(57)【要約】  本開示は、チラミンを発酵生産するための微生物細胞の遺伝子操作を記載し、新規の遺伝子操作型微生物細胞及び培養物、並びに関連するチラミン生産法を提供する。
2020513790.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子操作型微生物細胞であって、
(a)前記遺伝子操作型微生物細胞が、異種チロシンデカルボキシラーゼ(TYDC)を発現し、
(b)前記遺伝子操作型微生物細胞が、チラミン生合成経路における1つ又は複数の上流酵素(複数可)の、増大した活性を含み、前記増大した活性が、対照細胞と比較して増大している、遺伝子操作型微生物細胞。
【請求項２】
前記1つ又は複数の上流酵素(複数可)が、3-デオキシ-D-アラビノ-ヘプツロソネート-7-リン酸(DAHP)シンターゼを含む、請求項1に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【請求項３】
遺伝子操作型微生物細胞であって、
(a)前記遺伝子操作型微生物細胞が、異種チロシンデカルボキシラーゼ(TYDC)を発現し、
(b)前記遺伝子操作型微生物細胞が、デヒドロキネートシンターゼ、デヒドロキネートデヒドラターゼ、シキミ酸デヒドロゲナーゼ、シキミ酸キナーゼ、EPSPシンターゼ、芳香族五機能性酵素、コリスミ酸シンターゼ、コリスミ酸ムターゼ、プレフェン酸デヒドラターゼ、フェニルアラニンアミノトランスフェラーゼ、プレフェン酸デヒドロゲナーゼ、プレフェン酸アミノトランスフェラーゼ、アロゲン酸デヒドロゲナーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、及びチロシンアミノトランスフェラーゼからなる群から選択される1つ又は複数の酵素(複数可)の、増大した活性を含み、前記増大した活性が、対照細胞と比較して増大しており、
前記遺伝子操作型微生物細胞が、チラミンを生成する、遺伝子操作型微生物細胞。
【請求項４】
前記遺伝子操作型微生物細胞が、
(c)フィードバック調節不全3-デオキシ-D-アラビノ-ヘプツロソネート-7-リン酸(DAHP)シンターゼ又はフィードバック調節不全コリスミ酸ムターゼ
を追加的に発現する、請求項3に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【請求項５】
遺伝子操作型微生物細胞であって、前記遺伝子操作型微生物細胞が、
(a)異種チロシンデカルボキシラーゼ(TYDC)を発現するための手段、及び
(b)チラミン生合成経路における1つ又は複数の上流酵素(複数可)の活性を増大させるための手段
を含む、遺伝子操作型微生物細胞。
【請求項６】
前記1つ又は複数の上流酵素(複数可)が、3-デオキシ-D-アラビノ-ヘプツロソネート-7-リン酸(DAHP)シンターゼを含む、請求項5に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【請求項７】
遺伝子操作型微生物細胞であって、前記遺伝子操作型微生物細胞が、
(a)異種チロシンデカルボキシラーゼ(TYDC)を発現するための手段、及び
(b)デヒドロキネートシンターゼ、デヒドロキネートデヒドラターゼ、シキミ酸デヒドロゲナーゼ、シキミ酸キナーゼ、EPSPシンターゼ、芳香族五機能性酵素、コリスミ酸シンターゼ、コリスミ酸ムターゼ、プレフェン酸デヒドラターゼ、プレフェン酸アミノトランスフェラーゼ、アロゲン酸デヒドロゲナーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、フェニルアラニンアミノトランスフェラーゼ、プレフェン酸デヒドロゲナーゼ、及びチロシンアミノトランスフェラーゼからなる群から選択される1つ又は複数の酵素(複数可)の活性を増大させるための手段を含み、前記増大した活性が、対照細胞と比較して増大しており、
前記遺伝子操作型微生物細胞が、チラミンを生成する、遺伝子操作型微生物細胞。
【請求項８】
前記遺伝子操作型微生物細胞が、
(c)フィードバック調節不全DAHPシンターゼ又はフィードバック調節不全コリスミ酸ムターゼを発現するための手段
を追加的に発現する、請求項7に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【請求項９】
前記遺伝子操作型微生物細胞が、基質の発酵によりチラミンを生成し、前記基質の少なくとも50%が、タンパク質又はアミノ酸供給源に由来しない、請求項1から8のいずれか一項に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【請求項１０】
前記遺伝子操作型微生物細胞が、
(a)異種TYDC、及び
(b)フィードバック調節不全DAHPシンターゼ
を含む、請求項4、8、又は9のいずれか一項に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【請求項１１】
前記遺伝子操作型微生物細胞が、真菌細胞を含む、請求項3から10のいずれか一項に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【請求項１２】
前記遺伝子操作型微生物細胞が、酵母細胞を含む、請求項3から11のいずれか一項に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【請求項１３】
前記酵母細胞が、サッカロミセス属の細胞を含む、請求項8に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【請求項１４】
前記酵母細胞が、セレビシエ種の細胞である、請求項13に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【請求項１５】
前記DAHPシンターゼが、S.セレビシエDAHPシンターゼの変異体である、請求項4、8、又は9から14のいずれか一項に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【請求項１６】
前記異種TYDCが、ケシ由来のTYDCと少なくとも70%のアミノ酸配列同一性を有するTYDCを含む、請求項3から15のいずれか一項に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【請求項１７】
(a)前記異種TYDCが、ケシのチロシン/DOPAデカルボキシラーゼ2を含み、
(b)前記フィードバック調節不全DAHPシンターゼが、K229L突然変異を追加的に含むAro4遺伝子によってコードされるS.セレビシエDAHPシンターゼである、請求項4、8、又は9から16のいずれか一項に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【請求項１８】
前記遺伝子操作型微生物細胞が、前記対照細胞と比較して、プレフェン酸デヒドロゲナーゼの、増大した活性を含む、請求項3から17のいずれか一項に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【請求項１９】
前記遺伝子操作型微生物細胞が、野生型S.セレビシエのトランスアルドラーゼ遺伝子(transaldolase gene)の余剰コピーを発現する、請求項18に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【請求項２０】
前記遺伝子操作型微生物細胞が、酵母細胞を含む、請求項2又は6に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【請求項２１】
前記酵母細胞が、ヤロウィア属の細胞を含む、請求項20に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【請求項２２】
前記酵母細胞が、リポリティカ種の細胞である、請求項21に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【請求項２３】
前記異種TYDCが、エンテロコッカス・フェシウム由来のTYDCと少なくとも70%のアミノ酸配列同一性を有するTYDCを含む、請求項21又は22に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【請求項２４】
前記DAHPシンターゼが、S.セレビシエ由来のDAHPシンターゼと少なくとも70%のアミノ酸配列同一性を有するDAHPシンターゼを含む、請求項21から23のいずれか一項に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【請求項２５】
(a)前記異種TYDCが、E.フェシウムCom15由来のピリドキサール依存性デカルボキシラーゼ(TYDC)を含み、
(b)DAHPシンターゼが、S.セレビシエS288c由来のホスホ-2-デヒドロ-3-デオキシヘプトン酸アルドラーゼ(DAHPシンターゼ)を含む、請求項24に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【請求項２６】
ケシ由来のTYDCと少なくとも70%のアミノ酸配列同一性を有する異種チロシンデカルボキシラーゼ(TYDC)を含む酵母細胞である遺伝子操作型微生物細胞であって、前記遺伝子操作型酵母細胞が、チラミンを生成する、遺伝子操作型微生物細胞。
【請求項２７】
前記遺伝子操作型酵母細胞が、サッカロミセス属の細胞である、請求項26に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【請求項２８】
前記遺伝子操作型酵母細胞が、セレビシエ種の細胞である、請求項27に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【請求項２９】
前記遺伝子操作型酵母細胞が、細菌細胞である、請求項3から10のいずれか一項に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【請求項３０】
前記細菌細胞が、コリネバクテリウム属の細胞である、請求項29に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【請求項３１】
前記細菌細胞が、グルタミカム種の細胞である、請求項30に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【請求項３２】
前記細菌細胞が、S.セレビシエDAHPシンターゼの変異体であるフィードバック調節不全DAHPシンターゼを含む、請求項29から31のいずれか一項に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【請求項３３】
前記異種TYDCが、エンテロコッカス・フェシウム由来のTYDCと少なくとも70%のアミノ酸配列同一性を有する、又はジゴサッカロミセス・バイリ由来のTYDCと少なくとも70%のアミノ酸配列同一性を有するTYDCを含む、請求項29から32のいずれか一項に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【請求項３４】
(a)前記異種TYDCが、E.フェシウムのTYDCを含み、
(b)前記フィードバック調節不全DAHPシンターゼが、K229L突然変異を追加的に含むAro4遺伝子によってコードされるS.セレビシエDAHPシンターゼである、
請求項32又は33に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【請求項３５】
(a)前記異種TYDCが、Z.バイリのTYDCを含み、
(b)前記フィードバック調節不全DAHPシンターゼが、K229L突然変異を追加的に含むAro4遺伝子によってコードされるS.セレビシエDAHPシンターゼである、
請求項32又は33に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【請求項３６】
対照細胞と比較して、コリスミ酸シンターゼ又はプレフレネートデヒドロゲナーゼの、増大した活性を追加的に含む、請求項33に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【請求項３７】
前記遺伝子操作型酵母細胞が、コリスミ酸シンターゼの、増大した活性を含み、異種コリスミ酸シンターゼを発現する、請求項36に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【請求項３８】
前記遺伝子操作型酵母細胞が、プレフェン酸デヒドロゲナーゼの、増大した活性を含み、プレフェン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の追加コピーを発現する、請求項36に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【請求項３９】
前記遺伝子操作型酵母細胞が、細菌細胞を含む、請求項2又は6に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【請求項４０】
前記細菌細胞が、コリネバクテリウム属又はバチルス属の細胞を含む、請求項39に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【請求項４１】
前記細菌細胞が、それぞれグルタミカム種又はズブチリス種の細胞である、請求項40に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【請求項４２】
前記異種TYDCが、エンテロコッカス・フェシウム由来のTYDCと少なくとも70%のアミノ酸配列同一性を有するTYDCを含む、請求項40又は41に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【請求項４３】
前記DAHPシンターゼが、S.セレビシエ由来のDAHPシンターゼと少なくとも70%のアミノ酸配列同一性を有するDAHPシンターゼを含む、請求項40から42のいずれか一項に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【請求項４４】
前記遺伝子操作型酵母細胞が、対照細胞と比較して、シキミ酸キナーゼの、増大した活性を含む、請求項40から43のいずれか一項に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【請求項４５】
前記シキミ酸キナーゼが、エシェリキア・コリ由来のシキミ酸キナーゼと少なくとも70%のアミノ酸配列同一性を有するシキミ酸キナーゼを含む、請求項44に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【請求項４６】
(a)前記異種TYDCが、E.フェシウムCom15由来のピリドキサール依存性デカルボキシラーゼ(TYDC)を含み、
(b)前記DAHPシンターゼが、S.セレビシエS288c由来のホスホ-2-デヒドロ-3-デオキシヘプトン酸アルドラーゼ(DAHPシンターゼ)を含み、
(c)前記シキミ酸キナーゼが、E.コリK12由来のシキミ酸キナーゼを含む、請求項45に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【請求項４７】
培養時に、前記遺伝子操作型酵母細胞が、培養培地1Lあたり100mgを超えるレベルでチラミンを生成する、請求項13から46のいずれか一項に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【請求項４８】
前記遺伝子操作型酵母細胞が、培養培地1Lあたり少なくとも2.5gのレベルでチラミンを生成する、請求項47に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【請求項４９】
エンテロコッカス・フェシウム由来のTYDCと少なくとも70%のアミノ酸配列同一性を有する異種チロシンデカルボキシラーゼ(TYDC)を含む細菌細胞である遺伝子操作型微生物細胞であって、前記遺伝子操作型細菌細胞が、チラミンを生成する、遺伝子操作型微生物細胞。
【請求項５０】
前記細菌細胞が、コリネバクテリウム属の細菌細胞である、請求項49に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【請求項５１】
前記細菌細胞が、グルタミカム種の細菌細胞である、請求項50に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【請求項５２】
ジゴサッカロミセス・バイリ由来のTYDCと少なくとも70%のアミノ酸配列同一性を有する異種チロシンデカルボキシラーゼ(TYDC)を含む細菌細胞である遺伝子操作型微生物細胞であって、前記遺伝子操作型細菌細胞が、チラミンを生成する、遺伝子操作型微生物細胞。
【請求項５３】
前記細菌細胞が、コリネバクテリウム属の細菌細胞である、請求項52に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【請求項５４】
前記細菌細胞が、グルタミカム種の細菌細胞である、請求項53に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【請求項５５】
請求項13から54のいずれか一項に記載の遺伝子操作型微生物細胞の培養物。
【請求項５６】
前記チラミンが、基質の発酵からが生成され、前記基質の少なくとも50%がタンパク質又はアミノ酸供給源に由来しない、請求項55に記載の培養物。
【請求項５７】
前記基質が、尿素、アンモニウム塩、アンモニア、及びこれらの任意の組合せからなる群から選択される炭素源及び窒素源を含む、請求項56に記載の培養物。
【請求項５８】
前記遺伝子操作型微生物細胞が、前記培養物が600nmで10〜500の光学密度を有するような濃度で、存在する、請求項55から57のいずれか一項に記載の培養物。
【請求項５９】
前記培養物が、チラミンを含む、請求項55から58のいずれか一項に記載の培養物。
【請求項６０】
前記培養物が、培養培地1Lあたり100mgを超えるレベルでチラミンを含む、請求項55から59のいずれか一項に記載の培養物。
【請求項６１】
前記培養物が、培養培地1Lあたり少なくとも2.5gのレベルでチラミンを含む、請求項55から60のいずれか一項に記載の培養物。
【請求項６２】
請求項1から54のいずれか一項に記載の遺伝子操作型微生物細胞を培養する方法であって、前記方法が、非タンパク質炭素及び非タンパク質窒素源を含む発酵基質の存在下で前記細胞を培養する工程を含み、前記遺伝子操作型微生物細胞が、チラミンを生成する、方法。
【請求項６３】
前記方法が、1〜100g/Lの範囲内の初期グルコースレベルでのフェドバッチ培養、次に制御型糖供給を含む、請求項62に記載の方法。
【請求項６４】
前記発酵基質が、尿素、アンモニウム塩、アンモニア、及びこれらの任意の組合せからなる群から選択されるグルコース及び窒素源を含む、請求項62又は63に記載の方法。
【請求項６５】
前記培養物が、培養中にpH制御される、請求項62から64のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記培養物が、培養中に通気される、請求項62から65のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記遺伝子操作型微生物細胞が、培養培地1Lあたり100mgを超えるレベルでチラミンを生成する、請求項62から66のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記遺伝子操作型微生物細胞が、培養培地1Lあたり少なくとも2.5gのレベルでチラミンを生成する、請求項62から67のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記方法が、前記培養物からチラミンを回収する工程を追加的に含む、請求項62から68のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その全容が参照により本明細書に組み込まれている、2017年2月6日に出願された米国仮特許出願第62/455,428号の優先権を主張するものである。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発に関する記載
本発明は、DARPAによって与えられた認可番号HR0011-15-9-0014の下、政府の支援によってなされた。政府は本発明において確固たる権利を有する。
【０００３】
参照による配列表の組込み
本出願は、ASCII形式で電子出願され参照によりその全容が本明細書に組み込まれている配列表を含む。このASCIIコピーは、2018年2月6日に作製され、2018-02-05_ZMGNP001WO_seqlist.txtと名付けられ331,364バイトのサイズである。
【０００４】
一般に本開示は、発酵によりチラミンを過剰生成させるための微生物の遺伝子操作の分野に関する。
【背景技術】
【０００５】
チラミンは、チロシンの脱カルボキシル化産物として天然に存在することが公知である。チラミンは、タンパク質が豊富な材料が腐食又は腐敗した場合、環境中で生成又は処理されることが多い。チラミンは、動物母乳又はマメ科植物等のタンパク質が豊富な物質の発酵から生じた食品中に存在する。これらのプロセスは、芳香族アミノ酸を含有するタンパク質及びチロシンデカルボキシラーゼを発現する微生物の外部供給源に依存する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許公開第2011/0045563号
【特許文献２】米国特許第7,659,097号
【特許文献３】米国特許公開第2010/0297749号
【特許文献４】米国特許公開第2009/0282545号
【特許文献５】国際特許公開第WO2011/034863号
【特許文献６】米国特許公開第2014/0068797号
【特許文献７】米国公開特許出願第2014-0315985号
【特許文献８】米国特許公開第2009/0203102号
【特許文献９】米国特許公開第2010/0048964号
【特許文献１０】米国特許公開第2010/0003716号
【特許文献１１】国際公開第WO2009/076676号
【特許文献１２】国際公開第WO2010/003007号
【特許文献１３】国際公開第WO2009/132220号
【特許文献１４】国際公開第WO2004/033646号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?species=1423 & aa=1 & style=N
【非特許文献２】www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?species=4952 & aa=1 & style=N
【非特許文献３】www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?species=340322 & aa=1 & style=N
【非特許文献４】http://www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?species=4932 & aa=1 & style=N
【非特許文献５】Berka & Barnett、Biotechnology Advances、(1989年)、7(2):127〜154頁
【非特許文献６】Romanosら、Yeast、(1992年)、8(6):423〜488頁
【非特許文献７】Saunders & Warmbrodt、「Gene Expression in Algae and Fungi、Including Yeast」、(1993年)、National Agricultural Library、Beltsville、Md
【非特許文献８】Lindbergら、Metab.Eng、(2010年)12(1):70〜79頁
【非特許文献９】「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」、fourth edition(Sambrookら、2012年)
【非特許文献１０】「Oligonucleotide Synthesis」(M.J.Gait、ed、1984年)
【非特許文献１１】「Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique and Specialized Applications」(R.I.Freshnery、ed、6th Edition、2010年)
【非特許文献１２】「Methods in Enzymology」(Academic Press、Inc.)
【非特許文献１３】「Current Protocols in Molecular Biology」(F.M.Ausubelら、eds、1987年and periodic updates)
【非特許文献１４】「PCR:The Polymerase Chain Reaction」(Mullisら、eds、1994年)
【非特許文献１５】Singletonら、Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed、J.Wiley & Sons(New York、N.Y.1994年)
【非特許文献１６】Goeddel、Gene Expression Technology:Methods In Enzymology185、Academic Press、San Diego、Calif.(1990年)
【非特許文献１７】Jinek Mら、「A programmable dual-RNA-guided RNA endonuclease in adaptive bacterial immunity」、Science337:816〜21頁、2012年
【非特許文献１８】Ran、F.Aら、(「In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9」、Nature520(7546):186〜91頁、2015年4月9日、全ての拡張データ含む)
【非特許文献１９】Manual of Methods for General Bacteriology Gerhardtら、eds)、American Society for Microbiology、Washington、D.C.(1994年)
【非特許文献２０】Brock in Biotechnology:A Textbook of Industrial Microbiology、Second Edition(1989年)Sinauser Associates、Inc.、Sunderland、Mass
【発明の概要】
【０００８】
本明細書で企図する様々な実施形態は、以下の1つ又は複数だけに限定する必要はないが、これらを含み得る。
【０００９】
実施形態1:(a)異種チロシンデカルボキシラーゼ(TYDC)を発現し、且つ(b)チラミン生合成経路における1つ又は複数の上流酵素(複数可)の、増大した活性を含み、前記増大した活性が、対照細胞と比較して増大している、遺伝子操作型(engineered)微生物細胞。
【００１０】
実施形態2:1つ又は複数の上流酵素(複数可)が3-デオキシ-D-アラビノ-ヘプツロソネート-7-リン酸(DAHP)シンターゼを含む、実施形態1に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【００１１】
実施形態3:(a)異種チロシンデカルボキシラーゼ(TYDC)を発現し、且つ(b)デヒドロキネートシンターゼ、デヒドロキネートデヒドラターゼ、シキミ酸デヒドロゲナーゼ、シキミ酸キナーゼ、EPSPシンターゼ、芳香族五機能性酵素、コリスミ酸シンターゼ、コリスミ酸ムターゼ、プレフェン酸デヒドラターゼ、フェニルアラニンアミノトランスフェラーゼ、プレフェン酸デヒドロゲナーゼ、プレフェン酸アミノトランスフェラーゼ、アロゲン酸デヒドロゲナーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、及びチロシンアミノトランスフェラーゼからなる群から選択される1つ又は複数の酵素(複数可)の、増大した活性を含み、前記増大した活性が、対照細胞と比較して増大している、遺伝子操作型微生物細胞であって、チラミンを生成する遺伝子操作型微生物細胞。
【００１２】
実施形態4:(c)フィードバック調節不全3-デオキシ-D-アラビノ-ヘプツロソネート-7-リン酸(DAHP)シンターゼ又はフィードバック調節不全コリスミ酸ムターゼを追加的に発現する、実施形態3に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【００１３】
実施形態5:(a)異種チロシンデカルボキシラーゼ(TYDC)を発現するための手段、及び(b)チラミン生合成経路における1つ又は複数の上流酵素(複数可)の活性を増大させる手段
を含む遺伝子操作型微生物細胞。
【００１４】
実施形態6:1つ又は複数の上流酵素(複数可)が3-デオキシ-D-アラビノ-ヘプツロソネート-7-リン酸(DAHP)シンターゼを含む、実施形態5に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【００１５】
実施形態7:(a)異種チロシンデカルボキシラーゼ(TYDC)を発現するための手段、及び(b)デヒドロキネートシンターゼ、デヒドロキネートデヒドラターゼ、シキミ酸デヒドロゲナーゼ、シキミ酸キナーゼ、EPSPシンターゼ、芳香族五機能性酵素、コリスミ酸シンターゼ、コリスミ酸ムターゼ、プレフェン酸デヒドラターゼ、プレフェン酸アミノトランスフェラーゼ、アロゲン酸デヒドロゲナーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、フェニルアラニンアミノトランスフェラーゼ、プレフェン酸デヒドロゲナーゼ、及びチロシンアミノトランスフェラーゼからなる群から選択される1つ又は複数の酵素(複数可)の活性を増大させる手段を含み、前記増大した活性が、対照細胞と比較して増大している、遺伝子操作型微生物細胞であって、チラミンを生成する遺伝子操作型微生物細胞。
【００１６】
実施形態8:(c)フィードバック調節不全DAHPシンターゼ又はフィードバック調節不全コリスミ酸ムターゼを発現するための手段を追加的に発現する、実施形態7に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【００１７】
実施形態9:基質の発酵によりチラミンを生成し、基質の少なくとも50%がタンパク質又はアミノ酸供給源に由来しない、実施形態1から8のいずれか一実施形態に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【００１８】
実施形態10:(a)異種TYDC、及び(b)フィードバック調節不全DAHPシンターゼを含む、実施形態4、8、又は9のいずれか一実施形態に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【００１９】
実施形態11:真菌細胞を含む、実施形態3から10のいずれか一実施形態に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【００２０】
実施形態12:酵母細胞を含む、実施形態3から11のいずれか一実施形態に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【００２１】
実施形態13:酵母細胞がサッカロミセス属の細胞を含む、実施形態8に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【００２２】
実施形態14:酵母細胞がセレビシエ種の細胞である、実施形態13に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【００２３】
実施形態15:DAHPシンターゼがS.セレビシエDAHPシンターゼの変異体である、実施形態4、8、又は9から14のいずれか一実施形態に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【００２４】
実施形態16:異種TYDCがケシ(Papaver somniferum)由来のTYDCと少なくとも70%のアミノ酸配列同一性を有するTYDCを含む、実施形態3から15のいずれか一実施形態に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【００２５】
実施形態17:(a)異種TYDCがケシ由来のチロシン/DOPAデカルボキシラーゼ2を含み、且つ(b)フィードバック調節不全DAHPシンターゼが、K229L突然変異を追加的に含むAro4遺伝子によってコードされるS.セレビシエDAHPシンターゼである、実施形態4、8、又は9から16のいずれか一実施形態に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【００２６】
実施形態18:対照細胞と比較して、プレフェン酸デヒドロゲナーゼの、増大した活性を含む、実施形態3から17のいずれか一実施形態に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【００２７】
実施形態19:野生型S.セレビシエのプレフェン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の余剰コピーを発現する、実施形態18に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【００２８】
実施形態20:野生型S.セレビシエのトランスアルドラーゼ遺伝子(transaldolase gene)の余剰コピーを発現する、実施形態18に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【００２９】
実施形態21:酵母細胞を含む、実施形態2又は実施形態6に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【００３０】
実施形態22:酵母細胞がヤロウィア属(genus Yarrowia)の細胞を含む、実施形態21に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【００３１】
実施形態23:酵母細胞がリポリティカ種(species lipolytica)の細胞である、実施形態22に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【００３２】
実施形態24:異種TYDCがエンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)由来のTYDCと少なくとも70%のアミノ酸配列同一性を有するTYDCを含む、実施形態22又は実施形態23に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【００３３】
実施形態25:DAHPシンターゼがS.セレビシエ由来のDAHPシンターゼと少なくとも70%のアミノ酸配列同一性を有するDAHPシンターゼを含む、実施形態22から24のいずれか一実施形態に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【００３４】
実施形態26:(a)異種TYDCがエンテロコッカス・フェシウムCom15由来のピリドキサール依存性デカルボキシラーゼ(TYDC)を含み、且つ(b)DAHPシンターゼがS.セレビシエS288c由来のホスホ-2-デヒドロ-3-デオキシヘプトン酸アルドラーゼ(phospho-2-dehydro-3-deoxyheptonate aldolase)(DAHPシンターゼ)を含む、実施形態25に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【００３５】
実施形態27:ケシ由来のTYDCと少なくとも70%のアミノ酸配列同一性を有する異種チロシンデカルボキシラーゼ(TYDC)を含む酵母細胞である遺伝子操作型微生物細胞であって、遺伝子操作型酵母細胞がチラミンを生成する、遺伝子操作型微生物細胞。
【００３６】
実施形態28:遺伝子操作型酵母細胞がサッカロミセス属の細胞である、実施形態27に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【００３７】
実施形態29:遺伝子操作型酵母細胞がセレビシエ種の細胞である、実施形態28に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【００３８】
実施形態30:細菌細胞である、実施形態3から10のいずれか一実施形態に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【００３９】
実施形態31:細菌細胞がコリネバクテリウム属の細胞である、実施形態30に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【００４０】
実施形態32:細菌細胞がグルタミカム種の細胞である、実施形態31に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【００４１】
実施形態33:細菌細胞がS.セレビシエDAHPシンターゼの変異体であるフィードバック調節不全DAHPシンターゼを含む、実施形態30から32のいずれか一実施形態に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【００４２】
実施形態34:異種TYDCが、エンテロコッカス・フェシウム由来のTYDCと少なくとも70%のアミノ酸配列同一性を有する、又はジゴサッカロミセス・バイリ(Zygosaccharomyces bailii)由来のTYDCと少なくとも70%のアミノ酸配列同一性を有するTYDCを含む、実施形態30から33のいずれか一実施形態に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【００４３】
実施形態35:(a)異種TYDCがエンテロコッカス・フェシウム由来のTYDCを含み、且つ(b)フィードバック調節不全DAHPシンターゼが、K229L突然変異を追加的に含むAro4遺伝子によってコードされるS.セレビシエDAHPシンターゼである、実施形態33又は実施形態34に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【００４４】
実施形態36:(a)異種TYDCがジゴサッカロミセス・バイリ由来のTYDCを含み、且つ(b)フィードバック調節不全DAHPシンターゼが、K229L突然変異を追加的に含むAro4遺伝子によってコードされるS.セレビシエDAHPシンターゼである、実施形態33又は実施形態34に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【００４５】
実施形態37:対照細胞と比較して、コリスミ酸シンターゼ又はプレフレネートデヒドロゲナーゼの、増大した活性を追加的に含む、実施形態34に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【００４６】
実施形態38:コリスミ酸シンターゼの、増大した活性を含み、異種コリスミ酸シンターゼを発現する、実施形態37に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【００４７】
実施形態39:異種コリスミ酸シンターゼがS.セレビシエ由来のコリスミ酸シンターゼと少なくとも70%のアミノ酸配列同一性を有するコリスミ酸シンターゼを含む、実施形態38に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【００４８】
実施形態40:異種コリスミ酸シンターゼがS.セレビシエ由来のコリスミ酸シンターゼを含む、実施形態39に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【００４９】
実施形態41:プレフェン酸デヒドロゲナーゼの、増大した活性を含みプレフェン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の追加コピーを発現する、実施形態37に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【００５０】
実施形態42:プレフェン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の追加コピーがS.セレビシエ由来のプレフェン酸デヒドロゲナーゼと少なくとも70%のアミノ酸配列同一性を有するプレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする、実施形態41に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【００５１】
実施形態43:プレフェン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の追加コピーがS.セレビシエ由来のプレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする、実施形態42に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【００５２】
実施形態44:細菌細胞を含む、実施形態2又は実施形態6に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【００５３】
実施形態45:細菌細胞がコリネバクテリウム属又はバチルス属の細胞を含む、実施形態44に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【００５４】
実施形態46:細菌細胞がそれぞれグルタミカム種又はズブチリス種の細胞である、実施形態45に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【００５５】
実施形態47:異種TYDCがエンテロコッカス・フェシウム由来のTYDCと少なくとも70%のアミノ酸配列同一性を有するTYDCを含む、実施形態45又は実施形態46に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【００５６】
実施形態48:DAHPシンターゼがS.セレビシエ由来のDAHPシンターゼと少なくとも70%のアミノ酸配列同一性を有するDAHPシンターゼを含む、実施形態45から47のいずれか一実施形態に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【００５７】
実施形態49:対照細胞と比較して、シキミ酸キナーゼの、増大した活性を含む、実施形態45から48のいずれか一実施形態に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【００５８】
実施形態50:シキミ酸キナーゼがエシェリキア・コリ(Escherichia coli)由来のシキミ酸キナーゼと少なくとも70%のアミノ酸配列同一性を有するシキミ酸キナーゼを含む、実施形態49に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【００５９】
実施形態51:(a)異種TYDCがエンテロコッカス・フェシウムCom15由来のピリドキサール依存性デカルボキシラーゼ(TYDC)を含み、(b)DAHPシンターゼがS.セレビシエS288c由来のホスホ-2-デヒドロ-3-デオキシヘプトン酸アルドラーゼ(DAHPシンターゼ)を含み、且つ(c)シキミ酸キナーゼがE.コリK12由来のシキミ酸キナーゼを含む、実施形態50に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【００６０】
実施形態52:培養時に培養培地1Lあたり100mgを超えるレベルでチラミンを生成する、実施形態13から43のいずれか一実施形態に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【００６１】
実施形態53:培養培地1Lあたり少なくとも2.5gのレベルでチラミンを生成する、実施形態52に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【００６２】
実施形態54:エンテロコッカス・フェシウム由来のTYDCと少なくとも70%のアミノ酸配列同一性を有する異種チロシンデカルボキシラーゼ(TYDC)を含む細菌細胞である遺伝子操作型微生物細胞であって、遺伝子操作型細菌細胞がチラミンを生成する、遺伝子操作型微生物細胞。
【００６３】
実施形態55:細菌細胞がコリネバクテリウム属の細菌細胞である、実施形態54に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【００６４】
実施形態56:細菌細胞がグルタミカム種の細菌細胞である、実施形態55に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【００６５】
実施形態57:ジゴサッカロミセス・バイリ由来のTYDCと少なくとも70%のアミノ酸配列同一性を有する異種チロシンデカルボキシラーゼ(TYDC)を含む細菌細胞である遺伝子操作型微生物細胞であって、遺伝子操作型細菌細胞がチラミンを生成する、遺伝子操作型微生物細胞。
【００６６】
実施形態58:細菌細胞がコリネバクテリウム属の細菌細胞である、実施形態57に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【００６７】
実施形態59:細菌細胞がグルタミカム種の細菌細胞である、実施形態58に記載の遺伝子操作型微生物細胞。
【００６８】
実施形態60:実施形態13から59のいずれか一実施形態に記載の遺伝子操作型微生物細胞の培養物。
【００６９】
実施形態61:基質の発酵からチラミンが生成され、基質の少なくとも50%がタンパク質又はアミノ酸供給源に由来しない、実施形態60に記載の培養物。
【００７０】
実施形態62:基質が、尿素、アンモニウム塩、アンモニア、及びこれらの任意の組合せからなる群から選択される炭素源及び窒素源を含む、実施形態61に記載の培養物。
【００７１】
実施形態63:培養物が600nmで10〜500の光学密度を有するような濃度で遺伝子操作型微生物細胞が存在する、実施形態60から62のいずれか一実施形態に記載の培養物。
【００７２】
実施形態64:チラミンを含む、実施形態60から63のいずれか一実施形態に記載の培養物。
【００７３】
実施形態65:培養培地1Lあたり100mgを超えるレベルでチラミンを含む、実施形態60から64のいずれか一実施形態に記載の培養物。
【００７４】
実施形態66:培養培地1Lあたり少なくとも2.5gのレベルでチラミンを含む、実施形態60から65のいずれか一実施形態に記載の培養物。
【００７５】
実施形態67:非タンパク質炭素源及び非タンパク質窒素源を含む発酵基質の存在下で細胞を培養する工程を含み、遺伝子操作型微生物細胞がチラミンを生成する、実施形態1から59のいずれか一実施形態に記載の遺伝子操作型微生物細胞を培養する方法。
【００７６】
実施形態68:1〜100g/Lの範囲内の初期グルコースレベルでのフェドバッチ培養、次に制御型糖供給を含む、実施形態67に記載の方法。
【００７７】
実施形態69:発酵基質が、尿素、アンモニウム塩、アンモニア、及びこれらの任意の組合せからなる群から選択されるグルコース源及び窒素源を含む、実施形態67又は実施形態68に記載の方法。
【００７８】
実施形態70:培養物を培養中にpH制御する、実施形態67から69のいずれか一実施形態に記載の方法。
【００７９】
実施形態71:培養物に培養中に通気する、実施形態67から70のいずれか一実施形態に記載の方法。
【００８０】
実施形態72:遺伝子操作型微生物細胞が培養培地1Lあたり100mgを超えるレベルでチラミンを生成する、実施形態67から71のいずれか一実施形態に記載の方法。
【００８１】
実施形態73:遺伝子操作型微生物細胞が培養培地1Lあたり少なくとも2.5gのレベルでチラミンを生成する、実施形態67から72のいずれか一実施形態に記載の方法。
【００８２】
実施形態74:培養物からチラミンを回収する工程を追加的に含む、実施形態67から73のいずれか一実施形態に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】発酵によるチラミンの生成に関する経路の図である。
【図２】S.セレビシエ菌株を遺伝子操作するために開発した、「スプリットマーカー、ダブルクロスオーバー」のゲノム内組込み方針の図である。相補的5'及び3'相同アームとURA3選択可能マーカーの重複半分(破線によって示される直接リピート)を有する2つのプラスミドをメガヌクレアーゼで消化し、直鎖状断片として形質転換した。トリプルクロスオーバー事象によって所望の異種遺伝子を標的遺伝子座内に組み込み、完全URA3遺伝子を再構築した。この組込み事象から誘導したコロニーは、2つの3-プライマー反応を使用してアッセイし、5'と3'両方の接合部(UF/IF/野生型-R及びDR/IF/野生型-F)を確認した。実施例1を参照。
【図３】C.グルタミカム菌株を遺伝子操作するために開発した、「ループイン、シングルクロスオーバー」のゲノム内組込み方針の図である。(見出し「ループイン」で示す)ループイン専用構築物は、(「組込み遺伝子座」として表す)1つの2kb相同アーム、(「マーカー」として表す)陽性選択マーカー、及び(「プロモーター-遺伝子-ターミネーター」として表す)目的の遺伝子(複数可)を含有していた。シングルクロスオーバー事象によってプラスミドをC.グルタミカム染色体内に組み込んだ。抗生物質(例えば、25μg/mlのカナマイシン)の存在下における増大によりゲノム内の組込み事象は安定的に維持される。ループイン組込み由来のコロニーにおける正確なゲノム内組込みは、UF/IR及びDR/IFPCRプライマーを用いたコロニーPCRによって確認した。(見出し「ループイン、ループアウトで示す)ループイン、ループアウト構築物は、2つの2kb相同アーム(5'アームと3'アーム)、目的の遺伝子(複数可)(矢印)、(「マーカー」として表す)陽性選択マーカー、及び対抗選択マーカーを含有していた。「ループイン」専用構築物と同様に、シングルクロスオーバー事象によってプラスミドをC.グルタミカムの染色体内に組み込んだ。注釈、2つの可能な組込みの1つのみをここで示す。正確なゲノム内組込みはコロニーPCRによって確認し、プラスミド骨格と対抗選択マーカーが切除可能であるように対抗選択を施した。これは2つの可能性の1つ、野生型への復帰又は所望経路の組込みをもたらす。再度、コロニーPCRによって正確なゲノムループアウトを確認する。(略語:プライマー:UF=上流フォワードプライマー、DR=下流リバースプライマー、IR=内部リバースプライマー、IF=内部フォワードプライマー)。実施例1を参照。
【図４Ａ】チラミンを生成するよう遺伝子操作したS.セレビシエの培養に関して、異なる処理条件下で培養時間の関数としてバイオマスのグラフを示す図である。これらのデータは実施例2中に記載した試験からのものである。
【図４Ｂ】同じ培養に関するチラミン力価を示す図である。
【図４Ｃ】この培養中のグルコース濃度を培養時間の関数として示す図である。
【図５】第一世代の遺伝子操作型宿主ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)による発酵後、細胞外液ブロスにおいて測定したチラミン力価の図である。この菌株設定で追加的異種酵素の発現を試験した。
【図６】第一世代の遺伝子操作型宿主バチルス・ズブチリスによる発酵後、細胞外液ブロスにおいて測定したチラミン力価の図である。この菌株設定で追加的異種酵素の発現を試験した。
【図７】チラミン生成のため宿主評価設定を発現するよう遺伝子操作した宿主S.セレビシエによる発酵後、細胞外液ブロスにおいて測定したチラミン力価の図である。
【図８】チラミン生成のため宿主評価設定を発現するよう遺伝子操作した宿主C.グルタミカムによる発酵後、細胞外液ブロスにおいて測定したチラミン力価の図である。
【図９】(第三世代)の遺伝子操作型宿主S.セレビシエによる発酵後、細胞外液ブロスにおいて測定したチラミン力価の図である。この菌株設定で追加的異種酵素の発現を試験した。
【図１０】チラミンの構造の図である。
【発明を実施するための形態】
【００８４】
本開示は、チラミンを発酵生産するための微生物細胞の遺伝子操作を記載し、新規の遺伝子操作型微生物細胞及び培養物、並びに関連するチラミン生産法を提供する。
【００８５】
定義
特許請求の範囲及び本明細書中で使用する用語は、別段の指定がない限り以下で言及するように定義する。
【００８６】
用語「発酵(fermentation)」を本明細書中で使用して、如何なる化学的転換工程も必要とせずに、微生物細胞が1つ又は複数の生物学的転換工程によって、1つ又は複数の基質(複数可)を(チラミン等の)所望産物に転換するプロセスを指す。
【００８７】
用語「遺伝子操作(engineered)」を本明細書中で細胞に関して使用して、人間によって導入され遺伝子操作型細胞と天然に存在する細胞を区別する、少なくとも1つの標的遺伝子改変を細胞が含有することを示す。
【００８８】
用語「内在」を本明細書中で使用して、個々の細胞中に本来存在するポリヌクレオチド又はポリペプチド等の細胞成分を指す。
【００８９】
用語「異種」を本明細書中で、宿主細胞中に導入されるポリヌクレオチド又はポリペプチドに関して使用して、宿主細胞のそれと異なる生物、種、又は菌株に由来するポリヌクレオチド又はポリペプチドをそれぞれ指す。異種ポリヌクレオチド又はポリペプチドは、同じ宿主細胞中で見られる任意の配列(複数可)とは異なる配列を有する。
【００９０】
ポリペプチドに関して使用する用語「野生型」は、分子の源とは無関係に、天然に存在する生物由来のポリペプチド中に存在するアミノ酸配列を有する任意のポリペプチドを指す。即ち用語「野生型」は、分子が天然源から精製され、組換えによって発現され、次いで精製され、又は合成されたかどうかとは無関係に、配列の特徴を指す。用語、野生型も、天然に存在する細胞を表すために使用する。
【００９１】
「対照細胞」は、遺伝子操作型細胞において試験される特定遺伝子修飾(複数可)を欠くこと以外、遺伝子操作型細胞と同じ属及び種であることを含めて、試験する遺伝子操作型細胞と同一である細胞である。
【００９２】
それらが触媒する反応によって本明細書中で特定される酵素は、別段の指定がない限り、特定された反応を触媒可能な任意のポリペプチドを指す。別段の指定がない限り、酵素は任意の生物に由来してよく、天然に存在するアミノ酸配列又は突然変異アミノ酸配列を有し得る。周知のように、時折それらが由来する供給源生物に応じて、酵素は多数の機能及び/又は多数の名称を有し得る。本明細書中で使用する酵素の名称は、1つ又は複数の追加機能又は異なる名称を有し得る酵素を含めたオルソログを包含する。
【００９３】
用語「フィードバック調節不全」は本明細書中では、特定細胞中で酵素経路の下流産物により通常負の制御を受けている(即ちフィードバック阻害)酵素に関して使用する。この文脈では、「フィードバック調節不全」酵素は、細胞に内在する野生型酵素よりフィードバック阻害に対する感受性が低い型の酵素である。フィードバック調節不全酵素は、野生型酵素に1つ又は複数の突然変異を導入することによって生成することができる。或いは、フィードバック調節不全酵素は、特定微生物細胞に導入したとき、内在する野生型酵素ほどフィードバック阻害に対して感受性がない、単なる異種、野生型酵素であってよい。幾つかの実施形態では、フィードバック調節不全酵素は微生物細胞においてフィードバック阻害を示さない。
【００９４】
用語「チラミン」は4-(2-アミノエチル)フェノール(CAS#51-67-2)を指す。
【００９５】
用語「配列同一性」は、2つ以上のアミノ酸又はヌクレオチド配列の文脈では、配列比較アルゴリズムを使用した測定又は目視検査による測定で、最大対応性での比較及びアライメント時に、同一であるか又は指定の割合の同一であるアミノ酸残基若しくはヌクレオチドを有する2つ以上の配列を指す。
【００９６】
ヌクレオチド又はアミノ酸配列の同一性を決定するための配列比較用に、典型的には、「試験」配列と比較する「参照配列」として一配列が作用する。配列比較アルゴリズムを使用するとき、試験配列と参照配列はコンピュータへの入力値であり、部分列座標を指定し、必要な場合、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。したがって配列比較アルゴリズムは、指定プログラムパラメータに基づき、参照配列と比較した試験配列に関するパーセント配列同一性を計算する。配列比較のアライメントは、デフォルトパラメータを設定したBLASTを使用して実施することができる。
【００９７】
本明細書中で使用する用語「力価」は、培養体積で割った、微生物細胞の培養によって生じた生成物(例えばチラミン)の質量を指す。
【００９８】
細胞培養物からのチラミンの回収に関して本明細書中で使用する「回収」は、細胞培養培地の少なくとも1つの他の成分からチラミンを分離する工程を指す。
【００９９】
チラミン生成のための微生物の遺伝子操作
チラミン生合成経路
チラミンは、前駆体ホスホエノールピルビン酸(PEP)とエリスロース-4-リン酸(E4P)をベースとする、アミノ酸生合成の芳香族部分から誘導される。この経路は図1中に例証する。3-デオキシ-D-アラビノ-ヘプツロソネート-7-リン酸(DAHP)シンターゼによって触媒されるアミノ酸生合成経路の最初の工程は、芳香族アミノ酸チロシン、トリプトファン及びフェニルアラニンによるフィードバック阻害を受ける。多くの微生物は、この経路内の最初の工程を触媒する酵素、即ちチロシンデカルボキシラーゼ(TYDC)を欠いている。このような微生物宿主におけるチラミンの生成には、少なくとも1つの異種TYDC酵素の追加が必要である。
【０１００】
微生物のチラミン生成のための遺伝子操作
遺伝子操作する微生物細胞中で活性がある任意のTYDCを、典型的には標準的遺伝子操作技法を使用して、この酵素をコードする遺伝子の導入及び発現により細胞内に導入することができる。適切なTYDCは、植物、始原細菌、真菌、グラム陽性菌、及びグラム陰性菌供給源を含めた任意の供給源に由来してよい。例示的な供給源には、ケシ、ペトロセリナム・クリスパム(Petroselinum crispum)、オリザ・サティバ(Oryza sativa)、メタノスファエルラ・パルストリス(Methanospaerula palustris)、メタノカルドコックス・ヤンナスキイ(Methanocaldococcus jannaschii)、ジゴサッカロミセス・バイリ、ペニシリウム・マルネッフェイ(Penicillium marneffei)、タラロミセス・スティピタタス(Talaromyces stipitatus)、トリコフィトン・エイナム(Trichophyton equinum)、プロピオニバクテリウム種、オーラル(Propionibacterium sp.oral)、エンテロコッカス・フェシウム、ストレプトマイセス・ヒグロスコピクス(Streptomyces hygroscopicus)、ストレプトマイセス・スビセウス(Streptomyces sviceus)、モデストバクター・マリヌス(Modestobacter marinus)、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)、シノリゾビウム・フレディ(Sinorhizobium fredii)があるが、これらだけには限られない。ケシ等の幾つかの供給源は2つ以上の型のTYDCを含み、これらはいずれも本明細書中に記載する方法において使用することができる。
【０１０１】
TYDCの1つ又は複数のコピーを、選択した微生物宿主細胞中に導入することができる。2つ以上のTYDC遺伝子のコピーを導入する場合、そのコピーは同じであるか又は異なるTYDC遺伝子のコピーであってよい。幾つかの実施形態では、異種TYDC遺伝子(複数可)は強力な構成的プロモーターから発現される。幾つかの実施形態では、異種TYDC遺伝子(複数可)は誘導的プロモーターから発現される。異種遺伝子を任意選択でコドン最適化して、選択した微生物宿主細胞における発現を高めることが可能である。一般的な微生物宿主細胞に関するコドン最適化表が入手可能である。実施例中で使用したコドン最適化表は以下の通りである。バチルス・ズブチリスのKazusaコドン表:www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?species=1423 & aa=1 & style=N、ヤロウィア・リポリティカのKazusaコドン表:www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?species=4952 & aa=1 & style=N、コリネバクテリウム・グルタミカムのKazusaコドン表:www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?species=340322 & aa=1 & style=N、サッカロミセス・セレビシエのKazusaコドン表:http://www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?species=4932& aa=1 & style=N。更に使用したのは、以下に再現したS.セレビシエ及びC.グルタミカムに関する改変、組合せ型コドン使用スキームであった。
【０１０２】
【表１Ａ】
2020513790.tif 000003
【０１０３】
【表１Ｂ】
2020513790.tif 000004
【０１０４】
実施例1中、エンテロコッカス・フェシウム由来のTYDC(配列番号1)を発現するようC.グルタミカムを遺伝子操作し、それによって80μg/Lのチラミン力価を得た。
【０１０５】
チラミン生成を増大させるための遺伝子操作
内在上流酵素の活性の増大
異種TYDCを発現する微生物細胞においてチラミン生成を増大させるための一手法は、チラミン生合成経路における1つ又は複数の上流酵素の活性を増大させることである。上流経路の酵素は、供給原料からチロシンまで全ての転換に関与する全酵素を含む。特定の実施形態では、上流経路の酵素は、チラミンに至る経路中での最終天然代謝産物(即ちチロシン)への主要前駆体(即ち、E4P及びPEP)の転換に関与する酵素を具体的に指す。幾つかの実施形態では、1つ又は複数の上流経路の酵素の活性を、内在酵素(複数可)の発現又は活性の調節によって増大させる。幾つかの実施形態では、1つ又は複数の上流経路の酵素の活性を、TYDC発現微生物宿主細胞中に1つ又は複数の対応する遺伝子を導入することによって補う。このような遺伝子には、デヒドロキネートシンターゼ、デヒドロキネートデヒドラターゼ、シキミ酸デヒドロゲナーゼ、シキミ酸キナーゼ、EPSPシンターゼ、芳香族五機能性酵素、コリスミ酸シンターゼ、コリスミ酸ムターゼ、プレフェン酸デヒドラターゼ、フェニルアラニンアミノトランスフェラーゼ、プレフェン酸デヒドロゲナーゼ、プレフェン酸アミノトランスフェラーゼ、アロゲン酸デヒドロゲナーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、チロシンアミノトランスフェラーゼ等の芳香族アミノ酸トランスフェラーゼ、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、トランスアルドラーゼ、トランスケトラーゼ、DAHPシンターゼ、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ、グルタミン酸シンターゼをコードする遺伝子がある。適切な上流経路の遺伝子は、例えば異種TYDC遺伝子の供給源として前で論じた供給源を含めた、任意の供給源に由来してよい。
【０１０６】
実施例1は、上流遺伝子をコードする導入遺伝子と共に異種TYDC、コリスミ酸シンターゼ又はプレフェン酸デヒドロゲナーゼのいずれかを発現させた、微生物宿主細胞の首尾よい遺伝子操作を記載する。特に、ケシ由来のTYDC(配列番号2)、及びコリスミ酸シンターゼ(配列番号3)又はプレフェン酸デヒドロゲナーゼ(配列番号4)のいずれかをコードするS.セレビシエ遺伝子の追加コピーを発現するようS.セレビシエを遺伝子操作した。これらの結果は以下の実施例1中に与える。
【０１０７】
導入する上流経路の遺伝子は異種であってよく、又は単に内在遺伝子の追加コピーであってよい。幾つかの実施形態では、1つ又は複数のこのような遺伝子がTYDC発現微生物宿主細胞中に導入され、強力な構成的プロモーターから発現され、及び/又は任意選択でコドン最適化し選択した微生物宿主細胞における発現を高めることが可能である。例えばTYDC発現微生物細胞を遺伝子操作して、1つ又は複数の上流経路遺伝子の1つ又は複数のコピーを発現させることが可能である。
【０１０８】
様々な実施形態では、1つ又は複数の上流経路酵素の活性を増大させるためのTYDC発現微生物細胞の遺伝子操作によって、少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、若しくは90パーセント、又は少なくとも2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍、22倍、23倍、24倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65倍、70倍、75倍、80倍、85倍、90倍、95倍、若しくは100倍チラミン力価が増大する。様々な実施形態では、チラミン力価の増大は10パーセント〜100倍、2倍〜50倍、5倍〜40倍、10倍〜30倍の範囲、又は前述の任意の値によって境界付けられる任意の範囲内である(本明細書中の範囲はそれらの終点を含む)。上流経路酵素の如何なる活性の増大もないチラミン生成微生物細胞において観察されたチラミン力価と比較して、これらの増大を決定する。この参照細胞は、チラミン生成の増大を目的とした1つ又は複数の他の遺伝子改変を有する可能性があり、例えばその細胞はフィードバック調節不全酵素を発現し得る。
【０１０９】
様々な実施形態では、1つ又は複数の上流経路遺伝子の活性の増大によって得られるチラミン力価は、少なくとも10、50、75、100、200、300、400、500、600、700、800、若しくは900mg/L、又は少なくとも1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、若しくは10gm/Lである。様々な実施形態では、力価は10mg/L〜10gm/L、100mg/L〜5gm/L、200mg/L〜4gm/L、300mg/L〜3gm/Lの範囲、又は前述の任意の値によって境界付けられる任意の範囲内である。
【０１１０】
フィードバック調節不全酵素の導入
芳香族アミノ酸生合成はフィードバック阻害を受けるので、異種TYDCを発現するよう遺伝子操作した微生物細胞においてチラミン生成を増大させるための別の手法は、TYDC発現微生物細胞において通常フィードバック阻害を受ける、フィードバック調節不全型の1つ又は複数の酵素を導入することである。このような酵素の例には、DAHPシンターゼ及びコリスミ酸ムターゼがある。フィードバック調節不全型は、特定微生物宿主細胞中で内在酵素よりフィードバック阻害に対して感受性が低い、異種、野生型酵素であり得る。或いは、フィードバック調節不全型は、対応する野生型酵素よりそれをフィードバック阻害に対して感受性が低い1つ又は複数の突然変異がある内在又は異種酵素の変異体であり得る。後者の例には、それらにフィードバック阻害耐性を与える公知の点突然変異がある変異体DAHPシンターゼ(2つはS.セレビシエ由来、1つはE.コリ由来)、例えばS.セレビシエARO4Q166K(配列番号5)、S.セレビシエARO4K229L(配列番号6)、及びE.コリAroGD146N(配列番号7)がある。これらの表示の最後の5文字は、アミノ酸に関する標準1文字コードを使用したアミノ酸置換を示し、最初の文字は野生型残基を指し、最後の文字は置換残基を指し、数字は翻訳タンパク質中のアミノ酸置換の位置を示す。
【０１１１】
実施例1は、フィードバック調節不全DAHPシンターゼをコードする導入遺伝子と共に異種TYDCを発現させた、真菌及び細菌宿主細胞の首尾よい遺伝子操作を記載する。特に、ケシ由来のTYDC2(配列番号2)及びS.セレビシエARO4K229L(配列番号6)を発現するようS.セレビシエを遺伝子操作し、それによって387μg/Lのチラミン力価を得た。
【０１１２】
様々な実施形態では、フィードバック調節不全酵素を発現させるためのTYDC発現微生物細胞の遺伝子操作によって、少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、若しくは90パーセント、又は少なくとも2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍、22倍、23倍、24倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65倍、70倍、75倍、80倍、85倍、90倍、95倍、若しくは100倍チラミン力価が増大する。様々な実施形態では、チラミン力価の増大は10パーセント〜100倍、2倍〜50倍、5倍〜40倍、10倍〜30倍の範囲、又は前述の任意の値によって境界付けられる任意の範囲内である。フィードバック調節不全酵素を発現しないチラミン生成微生物細胞において観察されたチラミン力価と比較して、これらの増大を決定する。この参照細胞は、チラミン生成の増大を目的とした他の遺伝子改変を有する可能性があり(ただし必要はない)、即ち細胞は、フィードバック不感受性以外の何らかの手段に起因する上流経路酵素の、増大した活性を有する可能性がある。
【０１１３】
様々な実施形態では、チラミン生合成経路中の流動を増大させるためのフィードバック調節不全酵素の使用によって得られるチラミン力価は、少なくとも50、75、100、200、300、400、500、600、700、800、若しくは900mg/L、又は少なくとも1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、若しくは5gm/Lである。様々な実施形態では、力価は100mg/L〜5gm/L、200mg/L〜4gm/L、300mg/L〜3gm/Lの範囲、又は前述の任意の値によって境界付けられる任意の範囲内である。
【０１１４】
1つ又は複数の内在酵素の活性を補うため、及び/又は1つ又は複数のフィードバック調節不全酵素を導入するための手法をTYDC発現微生物細胞において組合せ、更により高いチラミン生成レベルを得ることができる。
【０１１５】
微生物宿主細胞
導入遺伝子を発現させるのに使用することができる任意の微生物を、前に記載したようなチラミンの発酵生産用に遺伝子操作することができる。特定の実施形態では、微生物は、本来チラミンの発酵生産ができない微生物である。幾つかの実施形態では、微生物は、容易に培養される微生物、例えば目的の化合物の発酵生産における宿主細胞として有用であることが公知の微生物等である。グラム陽性菌又はグラム陰性菌を含めた細菌細胞を、前に記載したように遺伝子操作することができる。例には、C.グルタミカム細胞以外に、P.シトレア(P.citrea)、B.ズブチリス、B.リケニフォルミス(B.licheniformis)、B.レンタス(B.lentus)、B.ブレビス(B.brevis)、B.ステアロサーモフィラス(B.stearothermophilus)、B.アルカロフィラス(B.alkalophilus)、B.アミロリクエファシエンス(B.amyloliquefaciens)、B.クラウジ(B.clausii)、B.ハロデュランス(B.halodurans)、B.メガテリウム(B.megaterium)、B.コアグランス(B.coagulans)、B.サークランス(B.circulans)、B.ロータス(B.lautus)、B.スリンギエンシス(B.thuringiensis)、S.アルブス(S.albus)、S.リビダンス(S.lividans)、S.コエリカラー(S.coelicolor)、S.グリセウス(S.griseus)、シュードモナス種(Pseudomonas sp.)、P.アルカリゲネス(P.alcaligenes)、ラクトバチルス種(Lactobacilis spp.)(L.ラクチス(L.lactis)、L.プランタラム(L.plantarum)等)、L.グレイ(L.grayi)、E.コリ、エンテロコッカス・フェシウム、E.ガリナルム(E.gallinarum)、E.カセリフラブス(E.casseliflavus)、及び/又はE.フェカリス(E.faecalis)細胞がある。
【０１１６】
本明細書中に記載する方法中で微生物宿主細胞として使用することができる、多数の型の嫌気性細胞が存在する。幾つかの実施形態では、微生物細胞は偏性嫌気性細胞である。偏性嫌気性菌は、酸素が存在する条件の場合、典型的には充分増殖しない。少量の酸素が存在し得ること、即ち偏性嫌気性菌が有する一定レベルの許容レベルで低レベルの酸素が存在することは理解されたい。前に記載したように遺伝子操作した偏性嫌気性菌は実質的無酸素条件下で増殖することができ、この場合存在する量の酸素が嫌気性菌の増殖、維持、及び/又は発酵に有害であることはない。
【０１１７】
或いは、本明細書中に記載する方法中で使用する微生物宿主細胞は通性嫌気性細胞であってよい。通性嫌気性菌は、酸素が存在する場合、有酸素呼吸(例えば、TCAサイクルの利用)によって細胞ATPを生成することができる。しかしながら、通性嫌気性菌は酸素の非存在下でも増殖することができる。前に記載したように遺伝子操作した通性嫌気性菌は実質的無酸素条件下で増殖することができ、この場合存在する量の酸素が嫌気性菌の増殖、維持、及び/又は発酵に有害であることはなく、又は代替的に多量の酸素の存在下で増殖することができる。
【０１１８】
幾つかの実施形態では、本明細書中に記載する方法中で使用する微生物宿主細胞は繊維状真菌細胞である(例えば、Berka & Barnett、Biotechnology Advances、(1989年)、7(2):127〜154頁を参照)。例には、トリコデルマ・ロンギブラキアタム(Trichoderma longibrachiatum)、T.ビリデ(T.viride)、T.コニンギ(T.koningii)、T.ハルジアナム(T.harzianum)、ペニシリウム種(Penicillium sp)、フミコーラ・インソレンス(Humicola insolens)、H.ラヌギノーズ(H.lanuginose)、H.グリーシア(H.grisea)、クリソスポリウム種(Chrysosporium sp)、C.ルクノベンス(C.lucknowense)、グリオクラジウム種(Gliocladium sp)、アスペルギルス種(Aspergillus sp)(A.オリザエ(A.oryzae)、A.ニガー(A.niger)、A.ソージャ(A.sojae)、A.ジャポニカス(A.japonicus)、A.ニデュランス(A.nidulans)、又はA.アワモリ(A.awamori)等)、フザリウム種(Fusarium sp)、(F.ロゼウム(F.roseum)、F.グラミヌム(F.graminum)、F.セレアリス(F.cerealis)、F.オキシスポラム(F.oxysporuim)、又はF.ベネナタム(F.venenatum)等)、ニューロスポラ種(Neurospora sp)、(N.クラッサ(N.crassa)又はヒポクレア種(Hypocrea sp)、ムコア種(Mucor sp)(M.ミエヘイ(M.miehei)等)、リゾプス種(Rhizopus sp)、及びエメリセラ種(Emericella sp)細胞がある。詳細な実施形態では、前に記載したように遺伝子操作する真菌細胞はA.ニデュランス、A.アワモリ、A.オリザエ、A.アクレアタス(A.aculeatus)、A.ニガー、A.ジャポニカス、T.リーゼイ(T.reesei)、T.ビリデ、F.オキシスポラム、又はF.ソラニ(F.solani)である。このような宿主と共に使用するための例示的プラスミド又はプラスミド成分には、米国特許公開第2011/0045563号中に記載されたものがある。
【０１１９】
本明細書中に記載する方法中で、微生物宿主細胞として酵母を使用することもできる。例には、サッカロミセス種、シゾサッカロミセス種(Schizosaccharomyces sp)、ピキア種(Pichia sp)、ハンセヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、ピキア・スチピテス(Pichia stipites)、クルイベロミセス・マルキシアヌス(Kluyveromyces marxianus)、クルイベロミセス種(Kluyveromyces spp)、ヤロウィア・リポリティカ及びカンジダ種(Candida sp)がある。幾つかの実施形態では、サッカロミセス種はS.セレビシエである(例えば、Romanosら、Yeast、(1992年)、8(6):423〜488頁を参照)。このような宿主と共に使用するための例示的プラスミド又はプラスミド成分には、米国特許第7,659,097号及び米国特許公開第2011/0045563号中に記載されたものがある。
【０１２０】
幾つかの実施形態では、宿主細胞は、例えば青藻、赤藻、灰色藻(glaucophyte)、クロララクニオン藻(chlorarachniophyte)、ミドリムシ目(euglenid)、クロミスタ(chromista)、又は渦鞭毛藻類(dinoflagellate)に由来する藻類細胞であってよい(例えば、Saunders & Warmbrodt、「Gene Expression in Algae and Fungi、Including Yeast」、(1993年)、National Agricultural Library、Beltsville、Mdを参照)。藻類細胞において使用するための例示的プラスミド又はプラスミド成分には、米国特許公開第2011/0045563号中に記載されたものがある。
【０１２１】
他の実施形態では、宿主細胞は、形態に基づいて以下の任意の群、クロロコックム目(Chlorococcales)、プレウロカプサル目(Pleurocapsales)、ユレモ目(Oscillatoriales)、ネンジュモ目(Nostocales)、シネコシスト目(Synechosystic)又はスティゴネマテイル目(Stigonematales)に分類されるシアノバクテリア等のシアノバクテリアである(例えば、Lindbergら、Metab.Eng、(2010年)12(1):70〜79頁を参照)。シアノバクテリア細胞において使用するための例示的プラスミド又はプラスミド成分には、米国特許公開第2010/0297749号、及び米国特許公開第2009/0282545号、及び国際特許公開第WO2011/034863号中に記載されたものがある。
【０１２２】
遺伝子操作方法
当技術分野の技術範囲内の分子生物学(組換え技法含む)、微生物学、細胞生物学、及び生化学の従来技法を使用して、チラミン発酵生産用に微生物細胞を遺伝子操作することができる。このような技法は文献中で完全に説明されている。例えば、「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」、fourth edition(Sambrookら、2012年);「Oligonucleotide Synthesis」(M.J.Gait、ed、1984年);「Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique and Specialized Applications」(R.I.Freshnery、ed、6th Edition、2010年);「Methods in Enzymology」(Academic Press、Inc.);「Current Protocols in Molecular Biology」(F.M.Ausubelら、eds、1987年and periodic updates);「PCR:The Polymerase Chain Reaction」(Mullisら、eds、1994年);Singletonら、Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed、J.Wiley &Sons(New York、N.Y.1994年)を参照。
【０１２３】
ベクターは、細胞中に遺伝物質を導入するために使用するポリヌクレオチドビヒクルである。本明細書中に記載する方法において有用なベクターは直鎖状又は環状であってよい。ベクターは宿主細胞の標的ゲノム中に組み込むことができ、又は宿主細胞中で独立に複製することができる。多くの用途に、安定した形質転換体を生成するベクターの組込みが好ましい。ベクターは、例えば複製起点、マルチクローニングサイト(MCS)、及び/又は選択可能マーカーを含むことができる。発現ベクターは、特定宿主細胞中でのポリヌクレオチド配列(コード配列であることが多い)の発現を容易にする制御エレメントを含有する発現カセットを典型的に含む。ベクターには、組込みベクター、原核生物プラスミド、エピソーム、ウイルスベクター、コスミド、及び人工染色体があるが、これらだけには限られない。
【０１２４】
発現カセット中で使用することができる例示的制御エレメントには、プロモーター、エンハンサー、内部リボソーム進入部位(IRES)、及び他の発現調節エレメント(例えば転写終結シグナル、ポリアデニル化シグナル及びポリ-U配列等)がある。このような制御エレメントは、例えばGoeddel、Gene Expression Technology:Methods In Enzymology185、Academic Press、San Diego、Calif.(1990年)中に記載されている。
【０１２５】
幾つかの実施形態では、ベクターを使用して、CRISPR系等のゲノム編集を実行できる系を導入することができる。2014年3月6日に公開された米国特許公開第2014/0068797号を参照。更に、Jinek Mら、「A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity」、Science337:816〜21頁、2012年も参照。TypeII CRISPR-Cas9系において、Cas9は部位特異的エンドヌクレアーゼ、即ち2つの異なるエンドヌクレアーゼドメイン(HNH及びRuvC/RNaseH様ドメイン)を使用して特定標的配列におけるポリヌクレオチドの切断を対象とする、又は対象とし得る酵素である。Cas9を遺伝子操作して任意の所望部位でDNAを切断することができる。Cas9はRNAによりその切断部位を対象とするからである。したがってCas9は「RNA-ガイド型ヌクレアーゼ」としても記載される。より具体的には、Cas9が1つ又は複数のRNA分子と結合状態になり、RNA分子は、標的ポリヌクレオチド中の特異的配列とRNA分子(複数可)の少なくとも一部分のハイブリダイゼーションに基づき、特異的ポリヌクレオチド標的にCas9を誘導する。Ran、F.Aら、(「In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9」、Nature520(7546):186〜91頁、2015年4月9日、全ての拡張データ含む)は、8つのTypeII CRISPR-Cas9系のcrRNA/tracrRNA配列及び二次構造を示す。Cas9様合成タンパク質も当技術分野で公知である(2014年10月23日に公開された、米国公開特許出願第2014-0315985号を参照)。
【０１２６】
実施例1は、S.セレビシエ及びC.グルタミカム細胞のゲノムにポリヌクレオチドを導入するための2つの例示的組込み手法を記載する。
【０１２７】
ベクター又は他のポリヌクレオチドを、形質転換、コンジュゲーション、エレクトロポレーション、核内マイクロインジェクション、形質導入、トランスフェクション(例えば、リポフェクション媒介若しくはDEAE-デキストリン媒介トランスフェクション又は組換えファージウイルスを使用したトランスフェクション)、リン酸カルシウムDNA沈殿を伴うインキュベーション、DNA-コーティングマイクロプロジェクタイルを用いた高速ボンバードメント、及びプロトプラスト融合等の様々な標準法のいずれかによって、微生物細胞中に導入することができる。当技術分野で公知の任意の方法によって形質転換体を選択することができる。形質転換体を選択するのに適した方法は、米国特許公開第2009/0203102号、米国特許公開第2010/0048964号、及び米国特許公開第2010/0003716号、並びに国際公開第WO2009/076676号、国際公開第WO2010/003007号、及び国際公開第WO2009/132220号中に記載されている。
【０１２８】
遺伝子操作型微生物細胞
前に記載した方法を使用して、チラミンを生成、及び特定の実施形態では過剰生成する遺伝子操作型微生物細胞を生成することができる。遺伝子操作型微生物細胞は、本明細書中に記載する任意の微生物宿主細胞等の野生型微生物細胞と比較して、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個、又はそれより多くの遺伝子改変、30〜40個の改変等を有し得る。以下の実施例中に記載した遺伝子操作型微生物細胞は、1、2、又は3個の遺伝子改変を有するが、当業者は本明細書中で言及するガイダンスに従い、追加的改変を有する微生物細胞を設計する。幾つかの実施形態では、遺伝子操作型微生物細胞は、野生型微生物細胞と比較して15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、又は4個を超えない遺伝子改変を有する。様々な実施形態では、チラミン生成用に遺伝子操作した微生物細胞は、以下の例示的範囲、1〜10個、1〜9個、1〜8個、2〜7個、2〜6個、2〜5個、2〜4個、2〜3個、3〜7個、3〜6個、3〜5個、3〜4個等のいずれかの範囲内の幾つかの遺伝子改変を有し得る。
【０１２９】
幾つかの実施形態では、遺伝子操作型微生物細胞は少なくとも1つの異種チロシンデカルボキシラーゼ(TYDC)を発現する。チラミンを本来生成しない微生物宿主細胞の場合、これは必要である。様々な実施形態では、微生物細胞は、例えば(1)1つの異種TYDC遺伝子、(2)同じであるか又は異なっていてよい2つ以上の異種TYDC遺伝子(言い換えると、同じ異種TYDC遺伝子の多数のコピーを導入でき、又は多数の異なる異種TYDC遺伝子を導入できる)、(3)1つの異種TYDC遺伝子及び内在TYDC遺伝子の1つ又は複数の追加コピー、又は(4)同じであるか又は異なっていてよい2つ以上の異種TYDC遺伝子、及び内在TYDC遺伝子の1つ又は複数の追加コピーを含み、これらを発現し得る。
【０１３０】
この遺伝子操作型宿主細胞は、チロシン(チラミンの直接前駆体)の生成をもたらす経路全体の流動を増大させる少なくとも1つの追加的遺伝子改変を含み得る。経路中のこれらの「上流」酵素には、これらの酵素活性を有する任意のアイソフォーム、パラログ、又はオルソログ(当業者が容易に理解するものは異なる名称によって公知であり得る)を含めた、デヒドロキネートシンターゼ、デヒドロキネートデヒドラターゼ、シキミ酸デヒドロゲナーゼ、シキミ酸キナーゼ、EPSPシンターゼ、芳香族五機能性酵素、コリスミ酸シンターゼ、コリスミ酸ムターゼ、プレフェン酸デヒドラターゼ、フェニルアラニンアミノトランスフェラーゼ、プレフェン酸デヒドロゲナーゼ、プレフェン酸アミノトランスフェラーゼ、アロゲン酸デヒドロゲナーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、及びチロシンアミノトランスフェラーゼがある。少なくとも1つの追加的改変は、任意の利用可能な手段によって、(1)内在酵素(複数可)の発現若しくは活性の調節、(2)内在酵素に関する遺伝子の1つ又は複数の追加コピーの発現、又は(3)1つ又は複数の異種酵素に関する遺伝子の1つ又は複数のコピーの発現によって上流経路酵素(複数可)の活性を増大させることができる。
【０１３１】
幾つかの実施形態では、経路全体の増大した流動を、前に論じたようなフィードバック調節不全酵素をコードする1つ又は複数の遺伝子の発現によって得ることができる。例えば、遺伝子操作型宿主細胞は、(1)1つ又は複数のフィードバック調節不全DAHPシンターゼ遺伝子、(2)1つ又は複数のフィードバック調節不全コリスミ酸ムターゼ遺伝子、又は(3)1つ又は複数のフィードバック調節不全DAHPシンターゼ遺伝子及び1つ又は複数のフィードバック調節不全コリスミ酸ムターゼ遺伝子を含み、これらを発現し得る。したがって、これらの遺伝子改変のいずれかを有する遺伝子操作型微生物細胞は、少なくとも1つの異種TYDC、及び任意選択で、1つ又は複数の上流経路酵素の活性を増大させるもう1つの遺伝子改変も含み得る。
【０１３２】
遺伝子操作型微生物細胞は、野生型ヌクレオチド配列を有するか又は野生型とは異なる導入遺伝子を含有し得る。例えば、特定宿主細胞中での発現用に、野生型ヌクレオチド配列をコドン最適化することができる。任意のこれらの導入遺伝子によってコードされるアミノ酸配列は野生型であるか、又は野生型とは異なってよい。様々な実施形態では、アミノ酸配列は、野生型アミノ酸配列と少なくとも0パーセント、70パーセント、75パーセント、80パーセント、85パーセント、90パーセント、95パーセント又は100パーセントのアミノ酸配列同一性を有する。
【０１３３】
様々な実施形態では、遺伝子操作型微生物細胞は、前に記載したように高力価でチラミンを生成することができる。幾つかの実施形態では、遺伝子操作型微生物細胞は基質の発酵によりチラミンを生成することができ、この場合少なくとも20パーセントの基質はタンパク質又はアミノ酸供給源に由来しない。様々な実施形態では、少なくとも25パーセント、30パーセント、35パーセント、40パーセント、45パーセント、50パーセント、55パーセント、60パーセント、65パーセント、70パーセント、75パーセント、80パーセント、85パーセント、90パーセント、95パーセント又は100パーセントの基質はタンパク質又はアミノ酸供給源に由来しない。幾つかの実施形態では、タンパク質又はアミノ酸供給源に由来しない発酵基質の割合は、以下の例示的範囲、40〜100パーセント、40〜90パーセント、40〜80パーセント、50〜100パーセント、50〜90パーセント、50〜80パーセント、60〜100パーセント、60〜90パーセント、60〜80パーセント等のいずれかの範疇に入る。
【０１３４】
本明細書中に記載する手法は、真菌細胞、即ち酵母S.セレビシエ(真核生物)、及び細菌細胞、即ちC.グルタミカム(原核生物)において実施されている(実施例1を参照)。
【０１３５】
例示的遺伝子操作型真菌細胞
例示的遺伝子操作型サッカロミセス・セレビシエ細胞
特定の実施形態では、遺伝子操作型酵母(例えばS.セレビシエ)細胞は、ケシ由来のTYDCと少なくとも70パーセント、75パーセント、80パーセント、85パーセント、90パーセント、95パーセント又は100パーセントのアミノ酸配列同一性を有する異種チロシンデカルボキシラーゼ(TYDC)を発現する。様々な実施形態では、ケシ由来のTYDCは配列番号20を含み得る。これは遺伝子操作型酵母細胞の唯一の遺伝子改変である可能性があり、又は酵母細胞は、前で更に一般的に論じたように、1つ又は複数の追加的遺伝子改変を含み得る。
【０１３６】
詳細な実施形態では、遺伝子操作型酵母(例えばS.セレビシエ)細胞は、野生型S.セレビシエDAHPシンターゼと少なくとも70パーセント、75パーセント、80パーセント、85パーセント、90パーセント、又は95パーセントのアミノ酸配列同一性を典型的に有するS.セレビシエDAHPシンターゼの変異体を追加的に発現する。例示的実施形態では、遺伝子操作型酵母(例えばS.セレビシエ)細胞は、ケシ由来のチロシン/DOPAデカルボキシラーゼ2(配列番号2)、及びK229L突然変異を追加的に含むAro4遺伝子によってコードされるフィードバック調節不全S.セレビシエDAHPシンターゼ(配列番号6)を発現する。
【０１３７】
第3の遺伝子改変を有する例示的酵母(例えばS.セレビシエ)細胞は、例えば、野生型S.セレビシエ由来プレフェン酸デヒドロゲナーゼ(配列番号4)遺伝子、又は野生型S.セレビシエ由来プレフェン酸デヒドロゲナーゼと少なくとも70パーセント、75パーセント、80パーセント、85パーセント、90パーセント、又は95パーセントのアミノ酸配列同一性を有するプレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の追加コピーの細胞中への導入によって生じる、対照細胞と比較して、プレフェン酸デヒドロゲナーゼ等の上流経路酵素の、増大した活性を追加的に有し得る。
【０１３８】
第4の遺伝子改変を有する例示的酵母(例えばS.セレビシエ)細胞は、例えば、野生型S.セレビシエ由来トランスアルドラーゼ(配列番号8)遺伝子、又は野生型S.セレビシエ由来トランスアルドラーゼと少なくとも70パーセント、75パーセント、80パーセント、85パーセント、90パーセント、又は95パーセントのアミノ酸配列同一性を有するトランスアルドラーゼをコードする遺伝子の細胞中への導入によって生じる、対照細胞と比較して、トランスアルドラーゼ等の上流経路酵素の、増大した活性を追加的に有し得る。例示的実施形態では、遺伝子操作型S.セレビシエ細胞は、コリネバクテリウム・グルタミカム及びS.セレビシエに関する改変組合せ型コドン表を使用してコドン最適化した、これらの型の遺伝子を発現する。
【０１３９】
例示的遺伝子操作型ヤロウィア・リポリティカ細胞
特定の実施形態では、遺伝子操作型酵母(例えばヤロウィア・リポリティカ)細胞は、エンテロコッカス・フェシウム(例えばCom15)由来のピリドキサール依存性デカルボキシラーゼ(TYDC)と少なくとも70パーセント、75パーセント、80パーセント、85パーセント、90パーセント、95パーセント又は100パーセントのアミノ酸配列同一性を有する異種チロシンデカルボキシラーゼ(TYDC)を発現する。様々な実施形態では、エンテロコッカス・フェシウム由来のTYDCは配列番号1を含み得る。これは遺伝子操作型酵母細胞の唯一の遺伝子改変である可能性があり、又は酵母細胞は、前で更に一般的に論じたように、1つ又は複数の追加的遺伝子改変を含み得る。
【０１４０】
詳細な実施形態では、遺伝子操作型酵母(例えばヤロウィア・リポリティカ)細胞は、野生型S.セレビシエ(例えばS288c)由来のホスホ-2-デヒドロ-3-デオキシヘプトン酸アルドラーゼ(DAHPシンターゼ)(配列番号9)と少なくとも70パーセント、75パーセント、80パーセント、85パーセント、90パーセント、又は95パーセントのアミノ酸配列同一性を典型的に有するS.セレビシエDAHPシンターゼを追加的に発現する。例示的実施形態では、遺伝子操作型ヤロウィア・リポリティカ細胞は、ヤロウィア・リポリティカに関してコドン最適化した、これらの型の遺伝子(配列番号10)を発現する。
【０１４１】
例示的遺伝子操作型細菌細胞
例示的遺伝子操作型コリネバクテリウム・グルタミカム細胞
特定の実施形態では、遺伝子操作型酵母(例えばC.グルタミカム)細胞は、エンテロコッカス・フェシウム(例えばCom15)由来又はジゴサッカロミセス・バイリ由来のTYDCと少なくとも70パーセント、75パーセント、80パーセント、85パーセント、90パーセント、95パーセント又は100パーセントのアミノ酸配列同一性を有する異種チロシンデカルボキシラーゼ(TYDC)を発現する。例えば、エンテロコッカス・フェシウム由来のTYDCは配列番号1を含む可能性があり、ジゴサッカロミセス・バイリ由来のTYDCは配列番号11を含む可能性がある。異種TYDCの発現は遺伝子操作型細菌細胞の唯一の遺伝子改変である可能性があり、又は細菌細胞は、前で更に一般的に論じたように、1つ又は複数の追加的遺伝子改変を含む可能性がある。
【０１４２】
詳細な実施形態では、遺伝子操作型細菌(例えばC.グルタミカム)細胞は、野生型S.セレビシエ由来のDAHPシンターゼ(配列番号9)と少なくとも70パーセント、75パーセント、80パーセント、85パーセント、90パーセント、又は95パーセントのアミノ酸配列同一性を典型的に有する、S.セレビシエ由来のDAHPシンターゼ(例えば、菌株S288c由来のホスホ-2-デヒドロ-3-デオキシヘプトン酸アルドラーゼ)又はその変異体を追加的に発現する。両方の遺伝子を、例えばS.セレビシエに関してコドン最適化することができる。例示的実施形態では、遺伝子操作型細菌(例えばC.グルタミカム)細胞は、K229L突然変異を追加的に含むAro4遺伝子によってコードされるフィードバック調節不全S.セレビシエDAHPシンターゼ(配列番号6)との組合せで、エンテロコッカス・フェシウム由来のTYDC(配列番号1)又はジゴサッカロミセス・バイリ由来のTYDC(配列番号11)の片方(又は両方)を発現する。
【０１４３】
代替的に、又はDAHPシンターゼ変異体の発現以外に、TYDC発現細菌(例えばC.グルタミカム)細胞は、対照細胞と比較して、コリスミ酸シンターゼ及び/又はプレフレネートデヒドロゲナーゼ等の上流経路酵素の、増大した活性を有し得る。例示的実施形態では、遺伝子操作型細菌(例えばC.グルタミカム)細胞は、野生型S.セレビシエ由来のコリスミ酸シンターゼ(配列番号3)と少なくとも70パーセント、75パーセント、80パーセント、85パーセント、90パーセント、又は95パーセントのアミノ酸配列同一性を有する、野生型S.セレビシエ由来のコリスミ酸シンターゼ(配列番号12)遺伝子又はコリスミ酸シンターゼをコードする遺伝子のコピーとの組合せで、エンテロコッカス・フェシウム由来のTYDC(配列番号1)を発現する。別の例示的実施形態では、遺伝子操作型細菌(例えばC.グルタミカム)細胞は、野生型S.セレビシエ由来のプレフェン酸デヒドロゲナーゼ(配列番号4)と少なくとも70パーセント、75パーセント、80パーセント、85パーセント、90パーセント、又は95パーセントのアミノ酸配列同一性を有する、野生型S.セレビシエ由来のプレフェン酸デヒドロゲナーゼ(配列番号13)遺伝子又はプレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のコピーとの組合せで、エンテロコッカス・フェシウム由来のTYDC(配列番号1)を発現する。
【０１４４】
例示的遺伝子操作型バチルス・ズブチリス細胞
特定の実施形態では、遺伝子操作型細菌(例えばバチルス・ズブチリス)細胞は、エンテロコッカス・フェシウム(例えばCom15)由来のTYDCと少なくとも70パーセント、75パーセント、80パーセント、85パーセント、90パーセント、95パーセント又は100パーセントのアミノ酸配列同一性を有する異種チロシンデカルボキシラーゼ(TYDC)を発現する。例えば、エンテロコッカス・フェシウム由来のTYDCは配列番号1を含む可能性がある。異種TYDCの発現は遺伝子操作型細菌細胞の唯一の遺伝子改変である可能性があり、又は細菌細胞は、前で更に一般的に論じたように、1つ又は複数の追加的遺伝子改変を含む可能性がある。
【０１４５】
詳細な実施形態では、遺伝子操作型細菌(例えばB.ズブチリス)細胞は、野生型S.セレビシエ由来のDAHPシンターゼ(配列番号9)と少なくとも70パーセント、75パーセント、80パーセント、85パーセント、90パーセント、又は95パーセントのアミノ酸配列同一性を典型的に有する、S.セレビシエ由来のDAHPシンターゼ(例えば、菌株288c由来のホスホ-2-デヒドロ-3-デオキシヘプトン酸アルドラーゼ)の変異体を追加的に発現する。
【０１４６】
第3の遺伝子改変を有する例示的細菌(例えばB.ズブチリス)細胞は、例えば、野生型E.コリ(例えばK12)由来シキミ酸キナーゼ2(配列番号14)遺伝子、又は野生型E.コリ由来シキミ酸キナーゼ2(配列番号15)と少なくとも70パーセント、75パーセント、80パーセント、85パーセント、90パーセント、又は95パーセントのアミノ酸配列同一性を有するシキミ酸キナーゼをコードする遺伝子の追加コピーの細胞中への導入によって生じる、対照細胞と比較して、シキミ酸キナーゼ等の上流経路酵素の、増大した活性を追加的に有し得る。例示的実施形態では、遺伝子操作型B.ズブチリス細胞は、S.セレビシエに関してコドン最適化した、これらの型の遺伝子を発現する。
【０１４７】
遺伝子操作型微生物細胞の培養
本明細書中に記載する任意の微生物細胞は、例えば維持、増殖、及び/又はチラミン生成用に培養することができる。一般に、チラミンは基質の発酵から生成され、この場合少なくとも20%の基質はタンパク質又はアミノ酸供給源に由来しない。したがって、本明細書中に記載する遺伝子操作型微生物細胞の培養は発酵基質を含み、この場合少なくとも20パーセントの基質はタンパク質又はアミノ酸供給源に由来しない。様々な実施形態では、少なくとも25パーセント、30パーセント、35パーセント、40パーセント、45パーセント、50パーセント、55パーセント、60パーセント、65パーセント、70パーセント、75パーセント、80パーセント、85パーセント、90パーセント、95パーセント又は100パーセントの基質はタンパク質又はアミノ酸供給源に由来しない。幾つかの実施形態では、タンパク質又はアミノ酸供給源に由来しない発酵基質の割合は、以下の例示的範囲、40〜100パーセント、40〜90パーセント、40〜80パーセント、50〜100パーセント、50〜90パーセント、50〜80パーセント、60〜100パーセント、60〜90パーセント、60〜80パーセント等のいずれかの範疇に入る。
【０１４８】
幾つかの実施形態では、600nmで10〜500の光学密度、50〜150の光学密度等まで培養物を増殖させる。
【０１４９】
様々な実施形態では、培養物は少なくとも10、50、75、100、200、300、400、500、600、700、800、若しくは900mg/L、又は少なくとも1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、若しくは10gm/Lの力価で生じるチラミンを含む。様々な実施形態では、力価は10mg/L〜10gm/L、100mg/L〜5gm/L、200mg/L〜4gm/L、300mg/L〜3gm/Lの範囲、又は前述の任意の値によって境界付けられる任意の範囲内である。
【０１５０】
培養培地
最小培地、即ち細胞が増殖可能な最小限の栄養素を含有する培地だけには限られないが、これを含めた任意の適切な培地において微生物細胞を培養することができる。最小培地は、(1)微生物増殖用の炭素源、(2)塩、これは個々の微生物細胞及び増殖条件に依存し得る、及び(3)水を典型的に含有する。適切な培地は、以下の、増殖及び産物形成用の窒素源、増殖用の硫黄源、増殖用のリン酸源、増殖用の金属塩、増殖用のビタミン、及び増殖用の他のコファクターの任意の組合せも含み得る。
【０１５１】
任意の適切な炭素源を使用して宿主細胞を培養することができる。用語「炭素源」は、微生物細胞によって代謝され得る1つ又は複数の炭素含有化合物を指す。様々な実施形態では、炭素源は炭水化物(単糖、二糖、オリゴ糖、又は多糖等)、又は転化糖(例えば、酵素によって処理されたスクロースシロップ)である。例示的な単糖にはグルコース(デキストロース)、フルクトース(レブロース)、及びガラクトースがあり、例示的なオリゴ糖にはデキストラン又はグルカンがあり、例示的な多糖にはデンプン及びセルロースがある。適切な糖にはC6糖(例えばフルクトース、マンノース、ガラクトース、又はグルコース)、及びC5糖(例えば、キシロース又はアラビノース)がある。他の安価な炭素源にはサトウキビジュース、ビートジュース、モロコシジュース等があり、これらはいずれも完全に又は部分的に脱イオン状態であり得るが、その必要はない。
【０１５２】
一般に培養培地中の塩は、マグネシウム、窒素、リン、及び硫黄等の必須元素を与え、細胞がタンパク質及び核酸を合成するのを可能にする。
【０１５３】
抗生物質等の1つ又は複数の選択作用物質を、最小培地に補充することができる。
【０１５４】
チラミンを生成するため、培養培地は尿素、アンモニウム塩、アンモニア、又はこれらの任意の組合せ等のグルコース源及び/又は窒素源を含み得る、及び/又はこれらを培養中に補充する。
【０１５５】
培養条件
微生物細胞の維持及び増殖に適した材料及び方法は、当技術分野で周知である。例えば、米国特許公開第2009/0203102号、米国特許公開第2010/0003716号、及び米国特許公開第2010/0048964号、並びに国際公開第WO2004/033646号、国際公開第WO2009/076676号、国際公開第WO2009/132220号、及び国際公開第WO2010/003007号、Manual of Methods for General Bacteriology Gerhardtら、eds)、American Society for Microbiology、Washington、D.C.(1994年)又はBrock in Biotechnology:A Textbook of Industrial Microbiology、Second Edition(1989年)Sinauser Associates、Inc.、Sunderland、Massを参照。
【０１５６】
一般に、(約20℃〜約37℃、約6%〜約84%のCO2、及び約5と約9の間のpH等の)適切な温度、気体混合物、及びpHで細胞を増殖させ維持する。幾つかの態様では、35℃で細胞を増殖させる。宿主細胞として高温菌を使用する場合等の、特定の実施形態では、より高温(例えば50℃〜75℃)を使用することができる。幾つかの態様では、発酵に関するpH範囲は約pH5.0と約pH9.0の間(約pH6.0〜pH8.0又は約6.5〜約7.0等)である。個々の細胞の要件に基づき、有酸素、低酸素、又は無酸素条件下で細胞を増殖させることが可能である。
【０１５７】
使用することができる標準的培養条件、及びバッチ、フェドバッチ、又は連続発酵等の発酵形式は、米国特許公開第2009/0203102号、米国特許公開第2010/0003716号、及び米国特許公開第2010/0048964号、並びに国際公開第WO2009/076676号、国際公開第WO2009/132220号、及び国際公開第WO2010/003007号中に記載されている。バッチ及びフェドバッチ発酵は一般的で、当技術分野で周知であり、Brock、Biotechnology:A Textbook of Industrial Microbiology、Second Edition(1989年)Sinauser Associates、Inc.において例を見ることができる。
【０１５８】
幾つかの実施形態では、限定的糖(例えばグルコース)条件下で細胞を培養する。様々な実施形態では、加える糖の量は、細胞によって消費され得る糖の量の約105%以下(約100%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、又は10%等)である。詳細な実施形態では、培養培地に加える糖の量は、特定期間中に細胞によって消費される糖の量とほぼ同じである。幾つかの実施形態では、細胞増殖の速度を、細胞培地中の糖の量によってサポートできる速度で細胞が増殖するように、加える糖の量を制限することによって制御する。幾つかの実施形態では、細胞培養時間中に糖が蓄積することはない。様々な実施形態では、約1、2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、若しくは70時間以上、又は更に最大約5〜10日の時間、限定的糖条件下で細胞を培養する。様々な実施形態では、細胞培養の時間全体の約5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、95、又は100%以上、限定的糖条件下で細胞を培養する。何らかの特定の理論によって拘束されたくないが、限定的糖条件はより好ましい細胞の制御をもたらすことができると考えられる。
【０１５９】
幾つかの態様では、バッチ培養で細胞を増殖させる。細胞はフェドバッチ培養中又は連続培養中で増殖させることも可能である。更に、前に記載した最小培地のいずれかに限られないが、これらを含めた最小培地中で細胞を培養することができる。最小培地には、1.0%(w/v)以下のグルコース(又は任意の他の六炭素糖)を更に補充することができる。具体的には、最小培地に1%(w/v)、0.9%(w/v)、0.8%(w/v)、0.7%(w/v)、0.6%(w/v)、0.5%(w/v)、0.4%(w/v)、0.3%(w/v)、0.2%(w/v)、又は0.1%(w/v)グルコースを補充することができる。幾つかの培養では、有意により高レベルの糖(例えばグルコース)、例えば少なくとも10%(w/v)、20%(w/v)、30%(w/v)、40%(w/v)、50%(w/v)、60%(w/v)、70%(w/v)の糖、又は培地中の糖の溶解限度までを使用する。幾つかの実施形態では、糖レベルは、前述の値のいずれか2つの範囲内、例えば0.1〜10%(w/v)、1.0〜20%(w/v)、10〜70%(w/v)、20〜60%(w/v)、又は30〜50%(w/v)に入る。更に、異なる培養期に異なる糖レベルを使用することができる。(例えばS.セレビシエ又はC.グルタミカムの)フェドバッチ培養に関して、糖レベルはバッチ相中で約100〜200g/L(10〜20%(w/v))、及び次いで最大約500〜700g/L(フィード中50〜70%)であってよい。
【０１６０】
更に、最小培地には0.1%(w/v)以下の酵母エキスを補充することができる。具体的には、最小培地に0.1%(w/v)、0.09%(w/v)、0.08%(w/v)、0.07%(w/v)、0.06%(w/v)、0.05%(w/v)、0.04%(w/v)、0.03%(w/v)、0.02%(w/v)、又は0.01%(w/v)酵母エキスを補充することができる。或いは、最小培地に1%(w/v)、0.9%(w/v)、0.8%(w/v)、0.7%(w/v)、0.6%(w/v)、0.5%(w/v)、0.4%(w/v)、0.3%(w/v)、0.2%(w/v)、又は0.1%(w/v)グルコース、及び0.1%(w/v)、0.09%(w/v)、0.08%(w/v)、0.07%(w/v)、0.06%(w/v)、0.05%(w/v)、0.04%(w/v)、0.03%(w/v)、又は0.02%(w/v)酵母エキスを補充することができる。幾つかの培養では、有意により高レベルの酵母エキス、例えば少なくとも1.5%(w/v)、2.0%(w/v)、2.5%(w/v)、又は3%(w/v)を使用することができる。(例えばS.セレビシエ又はC.グルタミカムの)幾つかの培養では、酵母エキスレベルは、前述の値のいずれか2つの範囲内、例えば0.5〜3.0%(w/v)、1.0〜2.5%(w/v)、又は1.5〜2.0%(w/v)に入る。
【０１６１】
本明細書中に記載する遺伝子操作型微生物細胞の維持と増殖に適した例示的材料及び方法は、以下の実施例1において見ることができる。
【０１６２】
チラミンの生成と回収
本明細書中に記載する任意の方法は、チラミンを回収する工程を更に含むことができる。幾つかの実施形態では、いわゆる採取流中に含有される生成チラミンを生産容器から回収/採取する。採取流は、生産容器からの無細胞又は細胞含有水溶液を例えば含む可能性があり、これは生産容器内での休止細胞による生成基質の転換の結果としてチラミンを含有する。採取流中に依然として存在する細胞は、当技術分野で公知の任意の作業、例えば濾過、遠心分離、デカンテーション、膜クロスフロー限外濾過若しくはマイクロ濾過、タンジェンシャルフロー限外濾過若しくはマイクロ濾過、又はデッドエンド濾過等によってチラミンから分離することができる。この細胞分離作業後、採取流は細胞をほとんど含まない。
【０１６３】
採取流中に含有される他の成分から生成チラミンを分離及び/又は精製する更なる工程、即ちいわゆる下流処理工程を、任意選択で実施することができる。これらの工程は、当業者に公知の任意の手段、例えば濃縮、抽出、結晶化、沈殿、吸着、イオン交換、クロマトグラフィー、蒸留、電気透析、バイポーラ膜電気透析及び/又は逆浸透現象等を含み得る。任意のこれらの手順を、単独又は組合せで使用してチラミンを精製することができる。更なる精製工程は、例えば濃縮、結晶化、沈殿、洗浄及び乾燥、活性炭を用いた処理、イオン交換及び/又は再結晶化の1つ又は複数を含むことができる。適切な精製プロトコールの設計は細胞、培養培地、培養のサイズ、生産容器等に依存する可能性があり、当業者の技術レベル内にある。
【０１６４】
以下の実施例は本開示の様々な実施形態を例示する目的で与え、何らかの形式で本開示を限定することは意味しない。特許請求の範囲によって定義された本開示の精神内に包含される本明細書中の変更及び他の使用は、当業者には明らかである。
【実施例】
【０１６５】
(実施例1)
チラミンを生成するように遺伝子操作したサッカロミセス・セレビシエ及びコリネバクテリウム・グルタミカムの菌株の構築及び選択
プラスミド/DNA設計
この実験で試験した全ての菌株はプラスミドDNAで形質転換し、専売ソフトウエアを使用して設計した。プラスミド設計は、この実験において遺伝子操作した2つの宿主生物の1つに特異的であった。プラスミドDNAは、標準的DNAアセンブリー法によって物理的に構築した。次いでこのプラスミドDNAを使用して、それぞれ以下に記載した2つの宿主特異的方法の1つによって代謝経路挿入物を組み込んだ。
【０１６６】
S.セレビシエの経路の組込み
「スプリットマーカー、ダブルクロスオーバー」のゲノム内組込み方針を開発してS.セレビシエ菌株を遺伝子操作した。図2は、S.セレビシエにおける相補的、スプリットマーカープラスミドのゲノム内組込み、及びコロニーPCRによる正確なゲノム内組込みの確認を例証する。相補的5'及び3'相同アームとURA3選択可能マーカーの重複半分(破線によって示される直接リピート)を有する2つのプラスミドをメガヌクレアーゼで消化し、直鎖状断片として形質転換した。トリプルクロスオーバー事象によって所望の異種遺伝子を標的遺伝子座内に組み込み、完全URA3遺伝子を再構築した。この組込み事象から誘導したコロニーは、2つの3-プライマー反応を使用してアッセイし、5'と3'両方の接合部(UF/IF/野生型-R及びDR/IF/野生型-F)を確認した。更なる遺伝子操作が望まれる菌株に関しては、菌株を5-FOAプレート上に平板培養してURA3の除去を選択し、元の直接リピートの小さな単コピーは残した。このゲノム内組込み方針は、同じワークフロー内で遺伝子ノックアウト、遺伝子ノックイン、及びプロモーター力価測定に使用することができる。
【０１６７】
C.グルタミカムの経路の組込み
「ループイン、シングルクロスオーバー」のゲノム内組込み方針を開発してC.グルタミカム菌株を遺伝子操作した。図3は、ループイン専用及びループイン/ループアウト構築物のゲノム内組込み、及びコロニーPCRによる正確な組込みの確認を例証する。(見出し「ループイン」で示す)ループイン専用構築物は、(「組込み遺伝子座」として表す)1つの2kb相同アーム、(「マーカー」として表す)陽性選択マーカー、及び(「プロモーター-遺伝子-ターミネーター」として表す)目的の遺伝子(複数可)を含有していた。シングルクロスオーバー事象によってプラスミドをC.グルタミカム染色体内に組み込んだ。抗生物質(25μg/mlのカナマイシン)の存在下における増殖によりゲノム内の組込み事象は安定的に維持される。ループイン組込み由来のコロニーにおける正確なゲノム内組込みは、UF/IR及びDR/IFPCRプライマーを用いたコロニーPCRによって確認した。
【０１６８】
(見出し「ループイン、ループアウトで示す)ループイン、ループアウト構築物は、2つの2kb相同アーム(5'アームと3'アーム)、目的の遺伝子(複数可)(矢印)、(「マーカー」として表す)陽性選択マーカー、及び対抗選択マーカーを含有していた。「ループイン」専用構築物と同様に、シングルクロスオーバー事象によってプラスミドをC.グルタミカムの染色体内に組み込んだ。注釈、2つの可能な組込みの1つのみをここで示す。正確なゲノム内組込みはコロニーPCRによって確認し、プラスミド骨格と対抗選択マーカーが切除可能であるように対抗選択を施した。これは2つの可能性の1つ、野生型への復帰(左下枠)又は所望経路の組込み(右下枠)をもたらす。再度、コロニーPCRによって正確なゲノムループアウトを確認する。(略語:プライマー:UF=上流フォワードプライマー、DR=下流リバースプライマー、IR=内部リバースプライマー、IF=内部フォワードプライマー)。
【０１６９】
細胞培養
培地要件及び増殖の違いのため、C.グルタミカムとS.セレビシエに関して別々のワークフローを設定した。両プロセスは、プレート全体の菌株を無作為に分ける自動ワークフローを使用し首尾よく構築された菌株を1つにまとめる、ヒットピッキング(hit-picking)工程を含んでいた。首尾よく構築されたそれぞれの菌株に関して、異なるコロニーから最大4個の複製を試験し、コロニー毎の変動及び他のプロセスの変動を試験した。4個より少ないコロニーを得た場合、望ましい各遺伝子型から少なくとも4ウエルを試験するように既存のコロニーを複製した。
【０１７０】
選択培地(C.グルタミカムに関してBHI、S.セレビシエに関してSD-ura)を含む96ウエルプレートにコロニーを1つにまとめ、飽和状態まで2日間培養し、次いで保存用に-80℃において16.6%グリセロールを用いて凍結させた。次いで凍結グリセロールストックを使用して、アミノ酸が低レベルである最小培地に種段階のものを接種し、増殖及び凍結からの回収を手助けした。シードプレートは30℃で1〜2日間増殖させた。次いでシードプレートを使用し、最小培地を含む主要培養プレートに接種し48〜88時間増殖させた。プレートは所望時間地点で除去し、細胞密度(OD600)、生存率に関して試験し、目的の生成物のLC-MS分析用にグルコース、上清試料を保存した。
【０１７１】
細胞密度
600nmでの各ウエルの吸光度を検出する分光測光アッセイを使用して、細胞密度を測定した。ロボットを使用して各培養プレートからの固定量の培養物をアッセイプレートに移し、次に175mMのリン酸ナトリウム(pH7.0)と混合して10倍希釈液を作製した。Tecan  M1000分光光度計を使用してアッセイプレートを測定し、アッセイデータはLIMSデータベースにアップロードした。非接種対照を使用してバックグラウンド吸光度を差し引いた。各ステージで多数のプレートに接種することにより細胞増殖をモニタリングし、次いで各時間地点でプレート全体の細胞を屠殺した。
【０１７２】
多数のプレートの処理中の細胞の定住(これによって測定中に非典型的試料が生成し得る)を最小限にするため、各回の読み取りの前に各プレートを10〜15秒間攪拌した。プレート内の細胞密度の大きな変動も、より高ODの培養物の過小評価につながる検出の直線範囲外の吸光度測定値をもたらす可能性がある。一般に、これまで試験した菌株がそれほど大幅に変動していないことは関心事である。
【０１７３】
細胞生存率
2つの方法を使用して細胞生存率を測定した。第1のアッセイは、一種の染色液、ヨウ化プロピジウムを利用して細胞生存率を評価した。ヨウ化プロピジウムはDNAと結合し、傷ついた細胞膜を有する細胞に浸透する。ヨウ化プロピジウムを取り込む細胞は非生存常態であると考えられる。対照培養物の細胞試料を95℃で10分間インキュベートすることにより、死細胞対照を使用して細胞全数を標準化した。これらの対照試料及び試験試料をヨウ化プロピジウム染色液と5分間インキュベートし、175mMリン酸バッファーで二回洗浄し、ブラックソリッドボトム(black solid-bottom)96ウエルプレート中で617nmにおいて蛍光測定した。
【０１７４】
グルコース
16U/mLグルコースオキシダーゼ(Sigma社)、及び0.2U/mLホースラディッシュペルオキシダーゼ(Sigma社)、及び0.2mMアンプレックスレッド(Amplex red)、175mMリン酸ナトリウムバッファー、pH7中を用いた酵素アッセイを使用してグルコースを測定する。グルコースの酸化によって過酸化水素が生じ、次いでアンプレックスレッドに酸化還元され、それによって560nmでの吸光度が変わる。吸光度の変化は、既知濃度の標準を使用した試料中のグルコース濃度と相互に関連している。
【０１７５】
液体-固体分離
LC-MSによる分析用の細胞外試料を採取するため、液体相と固体相を遠心分離によって分離した。培養プレートは4分間2000rpmで遠心分離し、上清はロボットを使用して指定プレートに移した。75μLの上清を各プレートに移し、長期保存用に第1の上清は4℃で保存し、第2の上清は80℃で保存した。
【０１７６】
第一世代の遺伝子操作とスクリーニングを、C.グルタミカムとS.セレビシエを宿主細胞として使用して実施した。幾つかの場合、フィードバック調節不全DAHPシンターゼと共に、異種TYDCをこれらの宿主細胞中で発現させた。幾つかの場合、TYDCヌクレオチド配列をC.グルタミカム又はS.セレビシエのいずれかに関してコドン最適化した。前に記載したように菌株を生成させ培養し、培養培地中のチラミン力価はLC-MSによって測定した。その菌株と結果はTable 1 (表2)中に示す。最高性能菌株は、K229Lアミノ酸置換があるS.セレビシエDAHPシンターゼ(配列番号6)と共にケシ由来TYDC(配列番号2)を発現したS.セレビシエ菌株であり、これは培養培地1Lあたり約387μgのチラミン力価をもたらした。この菌株を、第二世代の遺伝子操作とスクリーニング用に選択した。
【０１７７】
【表２Ａ】
2020513790.tif 000005
【０１７８】
【表２Ｂ】
2020513790.tif 000006
【０１７９】
【表２Ｃ】
2020513790.tif 000007
【０１８０】
第二世代の遺伝子操作/スクリーニングでは、第一世代からのK229Lアミノ酸置換があるS.セレビシエDAHPシンターゼと共に、ケシ由来TYDCを発現するS.セレビシエ菌株において第3の酵素を発現させた。幾つかの場合、第3の酵素をコードするヌクレオチド配列をコドン最適化した。Table 2 (表3)は、試験した第3の酵素と生じたチラミン力価を示す。より高い力価は約346mg/L、ほぼ1000倍の改良であり、これは第3の酵素として天然S.セレビシエ由来プレフェン酸デヒドロゲナーゼを発現した菌株によって得られた。
【０１８１】
【表３Ａ】
2020513790.tif 000008
【０１８２】
【表３Ｂ】
2020513790.tif 000009
【０１８３】
(実施例2A)
チラミン生成に関する異なる微生物宿主細胞のS.セレビシエの構築及び評価における改良世代(第三世代)の結果
要約
実施例1の最高性能菌株を対照菌株として選択し、サッカロミセス・セレビシエ中のチラミンを改良する試みにおいて第三世代の遺伝子操作を試験した(「改良世代」)。この対照菌株は、S.セレビシエ由来プレフェン酸デヒドロゲナーゼ(UniProtIDP20049)(配列番号4)、K229Lアミノ酸置換があるS.セレビシエS288c由来DAHPシンターゼ(UniProtIDP32449)(配列番号6)、及びケシ由来のチロシン/DOPAデカルボキシラーゼ2(UniProtIDP54769)(配列番号2)を発現した。チラミン生成は対照と比較して8菌株に関してS.セレビシエにおいて改良され、これらの菌株のうち、最高力価(対照に関して300mg/L対266mg/L)をもたらした菌株はS.セレビシエ由来のトランスアルドラーゼ(UniProtIDP15019)(配列番号8)を発現した。
【０１８４】
試験した菌株の設計
チラミン生成は、以下の異種酵素それぞれ又は異種酵素の組合せの発現により、対照と比較して改良された:
1)芳香族アミノ酸アミノトランスフェラーゼ(配列番号28)
2)エシェリキア・コリK12由来のホスホエノールピルビン酸シンターゼ(UniProtIDP23538)(配列番号29)
3)S.セレビシエ由来のトランスケトラーゼ(UniProtIDP23254)(配列番号30)
4)S.セレビシエ由来のトランスアルドラーゼ(UniProtIDP15019)(配列番号8)
5)S.セレビシエ由来のトランスケトラーゼ(UniProtIDP23254)(配列番号30)とS.セレビシエ由来のトランスアルドラーゼ(UniProtIDP15019)(配列番号8)
6)S.セレビシエ由来のトランスケトラーゼ(UniProtIDP23254)(配列番号30)とE.コリK12由来のホスホエノールピルビン酸シンターゼ(UniProtIDP23538)(配列番号29)
7)S.セレビシエ由来のトランスアルドラーゼ(UniProtIDP15019)(配列番号8)とK229Lアミノ酸置換があるS.セレビシエ由来DAHPシンターゼ(UniProtIDP32449)(配列番号6)
8)グラシラリア・グラシリス(Gracilaria gracilis)由来のグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(UniProtIDP30724)(配列番号31)
【０１８５】
結果
結果はTable 7 (表8)(以下)及び図9中に示す。
【０１８６】
以下の異種酵素又は異種酵素の組合せをこの実施例の最高性能菌株に加える工程を含有する、チラミンのその更なる設計、生成を菌株の改良に関して試験することができる:
1)2-デヒドロ-3-デオキシホスホヘプトン酸アルドラーゼ(配列番号32)
2)コリスミ酸ムターゼ(配列番号33)
3)コリスミ酸ムターゼ(配列番号33)とプレフェン酸デヒドロゲナーゼ(配列番号
4)シキミ酸キナーゼ1(配列番号34)
5)シキミ酸デヒドロゲナーゼ(配列番号35)
6)プレフェン酸デヒドロゲナーゼ(配列番号4)
7)チロシンアミノトランスフェラーゼ(配列番号36)
8)プレフェン酸デヒドロゲナーゼ(配列番号4)
9)グルタミン酸シンターゼ(GOGAT)大サブユニット(配列番号37)
10)グルタミン酸シンテターゼ(GS)(配列番号39)
11)グルタミン酸シンターゼ小サブユニット(配列番号38)
12)シキミ酸デヒドロゲナーゼ(配列番号35)
13)シキミ酸キナーゼ2(配列番号15)
14)コリスミ酸ムターゼ(配列番号33)とプレフェン酸デヒドロゲナーゼ(配列番号4)
【０１８７】
(実施例2B)
チラミン生成に関する異なる微生物宿主細胞の評価
要約
宿主評価設計をヤロウィア・リポリティカ、バチルス・ズブチリス、S.セレビシエ及びコリネバクテリウム・グルタミカムにおいて試験した。試験した全ての菌株においてチラミン生成を実証した。最高性能ヤロウィア・リポリティカ菌株は平均して54.5mg/Lのチラミンを生成した。最高性能B.ズブチリス菌株は19.9mg/Lのチラミンを生成した。宿主評価からの最高性能S.セレビシエ菌株は189mg/Lのチラミンを生成した。最高性能C.グルタミカム菌株は467mg/Lのチラミンを生成した。
【０１８８】
結果
最高性能ヤロウィア・リポリティカ菌株は平均して54.5mg/Lのチラミンを生成し、エンテロコッカス・フェシウムCom15由来のピリドキサール依存性デカルボキシラーゼ(TYDC)(UniProtIDC9ASN2)(配列番号1)、S.セレビシエS288c由来のホスホ-2-デヒドロ-3-デオキシヘプトン酸アルドラーゼ(DAHPシンターゼ)(UniProtIDP32449)(配列番号9)を発現し、この場合両酵素に関するDNA配列をヤロウィア・リポリティカに関してコドン最適化した(Table 3 (表4)、図5)(それぞれ配列番号40及び10)。
【０１８９】
最高性能B.ズブチリス菌株は19.9mg/Lのチラミンを生成し、エンテロコッカス・フェシウムCom15由来のピリドキサール依存性デカルボキシラーゼ(TYDC)(UniProtIDC9ASN2)(配列番号1)、S.セレビシエS288c由来のホスホ-2-デヒドロ-3-デオキシヘプトン酸アルドラーゼ(DAHPシンターゼ)(UniProtIDP32449)(配列番号9)、及びエシェリキア・コリK12由来のシキミ酸キナーゼ2(UniProtIDP0A6E1)(配列番号15)を発現し、この場合全3酵素に関するDNA配列をS.セレビシエに関してコドン最適化した(Table 4 (表5)、図6)(配列番号43、42、41)。
【０１９０】
宿主評価からの最高性能S.セレビシエ菌株は189mg/Lのチラミンを生成し、エンテロコッカス・フェシウムCom15由来のピリドキサール依存性デカルボキシラーゼ(TYDC)(UniProtIDC9ASN2)(配列番号1)、K229Lアミノ酸置換があるS.セレビシエS288c由来のホスホ-2-デヒドロ-3-デオキシヘプトン酸アルドラーゼ(DAHPシンターゼ)(UniProtIDP32449)(配列番号6)を発現し、この場合両酵素に関するDNA配列をC.グルタミカム及びS.セレビシエに関する改変組合せ型コドン表を使用してコドン最適化した(Table 5 (表6)、図7)(配列番号45、44)。
【０１９１】
最高性能C.グルタミカム菌株は467mg/Lのチラミンを生成し、エンテロコッカス・フェシウムCom15由来のピリドキサール依存性デカルボキシラーゼ(TYDC)(UniProtIDC9ASN2)(配列番号1)、S.セレビシエS288c由来のホスホ-2-デヒドロ-3-デオキシヘプトン酸アルドラーゼ(DAHPシンターゼ)(UniProtIDP32449)(配列番号9)を発現し、この場合両酵素に関するDNA配列をS.セレビシエに関してコドン最適化した(Table 6 (表7)、図8)(配列番号43、42)。
【０１９２】
スチルベン及び(2S)-フラバノンの生成に関してプラットフォームC.グルタミカム菌株を改良するため、Kallscheuerら(以下の参考文献参照)は、ポリプロパノイド分解オペロン(phdBCDE、cg0344-47)、4-ヒドロキシベンゾエート-3-ヒドロラーゼ(pobA(cg1226)、4-ヒドロキシベンゾエート、カテコール、ベンゾエート、及びプロトカテクエートの分解に必要不可欠であるcat、ben、pcaを有する遺伝子クラスター(cg2625-40)、及びシキミ酸同化経路の必須遺伝子を含むオペロンの一部であるqsuE(cg502)を含めた、芳香環を分解する遺伝子及びオペロンを欠失させた。C.グルタミカムにおけるチラミンの生成は、芳香族を分解するこれらの酵素を欠失又はその発現を低下させることによって、更なる改良のため試験することもできる。チラミンは芳香環を含有するからである。
【０１９３】
【表４Ａ】
2020513790.tif 000010
【０１９４】
【表４Ｂ】
2020513790.tif 000011
【０１９５】
【表４Ｃ】
2020513790.tif 000012
【０１９６】
【表４Ｄ】
2020513790.tif 000013
【０１９７】
【表５Ａ】
2020513790.tif 000014
【０１９８】
【表５Ｂ】
2020513790.tif 000015
【０１９９】
【表５Ｃ】
2020513790.tif 000016
【０２００】
【表５Ｄ】
2020513790.tif 000017
【０２０１】
【表６Ａ】
2020513790.tif 000018
【０２０２】
【表６Ｂ】
2020513790.tif 000019
【０２０３】
【表６Ｃ】
2020513790.tif 000020
【０２０４】
【表７Ａ】
2020513790.tif 000021
【０２０５】
【表７Ｂ】
2020513790.tif 000022
【０２０６】
【表７Ｃ】
2020513790.tif 000023
【０２０７】
【表８Ａ】
2020513790.tif 000024
【０２０８】
【表８Ｂ】
2020513790.tif 000025
【０２０９】
【表８Ｃ】
2020513790.tif 000026
【０２１０】
【表８Ｄ】
2020513790.tif 000027
【０２１１】
【表８Ｅ】
2020513790.tif 000028
【０２１２】
【表８Ｆ】
2020513790.tif 000029
【０２１３】
【表８Ｇ】
2020513790.tif 000030
【０２１４】
【表８Ｈ】
2020513790.tif 000031
【０２１５】
【表９Ａ】
2020513790.tif 000032
【０２１６】
【表９Ｂ】
2020513790.tif 000033
【０２１７】
【表９Ｃ】
2020513790.tif 000034
【０２１８】
【表９Ｄ】
2020513790.tif 000035
【０２１９】
【表９Ｅ】
2020513790.tif 000036
【０２２０】
【表９Ｆ】
2020513790.tif 000037
【０２２１】
【表９Ｇ】
2020513790.tif 000038
【０２２２】
【表９Ｈ】
2020513790.tif 000039
【０２２３】
【表９Ｉ】
2020513790.tif 000040
【０２２４】
【表９Ｊ】
2020513790.tif 000041
【０２２５】
【表９Ｋ】
2020513790.tif 000042
【０２２６】
【表９Ｌ】
2020513790.tif 000043
【０２２７】
【表９Ｍ】
2020513790.tif 000044
【０２２８】
【表９Ｎ】
2020513790.tif 000045
【０２２９】
【表９Ｏ】
2020513790.tif 000046
【０２３０】
【表９Ｐ】
2020513790.tif 000047
【０２３１】
【表９Ｑ】
2020513790.tif 000048
【０２３２】
【表９Ｒ】
2020513790.tif 000049
【０２３３】
【表９Ｓ】
2020513790.tif 000050
【０２３４】
【表９Ｔ】
2020513790.tif 000051
【０２３５】
(参考文献)
2020513790.tif 000052
【図１】
2020513790.tif 000053
【図２】
2020513790.tif 000054
【図３】
2020513790.tif 000055
【図４Ａ】
2020513790.tif 000056
【図４Ｂ】
2020513790.tif 000057
【図４Ｃ】
2020513790.tif 000058
【図５】
2020513790.tif 000059
【図６】
2020513790.tif 000060
【図７】
2020513790.tif 000061
【図８】
2020513790.tif 000062
【図９】
2020513790.tif 000063
【図１０】
2020513790.tif 000064
【配列表】
2020513790000001.app
【国際調査報告】
2020513790.tif 000065
2020513790.tif 000066
2020513790.tif 000067
2020513790.tif 000068
2020513790.tif 000069
2020513790.tif 000070
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