(57)【要約】Ｉ型シトルリン血症を処置する際に有用な組成物及びレジメンを提示する。この組成物は、ヒトアルギニノコハク酸シンターゼ１（ＡＳＳ１）の発現を駆動するトランスサイレチンエンハンサー及びプロモーターを有する組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を含む。【選択図】図１
2020506705.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シトルリン血症のための肝臓指向性治療薬として有用な組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶカプシドと、その中にパッケージングされたベクターゲノムとを含み、前記ベクターゲノムが、
（ａ）ＡＡＶ  ５’逆位末端リピート（ＩＴＲ）配列と、
（ｂ）プロモーターと、
（ｃ）ヒトアルギニノコハク酸シンターゼ１（ＡＳＳ１）をコードする最適化されたコーディング配列と、
（ｄ）ＡＡＶ  ３’ＩＴＲと
を含む、前記組換えアデノ随伴ウイルス。
【請求項２】
（ｃ）の前記コーディング配列が配列番号２である、請求項１に記載のｒＡＡＶ。
【請求項３】
前記ｒＡＡＶカプシドが、ＡＡＶ８カプシドまたはそのバリアントである、請求項１に記載のｒＡＡＶ。
【請求項４】
前記プロモーターがＴＢＧプロモーターである、請求項１に記載のｒＡＡＶ。
【請求項５】
前記プロモーターがＡ１ＡＴプロモーターである、請求項１に記載のｒＡＡＶ。
【請求項６】
前記プロモーターがＬＳＰプロモーターである、請求項１に記載のｒＡＡＶ。
【請求項７】
前記プロモーターがＴＴＲプロモーターである、請求項１に記載のｒＡＡＶ。
【請求項８】
前記ＡＡＶ  ５’ＩＴＲ及び／またはＡＡＶ  ３’ＩＴＲが、ＡＡＶ２に由来する、請求項１に記載のｒＡＡＶ。
【請求項９】
前記ベクターゲノムがポリＡを更に含む、請求項１に記載のｒＡＡＶ。
【請求項１０】
前記ポリＡがｂＧＨに由来する、請求項１に記載のｒＡＡＶ。
【請求項１１】
ＷＰＲＥを更に含む、請求項１に記載のｒＡＡＶ。
【請求項１２】
イントロンを更に含む、請求項１に記載のｒＡＡＶ。
【請求項１３】
前記イントロンが、ヒトベータグロビンＩＶＳ２またはＳＶ４０に由来する、請求項１２に記載のｒＡＡＶ。
【請求項１４】
エンハンサーを更に含む、請求項１に記載のｒＡＡＶ。
【請求項１５】
前記エンハンサーが、ＡＰＢエンハンサー、ＡＢＰＳエンハンサー、アルファｍｉｃ／ｂｉｋエンハンサー、ＴＴＲエンハンサー、ｅｎ３４、ＡｐｏＥである、請求項１４に記載のｒＡＡＶ。
【請求項１６】
前記ベクターゲノムが、約３キロベース〜約５．５キロベースのサイズである、請求項１に記載のｒＡＡＶ。
【請求項１７】
シトルリン血症患者への投与に好適な水性サスペンションであって、前記サスペンションが、水性懸濁液と、シトルリン血症のための肝臓指向性治療薬として有用な約１×１０
１２ＧＣ／ｍＬ〜約１×１０１４ＧＣ／ｍＬの組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）とを含み、前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶカプシドを有し、かつその中に、
（ａ）ＡＡＶ  ５’逆位末端リピート（ＩＴＲ）配列と、
（ｂ）プロモーターと、
（ｃ）ヒトアルギニノコハク酸シンターゼ１（ＡＳＳ１）をコードするコーディング配列と、
（ｄ）ＡＡＶ  ３’ＩＴＲと
を含むベクターゲノムがパッケージングされている、
前記水性サスペンション。
【請求項１８】
前記サスペンションが静脈内注射に好適である、請求項１７に記載のサスペンション。
【請求項１９】
前記サスペンションが、前記水性懸濁液中に溶解した界面活性剤、保存剤、及び／またはバッファーを更に含む、請求項１７に記載のサスペンション。
【請求項２０】
シトルリン血症を有する患者を請求項１に記載のｒＡＡＶで処置する方法であって、前記ｒＡＡＶが、水性サスペンション中約１×１０１２〜約１×１０１４ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇで送達され、前記ＧＣがｏｑＰＣＲまたはｄｄＰＣＲに基づいて決定され計算される、前記方法。
【請求項２１】
前記ベクターゲノムが、配列番号２２のｎｔ１〜ｎｔ３２１６を含む、請求項１に記載のｒＡＡＶ。
【請求項２２】
前記ベクターゲノムが、配列番号２３のｎｔ１〜ｎｔ２３３１、配列番号２４のｎｔ１〜ｎｔ３２６１、配列番号２５のｎｔ１〜ｎｔ３３２５、配列番号２６のｎｔ１〜ｎｔ２７７７、配列番号２７のｎｔ１〜ｎｔ２７７７、配列番号２８のｎｔ１〜ｎｔ３２１６、配列番号２９のｎｔ１〜ｎｔ３０６６、配列番号３０のｎｔ１〜ｎｔ２０８３、配列番号３１のｎｔ１〜ｎｔ２１２１、配列番号３２のｎｔ１〜ｎｔ３２２１、配列番号３３のｎｔ１〜ｎｔ４０４０、配列番号３４のｎｔ１〜ｎｔ２７９８、または配列番号３５のｎｔ１〜ｎｔ３０６６を含む、請求項１に記載のｒＡＡＶ。
【請求項２３】
前記ｒＡＡＶカプシドがＡＡＶ８カプシドである、請求項１７に記載のｒＡＡＶ。
【請求項２４】
患者のシトルリン血症を処置するための請求項１に記載のｒＡＡＶの使用であって、前記ｒＡＡＶが、水性サスペンション中約１×１０１２〜約１×１０１４ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇで送達され、前記ＧＣがｏｑＰＣＲまたはｄｄＰＣＲに基づいて決定され計算される、前記使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
電子形態で提出された資料の参照による組み込み
出願人は、本明細書と共に電子形態で提出された配列表資料を参照することにより本明細書に組み込む。このファイルは「１６−７９３８ＰＣＴ＿Ｓｅｑ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名称である。
【０００２】
１．背景
本出願は、Ｉ型シトルリン血症を処置するための遺伝子療法で有用な実施形態に関する。Ｉ型シトルリン血症は、シトルリン及びアスパラギン酸からのアルギニノコハク酸の合成を触媒するアルギニノコハク酸シンターゼ１（ＡＳＳ１）酵素の突然変異によって引き起こされる常染色体劣性疾患であり、シトルリン血症及びアンモニアの蓄積をもたらす。
【０００３】
Ｉ型シトルリン血症（ＣＴＬＮ１）の臨床スペクトルは、重度の新生児期発症型から、より軽度な遅発型まで及ぶ。Ｉ型シトルリン血症は新生児スクリーニングパネルに比較的最近加えられたため、Ｉ型シトルリン血症患者は早期に特定され、ただちに処置を実施することができる。しかしながら、この早期の疾患特定及び処置にもかかわらず、一部の患者は増悪する場合がある。無処置の古典型ＣＴＬＮ１における無処置死亡率は１００％であり、ほとんどの死は生後１７日目前に起こる。
【背景技術】
【０００４】
Ｉ型シトルリン血症の現在の処置アプローチとしては、食事制限（タンパク質摂取量の制限）、薬物療法（窒素捕捉剤療法及びカルニチン）、及びアルギニン補給が挙げられる。肝臓移植はシトルリン血症の治癒に有効であるが、移植レシピエントは、拒絶反応を防止するために不断の免疫抑制レジメンを維持することが必要である。Ｉ型シトルリン血症のための肝臓指向性ＡＡＶ処置については示されている。例えば、参照により本明細書に組み込まれている、Ｃｈａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｌｉｖｅｒ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ８  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｒｅｓｃｕｅｓ  ａ  ｌｅｔｈａｌ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅｍｉａ  ｔｙｐｅ  １，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（２０１３）２０，１１８８−１１９１を参照されたい。しかしながら、肝臓指向性遺伝子療法は、全身的なＡＳＳ１欠損の生化学的表現型を十分に是正せず、処置されたＣＴＬＮ１マウスモデル（ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄ）の個体におけるアルギニンレベルは、持続的な腎臓欠損が理由で急落した。参照により本明細書に組み込まれている、Ｋｏｋ  ｅｔ  ａｌ，Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖｉｒｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｒｅｓｃｕｅ  ｏｆ  Ｎｅｏｎａｔａｌ  Ｌｅｔｈａｌｉｔｙ  ｉｎ  Ａｒｇｉｎｉｎｏｓｕｃｃｉｎａｔｅ  Ｓｙｎｔｈａｓｅ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  Ｍｉｃｅ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｖｏｌ．２１  ｎｏ．１０，１８２３−１８３１，Ｏｃｔ．２０１３も参照されたい。
【０００５】
１型シトルリン血症に関しては、より効果的な処置が必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
２．概要
本明細書に記述される実施形態は、ベクターの静脈内投与後、長期間、ことによると１０年以上にわたり、Ｉ型シトルリン血症（ＣＴＬＮ１）（場合によりシトルリン尿症またはＡＳＳ１欠損とも呼ばれる）の臨床的に意義のある是正をもたらす、それを必要とする対象に正常なヒトアルギニノコハク酸シンターゼ１（ＡＳＳ１）を送達するためのＡＡＶ遺伝子療法ベクターに関する。対象患者集団は、中等度から重度のＩ型シトルリン血症を
有する患者であり、急性の新生児期型（「古典型」）、より軽度な遅発型（「非古典型」）、または女性が妊娠中もしくは産後に重度の症状を発症する形態を有するものを含む。意図されるベクター用量は、一実施形態では、正常に近いシトルリン、グルタミン、及びアンモニアの血漿レベルをもたらすＡＳＳ１を送達するよう意図される。しかしながら、シトルリンレベル、グルタミンレベル、及びアンモニアレベルのわずかな低下でさえ望ましく、望ましいエンドポイントである。Ｑｕｉｎｏｎｅｚ  ａｎｄ  Ｔｈｏｅｎｅ，Ｐａｇｏｎ  ＲＡ，Ａｄａｍ  ＭＰ，Ａｒｄｉｎｇｅｒ  ＨＨ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｉｔｏｒｓ．Ｓｅａｔｔｌｅ（ＷＡ）：Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ；１９９３−２０１６（参照により本明細書に組み込まれている）によって報告されたように、シトルリンまたはアンモニアのいずれかの許容レベルを超える上昇（アンモニア＞１００μｍｏｌ／Ｌまたは血漿シトルリン＞約１００μｍｏｌ／Ｌ）は、ＣＴＬＮ１の処置を開始するのに十分な証拠である。別の実施形態では、遺伝子検査に基づく新生児診断が、処置を開始するのに十分である。
【０００７】
一態様において、本出願は、ＣＴＬＮ１と診断された患者（ヒト対象）の肝臓細胞にヒトアルギニノコハク酸シンターゼ１（ｈＡＳＳ１）遺伝子を送達するための複製欠損アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の使用を提示する。ｈＡＳＳ１遺伝子を送達するために使用される組換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶ）（「ｒＡＡＶ．ｈＡＳＳ１」）は、肝臓への指向性を有するべきであり（例えば、ＡＡＶ８カプシドを有するｒＡＡＶ）、ｈＡＳＳ１導入遺伝子は、肝臓特異的な発現制御エレメントによって制御されるべきである。一実施形態において、発現制御エレメントは、エンハンサー、プロモーター、イントロン、ＷＰＲＥ、及びポリＡシグナルのうちの１つ以上を含む。このようなエレメントについては、本明細書において更に記述する。
【０００８】
一実施形態において、ＡＳＳ１タンパク質配列は配列番号１に示されている。一実施形態において、ｈＡＳＳ１コーディング配列は配列番号３に示されている。ｈＡＳＳ１のコーディング配列は、一実施形態では、ヒトにおける発現のためにコドン最適化されている。このような配列は、天然のｈＡＳＳ１コーディング配列（配列番号３）と少なくとも８０％の同一性を共有し得る。別の実施形態では、ｈＡＳＳ１コーディング配列は、配列番号３に示されているものである。
【０００９】
別の態様において、本明細書では、ＣＴＬＮ１患者への投与に好適な、本明細書に記述されるｒＡＡＶを含む水性サスペンションが提示される。一部の実施形態では、サスペンションは、水性懸濁液と、１ｍＬあたり約１×１０１２〜約１×１０１４ゲノムコピー（ＧＣ）のｒＡＡＶとを含む。サスペンションは、一実施形態では静脈内注射に好適である。他の実施形態では、サスペンションは、水性懸濁液中に溶解した界面活性剤、保存剤、及び／またはバッファーを更に含む。
【００１０】
別の実施形態において、本明細書では、ＣＴＬＮ１を有する患者を本明細書に記述されるｒＡＡＶで処置する方法が提示される。一実施形態では、水性サスペンションにおいて、患者の体重１ｋｇあたり約１×１０１１〜約３×１０１３ゲノムコピー（ＧＣ）のｒＡＡＶが患者に送達される。
【００１１】
３．図面の簡単な説明
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、ＡＡＶ．ｈＡＳＳ１ｃｏシスプラスミドの概略表現である。
【図２】図２Ａは、実施例２に記述したＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄマウスの生存曲線である。正方形は雄マウスであり、円形は雌マウスである。図２Ｂは、両性別（Ｍ、雄；Ｆ、雌）のＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄマウス（Ｆｏｌｄ）の体重の線グラフである。野生型同腹仔（ＷＴ）を対照として用意した。図２Ｃは、ＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄマウスの高い血漿ＮＨ３レベルを示すグラフである。野生型（ＷＴ）マウスを対照として用意した。各円形または三角形が１つの試料を示す。平均±ＳＥＭもプロットしてある。マン・ホイットニー検定を行い、示されている群間のｐ値を図に示した。図２Ｄは、ＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄマウスの高い血漿シトルリンレベルを示すグラフである。野生型（ＷＴ）マウスを対照として用意した。各円形または三角形が１つの試料を示す。平均±ＳＥＭもプロットしてある。マン・ホイットニー検定を行い、示されている群間のｐ値を図に示した。図２Ｅは、ＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄマウスの高い血漿アルギニンレベルを示すグラフである。野生型（ＷＴ）マウスを対照として用意した。各円形または三角形が１つの試料を示す。平均±ＳＥＭもプロットしてある。マン・ホイットニー検定を行い、示されている群間のｐ値を図に示した。図２Ｆは、全齢、または４週齢、５週齢、６週齢、８週齢、１０週齢、１２週齢、及び１４週齢以上におけるＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄマウスの高い尿中オロト酸レベルを示すグラフである。野生型（ＷＴ）マウスを対照として用意した。各ドットが１つの試料を示す。平均±ＳＥＭもプロットしてある。
【図３】図３Ａは、３×１０１１ＧＣ／子のＡＡＶ８．ＴＢＧ．ＰＩ．ｈＡＳＳ１ｃｏ．ＷＰＲＥ．ｂＧＨ（Ｆｏｌｄ−Ｍ−Ｇ２、灰色に塗られた正方形、ｎ＝１）、またはＡＡＶ８．ＬＳＰ．ＩＶＳ２．ｈＡＳＳ１ｃｏ．ｂＧＨ（Ｆｏｌｄ−Ｍ−Ｇ３、アスタリスク、ｎ＝３）、またはＡＡＶ８．ＴＢＧ．ＰＩ．ｈＡＳＳ１ｃｏ．ｂＧＨ（Ｆｏｌｄ−Ｍ−Ｇ４、三角形、ｎ＝３）を出生時に静脈内注射した雄ＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄマウスの体重の線グラフである。処置なしの雄ＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄマウス（Ｆｏｌｄ−Ｍ、白の正方形）及び野生型マウス（ＷＴ−Ｍ、黒く塗られた正方形）を対照として用意した。図３Ｂは、３×１０１１ＧＣ／子のＡＡＶ８．ＴＢＧ．ＰＩ．ｈＡＳＳ１ｃｏ．ＷＰＲＥ．ｂＧＨ（Ｆｏｌｄ−Ｆ−Ｇ２、灰色に塗られた円形、ｎ＝１）、またはＡＡＶ８．ＬＳＰ．ＩＶＳ２．ｈＡＳＳ１ｃｏ．ｂＧＨ（Ｆｏｌｄ−Ｆ−Ｇ３、アスタリスク、ｎ＝２）、またはＡＡＶ８．ＴＢＧ．ＰＩ．ｈＡＳＳ１ｃｏ．ｂＧＨ（Ｆｏｌｄ−Ｆ−Ｇ４、三角形、ｎ＝１）を出生時に静脈内注射した雌ＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄマウスの体重の線グラフである。処置なしの雌ＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄマウス（Ｆｏｌｄ−Ｆ、白の円形）及び野生型マウス（ＷＴ−Ｆ、黒く塗られた円形）を対照として用意した。図３Ｃは、１×１０１１ＧＣ／子のＡＡＶ８．ＴＢＧ．ＰＩ．ｈＡＳＳ１ｃｏ．ＷＰＲＥ．ｂＧＨ（Ｆｏｌｄ−Ｍ−Ｇ２、赤、ｎ＝２）、またはＡＡＶ８．ＬＳＰ．ＩＶＳ２．ｈＡＳＳ１ｃｏ．ｂＧＨ（Ｆｏｌｄ−Ｍ−Ｇ３、紫、ｎ＝１）を出生時に静脈内注射した雄ＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄマウスの体重の線グラフである。処置なしの雄ＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄマウス（Ｆｏｌｄ−Ｍ、青）及び野生型マウス（ＷＴ−Ｍ、黒）を対照として用意した。図３Ｄは、１×１０１１ＧＣ／子のＡＡＶ８．ＴＢＧ．ＰＩ．ｈＡＳＳ１ｃｏ．ＷＰＲＥ．ｂＧＨ（Ｆｏｌｄ−Ｆ−Ｇ２、赤、ｎ＝１）、またはＡＡＶ８．ＬＳＰ．ＩＶＳ２．ｈＡＳＳ１ｃｏ．ｂＧＨ（Ｆｏｌｄ−Ｆ−Ｇ３、紫、ｎ＝２）、またはＡＡＶ８．ＴＢＧ．ＰＩ．ｈＡＳＳ１ｃｏ．ｂＧＨ（Ｆｏｌｄ−Ｆ−Ｇ４、緑、ｎ＝２）を出生時に静脈内注射した雌ＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄマウスの体重の線グラフである。処置なしの雌ＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄマウス（Ｆｏｌｄ−Ｆ、青）及び野生型マウス（ＷＴ−Ｆ、黒）を対照として用意した。図３Ｅは、１×１０１１ＧＣ／マウスのＡＡＶ８．ＴＢＧ．ＰＩ．ｈＡＳＳ１ｃｏ．ＷＰＲＥ．ｂＧＨを出生後１４日目に腹腔内注射した雄ＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄマウス（Ｆｏｌｄ−Ｍ−ＩＰ  ｄ１４、水色、ｎ＝４）の体重の線グラフである。処置なしの雄ＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄマウス（Ｆｏｌｄ−Ｍ、青）及び野生型マウス（ＷＴ−Ｍ、黒）を対照として用意した。図３Ｆは、１×１０１１ＧＣ／マウスのＡＡＶ８．ＴＢＧ．ＰＩ．ｈＡＳＳ１ｃｏ．ＷＰＲＥ．ｂＧＨを出生後１４日目に腹腔内注射した雌ＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄマウス（Ｆｏｌｄ−Ｆ−ＩＰ  ｄ１４、マゼンタ、ｎ＝２）の体重の線グラフである。処置なしの雌ＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄマウス（Ｆｏｌｄ−Ｆ、青）及び野生型マウス（ＷＴ−Ｆ、黒）を対照として用意した。
【図４】図４Ａは、３×１０１１ＧＣ／子のＡＡＶ８．ＴＢＧ．ＰＩ．ｈＡＳＳ１ｃｏ．ＷＰＲＥ．ｂＧＨ（Ｇ２−６ｗ）、またはＡＡＶ８．ＬＳＰ．ＩＶＳ２．ｈＡＳＳ１ｃｏ．ｂＧＨ（Ｇ３−６ｗ）、またはＡＡＶ８．ＴＢＧ．ＰＩ．ｈＡＳＳ１ｃｏ．ｂＧＨ（Ｇ４−６ｗ）を出生時に静脈内注射したＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄマウスの血液中のシトルリンレベルの棒グラフである。処置なしのＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄマウス（Ｆｏｌｄ）及び野生型マウス（ＷＴ−Ｍ）を対照として用意した。図４Ｂは、１×１０１１ＧＣ／子のＡＡＶ８．ＴＢＧ．ＰＩ．ｈＡＳＳ１ｃｏ．ＷＰＲＥ．ｂＧＨ（Ｇ２Ｂ−１２ｗ）、またはＡＡＶ８．ＬＳＰ．ＩＶＳ２．ｈＡＳＳ１ｃｏ．ｂＧＨ（Ｇ３Ｂ−６ｗ）、またはＡＡＶ８．ＴＢＧ．ＰＩ．ｈＡＳＳ１ｃｏ．ｂＧＨ（Ｇ４Ｂ−６ｗ）を出生時に静脈内注射したＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄマウスの血液中のシトルリンレベルの棒グラフである。処置なしのＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄマウス（Ｆｏｌｄ）及び野生型マウス（ＷＴ−Ｍ）を対照として用意した。
【図５】図５Ａは、３×１０１１ＧＣ／子のＡＡＶ８．ＴＢＧ．ＰＩ．ｈＡＳＳ１ｃｏ．ＷＰＲＥ．ｂＧＨを出生時に静脈内注射したＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄマウスにおける尿中オロト酸レベルの線グラフである。識別番号０２８及び０３１のマウスからデータを取得し、プロットした。図５Ｂは、３×１０１１ＧＣ／子のＡＡＶ８．ＬＳＰ．ＩＶＳ２．ｈＡＳＳ１ｃｏ．ｂＧＨを出生時に静脈内注射したＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄマウスにおける尿中オロト酸レベルの線グラフである。識別番号０２２、０３８、０１８、及び００１のマウスからデータを取得し、プロットした。図５Ｃは、３×１０１１ＧＣ／子のＡＡＶ８．ＴＢＧ．ＰＩ．ｈＡＳＳ１ｃｏ．ｂＧＨを出生時に静脈内注射したＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄマウスにおける尿中オロト酸レベルの線グラフである。識別番号０２４、０２５、及び０４３のマウスからデータを取得し、プロットした。図５Ｄは、１×１０１１ＧＣ／子のＡＡＶ８．ＬＳＰ．ＩＶＳ２．ｈＡＳＳ１ｃｏ．ｂＧＨを出生時に静脈内注射したＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄマウスにおける尿中オロト酸レベルの線グラフである。識別番号０５９、０６９、及び０７０のマウスからデータを取得し、プロットした。
【図６】図６Ａは、肝臓指向性遺伝子療法がＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄの生存率を改善することを示すＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄマウスの生存曲線である。４週齢のＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄ（雄及び雌の両方）に、ＡＡＶ８．ＬＳＰ．ＩＶＳ．ｈＡＳＳ１ｃｏ．ｂＧＨベクターを、３×１０１１ＧＣ／マウス（ｎ＝１０）または１×１０１１ＧＣ／マウス（ｎ＝１０）の用量で単回後眼窩注射した。生存をモニタリングした。無処置のＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄマウスを対照として用意した（ｎ＝２４）。図６Ｂは、肝臓指向性遺伝子療法がＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄの体重を改善することを示す雄ＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄマウスの体重の線グラフである。４週齢のＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄに、ＡＡＶ８．ＬＳＰ．ＩＶＳ．ｈＡＳＳ１ｃｏ．ｂＧＨベクターを、３×１０１１ＧＣ／マウスまたは１×１０１１ＧＣ／マウスの用量で単回後眼窩注射した。体重をモニタリングした。同性の無処置のＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄマウス（Ｆｏｌｄ）及び野生型マウス（ＷＴ）を対照として用意した。図６Ｃは、肝臓指向性遺伝子療法がＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄの体重を改善することを示す雌ＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄマウスの体重の線グラフである。４週齢のＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄに、ＡＡＶ８．ＬＳＰ．ＩＶＳ．ｈＡＳＳ１ｃｏ．ｂＧＨベクターを、３×１０１１ＧＣ／マウスまたは１×１０１１ＧＣ／マウスの用量で単回後眼窩注射した。体重をモニタリングした。同性の無処置のＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄマウス（Ｆｏｌｄ）及び野生型マウス（ＷＴ）を対照として用意した。
【図７】図７Ａは、肝臓指向性遺伝子療法がＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄの体重を改善することを示す雄ＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄマウスの体重の線グラフである。４週齢のＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄに、ＡＡＶ８．ＡｐｏＥ．Ａ１ＡＴ（ｆｕｌｌ）．ＩＶＳ２．ｈＡＳＳ１ｃｏ．ｂＧＨベクターを、３×１０１１ＧＣ／マウスまたは１×１０１１ＧＣ／マウスの用量で単回後眼窩注射した。体重をモニタリングした。同性の無処置のＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄマウス（Ｆｏｌｄ）及び野生型マウス（ＷＴ）を対照として用意した。図７Ｂは、肝臓指向性遺伝子療法がＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄの体重を改善することを示す雌ＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄマウスの体重の線グラフである。４週齢のＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄに、ＡＡＶ８．ＡｐｏＥ．Ａ１ＡＴ（ｆｕｌｌ）．ＩＶＳ２．ｈＡＳＳ１ｃｏ．ｂＧＨベクターを、３×１０１１ＧＣ／マウスまたは１×１０１１ＧＣ／マウスの用量で単回後眼窩注射した。体重をモニタリングした。同性の無処置のＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄマウス（Ｆｏｌｄ）及び野生型マウス（ＷＴ）を対照として用意した。
【図８】図８は、ベクター投与後のＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄにおける尿中オロト酸の低減を示す線グラフである。４週齢のＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄに、ＡＡＶ８．ＬＳＰ．ＩＶＳ２．ｈＡＳＳ１ｃｏ．ｂＧＨベクターを、３×１０１１または１×１０１１ＧＣ／マウスの用量で単回後眼窩注射した。ＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄ（Ｆｏｌｄ）マウスを対照として用意した。
【図９】図９Ａ〜９Ｂは、ＡＡＶ８ベクター投与の２週間後及び６週間後のＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄマウスにおけるシトルリンレベルを示すグラフを提示する。４週齢のＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄに、示されているベクターを、３×１０１１ＧＣ／マウス（図９Ａ）または１×１０１１ＧＣ／マウス（図９Ｂ）の用量で単回後眼窩注射した。各ベクターのコードは表１に列記してある。無処置のＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄマウス（Ｆｏｌｄ）及び野生型マウス（ＷＴ）を対照として用意した。一元配置ＡＮＯＶＡダネットの多重比較検定を使用し、無処置のｆｏｌｄマウスと比較した有意差を計算した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図１０】図１０は、ＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄマウスの生存パーセントを示すグラフである。４週齢のＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄに、示されているベクターを、１×１０１１ＧＣ／マウスの用量で単回後眼窩注射した。各ベクターのコードは表１に列記してある。無処置のＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄマウス（Ｆｏｌｄ）及び野生型マウス（ＷＴ）を対照として用意した。
【図１１】図１１Ａは、雄ＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄマウスの体重を示すグラフである。４週齢のＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄに、示されているベクターを、１×１０１１ＧＣ／マウスの用量で単回後眼窩注射した。各ベクターのコードは表１に列記してある。無処置のＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄマウス（Ｆｏｌｄ）及び野生型マウス（ＷＴ）を対照として用意した。肝臓指向性遺伝子療法は、ＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄの体重を改善する。図１１Ｂは、雌ＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄマウスの体重を示すグラフである。４週齢のＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄに、示されているベクターを、１×１０１１ＧＣ／マウスの用量で単回後眼窩注射した。各ベクターのコードは表１に列記してある。無処置のＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄマウス（Ｆｏｌｄ）及び野生型マウス（ＷＴ）を対照として用意した。肝臓指向性遺伝子療法は、ＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄの体重を改善する。
【図１２】図１２Ａ及び１２Ｂは、ＡＡＶによる血漿シトルリンレベルの低下を示すグラフである。４週齢のＡＳＳ１  ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄ（雄及び雌の両方）に、ＡＡＶ８−ｈＡＳＳ１ベクターを、１×１０１１ＧＣ／マウスの用量で単回後眼窩注射した。各ベクターのコードは表１に列記してある。ベクター投与の２週間後（Ａ）及び６週間後（Ｂ）における血漿シトルリンレベルである。＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１（一元配置ＡＮＯＶＡ、クラスカル−ウォリス検定、無処置のｆｏｌｄマウスと比較した）。
【図１３】図１３は、ＡＡＶによる血漿シトルリンレベルの低下を示すグラフである。４週齢のｆｏｌｄマウスに、ＡＡＶ８−ｈＡＳＳ１ベクターを、１．０×１０１１ＧＣの用量で単回後眼窩注射した。ベクター注射の６週間後における血漿ＮＨ３レベルをここに示してある。＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１（一元配置ＡＮＯＶＡ、クラスカル−ウォリス検定、無処置のｆｏｌｄマウスと比較した）。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
４．詳細な説明
本出願に記述される実施形態は、１型シトルリン血症（ＣＴＬＮ１）と診断された患者（ヒト対象）の肝臓細胞にヒトアルギニノコハク酸シンターゼ１（ｈＡＳＳ１）遺伝子を送達するための複製欠損アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の使用に関する。ｈＡＳＳ遺伝子を送達するために使用される組換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶ）（「ｒＡＡＶ．ｈＡＳＳ１」）は、肝臓への指向性を有するべきであり（例えば、ＡＡＶ８カプシドを有するｒＡＡＶ）、ｈＡＳＳ１導入遺伝子は、肝臓特異的な発現制御エレメントによって制御されるべきである。一実施形態において、発現制御エレメントは、エンハンサー、プロモーター、イントロン、ＷＰＲＥ、及びポリＡシグナルのうちの１つ以上を含む。このようなエレメントについては、本明細書において更に記述する。
【００１４】
本明細書において使用される場合、「ＡＡＶ８カプシド」とは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＹＰ＿０７７１８０．１、配列番号１９のアミノ酸配列を有するＡＡＶ８カプシド、及び／またはＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦ５１３８５２．１、ｎｔ２１２１〜４３３７、配列番号３６の核酸配列によってコードされるＡＡＶ８カプシドを指し、これらの配列は参照により本明細書に組み込まれている。このコードされる配列からのある程度の差異が許容され、これには、ＹＰ＿０７７１８０．１及びＷＯ２００３／０５２０５１（これは参照により本明細書に組み込まれている）における参照アミノ酸配列と約９９％の同一性（すなわち、参照配列からの約１％未満の差異）を有する配列が含まれ得る。カプシドひいてはコーディング配列を生成する方法、及びｒＡＡＶウイルスベクターの産生のための方法については記述されている。例えば、Ｇａｏ，ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００（１０），６０８１−６０８６（２００３）及びＵＳ２０１５／０３１５６１２を参照されたい。
【００１５】
本明細書において使用される場合、「ＮＡｂ力価」とは、標的となるエピトープ（例えばＡＡＶ）の生理的効果を中和する中和抗体（例えば抗ＡＡＶ  Ｎａｂ）がどれだけ産生されるかの測定値である。抗ＡＡＶ  ＮＡｂ力価は、例えば、参照により本明細書に組み込まれているＣａｌｃｅｄｏ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  Ａｄｅｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，２００９．１９９（３）：ｐ．３８１−３９０に記述されているように測定することができる。
【００１６】
アミノ酸配列との関連における「同一性パーセント（％）」、「配列同一性」、「配列同一性パーセント」、または「パーセント同一」という用語は、２つの配列のうち、対応するようにアラインされたときに同じである残基を指す。同一性パーセントは、タンパク質の完全長にわたるアミノ酸配列、ポリペプチド、約３２アミノ酸、約３３０アミノ酸、もしくはそれらのペプチド断片、または対応する核酸配列コーディングシーケンサーについて容易に決定され得る。好適なアミノ酸断片は、少なくとも約８アミノ酸長であってよく、最長約７００アミノ酸であり得る。概して、２つの異なる配列間の「同一性」、「相同性」、または「類似性」を参照するとき、「同一性」、「相同性」、または「類似性」は、「アラインされた」配列に関して決定されたものである。「アラインされた」配列または「アライメント」とは、多くの場合、参照配列と比較した塩基またはアミノ酸の欠失または付加に対する補正を含む、複数の核酸配列またはタンパク質（アミノ酸）配列を指す。アライメントは、公的または商業的に利用可能な様々なＭｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔプログラムのいずれかを使用して行われる。アミノ酸配列には、例えば、「Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｘ」、「ＭＡＰ」、「ＰＩＭＡ」、「ＭＳＡ」、「ＢＬＯＣＫＭＡＫＥＲ」、「ＭＥＭＥ」、及び「Ｍａｔｃｈ−Ｂｏｘ」プログラムといった配列アライメントプログラムが利用可能である。概して、これらのプログラムのいずれかがデフォルト設定で使用されるが、当業者は、必要に応じてこれらの設定を変更することができる。代替的には、当業者は、参照されるアルゴリズム及びプログラムによって提供
されるレベルの同一性またはアライメントを少なくとも提供する別のアルゴリズムまたはコンピュータプログラムを利用してもよい。例えば、Ｊ．Ｄ．Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，“Ａ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ”，２７（１３）：２６８２−２６９０（１９９９）を参照されたい。
【００１７】
本明細書において使用される場合、「作動可能に連結した」という用語は、目的の遺伝子と連続している発現制御配列と、目的の遺伝子を制御するようにトランスに、すなわち離れて作用する発現制御配列との両方を指す。
【００１８】
「複製欠損ウイルス」または「ウイルスベクター」とは、目的の遺伝子を含有する発現カセットがウイルスカプシドまたはエンベロープ内にパッケージングされている合成または人工のウイルス粒子で、同様にウイルスカプシドまたはエンベロープ内にパッケージングされているあらゆるウイルスゲノム配列が複製欠損である、すなわち子孫ビリオンを生成することができないが、標的細胞に感染する能力を保持するものを指す。一実施形態において、ウイルスベクターのゲノムは、複製するのに必要な酵素をコードする遺伝子を含まないが（このゲノムは、人工ゲノムの増幅及びパッケージングに必要なシグナルに挟まれた目的の導入遺伝子のみを含有する「ガットレス」であるように工学操作されていてよい）、これらの遺伝子は産生中に供給されてもよい。したがって、これは遺伝子療法に使用するのに安全であるとみなされる。子孫ビリオンによる複製及び感染は、複製に必要なウイルス酵素の存在下を除いては起こり得ないためである。
【００１９】
「ａ」または「ａｎ」という用語は、１つ以上を指すことに留意されたい。したがって、「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上」、及び「少なくとも１つ」という用語は、本明細書では交換可能に使用される。
【００２０】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という言葉は、排他的ではなく包括的に解釈されるものとする。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」という言葉、及びその変化形は、包括的ではなく排他的に解釈されるものとする。本明細書における種々の実施形態は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という文言を使用して提示されるが、他の状況下では、関連する実施形態が「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という文言を使用して解釈され、かつ記述されていることも意図される。
【００２１】
本明細書において使用される場合、「約」という用語は、別途指定しない限り、与えられている基準から１０％の変動を意味する。
【００２２】
本明細書において別途定義しない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、当業者が一般的に理解し、また本出願において使用される用語の多くに関する一般的指針を当業者に提供する公開文献の参照により理解されるものと同じ意味を有する。
【００２３】
４．１  遺伝子療法ベクター
一態様では、遺伝子療法において使用するためのヒトＡＳＳ１遺伝子を搭載した組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターが提示される。ｒＡＡＶ．ｈＡＳＳ１ベクターは、肝臓への指向性を有するべきであり（例えば、ＡＡＶ８カプシドを有するｒＡＡＶ）、ｈＡＳＳ１導入遺伝子は、肝臓特異的な発現制御エレメントによって制御されるべきである。別の実施形態では、ｒＡＡＶ．ｈＡＳＳ１ベクターは、腎臓への指向性を有する。ベクターは、ヒト対象への注入に好適なバッファー／担体において製剤化される。バッファー／担体には、ｒＡＡＶが注入チューブに固着することを防止するが、インビボでｒＡ
ＡＶ結合活性に干渉しない成分が含まれているべきである。
【００２４】
４．１．１．ｒＡＡＶ．ｈＡＳＳベクター
４．１．１．１．ｈＡＳＳ１配列
シトルリン血症Ｉ型（ＣＴＬＮ１）（別称「古典型シトルリン血症」）は、シトルリンがアスパラギン酸と縮合してアルギノコハク酸を形成する尿素サイクルの第３のステップである酵素アルギニノコハク酸シンターゼ１（ＡＳＳ１）の欠損から生じる。
【００２５】
Ｉ型シトルリン血症は、肝臓、腎臓、及び培養線維芽細胞におけるＡＳＳ１の動態異常を示す。定量型シトルリン血症では、低いＡＳＳ１が肝臓に見られるが、腎臓または培養皮膚線維芽細胞には見られない。肝臓内の残存酵素は正常な動態特性を有する（Ｓａｈｅｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１）。ＡＳＳ１をコードするｍＲＮＡの研究において、Ｋｏｂａｙａｓｈｉら（Ａｍ  Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，３８：６６７−８０，１９８６、これは参照により本明細書に組み込まれている）は、定量型シトルリン血症患者が、それまでの研究において示されたように、肝臓における酵素の対照値の約１０％だが、ｍＲＮＡの正常レベルを有したことを見出した。彼らは、定量型シトルリン血症における酵素タンパク質の減少は、酵素の分解の増加、または肝臓における翻訳の減少もしくは阻害のいずれかに起因すると結論した。
【００２６】
ある特定の病原性バリアントはいくつかの表現型と特定されているが、表現型を全ての事例において予測することはできない。重度の古典型シトルリン血症Ｉ型は、典型的には、２２種の定義された病原性バリアントから生じる（Ｅｎｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ，２００９  Ｍａｒ；３０（３）：３００−７、これは参照により本明細書に組み込まれている）。エクソン１５における病原性バリアントであるｐ．Ｇｌｙ３９０Ａｒｇは、依然として、古典型表現型に関連付けられているもので最もよく見られる。軽度（すなわち遅発型）シトルリン血症Ｉ型は、１２種の病原性バリアントに関連付けられている。
【００２７】
本明細書に記述される療法の目標の１つは、１００μｍｏｌ／Ｌ未満のシトルリンレベル、グルタミンレベル、及び／またはアンモニアレベルをもたらす機能的なＡＳＳ１酵素をもたらすことである。別の実施形態では、シトルリンレベル、グルタミンレベル、及び／またはアンモニアレベルのいかなる低下も望ましい。他の好適な臨床成績には、捕捉剤の使用の低減、食事制限の緩和、または肝臓移植の必要がないことが含まれ得る。
【００２８】
一実施形態において、「対象」または「患者」は、上述のようにＣＴＬＮ１を有する哺乳動物対象である。いかなる重症度のＣＴＬＮ１を有する患者も、意図される対象であることが意図される。加えて、天然のＡＳＳ１遺伝子に何らかの突然変異を有する患者も、意図される対象であることが意図される。
【００２９】
一実施形態において、ｈＡＳＳ１遺伝子は、配列番号１に示されるｈＡＳＳ１タンパク質をコードする。したがって、一実施形態において、ｈＡＳＳ１導入遺伝子は、参照により本明細書に組み込まれている添付の配列表に提示されている配列番号２または配列番号３により提示される配列を含み得るが、これらに限定されない。配列番号３は、天然のヒトＡＳＳ１のｃＤＮＡを提示する。配列番号２は、ヒトにおける発現のためにコドン最適化された、工学操作されたヒトＡＳＳ１のｃＤＮＡ（本明細書では場合によりｈＡＳＳ１ｃｏと呼ばれる）を提示する。本明細書におけるｈＡＳＳ１への言及は、一部の実施形態では、ｈＡＳＳ１の天然配列またはコドン最適化配列を指し得ることを理解されたい。代替的には、または更に、ウェブベースまたは商業的に利用可能なコンピュータプログラム、ならびにサービスベースの企業を利用して、両ＲＮＡ及び／またはｃＤＮＡを含む核酸コーディング配列にアミノ酸配列を逆翻訳してもよい。例えば、ＥＭＢＯＳＳによるｂａ
ｃｋｔｒａｎｓｅｑ（／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｓｔ／）、Ｇｅｎｅ
Ｉｎｆｉｎｉｔｙ（ｗｗｗ．ｇｅｎｅｉｎｆｉｎｉｔｙ．ｏｒｇ／ｓｍｓ−／ｓｍｓ＿ｂａｃｋｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ．ｈｔｍｌ）、ＥｘＰａｓｙ（ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／）を参照されたい。所望の標的対象における発現のために（例えば、コドン最適化によって）最適化されている核酸配列を含め、記述されるｈＡＳＳ１ポリペプチド配列をコードする全ての核酸が包含されることが意図される。
【００３０】
一実施形態では、ｈＡＳＳ１をコードする核酸配列は、配列番号３の天然ｈＡＳＳ１コーディング配列と、少なくとも９５％の同一性を共有する。別の実施形態では、ｈＡＳＳ１をコードする核酸配列は、配列番号３の天然ｈＡＳＳ１コーディング配列と、少なくとも９０、８５、８０、７５、７０、または６５％の同一性を共有する。一実施形態では、ｈＡＳＳ１をコードする核酸配列は、配列番号３の天然ｈＡＳＳ１コーディング配列と、約８４％の同一性を共有する。一実施形態において、ｈＡＳＳ１をコードする核酸配列は配列番号２である。
【００３１】
一実施形態では、ｈＡＳＳ１コーディング配列は、望ましい対象種（例えばヒト）における発現のためにコドン最適化されている。コドン最適化されたコーディング領域は、種々の異なる方法によってデザインすることができる。この最適化は、オンラインで利用可能な方法（例えばＧｅｎｅＡｒｔ）、公開されている方法、または例えばＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）のようなコドン最適化サービスを提供する企業を利用して行ってもよい。コドン最適化アプローチの１つは、例えば、参照により本明細書に組み込まれている国際特許公開第ＷＯ２０１５／０１２９２４号に記述されている。例えば、米国特許公開第２０１４／００３２１８６号及び米国特許公開第２００６／０１３６１８４号も参照されたい。好適には、産物のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の全長が改変される。しかしながら一部の実施形態では、ＯＲＦの断片のみ（例えば、個々の免疫グロブリンドメインのうちの１つ以上）を変更してもよい。これらの方法のうちの１つを使用することにより、任意の所与のポリペプチド配列に頻度を適用し、このポリペプチドをコードするコドン最適化されたコーディング領域の核酸断片を産生することができる。
【００３２】
コドンの実際の変更を行うため、または本明細書に記述されるようにデザインされたコドン最適化コーディング領域を合成するためには、いくつかの選択肢が利用可能である。このような改変または合成は、当業者に周知の標準的かつルーチン的な分子生物学的操作を使用して行うことができる。１つのアプローチでは、各々８０〜９０ヌクレオチド長であり所望の配列の長さに及ぶ一連の相補的オリゴヌクレオチド対を、標準的方法によって合成する。これらのオリゴヌクレオチド対は、アニールすると、付着末端を含有する８０〜９０塩基対の二本鎖断片を形成するように合成される。例えば、対における各オリゴヌクレオチドは、対における他方のオリゴヌクレオチドに対して相補的である領域を、塩基３個分、４個分、５個分、６個分、７個分、８個分、９個分、１０個分、またはそれ以上超えて伸びるように合成される。各オリゴヌクレオチド対の一本鎖末端は、別のオリゴヌクレオチド対の一本鎖末端とアニールするようにデザインする。オリゴヌクレオチド対をアニールさせ、次に、一本鎖の付着末端を介してこれらの二本鎖断片のうちおよそ５〜６つを一緒にアニールさせてから、それらを一緒にライゲートし、標準的な細菌クローニングベクター、例えばＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃから入手可能なＴＯＰＯ（登録商標）ベクターにクローニングする。次に、この構築物を標準的方法によってシーケンシングする。８０〜９０塩基対の断片が５〜６つ一緒にライゲートされた断片（すなわち約５００塩基対の断片）からなる、こうした構築物をいくつか調製することで、一連のプラスミド構築物において所望の配列全体が表されるようにする。次に、これらのプラスミドのインサートを適切な制限酵素で切断し、一緒にライゲートして、最終構築物を形成する。次に、最終構築物を標準的な細菌クローニングベクターにクローニングし、シーケンシングする。更なる方法は、当業者にはすぐに明らかになるであろ
う。加えて、遺伝子合成は商業的に容易に利用可能である。
【００３３】
４．１．１．２．ｒＡＡＶベクター
ＡＳＳ１は肝臓で天然に発現するため、肝臓への指向性を示すＡＡＶを使用することが望ましい。一実施形態において、カプシドを供給するＡＡＶは、ＡＡＶ８である。別の実施形態では、カプシドを供給するＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ．１０である。更に別の実施形態では、カプシドを供給するＡＡＶは、クレードＥのＡＡＶである。このようなＡＡＶには、ｒｈ．２；ｒｈ．１０；ｒｈ．２５；ｂｂ．１、ｂｂ．２、ｐｉ．１、ｐｉ．２、ｐｉ．３、ｒｈ．３８、ｒｈ．４０、ｒｈ．４３、ｒｈ．４９、ｒｈ．５０、ｒｈ．５１、ｒｈ．５２、ｒｈ．５３、ｒｈ．５７、ｒｈ．５８、ｒｈ．６１、ｒｈ．６４、ｈｕ．６、ｈｕ．１７、ｈｕ．３７、ｈｕ．３９、ｈｕ．４０、ｈｕ．４１、ｈｕ．４２、ｈｕ．６６、及びｈｕ．６７が含まれる。このクレードは、改変されたｒｈ．２、改変されたｒｈ．５８、及び改変されたｒｈ．６４を更に含む。参照により本明細書に組み込まれているＷＯ２００５／０３３３２１を参照されたい。しかしながら、肝臓指向性のあるいくつかのｒＡＡＶベクターのうち、いずれを使用してもよい。別の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、腎臓への指向性を有する。
【００３４】
下記の実施例に記述される特定の実施形態において、遺伝子療法ベクターは、ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ＰＩ．ｈＡＳＳ１ｃｏ．ＷＰＲＥ．ｂＧＨと呼ばれるチロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーターの制御下でｈＡＳＳ１導入遺伝子を発現するＡＡＶ８ベクターである。別の実施形態では、ＷＰＲＥが除去される。別の実施形態では、遺伝子療法ベクターは、ＡＡＶ８．ＡｐｏＥ．Ａ１ＡＴ（ｆｕｌｌ）．ＩＶＳ２．ｈＡＳＳ１ｃｏ．ｂＧＨと呼ばれる、ＡｐｏＥ１エンハンサーを伴うＡ１ＡＴプロモーターの制御下でｈＡＳＳ１導入遺伝子を発現するＡＡＶ８ベクターである。外部のＡＡＶベクター成分は、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３の３種のＡＡＶウイルスタンパク質の１：１：１０の比における６０個のコピーからなる、血清型８、Ｔ＝１の正二十面体カプシドである。このカプシドは、一本鎖ＤＮＡ  ｒＡＡＶベクターゲノムを含有する。
【００３５】
一実施形態において、ｒＡＡＶ．ｈＡＳＳ１ゲノムは、２つのＡＡＶ逆位末端リピート（ＩＴＲ）に挟まれたｈＡＳＳ１導入遺伝子を含有する。一実施形態において、ｈＡＳＳ１導入遺伝子は、エンハンサー、プロモーター、イントロン、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、ｈＡＳＳ１コーディング配列、及びポリアデニル化（ポリＡ）シグナルのうちの１つ以上を含む。これらの制御配列は、ｈＡＳＳ１遺伝子配列に「作動可能に連結している」。これらの配列を含有する発現カセットは、ウイルスベクターの産生に使用されるプラスミドに、工学操作によって載せてもよい。
【００３６】
ＩＴＲは、ベクター産生中のゲノムの複製及びパッケージングに関与する遺伝子エレメントであり、ｒＡＡＶを生成するために必要な唯一のウイルスシスエレメントである。発現カセットをＡＡＶウイルス粒子中にパッケージングするために必要な最小限の配列はＡＡＶ  ５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲであり、これらは、カプシドと同じＡＡＶ起源をもっていてもよいし、異なるＡＡＶ起源をもっていてもよい（ＡＡＶシュードタイプを産生するため）。一実施形態では、ＡＡＶ２由来のＩＴＲ配列、またはその欠失バージョン（ΔＩＴＲ）が使用される。しかしながら、他のＡＡＶ源に由来するＩＴＲを選択してもよい。ＩＴＲの源がＡＡＶ２に由来し、ＡＡＶカプシドが別のＡＡＶ源に由来する場合、結果として生じるベクターは、シュードタイプ型と呼ばれる場合がある。典型的には、ＡＡＶベクターの発現カセットは、ＡＡＶ  ５’ＩＴＲ、ｈＡＳＳ１コーディング配列及び任意の調節配列、及びＡＡＶ  ３’ＩＴＲを含む。しかしながら、これらのエレメントの他の構成が好適な場合がある。Ｄ配列及び末端分解部位（ｔｒｓ）が欠失している、ΔＩＴＲと呼ばれる５’ＩＴＲの短縮バージョンが記述されている。他の実施形態では、完全長のＡＡＶ  ５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲが使用される。一実施形態において、５’ＩＴＲは、配
列番号１６に示されているものである。一実施形態において、３’ＩＴＲは、配列番号１７に示されているものである。
【００３７】
ｒＡＡＶを生成するための例示的な産生プラスミドは、配列番号２２〜３５に示されている。一実施形態では、配列番号２２のプラスミドが本明細書において提示される。別の実施形態では、配列番号２３のプラスミドが本明細書において提示される。別の実施形態では、配列番号２４のプラスミドが本明細書において提示される。別の実施形態では、配列番号２５のプラスミドが本明細書において提示される。別の実施形態では、配列番号２６のプラスミドが本明細書において提示される。別の実施形態では、配列番号２７のプラスミドが本明細書において提示される。別の実施形態では、配列番号２８のプラスミドが本明細書において提示される。別の実施形態では、配列番号２９のプラスミドが本明細書において提示される。別の実施形態では、配列番号３０のプラスミドが本明細書において提示される。別の実施形態では、配列番号３１のプラスミドが本明細書において提示される。別の実施形態では、配列番号３２のプラスミドが本明細書において提示される。別の実施形態では、配列番号３３のプラスミドが本明細書において提示される。別の実施形態では、配列番号３４のプラスミドが本明細書において提示される。別の実施形態では、配列番号３５のプラスミドが本明細書において提示される。
【００３８】
ｈＡＳＳ１コーディング配列の発現は、肝臓特異的プロモーターから駆動される。本明細書に記述される、説明に役立つプラスミド及びベクターは、チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター（配列番号９）、またはその改変バージョンを使用する。ＴＢＧプロモーターの改変バージョンの１つは、ＴＢＧ−Ｓ１と呼ばれる短縮バージョンである。改変されたチロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ−Ｓ１）プロモーター配列は、配列番号８に示されている。代替的には、他の肝臓特異的プロモーター、例えばトランスサイレチンプロモーター（ＴＴＲ）（配列番号１１）を使用してもよい。別の好適なプロモーターは、アルファ１抗トリプシン（Ａ１ＡＴ）、またはその改変バージョン（この配列は配列番号１０に示されている）である。一実施形態において、プロモーターは、場合によりＡｐｏＥ．Ａ１ＡＴ（ｆｕｌｌ）と呼ばれる、ＡｐｏＥエンハンサーと組み合わされたＡ１ＡＴプロモーターである。一実施形態において、その配列は配列番号２０に示されている。別の好適なプロモーターは、肝臓特異的プロモーターＬＳＰ（ＴＨ結合グロブリンプロモーター／アルファ１ミクログロブリン／ビクニンエンハンサー）（配列番号２１）である。他の好適なプロモーターとしては、ヒトアルブミン（Ｍｉｙａｔａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：５１２４  ３２（１９９７））、ｈｕｍＡｌｂ；及びＢ型肝炎ウイルスコアプロモーター（Ｓａｎｄｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，３：１００２−９（１９９６）が挙げられる。例えば、参照により組み込まれているＴｈｅ  Ｌｉｖｅｒ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ｒｕｌａｉ．ｓｃｈｌ．ｅｄｕ／ＬＳＰＤを参照されたい。さほど望ましくはないが、他のプロモーター、例えばウイルスプロモーター、構成的プロモーター、調節可能プロモーター［例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８及びＷＯ２０１３／０４９４３を参照されたい］、または生理学的合図に応答するプロモーターを使用してもよく、本明細書に記述されるベクターにおいて利用してもよい。
【００３９】
一実施形態において、発現制御配列は、１つ以上のエンハンサーを含む。一実施形態では、配列番号４に示されているＥｎ３４エンハンサー（ヒトアポリポタンパク質肝臓制御領域の３４ｂｐコアエンハンサー）が含まれる。別の実施形態では、ＥｎＴＴＲ（トランスサイレチンの１００ｂｐエンハンサー配列）が含まれる。このような配列は、配列番号５に示されている。参照により本明細書に組み込まれている、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１６（２）：２８０−２８９，Ｆｅｂ．２００８を参照されたい。更に別の実施形態では、α１ミクログロブリン／ビクニン前駆体エンハンサーが含まれる。更に別の実施形態では、ＡＢＰＳ（α１ミクログロブリン／ビクニン前駆体
［ＡＢＰ］の１００ｂｐの遠位エンハンサーが４２ｂｐに短縮されたバージョン）エンハンサーが含まれる。このような配列は、配列番号６に示されている。更に別の実施形態では、ＡｐｏＥエンハンサーが含まれる。このような配列は、配列番号７に示されている。別の実施形態では、２つ以上のエンハンサーが存在する。このような組み合わせは、本明細書に記述されるエンハンサーのうちのいずれかの２つ以上のコピー、及び／または２つ以上のタイプのエンハンサーを含み得る。
【００４０】
発現カセット及び／またはベクターは、プロモーターに加えて、他の適切な転写開始配列、終止配列、エンハンサー配列、及び効率的なＲＮＡプロセシングシグナルを含有してもよい。このような配列には、スプライシングシグナル及びポリアデニル化（ポリＡ）シグナル、発現を増強する調節エレメント（すなわちＷＰＲＥ（配列番号１５））、細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列、翻訳効率を増強する配列（すなわちＫｏｚａｋコンセンサス配列）、タンパク質安定性を増強する配列、そして所望であれば、コードされる産物の分泌を増強する配列が含まれる。一実施形態では、ｈＡＳＳ１  ｍＲＮＡ転写物の終止を媒介するため、ポリアデニル化（ポリＡ）シグナルが含まれる。他の好適なポリＡ配列の例としては、例えば、とりわけウシ成長ホルモン（配列番号１２）、ＳＶ４０、ウサギベータグロビン、及びＴＫポリＡが挙げられる。
【００４１】
一実施形態において、調節配列は、ｒＡＡＶベクターゲノム全体が約２．０〜約５．５キロベースのサイズになるように選択される。一実施形態において、調節配列は、ｒＡＡＶベクターゲノム全体が約２．１、２．３、２．８、３．１、３．２、３．３、または４．０ｋｂのサイズになるように選択される。一実施形態では、ｒＡＡＶベクターゲノムが天然ＡＡＶゲノムのサイズに近似することが望ましい。したがって、一実施形態において、調節配列は、ｒＡＡＶベクターゲノム全体が約４．７ｋｂのサイズになるように選択される。別の実施形態では、ｒＡＡＶベクターゲノム全体は、約５．２ｋｂ未満のサイズである。ベクターゲノムのサイズは、プロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリＡなどを含む調節配列のサイズに基づいて操作され得る。参照により本明細書に組み込まれている、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，Ｊａｎ  ２０１０  １８（１）：８０−６を参照されたい。
【００４２】
したがって、一実施形態では、イントロンがベクターに含まれる。好適なイントロンとしては、ヒトベータグロビンＩＶＳ２（配列番号１３）が挙げられる。参照により本明細書に組み込まれている、Ｋｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４３（９）：４７２１−３２（２０１５）を参照されたい。別の好適なプロモーターとしては、Ｐｒｏｍｅｇａのキメライントロン（配列番号１４）が挙げられる。参照により本明細書に組み込まれている、Ａｌｍｏｎｄ，Ｂ．ａｎｄ  Ｓｃｈｅｎｂｏｒｎ，Ｅ．Ｔ．Ａ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｐＣＩ−ｎｅｏ  Ｖｅｃｔｏｒ  ａｎｄ
ｐｃＤＮＡ４／ＨｉｓＭａｘ  Ｖｅｃｔｏｒ．［Ｉｎｔｅｒｎｅｔ］２０００を参照されたい。ｗｗｗ．ｐｒｏｍｅｇａ．ｃｏｍ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｐｕｂｈｕｂ／ｅｎｏｔｅｓ／ａ−ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ−ｏｆ−ｐｃｉｎｅｏ−ｖｅｃｔｏｒ−ａｎｄ−ｐｃｄｎａ４ｈｉｓｍａｘ−ｖｅｃｔｏｒ／から利用可能である。別の好適なイントロンとしては、ｈＦＩＸイントロン（配列番号１８）が挙げられる。本明細書において好適な種々のイントロンは当技術分野で公知であり、限定されるものではないが、参照により本明細書に組み込まれているｂｐｇ．ｕｔｏｌｅｄｏ．ｅｄｕ／〜ａｆｅｄｏｒｏｖ／ｌａｂ／ｅｉｄ．ｈｔｍｌにて見られるものを含む。参照により本明細書に組み込まれている、Ｓｈｅｐｅｌｅｖ  Ｖ．，Ｆｅｄｏｒｏｖ  Ａ．Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｅｘｏｎ−Ｉｎｔｒｏｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ．Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２００６，７：１７８−１８５も参照されたい。
【００４３】
一実施形態において、ｒＡＡＶベクターゲノムは、配列番号２２のｎｔ１〜ｎｔ３２１
６、配列番号２３のｎｔ１〜ｎｔ２３３１、配列番号２４のｎｔ１〜ｎｔ３２６１、配列番号２５のｎｔ１〜ｎｔ３３２５、配列番号２６のｎｔ１〜ｎｔ２７７７、配列番号２７のｎｔ１〜ｎｔ２７７７、配列番号２８のｎｔ１〜ｎｔ３２１６、配列番号２９のｎｔ１〜ｎｔ３０６６、配列番号３０のｎｔ１〜ｎｔ２０８３、配列番号３１のｎｔ１〜ｎｔ２１２１、配列番号３２のｎｔ１〜ｎｔ３２２１、配列番号３３のｎｔ１〜ｎｔ４０４０、配列番号３４のｎｔ１〜ｎｔ２７９８、または配列番号３５のｎｔ１〜ｎｔ３０６６から選択される配列を含む。
【００４４】
４．１．２．組成物
一実施形態において、ｒＡＡＶ．ｈＡＳＳ１ウイルスは、水性担体、賦形剤、希釈剤、またはバッファーを含む医薬組成物で提供される。一実施形態において、バッファーはＰＢＳである。特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ｈＡＳＳ１製剤は、ＴＭＮ２００（２００ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ塩化マグネシウム、２０ｍＭトリス、ｐＨ８．０）中に０．００１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８を含有する水溶液に懸濁した、有効量のｒＡＡＶ．ｈＡＳＳ１ベクターを含有するサスペンションである。しかしながら、緩衝食塩水、界面活性剤、及び塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）約１００ｍＭ〜塩化ナトリウム約２５０ｍＭと同等のイオン強度に調整した生理的に適合性がある塩もしくは塩の混合物、または同等のイオン濃度に調整した生理的に適合性がある塩のうちの１つ以上を含むものをはじめとする、種々の好適な溶液が公知である。
【００４５】
例えば、本明細書において提示されるサスペンションは、ＮａＣｌ及びＫＣｌの両方を含有し得る。ｐＨは、６．５〜８．５、または７〜８．５、または７．５〜８の範囲内であり得る。好適な界面活性剤または界面活性剤の組み合わせは、ポロキサマー、すなわち、中央にある疎水性のポリオキシプロピレン鎖（ポリ（プロピレンオキシド））が２つの親水性のポリオキシエチレン鎖（ポリ（エチレンオキシド））に挟まれた構成をしている非イオン性トリブロックコポリマー、ＳＯＬＵＴＯＬ  ＨＳ  １５（マクロゴール−１５ヒドロキシステアレート）、ＬＡＢＲＡＳＯＬ（ポリオキシカプリル酸グリセリド）、ポリオキシ１０オレイルエーテル、ＴＷＥＥＮ（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）、エタノール、及びポリエチレングリコールの中から選択され得る。一実施形態において、製剤はポロキサマーを含有する。これらのコポリマーは、一般的に、「Ｐ」の文字（ポロキサマーを表す）の後に３つの数字が続く名称を与えられる。最初の２つの数字に１００をかけると、ポリオキシプロピレンコアのおよその分子質量が求められ、最後の数字に１０をかけると、ポリオキシエチレン含有率が求められる。一実施形態では、ポロキサマー１８８が選択される。界面活性剤は、サスペンションの最大約０．０００５％〜約０．００１％の量で存在してよい。別の実施形態では、ベクターは、１８０ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．００１％ポロキサマー１８８を含有する水溶液（ｐＨ７．３）に懸濁される。
【００４６】
一実施形態において、製剤は、ヒト対象に使用するのに好適であり、静脈内投与される。一実施形態において、製剤は、ボーラス注射により、末梢静脈を介して送達される。一実施形態において、製剤は、約１０分（±５分）にわたる注入により、末梢静脈を介して送達される。一実施形態において、製剤は、約２０分（±５分）にわたる注入により、末梢静脈を介して送達される。一実施形態において、製剤は、約３０分（±５分）にわたる注入により、末梢静脈を介して送達される。一実施形態において、製剤は、約６０分（±５分）にわたる注入により、末梢静脈を介して送達される。一実施形態において、製剤は、約９０分（±１０分）にわたる注入により、末梢静脈を介して送達される。しかしながら、必要または所望であれば、この時間を調整してよい。任意の好適な方法またはルートを使用して、本明細書に記述されるＡＡＶ含有組成物を投与し、場合によっては、本明細書に記述されるｈＡＳＳ１のＡＡＶ媒介性送達と併せて、他の活性薬または療法薬を共投与することができる。投与ルートとしては、例えば、全身、経口、吸入、鼻腔内、気管内
、動脈内、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、及び他の非経口投与ルートが挙げられる。
【００４７】
一実施形態において、製剤は、例えば、参照により本明細書に組み込まれている、Ｍ．Ｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１４  Ａｐｒ；２５（２）：１１５−２５．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１３．１３１．Ｅｐｕｂ  ２０１４  Ｆｅｂ  １４に記述されているように、ｏｑＰＣＲまたはデジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によって測定した場合、例えば、約１．０×１０１１ＧＣ／ｋｇ（患者の体重１キログラムあたりのゲノムコピー）〜約１×１０１４ＧＣ／ｋｇ、約５×１０１１ＧＣ／ｋｇ（患者の体重１キログラムあたりのゲノムコピー）〜約３×１０１３ＧＣ／ｋｇ、または約１×１０１２〜約１×１０１４ＧＣ／ｋｇを含有し得る。一実施形態において、ｒＡＡＶ．ｈＡＳＳ製剤は、例えば、Ｍ．Ｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ（上記）に記述されているように、ｏｑＰＣＲまたはデジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によって測定した場合、少なくとも１×１０１３ゲノムコピー（ＧＣ）／ｍＬまたはそれ以上を含有するサスペンションである。
【００４８】
患者に投与されるＡＡＶ．ｈＡＳＳ１の用量から空のカプシドが除去されることを確実にするために、空のカプシドは、ベクター精製プロセス中に、例えば、本明細書において詳解される方法を使用して、ベクター粒子から分離される。一実施形態において、パッケージングされたゲノムを含有するベクター粒子は、参照により本明細書に組み込まれている、２０１６年４月１３日に出願され、「Ｓｃａｌａｂｌｅ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ＡＡＶ８」と題する米国特許出願第６２／３２２，０９８号に記述されているプロセスを使用して、空のカプシドから精製される。簡潔に述べると、清澄化され濃縮されたｒＡＡＶ産生細胞培養物の上清から、ゲノムを含有するｒＡＡＶベクター粒子を選択的に捕捉して単離する、２ステップの精製スキームが記述されている。このプロセスでは、高い塩濃度で行われる親和性捕捉法の後に、高いｐＨで行われるアニオン交換樹脂法を利用して、ｒＡＡＶ中間体を実質的に含まないｒＡＡＶベクター粒子をもたらす。他のカプシドを有するベクターのために同様の精製法を使用してもよい。
【００４９】
いかなる従来の製造プロセスを利用してもよいが、本明細書（及び米国特許出願第６２／３２２，０９８号）に記述されるプロセスは、５０〜７０％の粒子がベクターゲノムを有する、すなわち、完全粒子５０〜７０％のベクター調製物をもたらす。したがって、１．６×１０１２ＧＣ／ｋｇの例示的な用量では、総粒子用量は２．３×１０１２〜３×１０１２の粒子となる。別の実施形態では、提唱される用量は、１／２対数高いか、または５×１０１２ＧＣ／ｋｇであり、総粒子用量は７．６×１０１２〜１．１×１０１３の粒子となる。一実施形態において、製剤は、「空」対「完全」比が１以下、好ましくは０．７５未満、より好ましくは０．５、好ましくは０．３未満のｒＡＡＶストックを特徴とする。
【００５０】
ｒＡＡＶ８粒子（パッケージングされたゲノム）のストックまたは調製物は、ストック中のｒＡＡＶ８粒子が、ストック中のｒＡＡＶ８の少なくとも約７５％〜約１００％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも９９％であり、「空のカプシド」が、ストックまたは調製物中のｒＡＡＶ８の約１％未満、約５％未満、約１０％未満、約１５％未満であるとき、空のＡＡＶカプシド（及び他の中間体）を「実質的に含まない」。
【００５１】
概して、空のカプシド及びパッケージングされたゲノムを含むＡＡＶベクター粒子についてアッセイするための方法は、当技術分野において知られてきた。例えば、Ｇｒｉｍｍ
ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９９）６：１３２２−１３３０、Ｓｏｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．（２００３）７：１２２−１２８を参
照されたい。変性カプシドについて試験するには、その方法は、３つのカプシドタンパク質を分離させることができる任意のゲル、例えば、バッファー中に３〜８％トリス−アセテートを含有する勾配ゲルからなるＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に、処置済みＡＡＶストックを供し、次に、試料物質が分離されるまでゲルを泳動し、ナイロンまたはニトロセルロース膜、好ましくはナイロンにゲルをブロッティングすることを含む。次に、抗ＡＡＶカプシド抗体、好ましくは抗ＡＡＶカプシドモノクローナル抗体、最も好ましくはＢ１抗ＡＡＶ−２モノクローナル抗体を、変性カプシドタンパク質に結合する一次抗体として使用する（Ｗｏｂｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（２０００）７４：９２８１−９２９３）。次に、一次抗体に結合し、一次抗体との結合を検出するための手段を含む二次抗体、より好ましくはそれに共有結合した検出分子を含有する抗ＩｇＧ抗体、最も好ましくは西洋ワサビペルオキシダーゼに共有結合によって連結したヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体を使用する。一次抗体と二次抗体との間の結合を半定量的に決定するために、結合を検出するための方法、好ましくは、放射性同位体の放出、電磁放射、または比色変化を検出することができる検出方法、最も好ましくは化学発光検出キットを使用する。例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの場合、カラム画分から試料を取り、還元剤（例えばＤＴＴ）を含有するＳＤＳ−ＰＡＧＥローディングバッファー中で加熱してもよい。カプシドタンパク質は、プレキャスト勾配ポリアクリルアミドゲル（例えば、Ｎｏｖｅｘ）で分解した。製造元の説明に従ってＳｉｌｖｅｒＸｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）を使用し、銀染色を行ってもよい。一実施形態において、カラム画分中のＡＡＶベクターゲノム（ｖｇ）の濃度は、定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）によって測定することができる。試料を希釈し、ＤＮａｓｅ  Ｉ（または別の好適なヌクレアーゼ）で消化して、外来性ＤＮＡを除去する。ヌクレアーゼの失活後、試料を更に希釈し、複数のプライマーと、これらのプライマー間のＤＮＡ配列に対して特異的なＴａｑＭａｎ（商標）蛍光発生プローブとを使用して増幅した。各試料について、規定の蛍光レベルに達するために必要なサイクル数（閾値サイクル、Ｃｔ）を、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＰｒｉｓｍ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍで測定する。ＡＡＶベクターに含まれるものと同一の配列を含有するプラスミドＤＮＡを用い、Ｑ−ＰＣＲ反応の標準曲線を生成する。試料から得られたサイクル閾値（Ｃｔ）を使用して、ベクターゲノム力価をプラスミドの標準曲線のＣｔ値に対して正規化することにより、これを決定する。デジタルＰＣＲに基づくエンドポイントアッセイを使用することもできる。
【００５２】
一態様において、広域スペクトルセリンプロテアーゼ、例えばプロテイナーゼＫ（例えばＱｉａｇｅｎから市販されているもの）を利用する、最適化されたｑ−ＰＣＲ法が本明細書において提示される。より特定すると、最適化されたｑＰＣＲゲノム力価アッセイは、ＤＮａｓｅ  Ｉ消化後に試料をプロテイナーゼＫバッファーで希釈し、プロテイナーゼＫで処置してから熱失活することを除いては、標準的アッセイと同様である。好適には、試料サイズと等しい量のプロテイナーゼＫバッファーで試料を希釈する。プロテイナーゼＫバッファーは、２倍以上に濃縮してよい。典型的には、プロテイナーゼＫ処置は約０．２ｍｇ／ｍＬであるが、０．１ｍｇ／ｍＬから約１ｍｇ／ｍＬまで様々であり得る。処置ステップは約５５℃で約１５分間にわたって実施されるのが一般的だが、より低い温度（例えば、約３７℃〜約５０℃）でより長い期間（例えば、約２０分間〜約３０分間）にわたって、またはより高い温度（例えば、最高約６０℃）でより短い期間（例えば、約５〜１０分間）にわたって行ってもよい。同様に、熱失活は約９５℃で約１５分間にわたるのが一般的だが、温度を低下させ（例えば、約７０〜約９０℃）、時間を延長してもよい（例えば、約２０分間〜約３０分間）。次に、標準的アッセイにおいて説明されるように、試料を希釈し（例えば１０００倍）、ＴａｑＭａｎ解析に供する。
【００５３】
更に、または代替的には、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を使用してもよい。例えば、一本鎖及び自己相補的なＡＡＶベクターゲノムの力価をｄｄＰＣＲによって決定するための方法が記述されている。例えば、Ｍ．Ｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｈｕ  Ｇ
ｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１４  Ａｐｒ；２５（２）：１１５−２５．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１３．１３１．Ｅｐｕｂ  ２０１４  Ｆｅｂ  １４を参照されたい。
【００５４】
４．２  患者集団
上記で詳解したように、いかなる重症度のＣＴＬＮ１を有する対象も、本明細書に記述される組成物及び方法の意図されるレシピエントである。
【００５５】
対象は、各自の担当医の裁量にて、遺伝子療法処置の前及びそれと同時に、各自の標準治療処置（複数可）（例えば、タンパク質制限食、及び／または薬物療法（窒素捕捉剤療法及びカルニチンを含む））の継続が許容され得る。代替策では、医師が、遺伝子療法処置を供与する前に標準治療療法を停止し、場合により、遺伝子療法を供与した後に併用療法として標準治療処置を再開することを選ぶ場合がある。
【００５６】
遺伝子療法レジメンの望ましいエンドポイントは、約１００μｍｏｌ／Ｌ未満のシトルリンレベル及び／または約１００μｍｏｌ／Ｌ未満のアンモニアレベルをもたらすＡＳＳ活性の増加である。別の実施形態では、シトルリンレベル、グルタミンレベル、及び／またはアンモニアレベルのいかなる低下も望ましい。他の好適な臨床成績には、捕捉剤の使用の低減、食事制限の緩和、または肝臓移植の必要がないことが含まれ得る。一実施形態において、患者は、単独かつ／または補助的処置の使用と組み合わせたｒＡＡＶ．ｈＡＳＳ１を用いた処置の後に、循環ＡＳＳ１レベルの低下を達成する。
【００５７】
４．３．投薬及び投与ルート
一実施形態において、ｒＡＡＶ．ｈＡＳＳ１ベクターは、患者ごとに単回用量として送達される。一実施形態において、対象には、最小有効量（ＭＥＤ）（本明細書の実施例に記述される前臨床研究によって決定される）が送達される。本明細書において使用される場合、ＭＥＤとは、約１００μｍｏｌ／Ｌ未満のシトルリンレベル及び／または約１００μｍｏｌ／Ｌ未満のアンモニアレベルをもたらすＡＳＳ１活性を達成するために必要なｒＡＡＶ．ｈＡＳＳ１の用量を指す。
【００５８】
従来通り、ベクター力価は、ベクター調製物のＤＮＡ含有量に基づいて決定される。一実施形態では、実施例に記述される定量的ＰＣＲまたは最適化された定量的ＰＣＲを使用して、ｒＡＡＶ．ｈＡＳＳ１ベクター調製物のＤＮＡ含有量を決定する。一実施形態では、実施例に記述されるデジタルドロップレットＰＣＲを使用して、ｒＡＡＶ．ｈＡＳＳ１ベクター調製物のＤＮＡ含有量を決定する。一実施形態において、投与量は、約１×１０１１ゲノムコピー（ＧＣ）／体重１ｋｇ〜約１×１０１３ＧＣ／ｋｇ（両終点を含む）である。一実施形態において、投与量は５×１０１１ＧＣ／ｋｇである。別の実施形態では、投与量は５×１０１２ＧＣ／ｋｇである。特定の実施形態では、患者に投与されるｒＡＡＶ．ｈＡＳＳ１の用量は、少なくとも５×１０１１ＧＣ／ｋｇ、１×１０１２ＧＣ／ｋｇ、１．５×１０１２ＧＣ／ｋｇ、２．０×１０１２ＧＣ／ｋｇ、２．５×１０１２ＧＣ／ｋｇ、３．０×１０１２ＧＣ／ｋｇ、３．５×１０１２ＧＣ／ｋｇ、４．０×１０１２ＧＣ／ｋｇ、４．５×１０１２ＧＣ／ｋｇ、５．０×１０１２ＧＣ／ｋｇ、５．５×１０１２ＧＣ／ｋｇ、６．０×１０１２ＧＣ／ｋｇ、６．５×１０１２ＧＣ／ｋｇ、７．０×１０１２ＧＣ／ｋｇ、または７．５×１０１２ＧＣ／ｋｇである。また、複製欠損ウイルス組成物は、約１．０×１０９ＧＣ〜約１．０×１０１５ＧＣの範囲内の量の複製欠損ウイルスを含有するような投与量単位で製剤化され得る。本明細書において使用される場合、「投与量」という用語は、処置の過程において対象に送達される総投与量、または（複数のうちの）単一の投与において送達される量を指す場合がある。
【００５９】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶ．ｈＡＳＳ１は、低タンパク質食、または窒素捕捉剤療
法の供与、または透析といった、ＣＴＬＮ１を処置するための１つ以上の療法と組み合わせて投与される。
【００６０】
４．４．臨床的目標の測定
処置の効力の測定値は、アンモニアもしくはシトルリンレベル及び／またはＡＳＳ１活性によって決定される導入遺伝子の発現及び活性によって測定することができる。効力の更なる評価は、食事性のシトルリンに対する耐性の臨床的評価によって決定することができる。
【００６１】
本明細書において使用される場合、本明細書におけるｒＡＡＶ．ｈＡＳＳ１ベクターは、約１００μｍｏｌ／Ｌ未満のシトルリンレベル及び／またはアンモニアレベルをもたらすＡＳＳ１活性を達成するのに十分なレベルのＡＳＳ１を患者が発現する場合、患者の欠損したＡＳＳ１を活性ＡＳＳ１で「機能的に置き換える」または「機能的に補う」。別の実施形態では、ｒＡＡＶ．ｈＡＳＳ１ベクターは、部分的なレスキューがもたらされる場合、患者の欠損したＡＳＳ１を機能的に置き換えるまたは機能的に補う。これにより、捕捉剤及び食事制御の組み合わせを用いた処置が可能になる。一実施形態において、処置は、肝臓移植が必要とされないように十分なレスキューをもたらす。別の実施形態では、ウイルス性疾患（例えばインフルエンザ）などの合併症の率の低下が所望される。
【実施例】
【００６２】
５．実施例
以下の実施例は単なる説明であり、本発明を限定することを意図するものではない。
【００６３】
実施例１：ｈＡＳＳ１を含有するＡＡＶベクター
ヒト甲状腺ホルモン結合グロブリンプロモーター及びミクログロビン／ビクニンエンハンサーに基づくハイブリッドプロモーターであるＴＢＧの制御下にあるコドン最適化されたヒトＡＳＳ１  ｃＤＮＡ（ｈＡＳＳ１ｃｏ）を有するＡＡＶ８ベクターにより、例示的な遺伝子療法ベクターＡＡＶ８．ＴＢＧ．ＰＩ．ｈＡＳＳ１ｃｏ．ＷＰＲＥ．ｂＧＨを構築した。ＡＳＳ１発現カセットは、ＡＡＶ２由来の逆位末端リピート（ＩＴＲ）に挟まれ、その発現は、ＴＢＧエンハンサー／プロモーターのハイブリッド及びエンハンサーとしてのウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）によって駆動された。導入遺伝子は、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＳＶ４０  ｍｉｓｃイントロン（ＰＩ）及びウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ｂＧＨ）も含んだ。
【００６４】
Ａ１ＡＴプロモーター及びＡｐｏＥエンハンサーの制御下にあるコドン最適化されたヒトＡＳＳ１  ｃＤＮＡ（ｈＡＳＳ１ｃｏ）を有するＡＡＶ８ベクターにより、別の例示的な遺伝子療法ベクターＡＡＶ８．ＡｐｏＥ．Ａ１ＡＴ（ｆｕｌｌ）．ＩＶＳ２．ｈＡＳＳ１ｃｏ．ｂＧＨを構築した（図１）。ＡＳＳ１発現カセットは、ＡＡＶ２由来の逆位末端リピート（ＩＴＲ）に挟まれ、その発現は、ＡｐｏＥ．Ａ１ＡＴエンハンサー／プロモーターによって駆動された。導入遺伝子は、イントロンとしてのヒトベータグロビンＩＶＳ２及びウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ｂＧＨ）も含んだ。
【００６５】
エンハンサーとしてのＷＰＲＥがないベクターＡＡＶ８．ＴＢＧ．ＰＩ．ｈＡＳＳ１ｃｏ．ｂＧＨを上述のように構築した。
【００６６】
ＡＡＶ８．ＬＳＰ．ＩＶＳ２．ｈＡＳＳ１ｃｏ．ｂＧＨベクターは、介在配列２（ＩＶＳ２）及びウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ｂＧＨ）と共に、肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）の制御下で、コドン最適化されたヒトＡＳＳ１  ｃＤＮＡ（ｈＡＳＳ１ｃｏ）をコードする。
【００６７】
このベクターは、例えば、参照により本明細書に組み込まれている、Ｍｉｚｕｋａｍｉ，Ｈｉｒｏａｋｉ，ｅｔ  ａｌ．Ａ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｆｏｒ  ＡＡＶ  ｖｅｃｔｏｒ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｄｉｓｓ．Ｄｉ−ｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｅｄｉｃｉｎｅ，１９９８に記述されている、２９３細胞における従来のトリプルトランスフェクション技術を使用して調製した。全てのベクターは、これまでに記述されているように［Ｌｏｃｋ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，２１：１２５９−１２７１（２０１０）］、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＰｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａにてＶｅｃｔｏｒ  Ｃｏｒｅによって産生された。
【００６８】
実施例２：自然史研究
動物手技は全て、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＰｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）により認可されたプロトコールに従って行った。
【００６９】
シトルリン血症は、シトルリン及びアスパラギン酸からのアルギニノコハク酸の合成を触媒するアルギニノコハク酸シンターゼ（ＡＳＳ１）酵素の突然変異によって引き起こされる常染色体劣性疾患であり、シトルリン血症及びアンモニアの蓄積をもたらす。ＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄマウスは、欠損したアルギニノコハク酸シンターゼ１（ＡＳＳ１）を発現する［Ｈａｒｒｉｓ  ＢＳ，ｅｔ  ａｌ．，Ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ：ａ  ｎｅｗ  ｓｋｉｎ  ａｎｄ  ｈａｉｒ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｍｏｕｓｅ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ２．ＭＧＩ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｄａｔａ  Ｓｕｂｍｉｓｓｉｏｎ．２００７］。ＦＯＬＤ対立遺伝子マウスは、正常なＡＳＳ１  ｍＲＮＡ及びタンパク質レベルと共に、不安定なタンパク質構造をもたらすエクソン１５におけるＴ３８９Ｉ置換を有する。ホモ接合体は、最長３週間またはそれよりも長く生存し、５〜１０％の酵素活性を有し、ＣＴＬＮ１と同様の臨床パラメータ及び生化学的パラメータを示す。１週齢時のｆｏｌｄホモ接合体には毛がないため、これらを対照同腹仔と見分けることができ、２週齢時のｆｏｌｄホモ接合体は、しわの多い皮膚を有し、まばらな毛が生える。Ｐ１４までにマウスは、シトルリンレベルの１０〜４０倍の上昇、ならびにグルタミン、シスチン、メチオニン、及びリジンを含む多くのアミノ酸の血漿レベルの１．５〜３倍の上昇を示し、アルギニン、グルタミン酸、ロイシン、及びオルニチンレベルは低下する。
【００７０】
したがって、ＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄマウスをシトルリン血症のマウスモデルとした。雄２８匹及び雌２３匹のＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄマウスの観察に基づいて生存曲線を生成した（図２Ａ）。結果は、ＡＳＳ１の機能欠損がＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄマウスの寿命を著しく縮めたことを示した。
【００７１】
正常な発達及び成長に関する第２のパラメータとして、離乳後のＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄマウス及び健常な同腹仔の体重を厳密にモニタリングし、記録した。結果は、両性別の野生型同腹仔が観察期間にわたって定常な成長を呈した一方で、雌ＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄマウスの体重は比較的一定の状態を保ち、雄ＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄマウスの体重は約８週齢時にプラトーに達したことを示した（図２Ｂ）。ＡＳＳ１の機能欠損がマウスの発達及び成長を損なったことが更に示された。
【００７２】
無処置のＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄマウス及び健常な同腹仔に対し、血漿アンモニア（図２Ｃ）、血漿シトルリン（図２Ｄ）、血漿アルギニン（図２Ｅ）、尿中オロト酸（図２Ｅ）の測定を含む更なる試験を行った。アンモニアレベル、シトルリンレベル、アルギニンレベル、及びオロト酸レベルは全て、健常な同腹仔と比較して、無処置のＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄマウスにおいて高かった。
【００７３】
実施例３：シトルリン血症のモデルにおけるＡＡＶ８．ｈＡＳＳ１ベクター
ＡＡＶ８．ｈＡＳＳ１ｃｏベクターの効力を評価し、その用量依存性効果を決定するため、以下の表１に示すように、１×１０１１ＧＣ／マウスまたは３×１０１１ＧＣ／マウスの遺伝子療法ベクターを出生時のＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄマウスに静脈内注射した。野生型同腹仔及びヘテロ接合性同腹仔を対照とした。
【００７４】
３×１０１１ＧＣ／子のＡＡＶ８．ＬＳＰ．ＩＶＳ２．ｈＡＳＳ１ｃｏ．ｂＧＨベクターは、雄ＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄマウスの体重増加速度を上昇させるのに成功した（図３Ａ）。雌では、３×１０１１ＧＣ／子で試験した３種全てのベクターが、成長時の体重減少をレスキューした（図３Ｂ）。一方で、出生時に１×１０１１ＧＣ／子のベクターを静脈内注射したマウスは、わずかな体重増加を示した（図３Ｃ及び図３Ｄ）。出生後１４日目にＡＡＶ８．ＴＢＧ．ＰＩ．ｈＡＳＳ１ｃｏ．ＷＰＲＥ．ｂＧＨベクターの腹腔内注射を受けたマウスは、いかなる体重増加も呈さなかった（図３Ｅ及び図３Ｆ）。
【００７５】
更なる実験を行い、ＡＡＶ８．ｈＡＡＳｃｏベクターで処置したシトルリン血症マウスの生存を評価した。血液中のシトルリンの蓄積を評価するため、出生後０日目に１×１０１１または３×１０１１ＧＣ／子でＡＡＶ８．ＴＢＧ．ＰＩ．ｈＡＳＳ１ｃｏ．ＷＰＲＥ．ｂＧＨ、ＡＡＶ８．ＬＳＰ．ＩＶＳ２．ｈＡＳＳ１ｃｏ．ｂＧＨ、またはＡＡＶ８．ＴＢＧ．ＰＩ．ｈＡＳＳ１ｃｏ．ｂＧＨを静脈内注射したＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄマウスにおけるシトルリンの濃度を検査した（それぞれ図４Ｂ及び図４Ａ）。１×１０１１ＧＣ／子のベクターの注射は、無処置のＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄマウスと比較してシトルリンをわずかに減少させ（図４Ｂ）、３×１０１１ＧＣ／子のベクターは、シトルリンレベルを低下させるのに成功した（図４Ａ）。
【００７６】
注射後のＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄマウスにおけるＡＳＳ１の発現及び酵素活性の更なる研究を行った。ＡＡＶ８．ｈＡＳＳｃｏベクターを注射した試験マウス及び健常な同腹仔対照の肝臓を収集し、ライセートを調製した。ｍＲＮＡを抽出し、ＡＳＳ１の発現をＲＴ−ＰＣＲによって評価した。ウェスタンブロット及び免疫組織化学的検査により、ＡＳＳ１のタンパク質発現量を決定した。ベクターで処置したＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄマウス及び対照におけるＡＳＳ１活性を評価するための実験も行った。
【００７７】
更なる実験を行い、１×１０１１ＧＣ／子のベクターＡＡＶ８．ＴＢＧ．ＰＩ．ｈＡＳＳ１ｃｏ．ＷＰＲＥ．ｂＧＨで処置したＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄマウスの体重（図５Ａ）、ＡＬＴ（図５Ｂ）、及びアルカリホスファターゼ（図５Ｃ）を測定した。野生型同腹仔及びヘテロ接合性同腹仔を対照とした。
【００７８】
３×１０１１ＧＣ／子のＡＡＶ８．ＴＢＧ．ＰＩ．ｈＡＳＳ１ｃｏ．ＷＰＲＥ．ｂＧＨ（図６Ａ）、ＡＡＶ８．ＬＳＰ．ＩＶＳ２．ｈＡＳＳ１ｃｏ．ｂＧＨ（図６Ｂ）、ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ＰＩ．ｈＡＳＳ１ｃｏ．ｂＧＨ（図６Ｃ）、または１×１０１１ＧＣ／子のＡＡＶ８．ＬＳＰ．ＩＶＳ２．ｈＡＳＳ１ｃｏ．ｂＧＨ（図６Ｄ）を出生時に静脈内注射したＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄマウスにおいて、尿中オロト酸レベルを測定した。
【００７９】
実施例４：更なるベクター
以下の表に示した更なるＡＡＶベクターを産生した。出生後０日目のＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄマウスに、記載されているベクターを１×１０１１または３×１０１１ＧＣ／子で注射した。注射の２週間後及び６週間後にシトルリンレベルを測定した（図９Ａ及び９Ｂ）。
【００８０】
図１０は、Ｇ３、Ｇ７、Ｇ９、及びＧ１１を注射した雄及び雌マウスの生存曲線を示す。試験した全てのベクターが、ＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄマウスの生存率を著しく増加
させた。同様に、試験した全てのベクターが、雄マウス（図１１Ａ）及び雌マウス（図１１Ｂ）の両方の体重を増加させ、注射の２週間後（図１２Ａ）及び６週間後（図１２Ｂ）のシトルリンレベルを低下させ、アンモニアレベル（図１３）を低下させた。
【００８１】
まとめると、ＡＡＶ８．ｈＡＳＳｃｏベクターの単回注射は、ＡＳＳ１欠損マウスに静脈内投与したとき、実質的な血中シトルリンの低減及び付随する機能の是正をもたらした。
【００８２】
実施例５：肝臓指向性ＡＡＶ８媒介性遺伝子療法によるシトルリン血症Ｉ型の低次形態致死マウスモデルの長期レスキュー
シトルリン血症Ｉ型（ＣＴＬＮ１）は、アルギニノコハク酸シンターゼ１（ＡＳＳ１）の欠損によって引き起こされる尿素サイクルの常染色体劣性障害である。
【表１】
2020506705.tif 000003
【００８３】
ＣＴＬＮ１の臨床スペクトルは、重度の新生児期発症型から、より軽度な遅発型まで及ぶ。罹患した患者は、持続的な高い血漿シトルリンレベルを有し、不可逆的な認知障害、昏睡、及び死をもたらし得るような生命に関わるアンモニアの上昇のリスクがある。低タンパク質食、アルギニンの補給、及び窒素捕捉剤の投与を含むＣＴＬＮ１患者のための現在の処置は、多くの場合、進行中の高アンモニア血症発作を予防することができない。肝臓移植は、血漿アンモニア及びシトルリンレベルの低下の成功を示しているが、ドナーの肝臓は限定的であり、手技自体にかなりの疾病率が伴い、グラフトの期間にわたって免疫抑制薬が必要である。したがって、ＣＴＬＮ１の療法に対する他のアプローチが必要とされている。
【００８４】
ＡＡＶベクターベースの遺伝子療法は、ベクターが実質的な毒性を伴わずに十分かつ持続的に導入遺伝子を肝臓内で発現する限り、現在の処置選択肢に代わる代替策をもたらす。異なる肝臓特異的プロモーター、イントロン、及びｃＤＮＡ配列（天然またはコドン最適化型のｈＡＳＳ１  ｃＤＮＡ）を用いて、ＣＴＬＮ１のための候補ＡＡＶ８ベクターをいくつか生成した。ＣＴＬＮ１のマウスモデル（ＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄ）においてベクターのインビボ評価を行った。ホモ接合性ＡＳＳ１ｆｏｌｄ／ｆｏｌｄ（ｆｏｌｄ）マウスは低次形態突然変異を有し、離乳後の致死性を示した。無処置のｆｏｌｄマウスの半数は１２週齢前に死亡したが、数匹（５％）は５か月まで生きた。無処置のｆｏｌｄマウスは、著しく高い血漿シトルリンレベルに加えて、著しく低い体重、不定の高い血漿アンモニアレベル及び尿中オロト酸レベルを有し、繁殖力がなかった。
【００８５】
４週齢のｆｏｌｄマウスに、３×１０１１ＧＣまたは１×１０１１ＧＣのベクターを後眼窩注射または腹腔内注射によって投薬した。異なるベクターの性能を区別するための主な基準として、血漿シトルリンレベルの低下を選択した。ＡｐｏＥエンハンサー・アルファ１アンチトリプシンプロモーター及びベータグロブリン介在配列２を含有するリードベクターは、１×１０１１ＧＣの用量におけるベクター投与の２週間後、シトルリンレベルの７７％の低下を達成した。イントロンはＡＳＳ１の発現において重要な役割を果たし、同じプロモーターを他のイントロンと共に搭載したベクター、またはイントロンなしのベクターは、シトルリンレベルを低下させる効率の著しい乱れを示した。天然ｃＤＮＡ配列を有するベクターは、コドン最適化されたｃＤＮＡ配列を有するベクターよりもわずかに良好な性能を示した。トップ候補のベクターで処置したＦｏｌｄマウスは、体重が増加し、繁殖可能になり、９か月を超えて生存した（なお継続中である）。
【００８６】
（配列表フリーテキスト）
以下の情報は、識別番号＜２２３＞の下にフリーテキストを含む配列に関して提示するものである。
【表２】
2020506705.tif 000004
【００８７】
本明細書に引用される全ての公開文献は、２０１７年２月１日に出願された米国仮特許出願第６２／４５３，４２４号、及び２０１７年３月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／４６９，６５０号と同様に、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。同様に、本明細書において参照され、添付の配列表に記載される配列番号は、参照により組み込まれている。特定の実施形態を参照しながら本発明について記述したが、本発明の趣旨から逸脱することなく改変を行ってよいことは理解されよう。このような改変は、
添付の特許請求の範囲に含まれるよう意図される。
【図１】
2020506705.tif 000005
【図２−１】
2020506705.tif 000006
【図２−２】
2020506705.tif 000007
【図２−３】
2020506705.tif 000008
【図３−１】
2020506705.tif 000009
【図３−２】
2020506705.tif 000010
【図３−３】
2020506705.tif 000011
【図４】
2020506705.tif 000012
【図５−１】
2020506705.tif 000013
【図５−２】
2020506705.tif 000014
【図６−１】
2020506705.tif 000015
【図６−２】
2020506705.tif 000016
【図７Ａ】
2020506705.tif 000017
【図７Ｂ】
2020506705.tif 000018
【図８】
2020506705.tif 000019
【図９】
2020506705.tif 000020
【図１０】
2020506705.tif 000021
【図１１】
2020506705.tif 000022
【図１２】
2020506705.tif 000023
【図１３】
2020506705.tif 000024
【配列表】
2020506705000001.app
【国際調査報告】
2020506705.tif 000025
2020506705.tif 000026
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