣの代表的な免疫蛍光画像（パネルＡ）、ならびにＬＶで３６時間（パネルＢ）、およびＲＶで７２時間（パネルＣ）形質導入されたＨＳＣにおけるＭＦＩ／細胞としてのγ−Ｈ２ＡＸおよび５３ＢＰ１の定量化。ｐ３８阻害剤（ｐ３８ｉ）ありまたはなしでのγ−Ｈ２ＡＸについて染色されたＨＳＣのフローサイトメトリー分析からの代表的なヒストグラムプロット（パネルＤ）、ならびに指示された時間でのγ−Ｈ２ＡＸの平均蛍光強度（ＭＦＩ）（パネルＥ）およびγＨ２ＡＸ＋ＨＳＣパーセント（パネルＦ）の倍率変化の定量化。ヒストグラムに示されるパーセンテージはγＨ２ＡＸについて陽性の細胞であり、下の数字は平均蛍光強度（ＭＦＩ）（ｎ＝５の独立した実験）である。統計：マン・ホイットニーＵ検定および対応のあるｔ検定、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図１３−２】同上。
【図１４−１】ｐ３８ＭＡＰＫ阻害がＨＳＣをエクスビボ培養の初期時間中にＧ０静止期に保持し、より長いエクスビボ予備刺激時間後のヒトＨＳＣ富化細胞の形質導入がＧ２Ｍ期蓄積の増加を示すことを示す。ヒトＭＰＢ由来ＣＤ３４＋細胞を培養し、図１３、パネルＡに記載のように形質導入した。培養（パネルＡ）および定量化（パネルＢ）における指示された時間でｐ３８ｉありまたはなしでの細胞周期のＧ０（静止）、Ｇ１、およびＳ−Ｇ２Ｍ期における（ＣＤ３４＋３８−９０＋）ＨＳＣを表すＦＡＣＳプロットを示す。（Φ＝無処理）細胞周期のＧ０、Ｇ１、およびＳ−Ｇ２Ｍ期における（±ＳＥＭ）ＨＳＣのパーセンテージをｙ軸に示す。（２４時間ＬＶについてｎ＝４の独立した実験、４２時間ＬＶについてｎ＝７、および７２時間ＲＶについてｎ＝５））。パネルＣおよびＤ：ＬＶＥ（ＬＶ初期）（パネルＣ）またはＲＶ（パネルＤ）のいずれかでのＨＳＣにおけるＧ２Ｍ期蓄積の分析を表し、最後の形質導入の１８時間後（ｎ＝１）に分析されたヒストグラムプロット。初期（ＬＶＥ）もしくは後期（ＬＶＬ）のいずれかにＬＶで、またはγ−レトロウイルスベクター（ＲＶ）で形質導入されたＨＳＣにおけるＧ２−Ｍ期蓄積の経時的分析を表すヒストグラムプロット（パネルＥ）。７２時間の培養のＧ２Ｍ期でのＧＦＰ−（未形質導入）対ＧＦＰ＋（形質導入）細胞の倍率変化の定量化を示す（パネルＦ）（ｎ＝３の独立した実験）。統計：対応のあるスチューデントのｔ検定、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図１４−２】同上。
【図１４−３】同上。
【図１４−４】同上。
【図１５】ｐ３８ＭＡＰＫ阻害が骨髄（ＢＭ）由来のヒトＣＤ３４＋３８−９０＋細胞においてＤＮＡ損傷応答（ＤＤＲ）も低減することを示す。ヒトＢＭ由来ＣＤ３４＋細胞を培養し、レンチウイルス（ＬＶ）で４８時間形質導入した。パネルＡ：ｐ３８ｉありまたはなしでの細胞周期のＧ０（静止）、Ｇ１、およびＳ−Ｇ２−Ｍ期における骨髄由来（ＣＤ３４＋３８−９０＋）ＨＳＣを表す代表的なＦＡＣＳプロット（左）ならびに指示された時間および処理でのγＨ２ＡＸの対応する代表的なヒストグラムプロット（右）。ヒストグラムに示されるパーセンテージはγＨ２ＡＸについて陽性の細胞であり、下の数は平均蛍光強度（ＭＦＩ）である。様々な細胞周期におけるＨＳＣの定量的プロット（パネルＢ）およびその対応するγＨ２ＡＸ  ＭＦＩ（パネルＣ）を示す。ｎ＝１の実験。
【図１６】ｐ３８ＭＡＰＫ阻害がＨＳＣをエクスビボ培養および遺伝子導入の初期期間中Ｇ０静止期に保持することを示す。ヒトＭＰＢ由来ＣＤ３４＋細胞を培養し、図１３に記載のように形質導入した。エクスビボ培養の２４時間（ＬＶ）（パネルＡ）、４２時間（ＬＶ）（パネルＢ）、および７２時間（ＲＶ）（パネルＣ）のｐ３８ｉありまたはなしでの細胞周期のＧ０およびＧ１−Ｓ−Ｇ２−Ｍ期における（ＣＤ３４＋３８−９０＋）におけるＨＳＣを表す定量的プロット。（２４時間のＬＶについてｎ＝４の独立した実験、４２時間のＬＶについてｎ＝７、および７２時間のＲＶについてｎ＝５）。統計：対応のあるｔ検定、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図１７−１】非周期ＨＳＣの形質導入（ＬＶ、ＬＶＥでの６および１８時間）がＨＳＣ系統運命を保持するが、周期ＨＳＣの形質導入（ＲＶまたはＬＶ［ＬＶＬ］での４４時間および６８時間）が骨髄性に偏ったＨＳＣ運命をもたらすことを示す。パネルＡ：エクスビボ培養および形質導入スキーマ。パネルＢ：２４時間対７２時間培養（ＣＤ３４＋３８−９０＋）ＨＳＣにおける熟成に関連する遺伝子のｍＲＮＡ発現をｑＰＣＲにより分析した。ＧＡＰＤＨを参照遺伝子として使用した。ｎ＝３ＭＰＢドナー。データは±ＳＥＭを意味する。対応のないｔ検定。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。１Ｔ後２４週のＮＳＧマウスのＢＭにおける形質導入（ＧＦＰ＋）ＣＤ４５＋細胞内のＣＤ３３＋骨髄性（パネルＣ）およびＣＤ１９＋Ｂリンパ性（パネルＤ）系統比率。データを平均±ＳＥＭとして表した（２４ＬＶおよび７２ＬＶＥについてｎ＝５マウス、７２ＬＶＬまたは７２ＲＶについてｎ＝４マウス）。統計：マン・ホイットニーＵ検定、＊ｐ＜０．０５。パネルＥ：トランスフェクションスキーマ（上）φ（トランスフェクションコントロールなし）対遺伝子編集（ＧＥ）（トランスフェクト）（ＣＤ３４＋３８−９０＋）ＨＳＣにおけるＧ２Ｍ蓄積（下：左）。ＧＥを４４時間の予備刺激後にＣａｓ９およびｇＲＮＡを含有するＲＮＰのトランスフェクションによって行い、トランスフェクション後６時間または２４時間のいずれかに細胞周期を分析した。トランスフェクション後のＧ２−Ｍ蓄積の時間経過６時間対２４時間を示す定量的プロット（下：右）。パネルＦ：７日目のＧＥありまたはなしでの全ＣＤ３４＋細胞中のｈＣＤ４５発現％。
【図１７−２】同上。
【図１８】Ｇ２−Ｍ期のＨＳＣ富化細胞の増加がＣＨＫ２ではなくＣＨＫ１に特異的であり、エクスビボ培養中の形質導入がＨＩＦ１αを減少させ、γＨ２ＡＸを増加させ、これはｐ３８阻害剤（ｐ３８ｉ）とプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）との組み合わせによって逆転することを示す。パネルＡ：指示された化合物を用いて７２時間ＲＶで形質導入された（ＣＤ３４＋３８−９０＋）ＨＳＣ中のＧ２−Ｍ期蓄積（％表示）の代表的なヒストグラムプロット。パネルＢ：ＨＩＦ−１αについて染色されたＨＳＣの代表的なヒストグラムプロット、ＤＥＦ（フマル酸ジエチル）およびα−ＫＧ（α−ケトグルタレート）をＨＩＦ−１α染色の陽性および陰性対照として用いた。ｎ＝１。パネルＣ：指示された化合物での７２時間の培養およびＲＶ形質導入後の（ＣＤ３４＋３８−９０＋）ＨＳＣ中のγＨ２ＡＸの代表的なヒストグラムプロット。数字は平均蛍光強度（ＭＦＩ）を表す。φ＝形質導入なし、対照＝処理なし。
【図１９−１】後期形質導入ＨＳＣにおけるＧ２Ｍ期蓄積の増加およびＨＩＦ−１αの減少が、Ｃｈｋ１キナーゼ阻害剤（Ｃｈｋ１ｉ）またはプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）のいずれかと組み合わされたｐ３８阻害剤（ｐ３８ｉ）によって逆転することを示す。７２時間のＲＶ形質導入後のフローサイトメトリーによるＧ２Ｍ期におけるＧＦＰ−（未形質導入）対ＧＦＰ＋（形質導入）ＨＳＣ（ＣＤ３４＋３８−９０＋）の倍率変化の定量化（パネルＡ）（ｎ＝６、統計：対応のあるスチューデントのｔ検定、＊Ｐ＜０．０５。＊＊Ｐ＜０．０１）、およびγ−Ｈ２ＡＸ平均蛍光強度（ＭＦＩ）の倍率変化の定量化（パネルＢ）（ｎ＝９の独立した実験、統計：対応のあるウィルコクソン検定、＊Ｐ＜０．０５）。＊＊Ｐ＜０．０１）。パネルＣ：ＨＳＣにおけるＨＩＦ−１αＭＦＩの定量的倍率変化（３人の異なるＭＰＢドナーを用いたｎ＝３の独立した実験、対応のあるスチューデントのｔ検定）。ＨＩＦ−１αについて染色されたＨＳＣの代表的な免疫蛍光画像（パネルＤ）および細胞あたりのＨＩＦ−１αの定量的ＭＦＩを示す（パネルＥ）（統計：対応のあるウィルコクソン検定、＊Ｐ＜０．０５）。Ｇ２−Ｍ期のＨＳＣ富化細胞における定量的倍率変化（パネルＦ）（ｎ＝８）および指示された処理によるＨＳＣのγ−Ｈ２ＡＸ  ＭＦＩにおける倍率変化（パネルＧ）を示す（ｎ＝９の独立した実験、統計：対応のあるスチューデントｔ検定、＊Ｐ＜０．０５。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【図１９−２】同上。
【図２０−１】ｐ３８ｉとＰＧＥ２との併用処理が限界用量でヒト生着およびＣＤ３４＋細胞移植マウスにおける骨髄性歪み表現型の完全な逆転を増加させたことを示す。限界希釈移植を方法に記載されているように行った。マウスに、指示された数の開始ＣＤ３４＋細胞を、処理なし（φ：中抜き緑丸）、ｐ３８阻害剤（ｐ３８ｉ：塗りつぶし青丸）、もしくはＰＧＥ２（Ｐ：塗りつぶし紫丸）、またはｐ３８ｉ＋ＰＧＥ２（ｐ３８ｉ＋Ｐ：塗りつぶし赤丸）での４２時間のレンチウイルス（ＬＶ）形質導入および培養後に注射した。１Ｔ後６ヶ月の骨髄（ＢＭ）中のヒトＣＤ３３＋骨髄性細胞（未形質導入、ＧＦＰ−：パネルＡおよび形質導入ＧＦＰ＋：パネルＢ）およびＣＤ１９＋Ｂ−リンパ性細胞（未形質導入、ＧＦＰ−：パネルＣおよび形質導入ＧＦＰ＋：パネルＤ）のパーセンテージを示す（合計７６ＮＳＧマウスに対して、Ｐ：５００Ｋ用量ｎ＝４、ｐ３８ｉ＋Ｐ：５０Ｋ用量ｎ＝３、およびφ：２５０Ｋ用量ｎ＝４を除き、ＣＤ３４投入用量の各々についてｎ＝５マウス／処理）。一次移植（１Ｔ）後６ヶ月（６ｍｏ）の骨髄中のヒトＣＤ４５＋細胞％（ｙ軸）および同数の開始ＣＤ３４＋細胞（Ｘ軸）を示す（パネルＥ）。プロットされているのは、一次移植後６ヶ月の０．１％未満のヒトＣＤ４５＋細胞を含有する陰性または未移植マウスの割合である（パネルＦ）。機能的ＨＳＣ（競合的再増殖単位：ＣＲＵ）の頻度を表の横に示す。方法に記載されているように、１Ｔで使用された最高投入用量からの一次限界希釈移植の２４週後に二次移植を行った。二次移植（２Ｔ）後１２週のＢＭにおけるヒトＣＤ４５＋細胞％（パネルＧ）、ＧＦＰ＋ｈＣＤ４５＋細胞（パネルＨ）、およびヒトＣＤ３３＋骨髄性細胞％（未形質導入、ＧＦＰ−：パネルＩおよび形質導入ＧＦＰ＋：パネルＪ）、ＣＤ１９＋Ｂ−リンパ性細胞（未形質導入、ＧＦＰ−：パネルＫおよび形質導入ＧＦＰ＋：パネルＬ）を示す。合計３２ＮＳＧマウスに対して、φについてｎ＝９、ｐ３８ｉについてｎ＝７、Ｐについてｎ＝８、ｐ３８ｉ＋Ｐについてｎ＝８。データを平均±ＳＥＭとして表す。統計：マン・ホイットニーＵ検定、正確なＰ値を示す。
【図２０−２】同上。
【図２０−３】同上。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
造血幹細胞（ＨＳＣ）は、例えば、異常ヘモグロビン症を含む、様々な遺伝性血液疾患に対する遺伝子療法のための望ましい標的である。それらは造血系を再生するために造血前駆細胞（ＨＰＣ）に分化する能力を有する。しかしながら、ＨＳＣへの遺伝子導入またはＨＳＣにおける遺伝子編集は、典型的にはエクスビボ操作および培養を含み、それは大量のＨＳＣ喪失をもたらし、これらの細胞はインビボでの生着であまりコンピテントではなくなる。現在、自家移植後に再増殖するヒトＨＳＣの限られた数は、効果的な遺伝子導入の大きな限界となっている。したがって、常在ＨＳＣを破壊するための骨髄破壊的前処置での大きな形質導入ＨＳＣは、現在、生着の利点を提供するために必要とされている。しかしながら、ＨＳＣの供給源は限られており、骨髄破壊的前処置はそのような手順に感受性である患者において有害作用または合併症を誘導し得る。したがって、ＨＳＣ移植を必要とする対象における生着の増加のための造血幹細胞（ＨＳＣ）を調製するための方法および組成物を開発する必要がある。
【００２３】
ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤単独では、エクスビボ操作ストレス（例えば、長期エクスビボ培養および／または遺伝子操作）に関連するＤＮＡ損傷応答（ＤＤＲ）を効果的に低減することにより、それらの最初の細胞分裂前に造血幹細胞（ＨＳＣ）の幹細胞性を効果的に維持した一方で、ＨＳＣにおけるｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤のこのような効果は、ＨＳＣが細胞周期を通して進行した後にはそれほど効果的ではなくなった。本開示は、少なくとも部分的には、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤とＨＩＦ−１α安定化剤との組み合わせが幹細胞（例えば、周期または分裂ＨＳＣなどのＨＳＣ）の生着能力の向上に対して相乗効果を示したが、いずれの薬剤の不在もそうすることができなかったという予想外の発見に基づく。特に、（例えば、遺伝子操作による）ＤＮＡ二本鎖切断が周期または分裂ＨＳＣにおいて発生する場合、ＳおよびＧ２Ｍ後期にＨＳＣＳの蓄積があり、この現象が非周期ＨＳＣにおいて観察されなかったことが発見された。Ｇ２Ｍ蓄積を有するこのようなＨＳＣ集団は、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤単独によって効果的に救済されなかった骨髄性バイアス子孫を産生した。しかしながら、驚くべきことに、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤とＨＩＦ−１α安定化剤との組み合わせが、周期または分裂ＨＳＣを含むＨＳＣにおけるＤＤＲおよびＧ２Ｍ蓄積の両方を効果的に低減し、これによってＨＳＣにおける骨髄性歪みを回復、ＨＳＣの長期再増殖能を維持、および／またはインビボで移植されたＨＳＣの生着の増加させることが発見された。したがって、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤とＨＩＦ−１α安定化剤との組み合わせは、ＨＩＦ−１αを安定させると同時にｐ３８ＭＡＰＫストレスシグナル伝達を遮断することによって（例えば、長期培養および／または遺伝子操作などのエクスビボ操作に供される、周期ＨＳＣを含む）ＨＳＣのインビボ生着能力を相乗的に向上させることができる。
【００２４】
したがって、いくつかの態様では、本開示は、１つ以上のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤および１つ以上のＨＩＦ−１α安定化剤の存在下でＨＳＣなどの幹細胞の幹細胞性を保存するためのエクスビボ細胞培養方法を提供する。ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤とＨＩＦ−１α安定化剤との組み合わせは、長期エクスビボ培養および／または遺伝子操作による少なくともＤＮＡ損傷応答を抑制するだけでなく、ＨＳＣが細胞分裂中に遺伝子修飾される場合、細胞周期のＧＭ２期におけるＨＳＣの蓄積も低減する。いくつかの例では、幹細胞は、ＤＮＡ二本鎖切断を誘導する操作、例えば、幹細胞のゲノムに組み込むことができるベクターによる形質導入、またはゲノム編集を受け得る。ゲノム編集方法は、一般に、標的核酸における二本鎖切断の生成に関与するエンドヌクレアーゼのタイプに基づいて分類される。いずれの特定の理論にも縛られることを望むものではないが、ＨＳＣのエクスビボ操作は、ストレスシグナル伝達を活性化し、ＨＳＣ自己再生を犠牲にして造血前駆細胞（ＨＰＣ）へのそれらの関与をもたらし得る。ＤＮＡ二本鎖切断を伴う事象（例えば、ベクター組み込みまたは遺伝子編集事象）は、特に周期細胞においてＤＮＡ二本鎖切断が起こる場合、ＨＳＣ喪失を悪化させ得る。本発見は、ＨＩＦ−１αを安定させると共にｐ３８ＭＡＰＫシグナル伝達経路を遮断することが、エクスビボ培養および遺伝子操作におけるそのようなＨＳＣ喪失を救済することを示した。したがって、１つ以上のＨＩＦ−１α安定化剤と組み合わせて１つ以上のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤を使用して向上した生着活性を有するＨＳＣ（周期または分裂ＨＳＣを含む）などの幹細胞を調製するためのエクスビボ方法および組成物もまた本明細書に記載される。本明細書に記載の方法および組成物は、ＨＳＣ移植後の対象（例えば、ヒト患者）におけるＨＳＣの生着を促進する。ＨＳＣ生着活性を向上させることは、（ＨＳＣ移植時に）骨髄の造血および／または免疫機能の回復のレベルを増加させることを含み得る。あるいはまたは加えて、それは、この回復が起こる速度（例えば、生着の特定のマイルストーンを達成する時間）を増加させることを含み得る。
【００２５】
Ｉ．ｐ３８マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）阻害剤
ｐ３８マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）は、サイトカイン、紫外線照射、熱ショック、および／または浸透圧ショックなどのストレス刺激に応答するマイトジェン活性化タンパク質キナーゼの一種である。ｐ３８ＭＡＰＫファミリーは、４つのメンバー、ｐ３８−α（ＭＡＰＫ１４）、ｐ３８−β（ＭＡＰＫ１１）、ｐ３８−γ（ＭＡＰＫ１２／ＥＲＫ６）、およびｐ３８−δ（ＭＡＰＫ１３／ＳＡＰＫ４）を含み、これらはサイトカインおよびストレスに対する細胞応答を制御するシグナル伝達カスケードに関与する。ｐ３８ＭＡＰＫメンバーのいずれかに対する阻害剤は、本明細書に記載されるエクスビボ培養方法において使用することができる。いくつかの例では、本明細書で使用される阻害剤は、メンバーの１つに特異的であり、例えば、ｐ３８−α、ｐ３８−β、ｐ３８−γ、またはｐ３８−δに特異的である。他の例では、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、ｐ３８ＭＡＰＫファミリーの２つ以上のメンバーに普遍的である。一例では、本明細書で使用される阻害剤は、ｐ３８−α（ＭＡＰＫ１４）に対して特異的または選択的である。
【００２６】
様々な種の野生型ｐ３８ＭＡＰＫ配列（例えば、ｐ３８−α（ＭＡＰＫ１４）、ｐ３８−β（ＭＡＰＫ１１）、ｐ３８−γ（ＭＡＰＫ１２／ＥＲＫ６）、およびｐ３８−δ（ＭＡＰＫ１３／ＳＡＰＫ４）の配列）は、ヒト、マウス、およびラットを含み、ＮＣＢＩからワールドワイドウェブ上で入手可能である。例えば、ヒトｐ３８−α（ＭＡＰＫ１４）のアイソフォームをコードするヌクレオチド配列は、ＮＣＢＩにてＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１３１５で入手可能であり、その対応するアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１３０６で提供される。
【００２７】
本明細書で使用されるとき、「ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤」という用語は、ｐ３８ＭＡＰＫタンパク質の生物学的活性を部分的にまたは完全に遮断する、阻害する、または中和する分子を指す。適切な阻害剤分子には、具体的には、アンタゴニスト抗体（例えば、全長抗体または抗体断片）、天然ポリペプチドの断片またはアミノ酸配列バリアント、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、有機小分子、組換えタンパク質またはペプチドなどが含まれる。ポリペプチドの阻害剤を特定するための方法は、ポリペプチドを候補ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤分子と接触させること、およびポリペプチドに通常関連する１つ以上の生物学的活性の検出可能な変化を測定することを含むことができる。
【００２８】
ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、例えば、ｐ３８ＭＡＰＫコード核酸の転写もしくは翻訳を減少させること、またはｐ３８ＭＡＰＫポリペプチド活性を阻害もしくは遮断することのいずれか、あるいはその両方によって、細胞における少なくとも１つ以上のｐ３８ＭＡＰＫファミリーメンバー（例えば、ｐ３８−α（ＭＡＰＫ１４）、ｐ３８−β（ＭＡＰＫ１１）、ｐ３８−γ（ＭＡＰＫ１２／ＥＲＫ６）、およびｐ３８−δ（ＭＡＰＫ１３／ＳＡＰＫ４））に関連するシグナル伝達に干渉する任意のタイプの分子であり得る。いくつかの例では、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、ｐ３８−α（ＭＡＰＫ）に関連したシグナル伝達に干渉する薬剤である。ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤の例としては、アンチセンスポリヌクレオチド、干渉ＲＮＡ、触媒ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ、ｐ３８ＭＡＰＫ特異的アプタマー、抗ｐ３８ＭＡＰＫ抗体、抗ｐ３８ＭＡＰＫ抗体のｐ３８ＭＡＰＫ結合断片、ｐ３８ＭＡＰＫ結合小分子、ｐ３８ＭＡＰＫ結合ペプチド、およびｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤とｐ３８ＭＡＰＫとの間の相互作用がＰ３８ＭＡＰＫ活性または発現の低減または停止をもたらすように、ｐ３８ＭＡＰＫに特異的に結合する他のポリペプチド（任意に１つ以上の追加のドメインに融合した、１つ以上のｐ３８ＭＡＰＫリガンドのｐ３８ＭＡＰＫ結合断片を含むが、これらに限定されない）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの例では、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤が別のｐ３８ＭＡＰＫ活性に影響を与えることなく１つのｐ３８ＭＡＰＫ活性をアンタゴナイズまたは中和することができることは、当業者よって理解されるであろう。例えば、本明細書の特定の方法における使用に望ましいｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、例えば、他のｐ３８ＭＡＰＫ相互作用、例えば、ｐ３８−β、ｐ３８−γ、および／またはｐ３８−δを結合することのいずれにも影響を及ぼさず、または影響を最小限にして、ｐ３８−αに結合し、ｐ３８ＭＡＰＫシグナル伝達を遮断するｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤である。
【００２９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法に使用されるｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は細胞透過性である。
【００３０】
いくつかの実施形態では、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、ＨＳＣなどの遺伝子操作幹細胞におけるＤＮＡ二本鎖切断および／またはＤＮＡ損傷応答を直接的または間接的に阻害または低減する薬剤であり、例えば、ＤＮＡ二本鎖切断および／またはＤＮＡ損傷応答は、ｐ３８ＭＡＰＫの１つ以上のファミリーメンバー（例えば、ｐ３８−α、ｐ３８−β、ｐ３８−γ、ｐ３８−δ、およびそれらの任意の組み合わせ）によって媒介される。したがって、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、ｐ３８ＭＡＰＫ（例えば、ｐ３８−α、ｐ３８−β、ｐ３８−γ、ｐ３８−δ、およびそれらの任意の組み合わせ）またはｐ３８ＭＡＰＫの上流分子のいずれかを標的とすることができる。ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤の例としては、限定なく、抗ｐ３８−α分子、抗ｐ３８−β分子、抗ｐ３８−γ分子、抗ｐ３８−δ分子、およびそれらの任意の組み合わせが挙げられる。ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体、アプタマー、核酸、抗体、小分子、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。
【００３１】
ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、ｐ３８ＭＡＰＫの１つ以上のファミリーメンバー（例えば、ｐ３８−α、ｐ３８−β、ｐ３８−γ、ｐ３８−δ、およびそれらの任意の組み合わせ）の結合に干渉する分子（例えば、抗体、アプタマー、または小分子）であり得る。あるいは、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、ｐ３８ＭＡＰＫの１つ以上のファミリーメンバー（例えば、ｐ３８−α、ｐ３８−β、ｐ３８−γ、ｐ３８−δ、およびそれらの任意の組み合わせ）の転写および／または翻訳を抑制し、それによってこの酵素のｍＲＮＡ／タンパク質レベルを低減する分子（例えば、阻害ポリヌクレオチドまたは干渉ＲＮＡもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチド）であり得る。本明細書に記載のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、（例えば、遺伝子操作後のエクスビボ培養中に）幹細胞またはＨＳＣにおけるＰ３８ＭＡＰＫシグナル伝達を少なくとも２０％以上、例えば、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％以上低減し得る。ｐ３８ＭＡＰＫに対するそのような阻害剤の阻害活性は、例えば、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロットなどのタンパク質アッセイを使用して、例えば、ｐ−ｐ３８のリン酸化レベルを測定する、従来の方法によって決定することができる。
【００３２】
いくつかの実施形態では、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、ｐ３８ＭＡＰＫの１つ以上のファミリーメンバー（例えば、ｐ３８−α、ｐ３８−β、ｐ３８−γ、ｐ３８−δ、およびそれらの任意の組み合わせ）に特異的に結合し、ｐ３８ＭＡＰＫシグナル伝達経路を活性化するその活性を中和する抗体である。本明細書で使用されるとき、「抗体」という用語は、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、キメラ、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、およびＦ（ａｂ’）２断片、ならびに単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、融合タンパク質および抗体の抗原結合部位を含む他の合成タンパク質を含むが、これらに限定されない。
【００３３】
当業者は、抗体を当該技術分野において既知の方法ならびに商業的に利用可能なサービスおよびキットを用いて作製することができる。モノクローナル抗体の調製方法は、当該技術分野において周知であり、ハイブリドーマ技術およびファージディスプレイ技術を含む。本開示における使用に適したさらなる抗体は、例えば、以下の刊行物：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｅｄｗａｒｄ  Ａ．Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ３０，２０１３）、Ｍａｋｉｎｇ  ａｎｄ  Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｅｄｓ．Ｇａｒｙ  Ｃ．Ｈｏｗａｒｄ  ａｎｄ  Ｍａｔｔｈｅｗ  Ｒ．Ｋａｓｅｒ．ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（Ｊｕｌｙ  ２９，２０１３）、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）．Ｐａｔｒｉｃｋ  Ｃｈａｍｅｓ．Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（Ａｕｇｕｓｔ  ２１，２０１２）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）．Ｅｄｓ．Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ｏｓｓｉｐｏｗ  ａｎｄ  Ｎｉｃｏｌａｓ  Ｆｉｓｃｈｅｒ．Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（Ｆｅｂｒｕａｒｙ  １２，２０１４）、およびＨｕｍａｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）．Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｓｔｅｉｎｉｔｚ．Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ３０，２０１３））に記載されている。
【００３４】
抗体は、標準的な技法によって、例えば、適切なポリペプチドもしくはその部分（複数可）での免疫化によって、またはファージディスプレイライブラリーを使用することによって産生され得る。ポリクローナル抗体が所望される場合、選択された哺乳動物（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマなど）は、所望のエピトープ（複数可）を有する免疫原性ポリペプチドで免疫化され、任意に別のポリペプチドにハプテン化される。宿主種に応じて、免疫学的応答を増加させるために様々なアジュバントが使用され得る。そのようなアジュバントとしては、フロイント、水酸化アルミニウムなどの鉱物ゲル、ならびにリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、およびジニトロフェノールなどの界面活性物質が挙げられるが、これらに限定されない。免疫化動物からの血清は収集され、既知の手順に従って処理される。所望のエピトープに対するポリクローナル抗体を含有する血清が他の抗原に対する抗体を含有する場合、ポリクローナル抗体は免疫親和性クロマトグラフィーまたは当該技術分野で既知の任意の他の方法によって精製することができる。ポリクローナル抗血清を産生および処理するための技法は当該技術分野で周知である。
【００３５】
阻害剤が無関係なポリペプチドよりも高い親和性でｐ３８ＭＡＰＫの特定のメンバーに結合する場合、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤はｐ３８ＭＡＰＫのメンバー（例えば、ｐ３８−α、ｐ３８−β、ｐ３８−γ、またはｐ３８−δ）に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、阻害剤は、無関係なポリペプチドに対するよりも少なくとも５、または少なくとも１０、または少なくとも５０倍高い親和性でｐ３８ＭＡＰＫの１つのメンバー（例えば、ｐ３８−α、ｐ３８−β、ｐ３８−γ、またはｐ３８−δ）に結合する。いくつかの実施形態では、阻害剤は、無関係なポリペプチドに対するよりも少なくとも１００、または少なくとも１，０００、または少なくとも１０，０００倍高い親和性でｐ３８ＭＡＰＫの１つのメンバー（例えば、ｐ３８−α、ｐ３８−β、ｐ３８−γ、またはｐ３８−δ）に結合する。そのような結合は、当該技術分野で周知の方法、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなどの表面プラズモン共鳴によって決定され得る。いくつかの実施形態では、阻害剤は、少なくとも１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、または１０−１１Ｍのｐ３８ＭＡＰＫの特定のメンバー（例えば、ｐ３８−α、ｐ３８−β、ｐ３８−γ、またはｐ３８−δ）に対する（解離定数、ＫＤによって測定される）親和性を有する。
【００３６】
いくつかの実施形態では、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、典型的には５，０００ｋＤａ未満の分子量を有する、小有機分子などの小分子である。適切な小分子は、ｐ３８ＭＡＰＫの１つ以上のファミリーメンバー（例えば、ｐ３８−α、ｐ３８−β、ｐ３８−γ、またはｐ３８−δ）またはそれらの断片に結合するものを含み、化合物の大きなライブラリーをスクリーニングすることなどの方法（Ｂｅｃｋ−Ｓｉｃｋｉｎｇｅｒ＆Ｗｅｂｅｒ（２００１）Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ，Ｓｕｓｓｅｘ）、核磁気共鳴による構造−活性相関（Ｓｈｕｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ（１９９６）”Ｄｉｓｃｏｖｅｒｉｎｇ  ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ＳＡＲ  ｂｙ  ＮＭＲ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２７４：１５３１−１５３４）、コードされた自己集合化学ライブラリー（Ｍｅｌｋｋｏ  ｅｔ  ａｌ（２００４）“Ｅｎｃｏｄｅｄ  ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．”Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：５６８−５７４）、ＤＮＡテンプレート化学（Ｇａｒｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ（２００４）”ＤＮＡ−ｔｅｍ  ｐｌａｔｅｄ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｃｙｃｌｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ３０５：１６０１−１６０５）、動的コンビナトリアル化学（Ｒａｍｓｔｒｏｍ＆Ｌｅｈｎ（２００２）“Ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｂｙ  ｄｙｎａｍｉｃ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．”Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．１：２６−３６）、テザリング（Ａｒｋｉｎ＆Ｗｅｌｌｓ（２００４）“Ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｏｗａｒｄｓ  ｔｈｅ  ｄｒｅａｍ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．３：３０１−３１７）、およびスピードスクリーン（Ｍｕｃｋｅｎｓｃｈｎａｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ（２００４）“ＳｐｅｅｄＳｃｒｅｅｎ：ｌａｂｅｌ−ｆｒｅｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ−ｂａｓｅｄ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｏｒｐｈａｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｇａｎｄｓ．”Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２４：２４１−２４９）によって特定され得る。典型的には、小分子は、ナノモル範囲のＰ３８ＭＡＰＫに対する解離定数を有するであろう。
【００３７】
本明細書に記載のエクスビボ培養方法において使用するための小分子ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤の例を以下の表１に提供する。
【表１】
2020506696.tif 000003
2020506696.tif 000004
【００３８】
例示的なｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤としては、ドラマピモド（例えば、ＢＩＲＢ−７９６）、ラリメチニブ（例えば、ＬＹ２２２８８２０ジメシレート）、アミノピリジンベースのｐ３８ＭＡＰＫのＡＴＰ競合阻害剤（例えば、Ｖｘ７０２）、ピリジニルイミダゾール阻害剤（例えば、ＳＢ２０３５８０）、およびそれらの任意の組み合わせも挙げられる。
【００３９】
他のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、当該技術分野、例えば、米国特許第７，１６９，７７９号、同第６，６３５，６４４号、同第６，６０８，０６０号、同第６，６３２，９４５号、同第６，５２８，５０８号、同第６，５０９，３６３号（ｐ３８の複素環阻害剤）、同第６，１４７，０８０号、同第６，８００，６２６号、同第６，０９３，７４２号、同第６，９４９，５６０号（イミダゾ置換化合物）、同第６，８５２，７４０号（ピラゾール誘導体）、同第６，６３０，４８５号、同第６，７５９，４１０号（３，４−ジヒドロ−（１ｈ）−キナゾリン−２オン）、同第６，６９６，４７１号（アミノピロール化合物）、同第６，６９６，４４３号（ピペリジン／ピペラジン型阻害剤）、同第６，５０９，３６１号（１，５−ジアリール置換ピラゾール）、同第６，４４４，６９６号（ピラゾール誘導体）、およびＰＣＴ特許公開第ＷＯ２０００／０１７１７５号、同第ＷＯ２０００／０１７２０４号、同第ＷＯ１９９６／０２１６５４号、同第ＷＯ１９９９／０００３５７号、同第ＷＯ１９９９／０６４４００号に記載されるもの、参照により本明細書に組み込まれる各々の関連教示において周知である。Ｘｉｎｇ”Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｐ３８  ＭＡＰＫ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅｓ”（２０１５）ＭＡＰ  Ｋｉｎａｓｅ４：５５０８に記載される他のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤も、本明細書に記載のエクスビボ方法および組成物に使用され得る。
【００４０】
いくつかの実施形態では、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）などの干渉ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、ｐ３８ＭＡＰＫの１つ以上のファミリーメンバー（例えば、ｐ３８−α、ｐ３８−β、ｐ３８−γ、またはｐ３８−δ）のｍＲＮＡに結合し、その翻訳を遮断するか、またはＲＮＡ干渉を介してｍＲＮＡを分解する小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。例示的な小干渉ＲＮＡは、Ｈａｎｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，４１８（６８９４）：２４４−５１（２００２）、Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２１，２１（２００２）、およびＳｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９９，５５１５−５５２０（２００２）によって記載されている。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、サイレンシングされた遺伝子と配列が相同である二本鎖（ｄｓＲＮＡ）によって開始される動物における配列特異的転写後遺伝子サイレンシングのプロセスである。ｓｉＲＮＡは一般に、各鎖が２０〜２５（例えば、１９〜２１）塩基対長であるＲＮＡ二本鎖である。いくつかの実施形態では、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、ｐ３８ＭＡＰＫ核酸（例えば、ｐ３８ＭＡＰＫ  ｍＲＮＡ）に相補的な短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。ｓｈＲＮＡは、典型的には１９〜２９塩基対のステム、少なくとも４ヌクレオチド（ｎｔ）のループ、および任意に３’末端にジヌクレオチドオーバーハングを含有する。対象におけるｓｈＲＮＡの発現は、ｓｈＲＮＡをコードするベクター（例えば、プラスミドまたはウイルスもしくは細菌ベクター）の送達によって得ることができる。ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡは、当該技術分野において既知または市販の任意の方法を用いて設計され得る（例えば、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能な製品を参照されたい）。ｓｉＲＮＡはまた、その安定性および標的ｍＲＮＡに対する結合親和性を少なくとも改善するための塩基修飾および／または結合修飾などの１つ以上の化学修飾も含み得る。
【００４１】
いくつかの実施形態では、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、ｐ３８ＭＡＰＫ核酸（例えば、ｐ３８ＭＡＰＫ  ｍＲＮＡ）に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは一般に一本鎖核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはハイブリッドＲＮＡ−ＤＮＡ分子のいずれか）であり、これはｐ３８ＭＡＰＫ  ｍＲＮＡの一部などの標的核酸配列に相補的である。標的配列に結合することによって、ＲＮＡ−ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＤＮＡ、またはＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖が形成され、それによって、例えば、転写、プロセシング、ポリ（Ａ）付加、複製、翻訳を遮断するか、またはｍＲＮＡ分解を促進するなどの細胞の阻害メカニズムを促進することにより、標的核酸の機能またはレベルを阻害する。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１０〜４０、１２〜３５、もしくは１５〜３５塩基長、またはその間の任意の整数である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン（２−アミノ−ｄＡ）、５−ブロモｄＵ、５−メチルｄＣ、デオキシイノシン、ロックド核酸（ＬＮＡ）、５−ニトロインドール、２’−Ｏ−メチル塩基、ヒドロキシメチルｄＣ、２’フルオロ塩基などの１つ以上の修飾塩基を含むことができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合などの１つ以上の修飾結合を含むことができる。
【００４２】
いくつかの実施形態では、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、ｐ３８ＭＡＰＫ核酸（例えば、ｐ３８ＭＡＰＫ  ｍＲＮＡ）に相補的であり、ｐ３８ＭＡＰＫ核酸を切断するリボザイムである。リボザイムは、部位特異的に核酸を切断するＲＮＡまたはＲＮＡ−タンパク質複合体である。リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を有する特異的触媒ドメインを有する。本開示のリボザイムは、米国特許第５，２５４，６７８号に記載されているものなどの合成リボザイムであり得る。これらの合成リボザイムは、別々のハイブリダイズ領域および触媒領域を有し、したがって、ハイブリダイズ領域は、ｐ３８ＭＡＰＫ配列などの標的配列を認識するように設計することができる。
【００４３】
本明細書に記載のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｐ３８ＭＡＰＫ核酸（例えば、ｐ３８ＭＡＰＫ  ｍＲＮＡ）またはその一部に相補的であり得る。相補性は１００％の相補性を含むが、必ずしも１つ以上の位置でのミスマッチを排除するわけではなく、例えば、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の相補性をもたらすと理解される。
【００４４】
いくつかの実施形態では、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、非抗体ペプチドまたはタンパク質である。ペプチドまたはタンパク質は、ｐ３８ＭＡＰＫシグナル伝達に干渉するアミノ酸配列を含み得る。タンパク質およびペプチドは、当該技術分野で知られている任意の方法を使用して、例えば、ｐ３８ＭＡＰＫへの結合またはｐ３８ＭＡＰＫなどのリガンドへのｐ３８ＭＡＰＫ結合の阻害についてタンパク質またはペプチドのライブラリーをスクリーニングすることによって設計され得る。
【００４５】
小分子、タンパク質、またはペプチドなどの候補化合物がｐ３８ＭＡＰＫポリペプチドまたはその断片に結合または相互作用する能力は、タンパク質／タンパク質相互作用または他の化合物／タンパク質相互作用を検出／測定する任意の方法によって測定され得る。適切な方法としては、例えば、酵母ツーハイブリッド相互作用、共精製、ＥＬＩＳＡ、共免疫沈降、および表面プラズモン共鳴方法などの方法が挙げられる。したがって、全て当該技術分野において知られている、ＥＬＩＳＡ、共免疫沈降もしくは表面プラズモン共鳴法によって、または酵母ツーハイブリッド相互作用もしくは共精製法によって候補化合物とポリペプチドまたはその断片との間の相互作用が検出され得る場合、候補化合物はポリペプチドまたはその断片に結合することができると考えられ得る。ハイスループット操作が可能であるスクリーニングアッセイもまた企図される。例としては、細胞ベースのアッセイおよびタンパク質−タンパク質結合アッセイが挙げられ得る。
【００４６】
幹細胞のインビボ生着を増加させるためにエクスビボ培養および／または遺伝子操作中の幹細胞（例えば、造血幹細胞）の喪失を低減するための使用に適したＭＡＰＫ阻害剤の他の例は、その関連する開示が本明細書で参照される目的または主題のために参照により組み込まれる、国際特許公開第ＷＯ２０１７／０７５２７４号に記載されている。
【００４７】
ＩＩ．低酸素誘導因子−１α（ＨＩＦ−１α）安定化剤
低酸素誘導因子−１α（ＨＩＦ−１α）は、アルファおよびベータサブユニットからなるヘテロ二量体である、転写因子低酸素誘導因子−１（ＨＩＦ−１）のアルファサブユニットである。ＨＩＦ−１は、エネルギー代謝、血管新生、アポトーシス、およびそのタンパク質産物が酸素送達を増加させるかまたは低酸素への代謝適応を促進する遺伝子を含む、多くの遺伝子の転写を活性化することによって低酸素に対する細胞性および全身性恒常性応答のマスターレギュレーターとして機能する。したがって、ＨＩＦ−１は、胚性血管分布、腫瘍血管新生、および虚血性疾患の病態生理学において本質的な役割を果たす。ＨＥＫ細胞およびミクログリア細胞において、ＨＩＦ−１αは、ＣＸＣＲ４プロモーター内の低酸素応答エレメント（ＨＲＥ）と相互作用することによってＣＸＣＲ４を調節する。例えば、Ｓｔａｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．２００３；４２５（６９５５）：３０７−３１１、およびＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２００８；３７１（２）：２８３−２８８を参照されたい。ＨＩＦ−１αに対する安定化剤は、本明細書に記載されるエクスビボ培養方法において使用することができる。いくつかの例では、本明細書で使用される安定化剤は、ＨＩＦ−１αに対して特異的または選択的である。
【００４８】
ＨＩＦ−１のαサブユニットの安定性および活性は、ヒドロキシル化、ユビキチン化、アセチル化、およびリン酸化などのその翻訳後修飾によって調節することができる。例えば、酸素正常状態では、ＨＩＦ−１αの酸素依存的分解（ＯＤＤ）ドメインでの２つのプロリン残基のヒドロキシル化およびリジン残基のアセチル化は、ｐＶＨＬ  Ｅ３リガーゼ複合体とのその会合を誘導し、ユビキチン−プロテアソーム経路を介したＨＩＦ−１α分解をもたらす。低酸素状態では、ＨＩＦ−１αサブユニットは安定し、ｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質結合タンパク質／ｐ３００などのコアクチベーターと相互作用し、標的遺伝子の発現を調節する。
【００４９】
様々な種の野生型ＨＩＦ−１α配列およびそのアイソフォームは、ヒト、マウス、およびラットを含み、ＮＣＢＩからワールドワイドウェブ上で入手可能である。例えば、ヒトＨＩＦ−１αのアイソフォームをコードするヌクレオチド配列は、ＮＣＢＩにて受託番号ＮＭ＿００１５３０で入手可能であり、その対応するアミノ酸配列は、受託番号ＮＰ＿００１５２１である。
【００５０】
本明細書で使用されるとき、「ＨＩＦ−１α安定化剤」という用語は、ＨＩＦ−１αタンパク質および／もしくはその生物学的活性を直接的もしくは間接的に安定させる、例えば、ＨＩＦ−１αタンパク質レベルをＨＩＦ−１αｍＲＮＡ発現に対する最小限の効果もしくは効果なしで安定させる、ＨＩＦ−１αｍＲＮＡ発現を増加させる、またはＨＩＦ−１αタンパク質もしくはｍＲＮＡの分解を部分的もしくは完全に遮断もしくは阻害する分子を指す。適切な安定化剤分子には、具体的には、アゴニスト抗体（例えば、全長抗体または抗体断片）、天然ポリペプチドの断片またはアミノ酸配列バリアント、ペプチド、有機小分子、組換えタンパク質またはペプチドなどが含まれる。ポリペプチドの安定化剤を特定するための方法は、ポリペプチドを候補ＨＩＦ−１α安定化剤分子と接触させることと、そのレベルおよび／またはポリペプチドに通常関連する１つ以上の生物学的活性の検出可能な変化を測定することとを含むことができる。
【００５１】
ＨＩＦ−１α安定化剤は、例えば、その関連する内容が、参照により本明細書に参照される目的または主題のために組み込まれる、米国特許出願第ＵＳ２００６／０２７０６９９号に記載されているように、ＨＩＦ−１αタンパク質中のアミノ酸残基のヒドロキシル化を阻害する任意のタイプの分子であり得る。いくつかの実施形態では、ＨＩＦ−１α安定化剤は、ＨＩＦ−１αタンパク質中の１つまたは２つのプロリン残基（例えば、ＯＤＤドメインに位置するＰｒｏ４０２およびＰｒｏ５６４）のヒドロキシル化を阻害する任意のタイプの分子であり得る。
【００５２】
いくつかの実施形態では、ＨＩＦ−１α安定化剤は、ＨＩＦ−１αの分解を開始するＨＩＦ特異的プロリルヒドロキシラーゼの阻害剤であり得る。そのような阻害剤の例には、ジメチルオキサリルグリシン（ＤＭＯＧ、Ｎ−（メトキシオキソアセチル）−グリシンとしても知られる）、または２−オキソグルタレート（２−ＯＧ）もしくはその類似体（例えば、ＦＧ−４５９２としても知られる、ロキサデュスタット）、またはその誘導体もしくは類似体が含まれるが、これらに限定されない。
【００５３】
いくつかの実施形態では、ＨＩＦ−１α安定化剤は、ＨＩＦ−１αタンパク質中のリジン残基（例えば、ＯＤＤドメインに位置するＬｙｓ５３２）のアセチル化を阻害する任意のタイプの分子であり得る。
【００５４】
いくつかの実施形態では、ＨＩＦ−１α安定化剤は、プロスタグランジンＥ２受容体に結合および活性化する任意のタイプの分子であり得る。そのようなＨＩＦ−１α安定化剤の非限定的な例には、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）および例えば、１６−１６ジメチルプロスタグランジンＥ２（ｄｍＰＧＥ２）を含む、その類似体または誘導体が含まれる。
【００５５】
ＨＩＦ−１α安定化剤の他の例には、ジメチル−２−ケトグルタレート（ＤＫＧ）、デスフェリオキサミン（ＤＦＯ）、鉄キレート剤、およびそれらの任意の組み合わせが含まれる。
【００５６】
いくつかの実施形態では、ＨＩＦ−１α安定化剤は、フマル酸ジエチル（ＤＥＦ）またはその誘導体もしくは類似体であり得る。
【００５７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法に使用されるＨＩＦ−１α安定化剤は、細胞透過性である。
【００５８】
ＨＩＦ−１α安定化剤は、ＨＩＦ−１αの転写および／または翻訳を誘導し、それによってこのタンパク質のｍＲＮＡ／タンパク質レベルを増加させる分子（例えば、活性化ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド）であり得る。本明細書に記載のＨＩＦ−１α安定化剤は、（例えば、エクスビボ培養および／または遺伝子操作中に）幹細胞またはＨＳＣにおけるＨＩＦ−１αの転写および／または翻訳を少なくとも２０％以上、例えば、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％以上増加させ得る。そのようなＨＩＦ−１α安定化剤の活性は、例えば、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロットなどのタンパク質アッセイを使用して、例えば、ＨＩＦ−１αのタンパク質またはｍＲＮＡレベルを測定する、従来の方法によって決定することができる。
【００５９】
いくつかの実施形態では、ＨＩＦ−１α安定化剤は、ＨＩＦ−１αタンパク質もしくはその断片、またはＨＩＦ−１αペプチド模倣体であり得る。例えば、ＨＩＦ−１αの１つまたは２つのプロリン残基（例えば、ＯＤＤドメイン内に位置するＰｒｏ４０２および／またはＰｒｏ５６４）の変異は、ＨＩＦ−１αとｐＶＨＬとの相互作用を破壊し、したがって通常の酸素レベルの存在下でその安定性を増加させる（例えば、細胞培養中）。別の例として、ＨＩＦ−１αのＬｙｓ５３２（ＯＤＤドメインに位置する）のアルギニンへの変異は、ＨＩＦ−１αの安定性の増加をもたらし得る。例えば、Ｔａｎｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．２０００．ＥＭＢＯ（Ｅｕｒ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｏｒｇａｎ）Ｊ１９：４２９８−４３０９を参照されたい。
【００６０】
いくつかの実施形態では、ＨＩＦ−１α安定化剤は、典型的には５，０００ｋＤａ未満の分子量を有する、小有機分子などの小分子である。適切な小分子は、ＨＩＦ−１αまたはそれらの断片の分解経路を開始する１つ以上の酵素に結合するものを含み、化合物の大きなライブラリーをスクリーニングすることなどの方法（Ｂｅｃｋ−Ｓｉｃｋｉｎｇｅｒ＆Ｗｅｂｅｒ（２００１）Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ，Ｓｕｓｓｅｘ）、核磁気共鳴による構造−活性相関（Ｓｈｕｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ（１９９６）“Ｄｉｓｃｏｖｅｒｉｎｇ  ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ＳＡＲ  ｂｙ  ＮＭＲ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２７４：１５３１−１５３４）、コードされた自己集合化学ライブラリー（Ｍｅｌｋｋｏ  ｅｔ  ａｌ（２００４）“Ｅｎｃｏｄｅｄ  ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．”Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：５６８−５７４）、ＤＮＡテンプレート化学（Ｇａｒｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ（２００４）“ＤＮＡ−ｔｅｍ  ｐｌａｔｅｄ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｃｙｃｌｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ３０５：１６０１−１６０５）、動的コンビナトリアル化学（Ｒａｍｓｔｒｏｍ＆Ｌｅｈｎ（２００２）“Ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｂｙ  ｄｙｎａｍｉｃ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．”Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．１：２６−３６）、テザリング（Ａｒｋｉｎ＆Ｗｅｌｌｓ（２００４）“Ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｏｗａｒｄｓ  ｔｈｅ  ｄｒｅａｍ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．３：３０１−３１７）、およびスピードスクリーン（Ｍｕｃｋｅｎｓｃｈｎａｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ（２００４）“ＳｐｅｅｄＳｃｒｅｅｎ：ｌａｂｅｌ−ｆｒｅｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ−ｂａｓｅｄ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｏｒｐｈａｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｇａｎｄｓ．”Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２４：２４１−２４９）によって特定され得る。典型的には、小分子は、ナノモル範囲のＰ３８ＭＡＰＫに対する解離定数を有するであろう。
【００６１】
ＩＩＩ．エクスビボ培養で幹細胞の幹細胞性を保存するための方法
ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤とＨＩＦ−１α安定化剤との任意の組み合わせ、例えば、本明細書に記載のものは、エクスビボまたはインビトロ培養で幹細胞（例えば、造血幹細胞）の幹細胞性を保存するために使用することができる。幹細胞性とは、未分化細胞が未分化細胞として再生するが、依然として特定のタイプの細胞を産生するように分化するこの能力を保持する能力を指す。幹細胞能、または幹細胞（例えば、造血幹細胞）の「幹細胞性」は、特性：静止、再増殖能、自己再生能、および多系統分化能の組み合わせに依存する。幹細胞（例えば、ＨＳＣ）における細胞周期静止は、分化または老化から細胞を保護することによって幹細胞性を維持する。
【００６２】
本開示は、１つ以上のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤および１つ以上のＨＩＦ−１α安定化剤の存在下で幹細胞（例えば、ＨＳＣ）を培養することによって細胞培養物中の幹細胞の幹細胞性を保存するためのエクスビボ培養方法を特徴とする。このようにして調製された幹細胞は、幹細胞移植による適切な疾患の治療に使用することができる。
【００６３】
本明細書に記載のエクスビボ培養方法を実施するために、幹細胞（例えば、多能性幹細胞）の適切な集団を適切な供給源から得ることができる。いくつかの例では、幹細胞（例えば、ＨＳＣ）の集団は、従来の方法を介して、ヒト対象から、例えば、ヒト対象の骨髄細胞、末梢血細胞、および／または臍帯血細胞から誘導することができる。いくつかの例では、幹細胞は成体幹細胞（例えば、ＨＳＣ）であり、これはヒト成体の骨髄または末梢血細胞に由来し得る。いくつかの例では、幹細胞集団は臍帯幹細胞を実質的に含まない。
【００６４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の幹細胞集団のいずれも、ＤＮＡ損傷、例えば、二本鎖切断、二量体化、または架橋、不対塩基、修飾塩基、不対塩基をもたらす１つの塩基の別の塩基への変換、クロマチン巻き戻し、または他の修飾などを引き起こす遺伝子操作を受けている。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の幹細胞集団のいずれかは、二本鎖が切断する遺伝子操作を受けている。二本鎖切断および／またはＤＮＡ損傷応答は、ｐ３８ＭＡＰＫの１つ以上のファミリーメンバー（例えば、ｐ３８−α、ｐ３８−β、ｐ３８−γ、ｐ３８−δ、およびそれらの任意の組み合わせ）によって媒介され得る。遺伝子操作は、幹細胞（例えば、ＨＳＣ）中の遺伝子の少なくとも１つを修飾、挿入、または削除することを含む。遺伝子操作は、例えば、ゲノム編集技法および相同性指向修復（ＨＤＲ）媒介ゲノム編集技法による非相同末端結合（ＮＨＥＪ）媒介遺伝子破壊を含む、細胞ゲノムまたはゲノム編集に組み込むことができるベクターでの形質導入を含み得る。
【００６５】
本明細書で使用される「ベクター」は、核酸分子の幹細胞（例えば、ＨＳＣ）への移動を促進することができる任意の核酸ビヒクル（ＤＮＡまたはＲＮＡ）である。一般に、ベクターは、プラスミド、ファージミド、ウイルスベクター、および標的ヌクレオチド配列の挿入または組み込みによって操作されているウイルスまたは細菌源に由来する他のビヒクルを含むが、これらに限定されない。ウイルスベクターには、以下のウイルス：レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＳＶ４０型ウイルス、ポリオーマウイルス、エプスタイン−バーウイルス、パピローマウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルスのゲノムに由来するヌクレオチド配列を含むベクターが含まれるが、これらに限定されない。挙げられていないが当該技術分野に知られている他のベクターを容易に使用することができる。
【００６６】
ウイルスベクターは、非必須遺伝子が標的ヌクレオチド配列で置換されている非細胞変性真核生物ウイルスをベースとし得る。非細胞変性ウイルスはレトロウイルス（例えば、レンチウイルス）を含み、そのライフサイクルはゲノムウイルスＲＮＡのＤＮＡへの逆転写とそれに続く宿主細胞ＤＮＡへのプロウイルス組み込みを含む。レトロウイルスは、ヒトの遺伝子療法試験に承認されている。最も有用なものは、複製欠損性の（すなわち、所望のタンパク質の合成を指示することはできるが、感染性粒子を製造することはできない）レトロウイルスである。そのような遺伝的に改変されたレトロウイルス発現ベクターは、インビボでの遺伝子の高効率形質導入のための一般的な有用性を有する。複製欠損レトロウイルスを産生するための標準プロトコル（外因性遺伝物質のプラスミドへの組み込み、プラスミドで裏打ちされたパッケージング細胞のトランスフェクション、パッケージング細胞株による組換えレトロウイルスの産生、組織培養培地からのウイルス粒子の収集、標的細胞のウイルス粒子での感染）は、当該技術分野において知られている。
【００６７】
他のウイルスベクターにはアデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスが含まれ、これらは遺伝子療法におけるヒト使用にも承認されている二本鎖ＤＮＡウイルスである。アデノ随伴ウイルスは、複製欠損であるように操作することができ、広範囲の細胞型および種に感染することができる。レンチウイルスベクターは、それらの組み込み前複合体（ウイルス「シェル」）が標的細胞の核の無傷の膜を通過することができるので、分裂細胞および非分裂細胞の両方に感染することができるタイプのレトロウイルスである。例示的なレンチウイルスベクターとしては、ＨＩＶに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６８】
他のベクターには、当該技術分野で広く記載されており、当業者に周知である非ウイルスプラスミドベクターが含まれる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊｕｎｅ  １５，２０１２）を参照されたい。例示的なプラスミドには、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＲＣ／ＣＭＶ、ＳＶ４０、およびｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔが含まれる。他のプラスミドは当業者に周知である。加えて、プラスミドは、ＤＮＡの特定の断片を除去および付加するために制限酵素およびライゲーション反応を使用してカスタム設計され得る。
【００６９】
当該技術分野において知られている様々なゲノム編集技法を用いて、本明細書に記載の方法に関与する幹細胞（例えば、ＨＳＣ）を操作することができる。例えば、ゲノム編集は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターベースのヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム）の使用を含み得る。
【００７０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法および／または組成物に関与する幹細胞（例えば、ＨＳＣ）は、レトロウイルスベクターもしくはレンチウイルスベクターなどのウイルスベクターを用いて、または本明細書に記載の遺伝子編集方法によって遺伝子操作されている。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法および／または組成物に関与する幹細胞は、遺伝子修飾幹細胞（例えば、ＨＳＣ）である。
【００７１】
幹細胞の遺伝子操作は、幹細胞が休止細胞（非周期）、すなわち、分裂していない細胞である場合、または幹細胞が周期、すなわち、分裂している細胞である場合に実施され得る。例えば、細胞周期非依存的遺伝子操作方法（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮＳ、またはＣａｓ９ヌクレアーゼを使用するなどのレンチウイルス形質導入または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）媒介ゲノム編集方法）は、非周期および／または周期細胞を利用し得るが、細胞周期依存的遺伝子操作方法（例えば、レトロウイルスベクター形質導入または相同性指向修復（ＨＤＲ）媒介ゲノム編集方法）は、周期ＨＳＣを必要とする。
【００７２】
休止細胞は、静止Ｇ０期にあり得る。休止ＨＳＣの表現型は、当該技術分野において知られており、本明細書に記載の方法および／または組成物についてそのようなＨＳＣを特定するために使用することができる。例えば、ＨＳＣ富化集団は、少なくともＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ９０＋である。全ての体細胞と同様に、幹細胞（例えば、ＨＳＣ）は細胞周期を通して進行し、それは４つの期：Ｇ１（間期）、Ｓ（ＤＮＡ合成期）、Ｇ２（間期）、およびＭ（有糸分裂期）を特徴とする。Ｇ１期における制限点を過ぎて進行する幹細胞（例えば、ＨＳＣ）はＳ期に入るが、制限点を通過しないものは分裂しないままである。これらの分裂していない細胞は、細胞周期から撤退し、Ｇ０期：細胞が静止または休止期にある状態に入ることができる。Ｇ０期におけるそのような休止細胞は、細胞周期に可逆的に再入して分裂するか、または休止したまま、周期能を喪失し、いくつか場合では老化するかのいずれかであり得る。したがって、静止は、幹細胞（例えば、ＨＳＣ）を特徴付け、それらが細胞の幹細胞性を維持することを可能にする特性である。
【００７３】
理論に縛られることを望むものではないが、幹細胞（例えば、ＨＳＣ）が、（例えば、細胞が非周期である場合）細胞周期に入る前に遺伝的に操作または修飾され、その後ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤および任意にＨＩＦ−１α安定化剤の存在下で培養される場合、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、幹細胞（例えば、ＨＳＣ）のＳ期への移行を遅らせ、これは幹細胞（例えば、ＨＳＣ）が、例えば、遺伝子操作によって誘導される、いずれかのＤＮＡ損傷を修復することを可能にし得、任意のＨＩＦ−１α安定化剤は、ＨＳＣの系統運命を維持するのを助け、よって幹細胞（例えば、ＨＳＣ）の幹細胞性を保持し得る。これは、保持された長期再増殖能および／またはバランスのとれた系統産生によって特徴付けられ得る。したがって、本明細書に記載の方法および／または組成物に関与する幹細胞のいくつかの実施形態では、幹細胞（例えば、ＨＳＣ）は、非周期または非分裂細胞であり、例えば、幹細胞は、静止Ｇ０期にある。
【００７４】
遺伝子操作により誘導されるＤＮＡ二本鎖切断が周期または分裂幹細胞（例えば、ＨＳＣ）において発生する場合、Ｇ２Ｍ期においてＨＳＣの蓄積があり、そうでなければ非周期幹細胞（例えば、ＨＳＣ）が遺伝子修飾された場合に観察されなかったことが発見された。理論に縛られることを望むものではないが、ＤＮＡ二本鎖切断が、例えば、遺伝子操作によって周期ＨＳＣにおいて誘導される場合、ＤＮＡ損傷応答はＧ２Ｍ期においてＨＳＣを失速させ、この遅延は枯渇または老化に関連した表現型を示すＨＳＣ数の同時増加（例えば、Ｆｚｄ３および／またはＷｎｔ５ｂの発現増加）を伴い、主に骨髄性バイアス子孫を産生するＨＳＣをもたらす。しかしながら、分裂ＨＳＣがｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤およびＨＩＦ−１α安定化剤の共存在下で培養および／または遺伝子修飾される場合、組み合わされた処理は、ＨＳＣにおけるＧ２Ｍ蓄積およびＤＮＡ損傷応答を低減し、ＨＳＣ系統運命を回復させ、よって幹細胞（例えば、ＨＳＣ）の幹細胞性を保持する。これは、保持された長期再増殖能および／またはバランスのとれた系統産生によって特徴付けられ得る。したがって、本明細書に記載の方法および／または組成物に関与する幹細胞のいくつかの実施形態では、幹細胞（例えば、ＨＳＣ）は、周期または分裂細胞（例えば、ＨＳＣ）である。非周期および周期幹細胞（例えば、ＨＳＣ）は、例えば、細胞中のｐ３４（Ｃｄｋ２）ｍＲＮＡ発現を測定することによって特定することができる。周期幹細胞（例えば、ＨＳＣ）は一般に、非周期幹細胞（例えば、ＨＳＣ）よりも高レベルのｐ３４（Ｃｄｋ２）ｍＲＮＡ発現を有する。例えば、図１７、パネルＢを参照されたい。
【００７５】
本明細書に記載の幹細胞集団のいずれも、適切な培地（例えば、細胞培養培地）において、有効量の本明細書に記載のものとしての１つ以上のＨＩＦ−１α安定化剤と共に有効量の本明細書に記載のものとしての１つ以上のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤の存在下、適切な時間、例えば、少なくとも約１８時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間、少なくとも６０時間、少なくとも７２時間、少なくとも８４時間、少なくとも９６時間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間以上培養することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の幹細胞集団のいずれかを、適切な培地（例えば、細胞培養培地）において、有効量の本明細書に記載のものとしての１つ以上のＨＩＦ−１α安定化剤と共に有効量の本明細書に記載のものとしての１つ以上のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤の存在下、約１８時間〜約７日間、または約１日間〜約７日間、または約２日間〜約７日間、または約３日間〜約７日間以上培養することができる。
【００７６】
本明細書に記載の方法のいずれにおいても、幹細胞は、本明細書に記載のものとしての１つ以上のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤および本明細書に記載のものとしての１つ以上のＨＩＦ−１α安定化剤の同時存在下で培養され得る。例えば、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤（複数可）およびＨＩＦ−１α安定化剤（複数可）は、同時に幹細胞培養物に添加され得る。あるいは、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤（複数可）およびＨＩＦ−１α安定化剤（複数可）は、幹細胞がｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤（複数可）およびＨＩＦ−１α安定化剤（複数可）両方の同時存在下で最終的に培養されるように、逐次的様式で幹細胞培養物に添加され得る。
【００７７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法に関与する幹細胞は、まず本明細書に記載のものとして１つ以上のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤の存在下で適切な時間培養され、次いで本明細書に記載のものとして１つ以上のＨＩＦ−１α安定化剤の存在下で（ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤が実質的に存在しないか、または以前の培養で使用されたものよりも低い濃度の１つ以上のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤で）培養されるか、またはその逆であり得る。
【００７８】
本明細書で使用される「有効量」または「に有効な量」は、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤およびＨＩＦ−１α安定化剤の両方が存在する場合、組み合わせが、幹細胞、例えば、ＨＳＣの幹細胞性の少なくとも１つの特徴（静止、再増殖能、自己再生能、および多系統分化能）を保存するのに有効である、および／またはＨＳＣ移植後の対象におけるＨＳＣの生着の増加などの所望の臨床的効果をもたらすような、本明細書に記載のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤およびＨＩＦ−１α安定化剤の個別の量を指す。これは、日常的な方法によって監視することができ、または本明細書に記載のＨＳＣの生着を評価するための方法に従って監視することができる。ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤およびＨＩＦ−１α安定化剤の有効量は、別々におよび／または組み合わせて決定することができる。有効量は、当業者によって認識されるように、例えば、使用されるｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤およびＨＩＦ−１α安定化剤の効力、ならびに／またはその間に細胞が培養および／または遺伝子修飾される幹細胞（例えば、ＨＳＣ）の細胞周期状態（例えば、周期対非周期）に依存して変動する。
【００７９】
例えば、本明細書に記載の方法において幹細胞（例えば、ＨＳＣ）を培養するための有効量のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤の存在下での培養なしでのＧ０静止期における幹細胞（例えば、ＨＳＣ）の割合と比較して、例えば、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％以上を含む、少なくとも約１０％以上、Ｇ０静止期における幹細胞（例えば、ＨＳＣ）の割合の増加をもたらす。いくつかの実施形態では、有効量のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤の存在下での細胞の培養なしでのＧ０静止期における幹細胞（例えば、ＨＳＣ）の割合と比較して、例えば、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍以上を含む、少なくとも約１．１倍以上、Ｇ０静止期における幹細胞（例えば、ＨＳＣ）の割合の増加をもたらす。
【００８０】
いくつかの実施形態では、有効量の本明細書に記載の方法において使用されるｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤の存在下での培養なしでの第１の細胞分裂周期前のＳ−Ｇ２−Ｍ期における幹細胞（例えば、ＨＳＣ）の割合と比較して、例えば、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％以上を含む、少なくとも約１０％以上、第１の細胞分裂周期（例えば、２４時間）前のＳ−Ｇ２−Ｍ期における幹細胞（例えば、ＨＳＣ）の割合の減少をもたらす。
【００８１】
本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態では、幹細胞（例えば、ＨＳＣ）は、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤の存在下での培養なしで幹細胞において測定されるＤＮＡ損傷またはＤＮＡ二本鎖切断のレベルと比較して、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％以上を含む、少なくとも約２０％以上、幹細胞（例えば、ＨＳＣ）において（例えば、γＨ２ＡＸフォーカスまたは５３ｂｐ１の発現によって測定される）ＤＮＡ損傷またはＤＮＡ二本鎖切断を低減するのに有効な量のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤の存在下で培養される。
【００８２】
本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態では、幹細胞（例えば、ＨＳＣ）を培養するための有効量のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤の処理なしでの幹細胞（例えば、ＨＳＣ）におけるｐ３８ＭＡＰＫの対応するメンバーのリン酸化レベルと比較して、例えば、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％以上を含む、例えば、少なくとも約２０％以上、幹細胞（例えば、ＨＳＣ）におけるｐ３８ＭＡＰＫ（例えば、ｐ３８−α、ｐ３８−β、ｐ３８−γ、またはｐ３８−δ）の少なくとも１つ以上（例えば、少なくとも２つ、または少なくとも３つを含む）のリン酸化レベルの減少をもたらす。
【００８３】
本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態では、有効量のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤の処理なしでの幹細胞（例えば、ＨＳＣ）におけるＥＲＫまたはＪＮＫのリン酸化レベルと比較して、例えば、１０％以下、５％以下、３％以下を含む、例えば、２０％以下、幹細胞（例えば、ＨＳＣ）におけるＥＲＫまたはＪＮＫのリン酸化レベルを実質的には増加させない。
【００８４】
本明細書に記載の方法のためのｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤の有効用量は、少なくとも約１０ｎＭ、少なくとも約２０ｎＭ、少なくとも約３０ｎＭ、少なくとも約４０ｎＭ、少なくとも約５０ｎＭ、少なくとも約１００ｎＭ、少なくとも約２００ｎＭ、少なくとも約３００ｎＭ、少なくとも約４００ｎＭ、少なくとも約５００ｎＭ、少なくとも約６００ｎＭ、少なくとも約７００ｎＭ、少なくとも約８００ｎＭ、少なくとも約９００ｎＭ、少なくとも約１μＭ、少なくとも約２μＭ、少なくとも３μＭ、少なくとも約４μＭ、少なくとも約５μＭ、少なくとも約６μＭ、少なくとも約７μＭ、少なくとも約８μＭ、少なくとも約９μＭ、または少なくとも約１０μＭであり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法のためのｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤の有効用量は、１０μＭ以下、９μＭ以下、８μＭ以下、７μＭ以下、６μＭ以下、５μＭ以下、４μＭ以下、３μＭ以下、２μＭ以下、１μＭ以下、９００ｎＭ以下、８００ｎＭ以下、７００ｎＭ以下、６００ｎＭ以下、５００ｎＭ以下、４００ｎＭ以下、３００ｎＭ以下、２００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、４０ｎＭ以下、３０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、または１０ｎＭ以下であり得る。上記に参照した範囲の組み合わせも可能である。例えば、本明細書に記載される方法のためのｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤の有効用量は、約３０ｎＭ〜約１０μＭ、または約１００ｎＭ〜約５μＭ、または約４００ｎＭ〜約８００ｎＭであり得る。
【００８５】
本明細書に記載の方法および／または組成物のいくつかの実施形態では、ＨＩＦ−１αの有効量は、ＨＩＦ−１α安定化剤の存在下での培養なしで幹細胞において測定されたＨＩＦ−１αタンパク質および／または転写活性レベルと比較して、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％以上を含む、少なくとも約２０％以上、幹細胞（例えば、ＨＳＣ）におけるＨＩＦ−１αタンパク質および／または転写活性を安定させるのに有効であるように選択される。ＨＩＦ−１αタンパク質レベルは、例えば、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロットなどのタンパク質アッセイによって測定することができる。ＨＩＦ−１αの転写活性は、例えば、ＨＩＦ−１α下流応答性遺伝子（複数可）の活性および／またはレベルを測定することによって検出することができる。
【００８６】
いくつかの実施形態では、有効量の本明細書に記載の方法および／または組成物における使用に選択されるＨＩＦ−１α安定化剤は、ＨＩＦ−１α安定化剤の存在下での培養なしでのＨＳＣにおけるＣＸＣＲ４発現および／または活性レベルと比較して、例えば、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％以上を含む、少なくとも約１０％以上、幹細胞（例えば、ＨＳＣ）におけるＣＸＣＲ４発現および／または活性レベルの上方調節をもたらす。いくつかの実施形態では、有効量のＨＩＦ−１α安定化剤は、ＨＩＦ−１α安定化剤の存在下での培養なしでのＨＳＣにおけるＣＸＣＲ４発現および／または活性レベルと比較して、例えば、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、約１０倍以上を含む、少なくとも約１．１倍以上、幹細胞（例えば、ＨＳＣ）におけるＣＸＣＲ４発現および／または活性レベルの上方調節をもたらす。
【００８７】
本明細書に記載の方法のためのＨＩＦ−１α安定化剤の有効用量は、少なくとも約１０ｎＭ、少なくとも約２０ｎＭ、少なくとも約３０ｎＭ、少なくとも約４０ｎＭ、少なくとも約５０ｎＭ、少なくとも約１００ｎＭ、少なくとも約２００ｎＭ、少なくとも約３００ｎＭ、少なくとも約４００ｎＭ、少なくとも約５００ｎＭ、少なくとも約６００ｎＭ、少なくとも約７００ｎＭ、少なくとも約８００ｎＭ、少なくとも約９００ｎＭ、少なくとも約１μＭ、少なくとも約２μＭ、少なくとも３μＭ、少なくとも約４μＭ、少なくとも約５μＭ、少なくとも約６μＭ、少なくとも約７μＭ、少なくとも約８μＭ、少なくとも約９μＭ、少なくとも約１０μＭ、少なくとも約２０μＭ以上であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法のためのＨＩＦ−１α安定化剤の有効用量は、２０μＭ以下、１０μＭ以下、９μＭ以下、８μＭ以下、７μＭ以下、６μＭ以下、５μＭ以下、４μＭ以下、３μＭ以下、２μＭ以下、１μＭ以下、９００ｎＭ以下、８００ｎＭ以下、７００ｎＭ以下、６００ｎＭ以下、５００ｎＭ以下、４００ｎＭ以下、３００ｎＭ以下、２００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、４０ｎＭ以下、３０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、または１０ｎＭ以下であり得る。上記に参照した範囲の組み合わせも可能である。例えば、本明細書に記載の方法のためのＨＩＦ−１α安定化剤の有効用量は、約３０ｎＭ〜約２０μＭ、または約１００ｎＭ〜約１０μＭ、または約５００ｎＭ〜約１０μＭであり得る。
【００８８】
本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態では、幹細胞（例えば、分裂または周期ＨＳＣ）は、組み合わされる場合、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤またはＨＩＦ−１α安定化剤なしで培養された幹細胞（例えば、分裂または周期ＨＳＣ）におけるＧ２Ｍ蓄積と比較して、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％以上を含む、少なくとも約２０％以上、例えば、抗Ｋｉ−６７抗体およびヘキスト染色での細胞免疫染色によって評価される、細胞周期のＧ２Ｍ期における幹細胞（例えば、ＨＳＣ）の幹細胞の蓄積を低減するのに有効な量でｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤およびＨＩＦ−１α安定化剤の存在下で培養される。図１４を含む実施例１は、細胞周期分析を実施する例示的な方法を記載する。
【００８９】
本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態では、幹細胞（例えば、分裂または周期ＨＳＣ）は、組み合わされる場合、細胞がｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤またはＨＩＦ−１α安定化剤なしで培養される場合のＬＴＲＰと比較して、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％以上を含む、少なくとも約２０％以上、（二次移植（２Ｔ）において評価される）長期再増殖能（ＬＴＲＰ）の喪失を低減するのに有効な量のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤およびＨＩＦ−１α安定化剤の存在下で培養される。図２（パネルＢ）を含む実施例１は、２Ｔ異種移植片におけるＬＴＲＰを決定するための例示的な方法を記載する。
【００９０】
本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態では、幹細胞（例えば、分裂または周期ＨＳＣ）は、組み合わされる場合、細胞がｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤またはＨＩＦ−１α安定化剤なしで培養される場合の骨髄性歪みバイアスと比較して、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％以上を含む、少なくとも約２０％以上、幹細胞中の骨髄性歪みバイアスを低減するのに有効な量のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤およびＨＩＦ−１α安定化剤の存在下で培養される。図２（パネルＢ）および図３を含む、実施例１は、骨髄性歪みバイアスを評価するための多系統再構成のための例示的な方法を記載する。
【００９１】
いくつかの実施形態では、幹細胞（例えば、ＨＳＣ）は、インビボ移植の前に、本明細書に記載の有効量のｐ３８阻害剤および本明細書に記載の有効量のＨＩＦ−１α安定化剤を含む培地中で培養され、ここで、組み合わせは、移植前にｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤またはＨＩＦ−１α安定化剤での細胞の培養なしでの幹細胞（例えば、ＨＳＣ）の生着と比較して、例えば、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％以上を含む、少なくとも約１０％以上、インビボで幹細胞（例えば、ＨＳＣ）のその後の生着を増加させる。いくつかの実施形態では、組み合わされた有効量のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤およびＨＩＦ−１α安定化剤は、移植前にｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤またはＨＩＦ−１α安定化剤での細胞の培養なしでの幹細胞（例えば、ＨＳＣ）の生着と比較して、例えば、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍以上を含む、少なくとも約１．１倍以上、幹細胞（例えば、ＨＳＣ）のその後の生着を増加させる。
【００９２】
上記に参照した有効量のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤とＨＩＦ−１α安定化剤との組み合わせが可能である。例えば、いくつかの実施形態では、幹細胞（例えば、ＨＳＣ）は、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤およびＨＩＦ−１α安定化剤の存在下で培養され、ここで、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤の有効量は、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤の存在下での培養なしで幹細胞において測定されたＤＮＡ損傷またはＤＮＡ二本鎖切断のレベルと比較して、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％以上を含む、少なくとも約２０％以上、幹細胞（例えば、ＨＳＣ）における（例えば、γＨ２ＡＸフォーカスまたは５３ｂｐ１の発現によって測定される）ＤＮＡ損傷またはＤＮＡ二本鎖切断を低減するのに十分であり、ＨＩＦ−１α安定化剤の有効量は、ＨＩＦ−１α安定化剤の存在下での培養なしでの幹細胞中で測定されたＨＩＦ−１αタンパク質および／または転写活性レベルと比較して、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％以上を含む、少なくとも約２０％以上の、幹細胞（例えば、ＨＳＣ）中のＨＩＦ−１αタンパク質および／または転写活性を安定させるのに十分である。
【００９３】
いくつかの実施形態では、幹細胞（例えば、ＨＳＣ）は、インビボ移植の前に、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤およびＨＩＦ−１α安定化剤の存在下で培養され、ここで、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤の有効量は、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤の存在下での培養なしで幹細胞において測定されたＤＮＡ損傷またはＤＮＡ二本鎖切断のレベルと比較して、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％以上を含む、少なくとも約２０％以上、幹細胞（例えば、ＨＳＣ）における（例えば、γＨ２ＡＸフォーカスまたは５３ｂｐ１の発現によって測定されるような）ＤＮＡ損傷またはＤＮＡ二本鎖切断を低減するのに十分であり、ＨＩＦ−１α安定化剤の量は、選択された量のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤と組み合わされた場合、組み合わされた有効量のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤およびＨＩＦ−１α安定化剤が、移植前のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤またはＨＩＦ−１α安定化剤での細胞の培養なしでの幹細胞（例えば、ＨＳＣ）の生着と比較して、例えば、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％以上を含む、少なくとも約１０％以上、インビボで幹細胞（例えば、ＨＳＣ）のその後の生着を増加させるように選択される。いくつかの実施形態では、組み合わされた有効量のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤およびＨＩＦ−１α安定化剤は、移植前にｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤またはＨＩＦ−１α安定化剤での細胞の培養なしでの幹細胞（例えば、ＨＳＣ）の生着と比較して、例えば、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍以上を含む、少なくとも約１．１倍以上、幹細胞（例えば、ＨＳＣ）のその後の生着を増加させる。
【００９４】
いくつかの例では、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤とＨＩＦ−１α安定化剤との組み合わせは、幹細胞（例えば、周期または分裂ＨＳＣなどのＨＳＣ）に対する相乗効果を示し得る。本明細書で使用されるとき、本明細書で使用される「相乗効果」という用語は、例えば、幹細胞（例えば、ＨＳＣ）の幹細胞性を維持するなどの効果を生成する、および／または移植された幹細胞（例えば、ＨＳＣ）の生着効率を増加させる、例えば、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤およびＨＩＦ−１α安定化剤などの２つの薬剤の作用を指し、これは単独で投与された各薬剤の効果の単純加算よりも大きい。例えば、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤とＨＩＦ−１α安定化剤との組み合わせは、インビトロまたはエクスビボ操作（例えば、細胞培養および／または遺伝子操作）を受けた周期または分裂幹細胞のインビボ生着を向上させるが、いずれかの薬剤の不在はそうすることができない。相乗効果は、例えば、Ｓｉｇｍｏｉｄ−Ｅｍａｘ式（Ｈｏｌｆｏｒｄ，Ｎ．Ｈ．Ｇ．ａｎｄ  Ｓｃｈｅｉｎｅｒ，Ｌ．Ｂ．，Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．６：４２９−４５３（１９８１））、Ｌｏｅｗｅ相加性の式（Ｌｏｅｗｅ，Ｓ，ａｎｄ  Ｍｕｉｓｃｈｎｅｋ，Ｈ．，Ａｒｃｈ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１１４：３１３−３２６（１９２６））、および効果中央値式（Ｃｈｏｕ，Ｔ．Ｃ．ａｎｄ  Ｔａｌａｌａｙ，Ｐ．，Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｇｕｌ．２２：２７−５５（１９８４））などの適切な方法を使用して計算することができる。上記に参照した各式を実験データに適用して、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤とＨＩＦ−１α安定化剤との組み合わせの効果を評価するのに役立つ対応するグラフを生成することができる。上記に参照した式に関連する対応するグラフは、それぞれ濃度−効果曲線、イソボログラム曲線、および組み合せ指数曲線である。
【００９５】
幹細胞は、それらが本明細書に記載の方法に従ってｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤およびＨＩＦ−１α安定化剤の存在下で培養される場合にそれらの幹細胞性を保存することができる。いくつかの実施形態では、エクスビボ培養プロセス後の多能性幹細胞のパーセンテージは、エクスビボ培養前のそれの少なくとも７０％（例えば、８０％、９０％、９５％、９７％以上）である。他の実施形態では、幹細胞の３０％未満（例えば、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％以下未満）は、本明細書に記載されるエクスビボ培養プロセス中に、例えば、多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞から多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞へ、または多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）細胞から分化細胞へ分化するであろう。エクスビボ培養物中の異なるタイプの幹細胞、例えば、多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞および多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）細胞、ならびに分化細胞の存在は、日常的な方法によって監視することができ、特定のタイプの幹細胞に特異的な、または分化細胞に特異的な細胞表面マーカーの存在によって監視することができる。
【００９６】
いくつかの実施形態では、成体ＨＳＣは、１つ以上のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤および１つ以上のＨＩＦ−１α安定化剤の使用を含む、本明細書に記載のエクスビボ培養プロセスに供される。培養後のＨＳＣのパーセンテージは、培養前のＨＳＣのそれの少なくとも７０％（例えば、８０％、９０％、９５％以上）であり得る。あるいはまたは加えて、エクスビボ培養後の細胞中の造血前駆細胞（ＨＰＣ）のパーセンテージは、３０％未満（例えば、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％未満）であり得る。
【００９７】
ＩＶ．幹細胞療法
本明細書に記載のエクスビボ培養方法によって調製された幹細胞は、例えば、神経変性疾患および状態、糖尿病、心臓疾患、他の状態を含む、疾患または状態を治療または予防するための幹細胞の使用である、幹細胞療法において使用することができる。幹細胞療法によって治療される適切な状態の例には、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、骨髄異形成症候群、神経膠腫、および他の固形腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。幹細胞療法は、サラセミア、再生不良性貧血、ファンコニ貧血、免疫不全症候群、または先天性代謝異常などの非悪性状態にも適用することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のエクスビボ培養方法によって調製されたＨＳＣは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、若年性骨髄単球性白血病、ホジキンリンパ腫、および非ホジキンリンパ腫を含むがこれらに限定されない、造血障害の治療における移植に使用することができる。
【００９８】
造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）は、通常は骨髄、末梢血、または臍帯血に由来する、多能性造血幹細胞の移植である。いくつかの例では、ＨＳＣは自己由来であり得る（患者自身の幹細胞は、本明細書に記載のエクスビボ培養方法によって培養され、疾患を治療するために使用される）。他の例では、ＨＳＣは同種異系であり得る（幹細胞はドナーに由来し、次いで本明細書に記載のエクスビボ培養方法によって培養される）。そのようなＨＳＣは、多発性骨髄腫または白血病などの、血液または骨髄の特定の癌を治療するために使用することができる。これらの場合、レシピエントの免疫系は通常、移植前に放射線療法または化学療法によって破壊される。
【００９９】
いくつかの例では、本明細書に記載のＨＳＣ（例えば、ヒト成体ＨＳＣ）は、鎌状赤血球貧血およびサラセミアなどの貧血の治療における使用のためのγグロビンを発現するように遺伝子操作することができる。例えば、これらの各々の関連教示が本明細書で参照される目的または主題のために参照により組み込まれる、ＵＳ２０１１／０２９４１１４およびＷＯ２０１５／１１７０２７を参照されたい。
【０１００】
本明細書に記載の幹細胞療法のいずれにおいても、適切な幹細胞を本明細書に記載のエクスビボ培養方法から収集し、薬学的に許容される担体と混合して薬学的組成物を形成することができ、これも本開示の範囲内である。
【０１０１】
本明細書に記載の治療方法を実施するために、治療を必要とする対象に有効量または用量の幹細胞を投与することができる。投与または移植のためにｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤およびＨＩＦ−１α安定化剤の存在下で培養されたＨＳＣの用量は、それを必要とする個々の対象によって変動し得る。ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤およびＨＩＦ−１α安定化剤の存在下で培養されたＨＳＣは、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤およびＨＩＦ−１α安定化剤なしまたはそのいずれか一方で処理されるＨＳＣのそれよりも低い用量で投与または移植され得る。例えば、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤およびＨＩＦ−１α安定化剤の存在下で培養された約５０，０００〜約５００，０００個のＨＳＣの用量が対象に投与され得る。別の例として、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤およびＨＩＦ−１α安定化剤の存在下で培養された約５０，０００〜約１００，０００個のＨＳＣの用量が対象に投与され得る。いくつかの例では、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤およびＨＩＦ−１α安定化剤の存在下で培養された約５０，０００、約６０，０００、約７０，０００、約８０，０００、約９０，０００、約１００，０００、約２００，０００、約３００，０００、約４００，０００、または約５００，０００個のＨＳＣの用量が対象に投与され得る。本明細書に記載の方法のいずれかによって調製された５０，０００個未満のＨＳＣの用量もまた可能である。
【０１０２】
幹細胞は、対象にとって自己由来であり得る。対象への自己由来細胞の投与は、非自己由来細胞の投与と比較して幹細胞の拒絶反応の低減をもたらし得る。あるいは、幹細胞は、同種異系細胞である。例えば、同種異系幹細胞は、ヒトドナーに由来し、ドナーとは異なるヒトレシピエントに投与され得る。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、幹細胞は、本明細書に記載のものなどの標的疾患のための治療剤と併用することができる。本明細書に記載される幹細胞療法の有効性は、当該技術分野で既知の任意の方法によって評価され得、熟練した医療専門家には明らかであろう。ある量の本明細書に記載の細胞または組成物が治療効果を達成したかの決定は、当業者には明らかであろう。有効量は、当業者によって認識されるように、治療される特定の状態、状態の重症度、年齢、体調、体格、性別、および体重を含む個々の患者のパラメータ、治療の期間、併用療法（もしあれば）の性質、特定の投与経路、ならびに医療従事者の知識および専門知識内の同様の因子に応じて変動する。いくつかの実施形態では、有効量は、対象における任意の疾患または障害の症状を軽減、緩和、改善、向上、低減、またはその進行を遅延する。
【０１０４】
Ｖ．幹細胞生着能力の評価
本明細書に記載のエクスビボ培養方法のいずれかによって調製されたヒトＨＳＣなどのヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）の生着を評価するために、ＨＳＣを、ＨＳＣ移植を必要とするヒト対象からを入手または誘導し、免疫不全マウス（例えば、ＮＳＧマウス）などの適切な免疫不全動物に移植することができる。他の適切な免疫不全動物、例えば、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓによって提供されるものもまた当該技術分野で知られている（以下の表２を参照されたい）。
【表２】
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【０１０５】
適切な時間後、レシピエント動物の動員末梢血を収集することができ、その中のＣＤ４５＋細胞のレベルを従来の方法、例えば、ＦＡＣＳによって測定することができる。ＣＤ４５＋細胞のレベルは、ヒトＨＳＣ生着速度と逆の相関関係にある。
【０１０６】
ＶＩ．幹細胞の幹細胞性の保存における使用のためのキット
本開示はまた、幹細胞（例えば、ＨＳＣ）の幹細胞性の保存またはそれを必要とする対象における幹細胞生着の増加における使用のためのキットまたは組成物を提供する。そのようなキットまたは組成物は、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤およびＨＩＦ−１α安定化剤、ならびに任意に１つまたは集団の幹細胞（例えば、ＨＳＣ）を含む、１つ以上の容器を含むことができる。キットまたは組成物は、幹細胞（例えば、ＨＳＣ）を培養するのに適した細胞培養培地をさらに含み得る。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載の方法のいずれかに従った使用のための説明書を含むことができる。含まれる説明書は、有効量の本明細書に記載のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤および有効量のＨＩＦ−１α安定化剤を含む培地において幹細胞（例えば、ＨＳＣ）を培養することの説明を含むことができる。キットは、特定の幹細胞に関連する表面マーカー（例えば、ＨＳＣについてはＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ９０＋）を特定することに基づいて、特定の幹細胞、例えば、ＨＳＣを選択することの説明をさらに含み得る。さらに他の実施形態では、説明書は、処理を必要とする個体においてＨＳＣを投与することの説明を含む。
【０１０８】
ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤および／またはＨＩＦ−１α安定化剤の使用に関する説明書は、一般に、幹細胞（例えば、ＨＳＣ）の意図される処理のための投与量および投与スケジュールに関する情報を含む。容器は、単位用量、バルクパッケージ（例えば、多用量パッケージ）、またはサブユニット用量であり得る。本発明のキットに供給される説明書は、典型的にはラベルまたは添付文書（例えば、キットに含まれる紙のシート）上に書かれた説明書であるが、機械可読の説明書（例えば、磁気または光学記憶ディスク上に保持される説明書）も許容される。
【０１０９】
ラベルまたは添付文書は、組成物が幹細胞（例えば、ＨＳＣ）の幹細胞性を保存するために使用されることを示す。本明細書に記載の方法のいずれかを実施するために説明書が提供され得る。
【０１１０】
本発明のキットは、適切な包装中にある。適切な包装には、バイアル、ボトル、ジャー、フレキシブル包装（例えば、密封マイラーまたはビニール袋）などが含まれるが、これらに限定されない。吸入器、経鼻投与装置（例えば、アトマイザー）などの特定の装置、またはミニポンプなどの注入装置と組み合わされた使用のためのパッケージも考えられる。キットは、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針によって穿刺可能な栓を有するバイアルであり得る）。容器もまた、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針によって穿刺可能な栓を有するバイアルであり得る）。
【０１１１】
キットは、緩衝液などの追加成分および解釈情報を任意に提供し得る。通常、キットは、容器、および容器上のまたはそれに付随するラベルまたは添付文書（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、上記のキットの内容物を含む製造物品を提供する。
【０１１２】
一般的な技法
本発明の実施は、他に示されない限り、当該技術分野の技能の範囲内である、分子生物学（組み換え技法を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来技法を使用するであろう。そのような技法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ，ｅｄ．，１９９８）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８７）、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ  ａｎｄ  Ｐ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ａｎｄ  Ｄ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９９３−８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７）、ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９９９）、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ  ａｎｄ  Ｐ．Ｔｒａｖｅｒｓ，１９９７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，１９９７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．，ｅｄ．，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８−１９８９）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ  ａｎｄ  Ｃ．Ｄｅａｎ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０００）、Ｕｓｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９）、Ｔｈｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．Ｚａｎｅｔｔｉ  ａｎ��  Ｊ．Ｄ．Ｃａｐｒａ，ｅｄｓ．，Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）などの文献において十分に説明されている。
【０１１３】
さらに詳述しなくても、当業者であれば、上記の説明に基づいて、本開示を最大限に利用することができると考えられる。したがって、以下の特定の実施形態は、単なる例示として解釈されるべきであり、いかなる意味においても本開示の残部を限定するものではない。本明細書で引用される全ての刊行物は、本明細書で参照される目的または主題のために参照により組み込まれる。
【実施例】
【０１１４】
実施例：ＨＳＣの幹細胞性を維持するためにｐ３８マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）阻害剤および低酸素誘導因子−１α（ＨＩＦ−１α）安定化剤の存在下でＨＳＣを培養すること
概要
遺伝子療法（ＧＴ）は、適切な移植ドナーがいない単一遺伝子障害を有する患者を治癒するための同種造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）の魅力的な代替である１、２、３−１５。その成功は、遺伝子修飾造血幹細胞（ＨＳＣ）が、同時に自己再生して生涯にわたる血球産生を維持しながら、造血前駆細胞（ＨＰＣ）に分化して造血系を再生する能力に依存する１６−１８。ＧＴのために、稀なＨＳＣ（ＣＤ３４＋３８−９０＋４５ＲＡ−４９ｆ＋）１９を含有するＣＤ３４＋造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）を、ＨＳＣ分裂を強制するサイトカイン富化培地において２〜４日間培養し、遺伝子操作２０による影響を受けやすくし、次いで移植前化学療法前処置後に移植する。
【０１１５】
分裂細胞のみを形質導入するγ−レトロウイルスベクター（ＲＶ）を用いるＧＴ試験は、免疫不全障害（ＩＤＤＳ）１、２の治療を除いて、大部分が不成功であるか、またはＨＳＣＴ２１に使用されたものよりも５〜３０倍高い形質導入ＣＤ３４＋ＨＳＰＣでのみ控えめな成功であった。いくつかの生着遺伝子修飾ＨＳＣはとてつもなく大きな増幅能を有する長寿命リンパ性子孫を産生することができるので、免疫不全障害（ＩＤＤ）の治療の成功が報告された１、２。遺伝子編集（ＧＥ）アプローチは、ＲＶ遺伝子導入と同様の条件、例えば、特に相同性指向修復（ＨＤＲ）２２−２７について、周期ＨＳＣを必要とする。ＲＶと同様に、ＧＥでは、インビトロでの高い編集効率は、インビボでの高いＬＴＲＰにはつながらない２３、２８、２９。非分裂細胞を形質導入するレンチウイルスベクター（ＬＶ）にはより多くの成功があったが、ＩＤＤ３０以外では、成功は非常に高いＨＳＰＣ用量、および骨髄破壊的化学療法前処置で達成されている。ＬＶ−形質導入ＨＳＣは、残留ＨＳＣが高用量化学療法を受けているにもかかわらず、そうでなければ残留ＨＳＣと競合することができない３１−３３。大幅なＨＳＣ損失は、ＬＶでも、移植された形質導入ＨＳＣの数より２〜３桁少ない、患者の複数の血球系統における数百から数千の一般的な組み込み体の存在によって証明される。これらの報告は、遺伝子導入／編集でのＨＳＣの長期再増殖能（ＬＴＲＰ）の大幅な喪失を強調する。それゆえ、ＧＴの失敗は、ＨＳＣの喪失ならびにヒトＨＳＣ運命およびそれらのＬＴＲＰを遺伝子操作で改変させる経路の根本的なメカニズムの理解が不十分であることから生じる。これらが特定および標的化される場合、ＨＳＣを（ＲＶ、ＬＶ、またはＧＥでの）遺伝子操作中に維持し、ＧＴの最大の治療可能性を利用することができる。
【０１１６】
容易に入手可能なＨＳＣＴの供給源である臍帯血（ＣＢ）ＨＳＣをインビトロで増殖させる試みは、主に失敗した３４、３５。さらに、試験化合物のほとんど、Ｐ３８／ＭＡＰＫ阻害剤３６、３７、アンジオポエチン様タンパク質３８プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）３９−４２、ステムレゲニン−１（ＳＲ１）４３、４４、ＵＭ１７１４５、およびＵＮＣ０６３８４６は、ＨＳＰＣを増殖させないことが見出された。ＣＢ  ＨＳＣは、ＧＴの大部分は無関係の供給源であることに加えて、成体骨髄（ＢＭ）または動員末梢血（ＭＰＢ）由来ＨＳＣとは異なる。ＣＢ  ＨＳＣは、周期であるか、またはより迅速に細胞周期に入るかのいずれかである４７。成体ＨＳＣは、一方で、大部分が静止状態であり、静止によってゲノムを保護する４８。成体ＨＳＣをそれらの低酸素ＢＭニッチから取り出すこと、および強制周期後のそれらのゲノムの操作は、ＨＳＣ遺伝毒性ストレスシグナル伝達を誘導し得る。
【０１１７】
この研究では、ヒトＨＳＣの成体モデルを使用して、遺伝子操作によって静止および周期ＨＳＣのＬＴＲＰに影響を与えるメカニズムを特定した。本明細書では、ＨＳＣストレスシグナル伝達ならびにＤＮＡ損傷応答および修復（ＤＤＲ）経路の過剰な活性化は、ウイルスベクターインテグラーゼ／遺伝子編集ヌクレアーゼ誘導ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）から生じることが示された。共に、それらはＨＳＣ細胞周期動態を改変してＨＳＣ運命を変更し、ＬＴＲＰの喪失、および主に骨髄性バイアスの子孫を有するＨＳＣをもたらす。さらに、これらの経路を標的とすることは、遺伝的に操作されたＨＳＣの運命を回復させること、ならびにまた骨髄性およびリンパ性両方の系統における遺伝子マーキングの長期的な維持を可能にすることが示された。発見は、ウイルスベクターまたは遺伝子編集ヒトＨＳＣのいずれかを用いたＧＴの将来の成功に対して幅広い影響を有する。
【０１１８】
結果
エクスビボＨＳＣ分裂および遺伝子導入は、ＬＴＲＰの喪失および骨髄性歪み
遺伝子修飾子孫をもたらす。
ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウス異種移植片モデルをまず成体（ＢＭ／ＭＰＢ由来）ＨＳＣモデルに適合させた。１００万個のＭＰＢ  ＣＤ３４＋細胞を致死照射ＮＳＧマウスに移植し、骨髄（ＢＭ）における連続生着を６、１２、および２４週で評価した（循環ヒト細胞はＢＭにおける生着と相関しない、図１、パネルＡおよびＢ）。Ｂ−、Ｔ−、および骨髄性細胞からなる多能性移植片は、１：１二次移植片（２Ｔ）が成功したヒト二次生着（＞０．０１％ヒトＣＤ４５＋細胞）をもたらした場合のみ、２４週までに明らかであった（図１、パネルＣおよびＤ）。多能性生着を一次（１Ｔ）マウスにおいて２４週で、ＬＴＲＰを２Ｔマウスにおいて１．５〜３ヶ月で評価した（図２）。
【０１１９】
ＬＶおよびＲＶ形質導入のために２つの一般的に臨床利用されているプロトコルを利用した。これらのプロトコルは、特にウイルスベクター媒介遺伝子導入または遺伝子編集（ＧＥ）を包含するように選択された：両方とも細胞周期非依存的にＨＳＣを標的とするので、ＬＶ遺伝子導入は、遺伝子編集（ＧＥ）ヌクレアーゼ（ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、またはＣａｓ９ヌクレアーゼ）による非相同末端結合（ＮＨＥＪ）媒介遺伝子破壊を誘導するために使用されるものと類似している。両方とも周期ＨＳＣを必要とするので、ＲＶ遺伝子導入は、ＧＥヌクレアーゼによる遺伝子突然変異を修正するための相同性指向修復（ＨＤＲ）に類似している。ＭＰＢ  ＣＤ３４＋ＨＳＰＣを（ａ）１８〜２４時間以内にＧＦＰ−ＬＶで形質導入し、直ちに移植するか、または培養し続け、３６〜４２時間で照射ＮＳＧマウスに移植するかのいずれか、（ｂ）あるいは、ＣＤ３４＋細胞をエクスビボで２日間予備刺激し、２日目および３日目（４４時間および６８時間）にＧＦＰ−ＲＶで形質導入し、７２〜９６時間にＮＳＧマウスに移植した（図２、パネルＡおよびＢ）。対照として、ＮＳＧマウスに未操作ＣＤ３４＋ＨＳＰＣをそれらの単離直後（０時間）に移植した（図２）。
【０１２０】
ロバストなヒト造血生着（ヒトＣＤ４５＋細胞）が、１Ｔ後２４週で大きな変動なしに全ての条件下でＢＭにおいて観察された（図３、パネルＡ）。しかしながら、ＨＳＰＣが２４時間を超えて培養された条件では、２Ｔ動物においてＬＴＲＰの有意な喪失があり、ＬＴＲＰの喪失はＲＶ７２〜９６時間群において最も高かった（図３、パネルＢ）。ＲＶおよびＬＶでの（従来のコロニー形成アッセイを用いた）２週でのインビトロＣＤ３４＋細胞における遺伝子導入効率は同程度であった。ＬＶ形質導入（ＧＦＰ＋）ヒト細胞はインビトロで平均８０％から、インビボで２４週までに約５０％まで減少したが、ＲＶ形質導入（ＧＦＰ＋）細胞はインビトロで８０％からインビボで５〜８％までより高い漸減があった（図４）。それゆえ、ＲＶ形質導入ヒト異種移植片は、ＮＳＧマウスにおいて時間と共に大部分が失われたが、ＬＶベクターで形質導入されたものはより良好に維持された。
【０１２１】
１ＴマウスにおけるＢＭの６、１２、および２４週での多系統再構成を、ＨＳＰＣの未形質導入（ＧＦＰ−）および形質導入（ＧＦＰ＋）子孫において調査した。６週で、系統出力は、ＧＦＰ＋およびＧＦＰ−集団の両方で類似しており、未操作０時間対照から得られたものと同程度であった。しかしながら、１２週までに、７２〜９６時間ＲＶ遺伝子修飾集団は、骨髄性細胞子孫の有意な増加を示し、これはＢリンパ性細胞子孫の低減を犠牲にして起こり（図５）、２４週までに、この群では骨髄性バイアスが極度であったが、ＢおよびＴリンパ性集団の有意な低減を犠牲にして発生した３６〜４２時間ＬＶ移植片でも明らかであり、３６〜４２時間ＬＶおよび７２〜９６時間ＲＶ移植片の両方ではＧＦＰ＋ＣＤ３４＋細胞も有意に少なかった（図３、パネルＣ〜Ｊ）。条件のいずれにおいても未形質導入子孫においてそのような系統歪みが見られず、この系統歪みがサイトカイン／培養条件の影響ではなかったことを示し、さらに、未形質導入系統パターンが０時間ＨＳＰＣに由来する移植片と類似していたことは注目に値した。それゆえ、骨髄性系統バイアスは、遺伝子導入および培養時間の増加に続発した。本明細書で使用される自己不活性化ＲＶがウイルスエンハンサーを欠き、実験モデル５４、５５およびヒト試験５６、５７において挿入性有害事象または系統歪みを示していないことは注目に値する。同様に、ＬＶはまた、ベクター挿入からの有害事象なしでインビトロおよびヒト試験において試験されている３１、５８。
【０１２２】
集合的に、最初の２４時間を超えた遺伝子導入およびエクスビボ培養は、２ＴマウスにおけるＬＴＲＰの有意な喪失をもたらし、形質導入ＣＤ３４＋子孫は、リンパ性子孫を犠牲にして骨髄性バイアスであった。ＬＴＲＰの喪失は、多数のＲＶ  ＧＴ試験および遺伝子編集異種移植片２８、２９の結果を模倣し、高ＨＳＰＣ用量およびロバストなインビトロ遺伝子導入／ＨＤＲ２１にもかかわらず、短期生着（ほとんど未発表、５９）または控えめな遺伝子マーク長期生着のいずれかがあった。加えて、モデルはまた、短い培養プロトコル３０−３３で安定した遺伝子マーキングを示している成功したＬＶ  ＧＴ試験をシミュレートするが、ＬＶ形質導入がＲＶプロトコル６０と同様に行われた他のＬＶ試験では控えめな成功／失敗であり、集合的にこのモデルを遺伝子操作ＨＳＣ生着およびＬＴＲＰの前臨床モデルとして実証する。
【０１２３】
ＬＴＲＰの損失および骨髄性系統バイアス子孫のメカニズムを調査した。ＲＶ遺伝子導入およびＧＥ媒介ＨＤＲは分裂細胞において起こる。ＬＶ遺伝子導入およびＧＥ媒介ＮＨＥＪは、細胞の周期状態とは無関係に起こり得るが、ＬＶは分裂細胞に対する選好性も有する６１。ＲＶ試験の失敗は、容易に周期化し、ＣＤ３４＋ＨＳＰＣの９９％を構成する、導入遺伝子のＨＰＣまたは多能性前駆細胞（ＭＰＰ）への優先的な組み込み、およびＣＤ３４＋細胞の約１％を含む、静止ＨＳＣの形質導入不良によるものであった可能性がある。Ｄｉｃｋら１９によって特定されたヒトＨＳＣの表現型を使用して、本明細書に使用された臨床形質導入条件は、実際に、ＲＶおよびＬＶの両方で同等にヒトＨＳＣ（ＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ４９ｆ＋）、ＭＰＰ（ＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ９０−ＣＤ４５ＲＡ−１９、６２）、および総ＣＤ３４＋細胞を形質導入するために最適化されることが見出された（図６）。
【０１２４】
それゆえ、周期中に、形質導入されたＨＳＣは、ＨＰＣに運命を変更するか、または失われる可能性がある。ＨＳＰＣ区画の注意深い評価は、ＣＤ３４＋細胞の細胞死またはＨＳＣのアポトーシスを示さず、実際は、培養時間の増加と共に表現型ＨＳＣが増加した（図７、パネルＡ〜Ｃ）。ＥｄＵ標識は、高度ＨＳＣ富化ＣＤ３４＋３８−９０＋細胞が２４時間後に初めて細胞周期に入り、大多数が７２時間までに少なくとも１回の細胞分裂を経験したことを示した（図７、パネルＣおよびＤ）。
【０１２５】
ＨＳＣがそれらの低酸素ニッチに生理学的に維持されるか６３、および周囲酸素条件におけるサイトカイン富化培養において細胞分裂を誘導することが高い酸化ストレスを誘導する可能性があるか６４を次に決定しようとした。実際に、活性酸素種（ＲＯＳ）は７２〜９６時間の培養でＨＳＣにおいて有意に増加し、これらのＲＯＳはミトコンドリアから生成された（図７、パネルＥおよびＦ）。Ｎ−アセチルシステインアミドは、ＨＳＣにおいてＲＯＳを減少させることができたが、予想外に、遺伝子導入効率の相互低下をもたらした（図７、パネルＧおよびＨ）。したがって、増加した酸化ストレスによって活性化された下流経路を次に調査した。
【０１２６】
高いＲＯＳは、ストレスシグナル伝達、特にマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）を誘導することが示されている３７。ＥＲＫ、ＪＮＫ、およびｐ３８ＭＡＰＫのリン酸化状態を異なる培養プロトコルで分析し、２４時間を超えるエクスビボ培養でｐ３８ＭＡＰＫ（ｐ３８）のみの有意な活性化が見られた（図８、パネルＡ〜Ｆ）。興味深いことに、形質導入ＨＳＣではそうではないが、周期ＨＳＣでは有意により高いｐ３８活性化があった（図８、パネルＧ〜Ｉ）。全てのｐ３８阻害剤（ｐ３８ｉ）６５６６は、ＨＳＣにおけるｐ３８リン酸化を減少させ、この経路の活性化の特異性を示した（図８、パネルＪおよびＫ）。以前の報告は、ｐ３８阻害ありで１週間培養されたＣＢ  ＣＤ３４＋細胞が異種移植片において４ヶ月でヒト生着を増加させたことを示した３６。この時点は依然としてＨＰＣ出力を反映し得る。したがって、成体遺伝子修飾ＨＳＣのＬＴＲＰに対するｐ３８阻害の効果を調査した。
【０１２７】
Ｂｉｒｂ−７９６、選択的ｐ３８α阻害剤６７は、非特異的阻害を引き起こすものよりはるかに下の濃度で選択され、全ての条件における未操作ＨＳＣにおいて見られたレベルで、有意により低いホスホ−ｐ３８（ｐ−ｐ３８）が観察された（図９、パネルＡおよびＢ）。培養期間の効果から、非周期ＨＳＣ対周期ＨＳＣへの遺伝子導入の効果を区別するために、１８〜２４時間以内にＬＶで形質導入され（非周期ＨＳＣ）、２４、３６〜４２、もしくは７２〜９６時間後に移植された、または４４時間もしくは６８時間にＲＶで形質導入され（周期ＨＳＣ）、７２〜９６時間で移植されたヒトＣＤ３４＋ＨＳＰＣの連続移植（図２）を、ｐ３８ｉありまたはなしで行った。２４週で、ＮＳＧ  ＢＭにおけるヒトＣＤ４５＋細胞生着は、ｐ３８ｉあり／なしの全ての群の間で類似しており、実際に、ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞３６において報告された結果と同様に、７２〜９６時間ＬＶおよびＲＶ群についてｐ３８ｉで向上した（図９、パネルＣ）。
【０１２８】
興味深いことに、ｐ３８ｉは、３６〜４２時間および７２〜９６時間群で移植された２ＴマウスにおいてＬＴＲＰを０時間および２４時間群で観察されたレベルに回復させた（図９、パネルＤおよび図１０）：ほぼ３分の１の２Ｔマウスは、ＣＤ３４＋細胞をｐ３８ｉなしで２４時間より長く培養した場合、生着しなかったが、ｐ３８ｉの添加は、２ＴマウスにおけるＬＴＲＰを、ベクター型またはそれらがいつ形質導入されたかにかかわらず、未操作ＨＳＰＣで見られたレベルに回復させ、ＬＴＲＰの喪失が最初のインビトロＨＳＣ分裂で発生することを示した。
【０１２９】
ＨＳＣへの遺伝子導入が培養の最初の２４時間（周期ではない場合）に起こった場合、それらが長期培養にその後最大９６時間まで維持され、次いで移植された場合でも、ｐ３８ｉはまた２４週（１Ｔ）の移植片の多能性を０時間対照と同様のレベルに回復させた。しかしながら、周期ＨＳＣが形質導入された場合（ＲＶ群）、形質導入子孫の顕著な骨髄性歪みはいくらか低減したが、Ｂ細胞（図９、パネルＧおよびＨ）およびＣＤ３４＋ＨＳＰＣ（図９、パネルＩおよびＪ）における対応する低減と共に、依然としてかなり有意であった（図９、パネルＥおよびＦ）。この効果は、遺伝子操作ＨＳＣ子孫にのみ特異的であった（図９、パネルＥ〜Ｊ）。まとめると、遺伝子導入中のｐ３８ｉは長期エクスビボ培養条件中に形質導入ＨＳＣ  ＬＴＲＰを維持したが、周期ＨＳＣの形質導入での極度の骨髄性バイアス子孫およびリンパ性能の低減は部分的にのみ救済された。
【０１３０】
ヒトＨＳＣ運命に対するｐ３８阻害の作用機序
次に、ｐ３８阻害が培養および形質導入ＨＳＣのＬＴＲＰを保持することができるメカニズムを調査した。ｐ３８ｉは、ＣＤ３４＋細胞の総数、またはインビトロでの生存率に影響を及ぼさず、インビトロまたはインビボでの遺伝子導入効率にも影響を及ぼさなかった（図１１、パネルＡ〜Ｃ）。ＨＳＣ区画はまた、ｐ３８阻害でアポトーシス、形質導入効率、またはＲＯＳレベルにおいて差を示さず、表現型ＨＳＣ集団の増加は、ｐ３８ｉありまたはなしで、長期培養を除いて、表現型ＨＳＣがｐ３８ｉでより高かった場合に同様であった（図１２）。
【０１３１】
ＲＶ／ＬＶインテグラーゼ８、６８またはＧＥヌクレアーゼ媒介ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）は、ＤＮＡ損傷応答および修復（ＤＤＲ）経路を引き起こすことができた。したがって、ｐ３８阻害がＨＳＣ分裂および遺伝子導入でＤＤＲを低減するかを、免疫蛍光法によってＦＡＣＳ選別ＨＳＣにおいて調査した。実際、γＨ２ＡＸフォーカス／細胞の増加は、４２時間群または７２時間群のいずれかにおける形質導入ＨＳＣにおいて見られ、これは、ｐ３８阻害で非常に有意に低減し（図１３、パネルＡ〜Ｃ）、同時に行われた５３ｂｐ１染色は、γＨ２ＡＸの増加がＤＤＲフォーカスと関連していることを確認した（図１３、パネルＡ〜Ｃ）。
【０１３２】
ＤＤＲ経路活性化はまた、γＨ２ＡＸについてのフローサイトメトリーによって形質導入および未形質導入ＨＳＣにおいて比較された。未操作ＨＳＣ（０時間）と比較して、γＨ２ＡＸ  ＭＦＩの増加およびγＨ２ＡＸ陽性ＨＳＣの数の増加が２４時間（ＨＳＣが周期ではない期間）でも見られ、これはｐ３８ｉ処理ありでの未操作ＨＳＣにおいて見られるレベルに戻った（図１３、パネルＤ〜Ｆ）。特に、この集団は形質導入されるが、ＧＦＰタンパク質発現はこの初期２４時間時点では存在しない。それゆえ、２４時間でのＤＤＲの増加は、遺伝子導入誘導ＤＳＢによって引き起こされる可能性が高い。３６時間後、未形質導入（ＧＦＰ−）対形質導入（ＧＦＰ＋）ＨＳＣ集団を別々に分析することができた。形質導入（ＧＦＰ＋）集団は、３６〜４２時間群および７２〜９６時間群の両方において、未形質導入（ＧＦＰ−）集団よりも高いγＨ２ＡＸレベル、およびγＨ２ＡＸ陽性ＨＳＣのパーセンテージを有し、ｐ３８ｉは、γＨ２ＡＸ＋細胞のパーセンテージを有意に低減するが、これらの後の時点で、γＨ２ＡＸのレベルは、０時間ＨＳＣにおいて見られるレベルには戻らなかった［γＨ２ＡＸ（図１３、パネルＤ〜Ｆ）およびγＨ２ＡＸ  ＭＦＩ（図１３、パネルＤおよびＥ）について染色するＨＳＣの両方のパーセンテージ］。休止ＨＳＣを周期に誘導することもＤＤＲを誘導する６９。データは、未操作ＨＳＣにおいて見られるベースラインレベルまでではないが、ｐ３８阻害が、周期の増加および形質導入の両方でＨＳＣにおいてＤＤＲを有意に低減することを示す。
【０１３３】
ｐ３８活性化は、周期ＨＳＣにおいて最も高かった（図７、パネルＤ、ならびに図８、パネルＧおよびＨ）。したがって、ＨＳＣ細胞周期動態におけるｐ３８ｉの役割を調査した。ＭＰＢ（図１４、パネルＡ）またはＢＭ（図１５）から新たに単離された場合、ほぼ全てのＨＳＣがＧ０期にあり、２４時間までにそれらの３分の１がＧ１期に移行したが、ほとんどのＨＳＣが周期ではなかった（Ｓ−Ｇ２Ｍ期にはなかった）。ｐ３８ｉは、Ｇ０静止期におけるＨＳＣの割合を有意に増加させ、インビトロでの最初のＨＳＣ分裂前（２４時間）にＳ−Ｇ２Ｍ期におけるＨＳＣの割合を減少させた。しかしながら、ＨＳＣが細胞周期を通して進行した後、Ｇ０集団の増加に対するｐ３８ｉの効果が失われた（図１４、パネルＡおよびＢ）。したがって、ＨＳＣが周期ではないときに形質導入／ＤＳＢが起こる場合、Ｇ０期からＧ１期へおよびＧ１期からＳ期への移行のｐ３８ｉ媒介遅延（図１４、パネルＡおよびＢならびに図１６）は、ＤＤＲが低下するのを可能にすることができ、それゆえ、ＬＴＲＰの救済およびバランスのとれた系統産生によって示されるように、ＨＳＣ運命が維持される。同じ現象が成体ヒト骨髄由来のＨＳＣでも見られた（図１５）。それらが２４時間以内に形質導入されても、４２時間でＧ０期における有意により低いＧＦＰ＋ＨＳＣも認められ、ＬＶ、好ましくは形質導入Ｇ０細胞が深い休止にはなく、４２時間までに、これらがＧ１およびＳ−Ｇ２Ｍ期に進行したことを示す。しかしながら、ＲＶと同様に、それらが活性周期であるときにＨＳＣが形質導入された場合、ｐ３８ｉありまたはなしで、細胞周期の異なる期における細胞のパーセンテージに差はなかった（図１４、パネルＡおよびＢ、ならびに図１６）。
【０１３４】
別の注目すべき発見は、形質導入（ＧＦＰ＋）７２時間ＲＶ  ＨＳＣ集団のみが、ｐ３８阻害にかかわらず、Ｇ１期におけるＨＳＣの非常に有意な低減およびＳ−Ｇ２Ｍ期におけるそれらの増加を示したことであった。この条件では、移植ＨＳＣが、ｐ３８ｉが有意に救済しなかった骨髄性バイアス子孫を産生したので、Ｓ−Ｇ２Ｍ期を調査した（図９）。
【０１３５】
Ｓ−Ｇ２ＭチェックポイントとＨＩＦ−１αとの間のクロストークは、ＲＶ誘導ＤＳＢ、細胞周期、およびＨＳＣ運命を関連づける
形質導入および未形質導入非周期および周期ＨＳＣのＳ−Ｇ２Ｍ動態は、周期ＨＳＣにおいてＤＳＢが起こった場合（培養２日後のＲＶ形質導入）、ＳおよびＧ２Ｍ後期にＨＳＣの蓄積があったことを示した（図１４、パネルＣ）。しかしながら、最初の２４時間以内に（ＬＶで）ベクター組み込みが起こった場合、この現象は見られなかった（図１４、パネルＤ）。さらに、この効果はＲＶに特異的ではなかったが、形質導入された場合ＨＳＣの細胞周期に特異的であった。同じドナーからのＣＤ３４＋細胞を約２日間（４４時間）培養し、４４時間および６８時間にＬＶ（ＬＶ後期またはＬＶＬ）、またはＲＶのいずれかで形質導入するか、またはＨＳＣをＬＶで２４時間以内に形質導入したが７２時間（ＬＶＥ）培養し続けた（図１７、パネルＡ）。ＳおよびＧ２Ｍ後期蓄積は、ＬＶＬまたはＲＶ群における形質導入（ＧＦＰ＋）周期ＨＳＣにおいてのみ観察された（図１４、パネルＥおよびＦ）。ＬＶは周期および非周期の両方のＨＳＣを形質導入するので、Ｇ２Ｍ蓄積はＲＶよりもＬＶＬにおいて少なく、したがってＧＦＰ＋集団は混合集団で構成された。特に、このＧ２Ｍ蓄積はアポトーシスをもたらさず（むしろ、ＨＳＣ数は増加し、図７、パネルＣおよび図１２、パネルＣ）、連続的に続く場合、ＨＳＣはＧ２Ｍ期から移行した（図１４、パネルＥ）。このＧ２Ｍ蓄積は、非周期ＨＳＣを形質導入した場合（２４時間ＬＶまたはＬＶＥ、図１４、パネルＥ）、細胞周期分析をＬＶＥ対ＲＶでの形質導入後の同じ時点で行った場合（図１４、パネルＣおよびＤ）にも見られなかった。
【０１３６】
ＬＴＲＰの維持に失敗し、骨髄性バイアス子孫を産生する表現型ＨＳＣの増加は、老化／枯渇ＨＳＣを連想させる。ＨＳＣ集団を、ＲＮＡｓｅｑ分析のための１つの実験から、それぞれ２４時間および７２時間でのＬＶおよびＲＶ後に選別して、老化関連遺伝子の転写プロファイルの概観を得た。Ｗｎｔ５ａおよびＷｎｔ４（マウスＨＳＣの老化に関連する非古典的Ｗｎｔ遺伝子７０、７１）ｍＲＮＡレベルはヒトＣＤ３４＋３８−９０＋ＲＡ−４９ｆ＋ＨＳＣにおいて検出不能であり、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ１１、およびＦｚｄ３（Ｗｎｔシグナル伝達の下流標的７２）発現のみが検出可能なレベルであった。これらの時点でのＨＳＣの非周期および周期を検証するためにＰ３４（Ｃｄｋ２）ｍＲＮＡ発現を使用して、異なるＭＰＢドナーからの２４時間ＬＶＥおよび７２時間ＬＶＬ選別ＨＳＣにおけるこれらの遺伝子のｑＲＴＰＣＲは、ＬＶＬ群においてＦｚｄ３およびＷｎｔファミリー遺伝子の増加を示した（図１７、パネルＢ）。
【０１３７】
この現象がベクター誘導性ではなく、周期ＨＳＣにおいて任意の誘導されたＤＳＢから発生することをさらに検証するために、このＧ２Ｍ蓄積が遺伝子編集ヌクレアーゼでも起こるかを決定した。この目的のために、ＣＤ３４＋細胞をＬＶＬおよびＲＶ群と同じ４４時間培養し、次いで、ヒトＣＤ４５対立遺伝子において高速ＤＮＡ  ＤＳＢを誘導する、Ｃａｓ９／ｈＣＤ４５ｇＲＮＡリボ核タンパク質複合体でヌクレオポレートし、対照細胞を、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡリボ核タンパク質複合体なしで、ビヒクルでヌクレオポレートする実験を実施した。Ｇ２Ｍ蓄積を、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ誘導ＤＳＢに供されたＨＳＣ集団において観察した（ＨＳＣにおけるＦＡＣＳによるＣＤ４５発現の喪失によって示した、図１７、パネルＥおよびＦ）。
【０１３８】
機能的には、Ｇ２Ｍ期におけるＨＳＣのこの遅延は、ＨＳＣ系統運命を変更し、骨髄性バイアス子孫をもたらし、１Ｔ後６ヵ月の２４時間ＬＶおよび７２時間ＬＶＥ群は骨髄性バイアスを示さなかったが、７２時間ＬＶＬまたはＲＶ群はＢリンパ性能の喪失を犠牲にして骨髄性バイアス形質導入ＨＳＣ子孫を有した（図１７、パネルＣおよびＤ）。集合的には、データは、ＤＳＢが周期ＨＳＣにおいてベクター組み込みまたはヌクレアーゼを介して誘導される場合、ＤＤＲがＧ２Ｍ期においてＨＳＣを失速させ、この遅延が主に骨髄性子孫を産生するＨＳＣをもたらすことを示し、これはＦｚｄ３およびＷｎｔ５ｂの発現の増加と同時のＨＳＣの数の増加と共に、枯渇または老化に関連したＨＳＣ表現型を示唆し７１、あるいは、リンパ性バイアスＨＳＣ集団がＧ２Ｍ期における蓄積でより脆弱であり得る７３ことも企図される。
【０１３９】
それらの特定および標的化が周期中に形質導入されたＨＳＣにおける正常な細胞周期進行を回復し得るので、Ｇ２Ｍ蓄積のメカニズムが探求された。ほとんどのヒト疾患はＮＨＥＪ媒介遺伝子破壊では修正することができないので、周期ＨＳＣの遺伝子操作はＨＤＲ媒介遺伝子編集に必須である。ＤＮＡ  ＤＳＢは古典的に細胞周期チェックポイント、ＡＴＭ／Ｃｈｋ２キナーゼを誘導するが、ＤＳＢがＳ期およびＧ２期に起こる場合、これはＡＴＲ／Ｃｈｋ１キナーゼを誘導することができる７４−７７。より最近では、胸腺細胞におけるＶ（Ｄ）Ｊ組み換え中のＤＮＡ  ＤＳＢによってＭＫ２／ｐ３８ＭＡＰＫの活性化は、Ｇ２Ｍ細胞周期チェックポイントを誘導することが示されており７８、古典的ＡＴＲ／Ｃｈｋ１およびＡＴＭ／Ｃｈｋ２キナーゼに加え、ＭＫ２／ｐ３８ＭＡＰＫは、Ｃｈｋ１に平行にＤＮＡ損傷に対する細胞周期応答を制御する非古典的チェックポイントキナーゼであることが最近示されている７９。特定のＣｈｋ１阻害剤（ＭＫ−８７７６、Ｃｈｋ１ｉ）、Ｃｈｋ２阻害剤（ＰＶ１０１９、ｃｈｋ２ｉ）、および単独の、またはＣｈｋ１ｉもしくはＣｈｋ２ｉと組み合わされたｐ３８ｉを、Ｇ２Ｍ期に蓄積したＨＳＣにおけるそれらの役割を決定するのに使用した。Ｃｈｋ１ｉでは（統計的に有意ではないが）Ｇ２Ｍ期においてより少ない形質導入ＨＳＣが蓄積することが見出されたが、Ｃｈｋ２ｉではそうではなかった（図１８、パネルＡおよび図１９、パネルＡ）。しかしながら、Ｃｈｋ１ｉとｐ３８ｉとの組み合わせではＧ２Ｍ期において著しく少ない形質導入ＨＳＣが蓄積したが、Ｃｈｋ２ｉとｐ３８ｉとではそうではなく、周期ＨＳＣにおいてＤＳＢが誘導される場合、Ｃｈｋ１キナーゼおよびｐ３８ＭＡＰＫが共にＧ２Ｍチェックポイントを誘導することを示す（図１９、パネルＢ）。さらに、Ｃｈｋ１は形質導入ＨＳＣにおけるγＨ２ＡＸレベルを低減せず、これはｐ３８ｉを必要とし、Ｃｈｋ１ｉとｐ３８ｉとの組み合わせはγＨ２ＡＸを低減することにおいていかなる相加効果も有さなかった（図１９、パネルＢ）。ＨＳＣにおける細胞周期チェックポイントの阻害は、発生する他のＤＳＢのチェックを外すことを可能にし得る。それゆえ、Ｃｈｋ１ｉの代替物が探索された。
【０１４０】
ＨＩＦ−１α欠損マウスは老化ＨＳＣ表現型を発現する８０。ＨＳＣにおける細胞周期進行の遅延は、形質導入ＨＳＣ表現型を媒介するＨＩＦ−１αの不安定化をもたらし得、ＨＩＦ−１α欠損マウス胚線維芽細胞はＣｈｋ１発現の増加を示すので、ＨＩＦ−１αの喪失は、Ｃｈｋ１をさらに活性化し得ると仮定された８１。実際に、ＨＳＣが７２時間単に培養され、０時間のＨＳＣと比較して周期（７２時間）中に形質導入されたＨＳＣにおいてＨＩＦ−１αレベルがさらに低減した場合、免疫蛍光によるＨＩＦ−１αレベルの有意な減少が観察された（図１９、パネルＤ）。プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）は、ＨＳＣ８２においてＨＩＦ−１αを安定させることにより８２、マウスおよびＣＢのＨＳＣにおいてＨＳＣの生存およびホーミングを向上させる４２５２ことが報告されている。本明細書では、ＰＧＥ２が周期形質導入成体ＨＳＣにおいてＨＩＦ−１αを安定させるか、およびこの安定化がＧ２Ｍ蓄積を防止し、ＨＳＣ系統運命を回復するかを調査した。選別された高度ＨＳＣ富化ＣＤ３４＋３８−９０＋細胞におけるＨＩＦ−１αの免疫蛍光分析は、ＨＩＦ−１αが、周期ＨＳＣにおけるＲＶ誘導ＤＮＡ  ＤＳＢによって有意に低減し、ＰＧＥ２をｐ３８ｉと組み合わせた場合に最も高いＨＩＦ−１αレベルが見られたにもかかわらず、ＰＧＥ２で安定化され得ることを示した（図１９、パネルＣ〜Ｅ）。免疫蛍光データをフローサイトメトリーで確認した（図１８、パネルＢ）。さらに、形質導入周期ＨＳＣにおけるＨＩＦ−１αの増加は、細胞周期のＧ２Ｍ期におけるそれらの蓄積の低減と関連していた。重要なことに、ＰＧＥ２単独では、Ｇ２Ｍ期における周期形質導入ＣＤ３４＋３８−９０＋細胞の数を低減する傾向があったが、Ｇ２Ｍ蓄積の有意な低減は、ＰＧＥ２およびｐ３８ｉの組み合わせでのみ生じた。だが特に、ＰＧＥ２単独では、これらのＨＳＣ富化集団におけるＤＤＲの低減（γＨ２ＡＸレベルの低減）には効果がなかった。しかしながら、ｐ３８ｉは上記のようにγＨ２ＡＸを有意に低減し、ｐ３８ｉとＰＧＥ２との組み合わせはγＨ２ＡＸの非常に有意な低減（図１９、パネルＧおよび図１８、パネルＣ）およびＧ２Ｍ蓄積をもたらし、両者がＨＳＣのＬＴＲＰおよび系統運命保持に必須であることを示す。
【０１４１】
ＰＧＥ２と組み合わせされたｐ３８ｉは、形質導入ＨＳＣのＬＴＲＰおよび系統運命を回復させる。
次に、ＮＳＧマウスにおけるｐ３８ｉおよび／またはＰＧＥ２の併用処理での限界希釈移植を行った。ＣＤ３４＋細胞を一晩培養し、次いで１２時間あけて（１８時間および３０時間で）、４２時間の総培養期間にわたってＬＶで形質導入し、以前の実験で使用された半分の用量（５００ＫのＣＤ３４＋／マウス）から開始して、ＣＤ３４＋細胞の制限用量でＮＳＧマウスに移植した。ＲＶ形質導入細胞と同様に、５００Ｋおよび２５０Ｋの細胞群において骨髄性歪みおよびＢ−リンパ性能の喪失が６ヶ月で観察された（図２０、パネルＡ〜Ｄ）。注目すべきことに、生着ＨＳＣに重度の再生ストレスを課す、さらなる制限ＨＳＣ用量で、未形質導入ＣＤ３４＋細胞においても骨髄性歪みおよびＢリンパ性能の喪失が観察され、過剰なＨＳＣ増殖が骨髄性バイアス子孫を誘導することを示した。ｐ３８ｉ単独での処理は、より高いＨＳＰＣ投与量で未形質導入子孫における系統バランスを回復するのに十分であったが、（初期の実験における高ＨＳＣ用量で観察されたように［図９］）形質導入ＨＳＣ子孫に対する効果は少なかった。ＰＧＥ２単独は系統歪みを回復させるのに十分であったが、過剰な周期および形質導入ストレスの組み合わせが存在した場合、最低細胞用量で、ＰＧＥ２およびｐ３８ｉの組み合わせは、ＰＧＥ２単独よりも骨髄性歪みを逆転させ、Ｂリンパ性能を回復させるのに最も効果的であった（図２０、パネルＡ〜Ｄ）。また、１Ｔ後２４週での骨髄における全ヒト生着は、より高いＣＤ３４＋用量群においてｐ３８ｉおよびＰＧＥ２の組み合わせでより高い生着レベルを明らかにし、そこでは生着を有意に分析することができた（図２０、パネルＥ）。さらに、６ヶ月のＢＭにおける競合的再増殖単位（ＣＲＵ）は、ｐ３８ｉまたはＰＧＥ２での単回処理と比較して、併用処理でほぼ５倍向上した（図２０、パネルＦ）。最後に、３ヶ月の２ＴマウスにおけるＬＴＲＰの評価は、ＬＴＲＰおよび骨髄性歪み表現型の逆転の両方の増加について、ｐ３８ｉおよびＰＧＥ２の併用処理の効果を示した（図２０、パネルＧ、Ｉ〜Ｌ）。ｐ３８ｉもしくはＰＧＥ２または組み合わせの使用は、長期二次ヒト移植片においても、ＧＦＰマーキングにおけるいかなる効果も有さなかったことに留意されたい（図２０、パネルＨ）。
【０１４２】
考察
本明細書に提示されているのは、ＨＳＣのインビトロ遺伝子操作がＨＳＣの喪失および運命の変化をもたらす、重要かつ異なるメカニズムである。ｐ３８ストレスシグナル伝達は、ＲＯＳによって誘導されることが示されている３７。この研究では、ｐ３８活性化がＤＤＲを増加させ、これがＨＳＣのＬＴＲＰを低減することが示されている。本研究はまた、休止から出たＨＳＣおけるＤＤＲ増加のメカニズムおよびインビボマウスＨＳＣにおいて結果として見られるＨＳＣ消耗を説明し６９、ＤＤＲ応答が遺伝子導入媒介ＤＳＢによってさらに誇張され、これはｐ３８阻害でも低減することを示す。
【０１４３】
加えて、周期ＨＳＣにおけるベクターインテグラーゼまたは遺伝子編集ヌクレアーゼによって誘導されるＤＮＡ−ＤＳＢは、ＨＩＦ−１αを不安定化し、Ｃｈｋ１／ｐ３８媒介Ｇ２Ｍチェックポイントを誘導し、ＨＳＣの細胞周期進行を改変し、これはＨＳＣを老化／枯渇させると思われること（ＬＴＲＰ不良、骨髄性バイアス子孫、およびＷｎｔシグナル伝達の上方調節を有するＨＳＣの数の増加）が本明細書に示される。本明細書に提示されるデータは、それがＧ２Ｍチェックポイントを誘導するためにＣｈｋ１と協調して作用する、「周期ＨＳＣ」における非古典的チェックポイントキナーゼとしてｐ３８を支持するが、ｐ３８阻害がＧ０期におけるＨＳＣを増加させるので、ｐ３８シグナル伝達の増加はまた「静止ＨＳＣ」を急いで周期に入れ得る。Ｇ０期から活性細胞周期へのＨＳＣの急速な移行は、ＬＴＲＰが低減したＨＰＣへのそれらの運命を改変する。細胞周期および細胞運命は、多くの幹細胞型におけるクロマチンリモデリングによって密接に関連している８５。本明細書に提示されたデータは、インビトロでの最初のＨＳＣ分裂中の特定の細胞周期期間における改変がヒトＨＳＣ系統運命およびＬＴＲＰを改変するのに十分であることを明らかにする。
【０１４４】
さらに、この研究では、ＰＧＥ２またはＣｈｋ１のいずれかは、付随するｐ３８阻害がＧ２Ｍ蓄積を有意に無効にし、さらに重要なことに、ＨＳＣにおけるＤＤＲを低減することを必要とし、これらの組み合わされた効果は、周期成体ＨＳＣのＣＲＵ能をほぼ５倍向上させことが見出された。ＰＧＥ２は、遺伝毒性ストレスに対してより脆弱である、リンパ性バイアスＨＳＣの生存を媒介することも企図される７３。それにもかかわらず、本明細書に提示される研究は、周期ＨＳＣのベクター媒介遺伝子導入またはヌクレアーゼ媒介遺伝子修正の両方についての重要な機構的洞察に基づく解決法、ならびにそれらの系統運命およびＬＴＲＰの改変を防止する方法を提供する。
【０１４５】
加えて、ＤＤＲは非周期遺伝子操作ＨＳＣでも活性化されるが、ＨＳＣは静止している場合にこの遺伝毒性ストレスに対してはるかに耐性があるように思われることが観察された。したがって、ＮＨＥＪを介した遺伝子破壊を対象としたＧＥ方法論は、周期ＨＳＣのＧＥに関連する遺伝毒性ストレスを維持することなく、静止ＨＳＣを標的とすることができ、ここで、ｐ３８ｉはＤＤＲを弱め、おそらく再生ストレスを低減することができる。翻訳の観点から、本明細書に提示されるこれらの研究は、ＲＶおよびＬＶ  ＧＴ試験の結果の根拠を説明し、高いインビトロ遺伝子編集効率にもかかわらず、（周期ＨＳＣにおいてＨＤＲが発生する場合）遺伝子標的ＨＳＰＣの低いインビボ生着を説明する。
【０１４６】
要約すると、遺伝子導入によるＬＴＲＰの喪失およびＨＳＣ運命変化のメカニズムを特定することによって、本明細書に提示されているのは、ＨＳＣの異なる細胞周期における遺伝子導入／修復、ならびにまたベクター媒介およびＧＥ媒介ＨＤＲに適用可能である、ｐ３８ストレスシグナル伝達の阻害およびＨＩＦ−１αの安定化による周期ＨＳＣの遺伝子操作の手段に対する重要な洞察である。
【０１４７】
例示的な方法
ヒトＣＤ３４＋細胞単離、培養、および形質導入
新鮮なＧ−ＣＳＦ動員末梢血細胞を、ＩＲＢ承認プロトコルを用いて（全対象からインフォームドコンセントを得て）健常なボランティアからアフェレーシスによって収集し、以前２１記載されたようにＣｌｉｎｉＭａｃ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ドイツ）またはＩｎｄｉｒｅｃｔ  ＣＤ３４Ｍｉｃｒｏ  Ｂｅａｄ  Ｋｉｔ、ヒト（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．Ｂｉｓｌｅｙ、ドイツ）を用いて９５％より高い純度まで正の選択に供した。新鮮なまたは凍結保存されたＣＤ３４＋をエクスビボ培養および形質導入のために新たに使用した。対照として、新たに単離されたＣＤ３４＋細胞を直ちにＮＳＧマウスに移植した。いくつかの実験では、正常骨髄ドナー由来のＣＤ３４＋細胞を購入した。
【０１４８】
新たに単離されたＣＤ３４＋細胞を、可能な限り、特に０時間の対照に使用した。いくつかの実験では、凍結保存されたＣＤ３４＋細胞を、サイトカインを含有するＩＭＤＭ中で４時間解凍し、次いで洗浄し、実験に使用した。ＣＤ３４＋細胞を、２％ヒト血清アルブミン（Ｂａｘｔｅｒ）、組み換えヒトＦｌｔ−３リガンド（Ｆｌｔ３−Ｌ、２００ｎｇ／ｍＬ）、幹細胞因子（ＳＣＦ、３００ｎｇ／ｍＬ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ、１００ｎｇ／ｍＬ）（全てのサイトカインはＰｅｐｒｏＴｅｃｈから入手）、およびペニシリン−ストレプトマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が補充されたＸ−ＶＩＶＯ１０（Ｌｏｎｚａ）培地において、レトロネクチン（４μｇ／ｃｍ２、ＣＨ−２９６、Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．）でコーティングされた非組織培養処理プレート上で形質導入した。ＬＶ形質導入のために、ＣＤ３４＋細胞（２−５×１０６／ｍＬ）を、４〜８時間予備刺激し、培地体積ｍＬあたり５Ｘ１０７〜１Ｘ１０８感染単位（ＩＵ）のベクター濃度を維持するレンチウイルスベクター（ＬＶ）で、１２〜１４時間あけて２回形質導入した。細胞を合計１８〜２４時間、３６〜４２時間、または７２〜９６時間のいずれかにわたって培養し続けた。ＲＶ形質導入のために、ヒトＣＤ３４＋細胞を３×１０５細胞／ｍｌの細胞密度で約２日間（４２〜４８時間）予備刺激した。レトロネクチンでコーティングされた組織培養フラスコまたはプレートに、室温でＧＡＬＶシュードタイプＲＶを各々１時間にわたって２回予備装填した。ベクター上清を除去し、細胞をＲＶ装填レトロネクチン被覆フラスコに装填した。ＲＶ形質導入もまた、５〜１０の範囲のＭＯＩで２４時間あけて２回行った。合計７２〜９６時間の培養後、細胞を採取した。ＬＶおよびＲＶ形質導入を、周囲酸素濃度（２０％Ｏ２）中、５％ＣＯ２下、３７℃で行った。いくつかの実験について、ＬＶをＲＶと同様に２日間の予備刺激後に添加した。ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤Ｂｉｒｂ７９６（６００ｎＭ）、Ｖｘ−７４５（１μＭ）、またはＬＹ２２２８８２０（５００ｎＭ）（全てＳｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ製）を培地に補充した。Ｃｈｋ１阻害剤：ＭＫ−８７７６（１μＭ）（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ  Ｓ２７３５）またはＣｈｋ２阻害剤：ＰＶ１０１９（１μＭ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ２２０４８８）を形質導入のみで添加し、１６，１６ジメチルプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）（１０μＭ）（Ｃａｙｍａｎ）を培養の開始時、最初の形質導入時、および採取の１時間前に添加した。Ｎ−アセチルシステインアミド（ＮＡＣＡ）（Ｓｉｇｍａ  Ａ０７３７）を記載の濃度で使用した。
【０１４９】
形質導入後、細胞を採取し、洗浄し、ＰＢＳに再懸濁し、１３５Ｃ供給源（Ｍａｒｋ  Ｉ  Ｍｏｄｅｌ６８Ａ  Ｉｒｒａｄｉａｔｏｒ，Ｊ．Ｌ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ  ａｎｄ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓａｎ  Ｆｅｒｎａｎｄｏ，ＣＡ）を使用して、２８０ｃＧｙ照射を受けたＮＳＧマウスに（マウスあたり１×１０６細胞）を静脈内注射した。いくつかの実験では、細胞の一部をＭｅｔｈｏＣｕｌｔ  ＧＦ４４３４（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、バンクーバー、カナダ）上に播種して、コロニー形成単位細胞（ＣＦＣ）において１４日目の遺伝子導入効率を決定し、液体培養において７日目のｅＧＦＰ＋細胞のパーセンテージを推定した。
【０１５０】
異種移植
ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスを、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）から購入した。全ての動物は、特定の病原体を含まない環境において飼育および維持され、全ての実験は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）によって承認された。８〜１４週齢のオスおよびメスＮＳＧマウスに、照射の１週間前、その間、およびその２週間後ドキシサイクリン飼料（ＴｅｓｔＤｉｅｔ、０．０６２５％ドキシサイクリンを含むＭｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｒｏｌａｂ  ＲＭＨ−１５００）を与えた。左右の大腿骨から６週および１２週に行われたＢＭ吸引を介して、骨髄（ＢＭ）におけるヒト生着を分析した。２４週後に犠死させた後、全ての一次マウス（１Ｔ）からの骨髄を採取した。いくつかの実験では末梢血分析も行った。マウスＣＤ４５＋細胞を、ビオチンラット抗マウスＣＤ４５（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ５５３０７８）およびストレプトアビジン粒子プラス−ＤＭ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ５５７８１２）を用いて、各１Ｔマウスから別々に採取されたＢＭから枯渇させ、１匹の照射された（２８０ｃＧｙ）二次ＮＳＧマウスに注入した後に、二次移植（２Ｔ）を行った。限界希釈移植から競合的再増殖単位（ＣＲＵ）を計算するために、Ｌ−Ｃａｌｃソフトウェア（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した。この研究に使用された全てのマウスは、無作為に処置群に割り当てた。いずれの動物も分析から除外しなかった。
【０１５１】
レンチウイルスおよびγ−レトロウイルスベクター構築物
レンチウイルスベクター（ＬＶ）ｐＲＲＬ．ＳＩＮ．ｃＰＰＴ．ＭＮＤＵ３．ｅＧＦＰ．ＷＰＲＥ８６は、ＭＮＤＵ３プロモーターの制御下で向上された緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする。ベクターは、ＶＳＶ−Ｇエンベロープを用いてパッケージングされた。レトロウイルスベクター（ＲＶ）ｐＳＲＳ１１．ＥＦＳ．ＧＦＰ．ＰＲＥ（ＧＡＬＶ）８７は、短いＥＦ１α（ＥＦＳ）プロモーターの制御下でＧＦＰをコードし、ＧＡＬＶエンベロープを用いてパッケージングされた。
【０１５２】
フローサイトメトリー分析
ヒトＣＤ３４（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ５６０７１０または５５５８２４）、ＣＤ３８（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ４７−０３８９−４２）、ＣＤ９０（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ３２８１２０）、ＣＤ４５ＲＡ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ１７−０４５８−４２）、ＣＤ４９ｆ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ５５５７３６）、ＣＤ４５（ＢＤ５５４８５またはＢｉｏｌｅｇｅｎｄ３０４０２６）、ＣＤ３３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ２５−０３３８−４２）、ＣＤ１９（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ５５７７９１）、またはＣＤ３（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ５５５３４０）に対するＰＥ−Ｃｙａｎｉｎｅ７またはＡＰＣ−ｅＦｌｕｏｒ７８０、ＡＰＣまたはＰＥ複合抗体。細胞（約５×１０５〜１×１０６）を、適切なアイソタイプコントロールと製造業者の指示通りに抗体で標識するために使用した。ホスホフローについて、一次抗体ホスホ−ｐ３８（Ｔｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２、４０９２Ｓ）、ホスホ−ｐ４４／４２ＭＡＰＫ（ＥＲＫ１／２）（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４、４０９４Ｓ）、およびホスホ−ＪＮＫ（Ｔｈｒ１８３−Ｔｙｒ１８５ＰＥ複合体、５７５  ５Ｓ）（全てＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ製）を一晩染色に使用し、続いて洗浄およびヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）またはヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）またはＰａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ（Ｐ−１０９９４）抗体を含む二次抗体染色を行った。製造業者の説明書に従って、ＰＥアネキシンＶアポトーシス検出キット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ５５９７６３）を使用してアポトーシスアッセイを実施した。総ＲＯＳおよびミトコンドリア特異的ＲＯＳを、製造業者の指示に従って、それぞれ１０μＭのＣＭ−Ｈ２ＤＣＦＤＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃ６８２７）および５μＭのＭｉｔｏＳＯＸ  Ｒｅｄ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｍ３６００８）を用いて検出した。
【０１５３】
細胞周期分析のために、以前に記載されているように８８、細胞をまず表面マーカーで標識し、ＢＤ固定／透過処理溶液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ５５４７１４）を用いて固定および透過処理し、次いでＰｅｒＣＰ−Ｃｙ（商標）５．５抗Ｋｉ−６７（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ５６１２８４）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７抗−Ｋｉ−６７（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ５５８６１５）、およびＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｂ２２６１）で１０μｇ／ｍＬで染色した。ＥｄＵ取り込みアッセイのために、細胞を、培養期間を通して１０μＭ  ＥｄＵでインキュベートし、Ｃｌｉｃｋ−ｉｔ  Ｐｌｕｓ  ＥｄＵ  Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃ１０６３６）を染色に使用した。ＤＤＲ検出のために、固定および透過処理された細胞をＰＥマウス抗Ｈ２ＡＸ（ｐＳ１３９）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ５６２３７７）で染色した。試料をＦＡＣＳＣａｎｔｏ、Ｆｏｒｔｅｓｓａ、またはＬＳＲ２フローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に通し、データをＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（ＢＤ）によって分析した。いくつかの実験では、細胞を上記のように適切な抗体で染色し、次いでＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩセルソーターを用いて選別した。
【０１５４】
免疫蛍光
ＦＡＣＳ選別ＣＤ３４＋３８−９０＋細胞を２％パラホルムアルデヒドで固定し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて透過処理した。細胞を次いで、一次抗体抗ホスホＨ２ＡＸ（Ｓｅｒ１３９）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、０５−６３６）、抗５３ＢＰ１抗体（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、ＮＢ１００−９０４）、または抗ＨＩＦ−１α（ａｂ１０３０６３）で染色した。二次抗体について、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５９４複合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ａ−１１０３７）またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７複合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ａ−２１２４５）（共にＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を３７℃で１時間使用した。細胞を対比染色し、ＤＡＰＩを含むＶｅｃｔａＳｈｉｅｌｄ褪色防止封入剤（Ｈ−１２００Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で封入した。画像を、Ｎｉｋｏｎ９０ｉ直立顕微鏡を用いて得た。
【０１５５】
ヒトＣＤ３４＋細胞におけるＣａｓ９／ｇＲＮＡ  ＲＮＰのヌクレオポレーション
ＣＤ４５ｓｇＲＮＡを、ＧｅｎｅＡｒｔ（商標）Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ｇＲＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔを用いてアセンブリＰＣＲおよびインビトロ転写により合成した。ｓｇＲＮＡ試料の品質を、それを１０％Ｎｏｖｅｘ（商標）ＴＢＥ−尿素ゲル上で泳動することにより決定し、１００塩基での離散バンドが無傷のｓｇＲＮＡを示した。Ｃａｓ９緩衝液を、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１０％グリセロール、および１ｍＭのＴＣＥＰで調製した。解凍され、４４時間予備刺激されたヒトＭＰＢ由来ＣＤ３４＋細胞をＣａｓ９ＲＮＰでのヌクレオフェクションに供した。Ｃａｓ９ＲＮＰを、以前に記載されたように、ＣＤ３４＋細胞のヌクレオフェクション直前に組み立てた２９。２０μＬの細胞懸濁液（１５０，０００〜２００，０００細胞）をＣａｓ９ＲＮＰでヌクレオフェクトするために、Ｃａｓ９緩衝液中に１２０ｐｍｏｌのｓｇＲＮＡを含有する５μＬの溶液を調製した。Ｃａｓ９緩衝液中に１００ｐｍｏｌのＣａｓ９タンパク質を含有する５μＬの溶液を調製し、約３０秒間かけてゆっくりとｓｇＲＮＡ溶液に添加し、室温で２０分間インキュベートした。各ヌクレオフェクションについて、１５０，０００〜２００，０００のＣＤ３４＋細胞を２０μＬのＰ３溶液（Ｌｏｎｚａ）に再懸濁し、１０μＬのＣａｓ９ＲＮＰと混合した。この混合物を次いで、Ｅ０１００プログラムを用いてＬｏｎｚａ４Ｄヌクレオフェクターを用いてヌクレオフェクトした。ヌクレオフェクトされた細胞を（上記のようにヒトサイトカインを補充した）新鮮な培地に回収し、さらなる時間３７℃で培養した。細胞を、細胞周期染色のためにヌクレオフェクション後６および２４時間で採取した。残りの細胞を、ジェノタイピングおよびフローサイトメトリーのためのＣＤ４５染色の前にさらに５〜８日間培養した。
【０１５６】
定量的ＰＣＲ分析
１つの実験において、ｐ３８ｉでの２４時間および７２時間の処理ありならびに処理なしでのＦＡＣＳ選別培養および形質導入ＣＤ３４＋３８−９０＋４５ＲＡ−４９ｆ＋ＨＳＣからのＲＮＡについてＲＮＡｓｅｑ分析を行った。ｑＲＴ  ＰＣＲのために、培養および形質導入された細胞を採取し、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａセルソーター（ＢＤ）を用いてＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ９０＋マーカーについて直接ＴＲＩ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｉｎｃ．）に選別した。クロロホルムによる相分離およびイソプロパノールによる沈殿で全ＲＮＡを精製した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＶ  ＶＩＬＯ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ１１７５６０５０）を用いてｃＤＮＡを生成した。以下：ＦＺＤ３Ｈｓ００１８４０４３＿ｍ１、ＷＮＴ５Ｂ  Ｈｓ０１０８６８６４＿ｍ１、ｐ３４ＣＤＣ２Ｈｓ００９３８７７７＿ｍ１（ＡＢＩ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、４３３１１８２）のようなプライマー／プローブセットを使用してｑＰＣＲによりｃＤＮＡを増幅し、ＡＢＩ７９００高速リアルタイムＰＣＲシステム上で分析した。ｑＰＣＲ設定に使用したマスターミックスは、ｉＴａｑ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ＢｉｏＲａｄ１７２５１３４）であった。遺伝子発現レベルは、ヒトグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）（ＡＢＩ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に対して正規化したΔΔＣｔ法を用いて計算した。
【０１５７】
統計分析
データは、平均±標準誤差（ＳＥＭ）として表す。群に応じて、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（Ｖ．７）ソフトウェアを使用して、図の凡例に示されるように、両側マン・ホイットニーＵ検定、対応のあるスチューデントｔ検定、またはウィルコクソン検定、ログランク検定を用いることによってデータを分析した。二群間の対比較を行ったので、多重比較検定は用いなかった。Ｐ値≦０．０５を有意とみなした。
【０１５８】
実施例において引用されている参考文献
１  Ｈａｃｅｉｎ−Ｂｅｙ−Ａｂｉｎａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｌ  ｏｎｃｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ４  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ａｆｔｅｒ  ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ＳＣＩＤ−Ｘ１．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ１１８，３１３２−３１４２（２００８）．
２  Ｇｉｎｎ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｌｙｍｐｈｏｍａｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ＳＣＩＤ−Ｘ１ｍｉｃｅ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｆ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｌ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｇａｍｍａｃ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １８，９６５−９７６，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔ．２０１０．５０（２０１０）．
３  Ｎｅｇｒｅ，Ｏ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ａｎｄ  ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｂｅｔａ−ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ  ａｎｄ  ｓｉｃｋｌｅ  ｃｅｌｌ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ１５，６４−８１（２０１５）．
４  Ｉｍｒｅｎ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ  ｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ  ｉｎｔｒａｇｅｎｉｃ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ１１４，９５３−９６２（２００４）．
５  Ｉｍｒｅｎ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｅｒｍａｎｅｎｔ  ａｎｄ  ｐａｎｅｒｙｔｈｒｏｉｄ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ｂｅｔａ  ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ  ｂｙ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ９９，１４３８０−１４３８５（２００２）．
６  Ｐａｗｌｉｕｋ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｃｋｌｅ  ｃｅｌｌ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌｓ  ｂｙ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２９４，２３６８−２３７１（２００１）．
７  Ｍａｙ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｈａｅｍｏｇｌｏｂｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  ｂｅｔａ−ｔｈａｌａｓｓａｅｍｉｃ  ｍｉｃｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ−ｅｎｃｏｄｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ．Ｎａｔｕｒｅ４０６，８２−８６（２０００）．
８  Ｒｉｖｅｌｌａ，Ｓ．，Ｍａｙ，Ｃ．，Ｃｈａｄｂｕｒｎ，Ａ．，Ｒｉｖｉｅｒｅ，Ｉ．＆  Ｓａｄｅｌａｉｎ，Ｍ．Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｃｏｏｌｅｙ  ａｎｅｍｉａ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｅｓｃｕｅ  ｂｙ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｂｌｏｏｄ１０１，２９３２−２９３９（２００３）．
９  Ｐｅｒｓｏｎｓ，Ｄ．Ａ．，Ｈａｒｇｒｏｖｅ，Ｐ．Ｗ．，Ａｌｌａｙ，Ｅ．Ｒ．，Ｈａｎａｗａ，Ｈ．＆Ｎｉｅｎｈｕｉｓ，Ａ．Ｗ．Ｔｈｅ  ｄｅｇｒｅｅ  ｏｆ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ｂｅｔａ−ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｇａｍｍａ−ｇｌｏｂｉｎ  ｇｅｎｅ  ｉｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｄ  ｂｙ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ａｎｄ  ｖｅｃｔｏｒ  ｃｏｐｙ  ｎｕｍｂｅｒ．Ｂｌｏｏｄ１０１，２１７５−２１８３（２００３）．
１０  Ｐｅｓｔｉｎａ，Ｔ．Ｉ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ｓｉｃｋｌｅ  ｃｅｌｌ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｕｓｉｎｇ  ｇａｍｍａ−ｇｌｏｂｉｎ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｔｏ  ｍｅｄｉａｔｅ  ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｆｅｔａｌ  ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ１７，２４５−２５２（２００９）．
１１  Ｐｕｔｈｅｎｖｅｅｔｉｌ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｂｅｔａ−ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ  ｍａｊｏｒ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ．Ｂｌｏｏｄ１０４，３４４５−３４５３（２００４）．
１２  Ａｒｕｍｕｇａｍ，Ｐ．Ｉ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｓｅｌｆ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｃａｒｒｙｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｈｉｃｋｅｎ  ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ−４（ｃＨＳ４）ｉｎｓｕｌａｔｏｒ  ｅｌｅｍｅｎｔ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １５，１８６３−１８７１，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｊ．ｍｔ．６３００２５９（２００７）．
１３  Ｐｅｒｕｍｂｅｔｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｈｕｍａｎ  ｇａｍｍａ−ｇｌｏｂｉｎ  ｇｅｎｅ  ｖｅｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｃｋｌｅ  ｃｅｌｌ  ａｎｅｍｉａ  ｉｎ  ａ  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ｓｉｃｋｌｅ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ：ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｆｏｒ  ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ．Ｂｌｏｏｄ１１４，１１７４−１１８５，ｄｏｉ：１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ−２００９−０１−２０１８６３（２００９）．
１４  Ｋｉｅｍ，Ｈ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｉｇｔａｉｌｅｄ  ｍａｃａｑｕｅｓ  ａｓ  ａ  ｍｏｄｅｌ  ｔｏ  ｓｔｕｄｙ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎｏｐａｔｈｉｅｓ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｌｉｎ  Ｄｅｖ  １，１４０５５，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｍ．２０１４．５５（２０１４）．
１５  Ｒｏｍｅｒｏ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．ｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｆｏｒ  ｓｉｃｋｌｅ  ｃｅｌｌ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ，ｄｏｉ：１０．１１７２／ＪＣＩ６７９３０（２０１３）．
１６  Ａｋａｌａ，Ｏ．Ｏ．＆  Ｃｌａｒｋｅ，Ｍ．Ｆ．Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｇｅｎｅｔ  Ｄｅｖ１６，４９６−５０１（２００６）．
１７  Ｏｒｆｏｒｄ，Ｋ．Ｗ．＆  Ｓｃａｄｄｅｎ，Ｄ．Ｔ．Ｄｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ：ｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ｃｅｌｌ−ｃｙｃｌｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ９，１１５−１２８（２００８）．
１８  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｊ．＆  Ｋｉｍｂｌｅ，Ｊ．Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  ａｎｄ  ｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  ｓｔｅｍ−ｃｅｌｌ  ｄｉｖｉｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔｕｒｅ４４１，１０６８−１０７４（２００６）．
１９  Ｎｏｔｔａ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｃａｐａｂｌｅ  ｏｆ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ  ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）３３３，２１８−２２１，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２０１２１９（２０１１）．
２０  Ｇｉｒａｒｄ−Ｇａｇｎｅｐａｉｎ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｂａｂｏｏｎ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ  ＬＶｓ  ｏｕｔｐｅｒｆｏｒｍ  ＶＳＶ−Ｇ−ＬＶｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎｔｏ  ｅａｒｌｙ−ｃｙｔｏｋｉｎｅ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ａｎｄ  ｒｅｓｔｉｎｇ  ＨＳＣｓ．Ｂｌｏｏｄ１２４，１２２１−１２３１，ｄｏｉ：１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ−２０１４−０２−５５８１６３（２０１４）．
２１  Ｋａｎｇ，Ｅ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｃａｎ  ａｃｈｉｅｖｅ  ｓｔａｂｌｅ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｘｉｄａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ．Ｂｌｏｏｄ１１５，７８３−７９１，ｄｏｉ：１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ−２００９−０５−２２２７６０（２０１０）．
２２  Ｇｏｕｂｌｅ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｉｎ  ｔｏｔｏ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｌｉｖｅｒ  ｂｙ  ｍｅｇａｎｕｃｌｅａｓｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋ．Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ８，６１６−６２２，ｄｏｉ：１０．１００２／ｊｇｍ．８７９（２００６）．
２３  Ｈｏｂａｎ，Ｍ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｉｃｋｌｅ  ｃｅｌｌ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ／ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ１２５，２５９７−２６０４，ｄｏｉ：１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ−２０１４−１２−６１５９４８（２０１５）．
２４  Ｕｒｎｏｖ，Ｆ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｈｉｇｈｌｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．４３５，６４６−６５１（２００５）．
２５  Ｗａｎｇ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｄｒｉｖｅｎ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｉｎ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ＺＦＮ  ｍＲＮＡ  ａｎｄ  ＡＡＶ６ｄｏｎｏｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３３，１２５６−１２６３，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３４０８（２０１５）．
２６  Ｓａｔｈｅｒ，Ｂ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＣＲ５ｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｍｅｇａＴＡＬ  ｎｕｃｌｅａｓｅ  ａｎｄ  ＡＡＶ  ｄｏｎｏｒ  ｔｅｍｐｌａｔｅ．Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ７，３０７ｒａ１５６，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｔｒａｎｓｌｍｅｄ．ａａｃ５５３０（２０１５）．
２７  Ｇｅｎｏｖｅｓｅ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ  ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ５１０，２３５−２４０，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１３４２０（２０１４）．
２８  Ｈｏｂａｎ，Ｍ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｉｃｋｌｅ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  ＣＤ３４＋ｃｅｌｌｓ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ２４，１５６１−１５６９，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔ．２０１６．１４８（２０１６）．
２９  ＤｅＷｉｔｔ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ−ｆｒｅｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｉｃｋｌｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ａｄｕｌｔ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ／ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ８，３６０ｒａ１３４，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｔｒａｎｓｌｍｅｄ．ａａｆ９３３６（２０１６）．
３０  Ａｉｕｔｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｗｉｓｋｏｔｔ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ３４１，１２３３１５１，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２３３１５１（２０１３）．
３１  Ｃａｒｔｉｅｒ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ａ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ  ｉｎ  Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ  ａｄｒｅｎｏｌｅｕｋｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ３２６，８１８−８２３（２００９）．
３２  Ｂｉｆｆｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｂｅｎｅｆｉｔｓ  ｍｅｔａｃｈｒｏｍａｔｉｃ  ｌｅｕｋｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ３４１，１２３３１５８，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２３３１５８（２０１３）．
３３  Ｃａｖａｚｚａｎａ−Ｃａｌｖｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ａｎｄ  ＨＭＧＡ２ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｂｅｔａ−ｔｈａｌａｓｓａｅｍｉａ．Ｎａｔｕｒｅ４６７，３１８−３２２，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０９３２８（２０１０）．
３４  Ｃｈｏｕ，Ｓ．，Ｃｈｕ，Ｐ．，Ｈｗａｎｇ，Ｗ．＆Ｌｏｄｉｓｈ，Ｈ．Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ７，４２７−４２８，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍ．２０１０．０９．００１（２０１０）．
３５  Ｈｕａｎｇ，Ｊ．，Ｎｇｕｙｅｎ−ＭｃＣａｒｔｙ，Ｍ．，Ｈｅｘｎｅｒ，Ｅ．Ｏ．，Ｄａｎｅｔ−Ｄｅｓｎｏｙｅｒｓ，Ｇ．＆Ｋｌｅｉｎ，Ｐ．Ｓ．Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｗｎｔ  ａｎｄ  ｍＴＯＲ  ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ１８，１７７８−１７８５，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ．２９８４（２０１２）．
３６  Ｚｏｕ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐ３８  ＭＡＰＫ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｅｘ  ｖｉｖｏ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ９１，８１３−８２３，ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ００２７７−０１１−１３９７−７（２０１２）．
３７  Ｉｔｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ａｃｔ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｐ３８  ＭＡＰＫ  ｔｏ  ｌｉｍｉｔ  ｔｈｅ  ｌｉｆｅｓｐａｎ  ｏｆ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ１２，４４６−４５１，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ１３８８（２００６）．
３８  Ｚｈａｎｇ，Ｃ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅ  ｅｘ  ｖｉｖｏ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ１２，２４０−２４５，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ１３４２（２００６）．
３９  Ｈｏｇｇａｔｔ，Ｊ．，Ｓｉｎｇｈ，Ｐ．，Ｓａｍｐａｔｈ，Ｊ．＆Ｐｅｌｕｓ，Ｌ．Ｍ．Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｅ２  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｈｏｍｉｎｇ，ｓｕｒｖｉｖａｌ，ａｎｄ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．Ｂｌｏｏｄ１１３，５４４４−５４５５，ｄｏｉ：１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ−２００９−０１−２０１３３５（２００９）．
４０  Ｈｏｇｇａｔｔ，Ｊ．，Ｍｏｈａｍｍａｄ，Ｋ．Ｓ．，Ｓｉｎｇｈ，Ｐ．＆Ｐｅｌｕｓ，Ｌ．Ｍ．Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｅ２  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｂｕｔ  ｄｏｅｓ  ｎｏｔ  ｐｅｒｍａｎｅｎｔｌｙ  ａｌｔｅｒ  ｉｎｈｅｒｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅｎｅｓｓ．Ｂｌｏｏｄ１２２，２９９７−３０００，ｄｏｉ：１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ−２０１３−０７−５１５２８８（２０１３）．
４１  Ｎｏｒｔｈ，Ｔ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｅ２  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ．Ｎａｔｕｒｅ４４７，１００７−１０１１，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０５８８３（２００７）．
４２  Ｇｏｅｓｓｌｉｎｇ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｅ２  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ  ａｎｄ  ｓｈｏｗｓ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｓａｆｅｔｙ  ｉｎ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｎｏｎｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｔｅ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｍｏｄｅｌｓ．Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ８，４４５−４５８，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍ．２０１１．０２．００３（２０１１）．
４３  Ｂｏｉｔａｎｏ，Ａ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ａｒｙｌ  ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｔｈｅ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ３２９，１３４５−１３４８，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１９１５３６（２０１０）．
４４  Ｗａｇｎｅｒ，Ｊ．Ｅ．，Ｊｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｈａｓｅ  Ｉ／ＩＩ  Ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ＳｔｅｍＲｅｇｅｎｉｎ−１Ｅｘｐａｎｄｅｄ  Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  Ｃｏｒｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｓｕｐｐｏｒｔｓ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ａｓ  ａ  Ｓｔａｎｄ−Ａｌｏｎｅ  Ｇｒａｆｔ．Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ１８，１４４−１５５，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍ．２０１５．１０．００４（２０１６）．
４５  Ｆａｒｅｓ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ．Ｐｙｒｉｍｉｄｏｉｎｄｏｌｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｒｅ  ａｇｏｎｉｓｔｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４５，１５０９−１５１２，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２５６３３７（２０１４）．
４６  Ｃｈｅｎ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ．Ｇ９ａ／ＧＬＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｈｉｓｔｏｎｅ  Ｈ３Ｋ９ｍｅ２ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ  ｄｕｒｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅａｇｅ  ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ２６，２４９９−２５１１ｄｏｉ：１０．１１０１／ｇａｄ．２００３２９．１１２（２０１２）．
４７  Ｈａｏ，Ｑ．Ｌ．，Ｓｈａｈ，Ａ．Ｊ．，Ｔｈｉｅｍａｎｎ，Ｆ．Ｔ．，Ｓｍｏｇｏｒｚｅｗｓｋａ，Ｅ．Ｍ．＆Ｃｒｏｏｋｓ，Ｇ．Ｍ．Ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ＣＤ３４＋ＣＤ３８−ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ．Ｂｌｏｏｄ８６，３７４５−３７５３（１９９５）．
４８  Ｂａｋｋｅｒ，Ｓ．Ｔ．＆Ｐａｓｓｅｇｕｅ，Ｅ．Ｒｅｓｉｌｉｅｎｔ  ａｎｄ  ｒｅｓｏｕｒｃｅｆｕｌ：ｇｅｎｏｍｅ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ４１，９１５−９２３，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｅｘｐｈｅｍ．２０１３．０９．００７（２０１３）．
４９  Ｃｕａｄｒａｄｏ，Ａ．＆Ｎｅｂｒｅｄａ，Ａ．Ｒ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｐ３８  ＭＡＰＫ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ．Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ４２９，４０３−４１７，ｄｏｉ：１０．１０４２／ｂｊ２０１００３２３（２０１０）．
５０  Ｂａｕｄｅｔ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．ＲＮＡｉ  ｓｃｒｅｅｎ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ＭＡＰＫ１４  ａｓ  ａ  ｄｒｕｇｇａｂｌｅ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ．Ｂｌｏｏｄ１１９，６２５５−６２５８，ｄｏｉ：１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ−２０１２−０１−４０３９４９（２０１２）．
５１  Ｇｏｅｓｓｌｉｎｇ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＧＥ２ａｎｄ  Ｗｎｔ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ１３６，１１３６−１１４７，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２００９．０１．０１５（２００９）．
５２  Ｃｕｔｌｅｒ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ−ｍｏｄｕｌａｔｅｄ  ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｂｌｏｏｄ１２２，３０７４−３０８１，ｄｏｉ：１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ−２０１３−０５−５０３１７７（２０１３）．
５３  Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎ，Ａ．＆Ｆｒｅｎｅｔｔｅ，Ｐ．Ｓ．Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｎｉｃｈｅ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｄｕｒｉｎｇ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ  ａｎｄ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ２０，８３３−８４６，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ．３６４７（２０１４）．
５４  Ｔｈｏｒｎｈｉｌｌ，Ｓ．Ｉ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｌｆ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｇａｍｍａｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ  ｓｅｖｅｒｅ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ１６，５９０−５９８（２００８）．
５５  Ｚｙｃｈｌｉｎｓｋｉ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ  ｒｅｄｕｃｅ  ｔｈｅ  ｇｅｎｏｔｏｘｉｃ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ  ｇｅｎｅ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ１６，７１８−７２５（２００８）．
５６  Ｈａｃｅｉｎ−Ｂｅｙ−Ａｂｉｎａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｇａｍｍａ−ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ  ｆｏｒ  Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ  ｓｅｖｅｒｅ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ３７１，１４０７−１４１７，ｄｏｉ：１０．１０５６／ＮＥＪＭｏａ１４０４５８８（２０１４）．
５７  Ｄｅ  Ｒａｖｉｎ，Ｓ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ  ｓｅｖｅｒｅ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ８，３３５ｒａ３５７，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｔｒａｎｓｌｍｅｄ．ａａｄ８８５６（２０１６）．
５８  Ｚｈｏｕ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｌ  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂｌｏｃｋｅｄ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅｄ  Ｔｈｙｍｏｃｙｔｅｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ２４，１０９０−１０９９，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔ．２０１６．５５（２０１６）．
５９  Ｋｅｌｌｙ，Ｐ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎ  Ｆａｎｃｏｎｉ  ａｎｅｍｉａ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ１５，２１１−２１９（２００７）．
６０  Ｓａｄｅｌａｉｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ａ  ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ  ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌ  ｔｏ  ｅｖａｌｕａｔｅ  ｇｌｏｂｉｎ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎ  ｂｅｔａ−ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ．Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ１２０２，５２−５８，ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．１７４９−６６３２．２０１０．０５５９７．ｘ（２０１０）．
６１  Ｌｅｗｉｓ，Ｐ．Ｆ．＆Ｅｍｅｒｍａｎ，Ｍ．Ｐａｓｓａｇｅ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｍｉｔｏｓｉｓ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｏｎｃｏｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ６８，５１０−５１６（１９９４）．
６２  Ｈｕｎｔｓｍａｎ，Ｈ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍａｎ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｃａｎ  ｂｅ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ＣＤ４９ｆ  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｂｌｏｏｄ１２６，１６３１−１６３３，ｄｏｉ：１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ−２０１５−０７−６６０６７０（２０１５）．
６３  Ｋｕｂｏｔａ，Ｙ．，Ｔａｋｕｂｏ，Ｋ．＆Ｓｕｄａ，Ｔ．Ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｌｏｎｇ  ｌａｂｅｌ−ｒｅｔａｉｎｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｒｅｓｉｄｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｉｎｕｓｏｉｄａｌ  ｈｙｐｏｘｉｃ  ｎｉｃｈｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ３６６，３３５−３３９，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｂｒｃ．２００７．１１．０８６（２００８）．
６４  Ｍａｎｔｅｌ，Ｃ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｂｙ  Ｍｉｔｉｇａｔｉｎｇ  Ｏｘｙｇｅｎ  Ｓｈｏｃｋ．Ｃｅｌｌ１６１，１５５３−１５６５，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１５．０４．０５４（２０１５）．
６５  ＭｃＧｕｉｒｅ，Ｖ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｒｏｓｓ  ｔａｌｋ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｈｅ  Ａｋｔ  ａｎｄ  ｐ３８ａｌｐｈａ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｏｆ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ３３，４１５２−４１６５，ｄｏｉ：１０．１１２８／ｍｃｂ．０１６９１−１２（２０１３）．
６６  Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｒ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＬＹ２２２８８２０  ｄｉｍｅｓｙｌａｔｅ，ａ  ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｐ３８  ＭＡＰＫ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ１３，３６４−３７４，ｄｏｉ：１０．１１５８／１５３５−７１６３．ｍｃｔ−１３−０５１３（２０１４）．
６７  Ｐａｒｇｅｌｌｉｓ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐ３８  ＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅ  ｂｙ  ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ９，２６８−２７２，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｓｂ７７０（２００２）．
６８  Ｓｋａｌｋａ，Ａ．Ｍ．＆Ｋａｔｚ，Ｒ．Ａ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ＤＮＡ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  １２  Ｓｕｐｐｌ１，９７１−９７８，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｊ．ｃｄｄ．４４０１５７３（２００５）．
６９  Ｗａｌｔｅｒ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｉｔ  ｆｒｏｍ  ｄｏｒｍａｎｃｙ  ｐｒｏｖｏｋｅｓ  ＤＮＡ−ｄａｍａｇｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｔｔｒｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ５２０，５４９−５５２，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１４１３１（２０１５）．
７０  Ｆｌｏｒｉａｎ，Ｍ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｔｏ  ｎｏｎ−ｃａｎｏｎｉｃａｌ  Ｗｎｔ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｓｗｉｔｃｈ  ｉｎ  ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ−ｃｅｌｌ  ａｇｅｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ５０３，３９２−３９６，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１２６３１（２０１３）．
７１  Ｇｅｉｇｅｒ，Ｈ．，ｄｅ  Ｈａａｎ，Ｇ．＆Ｆｌｏｒｉａｎ，Ｍ．Ｃ．Ｔｈｅ  ａｇｅｉｎｇ  ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ．Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１３，３７６−３８９，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｉ３４３３（２０１３）．
７２  Ｋｈｏｏ，Ｍ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｒｅｖｅａｌｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ａｌｔｅｒｅｄ  Ｗｎｔ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｌｏｓｓ  ｏｆ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｗｉｔｈ  ａｇｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ａｇｉｎｇ  ｃｅｌｌ１３，７４４−７５４，ｄｏｉ：１０．１１１１／ａｃｅｌ．１２２２９（２０１４）．
７３  Ｗａｎｇ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｅｒ２  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｌｉｍｉｔｓ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ−ｂｉａｓｅｄ  ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｌｙｍｐｈｏｐｏｉｅｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｅｘｔ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ａｎｄ  ａｇｅｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ１８，４８０−４９０，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｂ３３４２（２０１６）．
７４  Ｉｌｉａｋｉｓ，Ｇ．，Ｗａｎｇ，Ｙ．，Ｇｕａｎ，Ｊ．＆Ｗａｎｇ，Ｈ．ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｉｎ  ｃｅｌｌｓ  ｅｘｐｏｓｅｄ  ｔｏ  ｉｏｎｉｚｉｎｇ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ２２，５８３４−５８４７，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｊ．ｏｎｃ．１２０６６８２（２００３）．
７５  Ｓａｒｔｏｒｉ，Ａ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍａｎ  ＣｔＩＰ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ＤＮＡ  ｅｎｄ  ｒｅｓｅｃｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ４５０，５０９−５１４，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０６３３７（２００７）．
７６  Ｊａｚａｙｅｒｉ，Ａ．，ＭｃＡｉｎｓｈ，Ａ．Ｄ．＆Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｓ．Ｐ．Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓｉｎ３ｐ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ  ＤＮＡ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋ  ｒｅｐａｉｒ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ１０１，１６４４−１６４９，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０３０４７９７１０１（２００４）．
７７  Ｂｙｕｎ，Ｔ．Ｓ．，Ｐａｃｅｋ，Ｍ．，Ｙｅｅ，Ｍ．Ｃ．，Ｗａｌｔｅｒ，Ｊ．Ｃ．＆Ｃｉｍｐｒｉｃｈ，Ｋ．Ａ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｏｆ  ＭＣＭ  ｈｅｌｉｃａｓｅ  ａｎｄ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｔｈｅ  ＡＴＲ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ１９，１０４０−１０５２，ｄｏｉ：１０．１１０１／ｇａｄ．１３０１２０５（２００５）．
７８  Ｐｅｄｒａｚａ−Ａｌｖａ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐ３８  ＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋｓ  ｉｎ  Ｖ（Ｄ）Ｊ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａ  Ｇ２／Ｍ  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ．ＥＭＢＯ  Ｊ２５，７６３−７７３，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｊ．ｅｍｂｏｊ．７６００９７２（２００６）．
７９  Ｒｅｉｎｈａｒｄｔ，Ｈ．Ｃ．＆  Ｙａｆｆｅ，Ｍ．Ｂ．Ｋｉｎａｓｅｓ  ｔｈａｔ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ：Ｃｈｋ１，Ｃｈｋ２，ａｎｄ  ＭＫ２．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ２１，２４５−２５５，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｂ．２００９．０１．０１８（２００９）．
８０  Ｔａｋｕｂｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＨＩＦ−１ａｌｐｈａ  ｌｅｖｅｌ  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ７，３９１−４０２，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍ．２０１０．０６．０２０（２０１０）．
８１  Ｗｉｒｔｈｎｅｒ，Ｒ．，Ｗｒａｎｎ，Ｓ．，Ｂａｌａｍｕｒｕｇａｎ，Ｋ．，Ｗｅｎｇｅｒ，Ｒ．Ｈ．＆  Ｓｔｉｅｈｌ，Ｄ．Ｐ．Ｉｍｐａｉｒｅｄ  ＤＮＡ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋ  ｒｅｐａｉｒ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  ｃｈｅｍｏｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  ＨＩＦ−１  ａｌｐｈａ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ２９，２３０６−２３１６，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｃａｒｃｉｎ／ｂｇｎ２３１（２００８）．
８２  Ｓｐｅｔｈ，Ｊ．Ｍ．，Ｈｏｇｇａｔｔ，Ｊ．，Ｓｉｎｇｈ，Ｐ．＆Ｐｅｌｕｓ，Ｌ．Ｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｉｎ  ＨＩＦ１ａｌｐｈａ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｈｏｍｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ．Ｂｌｏｏｄ１２３，２０３−２０７，ｄｏｉ：１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ−２０１３−０７−５１６３３６（２０１４）．
８３  Ｔｅｓｉｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｑｕｉｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｒｅ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ＣＹＬＤ−ＴＲＡＦ２−ｐ３８ＭＡＰＫ  ｐａｔｈｗａｙ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ２１２，５２５−５３８，ｄｏｉ：１０．１０８４／ｊｅｍ．２０１４１４３８（２０１５）．
８４  Ｗａｎｇ，Ｙ．，Ｋｅｌｌｎｅｒ，Ｊ．，Ｌｉｕ，Ｌ．＆  Ｚｈｏｕ，Ｄ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐ３８  ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｅｘ  ｖｉｖｏ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ．Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ２０，１１４３−１１５２，ｄｏｉ：１０．１０８９／ｓｃｄ．２０１０．０４１３（２０１１）．
８５  Ｍａ，Ｙ．，Ｋａｎａｋｏｕｓａｋｉ，Ｋ．＆  Ｂｕｔｔｉｔｔａ，Ｌ．Ｈｏｗ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｉｍｐａｃｔｓ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ  ｃｅｌｌ  ｆａｔｅ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ６，１９，ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｇｅｎｅ．２０１５．０００１９（２０１５）．
８６  Ｒｏｂｅｒｔ−Ｒｉｃｈａｒｄ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｕｒｉｎｅ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ  Ｉｎｄｕｃｅ  Ｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｄｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｔｈａｔ  ｃａｎ  ｂｅ  Ｐａｒｔｉａｌｌｙ  Ｐｒｅｖｅｎｔｅｄ  ｂｙ  Ｉｎｓｕｌａｔｏｒｓ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ１５，１７３−１８２（２００７）．
８７  Ａｒｕｍｕｇａｍ，Ｐ．Ｉ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｔｏｘｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｌｉｎｅａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｃａｒｒｙｉｎｇ  ｔｈｅ  ｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ  ｌｏｃｕｓ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｒｅｇｉｏｎ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １７，１９２９−１９３７，ｄｏｉ：ｍｔ２００９１８３［ｐｉｉ］１０．１０３８／ｍｔ．２００９．１８３（２００９）．
８８  Ｗｉｌｓｏｎ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｙ  ｓｗｉｔｃｈ  ｆｒｏｍ  ｄｏｒｍａｎｃｙ  ｔｏ  ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ  ｄｕｒｉｎｇ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ  ａｎｄ  ｒｅｐａｉｒ．Ｃｅｌｌ１３５，１１１８−１１２９，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２００８．１０．０４８（２００８）．
【０１５９】
他の実施形態
本明細書に開示されている全ての特徴は、任意の組み合わせで組み合わされ得る。本明細書に開示されている各特徴は、同じ、同等、または類似の目的を果たす代替の特徴によって置き換えられ得る。したがって、他に明示的に述べられていない限り、開示された各特徴は、包括的な一連の同等または類似の特徴の一例にすぎない。
【０１６０】
上記の説明から、当業者は、本開示の本質的な特徴を容易に確認することができ、その趣旨および範囲から逸脱することなく、様々な使用および条件に適合させるために本開示に様々な変更および修正を行うことができる。したがって、他の実施形態も特許請求の範囲内にある。
【０１６１】
等価物
本明細書ではいくつかの発明の実施形態が説明および例示されたが、当業者であれば、機能を実行する、かつ／または結果および／もしくは本明細書に記載の利点の１つ以上を得るための様々な他の手段および／または構造を容易に想起し、そのような変形および／または修正の各々は、本明細書に記載の発明の実施形態の範囲内にあるとみなされる。より一般的には、当業者であれば、本明細書に記載の全てのパラメータ、寸法、材料、および構成が例示的であることを意味すること、ならびに実際のパラメータ、寸法、材料、および／または構成が発明の教示が使用される特定の用途（複数可）に依存するであろうことを容易に理解するであろう。当業者であれば、本明細書に記載の特定の発明の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または日常的な実験のみを用いて確認することができるであろう。したがって、前述の実施形態が例としてのみ提示されること、ならびに添付の特許請求の範囲およびその等価物の範囲内で、発明の実施形態が具体的に説明および特許請求される以外で実施され得ることを理解されたい。本開示の発明の実施形態は、本明細書に記載される各個々の特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法に関する。加えて、そのような特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法が互いに矛盾していない場合、２つ以上のそのような特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法の任意の組み合わせは、本開示の発明の範囲内に含まれる。
【０１６２】
本明細書で定義および使用される全ての定義は、辞書の定義、参照により組み込まれる文書中の定義、および／または定義された用語の通常の意味に優先すると理解されるべきである。
【０１６３】
本明細書に開示されている全ての参考文献、特許、および特許出願は、いくつかの場合では文書の全体を包含し得る、各々が引用されている主題に関して参照により組み込まれる。
【０１６４】
本明細書および特許請求の範囲で使用される不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、それとは反対に明確に示されていない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきである。
【０１６５】
本明細書および特許請求の範囲で使用される「および／または」という句は、そのように結合された要素、すなわち、いくつかの場合では結合的に存在し、他の場合では分離的に存在する要素の「いずれかまたは両方」を意味すると理解されるべきである。「および／または」で列挙された複数の要素は、同じように、すなわち、そのように結合された要素の「１つ以上」と解釈されるべきである。具体的に特定された要素に関連するかまたは関連しないかにかかわらず、「および／または」節によって具体的に特定された要素以外の他の要素が任意に存在し得る。したがって、非限定的な例として、「Ａおよび／またはＢ」への言及は、「含む」などのオープンエンド言語と共に使用される場合、一実施形態では、Ａのみ（任意にＢ以外の要素を含む）、別の実施形態では、Ｂのみ（任意にＡ以外の要素を含む）、さらに別の実施形態では、ＡおよびＢの両方（任意に他の要素を含む）、などを指すことができる。
【０１６６】
本明細書および特許請求の範囲で使用されるとき、「または」は、上で定義される「および／または」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、リスト中の項目を分離する場合、「または」または「および／または」は、包括的、すなわち、多数の要素またはそのリスト、および任意に追加の列挙されていない項目の、少なくとも１つを含むが、２つ以上も含むものとして解釈されるべきである。特許請求の範囲で使用される場合、「〜の１つのみ」または「〜の厳密に１つ」などのそれとは反対に明確に示された用語のみが、多数の要素またはそのリストの厳密に１つの要素の包含を指すであろう。一般に、本明細書で使用される「または」という用語は、「いずれか」、「〜の１つ」、「〜の１つのみ」、または「〜の厳密に１つ」などの排他性の用語が先行する場合にのみ排他的な代替物（すなわち、「両方ではない一方または他方」）を示すと解釈されるものとする。「本質的に〜からなる」は、特許請求の範囲において使用される場合、特許法の分野において使用されるその通常の意味を有するものとする。
【０１６７】
本明細書および特許請求の範囲で使用されるとき、１つ以上の要素のリストに関する「少なくとも１つ」という句は、要素のリスト中の要素のいずれか１つ以上から選択されるが、必ずしも要素のリスト内に具体的に列挙される要素の各々および全ての要素の少なくとも１つを含まず、要素のリスト中の要素のいずれの組み合わせも除外しない、少なくとも１つの要素を意味することが理解されるべきである。この定義はまた、「少なくとも１つ」という句が指す要素のリスト内で具体的に特定される要素以外の要素が、具体的に特定される要素に関連するかまたは関連しないかにかかわらず、任意に存在し得ることを可能にする。したがって、非限定的な例として、「ＡおよびＢの少なくとも一方」（または同等に、「ＡまたはＢの少なくとも一方」、または同等に「Ａおよび／またはＢの少なくとも一方」）は、一実施形態では、任意に２つ以上、Ａを含み、Ｂが存在しない（および任意にＢ以外の要素を含む）少なくとも１つ、別の実施形態では、任意に２つ以上、Ｂを含み、Ａが存在しない（および任意にＡ以外の要素を含む）少なくとも１つ、さらに別の実施形態では、任意に２つ以上、Ａを含む、少なくとも１つ、および任意に２つ以上、Ｂを含む（および任意に他の要素を含む）少なくとも１つ、などを指すことができる。
【０１６８】
それとは反対に明確に示されていない限り、２つ以上のステップまたは行為を含む本明細書で特許請求されるいかなる方法において、方法のステップまたは行為の順序は、必ずしも方法のステップまたは行為が列挙されている順序に限定されないことも理解されるべきである。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１４−４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２０−３】
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【国際調査報告】
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