(57)【要約】  本発明は、Ａｃａｎｔｈｕｓ  ｍｏｌｌｉｓ種子のメタノール抽出物の抗血小板活性、並びにＬＴＡ、ＮＭＲ、ＨＰＬＣ及びＬＣ−ＭＳのそれぞれの技術を用いた、この効果に関与するその成分の同定に関する。本発明者らは、Ａｃａｎｔｈｕｓ  ｍｏｌｌｉｓ種子のメタノール抽出物が、ＡＡ及びＴＲＡＰ−６誘導血小板凝集に対して二重の有利な抗血小板活性を示す、すなわち、血小板凝集を引き起こす２つの重要な経路（それぞれ、ＣＯＸ−１の作用によってＡＡから形成されるＴｘＡ２によって媒介される経路並びにトロンビン受容体ＰＡＲ−１に媒介される血小板凝集）を特異的に阻害することを発見した。この効果は、その個別の構成成分であるＤＩＢＯＡ−Ｇｌｃ、イソベルバスコシド及びベルバスコシドに起因する。ＡＡに対する抗血小板活性は、そのＤＩＢＯＡ−Ｇｌｃ分によるものである。ＤＩＢＯＡ−Ｇｌｃ活性は、ベルバスコシド又はイソベルバスコシドの存在下で増強され、それらの組み合わせによってはるかに増強される。ＴＲＡＰ−６に対する抗血小板活性は、イソベルバスコシドだけに起因する。結論として、Ａｃａｎｔｈｕｓ  ｍｏｌｌｉｓ種子の成分は、アスピリン抵抗性の患者においてアスピリンに取って代わることができることから、ＣＶＤ患者に使用される（ＤＩＢＯＡ−Ｇｌｃ単独で又はベルバスコシド若しくは／及びイソベルバスコシドと組み合わせて）、また、血小板トロンビン受容体ＰＡＲ−１の特異的アンタゴニストとして使用される（イソベルバスコシド）、新しい治療剤であると考えることができる。さらに、全抽出物は、これらの患者においてアスピリン及びＰ２Ｙ１２アンタゴニストを用いた標準治療に加えて、重要なサプリメントとして使用し得る。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＡ経路及びＰＡＲ−１受容体経路を特異的に阻害することによって二重の抗血小板活性、したがって抗血栓活性を有する、ヒト用医薬又はサプリメントを調製するための、Ａｃａｎｔｈｕｓ  ｍｏｌｌｉｓ種子の全メタノール抽出物の使用。
【請求項２】
アラキドン酸誘導血小板凝集を特異的に阻害することによって抗血小板効果、したがって抗血栓活性を有する、ヒト用医薬を調製するための、ＤＩＢＯＡ−Ｇｌｃの使用。
【請求項３】
ＰＡＲ−１受容体によって媒介される血小板凝集に対して特異的阻害作用を有する、ヒト用医薬を調製するための、イソベルバスコシドの使用。
【請求項４】
アラキドン酸誘導血小板凝集に対して相乗効果を示す、ヒト用医薬を調製するための、ＤＩＢＯＡ−Ｇｌｃと、イソベルバスコシド若しくはベラバスコシド（Ｖｅｒａｂａｓｃｏｓｉｄｅ）又は両方との組み合わせの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ａｃａｎｔｈｕｓ  ｍｏｌｌｉｓ種子の全抽出物によって、さらにその成分であるＤＩＢＯＡ−Ｇｌｃ、ベルバスコシド及びイソベルバスコシドのそれぞれ、並びにこれらの組み合わせによって発現される抗血小板活性に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、アテローム血栓症は世界的な主要死因である。血小板凝集は、動脈及び静脈血栓症の病態生理において重要な役割を果たしており、一方、血小板活性化はまた、アテローム形成並びに他の病態生理学的状態、例えば炎症及び発癌などにも大きく寄与する。そのため、抗血小板療法は、心血管疾患（ＣＶＤ）を有する患者、特に急性冠動脈症候群（ＡＣＳ）を呈する患者の治療の基礎となる。さらに、抗血小板薬を用いた患者の長期にわたる治療は、例えばがんなどの他の障害の予防に大きく寄与し得る。現在利用可能な抗血小板薬は、血小板活性化の重要点、例えば、シクロオキシゲナーゼ−１（ＣＯＸ−１）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）のＰ２Ｙ１２受容体及びインテグリン受容体αＩＩｂ／β３（ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ）を介したトロンボキサンＡ２（ＴｘＡ２）の合成などを標的としている。現在の研究は、他の血小板受容体、例えば、プロテアーゼ活性化受容体１（ＰＡＲ−１）と命名されているトロンビン受容体（Ｍｉｃｈｅｌｓｏｎ  ＡＤら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．２０１０；９：１５４−６９；Ｔｓｏｕｍａｎｉ  ＭＥ、Ｔｓｅｌｅｐｉｓ  ＡＤ、Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｄｅｓ．２０１７；先行公開のオンライン版）などを標的とするアンタゴニストの開発に関するものである。
【発明の概要】
【０００３】
過去数年、最新の研究では、いくつかの生物学的活性、例えば抗炎症活性、抗酸化活性及び抗血小板活性などを示す天然物（オリーブ油、キノコ、ワインなど）及びそれらの成分に特に関心が持たれている（Ｋｏｎｔｏｇｉａｎｎｉ  ＶＧら、Ｊ，Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．２０１６；２２：４５１１〜４５２１；Ｔｚａｋｏｓ  ＡＧら、Ｊ  Ａｇｒｉｃ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．２０１２；６０：６９７７〜８３；Ｊｏｓｅ  Ｎら、Ｐｈｙｔｏｔｈｅｒ．Ｒｅｓ．２００４；１：４３〜６）。したがって、本研究の目的は、Ａｃａｎｔｈｕｓ  ｍｏｌｌｉｓ種子の全抽出物の考えられる抗血小板効果を研究すること及びこの効果の発現に関与する主要な構成成分を同定することであった。
【０００４】
キツネノマゴ科（Ａｃａｎｔｈａｃｅａｅ）は、３４６の属に分類される４３００種を含む植物の大きな科である（Ｒｅｚａｎｋａ  Ｔら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ．２００９；７０：１０４９〜１０５４）。この科のメンバーは、熱帯地域及び温帯地域において、主に地中海地域において存在している。ハアザミ属（Ａｃａｎｔｈｕｓ）は、草地、森林並びに丘陵地の岩場及び茂みに生育する野草の一属である。この属を代表する最も重要なものは、ポルトガル及びアフリカ北西部からバルカン諸国にかけて様々な地中海地域に存在する多年草植物であるＡｃａｎｔｈｕｓ  ｍｏｌｌｉｓである。この植物は、春と初夏の間にだけ発芽する。しかしながら、根茎が年間を通じて生きたままであるので、この植物は多年生と言われている。葉の大部分は、切れ込みがあり、わずかに棘がある光沢のある緑色の葉によって形成されている。葉の特別な特徴は、棘又は綿毛がないことによる柔らかい葉質である。花は紫色を帯びた白色である。この植物の果実は滑らかな表面を有しており、その大きさはレモン程度であり、その色は緑色である。果実は成熟すると、堅くなり、裂開し、果実の中にある種子を排出する。種子もまた堅く、わずかにしわのある褐色の種皮を有しており、それらの形は卵形及び扁平である。Ａｃａｎｔｈｕｓ  ｍｏｌｌｉｓは、乾癬及びエイコサノイドの不均衡な産生のために発症する他の皮膚疾患に対して使用される。葉のメタノール抽出物が、２００ｍｇ／ｍＬの濃度で５−リポキシゲナーゼ（５−ＬＯＸ）及びシクロオキシゲナーゼ−１（ＣＯＸ−１）活性を阻害し、抗炎症性エイコサノイドの１５（Ｓ）−ＨＥＴＥの生合成を増加させることが実証された（Ｂａｄｅｒ  Ａら、Ｐｈｙｔｏｔｈｅｒ．Ｒｅｓ．２０１５；２９：１０８〜１１３）。しかしながら、本発明者らの知る限りでは、ヒト血小板活性化に対するＡｃａｎｔｈｕｓ  ｍｏｌｌｉｓ種子メタノール抽出物の効果はこれまで研究されていない。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
本研究プロトコールの第１段階において、本発明者らは、血小板凝集に対して最大の生物学的活性を示す抽出物を得るために、Ａｃａｎｔｈｕｓ  ｍｏｌｌｉｓ種子を抽出する最良の方法を特定することを目的とした。したがって、１３ｇの乾燥種子（−２０℃で貯蔵、採取２日後）を、真鍮製乳鉢で粉砕−微粉砕して粉末にした。次いで粉末を、極性を徐々に高めた２００ｍｌの溶媒２種、まずヘキサン、次いでメタノールを用いて、ソックスレー抽出器において各溶媒で６時間、順次抽出した。本発明者らは、予備実験において、ソックスレー抽出器での抽出によって得られた、調製した全ての抽出物（ヘキサン抽出物、酢酸エチル抽出物、ジクロロメタン抽出物及びメタノール抽出物）のうち、メタノール抽出物のみが、血小板凝集に対して生物学的活性を示す一方、全ての他の抽出物はほとんど又は全く抗血小板効果を有さないことを見出した後、この抽出方法に到達した。
【０００６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの血小板凝集に対するメタノール抽出物の効果を、健常ボランティアのヒト多血小板血漿（ＰＲＰ）において、本発明者らが以前に記述したように、透過光血小板凝集検査法（ＬＴＡ）を使用して広範に研究した（Ｍｉｔｓｉｏｓ  ＪＶら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００４；２７１：８５５〜８６２）。ＰＲＰは、アゴニストとしてのアラキドン酸（ＡＡ；０．５ｍＭ）、トロンビン受容体活性化ペプチド−６（ＴＲＡＰ−６；１０μΜ）及びＡＤＰ（１０μΜ）によって活性化された。窒素下でメタノールを蒸発させ、次いで残留物をＤＭＳＯ中に溶解させることによってサンプルは調製された。各アゴニストの添加から４分以内に達成された最大の凝集を決定し、各検体について較正した１００％光透過のパーセンテージ（最大凝集率％）として表した。種子抽出物の阻害効力はＩＣ５０値（半数阻害濃度）として表された。３つの異なるメタノール抽出物調製物（上述した通り調製された）を使用して、各血小板アゴニストについて行った少なくとも３つの独立した実験から得られる全ての値を、平均±標準偏差（Ｓ．Ｄ．）として表す。各アッセイにおけるＤＭＳＯの最終濃度は０．０１体積％であった。図１に示すように、Ａｃａｎｔｈｕｓ  ｍｏｌｌｉｓ種子のメタノール抽出物は、ＡＡ（ＩＣ５０＝０．１５ｍｇ／ｍＬ）及びＴＲＡＰ−６（ＩＣ５０＝０．１４ｍｇ／ｍＬ）によって誘導される血小板凝集を用量依存的に阻害するが、ＡＤＰによって誘導される血小板凝集は阻害せず、その阻害効果が、ＡＡ（これは血小板中でＣＯＸ−１によって代謝されてＴｘＡ２を生成し、ＴｘＡ２はその受容体を介して血小板を活性化する）によって、及び本発明者らの実験で使用されるペプチドＴＲＡＰ−６によって特異的に活性化されるトロンビンの血小板受容体ＰＡＲ−１によって、媒介される特定の血小板活性化経路に関係していることを示す。
【０００７】
続いて、Ａｃａｎｔｈｕｓ  ｍｏｌｌｉｓ種子のメタノール抽出物の植物化学プロファイルの分析を実施した。窒素下でのメタノール蒸発後に得られた残留物（５ｍｇ）を０．５ｍＬのＤＭＳＯ−ｄ６中に溶解させ、ＮＭＲチューブ（５ｍｍ）に移し、その結果、１Ｄ  １Ｈ−ＮＭＲスペクトルを記録し、特徴ピークを示した（図２Ａ）。トリメチルシリルプロパン酸ナトリウム塩（ＴＭＳＰ−ｄ４）を参照化合物として使用した。ＮＭＲ実験は、ヨアニナ大学の核磁気共鳴センター（ｔｈｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｏｆ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｏａｎｎｉｎａ）で、Ｂｒｕｋｅｒ  ＬＣ−ＮＭＲ  ＡＶ−５００分光計（Ｂｒｕｋｅｒ）で行った。実験条件は以下の通りであった：スキャン数（ＮＳ）＝２５６、Ｔ＝２９８Ｋ、実験時間＝３０ｍｉｎ、５００ＭＨｚ）。ＮＭＲシステムは、ソフトウェアＴｏｐ  Ｓｐｉｎ（Ｂｒｕｋｅｒ）で制御した。結果は２Ｄ  １Ｈ−１３Ｃ  ＨＳＱＣ及びＨＭＢＣスペクトルに基づいて評価した。
【０００８】
メタノール抽出物の主要な化合物を決定するために、ＮＭＲ分光法の補助的な方法としてＬＣ−ＭＳ法も使用し、逆もまた同様であった。メタノール抽出物のサンプルを希釈して０．０５ｍｇ／ｍＬの濃度にした。１０μＬの濾過したサンプル（０．４５μｍ）をＬＣ−ＭＳ装置に注入した。全てのＬＣ−ＭＳｎ実験は、１１００バイナリＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、ドイツ）を改造し、脱気装置、オートサンプラー、ダイオードアレイ検出器及びエレクトロスプレーイオン源を備えた四重極イオントラップ質量分析器（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、モデルＭＳＤトラップＳＬ）において実施した。全ての機器部品は、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅで制御した。分離は、１５ｃｍ×４．６ｍｍ、ｉ．ｄ．５μｍのＺｏｒｂａｘ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＸＤＢ−Ｃ１８分析用カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ、米国）において、０．６ｍＬ／ｍｉｎの流速で、溶媒Ａ（水／ギ酸、９９．９：０．１  ｖ／ｖ）及び溶媒Ｂ（アセトニトリル）を使用して、達成した。分析に使用した勾配は、０〜６ｍｉｎ  ９０％Ａ、定組成溶離；６〜１０ｍｉｎ  ９５〜８５％Ａ；１０〜１５ｍｉｎ  ８５％Ａ、定組成溶離；１５〜２０ｍｉｎ  ８５〜７５％Ａ；２０〜３５ｍｉｎ  ７５〜６０％Ａ；３５〜４０ｍｉｎ  ６０〜９０％Ａであった。２００〜５５０ｎｍの範囲でＵＶ／ＶＩＳスペクトルを記録し、２８０及び３３０ｎｍでクロマトグラムを取得した。
【０００９】
フェノール化合物のプリカーサー及びプロダクト（ＭＳ２及びＭＳ３）両イオンのスキャニングを、負極性においてｍ／ｚ  ５０〜ｍ／ｚ  １２００の間でモニタリングした。イオン源条件は以下の通りであった：キャピラリー電圧、３．５ｋＶ；乾燥ガス温度、３５０℃；窒素流量及び圧力、それぞれ１１Ｌ／ｍｉｎ及び５０ｐｓｉ。イオントラップの最大蓄積時間及びＭＳ平均スペクトルを得るためのＭＳ繰り返し回数はそれぞれ３０及び３ｍｓとした。全イオン電流（ＴＩＣ）クロマトグラム（図３Ａ）、ＵＶクロマトグラム及びＭＳ、ＭＳ２及びＭＳ３スペクトルを記録した。主要な化合物（１、２及び３）の同定は、以前に記述されているように、擬分子［Ｍ−Ｈ］−イオンの正確な質量測定値及びそれらのフラグメンテーションパターンに基づいて行った（Ｗｏｌｆ  ＲＢら、Ｊ  Ｎａｔ  Ｐｒｏｄ．１９８５；４８：５９〜６３；Ｒｙａｎ  Ｄら、Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ  １９９９；８３２：８７〜９６）。結果によると、ピーク１は化合物２−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−４−ヒドロキシ−１，４−ベンゾオキサジン−３−オン（二量体）（ＤＩＢＯＡ−Ｇｌｃ）を含有し、ピーク２は主にベルバスコシド及び微量のイソベルバスコシド（イソアクテオシド）を含有し、一方、ピーク３は主にイソベルバスコシド及び微量のベルバスコシドを含有する。これらの化合物の全ての特徴を以下の表にまとめる。
【００１０】
【表１】
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【００１１】
主要な化合物について何であるかを確かめるために、これらを、分取高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して単離した。窒素下でメタノール蒸発後に得られた残留物（２０〜６０ｍｇ）を、メタノール（３．２ｍＬ）中に再び溶解させた。３．１ｍＬの濾過したサンプル（０．４５μｍ）をＨＰＬＣ装置（分取クロマトグラフィーシステム、島津製作所、日本）中に注入し、２５ｃｍ×２１．２ｍｍ  ｉ．ｄ．１０μｍ  Ａｓｃｅｎｔｉｓ  Ｃ１８分析用カラム（島津製作所、日本）において、１６ｍＬ／ｍｉｎの流速で、溶媒Ａ（水／ギ酸、９９．９：０．１  ｖ／ｖ）及び溶媒Ｂ（アセトニトリル）を使用して、分離を達成した。分析に使用した勾配はＬＣ−ＭＳ実験で記載したものと同じであり、ＵＶ／ＶＩＳスペクトルを２８０及び３３０ｎｍで取得した。画分は、その後の実験で使用する前に凍結乾燥した。
【００１２】
上記のＨＰＬＣ手法を使用して３つの画分を単離し、次いで上記の同じ実験条件を用いてＬＣ−ＭＳで分析した。ＴＩＣクロマトグラム、ＵＶクロマトグラム並びにＭＳ、ＭＳ２及びＭＳ３スペクトルを記録した。本発明者らの結果によると、画分１はＤＩＢＯＡ−Ｇｌｃに対応し（図３Ｂ）、一方、画分２（図３Ｃ）及び画分３（図３Ｄ）は、ベルバスコシド及びイソベルバスコシドの混合物であり、ベルバスコシドは画分２においてイソベルバスコシドより多量であり、イソベルバスコシドは画分３においてベルバスコシドより多量であった。ベルバスコシド及びイソベルバスコシドの存在を確かめるために、真正標準化合物（Ｍｅｄｃｈｅｍ  Ｅｘｐｒｅｓｓ、米国）を０．０５ｍｇ／ｍＬの所望濃度で使用した（図４）。
【００１３】
加えて、ＨＰＬＣで単離された画分をＮＭＲによる分析にかけた。各画分（５ｍｇ）を０．５ｍＬのＤＭＳＯ−ｄ６中に溶解させ、ＮＭＲチューブ（５ｍｍ）に移し、その後、１Ｄ  １Ｈ−ＮＭＲスペクトルを記録した。トリメチルシリルプロパン酸ナトリウム塩（ＴＭＳＰ−ｄ４）を参照化合物として再び使用した。ＤＩＢＯＡ−Ｇｌｃとしての画分１（図２Ｂ）、ベルバスコシドとイソベルバスコシドとの混合物としての画分２（図２Ｃ）及び画分３（図２Ｄ）の完全な帰属は、以前に公開されている値に従った（Ｈａｒｔｅｎｓｔｅｉｎ  Ｈら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９４；３５：８２７〜８２８．；Ｋａｎｃｈａｎａｐｏｏｍ  Ｔら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２０１１；５８：６３７〜６４０．；Ｙｉｎ  Ｈら、Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ．２００８；１２０５：１７７〜１８１）。
【００１４】
上記の分析に続いて、全抽出物がＡＡ（０．５ｍＭ）及びＴＲＡＰ−６（１０μΜ）だけによって誘導される血小板凝集を阻害した（図１）ことからアゴニストとしてこれらの２つのアゴニストを使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの血小板凝集に対する３つの画分の生物学的効果を、本発明者らが上述したようにＬＴＡによってＰＲＰにおいて試験した。各画分をＤＭＳＯ中に溶解させ、１ｍｇ／ｍＬの最終濃度で使用した。ベルバスコシド及びイソベルバスコシドの標準物質もまたＤＭＳＯ中に溶解させ、１ｍｇ／ｍＬの最終濃度で使用した。図５Ａに示すように、３画分のうち、画分１（ＤＩＢＯＡ−Ｇｌｃ）だけがＡＡによって誘導される血小板凝集を阻害し、０．２ｍｇ／ｍＬの閾値濃度（最大阻害効果を誘導する低い方の濃度）を示した。この濃度は、全抽出物の閾値濃度である０．２５ｍｇ／ｍＬと比較してそれほど低いものではなかった（本発明者らが、ＡＡ誘導血小板凝集に対する阻害活性を発現する全抽出物からの精製画分を使用したことから予想された通り）。したがって、本発明者らは、画分１と画分２又は３との組み合わせ（１：１の質量比で）又は３つの画分の組み合わせ（１：１：１の質量比で）を使用した。図５Ａに示すように、画分２又は３は血小板凝集を阻害しないが、これらは画分１の抗血小板効果を顕著に増強し、３つの画分の組み合わせを使用した場合に最大阻害が観察された。このことは、ベルバスコシド及びイソベルバスコシドが、ＡＡ誘導血小板凝集に対してＤＩＢＯＡ−Ｇｌｃとの相乗的な阻害効果を発現することを示唆する。この示唆をさらに支持するために、本発明者らは、画分１（ＤＩＢＯＡ−Ｇｌｃ）と組み合わせて標準物質ベルバスコシド及びイソベルバスコシドの効果を試験した。図６Ａに示すように、ベルバスコシド及びイソベルバスコシド単独又はこれらの組み合わせは、ＡＡ誘導血小板凝集に対して血小板凝集を阻害しないが、画分１（ＤＩＢＯＡ−Ｇｌｃ）の抗血小板効果を顕著に増強し、それらの組み合わせを画分１に添加した場合に最大阻害が観察された。
【００１５】
次に本発明者らは、ＴＲＡＰ−６によって誘導される血小板凝集に対する３つの画分の生物学的効果を評価した。図５Ｂに示すように、阻害活性は主に画分３（主にイソベルバスコシド及び微量のベルバスコシドを含有）によって発現され、一方で、画分２（主にベルバスコシド及び微量のイソベルバスコシドを含有）によって発現された活性ははるかに低かった。画分１は、ＴＲＡＰ−６によって誘導される血小板凝集に対して阻害活性を有さず、画分３により発現される阻害活性を増強することもなかった（図５Ｂ）。これらの結果により、ＴＲＡＰ−６誘導血小板凝集に対する全メタノール抽出物の阻害効果は主としてイソベルバスコシドに起因すると考えられることが示唆される。この示唆をさらに支持するために、本発明者らは、標準物質イソベルバスコシド及びベルバスコシド単独又はこれらの組み合わせ（質量比１：１で）、並びに画分１（ＤＩＢＯＡ−Ｇｌｃ）と組み合わせて（質量比１：１：１で）、その効果を試験した。図６Ｂに示すように、イソベルバスコシドだけが血小板凝集を阻害し、一方で、ベルバスコシド又は画分１（ＤＩＢＯＡ−Ｇｌｃ）又はこれらの組み合わせは、イソベルバスコシドの阻害効果を増強しなかった。
【００１６】
全体的にみて、Ａｃａｎｔｈｕｓ  ｍｏｌｌｉｓ種子のメタノール抽出物は、ＡＡ経路及びＰＡＲ−１受容体によって媒介される血小板凝集を阻害する。ＡＡに対する阻害効果は主としてそのＤＩＢＯＡ−Ｇｌｃ分に起因すると考えられ、一方で、ＤＩＢＯＡ−Ｇｌｃとイソベルバスコシド、ベルバスコシド、並びにこれらの組み合わせとの組み合わせによって相乗効果が観察される。対称的に、ＰＡＲ−１受容体によって媒介される血小板凝集に対する阻害効果は、そのイソベルバスコシド分だけに起因すると考えられる。
【００１７】
現在までのところ、心血管疾患を有する患者には、抗血小板療法、主としてアスピリン（ＣＯＸ−１及び、したがってＡＡ誘導血小板凝集を阻害する）及びＡＤＰ受容体Ｐ２Ｙ１２アンタゴニスト（クロピドグレル、プラスグレル又はチカグレロル）を投与するべきである（Ｋａｌａｎｔｚｉ  ＫＩら、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１２；５：３１９〜３６；Ｔｓｏｕｍａｎｉ  ＭＥ、Ｔｓｅｌｅｐｉｓ  ＡＤ、Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｄｅｓ．２０１７；冊子体出版前の電子版））。しかしながら、いくつかの研究により、アスピリン又はクロピドグレルを投与されている一部の患者は、薬物作用に十分には応答せず、新たな虚血性心血管事象（アスピリン又はクロピドグレル抵抗性と名付けられた現象）を示すことが実証された。最近の研究では、ＰＡＲ−１アンタゴニスト（ボラパクサール）は、アテローム血栓事象の予防において重要な臨床的有効性を示すが、出血リスクの上昇のためにその治療上の有用性は限定されていることが示された（Ｍｏｓｃｈｏｎａｓ  ＩＣら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｌ．２０１５；１８５：９〜１８）。
【００１８】
したがって、本研究の結果に基づいて、上記のＡｃａｎｔｈｕｓ  ｍｏｌｌｉｓ種子の成分は、これらがアスピリン抵抗性の患者におけるアスピリンに取って代わることができることからＣＶＤ患者に使用される新しい治療剤である（ＤＩＢＯＡ−Ｇｌｃ単独で又はベルバスコシド若しくは／及びイソベルバスコシドと組み合わせて）、また、血小板トロンビン受容体ＰＡＲ−１の特異的アンタゴニストとして使用される新しい治療剤である（イソベルバスコシド）と考えることができる。最後に、全抽出物は、これらの患者においてアスピリン及びＰ２Ｙ１２アンタゴニストを用いた標準治療に加えて重要なサプリメントとして使用できると思われる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】Ａ．Ａ（０．５ｍＭ）（Ａ）及びＴＲＡＰ−６（１０μΜ）（Ｂ）によって誘導されるがＡＤＰ（１０μΜ）（Ｃ）によっては誘導されない血小板凝集に対する、Ａｃａｎｔｈｕｓ  ｍｏｌｌｉｓ種子のメタノール抽出物の阻害効果についての代表的な用量応答曲線を示す図である。ＤＭＳＯの最終濃度は０．０１体積％であった。
【図２】ＤＭＳＯ−ｄ６におけるＡｃａｎｔｈｕｓ  ｍｏｌｌｉｓ種子のメタノール抽出物（Ａ）、画分１（Ｂ）、画分２（Ｃ）及び画分３（Ｄ）の１Ｄ  １Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である（ＮＳ＝２５６、Ｔ＝２９８Ｋ、実験時間＝３０ｍｉｎ、５００ＭＨｚ）。図２Ｃ及び２Ｄにおいて観察されるように、画分２及び３は、ベルバスコシド及びイソベルバスコシドの混合物を含有する。
【図３】（Ａ）主要な構成成分を示すＡ．ｍｏｌｌｉｓメタノール抽出物のＴＩＣクロマトグラム、（Ｂ）画分１のＭＳスペクトル（ｍ／ｚ  ６８５．１、Ｒｔ＝１１．９ｍｉｎ）、（Ｃ）画分２のＭＳスペクトル（ｍ／ｚ  ６２３．２、Ｒｔ＝２３．６ｍｉｎ）及び（Ｄ）画分３のＭＳスペクトル（ｍ／ｚ  ６２３．２、Ｒｔ＝２４．５ｍｉｎ）を示す図である。
【図４】（Ａ）画分２中にベルバスコシド及び少量のイソベルバスコシドが存在することを示す、画分２（黒色）、標準物質ベルバスコシド（赤色）及びイソベルバスコシド（緑色）の、並びに（Ｂ）画分３中にイソベルバスコシド及び少量のベルバスコシドが存在することを示す、画分３（黒色）、標準物質ベルバスコシド（赤色）及びイソベルバスコシド（緑色）の、重ね合わせた全イオンクロマトグラムである。
【図５】（Ａ）ＡＡ（０．５ｍＭ）及び（Ｂ）ＴＲＡＰ−６（１０μΜ）によって誘導されるＰＲＰにおけるヒト血小板凝集に対する、画分１、２及び３並びにこれらの組み合わせの効果を示す棒グラフである。ＰＲＰ中の各画分の最終濃度は１ｍｇ／ｍＬであった。ＰＲＰ中のＤＭＳＯの最終濃度は０．０１体積％であった。画分１と比較して＊Ｐ＜０．０５及び＊＊Ｐ＜０．０１。
【図６】（Ａ）ＡＡ（０．５ｍＭ）及び（Ｂ）ＴＲＡＰ−６（１０μΜ）によって誘導されるＰＲＰにおけるヒト血小板凝集に対する、画分１、ベルバスコシド及びイソベルバスコシド並びにこれらの組み合わせの効果を示す棒グラフである。使用した各作用物質のＰＲＰ中の最終濃度は１ｍｇ／ｍＬであった。ＤＭＳＯの最終濃度は０．０１体積％であった。画分１と比較して＊Ｐ＜０．０５及び＊＊Ｐ＜０．０１。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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