(57)【要約】本発明は、小型化ヒトマイクロジストロフィン遺伝子を発現するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどの遺伝子治療用ベクター、ならびに横隔膜および心筋を含む骨格筋でマイクロジストロフィンを発現し、筋ジストロフィーを患っている対象において、筋繊維を損傷から保護し、筋力を増加させ、線維症を軽減および／または予防するためにこれらのベクターを使用する方法を提供する。一実施形態では、本発明は、筋肉特異的制御エレメントのヌクレオチド配列と、マイクロジストロフィンタンパク質をコードするヌクレオチド配列と、を含む、ｒＡＡＶベクターを提供する。【選択図】図１
2020513811.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
筋肉特異的制御エレメントのヌクレオチド配列と、マイクロジストロフィンタンパク質をコードするヌクレオチド配列と、を含む、組換えＡＡＶベクター。
【請求項２】
前記マイクロジストロフィンタンパク質をコードするヌクレオチド配列が、
ａ）配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも８５％同一であり、機能的マイクロジストロフィンタンパク質をコードするヌクレオチド配列、または
ｂ）配列番号１のヌクレオチド配列、を含む、請求項１に記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項３】
前記筋肉特異的制御エレメントが、ヒト骨格アクチン遺伝子エレメント、心臓アクチン遺伝子エレメント、筋細胞特異的エンハンサー結合因子（ＭＥＦ）、筋肉クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）、短縮型ＭＣＫ（ｔＭＣＫ）、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）、ハイブリッドα−ミオシン重鎖エンハンサー／ＭＣＫエンハンサープロモーター（ＭＨＣＫ７）、Ｃ５−１２、マウスクレアチンキナーゼエンハンサー因子、速筋骨格筋トロポニンｃ遺伝子エレメント、遅筋心臓トロポニンｃ遺伝子エレメント、遅筋トロポニンｉ遺伝子エレメント、低酸素誘導性核内因子、ステロイド誘導性エレメント、または糖質コルチコイド応答エレメント（ＧＲＥ）である、請求項１または２に記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項４】
前記筋肉特異的制御エレメントが、筋肉クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）またはハイブリッドα−ミオシン重鎖エンハンサー／ＭＣＫエンハンサープロモーター（ＭＨＣＫ７）である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項５】
前記筋肉特異的制御エレメントが、配列番号４のヌクレオチド配列を含む筋肉クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）、または配列番号２のヌクレオチド配列を含むハイブリッドα−ミオシン重鎖エンハンサー／ＭＣＫエンハンサープロモーター（ＭＨＣＫ７）である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項６】
配列番号１および２のヌクレオチド配列を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項７】
配列番号３のヌクレオチド配列を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項８】
配列番号１のヒトマイクロジストロフィンヌクレオチド配列および配列番号２のＭＨＣＫ７プロモーター配列を含む、組換えＡＡＶベクター。
【請求項９】
配列番号３のｐＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物のヌクレオチド配列を含む、組換えＡＡＶベクター。
【請求項１０】
配列番号１および４のヌクレオチド配列を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項１１】
配列番号５のヌクレオチド配列を含む、請求項１〜５または１０のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項１２】
前記ベクターが、血清型ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、またはＡＡＶ１３である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項１３】
前記筋肉特異的制御エレメントのヌクレオチド配列が、マイクロジストロフィンヌクレオチド配列に動作可能に連結されている、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶベクター。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶベクターと、薬学的に許容される担体と、を含む、組成物。
【請求項１５】
筋ジストロフィーを患っている対象において筋力または筋肉量を増加させる方法であって、治療有効量の、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶベクターまたは請求項１４に記載の組成物を投与することを含む、方法。
【請求項１６】
筋ジストロフィーを患っている対象において線維症を軽減または予防する方法であって、治療有効量の、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶベクターまたは請求項１４に記載の組成物を投与することを含む、方法。
【請求項１７】
筋ジストロフィーを治療する方法であって、治療有効量の、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶベクターまたは請求項１４に記載の組成物を投与することを含む、方法。
【請求項１８】
筋ジストロフィーを治療する方法であって、配列番号１のヒトマイクロジストロフィンヌクレオチド配列および配列番号２のＭＨＣＫ７プロモーターヌクレオチド配列を含む、治療有効量の組換えＡＡＶベクターを投与することを含む、方法。
【請求項１９】
筋ジストロフィーを治療する方法であって、配列番号３のｐＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物のヌクレオチド配列を含む、治療有効量の組換えＡＡＶベクターを投与することを含む、方法。
【請求項２０】
前記筋ジストロフィーがデュシェンヌ型筋ジストロフィーである、請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記組換えＡＡＶベクターまたは前記組成物が、筋肉内注射または静脈内注射により投与される、請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記組換えＡＡＶベクターまたは前記組成物が全身投与される、請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記組換えＡＡＶベクターまたは前記組成物が注射、注入、または移植により非経口投与される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
筋ジストロフィーを患っている対象において筋力または筋肉量を増加させるための、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶベクターを含む組成物。
【請求項２５】
筋ジストロフィーの治療のための、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶベクターを含む組成物。
【請求項２６】
筋ジストロフィーの治療のための、配列番号１のヒトマイクロジストロフィンヌクレオチド配列および配列番号２のＭＨＣＫ７プロモーター配列を含む組換えＡＡＶベクターを含む組成物。
【請求項２７】
筋ジストロフィーの治療のための、配列番号３のｐＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物ヌクレオチド配列を含む組換えＡＡＶベクターを含む組成物。
【請求項２８】
前記筋ジストロフィーがデュシェンヌ型筋ジストロフィーである、請求項２４〜２７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２９】
筋肉内注射または静脈内注射のために製剤化された、請求項２４〜２８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３０】
前記組換えＡＡＶベクターまたは前記組成物が全身投与される、請求項２４〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記組換えＡＡＶベクターまたは前記組成物が、注射、注入、または移植による非経口投与である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
筋ジストロフィーを患っている対象において筋力または筋肉量を増加させるための薬剤の調製のための、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶベクターまたは請求項１４に記載の組成物の使用。
【請求項３３】
筋ジストロフィーの治療のための薬剤の調製のための、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶベクターまたは請求項１４に記載の組成物の使用。
【請求項３４】
筋ジストロフィーを患っている対象において線維症を軽減または予防するための薬剤の調製のための、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶベクターまたは請求項１４に記載の組成物の使用。
【請求項３５】
筋ジストロフィーの治療のための薬剤の調製のための、配列番号１のヒトマイクロジストロフィンヌクレオチド配列および配列番号２のＭＨＣＫ７プロモーターヌクレオチド配列を含む、組換えＡＡＶベクターの使用。
【請求項３６】
筋ジストロフィーの治療のための、配列番号３のｐＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物のヌクレオチド配列を含む、組換えＡＡＶベクターの使用。
【請求項３７】
前記筋ジストロフィーがデュシェンヌ型筋ジストロフィーである、請求項３２〜３６のいずれか１項のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３８】
前記薬剤が筋肉内または静脈内投与のために製剤化される、請求項３２〜３７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３９】
前記薬剤が全身送達のために製剤化される、請求項３２〜３７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４０】
前記薬剤が、注射、注入、または移植による非経口投与のために製剤化される、請求項３９に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、国立衛生研究所／国立神経疾患・脳卒中研究所によって授与された助成金番号ＮＳ０５５９５８の下で政府の支援を受けてなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
この出願は、２０１７年３月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／４７３，１４８号の優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
電子的に提出された資料の参照による組み込み
本出願は、本開示の別個の部分として、以下のように識別されるコンピューター可読形式の配列表を含み、その全体が参照により組み込まれる：ファイル名：５１４７５＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ；サイズ：２９，５１９バイト、作成；２０１８年３月１３日。
【０００３】
本発明は、小型化ヒトマイクロジストロフィン遺伝子を発現するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどの遺伝子治療用ベクター、ならびにこれらのベクターを使用して横隔膜および心筋を含む骨格筋でマイクロジストロフィンを発現し、筋ジストロフィーを患っている対象において、筋繊維を損傷から保護し、筋力を増加させ、線維症を軽減および／または予防する方法を提供する。
【背景技術】
【０００４】
運動および呼吸などの日常活動、ならびに全身代謝のための筋肉量と筋力の重要性は明確である。筋肉機能の欠損は、筋力の低下と消耗を特徴とし、生活の質に深刻な影響を及ぼす筋ジストロフィー（ＭＤ）を生じさせる。最もよく特性評価されたＭＤは、ジストロフィン結合タンパク質複合体（ＤＡＰＣ）のメンバーをコードする遺伝子の変異に起因する。これらのＭＤは、ＤＡＰＣによる筋細胞膜−細胞骨格係留の喪失に関連する膜の脆弱性に起因する。デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、５０００人に１人の新生児男性が罹患する最も壊滅的な筋肉疾患のうちの１つである。
【０００５】
ＤＭＤは、ｍＲＮＡの減少と、ジストロフィン結合タンパク質複合体（ＤＡＰＣ）に結合する４２７ｋＤの筋細胞膜タンパク質であるジストロフィンの欠如をもたらすＤＭＤ遺伝子の変異によって引き起こされる（Ｈｏｆｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ５１（６）：９１９−２８，１９８７）。ＤＡＰＣは、筋細胞膜の複数のタンパク質で構成され、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）と、アクチン結合タンパク質であるジストロフィン、およびラミニン結合タンパク質であるアルファジストログリカンを介した細胞骨格との構造的な連結を形成する。これらの構造的な連結は、収縮中に筋肉細胞膜を安定させ、収縮による損傷から保護するように作用する。ジストロフィンの喪失により、膜の脆弱性は筋細胞膜の裂離とカルシウムの流入をもたらし、カルシウム活性化プロテアーゼと分節線維壊死を引き起こす（Ｓｔｒａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．１０（２）：１６８−７５，１９９７）。筋肉の変性と再生のこの制御不能のサイクルは、最終的に筋肉幹細胞集団を使い果たし（Ｓａｃｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１０．１４３（７）：ｐ．１０５９−７１；Ｗａｌｌａｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００９．７１：ｐ．３７−５７）、進行性の筋力低下、筋内膜炎、および線維性瘢痕をもたらす。
【０００６】
ジストロフィンまたはマイクロジストロフィンによる膜の安定化がなければ、ＤＭＤは組織損傷と修復の制御不能なサイクルを示し、最終的に、結合組織の増殖を通じて喪失した筋線維を線維性瘢痕組織に置き換える。線維症は、コラーゲンおよびエラスチンを含むＥＣＭマトリックスタンパク質の過剰な沈着を特徴とする。ＥＣＭタンパク質は、主に、ストレスおよび炎症に反応する活性化線維芽細胞によって放出されるＴＧＦβなどのサイトカインから生成される。ＤＭＤの主な病理学的特徴は筋線維の変性と壊死であるが、病理学的な結果としての線維症は同等の影響を及ぼす。線維組織の過剰産生は、筋肉の再生を制限し、ＤＭＤ患者の進行性の筋力低下の一因となる。ある研究では、初期のＤＭＤ筋生検での線維症の存在は、１０年間の追跡調査での運動転帰不良と高い相関があった（Ｄｅｓｇｕｅｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ  Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ，２００９．６８（７）：ｐ．７６２−７）。これらの結果は、線維症がＤＭＤ筋機能障害の主な原因であることを示しており、顕性線維症の前の早期介入の必要性を強調している。
【０００７】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、複製欠損パルボウイルスであり、その一本鎖ＤＮＡゲノムは、１４５ヌクレオチドの末端逆位配列（ＩＴＲ）を含む約４．７ｋｂの長さである。ＡＡＶの複数の血清型がある。ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は公知である。例えば、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）ゲノムのヌクレオチド配列は、Ｒｕｆｆｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ，７５：３３８５−３３９２（１９９４）によって修正されたＳｒｉｖａｓｔａｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，４５：５５５−５６４（１９８３）に提示されている。他の例として、ＡＡＶ−１の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受理番号ＮＣ＿００２０７７に提示されており、ＡＡＶ−３の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受理番号ＮＣ＿１８２９に提示されており、ＡＡＶ−４の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受理番号ＮＣ＿００１８２９に提示されており、ＡＡＶ−５ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受理番号ＡＦ０８５７１６に提示されており、ＡＡＶ−６の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受理番号ＮＣ＿００１８６２に提示されており、ＡＡＶ−７およびＡＡＶ−８のゲノムの少なくとも一部は、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ受理番号ＡＸ７５３２４６およびＡＸ７５３２４９に提示されており（ＡＡＶ−８に関する米国特許第７，２８２，１９９および同第７，７９０，４４９もまた参照されたい）、ＡＡＶ−９ゲノムは、Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１−６３８８（２００４）に提示されており、ＡＡＶ−１０ゲノムは、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：６７−７６（２００６）に提示されており、ＡＡＶ−１１ゲノムは、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５−３８３（２００４）に提示されている。ＡＡＶｒｈ．７４血清型のクローニングは、Ｒｏｄｉｎｏ−Ｋｌａｐａｃ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ５，４５（２００７）に記載されている。ウイルスＤＮＡ複製（ｒｅｐ）、カプシド形成／パッケージング、および宿主細胞染色体組込みを指示するＣｉｓ作用配列は、ＩＴＲ内に含有される。３つのＡＡＶプロモーター（それらの相対マップ位置に対してｐ５、ｐ１９、およびｐ４０と名付けられる）は、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をコードする２つのＡＡＶ内部オープンリーディングフレームの発現を駆動する。単一のＡＡＶイントロンの差異的スプライシング（例えば、ＡＡＶ２のヌクレオチド２１０７および２２２７における）と相まって、２つのｒｅｐプロモーター（ｐ５およびｐ１９）により、ｒｅｐ遺伝子から４つのｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、およびｒｅｐ４０）が生成される。Ｒｅｐタンパク質は、最終的にウイルスゲノムの複製に関与する複数の酵素特性を有する。ｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモーターから発現され、３つのカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３をコードする。選択的スプライシングおよび非コンセンサス翻訳開始部位は、３つの関連カプシドタンパク質の産生に関与する。単一コンセンサスポリアデニル化部位は、ＡＡＶゲノムのマップ位置９５に位置する。ＡＡＶの生活環および遺伝学は、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉ���  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５８：９７−１２９（１９９２）においてレビューされる。
【０００８】
ＡＡＶは、例えば、遺伝子療法において、外来ＤＮＡを細胞に送達するためのベクターとして魅力的にする固有の特徴を有する。培養中の細胞のＡＡＶ感染は、非細胞変性であり、ヒトおよび他の動物の自然感染は、サイレントかつ無症候性である。さらに、ＡＡＶは、多くの哺乳動物細胞を感染させ、インビボで多くの異なる組織を標的化する可能性を可能にする。さらに、ＡＡＶは、緩徐に分裂する細胞および非分裂細胞を形質導入し、転写的に活性な核エピソーム（染色体外要素）として本質的にそれらの細胞の寿命にわたって存続し得る。ＡＡＶプロウイルスゲノムは、組換えゲノムの構築を実現可能にするプラスミド中のクローン化ＤＮＡとして感染性である。さらに、ＡＡＶ複製、ゲノムカプシド形成および組込みを指示するシグナルがＡＡＶゲノムのＩＴＲ内に含まれるので、ゲノムの内部約４．３ｋｂ（複製および構造カプシドタンパク質、ｒｅｐ−ｃａｐをコードする）のいくつかまたは全てを、プロモーター、目的のＤＮＡおよびポリアデニル化シグナルを含む遺伝子カセットのような外来ＤＮＡと置換し得る。ｒｅｐおよびｃａｐタンパク質は、トランスで提供され得る。ＡＡＶの別の重要な特徴は、それが極めて安定した頑健なウイルスであることである。これは、アデノウイルスを不活性化するために使用される条件（５６℃〜６５℃で数時間）に容易に耐え、ＡＡＶの低温保存の重要性を低くする。ＡＡＶは、凍結乾燥され得る。最後に、ＡＡＶ感染細胞は、重複感染に耐性を示さない。
【０００９】
複数の研究により、筋肉における長期（１．５年を超える）の組換えＡＡＶ媒介タンパク質発現が実証されている。Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，８：６５９−６６９（１９９７）；Ｋｅｓｓｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ．Ａｃａｄ  Ｓｃ．ＵＳＡ，９３：１４０８２−１４０８７（１９９６）；およびＸｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，７０：８０９８−８１０８（１９９６）を参照されたい。Ｃｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，２：６１９−６２３（２０００）ａｎｄ  Ｃｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，４：２１７−２２２（２００１）もまた参照されたい。さらに、筋肉は高度に血管化されているため、Ｈｅｒｚｏｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９４：５８０４−５８０９（１９９７）、およびＭｕｒｐｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９４：１３９２１−１３９２６（１９９７）に記載されているように、組換えＡＡＶ形質導入により、筋肉内注射後の体循環において導入遺伝子産物が出現する。さらに、Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，７６：８７６９−８７７５（２００２）は、骨格筋線維が抗体の正しいグリコシル化、フォールディング、および分泌に必要な細胞因子を持っていることを実証し、筋肉が分泌タンパク質治療薬を安定して発現できることを示している。
ＤＭＤおよびその他の筋ジストロフィーに苦しむ患者の機能改善には、疾患の初期段階での遺伝子修復が必要である。筋力を増加させ、ＤＭＤに苦しむ患者の筋肉損傷から保護する治療が必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｈｏｆｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ５１（６）：９１９−２８，１９８７
【非特許文献２】Ｓｔｒａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．１０（２）：１６８−７５，１９９７
【非特許文献３】Ｓａｃｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１０．１４３（７）：ｐ．１０５９−７１
【非特許文献４】Ｗａｌｌａｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００９．７１：ｐ．３７−５７
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、横隔膜および心筋を含む骨格筋に対する、筋線維を損傷から保護し、筋力を増加させ、線維症を軽減および／または予防するための、マイクロジストロフィン遺伝子を発現する遺伝子用治療ベクター、例えばＡＡＶを対象とする。
【００１２】
本発明は、ＤＭＤで観察される遺伝子欠損に対処するために遺伝子用治療ベクターを使用してマイクロジストロフィンを送達することにより、筋力を増加させるおよび／または筋肉量を増加させる治療およびアプローチを提供する。実施例２に示すように、マイクロジストロフィン遺伝子治療による治療は、インビボでより大きな筋力をもたらした。さらに、筋肉内および全身へのマイクロジストロフィン遺伝子治療の送達は、マウスモデルにおいてインビボで筋肉へのジストロフィンの送達を示した。
【００１３】
一実施形態では、本発明は、筋肉特異的制御エレメントのヌクレオチド配列と、マイクロジストロフィンタンパク質をコードするヌクレオチド配列と、を含む、ｒＡＡＶベクターを提供する。例えば、ヌクレオチド配列は機能的マイクロジストロフィンタンパク質をコードし、ヌクレオチドは、配列番号１に対して、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、または８９％、より一般的には少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、または９４％、さらにより一般的には少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性であり、タンパク質はマイクロジストロフィン活性を保持する。マイクロジストロフィンタンパク質は、筋肉収縮時に筋肉膜に安定性を提供し、例えば、マイクロジストロフィンは、筋肉収縮時にショックアブソーバーとして機能する。
【００１４】
本発明はまた、ヌクレオチド配列が、ストリンジェントな条件下で配列番号１の核酸配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む機能的マイクロジストロフィンタンパク質、またはその相補体（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔｓ）をコードし、機能的マイクロジストロフィンタンパク質をコードするｒＡＡＶベクターも提供する。
【００１５】
一実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンと呼ばれる非複製の、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。このベクターゲノムには、ＭＨＣＫ７プロモーター／エンハンサーの制御下にあるＡＡＶ２末端逆位配列（ＩＴＲ）、マイクロジストロフィン、ＳＶ４０イントロン（ＳＤ／ＳＡ）、および合成ポリアデニル化（ポリＡ）シグナルを含む、遺伝子発現に必要な最小限の要素が含まれている。ベクターゲノムおよび発現カセットの概略図を図１に示する。ＡＡＶｒｈ７４血清型は、ＩＶ投与後の骨格筋および心筋における効率的な遺伝子導入を達成するために使用できる。
【００１６】
「ストリンジェントな」という用語は、ストリンジェントとして当該技術分野において一般に理解される条件を指すために使用される。ハイブリダイゼーションストリンジェシーは、主に、温度、イオン強度、およびホルムアミドなどの変性剤の濃度によって決定される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄のためのストリンジェントな条件の例は、０．０１５Ｍの塩化ナトリウム、６５〜６８℃の０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウムまたは０．０１５Ｍの塩化ナトリウム、０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム、および４２℃の５０％ホルムアミドである。Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．１９８９）を参照されたい。よりストリンジェントな条件（より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミド、または他の変性剤など）も使用できるが、ハイブリダイゼーションの速度が影響を受ける。デオキシオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが関係する場合、追加のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例には、３７℃（１４塩基オリゴの場合）、４８℃（１７塩基オリゴの場合）、５５℃（２０塩基オリゴの場合）、および６０℃（２３塩基オリゴの場合）での６×ＳＳＣ、０．０５％ピロリン酸ナトリウムでの洗浄が含まれる。
【００１７】
非特異的および／またはバックグラウンドハイブリダイゼーションを低減する目的で、ハイブリダイゼーションおよび洗浄緩衝液に他の薬剤を含めることができる。例としては、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、ＮａＤｏｄＳＯ４、（ＳＤＳ）、フィコール、デンハルト溶液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（または他の非相補的ＤＮＡ）、および硫酸デキストランが挙げられるが、他の適切な薬剤も使用できる。これらの添加物の濃度および種類は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を与えることなく変更できる。ハイブリダイゼーション実験は通常、ｐＨ６．８〜７．４で行われるが、典型的なイオン強度条件では、ハイブリダイゼーションの速度はｐＨにほとんど依存しない。Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｃｈ．４，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を参照されたい。ハイブリダイゼーション条件は、これらの変数を考慮して、異なる配列類似性のＤＮＡがハイブリッドを形成することを可能にするために、当業者によって調整され得る。
【００１８】
「筋肉特異的制御エレメント」という用語は、筋肉組織での発現に特異的なコード配列の発現を調節するヌクレオチド配列を指する。これらの制御エレメントには、エンハンサーとプロモーターが含まれる。本発明は、筋肉特異的制御エレメントＭＣＫＨ７プロモーター、ＭＣＫプロモーターおよびＭＣＫエンハンサーを含む構築物を提供する。
【００１９】
「動作可能に連結された」という用語は、調節エレメントヌクレオチド配列、例えばプロモーターヌクレオチド配列の、前記調節エレメントによる前記ヌクレオチド配列の発現を付与する配置を指す。
【００２０】
一態様では、本発明は、前記筋肉特異的制御エレメントが、ヒト骨格アクチン遺伝子エレメント、心臓アクチン遺伝子エレメント、筋細胞特異的エンハンサー結合因子（ＭＥＦ）、筋肉クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）、短縮型ＭＣＫ（ｔＭＣＫ）、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）、ハイブリッドα−ミオシン重鎖エンハンサー／ＭＣＫエンハンサープロモーター（ＭＨＣＫ７）、Ｃ５−１２、マウスクレアチンキナーゼエンハンサー因子、速筋骨格筋トロポニンｃ遺伝子エレメント、遅筋心臓トロポニンｃ遺伝子エレメント、遅筋トロポニンｉ遺伝子エレメント、低酸素誘導性核内因子、ステロイド誘導性エレメント、または糖質コルチコイド応答エレメント（ＧＲＥ）である、ｒＡＡＶベクターを提供する。
【００２１】
例えば、筋肉特異的制御エレメントはＭＨＣＫ７プロモーターヌクレオチド配列の配列番号２であるか、または、筋肉特異的制御エレメントはＭＣＫヌクレオチド配列の配列番号４である。さらに、本発明のｒＡＡＶベクターのいずれかにおいて、筋肉特異的制御エレメントヌクレオチド配列、例えばＭＨＣＫ７またはＭＣＫヌクレオチド配列は、マイクロジストロフィンタンパク質をコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結されている。例えば、ＭＨＣＫ７プロモーターヌクレオチド配列（配列番号２）は、図１または図１０に提示される構築物（配列番号３）に記述されるように、ヒトマイクロジストロフィンコード配列（配列番号１）に動作可能に連結されている。別の例では、ＭＣＫプロモーター（配列番号４）は、図７または図１１に提示される構築物（配列番号５）に記述されるように、ヒトマイクロジストロフィンコード配列（配列番号１）に動作可能に連結されている。別の態様において、本発明は、配列番号１および配列番号２のヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶベクターを提供する。本発明はまた、配列番号１および配列番号４のヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶベクターを提供する。
【００２２】
さらなる態様では、本発明は、配列番号３または配列番号５のヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶベクターを提供する。例えば、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンベクターは、配列番号３のヌクレオチド配列を含み、図１０に示されている。このｒＡＡＶベクターは、ＭＨＣＫ７プロモーター、キメライントロン配列、ヒトマイクロジストロフィン遺伝子のコード配列、ポリＡ、アンピシリン耐性、およびｐＢＲ３２２複製起点を有するｐＧＥＸプラスミド骨格を含む。
【００２３】
本発明は、配列番号１のヒトマイクロジストロフィンヌクレオチド配列および配列番号３のＭＨＣＫ７プロモーターヌクレオチド配列を含む、ｒＡＡＶベクターを提供する。このｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型ＡＡＶｒｈ．７４である。
【００２４】
本発明はまた、配列番号３のｐＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物のヌクレオチド配列を含む、ｒＡＡＶベクターを提供する。このｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型ＡＡＶｒｈ．７４である。
【００２５】
本発明のｒＡＡＶベクターは、血清型ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、またはＡＡＶ１３などの任意のＡＡＶ血清型であり得る。
【００２６】
本発明はまた、本発明のｒＡＡＶベクターのいずれかを含む医薬組成物（または、本明細書ではしばしば、単に「組成物」と呼ばれる）も提供する。
【００２７】
別の実施形態では、本発明は、本発明のいずれかのｒＡＡＶベクターでトランスフェクトされた細胞を培養することと、トランスフェクトされた細胞の培養上清からｒＡＡＶ粒子を回収することと、を含む、ｒＡＡＶベクター粒子の産生方法を提供する。本発明はまた、本発明の組換えＡＡＶベクターのいずれかを含むウイルス粒子を提供する。
【００２８】
本発明は、ヒトマイクロジストロフィンを発現する本発明の組換えＡＡＶベクターのいずれかの治療有効量を投与することを含む、筋ジストロフィーの治療方法を提供する。
【００２９】
本発明は、筋ジストロフィーを治療する方法であって、配列番号１のヒトマイクロジストロフィンヌクレオチド配列および配列番号２のＭＨＣＫ７プロモーターヌクレオチド配列を治療有効量の含む組換えＡＡＶベクターを投与することを含む、方法を提供する。
【００３０】
本発明はまた、筋ジストロフィーを治療する方法であって、配列番号３のｐＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物のヌクレオチド配列を含む治療有効量の組換えＡＡＶベクターを投与することを含む、方法を提供する。
【００３１】
「線維症」とは、骨格筋、心筋、肝臓、肺、腎臓、および膵臓を含む、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分の過剰または無秩序な沈着および損傷時の組織の異常な修復プロセスを指す。沈着するＥＣＭ成分には、フィブロネクチンおよびコラーゲン、例えばコラーゲン１、コラーゲン２、またはコラーゲン３が含まれる。
【００３２】
本発明はまた、筋ジストロフィーを患っている対象において線維症を軽減または予防する方法であって、本発明の任意の組換えＡＡＶベクターの治療有効量を投与することを含む、方法を提供する。
【００３３】
別の実施形態では、本発明は、それを必要とする対象の線維症を予防する方法であって、本発明の任意の組換えＡＡＶベクターの治療有効量を投与することを含む、方法を提供する。例えば、本発明のｒＡＡＶのいずれも、筋ジストロフィーを患っている対象に投与して線維症を予防することができ、例えば、本発明のヒトマイクロジストロフィンタンパク質を発現するｒＡＡＶは、対象で線維症が観察される前に投与される。さらに、本発明のヒトマイクロジストロフィン遺伝子を発現するｒＡＡＶは、筋ジストロフィー、例えばＤＭＤを患っているかまたは診断されたものなど、線維症を発症するリスクのある対象に投与することができる。本発明のｒＡＡＶは、筋ジストロフィーを患っている対象に投与して、これらの対象の新規の線維症を予防することができる。
【００３４】
本発明は、対象において線維症が観察される前に、本発明のＡＡＶベクターのいずれかを投与することを企図する。さらに、本発明のｒＡＡＶは、筋ジストロフィー、例えばＤＭＤを患っているかまたは診断されたものなど、線維症を発症するリスクのある対象に投与することができる。本発明のｒＡＡＶは、筋ジストロフィーを患っており、既に線維症を発症している対象に投与して、これらの対象の新規の線維症を予防することができる。
【００３５】
本発明はまた、筋ジストロフィーを患っている対象において筋力および／または筋肉量を増加させる方法であって、本発明の任意のヒトマイクロジストロフィンを発現するｒＡＡＶベクターの治療有効量を投与することを含む、方法を提供する。これらの方法は、マイクロジストロフィンを発現するｒＡＡＶを投与するステップをさらに含むことができる。
【００３６】
本発明は、対象において線維症が観察される前、または筋力が減少する前、または筋肉量が減少する前に、ＤＭＤと診断された患者に本発明のＡＡＶベクターのいずれかを投与することを企図する。
【００３７】
本発明はまた、これらの対象の新規の線維症を予防するため、またはこれらの患者の線維症を軽減するために、既に線維症を発症している筋ジストロフィーを患っている対象に本発明のＡＡＶを投与することを企図する。本発明はまた、筋肉をさらなる損傷から保護するために、すでに筋力が低下している、または筋肉量が低下している筋ジストロフィーを患っている患者に、本発明のｒＡＡＶのいずれかを投与することを提供する。
【００３８】
本発明の方法のいずれにおいても、対象は、ＤＭＤまたは任意の他のジストロフィン関連筋ジストロフィーなどの筋ジストロフィーを患っている可能性がある。
【００３９】
別の態様では、マイクロジストロフィンタンパク質を発現するｒＡＡＶベクターは、ＭＨＣＫ７またはＭＣＫ以外の筋肉特異的制御エレメントに動作可能に連結されたマイクロジストロフィン遺伝子のコード配列を含む。例えば、筋肉特異的制御エレメントは、ヒト骨格アクチン遺伝子エレメント、心臓アクチン遺伝子エレメント、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ＭＥＦ、短縮型ＭＣＫ（ｔＭＣＫ）、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）、Ｃ５−１２（合成プロモーター）、マウスクレアチンキナーゼエンハンサー因子、速筋骨格筋トロポニンＣ遺伝子エレメント、遅筋心臓トロポニンＣ遺伝子エレメント、遅筋トロポニンＩ遺伝子エレメント、低酸素（ｈｙｐｏｚｉａ）誘導性核内因子、ステロイド誘導性エレメント、または糖質コルチコイド応答エレメント（ＧＲＥ）である。
【００４０】
本発明の方法のいずれにおいても、ｒＡＡＶベクターまたは組成物は、筋肉内注射または静脈内注射により投与することができる。
【００４１】
さらに、本発明の方法のいずれにおいても、ｒＡＡＶベクターまたは組成物は、全身投与することができる。例えば、ｒＡＡＶベクターまたは組成物は、注射、注入、または移植による非経口投与であり得る。
【００４２】
別の実施形態では、本発明は、それを必要とする対象の線維症を軽減するための本発明のｒＡＡＶベクターのいずれかを含む組成物を提供する。
【００４３】
さらに、本発明は、筋ジストロフィーを患っている患者の線維症を予防するための本発明の組換えＡＡＶベクターのいずれかを含む組成物を提供する。
【００４４】
本発明は、筋ジストロフィーを治療するための本発明の組換えＡＡＶベクターのいずれかを含む組成物を提供する。
【００４５】
本発明は、筋ジストロフィーの治療のための、配列番号１のヒトマイクロジストロフィンヌクレオチド配列と、配列番号２のＭＨＣＫ７プロモーター配列とを含む組換えＡＡＶベクターを含む組成物を提供する。
【００４６】
本発明は、筋ジストロフィーの治療のための、配列番号３のヌクレオチド配列を含むｐＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物を含む組換えＡＡＶベクターを含む組成物を提供する。
【００４７】
本発明はまた、筋ジストロフィーを患っている対象の筋力および／または筋肉量を増加させるための本発明のｒＡＡＶベクターのいずれかを含む組成物を提供する。さらなる態様において、本発明は、筋ジストロフィーの治療のための本発明のｒＡＡＶベクターのいずれかを含む組成物を提供する。
【００４８】
本発明の組成物は、筋肉内注射または静脈内注射のために製剤化することができる。本発明の組成物はまた、注射、注入、または移植による非経口投与などの全身投与のために製剤化される。
【００４９】
さらに、任意の組成物は、ＤＭＤまたは任意の他のジストロフィン関連筋ジストロフィーなどの筋ジストロフィーを患っている対象への投与のために製剤化することができる。
【００５０】
さらなる実施形態では、本発明は、それを必要とする対象において線維症を軽減するための薬剤の調製のための本発明のｒＡＡＶベクターのいずれかの使用を提供する。例えば、必要とする対象は、ＤＭＤまたは任意の他のジストロフィン関連筋ジストロフィーなどの筋ジストロフィーを患っている可能性がある。
【００５１】
別の実施形態では、本発明は、筋ジストロフィーを患っている対象の線維症を予防するための薬剤の調製のための本発明のｒＡＡＶベクターの使用を提供する。
【００５２】
さらに、本発明は、筋ジストロフィーを患っている対象の筋力および／または筋肉量を増加させるための薬剤の調製への本発明の組換えＡＡＶベクターの使用を提供する。
【００５３】
本発明はまた、筋ジストロフィーの治療のための薬剤の調製のための本発明のｒＡＡＶベクターの使用を提供する。
【００５４】
本発明は、筋ジストロフィーの治療のための薬剤の調製のための、配列番号１のヒトマイクロジストロフィンヌクレオチド配列と配列番号２のＭＨＣＫ７プロモーターヌクレオチド配列とを含む組換えＡＡＶベクターの使用を提供する。
【００５５】
本発明は、筋ジストロフィーの治療のための、配列番号３のｐＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物のヌクレオチド配列を含む組換えＡＡＶベクターの使用を提供する。
【００５６】
本発明の使用のいずれにおいても、薬剤は筋肉内注射または静脈内注射用のために製剤化することができる。さらに、本発明の使用のいずれにおいても、薬剤は、注射、注入、または移植による非経口投与などの全身投与のために製剤化される。
【００５７】
薬剤のいずれも、ＤＭＤまたは任意の他のジストロフィン関連筋ジストロフィーなどの筋ジストロフィーを患っている対象への投与のために調製することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】ｐＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物を図示する。この構築物では、ｃＤＮＡ発現カセットにＡＡＶ２末端逆位配列（ＩＴＲ）が隣接している。構築物はインフレームロッド欠失（Ｒ４〜Ｒ２３）を特徴とし、ヒンジ１、２、および４（Ｈ１、Ｈ２、およびＨ４）ならびにシステインリッチドメインが１３８ｋＤａタンパク質を産生することを維持する。マイクロジストロフィンタンパク質（３５７９ｂｐ）の発現は、ＭＨＣＫ７プロモーター（７９５ｂｐ）によって誘導される。イントロンおよび５’ＵＴＲは、プラスミドｐＣＭＶβ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に由来する。マイクロジストロフィンカセットは、ＡＴＧ開始の直前にコンセンサスのコザックがあり、ｍＲＮＡ終了のための小さな５３ｂｐの合成ポリＡシグナルを有していた。Ｈａｒｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ８，２５３−２６１（２００２））によって以前に記載されたように、ヒトマイクロジストロフィンカセットは、（Ｒ４〜Ｒ２３／Δ７１〜７８）ドメインを含んでいた。
【図２】ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７構築物の筋肉内送達後のジストロフィンタンパク質の発現を実証する。ｍｄｘマウスの前脛骨筋に１×１０１１ｖｇ（１群あたりｎ＝５）を注射した。６週間後、筋肉を採取し、ジストロフィン発現についてジストロフィンのＮ末端抗体でならびにヘマトキシリンおよびエオシン染色で染色した。
【図３Ａ】ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７構築物の筋肉内注射後の骨格筋力測定とマイクロジストロフィン発現の定量化を提供する。（Ａ）ｍｄｘマウスの前脛骨筋にＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７構築物を１×１０１１ｖｇ（ｎ＝５）で注入した。６週間後、前脛骨筋を採取し、インビボ力測定を行った。投与されたコホートは、未処理のｍｄｘ対照よりも顕著に大きな力の発生を示した。
【図３Ｂ】ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７構築物の筋肉内注射後の骨格筋力測定とマイクロジストロフィン発現の定量化を提供する。（Ａ）ｍｄｘマウスの前脛骨筋にＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７構築物を１×１０１１ｖｇ（ｎ＝５）で注入した。６週間後、前脛骨筋を採取し、インビボ力測定を行った。投与されたコホートは、未処理のｍｄｘ対照よりも顕著に大きな力の発生を示した。
【図３Ｃ】ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７構築物の筋肉内注射後の骨格筋力測定とマイクロジストロフィン発現の定量化を提供する。（Ａ）ｍｄｘマウスの前脛骨筋にＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７構築物を１×１０１１ｖｇ（ｎ＝５）で注入した。６週間後、前脛骨筋を採取し、インビボ力測定を行った。投与されたコホートは、未処理のｍｄｘ対照よりも顕著に大きな力の発生を示した。
【図４Ａ】ＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｍｉｃｒｏ−ｄｙｓ構築物の全身投与後の骨格、横隔膜、および心筋線維の広範な形質導入を実証する。（Ａ）Ｍｄｘマウスは、１２週間の治療後に、６週齢で尾静脈を介して、６×１０１２ｖｇ（２×１０１４ｖｇ／ｋｇ）のＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンで全身的に治療された。（Ｂ）マイクロジストロフィンの染色は、各組織でマイクロジストロフィンを発現している筋線維の割合の定量化を示している。（Ｃ）低および高（臨床的）用量で横隔膜において測定された比力を示す。低用量では顕著な差は見られなかったが、高用量では顕著な改善があった。
【図４Ｂ】ＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｍｉｃｒｏ−ｄｙｓ構築物の全身投与後の骨格、横隔膜、および心筋線維の広範な形質導入を実証する。（Ａ）Ｍｄｘマウスは、１２週間の治療後に、６週齢で尾静脈を介して、６×１０１２ｖｇ（２×１０１４ｖｇ／ｋｇ）のＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンで全身的に治療された。（Ｂ）マイクロジストロフィンの染色は、各組織でマイクロジストロフィンを発現している筋線維の割合の定量化を示している。（Ｃ）低および高（臨床的）用量で横隔膜において測定された比力を示す。低用量では顕著な差は見られなかったが、高用量では顕著な改善があった。
【図４Ｃ】ＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．ｍｉｃｒｏ−ｄｙｓ構築物の全身投与後の骨格、横隔膜、および心筋線維の広範な形質導入を実証する。（Ａ）Ｍｄｘマウスは、１２週間の治療後に、６週齢で尾静脈を介して、６×１０１２ｖｇ（２×１０１４ｖｇ／ｋｇ）のＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンで全身的に治療された。（Ｂ）マイクロジストロフィンの染色は、各組織でマイクロジストロフィンを発現している筋線維の割合の定量化を示している。（Ｃ）低および高（臨床的）用量で横隔膜において測定された比力を示す。低用量では顕著な差は見られなかったが、高用量では顕著な改善があった。
【図５】ＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物の全身送達後のジストロフィンタンパク質の発現を示している。Ｍｄｘマウス（ｎ＝５）は、６週齢から開始する尾静脈を介した６×１０１２ｖｇのＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンで全身処理された。１２週間の治療後、全ての筋肉を採取し、ジストロフィンとＤＡＰＣ成分（ベータサルコグリカンを示している）の回復について染色した。
【図６Ａ】ＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７の毒性／安全性を実証する。ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色は、毒性を分析するために次の筋肉組織で行われた：前脛骨筋（ＴＡ）、腓腹筋（ＧＡＳ）、大腿四頭筋（ＱＤ）、腰筋（ＰＳＯ）、上腕三頭筋（ＴＲＩ）、および横隔膜（ＤＩＡ）（図６Ａ）。毒性は認められなかった。有効性の指標として、中心に配置された核（ＣＮ）を持つ筋線維の数を定量化した（図６Ｂ）。ＣＮは筋肉の変性と再生のサイクルを示しているため、ＣＮの減少は治療効果を実証する。（図６Ｃ）繊維の総数は処理によって変化しないことを実証する。クレアチンキナーゼの量は（Ｄ）に示されており、高用量での改善を示している。独立したｔ検定を使用して差異を特定し（ｐ＜０．０５）、データを平均±ＳＥＭとして報告する。
【図６Ｂ】ＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７の毒性／安全性を実証する。ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色は、毒性を分析するために次の筋肉組織で行われた：前脛骨筋（ＴＡ）、腓腹筋（ＧＡＳ）、大腿四頭筋（ＱＤ）、腰筋（ＰＳＯ）、上腕三頭筋（ＴＲＩ）、および横隔膜（ＤＩＡ）（図６Ａ）。毒性は認められなかった。有効性の指標として、中心に配置された核（ＣＮ）を持つ筋線維の数を定量化した（図６Ｂ）。ＣＮは筋肉の変性と再生のサイクルを示しているため、ＣＮの減少は治療効果を実証する。（図６Ｃ）繊維の総数は処理によって変化しないことを実証する。クレアチンキナーゼの量は（Ｄ）に示されており、高用量での改善を示している。独立したｔ検定を使用して差異を特定し（ｐ＜０．０５）、データを平均±ＳＥＭとして報告する。
【図６Ｃ】ＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７の毒性／安全性を実証する。ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色は、毒性を分析するために次の筋肉組織で行われた：前脛骨筋（ＴＡ）、腓腹筋（ＧＡＳ）、大腿四頭筋（ＱＤ）、腰筋（ＰＳＯ）、上腕三頭筋（ＴＲＩ）、および横隔膜（ＤＩＡ）（図６Ａ）。毒性は認められなかった。有効性の指標として、中心に配置された核（ＣＮ）を持つ筋線維の数を定量化した（図６Ｂ）。ＣＮは筋肉の変性と再生のサイクルを示しているため、ＣＮの減少は治療効果を実証する。（図６Ｃ）繊維の総数は処理によって変化しないことを実証する。クレアチンキナーゼの量は（Ｄ）に示されており、高用量での改善を示している。独立したｔ検定を使用して差異を特定し（ｐ＜０．０５）、データを平均±ＳＥＭとして報告する。
【図６Ｄ】ＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７の毒性／安全性を実証する。ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色は、毒性を分析するために次の筋肉組織で行われた：前脛骨筋（ＴＡ）、腓腹筋（ＧＡＳ）、大腿四頭筋（ＱＤ）、腰筋（ＰＳＯ）、上腕三頭筋（ＴＲＩ）、および横隔膜（ＤＩＡ）（図６Ａ）。毒性は認められなかった。有効性の指標として、中心に配置された核（ＣＮ）を持つ筋線維の数を定量化した（図６Ｂ）。ＣＮは筋肉の変性と再生のサイクルを示しているため、ＣＮの減少は治療効果を実証する。（図６Ｃ）繊維の総数は処理によって変化しないことを実証する。クレアチンキナーゼの量は（Ｄ）に示されており、高用量での改善を示している。独立したｔ検定を使用して差異を特定し（ｐ＜０．０５）、データを平均±ＳＥＭとして報告する。
【図７】ｐＡＡＶ．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンプラスミド構築物を示す。
【図８】ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫマイクロジストロフィン（ヒト）効力アッセイの結果を提供する。ｍｄｘマウスの前脛骨筋に、３×１０９、３×１０１０、または１×１０１１ｖｇ（群当たりｎ＝３）を注射した。４週間後、筋肉を採取し、Ｎ末端のＤｙｓ３抗体でジストロフィンの発現について染色した。３×１０９ｖｇでの非常にわずかな発現（効果なしのレベル）と１×１０１１ｖｇでの８９％の発現による、発現と用量の間には線形相関があった。
【図９Ａ】ヒトマイクロジストロフィンは、力の発生と、異常収縮による損傷からの保護を改善することを示している。（Ａ）長指伸筋（ＥＤＬ）およびＴＡにおけるジストロフィンタンパク質の免疫染色は、大腿動脈を介したｒＡＡＶｒｈ．７４−ＭＣＫ−マイクロジストロフィン（ヒト）注射後のｍｄｘ筋線維における発現を示している。模擬感染した筋肉は同一の方法で染色され、暴露時間は一致している。（Ｂ）ｒＡＡＶｒｈ．７４−ＭＣＫ−マイクロジストロフィンは、模擬処理されたｍｄｘ筋肉と比較して、正常化した比力を有意に増加させた（Ｐ＜０．０５対ｍｄｘ）。（Ｃ）ｒＡＡＶｒｈ．７４−ＭＣＫ−Ｍｉｃｒｏ−ｄｙｓ（ヒト）に感染したｍｄｘ筋肉を、遺伝子導入後１２週間での反復性の伸張性収縮中の力低下について、模擬感染した反対側のｍｄｘ  ＥＤＬ筋肉およびＷＴ（ＷＴ  Ｃ５７Ｂｌ／１０）ＥＤＬ筋肉と比較した。ｒＡＡＶｒｈ．７４−ＭＣＫ−マイクロジストロフィン（Ｍｉｃｒｏ−ｄｙｓ）処理は、模擬処理されたｍｄｘ筋肉と比較して、力の損失に対して有意に保護された（Ｐ＜０．００１対ｍｄｘ）。誤差はＳＥＭである。
【図９Ｂ】ヒトマイクロジストロフィンは、力の発生と、異常収縮による損傷からの保護を改善することを示している。（Ａ）長指伸筋（ＥＤＬ）およびＴＡにおけるジストロフィンタンパク質の免疫染色は、大腿動脈を介したｒＡＡＶｒｈ．７４−ＭＣＫ−マイクロジストロフィン（ヒト）注射後のｍｄｘ筋線維における発現を示している。模擬感染した筋肉は同一の方法で染色され、暴露時間は一致している。（Ｂ）ｒＡＡＶｒｈ．７４−ＭＣＫ−マイクロジストロフィンは、模擬処理されたｍｄｘ筋肉と比較して、正常化した比力を有意に増加させた（Ｐ＜０．０５対ｍｄｘ）。（Ｃ）ｒＡＡＶｒｈ．７４−ＭＣＫ−Ｍｉｃｒｏ−ｄｙｓ（ヒト）に感染したｍｄｘ筋肉を、遺伝子導入後１２週間での反復性の伸張性収縮中の力低下について、模擬感染した反対側のｍｄｘ  ＥＤＬ筋肉およびＷＴ（ＷＴ  Ｃ５７Ｂｌ／１０）ＥＤＬ筋肉と比較した。ｒＡＡＶｒｈ．７４−ＭＣＫ−マイクロジストロフィン（Ｍｉｃｒｏ−ｄｙｓ）処理は、模擬処理されたｍｄｘ筋肉と比較して、力の損失に対して有意に保護された（Ｐ＜０．００１対ｍｄｘ）。誤差はＳＥＭである。
【図９Ｃ】ヒトマイクロジストロフィンは、力の発生と、異常収縮による損傷からの保護を改善することを示している。（Ａ）長指伸筋（ＥＤＬ）およびＴＡにおけるジストロフィンタンパク質の免疫染色は、大腿動脈を介したｒＡＡＶｒｈ．７４−ＭＣＫ−マイクロジストロフィン（ヒト）注射後のｍｄｘ筋線維における発現を示している。模擬感染した筋肉は同一の方法で染色され、暴露時間は一致している。（Ｂ）ｒＡＡＶｒｈ．７４−ＭＣＫ−マイクロジストロフィンは、模擬処理されたｍｄｘ筋肉と比較して、正常化した比力を有意に増加させた（Ｐ＜０．０５対ｍｄｘ）。（Ｃ）ｒＡＡＶｒｈ．７４−ＭＣＫ−Ｍｉｃｒｏ−ｄｙｓ（ヒト）に感染したｍｄｘ筋肉を、遺伝子導入後１２週間での反復性の伸張性収縮中の力低下について、模擬感染した反対側のｍｄｘ  ＥＤＬ筋肉およびＷＴ（ＷＴ  Ｃ５７Ｂｌ／１０）ＥＤＬ筋肉と比較した。ｒＡＡＶｒｈ．７４−ＭＣＫ−マイクロジストロフィン（Ｍｉｃｒｏ−ｄｙｓ）処理は、模擬処理されたｍｄｘ筋肉と比較して、力の損失に対して有意に保護された（Ｐ＜０．００１対ｍｄｘ）。誤差はＳＥＭである。
【図１０−１】核酸配列（配列番号３、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン）を提示する。
【図１０−２】核酸配列（配列番号３、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン）を提示する。
【図１０−３】核酸配列（配列番号３、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン）を提示する。
【図１０−４】核酸配列（配列番号３、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン）を提示する。
【図１１−１】核酸配列（配列番号５）ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンを提示する。
【図１１−２】核酸配列（配列番号５）ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンを提示する。
【図１１−３】核酸配列（配列番号５）ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンを提示する。
【図１１−４】核酸配列（配列番号５）ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンを提示する。
【図１２Ａ】は、非ヒト霊長類へのＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンの全身送達に対する免疫応答を提示する。（Ａ）ＡＡＶカプシドおよびマイクロジストロフィンペプチドプールに対するＥＬＩＳｐｏｔ応答。ＣｏｎＡは陽性対照であり、ＤＭＳＯは陰性対照である。ＡＡＶｒｈ７４には３つのプールがあり、マイクロジストロフィンに特異的な４つのペプチドプールがあった。（Ｂ）ベクターカプシドに対する循環中和抗体のＥＬＩＳＡ陽性力価。霊長類から隔週に血清を分離し、抗体価を分析した。報告された力価は、応答の比が２以上である最後の希釈に対応する。
【図１２Ｂ】は、非ヒト霊長類へのＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンの全身送達に対する免疫応答を提示する。（Ａ）ＡＡＶカプシドおよびマイクロジストロフィンペプチドプールに対するＥＬＩＳｐｏｔ応答。ＣｏｎＡは陽性対照であり、ＤＭＳＯは陰性対照である。ＡＡＶｒｈ７４には３つのプールがあり、マイクロジストロフィンに特異的な４つのペプチドプールがあった。（Ｂ）ベクターカプシドに対する循環中和抗体のＥＬＩＳＡ陽性力価。霊長類から隔週に血清を分離し、抗体価を分析した。報告された力価は、応答の比が２以上である最後の希釈に対応する。
【図１３Ａ】ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅにおけるＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンの全身送達を実証する。左側の筋肉の抗ＦＬＡＧ免疫蛍光染色は、堅牢なマイクロジストロフィンの発現を実証した。
【図１３Ｂ】ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅにおけるＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンの全身送達を実証する。左側の筋肉の抗ＦＬＡＧ免疫蛍光染色は、堅牢なマイクロジストロフィンの発現を実証した。
【図１４】ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンによる全身治療の導入遺伝子発現に対する効果を実証する。心臓、横隔膜、腰筋、および前脛骨筋（ＴＡ）における、Ｎ末端ジストロフィン抗体を使用したマイクロジストロフィンの免疫蛍光染色は、中用量（６ｅ１２ｖｇ；２ｅ１４ｖｇ／ｋｇ）および高用量（１．２ｅ１３ｖｇ；６ｅ１４ｖｇ／ｋｇ）で処理した注射後３ヶ月の動物における堅牢な発現を実証する。２０倍の画像が示される。
【図１５】ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンによる全身治療の導入遺伝子発現に対する効果を実証する。腓腹筋、大腿四頭筋、上腕三頭筋、および殿筋における、Ｎ末端ジストロフィン抗体を使用したマイクロジストロフィンの免疫蛍光染色は、中用量（６ｅ１２ｖｇ；２ｅ１４ｖｇ／ｋｇ）および最高用量（１．２ｅ１３ｖｇ；６ｅ１４ｖｇ／ｋｇ）で処理した注射後３ヶ月の動物における堅牢な発現を実証する。２０倍の画像が示される。
【図１６】ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンによる全身治療の筋肉病変に対する効果を実証する。（Ａ）Ｃ５７ＢＬ／６  ＷＴ、ｍｄｘ、およびｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン処理マウス（中用量２ｅ１４ｖｇ／ｋｇ；高用量−６ｅ１４ｖｇ／ｋｇ）の横隔膜、前脛骨筋、腓腹筋、および大腿四頭筋のＨ＆Ｅ染色、（Ｂ）平均繊維サイズの定量化により、全ての組織にわたる繊維サイズの正常化が実証された。＊＊＊＊ｐ＜０．００１、一元配置分散分析；データは平均±ＳＥＭとして報告される。２０倍の画像が示される。
【図１７】ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンによる全身治療の筋肉病変に対する効果を実証する。（Ａ）Ｃ５７ＢＬ／６  ＷＴ、ｍｄｘ、およびｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン処理マウス（中用量２ｅ１４ｖｇ／ｋｇ；高用量−６ｅ１４ｖｇ／ｋｇ）の上腕三頭筋、殿筋、および腰筋のＨ＆Ｅ染色、（Ｂ）平均繊維サイズの定量化により、用量依存的により大きな繊維が実証された。＊＊＊＊ｐ＜０．００１、一元配置分散分析；データは平均±ＳＥＭとして報告される。２０倍の画像が示される。
【図１８】中心核形成に対するｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンによる全身処理の効果を実証する。用量漸増は、全ての骨格筋および横隔膜の中心核形成の減少を示している。二元配置分散分析を使用して、差異を特定した（ｐ＜０．０５）。データは平均±ＳＥＭで報告される。
【図１９】コラーゲン沈着に対するｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンによる全身処理の効果を実証する。用量漸増は、横隔膜のコラーゲン蓄積（％）の減少を示している。＊ｐ＜０．０５、一元配置分散分析；データは平均±ＳＥＭとして報告される。２０倍の画像が示される。
【図２０】横隔膜の力欠損の矯正を示す。３か月または６か月の処理後、横隔膜筋片を採取して比力を測定した（断面積に対して標準化）。処理は力をＷＴレベルに回復させた。＊ｐ＜０．０５。一元配置分散分析を使用して、ｍｄｘ−ＬＲマウスとの差異を特定した。
【図２１】ＴＡの力欠損の矯正を示す。（Ａ）３〜６ヶ月の処理後、比力（ＴＡ重量に対して標準化）を測定するためにＴＡ筋肉を採取した（左右両方）。処理は力をＷＴレベルに回復させた。（Ｂ）伸張性収縮の厳密なプロトコールの後、処理はＴＡ筋肉を疲労から救済した。＊ｐ＜０．０５。一元配置分散分析を使用して、ｍｄｘ−ＬＲマウスとの差異を特定した。
【図２２】ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンのＩＶ送達後の３匹のｍｄｘマウスからの様々な組織の平均ｖｇコピーの分布を提示する。
【図２３】ｓｓＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンを全身注射したマウスの血清化学および年齢が一致した対照群の血清化学は、分析された全ての化学物質の正常値を示す、独立したＣＲＯ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によって分析された。異常な値は、処理で正常化されたＭＤＸビヒクル処理動物［ＭＤＸ−ＬＲ（乳酸リンゲル液）］で認められたＡＳＴおよびＡＬＴの上昇のみであった。ＡＳＴとＡＬＴはＤＭＤで上昇することが知られている。ＡＬＴ＝アラニンアミノ基転移酵素、ＡＬＰ／Ｋ＝アルカリホスファターゼ、ＡＳＴ＝アスパラギン酸アミノ基転移酵素、ＢＵＮ＝血中尿素窒素、Ｂ／Ｃ＝血液／クレアチニン比、ＣＲＥＡＴ＝クレアチン、ＧＬＵ＝グルコース、ＴＰ＝総タンパク質、ＴＢＩＬ＝総ビリルビン、ＤＢＩＬ＝直接ビリルビン
【図２４】ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンを全身注射したｍｄｘマウスの筋肉および臓器の生体内分布ウェスタンブロットを提示する。
【図２５】ｐＮＬＲＥＰ２−Ｃａｐｒｈ７４  ＡＡＶヘルパープラスミドマップを提示する。
【図２６】Ａｄ  ＨｅｌｐｅｒプラスミドｐＨＥＬＰを提示する。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
本発明は、ヒトマイクロジストロフィンを過剰発現する遺伝子用治療ベクター、例えばｒＡＡＶベクター、ならびに筋ジストロフィー患者の線維症を軽減および予防する方法を提供する。ＤＭＤの診断の最も早い年齢で採取された筋生検は、顕著な結合組織の増殖を明らかにする。筋線維症は複数の点で有害である。それは、結合組織関門を介した筋内膜の栄養素の通常の通過を減らし、血流を減らし、筋肉から血管由来の栄養成分を奪い、四肢拘縮による歩行の早期喪失の機能的な一因となる。経時的に、筋肉の顕著な線維化の結果として、治療の課題が増加する。これは、連続した時点での結合組織の増殖を比較する筋生検で観察できる。このプロセスは悪化を続け、特に車椅子依存の患者では、歩行の喪失をもたらし、制御不能を加速する。
【００６０】
線維症を軽減するための並行アプローチを含む早期治療なしでは、エクソンスキッピング、ストップコドンリードスルー、または遺伝子置換療法の利点が完全に達成される可能性は低いであろう。低分子またはタンパク質置換戦略でさえ、筋線維症を軽減するアプローチなしでは失敗する可能性がある。ＡＡＶ．マイクロジストロフィンで治療した既存の線維症を有する高齢ｍｄｘマウスでの以前の研究では、完全な機能回復を達成できないことが示された（Ｌｉｕ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １１，２４５−２５６（２００５））。ＤＭＤ心筋症の進行は、心室壁の瘢痕化と線維化を伴うことも知られている。
【００６１】
本明細書で使用される場合、「ＡＡＶ」という用語は、アデノ随伴ウイルスの一般的な略語である。アデノ随伴ウイルスは、ある特定の機能が同時感染ヘルパーウイルスによって提供される細胞内でのみ成長する一本鎖ＤＮＡパルボウイルスである。現在、特性評価されているＡＡＶの血清型は１３個存在する。ＡＡＶの一般的な情報および概説は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９８９，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｖｏｌ．１，ｐｐ．１６９−２２８、およびＢｅｒｎｓ，１９９０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｐｐ．１７４３−１７６４，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に見出すことができる。しかしながら、様々な血清型が遺伝子レベルでさえも構造的および機能的の両方で非常に密接に関連していることがよく知られているため、これらの同じ原理が追加のＡＡＶ血清型に適用可能であることが十分に予想される。（例えば、Ｂｌａｃｋｌｏｗｅ，１９８８，ｐｐ．１６５−１７４  ｏｆ  Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｊ．Ｒ．Ｐａｔｔｉｓｏｎ，ｅｄ．、およびＲｏｓｅ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３：１−６１（１９７４）を参照されたい）。例えば、全てのＡＡＶ血清型は、相同ｒｅｐ遺伝子によって媒介される非常に類似した複製特性を明らかに呈し、これらは全て、ＡＡＶ２で発現されたもの等の３つの関連カプシドタンパク質を有する。関連性の程度は、ゲノムの長さに沿った遺伝子型間の広範な交差ハイブリダイゼーション、および「逆方向末端反復配列」（ＩＴＲ）に対応する末端における類似の自己アニーリングセグメントの存在を明らかにするヘテロ二本鎖分析によってさらに示唆される。類似の感染性パターンは、各血清型における複製機能が類似の調節制御下にあることも示唆する。
【００６２】
本明細書で使用される「ＡＡＶベクター」とは、ＡＡＶ末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接している１つ以上の目的とするポリヌクレオチド（またはトランス遺伝子）を指す。かかるＡＡＶベクターは、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物をコードおよび発現するベクターでトランスフェクトされた宿主細胞中に存在する場合に、感染ウイルス粒子に複製およびパッケージングされ得る。
【００６３】
「ＡＡＶビリオン」または「ＡＡＶウイルス粒子」または「ＡＡＶベクター粒子」とは、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質およびカプシドに包まれたポリヌクレオチドＡＡＶベクターから成るウイルス粒子を指す。粒子が異種ポリヌクレオチド（すなわち、哺乳類細胞に送達されるトランス遺伝子等の野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を含む場合、それは、典型的には、「ＡＡＶベクター粒子」または単に「ＡＡＶベクター」と称される。したがって、かかるベクターがＡＡＶベクター粒子内に含有されるため、ＡＡＶベクター粒子の産生には、必然的にＡＡＶベクターの産生が含まれる。
【００６４】
ＡＡＶ
本発明の組換えＡＡＶゲノムは、本発明の核酸分子および核酸分子に隣接する１つ以上のＡＡＶ  ＩＴＲを含む。ｒＡＡＶゲノムのＡＡＶ  ＤＮＡは、ＡＡＶ血清型ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７、ＡＡＶ−８、ＡＡＶ−９、ＡＡＶ−１０、ＡＡＶ−１１、ＡＡＶ−１２、およびＡＡＶ−１３を含むがこれらに限定されない、組換えウイルスを誘導できる任意のＡＡＶ血清型に由来し得る。偽型ｒＡＡＶの産生は、例えばＷＯ０１／８３６９２に開示されている。他のタイプのｒＡＡＶ変異体、例えば、カプシド変異を有するｒＡＡＶも企図される。例えば、Ｍａｒｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２２（１１）：１９００−１９０９（２０１４）を参照されたい。上述の背景技術のセクションに記載されるように、様々なＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列が、当該技術分野において公知である。骨格筋特異的発現を促進するために、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８またはＡＡＶｒｈ．７４を使用することができる。
【００６５】
本発明のＤＮＡプラスミドは、本発明のｒＡＡＶゲノムを含む。ＤＮＡプラスミドは、感染性ウイルス粒子中にｒＡＡＶゲノムを組み立てるために、ＡＡＶのヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、Ｅ１欠損アデノウイルス、またはヘルペスウイルス）による感染を許容できる細胞に導入される。パッケージングされるべきＡＡＶゲノム、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能が細胞に提供される、ｒＡＡＶ粒子を産生する技術は、当該技術分野において標準的である。ｒＡＡＶの産生は、以下の成分、ｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離した（すなわち、その中に存在しない）ＡＡＶ  ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能が、単一細胞（本明細書でパッケージング細胞と表される）内に存在することを必要とする。ＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は、組換えウイルスが由来し得る任意のＡＡＶ血清型に由来してもよく、ｒＡＡＶゲノムＩＴＲとは異なるＡＡＶ血清型、例えば、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶ−８、ＡＡＶ−９、ＡＡＶ−１０、ＡＡＶ−１１、ＡＡＶ−１２、およびＡＡＶ−１３を含むがこれらに限定されない血清型に由来してもよい。偽型ｒＡＡＶの生成は、例えば、ＷＯ０１／８３６９２に開示され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００６６】
パッケージング細胞を生成する方法は、ＡＡＶ粒子の産生に必要な全ての成分を安定して発現する細胞株を作成することである。例えば、ＡＡＶ  ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を欠くｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離したＡＡＶ  ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、およびネオマイシン耐性遺伝子などの選択可能なマーカーを含むプラスミド（または複数のプラスミド）が、細胞のゲノムに組み込まれる。ＡＡＶゲノムは、ＧＣテーリング（Ｓａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ６．ＵＳＡ，７９：２０７７−２０８１）、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む合成リンカーの付加（Ｌａｕｇｈｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｇｅｎｅ，２３：６５−７３）、または直接的な平滑末端ライゲーション（Ｓｅｎａｐａｔｈｙ＆Ｃａｒｔｅｒ，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：４６６１−４６６６）などの方法によって、バクテリアプラスミドに導入されている。次いで、パッケージング細胞株を、アデノウイルスなどのヘルパーウイルスに感染させる。この方法の利点は、細胞が選択可能であり、ｒＡＡＶの大規模産生に好適であることである。好適な方法の他の例は、ｒＡＡＶゲノムならびに／またはｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をパッケージング細胞に導入するためにプラスミドではなくアデノウイルスまたはバキュロウイルスを用いる。
【００６７】
ｒＡＡＶ産生の一般的原理は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９９２，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５３３−５３９、およびＭｕｚｙｃｚｋａ，１９９２，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：９７−１２９）に概説されている。様々なアプローチは、Ｒａｔｓｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２（１９８４）、Ｈｅｒｍｏｎａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６４６６（１９８４）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏ１．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１（１９８５）、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３（１９８８）、およびＬｅｂｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：３４９（１９８８）、Ｓａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２−３８２８（１９８９）、米国特許第５，１７３，４１４号、ＷＯ９５／１３３６５、ならびに対応する米国特許第５，６５８．７７６号、ＷＯ９５／１３３９２、ＷＯ９６／１７９４７、ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００、ＷＯ９７／０９４４１（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４４２３）、ＷＯ９７／０８２９８（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１３８７２）、ＷＯ９７／２１８２５（ＰＣＴ／ＵＳ９６／２０７７７）、ＷＯ９７／０６２４３（ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１０６４）、ＷＯ９９／１１７６４、Ｐｅｒｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ  １３：１２４４−１２５０（１９９５）、Ｐａｕｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４：６０９−６１５（１９９３）、Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ３：１１２４−１１３２（１９９６）、米国特許第５，７８６，２１１号、米国特許第５，８７１，９８２号、および米国特許第６，２５８，５９５号に記載されている。前述の文書は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれ、ｒＡＡＶ産生に関する文書の部分を特に強調する。
【００６８】
したがって、本発明は、感染性ｒＡＡＶを産生するパッケージング細胞を提供する。一実施形態では、パッケージング細胞は、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、およびＰｅｒＣ．６細胞（同種２９３株）などの安定して形質転換された癌細胞であり得る。別の実施形態では、パッケージング細胞は、形質転換された癌細胞ではない細胞、例えば、低継代２９３細胞（アデノウイルスのＥ１で形質転換されたヒト胎児腎細胞）、ＭＲＣ−５細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、ＷＩ−３８細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、Ｖｅｒｏ細胞（サル腎細胞）、およびＦＲｈＬ−２細胞（アカゲザル胎児肺細胞）である。
【００６９】
本発明の組換えＡＡＶ（すなわち、感染性カプシド化ｒＡＡＶ粒子）は、ｒＡＡＶゲノムを含む。例示的な実施形態では、ｒＡＡＶのゲノムは、ＡＡＶのｒｅｐとｃａｐの両方のＤＮＡを欠いており、すなわち、ｒＡＡＶのゲノムのＩＴＲ間にＡＡＶのｒｅｐまたはｃａｐのＤＮＡが存在しない。本発明の核酸分子を含むように構築され得るｒＡＡＶの例は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０４７９９９号（ＷＯ２０１３／０１６３５２）に記載されている。
【００７０】
例示的な実施形態では、本発明（ｉｎｖｅｉｔｏｎ）の組換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶベクタープラスミドｐＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン、ｐＮＬＲｅｐ２−Ｃａｐｒｈ７４、およびｐＨｅｌｐを使用する三重トランスフェクション法（Ｘｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７２，２２２４−２２３２（１９９８）によって産生され、ｐＡＡＶには、ＡＡＶ２末端逆位配列（ＩＴＲ）が隣接するマイクロジストロフィン遺伝子発現カセットが含まれている。ＡＡＶｒｈ７４ビリオンにカプシド化されるのはこの配列である。プラスミドには、マイクロジストロフィン配列と、遺伝子発現を駆動するＭＨＣＫ７エンハンサーおよび筋肉特異的プロモーターのコアプロモーターエレメントが含まれている。発現カセットには、高レベルの遺伝子発現を促進するＳＶ４０イントロン（ＳＤ／ＳＡ）も含まれており、効率的な転写終結のためにウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナルが使用される。
【００７１】
ｐＮＬＲＥＰ２−Ｃａｐｒｈ７４は、血清型ｒｈ７４由来の４つの野生型ＡＡＶ２  ｒｅｐタンパク質と３つの野生型ＡＡＶ  ＶＰカプシドタンパク質をコードするＡＡＶヘルパープラスミドである。ｐＮＬＲＥＰ２−Ｃａｐｒｈ７４プラスミドの概略図は、エラー！参照元が見つかりません。２５に示される。
【００７２】
ｐＨＥＬＰアデノウイルスヘルパープラスミドは１１，６３５ｂｐで、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｖｉｒｏｍｉｃｓから入手した。このプラスミドには、ＡＡＶ複製に重要なアデノウイルスゲノムの領域、すなわちＥ２Ａ、Ｅ４ＯＲＦ６、およびＶＡ  ＲＮＡが含まれている（アデノウイルスＥ１機能は２９３細胞によって提供される）。このプラスミドに存在するアデノウイルス配列は、アデノウイルスゲノムの約４０％に過ぎず、アデノウイルスの末端反復配列などの複製に重要なシスエレメントを含んでいない。したがって、このような生産システムから感染性アデノウイルスが生成されることは予想されない。ｐＨＥＬＰプラスミドの概略図を図２６に示す。
【００７３】
ｒＡＡＶは、当該技術分野で標準の方法によって、例えば、カラムクロマトグラフィーまたは塩化セシウム勾配によって精製され得る。ヘルパーウイルスからｒＡＡＶベクターを精製するための方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，１０（６）：１０３１−１０３９（１９９９）、Ｓｃｈｅｎｐｐ  ａｎｄ  Ｃｌａｒｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，６９  ４２７−４４３（２００２）、米国特許第６，５６６，１１８号、およびＷＯ９８／０９６５７に開示される方法を含む。
【００７４】
別の実施形態では、本発明は、本発明のｒＡＡＶを含む組成物を企図する。本発明の組成物は、ｒＡＡＶおよび薬学的に許容される担体を含む。組成物はまた、希釈剤およびアジュバントなどの他の成分を含んでもよい。許容される担体、希釈剤、およびアジュバントは、受容者に対して無毒であり、好ましくは、採用される用量および濃度で不活性であり、緩衝液およびプルロニックなどの界面活性剤を含む。
【００７５】
本発明の方法で投与されるｒＡＡＶの力価は、例えば、特定のｒＡＡＶ、投与方法、治療目標、個体、および標的とされる細胞型（複数可）に応じて変動し、当該技術分野における標準の方法によって決定され得る。ｒＡＡＶの力価は、ｍｌあたり、約１×１０６、約１×１０７、約１×１０８、約１×１０９、約１×１０１０、約１×１０１１、約１×１０１２、約１×１０１３、約１×１０１４から、またはそれ以上のＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）の範囲であってもよい。投薬量は、ウイルスゲノム（ｖｇ）の単位で表されてもよい。
【００７６】
インビボまたはインビトロで、標的細胞にｒＡＡＶを形質導入する方法が、本発明によって企図される。インビボ方法は、本発明のｒＡＡＶを含む組成物の有効用量または有効な複数用量を、それを必要とする動物（ヒトを含む）に投与するステップを含む。用量が、障害／疾患の発症前に投与される場合、投与は予防的である。用量が、障害／疾患の発症後に投与される場合、投与は治療的である。本発明の実施形態では、有効用量は、治療すべき障害／疾患の状態に関連する少なくとも１つの症状を緩和（排除もしくは軽減）する用量であり、障害／疾患の状態への進行を緩徐化もしくは予防する用量であり、疾患の範囲を縮小する用量であり、疾患の寛解（部分的もしくは完全な）をもたらす用量であり、ならびに／または生存を延長させる用量である。本発明の方法による予防または治療が企図される疾患の例はＤＭＤである。
【００７７】
併用療法も本発明により企図される。本明細書で使用されるとき、組み合わせは、同時治療と逐次的治療の両方を含む。本発明の方法と標準的な医学的治療（例えば、コルチコステロイド）との組み合わせは、新規治療との組み合わせと同様に特に企図されている。
【００７８】
組成物の有効用量の投与は、筋肉内、非経口、静脈内、経口、頬側、鼻、肺、頭蓋内、骨内、眼内、直腸、または膣を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で標準的な経路によるものであり得る。本発明のｒＡＡＶのＡＡＶ成分（特に、ＡＡＶ  ＩＴＲおよびカプシドタンパク質）の投与経路（複数可）および血清型（複数可）は、感染および／または治療される疾患状態ならびにマイクロジストロフィンタンパク質を発現する標的細胞／組織（複数可）を考慮して当業者により選択および／または適合され得る。
【００７９】
本発明は、本発明のｒＡＡＶおよび組成物の有効用量の局所投与および全身投与を提供する。例えば、全身投与とは、全身が影響を受けるように循環系に投与することである。全身投与には、消化管を介した吸収などの経腸投与、および注射、注入、または移植による非経口投与が含まれる。
【００８０】
特に、本発明のｒＡＡＶの実際の投与は、ｒＡＡＶ組換えベクターを動物の標的組織に輸送する任意の物理的方法を使用することにより達成され得る。本発明による投与には、筋肉への注射および血流への注射が含まれるが、これらに限定されない。単にリン酸緩衝生理食塩水にｒＡＡＶを再懸濁することは、筋肉組織での発現に有用なビヒクルを提供するのに十分であることが実証されており、担体またはｒＡＡＶと共投与できる他の成分に既知の制限はない（ＤＮＡを分解する組成物は、ｒＡＡＶを伴う通常の方法では回避すべきである）。ｒＡＡＶのカプシドタンパク質は、ｒＡＡＶが筋肉などの目的の特定の標的組織を標的とするように修飾されてもよい。例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ０２／０５３７０３を参照されたい。医薬組成物は、注射可能な製剤として、または経皮輸送により筋肉に送達される局所製剤として調製することができる。筋肉内注射と経皮輸送の両方のための多数の製剤がこれまでに開発されており、本発明の実施において使用することができる。ｒＡＡＶは、投与および取り扱いを容易にするために、任意の薬学的に許容される担体とともに使用できる。
【００８１】
本明細書に開示される方法で投与されるｒＡＡＶの用量は、例えば、特定のｒＡＡＶ、投与方法、治療目標、個体、および標的とされる細胞型（複数可）に応じて変動し、当該技術分野における標準の方法によって決定され得る。投与される各々のｒＡＡＶの力価は、ｍｌあたり、約１×１０６、約１×１０７、約１×１０８、約１×１０９、約１×１０１０、約１×１０１１、約１×１０１２、約１×１０１３、約１×１０１４から、または約１×１０１５まで、またはそれ以上のＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）の範囲であってもよい。投薬量は、ウイルスゲノム（ｖｇ）の単位で表されてもよい（すなわち、それぞれ、１×１０７ｖｇ、１×１０８ｖｇ、１×１０９ｖｇ、１×１０１０ｖｇ、１×１０１１ｖｇ、１×１０１２ｖｇ、１×１０１３ｖｇ、１×１０１４ｖｇ、１×１０１５）。投薬量は、体重１キログラム（ｋｇ）あたりのウイルスゲノム（ｖｇ）の単位で表されてもよい（すなわち、それぞれ、１×１０１０ｖｇ／ｋｇ、１×１０１１ｖｇ／ｋｇ、１×１０１２ｖｇ／ｋｇ、１×１０１３ｖｇ／ｋｇ、１×１０１４ｖｇ／ｋｇ、１×１０１５ｖｇ／ｋｇ）。ＡＡＶを滴定する方法は、Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，１０：１０３１−１０３９（１９９９）に記載されている。
【００８２】
特に、本発明のｒＡＡＶの実際の投与は、ｒＡＡＶ組換えベクターを動物の標的組織に輸送する任意の物理的方法を使用することにより達成され得る。本発明による投与には、筋肉への注射および血流への注射が含まれるが、これらに限定されない。単にリン酸緩衝生理食塩水にｒＡＡＶを再懸濁することは、筋肉組織での発現に有用なビヒクルを提供するのに十分であることが実証されており、担体またはｒＡＡＶと共投与できる他の成分に既知の制限はない（ＤＮＡを分解する組成物は、ｒＡＡＶを伴う通常の方法では回避すべきである）。ｒＡＡＶのカプシドタンパク質は、ｒＡＡＶが筋肉などの目的の特定の標的組織を標的とするように修飾されてもよい。例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ０２／０５３７０３を参照されたい。医薬組成物は、注射可能な製剤として、または経皮輸送により筋肉に送達される局所製剤として調製することができる。筋肉内注射と経皮輸送の両方のための多数の製剤がこれまでに開発されており、本発明の実施において使用することができる。ｒＡＡＶは、投与および取り扱いを容易にするために、任意の薬学的に許容される担体とともに使用できる。
【００８３】
筋肉内注射の目的のために、ゴマ油または落花生油などのアジュバントの溶液、または水性プロピレングリコールの溶液、ならびに滅菌水溶液を使用することができる。そのような水溶液は、必要に応じて緩衝化することができ、液体希釈剤は最初に生理食塩水またはグルコースで等張にされる。遊離酸（ＤＮＡは酸性リン酸基を含む）または薬理学的に許容される塩としてのｒＡＡＶの溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合した水で調製できる。ｒＡＡＶの分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中で、ならびに油中で調製できる。通常の保存および使用条件下においては、これらの製剤は、微生物の増殖を防止するために保存剤を含む。これに関連して、使用される滅菌水性媒体はすべて、当業者に周知の標準的な技術により容易に入手可能である。
【００８４】
注射用途に適した薬学的な担体、希釈剤、または賦形剤には、滅菌水溶液または分散液、および滅菌注射溶液または分散液の即時調製用の滅菌粉末が含まれる。全ての場合において、形態は滅菌でなければならず、容易な注射可能性が存在する程度に流動性でなければならない。製造および保管の条件下で安定していなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、および植物油を含む溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散剤の場合には必要な粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。注射可能な組成物の長期の吸収は、吸収遅延剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によってもたらすことができる。
【００８５】
滅菌されている注射可能な溶液は、必要な量のｒＡＡＶを適切な溶媒に、必要に応じて上記に列挙した他のさまざまな成分とともに組み込み、その後濾過滅菌することによって調製される。一般的に、分散剤は滅菌した活性成分を、基礎的な分散媒および上に列挙されるものからの必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクルへと混合することによって調製される。滅菌されている注射可能な溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、真空乾燥および凍結乾燥技術であり、それは、活性成分プラス予め滅菌濾過したそれらの溶液からの任意の追加の所望の成分の粉末をもたらす。
【００８６】
ｒＡＡＶによる形質導入は、インビトロで行うこともできる。一実施形態では、所望の標的筋肉細胞を対象から取り出し、ｒＡＡＶで形質導入し、対象に再導入する。代替的に、同系または異種の筋肉細胞は、それらの細胞が対象において不適切な免疫応答を生成しない場合に使用できる。
【００８７】
対象への形質導入および形質導入細胞の再導入のための適切な方法は、当該技術分野で公知である。一実施形態では、細胞は、例えば適切な培地でｒＡＡＶを筋肉細胞と組み合わせ、サザンブロットおよび／またはＰＣＲなどの従来の技術を使用して、または選択可能なマーカーを使用して目的のＤＮＡを持つ細胞をスクリーニングすることにより、インビトロで形質導入することができる。次いで、形質導入された細胞を医薬組成物に製剤化し、組成物を、筋肉内、静脈内、皮下、および腹腔内注射による、または例えばカテーテルを使用した平滑筋および心筋への注射によるなど、様々な技術により対象に導入することができる。
【００８８】
本発明のｒＡＡＶによる細胞の形質導入は、マイクロジストロフィンタンパク質の持続的発現をもたらす。したがって、本発明は、マイクロジストロフィンタンパク質を発現するｒＡＡＶを動物、好ましくはヒトに投与／送達する方法を提供する。これらの方法は、本発明の１つ以上のｒＡＡＶを組織（筋肉などの組織、肝臓や脳などの臓器、唾液腺などの腺を含むが、これらに限定されない）に形質導入することを含む。組織特異的制御エレメントを含む遺伝子カセットを用いて形質導入を実施してもよい。例えば、本発明の一実施形態は、ｍｙｏＤ遺伝子ファミリー（Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：７６１−７６６（１９９１）を参照されたい）などのアクチンおよびミオシン遺伝子ファミリーに由来するもの、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ＭＥＦ−２（Ｃｓｅｒｊｅｓｉ  ａｎｄ  Ｏｌｓｏｎ，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １１：４８５４−４８６２（１９９１））、ヒト骨格アクチン遺伝子（Ｍｕｓｃａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，７：４０８９−４０９９（１９８７））、心臓アクチン遺伝子、筋肉クレアチンキナーゼ配列エレメント（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，９：３３９３−３３９９（１９８９）を参照されたい）、およびマウスクレアチンキナーゼエンハンサー（ｍＣＫ）エレメントに由来する制御エレメント、速筋骨格筋トロポニンＣ遺伝子、遅筋心臓トロポニンＣ遺伝子エレメント、および遅筋トロポニンＩ遺伝子、低酸素誘導性核内因子（Ｓｅｍｅｎｚａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８８：５６８０−５６８４（１９９１））に由来する制御エレメント、グルココルチコイド応答エレメント（ＧＲＥ）（Ｍａｄｅｒ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５６０３−５６０７（１９９３）を参照されたい）を含むステロイド誘導性エレメントおよびプロモーター、ならびにその他の制御エレメントを含むが、これらに限定されない筋肉特異的制御エレメントによって誘導される筋肉細胞および筋肉組織を形質導入する方法を提供する。
【００８９】
筋肉組織は生命維持に必須な臓器ではなく、アクセスしやすいため、インビボＤＮＡ送達の魅力的な標的である。本発明は、形質導入された筋線維からのマイクロジストロフィンの持続的発現を企図する。
【００９０】
「筋肉細胞」または「筋肉組織」とは、あらゆる種類の筋肉（例えば、消化管、膀胱、血管、または心臓組織に由来する骨格筋および平滑筋）に由来する細胞または細胞群を意味する。そのような筋肉細胞は、筋芽細胞、筋細胞、筋管、心筋細胞、および心筋芽細胞など、分化または未分化であり得る。
【００９１】
「形質導入」という用語は、レシピエント細胞によるマイクロジストロフィンの発現をもたらす、本発明の複製欠損ｒＡＡＶを介した、インビボまたはインビトロのいずれかでの、レシピエント細胞へのマイクロジストロフィンのコード領域の投与／送達を指すように使用される。
【００９２】
したがって、本発明は、マイクロジストロフィンをコードするｒＡＡＶの有効用量（または、本質的に同時に投与される用量もしくは間隔を置いて投与される用量）を、それを必要とする患者に投与する方法を提供する。
【実施例】
【００９３】
実施例１
ｐＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物の生成
ｐＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンプラスミドには、ＡＡＶ２末端逆位配列（ＩＴＲ）が隣接するヒトマイクロジストロフィンｃＤＮＡ発現カセットが含まれている（図１を参照されたい）。マイクロジストロフィン構築物は、インフレームロッド欠失（Ｒ４〜Ｒ２３）を特徴とし、ヒンジ１、２、および４、ならびにシステインリッチドメインが１３８ｋＤａタンパク質を産生することを維持する。マイクロジストロフィンタンパク質（３５７９ｂｐ）の発現は、ＭＨＣＫ７プロモーター（７９５ｂｐ）によって誘導された。ｐＡＡＶ．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンプラスミドからＭＣＫプロモーターを除去し、ＭＨＣＫ７プロモーターを挿入することにより、プラスミドを構築した。コアプロモーターの後、５３ｂｐの内因性マウスＭＣＫエクソン１（非翻訳）が効率的な転写開始のために存在し、その後にＳＶ４０後期１６Ｓ／１９Ｓスプライスシグナル（９７ｂｐ）および小さな５’ＵＴＲ（６１ｂｐ）が続く。イントロンおよび５’ＵＴＲは、プラスミドｐＣＭＶβ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に由来する。マイクロジストロフィンカセットは、ＡＴＧ開始の直前にコンセンサスのコザックがあり、ｍＲＮＡ終了のための小さな５３ｂｐの合成ポリＡシグナルを有していた。Ｈａｒｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ８，２５３−２６１（２００２））によって以前に記載されたように、ヒトマイクロジストロフィンカセットは、（Ｒ４〜Ｒ２３／Δ７１〜７８）ドメインを含んでいた。相補的ＤＮＡは、ヒトでの使用のためにコドン最適化され、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって合成された（Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １８，１０９−１１７（２０１０））。このベクターに含まれる唯一のウイルス配列は、ウイルスＤＮＡの複製とパッケージングの両方に必要なＡＡＶ２の末端逆位配列であった。マイクロジストロフィンカセットは、ｍＲＮＡ終結のための小さな５３ｂｐの合成ポリＡシグナルを有する。
【００９４】
以前の研究では、ＭＨＣＫ７プロモーター（Ｓａｌｖａ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １５，３２０−３２９（２００７）を使用する心臓での発現が立証され、ＡＡＶｒｈ７４が骨格筋、横隔膜、および心筋での発現を達成した（Ｓｏｎｄｅｒｇａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ２，２５６−２７０  （２０１５））。図１の構築物の配列は、ＡＡＶｒｈ．７４ビリオンにカプシド化された。ＡＡＶｒｈ．７４血清型の分子クローンはｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅのリンパ節からクローン化され、Ｒｏｄｉｎｏ−Ｋｌａｐａｃ  ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ５，４５（２００７）に記載されている。
表１は、プラスミドｐＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン（配列番号３）の分子の特徴を示す。
【表１】
2020513811.tif 000003
【００９５】
実施例２
ｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンを使用した筋肉内発現研究
発現研究は、筋肉内注射により、ヒトマイクロジストロフィン構築物（ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン；実施例１に記載）で実施された。ｍｄｘマウス（ジストロフィンを発現しない自発的なＤｍｄｍｄｘ変異体マウス）の前脛骨筋に１×１０１１ｖｇのカセット（群あたりｎ＝５）を注射した。６週間後、筋肉を採取し、ジストロフィン発現についてジストロフィンのＮ末端抗体で（Ｄｙｓ３）ならびにヘマトキシリンおよびエオシン（ＨＥ）染色で染色した。図２は、未処理の筋肉と比較して１×１０１１ｖｇの用量での拡散した遺伝子発現と中心に配置された核の減少を示す。さらに、平均繊維／フレームの増加に伴う中心核形成の減少が、マイクロジストロフィン構築物での処理後に観察された。ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物の発現レベルは約７３％と定量化された。
【００９６】
マイクロジストロフィンの局在と発現レベルの測定に加えて、カセットの筋肉内注射後の骨格筋力を測定した。ｐＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン構築物の筋肉内発現により、未処理の対照と比較して、絶対的な力および比力の生成が大幅に増加した（それぞれ、図３Ａおよび３Ｂ）。
【００９７】
実施例３
ｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンのｍｄｘマウスへの全身送達
ｍｄｘマウスのコホートに、６週齢で、２×１０１２ｖｇ（８×１０１３ｖｇ／ｋｇ）または高用量（計画された臨床用量）６×１０１２ｖｇ（２×１０１４ｖｇ／ｋｇ）のいずれかのｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンを尾静脈を介して注射した。１２週間の治療後、全ての筋肉を採取し、ジストロフィンとＤＡＰＣ成分の回復について染色した。全身注射（尾静脈）マウスは、全ての筋肉にわたってジストロフィンの高レベルの染色を示した。図４Ａは、６×１０１２ｖｇ（２×１０１４ｖｇ／ｋｇ）の全身投与後の骨格、横隔膜、および心筋線維の広範な形質導入を表している。図４Ｂは、各組織でマイクロジストロフィンを発現している筋線維の割合の定量化を示している。最後に、横隔膜の機能改善を試験した（図４Ｃ）。低用量では顕著な差は見られなかったが、高用量では顕著な改善があった。重要なことに、図５は、ＤＡＰＣの他の成分がマイクロジストロフィンの送達後に完全に復元されたことを示している。示されているのはベータサルコグリカン（Ｂ−ＳＧ）である。
【００９８】
ＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンの毒物学／安全性は、表２に従ってｍｄｘマウスの尾静脈への静脈内（ｉ．ｖ．）注射によりベクターを投与することにより評価された。次を含む分析された筋肉組織のいずれにおいても毒性の証拠はなかった：前脛骨筋（ＴＡ）、腓腹筋（ＧＡＳ）、大腿四頭筋（ＱＤ）、腰筋（ＰＳＯ）、上腕三頭筋（ＴＲＩ）、および横隔膜（ＤＩＡ）（図６Ａおよび６Ｂ）。中心に配置された核の数は、高用量６×１０１２ｖｇ（２×１０１４ｖｇ／ｋｇ）で減少した。歴史的に、未処理の年齢適合ｍｄｘマウスの骨格筋の中心核形成は、平均で約８０％である。最後に、小さい試料サイズ（ｎ＝３）からの予備データは、高用量（Ｄ）処理マウスの血清におけるＣＫ放出レベル（Ｕ／Ｌ）の減少を実証する。独立したｔ検定を使用して差異を特定し（ｐ＜０．０５）、データを平均±ＳＥＭとして報告する。
【表２】
2020513811.tif 000004
【００９９】
実施例４
ｐＡＡＶ．ＭＣＫ．マイクロジストロフィン構築物の生成
ｐＡＡＶ．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンプラスミドは、コドン最適化ヒトマイクロジストロフィンｃＤＮＡ配列を駆動するＭＣＫ発現カセットをＡＡＶクローニングベクターｐｓｕｂ２０１（Ｓａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１（１０）：３０９６−３１０１）に挿入することにより構築された。筋肉特異的な遺伝子発現を駆動するために、筋肉特異的な調節エレメントが構築物に含まれていた。この調節エレメントは、３５１ｂｐのＭＣＫコアプロモーター（近位）に融合したマウスＭＣＫコアエンハンサー（２０６ｂｐ）で構成されていた。コアプロモーターの後、構築物には、効率的な転写開始のための５３ｂｐの内因性マウスＭＣＫエクソン１（非翻訳）が含まれ、その後にＳＶ４０後期１６Ｓ／１９Ｓスプライスシグナル（９７ｂｐ）および小さな５’ＵＴＲ（６１ｂｐ）が続く。イントロンおよび５’ＵＴＲは、プラスミドｐＣＭＶβ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に由来した。マイクロジストロフィンカセットは、ＡＴＧ開始の直前にコンセンサスのコザックがあり、ｍＲＮＡ終了のための小さな５３ｂｐの合成ポリＡシグナルを有している。Ｈａｒｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８（３）：２５３−６１，２００２によって以前に記載されたように、ヒトマイクロジストロフィンカセットは、（Ｒ４〜Ｒ２３／Δ７１〜７８）ドメインを含んでいる。
【０１００】
ｐＡＡＶ．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンプラスミドには、ＡＡＶ２末端逆位配列（ＩＴＲ）が隣接するヒトマイクロジストロフィンｃＤＮＡ発現カセットが含まれていた（図７を参照されたい）。この配列はＡＡＶｒｈ．７４ビリオンにカプシド化された。ＡＡＶｒｈ．７４血清型の分子クローンはｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅのリンパ節からクローン化され、Ｒｏｄｉｎｏ−Ｋｌａｐａｃ  ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｒａｎ．Ｍｅｄ．４５（２００７）に記載されている。
【０１０１】
実施例５
ｒＡＡＶ．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンを使用した効力と用量の分析
発現研究は、筋肉内注射により、ヒトマイクロジストロフィン構築物（ｒＡＡＶ．ＭＣＫ．マイクロジストロフィン；実施例１に記載）で実施された。ｍｄｘマウス（ジストロフィンを発現しない自発的なＤｍｄｍｄｘ変異体マウス）の前脛骨（ＴＡ）筋に３×１０９、３×１０１０、または１×１０１１ｖｇのカセット（群あたりｎ＝３）を注射した。４週間後、筋肉を採取し、ジストロフィン発現についてＮ末端Ｄｙｓ３に特異的な抗体を使用してならびにヘマトキシリンおよびエオシン（ＨＥ）染色で染色した。図８は、３×１０９ｖｇでの非常にわずかな発現（効果なしのレベル）と１×１０１１ｖｇでの８９％の発現による、発現と用量の間には線形相関を示す。
【０１０２】
実施例６
ｒＡＡＶ．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンのｍｄｘマウスへの血管送達
分離式肢灌流モデル（Ｒｏｄｉｎｏ−Ｋｌａｐａｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｔｒａｎｓ．Ｍｅｄ．５（４５）：１−１１，２００７）を使用して、ｍｄｘマウス（ｎ＝１０）に１×１０１１ｖｇのｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンを大腿動脈から注射し、実施した結果の分析を実施した。遺伝子導入の３ヵ月後、下肢の筋肉が採取され、有効性の研究により、力と伸張性収縮誘発損傷に対する抵抗性の両方で大幅な改善が示された（図９）。
【０１０３】
長指伸筋（ＥＤＬ）筋肉およびＴＡ筋肉におけるジストロフィンタンパク質の免疫染色は、大腿動脈を介したｒＡＡＶｒｈ．７４−ＭＣＫ−マイクロジストロフィン処理後のｍｄｘ筋線維における発現を示している（図９Ａ）。模擬感染した筋肉は同一の方法で染色され、暴露時間は一致していた。図９Ｂは、ｒＡＡＶｒｈ．７４−ＭＣＫ−マイクロジストロフィンは、模擬処理されたｍｄｘ筋肉と比較して、正常化した比力を有意に増加させたことを実証する（Ｐ＜０．０５対ｍｄｘ）。さらに、ｒＡＡＶｒｈ．７４−ＭＣＫ−マイクロジストロフィン（ヒト）に感染したｍｄｘ筋肉を、遺伝子導入後１２週間で、反復的伸張性収縮中の力低下について、模擬感染した反対側のｍｄｘ  ＥＤＬ筋肉（青）および野生型（ＷＴ  Ｃ５７Ｂｌ／１０）ＥＤＬ筋肉と比較した（図９Ｃ）。ｒＡＡＶｒｈ．７４−ＭＣＫ−マイクロジストロフィン（Ｍｉｃｒｏ−ｄｙｓ）処理は、模擬処理されたｍｄｘ筋肉と比較して、力の損失に対して有意に保護することが見い出された（Ｐ＜０．００１対ｍｄｘ）。
【０１０４】
実施例７
霊長類研究
マウスにおける前臨床所見を臨床パラダイムに適用するため、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）が、将来の臨床試験の安全性と有効性を評価するために全身投与された。ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン．ＦＬＡＧの２×１０１４ｖｇ総用量の、頭部静脈を介して静脈内送達された効果を、非ヒト霊長類で研究した。この用量は、マウスに与えられた全身用量に比例し（動物の体重に基づいて）、マウスに与えられた中用量（６．０×１０１２ｖｇ総用量）に対応した。
【０１０５】
ベースラインの化学および酵素結合免疫吸着スポットアッセイ（ＥＬＩＳｐｏｔ）分析を含む免疫学的研究を実施して、ＡＡＶｒｈ．７４カプシドおよびマイクロジストロフィンに対するＴ細胞、ならびに抗ＡＡＶ抗体力価を測定した。ＡＡＶｒｈ．７４カプシドタンパク質（Ｇｅｎｅｍｅｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓａｎ  Ａｎｔｏｎｉｏ，ＴＸ）のために、それぞれが１８アミノ酸長で１１残基オーバーラップする３４〜３６ペプチドを含む３つのペプチドプールを使用した。マイクロジストロフィン．ＦＬＡＧタンパク質（Ｇｅｎｅｍｅｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）を含む４つのペプチドプールは、それぞれ１８アミノ酸長で、１１残基重複している。コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）（Ｓｉｇｍａ、１μｇ／ｍＬ）を陽性対照として、０．２５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を陰性対照として使用した。これらの研究は、研究全体で２週間ごとに繰り返された。治療後３ヶ月で、完全な組織剖検を得るために動物を安楽死させた。免疫学的アッセイでは、ＥＬＩＳｐｏｔによるカプシドまたは導入遺伝子に対する予期しない応答は示されず（図１２Ａ）、ＥＬＩＳＡによるＡＡＶｒｈ７４カプシドに対する予期しない抗体応答も示されなかった（図１２Ｂ）。
【０１０６】
さらに、以下の表３に示すように、完全な全血球数および化学パネルにより、肝酵素のわずかな上昇が認められたが、これは介入または治療の必要なしに正常化してベースラインに戻った。
【表３】
2020513811.tif 000005
【０１０７】
研究期間中、他の予期しない化学値はなかった。最後に、全ての骨格筋の完全な分析により、ＦＬＡＧ特異抗体による免疫蛍光染色と、ジストロフィンに対するマウスモノクローナル抗体を使用したウェスタンブロット検出により、筋線維での広範な発現が示された（図１４Ａ、Ｂ）。
【０１０８】
データは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン．ＦＬＡＧの全身送達が、非ヒト霊長類の全ての骨格筋にわたって広範囲に発現する安全性と有効性を確立したことを示している。
【０１０９】
実施例８
有効性を実証する前臨床研究
ｍｄｘマウスの骨格および心筋の欠損の処理におけるｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンの全身送達の有効性を実証するために、前臨床研究が実施された。実施例１に記載される筋肉および心臓特異的プロモーターＭＨＣＫ７により駆動されるコドン最適化ヒトマイクロジストロフィン導入遺伝子を含むＡＡＶｒｈ７４ベクターをこの研究に使用した。
【０１１０】
ｍｄｘ（ジストロフィンヌル）マウスの尾静脈を介したｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンの全身注射は、用量反応研究に使用された。この研究の結果は、ｍｄｘマウスへの全身注射が用量依存的に四肢および横隔膜で測定された組織学的および機能的結果を正常化するのに効果的であることを実証した。さらに、委員会認定の獣医病理学者による正式な組織病理学調査の後、重要なベクター関連毒性は報告されなかった。
【０１１１】
この研究のためのベクターは、研究グレードの条件下で、ＨＥＫ２９３細胞の三重トランスフェクション法を利用して、ナショナルワイド・チルドレンズ病院のウイルスベクターコアによって作成された。生産後のベクターの特性評価には、スーパーコイル標準、エンドトキシンレベル測定（ＥＵ／ｍＬ）および無菌性評価を伴う、ｑＰＣＲによる力価決定が含まれる。生成されたベクターをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、予想されるｒＡＡＶとのバンドパターンの一貫性を検証した。ベクターは、マイクロジストロフィン構築物、発現を駆動する筋肉特異的ＭＨＣＫ７プロモーター、コンセンサスコザック配列（ＣＣＡＣＣ）、ＳＶ４０キメライントロン、合成ポリアデニル化部位（５３ｂｐ）を含むプラスミドを使用して作成された（エラー！参照ソースが見つかりません。）。マイクロジストロフィン発現カセットは、骨格および心臓組織の形質導入を強化するために、ＡＡＶｒｈ７４ベクターにパッケージ化されたＡＡＶ２  ＩＴＲの間にクローニングされた。
【０１１２】
ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン試験試料の効力決定は、ｍｄｘマウスへのベクターの筋肉内注射を行うことにより達成された。野生型マウスは陽性対照として機能し、無菌乳酸リンゲル液のｍｄｘマウスへの注射は陰性対照として機能する。
【表４】
2020513811.tif 000006
【０１１３】
表４に示されている動物に、示された年齢（４〜５週齢）で全身送達のための尾静脈注射を投与した。筋肉内注射で正確な投与を行うために、動物をイソフルラン吸入により簡単に麻酔した。下後肢の前脛骨筋への直接注射により用量を投与した。全身送達による正確な投与には麻酔は必要なかった。用量は、尾静脈を通して血管系により投与された。ベクター用量全体を血管に正確に置くように注意した。投与が行われた後、動物は自発運動が回復するまで加熱パッド上に置かれ、その後ケージに戻された。各動物の観察は、研究の全期間にわたって毎週行われた。
【０１１４】
表４に記載されている適切な年齢で、マウスにケタミン／キシラジン混合物（２００ｍｇ／ｋｇ／２０ｍｇ／ｋｇ）を過剰投与した。血液を心臓穿刺で採取し、全血を全血球計算（ＣＢＣ）分析のために送って、血清をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙが分析するまで−８０℃で保存した。その後、組織を収集し、独立した獣医組織病理学者による分析と社内での分析のために送った。
【０１１５】
ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンを１×１０１１ｖｇの総用量でジストロフィンヌルマウスに筋肉内送達すると、注入されたＴＡ筋肉で約７０％のジストロフィンが発現した。ベクター投与マウスの免疫蛍光イメージングにより、マイクロジストロフィン遺伝子の発現が確認された。
【０１１６】
ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンによる全身処理後のジストロフィン発現の回復
ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン試験試料の効力決定は、注射後３か月および６か月の時点で全身に送達されたときの導入遺伝子発現およびベクターの有効性を評価するために、低、中、および高用量（２．０×１０１２ｖｇ総用量；６．０×１０１２ｖｇ総用量；１．２×１０１３ｖｇ総用量）での用量漸増で、ｍｄｘマウス（遺伝子型：Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ−ＤＭＤｍｄｘ／Ｊ）における全身注射を行うことによって達成された。マウスに生後４〜５週間で注射し、注射後３ヶ月と６ヶ月の両方で完全な剖検を実施した。群あたりの平均動物体重に基づいて、これらの用量は８×１０１３ｖｇ／ｋｇ、２×１０１４ｖｇ／ｋｇおよび６×１０１４ｖｇ／ｋｇに等しい。等量の乳酸リンゲル液の注射が陰性対照として機能した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスへの乳酸リンゲル液の同量の注射は、陽性対照として機能した。安全性は、６．０×１０１２ｖｇ総用量の用量でＷＴマウスに全身注射（ＷＴ  ＴＸ−中用量群と呼ばれる）を行うことによって決定された。骨格筋、前脛骨筋（ＴＡ）、腓腹筋（ＧＡＳ）、大腿四頭筋（ＱＵＡＤ）、殿筋（ＧＬＵＴ）、腰筋、上腕三頭筋（ＴＲＩ）、横隔膜（ＤＩＡ）、および心臓の免疫蛍光染色を実施して、ジストロフィンの回復を判定し、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンのウイルスベクターの有効性を確認した。
【０１１７】
分析のために、骨格筋（ＴＡ、ＱＵＡＤ、ＧＬＵＴ、ＴＲＩ）が心臓および横隔膜とともに抽出された。毒物学および体内分布の研究のために臓器も摘出された。マイクロジストロフィン導入遺伝子の発現は、３〜６ヶ月の処理後も高いままであった。これは、筋肉組織病理学の改善と機能の改善が伴い、オフターゲット臓器での有害作用はなかった。
【０１１８】
ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン全身処理ｍｄｘマウスのジストロフィー表現型の反転
骨格筋、横隔膜、および心臓のヘマトキシリン＆エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を行って、各用量において注射後１２週間で安楽死を伴う、２×１０１２ｖｇ総用量（低用量；ｎ＝１）、６×１０１２ｖｇの総用量（中用量；ｎ＝８）１．２×１０１３ｖｇの総用量（高用量；ｎ＝８）でのｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンの全身注射後のジストロフィー病理の反転と改善を判定した。注射後２４週間で、中用量（６×１０１２ｖｇ総用量）で処理した動物の２番目のコホートを、ジストロフィンの病理の反転と改善について評価した（ｎ＝５）。
【０１１９】
ヒトのマイクロジストロフィンタンパク質の免疫蛍光染色を使用して、マイクロジストロフィンベクターを注射した全てのジストロフィンヌルマウスにおいて、６つの骨格筋（ＴＡ、ＧＡＳ、ＱＵＡＤ、ＧＬＵＴ、腰筋、ＴＲＩ）の左右両側、ならびに横隔膜および心臓のマイクロジストロフィン導入遺伝子発現を判定した。これは、ジストロフィンの回復を判定し、各用量において注射後１２週間で安楽死を伴う、２×１０１２ｖｇ総用量（低用量；ｎ＝２）、６×１０１２ｖｇの総用量（中用量；ｎ＝８）１．２×１０１３ｖｇの総用量（高用量；ｎ＝８）でのｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンのウイルスベクターの有効性を確保するために、実施された。
【０１２０】
発現および形質導入効率を評価するために、３つの投与コホート全ておよび各筋肉の左右両側からの画像を定量化に利用した。各筋肉の４つの２０倍画像を撮影し、各画像のマイクロジストロフィン陽性線維の割合を決定して、各筋肉の平均形質導入パーセントを求めた。図１４および１５は、中用量（６×１０１２ｖｇ；２×１０１４ｖｇ／ｋｇ）および高用量（１．２×１０１３ｖｇ；６×１０１４ｖｇ／ｋｇ）の処理マウスの代表的な画像を示す。乳酸リンゲル液を注射し、年齢を一致させたジストロフィンヌルマウスを陰性対照に含め、乳酸リンゲル液を注射した野生型マウスを陽性対照に含めた。心臓は、分析した全ての動物で７５％以上を示した。
【０１２１】
未処理動物の筋肉は、脂肪浸潤、中心核形成、線維症、および壊死の焦点領域を含む広範なミオパチーを示した。におけるＨ＆Ｅ染色エラー！参照元が見つかりません。１６およびエラー！参照ソースが見つかりません。１７は、正常なＷＴマウスと比較したときのジストロフィンヌルマウスのこのジストロフィー表現型と、中用量（６×１０１２ｖｇ；２×１０１４ｖｇ／ｋｇ）または高用量（１．２×１０１３ｖｇ；６×１０１４ｖｇ／ｋｇ）での治療後の筋肉病理の改善を示している。組織学的パラメーターの定量化により、中心核形成の減少（図１８）および平均繊維径の正規化（エラー！参照ソースが見つかりません。１６および１７）処理マウスでは、全ての筋肉が、用量依存的である。シリウスレッド染色は、未処理（ｍｄｘ  ＬＲ）コホートと比較して、中用量と高用量のコホートの両方で横隔膜のコラーゲン沈着の減少を示した（図１９）。
【０１２２】
ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンによる全身処理の機能的評価
マイクロジストロフィン遺伝子導入が疾患を有する筋肉に機能的強度の利益を提供するかどうかを判断するために、ｍｄｘマウス、ＷＴマウス、および３つの用量レベルでのベクター投与マウスの横隔膜と前脛骨筋の両方の機能特性を評価した。用量漸増には、低用量（８×１０１３ｖｇ／ｋｇ）、中用量（２×１０１４ｖｇ／ｋｇ）、および高用量（６×１０１４ｖｇ／ｋｇ）が含まれた。６×１０１２ｖｇ総用量（中用量）でｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンを全身注射した動物では、ＴＡの伸張性収縮後の比力と力出力の減少のエクスビボ評価を使用したｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンによる全身処理の機能評価を注射後２４週間に利用した。さらに、横隔膜での比力の出力は、同一の動物で評価された。
【０１２３】
上述の図で概説したように、組織病理学は、中用量および高用量での中心核形成、コラーゲン沈着、および繊維サイズの改善により、より正常化された環境を示した。ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンの尾静脈送達は、横隔膜における比力出力の段階的改善（中間用量群での１７６．９ｍＮ／ｍｍ２対高用量群での２２７．７８ｍＮ／ｍｍ２）につながった。また、長期処理したコホートは、注射（中用量２×１０１４ｖｇ／ｋｇ）後６か月のマウスを表し、横隔膜比力出力の長期で偏差がなかった（１７６．９ｍＮ／ｍｍ２対１９４．９ｍＮ／ｍｍ２）（エラー！参照ソースが見つかりません。２０）。
【０１２４】
さらに、ＷＴマウスと比較して、ｍｄｘマウスの前脛骨筋の機能的欠損が観察された。Ｍｄｘマウスは、ＷＴマウスと比較して力の出力が５０％減少（１７１．３ｍＮ／ｍｍ２対２９１．６５ｍＮ／ｍｍ２）および伸張性収縮後の力のより大きな損失（ｍｄｘの３２％の損失、ＷＴの５％の損失）を示した。ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンの中用量レベルの全身送達により、前脛骨筋で６５．５％のジストロフィンおよび２３５．４ｍＮ／ｍｍ２に改善された比力出力の回復がもたらされ、筋肉が、力の２５％のみの減少で、繰り返しの伸張性収縮の損傷から保護された（図２１）。ＷＴ中用量グループは、ベクター処理後の毒性の欠如と機能的結果の測定値の維持を示すために、野生型の処理されたコホートを表している。
【０１２５】
概要
筋肉内注射による生体力価の最初の実証後、骨格筋、横隔膜、および心臓に形質導入しながら、血管送達によりマイクロジストロフィンの同等または増加した回復が達成された。有効性は、炎症の減少、変性線維の減少、および前脛骨筋と横隔膜の伸張性収縮から保護することによる機能回復の改善による、用量依存的なジストロフィー機能の反転を実証した。ベクターの機能的な利点には、横隔膜とＴＡの力の生成における野生型レベルの段階的な改善が含まれる。
【０１２６】
実施例９
ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンによる全身処理の毒性と体内分布
ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンの全身注射を与えられたｍｄｘマウスからの臓器および組織は、ベクターＤＮＡの特定の配列を検出するためのリアルタイム定量ＰＣＲのために収集された。収集された全ての臓器および組織から抽出されたタンパク質をウェスタンブロットで分析し、オフターゲット臓器のマイクロジストロフィンを検出した。
【０１２７】
試験試料は、４〜５週齢で静脈内経路により、低用量（２×１０１２ｖｇ；８×１０１３ｖｇ／ｋｇ）、中用量（６×１０１２ｖｇ；８×１０１４ｖｇ／ｋｇ）、および高用量（１．２×１０１３ｖｇ；６×１０１４ｖｇ／ｋｇ）の３つの用量レベルで与えられた。ベクターの安全性を評価するために、筋肉組織の凍結切片および前述のマウスの同一のコホートから採取した全ての主要臓器でＨ＆Ｅ染色を実施した。また、中用量のベクターで全身処理したＣ５７ＢＬ６  ＷＴマウスからの臓器と筋肉も含まれていた。乳酸リンゲル液処理ｍｄｘおよびＷＴマウスも組織病理学分析に含まれていた。これらの切片は、第三者の委員会認定の獣医病理学者によって毒性について正式に調査され、どのマウスのいずれの試料でも有害作用は検出されなかった。結果を以下に要約する。
【０１２８】
群の詳細と研究デザインを以下の４に示す。
【表５】
2020513811.tif 000007
【０１２９】
ベクター形質導入組織の病理組織学的調査
ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンの静脈内注射は、検査されたいずれの骨格筋でも筋線維の顕微鏡的変化をまったく誘発しなかった。さらに、組織学的に評価された組織のいずれにも治療関連の病変は見られなかった。注目されたいずれの変化も、処理マウスと対照マウスの両方で見られ、偶発的な所見とみなされた。まとめると、これらのデータは、この試験試料が試験対象によって十分に許容されたことを示している。さらに、年齢を一致させた未処理のｍｄｘマウスからの参照標本と比較して、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンの投与は、処理されたｍｄｘマウスの筋線維萎縮を減少させたため、試験試料がｍｄｘの欠乏に関連するミオパチーの程度を改善できることを示している。
【０１３０】
ベクターで全身処理された疾患を有するｍｄｘマウスの調査に加えて、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンは、ｍｄｘマウスにおける上述の研究で確立された最小有効用量（ＭＥＤ）である６×１０１２ｖｇの総用量（２×１０１４ｖｇ／ｋｇ）と同一の用量で５匹のＣ５７ＢＬ／６  ＷＴマウスに全身送達された。これにより、健康なＷＴマウスでの試験試料の静脈内送達の研究が可能になり、処理のみによって何らかの有害作用が生じるかどうかをより明確に決定することができた。ここで同様に、心臓と横隔膜を含むさまざまな骨格筋、および他の５つの臓器が採取され、各組織のＨ＆Ｅ切片が独立した獣医病理学者によって正式に調査された。
【０１３１】
ベクターゲノム生体内分布
リアルタイムの定量的ＰＣＲアッセイ（ｑＰＣＲ）を使用して、試験試料特異的なＤＮＡ配列の存在を調べた。生体内分布解析は、用量レベルごとに３匹のベクター投与ｍｄｘ動物から収集した組織試料で実施した。陽性シグナルは、検出されたゲノムＤＮＡ１μｇあたり１００以上の一本鎖ＤＮＡコピーであった。剖検時に組織を採取し、ＭＨＣＫ７プロモーターの配列に特異的なベクター特異的プライマープローブセットを使用した。以下の図２２および表６は、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン注射マウスの各組織試料で検出されたベクターゲノムコピーを示している。
【表６】
2020513811.tif 000008
【０１３２】
ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン転写物は、収集された全ての組織においてさまざまなレベルで検出されました。予想通り、最高レベルは骨格筋と心臓で見られた。最低レベルは生殖腺、肺、腎臓、および脾臓で検出された。これらのデータは、試験試料がベクター投与マウスの調査された全ての組織に効率的に送達されたことを示している。
【０１３３】
上述のｑＰＣＲの結果が示すように、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンの静脈内送達により、ほとんどの組織においてベクター転写物がさまざまなレベルで分布し、最高レベルは肝臓、心臓、および大腿四頭筋（中用量）、ならびに肝臓、心臓、および腓腹筋（高用量）において起きた。したがって、研究のこの部分の目的は、これらの組織におけるヒトマイクロジストロフィン導入遺伝子のタンパク質発現を決定し、筋肉特異的ＭＨＣＫ７プロモーターの機能性を確実にすることであった。ウェスタンブロッティングを使用して、組織試料でのマイクロジストロフィン発現を検出した。
【０１３４】
タンパク質の発現とベクターの生体内分布もｑＰＣＲとウェスタンブロッティングを使用して評価し（図２３）、これらのデータは、オフサイト臓器のベクターの正常レベルと、高用量で処理した肝臓でのマイクロジストロフィンタンパク質の最小の検出を示している。これらの結果は、肝臓の病理学者によって決定された無毒性と相関していた。さらに、独立したＣＲＯ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によって血清化学が分析され、分析された全ての化学にわたって正常値が示された。肝臓酵素ＡＳＴには３つの異常値があり、そのうち２つはｍｄｘ−ＬＲ群で、１つは中用量群で示された（図２３）。動物のサブセットはクレアチンキナーゼ分析（ＣＫ）を受けたが、試料は生理学的評価の前後に分析された。血清の分析は、試験試料の送達後の毒性の欠如を裏付けている。
【０１３５】
マイクロジストロフィンタンパク質の発現は、全ての骨格筋試料と心臓試料においてさまざまな量で観察された（図２４）。しかしながら、肝臓の高用量コホートで検出されたタンパク質は最小限であった。これは良性の結果であると考えられており、肝臓における存在は肝臓の平滑筋での発現によるものである可能性がある。重要なことには、肝臓における独立した病理学者の報告が示す組織病理学的な有害作用はなかった。
【０１３６】
概要
病理組織学的調査により、ｍｄｘ−ＬＲコホートは、評価された７つの骨格筋全ておよび心臓の右心室壁に影響を及ぼす広範なミオパチーを示したと結論付けられた。組織病理学レビューの主要な発見には、顕著な広範囲の筋線維萎縮（正常な筋線維サイズの３０〜７５％）、最小限から軽度の単核細胞炎症、間質腔の増加、および細胞質ミネラル沈着の増加が含まれた。横隔膜は、単核細胞浸潤および筋線維萎縮の最も顕著な変化を示した。心臓は、心室心筋に最小の単核細胞蓄積の小さな焦点を示した。ベクター投与コホートでは、全ての骨格組織と心臓のミオパチーが大幅に減少した。病理組織学的所見における減少は用量依存的であり、高用量群では変性と炎症が実質的に少なかった。ＷＴ処理コホートおよびベクター投与ｍｄｘコホートで実証されているように、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンによるベクター処理による有害作用はなかった。処理に関係なく、マウスが肝細胞細胞質の軽度の空胞化を示したｍｄｘおよびＷＴマウスの肝臓および肺に偶発的な所見があった。したがって、試験試料は安全かつ有効であり、保護効果は用量依存的であった。
引用文献
１．Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｅ．Ｐ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｒ．Ｈ．，Ｊｒ．＆Ｋｕｎｋｅｌ，Ｌ．Ｍ．Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ：ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ  ｌｏｃｕｓ．Ｃｅｌｌ  ５１，９１９−９２８（１９８７）．
２．Ｓｔｒａｕｂ，Ｖ．＆Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｋ．Ｐ．Ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｎｅｕｒｏｌ  １０，１６８−１７５（１９９７）．
３．Ｓａｃｃｏ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．Ｓｈｏｒｔ  ｔｅｌｏｍｅｒｅｓ  ａｎｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ  ｍｏｄｅｌ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ  ｉｎ  ｍｄｘ／ｍＴＲ  ｍｉｃｅ．Ｃｅｌｌ  １４３，１０５９−１０７１（２０１０）．
４．Ｗａｌｌａｃｅ，Ｇ．Ｑ．＆ＭｃＮａｌｌｙ，Ｅ．Ｍ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｍｕｓｃｌｅ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｒｅｐａｉｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｅｓ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ７１，３７−５７（２００９）．
５．Ｚｈｏｕ，Ｌ．＆  Ｌｕ，Ｈ．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｉｎ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ  Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ  ６９，７７１−７７６（２０１０）．
６．Ｄｅｓｇｕｅｒｒｅ，Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．Ｅｎｄｏｍｙｓｉａｌ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｉｎ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ：ａ  ｍａｒｋｅｒ  ｏｆ  ｐｏｏｒ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ  Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ  ６８，７６２−７７３（２００９）．
７．ＤｉＰｒｉｍｉｏ，Ｎ．，ＭｃＰｈｅｅ，Ｓ．Ｗ．＆Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｕｓｃｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ：ｔｏｗａｒｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌｓ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １２，５５３−５６０（２０１０）．
８．Ｍｅｎｄｅｌｌ，Ｊ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｌｐｈａ−ｓａｒｃｏｇｌｙｃａｎ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎ  ｌｉｍｂ−ｇｉｒｄｌｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ，ｔｙｐｅ  ２Ｄ．Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ  ６８，６２９−６３８（２０１０）．
９．Ｍｅｎｄｅｌｌ，Ｊ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．Ｌｉｍｂ−ｇｉｒｄｌｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ  ｔｙｐｅ  ２Ｄ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｒｅｓｔｏｒｅｓ  ａｌｐｈａ−ｓａｒｃｏｇｌｙｃａｎ  ａｎｄ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ  ６６，２９０−２９７（２００９）．
１０．Ｍｅｎｄｅｌｌ，Ｊ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｐｈａｓｅ  １／２ａ  ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｔｒｉａｌ  ｆｏｒ  ｂｅｃｋｅｒ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２３，１９２−２０１（２０１５）．
１１．Ｃａｒｎｗａｔｈ，Ｊ．Ｗ．＆Ｓｈｏｔｔｏｎ，Ｄ．Ｍ．Ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｄｘ  ｍｏｕｓｅ：  ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｏｌｅｕｓ  ａｎｄ  ｅｘｔｅｎｓｏｒ  ｄｉｇｉｔｏｒｕｍ  ｌｏｎｇｕｓ  ｍｕｓｃｌｅｓ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｓｃｉ  ８０，３９−５４（１９８７）．
１２．Ｃｏｕｌｔｏｎ，Ｇ．Ｒ．，Ｍｏｒｇａｎ，Ｊ．Ｅ．，Ｐａｒｔｒｉｄｇｅ，Ｔ．Ａ．＆Ｓｌｏｐｅｒ，Ｊ．Ｃ．Ｔｈｅ  ｍｄｘ  ｍｏｕｓｅ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ  ｍｙｏｐａｔｈｙ：Ｉ．Ａ  ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ，ｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｉｃ  ａｎｄ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  １４，５３−７０（１９８８）．
１３．Ｃｕｌｌｅｎ，Ｍ．Ｊ．＆Ｊａｒｏｓ，Ｅ．Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｘ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ（ｍｄｘ）ｍｏｕｓｅ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ  ７７，６９−８１（１９８８）．
１４．Ｄｕｐｏｎｔ−Ｖｅｒｓｔｅｅｇｄｅｎ，Ｅ．Ｅ．＆ＭｃＣａｒｔｅｒ，Ｒ．Ｊ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ  ｉｎ  ｄｉａｐｈｒａｇｍ  ｖｅｒｓｕｓ  ｈｉｎｄｌｉｍｂ  ｍｕｓｃｌｅｓ  ｏｆ  ｍｄｘ  ｍｉｃｅ．Ｍｕｓｃｌｅ  Ｎｅｒｖｅ  １５，１１０５−１１１０（１９９２）．
１５．Ｓｔｅｄｍａｎ，Ｈ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｍｄｘ  ｍｏｕｓｅ  ｄｉａｐｈｒａｇｍ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｅｓ  ｔｈｅ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｏｆ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｎａｔｕｒｅ  ３５２，５３６−５３９（１９９１）．
１６．Ｄｅｃｏｎｉｎｃｋ，Ａ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．Ｕｔｒｏｐｈｉｎ−ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ  ａｓ  ａ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｃｅｌｌ  ９０，７１７−７２７（１９９７）．
１７．Ｇｒａｄｙ，Ｒ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．Ｓｋｅｌｅｔａｌ  ａｎｄ  ｃａｒｄｉａｃ  ｍｙｏｐａｔｈｉｅｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｌａｃｋｉｎｇ  ｕｔｒｏｐｈｉｎ  ａｎｄ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ：  ａ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｃｅｌｌ  ９０，７２９−７３８（１９９７）．
１８．Ｌｏｖｅ，Ｄ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．Ａｎ  ａｕｔｏｓｏｍａｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｉｎ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ  ｗｉｔｈ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｔｏ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ３３９，５５−５８（１９８９）．
１９．Ｔｉｎｓｌｅｙ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ３６０，５９１−５９３（１９９２）．
２０．Ｔｉｎｓｌｅｙ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｕｔｒｏｐｈｉｎ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ  ｉｎ  ｍｄｘ  ｍｉｃｅ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ４，１４４１−１４４４（１９９８）．
２１．Ｓｑｕｉｒｅ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｉｎ  ｍｄｘ  ｍｉｃｅ  ｂｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｕｔｒｏｐｈｉｎ：ａｎａｌｙｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ａｎ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  １１，３３３３−３３４４（２００２）．
２２．Ｒａｆａｅｌ，Ｊ．Ａ．，Ｔｉｎｓｌｅｙ，Ｊ．Ｍ．，Ｐｏｔｔｅｒ，Ａ．Ｃ．，Ｄｅｃｏｎｉｎｃｋ，Ａ．Ｅ．＆Ｄａｖｉｅｓ，Ｋ．Ｅ．Ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｕｔｒｏｐｈｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｒｅｓｃｕｅｓ  ｕｔｒｏｐｈｉｎ−ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  １９，７９−８２（１９９８）．
２３．Ｚｈｏｕ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．Ｈａｐｌｏｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ｕｔｒｏｐｈｉｎ  ｇｅｎｅ  ｗｏｒｓｅｎｓ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｉｎ  ｍｄｘ  ｍｉｃｅ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｓｃｉ  ２６４，１０６−１１１（２００８）．
２４．Ｇｕｔｐｅｌｌ，Ｋ．Ｍ．，Ｈｒｉｎｉｖｉｃｈ，Ｗ．Ｔ．＆Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｌ．Ｍ．Ｓｋｅｌｅｔａｌ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／−Ｍｏｕｓｅ  Ｖａｌｉｄａｔｅｓ  Ｉｔｓ  Ｓｕｉｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｓ  ａ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  Ｍｕｓｃｕｌａｒ  Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  １０，ｅ０１１７３０６（２０１５）．
２５．Ｒｏｄｉｎｏ−Ｋｌａｐａｃ，Ｌ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．Ｍｉｃｒｏ−ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ａｎｄ  ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ  ｃｏ−ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｒｅｓｔｏｒｅｓ  ｍｕｓｃｌｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｇｅｄ  ＤＭＤ  ｍｏｄｅｌ．Ｈｕｍａｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２２，４９２９−４９３７（２０１３）．
２６．Ｎｅｖｏ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ｒａｓ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ，ｆａｒｎｅｓｙｌｔｈｉｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ  ａｃｉｄ（ＦＴＳ），ｄｅｃｒｅａｓｅｓ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｍｕｓｃｌｅ  ｓｔｒｅｎｇｔｈ  ｉｎ  ｄｙ／ｄｙ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  ６，ｅ１８０４９（２０１１）．
２７．Ｒｏｄｉｎｏ−Ｋｌａｐａｃ，Ｌ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  ｌｉｍｂ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｉｃｒｏ−ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ｇｅｎｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｈｉｇｈ  ｖｏｌｕｍｅ  ｏｒ  ｈｉｇｈ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｊ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ５，４５（２００７）．
２８．Ｍｕｌｉｅｒｉ，Ｌ．Ａ．，Ｈａｓｅｎｆｕｓｓ，Ｇ．，Ｉｔｔｌｅｍａｎ，Ｆ．，Ｂｌａｎｃｈａｒｄ，Ｅ．Ｍ．＆Ａｌｐｅｒｔ，Ｎ．Ｒ．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ  ｆｒｏｍ  ｃｕｔｔｉｎｇ  ｉｎｊｕｒｙ  ｗｉｔｈ  ２，３−ｂｕｔａｎｅｄｉｏｎｅ  ｍｏｎｏｘｉｍｅ．Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ  ６５，１４４１−１４４９（１９８９）．
２９．Ｒｏｄｉｎｏ−Ｋｌａｐａｃ，Ｌ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＦＬＡＧ−ｔａｇｇｅｄ  ｍｉｃｒｏ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ｉｎ  ｎｏｎｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｔｅｓ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １８，１０９−１１７（２０１０）．
３０．Ｇｒｏｓｅ，Ｗ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｄｙｓｆｅｒｌｉｎ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ＡＡＶ５  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ．ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  ７，ｅ３９２３３（２０１２）．
３１．Ｌｉｕ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｍｉｃｒｏｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｙｏｕｎｇ  ｍｄｘ  ｍｕｓｃｌｅ  ｆｒｏｍ  ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎｊｕｒｙ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １１，２４５−２５６（２００５）．
３２．Ｈａｒｐｅｒ，Ｓ．Ｑ．，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｄｕｌａｒ  ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ８，２５３−２６１（２００２）．
３３．Ｒｏｄｉｎｏ−Ｋｌａｐａｃ，Ｌ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＦＬＡＧ−ｔａｇｇｅｄ  ｍｉｃｒｏ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ｉｎ  ｎｏｎｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｔｅｓ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １８，１０９−１１７（２０１０）．
３４．Ｓａｌｖａ，Ｍ．Ｚ．，ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｃａｓｓｅｔｔｅｓ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ  ｒＡＡＶ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ａｎｄ  ｃａｒｄｉａｃ  ｍｕｓｃｌｅ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １５，３２０−３２９（２００７）．
３５．Ｓｏｎｄｅｒｇａａｒｄ，Ｐ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．ＡＡＶ．Ｄｙｓｆｅｒｌｉｎ  Ｏｖｅｒｌａｐ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｒｅｓｔｏｒｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｄｙｓｆｅｒｌｉｎｏｐａｔｈｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｍｏｄｅｌｓ．Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ２，２５６−２７０（２０１５）．
３６．Ｄｅ，Ｂ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．Ｈｉｇｈ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｐｈａ１−ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｎｏｎｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｔｅ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ｒｈ．１０  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｄｅｓｐｉｔｅ  ｐｒｅｅｘｉｓｔｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｔｏ  ｃｏｍｍｏｎ  ｈｕｍａｎ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １３，６７−７６（２００６）．
３７．Ｒｏｄｉｎｏ−Ｋｌａｐａｃ，Ｌ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  ｌｉｍｂ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｉｃｒｏ−ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ｇｅｎｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｈｉｇｈ  ｖｏｌｕｍｅ  ｏｒ  ｈｉｇｈ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ５，４５（２００７）．
３８．Ｂｕｌｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｘ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ（ｍｄｘ）  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１９８４；８１（４）：１１８９−１１９２．
３９．Ｓｉｃｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｄｘ  ｍｏｕｓｅ：ａ  ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９８９  ３０；２４４（４９１２）：１５７８−８０
配列表
＜１１０＞ネーションワイド・チルドレンズ病院の研究所
＜１２０＞筋肉特異的なアデノ随伴ウイルスベクター送達
筋ジストロフィーを治療するためのマイクロジストロフィン
＜１３０＞  ２８３３５／５１４７５Ａ  ＰＣＴ
＜１５０＞  ＵＳ６２／４７３，１４８
＜１５１＞  ２０１７−０３−１７
＜１６０＞  ５
＜１７０＞  ＰａｔｅｎｔＩｎバージョン３．５
＜２１０＞  １
＜２１１＞  ３５７９
＜２１２＞  ＤＮＡ
＜２１３＞  Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ
＜４００＞  １
ａｔｇｃｔｇｔｇｇｔ  ｇｇｇａｇｇａｇｇｔ  ｇｇａｇｇａｔｔｇｔ  ｔａｔｇａａａｇｇｇ  ａｇｇａｃｇｔｇｃａ  ｇａａｇａａｇａｃｔ  ６０
ｔｔｔａｃｃａａｇｔ  ｇｇｇｔｇａａｃｇｃ  ｔｃａｇｔｔｃａｇｃ  ａａａｔｔｔｇｇｇａ  ａｇｃａｇｃａｃａｔ  ｃｇａｇａａｔｃｔｇ  １２０
ｔｔｔｔｃｃｇａｃｃ  ｔｇｃａｇｇａｔｇｇ  ｇａｇａｃｇｇｃｔｇ  ｃｔｇｇａｔｃｔｇｃ  ｔｇｇａａｇｇａｃｔ  ｇａｃｔｇｇｃｃａｇ  １８０
ａａｇｃｔｇｃｃｃａ  ａａｇａｇａａｇｇｇ  ｇａｇｃａｃｔａｇｇ  ｇｔｇｃａｃｇｃｃｃ  ｔｇａａｃａａｃｇｔ  ｇａａｃａａａｇｃｔ  ２４０
ｃｔｇａｇａｇｔｇｃ  ｔｇｃａｇａａｃａａ  ｃａａｃｇｔｇｇａｔ  ｃｔｇｇｔｇａａｔａ  ｔｔｇｇｃａｇｔａｃ  ｔｇａｔａｔｃｇｔｇ  ３００
ｇａｃｇｇｇａａｃｃ  ａｃａａａｃｔｇａｃ  ａｃｔｇｇｇｃｃｔｇ  ａｔｃｔｇｇａａｃａ  ｔｔａｔｔｃｔｇｃａ  ｃｔｇｇｃａｇｇｔｇ  ３６０
ａａａａａｔｇｔｇａ  ｔｇａａｇａａｃａｔ  ｃａｔｇｇｃｃｇｇｇ  ｃｔｇｃａｇｃａｇａ  ｃｃａａｔｔｃｃｇａ  ｇａａｇａｔｃｃｔｇ  ４２０
ｃｔｇｔｃｔｔｇｇｇ  ｔｇｃｇｇｃａｇａｇ  ｃａｃｃｃｇｃａａｃ  ｔａｔｃｃｃｃａｇｇ  ｔｇａａｃｇｔｇａｔ  ｔａａｃｔｔｃａｃｔ  ４８０
ａｃａｔｃｃｔｇｇａ  ｇｃｇａｃｇｇｇｃｔ  ｇｇｃｃｃｔｇａａｔ  ｇｃｔｃｔｇａｔｔｃ  ａｃａｇｃｃａｃａｇ  ｇｃｃｔｇａｔｃｔｇ  ５４０
ｔｔｃｇａｃｔｇｇａ  ａｔａｇｃｇｔｇｇｔ  ｇｔｇｃｃａｇｃａｇ  ｔｃｔｇｃｃａｃａｃ  ａｇｃｇｃｃｔｇｇａ  ａｃａｔｇｃｃｔｔｃ  ６００
ａａｔａｔｃｇｃｔｃ  ｇｇｔａｃｃａｇｃｔ  ｇｇｇｇａｔｃｇａａ  ａａａｃｔｇｃｔｇｇ  ａｃｃｃａｇａｇｇａ  ｔｇｔｇｇａｃａｃｔ  ６６０
ａｃａｔａｃｃｃａｇ  ａｔａａａａａｇｔｃ  ｔａｔｔｃｔｇａｔｇ  ｔａｃａｔｔａｃｔａ  ｇｃｃｔｇｔｔｃｃａ  ｇｇｔｇｃｔｇｃｃａ  ７２０
ｃａｇｃａｇｇｔｇｔ  ｃｔａｔｔｇａａｇｃ  ｃａｔｔｃａｇｇａｇ  ｇｔｇｇａａａｔｇｃ  ｔｇｃｃｃｃｇｃｃｃ  ｃｃｃｃａａａｇｔｇ  ７８０
ａｃｔａａａｇａｇｇ  ａｇｃａｔｔｔｔｃａ  ｇｃｔｇｃａｔｃａｔ  ｃａｇａｔｇｃａｔｔ  ａｃａｇｃｃａｇｃａ  ｇａｔｔａｃｃｇｔｇ  ８４０
ａｇｃｃｔｇｇｃｔｃ  ａｇｇｇａｔａｔｇａ  ｇｃｇｃａｃｃａｇｔ  ａｇｔｃｃａａａａｃ  ｃａｃｇｇｔｔｃａａ  ｇｔｃｃｔａｃｇｃｔ  ９００
ｔａｔａｃｃｃａｇｇ  ｃｔｇｃｃｔａｃｇｔ  ｇａｃａａｃｔａｇｃ  ｇａｃｃｃｔａｃｔａ  ｇａｔｃｃｃｃｃｔｔ  ｔｃｃａｔｃｃｃａｇ  ９６０
ｃａｃｃｔｇｇａｇｇ  ｃｃｃｃａｇａｇｇａ  ｃａａｇａｇｃｔｔｔ  ｇｇｇｔｃｃａｇｃｃ  ｔｇａｔｇｇａａａｇ  ｃｇａｇｇｔｇａａｔ  １０２０
ｃｔｇｇａｔｃｇｇｔ  ａｃｃａｇａｃａｇｃ  ｃｃｔｇｇａｇｇａｇ  ｇｔｇｃｔｇａｇｃｔ  ｇｇｃｔｇｃｔｇａｇ  ｔｇｃｔｇａａｇａｃ  １０８０
ａｃａｃｔｇｃａｇｇ  ｃｃｃａｇｇｇｃｇａ  ａａｔｔｔｃｃａａｔ  ｇａｃｇｔｇｇａａｇ  ｔｇｇｔｇａａｇｇａ  ｔｃａｇｔｔｃｃａｃ  １１４０
ａｃａｃａｃｇａｇｇ  ｇｃｔａｔａｔｇａｔ  ｇｇａｃｃｔｇａｃａ  ｇｃｔｃａｃｃａｇｇ  ｇｇｃｇｃｇｔｇｇｇ  ｃａａｔａｔｃｃｔｇ  １２００
ｃａｇｃｔｇｇｇｃｔ  ｃｔａａａｃｔｇａｔ  ｃｇｇｃａｃｃｇｇｇ  ａａａｃｔｇａｇｔｇ  ａｇｇａｃｇａｇｇａ  ａａｃａｇａａｇｔｇ  １２６０
ｃａｇｇａｇｃａｇａ  ｔｇａａｃｃｔｇｃｔ  ｇａａｃａｇｃｃｇｃ  ｔｇｇｇａｇｔｇｔｃ  ｔｇａｇａｇｔｇｇｃ  ｔａｇｔａｔｇｇａｇ  １３２０
ａａｇｃａｇｔｃｃａ  ａｃｃｔｇｃａｃｃｇ  ｇｇｔｇｃｔｇａｔｇ  ｇａｃｃｔｇｃａｇａ  ａｃｃａｇａａａｃｔ  ｇａａａｇａｇｃｔｇ  １３８０
ａａｃｇａｃｔｇｇｃ  ｔｇａｃａａａｇａｃ  ｔｇａｇｇａａｃｇｃ  ａｃａａｇｇａａｇａ  ｔｇｇａｇｇａｇｇａ  ｇｃｃａｃｔｇｇｇａ  １４４０
ｃｃｃｇａｃｃｔｇｇ  ａｇｇａｔｃｔｇａａ  ｇａｇａｃａｇｇｔｇ  ｃａｇｃａｇｃａｔａ  ａｇｇｔｇｃｔｇｃａ  ｇｇａｇｇａｔｃｔｇ  １５００
ｇａａｃａｇｇａｇｃ  ａｇｇｔｇｃｇｇｇｔ  ｇａａｃｔｃｃｃｔｇ  ａｃａｃａｔａｔｇｇ  ｔｇｇｔｇｇｔｇｇｔ  ｇｇａｃｇａａｔｃｔ  １５６０
ａｇｔｇｇａｇａｔｃ  ａｃｇｃｃａｃｃｇｃ  ｃｇｃｃｃｔｇｇａｇ  ｇａａｃａｇｃｔｇａ  ａｇｇｔｇｃｔｇｇｇ  ｇｇａｃｃｇｇｔｇｇ  １６２０
ｇｃｃａａｃａｔｔｔ  ｇｃｃｇｇｔｇｇａｃ  ｃｇａｇｇａｃａｇｇ  ｔｇｇｇｔｇｃｔｇｃ  ｔｇｃａｇｇａｃａｔ  ｃｃｔｇｃｔｇａａａ  １６８０
ｔｇｇｃａｇａｇｇｃ  ｔｇａｃｃｇａｇｇａ  ｇｃａｇｔｇｔｃｔｇ  ｔｔｔａｇｔｇｃｔｔ  ｇｇｃｔｇａｇｃｇａ  ｇａａａｇａｇｇａｃ  １７４０
ｇｃｃｇｔｇａａｃａ  ａｇａｔｃｃａｃａｃ  ａａｃｃｇｇｃｔｔｔ  ａａｇｇａｔｃａｇａ  ａｃｇａａａｔｇｃｔ  ｇｔｃｔａｇｃｃｔｇ  １８００
ｃａｇａａａｃｔｇｇ  ｃｔｇｔｇｃｔｇａａ  ｇｇｃｃｇａｔｃｔｇ  ｇａｇａａａａａｇａ  ａｇｃａｇａｇｃａｔ  ｇｇｇｃａａａｃｔｇ  １８６０
ｔａｔａｇｃｃｔｇａ  ａａｃａｇｇａｃｃｔ  ｇｃｔｇａｇｃａｃｃ  ｃｔｇａａｇａａｃａ  ａｇａｇｃｇｔｇａｃ  ｃｃａｇａａｇａｃａ  １９２０
ｇａａｇｃｃｔｇｇｃ  ｔｇｇａｔａａｃｔｔ  ｔｇｃｃｃｇｃｔｇｃ  ｔｇｇｇａｃａａｃｃ  ｔｇｇｔｇｃａｇａａ  ａｃｔｇｇａｇａａａ  １９８０
ａｇｔａｃａｇｃｔｃ  ａｇａｔｃｔｃｔｃａ  ｇｇｃｔｇｔｇａｃｃ  ａｃａａｃｃｃａｇｃ  ｃｔａｇｃｃｔｇａｃ  ｃｃａｇａｃａａｃｃ  ２０４０
ｇｔｇａｔｇｇａａａ  ｃｃｇｔｇａｃｃａｃ  ｃｇｔｇａｃａａｃｃ  ｃｇｃｇａａｃａｇａ  ｔｃｃｔｇｇｔｇａａ  ａｃａｔｇｃｃｃａｇ  ２１００
ｇａａｇａｇｃｔｇｃ  ｃａｃｃｔｃｃａｃｃ  ｔｃｃｃｃａｇａａｇ  ａａｇａｇａａｃｃｃ  ｔｇｇａｇｃｇｇｃｔ  ｇｃａｇｇａｇｃｔｇ  ２１６０
ｃａｇｇａａｇｃｃａ  ｃｔｇａｃｇａａｃｔ  ｇｇａｃｃｔｇａａｇ  ｃｔｇａｇｇｃａｇｇ  ｃｃｇａａｇｔｇａｔ  ｔａａｇｇｇｇｔｃｔ  ２２２０
ｔｇｇｃａｇｃｃｔｇ  ｔｇｇｇｃｇａｔｃｔ  ｇｃｔｇａｔｔｇａｔ  ｔｃｃｃｔｇｃａｇｇ  ａｃｃａｃｃｔｇｇａ  ａａａｇｇｔｇａａｇ  ２２８０
ｇｃｔｃｔｇａｇａｇ  ｇｃｇａａａｔｔｇｃ  ｔｃｃａｃｔｇａａｇ  ｇａｇａａｃｇｔｇａ  ｇｔｃａｔｇｔｇａａ  ｃｇａｔｃｔｇｇｃｔ  ２３４０
ａｇａｃａｇｃｔｇａ  ｃａａｃａｃｔｇｇｇ  ｃａｔｃｃａｇｃｔｇ  ａｇｃｃｃａｔａｃａ  ａｔｃｔｇａｇｃａｃ  ａｃｔｇｇａｇｇａｃ  ２４００
ｃｔｇａａｔａｃｃａ  ｇｇｔｇｇａａｇｃｔ  ｇｃｔｇｃａｇｇｔｇ  ｇｃｔｇｔｇｇａａｇ  ａｃｃｇｇｇｔｇｃｇ  ｇｃａｇｃｔｇｃａｔ  ２４６０
ｇａｇｇｃｃｃａｔｃ  ｇｃｇａｃｔｔｃｇｇ  ａｃｃａｇｃｃａｇｃ  ｃａｇｃａｃｔｔｔｃ  ｔｇａｇｃａｃａｔｃ  ｃｇｔｇｃａｇｇｇｇ  ２５２０
ｃｃｃｔｇｇｇａｇａ  ｇｇｇｃｃａｔｔｔｃ  ｔｃｃｃａａｃａａｇ  ｇｔｇｃｃｃｔａｃｔ  ａｔａｔｔａａｔｃａ  ｃｇａｇａｃｃｃａｇ  ２５８０
ａｃｃａｃｔｔｇｔｔ  ｇｇｇａｃｃａｔｃｃ  ｃａａｇａｔｇａｃａ  ｇａａｃｔｇｔａｃｃ  ａｇｔｃｃｃｔｇｇｃ  ｃｇａｔｃｔｇａａｃ  ２６４０
ａａｃｇｔｇａｇｇｔ  ｔｔａｇｃｇｃｔｔａ  ｃａｇａａｃｃｇｃｔ  ａｔｇａａｇｃｔｇａ  ｇａｃｇｇｃｔｇｃａ  ｇａａｇｇｃｃｃｔｇ  ２７００
ｔｇｃｃｔｇｇａｔｃ  ｔｇｃｔｇｔｃｃｃｔ  ｇｔｃｃｇｃｃｇｃｃ  ｔｇｃｇａｔｇｃｃｃ  ｔｇｇａｔｃａｇｃａ  ｔａａｔｃｔｇａａｇ  ２７６０
ｃａｇａａｃｇａｔｃ  ａｇｃｃａａｔｇｇａ  ｔａｔｃｃｔｇｃａｇ  ａｔｃａｔｃａａｃｔ  ｇｃｃｔｇａｃｃａｃ  ｔａｔｃｔａｃｇａｃ  ２８２０
ａｇｇｃｔｇｇａｇｃ  ａｇｇａｇｃａｃａａ  ｃａａｃｃｔｇｇｔｇ  ａａｃｇｔｇｃｃｔｃ  ｔｇｔｇｃｇｔｇｇａ  ｔａｔｇｔｇｃｃｔｇ  ２８８０
ａａｃｔｇｇｃｔｇｃ  ｔｇａａｃｇｔｇｔａ  ｔｇａｃａｃｔｇｇｇ  ｃｇｃａｃｃｇｇｃｃ  ｇｇａｔｃａｇａｇｔ  ｇｃｔｇａｇｔｔｔｔ  ２９４０
ａａａａｃｔｇｇｇａ  ｔｔａｔｃｔｃｃｃｔ  ｇｔｇｔａａｇｇｃｃ  ｃａｃｃｔｇｇａｇｇ  ａｃａａｇｔａｃａｇ  ｇｔａｃｃｔｇｔｔｃ  ３０００
ａａｇｃａｇｇｔｇｇ  ｃｔａｇｔａｇｃａｃ  ｔｇｇａｔｔｔｔｇｔ  ｇａｃｃａｇｃｇｃｃ  ｇｃｃｔｇｇｇａｃｔ  ｇｃｔｇｃｔｇｃａｔ  ３０６０
ｇａｔａｇｔａｔｃｃ  ａｇａｔｔｃｃｔａｇ  ａｃａｇｃｔｇｇｇａ  ｇａｇｇｔｇｇｃｔａ  ｇｔｔｔｃｇｇａｇｇ  ａｔｃｔａａｃａｔｃ  ３１２０
ｇａａｃｃｃａｇｃｇ  ｔｇｃｇｃａｇｃｔｇ  ｔｔｔｃｃａｇｔｔｔ  ｇｃｃａａｔａａｃａ  ａａｃｃｔｇａａａｔ  ｃｇａｇｇｃｔｇｃｔ  ３１８０
ｃｔｇｔｔｃｃｔｇｇ  ａｔｔｇｇａｔｇｃｇ  ｃｃｔｇｇａａｃｃａ  ｃａｇａｇｃａｔｇｇ  ｔｇｔｇｇｃｔｇｃｃ  ｔｇｔｇｃｔｇｃａｃ  ３２４０
ａｇａｇｔｇｇｃｔｇ  ｃｃｇｃｃｇａａａｃ  ｔｇｃｃａａｇｃａｃ  ｃａｇｇｃｔａａａｔ  ｇｃａａｃａｔｃｔｇ  ｃａａｇｇａａｔｇｔ  ３３００
ｃｃｃａｔｔａｔｃｇ  ｇｃｔｔｔｃｇｃｔａ  ｃａｇｇａｇｔｃｔｇ  ａａａｃａｔｔｔｔａ  ａｃｔａｃｇａｔａｔ  ｔｔｇｃｃａｇａｇｃ  ３３６０
ｔｇｃｔｔｃｔｔｔｔ  ｃｃｇｇａａｇａｇｔ  ｇｇｃｃａａａｇｇａ  ｃａｃａａｇａｔｇｃ  ａｃｔａｃｃｃｔａｔ  ｇｇｔｇｇａａｔａｔ  ３４２０
ｔｇｃａｃｃｃｃａａ  ｃｔａｃａｔｃｔｇｇ  ｃｇａａｇａｔｇｔｇ  ｃｇｃｇａｔｔｔｔｇ  ｃｃａａｇｇｔｇｃｔ  ｇａａｇａａｔａａｇ  ３４８０
ｔｔｔｃｇｇａｃｔａ  ａｇａｇｇｔａｃｔｔ  ｃｇｃｃａａｇｃａｃ  ｃｃｃｃｇｃａｔｇｇ  ｇｇｔａｔｃｔｇｃｃ  ａｇｔｇｃａｇａｃａ  ３５４０
ｇｔｇｃｔｇｇａａｇ  ｇａｇａｃａａｔａｔ  ｇｇａｇａｃｃｇａｔ  ａｃａａｔｇｔｇａ  ３５７９
＜２１０＞  ２
＜２１１＞  ８１０
＜２１２＞  ＤＮＡ
＜２１３＞アデノ随伴ウイルス
＜４００＞  ２
ｇｔｔｔａａａｃａａ  ｇｃｔｔｇｃａｔｇｔ  ｃｔａａｇｃｔａｇａ  ｃｃｃｔｔｃａｇａｔ  ｔａａａａａｔａａｃ  ｔｇａｇｇｔａａｇｇ  ６０
ｇｃｃｔｇｇｇｔａｇ  ｇｇｇａｇｇｔｇｇｔ  ｇｔｇａｇａｃｇｃｔ  ｃｃｔｇｔｃｔｃｔｃ  ｃｔｃｔａｔｃｔｇｃ  ｃｃａｔｃｇｇｃｃｃ  １２０
ｔｔｔｇｇｇｇａｇｇ  ａｇｇａａｔｇｔｇｃ  ｃｃａａｇｇａｃｔａ  ａａａａａａｇｇｃｃ  ａｔｇｇａｇｃｃａｇ  ａｇｇｇｇｃｇａｇｇ  １８０
ｇｃａａｃａｇａｃｃ  ｔｔｔｃａｔｇｇｇｃ  ａａａｃｃｔｔｇｇｇ  ｇｃｃｃｔｇｃｔｇｔ  ｃｔａｇｃａｔｇｃｃ  ｃｃａｃｔａｃｇｇｇ  ２４０
ｔｃｔａｇｇｃｔｇｃ  ｃｃａｔｇｔａａｇｇ  ａｇｇｃａａｇｇｃｃ  ｔｇｇｇｇａｃａｃｃ  ｃｇａｇａｔｇｃｃｔ  ｇｇｔｔａｔａａｔｔ  ３００
ａａｃｃｃａｇａｃａ  ｔｇｔｇｇｃｔｇｃｃ  ｃｃｃｃｃｃｃｃｃｃ  ｃａａｃａｃｃｔｇｃ  ｔｇｃｃｔｃｔａａａ  ａａｔａａｃｃｃｔｇ  ３６０
ｔｃｃｃｔｇｇｔｇｇ  ａｔｃｃｃｃｔｇｃａ  ｔｇｃｇａａｇａｔｃ  ｔｔｃｇａａｃａａｇ  ｇｃｔｇｔｇｇｇｇｇ  ａｃｔｇａｇｇｇｃａ  ４２０
ｇｇｃｔｇｔａａｃａ  ｇｇｃｔｔｇｇｇｇｇ  ｃｃａｇｇｇｃｔｔａ  ｔａｃｇｔｇｃｃｔｇ  ｇｇａｃｔｃｃｃａａ  ａｇｔａｔｔａｃｔｇ  ４８０
ｔｔｃｃａｔｇｔｔｃ  ｃｃｇｇｃｇａａｇｇ  ｇｃｃａｇｃｔｇｔｃ  ｃｃｃｃｇｃｃａｇｃ  ｔａｇａｃｔｃａｇｃ  ａｃｔｔａｇｔｔｔａ  ５４０
ｇｇａａｃｃａｇｔｇ  ａｇｃａａｇｔｃａｇ  ｃｃｃｔｔｇｇｇｇｃ  ａｇｃｃｃａｔａｃａ  ａｇｇｃｃａｔｇｇｇ  ｇｃｔｇｇｇｃａａｇ  ６００
ｃｔｇｃａｃｇｃｃｔ  ｇｇｇｔｃｃｇｇｇｇ  ｔｇｇｇｃａｃｇｇｔ  ｇｃｃｃｇｇｇｃａａ  ｃｇａｇｃｔｇａａａ  ｇｃｔｃａｔｃｔｇｃ  ６６０
ｔｃｔｃａｇｇｇｇｃ  ｃｃｃｔｃｃｃｔｇｇ  ｇｇａｃａｇｃｃｃｃ  ｔｃｃｔｇｇｃｔａｇ  ｔｃａｃａｃｃｃｔｇ  ｔａｇｇｃｔｃｃｔｃ  ７２０
ｔａｔａｔａａｃｃｃ  ａｇｇｇｇｃａｃａｇ  ｇｇｇｃｔｇｃｃｃｔ  ｃａｔｔｃｔａｃｃａ  ｃｃａｃｃｔｃｃａｃ  ａｇｃａｃａｇａｃａ  ７８０
ｇａｃａｃｔｃａｇｇ  ａｇｃｃａｇｃｃａｇ  ｃｇｇｃｇｃｇｃｃｃ  ８１０
＜２１０＞  ３
＜２１１＞  ８６１１
＜２１２＞  ＤＮＡ
＜２１３＞アデノ随伴ウイルス
＜４００＞  ３
ｇｃｃｃａａｔａｃｇ  ｃａａａｃｃｇｃｃｔ  ｃｔｃｃｃｃｇｃｇｃ  ｇｔｔｇｇｃｃｇａｔ  ｔｃａｔｔａａｔｇｃ  ａｇｃｔｇｇｃｇｃｇ  ６０
ｃｔｃｇｃｔｃｇｃｔ  ｃａｃｔｇａｇｇｃｃ  ｇｃｃｃｇｇｇｃａａ  ａｇｃｃｃｇｇｇｃｇ  ｔｃｇｇｇｃｇａｃｃ  ｔｔｔｇｇｔｃｇｃｃ  １２０
ｃｇｇｃｃｔｃａｇｔ  ｇａｇｃｇａｇｃｇａ  ｇｃｇｃｇｃａｇａｇ  ａｇｇｇａｇｔｇｇｃ  ｃａａｃｔｃｃａｔｃ  ａｃｔａｇｇｇｇｔｔ  １８０
ｃｃｔｔｇｔａｇｔｔ  ａａｔｇａｔｔａａｃ  ｃｃｇｃｃａｔｇｃｔ  ａａｔｔａｔｃｔａｃ  ｇｔａｇｃｃａｔｇｔ  ｃｔａｇａｇｔｔｔａ  ２４０
ａａｃａａｇｃｔｔｇ  ｃａｔｇｔｃｔａａｇ  ｃｔａｇａｃｃｃｔｔ  ｃａｇａｔｔａａａａ  ａｔａａｃｔｇａｇｇ  ｔａａｇｇｇｃｃｔｇ  ３００
ｇｇｔａｇｇｇｇａｇ  ｇｔｇｇｔｇｔｇａｇ  ａｃｇｃｔｃｃｔｇｔ  ｃｔｃｔｃｃｔｃｔａ  ｔｃｔｇｃｃｃａｔｃ  ｇｇｃｃｃｔｔｔｇｇ  ３６０
ｇｇａｇｇａｇｇａａ  ｔｇｔｇｃｃｃａａｇ  ｇａｃｔａａａａａａ  ａｇｇｃｃａｔｇｇａ  ｇｃｃａｇａｇｇｇｇ  ｃｇａｇｇｇｃａａｃ  ４２０
ａｇａｃｃｔｔｔｃａ  ｔｇｇｇｃａａａｃｃ  ｔｔｇｇｇｇｃｃｃｔ  ｇｃｔｇｔｃｔａｇｃ  ａｔｇｃｃｃｃａｃｔ  ａｃｇｇｇｔｃｔａｇ  ４８０
ｇｃｔｇｃｃｃａｔｇ  ｔａａｇｇａｇｇｃａ  ａｇｇｃｃｔｇｇｇｇ  ａｃａｃｃｃｇａｇａ  ｔｇｃｃｔｇｇｔｔａ  ｔａａｔｔａａｃｃｃ  ５４０
ａｇａｃａｔｇｔｇｇ  ｃｔｇｃｃｃｃｃｃｃ  ｃｃｃｃｃｃａａｃａ  ｃｃｔｇｃｔｇｃｃｔ  ｃｔａａａａａｔａａ  ｃｃｃｔｇｔｃｃｃｔ  ６００
ｇｇｔｇｇａｔｃｃｃ  ｃｔｇｃａｔｇｃｇａ  ａｇａｔｃｔｔｃｇａ  ａｃａａｇｇｃｔｇｔ  ｇｇｇｇｇａｃｔｇａ  ｇｇｇｃａｇｇｃｔｇ  ６６０
ｔａａｃａｇｇｃｔｔ  ｇｇｇｇｇｃｃａｇｇ  ｇｃｔｔａｔａｃｇｔ  ｇｃｃｔｇｇｇａｃｔ  ｃｃｃａａａｇｔａｔ  ｔａｃｔｇｔｔｃｃａ  ７２０
ｔｇｔｔｃｃｃｇｇｃ  ｇａａｇｇｇｃｃａｇ  ｃｔｇｔｃｃｃｃｃｇ  ｃｃａｇｃｔａｇａｃ  ｔｃａｇｃａｃｔｔａ  ｇｔｔｔａｇｇａａｃ  ７８０
ｃａｇｔｇａｇｃａａ  ｇｔｃａｇｃｃｃｔｔ  ｇｇｇｇｃａｇｃｃｃ  ａｔａｃａａｇｇｃｃ  ａｔｇｇｇｇｃｔｇｇ  ｇｃａａｇｃｔｇｃａ  ８４０
ｃｇｃｃｔｇｇｇｔｃ  ｃｇｇｇｇｔｇｇｇｃ  ａｃｇｇｔｇｃｃｃｇ  ｇｇｃａａｃｇａｇｃ  ｔｇａａａｇｃｔｃａ  ｔｃｔｇｃｔｃｔｃａ  ９００
ｇｇｇｇｃｃｃｃｔｃ  ｃｃｔｇｇｇｇａｃａ  ｇｃｃｃｃｔｃｃｔｇ  ｇｃｔａｇｔｃａｃａ  ｃｃｃｔｇｔａｇｇｃ  ｔｃｃｔｃｔａｔａｔ  ９６０
ａａｃｃｃａｇｇｇｇ  ｃａｃａｇｇｇｇｃｔ  ｇｃｃｃｔｃａｔｔｃ  ｔａｃｃａｃｃａｃｃ  ｔｃｃａｃａｇｃａｃ  ａｇａｃａｇａｃａｃ  １０２０
ｔｃａｇｇａｇｃｃａ  ｇｃｃａｇｃｇｇｃｇ  ｃｇｃｃｃａｇｇｔａ  ａｇｔｔｔａｇｔｃｔ  ｔｔｔｔｇｔｃｔｔｔ  ｔａｔｔｔｃａｇｇｔ  １０８０
ｃｃｃｇｇａｔｃｃｇ  ｇｔｇｇｔｇｇｔｇｃ  ａａａｔｃａａａｇａ  ａｃｔｇｃｔｃｃｔｃ  ａｇｔｇｇａｔｇｔｔ  ｇｃｃｔｔｔａｃｔｔ  １１４０
ｃｔａｇｇｃｃｔｇｔ  ａｃｇｇａａｇｔｇｔ  ｔａｃｔｔｃｔｇｃｔ  ｃｔａａａａｇｃｔｇ  ｃｇｇａａｔｔｇｔａ  ｃｃｃｇｃｇｇｃｃｇ  １２００
ｃｃａｃｃａｔｇｃｔ  ｇｔｇｇｔｇｇｇａｇ  ｇａｇｇｔｇｇａｇｇ  ａｔｔｇｔｔａｔｇａ  ａａｇｇｇａｇｇａｃ  ｇｔｇｃａｇａａｇａ  １２６０
ａｇａｃｔｔｔｔａｃ  ｃａａｇｔｇｇｇｔｇ  ａａｃｇｃｔｃａｇｔ  ｔｃａｇｃａａａｔｔ  ｔｇｇｇａａｇｃａｇ  ｃａｃａｔｃｇａｇａ  １３２０
ａｔｃｔｇｔｔｔｔｃ  ｃｇａｃｃｔｇｃａｇ  ｇａｔｇｇｇａｇａｃ  ｇｇｃｔｇｃｔｇｇａ  ｔｃｔｇｃｔｇｇａａ  ｇｇａｃｔｇａｃｔｇ  １３８０
ｇｃｃａｇａａｇｃｔ  ｇｃｃｃａａａｇａｇ  ａａｇｇｇｇａｇｃａ  ｃｔａｇｇｇｔｇｃａ  ｃｇｃｃｃｔｇａａｃ  ａａｃｇｔｇａａｃａ  １４４０
ａａｇｃｔｃｔｇａｇ  ａｇｔｇｃｔｇｃａｇ  ａａｃａａｃａａｃｇ  ｔｇｇａｔｃｔｇｇｔ  ｇａａｔａｔｔｇｇｃ  ａｇｔａｃｔｇａｔａ  １５００
ｔｃｇｔｇｇａｃｇｇ  ｇａａｃｃａｃａａａ  ｃｔｇａｃａｃｔｇｇ  ｇｃｃｔｇａｔｃｔｇ  ｇａａｃａｔｔａｔｔ  ｃｔｇｃａｃｔｇｇｃ  １５６０
ａｇｇｔｇａａａａａ  ｔｇｔｇａｔｇａａｇ  ａａｃａｔｃａｔｇｇ  ｃｃｇｇｇｃｔｇｃａ  ｇｃａｇａｃｃａａｔ  ｔｃｃｇａｇａａｇａ  １６２０
ｔｃｃｔｇｃｔｇｔｃ  ｔｔｇｇｇｔｇｃｇｇ  ｃａｇａｇｃａｃｃｃ  ｇｃａａｃｔａｔｃｃ  ｃｃａｇｇｔｇａａｃ  ｇｔｇａｔｔａａｃｔ  １６８０
ｔｃａｃｔａｃａｔｃ  ｃｔｇｇａｇｃｇａｃ  ｇｇｇｃｔｇｇｃｃｃ  ｔｇａａｔｇｃｔｃｔ  ｇａｔｔｃａｃａｇｃ  ｃａｃａｇｇｃｃｔｇ  １７４０
ａｔｃｔｇｔｔｃｇａ  ｃｔｇｇａａｔａｇｃ  ｇｔｇｇｔｇｔｇｃｃ  ａｇｃａｇｔｃｔｇｃ  ｃａｃａｃａｇｃｇｃ  ｃｔｇｇａａｃａｔｇ  １８００
ｃｃｔｔｃａａｔａｔ  ｃｇｃｔｃｇｇｔａｃ  ｃａｇｃｔｇｇｇｇａ  ｔｃｇａａａａａｃｔ  ｇｃｔｇｇａｃｃｃａ  ｇａｇｇａｔｇｔｇｇ  １８６０
ａｃａｃｔａｃａｔａ  ｃｃｃａｇａｔａａａ  ａａｇｔｃｔａｔｔｃ  ｔｇａｔｇｔａｃａｔ  ｔａｃｔａｇｃｃｔｇ  ｔｔｃｃａｇｇｔｇｃ  １９２０
ｔｇｃｃａｃａｇｃａ  ｇｇｔｇｔｃｔａｔｔ  ｇａａｇｃｃａｔｔｃ  ａｇｇａｇｇｔｇｇａ  ａａｔｇｃｔｇｃｃｃ  ｃｇｃｃｃｃｃｃｃａ  １９８０
ａａｇｔｇａｃｔａａ  ａｇａｇｇａｇｃａｔ  ｔｔｔｃａｇｃｔｇｃ  ａｔｃａｔｃａｇａｔ  ｇｃａｔｔａｃａｇｃ  ｃａｇｃａｇａｔｔａ  ２０４０
ｃｃｇｔｇａｇｃｃｔ  ｇｇｃｔｃａｇｇｇａ  ｔａｔｇａｇｃｇｃａ  ｃｃａｇｔａｇｔｃｃ  ａａａａｃｃａｃｇｇ  ｔｔｃａａｇｔｃｃｔ  ２１００
ａｃｇｃｔｔａｔａｃ  ｃｃａｇｇｃｔｇｃｃ  ｔａｃｇｔｇａｃａａ  ｃｔａｇｃｇａｃｃｃ  ｔａｃｔａｇａｔｃｃ  ｃｃｃｔｔｔｃｃａｔ  ２１６０
ｃｃｃａｇｃａｃｃｔ  ｇｇａｇｇｃｃｃｃａ  ｇａｇｇａｃａａｇａ  ｇｃｔｔｔｇｇｇｔｃ  ｃａｇｃｃｔｇａｔｇ  ｇａａａｇｃｇａｇｇ  ２２２０
ｔｇａａｔｃｔｇｇａ  ｔｃｇｇｔａｃｃａｇ  ａｃａｇｃｃｃｔｇｇ  ａｇｇａｇｇｔｇｃｔ  ｇａｇｃｔｇｇｃｔｇ  ｃｔｇａｇｔｇｃｔｇ  ２２８０
ａａｇａｃａｃａｃｔ  ｇｃａｇｇｃｃｃａｇ  ｇｇｃｇａａａｔｔｔ  ｃｃａａｔｇａｃｇｔ  ｇｇａａｇｔｇｇｔｇ  ａａｇｇａｔｃａｇｔ  ２３４０
ｔｃｃａｃａｃａｃａ  ｃｇａｇｇｇｃｔａｔ  ａｔｇａｔｇｇａｃｃ  ｔｇａｃａｇｃｔｃａ  ｃｃａｇｇｇｇｃｇｃ  ｇｔｇｇｇｃａａｔａ  ２４００
ｔｃｃｔｇｃａｇｃｔ  ｇｇｇｃｔｃｔａａａ  ｃｔｇａｔｃｇｇｃａ  ｃｃｇｇｇａａａｃｔ  ｇａｇｔｇａｇｇａｃ  ｇａｇｇａａａｃａｇ  ２４６０
ａａｇｔｇｃａｇｇａ  ｇｃａｇａｔｇａａｃ  ｃｔｇｃｔｇａａｃａ  ｇｃｃｇｃｔｇｇｇａ  ｇｔｇｔｃｔｇａｇａ  ｇｔｇｇｃｔａｇｔａ  ２５２０
ｔｇｇａｇａａｇｃａ  ｇｔｃｃａａｃｃｔｇ  ｃａｃｃｇｇｇｔｇｃ  ｔｇａｔｇｇａｃｃｔ  ｇｃａｇａａｃｃａｇ  ａａａｃｔｇａａａｇ  ２５８０
ａｇｃｔｇａａｃｇａ  ｃｔｇｇｃｔｇａｃａ  ａａｇａｃｔｇａｇｇ  ａａｃｇｃａｃａａｇ  ｇａａｇａｔｇｇａｇ  ｇａｇｇａｇｃｃａｃ  ２６４０
ｔｇｇｇａｃｃｃｇａ  ｃｃｔｇｇａｇｇａｔ  ｃｔｇａａｇａｇａｃ  ａｇｇｔｇｃａｇｃａ  ｇｃａｔａａｇｇｔｇ  ｃｔｇｃａｇｇａｇｇ  ２７００
ａｔｃｔｇｇａａｃａ  ｇｇａｇｃａｇｇｔｇ  ｃｇｇｇｔｇａａｃｔ  ｃｃｃｔｇａｃａｃａ  ｔａｔｇｇｔｇｇｔｇ  ｇｔｇｇｔｇｇａｃｇ  ２７６０
ａａｔｃｔａｇｔｇｇ  ａｇａｔｃａｃｇｃｃ  ａｃｃｇｃｃｇｃｃｃ  ｔｇｇａｇｇａａｃａ  ｇｃｔｇａａｇｇｔｇ  ｃｔｇｇｇｇｇａｃｃ  ２８２０
ｇｇｔｇｇｇｃｃａａ  ｃａｔｔｔｇｃｃｇｇ  ｔｇｇａｃｃｇａｇｇ  ａｃａｇｇｔｇｇｇｔ  ｇｃｔｇｃｔｇｃａｇ  ｇａｃａｔｃｃｔｇｃ  ２８８０
ｔｇａａａｔｇｇｃａ  ｇａｇｇｃｔｇａｃｃ  ｇａｇｇａｇｃａｇｔ  ｇｔｃｔｇｔｔｔａｇ  ｔｇｃｔｔｇｇｃｔｇ  ａｇｃｇａｇａａａｇ  ２９４０
ａｇｇａｃｇｃｃｇｔ  ｇａａｃａａｇａｔｃ  ｃａｃａｃａａｃｃｇ  ｇｃｔｔｔａａｇｇａ  ｔｃａｇａａｃｇａａ  ａｔｇｃｔｇｔｃｔａ  ３０００
ｇｃｃｔｇｃａｇａａ  ａｃｔｇｇｃｔｇｔｇ  ｃｔｇａａｇｇｃｃｇ  ａｔｃｔｇｇａｇａａ  ａａａｇａａｇｃａｇ  ａｇｃａｔｇｇｇｃａ  ３０６０
ａａｃｔｇｔａｔａｇ  ｃｃｔｇａａａｃａｇ  ｇａｃｃｔｇｃｔｇａ  ｇｃａｃｃｃｔｇａａ  ｇａａｃａａｇａｇｃ  ｇｔｇａｃｃｃａｇａ  ３１２０
ａｇａｃａｇａａｇｃ  ｃｔｇｇｃｔｇｇａｔ  ａａｃｔｔｔｇｃｃｃ  ｇｃｔｇｃｔｇｇｇａ  ｃａａｃｃｔｇｇｔｇ  ｃａｇａａａｃｔｇｇ  ３１８０
ａｇａａａａｇｔａｃ  ａｇｃｔｃａｇａｔｃ  ｔｃｔｃａｇｇｃｔｇ  ｔｇａｃｃａｃａａｃ  ｃｃａｇｃｃｔａｇｃ  ｃｔｇａｃｃｃａｇａ  ３２４０
ｃａａｃｃｇｔｇａｔ  ｇｇａａａｃｃｇｔｇ  ａｃｃａｃｃｇｔｇａ  ｃａａｃｃｃｇｃｇａ  ａｃａｇａｔｃｃｔｇ  ｇｔｇａａａｃａｔｇ  ３３００
ｃｃｃａｇｇａａｇａ  ｇｃｔｇｃｃａｃｃｔ  ｃｃａｃｃｔｃｃｃｃ  ａｇａａｇａａｇａｇ  ａａｃｃｃｔｇｇａｇ  ｃｇｇｃｔｇｃａｇｇ  ３３６０
ａｇｃｔｇｃａｇｇａ  ａｇｃｃａｃｔｇａｃ  ｇａａｃｔｇｇａｃｃ  ｔｇａａｇｃｔｇａｇ  ｇｃａｇｇｃｃｇａａ  ｇｔｇａｔｔａａｇｇ  ３４２０
ｇｇｔｃｔｔｇｇｃａ  ｇｃｃｔｇｔｇｇｇｃ  ｇａｔｃｔｇｃｔｇａ  ｔｔｇａｔｔｃｃｃｔ  ｇｃａｇｇａｃｃａｃ  ｃｔｇｇａａａａｇｇ  ３４８０
ｔｇａａｇｇｃｔｃｔ  ｇａｇａｇｇｃｇａａ  ａｔｔｇｃｔｃｃａｃ  ｔｇａａｇｇａｇａａ  ｃｇｔｇａｇｔｃａｔ  ｇｔｇａａｃｇａｔｃ  ３５４０
ｔｇｇｃｔａｇａｃａ  ｇｃｔｇａｃａａｃａ  ｃｔｇｇｇｃａｔｃｃ  ａｇｃｔｇａｇｃｃｃ  ａｔａｃａａｔｃｔｇ  ａｇｃａｃａｃｔｇｇ  ３６００
ａｇｇａｃｃｔｇａａ  ｔａｃｃａｇｇｔｇｇ  ａａｇｃｔｇｃｔｇｃ  ａｇｇｔｇｇｃｔｇｔ  ｇｇａａｇａｃｃｇｇ  ｇｔｇｃｇｇｃａｇｃ  ３６６０
ｔｇｃａｔｇａｇｇｃ  ｃｃａｔｃｇｃｇａｃ  ｔｔｃｇｇａｃｃａｇ  ｃｃａｇｃｃａｇｃａ  ｃｔｔｔｃｔｇａｇｃ  ａｃａｔｃｃｇｔｇｃ  ３７２０
ａｇｇｇｇｃｃｃｔｇ  ｇｇａｇａｇｇｇｃｃ  ａｔｔｔｃｔｃｃｃａ  ａｃａａｇｇｔｇｃｃ  ｃｔａｃｔａｔａｔｔ  ａａｔｃａｃｇａｇａ  ３７８０
ｃｃｃａｇａｃｃａｃ  ｔｔｇｔｔｇｇｇａｃ  ｃａｔｃｃｃａａｇａ  ｔｇａｃａｇａａｃｔ  ｇｔａｃｃａｇｔｃｃ  ｃｔｇｇｃｃｇａｔｃ  ３８４０
ｔｇａａｃａａｃｇｔ  ｇａｇｇｔｔｔａｇｃ  ｇｃｔｔａｃａｇａａ  ｃｃｇｃｔａｔｇａａ  ｇｃｔｇａｇａｃｇｇ  ｃｔｇｃａｇａａｇｇ  ３９００
ｃｃｃｔｇｔｇｃｃｔ  ｇｇａｔｃｔｇｃｔｇ  ｔｃｃｃｔｇｔｃｃｇ  ｃｃｇｃｃｔｇｃｇａ  ｔｇｃｃｃｔｇｇａｔ  ｃａｇｃａｔａａｔｃ  ３９６０
ｔｇａａｇｃａｇａａ  ｃｇａｔｃａｇｃｃａ  ａｔｇｇａｔａｔｃｃ  ｔｇｃａｇａｔｃａｔ  ｃａａｃｔｇｃｃｔｇ  ａｃｃａｃｔａｔｃｔ  ４０２０
ａｃｇａｃａｇｇｃｔ  ｇｇａｇｃａｇｇａｇ  ｃａｃａａｃａａｃｃ  ｔｇｇｔｇａａｃｇｔ  ｇｃｃｔｃｔｇｔｇｃ  ｇｔｇｇａｔａｔｇｔ  ４０８０
ｇｃｃｔｇａａｃｔｇ  ｇｃｔｇｃｔｇａａｃ  ｇｔｇｔａｔｇａｃａ  ｃｔｇｇｇｃｇｃａｃ  ｃｇｇｃｃｇｇａｔｃ  ａｇａｇｔｇｃｔｇａ  ４１４０
ｇｔｔｔｔａａａａｃ  ｔｇｇｇａｔｔａｔｃ  ｔｃｃｃｔｇｔｇｔａ  ａｇｇｃｃｃａｃｃｔ  ｇｇａｇｇａｃａａｇ  ｔａｃａｇｇｔａｃｃ  ４２００
ｔｇｔｔｃａａｇｃａ  ｇｇｔｇｇｃｔａｇｔ  ａｇｃａｃｔｇｇａｔ  ｔｔｔｇｔｇａｃｃａ  ｇｃｇｃｃｇｃｃｔｇ  ｇｇａｃｔｇｃｔｇｃ  ４２６０
ｔｇｃａｔｇａｔａｇ  ｔａｔｃｃａｇａｔｔ  ｃｃｔａｇａｃａｇｃ  ｔｇｇｇａｇａｇｇｔ  ｇｇｃｔａｇｔｔｔｃ  ｇｇａｇｇａｔｃｔａ  ４３２０
ａｃａｔｃｇａａｃｃ  ｃａｇｃｇｔｇｃｇｃ  ａｇｃｔｇｔｔｔｃｃ  ａｇｔｔｔｇｃｃａａ  ｔａａｃａａａｃｃｔ  ｇａａａｔｃｇａｇｇ  ４３８０
ｃｔｇｃｔｃｔｇｔｔ  ｃｃｔｇｇａｔｔｇｇ  ａｔｇｃｇｃｃｔｇｇ  ａａｃｃａｃａｇａｇ  ｃａｔｇｇｔｇｔｇｇ  ｃｔｇｃｃｔｇｔｇｃ  ４４４０
ｔｇｃａｃａｇａｇｔ  ｇｇｃｔｇｃｃｇｃｃ  ｇａａａｃｔｇｃｃａ  ａｇｃａｃｃａｇｇｃ  ｔａａａｔｇｃａａｃ  ａｔｃｔｇｃａａｇｇ  ４５００
ａａｔｇｔｃｃｃａｔ  ｔａｔｃｇｇｃｔｔｔ  ｃｇｃｔａｃａｇｇａ  ｇｔｃｔｇａａａｃａ  ｔｔｔｔａａｃｔａｃ  ｇａｔａｔｔｔｇｃｃ  ４５６０
ａｇａｇｃｔｇｃｔｔ  ｃｔｔｔｔｃｃｇｇａ  ａｇａｇｔｇｇｃｃａ  ａａｇｇａｃａｃａａ  ｇａｔｇｃａｃｔａｃ  ｃｃｔａｔｇｇｔｇｇ  ４６２０
ａａｔａｔｔｇｃａｃ  ｃｃｃａａｃｔａｃａ  ｔｃｔｇｇｃｇａａｇ  ａｔｇｔｇｃｇｃｇａ  ｔｔｔｔｇｃｃａａｇ  ｇｔｇｃｔｇａａｇａ  ４６８０
ａｔａａｇｔｔｔｃｇ  ｇａｃｔａａｇａｇｇ  ｔａｃｔｔｃｇｃｃａ  ａｇｃａｃｃｃｃｃｇ  ｃａｔｇｇｇｇｔａｔ  ｃｔｇｃｃａｇｔｇｃ  ４７４０
ａｇａｃａｇｔｇｃｔ  ｇｇａａｇｇａｇａｃ  ａａｔａｔｇｇａｇａ  ｃｃｇａｔａｃａａｔ  ｇｔｇａｇｃｇｇｃｃ  ｇｃａａｔａａａａｇ  ４８００
ａｔｃｔｔｔａｔｔｔ  ｔｃａｔｔａｇａｔｃ  ｔｇｔｇｔｇｔｔｇｇ  ｔｔｔｔｔｔｇｔｇｔ  ｇｔｃｔａｇａｇｃａ  ｔｇｇｃｔａｃｇｔａ  ４８６０
ｇａｔａａｇｔａｇｃ  ａｔｇｇｃｇｇｇｔｔ  ａａｔｃａｔｔａａｃ  ｔａｃａａｇｇａａｃ  ｃｃｃｔａｇｔｇａｔ  ｇｇａｇｔｔｇｇｃｃ  ４９２０
ａｃｔｃｃｃｔｃｔｃ  ｔｇｃｇｃｇｃｔｃｇ  ｃｔｃｇｃｔｃａｃｔ  ｇａｇｇｃｃｇｇｇｃ  ｇａｃｃａａａｇｇｔ  ｃｇｃｃｃｇａｃｇｃ  ４９８０
ｃｃｇｇｇｃｔｔｔｇ  ｃｃｃｇｇｇｃｇｇｃ  ｃｔｃａｇｔｇａｇｃ  ｇａｇｃｇａｇｃｇｃ  ｇｃｃａｇｃｔｇｇｃ  ｇｔａａｔａｇｃｇａ  ５０４０
ａｇａｇｇｃｃｃｇｃ  ａｃｃｇａｔｃｇｃｃ  ｃｔｔｃｃｃａａｃａ  ｇｔｔｇｃｇｃａｇｃ  ｃｔｇａａｔｇｇｃｇ  ａａｔｇｇａａｇｔｔ  ５１００
ｃｃａｇａｃｇａｔｔ  ｇａｇｃｇｔｃａａａ  ａｔｇｔａｇｇｔａｔ  ｔｔｃｃａｔｇａｇｃ  ｇｔｔｔｔｔｃｃｔｇ  ｔｔｇｃａａｔｇｇｃ  ５１６０
ｔｇｇｃｇｇｔａａｔ  ａｔｔｇｔｔｃｔｇｇ  ａｔａｔｔａｃｃａｇ  ｃａａｇｇｃｃｇａｔ  ａｇｔｔｔｇａｇｔｔ  ｃｔｔｃｔａｃｔｃａ  ５２２０
ｇｇｃａａｇｔｇａｔ  ｇｔｔａｔｔａｃｔａ  ａｔｃａａａｇａａｇ  ｔａｔｔｇｃｇａｃａ  ａｃｇｇｔｔａａｔｔ  ｔｇｃｇｔｇａｔｇｇ  ５２８０
ａｃａｇａｃｔｃｔｔ  ｔｔａｃｔｃｇｇｔｇ  ｇｃｃｔｃａｃｔｇａ  ｔｔａｔａａａａａｃ  ａｃｔｔｃｔｃａｇｇ  ａｔｔｃｔｇｇｃｇｔ  ５３４０
ａｃｃｇｔｔｃｃｔｇ  ｔｃｔａａａａｔｃｃ  ｃｔｔｔａａｔｃｇｇ  ｃｃｔｃｃｔｇｔｔｔ  ａｇｃｔｃｃｃｇｃｔ  ｃｔｇａｔｔｃｔａａ  ５４００
ｃｇａｇｇａａａｇｃ  ａｃｇｔｔａｔａｃｇ  ｔｇｃｔｃｇｔｃａａ  ａｇｃａａｃｃａｔａ  ｇｔａｃｇｃｇｃｃｃ  ｔｇｔａｇｃｇｇｃｇ  ５４６０
ｃａｔｔａａｇｃｇｃ  ｇｇｃｇｇｇｔｇｔｇ  ｇｔｇｇｔｔａｃｇｃ  ｇｃａｇｃｇｔｇａｃ  ｃｇｃｔａｃａｃｔｔ  ｇｃｃａｇｃｇｃｃｃ  ５５２０
ｔａｇｃｇｃｃｃｇｃ  ｔｃｃｔｔｔｃｇｃｔ  ｔｔｃｔｔｃｃｃｔｔ  ｃｃｔｔｔｃｔｃｇｃ  ｃａｃｇｔｔｃｇｃｃ  ｇｇｃｔｔｔｃｃｃｃ  ５５８０
ｇｔｃａａｇｃｔｃｔ  ａａａｔｃｇｇｇｇｇ  ｃｔｃｃｃｔｔｔａｇ  ｇｇｔｔｃｃｇａｔｔ  ｔａｇｔｇａｔｔｔａ  ｃｇｇｃａｃｃｔｃｇ  ５６４０
ａｃｃｃｃａａａａａ  ａｃｔｔｇａｔｔａｇ  ｇｇｔｇａｔｇｇｔｔ  ｃａｃｇｔａｇｔｇｇ  ｇｃｃａｔｃｇｃｃｃ  ｔｇａｔａｇａｃｇｇ  ５７００
ｔｔｔｔｔｃｇｃｃｃ  ｔｔｔｇａｃｇｔｔｇ  ｇａｇｔｃｃａｃｇｔ  ｔｃｔｔｔａａｔａｇ  ｔｇｇａｃｔｃｔｔｇ  ｔｔｃｃａａａｃｔｇ  ５７６０
ｇａａｃａａｃａｃｔ  ｃａａｃｃｃｔａｔｃ  ｔｃｇｇｔｃｔａｔｔ  ｃｔｔｔｔｇａｔｔｔ  ａｔａａｇｇｇａｔｔ  ｔｔｇｃｃｇａｔｔｔ  ５８２０
ｃｇｇｃｃｔａｔｔｇ  ｇｔｔａａａａａａｔ  ｇａｇｃｔｇａｔｔｔ  ａａｃａａａａａｔｔ  ｔａａｃｇｃｇａａｔ  ｔｔｔａａｃａａａａ  ５８８０
ｔａｔｔａａｃｇｔｔ  ｔａｃａａｔｔｔａａ  ａｔａｔｔｔｇｃｔｔ  ａｔａｃａａｔｃｔｔ  ｃｃｔｇｔｔｔｔｔｇ  ｇｇｇｃｔｔｔｔｃｔ  ５９４０
ｇａｔｔａｔｃａａｃ  ｃｇｇｇｇｔａｃａｔ  ａｔｇａｔｔｇａｃａ  ｔｇｃｔａｇｔｔｔｔ  ａｃｇａｔｔａｃｃｇ  ｔｔｃａｔｃｇａｔｔ  ６０００
ｃｔｃｔｔｇｔｔｔｇ  ｃｔｃｃａｇａｃｔｃ  ｔｃａｇｇｃａａｔｇ  ａｃｃｔｇａｔａｇｃ  ｃｔｔｔｇｔａｇａｇ  ａｃｃｔｃｔｃａａａ  ６０６０
ａａｔａｇｃｔａｃｃ  ｃｔｃｔｃｃｇｇｃａ  ｔｇａａｔｔｔａｔｃ  ａｇｃｔａｇａａｃｇ  ｇｔｔｇａａｔａｔｃ  ａｔａｔｔｇａｔｇｇ  ６１２０
ｔｇａｔｔｔｇａｃｔ  ｇｔｃｔｃｃｇｇｃｃ  ｔｔｔｃｔｃａｃｃｃ  ｇｔｔｔｇａａｔｃｔ  ｔｔａｃｃｔａｃａｃ  ａｔｔａｃｔｃａｇｇ  ６１８０
ｃａｔｔｇｃａｔｔｔ  ａａａａｔａｔａｔｇ  ａｇｇｇｔｔｃｔａａ  ａａａｔｔｔｔｔａｔ  ｃｃｔｔｇｃｇｔｔｇ  ａａａｔａａａｇｇｃ  ６２４０
ｔｔｃｔｃｃｃｇｃａ  ａａａｇｔａｔｔａｃ  ａｇｇｇｔｃａｔａａ  ｔｇｔｔｔｔｔｇｇｔ  ａｃａａｃｃｇａｔｔ  ｔａｇｃｔｔｔａｔｇ  ６３００
ｃｔｃｔｇａｇｇｃｔ  ｔｔａｔｔｇｃｔｔａ  ａｔｔｔｔｇｃｔａａ  ｔｔｃｔｔｔｇｃｃｔ  ｔｇｃｃｔｇｔａｔｇ  ａｔｔｔａｔｔｇｇａ  ６３６０
ｔｇｔｔｇｇａａｇｔ  ｔｃｃｔｇａｔｇｃｇ  ｇｔａｔｔｔｔｃｔｃ  ｃｔｔａｃｇｃａｔｃ  ｔｇｔｇｃｇｇｔａｔ  ｔｔｃａｃａｃｃｇｃ  ６４２０
ａｔａｔｇｇｔｇｃａ  ｃｔｃｔｃａｇｔａｃ  ａａｔｃｔｇｃｔｃｔ  ｇａｔｇｃｃｇｃａｔ  ａｇｔｔａａｇｃｃａ  ｇｃｃｃｃｇａｃａｃ  ６４８０
ｃｃｇｃｃａａｃａｃ  ｃｃｇｃｔｇａｃｇｃ  ｇｃｃｃｔｇａｃｇｇ  ｇｃｔｔｇｔｃｔｇｃ  ｔｃｃｃｇｇｃａｔｃ  ｃｇｃｔｔａｃａｇａ  ６５４０
ｃａａｇｃｔｇｔｇａ  ｃｃｇｔｃｔｃｃｇｇ  ｇａｇｃｔｇｃａｔｇ  ｔｇｔｃａｇａｇｇｔ  ｔｔｔｃａｃｃｇｔｃ  ａｔｃａｃｃｇａａａ  ６６００
ｃｇｃｇｃｇａｇａｃ  ｇａａａｇｇｇｃｃｔ  ｃｇｔｇａｔａｃｇｃ  ｃｔａｔｔｔｔｔａｔ  ａｇｇｔｔａａｔｇｔ  ｃａｔｇａｔａａｔａ  ６６６０
ａｔｇｇｔｔｔｃｔｔ  ａｇａｃｇｔｃａｇｇ  ｔｇｇｃａｃｔｔｔｔ  ｃｇｇｇｇａａａｔｇ  ｔｇｃｇｃｇｇａａｃ  ｃｃｃｔａｔｔｔｇｔ  ６７２０
ｔｔａｔｔｔｔｔｃｔ  ａａａｔａｃａｔｔｃ  ａａａｔａｔｇｔａｔ  ｃｃｇｃｔｃａｔｇａ  ｇａｃａａｔａａｃｃ  ｃｔｇａｔａａａｔｇ  ６７８０
ｃｔｔｃａａｔａａｔ  ａｔｔｇａａａａａｇ  ｇａａｇａｇｔａｔｇ  ａｇｔａｔｔｃａａｃ  ａｔｔｔｃｃｇｔｇｔ  ｃｇｃｃｃｔｔａｔｔ  ６８４０
ｃｃｃｔｔｔｔｔｔｇ  ｃｇｇｃａｔｔｔｔｇ  ｃｃｔｔｃｃｔｇｔｔ  ｔｔｔｇｃｔｃａｃｃ  ｃａｇａａａｃｇｃｔ  ｇｇｔｇａａａｇｔａ  ６９００
ａａａｇａｔｇｃｔｇ  ａａｇａｔｃａｇｔｔ  ｇｇｇｔｇｃａｃｇａ  ｇｔｇｇｇｔｔａｃａ  ｔｃｇａａｃｔｇｇａ  ｔｃｔｃａａｃａｇｃ  ６９６０
ｇｇｔａａｇａｔｃｃ  ｔｔｇａｇａｇｔｔｔ  ｔｃｇｃｃｃｃｇａａ  ｇａａｃｇｔｔｔｔｃ  ｃａａｔｇａｔｇａｇ  ｃａｃｔｔｔｔａａａ  ７０２０
ｇｔｔｃｔｇｃｔａｔ  ｇｔｇｇｃｇｃｇｇｔ  ａｔｔａｔｃｃｃｇｔ  ａｔｔｇａｃｇｃｃｇ  ｇｇｃａａｇａｇｃａ  ａｃｔｃｇｇｔｃｇｃ  ７０８０
ｃｇｃａｔａｃａｃｔ  ａｔｔｃｔｃａｇａａ  ｔｇａｃｔｔｇｇｔｔ  ｇａｇｔａｃｔｃａｃ  ｃａｇｔｃａｃａｇａ  ａａａｇｃａｔｃｔｔ  ７１４０
ａｃｇｇａｔｇｇｃａ  ｔｇａｃａｇｔａａｇ  ａｇａａｔｔａｔｇｃ  ａｇｔｇｃｔｇｃｃａ  ｔａａｃｃａｔｇａｇ  ｔｇａｔａａｃａｃｔ  ７２００
ｇｃｇｇｃｃａａｃｔ  ｔａｃｔｔｃｔｇａｃ  ａａｃｇａｔｃｇｇａ  ｇｇａｃｃｇａａｇｇ  ａｇｃｔａａｃｃｇｃ  ｔｔｔｔｔｔｇｃａｃ  ７２６０
ａａｃａｔｇｇｇｇｇ  ａｔｃａｔｇｔａａｃ  ｔｃｇｃｃｔｔｇａｔ  ｃｇｔｔｇｇｇａａｃ  ｃｇｇａｇｃｔｇａａ  ｔｇａａｇｃｃａｔａ  ７３２０
ｃｃａａａｃｇａｃｇ  ａｇｃｇｔｇａｃａｃ  ｃａｃｇａｔｇｃｃｔ  ｇｔａｇｃａａｔｇｇ  ｃａａｃａａｃｇｔｔ  ｇｃｇｃａａａｃｔａ  ７３８０
ｔｔａａｃｔｇｇｃｇ  ａａｃｔａｃｔｔａｃ  ｔｃｔａｇｃｔｔｃｃ  ｃｇｇｃａａｃａａｔ  ｔａａｔａｇａｃｔｇ  ｇａｔｇｇａｇｇｃｇ  ７４４０
ｇａｔａａａｇｔｔｇ  ｃａｇｇａｃｃａｃｔ  ｔｃｔｇｃｇｃｔｃｇ  ｇｃｃｃｔｔｃｃｇｇ  ｃｔｇｇｃｔｇｇｔｔ  ｔａｔｔｇｃｔｇａｔ  ７５００
ａａａｔｃｔｇｇａｇ  ｃｃｇｇｔｇａｇｃｇ  ｔｇｇｇｔｃｔｃｇｃ  ｇｇｔａｔｃａｔｔｇ  ｃａｇｃａｃｔｇｇｇ  ｇｃｃａｇａｔｇｇｔ  ７５６０
ａａｇｃｃｃｔｃｃｃ  ｇｔａｔｃｇｔａｇｔ  ｔａｔｃｔａｃａｃｇ  ａｃｇｇｇｇａｇｔｃ  ａｇｇｃａａｃｔａｔ  ｇｇａｔｇａａｃｇａ  ７６２０
ａａｔａｇａｃａｇａ  ｔｃｇｃｔｇａｇａｔ  ａｇｇｔｇｃｃｔｃａ  ｃｔｇａｔｔａａｇｃ  ａｔｔｇｇｔａａｃｔ  ｇｔｃａｇａｃｃａａ  ７６８０
ｇｔｔｔａｃｔｃａｔ  ａｔａｔａｃｔｔｔａ  ｇａｔｔｇａｔｔｔａ  ａａａｃｔｔｃａｔｔ  ｔｔｔａａｔｔｔａａ  ａａｇｇａｔｃｔａｇ  ７７４０
ｇｔｇａａｇａｔｃｃ  ｔｔｔｔｔｇａｔａａ  ｔｃｔｃａｔｇａｃｃ  ａａａａｔｃｃｃｔｔ  ａａｃｇｔｇａｇｔｔ  ｔｔｃｇｔｔｃｃａｃ  ７８００
ｔｇａｇｃｇｔｃａｇ  ａｃｃｃｃｇｔａｇａ  ａａａｇａｔｃａａａ  ｇｇａｔｃｔｔｃｔｔ  ｇａｇａｔｃｃｔｔｔ  ｔｔｔｔｃｔｇｃｇｃ  ７８６０
ｇｔａａｔｃｔｇｃｔ  ｇｃｔｔｇｃａａａｃ  ａａａａａａａｃｃａ  ｃｃｇｃｔａｃｃａｇ  ｃｇｇｔｇｇｔｔｔｇ  ｔｔｔｇｃｃｇｇａｔ  ７９２０
ｃａａｇａｇｃｔａｃ  ｃａａｃｔｃｔｔｔｔ  ｔｃｃｇａａｇｇｔａ  ａｃｔｇｇｃｔｔｃａ  ｇｃａｇａｇｃｇｃａ  ｇａｔａｃｃａａａｔ  ７９８０
ａｃｔｇｔｃｃｔｔｃ  ｔａｇｔｇｔａｇｃｃ  ｇｔａｇｔｔａｇｇｃ  ｃａｃｃａｃｔｔｃａ  ａｇａａｃｔｃｔｇｔ  ａｇｃａｃｃｇｃｇｔ  ８０４０
ａｃａｔａｃｃｔｃｇ  ｃｔｃｔｇｃｔａａｔ  ｃｃｔｇｔｔａｃｃａ  ｇｔｇｇｃｔｇｃｔｇ  ｃｃａｇｔｇｇｃｇａ  ｔａａｇｔｃｇｔｇｔ  ８１００
ｃｔｔａｃｃｇｇｇｔ  ｔｇｇａｃｔｃａａｇ  ａｃｇａｔａｇｔｔａ  ｃｃｇｇａｔａａｇｇ  ｃｇｃａｇｃｇｇｔｃ  ｇｇｇｃｔｇａａｃｇ  ８１６０
ｇｇｇｇｇｔｔｃｇｔ  ｇｃａｃａｃａｇｃｃ  ｃａｇｃｔｔｇｇａｇ  ｃｇａａｃｇａｃｃｔ  ａｃａｃｃｇａａｃｔ  ｇａｇａｔａｃｃｔａ  ８２２０
ｃａｇｃｇｔｇａｇｃ  ｔａｔｇａｇａａａｇ  ｃｇｃｃａｃｇｃｔｔ  ｃｃｃｇａａｇｇｇａ  ｇａａａｇｇｃｇｇａ  ｃａｇｇｔａｔｃｃｇ  ８２８０
ｇｔａａｇｃｇｇｃａ  ｇｇｇｔｃｇｇａａｃ  ａｇｇａｇａｇｃｇｃ  ａｃｇａｇｇｇａｇｃ  ｔｔｃｃａｇｇｇｇｇ  ａａａｃｇｃｃｔｇｇ  ８３４０
ｔａｔｃｔｔｔａｔａ  ｇｔｃｃｔｇｔｃｇｇ  ｇｔｔｔｃｇｃｃａｃ  ｃｔｃｔｇａｃｔｔｇ  ａｇｃｇｔｃｇａｔｔ  ｔｔｔｇｔｇａｔｇｃ  ８４００
ｔｃｇｔｃａｇｇｇｇ  ｇｇｃｇｇａｇｃｃｔ  ａｔｇｇａａａａａｃ  ｇｃｃａｇｃａａｃｇ  ｃｇｇｃｃｔｔｔｔｔ  ａｃｇｇｔｔｃｃｔｇ  ８４６０
ｇｃｃｔｔｔｔｇｃｔ  ｇｇｃｃｔｔｔｔｇｃ  ｔｃａｃａｔｇｔｔｃ  ｔｔｔｃｃｔｇｃｇｔ  ｔａｔｃｃｃｃｔｇａ  ｔｔｃｔｇｔｇｇａｔ  ８５２０
ａａｃｃｇｔａｔｔａ  ｃｃｇｇｇｔｔｔｇａ  ｇｔｇａｇｃｔｇａｔ  ａｃｃｇｃｔｃｇｃｃ  ｇｃａｇｃｃｇａａｃ  ｇａｃｃｇａｇｃｇｃ  ８５８０
ａｇｃｇａｇｔｃａｇ  ｔｇａｇｃｇａｃｃａ  ａｇｃｇｇａａｇａｇ  ｃ  ８６１１
＜２１０＞  ４
＜２１１＞  ５６４
＜２１２＞  ＤＮＡ
＜２１３＞アデノ随伴ウイルス
＜４００＞  ４
ｃａｇｃｃａｃｔａｔ  ｇｇｇｔｃｔａｇｇｃ  ｔｇｃｃｃａｔｇｔａ  ａｇｇａｇｇｃａａｇ  ｇｃｃｔｇｇｇｇａｃ  ａｃｃｃｇａｇａｔｇ  ６０
ｃｃｔｇｇｔｔａｔａ  ａｔｔａａｃｃｃａｇ  ａｃａｔｇｔｇｇｃｔ  ｇｃｔｃｃｃｃｃｃｃ  ｃｃｃａａｃａｃｃｔ  ｇｃｔｇｃｃｔｇａｇ  １２０
ｃｃｔｃａｃｃｃｃｃ  ａｃｃｃｃｇｇｔｇｃ  ｃｔｇｇｇｔｃｔｔａ  ｇｇｃｔｃｔｇｔａｃ  ａｃｃａｔｇｇａｇｇ  ａｇａａｇｃｔｃｇｃ  １８０
ｔｃｔａａａａａｔａ  ａｃｃｃｔｇｔｃｃｃ  ｔｇｇｔｇｇｇｃｔｇ  ｔｇｇｇｇｇａｃｔｇ  ａｇｇｇｃａｇｇｃｔ  ｇｔａａｃａｇｇｃｔ  ２４０
ｔｇｇｇｇｇｃｃａｇ  ｇｇｃｔｔａｔａｃｇ  ｔｇｃｃｔｇｇｇａｃ  ｔｃｃｃａａａｇｔａ  ｔｔａｃｔｇｔｔｃｃ  ａｔｇｔｔｃｃｃｇｇ  ３００
ｃｇａａｇｇｇｃｃａ  ｇｃｔｇｔｃｃｃｃｃ  ｇｃｃａｇｃｔａｇａ  ｃｔｃａｇｃａｃｔｔ  ａｇｔｔｔａｇｇａａ  ｃｃａｇｔｇａｇｃａ  ３６０
ａｇｔｃａｇｃｃｃｔ  ｔｇｇｇｇｃａｇｃｃ  ｃａｔａｃａａｇｇｃ  ｃａｔｇｇｇｇｃｔｇ  ｇｇｃａａｇｃｔｇｃ  ａｃｇｃｃｔｇｇｇｔ  ４２０
ｃｃｇｇｇｇｔｇｇｇ  ｃａｃｇｇｔｇｃｃｃ  ｇｇｇｃａａｃｇａｇ  ｃｔｇａａａｇｃｔｃ  ａｔｃｔｇｃｔｃｔｃ  ａｇｇｇｇｃｃｃｃｔ  ４８０
ｃｃｃｔｇｇｇｇａｃ  ａｇｃｃｃｃｔｃｃｔ  ｇｇｃｔａｇｔｃａｃ  ａｃｃｃｔｇｔａｇｇ  ｃｔｃｃｔｃｔａｔａ  ｔａａｃｃｃａｇｇｇ  ５４０
ｇｃａｃａｇｇｇｇｃ  ｔｇｃｃｃｃｃｇｇｇ  ｔｃａｃ  ５６４
＜２１０＞  ５
＜２１１＞  ８４０９
＜２１２＞  ＤＮＡ
＜２１３＞アデノ随伴ウイルス
＜４００＞  ５
ｇｃｃｃａａｔａｃｇ  ｃａａａｃｃｇｃｃｔ  ｃｔｃｃｃｃｇｃｇｃ  ｇｔｔｇｇｃｃｇａｔ  ｔｃａｔｔａａｔｇｃ  ａｇｃｔｇｇｃｇｃｇ  ６０
ｃｔｃｇｃｔｃｇｃｔ  ｃａｃｔｇａｇｇｃｃ  ｇｃｃｃｇｇｇｃａａ  ａｇｃｃｃｇｇｇｃｇ  ｔｃｇｇｇｃｇａｃｃ  ｔｔｔｇｇｔｃｇｃｃ  １２０
ｃｇｇｃｃｔｃａｇｔ  ｇａｇｃｇａｇｃｇａ  ｇｃｇｃｇｃａｇａｇ  ａｇｇｇａｇｔｇｇｃ  ｃａａｃｔｃｃａｔｃ  ａｃｔａｇｇｇｇｔｔ  １８０
ｃｃｔｔｇｔａｇｔｔ  ａａｔｇａｔｔａａｃ  ｃｃｇｃｃａｔｇｃｔ  ａａｔｔａｔｃｔａｃ  ｇｔａｇｃｃａｔｇｔ  ｃｔａｇａｃａｇｃｃ  ２４０
ａｃｔａｔｇｇｇｔｃ  ｔａｇｇｃｔｇｃｃｃ  ａｔｇｔａａｇｇａｇ  ｇｃａａｇｇｃｃｔｇ  ｇｇｇａｃａｃｃｃｇ  ａｇａｔｇｃｃｔｇｇ  ３００
ｔｔａｔａａｔｔａａ  ｃｃｃａｇａｃａｔｇ  ｔｇｇｃｔｇｃｔｃｃ  ｃｃｃｃｃｃｃｃａａ  ｃａｃｃｔｇｃｔｇｃ  ｃｔｇａｇｃｃｔｃａ  ３６０
ｃｃｃｃｃａｃｃｃｃ  ｇｇｔｇｃｃｔｇｇｇ  ｔｃｔｔａｇｇｃｔｃ  ｔｇｔａｃａｃｃａｔ  ｇｇａｇｇａｇａａｇ  ｃｔｃｇｃｔｃｔａａ  ４２０
ａａａｔａａｃｃｃｔ  ｇｔｃｃｃｔｇｇｔｇ  ｇｇｃｔｇｔｇｇｇｇ  ｇａｃｔｇａｇｇｇｃ  ａｇｇｃｔｇｔａａｃ  ａｇｇｃｔｔｇｇｇｇ  ４８０
ｇｃｃａｇｇｇｃｔｔ  ａｔａｃｇｔｇｃｃｔ  ｇｇｇａｃｔｃｃｃａ  ａａｇｔａｔｔａｃｔ  ｇｔｔｃｃａｔｇｔｔ  ｃｃｃｇｇｃｇａａｇ  ５４０
ｇｇｃｃａｇｃｔｇｔ  ｃｃｃｃｃｇｃｃａｇ  ｃｔａｇａｃｔｃａｇ  ｃａｃｔｔａｇｔｔｔ  ａｇｇａａｃｃａｇｔ  ｇａｇｃａａｇｔｃａ  ６００
ｇｃｃｃｔｔｇｇｇｇ  ｃａｇｃｃｃａｔａｃ  ａａｇｇｃｃａｔｇｇ  ｇｇｃｔｇｇｇｃａａ  ｇｃｔｇｃａｃｇｃｃ  ｔｇｇｇｔｃｃｇｇｇ  ６６０
ｇｔｇｇｇｃａｃｇｇ  ｔｇｃｃｃｇｇｇｃａ  ａｃｇａｇｃｔｇａａ  ａｇｃｔｃａｔｃｔｇ  ｃｔｃｔｃａｇｇｇｇ  ｃｃｃｃｔｃｃｃｔｇ  ７２０
ｇｇｇａｃａｇｃｃｃ  ｃｔｃｃｔｇｇｃｔａ  ｇｔｃａｃａｃｃｃｔ  ｇｔａｇｇｃｔｃｃｔ  ｃｔａｔａｔａａｃｃ  ｃａｇｇｇｇｃａｃａ  ７８０
ｇｇｇｇｃｔｇｃｃｃ  ｃｃｇｇｇｔｃａｃｃ  ａｃｃａｃｃｔｃｃａ  ｃａｇｃａｃａｇａｃ  ａｇａｃａｃｔｃａｇ  ｇａｇｃｃａｇｃｃａ  ８４０
ｇｃｃａｇｇｔａａｇ  ｔｔｔａｇｔｃｔｔｔ  ｔｔｇｔｃｔｔｔｔａ  ｔｔｔｃａｇｇｔｃｃ  ｃｇｇａｔｃｃｇｇｔ  ｇｇｔｇｇｔｇｃａａ  ９００
ａｔｃａａａｇａａｃ  ｔｇｃｔｃｃｔｃａｇ  ｔｇｇａｔｇｔｔｇｃ  ｃｔｔｔａｃｔｔｃｔ  ａｇｇｃｃｔｇｔａｃ  ｇｇａａｇｔｇｔｔａ  ９６０
ｃｔｔｃｔｇｃｔｃｔ  ａａａａｇｃｔｇｃｇ  ｇａａｔｔｇｔａｃｃ  ｃｇｃｇｇｃｃｇｃｃ  ａｃｃａｔｇｃｔｇｔ  ｇｇｔｇｇｇａｇｇａ  １０２０
ｇｇｔｇｇａｇｇａｔ  ｔｇｔｔａｔｇａａａ  ｇｇｇａｇｇａｃｇｔ  ｇｃａｇａａｇａａｇ  ａｃｔｔｔｔａｃｃａ  ａｇｔｇｇｇｔｇａａ  １０８０
ｃｇｃｔｃａｇｔｔｃ  ａｇｃａａａｔｔｔｇ  ｇｇａａｇｃａｇｃａ  ｃａｔｃｇａｇａａｔ  ｃｔｇｔｔｔｔｃｃｇ  ａｃｃｔｇｃａｇｇａ  １１４０
ｔｇｇｇａｇａｃｇｇ  ｃｔｇｃｔｇｇａｔｃ  ｔｇｃｔｇｇａａｇｇ  ａｃｔｇａｃｔｇｇｃ  ｃａｇａａｇｃｔｇｃ  ｃｃａａａｇａｇａａ  １２００
ｇｇｇｇａｇｃａｃｔ  ａｇｇｇｔｇｃａｃｇ  ｃｃｃｔｇａａｃａａ  ｃｇｔｇａａｃａａａ  ｇｃｔｃｔｇａｇａｇ  ｔｇｃｔｇｃａｇａａ  １２６０
ｃａａｃａａｃｇｔｇ  ｇａｔｃｔｇｇｔｇａ  ａｔａｔｔｇｇｃａｇ  ｔａｃｔｇａｔａｔｃ  ｇｔｇｇａｃｇｇｇａ  ａｃｃａｃａａａｃｔ  １３２０
ｇａｃａｃｔｇｇｇｃ  ｃｔｇａｔｃｔｇｇａ  ａｃａｔｔａｔｔｃｔ  ｇｃａｃｔｇｇｃａｇ  ｇｔｇａａａａａｔｇ  ｔｇａｔｇａａｇａａ  １３８０
ｃａｔｃａｔｇｇｃｃ  ｇｇｇｃｔｇｃａｇｃ  ａｇａｃｃａａｔｔｃ  ｃｇａｇａａｇａｔｃ  ｃｔｇｃｔｇｔｃｔｔ  ｇｇｇｔｇｃｇｇｃａ  １４４０
ｇａｇｃａｃｃｃｇｃ  ａａｃｔａｔｃｃｃｃ  ａｇｇｔｇａａｃｇｔ  ｇａｔｔａａｃｔｔｃ  ａｃｔａｃａｔｃｃｔ  ｇｇａｇｃｇａｃｇｇ  １５００
ｇｃｔｇｇｃｃｃｔｇ  ａａｔｇｃｔｃｔｇａ  ｔｔｃａｃａｇｃｃａ  ｃａｇｇｃｃｔｇａｔ  ｃｔｇｔｔｃｇａｃｔ  ｇｇａａｔａｇｃｇｔ  １５６０
ｇｇｔｇｔｇｃｃａｇ  ｃａｇｔｃｔｇｃｃａ  ｃａｃａｇｃｇｃｃｔ  ｇｇａａｃａｔｇｃｃ  ｔｔｃａａｔａｔｃｇ  ｃｔｃｇｇｔａｃｃａ  １６２０
ｇｃｔｇｇｇｇａｔｃ  ｇａａａａａｃｔｇｃ  ｔｇｇａｃｃｃａｇａ  ｇｇａｔｇｔｇｇａｃ  ａｃｔａｃａｔａｃｃ  ｃａｇａｔａａａａａ  １６８０
ｇｔｃｔａｔｔｃｔｇ  ａｔｇｔａｃａｔｔａ  ｃｔａｇｃｃｔｇｔｔ  ｃｃａｇｇｔｇｃｔｇ  ｃｃａｃａｇｃａｇｇ  ｔｇｔｃｔａｔｔｇａ  １７４０
ａｇｃｃａｔｔｃａｇ  ｇａｇｇｔｇｇａａａ  ｔｇｃｔｇｃｃｃｃｇ  ｃｃｃｃｃｃｃａａａ  ｇｔｇａｃｔａａａｇ  ａｇｇａｇｃａｔｔｔ  １８００
ｔｃａｇｃｔｇｃａｔ  ｃａｔｃａｇａｔｇｃ  ａｔｔａｃａｇｃｃａ  ｇｃａｇａｔｔａｃｃ  ｇｔｇａｇｃｃｔｇｇ  ｃｔｃａｇｇｇａｔａ  １８６０
ｔｇａｇｃｇｃａｃｃ  ａｇｔａｇｔｃｃａａ  ａａｃｃａｃｇｇｔｔ  ｃａａｇｔｃｃｔａｃ  ｇｃｔｔａｔａｃｃｃ  ａｇｇｃｔｇｃｃｔａ  １９２０
ｃｇｔｇａｃａａｃｔ  ａｇｃｇａｃｃｃｔａ  ｃｔａｇａｔｃｃｃｃ  ｃｔｔｔｃｃａｔｃｃ  ｃａｇｃａｃｃｔｇｇ  ａｇｇｃｃｃｃａｇａ  １９８０
ｇｇａｃａａｇａｇｃ  ｔｔｔｇｇｇｔｃｃａ  ｇｃｃｔｇａｔｇｇａ  ａａｇｃｇａｇｇｔｇ  ａａｔｃｔｇｇａｔｃ  ｇｇｔａｃｃａｇａｃ  ２０４０
ａｇｃｃｃｔｇｇａｇ  ｇａｇｇｔｇｃｔｇａ  ｇｃｔｇｇｃｔｇｃｔ  ｇａｇｔｇｃｔｇａａ  ｇａｃａｃａｃｔｇｃ  ａｇｇｃｃｃａｇｇｇ  ２１００
ｃｇａａａｔｔｔｃｃ  ａａｔｇａｃｇｔｇｇ  ａａｇｔｇｇｔｇａａ  ｇｇａｔｃａｇｔｔｃ  ｃａｃａｃａｃａｃｇ  ａｇｇｇｃｔａｔａｔ  ２１６０
ｇａｔｇｇａｃｃｔｇ  ａｃａｇｃｔｃａｃｃ  ａｇｇｇｇｃｇｃｇｔ  ｇｇｇｃａａｔａｔｃ  ｃｔｇｃａｇｃｔｇｇ  ｇｃｔｃｔａａａｃｔ  ２２２０
ｇａｔｃｇｇｃａｃｃ  ｇｇｇａａａｃｔｇａ  ｇｔｇａｇｇａｃｇａ  ｇｇａａａｃａｇａａ  ｇｔｇｃａｇｇａｇｃ  ａｇａｔｇａａｃｃｔ  ２２８０
ｇｃｔｇａａｃａｇｃ  ｃｇｃｔｇｇｇａｇｔ  ｇｔｃｔｇａｇａｇｔ  ｇｇｃｔａｇｔａｔｇ  ｇａｇａａｇｃａｇｔ  ｃｃａａｃｃｔｇｃａ  ２３４０
ｃｃｇｇｇｔｇｃｔｇ  ａｔｇｇａｃｃｔｇｃ  ａｇａａｃｃａｇａａ  ａｃｔｇａａａｇａｇ  ｃｔｇａａｃｇａｃｔ  ｇｇｃｔｇａｃａａａ  ２４００
ｇａｃｔｇａｇｇａａ  ｃｇｃａｃａａｇｇａ  ａｇａｔｇｇａｇｇａ  ｇｇａｇｃｃａｃｔｇ  ｇｇａｃｃｃｇａｃｃ  ｔｇｇａｇｇａｔｃｔ  ２４６０
ｇａａｇａｇａｃａｇ  ｇｔｇｃａｇｃａｇｃ  ａｔａａｇｇｔｇｃｔ  ｇｃａｇｇａｇｇａｔ  ｃｔｇｇａａｃａｇｇ  ａｇｃａｇｇｔｇｃｇ  ２５２０
ｇｇｔｇａａｃｔｃｃ  ｃｔｇａｃａｃａｔａ  ｔｇｇｔｇｇｔｇｇｔ  ｇｇｔｇｇａｃｇａａ  ｔｃｔａｇｔｇｇａｇ  ａｔｃａｃｇｃｃａｃ  ２５８０
ｃｇｃｃｇｃｃｃｔｇ  ｇａｇｇａａｃａｇｃ  ｔｇａａｇｇｔｇｃｔ  ｇｇｇｇｇａｃｃｇｇ  ｔｇｇｇｃｃａａｃａ  ｔｔｔｇｃｃｇｇｔｇ  ２６４０
ｇａｃｃｇａｇｇａｃ  ａｇｇｔｇｇｇｔｇｃ  ｔｇｃｔｇｃａｇｇａ  ｃａｔｃｃｔｇｃｔｇ  ａａａｔｇｇｃａｇａ  ｇｇｃｔｇａｃｃｇａ  ２７００
ｇｇａｇｃａｇｔｇｔ  ｃｔｇｔｔｔａｇｔｇ  ｃｔｔｇｇｃｔｇａｇ  ｃｇａｇａａａｇａｇ  ｇａｃｇｃｃｇｔｇａ  ａｃａａｇａｔｃｃａ  ２７６０
ｃａｃａａｃｃｇｇｃ  ｔｔｔａａｇｇａｔｃ  ａｇａａｃｇａａａｔ  ｇｃｔｇｔｃｔａｇｃ  ｃｔｇｃａｇａａａｃ  ｔｇｇｃｔｇｔｇｃｔ  ２８２０
ｇａａｇｇｃｃｇａｔ  ｃｔｇｇａｇａａａａ  ａｇａａｇｃａｇａｇ  ｃａｔｇｇｇｃａａａ  ｃｔｇｔａｔａｇｃｃ  ｔｇａａａｃａｇｇａ  ２８８０
ｃｃｔｇｃｔｇａｇｃ  ａｃｃｃｔｇａａｇａ  ａｃａａｇａｇｃｇｔ  ｇａｃｃｃａｇａａｇ  ａｃａｇａａｇｃｃｔ  ｇｇｃｔｇｇａｔａａ  ２９４０
ｃｔｔｔｇｃｃｃｇｃ  ｔｇｃｔｇｇｇａｃａ  ａｃｃｔｇｇｔｇｃａ  ｇａａａｃｔｇｇａｇ  ａａａａｇｔａｃａｇ  ｃｔｃａｇａｔｃｔｃ  ３０００
ｔｃａｇｇｃｔｇｔｇ  ａｃｃａｃａａｃｃｃ  ａｇｃｃｔａｇｃｃｔ  ｇａｃｃｃａｇａｃａ  ａｃｃｇｔｇａｔｇｇ  ａａａｃｃｇｔｇａｃ  ３０６０
ｃａｃｃｇｔｇａｃａ  ａｃｃｃｇｃｇａａｃ  ａｇａｔｃｃｔｇｇｔ  ｇａａａｃａｔｇｃｃ  ｃａｇｇａａｇａｇｃ  ｔｇｃｃａｃｃｔｃｃ  ３１２０
ａｃｃｔｃｃｃｃａｇ  ａａｇａａｇａｇａａ  ｃｃｃｔｇｇａｇｃｇ  ｇｃｔｇｃａｇｇａｇ  ｃｔｇｃａｇｇａａｇ  ｃｃａｃｔｇａｃｇａ  ３１８０
ａｃｔｇｇａｃｃｔｇ  ａａｇｃｔｇａｇｇｃ  ａｇｇｃｃｇａａｇｔ  ｇａｔｔａａｇｇｇｇ  ｔｃｔｔｇｇｃａｇｃ  ｃｔｇｔｇｇｇｃｇａ  ３２４０
ｔｃｔｇｃｔｇａｔｔ  ｇａｔｔｃｃｃｔｇｃ  ａｇｇａｃｃａｃｃｔ  ｇｇａａａａｇｇｔｇ  ａａｇｇｃｔｃｔｇａ  ｇａｇｇｃｇａａａｔ  ３３００
ｔｇｃｔｃｃａｃｔｇ  ａａｇｇａｇａａｃｇ  ｔｇａｇｔｃａｔｇｔ  ｇａａｃｇａｔｃｔｇ  ｇｃｔａｇａｃａｇｃ  ｔｇａｃａａｃａｃｔ  ３３６０
ｇｇｇｃａｔｃｃａｇ  ｃｔｇａｇｃｃｃａｔ  ａｃａａｔｃｔｇａｇ  ｃａｃａｃｔｇｇａｇ  ｇａｃｃｔｇａａｔａ  ｃｃａｇｇｔｇｇａａ  ３４２０
ｇｃｔｇｃｔｇｃａｇ  ｇｔｇｇｃｔｇｔｇｇ  ａａｇａｃｃｇｇｇｔ  ｇｃｇｇｃａｇｃｔｇ  ｃａｔｇａｇｇｃｃｃ  ａｔｃｇｃｇａｃｔｔ  ３４８０
ｃｇｇａｃｃａｇｃｃ  ａｇｃｃａｇｃａｃｔ  ｔｔｃｔｇａｇｃａｃ  ａｔｃｃｇｔｇｃａｇ  ｇｇｇｃｃｃｔｇｇｇ  ａｇａｇｇｇｃｃａｔ  ３５４０
ｔｔｃｔｃｃｃａａｃ  ａａｇｇｔｇｃｃｃｔ  ａｃｔａｔａｔｔａａ  ｔｃａｃｇａｇａｃｃ  ｃａｇａｃｃａｃｔｔ  ｇｔｔｇｇｇａｃｃａ  ３６００
ｔｃｃｃａａｇａｔｇ  ａｃａｇａａｃｔｇｔ  ａｃｃａｇｔｃｃｃｔ  ｇｇｃｃｇａｔｃｔｇ  ａａｃａａｃｇｔｇａ  ｇｇｔｔｔａｇｃｇｃ  ３６６０
ｔｔａｃａｇａａｃｃ  ｇｃｔａｔｇａａｇｃ  ｔｇａｇａｃｇｇｃｔ  ｇｃａｇａａｇｇｃｃ  ｃｔｇｔｇｃｃｔｇｇ  ａｔｃｔｇｃｔｇｔｃ  ３７２０
ｃｃｔｇｔｃｃｇｃｃ  ｇｃｃｔｇｃｇａｔｇ  ｃｃｃｔｇｇａｔｃａ  ｇｃａｔａａｔｃｔｇ  ａａｇｃａｇａａｃｇ  ａｔｃａｇｃｃａａｔ  ３７８０
ｇｇａｔａｔｃｃｔｇ  ｃａｇａｔｃａｔｃａ  ａｃｔｇｃｃｔｇａｃ  ｃａｃｔａｔｃｔａｃ  ｇａｃａｇｇｃｔｇｇ  ａｇｃａｇｇａｇｃａ  ３８４０
ｃａａｃａａｃｃｔｇ  ｇｔｇａａｃｇｔｇｃ  ｃｔｃｔｇｔｇｃｇｔ  ｇｇａｔａｔｇｔｇｃ  ｃｔｇａａｃｔｇｇｃ  ｔｇｃｔｇａａｃｇｔ  ３９００
ｇｔａｔｇａｃａｃｔ  ｇｇｇｃｇｃａｃｃｇ  ｇｃｃｇｇａｔｃａｇ  ａｇｔｇｃｔｇａｇｔ  ｔｔｔａａａａｃｔｇ  ｇｇａｔｔａｔｃｔｃ  ３９６０
ｃｃｔｇｔｇｔａａｇ  ｇｃｃｃａｃｃｔｇｇ  ａｇｇａｃａａｇｔａ  ｃａｇｇｔａｃｃｔｇ  ｔｔｃａａｇｃａｇｇ  ｔｇｇｃｔａｇｔａｇ  ４０２０
ｃａｃｔｇｇａｔｔｔ  ｔｇｔｇａｃｃａｇｃ  ｇｃｃｇｃｃｔｇｇｇ  ａｃｔｇｃｔｇｃｔｇ  ｃａｔｇａｔａｇｔａ  ｔｃｃａｇａｔｔｃｃ  ４０８０
ｔａｇａｃａｇｃｔｇ  ｇｇａｇａｇｇｔｇｇ  ｃｔａｇｔｔｔｃｇｇ  ａｇｇａｔｃｔａａｃ  ａｔｃｇａａｃｃｃａ  ｇｃｇｔｇｃｇｃａｇ  ４１４０
ｃｔｇｔｔｔｃｃａｇ  ｔｔｔｇｃｃａａｔａ  ａｃａａａｃｃｔｇａ  ａａｔｃｇａｇｇｃｔ  ｇｃｔｃｔｇｔｔｃｃ  ｔｇｇａｔｔｇｇａｔ  ４２００
ｇｃｇｃｃｔｇｇａａ  ｃｃａｃａｇａｇｃａ  ｔｇｇｔｇｔｇｇｃｔ  ｇｃｃｔｇｔｇｃｔｇ  ｃａｃａｇａｇｔｇｇ  ｃｔｇｃｃｇｃｃｇａ  ４２６０
ａａｃｔｇｃｃａａｇ  ｃａｃｃａｇｇｃｔａ  ａａｔｇｃａａｃａｔ  ｃｔｇｃａａｇｇａａ  ｔｇｔｃｃｃａｔｔａ  ｔｃｇｇｃｔｔｔｃｇ  ４３２０
ｃｔａｃａｇｇａｇｔ  ｃｔｇａａａｃａｔｔ  ｔｔａａｃｔａｃｇａ  ｔａｔｔｔｇｃｃａｇ  ａｇｃｔｇｃｔｔｃｔ  ｔｔｔｃｃｇｇａａｇ  ４３８０
ａｇｔｇｇｃｃａａａ  ｇｇａｃａｃａａｇａ  ｔｇｃａｃｔａｃｃｃ  ｔａｔｇｇｔｇｇａａ  ｔａｔｔｇｃａｃｃｃ  ｃａａｃｔａｃａｔｃ  ４４４０
ｔｇｇｃｇａａｇａｔ  ｇｔｇｃｇｃｇａｔｔ  ｔｔｇｃｃａａｇｇｔ  ｇｃｔｇａａｇａａｔ  ａａｇｔｔｔｃｇｇａ  ｃｔａａｇａｇｇｔａ  ４５００
ｃｔｔｃｇｃｃａａｇ  ｃａｃｃｃｃｃｇｃａ  ｔｇｇｇｇｔａｔｃｔ  ｇｃｃａｇｔｇｃａｇ  ａｃａｇｔｇｃｔｇｇ  ａａｇｇａｇａｃａａ  ４５６０
ｔａｔｇｇａｇａｃｃ  ｇａｔａｃａａｔｇｔ  ｇａｇｃｇｇｃｃｇｃ  ａａｔａａａａｇａｔ  ｃｔｔｔａｔｔｔｔｃ  ａｔｔａｇａｔｃｔｇ  ４６２０
ｔｇｔｇｔｔｇｇｔｔ  ｔｔｔｔｇｔｇｔｇｔ  ｃｔａｇａｇｃａｔｇ  ｇｃｔａｃｇｔａｇａ  ｔａａｇｔａｇｃａｔ  ｇｇｃｇｇｇｔｔａａ  ４６８０
ｔｃａｔｔａａｃｔａ  ｃａａｇｇａａｃｃｃ  ｃｔａｇｔｇａｔｇｇ  ａｇｔｔｇｇｃｃａｃ  ｔｃｃｃｔｃｔｃｔｇ  ｃｇｃｇｃｔｃｇｃｔ  ４７４０
ｃｇｃｔｃａｃｔｇａ  ｇｇｃｃｇｇｇｃｇａ  ｃｃａａａｇｇｔｃｇ  ｃｃｃｇａｃｇｃｃｃ  ｇｇｇｃｔｔｔｇｃｃ  ｃｇｇｇｃｇｇｃｃｔ  ４８００
ｃａｇｔｇａｇｃｇａ  ｇｃｇａｇｃｇｃｇｃ  ｃａｇｃｔｇｇｃｇｔ  ａａｔａｇｃｇａａｇ  ａｇｇｃｃｃｇｃａｃ  ｃｇａｔｃｇｃｃｃｔ  ４８６０
ｔｃｃｃａａｃａｇｔ  ｔｇｃｇｃａｇｃｃｔ  ｇａａｔｇｇｃｇａａ  ｔｇｇａａｇｔｔｃｃ  ａｇａｃｇａｔｔｇａ  ｇｃｇｔｃａａａａｔ  ４９２０
ｇｔａｇｇｔａｔｔｔ  ｃｃａｔｇａｇｃｇｔ  ｔｔｔｔｃｃｔｇｔｔ  ｇｃａａｔｇｇｃｔｇ  ｇｃｇｇｔａａｔａｔ  ｔｇｔｔｃｔｇｇａｔ  ４９８０
ａｔｔａｃｃａｇｃａ  ａｇｇｃｃｇａｔａｇ  ｔｔｔｇａｇｔｔｃｔ  ｔｃｔａｃｔｃａｇｇ  ｃａａｇｔｇａｔｇｔ  ｔａｔｔａｃｔａａｔ  ５０４０
ｃａａａｇａａｇｔａ  ｔｔｇｃｇａｃａａｃ  ｇｇｔｔａａｔｔｔｇ  ｃｇｔｇａｔｇｇａｃ  ａｇａｃｔｃｔｔｔｔ  ａｃｔｃｇｇｔｇｇｃ  ５１００
ｃｔｃａｃｔｇａｔｔ  ａｔａａａａａｃａｃ  ｔｔｃｔｃａｇｇａｔ  ｔｃｔｇｇｃｇｔａｃ  ｃｇｔｔｃｃｔｇｔｃ  ｔａａａａｔｃｃｃｔ  ５１６０
ｔｔａａｔｃｇｇｃｃ  ｔｃｃｔｇｔｔｔａｇ  ｃｔｃｃｃｇｃｔｃｔ  ｇａｔｔｃｔａａｃｇ  ａｇｇａａａｇｃａｃ  ｇｔｔａｔａｃｇｔｇ  ５２２０
ｃｔｃｇｔｃａａａｇ  ｃａａｃｃａｔａｇｔ  ａｃｇｃｇｃｃｃｔｇ  ｔａｇｃｇｇｃｇｃａ  ｔｔａａｇｃｇｃｇｇ  ｃｇｇｇｔｇｔｇｇｔ  ５２８０
ｇｇｔｔａｃｇｃｇｃ  ａｇｃｇｔｇａｃｃｇ  ｃｔａｃａｃｔｔｇｃ  ｃａｇｃｇｃｃｃｔａ  ｇｃｇｃｃｃｇｃｔｃ  ｃｔｔｔｃｇｃｔｔｔ  ５３４０
ｃｔｔｃｃｃｔｔｃｃ  ｔｔｔｃｔｃｇｃｃａ  ｃｇｔｔｃｇｃｃｇｇ  ｃｔｔｔｃｃｃｃｇｔ  ｃａａｇｃｔｃｔａａ  ａｔｃｇｇｇｇｇｃｔ  ５４００
ｃｃｃｔｔｔａｇｇｇ  ｔｔｃｃｇａｔｔｔａ  ｇｔｇａｔｔｔａｃｇ  ｇｃａｃｃｔｃｇａｃ  ｃｃｃａａａａａａｃ  ｔｔｇａｔｔａｇｇｇ  ５４６０
ｔｇａｔｇｇｔｔｃａ  ｃｇｔａｇｔｇｇｇｃ  ｃａｔｃｇｃｃｃｔｇ  ａｔａｇａｃｇｇｔｔ  ｔｔｔｃｇｃｃｃｔｔ  ｔｇａｃｇｔｔｇｇａ  ５５２０
ｇｔｃｃａｃｇｔｔｃ  ｔｔｔａａｔａｇｔｇ  ｇａｃｔｃｔｔｇｔｔ  ｃｃａａａｃｔｇｇａ  ａｃａａｃａｃｔｃａ  ａｃｃｃｔａｔｃｔｃ  ５５８０
ｇｇｔｃｔａｔｔｃｔ  ｔｔｔｇａｔｔｔａｔ  ａａｇｇｇａｔｔｔｔ  ｇｃｃｇａｔｔｔｃｇ  ｇｃｃｔａｔｔｇｇｔ  ｔａａａａａａｔｇａ  ５６４０
ｇｃｔｇａｔｔｔａａ  ｃａａａａａｔｔｔａ  ａｃｇｃｇａａｔｔｔ  ｔａａｃａａａａｔａ  ｔｔａａｃｇｔｔｔａ  ｃａａｔｔｔａａａｔ  ５７００
ａｔｔｔｇｃｔｔａｔ  ａｃａａｔｃｔｔｃｃ  ｔｇｔｔｔｔｔｇｇｇ  ｇｃｔｔｔｔｃｔｇａ  ｔｔａｔｃａａｃｃｇ  ｇｇｇｔａｃａｔａｔ  ５７６０
ｇａｔｔｇａｃａｔｇ  ｃｔａｇｔｔｔｔａｃ  ｇａｔｔａｃｃｇｔｔ  ｃａｔｃｇａｔｔｃｔ  ｃｔｔｇｔｔｔｇｃｔ  ｃｃａｇａｃｔｃｔｃ  ５８２０
ａｇｇｃａａｔｇａｃ  ｃｔｇａｔａｇｃｃｔ  ｔｔｇｔａｇａｇａｃ  ｃｔｃｔｃａａａａａ  ｔａｇｃｔａｃｃｃｔ  ｃｔｃｃｇｇｃａｔｇ  ５８８０
ａａｔｔｔａｔｃａｇ  ｃｔａｇａａｃｇｇｔ  ｔｇａａｔａｔｃａｔ  ａｔｔｇａｔｇｇｔｇ  ａｔｔｔｇａｃｔｇｔ  ｃｔｃｃｇｇｃｃｔｔ  ５９４０
ｔｃｔｃａｃｃｃｇｔ  ｔｔｇａａｔｃｔｔｔ  ａｃｃｔａｃａｃａｔ  ｔａｃｔｃａｇｇｃａ  ｔｔｇｃａｔｔｔａａ  ａａｔａｔａｔｇａｇ  ６０００
ｇｇｔｔｃｔａａａａ  ａｔｔｔｔｔａｔｃｃ  ｔｔｇｃｇｔｔｇａａ  ａｔａａａｇｇｃｔｔ  ｃｔｃｃｃｇｃａａａ  ａｇｔａｔｔａｃａｇ  ６０６０
ｇｇｔｃａｔａａｔｇ  ｔｔｔｔｔｇｇｔａｃ  ａａｃｃｇａｔｔｔａ  ｇｃｔｔｔａｔｇｃｔ  ｃｔｇａｇｇｃｔｔｔ  ａｔｔｇｃｔｔａａｔ  ６１２０
ｔｔｔｇｃｔａａｔｔ  ｃｔｔｔｇｃｃｔｔｇ  ｃｃｔｇｔａｔｇａｔ  ｔｔａｔｔｇｇａｔｇ  ｔｔｇｇａａｇｔｔｃ  ｃｔｇａｔｇｃｇｇｔ  ６１８０
ａｔｔｔｔｃｔｃｃｔ  ｔａｃｇｃａｔｃｔｇ  ｔｇｃｇｇｔａｔｔｔ  ｃａｃａｃｃｇｃａｔ  ａｔｇｇｔｇｃａｃｔ  ｃｔｃａｇｔａｃａａ  ６２４０
ｔｃｔｇｃｔｃｔｇａ  ｔｇｃｃｇｃａｔａｇ  ｔｔａａｇｃｃａｇｃ  ｃｃｃｇａｃａｃｃｃ  ｇｃｃａａｃａｃｃｃ  ｇｃｔｇａｃｇｃｇｃ  ６３００
ｃｃｔｇａｃｇｇｇｃ  ｔｔｇｔｃｔｇｃｔｃ  ｃｃｇｇｃａｔｃｃｇ  ｃｔｔａｃａｇａｃａ  ａｇｃｔｇｔｇａｃｃ  ｇｔｃｔｃｃｇｇｇａ  ６３６０
ｇｃｔｇｃａｔｇｔｇ  ｔｃａｇａｇｇｔｔｔ  ｔｃａｃｃｇｔｃａｔ  ｃａｃｃｇａａａｃｇ  ｃｇｃｇａｇａｃｇａ  ａａｇｇｇｃｃｔｃｇ  ６４２０
ｔｇａｔａｃｇｃｃｔ  ａｔｔｔｔｔａｔａｇ  ｇｔｔａａｔｇｔｃａ  ｔｇａｔａａｔａａｔ  ｇｇｔｔｔｃｔｔａｇ  ａｃｇｔｃａｇｇｔｇ  ６４８０
ｇｃａｃｔｔｔｔｃｇ  ｇｇｇａａａｔｇｔｇ  ｃｇｃｇｇａａｃｃｃ  ｃｔａｔｔｔｇｔｔｔ  ａｔｔｔｔｔｃｔａａ  ａｔａｃａｔｔｃａａ  ６５４０
ａｔａｔｇｔａｔｃｃ  ｇｃｔｃａｔｇａｇａ  ｃａａｔａａｃｃｃｔ  ｇａｔａａａｔｇｃｔ  ｔｃａａｔａａｔａｔ  ｔｇａａａａａｇｇａ  ６６００
ａｇａｇｔａｔｇａｇ  ｔａｔｔｃａａｃａｔ  ｔｔｃｃｇｔｇｔｃｇ  ｃｃｃｔｔａｔｔｃｃ  ｃｔｔｔｔｔｔｇｃｇ  ｇｃａｔｔｔｔｇｃｃ  ６６６０
ｔｔｃｃｔｇｔｔｔｔ  ｔｇｃｔｃａｃｃｃａ  ｇａａａｃｇｃｔｇｇ  ｔｇａａａｇｔａａａ  ａｇａｔｇｃｔｇａａ  ｇａｔｃａｇｔｔｇｇ  ６７２０
ｇｔｇｃａｃｇａｇｔ  ｇｇｇｔｔａｃａｔｃ  ｇａａｃｔｇｇａｔｃ  ｔｃａａｃａｇｃｇｇ  ｔａａｇａｔｃｃｔｔ  ｇａｇａｇｔｔｔｔｃ  ６７８０
ｇｃｃｃｃｇａａｇａ  ａｃｇｔｔｔｔｃｃａ  ａｔｇａｔｇａｇｃａ  ｃｔｔｔｔａａａｇｔ  ｔｃｔｇｃｔａｔｇｔ  ｇｇｃｇｃｇｇｔａｔ  ６８４０
ｔａｔｃｃｃｇｔａｔ  ｔｇａｃｇｃｃｇｇｇ  ｃａａｇａｇｃａａｃ  ｔｃｇｇｔｃｇｃｃｇ  ｃａｔａｃａｃｔａｔ  ｔｃｔｃａｇａａｔｇ  ６９００
ａｃｔｔｇｇｔｔｇａ  ｇｔａｃｔｃａｃｃａ  ｇｔｃａｃａｇａａａ  ａｇｃａｔｃｔｔａｃ  ｇｇａｔｇｇｃａｔｇ  ａｃａｇｔａａｇａｇ  ６９６０
ａａｔｔａｔｇｃａｇ  ｔｇｃｔｇｃｃａｔａ  ａｃｃａｔｇａｇｔｇ  ａｔａａｃａｃｔｇｃ  ｇｇｃｃａａｃｔｔａ  ｃｔｔｃｔｇａｃａａ  ７０２０
ｃｇａｔｃｇｇａｇｇ  ａｃｃｇａａｇｇａｇ  ｃｔａａｃｃｇｃｔｔ  ｔｔｔｔｇｃａｃａａ  ｃａｔｇｇｇｇｇａｔ  ｃａｔｇｔａａｃｔｃ  ７０８０
ｇｃｃｔｔｇａｔｃｇ  ｔｔｇｇｇａａｃｃｇ  ｇａｇｃｔｇａａｔｇ  ａａｇｃｃａｔａｃｃ  ａａａｃｇａｃｇａｇ  ｃｇｔｇａｃａｃｃａ  ７１４０
ｃｇａｔｇｃｃｔｇｔ  ａｇｃａａｔｇｇｃａ  ａｃａａｃｇｔｔｇｃ  ｇｃａａａｃｔａｔｔ  ａａｃｔｇｇｃｇａａ  ｃｔａｃｔｔａｃｔｃ  ７２００
ｔａｇｃｔｔｃｃｃｇ  ｇｃａａｃａａｔｔａ  ａｔａｇａｃｔｇｇａ  ｔｇｇａｇｇｃｇｇａ  ｔａａａｇｔｔｇｃａ  ｇｇａｃｃａｃｔｔｃ  ７２６０
ｔｇｃｇｃｔｃｇｇｃ  ｃｃｔｔｃｃｇｇｃｔ  ｇｇｃｔｇｇｔｔｔａ  ｔｔｇｃｔｇａｔａａ  ａｔｃｔｇｇａｇｃｃ  ｇｇｔｇａｇｃｇｔｇ  ７３２０
ｇｇｔｃｔｃｇｃｇｇ  ｔａｔｃａｔｔｇｃａ  ｇｃａｃｔｇｇｇｇｃ  ｃａｇａｔｇｇｔａａ  ｇｃｃｃｔｃｃｃｇｔ  ａｔｃｇｔａｇｔｔａ  ７３８０
ｔｃｔａｃａｃｇａｃ  ｇｇｇｇａｇｔｃａｇ  ｇｃａａｃｔａｔｇｇ  ａｔｇａａｃｇａａａ  ｔａｇａｃａｇａｔｃ  ｇｃｔｇａｇａｔａｇ  ７４４０
ｇｔｇｃｃｔｃａｃｔ  ｇａｔｔａａｇｃａｔ  ｔｇｇｔａａｃｔｇｔ  ｃａｇａｃｃａａｇｔ  ｔｔａｃｔｃａｔａｔ  ａｔａｃｔｔｔａｇａ  ７５００
ｔｔｇａｔｔｔａａａ  ａｃｔｔｃａｔｔｔｔ  ｔａａｔｔｔａａａａ  ｇｇａｔｃｔａｇｇｔ  ｇａａｇａｔｃｃｔｔ  ｔｔｔｇａｔａａｔｃ  ７５６０
ｔｃａｔｇａｃｃａａ  ａａｔｃｃｃｔｔａａ  ｃｇｔｇａｇｔｔｔｔ  ｃｇｔｔｃｃａｃｔｇ  ａｇｃｇｔｃａｇａｃ  ｃｃｃｇｔａｇａａａ  ７６２０
ａｇａｔｃａａａｇｇ  ａｔｃｔｔｃｔｔｇａ  ｇａｔｃｃｔｔｔｔｔ  ｔｔｃｔｇｃｇｃｇｔ  ａａｔｃｔｇｃｔｇｃ  ｔｔｇｃａａａｃａａ  ７６８０
ａａａａａｃｃａｃｃ  ｇｃｔａｃｃａｇｃｇ  ｇｔｇｇｔｔｔｇｔｔ  ｔｇｃｃｇｇａｔｃａ  ａｇａｇｃｔａｃｃａ  ａｃｔｃｔｔｔｔｔｃ  ７７４０
ｃｇａａｇｇｔａａｃ  ｔｇｇｃｔｔｃａｇｃ  ａｇａｇｃｇｃａｇａ  ｔａｃｃａａａｔａｃ  ｔｇｔｃｃｔｔｃｔａ  ｇｔｇｔａｇｃｃｇｔ  ７８００
ａｇｔｔａｇｇｃｃａ  ｃｃａｃｔｔｃａａｇ  ａａｃｔｃｔｇｔａｇ  ｃａｃｃｇｃｇｔａｃ  ａｔａｃｃｔｃｇｃｔ  ｃｔｇｃｔａａｔｃｃ  ７８６０
ｔｇｔｔａｃｃａｇｔ  ｇｇｃｔｇｃｔｇｃｃ  ａｇｔｇｇｃｇａｔａ  ａｇｔｃｇｔｇｔｃｔ  ｔａｃｃｇｇｇｔｔｇ  ｇａｃｔｃａａｇａｃ  ７９２０
ｇａｔａｇｔｔａｃｃ  ｇｇａｔａａｇｇｃｇ  ｃａｇｃｇｇｔｃｇｇ  ｇｃｔｇａａｃｇｇｇ  ｇｇｇｔｔｃｇｔｇｃ  ａｃａｃａｇｃｃｃａ  ７９８０
ｇｃｔｔｇｇａｇｃｇ  ａａｃｇａｃｃｔａｃ  ａｃｃｇａａｃｔｇａ  ｇａｔａｃｃｔａｃａ  ｇｃｇｔｇａｇｃｔａ  ｔｇａｇａａａｇｃｇ  ８０４０
ｃｃａｃｇｃｔｔｃｃ  ｃｇａａｇｇｇａｇａ  ａａｇｇｃｇｇａｃａ  ｇｇｔａｔｃｃｇｇｔ  ａａｇｃｇｇｃａｇｇ  ｇｔｃｇｇａａｃａｇ  ８１００
ｇａｇａｇｃｇｃａｃ  ｇａｇｇｇａｇｃｔｔ  ｃｃａｇｇｇｇｇａａ  ａｃｇｃｃｔｇｇｔａ  ｔｃｔｔｔａｔａｇｔ  ｃｃｔｇｔｃｇｇｇｔ  ８１６０
ｔｔｃｇｃｃａｃｃｔ  ｃｔｇａｃｔｔｇａｇ  ｃｇｔｃｇａｔｔｔｔ  ｔｇｔｇａｔｇｃｔｃ  ｇｔｃａｇｇｇｇｇｇ  ｃｇｇａｇｃｃｔａｔ  ８２２０
ｇｇａａａａａｃｇｃ  ｃａｇｃａａｃｇｃｇ  ｇｃｃｔｔｔｔｔａｃ  ｇｇｔｔｃｃｔｇｇｃ  ｃｔｔｔｔｇｃｔｇｇ  ｃｃｔｔｔｔｇｃｔｃ  ８２８０
ａｃａｔｇｔｔｃｔｔ  ｔｃｃｔｇｃｇｔｔａ  ｔｃｃｃｃｔｇａｔｔ  ｃｔｇｔｇｇａｔａａ  ｃｃｇｔａｔｔａｃｃ  ｇｇｇｔｔｔｇａｇｔ  ８３４０
ｇａｇｃｔｇａｔａｃ  ｃｇｃｔｃｇｃｃｇｃ  ａｇｃｃｇａａｃｇａ  ｃｃｇａｇｃｇｃａｇ  ｃｇａｇｔｃａｇｔｇ  ａｇｃｇａｃｃａａｇ  ８４００
ｃｇｇａａｇａｇｃ  ８４０９
【図１】
2020513811.tif 000009
【図２】
2020513811.tif 000010
【図３Ａ】
2020513811.tif 000011
【図３Ｂ】
2020513811.tif 000012
【図３Ｃ】
2020513811.tif 000013
【図４Ａ】
2020513811.tif 000014
【図４Ｂ】
2020513811.tif 000015
【図４Ｃ】
2020513811.tif 000016
【図５】
2020513811.tif 000017
【図６Ａ】
2020513811.tif 000018
【図６Ｂ】
2020513811.tif 000019
【図６Ｃ】
2020513811.tif 000020
【図６Ｄ】
2020513811.tif 000021
【図７】
2020513811.tif 000022
【図８】
2020513811.tif 000023
【図９Ａ】
2020513811.tif 000024
【図９Ｂ】
2020513811.tif 000025
【図９Ｃ】
2020513811.tif 000026
【図１０−１】
2020513811.tif 000027
【図１０−２】
2020513811.tif 000028
【図１０−３】
2020513811.tif 000029
【図１０−４】
2020513811.tif 000030
【図１１−１】
2020513811.tif 000031
【図１１−２】
2020513811.tif 000032
【図１１−３】
2020513811.tif 000033
【図１１−４】
2020513811.tif 000034
【図１２Ａ】
2020513811.tif 000035
【図１２Ｂ】
2020513811.tif 000036
【図１３Ａ】
2020513811.tif 000037
【図１３Ｂ】
2020513811.tif 000038
【図１４】
2020513811.tif 000039
【図１５】
2020513811.tif 000040
【図１６】
2020513811.tif 000041
【図１７】
2020513811.tif 000042
【図１８】
2020513811.tif 000043
【図１９】
2020513811.tif 000044
【図２０】
2020513811.tif 000045
【図２１】
2020513811.tif 000046
【図２２】
2020513811.tif 000047
【図２３】
2020513811.tif 000048
【図２４】
2020513811.tif 000049
【図２５】
2020513811.tif 000050
【図２６】
2020513811.tif 000051
【配列表】
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【国際調査報告】
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