(57)【要約】本発明は、細胞、好ましくは植物細胞における標的遺伝子変化の方法並びに、部位特異的ヌクレアーゼドメイン及びデアミナーゼドメインを含む融合タンパク質又は同じ物をコードする構築物を少なくとも使用して次に得られた植物細胞及び植物に関する。方法は、好ましくは本発明の方法における使用のために、シトシンデアミナーゼドメインを含む第１の融合タンパク質とアデニンデアミナーゼドメインを含む第２の融合タンパク質との組合せを含む、組成物及びキットも提供する。方法は、有効性が増加した、植物細胞におけるＤＮＡ二重鎖の標的変化を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞においてＤＮＡを、部位特異的ヌクレアーゼドメイン及びデアミナーゼドメインを含む少なくとも１つの融合タンパク質と接触させるステップを含む、細胞における標的ヌクレオチド編集のための方法。
【請求項２】
前記部位特異的ヌクレアーゼドメインがＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼであり、前記ＤＮＡと１つ又は複数のガイドＲＮＡとを接触させるステップをさらに含み、前記１つ又は複数のガイドＲＮＡはそれぞれが前記部位特異的ヌクレアーゼを前記ＤＮＡ中の標的配列に標的化するためのガイド配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼがＣａｓ９又はＣｐｆ１である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記デアミナーゼドメインが、アポリポタンパク質Ｂ  ｍＲＮＡ編集複合体（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリーデアミナーゼ、活性化誘導シトシンデアミナーゼ（ＡＩＤ）、ＡＣＦ１／ＡＳＥデアミナーゼ、アデニンデアミナーゼ及びＡＤＡＴファミリーデアミナーゼからなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１つの融合タンパク質中の前記デアミナーゼドメインが前記ヌクレアーゼドメインのＮ末端に融合されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ＤＮＡが少なくとも第１の及び第２の融合タンパク質と接触させられ、前記第１の融合タンパク質がシトシンデアミナーゼドメインを含み、前記第２の融合タンパク質がアデニンデアミナーゼドメインを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
シトシンデアミナーゼドメインを含む前記融合タンパク質がウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害ドメインをさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害ドメインが前記ヌクレアーゼドメインのＣ末端に融合されている、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも１つの融合タンパク質及び／又は前記１つ若しくは複数のガイドＲＮＡが、前記細胞における前記融合タンパク質及び／又は前記ガイドＲＮＡの発現のための１つ又は複数のＤＮＡ構築物を前記細胞に導入するステップによって前記ＤＮＡに接触する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの融合タンパク質及び／又は前記１つ若しくは複数のガイドＲＮＡが、前記融合タンパク質及び／又は前記ガイドＲＮＡを前記細胞に導入するステップによって前記ＤＮＡ分子に接触する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞が植物細胞であって、前記少なくとも１つの融合タンパク質、前記１つ若しくは複数のガイドＲＮＡ及び／又は同じ物をコードする前記１つ若しくは複数の構築物が、ポリエチレングリコール媒介形質転換を使用して、好ましくはＰＥＧを含む水性培地を使用して前記植物細胞に導入される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞が植物細胞であり、前記標的変化を含む植物又はその子孫を再生するステップを好ましくはさらに含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法によって得られる植物、植物部分、植物産物、種子又は植物細胞であって、前記細胞が植物細胞であり、前記植物、植物部分、種子又は植物細胞が、対照の植物、植物部分、種子又は植物細胞と比較した場合の前記標的変化を含むことによって改変され、好ましくは前記対照の植物、植物部分、種子又は植物細胞が、請求項１〜１２のいずれかの方法によって前記標的変化が導入される前の植物、植物部分、種子又は植物細胞である、植物、植物部分、植物産物、種子又は植物細胞。
【請求項１４】
細胞における標的ヌクレオチド編集における、部位特異的ヌクレアーゼ及びデアミナーゼドメインを含む少なくとも１つの融合タンパク質、又は同じ物をコードする構築物の使用。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれかに定義される第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質、又は同じ物をコードする構築物（複数可）を含む組成物であって、前記第１の融合タンパク質がシトシンデアミナーゼドメインを含み、前記第２の融合タンパク質がアデニンデアミナーゼドメインを含む、組成物。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれかに定義される少なくとも第１の及び第２の融合タンパク質を含む、細胞におけるＤＮＡの標的ヌクレオチド編集のためのキットであって、前記第１の融合タンパク質がシトシンデアミナーゼドメインを含み、前記第２の融合タンパク質がアデニンデアミナーゼドメインを含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
生細胞の遺伝材料に変化を計画的に創出する工程は、細胞又は、細胞がその部分を形成する若しくはそれに再生し得る生物の１つ又は複数の遺伝的にコードされた生物学的特性を改変する目標を一般に有する。これらの変更は、遺伝材料の一部の欠失、外来性遺伝材料の付加、又は遺伝材料の既存のヌクレオチド配列における変更の形態を取り得る。
【０００２】
真核生物の遺伝材料を変化させる方法は、２０年間を超えて周知であり、農業、ヒトの健康、食品の品質及び環境保護の分野における改善のために植物、ヒト及び動物細胞並びに微生物において広範な適用を見出している。
【０００３】
最も一般的な方法は、外来性ＤＮＡ断片を細胞のゲノムに付加することからなり、外来性ＤＮＡ断片は次いで、既に存在する遺伝子によってコードされている特性を超えて及び上にその細胞又はその生物に新規特性を付与する（既存の遺伝子の発現がそれにより抑制される適用を含む）。望ましい特性を得ることにおいて多数のそのような例は有効であるが、それでもなお、これらの方法は、外来性ＤＮＡ断片が挿入され得るゲノム位置に関する（及び、それにより発現の最終的なレベルに関する）調節がないことから、並びに所望の効果が、元の及び十分均衡のとれたゲノムによってコードされた天然の特性を超えて明らかにされる必要があることから、あまり正確ではない。
【０００４】
反対に、予め定義された、すなわち標的化されたゲノム遺伝子座にヌクレオチドの付加、欠失又は変換を生じるゲノム編集の方法は、ゲノム、例えば既存の遺伝子の正確な改変を可能にする。
【０００５】
ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）及びクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）などの部位特異的ヌクレアーゼを使用することによって、標的ＤＮＡ変化の分野は急速に発展している。標的ＤＮＡ変化の機序の理解における近年の進歩にも関わらず、植物材料における標的変化は、まだ必ずしも成功する又は効率的であるとは限らない。実際に、利用可能な方法は、動物、特にヒト、細胞材料にしばしば最適化されており、特に植物細胞に適用される場合は必ずしも成功する又は効率的であるとは限らない。したがって、そのような植物細胞のために特に設計されたシステム及びプロトコールを用いて標的変化が導入された植物細胞をもたらす新規方法に対する必要がある。植物細胞におけるＤＮＡの標的変化のそのような方法は、好ましくは、当技術分野において周知の方法と比較して好適な効率を有して種々の植物細胞に成功裏に適用され得る。
【０００６】
この観点から、植物細胞におけるＤＮＡの標的変化のため、及び標的変化が導入された植物細胞及び植物を提供するための新規方法は、非常に望ましい。特に植物細胞におけるＤＮＡ分子の効率的な標的変化を可能にする信頼でき、効率的で、再現性がある、特に標的化する方法に対する明確な必要が当技術分野にある。したがって、本発明の根底にある技術的課題は、前述の必要のいずれかに応じるための方法の提供において見ることができる。技術的課題は、特許請求の範囲及び本明細書下記において特徴付けられる実施形態によって解決される。
【０００７】
近年、プログラム可能なデアミナーゼが報告された（Ｋｏｍｏｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１６，Ｎａｔｕｒｅ  ５３３：４２０〜４２４；Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１６  Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ７：１３３３０；Ｇａｕｄｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１７  Ｎａｔｕｒｅ  ５５１：４６４〜４７１）。本発明者らは、プログラム可能なデアミナーゼ（の組合せ）を使用する植物細胞の有効なゲノム編集を初めて報告する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１−１】デアミナーゼ−Ｃａｓ９融合構築物のヌクレオチド及びタンパク質配列を示す図である。ｒＡＰＯＢＥＣ−Ｃａｓ９−ＵＧＩ−ＮＬＳ構築物について、ヌクレオチド配列（配列番号１）及びタンパク質配列（配列番号２）の両方において、ｒＡＰＯＢＥＣ配列は斜字体で示されており、Ｃａｓ９配列は太字で示されており、ＵＧＩ配列は下線付き斜字体で示されており、スペーサーは下線付き通常書体で示されており、ＮＬＳ配列は太字斜字体で示されている。Ｄ１０及びＨ８４０アミノ酸コドン／残基は影が付けられている。構築物ＫＧ１００９８にＤ１０Ａ変化が導入されている。ＴａｄＡ−Ｃａｓ９  Ｄ１０Ａ−ＮＬＳ構築物について、ヌクレオチド配列（配列番号３）及びタンパク質配列（配列番号４）の両方において、デアミナーゼドメインは斜字体で示されており、スペーサーは下線付き通常書体で示されており、Ｃａｓ９  Ｄ１０Ａ配列は、太字で示されており、ＮＬＳ配列は太字斜字体で示されている。
【図１−２】デアミナーゼ−Ｃａｓ９融合構築物のヌクレオチド及びタンパク質配列を示す図である。ｒＡＰＯＢＥＣ−Ｃａｓ９−ＵＧＩ−ＮＬＳ構築物について、ヌクレオチド配列（配列番号１）及びタンパク質配列（配列番号２）の両方において、ｒＡＰＯＢＥＣ配列は斜字体で示されており、Ｃａｓ９配列は太字で示されており、ＵＧＩ配列は下線付き斜字体で示されており、スペーサーは下線付き通常書体で示されており、ＮＬＳ配列は太字斜字体で示されている。Ｄ１０及びＨ８４０アミノ酸コドン／残基は影が付けられている。構築物ＫＧ１００９８にＤ１０Ａ変化が導入されている。ＴａｄＡ−Ｃａｓ９  Ｄ１０Ａ−ＮＬＳ構築物について、ヌクレオチド配列（配列番号３）及びタンパク質配列（配列番号４）の両方において、デアミナーゼドメインは斜字体で示されており、スペーサーは下線付き通常書体で示されており、Ｃａｓ９  Ｄ１０Ａ配列は、太字で示されており、ＮＬＳ配列は太字斜字体で示されている。
【図１−３】デアミナーゼ−Ｃａｓ９融合構築物のヌクレオチド及びタンパク質配列を示す図である。ｒＡＰＯＢＥＣ−Ｃａｓ９−ＵＧＩ−ＮＬＳ構築物について、ヌクレオチド配列（配列番号１）及びタンパク質配列（配列番号２）の両方において、ｒＡＰＯＢＥＣ配列は斜字体で示されており、Ｃａｓ９配列は太字で示されており、ＵＧＩ配列は下線付き斜字体で示されており、スペーサーは下線付き通常書体で示されており、ＮＬＳ配列は太字斜字体で示されている。Ｄ１０及びＨ８４０アミノ酸コドン／残基は影が付けられている。構築物ＫＧ１００９８にＤ１０Ａ変化が導入されている。ＴａｄＡ−Ｃａｓ９  Ｄ１０Ａ−ＮＬＳ構築物について、ヌクレオチド配列（配列番号３）及びタンパク質配列（配列番号４）の両方において、デアミナーゼドメインは斜字体で示されており、スペーサーは下線付き通常書体で示されており、Ｃａｓ９  Ｄ１０Ａ配列は、太字で示されており、ＮＬＳ配列は太字斜字体で示されている。
【図１−４】デアミナーゼ−Ｃａｓ９融合構築物のヌクレオチド及びタンパク質配列を示す図である。ｒＡＰＯＢＥＣ−Ｃａｓ９−ＵＧＩ−ＮＬＳ構築物について、ヌクレオチド配列（配列番号１）及びタンパク質配列（配列番号２）の両方において、ｒＡＰＯＢＥＣ配列は斜字体で示されており、Ｃａｓ９配列は太字で示されており、ＵＧＩ配列は下線付き斜字体で示されており、スペーサーは下線付き通常書体で示されており、ＮＬＳ配列は太字斜字体で示されている。Ｄ１０及びＨ８４０アミノ酸コドン／残基は影が付けられている。構築物ＫＧ１００９８にＤ１０Ａ変化が導入されている。ＴａｄＡ−Ｃａｓ９  Ｄ１０Ａ−ＮＬＳ構築物について、ヌクレオチド配列（配列番号３）及びタンパク質配列（配列番号４）の両方において、デアミナーゼドメインは斜字体で示されており、スペーサーは下線付き通常書体で示されており、Ｃａｓ９  Ｄ１０Ａ配列は、太字で示されており、ＮＬＳ配列は太字斜字体で示されている。
【図１−５】デアミナーゼ−Ｃａｓ９融合構築物のヌクレオチド及びタンパク質配列を示す図である。ｒＡＰＯＢＥＣ−Ｃａｓ９−ＵＧＩ−ＮＬＳ構築物について、ヌクレオチド配列（配列番号１）及びタンパク質配列（配列番号２）の両方において、ｒＡＰＯＢＥＣ配列は斜字体で示されており、Ｃａｓ９配列は太字で示されており、ＵＧＩ配列は下線付き斜字体で示されており、スペーサーは下線付き通常書体で示されており、ＮＬＳ配列は太字斜字体で示されている。Ｄ１０及びＨ８４０アミノ酸コドン／残基は影が付けられている。構築物ＫＧ１００９８にＤ１０Ａ変化が導入されている。ＴａｄＡ−Ｃａｓ９  Ｄ１０Ａ−ＮＬＳ構築物について、ヌクレオチド配列（配列番号３）及びタンパク質配列（配列番号４）の両方において、デアミナーゼドメインは斜字体で示されており、スペーサーは下線付き通常書体で示されており、Ｃａｓ９  Ｄ１０Ａ配列は、太字で示されており、ＮＬＳ配列は太字斜字体で示されている。
【図１−６】デアミナーゼ−Ｃａｓ９融合構築物のヌクレオチド及びタンパク質配列を示す図である。ｒＡＰＯＢＥＣ−Ｃａｓ９−ＵＧＩ−ＮＬＳ構築物について、ヌクレオチド配列（配列番号１）及びタンパク質配列（配列番号２）の両方において、ｒＡＰＯＢＥＣ配列は斜字体で示されており、Ｃａｓ９配列は太字で示されており、ＵＧＩ配列は下線付き斜字体で示されており、スペーサーは下線付き通常書体で示されており、ＮＬＳ配列は太字斜字体で示されている。Ｄ１０及びＨ８４０アミノ酸コドン／残基は影が付けられている。構築物ＫＧ１００９８にＤ１０Ａ変化が導入されている。ＴａｄＡ−Ｃａｓ９  Ｄ１０Ａ−ＮＬＳ構築物について、ヌクレオチド配列（配列番号３）及びタンパク質配列（配列番号４）の両方において、デアミナーゼドメインは斜字体で示されており、スペーサーは下線付き通常書体で示されており、Ｃａｓ９  Ｄ１０Ａ配列は、太字で示されており、ＮＬＳ配列は太字斜字体で示されている。
【図１−７】デアミナーゼ−Ｃａｓ９融合構築物のヌクレオチド及びタンパク質配列を示す図である。ｒＡＰＯＢＥＣ−Ｃａｓ９−ＵＧＩ−ＮＬＳ構築物について、ヌクレオチド配列（配列番号１）及びタンパク質配列（配列番号２）の両方において、ｒＡＰＯＢＥＣ配列は斜字体で示されており、Ｃａｓ９配列は太字で示されており、ＵＧＩ配列は下線付き斜字体で示されており、スペーサーは下線付き通常書体で示されており、ＮＬＳ配列は太字斜字体で示されている。Ｄ１０及びＨ８４０アミノ酸コドン／残基は影が付けられている。構築物ＫＧ１００９８にＤ１０Ａ変化が導入されている。ＴａｄＡ−Ｃａｓ９  Ｄ１０Ａ−ＮＬＳ構築物について、ヌクレオチド配列（配列番号３）及びタンパク質配列（配列番号４）の両方において、デアミナーゼドメインは斜字体で示されており、スペーサーは下線付き通常書体で示されており、Ｃａｓ９  Ｄ１０Ａ配列は、太字で示されており、ＮＬＳ配列は太字斜字体で示されている。
【図２】使用されたｓｇＲＮＡカセット（配列番号５〜１２）を示す図である。シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）Ｕ６プロモーターの配列は下線を引かれ、標的遺伝子座と同一のｓｇＲＮＡの２０ｂｐｓは、太字で示されており、ｓｇＲＮＡの残りは斜字体で示されている。
【図３】トマトのＬＩＮ５遺伝子座での標的塩基変更を示す図である。構築物ＫＧ１００９８（ｐＫ２ＧＷ７：：ｒＡＰＯＢＥＣ１−Ｃａｓ９  Ｄ１０Ａ−ＵＧＩ−ＮＬＳ）、ＫＧ１０１２６（ｐＫ２ＧＷ７：：ｒＡＰＯＢＥＣ１−Ｃａｓ９−ＵＧＩ−ＮＬＳ）又はＫＧ１０４３６（ＴａｄＡ−Ｃａｓ９  Ｄ１０Ａ−ＮＬＳ）は、ＬＩＮ５  ｓｇＲＮＡ発現プラスミドＫＧ１００７５（配列番号５）又はＫＧ１０２５２（配列番号６）との組合せで使用された。２０ｂｐｓ  ＬＩＮ５標的部位は、参照（配列番号１３〜１７）として、下に列挙されている特異的配列変更を示す配列読み取りデータの百分率と共に示されている。同一のヌクレオチドはドット（．）で及び欠損ヌクレオチドはダッシュ（−）で示されている。ＰＡＭ配列は、太字で示されている。
【図４】再生された植物のＬＩＮ５遺伝子座において見出された変異を示す図である。ＫＧ１００７５及びＫＧ１０２５２標的配列を含有するＬＩＮ５領域は、異なる変異体カルスから再生された植物から増幅され、次に配列決定された。ＷＴ標的配列（配列番号１８）及び、その下に各植物株において見出された配列（配列番号１９〜２４）が示されている。ヌクレオチド変更は下線が引かれている。Ｙ＝（Ｃ／Ｔ）、Ｒ＝（Ｇ／Ａ）。元のトランスフェクションにおいて使用されたＬＩＮ５  ｓｇＲＮＡ発現プラスミドも示されている。
【図５】標的脱アミノ化を使用してトマトＡＬＳ遺伝子座に除草剤抵抗性を創出することを示す図である。トマトＡＬＳ２遺伝子由来の標的領域（２本鎖）の配列は、太字で示されたコドンＰ１８４及びＳ６４０と共に示されている（配列番号２５〜２８）。
【図６−１】ＡＬＳコドンＰ１８４及びＳ６４０の変異導入を示す図である。トマトＡＬＳ２遺伝子中のコドンＰ１８４及びＳ６４０周囲の配列が示されている（配列番号２９〜３１）。特異的ｓｇＲＮＡによって導入され得る変異及びアミノ酸配列に生じる影響が示されている。同一のヌクレオチドはドット（．）で示されている。
【図６−２】ＡＬＳコドンＰ１８４及びＳ６４０の変異導入を示す図である。トマトＡＬＳ２遺伝子中のコドンＰ１８４及びＳ６４０周囲の配列が示されている（配列番号２９〜３１）。特異的ｓｇＲＮＡによって導入され得る変異及びアミノ酸配列に生じる影響が示されている。同一のヌクレオチドはドット（．）で示されている。
【図６−３】ＡＬＳコドンＰ１８４及びＳ６４０の変異導入を示す図である。トマトＡＬＳ２遺伝子中のコドンＰ１８４及びＳ６４０周囲の配列が示されている（配列番号２９〜３１）。特異的ｓｇＲＮＡによって導入され得る変異及びアミノ酸配列に生じる影響が示されている。同一のヌクレオチドはドット（．）で示されている。
【図７】ＡＬＳ遺伝子座にＣからＴへの変異を有する再生植物を示す図である。ＡＬＳ１／ＡＬＳ２  Ｐ１８６／Ｐ１８４コドン（Ａ）及びＡＬＳ２  Ｓ６４０コドン（Ｂ）に見出された変異。Ｐ１８６／Ｐ１８４及びＳ６４０コドンは、下線を引かれ、各株における変異及び変異がもたらしたアミノ酸変更が、示されている。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、細胞中のＤＮＡを、部位特異的ヌクレアーゼドメイン及びデアミナーゼドメインを含む少なくとも１つの融合タンパク質と接触させるステップを含む、細胞、好ましくは植物細胞における標的ヌクレオチド編集のための方法を提供する。前記部位特異的ヌクレアーゼドメインは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼであり、前記方法が、部位特異的ヌクレアーゼをＤＮＡ中の標的配列に標的化するためのガイド配列をそれぞれ含む１つ又は複数のガイドＲＮＡとＤＮＡを接触させるステップをさらに含むことが好ましい。前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、Ｃａｓ９又はＣｐｆ１であることが好ましい。デアミナーゼドメインは、アポリポタンパク質Ｂ  ｍＲＮＡ編集複合体（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリーデアミナーゼ、活性化誘導シトシンデアミナーゼ（ＡＩＤ）、ＡＣＦ１／ＡＳＥデアミナーゼ、アデニンデアミナーゼ及びＡＤＡＴファミリーデアミナーゼからなる群から選択されることが好ましい。
【００１０】
少なくとも１つの融合タンパク質のデアミナーゼドメインは、ヌクレアーゼドメインのＮ末端に融合されていることが好ましい。
【００１１】
本発明の方法は、ＤＮＡを、少なくとも第１の及び第２の融合タンパク質と接触させるステップを含み、第１の融合タンパク質はシトシンデアミナーゼドメインを含み、第２の融合タンパク質はアデニンデアミナーゼドメインを含むことが好ましい。
【００１２】
シトシンデアミナーゼを含む融合タンパク質は、好ましくはヌクレアーゼドメインのＣ末端に融合されているウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害ドメインをさらに含む場合がある。
【００１３】
任意選択で、本発明の方法において使用される少なくとも１つの融合タンパク質及び／又は１つ若しくは複数のガイドＲＮＡは、細胞における前記融合タンパク質及び／又は前記ガイドＲＮＡの発現のための１つ又は複数のＤＮＡ構築物を細胞に導入することによってＤＮＡに接触される。
【００１４】
任意選択で、本発明の方法において使用される少なくとも１つの融合タンパク質及び／又は１つ若しくは複数のガイドＲＮＡは、前記融合タンパク質及び／又は前記ガイドＲＮＡを細胞に導入することによってＤＮＡに接触される。
【００１５】
融合タンパク質、１つ若しくは複数のガイドＲＮＡ及び／又は同じ物をコードする構築物は、ポリエチレングリコール媒介形質転換を使用して、好ましくはＰＥＧを含む水性培地を使用して細胞に導入されることが好ましい。本発明の方法の細胞が植物細胞である場合、本発明の方法は、標的変化を含む植物又はその子孫を再生するステップをさらに含み得る。
【００１６】
本発明は、本発明の方法によって得られる植物、植物部分、植物産物、種子又は植物細胞であって、細胞が植物細胞であり、植物、植物部分、種子又は植物細胞が、対照の植物、植物部分、植物産物、種子又は植物細胞と比較した場合の導入された標的変化を含むことによって改変され、好ましくは対照の植物、植物部分、植物産物、種子又は植物細胞が、標的変化が前記請求項のいずれかの方法によって導入される前の植物、植物部分、植物産物、種子又は植物細胞である、植物、植物部分、植物産物、種子又は植物細胞をさらに提供する。
【００１７】
本発明は、細胞、好ましくは植物細胞におけるＤＮＡの標的ヌクレオチド編集における、本明細書に定義される少なくとも１つの融合タンパク質又は同じ物をコードする構築物の使用をさらに提供する。
【００１８】
本発明は、本発明の第１の及び第２の融合タンパク質又は同じ物をコードする構築物（複数可）を含む組成物であって、第１の融合タンパク質がシトシンデアミナーゼドメインを含み、第２の融合タンパク質がアデニンデアミナーゼドメインを含む組成物も提供する。
【００１９】
本発明は、本発明の少なくとも第１の及び第２の融合タンパク質を含む標的ヌクレオチド編集のためのキットであって、第１の融合タンパク質がシトシンデアミナーゼドメインを含み、第２の融合タンパク質がアデニンデアミナーゼドメインを含む、キットも提供する。
【定義】
【００２０】
本発明の方法、組成物、使用及び他の態様に関する種々の用語は、明細書及び特許請求の範囲を通じて使用される。そのような用語は、別に示されない限り、本発明が属する技術分野におけるそれらの通常の意味を与えられている。他に具体的に定義される用語は、本明細書で提供される定義と一致する様式で解釈される。本明細書に記載されるものに類似又は等価の任意の方法及び材料は、本発明の検査のための実施において使用され得るが、好ましい材料及び方法は、本明細書に記載されている。
【００２１】
「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」：これらの単数形語は、内容が他を明確に示さない限り複数形を含む。したがって、例えば「細胞」を参照することは、２つ以上の細胞の組合せなどを含む。
【００２２】
本明細書において使用される場合、用語「約」は、小さな変動を記載及び説明するために使用される。例えば、用語は、±５％以下、±４％以下、±３％以下、±２％以下、±１％以下、±０．５％以下、±０．１％以下又は±０．０５％以下などの±１０％以下を指し得る。追加的に量、比及び他の数値は、範囲の形式で本明細書に表される場合がある。そのような範囲の形式が簡便及び簡潔のために使用され、範囲の限界として明確に指定された数値を含むだけでなく、その範囲内に包含されるすべての個々の数値又は部分的範囲も、各数値及び部分的範囲が明確に指定されたように含んで柔軟に理解されるべきである。例えば、約１〜約２００の範囲内の比は、約１及び約２００の明確に引用される限界を含むだけでなく、約２、約３及び約４などの個々の比、並びに約１０〜約５０、約２０〜約１００などの部分的範囲も含んで理解されるべきである。
【００２３】
「及び／又は」：用語「及び／又は」は、述べられている場合の１つ又は複数が、単独で又は、述べられている場合の少なくとも１つから述べられている場合のすべてまでの組合せで生じ得る状況を指す。
【００２４】
「コドン最適化」：この用語は、第２の生物におけるタンパク質翻訳に適合させ、最適化するための、第２の異なる生物（例えば植物）において同じアミノ酸についてより頻繁に使用されており、コードしているコドンを用いる第１の生物（例えば細菌）由来の核酸のコドンの１つ又は複数の置き換え（複数可）を指す。
【００２５】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」：この用語は、包括的及びオープンエンドであり、排他的ではないとして解釈される。具体的には、用語及びその変形は、指定された特性、ステップ又は構成成分が含まれていることを意味する。これらの用語は、他の特性、ステップ又は構成成分の存在を排除すると解釈されない。
【００２６】
「構築物」又は「核酸構築物」又は「ベクター」：これは、組換えＤＮＡ技術の使用から生じた人工核酸分子を指し、宿主細胞に外来性ＤＮＡを送達するために使用され、構築物に含まれるＤＮＡ領域の宿主細胞における発現の目的をしばしば有する。構築物のベクター骨格は、（キメラ）遺伝子が組み込まれる例えばプラスミドであってもよく、好適な転写制御配列が既に存在する（例えば（誘導性）プロモーター）場合は、望ましいヌクレオチド配列（例えばコード配列）だけが転写制御配列の下流に組み込まれる。ベクターは、分子クローニングにおけるそれらの使用を促進するために、例えば選択可能マーカー、マルチクローニング部位などのさらなる遺伝エレメントを含む場合がある。
【００２７】
「例示的」：この用語は、「例、実例又は図解として役立つこと」を意味し、本明細書において開示される他の構成を排除するとして解釈されるべきでない。
【００２８】
「発現」：これは、適切な制御領域、特にプロモーターに作動可能に連結されたＤＮＡ領域が、次にタンパク質又はペプチドに翻訳されるＲＮＡに転写される工程を指す。
【００２９】
「ガイドＲＮＡ」は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを標的配列に標的化するＲＮＡとして本明細書において理解され、Ｃｐｆ１との組合せで使用されるなどのＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、又は２つのＲＮＡ鎖として若しくは、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）として当技術分野において周知である単一の融合物としてのｃｒＲＮＡとトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との組合せであってもよい。ｓｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡとトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の少なくとも部分との間の融合物として操作される。ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡ又はｓｇＲＮＡの組合せは、Ｃａｓ、好ましくはＣａｓ９との組合せで使用され得る。
【００３０】
「ガイド配列」は、二重鎖ＤＮＡ中の標的配列にｓｇＲＮＡ又はｃｒＲＮＡを標的化するための、ｓｇＲＮＡ又はｃｒＲＮＡのセクションとして本明細書において理解される。
【００３１】
「植物」：これは、植物細胞、植物プロトプラスト、植物が再生され得る植物細胞組織培養物、植物カルス、植物凝集塊及び、胚、花粉、胚珠、種子、葉、花、枝、果実、仁（ｋｅｒｎｅｌ）、穂、穂軸（ｃｏｂ）、外皮、柄、根、根端、葯、子実などの植物又は植物の部分においてインタクトである植物細胞を含む。植物の非限定的例として、オオムギ、キャベツ、キャノーラ、キャッサバ、カリフラワー、チコリ、ワタ、キュウリ、ナス、ブドウ、トウガラシ、レタス、トウモロコシ、メロン、アブラナ、ジャガイモ、カボチャ（ｐｕｍｐｋｉｎ）、イネ、ライムギ、モロコシ、カボチャ（ｓｑｕａｓｈ）、サトウキビ、サトウダイコン、ヒマワリ、ピーマン、トマト、スイカ、コムギ及びズッキーニなどの作物及び栽培植物が挙げられる。
【００３２】
「核酸配列」又は「ヌクレオチド配列」：これは、ヌクレオチドの又は核酸内の順序を指す。言い換えると、核酸におけるヌクレオチドの任意の順序は、核酸配列の配列と称され得る。同様に「標的配列」は、標的化される、すなわち変化が導入される核酸内のヌクレオチドの順序を記す。本発明の内容において第１の標的核酸配列は、さらなる標的核酸配列内に含まれる、又はそれと重複し得る。標的配列は、ＤＮＡ二重鎖の第１の鎖に含まれるヌクレオチドの順序であり得る。
【００３３】
用語「デアミナーゼ」は、脱アミノ化反応を触媒する酵素を指す。一部の実施形態では、デアミナーゼは、シトシンからウラシルへの加水分解性脱アミノ化を触媒するシトシンデアミナーゼである。デアミナーゼは、また、アデニンの脱アミノ化を触媒し、それによりアデニンをイノシンに変換するアデニンデアミナーゼであり得る。
【００３４】
本明細書において使用される場合、用語「有効量」は、望ましい生物学的応答を誘発するために十分である生物学的活性剤の量を指す。例えば、一部の実施形態では、ヌクレアーゼの有効量は、ヌクレアーゼによって特異的に結合され、切断される標的部位の切断を誘導するために十分であるヌクレアーゼの量を指し得る。一部の実施形態では、本明細書で提供される融合タンパク質、例えばヌクレアーゼドメイン及びデアミナーゼドメインを含む融合タンパク質の有効量は、融合タンパク質によって特異的に結合され、編集される標的部位の編集を誘導するために十分である融合タンパク質の量を指し得る。当業者によって理解されるとおり、作用剤、例えば融合タンパク質、ヌクレアーゼ、デアミナーゼ、リコンビナーゼ、ハイブリッドタンパク質、タンパク質二量体、タンパク質（若しくはタンパク質二量体）とポリヌクレオチドとの複合体又はポリヌクレオチドの有効量は、例えば、望ましい生物学的応答、例えば、特異的対立遺伝子、ゲノム又は編集される標的部位、標的化される細胞若しくは組織及び使用される作用剤などの種々の要因に応じて変動する場合がある。
【００３５】
特定の核酸又はポリペプチドのヌクレオチド又はポリペプチド「変種」は、特定のヌクレオチド又はポリペプチドに「由来する」ヌクレオチド又はポリペプチドとして本明細書において理解される。例えば、配列番号１若しくは３を有する核酸の変種、又は配列番号１若しくは３を有する核酸由来の核酸は、それぞれ配列番号１又は３に少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０、９１、９２、９３、９４、９５  ９６  ９７、９８又は少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を好ましくは含む、又はそれからなる。さらなる例では、配列番号２若しくは４を有するポリペプチド若しくはタンパク質の変種、又は配列番号２若しくは４を有するポリペプチド若しくはタンパク質由来のポリペプチド若しくはタンパク質は、それぞれ配列番号２又は４に少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０、９１、９２、９３、９４、９５  ９６  ９７、９８又は少なくとも９９％の同一性を含む又はそれからなるアミノ酸配列を好ましくは含む又はそれからなる。
【詳細な説明】
【００３６】
本明細書に記載される任意の方法、使用又は組成物が、本明細書に記載される任意の他の方法、使用又は組成物に関して実行され得ることは検討される。本発明の方法、使用及び／又は組成物の内容において考察される実施形態は、本明細書に記載される任意の他の方法、使用又は組成物に関して使用され得る。したがって、１つの方法、使用又は組成物に関する実施形態は、本発明の他の方法、使用及び組成物にも同様に適用され得る。
【００３７】
本明細書に具体化かつ広く記載されるとおり、本発明は、デアミナーゼドメインに融合された部位特異的ヌクレアーゼドメインを使用する細胞、好ましくは植物細胞におけるＤＮＡの標的編集のための方法に方向付けられている。さらに詳細には本発明は、細胞においてＤＮＡ、好ましくはゲノムＤＮＡを、部位特異的ヌクレアーゼドメイン及びデアミナーゼドメインを含む少なくとも１つの融合タンパク質に接触させるステップを含む、細胞、好ましくは植物細胞における標的ヌクレオチド編集のための方法を提供する。任意選択で、少なくとも２つの異なる融合タンパク質が本発明の方法において使用され、好ましくは第１の融合タンパク質はシトシンデアミナーゼドメインを含み、第２の融合タンパク質はアデニンデアミナーゼドメインを含む。本発明者らは、本方法を使用して植物細胞の有効な標的ヌクレオチド編集を初めて報告する。本発明による方法は、特に、これだけに限らないが植物細胞に存在する二重鎖ＤＮＡ中に存在する目的の遺伝子座での予め定義された所望の改変の正確な導入のために特に好適である。本発明の方法は、例えば微生物、哺乳動物細胞、真核細胞、ヒト細胞及び／又は動物細胞に存在する、二重鎖ＤＮＡ中に存在する目的の遺伝子座への予め定義された所望の改変の正確な導入のためにも使用され得る。細胞がヒト又は動物細胞である場合、本発明の方法はｅｘ  ｖｉｖｏ（例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ）方法であることが好ましい。任意選択で、本明細書において定義される方法は、ヒト又は動物の身体の処置のための方法ではない。任意選択で、本明細書において定義される方法は、ヒト又は動物の身体において実施されない。上に広範に記載された予期せぬ発見に加えて本発明者らは、本発明の方法において、さらにいっそう最適な結果が下に詳述されるいくつかの他の因子を含むことによって達成され得ることも見出した。
【００３８】
続く詳細な記載から、当業者は、細胞、好ましくは植物細胞におけるＤＮＡの標的変化のための方法が、細胞中の二重鎖ＤＮＡ分子中に標的変化又は改変を有する細胞の提供のための方法としての使用も見出し得ることを理解する。さらに、本発明の方法は、植物又は植物部分中の二重鎖ＤＮＡ分子中に標的変化又は改変を含む植物及びその子孫又は植物部分であって、変化又は改変が本発明による方法を用いて処置されていない植物又は植物部分の二重鎖ＤＮＡ分子に対するものである、植物及びその子孫又は植物部分を提供することができる。
【００３９】
本発明の方法を用いて、ヌクレオチドにおける変化（すなわち変更又は改変）は、細胞の二重鎖ＤＮＡに導入されてもよく、前記ＤＮＡの配列を変える。言い換えると、標的変化は、二重鎖ＤＮＡ中の（１つの）特異的部位（複数可）での１つ又は複数のヌクレオチドの特異的及び選択的変化である。
【００４０】
細胞中の二重鎖ＤＮＡは、第１のＤＮＡ鎖、第２のＤＮＡ鎖を含む。第２のＤＮＡ鎖は、第１のＤＮＡ鎖の相補体であり、二重鎖を形成するように第１のＤＮＡ鎖と対合する。例えば第１のＤＮＡ鎖配列ＡＴＴＴ（５’から３’への方向に）の相補体は、ＴＡＡＡ（３’から５’への方向）である。二重鎖ＤＮＡのＤＮＡは、任意の種類のＤＮＡ、内在性又は外来性、例えばゲノムＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、人工染色体、プラスミドＤＮＡ又はエピソームＤＮＡであり得る。二重鎖は、核又はオルガネラＤＮＡであり得る。ＤＮＡ二重鎖は染色体ＤＮＡであることが好ましく、細胞に内在性であることが好ましい。用語「ＤＮＡ」、「二重鎖ＤＮＡ」及び「ＤＮＡ分子」が、１本鎖ＤＮＡ分子が意図されることが内容から明白である場合を除いて本明細書において互換的に使用され得ることはさらに理解される。
【００４１】
本発明の内容において、ＤＮＡ二重鎖の第１のＤＮＡ鎖は、標的配列を含み、第２の（相補性）鎖は、標的配列にアンチセンスであり、標的配列にハイブリダイズできるヌクレオチド配列を含む。
【００４２】
当業者は、「標的配列」が標的化される、すなわち変化が導入されるヌクレオチドの順序（すなわちヌクレオチド配列）を記すためであることを理解している。言い換えると、第１の鎖は、本発明の方法を用いて標的化される、すなわち変化が導入される核酸配列を含む。
【００４３】
標的配列は、ＤＮＡの特定の部分又はセクションに限定されない。標的配列は、例えばイントロン若しくはエクソンの一部であってもよい、コード若しくは非コード配列の一部であってもよい、及び／又は調節エレメントの一部であってもなくてもよい。したがって標的配列は、第１の鎖に含まれるヌクレオチドの順序を指す。標的配列は、ＤＮＡ中に１回又は２回だけ存在することが好ましい。しかし標的配列は、細胞のＤＮＡ中にさらに頻繁に、例えばこれだけに限らないが３、４、５、６、７、８、９又は１０回存在する場合がある。
【００４４】
本発明の融合タンパク質の部位特異的ヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼである場合、第１の鎖の標的配列又は第２の鎖におけるそのアンチセンス配列は、特定のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼによって必要とされるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列によって隣接されている又はそれが続いている。ＰＡＭについての正確な配列及び長さ必要要件は、使用されるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに応じて異なるが、ＰＡＭは、典型的には、ガイドＲＮＡのガイド配列によって認識される配列に近接する２〜５塩基対配列である。当業者は、所与のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを用いる使用のためのさらなるＰＡＭ配列を同定できる。例えば、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼがＣａｓ９である場合、ガイド配列によって標的化される配列は、ＳｐＣａｓ９又はＳａＣａｓ９酵素（又はそれ由来の酵素）のための好適なＰＡＭ、例えば５’−ＮＲＧ（例えば５’−ＮＧＧ）又は５’−ＮＮＧＲＲによってその３’末端でそれぞれ隣接される。ヌクレアーゼがＣｐｆ１である場合、ガイド配列によって標的化される配列は、好適なＰＡＭ、例えば５’−ＴＴＴＮによってその５’末端で隣接される。
【００４５】
さらに詳細には本発明は、ＤＮＡ分子を部位特異的ヌクレアーゼ及びデアミナーゼドメインを含む少なくとも１つの融合タンパク質と接触させるステップを含む、植物細胞における標的ヌクレオチド編集のための方法を提供する。
【００４６】
本発明の方法では、標的化されるＤＮＡを含む細胞、好ましくは植物細胞が提供され、前記ＤＮＡは、少なくとも部位特異的ヌクレアーゼドメイン及びデアミナーゼドメインを含む少なくとも１つの融合タンパク質に曝露される。本明細書においてさらに詳述されるとおりヌクレアーゼドメインがＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼである場合、ＤＮＡは、融合タンパク質をＤＮＡ鎖中の標的配列に標的化するためのガイドＲＮＡにさらに曝露される。任意選択で、融合タンパク質及び任意選択でガイドＲＮＡと共に、ＤＮＡ分子は、本明細書においてさらに詳述される機能性タンパク質にさらに曝露されてもよい。ＤＮＡ分子は、融合タンパク質並びに任意選択でガイドＲＮＡ及び／又はさらなる機能性タンパク質に、ヌクレオチド塩基の脱アミノ化のために有効な量及び好適な条件下で曝露される。シトシンの脱アミノ化は、ウラシルへの直接変換をもたらし、それによりＣからＴへの置換又は相補鎖が標的化される場合はＧからＡへの置換を引き起こす。アデニンの脱アミノ化は、イノシンへの直接変換をもたらし、それによりＡからＧへの置換又は相補鎖が標的化される場合はＴからＣへの置換を引き起こす。本方法の態様は、本明細書下にさらに詳述される。
【００４７】
植物細胞
本明細書において示されるとおり、本発明の方法は、ＤＮＡが編集されることが望まれる任意の種類の細胞に適用され得る。細胞は植物細胞であることが好ましい。本発明により、植物細胞がＤＮＡ二重鎖の、本明細書において定義される融合タンパク質（例えば部位特異的ヌクレアーゼを含む）、及び一部の実施形態ではガイドＲＮＡへの曝露を許容する限り、任意の種類の植物細胞が方法において使用され得る。しかし、好ましい実施形態では植物細胞は、植物プロトプラストである。当業者は、植物プロトプラストを調製及び増殖させるための方法及びプロトコールを認識している、例えばＰｌａｎｔ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＩＳＢＮ：９７８−０−１２−４１５９２０−４、Ｒｏｂｅｒｔａ  Ｈ．Ｓｍｉｔｈ）を参照されたい。本発明の方法における使用のための植物プロトプラストは、植物細胞プロトプラストの生成のために使用される一般的手順を使用して（例えばマセラーゼ（ｍａｃｅｒａｓｅ）及び／又はセルラーゼ及びペクチナーゼを使用して）提供され得る。
【００４８】
植物細胞プロトプラストシステムは、例えばトマト、タバコ及びさらに多数（ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）、ダウカス・カロタ（Ｄａｕｃｕｓ  ｃａｒｏｔａ）、ラクツカ・サティバ（Ｌａｃｔｕｃａ  ｓａｔｉｖａ）、ジー・メイズ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、ニコチアナ・ベンサミアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）、ペチュニア・ハイブリダ（Ｐｅｔｕｎｉａ  ｈｙｂｒｉｄａ）、ソラナム・ツベロスム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、オリザ・サティバ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ））について記載されている。本発明は、参照により本明細書に組み込まれる次の参考文献：Ｂａｒｓｂｙ  ｅｔ  ａｌ．１９８６，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ５（２）：１０１〜１０３；Ｆｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９２，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．１１（１２）：６３２〜６３６；Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．１９９９，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ５９：１８９〜１９６；Ｎｉｅｄｚ  ｅｔ  ａｌ．１９８５，Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３９：１９９〜２０４；Ｐｒｉｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓｏｎｄａｈｌ，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：５８９〜５９４；Ｓ．Ｒｏｅｓｔ  ａｎｄ  Ｇｉｌｉｓｓｅｎ  １９８９，Ａｃｔａ  Ｂｏｔ．Ｎｅｅｒｌ．３８（１）：１〜２３；Ｓｈｅｐａｒｄ  ａｎｄ  Ｔｏｔｔｅｎ，１９７５，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．５５：６８９〜６９４；Ｓｈｅｐａｒｄ  ａｎｄ  Ｔｏｔｔｅｎ，１９７７，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．６０：３１３〜３１６のいずれか１つに記載されているシステムがこれだけに限らないが挙げられる、任意のプロトプラストシステムに一般に適用可能である。
【００４９】
本明細書において説明されるとおり、当業者は、本発明の方法が異なる種類の植物細胞、例えば異なる植物種の植物細胞に適用され得ることを理解している。実際に、本明細書において開示される本発明が、広範な植物、単子葉植物及び双子葉植物の両方の植物細胞に適用され得ることは考慮される。非限定的例として、ウリ科（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ）、ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）及びイネ科（Ｇｒａｍｉｎｅａｅ）、トウモロコシ／コーン（ゼア種（Ｚｅａ  ｓｐｅｃｉｅｓ））、コムギ（トリチカム種（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ））、オオムギ（例えばホルデウム・ブルガレ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ））、カラスムギ（例えばアヴィーナ・サティバ（Ａｖｅｎａ  ｓａｔｉｖａ））、モロコシ（ソルガム・バイカラー（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ））、ライムギ（セカレ・セレアレ（Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ））、ダイズ（グリシン種（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｓｐｐ）、例えばＧ．マックス（Ｇ．ｍａｘ））、ワタ（ゴシッピウム種（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばＧ．ヒルスツム（Ｇ．ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、Ｇ．バーバデンス（Ｇ．ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ））、ブラシカ種（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｓｐｐ．）（例えばＢ．ナプス、Ｂ．ジュンセア（Ｂ．ｊｕｎｃｅａ）、Ｂ．オレラセア（Ｂ．ｏｌｅｒａｃｅａ）、Ｂ．ラパ（Ｂ．ｒａｐａ）など）、ヒマワリ（ヘリアンタス・アヌウス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｓ））、ベニバナ、ヤムイモ、キャッサバ、アルファルファ（メディカゴ・サティバ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ））、イネ（オリザ種（Ｏｒｙｚａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばＯ．サティバ・インディカ（Ｏ．ｓａｔｉｖａ  ｉｎｄｉｃａ）栽培品種群又はジャポニカ栽培品種群）、フォレージグラス（ｆｏｒａｇｅ  ｇｒａｓｓｅｓ）、セトウジンビエ（ペニセタム種（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ  ｓｐｐ．）例えばＰ．グラウカム（Ｐ．ｇｌａｕｃｕｍ））、樹種（マツ、ポプラ、モミ、プランテン（ｐｌａｎｔａｉｎ）など）、チャ、コフィア属、油ヤシ、ココナッツ、エンドウマメ、ズッキーニ、マメ（例えばファセオルス種（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ））、キュウリ、アーティチョーク、アスパラガス、ブロッコリー、ニンニク、ニラ、レタス、タマネギ、ラディッシュ、レタス、カブ、芽キャベツ、ニンジン、カリフラワー、チコリ、セロリ、ホウレンソウ、エンダイブ、ウイキョウ、テンサイなどの野菜種、新鮮果実を結実する植物（ブドウ、モモ、プラム、イチゴ、マンゴー、リンゴ、プラム、サクランボ、アンズ、バナナ、ブラックベリー、ブルーベリー、カンキツ類、キーウィ、イチジク、レモン、ライム、ネクタリン、ラズベリー、スイカ、オレンジ、グレープフルーツなど）、装飾花種（例えばバラ、ペチュニア、キク、ユリ、ガーベラ種）、ハーブ（ミント、パセリ、バジル、タイムなど）、木質木（例えばポプラ、ヤナギ、カシ、ユーカリの種）、繊維種、例えば亜麻（リナム・ウシタティッシムム（Ｌｉｎｕｍ  ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ））及び大麻（カンナビス・サティバ（Ｃａｎｎａｂｉｓ  ｓａｔｉｖａ））又はアラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）などのモ���ル生物、由来の植物細胞が挙げられる。
【００５０】
しかし、好ましい実施形態では植物細胞は、ジャガイモ又はトマト（例えばソラナム・リコペルシカム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ））などのソラナム種（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ）から得られた植物細胞である。
【００５１】
当業者は、種々の植物についての植物プロトプラストの調製のために当技術分野において利用可能な方法を使用することによって植物プロトプラストを供給できる。例えば、植物プロトプラストは、植物全体、植物の部分又は植物細胞をセルロース若しくはペクチナーゼなどの酵素を用いて処置することによって、又は細胞壁を除去するための適切な機械的手段によって調製され得る。得られた植物プロトプラストは、次にそれらを安定形態で維持するために浸透圧調整剤を含有する水溶液中に置かれる（例えばＲｅｕｓｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９６６）１５４（３７４６）：２８０〜２８１  ＤＯＩ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１５４．３７４６．２８０又はＭｕｈｌｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔａ（１９８０）１４８（１）：８９〜９６を参照されたい）。
【００５２】
当業者は、本発明の内容においてどのように植物細胞を提供するか、例えば好適な培地中の好適な温度に生植物細胞を供給することによることを理解している。細胞の数はいかなる方法においても限定されないが、一般に植物細胞の集団が提供されることは当業者によって理解される。非限定的な細胞数は、方法において使用される水性培地１ミリリットルあたり例えば植物細胞１０，０００〜２，０００，０００個であり得る。植物細胞は同じ種由来であることが好ましいが、一部の実施形態では、１種より多い種の植物細胞が同じ実験において使用され得る。
【００５３】
融合タンパク質
本発明の方法において使用される１つ又は複数の融合タンパク質は、少なくとも１つの部位特異的ヌクレアーゼドメイン及び少なくとも１つのデアミナーゼドメインを含む。
【００５４】
部位特異的ヌクレアーゼドメイン
部位特異的ヌクレアーゼドメインは、ＤＮＡ分子内の具体的な認識配列に結合し、認識する部位特異的ヌクレアーゼである、又はそれに由来する又はその変種である。二重鎖ＤＮＡに結合すると、触媒的に活性な部位特異的ヌクレアーゼは、厳密に決定された様式でＤＮＡ鎖の一方又は両方を切断することができる。本明細書において定義される融合タンパク質のヌクレアーゼドメインは、本明細書下に詳述するとおり、活性又は部分的に若しくは全体的に触媒的に不活性である場合がある。
【００５５】
ヌクレアーゼドメインは、任意の種類の部位特異的ヌクレアーゼ又はその変種若しくは断片であり得る。ヌクレアーゼドメインは、Ｃａｓ９又はＣｐｆ１などのＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼである、又はその変種であることが好ましい。任意選択で、ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ又はＴＡＬＥヌクレアーゼである。ＴＡＬＥヌクレアーゼは、細菌ヌクレアーゼＦｏｋＩに融合されたＴＡＬＥ結合ドメインを有するヌクレアーゼである。ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ヌクレアーゼの１つ又は複数のドメインが不活性化されている変異体ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼであってもよい。Ｃａｓ９及びＣｐｆ１は、それぞれがＤＮＡ二重鎖の１本鎖を切断する２つのヌクレアーゼドメインを含む。これらのドメインの１つが不活性化される場合、２本鎖ＤＮＡの１本の鎖を切断するニッカーゼが生じる。両方のドメインが不活性化される場合、核酸切断活性を全く有さないデッドヌクレアーゼが生じる。
【００５６】
ヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼである場合、前記ヌクレアーゼはＲＮＡガイドヌクレアーゼである。ＲＮＡガイドヌクレアーゼは、ヌクレアーゼドメイン及び、ガイドＲＮＡと相互作用する少なくとも１つのドメインを含む。ＲＮＡガイドヌクレアーゼは、ガイドＲＮＡによって特定の核酸配列に方向付けられる。ガイドＲＮＡは、ＲＮＡガイドヌクレアーゼ及びＤＮＡ中の特異的認識配列と相互作用し、特異的ヌクレオチド酸配列を含む部位に方向付けられると、ＲＮＡガイドヌクレアーゼは、ヌクレアーゼの１つ又は両方のドメインが触媒的に活性である場合、それぞれ標的部位に１本又は２本鎖のブレイクを導入できる。
【００５７】
それと共に、本発明の方法は、部位特異的ヌクレアーゼをＤＮＡ分子中の標的部位に標的化するためのガイド配列を含む、ガイドＲＮＡにＤＮＡを接触させることをさらに含み得る。ＤＮＡに接触しているガイドＲＮＡはヌクレアーゼドメイン（複数可）とも同時に相互作用することが好ましい。当業者は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを含むＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳシステムの異なる構成成分をどのように調整するかを承知している。先行技術では、その設計及び使用について多数の報告が利用可能である。例えば、すべてが参照により本明細書に組み込まれる、ガイドＲＮＡの設計及びＣＡＳ−タンパク質（化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）から最初に得られた）とのその組合せ使用についてＨａｅｕｓｓｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ（Ｊ  Ｇｅｎｅｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．（２０１６）４３（５）：２３９〜５０．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｇｇ．２０１６．０４．００８．）による近年の概説又はＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ（２０１６）１４（２）４４８〜４６２）による近年の概説を参照されたい。したがって、当業者は、触媒的に活性なＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと組み合わせる場合にＤＮＡ分子中の予め定義された部位への鎖ブレイクの導入に影響を与える様式でガイドＲＮＡをどのように設計するかを十分認識している。
【００５８】
ヌクレアーゼドメインは、細菌化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（ＳｐＣａｓ９；ＮＣＢＩ参照配列ＮＣ＿０１７０５３．１；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｑ９９ＺＷ２）に由来するＣａｓ９タンパク質であり得る又はその変種であり得る。変種は、Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５（Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ２０１５，５２３，４８１〜４８５）に記載されているＳｐＣａｓ９  ＶＱＲ変異体、ＳｐＣａｓ９  ＶＲＥＲ変異体及び／又はＳｐＣａｓ９  ＥＱＲ変異体であり得る。ストレプトコッカス・アウレウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９又はＳａＣａｓ９（ＣＣＫ７４１１７３．１）及び、ＳａＣａｓ９  ＫＫＨ変異体（Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０１５，３３，１２９３〜１２９８）、ＧｅｏＣａｓ９（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２０１７  Ｎｏｖ  １０；８（１）：１４２４）及びＴｈｅｒｍｏＣａｓ９（Ｍｏｕｇｉａｋｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ２０１７  Ｎｏｖ  ２１；８（１）：１６４７）若しくはこれらの変種、などのこれらの変種などの他のＣａｓ９タンパク質も有用であり得る。ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質のさらに有用な例として、これだけに限らないがＣＡＳ９、ＣＳＹ４、ｄＣＡＳ９及びｄＣＡＳ９エフェクタードメイン（活性化因子及び／又は阻害ドメイン）融合タンパク質、並びにＣｐｆ１など及び例えばＺｅｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｅｌｌ  １６３，７５９〜７７１）によって２０１５年に及びＷＯ２０１５／００６７４７において記載されたなどの別の例が挙げられる。Ｃｐｆ１は、例えばＡｓＣｐｆ１（アシダミノコッカス（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）由来）及びＬｂＣｐｆ１（ラクノスピラセアエ（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）由来）又はこれらの変種であってもよい。Ｃｐｆ１は、Ｃｌａｓｓ  ２  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの単一ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼである（例えばＣｅｌｌ（２０１５）１６３（３）：７５９〜７７１を参照されたい。Ｃｐｆ１は、ｔｒａｃｒＲＮＡを欠失している単一ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼであり、Ｔリッチプロトスペーサー隣接モチーフを利用する。Ｃｐｆ１は、ねじれ型ＤＮＡ２本鎖ブレイクを介してＤＮＡを切断する。Ｃｐｆ１は、ヒト細胞において効率的なゲノム編集活性を有することが示されている。したがって、Ｃｐｆ１は、ＣＲＩＳＰＲシステムの一部として代替ＣＡＳ−タンパク質として使用され得る。
【００５９】
一般に、Ｃａｓ９タンパク質などのＣａｓタンパク質は、２つのヌクレアーゼドメインを含む。例えばＣａｓ９タンパク質は、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメイン及びＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインを含み得る。ＲｕｖＣ及びＨＮＨドメインは、ＤＮＡにおいて２本鎖ブレイクを作るように１本鎖を切るために共に作用する（Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７：８１６〜８２１）。通常ＤＳＢを導入するそのようなＣａｓタンパク質は、機能性ヌクレアーゼドメイン（例えば、ＲｕｖＣ様又はＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインのいずれか）を１つだけ含有するように又は機能性ヌクレアーゼドメインを含有しないように改変され得る。ヌクレアーゼドメインは、１つ又は複数のヌクレアーゼドメインがもはや機能性でない（すなわち、ヌクレアーゼ活性が存在しない）ように変異されているＣａｓタンパク質であってもよく、又はその変種であってもよく、それによりＣＲＩＳＰＲニッカーゼが創出される。例は、Ｄ１０Ａ（例えばＣｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ（Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１３）；３３９（６１２１）：８１９〜２３）によって記載されている）又はＨ８４０Ａなどの変異を有するＳｐＣａｓ９変種である。したがって、そのようなＣＲＩＳＰＲニッカーゼは、２本鎖核酸にニックを導入できるが、２本鎖ＤＮＡを切断しない。両方のドメインが、それらがもはや機能性でないように変異されている場合、ｄＣａｓが生じる。一例は、Ｄ１０Ａ及びＨ８４０Ａの両方の変異を有するＳｐＣａｓ９変種である。そのようなｄＣａｓは、２本鎖核酸に結合できるが、いずれの鎖も切断しない。ＣＲＩＳＰＲニッカーゼ及びｄＣａｓは当業者に周知であり、その例は本明細書他所で提供されている。ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの１つ又は両方のヌクレアーゼドメインは、部位特異的変異導入、ＰＣＲ媒介変異導入及び全遺伝子合成並びに当技術分野において周知の他の方法などの十分周知の方法を使用して改変、例えば不活性化され得る。
【００６０】
融合タンパク質のヌクレアーゼドメインは、Ｃａｓ９タンパク質全体若しくは変種を含み得る、若しくはそれからなり得る、又はその断片を含み得る。そのような断片は、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ又はｓｇＲＮＡに結合するが、ヌクレアーゼ活性のために必要な１つ又は複数の残基を欠いている場合があることが好ましい。上に示された好ましいＣａｓ９タンパク質に加えて、Ｃａｓ９は、コリネバクテリウム・ウルセロウス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｕｌｃｅｒｏｕｓ）（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｓ：ＮＣ＿０１５６８３．１、ＮＣ＿０１７３１７．１）；コリネバクテリウム・ジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｓ：ＮＣ＿０１６７８２．１、ＮＣ＿０１６７８６．１）；スピロプラズマ・シルフィディコラ（Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ  ｓｙｒｐｈｉｄｉｃｏｌａ）（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆ：ＮＣ＿０２１２８４．１）；プレボテラ・インターメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆ：ＮＣ＿０１７８６１．１）；スピロプラズマ・タイワネンス（Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ  ｔａｉｗａｎｅｎｓｅ）（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆ：ＮＣ＿０２１８４６．１）；ストレプトコッカス・イニアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｉａｅ）（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆ：  ＮＣ＿０２１３１４．１）；ベルリエラ・バルティカ（Ｂｅｌｌｉｅｌｌａ  ｂａｌｔｉｃａ）（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆ：ＮＣ＿０１８０１０．１）；サイクロフレクス・トルキシル（Ｐｓｙｃｈｒｏｆｌｅｘｕｓ  ｔｏｒｑｕｉｓｌ）（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆ：ＮＣ＿０１８７２１．１）；ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆ：ＹＰ＿８２０８３２．１）；リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ）（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆ：ＮＰ＿４７２０７３．１）；カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆ：ＹＰ＿００２３４４９００．１）；又はナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ，ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆ：ＹＰ＿００２３４２１００．１）由来のＣａｓ９であってもよい。包含されるのは、これら由来のＣａｓ９変種であり、不活性化ＨＮＨ及び／又は、ＳｐＣａｓ９  Ｄ１０Ａ、ＳｐＣａｓ９  Ｈ８４０Ａ及びＳｐＣａｓ９  Ｄ１０Ａ／Ｈ８４０Ａに相同性のＲｕｖＣドメインを有する。
【００６１】
近年発見されたＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓヌクレアーゼＣｐｆ１は、ＲｕｖＣヌクレアーゼドメインだけを含有すると最初考えられたが、ごく最近、構造的及び機能的研究は、Ｃｐｆ１がモノマーとして作用し、第２の推定新規ヌクレアーゼ（ＮＵＣ）ドメインを含有することを示している（Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１６）２６：９０１〜９１３，Ｙａｍａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ（２０１６）１６５（４）：９４９〜９６２を参照されたい）。
【００６２】
好ましい実施形態により、ヌクレアーゼドメインは、Ｃｐｆ１タンパク質又はその断片若しくは変種であってもよい。Ｃｐｆ１は、アシダミノコッカス種由来のＣｐｆ１；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｕ２ＵＭＱ６であってもよい。変種は、不活性化ＲｕｖＣ及び／又はＮＵＣドメインを有するＣｐｆ１であってもよく、ＲｕｖＣ及び／又はＮＵＣドメインは、もはやヌクレアーゼ活性を有さない。当業者は、不活性化ＲｕｖＣ、ＮＵＣ及び／又はＨＮＨドメインなどの不活性化ヌクレアーゼを可能にする、部位特異的変異導入、ＰＣＲ媒介変異導入及び全遺伝子合成などの当技術分野において利用可能な技術を十分認識している。本発明の方法のヌクレアーゼドメインは、不活性化ＮＵＣドメインを有するＣｐｆ１の変種であってもよい。そのような変種の一例は、Ｃｐｆ１  Ｒ１２２６Ａである（Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１６）２６：９０１〜９１３，Ｙａｍａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ（２０１６）１６５（４）：９４９〜９６２を参照されたい）。この変種において、ＮＵＣドメインを不活性化する、アルギニンからアラニンへの（Ｒ１２２６Ａ）変換がＮＵＣドメイン中にある。
【００６３】
別の実施形態では、部位特異的ヌクレアーゼは、ＴＡＬＥヌクレアーゼの機能性断片であってもよい。転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、ゲノム編集及び、標的２本鎖ブレイク（ＤＳＢ）を導入する、すなわちＤＮＡ二重鎖の両方の鎖が切断されるためのＺＦＮの代替として急に明らかになった。ＴＡＬＥＮは、ＺＦＮに類似しており、カスタマイズ可能なＤＮＡ結合ドメインに融合された非特異的ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインを含む。このＤＮＡ結合ドメインは、宿主植物細胞における遺伝子の転写を変化させるようにキサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）細菌によって分泌されるタンパク質である、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）由来の高度に保存された反復からなる。
【００６４】
より詳細には、ＴＡＬＥは、多数の反復タンパク質ドメインからなり、そのそれぞれは４個のＤＮＡヌクレオチド（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）の１つを特異的に認識でき、結合できる。各ヌクレオチドについて特異的なドメインは同定され、任意のＤＮＡ配列に高い結合親和性を有するこれらのドメインのアレイは産生され得る（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ，２０１０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １８６：７５７〜７６１；Ｃｏｒｍａｃ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３９：ｅ８２；Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ  ａｎｄ  Ｖｏｙｔａｓ，２０１１，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３３：１８４３〜１８４６；Ｂｏｃｈ，２０１１，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２９：１３５〜１３６）。次にこれらのアレイは、ＴＡＬＥＮを創出するようにＦｏｋＩのヌクレアーゼドメインに融合され、ＺＦＮと同様に、２個のＴＡＬＥＮタンパク質は、標的ＤＮＡ二重鎖においてＤＮＡ  ＤＳＢを誘導するために使用される。いくつかの論文は、標的配列に変異を創出するためのＴＡＬＥＮの使用を記載しており（Ｃｕｒｔｉｎ（２０１２）Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｇｅｎｏｍｅ，５，４２〜５０）．Ｊｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（２０１３）１４（１）：４９〜５５．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｍ３４８６Ａ）、標的ゲノム編集においてＴＡＬＥＮを使用する種々の技術を概説及び比較している。ＣＲＩＳＰＲシステムと同様に、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、効率的なゲノム編集ツールである。
【００６５】
任意選択で、部位特異的ヌクレアーゼドメインは、２本鎖にブレイクを導入しないが、鎖の１本にニックだけを導入するＴＡＬＥヌクレアー又はその機能性断片である。任意選択で、前記部位特異的ヌクレアーゼドメインは、ヌクレアーゼ活性を有さない、すなわちＴＡＬＥヌクレアーゼの両方のドメイン又はモノマーが不活性であるＴＡＬＥヌクレアーゼ又はその機能性断片である。当業者は、ＴＡＬＥニッカーゼ又はヌクレアーゼ不活性ＴＡＬＥの提供を可能にする、部位特異的変異導入、ＰＣＲ媒介変異導入及び全遺伝子合成などの当技術分野において利用可能な技術を十分認識している。ＴＡＬＥニッカーゼの例は、当技術分野において記載されている（例えば、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．（２０１４）２０１４  Ｍａｒ  ２８；４４６（１）：２６１〜２６６及びＬｕｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ６（２０１６），Ａｒｔｉｃｌｅ  ｎｕｍｂｅｒ：２０６５７並びにＷＯ２０１５／１６４７４８を参照されたい）。ＴＡＬＥモノマーの不活性化は、鎖特異的ニッキング活性を有する不活性モノマーを創出するＦｏｋＩ触媒ドメインのＤ４５０変異を含む（上記Ｌｕｏ  ｅｔ  ａｌ．を参照されたい）。
【００６６】
デアミナーゼドメイン
任意選択で、本発明の方法のデアミナーゼドメインは、アポリポタンパク質Ｂ  ｍＲＮＡ編集複合体（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリーデアミナーゼ、活性化誘導シトシンデアミナーゼ（ＡＩＤ）、ＡＣＦ１／ＡＳＥデアミナーゼ、アデニンデアミナーゼ及びＡＤＡＴファミリーデアミナーゼからなる群から選択されるデアミナーゼ、又はその機能性断片である。代替的にデアミナーゼ又はその機能性断片は、ＡＤＡＲ１若しくはＡＤＡＲ２又はその変種であってもよい。
【００６７】
シトシンデアミナーゼ酵素のアポリポタンパク質Ｂ  ｍＲＮＡ編集複合体（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリーは、調節された有利な手段で変異導入を開始するように作用する１１個のタンパク質を包含する。ＡＰＯＢＥＣファミリーのシトシンデアミナーゼは、活性化誘導シトシン（若しくはシチジン）デアミナーゼ（ＡＩＤ）又はアポリポタンパク質Ｂ編集複合体３（ＡＰＯＢＥＣ３）である。これらのタンパク質は、すべて触媒活性のためにＺｎ２＋配位モチーフ（Ｈｉｓ−Ｘ−Ｇｌｕ−Ｘ２３−２６−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｘ２＿４−Ｃｙｓ）及び結合水分子を必要とする。本発明の方法において融合タンパク質のデアミナーゼドメインは、ＡＰＯＢＥＣ１ファミリーデアミナーゼであることが好ましい。デアミナーゼドメインは、図１中に斜字体で示されている配列（配列番号１はコード配列を提供し、配列番号２はアミノ酸配列を提供する）を有するラットデアミナーゼ（ｒＡＰＯＢＥＣ１）又はその変種であることが好ましい。
【００６８】
本発明の方法の融合タンパク質における使用のためのデアミナーゼの別の例示的で好適な種類は、アデニン（又はアデノシン）デアミナーゼである。例えばＡＤＡＴファミリーアデニンデアミナーゼは、Ｃａｓ９ドメイン、例えばヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９ドメインなどの部位特異的ヌクレアーゼドメインに融合されてもよく、それによりＣａｓ９−ＡＤＡＴ融合タンパク質をもたらす。さらにアデニンデアミナーゼは、ＴａｄＡ又はその変種であってもよく、好ましくはＧａｕｄｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７（Ｇａｕｄｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１７  Ｎａｔｕｒｅ  ５５１：４６４〜４７１）に記載されている。デアミナーゼドメインは、図１中において斜字体で示されている配列（配列番号３はコード配列を提供し、配列番号４はアミノ酸配列を提供する）を有するＴａｄＡ又はその変種であることが好ましい。さらに融合タンパク質は、アデニンデアミナーゼドメイン、例えばＡＤＡＲ１又はＡＤＡＲ２由来に融合されたＣａｓ９ドメインなどの部位特異的ヌクレアーゼドメインを含んでもよい。
【００６９】
本発明のデアミナーゼドメインは、デアミナーゼタンパク質全体又は触媒活性を有するその断片を含み得る又はそれからなり得る。
【００７０】
リンカー
デアミナーゼドメインは、ヌクレアーゼドメインのＮ又はＣ末端に融合され得る。デアミナーゼドメインは、ヌクレアーゼドメインのＮ末端に融合されることが好ましい。任意選択で、本発明の方法の融合タンパク質のデアミナーゼ及びヌクレアーゼドメインは、互いに直接又はリンカー（本明細書においてスペーサーとも称される）を介して融合される。リンカーは、例えば、形態（ＧＧＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＳ）ｎ及び（Ｇ）ｎの非常に可動性のリンカーから形態（ＥＡＡＡＫ）ｎ（配列番号３８）、ＳＰＫＫＫＲＫＶＥＡＳ（配列番号３２）若しくはＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ配列番号３３）若しくはＫＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号３４）又はこれらの任意の変種のさらに強固なリンカーの範囲にわたる、当技術分野における任意の好適なリンカーであり得、この場合ｎは好ましくは１〜７の間、すなわち１、２、３、４、５、６又は７である。リンカーは、２〜３０アミノ酸の間、又は３〜２３アミノ酸の間、又は３〜１２アミノ酸の間の長さを好ましくは有する。リンカーは、図１中に配列番号１及び３（コード配列）並びに配列番号２及び４（アミノ酸配列）において下線付き通常書体で示されている配列、又はこれらの変種を有し得る。
【００７１】
ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤ドメイン
任意選択で融合タンパク質は、ＵＤＧ阻害（ＵＧＩ）ドメインをさらに含む。ＵＧＩドメインは、ヌクレアーゼドメインのＮ又はＣ末端に融合され得る。デアミナーゼドメインは、ヌクレアーゼドメインのＣ末端に融合されることが好ましい。融合は、直接又は上に示されるリンカーを介してであり得る。融合タンパク質は、ヌクレアーゼドメインのＮ末端に融合されたデアミナーゼドメインを含み、ＵＧＩドメインはヌクレアーゼドメインのＣ末端に融合されていることが好ましい。
【００７２】
ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧｓ）は、ＤＮＡ中に意図無く存在するウラシルを認識し、ウラシルとデオキシリボース糖との間のＮ−グリコシド結合を切断し、ウラシルを放出し、塩基部位（ＡＰ部位）を後に残すことによってウラシル切除修復経路を開始する。次にＡＰ部位は、プロセスされ、ＡＰ−エンドヌクレアーゼ、ｄＲＰａｓｅ、ＤＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡリガーゼ酵素の続く作用によって古典的塩基に回復される。ＵＧＩドメインをシトシンデアミナーゼ−ヌクレアーゼ融合タンパク質に融合することによって、塩基編集の効率は増加する。ＵＧＩドメインは、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）バクテリオファージＰＢＳ１又はＰＢＳ２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｐ１４７３９）由来のＵＧＩである、又はその変種であることが好ましい。ＵＧＩドメインは、図１において配列番号１（コード配列）及び２（アミノ酸配列）中に下線付き斜字体で示された配列又はその変種を有してもよい。
【００７３】
一実施形態ではＵＤＧ阻害剤は、本明細書に定義される融合タンパク質に融合されないが、さらなる機能性タンパク質として編集されるＤＮＡに、好ましくは融合タンパク質と及び任意選択でガイドＲＮＡと共に、接触される。本実施形態では、細胞、好ましくは植物細胞は、ＵＤＧ阻害剤又はＵＤＧ阻害剤をコードする構築物を使用してトランスフェクトされ得る。後者の場合、前記構築物は、本発明の融合タンパク質をコードする配列をさらに含んでもよく、又は代替的にＵＤＧ阻害剤及び本発明の融合タンパク質は別々の構築物にコードされてもよい。
【００７４】
タグ
融合タンパク質は、精製及び／又は検出の容易さのためのタグをさらに提供できる。そのようなタグは、当技術分野において十分周知である。そのようなタグは、融合タンパク質のＮ又はＣ末端、好ましくはＮ末端に好ましくは位置付けられている。タグは、Ｈｉｓタグ（ＨＨＨＨＨＨ）（配列番号３７）であることが好ましい。
【００７５】
本発明の融合タンパク質は、１つ又は複数の核局在化シグナル配列（ＮＬＳ）を、好ましくは融合タンパク質のＮ若しくはＣ末端又はＮ及びＣ末端の両方にさらに含み得る。ＮＬＳは、当技術分野において周知の任意の好適なＮＬＳであり得、図１の配列番号１及び３（コード配列）並びに配列番号２及び４（アミノ酸配列）において太字斜字体で示されている配列又はこれらの変種を好ましくは有する。
【００７６】
本発明の方法において使用される融合タンパク質は、図１において示される配列（配列番号１及び３）、又は図１において示されるヌクレオチド配列（配列番号１若しくは配列番号３）を有する翻訳領域（ＯＲＦ）に、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％などの少なくとも７０％の配列同一性を有するその変種を含む、又はそれからなるヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質であり得る。融合タンパク質は、図１において示されるアミノ酸配列（配列番号２及び４）、又は図１において示されるアミノ酸配列（配列番号２若しくは配列番号４）に、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％などの少なくとも７０％の配列同一性を有するその変種を含む、又はそれからなるタンパク質であることが好ましい。
【００７７】
ガイドＲＮＡ
ヌクレアーゼドメインがＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼである又はその変種である場合、本発明の方法は、融合タンパク質（複数可）を標的化するためのガイド配列及び／又は標的配列若しくはＤＮＡ分子中の相補鎖中のアンチセンス配列に対する部位特異的ヌクレアーゼドメインを含む、ガイドＲＮＡにＤＮＡ分子を接触させることをさらに含む。ガイドＲＮＡはある特定のサイズ（長さ、ヌクレオチド）に特に限定されないが、好ましい実施形態によりガイド配列は、長さ５〜１００、好ましくは１０〜５０、さらにより好ましくは１５〜２５又は２０ヌクレオチドである。任意選択で、１つより多い種類のガイドＲＮＡが例えば２つ以上の異なる標的配列を目標にする、又はさらに同じ標的配列を目標にする同じ実験において使用され得る。
【００７８】
ガイド配列は、編集される鋳型の標的配列又は相補鎖におけるそのアンチセンス配列と同一であることが好ましい。言い換えると、ガイドＲＮＡは、ガイド配列が編集される鋳型の配列又はそのアンチセンスと同一であるように設計されることが好ましい。ガイド配列は、編集されるヌクレオチド（複数可）を含む標的配列又はその配列アンチセンスと同じ配列、すなわち脱アミノ化されるヌクレオチドを含む標的配列又はその配列アンチセンスの５〜１００、好ましくは１０〜５０、さらにより好ましくは１５〜２５又は２０ヌクレオチドのストレッチを含む、又はそれからなることが好ましい。
【００７９】
標的配列の望ましい編集は、融合タンパク質（複数可）とガイドＲＮＡ（複数可）との組合せの設計を決定する。例えば、１つ又は複数のＣからＴへの（又はＧからＡへの）変換が標的配列において望ましい場合、好ましくは融合タンパク質は、部位特異的（例えばＣＲＩＳＰＲ）ヌクレアーゼに融合されたシトシンデアミナーゼを含んで本明細書に定義されるとおり選択される。同様に、１つ又は複数のＡからＧへの（又はＴからＣへの）変換が標的配列において望ましい場合、好ましくは融合タンパク質は、部位特異的（例えばＣＲＩＳＰＲ）ヌクレアーゼに融合されたアデニンデアミナーゼを含んで本明細書に定義されるとおり選択される。
【００８０】
融合タンパク質がＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼドメインを含む場合、好ましくは、ヌクレアーゼドメインは、ＰＡＭ配列を含む鎖に相補的な鎖にニッキングできるＣＲＩＳＰＲニッカーゼである。そのようなＣＲＩＳＰＲニッカーゼは、Ｃａｓ９−Ｄ１０ＡなどのＲｕｖＣドメインにヌクレアーゼ無効変異を含有するＣａｓ９、又はその変種であり得る。標的配列の望ましい編集は、融合ドメインがＲｕｖＣドメインにヌクレアーゼ無効変異を含有するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９であるヌクレアーゼドメインを含んで使用される状況について下に例示されるとおり、融合タンパク質（複数可）とガイドＲＮＡ（複数可）との組合せの設計を決定する。
【００８１】
例えば、１つ又は複数のＣからＴへの変換が標的配列において望ましい場合、好ましくは本発明の方法において使用される融合タンパク質は、標的配列を含む又はそれからなるガイド配列を含む好適なガイドＲＮＡが、融合タンパク質ガイドＲＮＡを標的部位に標的化し、標的配列を含む鎖に対する相補鎖にニッキングを生じるように、標的配列に隣接されているＰＡＭ配列を必要とするＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに融合されたシトシンデアミナーゼを含む。いかなる理論にも束縛されることなく、標的配列に対する相補鎖のニッキングは、インタクトなままである鎖の１つ又は複数のシトシンをデアミナーゼが変換できるようにすると考えられる。
【００８２】
１つ又は複数のＡからＧへの変換が標的配列において望ましい場合、好ましくは本発明の方法において使用される融合タンパク質は、標的配列を含む又はそれからなるガイド配列を含む好適なガイドＲＮＡが融合タンパク質ガイドＲＮＡを標的部位に標的化し、標的配列を含む鎖に対する相補鎖にニッキングを生じるように、標的配列に隣接されているＰＡＭ配列を必要とするＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに融合されたアデニンデアミナーゼを含む。いかなる理論にも束縛されることなく、標的配列に対する相補鎖のニッキングは、インタクトなままである鎖の１つ又は複数のアデニンをデアミナーゼが変換できるようにすると考えられる。
【００８３】
１つ又は複数のＧからＡへの変換が標的配列において望ましい場合、好ましくは本発明の方法において使用される融合タンパク質は、標的配列に相補的であるガイド配列を含む好適なガイドＲＮＡが融合タンパク質ガイドＲＮＡを標的部位に標的化し、標的配列を含む鎖のニッキングを生じるように、標的配列のアンチセンス配列（すなわち標的配列を含む鎖に対する相補鎖）に隣接されているＰＡＭ配列を必要とするＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、好ましくはＣａｓ９−Ｄ１０Ａ変種、に融合されたシトシンデアミナーゼを含む。インタクトなままである鎖（すなわち、アンチセンス配列を含む鎖）における１つ又は複数のシトシンのウラシルへの変換は、標的配列において１つ又は複数のグアニンからアデニンへの変換を有効に生じる。
【００８４】
１つ又は複数のＴからＣへの変換が標的配列において望ましい場合、好ましくは本発明の方法において使用される融合タンパク質は、標的配列に相補的であるガイド配列を含む好適なガイドＲＮＡが融合タンパク質ガイドＲＮＡを標的部位に標的化し、標的配列を含む鎖のニッキングを生じるように、標的配列のアンチセンス配列（すなわち標的配列を含む鎖に対する相補鎖）に隣接されているＰＡＭ配列を必要とするＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、好ましくはＣａｓ９−Ｄ１０Ａ変種、に融合されたアデニンデアミナーゼを含む。インタクトなままである鎖（すなわち、アンチセンス配列を含む鎖）における１つ又は複数のアデニンからイノシンへの変換は、標的配列において１つ又は複数のチミンからシトシンへの変換を有効に生じる。
【００８５】
本明細書において詳述するとおり、本発明者らは、異なる融合タンパク質の組合せの使用を、１回のトランスフェクション事象及び単一細胞中で標的配列を有効に編集するために使用できることを予想外に発見した。異なる融合タンパク質及び／又は異なるガイドＲＮＡを使用して１回のトランスフェクション事象において及び単一の細胞中で単一の標的配列を編集し、それにより単一標的配列において、いくつかの異なるヌクレオチド変換（例えば、１つ若しくは複数のＣからＴへの、１つ若しくは複数のＡからＧへの、１つ若しくは複数のＧからＡへの及び／又は１つ若しくは複数のＴからＣへの変換の組合せ）を作製することさえ可能である。したがって、本発明の方法は、１回のトランスフェクション事象において単一の細胞中の単一の標的配列に、異なる種類のヌクレオチドの変換、すなわち異なるヌクレオチドでの変異導入（すなわち１つ又は複数のＣからＴへの変換、１つ又は複数のＧからＡへの変換、１つ又は複数のＡからＧへの変換、１つ又は複数のＴからＣへの変換及びこれらの任意の組合せ）のために特に好適である。
【００８６】
接触
本発明の方法では、細胞、好ましくは植物細胞のＤＮＡは、本発明の融合タンパク質に少なくとも接触される。任意選択で、細胞は、好ましくはそれぞれ異なるデアミナーゼドメインを含む本発明の少なくとも２つのタンパク質に接触される。例えば、融合タンパク質の１つ（第１の融合タンパク質）は、シトシンデアミナーゼドメインを含み得、他の融合タンパク質（第２の融合タンパク質）は、アデニンデアミナーゼドメインを含み得る。上に記載されるとおり、これは、単一の細胞において１回のトランスフェクション事象で、１つ又は複数のＣからＴへの（又はＧからＡへの）変換及び１つ又は複数のＡからＧへの（又はＴからＣへの）変換を可能にする。本発明者らは、１つ又は複数のＣからＴへの（又はＧからＡへの）変換及び１つ又は複数のＡからＧへの（又はＴからＣへの）変換が、細胞内の単一の標的部位で本方法を使用して、すなわち第１の及び第２の融合タンパク質の両方を同じ標的配列に標的化する単一のガイドＲＮＡを使用して、行われ得ることをさらに見出した。したがって提供されるのは、ＤＮＡを、シトシンデアミナーゼドメインを含む融合タンパク質及びアデニンデアミナーゼドメインを含む融合タンパク質に接触させることを含む方法であって、前記接触させることは、１回のトランスフェクション事象を使用して達せられる。言い換えると本実施形態において、標的ヌクレオチド編集が望ましい細胞は、第１の及び第２の融合タンパク質の両方、又は同じ物をコードする構築物（複数可）を含むトランスフェクション培地を使用してトランスフェクトされる。両方の融合タンパク質がＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを含む場合、単一の標的配列におけるＣからＴへの（又はＧからＡへの）及びＡからＧへの（又はＴからＣへの）変換（複数可）の両方が望ましく、そのようなトランスフェクション培地は、例えば両方の融合タンパク質が同じＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼドメインを含むことから、第１の及び第２の融合タンパク質を前記標的配列に標的化できる単一のガイドＲＮＡ、をさらに含み得る。
【００８７】
代替的に、少なくとも２つのガイドＲＮＡを使用でき、第１の及び第２のガイドＲＮＡは両方とも融合タンパク質と複合体化して、細胞のＤＮＡに標的化できるが、しかしそれらのガイド配列は、それらが細胞のＤＮＡの異なる部位に、又は同じ部位だがそれぞれ二重鎖ＤＮＡの異なる鎖にハイブリダイズできるように異なっている。後者の場合、第１のガイドＲＮＡのガイド配列は標的配列にアンチセンスであってもよく、第２のガイドＲＮＡのガイド配列は標的配列にセンスであってもよい。この場合、標的配列におけるＣからＴへの変更及びＧからＡへの変更の組合せは、融合タンパク質がシトシンデアミナーゼを含む場合に達成され得る。同様に、ＡからＧへ及びＴからＣへの変換の組合せは、融合タンパク質がアデニンデアミナーゼを含む場合に達成され得る。ＣからＴへ（又はＧからＡへ）が細胞のＤＮＡの第１の標的配列で望ましく、ＡからＧへ（又はＴからＣへ）の変換が前記ＤＮＡの第２の（異なる）標的配列で望ましい場合、本発明の方法は、前記ＤＮＡを少なくとも第１の及び第２のガイドＲＮＡと接触させることを含んでもよく、この場合第１のガイドＲＮＡは第１の融合タンパク質を第１の標的配列に標的化でき、第２のガイドＲＮＡは第２の融合タンパク質を第２の標的配列に標的化でき、この場合好ましくは第１のガイドＲＮＡは、第２の融合タンパク質を第１の標的配列に標的化できない、又は少なくともより少ない程度であり、逆も同様である。
【００８８】
「接触（ｃｏｎｔａｃｔｅｄ）」は、細胞、好ましくは植物細胞内のＤＮＡを、本明細書に定義される融合タンパク質に曝露することを意味することが意図される。これは、細胞を前記融合タンパク質（本明細書においてタンパク質と称される）と、任意選択でガイドＲＮＡ（本明細書においてタンパク質／ＲＮＡトランスフェクションと称される）又は同じ物をコードする構築物（本明細書においてヌクレオチド構築物トランスフェクションと称される）との組合せで、融合タンパク質又は構築物が細胞の内部に接続を得て、（コードされた）融合タンパク質が標的配列を含むＤＮＡと相互作用できるようにする手段で、接触させることによって達せられ得る。ヌクレアーゼドメインがＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼである場合、接触は、細胞を融合構築物をコードする構築物と、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写又は合成ガイドＲＮＡとの組合せで、同時又は連続的のいずれかで接触させることによって達せられる。
【００８９】
本発明の方法は、細胞が、本明細書においてさらに詳述される所望の編集が生じるために必要とされる１つ又は複数の融合タンパク質、任意選択でガイドＲＮＡ（複数可）及び任意選択でさらなる機能性タンパク質（複数可）又は同じ物をコードする構築物、を含む単一のトランスフェクション培地に曝露される、本明細書において単一のインキュベーションステップとして理解される１回のトランスフェクション事象を利用することが好ましい。
【００９０】
本発明の方法は、細胞に融合タンパク質を導入するための具体的な方法に依存しない。タンパク質／ＲＮＡトランスフェクションの場合、融合タンパク質は、細胞内部に取り込まれるポリペプチドとして、任意選択でガイドＲＮＡ及び／又は本明細書において定義するＵＤＧ阻害タンパク質などのさらなる機能性タンパク質（複数可）と併せて細胞に提供される。ヌクレオチド構築物トランスフェクションの場合、細胞又はプロトプラストのＤＮＡは、融合タンパク質並びに任意選択でガイドＲＮＡ及び／又はさらなる機能性タンパク質（複数可）に、細胞における同じ物の発現のための１つ又は複数の核酸構築物を細胞に導入することによって曝露される。そのような核酸構築物は、当技術分野において周知の任意の好適な構築物であってもよく、構築物に含まれるＤＮＡ領域（ここで、融合タンパク質及び／又はガイドＲＮＡ）の宿主細胞での発現の目的を有して、宿主細胞に外来性ＤＮＡを送達するために使用される。融合タンパク質、ガイドＲＮＡ及び／若しくはさらなる機能性タンパク質（複数可）又は同じ物をコードする核酸構築物の導入は、細胞へのタンパク質又は核酸構築物の良好な導入を可能にし、核酸構築物の場合、導入された核酸の発現を生じる、任意の周知の方法によって達成され得る。方法として、これだけに限らないが、トランスフェクション、微量注入、電気穿孔法、ヌクレオフェクション及びリポフェクションなどの方法が挙げられる。本明細書下においてさらに詳述されるＰＥＧトランスフェクションが使用されることが好ましい。
【００９１】
核酸構築物トランスフェクションの場合、融合タンパク質及び、適用可能な場合ガイドＲＮＡ及び／又はさらなる機能性タンパク質（複数可）は、同じ核酸構築物を使用して細胞に好ましくは導入される。言い換えると、核酸構築物は、細胞における融合タンパク質及びガイドＲＮＡの両方の発現のためである。任意選択で、融合タンパク質、１つ若しくは複数のガイドＲＮＡ及び／又はさらなる機能性タンパク質は、異なる核酸構築物を使用して細胞に導入される。いずれの場合でも、タンパク質（すなわち融合タンパク質及び／又はさらなる機能性タンパク質（複数可））をコードする核酸配列並びにガイドＲＮＡをコードする核酸配列が、異なるプロモーターの調節下にあることは好ましい。例えばガイドＲＮＡは、好ましくは目的の種類の細胞における発現のために、例えば本発明の方法の細胞が植物細胞である場合、植物における発現のために、好ましくは、ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター（Ｕ６及びＨ１など）の調節下にあってもよく、すなわち作動可能に連結されていてもよく；Ｕ６及びＨ１などのＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターは、これらの小さなＲＮＡを発現するために一般に使用される（例えばＭａ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ（２０１４）３，ｅ１６１を参照されたい）。
【００９２】
例えば、融合タンパク質及び／又はさらなる機能性タンパク質（複数可）は、好ましくは目的の種類の細胞における発現のために、例えば、本発明の方法の細胞が植物細胞である場合植物における発現のために、３５Ｓプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）由来３５Ｓプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｄ）；Ｏｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：８１０−８１２；１９８５）などの、好ましくは構成的プロモーターの調節下にあり得る。他の好適な構成的プロモーターとして、これだけに限らないが、キャッサバ葉脈モザイクウイルス（ＣｓＶＭＶ）プロモーター及びサトウキビ・バシリフォーム・バドナウイルス（ｓｕｇａｒｃａｎｅ  ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍ  ｂａｄｎａｖｉｒｕｓ）（ＳｃＢＶ）プロモーター（例えばＳａｍａｃ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．２００４  Ａｕｇ；１３（４）：３４９〜６１を参照されたい）が挙げられる。他の構成的プロモーターとして、例えば、Ｒｓｙｎ７プロモーターのコアプロモーター及びＷＯ９９／４３８３８及びＵＳ６０７２０５０に開示されている他の構成的プロモーター；ユビキチン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２：６１９〜６３２，１９８９及びＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：６７５〜６８９，１９９２）；ｐＥＭＵ（Ｌａｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８１：５８１〜５８８，１９９１）；ＡＡ６プロモーター（ＷＯ２００７／０６９８９４）；などが挙げられる。
【００９３】
核酸構築物は、転写終結領域も含み得る。転写終結領域が使用される場合、任意の終結領域は、核酸構築物の調製において使用され得る。
【００９４】
好ましい実施形態では、核酸構築物は一過性発現のためである。言い換えると、本発明の方法の細胞が植物細胞である場合、植物材料における発現は、核酸構築物の非永久的存在の結果として一時的である。発現は、例えば、構築物が宿主ゲノムに組み込まれない場合は、一過性であり得る。例えば、融合タンパク質、ガイドＲＮＡ及び／若しくはさらなる機能性タンパク質（複数可）又は同じ物を発現している構築物（複数可）は、植物細胞に一過的に提供され、構成成分の１つ又は複数の量の低下が続く。続いて植物細胞、植物細胞の後代及び、二重鎖ＤＮＡが変化された植物細胞を含む植物は、本発明の方法において使用される１つ若しくは複数の構成成分の量の減少を含む、又は１つ若しくは複数の構成成分をもはや含有しない。
【００９５】
本明細書に開示されるいずれかの方法及び好ましい実施形態と共に、核酸構築物は、形質転換細胞、好ましくは植物細胞における発現の増加のために最適化され得る。本実施形態では、本発明の方法が提供され、この場合、融合タンパク質をコードする核酸配列は、目的の種類の細胞における発現のため、例えば本発明の方法の細胞が植物細胞である場合、植物細胞における発現のためにコドン最適化される。すなわち、融合タンパク質をコードする核酸構築物は、発現の改善のために植物の好ましいコドン（ｐｌａｎｔ−ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ  ｃｏｄｏｎ）を使用して合成され得る。例えば宿主の好ましいコドン使用頻度の考察について、Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ａｎｄ  Ｇｏｗｒｉ，（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９２：１〜１１，１９９０）を参照されたい。方法は、植物の好ましい遺伝子を合成するために当技術分野において利用可能である（例えば、Ｍｕｒｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８９）１７：４７７〜４９８又はＬａｎｚａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）ＢＭＣ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ８：３３〜４３を参照されたい）。
【００９６】
本発明の方法の細胞が植物細胞である場合、ＰＥＧ形質転換は、本発明の方法において植物細胞に融合タンパク質、適用可能であればガイドＲＮＡ及び／若しくはさらなる機能性タンパク質（複数可）又は同じ物をコードする核酸構築物（複数可）を導入するために使用され得る。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、産業生産から医薬まで多数の適用を有するポリエーテル化合物である。ＰＥＧは、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）又はポリオキシエチレン（ＰＯＥ）としても周知である。ＰＥＧの構造は、一般にＨ−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ−ＯＨと表される。本発明による方法において使用されるＰＥＧは、２０，０００ｇ／ｍｏｌ未満の分子量を有するオリゴマー及び／若しくはポリマー又はその混合物であることが好ましい。ＰＥＧ媒介遺伝子形質転換は、１９８５年から周知である。植物プロトプラスト形質転換のための最初の方法は、ＰＥＧを利用した（Ｋｒｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：７２〜７４；Ｐｏｔｙｒｙｋｕｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｐｌａｎｔ  ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．３：１１７〜１２８；Ｎｅｇｒｕｔｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８：３６３〜３７３）。技術は、多数の異なる植物由来のプロトプラストに適用可能である（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．８９：１９９〜２０７）。ＰＥＧは、二価カチオンの存在下でＤＮＡを、次にそれが内部移行する植物プロトプラストの表面に沈殿させることによって形質転換を刺激すると考えられている（Ｍａａｓ  ＆  Ｗｅｒｒ（１９８９）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．８：１４８〜１５１）。
【００９７】
本発明の方法は、植物細胞を水性培地と接触させることを含むことが好ましく、水性培地は融合タンパク質並びに任意選択でガイドＲＮＡ及び／若しくはさらなる機能性タンパク質（複数可）又は同じ物をコードする構築物を含み、水性培地はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含み、グリセロールを実質的に含まない。グリセロールは単純なポリオール化合物である。グリセロールは無色、無臭、甘味のある粘稠性液体であり、一般に無毒と考えられる。グリセロールは、生物科学において使用される緩衝液、培地などにおいて一般に使用されている。グリセロールは、溶液中でタンパク質を安定化させるため及び／又は凍結防止剤として使用され、それによりタンパク質及び酵素は低温で保存され得る。例えば、ＣＡＳ９タンパク質は、高レベルのグリセロールを含む保存溶液の形態で一般に販売されている（例えば５０％まで；例えば、ｗｗｗ．ｎｅｂ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｍ０３８６−ｃａｓ９−ｎｕｃｌｅａｓｅ−ｓ−ｐｙｏｇｅｎｅｓ＃ｐｄ−ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎを参照されたい）。したがって、グリセロールは溶液中のタンパク質を安定化するために使用される一方で、本発明の内容では、融合タンパク質を含む水性培地でのそのようなグリセロールの存在が方法の（例えば、ＤＮＡ分子中に標的変化を有する植物細胞を提供することにおいて）全体的な有効性を低減することが見出された。実際に、グリセロール濃度が水性培地において高すぎる場合、結果は、ＤＮＡ分子中に標的変化を有する植物細胞が全く得られない場合があることを示した。
【００９８】
当業者は、グリセロールの許容可能な濃度が、ある程度、実験設定に依存し、本開示に基づいて、当業者はそのような最大許容可能濃度を決定することに課題を有さず、それを超えると本発明の方法の有効性が低減することを理解している。好ましい実施形態では、植物細胞を含む水性培地は０．１％（ｖ／ｖ）未満のグリセロールを含む、好ましくは水性培地は（検出可能な）グリセロールを含まない。言い換えると、植物細胞を含む水性培地中の最終グリセロール濃度は、好ましくは０．１％（ｖ／ｖ）未満、例えば０．０８％、０．０５％、０．０１％、０．００５％、０．００１％（ｖ／ｖ）未満グリセロールである。
【００９９】
トランスフェクションのために、水性培地１ミリリットルあたり植物細胞約１００００〜２００００００個の植物細胞又はプロトプラストの水溶液は、融合タンパク質並びに任意選択でガイドＲＮＡ及び／若しくはさらなる機能性タンパク質又は同じ物をコードする発現構築物（複数可）並びにＰＥＧ溶液に接触されることが好ましい。ガイドＲＮＡ及び／若しくはさらなる機能性タンパク質又は同じ物をコードする発現構築物（複数可）は、１ミリリットルあたり植物細胞約１００００００個を含む水溶液の量に加えられることが好ましく、次にＰＥＧ溶液と、好ましくは約１：１の比で混合される。
【０１００】
一実施形態では、ヌクレアーゼドメインはＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼである若しくはそれ由来であり、トランスフェクションは融合タンパク質又はガイドＲＮＡのいずれかをコードする異なる構築物を使用して実施され、融合タンパク質発現プラスミドに対するガイドＲＮＡ発現プラスミドの重量比は、２：１〜１：１０又は１：１〜１：５などの１０：１〜１：２００の範囲内、より好ましくは約１：２などの１：１〜１：３の範囲内である。少なくとも０．５μｇ、少なくとも１μｇ、少なくとも５μｇ又は少なくとも１０μｇ又は約１０μｇなどの、少なくとも０．１μｇの融合タンパク質発現プラスミドがトランスフェクション溶液（水溶液中の細胞及びＰＥＧの両方を含む）１ｍＬあたりに使用されることが好ましい。一実施形態では、少なくとも０．５μｇ、少なくとも１μｇ、少なくとも５μｇ又は少なくとも１０μｇ又は約１０μｇなどの前記少なくとも０．１μｇの融合タンパク質発現プラスミドは、本明細書において教示される適切な重量範囲でガイドＲＮＡ発現プラスミドと組み合わせられ、融合タンパク質発現プラスミドとガイドＲＮＡ発現プラスミドとの前記組合せは、１０，０００〜１０，０００，０００個、好ましくは約５０，０００〜５，０００，０００個、より好ましくは約１００，０００〜１，０００，０００個、例えば約５００，０００個の植物細胞又は植物プロトプラストと組み合わせられる。
【０１０１】
別の好ましい実施形態では、水性培地がいかなるプラスミド又はベクター材料、特に融合タンパク質をコードするいかなるプラスミド材料又はベクター材料も含まない、本発明の方法が提供される。培地中にそのようなベクターが存在することは、植物又は植物細胞中のＤＮＡ分子へのプラスミド材料又はベクター材料の望ましくない導入が生じる場合がある。一実施形態では、融合タンパク質、ガイドＲＮＡ及び／若しくはさらなる機能性タンパク質又は同じ物をコードする構築物を用いるトランスフェクションのために、植物細胞又は植物プロトプラストは、約５００μｌの体積中に存在し得る。一実施形態では、植物細胞／植物プロトプラスト（融合タンパク質／ガイドＲＮＡを含む）のＰＥＧ溶液、好ましくは４００ｇ／Ｌ  ＰＥＧ４０００及び０．１Ｍ  Ｃａ（ＮＯ３）２を含む溶液である、に対する体積比は、２：１〜２：３の範囲、好ましくは約１：１である。
【０１０２】
タンパク質／ＲＮＡトランスフェクション（すなわち、融合タンパク質の、任意選択でガイドＲＮＡ及び／又はさらなる機能性タンパク質（複数可）と併せたトランスフェクション）の場合、望ましい結果は、植物細胞を含む水性培地水性培地が２〜８０ナノモル（ｎＭ）の融合タンパク質を含む場合に得られる。したがって濃度が、例えば１〜２００ｎＭの間で変動し得る場合、好ましい実施形態では濃度は、２〜８０ｎＭの間、例えば５〜７０ｎＭの間、１０〜５０ｎＭの間又は２０〜４０ｎＭの間である。水性培地中のガイドＲＮＡの濃度は、本明細書において開示される本発明の内容においては、好ましくはある特定の範囲内である。さらに詳細には水性培地において濃度３０〜６００ナノモルの濃度のガイドＲＮＡを使用することは、得られる結果を改善する（例えばＤＮＡ分子中に標的変化を有する植物細胞を提供することにおいて）ことが見出された。したがって、例えば、１０〜１０００ｎＭの濃度のガイドＲＮＡ（１つより多い異なるガイドＲＮＡが同時に使用される場合、合計濃度が本発明において使用される）は、使用され得るが、好ましい濃度は、３０〜６００ｎＭの間、例えば５０〜４００ｎＭの間、例えば１００〜３００ｎＭの間、例えば１５０〜２５０ｎＭの間である。水性培地中の融合タンパク質とガイドＲＮＡとの間のモル比は、１：３００〜８：３であることが好ましく、好ましくはモル比は１：２０である。例えばモル比は、１：１〜１：５０又は１：５〜１：３０又は１：１〜８：３であり得、これらの好ましい比の内の任意の他の比であり得る。融合タンパク質とガイドＲＮＡとの濃度及び比は、両方とも所与の濃度範囲及び所与のモル比内であることが好ましい。
【０１０３】
本発明の内容において、核酸構築物のため及びタンパク質／ＲＮＡトランスフェクションの両方のためのＰＥＧの濃度は、好ましくは、ある特定の範囲内であることが見出された。特に植物細胞を含む水性培地は、１００〜４００ｍｇ／ｍｌ  ＰＥＧを含む。そのためＰＥＧの最終濃度は、１００〜４００ｍｇ／ｍｌの間、例えば１５０〜３００ｍｇ／ｍｌの間、例えば１８０〜２５０ｍｇ／ｍｌの間である。好ましいＰＥＧは、ＰＥＧ  ４０００  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ｎｏ．８１２４０である（すなわち平均Ｍｎ４０００を有する（Ｍｎ、平均分子量は、試料中のすべてのポリマー分子の合計重量を試料中のポリマー分子の合計数によって割ったものである）。使用されるＰＥＧは、約１０００〜１０，０００、例えば２０００〜６０００の間のＭｎを有することが好ましい）。
【０１０４】
本明細書において既に詳述のとおり、非常に好ましい実施形態では、タンパク質／ＲＮＡトランスフェクションは植物細胞を含む水性培地を使用して実施され、前記培地は：
２〜８０ナノモル（ｎＭ）融合タンパク質、前記融合タンパク質はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを含む；
３０〜６００ナノモル（ｎＭ）ガイドＲＮＡ；
０．１％（ｖ／ｖ）未満グリセロール；
１００〜４００ｍｇ／ｍｌ  ＰＥＧ、及び
植物細胞１０，０００〜２，０００，０００個／ｍｌ
をさらに含む。
【０１０５】
パラメーターのこの組合せがＤＮＡ分子中に標的変化を有する植物細胞を提供することにおいて驚くほど有効であることが見出された。実際に、上のパラメーターの逸脱が、効率及び／又は有効性を低減させ得ることが見出された。加えて、融合タンパク質及び任意選択でガイドＲＮＡが培地に供給された後にＰＥＧが水性培地に加えられた場合に、本発明の方法の効率及び／又は有効性が改善されることが見出された。したがって、融合タンパク質及び任意選択でガイドＲＮＡが培地に供給される前にＰＥＧは水性培地に加えられ得るが、好ましくは水性培地は、融合タンパク質及び任意選択でガイドＲＮＡと共に最初に供給され、その後ＰＥＧが培地に供給される。融合タンパク質及び任意選択でガイドＲＮＡを加えることとＰＥＧを加えることとの間の時間は、５秒間〜１０分間の間であることが好ましいが、所望により短くても長くてもよい。
【０１０６】
これに限定されないが、植物細胞は、タンパク質（複数可）、ＲＮＡ又は同じ物をコードする構築物と、本明細書に定義されるとおり少なくとも５分間、例えば５分間〜２４時間の間、又は５分間〜６時間の間、又は５分間〜６０分間の間、又は５分間〜３０分間の間、又は５分間〜２５分間の間の期間好ましくは接触される。接触は、任意の好適な温度、例えば摂氏４度〜摂氏４０度の間、好ましくは摂氏１０度〜摂氏３０度の間の温度、例えば室温においてであり得る。さらに当業者は、培地に関して本明細書において定義された具体的な要件とは別に、任意の好適な培地であり得ることを理解している。例えば培地は、好ましくは５〜８の間、好ましくは６〜７．５の間のｐＨ値を有する。一実施形態では、ＰＥＧトランスフェクションは、１５〜４０分間などの１０〜６０分間の範囲の時間、好ましくは約２０分間の期間について実行され得る。
【０１０７】
トランスフェクション後、０．２〜０．４Ｍなどの０．１〜０．６Ｍ又は約０．２７５ＭのＣａ（ＮＯ３）２溶液は、上に教示されるトランスフェクション溶液に加えられ得る。上に教示されるトランスフェクション溶液の約１０倍などの約８〜１２倍の体積が遠心分離及びさらなる培養のための培養培地への再懸濁によって細胞又はプロトプラストを採取にする前に使用され得ることが好ましい。
【０１０８】
さらに好ましい実施形態により、本発明の方法が提供され、この場合植物細胞はフィーダー植物細胞の存在下でさらに培養され、すなわち本明細書に詳述する水性培地に接触された後、好ましくはフィーダー植物細胞は植物プロトプラストであり、好ましくはフィーダー植物細胞は編集される植物細胞と同じ植物種のものであり、好ましくはフィーダー植物細胞は、フィーダーディスクの形態で、好ましくはフィーダー植物細胞５００００〜２５００００個を含有して、提供される。
【０１０９】
当業者は、例えば実施例に詳述されるフィーダー細胞の存在下でプロトプラストをどのように培養するかを承知している。実質的にグリセロールを含まないが、融合タンパク質並びに任意選択でガイドＲＮＡ及びＰＥＧを含む水性培地に植物細胞が接触された後の培養期間の際のフィーダー細胞の存在が、本発明による方法の全体的な有効性及び／又は有効性を増加させ得ることが見出された。これは、フィーダー細胞が、水性培地中で融合タンパク質及び／又はガイドＲＮＡに接触された植物細胞と同じ植物種のものである場合、特にフィーダーディスクあたりフィーダー植物細胞５００００〜２５００００個の量が使用される場合（通常実験あたり１枚のフィーダーディスクが使用される）に特に事実である。
【０１１０】
当業者は、例えばＰｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９８４）３３（３）：２９３〜３０２；ｄｏｉ：１０．１０１６／０３０４−４２１１（８４）９００２０−８に詳述される又はＰｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＩＳＢＮ  ０−７９２３−２４９３−５；Ｖａｓｉｌ及びＴｈｏｒｐｅにより編集；Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）を含む種々のハンドブックに記載のとおり、フィーダー細胞の存在下でプロトプラストをどのように培養するかについての他の技術を承知している。
【０１１１】
本発明の方法についても同様に検討され、個々のプロトプラストは、植物細胞壁、植物カルス及び／又は植物を含む植物細胞にさらに培養される。
【０１１２】
本発明の方法は、ＤＮＡ分子、ヌクレオチド配列、例えば遺伝子又はプロモーター内を標的化するために特に好適であり、次の形質：除草剤寛容性、乾燥寛容性、雄性不稔、昆虫抵抗性、非生物的ストレス寛容性、改変脂肪酸代謝、改変炭水化物代謝、改変種子収量、改変油パーセント、改変タンパク質パーセント及び細菌性疾患、真菌性疾患又はウイルス性疾患への抵抗性、の１つ又は複数を付与するが、ＤＮＡ分子内の任意の種類の配列を標的化するために使用され得る。
【０１１３】
別の選択により、本発明の方法において２つ以上ガイドＲＮＡが使用される。２つ以上のガイドＲＮＡは、本発明の方法の融合タンパク質をＤＮＡ二重鎖中の同じ部位、又は異なる部位に（例えば同じ鎖又は他の鎖のいずれかに１つより多いニックを導入するために）方向付けることができる。
【０１１４】
別の好ましい融合タンパク質により、適用可能な場合は、ガイドＲＮＡ及び／又は同じ物をコードする構築物は、本明細書他所で既に考察のとおり、細胞、好ましくは植物細胞において一過的に発現される。
【０１１５】
本発明による方法を用いて、変化は細胞中、好ましくは植物細胞中の二重鎖ＤＮＡに導入される。前記標的変化は、少なくとも１つの塩基対の改変を含み得ることが好ましい。例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える塩基対は、本発明の方法を用いて変化され得る。１つより多い改変は、１回の実験で導入され得る、及び／又は実験は、細胞中の二重鎖ＤＮＡに次の変化を導入するために繰り返され得る。１つより多い塩基対は、本発明の方法を用いた１回のトランスフェクション事象において変化されることが好ましい。ＣからＴ、ＧからＡ、ＡからＧ及びＴからＣへの変化の任意の組合せは、１回のトランスフェクション事象で作製されることが好ましい。したがって本発明は、融合タンパク質の組合せも混合物又は組成物中に、好ましくは本発明の方法における使用のために提供する。そのような混合物又は組成物は、第１の及び第２の融合タンパク質の両方を含むことが好ましく、第１の融合タンパク質は、シトシンデアミナーゼドメインを含む本明細書において定義された融合タンパク質であり、第２の融合タンパク質はアデニンデアミナーゼドメインを有する本明細書において定義された融合タンパク質である。前記第１の融合タンパク質は、配列番号２の配列からなる若しくはそれを含む融合タンパク質又はその変種であってもよく、前記第２の融合タンパク質は、配列番号４の配列からなる若しくはそれを含む融合タンパク質又はその変種であってもよい。前記第１の融合タンパク質は、配列番号１を含む若しくはそれからなるヌクレオチド配列によってコードされた融合タンパク質又はその変種であってもよく、前記第２の融合タンパク質は、配列番号３を含む若しくはそれからなるヌクレオチド配列によってコードされた融合タンパク質又はその変種であってもよい。混合物は、融合タンパク質をタンパク質の形態で又は同じ物をコードする構築物として含んでもよい。前記混合物は、第１の融合タンパク質をコードする第１の構築物又は第２の融合タンパク質をコードする第２の構築物を含み得る。前記第１の構築物は、配列番号１若しくはその変種を含む、又は配列番号２若しくはその変種をコードし、前記第２の構築物は、配列番号３若しくはその変種を含む、又は配列番号４若しくはその変種をコードすることが好ましい。代替的に、混合物は、第１の及び第２の両方の融合タンパク質をコードする構築物を含み得る。前記構築物は、配列番号１及び３の両方若しくはその変種を含む、又は、配列番号２及び４の両方若しくはその変種をコードすることが好ましい。任意選択で、上に示された混合物は、本明細書に定義される１つ又は複数のガイドＲＮＡ又は同じ物をコードする構築物をさらに含み得る。任意選択で前記１つ又は複数のガイドＲＮＡは、本発明の方法のもう１つの融合タンパク質をさらにコードする構築物によってコードされる。任意選択で、前記構築物は、本明細書に定義されるシトシンデアミナーゼドメインを含む融合タンパク質及び本明細書に定義されるアデニンデアミナーゼドメインを含む融合タンパク質の両方をさらにコードする。
【０１１６】
本発明の方法の細胞が植物細胞である場合、方法は、標的変化を含む植物又はその子孫を再生するステップをさらに含み得る。当業者は、植物細胞から植物を再生する方法及びプロトコールを十分認識している。再生された植物の後代、子孫、変種及び変異体も、これらの部分が本発明による方法を用いて導入された標的変化を含む限り、本発明の範囲に含まれる。
【０１１７】
本明細書では、本明細書上に詳述した、細胞、好ましくは植物細胞における標的ヌクレオチド編集のための融合タンパク質又は同じ物をコードする築物の使用を提供する。同様に提供されるのは、本明細書上に詳述した方法によって得られた植物、植物部分、種子又は植物細胞であり、植物、植物部分、植物産物、種子又は植物細胞は、対照植物細胞と比較した場合に標的変化を含むことによって改変されており、この場合対照植物細胞は、本明細書上に詳述されるいずれかの方法によって標的変化が導入される前の植物細胞である。任意選択で、前記植物産物（例えば植物油、植物タンパク質、植物炭水化物）は、非増殖性であり得る。
【０１１８】
本発明は、キットを、好ましくは本発明の方法における使用をさらに提供する。前記キットは、好ましくは少なくとも２つの融合タンパク質、すなわち少なくとも第１の及び第２の融合タンパク質、又は本発明による同じ物をコードする構築物（複数可）を含み、第１の融合タンパク質はシトシンデアミナーゼドメインを含み、第２の融合タンパク質はアデニンデアミナーゼドメインを含む。言い換えると本発明のキットは：
第１の及び第２の融合タンパク質の両方
第１の及び第２の融合タンパク質をコードする構築物、又は
第１の融合タンパク質をコードする構築物及び第２の融合タンパク質をコードする構築物
を含む第１のバイアルを含み得る。
【０１１９】
代替的に、本発明のキットは
第１の融合タンパク質又は第１の融合タンパク質をコードする構築物を含む第１のバイアル、及び
第２の融合タンパク質又は第２の融合タンパク質をコードする構築物を含む第２のバイアル
を含み得る。
【０１２０】
キットは、それぞれ１つ又は複数のガイドＲＮＡを含む１つ又は複数のさらなるバイアルをさらに含み得る。任意選択で、これらの１つ又は複数のガイドＲＮＡは、本明細書上において定義される第１の及び／又は第２のバイアル内に含まれる又はその中に含まれる。キットのバイアルの容積は、好ましくは１〜５ｍＬの間又は１〜１０ｍＬの間又は１〜２５ｍＬの間である。
【０１２１】
本発明はここに一般に記載され、同じ物は、例示の方法によって提供され、本発明の限定であると意図されない続く実施例を参照することを通じてさらに容易に理解され得る。
【実施例】
【０１２２】
実施例１  植物細胞中のＬｉｎ５遺伝子座での標的塩基のプログラム可能な編集
構築物
３つの構成成分、ラットＡＰＯＢＥＣデアミナーゼ（ｒＡＰＯＢＥＣ１）、Ｃａｓ９タンパク質及びＵＤＰ−ウラシルグリコシラーゼ阻害タンパク質ＵＧＩからなる構築物を融合タンパク質を創出するように構築した。ｒＡＰＯＢＥＣ１配列をソラヌム種における発現のためにコドン最適化し、Ｃａｓ９のＮ末端でのクローニングのためにＮｃｏＩ／ＫｐｎＩ部位に隣接させた。６ｘＨｉｓタグもｒＡＰＯＢＥＣ１配列の５’末端に導入した。ＵＧＩ配列もソラヌム種のためにコドン最適化し、核局在化シグナル（ＮＬＳ）と共に合成し、ＡｇｅＩ／ＸｈｏＩ部位に隣接させた。次にＣａｓ９  ＯＲＦ（ｐＥＴ２８：：Ｃａｓ９）を含有するベクターをベクター骨格の単離のために酵素ＮｃｏＩ及びＸｈｏＩを用いて、並びにＣａｓ９  ＯＲＦの断片を単離するためにＫｐｎＩ／ＡｇｅＩを用いて消化した。次にｒＡＰＯＢＥＣ１、Ｃａｓ９、ＵＧＩ−ＮＬＳ及びベクター断片を１回のライゲーションで組合せ、すべての断片からなるクローンを単離し、構築物ｐＥＴ２８：：ｒＡＰＯＢＥＣ１−Ｃａｓ９−ＵＧＩ−ＮＬＳを生じさせた。この構築物をＣａｓ９  ＯＲＦのＤ１０又はＨ８４０アミノ酸残基のいずれかをアミノ酸アラニンに変異導入するための鋳型として使用し、元の構築物のニッカーゼバージョン（Ｄ１０Ａ又はＨ８４０Ａ）を創出した。次にｐＥＴ２８：：ｒＡＰＯＢＥＣ１−Ｃａｓ９−ＵＧＩ−ＮＬＳ及びニッカーゼ誘導体をＰＣＲによって増幅し、Ｇａｔｅｗａｙ適合性エントリーベクターｐＤＯＮＲ２２１にクローニングした。次にそれらを３５Ｓプロモーターを保有する植物発現デスティネーションベクターｐＫ２ＧＷ７に移した。次に構築物ｐＫ２ＧＷ７：：ｒＡＰＯＢＥＣ１−Ｃａｓ９−ＵＧＩ−ＮＬＳ  （ＫＧ１００１２）、ｐＫ２ＧＷ７：：ｒＡＰＯＢＥＣ１−Ｃａｓ９  Ｄ１０Ａ−ＵＧＩ−ＮＬＳ（ＫＧ１００９８）及びｐＫ２ＧＷ７：：ｒＡＰＯＢＥＣ１−Ｃａｓ９  Ｈ８４０Ａ−ＵＧＩ−ＮＬＳ（ＫＧ１０１１２）のプラスミドＤＮＡをトマトプロトプラストトランスフェクションのために単離した。Ｃａｓ９ニッカーゼのＮ末端に融合されたアデニンデアミナーゼを保有する構築物（ＴａｄＡ−Ｃａｓ９  Ｄ１０Ａ−ＮＬＳ）をｐＤＯＮＲ２２１に合成した。次にこのカセットも植物発現ベクターＫ２ＧＷ７に移し、構築物ＫＧ１０４３６を生じさせ、プロトプラストトランスフェクションのためのプラスミドＤＮＡを単離した。これらの構築物のＤＮＡ及びタンパク質配列を図１に示す。
【０１２３】
融合タンパク質（複数可）をトマトＬＩＮ５遺伝子座に標的化できる２つのｓｇＲＮＡを設計し、合成した。これは、植物細胞における発現のためのＡ．タリアナＵ６プロモーターに連結されたｓｇＲＮＡの配列を含んだ。次に、これらのカセット（ＫＧ１００７５及びＫＧ１０２５２）を保有するプラスミドをトマトプロトプラストトランスフェクションのために単離した。
【０１２４】
タンパク質発現及び精製
ｐＥＴ２８：：ｒＡＰＯＢＥＣ１−Ｃａｓ９−ＵＧＩ−ＮＬＳ発現プラスミドを含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ストレインＢＬ２１  ＤＥ３をカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を補充したＬＢ培地でＯＤ６００＝０．６まで増殖させ、次にＩＰＴＧをタンパク質産生を誘導するために最終濃度１ｍＭまで加えた。次にこれらの培養物を、最適なタンパク質発現のために振とう機、２２℃で一晩増殖させた。次に組換えタンパク質をＮｉ−ＮＴＡ  Ｓｐｉｎ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を製造者のプロトコールに従って使用して精製した。次にタンパク質産生を１０％ポリアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上での精製タンパク質の分離に続くクーマシー染色によって確認した。次に精製タンパク質を２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ及び１０％グリセロールからなる緩衝液（Ｇ）に対して２０Ｋ  Ｓｌｉｄｅ−ａ−Ｌｙｚｅｒ  ｄｉａｌｙｓｉｓ  ｃａｓｓｅｔｔｅｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して４℃で、一晩透析した。次にタンパク質をカセットから外し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４  １００Ｋ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ  Ｆｉｌｔｅｒ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通した。フィルター上のタンパク質を１ｘＰＢＳ緩衝液（ＮａＣｌ、８０ｇ／ｌ；ＫＣｌ、２ｇ／ｌ；Ｎａ２ＨＰＯ４、１４．４ｇ／ｌ；ＫＨ２ＰＯ４、２．４ｇ／ｌ；ｐＨ７．４）を用いて洗浄し、次に２００μｌ  １ｘＰＢＳ緩衝液を使用して、フィルターから最終洗浄した。Ｃａｓ９タンパク質の濃度を市販のＣａｓ９タンパク質（Ｍ０６４１、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、１６６ｎｇ／μｌ）を基準として使用して、１０％ポリアクリルアミドゲルに続くクーマシーゲル染色によって定量した。
【０１２５】
ＬＩＮ５  ｓｇＲＮＡ合成
フォワードプライマーがＴ７ポリメラーゼプロモーターも含むことによって、ＬＩＮ５  ｓｇＲＮＡをプラスミドＫＧ１００７５からプライマーを使用して増幅した。次にＰＣＲ産物を沈殿させ、Ｐｒｏｂｅ  Ｑｕａｎｔ  Ｇ５０  Ｍｉｃｒｏ  ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により精製し、次にＡｍｐｌｉｓｃｒｉｂｅ  Ｔ７  Ｆｌａｓｈ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＲＮＡ合成のための鋳型として使用した。次にｓｇＲＮＡを精製し、ｓｓＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｃｌｅａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ  ｋｉｔ（ＺｙｍｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を使用して濃縮し、Ｑｕｂｉｔ上で定量した。
【０１２６】
トマトプロトプラスト単離及びトランスフェクション
ソラナム・リコペルシコン（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ）変種Ｍｏｎｅｙｂｅｒｇのｉｎ  ｖｉｔｒｏシュート培養物を０．８％アガーを含むＭＳ２０培地、高プラスチックジャーで、２０００ルクス、１６／８時間の光周期、２５℃、６０〜７０％ＲＨで維持した。若葉（１ｇ）を、酵素混合物の浸透を容易にするために中央の筋に垂直に穏やかにスライスした。スライスした葉を酵素混合物（ＣＰＷ９Ｍ中２％Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ  Ｏｎｏｚｕｋａ  ＲＳ、０．４％Ｍａｃｅｒｏｚｙｍｅ  Ｏｎｏｚｕｋａ  Ｒ１０）に移し、細胞壁消化を暗所、２５℃で一晩進めた。プロトプラストを５０μｍナイロンシーブを通してろ過し、５分間、８００ｒｐｍでの遠心分離によって採取した。プロトプラストをＣＰＷ９Ｍ（Ｆｒｅａｒｓｏｎ，１９７３）培地に再懸濁し、３ｍＬ  ＣＰＷ１８Ｓ（Ｆｒｅａｒｓｏｎ、１９７３）をロングネックガラスパスツールピペットを使用して各チューブの底に加えた。生プロトプラストを１０分間、８００ｒｐｍでの遠心分離によって細胞画分としてショ糖とＣＰＷ９Ｍ培地の間の界面で採取した。プロトプラストを計数し、ＭａＭｇ（Ｎｅｇｒｕｔｉｕ，１９８７）培地に最終密度１ｍＬあたり１０６個で再懸濁した。
【０１２７】
プロトプラストトランスフェクションのために１０μｇのｒＡＰＯＢＥＣ１−Ｃａｓ９−ＵＧＩ−ＮＬＳ発現プラスミド（若しくはニッカーゼ変種）又はＴａｄＡ−Ｃａｓ９  Ｄ１０Ａ−ＮＬＳ発現プラスミドと共に２０μｇのｓｇＲＮＡ発現プラスミドＫＧ１００７５を５００μＬ（プロトプラスト５０００００個）のプロトプラスト懸濁物と混合し、次に５００μＬのＰＥＧ溶液（４００ｇ／ｌポリ（エチレングリコール）４０００、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ＃８１２４０；０．１Ｍ  Ｃａ（ＮＯ３）２）を加え、トランスフェクションを２０分間、室温で実行させた。他の実験では、５μｇのｒＡＰＯＢＥＣ１−Ｃａｓ９  Ｄ１０Ａ−ＵＧＩ−ＮＬＳ（ＫＧ１００９８）及び５μｇのＴａｄＡ−Ｃａｓ９  Ｄ１０Ａ−ＮＬＳ（ＫＧ１０４３６）を２０μｇのｓｇＲＮＡ発現プラスミドＫＧ１００７５と併せて混合し、上に記載されるとおりトマトプロトプラストにトランスフェクトした。対照試料も、トランスフェクションから１つ又は両方のプラスミドを除くことによって産生した。精製ｒＡＰＯＢＥＣ１−Ｃａｓ９−ＵＧＩ−ＮＬＳタンパク質及びＬＩＮ５  ｓｇＲＮＡを使用した場合、１ｘＰＢＳ緩衝液に再懸濁した８ｐｍｏｌのＣａｓ９タンパク質及び１５０ｐｍｏｌのＬＩＮ５  ｓｇＲＮＡを（プロトプラスト５０００００個）のプロトプラスト懸濁物と混合し、次に５００μＬのＰＥＧ溶液（４００ｇ／ｌポリ（エチレングリコール）４０００、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ＃８１２４０；０．１Ｍ  Ｃａ（ＮＯ３）２）を加え、トランスフェクションを２０分間、室温で実行させた。
【０１２８】
次に、１０ｍＬの０．２７５Ｍ  Ｃａ（ＮＯ３）２溶液を加え、完全にだが穏やかに混合した。プロトプラストを５分間、８００ｒｐｍでの遠心分離によって採取し、９Ｍ培養培地中に１ｍｌあたり０．５ｘ１０６個の密度で再懸濁し、直径４ｃｍのペトリ皿に移し、等量の２％アルギン酸溶液（２０ｇ／ｌアルギン酸−Ｎａ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ＃Ａ０６８２）、０．１４ｇ／ｌ  ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、９０ｇ／ｌマンニトール）を加えた。次に１ｍｌアリコート（トランスフェクトされたプロトプラスト１２５０００個）をＣａ−Ａｇａｒプレート（７２．５ｇ／ｌマンニトール、７．３５ｇ／ｌ  ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、８ｇ／ｌアガー、ｐＨ５．８）に広げ、１時間ポリマー化させた。プラスミド構築物をトランスフェクションにおいて使用する場合、包埋したプロトプラストを４ｍｌのＫ８ｐ（Ｋａｏ，１９７５）培養培地を含む４ｃｍ組織培養皿で増殖させた。融合タンパク質がトランスフェクションにおいて使用される場合、本発明者らは、トランスフェクトされていないが、上記と同じプロトコールを使用してアルギン酸に包埋した２０００００個のトマトプロトプラスト（Ｍｏｎｅｙｂｅｒｇ変種）を含有する「フィーダー」ディスクを産生することによってプロトプラスト生存率を改善した。トランスフェクトしたプロトプラストのディスク一枚を、次に４ｍｌのＫ８ｐ（Ｋａｏ，１９７５）培養培地を含有する４ｃｍ組織培養皿において、プロトプラストのフィーダーディスク一枚と組み合わせた。トマトプロトプラスト中のインデルを検出するために、トランスフェクトしたプロトプラストのディスクを４８時間後に皿から除き、アルギン酸を溶解し、プロトプラストを単離した。カルスの再生のために、プロトプラストをＫ８ｐ培地中で２１日間、２８℃、暗所でインキュベートした。この期間の後、トランスフェクトしたプロトプラストのディスクを、１ｍｇ．ｌ−１ゼアチン及び０．２ｍｇ．ｌ−１ＧＡ３を補充した固体ＧＭ培地（Ｔａｎ，１９８７）に移し、さらに３週間増殖させ、この時点でカルスはサイズおよそ０．３ｍｍであった。次にアルギン酸を溶解し、カルスをＧＭ培地の新鮮プレートに広げ、カルスがおよそ１．５ｍｍになるまで増殖させ、この時点でカルスを再度新鮮培地に移し、次にさらに１４日後に遺伝子型判定した。
【０１２９】
プロトプラスト及びカルスの遺伝子型判定
全ゲノムＤＮＡをＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してトマトプロトプラストから単離した（トランスフェクション後４８時間）。次にｇＤＮＡを次のプライマー（Ｆｗ：５’ＣＡＣＴＡＴＴＧＧＣＡＴＧＴＡＴＣＡＣＡＣ（配列番号３５）；Ｒｅｖ：５’ＧＴＧＡＴＧＣＴＧＡＧＡＴＣＣＣＴＴＴＡＡＣ（配列番号３６））を使用してＬＩＮ５  標的部位を増幅するＰＣＲ反応において使用した。次にこのＰＣＲ産物を次にＭｉＳｅｑプラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）で配列決定する各試料からライブラリーを生成するための鋳型として使用した。各試料を固有の５ｂｐタグを使用して同定した。配列決定後、各試料の読み取りデータを標的部位に存在する配列変更の数及び種類を同定するために処理した。
【０１３０】
カルスをダイレクトＰＣＲキット（Ｐｈｉｒｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｄｉｒｅｃｔ  ＰＣＲ  ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び上に記載した遺伝子特異的プライマーを使用して直接遺伝子型判定した。次に生じたＰＣＲ産物をどのカルスが標的部位に変異を含有するかを同定するために遺伝子型判定した。次にこれらを２ｍｇ．ｌ−１ゼアチン及び０．１ｍｇ．ｌ−１  ＩＡＡ培地を補充したＭＳ培地に移し、その後温室に移す前に再生トマト植物を０．５ｍｇ．ｌ−１  ＩＢＡを補充したＭＳ培地に根付かせた。
【０１３１】
結果
ＣからＴへの変換をもたらすシトシンの標的脱アミノ化が植物細胞において実現可能であることを実証するために、本発明者らは、そのような事象がトランスフェクトされたプラスミド構築物からのｒＡＰＯＢＥＣ１−Ｃａｓ９−ＵＧＩ−ＮＬＳ融合タンパク質及びＬＩＮ５  ｓｇＲＮＡの発現後に、又は融合タンパク質及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＬＩＮ５  ｓｇＲＮＡのトランスフェクション後に検出できるかどうかを最初に検査した。本発明者らは、ＡＰＯＢＥＣ１ドメインのデアミナーゼ活性がガイドＲＮＡに存在する標的部位の２０ｂｐｓ以内に位置付けられたシトシンに活性であることを想定した。本発明者らは、それが、ＡＰＯＢＥＣ１ドメインによる脱アミノ化のために理想的に位置付けられている標的部位の５’末端に位置付けられた３個のシトシンを含有することから、ＬＩＮ５ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を選択した。トマトプロトプラスト中のさまざまなガイドＲＮＡの効率は、顕著に異なる可能性があり、したがって特定のガイドＲＮＡ設計が植物細胞において活性であるかどうか及びどの程度かを検査することが最初に重要である。したがって本発明者らは、ベクター（ＫＧ１００７５）に存在するＬＩＮ５  ｓｇＲＮＡ発現カセットを、Ｃａｓ９タンパク質（３５Ｓ：Ｃａｓ９、ＫＧ１００８８）を発現するベクターと共にトマトプロトプラストに最初に導入した。４８時間後、細胞を採取し、ゲノムＤＮＡを単離した。次にＬＩＮ５標的配列を試料中のすべての細胞から増幅し、生じた増副産物をＭｉＳｅｑプラットフォームでの配列決定ためのライブラリーを調製するために使用した。次に得られた配列読み取りデータをＰＡＭ部位中及び付近のインデル変異の存在について分析した。本発明者らは、読み取りデータの＞１６％が予測された位置にインデルを保有し、ＬＩＮ５  ｓｇＲＮＡがトマトプロトプラストにおいて高度に活性で、したがって、本発明者らの脱アミノ化実験において使用できることを見出した。
【０１３２】
ｒＡＰＯＢＥＣ１のデアミナーゼ活性がＣａｓ９によってこのＬＩＮ５配列中のシトシンに標的化され得るかどうかを検査するために、本発明者らは、最初に構築物ＫＧ１００９８（ｐＫ２ＧＷ７：：ｒＡＰＯＢＥＣ１−Ｃａｓ９  Ｄ１０Ａ−ＵＧＩ−ＮＬＳ）及びＫＧ１０１２６（ｐＫ２ＧＷ７：：ｒＡＰＯＢＥＣ１−Ｃａｓ９−ＵＧＩ−ＮＬＳ）をプラスミドＫＧ１００７５と共にトマトプロトプラストにトランスフェトし、４８時間後、細胞を採取し、トランスフェクトした細胞からＬＩＮ５標的部位を増幅した。同様の実験において本発明者らは、精製ｒＡＰＯＢＥＣ１−Ｃａｓ９  Ｄ１０Ａ−ＵＧＩ−ＮＬＳタンパク質もｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＬＩＮ５  ｓｇＲＮＡと共にトマトプロトプラストに導入し、これらのプロトプラストもＬＩＮ５標的部位でのＣからＴへの移行について分析した。ＬＩＮ５増副産物をライブラリー調製のために使用し、次にＭｉＳｅｑプラットフォームで配列決定した。生じた読み取りデ−タをＬＩＮ５標的部位で生じた可能性があるすべてのヌクレオチド変更を同定するために分析した。図３において示すとおり、ベクターＫＧ１００９８を使用した場合、本発明者らは、標的部位の５’末端から６ｎｔのシトシンに単一のＣからＴへの移行を含有する多数の配列読み取りデータ（０．８％）を見出した。本発明者らは、単一の読み取りデータで複数のシトシンがチミンに変換されていたより少ない数の読み取りデータ（０．０８％）も見出した。本発明者らは、ベクターＫＧ１００９８がそのニッキング活性がインデル形成をもたらさないＣａｓ９ニッカーゼを発現していることから、ＰＡＭ部位中又は付近にインデルを含有するいかなる読み取りデータも検出しなかった。ベクターを用いない又は１つだけを用いるトマトプロトプラストのトランスフェクションも実施したが、そのような試料は、ＬＩＮ５標的部位に変異を示す読み取りデータを全く生じなかった。そのようなＣからＴへの移行は、標的部位にＤＮＡ  ＤＳＢをまだ導入できる構築物ＫＧ１０１２６（ｐＫ２ＧＷ７：：ｒＡＰＯＢＥＣ１−Ｃａｓ９−ＵＧＩ−ＮＬＳ）が使用された場合にも生じ得る。この場合、本発明者らは、ＣからＴへの移行の効率が細胞においてｒＡＰＯＢＥＣ１−Ｃａｓ９  Ｄ１０−  ＵＧＩ−ＮＬＳニッカーゼが発現された場合よりも１０分の１低かったことを見出した。しかし、このことは、そのＤＳＢ導入活性を保持しているデアミナーゼ−Ｃａｓ９融合タンパク質が植物細胞において活性であることを実証した。一部の配列読み取りデータも、ＰＡＭ部位中及び付近にインデル変異を、場合により移行との組合せで含有していた。このことは、ＣからＴへの移行の相対的効率をインデル形成のものと比較できるようにした。本発明者らは、ＫＧ１０１２６が使用された場合に読み取りデータのおよそ０．８９％がインデル変異を含有することを、ＫＧ１００９８が使用された場合に読み取りデータの０．８％が単一のＣからＴへの移行を含有することと比較して見出した。したがって本発明者らは、ＬＩＮ５標的配列でのＣからＴへの移行の効率がインデル形成と同様に効率的であることを結論付けることができた。
【０１３３】
本発明者らは、ＫＧ１０１２６を使用するインデル効率が本発明者らの実験において未改変Ｃａｓ９タンパク質を使用した場合よりもおよそ１６分の１低かったことを認識した。このことは、Ｃａｓ９タンパク質のＮ及びＣ末端でのＡＰＯＢＥＣ１及び／又はＵＧＩ配列の付加が、そのＤＳＢ誘導能力に悪影響を有することを実証している。本発明者らは、ｒＡＰＯＢＥＣ１−Ｃａｓ９  Ｄ１０Ａ−ＵＧＩ−ＮＬＳタンパク質及びＬＩＮ５  ｓｇＲＮＡがトマトプロトプラストにトランスフェクトされた場合に同様の結果を見出した。これらのプロトプラストに由来する読み取りデータの分析は、同じタンパク質がプラスミド構築物から発現された場合と、およそ同じ効率及び位置でのＬＩＮ５標的配列におけるＣからＴへの移行も示した。
【０１３４】
要約すると、この結果は、デアミナーゼタンパク質がＣａｓ９タンパク質へのその融合によって植物細胞において特異的ゲノム配列に標的化され得ることを示している。ＣからＴへの移行は、遺伝子のコード配列において産生され得、それによりコドンを変化させ、変化したタンパク質配列を生じる。したがって、本技術は、植物全体の性能の改善をもたらし得るコード配列において個々アミノ酸を変更するために使用できる。構築物ＫＧ１００９８もＬＩＮ５  ｓｇＲＮＡ２（ＫＧ１０２５２）を発現するプラスミドと共にプロトプラストにトランスフェクトし、配列決定をこの代替的標的配列での脱アミノ化反応の効率を決定するために行った。結果を図３に示す。この第２の標的配列で、単一又は複数のシトシンのチミンへの効率的な変換を再度観察した。
【０１３５】
Ｃａｓ９のＮ末端に融合された改変アデニンデアミナーゼ（ＴａｄＡ）は、次にシトシンと優先的に塩基対合するイノシンにアデニンを転換する。次にこれは、特定のゲノム配列に標的化され得るＡ：ＴからＧ：Ｃへの変換活性を生じる。ｐＫ２ＧＷ７：：ＴａｄＡ−Ｃａｓ９  Ｄ１０Ａ−ＮＬＳ構築物（ＫＧ１０４３６）をＬＩＮ５  ｓｇＲＮＡ１プラスミドＫＧ１００７５と共にトマトプロトプラストにトランスフェクトし、配列決定をこの標的配列でのＡ：ＴからＣ：Ｇへの変換の効率を決定するためにプロトプラストで実施した。図３に示すとおり、本発明者らは、５位及び８位でのアデニンがグアニンに変換された読み取りデータを検出できた。このことは、標的アデニン脱アミノ化が植物細胞において実現可能であることを実証している。
【０１３６】
次にシトシン及びアデニン標的デアミナーゼの両方の組合せを植物細胞において検査した。構築物ＫＧ１００９８とＫＧ１０４３６とを混合し、ＬＩＮ５  ｓｇＲＮＡ１  ｓｇＲＮＡ発現プラスミドと共にトマトプロトプラストにトランスフェクトした。ｒＡＰＯＢＥＣ１−Ｃａｓ９  Ｄ１０Ａ−ＵＧＩ−ＮＬＳ  （ＫＧ１００９８）及びＴａｄＡ−Ｃａｓ９  Ｄ１０Ａ−ＮＬＳ（ＫＧ１０４３６）シトシン及びアデニンデアミナーゼは、標的化のために同じｓｇＲＮＡを利用してＬＩＮ５  ｓｇＲＮＡ１標的部位でそれぞれ両方とも活性である。併せてトラスフェクトした場合、デアミナーゼはＣからＴへ、及びＡからＧへの変換を単一の細胞の標的配列で産生できる。このことは、配列決定の存在によって検出でき、デアミナーゼをヌクレオチド変更の新規組合せを導入するために併せて使用できることを実証している。この実験の結果を図３に示す。この試料では、読み取りデータの０．３５％が６位にシトシンデアミナーゼ（ＫＧ１００９８）によって生成されたＣからＴへの変更を含有し、読み取りデータの０．１５％が５位にアデニンデアミナーゼ（ＫＧ１０４３６）によって産生されたＡからＧへの変更を含有した。興味深いことに、読み取りデータは、同じ遺伝子座での両方のデアミナーゼの活性を通じてだけ産生され得る６位のＣからＴへの変更及び８位のＡからＧへの変更の両方を見出した。したがって、このアプローチは、シトシン及びアデニンデアミナーゼが同じ植物細胞（複数可）において発現でき、異なるヌクレオチド変更を産生できる場合に同じ遺伝子座に標的化されることを示している。したがってこれは、達成され得るアミノ酸変更の範囲を増加させる。
【０１３７】
標的化されたＣからＴへの移行を有する植物を得るために、そのような変異を含有するプロトプラストを成熟植物に再生しなければならない。次にこれらを、変異が再生工程の際に失われていないことを示すために遺伝子型判定する。トマトプロトプラストをｒＡＰＯＢＥＣ−Ｃａｓ９  Ｄ１０Ａ−ＵＧＩ−ＮＬＳベクター（ＫＧ１００９８）を用いてＫＧ１００７５又はＫＧ１０２５２との組合せでトラスフェクトした。代替的にｒＡＰＯＢＥＣ１−Ｃａｓ９  Ｄ１０Ａ−ＵＧＩ−ＮＬＳタンパク質をＬＩＮ５  ｓｇＲＮＡ１と併せて使用した。次にプロトプラストを増殖培地でそれらが、ＬＩＮ５標的配列でのＣからＴへの移行の存在について遺伝子型判定され得るカルスを形成するまでインキュベートした。ＫＧ１００９８及びＫＧ１００７５トランスフェクションから、２０００個を超えるカルスが生成され、遺伝子型判定した。これらのおよそ１．５％（カルス３２個）が標的配列中の６位でのＣからＴへの移行についてヘテロ接合性であることが見出され、配列決定後に見出されたこの位置での変異頻度（０．８％）と十分一致する。別のカルス６個は、６位でのＣからＴへの移行についてホモ接合性であることが示され、これらの試薬が二対立遺伝子変異を産生できることを実証している。本発明者らは、ｒＡＰＯＢＥＣ１−Ｃａｓ９  Ｄ１０Ａ−ＵＧＩ−ＮＬＳタンパク質及びＬＩＮ５  ｓｇＲＮＡ１を使用した場合にＬＩＮ５標的配列に変異を有する同様の数のカルスを見出した。次にカルスを次いで遺伝子型判定する成熟植物に再生させた（図４）。大部分の株は、３個の二対立遺伝子変異を含有する株６を除いて、標的領域でのＣからＴ変異についていくつかのヘテロ接合性を保有していた。それぞれの場合において、カルスにおいて見出された変異は、再生されたシュートに存在した。これらの結果は、標的塩基編集を植物プロトプラストにおいて実行することができ、再生後に変異体カルスを遺伝子型判定によって（選択を適応することなく）同定し、次に成熟変異体植物に再生できることを実証している。
【０１３８】
実施例２  植物に除草剤抵抗性を導入するための標的デアミナーゼの使用
トマトは、そのタンパク質が広範な除草剤の標的である遺伝子アセト乳酸合成酵素（ＡＬＳ１及びＡＬＳ２）を２コピー含有している。ＡＬＳ２  Ｐ１８４位及びＳ６４０位並びにＡＬＳ１タンパク質での対応するアミノ酸（Ｐ１８６及びＳ６４２）での特異的アミノ酸変更は、除草剤の活性に抵抗性であるタンパク質を生成し、そのようなタンパク質を発現する植物細胞は、除草剤適用で残存する。Ｐ１８４及びＳ６４０コドンの両方での変異は、顕性であり、単一の細胞及び植物レベルの両方について選択できる。本発明者らは、ｒＡＰＯＢＥＣ１−Ｃａｓ９  Ｄ１０Ａ−ＵＧＩ−ＮＬＳタンパク質は、プロトプラスト中のこれらのコドンに標的化され得、除草剤抵抗性を付与する変異を生成すると判断した。プロトプラスト増殖培地への除草剤の添加は、Ｐ１８４及びＳ６４０コドン中及び付近にＣからＴへの移行を含有するプロトプラストを選択し、次に除草剤抵抗性カルスが生成される。そのようなカルスは、次に、これらの標的部位で産生された変異を同定するために遺伝子型判定され得る。これらの実験は、ＣからＴへの移行が他の植物遺伝子座に導入され得ることを実証する。本発明者らが実施例１において実証したとおり、標的領域中の複数のシトシンは、変化され得、いくつかの隣接アミノ酸の変化を生じる。したがって、本発明者らは、ＡＬＳ阻害除草剤への抵抗性の改善を示す、以前同定されたことがないアミノ酸変更の組合せを有する除草剤抵抗性カルスを選択できる場合がある。同様に、２コピーのＡＬＳがトマトに存在することから、本発明者らは、単一の細胞においてＡＬＳ１及びＡＬＳ２遺伝子の両方に同時に変異を導入するデアミナーゼ−Ｃａｓ９タンパク質の能力を評価しようと考えた。
【０１３９】
標的コドン周辺のＰＡＭ配列（ＮＧＧ）の位置に基づいて、本発明者らは、ＡＬＳ１及びＡＬＳ２遺伝子座の両方について３個のｓｇＲＮＡを設計し（図５）、次にシロイヌナズナＵ６プロモーターに融合したこれらを合成した（図２）。次にこれらのｓｇＲＮＡ発現ベクターをＰＥＧトランスフェクションによってｒＡＰＯＢＥＣ１−Ｃａｓ９  Ｄ１０Ａ−ＵＧＩ−ＮＬＳ発現ベクターＫＧ１００９８と共にトマトプロトプラストに導入した。４８時間後、１枚のアルギン酸ディスクでトランスフェクトしたプロトプラストをゲノムＤＮＡ単離のために採取し、一方、他方のディスクをＰ１８４での変異について選択するためのクロルスルフロン又はＳ６４０での変異について選択するためのイミダゾールのいずれかを含有する増殖培地でインキュベートした。トランスフェクトしたプロトプラストからのゲノムＤＮＡをＡＬＳ１及びＡＬＳ２遺伝子座の両方由来の標的コドンを含有する増副産物を生成するための鋳型として使用し、これらをＭｉＳｅｑプラットフォームで次に配列決定するライブラリーを調製するために使用した。次に配列読み取りデータをＣからＴへの移行の存在について分析した。いずれかの除草剤に抵抗性のカルスを遺伝子型判定し、ＡＬＳ１及び／又はＡＬＳ２遺伝子座の両方に存在する変異を同定した。
【０１４０】
図６は、いずれかのＤＮＡ鎖でのＣからＴへの移行によって予測され得るヌクレオチド変更及びこれらの変異から生じるアミノ酸変更を示している。図６に示されるすべての変異は、配列読み取りデータに見出すことができ、ｒＡＰＯＢＥＣ１−Ｃａｓ９  Ｄ１０Ａ−ＵＧＩ−ＮＬＳタンパク質がＡＬＳ１及びＡＬＳ２遺伝子座の両方にＣからＴへの移行を産生できることを実証している。次に植物を除草剤抵抗性カルスから再生し、遺伝子型判定した。図７に示すとおり、植物をＡＬＳ１及びＡＬＳ２のそれぞれＰ１８６及び／又はＰ１８４コドンに大部分のヘテロ接合性変異を含有して、再生した。例えば図７、表Ａでの株５は、ＡＬＳ１及びＡＬＳ２遺伝子座の両方に除草剤抵抗性を付与する変異を含有しており、単一のガイドＲＮＡを同じ細胞中の保存された遺伝子ファミリーのメンバーにおいて変異を創出するために使用できることを示している。この場合、使用したガイドＲＮＡとＡＬＳ１標的配列との間に単一のＳＮＰがあるが、ガイドＲＮＡはこの遺伝子座でいまだ活性である。イマザピルに抵抗性の植物の遺伝子型を図７、表Ｂに示す。この場合ガイドＲＮＡは、ＡＬＳ１遺伝子座が対応するＰＡＭ部位を欠失していることからＡＬＳ２遺伝子座だけで活性であった。ヘテロ接合性変異が、Ｓ６４０Ｎイマザピル抵抗性変異及び２個の追加的ヘテロ接合性変異（Ｓ６４０Ｎ、Ｇ６４２Ｎ）を含有する株を産生したことが見出された。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図１−７】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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