(57)【要約】本開示は、少なくとも２つの別個の組換え標的部位（ＲＴＳ）を含み、２つのＲＴＳがＮＬ１座位又はＮＬ２座位内において染色体に組み込まれている、部位特異的組込み（ＳＳＩ）哺乳動物細胞に関する。本開示はまた、少なくとも４つの別個のＲＴＳを含み、２つのＲＴＳがＮＬ１又はＮＬ２座位内において染色体に組み込まれ、２つのＲＴＳが、別々の座位内において染色体に組み込まれている、ＳＳＩ哺乳動物細胞に関する。本開示はまた、ＳＳＩ哺乳動物細胞を使用して、発現困難タンパク質を発現できる組換えタンパク質発現細胞株を生産する方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つの別個の組換え標的部位（ＲＴＳ）を含み、２つのＲＴＳがＮＬ１座位又はＮＬ２座位内において染色体に組み込まれている哺乳動物細胞。
【請求項２】
２つの別個のＲＴＳを含む、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
前記２つの別個のＲＴＳが、ＮＬ１座位内において染色体に組み込まれている、請求項１に記載の細胞。
【請求項４】
前記２つの別個のＲＴＳが、ＮＬ２座位内において染色体に組み込まれている、請求項１に記載の細胞。
【請求項５】
４つの別個のＲＴＳを含む、請求項１に記載の細胞。
【請求項６】
前記４つの別個のＲＴＳが、同じ座位において染色体に組み込まれている、請求項１に記載の細胞。
【請求項７】
２つのＲＴＳが、別々の座位において染色体に組み込まれている、請求項６に記載の細胞。
【請求項８】
前記別々の座位がＦｅｒ１Ｌ４座位である、請求項７に記載の細胞。
【請求項９】
２つの別個のＲＴＳがＮＬ１座位内において染色体に組み込まれ、２つの別個のＲＴＳがＮＬ２座位内において染色体に組み込まれている、請求項５に記載の細胞。
【請求項１０】
６つの別個のＲＴＳを含む、請求項１に記載の細胞。
【請求項１１】
少なくとも４つの別個のＲＴＳが、同じ座位において染色体に組み込まれている、請求項１０に記載の細胞。
【請求項１２】
少なくとも２つの別個のＲＴＳが、別々の座位において染色体に組み込まれている、請求項１０に記載の細胞。
【請求項１３】
前記別々の座位がＦｅｒ１Ｌ４座位である、請求項１２に記載の細胞。
【請求項１４】
少なくとも２つの別個のＲＴＳがＮＬ１座位内において染色体に組み込まれ、少なくとも２つの別個のＲＴＳがＮＬ２座位内において染色体に組み込まれている、請求項１０に記載の細胞。
【請求項１５】
前記ＲＴＳの少なくとも１つが、ｆｒｔ部位、ｌｏｘ部位、ｒｏｘ部位又はａｔｔ部位である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１６】
前記ＲＴＳの少なくとも１つが、配列番号１〜３０からなる群から選択される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１７】
マウス細胞、ヒト細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＣＨＯ−ＤＸＢ１１細胞、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞、すべてのバリアントを含むＣＨＯＫ１ＳＶ（商標）細胞、すべてのバリアントを含むＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）（グルタミン合成酵素ノックアウト）細胞、ＨＥＫ細胞、付着適応及び懸濁適応バリアントを含むＨＥＫ２９３細胞、ヒーラ細胞又はＨＴ１０８０細胞である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１８】
ＨＥＫ細胞、又は付着適応及び懸濁適応バリアントを含むＨＥＫ２９３細胞である、請求項１７に記載の細胞。
【請求項１９】
第１の目的遺伝子をさらに含み、前記第１の目的遺伝子が染色体に組み込まれている、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２０】
前記第１の目的遺伝子が、レポーター遺伝子、選択遺伝子、治療目的遺伝子、補助的遺伝子又はそれらの組合せを含む、請求項１９に記載の細胞。
【請求項２１】
前記治療目的遺伝子が、発現困難タンパク質をコードする遺伝子を含む、請求項２０に記載の細胞。
【請求項２２】
前記発現困難タンパク質が、Ｆｃ融合タンパク質、酵素、膜受容体又はモノクローナル抗体からなる群から選択される、請求項２１に記載の細胞。
【請求項２３】
前記モノクローナル抗体が、二重特異性モノクローナル抗体又は三重特異性モノクローナル抗体である、請求項２２に記載の細胞。
【請求項２４】
前記第１の目的遺伝子が、２つの前記ＲＴＳの間に位置する、請求項１８〜２３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２５】
前記第１の目的遺伝子が、ＮＬ１座位内に位置する、請求項１８〜２４のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２６】
第２の目的遺伝子をさらに含み、前記第２の目的遺伝子が染色体に組み込まれている、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２７】
前記第２の目的遺伝子が、レポーター遺伝子、選択遺伝子、治療目的遺伝子、補助的遺伝子又はそれらの組合せを含む、請求項２６に記載の細胞。
【請求項２８】
前記治療目的遺伝子が、発現困難タンパク質をコードする遺伝子を含む、請求項２７に記載の細胞。
【請求項２９】
前記発現困難タンパク質が、Ｆｃ融合タンパク質、酵素、膜受容体又はモノクローナル抗体からなる群から選択される、請求項２８に記載の細胞。
【請求項３０】
第２の目的遺伝子が、２つの前記ＲＴＳの間に位置する、請求項２６〜２９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３１】
前記第２の目的遺伝子が、ＮＬ１座位又はＮＬ２座位内に位置する、請求項２６〜３０のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３２】
前記第１の目的遺伝子がＮＬ１座位内に位置し、前記第２の目的遺伝子がＮＬ２座位内に位置する、請求項２６〜３１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３３】
第３の目的遺伝子をさらに含み、前記第３の目的遺伝子が染色体に組み込まれている、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３４】
前記第３の目的遺伝子が、レポーター遺伝子、選択遺伝子、治療目的遺伝子、補助的遺伝子又はそれらの組合せを含む、請求項３３に記載の細胞。
【請求項３５】
前記治療目的遺伝子が、発現困難タンパク質をコードする遺伝子を含む、請求項３４に記載の細胞。
【請求項３６】
前記第３の目的遺伝子が、２つの前記ＲＴＳの間に位置する、請求項３３〜３５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３７】
前記第３の目的遺伝子が、ＮＬ１座位又はＮＬ２座位内に位置する、請求項３３〜３６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３８】
前記第３の目的遺伝子が、ＮＬ１座位及びＮＬ２座位とは別の座位内に位置する、請求項３３〜３７のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３９】
前記第１の目的遺伝子、前記第２の目的遺伝子及び前記第３の目的遺伝子が、３つの別々の座位内にある、請求項３３〜３８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項４０】
ａ．前記第１の目的遺伝子、前記第２の目的遺伝子及び前記第３の目的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＮＬ１座位内にあり、
ｂ．前記第１の目的遺伝子、前記第２の目的遺伝子及び前記第３の目的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＮＬ２座位内にある、請求項３３〜３９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項４１】
部位特異的リコンビナーゼ遺伝子をさらに含む、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項４２】
前記部位特異的リコンビナーゼ遺伝子が、染色体に組み込まれている、請求項４１に記載の細胞。
【請求項４３】
少なくとも４つの別個の組換え標的部位（ＲＴＳ）を含む哺乳動物細胞であって、
ａ．ＮＬ１座位又はＮＬ２座位内において染色体に組み込まれている少なくとも２つの別個のＲＴＳと、
ｂ．（ａ）の少なくとも２つのＲＴＳの間に組み込まれている第１の目的遺伝子であって、レポーター遺伝子、発現困難タンパク質をコードする遺伝子、補助的遺伝子又はそれらの組合せを含む、前記第１の目的遺伝子と、
ｃ．（ａ）の座位とは別の第２の染色体座位内に組み込まれている第２の目的遺伝子であって、レポーター遺伝子、発現困難タンパク質をコードする遺伝子、補助的遺伝子又はそれらの組合せを含む、前記第２の目的遺伝子と
を含む、哺乳動物細胞。
【請求項４４】
少なくとも４つの別個の組換え標的部位（ＲＴＳ）を含む哺乳動物細胞であって、
ａ．Ｆｅｒ１Ｌ４座位内において染色体に組み込まれている少なくとも２つの別個のＲＴＳと、
ｂ．ＮＬ１座位又はＮＬ２座位内において染色体に組み込まれている少なくとも２つの別個のＲＴＳと、
ｃ．Ｆｅｒ１Ｌ４座位内において染色体に組み込まれている第１の目的遺伝子であって、レポーター遺伝子、発現困難タンパク質をコードする遺伝子、補助的遺伝子又はそれらの組合せを含む、前記第１の目的遺伝子と、
ｄ．（ｂ）のＮＬ１座位又はＮＬ２座位内において染色体に組み込まれている第２の目的遺伝子であって、レポーター遺伝子、発現困難タンパク質をコードする遺伝子、補助的遺伝子又はそれらの組合せを含む、前記第２の目的遺伝子と
を含む、哺乳動物細胞。
【請求項４５】
少なくとも６つの別個の組換え標的部位（ＲＴＳ）を含む哺乳動物細胞であって、
ａ．Ｆｅｒ１Ｌ４座位内において染色体に組み込まれている少なくとも２つの別個のＲＴＳ及び第１の目的遺伝子と、
ｂ．ＮＬ１座位内において染色体に組み込まれている少なくとも２つの別個のＲＴＳ及び第２の目的遺伝子と、
ｃ．ＮＬ２座位内において染色体に組み込まれている少なくとも２つのＲＴＳ及び第３の目的遺伝子と
を含む、哺乳動物細胞。
【請求項４６】
ＨＥＫ細胞、又は付着適応及び懸濁適応バリアントを含むＨＥＫ２９３細胞である、請求項４３〜４５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項４７】
組換えタンパク質プロデューサー細胞を生産する方法であって、
ａ．少なくとも４つの別個の組換え標的部位（ＲＴＳ）及び部位特異的リコンビナーゼをコードする遺伝子を含み、少なくとも２つの別個のＲＴＳがＮＬ１座位内において染色体に組み込まれ、少なくとも２つの別個のＲＴＳがＮＬ２座位内において染色体に組み込まれている細胞を用意するステップと、
ｂ．（ａ）の前記細胞に、第１の目的遺伝子をコードする交換可能なカセットを含む第１のベクターと、第２の目的遺伝子をコードする交換可能なカセットを含む第２のベクターとをトランスフェクトするステップと、
ｃ．ＮＬ１座位内に第１の交換可能なカセットを、ＮＬ２座位内に第２の交換可能なカセットを組み込むステップと、
ｄ．染色体に組み込まれた前記第１の交換可能なカセット及び前記第２の交換可能なカセットを含む組換えタンパク質プロデューサー細胞を選択するステップと
を含む方法。
【請求項４８】
前記第１の目的遺伝子が、レポーター遺伝子、選択遺伝子、治療目的遺伝子、補助的遺伝子又はそれらの組合せを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記治療目的遺伝子が、発現困難タンパク質をコードする遺伝子を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記発現困難タンパク質が、Ｆｃ融合タンパク質、酵素、膜受容体又はモノクローナル抗体からなる、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記モノクローナル抗体が、二重特異性モノクローナル抗体又は三重特異性モノクローナル抗体である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記第１の目的遺伝子が、２つの前記ＲＴＳの間に位置する、請求項４５〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記第２の目的遺伝子が、レポーター遺伝子、選択遺伝子、治療目的遺伝子、補助的遺伝子又はそれらの組合せを含む、請求項４７〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記治療目的遺伝子が、発現困難タンパク質をコードする遺伝子を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記第２の目的遺伝子が、２つの前記ＲＴＳの間に位置する、請求項４７〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
組換えタンパク質プロデューサー細胞を生産する方法であって、
ａ．少なくとも少なくとも４つの別個の組換え標的部位（ＲＴＳ）及び部位特異的リコンビナーゼをコードする遺伝子を含み、少なくとも２つの別個のＲＴＳがＦｅｒ１Ｌ４座位内において染色体に組み込まれ、少なくとも２つの別個のＲＴＳがＮＬ１座位又はＮＬ２座位内において染色体に組み込まれている細胞を用意するステップと、
ｂ．（ａ）の前記細胞に、第１の目的遺伝子をコードする交換可能なカセットを含む第１のベクターと、第２の目的遺伝子をコードする交換可能なカセットを含む第２のベクターとをトランスフェクトするステップと、
ｃ．Ｆｅｒ１Ｌ４座位内に第１の交換可能なカセットを、ＮＬ１座位又はＮＬ２座位内に第２の交換可能なカセットを組み込むステップと、
ｄ．染色体に組み込まれた前記第１の交換可能なカセット及び前記第２の交換可能なカセットを含む組換えタンパク質プロデューサー細胞を選択するステップと
を含む方法。
【請求項５７】
前記細胞が、ＨＥＫ細胞、又は付着適応及び懸濁適応バリアントを含むＨＥＫ２９３細胞である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記第１の目的遺伝子が、レポーター遺伝子、選択遺伝子、治療目的遺伝子、補助的遺伝子又はそれらの組合せを含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
前記治療目的遺伝子が、発現困難タンパク質をコードする遺伝子を含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記発現困難タンパク質が、Ｆｃ融合タンパク質、酵素、膜受容体又はモノクローナル抗体からなる、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記モノクローナル抗体が、二重特異性モノクローナル抗体又は三重特異性モノクローナル抗体である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記第１の目的遺伝子が、２つの前記ＲＴＳの間に位置する、請求項５６〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記第２の目的遺伝子が、レポーター遺伝子、選択遺伝子、治療目的遺伝子、補助的遺伝子又はそれらの組合せを含む、請求項５６〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記治療目的遺伝子が、発現困難タンパク質をコードする遺伝子を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記第２の目的遺伝子が、２つの前記ＲＴＳの間に位置する、請求項５６〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
組換えタンパク質プロデューサー細胞を生産する方法であって、
ａ．少なくとも少なくとも６つの別個の組換え標的部位（ＲＴＳ）及び部位特異的リコンビナーゼをコードする遺伝子を含み、少なくとも２つの別個のＲＴＳがＦｅｒ１Ｌ４座位内において染色体に組み込まれ、少なくとも２つの別個のＲＴＳがＮＬ１座位内において染色体に組み込まれ、少なくとも２つの別個のＲＴＳがＮＬ２座位内において染色体に組み込まれている細胞を用意するステップと、
ｂ．（ａ）の前記細胞に、第１の目的遺伝子をコードする交換可能なカセットを含む第１のベクターと、第２の目的遺伝子をコードする交換可能なカセットを含む第２のベクターと、第３の目的遺伝子をコードする交換可能なカセットを含む第３のベクターとをトランスフェクトするステップと、
ｃ．Ｆｅｒ１Ｌ４座位内に第１の交換可能なカセットを、ＮＬ１座位内に第２の交換可能なカセットを、ＮＬ２座位内に第３の交換可能なカセットを組み込むステップと、
ｄ．染色体に組み込まれた前記第１の交換可能なカセット、前記第２の交換可能なカセット及び前記第３の交換可能なカセットを含む組換えタンパク質プロデューサー細胞を選択するステップと
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0001]本開示は、少なくとも２つの別個の組換え標的部位（ＲＴＳ）を含み、２つのＲＴＳがＮＬ１座位又はＮＬ２座位内において染色体に組み込まれている、部位特異的組込み（ＳＳＩ）哺乳動物細胞に関する。本開示はまた、少なくとも４つの別個のＲＴＳを含み、２つのＲＴＳがＮＬ１又はＮＬ２座位内において染色体に組み込まれ、２つのＲＴＳが、別々の座位内において染色体に組み込まれている、ＳＳＩ哺乳動物細胞に関する。本開示はまた、ＳＳＩ哺乳動物宿主細胞株を使用して、発現困難タンパク質をさらに発現できる組換えタンパク質発現細胞株を生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
[0002]バイオ医薬品（新薬及びバイオシミラー）には高いニーズがあり、またそれは販売収入の増加をもたらすものである。普及が増加している新規なフォーマットとして、非モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、組換えタンパク質（ｒＰ）が存在するが、それらの多くは発現困難（ＤｔＥ）と分類されており、ゆえにバイオ医薬品産業に対し、治療薬の送達に関する課題を提起することとなりうる。ＤｔＥタンパク質に関連する課題としては、予想より低い力価や、多重鎖発現、補助的タンパク質、生成物の回収又は精製に関する課題が挙げられる（Ｐｙｂｕｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１１１：３７２−８５  （２０１４））。ＤｔＥタンパク質の例としては、Ｆｃ融合タンパク質、２重及び３重特異的ＭＡｂ、酵素、膜受容体及び２重特異的Ｔ細胞エンゲージャー（ｅｎｇａｇｅｒ）ＢＩＴＥ（登録商標）（Ｍｉｃｒｏｍｅｔ  ＡＧ社、Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）分子及び選択されたｍＡｂが挙げられるが、これらに限定されない。
【０００３】
[0003]ある１つの報告された、組換えタンパク質（ｒＰ）発現カセットを宿主細胞ゲノムに組み込む方法は、ランダム組込み（ＲＩ）すなわち、ＤＮＡを細胞に導入し、ゲノム内に存在する既存の二重鎖切断（ＤＳＢ）により組み込ませるプロセス、に依存する。したがって、かかる方法を使用するときは、組み込まれる遺伝子コピーの数及び組込み部位（斑入り位置効果）における発現の特徴が大きく変動しうる。これは、いくつかの理由から、ＤｔＥタンパク質の場合には問題となりうる。例えば、いくつかの多重鎖タンパク質の場合、個々の鎖をコードする遺伝子又は補助的遺伝子の組み込まれるコピー数の制御が困難となること、ベクターサイズ限界が多重鎖タンパク質の発現を妨げうること、ベクターでの多重トランスフェクションでは組込み効率が低くなり、またいくつかのＤｔＥでは高発現により毒性が生じるおそれがあること、が挙げられる。
【０００４】
[0004]ｒＰ発現カセットを組み込む別の方法は、部位特異的組込み（ＳＳＩ）を用いる方法である。ＳＳＩ細胞株のゲノムに配置される「ランディングパッド」は、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＦＬＰ−Ｆｒｔ系又はバクテリオファージＰ１由来のＣｒｅ−ｌｏｘＰ系などの、部位特異的リコンビナーゼ系に由来する組換え標的部位（ＲＴＳ）を利用することができる。これらの系において、組換え酵素又はリコンビナーゼは、互換性を有する組換え部位（それぞれ、Ｆｒｔ又はｌｏｘＰ）を含むドナー及び標的ＤＮＡ間での組換えイベントに関わる（Ｗｉｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１８：４１１−９（２００７）を参照）。（ドナー及び標的ＤＮＡにおいて）交換されるカセットの５’及び３’末端の別個の組換え部位を用いることにより、組換えが一定方向で起こり、好ましいカセット領域のみが確実に交換されると考えられる。したがって、ＳＳＩはランダム組込み方法よりも有利である。ＳＳＩ細胞株へのカセットの組込みプロセスは、リコンビナーゼにより触媒されるカセット交換（ＲＭＣＥ）と呼ばれる。実際には、ＲＭＣＥを用いる組換えタンパク質生産のための細胞株の構築は一般に、リコンビナーゼをコードする発現ベクターを、（ｒＰをコードする）目的遺伝子及びリコンビナーゼ標的配列が隣接する選択マーカーを含むターゲッティング発現ベクターと共に、コトランスフェクトすることを含む。
【０００５】
[0005]単一のランディングパッドを使用するＳＳＩ生成細胞株はまた、限界を有する。例えば、かかるアプローチは通常、デザイン上、組み込まれる遺伝子のコピー数が少なく、ｒＰ生産された組換えタンパク質の発現力価を間接的に制限する結果となりうる。ｒＰ生産において、単一のランディングパッドを含むＳＳＩ宿主細胞株における複数のタンパク質の生産が求められる場合、必要な遺伝子の全てを単一のベクターに含めることが必要となりうる。組換え遺伝子の組込みコピー数を増加させる１つの方法は、累積的（或いは重層的又は多重的とも呼ばれる）ＳＳＩである（例えばＫａｍｅｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１０５：１１０６−１４（２０１０），Ｋａｗａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６４：２６７−７９（２０１２）及びＴｕｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０２：５２−６９（２０１０）を参照）。かかる方法においては、ＲＭＣＥのラウンドを繰り返し行うことにより、単一の部位にｒＰ発現カセットのコピーを複数、直列的に配置することができる。このタイプのＳＳＩ宿主細胞株のランディングパッドは、独立して部位指定をすることができず、ＲＭＣＥのラウンドを繰り返して各サイクル毎にさらなる時間を費やす必要がある。
【０００６】
[0006]各種の刊行物を本願明細書において引用し、それらの全開示内容を参照により本願明細書に組み込む。
【発明の概要】
【０００７】
［発明の簡単な説明］
[0007]単一のゲノム挿入部位のみを有するＳＳＩ宿主の限界を克服するＳＳＩ宿主細胞株を生成することに対するニーズが存在する。本発明では、直列型のＳＳＩランディングパッドを用いることによりこのニーズを満たすものであり、その際２つ以上のランディングパッドが同一の座位に組み込まれる、それにより累積的な部位特異的組込みの限界が克服されうる。かかる系では、ランディングパッドは（組換え部位及び選択マーカーの選択により）独立して部位指定可能である。
【０００８】
[0008]いくつかの実施形態では、本開示は、少なくとも２つの別個のＲＴＳを含み、２つのＲＴＳがＮＬ１座位又はＮＬ２座位内において染色体に組み込まれている哺乳動物細胞を提供する。いくつかの実施形態では、細胞は２つの別個のＲＴＳを含む。いくつかの実施形態では、２つの別個のＲＴＳは、ＮＬ１座位内において染色体に組み込まれている。いくつかの実施形態では、２つの別個のＲＴＳは、ＮＬ２座位内において染色体に組み込まれている。いくつかの実施形態では、細胞は４つの別個のＲＴＳを含む。いくつかの実施形態では、４つの別個のＲＴＳは、同じ座位内において染色体に組み込まれている。いくつかの実施形態では、２つの別個のＲＴＳは、別々の座位において染色体に組み込まれている。いくつかの実施形態では、別々の座位は、Ｆｅｒ１Ｌ４座位である。いくつかの実施形態では、２つの別個のＲＴＳはＮＬ１座位内において染色体に組み込まれ、２つの別個のＲＴＳはＮＬ２座位内において染色体に組み込まれている。いくつかの実施形態では、細胞は６つの別個のＲＴＳを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも４つの別個のＲＴＳは、同じ座位内において染色体に組み込まれている。いくつかの実施形態では、少なくとも２つの別個のＲＴＳはＮＬ１座位又はＮＬ２座位内において染色体に組み込まれ、少なくとも２つの別個のＲＴＳは別々の座位において染色体に組み込まれている。いくつかの実施形態では、別々の座位は、Ｆｅｒ１Ｌ４座位である。いくつかの実施形態では、少なくも２つの別個のＲＴＳはＮＬ１座位内において染色体に組み込まれ、少なくとも２つの別個のＲＴＳはＮＬ２座位内において染色体に組み込まれている。いくつかの実施形態では、ＲＴＳの少なくとも１つは、Ｆｒｔ部位、ｌｏｘ部位、ｒｏｘ部位又はａｔｔ部位である。いくつかの実施形態では、ＲＴＳの少なくとも１つは、配列番号１〜３０から選択される。いくつかの実施形態では、細胞は、マウス細胞、ヒト細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＣＨＯ−ＤＸＢ１１細胞、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞、すべてのバリアントを含むＣＨＯＫ１ＳＶ（商標）細胞、すべてのバリアントを含むＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）（グルタミン合成酵素ノックアウト）細胞、ＨＥＫ細胞、付着適応及び懸濁適応バリアントを含むＨＥＫ２９３細胞、ヒーラ細胞又はＨＴ１０８０細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はＨＥＫ細胞である。
【０００９】
[0009]いくつかの実施形態では、細胞は第１の目的遺伝子を含み、第１の目的遺伝子は染色体に組み込まれている。いくつかの実施形態では、第１の目的遺伝子は、レポーター遺伝子、選択遺伝子、治療目的遺伝子、補助的遺伝子又はそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、治療目的遺伝子は、ＤｔＥタンパク質をコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ＤｔＥタンパク質は、Ｆｃ融合タンパク質、酵素、膜受容体、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢＩＴＥ（登録商標）Ｍｉｃｒｏｍｅｔ  ＡＧ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）又はモノクローナル抗体からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、二重特異性モノクローナル抗体又は三重特異性モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、第１の目的遺伝子は、２つのＲＴＳの間に位置する。いくつかの実施形態では、第１の目的遺伝子は、ＮＬ１座位に位置する。いくつかの実施形態では、細胞は第２の目的遺伝子を含み、第２の目的遺伝子は染色体に組み込まれている。いくつかの実施形態では、第２の目的遺伝子は、レポーター遺伝子、選択遺伝子、治療目的遺伝子、補助的遺伝子又はそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、治療目的遺伝子は、ＤｔＥタンパク質をコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ＤｔＥタンパク質は、Ｆｃ融合タンパク質、酵素、膜受容体、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢＩＴＥ（登録商標））又はモノクローナル抗体からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第２の目的遺伝子は、２つのＲＴＳの間に位置する。いくつかの実施形態では、第２の目的遺伝子は、ＮＬ１座位又はＮＬ２座位内に位置する。いくつかの実施形態では、第１の目的遺伝子はＮＬ１座位内に位置し、第２の目的遺伝子はＮＬ２座位内に位置する。いくつかの実施形態では、細胞は第３の目的遺伝子を含み、第３の目的遺伝子は染色体に組み込まれている。いくつかの実施形態では、第３の目的遺伝子は、レポーター遺伝子、選択遺伝子、治療目的遺伝子、補助的遺伝子又はそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、治療目的遺伝子は、ＤｔＥタンパク質をコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、第３の目的遺伝子は、２つのＲＴＳの間に位置する。いくつかの実施形態では、第３の目的遺伝子は、ＮＬ１座位又はＮＬ２座位内に位置する。いくつかの実施形態では、第３の目的遺伝子は、ＮＬ１座位及びＮＬ２座位とは別の座位内に位置する。いくつかの実施形態では、第１の目的遺伝子、第２の目的遺伝子及び第３の目的遺伝子は、３つの別々の座位内にある。いくつかの実施形態では、第１の目的遺伝子、第２の目的遺伝子及び第３の目的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＮＬ１座位内にあり、第１の目的遺伝子、第２の目的遺伝子及び第３の目的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＮＬ２座位内にある。いくつかの実施形態では、細胞は、部位特異的リコンビナーゼ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、部位特異的リコンビナーゼ遺伝子は、染色体に組み込まれている。
【００１０】
[0010]いくつかの実施形態では、本開示は、少なくとも４つの別個のＲＴＳを含む哺乳動物細胞を提供し、細胞は、（ａ）ＮＬ１座位又はＮＬ２座位内において染色体に組み込まれている少なくとも２つの別個のＲＴＳと、（ｂ）（ａ）の少なくとも２つのＲＴＳの間に組み込まれている第１の目的遺伝子であって、レポーター遺伝子、ＤｔＥタンパク質をコードする遺伝子、補助的遺伝子又はそれらの組合せを含む第１の目的遺伝子と、（ｃ）（ａ）の座位とは別の第２の染色体座位内に組み込まれている第２の目的遺伝子であって、レポーター遺伝子、ＤｔＥタンパク質をコードする遺伝子、補助的遺伝子又はそれらの組合せを含む第２の目的遺伝子とを含む。
【００１１】
[0011]いくつかの実施形態では、本開示は、少なくとも４つの別個のＲＴＳを含む哺乳動物細胞を提供し、細胞は、（ａ）Ｆｅｒ１Ｌ４座位内において染色体に組み込まれている少なくとも２つの別個のＲＴＳと、（ｂ）ＮＬ１座位又はＮＬ２座位内において染色体に組み込まれている少なくとも２つの別個のＲＴＳと、（ｃ）Ｆｅｒ１Ｌ４座位内において染色体に組み込まれている第１の目的遺伝子であって、レポーター遺伝子、ＤｔＥタンパク質をコードする遺伝子、補助的遺伝子又はそれらの組合せを含む、第１の目的遺伝子と、（ｄ）（ｂ）のＮＬ１座位又はＮＬ２座位において染色体に組み込まれている第２の目的遺伝子であって、レポーター遺伝子、ＤｔＥタンパク質をコードする遺伝子、補助的遺伝子又はそれらの組合せを含む、第２の目的遺伝子とを含む。
【００１２】
[0012]いくつかの実施形態では、本開示は、少なくとも６つの別個のＲＴＳを含む哺乳動物細胞を提供し、細胞は、（ａ）Ｆｅｒ１Ｌ４座位内において染色体に組み込まれている少なくとも２つの別個のＲＴＳ及び第１の目的遺伝子と、（ｂ）ＮＬ１座位内において染色体に組み込まれている少なくとも２つの別個のＲＴＳ及び第２の目的遺伝子と、（ｃ）ＮＬ２座位内において染色体に組み込まれている少なくとも２つの別個のＲＴＳ及び第３の目的遺伝子とを含む。
【００１３】
[0013]いくつかの実施形態では、本開示は、組換えタンパク質プロデューサー細胞を生産する方法を提供し、該方法は、（ａ）少なくとも少なくとも４つの別個のＲＴＳ及び部位特異的リコンビナーゼをコードする遺伝子を含み、少なくとも２つの別個のＲＴＳが、ＮＬ１座位内において染色体に組み込まれ、少なくとも２つの別個のＲＴＳが、ＮＬ２座位内において染色体に組み込まれている細胞を用意するステップと、（ｂ）（ａ）の細胞に、第１の目的遺伝子をコードする交換可能なカセットを含む第１のベクターと、第２の目的遺伝子をコードする交換可能なカセットを含む第２のベクターとをトランスフェクトするステップと、（ｃ）ＮＬ１座位内に第１の交換可能なカセットを、ＮＬ２座位内に第２の交換可能なカセットを組み込むステップと、（ｄ）染色体に組み込まれた第１の交換可能なカセット及び第２の交換可能なカセットを含む組換えタンパク質プロデューサー細胞を選択するステップとを含む。いくつかの実施形態では、第１の目的遺伝子は、レポーター遺伝子、選択遺伝子、治療目的遺伝子、補助的遺伝子又はそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、治療目的遺伝子は、ＤｔＥタンパク質をコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ＤｔＥタンパク質は、Ｆｃ融合タンパク質、酵素、膜受容体、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢＩＴＥ（登録商標））又はモノクローナル抗体からなる。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、二重特異性モノクローナル抗体又は三重特異性モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、第１の目的遺伝子は、２つのＲＴＳの間に位置する。いくつかの実施形態では、第２の目的遺伝子は、レポーター遺伝子、選択遺伝子、治療目的遺伝子、補助的遺伝子又はそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、治療目的遺伝子は、ＤｔＥタンパク質をコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、第２の目的遺伝子は、２つのＲＴＳの間に位置する。
【００１４】
[0014]いくつかの実施形態では、本開示は、組換えタンパク質プロデューサー細胞を生産する方法を提供し、該方法は、（ａ）少なくとも４つの別個のＲＴＳ及び部位特異的リコンビナーゼをコードする遺伝子を含み、少なくとも２つの別個のＲＴＳが、Ｆｅｒ１Ｌ４座位内において染色体に組み込まれ、少なくとも２つの別個のＲＴＳが、ＮＬ１座位又はＮＬ２座位内において染色体に組み込まれている細胞を用意するステップと、（ｂ）（ａ）の細胞に、第１の目的遺伝子をコードする交換可能なカセットを含む第１のベクターと、第２の目的遺伝子をコードする交換可能なカセットを含む第２のベクターとをトランスフェクトするステップと、（ｃ）Ｆｅｒ１Ｌ４座位内に第１の交換可能なカセットを、ＮＬ１座位又はＮＬ２座位内に第２の交換可能なカセットを組み込むステップと、（ｄ）染色体に組み込まれた第１の交換可能なカセット及び第２の交換可能なカセットを含む組換えタンパク質プロデューサー細胞を選択するステップとを含む。いくつかの実施形態では、第１の目的遺伝子は、レポーター遺伝子、選択遺伝子、治療目的遺伝子、補助的遺伝子又はそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、治療目的遺伝子は、ＤｔＥタンパク質をコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ＤｔＥタンパク質は、Ｆｃ融合タンパク質、酵素、膜受容体、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢＩＴＥ（登録商標））又はモノクローナル抗体からなる。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、二重特異性モノクローナル抗体又は三重特異性モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、第１の目的遺伝子は、２つのＲＴＳの間に位置する。いくつかの実施形態では、第２の目的遺伝子は、レポーター遺伝子、選択遺伝子、治療目的遺伝子、補助的遺伝子又はそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、治療目的遺伝子は、ＤｔＥタンパク質をコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、第２の目的遺伝子は、２つのＲＴＳの間に位置する。
【００１５】
[0015]いくつかの実施形態では、本開示は、組換えタンパク質プロデューサー細胞を生産する方法を提供し、該方法は、（ａ）少なくとも少なくとも６つの別個のＲＴＳ及び部位特異的リコンビナーゼをコードする遺伝子を含み、少なくとも２つの別個のＲＴＳがＦｅｒ１Ｌ４座位内において染色体に組み込まれ、少なくとも２つの別個のＲＴＳがＮＬ１座位において染色体に組み込まれ、少なくとも２つの別個のＲＴＳがＮＬ２座位内において染色体に組み込まれている細胞を用意するステップと、（ｂ）（ａ）の細胞に、第１の目的遺伝子をコードする交換可能なカセットを含む第１のベクターと、第２の目的遺伝子をコードする交換可能なカセットを含む第２のベクターと、第３の目的遺伝子をコードする交換可能なカセットを含む第３のベクターとをトランスフェクトするステップと、（ｃ）Ｆｅｒ１Ｌ４座位内に第１の交換可能なカセットを、ＮＬ１座位内に第２の交換可能なカセットを、ＮＬ２座位内に第３の交換可能なカセットを組み込むステップと、（ｄ）染色体に組み込まれた第１の交換可能なカセット、第２の交換可能なカセット及び第３の交換可能なカセットを含む組換えタンパク質プロデューサー細胞を選択するステップとを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】２つの独立に部位指定可能なランディングパッドを有する多部位部位特異的組込み（ＳＳＩ）宿主細胞株を用いた、リコンビナーゼにより触媒されるカセット交換（ＲＭＣＥ）方法の概略図である。ランディングパッドの数は、適切な座位の入手可能性、互換性を有さないＦｒｔリコンビナーゼ部位（例えば野生型Ｆｒｔ（Ｆ）、Ｆｒｔ  Ｆ５（Ｆ５）、Ｆｒｔ  Ｆ１４、Ｆ１４）及びＦｒｔ  Ｆ１５（Ｆ１５）、並びにかかる多重化アプローチと互換性を有する選択マーカー（例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又は赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ））により制限される。
【図２】図２Ａは、２つの異なる図示するランディングパッド（ランディングパッドＡ及びランディングパッドＢ）を含むＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）（グルタミンシンセターゼ・ノックアウト）多部位ＳＳＩ宿主のランディングパッド配置の概略図を示す。単一及び多部位ＧＳ−ＣＨＯＫ１ＳＶ（商標）ＳＳＩ宿主におけるこれらのランディングパッドの染色体組込みに関する詳細は、表１０に示す。ランディングパッドＡは、ハイグロマイシン・ホスホトランスフェラーゼ（Ｈｐｔ）により強化された緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）融合遺伝子（Ｈｐｔ−ｅＧＦＰ）を含む。Ｈｐｔ−ｅＧＦＰ融合遺伝子発現は、ＳＶ４０初期プロモーターの制御下にあり、ＳＶ４０ポリＡ配列を有する。ＲＭＣＥのため、別個の及び異なるＦｒｔ部位は、ＳＶ４０プロモーターとＨｐｔ−ｅＧＦＰ遺伝子との間（Ｆ５）、及び５’側のＳＶ４０ポリＡ配列の隣（Ｆ）に位置する。ランディングパッドＢは、ＳＶ４０プロモーターの制御下のピューロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ−ＤｓＲｅｄ（ＰＡＣ−ＤｓＲｅｄ）融合遺伝子を含み、またＳＶ４０ポリＡ配列を含む。ランディングパッドＡとは別個のＦｒｔ部位の異なる対は、ＳＶ４０初期プロモーターとＰＡＣ−ＤｓＲｅｄ遺伝子との間（Ｆ１４）、及び５’側のＳＶ４０ポリＡ配列の隣（Ｆ１５）に位置する。ＳＶ４０Ｅプロモーターと選択マーカーとの間にＦｒｔ部位を配置することにより、ＲＭＣＥの次のラウンドでの使用が可能となる。単一ＳＳＩ及び多部位宿主のＲＭＣＥのために設計されたターゲティングベクターは、目的のランディングパッドと互換性を有するＦｒｔ部位のすぐ３’側に配置される陽性選択マーカー（例えばＧＳ）を含む（図２Ｂ）。ベクターの残りの部分は、ランディングパッドの第２のＦｒｔ部位と互換性を有する持つＦｒｔ部位が続くＧＯＩ（例えばｍＡｂ）の転写単位を含む。ターゲティングベクターＤＮＡ（図３Ａ及び図５）を、ＦｌｐＥリコンビナーゼを発現するベクターとコトランスフェクトする（Ｔａｋａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｅｌｌｓ  １６：  ７（２０１１）、図３Ｂ）。トランスフェクトされた細胞を２４時間インキュベートし、次に選択圧（例えば培地からのグルタミンの除去）を適用する。ＲＭＣＥが成功した場合、Ｈｐｔ−ｅＧＦＰ遺伝子の喪失及び陽性選択マーカー遺伝子による置換がその標識となる（図２Ｃ）。細胞は、蛍光顕微鏡下又はフローサイトメトリー分析により暗く見える。陽性選択において回収される非置換細胞は、蛍光に基づく細胞選別により容易に除去される。
【図３】ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）ＳＳＩ宿主のＤｓＲｅｄ生産細胞株の作製に用いた、ｐＭＦ２５ターゲティングベクター（図３Ａ）及びｐＭＦ４リコンビナーゼ発現ベクター（図３Ｂ）を示す。ｐＭＦ２５（図３Ａ）は、ＤｓＲｅｄ遺伝子を組み込んだ転写単位を含み、変異型（Ｆ５）及び野生型（Ｆ）のＦｒｔ部位が両側に隣接する。ＤｓＲｅｄモノマーの転写は、ｈＣＭＶ主要中間体初期遺伝子１（ｈＣＭＶ）のプロモーター及びその第１イントロン（イントロンＡ、ｈＣＭＶイントロン）により駆動され、また５’ＵＴＲをコードするフランキングエキソンをＥｘ１及びＥｘ２として示す。グルタミンシンセターゼのｃＤＮＡ（ＧＳ）及びＳＶ４０イントロンＡ（ＳＶ４０イントロン）は、Ｆｒｔ  Ｆ５のすぐ３’側に位置し、ＲＭＣＥが成功した場合、ランディングパッドに位置するＳＶ４０Ｅプロモーターにより転写が駆動される。ｐＭＦ４（図３Ｂ）はＦｌｐＥ遺伝子を組み込んだ転写単位を含み（Ｔａｋａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｅｌｌｓ  １６：  ７（２０１１）、ｈＣＭＶ主要中間体初期遺伝子１（ｈＣＭＶ）及びその第１イントロン（イントロンＡ、ｈＣＭＶイントロンのプロモーター）により駆動される）、また５’ＵＴＲをコードするフランキングエキソンをＥｘ１及びＥｘ２として示す。両方のベクターにおいて、それぞれ、ポリアデニル化配列及びβ−ラクタマーゼをｐＡ及びｂｌａとして示す。
【図４】ｐＭＦ２５及びＦｌｐＥリコンビナーゼをコードするベクターによるコトランスフェクション前後における、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）ＳＳＩ宿主クローン（７８７８、８０８６、８０９６、９１１３、９１１６及び９１１５）のフローサイトメトリー分析から得られたデータを示す。ＲＭＣＥの前及び後（グルタミンフリーの培地で１１日間の選択）において、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｇｕａｖａフローサイトメトリーを使用し、緑色及び黄色の蛍光を、７８７８及び８０８６（単一部位、Ｆｅｒ１Ｌ４ランディングパッドＡ）、８０８６及び９１１３（単一部位、ＮＬ１ランディングパッドＡ）及び９１１６及び９１１５（単一部位、ＮＬ２ランディングパッドＡ）について測定した。ｅＧＦＰの蛍光を緑色チャネルにおいて検出し、ＤｓＲｅｄは黄色チャネルにおいて検出した。
【図５】ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）由来のＳＳＩ宿主において、ターゲティングベクターによりｍＡｂを生産する細胞株が作製されたことを示す。ベクターｐＭＦ２６（Ａ）、ｐＭＦ２７（Ｂ）及びｐＭＦ２８（Ｃ）は、（それぞれ）リツキシマブ、ｃＢ７２．３及びＨ３１Ｋ５抗体遺伝子を組み込んだ転写単位を含み、それらは変異型（Ｆ５）及び野生型（Ｆ）Ｆｒｔ部位が両側に隣接する。重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）遺伝子の転写は、ｈＣＭＶ主要中間体初期遺伝子１（ｈＣＭＶ）のプロモーター及びその第１イントロン（イントロンＡ（ｈＣＭＶイントロン））により駆動され、また５’ＵＴＲをコードするフランキングエキソンをＥｘ１及びＥｘ２として示す。ＲＭＣＥの後、的確な組込みがなされたものを選択するために、Ｆｒｔ  Ｆ５のすぐ３’側に、グルタミンシンセターゼのｃＤＮＡ（ＧＳ）及びＳＶ４０イントロン−ポリＡ配列（図５においてｐＡとして示す）を配置する。β−ラクタマーゼをｂｌａとしてそれぞれ示す。
【図６】バッチ培養において増殖させたＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）ＳＳＩプールから分泌されたリツキシマブ、ｃＢ７２．３及びＨ３１Ｋ５のｍＡｂ濃度を示す。ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）ＳＳＩ宿主クローン１１４３４（単一部位、Ｆｅｒ１Ｌ４ランディングパッドＡ）を、ｐＭＦ２６（リツキシマブ）、ｐＭＦ２７（ｃＢ７２．３）又はｐＭＦ２８（Ｈ３１Ｋ５）でトランスフェクトした。反復試験（ｎ≧３）にて、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）ＳＳＩプールを８日間バッチ培養した。分泌されたリツキシマブ（Ａ）、ｃＢ７２．３（Ｂ）及びＨ３１Ｋ５（Ｃ）ｍＡｂ（ｍｇ／Ｌ）を、プロテインＡ  ＨＰＬＣで測定した。
【図７】ＲＭＣＥ前の、多部位ＳＳＩ宿主のフローサイトメトリー分析から得られたデータを示す。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｇｕａｖａフローサイトメトリーを使用し、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）宿主（宿主）、１１４３４（単一部位、Ｆｅｒ１Ｌ４ランディングパッドＡ）、ＤｓＲｅｄランダム組込みコントロール及び６つのＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）多部位宿主クローン（１２１５１、１２１５２、１２６０６、１２６０７、１２６０８及び１２６０９）（Ｆｅｒ１Ｌ４座位のランディングパッドＡ及びＮＬ１座位のランディングパッドＢを有する多部位姉妹クローン）における緑色及び黄色の蛍光を測定した。ｅＧＦＰの蛍光を緑色チャネルにおいて検出し、ＤｓＲｅｄは黄色チャネルにおいて検出した。
【図８】ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ  ＳＳＩ宿主のＦｅｒ１Ｌ４及びＮＬ１ランディングパッドを標的とするベクターｐＣＭ９及びｐＣＭ１１の概略図である。ベクターは、以下の通りである：図８Ａ：ｐＣＭ９（Ｆｅｒ１Ｌ４座位を標的とするＥ２クリムゾン発現ベクター）。図８Ｂ：ｐＣＭ１１（ＮＬ１座位を標的とするＥ２クリムゾン発現ベクター）。
【図９】ｐＣＭ９及びｐＣＭ１１により標的とされた細胞から得られた、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ  ＳＳＩのフローサイトメトリー分析結果を示す。多重ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ  ＳＳＩクローン１２１５１（Ｆｅｒ１Ｌ４座位のランディングパッドＡ（図２Ａ）及びＮＬ１座位のランディングパッドＢ（図２Ａ）を含む）を、ｐＣＭ９（Ｆｅｒ１Ｌ４座位を標的とするＥ２クリムゾン発現ベクター）及びｐＣＭ１１（ＮＬ１座位を標的とするＥ２クリムゾン発現ベクター）によりトランスフェクトした。
【図１０】Ｆｅｒ１Ｌ４（図２、ランディングパッドＡ）、ＮＬ１（図２、ランディングパッドＢ）又はその両方を標的とするリツキシマブ発現ベクターｐＭＦ２６、ｐＣＭ３８、ｐＣＭ２２及びｐＡＲ５の概略図である。ベクターは、以下の通りとした：ｐＭＦ２６（図１０Ａ：Ｆｅｒ１Ｌ４座位を標的とするリツキシマブ  １×ＬＣ、１×ＨＣ発現ベクター）、ｐＣＭ３８（図１０Ｂ：Ｆｅｒ１Ｌ４座位を標的とするリツキシマブ  ２×ＬＣ、２×ＨＣ発現ベクター）、ｐＣＭ２２（図１０Ｃ：ＮＬ１座位を標的とする空の発現ベクター）、及びｐＡＲ５（図１０Ｄ：ＮＬ１座位を標的とするリツキシマブ  １×ＬＣ、１×ＨＣ発現ベクター）。
【図１１】ｐＭＦ２６、ｐＣＭ３８、ｐＣＭ２２及びｐＡＲ５により標的とされたＲＭＣＥプールにおける、８日間のバッチ培養後の、細胞特異的なリツキシマブ生産速度（ｑｍＡｂ）を示す。
【図１２】Ｆｅｒ１Ｌ４（図２、ランディングパッドＡ）、ＮＬ１（図２、ランディングパッドＢ）又はその両方を標的とするセルグツズマブアムナロイキン（ＣＥＡ−ＩＬ２ｖ）発現ベクターｐＡＢ２、ｐＡＢ５、ｐＣＭ４６及びｐＡＲ２の概略図である。ベクターは、以下の通りとした：ｐＡＢ２（Ｆｅｒ１Ｌ４座位を標的とするＣＥＡ−ＩＬ２ｖ  ＬＣ、ＨＣ及びＨＣ−ＩＬ２発現ベクター）、ｐＡＢ５（Ｆｅｒ１Ｌ４座位を標的とするＣＥＡ−ＩＬ２ｖ  ＬＣ及びＨＣ−ＩＬ２発現ベクター）、ｐＣＭ４６（ＮＬ１座位を標的とする空の発現ベクター）及びｐＡＲ２（ＮＬ１座位を標的とするＣＥＡ−ＩＬ２ｖ  ＨＣ発現ベクター）。
【図１３Ａ】ｐＡＢ２、ｐＡＢ５、ｐＣＭ４６及びｐＡＲ２（図１２）によるトランスフェクションの後、セルグツズマブアムナロイキン（ＣＥＡ−ＩＬ２ｖ）を発現するＲＭＣＥプールのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の概略図である。Ａ：非還元条件で生成した１０％ビストリスプロテインゲルのイメージ（レーン１〜９としてラベルした）。レーン１：Ｓｅｅｂｌｕｅ  Ｐｌｕｓ２  プレステインプロテインスタンダード。レーン２：ｐＡＢ２の空のバージョンをトランスフェクトして生成したモック（空）プールの解析。レーン２〜５：フォールディング中間体の割り当てに用いるＣＥＡ−ＩＬ２ｖを生成するのに必要となる３つの鎖のうち２つのみを発現するベクターから得られたコントロールプール。レーン６：Ｆｅｒ１Ｌ４座位にＣＥＡ−ＩＬ２ｖのＬＣ、ＨＣ及びＨＣ−ＩＬ２（ｐＡＢ２）を有するプールの解析。レーン７：Ｆｅｒ１Ｌ４座位にＣＥＡ−ＩＬ２ｖ  ＬＣ及びＨＣ−ＩＬ２を有し、ＮＬ１に空ベクター（ｐＣＭ４６）を有するプールの解析。レーン８及び９：Ｆｅｒ１Ｌ４座位にＣＥＡ−ＩＬ２ｖ  ＬＣ及びＨＣ−ＩＬ２を有し、ＮＬ１座位にＣＥＡ−ＩＬ２ｖ  ＨＣ（ｐＡＲ２）を有する。Ｂ：軽鎖（ＬＣ）、軽鎖ダイマー（２ＬＣ）、半分抗体（１ＬＣ、１ＨＣ−ＩＬ２）及びセルグツズマブアムナロイキンを組み立てるパーツ（２ＬＣ、２ＨＣ−ＩＬ２及び２ＬＣ、２ＨＣ）を表すと仮定されるバンドの強度を要約するヒストグラム。
【図１３Ｂ】ｐＡＢ２、ｐＡＢ５、ｐＣＭ４６及びｐＡＲ２（図１２）によるトランスフェクションの後、セルグツズマブアムナロイキン（ＣＥＡ−ＩＬ２ｖ）を発現するＲＭＣＥプールのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の概略図である。Ａ：非還元条件で生成した１０％ビストリスプロテインゲルのイメージ（レーン１〜９としてラベルした）。レーン１：Ｓｅｅｂｌｕｅ  Ｐｌｕｓ２  プレステインプロテインスタンダード。レーン２：ｐＡＢ２の空のバージョンをトランスフェクトして生成したモック（空）プールの解析。レーン２〜５：フォールディング中間体の割り当てに用いるＣＥＡ−ＩＬ２ｖを生成するのに必要となる３つの鎖のうち２つのみを発現するベクターから得られたコントロールプール。レーン６：Ｆｅｒ１Ｌ４座位にＣＥＡ−ＩＬ２ｖのＬＣ、ＨＣ及びＨＣ−ＩＬ２（ｐＡＢ２）を有するプールの解析。レーン７：Ｆｅｒ１Ｌ４座位にＣＥＡ−ＩＬ２ｖ  ＬＣ及びＨＣ−ＩＬ２を有し、ＮＬ１に空ベクター（ｐＣＭ４６）を有するプールの解析。レーン８及び９：Ｆｅｒ１Ｌ４座位にＣＥＡ−ＩＬ２ｖ  ＬＣ及びＨＣ−ＩＬ２を有し、ＮＬ１座位にＣＥＡ−ＩＬ２ｖ  ＨＣ（ｐＡＲ２）を有する。Ｂ：軽鎖（ＬＣ）、軽鎖ダイマー（２ＬＣ）、半分抗体（１ＬＣ、１ＨＣ−ＩＬ２）及びセルグツズマブアムナロイキンを組み立てるパーツ（２ＬＣ、２ＨＣ−ＩＬ２及び２ＬＣ、２ＨＣ）を表すと仮定されるバンドの強度を要約するヒストグラム。
【図１４】Ｆｅｒ１Ｌ４（図２、ランディングパッドＡ）、ＮＬ１（図２、ランディングパッドＢ）又はその両方を標的とする、エタナーセプト、補助的タンパク質又は不安定化ＧＦＰ（３’ＵＴＲにｍｉＲ標的配列を有するｄｓＧＦＰ）遺伝子を有するベクターの概略図である。ベクターは、以下の通りとした：ｐＴＣ１（図１４Ａ、Ｂ及びＣ：Ｆｅｒ１Ｌ４座位を標的とするエタナーセプト発現ベクター）、ｐＣＭ２２（図１４Ａ：ＮＬ１を標的とする空ベクター）、ｐＣＭ３９（図１４Ｂ：ＮＬ１を標的とするハツカネズミ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＳＣＤ１（ｍＳＣＤ１）発現ベクター）、ｐＣＭ４０（図１４Ｂ：ＮＬ１を標的とするチャイニーズハムスター（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）（ｃｃｍＳＣＤ１）発現ベクター用にコドン最適化したハツカネズミＳＣＤ１）、ｐＣＭ４１（図１４Ｂ：ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）ＳＣＤ１（ｈＳＣＤ１）、ｐＣＭ４２（図１４Ｂ：ＮＬ１を標的とするチャイニーズハムスターＳＲＥＢＦ１（ｃｃＳＲＥＢＦ１）発現ベクター）、ｐＣＭ４３（図１４Ｃ：ＮＬ１を標的とするｄｓＧＦＰ＿６ｎ  ＣＰＥＢ２Ａ発現ベクター）、ｐＣＭ４４（図１４Ｃ：ＮＬ１を標的とするｄｓＧＦＰ＿６ｎ  ＣＰＥＢ２Ｂ発現ベクター）及びｐＣＭ４５（図１４Ｃ：ＮＬ１を標的とするｄｓＧＦＰ＿６ｎ  ＳＲＰα発現ベクター）。補助的遺伝子及びスポンジ配列の詳細については表１１及び表１２を参照。
【図１５】エタナーセプトを発現するＲＭＣＥプールの、補助的遺伝子発現の有無における８日間の培養から得られた、増殖及び生産性の測定結果をまとめた図（図１４を参照）。データを平均（ｎ＝２）±標準偏差で表す。Ａ：細胞特異的生産速度（ｑＰ）。Ｂ：生細胞濃度の積分値（ＩＶＣＣ）。Ｃ：分泌されたエタナーセプトの濃度。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
［発明の詳細な説明］
[0031]単語「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」の使用は、特許請求の範囲及び／又は明細書中の「含む」という用語との関係で用いられるときは、「１つ」を意味する場合もあるが、また「１つ又は複数」、「少なくとも１つ」及び「１つ又は複数以上」を意味することとも整合する。
【００１８】
[0032]本願において「約」という用語は、ある値が、その値を測定するために使用される方法／装置において固有の誤差変動を有するか、又は試験対象物中にかかる変動が存在することを示すために用いられる。典型的には、用語は、状況に応じて、およそ１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％若しくは２０％の、又はそれ未満の変動性を含むことを意味する。
【００１９】
[0033]特許請求の範囲における用語「又は」の使用は、それが単なる代替物であるか、又は該代替物を排他的に含まないことを意図することが明確に示されない限り、「及び／又は」を意味するものとするが、本開示では、かかる代替物及び「及び／又は」に関連する定義に関するサポートは設けている。
【００２０】
[0034]本明細書及び請求項（複数含む）において用いられる単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（また例えば「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」及び「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」などのあらゆる同義語）、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」（また例えば「ｈａｖｅ」及び「ｈａｓ」などのあらゆる同義語）、「包含する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（また例えば「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」及び「ｉｎｃｌｕｄｅ」などのあらゆる同義語）又は「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（また例えば「ｃｏｎｔａｉｎｓ」及び「ｃｏｎｔａｉｎ」などのあらゆる同義語）は、包括的であるか又はオープンエンドであり、さらなる、記載されていないエレメント又は方法ステップを排除するものではない。本明細書で述べられるいかなる実施形態も、本発明のいかなる方法、システム、宿主細胞、発現ベクター及び／又は組成物に関して実施されることができると考えられる。さらにまた、本発明の組成物、システム、細胞及び／又はベクターは、本願明細書に記載される方法のいずれかを実施するために用いることができる。
【００２１】
[0035]用語「例えば」及びその対応する省略形「ｅ．ｇ．」（イタリック体か否かを問わない）の使用は、記載される具体的な用語が開示の代表的な例及び実施形態であって、特に断りのない限り、参照される又は引用される具体例に限定されるものではないことを意味する。
【００２２】
[0036]いくつかの実施形態では、本開示は、少なくとも２つの別個のＲＴＳを含み、ＲＴＳがＮＬ１座位又はＮＬ２座位内において染色体に組み込まれている哺乳動物細胞を提供する。
【００２３】
[0037]本願明細書の用語「哺乳動物細胞」には、哺乳動物綱（Ｍａｍｍａｌｉａ）に属するあらゆるメンバーに由来する細胞（例えばヒト細胞、マウス細胞、ラット細胞、サル細胞、ハムスター細胞及びその他）が包含される。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は、マウス細胞、ヒト細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＣＨＯ−ＤＸＢ１１細胞、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞、すべてのバリアント（例えばＣＨＯＫ１ＳＶ（商標）ＰＯＴＥＬＬＩＧＥＮＴ（登録商標）、Ｌｏｎｚａ、Ｓｌｏｕｇｈ、英国）を含むＣＨＯＫ１ＳＶ（商標）細胞、すべてのバリアントを含むＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）（グルタミン合成酵素ノックアウト）細胞、付着適応及び懸濁適応バリアントを含むＨＥＫ２９３細胞、ヒーラ細胞又はＨＴ１０８０細胞である。
【００２４】
[0038]「核酸」、「核酸分子」又は「オリゴヌクレオチド」は、共有結合したヌクレオチドを含むポリマー化合物を意味する。用語「核酸」には、ポリリボ核酸（ＲＮＡ）及びポリデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）が包含され、そのいずれも、一本鎖でも二本鎖でもよい。ＤＮＡには、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡ、プラスミド若しくはベクターＤＮＡ、及び合成ＤＮＡが包含されるが、これらに限定されない。ＲＮＡには、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又はＭＩＲＮＡが包含されるが、これらに限定されない。
【００２５】
[0039]本発明で使用する「アミノ酸」とは、カルボキシル（−ＣＯＯＨ）及びアミノ（−ＮＨ２）基を含む化合物を意味する。「アミノ酸」は、天然の、及び非天然の、すなわち合成された、アミノ酸を指す。天然アミノ酸（その３文字及び１文字標記と併記する）には、アラニン（Ａｌａ；Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ；Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）、システイン（システイン；Ｃ）、グルタミン（Ｇｌｎ；Ｑ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）、グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ；Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ；Ｌ）、リジン（Ｌｙｓ；Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ；Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ；Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ；Ｓ）、スレオニン（Ｔｈｒ；Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ；Ｙ）及びバリン（Ｖａｌ；Ｖ）が含まれる。
【００２６】
[0040]用語「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、本願明細書においては交換可能に用いられ、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態のことを指し、それには、変性ペプチド主鎖を有するコード化及び非コード化アミノ酸、化学的又は生化学的に修飾された又は誘導体化されたアミノ酸及びポリペプチドが包含される。用語「鎖」及びポリペプチド「鎖」は、本願明細書において交換可能に用いられ、単一のペプチド主鎖を有するアミノ酸のポリマー形態を指す。
【００２７】
[0041]用語「組換え」は、核酸分子、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質に関して用いるときは、天然に存在することが公知でない遺伝的物質の新規な組合せ、又はそれらの結果物を意味する。組換え分子は、限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、遺伝子切断（例えば制限エンドヌクレアーゼを使用）及び核酸分子、ペプチド又はタンパク質の固相合成などの、組換技術の分野において利用可能な周知技術のいずれかにより調製することができる。いくつかの実施形態では、「組換え」は、天然に存在することが公知でないウイルスベクター又はウイルスを指し、例えば、ウイルスベクター又はウイルス中に１つ又は複数の変異、核酸挿入又は異種遺伝子を有するウイルスベクター又はウイルスを指す。いくつかの実施形態では、「組換え」は、天然に存在することが公知でない細胞又は宿主細胞を指し、例えば細胞又は宿主細胞中に１つ又は複数の変異、核酸挿入又は異種遺伝子を有する細胞又は宿主細胞を指す。
【００２８】
[0042]「単離された」ポリペプチド、タンパク質、ペプチド又は核酸は、その天然の環境から取り出された分子である。「単離された」ポリペプチド、タンパク質、ペプチド又は核酸は、賦形剤（例えば希釈剤又はアジュバント）と共に調製されてもよく、それによっても、未だ単離されたと考えられる。
【００２９】
[0043]核酸配列又はアミノ酸配列の文脈における用語「配列同一性」又は「％同一性」とは、ある複数の配列が指定された比較ウインドウで整列配置されたときの、比較された配列中の同一である残基のパーセンテージを意味する。比較ウインドウは、配列が整列配置されることができる及び比較されることができる、少なくとも１０〜１０００以上の残基のセグメントでありうる。配列同一性の決定のためのアラインメント方法は、従来技術において周知であり、一般公開されているデータベース（例えばＢＬＡＳＴ（ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ．））を使用して実施できる。
【００３０】
[0044]いくつかの実施形態では、ポリペプチド又は核酸分子は、参照ポリペプチド又は核酸分子（又は参照ポリペプチド若しくは核酸分子の断片）と、それぞれ、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％の配列同一性を有する。本開示の特定の実施形態では、ポリペプチド又は核酸分子は、参照ポリペプチド又は核酸分子（又は参照ポリペプチド若しくは核酸分子の断片）と、それぞれ、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチド又は核酸分子は、参照ポリペプチド又は核酸分子と、それぞれ、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％の配列同一性を有する。
【００３１】
[0045]「遺伝子」は、ポリペプチドをコードするヌクレオチドの集合体を指し、ｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡである核酸分子が包含される。「遺伝子」はまた、コーディング配列に先行する（５’非コード配列）及び続く（３’非コード配列）制御配列として作用することができる核酸断片を指すこともある。いくつかの実施形態では、遺伝子は、複数のコピーで宿主細胞のゲノムに組み込まれる。いくつかの実施形態では、遺伝子は、所定のコピー数で宿主細胞のゲノムに組み込まれる。
【００３２】
[0046]本願明細書に記載される用語「制御エレメント」は、核酸配列の発現のいくつかの態様を制御する遺伝的エレメントを指す。本明細書において、「プロモーター」、「プロモーター配列」又は「プロモーター領域」は、ＲＮＡポリメラーゼを結合させることができ、下流のコード配列又は非コード配列の転写開始に関与するＤＮＡ制御領域／配列を指す。本開示のいくつかの例において、プロモーター配列は、転写開始点を含み、上流側に向かって、バックグラウンドよりも高い検出可能なレベルで転写開始するのに必要最小限の塩基又はエレメントを含む。いくつかの実施形態では、プロモーター配列は、転写開始点、並びにＲＮＡポリメラーゼを結合させる役割を果たすタンパク質結合ドメインを含む。真核生物プロモーターは、常にではないがしばしば、「ＴＡＴＡ」ボックス及び「ＣＡＴ」ボックスを含む。誘導性プロモーターなどの各種のプロモーターを、例えば本開示の宿主細胞又はベクターにおいて用いて、遺伝子発現を駆動させうる。いくつかの実施形態では、プロモーターはリーク発現をもたらすプロモーターではなく、すなわち、該プロモーターは、本願明細書に記載される遺伝子産物のうちのいずれか１つを構成的に発現しない。
【００３３】
[0047]本明細書中で使用する「異種プロモーター」という用語は、それが作動可能に連結される遺伝子とは異なる種に由来する、かかる制御エレメントを指す。いくつかの実施形態では、異種プロモーターは原核生物の系に由来する。いくつかの実施形態では、異種プロモーターは真核生物の系に由来する。いくつかの実施形態では、本開示は、１つ又は複数の異種プロモーターが染色体に組み込まれて宿主細胞のゲノムに入っている細胞を提供する。
【００３４】
[0048]本願明細書に記載される用語「作動可能な組合せにおいて」、「作動可能な順序で」及び「作動可能に連結される」は、所定の遺伝子の転写及び／又は所望のタンパク質分子の合成を誘導できる核酸分子が生産される態様での核酸配列の結合を指す。用語はまた、機能性タンパク質が得られる態様でのアミノ酸配列の結合を指す場合もある。いくつかの実施形態では、目的遺伝子はプロモーターに作動可能に連結され、目的遺伝子は染色体に組み込まれて宿主細胞に入っている。いくつかの実施形態では、目的遺伝子は異種プロモーターに作動可能に連結され、目的遺伝子は染色体に組み込まれて宿主細胞に入っている。いくつかの実施形態では、補助的遺伝子はプロモーターに作動可能に連結され、補助的遺伝子は宿主細胞の染色体に組み込まれて宿主細胞のゲノムに入っている。いくつかの実施形態では、補助的遺伝子は異種プロモーターに作動可能に連結され、補助的遺伝子は宿主細胞の染色体に組み込まれて宿主細胞のゲノムに入っている。いくつかの実施形態では、ＤｔＥタンパク質をコードする遺伝子はプロモーターに作動可能に連結され、ＤｔＥタンパク質をコードする遺伝子は宿主細胞の染色体に組み込まれて宿主細胞のゲノムに入っている。いくつかの実施形態では、ＤｔＥタンパク質をコードする遺伝子は異種プロモーターに作動可能に連結され、ＤｔＥタンパク質をコードする遺伝子は宿主細胞の染色体に組み込まれて宿主細胞のゲノムに入っている。いくつかの実施形態では、リコンビナーゼ遺伝子はプロモーターに作動可能に連結され、リコンビナーゼ遺伝子は染色体に組み込まれて宿主細胞に入っている。いくつかの実施形態では、リコンビナーゼ遺伝子はプロモーターに作動可能に連結され、リコンビナーゼ遺伝子は染色体に組み込まれて宿主細胞のゲノムに入っていない。いくつかの実施形態では、リコンビナーゼ遺伝子は異種プロモーターに作動可能に連結され、リコンビナーゼ遺伝子は染色体に組み込まれて宿主細胞のゲノムに入っていない。いくつかの実施形態では、リコンビナーゼ遺伝子は異種プロモーターに作動可能に連結され、リコンビナーゼ遺伝子は染色体に組み込まれて宿主細胞のゲノムに入っていない。
【００３５】
[0049]いくつかの実施形態では、制御エレメントは、遺伝子発現を、外因的に供給されたリガンドの存在に作動可能に連結する。いくつかの実施形態では、目的遺伝子はプロモーターに作動可能に連結され、プロモーターは遺伝子発現を外因的に供給されたリガンドの存在に作動可能に連結し、目的遺伝子は宿主細胞の染色体に組み込まれて宿主細胞のゲノムに入っている。いくつかの実施形態では、補助的遺伝子はプロモーターに作動可能に連結され、プロモーターは遺伝子発現を外因的に供給されたリガンドの存在に作動可能に連結し、補助的遺伝子は染色体に組み込まれて宿主細胞に入っている。いくつかの実施形態では、ＤｔＥタンパク質をコードする遺伝子はプロモーターに作動可能に連結し、プロモーターは遺伝子発現を外因的に供給されたリガンドの存在に作動可能に連結し、ＤｔＥタンパク質をコードする遺伝子は宿主細胞の染色体に組み込まれて宿主細胞のゲノムに入っている。いくつかの実施形態では、リコンビナーゼ遺伝子はプロモーターに作動可能に連結され、プロモーターは遺伝子発現を外因的に供給されたリガンドの存在に作動可能に連結し、リコンビナーゼ遺伝子は染色体に組み込まれて宿主細胞のゲノムに入っている。いくつかの実施形態では、リコンビナーゼ遺伝子はプロモーターに作動可能に連結され、プロモーターは遺伝子発現を外因的に供給されたリガンドの存在に作動可能に連結し、リコンビナーゼ遺伝子は染色体に組み込まれて宿主細胞のゲノムに入っていない。
【００３６】
[0050]本願明細書の用語「染色体に組み込まれた」又は「染色体への組込み」は、宿主細胞（例えば哺乳動物細胞）の染色体への核酸配列の安定な取り込み、すなわち、宿主細胞（例えば哺乳動物細胞）の染色体のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）に核酸配列が組み込まれることを指す。いくつかの実施形態では、染色体に組み込まれている核酸配列は安定である。いくつかの実施形態では、染色体に組み込まれている核酸配列は、プラスミド又はベクターに配置されない。いくつかの実施形態では、染色体に組み込まれている核酸配列は切除されない。いくつかの実施形態では、染色体への組込みは、クラスター形成され一定の間隔をあけられた短いパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）、及びＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）遺伝子編集システム（ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ）により媒介される。
【００３７】
[0051]本願明細書に記載される用語「染色体座位」は、少なくとも１つの遺伝子を含みうる、細胞の染色体上の核酸の、所定の位置を指す。いくつかの実施形態では、染色体座位は、約５００塩基対〜約１００，０００塩基対、約５，０００塩基対〜約７５，０００塩基対、約５，０００塩基対〜約６０，０００塩基対、約２０，０００塩基対〜約５０，０００塩基対、約３０，０００塩基対〜約５０，０００塩基対又は約４５，０００塩基対〜約４９，０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、染色体座位は、所定の核酸配列の５’又は３’末端から最大約１００塩基対、約２５０塩基対、約５００塩基対、約７５０塩基対又は約１０００塩基対伸長する。いくつかの実施形態では、染色体座位は内因性の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、染色体座位は、分子生物学の当業者に公知の方法を使用して染色体に組み込まれた外因性のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、染色体座位は、宿主細胞のゲノム内に、染色体座位内に組み込まれる目的遺伝子によりコードされる異種タンパク質を強力且つ安定に生産させるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、染色体座位は、宿主細胞のゲノム内に、ウイルス遺伝子を強力且つ安定に発現させるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、染色体座位は、宿主細胞のゲノム内にて、効率的に部位特異的な組込みを生じさせるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、染色体座位は、表１に記載されるＮＬ１座位、ＮＬ２座位、ＮＬ３座位、ＮＬ４座位、ＮＬ５座位又はＮＬ６座位を含む。  いくつかの実施形態では、本開示は、少なくとも２つの別個のＲＴＳを含む哺乳動物細胞に関し、２つのＲＴＳは、表１に記載のＮＬ１座位、ＮＬ２座位、ＮＬ３座位、ＮＬ４座位、ＮＬ５座位又はＮＬ６座位内において染色体に組み込まれている。いくつかの実施形態では、本開示は、少なくとも２つの別個のＲＴＳを含む哺乳動物細胞に関し、２つのＲＴＳは、表１に記載のＮＬ１座位又はＮＬ２座位内において染色体に組み込まれている。
【００３８】
【表１】
2020511954.tif 000002
2020511954.tif 000003
[0052]当業者は「ＮＬ１座位内で組み込まれる」又は「ＮＬ２座位内で組み込まれる」という用語が、座位のいかなる部分への組込みも包含し、それが示されるゲノム座標にのみ限定されないことを理解するであろう。当業者は「ＮＬ１座位内で組み込まれる」又は「ＮＬ２座位内で組み込まれる」という用語が、対応する生物における対応する座も包含するものと理解するであろう。したがって、いくつかの実施形態では、「ＮＬ１座位内で組み込まれる」又は「ＮＬ２座位内で組み込まれる」という用語は、示されるゲノム座標の約５０，０００ｂｐ以内、約４０，０００ｂｐ以内、約３０，０００ｂｐ以内、２０，０００ｂｐ以内又は１０，０００ｂｐ以内への組込みを包含するであろう。
【００３９】
[0053]いくつかの実施形態では、本開示は、少なくとも２つの別個のＲＴＳを含む哺乳動物細胞に関し、２つのＲＴＳは、Ｆｅｒ１Ｌ４（例えば米国特許出願第１４／４０９，２８３号を参照）、ＲＯＳＡ２６、ＨＧＰＲＴ、ＤＨＦＲ、ＣＯＳＭＣ、ＬＤＨＡ又はＭＧＡＴ１から選択される染色体座位内において染色体に組み込まれている。いくつかの実施形態では、染色体座位は、Ｘ染色体上のＭＩＤ１の第１イントロンを含む。いくつかの実施形態では、染色体座位は、発現増強及び安定性領域（ＥＥＳＹＲ、例えば米国特許第７，７７１，９９７号明細書を参照）を含む。いくつかの実施形態では、天然の染色体座位の少なくとも一部の遺伝子は欠失している。
【００４０】
[0054]「ベクター」又は「発現ベクター」は、例えばプラスミド、ファージ、ウイルス又はコスミドなどのレプリコンであり、それに対して他のＤＮＡ断片が連結され、細胞内において当該連結されたＤＮＡ断片の複製及び／又は発現がなされる。「ベクター」には、エピソーム性（例えばプラスミド）及び非エピソーム性のベクターが含まれる。本開示のいくつかの実施形態では、ベクターはエピソーム性のベクターであり、それは、例えば非対称的な分離により、度重なる細胞世代を経た後で細胞集団から除去され／失われる。用語「ベクター」は、インビトロ、インビボ、又はエクスビボで核酸分子を細胞に導入するためのウイルス性及び非ウイルス性の手段を包含する。用語ベクターには、合成ベクターが包含されうる。ベクターは、トランスフェクション、トランスダクション、細胞融合及びリポフェクションを含むがこれに限定されない周知の方法により、所望の宿主細胞に導入できる。ベクターは、プロモーターを含む各種の制御エレメントを含んでもよい。
【００４１】
[0055]本明細書において、「交換可能なカセット」又は「カセット」という用語は、遺伝子及び組換え部位を含む一種の可動的な遺伝的エレメントである。いくつかの実施形態では、交換可能なカセットは少なくとも２つのＲＴＳを含む。いくつかの実施形態では、交換可能なカセットはレポーター遺伝子又は選択遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、カセットは、リコンビナーゼにより媒介されるカセット交換（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃａｓｓｅｔｔｅ−ｅｘｃｈａｎｇｅ：ＲＭＣＥ）により交換される。
【００４２】
[0056]いくつかの実施形態では、部位特異的組込みは、１つ又は複数の遺伝子を宿主細胞の染色体に導入するために用いる。参照により本願明細書に組み込む、Ｂｏｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３８１：８０１−８１３（２０００），Ｋｏｌｂ，Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ４：３８１−３９２（２００２）及びＣｏａｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：４０７−４１９（２００５）を参照。いくつかの実施形態では、「部位特異的組込み」は、ある核酸配列を染色体の特定の部位に組み込むことを指す。いくつかの実施形態では、部位特異的組込みは、「部位特異的組換え」を意味することもある。いくつかの実施形態では、「部位特異的組換え」は、配列又は標的部位のそれらの同族対での組換を触媒する特異的な酵素による、２つのＤＮＡパートナー分子の再編成を指す。部位特異的組換えは、相同組換とは対照的に、パートナーＤＮＡ分子の間にＤＮＡ相同性を必要とせず、ＲｅｃＡとは独立しており、またいかなる段階においてもＤＮＡ複製が関与しない。いくつかの実施形態では、部位特異的組換えは、宿主細胞（例えば哺乳動物細胞）における核酸の部位特異的組込みを触媒する部位特異的リコンビナーゼシステムを使用する。リコンビナーゼシステムは、典型的には、２つの特異的なＤＮＡ配列（組換え標的部位）、及び特異的な酵素（リコンビナーゼ）の３つのエレメントからなる。リコンビナーゼは、複数の特異的な組換え部位間での組換え反応を触媒する。
【００４３】
[0057]リコンビナーゼ酵素又はリコンビナーゼは、部位特異的組換えにおいて、組換えを触媒する酵素である。本開示のいくつかの実施形態では、部位特異的組換えに使用するリコンビナーゼは、非哺乳動物の系に由来する。いくつかの実施形態では、リコンビナーゼは、細菌、バクテリオファージ又は酵母に由来する。
【００４４】
[0058]いくつかの実施形態では、リコンビナーゼをコードする核酸配列は、宿主細胞（例えば哺乳動物細胞）に組み込まれる。いくつかの実施形態では、リコンビナーゼをコードする核酸配列は、分子生物学において公知の方法により宿主細胞に送達される。いくつかの実施形態では、リコンビナーゼのポリペプチド配列を直接細胞に送達してもよい。いくつかの実施形態では、リコンビナーゼは、Ｃｒｅリコンビナーゼ、ＦＬＰリコンビナーゼ、Ｄｒｅリコンビナーゼ、ＫＤリコンビナーゼ、Ｂ２Ｂ３リコンビナーゼ、Ｈｉｎリコンビナーゼ、Ｔｒｅコンビナーゼ、λインテグラーゼ、ＨＫ０２２インテグラーゼ、ＨＰ１インテグラーゼ、γδレゾルバーゼ／インベルターゼ、ＰａｒＡレゾルバーゼ／インベルターゼ、Ｔｎ３レゾルバーゼ／インベルターゼ、Ｇｉｎレゾルバーゼ／インベルターゼ、φＣ３１インテグラーゼ、ＢｘＢ１インテグラーゼ、Ｒ４インテグラーゼ又は他の機能性リコンビナーゼ酵素である。例えば、Ｔｈｏｒｐｅ  ＆  Ｓｍｉｔｈ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５：  ５５０５−５５１０（１９９８）、Ｋｕｈｓｔｏｓｓ  ＆  Ｒａｏ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２２：８９７−８９０（１９９１）、米国特許第５，１９０，８７１号明細書、Ｏｗ  ＆  Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １５５：７０４−７１３（１９８３）、Ｍａｔｓｕｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７８：３３７４−３３７６（１９９６）、Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７２：１０９２−１０９８（１９９０）、Ｓｔｒａｇｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：５０７−５１２（１９８９）、Ｃａｒｒａｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  ８：  ７４−８３（１９９４）、Ｂａｎｎａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １６：５３５−５５１（１９９５）、Ｃｒｅｌｉｎ  ＆  Ｒｏｏｄ，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７９：５１４８−５１５６（１９９７）を参照。
【００４５】
[0059]いくつかの実施形態では、本願明細書に記載されるリコンビナーゼはＦＬＰリコンビナーゼである。ＦＬＰリコンビナーゼは、ＤＮＡ複製の間、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の２μプラスミドのコピー数の増幅に関係する部位特異的組換え反応を触媒するタンパク質である。いくつかの実施形態では、本開示のＦＬＰリコンビナーゼはサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の種に由来する。いくつかの実施形態では、ＦＬＰリコンビナーゼはサッカロマイセス・セレビシエに由来する。いくつかの実施形態では、ＦＬＰリコンビナーゼはサッカロマイセス・セレビシエの株に由来する。いくつかの実施形態では、ＦＬＰリコンビナーゼは耐熱性の変異ＦＬＰリコンビナーゼである。いくつかの実施形態では、ＦＬＰリコンビナーゼはＦＬＰ１又はＦＬＰｅである。いくつかの実施形態では、ＦＬＰリコンビナーゼをコードする核酸配列は、ヒトにおいて最適化されたコドンを含む。
【００４６】
[0060]いくつかの実施形態では、リコンビナーゼはＣｒｅリコンビナーゼである。Ｃｒｅ（ｃａｕｓｅｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）は、リコンビナーゼのＩｎｔファミリーのメンバーであり（Ａｒｇｏｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８６）  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ５：４３３）、細菌のみならず真核細胞においても、ｌｏｘ部位（ｌｏｃｕｓ  ｏｆ  Ｘ−ｉｎｇ  ｏｖｅｒ）の効率的な組換えを行うことが示されている（Ｓａｕｅｒ（１９８７）  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ７：２０８７、Ｓａｕｅｒ  ａｎｄ  Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ（１９８８）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ８５：５１６６）。いくつかの実施形態では、本願明細書に記載され、使用されるＣｒｅリコンビナーゼは、バクテリオファージに由来する。いくつかの実施形態では、ＣｒｅリコンビナーゼはＰ１バクテリオファージに由来する。
【００４７】
[0061]本明細書に記載される用語「部位特異的組込み部位」、「組換え標的部位」、「ＲＴＳ」及び「部位特異的リコンビナーゼ標的部位」は、短い（例えば約６０未満の塩基対の）核酸部位又は配列を指し、それは部位特異的リコンビナーゼにより認識され、部位特異的組換えイベントの間の交差領域となる。いくつかの実施形態では、組換え標的部位は、約６０未満の塩基対、約５５未満の塩基対、約５０未満の塩基対、約４５未満の塩基対、約４０未満の塩基対、約３５未満の塩基対又は約３０未満の塩基対である。いくつかの実施形態では、組換え標的部位は、約３０〜約６０の塩基対、約３０〜約５５の塩基対、約３２〜約５２の塩基対、約３４〜約４４の塩基対、約３２の塩基対、約３４の塩基対又は約５２の塩基対である。部位特異的組換え標的部位の例には、ｌｏｘ部位、ｒｏｘ部位、ｆｒｔ部位、ａｔｔ部位及びｄｉｆ部位が包含されるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、組換え標的部位は、配列番号１〜３０に示すのと実質的に同じ配列を有する核酸である。
【００４８】
[0062]いくつかの実施形態では、ＲＴＳは、表１から選択されるｌｏｘ部位である。本願明細書に記載の用語「ｌｏｘ部位」は、Ｃｒｅリコンビナーゼが部位特異的組換えを触媒できるヌクレオチド配列を指す。様々な同一でないｌｏｘ部位が当技術分野で公知である。各種のｌｏｘ部位の配列は、組換えが起こる８塩基の対非対称コア領域に隣接する同一の１３塩基対の逆向き反復配列をそれら全てが含むという点で類似している。部位の方向性、及び各種のｌｏｘ部位の変動性の原因となるのは、非対称コア領域である。これらの（非限定的な）例としては、天然のｌｏｘＰ（Ｐ１ゲノムに存在する配列）、ｌｏｘＢ、ｌｏｘＬ及びｌｏｘＲ（これらは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体に存在）、並びにいくつかの変異型又は改変型ｌｏｘ部位（例えばｌｏｘＰ５１１、ｌｏｘΔ８６、ｌｏｘΔ１１７、ｌｏｘＣ２、ｌｏｘＰ２、ｌｏｘＰ３及びｌｏｘＰ２３）が挙げられる。いくつかの実施形態では、ｌｏｘ組換え標的部位は、表２に示す配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する核酸である。
【００４９】
【表２】
2020511954.tif 000004
[0063]いくつかの実施形態では、ＲＴＳは、ｌｏｘΔ８６、ｌｏｘΔ１１７、ｌｏｘＣ２、ｌｏｘＰ２、ｌｏｘＰ３及びｌｏｘＰ２３から選択されるｌｏｘ部位である。
【００５０】
[0064]いくつかの実施形態では、ＲＴＳは、表３から選択されるＦｒｔ部位である。本願明細書に記載の用語「Ｆｒｔ部位」は、酵母の２μｍプラスミドのＦＬＰ遺伝子の産物（ＦＬＰリコンビナーゼ）が部位特異的組換えを触媒できるヌクレオチド配列を指す。様々な同一でないＦｒｔ部位が当技術分野で公知である。各種のＦｒｔ部位の配列は、組換えが起こる８塩基の対非対称コア領域に隣接する同一の１３塩基対の逆向き反復配列をそれら全てが含むという点で類似している。部位の方向性、及び各種のＦｒｔ部位の変動性の原因となるのは、非対称コア領域である。これらの（非限定的な）例には、天然のＦｒｔ（Ｆ）及びいくつかの変異型又は改変型Ｆｒｔ部位（例えばＦｒｔ  Ｆ１及びＦｒｔ  Ｆ２）が包含される。いくつかの実施形態では、Ｆｒｔ組換え標的部位は、表３に示す配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する核酸である。
【００５１】
【表３】
2020511954.tif 000005
[0065]いくつかの実施形態では、ＲＴＳは、表４から選択されるｒｏｘ部位である。本願明細書に記載の用語「ｒｏｘ部位」は、Ｄｒｅリコンビナーゼが部位特異的組換えを触媒できるヌクレオチド配列を指す。様々な同一でないｒｏｘ部位が当技術分野で公知である。これらの（非限定的な）例としては、ｒｏｘＲ及びｒｏｘＦが包含される。いくつかの実施形態では、ｒｏｘ組換え標的部位は、表４に示す配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する核酸である。
【００５２】
【表４】
2020511954.tif 000006
[0066]いくつかの実施形態では、ＲＴＳは、表５から選択されるａｔｔ部位である。本願明細書に記載の用語「ａｔｔ部位」は、λインテグラーゼ又はφＣ３１インテグラーゼが部位特異的組換えを触媒できるヌクレオチド配列を指す。様々な同一でないａｔｔ部位が当技術分野で公知である。これらの（非限定的な）例としては、ａｔｔＰ、ａｔｔＢ、ｐｒｏＢ、ｔｒｐＣ、ｇａｌＴ、ｔｈｒＡ及びｒｒｎＢが包含される。いくつかの実施形態では、ａｔｔ組換え標的部位は、表５に示す配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する核酸である。
【００５３】
【表５】
2020511954.tif 000007
[0067]本願明細書に記載される用語「別個の組換え標的部位」は、同一でない、又は異種特異的な組換え標的部位を指す。例えば、いくつかのバリアントＦｒｔ部位が存在するが、組換えは通常、同一の２つのＦｒｔ部位の間でのみ起こりうる。いくつかの実施形態では、別個の組換え標的部位は、同じ組換え系（例えばＬｏｘＰ及びＬｏｘＲ）に由来する同一でない組換え標的部位を指す。いくつかの実施形態では、別個の組換え標的部位は、異なる組換え系（例えばＬｏｘＰ及びＦｒｔ）に由来する同一でない組換え標的部位を指す。いくつかの実施形態では、別個の組換え標的部位は、同じ組換え系に由来する組換え標的部位と、異なる組換え系に由来する組換え標的部位との組合せ（例えばＬｏｘＰ、ＬｏｘＲ、Ｆｒｔ及びＦｒｔ１）を指す。
【００５４】
[0068]各種のＲＴＳの組合せが使用できる。いくつかの実施形態では、細胞は２つの別個のＲＴＳを含む。いくつかの実施形態では、細胞は４つのＲＴＳを含む。いくつかの実施形態では、細胞は６つのＲＴＳを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＴＳは、配列番号１〜３０から選択される。いくつかの実施形態では、細胞は６つのＲＴＳを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＴＳは、配列番号１〜６から選択される。いくつかの実施形態では、細胞は６つのＲＴＳを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＴＳは、配列番号７〜２１から選択される。いくつかの実施形態では、細胞は６つのＲＴＳを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＴＳは、配列番号２２〜２３から選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＴＳは、配列番号２８〜３０から選択される。いくつかの実施形態では、細胞は６つのＲＴＳを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＴＳは、配列番号２４〜２７から選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも４つの別個のＲＴＳを含む細胞は、以下のＲＴＳを含む：ＬｏｘＰ５１１、Ｆｒｔ  Ｆ５、Ｆｒｔ及びＬｏｘＰ。いくつかの実施形態では、少なくとも４つの別個のＲＴＳを含む細胞は、以下のＲＴＳを含む：Ｆｒｔ  Ｆ１４及びＦｒｔ  Ｆ１５。いくつかの実施形態では、少なくとも４つの別個のＲＴＳを含む細胞は、以下のＲＴＳを含む：ＬｏｘＰ５１１、Ｆｒｔ  Ｆ５、Ｆｒｔ、ＬｏｘＰ、Ｆｒｔ  Ｆ１４及びＦｒｔ  Ｆ１５。いくつかの実施形態では、少なくとも４つの別個のＲＴＳを含む細胞は、以下のＲＴＳを含んでもよい：Ｆｒｔ  １、Ｆｒｔ  ２、Ｆｒｔ  ３、Ｆｒｔ  ４。いくつかの実施形態では、少なくとも４つの別個のＲＴＳを含む細胞は、以下のＲＴＳを含む：Ｆｒｔ  ｍ５、Ｆｒｔ  ｗｔ、Ｆｒｔ  ｍ１４、Ｆｒｔ  ｍ１５、Ｆｒｔ  ｍ７及びＦｒｔ  ｍ６。いくつかの実施形態では、６つの別個のＲＴＳを含む細胞は、以下のＲＴＳを含んでもよい：Ｆｒｔ  １、Ｆｒｔ  ２、Ｆｒｔ  ３、Ｆｒｔ  ４、Ｆｒｔ  ５、Ｆｒｔ  ６。いくつかの実施形態では、少なくとも４つの別個のＲＴＳを含む細胞は、以下のＲＴＳを含んでもよい：Ｆｒｔ  ｍ５、Ｆｒｔ、Ｆｒｔ  ｍ１４、Ｆｒｔ  ｍ１５。
【００５５】
[0069]本願明細書に記載される用語「ランディングパッド」は、宿主細胞において染色体に組み込まれている第１の組換え標的部位を含む核酸配列を指す。いくつかの実施形態では、ランディング部位は、宿主細胞において染色体に組み込まれている２つ以上の組換え標的部位を含む。いくつかの実施形態では、細胞は１、２、３、４、５、６、７又は８つのランディングパッドを含む。いくつかの実施形態では、細胞は１、２又は３つのランディングパッドを含む。いくつかの実施形態では、細胞は４つのランディングパッドを含む。いくつかの実施形態では、ランディングパッドは、最大１、２、３、４、５、６、７又は８つの別個の染色体座位に組み込まれている。いくつかの実施形態では、ランディングパッドは、最大１、２又は３つの別個の染色体座位に組み込まれている。いくつかの実施形態では、ランディングパッドは、最大４つの別個の染色体座位に組み込まれている。
【００５６】
[0070]いくつかの実施形態では、本開示は、各種の座位から、例えばＤｔＥタンパク質などの各種のタンパク質を発現させることによって、タンパク質の所望の発現を達成させる方法を記載する。いくつかの実施形態では、ＤｔＥタンパク質は、例えばＣＨＯの染色体のＮＬ１座位から発現される。いくつかの実施形態では、ＤｔＥタンパク質は、例えばＣＨＯの染色体のＮＬ２座位から発現される。
【００５７】
[0071]いくつかの実施形態では、細胞は２つの別個のＲＴＳを含む。いくつかの実施形態では、２つの別個のＲＴＳは、ＮＬ１座位内において染色体に組み込まれている。いくつかの実施形態では、２つの別個のＲＴＳは、ＮＬ２座位内において染色体に組み込まれている。いくつかの実施形態では、細胞は４つの別個のＲＴＳを含む。いくつかの実施形態では、４つの別個のＲＴＳは、同じ座位内において染色体に組み込まれている。いくつかの実施形態では、２つの別個のＲＴＳはＮＬ１座位又はＮＬ２座位内において染色体に組み込まれ、２つの別個のＲＴＳは別々の座位において染色体に組み込まれている。いくつかの実施形態では、別々の座位は、Ｆｅｒ１Ｌ４座位である。いくつかの実施形態では、２つの別個のＲＴＳはＮＬ１座位内において染色体に組み込まれ、２つの別個のＲＴＳはＮＬ２座位内において染色体に組み込まれている。いくつかの実施形態では、細胞は６つの別個のＲＴＳを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも４つの別個のＲＴＳは、同じ座位内において染色体に組み込まれている。いくつかの実施形態では、少なくとも２つの別個のＲＴＳはＮＬ１座位又はＮＬ２座位内において染色体に組み込まれ、少なくとも２つの別個のＲＴＳは別々の座位において染色体に組み込まれている。いくつかの実施形態では、別々の座位は、Ｆｅｒ１Ｌ４座位である。いくつかの実施形態では、少なくも２つの別個のＲＴＳはＮＬ１座位内において染色体に組み込まれ、少なくとも２つの別個のＲＴＳはＮＬ２座位内において染色体に組み込まれている。いくつかの実施形態では、ＲＴＳの少なくとも１つは、ｆｒｔ部位、ｌｏｘ部位、ｒｏｘ部位又はａｔｔ部位である。いくつかの実施形態では、ＲＴＳの少なくとも１つは、配列番号１〜３０から選択される。
【００５８】
[0072]各種の細胞が、本開示に従い使用できる。いくつかの実施形態では、細胞は、マウス細胞、ヒト細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＣＨＯ−ＤＸＢ１１細胞、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞、すべてのバリアント（例えばＣＨＯＫ１ＳＶ  ＰＯＴＥＬＬＩＧＥＮＴ（登録商標）、Ｌｏｎｚａ、Ｓｌｏｕｇｈ、英国）を含むＣＨＯＫ１ＳＶ（商標）細胞、すべてのバリアントを含むＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞（グルタミン合成酵素ノックアウト）、付着適応及び懸濁適応バリアントを含むＨＥＫ２９３細胞、ヒーラ細胞又はＨＴ１０８０細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は少なくとも２つの別個のＲＴＳを含み、ＲＴＳはＮＬ１座位、ＮＬ２座位又はＦｅｒ１Ｌ４座位内において染色体に組み込まれている。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は少なくとも４つの別個のＲＴＳを含み、２つの別個のＲＴＳはＮＬ１座位又はＮＬ２座位内において染色体に組み込まれ、２つの別個のＲＴＳは別々の座位において染色体に組み込まれている。いくつかの実施形態では、別々の座位は、Ｆｅｒ１Ｌ４座位である。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は少なくとも４つの別個のＲＴＳを含む、２つの別個のＲＴＳはＮＬ１座位内において染色体に組み込まれ、２つの別個のＲＴＳはＮＬ２座位内において染色体に組み込まれている。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は少なくとも４つの別個のＲＴＳを含み、４つの別個のＲＴＳはＮＬ１座位又はＮＬ２座位内において染色体に組み込まれている。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は少なくとも６つの別個のＲＴＳを含み、２つの別個のＲＴＳはＮＬ１座位内において染色体に組み込まれ、２つの別個のＲＴＳはＮＬ２座位内において染色体に組み込まれ、２つの別個のＲＴＳは別々の座位において染色体に組み込まれている。いくつかの実施形態では、別々の座位は、Ｆｅｒ１Ｌ４座位である。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は少なくとも６つの別個のＲＴＳを含み、６つの別個のＲＴＳはＮＬ１座位又はＮＬ２座位内に組み込まれている。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は少なくとも６つの別個のＲＴＳを含み、４つの別個のＲＴＳはＮＬ１座位又はＮＬ２座位内に組み込まれ、２つの別個のＲＴＳは別々の座位に組み込まれている。いくつかの実施形態では、第２の座位は、Ｆｅｒ１Ｌ４座位である。
【００５９】
[0073]いくつかの実施形態では、細胞は第１の目的遺伝子を含み、第１の目的遺伝子は染色体に組み込まれている。
【００６０】
[0074]本願明細書に記載される「目的遺伝子」又は「ＧＯＩ」という用語は、異種遺伝子を記載するために用いる。本願明細書に記載される「異種遺伝子」又は「ＨＧ」という用語は、コーディング配列又は制御配列などの核酸配列に関連する場合には、通常では結合されず、及び／又は通常では特定の細胞との関連がない、核酸配列（例えば遺伝子）を意味する。いくつかの実施形態では、異種遺伝子は、コーディング配列自体が天然で見つからない構築物（例えば天然遺伝子と異なるコドンを有する合成配列）である。アレルの変動又は天然に生じる変異イベントは、本発明で用いられるような異種ＤＮＡを生じさせない。
【００６１】
[0075]いくつかの実施形態では、目的遺伝子は、レポーター遺伝子、選択遺伝子、治療目的遺伝子、補助的遺伝子又はそれらの組合せを含む。
【００６２】
[0076]本願明細書に記載される「レポーター遺伝子」は、その発現が、細胞に対して容易に同定でき及び測定できる表現型を付与する遺伝子のことである。いくつかの実施形態では、レポーター遺伝子は蛍光タンパク質遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、レポーター遺伝子は選択遺伝子を含む。
【００６３】
[0077]本願明細書に記載される用語「選択遺伝子」は、通常の必須栄養素が欠損する培地において増殖する能力を付与するための酵素活性をコードする遺伝子の使用を指し、加えて、選択遺伝子は、該選択遺伝子が発現される細胞に抗生物質又は薬剤に対する耐性を付与できるものであってもよい。選択遺伝子を用いて、宿主細胞に特定の表現型を与えてもよい。宿主細胞が、選択培地において増殖しようとするときに選択遺伝子を発現しなければならない場合、該遺伝子はポジティブセレクション遺伝子と呼ばれる。また選択遺伝子は、特定の遺伝子を含む宿主細胞に対する選択に用いることもでき、このように用いられる選択遺伝子はネガティブセレクション遺伝子と呼ばれる。
【００６４】
[0078]本願明細書に記載される用語「治療目的遺伝子」は、何らかの機能的関連性のあるヌクレオチド配列を指す。したがって、本開示の治療目的遺伝子は、治療的な組換えタンパク質を調製するために発現させる必要のあるタンパク質をコードするいかなる好ましい遺伝子を含んでもよい。治療目的遺伝子の適切な（非限定的な）代表例には、モノクローナル抗体、二重特異性モノクローナル抗体又は抗体薬物コンジュゲートが挙げられる［血液凝固因子、タンパク質発現が転写において制限される、十分に発現されるｍＡｂ、ホルモン（例えばＥＰＯ）、免疫融合タンパク質（Ｆｃ融合体）、三重特異性ｍＡｂを含む］。
【００６５】
[0079]本明細書に記載される用語「補助的遺伝子」又は「ヘルパー遺伝子」は、第２の遺伝子の発現を補助するか、又は第２の遺伝子の産物の安定化、フォールディング若しくは翻訳後修飾の補助を行うか、又は第２の遺伝子の産物の生産を促進する細胞環境を構築する、第１の遺伝子を指すものとして交換可能に用いられる。いくつかの実施形態では、第２の遺伝子はＤｔＥをコードする遺伝子である。いくつかの実施形態では、補助的遺伝子はＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態では、補助的遺伝子はｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ又はｍｉＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態では、補助的遺伝子は、転写因子、シャペロン、シャペロニン、シンセターゼ、オキシダーゼ、レダクターゼ、グリコトランスフェラーゼ、プロテアーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、アセチルトランスフェラーゼ、リパーゼ又はアルキラーゼをコードする。
【００６６】
[0080]いくつかの実施形態では、第１の目的遺伝子は、レポーター遺伝子、選択遺伝子、治療目的遺伝子、補助的遺伝子又はそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、治療目的遺伝子は、所望のコピー数で十分に発現される治療的なタンパク質をコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、十分に発現される治療的なタンパク質をコードする遺伝子は、２コピー、３コピー、４コピー、５コピー、６コピー、７コピー、８コピー、９コピー又は１０コピーのコピー数である。いくつかの実施形態では、治療目的遺伝子は、ＤｔＥタンパク質をコードする遺伝子を含む。
【００６７】
[0081]本願明細書に記載される用語「発現困難タンパク質」は、その生産が困難であるタンパク質を指す。いくつかの実施形態では、ＤｔＥタンパク質の生産は、タンパク質発現が高度に制御されるために困難である場合もある。いくつかの実施形態では、ＤｔＥタンパク質は、宿主細胞からの回収が困難である。いくつかの実施形態では、ＤｔＥタンパク質は、ミスフォールディングの傾向を有するタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＤｔＥタンパク質は、クリッピングの傾向を有するタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＤｔＥタンパク質は、分解される傾向を有するタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＤｔＥタンパク質は、凝集の傾向を有するタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＤｔＥタンパク質は、溶解性が低いタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＤｔＥタンパク質は、膜結合タンパク質である。いくつかの実施形態では、ＤｔＥタンパク質は、精製が困難である。いくつかの実施形態では、ＤｔＥタンパク質は、細胞毒性を有する。いくつかの実施形態では、ＤｔＥタンパク質は、複数のポリペプチド鎖（例えば２、３又は４つのポリペプチド鎖）を含む。いくつかの実施形態では、ＤｔＥタンパク質の複数のポリペプチド鎖は、ホモオリゴマーを形成してＤｔＥタンパク質を生産する。いくつかの実施形態では、ＤｔＥタンパク質の複数のポリペプチド鎖は、ヘテロオリゴマーを形成して、ＤｔＥタンパク質を生産する。いくつかの実施形態では、ホモオリゴマー又はヘテロオリゴマーは、共有結合性の相互作用、非共有結合性の相互作用又はそれらの組合せにより形成される。いくつかの実施形態では、ＤｔＥタンパク質は、補助的遺伝子の発現がＤｔＥタンパク質の生産に必要となるタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＤｔＥタンパク質は、翻訳後修飾がＤｔＥタンパク質の生産に必要となるタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＤｔＥタンパク質は、分子生物学の当業者に公知の標準的な技術を用いた発現が変動的な特徴を有する生産タンパク質をもたらすタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＤｔＥタンパク質は融合タンパク質である。
【００６８】
[0082]例えば、いくつかの実施形態では、本開示は、ＤｔＥタンパク質が２ｇ／Ｌ以上のタンパク質生成力価において得られるよう、ＮＬ１座位及び／又はＮＬ２座位からＤｔＥタンパク質を発現させる方法を記載する。いくつかの実施形態では、ＮＬ１座位におけるＤｔＥタンパク質の発現は、ＤｔＥタンパク質を２ｇ／Ｌ超で生産させる。いくつかの実施形態では、ＮＬ２座位におけるＤｔＥタンパク質の発現は、ＤｔＥタンパク質を２ｇ／Ｌ超で生産させる。いくつかの実施形態では、ＤｔＥタンパク質は、分子生物学の当業者に公知の標準的な技術を用いた発現が２ｇ／Ｌ未満のタンパク質生成力価をもたらすタンパク質である。
【００６９】
[0083]いくつかの実施形態では、ＤｔＥタンパク質はモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、ＤｔＥタンパク質は二重特異性モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、ＤｔＥタンパク質は三重特異性モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、ＤｔＥタンパク質はＦｃ融合タンパク質である。本願明細書に記載される用語「Ｆｃ融合タンパク質」は、免疫グロブリンのＦｃドメインが第２のペプチドに作動可能に連結される融合タンパク質を指す。いくつかの実施形態では、ＤｔＥタンパク質は酵素である。いくつかの実施形態では、ＤｔＥタンパク質は膜受容体である。いくつかの実施形態では、ＤｔＥタンパク質は二重特異的なＴ細胞エンゲージャー（ＢＩＴＥ（登録商標）、Ｍｉｃｒｏｍｅｔ  ＡＧ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）である。
【００７０】
[0084]いくつかの実施形態では、ＤｔＥタンパク質は、Ｆｃ融合タンパク質、酵素、膜受容体又はモノクローナル抗体からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、二重特異性モノクローナル抗体又は三重特異性モノクローナル抗体である。
【００７１】
[0085]いくつかの実施形態では、ＤｔＥタンパク質は、１つ又は複数の目的遺伝子にコードされる。いくつかの実施形態では、第１の目的遺伝子は、２つのＲＴＳの間に位置する。
【００７２】
[0086]本願明細書に記載される用語「２つのＲＴＳの間に位置する」とは、２つのＲＴＳの間に位置する遺伝子を指し、すなわち、ＲＴＳの１つが遺伝子の５’に位置し、別のＲＴＳが遺伝子の３’に位置することを指す。いくつかの実施形態では、ＲＴＳは、それらの間に位置する遺伝子に直接隣接して位置する。いくつかの実施形態では、ＲＴＳは、それらの間に位置する遺伝子から所定の距離を置いて位置する。いくつかの実施形態では、ＲＴＳは方向性を有する配列である。いくつかの実施形態では、ＲＴＳの間に位置する遺伝子の５’及び３’は、順方向に配向される（すなわち、それらは同じ方向に配向する）。いくつかの実施形態では、ＲＴＳの間に位置する遺伝子の５’及び３’は、逆方向に配向される（すなわち、それらは異なる方向に配向する）。
【００７３】
[0087]いくつかの実施形態では、第１の目的遺伝子は、ＮＬ１座位に位置する。いくつかの実施形態では、細胞は第２の目的遺伝子を含み、第２の目的遺伝子は染色体に組み込まれている。いくつかの実施形態では、第２の目的遺伝子は、レポーター遺伝子、選択遺伝子、治療目的遺伝子、補助的遺伝子又はそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、治療目的遺伝子は、ＤｔＥタンパク質をコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ＤｔＥタンパク質は、Ｆｃ融合タンパク質、酵素、膜受容体、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ（登録商標））又はモノクローナル抗体からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第２の目的遺伝子は、２つのＲＴＳの間に位置する。いくつかの実施形態では、第２の目的遺伝子は、ＮＬ１座位又はＮＬ２座位内に位置する。いくつかの実施形態では、第１の目的遺伝子はＮＬ１座位内に位置し、第２の目的遺伝子はＮＬ２座位内に位置する。いくつかの実施形態では、細胞は第３の目的遺伝子を含み、第３の目的遺伝子は染色体に組み込まれている。いくつかの実施形態では、第３の目的遺伝子は、レポーター遺伝子、選択遺伝子、治療目的遺伝子、補助的遺伝子又はそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、治療目的遺伝子は、ＤｔＥタンパク質をコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、第３の目的遺伝子は、２つのＲＴＳの間に位置する。いくつかの実施形態では、第３の目的遺伝子は、ＮＬ１座位又はＮＬ２座位内に位置する。いくつかの実施形態では、第３の目的遺伝子は、ＮＬ１座位及びＮＬ２座位とは別の座位内に位置する。いくつかの実施形態では、第１の目的遺伝子、第２の目的遺伝子及び第３の目的遺伝子は、３つの別々の座位内にある。いくつかの実施形態では、第１の目的遺伝子、第２の目的遺伝子及び第３の目的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＮＬ１座位内にあり、第１の目的遺伝子、第２の目的遺伝子及び第３の目的遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＮＬ２座位内にある。
【００７４】
[0088]いくつかの実施形態では、細胞は、部位特異的リコンビナーゼ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、部位特異的リコンビナーゼ遺伝子は、染色体に組み込まれている。
【００７５】
[0089]いくつかの実施形態では、本開示は、少なくとも４つの別個のＲＴＳを含む哺乳動物細胞を提供し、細胞は、（ａ）ＮＬ１座位又はＮＬ２座位内において染色体に組み込まれている少なくとも２つの別個のＲＴＳと、（ｂ）（ａ）の少なくとも２つのＲＴＳの間に組み込まれている第１の目的遺伝子であって、レポーター遺伝子、ＤｔＥタンパク質をコードする遺伝子、補助的遺伝子又はそれらの組合せを含む第１の目的遺伝子と、（ｃ）（ａ）の座位とは別の第２の染色体座位内に組み込まれている第２の目的遺伝子であって、レポーター遺伝子、ＤｔＥタンパク質をコードする遺伝子、補助的遺伝子又はそれらの組合せを含む第２の目的遺伝子とを含む。
【００７６】
[0090]いくつかの実施形態では、本開示は、少なくとも４つの別個のＲＴＳを含む哺乳動物細胞を提供し、細胞は、（ａ）Ｆｅｒ１Ｌ４座位内において染色体に組み込まれている少なくとも２つの別個のＲＴＳと、（ｂ）ＮＬ１座位又はＮＬ２座位内において染色体に組み込まれている少なくとも２つの別個のＲＴＳと、（ｃ）Ｆｅｒ１Ｌ４座位内において染色体に組み込まれている第１の目的遺伝子であって、レポーター遺伝子、ＤｔＥタンパク質をコードする遺伝子、補助的遺伝子又はそれらの組合せを含む、第１の目的遺伝子と、（ｄ）（ｂ）のＮＬ１座位又はＮＬ２座位において染色体に組み込まれている第２の目的遺伝子であって、レポーター遺伝子、ＤｔＥタンパク質をコードする遺伝子、補助的遺伝子又はそれらの組合せを含む、第２の目的遺伝子とを含む。
【００７７】
[0091]いくつかの実施形態では、本開示は、少なくとも６つの別個のＲＴＳを含む哺乳動物細胞を提供し、細胞は、（ａ）Ｆｅｒ１Ｌ４座位内において染色体に組み込まれている少なくとも２つの別個のＲＴＳ及び第１の目的遺伝子と、（ｂ）ＮＬ１座位内において染色体に組み込まれている少なくとも２つの別個のＲＴＳ及び第２の目的遺伝子と、（ｃ）ＮＬ２座位内において染色体に組み込まれている少なくとも２つの別個のＲＴＳ及び第３の目的遺伝子とを含む。
【００７８】
[0092]いくつかの実施形態では、本開示は、組換えタンパク質プロデューサー細胞を生産する方法を提供し、該方法は、（ａ）少なくとも４つの別個のＲＴＳ及び部位特異的リコンビナーゼをコードする遺伝子を含み、少なくとも２つの別個のＲＴＳがＮＬ１座位内において染色体に組み込まれ、少なくとも２つの別個のＲＴＳがＮＬ２座位内において染色体に組み込まれている細胞を用意するステップと、（ｂ）（ａ）の細胞に、第１の目的遺伝子をコードする交換可能なカセットを含む第１のベクターと、第２の目的遺伝子をコードする交換可能なカセットを含む第２のベクターとをトランスフェクトするステップと、（ｃ）ＮＬ１座位内に第１の交換可能なカセットを、ＮＬ２座位内に第２の交換可能なカセットを組み込むステップと、（ｄ）染色体に組み込まれた第１の交換可能なカセット及び第２の交換可能なカセットを含む組換えタンパク質プロデューサー細胞を選択するステップとを含む。
【００７９】
[0093]本発明で用いられる「トランスフェクション」は、ベクターを含む外因性の核酸分子を細胞に導入することを意味する。「トランスフェクトされた」細胞は、細胞内に外因性の核酸分子を含み、また「変換された」細胞は、細胞内の外因性の核酸分子により細胞の表現型の変化が誘導されたものである。トランスフェクトされた核酸分子は、宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれる場合も、及び／又は、細胞により、染色体外において一時的に維持されるか若しくは長期間維持される場合もある。外因性の核酸分子又は断片を発現する宿主細胞又は生物は、「組換え」、「形質転換」又は「トランスジェニック」生物と呼ばれる。多くのトランスフェクション技術が従来技術において一般に公知である。例えば、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ５２：４５６（１９７３）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）、Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（１９８６）及びＣｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  １３：１９７（１９８１）を参照。かかる技術を用いて、１つ又は複数の外来性ＤＮＡ部分を適切な宿主細胞に導入することができる。
【００８０】
[0094]２つのＲＴＳ配列に関する用語「マッチング」は、リコンビナーゼと結合して、２つの配列間での部位特異的組換えに影響を及ぼしうる能力を有する２つの配列を意味する。いくつかの実施形態では、細胞のＲＴＳにマッチングする交換可能なカセット上のＲＴＳは、細胞のＲＴＳと実質的に同一の配列を有する該カセット上のＲＴＳを指す。いくつかの実施形態では、交換可能なカセットは、染色体に組み込まれて宿主細胞のゲノムに入っている１つ又は２つのＲＴＳと実質的に同一の配列を含む。
【００８１】
[0095]いくつかの実施形態では、「組み込む」という用語は、交換可能なカセットの染色体への組込み（例えば挿入）を指す。いくつかの実施形態では、組込みは、部位特異的リコンビナーゼにより媒介される。いくつかの実施形態では、本発明者らは、細胞がそれらの遺伝的構成において相同であるため、ＳＳＩの使用が、トランスフェクトした細胞からのクローニングの必要性を排除することを見出している。
【００８２】
[0096]いくつかの実施形態では、用語「選択」は、染色体に組み込まれたマーカーを含む細胞を同定することを指す。いくつかの実施形態では、選択は、周知の方法を用いたマーカーの存在の検出により行う。いくつかの実施形態では、選択は、周知の方法を用いたマーカーの不存在の検出により行う。
【００８３】
[0097]いくつかの実施形態では、第１の目的遺伝子は、レポーター遺伝子、選択遺伝子、治療目的遺伝子、補助的遺伝子又はそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、治療目的遺伝子は、ＤｔＥタンパク質をコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ＤｔＥタンパク質は、Ｆｃ融合タンパク質、酵素、膜受容体、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢＩＴＥ（登録商標））又はモノクローナル抗体からなる。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、二重特異性モノクローナル抗体又は三重特異性モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、第１の目的遺伝子は、２つのＲＴＳの間に位置する。いくつかの実施形態では、第２の目的遺伝子は、レポーター遺伝子、選択遺伝子、治療目的遺伝子、補助的遺伝子又はそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、治療目的遺伝子は、ＤｔＥタンパク質をコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、第２の目的遺伝子は、２つのＲＴＳの間に位置する。
【００８４】
[0098]いくつかの実施形態では、本開示は、組換えタンパク質プロデューサー細胞を生産する方法を提供し、該方法は、（ａ）少なくとも少なくとも４つの別個のＲＴＳ及び部位特異的リコンビナーゼをコードする遺伝子を含み、少なくとも２つの別個のＲＴＳが、Ｆｅｒ１Ｌ４座位内において染色体に組み込まれ、少なくとも２つの別個のＲＴＳが、ＮＬ１座位又はＮＬ２座位内において染色体に組み込まれている細胞を用意するステップと、（ｂ）（ａ）の細胞に、第１の目的遺伝子をコードする交換可能なカセットを含む第１のベクターと、第２の目的遺伝子をコードする交換可能なカセットを含む第２のベクターとをトランスフェクトするステップと、（ｃ）Ｆｅｒ１Ｌ４座位内に第１の交換可能なカセットを、ＮＬ１座位又はＮＬ２座位内に第２の交換可能なカセットを組み込むステップと、（ｄ）染色体に組み込まれた第１の交換可能なカセット及び第２の交換可能なカセットを含む組換えタンパク質プロデューサー細胞を選択するステップとを含む。いくつかの実施形態では、第１の目的遺伝子は、レポーター遺伝子、選択遺伝子、治療目的遺伝子、補助的遺伝子又はそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、治療目的遺伝子は、ＤｔＥタンパク質をコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ＤｔＥタンパク質は、Ｆｃ融合タンパク質、酵素、膜受容体、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢＩＴＥ（登録商標））又はモノクローナル抗体からなる。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、二重特異性モノクローナル抗体又は三重特異性モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、第１の目的遺伝子は、２つのＲＴＳの間に位置する。いくつかの実施形態では、第２の目的遺伝子は、レポーター遺伝子、選択遺伝子、治療目的遺伝子、補助的遺伝子又はそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、治療目的遺伝子は、ＤｔＥタンパク質をコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、第２の目的遺伝子は、２つのＲＴＳの間に位置する。
【００８５】
[0099]いくつかの実施形態では、本開示は、組換えタンパク質プロデューサー細胞を生産する方法を提供し、該方法は、（ａ）少なくとも少なくとも６つの別個のＲＴＳ及び部位特異的リコンビナーゼをコードする遺伝子を含み、少なくとも２つの別個のＲＴＳが、Ｆｅｒ１Ｌ４座位内において染色体に組み込まれ、少なくとも２つの別個のＲＴＳが、ＮＬ１座位において染色体に組み込まれ、少なくとも２つの別個のＲＴＳが、ＮＬ２座位内において染色体に組み込まれている細胞を用意するステップと、（ｂ）（ａ）の細胞に、第１の目的遺伝子をコードする交換可能なカセットを含む第１のベクターと、第２の目的遺伝子をコードする交換可能なカセットを含む第２のベクターと、第３の目的遺伝子をコードする交換可能なカセットを含む第３のベクターとをトランスフェクトするステップと、（ｃ）Ｆｅｒ１Ｌ４座位内に第１の交換可能なカセットを、ＮＬ１座位内に第２の交換可能なカセットを、ＮＬ２座位内に第３の交換可能なカセットを組み込むステップと、（ｄ）染色体に組み込まれた第１の交換可能なカセット、第２の交換可能なカセット及び第３の交換可能なカセットを含む組換えタンパク質プロデューサー細胞を選択するステップとを含む。
【００８６】
[00100]いくつかの実施形態では、本発明者らは、ｒＰ発現細胞の調製におけるＳＳＩの使用が、ｒＰ発現細胞のプールの遺伝的構造を相同なものとすることを見出した。いくつかの実施形態では、本発明者らは、ｒＰ発現細胞の調製におけるＳＳＩの使用が、ｒＰ発現細胞のプールをその効率において相同なものとすることを見出した。いくつかの実施形態では、本発明者らは、ｒＰ発現細胞の調製におけるＳＳＩの使用が、ｒＰ発現細胞のプールを、第２のヘルパー遺伝子に対する第１のヘルパー遺伝子の比率において相同なものとすることを見出した。いくつかの実施形態では、本発明者らは、ｒＰ発現細胞の調製におけるＳＳＩの使用が、ｒＰ発現細胞のプールを、治療目的遺伝子に対するヘルパー遺伝子の比率において相同なものとすることを見出した。いくつかの実施形態では、本発明者らは、ｒＰ発現細胞の調製におけるＳＳＩの使用が、より一貫したｒＰ産物の品質保持を可能とすることを見出した。
【００８７】
[00101]本願明細書に記載される原核及び／又は真核細胞株などの細胞株は、本願明細書に記載されるいかなる好適な装置、施設及び方法を使用して培養することができる。さらに、実施形態では、装置、施設及び方法は、懸濁細胞又は足場依存性（付着）細胞の培養に適しており、例えばポリペプチド製品、核酸製品（例えばＤＮＡ又はＲＮＡ）、又は、例えば細胞及び／若しくはウイルス及び微生物治療に使用される哺乳動物若しくは微生物の細胞、及び／又は、ウイルスなどの、薬学的及び生物薬学的製品、の製造用に構成された製造操作に適する。
【００８８】
[00102]いくつかの実施形態では、細胞は、例えば治療用又は診断用の組換え製品などの製品を発現するか又は生産する。以下に詳細に説明するように、細胞により生産される製品の例としては、限定されないが、抗体分子（例えばモノクローナル抗体、二重特異性抗体）、抗体ミメティック（抗原と特異的に結合するが、抗体とは構造的な関連性がないポリペプチド分子（例えばＤＡＲＰｉｎ、ａｆｆｉｂｏｄｙ、ａｄｎｅｃｔｉｎ又はＩｇＮＡＲ））、融合タンパク質（例えばＦｃ融合タンパク質、キメラサイトカイン）、他の組換えタンパク質（例えばグリコシル化タンパク質、酵素、ホルモン）、ウイルス治療薬（例えば抗癌腫瘍溶解性ウイルス、遺伝子治療及びウイルス免疫療用のウイルスベクター）、細胞治療薬（例えば多能性幹細胞、間葉系幹細胞及び成人幹細胞）、ワクチン又は脂質封入粒子（例えばエキソーム、ウイルス様粒子）、ＲＮＡ（例えばｓｉＲＮＡ）、又はＤＮＡ（例えばプラスミドＤＮＡなど）（抗生物質）又はアミノ酸が挙げられる。実施形態では、装置、施設及び方法は、バイオシミラーの製造に用いられうる。
【００８９】
[00103]上記のように、実施形態では、装置、施設及び方法は、真核細胞（例えば哺乳動物細胞）又は下等真核細胞（例えば酵母細胞若しくは糸状菌細胞）、又は原核細胞（例えばグラム陽性若しくはグラム陰性細胞）、及び／又は真核細胞により合成される、真核若しくは原核細胞の産物（例えばタンパク質、ペプチド、抗生物質、アミノ酸、核酸（例えばＤＮＡ若しくはＲＮＡ））の、大規模スケールにて製造することを可能にする。いくつかの実施形態では、微生物叢治療において利用される微生物及びその胞子の使用も開示される。本願明細書において特に明記しない限り、装置、施設及び方法には、限定されないが、ベンチスケール、パイロットスケール及び最大生産スケールなど、あらゆる望ましい容量又は生成能力のものが包含されうる。
【００９０】
[00104]さらに、本願明細書において特に明記しない限り、装置、施設及び方法は、あらゆる適切な反応器又はバイオリアクターを備えてもよく、限定されないが、撹拌槽、エアーリフト、線維、マイクロファイバー、中空糸、セラミックマトリックス、流動床、固定床及び／又はスパウテッドベッドバイオリアクターが挙げられる。本明細書において、「反応器」又は「バイオリアクター」は、培養槽又は培養ユニット、又は他のいかなる反応容器を備えてもよく、用語「反応器」は「培養槽」と交換可能に用いられる。「培養槽」又は「培養」という用語は、微生物及び哺乳動物組織のいずれの培養をも指す。例えば、いくつかの態様において、一例としてのバイオリアクターユニットは、栄養分及び／又は炭素源のフィード、適切なガス（例えば酸素）注入、発酵培地又は細胞培地の吸排気、気液相の分離、温度の維持、酸素及びＣＯ２レベルの維持、ｐＨレベルの維持、撹拌（例えば回転）及び／又は洗浄／殺菌、のうちの１つ又は複数又は全てを行うことができる。例示的な反応器ユニット（例えば培養ユニット）は、ユニット内に複数の反応器を備えてもよく、例えば、当該ユニットは１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０又は１００又はそれ超のユニットのバイオリアクターを有してもよく、及び／又は、施設には、施設内に単一の又は複数の反応器を有する複数のユニットを設置してもよい。各種実施形態では、バイオリアクターは、バッチ、セミフェドバッチ、フェドバッチ、潅流及び／又は連続発酵プロセスに適したものとしうる。反応器の直径を適宜調節しうる。実施形態では、バイオリアクターは、約１００ｍＬ〜約５０，０００Ｌの容量としうる。非限定的な例としては、１００ｍＬ、２５０ｍＬ、５００ｍＬ、７５０ｍＬ、１Ｌ、２Ｌ、３Ｌ、４Ｌ、５Ｌ、６Ｌ、７Ｌ、８Ｌ、９Ｌ、１０Ｌ、１５Ｌ、２０Ｌ、２５Ｌ、３０Ｌ、４０Ｌ、５０Ｌ、６０Ｌ、７０Ｌ、８０Ｌ、９０Ｌ、１００Ｌ、１５０Ｌ、２００Ｌ、２５０Ｌ、３００Ｌ、３５０Ｌ、４００Ｌ、４５０Ｌ、５００Ｌ、５５０Ｌ、６００Ｌ、６５０Ｌ、７００Ｌ、７５０Ｌ、８００Ｌ、８５０Ｌ、９００Ｌ、９５０Ｌ、１０００Ｌ、１５００Ｌ、２０００Ｌ、２５００Ｌ、３０００Ｌ、３５００Ｌ、４０００Ｌ、４５００Ｌ、５０００Ｌ、６０００Ｌ、７０００Ｌ、８０００Ｌ、９０００Ｌ、１０，０００Ｌ、１５，０００Ｌ、２０，０００Ｌ及び／又は５０，０００Ｌの容量が挙げられる。さらに、適切な反応器は、複数回使用用、一回使用用、使い捨て可能、又は非使い捨て可能であってもよく、合金製（例えばステンレス鋼（例えば、３１６Ｌ又は他のいかなる適切なステンレス鋼）及びインコネル）、プラスチック製及び／又はガラス製など、いかなる適切な材料により形成されてもよい。
【００９１】
[00105]実施形態では、本願明細書において特に明記しない限り、本願明細書に記載される装置、施設及び方法は、その他の記載されていないいずれの適切な操作ユニット及び／又は器材、例えば分離、精製及びかかる製品の単離のための操作ユニット及び／又は器材を備えてもよい。いかなる適切な施設及び環境を使用してもよく、例えば従来の現場組立施設、モジュール式、移動式及び仮設式の施設、又は他のいかなる適切な建設物、施設及び／又はレイアウトを使用してもよい。例えば、いくつかの実施形態ではモジュール式のクリーンルームを使用してもよい。さらに、特に明記しない限り、本願明細書に記載される装置、システム及び方法は、単一の場所又は施設の中において格納され、及び／又は実施してもよく、或いは別々の又は複数の場所及び／又は施設の中において格納され、及び／又は実施してもよい。
【００９２】
[00106]適切でありうる施設、器材及び／又はシステムの非限定的な例としては、限定されないが、米国特許出願公開第２０１３／０２８０７９７号、第２０１２／００７７４２９号、第２０１１／０２８０７９７号、第２００９／０３０５６２６号、並びに米国特許第８，２９８，０５４号、第７，６２９，１６７号及び第５，６５６，４９１号に記載のものが挙げられ、それらの全開示内容を参照により本願明細書に組み込む。
【００９３】
[00107]実施形態では、細胞は真核細胞（例えば哺乳動物細胞）である。例えば、哺乳動物細胞は、ヒト又は齧歯目又はウシの細胞系又は細胞株でありうる。例えば、かかる細胞、細胞系又は細胞株の例としては、マウス骨髄腫（例えばＮＳ０又はＳＰ２／０細胞系）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系、ＨＴ１０８０、Ｈ９、ＨｅｐＧ２、ＭＣＦ７、ＭＤＢＫ  Ｊｕｒｋａｔ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ１２、ＢＨＫ（乳児ハムスター腎臓細胞）、ＶＥＲＯ、ＹＢ２／０、Ｙ０、Ｃ１２７、Ｌ細胞、ＣＯＳ（例えばＣＯＳ１及びＣＯＳ７）、ＱＣ１−３、ＨＥＫ−２９３、ＶＥＲＯ、ＰＥＲ．Ｃ６、ＨｅＬａ、ＥＢｌ、ＥＢ２、ＥＢ３、腫瘍溶解性又はハイブリドーマ細胞系が挙げられる。好ましくは、哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞系である。一実施形態では、細胞はＣＨＯ細胞である。一実施形態では、細胞は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ細胞、ＤＧ４４  ＣＨＯ細胞、ＤＵＸＢ１１  ＣＨＯ細胞、ＣＨＯＳ、ＣＨＯ  ＧＳノックアウト細胞、ＣＨＯ  ＦＵＴ８  ＧＳノックアウト細胞、ＣＨＯＺＮ又はＣＨＯ由来の細胞である。ＣＨＯ  ＧＳノックアウト細胞（例えばＧＳＫＯ細胞）は、例えばＣＨＯＫ１ＳＶ（商標）ＧＳノックアウト細胞（ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標））である。ＣＨＯ  ＦＵＴ８ノックアウト細胞は、例えばＣＨＯＫ１ＳＶ（商標）Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ（登録商標）（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ．社）である。真核細胞は、鳥類の細胞、細胞株又は細胞系統（例えばＥＢｘ（登録商標）細胞、ＥＢ１４、ＥＢ２４、ＥＢ２６、ＥＢ６６又はＥＢｖｌ３）であってもよい。
【００９４】
[00108]いくつかの実施形態では、真核細胞は幹細胞である。幹細胞は、例えば多能性幹細胞であってもよく、例えば胚幹細胞（ＥＳＣ）、成人幹細胞、誘導された多能性幹細胞（ｉＰＳＣｓ）、組織特異的幹細胞（例えば造血幹細胞）及び間葉系幹細胞（ＭＳＣ）が挙げられる。
【００９５】
[00109]一実施形態では、細胞は、本願明細書に記載される細胞のいずれかの分化形態である。一実施形態では、細胞は、培養物中のいずれかの初代細胞から誘導された細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は幹細胞から誘導されたものではない。例えば、いくつかの実施形態では、細胞は、個々の患者から抽出され単離された、又は確立された細胞バンクから得た細胞（例えばリンパ球）として免疫療法において用いられる。いくつかの実施形態では、細胞には、遺伝的に操作された細胞（すなわちＣＡＲ−Ｔなど）が包含されうる。
【００９６】
[00110]実施形態では、細胞は肝細胞（例えばヒト肝細胞、動物の肝細胞又は非実質細胞）である。例えば、細胞は、プレート培養可能な代謝試験用ヒト肝細胞、プレート培養可能な誘導試験用ヒト肝細胞、プレート培養可能なＱｕａｌｙｓｔ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ（商標）ヒト肝細胞、懸濁培養用ヒト肝細胞（１０ドナー及び２０ドナーをプールした肝細胞を含む）、ヒト肝クッパー細胞、ヒト肝星状細胞、イヌ肝細胞（単一及びプールされたビーグル肝細胞を含む）、マウス肝細胞（ＣＤ−１及びＣ５７ＢＩ／６肝細胞を含む）、ラット肝細胞（スピローグ−ドーリー、ウィスターハム及びウィスター肝細胞を含む）、サル肝細胞（カニクイザル又はアカゲザル肝細胞を含む）、ネコ肝細胞（イエ・短毛ネコ肝細胞を含む）、及びウサギ肝細胞（ニュージランドホワイト肝細胞を含む）であってもよい。肝細胞は、例えばＴｒｉａｎｇｌｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ、ＬＬＣ（６  デイビスドライブリサーチトライアングルパーク、ノースカロライナ、米国２７７０９）から市販されている。
【００９７】
[00111]一実施形態では、真核細胞は下等真核細胞であり、例えば酵母細胞（例えばピキア属（例えばピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピキア・クルイベリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、及びピキア・アングスタ（Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ））、コマガタエラ属（例えばコマガタエラ・パストリス（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、コマガタエラ・シュードパストリス（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐｓｅｕｄｏｐａｓｔｏｒｉｓ）又はコマガタエラ・ファフィイ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐｈａｆｆｉｉ））、サッカロマイセス属（例えばサッカロマイセス・セレビシエ、サッカロマイセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロマイセス・ウバルム（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｕｖａｒｕｍ））、クリベロマイセス属（例えばクリベロマイセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、クリベロマイセス・マルキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ））、カンジダ属（例えばカンジダ・ウチリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）、カンジダ・カカオイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｃａｃａｏｉ）、カンジダ・ボイディニイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ））、ゲオトリクム属（例えば（ゲオトリクム・ファーメンタンスＧｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ））、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ヤロウイア・リポリチカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）又はシゾサッカロマイセス・ポンペ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ））が挙げられる。ピキア・パストリスの種が好ましい。ピキア・パストリスの株の例は、Ｘ３３、ＧＳ１１５、ＫＭ７１、ＫＭ７１Ｈ及びＣＢＳ７４３５である。
【００９８】
[00112]一実施形態では、真核細胞は菌類の細胞であり、例えばアスペルギルス（例えばＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・フミガツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、Ａ．オリザエ（Ａ．ｏｒｚｙａｅ）、Ａ．ニドゥラ（Ａ．ｎｉｄｕｌａ））、アクレモニウム（例えばＡ．サーモフィラム（Ａ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ））、カエトモニウム（例えばＣ．サーモフィラム（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ））、クリソスポリウム（例えばＣ．サーモフィラム（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ））、コルジセプス（例えばＣ．ミリタリス（Ｃ．ｍｉｌｉｔａｒｉｓ））、コリナスクス（Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ）、クテノマイセス（Ｃｔｅｎｏｍｙｃｅｓ）、フザリウム（例えばＦ．オキシスポルム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ））、グロメレラ（例えばＧ．グラミニコラ（Ｇ．ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ））、ヒポクレア（例えばＨ．ジェコリナ（Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ））、マグナポルテ（例えばＭ．オリザエ（Ｍ．ｏｒｚｙａｅ））、ミセリオフトラ（例えばＭ．サーモフィレ（Ｍ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ））、ネクトリア（例えばＮ．ヘマトコッカ（Ｎ．ｈｅａｍａｔｏｃｏｃｃａ））、ニューロスポラ（例えばＮ．クラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ））、ペニシリウム、スポロトリクム（例えばＳ．サーモフィレ（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ））、チエラビア（例えばＴ．テレストリス（Ｔ．ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、Ｔ．ヘテロサリカ（Ｔ．ｈｅｔｅｒｏｔｈａｌｌｉｃａ））、トリコデルマ（例えばＴ．リーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ））又はバーティシリウム（例えばＶ．ダーリア（Ｖ．ｄａｈｌｉａ））が挙げられる。
【００９９】
[00113]一実施形態では、真核細胞は、昆虫細胞（例えばＳｆ９、Ｍｉｍｉｃ（商標）Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ（商標）（ＢＴ１−ＴＮ−５Ｂ１−４）又はＢＴ１−Ｅａ８８細胞）、藻類細胞（例えばアンフォラ（Ａｍｐｈｏｒａ）、珪藻、ドゥナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）、クロレラ、クラミドモナス、シアノフィタ（Ｃｙａｎｏｐｈｙｔａ）（シアノバクテリア）、ナノクロロピス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）、スピルリナ又はオクロモナス（Ｏｃｈｒｏｍｏｎａｓ））、又は植物細胞（例えば単子葉植物（例えばトウモロコシ、米、小麦又はエノコログサ）由来の細胞、又は双子葉植物（例えばカッサバ、ジャガイモ、大豆、トマト、タバコ、アルファルファ、ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）又はアラビドプシス）由来の細胞である。
【０１００】
[00114]一実施形態では、細胞は細菌又は原核細胞である。いくつかの実施形態では、原核細胞はグラム陽性細胞（例えばバシラス、ストレプトマイセス、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス又はラクトバシラス）である。使用できるバシラスは、例えばＢ．サブティルス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．アミノリクエファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．ナットー（Ｂ．ｎａｔｔｏ）又はＢ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）である。実施形態では、細胞はＢ．サブティルス（例えばＢ．サブティルス３ＮＡ及びＢ．サブティルス１６８）である。例えば、バシラスは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ５５６，  ４８４  Ｗｅｓｔ  １２ｔｈ  Ａｖｅｎｕｅ，  Ｃｏｌｕｍｂｕｓ  ＯＨ  ４３２１０−１２１４）から入手できる。
【０１０１】
[00115]一実施形態では、原核細胞はグラム陰性細胞、例えばサルモネラ菌ｓｐｐ．又は大腸菌（例えばＴＧ１、ＴＧ２、Ｗ３１１０、ＤＨ１、ＤＨＢ４、ＤＨ５ａ、ＨＭＳ  １７４、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、ＮＭ５３３、Ｃ６００、ＨＢ１０１、ＪＭ１０９、ＭＣ４１００、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ及びＯｒｉｇａｍｉ）、並びに、大腸菌Ｂ−株に由来する細胞（例えばＢＬ−２１又はＢＬ２１（ＤＥ３））であり、それらの全ては市販されている。適切な宿主細胞は、例えば、ＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ａｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ，  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）又はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）などの微生物収集機関から市販されている。いくつかの実施形態では、細胞には、治療薬として利用される他の微生物叢が包含される。これらは、ファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）、プロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、ベラムミクロビア（Ｖｅｒｒｕｍｉｃｒｏｂｉａ）、アクチノバクテリア、フゾバクテリア及びシアノバクテリアに属するヒトマイクロバイオームに存在する微生物叢を包含する。微生物叢には、好気性、絶対嫌気性又は通性嫌気性のいずれも包含され、また細胞又は胞子が包含される。治療的な微生物叢には、遺伝的に操作された生物及びそれらの操作において利用されるベクターも包含される。他のマイクロバイオーム関連の治療的な生物としては、アルケー、菌類及びウイルスが挙げられる。例えば、Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４８６，  ２０７−２１４  （１４  Ｊｕｎｅ  ２０１２）、Ｗｅｉｎｓｔｏｃｋ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ４８９（７４１５）：  ２５０−２５６（２０１２）、Ｌｌｏｙｄ−Ｐｒｉｃｅ，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ８：５１（２０１６）を参照。
【０１０２】
[00116]いくつかの実施形態では、培養細胞を用いて、治療的使用のためのタンパク質、例えば抗体（例えばモノクローナル抗体）及び／又は組換えタンパク質を生産させる。実施形態では、培養細胞は、ペプチド、アミノ酸、脂肪酸又は他の有用な生化学的中間体又は代謝産物を生産する。例えば、実施形態では、約４０００ダルトンから、約１４０，０００ダルトン超の分子量を有する分子を生産させることができる。実施形態では、これらの分子は、一定の範囲の複雑さを有する場合があり、グリコシル化などの翻訳後修飾を含む場合がある。
【０１０３】
[00117]実施形態では、タンパク質は、例えば、ボトックス、ミオブロック、ニューロブロック、ディスポート（又はボツリヌス神経毒の他の血清型）、アルグルコシダーゼα、ダプトマイシン、ＹＨ−１６、コリオゴナドトロピンα、フィルグラスチム、セトロレキシル、インターロイキン−２、アルデスロイキン、セテロイキン（ｃｔｅｃｅｌｅｕｌｉｎ）、デニロイキンディフィトックス、インターフェロンα−ｎ３（注入）、インターフェロンα−ｎｌ、ＤＬ−８２３４、インターフェロン、サントリー（γ−１ａ）、インターフェロンγ、サイモシンα１、タソネルミン、ＤｉｇｉＦａｂ、ビペラタブ、エチタブ、ＣｒｏＦａｂ、ネシリチド、アバタセプト、アレファセプト、レビフ、エプトテルミンα、テリパラチド（骨粗鬆症）、カルシトニン注射可能剤（骨疾患）、カルシトニン（鼻、骨粗鬆症）、エタナーセプト、ヘモグロビングルタマー  ２５０（ウシ）、ドロトレコギンα、コラゲナーゼ、カルペリチド、組換えヒト上皮成長因子（局所ゲル、創傷癒合）、ＤＷＰ４０１、ダーベポエチンα、エポエチンω、エポエチンβ、エポエチンα、デシルジン、レピルジン、ビバリルジン、ノナコグα、モノナイン、エプタコグα（活性化）、組換え因子ＶＩＩＩ＋ＶＷＦ、リコンビネート、組換え因子ＶＩＩＩ、因子ＶＩＩＩ（組換え）、アルフマート（Ａｌｐｈｎｍａｔｅ）、オクトコグα、因子ＶＩＩＩ、パリフェルミン、インディキナーゼ（Ｉｎｄｉｋｉｎａｓｅ）、テネクテプラーゼ、アルテプラーゼ、パミテプラーゼ、レテプラーゼ、ナテプラーゼ、モンテプラーゼ、卵胞刺激ホルモンα、ｒＦＳＨ、ｈｐＦＳＨ、ミカファンギン、ペグフィルグラスチム、レノグラスチム、ナルトグラスチム、セルモレリン、グルカゴン、エキセナチド、プラムリンチド、イニグルセラーゼ、ガルスルファーゼ、ロイコトロピン（Ｌｅｕｃｏｔｒｏｐｉｎ）、モルグラモスチム、トリプトレリン酢酸塩、ヒステレリン（皮下インプラント、ハイドロン）、デスロレリン、ヒステレリン、ナファレリン、ロイプロリド持続的放出デポー（ＡＴＲＩＧＥＬ）、ロイプロリドインプラント（ＤＵＲＯＳ）、ゴセレリン、ユートロピン（Ｅｕｔｒｏｐｉｎ）、ＫＰ−１０２プログラム、ソマトロピン、メカセルミン（成長不全）、エンフビルチド（ｅｎｌｆａｖｉｒｔｉｄｅ）、Ｏｒｇ−３３４０８、インスリングラルギン、インスリングルリジン、インスリン（吸入）、インスリンリスプロ、インスリンデテミル（ｄｅｔｅｒｎｉｒ）、インスリン（頬、ＲａｐｉｄＭｉｓｔ）、メカセルミンリンファバート、アナキンラ、セルモロイキン、９９ｍＴｃ−アプシチド注入、ミエロピド（ｍｙｅｌｏｐｉｄ）、ベタセロン、酢酸ガラティラメル、ゲポン（Ｇｅｐｏｎ）、サルグラモスチム、オプレルベキン、ヒト白血球由来のαインターフェロン、ビリブ（Ｂｉｌｉｖｅ）、インスリン（組換え）、組換えヒトインスリン、インスリンアスパルト、メカセルミン（ｍｅｃａｓｅｎｉｎ）、ロフェロン−Ａ、インターフェロン−α２、アルファフェロン、インターフェロンアルファコン−１、インターフェロンα、アボネックス組換えヒト黄体化ホルモン、ドルナーゼα、トラフェルミン、ジコノチド、タルチレリン、ジボテルミンα、アトシバン、ベ���プレルミン、エプチフィバチド、ゼマイラ、ＣＴＣ−１１１、シャンバック（Ｓｈａｎｖａｃ）−Ｂ、ＨＰＶワクチン（四価）、オクトレオチド、ランレオチド、アンセスチム（ａｎｃｅｓｔｉｒｎ）、アガルシダーゼβ、アガルシダーゼα、ラロニダーゼ、酢酸プレザチド銅（局所ゲル）、ラスブリケース、ラニビズマブ、アクチミューン（Ａｃｔｉｍｍｕｎｅ）、ＰＥＧ−イントロン、トリコミン、組換え型ダニアレルギー減感作注入剤、組換えヒト上皮小体ホルモン（副甲状腺ホルモン）１−８４（ｓｃ、骨粗鬆症）、エポエチンデルタ、トランスジェニック抗トロンビンＩＩＩ、グランジトロピン（Ｇｒａｎｄｉｔｒｏｐｉｎ）、ビトラーゼ（Ｖｉｔｒａｓｅ）、組換えインスリン、インターフェロン−α（経口トローチ剤）、ＧＥＭ−２１Ｓ、バプレオチド、イデュルスルファーゼ、オマパトリラト、組換え血清アルブミン、セルトリズマブペゴル、グルカルピダーゼ、ヒト組換えＣ１エステラーゼインヒビター（血管性浮腫）、ラノテプラーゼ、組換えヒト成長ホルモン、エンフュービルタイド（ニードルフリー注射液、バイオジェクター（Ｂｉｏｊｅｃｔｏｒ）  ２０００）、ＶＧＶ−１、インターフェロン（α）、ルシナクタント、アビプタジル（吸入、肺疾患）、イカチバント、エカランチド、オミガナン、アウログラブ（Ａｕｒｏｇｒａｂ）、ペキシガナンアセテート、ＡＤＩ−ＰＥＧ−２０、ＬＤＩ−２００、デガレリクス、シントレデキンベスドトクス（ｃｉｎｔｒｅｄｅｌｉｎ  ｂｅｓｕｄｏｔｏｘ）、Ｆａｖｌｄ、ＭＤＸ−１３７９、ＩＳＡｔｘ−２４７、リラグルチド、テリパラチド（骨粗鬆症）、ティファコギン（ｔｉｆａｃｏｇｉｎ）、ＡＡ４５００、Ｔ４Ｎ５リポソームローション剤、カツマキソマブ、ＤＷＰ４１３、ＡＲＴ−１２３、クリサリン（Ｃｈｒｙｓａｌｉｎ）、デスモテプラーゼ、アメジプラーゼ、コリフォリトロピンα、ＴＨ−９５０７、テデュグルチド、ダイアミド（Ｄｉａｍｙｄ）、ＤＷＰ−４１２、成長ホルモン（持続的放出注入）、組換えＧ−ＣＳＦ、インスリン（吸入、ＡＩＲ）、インスリン（吸入、テクノスフィア（Ｔｅｃｈｎｏｓｐｈｅｒｅ））、インスリン（吸入、ＡＥＲｘ）、ＲＧＮ−３０３、ＤｉａＰｅｐ２７７、インターフェロンβ（Ｃ型肝炎ウイルス感染（ＨＣＶ））、インターフェロンα−ｎ３（経口）、ベラタセプト、経皮インスリンパッチ、ＡＭＧ−５３１、ＭＢＰ−８２９８、キセレセプト（Ｘｅｒｅｃｅｐｔ）、オペバカン、ＡＩＤＳＶＡＸ、ＧＶ−１００１、リンホスキャン（ＬｙｍｐｈｏＳｃａｎ）、ランピルナーゼ、リポキシサン（Ｌｉｐｏｘｙｓａｎ）、ルスプルチド、ＭＰ５２（β−リン酸三カルシウム担体、骨再生）、黒色腫ワクチン、シプリューセル−Ｔ、ＣＴＰ−３７、インセジア（Ｉｎｓｅｇｉａ）、ビテスペン（ｖｉｔｅｓｐｅｎ）、ヒトトロンビン（冷凍、外科手術出血）、トロンビン、ＴｒａｎｓＭＩＤ、アルフィメプラーゼ、プリカーゼ（Ｐｕｒｉｃａｓｅ）、テルリプレシン（静脈、肝腎症候群）、ＥＵＲ−１００８Ｍ、組換えＦＧＦ−Ｉ（注射可能剤、血管疾患）、ＢＤＭ−Ｅ、ロチガプチド、ＥＴＣ−２１６、Ｐ−１１３、ＭＢＩ−５９４ＡＮ、デュラマイシン（吸入、嚢胞性線維形成）、ＳＣＶ−０７、ＯＰ��−４５、エンドスタチン、アンジオスタチン、ＡＢＴ−５１０、ボウマンビルク阻害剤濃縮物、ＸＭＰ−６２９、９９ｍＴｃ−ハイニック−アネキシンＶ、カハラリド（ｋａｈａｌａｌｉｄｅ）Ｆ、ＣＴＣＥ−９９０８、テベレリックス（ｔｅｖｅｒｅｌｉｘ）（持続放出）、オザレリクス、ロミデプシン（ｒｏｒｎｉｄｅｐｓｉｎ）、ＢＡＹ−５０４７９８、インターロイキン４、ＰＲＸ−３２１、ペプスキャン（Ｐｅｐｓｃａｎ）、イボクタデキン（ｉｂｏｃｔａｄｅｋｉｎ）、ｒｈラクトフェリン、ＴＲＵ−０１５、ＩＬ−２１、ＡＴＮ−１６１、シレンギチド、アルブフェロン（Ａｌｂｕｆｅｒｏｎ）、バイファシックス（Ｂｉｐｈａｓｉｘ）、ＩＲＸ−２、ωインターフェロン、ＰＣＫ−３１４５、ＣＡＰ−２３２、パシレオチド、ｈｕＮ９０１−ＤＭＩ、卵巣癌免疫療法ワクチン、ＳＢ−２４９５５３、オンコバックス（Ｏｎｃｏｖａｘ）−ＣＬ、オンコバックス−Ｐ、ＢＬＰ−２５、ＣｅｒＶａｘ−１６、マルチエピトープペプチド黒色腫ワクチン（ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００、チロシナーゼ）、ネミフィチド、ｒＡＡＴ（吸入）、ｒＡＡＴ（皮膚病学的）、ＣＧＲＰ（吸入、喘息）、ペグスネルセプト、チモシンβ４、プリチデプシン、ＧＴＰ−２００、ラモプラニン、ＧＲＡＳＰＡ、ＯＢＩ−１、ＡＣ−１００、サーモンカルシトニン（経口薬、ｅｌｉｇｅｎ）、カルシトニン（経口薬、骨粗鬆症）、エキサモレリン（ｅｘａｍｏｒｅｌｉｎ）、カプロモレリン、カルデバ（Ｃａｒｄｅｖａ）、ベラフェルミン、１３１Ｉ−ＴＭ−６０１、ＫＫ−２２０、Ｔ−１０、ウラリチド、デペレスタット、ヘマチド、クリサリン（Ｃｈｒｙｓａｌｉｎ）（局所）、ｒＮＡＰｃ２、組換え因子Ｖ１１１（ＰＥＧ化リポソーム）、ｂＦＧＦ、ＰＥＧ化組換えスタフィロキナーゼバリアント、Ｖ−１０１５３、ソノリシス  プロリーゼ、ニューロバックス（ＮｅｕｒｏＶａｘ）、ＣＺＥＮ−００２、膵島細胞新生治療薬、ｒＧＬＰ−１、ＢＩＭ−５１０７７、ＬＹ−５４８８０６、エキセナチド（放出制御、メディソルブ）、ＡＶＥ−００１０、ＧＡ−ＧＣＢ、アボレリン（ａｖｏｒｅｌｉｎ）、ＡＣＭ−９６０４、ｌｉｎａｃｌｏｔｉｄ  ｅａｃｅｔａｔｅ、ＣＥＴｉ−１、ヘモスパン（Ｈｅｍｏｓｐａｎ）、ＶＡＬ（注射可能）、速効性インスリン（注射可能剤、ビアデル（Ｖｉａｄｅｌ））、鼻腔内インスリン、インスリン（吸入）、インスリン（経口、エリゲン（ｅｌｉｇｅｎ））、組換えメチオニルヒトレプチン、ピトラキンラ（皮下注入、湿疹）、ピトラキンラ（吸入用乾燥粉末、喘息）、マルチカイン（Ｍｕｌｔｉｋｉｎｅ）、ＲＧ−１０６８、ＭＭ−０９３、ＮＢＩ−６０２４、ＡＴ−００１、ＰＩ−０８２４、Ｏｒｇ−３９１４１、Ｃｐｎ１０（自己免疫疾患／炎症）、タラクトフェリン（局所）、ｒＥＶ−１３１（眼）、ｒＥＶ−１３１（呼吸器疾患）、経口組換えヒトインスリン（糖尿病）、ＲＰＩ−７８Ｍ、オプレルベキン（経口）、ＣＹＴ−９９００７  ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、ＤＴＹ−００１、バラテグラスト、インターフェロンα−ｎ３（局所）、ＩＲＸ−３、ＲＤＰ−５８、タウフェロン、胆汁酸塩刺激されたリパーゼ、メリスパーゼ、アルカリホスファターゼ、ＥＰ−２１０４Ｒ、メラノタン−ＩＩ��ブリメラノチド、ＡＴＬ−１０４、組換えヒトマイクロプラスミン、ＡＸ−２００、ＳＥＭＡＸ、ＡＣＶ−１、Ｘｅｎ−２１７４、ＣＪＣ−１００８、ダイノルフィンＡ、ＳＩ−６６０３、ＬＡＢ  ＧＨＲＨ、ＡＥＲ−００２、ＢＧＣ−７２８、マラリアワクチン（バイロソーム（ｖｉｒｏｓｏｍｅｓ）、ＰｅｖｉＰＲＯ）、ＡＬＴＵ−１３５、パルボウイルスＢ１９ワクチン、インフルエンザワクチン（組換えノイラミニダーゼ）、マラリア／ＨＢＶワクチン、炭疽菌ワクチン、Ｖａｃｃ−５ｑ、Ｖａｃｃ−４ｘ、ＨＩＶワクチン（経口）、ＨＰＶワクチン、Ｔａｔトキソイド、ＹＳＰＳＬ、ＣＨＳ−１３３４０、ＰＴＨ（１−３４）リポソームクリーム（ノバソーム（Ｎｏｖａｓｏｍｅ））、オスタボリン（Ｏｓｔａｂｏｌｉｎ）−Ｃ、ＰＴＨ類似体（局所、乾癬）、ＭＢＲＩ−９３．０２、ＭＴＢ７２Ｆワクチン（結核）、ＭＶＡ−Ａｇ８５Ａワクチン（結核）、ＦＡＲＡ０４、ＢＡ−２１０、組換え疫病ＦＩＶワクチン、ＡＧ−７０２、ＯｘＳＯＤｒｏｌ、ｒＢｅｔＶ１、Ｄｅｒ−ｐ１／Ｄｅｒ−ｐ２／Ｄｅｒ−ｐ７アレルゲンターゲッティングワクチン（ダニアレルギー）、ＰＲ１ペプチド抗原（白血病）、変異型ｒａｓワクチン、ＨＰＶ−１６  Ｅ７リポペプチドワクチン、ラビリンチン（ｌａｂｙｒｉｎｔｈｉｎ）ワクチン（腺癌）、ＣＭＬワクチン、ＷＴ１−ペプチドワクチン（癌）、ＩＤＤ−５、ＣＤＸ−１１０、ペントリス（Ｐｅｎｔｒｙｓ）、ノレリン（Ｎｏｒｅｌｉｎ）、ＣｙｔｏＦａｂ、Ｐ−９８０８、ＶＴ−１１１、イクロカプチド、テルベルミン（皮膚病、糖尿病性足潰瘍）、ルピントリビル、レチクロース（ｒｅｔｉｃｕｌｏｓｅ）、ｒＧＲＦ、ＨＡ、αガラクトシダーゼＡ、ＡＣＥ−０１１、ＡＬＴＵ−１４０、ＣＧＸ−１１６０、アンジオテンシン治療ワクチン、Ｄ−４Ｆ、ＥＴＣ−６４２、ＡＰＰ−０１８、ｒｈＭＢＬ、ＳＣＶ−０７（経口薬、結核）、ＤＲＦ−７２９５、ＡＢＴ−８２８、ＥｒｂＢ２特異的免疫毒素（抗癌）、ＤＴ３ＳＳＩＬ−３、ＴＳＴ−１００８８、ＰＲＯ−１７６２、コムボトックス（Ｃｏｍｂｏｔｏｘ）、コレシストキニン−Ｂ／ガストリン受容体結合ペプチド、１１１Ｉｎ−ｈＥＧＦ、ＡＥ−３７、トラスニズマブ−ＤＭ１、アンタゴニストＧ、ＩＬ−１２（組換え）、ＰＭ−０２７３４、ＩＭＰ−３２１、ｒｈＩＧＦ−ＢＰ３、ＢＬＸ−８８３、ＣＵＶ−１６４７（局所
）、Ｌ−１９ベースの放射性免疫治療剤（癌）、Ｒｅ−１８８  Ｐ−２０４５、ＡＭＧ−３８６、ＤＣ／１５４０／ＫＬＨワクチン（癌）、ＶＸ−００１、ＡＶＥ−９６３３、ＡＣ−９３０１、ＮＹ−ＥＳＯ−１ワクチン（ペプチド）、ＮＡ１７．Ａ２ペプチド、黒色腫ワクチン（治療的なパルス化抗原）、前立腺癌ワクチン、ＣＢＰ−５０１、組換えヒトラクトフェリン（ドライアイ）、ＦＸ−０６、ＡＰ−２１４、ＷＡＰ−８２９４Ａ（注射可能）、ＡＣＰ−ＨＩＰ、ＳＵＮ−１１０３１、ペプチドＹＹ［３−３６］（肥満、鼻腔）、ＦＧＬＬ、アタシセプト（ａｔａｃｉｃｅｐｔ）、ＢＲ３−Ｆｃ、ＢＮ−００３、ＢＡ−０５８、ヒト上皮小体ホルモン１−３４（鼻、骨粗鬆症）、Ｆ−１８−ＣＣＲ１、ＡＴ−１１００（セリアック病／糖尿病）、ＪＰＤ−００３、ＰＴＨ（７−３４）リポソームクリーム（ノバソーム）、デュラマイシン（眼、ドライアイ）、ＣＡＢ−２、ＣＴＣＥ−０２１４、グリコＰＥＧ化エリスロポイエチン、ＥＰＯ−Ｆｃ、ＣＮＴＯ−５２８、ＡＭＧ−１１４、ＪＲ−０１３、因子ＸＩＩＩ、アミノカンジン（ａｍｉｎｏｃａｎｄｉｎ）、ＰＮ−９５１、７１６１５５、ＳＵＮ−Ｅ７００１、ＴＨ−０３１８、ＢＡＹ−７３−７９７７、テベレリックス（即時放出）、ＥＰ−５１２１６、ｈＧＨ（放出制御、バイオスフィア）、ＯＧＰ−Ｉ、シフビルチド（ｓｉｆｕｖｉｒｔｉｄｅ）、ＴＶ４７１０、ＡＬＧ−８８９、Ｏｒｇ−４１２５９、ｒｈＣＣ１０、Ｆ−９９１、チモペンチン（肺疾患）、ｒ（ｍ）ＣＲＰ、肝選択インスリン、スバリン（ｓｕｂａｌｉｎ）、Ｌ１９−ＩＬ−２融合タンパク質、エラフィン、ＮＭＫ−１５０、ＡＬＴＵ−１３９、ＥＮ−１２２００４、ｒｈＴＰＯ、トロンボポエチン受容体アゴニスト（血小板減少障害）、ＡＬ−１０８、ＡＬ−２０８、神経成長因子アンタゴニスト（痛み）、ＳＬＶ−３１７、ＣＧＸ−１００７、ＩＮＮＯ−１０５、経口テリパラチド（エリゲン）、ＧＥＭ−ＯＳ１、ＡＣ−１６２３５２、ＰＲＸ−３０２、ＬＦｎ−ｐ２４融合ワクチン（テラポア（Ｔｈｅｒａｐｏｒｅ））、ＥＰ−１０４３、小児Ｓ肺炎ワクチン、マラリアワクチン、髄膜炎菌グループＢワクチン、新生児のグループＢ溶連菌ワクチン、炭疽菌ワクチン、ＨＣＶワクチン（ｇｐＥ１＋ｇｐＥ２＋ＭＦ−５９）、中耳炎治療、ＨＣＶワクチン（コア抗原＋イスコマトリックス（ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ））、ｈＰＴＨ（１−３４）（経皮、ＶｉａＤｅｒｍ）、７６８９７４、ＳＹＮ−１０１、ＰＧＮ−００５２、アビスクミン、ＢＩＭ−２３１９０、結核ワクチン、マルチエピトープチロシナーゼペプチド、癌ワクチン、エンカスチム（ｅｎｋａｓｔｉｍ）、ＡＰＣ−８０２４、ＧＩ−５００５、ＡＣＣ−００１、ＴＴＳ−ＣＤ３、血管標的化ＴＮＦ（固形腫瘍）（デスモプレシン）（頬、徐放性）、オネルセプト及びＴＰ−９２０１が挙げられる。
【０１０４】
[00118]いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、アダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ）、インフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（商標））、リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（商標）／ＭＡＢＴＨＥＲＡ（商標））エタナーセプト（ＥＮＢＲＥＬ（商標））、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（商標））、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（商標））、ペグリルグラスチム（ｐｅｇｒｉｌｇｒａｓｔｉｍ）（ＮＥＵＬＡＳＴＡ（商標））又は、バイオシミラー及びバイオベターを含む他のあらゆる適切なポリペプチドである。
【０１０５】
[00119]他の適切なポリペプチドは、下記の表６、及び米国特許出願公開第２０１６／００９７０７４号の表１に記載のものである。当業者であれば、本発明の開示がさらに、本願明細書において記載されている製品及び／又はコンジュゲートの組合せ（すなわち、マルチプロテイン、修飾タンパク質（ＰＥＧ、毒素、他の活性成分へのコンジュゲート）を包含することを認識できるであろう。
【０１０６】
【表６】
2020511954.tif 000008
2020511954.tif 000009
2020511954.tif 000010
2020511954.tif 000011
[00120]実施形態では、ポリペプチドは、表７に示すホルモン、血液凝固／凝固因子、サイトカイン／成長因子、抗体分子、融合タンパク質、タンパク質ワクチン又はペプチドである。
【０１０７】
【表７】
2020511954.tif 000012
2020511954.tif 000013
[00121]実施形態では、タンパク質は多重特異的なタンパク質（例えば表８で示す二重特異性抗体）である。
【０１０８】
【表８】
2020511954.tif 000014
2020511954.tif 000015
2020511954.tif 000016
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2020511954.tif 000018
【実施例】
【０１０９】
実施例１：高い発現及び安定性をもたらす座位の同定
[00122]以下の基準を満たす、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）（ランダム組込みを用いて構築）を生産する４００個のＧＳ−ＣＨＯＫ１ＳＶ（商標）クローン細胞株（Ｌｏｎｚａ社、バーゼル、スイス）をスクリーニングした：高いｑｍＡｂ量（＞１．２５ｐｇ／細胞・時間）、安定生産性（＞７０世代）及び適切な増殖（ＩＶＣＣ＞１５００×１０６細胞／ｍＬ・時間、μ〜０．０３時間−１）。大部分のこれらの細胞株は、２つの公表されたＬｏｎｚａプロジェクトに由来するものであり（Ｐｏｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ２６：１４５５−１４６４（２０１０）及びＰｏｖｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １８４：８４−９３（２０１４））、ＧＳ−ＣＨＯＫ１ＳＶ（商標）クローン細胞株の構築プロセスはＰｏｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０に詳述されている。簡潔には、ｍＡｂをコードするＰｖｕＩ直鎖化Ｌｏｎｚａグルタミン合成酵素（ＧＳ）発現ベクターを、標準的なエレクトロポレーション方法を使用して宿主細胞株（ＣＨＯＫ１ＳＶ（商標））に導入した。トランスフェクション混合物を８０枚の９６ウェルプレート全体に分配した。次の日、新鮮な培地をプレート内の細胞懸濁液に添加し、各ウェル中の最終的なＭＳＸ濃度が５０μＭとなるように、培地中のメチオニンスルホキシイミン（ＭＳＸ）濃度を調整した。コロニーのバイオマスが増加したとき、細胞株を２４ウェルの静置培養プレートで培養し、次に２５ｃｍ２のＴ型培養フラスコにおいて静置培養した。懸濁培養は、コンフルエントとなった２５ｃｍ２のＴ型培養フラスコから開始し、１０Ｌのフェドバッチバイオリアクター培養で増殖させ、凍結保存した。
【０１１０】
[00123]これらの２０の細胞株のうち最も低い世代数のアンプルを、ｑＰＣＲ（βラクタマーゼ遺伝子のプライマー／プローブセット）を用いた組み込まれたベクターコピー数の分析のため、指数増殖期の中期となるまで培養した。コピー数基準（ゲノム当たりβラクタマーゼのコピー数≦５）を満たすとして同定された５つの細胞株（９６４Ｅ７、９５２Ｃ８、２Ａ６、Ｅ２２及びＥ１４）をサンプリングし、隣接配列の同定を行った。
【０１１１】
[00124]上述した５つの細胞株に由来する細胞を用いてゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）抽出物を調製し、配列捕捉分析を行った。ｍＡｂ遺伝子を担持するグルタミン合成酵素（ＧＳ）発現ベクター内の領域に対して設計したバイトを用い、組換え細胞株に由来する断片化ｇＤＮＡに対し、ＮｉｍｂｌｅＧｅｎ  ＳｅｑＣａｐターゲットエンリッチメント（Ｒｏｃｈｅ  ＮｉｍｂｌｅＧｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＵＳＡ）を実施した。標的を富化したプールを溶出させ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭＩＳＥＱ（登録商標）（Ｎｅｘｔ  Ｇｅｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてシークエンシングを行った。同じ５つの細胞株に対して全ゲノム再シークエンシング（ＷＧＲＳ）分析を行い（ＢＧＩ，Ｔａｉ  Ｐｏ，Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ）、２つの選択された細胞株（９６４Ｅ７及び９５２Ｃ８）に対し、標的特異的座位増幅（ＴＬＡ）（Ｃｅｒｇｅｎｔｉｓ  Ｂ．Ｖ．，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて分析を行って、標的特異的シークエンシング及びＷＧＲＳの結果を評価した。
【０１１２】
[00125]シークエンシングのリードのバイオインフォマティックス解析を実施した。捕捉シークエンシングのデータをゲノム及びベクター配列にマッピングした。スプリットリード（ゲノムから半分、ベクターから半分）を用い、潜在的組込み部位及びブレークポイントを同定した。加えて、ベクター挿入を示唆するリードペア（ゲノム上の一端、ベクター上の一端）も、組込み部位を裏付ける証拠として同定した。潜在的組込み部位のリストを、配列捕捉データから同定し、その部位を裏付け証拠によりランク付けした。ＷＧＲＳデータを全ての潜在的組込み部位にマッピングし、さらなる裏付け証拠とした。ブレークポイントを横切ってマッピングされるＷＧＲＳからのリード、並びにブレークポイントをカバーするリードペアを、正のサポートとしてカウントした。組込み部位ごとに、左（Ｌ）及び右（Ｒ）の記号を用い、ゲノム配列の位置を示した（チャイニーズハムスター（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）足場及びコンティグ配列により、常に５’→３’）。左側又は右側において、ベクターを順方向（Ｆ）又は逆方向（Ｒ）に挿入した。細胞株９６４Ｅ７及び９５２Ｃ８に関するデータは、後でＣｅｒｇｅｎｔｉｓ社（ユトレヒト、ＮＬ）における近傍ライゲーションを用いた標的特異的シークエンシングにより得た（例えばｄｅ  Ｖｒｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３２：１０１９−２５（２０１４）を参照）。  
[00126]組込み部位は、全５つの細胞株における予測されるゲノム：ベクター境界を横切るＰＣＲ増幅により確認した。表９は、これらの組換え細胞株のβラクタマーゼ遺伝子のコピー数、生産性及び増殖データと共に、これらの組込み部位に関する知見を要約する。合計６つの部位（新規な座位１〜６（ＮＬ１〜６））を、５つの細胞株のＰＣＲによって確認し、そのうち３つ（ＮＬ１、ＮＬ２及びＮＬ４）ではＰＣＲによって両方のゲノム：ベクター境界にあることが確認され、また残りの３つ（ＮＬ３、ＮＬ５及びＮＬ６）では片方のみにあることが確認された。
【０１１３】
【表９】
2020511954.tif 000019
[00127]ＮＬ１座位及びＮＬ２座位を、ＳＳＩランディングパッドによる組込みに用いたところ、誘導体細胞株９６４Ｅ７及び９５２Ｃ８が、その他の３つの細胞株と同等のβ−ラクタマーゼ組込みコピー数を有していたが、高い比生産性（４７〜４８ｐｇ／細胞・日）であったため、これらの領域が高い組換え遺伝子発現をサポートすることを示唆する。ＣＨＯＫ１ＳＶ（商標）誘導体宿主において生成した組換え細胞株からの座位の選択、及びＧＳ選択マーカー（ＲＭＣＥステップの説明についてステージ２を参照）の使用により、座位とＧＳ発現系ベースの系との互換性を確保した。これらの座位は、増殖にとり重要なプロセスに悪影響を与えることなく、安定な組換え遺伝子の発現（ｑＰ：２３〜４８ｐｇ／細胞．日）を支持することが示された（ＩＶＣＣ：２０３９〜６０１５×１０６細胞／時・ｍＬ）。
【０１１４】
実施例２：選択された座位の組合せへのランディングパッドのエンジニアリング
[00128]次のＲＭＣＥに適するランディングパッドを、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）宿主細胞株に組み込んだ。
【０１１５】
[00129]ランディングパッド（ランディングパッドＡ：図２）を最初に、Ｆｅｒ１Ｌ４（国際公開第２０１３１９００３２Ａ１号パンフレット及び欧州特許出願公開第２７１１４２８Ａ１号明細書参照）（図４：クローン７８７８及び８０８６、図７：クローン１１４３４）、ＮＬ１（図４：クローン８０９６及び９１１３）及びＮＬ２（クローン９１１６及び９１１５）座位に別々に組み込んだ。クローン１１４３４（Ｆｅｒ１Ｌ４座位のランディングパッド、ランディングパッドＡ：図２Ａ）を選択し、ＮＬ１における第２のランディングパッドのエンジニアリングに供した（ランディングパッドＢ：図２Ａ）。本決定は、ＧＳ選択を用いるときにＲＭＣＥを完了させる能力、反復継代培養の間のプールにおけるＲＦＰの発現安定性、及び回収時にフェドバッチ培養培地に分泌されるｍＡｂの濃度に基づき行った。Ａ又はＢタイプのランディングパッドが表１のいずれの座位にも挿入されうるという一般的な可能性が見事に示された。合計６つの多重部位ＳＳＩクローンが生成された（１２１５１、１２１５２、１２６０６、１２６０７、１２６０８及び１２６０９）。これらの２部位宿主は、Ｆｅｒ１Ｌ４に、Ｆｒｔ  Ｆ５及び野生型Ｆｒｔ  Ｆ  ＲＴＳが隣接するＨｐｔ−ｅＧＦＰ融合を含むランディングパッドを、並びに、部位２に、Ｆｒｔ  Ｆ１４及びＦｒｔ  Ｆ１５  ＲＴＳが隣接するＰＡＣ−ＤｓＲｅｄ融合遺伝子を含む第２のランディングパッド（ＮＬ１座位のランディングパッド、ランディングパッドＢ：図２）を、有する。ＳＶ４０Ｅプロモーターと選択マーカーとの間のＦｒｔ部位の配置により、次のＲＭＣＥのラウンドにおけるその使用が可能となる。
【０１１６】
[00130]ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）単一及び多重ランディングパッド宿主におけるＲＭＣＥのために設計されたターゲッティングベクターは、目的のランディングパッドと互換性を有するＦｒｔ部位の３’側のすぐ横に配置されるＧＳのｃＤＮＡを含んだ（図２Ｂ）。ベクターの残りの部分は、ランディングパッドの第２のＦｒｔ部位と互換性を有するＦｒｔ部位が続くＧＯＩ（例えばｍＡｂ）のための転写単位を含んだ。ターゲッティングベクターＤＮＡ（図３Ａ）を、ＦｌｐＥリコンビナーゼを発現するベクター（図３Ｂ）と共に、（それぞれ１：９のプラスミドのモル比で）コトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を６ｍＭのグルタミンの存在下で２４時間インキュベートし、ＦｌｐＥリコンビナーゼの一過性発現を行わせた。このトランスフェクタントのプールを次に洗浄し、グルタミン欠損培地においてインキュベートした。生細胞濃度及び培養生存率を、選択ステップ全体にわたりモニターした。ＲＭＣＥの成功は、Ｈｐｔ−ｅＧＦＰ遺伝子の喪失及びターゲッティングベクター中のＧＳ遺伝子との置換により示された。ＦｌｐＥの無いコントロールを全てのトランスフェクションに含め（ｐＭＦ４無しでターゲッティングベクターＤＮＡでトランスフェクション）、いかなるリカバリーも一過性のＦｌｐＥリコンビナーゼ発現（ＲＭＣＥ）の結果であることを確認した。ＲＭＣＥが成功したとき、細胞は、蛍光顕微鏡下又はフローサイトメトリー分析において暗く見えた。ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）宿主が機能的内因性ＧＳ遺伝子を欠失するため、ＧＳが的確に組み込まれたそれらの細胞は、グルタミン非存在下でも増殖可能であり、トランスフェクション後１２〜１４日の培養生存率も９５％を超えるものであった。ターゲッティングベクターのＧＳ  ｃＤＮＡがプロモーターを欠いていたため、ＧＳ遺伝子のオフターゲット組込みが、充分なＧＳタンパク質量を生じさせグルタミン非存在下での増殖を可能にする確率は極めて低いと考えられた。内因性酵素活性の抑制による選択は、オフターゲット効果（例えばＭＳＸ、Ｆｅａｒｙら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．（２０１６）を参照）といえ、したがって、グルタミンなどの代謝物質の非存在下での選択は有効であった。この選択システムは、極めてストリンジェントであり、トランスフェクションの１４日後における非交換細胞（ＧＦＰ蛍光の有無が標識）のパーセンテージは典型的には２〜５％程度であり、蛍光を利用する細胞選別により容易に除去された。２つの部位が１つのベクターにより標的とされる場合、複数のＦｒｔ部位をコンカテマーとして配置でき、それによりトランスフェクションを単純化できる。
【０１１７】
実施例３：ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）ＳＳＩ宿主におけるＦｅｒ１Ｌ４、ＮＬ１及びＮＬ２座位の別々の評価
[00131]次に、Ｆｅｒ１Ｌ４、ＮＬ１及びＮＬ２座位の、組換え遺伝子発現を支持しＲＭＣＥを完了させる能力を試験した。ターゲッティングベクターｐＭＦ２５（図３Ａ）及びリコンビナーゼベクターｐＭＦ４（図３Ｂ）を、６つのＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）（図４：Ｆｅｒ１Ｌ４座位：７８７８及び８０８６（ＮＬ１）：８０９６及び９１１３（ＮＬ２）：９１１６及び９１１５）単一ランディングパッドＳＳＩ宿主にコトランスフェクトし、グルタミンフリーの培地においてインキュベートし、ＲＭＣＥを完了させた細胞を選択した。これらのＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）ＳＳＩプールは、ＲＭＣＥ前、及びグルタミンフリー培地において１１日後に、フローサイトメトリーにより解析した（図４）。クローン中のランディングパッド（ランディングパッドＡ、図２）はＨｐｔ−ｅＧＦＰレポーター（緑のチャネルにおいて検出）を含み、ｐＭＦ２５ターゲッティングベクターはＤｓＲｅｄレポーター（黄色のチャネルにおいて検出）を含むため、ＲＭＣＥの成功により、＋ＧＦＰ及び−ＹＦＰから−ＧＦＰ及びＹＦＰへの蛍光変化が示される。
【０１１８】
[00132]次に、ＳＳＩ宿主クローン１１４３４（Ｆｅｒ１Ｌ４座位のランディングパッド、ランディングパッドＡ：図２）を用い、治療的ｍＡｂを生産する能力について試験した。クローン１１４３４のＦｅｒ１Ｌ４座位を標的とする、リツキシマブ、ｃＢ７２．３及びＨ３１Ｋ５の転写単位を含むベクターを構築した（図５を参照）。次に、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）プールを構築し、８日間バッチ懸濁培養した。回収時の分泌されたｍＡｂの濃度は、収穫時におけるプロテインＡ  ＨＰＬＣにより測定した（図６を参照）。これらのデータは、複製されたプール間、異なるｍＡｂの間において、非常に一貫した発現を示す（２５０〜３００ｍｇ／Ｌ）。
【０１１９】
実施例４：多部位ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）ＳＳＩ宿主におけるＦｅｒ１Ｌ４及びＮＬ１の評価
[00133]実施例２に記載される６つの多部位宿主をフローサイトメトリーにより解析し、組換え遺伝子発現を支持する座位の能力を確認した（図７）。Ｆｅｒ１Ｌ４座位で組み込んだランディングパッドはＨｐｔ−ｅＧＦＰ遺伝子を含み（図２：ランディングパッドＡ）、ＮＬ１座位で組み込んだランディングパッドはＰＡＣ−ＤｓＲｅｄ遺伝子を含む（図２：ランディングパッドＢ）。ｅＧＦＰ蛍光を緑のチャネルにおいて検出し、ＤｓＲｅｄを黄色のチャネルにおいて検出した。ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）宿主（宿主）を陰性コントロールとして用いた。クローン１１４３４（Ｆｅｒ１Ｌ４座位にランディングパッド、ランディングパッドＡ：図２）をｅＧＦＰ蛍光の陽性コントロールとして用いた。ランダム組込みにより生成したＤｓＲｅｄ遺伝子を発現するＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）プール（ＤｓＲｅｄ  ＲＩコントロール）を、Ｄｓｒｅｄ蛍光の陽性コントロールとして用いた。予想通り、全６つの多部位ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）ＳＳＩクローン（１２１５１、１２１５２、１２６０６、１２６０７、１２６０８及び１２６０９）は、１１４３４及びＤｓＲｅｄ  ＲＩコントロールと同等のｅＧＦＰ及びＤｓＲｅｄ蛍光強度であった（図７）。これは、両方の部位が外因性遺伝子の発現を支持できることを証明するものであった。次に、ＲＭＣＥを完了する多部位宿主の能力を確認した。ターゲッティングベクターｐＣＭ９（図８Ａ、Ｅ２クリムゾン発現カセットを含み、ランディングパッドＡ：Ｆｅｒ１Ｌ４を標的とする）及びｐＣＭ１１（図８Ｂ、Ｅ２クリムゾン発現カセットを含み、ランディングパッドＡ：ＮＬ１を標的とする）を、多部位ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）ＳＳＩ宿主１２１５１にトランスフェクトした。グルタミンフリー培地においてプールをインキュベートし、ＲＭＣＥを完了した細胞を選択した。ＦｌｐＥの無いコントロールは、ＲＭＣＥプールによってリカバーしなかった。これらのＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）ＳＳＩプールを、ＲＭＣＥ前及びグルタミンフリー培地において１４日後に、フローサイトメトリーにより解析した（図８）。ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）ＳＳＩ宿主のランディングパッドＡ（ランディングパッドＡ、図２）がＨｐｔ−ｅＧＦＰレポーターを含み、ｐＣＭ９ターゲッティングベクターがＥ２クリムゾンレポーター（赤いチャネルにおいて検出）を含むため、＋ＧＦＰ及び−ＲＦＰから−ＧＦＰ及び＋ＲＦＰへの蛍光変化により、ＲＭＣＥの成功が示された。ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）ＳＳＩ宿主のランディングパッドＢ（ランディングパッドＢ、図２）はＰＡＣ−ＤｓＲｅｄレポーターを含むが、しかしながら、フローサイトメーターではＤｓＲｅｄシグナルは検出されなかった（図９）。ｐＣＭ１１ターゲッティングベクターはＥ２クリムゾンレポーターを含み、したがって、＋ＧＦＰ及び−ＲＦＰから＋ＧＦＰ及び＋ＲＦＰへの変化（図９）により、ランディングパッドＡ（Ｈｐｔ−ｅＧＦＰ遺伝子を含む）の喪失なくＲＭＣＥが成功したことが示された。
【０１２０】
[00134]治療的タンパク質のための系の利点を実現するため、表１０で概説する治療的タンパク質を発現させるために、ＣＨＯＫ１ＳＶ（商標）ＳＳＩ多部位宿主（図２を参照）を試験した。実験を、３つのフェーズに分ける；フェーズ１：多部位ＳＳＩの用途を試験し、ｑＰを増加させる；フェーズ２：多部位ＳＳＩの能力を試験し、２つのランディングパッドにわたる３遺伝子二重特異性ｍＡｂを発現させる；フェーズ３：１つの部位において補助的遺伝子を発現させ、他の部位においてコードされるＤｔＥタンパク質の発現を補助する。
【０１２１】
【表１０】
2020511954.tif 000020
[00135]フェーズ１：いくつかの単一部位ＳＳＩシステムの限界は、必要な転写単位が単一コピーでは臨床製造のための適切な力価を発生させるのに不十分であるということである。したがって、本実施例ではオプションを評価し、多部位ＳＳＩを用いて、ｍＡｂ遺伝子の組込みコピー数を増加させる。モノクローナル抗体リツキシマブを用いて、組込みコピー数の増加のための２つのアプローチを試験した。第１のアプローチにおいて、４つのｍＡｂ発現カセットを含むターゲッティングベクターを生成し（図１０Ｂ：ｐＣＭ３８＝２×ＨＣ及び２つのＬＣ）、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）ＳＳＩ宿主（ランディングパッドＡ、図２Ａ）のランディングパッドＡをターゲッティングした。このベクター及び２つのｍＡｂ発現カセット相当のベクター（図１０Ａ：ｐＭＦ２６）をＧＳ−ＫＯ  ＳＳＩ宿主クローン１２１５１（図１０Ａ及びＢ）に別々にトランスフェクトし（２回）、グルタミンフリー培地においてプールを選択した（詳細なトランスフェクション方法は実施例２を参照）。第２のアプローチにおいて、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ＮＥＯ）に加えて２つのｍＡｂ発現カセットを含み、ランディングパッドＢを標的とする（ランディングパッドＢ、図２Ａ）ターゲッティングベクター（図１０Ｃ及びＤ：ｐＡＲ５＝１×ＨＣ及び１×ＬＣ）を生成した。ｍＡｂ遺伝子を欠失するｐＡＲ５のバージョンもまた作製し、それをｐＣＭ２２（図１０Ｃ）と称した。次に、ｐＭＦ２６によりトランスフェクションされ、グルタミンフリー培地において選択されたＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）ＳＳＩプールを、ｐＡＲ５（図１０Ｄ）又はｐＣＭ２２（図１０Ｃ）によりトランスフェクトし（２回）、ｐＭＦ４（図３Ｂ）の存在下で２４時間インキュベートし、次に４００μｇ／ｍＬジェネテシン（Ｇ４１８）において選択した（詳細なトランスフェクション方法は実施例２を参照）。グルタミンフリー培地の選択と整合して、培養したＦｌｐＥの無いコントロールは、Ｇ４１８の存在下では、ＲＭＣＥプールによりリカバーされなかった。選択からの回収の後、８つのＲＭＣＥプールを継代培養し、次に８日間のバッチ培養に移行させた。Ｖｉｃｅｌｌセルカウンターを用いて４、６及び８日目に生細胞濃度を測定し、回収時の分泌されたｍＡｂの濃度をプロテインＡセンサーを用いたＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｔにより測定した。リツキシマブの細胞特異的な生産率（回収時のｑｍＡｂ）を算出した（図１１を参照）。これらのデータは、両方のシナリオが、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）ＳＳＩ宿主からの細胞特異的なｍＡｂ生産率を増加させる現実的なオプションであることを立証するものであった。
【０１２２】
フェーズ２：大多数の次世代抗体（例えば四価の二重特異性抗体）の場合、複数の重鎖又は軽鎖の会合は繰り返し起こる課題である。極めて少ない不必要な副産物量の最適な生成物の品質を得るため、安定的及び高い再現性で、４つの抗体鎖を発現する適切なＣＨＯクローンの選択が有効である。その結果、クローン選択の間、ＥＬＩＳＡ、ＲＰ−ＨＰＬＣ又はＣＤ−ＳＤＳを利用する多くの生成物の解析がしばしば必要とされる。しかしながら、多部位ＳＳＩ細胞株では、複数鎖タンパク質をコードする遺伝子は個々のプロモーターにより駆動され、少なくとも２つの部位にわたり空間的に切り離される。これにより、個々の鎖のコピー数及び相対的な発現がトランスフェクタントプールと早い時期に整合することが確実となり、コード化される転写単位のプロモーター強度又はコピー数の操作による個々のポリペプチド鎖の取得可能性の効果的な経験的微調整が可能となる。この利点としては、生成物の品質がより均一となり、ＳＳＩ生成プール及び細胞株から生産されるミスフォールディングされた複数鎖組換えタンパク質の比率が減少し、初期段階での評価の必要性が劇的に減少することが挙げられる。したがって、本実施例では、多部位ＳＳＩを用いて、以下の３つの遺伝子によりコードされるセルグツズマブアムナロイキン（ＣＥＡ−ＩＬ２ｖ）の発現の有無を評価した：ＬＣ、ＨＣ及びＨＣ−ＩＬ２（Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６：  ３（２０１７））。本実施例では、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）ＳＳＩ宿主のゲノムへのこれらの３つの遺伝子の挿入のため、２つのアプローチを試験した。本実験（フェーズ２）において、ヒトイントロンＡ（Ａｄｄｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７８（１９９７））との組合せによるマウスサイトメガロウイルス第１の初期遺伝子（ＩＥ１）（ｍＣＭＶ）プロモーター（欧州特許出願公開第１５２５３２０号）を用い、ｈＣＭＶプロモーターの代わりに組換えタンパク質の発現を行わせた。第１のアプローチにおいて、本実施例では、ターゲッティングベクターｐＡＢ２（図１２Ａ）を用いて、ランディングパッドＡにセルグツズマブアムナロイキンのＬＣ、ＨＣ及びＨＣ−ＩＬ２を挿入した。選択は、実施例２にて説明したようにグルタミンの不存在下で行った。第２のアプローチにおいて、ランディングパッドＡをターゲッティングするセルグツズマブアムナロイキンのＬＣ及びＨＣ−ＩＬ２のための発現ユニットを含むｐＡＢ５（図１２Ｂ）により、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）ＳＳＩ宿主をトランスフェクトした（図２）。選択は、実施例２にて説明したようにグルタミンの不存在下で行った。その後、本実施例では、ランディングパッドＢ（ランディングパッドＢ、図２Ａ）を標的とするネオマイシンホスホトランスフェラーゼ選択マーカー遺伝子（ＮＥＯ）に加えて、単一のセルグツズマブアムナロイキンのＨＣ発現カセット（図１２Ｃ：ｐＡＲ２）を含むターゲッティングベクターを生成した。ｍＡｂ遺伝子を欠くｐＡＲ２のバージョンもまた作製し、それをｐＣＭ４６（図１２Ｂ：ｐＣＭ４６）と称した。次に、ｐＡＢ５によりトランスフェクトし、グルタミ��フリー培地において選択したＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）ＳＳＩプールを、ｐＣＭ４６又はｐＡＲ２（詳細なトランスフェクション方法は実施例２を参照）によりトランスフェクトし（２回）、４００μｇ／ｍＬのジェネテシン（Ｇ４１８）を含む培地において選択した。コントロールプールも構築し、その内訳は、ｐＡＲ２の空のバージョンを有する「モック」トランスフェクション、並びにＣＥＡ−ＩＬ２ｖ抗体種を同定するために用いる３つのプール（各々セルグツズマブアムナロイキンをコードする３つの遺伝子のうちの１つを欠く、ＬＣ＋ＨＣ、ＬＣ＋ＨＣ−ＩＬ２及びＨＣ＋ＨＣ−ＩＬ２）とした。選択からの回収後、ＲＭＣＥプールを継代培養し、次に８日間のバッチ培養に移行させた。Ｖｉｃｅｌｌセルカウンターを用い、生細胞濃度を４、６及び８日目に測定した。セルグツズマブアムナロイキンの会合体種を、上清の１０％のビス−トリスＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルにおける非還元的分析（図１３Ａ）、及び次のデンシトメトリー分析（ＩｍａｇｅＪソフトウェア）（図１３Ｂ）により測定した。これらのデータは、セルグツズマブアムナロイキンのＬＣ、ＨＣ及びＨＣ−ＩＬ２遺伝子がランディングパッドＡに挿入されるとき、個々の鎖の発現が低く、また完全に組み立てられた生成物と考えられるものもごくわずかであった。対照的に、セルグツズマブアムナロイキンのＬＣ及びＨＣ−ＩＬ２でランディングパッドＡを標的とし、ＨＣでランディングパッドＢを標的としたとき、個々の鎖の発現は増加し、より完全に組み立てられた生成物が検出される。この結果の再現性（反復したプール）は、多部位ＳＳＩ法を用いたアプローチにより各鎖の相対量を調製し、生成物の品質を向上させる可能性をサポートするものである。二重特異性会合のために必要とされる遺伝子を、２つの部位にわたり切り離す（また第２部位を一杯にしない）ことにより、発現の改善が示された。
【０１２３】
フェーズ３：ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞株の分泌能力の増加を目的とする内因性タンパク質の発現は、生成物の力価を増加させる確立されたアプローチである。国際公開第２０１５／０１８７０３Ａ１号から同定される候補、並びに表１０、１１及び１２のそれらを、多部位ＳＳＩ細胞株において評価した。この概念を試験するため、ランディングパッドＡを標的とするエタナーセプトを発現するベクター（図１４Ａ、Ｂ及びＣ：ｐＴＣ１）を構築した。これを別々にＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）ＳＳＩ宿主（図１４）にトランスフェクトし、プールをグルタミンフリー培地において、選択（２回）した（詳細なトランスフェクション方法は実施例２を参照）。ｐＣＭ３９からｐＣＭ４５は、ヒトサイトメガロウイルスの主要初期（ｈＣＭＶ）プロモーター（その第１イントロンＡを有する）の制御下の補助的遺伝子の発現ユニット、及び標的ランディングパッドＢを含む（図１４）（表１１及び１２）。ｐＣＭ３９−４２において、ステアロイルＣｏＡデサチュラーゼ−１（Ｓｃｄ１）及びステロール制御エレメント結合タンパク質１（ＳＲＥＢＦ１）のバリアントにより、ＮＬ１座位をターゲッティングした。ｐＣＭ４３、４４及び４５において、配列ｇｂ：ＣＱ８７１８２７からのｃ−末端ＰＥＳＴ配列を有する半減期の短いＧＦＰ（又はｄｓＧＦＰ）を構築し、また３’ＵＴＲにＣＰＥＢ２Ａ（ｐＣＭ４３）、ＣＥＰＢ２Ｂ（ｐＣＭ４４）及びＳＲＰα（ｐＣＭ４５）のためのｍｉＲ標的配列を６コピー挿入した。これらのターゲッティングベクターは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ＮＥＯ）を含み、二重のｐＴＣ０１トランスフェクション済みプールに各ベクターで（ｐＭＦ４と共に）トランスフェクトした２４時間後、４００μｇ／ｍＬのＧ４１８を補充した培地を用いて選択を行った。プール回収の成功及び少なくとも１回の継代培養の後、８バッチ培養を行った。Ｖｉｃｅｌｌセルカウンターを用い、生細胞濃度を４、６及び８日目に測定し、回収時の分泌されたｍＡｂの濃度をプロテインＡセンサーを用いたＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｔにより測定した。生細胞濃度（ＩＶＣＣ）、細胞特異的生産率（回収時ｑＰ）及び分泌されたエタナーセプト濃度の全体を示す（図１５を参照）。これらのデータは、マウスＳＣＤ１（ｍＳＣＤ１）の発現及びＣＥＰＢ２Ａ（ｄｓＧＦＰ＿６ｎ  ＣＰＥＢ２Ａ）、ＣＰＥＢ２Ｂ（ｄｓＧＦＰ＿６ｎ  ＣＰＥＢ２Ｂ）及びＳＲＰα（ｄｓＧＦＰ＿６ｎ  ＳＲＰα）ｍｉＲ結合部位を３’ＵＴＲに担持するスポンジベクターによるエタナーセプトの分泌量増加を示すものであった。
【０１２４】
【表１１】
2020511954.tif 000021
【表１２】
2020511954.tif 000022
実施例５：ＣＨＯＫ１ＳＶとＨＥＫ２９３細胞株との間の座位の転移
[00136]ＨＥＫ２９３  ＳＳＩ宿主を生成するため、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  （ＵＣＳＣ）ヒトゲノムデータベースのスタンドアロンコピー（バージョン：２００６年３月（ＮＣＢＩ３６／ｈｇ１８））を使用し、ＣＨＯＫ１ＳＶ由来のベクター組込み部位、及びランディングパッド位置を、ヒトゲノムに対してＢＬＡＴ検索した。ＣＨＯＫ１ＳＶ配列の少なくとも２５塩基対において、９５％（以上）の配列類似性が同定された。類似の領域を、ＩＧＶビューア（Ｂｒｏａｄ  ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．４）で視覚化した。社内のＣｒｉｓｐｒ−Ｃａｓ９デザインツールを使用して、Ｃｒｉｓｐｒ−Ｃａｓ９  ｇＲＮＡをデザインした。ＣＨＯＫ１ＳＶ及びＨＥＫ２９３の座位を表１にまとめる。
【図１】
2020511954.tif 000023
【図２】
2020511954.tif 000024
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2020511954.tif 000030
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2020511954.tif 000033
【図１２】
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【図１３Ａ】
2020511954.tif 000035
【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
2020511954.tif 000038
【配列表】
2020511954000001.app
【国際調査報告】
2020511954.tif 000039
2020511954.tif 000040
2020511954.tif 000041
2020511954.tif 000042
2020511954.tif 000043
2020511954.tif 000044