(57)【要約】  本開示は、ヒトβ−クロトーに結合するモノクローナル抗体及びその抗原結合フラグメント、並びにそれを含む医薬組成物及び処置方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
β−クロトーに結合する単離抗体又はその抗原結合フラグメントであって、
配列番号６、９、１０、又は１２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）；
配列番号７、１１、又は１３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）；
配列番号８又は１４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
配列番号１９、３１、２２、又は２５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）；
配列番号２０又は２３のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）；
及び
配列番号２１又は２４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）
を含む抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、
配列番号６、９、１０又は１２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）；
配列番号７、１１、又は１３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）；
配列番号８又は１４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
配列番号３１、２２、又は２５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）；
配列番号２０又は２３のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）；
及び
配列番号２１又は２４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）
を含む、請求項１に記載の単離抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、
配列番号６、９、１０、又は１２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）；
配列番号７、１１、又は１３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）；
配列番号８又は１４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
配列番号１９、２２、又は２５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）；
配列番号２０又は２３のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）；
及び
配列番号２１又は２４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）
を含む、請求項１に記載の単離抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項４】
前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、
（ｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号７のアミノ鎖配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、配列番号３１のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３；
（ｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号７のアミノ鎖配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、配列番号３１のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３；
（ｉｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ鎖配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、配列番号２２のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号２４のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３；
又は
（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ鎖配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３
を含む、請求項１に記載の単離抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項５】
前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、
（ｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号７のアミノ鎖配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３；
（ｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号７のアミノ鎖配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３；
（ｉｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ鎖配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、配列番号２２のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号２４のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３；
又は
（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ鎖配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３
を含む、請求項１に記載の単離抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項６】
前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、
（ｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号７のアミノ鎖配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、配列番号１９若しくは３１のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３；
（ｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号７のアミノ鎖配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、配列番号１９若しくは３１のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３；
（ｉｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ鎖配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、配列番号２２のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号２４のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３；
又は
（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ鎖配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３
を含む、請求項１に記載の単離抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項７】
前記抗体又はフラグメントは、（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列又はその少なくとも９０％若しくは９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）；及び（ｉｉ）配列番号２６若しくは３２のアミノ酸配列又はその少なくとも９０％若しくは９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項８】
前記抗体又はフラグメントは、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項９】
前記抗体又はフラグメントは、配列番号２６又は３２のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の単離抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１０】
前記抗体又はフラグメントは、（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号２６のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は（ｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号３２のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、請求項８に記載の単離抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１１】
前記抗体は、（ｉ）配列番号１７のアミノ酸を含む重鎖、及び配列番号２８のアミノ酸配列を含む軽鎖、又は（ｉｉ）配列番号１７のアミノ酸を含む重鎖、及び配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の単離抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１２】
β−クロトーに結合する単離抗体又はその抗原結合フラグメントであって、前記抗体又はフラグメントは、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の単離抗体又はフラグメントと同一のエピトープに結合し、前記抗体又は抗原結合フラグメントは、（ｉ）表２に記載された抗体ＮＯＶ００４の組合せＣＤＲ若しくはＫａｂａｔ  ＣＤＲ、並びに／又は（ｉｉ）配列番号４３若しくは５５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号４７若しくは５７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含まない、単離抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項１３】
β−クロトーに結合する単離抗体又はその抗原結合フラグメントであって、前記抗体又はフラグメントは、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の単離抗体又はフラグメントと、β−クロトーへの結合に関して競合し、前記抗体又は抗原結合フラグメントは、（ｉ）表２に記載された抗体ＮＯＶ００４の組合せＣＤＲ若しくはＫａｂａｔ  ＣＤＲ、並びに／又は（ｉｉ）配列番号４３若しくは５５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号４７若しくは５７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含まない、単離抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項１４】
前記抗体又はフラグメントは、（ｉ）表２に記載された抗体ＮＯＶ００４の組合せＣＤＲ若しくはＫａｂａｔ  ＣＤＲ、並びに／又は（ｉｉ）配列番号４３若しくは５５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号４７若しくは５７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含まない、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の単離抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントと、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。
【請求項１６】
代謝障害を処置する方法であって、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合フラグメントを含む医薬組成物の有効な量を、代謝障害を患う対象に投与することを含む方法。
【請求項１７】
前記対象は、肥満、１型糖尿病及び２型糖尿病、膵炎、脂質異常症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、インスリン抵抗性、高インスリン血症、耐糖能障害、高血糖、及びメタボリックシンドロームのうちの１つ又は複数を患う、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記対象は、肥満、糖尿病、高トリグリセリド血症、及び脂質異常症のうちの１つ又は複数を患う、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
心血管障害を処置する方法であって、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の抗体又はフラグメントを含む医薬組成物の有効な量を、心血管障害を患う対象に投与することを含む方法。
【請求項２０】
前記対象は、粥状動脈硬化、末梢動脈疾患、脳卒中、心不全、及び冠動脈心疾患のうちの１つ又は複数を患う、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
医薬としての使用のための、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項２２】
体重を減少させる方法であって、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合フラグメントを含む医薬組成物の有効な量を、必要とする対象に投与することを含む方法。
【請求項２３】
食欲又は食物摂取量を減少させる方法であって、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合フラグメントを含む医薬組成物の有効な量を、必要とする対象に投与することを含む方法。
【請求項２４】
対象の血漿トリグリセリド（ＴＧ）濃度又は血漿総コレステロール（ＴＣ）濃度を低下させる方法であって、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合フラグメントを含む医薬組成物の有効な量を、必要とする対象に投与することを含む方法。
【請求項２５】
前記対象は代謝障害を患う、請求項２２、２３、又は２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記対象は、肥満、１型糖尿病及び２型糖尿病、膵炎、脂質異常症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、インスリン抵抗性、高インスリン血症、耐糖能障害、高血糖、及びメタボリックシンドロームのうちの１つ又は複数を患う、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１〜２６のいずれか一項に記載の抗体のうちの１つ若しくは複数、又は前記抗体のいずれか１つのＶＬ及び／若しくはＶＨをコードする核酸。
【請求項２８】
表１に記載された配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む核酸。
【請求項２９】
表１に記載された配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む核酸。
【請求項３０】
表１に記載された配列を含む核酸。
【請求項３１】
請求項２７、２８、２９、又は３０に記載の核酸を含むベクター。
【請求項３２】
請求項３１に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３３】
代謝障害の処置での使用のための、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合フラグメントを含む医薬組成物。
【請求項３４】
β−クロトーに結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを製造する方法であって、前記抗体又はそのフラグメントの発現に適した条件下で、請求項３２に記載の宿主細胞を培養する工程を含む方法。
【請求項３５】
前記代謝障害は、肥満、糖尿病、高トリグリセリド血症、及び脂質異常症である、請求項３３に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
心血管障害の処置での使用のための、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合フラグメントを含む医薬組成物。
【請求項３７】
体重を減少させる方法での使用のための、食欲又は食物摂取量を減少させる方法での使用のための、対象の血漿トリグリセリド（ＴＧ）濃度又は血漿総コレステロール（ＴＣ）濃度を低下させる方法での使用のための、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合フラグメントを含む医薬組成物。
【請求項３８】
対象の、代謝障害を処置するための医薬の調製での、心血管障害を処置するための医薬の調製での、体重を減少させるための医薬の調製での、食欲又は食物摂取量を減少させるための医薬の調製での、血漿ＴＧ濃度又は血漿ＴＣ濃度を低下させるための医薬の調製での、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１７年２月８日出願の米国仮特許出願第６２／４５６，６０９号の利益を主張し、これは、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含有し、これは、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。前記ＡＳＣＩＩコピー（２０１８年１月１９日作成）は、ＰＡＴ０５７５７８−ＷＯ−ＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、８０，５３１バイトのサイズである。
【０００３】
分野
本開示は、線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）模倣抗体に関する。同様に開示されているのは、ＦＧＦ２１関連障害を処置する方法であり、例えば、肥満、１型糖尿病及び２型糖尿病、膵炎、脂質異常症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、インスリン抵抗性、高インスリン血症、耐糖能障害、高血糖、メタボリックシンドローム、及び他の代謝障害を処置する方法と、重症患者の死亡率及び罹患率を低下させる方法とである。
【背景技術】
【０００４】
線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリは２２種の遺伝的に異なる相同リガンドを特徴とし、これらの相同リガンドは７種のサブファミリに分類される。公開されている文献によれば、このＦＧＦファミリは現在、少なくとも２３種のメンバーＦＧＦ−１〜ＦＧＦ−２３からなる（Ｒｅｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ．３１３：１３９−１５７）。
【０００５】
線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）はマウス胚から単離されており、ＦＧＦ１９及びＦＧＦ２３に最も近い。このＦＧＦサブファミリは、古典的なＦＧＦには珍しく多様な生理学的プロセス（即ち、エネルギー及び胆汁酸の恒常性、グルコース及び脂質の代謝、並びにリン酸塩、並びにビタミンＤの恒常性）を調節する。さらに、古典的なＦＧＦとは異なり、このサブファミリは内分泌的に作用する（Ｍｏｏｒｅ，Ｄ．Ｄ．（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１６，１４３６−８）。ＦＧＦ２１は、肝臓中で優先的に発現されることが報告されており（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１４９２：２０３−２０６；特許公報国際公開第０１／３６６４０号パンフレット；及び特許公報国際公開第０１／１８１７２号パンフレット）、且つ虚血性血管疾患、創傷治癒、及び肺、気管支又は肺胞細胞の機能の喪失と関連する疾患、及び多数の他の障害の処置として説明されている。
【０００６】
ＦＧＦ２１は、強力な代謝調節因子として特定されている。食餌誘発性肥満又は遺伝性肥満及び糖尿病を有する齧歯動物及びアカゲザルへのＦＧＦ２１の全身投与により、強力な血糖降下作用及びトリグリセリド低下作用が発揮され、体重が減少する（Ｃｏｓｋｕｎ，Ｔ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４９：６０１８−６０２７；Ｋｈａｒｉｔｏｎｅｎｋｏｖ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  １１５：１６２７−１６３５；Ｋｈａｒｉｔｏｎｅｎｋｏｖ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４８：７７４−７８１；Ｘｕ，Ｊ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５８：２５０−２５９）。ＦＧＦ２１は、２８個のアミノ酸のリーダー配列を含む２０９個のアミノ酸ポリペプチドである。ヒトＦＧＦ２１は、マウスＦＧＦ２１に対して約７９％のアミノ酸同一性を有し、且つラットＦＧＦ２１に対して約８０％のアミノ酸同一性を有する。
【０００７】
哺乳動物では、ＦＧＦは、複数のスプライスバリアントにおいて順に発現される４種のＦＧＦレセプターＦＧＦＲ１〜４のセットを介してこのＦＧＦの作用を媒介する。各ＦＧＦレセプターは、リガンド結合時に活性化される細胞内チロシンキナーゼドメインを含み、ＭＡＰＫ（Ｅｒｋ１／２）、ＲＡＦ１、ＡＫＴ１及びＳＴＡＴを含む下流のシグナル伝達経路へとつながっている（Ｋｈａｒｉｔｏｎｅｎｋｏｖ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２００８）ＢｉｏＤｒｕｇｓ  ２２：３７−４４）。いくつかの報告は、ＦＧＦＲ１〜３の「ｃ」レポータースプライスバリアントがβ−クロトー（β−ｋｌｏｔｈｏ）に対して特異的親和性を示し、且つＦＧＦ２１の内在性レセプターとして作用する可能性があることを示唆した（Ｋｕｒｏｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００７  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２：２６６８７−２６６９５）；Ｏｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２００７  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０４：７４３２−７４３７；Ｋｈａｒｉｔｏｎｅｎｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，２００８  Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２１５，１−７）。３Ｔ３−Ｌ１細胞及び白色脂肪組織では、ＦＧＦＲ１は圧倒的に最も豊富なレセプターであり、従って、この組織におけるＦＧＦ２１の主な機能的レセプターはβ−クロトー−ＦＧＦＲ１ｃ複合体である可能性が最も高い。
【０００８】
ＦＧＦ２１は、ＦＧＦレセプター、並びに下流のシグナル伝達分子（例えば、ＦＲＳ２ａ、及び細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ））を活性化するが、ＦＧＦＲとＦＧＦ２１との直接的な相互作用は検出されていない。さらに、様々な非脂肪細胞は、たとえ複数のＦＧＦＲアイソフォームを発現してもＦＧＦ２１には応答しない。これらのデータは全て、補因子が、ＦＧＦＲを介したＦＧＦ２１シグナル伝達を媒介しなければならないことを示唆する。研究により、ＦＧＦ２１に対する細胞応答の決定因子として、肝臓、脂肪細胞、及び膵臓で高度に発現されるベータ−クロトー（β−クロトー）が特定されている（Ｋｕｒｏｓｕ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８２，２６６８７−９５）。ＦＧＦＲ単独ではなくβ−クロトー−ＦＧＦＲ複合体が、インビトロでＦＧＦ２１に結合する（Ｋｈａｒｉｔｏｎｅｎｋｏｖ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２１５，１−７）。ＦＧＦ２１は、ＦＧＦＲ１ｃ、２ｃ、又は３ｃとの複合体でβ−クロトーに結合するが、ＦＧＦＲ４との複合体ではβ−クロトーに結合しない（Ｏｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ２６：２２−２９）。同様のメカニズムが、ＦＧＦ２３−クロトー−ＦＧＦＲシステムで確認されている（Ｕｒａｋａｗａ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ  ４４４，７７０−４）。
【０００９】
ＦＧＦ２１の生物活性は、マウス３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞グルコース取込みアッセイで初めて特定された（Ｋｈａｒｉｔｏｎｅｎｋｏｖ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１５，１６２７−３５）。その後、ＦＧＦ２１は、インスリン非依存性のグルコース取込み及びＧＬＵＴ１発現を誘導することが分かった。ＦＧＦ２１は、様々な糖尿病齧歯動物モデルで高血糖を改善することも分かっている。加えて、ＦＧＦ２１を過剰発現する遺伝子導入マウスは、食餌誘発性の代謝異常（例えば、体重及び脂肪量の減少、インスリン感受性の増強）に耐性を示すことが見出された（Ｂａｄｍａｎ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ  ５，４２６−３７）。糖尿病非ヒト霊長類（ＮＨＰ）へのＦＧＦ２１の投与により、空腹時での血漿中のグルコース、トリグリセリド、インスリン、及びグルカゴンのレベルの低下が生じ、リポタンパク質プロファイルが顕著に改善された（例えば、ＨＤＬコレステロールのほぼ８０％の増加）（Ｋｈａｒｉｔｏｎｅｎｋｏｖ，Ａ．  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４８，７７４−８１）。重要なことに、このＮＨＰ研究中のいかなる時点でも、低血糖を観測しなかった。他の研究では、ＦＧＦ２１は、絶食状態への適応を制御するのに役立つ重要な内分泌ホルモンとして特定された。これにより、ＰＰＡＲαの下流に、これまで失われていたリンクが提供され、これにより、肝臓は、エネルギー恒常性の生体の調節において身体の他の部分と通信する。ＦＧＦ２１が脂肪（脂肪分解）、肝臓（脂肪酸酸化及びケトン体生成）、並びに脳（無気力）を調節するという複合観察により、ＦＧＦ２１は、空腹への応答の主要な内分泌調節因子として確立される（Ｋｈａｒｉｔｏｎｅｎｋｏｖ，Ａ．＆  Ｓｈａｎａｆｅｌｔ，Ａ．Ｂ．（２００８）ＢｉｏＤｒｕｇｓ  ２２，３７−４４）。
【発明の概要】
【００１０】
生物治療薬（ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）としてＦＧＦ２１を直接使用することの問題は、ＦＧＦ２１の半減期が非常に短いということである。マウスでは、ヒトＦＧＦ２１の半減期は０．５〜１時間であり、カニクイザルでは、この半減期は２〜３時間である。さらに、野生型ＦＧＦ２１を医薬製剤又は医薬調製物で使用する場合には、野生型ＦＧＦ２１の安定性は、防腐剤（例えばｍ−クレゾール）の悪影響を受ける。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本開示は、ＦＧＦ２１模倣抗体（即ち、ベータ−クロトー（β−クロトー）に結合し、且つヒト線維芽細胞増殖因子２１（以降、「ＦＧＦ２１」と称することがある）レセプター複合体及びＦＧＦ２１媒介シグナル伝達（例えば、ＦＧＦ２１−レセプター依存性シグナル伝達）を活性化するモノクローナル抗体）、その抗原結合フラグメント、並びにそれを含む医薬組成物及び処置方法に関する。
【００１２】
具体的な態様において、本開示の（ＦＧＦ２１模倣のβ−クロトー結合抗体の）抗原結合フラグメントは、ＦＧＦ２１様活性及び選択性を有するが治療上望ましい特性（例えば、タンパク質安定性、低免疫原性、製造の容易さ、及び望ましいインビボでの半減期）が追加された分子であり得る。
【００１３】
本開示のモノクローナルＦＧＦ２１模倣抗体、その抗原結合フラグメント、及びそれを含む医薬組成物は、ＦＧＦ２１関連障害の処置に有用であり、例えば、肥満、２型糖尿病、１型糖尿病、膵炎、脂質異常症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、インスリン抵抗性、高インスリン血症、耐糖能障害、高血糖、メタボリックシンドローム、高血圧、循環器疾患、粥状動脈硬化、末梢動脈疾患、脳卒中、心不全、冠動脈心疾患、腎疾患、糖尿病合併症、神経障害、胃不全麻痺、及び他の代謝障害の処置に有用であり、且つ重症患者の死亡率及び罹患率の低下で有用である。
【００１４】
特定の態様において、本明細書で説明された単離ＦＧＦ２１模倣抗体又は抗原結合フラグメントは、例えばＢＩＡＣＯＲＥ（商標）結合アッセイにより決定した場合に、５００ｐＭ又は４００ｐＭ以下の平衡解離定数（ＫＤ）でβ−クロトーに結合し、且つ例えば細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）リン酸化（ｐＥＲＫ又はホスホ−ＥＲＫ）細胞アッセイにより測定した場合に、５０ｎＭ以下のＥＣ５０でカニクイザルＦＧＦＲ１ｃ＿β−クロトーレセプター複合体も活性化し得る。特定の態様において、本明細書で説明された単離ＦＧＦ２１模倣抗体又は抗原結合フラグメントは、例えばＢＩＡＣＯＲＥ（商標）結合アッセイにより決定した場合に、３００ｐＭ又は４００ｐＭ以下の平衡解離定数（ＫＤ）でβ−クロトーに結合し、且つ例えばｐＥＲＫ細胞アッセイにより測定した場合に、５０ｎＭ以下のＥＣ５０でカニクイザルＦＧＦＲ１ｃ＿β−クロトーレセプター複合体も活性化し得る。
【００１５】
特定の態様において、本明細書で説明された単離ＦＧＦ２１模倣抗体又は抗原結合フラグメントは、１００ｐＭ又は５０ｐＭ以下の平衡解離定数（ＫＤ）でβ−クロトーに結合する。例えば、本明細書で説明された単離抗体又は抗原結合フラグメントは、１００ｐＭ以下の、５０ｐＭ以下の、４５ｐＭ以下の、４０ｐＭ以下の、３５ｐＭ以下の、２５ｐＭ以下の、又は１５ｐＭ以下のＫＤでヒトβ−クロトーに結合し得る。より具体的には、本明細書で説明された単離抗体又は抗原結合フラグメントは、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）結合アッセイ又は溶液平衡滴定アッセイ（ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｔｉｔｒａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）（ＳＥＴ）により測定した場合に、１０ｐＭ以下のＫＤでヒトβ−クロトーにも結合し得、且つ例えばｐＥＲＫ細胞アッセイにより測定した場合に、５０ｎＭ以下のＥＣ５０でカニクイザルＦＧＦＲ１ｃ＿β−クロトーレセプター複合体も活性化し得る。
【００１６】
本開示は、ヒトβ−クロトー及びカニクイザルβ−クロトーに結合する単離抗体又はその抗原結合フラグメントに関する。本開示はまた、β−クロトーに結合し、且つＦＧＦ２１レセプター複合体及びＦＧＦ２１媒介シグナル伝達（例えば、ＦＧＦ２１−レセプター依存性シグナル伝達）を活性化する単離抗体又はその抗原結合フラグメントにも関する。特定の態様において、本明細書で説明された単離抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒトＦＧＦＲ２ｃ＿β−クロトーレセプター複合体、ヒトＦＧＦＲ３ｃ＿β−クロトーレセプター複合体、又はヒトＦＧＦＲ４＿β−クロトーレセプター複合体を活性化しない。
【００１７】
本開示はまた、β−クロトーに結合し、且つ表１で説明された抗体（例えば、抗体ＮＯＶ００５又はＮＯＶ００６）と結合に関してさらに競合する単離抗体又はその抗原結合フラグメントにも関する。本開示はまた、さらに、表１で説明された抗体（例えば、抗体ＮＯＶ００５又はＮＯＶ００６）と同一のエピトープに結合する単離抗体又はその抗原結合フラグメントにも関する。
【００１８】
本明細書で説明されている場合、抗体及び／又はその抗原結合フラグメントの間の「競合」は、（例えば、当業者に公知の方法のいずれかにより、競合結合アッセイにより決定した場合に）両方の抗体（又はその結合フラグメント）が同一のβ−クロトーエピトープに結合することを示す。抗体又はその抗原結合フラグメントはまた、前記競合する抗体又はその抗原結合フラグメントが、本開示の抗体又は抗原結合フラグメントと同一のβ−クロトーエピトープ又は重複するβ−クロトーエピトープに結合する場合には、本開示のβ−クロトー抗体又は抗原結合フラグメント（例えば、ＮＯＶ００５又はＮＯＶ００６）とも「競合」する。本明細書で使用される場合、競合する抗体又はその抗原結合フラグメントは、（ｉ）本開示の抗体若しくは抗原結合フラグメントがその標的に結合することを立体的にブロックするもの（例えば、前記競合する抗体が近くの非重複β−クロトー及び／若しくはβ−クロトーエピトープに結合し、本開示の抗体若しくは抗原結合フラグメントがその標的に結合することを物理的に妨げる場合）、並びに／又は（ｉｉ）異なる非重複β−クロトーエピトープに結合してβ−クロトータンパク質に立体構造変化を誘発し、その結果、前記タンパク質には、前記立体構造変化がない場合には起こるであろう形では本開示のβ−クロトー抗体若しくは抗原結合フラグメントがもはや結合し得ないものも含み得る。
【００１９】
本明細書で説明された単離抗体及び抗原結合フラグメントの結合親和性は、溶液平衡滴定（ＳＥＴ）により決定され得る。ＳＥＴの方法は当技術分野で既知であり、下記でさらに詳細に説明する。あるいは、本明細書で説明された単離抗体又はフラグメントの結合親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイにより決定し得る。Ｂｉａｃｏｒｅ速度論的アッセイ（Ｂｉａｃｏｒｅ  ｋｉｎｅｔｉｃ  ａｓｓａｙ）の方法は当技術分野で既知であり、下記でさらに詳細に説明する。
【００２０】
本単離ＦＧＦ２１模倣抗体又はその抗原結合フラグメントを、ＦＧＦ２１レセプター複合体の活性化を増加させ、それによりＦＧＦ２１シグナル伝達経路を増加させるために使用し得る。特定の態様において、単離ＦＧＦ２１模倣抗体又はその抗原結合フラグメントを、ＦＧＦ２１レセプター複合体の活性化、及びそれによるＦＧＦ２１シグナル伝達経路を、少なくとも約１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％増加させるために使用し得る。
【００２１】
本明細書で説明された単離ＦＧＦ２１模倣抗体又はその抗原結合フラグメントは、モノクローナル抗体、ヒト抗体若しくはヒト化抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆｖフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、又はｓｃＦｖフラグメント、及び／又はＩｇＧアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１，ＩｇＧ２、若しくはＩｇＧ４）であり得る。
【００２２】
本明細書で説明された単離ＦＧＦ２１模倣抗体又はその抗原結合フラグメントはまた、アミノ酸がそれぞれのヒトＶＨ生殖系列配列又はヒトＶＬ生殖系列配列からの抗体フレームワークへと置換されているフレームワークも含み得る。
【００２３】
本開示の別の態様は、表１で説明されたＦａｂ（例えば、抗体ＮＯＶ００５又はＮＯＶ００６）の完全な重鎖配列及び軽鎖配列を有する単離抗体又はその抗原結合フラグメントを含む。より具体的には、この単離抗体又はその抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ  ＮＯＶ００５又はＮＯＶ００６の重鎖配列及び軽鎖配列を有し得る。
【００２４】
本開示のさらなる態様は、表１で説明されたＦａｂ（例えば、抗体ＮＯＶ００５又はＮＯＶ００６）の重鎖可変ドメイン配列及び軽鎖可変ドメイン配列を含む単離抗体又はその抗原結合フラグメントを含む。より具体的には、この単離抗体又はその抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ  ＮＯＶ００５又はＮＯＶ００６の重鎖可変ドメイン配列及び軽鎖可変ドメイン配列を含む。
【００２５】
本開示はまた、本明細書で説明された単離抗体又はその抗原結合フラグメント（例えば、ＮＯＶ００５又はＮＯＶ００６）を含む組成物（例えば医薬組成物）と、薬学的に許容可能な担体と組み合わされた抗体組成物とにも関する。具体的には、本開示は、表１の抗体又はその抗原結合フラグメント（例えば、抗体ＮＯＶ００５又はＮＯＶ００６等）を含む医薬組成物をさらに含む。本開示はまた、表１の単離抗体又はその抗原結合フラグメント（例えば、抗体ＮＯＶ００５又はＮＯＶ００６）のうちの２つ以上の組み合わせを含む医薬組成物にも関する。
【００２６】
本開示はまた、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域をコードする核酸配列を含む単離核酸分子にも関する。特定の態様において、この核酸分子は、配列番号１６、３６、又は３８からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む。本開示のさらなる態様において、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号１６、３６、又は３８の核酸配列を含む。
【００２７】
本開示はまた、配列番号２６又は３２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域をコードする核酸配列を含む単離核酸分子にも関する。特定の態様において、この核酸分子は、配列番号２７、５４、３３、又は４０の核酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む。本開示のさらなる態様において、本明細書で提供される核酸分子は、配列番号２７、５４、３３、又は４０の核酸配列を含む。
【００２８】
本開示はまた、本明細書で説明された核酸分子のうちの１つ又は複数を含むベクターにも関する。具体的な態様において、第１のベクターは、本明細書で提供される抗体（例えば、ＮＯＶ００５又はＮＯＶ００６）の重鎖可変領域又は重鎖をコードし、第２のベクターは、本明細書で提供される抗体（例えば、ＮＯＶ００５又はＮＯＶ００６）の軽鎖可変領域又は重鎖をコードする。この第１のベクター及び第２のベクターは、共発現のために宿主細胞に形質導入され、そのような重鎖及びそのような軽鎖を含む抗体が形成される。
【００２９】
本開示はまた、上記で説明された抗体の重鎖をコードする組換えＤＮＡ配列と、上記で説明された抗体の軽鎖をコードする別の組換えＤＮＡ配列とを含む単離宿主細胞にも関し、前記ＤＮＡ配列はプロモータに作動可能に連結されており、この宿主細胞中で発現され得る。この抗体はヒトモノクローナル抗体であり得ることが企図されている。この宿主細胞は非ヒト哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞又はＨＥＫ２９３細胞）であることも企図されている。
【００３０】
本開示はまた、線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）レセプターの活性化、及びそれによるＦＧＦ２１媒介シグナル伝達（例えば、ＦＧＦ２１−レセプター依存性シグナル伝達）の活性化にも関し、この方法は、細胞と、本明細書で説明された単離抗体又はその抗原結合フラグメントを含む組成物の有効な量とを接触させる工程を含む。
【００３１】
特定の一態様において、この宿主細胞はヒト細胞であることが企図されている。この細胞は対象中に存在することがさらに企図されている。一実施形態において、この細胞は脂肪細胞であることが企図されている。別の実施形態において、この細胞は、肝細胞、膵細胞、内皮細胞、筋肉、又は腎細胞のうちの１つ又は複数であり得る。具体的な態様において、この対象はヒトであることがさらに企図されている。
【００３２】
本開示はまた、対象のＦＧＦ２１関連障害を処置する、管理する、改善する、又は予防する方法であって、本明細書で説明された抗体又はその抗原結合フラグメント（例えば、ＮＯＶ００５又はＮＯＶ００６）を含む組成物の有効な量を対象に投与する工程を含む方法にも関する。一態様において、このＦＧＦ２１関連障害は肥満である。一態様において、このＦＧ２１関連障害は２型糖尿病である。この対象はヒトであることが企図されている。
【００３３】
上述の単離抗体又はその抗原結合フラグメントはいずれも、モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントであり得る。
【００３４】
本開示の非限定的な実施形態を、下記の態様で説明する：
１．β−クロトーのエピトープに結合する単離抗体又はその抗原結合フラグメントであって、
配列番号６、９、１０、又は１２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）；
配列番号７、１１、又は１３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）；
配列番号８又は１４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
配列番号１９、３１、２２、又は２５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）；
配列番号２０又は２３のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）；
及び
配列番号２１又は２４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）
を含む抗体又はその抗原結合フラグメント。
【００３５】
２．前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、
配列番号６、９、１０又は１２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）；
配列番号７、１１、又は１３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）；
配列番号８又は１４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
配列番号３１、２２、又は２５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）；
配列番号２０又は２３のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）；
及び
配列番号２１又は２４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）
を含む、態様１に記載の単離抗体又はその抗原結合フラグメント。
【００３６】
３．前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、
配列番号６、９、１０、又は１２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）；
配列番号７、１１、又は１３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）；
配列番号８又は１４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
配列番号１９、３１、２２、又は２５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）；
配列番号２０又は２３のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）；
及び
配列番号２１又は２４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）
を含む、態様１に記載の単離抗体又はその抗原結合フラグメント。
【００３７】
４．前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、
（ｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号７のアミノ鎖配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、配列番号３１のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３；
（ｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号７のアミノ鎖配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、配列番号３１のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３；
（ｉｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ鎖配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、配列番号２２のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号２４のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３；
又は
（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ鎖配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３
を含む、態様１に記載の単離抗体又はその抗原結合フラグメント。
【００３８】
５．前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、
（ｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号７のアミノ鎖配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３；
（ｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号７のアミノ鎖配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３；
（ｉｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ鎖配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、配列番号２２のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号２４のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３；
又は
（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ鎖配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３
を含む、態様１に記載の単離抗体又はその抗原結合フラグメント。
【００３９】
６．前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号８のアミノ鎖配列を含むＨＣＤＲ３、配列番号１９又は３１のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む、態様１に記載の単離抗体又はその抗原結合フラグメント。
【００４０】
７．前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号８のアミノ鎖配列を含むＨＣＤＲ３、配列番号１９又は３１のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む、態様１に記載の単離抗体又はその抗原結合フラグメント。
【００４１】
８．前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号８のアミノ鎖配列を含むＨＣＤＲ３、配列番号２２のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号２４のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む、態様１に記載の単離抗体又はその抗原結合フラグメント。
【００４２】
９．前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号１４のアミノ鎖配列を含むＨＣＤＲ３、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む、態様１に記載の単離抗体又はその抗原結合フラグメント。
【００４３】
１０．前記抗体又はフラグメントはβ−クロトー及びＦＧＦＲ１ｃの活性を増加させる、態様１〜９のいずれか一つに記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【００４４】
１１．ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）結合アッセイにより測定した場合に、４５０ｐＭ以下のＫＤでヒトβ−クロトータンパク質に結合する態様１〜９のいずれか一つに記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【００４５】
１２．前記エピトープは、（ｉ）β−クロトー配列（配列番号５２）の残基２４６〜２６５、５３６〜５５０、８３４〜８５７、及び９５９〜９８６のうちの１個若しくは複数個のアミノ酸、又は（ｉｉ）β−クロトー配列（配列番号５２）の残基２４６〜２６５、５３６〜５５０、８３４〜８５７、及び９５９〜９８６のストレッチのそれぞれからの１個、２個、３個、４個、５個、若しくはより多くのアミノ酸残基を含むか、又はから本質的になる、態様１〜９のいずれか一つに記載の単離抗体又はその抗原結合フラグメント。
【００４６】
１３．前記エピトープは、（ｉ）β−クロトー配列（配列番号５２）の残基６４６〜６７０、６９６〜７００、及び６４６〜６８９のうちの１個又は複数個のアミノ酸、又は（ｉｉ）β−クロトー配列（配列番号５２）の残基６４６〜６７０、６９６〜７００、及び６４６〜６８９のストレッチのそれぞれからの１個、２個、３個、４個、５個、若しくはより多くのアミノ酸残基を含むか、又はから本質的になる、態様１〜９のいずれか一つに記載の単離抗体又はその抗原結合フラグメント。
【００４７】
１４．ｐＥＲＫ細胞アッセイにより測定した場合に、５０ｎＭ以下のＥＣ５０でカニクイザルＦＧＦＲ１ｃ−β−クロトーレセプター複合体を活性化し得る態様１〜１３のいずれか一つに記載の単離抗体又はその抗原結合フラグメント。
【００４８】
１５．前記抗体又はフラグメントは、ヒトβ−クロトー（配列番号５２）の残基７０１（Ｔｙｒ）又は７０３（Ａｒｇ）と接触しない、態様１〜１４のいずれか一つに記載の単離抗体又は抗原結合フラグメント。
【００４９】
１６．前記抗体又はフラグメントは、配列番号１５のアミノ酸配列又はその少なくとも９０％若しくは９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）；及び配列番号２６若しくは３２のアミノ酸配列又はその少なくとも９０％若しくは９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、態様１〜１５のいずれか一つに記載の単離抗体又は抗原結合フラグメント。
【００５０】
１７．前記抗体又はフラグメントは、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨを含む、態様１〜１６のいずれか一つに記載の単離抗体又は抗原結合フラグメント。
【００５１】
１８．前記抗体又はフラグメントは、配列番号２６又は３２に記載のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、態様１〜１７のいずれか一つに記載の単離抗体又は抗原結合フラグメント。
【００５２】
１９．前記抗体又はフラグメントは、（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号２６のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は（ｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号３２のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、態様１７に記載の単離抗体又は抗原結合フラグメント。
【００５３】
２０．前記抗体は、（ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号２８のアミノ酸配列を含む軽鎖、又は（ｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、態様１〜１９のいずれか一つに記載の単離抗体又は抗原結合フラグメント。
【００５４】
２１．単離抗体又はその抗原結合フラグメントであって、前記抗体又はフラグメントは、態様１〜２０のいずれか一つに記載の単離抗体又はフラグメントと同一のエピトープに結合し、前記抗体又は抗原結合フラグメントは、（ｉ）表２に記載された抗体ＮＯＶ００４の組合せＣＤＲ若しくはＫａｂａｔ  ＣＤＲ；並びに／又は（ｉｉ）配列番号４３若しくは５５のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、及び配列番号４７若しくは５７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含まない、単離抗体又はその抗原結合フラグメント。
【００５５】
２２．単離抗体又はその抗原結合フラグメントであって、前記抗体又はフラグメントは、態様１〜２０のいずれか一つに記載の単離抗体又はフラグメントと、β−クロトーへの結合に関して競合し、前記抗体又は抗原結合フラグメントは、（ｉ）表２に記載された抗体ＮＯＶ００４の組合せＣＤＲ若しくはＫａｂａｔ  ＣＤＲ；並びに／又は（ｉｉ）配列番号４３若しくは５５のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、及び配列番号４７若しくは５７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含まない、単離抗体又はその抗原結合フラグメント。
【００５６】
２３．前記抗体又はフラグメントは、（ｉ）表２に記載された抗体ＮＯＶ００４の組合せＣＤＲ若しくはＫａｂａｔ  ＣＤＲ；並びに／又は（ｉｉ）配列番号４３若しくは５５のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、及び配列番号４７若しくは５７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含まない、態様１〜２０のいずれか一つに記載の単離抗体又は抗原結合フラグメント。
【００５７】
２４．上記の態様のいずれか一つに記載の抗体又はその抗原結合フラグメントと、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。
【００５８】
２５．代謝障害を処置する方法であって、態様１〜２３のいずれか一つに記載の抗体又は抗原結合フラグメントを含む医薬組成物の有効な量を、代謝障害を患う対象に投与することを含む方法。
【００５９】
２６．前記対象は、肥満、１型糖尿病及び２型糖尿病、膵炎、脂質異常症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、インスリン抵抗性、高インスリン血症、耐糖能障害、高血糖、高トリグリセリド血症、及びメタボリックシンドロームのうちの１つ又は複数を患う、態様２５に記載の方法。
【００６０】
２７．前記対象は、肥満、糖尿病、及び脂質異常症のうちの１つ又は複数を患う、態様２５に記載の方法。
【００６１】
２８．心血管障害を処置する方法であって、上述の態様のいずれか一つに記載の抗体又はフラグメントを含む医薬組成物の有効な量を、心血管障害を患う対象に投与することを含む、方法。
【００６２】
２９．前記対象は、粥状動脈硬化、末梢動脈疾患、脳卒中、心不全、及び冠動脈心疾患のうちの１つ又は複数を患う、態様２８に記載の方法。
【００６３】
３０．医薬としての使用のための、態様１〜２３のいずれか一つに記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【００６４】
３１．体重を減少させる方法であって、態様１〜２３のいずれか一つに記載の抗体又は抗原結合フラグメントを含む医薬組成物の有効な量を、必要とする対象に投与することを含む方法。
【００６５】
３２．食欲又は食物摂取量を減少させる方法であって、態様１〜２３のいずれか一つに記載の抗体又は抗原結合フラグメントを含む医薬組成物の有効な量を、必要とする対象に投与することを含む方法。
【００６６】
３３．対象の血漿トリグリセリド（ＴＧ）濃度又は血漿総コレステロール（ＴＣ）濃度を低下させる方法であって、態様１〜２３のいずれか一つに記載の抗体又は抗原結合フラグメントを含む医薬組成物の有効な量を、必要とする対象に投与することを含む方法。
【００６７】
３４．前記対象は代謝障害を患う、態様３１、３２、又は３３に記載の方法。
【００６８】
３５．前記対象は、肥満、１型糖尿病及び２型糖尿病、膵炎、脂質異常症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、インスリン抵抗性、高インスリン血症、耐糖能障害、高血糖、並びにメタボリックシンドロームのうちの１つ又は複数を患う、態様３４に記載の方法。
【００６９】
３６．上述の態様のいずれか一つに記載の抗体のうちの１つ若しくは複数、又は前記抗体のうちのいずれか１つのＶＬ及び／若しくはＶＨをコードする核酸。
【００７０】
３７．表１に記載された配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む核酸。
【００７１】
３８．表１に記載された配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む核酸。
【００７２】
３９．表１に記載された配列を含む核酸。
【００７３】
４０．態様３６、３７、３８、又は３９に記載の核酸を含むベクター。
【００７４】
４１．態様４０のベクターを含む宿主細胞。
【００７５】
４２．代謝障害の処置での使用のための、態様１〜２３のいずれか一つに記載の抗体又は抗原結合フラグメントを含む医薬組成物
【００７６】
４３．β−クロトーに結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを製造する方法であって、前記抗体又はそのフラグメントの発現に適した条件下で、態様４１に記載の宿主細胞を培養する工程を含む方法。
【００７７】
４４．前記代謝障害は、肥満、糖尿病、高トリグリセリド血症、又は脂質異常症である、態様４２に記載の医薬組成物。
【００７８】
４５．心血管障害の処置での使用のための、態様１〜２３のいずれか一つに記載の抗体又は抗原結合フラグメントを含む医薬組成物。
【００７９】
４６．体重を減少させる方法での使用のための、食欲又は食物摂取量を減少させる方法での使用のための、対象の血漿トリグリセリド（ＴＧ）濃度又は血漿総コレステロール（ＴＣ）濃度を低下させる方法での使用のための、態様１〜２３のいずれか一つに記載の抗体又は抗原結合フラグメントを含む医薬組成物。
【００８０】
４７．対象の、代謝障害を処置するための医薬の調製での、心血管障害を処置するための医薬の調製での、体重を減少させるための医薬の調製での、食欲又は食物摂取量を減少させるための医薬の調製での、血漿ＴＧ濃度又は血漿ＴＣ濃度を低下させるための医薬の調製での、態様１〜２３のいずれか一つに記載の抗体又はその抗原結合フラグメントの使用。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】ＮＯＶ００４、ＮＯＶ００５、及びＮＯＶ００６による、ヒトＦＧＦＲ１ｃ＿β−クロトー＿ＨＥＫ２９３細胞のｐＥＲＫ活性化（図１Ａ）、及びカニクイザルＦＧＦＲ１ｃ＿β−クロトー＿ＨＥＫ２９３細胞のｐＥＲＫ活性化（図１Ｂ）を示す図。このｐＥＲＫ活性化データは、（ｉ）ＮＯＶ００４が、それぞれ約３ｎＭ及び２０ｎＭのＥＣ５０で、ヒトＦＧＦＲ１ｃ＿β−クロトーレセプター複合体及びカニクイザルＦＧＦＲ１ｃ＿β−クロトーレセプター複合体を活性化し、（ｉｉ）ＮＯＶ００５が、それぞれ約３ｎＭ及び１６ｎＭのＥＣ５０で、ヒトＦＧＦＲ１ｃ＿β−クロトーレセプター複合体及びカニクイザルＦＧＦＲ１ｃ＿β−クロトーレセプター複合体を活性化し、（ｉｉｉ）ＮＯＶ００６が、それぞれ約４ｎＭ及び１８ｎＭのＥＣ５０で、ヒトＦＧＦＲ１ｃ＿β−クロトーレセプター複合体及びカニクイザルＦＧＦＲ１ｃ＿β−クロトーレセプター複合体を活性化したことを示す。
【図２−１】図２：ヒトＦＧＦＲ２ｃ＿β−クロトーＨＥＫ２９３細胞（図２Ａ）、ヒトＦＧＦＲ３ｃ＿β−クロトーＨＥＫ２９３細胞（図２Ｂ）、及びヒトＦＧＦＲ４＿β−クロトーＨＥＫ２９３細胞（図２ｃ）のｐＥＲＫ活性化に関するＮＯＶ００４、ＮＯＶ００５、及びＮＯＶ００６のプロファイリングを示す図である。ＦＧＦ２１を、ＦＧＦＲ２ｃ＿β−クロトー又はＦＧＦＲ３ｃ＿β−クロトーの活性化に関する陽性対照として使用した。ＦＧＦ１９を、ＦＧＦＲ４＿β−クロトーの活性化に関する陽性対照として使用した。
【図２−２】（上記の通り。）
【図２−３】（上記の通り。）
【図３】α−クロトー、Ｅｇｒ１−ルシフェラーゼ、及びレニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼを遺伝子導入したＨＥＫ２９３細胞を使用した、ＦＧＦ２３活性に関するＮＯＶ００４、ＮＯＶ００５、及びＮＯＶ００６のプロファイリングを示す図である。ＦＧＦ２３を陽性対照として使用した。
【図４】ヒトβ−クロトーに関する、ＮＯＶ００４に対するＮＯＶ００５及びＮＯＶ００６の競合的結合活性を示す図である。Ｆｏｒｔｅ  Ｂｉｏ（登録商標）Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒシステムを使用して、ヒトβ−クロトーへの競合的結合活性を決定した。工程１では、組換えヒトβ−クロトーをセンサー上にロードし、続いて工程２において飽和するまでＮＯＶ００４をロードした。次いで、ＮＯＶ００５又はＮＯＶ００６をロードし、ＮＯＶ００４に対する競合的結合活性を検出した。第２の結合シグナルが存在しないことは、これらの抗体がヒトβ−クロトーへの結合に関して競合することを示す。無関係の抗体を陰性対照として使用し、ＮＯＶ００４を自己競合の陽性対照として使用した。
【図５−１】図５：ラットでのＩＶ注射後のＮＯＶ００４、ＮＯＶ００５、及びＮＯＶ００６の濃度−時間プロファイルを示す図である。動物は、ＮＯＶ００４（図５Ａ）、ＮＯＶ００５（図５Ｂ）、又はＮＯＶ００６（図５Ｃ）のＩＶ投与後１時間で約２００μｇ／ｍＬの平均Ｃｍａｘを示し、３種全ての抗体が同等のＰＫプロファイルを示した。
【図５−２】（上記の通り。）
【図５−３】（上記の通り。）
【図６−１】図６：ＮＯＶ００５（ｎ＝５の動物）又はビヒクル（ｎ＝３の動物）の２種の皮下の１ｍｇ／ｋｇの用量を、１週間間隔（投与日を矢印で示す）で、雄の血糖正常の肥満カニクイザルに投与した。標準固形飼料の摂餌量データを、群平均±ＳＥＭでベースラインのパーセントとして正規化した。サルは、研究全体を通して、おやつとして果物、野菜、及びピーナッツを摂取した。ＮＯＶ００５（ｎ＝５の動物）又はビヒクル（ｎ＝３の動物）の２種の皮下の１ｍｇ／ｋｇの用量を、１週間間隔（投与日を矢印で示す）で、雄の血糖正常の肥満カニクイザルに投与した。ＮＯＶ００５及びビヒクルで処理した動物のベースライン体重は、それぞれ１１．３＋１．２及び１１．４＋１．３ｋｇであった。体重データを、（Ａ）群平均±ＳＥＭ及び（Ｂ）示した個々の動物データでベースラインのパーセントとして正規化した。
【図６−２】（上記の通り。）
【発明を実施するための形態】
【００８２】
本開示は、β−クロトーに特異的に結合し、且つＦＧＦレセプター（例えばＦＧＦＲ１ｃ）の活性化及びＦＧＦ２１媒介シグナル伝達（例えばＦＧＦ２１−レセプター依存性シグナル伝達）の活性化をもたらす抗体分子の発見に部分的に基づく。本開示は、完全なＩｇＧ形式の抗体及びその抗原結合フラグメント（例えばＦａｂフラグメント）の両方（例えば、抗体ＮＯＶ００５又はＮＯＶ００６）に関する。
【００８３】
従って、本開示は、β−クロトー（例えば、ヒト及びカニクイザルのβ−クロトー）に特異的に結合する抗体、医薬組成物、製造方法、並びにそのような抗体及び組成物の使用方法を提供する。
【００８４】
用語法
別途定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が関連する分野の当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。
【００８５】
本明細書で使用される場合、用語「ＦＧＦ２１」は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）タンパク質ファミリのメンバーを指す。ＦＧＦ２１の典型的なアミノ酸配列は配列番号１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０６１９８６．１）に記載されており、この対応するポリヌクレオチド配列は配列番号２（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿０１９１１３．２）に記載されている。
【００８６】
本明細書で使用される場合、用語「ＦＧＦ２１レセプター」は、ＦＧＦ２１に関するレセプターを指す（Ｋｈａｒｉｔｏｎｅｎｋｏｖ，Ａ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ２１５：１−７；Ｋｕｒｏｓｕ，Ｈ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）ＪＢＣ  ２８２：２６６８７−２６６９５；Ｏｇａｗａ，Ｙ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）ＰＮＡＳ  １０４：７４３２−７４３７）。
【００８７】
用語「ＦＧＦ２１ポリペプチド」は、ヒト中で発現される、天然に存在するポリペプチドを指す。本開示の目的のために、用語「ＦＧＦ２１ポリペプチド」は、２０９個のアミノ酸残基からなり且つ配列番号２のヌクレオチド配列によりコードされるあらゆる完全長ＦＧＦ２１ポリペプチド（例えば配列番号１）；１８１個のアミノ酸残基からなり且つ完全長ＦＧＦ２１ポリペプチドのアミノ末端の２８個のアミノ酸残基（即ち、シグナルペプチドを構成するアミノ酸残基）が除去されているポリペプチドのあらゆる成熟型、並びにそれらのバリアンを指すために互換的に使用され得る。
【００８８】
用語「抗体」は、本明細書で使用される場合、全抗体、及びその任意の抗原結合フラグメント（即ち、「抗原結合部分」）又は一本鎖を意味する。全抗体は、ジスルフィド結合により相互に接続された少なくとも２本の重（Ｈ）鎖及び２本の軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書中でＶＨと省略した）及び重鎖定常領域で構成される。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書中でＶＬと省略した）及び軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬで構成される。ＶＨ領域及びＶＬ領域はさらに、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域に再分割され得、より保存されている、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる領域が散在する。ＶＨ及びＶＬはそれぞれ、アミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順序で配置される３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫グロブリンの、宿主の組織又は因子への結合を媒介し得る（免疫系の種々の細胞（例えばエフェクタ細胞）及び古典的補体系の第１の成分（Ｃ１ｑ）が挙げられる）。抗体は、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ科動物の抗体、又はキメラ抗体であってよい。
【００８９】
抗体の用語「抗原結合部分」又は「抗原結合フラグメント」は、本明細書で使用される場合、所与の抗原（例えばβ−クロトー）に特異的に結合する能力を保持する無傷の抗体の１個又は複数個のフラグメントを指す。抗体の抗原結合機能は、無傷の抗体のフラグメントにより実施され得る。抗体の用語抗原結合部分又は抗原結合フラグメントに包含される結合フラグメントの例として、下記が挙げられる：Ｆａｂフラグメント（ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメイン、及びＣＨ１ドメインからなる一価のフラグメント）；Ｆ（ａｂ）２フラグメント（ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２個のＦａｂフラグメントを含む二価のフラグメント）；ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；抗体の単一アームのＶＬドメイン及びＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）フラグメント（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９  Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）（ＶＨドメイン又はＶＬドメインからなる）；並びに単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）。
【００９０】
さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン、ＶＬ及びＶＨは、別々の遺伝子によってコードされるが、組換え方法を用いて、人工ペプチドリンカーによって結合され得、これは、２つのドメインを、ＶＬ領域及びＶＨ領域が対形成して、一価の分子を形成する単一のタンパク質鎖として製造することを可能にする（単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている；例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；及びＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：５８７９−５８８３，１９８８参照）。そのような単鎖抗体は、１つ又は複数の抗原結合部分又は抗体のフラグメントを含む。これらの抗体フラグメントは、当業者に知られている従来の技術を用いて得られ、そして当該フラグメントは、無傷の抗体であるのと同じ様式で、実用性の有無に関してスクリーニングされる。
【００９１】
抗原結合フラグメントはまた、単一のドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ−ＮＡＲ、及びビス−ｓｃＦｖ中に組み込まれてもよい（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈｕｄｓｏｎ，２００５，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３，９，１１２６−１１３６参照）。抗体の抗原結合部分は、ポリペプチドに基づくスカフォールド、例えばフィブロネクチンＩＩＩ型（Ｆｎ３）中に融合（ｇｒａｆｔｅｄ）されてよい（米国特許第６，７０３，１９９号明細書（フィブロネクチンポリペプチドモノボディを記載）参照）。
【００９２】
抗原結合フラグメントは、一対のタンデムＦｖセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む単鎖分子中に組み込まれてよく、これは、相補的軽鎖ポリペプチドと一緒になって、一対の抗原結合領域を形成する（Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８：１０５７−１０６２；及び米国特許第５，６４１，８７０号明細書）。
【００９３】
本明細書で使用される場合、用語「親和性」は、単一の抗原部位での抗体と抗原との間の相互作用の強さを指す。各抗原部位内で、抗体の「アーム」の可変領域は、多数の部位で抗原と弱い非共有結合力を介して相互作用し、相互作用が大きいほど親和性はより強い。本明細書で使用される場合、抗体又はその抗原結合フラグメント（例えばＦａｂフラグメント）に対する用語「高親和性」は概して、１０−９Ｍ以下のＫＤを有する抗体又は抗原結合フラグメントを指す。
【００９４】
用語「アミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸、及び合成アミノ酸、並びにアミノ酸類似体、及び天然に存在するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸模擬物を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝的コードによってコードされるアミノ酸、並びに後に修飾されたアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタマート、及びＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的な化学構造を有する化合物、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、及びＲ基に結合したアルファ−炭素、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。そのような類似体は、修飾されたＲ基（例えばノルロイシン）又は修飾されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的な化学構造を保持する。アミノ酸模擬物は、アミノ酸の一般的な化学構造と異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様に機能する化合物を指す。
【００９５】
用語「結合親和性」は、本明細書で使用される場合、個々の抗体結合部位が１つの抗原決定基のみと反応する能力を指す。
【００９６】
抗体（例えばβ−クロトー結合抗体）に語句「特異的に（又は選択的に）結合する」は、タンパク質及び他の生物製剤の不均一な集団中における同族抗原（例えば、ヒトβ−クロトー又はカニクイザルβ−クロトー）の存在を決定する結合反応を指す。語句「抗原を認識する抗体」及び「抗原に特異的な抗体」は、本明細書では、用語「抗原に特異的に結合する抗体」と互換的に使用される。
【００９７】
用語「ＦＧＦ２１媒介」又は類似のものは、本開示のＦＧＦ２１レセプター及び／又は抗体が、β−クロトーへの結合時に細胞応答及びＦＧＦ２１シグナル伝達経路を媒介し、それにより、血漿トリグリセリド、血漿インスリン、血漿グルコース、食物摂取量、及び体重のうちの１つ又は複数の減少が挙げられるがこれらに限定されない様々な生理作用をもたらすという事実を指す。
【００９８】
「ＦＧＦ関連障害」、「ＦＧＦ２１関連状態」、「ＦＧＦ２１と関連する疾患若しくは状態」又は類似の用語は、本明細書で使用される場合、ＦＧＦシグナル伝達経路の活性化による（例えば、ＦＧＦ２１レセプターシグナル伝達の活性化による）予防、診断、及び／又は処置が探索されている様々な状態又は疾患を指す。これらとして、異常なＦＧＦ２１シグナル伝達（例えば、ＦＧＦ２１媒介シグナル伝達及び／又はＦＧＦ２１レセプターシグナル伝達の異常な活性化）を特徴とする状態、疾患、又は障害が挙げられ得る。これらの状態として、下記が挙げられるがこれらに限定されない：代謝障害、内分泌障害、及び心血管障害、例えば、肥満、１型糖尿病及び２型糖尿病、膵炎、脂質異常症、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、インスリン抵抗性、高インスリン血症、耐糖能障害、高血糖、メタボリックシンドローム、急性心筋梗塞、高血圧、循環器疾患、粥状動脈硬化、末梢動脈疾患、脳卒中、心不全、冠動脈心疾患、腎疾患、糖尿病合併症、神経障害、胃不全麻痺、インスリンレセプター中における重度の不活性化突然変異と関連する障害、並びに他の代謝障害、並びに重症患者の死亡率及び罹患率の低下。
【００９９】
「２型糖尿病」とは、インスリンが利用可能であるにもかかわらず過剰なグルコース産生を特徴とする状態のことであり、不十分なグルコースクリアランスの結果として、循環グルコースレベルは過剰に高いままである。
【０１００】
「１型糖尿病」とは、インスリンの完全な欠如により引き起こされる高い血糖値を特徴とする状態のことである。このことは、身体の免疫系が、膵臓中のインスリン産生ベータ細胞を攻撃して破壊した場合に起こる。次いで、膵臓はインスリンをほとんど産生しないか、又は全く産生しない。
【０１０１】
「膵炎」とは、膵臓の炎症のことである。
【０１０２】
「脂質異常症」とは、リポタンパク質代謝の障害（例えば、リポタンパク質の過剰発現又は欠乏）のことである。脂質異常症は、総コレステロール、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロール、及びトリグリセリドの濃度の上昇、並びに血液中における高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロール濃度の低下を呈する場合がある。
【０１０３】
「非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）」とは、アルコール消費とは関連しない肝疾患のことであり、肝細胞の脂肪変化を特徴とし、小葉内の炎症及び線維症を伴う。
【０１０４】
「耐糖能障害（Ｇｌｕｃｏｓｅ  ｉｎｔｏｌｅｒａｎｃｅ）」又は耐糖能障害（Ｉｍｐａｉｒｅｄ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）（ＩＧＴ）とは、心血管病理のリスクの増加と関連する高血糖（ｄｙｓｇｌｙｃｅｍｉａ）の前糖尿病状態のことである。前糖尿病状態は、対象が、グルコースを効率的に細胞中に移動させて効率的な燃料源として利用することを妨げ、血液中のグルコースレベルの上昇及びある程度のインスリン抵抗性をもたらす。
【０１０５】
「高血糖」は、血液中における過剰な糖（グルコース）として定義される。
【０１０６】
低血糖（ｌｏｗ  ｂｌｏｏｄ  ｓｕｇａｒ）とも呼ばれる「低血糖（Ｈｙｐｏｇｌｙｃｅｍｉａ）」は、血糖値が低下して身体の活動に十分なエネルギーが供給されない場合に生じる。
【０１０７】
「高インスリン血症」は、血液中におけるインスリンの通常よりも高いレベルと定義される。
【０１０８】
「インスリン抵抗性」は、インスリンの正常量が亜正常の生物学的反応を生じる状態として定義される。
【０１０９】
ヒト対象に関する「肥満」は、所与の集団の理想体重を２０パーセント超える体重として定義され得る（Ｒ．Ｈ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１９７４，ｐ．９０４−９１６）。また、３０以上のＢｏｄｙ  Ｍａｓｓ  Ｉｎｄｅｘ（ＢＭＩ、メートル単位の身長の二乗で除算したキログラム単位の体重（ｋｇ／ｍ２）として定義される）としても定義され得る。
【０１１０】
「メタボリックシンドローム」は、下記の兆候のうちの少なくとも３つのクラスターとして定義され得る：腹部脂肪−ほとんどの男性では、４０インチ以上のウエスト、高血糖−断食後に１デシリットル当たり少なくとも１１０ミリグラム（ｍｇ／ｄｌ）；高トリグリセリド−血流中に少なくとも１５０ｍｇ／ｄＬ；低ＨＤＬ−４０ｍｇ／ｄｌ未満；及び１３０／８５ｍｍＨｇ以上の血圧。
【０１１１】
「高血圧（Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ）」又は高血圧（ｈｉｇｈ  ｂｌｏｏｄ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ）とは、心血管損傷又は他の有害な結果を誘発する可能性があるレベルまでの、全身動脈血圧の一時的な又は継続的な上昇のことである。高血圧は、１４０ｍｍＨｇを超える収縮期血圧、又は９０ｍｍＨｇを超える拡張期血圧として任意に定義されている。
【０１１２】
「循環器疾患」とは、心臓又は血管に関連する疾患のことである。
【０１１３】
「末梢動脈疾患」は、頭、臓器、及び手足へと血液を運ぶ動脈中でプラークが蓄積される場合に生じる。時間と共に、プラークは動脈を硬化させて狭める可能性があり、臓器及び身体の他の部分への酸素リッチな血液の流れが制限される。
【０１１４】
「粥状動脈硬化」は、大サイズの及び中サイズの動脈の内膜中における不規則に分布した脂質沈着を特徴とする血管疾患であり、動脈内腔の狭窄を引き起こし、最終的には線維症及び石灰化へと進行する。病変は通常、限局性であり、緩やかに且つ断続的に進行する。血流の制限はほとんどの臨床症状を説明し、この臨床症状は、病変の分布及び重症度により異なる。
【０１１５】
「脳卒中」とは、２４時間を超えて持続するあらゆる急性臨床事象（脳循環の障害に関連する）のことである。脳卒中には不可逆な脳損傷が含まれ、症状の種類及び重症度は、循環が損なわれている脳組織の位置及び範囲に依存する。
【０１１６】
うっ血性心不全とも呼ばれる「心不全」とは、心臓が身体の残りの部分へと十分な血液をもはや送り込むことができない状態のことである。
【０１１７】
冠動脈疾患とも呼ばれる「冠動脈心疾患」とは、心臓に血液及び酸素を供給する小さい血管の狭窄のことである。
【０１１８】
「腎疾患」又は腎症とは、腎臓のあらゆる疾患のことである。糖尿病性腎症は、１型糖尿病又は２型糖尿病を有する人々において罹患率及び死亡率の主な原因である。
【０１１９】
「糖尿病合併症」とは、他の身体機能（例えば、腎臓、神経（神経障害）、足（足の潰瘍及び循環不良）、並びに眼（例えば網膜症））に関連する問題（高血糖値により引き起こされる）のことである。糖尿病はまた、心臓病並びに骨及び関節の障害のリスクも高める。糖尿病の他の長期合併症として、皮膚の問題、消化の問題、性機能障害、並びに歯及び歯茎の問題が挙げられる。
【０１２０】
「神経障害」とは、脳神経、又は末梢神経系若しくは自律神経系に関するあらゆる疾患のことである。
【０１２１】
「胃不全麻痺」とは胃の蠕動の衰弱のことであり、これにより腸の排出が遅延する。
【０１２２】
本開示に包含される重症患者は概して、不安定な代謝亢進状態を経験する。この不安定な代謝状態は基礎代謝の変化に起因し、一部の栄養素の相対的な欠乏につながる場合がある。一般に、脂肪及び筋肉の両方の酸化が増加している。
【０１２３】
さらに、重症患者は好ましくは、全身性炎症反応症候群又は呼吸困難を経験している患者である。罹患率の低下は、重症患者が、さらなる病気、状態、若しくは症状を発症する可能性を低下させることを意味するか、又はさらなる病気、状態、若しくは症状の重症度を軽減することを意味する。例えば、罹患率の低下は、菌血症若しくは敗血症、又は多臓器不全と関連する合併症の発生率の低下に対応し得る。
【０１２４】
用語「保存的に修飾された変異体」は、アミノ酸配列及び核酸配列の双方に用いられる。特定の核酸配列に関して、保存的に修飾された変異体は、同じ、若しくは本質的に同じアミノ酸配列をコードする核酸を、又は、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同じ配列を指す。遺伝的コードの縮重によって、多数の機能的に同じ核酸が、所定のいずれかのタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、及びＧＣＵは全て、アミノ酸アラニンをコードする。ゆえに、コドンによってアラニンが特定される全ての位置にて、コドンは、記載される対応するコドンのいずれかに変更され得、コードされるポリペプチドを変更することはない。そのような核酸変異は「サイレント変異」であり、これは、保存的に修飾された変異の一種である。また、ポリペプチドをコードする本明細書中の全ての核酸配列が、核酸の全ての可能なサイレント変異を記載する。当業者であれば、核酸中の各コドン（通常メチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧ、及び通常トリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧ以外）が、機能的に同じ分子を産するように修飾され得ることを認識するであろう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異が、記載される各配列内に潜在する。
【０１２５】
ポリペプチド配列について、「保存的に修飾された変異体」は、化学的に類似するアミノ酸でアミノ酸を置換する、ポリペプチド配列に対する個々の置換、欠失、又は付加を含む。機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的置換の表が、当該技術において周知である。そのような保存的に修飾された変異体は、本開示の多型の変異体、異種間相同体、及び対立遺伝子にも加えられ、これらを排除しない。以下の８つの群が、互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；及び８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４）参照）。一部の実施形態において、用語「保存的配列修飾」は、アミノ酸配列を含有する抗体の結合特性に大きく影響を及ぼさない、又はこれを大きく変更しないアミノ酸修飾を指すのに用いられる。
【０１２６】
用語「エピトープ」は、抗体に特異的に結合し得るタンパク質決定基を意味する。エピトープは通常、アミノ酸又は糖側鎖等の分子の化学的に活性な表面グループで構成されており、通常は特定の三次元構造特性と特定の電荷特性とを有する。立体構造エピトープ及び非立体構造エピトープは、変性溶媒の存在下において前者への結合が失われているが後者への結合は失われていないという点で区別される。
【０１２７】
用語「ヒト抗体」は、本明細書で使用される場合、フレームワーク領域及びＣＤＲ領域の両方がヒト起源の配列に由来する可変領域を有する抗体を含むことが意図されている。さらに、この抗体が定常領域を含む場合には、この定常領域はまた、そのようなヒト配列（例えば、ヒト生殖系列配列、又はヒト生殖系列配列の突然変異バージョン）に由来する。本開示のヒト抗体は、ヒト配列によりコードされていないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダムな若しくは部位特異的な突然変異誘発により導入される突然変異、又はインビボでの体細胞突然変異により導入される突然変異）を含み得る。
【０１２８】
用語「ヒトモノクローナル抗体」は、フレームワーク領域及びＣＤＲ領域の両方がヒト配列に由来する可変領域を有する、単一の結合特異性を示す抗体を指す。一実施形態において、このヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合したヒト重鎖導入遺伝子及び軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物（例えば、トランスジェニックマウス）から得られるＢ細胞を含むハイブリドーマにより産生される。
【０１２９】
「ヒト化」抗体とは、ヒト中では免疫原性が低いが、非ヒト抗体の反応性を保持する抗体のことである。このことは、例えば、非ヒトＣＤＲ領域を保持し、且つこの抗体の残りの部をそのヒトカウンターパート（即ち、定常領域、及び可変領域のフレームワーク部分）に置き換えることにより達成され得る。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５，１９８４；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｏｉ，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４４：６５−９２，１９８８；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６，１９８８；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．，２８：４８９−４９８，１９９１；及びＰａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．，３１：１６９−２１７，１９９４を参照されたい。ヒト操作技術の他の例として、米国特許第５，７６６，８８６号明細書で開示されているＸｏｍａ技術が挙げられるがこれに限定されない。
【０１３０】
２つ以上の核酸配列又はポリペプチド配列の文脈における用語「同じ」又はパーセント「同一性」は、２つ以上の配列又はサブ配列が同じであることを指す。２つの配列は、比較ウィンドウ、又は指定された領域上で、以下の配列比較アルゴリズムの１つを用いて、又は手動のアラインメント及び視覚による検査によって測定されて、最大一致について比較且つアラインされた場合に、アミノ酸残基又はヌクレオチドの特定のパーセンテージが同じである（すなわち、特定の領域にわたって、又は、特定されない場合には、配列全体にわたって、６０％の同一性、場合によっては６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の同一性）ならば、「実質的に同じである」。場合によっては、同一性は、長さが少なくとも約５０ヌクレオチド（又は１０アミノ酸）である領域、より好ましくは長さが１００〜５００ヌクレオチド又は１０００ヌクレオチド以上（又は２０、５０、２００アミノ酸以上）である領域にわたって存在する。
【０１３１】
配列比較について、典型的には、１つの配列が、試験配列が比較される参照配列として機能する。配列比較アルゴリズムを用いて、試験配列及び参照配列がコンピュータに入力されて、必要に応じて、サブ配列座標（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ）が指定されて、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。デフォルトのプログラムパラメータが用いられてもよいし、代替パラメータが指定されてもよい。次に、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を算出する。
【０１３２】
本明細書中で用いられる「比較ウィンドウ」は、２つの配列が最適にアラインされた後に、配列が、同じ数の隣接位置の参照配列と比較され得る、２０〜６００、通常約５０〜約２００、さらに通常約１００〜約１５０からなる群から選択される隣接位置の数のいずれか１つのセグメントへの言及を含む。比較のための配列アラインメント方法が、当該技術において周知である。比較のための最適な配列アラインメントが、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，（１９７０）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２ｃの局所的相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４，１９８８の類似性検索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化されたインプリメンテーション（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおける、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）によって、又は手動アラインメント及び視覚による検査（例えば、Ｂｒｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（Ｒｉｎｇｂｏｕ  ｅｄ．，２００３参照）によって行われ得る。
【０１３３】
パーセント配列同一性及び配列類似性を判定するのに適したアルゴリズムの２つの例として、ＢＬＡＳＴアルゴリズム及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムがあり、これらはそれぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９７７；及びＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアが、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎから一般に入手可能である。このアルゴリズムは、最初に、高いスコアリング配列対（ＨＳＰ）を、クエリ配列中の長さＷのショートワードを特定することによって特定することを包含し、これは、データベース配列において同じ長さのワードとアラインされた場合に、一部の正の値の閾値スコアＴにマッチし、又はこれを満たすものである。Ｔは、近隣ワードスコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，前掲）。これらの最初の近隣ワードヒットは、これを含有するより長いＨＳＰを見出すための検索を開始させるシードとして機能する。ワードヒットは、累積アラインメントスコアが増大し得る限り、各配列に沿って両方向に延長される。累積スコアが、ヌクレオチド配列について、パラメータＭ（一対のマッチング残基についての報酬スコア；常に＞０）及びＮ（ミスマッチング残基についてのペナルティスコア；常に＜０）を用いて算出される。アミノ酸配列について、スコアリングマトリックスが、累積スコアを算出するのに用いられる。各方向におけるワードヒットの延長は、次の場合に停止する：累積アラインメントスコアが、その最大達成値から量Ｘ落ちた場合；累積スコアが、１つ以上の負の値のスコアリング残基アラインメントの蓄積に起因して、ゼロ以下になった場合；又はいずれかの配列の端部に達した場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ、Ｔ、及びＸは、アラインメントの感度及び速度を判定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、１０の予想（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び双方の鎖の比較を用いる。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして３のワード長、及び１０の予想（Ｅ）、並びにＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５，１９８９参照）は、５０のアラインメント（Ｂ）、１０の予想（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び双方の鎖の比較を用いる。
【０１３４】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計学的分析を実行する（例えば、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７，１９９３参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の一尺度が、最小和確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド配列又はアミノ酸配列間のマッチが偶然によって起こるであろう確率の指標を提供する。例えば、核酸は、参照核酸に対する試験核酸の比較において最小和確率が約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満であれば、参照配列に類似すると考える。
【０１３５】
２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性はまた、Ｅ．Ｍｅｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒ（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．４：１１−１７，１９８８）のアルゴリズムを用いて（これは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている）、ＰＡＭ１２０加重残留表（ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅ）、１２のギャップ長ペナルティ、及び４のギャップペナルティを用いて判定され得る。加えて、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３，１９７０）アルゴリズムを用いて（これは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ワールドワイドウェブｇｃｇ．ｃｏｍにて入手可能）において、ＧＡＰプログラムに組み込まれている）、Ｂｌｏｓｓｏｍ６２マトリックス又はＰＡＭ２５０マトリックス、並びに１６、１４、１２、１０、８、６、又は４のギャップ加重及び１、２、３、４、５、又は６の長さ加重を用いて判定され得る。
【０１３６】
先で注目された配列同一性のパーセンテージ以外の、２つの核酸配列又はポリペプチドが実質的に同じであることの別の指標として、第１の核酸によってコードされるポリペプチドが、下記のように、免疫学的に、第２の核酸によってコードされるポリペプチドに対して高められた抗体と交差反応性であることがある。ゆえに、ポリペプチドは典型的に、第２のポリペプチドと、例えば、２つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合、実質的に同じである。２つの核酸配列が実質的に同じであることの別の指標として、下記のように、２つの分子又はそれらの相補体が、ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることがある。２つの核酸配列が実質的に同じであることのさらに別の指
標として、配列を増幅させるのに同じプライマーが用いられ得ることがある。
【０１３７】
用語「単離抗体」は、抗原特異性が異なる他の抗体を実質的に含まない抗体を指す（例えば、β−クロトーに特異的に結合する単離抗体は、β−クロトー以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかしながら、β−クロトーに特異的に結合する単離抗体は、他の抗原に対する交差反応性を有する場合がある。さらに、単離抗体は、他の細胞物質及び／又は化学物質を実質的に含まない場合がある。
【０１３８】
用語「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によりもたらされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、例えばＩｇＧ１又はＩｇＧ４）を指す。アイソタイプには、これらのクラスのうちの１つの改変バージョンも含まれ、改変は、例えば、エフェクター機能又はＦｃレセプターへの結合を増強するために又は低減するために、Ｆｃ機能を変更すべく行なわれている。
【０１３９】
用語「ｋａｓｓｏｃ」又は「ｋａ」は、本明細書で使用される場合、特定の抗体−抗原相互作用の会合速度を指すことが意図されており、用語「ｋｄｉｓ」又は「ｋｄ」は、本明細書で使用される場合、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度を指すことが意図されている。用語「ＫＤ」は、本明細書で使用される場合、解離定数を指すことが意図されており、この解離定数は、ｋａに対するｋｄの比（即ち、ｋｄ／ｋａ）から得られ、モル濃度（Ｍ）として表される。当技術分野で十分に確立された方法を使用して、抗体のＫＤ値を決定し得る。抗体のＫＤを決定する方法として、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システム等のバイオセンサーシステムを使用した表面プラズモン共鳴の測定、又は溶液平衡滴定（ＳＥＴ）による溶液中の親和性の測定が挙げられる。
【０１４０】
用語「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」は、本明細書で使用される場合、単一分子組成の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性及び親和性を示す。
【０１４１】
用語「核酸」は、本明細書中で、用語「ポリヌクレオチド」と互換的に用いられ、一本鎖の形態又は二本鎖の形態のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド、及びそれらのポリマーを指す。当該用語は、知られているヌクレオチド類似体又は修飾された骨格残基若しくは結合を含有する核酸を包含し、これらは、合成核酸、天然に存在する核酸、及び天然に存在しない核酸であり、参照核酸と類似の結合特性を有し、そして参照ヌクレオチドと類似の様式で代謝される。そのような類似体の例として、限定されないが、ホスホロチオアート、ホスホロアミダート、メチルホスホナート、キラルメチルホスホナート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。
【０１４２】
特に明記されない限り、特定の核酸配列はまた、暗に、その保存的に修飾された変異体（例えば縮重コドン置換）及び相補配列、並びに明示的に示される配列を包含する。具体的には、以下で詳述されるように、縮重コドン置換は、１つ以上の選択された（又は全ての）コドンの第３の位置が、混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換されている配列を生じさせることによって、達成され得る（Ｂａｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１，１９９１；Ｏｈｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８，１９８５；及びＲｏｓｓｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８，１９９４）。
【０１４３】
用語「作動可能に結合される」は、２つ以上のポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ）セグメント間の機能的関係を指す。典型的に用語は、転写調節配列の、転写される配列との機能的関係を指す。例えば、プロモータ又はエンハンサ配列は、適切な宿主細胞又は他の発現系において、コード配列の転写を刺激又は調節するならば、コード配列に作動可能に結合されている。通常、転写される配列に作動可能に結合されるプロモータ転写調節配列は、転写される配列に物理的に隣接している、すなわちシス作用性である。しかしながら、一部の転写調節配列、例えばエンハンサは、転写を増強するコード配列に物理的に隣接する必要もないし、それに近接して位置決めされる必要もない。
【０１４４】
本明細書で使用される場合、用途「最適化された」は、産生細胞又は産生生物（一般的には真核細胞、例えばピキア（Ｐｉｃｈｉａ）の細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、又はヒト細胞）において好ましいコドンを使用して、アミノ酸配列をコードするようにヌクレオチド配列が変更されていることを意味する。最適化されたヌクレオチド配列は、「親」配列としても既知である開始ヌクレオチド配列により元々コードされているアミノ酸配列を完全に又は可能な限り保持するように操作されている。最適化された配列は、本明細書では、哺乳動物細胞で好ましいコドンを有するように操作されている。しかしながら、他の真核細胞又は原核細胞でのこの配列の最適化された発現も本明細書で想定される。最適化されたヌクレオチド配列によりコードされたアミノ酸配列も、最適化されたと称される。
【０１４５】
用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すのに、本明細書中で互換的に用いられる。当該用語は、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工化学模擬物であるアミノ酸ポリマーに、そして天然に存在するアミノ酸ポリマー及び天然に存在しないアミノ酸ポリマーに用いられる。特に明記されない限り、特定のポリペプチド配列はまた、暗に、その保存的に修飾された変異体を包含する。
【０１４６】
用語「組換えヒト抗体」は、本明細書で使用される場合、組換え手段により調製され、発現され、作製され、又は単離された全てのヒト抗体を含み、この抗体として下記が挙げられる：ヒト免疫グロブリン遺伝子又はそれから調製されるハイブリドーマに対してトランスジェニック又はトランスクロモソーマル（ｔｒａｎｓｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ）である動物（例えばマウス）から単離された抗体、ヒト抗体を発現するように形質転換された宿主細胞（例えばトランスフェクトーマ（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｏｍａ））から単離された抗体、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリから単離された抗体、及び他のＤＮＡ配列へのヒト免疫グロブリン遺伝子配列の全て又は一部のスプライシングを含む任意の他の手段により調製され、発現され、作製され、又は単離された抗体。そのような組換えヒト抗体は、フレームワーク領域及びＣＤＲ領域がヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する。しかしながら、特定の実施形態において、そのような組換えヒト抗体は、インビトロでの突然変異誘発（又は、ヒトＩｇ配列に対してトランスジェニックな動物を使用する場合には、インビボでの体細胞突然変異誘発）に供され得、そのため、この組換え抗体のＶＨ領域及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列のＶＨ配列及びＶＬ配列に由来し且つ関連している一方で、インビボでヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然には存在し得ない配列である。
【０１４７】
用語「組換え宿主細胞」（又は単に「宿主細胞」）は、組換え発現ベクターが導入されている細胞を指す。そのような用語は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫も指すことが意図されていることを理解すべきである。突然変異又は環境の影響のいずれかに起因して、後継の世代では特定の改変が起こる場合があることから、そのような子孫は実際には親細胞と同一ではない可能性があるが、本明細書で使用される用語「宿主細胞」の範囲には依然として含まれる。
【０１４８】
用語「対象」は、ヒト及び非ヒト動物を含む。非ヒト動物は、全ての脊椎動物（例えば、哺乳動物及び非哺乳動物）を含み、例えば、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、及び爬虫類を含む。注記した場合以外では、用語「患者」又は「対象」は、本明細書では互換的に使用される。本明細書で使用される場合、用語「ｃｙｎｏ」又は「カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ）」は、カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  ｍｏｎｋｅｙ）（カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ））を指す。
【０１４９】
本明細書中で用いられる用語、いずれかの疾患又は障害（例えば、図２１に関連する障害）を「処置すること」、又はその「処置」は、一実施形態において、疾患又は障害を改善すること（すなわち、疾患の進行、又はその臨床病徴の少なくとも１つを遅らせ、抑制し、又は軽減すること）を指す。別の実施形態において、「処置すること」、又は「処置」は、患者によって識別され得ないものを含む少なくとも１つの物理的パラメータを軽減又は改善することを指す。さらに別の実施形態において、「処置すること」、又は「処置」は、物理的に（例えば、識別できる病徴の安定化）、生理的に（例えば、物理的パラメータの安定化）、又は両方で、疾患又は障害を調節することを指す。さらに別の実施形態において、「処置すること」、又は「処置」は、疾患又は障害の発症又は進行を予防し、又は遅延させることを指す。
【０１５０】
「予防」は、本明細書で説明された適応症（例えば、ＦＧＦ２１関連障害）に関する場合、ＦＧＦ２１関連疾患のパラメータの悪化のリスクのある患者において、下記で説明するように、例えば、前記悪化を予防するか、又は遅延させるあらゆる作用を意味する。
【０１５１】
用語「ベクター」は、このベクターが連結されている別のポリヌクレオチドを輸送し得るポリヌクレオチド分子を指すことが意図されている。ベクターの１つのタイプは「プラスミド」であり、このプラスミドは、追加のＤＮＡセグメントがライゲートされ得る環状の二本鎖ＤＮＡループを指す。ベクターの別のタイプはウイルスベクター（例えばアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ又はＡＡＶ２））であり、このウイルスゲノム中に追加のＤＮＡセグメントがライゲートされ得る。特定のベクターは、このベクターが導入される宿主細胞中での自律複製が可能である（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター、及びエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時にこの宿主細胞のゲノムに組み込まれ得、それにより宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターは、このベクターが作動可能に連結されている遺伝子の発現を指示し得る。そのようなベクターは、本明細書において「組換え発現ベクター」（又は単に「発現ベクター」と称される。
【０１５２】
一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターはプラスミドの形態であることが多い。本明細書では、「プラスミド」及び「ベクター」は、プラスミドがベクターの最も一般的に使用される形態であることから互換的に使用され得る。しかしながら、本開示は、同等の機能を果たす発現ベクター（例えばウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス））のそのような他の形態を含むことが意図されている。
【０１５３】
「ＦＧＦ２１活性の調節」は、本明細書で使用される場合、例えば、薬剤とＦＧＦ２１ポリヌクレオチド若しくはＦＧＦ２１ポリペプチドとの相互作用の結果、ＦＧＦ２１シグナル伝達経路の活性化の結果、及び／又はＦＧＦ２１媒介シグナル伝達（例えば、ＦＧＦ２１−レセプター依存性シグナル伝達）の活性化の結果、及び同類の結果であり得るＦＧＦ２１活性の増加又は減少を指す。例えば、生物活性の調節は、生物活性の増加又は減少を指す。対象の血中のグルコース、インスリン、トリグリセリド、若しくはコレステロールのレベルをアッセイすることが挙げられるがこれに限定されない手段により；ベータ−クロトー及び／若しくはＦＧＦレセプター（例えばＦＧＦＲ−１ｃ）のポリペプチドレベルを評価することにより；又は、ＦＧＦ２１媒介シグナル伝達（例えば、ＦＧＦ２１−レセプター依存性シグナル伝達）の活性化を評価することにより、ＦＧＦ２１活性を評価し得る。
【０１５４】
例えば、ＦＧＦ２１下流バイオマーカーのレベルを測定し、且つＦＧＦ２１シグナル伝達の増加を測定することによっても、ＦＧＦ２１活性の比較を達成し得る。下記の測定によっても活性を評価し得る：細胞シグナル伝達；キナーゼ活性；脂肪細胞中へのグルコースの取込み；血中のインスリン、トリグリセリド、又はコレステロールのレベルの変動；肝臓脂質又は肝臓トリグリセリドのレベルの変化；ＦＧＦ２１及び／若しくはベータ−クロトーとＦＧＦ２１レセプターとの間の相互作用；又はＦＧＦ２１レセプターのリン酸化。一部の実施形態において、ＦＧＦ２１レセプターのリン酸化はチロシンリン酸化であり得る。一部の実施形態において、ＦＧＦ２１活性の調節は、ＦＧＦ２１関連表現型の調節を生じ得る。
【０１５５】
「ＦＧＦ２１下流バイオマーカー」は、本明細書で使用される場合、遺伝子若しくは遺伝子産物、又は遺伝子若しくは遺伝子産物の測定可能な指標である。一部の実施形態において、ＦＧＦ２１の下流マーカーである遺伝子又は活性は、発現のレベルの変化を示すか、又は血管組織中でのレベルの変化を示す。一部の実施形態において、下流マーカーの活性は、ＦＧＦ２１モジュレータの存在下で変化する。一部の実施形態において、ＦＧＦ２１が本開示のＦＧＦ２１モジュレータにより撹乱されると、下流マーカーは発現レベルの変化を示す。ＦＧＦ２１下流マーカーとして、グルコース又は２−デオキシ−グルコースの取込み、ｐＥＲＫ及び他のリン酸化タンパク質若しくはアセチル化タンパク質、又はＮＡＤのレベルが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１５６】
本明細書で使用される場合、用語「上方調節する」は、活性又は量の増加、活性化、又は刺激を指す。例えば、本開示の文脈において、ＦＧＦ２１モジュレータは、ベータ−クロトー及び／又はＦＧＦ２１レセプターの活性を増加させ得る。一実施形態において、ＦＧＦＲ−１ｃは、ＦＧＦ２１モジュレータに応答して上方調節され得る。上方調節はまた、ＦＧＦ２１関連活性も指し得、例えば、血中のグルコース、インスリン、トリグリセリド、若しくはコレステロールのレベルを低下させる能力；肝臓の脂質若しくはトリグリセリドのレベルを減少させる能力；体重を減少させる能力；耐糖能、エネルギー消費、若しくはインスリン感受性を改善させる能力；又はＦＧＦ２１レセプターのリン酸化を引き起こす能力；又はＦＧＦ２１下流マーカーを増加させる能力も指し得る。ＦＧＦ２１レセプターは、β−クロトー及びＦＧＦＲ−１ｃであり得る。上方調節は、コントロールと比較して、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも２５０％、少なくとも４００％、又は少なくとも５００％であり得る。
【０１５７】
本明細書で使用される場合、用語「モジュレータ」は、ＦＧＦ２１関連障害と関連する１種又は複数種の生理学的な又は生化学的な事象（例えば、１型糖尿病若しくは２型糖尿病、又は肥満のような代謝状態）を調節する組成物を指す。前記事象として、血中のグルコース、インスリン、トリグリセリド、又はコレステロールのレベルを低下させる能力；肝臓脂質又は肝臓トリグリセリドのレベルを低下させる能力；体重を減少させる能力；及び耐糖能、エネルギー消費、又はインスリン感受性を改善させる能力が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１５８】
ＦＧＦ２１タンパク質
本開示は、本明細書で定義されているように、ＦＧＦ２１媒介シグナル伝達（例えば、ＦＧＦ２１−レセプター媒介シグナル伝達）を誘発し得るＦＧＦ２１模倣抗体（例えば、ベータ−クロトー（β−クロトー）に結合するモノクローナル抗体）を提供する。インビボでは、ＦＧＦ２１の成熟型は、この分子の活性型である。例示的なヒトＦＧＦ２１野生型配列は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿０６１９８６．１を有し、例えば、下記に記載されているように、米国特許第６，７１６，６２６Ｂ１号明細書等の発行された特許中に見出され得る（配列番号１）。
【化１】
2020506728.tif 000002
【０１５９】
完全長ＦＧＦ２１ポリペプチドをコードする、対応するｍＲＮＡ配列（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿０１９１１３．２）を下記に示す（配列番号２）
【化２】
2020506728.tif 000003
【０１６０】
成熟ＦＧＦ２１配列はリーダー配列を欠いており、且つ他のポリペプチド改変も含み得、この他のポリペプチド改変として、アミノ末端（リーダー配列を有するか、若しくは有しない）及び／又はカルボキシル末端のタンパク質分解プロセシング、より大きな前駆体からのより小さいポリペプチドの開裂、Ｎ−結合グリコシル化及び／又はＯ−結合グリコシル化、並びに当業者により理解される他の翻訳後改変が挙げられる。成熟ＦＧＦ２１配列の代表例は、下記の配列（配列番号５３、完全長ＦＧＦ２１タンパク質配列（ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿０６１９８６．１）のアミノ酸位置２９〜２０９を表す）を有する。
【化３】
2020506728.tif 000004
【０１６１】
成熟ＦＧＦ２１ポリペプチド（配列番号５３）をコードする、対応するｃＤＮＡ配列を下記に示す（配列番号６３）。
【化４】
2020506728.tif 000005
【０１６２】
ＦＧＦ２１模倣抗体＆抗原結合フラグメント
本開示は、β−クロトー（例えば、ヒトβ−クロトー）に特異的に結合する抗体を提供する。一部の実施形態において、本開示は、ヒト及びカニクイザルのβ−クロトーに特異的に結合する抗体を提供する。本開示の抗体として、実施例で説明するように単離された、ヒトモノクローナル抗体及びＦａｂが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６３】
β−クロトー野生型配列はＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿７８３８６４．１を有し、且つＸｕ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２８２（４０）：２９０６９−７２及びＬｉｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２８２（３７）：２７２７７−８４等の文献中に見出され得る。ヒトβ−クロトーをコードする完全長ｃＤＮＡは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿１７５７３７）を有する。このタンパク質配列は下記のとおりである（配列番号５２）。
【化５】
2020506728.tif 000006
【０１６４】
本開示は、β−クロトータンパク質（例えば、ヒト及び／又はカニクイザルのβ−クロトー）に特異的に結合し、且つβ−クロトー／ＦＧＦＲ１ｃレセプター複合体の活性を活性化し得るか又は増加させ得る抗体及びその抗原結合フラグメントであって、この抗体は表１で説明されている（例えば、ＮＯＶ００５又はＮＯＶ００６）、抗体及びその抗原結合フラグメントを提供する。具体的な態様において、β−クロトータンパク質（例えば、ヒト及び／又はカニクイザルのβ−クロトー）に特異的に結合し、且つβ−クロトー／ＦＧＦＲ１ｃレセプター複合体の活性を活性化し得るか又は増加させ得る、本明細書で提供される抗体及びその抗原結合フラグメントは、表２で説明された抗体（例えば、ＮＯＶ００１、ＮＯＶ００２、ＮＯＶ００３、又はＮＯＶ００４）ではない。表２で説明された抗体は、２０１６年８月２日に出願されたＰＣＴ国際特許出願第ＰＣＴ／ＩＢ２０１６／０５４６６０号で説明されており、この出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１６５】
本開示は、β−クロトータンパク質（例えば、ヒト及び／又はカニクイザルのβ−クロトー）に特異的に結合する抗体であって、配列番号１５のアミノ酸配列を有するＶＨドメインを含む抗体を提供する。本開示はまた、β−クロトータンパク質に特異的に結合する抗体であって、下記の表１で列挙されたＶＨ  ＣＤＲのうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲを含む抗体も提供する。具体的には、本開示は、β−クロトータンパク質（例えば、ヒト及びカニクイザルのβ−クロトー）に特異的に結合する抗体であって、下記の表１で列挙されたＶＨ  ＣＤＲのうちのいずれかのアミノ酸配列を有する１個、２個、３個、又はより多くのＶＨ  ＣＤＲを含む（あるいは、からなる）抗体を提供する。
【０１６６】
本開示は、β−クロトータンパク質に特異的に結合する抗体であって、配列番号２６又は３２のアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含む前記抗体を提供する。本開示はまた、β−クロトータンパク質（例えば、ヒト及びカニクイザルのβ−クロトー）に特異的に結合する抗体であって、下記の表１で列挙されたＶＬ  ＣＤＲのうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲを含む抗体も提供する。具体的には、本開示は、β−クロトータンパク質（例えば、ヒト及びカニクイザルのβ−クロトー）に特異的に結合する抗体であって、下記の表１で列挙されたＶＬ  ＣＤＲのうちのいずれかのアミノ酸配列を有する１個、２個、３個、又はより多くのＶＬ  ＣＤＲを含む（あるいは、からなる）抗体を提供する。
【０１６７】
本開示の他の抗体は、アミノ酸であって、突然変異しているが、表１で説明された配列中に示されるＣＤＲ領域と、ＣＤＲ領域中において少なくとも６０、７０、８０、８５、９０、又は９５パーセントの同一性を依然として有するアミノ酸を含む。一部の実施形態において、本開示の他の抗体は、表１で説明された配列中に示されるＣＤＲ領域と比較した場合に、ＣＤＲ領域中において１個、２個、３個、４個、又は５個以下のアミノ酸が突然変異している突然変異アミノ酸配列を含む。
【０１６８】
本開示はまた、β−クロトータンパク質（例えば、ヒト及びカニクイザルのβ−クロトー）に特異的に結合する抗体のＶＨ、ＶＬ、完全長重鎖、及び完全長軽鎖をコードする核酸配列を含む核酸分子又はポリヌクレオチドも提供する。そのような核酸配列を、哺乳動物細胞中での発現に最適化し得る（例えば、表１は、本開示の抗体の重鎖及び軽鎖に最適化された核酸配列を示す）。
【０１６９】
【表１】
2020506728.tif 000007
【０１７０】
【表２】
2020506728.tif 000008
【０１７１】
【表３】
2020506728.tif 000009
【０１７２】
【表４】
2020506728.tif 000010
【０１７３】
【表５】
2020506728.tif 000011
【０１７４】
【表６】
2020506728.tif 000012
【０１７５】
【表７】
2020506728.tif 000013
【０１７６】
【表８】
2020506728.tif 000014
【０１７７】
【表９】
2020506728.tif 000015
【０１７８】
【表１０】
2020506728.tif 000016
【０１７９】
【表１１】
2020506728.tif 000017
【０１８０】
【表１２】
2020506728.tif 000018
【０１８１】
本開示の他の抗体として、アミノ酸又はこのアミノ酸をコードする核酸が突然変異しているが、表１で説明された配列に対して少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、又は９５パーセントの同一性を依然として有する抗体が挙げられる。一部の実施形態は、実質的に同一の抗原結合活性を保持しつつ、表１で説明された配列中に示された可変領域と比較した場合に、可変領域中で１個、２個、３個、４個、又は５個を超えるアミノ酸が突然変異している突然変異アミノ鎖配列を含む。
【０１８２】
本開示の他の抗体として、アミノ酸又はこのアミノ酸をコードする核酸が突然変異しているが、表１で説明された配列に対して少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、又は９５パーセントの同一性を依然として有する抗体が挙げられる。一部の実施形態は、実質的に同一の抗原結合活性を保持しつつ、表１で説明された配列中に示された可変領域と比較した場合に、可変領域中で１個、２個、３個、４個、又は５個を超えるアミノ酸が突然変異している突然変異アミノ鎖配列を含む。
【０１８３】
これらの抗体はそれぞれβ−クロトーに結合し得ることから、ＶＨ配列、ＶＬ配列、完全長軽鎖配列、及び完全長重鎖配列（アミノ酸配列、及びこのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列）を「混合且つマッチ（ｍｉｘｅｄ  ａｎｄ  ｍａｔｃｈｅｄ）」させて、本開示の他のβ−クロトー結合抗体を作製し得る。そのような「混合且つマッチ」されたβ−クロトー結合抗体を、当技術分野で既知の結合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、及び実施例の項で説明される他のアッセイ）を使用して試験し得る。これらの鎖が混合且つマッチされている場合には、特定のＶＨ／ＶＬの対合由来のＶＨ配列は、構造的に類似するＶＨ配列に置き換えられているべきである。同様に、特定の完全長重鎖／完全長軽鎖の対合由来の完全長重鎖配列は、構造的に類似する完全長重鎖配列に置き換えられているべきである。同様に、特定のＶＨ／ＶＬの対合由来のＶＬ配列は、構造的に類似するＶＬ配列に置き換えられているべきである。同様に、特定の完全長重鎖／完全長軽鎖の対合由来の完全長軽鎖配列は、構造的に類似する完全長軽鎖配列に置き換えられているべきである。
【０１８４】
従って、一多様において、本開示は、単離抗体（例えばモノクローナル抗体）又はその抗原結合領域であって、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号２６又は３２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを有し、この抗体はβ−クロトー（例えば、ヒト及びカニクイザルのβ−クロトー）に特異的に結合する、単離抗体又はその抗原結合領域を提供する。
【０１８５】
別の態様において、本開示は、（ｉ）単離抗体であって、配列番号１７のアミノ酸配列（哺乳動物細胞中での発現に最適化されている）を含む完全長重鎖と、配列番号２８若しくは３４のアミノ酸配列（哺乳動物細胞中での発現に最適化されている）を含む完全長軽鎖とを有する単離抗体、又は（ｉｉ）その抗原結合部分を含む機能的タンパク質を提供する。より具体的には、特定の態様において、本開示は、重鎖及び軽鎖を含む単離抗体又はその抗原結合領域であって、この重鎖及び軽鎖はそれぞれ、配列番号１７及び２８、又は配列番号１７及び３４から選択されるアミノ酸配列を含む、単離抗体又はその抗原結合領域を提供する。
【０１８６】
具体的な態様において、本明細書で提供されるのは、β−クロトーのエピトープに結合し且つＦＧＦ２１レセプター複合体（例えばＦＧＦＲ１ｃ−β−クロトーレセプター複合体）の活性を誘発する単離抗体（例えばモノクローナル抗体）又はその抗原結合フラグメントであって、この抗体又はフラグメントは、配列番号１５のアミノ酸配列又はその少なくとも９０％若しくは９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号２６若しくは３２のアミノ酸配列又はその少なくとも９０％若しくは９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、単離抗体又はその抗原結合フラグメントである。
【０１８７】
具体的な態様において、本明細書で提供されるのは、β−クロトーのエピトープに結合し且つＦＧＦ２１レセプター複合体（例えばＦＧＦＲ１ｃ−β−クロトーレセプター複合体）の活性を誘発する単離抗体（例えばモノクローナル抗体）又はその抗原結合フラグメントであって、この抗体又はフラグメントは、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨを含む、単離抗体又はその抗原結合フラグメントである。
【０１８８】
具体的な態様において、本明細書で提供されるのは、β−クロトーのエピトープに結合し且つＦＧＦ２１レセプター複合体（例えばＦＧＦＲ１ｃ−β−クロトーレセプター複合体）の活性を誘発する単離抗体（例えばモノクローナル抗体）又はその抗原結合フラグメントであって、この抗体又はフラグメントは、配列番号２６又は３２のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、単離抗体又はその抗原結合フラグメントである。
【０１８９】
具体的な態様において、本明細書で提供されるのは、β−クロトーのエピトープに結合し且つＦＧＦ２１レセプター複合体（例えばＦＧＦＲ１ｃ−β−クロトーレセプター複合体）の活性を誘発する単離抗体（例えばモノクローナル抗体）又はその抗原結合フラグメントであって、この抗体又はフラグメントは、（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号２６のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は（ｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号３２のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、単離抗体又はその抗原結合フラグメントである。
【０１９０】
具体的な態様において、本明細書で提供されるのは、β−クロトーのエピトープに結合し且つＦＧＦ２１レセプター複合体（例えばＦＧＦＲ１ｃ−β−クロトーレセプター複合体）の活性を誘発する単離抗体（例えばモノクローナル抗体）又はその抗原結合フラグメントであって、この抗体は、（ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号２８のアミノ酸配列を含む軽鎖、又は（ｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、単離抗体又はその抗原結合フラグメントである。
【０１９１】
具体的な態様において、本明細書で提供されるのは、β−クロトーのエピトープに結合し且つＦＧＦ２１レセプター複合体（例えばＦＧＦＲ１ｃ−β−クロトーレセプター複合体）の活性を誘発する単離抗体（例えばモノクローナル抗体）又はその抗原結合フラグメントであって、この抗体又は抗原結合フラグメントは、表２に記載された抗体ＮＯＶ００４の組合せＣＤＲ又はＫａｂａｔ  ＣＤＲを含まない、単離抗体又はその抗原結合フラグメントである。
【０１９２】
用語「相補性決定領域」及び「ＣＤＲ」は、本明細書で使用される場合、抗原特異性及び結合親和性を付与する抗体可変領域内のアミノ酸の配列を指す。一般に、各重鎖可変領域中に３個のＣＤＲが存在し（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）、且つ各軽鎖可変領域中に３個のＣＤＲが存在する（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）。
【０１９３】
所与のＣＤＲの正確なアミノ酸配列の境界を、多くの公知のスキームのいずれかを使用して容易に決定し得、このスキームとして、下記で説明されているものが挙げられる：Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１），”Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（「Ｋａｂａｔ」ナンバリングスキーム）、Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）ＪＭＢ  ２７３，９２７−９４８（「Ｃｈｏｔｈｉａ」ナンバリングスキーム）、及びＩｍＭｕｎｏＧｅｎＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）ナンバリング（Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．，Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ，７，１３２−１３６（１９９９）；Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７，５５−７７（２００３）（「ＩＭＧＴ」ナンバリングスキーム）。例えば、古典的フォーマットの場合、Ｋａｂａｔ下では、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）中のＣＤＲアミノ酸残基には、３１〜３５（ＨＣＤＲ１）、５０〜６５（ＨＣＤＲ２）、及び９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）の番号が付され、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）中のＣＤＲアミノ酸残基には、２４〜３４（ＬＣＤＲ１）、５０〜５６（ＬＣＤＲ２）、及び８９〜９７（ＬＣＤＲ３）の番号が付される。Ｃｈｏｔｈｉａ下では、ＶＨ中のＣＤＲアミノ酸には、２６〜３２（ＨＣＤＲ１）、５２〜５６（ＨＣＤＲ２）、及び９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）の番号が付され、ＶＬ中のアミノ酸残基には、２６〜３２（ＬＣＤＲ１）、５０〜５２（ＬＣＤＲ２）、及び９１〜９６（ＬＣＤＲ３）の番号が付される。Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの両方のＣＤＲ定義を組み合わせることにより、ＣＤＲは、ヒトＶＨ中のアミノ酸残基２６〜３５（ＨＣＤＲ１）、５０〜６５（ＨＣＤＲ２）、及び９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）と、ヒトＶＬ中のアミノ酸残基２４〜３４（ＬＣＤＲ１）、５０〜５６（ＬＣＤＲ２）、及び８９〜９７（ＬＣＤＲ３）とからなる。ＩＭＧＴ下では、ＶＨ中のＣＤＲアミノ酸残基には、約２６〜３５（ＣＤＲ１）、５１〜５７（ＣＤＲ２）、及び９３〜１０２（ＣＤＲ３）の番号が付され、ＶＬ中のＣＤＲアミノ酸残基には、約２７〜３２（ＣＤＲ１）、５０〜５２（ＣＤＲ２）、及び８９〜９７（ＣＤＲ３）の番号が付される（「Ｋａｂａｔ」に従うナンバリング）。ＩＭＧＴ下では、抗体のＣＤＲ領域は、プログラムＩＭＧＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐ  Ａｌｉｇｎを使用して決定され得る。Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの両方のＣＤＲ定義を組み合わせることにより、「組合せ」ＣＤＲは、ヒトＶＨ中のアミノ酸残基２６〜３５（ＨＣＤＲ１）、５０〜６５（ＨＣＤＲ２）、及び９９〜１０８（ＨＣＤＲ３）と、ヒトＶＬ中のアミノ酸残基２４〜３９（ＬＣＤＲ１）、５５〜６１（ＬＣＤＲ２）、及び９４〜１０２（ＬＣＤＲ３）とからなり得る。
【０１９４】
別の態様において、本開示は、表１で説明された重鎖及び軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、又はそれらの組合せを含むβ−クロトー結合抗体を提供する。具体的な態様において、これらのＣＤＲはＫａｂａｔシステムを使用して描写される。別の具体的な態様において、これらのＣＤＲは組合せシステムを使用して描写される。
【０１９５】
これらの抗体のそれぞれがβ−クロトーに結合し得、且つ抗原結合特異性が、ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、及びＣＤＲ３領域により主に付与されることを考慮すると、ＶＨ  ＣＤＲ１、２、及び３の配列、並びにＶＬ  ＣＤＲ１、２、及び３の配列は「混合且つマッチ」され得る（即ち、異なる抗体からのＣＤＲが混合且つマッチされ得るが、各抗体は、本開示の他のβ−クロトー結合分子を作製するために、ＶＨ  ＣＤＲ１、２、及び３、並びにＶＬ  ＣＤＲ１、２、及び３を好ましくは含む）。そのような「混合且つマッチ」されたβ−クロトー結合抗体を、当技術分野で既知の結合アッセイ及び実施例で説明されているもの（例えば、ＥＬＩＳＡ、ＳＥＴ、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）結合アッセイ）を使用して試験し得る。ＶＨ  ＣＤＲ配列が混合且つマッチされている場合には、特定のＶＨ配列からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／又はＣＤＲ３の配列は、構造的に類似するＣＤＲ配列に置き換えられているべきである。同様に、ＶＬ  ＣＤＲ配列が混合且つマッチされている場合には、特定のＶＬ配列からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／又はＣＤＲ３の配列は、構造的に類似するＣＤＲ配列に置き換えられているべきである。１個又は複数個のＶＨ  ＣＤＲ領域及び／又はＶＬ  ＣＤＲ領域の配列を、本開示のモノクローナル抗体に関して本明細書で示されたＣＤＲ配列からの構造的に類似する配列に置き換えることにより、新規のＶＨ及びＶＬの配列を作製し得ることが、当業者に容易に明らかであるだろう。上述に加えて、一実施形態において、本明細書で説明された抗体の抗原結合フラグメントは、ＶＨ  ＣＤＲ１、２、及び３、又はＶＬ  ＣＤＲ１、２、及び３を含み得、このフラグメントは、単一可変ドメインとしてβ−クロトーに結合する。
【０１９６】
本開示の特定の実施形態において、本抗体又はその抗原結合フラグメントは、表１で説明されたＦａｂの重鎖及び軽鎖の配列を有し得る。より具体的には、この抗体又はその抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ  ＮＯＶ００５又はＮＯＶ００６の重鎖及び軽鎖の配列を有し得る。
【０１９７】
本開示の特定の実施形態において、β−クロトーに特異的に結合する抗体又は抗原結合フラグメントは、例えば、表１に記載されているように、Ｆａｂ  ＮＯＶ００５又はＮＯＶ００６の重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３と、Ｆａｂ  ＮＯＶ００５又はＮＯＶ００６の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３とを含む。
【０１９８】
本開示の他の実施形態において、β−クロトーに特異的に結合する抗体又は抗原結合フラグメントは、Ｋａｂａｔにより定義され且つ表１で説明された重鎖可変領域ＣＤＲ１、重鎖可変領域ＣＤＲ２、重鎖可変領域ＣＤＲ３、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、軽鎖可変領域ＣＤＲ２、及び軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。本開示のさらに他の実施形態において、β−クロトーに特異的に結合する抗体又は抗原結合フラグメントは、Ｃｈｏｔｈｉａにより定義され且つ表１で説明された重鎖可変領域ＣＤＲ１、重鎖可変領域ＣＤＲ２、重鎖可変領域ＣＤＲ３、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、軽鎖可変領域ＣＤＲ２、及び軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。本開示のさらに他の実施形態において、β−クロトーに特異的に結合する抗体又は抗原結合フラグメントは、Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの組合せにより定義され且つ表１で説明された重鎖可変領域ＣＤＲ１、重鎖可変領域ＣＤＲ２、重鎖可変領域ＣＤＲ３、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、軽鎖可変領域ＣＤＲ２、及び軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。本開示のさらに他の実施形態において、β−クロトーに特異的に結合する抗体又は抗原結合フラグメントは、ＩＭＧＴにより定義され且つ表１で説明された重鎖可変領域ＣＤＲ１、重鎖可変領域ＣＤＲ２、重鎖可変領域ＣＤＲ３、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、軽鎖可変領域ＣＤＲ２、及び軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
【０１９９】
特定の実施形態において、本開示は、表１で説明された、β−クロトーに特異的に結合する抗体又は抗原結合フラグメント（例えば、抗体ＮＯＶ００５又はＮＯＶ００６）を含む。好ましい実施形態において、β−クロトーに結合し且つＦＧＦ２１レセプター複合体を活性化する抗体又は抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ  ＮＯＶ００５又はＮＯＶ００６である。
【０２００】
具体的な態様において、本明細書で提供されるのは、β−クロトーのエピトープに結合し且つＦＧＦ２１レセプター複合体（例えばＦＧＦＲ１ｃ−β−クロトーレセプター複合体）の活性を誘発する単離抗体（例えばモノクローナル抗体）又はその抗原結合フラグメントであって、この抗体又はその抗原結合フラグメントは、
（ｉ）配列番号６、９、１０又は１２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）；
（ｉｉ）配列番号７、１１又は１３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）；
（ｉｉｉ）配列番号８又は１４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
（ｉｖ）配列番号１９、３１、２２、又は２５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）；
（ｖ）配列番号２０又は２３のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）；
及び
（ｖｉ）配列番号２１又は２４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）
を含む、単離抗体又はその抗原結合フラグメントである。
【０２０１】
具体的な態様において、本明細書で提供されるのは、β−クロトーのエピトープに結合し且つＦＧＦ２１レセプター複合体（例えばＦＧＦＲ１ｃ−β−クロトーレセプター複合体）の活性を誘発する単離抗体（例えばモノクローナル抗体）又はその抗原結合フラグメントであって、この抗体又はその抗原結合フラグメントは、
（ｉ）配列番号６、９、１０又は１２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）；
（ｉｉ）配列番号７、１１、又は１３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）；
（ｉｉｉ）配列番号８又は１４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
（ｉｖ）配列番号３１、２２、又は２５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）；
（ｖ）配列番号２０又は２３のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）；
及び
（ｖｉ）配列番号２１又は２４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）
を含む、単離抗体又はその抗原結合フラグメントである。
【０２０２】
具体的な態様において、本明細書で提供されるのは、β−クロトーのエピトープに結合し且つＦＧＦ２１レセプター複合体（例えばＦＧＦＲ１ｃ−β−クロトーレセプター複合体）の活性を誘発する単離抗体（例えばモノクローナル抗体）又はその抗原結合フラグメントであって、この抗体又はその抗原結合フラグメントは、
（ｉ）配列番号６、９、１０、又は１２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）；
（ｉｉ）配列番号７、１１、又は１３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）；
（ｉｉｉ）配列番号８又は１４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
（ｉｖ）配列番号１９、３１、２２、又は２５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）；
（ｖ）配列番号２０又は２３のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）；
及び
（ｖｉ）配列番号２１又は２４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）
を含む、単離抗体又はその抗原結合フラグメントである。
【０２０３】
具体的な態様において、本明細書で提供されるのは、β−クロトーのエピトープに結合し且つＦＧＦ２１レセプター複合体（例えばＦＧＦＲ１ｃ−β−クロトーレセプター複合体）の活性を誘発する単離抗体（例えばモノクローナル抗体）又はその抗原結合フラグメントであって、この抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含むＶＨと、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含むＶＬとを含み、
ＨＣＤＲ１は配列番号６のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２は配列番号７のアミノ鎖配列を含み、ＨＣＤＲ３は配列番号８のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１は配列番号３１のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２は配列番号２０のアミノ酸配列を含み、且つＬＣＤＲ３は配列番号２１のアミノ酸配列を含む、
単離抗体又はその抗原結合フラグメントである。
【０２０４】
具体的な態様において、本明細書で提供されるのは、β−クロトーのエピトープに結合し且つＦＧＦ２１レセプター複合体（例えばＦＧＦＲ１ｃ−β−クロトーレセプター複合体）の活性を誘発する単離抗体（例えばモノクローナル抗体）又はその抗原結合フラグメントであって、この抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含むＶＨと、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含むＶＬとを含み、
ＨＣＤＲ１は配列番号９のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２は配列番号７のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３は配列番号８のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１は配列番号３１のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２は配列番号２０のアミノ酸配列を含み、且つＬＣＤＲ３は配列番号２１のアミノ酸配列を含む、
単離抗体又はその抗原結合フラグメントである。
【０２０５】
具体的な態様において、本明細書で提供されるのは、β−クロトーのエピトープに結合し且つＦＧＦ２１レセプター複合体（例えばＦＧＦＲ１ｃ−β−クロトーレセプター複合体）の活性を誘発する単離抗体（例えばモノクローナル抗体）又はその抗原結合フラグメントであって、この抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含むＶＨと、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含むＶＬとを含み、
ＨＣＤＲ１は配列番号１０のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２は配列番号１１のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３は配列番号８のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１は配列番号２２のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２は配列番号２３のアミノ酸配列を含み、且つＬＣＤＲ３は配列番号２４のアミノ酸配列を含む、
単離抗体又はその抗原結合フラグメントである。
【０２０６】
具体的な態様において、本明細書で提供されるのは、β−クロトーのエピトープに結合し且つＦＧＦ２１レセプター複合体（例えばＦＧＦＲ１ｃ−β−クロトーレセプター複合体）の活性を誘発する単離抗体（例えばモノクローナル抗体）又はその抗原結合フラグメントであって、この抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含むＶＨと、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含むＶＬとを含み、
ＨＣＤＲ１は配列番号１２のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２は配列番号１３のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３は配列番号１４のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１は配列番号２５のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２は配列番号２３のアミノ酸配列を含み、且つＬＣＤＲ３は配列番号２１のアミノ酸配列を含む、
単離抗体又はその抗原結合フラグメントである。
【０２０７】
具体的な態様において、本明細書で提供されるのは、β−クロトーのエピトープに結合し且つＦＧＦ２１レセプター複合体（例えばＦＧＦＲ１ｃ−β−クロトーレセプター複合体）の活性を誘発する単離抗体（例えばモノクローナル抗体）又はその抗原結合フラグメントであって、この抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含むＶＨと、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含むＶＬとを含み、
（ｉ）ＨＣＤＲ１は配列番号６のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２は配列番号７のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３は配列番号８のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１は配列番号１９のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２は配列番号２０のアミノ酸配列を含み、且つＬＣＤＲ３は配列番号２１のアミノ酸配列を含むか、又は
（ｉｉ）ＨＣＤＲ１は配列番号９のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２は配列番号７のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３は配列番号８のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１は配列番号１９のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２は配列番号２０のアミノ酸配列を含み、且つＬＣＤＲ３は配列番号２１のアミノ酸配列を含む、
単離抗体又はその抗原結合フラグメントである。
【０２０８】
具体的な態様において、本明細書で提供されるのは、β−クロトーのエピトープに結合し且つＦＧＦ２１レセプター複合体（例えばＦＧＦＲ１ｃ−β−クロトーレセプター複合体）の活性を誘発する単離抗体（例えばモノクローナル抗体）又はその抗原結合フラグメントであって、この抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含むＶＨと、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含むＶＬとを含み、
ＨＣＤＲ１は配列番号１０のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２は配列番号１１のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３は配列番号８のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１は配列番号２２のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２は配列番号２３のアミノ酸配列を含み、且つＬＣＤＲ３は配列番号２４のアミノ酸配列を含む、
単離抗体又はその抗原結合フラグメントである。
【０２０９】
具体的な態様において、本明細書で提供されるのは、β−クロトーのエピトープに結合し且つＦＧＦ２１レセプター複合体（例えばＦＧＦＲ１ｃ−β−クロトーレセプター複合体）の活性を誘発する単離抗体（例えばモノクローナル抗体）又はその抗原結合フラグメントであって、この抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含むＶＨと、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含むＶＬとを含み、
ＨＣＤＲ１は配列番号１２のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２は配列番号１３のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３は配列番号１４のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１は配列番号２５のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２は配列番号２３のアミノ酸配列を含み、且つＬＣＤＲ３は配列番号２１のアミノ酸配列を含む、
単離抗体又はその抗原結合フラグメントである。
【０２１０】
具体的な態様において、本明細書で提供されるのは、β−クロトーのエピトープに結合し且つＦＧＦ２１レセプター複合体（例えばＦＧＦＲ１ｃ−β−クロトーレセプター複合体）の活性を誘発する単離抗体（例えばモノクローナル抗体）又はその抗原結合フラグメントであって、この抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＣＤＲ  ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含むＶＨと、ＣＤＲ  ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含むＶＬとを含み、この抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、配列番号１９又は３１のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む、単離抗体又はその抗原結合フラグメントである。
【０２１１】
具体的な態様において、本明細書で提供されるのは、β−クロトーのエピトープに結合し且つＦＧＦ２１レセプター複合体（例えばＦＧＦＲ１ｃ−β−クロトーレセプター複合体）の活性を誘発する単離抗体（例えばモノクローナル抗体）又はその抗原結合フラグメントであって、この抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＣＤＲ  ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含むＶＨと、ＣＤＲ  ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含むＶＬとを含み、この抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、配列番号１９又は３１のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む、単離抗体又はその抗原結合フラグメントである。
【０２１２】
具体的な態様において、本明細書で提供されるのは、β−クロトーのエピトープに結合し且つＦＧＦ２１レセプター複合体（例えばＦＧＦＲ１ｃ−β−クロトーレセプター複合体）の活性を誘発する単離抗体（例えばモノクローナル抗体）又はその抗原結合フラグメントであって、前記抗体又はフラグメントはβ−クロトー及び／−又はＦＧＦＲ１ｃの活性を増加させる、単離抗体又はその抗原結合フラグメントである。具体的な態様において、前記抗体又はそのフラグメントは、例えばホスホ−ＥＲＫ活性により決定した場合に、β−クロトー及び／又はＦＧＦＲ１ｃの活性を少なくとも約１０％又は２０％増加させる。具体的な態様において、前記抗体又はそのフラグメントは、例えばホスホ−ＥＲＫ活性により決定した場合に、β−クロトー及び／又はＦＧＦＲ１ｃの活性を少なくとも約３０％又は４０％増加させる。具体的な態様において、前記抗体又はそのフラグメントは、例えばホスホ−ＥＲＫ活性により決定した場合に、β−クロトー及び／又はＦＧＦＲ１ｃの活性を少なくとも約５０％又は６０％増加させる。具体的な態様において、前記抗体又はそのフラグメントは、例えばホスホ−ＥＲＫ活性により決定した場合に、β−クロトー及び／又はＦＧＦＲ１ｃの活性を少なくとも約７０％又は８０％増加させる。具体的な態様において、前記抗体又はそのフラグメントは、例えばホスホ−ＥＲＫ活性により決定した場合に、β−クロトー及び／又はＦＧＦＲ１ｃの活性を少なくとも約９０％又は９５％増加させる。
【０２１３】
具体的な態様において、本明細書で提供されるのは、β−クロトーのエピトープに結合し且つＦＧＦ２１レセプター複合体（例えばＦＧＦＲ１ｃ−β−クロトーレセプター複合体）の活性を誘発する単離抗体（例えばモノクローナル抗体）又はその抗原結合フラグメントであって、この抗体又は抗原結合フラグメントは、例えばＢＩＡＣＯＲＥ（商標）結合アッセイにより決定した場合に、５００ｐＭ又は４５０ｐＭ以下のＫＤでヒトβ−クロトータンパク質に結合する、単離抗体又はその抗原結合フラグメントである。具体的な態様において、本明細書で提供されるのは、β−クロトーのエピトープに結合し且つＦＧＦ２１レセプター複合体（例えばＦＧＦＲ１ｃ−β−クロトーレセプター複合体）の活性を誘発する単離抗体（例えばモノクローナル抗体）又はその抗原結合フラグメントであって、この抗体又は抗原結合フラグメントは、例えばＢＩＡＣＯＲＥ（商標）結合アッセイにより決定した場合に、４５０ｐＭ又は４００ｐＭ以下のＫＤでヒトβ−クロトータンパク質に結合する、単離抗体又はその抗原結合フラグメントである。
【０２１４】
具体的な態様において、本明細書で提供されるのは、β−クロトーのエピトープに結合し且つＦＧＦ２１レセプター複合体（例えばＦＧＦＲ１ｃ−β−クロトーレセプター複合体）の活性を誘発する単離抗体（例えばモノクローナル抗体）又はその抗原結合フラグメントであって、この抗体又は抗原結合フラグメントは、例えばＢＩＡＣＯＲＥ（商標）結合アッセイにより決定した場合に、１０ｐＭ又は２０ｐＭ以下のＫＤでヒトβ−クロトータンパク質に結合する、単離抗体又はその抗原結合フラグメントである。
【０２１５】
具体的な態様において、本明細書で提供されるのは、β−クロトーのエピトープに結合し且つＦＧＦ２１レセプター複合体（例えばＦＧＦＲ１ｃ−β−クロトーレセプター複合体）の活性を誘発する単離抗体（例えばモノクローナル抗体）又はその抗原結合フラグメントであって、前記β−クロトーのエピトープは、β−クロトー配列（配列番号５２）の残基２４６〜２６５、５３６〜５５０、８３４〜８５７、及び９５９〜９８６のうちの１個又は複数個のアミノ酸を含む、単離抗体又はその抗原結合フラグメントである。
【０２１６】
具体的な態様において、本明細書で提供されるのは、β−クロトーのエピトープに結合し且つＦＧＦ２１レセプター複合体（例えばＦＧＦＲ１ｃ−β−クロトーレセプター複合体）の活性を誘発する単離抗体（例えばモノクローナル抗体）又はその抗原結合フラグメントであって、前記エピトープは、β−クロトー配列（配列番号５２）の残基６４６〜６７０、６９６〜７００、及び６４６〜６８９のアミノ酸のうちの１個又は複数個を含む、単離抗体又はその抗原結合フラグメントである。
【０２１７】
具体的な態様において、本明細書で提供されるのは、β−クロトーのエピトープに結合し且つＦＧＦ２１レセプター複合体（例えばＦＧＦＲ１ｃ−β−クロトーレセプター複合体）の活性を誘発する単離抗体（例えばモノクローナル抗体）又はその抗原結合フラグメントであって、前記抗体又は抗原結合フラグメントは、水素重水素交換（ＨＤｘ）により決定した場合に、ヒトβ−クロトー（配列番号５２）の残基２４６〜２６５、５３６〜５５０、８３４〜８５７、及び９５９〜９８６のうちの１個又は複数個のアミノ酸を保護する、単離抗体又はその抗原結合フラグメントである。
【０２１８】
具体的な態様において、本明細書で提供されるのは、β−クロトーのエピトープに結合し且つＦＧＦ２１レセプター複合体（例えばＦＧＦＲ１ｃ−β−クロトーレセプター複合体）の活性を誘発する単離抗体（例えばモノクローナル抗体）又はその抗原結合フラグメントであって、前記抗体又は抗原結合フラグメントは、β−クロトー配列（配列番号５２）の残基６４６〜６７０、６９６〜７００、及び６４６〜６８９のアミノ酸のうちの１個又は複数個を保護する、単離抗体又はその抗原結合フラグメントである。
【０２１９】
具体的な態様において、本明細書で提供されるのは、β−クロトーのエピトープに結合し且つＦＧＦ２１レセプター複合体（例えばＦＧＦＲ１ｃ−β−クロトーレセプター複合体）の活性を誘発する単離抗体（例えばモノクローナル抗体）又はその抗原結合フラグメントであって、前記抗体又はフラグメントは、ヒトβ−クロトー（配列番号５２）の残基７０１（Ｔｙｒ）又は７０３（Ａｒｇ）と接触しない、単離抗体又はその抗原結合フラグメント。
【０２２０】
具体的な態様において、本明細書で提供されるのは、β−クロトーのエピトープに結合し且つＦＧＦ２１レセプター複合体（例えばＦＧＦＲ１ｃ−β−クロトーレセプター複合体）の活性を誘発する単離抗体（例えばモノクローナル抗体）又はその抗原結合フラグメントであって、前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、例えば、ｐＥＲＫ細胞アッセイにより測定した場合に５０ｎＭ以下のＥＣ５０で、ヒトＦＧＦＲ１ｃ＿β−クロトーレセプター複合体を活性化し得る、単離抗体又はその抗原結合フラグメントである。
【０２２１】
具体的な態様において、本明細書で提供されるのは、β−クロトーのエピトープに結合し且つＦＧＦ２１レセプター複合体（例えばＦＧＦＲ１ｃ−β−クロトーレセプター複合体）の活性を誘発する単離抗体（例えばモノクローナル抗体）又はその抗原結合フラグメントであって、前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、例えば、ｐＥＲＫ細胞アッセイにより測定した場合に１００ｎＭ以下のＥＣ５０で、ヒトＦＧＦＲ１ｃ＿β−クロトーレセプター複合体を活性化し得る、単離抗体又はその抗原結合フラグメントである。
【０２２２】
具体的な態様において、本明細書で提供されるのは、β−クロトーのエピトープに結合し且つＦＧＦ２１レセプター複合体（例えばＦＧＦＲ１ｃ−β−クロトーレセプター複合体）の活性を誘発する単離抗体（例えばモノクローナル抗体）又はその抗原結合フラグメントであって、前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、例えば、ｐＥＲＫ細胞アッセイにより測定した場合に４０ｎＭ又は３０ｎＭ以下のＥＣ５０で、ヒトＦＧＦＲ１ｃ＿β−クロトーレセプター複合体を活性化し得る、単離抗体又はその抗原結合フラグメントである。
【０２２３】
具体的な態様において、本明細書で提供されるのは、β−クロトーのエピトープに結合し且つＦＧＦ２１レセプター複合体（例えばＦＧＦＲ１ｃ−β−クロトーレセプター複合体）の活性を誘発する単離抗体（例えばモノクローナル抗体）又はその抗原結合フラグメントであって、前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、例えば、ｐＥＲＫ細胞アッセイにより測定した場合に５０ｎＭ以下のＥＣ５０で、ヒトＦＧＦＲ１ｃ＿β−クロトーレセプター複合体を活性化し得、この抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＦＧＦＲ２ｃ−β−クロトーレセプター複合体、ＦＧＦＲ３ｃ−β−クロトーレセプター複合体、及び／又はＦＧＦＲ４−β−クロトーレセプター複合体を活性化し得ない、単離抗体又はその抗原結合フラグメントである。
【０２２４】
具体的な態様において、本明細書で提供されるのは、β−クロトーのエピトープに結合し且つＦＧＦ２１レセプター複合体（例えばＦＧＦＲ１ｃ−β−クロトーレセプター複合体）の活性を誘発する単離抗体（例えばモノクローナル抗体）又はその抗原結合フラグメントであって、前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、ｐＥＲＫ細胞アッセイにより測定した場合に５０ｎＭ以下のＥＣ５０で、カニクイザルＦＧＦＲ１ｃ＿β−クロトーレセプター複合体を活性化し得る、単離抗体又はその抗原結合フラグメントである。
【０２２５】
具体的な態様において、本明細書で提供されるのは、β−クロトーのエピトープに結合し且つＦＧＦ２１レセプター複合体（例えばＦＧＦＲ１ｃ−β−クロトーレセプター複合体）の活性を誘発する単離抗体（例えばモノクローナル抗体）又はその抗原結合フラグメントであって、前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、ｐＥＲＫ細胞アッセイにより測定した場合に４０ｎＭ又は３０ｎＭ以下のＥＣ５０で、カニクイザルＦＧＦＲ１ｃ＿β−クロトーレセプター複合体を活性化し得る、単離抗体又はその抗原結合フラグメントである。
【０２２６】
具体的な態様において、本明細書で提供されるのは、β−クロトーのエピトープに結合し且つＦＧＦ２１レセプター複合体（例えばＦＧＦＲ１ｃ−β−クロトーレセプター複合体）の活性を誘発する単離抗体（例えばモノクローナル抗体）又はその抗原結合フラグメントであって、前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、ｐＥＲＫ細胞アッセイにより測定した場合に２０ｎＭ以下のＥＣ５０で、カニクイザルＦＧＦＲ１ｃ＿β−クロトーレセプター複合体を活性化し得る、単離抗体又はその抗原結合フラグメントである。本明細書で使用される場合、ヒト抗体の可変領域又は完全長鎖が、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子を使用するシステムから得られる場合には、この抗体は、特定の生殖系列配列の「産物」であるか又はこの配列に「由来」する、重鎖若しくは軽鎖の可変領域又は完全長の重鎖若しくは軽鎖を含む。そのようなシステムは、目的の抗原により、ヒト免疫免疫グロブリン遺伝子を運ぶトランスジェニックマウスに免疫付与すること、又は目的の抗原により、ファージ上で提示されたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリをスクリーニングすることを含む。ヒト生殖系列免疫グロブリン配列の「産物」であるか又はこの配列に「由来」するヒト抗体は、ヒト抗体のアミノ酸配列をヒト生殖系列免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較し、このヒト抗体の配列に配列が最も近い（即ち、最大の同一性％）ヒト生殖系列免疫グロブリン配列を選択することにより、そのように同定され得る。
【０２２７】
特定のヒト生殖系列免疫グロブリン配列の「産物」であるか又はこの配列に「由来」するヒト抗体は、例えば、天然に存在する体細胞突然変異、又は部位特異的突然変異の意図的な導入に起因して、生殖系列配列と比較して異なるアミノ酸を含み得る。しかしながら、ＶＨ又はＶＬのフレームワーク領域において、選択されたヒト抗体は概して、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列に対してアミノ酸配列が少なくとも９０％同一であり、且つ他の種の生殖系列免疫グロブリンのアミノ酸配列（例えばマウスの生殖系列配列）と比較した場合に、このヒト抗体をヒトであると同定するアミノ酸残基を含む。特定の場合において、ヒト抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列に対してアミノ酸配列が少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、又は少なくとも９５％、又はさらに少なくとも９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一であり得る。
【０２２８】
典型的には、組換えヒト抗体は、ＶＨ又はＶＬのフレームワーク領域中において、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列とは１０個以下のアミノ酸の差異を示すだろう。特定の場合において、このヒト抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列とは５個以下の、又はさらに４個、３個、２個、又は１個以下のアミノ酸の差異を示し得る。ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子の例として、下記で説明される可変ドメイン生殖系列フラグメント、並びにＤＰ４７及びＤＰＫ９が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２２９】
相同な抗体
さらに別の実施形態において、本開示は、表１で説明された配列に対して相同であるアミノ酸配列を含む抗体又はその抗原結合フラグメントを提供し、この抗体は、β−クロトータンパク質（例えば、ヒト及びカニクイザルのβ−クロトー）に結合し、且つ表１で説明されたものの所望される機能特性（例えば、β−クロトー／ＦＧＦＲ１ｃレセプター複合体の活性及び／又はＦＧＦ２１の１種若しくは複数種の活性の活性化又は増加）を保持する。
【０２３０】
例えば、本開示は、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む単離抗体（例えば、β−クロトー／ＦＧＦＲ１ｃレセプター複合体の活性を活性化し得るか若しくは増加させ得る抗体）又はその機能的抗原結合フラグメントであって、この重鎖可変ドメインは、配列番号１５のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％同一であるか、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％同一であるか、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み、この軽鎖可変ドメインは、配列番号２６又は３２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％同一であるか、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％同一であるか、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み、この抗体は、β−クロトー（例えば、ヒト及びカニクイザルのβ−クロトー）に特異的に結合し、且つβ−クロトーの活性を誘発し、この重鎖可変ドメインは、表２に記載されたアミノ酸配列（例えば、配列番号４３又は５５のアミノ酸配列）を含まず、且つこの軽鎖可変領域は、表２に記載されたアミノ酸配列（例えば、配列番号４７又は５７のアミノ酸配列）を含まない、単離抗体又はその機能的抗原結合フラグメントを提供する。本開示の特定の態様において、この重鎖及び軽鎖の配列は、例えば表１に記載されているように、Ｋａｂａｔにより定義されたＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３の配列をさらに含む。本開示の特定の他の態様において、この重鎖及び軽鎖の配列はそれぞれ、例えば表１に記載されているように、Ｃｈｏｔｈｉａにより定義されたＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３の配列をさらに含む。本開示の特定の他の態様において、この重鎖及び軽鎖の配列はそれぞれ、例えば表１に記載されているように、組合せにより定義されたＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３の配列をさらに含む。本開示の特定の他の態様において、この重鎖及び軽鎖の配列はそれぞれ、例えば表１に記載されているように、ＩＭＧＴにより定義されたＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３の配列をさらに含む。
【０２３１】
例えば、本開示は、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む単離抗体（例えば、β−クロトー／ＦＧＦＲ１ｃレセプター複合体の活性を活性化し得るか若しくは増加させ得る抗体）又はその機能的抗原結合フラグメントであって、この重鎖可変ドメインは、配列番号１５のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％同一であるか、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％同一であるか、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み、この軽鎖可変ドメインは、配列番号２６又は３２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％同一であるか、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％同一であるか、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み、この抗体は、β−クロトー（例えば、ヒト及びカニクイザルのβ−クロトー）に特異的に結合し、この重鎖可変ドメインは、表２に記載されたアミノ酸配列（例えば、配列番号４３又は５５のアミノ酸配列）を含まず、且つこの軽鎖可変領域は、表２に記載されたアミノ酸配列（例えば、配列番号４７又は５７のアミノ酸配列）を含まない、単離抗体又はその機能的抗原結合フラグメントを提供する。本開示の特定の態様において、この重鎖及び軽鎖の配列は、例えば表１に記載されているように、Ｋａｂａｔにより定義されたＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３の配列をさらに含む。本開示の特定の他の態様において、この重鎖及び軽鎖の配列は、例えば表１に記載されているように、Ｃｈｏｔｈｉａにより定義されたＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３の配列をさらに含む。本開示の特定の他の態様において、この重鎖及び軽鎖の配列は、例えば表１に記載されているように、組合せにより定義されたＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３の配列をさらに含む。本開示の特定の他の態様において、この重鎖及び軽鎖の配列は、例えば表１に記載されているように、ＩＭＧＴにより定義されたＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３の配列をさらに含む。
【０２３２】
他の実施形態において、ＶＨ及び／又はＶＬのアミノ酸配列は、表１に記載された配列に対して５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であり得、この重鎖可変ドメインは、表２に記載されたアミノ酸配列（例えば配列番号４３又は５５のアミノ酸配列）を含まず、且つこの軽鎖可変領域は、表２に記載されたアミノ酸配列（例えば、配列番号４７又は５７のアミノ酸配列）を含まない。他の実施形態において、ＶＨ及び／又はＶＬのアミノ酸配列は、１箇所、２箇所、３箇所、４箇所、又は５箇所以下のアミノ酸位置でのアミノ酸置換を除いて同一であり得る。表１で説明されているもののＶＨ領域及びＶＬ領域に対して高い（即ち８０％以上の）同一性を有するＶＨ領域及びＶＬ領域を有する抗体を、それぞれ配列番号１０、３０、５０、又は７０、及び配列番号２０、４０、６０、又は８０をコードする核酸分子の突然変異誘発（例えば、部位特異的突然変異誘発又はＰＣＲ媒介突然変異誘発）、及びそれに続く、本明細書で説明された機能的アッセイを使用した、保持された機能に関する、コードされた変更抗体の試験により得ることができ、この重鎖可変ドメインは、表２に記載されたアミノ酸配列（例えば配列番号４３又は５５のアミノ酸配列）を含まず、且つこの軽鎖可変領域は、表２に記載されたアミノ酸配列（例えば配列番号４７又は５７のアミノ酸配列）を含まない。
【０２３３】
他の実施形態において、完全長重鎖及び／又は完全長軽鎖のアミノ酸配列は、表１に記載された配列に対して５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であり得、この重鎖は、表２に記載された重鎖アミノ酸配列（例えば、配列番号４５、５６、５９、又は６１のアミノ酸配列）を含まず、且つこの軽鎖は、表２に記載された軽鎖アミノ酸配列（例えば、配列番号４９、５８、６０、又は６２のアミノ酸配列）を含まない。配列番号１７の完全長重鎖及び配列番号２８又は３４の完全長軽鎖に対して高い（即ち８０％以上の）同一性を有する完全長重鎖及び完全長軽鎖を有する抗体を、そのようなポリペプチドをコードする核酸分子の突然変異誘発（例えば、部位特異的突然変異誘発又はＰＣＲ媒介突然変異誘発）、及びそれに続く、本明細書で説明された機能的アッセイを使用した、保持された機能に関する、コードされた変更抗体の試験により得ることができ、この重鎖は、表２に記載された重鎖アミノ酸配列（例えば配列番号４５、５６、５９、又は６１のアミノ酸配列）を含まず、且つこの軽鎖は、表２に記載された軽鎖アミノ酸配列（例えば配列番号４９、５８、６０、又は６２のアミノ酸配列）を含まない。配列番号１７の完全長重鎖及び配列番号２８又は３４の完全長軽鎖に対して高い（即ち８０％以上の）同一性を有する完全長重鎖及び完全長軽鎖を有する抗体を、そのようなポリペプチドをコードする核酸分子の突然変異誘発（例えば、部位特異的突然変異誘発又はＰＣＲ媒介突然変異誘発）、及びそれに続く、本明細書で説明された機能的アッセイを使用した、保持された機能に関する、コードされた変更抗体の試験により得ることができ、この重鎖は、表２に記載された重鎖アミノ酸配列（例えば配列番号４５、５６、５９、又は６１のアミノ酸配列）を含まず、且つこの軽鎖は、表２に記載された軽鎖アミノ酸配列（例えば配列番号４９、５８、６０、又は６２のアミノ酸配列）を含まない。
【０２３４】
他の実施形態において、この完全長重鎖及び／又は完全長軽鎖のヌクレオチド配列は、表１に記載された配列に対して６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であり得、この重鎖は、表２に記載された重鎖アミノ酸配列（例えば、配列番号４５、５６、５９、又は６１のアミノ酸配列）を含まず、且つこの軽鎖は、表２に記載された軽鎖アミノ酸配列（例えば、配列番号４９、５８、６０、又は６２のアミノ酸配列）を含まない。
【０２３５】
他の実施形態において、重鎖の可変領域及び／又は軽鎖の可変領域のヌクレオチド配列は、表１に記載された配列に対して６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であり得、この重鎖は、表２に記載された重鎖アミノ酸配列（例えば、配列番号４５、５６、５９、又は６１のアミノ酸配列）を含まず、且つこの軽鎖は、表２に記載された軽鎖アミノ酸配列（例えば、配列番号４９、５８、６０、又は６２のアミノ酸配列）を含まない。
【０２３６】
本明細書で使用される場合、２種の配列の間の同一性パーセントは、ギャップの数及び各ギャップの長さを考慮して、これらの配列が共有する同一の位置の数の関数であり（即ち、同一性％は、同一の位置の数／位置の総数×１００と等しい）、これら２種の配列の最適なアラインメントのために導入される必要がある。配列の比較、及び２種の配列の間の同一性パーセントの決定を、下記の非限定的な実施例で説明されているように、数学的アルゴリズムを使用して達成し得る。
【０２３７】
加えて、又はあるいは、本開示のタンパク質配列は、例えば関連配列を同定するために公共のデータベースに対して検索を実施すべく、「クエリ配列」としてさらに使用され得る。例えば、そのような検索を、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，１９９０  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０のＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して実施し得る。
【０２３８】
保存的改変を有する抗体
特定の実施形態において、本開示の抗体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の配列を含む重鎖可変領域と、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の配列を含む軽鎖可変領域とを有し、これらのＣＤＲ配列のうちの１つ又は複数は、本明細書で説明された抗体又はその保存的改変に基づいて特定のアミノ酸配列を有し、この抗体は、本開示のβ−クロトー結合抗体の所望される機能的特性を保持する。
【０２３９】
従って、本開示は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の配列を含む重鎖可変領域と、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の配列を含む軽鎖可変領域とからなる、単離抗体（例えば、β−クロトー／ＦＧＦＲ１ｃレセプター複合体の活性を活性化し得るか若しくは増加させ得る抗体）又はその抗原結合フラグメントであって、この重鎖可変領域ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号６及びその保存的改変からなる群から選択され；この重鎖可変領域ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号７及びその保存的改変からなる群から選択され；この重鎖可変領域ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号８及びその保存的改変からなる群から選択され；この軽鎖可変領域ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号１９及び３１並びにそれらの保存的改変からなる群から選択され；この軽鎖可変領域ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号２０及びその保存的改変からなる群から選択され；ＣＤＲ３のアミノ酸配列の軽鎖可変領域は、配列番号２１及びその保存的改変からなる群から選択され；この抗体又はその抗原結合フラグメントはβ−クロトーに特異的に結合する、単離抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
【０２４０】
従って、本開示は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の配列を含む重鎖可変領域と、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の配列を含む軽鎖可変領域とからなる単離抗体（例えば、β−クロトー／ＦＧＦＲ１ｃレセプター複合体の活性を活性化し得るか若しくは増加させ得る抗体）又はその抗原結合フラグメントであって、この重鎖可変領域ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号６、９、１０、及び１２並びにそれらの保存的改変からなる群から選択され；この重鎖可変領域ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号７、１１、及び１３並びにそれらの保存的改変からなる群から選択され；この重鎖可変領域ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号８及び１４並びにそれらの保存的改変からなる群から選択され；この軽鎖可変領域ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号１９、３１、２２、及び２５並びにそれらの保存的改変からなる群から選択され；この軽鎖可変領域ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号２０及び２３並びにそれらの保存的改変からなる群から選択され；ＣＤＲ３のアミノ酸配列の軽鎖可変領域は、配列番号２１又は２４及びそれらの保存的改変からなる群から選択され；この抗体又はその抗原結合フラグメントはβ−クロトーに特異的に結合する、単離抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
【０２４１】
一態様において、本開示は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、哺乳動物細胞中での発現に最適化された単離抗体であって、この重鎖可変領域は、配列番号１５及びその保存的改変の群から選択されるアミノ酸を有し、且つこの完全長軽鎖は、配列番号２６及び３２並びにそれらの保存的改変の群から選択されるアミノ酸配列を有し；この抗体は、β−クロトー（例えば、ヒト及びカニクイザルのβ−クロトー）に特異的に結合し、この重鎖可変領域は、表２に記載された重鎖可変領域のアミノ酸配列（例えば、配列番号４３又は５５のアミノ酸配列）を含まず、且つこの軽鎖可変領域は、表２に記載された軽鎖可変領域のアミノ酸配列（例えば、配列番号４７又は５７のアミノ酸配列）を含まない、単離抗体を提供する。
【０２４２】
他の実施形態において、哺乳動物細胞中での発現に最適化された本開示の抗体は、完全長重鎖配列及び完全長軽鎖配列を有し、これらの配列のうちの１つ又は複数は、本明細書で説明された抗体又はその保存的改変に基づいて特定のアミノ酸配列を有し、この抗体は、本開示のβ−クロトー結合抗体の所望される機能特性を保持する。従って、本開示は、完全長重鎖及び完全長軽鎖からなる、哺乳動物細胞中での発現に最適化された単離抗体であって、この完全長重鎖は、配列番号１７及びその保存的改変の群から選択されるアミノ酸配列を有し、且つこの完全長軽鎖は、配列番号２８及び３４並びにそれらの保存的改変の群から選択されるアミノ酸配列を有し；この抗体は、β−クロトー（例えば、ヒト及びカニクイザルのβ−クロトー）に特異的に結合し、この重鎖は、表２に記載された重鎖アミノ酸配列（例えば、配列番号４５、５６、５９、又は６１のアミノ酸配列）を含まず、且つこの軽鎖は、表２に記載された軽鎖アミノ酸配列（例えば、配列番号４９、５８、６０、又は６２のアミノ酸配列）を含まない、単離抗体を提供する。
【０２４３】
同一のエピトープに結合するか又は同一のエピトープへの結合を競合する抗体
本開示は、表１で説明されたβ−クロトー結合抗体（例えばＮＯＶ００５又はＮＯＶ００６）と同一のエピトープに結合する抗体（例えば、β−クロトー／ＦＧＦＲ１ｃレセプター複合体の活性を活性化し得るか又は増加させ得る抗体）を提供する。特定の態様において、そのような抗体及び抗原結合フラグメントは、β−クロトー及びＦＧＦＲ１ｃの活性を増加させ得る。従って、追加の抗体を、β−クロトー結合アッセイ（例えば、実施例で説明されたもの）において、本開示の他の抗体と競合する（例えば、統計的に有意な方法で結合を競合的に阻害する）能力に基づいて同定し得る。β−クロトータンパク質への本開示の抗体の結合を阻害する試験抗体の能力は、この試験抗体が、βクロトーへの結合に関してこの抗体と競合し得ることを示し、そのような抗体は、非限定的な理論に従って、競合する抗体と同一の又は関連する（例えば、構造的に類似の又は空間的に近位の）β−クロトータンパク質上のエピトープに結合し得る。特定の実施形態において、本開示の抗体と同一のβ−クロトー上のエピトープに結合する抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。そのようなヒトモノクローナル抗体を、本明細書で説明されているように調製して単離し得る。本明細書で使用される場合、等モル濃度の競合抗体の存在下において、この競合抗体が本開示の抗体又は抗原結合フラグメントのβ−クロトー結合を５０％超（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％）阻害する場合には、この抗体は結合に関して「競合する」。特定の実施形態において、本開示の抗体と同一のβ−クロトー上のエピトープに結合する抗体は、ヒト化モノクローナル抗体である。そのようなヒト化モノクローナル抗体を、本明細書で説明されているように調製して単離し得る。
【０２４４】
特定の態様において、本開示は、β−クロトー結合抗体ＮＯＶ００５又はＮＯＶ００６と同一のエピトープに結合する抗体（例えば、β−クロトー／ＦＧＦＲ１ｃレセプター複合体の活性を活性化し得るか又は増加させ得る抗体）を提供する。
【０２４５】
特定の態様において、本開示は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と配列番号２６又は３２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むβ−クロトー結合抗体と同一のエピトープに結合する抗体（例えば、β−クロトー／ＦＧＦＲ１ｃレセプター複合体の活性を活性化し得るか又は増加させ得る抗体）を提供する。
【０２４６】
特定の態様において、本開示は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むβ−クロトー結合抗体と同一のエピトープに結合する抗体（例えば、β−クロトー／ＦＧＦＲ１ｃレセプター複合体の活性を活性化し得るか又は増加させ得る抗体）を提供する。
【０２４７】
特定の態様において、本開示は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むβ−クロトー結合抗体と同一のエピトープに結合する抗体を提供する。
【０２４８】
特定の態様において、本開示は、β−クロトー結合抗体ＮＯＶ００５又はＮＯＶ００６と重複するエピトープに結合する抗体（例えば、β−クロトー／ＦＧＦＲ１ｃレセプター複合体の活性を活性化し得るか又は増加させ得る抗体）を提供する。
【０２４９】
特定の態様において、本開示は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と配列番号２６又は３２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むβ−クロトー結合抗体と重複するエピトープに結合する抗体（例えば、β−クロトー／ＦＧＦＲ１ｃレセプター複合体の活性を活性化し得るか又は増加させ得る抗体）を提供する。
【０２５０】
特定の態様において、本開示は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むβ−クロトー結合抗体と重複するエピトープに結合する抗体（例えば、β−クロトー／ＦＧＦＲ１ｃレセプター複合体の活性を活性化し得るか又は増加させ得る抗体）を提供する。
【０２５１】
特定の態様において、本開示は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むβ−クロトー結合抗体と重複するエピトープに結合する抗体（例えば、β−クロトー／ＦＧＦＲ１ｃレセプター複合体の活性を活性化し得るか又は増加させ得る抗体）を提供する。
【０２５２】
特定の態様において、本明細書で提供されるのは、β−クロトーのエピトープに結合する単離抗体（例えば、β−クロトー／ＦＧＦＲ１ｃレセプター複合体の活性を活性化し得るか若しくは増加させ得る抗体）又はその抗原結合フラグメントであって、前記エピトープは、β−クロトー配列（配列番号５２）の残基２４６〜２６５のうちの１個又は複数個のアミノ酸を含む、単離抗体又はその抗原結合フラグメントである。特定の態様において、本明細書で提供されるのは、β−クロトーのエピトープに結合する単離抗体（例えば、β−クロトー／ＦＧＦＲ１ｃレセプター複合体の活性を活性化し得るか若しくは増加させ得る抗体）又はその抗原結合フラグメントであって、前記エピトープは、β−クロトー配列（配列番号５２）の残基５３６〜５５０のうちの１個又は複数個のアミノ酸を含む、単離抗体又はその抗原結合フラグメントである。特定の態様において、本明細書で提供されるのは、β−クロトーのエピトープに結合する単離抗体（例えば、β−クロトー／ＦＧＦＲ１ｃレセプター複合体の活性を活性化し得るか若しくは増加させ得る抗体）又はその抗原結合フラグメントであって、前記エピトープは、β−クロトー配列（配列番号５２）の残基８３４〜８５７のうちの１個又は複数個のアミノ酸を含む、単離抗体又はその抗原結合フラグメントである。特定の態様において、本明細書で提供されるのは、β−クロトーのエピトープに結合する単離抗体（例えば、β−クロトー／ＦＧＦＲ１ｃレセプター複合体の活性を活性化し得るか若しくは増加させ得る抗体）又はその抗原結合フラグメントであって、前記エピトープは、β−クロトー配列（配列番号５２）の残基９５９〜９８６のうちの１個又は複数個のアミノ酸を含む、単離抗体又はその抗原結合フラグメントである。
【０２５３】
特定の態様において、本明細書で提供されるのは、β−クロトーのエピトープに結合する単離抗体（例えば、β−クロトー／ＦＧＦＲ１ｃレセプター複合体の活性を活性化し得るか若しくは増加させ得る抗体）又はその抗原結合フラグメントであって、前記エピトープは、β−クロトー配列（配列番号５２）の残基２４６〜２６５、５３６〜５５０、８３４〜８５７、及び９５９〜９８６のうちの１個又は複数個のアミノ酸を含む、単離抗体又はその抗原結合フラグメントである。具体的な態様において、本明細書で提供されるのは、β−クロトーのエピトープに結合する単離抗体（例えば、β−クロトー／ＦＧＦＲ１ｃレセプター複合体の活性を活性化し得るか若しくは増加させ得る抗体）又はその抗原結合フラグメントであって、前記エピトープは、β−クロトー配列（配列番号５２）の残基２４６〜２６５、５３６〜５５０、８３４〜８５７、及び９５９〜９８６のうちの２個以上のアミノ酸を含む、単離抗体又はその抗原結合フラグメントである。具体的な態様において、本明細書で提供されるのは、β−クロトーのエピトープに結合する単離抗体（例えば、β−クロトー／ＦＧＦＲ１ｃレセプター複合体の活性を活性化し得るか若しくは増加させ得る抗体）又はその抗原結合フラグメントであって、前記エピトープは、β−クロトー配列（配列番号５２）の残基２４６〜２６５、５３６〜５５０、８３４〜８５７、及び９５９〜９８６のうちの３個以上のアミノ酸を含む、単離抗体又はその抗原結合フラグメントである。具体的な態様において、本明細書で提供されるのは、β−クロトーのエピトープに結合する単離抗体（例えば、β−クロトー／ＦＧＦＲ１ｃレセプター複合体の活性を活性化し得るか若しくは増加させ得る抗体）又はその抗原結合フラグメントであって、前記エピトープは、β−クロトー配列（配列番号５２）の残基２４６〜２６５、５３６〜５５０、８３４〜８５７、及び９５９〜９８６のアミノ酸を含む、単離抗体又はその抗原結合フラグメントである。具体的な態様において、本明細書で提供されるのは、β−クロトーのエピトープに結合する単離抗体（例えば、β−クロトー／ＦＧＦＲ１ｃレセプター複合体の活性を活性化し得るか若しくは増加させ得る抗体）又はその抗原結合フラグメントであって、前記エピトープは、β−クロトー配列（配列番号５２）のアミノ酸残基２４６〜２６５、５３６〜５５０、８３４〜８５７、及び９５９〜９８６のストレッチのそれぞれからの少なくとも１個のアミノ酸残基を含む、単離抗体又はその抗原結合フラグメントである。
【０２５４】
特定の態様において、本明細書で提供されるのは、β−クロトーの１個又は複数個のエピトープに結合する単離抗体（例えば、β−クロトー／ＦＧＦＲ１ｃレセプター複合体の活性を活性化し得るか若しくは増加させ得る抗体）又はその抗原結合フラグメントであって、前記エピトープは、β−クロトー配列（配列番号５２）の残基６４６〜６７０のアミノ酸のうちの１個又は複数個を含む、単離抗体又はその抗原結合フラグメントである。特定の態様において、本明細書で提供されるのは、β−クロトーの１個又は複数個のエピトープに結合する単離抗体（例えば、β−クロトー／ＦＧＦＲ１ｃレセプター複合体の活性を活性化し得るか若しくは増加させ得る抗体）又はその抗原結合フラグメントであって、前記エピトープは、β−クロトー配列（配列番号５２）の残基６９６〜７００のアミノ酸のうちの１個又は複数個を含む、単離抗体又はその抗原結合フラグメントである。特定の態様において、本明細書で提供されるのは、β−クロトーの１個又は複数個のエピトープに結合する単離抗体（例えば、β−クロトー／ＦＧＦＲ１ｃレセプター複合体の活性を活性化し得るか若しくは増加させ得る抗体）又はその抗原結合フラグメントであって、前記エピトープは、β−クロトー配列（配列番号５２）の残基６４６〜６８９のアミノ酸のうちの１個又は複数個を含む、単離抗体又はその抗原結合フラグメントである。
【０２５５】
特定の態様において、本明細書で提供されるのは、β−クロトーの１個又は複数個のエピトープ（例えば不連続エピトープ）に結合する単離抗体（例えば、β−クロトー／ＦＧＦＲ１ｃレセプター複合体の活性を活性化し得るか若しくは増加させ得る抗体）又はその抗原結合フラグメントであって、前記エピトープは、β−クロトー配列（配列番号５２）の残基６４６〜６７０、６９６〜７００、及び６４６〜６８９のアミノ酸のうちの１個、又は２個、又は３個、又は４個、又は５個、又はより多くを含む、単離抗体又はその抗原結合フラグメントである。特定の態様において、本明細書で提供されるのは、β−クロトーの２個以上のエピトープ（例えば不連続エピトープ）に結合する単離抗体（例えば、β−クロトー／ＦＧＦＲ１ｃレセプター複合体の活性を活性化し得るか若しくは増加させ得る抗体）又はその抗原結合フラグメントであって、前記エピトープは、β−クロトー配列（配列番号５２）の残基６４６〜６７０、６９６〜７００、及び６４６〜６８９のアミノ酸のうちの１個又は複数個を含む、単離抗体又はその抗原結合フラグメントである。具体的な態様において、本明細書で提供されるのは、β−クロトーの３個以上のエピトープ（例えば不連続エピトープ）に結合する単離抗体（例えば、β−クロトー／ＦＧＦＲ１ｃレセプター複合体の活性を活性化し得るか若しくは増加させ得る抗体）又はその抗原結合フラグメントであって、前記エピトープは、β−クロトー配列（配列番号５２）の残基６４６〜６７０、６９６〜７００、及び６４６〜６８９のアミノ酸のうちの１個又は複数個を含む、単離抗体又はその抗原結合フラグメントである。具体的な態様において、本明細書で提供されるのは、β−クロトーの３個以上のエピトープ（例えば不連続エピトープ）に結合する単離抗体（例えば、β−クロトー／ＦＧＦＲ１ｃレセプター複合体の活性を活性化し得るか若しくは増加させ得る抗体）又はその抗原結合フラグメントであって、前記エピトープは、β−クロトー配列（配列番号５２）の残基６４６〜６７０、６９６〜７００、及び６４６〜６８９のアミノ酸を含む、単離抗体又はその抗原結合フラグメントである。具体的な態様において、本明細書で提供されるのは、β−クロトーの３個以上のエピトープ（例えば不連続エピトープ）に結合する単離抗体（例えば、β−クロトー／ＦＧＦＲ１ｃレセプター複合体の活性を活性化し得るか若しくは増加させ得る抗体）又はその抗原結合フラグメントであって、前記エピトープは、β−クロトー配列（配列番号５２）のアミノ酸残基６４６〜６７０、６９６〜７００、及び６４６〜６８９の範囲のそれぞれからのアミノ酸残基を含む、単離抗体又はその抗原結合フラグメントである。
【０２５６】
特定の態様において、本明細書で提供されるのは、水素−重水素交換（ＨＤｘ）により決定した場合に、β−クロトー（配列番号５２）の下記のペプチド：アミノ酸残基２４５〜２６６、２４６〜２６５、３４３〜３４９、３４４〜３４９、４２１〜４２９、４８８〜４９８、５０９〜５２４、５３６〜５５０、５６８〜５７６、６４６〜６６９、６４６〜６７０、６９６〜７００、７７３〜８０４、８３４〜８５７、及び９５９〜９８６のうちの１個、２個、３個、４個、５個、又はより多くを保護する単離抗体（例えば、β−クロトー／ＦＧＦＲ１ｃレセプター複合体の活性を活性化し得るか若しくは増加させ得る抗体）又はその抗原結合フラグメントである。
【０２５７】
特定の態様において、本明細書で提供されるのは、水素−重水素交換（ＨＤｘ）により決定した場合に、β−クロトー（配列番号５２）の下記のペプチド：アミノ酸残基２４６〜２６５、５３６〜５５０、８３４〜８５７、及び９５９〜９８６を保護する単離抗体（例えば、β−クロトー／ＦＧＦＲ１ｃレセプター複合体の活性を活性化し得るか若しくは増加させ得る抗体）又はその抗原結合フラグメントである。
【０２５８】
特定の態様において、本明細書で提供されるのは、水素−重水素交換（ＨＤｘ）により決定した場合に、β−クロトー（配列番号５２）の下記のペプチド：アミノ酸残基２４５〜２６６、２４６〜２６５、３４３〜３４９、３４４〜３４９、４２１〜４２９、４８８〜４９８、５０９〜５２４、５３６〜５５０、５６８〜５７６、６４６〜６６９、６４６〜６７０、６９６〜７００、７７３〜８０４、８３４〜８５７、及び９５９〜９８６を保護する単離抗体（例えば、β−クロトー／ＦＧＦＲ１ｃレセプター複合体の活性を活性化し得るか若しくは増加させ得る抗体）又はその抗原結合フラグメントである。
【０２５９】
特定の態様において、本明細書で提供されるのは、β−クロトー及びＦＧＦＲ１ｃの活性を増加させる単離抗体（例えば、β−クロトー／ＦＧＦＲ１ｃレセプター複合体の活性を活性化し得るか若しくは増加させ得る抗体）又はその抗原結合フラグメントであって、ヒトβ−クロトー（配列番号５２）の残基７０１（Ｔｙｒ）又は７０３（Ａｒｇ）と接触しない単離抗体又はその抗原結合フラグメントである。
【０２６０】
特定の態様において、本明細書で提供されるのは、β−クロトーに結合する単離抗体（例えば、β−クロトー／ＦＧＦＲ１ｃレセプター複合体の活性を活性化し得るか若しくは増加させ得る抗体）又はその抗原結合フラグメントであって、例えば、ｘ線結晶構造解析、水素−重水素交換アッセイ、又は突然変異誘発のスキャニングにより決定した場合に、β−クロトー配列（配列番号５２）の残基２４６〜２６５のうちの１個又は複数個のアミノ酸と接触する単離抗体又はその抗原結合フラグメントである。特定の態様において、本明細書で提供されるのは、β−クロトーに結合する単離抗体（例えば、β−クロトー／ＦＧＦＲ１ｃレセプター複合体の活性を活性化し得るか若しくは増加させ得る抗体）又はその抗原結合フラグメントであって、例えば、ｘ線結晶構造解析、水素−重水素交換アッセイ、又は突然変異誘発のスキャニングにより決定した場合に、β−クロトー配列（配列番号５２）の残基５３６〜５５０のうちの１個又は複数個のアミノ酸と接触する単離抗体（例えば、β−クロトー／ＦＧＦＲ１ｃレセプター複合体の活性を活性化し得るか若しくは増加させ得る抗体）又はその抗原結合フラグメントである。特定の態様において、本明細書で提供されるのは、β−クロトーに結合する単離抗体（例えば、β−クロトー／ＦＧＦＲ１ｃレセプター複合体の活性を活性化し得るか若しくは増加させ得る抗体）又はその抗原結合フラグメントであって、例えば、ｘ線結晶構造解析、水素−重水素交換アッセイ、又は突然変異誘発のスキャニングにより決定した場合に、β−クロトー配列（配列番号５２）の残基８３４〜８５７のうちの１個又は複数個のアミノ酸と接触する単離抗体又はその抗原結合フラグメントである。特定の態様において、本明細書で提供されるのは、β−クロトーに結合する単離抗体（例えば、β−クロトー／ＦＧＦＲ１ｃレセプター複合体の活性を活性化し得るか若しくは増加させ得る抗体）又はその抗原結合フラグメントであって、例えば、ｘ線結晶構造解析、水素−重水素交換アッセイ、又は突然変異誘発のスキャニングにより決定した場合に、β−クロトー配列（配列番号５２）の残基９５９〜９８６のうちの１個又は複数個のアミノ酸と接触する単離抗体又はその抗原結合フラグメントである。
【０２６１】
特定の態様において、本明細書で提供されるのは、β−クロトーに結合する単離抗体（例えば、β−クロトー／ＦＧＦＲ１ｃレセプター複合体の活性を活性化し得るか若しくは増加させ得る抗体）又はその抗原結合フラグメントであって、例えば、ｘ線結晶構造解析、水素−重水素交換アッセイ、又は突然変異誘発のスキャニングにより決定した場合に、β−クロトー配列（配列番号５２）の残基２４６〜２６５、５３６〜５５０、８３４〜８５７、及び９５９〜９８６のうちの１個又は複数個のアミノ酸と接触する単離抗体又はその抗原結合フラグメントである。具体的な態様において、本明細書で提供されるのは、β−クロトーに結合する単離抗体（例えば、β−クロトー／ＦＧＦＲ１ｃレセプター複合体の活性を活性化し得るか若しくは増加させ得る抗体）又はその抗原結合フラグメントであって、例えば、ｘ線結晶構造解析、水素−重水素交換アッセイ、又は突然変異誘発のスキャニングにより決定した場合に、β−クロトー配列（配列番号５２）の残基２４６〜２６５、５３６〜５５０、８３４〜８５７、及び９５９〜９８６のうちの２個以上のアミノ酸と接触する単離抗体又はその抗原結合フラグメントである。具体的な態様において、本明細書で提供されるのは、β−クロトーに結合する単離抗体（例えば、β−クロトー／ＦＧＦＲ１ｃレセプター複合体の活性を活性化し得るか若しくは増加させ得る抗体）又はその抗原結合フラグメントであって、例えば、ｘ線結晶構造解析、水素−重水素交換アッセイ、又は突然変異誘発のスキャニングにより決定した場合に、β−クロトー配列（配列番号５２）の残基２４６〜２６５、５３６〜５５０、８３４〜８５７、及び９５９〜９８６のうちの３個以上のアミノ酸と接触する単離抗体又はその抗原結合フラグメントである。具体的な態様において、本明細書で提供されるのは、β−クロトーに結合する単離抗体（例えば、β−クロトー／ＦＧＦＲ１ｃレセプター複合体の活性を活性化し得るか若しくは増加させ得る抗体）又はその抗原結合フラグメントであって、例えば、ｘ線結晶構造解析、水素−重水素交換アッセイ、又は突然変異誘発のスキャニングにより決定した場合に、β−クロトー配列（配列番号５２）の残基２４６〜２６５、５３６〜５５０、８３４〜８５７、及び９５９〜９８６のアミノ酸と接触する単離抗体又はその抗原結合フラグメントである。具体的な態様において、本明細書で提供されるのは、β−クロトーに結合する単離抗体（例えば、β−クロトー／ＦＧＦＲ１ｃレセプター複合体の活性を活性化し得るか若しくは増加させ得る抗体）又はその抗原結合フラグメントであって、例えば、ｘ線結晶構造解析、水素−重水素交換アッセイ、又は突然変異誘発のスキャニングにより決定した場合に、β−クロトー配列（配列番号５２）のアミノ酸残基２４６〜２６５、５３６〜５５０、８３４〜８５７、及び９５９〜９８６のストレッチのそれぞれからの少なくとも１個のアミノ酸残基と接触する単離抗体又はその抗原結合フラグメントである。
【０２６２】
特定の態様において、本明細書で提供されるのは、β−クロトーに結合する単離抗体（例えば、β−クロトー／ＦＧＦＲ１ｃレセプター複合体の活性を活性化し得るか若しくは増加させ得る抗体）又はその抗原結合フラグメントであって、例えば、ｘ線結晶構造解析、水素−重水素交換アッセイ、又は突然変異誘発のスキャニングにより決定した場合に、β−クロトー配列（配列番号５２）の残基６４６〜６７０のアミノ酸のうちの１個又は複数個と接触する単離抗体又はその抗原結合フラグメントである。特定の態様において、本明細書で提供されるのは、β−クロトーに結合する単離抗体（例えば、β−クロトー／ＦＧＦＲ１ｃレセプター複合体の活性を活性化し得るか若しくは増加させ得る抗体）又はその抗原結合フラグメントであって、例えば、ｘ線結晶構造解析、水素−重水素交換アッセイ、又は突然変異誘発のスキャニングにより決定した場合に、β−クロトー配列（配列番号５２）の残基６９６〜７００のアミノ酸のうちの１個又は複数個と接触する単離抗体又はその抗原結合フラグメントである。特定の態様において、本明細書で提供されるのは、β−クロトーに結合する単離抗体（例えば、β−クロトー／ＦＧＦＲ１ｃレセプター複合体の活性を活性化し得るか若しくは増加させ得る抗体）又はその抗原結合フラグメントであって、例えば、ｘ線結晶構造解析、水素−重水素交換アッセイ、又は突然変異誘発のスキャニングにより決定した場合に、β−クロトー配列（配列番号５２）の残基６４６〜６８９のアミノ酸のうちの１個又は複数個と接触する単離抗体又はその抗原結合フラグメントである。
【０２６３】
特定の態様において、本明細書で提供されるのは、β−クロトーに結合する単離抗体（例えば、β−クロトー／ＦＧＦＲ１ｃレセプター複合体の活性を活性化し得るか若しくは増加させ得る抗体）又はその抗原結合フラグメントであって、例えば、ｘ線結晶構造解析、水素−重水素交換アッセイ、又は突然変異誘発のスキャニングにより決定した場合に、β−クロトー配列（配列番号５２）の残基６４６〜６７０、６９６〜７００、及び６４６〜６８９のアミノ酸のうちの１個、又は２個、又は３個、又は４個、又は５個、又はより多くと接触する単離抗体又はその抗原結合フラグメントである。特定の態様において、本明細書で提供されるのは、β−クロトーに結合する単離抗体（例えば、β−クロトー／ＦＧＦＲ１ｃレセプター複合体の活性を活性化し得るか若しくは増加させ得る抗体）又はその抗原結合フラグメントであって、例えば、ｘ線結晶構造解析、水素−重水素交換アッセイ、又は突然変異誘発のスキャニングにより決定した場合に、β−クロトー配列（配列番号５２）のアミノ酸残基６４６〜６７０、６９６〜７００、及び６４６〜６８９のストレッチのそれぞれからのアミノ酸残基のうちの１個又は複数個と接触する単離抗体又はその抗原結合フラグメントである。具体的な態様において、本明細書で提供されるのは、β−クロトーに結合する単離抗体（例えば、β−クロトー／ＦＧＦＲ１ｃレセプター複合体の活性を活性化し得るか若しくは増加させ得る抗体）又はその抗原結合フラグメントであって、例えば、ｘ線結晶構造解析、水素−重水素交換アッセイ、又は突然変異誘発のスキャニングにより決定した場合に、β−クロトー配列（配列番号５２）のアミノ酸残基６４６〜６７０、６９６〜７００、及び６４６〜６８９のストレッチのそれぞれからのアミノ酸残基のうちの１個又は複数個と接触する単離抗体又はその抗原結合フラグメントである。具体的な態様において、本明細書で提供されるのは、β−クロトーに結合する単離抗体（例えば、β−クロトー／ＦＧＦＲ１ｃレセプター複合体の活性を活性化し得るか若しくは増加させ得る抗体）又はその抗原結合フラグメントであって、例えば、ｘ線結晶構造解析、水素−重水素交換アッセイ、又は突然変異誘発のスキャニングにより決定した場合に、β−クロトー配列（配列番号５２）のアミノ酸残基６４６〜６７０、６９６〜７００、及び６４６〜６８９と接触する単離抗体又はその抗原結合フラグメントである。
【０２６４】
特定の態様において、本開示は、β−クロトーへの結合に関して抗体ＮＯＶ００５又はＮＯＶ００６と競合する抗体（例えば、β−クロトー／ＦＧＦＲ１ｃレセプター複合体の活性を活性化し得るか若しくは増加させ得る抗体）を提供する。
【０２６５】
特定の態様において、本開示は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と配列番号２６又は３２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むβ−クロトー結合抗体とβ−クロトーへの結合に関して競合する抗体（例えば、β−クロトー／ＦＧＦＲ１ｃレセプター複合体の活性を活性化し得るか若しくは増加させ得る抗体）を提供する。
【０２６６】
特定の態様において、本開示は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むβ−クロトー結合抗体とβ−クロトーへの結合に関して競合する抗体（例えば、β−クロトー／ＦＧＦＲ１ｃレセプター複合体の活性を活性化し得るか若しくは増加させ得る抗体）を提供する。
【０２６７】
特定の態様において、本開示は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むβ−クロトー結合抗体とβ−クロトーへの結合に関して競合する抗体（例えば、β−クロトー／ＦＧＦＲ１ｃレセプター複合体の活性を活性化し得るか若しくは増加させ得る抗体）を提供する。
【０２６８】
操作されて改変された抗体
本開示の抗体（例えばＮＯＶ００５又はＮＯＶ００６）を、改変抗体を操作するための出発物質として本明細書で示されたＶＨ配列及び／又はＶＬ配列のうちの１つ又は複数を有する抗体を使用してさらに調製し得、この改変抗体は、出発抗体から変更された特性を有し得る。一方又は両方の可変領域（即ち、ＶＨ及び／又はＶＬ）内の（例えば、１個若しくは複数個のＣＤＲ領域内の、及び／又は１個若しくは複数個のフレームワーク領域内の）１個又は複数個の残基を改変することにより、抗体を操作し得る。加えて、又はあるいは、定常領域内の残基を改変することにより抗体を操作して、例えば、この抗体のエフェクター機能を変更し得る。
【０２６９】
実施し得る可変領域の操作の１つのタイプは、ＣＤＲ移植である。抗体は、重鎖及び軽鎖の６個の相補性決定領域（ＣＤＲ）中に位置するアミノ酸残基を主に介して、標的抗原と相互作用する。この理由から、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、ＣＤＲ外の配列と比べて個々の抗体間で態様である。ＣＤＲ配列はほとんどの抗体−抗原相互作用に関与していることから、特性が異なる様々な抗体に由来するフレームワーク配列上に移植された、特定の天然に存在する抗体に由来するＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することにより、特定の天然に存在する抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現させることが可能になる（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，１９９８  Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７；Ｊｏｎｅｓ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，１９８６  Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５；Ｑｕｅｅｎ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，１９８９  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：１００２９−１００３３；Ｗｉｎｔｅｒに対する米国特許第５，２２５，５３９号明細書、及びＱｕｅｅｎ他に対する米国特許第５，５３０，１０１号明細書；同第５，５８５，０８９号明細書；同第５，６９３，７６２号明細書、及び同第６，１８０，３７０号明細書を参照されたい）。
【０２７０】
従って、本開示の別の実施形態は、単離抗体又はその抗原結合フラグメントであって、表１に記載されたＨＣＤＲ１配列から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１配列；表１に記載されたＨＣＤＲ２配列から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２配列；表１に記載されたＨＣＤＲ３配列から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域と、表１に記載されたＬＣＤＲ１配列から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１配列；表１に記載されたＬＣＤＲ２配列から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２配列；表１に記載されたＬＣＤＲ３配列から選択されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域とを含む単離抗体又はその抗原結合フラグメントに関する。そのため、そのような抗体はモノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲ配列を含み、さらには、これらの抗体とは異なるフレームワーク配列を含み得る。
【０２７１】
従って、本開示の別の実施形態は、単離抗体又はその抗原結合フラグメントであって、配列番号６及び９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１配列；配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２配列；配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１９及び３１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１配列；配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２配列；及び配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３配列を有する軽鎖可変領域とを含む単離抗体又はその抗原結合フラグメントに関する。そのため、そのような抗体はモノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲ配列を含み、さらには、これらの抗体とは異なるフレームワーク配列を含み得る。
【０２７２】
そのようなフレームワーク配列を、生殖系列抗体遺伝子配列を含む公共のＤＮＡデータベース又は公開された参考文献から得ることができる。例えば、ヒトの重鎖及び軽鎖の可変領域遺伝子に関する生殖系列ＤＮＡ配列を、「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖系列配列データベース（ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅにてワールド・ワイド・ウェブ上で入手可能である）、並びにＫａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９１  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｉ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９２  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６−７９８；及びＣｏｘ，Ｊ．Ｐ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，１９９４  Ｅｕｒ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：８２７−８３６で見出し得、これらのそれぞれの内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【０２７３】
本開示の抗体で使用されるフレームワーク配列の一例は、本開示の選択された抗体により使用されるフレームワーク配列（例えば、本開示のモノクローナル抗体により使用されるコンセンサス配列及び／又はフレームワーク配列）と構造的に類似するものである。ＶＨ  ＣＤＲ１、２、及び３の配列、並びにＶＬ  ＣＤＲ１、２、及び３の配列をフレーム領域上に移植し得、このフレームワーク領域は、このフレームワーク領域が由来する生殖系列免疫グロブリン遺伝子中で見出されるのと同一の配列を有するか、又はこれらのＣＤＲ配列を、生殖系列配列と比較して１個又は複数個の突然変異を含むフレームワーク領域上に移植し得る。例えば、特定の場合には、フレームワーク領域内の残基を突然変異させて抗体の抗原結合能力を維持するか又は増強することが有利であることが分かっている（例えば、Ｑｕｅｅｎ他に対する米国特許第５，５３０，１０１号明細書；同第５，５８５，０８９号明細書；同第５，６９３，７６２号明細書、及び同第６，１８０，３７０号明細書を参照されたい）。本明細書で説明された抗体及び抗原結合フラグメントを構築する足場として利用され得るフレームワークとして、ＶＨ１Ａ、ＶＨ１Ｂ、ＶＨ３、Ｖｋ１、Ｖｌ２、及びＶｋ２が挙げられるがこれらに限定されない。更なるフレームワークが当技術分野で既知であり、例えば、ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ？＆ＭＭＮ＿ｐｏｓｉｔｉｏｎ＝１：１にてワールド・ワイド・ウェブ上のｖＢａｓｅデータベース中に見出され得る。
【０２７４】
従って、本開示のある実施形態は、単離β−クロトー結合抗体又はその抗原結合フラグメントであって、配列番号１５のアミノ酸配列又はそのような配列のフレームワーク領域中に１個、２個、３個、４個、若しくは５個のアミノ酸の置換、欠失、若しくは付加を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、且つ配列番号２６若しくは３２からなる群から選択されるアミノ酸配列又はそのような配列のフレームワーク領域中に１個、２個、３個、４個、若しくは５個のアミノ酸の置換、欠失、若しくは付加を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域をさらに含み、この重鎖可変領域は、表２に記載された重鎖可変領域のアミノ酸配列（例えば、配列番号４３又は５５のアミノ酸配列）を含まず、且つこの軽鎖可変領域は、表２に記載された軽鎖可変領域のアミノ酸配列（例えば、配列番号４７又は５７のアミノ酸配列）を含まない、単離β−クロトー結合抗体又はその抗原結合フラグメントに関する。
【０２７５】
可変領域改変の別のタイプは、ＶＨ及び／又はＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／又はＣＤＲ３の領域内のアミノ酸残基を突然変異させ、それにより、「親和性成熟」として既知である、目的の抗体の１種又は複数種の結合特性（例えば親和性）を改善することである。部位特異的突然変異誘発又はＰＣＲ媒介突然変異誘発を実施して突然変異を導入し得、抗体結合又は目的の他の機能特性に対する効果を、本明細書で説明され且つ実施例に記載されたインビトロでの又はインビボでのアッセイで評価し得る。保存的改変（上記で論じた）を導入してもよい。この突然変異は、アミノ酸の置換であってもよいし、付加であってもよいし、欠失であってもよい。さらに、ＣＤＲ領域内の典型的には１個、２個、３個、４個、又は５個以下の残基を変更する。
【０２７６】
特定のアミノ鎖配列モチーフは、翻訳後改変（ＰＴＭ）（例えば、グリコシル化（即ち、ＮｘＳ／Ｔ、ｘはＰ以外）、遊離システインの酸化、脱アミド化（例えばＮＧ）、又は異性化（例えばＤＧ））を受けることが知られている。ＣＤＲ中に存在する場合には、このモチーフは、製品の均一質性を高めるために、部位特異的変異誘発により理想的には除去される。
【０２７７】
親和性成熟のプロセスは当技術分野で十分に説明されている。多くのディスプレイシステムの中でも、ファージディスプレイ（Ｓｍｉｔｈ  ＧＰ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１３１５−１３１７）及び酵母等の真核細胞によるディスプレイ（Ｂｏｄｅｒ  ＥＴ  ａｎｄ  Ｗｉｔｔｒｕｐ  ＫＤ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １５：５５３−５５７）は、抗体−抗原相互作用に関して選択するために最も一般的に適用されるシステムであると思われる。これらのディスプレイシステムの利点は、広範囲の抗原に適していること、及び選択の厳密さを容易に調整し得ることである。ファージディスプレイでは、ｓｃＦｖフラグメント又はＦａｂフラグメントを提示し得、加えて酵母中では完全長ＩｇＧを提示する。これらの一般に適用された方法により、１０Ｅ７を超える多様性を有するより大きなライブラリからの所望される抗体バリアントの選択が可能になる。多様性がより少ない（例えば１０Ｅ３）ライブラリを、微量発現及びＥＬＩＳＡによりスクリーニングし得る。
【０２７８】
非標的の又はランダムな抗体バリアントライブラリは、例えば、エラー−プローンＰＣＲ（Ｃａｄｗｅｌｌ  ＲＣ  ａｎｄ  Ｊｏｙｃｅ  ＧＦ（１９９４）Ｍｕｔａｇｅｎｉｃ  ＰＣＲ．ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．３：Ｓ１３６−Ｓ１４０）により生成され得、非常にシンプルではあるが時には制限されるアプローチを提供する。別の戦略は、抗体候補のＣＤＲにより方向付けられた多様化である。１個又は複数個のＣＤＲ中の１箇所又は複数箇所の位置を、例えば変性オリゴ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５６：７７−８８）、トリヌクレオチド突然変異誘発（ＴＲＩＭ）（Ｋａｙｕｓｈｉｎ  ＡＬ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：３７４８−３７５５）、又は当技術分野で既知の任意の他のアプローチを使用して特異的に標的とし得る。
【０２７９】
従って、別の実施形態では、本開示は、単離β−クロトー結合抗体又はその抗原結合フラグメントであって、配列番号６及び９を有する群から選択されるアミノ酸配列、又は配列番号６及び９と比較して１個、２個、３個、４個、若しくは５個のアミノ酸の置換、欠失、若しくは付加を有するアミノ酸配列からなるＶＨ  ＣＤＲ１領域；配列番号７のアミノ酸配列、又は配列番号７と比較して１個、２個、３個、４個、若しくは５個のアミノ酸の置換、欠失、若しくは付加を有するアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２領域；配列番号８のアミノ酸配列、又は配列番号８と比較して１個、２個、３個、４個、若しくは５個のアミノ酸の置換、欠失、若しくは付加を有するアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３領域を有する重鎖可変領域と、配列番号１９若しくは３１からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は配列番号１９若しくは３１と比較して１個、２個、３個、４個、若しくは５個のアミノ酸の置換、欠失、若しくは付加を有するアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１領域；配列番号２０のアミノ酸配列、又は配列番号２０と比較して１個、２個、３個、４個、若しくは５個のアミノ酸の置換、欠失、若しくは付加を有するアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２領域；及び配列番号２１のアミノ酸配列、又は配列番号２１と比較して１個、２個、３個、４個、若しくは５個のアミノ酸の置換、欠失、若しくは付加を有するアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３領域とからなる単離β−クロトー結合抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
【０２８０】
代替フレームワーク又は代替足場への抗原結合ドメインの移植
結果として得られるポリペプチドが、β−クロトーに特異的に結合する少なくとも１個の結合領域を含む限りは、多種多様な抗体／免疫グロブリンのフレームワーク又は足場を利用し得る。そのようなフレームワーク又は足場は、ヒト免疫グロブリン又はそのフラグメントの５種の主要なイディオタイプを含み、且つ好ましくはヒト化側面を有する他の動物種の免疫グロブリンを含む。ラクダ科動物で同定されたもの等の単一の重鎖抗体は、これに関して特に興味深い。新規のフレームワーク、足場、及びフラグメントが、当業者により発見され続けており、及び開発され続けている。
【０２８１】
一態様において、本開示は、本開示のＣＤＲを移植し得る非免疫グロブリン足場を使用して非免疫グロブリンベースの抗体を生成することに関する。標的β−クロロータンパク質に特異的な結合領域を含む限りにおいて、既知の又は将来の非免疫グロブリンのフレームワーク及び足場を利用し得る。既知の非免疫グロブリンのフレームワーク又は足場として、下記が挙げられるがこれらに限定されない：フィブロネクチン（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、アンキリン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ  ＡＧ，Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ドメイン抗体（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｌｔｄ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ、及びＡｂｌｙｎｘ  ｎｖ，Ｚｗｉｊｎａａｒｄｅ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）、リポカリン（Ｐｉｅｒｉｓ  Ｐｒｏｔｅｏｌａｂ  ＡＧ，Ｆｒｅｉｓｉｎｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、小モジュラー免疫医薬品（Ｔｒｕｂｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）、マキシボディ（ｍａｘｙｂｏｄｙ）（Ａｖｉｄｉａ，Ｉｎｃ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）、プロテインＡ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ  ＡＧ，Ｓｗｅｄｅｎ）、並びにアフィリン（ａｆｆｉｌｉｎ）（ガンマ−クリスタリン又はユビキチン）（Ｓｃｉｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ＧｍｂＨ，Ｈａｌｌｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。
【０２８２】
フィブロネクチン足場は、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（例えば、フィブロネクチンＩＩＩ型の１０番目のモジュール（１０Ｆｎ３ドメイン）に基づく。フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインは、２個のベータシート間に分布する７個又は８個のベータ鎖を有し、これらはそれ自体、互いにパックしてタンパク質のコアを形成し、ベータ鎖を互いに接続して溶媒に露出するループ（ＣＤＲに相同）をさらに含む。ベータシートサンドイッチの各縁には少なくとも３個のそのようなループが存在し、この縁は、ベータ鎖の方向に対して垂直なタンパク質の境界である（米国特許第６，８１８，４１８号明細書を参照されたい）。このフィブロネクチンベースの足場は免疫グロブリンではないが、全体の折り畳みは、ラクダ及びラマのＩｇＧ中の抗原認識ユニット全体を含む最小の機能的抗体フラグメント（重鎖の可変領域）の折り畳みに密接に関連する。この構造のために、非免疫グロブリン抗体は、抗体と性質及び親和性が類似する抗原結合特性を模倣する。この足場は、インビボでの抗体の親和性成熟のプロセスに類似するインビトロでのループランダム化及びシャフリング戦略で使用され得る。このフィブロネクチンベースの分子は、標準的なクローニング技術を使用して、この分子のループ領域を本開示のＣＤＲに置き換え得る足場として使用され得る。
【０２８３】
アンキリン技術は、様々な標的への結合に使用され得る可変領域を持つための足場として、アンキリン由来の反復モジュールを有するタンパク質を使用することに基づく。アンキリン反復モジュールは、２個の逆平行のα−ヘリックス及びβ−ターンからなる３３個のアミノ酸ポリペプチドである。可変領域の結合は、リボソームディスプレイを使用することによりほとんど最適化されている。
【０２８４】
アビマー（Ａｖｉｍｅｒ）は、ＬＲＰ−１等の天然のＡドメイン含有タンパク質に由来する。このドメインは本来、タンパク質間相互作用のために使用され、ヒトでは、２５０個を超えるタンパク質が構造的にＡ−ドメインに基づく。アビマーは、アミノ酸リンカーを介して連結された多くの異なる「Ａ−ドメイン」モノマー（２〜１０個）からなる。例えば、米国特許出願公開第２００４０１７５７５６号明細書；同第２００５００５３９７３号明細書；同第２００５００４８５１２号明細書；及び同第２００６０００８８４４号明細書で説明された方法論を使用して、標的抗原に結合し得るアビマーを作製し得る。
【０２８５】
アフィボディアフィニティリガンドは、プロテインＡのＩｇＧ結合ドメインのうちの１つの足場に基づく３個のヘリックスの束で構成される、小さくて単純なタンパク質である。プロテインＡは、細菌スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）由来の表面タンパク質である。この足場ドメインは５８個のアミノ酸からなり、そのうちの１３個はランダム化されて、多数のリガンドバリアントを有するアフィボディライブラリが生成されている（例えば、米国特許第５，８３１，０１２号明細書を参照されたい）。アフィボディ分子は抗体を模倣し、１５０ｋＤａである抗体の分子量と比較して、分子量は６ｋＤａである。アフィボディ分子の小さいサイズにもかかわらず、アフィボディ分子の結合部位は抗体の結合部位に類似する。
【０２８６】
アンチカリン（Ａｎｔｉｃａｌｉｎ）は、Ｐｉｅｒｉｓ  ＰｒｏｔｅｏＬａｂ  ＡＧ社により開発された商品である。アンチカリンはリポカリンに由来し、このリポカリンは、化学的に敏感な又は不溶性の化合物の生理的輸送又は貯蔵に通常関与する、小さくて頑強なタンパク質の幅広い群である。いくつかの天然リポカリンは、ヒトの組織中に又は体液中に存在する。このタンパク質の構造は、強固なフレームワーク上の超可変ループにより、免疫グロブリンを連想させる。しかしながら、抗体又はその組換えフラグメントとは対照的に、リポカリンは、１６０〜１８０個のアミノ酸残基を有する単一のポリペプチド鎖で構成されており、単一の免疫グロブリンドメインと比べてわずかに大きい。結合ポケットを構成する４個のループのセットは顕著な構造的柔軟性を示し、様々な側鎖を許容する。そのため、結合部位は、高い親和性及び特異性にて、形状が異なる所定の標的分子を認識するために、独自のプロセスで再形成され得る。リポカリンファミリの１種のタンパク質である、オオモンシロチョウ（Ｐｉｅｒｉｓ  Ｂｒａｓｓｉｃａｅ）のビリン結合タンパク質（ＢＢＰ）は、４個のループのセットを突然変異誘発することによってアンチカリンを開発するために使用されている。アンチカリンを説明する特許出願の一例は、国際公開第１９９９１６８７３号パンフレットである。
【０２８７】
アフィリン分子は、タンパク質及び小分子に対する特異的な親和性のために設計されている小さい非免疫グロブリンタンパク質である。新規のアフィリン分子は、それぞれが異なるヒト由来足場タンパク質に基づいている２種のライブラリから非常に迅速に選択され得る。アフィリン分子は、免疫グロブリンタンパク質に対して構造的類似性を全く示さない。現在、２種のアフィリン足場が採用されており、そのうちの一方はガンマ結晶であり、ヒトの構造的な眼の水晶体タンパク質であり、他方は「ユビキチン」スーパーファミリタンパク質である。両方のヒト足場は非常に小さく、高温安定性を示し、且つｐＨ変化及び変性剤にほとんど耐性を示す。この高い安定性は、タンパク質の拡大されたベータシート構造に主に起因する。ガンマ結晶由来タンパク質の例が国際公開第２００１０４１４４号パンフレットで説明されており、「ユビキチン様」タンパク質の例が国際公開第２００４１０６３６８号パンフレットで説明されている。
【０２８８】
タンパク質エピトープ模倣物（ＰＥＭ）は、タンパク質間の相互作用に関与する主要な二次構造であるタンパク質のベータ−ヘアピン二次構造を模倣する、中程度の大きさの環状ペプチド様分子（ＭＷ  １〜２ｋＤａ）である。
【０２８９】
本開示は、β−クロトータンパク質に特異的に結合する完全ヒト抗体を提供する。特定の態様において、キメラ抗体又はヒト化抗体と比較して、本開示のヒトβ−クロトー結合抗体は、ヒト対象に投与された場合に抗原性がさらに低下している。
【０２９０】
ラクダ科動物抗体
ラマ種（アルパカ（Ｌａｍａ  ｐａｃｃｏｓ）、リャマ（Ｌａｍａ  ｇｌａｍａ）、及びビクーニャ（Ｌａｍａ  ｖｉｃｕｇｎａ））等の新世界のメンバーを含むラクダ及びヒトコブラクダ（フタコブラクダ（Ｃａｍｅｌｕｓ  ｂａｃｔｒｉａｎｕｓ）及びヒトコブラクダ（Ｃａｌｅｌｕｓ  ｄｒｏｍａｄｅｒｉｕｓ））ファミリのメンバーから得られた抗体タンパク質は、サイズ、構造の複雑さ、及びヒト対象の場合の抗原性に関して特徴が明らかにされている。自然界で見られるこの哺乳動物のファミリからの特定のＩｇＧ抗体は軽鎖を欠いており、そのため、他の動物からの抗体の場合の２本の重鎖及び２本の軽鎖を有する典型的な４本鎖四次構造とは構造が異なる。第ＰＣＴ／ＥＰ９３／０２２１４号（１９９４年３月３日に公開された国際公開第９４／０４６７８号パンフレット）を参照されたい。
【０２９１】
ＶＨＨとして特定される小さい単一可変ドメインであるラクダ科動物抗体の領域を、標的に対して高い親和性を有する小さいタンパク質を得るための遺伝子操作により得ることができ、結果として、「ラクダ科動物ナノボディ」として知られている低分子量の抗体由来タンパク質が得られる。１９９８年６月２日に発行された米国特許第５，７５９，８０８号明細書を参照し、Ｓｔｉｊｌｅｍａｎｓ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，２００４  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９：１２５６−１２６１；Ｄｕｍｏｕｌｉｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，２００３  Ｎａｔｕｒｅ  ４２４：７８３−７８８；Ｐｌｅｓｃｈｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．２００３  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ  １４：４４０−４４８；Ｃｏｒｔｅｚ−Ｒｅｔａｍｏｚｏ，Ｖ．ｅｔ  ａｌ．２００２  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ８９：４５６−６２；及びＬａｕｗｅｒｅｙｓ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．１９９８  ＥＭＢＯ  Ｊ  １７：３５１２−３５２０も参照されたい。ラクダ科動物抗体及び抗体フラグメントの操作されたライブラリは、例えば、Ａｂｌｙｎｘ，Ｇｈｅｎｔ，Ｂｅｌｇｉｕｍから市販されている。非ヒト起源の他の抗体と同様に、ラクダ科動物抗体のアミノ酸配列を組換えにより変更して、ヒト配列により密接に類似する配列を得ることができる（即ち、このナノボディを「ヒト化」し得る）。そのため、ヒトに対するラクダ科動物抗体の自然な低抗原性をさらに低下させ得る。
【０２９２】
ラクダ科動物ナノボディは、分子量がヒトＩｇＧ分子の約１０分の１であり、且つタンパク質の物理的直径はわずか数ナノメートルである。小さいサイズによる１つの帰結は、より大きな抗体タンパク質には機能的に見えない抗原部位に結合する、ラクダ科動物ナノボディの能力である（即ち、ラクダ科動物ナノボディは、古典的な免疫学的技術を使用すると陰性である抗原を検出する試薬として、且つ可能な治療薬として有用である）。そのため、小さいサイズによるさらに別の帰結は、ラクダ科動物ナノボディが、標的タンパク質の溝又は狭い裂け目中の特定の部位への結合の結果として阻害し得ることであり、従って、古典的な抗体の機能と比べて古典的な低分子量薬物の機能により密接に類似する能力で役立ち得る。
【０２９３】
低分子量及びコンパクトなサイズにより、熱安定性が非常に高く、極端なｐＨ及びタンパク質分解に対して安定であり、且つ抗原性が低いラクダ科動物ナノボディがさらに得られる。別の帰結は、ラクダ科動物ナノボディが循環系から組織中へと容易に移動し、血液脳関門さえも容易に通過し、神経組織に影響を及ぼす障害を処置し得ることである。ナノボディはさらに、血液脳関門を通過する薬物移動を促進し得る。２００４年８月１９日に公開された米国特許出願公開第２００４０１６１７３８号明細書を参照されたい。これらの特徴は、ヒトに対する低い抗原性と相まって、大きな治療可能性を示す。さらに、この分子は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）等の原核細胞中で完全に発現され得、バクテリオファージとの融合タンパク質として発現され、且つ機能する。
【０２９４】
従って、本開示の特徴は、β−クロトー（例えばヒトβ−クロトー）に対して特異的な親和性を有するラクダ科動物の抗体又はナノボディである。本明細書の特定の実施形態において、ラクダ科動物の抗体又はナノボディは、ラクダ科の動物中で天然に産生される（即ち、他の抗体に関して本明細書で説明された技術を使用して、β−クロトー又はそのペプチドフラグメントにより免疫を付与した後のラクダ科動物により産生される）。あるいは、このβ−クロトー結合ラクダ科動物ナノボディは操作されている（即ち、例えば、本明細書の実施例で説明されているように標的としてβ−クロトーを使用するパニング手順を使用して、適切に変異誘発されたラクダ科動物ナノボディタンパク質を提示するファージのライブラリからの選択により作製される）。操作されたナノボディは、レシピエント対象中での半減期が４５分〜２週間となるように、遺伝子操作によりさらにカスタマイズされ得る。具体的な実施形態において、ラクダ科動物の抗体又はナノボディは、例えばＰＣＴ／ＥＰ９３／０２２１４号で説明されているように、本開示のヒト抗体の重鎖又は軽鎖のＣＤＲ配列をナノボディ又は単一ドメイン抗体のフレームワーク配列中に移植することにより得られる。
【０２９５】
二重特異性分子及び多価抗体
別の態様において、本開示は、本開示のβ−クロトー結合抗体又はそのフラグメント（例えば、抗体ＮＯＶ００５又はＮＯＶ００６）を含む二重特異性分子若しくは多重特異性分子を特徴とする。本開示の抗体又はその抗原結合領域を誘導体化するか、又は別の機能的分子に連結させて、例えば別のペプチド又はタンパク質（例えば、別の抗体又はレセプターに対するリガンド）に連結させて、少なくとも２種の異なる結合部位又は標的分子に結合する二重特異性分子を生成し得る。本開示の抗体を実際に誘導体化するか、又は複数の他の機能的分子に連結させて、２種以上の異なる結合部位及び／又は標的分子に結合する多重特異性分子を生成し得、そのような多重特異性分子はまた、本明細書で使用される場合には用語「二重特異性分子」に包含されることも意図されている。本開示の二重特異性分子を作製するために、本開示の抗体を、二重特異性分子を生じさるように、１種又は複数種の他の結合分子（例えば、別の抗体、抗体フラグメント、ペプチド又は結合模倣物）に（例えば、化学的カップリング、遺伝的融合、非共有結合的会合、又は別の方法により）機能的に連結させ得る。
【０２９６】
従って、本開示は、β−クロトーに対する少なくとも１種の第１の結合特異性と、第２の標的エピトープに対する第２の結合特異性とを含む二重特異性分子を含む。例えば、この第２の標的エピトープは、第１の標的エピトープとは異なるβ−クロトーの別のエピトープである。
【０２９７】
加えて、この二重特異性分子が多重特異性である本開示の場合、この分子は、第１の及び第２の標的エピトープに加えて、第３の結合特異性をさらに含み得る。
【０２９８】
一態様において、本開示の二重特異性分子は、結合特異性として、少なくとも１種の抗体又はその抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、又は一本鎖Ｆｖ）を含む。この抗体はまた、軽鎖若しくは重鎖の二量体又はその任意の最小フラグメント（例えばＦｖ）であってもよいし、Ｌａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第４，９４６，７７８号明細書で説明されている一本鎖構築物であってもよい。
【０２９９】
ダイアボディは、同一鎖上の２個のドメイン間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーにより接続されている、ＶＨ及びＶＬのドメインが単一のポリペプチド鎖上で発現される二価の二重特異性分子である。ＶＨドメイン及びＶＬドメインは別の鎖の相補ドメインと対形成し、それにより２個の抗原結合部位が作製される（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８；Ｐｏｌｊａｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３を参照されたい）。ダイアボディは、同一の細胞内で、構造ＶＨＡ−ＶＬＢ及びＶＨＢ−ＶＬＡ（ＶＨ−ＶＬ配置）又はＶＬＡ−ＶＨＢ及びＶＬＢ−ＶＨＡ（ＶＬ−ＶＨ配置）のいずれかを有する２本のポリペプチド鎖を発現させることにより産生され得る。これらのほとんどは、細菌中において可溶型で発現され得る。一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）は、約１５個のアミノ酸残基のリンカーで２本のダイアボディ形成ポリペプチド鎖を接続することにより産生される（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，１９９７  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，４５（３−４）：１２８−３０；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６  Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２（１）：２１−３６を参照されたい）。ｓｃＤｂは、細菌中において、可溶性の活性モノマー型で発現され得る（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，１９９７  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，４５（３４）：１２８−３０；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６  Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２（１）：２１−３６；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ａｎｄ  Ｐａｃｋ，１９９７  Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３（２）：８３−１０５；Ｒｉｄｇｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，９（７）：６１７−２１を参照されたい）。ダイアボディをＦｃと融合させて、「ジダイアボディ（ｄｉ−ｄｉａｂｏｄｙ）」を作製し得る（Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００４  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７９（４）：２８５６−６５を参照されたい）。
【０３００】
本開示の二重特異性分子で利用され得る他の抗体は、マウス抗体、キメラ抗体、及びヒト化モノクローナル抗体である。
【０３０１】
当技術分野で既知の方法を使用して、構成物の結合特異性部分を結合させることにより、二重特異性分子を調製し得る。例えば、二重特異性分子の各結合特異性部分を別々に生成し、次いで互いに結合させ得る。この結合特異性部分がタンパク質又はペプチドである場合には、共役結合させるために、様々なカップリング剤又は架橋剤を使用し得る。架橋剤の例として、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ−フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、及びスルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）が挙げられる（例えば、Ｋａｒｐｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６０：１６８６；Ｌｉｕ，ＭＡ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：８６４８を参照されたい）。他の方法として、Ｐａｕｌｕｓ，１９８５  Ｂｅｈｒｉｎｇ  Ｉｎｓ．Ｍｉｔｔ．Ｎｏ．７８，１１８−１３２；Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１−８３）、及びＧｌｅｎｎｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：２３６７−２３７５）で説明されているものが挙げられる。結合剤はＳＡＴＡ及びスルホ−ＳＭＣＣであり、両方ともＰｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）から入手可能である。
【０３０２】
結合特異性部分が抗体である場合には、２本の重鎖のＣ末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合により、それらを結合させ得る。特定の実施形態において、このヒンジ領域は、結合の前に、奇数個（例えば１個）のスルフヒドリル残基を含むように改変されている。
【０３０３】
あるいは、両方の結合特異性部分を同一のベクター中でコードし得、且つ同一の宿主細胞中で発現させて構築させ得る。この方法は、二重特異性分子がｍＡｂ×ｍＡｂ融合タンパク質、ｍＡｂ×Ｆａｂ融合タンパク質、Ｆａｂ×Ｆ（ａｂ’）２融合タンパク質、又はリガンド×Ｆａｂ融合タンパク質である場合に特に有用である。本開示の二重特異性分子は、１個の一本鎖抗体及び１個の結合決定基を含む一本鎖分子であり得るか、又は２個の結合決定基を含む一本鎖二重特異性分子であり得る。二重特異性分子は、少なくとも２個の一本鎖分子を含み得る。二重特異性分子を調製する方法は、例えば、米国特許第５，２６０，２０３号明細書；同第５，４５５，０３０号明細書；同第４，８８１，１７５号明細書；同第５，１３２，４０５号明細書；同第５，０９１，５１３号明細書；同第５，４７６，７８６号明細書；同第５，０１３，６５３号明細書；同第５，２５８，４９８号明細書；及び同第５，４８２，８５８号明細書で説明されている。
【０３０４】
この二重特異性分子のその特異的標的への結合を、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＥＡ）、ＦＡＣＳ分析、バイオアッセイ（例えば増殖阻害）、又はウェスタンブロットアッセイにより確認し得る。これらのアッセイのそれぞれは概して、目的の複合体に対して特異的な、標識された試薬（例えば抗体を）を利用することにより、特定の目的のタンパク質−抗体複合体の存在を検出する。
【０３０５】
別の態様において、本開示は、β−クロトーに結合する本開示の抗体の少なくとも２個の同一の又は異なる抗原結合部分を含む多価化合物を提供する。この抗原結合部分は、タンパク質融合又は共有結合の若しくは非共有結合の連結を介して互いに連結され得る。あるいは、連結の方法は、二重特異性分子に関して説明されている。例えば、本開示の抗体の定常領域（例えばＦｃ領域又はヒンジ領域）に結合する抗体で本開示の抗体の抗体を架橋することにより、四価化合物を得ることができる。
【０３０６】
三量体化ドメインは、例えばＢｏｒｅａｎの欧州特許第１  ０１２  ２８０Ｂ１号明細書で説明されている。五量体化モジュールは、例えばＰＣＴ／ＥＰ９７／０５８９７号で説明されている。
【０３０７】
半減期が延長されている抗体
本開示は、インビボでの半減期が延長されている、β−クロトータンパク質に特異的に結合する抗体（例えばＮＯＶ００５又はＮＯＶ００６）を提供する。
【０３０８】
多くの因子が、インビボでのタンパク質の半減期に影響を及ぼし得る。例えば、腎臓ろ過、肝臓中での代謝、タンパク質分解酵素（プロテアーゼ）による分解、並びに免疫原性応答（例えば、抗体によるタンパク質中和、並びにマクロファージ及び樹状細胞による取込み）。様々な戦略を使用して、本開示の抗体の半減期を延長させ得る。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ｒｅＣＯＤＥ  ＰＥＧ、抗体足場、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、アルブミン結合リガンド、及び炭水化物シールドへの化学的連結による；血清タンパク質（例えば、アルブミン、ＩｇＧ、ＦｃＲＮ、及びトランスフェリン（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ））に結合するタンパク質への遺伝子融合による；血清タンパク質（例えばナノボディ、Ｆａｂ、ＤＡＲＰイン、アビマー、アフィボディ、及びアンチカリン）に結合する他の結合部分へのカップリング（遺伝子的又は化学的）による；ｒＰＥＧ、アルブミン、アルブミンのドメイン、アルブミン結合タンパク質、及びＦｃへの遺伝子融合による；又は、ナノ担体、徐放製剤、若しくは医療デバイスへの組み込みによる。
【０３０９】
インビボでの抗体の血清中循環を延長するために、不活性のポリマー分子（例えば高分子量ＰＥＧ）を、この抗体のＮ末端若しくはＣ末端へのＰＥＧの部位特異的結合を介して、又はリシン残基上に存在するイプシロン−アミノ基を介して、多官能性リンカーにより又は多官能性リンカー無しで、抗体又はそのフラグメントへと付着させ得る。抗体をペグ化するためには、１個又は複数個のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基が、この抗体又は抗体フラグメントに付着するようになる条件下で、この抗体又はそのフラグメントを概して、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧの反応性エステル又はアルデヒド誘導体）と反応させる。このペグ化を、反応性ＰＥＧ分子（又は類似する反応性の水溶性ポリマー）とのアシル化反応又はアルキル化反応により実行し得る。本明細書で使用される場合、用語「ポリエチレングリコール」は、他のタンパク質を誘導体化するために使用されているＰＥＧの形態（例えば、モノ（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシ−ポリエチレングリコール若しくはアリールオキシポリエチレングリコール又はポリエチレングリコール−マレイミド）のうちのいずれかを包含することが意図されている。特定の実施形態において、ペグ化される抗体は、脱グリコシル化抗体（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）である。結果として生物学的活性の喪失が最小である直鎖ポリマー又は分枝ポリマーの誘導体化が使用されるであろう。結合の程度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び質量分析により緊密にモニタリングして、抗体へのＰＥＧ分子の適切な結合を確実にし得る。未反応のＰＥＧを、サイズ排除クロマトグラフィー又はイオン交換クロマトグラフィーにより、抗体−ＰＥＧ結合体から分離し得る。ＰＥＧ誘導体化抗体を、当業者に公知の方法を使用して、例えば、本明細書で説明されたイムノアッセイにより、結合活性及びインビボでの有効性に関して試験し得る。タンパク質をペグ化する方法は当技術分野で既知であり、本開示の抗体に適用され得る。例えば、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ他による欧州特許第０１５４３１６号明細書、及びＩｓｈｉｋａｗａ他による欧州特許第０４０１３８４号明細書を参照されたい。
【０３１０】
他の改変されたペグ化技術として、再構成化学的直交性直接操作技術（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｎｇ  ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（ＲｅＣＯＤＥ  ＰＥＧ）が挙げられ、この技術により、ｔＲＮＡシンセターゼ及びｔＲＮＡを含む再構成系を介して、化学的に特定された側鎖が生合成タンパク質へと組み込まれる。この技術は、３０種を超える新規のアミノ酸の、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中での、酵母中での、及び哺乳動物細胞中での生合成タンパク質への組み込みを可能にする。ｔＲＮＡは、非天然アミノ酸を、アンバーコドンが配置される任意の場所に組み込み、終止コドンから、化学的に特定されたアミノ酸の組み込みをシグナル伝達するコドンへとアンバーを変換する。
【０３１１】
組換えペグ化技術（ｒＰＥＧ）を、血清半減期の延長にも使用し得る。この技術は、３００〜６００個のアミノ酸の非構造化タンパク質テイルを、既存の医薬用タンパク質へと遺伝子融合させることを含む。そのような非構造化タンパク質鎖の見かけ上の分子量は、その実際の分子量と比べて約１５倍大きいことから、このタンパク質の血清半減期は大きく増大する。化学的結合及び再精製を必要とする伝統的なＰＥＧ化とは対照的に、製造工程は大きく簡略化され、且つ生成物は均質である。
【０３１２】
ポリシアリル化は、天然ポリマーであるポリシアル酸（ＰＳＡ）を使用して、活性寿命を延長し且つ治療用ペプチド及び治療用タンパク質の安定性を改善する、別の技術である。ＰＳＡは、シアル酸（糖）のポリマーである。タンパク質及び治療用ペプチドの薬物送達に使用される場合、結合によりポリシアル酸は保護的微小環境をもたらす。これにより、循環中の治療用タンパク質の活性寿命が増加し、この治療用タンパク質が免疫系により認識されることが防止される。ＰＳＡポリマーは人体内で天然に見出される。ＰＳＡポリマーは特定の細菌により利用されており、この細菌は、この細菌の壁をＰＳＡポリマーでコーティングするように数百年にわたり進化した。次いで、これらの天然にポリシアリル化した細菌は、分子的模倣により、身体の防御系を無効にすることが可能になった。天然の究極のステルス技術であるＰＳＡを、そのような細菌から、大量に且つ所定の物理的特徴を伴って容易に産生させ得る。細菌ＰＳＡは、ヒト身体内ではＰＳＡと化学的に同一であることから、タンパク質へとカップリングされた場合であっても、完全に非免疫原性である。
【０３１３】
別の技術は、抗体に連結されたヒドロキシエチルデンプン（「ＨＥＳ」）誘導体の使用を含む。ＨＥＳは、ろう様のトウモロコシデンプンに由来する改変された天然ポリマーであり、身体の酵素により代謝され得る。ＨＥＳ溶液は通常、不足した血液量の代わりとなるために且つ血液のレオロジー特性を改善するために投与される。抗体のＨＥＳ化により、分子の安定性を増加させることによって、及び腎クリアランスを低減することによって、循環半減期の延長が可能となり、生物学的活性が増加する。様々なパラメータ（例えば、ＨＥＳの分子量）を変えることにより、広範囲なＨＥＳ抗体結合体をカスタマイズし得る。
【０３１４】
インビボでの半減期が増加した抗体を、１個又は複数個のアミノ酸改変（即ち、置換、挿入、又は欠失）を、ＩｇＧ定常ドメイン又はそのＦｃＲｎ結合フラグメント（好ましくは、Ｆｃドメインフラグメント又はヒンジＦｃドメインフラグメント）へ導入することによっても生成し得る。例えば、国際公開第９８／２３２８９号パンフレット；同第９７／３４６３１号パンフレット；及び米国特許第６，２７７，３７５号明細書を参照されたい。
【０３１５】
さらに、抗体又は抗体フラグメントをインビボでより安定させるために、又はインビボでの半減期をより長くするために、抗体をアルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン；ＨＳＡ）に結合させ得る。この技法は当技術分野で公知であり、例えば、国際公開第９３／１５１９９号パンフレット、同第９３／１５２００号パンフレット、及び同第０１／７７１３７号パンフレット；並びに欧州特許第４１３，６２２号明細書を参照されたい。加えて、上記で説明した二重特異性抗体の文脈において、この抗体の特異性を、この抗体の１個の結合ドメインがＦＧＦ２１に結合するが、この抗体の第２の結合ドメインが血清アルブミン（好ましくはＨＳＡ）に結合するように設計し得る。
【０３１６】
半減期を増加させるための戦略は、インビボでの半減期の増加が望まれるナノボディ、フィブロネクチンベースの結合剤、及び他の抗体又はタンパク質において、特に有用である。
【０３１７】
抗体結合体
本開示は、β−クロトータンパク質に特異的に結合する抗体又はそのフラグメントであって、融合タンパク質を生成するために異種タンパク質若しくは異種ポリペプチド（又はそれらのフラグメント、好ましくは、少なくとも１０個の、少なくとも２０個の、少なくとも３０個の、少なくとも４０個の、少なくとも５０個の、少なくとも６０個の、少なくとも７０個の、少なくとも８０個の、少なくとも９０個の、又は少なくとも１００個のアミノ酸のポリペプチド）に組換えにより融合されたか、又は化学的に結合（共有結合及び非共有結合の両方を含む）した、抗体又はそのフラグメントを提供する。具体的には、本開示は、本明細書で説明された抗体（例えばＮＯＶ００５又はＮＯＶ００６）の抗原結合フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆｖフラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメント、ＶＨドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ、ＶＬドメイン、又はＶＬ  ＣＤＲ）と、異種タンパク質、異種ポリペプチド、又は異種ペプチドとを含む融合タンパク質を提供する。抗体又は抗体フラグメントにタンパク質、ポリペプチド、又はペプチドを融合させる方法又は結合させる方法は、当技術分野で既知である。例えば、米国特許第５，３３６，６０３号明細書、同第５，６２２，９２９号明細書、同第５，３５９，０４６号明細書、同第５，３４９，０５３号明細書、同第５，４４７，８５１号明細書、及び同第５，１１２，９４６号明細書；欧州特許第３０７，４３４号明細書、及び同第３６７，１６６号明細書；国際公開第９６／０４３８８号パンフレット、及び同第９１／０６５７０号パンフレット；Ａｓｈｋｅｎａｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１０５３５−１０５３９；Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５５９０−５６００；及びＶｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１１３３７−１１３４１を参照されたい。
【０３１８】
遺伝子シャフリング、モチーフシャフリング、エクソンシャフリング、及び／又はコドンシャフリング（まとめて「ＤＮＡシャフリング」と称される）の技術により、さらなる融合タンパク質を生成し得る。ＤＮＡシャフリングを利用して、本開示の抗体又はそのフラグメント（例えば、親和性がより高く且つ解離速度がより低い抗体又はそのフラグメント）の活性を変更し得る。一般に、米国特許第５，６０５，７９３号明細書、同第５，８１１，２３８号明細書、同第５，８３０，７２１号明細書、同第５，８３４，２５２号明細書、及び同第５，８３７，４５８号明細書；Ｐａｔｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：７２４−３３；Ｈａｒａｙａｍａ，１９９８，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（２）：７６−８２；Ｈａｎｓｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８７：２６５−７６；及びＬｏｒｅｎｚｏ  ａｎｄ  Ｂｌａｓｃｏ，１９９８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２４（２）：３０８−３１３を参照されたい（これらの特許及び刊行物のそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。抗体若しくはそのフラグメント、又はコードされた抗体若しくはそのフラグメントを、組換えの前に、エラープローンＰＣＲによるランダム突然変異誘発、ランダムヌクレオチド挿入、又は他の方法に供することにより変更し得る。β−クロトータンパク質に特異的に結合する抗体又はそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドを、１種又は複数種の異種分子の１種又は複数種の構成要素、モチーフ、区間、部分、ドメイン、フラグメント等で組み換え得る。
【０３１９】
さらに、この抗体又はそのフラグメントを、精製を容易にするために、ペプチド等のマーカー配列に融合させ得る。好ましい実施形態において、このマーカーアミノ酸配列は、その多くが市販されているが、その中でも、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，９２５９  Ｅｔｏｎ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）で提供されるタグ等のヘキサヒスチジンペプチド（配列番号６４）である。Ｇｅｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８２１−８２４で説明されているように、例えば、ヘキサヒスチジン（配列番号６４）により、融合タンパク質の簡便な精製がもたらされる。精製に有用な他のペプチドタグとして、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質に由来するエピトープに対応するヘマグルチニン（「ＨＡ」）タグ（Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ  ３７：７６７）、及び「フラッグ」タグが挙げられるがこれらに限定されない。
【０３２０】
他の実施形態において、本開示の抗体又はそのフラグメントは、診断薬又は検出可能薬に結合している。そのような抗体は、臨床検査手順の一部として、疾患又は障害の発生、発達、進行、及び／又は重症度をモニタリングするか又は予後診断する（例えば、特定の治療の有効性を決定する）のに有用であり得る。そのような診断及び検出を、この抗体を検出可能な物質にカップリングさせることにより達成し得、この検出可能な物質として、下記が挙げられるがこれらに限定されない：様々な酵素、例えば、限定されないが西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼ；補欠分子族、例えば、限定されないがストレプトアビジン／ビオチン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎｌｂｉｏｔｉｎ）、及びアビジン／ビオチン；蛍光材料、例えば、限定されないがウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、又はフィコエリトリン；発光材料、例えば、限定されないがルミノール；生物発光材料、例えば、限定されないがルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリン；放射性材料、例えば限定されないがヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、及び１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉ、１１２Ｉｎ、及び１１１Ｉｎ）、テクネチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎ、及び１１７Ｔｉｎ；並びに様々なポジトロン放出断層撮影を使用するポジトロン放出金属、及び非放射性の常磁性金属イオン。
【０３２１】
本開示は、治療用部分に結合した抗体又はそのフラグメントの使用をさらに包含する。抗体又はそのフラグメントを、治療用部分（例えば、細胞毒素（例えば細胞分裂阻害剤若しくは殺細胞剤）、治療薬、又は放射性金属イオン（例えばアルファ放射体））に結合させ得る。細胞毒素又は細胞傷害性薬は、細胞に有害なあらゆる薬剤を含む。
【０３２２】
さらに、抗体又はそのフラグメントを、所与の生物学的応答を改変する治療用部分又は薬物部分に結合させ得る。治療用部分又は薬物部分は、古典的な化学的治療薬に限定されると解釈されないものとする。例えば、この薬物部分は、所望される生物学的活性を有するタンパク質、ペプチド、又はポリペプチドであり得る。そのようなタンパク質として、例えば下記が挙げられ得る：毒素、例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素、コレラ毒素、又はジフテリア毒素；タンパク質、例えば、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノーゲン活性化剤、アポトーシス剤、抗血管新生剤；又は生物学的応答改変剤、例えばリンホカイン。
【０３２３】
さらに、抗体を、治療用部分（例えば、放射性金属イオン、例えば、アルファ放射体、例えば２１３Ｂｉ）、又はポリペプチドに放射性金属イオン（例えば、限定されないが１３１Ｉｎ、１３１ＬＵ、１３１Ｙ、１３１Ｈｏ、１３１Ｓｍ）を結合させるのに有用な大環状キレート化剤に結合させ得る。特定の実施形態において、この大環状キレート化剤は、リンカー分子を介して抗体に付着され得る１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）である。そのようなリンカー分子は当技術分野で一般に知られており、Ｄｅｎａｒｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４（１０）：２４８３−９０；Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１０（４）：５５３−７；及びＺｉｍｍｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２６（８）：９４３−５０（それぞれはその全体が参照に組み込まれる）で説明されている。
【０３２４】
抗体に治療用部分を結合させるための技術は公知であり、例えば下記を参照されたい：Ａｒｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ”，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．２４３−５６（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，”Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”，ｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（２ｎｄ  Ｅｄ．），Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．６２３−５３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ，”Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ”，  ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｉｎｃｈｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．４７５−５０６（１９８５）；”Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ”，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．３０３−１６（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５）、及びＴｈｏｒｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９−５８。
【０３２５】
抗体を固体支持体にも付着させ得、この固体支持体は、イムノアッセイ又は標的抗原の精製に特に有用である。そのような固体支持体として、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、又はポリプロピレンが挙げられるがこれらに限定されない。
【０３２６】
抗体を製造する方法
抗体をコードする核酸
本開示は、上記で説明されたβ−クロトー結合抗体鎖のセグメント又はドメインを含むポリペプチドをコードする、実質的に精製された核酸分子を提供する。本開示の核酸のうちのいくつかは、配列番号１５に示された重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列、及び／又は配列番号２６若しくは３２に示された軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む。具体的な態様において、本明細書で提供される核酸分子は、表１で特定されたものであり、例えば、ＶＨをコードする配列番号１６、３６、若しくは３８の配列を含む核酸分子、又はＶＬをコードする配列番号２７、５４、３３、若しくは４０の配列を含む核酸分子である。本開示のいくつかの他の核酸分子は、表１で特定されたもののヌクレオチド配列と実質的に（例えば、少なくとも６５、８０％、９５％、又は９９％）同一であるヌクレオチド配列を含み、例えば、ＶＨをコードする配列番号１６、３６、若しくは３８の配列を含む核酸分子又はＶＬをコードする配列番号２７、５４、３３、若しくは４０の配列を含む核酸分子と実質的に（例えば、少なくとも６５、８０％、９５％、又は９９％）同一であるヌクレオチド配列を含む。適切な発現ベクターから発現された場合には、これらのポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドは、ＦＧＦ２１抗原結合能を示し得る。
【０３２７】
本開示で同様に提供されるのは、本明細書に記載されたβ−クロトー結合抗体（例えば、表１に記載されたもの）の重鎖及び／又は軽鎖の可変領域配列の全て又は実質的に全てをコードするポリヌクレオチドである。具体的な態様において、本開示は、β−クロトー結合抗体ＮＯＶ００５のＶＨ及び／又はＶＬの全て又は実質的に全てをコードするポリヌクレオチドを提供する。具体的な態様において、本開示は、β−クロトー結合抗体ＮＯＶ００５の重鎖及び／又は軽鎖の全て又は実質的に全てをコードするポリヌクレオチドを提供する。具体的な態様において、本開示は、β−クロトー結合抗体ＮＯＶ００６のＶＨ及び／又はＶＬの全て又は実質的に全てをコードするポリヌクレオチドを提供する。具体的な態様において、本開示は、β−クロトー結合抗体ＮＯＶ００６の重鎖及び／又は軽鎖の全て又は実質的に全てをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【０３２８】
コードの縮重のために、様々な核酸配列が、免疫グロブリンアミノ酸配列のそれぞれをコードするだろう。例えば、配列番号１６及び３６は、ＮＯＶ００５のＶＨをコードする２種の核酸配列であり、配列番号２７及び５４は、ＮＯＶ００５のＶＬをコードする２種の核酸配列である。
【０３２９】
本開示の核酸分子は、本抗体の可変領域及び定常領域の両方をコードし得る。本開示の核酸配列のうちのいくつかは、配列番号１７に記載された重鎖配列と実質的に（例えば、少なくとも８０％、９０％、又は９９％）同一である重鎖配列をコードするヌクレオチドを含む。配列番号２８又は３４に記載された軽鎖配列と実質的に（例えば、少なくとも８０％、９０％、又は９９％）同一である軽鎖配列をコードするヌクレオチドを含む、いくつかの他の核酸配列。具体的な態様において、本明細書で提供される核酸分子は、表１で特定されたものであり、例えば、重鎖をコードする配列番号１８、３７、３０、若しくは３９の配列を含む核酸分子、又は軽鎖をコードする配列番号２９、５１、３５、若しくは４１の配列を含む核酸分子である。
【０３３０】
具体的な態様において、本明細書で提供されるのは、ＶＨをコードする配列番号１６の核酸配列を含むポリヌクレオチドである。具体的な態様において、本明細書で提供されるのは、ＶＨをコードする配列番号３６の核酸配列を含むポリヌクレオチドである。具体的な態様において、本明細書で提供されるのは、ＶＨをコードする配列番号３８の核酸配列を含むポリヌクレオチドである。具体的な態様において、本明細書で提供されるのは、ＶＬをコードする配列番号２７の核酸配列を含むポリヌクレオチドである。具体的な態様において、本明細書で提供されるのは、ＶＬをコードする配列番号５４の核酸配列を含むポリヌクレオチドである。具体的な態様において、本明細書で提供されるのは、ＶＬをコードする配列番号２９の核酸配列を含むポリヌクレオチドである。具体的な態様において、本明細書で提供されるのは、ＶＬをコードする配列番号５１の核酸配列を含むポリヌクレオチドである。
【０３３１】
具体的な態様において、本明細書で提供されるのは、重鎖をコードする配列番号１８の核酸配列を含むポリヌクレオチドである。具体的な態様において、本明細書で提供されるのは、重鎖をコードする配列番号３７の核酸配列を含むポリヌクレオチドである。具体的な態様において、本明細書で提供されるのは、重鎖をコードする配列番号３０の核酸配列を含むポリヌクレオチドである。具体的な態様において、本明細書で提供されるのは、重鎖をコードする配列番号３９の核酸配列を含むポリヌクレオチドである。
【０３３２】
具体的な態様において、本明細書で提供されるのは、軽鎖をコードする配列番号２９の核酸配列を含むポリヌクレオチドである。具体的な態様において、本明細書で提供されるのは、軽鎖をコードする配列番号５１の核酸配列を含むポリヌクレオチドである。具体的な態様において、本明細書で提供されるのは、軽鎖をコードする配列番号３５の核酸配列を含むポリヌクレオチドである。具体的な態様において、本明細書で提供されるのは、軽鎖をコードする配列番号４１の核酸配列を含むポリヌクレオチドである。
【０３３３】
ポリヌクレオチド配列は、β−クロトー結合抗体又はその結合フラグメントをコードする既存の配列（例えば、以下の実施例に記載される配列）のデノボ固相ＤＮＡ合成によって、又はＰＣＲ突然変異誘発によって生成され得る。核酸の直接的化学合成が、当該技術において知られている方法によって達成され得、例えば、Ｎａｒａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０，１９７９のホスホトリエステル法；Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９７９，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９のホスホジエステル法；Ｂｅａｕｃａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．，２２：１８５９，１９８１のジエチルホスホロアミダイト法；及び米国特許第４，４５８，０６６号明細書の固体支持法がある。ＰＣＲによるポリヌクレオチド配列への突然変異の導入は、例えば、ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ（Ｅｄ．），Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ＮＹ，１９９２；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９０；Ｍａｔｔｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：９６７，１９９１；及びＥｃｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  １：１７，１９９１に記載されるようにして実行され得る。
【０３３４】
また、本開示において提供されるのが、本明細書に記載のβ−クロトー結合抗体、例えばＮＯＶ００５又はＮＯＶ００６を生成するための発現ベクター及び宿主細胞である。種々の発現ベクターを使用して、β−クロトー結合抗体鎖又は結合フラグメントをコードするポリヌクレオチドを発現させることができる。ウイルスベースの発現ベクター及び非ウイルス発現ベクターの双方が、哺乳類宿主細胞において抗体を生成するのに用いられ得る。非ウイルスベクター及び非ウイルス系として、プラスミド又はエピソームベクター（典型的には、タンパク質又はＲＮＡを発現するための発現カセットを有する）及びヒト人工染色体が挙げられる（例えば、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．１５：３４５，１９９７参照）。例えば、哺乳類（例えばヒト）細胞におけるＦＧＦ２１結合ポリヌクレオチド及びポリペプチドの発現に有用な非ウイルスベクターとして、ｐＴｈｉｏＨｉｓ  Ａ，Ｂ  ＆  Ｃ、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ、ｐＥＢＶＨｉｓ  Ａ，Ｂ  ＆  Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＭＰＳＶベクター、及び他のタンパク質を発現させるための当該技術において知られている多数の他のベクターが挙げられる。有用なウイルスベクターとして、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスに基づくベクター、ＳＶ４０、パピローマウイルス、ＨＢＰエプスタインバールウイルスに基づくベクター、ワクシニアウイルスベクター、及びセムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）が挙げられる。Ｂｒｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．、前掲；Ｓｍｉｔｈ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４９：８０７，１９９５；及びＲｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ６８：１４３，１９９２参照。
【０３３５】
発現ベクターの選択は、ベクターが発現されることとなる意図される宿主細胞に依存する。典型例として、発現ベクターは、β−クロトー結合抗体鎖又はフラグメントをコードするポリヌクレオチドに作動可能に結合されているプロモータ及び他の調節配列（例えばエンハンサ）を含有する。一部の実施形態において、誘導プロモータを使用して、挿入された配列の発現を、誘導条件下以外では防止する。誘導プロモータとして、例えば、アラビノース、ｌａｃＺ、メタロチオネインプロモータ、又はヒートショックプロモータが挙げられる。形質転換された生物の培養体は、非誘導条件下で、集団を、発現産物が宿主細胞によってより良好に許容されるコード配列について偏らせることなく、増殖し得る。また、プロモータに加えて、他の調節要素が、β−クロトー結合抗体鎖又はフラグメントの効率的な発現に必要とされてよく、又は所望されてよい。当該要素として、典型的に、ＡＴＧ開始コドン及び隣接するリボソーム結合部位又は他の配列が挙げられる。加えて、発現の効率が、使用される細胞系に適したエンハンサの包含によって増強され得る（例えば、Ｓｃｈａｒｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒ．２０：１２５，１９９４；及びＢｉｔｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５３：５１６，１９８７参照）。例えば、ＳＶ４０エンハンサ又はＣＭＶエンハンサを用いて、哺乳類宿主細胞における発現を増大させることができる。
【０３３６】
発現ベクターはまた、挿入されたＦＧＦ２１結合抗体配列によってコードされるポリペプチドとの融合タンパク質を形成するように、分泌シグナル配列位置を提供し得る。多くの場合、挿入されるβ−クロトー結合抗体配列は、ベクター内に含まれる前に、シグナル配列に結合される。また、β−クロトー結合抗体の軽鎖及び重鎖の可変ドメインをコードする配列を受け入れるのに用いられることとなるベクターは時折、定常領域又はその部分をコードする。そのようなベクターは、定常領域との融合タンパク質として可変領域を発現することによって、無傷の抗体又はそのフラグメントを生成し得る。典型的に、定常領域はヒトである。
【０３３７】
β−クロトー結合抗体鎖を保有且つ発現させるための宿主細胞は、原核生物であっても真核生物であってもよい。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、本開示のポリヌクレオチドをクローニングして発現させるのに有用な一原核生物宿主である。使用に適した他の微生物宿主として、桿菌、例えば枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、並びに他の腸内細菌科（ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、例えばサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、及び種々のシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属の種が挙げられる。これらの原核生物宿主において、当業者であれば発現ベクターを構築することもでき、これは典型的に、宿主細胞と適合する発現制御配列（例えば複製起点）を含有する。加えて、任意の数の種々の周知のプロモータが存在することとなり、例えば、ラクトースプロモータ系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモータ系、ベータ−ラクタマーゼプロモータ系、又はファージラムダ由来のプロモータ系がある。プロモータは典型的に、場合によってはオペレータ配列と共に、発現を制御し、そしてリボソーム結合部位配列等を有しており、転写及び翻訳を開始して完了させる。また、他の微生物、例えば酵母を使用して、本開示のＦＧＦ２１結合ポリペプチドを発現させることもできる。バキュロウイルスベクターと組み合わせた昆虫細胞を用いることもできる。
【０３３８】
一部の好ましい実施形態において、哺乳類宿主細胞を用いて、本開示のβ−クロトー結合ポリペプチドを発現させて生成することができる。例えば、哺乳類宿主細胞は、内因性の免疫グロブリン遺伝子を発現するハイブリドーマ細胞株（例えば、実施例に記載されている１Ｄ６．Ｃ９骨髄腫ハイブリドーマクローン）であってもよいし、外因性の発現ベクターを保有する哺乳類の細胞株（例えば、以下で例示されるＳＰ２／０骨髄腫細胞）であってもよい。これらとして、死に至る標準的な、又は不死の標準的若しくは異常な、あらゆる動物細胞又はヒト細胞が挙げられる。例えば、無傷の免疫グロブリンを分泌することができる適切ないくつかの宿主細胞株が開発されており、ＣＨＯ細胞株、種々のＣＯＳ細胞株、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞株、形質転換されたＢ細胞、及びハイブリドーマが挙げられる。ポリペプチドを発現させるための哺乳類組織細胞培養の使用が、概して、例えば、Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎ．Ｙ．，Ｎ．Ｙ．，１９８７において考察されている。哺乳類宿主細胞用の発現ベクターは、発現制御配列、例えば、複製起点、プロモータ、及びエンハンサ（例えば、Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．８９：４９−６８，１９８６参照）、並びに必須のプロセシング情報部位、例えば、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写ターミネータ配列を含み得る。これらの発現ベクターは、通常、哺乳類の遺伝子に、又は哺乳類のウイルスに由来するプロモータを含有する。適切なプロモータは、構成的であり得、細胞型特異的であり得、ステージ特異的であり得、且つ／又は調整可能若しくは調節可能であり得る。有用なプロモータとして、以下に限定されないが、メタロチオネインプロモータ、構成的アデノウイルス主要後期プロモータ、デキサメタゾン誘導ＭＭＴＶプロモータ、ＳＶ４０プロモータ、ＭＲＰ  ｐｏｌＩＩＩプロモータ、構成的ＭＰＳＶプロモータ、テトラサイクリン誘導ＣＭＶプロモータ（例えばヒト即初期ＣＭＶプロモータ）、構成的ＣＭＶプロモータ、及び当該技術において知られているプロモータ−エンハンサの組合せが挙げられる。
【０３３９】
対象となるポリヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを導入する方法は、細胞宿主の型に応じて変わる。例えば、塩化カルシウム形質移入が、原核細胞に一般的に利用されるが、リン酸カルシウム処理又は電気穿孔法が、他の細胞宿主に用いられ得る（概して、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、前掲参照）。他の方法として、例えば、電気穿孔法、リン酸カルシウム処理、リポソーム媒介形質転換、注射及びマイクロインジェクション、バリスティック法、ウイロゾーム、免疫リポソーム、ポリカチオン：核酸結合体、裸のＤＮＡ、人工ビリオン、ヘルペスウイルス構造タンパク質ＶＰ２２への融合（Ｅｌｌｉｏｔ  ａｎｄ  Ｏ’Ｈａｒｅ，Ｃｅｌｌ  ８８：２２３，１９９７）、剤によるＤＮＡ吸収増強（ａｇｅｎｔ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｕｐｔａｋｅ  ｏｆ  ＤＮＡ）、並びにイクスビボ形質導入が挙げられる。多くの場合、組換えタンパク質の長期的多収産生のために、安定した発現が所望されることとなる。例えば、β−クロトー結合抗体鎖又は結合フラグメントを安定して発現する細胞株が、ウイルスの複製起点又は内因性の発現要素を含有する本開示の発現ベクター及び選択マーカー遺伝子を用いて、調製され得る。ベクターの導入後、細胞を、富化培地中で１〜２日間増殖させてから、選択培地にスイッチすることができる。選択マーカーの目的は、選択に対する耐性を付与することであり、そしてその存在により、選択培地において、導入された配列を首尾よく発現する細胞の成長が可能となる。耐性を示す、安定して形質移入された細胞が、細胞型に適した組織培養技術を用いて増殖され得る。
【０３４０】
モノクローナル抗体の生成
様々な技術（例えば、従来のモノクローナル抗体方法論、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５の標準的な体細胞ハイブリダーション技術）により、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を製造し得る。モノクローナル抗体を製造するための多くの技術（例えば、Ｂリンパ球のウイルス性形質転換又は発癌性形質転換）を利用し得る。
【０３４１】
ハイブリドーマを調製するための動物系として、マウス系、ラット系、及びウサギ系が挙げられる。マウス中でのハイブリドーマ産生は、十分に確立された手順である。免疫付与プロトコル、及び融合のための免疫付与された脾細胞の単離のための技術は当技術分野で既知である。融合パートナー（例えば、マウス骨髄腫細胞）及び融合手順も既知である。
【０３４２】
本開示のキメラ抗体又はヒト化抗体を、上記で説明されたように調製されたマウスモノクローナル抗体の配列に基づいて調製し得る。重鎖免疫グロブリン及び軽鎖免疫グロブリンをコードするＤＮＡを、目的のマウスハイブリドーマから得ることができ、標準的な分子生物学的技術を使用して、非マウス（例えばヒト）免疫グロブリン配列を含むように操作することができる。例えば、キメラ抗体を作製するために、当技術分野で既知の方法（例えば、Ｃａｂｉｌｌｙ他に対する米国特許第４，８１６，５６７号明細書）を使用して、マウス可変領域をヒト定常領域に連結させ得る。ヒト化抗体を作製するために、当技術分野で既知の方法を使用して、マウスＣＤＲ領域をヒトフレームワーク中に挿入し得る。例えば、Ｗｉｎｔｅｒに対する米国特許第５２２５５３９号明細書、及びＱｕｅｅｎ他に対する米国特許第５５３０１０１号明細書；同第５５８５０８９号明細書；同第５６９３７６２号明細書、及び同第６１８０３７０号明細書を参照されたい。
【０３４３】
特定の実施形態において、本開示の抗体はヒトモノクローナル抗体である。β−クロトーに対するそのようなヒトモノクローナル抗体を、マウス系ではなくヒト免疫系の一部を保有するトランスジェニックマウス又はトランスクロモソミック（ｔｒａｎｓｃｈｒｏｍｏｓｏｍｉｃ）マウスを使用して生成し得る。これらのトランスジェニックマウス又はトランスクロモソミックマウスはそれぞれ、本明細書ではＨｕＭＡｂマウス及びＫＭマウスと称されるマウスを含み、本明細書ではまとめて「ヒトＩｇマウス」と称される。
【０３４４】
ＨｕＭＡｂマウス（登録商標）（Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．）は、ヒト免疫グロブリン遺伝子のミニ遺伝子座であって、再配列されていないヒト重（μ及びγ）鎖免疫グロブリン配列並びにκ軽鎖免疫グロブリン配列を、内因性μ鎖遺伝子座及びκ鎖遺伝子座を不活性化する標的突然変異と一緒にコードするミニ遺伝子座を含む（例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ，ｅｔ  ａｌ．，１９９４  Ｎａｔｕｒｅ  ３６８（６４７４）：８５６−８５９を参照されたい）。従って、このマウスは、マウスＩｇＭ又はマウスＩｇκの発現の減少を示し、免疫付与に応答して、導入されたヒト重鎖及び軽鎖の導入遺伝子は、クラススイッチング及び体細胞突然変異を受けて、抗親和性ヒトＩｇＧκモノクローナルを生成する（Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，１９９４  ｓｕｐｒａ；ｒｅｖｉｅｗｅｄ  ｉｎ  Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．，１９９４  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １１３：４９−１０１；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｄ．，１９９５  Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３、及びＨａｒｄｉｎｇ，Ｆ．ａｎｄ  Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．，１９９５  Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５３６−５４６）。ＨｕＭＡｂマウスの調製及び使用、並びにそのようなマウスにより保有されるゲノム改変は、下記でさらに説明されている：Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，１９９２  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０：６２８７−６２９５；Ｃｈｅｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｔ．，１９９３  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５：６４７−６５６；Ｔｕａｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：３７２０−３７２４；Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４：１１７−１２３；Ｃｈｅｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，１９９３  ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：８２１−８３０；Ｔｕａｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：２９１２−２９２０；Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，１９９４  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５７９−５９１；及びＦｉｓｈｗｉｌｄ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，１９９６  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−８５１（これらの全ての内容は、その全体が参照により本明細書に具体的に組み込まれる）。さらに、米国特許第５，５４５，８０６号明細書；同第５，５６９，８２５号明細書；同第５，６２５，１２６号明細書；同第５，６３３，４２５号明細書；同第５，７８９，６５０号明細書；同第５，８７７，３９７号明細書；同第５，６６１，０１６号明細書；同第５，８１４，３１８号明細書；同第５，８７４，２９９号明細書；及び同第５，７７０，４２９号明細書（全てはＬｏｎｂｅｒｇ及びＫａｙに対する）；Ｓｕｒａｎｉ他に対する米国特許第５，５４５，８０７号明細書；国際公開第９２１０３９１８号パンフレット、同第９３／１２２２７号パンフレット、同第９４／２５５８５号パンフレット、同第９７１１３８５２号パンフレット、同第９８／２４８８４号パンフレット、及び同第９９／４５９６２号パンフレット（全てはＬｏｎｂｅｒｇ及���Ｋａｙに対する）；並びにＫｏｒｍａｎ他に対する国際公開第０１／１４４２４号パンフレットを参照されたい。
【０３４５】
別の実施形態において、導入遺伝子上に及び導入染色体上にヒト免疫グロブリン配列を保有するマウス（例えば、ヒト重鎖導入遺伝子及びヒト軽鎖導入染色体を保有するマウス）を使用して、本開示のヒト抗体を生じさせ得る。そのようなマウス（本明細書では「ＫＭマウス」と称される）は、Ｉｓｈｉｄａ他に対する国際公開第０２／４３４７８号パンフレットで詳細に説明されている。
【０３４６】
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替のトランスジェニック動物系が当技術分野で利用可能であり、本開示のβ−クロトー結合抗体を生じさせるために使用され得る。例えば、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．）と称される代替のトランスジェニック系も使用し得る。そのようなマウスは、例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ他に対する米国特許第５，９３９，５９８号明細書；同第６，０７５，１８１号明細書；同第６，１１４，５９８号明細書；同第６，１５０，５８４号明細書、及び同第６，１６２，９６３号明細書で説明されている。
【０３４７】
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替のトランスクロモソミック動物系が当技術分野で利用可能であり、本開示のβ−クロトー結合抗体を生じさせるために使用され得る。例えば、ヒト重鎖導入染色体及びヒト軽鎖導入染色体の両方を保有するマウス（「ＴＣマウス」と称される）を使用し得、そのようなマウスは、Ｔｏｍｉｚｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：７２２−７２７で説明されている。さらに、ヒト重鎖導入染色体及びヒト軽鎖導入染色体を保有するウシも当技術分野で説明されており（Ｋｕｒｏｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０：８８９−８９４）、本開示のＦＧＦ２１結合抗体を生じさせるために使用され得る。
【０３４８】
ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリをスクリーニングするためのファージディスプレイ法を使用しても、本開示のヒトモノクローナル抗体を調製し得る。ヒト抗体を単離するためのそのようなファージディスプレイ法は当技術分野で確立されているか、又は下記の実施例で説明されている。例えば、Ｌａｄｎｅｒ他に対する米国特許第５，２２３，４０９号明細書；同第５，４０３，４８４号明細書；及び同第５，５７１，６９８号明細書；Ｄｏｗｅｒ他に対する米国特許第５，４２７，９０８号明細書、及び同第５，５８０，７１７号明細書；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ他に対する米国特許第５，９６９，１０８号明細書、及び同第６，１７２，１９７号明細書；並びにＧｒｉｆｆｉｔｈｓ他に対する米国特許第５，８８５，７９３号明細書；同第６，５２１，４０４号明細書；同第６，５４４，７３１号明細書；同第６，５５５，３１３号明細書；同第６，５８２，９１５号明細書、及び同第６，５９３，０８１号明細書を参照されたい。
【０３４９】
免疫付与時にヒト抗体応答が生じるようにヒト免疫細胞が再構築されているＳＣＩＤマウスを使用しても、本開示のヒトモノクローナル抗体を調製し得る。そのようなマウスは、例えば、Ｗｉｌｓｏｎ他に対する米国特許第５，４７６，９９６号明細書、及び同第５，６９８，７６７号明細書で説明されている。
【０３５０】
フレームワーク又はＦｃの操作
本開示の操作された抗体として、例えばこの抗体の特性を改善するために、ＶＨ内の及び／又はＶＬ内のフレームワーク残基に改変を行なっている抗体が挙げられる。典型的には、そのようなフレームワーク改変を、この抗体の免疫原性を低下させるために行なう。例えば、１つのアプローチは、１個又は複数個のフレームワーク残基を、対応する生殖系列配列に「復帰突然変異させる」ことである。より具体的には、体細胞突然変異を受けている抗体は、この抗体が由来する生殖系列配列とは異なるフレームワーク残基を含み得る。そのような残基を、抗体フレームワーク配列と、この抗体が由来する生殖系列配列とを比較することにより特定し得る。フレームワーク領域配列をその生殖系列配置に戻すために、例えば、部位特異的突然変異誘発により、体細胞突然変異を、生殖系列配列へと「復帰突然変異させ」得る。そのような「復帰突然変異した」抗体も本開示に包含されることが意図されている。
【０３５１】
フレームワーク改変の別のタイプは、フレームワーク領域内の又はさらには１個若しくは複数個のＣＤＲ領域内の１個又は複数個の残基を突然変異させてＴ細胞−エピトープを除去し、それにより抗体の潜在的な免疫原性を低下させることを含む。このアプローチはまた、「脱免疫付与」とも称されており、Ｃａｒｒ他により米国特許出願公開第２００３０１５３０４３号明細書でさらに詳細に説明されている。
【０３５２】
フレームワーク内又はＣＤＲ領域内で行なわれた改変に加えて、又はこの改変の代替として、本開示の抗体を、Ｆｃ領域内の改変を含むように操作し得、典型的には、この抗体の１種又は複数種の機能的特性（例えば、血清半減期、補体結合、Ｆｃレセプター結合、及び／又は抗原依存性細胞傷害）を変更するように操作し得る。さらに、本開示の抗体を化学的に改変し（例えば、この抗体に、１個又は複数個の化学的部分を付着し得る）てもよいし、又はそのグリコシル化を変更して、この抗体の１種又は複数種の機能的特性を再び変更してもよい。これらの実施形態のそれぞれを、下記でさらに詳細に説明する。Ｆｃ領域中の残基のナンバリングは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスのものである。
【０３５３】
一実施形態において、ＣＨ１のヒンジ領域中のシステイン残基数が変更される（例えば、増加するか又は減少する）ように、このヒンジ領域を改変する。このアプローチは、Ｂｏｄｍｅｒ他により米国特許第５，６７７，４２５号明細書でさらに説明されている。ＣＨ１のヒンジ領域中のシステイン残基の数を変更して、例えば、軽鎖及び重鎖の構築を容易にするか、又は抗体の安定性を増加させるか若しくは低下させる。
【０３５４】
別の実施形態において、抗体のＦｃヒンジ領域を突然変異させて、この抗体の生物学的半減期を減少させる。より具体的には、この抗体はブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｙｌ）のプロテインＡ（ＳｐＡ）結合が天然のＦｃヒンジドメインＳｐＡ結合と比べて損なわれているように、このＦｃヒンジフラグメントのＣＨ２−ＣＨ３ドメイン界面領域中に１個又は複数個のアミノ酸突然変異を導入する。このアプローチは、Ｗａｒｄ他により米国特許第６，１６５，７４５号明細書でさらに詳細に説明されている。
【０３５５】
別の実施形態において、この抗体は、その生物学的半減期を増加させるように改変される。様々なアプローチが可能である。例えば、Ｗａｒｄに対する米国特許第６，２７７，３７５号明細書で説明されているように、下記の突然変異のうちの１つ又は複数を導入し得る：Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆ。あるいは、生物学的半減期を増加させるために、この抗体を、Ｐｒｅｓｔａ他により米国特許第５，８６９，０４６号明細書及び同第６，１２１，０２２号明細書で説明されているように、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２個のループから得られたサルベージレセプター結合エピトープを含むように、ＣＨ１領域内で又はＣＬ領域内で変更し得る。
【０３５６】
さらに他の実施形態において、少なくとも１個のアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基に置き換えてＦｃ領域を変更して、抗体のエフェクター機能を変更する。例えば、この抗体が、エフェクターリガンドに対する親和性が変更されているが、親抗体の抗原結合能力を保持するように、１個又は複数個のアミノ酸を異なるアミノ酸残基に置き換え得る。親和性が変更されるエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃレセプター又は補体のＣ１成分であり得る。このアプローチは、Ｗｉｎｔｅｒ他により米国特許第５，６２４，８２１号明細書及び同第５，６４８，２６０号明細書でさらに詳細に説明されている。
【０３５７】
別の実施形態において、この抗体が、Ｃ１ｑ結合が変更されており、及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を減少させるか若しくは消失させるように、アミノ酸残基から選択される１個又は複数個のアミノ酸を異なるアミノ酸残基に置き換え得る。このアプローチは、Ｉｄｕｓｏｇｉｅ他により米国特許第６，１９４，５５１号明細書でさらに詳細に説明されている。
【０３５８】
別の実施形態において、１個の又は複数個のアミノ酸残基を変更し、それにより、抗体の、補体に結合する能力を変更する。このアプローチは、Ｂｏｄｍｅｒ他により国際公開第９４／２９３５１号パンフレットでさらに説明されている。
【０３５９】
さらに別の実施形態において、１個又は複数個のアミノ酸を改変することにより、抗体の、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する能力を増大させるように、及び／又はＦｃγレセプターに対する抗体の親和性を増加させるように、Ｆｃ領域を改変する。このアプローチは、Ｐｒｅｓｔａにより国際公開第００／４２０７２号パンフレットでさらに説明されている。さらに、ＦｃγＲｌ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、及びＦｃＲｎに対する、ヒトＩｇＧ１上の結合部位がマッピングされており、結合が改善されているバリアントも説明されている（Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，２００１  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｎ．２７６：６５９１−６６０４を参照されたい）。
【０３６０】
さらに別の実施形態において、抗体のグリコシル化を改変する。例えば、脱グリコシル化抗体を作製し得る（即ち、この抗体はグリコシル化を欠く）。グリコシル化を、例えば「抗原」に対するこの抗体の親和性を増加させるように変更し得る。そのような炭水化物改変は、例えば、抗体配列内の１個又は複数個のグリコシル化部位を変更することにより達成され得る。例えば、結果として１個又は複数個の可変領域フレームワークグリコシル化部位が消失し、それにより、この部位でのグリコシル化が消失する１個又は複数個のアミノ酸置換を行ない得る。そのような脱グリコシル化により、抗原に対する抗体の親和性が増加し得る。そのようなアプローチは、Ｃｏ他により米国特許第５，７１４，３５０号明細書及び同第６，３５０，８６１号明細書でさらに詳細に説明されている。
【０３６１】
加えて、又はあるいは、グリコシル化のタイプが変更されている抗体（例えば、フコシル残基の量が減少している低フコシル化抗体、又は２分枝ＧｌｃＮａｃ構造（ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ  ＧｌｃＮａｃ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）が増加している抗体）を作製し得る。そのようなグリコシルパターンの変更は、抗体のＡＤＣＣ能力を増加させることが実証されている。そのような炭水化物改変は、例えば、グリコシル化機構が変更されている宿主細胞中で抗体を発現させることにより達成され得る。グリコシル化機構が変更されている細胞は当技術分野で説明されており、本開示の組換え抗体を発現させ、それによりグリコシル化が変更されている抗体を産生するために、宿主細胞として使用され得る。例えば、Ｈａｎｇ他による欧州特許第１，１７６，１９５号明細書では、フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子が機能的に破壊されている細胞株が説明されており、結果として、そのような細胞株内で発現された抗体は低フコシル化を示す。Ｐｒｅｓｔａによる国際公開第０３／０３５８３５号パンフレットでは、フコースを、Ａｓｎ（２９７）が連結された炭水化物へと付着させる能力が低下し、結果として、この宿主細胞中で発現された抗体が低フコシル化される、バリアントＣＨＯ細胞株Ｌｅｃｌ３細胞が説明されている（Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，２００２  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−２６７４０も参照されたい）。Ｕｍａｎａ他による国際公開第９９／５４３４２号パンフレットでは、糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、ベータ（１，４）−ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）を発現するように操作された細胞株が説明されており、その結果、操作された細胞株で発現された抗体は、結果として抗体のＡＤＣＣ活性を増加させる２分枝ＧｌｃＮａｃ構造の増加を示す（Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６−１８０も参照されたい）。
【０３６２】
変更された抗体を操作する方法
上記で論じたように、本明細書で示された、ＶＨ配列及びＶＬ配列又は完全長重鎖配列及び完全長軽鎖配列を有するβ−クロトー結合抗体を使用して、完全長重鎖配列及び／若しくは完全長軽鎖配列、ＶＨ配列及び／若しくはＶＬ配列、又はこれらに付着した定常領域を改変することにより、新規のβ−クロトー結合抗体を作製し得る。そのため、本開示の別の態様において、本開示のβ−クロトー結合抗体の構造的特徴を使用して、本開示の抗体の少なくとも１種の機能的特性（例えば、ヒトβ−クロトーへの結合、及び同様にＦＧＦ２１−レセプター複合体の１種又は複数種の機能的特性の活性化（例えば、ＦＧＦ２１−レセプターシグナル伝達の活性化）を保持する、構造的に関連するβ−クロトー結合抗体を作製し得る。
【０３６３】
例えば、上記で論じたように、本開示の抗体の１個若しくは複数個のＣＤＲ領域、又はそれらの突然変異を、組換えにより既知のフレームワーク領域及び／又は他のＣＤＲと組み合わせて、さらなる組換えにより操作された本開示のβ−クロトー結合抗体を作製し得る。改変の他の種類として、以前の項で説明されたものが挙げられる。操作方法のための出発物質は、本明細書で提供されるＶＨ配列及び／若しくはＶＬ配列のうちの１つ若しくは複数、又はそれらの１個若しくは複数個のＣＤＲ領域である。操作された抗体を作製するために、本明細書で提供されるＶＨ配列及び／若しくはＶＬ配列のうちの１つ若しくは複数又はそれらの１個若しくは複数個のＣＤＲ領域を有する抗体を実際に調製する（即ち、タンパク質として発現させる）必要はない。むしろ、配列に含まれる情報を出発物質として使用して、元々の配列に由来する「第２世代」配列を作製し、次いで、「第２世代」配列を調製してタンパク質として発現させる。
【０３６４】
従って、別の実施形態において、本開示は、配列番号６若しくは９のＣＤＲ１配列、配列番号７のＣＤＲ２配列、及び／又は配列番号８のＣＤＲ３配列を有する重鎖可変領域抗体配列と、配列番号１９若しくは３１のＣＤＲ１配列、配列番号２０のＣＤＲ２配列、及び／又は配列番号２１のＣＤＲ３配列を有する軽鎖可変領域抗体配列とを含むβ−クトロー結合抗体（即ち、ＮＯＶ００５又はＮＯＶ００６）を調製し、任意選択により、重鎖可変領域抗体配列内の及び／又は軽鎖可変領域抗体配列内の少なくとも１個のアミノ酸残基を変更して、少なくとも１種の変更された抗体配列を作製し、及びこの変更された抗体配列をタンパク質として発現させる方法を提供する。
【０３６５】
従って、別の実施形態において、本開示は、配列番号１７の配列を含む完全長重鎖抗体配列と、配列番号２８又は３４の配列を含む完全長軽鎖抗体配列とからなる、哺乳動物細胞中での発現に最適化されたβ−クロトー結合抗体を調製し、任意選択により、完全長重鎖抗体配列内の及び／又は完全長軽鎖抗体配列内の少なくとも１個のアミノ酸残基を変更して、少なくとも１種の変更された抗体配列を作製し、及びこの変更された抗体配列をタンパク質として発現させる方法を提供する。一実施形態において、重鎖又は軽鎖の変更は、この重鎖又は軽鎖のフレームワーク領域中である。
【０３６６】
この変更された抗体配列を、ＣＤＲ３配列又は米国特許出願公開第２００５／０２５５５５２号明細書で説明されている最小の必須結合決定基が固定されており、且つＣＤＲ１配列及びＣＤＲ２配列に対しては多様性を有する抗体ライブラリをスクリーニングすることによっても調製し得る。このスクリーニングを、抗体ライブラリから抗体をスクリーニングするのに適したあらゆるスクリーニング技術（例えばファージディスプレイ技術）に従って実施し得る。
【０３６７】
標準的な分子生物学的技術を使用して、この変更された抗体配列を調製して発現させ得る。この変更された抗体配列によりコードされる抗体は、本明細書で説明されたβ−クロトー結合抗体の機能特性のうちの１つ、いくつか、又は全てを保持する抗体であり、この機能特性として、ヒト、カニクイザル、ラット、及び／又はマウスのβ−クロトーへの特異的結合が挙げられるがこれに限定されず、この抗体は、ＦＧＦＲ１ｃ＿β−クロトー＿ＨＥＫ２９３  ｐＥＲＫ細胞アッセイにおいて、ＦＧＦ２１媒介シグナル伝達（例えばＦＧＦ２１−レセプター依存性シグナル伝達）を活性化する。
【０３６８】
本開示の抗体を操作する方法の特定の実施形態において、β−クロトー結合抗体のコード配列の全て又は一部に沿って、ランダムに又は選択的に突然変異を導入し得、結果として得られる改変β−クロトー結合抗体を、本明細書で説明された結合活性及び／又は他の機能特性に関してスクリーニングし得る。突然変異法は当技術分野で説明されている。例えば、Ｓｈｏｒｔによる国際公開第０２／０９２７８０号パンフレットでは、飽和突然変異誘発、合成ライゲーション構築（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ａｓｓｅｍｂｌｙ）、又はこれらの組合せを使用して、抗体突然変異を作製してスクリーニングする方法が説明されている。あるいは、Ｌａｚａｒ他による国際公開第０３／０７４６７９号パンフレットでは、抗体の生理化学的特性を最適化するためにコンピュータスクリーニング法を使用する方法が説明されている。
【０３６９】
本開示の特定の実施形態において、抗体は、脱アミド化部位を除去するように操作されている。脱アミド化は、ペプチド中で又はタンパク質中で構造的変化及び機能的変化を引き起こすことが知られている。脱アミド化により、生物活性の減少、並びにタンパク質医薬品の薬物動態及び抗原性の変更がもたらされ得る（Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．２００５  Ｍａｒ  １；７７（５）：１４３２−９）。
【０３７０】
本開示の特定の実施形態において、本抗体は、ｐＩを増加させ且つこの抗体の薬物様特性を改善するように操作されている。タンパク質のｐＩは、分子の全体的な生物物理的特性の鍵となる決定因子である。ｐＩが低い抗体は、可溶性が低く、安定性が低く、且つ凝集しやすいことが知られている。さらに、ｐＩが低い抗体の精製は、特に臨床的使用のためのスケールアップにおいて、困難であり且つ問題があり得る。本開示の抗β−クロトー抗体又はＦａｂのｐＩを増加させることにより、それらの可溶性が改善され、この抗体をより高い濃度（＞１００ｍｇ／ｍｌ）で製剤化することが可能になった。高濃度（例えば＞１００ｍｇ／ｍｌ）でのこの抗体の製剤化により、この抗体のより高い用量を、硝子体内注射を介して患者の眼に投与することが可能となるという利点が付与され、これにより、心血管障害等の慢性疾患の処置にとって顕著な利点である投与頻度の減少が可能となり得る。より高いｐＩはまた、この抗体のＩｇＧバージョンのＦｃＲｎ媒介リサイクリングも増加させ得、そのため、薬物が、より長い持続時間にわたり体内に留まることが可能となり、必要とされる注射がより少なくなる。最後に、この抗体の全体的な安定性は、より長い保存可能期間及びインビボでの生物活性をもたらすより高いｐＩに起因して、顕著に改善されている。好ましくは、このｐＩは８．２以上である。
【０３７１】
この変更された抗体の機能特性は、例えば実施例で記載されたもの（例えばＥＬＩＳＡ）等の当技術分野で利用可能である及び／又は本明細書で説明された標準的なアッセイを使用して評価し得る。
【０３７２】
予防的使用及び治療的使用
本開示の抗体又は抗原結合フラグメント（例えばＮＯＶ００５又はＮＯＶ００６）の有効な量を、必要とする対象に投与することにより、本明細書で説明されたβ−クロトーに結合する抗体（例えばＮＯＶ００５又はＮＯＶ００６）及びその抗原結合フラグメントを、異常なＦＧＦ２１シグナル伝達（例えば、ＦＧＦ２１媒介シグナル伝達及び／又はＦＧＦ２１レセプターシグナル伝達の異常な活性化）と関連する疾患又は障害の処置に治療上有用な濃度で使用し得る。本開示は、本開示の抗体（例えばＮＯＶ００５又はＮＯＶ００６）の有効な量を、必要とする対象に投与することによる、ＦＧＦ２１に関連する代謝障害を処置する方法を提供する。本開示は、本開示の抗体（例えばＮＯＶ００５又はＮＯＶ００６）の有効な量を、必要とする対象に投与することによる、ＦＧＦ２１に関連する心血管障害を処置する方法を提供する。
【０３７３】
本開示の抗体（例えばＮＯＶ００５又はＮＯＶ００６）を使用して、特に、ＦＧＦ２１に関連する状態又は障害を予防的処置し得、予防し得、及び改善し得、この状態又は障害として下記が挙げられるがこれらに限定されず：代謝障害、内分泌障害、及び心血管障害、例えば、肥満、１型糖尿病及び２型糖尿病、膵炎、脂質異常症、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、インスリン抵抗性、高インスリン血症、耐糖能障害、高血糖、高トリグリセリド血症、メタボリックシンドローム、急性心筋梗塞、高血圧、循環器疾患、粥状動脈硬化、末梢動脈疾患、脳卒中、心不全、冠動脈心疾患、腎疾患、糖尿病合併症、神経障害、胃不全麻痺、インスリンレセプター中における重度の不活性化突然変異と関連する障害、並びに他の代謝障害、且つ重症患者の死亡率及び罹患率の低下でも使用し得る。
【０３７４】
本開示の抗体（例えばＮＯＶ００５又はＮＯＶ００６）を使用して、特に、多くの疾患、障害、又は状態を処置し得、診断し得、寛解させ得、改善し得、又は予防し得、この疾患、障害、又は状態として下記が挙げられるがこれらに限定されず：インスリン抵抗性と関連する代謝性疾患、例えば、２型糖尿病、１型糖尿病、インスリンレセプター突然変異障害（ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）（ＩＮＳＲ障害、例えばＢ型インスリン抵抗性）、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、並びに様々な形態の部分型リポジストロフィー、例えば、家族性部分型リポジストロフィー及びＨＩＶ高活性抗レトロウイルス療法（ＨＩＶ−ＨＡＡＲＴ）により誘発された部分型リポジストロフィー（ＨＩＶ−ｈｉｇｈｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ａｎｔｉｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ（ＨＩＶ−ＨＡＡＲＴ）  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐａｒｔｉａｌ  ｌｉｐｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、並びにインスリン産生と関連する疾患（例えば１型糖尿病）、且つ重症患者の死亡率及び罹患率の低下でも使用し得る。
【０３７５】
ＩＮＳＲの複数の不活性化突然変異が、様々な表現型で説明されている。患者は概して、思春期に高血糖へと進行する、インスリンの作用に対する重度の抵抗性を示す。現在の標準的な治療は、対象が高血糖性になった場合に非常に高い用量のインスリンで処置することであり、これは概して、高血糖の制御には不十分である。
【０３７６】
特定の態様において、本開示の抗体（例えばＮＯＶ００５又はＮＯＶ００６）を使用して、特に、１型糖尿病、脂質異常症、高血糖、低血糖、耐糖能障害、高トリグリセリド血症、又はＨＩＶ−ＨＡＡＲＴにより誘発された部分型リポジストロフィーを処置し得るか、又は管理し得る。
【０３７７】
本開示の抗体を、ＦＧＦ２１関連障害の予防、処置、又は改善のための他の薬剤と組み合わせても使用し得る。例えば、スタチン療法を、心血管障害又は代謝障害を有する患者の処置のために、本開示のＦＧＦ２１模倣抗体及びその抗原結合フラグメントと組み合わせて使用し得る。
【０３７８】
特定の態様において、本明細書で提供されるのは、対象の体重を（例えば、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１２％、少なくとも１５％、又は少なくとも２０％）減少させる方法であって、β−クロトーに結合し且つβ−クロトー／ＦＧＦＲ１ｃレセプター複合体の活性を増加させ得る本明細書で説明された抗体又は抗原結合フラグメント（例えばＮＯＶ００５又はＮＯＶ００６）を含む医薬組成物の有効な量を、必要とする対象に投与することを含む方法である。
【０３７９】
特定の態様において、本明細書で提供されるのは、対象の食欲又は食物摂取量を（例えば、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１２％、少なくとも１５％、又は少なくとも２０％）減少させる方法であって、β−クロトーに結合し且つβ−クロトー／ＦＧＦＲ１ｃレセプター複合体の活性を増加させ得る本明細書で説明された抗体又は抗原結合フラグメント（例えばＮＯＶ００５又はＮＯＶ００６）を含む医薬組成物の有効な量を、必要とする対象に投与することを含む方法である。
【０３８０】
特定の態様において、本明細書で提供されるのは、対象の血漿トリグリセリド（ＴＧ）濃度又は血漿総コレステロール（ＴＣ）濃度を（例えば、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１２％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％）低下させる方法であって、β−クロトーに結合し且つβ−クロトー／ＦＧＦＲ１ｃレセプター複合体の活性を増加させ得る本明細書で説明された抗体又は抗原結合フラグメント（例えばＮＯＶ００５又はＮＯＶ００６）を含む医薬組成物の有効な量を、必要とする対象に投与することを含む方法である。
【０３８１】
本明細書で提供される方法の具体的な態様において、この対象は代謝障害に苦しめられており、例えば、肥満、１型糖尿病及び２型糖尿病、膵炎、脂質異常症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、インスリン抵抗性、高インスリン血症、耐糖能障害、高血糖、高トリグリセリド血症、及びメタボリックシンドロームを患う。本明細書で提供される方法の具体的な態様において、この対象は心血管障害を患う。特定の態様において、この対象はヒトである。
【０３８２】
特定の態様において、本明細書で提供されるのは、対象の肥満を処置する又は管理する方法であって、β−クロトーに結合し且つβ−クロトー／ＦＧＦＲ１ｃレセプター複合体の活性を増加させ得る本明細書で説明された抗体又は抗原結合フラグメント（例えばＮＯＶ００５又はＮＯＶ００６）を含む医薬組成物の有効な量を、必要とする対象に投与することを含む方法である。
【０３８３】
特定の態様において、本明細書で提供されるのは、対象の２型糖尿病を処置する又は管理する方法であって、β−クロトーに結合し且つβ−クロトー／ＦＧＦＲ１ｃレセプター複合体の活性を増加させ得る本明細書で説明された抗体又は抗原結合フラグメント（例えばＮＯＶ００５又はＮＯＶ００６）を含む医薬組成物の有効な量を、必要とする対象に投与することを含む方法である。
【０３８４】
特定の態様において、本明細書で提供されるのは、対象の１型糖尿病を処置する又は管理する方法であって、β−クロトーに結合し且つβ−クロトー／ＦＧＦＲ１ｃレセプター複合体の活性を増加させ得る本明細書で説明された抗体又は抗原結合フラグメント（例えばＮＯＶ００５又はＮＯＶ００６）を含む医薬組成物の有効な量を、必要とする対象に投与することを含む方法である。
【０３８５】
特定の態様において、本明細書で提供されるのは、対象のリポジストロフィー（ｌｉｐｏｄｙｓｔｒｏｐｙ）（例えば、ＨＩＶ−ＨＡＡＲＴにより誘発された部分型リポジストロフィー）を処置する又は管理する方法であって、β−クロトーに結合し且つβ−クロトー／ＦＧＦＲ１ｃレセプター複合体の活性を増加させ得る本明細書で説明された抗体又は抗原結合フラグメント（例えばＮＯＶ００５又はＮＯＶ００６）を含む医薬組成物の有効な量を、必要とする対象に投与することを含む方法である。
【０３８６】
特定の態様において、本明細書で提供されるのは、対象のＮＡＳＨを処置する又は管理する方法であって、β−クロトーに結合し且つβ−クロトー／ＦＧＦＲ１ｃレセプター複合体の活性を増加させ得る本明細書で説明された抗体又は抗原結合フラグメント（例えばＮＯＶ００５又はＮＯＶ００６）を含む医薬組成物の有効な量を、必要とする対象に投与することを含む方法である。
【０３８７】
特定の態様において、本明細書で提供されるのは、対象のインスリンレセプター突然変異障害を処置する又は管理する方法であって、β−クロトーに結合し且つβ−クロトー／ＦＧＦＲ１ｃレセプター複合体の活性を増加させ得る本明細書で説明された抗体又は抗原結合フラグメント（例えばＮＯＶ００５又はＮＯＶ００６）を含む医薬組成物の有効な量を、必要とする対象に投与することを含む方法である。
【０３８８】
医薬組成物
本開示は、薬学的に許容可能な担体と一緒に製剤化されたβ−クロトー結合抗体（無傷、又は結合フラグメント）を含む医薬組成物を提供する。この組成物は、例えば心血管障害の処置又は予防に適した１種又は複数種の他の治療薬をさらに含み得る。薬学的に許容される担体は、この組成物を強化するか、若しくは安定化させ、又はこの組成物の調製を容易にするために使用され得る。薬学的に許容される担体として、生理学的に適合する溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、並びに同類のものが挙げられる。
【０３８９】
本開示の医薬組成物を、当技術分野で既知の様々な方法により投与し得る。投与経路及び／又は投与様式は、所望される結果に応じて変わる。投与が硝子体内、静脈内、筋肉内、腹腔内、若しくは皮下であるか、又は標的部位に近接して投与することが好ましい。薬学的に許容可能な担体は、（例えば注射又は注入による）硝子体内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、非経口投与、脊髄投与、又は表皮投与に適しているべきである。投与経路に応じて、活性化合物（即ち、二重特異性分子及び多重特異性分子である抗体）を、この化合物を不活性化する場合がある酸及び他の天然条件の作用からこの化合物を保護する材料でコーティングし得る。具体的な態様において、本明細書で提供される方法での使用のための、本明細書で説明されたβ−クロトー結合抗体（例えば抗体ＮＯＶ００５又はＮＯＶ００６）を含む医薬組成物を、皮下投与する。具体的な態様において、本明細書で提供される方法での使用のための、本明細書で説明されたβ−クロトー結合抗体（例えば抗体ＮＯＶ００５又はＮＯＶ００６）を含む医薬組成物を、静脈内投与する。
【０３９０】
この組成物は、滅菌であり且つ流体であるべきである。例えば、レシチン等のコーティングの使用により、分散液の場合には必要な粒径の維持により、及び界面活性剤の使用により、適切な流動性を維持し得る。多くの場合には、この組成物に等張剤を含めることが好ましく、例えば、糖、多価アルコール（例えばマンニトール又はソルビトール）、及び塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射用組成物の長時間吸収を、この組成物に、吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウム又はゼラチン）を含めることによりもたらし得る。
【０３９１】
本開示の医薬組成物を、当技術分野で公知であり且つ日常的に実行される方法に従って調製し得る。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，２０ｔｈ  ｅｄ．，２０００；及びＳｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７８を参照されたい。医薬組成物を、好ましくはＧＭＰ条件下で製造する。典型的には、本開示の医薬組成物では、本β−クロトー結合抗体の治療上有効な用量又は治療上効果的な用量を利用する。当業者に既知の従来の方法により、本β−クロトー結合抗体を、薬学的に許容可能な剤形へと製剤化する。投与レジメンを、所望される最適応答（例えば治療応答）がもたらされるように調整する。例えば、単一のボーラスを投与し得、いくつかの分割された用量を経時的に投与し得、又はこの用量を、治療状況の緊急性により示されるように比例的に減少させ得るか若しくは増加させ得る。投与の容易さ及び投与量の均一性のために、非経口組成物を単位剤形で製剤化することが特に有利である。単位剤形は、本明細書で使用される場合、処置される対象のための単位投与量として適している物理的に個別の単位を指し、各単位は、必要とされる医薬担体と関連して、所望される治療効果をもたらすように算出された所定量の活性化合物を含む。
【０３９２】
本開示の医薬組成物中の活性成分の実際の投薬量レベルは、特定の患者、組成物、及び投与様式にとって所望される治療反応を、患者に有毒であることなく達成するのに有効である活性成分の量を得るように変わり得る。選択される投薬量レベルは、使用される本開示の特定の組成物、又はそのエステル、塩若しくはアミドの活性、投与経路、投与の時点、使用されることとなる特定の化合物の排泄速度、処置の期間、使用される特定の組成物と組み合わせて用いられる他の薬物、化合物、及び／又は材料、処置されることとなる患者の年齢、性別、体重、症状、健康状態、及び先の病歴などの因子が挙げられる、種々の因子に依存する。
【０３９３】
医師又は獣医師は、本医薬組成物で利用される本開示の抗体の用量を、所望される治療効果を達成するのに必要な用量と比べて低いレベルで開始し、所望される効果が達成されるまで投与量を徐々に増加させ得る。一般に、本明細書で説明された心血管障害の処置に有効な本開示の組成物の用量は多くの異なる因子に応じて変化し、この因子として下記が挙げられる：投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトであるか動物であるか、投与される他の医薬品、及び処置が予防的であるか治療的であるか。処置投与量を、安全性及び有効性を最適化するために滴定することが必要である。特定の実施形態において、抗体の全身投与の場合には、投与量は、宿主の体重の約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ又は０．０１〜１５ｍｇ／ｋｇの範囲である。例示的な処置レジメンは、２週間当たり１回の、又は１ヶ月に１回の、又は３〜６ヶ月に１回の全身投与を伴う。例示的な処置レジメンは、２週間当たり１回の、又は１ヶ月に１回の、又は３〜６ヶ月に１回の、又は必要に応じた（ＰＲＮ）全身投与を伴う。
【０３９４】
通常、抗体を複数回投与する。単回投与量の間の間隔は、毎週、毎月、又は毎年である。間隔はまた、患者におけるβ−クロトー結合抗体の血中レベルを測定することにより示されているように、不規則でもあり得る。加えて、医師により代替の投与間隔が決定され得、毎月又は効果的であるために必要に応じて投与される。全身投与のいくつかの方法において、投与量は、１〜１０００μｇ／ｍｌ（いくつかの方法では２５〜５００μｇ／ｍｌ）の血漿中抗体濃度を達成するために調整されている。あるいは、抗体を徐放製剤として投与し得、この場合には、低頻度の投与が必要とされる。投与量及び頻度は、患者中での抗体の半減期に応じて変わる。一般に、ヒト化抗体は、キメラ抗体及び非ヒト抗体の半減期と比べて長い半減期を示す。投与量及び投与頻度は、処置が予防的であるか又は治療的であるかに応じて変わり得る。予防的適用では、比較的低い投与量を、比較的低頻度の間隔で長期にわたり投与する。一部の患者には、彼らの余生にわたり処置を施し続ける。治療的適用では、疾患の進行が軽減されるか又は終結するまで、及び好ましくは、患者が、疾患の症状の部分的な又は完全な寛解を示すまで、比較的短い間隔での比較的高い投与量が必要とされる場合がある。その後、この患者には予防的レジメンを投与し得る。
【実施例】
【０３９５】
下記の実施例は、本発明をさらに説明するために提示されており、本発明の範囲を限定するために提示されるものではない。本発明の他の変形は当業者に容易に明らかであり、且つ添付された特許請求の範囲に包含される。
【０３９６】
実施例１：抗体のスクリーニング及び産生
抗原としての使用のためのヒトＦＧＦＲ１ｃ＿β−クロトー＿３００．１９細胞の調製
ヒトＦＧＦＲ１ｃ（１〜３８６ａａ）及びβ−クロトーを安定的に発現する３００．１９細胞を、全細胞抗原として使用するために生成した。ヒトβ−クロトーをコードする完全長ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿１７５７３７）を、ｐＥＦ１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ  Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ｖ９２１２０）のＥｃｏＲＩ部位及びＥｃｏＲＶ部位にクローニングした。ヒトＦＧＦＲ１ｃのアミノ酸１〜３８６をコードするｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０２３１０６）を、ｐＥＦ６／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ  Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｖ９６２２０）のＢａｍＨＩ部位及びＮｏｔＩ部位にクローニングした。両方の構築物において、Ｋｏｚａｋ配列（ＣＡＣＣ）を開始コドンの直前に含め、且つ終止コドンをベクター中のＭｙｃ−Ｈｉｓタグの前に追加した。Ａｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒデバイス及びＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキット（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号ＶＣＡ−１００３）を使用するエレクトロポレーションにより、マウスプレ−Ｂ  ３００−１９細胞に、β−クロトープラスミド及びＦＧＦＲ１ｃプラスミドを共遺伝子導入した。３週間にわたり、１ｍｇ／ｍｌのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１０１３１）及び８μｇ／ｍｌのＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号４６−１１２０）を使用して、安定したクローンを選択した。
【０３９７】
細胞アッセイでの使用のためのＦＧＦＲ／β−クロトー発現ＨＥＫ２９３細胞の調製
β−クロトー抗体の結合特異性、機能活性、又はオルソログ交差反応性を試験するために、ヒトＦＧＦＲ１ｃ＿β−クロトー、ヒトＦＧＦＲ２ｃ＿β−クロトー、ヒトＦＧＦＲ３ｃ＿β−クロトー、ヒトＦＧＦＲ４＿β−クロトー、又はカニクイザルＦＧＦＲ１ｃ＿β−クロトーを安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞を、標準的なＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００遺伝子導入及び細胞クローン選択法を使用して生成した。
【０３９８】
完全長のヒトβ−クロトー（ＮＭ＿１７５７３７）、ヒトＦＧＦＲ１ｃ（ＮＭ＿０２３１０６）、ヒトＦＧＦＲ２ｃ（ＮＰ＿００１１３８３８７）、ヒトＦＧＦＲ３ｃ（ＮＰ＿０００１３３）、又はヒトＦＧＦＲ４（ＮＰ＿９９８８１２）のｃＤＮＡをコードする下記の哺乳類発現プラスミドを使用した：カニクイザルβ−クロトーの場合には、完全長配列を、ヒト及びアカゲザルのβ−クロトー配列に基づくプライマーによりカニクイザル脂肪組織ｃＤＮＡ（ＢｉｏＣｈａｉｎ、カタログ番号Ｃ１５３４００３−Ｃｙ）からＰＣＲ増幅させ、次いでクローニングした。カニクイザルＦＧＦＲ１ｃ  ｃＤＮＡを、ヒトＦＧＦＲ１ｃ配列（＃ＮＭ＿０２３１０６）に基づくプライマーを使用してカニクイザル脂肪組織ｃＤＮＡ（ＢｉｏＣｈａｉｎ、カタログ番号Ｃ１５３４００３−Ｃｙ）からクローニングし、ヒトＦＧＦＲ１ｃとアミノ酸レベルで１００％同一であることが分かった。従って、上記で説明したヒトＦＧＦＲ１ｃ  ｃＤＮＡ構築物を使用して、カニクイザルβ−クロトー及びヒトＦＧＦＲ１ｃ（＃ＮＭ＿０２３１０６）を安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞を作製し、なぜならば、ヒトＦＧＦＲ１ｃアミノ酸配列とカニクイザルＦＧＦＲ１ｃアミノ鎖配列とは同一だからである。
【０３９９】
β−クロトーに対する抗体の結合親和性の決定
抗体の結合親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ速度論的分析を使用して決定した。Ｓｅｒｉｅｓ  Ｓ  Ｓｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＣＭ５（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ−１００５−３０）を、約３０分にわたり周囲温度で平衡化させた。このシステムを、１×ＨＢＳ−ＥＰ＋バッファ（１０倍溶液、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ−１００６−６９）でプライミングし、このチップをＢｉａｃｏｒｅ機器にロードした。このチップを、ＢＩＡｎｏｒｍａｌｉｚｉｎｇ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ−１００６−５１）溶液を使用して規格化し、このチップを、全ての流路で６０μＬ／分の流速を使用して５０ｍＭのＮａＯＨにより条件付けした。３０秒間の注入を、６０秒間の待機時間にて３回繰り返した。１０ｍＭの酢酸ナトリウムｐＨ５．０を１２０秒にわたり６０μＬ／分にて注入し、２回繰り返した。その後、Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｋｉｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ−１００８−３９）を使用して、抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃを固定するために新たなサイクルを開始した。この抗ヒトＦｃ  Ａｂを、固定化バッファ（１０ｍＭの酢酸ナトリウムｐＨ５．０）で５０μｇ／ｍＬまで希釈した。アミンカップリング試薬を１：１（ＥＤＣ及びＮＨＳ）で混合し、１０μＬ／分にて７分にわたり注入した。次いで、抗ヒトＦｃ  Ａｂを１０μＬ／分にて６分にわたり注入した。最後に、エタノールアミノを、６０秒間の待機時間で１０μＬ／分にて７分にわたり注入した。これにより、結果として約８０００〜１００００ＲＵの固定化が生じるはずである。次いで、本発明者らは、ＮＯＶ００４、ＮＯＶ００５、及びＮＯＶ００６に関して、１０ＲＵ（捕捉レベル＝約２８ＲＵ）のＲｍａｘの試験注入を実施した。このことを、１０ｕＬ／ｍＬの流速、及び３ＭのＭｇＣｌ２再生バッファを使用して実行した。チップ表面の変化、ＩｇＧの親和性、ＩｇＧタンパク質の品質、及び希釈の差異に起因して、各フローセルを毎回評価した。本発明者らは、０．５ｕｇ／ｍＬのＩｇＧ濃度で開始し、サンプル注入の結果に応じて、この濃度を増加させた（又は低下させた）。例えば、１５秒で１００ＲＵを観察した場合には、本発明者らはＡｂ溶液を０．２５ｕｇ／ｍＬまで希釈し、注入を繰り返した。各フローセル中の各抗体に関して捕捉パラメータを決定した後、様々な濃度でヒトβ−クロトーをチップに通し、Ｂｉａｃｏｒｅ速度式によりｋａ（１／Ｍｓ）、ｋｄ（１／ｓ）、ＫＤ（Ｍ）、及びＲｍａｘ（ＲＵ）を算出した。
【０４００】
異なる抗体がβ−クロトーに競合的に結合するかどうかの決定
Ｆｏｒｔｅ  Ｂｉｏを使用して、抗体がヒトβ−クロトーに競合的に結合するかどうかを決定した。全てのサンプル及び試薬を、１／１０（体積／体積）比でＰＢＳバッファを含む１０倍キネティクスバッファ（ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｂｕｆｆｅｒ）（Ｆｏｒｔｅ  Ｂｉｏ  カタログ番号１８−１０９２）で希釈した。ヒトβ−クロトー（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ５８８９−ＫＢ−０５０）を、所望される濃度（５ｕｇ／ｍｌ）までキネティクスバッファで希釈した。ヒトβ−クロトーを、２０秒にわたり抗ｈｉｓセンサー（Ｆｏｒｔｅ  Ｂｉｏ、カタログ番号１８−５１１４）にロードし、次いで、抗体１を、飽和状態（２００ｎＭ）に達するまで、このセンサーに４００秒にわたりロードした。最後に、競合する抗体を、２００ｎＭの抗体１の存在下で、２００ｎＭで１００秒にわたり、このセンサーにロードした。第２の結合シグナルがないことは、これらの抗体がヒトβ−クロトーへの結合に関して競合することを示す。
【０４０１】
ｐＥＲＫ細胞アッセイを使用する、ＦＧＦＲ＿β−クロトーレセプター活性化の測定
細胞培養、及びホスホ−ＥＲＫ  １／２（ｐＥＲＫ）レベルの測定に、標準的な技術を使用した。簡潔に説明すると、ヒトＦＧＦＲ１ｃ＿β−クロトー、ヒトＦＧＦＲ２ｃ＿β−クロトー、ヒトＦＧＦＲ３ｃ＿β−クロトー、ヒトＦＧＦＲ４＿β−クロトー、又はカニクイザルＦＧＦＲ１ｃ＿β−クロトーを安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞を、５％ＣＯ２下で３７℃にて、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＳＨ３００７１）、ブラストサイジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ１１１３９０２）、及びＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１０１３１０３５）を含むＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１１９９５）中で維持した。細胞を、３８４ウェルのポリ−Ｄ−リシン被覆プレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、３５４６６３）中に播種し、５％ＣＯ２下で３７℃にて一晩インキュベートし、続いて血清飢餓させた。
【０４０２】
ハイブリドーマ上清又はβ−クロトー抗体をＦｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３培地で希釈し、このプレートに、様々な濃度の抗体を添加した。インキュベーション後、細胞を洗浄し、次いで溶解バッファで溶解させた。細胞溶解物を３８４ウェルアッセイプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、カタログ番号６００８２８０）に移し、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ  ＳｕｒｅＦｉｒｅ（商標）ｐＥＲＫ  １／２  Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、ＴＧＲＥＳ１０Ｋ）を使用してホスホ−ＥＲＫ  １／２レベルを測定した。標準的なＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ設定を使用して、プレートをＥｎＶｉｓｉｏｎ  ２１０４マルチラベルリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で読み取った。式Ｙ＝Ｂｏｔｔｏｍ＋（Ｔｏｐ−Ｂｏｔｔｏｍ）／（１＋１０＾（（ＬｏｇＥＣ５０−Ｘ）×ＨｉｌｌＳｌｏｐｅ））及びＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５  Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して、用量応答データを、タンパク質濃度と対比した基底に対するｐＥＲＫ活性の倍数（ｐＥＲＫ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｆｏｌｄ  ｏｖｅｒ  ｂａｓａｌ）としてグラフ化して、ＥＣ５０値を決定した。
【０４０３】
モノクローナル抗体の調製
抗ヒトβ−クロトー抗体を、基本的にはＤｒｅｙｅｒ他（２０１０）（Ｄｒｅｙｅｒ  ＡＭ  ｅｔ．ａｌ．（２０１０）ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：８７）で説明されている全細胞免疫付与により、Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ株：ＢＡＬＢ／ｃＪ）中で又はＢｃｌ２  ２２  ｗｅｈｉマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ株：Ｃ．Ｃｇ−Ｔｇ（ＢＣＬ２）２２Ｗｅｈｉ／Ｊ）中で生成した。
【０４０４】
簡潔に説明すると、１×１０７個のヒトＦＧＦＲ１ｃ＿β−クロトー＿３００．１９細胞を、１０〜３０日間の間隔で６回Ｂａｌｂ／ｃマウスに注射した。最初の全細胞注射を、Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｆ５８８１）で行なった。細胞及びアジュバントを、２箇所の近接するが別々の皮下部位に、混合せずに別個に注射した。これらの後に、同一細胞の腹腔内注射を、Ｓｉｇｍａ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｓ６３２２）を伴うか、又はアジュバントと伴わずに行なった。
【０４０５】
Ｂｃｌ２  ２２  ｗｅｈｉマウスを使用して、１×１０７個のヒトＦＧＦＲ１ｃ＿β−クロトー＿３００．１９細胞を、７日間の間隔で４回、この動物に注射した。最初の注射を、Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｆ５８８１）で行なった。細胞及びアジュバントを、２箇所の近接するが別々の皮下部位の２つのセットに別個に注射した。後続の細胞の注射を、アジュバントを伴わずに皮下で行なった。
【０４０６】
免疫付与されたマウスでの免疫応答を、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）アッセイにより測定した。１，０００倍又は１０，０００倍に希釈された免疫付与マウス由来の血清を使用して、ヒトＦＧＦＲ１ｃ＿β−クロトー＿ＨＥＫ細胞及びヒトＦＧＦＲ１ｃ＿β−クロトー＿３００．１９細胞を染色し、続いて、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）二次抗マウスＩｇＧ検出抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  カタログ番号１１５−１３６−０７１）を使用した。蛍光を、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＬＳＲＩＩフローサイトメーター又はＦｏｒｅｓｓａフローサイトメーターで読み取った。力価が最高である４匹のマウスを、電気融合のために選択した。
【０４０７】
ハイブリドーマのスクリーニング、サブクローニング、及び選択
２×１０８個の脾臓細胞及び５×１０７個の融合パートナーＦ０細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１６４６）をＣｙｔｏｆｕｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＬＣＭ−Ｃ、Ｃｙｔｏ  Ｐｕｌｓｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で洗浄し、６００ボルトのピークパルスにより、製造業者の仕様に従ってＨｙｂｒｉｍｕｎｅ  Ｗａｖｅｆｏｒｍ  Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ（Ｃｙｔｏ  Ｐｕｌｓｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、モデルＣＥＥＦ−５０Ｂ）を使用して融合させた。細胞を、１つのウェル当たり３，０００個のＦ０細胞の算出密度で３８４ウェルプレート中に播種し、ＨＡＴ選択培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  カタログ番号Ｈ０２６２）中で培養した。
【０４０８】
一次スクリーニングを、ハイスループットＦＡＣＳプラットフォーム（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｐａｕｌ．Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ，Ａｒｃｈｉｖｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｉｎ：３ｒｄ  Ａｎｎｕａｌ  ２０１４  ＳＬＡＳ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ．Ｊａｎ．１８−２２，２０１４，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して実施した。簡潔に説明すると、ハイブリドーマ上清を、ヒトＦＧＦＲ１ｃ＿β−クロトーを安定的に発現する細胞株及び発現しない細胞株と共にインキュベートし、抗体の結合を、抗マウスＩｇＧ−ＡＰＣ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｃｈ  カタログ番号１１５−１３６−０７１）により決定した。
【０４０９】
各ハイブリドーマ上清由来の抗体を、４種のバーコード付き細胞株：３００．１９親細胞、ヒト＿ＦＧＦＲ１ｃ＿β−クロトー＿３００．１９細胞、親ＨＥＫ  ２９３細胞、及びヒトＦＧＦＲ１ｃ−β−クロトー＿ＨＥＫ  ２９３細胞に対する同時の結合を試験した。この一次スクリーニングで３４８個のヒットを選択した。一次ヒットを９６ウェルプレート中で拡大させ、結合を、ＦＡＣＳによりヒトＦＧＦＲ１ｃ＿β−クロトー＿ＨＥＫ  ２９３細胞上で再び確認し、１２２個の確認されたヒットを得た。本明細書で説明されたホスホ−ＥＲＫ  １／２アッセイを使用して、１１５個のＦＡＣＳにより結合を再確認したヒットのＨＡＴ（ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン）培地含有上清を、ヒトＦＧＦＲ１ｃ＿β−クロトーレセプター複合体の細胞活性化に関してプロファイリングした。
【０４１０】
これらの上清中のホスホ−ＥＲＫ  １／２細胞の活性が最高であるハイブリドーマを拡大させ、これらの上清からＩｇＧを精製した。実施例２で説明されたホスホ−ＥＲＫ  １／２アッセイを使用して、７４個のハイブリドーマ由来の精製済ＩｇＧを、ヒトＦＧＦＲ１ｃ＿β−クロトーレセプター複合体の細胞活性化に関してプロファイリングした。実施例２で説明されたホスホ−ＥＲＫ  １／２アッセイを使用して、ヒトＦＧＦＲ１ｃ＿β−クロトーレセプター複合体のホスホ−ＥＲＫ  １／２活性化の効力が最良であるハイブリドーマ由来のＩｇＧを、カニクイザルＦＧＦＲ１ｃ＿β−クロトーレセプター複合体とのオルソログ交差反応性、並びにヒトＦＧＦＲ２ｃ＿β−クロトーレセプター複合体及びヒトＦＧＦＲ３ｃ＿β−クロトーレセプター複合体に対する選択性に関してプロファイリングした。これらのプロファイリング結果に基づいて、数個のハイブリドーマクローン（例えば１２７Ｆ１９）を、さらなるプロファイリングのために選択した。具体的には、効力が最高である精製済ＩｇＧ（例えばクローン１２７Ｆ１９）を交差反応性に関してプロファイリングし、カニクイザルＦＧＦＲ１ｃ＿β−クロトーを活性化することが分かったが、ヒトＦＧＦＲ２ｃ＿β−クロトー、ＦＧＦＲ３ｃ＿β−クロトー、ＦＧＦＲ４＿β−クロトー、又はクロトー＿ＦＧＦＲを活性化しなかった。選択されたＩｇＧ（例えばクローン１２７Ｆ１９）は、β−クロトー又はＦＧＦＲ１ｃ＿β−クロトーを発現する細胞に結合し、ＦＧＦＲ１ｃのみを発現する細胞には結合しなかった。
【０４１１】
α−クロトーを発現する細胞中における１２７Ｆ１９シグナル伝達を評価するために、ＨＥＫ２９３細胞に、α−クロトー、Ｅｇｒ１−ルシフェラーゼ、及びウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼを遺伝子導入した。簡潔に説明すると、ＨＥＫ２９３細胞をＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ中で培養し、３００００個の細胞／ウェルで播種し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を使用して、クロトー、Ｅｇｒ−１−ｌｕｃ、及びＴＫ−Ｒｅｎｎｉｌａを遺伝子導入した。翌日、ＦＧＦ２３、ＦＧＦ２１、及び１２７Ｆ１９を、０．１％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭで、示した濃度まで希釈し、遺伝子導入された細胞に一晩添加した。ルシフェラーゼ活性を、製造業者の指示に従ってＤｕａｌ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ２９２０）により検出した。予想したように、シグナル伝達のためにα−クロトーの発現を必要とするＦＧＦ２３は、強力なルシフェラーゼ発現を示した。しかしながら、ＦＧＦ２１も１２７Ｆ１９も顕著なルシフェラーゼ発現を全く示さず、このことは、α−クロトーは、ＦＧＦ２１又はこれらのＦＧＦ２１模倣抗体の共レセプターとして作用しないことを示唆する。
【０４１２】
モノクローナル抗体のヒト化及び親和性成熟
ヒト化
ヒト化のプロセスは当技術分野で十分に説明されている（Ｊｏｎｅｓ  ＰＴ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５；Ｑｕｅｅｎ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８６：１００２９−１００３３；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６）。用語ヒト化は、非ヒト抗体（例えばマウス由来抗体）の抗原結合部位の、ヒトアクセプターフレームワーク（例えばヒト生殖系列配列）への導入を説明する（Ｒｅｔｔｅｒ  Ｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３：Ｄ６７１−Ｄ６７４．）。
【０４１３】
抗体をヒト化する主な理論的根拠は、ヒトにおいて抗体に対する免疫原性応答を発生させるリスクを最小化することに見られる（Ｒｅｂｅｌｌｏ  ＰＲ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６８：  １４１７−１４２０）。抗原結合部位は、相補性決定領域（ＣＤＲ）（Ｃｈｏｔｈｉａ  Ｃ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ  ＡＭ（１９８７）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９６：９０１−９１７；Ｋａｂａｔ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ａｎｏｎ．５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ｅｄ；ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１：３２４２）と、ＣＤＲ外の位置（即ち、結合に直接的に又は間接的に影響を及ぼす、可変ドメイン（ＶＬ及びＶＨ）のフレームワーク領域中の位置）とを含む。結合に直接的に影響を及ぼし得るフレームワーク残基は、例えば、ＣＤＲ２とＣＤＲ３との間に位置する、いわゆる「アウター」ループ領域中で見出され得る。結合に間接的に影響を及ぼす残基は、例えば、いわゆるバーニヤゾーン（Ｖｅｒｎｉｅｒ  Ｚｏｎｅ）で見出される（Ｆｏｏｔｅ  Ｊ，Ｗｉｎｔｅｒ  Ｇ．（１９９２）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２２４：４  ８７−４９９）。これらは、ＣＤＲの高次構造を支持すると考えられる。ＣＤＲ外のこれらの位置は、フレームワーク領域中のヒト生殖系列アクセプター配列に対する最終的なヒト化抗体の逸脱の数を最小化するのに適したアクセプターフレームワークを選択する際に考慮される。
【０４１４】
複数のヒト生殖系列アクセプターフレームワークを、軽鎖と重鎖との両方のヒト化に関して試験した。例えば、ヒトフレームワークＶＢａｓｅ＿ＶＨ４＿４−３０．１及びＶＢａｓｅ＿ＶＨ３＿３−２１を重鎖のヒト化に関して試験し、ヒトフレームワークＶＢａｓｅ＿ＶＫ１＿Ｏ１８及びＶＢａｓｅ＿ＶＫ３＿Ｌ２５を軽鎖のヒト化に関して試験した。
【０４１５】
配列最適化親和性成熟
特定のアミノ酸配列モチーフは、翻訳後改変（ＰＴＭ）（例えば、グリコシル化（即ち、ＮｘＳ／Ｔ、ｘはＰ以外）、遊離システインの酸化、脱アミド化（例えばＮＧ）、又は異性化（例えばＤＧ））を受けることが知られている。ＣＤＲ中に存在する場合には、このモチーフは、製品の均一質性を高めるために、部位特異的変異誘発により理想的には除去される。
【０４１６】
親和性成熟のプロセスは当技術分野で十分に説明されている。多くのディスプレイシステムの中でも、ファージディスプレイ（Ｓｍｉｔｈ  ＧＰ，１９８５，Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｈａｇｅ：ｎｏｖｅｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｔｈａｔ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｃｌｏｎｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｖｉｒｉｏｎ  ｓｕｒｆａｃｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１３１５−１３１７）及び酵母等の真核細胞によるディスプレイ（Ｂｏｄｅｒ  ＥＴ  ａｎｄ  Ｗｉｔｔｒｕｐ  ＫＤ，１９９７，Ｙｅａｓｔ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｆｏｒ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １５：  ５５３−５５７）は、抗体−抗原相互作用に関して選択するために最も一般的に適用されるシステムであると思われる。これらのディスプレイシステムの利点は、広範囲の抗原に適していること、及び選択の厳密さを容易に調整し得ることである。ファージディスプレイでは、ｓｃＦｖフラグメント又はＦａｂフラグメントを示し得、加えて酵母中では完全長ＩｇＧを示す。これらの一般に適用された方法により、１０Ｅ７を超える多様性を有するより大きなライブラリからの所望される抗体バリアントの選択が可能になる。多様性がより少ない（例えば１０Ｅ３）ライブラリを、微量発現及びＥＬＩＳＡによりスクリーニングし得る。非標的の又はランダムな抗体バリアントライブラリは、例えば、エラー−プローンＰＣＲ（Ｃａｄｗｅｌｌ  ＲＣ  ａｎｄ  Ｊｏｙｃｅ  ＧＦ，１９９４，Ｍｕｔａｇｅｎｉｃ  ＰＣＲ．ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．３：Ｓ１３６−Ｓ１４０）により生成され得、非常にシンプルではあるが時には制限されるアプローチを提供する。別の戦略は、抗体候補のＣＤＲにより方向付けられた多様化である。１個又は複数個のＣＤＲ中の１箇所又は複数箇所の位置を、例えば変性オリゴ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｈｅ  ｔｈｉｒｄ  ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｏｏｐ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ：ｕｓｅ  ｏｆ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｔｏ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｂｒｏａｄｅｎ  ｓｔｒａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５６：  ７７−８８）、トリヌクレオチド突然変異誘発（ＴＲＩＭ）（Ｋａｙｕｓｈｉｎ  ＡＬ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ａ  ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｔｒｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ−−ｓｙｎｔｈｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ／ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：３７４８−３７５５）、又は当技術分野で既知の任意の他のアプローチを使用して、特異的に標的とし得る。ヒト化候補に対してアミノ酸改変を行ない、ＰＴＭを除去した。
【０４１７】
発現プラスミドの生成
ヒトへのコドン最適化を含む、ヒト化ＶＬドメイン及びヒト化ＶＨドメインをコードするＤＮＡ配列を、ＧｅｎｅＡｒｔ（商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に注文した。ＶＬドメイン及びＶＨドメインをコードする配列を、ＧｅｎｅＡｒｔ由来のベクターからの切り貼りにより、哺乳動物細胞中での分泌に適した発現ベクターにサブクローニングした。重鎖及び軽鎖を、共遺伝子導入が可能となるように個別の発現ベクターにクローニングした。この発現ベクターの構成要素として下記が挙げられる：プロモータ（サイトメガロウイルス（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）エンハンサ−プロモータ）、分泌を容易にするためのシグナル配列、ポリアデニル化シグナル、並びに転写ターミネータ（ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）遺伝子）、エピソームの複製及び原核生物における複製を可能にする構成要素（例えば、ＳＶ４０起点、及びＣｏｌＥ１、又は当技術分野で既知の他のもの）、並びに選択を可能にするための構成要素（アンピシリン耐性遺伝子及びゼオシンマーカー）。
【０４１８】
ヒト化抗体候補の発現及び精製
ＳＶ４０ラージＴ抗原を構成的に発現するヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ２９３−Ｔ  ＡＴＣＣ１１２６８）は、ヒト化ＩｇＧタンパク質及び／又は最適化されたＩｇＧタンパク質の一時的な発現のために一般に使用される宿主細胞株のうちの１つである。遺伝子導入試薬としてＰＥＩ（ポリエチレンイミン、ＭＷ  ２５．０００  直鎖状、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ  カタログ番号２３９６６）を使用して、遺伝子導入を実施した。
【０４１９】
最初の精製を、ＨｉＴｒａｐ  ＰｒｏｔＡ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（登録商標）ＳｕＲｅカラムによる親和性により実施した。溶出液を、凝集（ＳＥＣ−ＭＡＬＳ）並びに純度（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＬＡＬ、及びＭＳ）に関して試験した。必要に応じて、最初の精製からのプールをＳＰＸ（Ｈｉ  Ｌｏａｄ  １６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００グレード  １２０ｍＬ（ＧＥ−Ｈｅｌｔｈｃａｒｅ））にロードした。ＮＯＶ００４、ＮＯＶ００５、及びＮＯＶ００６は、マウスハイブリドーマ１２７Ｆ１９に由来するヒト化ｍＡｂである。ＩｇＧ１  Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）アイソタイプ又はＩｇＧ１κ  Ｄ２６５Ａ／Ｐ３２９Ａ（ＤＡＰＡ）アイソタイプを、抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を促進する抗体の能力を低下させるための予防手段として選択した（例えば、Ｈｅｚａｒｅｈ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７５：１２１６１−１２１６８を参照されたい）。ＩｇＧ１（ＤＡＰＡ）アイソタイプであるヒト化候補ＮＯＶ００４、ＮＯＶ００５、及びＮＯＶ００６を、説明されているように発現させて精製した。
【０４２０】
実施例２：モノクローナル抗体のインビトロでの特徴付け
ＮＯＶ００４、ＮＯＶ００５、及びＮＯＶ００６の結合特性及び細胞活性特性を示すために、インビトロでの研究を行なった。実施例１で説明されたＢｉａｃｏｒｅを使用して、ヒトβ−クロトーに対するｍＡｂのＫＤを推定した。ＮＯＶ００４、ＮＯＶ００５、及びＮＯＶ００６はそれぞれ、約３×Ｅ−１０Ｍ、３×Ｅ−１０Ｍ、及び４×Ｅ−１０Ｍであると算出したＫＤを有する。
【０４２１】
実施例１で説明されたｐＥＲＫアッセイを使用して、ｍＡｂを、ＦＧＦＲ＿β−クロトーレセプター活性に関してプロファイリングした。ＮＯＶ００４は、ヒト及びカニクイザルのＦＧＦＲ１ｃ＿β−クロトーレセプター複合体をそれぞれ、約３ｎＭ及び２０ｎＭであると算出したＥＣ５０で活性化した（図１）。ＮＯＶ００５は、ヒト及びカニクイザルのＦＧＦＲ１ｃ＿β−クロトーレセプター複合体をそれぞれ、約３ｎＭ及び１６ｎＭであると算出したＥＣ５０で活性化した（図１）。ＮＯＶ００６は、ヒト及びカニクイザルのＦＧＦＲ１ｃ＿β−クロトーレセプター複合体をそれぞれ、約４ｎＭ及び１８ｎＭであると算出したＥＣ５０で活性化した（図１）。ＮＯＶ００５、ＮＯＶ００６、及びＮＯＶ００６は、ヒトＦＧＦＲ２ｃ＿β−クロトーレセプター複合体、ヒトＦＧＦＲ３ｃ＿β−クロトーレセプター複合体、又はヒトＦＧＦＲ４＿β−クロトーレセプター複合体を活性化しなかった（図２）。これらのｍＡｂを、実施例１で説明したＦＧＦ２３活性に関してプロファイリングした。ＮＯＶ００５、ＮＯＶ００６、及びＮＯＶ００４はＦＧＦ２３活性を示さなかった（図３）。Ｆｏｒｔｅ  Ｂｉｏデータは、ＮＯＶ００５及びＮＯＶ００６が、ヒトβ−クロトーへの結合に関してＮＯＶ００４と競合することを示す（図４）。
【０４２２】
ヒトＩｇＧ１−ＬＡＬＡアイソタイプを有するＮＯＶ００４のバージョンとのヒトヒトβ−クロトー細胞外ドメインの水素重水素交換によるエピトープマッピング研究は、下記のペプチドがｍＡｂ−β−クロトーＥＣＤ複合体中で有意に保護されることを示し：２４６〜２６５、３４３〜３４９、４２１〜４２９、４８８〜４９８、５０９〜５２４、５３６〜５５０、５６８〜５７６、６４６〜６６９、７７３〜８０４、８３４〜８５７、及び９５９〜９８６ａａ；下記の領域が最も強く保護されることを示す：２４６〜２６５、５３６〜５５０、８３４〜８５７、及び９５９〜９８６ａａ（データは示さない；国際公開第２０１７／０２１８９３号パンフレットを参照し、このパンフレットは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。この研究は、結合データ、活性データ、及び競合データとの組合せで、ＮＯＶ００５及びＮＯＶ００６もそのようなβ−クロトーＥＣＤ領域を有意に保護するであろうことを示す。
【０４２３】
実施例３：ラットにおけるモノクローナル抗体の薬物動態プロファイリング
動物、及び維持条件
動物のケア及び飼育を、Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ）に従って施した。全ての手順を、ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓにより示された基準により管理し、Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｆｏｒ  ＢｉｏＭｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＮＩＢＲ）Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認されたプロトコルに従って実施した。雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（ｎ＝３／群）を、不断に自動で給水されるラック上の底が頑丈なケージ中で飼育し、１２時間の明／暗サイクル（午前６時〜午後６時）で維持し、標準的な齧歯動物用食餌（Ｈａｒｌａｎ−Ｔｅｋｌａｄ；Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ；カタログ番号８６０４）に自由にアクセスできるようにした。この動物施設を、湿度が３０〜７０％の６８〜７６°Ｆで維持した。
【０４２４】
ＮＯＶ００４、ＮＯＶ００５、又はＮＯＶ００６の調製及び投与
１０ｍＭのＨｉｓ／Ｈｉｓ−ＨＣｌ、２２０ｍＭのスクロース中のＮＯＶ００４、ＮＯＶ００５、及びＮＯＶ００６のストック溶液を、使用前に冷蔵下で解凍した。投与の朝に、３種全ての抗体をＰＢＳで約３ｍｇ／ｍＬで希釈し、適切な容量を投与シリンジに吸引し（３ｍＬ／ｋｇ）、投与まで室温で保持した。動物を試験管保定器（ｔｕｂｅ  ｒｅｓｔｒａｉｎｅｒ）に置き、尾静脈への静脈内（ＩＶ）注射（１０ｍｇ／ｋｇ）により、ＮＯＶ００４、ＮＯＶ００５、又はＮＯＶ００６のいずれかを投与した。
【０４２５】
血液サンプルの採取
血液サンプルを、−３日目（ベースライン）、投与後０日目（投与後１時間及び６時間）並びに１日目、２日目、３日目、４日目、８日目、１６日目、及び２８日目に採取した。全ての時点を、０日目に投与した用量の投与の終了から計時した。各時点で、約７０μｌ（７０μＬ）の血液を、ＥＤＴＡが入ったＢＤ  Ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ採取／セパレーターチューブ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ；Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ；カタログ番号３６５９７３）に採取した。ガーゼで圧力を加えて出血を止めた。サンプルを２０，８１７×ｇで１０分にわたり遠心分離し、次いで、約３０μＬの血漿を、０．２ｍＬ  Ｔｈｅｒｍｏ−ｓｔｒｉｐチューブ（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ，ＰＡ；カタログ番号ＡＢ−０４５１）に移して８０℃で凍結させた。各採取の後に、ラットをそれぞれの飼育ケージに戻した。
【０４２６】
血漿総ＮＯＶ００４濃度、血漿総ＮＯＶ００５濃度、又は血漿総ＮＯＶ００６濃度の測定
捕捉抗体としてのヤギ抗ヒトＦｃガンマ抗体（ＫＰＬ  ＃１０９−００５−０９８）と、検出抗体としての、ＨＲＰ標識を有するヤギ抗ヒトＩｇＧとによるカスタムのサンドイッチイムノアッセイを使用して、ラット血漿中のヒトＩｇＧ（即ち、ＮＯＶ００４、ＮＯＶ００５、又はＮＯＶ００６）を定量した。この捕捉抗体（ＰＢＳ中に２μｇ／ｍＬ、３０μＬ／ウェル）で、３８４ウェルの白色マイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ；Ｍｏｎｒｏｅ，ＮＣ；カタログ番号７８１０７４）をコーティングした。このプレートを、振盪することなく室温（ＲＴ）で一晩インキュベートした。洗浄することなくコーティング溶液を吸引した後、１×Ｍｉｌｋ  Ｄｉｌｕｅｎｔ／Ｂｌｏｃｋｉｎｇ溶液（ＫＰＬ；Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ；カタログ番号５０−８２−０１）９０μＬを各ウェルに添加し、このプレートをＲＴで２時間にわたりインキュベートした。インキュベーションの終了時にこの溶液を吸引し、このプレートを、−８０℃にて、乾燥剤と共にフォイルパウチ中で貯蔵した。
【０４２７】
アッセイの当日、１６種のＮＯＶ００４、ＮＯＶ００５、及びＮＯＶ００６の標準濃度（０．２４４〜４０００ｐＭの範囲）を、カゼインバッファによる段階希釈により調製した（バッファ陰性対照を含む）。全ての研究サンプルをカゼインバッファにより手動で１：５０に希釈し、次いで、Ｂｉｏｍｅｋ  Ｆｘを使用して、合計３回の希釈で５倍に連続的に希釈した。プレートをＲＴで２時間にわたりインキュベートし、次いで、リン酸洗浄バッファで３回洗浄した（９０μＬ／ウェル）。各プレートに、ＨＲＰで標識されたヤギ抗ヒトＩｇＧ（カゼインバッファ中に４００ｎｇ／ｍＬ、３０μＬ／ウェル）を添加し、このプレートをＲＴで１時間にわたりインキュベートした。このプレートをリン酸洗浄バッファ（９０μＬ／ウェル）で３回洗浄し、次いで、ＫＰＬ  ＬｕｍｉＧＬＯ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅを添加した（３０μＬ／ウェル；カタログ番号５４−６１−００）。化学発光を、５０ミリ秒の積分時間で、全ての波長にてＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で速やかに読み取った。血漿サンプル中のヒトＦｃ濃度（ｐＭ）を、ＮＯＶ００４、ＮＯＶ００５、又はＮＯＶ００６の標準曲線から内挿し、希釈係数を乗算し、ｎＭ濃度へと変換した。
【０４２８】
動物は、ＮＯＶ００４、ＮＯＶ００５、又はＮＯＶ００６のＩＶ投与から１時間後に、約２００μｇ／ｍＬの平均Ｃｍａｘを示した。ＮＯＶ００４、ＮＯＶ００５、及びＮＯＶ００６は、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおいて同等のＰＫプロファイルを示した（図５）。
【０４２９】
実施例４：開発可能性（ｄｅｖｅｌｏｐａｂｉｌｉｔｙ）、及び製剤の評価
抗体ＮＯＶ００４、ＮＯＶ００５、及びＮＯＶ００６の製造プロセス及び製剤の研究を実行した。ＮＯＶ００４の以前の評価中に観測した高分子量種（ＨＭＷ）の形成は、溶液中での高度の凝集を示唆しており、同等の機能的活性を有するがより良い製造プロファイル及び製剤プロファイルを有する（例えば、ＨＭＷの形成を全く観測しないかほとんど観測しない（例えば、２０％未満、１５％未満、１０％未満、又は５％未満））他のＦＧＦ２１模倣抗体の開発及び評価を促した。
【０４３０】
ヒトへのコドン最適化を含む、抗体ＮＯＶ００５及びＮＯＶ００６をコードするＤＮＡ配列を、ＧｅｎｅＡｒｔ（商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）及びＡＴＵＭ（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）に注文した。ＮＯＶ００４、ＮＯＶ００５、及びＮＯＶ００６を発現するベクターを線形化し、ＣＨＯ細胞株に遺伝子導入した。＞９５％の生存率に回復するまで、１０ｎＭのメトトレキサート（ＭＴＸ）を使用してプールを選択した。各分子に関して１つのプールをウェーブ製造（ｗａｖｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）のために選択し、適切にスケールアップした。１３日後に、このウェーブ製造からの培養上清を回収してろ過した。
【０４３１】
ＮＯＶ００５及びＮＯＶ００６のウェーブ回収物質を、標準抗体用の２種のカラムクロマトグラフィー精製プロセス（アフィニティクロマトグラフィー（樹脂−ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ）を使用して捕捉し、カチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＣ）（樹脂−Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＳＯ３−）を使用してポリッシュする）を使用して処理した。捕捉した物質を、ウイルス不活性化（３．５へのｐＨの調整、７０分にわたる室温での、このｐＨにおけるインキュベーション、及びその後の５．０へのｐＨの調整）、並びに滅菌ろ過に供した後に、ＣＥＣにより処理した。ＣＥＣの後、接線流ろ過を使用してこの物質を透析ろ過し、１０ｍＭのヒスチジン／ヒスチジン−ＨＣｌ、ｐＨ５．０へとバッファ交換した。その後、この物質を約２００ｍｇ／ｍＬまで濃縮して製剤研究用の物質とした。例えば、抗体を製剤バッファ中で評価し、特定のパラメータ（具体的には、４０℃での４週間後のＨＭＷの形成）を決定した。下記の表３では、４０℃での４週間後のＮＯＶ００４、ＮＯＶ００５、及びＮＯＶ００６のサンプル中で観測したＨＭＷの形成を評価する例示的な実験からのデータが要約されている。
【０４３２】
【表１３】
2020506728.tif 000019
【０４３３】
ＮＯＶ００４に対するＮＯＶ００５及びＮＯＶ００６の配列の差異により、貯蔵時でのＨＭＷの形成に顕著な改善がもたらされた。ＮＯＶ００５及びＮＯＶ００６は両方とも、４週間にわたる４０℃で約１％未満のＨＭＷ形成を示したが、ＮＯＶ００４は、４週間にわたる４０℃で約６４％のＨＭＷ形成というはるかに高いＨＭＷ形成を示した。
【０４３４】
ＮＯＶ００５及びＮＯＶ００４のＶＨ及びＶＬの配列アラインメントを下記に記載する：
ＶＨ
同一性：７９．２
類似性：８８．３％
【化６】
2020506728.tif 000020
ＶＬ
同一性：９９．１％
類似性：１００．０％
【化７】
2020506728.tif 000021
【０４３５】
このデータは、ＮＯＶ００５及びＮＯＶ００６が、驚くべきことに、ＮＯＶ００４と対比したＨＭＷの形成により示されるように最小限の凝集傾向を示したことを示し、並びにＮＯＶ００５及びＮＯＶ００６が、医薬製剤に適しており且つより好ましいであろう特性を示すこと示唆する。
【０４３６】
実施例５：肥満のカニクイザルにおける研究
肥満のカニクイザルにおける摂餌量、体重、及び血漿バイオマーカーへのＦＧＦ２１模倣ｍＡｂ（例えば、ＮＯＶ００４、ＮＯＶ００５、又はＮＯＶ００６）の効果を研究する。
【０４３７】
実験プロトコル：
５匹の雄のカニクイザルを皮下（ｓ．ｃ．）で２回処置し（１ｍｇ／ｋｇ用量のＦＧＦ２１模倣ｍＡｂ（例えば、ＮＯＶ００４、ＮＯＶ００５、又はＮＯＶ００６）を隔週（研究の０日目及び７日目）で投与する）、投与後１００日超にわたり、摂餌量、体重、及び血漿バイオマーカーを評価する。各投与に関して、動物を飼育ケージ内で拘束し、血液サンプルを採取し、次いで各動物に１ｍｇ／ｋｇのＦＧＦ２１模倣ｍＡｂ（例えば、ＮＯＶ００４、ＮＯＶ００５、又はＮＯＶ００６）を皮下投与する。摂餌量の測定を最初の投与の１週間前に開始し、この研究全体を通して継続する。研究用飼料を給餌の前に秤量し、毎日２等分する。翌朝、残っている飼料を回収して秤量する。受皿に落ちているペレット（各１ｇ）の数を数え、残っている食物の重量に加える。供給した食物の重量から回収した食物を減算して、毎日の摂餌量を算出する。果物及び野菜の摂取量は測定しない。体重計の動的特徴を使用して、空腹時の体重を１週間当たり３回の朝（血液採取前、又は投与前）に二重に測定する。
【０４３８】
血漿ＦＧＦ２１模倣ｍＡｂ濃度の測定
ＥＬＩＳＡベースのサンドインチイムノアッセイを使用して、カニクイザル血漿中のヒトＦｃ  ＩｇＧを定量する。ヒトＩｇＧに対するマウスモノクローナル抗体である抗ヒトＩｇＧマウスＩｇＧ１を捕捉抗体として使用する。白色のＧｒｅｉｎｅｒ３８４ウェルプレートを、２μｇ／ｍＬの抗ヒトＩｇＧマウスＩｇＧ１（３０μＬ／ウェル）でコーティングし、室温（ＲＴ）で一晩インキュベートする。コーティング抗体を吸引し、１×ミルクブロッカー（ｍｉｌｋ  ｂｌｏｃｋｅｒ）（ＫＰＬ  ＃５０−８２−０１）をＲＴで２時間にわたり９０μＬ／ウェルで添加する。このブロッキング溶液を吸引し、プレートを、アッセイまで、乾燥剤と共にプレートバッグ中で−８０℃にて貯蔵する。アッセイの当日、プレート及び試薬をＲＴにする。カスタムのカゼインサンプル希釈液で、精製されたＩｇＧを４０００〜１６ｐＭに希釈し、バッファ対照を含めることにより、標準を作製する。サンプルを、標準と同一の希釈液で１：５０、１：２５０、１：１２５０、及び１：６２５０に二重で希釈し、次いで、標準、希釈したサンプル、及び対照を、ＲＴで２時間にわたりプレートに添加する（全ての工程に関するワーキング容量は、３０μＬ／ウェルであった）。次いで、プレートを、リン酸塩ベースの洗浄バッファで３回洗浄する。このプレートに、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識された抗ヒトＦｃ−ガンマ抗体をＲＴで１時間にわたり添加し、次いで、このプレートを、リン酸塩ベースの洗浄バッファで３回洗浄する。このプレートに化学発光基質を添加し、このプレートを発光プレートリーダーで速やかに読み取る。
【０４３９】
ＦＧＦ２１模倣ｍＡｂ（例えば、ＮＯＶ００４、ＮＯＶ００５、又はＮＯＶ００６）、標準を、１枚のプレート当たり三重にアッセイする。希釈した血漿サンプルを二重にアッセイする。未知のサンプルをＩｇＧ標準曲線から内挿する。サンプル濃度の曲線への当てはめ、逆算、回復％、及び内挿を、ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖ５．４．１を使用して実施する。ＩｇＧ標準により生じたシグナルをプロットし、４パラメータロジスティック曲線当てはめオプションを使用して当てはめた。血漿サンプル中のＦｃ濃度（ｐＭ）をＦＧＦ２１模倣ｍＡｂ標準曲線から内挿し、希釈係数を乗算する。このアッセイの定量下限（ＬＬＯＱ）及び定量上限（ＵＬＯＱ）を決定する。ＬＬＯＱ及びＵＬＯＱを、１００％回復±２０％及びＣＶ＜２０％の標準濃度の上限及び下限として定義し、次いで、希釈係数で乗算する。
【０４４０】
抗薬物抗体の検出
血漿サンプルを、ＬｏｗＣｒｏｓｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｏｃａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ；カタログ番号１００  ５００）で１：５に希釈する。ＬｏｗＣｒｏｓｓバッファ中に０．６μｇ／ｍＬのビオチンで標識されたＦＧＦ２１模倣ｍＡｂと０．６μｇ／ｍＬのジゴキシゲニンで標識されたＦＧＦ２１模倣ｍＡｂとを含む反応混合物を調製する。希釈した血漿（８０μＬ）を、９６ウェルＵ底プレート（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ；Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ；カタログ番号３５１１７７）中で反応混合物１６０μＬと組み合わせる。このプレートの縁をパラフィルムで密封し、このプレートを、２時間にわたり３７℃にて振盪プラットフォーム上でインキュベートする（１５０ｒｐｍ、光から保護する）。次いで、各混合物のアリコート（１００μＬ）を、ストレプトアビジンでコーティングされた９６ウェルプレート（Ｒｏｃｈｅ；カタログ番号１１７３４７７６００１）の二連のウェルに移し、最初に、０．０５％（体積／体積）のＴｗｅｅｎ−２０（１つのウェル当たり３００μＬ）を含む１×ＰＢＳからなる洗浄バッファで３回洗浄する。このプレートを密封し、次いで、１時間にわたり振盪プレットフォーム上でＲＴにてインキュベートする（３００ｒｐｍ、光から保護する）。プレートを、洗浄バッファ（１枚のウェル当たり３００μＬ）で３回洗浄し、次いで、ＬｏｗＣｒｏｓｓバッファで１：２５００に希釈した抗ジゴキシゲニンペルオキシダーゼ＿ＰＯＤ  Ｆａｂフラグメント（Ｒｏｃｈｅ；カタログ番号１１６３３７１６００１）１００μＬを各ウェルに添加する。このプレートを密封し、４５分にわたり振盪プラットフォーム上でＲＴにてインキュベートし（３００ｒｐｍ、光から保護する）、次いで、洗浄バッファ（１枚のウェル当たり３００μＬ）で３回洗浄する。各ウェルに、ＴＭＢ  Ｏｎｅ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ＨＲＰ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ  ＴＸ；カタログ番号Ｅ１０２；１００μＬ／ウェル）を添加し、光から保護しつつ青色を９〜１０分にわたり発色させた。各ウェルに０．１８Ｎ  Ｈ２ＳＯ４  １００μＬを添加することにより、この発色反応を停止させ、このプレートを短時間にわたり振とうし、ＯＤ４５０で黄色を測定する。
【０４４１】
血漿グルコース濃度の測定
血漿グルコース濃度を、Ａｕｔｏｋｉｔ  Ｇｌｕｃｏｓｅアッセイ（Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ；Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＶＡ；カタログ番号４３９−９０９０１）を使用して測定する。検量用試料を５００、２００、１００、５０、２０、及び０ｍｇ／ｄＬの標準まで希釈することにより、標準曲線を作成する。透明な平底９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；カタログ番号２６９６２０）中において、３７℃まで予め温めたアッセイ試薬（３００μＬ）を、２μＬの血漿、標準、及び対象サンプルに添加する。このプレートを３０秒にわたりプレートシェーカー上で混合し、次いで、５分にわたり３７℃でインキュベートする。２０秒間の混合の後、このプレートを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ  ＰＬＵＳ  ３８４（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用して５０５／６００ｎｍで読み取る。標準曲線と比較することにより、サンプル中のグルコース濃度を算出する。
【０４４２】
血漿インスリン濃度の測定
血漿インスリン濃度を、製造業者の指示に従ってＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＲＩＡ  Ｋｉｔ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ；カタログ番号ＨＩ−１４Ｋ）を使用して決定する。５ｍＬ，７５×１２ｍｍのＰＰ  ＳＡＲＳＴＥＤＴチューブ（カタログ番号５５．５２６）中において、適切な量のアッセイバッファ、標準、又は希釈した血漿サンプルを、１２５Ｉ−インスリン及び抗インスリン抗体と混合する。このチューブをボルテックスし、カバーし、ＲＴで２０時間にわたりインキュベートする。このインキュベーションの後、４℃の沈殿試薬１ｍＬを添加し、このチューブをボルテックスし、次いで４℃で３０分にわたりインキュベートする。全てのチューブを３０分にわたり遠心分離し（４℃で３０００ｒｐｍ）、上清をデカントし、ペレットを、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ＷＩＺＡＲＤ２  Ａｕｔｏｍａｔｉｃ  Ｇａｍｍａ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（モデル番号２４７０；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）でカウントする。既知のインスリン量を使用して作成した標準曲線と比較することにより、インスリン濃度を算出する。
【０４４３】
血漿トリグリセリド濃度の測定
血漿トリグリセリド（ＴＧ）濃度を、Ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ（ＧＰＯ）Ｌｉｑｕｉｄ  Ｒｅａｇｅｎｔセット（Ｐｏｉｎｔｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｃａｎｔｏｎ，ＭＩ；カタログ番号Ｔ７５３２−５００）を使用して測定する。予め温めたアッセイ試薬（３００μＬ、３７℃）を、透明な平底９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ，ＭＡ；カタログ番号２６９６２０）中の血漿５μＬに添加する。このプレートを３０秒にわたりプレートシェーカー上で混合し、次いで、５分にわたり３７℃でインキュベーター中に静置する。２０秒間の混合の後、ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ  ＰＬＵＳプレートリーダーにより５００ｎｍで吸光度を測定する。既知のＴＧ標準（Ｐｏｉｎｔｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；カタログ番号Ｔ７５３１−ＳＴＤ）量を使用して作成した検量線と比較することにより、ＴＧ濃度を算出する。
【０４４４】
血漿コレステロール濃度の測定：
血漿総コレステロール（ＴＣ）を、Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ（Ｌｉｑｕｉｄ）Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｓｅｔ（Ｐｏｉｎｔｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；カタログ番号Ｃ７５１０−５００）を使用して定量する。予め温めたアッセイ試薬（２００μＬ、３７℃）を、透明な平底９６ウェルアッセイプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；カタログ番号２６９６２０）中の血漿１０μＬに添加する。このプレートを３０秒にわたりプレートシェーカー上で混合し、次いで、５分にわたり３７℃でインキュベートする。２０秒間の混合の後、ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ  ＰＬＵＳプレートリーダー中で５００ｎｍにて吸光度を測定する。既知のコレステロール標準（Ｓｔａｎｂｉｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｂｏｅｒｎｅ，ＴＸ；カタログ番号１０１２−０３０）量を使用して作成した検量線と比較することにより、コレステロール濃度を算出する。
【０４４５】
血漿高密度リポタンパク質コレステロール濃度の測定
高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロール濃度を決定するために、血漿サンプル５０μＬを、０．５ｍＬのマイクロ遠心チューブ中のＣｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ；Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＶＡ；カタログ番号４３１−５２５０１）５０μＬと組み合わせ、短時間にわたりボルテックスする。このチューブを１０分にわたり室温で静置し、次いで、４℃で１０分にわたり２０００×ｇで遠心分離する。遠心分離の後、上清（元々の血漿サンプルのＨＤＬコレステロール部分を含む）の約半分を取り出し、１０μＬを、上記で説明したコレステロールアッセイに使用する。
【０４４６】
血漿β−ヒドロキシ酪酸濃度の測定
血漿β−ヒドロキシ酪酸（β−ＨＢ）濃度を、β−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ  ＬｉｑｕｉＣｏｌｏｒ  Ｔｅｓｔキット（Ｓｔａｎｂｉｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；カタログ番号２４４０−０５８）を使用して測定する。アッセイ試薬Ｒ１（３７℃まで予め温めた２１５μＬ）を、透明な平底９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；カタログ番号２６９６２０）中の２０μＬの品質対照サンプル又は血漿サンプルに添加する。このプレートを３０秒にわたりプレートシェーカー上で混合し、次いで、５分にわたり３７℃でインキュベーター中に静置する。予め読み取る吸光度を、ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ  ＰＬＵＳプレートリーダー中で５０５ｎｍにて測定する。各ウェルにアッセイ試薬Ｒ２（３７℃まで予め温めた３５μＬ）を添加し、このプレートを、３０秒にわたりプレートシェーカー上で再び混合し、次いで５分にわたり３７℃にてインキュベートする。２０秒間の混合の後、最終的な吸光度を５０５ｎｍで測定し、この吸光度から、予め読み取った値を減算した。既知のβ−ＨＢ検量用試料（Ｗａｋｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ；Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＶＡ；カタログ番号４１２−７３７９１）量を使用して作成した検量線と比較することにより、β−ＨＢ濃度を算出する。
【０４４７】
統計解析
ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．０５；ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ；Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用して統計解析を実施する。各動物に関する食物摂取量データを、ベースライン（−６日目〜０日目の平均として算出する）の割合として正規化し、次いで群平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）を算出し、Ｄｕｎｎの多重比較事後検定を伴うノンパラメトリックＦｒｉｅｄｍａｎの検定により各日を０日目と比較する。体重を、ベースライン（−７日目、−５日目、−３日目、及び０日目の平均として算出する）の割合として算出した群平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表す。生の体重データ及び血漿バイオマーカーデータも、Ｄｕｎｎの多重比較事後検定を伴うノンパラメトリックＦｒｉｅｄｍａｎの検定により解析する。Ｐ＜０．０５を有意と考える。
【０４４８】
実施例６：肥満カニクイザルにおける研究
雄の血糖正常の肥満カニクイザルにおけるＮＯＶ００５の効果を評価するために、２回の皮下の１ｍｇ／ｋｇの用量のＮＯＶ００５（ｎ＝５の動物）又はビヒクル（ｎ＝３の動物）を１週間間隔で投与した。中間研究の結果を下記にまとめる。
・  ＮＯＶ００５は、ベースラインと比較して約６０％のピーク平均減少（図６）及びＮＯＶ００５処置マウスにおけるベースラインと比較して約１０％の平均ピーク体重減少（図６Ｂ）で、標準固形飼料の摂餌量を減少させた。
・  非絶食動物からの血漿を、脂質及び炭水化物の代謝のバイオマーカーの変化を分析した。
○  ３５日目のベースラインと比較して、ＮＯＶ００５処置マウスにおける血漿ＴＧレベルに関して、約６５％の平均減少を観察した。
○  ＮＯＶ００５はまた、３５日目のベースラインと比較して総コレステロール及びインスリンも減少させたが、これらの変化は統計的に有意ではなかった。
○  この研究の終了時に測定される他のバイオマーカーとして、アディポネクチンプロファイル、β−ヒドロキシブチレートプロファイル、ＡｐｏＣＩＩＩプロファイル、ＨＤＬ−Ｃプロファイル、及びリポタンパク質プロファイルが挙げられる。
【０４４９】
【表１４】
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【０４５０】
参照による組み込み
本明細書で引用される全ての参考文献（例えば、特許、特許出願、論文、教科書、及び同類のもの）、並びにこの参考文献で引用される参考文献は、これらが既に組み込まれていない限りにおいて、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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