(57)【要約】  本開示は、MTM1突然変異又は欠損に関連する疾患又は障害の処置における使用のための、MTMR2-Sポリペプチド、又は前記MTMR2-Sポリペプチドを産生する又はコードする核酸配列に関する。本発明は、それを必要とする対象において、MTM1突然変異又は欠損に関連するミオパチー又は疾患又は障害を処置するための組成物及び方法を提供する。本発明は、中心核ミオパチーを抱える対象等の、改善された筋肉機能を必要とする対象にMTMR2-Sポリペプチドを送達する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
MTM1突然変異又は欠損に関連する疾患又は障害の処置における使用のための、MTMR2-Sポリペプチド、又は前記MTMR2-Sポリペプチドを産生する核酸配列。
【請求項２】
中心核ミオパチーの処置における使用のための、請求項1に記載の使用のための、MTMR2-Sポリペプチド、又は前記MTMR2-Sポリペプチドを産生する核酸配列。
【請求項３】
X連結CNM、常染色体劣性CNM、及び常染色体優性CNMの、更に具体的にはXLCNMの処置における使用のための、請求項1又は2に記載の使用のための、MTMR2-Sポリペプチド、又は前記MTMR2-Sポリペプチドを産生する核酸配列。
【請求項４】
使用が筋肉機能を改善する又は筋肉の形成を増やすためである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の使用のための、MTMR2-Sポリペプチド、又は前記MTMR2-Sポリペプチドを産生する核酸配列。
【請求項５】
MTMR2-Sポリペプチドが、
配列番号1に少なくとも90%同一(又は相同)なアミノ酸配列を有するポリペプチド、又はその生理活性な断片若しくは変異体;
配列番号1に少なくとも80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%又は100%同一なアミノ酸配列を含み、571アミノ酸長以下であるポリペプチド、又はその生理活性な断片若しくは変異体
からなる群から選択される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の使用のための、MTMR2-Sポリペプチド、又は前記MTMR2-Sポリペプチドを産生する核酸配列。
【請求項６】
MTMR2-Sポリペプチドを産生する又はコードする核酸配列が、裸の核酸配列である又はそのようなポリペプチドを産生するのに有用な構築物若しくはその構築物を含むベクター内にある、請求項1〜5のいずれか一項に記載の使用のための、MTMR2-Sポリペプチド、又は前記MTMR2-Sポリペプチドを産生する核酸配列。
【請求項７】
核酸配列が配列番号2、3、4又は5のうちの少なくとも1つを含む配列を含む、請求項6に記載の使用のための、MTMR2-Sポリペプチド、又は前記MTMR2-Sポリペプチドを産生する核酸配列。
【請求項８】
MTMR2-Sポリペプチド、又は前記MTMR2-Sポリペプチドを産生する核酸配列を、好ましくは薬学的に許容される支持体中に含む組成物。
【請求項９】
MTMR2-Sポリペプチド、又は前記MTMR2-Sポリペプチドを産生する核酸配列が、請求項5〜7のいずれか一項において定義されている通りである、請求項8に記載の組成物。
【請求項１０】
中心核ミオパチー、好ましくはXLCNMを含む、MTM1突然変異又は欠損に関連する疾患又は障害の処置における使用のための、請求項8又は9に記載の組成物。
【請求項１１】
MTMR2-Sポリペプチドをコードする核酸配列であって、前記ポリペプチドの産生を指示する1つ又は複数の制御配列に作動可能に連結されている核酸配列を含む核酸構築物、組換え発現ベクター、又は組換え宿主細胞。
【請求項１２】
核酸配列又はMTMR2-Sポリペプチドが請求項5〜7のいずれか一項に定義されている通りである、請求項11に記載の核酸構築物、組換え発現ベクター、又は組換え宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、MTM1突然変異又は欠損に関連する疾患又は障害の処置における使用のためのMTMR2-Sポリペプチド、又は前記MTMR2-Sポリペプチドを産生する若しくはコードする核酸配列に関する。本発明は、それを必要とする対象における、MTM1突然変異又は欠損に関連するミオパチー又は疾患又は障害の処置のための組成物及び方法を提供する。本発明は、中心核ミオパチーを抱えた対象等の、改善された筋肉機能を必要とする対象にMTMR2-Sポリペプチドを送達する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
中心核ミオパチー(CNM)は、筋力低下を特徴とし、組織学的には、筋再生に続発しない線維萎縮、I型線維の優勢及び、核の集中化の増加により確かめられる一群の先天性ミオパチーである。3つの主な特徴的形態のCNMの間で、X連鎖中心核ミオパチー(XLCNM、筋細管ミオパチー-XLMTM、又はOMIM310400とも呼ばれる)が最も一般的で重症型のCNMであり、新生児期発症及び死亡は生後数年で発生することが多い(Jungbluth、H.ら、Orphanet J Rare Dis、2008年、3: 26頁)。出生後期を過ぎるまでの生存には、多くの場合胃瘻造設給餌及び人工呼吸を含む集中的支援が必要である。現在、この障害に対して利用可能な治療法も効果的な処置もない。
【０００３】
XLCNMは、ホスホイノシチドホスファターゼミオチューブラリン(MTM1)の突然変異に起因する(Laporte、J.ら、Nature Genetics、1996年、13(2): 175〜82頁)。現在まで、約450家族でMTM1の200を超える異なる突然変異が報告されており、その突然変異の大半がタンパク質の強い減少をもたらす。Mtm1ノックアウト又はノックインマウスは以前に特徴付けられており、このマウスは、筋力の対応する低下に伴う、異常なオルガネラ配置、核の誤った局在化及び筋萎縮を含む古典的組織学的特長を有するCNM表現型を再現する(Buj-Bello A、Laugel V、Messaddeq N、Zahreddine H、Laporte J、Pellissier JF、Mandel JL.、The lipid phosphatase myotubularin is essential for skeletal muscle maintenance but not for myogenesis in mice、Proc Natl Acad Sci U S A. 2002年11月12日; 99(23):15060〜5頁、Epub 2002年10月21日; Pierson CR、Dulin-Smith AN、Durban AN、Marshall ML、Marshall JT、Snyder AD、Naiyer N、Gladman JT、Chandler DS、Lawlor MW、Buj-Bello A、Dowling JJ、Beggs AH.、Hum Mol Genet. 2012年2月15日;21(4):811〜25頁、doi: 10.1093/hmg/ddr512. Epub 2011年11月7日; Mol Cell Biol. 2013年1月;33(1):98〜110頁、doi: 10.1128/MCB.01075-12. Epub 2012年10月29日.Defective autophagy and mTORC1 signaling in myotubularin null mice. Fetalvero KM、Yu Y、Goetschkes M、Liang G、Valdez RA、Gould T、Triantafellow E、Bergling S、Lour
eiro J、Eash J、Lin V、Porter JA、Finan PM、Walsh K、Yang Y、Mao X、Murphy LO)。異常な興奮収縮連関に関連するトライアド構造の欠損が、異なる形態のCNMを有するいくつかの動物モデル及び患者で検出されており、すべてのCNM形態で共通の欠損を確認している(Toussaint A.ら、Acta Neuropathol. 2011年2月; 121(2):253〜66頁)。これは、トライアドの筋小胞体構成成分上のホスホイノシチドレベルの調節でのMTM1の提唱される役割と一致している。ミオチューブラリン関連タンパク質2でのホスファターゼ活性の喪失は、シャルコーマリートゥース病4B1型と関連している(Charcot-Marie-Tooth type 4B is caused by mutations in the gene encoding myotubularin-related protein-2.、Bolino A、Muglia M、Conforti FL、LeGuern E、Salih MA、Georgiou DM、Christodoulou K、Hausmanowa-Petrusewicz I、Mandich P、Schenone A、Gambardella A、Bono F、Quattrone A、Devoto M、Monaco AP. Charcot-Marie-Tooth type 4B is caused by mutations in the gene encoding myotubularin-related protein-2 - Nat Genet. 2000年5月;25(1):17〜9頁)。
【０００４】
ミオチューブラリン及びミオチューブラリン関連タンパク質(MTM)は、異なる神経筋疾患に関連付けられる保存されたタンパク質ファミリーを規定する(Raess, M.A.、Friant,  S.、Cowling, B.S.、及びLaporte, J. (2016). WANTED - Dead or alive: Myotubularins、a large disease-associated protein family. Adv Biol Regul.)。そのタンパク質はホスファターゼスーパーファミリーに分類されている。ヒトでは、8つのミオチューブラリンがチロシン及び二重特異性ホスファターゼに見られるC(X)5Rモチーフを共有して酵素活性を示し、その他の6つのミオチューブラリンはこのモチーフを欠き、デッドホスファターゼと名付けられている。予想外に、酵素的に活性なミオチューブラリンがタンパク質には作用せず、特定の膜サブドメインに集中する脂質である、脱リン酸ホスホイノシチド(PPIn)に作用することが見出された(Blondeau, F.、Laporte, J.、Bodin, S.、Superti-Furga, G.、Payrastre, B.、及びMandel, J.L. (2000). Myotubularin, a phosphatase deficient in myotubular myopathy, acts on phosphatidylinositol 3-kinase and phosphatidylinositol 3-phosphate pathway. Hum Mol Genet 9、2223〜2229頁;Taylor, G.S.、Maehama, T.、及びDixon, J.E. (2000)). Inaugural article: myotubularin, a protein tyrosine phosphatase mutated in myotubular myopathy, dephosphorylates the lipid second messenger、phosphatidylinositol 3-phosphate. Proc Natl Acad Sci U S A 97、8910〜8915頁)。PPInは、シグナル伝達及び細
胞内組織化を含む広範囲の細胞プロセルに関連付けられる脂質二次メッセンジャーである(Vicinanza, M.、D'Angelo, G.、Di Campli, A.、及びDe Matteis、M.A. (2008). Function and dysfunction of the PI system in membrane trafficking. EMBO J 27、2457〜2470頁)。ミオチューブラリンは、ホスファチジルイノシトール3-ホスフェート(PtdIns3P)及びホスファチジルイノシトール3,5-ビスホスフェート(PtdIns(3,5)P2)を脱リン酸して、PtdIns5Pを産生するPPIn 3-ホスファターゼである(Berger, P.、Bonneick, S.、Willi, S.、Wymann, M.、and Suter, U. (2002). Inaugural article: myotubularin, a protein tyrosine phosphatase mutated in myotubular myopathy, dephosphorylates the lipid second messenger、phosphatidylinositol 3-phosphate. Proc Natl Acad Sci U S A 97、8910〜8915頁; Tronchere, H.、Laporte, J.、Pendaries, C.、Chaussade, C.、Liaubet, L.、Pirola, L.、Mandel, J.L.、及びPayrastre, B. (2004). Production of phosphatidylinositol 5-phosphate by the phosphoinositide 3-phosphatase myotubularin in mammalian cells. (Tronchere H、Laporte J、Pendaries C、Chaussade C、Liaubet L、Pirola L、Mandel JL、Payrastre B. J Biol Chem. 2004年2月20日;279(8):7304〜12頁、Epub 2003年12月1日)。PtdIns5Pは転写調節及び成長因子シグナル伝達に関連付けられており、PtdIns3P及びPtdIns(3,5)P2は膜輸送及びオートファジーを調節する。PtdIns3PはクラスII及びIII PtdIns 3-キナーゼによるPtdInsのリン酸化によって産生され、PtdIns(3,5)P2は、主にPIKfyveによるPtdIns3Pのリン酸化から得られる(Jin, N.、Lang, M.J.、及びWeisman, L.S. (2016). Phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate: regulation of cellular events in space and time. Biochem Soc Trans 44、177〜184頁; Schink, K.O.、Raiborg, C.、及びStenmark, H. (2013). Phosphatidylinositol 3-phosphate, a lipid that regulates membrane dynamics, protein sorting and cell signalling. Bioessays 35、900〜912頁)。それらのホスファターゼは特定のエンドソームプールに又は小胞体にタンパク質を動員し、それぞれエンドソームの成熟及び相互変換又は自己貪食空胞の形成を可能にする。例えば、EEA1のFYVE (Fab1-YOTB-Vac1-EEA1)ドメインは初期エンドソーム上に濃縮しているPtdIns3Pに特異的に結合して、エンドソーム融合及びカーゴ送達を調節する(Schinkら、2013年、前記)。デッドミオチューブラリンはオリゴマー形成し、活性相同物の酵素活性及び/又は細胞内局在を調節する(Berger, P.、Berger, I.、Schaffitzel, C.、Tersar, K.、Volkmer, B.、及びSuter, U. (2006). Multi-level regulation of myotubularin-related protein-2 phosphatase activity by myotubularin-related protein-13/set-binding factor-2. Hum Mol Genet 15、569〜579頁; Kimら、2003年、前
記; Nandurkar, H.H.、Layton, M.、Laporte, J.、Selan, C.、Corcoran, L.、Caldwell, K.K.、Mochizuki, Y.、Majerus, P.W.、及びMitchell, C.A. (2003). Identification of myotubularin as the lipid phosphatase catalytic subunit associated with the 3-phosphatase adapter protein, 3-PAP. Proc Natl Acad Sci U S A 100、8660〜8665頁)。活性又はデッドホスファターゼドメインに加えて、ミオチューブラリンは、PPIn又はタンパク質、及びそのオリゴマー形成に関連付けられているコイルドコイルドメインに結合するPH-GRAM(プレックストリン相同性、グルコース転移酵素、Rab様GTPアーゼ活性化因子及びミオチューブラリン)ドメインを共有する(Raessら、2016年、前記)。
【０００５】
ヒトには14のミオチューブラリン、酵母(出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae))には1つの活性ミオチューブラリンが存在する(Lecompte, O.、Poch, O.、及びLaporte, J. (2008). PtdIns5P regulation through evolution: roles in membrane trafficking? Trends Biochem Sci 33、453〜460頁; Raessら、2016年、前記)。酵母ミオチューブラリン(Ymr1p)は、空胞タンパク質選別及び断片化を調節する(Parrish, W.R.、Stefan, C.J.、及びEmr, S.D. (2004). Essential role for the myotubularin-related phosphatase Ymr1p and the synaptojanin-like phosphatases Sjl2p and Sjl3p in regulation of phosphatidylinositol 3-phosphate in yeast. Mol Biol Cell 15、3567〜3579頁)。酵母においてヒトミオチューブラリンが過剰発現されると、そのホスファターゼ活性の結果として空胞が拡大する(Amoasii, L.、Bertazzi, D.L.、Tronchere, H.、Hnia, K.、Chicanne, G.、Rinaldi, B.、Cowling, B.S.、Ferry, A.、Klaholz, B.、Payrastre, B.ら(2012). Phosphatase-dead myotubularin ameliorates X-linked centronuclear myopathy phenotypes in mice. PLoS Genet 8、e1002965; Blondeauら、2000年、前記)。前述の通り、ヒトでは、ミオチューブラリン1(MTM1)の機能喪失突然変異によりXLCNMと呼ばれる重症の先天性ミオパチーが引き起こされ、活性ミオチューブラリン関連2遺伝子タンパク質(MTMR2)又はデッドミオチューブラリン関連タンパク質MTMR13の突然変異により、シャルコーマリートゥース病(C
MT)末梢性ニューロパチーが引き起こされる(それぞれCMT4B1、OMIM 601382及びCMT4B2、OMIM 604563) (Azzedine, H.、Bolino, A.、Taieb, T.、Birouk, N.、Di Duca, M.、Bouhouche, A.、Benamou, S.、Mrabet, A.、Hammadouche, T.、Chkili, T.ら(2003). Mutations in MTMR13, a New Pseudophosphatase Homologue of MTMR2 and Sbf1, in Two Families with an Autosomal Recessive Demyelinating Form of Charcot-Marie-Tooth Disease Associated with Early-Onset Glaucoma. Am J Hum Genet 72、1141〜1153頁; Bolino, A.、Muglia, M.、Conforti, F.L.、LeGuern, E.、Salih, M.A.、Georgiou, D.M.、Christodoulou, K.、Hausmanowa-Petrusewicz, I.、Mandich, P.、Schenone, A.ら(2000). Charcot-Marie-Tooth type 4B is caused by mutations in the gene encoding myotubularin-related protein-2. Nat Genet 25、17〜19頁; Senderek, J.、Bergmann, C.、Weber, S.、Ketelsen, U.P.、Schorle, H.、Rudnik-Schoneborn, S.、Buttner, R.、Buchheim, E.、及びZerres, K. (2003). Mutation of the SBF2 gene, encoding a novel member of the myotubularin family, in Charcot-Marie-Tooth neuropathy type 4B2/11p15. Hum Mol Genet 12、349〜356頁)。更に、MTMR5 (Sbf1)における推定突然変異はCMT4B3 (OMIM 615284)及び軸索型ニューロパチーに関連付けられた(Alazami, A.M.、Alzahrani, F.、Bohlega, S.、及びAlkuraya, F.S. (2014). SET binding factor 1 (SBF1) mutation causes Charcot-Marie-tooth disease type 4B3. Neurology 82、1665〜1666頁; Manole, A.、Horga, A.、Gamez, J.、Raguer, N.、Salvado, M.、San Millan, B.、Navarro, C.、Pittmann, A.、Reilly, M.M.、及びHoulden, H. (2016). SBF1 mutations associated with autosomal recessive axonal neuropathy with cranial nerve involvement. Neurogenetics; Nakhroら、2013年)。
【０００６】
したがって、ミオチューブラリンの相同体は遍在性に発現しているが、1つのミオチューブラリンが欠如するとその相同体では完全に代償されない。更に、関連疾患は異なる組織を冒す。注目すべきは、MTM1及びMTMR2は、その配列に基づいて同じ進化的なサブグループの一部である(Lecompteら、2008年、前記)。したがって、これにより、異なる活性又は異なる相互作用物質を潜在的に反映している、特徴付けられていない組織特異的機能が示唆される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第5,399,346号
【特許文献２】米国特許第5,580,859号
【特許文献３】米国特許第5,589,466号
【特許文献４】国際公開第01/96584号
【特許文献５】国際公開第01/29058号
【特許文献６】米国特許第6,326,193号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Jungbluth, H.ら、Orphanet J Rare Dis、2008年、3: 26頁
【非特許文献２】Laporte, J.ら、Nature Genetics、1996年、13(2): 175〜82頁
【非特許文献３】Buj-Bello A、Laugel V、Messaddeq N、Zahreddine H、Laporte J、Pellissier JF、Mandel JL.、The lipid phosphatase myotubularin is essential for skeletal muscle maintenance but not for myogenesis in mice、Proc Natl Acad Sci U S A. 2002年11月12日; 99(23):15060〜5頁、Epub 2002年10月21日
【非特許文献４】Pierson CR、Dulin-Smith AN、Durban AN、Marshall ML、Marshall JT、Snyder AD、Naiyer N、Gladman JT、Chandler DS、Lawlor MW、Buj-Bello A、Dowling JJ、Beggs AH.、Hum Mol Genet. 2012年2月15日;21(4):811〜25頁、doi: 10.1093/hmg/ddr512. Epub 2011年11月7日
【非特許文献５】Mol Cell Biol. 2013年1月;33(1):98〜110頁、doi: 10.1128/MCB.01075-12. Epub 2012年10月29日.Defective autophagy and mTORC1 signaling in myotubularin null mice. Fetalvero KM、Yu Y、Goetschkes M、Liang G、Valdez RA、Gould T、Triantafellow E、Bergling S、Loureiro J、Eash J、Lin V、Porter JA、Finan PM、Walsh K、Yang Y、Mao X、Murphy LO
【非特許文献６】Toussaint A.ら、Acta Neuropathol. 2011年2月; 121(2):253〜66頁
【非特許文献７】Bolino A、Muglia M、Conforti FL、LeGuern E、Salih MA、Georgiou DM、Christodoulou K、Hausmanowa-Petrusewicz I、Mandich P、Schenone A、Gambardella A、Bono F、Quattrone A、Devoto M、Monaco AP. Charcot-Marie-Tooth type 4B is caused by mutations in the gene encoding myotubularin-related protein-2 - Nat Genet. 2000年5月;25(1):17〜9頁
【非特許文献８】Raess, M.A.、Friant, S.、Cowling, B.S.、and Laporte, J. (2016). WANTED - Dead or alive: Myotubularins、a large disease-associated protein family. Adv Biol Regul.
【非特許文献９】Blondeau, F.、Laporte, J.、Bodin, S.、Superti-Furga, G.、Payrastre, B.、and Mandel, J.L. (2000). Myotubularin, a phosphatase deficient in myotubular myopathy, acts on phosphatidylinositol 3-kinase and phosphatidylinositol 3-phosphate pathway. Hum Mol Genet 9、2223〜2229頁
【非特許文献１０】Taylor, G.S.、Maehama, T.、and Dixon, J.E. (2000)). Inaugural article: myotubularin, a protein tyrosine phosphatase mutated in myotubular myopathy, dephosphorylates the lipid second messenger、phosphatidylinositol 3-phosphate. Proc Natl Acad Sci U S A 97、8910〜8915頁
【非特許文献１１】Vicinanza, M.、D'Angelo, G.、Di Campli, A.、and De Matteis, M.A. (2008). Function and dysfunction of the PI system in membrane trafficking. EMBO J 27、2457〜2470頁
【非特許文献１２】Berger, P.、Bonneick, S.、Willi, S.、Wymann, M.、and Suter, U. (2002). Inaugural article: myotubularin, a protein tyrosine phosphatase mutated in myotubular myopathy, dephosphorylates the lipid second messenger、phosphatidylinositol 3-phosphate. Proc Natl Acad Sci U S A 97、8910〜8915頁
【非特許文献１３】Tronchere, H.、Laporte, J.、Pendaries, C.、Chaussade, C.、Liaubet, L.、Pirola, L.、Mandel, J.L.、and Payrastre, B. (2004). Production of phosphatidylinositol 5-phosphate by the phosphoinositide 3-phosphatase myotubularin in mammalian cells. (Tronchere H、Laporte J、Pendaries C、Chaussade C、Liaubet L、Pirola L、Mandel JL、Payrastre B. J Biol Chem. 2004年2月20日;279(8):7304〜12頁、Epub 2003年12月1日)
【非特許文献１４】Jin, N.、Lang, M.J.、and Weisman, L.S. (2016). Phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate: regulation of cellular events in space and time. Biochem Soc Trans 44、177〜184頁
【非特許文献１５】Schink, K.O.、Raiborg, C.、and Stenmark, H. (2013). Phosphatidylinositol 3-phosphate, a lipid that regulates membrane dynamics, protein sorting and cell signalling. Bioessays 35、900〜912頁
【非特許文献１６】Berger, P.、Berger, I.、Schaffitzel, C.、Tersar, K.、Volkmer, B.、and Suter, U. (2006). Multi-level regulation of myotubularin-related protein-2 phosphatase activity by myotubularin-related protein-13/set-binding factor-2. Hum Mol Genet 15、569〜579頁
【非特許文献１７】Nandurkar, H.H.、Layton, M.、Laporte, J.、Selan, C.、Corcoran, L.、Caldwell, K.K.、Mochizuki, Y.、Majerus, P.W.、and Mitchell, C.A. (2003). Identification of myotubularin as the lipid phosphatase catalytic subunit associated with the 3-phosphatase adapter protein, 3-PAP. Proc Natl Acad Sci U S A 100、8660〜8665頁
【非特許文献１８】Lecompte, O.、Poch, O.、and Laporte, J. (2008). PtdIns5P regulation through evolution: roles in membrane trafficking? Trends Biochem Sci 33、453〜460頁
【非特許文献１９】Parrish, W.R.、Stefan, C.J.、and Emr, S.D. (2004). Essential role for the myotubularin-related phosphatase Ymr1p and the synaptojanin-like phosphatases Sjl2p and Sjl3p in regulation of phosphatidylinositol 3-phosphate in yeast. Mol Biol Cell 15、3567〜3579頁
【非特許文献２０】Amoasii, L.、Bertazzi, D.L.、Tronchere, H.、Hnia, K.、Chicanne, G.、Rinaldi, B.、Cowling, B.S.、Ferry, A.、Klaholz, B.、Payrastre, B.ら(2012). Phosphatase-dead myotubularin ameliorates X-linked centronuclear myopathy phenotypes in mice. PLoS Genet 8、e1002965
【非特許文献２１】Azzedine, H.、Bolino, A.、Taieb, T.、Birouk, N.、Di Duca, M.、Bouhouche, A.、Benamou, S.、Mrabet, A.、Hammadouche, T.、Chkili, T.ら(2003). Mutations in MTMR13, a New Pseudophosphatase Homologue of MTMR2 and Sbf1, in Two Families with an Autosomal Recessive Demyelinating Form of Charcot-Marie-Tooth Disease Associated with Early-Onset Glaucoma. Am J Hum Genet 72、1141〜1153頁
【非特許文献２２】Senderek, J.、Bergmann, C.、Weber, S.、Ketelsen, U.P.、Schorle, H.、Rudnik-Schoneborn, S.、Buttner, R.、Buchheim, E.、and Zerres, K. (2003). Mutation of the SBF2 gene, encoding a novel member of the myotubularin family, in Charcot-Marie-Tooth neuropathy type 4B2/11p15. Hum Mol Genet 12、349〜356頁
【非特許文献２３】Alazami, A.M.、Alzahrani, F.、Bohlega, S.、and Alkuraya, F.S. (2014). SET binding factor 1 (SBF1) mutation causes Charcot-Marie-tooth disease type 4B3. Neurology 82、1665〜1666頁
【非特許文献２４】Manole, A.、Horga, A.、Gamez, J.、Raguer, N.、Salvado, M.、San Millan, B.、Navarro, C.、Pittmann, A.、Reilly, M.M.、and Houlden, H. (2016). SBF1 mutations associated with autosomal recessive axonal neuropathy with cranial nerve involvement. Neurogenetics
【非特許文献２５】Sambrookら(2001年、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、New York)
【非特許文献２６】Wuら、2005年、Gene Ther、12(6): 477〜486頁
【非特許文献２７】P. Maliら、Nature Methods、vol. 10 No. 10、2013年10月
【非特許文献２８】Remington: The Science and Practice of Pharmacy (第20版)、A. R. Gennar、Lippincott Williams & Wilkins編、2000年
【非特許文献２９】Encyclopedia of Pharmaceutical Technology、 J. Swarbrick and J. C. Boylan編、1988〜1999頁、Marcel Dekker、New York
【非特許文献３０】Alberti, S.、Gitler, A.D. and Lindquist, S. (2007) A suite of Gateway cloning vectors for high-throughput genetic analysis in Saccharomyces cerevisiae. Yeast、24、913〜919頁
【非特許文献３１】Van Mullem, V.、Wery, M.、De Bolle, X. and Vandenhaute, J. (2003) Construction of a set of Saccharomyces cerevisiae vectors designed for recombinational cloning. Yeast、20、739〜746頁
【非特許文献３２】Katzmann, D.J.、Stefan, C.J.、Babst, M. and Emr, S.D. (2003) Vps27 recruits ESCRT machinery to endosomes during MVB sorting. J. Cell Biol.、162、413〜423頁
【非特許文献３３】Bolino, A.、Marigo, V.、Ferrera, F.、Loader, J.、Romio, L.、Leoni, A.、Di Duca, M.、Cinti, R.、Cecchi, C.、Feltri, M.L.ら(2002) Molecular characterization and expression analysis of Mtmr2, mouse homologue of MTMR2、the Myotubularin-related 2 gene, mutated in CMT4B. Gene、283、17〜26頁
【非特許文献３４】Hama, H.、Takemoto, J.Y. and DeWald, D.B. (2000) Analysis of phosphoinositides in protein trafficking. Methods、20、465〜473頁
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【非特許文献３７】Cowling, B.S.、Chevremont, T.、Prokic, I.、Kretz, C.、Ferry, A.、Coirault, C.、Koutsopoulos, O.、Laugel, V.、Romero, N.B. and Laporte, J. (2014) Reducing dynamin 2 expression rescues X-linked centronuclear myopathy. J Clin Invest、124、1350〜1363頁
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【非特許文献３９】Begley, M.J.、Taylor, G.S.、Brock, M.A.、Ghosh, P.、Woods, V.L. and Dixon, J.E. (2006) Molecular basis for substrate recognition by MTMR2、a myotubularin family phosphoinositide phosphatase. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.、103、927〜932頁
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【非特許文献４４】Buj-Belloら、2002年; Cowling, B.S.、Chevremont, T.、Prokic, I.、Kretz, C.、Ferry, A.、Coirault, C.、Koutsopoulos, O.、Laugel, V.、Romero, N.B. and Laporte, J. (2014) J Clin Invest、124、1350〜1363頁
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【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、適切な中心核ミオパチー処置の、特に新しいもっと効果的な治療薬の大きな必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
ここでは、MTM1及びMTMR2のインビボ機能を酵母及びマウスにおいて比較し、MTMR2の特定のアイソフォームがMTM1の喪失を極めて効率的に代償する能力を有することが見出された。そのようなMTMR2型はMtm1KOマウスにより示されるミオパチーをレスキューすることが可能であり、このせいでMTMR2は中心核ミオパチーの処置のための、もっと具体的にはXLCNMの処置のための効果的な薬剤になる。
【００１１】
本開示は、中心核ミオパチーを処置するための又はMTM1突然変異若しくは欠損に関連する疾患若しくは障害を処置するための方法及び組成物を提供する。本発明は、それを必要とする対象におけるミオパチー又はMTM1突然変異若しくは欠損に関連する疾患若しくは障害を処置するための組成物又は方法を提供する。本発明は、本明細書ではMTMR2の短アイソフォームと呼ばれる特定のMTMR2ポリペプチドを、改善された筋肉機能を必要とする対象に送達する方法に関する。本発明の組成物及び方法は、対象において筋肉の形成を増やし筋肉機能を改善する。
【００１２】
一実施形態において、本発明は、ミオパチーを抱える個体を処置するのに有用である。別の実施形態において、本発明はXLCNMを抱える個体を処置するのに有用である。本発明は、罹災対象において筋肉機能を改善し生存を延長する。しかし、本発明は、XLCNMを有する対象に限定されない。むしろ、本発明は、改善された筋肉機能を必要とするいかなる対象でも筋肉機能を改善するのに、又はMTM1突然変異若しくは欠損に関連する疾患若しくは障害を処置するのに適用可能である。
【００１３】
特定の態様では、本発明は、本明細書ではMTMR2の短アイソフォームと呼ばれる特定のMTMR2ポリペプチド又は前記特定のMTMR2ポリペプチドを産生する若しくはコードする核酸配列を含む組成物に関する。前記組成物は、中心核ミオパチーの処置において使用するため又はMTM1突然変異若しくは欠損に関連する疾患若しくは障害を処置するためのものであり得る。
【００１４】
特定の実施形態では、中心核ミオパチーは、X連結CNM(XLCNM)、常染色体劣性CNM(ARCNM)、及び常染色体優性CNM(XLCNM)からなる群から選択される。好ましい実施形態では、中心核ミオパチーはXLCNMである。
【００１５】
本発明は、MTMR2ポリペプチドの短アイソフォームを含む単離されたポリペプチド並びにMTMR2ポリペプチドの短アイソフォームを医薬担体と組み合わせて含む医薬組成物も提供する。
【００１６】
そのようなポリペプチドを産生するのに有用な構築物も開示される。更に、本発明は、そのようなポリペプチド又はそのようなポリペプチドをコードする構築物を作る方法に関する。更に、例えば、MTM1突然変異又は欠損に関連する疾患又は障害を処置のために、前記ポリペプチドを使用する方法が本明細書で開示される。
【００１７】
本発明のこれらの及び他の目的並びに実施形態は、本発明の詳細な説明後には更に明白になる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】MTMR2スプライシングアイソフォームは差示的に発現され、長い及び短いタンパク質アイソフォームをコードする。(A)GTExデータベース採掘由来の20のヒト組織におけるMTMR2 mRNAアイソフォームV1〜V4の相対的発現(上)。ヒトMTMR2 V2アイソフォームはV1と比べて追加のエキソン1a及び2aを含有し、V3はエキソン1aを含有し、V4はエキソン1a及び2bを含有する。それぞれのアイソフォームの単独での組織発現(下)。(B)MTM1と比べて、V1 mRNAアイソフォームによりコードされるタンパク質ドメインMTMR2-L、及びその他のアイソフォームによりコードされるMTMR2-S。
【図２】短MTMR2アイソフォームはMTM1様の活性を示すが、長MTMR2アイソフォームはMTM1様の活性を示さない。ymr1Δ酵母細胞において高コピー数のプラスミド2μを使用するヒトMTM1及びMTMR2長及び短アイソフォームの外因性発現。(A)同じ試料を用いる2つの独立したブロットでの、抗MTM1又は抗MTMR2抗体を使用するウェスタンブロットによる外因性に発現されるヒトミオチューブラリンの検出。空ベクターを有する野生型(WT)及びymr1Δ酵母株を対照として使用する。pgk1pは負荷対照として使用される。このブロットは少なくとも3つの独立した実験を表している。(B)タグ付けされていないミオチューブラリンを過剰発現している酵母細胞における空胞形態の定量化。構築物あたり分析された3つのクローン;クローンあたり計数された細胞の数は上に示されている。データは平均±s.e.m.を表す。***p<0.0001、ns  有意ではない(ANOVA検定)。(C)GFPタグ付けヒトミオチューブラリンの局在性。空胞形態は親油性色素FM4-64及びノマルスキー微分コントラストにより評価される。ymr1Δ酵母細胞及びMTMR2-L発現細胞は断片化された空胞を示し、MTM1及びMTMR2-S過剰発現細胞は大きな空胞を有する。(D)タグ付けされていないミオチューブラリンを発現している酵母クローンにおけるFYVE中断局在化及びPtdIns3Pに特異的に結合するDsREDタグ付けFYVEドメイン。(E)(D)において表される細胞あたりのFYVE陽性ドットの数を計数することによるPtdIns3Pの定量化。PtdIns3PはMTM1及びMTMR2-S発現により減少するがMTMR2-Lでは減少しない。データは平均±s.e.m.を表す。*p<0.05、**p<0.01、(ANOVA検定)。(F)タグ付けされていないミオチューブラリンを過剰発現している酵母細胞由来の全脂質抽出物上でのマスアッセイによるPtdIns5Pの定量化。構築物あたり分析される3つのクローン。データは平均±s.e.m.を表す。*p<0.05 (ANOVA検定)。
【図３】Mtml KOミオパチーマウスにおいてはMTM1と同様にMTMR2短アイソフォームは筋肉重量及び筋力をレスキューする。生後2〜3週間のMtml KOマウス由来のTA筋肉にミオチューブラリンを発現しているAAV2/1を注射し、4週間後に分析した。(A)抗MTM1又は抗MTMR2抗体を使用するウェスタンブロットによる外因性に発現されるヒトミオチューブラリンの検出;GAPDHを負荷対照として使用する。非特異的バンドは星印により示される。このブロットはそれぞれの構築物を表し、構築物あたり少なくとも10の筋肉を分析した。(B)空AAVを注射した反対側の脚と比べたヒトミオチューブラリンを発現しているTAの筋肉重量の比。MTM1と同様にMTMR2-Sは筋肉量を改善し、MTNR2-Lは何の効果もなかった。空のAAVを注射されたMtml KOマウスについて値1が設定された。n>10。データは平均±s.e.m.を表す。****p<0.0001、ns  有意ではない(ANOVA検定)。(C)TA筋肉の特定の最大力(絶対値)。両方のMTMR2アイソフォームは筋力を改善した。n>7。データは平均±s.e.m.を表す。**p<0.01、****p<0.0001、ns  有意ではない(ANOVA検定)。
【図４】両方の長及び短MTMR2アイソフォームはMtml KOマウスの組織学的特質を改善する。Mtml KOマウス由来のTA筋肉に生後2〜3週間でミオチューブラリンを発現しているAAV2/1を注射し、4週間後に分析した。(A)TA筋肉切片のヘマトキシリン-エオジン染色。スケールバー100μm。(B)TA筋肉切片のコハク酸脱水素酵素(SDH)染色。スケールバー100μm。(C)線維領域の定量化。線維サイズは200μm2間隔でグループ分けし、それぞれのグループで全線維のパーセントとして表す。8頭のマウスでn>1000。(D)800μm2を超える線維のパーセント。n>8。データは平均±s.e.m.を表す。*p<0.05、***p<0.001、****p<0.0001 (ANOVA検定)。WTの値は、すべてのMtml KO注射群とは統計的に異なっている。(E)TA筋肉での核の配置。良好な位置にある周辺核のパーセント。n>6動物。データは平均±s.e.m.を表す。***p<0.001、****p<0.0001(ANOVA検定)。WTの値は、すべてのMtml KO注射群とは統計的に異なっている。
【図５】MTMR2アイソフォームはMtml KO筋肉の筋肉超微細構造及びトライアド形態をレスキューする。Mtml KOマウス由来のTA筋肉にミオチューブラリンを発現しているAAV2/1を注射した。(A)サルコメア、ミトコンドリア及びトライアド組織を示している電子顕微鏡写真。スケールバー1μm。代表的なトライアドは拡大枠に示されている。(B)サルコメアあたりの整然としたトライアドの数の定量化。2頭のマウスそれぞれについてn>20画像。ミオチューブラリンを発現しているすべての筋肉はMtml KOとは異なった数値化を行う。データは平均±s.e.m.を表す。*p<0.05、****p<0.0001 (ANOVA検定)。
【図６】MTMR2-S短アイソフォームはMtml KOマウスでは減少しており、その過剰発現はPtdIns3Pレベルを正常化する。(A)異なるミオチューブラリンを発現しているMtml KOマウス由来のTA筋肉における及びWT筋肉における競合ELISAによるPtdIns3Pレベルの定量化。n>3マウス。データは平均±s.e.m.を表す。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001 (ANOVA検定)。異なるミオチューブラリンを発現しているMtml KO筋肉でのPtdIns3PレベルはWT対照とは統計的に異なってはいない。(B)WTマウスと比べたMtml KOマウスのTA筋肉におけるMTMR2アイソフォーム(V1〜V4)のqRT-PCRによる定量化。n>6。それぞれのアイソフォームは独立した比として提示され、WTマウスにおける発現に値1が設定されている。データは平均±s.d.を表す。**p<0.01、***p<0.001、****p<0.0001、ns  有意ではない(スチューデントt-検定)。(C)対照と比べたMTM1患者の筋肉におけるMTMR2アイソフォーム(V1〜V4)のqRT-PCRによる定量化。N=3。それぞれのアイソフォームは独立した比として提示され、対照患者における発現に値1が設定されている。データは平均±s.d.を表す。P値はアイソフォームごとに示される(スチューデントt-検定)。
【図７】ヒト及びマウスにおけるMTMR2 mRNA及びタンパク質アイソフォーム。(A)マウスにおけるMTMR2のゲノム構造及びmRNAアイソフォーム。選択的エキソン1a又は2aのいかなる組合せの包含も中途終止コドンをもたらし、エキソン3での選択的開始部位を明らかにする。マウスMTMR2 V1はMTMR2-Lをコードし、アイソフォームV2〜V4はMTMR2-Sをコードする。(B)ヒト及びマウスMTM1、MTMR2-L及びMTMR2-SのN末端領域のタンパク質アラインメント。PH-GRAMドメインは75位で開始する。(C)筋肉由来のRT-PCR産物の塩基配列決定からのマウス選択的エキソン1a及び2aの配列。(D)WT及びMtml KOマウスから単離されたTA筋肉由来の並びにWT肝臓由来のcDNA上のMTMR2のエキソン1と3の間のPCR。4つのmRNA変異体が検出される。
【図８】WTマウスではMTMR2アイソフォームの発現は筋肥大を誘導しない。WTマウス由来のTA筋肉に生後3週間目でミオチューブラリンを発現しているAAV2/1を注射し、4週間後に分析した。空AAVを注射した反対側の脚と比べたヒトミオチューブラリンを発現しているTAの筋肉重量の比。WT TA筋肉重量について値1が設定される。データは平均±s.e.m.を表す。有意差はなかった(ANOVA検定)。
【図９】MTMR2-Sアイソフォームはミオパチーマウスの体重を改善する。異なるミオチューブラリンを過剰発現しているMtm1 KO又はWTマウスの生後3週から最大10週までの体重の測定。
【図１０】MTMR2-SアイソフォームはMtm1 KOマウスの筋力をレスキューする。異なるミオチューブラリンを過剰発現しているMtm1 KO又はWTマウスの筋力は、生後3週から10週までの各週のハンギング試験により評価した。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
別段に定義されていなければ、本明細書で使用されるすべての専門及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者一般に理解しているのと同じ意味を有する。
【００２０】
冠詞「a」及び「an」は、冠詞の文法上の対象の1つ又は1つよりも多い(即ち、少なくとも1つ)を指すために本明細書では使用される。例によれば、「an element」は、1つの要素又は1つよりも多い要素を意味する。
【００２１】
量、時間的期間等の測定可能値を指す場合に本明細書で使用される「約(about)」は、所定値から±20%又は±10%、更に好ましくは±5%、更に好ましくは±1%、更に好ましくは±0.1%の変動を包含するように意図されてる。これは、このような変動は開示された方法又は組成物を実施するのに適しているからである。
【００２２】
範囲:本開示全体を通じて、本発明の種々の態様は範囲形式で提示することが可能である。範囲形式での説明は便宜及び簡潔さのためであることを理解するべきであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない制限と解釈するべきではない。したがって、範囲の説明は、その範囲内のすべての可能な部分的範囲並びに個々の数値を具体的に開示していると見なすべきである。例えば、1から6まで等の範囲の説明は、1から3まで、1から4まで、1から5まで、2から4まで、2から6まで、3から6まで、等の部分的範囲、並びにその範囲内の個々の数字、例えば、1、2、2.7、3、4、5、5.3及び6を具体的に開示していると見なすべきである。これは、範囲の幅とは無関係に当てはまる。
【００２３】
本発明によれば、用語「含む(comprise(s))」又は「含む(comprising)」(及び他の匹敵する用語、例えば、「含有する(containing)」及び「含む(including)」)は「開放式」であり、具体的に言及された特長のすべて並びにいかなる任意選択の、追加の及び特定されていない特長も含まれるように一般的に解釈することが可能である。特定の実施形態によれば、前記用語は、請求されている発明の基本的及び新規の特徴に実質的な影響を及ぼさない特定の特長並びにいかなる任意選択の、追加の及び特定されていない特長も含まれる語句「から本質的になる」又は別段に記述されていなければ、特定の特長のみが含まれる語句「からなる」と解釈することも可能である。
【００２４】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は本明細書では互換的に使用されて、ペプチド結合により共有結合しているアミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、1つ又は複数のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工的化学的模倣物であるアミノ酸ポリマーに、並びに天然に存在するアミノ酸ポリマー及び天然には存在しないアミノ酸ポリマーに当てはまる。「ポリペプチド」は、例えば、とりわけ、生物学的に活性な断片、実質的に相同性のポリペプチド、オリゴペプチド、ホモダイマー、ヘテロダイマー、ポリペプチドの変異体、改変ポリペプチド、誘導体、類似物、融合タンパク質を含む。ポリペプチドは、天然ペプチド、組換えペプチド、合成ペプチド、又はその組合せを含む。
【００２５】
本明細書で使用される場合、「疾患又は障害を処置する」とは、疾患又は障害の症状を患者が体験する頻度を低減することを意味する。疾患及び障害は本明細書では互換的に使用される。本明細書で使用される疾患を「処置する」ことは、対象が体験する疾患又は障害の少なくとも1つの徴候又は症状の頻度又は重症度を低減することを意味する。本発明の文脈内では、用語処置は、根治的処置、対処療法及び予防処置を表す。本明細書で使用される場合、用語疾患の「処置」とは、治療及び疾患進行の遅延等の対象(又は患者)の寿命を延ばすように意図されている任意の行為のことである。処置は、疾患を根絶する、疾患の進行を止める、及び/又は疾患の後退を促進するように設計することが可能である。用語疾患の「処置」とは、筋緊張低下及び筋力低下等の疾患に関連する症状を減らすように意図されている任意の行為のことでもある。更に具体的には、本発明に従った処置は、中心核ミオパチー表現型又は症状の出現を遅らせる、運動行動及び/又は筋肉行動及び/又は寿命を回復させることが意図されている。
【００２６】
疾患又は障害は、疾患又は障害の症状の重症度、そのような症状を患者が体験する頻度、又はその両方が低減された場合は、「軽減される」。「治療的」処置は、病理の徴候を示す対象に、それらの徴候の少なくとも1つ又はすべてを減少させる又は除去する目的で施される処置である。
【００２７】
本明細書で使用される語句「治療有効量」とは、対象に有益な効果を提供する又はそのような疾患の症状を軽減するを含む、疾患又は障害を予防する又は処置する(その発病を遅らせる若しくは予防する、その進行を妨げる、それを阻害する、減少する又は好転させる)のに十分である又は効果的である量のことである。
【００２８】
用語「患者」、「対象」、「個体」、等は本明細書では互換的に使用され、インビトロであれインビボであれ、本明細書に記載される方法を受け入れられる任意の動物、又はその細胞のことである。ある特定の非限定的実施形態では、患者、対象又は個体はヒトである。好ましくは、年齢又は性別が何であれ、対象はヒト患者である。新生児、幼児、子供も同様に含まれる。
【００２９】
「コードする」とは、ヌクレオチドの限定された配列(即ち、rRNA、tRNA及びmRNA)又はアミノ酸の限定された配列及びそこから生じる生物学的特性を有する、生物学的プロセスにおいて他のポリマー及び巨大分子の合成のための鋳型としての役目を果たす遺伝子、cDNA、又はmRNA等のポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドの特定の配列の固有の特性のことである。したがって、遺伝子は、その遺伝子に対応するmRNAの転写及び翻訳が細胞又は他の生物システムにおいてタンパク質を産生する場合には、タンパク質をコードしている。そのヌクレオチド配列がmRNA配列と同一であり通常、配列表で提供されるコード鎖と遺伝子又はcDNAの転写のための鋳型として使用される非コード鎖の両方が、その遺伝子又はcDNAのタンパク質又は他の産物をコードしていると呼ぶことが可能である。
【００３０】
「発現ベクター」とは、発現されるヌクレオチド配列に作動可能に連結されている発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターのことであり、本明細書では構築物と呼ばれる。発現ベクターは発現に十分なシス作用性エレメントを含み、発現のための他のエレメントは宿主細胞により又はインビトロ発現系において供給することが可能である。発現ベクターは、組換えポリヌクレオチドを組み込んでいるコスミド、プラスミド(例えば、裸の又はリポソーム中に含まれる)及びウイルス(例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ関連ウイルス)等の、当技術分野で公知のあらゆるベクターを含む。したがって、用語「ベクター」は自律複製プラスミド又はウイルスを含む。この用語は、例えば、ポリリジン化合物、リポソーム、等の細胞内への核酸の移入を促進する非プラスミド及び非ウイルス化合物も含むとも解釈するべきである。ウイルスベクターの例は、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、等を含むがこれらに限定されない。したがって、構築物は発現ベクターに組み込まれる。
【００３１】
「相同性」とは、2つのポリペプチド間又は2つの核酸分子間の配列類似性又は配列同一性のことである。2つの比較される配列の両方において位置が同じ塩基又はアミノ酸モノマーサブユニットで占められている場合、例えば、2つのDNA分子のそれぞれの位置がアデニンで占められているならば、分子はその位置で相同である。2つの配列間の相同性のパーセントは、その2つの配列が共有する適合する又は相同性の位置の数を比較された位置の数で割って100を掛ける関数である。例えば、2つの配列の位置の10のうちの6が適合している又は相同である場合、その2つの配列は60%相同である。例として、DNA配列ATTGCC及びTATGGCは50%相同性を共有している。一般的に、比較は、2つの配列が整列されて最大相同性を与えるときに行われる。
【００３２】
「単離された」は天然の状態から変更された又は取り除かれたを意味する。例えば、生きた動物に天然に存在する核酸又はペプチドは「単離されて」いないが、その天然の状態の共存している物質から部分的に又は完全に分離されている同じ核酸又はペプチドは「単離されて」いる。単離された核酸若しくはタンパク質は実質的に精製された形態で存在し得る、又は、例えば、宿主細胞等の非天然の環境において存在し得る。
【００３３】
本発明の文脈では、一般的に存在する核酸塩基を表す次の略字が使用される。「A」はアデノシンを指し、「C」はシトシンを指し、「G」はグアノシンを指し、「T」はチミジンを指し、「U」はウリジンを指す。
【００３４】
別段に明記されなければ、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いの縮重バージョンである、及び同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列を含む。タンパク質又はRNAをコードする語句ヌクレオチド配列は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列があるバージョンではイントロンを含有する場合がある程度にイントロンを含んでもよい。
【００３５】
本明細書で使用される用語「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチドの鎖と定義される。更に、核酸はヌクレオチドのポリマーである。したがって、本明細書で使用される核酸とポリヌクレオチドは互換的である。当業者であれば、核酸がポリヌクレオチドであり、これはモノマー「ヌクレオチド」に加水分解することが可能であるという一般知識を持つ。モノマーヌクレオチドはヌクレオシドに加水分解することが可能である。本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドは、限定せずに、組換え手段、即ち、通常のクローニング技術及びPCR(商標)、等を使用して、並びに合成的手段により、組換えライブラリー又は細胞ゲノムから核酸配列をクローニングすることを含む、当技術分野で利用可能な任意の手段により得られるすべての核酸配列を含むがこれらに限定されない。
【００３６】
本明細書で使用される用語「プロモーター」は、ポリヌクレオチド配列の特定の転写を開始するのに必要な細胞の合成機械、又は導入された合成機械により認識されるDNA配列と定義される。
【００３７】
本明細書で使用される場合、用語「プロモーター/調節配列」は、プロモーター/調節配列に作動可能に連結された遺伝子産物の発現に必要である核酸配列を意味する。一部の例では、この配列はコアプロモーター配列でもよく、他の例では、この配列はエンハンサー配列及び遺伝子産物の発現に必要である他の調節エレメントも含んでいてよい。プロモーター/調節配列は、例えば、遺伝子産物を組織特異的様式で発現する配列でもよい。
【００３８】
「構成的」プロモーターとは、遺伝子産物をコードする又は特定するポリヌクレオチドと作動可能に連結している場合、細胞の大半の又はすべての生理的条件下で細胞において遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列である。
【００３９】
「誘導性」プロモーターとは、遺伝子産物をコードする又は特定するポリヌクレオチドと作動可能に連結している場合、プロモーターに対応する誘導物質が細胞中に存在する場合にのみ細胞において実質的に遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列である。
【００４０】
「組織特異的」プロモーターとは、遺伝子をコードする又は遺伝子により特定されるポリヌクレオチドに作動可能に連結している場合、細胞がプロモーターに対応する組織型の細胞である場合にのみ細胞において実質的に遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列である。
【００４１】
本発明のMTMR2ポリペプチド(本明細書では短アイソフォームMTMR2又はMTMR2-Sとも呼ばれる)は、好ましくは、571アミノ酸長であるヒトMTMR2の短いスプライスされた天然に存在するアイソフォームである。前記MTMR2ポリペプチドは配列番号1により表される。更に具体的には、MTMR2ポリペプチドの前記短アイソフォームは天然に存在する長鎖ヒトMTMR2ポリペプチドを含まない。
【００４２】
配列番号1により表されるMTMR2の前記アイソフォームがMTM1の喪失を極めて効率的に代償する能力を有することが本明細書では開示されている。そのようなMTMR2アイソフォームは、Mtm1 KOマウスにより示されるミオパチーをレスキューすることが可能であり、このせいでMTMR2アイソフォームは、中心核ミオパチーの処置のための、更に具体的には、XLCNMの処置のための効果的な薬剤となっている。この方法は、筋力、サイズ、及び機能を持続的に改善することが可能である。
【００４３】
一態様では、本明細書で使用されるMTMR2-Sは、配列番号1に少なくとも90%同一(又は相同な)アミノ酸配列又はその生理活性な断片若しくは変異体を含む。一部の実施形態では、MTMR2ポリペプチドは配列番号1に少なくとも80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%又は100%同一なアミノ酸配列を含み、571アミノ酸長以下である、又はその生理活性な断片若しくは変異体である。
【００４４】
本明細書で使用される場合、本明細書で使用されるMTMR2-Sは、上に記載される及び配列番号1により表される571アミノ酸長である短いスプライスされた天然に存在するヒトMTMR2アイソフォームの種々のスプライシングアイソフォーム、断片、変異体、融合タンパク質、及び改変型を含む。天然に存在するアイソフォームMTMR2-Sポリペプチドのそのようなアイソフォーム、断片又は変異体、融合タンパク質、及び改変型は、天然に存在するアイソフォームMTMR2-Sポリペプチドに実質的な配列同一性のアミノ酸配列の少なくとも一部を有し、天然に存在するMTMR2-Sポリペプチドの少なくとも1つの機能を保持している。ある特定の実施形態では、天然に存在するアイソフォームMTMR2-Sポリペプチドの生理活性な断片、変異体、又は融合タンパク質は、配列番号1の天然に存在するアイソフォームMTMR2-Sに少なくとも80%、85%、好ましくは少なくとも90%、95%、97%、98%、99%又は100%同一であるアミノ酸配列を含む。本明細書で使用される場合、「断片」は、本明細書に記載される「生理活性」を示す生理活性な断片又は生理活性な変異体を含むと理解されている。即ち、MTMR2-Sの生理活性な断片又は変異体は測定し試験することが可能な生理活性を示す。例えば、生理活性な断片又は変異体は、天然の(即ち、野生型又は正常な)MTM1タンパク質と同じ又は実質的に同じ生理活性を示し、そのような生理活性は、例えば、当技術分野で公知の内在性ホスホイノシチド基質、又はインビトロアッセイのための人工的ホスホイノシチド基質を切断する又は加水分解する断片又は変異体の能力(即ち、ホスホイノシチドホスファターゼ活性)により評価することが可能である。これらの基準のいずれかを評価する方法は本明細書に記載されており、更に具体的には、AAVベクター又はAAVミオチューブラリン構築物を発現しているMtm1 KOマウスの筋肉抽出物におけるELISAによるPtdIns3P定量化を、特異的なPtdIns3P結合能力を有する直列FYVEタンパク質ドメインから構成されたバイオセンサーによるPtdIns3Pの検出によって実施した下の実施例を参照しなければならない。下の実施例の一部で述べられているように(図6Aも参照されたい)、PtdIns3PレベルはMTM1又は天然に存在するアイソフォームMTMR2-Sを発現している場合には、WTレベルに正規化した。本明細書で使用される場合、「実質的に同じ」とは、パラメータを測定する際に対比される対照(例えば、実施例中のKO+MTM1又はWT+空AAV)の少なくとも70%である任意のパラメータ(例えば、活性)のことである。ある特定の実施形態では、「実質的に同じ」は、パラメータを測定する際に対比される対照の少なくとも75%、80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%、100%、102%、105%、又は110%である任意のパラメータ(例えば、活性)のことでもある。
【００４５】
ある特定の実施形態では、本明細書で開示される前述の又は以下のMTMR2-Sポリペプチドのいずれも、おそらく、インビボ安定性、インビボ半減期、取込み/投与、及び/又は精製のうちの1つ又は複数を増強する1つ又は複数のポリペプチド部分を更に含むキメラポリペプチドでの使用を目的とする。
【００４６】
本発明は、筋肉におけるMTMR2-Sポリペプチド、又はその生理活性な断片若しくは変異体の発現を増やす組成物を提供する。例えば、一実施形態では、組成物はMTMR2-Sポリペプチド、又はその生物学的に機能的な断片若しくは変異体を産生する又はコードする単離された核酸配列を含む。本明細書に記載されるように、そのような核酸配列を含む組成物を送達すれば筋肉機能が改善される。更に、そのような核酸配列を含む組成物を送達すれば、MTM1に機能喪失突然変異がある対象の生存が延ばされる。
【００４７】
本発明は、上で定義されるMTMR2-Sポリペプチド、又はそのようなポリペプチドを産生するのに有用な構築物を、医薬担体と組み合わせて含む医薬組成物にも関する。中心核ミオパチーの処置における使用のための又は筋肉機能を改善するための処置における使用のための前記組成物も開示される。
【００４８】
本発明は、中心核ミオパチーの処置のための又は筋肉機能を改善する処置のための方法であって、そのような処置を必要とする対象中に上で定義されるMTMR2-Sポリペプチド、又はこのMTMR2-Sポリペプチドを提供する構築物の治療有効量を投与するステップを含む方法に更に関する。
【００４９】
最後に、本発明は、MTM1突然変異又は欠損に関連する疾患又は障害の処置のため、中心核ミオパチーの処置のため、又は筋肉機能を改善する処置のための、上で定義されるMTMR2-Sポリペプチド、又はこのMTMR2-Sポリペプチドを提供する構築物の使用に関する。
【００５０】
一実施形態では、組成物は、上で定義されるMTMR2-Sポリペプチド又はその生物学的に機能的な断片若しくは変異体をコードする配列を含む単離された核酸を含む。一実施形態では、核酸は配列番号2の少なくとも1つを含む配列を含む。他の実施形態では、核酸は、上で定義されるMTMR2-Sポリペプチド又はその生物学的に機能的な断片若しくは変異体をコードするmRNA配列を含む。特定の実施形態では、核酸は配列番号3、4又は5のうちの少なくとも1つを含むmRNA配列を含み、これらの配列はMTMR2-Sタンパク質をコードする3つのアイソフォームRNAである。前で述べたように、核酸は定義されたMTMR2ポリペプチドの前記短アイソフォームをコードするが、天然に存在するヒトMTMR2ポリペプチドをコードしない。上で定義されるMTMR2-Sポリペプチド又はその生物学的に機能的な断片若しくは変異体をコードする単離された核酸配列は、例えば、標準技法(PCR等の)を使用して、MTMR2遺伝子を発現している細胞由来のライブラリーをスクリーニングすることによる、MTMR2遺伝子を含むことがわかっているベクターからその遺伝子を得ることによる、又はMTMR2遺伝子を含有する細胞及び組織から直接単離することによる等の当技術分野で公知の多くの組換え方法のいずれかを使用して得ることが可能である。或いは、目的の遺伝子は、クローニングするのではなく、合成的に作製することが可能である。
【００５１】
本発明は、本発明の単離された核酸が挿入されるベクターも含む。当技術分野は本発明に有用な適切なベクターが豊富である。ベクターとは、上で定義されるMTMR2-Sポリペプチドをコードし、前記ポリペプチドの産生を指示する1つ又は複数の制御配列に作動可能に連結されている核酸配列を含む核酸構築物又は組換え宿主細胞のことでもある。
【００５２】
要約すると、MTMR2-Sをコードする天然又は合成核酸の発現は、典型的には、MTMR2-S又はその部分をコードする核酸をプロモーターに作動可能に連結し、構築物を発現ベクター中に組み込むことにより達成される。使用されるベクターは、複製及び、任意選択で、真核細胞での組込みに適している。典型的なベクターは、転写及び翻訳ターミネーター、開始配列、並びに所望の核酸配列の発現の調節に有用であるプロモーターを含有する。
【００５３】
本発明のベクターは、標準遺伝子送達プロトコルを使用して、遺伝子療法に使用してもよい。遺伝子送達の方法は当技術分野では公知である。例えば、米国特許第5,399,346号;米国特許第5,580,859号;又は米国特許第5,589,466号を参照されたい。別の実施形態では、本発明は遺伝子療法ベクターを提供する。
【００５４】
本発明の単離された核酸はいくつかのタイプのベクター中にクローニングすることが可能である。例えば、核酸は、プラスミド、ファージミド、ファージ派生物、動物ウイルス、及びコスミドを含むがこれらに限定されないベクター中にクローニングすることが可能である。特定の目的のベクターは、発現ベクター、複製ベクター、プローブジェネレーションベクター、及びシークエンシングベクターを含む。
【００５５】
更に、ベクターはウイルスベクターの形態で細胞に提供してもよい。ウイルスベクター技術は当技術分野では周知であり、例えば、Sambrookら(2001年、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、New York)に並びに他のウイルス学及び分子生物学マニュアルに記載されている。ウイルスは、ベクターとして有用であり、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、及びレンチウイルスを含むがこれらに限定されない。一般に、適切なベクターは少なくとも1つの生物で機能的な複製起点、プロモーター配列、都合のよい制限エンドヌクレアーゼ部位、及び1つ又は複数の選択可能マーカーを含有する(例えば、国際公開第01/96584号;国際公開第01/29058号;及び米国特許第6,326,193号)。
【００５６】
哺乳動物細胞中への遺伝子移入のためにいくつかのウイルスベースのシステムが開発されてきた。例えば、レトロウイルスは遺伝子送達システムに便利なプラットホームを提供する。選択された遺伝子は、当技術分野で公知の技法を使用して、ベクター中に挿入しレトロウイルス粒子中にパッケージングすることが可能である。次に、組換えウイルスは単離され、インビボ又はエクスビボで対象の細胞に送達することが可能である。当技術分野ではいくつかのレトロウイルスシステムが知られている。一部の実施形態では、アデノウイルスベクターが使用される。当技術分野ではいくつかのアデノウイルスベクターが知られている。一実施形態では、レンチウイルスベクターが使用さる。
【００５７】
例えば、レンチウイルス等のレトロウイルス由来のベクターは長期の遺伝子移入を達成するのに適したツールである。なぜならば、そのようなベクターは娘細胞におけるトランス遺伝子の長期の安定な組込み及びその増殖を可能にするからである。好ましい実施形態では、組成物はアデノ関連ウイルス(AAV)由来のベクターを含む。アデノ関連ウイルス(AAV)ベクターは、種々の障害の処置のための強力な遺伝子送達ツールになっている。AAVベクターには、それが遺伝子移入に理想的に適している理由となる、病原性の欠如、最小の免疫原性、及び分裂終了細胞を安定で効率的な様式で形質導入する能力を含むいくつかの特長がある。AAVベクター内に含有される特定の遺伝子の発現を、AAV血清型、プロモーター、及び送達方法の適切な組合せを選ぶことにより、1つ又は複数のタイプの細胞に特異的に向けることが可能である。
【００５８】
一実施形態では、MTMR2-Sコード配列はAAVベクター内に含有される。AAVの30を超える天然に存在する血清型を利用可能である。AAVカプシド中の多くの天然の変異体が存在し、骨格筋に特に適している特性を有するAAVの同定及び使用を可能にする。AAVウイルスは従来の分子生物学技法を使用して操作してもよく、ミオチューブラリン核酸配列の細胞特異的送達のために、免疫原性を最小限に抑えるために、安定性及び粒子寿命を調整するために、効率的分解のために、核への正確な送達のために、等、これらの粒子を最適化することが可能になる。
【００５９】
ヒト又は非ヒト霊長類(NHP)から単離し、十分に特徴付けられているAAVの血清型の間で、ヒト血清型2は遺伝子移入ベクターとして開発された最初のAAVであり、異なる標的組織及び動物モデルにおいて効率的遺伝子移入実験に広く使用されてきた。いくつかのヒト疾患モデルへのAAV2ベースのベクターの実験的応用の臨床試験が進行中である。他の有用なAAV血清型は、AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9及びAAV10を含む。
【００６０】
一実施形態では、本明細書に記載される組成物及び方法において有用であるベクターは、最低限で、選択されたAAV血清型カプシド、例えば、AAV8カプシド、又はその断片をコードする配列を含有する。別の実施形態では、有用なベクターは、最低限で、選択されたAAV血清型repタンパク質、例えば、AAV8 repタンパク質、又はその断片をコードする配列を含有する。任意選択で、そのようなベクターはAAV capとrepタンパク質の両方を含有していてもよい。
【００６１】
本発明のAAVベクターは、AAV 5'(逆位末端反復配列)ITR及びAAV 3' ITRが隣接している上に記載されるMTMR2-Sポリペプチドを産生するMTMR2-S核酸配列を含むミニ遺伝子を更に含有する。適切な組換えアデノ関連ウイルス(AAV)は、本明細書で定義されるアデノ関連ウイルス(AAV)血清型カプシドタンパク質、又はその断片をコードする核酸配列;機能的なrep遺伝子;最低限で、AAV逆位末端反復配列(ITR)及びMTMR2-S核酸配列、又はその生物学的に機能的な断片で構成されるミニ遺伝子;並びにミニ遺伝子をAAVカプシドタンパク質中にパッケージングさせるのに十分なヘルパー機能を含有する宿主細胞を培養することにより作製される。AAVミニ遺伝子をAAVカプシド中にパッケージングするために宿主細胞において培養する必要のある構成成分は、トランスで宿主細胞に提供してもよい。或いは、必要な構成成分(例えば、ミニ遺伝子、rep配列、cap配列、及び/又はヘルパー機能)のうちの任意の1つ又は複数を、当業者には公知の方法を使用して必要な構成成分のうちの1つ又は複数を含有するよう操作されている安定な宿主細胞が提供してもよい。
【００６２】
特定の実施形態では、そのような安定な宿主細胞は、構成的プロモーターの制御下で必要な構成成分を含有することになる。他の実施形態では、必要な構成成分は誘導性プロモーターの制御下にあってもよい。適切な誘導性及び構成的プロモーターの例は本明細書の別の場所に提供されており、当技術分野では周知である。更に別の代替物では、選択された安定な宿主細胞は構成的プロモーターの制御下で選択された構成成分を、1つ又は複数の誘導性プロモーターの制御下で他の選択された構成成分を含有してもよい。例えば、293細胞(構成的プロモーターの制御下でE1ヘルパー機能を含有する)由来であるが、誘導性プロモーターの制御下でrep及び/又はcapタンパク質を含有する安定な宿主細胞を作製してもよい。当業者であれば更に他の安定な宿主細胞を作製してもよい。
【００６３】
本発明のrAAVを作製するのに必要なミニ遺伝子、rep配列、cap配列、及びヘルパー機能は、その上で運ばれる配列を移入する任意の遺伝要素の形態でパッケージング宿主細胞に送達してもよい。選択された遺伝要素は、本明細書に記載される方法及び当技術分野で利用可能な任意の他の方法を含む、任意の適切な方法を使用して送達してもよい。本発明の任意の実施形態を構築するのに使用される方法は、核酸操作の技術を持つ当業者には公知であり、遺伝子工学、組換え工学、及び合成技法を含む。同様に、rAAVビリオンを作製する方法は周知であり、適切な方法の選択は本発明に限定されない。
【００６４】
別段に明記されなければ、本明細書に記載されるAAV ITR、及び他の選択されたAAV成分は、限定せずに、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9及びAAV10又は他の既知の若しくはいまだ未知のAAV血清型を含む任意のAAV血清型の間から手軽に選択してもよい。これらのITR又は他のAAV構成成分は、当業者が利用可能である技法を使用してAAV血清型から手軽に単離してもよい。そのようなAAVは単離する、又は大学、商業、若しくは公共の供給源(例えば、the American Type Culture Collection、Manassas、Va.)から入手してもよい。或いは、AAV配列は、例えば、ジェンバンク、PubMed、又は同種のもの等の文献において又はデータベースにおいて入手可能である等の公表されている配列を参照することにより合成手段又は他の適切な手段を通じて入手してもよい。
【００６５】
ミニ遺伝子は、最低限で、MTMR2-Sコード核酸配列(トランス遺伝子)及びその調節配列、並びに5'及び3' AVV逆位末端反復配列(ITR)で構成されている。一実施形態では、AAV血清型2のITRが使用される。しかし、他の適切な血清型由来のITRを選択してもよい。カプシドタンパク質中にパッケージングされ、選択された細胞に送達されるのはこのミニ遺伝子である。MTMR2-Sコード核酸コード配列は、宿主細胞においてトランス遺伝子転写、翻訳、及び/又は発現を可能にする様式で調節構成成分に作動可能に連結されている。
【００６６】
ミニ遺伝子について上で同定された主要エレメントに加えて、AAVベクターは一般的に、本発明により作製されたプラスミドベクターをトランスフェクトさせた又はウイルスを感染させた細胞においてトランス遺伝子転写、翻訳、及び/又は発現を可能にする様式でトランス遺伝子に作動可能に連結されている従来の制御エレメントを含む。本明細書で使用される場合、「作動可能に連結されている」配列は、目的の遺伝子と近接している発現制御配列とトランスで又は少し離れて作用して目的の遺伝子を制御する発現制御配列の両方を含む。発現制御配列は、適切な転写開始、終止、プロモーター及びエンハンサー配列;スプライシング等の効率的なRNAプロセシングシグナル及びポリアデニル化(ポリA)シグナル;細胞質mRNAを安定化する配列;翻訳効率を増強する配列(即ち、コザックコンセンサス配列);タンパク質安定性を増強する配列;及び所望の場合には、コードされた産物の分泌を増強する配列を含む。天然の、構成的、誘導性及び/又は組織特異的なプロモーターを含む、多数の発現制御配列が当技術分野では公知であり、利用してもよい。追加のプロモーターエレメント、例えば、エンハンサーは、転写開始の頻度を調節する。典型的には、これらは開始部位の30〜110bp上流の領域に位置しているが、いくつかのプロモーターは、開始部位の下流にも同様に機能的エレメントを含有することが最近明らかにされている。プロモーターエレメント間のスペーシングは柔軟であることが多く、そのためプロモーター機能は、エレメントが反転する又は互いに対して移動される場合に保存される。プロモーターに応じて、個々のエレメントは協同的に又は独立して機能して転写を活性化すると思われる。
【００６７】
MTMR2-Sの発現を評価するため、細胞中に導入される発現ベクターは、ウイルスベクターによってトランスフェクトする又は感染させようとする細胞の集団からの発現している細胞の同定及び選択を促進するために、選択可能マーカー遺伝子又はレポーター遺伝子又は両方を含有することも可能である。他の態様では、選択可能マーカーはDNAの別々の部分上に保持され、同時トランスフェクション手順で使用してもよい。選択可能マーカーとレポーター遺伝子の両方は、宿主細胞での発現を可能にする適切な調節配列に隣接していてもよい。有用な選択可能マーカーは、例えば、neo及び同類の物等の抗生物質耐性遺伝子を含む。
【００６８】
レポーター遺伝子は、潜在的にトランスフェクトされた細胞を同定するため及び調節配列の機能性を評価するために使用される。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエント生物又は組織には存在せず発現もされない遺伝子であり、その発現がある容易に検出可能な特性、例えば、酵素活性により明らかにされるポリペプチドをコードする遺伝子である。レポーター遺伝子の発現はDNAがレシピエント細胞中に導入された後の適切な時間にアッセイされる。適切なレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、ベータガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌されたアルカリホスファターゼをコードする遺伝子、又は緑色蛍光タンパク質遺伝子を含んでもよい。適切な発現系は周知であり、公知の技法を使用して調製する又は市販のものを入手してもよい。一般に、レポーター遺伝子の最も高い発現レベルを示す最小5'隣接領域を有する構築物はプロモーターとして同定される。そのようなプロモーター領域はレポーター遺伝子に連結し、プロモーター駆動転写を調節する能力について作用物質を評価するのに使用してもよい。
【００６９】
一実施形態では、組成物はMTMR2-S、又はその生物学的に機能的な断片をコードする裸の単離された核酸を含み、単離された核酸は、トランスフェクション促進タンパク質、ウイルス粒子、リポソーム製剤及び同類の物が本質的にない。例えば、裸のDNAを含む裸の単離された核酸構造物を使用すれば筋肉における発現を誘導するのにうまく機能することは当技術分野では周知である。したがって、本発明は、筋肉への局所的送達のための及び全身投与のためのそのような組成物の使用を包含する(Wuら、2005年、Gene Ther、12(6): 477〜486頁)。
【００７０】
細胞中に遺伝子を導入し発現させる方法は当技術分野では公知である。発現ベクターという文脈では、ベクターは、当技術分野における任意の方法によって宿主細胞、例えば、哺乳動物、細菌、酵母、又は昆虫細胞中に容易に導入することが可能である。例えば、発現ベクターは、物理的、化学的、又は生物学的手段によって宿主細胞中に移入することが可能である。
【００７１】
インビボでの使用では、本発明のヌクレオチドは、リン酸骨格修飾(例えば、ホスホロチオエート結合)等の化学修飾を介して安定化させてもよい。本発明のヌクレオチドは、遊離(裸の)型で又は安定性及び/若しくはターゲティングを増強する送達システム、例えば、リポソームを使用することにより、又はハイドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプセル、バイオ接着性マイクロスフェア、若しくはタンパク質性ベクター等の他の媒体に組み込ませて、又はカチオン性ペプチドと組み合わせて投与してもよい。本発明のヌクレオチドは、生物模倣型の細胞浸透性ペプチドに連結させることも可能である。本発明のヌクレオチドは、その前駆体又はコードDNAの形態で投与してもよい。
【００７２】
ヌクレオチドの化学的に安定化されたバージョンは、「モルフォリノ」(ホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマー、PMO)、2'-O-メチルオリゴマー、AcHN-(RXRRBR)2XBペプチドタグ付きPMO(R、アルギニン、X、6-アミノヘキサン酸及びB、登録商標-アラニン)(PPMO)、トリシクロ-DNA、又は核内低分子(sn)RNAも含む。これらの技法はすべて当技術分野では周知である。ヌクレオチドのこれらのバージョンはまた、内在性MTMR2-Sの発現を促進するエキソンスキッピングのためにも使用することができると考えられる。
【００７３】
非ウイルス送達システムが利用される場合では、例示的送達媒体はリポソームである。脂質製剤の使用は、宿主細胞中への核酸の導入(インビトロ、エクスビボ又はインビボでの)のために想定されている。別の態様では、核酸は脂質と会合させてもよい。脂質と会合した核酸は、リポソームの水性内部にカプセル化する、リポソームの脂質二重層内に分散させる、リポソームとオリゴヌクレオチドの両方に会合している連結分子を介してリポソームに結合させる、リポソームに封入する、リポソームと複合体化する、脂質を含有する溶液中に分散させる、脂質と混ぜ合わせる、脂質と組み合わせる、脂質中に懸濁液として含有させる、ミセルに含有させる若しくはこれと複合体化する、又は他の方法で脂質と会合させてもよい。脂質、脂質/DNA又は脂質/発現ベクター会合組成物は、溶液中のいかなる特定の構造にも限定されない。
【００７４】
外来性核酸を宿主細胞に導入する又は他の方法で本発明のMTMR2-Sに細胞を曝露するのに使用する方法とは無関係に、宿主細胞中の組換えDNA配列の存在を確認するため、種々のアッセイを実施してもよい。そのようなアッセイは、例えば、サザン及びノーザンブロッティング、RT-PCR及びPCR等の当業者に周知である「分子生物学」アッセイ;例えば、免疫学的手段(ELISA及びウェスタンブロット)により又は本発明の範囲内に入る作用物質を同定するための本明細書に記載されるアッセイにより特定のペプチドの有無を検出する等の「生化学的」アッセイを含む。
【００７５】
本発明に従ってゲノム編集をツールとして使用することも可能である。ゲノム編集は、人工的に操作されたヌクレアーゼ、又は「分子はさみ」を使用してDNAを挿入する、置換する、又はゲノムから取り除くタイプの遺伝子操作である。ヌクレアーゼはゲノムの所望の位置に特定の二本鎖切断(DSB)を作り出し、細胞の内在性機構を利用して、相同組換え(HR)及び非相同末端結合(NHEJ)という天然のプロセスにより誘導された切断を修復する。現在4つファミリーの操作されたヌクレアーゼが使用されており:Znフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、CRISPR/Casシステム(更に具体的には、Cas9システム、P. Maliらにより、Nature Methods、vol. 10 No. 10、2013年10月に記載されている)、又は操作されたメガヌクレアーゼ再設計ホーミングエンドヌクレアーゼがある。前記ヌクレアーゼはDNA又はmRNAとして細胞に送達することが可能であり、そのようなDNA又はmRNAは本発明に従ったMTMR2ポリペプチドを産生するように操作されている。
【００７６】
上で定義され本発明に従って使用されるヌクレオチドは、DNA前駆体又はそれをコードする分子の形態で投与することが可能である。
【００７７】
上で定義されるMTMR2-Sポリペプチドは、その断片又は変異体を含めて、従来の固相化学等の当技術分野で公知の技法を使用して化学的に合成することが可能である。断片又は変異体は、産生し(例えば、化学的合成により)、試験して、例えば、内在性ホスホイノシチド基質若しくは合成ホスホイノシチド基質を切断する若しくは加水分解する(即ち、ホスホイノシチドホスファターゼ活性)、例えば、デスミン、PI 3-キナーゼhVps34又はhVps15(即ち、適切な局在性)等の他のタンパク質を動員する及び/若しくはこれと会合する、又は中心核ミオパチーを処置する若しくはMTM1突然変異若しくは欠損に関連する疾患若しくは障害を処置する能力を試験することにより、天然のMTM1タンパク質と同様の又は実質的に類似する機能を果たすことが可能である断片又は変異体を同定することが可能である。
【００７８】
ある特定の実施形態では、本発明は、治療若しくは予防効果、又は安定性(例えば、エクスビボでの貯蔵寿命及びインビボでのタンパク質分解に対する耐性)を増強する等の目的でMTMR2-Sポリペプチドの構造を改変することを想定している。そのような改変MTMR2-Sポリペプチドは、天然に存在する(即ち、天然の又は野生型の)MTMR2-Sポリペプチドと同じ又は実質的に同じ生理活性を有する。改変されたポリペプチドは、例えば、1つ又は複数の位置でのアミノ酸置換、欠失、又は付加により産生することが可能である。例として、例えば、ロイシンをイソロイシン若しくはバリンで、アスパラギン酸をグルタミン酸で単独置換すれば、又はアミノ酸を構造的に関係するアミノ酸で類似の置換(例えば、保存的突然変異)をすれば、得られる分子の生物活性に大きな影響を与えないと予想するのは妥当である。保存的置換はその側鎖が関係するアミノ酸のファミリー内で起こる置換である。
【００７９】
特定の実施形態では、本発明に従って投与される治療有効量は、中心核ミオパチーを含む、MTM1突然変異若しくは変更に関連する疾患若しくは障害の徴候の少なくとも1つ若しくはすべてを軽減する、又は筋肉機能を改善するのに十分な量である。投与するMTMR2-Sの量は、当業者が周知の標準手順により決定することが可能である。患者の生理的データ(例えば、年齢、サイズ、及び体重)、投与経路及び処置する疾患は、適切な投与量を決定するには考慮に入れなければならず、任意選択で中心核ミオパチーを呈していない対象と比較される。当業者であれば、MTMR2-Sポリペプチドの又は投与されるMTMR2-Sを産生する核酸を含有している若しくは発現しているベクターの量は、中心核ミオパチーを含む、MTM1突然変異に関連する疾患若しくは障害の徴候の少なくとも1つ若しくはすべてを処置する、又は筋肉機能を改善するのに十分な量になることを認識している。そのような量は、特に選択されたMTMR2-Sポリペプチド又はこのポリペプチドを発現しているベクター、患者の性別、年齢、体重、全体的な健康状態、等の要因に応じて変動してもよく、ケースバイケースで決定してもよい。量は処置プロトコルの他の構成要素(例えば、他の医薬品の投与、等)に従って変動してもよい。一般的に、治療薬が核酸の場合、適切な用量は、約1mg/kg〜約100mg/kg、更に通常では約2mg/kg/日〜約10mg/kgの範囲である。核酸のウイルスベース送達が選ばれる場合、適切な用量は、用いられるウイルス、送達経路(筋肉内、静脈内、動脈内その他)等の異なる要因に依存することになるが、典型的には10-9〜10-15ウイルス粒子/kgの範囲に及んでもよい。当業者であれば、そのようなパラメータは通常臨床試験中に案出されることを認識している。更に、当業者であれば、疾患症状が本明細書に記載される処置により完全に軽減される可能性がある間は、これはそうでなくてもよいことを認識している。症状の部分的又は断続的軽減でさえレシピエントにとっては大きな恩恵となる場合がある。更に、患者の処置は単回事象でもよく、又は患者は、得られた結果に応じて、数日離れて、数週間離れて、又は数か月離れて、又は数年さえ離れてでもよい複数の機会にMTMR2-S又はこれをコードする核酸を投与される。
【００８０】
本発明の医薬組成物は、当業者に公知である標準薬務に従って処方される(例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (第20版)、A. R. Gennaro、Lippincott Williams & Wilkins編、2000年及びEncyclopedia of Pharmaceutical Technology、J. Swarbrick and J. C. Boylan編、1988〜1999頁、Marcel Dekker、New York参照)。
【００８１】
ありうる医薬組成物は、経口、直腸、膣内、粘膜、局所的(経皮、頬側及び舌下を含む)、又は非経口(皮下(sc)、筋肉内(im)、静脈内(iv)、動脈内、皮内、胸骨内、注射、腹腔内又は注入技法を含む)投与に適した医薬組成物を含む。これらの製剤では、従来の賦形剤を当業者に周知である技法に従って使用することが可能である。特に、筋肉内又は腹腔内投与等の全身投与が好ましい。局在的な治療効果を提供するためには、特定の筋肉又は筋肉内投与経路が好ましい。
【００８２】
本発明に従った医薬組成物は、実質的に投与次第又は投与後のいかなる所定の時間でも若しくは時限でも活性薬物を放出するように処方してもよい。
【００８３】
以下の実施例は説明目的で与えられ、制限するためのものではない。
【実施例】
【００８４】
明細書で使用される略語
Aa:アミノ酸
AAV:アデノ関連ウイルス
CMT:シャルコー・マリー・トゥース病
CNM:中心核ミオパチー
FYVE:Fab1-YOTB-Vac1-EEA1
HE:ヘマトキシリン-エオシン
KO:ノックアウト
MTM:ミオチューブラリン
MTMR:ミオチューブラリン関係
PH-GRAM:プレックストリン相同性、グルコース転移酵素、Rab様GTPアーゼ活性化因子及びミオチューブラリン
PPIn:ホスホイノシチド
PtdIns3P:ホスファチジルイノシトール-3-リン酸
PtdIns(3,5)P2: ホスファチジルイノシトール-3,5-二リン酸
TA:前脛骨
WT:野生型
【００８５】
材料及び方法
プラスミド及び構築物
ヒトMTM1(1812bp、603aa)及びMTMR2-L(1932bp、643aa)ORFをpDONR207プラスミド(Invitrogen、Carlsbad、CA)中にクローニングして、エントリークローン(それぞれpSF108及びpSF98)を作製した。pSF98ベクターへのMTMR2-Lに部位特異的変異誘発を行って、72の最初のアミノ酸に対応する216の最初のヌクレオチドを欠失させることによりpDONR207-MTMR2-S(1716 bp、571 aa、pSF101)を得た。Gatewayシステム(Invitrogen、Carlsbad、CA)を使用して、異なるミオチューブラリン構築物を酵母デスティネーション発現ベクターpAG424GPD-ccdB-EGFP(Alberti, S.、Gitler, A.D.及びLindquist, S. (2007) A suite of Gateway cloning vectors for high-throughput genetic analysis in Saccharomyces cerevisiae. Yeast、24、913〜919頁)及びFunctional Analysis EUROSCARFのためのヨーロッパ出芽酵母(European Saccharomyces cerevisiae)アーカイブから入手したpVV200 (Van Mullem, V.、Wery, M.、De Bolle, X.及びVandenhaute, J. (2003) Construction of a set of Saccharomyces cerevisiae vectors designed for recombinational cloning. Yeast、20、739〜746頁)に、又はpAAV-MCSベクター(CMVプロモーター)にクローニングした。すべての構築物は塩基配列決定により確かめた。pCS211 DsRED-FYVEプラスミドは以前記載されていた(Katzmann, D.J.、Stefan, C.J.、Babst, M.及びEmr, S.D. (2003) Vps27 recruits ESCRT machinery to endosomes during MVB sorting. J. Cell Bi
ol.、162、413〜423頁)。
【００８６】
抗体
使用した一次抗体はウサギポリクローナル抗MTM1(2827)、マウスモノクローナル抗MTMR2(4G3)、マウスモノクローナル抗ホスホグリセリン酸キナーゼ1(PGK1、Invitrogen社)及びマウスモノクローナル抗グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素(anti-GAPDH、Chemicon by Merck Millipore、Darmstadt、Germany)であった。抗MTM1及び抗MTMR2抗体は、Institut de Genetique et Biologie Moleculaire et Cellulaire (IGBMC)の抗体施設の構内で作られた。抗MTMR2抗体は、完全長ヒトMTMR2に対して産生され、トランスフェクトされたCOS-7細胞を使用して本研究において確認された。西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)とコンジュゲートされた、マウス及びウサギIgGに対する二次抗体は、Jackson ImmunoResearch Laboratories (West Grove、PA)から入手した。
【００８７】
インビボモデル
出芽酵母ymr1Δ(MATα、ura3-52、leu2-3,112、his3-Δ200、trp1-Δ901、lys2-801、suc2-Δ9 ymr1::HIS3)(14)及び野生型(MATα、his3Δ1、leu2Δ0、lys2Δ0、ura3Δ0)株は30℃、富栄養培地(YPD):1%酵母抽出物、2%ペプトン、2%グルコース又は合成ドロップアウト培地(SC):アミノ酸無の0.67%酵母ニトロゲンベース、2%グルコース及び適切なアミノ酸混合物で生育させて、プラスミド維持を確実にした。酵母組織的欠失コレクション由来のBY4742バックグラウンドのymr1Δ(MATα、his3Δ1、leu2Δ0、lys2Δ0、ura3Δ0、ymr1::KanMX)は使用しなかった。なぜならば、この酵母はScott D Emr's laboratoryにより記載されたymr1Δ表現型を持たないからである(Parrish, W.R.、Stefan, C.J.及びEmr, S.D. (2004) Essential role for the myotubularin-related phosphatase Ymr1p and the synaptojanin-like phosphatases Sjl2p and Sjl3p in regulation of phosphatidylinositol 3-phosphate in yeast. Mol. Biol. Cell、15、3567〜3579頁)。
【００８８】
本研究では、野生型及びMtml KO 129 PASマウスを使用した。Mtml KOマウスは、2〜3週目で始まり8週目までで死に至る進行性筋萎縮症及び虚弱を特徴とする(30)。動物は、12:12時間明/暗周期で恒温室(19〜22℃)に収容された。
【００８９】
バイオインフォマティクス分析
MTMR2 mRNAアイソフォームの発現レベルは、遺伝子型組織発現(GTEx, www.gtexportal.org/home/)データベースを取り出すことにより得られ、このデータベースは、何百ものドナー及び培養中の2つの形質転換された細胞型由来の51の異なる組織の試料を使用して組織的RNA塩基配列決定により築かれていた。次に、このデータを使用して、20の極めて関連性のある組織においてMTMR2 mRNAアイソフォームの相対的発現を計算し、組織特異的アイソフォームが最も発現されている/最も発現されていないヒートマップアンダーラインを作成した。
【００９０】
MTM1、MTMR2-L及びMTMR2-SのN末端部分のアライメントをJalview (www.jalview.org/)を使用して行い、整列アミノ酸はClustalx色分けによって同定した。
【００９１】
発現分析
全RNAは、トリゾール試薬(Invitrogen社、Carlsbad、CA)を製造業者の説明書に従って使用して、生後7週間の野生型及びMtml KOマウスの前脛骨(TA)筋及び肝臓から、又はXLCNM患者及び対照の筋生検から精製した。cDNAは、Superscript II逆転写酵素(Invitrogen社)及びランダムヘキサマーを使用して、500ngの全RNAから合成した。
【００９２】
TA筋及び肝臓由来の1/10希釈cDNAのPCR増幅は、以前に記載された通り(Bolino, A.、Marigo, V.、Ferrera, F.、Loader, J.、Romio, L.、Leoni, A.、Di Duca, M.、Cinti, R.、Cecchi, C.、Feltri, M.L.ら(2002) Molecular characterization and expression analysis of Mtmr2, mouse)、72℃(及び融解温度として65℃)での増幅及び72℃での30分の最終伸長の35サイクルで、
MTMR2の5'-UTR由来のフォワードプライマー:
配列番号6: 5'-AGCGGCCTCCAGTTTCTCGCGC-3'
及びエキソン3由来のリバースプライマー:
配列番号7: 5'-TCTCTCCTGGAAGCAGGGCTGGTTCC-3'
を使用して実施した。産物は2%アガロースゲル上で分析し、それぞれのバンドはNucleospin Gel及びPCR cleanup kit (Macherey-Nagel社、Duren、Germany)を使用して精製しており、次にCloneJet PCRクローニングキット(ThermoFisher Scientific社、Waltham、MA)を使用してpJet2.1ベクター中にクローニングし、サンガーにより塩基配列決定した。
【００９３】
マウスTA筋肉又はヒト筋生検由来の1/10希釈cDNAの定量的PCR増幅は、融解温度として53℃を使用してLight-Cycler 480 II instrument (Roche社、Basel、Swiss)上で実施した。マウスMTMR2アイソフォームごとに特定の組のプライマーを使用した:
マウスV1では
配列番号8:  フォワード5'-GACTCACTGTCCAGTGCTTC-3'及び
配列番号9:  リバース5'-CCTCCCTCAGGACCCTCA-3'、
マウスV2では
配列番号10:  フォワード5'-GACTCACTGTCCAGTGCTTC-3'及び
配列番号11:  リバース5'-CAGCTGGGCACTCCCTCA-3'、
マウスV3では
配列番号12:  フォワード5'-AAGATAAAACATCTCAAAAATTATAATTGCTTC-3'及び
配列番号13:  リバース5'-CAGCTGGGCACTCCCTCA-3'、
マウスV4では
配列番号14:  フォワード5'-AAGATAAAACATCTCAAAAATTATAATTGCTTC-3'及び
配列番号15:  リバース5'-GACTCACTGTCCAGTGCTTC-3'。
【００９４】
すべてのマウスアイソフォームに共通する配列を増幅する別のセットのプライマー(配列番号16:フォワード5'-TCCTGTGTCTAATGGCTTGC-3'及び配列番号17:リバース5'-AACCAAGAGGGCAGGATATG-3')を使用して全マウスMTMR2を定量化した。他の特定のセットのプライマーはヒトMTMR2アイソフォームごとに使用した:
ヒトV1では
配列番号18:  フォワード5'-ACTCCTTGTCCAGTGCCTC-3'及び
配列番号19:  リバース5'-GACTCCCTCAGGACCCTC-3'、
ヒトV2では
配列番号20:  フォワード5'-AAGATAAAACATCTCAAAAATTATAATTGCCTC-3'及び
配列番号21:  リバース5'-GACTCCCTCAGGACCCTC-3'、
ヒトV3では
配列番号22:  フォワード5'-AAGATAAAACATCTCAAAAATTATAATTGCCTC-3'及び
配列番号23:  リバース5'-GAGCGAGACTCCCTCCTC-3'、
ヒトV4では
配列番号24:  フォワード5'-AAGATAAAACATCTCAAAAATTATAATTGCCTC-3'及び
配列番号25:  リバース5'-CTGGACTGCATGGGCCTC-3'。
【００９５】
すべてのヒトアイソフォームに共通する配列を増幅する別のセットのプライマー(配列番号26:フォワード5'-TTTCCTGTCTCTAATAACCTGCC-3'及び配列番号27:リバース5'-CCAGGAGGGCAGGGTATG-3')を使用して全ヒトMTMR2を定量化した。すべてのqPCRでは、HPRT遺伝子発現は、対照とXLCNM筋肉の間のその発現における非変異のせいで対照として使用した。
【００９６】
ウェスタンブロット
全タンパク質は、TCA沈澱及びNaOH溶解(45)により酵母細胞(OD600nm=0.5〜0.9、構築物あたり最小3クローン)から、及び組織ホモジナイザー(Omni TH社、Kennesaw、GA)を使用するRIPAバッファー中での均質化によりTA筋(構築物あたり最小10筋肉)から抽出した。タンパク質ライセートは、ニトロセルロース膜上でSDS-PAGE及びウェスタンブロッティングにより分析した。タンパク質は、一次抗体(抗MTM1 1/500、抗MTMR2 1/1000、抗PGK1 1/1000及び抗GAPDH 1/1000)、続いてHRPに連結した二次抗体と一緒のインキュベーション、及び大規模洗浄を使用して検出した。膜はECL化学発光反応キット(Supersignal west pico kit、ThermoFisher Scientific社、Waltham、MA)により曝露した。
【００９７】
酵母表現型決定
ymr1Δ酵母細胞を、MTM1、MTMR2-L又はMTMR2-S cDNAを含有する酵母発現プラスミドpAG424GPD-ccdB-EGFP(2μ、C-terにGFPタグ)又はpVV200 (2μ、タグなし)でLiAc-PEG法(46)を使用して形質転換した。空のプラスミドで形質転換した酵母細胞は対照として使用した。
【００９８】
空胞染色では、細胞の1 OD600nmユニットを1分間、500×g遠心分離により収穫し、30℃で15分間、50μlのYPD培地で2μlのFM4-64(200μM、Invitrogen社)と一緒にインキュベートし、900μlのYPDでの事前の洗浄及び30℃で10分間のインキュベーションによるチェーシング、続いてSC完全培地での第2の洗浄を行い、染色された生きた酵母細胞は蛍光顕微鏡により観察された。クローンあたり100〜600細胞(構築物あたり3種の異なるクローン9)を計数し、2つの範疇:大きな又は中等の単葉空胞、及び小又は断片化空胞に分類した。
【００９９】
PtdIns3P定量化では、PtdIns3P濃縮膜構造物のために、酵母細胞をpVV200プラスミド(空又はMTM1、MTMR2-L若しくはMTMR2-S cDNAを含有する)及びDsRED-FYVEレポーターを発現しているpCS211プラスミドで共形質転換した(Katzmann, D.J.、Stefan, C.J.、Babst, M. and Emr, S.D. (2003) Vps27 recruits ESCRT machinery to endosomes during MVB sorting. J. Cell Biol.、162、413〜423頁)。蛍光顕微鏡観察後、細胞あたりのドットの数をクローンあたり最小で100細胞(構築物あたり2つの異なるクローン)で数量化した。
【０１００】
PtdIns5P定量化では、異なるMTM1及びMTMR2構築物を産生している酵母ymrΔ細胞を対数期まで生育した。脂質抽出を200 OD600nmユニットの細胞でHamaら、に記載される通りに実行した(Hama, H.、Takemoto, J.Y.及びDeWald, D.B. (2000) Analysis of phosphoinositides in protein trafficking. Methods、20、465〜473頁)。PtdIns5P細胞内レベルはMorris J.B.らに記載される通りに決定した。PtdIns(5)Pレベルの定量化は、Morrisらにより記載される通りに実施し(Morris, J.B.、Hinchliffe, K.A.、Ciruela, A.、Letcher, A.J.及びIrvine, R.F. (2000) Thrombin stimulation of platelets causes an increase in phosphatidylinositol 5-phosphate revealed by mass assay. FEBS Lett.、475、57〜60頁)、結果は全脂質濃度に基づいて正規化した。
【０１０１】
すべての蛍光顕微鏡観察は、GPF又はDsREDフィルター及びDIC光学を使用して、蛍光Axio Observer D1顕微鏡(Zeiss社)上で100×/1.45オイル対物レンズ(Zeiss社)で行った。画像はCoolSnap HQ2 photometrixカメラ(Roper Scientific社)でとらえ、ImageJにより処理した(Rasband W.S.、ImageJ、U. S. National Institutes of Health、Bethesda、Maryland、USA、http://imagej.nih.gov/ij/)。
【０１０２】
筋肉抽出物におけるELISAによるPtdIns3P定量化
PtdIns3P MASS ELISAは、製造業者の推奨に従い、PtdIns3P Mass ELISAキット(Echelon Biosciences社、Salt Lake City、UT)を使用して、全前脛骨(TA)筋調整物由来の脂質抽出物で実施した。生後7週間の野生型Mtml KOマウス由来のTA筋の重量を測り、液体窒素下で乳鉢と乳棒を使用して磨り潰して粉末にし、次に、氷冷5%のTCA中でインキュベートして脂質を抽出した。抽出脂質は3%のタンパク質安定化剤を有するPBS-T中に再懸濁し、次にPtdIns3P MASS ELISAプレート上に2通りにスポットを付けた。PtdIns3Pレベルは、プレート読取り機上450nmで吸光度を測定するにより検出した。既知量のPtdIns3Pで作成した標準曲線と値を比べることにより特定量を決定した。
【０１０３】
AAV作製
rAAV2/1ベクターは、CMVプロモーター制御下でインサートを含有し血清型-2逆位末端反復配列が隣接しているpAAV2-インサート、AAV血清型-1のrep及びcap遺伝子を含有するpXR1、並びにアデノウイルスヘルパー機能をコードするpHelperでAAV-293細胞株をトリプルトランスフェクションすることにより作製した。ウイルスベクターは精製し、プラスミド標準pAAV-eGFPを使用してリアルタイムPCRにより定量化した。タイターはmlあたりのウイルスゲノム(vg/ml)として表し、ここで使用したrAAVタイターは5〜7.1011vg/mlであった。
【０１０４】
野生型及びMtml KOマウスの前脛骨筋のAAV形質導入
生後2〜3週間の野生型又はMtml KOオス129PASマウスは、5ml/gのケタミン(20mg/mL; Virbac社、Carros、France)及びキシラジン(0.4%, Rompun; Bayer社、Wuppertal、Germany)の腹腔内注射により麻酔をかけた。前脛骨(TA)筋に20mlのAAV2/1調製物又は無菌AAV2/1空ベクターを注射した。4週間後、マウスに麻酔をかけTA筋肉は機能に関し分析する(下に記載する通りに)、又は組織学のために直接解体し窒素冷却イソペンタンに凍結する、又は電子顕微鏡用に固定した(下に記載する通りに)。
【０１０５】
野生型及びMtml KOマウスのAAV形質導入
全身性注射では、野生型又はMtml KOの子は、誕生時に又は1日目に1.5×1012ユニットの空AAVウイルス粒子又はヒトMTM1若しくはMTMR2-Sを発現しているAAVを腹腔内に注射した。次に注射3週間後、体重及びマウスの骨格筋力を2種類の異なる検査:グリップ検査及びハンギング検査(下記)により毎週分析した。
【０１０６】
筋肉の機能分析
筋力測定は、以前記載された通りに、神経及び筋肉刺激に応答したインサイツ筋収縮を測定することにより評価した(Cowling, B.S.、Chevremont, T.、Prokic, I.、Kretz, C.、Ferry, A.、Coirault, C.、Koutsopoulos, O.、Laugel, V.、Romero, N.B.及びLaporte, J. (2014) Reducing dynamin 2 expression rescues X-linked centronuclear myopathy. J Clin Invest、124、1350〜1363頁)。動物はペントバルビタールナトリウム(kgあたり50mg)の腹腔内注射により麻酔をかけた。TAの遠位腱を引き離し、絹結紮糸で等尺性トランスデューサー(Harvard Bioscience社、Holliston、MA)に結び付けた。坐骨神経を遠位に刺激し、高頻度反復刺激(50〜143Hzのパルス周波数)への応答を記録し、絶対最大力を決定した。収縮測定後、動物は頸椎脱臼により屠殺した。特定の最大力を決定するため、TA筋を解体し重さを測った。
【０１０７】
組織学
筋肉内注射では、マウスTA骨格筋の横行凍結切片(9μm)をヘマトキシリン-エオシン(HE)又はコハク酸脱水素酵素(SDH)で染色し、NanoZoomer 2.0HTスライドスキャナー(Hamamatsu社、Hamamatsu city、Japan)で見た。線維領域は、ImageJ画像解析ソフトウェアのRoiManagerプラグインを使用してHE切片上で分析した。周辺核のパーセントはImageJ画像解析ソフトウェアの細胞カウンタープラグインを使用して計数した。ImageJプラグインを使用して、核の配置を線維サイズと関連付け、筋線維の色分けでは線維サイズに拠った。
【０１０８】
全身性注射では、パラフィン包埋器官由来の5μmの切片を調製し、固定し、ヘマトキシリン及びエオシン(H&E)により染色した。切片はNanoZoomer 2.0HTスライドスキャナー(Hamamatsu社)で画像化した。
【０１０９】
電子顕微鏡
麻酔をかけたマウスのTA筋は、0.1Mのリン酸緩衝液(pH7.2)中4%のPEA及び2.5%のグルタルアルデヒドで固定し、記載の通りに処理した(Cowling, B.S.、Toussaint, A.、Amoasii, L.、Koebel, P.、Ferry, A.、Davignon, L.、Nishino, I.、Mandel, J.L.及びLaporte, J. (2011) Increased expression of wild-type or a centronuclear myopathy mutant of dynamin 2 in skeletal muscle of adult mice leads to structural defects and muscle weakness. Am. J. Pathol、178、2224〜2235頁)。トライアド/サルコメアの比は、同定されたトライアド構造の数を切片上に存在するサルコメアの総数で割ることにより計算した(遺伝子型あたり2マウス、マウスあたり分析された最小10線維、線維あたり最小20トライアド)。
【０１１０】
統計分析
データは、図説明文に付記されている通り平均±s.e.m.又は±SDである。統計分析は、対応のない両側スチューデントt検定を実施した発現分析(図6B〜C)を除いてすべてのデータについて、一元配置分散分析続いてチューキーの多重比較検定を使用して実施した。0.05未満のP値は有意と見なした。
【０１１１】
結果
MTMR2スプライシング変異体は差示的に発現され長及び短タンパク質アイソフォームをコードする
MTMR2遺伝子中の突然変異がシャルコー・マリー・トゥース病(CMT4B1)の原因であり、MTM1中の突然変異がX連鎖中心核ミオパチー(XLCNM)をもたらし、これら2つの遍在的に発現されるミオチューブラリンがはっきり異なる機能を持つことが示唆される。大半の組織は1つよりも多いアイソフォームを含有し、したがって、発現のその局在性及び程度はその異なる機能を説明するのに役立つと考えられる。MTMR2機能を調べるために、その組織発現及びアイソフォームを先ず明らかにした。マウスでは、4つのMTMR2 mRNAアイソフォーム(V1〜V4)が以前末梢神経において報告されており、潜在的に2つのタンパク質アイソフォームをコードしている(図7A〜B)。変異体V2〜V4は、中途終止コドンをもたらす選択的エキソン1a及び/又は2aを含み、エキソン3において代わりの開始部位を曝露することにより変異体V1とは異なる。変異体V1はMTMR2-L(長)と名付けることが可能な643アミノ酸タンパク質をコードし、その他のアイソフォームは、以前種々の細胞株で検出されたMTMR2-S(短)と名付けられた571アミノ酸タンパク質をコードする(Bolino, A.、Marigo, V.、Ferrera, F.、Loader, J.、Romio, L.、Leoni, A.、Di Duca, M.、Cinti, R.、Cecchi, C.、Feltri, M.L.ら(2002) Molecular characterization and expression analysis of Mtmr2, mouse homologue of MTMR2, the Myotubularin-related 2 gene、mutated in CMT4B. Gene、283、17〜26頁)。2つのタンパク質アイソフォームはその翻訳開始部位のみが異なり;MTMR2-SはPH-GRAMドメインのすぐ前で開始し、MTMR2-Lは、いかなるタンパク質ドメインとも既知の相同性がなく、結晶構造では見えない伸長N末端配列を有する(図1C;図7B) (Begley, M.J.、Taylor, G.S.、Brock, M.A.、Ghosh, P.、Woods, V.L. and Dixon, J.E. (2006) Molecular basis for substrate recognition by MTMR2、a myotubularin family phosphoinositide phosphatase. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.、103、927〜932頁; Begley, M.J.、Taylor, G.S.、Kim, S.A.、Veine, D.M.、Dixon, J.E. and Stuckey、J.A. (2003) Crystal structure of a phosphoinositide phosphatase, MTMR2: insights into myotubular myopathy and Charcot-Marie-Tooth syndrome. Mol. Cell、12、1391〜1402頁)。これらのアイソフォームの発現レベルを、51のヒト組織に関するデータを包含するGTEx発現データべースを発掘することによってヒトにおいて先ず調べた(GTEx_consortium. (2015) Human genomics. The Genotype-Tissue Expression (GTEx) pilot analysis: multitissue gene regulation in humans. Science、348、648〜660頁)。変異体V1は脳、肝臓及び脾臓において主要なMTMR2 RNAであり、変異体V2はその他の組織において優勢である。異なる変異体は骨格筋においては不十分にしか発現されなかった(図1A)。マウスでは、RT-PCR及びサンガー塩基配列決定は、野生型(WT)及びMtml KOマウスの前脛骨(TA)骨格筋において並びに肝臓において4つのMTMR2 mRNA変異体(V1〜V4)の存在を確認しており(図7C〜1D)、MTMR2-LとMTMR2-Sタンパク質の両方が骨格筋に存在することが示唆される。
【０１１２】
短MTMR2アイソフォームは酵母細胞においてMTM1様活性を示すが長MTMR2アイソフォームは示さない
インビボにおいてMTM1、MTMR2-L及びMTMR2-Sタンパク質の細胞機能を比較するため、酵母細胞でのこれらヒトミオチューブラリンの異種発現を使用した。酵母は、酵母から高等真核生物まで保存されているホスホイノシチド依存性膜輸送を研究するにはよいモデルである(Katzmann, D.J.、Stefan, C.J.、Babst, M.及びEmr, S.D. (2003) Vps27 recruits ESCRT machinery to endosomes during MVB sorting. J. Cell Biol.、162、413〜423頁)。酵母細胞では、空胞体積、形態学、酸性度及び膜電位は、Fab1/PIKfyveキナーゼによりPtdIns3Pのリン酸化によって産生されるPtdIns(3,5)P2により制御される。fab1Δ変異細胞では、低レベルのPtdIns(3,5)P2のせいで空胞は非常に大きく、単葉である。それどころか、独特の酵母チューブラリンを欠くymr1Δ細胞はPtdIns(3,5)P2及び/又はPtdIns3P過多のせいで断片化した空胞を有し(14)、この表現型は、大きな空胞表現型を誘導するヒトMTM1の発現により補完される(Amoasii, L.、Bertazzi, D.L.、Tronchere, H.、Hnia, K.、Chicanne, G.、Rinaldi, B.、Cowling, B.S.、Ferry, A.、Klaholz, B.、Payrastre, B.ら(2012) PLoS Genet、8、e1002965)。MTM1、MTMR2-L及びMTMR2-S細胞内局在化を判定するため、GFPタグ付き融合物をymr1Δ細胞において過剰発現させた。MTM1-GFP及びMTMR2-S-GFPタンパク質は空胞に隣接する膜斑状構造物に濃縮され(FM4-64脂質色素にも陽性である)、MTMR2-L-GFPタンパク質は主に細胞質に存在した(図2C)。空胞膜を親油性色素FM4-64で染色することによるymr1Δ細胞におけるGFPタグ付き又はタグなしヒトミオチューブラリンの過剰発現での空胞形態を評価した(図2B〜C)。MTMR2アイソフォームを検出するため、組換え完全長ヒトMTMR2-Lに対してマウスモノクローナル抗体を産生させた。この抗体は形質転換された酵母タンパク質抽出物上で確認され、MTMR2-L及びMTMR2-Sを特異的に認識した(図2A)。空胞はymr1Δ細胞ではMTM1又はMTMR2-Sの発現により著しく拡大され、MTMR2-Lでは断片化したままであった。MTM1及びMTMR2-Sは、これらのホスファターゼの高発現レベルのせいでfab1Δ表現型を模倣する大きな空胞形態を誘導している(過剰発現プラスミド)。これらの結果は、膜局在化ミオチューブリン構築物のみがymr1Δ細胞の空胞形態欠損をレスキューしたことを示している。空胞形態はPtdIns(3,5)P2レベルを反映するので、及びPtdIns(3,5)P2は正常な成長条件で検出されるほど豊富ではないので(Dove, S.K.、Cooke, F.T.、Douglas, M.R.、Sayers, L.G.、Parker, P.J. and Michell, R.H. (1997) Osmotic stress activates phosphatidylinositol-3,5-bisphosphate synthesis. Nature、390、187〜192頁)、PtdIns(3,5)P2からミオチューブラリンホスファターゼ活性により生成される脂質であるPtdIns5Pのレベルを質量アッセイにより定量化した(図2F)。PtdIns5Pレベルはymr1Δ細胞においてMTM1及びMTMR2-S過剰発現により増加し、MTMR2-Lは何の効果もなかった。PtdIns3Pミオチューブラリン基質レベルも、PtdIns3P濃縮膜のレポーターであるDsRED-FYVEに対して陽性であった斑状構造を計数することにより定量化した(Katzmann, D.J.、Stefan, C.J.、Babst, M.及びEmr, S.D. (2003) Vps27 recruits ESCRT machinery to endosomes during MVB sorting. J. Cell Biol.、162、413〜423頁)(図2D〜E)。MTM1及びMTMR2-Sの過剰発現はPtdIns3Pレベルを著しく減少させ、MTMR2-Lは何の効果もなかった。しかし、以前のデータは、MTMR2-Lはインビトロで強力なホスファターゼ活性を有することを示し(Berger, P.、Bonneick, S.、Willi, S.、Wymann, M. and Suter, U. (2002) Loss of phosphatase activity in myotubularin-related protein 2 is associated with Charcot-Marie-Tooth disease type 4B1. Hum. Mol. Genet.、11、1569〜1579頁)、酵母細胞におけるこのアイソフォームの細胞質局在化はPPIn基質脱リン酸化をさせないことが示唆される。結論として、MTMR2-Sのみが酵母細胞においてMTM1と類似するホスファターゼ活性及び局在化を有し、MTMR2-Lは振る舞いが異なる。
【０１１３】
Mtml KOマウスにおけるMTMR2短アイソフォームの外因性発現はMTM1発現に類似して筋肉重量及び筋力をレスキューする
哺乳動物においてMTMR2-SがMTMR2-Lと比べてMTM1に機能的にも近いのかどうかを評価するため、MTM1、MTMR2-L及びMTMR2-SをMtml KOマウスにおいて過剰発現させ異なるミオパチー様表現型を分析した。異なるミオチューブラリンをCMVプロモーターの制御下でアデノ関連ウイルスAAV2/1から発現させ、組換えビリオンを生後2〜3週間のMtml KOマウスのTA筋中に注射した。Mtml KOマウスは2〜3週間で進行性筋収縮症及び虚弱を発症し、8週間までに死に至り、TA筋はこのモデルで検出された最も冒されている筋肉である(Buj-Belloら、2002年; Cowling, B.S.、Chevremont, T.、Prokic, I.、Kretz, C.、Ferry, A.、Coirault, C.、Koutsopoulos, O.、Laugel, V.、Romero, N.B. and Laporte, J. (2014) J Clin Invest、124、1350〜1363頁)。TA筋における4週間のMTM1のAAV媒介発現がMtml KOマウスにおいてミオパチー表現型を修正することが以前明らかにされた(Amoasii, L.、Bertazzi, D.L.、Tronchere, H.、Hnia, K.、Chicanne, G.、Rinaldi, B.、Cowling, B.S.、Ferry, A.、Klaholz, B.、Payrastre, B.ら(2012) PLoS Genet、8、e1002965)。したがって、Mtml KOマウス中へのMTMR2-L及びMTMR2-Sの導入の影響を判定するため、MTM1をレスキューについての陽性対照として、空AAV2/1を対側筋における疾患対照として使用して、AAV注射のための以前記載されたプロトコルに従った(Amoasii, L.、Bertazzi, D.L.、Tronchere, H.、Hnia, K.、Chicanne, G.、Rinaldi, B.、Cowling, B.S.、Ferry, A.、Klaholz, B.、Payrastre, B.ら(2012) PLoS Genet、8、e1002965)。抗MTM1及び抗MTMR2ウェスタンブロット分析から明らかにされたように、MTM1、MTMR2-L及びMTMR2-Sヒトミオチューブラリンは、注射されたTAにおいて発現した(図3A)。多分、低レベルの内在性発現のせいで、内在性MTMR2タンパク質は空AAVを注射された筋肉では検出されなかった(図3A)。
【０１１４】
AAV注射の4週間後、Mtml KOマウスのTA筋肉重量はWTマウスと比べて2.5分の1に減少した(両方とも空AAV対照を注射していた)。Mtml KOマウスにおけるMTM1又はMTMR2-S発現は空AAV対照と比べて筋肉量が有意に増加し(1.5倍)、MTMR2-Lとは逆であった(図3B)。野生型(WT)マウスにおけるヒトMTM1又はMTMR2構築物の潜在的肥大効果に取り組むため、注射されたWTマウスのTA筋重量を定量化した(図8)。増加した筋肉量はいかなるミオチューブラリンでも認められず、Mtml KOマウスにおいて観察された改善は肥大効果のせいではなく、機能的レスキューのせいであったことを示している。
【０１１５】
Mtml KOマウスはWTマウスと比べて非常に弱い筋力を示し、MTMR2-Lを含むすべてのミオチューブラリン構築物はTA特異的筋力を改善した(図3C)。注目すべきことに、MTM1及びMTMR2-Sについては類似するレスキューが観察され、MTMR2-L注射筋肉について観察されたレスキューよりも有意に上であった。これらの結果は、MTMR2-LとMTMR2-Sアイソフォームの両方がMTM1の喪失に起因する筋肉虚弱を改善し、MTMR2-S発現がMTM1遺伝子置換により観察されるレスキューに類似するレスキューを誘導することを示している。
【０１１６】
MTMR2アイソフォームはMtml KOマウスの組織病理学的特質をレスキューする
Mtml KOマウスでは、MTM1、MTMR2-L又はMTMR2-Sを保有するAAV2/1のTA注射は、筋肉量(MTMR2-Lを除いて)及び筋力を増加した(図3)。組織学的レベルでレスキューを分析するため、線維サイズ及び核局在化を決定した(図4)。HE(ヘマトキシリン-エオシン)染色は、空AAV又はMTMR2-Lで処置したMtml KOマウスよりもAAV-MTM1及びAAV-MTMR2-Sのほうが線維サイズが増加したことを明らかにしたが(図4A)、一部の領域はそれでももっと小さな萎縮線維を示している筋肉の空間的不均一性を本発明者らは観察した。形態計測的分析により、試験した異なるミオチューブラリン間では、MTM1はMTMR2構築物及び空AAVと比べてより大きな線維直径への明白な移行を誘導することが明らかにされた(図4C)。AAV-MTM1(平均58.4%)とAAV-MTMR2-L(平均26.2%)の間では、800μm2を超える面積を有する筋線維のパーセントで極めて有意な差(P<0.0001)が観察され、MTM1とMTMR2-S(39.8%)の間では有意差は低かった(P=0.033)(図4D)。Mtml KOマウスでは核は筋線維内の異常な位置にあるので、核の分布を分析した。Mtml KOのTA筋中へのMTM1、MTMR2-S又はMTMR2-Lの注射は、空AAVを注射した対側対照筋肉と比べて、適切に配置された周辺核のパーセントを有意に増加させた(図4E)。コハク酸脱水素酵素(SDH)染色は、Mtml KO線維の周辺及び中央での蓄積を示しており(Amoasii, L.、Bertazzi, D.L.、Tronchere, H.、Hnia, K.、Chicanne, G.、Rinaldi, B.、Cowling, B.S.、Ferry, A.、Klaholz, B.、Payrastre, B.ら(2012) PLoS Genet、8、e1002965)、異なるミオチューブラリン構築物が発現するとこの蓄積は大いに改善される(図4B)。これらの結果は、両方のMTMR2アイソフォームがMTM1ミオパチーの組織病理学的特質を改善することができ、MTMR2-Sのほうが効果的であったことを示している。
【０１１７】
MTMR2アイソフォームはMtml KO筋肉組織崩壊をレスキューしPtdIns3Pレベル正常化する
筋細管ミオパチーを抱えた患者及びMtml KOマウスは、微細構造レベルでその筋線維の細胞内組織崩壊を示す(Buj-Bello、2002年; Spiro, A.J.、Shy, G.M. and Gonatas, N.K. (1966) Myotubular myopathy. Persistence of fetal muscle in an adolescent boy. Arch. Neurol.、14、1〜14頁)。収縮装置及びトライアドの組織化を判定するため、異なる注射されたTA筋の微細構造を電子顕微鏡により評価した。以前公表されたように、空AAVを注射されたMtml KO筋肉ではZ線及びミトコンドリア誤整列、より細いサルコメア並びによく組織化されたトライアドの欠如が観察された(Amoasii, L.、Bertazzi, D.L.、Tronchere, H.、Hnia, K.、Chicanne, G.、Rinaldi, B.、Cowling, B.S.、Ferry, A.、Klaholz, B.、Payrastre, B.ら(2012) PLoS Genet、8、e1002965)(図5A)。MTM1及び両方のMTMR2アイソフォームの発現はこれらの異なる表現型を改善し、MTM1、MTMR2-L又はMTMR2-Sを注射した筋肉においては中央横行小管(T管)に関連する2つの筋小胞体槽を有するよく組織化されたトライアドが観察された(図5A)。更に、MTM1、MTMR2-L及びMTMR2-SのAAV媒介発現はサルコメアあたりのトライアドの数をほぼWTレベルにまで再び増やし、MTMR2-Lと比べてMTMR2-Sのほうが効果は優れていた(図5B)。
【０１１８】
酵母では、空胞形態により評価した場合、MTMR2-SのみがPtdIns3Pミオチューブラリン基質レベル、並びにPtdIns(3,5)P2のレベルを調節したが、MTMR2-Lはそうではなかった(図2B)。マウスにおけるMTMR2のレスキュー能力がその酵素活性と関連しているのかどうかを判定するため、Mtml KOマウスのAAV空、MTM1、MTMR2-L及びMTMR2-S注射TA筋においてPtdIns3Pの細胞内レベルを定量化した(図6A)。PtdIns3Pレベルは空AAV注射Mtml KO筋肉ではWT筋肉の2.3倍であり、PtdIns3P脂質基質へのMTM1の喪失の影響を反映している。MTM1が発現すると、PtdIns3Pレベルは野生型レベルにまで減少し、MTM1のインビボホスファターゼ活性を反映している。両方のMTMR2アイソフォームはMtml KOマウスで発現すると、PtdIns3Pレベルの減少を誘導したが、短MTMR2-SアイソフォームのみがPtdIns3Pを野生型レベルにまで正常化した。これらの結果は、MTMR2が筋肉においてインビボ酵素活性を示すことを明らかにしている。更に、MTMR2触媒活性はMtml KOミオパチーマウスにおける外因性発現により観察されるレスキューと相関している。
【０１１９】
まとめると、MTM1又はMTMR2-Sアイソフォームを発現しているMtml KOマウスでの結果は、筋力の低下、筋線維萎縮、核の位置ずれ、サルコメア及びトライアドの組織崩壊並びにPtdIns3Pレベルの増加を含む、ミオパチーに関連する異なる表現型が、空AAVを注射された対照マウスと比べて改善されていることを示している(表1)。注目すべきことに、酵母研究において観察されるように、短いほうのアイソフォームMTMR2-SはMTMR2-Lよりも良好なレスキューを提供し、MTM1に匹敵することが多かった。
【０１２０】
【表１】
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【０１２１】
MTMR2短アイソフォームの発現はMtml KOマウス筋肉において減少する
GTEx発現データベースに基づいて、これら2つのMTMR2タンパク質アイソフォームを産生するMTMR2 mRNA変異体(V1〜V4)が異なれば、発現される組織も異なり、骨格筋では低発現レベルであった(図1)。しかし、Mtml KOマウスのTA筋において過剰発現によるその強力なレスキュー特性にもかかわらず(図3〜5、6A;表1)、MTMR2変異体の内在性発現はミオパチー患者でのMTM1機能の喪失を代償しない。MTMR2-Lと-Sアイソフォームの間で観察されるレスキューの違いを理解するのを助けるため、本発明者らは、野生型(WT)マウスと比べたMtml KOのTA筋において異なるMTMR2変異体(V1〜V4)のmRNAレベルを定量化した(図6B)。結果は、MTMR2 mRNA全レベルはMtml KO筋では2分の1に減少したことを示している。これは主に、MTMR2-SアイソフォームをコードするV2及びV3転写物が強く減少したことに起因しており、MTMR2-LをコードするV1転写物のレベルはMtml KOとWTマウスの間で統計的に変化しないままであった。これらの減少は、図1Bが定量化を可能にしない従来のRT-PCRを示しているため図1Bでは観察されなかったことに留意されたい。MTMR2-SアイソフォームをコードするV2及びV3転写物の同じくらい類似する下方調節がXLCNM患者筋肉において観察された(図6C)。これらのデータは、内在性MTMR2によるMTM1喪失の代償の欠如が、骨格筋におけるMTMR2-S減少レベルに関連しているMTMR2の低発現レベルに関連付けられることを示唆している。或いは、これは筋肉における低レベルのMTMR2タンパク質と関連付けることができると考えられる。
【０１２２】
考察
ここでは、タンパク質の同じファミリーに属し、突然変異すると異なる組織を冒す異なる疾患、それぞれミオパチー及び神経障害を生じるMTM1及びMTMR2ミオチューブラリンの機能的特異性及び重複性を判定することを目標とした。潜在的な新規の治療戦略として互いを代償するその能力も試験した。酵母細胞における及びMtml KOミオパチーマウスの骨格筋におけるこれらヒトミオチューブラリンの分子調査及び過剰発現を使用して、そのPPIn基質に接近するその能力に関連付けられる異なる触媒活性を有する2つのMTMR2アイソフォームを特徴付けた。更に、MTMR2の過剰発現がMTM1喪失に起因するミオパチーをレスキューし、MTMR2-Lと比べて、短MTMR2-Sアイソフォームは酵母において及びマウスにおいて良好なPtdIns3Pホスファターゼ活性を示し、ミオチューブリン枯渇ymr1Δ酵母細胞における及びMtml KOマウスにおけるより良好なレスキュー特性と相関していることが明らかにされた。MTMR2-Lは、酵母アッセイでは性能は不十分であったがMtml KOマウスの表現型を部分的に改善したという事実は、酵母異種系における調節タンパク質の欠如のせいであると考えられる。
【０１２３】
MTMR2アイソフォーム及び機能
ヒト及びマウスには、N末端で72のアミノ酸伸長が異なる2つのタンパク質アイソフォーム(MTMR2-L及び-S)をコードする4つの天然に存在するMTMR2 mRNA変異体が存在する。MTMR2-Sは酵母及びマウスにおいてインビボでMTMR2-Lよりも高いホスファターゼ活性を示し、N末端がMTMR2機能の調節に重要であることを示唆している。このN末端伸長内のセリン58のリン酸化はMTMR2エンドソーム膜局在及び触媒機能に重要であることが明らかにされた。実際、MTMR2-S58Aリン酸化欠損突然変異体は膜構造体に局在化しており、リン酸化模倣突然変異体MTMR2-S58Eとは逆に、PtdIns3Pに対して活性であった。ここで、S58リン酸化残基を包含するN末端配列を欠くMTMR2-Sタンパク質は、酵母で発現される場合は膜に集中しており(図2B)、酵母では(図2D)及びマウス筋肉では(図6A)MTMR2-Lと比べてPtdIns3Pに対してより活性である。MTMR2のN末端伸長は結晶構造では解像されておらず、MTMR2のN末端伸長は異なる立体構造をとることが可能であり、MTMR2機能を調節している可能性があるという仮説を支持している(Begley, M.J.、Taylor, G.S.、Brock, M.A.、Ghosh, P.、Woods, V.L. and Dixon, J.E. (2006) Molecular basis for substrate recognition by MTMR2、a myotubularin family phosphoinositide phosphatase. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.、103、927〜932頁; Begley, M.J.、Taylor, G.S.、Kim, S.A.、Veine, D.M.、Dixon, J.E. and Stuckey、J.A. (2003) Crystal structure of a phosphoinositide phosphatase, MTMR2: insights into myotubular myopathy and Charcot-Marie-Tooth syndrome. Mol. Cell、12、1391〜1402頁)。これらの結果は、MTMR2には2つの形態が存在し、MTMR2-Sは主に膜局在化し、インビボでは高いホスファターゼ活性を有し、MTMR2-Lはその膜局在化がS58残基でのリン酸化に依存していることを示している。興味深いことに、脳では発現はMTMR2-LをコードするMTMR2 V1変異体に偏っている(図1)。S58リン酸化は、脳での発現が他の組織でよりもはっきりと高いErk2キナーゼによって媒介され、MTMR2-L発現と相関している(GTExデータベース)。
【０１２４】
ミオチューブラリン内での機能的重複性及び代償
ヒト組織には大部分が遍在性に発現される14のミオチューブラリンが存在するが、MTM1を喪失すると、特異的に重症先天性ミオパチーが生じる。これは、MTM1相同体、とりわけ、もっと近いMTMR2相同体が、内在性レベルで発現された場合、骨格筋においてMTM1の欠如を代償しないことを明らかにしている。ここで、MTMR2-SがミオパチーMtml KOマウスの骨格筋では下方調節されていることが証明される。更に、脳及び他の組織と比べて、MTMR2転写物の発現は骨格筋では低い。全体的に見て、これは、ミオパチーマウスモデルにおいて及びXLCNM患者筋肉においてその下方調節により悪化した筋肉でのMTMR2のこの低発現が代償の欠如の根拠であることを示唆している。実際、MTMR2-Sは、機能的ミオパチー表現型と構造的ミオパチー表現型の両方を更に良好に改善し、ミオパチー筋肉においてMTMR2-Lよりも有意に下方調節されている。これは、MTM1とMTMR2の間の機能的違いの分子基盤がPH-GRAMドメイン上流のN末端伸長に存在し、この伸長を欠くMTMR2-Sが酵母において及びマウスにおいてMTM1と類似するインビボ機能を示すことを明らかにしている。天然のMTMR2-LアイソフォームにおいてこのN末端伸長を取り除くとMTMR2活性はMTM1様活性に変換される。
【０１２５】
筋細管ミオパチーに対する新規の治療標的としてのMTMR2-S
このように、MTMR2-Sは治療標的として使用することが可能だと考えられる。ヒトMTMR2-SのMtml KOマウス中への筋肉内AAV形質導入は表現型を大いに改善し、筋肉ではレスキューが細胞自律的であることを支持している。この実際のプロトコルは筋肉内注射を通じたMTMR2による細胞自律的代償を調べることを目標としたが、Mtml KOマウスは九分どおり呼吸不全及び給餌不良からおよそ2か月で死亡するので、レスキューの程度及びMTMR2媒介レスキューの長期潜在力を判定することはできなかった。これらのデータは、MTMR2-Sアイソフォームが主な記載のMTMR2-Lアイソフォームよりも良好なレスキュー能力を有し、筋肉においてを含む天然に存在する変異体であることを支持している。MTMR2-S転写物はMtml KO筋肉では減少しているので、潜在的な戦略は、MTMR2選択的スプライシング又は外因性発現の調節によりその発現を促進することになる。
【０１２６】
全身注射を通じた全体的なマウスに対するMTMR2-S発現の効果
上記のように、筋肉内注射はMtml KOマウスモデルにおけるMTM1及びMTMR2の筋肉特異的機能及びレスキュー能力を調べることを可能にした。この研究を完了させ全体的なマウスに対するMTMR2発現の効果を観察するため、全身注射を実施した。
【０１２７】
野生型又はMtml KOの仔に、誕生時に又は1日目に1.5×1012ユニットの空AAVウイルス粒子又はMTM1若しくはMTMR2-Sを過剰発現しているAAVを腹腔内注射した。次に、注射の3週間後、体重及びマウス骨格筋力を2つの異なる試験:グリップ試験及びハンギング試験により測定した。マウスは、空AVVを注射したMtml KO罹患マウスがまだ生存してる場合、生後7週間から屠殺し、ミオチューブラリン過剰発現と空ベクターを比較することを可能にした。
【０１２８】
MTM1及びMTMR2-Sアイソフォームの過剰発現は、前脛骨筋及び横隔膜骨格筋でウェスタンブロットにより評価した。どちらの場合でも、筋肉内注射について上で見られたように、ミオチューブラリンは予想されたサイズでよく検出された。これにより、すべてのミオチューブラリンがマウスにおいて出生後1日目でのAAVの全身送達後骨格筋においてよく発現されることが確かめられた。
【０１２９】
注射したマウスの寿命及び体重に対するミオチューブラリンの全身発現の効果を分析した。最初の主要な所見は、MTMR2-SがMtml KOマウスの寿命を増やした(3/4が7〜10週まで生存した)ことであった。ミオパチーマウスは通常であれば生後およそ5〜7週に死亡するが、MTMR2-S過剰発現により2頭のマウスが生後10週に達することができた(測定した最も高齢の時点)。MTM1が寿命に対して類似するレスキュー効果があることはすでに公表されていた。この実験により、MTMR2-SアイソフォームがMtmlノックアウトマウスの寿命を増やすことが可能であることが確認される。
【０１３０】
ミオパチーMtml KOマウスの主要な臨床表現型は、WTマウスと比べて生後2〜3週以降の低体重、及び生後およそ5週目に始まる進行性の体重減少である(Cowlingら、2014年)。後者は主に筋肉量の減少、及び疾患の最終段階では餌まで達することが困難になることに起因する。これとは対照的に、WTマウスはその一生の最初の10〜12週の間は次第に体重が増え続ける(図9)。ヒトMTM1を過剰発現しているマウスは初めのうちは空AAVを注射されたMtml KOマウスよりも大きく、WTマウスと同じ速度で申し分なく体重が増える。並べて見ると、MTMR2-Sを過剰発現しているマウスも生後3週〜5週まで体重の良好なレスキューを示すが、その後、体重が減り始めMtml KOレベルに達する(図9)。相関関係では、MTMR2-S発現のプラス効果は生後5週までは臨床的に明らかであり(しかし、定量化はしていない)、その後マウスはMtml KOの典型的な表現型(筋肉量及び筋力の減少、脊柱側弯症、呼吸及び歩行困難)を次第に発症し始めた。
【０１３１】
これらの結果は、MTMR2短アイソフォームがMtml KOマウスの寿命及び体重を改善したことを示している。
【０１３２】
筋細管ミオパチーのその他の明白な臨床特長は、Mtml KOマウスモデルで再現される重症筋力低下である。ハンギング試験は全身の強さを測定する。MTMR2アイソフォームの過剰発現のせいで、Mtml KOマウスは次第に長くハンギングする(30〜40秒で開始して)ことができるようになり、ついにはWTレベルに達し、7週後には3×60秒ハンギングできた(図10)。同じ年齢で、Mtml KOマウスの半分は通常死亡しており、試験した2頭のマウスは5週間後数秒を超えてハンギングすることはできなかった。MTM1効果ははるかに良好であり、Mtml KOマウスは4週間後には60秒間申し分なくハンギングできるようになった。常に60秒間ハンギングできたWTマウスではいかなるミオチューブラリンについてもマイナス効果は観察されなかった。
【０１３３】
これらの結果は、MTMR2-SアイソフォームがMtml KOマウスの筋力をレスキューしたことを示していた。とりわけ、外見上病んでおり(呼吸困難、脊柱側弯症)MTMR2アイソフォームを注射されたこれらのマウスは、WTマウス同様に60秒間ハンギングができ、全身の強さが強力に改善されたことを示唆している(図10)。
【０１３４】
結論
同定された短MTMR2アイソフォームと長MTMR2アイソフォーム両方の筋肉内注射はミオパチー表現型を改善し、並べて比べた場合、短アイソフォーム(MTMR2-S)のほうが良好なレスキュー効果を示していた。全身注射により、MTMR2-Sアイソフォーム発現はMtml KOマウスにおいてミオパチー表現型発病を遅らせることができ、その筋力を著しくレスキューしたことが確認された。MTMR2アイソフォームを過剰発現しているマウスはそれでも冒されたが、Mtml KOマウスより明らかに動き回ることができた。全体的に見て、この全身研究は申し分のない予備的データを示しており、MTMR2-Sの過剰発現が、筋細管ミオパチーのマウスモデルであるMtmlノックアウトマウスにおいてミオパチー表現型を改善することができることを支持している。
【０１３５】
MTMR2-S配列
配列番号1(ヒトMTMR2-Sタンパク質)
ヒトMTMR2-Sタンパク質配列(NP_001230500.1, NP_958438.1 et NP_958435.1)
配列番号2(ヌクレオチドヒトMTMR2-S、cDNA)コード配列
ヒトMTMR2-Sコード配列(CCDS:CCDS8306.1 - NM_201278.2:664..2379)
同じタンパク質MTMR2-Sをコードする3つのアイソフォームRNA:
配列番号3:ヒトMTMR2 mRNA V2に対応するcDNA(NM_201278.2)
配列番号4:ヒトMTMR2 mRNA V3に対応するcDNA(NM_201281.2)
配列番号5:ヒトMTMR2 mRNA V4に対応するcDNA(NM_001243571.1)
【図１】
2020529836.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
2020529836000001.app
【国際調査報告】
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