(57)【要約】本発明はレプチン受容体（ＬＥＰＲ）に結合する抗体および抗体の抗原結合性断片ならびにそれを使用する方法を提供する。ある特定の実施形態によれば本発明はＬＥＰＲに結合しＬＥＰＲシグナル伝達をアンタゴナイズする抗体および抗体の抗原結合性断片を含む。ある特定の実施形態では本発明はレプチンの存在下または非存在下でＬＥＰＲに結合する抗体および抗体の抗原結合性断片を含む。他の実施形態では本発明はＬＥＰＲシグナル伝達の部分的なアゴニズムを呈する抗体および抗体の抗原結合性断片を含む。本発明の抗体および抗原結合性断片は鬱血性心不全悪液質、肺悪液質およびがん悪液質、自己免疫障害、がん等の疾患および上昇したレプチンシグナル伝達に関連するまたはそれにより引き起こされる他の疾患および障害が挙げられるがこれらに限定されない様々な状態の治療のために有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトレプチン受容体（ＬＥＰＲ）に結合し、ＬＥＰＲシグナル伝達をアンタゴナイズするが、レプチンとＬＥＰＲとの相互作用をブロックしない、単離された抗体またはその抗原結合性断片であって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのレプチン結合アッセイにおける測定において、約４０％より多く前記相互作用をブロックしない、単離された抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項２】
（ｉ）表面プラズモン共鳴による測定で、約１０ｎＭ未満のＫＤで２５℃において単量体ヒトＬＥＰＲに結合すること；
（ｉｉ）表面プラズモン共鳴による測定で、約５分より長いｔ１／２で２５℃において単量体ヒトＬＥＰＲに結合すること；
（ｉｉｉ）表面プラズモン共鳴による測定で、約２．０ｎＭ未満のＫＤで２５℃において二量体ヒトＬＥＰＲに結合すること；
（ｉｖ）表面プラズモン共鳴による測定で、約２０分より長いｔ１／２で２５℃において二量体ヒトＬＥＰＲに結合すること；
（ｖ）ヒトヒトレプチンとの複合体でヒトＬＥＰＲに結合すること；
（ｖｉ）ヒトレプチンの存在下および非存在下で細胞表面発現ＬＥＰＲに結合すること；および
（ｖｉｉ）細胞ベースのレポーターアッセイにおいて、約３．０ｎＭ未満のＩＣ５０でレプチン誘導性のＬＥＰＲシグナル伝達を阻害すること
からなる群から選択される１つまたは複数の追加の特性を呈する、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項３】
ヒトレプチンの非存在下での細胞ベースのレポーターアッセイにおいて、ＬＥＰＲシグナル伝達の少なくとも部分的な活性化を呈する、請求項１または２に記載の単離された抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項４】
ヒトレプチン受容体（ＬＥＰＲ）に結合する単離された抗体またはその抗原結合性断片であって、（ａ）配列番号２、配列番号４２、および配列番号５８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）および（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）のＣＤＲを含む、単離された抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項５】
配列番号２／１０、４２／１０、および５８／１０からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲのアミノ酸配列対の重鎖および軽鎖ＣＤＲを含む、請求項４に記載の単離された抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項６】
配列番号２／１０、４２／１０、および５８／１０からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲのアミノ酸配列対を含む、請求項５に記載の単離された抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項７】
ＬＥＰＲシグナル伝達をアンタゴナイズする、請求項６に記載の単離された抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項８】
ヒトレプチン受容体（ＬＥＰＲ）に結合し、（ａ）配列番号２、配列番号４２、および配列番号５８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）および（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）のＣＤＲを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項９】
配列番号２／１０、４２／１０、および５８／１０からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲのアミノ酸配列対を含む参照抗体と、ＬＥＰＲへの結合について競合する、請求項１から４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１０】
配列番号２／１０、４２／１０、および５８／１０からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲのアミノ酸配列対を含む参照抗体と同じＬＥＰＲ上のエピトープに結合する、請求項１から９のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む、医薬組成物。
【請求項１２】
レプチンシグナル伝達に関連するまたはそれにより引き起こされる疾患を治療する方法であって、それを必要とする対象に請求項１１に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項１３】
前記レプチンシグナル伝達に関連するまたはそれにより引き起こされる疾患または状態が、無食欲または他の精神医学的摂食障害、慢性腎臓疾患悪液質、他の悪液質、例えば、鬱血性心不全悪液質、肺悪液質、放射線悪液質、およびがん悪液質、自己免疫障害、例えば、炎症性腸疾患、ループスエリテマトーデス、多発性硬化症、乾癬、心臓血管疾患、高血圧、鬱病、非アルコール性脂肪肝疾患、神経変性障害、鬱病、がん、例えば、肝細胞癌、黒色腫および乳がんからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
活性化ＬＥＰＲ変異に関連するまたはそれにより引き起こされる疾患または状態を治療する方法であって、それを必要とする対象に請求項１１に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項１５】
前記ＬＥＰＲ変異がＬＥＰＲ  Ｑ２２３Ｒである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記活性化ＬＥＰＲ変異に関連するまたはそれにより引き起こされる疾患または状態が悪液質である、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
第２の治療剤を前記対象に投与することをさらに含み、前記第２の治療剤が、抗うつ剤、食欲刺激剤、無食欲および悪液質の治療、ＣＯＸ−２阻害剤、ＮＳＡＩＤ、悪液質を伴うまたは伴わない筋肉量、筋肉機能および／または筋肉強度の損失を回復させるための治療、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の治療、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ感染症の治療、ＴＮＦ−アルファ産生のブロッキング剤、酸化防止剤、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）のアンタゴニスト、Ｂリンパ球刺激剤、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、キナーゼ阻害剤、ならびに化学療法剤から選択される、請求項１２から１６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
レプチンは、主に脂肪組織により発現されるポリペプチドホルモンであり、代謝の調節、エネルギーバランスおよび摂食に関与する。レプチン活性は、レプチン受容体との相互作用、およびレプチン受容体を通じたシグナル伝達により媒介される。レプチン受容体（「ＬＥＰＲ」、「ＷＳＸ」「ＯＢ受容体」、「ＯＢ−Ｒ」、および「ＣＤ２９５」としても公知）は、大きい（８１８アミノ酸）細胞外ドメインを有するクラスＩサイトカイン受容体ファミリーの１回膜貫通型受容体である。レプチン、Ｏｂ−Ｒレプチン受容体または両方の上昇した発現は、無食欲または他の精神医学的摂食障害、慢性腎臓疾患悪液質、他の悪液質、例えば、鬱血性心不全悪液質、肺悪液質、放射線悪液質、およびがん悪液質、自己免疫障害、例えば、炎症性腸疾患、ループスエリテマトーデス、多発性硬化症、乾癬、心臓血管疾患、高血圧、鬱病、非アルコール性脂肪肝疾患、神経変性障害、鬱病、がん、例えば、肝細胞癌、黒色腫および乳がんが挙げられるがこれらに限定されない多数の障害に寄与し得る。
【背景技術】
【０００２】
高いレプチンシグナル伝達に対処するための提案される治療アプローチとしては、レプチン受容体ペプチドアンタゴニストおよびアンタゴニスト変異体、例えば、可溶性レプチン受容体バリアント、競合的ＬＥＰＲアンタゴニスト、例えば抗体９Ｆ８（Ｆａｚｅｌｉら（２００６年）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３１２巻、１９０〜２００頁）、またはレプチン受容体を標的化するナノボディ（ＭｃＭｕｒｐｈｙら、ＰＬＯＳ  Ｏｎｅ（２０１４年）９巻（２号）：ｅ８９８９５）、フィブロネクチンＩＩＩドメイン、食欲誘発物質（例えば、グレリンおよびＮＰＹ）の使用、レプチンの下流メディエーター（例えば、メラノコルチン受容体４）のブロックおよび／またはライフスタイルの変更が挙げられる。しかしながら、そのようなアプローチは一般に有効性が限られることが示されている。したがって、レプチン抵抗性ならびに上昇した血清レプチンレベル、および／または過度のＬＥＰＲシグナル伝達に関連する他の状態を治療するための代替アプローチに対する必要性が当該技術分野において存在する。
配列表
配列表の正式なコピーを、ファイル名：２０１７＿１１＿０８＿１０２７１ＷＯ０１＿ＳＥＱ＿ＬＩＳＴ＿ＳＴ２５．ＴＸＴ、作成日：２０１７年１１月８日、サイズ：約８７．４キロバイトのＡＳＣＩＩ形式の配列表としてＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に本明細書と同時に提出する。このＡＳＣＩＩ形式の文書中に含まれる配列表は本明細書の一部であり、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｆａｚｅｌｉら（２００６年）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３１２巻、１９０〜２００頁
【非特許文献２】ＭｃＭｕｒｐｈｙら、ＰＬＯＳ  Ｏｎｅ（２０１４年）９巻（２号）：ｅ８９８９５
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明の簡単な要旨
本発明は、ヒトレプチン受容体（ＬＥＰＲ）に結合する抗体およびその抗原結合性断片を提供する。本発明の抗体はアンタゴニスト抗体であり、すなわち、ＬＥＰＲへの本発明の抗ＬＥＰＲ抗体の結合は、細胞においてレプチン受容体シグナル伝達のブロックまたは下方調節を結果としてもたらす。したがって、様々な実施形態において、本発明のアンタゴニスト抗体は弱い部分アゴニスト活性を呈する。代わりに、本発明の抗体は、例えば、対象においてレプチンの生物学的活性を下方調節するために有用である。したがって、本発明の抗体および抗原結合性断片は、上昇したレプチンシグナル伝達に関連する疾患および障害の治療処置において有用である。
【０００５】
本発明の抗体は、全長（例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４抗体）であってよく、または抗原結合部分（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２またはｓｃＦｖ断片）のみを含んでもよく、機能性に影響するように、例えば、残留エフェクター機能を取り除くように、修飾されていてもよい（Ｒｅｄｄｙら、２０００年、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６４巻：１９２５〜１９３３頁）。
【０００６】
例示的な本発明のＬＥＰＲアンタゴニスト抗体は本明細書中の表１および表２に列記される。表１は、例示的なＬＥＰＲアンタゴニスト抗体の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）、重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）、および軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列特定番号を記載する。表２は、例示的なＬＥＰＲアンタゴニスト抗体のＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２  ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３の核酸配列特定番号を記載する。
【０００７】
本発明は、表１に列記されるＨＣＶＲのアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲを含む、ＬＥＰＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
【０００８】
本発明はまた、表１に列記されるＬＣＶＲのアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲを含む、ＬＥＰＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
【０００９】
本発明はまた、表１に列記されるＬＣＶＲのアミノ酸配列のいずれかと対になった表１に列記されるＨＣＶＲのアミノ酸配列のいずれかを含むＨＣＶＲおよびＬＣＶＲのアミノ酸配列対（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）を含む、ＬＥＰＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片を提供する。ある特定の実施形態によれば、本発明は、表１に列記される例示的な抗ＬＥＰＲ抗体のいずれか内に含有されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲのアミノ酸配列対を含む、抗体またはその抗原結合性断片を提供する。ある特定の実施形態では、ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲのアミノ酸配列対は、配列番号２／１０、１８／１０、２６／１０、３４／１０、４２／１０、５０／１０、５８／１０、６６／１０、および７４／８２からなる群から選択される。
【００１０】
本発明はまた、表１に列記される重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）のアミノ酸配列または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１を含む、ＬＥＰＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
【００１１】
本発明はまた、表１に列記される重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）のアミノ酸配列または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２を含む、ＬＥＰＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
【００１２】
本発明はまた、表１に列記される重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）のアミノ酸配列または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３を含む、ＬＥＰＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
【００１３】
本発明はまた、表１に列記される軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）のアミノ酸配列または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１を含む、ＬＥＰＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
【００１４】
本発明はまた、表１に列記される軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）のアミノ酸配列または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２を含む、ＬＥＰＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
【００１５】
本発明はまた、表１に列記される軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む、ＬＥＰＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
【００１６】
本発明はまた、表１に列記されるＬＣＤＲ３のアミノ酸配列のいずれかと対になった表１に列記されるＨＣＤＲ３のアミノ酸配列のいずれかを含むＨＣＤＲ３およびＬＣＤＲ３のアミノ酸配列対（ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３）を含む、ＬＥＰＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片を提供する。ある特定の実施形態によれば、本発明は、表１に列記される例示的な抗ＬＥＰＲ抗体のいずれか内に含有されるＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列対を含む、抗体またはその抗原結合性断片を提供する。ある特定の実施形態では、ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列対は、配列番号８／１６、２４／１６、３２／１６、４０／１６、４８／１６、５６／１６、６４／１６、７２／１６、８０／１６および８０／８８からなる群から選択される。
【００１７】
本発明はまた、表１に列記される例示的な抗ＬＥＰＲ抗体のいずれか内に含有される６つのＣＤＲ（すなわち、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）のセットを含む、ＬＥＰＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片を提供する。ある特定の実施形態では、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３のアミノ酸配列のセットは、配列番号４、６、８、１２、１４、１６；２０、２２、２４、１２、１４、１６；２８、３０、３２、１２、１４、１６；３６、３８、４０、１２、１４、１６；５２、５４、５６、１２、１４、１６；６０、６２、６４、１２、１４、１６；６８、７０、７２、１２、１４、１６；および７６、７８、８０、８４、８６、８８からなる群から選択される。
【００１８】
関連する実施形態では、本発明は、表１に列記される例示的な抗ＬＥＰＲ抗体のいずれかにより定義されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲのアミノ酸配列対内に含有される６つのＣＤＲ（すなわち、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）のセットを含む、ＬＥＰＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片を提供する。例えば、本発明は、配列番号２／１０、１８／１０、２６／１０、３４／１０、４２／１０、５０／１０、５８／１０、６６／１０、および７４／８２からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲのアミノ酸配列対内に含有されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３のアミノ酸配列のセットを含む、ＬＥＰＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片を含む。ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲのアミノ酸配列内のＣＤＲを同定する方法および技術は当該技術分野において周知であり、それを使用して、本明細書に開示される特定のＨＣＶＲおよび／またはＬＣＶＲのアミノ酸配列内のＣＤＲを同定することができる。ＣＤＲの境界を同定するために使用できる例示的な規則としては、例えば、Ｋａｂａｔの定義、Ｃｈｏｔｈｉａの定義、およびＡｂＭの定義が挙げられる。一般的に、Ｋａｂａｔの定義は配列の可変性に基づき、Ｃｈｏｔｈｉａの定義は構造的ループ領域の位置に基づき、ＡｂＭの定義はＫａｂａｔのアプローチとＣｈｏｔｈｉａのアプローチとの妥協である。例えば、Ｋａｂａｔ、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１年）；Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２７３巻：９２７〜９４８頁（１９９７年）；およびＭａｒｔｉｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６巻：９２６８〜９２７２頁（１９８９年）を参照。抗体内のＣＤＲの配列を同定するための公的データベースも利用可能である。
【００１９】
本発明はまた、抗ＬＥＰＲ抗体またはその部分をコードする核酸分子を提供する。例えば、本発明は、表１に列記されるＨＣＶＲのアミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供し、ある特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列記されるＨＣＶＲの核酸配列、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
【００２０】
本発明はまた、表１に列記されるＬＣＶＲのアミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供し、ある特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列記されるＬＣＶＲの核酸配列、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
【００２１】
本発明はまた、表１に列記されるＨＣＤＲ１のアミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供し、ある特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列記されるＨＣＤＲ１の核酸配列、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
【００２２】
本発明はまた、表１に列記されるＨＣＤＲ２のアミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供し、ある特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列記されるＨＣＤＲ２の核酸配列、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
【００２３】
本発明はまた、表１に列記されるＨＣＤＲ３のアミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供し、ある特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列記されるＨＣＤＲ３の核酸配列、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
【００２４】
本発明はまた、表１に列記されるＬＣＤＲ１のアミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供し、ある特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列記されるＬＣＤＲ１の核酸配列、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
【００２５】
本発明はまた、表１に列記されるＬＣＤＲ２のアミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供し、ある特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列記されるＬＣＤＲ２の核酸配列、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
【００２６】
本発明はまた、表１に列記されるＬＣＤＲ３のアミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供し、ある特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列記されるＬＣＤＲ３の核酸配列、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
【００２７】
本発明はまた、ＨＣＶＲをコードする核酸分子であって、ＨＣＶＲが、３つのＣＤＲ（すなわち、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）のセットを含み、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列のセットが、表１に列記される例示的な抗ＬＥＰＲ抗体のいずれかにより定義される、核酸分子を提供する。
【００２８】
本発明はまた、ＬＣＶＲをコードする核酸分子であって、ＬＣＶＲが、３つのＣＤＲ（すなわち、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）のセットを含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列のセットが、表１に列記される例示的な抗ＬＥＰＲ抗体のいずれかにより定義される、核酸分子を提供する。
【００２９】
本発明はまた、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲの両方をコードする核酸分子であって、ＨＣＶＲが、表１に列記されるＨＣＶＲのアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列を含み、かつ、ＬＣＶＲが、表１に列記されるＬＣＶＲのアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列を含む、核酸分子を提供する。ある特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列記されるＨＣＶＲの核酸配列、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、および表２に列記されるＬＣＶＲの核酸配列、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列を含む。本発明のこの態様によるある特定の実施形態では、核酸分子は、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲをコードし、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲの両方は、表１に列記される同じ抗ＬＥＰＲ抗体に由来する。
【００３０】
本発明はまた、抗ＬＥＰＲ抗体の重鎖または軽鎖可変領域を含むポリペプチドを発現できる組換え発現ベクターを提供する。例えば、本発明は、上記の核酸分子、すなわち、表１に記載されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲの配列のいずれかをコードする核酸分子のいずれかを含む組換え発現ベクターを含む。そのようなベクターが導入された宿主細胞の他に、抗体または抗体断片の産生を可能とする条件下で宿主細胞を培養すること、およびそのようにして産生された抗体および抗体断片を回収することにより抗体またはその部分を製造する方法も本発明の範囲内に含まれる。
【００３１】
別の態様では、本発明は、ＬＥＰＲに特異的に結合する組換えヒト抗体またはその断片および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。関連する態様では、本発明は、抗ＬＥＰＲ抗体と第２の治療剤との組合せである組成物を特徴とする。一実施形態では、第２の治療剤は、抗ＬＥＰＲ抗体と有利に組み合わせられる任意の剤である。
【００３２】
さらに別の態様では、本発明は、本発明の抗ＬＥＰＲ抗体または抗体の抗原結合部分を使用してＬＥＰＲシグナル伝達を下方調節しまたは無効化させるための治療方法を提供する。本発明のこの態様による治療方法は、本発明の抗体または抗体の抗原結合性断片を含む治療有効量の医薬組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む。治療される障害は、ＬＥＰＲシグナル伝達を下方調節し、もしくは無効化させることにより、またはレプチンの活性をブロックすることにより改善され、良くなり、阻害されまたは予防される任意の疾患または状態である。
【００３３】
他の実施形態は以下の詳細な説明の検討から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１は、３０ｍｇ／ｋｇの抗ＬＥＰＲ抗体Ｈ４Ｈ１７３２２Ｐ２、Ｈ４Ｈ１８４５７Ｐ２、もしくはＨ４Ｈ１８４６４、または同位体対照抗体で処置したマウスの摂食量の変化のパーセントを示す。
【００３５】
【図２】図２は、３０ｍｇ／ｋｇの抗ＬＥＰＲ抗体Ｈ４Ｈ１７３２２Ｐ２、Ｈ４Ｈ１８４５７Ｐ２、もしくはＨ４Ｈ１８４６４、または同位体対照抗体で処置したマウスの体重の変化の平均パーセントを示す。
【００３６】
【図３】図３は、３０ｍｇ／ｋｇの抗ＬＥＰＲ抗体Ｈ４Ｈ１７３２２Ｐ２、Ｈ４Ｈ１８４５７Ｐ２、もしくはＨ４Ｈ１８４６４、または同位体対照抗体で処置したマウスの平均脂肪量を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
発明の詳細な説明
本発明を説明する前に、本発明は記載される特定の方法および実験条件に限定されず、そのような方法および条件を変更できることが理解されるべきである。本明細書で使用される学術用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、限定的であることは意図されないことも理解されるべきであり、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【００３８】
別段の定義がなければ、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で使用される場合、特定の記載された数値に関して使用された場合の「約」という用語は、その値が記載した値から１％以下で変化してもよいことを意味する。例えば、本明細書で使用される場合、「約１００」という表現は、９９および１０１ならびにこれらの間の全ての値（例えば、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４など）を含む。
【００３９】
本明細書に記載される方法および材料に類似のまたは同等の任意の方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料をこれより説明する。本明細書において言及される全ての特許、特許出願および非特許文献は、参照することによりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
定義
【００４０】
本明細書で使用される場合、「レプチン受容体」、「ＬＥＰＲ」などの表現は、配列番号８９（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ４８３５７も参照）に示されるアミノ酸配列を含むヒトレプチン受容体を指す。科学文献において使用されるＬＥＰＲの代替的な名称としては、「ＯＢ受容体」、「ＯＢ−Ｒ」および「ＣＤ２９５」が挙げられる。ＬＥＰＲはまた、「ＷＳＸ」とも称される（例えば、米国特許第７，５２４，９３７号を参照）。「ＬＥＰＲ」という表現は、単量体および多量体（例えば、二量体）の両方のＬＥＰＲ分子を含む。本明細書で使用される場合、「単量体ヒトＬＥＰＲ」という表現は、いかなる多量体化ドメインも含有または保有せず、別のＬＥＰＲ分子への直接的な物理的接続なしで単一のＬＥＰＲ分子として通常条件下で存在するＬＥＰＲタンパク質またはその部分を意味する。例示的な単量体ＬＥＰＲ分子は、配列番号９０のアミノ酸配列を含む本明細書において「ｈＬＥＰＲ．ｍｍｈ」と称される分子である（例えば、本明細書の実施例３を参照）。本明細書で使用される場合、「二量体ヒトＬＥＰＲ」という表現は、リンカー、共有結合、非共有結合、または抗体Ｆｃドメインなどの多量体化ドメインを通じて互いに接続された２つのＬＥＰＲ分子を含む構築物を意味する。例示的な二量体ＬＥＰＲ分子は、配列番号９１のアミノ酸配列を含む本明細書において「ｈＬＥＰＲ．ｍＦｃ」と称される分子（例えば、本明細書の実施例３を参照）、または配列番号９２のアミノ酸配列を含む本明細書において「ｈＬＥＰＲ．ｈＦｃ」と称される分子である。本明細書で使用される場合、「抗ＬＥＰＲ抗体」、「ＬＥＰＲに特異的に結合する抗体」、「ＬＥＰＲ特異的結合タンパク質」などの表現は、そうでないことを具体的に指し示さない限り、全長ヒトＬＥＰＲ、単量体ヒトＬＥＰＲ、二量体ヒトＬＥＰＲ、またはＬＥＰＲ細胞外ドメインを含むもしくはそれからなる他の構築物に結合する分子を指す。
【００４１】
本明細書におけるタンパク質、ポリペプチドおよびタンパク質断片への全ての言及は、非ヒト種からのものであることが明示的に特定されない限り、各々のタンパク質、ポリペプチドまたはタンパク質断片のヒトバージョンを指すことが意図される。したがって、「ＬＥＰＲ」という表現は、非ヒト種、例えば、「マウスＬＥＰＲ」、「サルＬＥＰＲ」などからのものであることが明示的に特定されない限り、ヒトＬＥＰＲを意味する。
【００４２】
本明細書で使用される場合、「細胞表面発現ＬＥＰＲ」という表現は、ＬＥＰＲタンパク質の少なくとも一部分が細胞膜の細胞外側に露出され、かつ抗体の抗原結合部分に接近可能であるようにｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで細胞の表面上に発現される１つまたは複数のＬＥＰＲタンパク質、またはその細胞外ドメインを意味する。「細胞表面発現ＬＥＰＲ」は、通常（例えば、天然または野生型状態で）ＬＥＰＲタンパク質を発現する細胞の表面上に発現されるＬＥＰＲタンパク質を含むまたはそれからなることができる。あるいは、「細胞表面発現ＬＥＰＲ」は、通常その表面上にヒトＬＥＰＲを発現しないが、その表面上にＬＥＰＲを発現するように人工的に操作されている細胞の表面上に発現されるＬＥＰＲタンパク質を含むまたはそれからなることができる。
【００４３】
本明細書で使用される場合、「抗ＬＥＰＲ抗体」または「ヒトレプチン受容体に結合する抗体」などの表現は、単一の特異性を有する一価抗体の他に、ＬＥＰＲに結合する第１のアームおよび第２の（標的）抗原に結合する第２のアームを含み、抗ＬＥＰＲアームが本明細書の表１に記載されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲまたはＣＤＲの配列のいずれかを含む二重特異的抗体の両方を含む。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、特定の抗原（例えば、ＬＥＰＲ）に特異的に結合しまたは相互作用する少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む任意の抗原結合分子または分子複合体を意味する。「抗体」という用語は、ジスルフィド結合により相互接続された４つのポリペプチド鎖、すなわち、２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリン分子の他に、その多量体（例えば、ＩｇＭ）を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＨＣＶＲまたはＶＨと略記される）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、すなわち、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＬＣＶＲまたはＶＬと略記される）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は１つのドメイン（ＣＬ１）を含む。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに分割することができる。各ＶＨおよびＶＬは３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成され、これらはアミノ末端からカルボキシ末端へと以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で並べられる。本発明の異なる実施形態では、抗ＬＥＰＲ抗体（またはその抗原結合部分）のＦＲは、ヒト生殖細胞系列配列と同一であってよく、または天然にもしくは人工的に改変されてもよい。アミノ酸コンセンサス配列は、２つまたはそれより多くのＣＤＲの対比解析に基づいて定義することができる。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、完全抗体分子の抗原結合性断片も含む。本明細書で使用される場合、抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合性断片」などの用語は、抗原に特異的に結合して複合体を形成する任意の天然に存在する、酵素により得られ得る、合成の、または遺伝子操作されたポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。抗体の抗原結合性断片は、例えば、任意の好適な標準技術、例えば、タンパク質消化分解または抗体可変ドメインおよび任意選択で定常ドメインをコードするＤＮＡのマニピュレーションおよび発現を伴う組換え遺伝子操作技術を使用して、完全抗体分子に由来してよい。そのようなＤＮＡは公知であり、かつ／または、例えば、商業的な供給元、ＤＮＡライブラリー（例えば、ファージ抗体ライブラリーなど）から容易に入手可能であり、または合成することができる。ＤＮＡは、シークエンシングすることができ、および、化学的にまたは分子生物学技術を使用して、例えば、１つまたは複数の可変および／または定常ドメインを好適な構成に並べ、またはコドンを導入し、システイン残基を作出し、アミノ酸を改変し、付加しもしくは欠失させることなどによりマニピュレーションを行うことができる。
【００４６】
抗原結合性断片の非限定的な例としては以下が挙げられる：（ｉ）Ｆａｂ断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）Ｆｄ断片；（ｉｖ）Ｆｖ断片；（ｖ）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子；（ｖｉ）ｄＡｂ断片；および（ｖｉｉ）抗体の超可変領域（例えば、単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、例えばＣＤＲ３ペプチド）、または拘束されたＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４ペプチドを模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位。他の操作された分子、例えば、ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ナノボディ（例えば、一価ナノボディ、二価ナノボディなど）、小モジュラー免疫医薬（ＳＭＩＰ）、およびサメ可変ＩｇＮＡＲドメインもまた本明細書で使用される「抗原結合性断片」という表現に包含される。
【００４７】
抗体の抗原結合性断片は、典型的に、少なくとも１つの可変ドメインを含む。可変ドメインは、任意の大きさまたはアミノ酸組成であってよく、通常、１つまたは複数のフレームワーク配列に隣接するまたはそれとインフレームである少なくとも１つのＣＤＲを含む。ＶＬドメインが付随するＶＨドメインを有する抗原結合性断片において、ＶＨおよびＶＬドメインは、互いに対して任意の好適な並びで位置してよい。例えば、可変領域は二量体であってよく、ＶＨ−ＶＨ、ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＬ二量体を含有してよい。あるいは、抗体の抗原結合性断片は、単量体ＶＨまたはＶＬドメインを含有してもよい。
【００４８】
ある特定の実施形態では、抗体の抗原結合性断片は、少なくとも１つの定常ドメインに共有結合により連結した少なくとも１つの可変ドメインを含有してよい。本発明の抗体の抗原結合性断片内に見出され得る可変および定常ドメインの非限定的な、例示的な構成としては以下が挙げられる：（ｉ）ＶＨ−ＣＨ１；（ｉｉ）ＶＨ−ＣＨ２；（ｉｉｉ）ＶＨ−ＣＨ３；（ｉｖ）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２；（ｖ）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；（ｖｉ）ＶＨ−ＣＨ２−ＣＨ３；（ｖｉｉ）ＶＨ−ＣＬ；（ｖｉｉｉ）ＶＬ−ＣＨ１；（ｉｘ）ＶＬ−ＣＨ２；（ｘ）ＶＬ−ＣＨ３；（ｘｉ）ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２；（ｘｉｉ）ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；（ｘｉｉｉ）ＶＬ−ＣＨ２−ＣＨ３；および（ｘｉｖ）ＶＬ−ＣＬ。上記に列記される例示的な構成のいずれかなどの可変および定常ドメインの任意の構成において、可変および定常ドメインは互いに直接的に連結していてもよいし、または全体的もしくは部分的なヒンジもしくはリンカー領域により連結されていてもよい。ヒンジ領域は、単一のポリペプチド分子中の隣接する可変および／または定常ドメインの間の柔軟または半柔軟な連結を結果としてもたらす少なくとも２つ（例えば、５、１０、１５、２０、４０、６０またはそれより多く）のアミノ酸からなるものであってよい。さらに、本発明の抗体の抗原結合性断片は、互いとのおよび／もしくは１つまたは複数の単量体ＶＨもしくはＶＬドメインとの非共有結合による会合（例えば、ジスルフィド結合による）において上記に列記される可変および定常ドメインの構成のいずれかのホモ二量体またはヘテロ二量体（または他の多量体）を含んでもよい。
【００４９】
完全抗体分子と同様、抗原結合性断片は、単一特異的または多重特異的（例えば、二重特異的）であってよい。抗体の多重特異的な抗原結合性断片は、典型的に、少なくとも２つの異なる可変ドメインを含み、各可変ドメインは別々の抗原にまたは同じ抗原上の異なるエピトープに特異的に結合することができる。本明細書に開示される例示的な二重特異的抗体フォーマットなどの任意の多重特異的抗体フォーマットは、当該技術分野において利用可能なルーチン技術を使用して本発明の抗体の抗原結合性断片の文脈において使用するために適合させることができる。
【００５０】
本発明のある特定の実施形態では、本発明の抗ＬＥＰＲ抗体はヒト抗体である。本明細書で使用される場合、「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に由来する可変および定常領域を有する抗体を含むことが意図される。本発明のヒト抗体は、例えばＣＤＲ、特にＣＤＲ３において、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのランダムなもしくは部位特異的な変異生成によりまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの体細胞変異により導入された変異）を含んでよい。しかしながら、本明細書で使用される場合、「ヒト抗体」という用語は、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖細胞系列に由来するＣＤＲの配列がヒトフレームワーク配列にグラフトされた抗体を含むことは意図されない。
【００５１】
一部の実施形態では、本発明の抗体は組換えヒト抗体であってよい。本明細書で使用される場合、「組換えヒト抗体」という用語は、組換え手段により調製され、発現され、作出されまたは単離された全てのヒト抗体を含むことが意図され、例えば、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現された抗体（以下にさらに説明する）、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体（以下にさらに説明する）、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックな動物（例えば、マウス）から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒら（１９９２年）Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２０巻：６２８７〜６２９５頁を参照）または他のＤＮＡ配列へのヒト免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングを伴う任意の他の手段により調製され、発現され、作出されもしくは単離された抗体などである。そのような組換えヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に由来する可変および定常領域を有する。しかしながら、ある特定の実施形態では、そのような組換えヒト抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの変異生成（または、ヒトＩｇ配列にトランスジェニックな動物が使用される場合、ｉｎ  ｖｉｖｏでの体細胞変異生成）に供され、したがって、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列のＶＨおよびＶＬ配列に由来し、それに関するが、ｉｎ  ｖｉｖｏでヒト抗体の生殖細胞系列レパートリー内に天然に存在しなくてもよい配列である。
【００５２】
本発明は、ヒンジ、ＣＨ２またはＣＨ３領域中に１つまたは複数の変異を有する抗体を包含し、該変異は、例えば、製造時に所望の抗体形態の収率を向上させるために望ましいものであり得る。
【００５３】
本発明の抗体は、単離された抗体であってよい。本明細書で使用される場合、「単離された抗体」は、同定され、かつその天然の環境の少なくとも１つの成分から分離および／または回収された抗体を意味する。例えば、生物の少なくとも１つの成分から、または抗体が天然に存在するもしくは天然に産生される組織もしくは細胞から分離または除去された抗体は、本発明の目的のための「単離された抗体」である。単離された抗体はまた、組換え細胞内でｉｎ  ｓｉｔｕの抗体を含む。単離された抗体は、少なくとも１つの精製または単離ステップに供された抗体である。ある特定の実施形態によれば、単離された抗体は、他の細胞材料および／または化学物質を実質的に含まないものであってよい。
【００５４】
本発明は、抗体が由来する対応する生殖細胞系列配列と比較して重鎖および軽鎖可変ドメインのフレームワークおよび／またはＣＤＲ領域中に１つまたは複数のアミノ酸置換、挿入および／または欠失を含む本明細書に開示される抗ＬＥＰＲ抗体のバリアントを含む。そのような変異は、例えば、公的な抗体配列データベースから入手可能な生殖細胞系列配列に対して本明細書に開示されるアミノ酸配列を比較することにより容易に確認することができる。本発明は、本明細書に開示されるアミノ酸配列のいずれかに由来する抗体およびその抗原結合性断片であって、１つまたは複数のフレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内の１つまたは複数のアミノ酸が、抗体が由来する生殖細胞系列配列の対応する残基に、または別のヒト生殖細胞系列配列の対応する残基に、または対応する生殖細胞系列の残基の保存的アミノ酸置換に変異した、抗体およびその抗原結合性断片を含む（そのような配列の変更を本明細書において「生殖細胞系列変異」と総称する）。当業者は、本明細書に開示される重鎖および軽鎖可変領域の配列から開始して、１つまたは複数の個々の生殖細胞系列変異またはこれらの組合せを含む多数の抗体および抗原結合性断片を容易に製造することができる。ある特定の実施形態では、ＶＨおよび／またはＶＬドメイン内のフレームワークおよび／またはＣＤＲの残基の全ては、抗体が由来した元々の生殖細胞系列配列において見出される残基に戻るように変異している。他の実施形態では、ある特定の残基のみが元々の生殖細胞系列配列に戻るように変異しており、例えば、ＦＲ１の最初の８アミノ酸内もしくはＦＲ４の最後の８アミノ酸内にのみ変異した残基が見出され、またはＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３内にのみ変異した残基が見出される。他の実施形態では、フレームワークおよび／またはＣＤＲの残基の１つまたは複数は、異なる生殖細胞系列配列（すなわち、抗体が元々由来した生殖細胞系列配列とは異なる生殖細胞系列配列）の対応する残基に変異している。さらには、本発明の抗体は、フレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内の２つまたはそれより多くの生殖細胞系列変異の任意の組合せを含有してよく、例えば、ある特定の個々の残基が、特定の生殖細胞系列配列の対応する残基に変異していると同時に、元々の生殖細胞系列配列とは異なるある特定の他の残基が維持されているか、または異なる生殖細胞系列配列の対応する残基に変異している。１つまたは複数の生殖細胞系列変異を含有する抗体および抗原結合性断片が得られたら、それを１つまたは複数の所望の特性、例えば、結合特異性の向上、結合親和性の増加、アンタゴニストまたはアゴニストの生物学的特性の向上または増進（それぞれの場合に応じて）、免疫原性の低減などについて容易に試験することができる。この一般的方法で得られた抗体および抗原結合性断片は本発明に包含される。
【００５５】
本発明はまた、１つまたは複数の保存的置換を有する本明細書に開示されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲのアミノ酸配列のいずれかのバリアントを含む抗ＬＥＰＲ抗体を含む。例えば、本発明は、本明細書の表１に記載されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲのアミノ酸配列のいずれかに対して、例えば、１０またはそれ未満、８またはそれ未満、６またはそれ未満、４またはそれ未満などの保存的アミノ酸置換を有するＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲのアミノ酸配列を有する抗ＬＥＰＲ抗体を含む。ある特定の実施形態では、本発明は、本明細書の表１に記載される配列に対してバリアントのＨＣＶＲ、ＬＣＶＲおよび／またはＣＤＲのアミノ酸配列（例えば、保存的アミノ酸置換を含む）を含む抗ＬＥＰＲ抗体であって、そのようなバリアント抗体は、それにもかかわらず、本明細書に開示される例示的な抗ＬＥＰＲ抗体の１つまたは複数の機能および／または特性を呈する、抗ＬＥＰＲ抗体を提供する。
【００５６】
「エピトープ」という用語は、パラトープとして公知の抗体分子の可変領域中の特定の抗原結合部位と相互作用する抗原決定基を指す。単一の抗原は１つより多くのエピトープを有してよい。したがって、異なる抗体は抗原上の異なるエリアに結合してよく、また異なる生物学的効果を有してよい。エピトープは、コンホメーショナルまたはリニアのいずれであってもよい。コンホメーショナルエピトープは、線状ポリペプチド鎖の異なるセグメントからの空間的に並置されたアミノ酸により産生される。リニアエピトープは、ポリペプチド鎖中の隣接するアミノ酸残基により産生されるエピトープである。ある特定の状況において、エピトープは、抗原上にサッカリド、ホスホリル基、またはスルホニル基の部分を含んでよい。
【００５７】
本発明は、本明細書に開示される例示的な抗ＬＥＰＲ抗体のいずれかに見出される１つまたは複数の可変ドメインまたはＣＤＲのアミノ酸配列に実質的に類似または実質的に同一のアミノ酸配列を含む抗ＬＥＰＲ抗体およびその抗原結合性断片を含む。
【００５８】
ポリペプチドに適用される場合、「実質的な類似性」または「実質的に類似」という用語は、２つのペプチド配列が、デフォルトのギャップ重み付けを使用するＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどのプログラムにより最適にアライメントされた時に、少なくとも９５％の配列同一性、よりいっそう好ましくは少なくとも９８％または９９％の配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、同一でない残基の位置は保存的アミノ酸置換により異なる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基により置換されるアミノ酸置換である。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させない。２つまたはそれより多くのアミノ酸配列が保存的置換により互いに異なる場合、配列同一性パーセントまたは類似の度合いは、置換の保存的性質による訂正のために上向きに調整されてよい。この調整を行うための手段は当業者に周知である。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９４年）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２４巻：３０７〜３３１頁（参照することにより本明細書に組み込まれる）を参照。類似の化学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸の群の例としては以下が挙げられる：（１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン；（２）脂肪族ヒドロキシル側鎖：セリンおよびスレオニン；（３）アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン；（４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン；（５）塩基性側鎖：リシン、アルギニン、およびヒスチジン；（６）酸性側鎖：アスパラギン酸およびグルタミン酸、および（７）硫黄含有側鎖はシステインおよびメチオニン。好ましい保存的アミノ酸置換群は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、およびアスパラギン−グルタミンである。あるいは、保存的置き換えは、Ｇｏｎｎｅｔら（１９９２年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６巻：１４４３〜１４４５頁（参照することにより本明細書に組み込まれる）に開示されるＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて正の値を有する任意の変化である。「中等度に保存的」な置き換えは、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて負でない値を有する任意の変化である。
【００５９】
配列同一性とも称されるポリペプチドの配列類似度は、典型的に、配列解析ソフトウェアを使用して測定される。タンパク質解析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換などの、様々な置換、欠失および他の修飾に割り当てられた類似性の尺度を使用して類似の配列をマッチさせる。例えば、ＧＣＧソフトウェアは、デフォルトのパラメーターと共に使用して、密接に関連するポリペプチド間の、例えば、異なる生物の種からの相同的ポリペプチドまたは野生型タンパク質とそのムテインとの間などの、配列相同性または配列同一性を決定できるＧａｐおよびＢｅｓｔｆｉｔなどのプログラムを含有する。例えば、ＧＣＧバージョン６．１を参照。ポリペプチド配列はまた、デフォルトまたは推奨されるパラメーターを使用して、ＧＣＧバージョン６．１中のプログラムであるＦＡＳＴＡを使用して比較することができる。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３）は、クエリ配列と検索配列との間で最もよく重なり合う領域のアライメントおよび配列同一性パーセントを提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ（２０００年）、上掲）。異なる生物からの多数の配列を含有するデータベースに対して本発明の配列を比較する場合の別の好ましいアルゴリズムは、デフォルトのパラメーターを使用するコンピュータープログラムＢＬＡＳＴ、特にＢＬＡＳＴＰまたはＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５巻：４０３〜４１０頁およびＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５巻：３３８９〜４０２頁（それぞれは参照することにより本明細書に組み込まれる）を参照。
Ｆｃバリアントを含む抗ＬＥＰＲ抗体
【００６０】
本発明のある特定の実施形態によれば、例えば、中性ｐＨと比較して酸性ｐＨで、ＦｃＲｎ受容体への抗体結合を増進または減少させる１つまたは複数の変異を含むＦｃドメインを含む、抗ＬＥＰＲ抗体が提供される。例えば、本発明は、ＦｃドメインのＣＨ２またはＣＨ３領域中に変異を含む抗ＬＥＰＲ抗体であって、変異が、酸性環境中（例えば、ｐＨが約５．５〜約６．０の範囲に及ぶエンドソーム中）でＦｃＲｎへのＦｃドメインの親和性を増加させる、抗ＬＥＰＲ抗体を含む。そのような変異は、動物に投与された時に抗体の血清半減期の増加を結果としてもたらし得る。そのようなＦｃ改変の非限定的な例としては、例えば、位置２５０（例えば、ＥまたはＱ）；２５０および４２８（例えば、ＬまたはＦ）；２５２（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／ＷまたはＴ）、２５４（例えば、ＳまたはＴ）、および２５６（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤまたはＴ）での改変；または位置４２８および／もしくは４３３（例えば、Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／ＱまたはＫ）および／もしくは４３４（例えば、Ｈ／ＦまたはＹ）での改変；または位置２５０および／もしくは４２８での改変；または位置３０７もしくは３０８（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）、および４３４での改変が挙げられる。一実施形態では、改変は、４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８Ｌ）および４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）の改変；４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２５９Ｉ）、および３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）の改変；４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）および４３４（例えば、４３４Ｙ）の改変；２５２、２５４、および２５６（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅ）の改変；２５０Ｑおよび４２８Ｌの改変（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ４２８Ｌ）；ならびに３０７および／または３０８の改変（例えば、３０８Ｆまたは３０８Ｐ）を含む。
【００６１】
例えば、本発明は、２５０Ｑおよび２４８Ｌ（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ２４８Ｌ）；２５２Ｙ、２５４Ｔおよび２５６Ｅ（例えば、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴおよびＴ２５６Ｅ）；４２８Ｌおよび４３４Ｓ（例えば、Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓ）；ならびに４３３Ｋおよび４３４Ｆ（例えば、Ｈ４３３ＫおよびＮ４３４Ｆ）からなる群から選択される変異の１つまたは複数の対または群を含むＦｃドメインを含む抗ＬＥＰＲ抗体を含む。以上のＦｃドメインの変異および本明細書に開示される抗体可変ドメイン内の他の変異の全ての可能な組合せは本発明の範囲内にあると想定される。
【００６２】
本発明の抗ＬＥＰＲ抗体は、低減されたエフェクター機能を有する改変されたＦｃドメインを含んでよい。本明細書で使用される場合、「低減されたエフェクター機能を有する改変されたＦｃドメイン」は、改変されたＦｃを含む分子が、Ｆｃ部分の野生型の、天然に存在するバージョンを含む比較用分子と比べて、細胞殺傷（例えば、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ）、補体活性化、食作用およびオプソニン化からなる群から選択される少なくとも１つの効果の大きさまたは程度の低減を呈するように、野生型の、天然に存在するＦｃドメインと比べて、改変、変異、切断などを為された免疫グロブリンの任意のＦｃ部分を意味する。ある特定の実施形態では、「低減されたエフェクター機能を有する改変されたＦｃドメイン」は、Ｆｃ受容体（例えば、ＦｃγＲ）への低減または減弱された結合性を有するＦｃドメインである。
【００６３】
本発明のある特定の実施形態では、改変されたＦｃドメインは、ヒンジ領域中に置換を含むバリアントＩｇＧ１  ＦｃまたはバリアントＩｇＧ４  Ｆｃである。例えば、本発明の文脈において使用するための改変されたＦｃは、ＩｇＧ１  Ｆｃヒンジ領域の少なくとも１つのアミノ酸がＩｇＧ２  Ｆｃヒンジ領域からの対応するアミノ酸で置き換えられたバリアントＩｇＧ１  Ｆｃを含み得る。あるいは、本発明の文脈において使用するための改変されたＦｃは、ＩｇＧ４  Ｆｃヒンジ領域の少なくとも１つのアミノ酸がＩｇＧ２  Ｆｃヒンジ領域からの対応するアミノ酸で置き換えられたバリアントＩｇＧ４  Ｆｃを含み得る。本発明の文脈において使用できる非限定的な、例示的な改変されたＦｃ領域は米国特許出願公開第２０１４／０２４３５０４号に記載されており（その開示は参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）、改変されたＦｃ領域の任意の機能的に同等のバリアントについても該文献に記載されている。
【００６４】
本発明の文脈において使用できる他の改変されたＦｃドメインおよびＦｃ改変としては、ＵＳ２０１４／０１７１６２３；ＵＳ８，６９７，３９６；ＵＳ２０１４／０１３４１６２；ＷＯ２０１４／０４３３６１（これらの開示は参照することによりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）に記載される改変のいずれかが挙げられる。本明細書に記載される改変されたＦｃドメインを含む抗体または他の抗原結合性融合タンパク質を構築する方法は当該技術分野において公知である。
抗体の生物学的特徴
【００６５】
本発明は、ヒトＬＥＰＲに結合し、ＬＥＰＲシグナル伝達をアンタゴナイズする抗体およびその抗原結合性断片を含む。そのような抗体は、本明細書において「アンタゴニスト抗体」と称されることがある。本発明の文脈において、「ＬＥＰＲシグナル伝達のアンタゴニスト」は、ＬＥＰＲに結合し、通常、ＬＥＰＲを発現する細胞中でのＬＥＰＲとのレプチンの相互作用の結果としてもたらされる細胞内効果を阻害する抗体またはその断片を意味する。様々な実施形態では、本発明のアンタゴニスト抗体は、ＬＥＰＲアゴニストの機能、および／またはＬＥＰＲ部分アゴニストの機能を阻害する。ある特定の実施形態では、「ＬＥＰＲシグナル伝達をアンタゴナイズする」は、例えば、レポーター細胞株中で発現される標識化バージョンのＳＴＡＴ３を使用して直接的または間接的にＳＴＡＴ３活性を測定または同定できる任意の方法を使用して検出できる、ＳＴＡＴ３のレプチン刺激による転写活性化の阻害を意味する。例えば、本発明は、実施例６に記載される細胞ベースのレポーターアッセイ、または実質的に類似のアッセイにおいて、ＬＥＰＲシグナル伝達を下方調節するアンタゴニスト抗体およびその抗原結合性断片を含む。本発明はまた、実施例６のアッセイ、または実質的に類似のアッセイにおいて７２３ｐＭ〜１．８ｎＭに及ぶＩＣ５０値を有するレプチン誘導性のＬＥＰＲシグナル伝達の完全な阻害を実証するアンタゴニスト抗体およびその抗原結合性断片を含む。本明細書の実施例５に記載されるアッセイなどの、ＬＥＰＲを発現する細胞に結合する抗体を検出する細胞ベースの結合アッセイは、レプチンなしで８２４〜３１８７倍および１μＭのレプチンの存在下で３９８〜３１０６倍の結合比でのＨＥＫ２９３／ｈＬＥＰＲ−ＧＰＩ細胞への結合を実証した。本発明の抗体は、１μＭの過剰のレプチンの存在下でさえＬＥＰＲに結合することが発見され、これは本発明のＬＥＰＲ抗体が、レプチン結合部位と重なり合わないｈＬＥＰＲ上の部位に結合することを指し示す。本発明はまた、レプチンシグナル伝達をアンタゴナイズするが、レプチンの非存在下で部分的なＬＥＰＲシグナル伝達の促進も行う抗ＬＥＰＲ抗体を含み、そのような抗体は、本明細書において「部分アゴニスト」または「ＬＥＰＲシグナル伝達のアゴニズムを呈する抗体」とも称される。
【００６６】
本発明のある特定の例示的な実施形態では、レプチンの存在下または非存在下でヒト二量体ＬＥＰＲ（ｈＬＥＰＲ．ｈＦｃ、配列番号９２）に結合する抗ＬＥＰＲ抗体が提供され、本発明の抗体のいずれも、例えば、本明細書の実施例４に定義されるアッセイフォーマット、または実質的に類似のアッセイを使用して、ＬＥＰＲ：レプチン相互作用の４０％より多くのブロックを実証しない。
【００６７】
本発明は、高親和性で単量体ヒトＬＥＰＲに結合する抗体およびその抗原結合性断片を含む。例えば、本発明は、例えば、本明細書の実施例３に定義されるアッセイフォーマット、または実質的に類似のアッセイを使用して、２５℃での表面プラズモン共鳴による測定で、約１０ｎＭ未満のＫＤ、または３７℃での表面プラズモン共鳴による測定で、約２５ｎＭ未満のＫＤで、単量体ヒトＬＥＰＲ（例えば、ｈＬＥＰＲ．ｍｍｈ、配列番号９０）に結合する抗ＬＥＰＲ抗体を含む。ある特定の実施形態によれば、例えば、本明細書の実施例３に定義されるアッセイフォーマット、または実質的に類似のアッセイを使用して、表面プラズモン共鳴による測定で、２５℃で、約１２ｎＭ未満、約１１ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約９ｎＭ未満、約８ｎＭ未満、約７ｎＭ未満、約６ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約４ｎＭ未満、約３ｎＭ未満、約２ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、約９００ｐＭ未満、約８００ｐＭ未満、約７００ｐＭ未満、約６００ｐＭ未満、約５００ｐＭ未満、約４００ｐＭ未満、約３００ｐＭ未満、約２００ｐＭ未満または約１００ｐＭ未満のＫＤで単量体ヒトＬＥＰＲに結合する抗ＬＥＰＲ抗体が提供される。
【００６８】
本発明はまた、例えば、本明細書の実施例３に定義されるアッセイフォーマット、または実質的に類似のアッセイを使用して、２５℃での表面プラズモン共鳴による測定で、約５分より長いまたは３７℃での表面プラズモン共鳴による測定で、約１分より長い解離半減期（ｔ１／２）で単量体ヒトＬＥＰＲ（例えば、ｈＬＥＰＲ．ｍｍｈ、配列番号９０）に結合する抗体およびその抗原結合性断片を含む。ある特定の実施形態によれば、例えば、本明細書の実施例３に定義されるアッセイフォーマット、または実質的に類似のアッセイを使用して、表面プラズモン共鳴による測定で、２５℃で、約５分より長い、約１０分より長い、約２０分より長い、約４０分より長い、約５０分より長い、またはそれより長いｔ１／２で単量体ヒトＬＥＰＲに結合する抗ＬＥＰＲ抗体が提供される。
【００６９】
本発明はまた、高親和性で二量体ヒトＬＥＰＲ（例えば、ｈＬＥＰＲ．ｍＦｃ、配列番号９１）に結合する抗体およびその抗原結合性断片を含む。例えば、本発明は、例えば、本明細書の実施例３に定義されるアッセイフォーマット、または実質的に類似のアッセイを使用して、２５℃または３７℃での表面プラズモン共鳴による測定で、約４ｎＭ未満のＫＤで二量体ヒトＬＥＰＲ（例えば、ｈＬＥＰＲ．ｍＦｃ、配列番号９１）に結合する抗ＬＥＰＲ抗体を含む。ある特定の実施形態によれば、例えば、本明細書の実施例３に定義されるアッセイフォーマット、または実質的に類似のアッセイを使用して、表面プラズモン共鳴による測定で、２５℃で、約１５ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約９．０ｎＭ未満、約８．０ｎＭ未満、約７．０ｎＭ未満、約６．０ｎＭ未満、約５．０ｎＭ未満、約４．０ｎＭ未満、約３．０ｎＭ未満、約２．０ｎＭ未満、約１．０ｎＭ未満、約９００ｐＭ未満、約８００ｐＭ未満、約７００ｐＭ未満、約６００ｐＭ未満、約５００ｐＭ未満、約４００ｐＭ未満、約３００ｐＭ未満、約２００ｐＭ未満、または約１００ｐＭ未満のＫＤで二量体ヒトＬＥＰＲに結合する抗ＬＥＰＲ抗体が提供される。
【００７０】
本発明はまた、例えば、本明細書の実施例３に定義されるアッセイフォーマット、または実質的に類似のアッセイを使用して、２５℃または３７℃での表面プラズモン共鳴による測定で、約１０分より長い解離半減期（ｔ１／２）で二量体ヒトＬＥＰＲ（例えば、ｈＬＥＰＲ．ｍＦｃ、配列番号９１）に結合する抗体およびその抗原結合性断片を含む。ある特定の実施形態によれば、例えば、本明細書の実施例３に定義されるアッセイフォーマット、または実質的に類似のアッセイを使用して、表面プラズモン共鳴による測定で、２５℃で、約１５分より長い、約２０分より長い、約３０分より長い、約４０分より長い、５０分より長い、約６０分より長い、約７０分より長い、８０分より長い、９０分より長い、１００分より長い、またはそれより長いｔ１／２で二量体ヒトＬＥＰＲに結合する抗ＬＥＰＲ抗体が提供される。
【００７１】
本発明はまた、ヒトレプチンとの複合体でＬＥＰＲに結合する抗体およびその抗原結合性断片を含む（「ヒトレプチンとの複合体でＬＥＰＲ」は「レプチン：ＬＥＰＲ」という表現により表されることもある）。例えば、本発明は、ｈＬＥＰＲおよびヒトレプチンを含む予め形成された複合体に結合できる抗体およびその抗原結合性断片を含む。すなわち、ある特定の実施形態によれば、抗ＬＥＰＲ抗体とＬＥＰＲとの相互作用は、ＬＥＰＲとの複合体でレプチンの存在により阻害されず、同様に、本発明のこの態様によれば、レプチンとＬＥＰＲとの相互作用は、抗ＬＥＰＲ抗体の存在により阻害されない。抗体またはその抗原結合性断片がヒトレプチンとの複合体でＬＥＰＲに結合するかどうかを決定するための例示的なアッセイフォーマットは本明細書の実施例４に記載される。
【００７２】
本発明はまた、ヒトレプチンの存在下および／または非存在下で細胞表面発現ＬＥＰＲに結合する抗体およびその抗原結合性断片を含む。細胞表面発現ＬＥＰＲは、天然に、または抗体もしくはその抗原結合性断片がＬＥＰＲ分子に結合できるように操作された細胞株において、細胞の表面上に発現されるＬＥＰＲまたはその部分（例えば、ＬＥＰＲの細胞外部分）を意味する。ある特定の実施形態では、細胞表面発現ＬＥＰＲは、タグまたはアンカー（例えば、本明細書の実施例６に示されるようなＧＰＩアンカー）を介して細胞に接続されたＬＥＰＲの細胞外ドメインを含む組換え複合体を含む。本発明のこの態様によれば、レプチンの非存在下で細胞表面発現ＬＥＰＲに結合することができ、かつレプチンの存在下（すなわち、レプチンが細胞表面発現ＬＥＰＲに結合できる状況下）で細胞表面発現ＬＥＰＲに結合することもできる抗体が提供される。すなわち、ある特定の実施形態によれば、抗ＬＥＰＲ抗体と細胞表面発現ＬＥＰＲとの相互作用は、細胞表面発現ＬＥＰＲとの複合体でレプチンの存在により阻害されない。本発明のこの態様による抗体は、抗体、細胞表面発現ＬＥＰＲおよびレプチンを含む細胞の表面上の３メンバー複合体を形成することができる。抗体またはその抗原結合性断片がヒトレプチンの存在下および非存在下で細胞表面発現ＬＥＰＲに結合できるかどうかを決定するための例示的なアッセイフォーマットは本明細書の実施例５に記載される。
【００７３】
本発明の抗体は、上述の生物学的特徴の１つもしくは複数、またはこれらの任意の組合せを持ってよい。本発明の抗体の生物学的特徴の以上の列記は、網羅的であることを意図しない。本発明の抗体の他の生物学的特徴は、本明細書中の実施例を含む本開示の検討から当業者に明らかとなるであろう。
エピトープマッピングおよび関連技術
【００７４】
本発明の抗体が結合するエピトープは、ＬＥＰＲタンパク質の３つまたはそれより多く（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれより多く）のアミノ酸の単一の連続する配列からなるものであってよい。あるいは、エピトープは、ＬＥＰＲの複数の不連続のアミノ酸（またはアミノ酸配列）からなるものであってよい。一部の実施形態では、エピトープは、ＬＥＰＲのレプチン結合ドメイン上またはその近くに位置する。他の実施形態では、エピトープは、ＬＥＰＲのレプチン結合ドメインとは別個の領域、例えば、抗体がそのようなエピトープに結合した時にＬＥＰＲへのレプチンの結合に干渉しないＬＥＰＲの表面上の位置に位置する。
【００７５】
特定の抗体により認識されるエピトープ内のアミノ酸を同定するために当業者に公知の様々な技術を使用することができる。例示的な技術としては、例えば、アラニンスキャニング変異解析、ペプチドブロット分析、およびペプチド切断解析が挙げられる。加えて、エピトープ除去、エピトープ抽出および抗原の化学修飾などの方法を用いることができる（Ｔｏｍｅｒ（２０００年）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ９巻：４８７〜４９６頁）。抗体が相互作用するポリペプチド内のアミノ酸を同定するために使用できる別の方法は、質量分析により検出される水素／重水素交換である。一般的に、水素／重水素交換法は、目的のタンパク質を重水素標識した後、抗体を重水素標識化タンパク質に結合させることを伴う。次に、タンパク質／抗体複合体を水に移して、抗体により保護された残基（これは重水素標識されたままである）を除いて全ての残基において水素−重水素交換を起こさせる。抗体の解離後、標的タンパク質をプロテアーゼ切断および質量分析に供し、それにより、抗体が相互作用する特定のアミノ酸に対応する重水素標識化残基を明らかにする。例えば、Ｅｈｒｉｎｇ（１９９９年）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６７巻（２号）：２５２〜２５９頁；ＥｎｇｅｎおよびＳｍｉｔｈ（２００１年）Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  ７３巻：２５６Ａ〜２６５Ａ頁を参照。その抗原と複合体で抗体のＸ線結晶構造解析もまた、抗体が相互作用するポリペプチド内のアミノ酸を同定するために使用することができる。
【００７６】
本発明は、本明細書に記載される特定の例示的な抗体のいずれか（例えば、本明細書の表１に記載されるアミノ酸配列のいずれかを含む抗体）と同じエピトープに結合する抗ＬＥＰＲ抗体をさらに含む。同様に、本発明はまた、本明細書に記載される特定の例示的な抗体のいずれか（例えば、本明細書の表１に記載されるアミノ酸配列のいずれかを含む抗体）とＬＥＰＲへの結合について競合する抗ＬＥＰＲ抗体を含む。
【００７７】
当該技術分野において公知のおよび本明細書に例示されるルーチンの方法を使用することにより、抗体が参照抗ＬＥＰＲ抗体と同じエピトープに結合する、またはそれと結合について競合するかどうかを決定することができる。例えば、試験抗体が本発明の参照抗ＬＥＰＲ抗体と同じエピトープに結合するかどうかを決定するために、参照抗体をＬＥＰＲタンパク質に結合させる。次に、ＬＥＰＲ分子に結合する試験抗体の能力を評価する。試験抗体が参照抗ＬＥＰＲ抗体との飽和結合に続いてＬＥＰＲに結合できる場合、試験抗体は参照抗ＬＥＰＲ抗体とは異なるエピトープに結合すると結論付けることができる。他方、試験抗体が参照抗ＬＥＰＲ抗体との飽和結合に続いてＬＥＰＲ分子に結合できない場合、試験抗体は、本発明の参照抗ＬＥＰＲ抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合し得る。次に、追加のルーチン実験（例えば、ペプチド変異および結合解析）を実行して、実際に、試験抗体の結合の観察された欠如が参照抗体と同じエピトープに結合することによるのか、それとも立体障害（または別の現象）が観察された結合の欠如に関与するのかどうかを確認することができる。この種類の実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ、フローサイトメトリーまたは当該技術分野において利用可能な任意の他の定量的もしくは定性的な抗体結合アッセイを使用して行うことができる。本発明のある特定の実施形態によれば、例えば、１、５、１０、２０または１００倍過剰の１つの抗体が他の抗体の結合を、競合結合アッセイでの測定で少なくとも５０％、好ましくは７５％、９０％またはさらには９９％阻害する場合、２つの抗体は同じ（または重なり合う）エピトープに結合する（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓら（１９９０年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５０巻：１４９５〜１５０２頁を参照）。あるいは、１つの抗体の結合を低減させまたは取り除く抗原中の本質的に全てのアミノ酸変異が他の抗体の結合を低減させまたは取り除く場合、２つの抗体は同じエピトープに結合するとみなされる。１つの抗体の結合を低減させまたは取り除くアミノ酸変異の一部のみが他の抗体の結合を低減させまたは取り除く場合、２つの抗体は「重なり合うエピトープ」を有するとみなされる。
【００７８】
抗体が参照抗ＬＥＰＲ抗体と結合について競合する（または結合について交差競合する）かどうかを決定するために、上記の結合方法論が２つの方向性で行われる：第１の方向性では、参照抗体を飽和条件下でＬＥＰＲタンパク質に結合させた後、ＬＥＰＲ分子への試験抗体の結合を評価する。第２の方向性では、試験抗体を飽和条件下でＬＥＰＲ分子に結合させた後、ＬＥＰＲ分子への参照抗体の結合を評価する。両方の方向性において第１の（飽和）抗体のみがＬＥＰＲ分子に結合できる場合、試験抗体および参照抗体はＬＥＰＲへの結合について競合すると結論付けられる。当業者により理解されるように、参照抗体と結合について競合する抗体は、必ずしも参照抗体と同じエピトープに結合しなくてよく、重なり合うまたは隣接するエピトープに結合することにより参照抗体の結合を空間的にブロックしてもよい。
ヒト抗体の調製
【００７９】
本発明の抗ＬＥＰＲ抗体は完全にヒト抗体であり得る。完全にヒトのモノクローナル抗体などのモノクローナル抗体を生成する方法は当該技術分野において公知である。ヒトＬＥＰＲに特異的に結合するヒト抗体を作るために任意のそのような公知の方法を本発明の文脈において使用することができる。
【００８０】
例えば、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（商標）技術、または完全にヒトのモノクローナル抗体を生成するための任意の他の類似の公知の方法を使用して、ヒト可変領域およびマウス定常領域を有するＬＥＰＲに対する高親和性キメラ抗体が最初に単離される。下記の実験セクションにあるように、抗体は、親和性、リガンドのブロッキング活性、選択性、エピトープなどの望ましい特徴について特徴付けされ、選択される。必要であれば、マウス定常領域を所望のヒト定常領域、例えば野生型または改変ＩｇＧ１またはＩｇＧ４と置き換えて、完全にヒトの抗ＬＥＰＲ抗体を生成する。選択される定常領域は特定の用途に従って異なってよいが、高親和性抗原結合および標的特異性の特徴は可変領域にある。ある特定の例では、完全にヒトの抗ＬＥＰＲ抗体は、抗原陽性Ｂ細胞から直接的に単離される。
生物学的同等物
【００８１】
本発明の抗ＬＥＰＲ抗体および抗体断片は、記載される抗体とは異なるが、ヒトＬＥＰＲに結合する能力を保持するアミノ酸配列を有するタンパク質を包含する。そのようなバリアント抗体および抗体断片は、親配列と比較した時にアミノ酸の１つまたは複数の付加、欠失、または置換を含むが、記載される抗体の生物学的活性と本質的に同等の生物学的活性を呈する。同様に、本発明の抗ＬＥＰＲ抗体をコードするＤＮＡ配列は、開示される配列と比較した時にヌクレオチドの１つまたは複数の付加、欠失、または置換を含むが、本発明の抗ＬＥＰＲ抗体または抗体断片と本質的に生物学的に同等な抗ＬＥＰＲ抗体または抗体断片をコードする配列を包含する。そのようなバリアントアミノ酸およびＤＮＡ配列の例は上記で論じられている。
【００８２】
２つの抗原結合タンパク質、または抗体が、例えば、単回投与または複数回投与のいずれかで類似の実験条件下で同じモル用量で投与された時にそれらの吸収速度および程度が有意差を示さない薬学的等価物または薬学的代替物である場合、それらは生物学的同等物であると考えられる。一部の抗体は、吸収の程度において同等であるが吸収速度において同等でない場合に同等物または薬学的代替物と考えられるが、それでも生物学的同等物と考えられ得るのは、吸収速度のそのような差異は意図的なものであり、ラベリングに反映され、例えば慢性使用に対して、効果的な身体薬物濃度の達成にとって必須ではなく、試験される特定の薬品製造物にとって医療上重要でないと考えられるためである。
【００８３】
一実施形態では、２つの抗原結合タンパク質は、安全性、純度、および力価において臨床的に意味のある差異がない場合に生物学的同等である。
【００８４】
一実施形態では、参照製造物と生物学的製品との間での１回または複数回の切換えなしで継続された療法と比較して、有害効果のリスクの予想される増加、例えば、免疫原性の臨床的に有意な変化、または有効性の減少などがなく、患者がそのような切換えを行うことができる場合、２つの抗原結合タンパク質は生物学的同等である。
【００８５】
一実施形態では、そのような機序が公知である限り、２つの抗原結合タンパク質の両方が、使用の１つまたは複数の条件について１つまたは複数の共通の作用機序により作用する場合、それらは生物学的同等である。
【００８６】
生物学的同等性は、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法により実証されてよい。生物学的同等性の尺度としては、例えば、（ａ）血液、血漿、血清、または他の体液中の抗体またはその代謝物の濃度が時間の関数として測定されるヒトまたは他の哺乳動物におけるｉｎ  ｖｉｖｏ試験；（ｂ）ヒトのｉｎ  ｖｉｖｏバイオアベイラビリティデータと関係付けられ、それを合理的に予測するｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験；（ｃ）抗体（またはその標的）の適切な急性の薬理学的効果が時間の関数として測定されるヒトまたは他の哺乳動物におけるｉｎ  ｖｉｖｏ試験；および（ｄ）抗体の安全性、有効性、またはバイオアベイラビリティまたは生物学的同等性を確立するよく制御された臨床試験が挙げられる。
【００８７】
本発明の抗ＬＥＰＲ抗体の生物学的同等のバリアントは、例えば、残基もしくは配列を様々に置換させることまたは生物学的活性のために必要とされない末端もしくは内部の残基もしくは配列を欠失させることにより構築されてよい。例えば、生物学的活性のために必須でないシステイン残基を欠失させまたは他のアミノ酸と置き換えて、再生時に不必要なまたは正しくない分子内ジスルフィド架橋を形成するのを防止することができる。他の文脈では、生物学的同等の抗体は、抗体のグリコシル化の特徴を改変するアミノ酸変化、例えば、グリコシル化を取り除くまたは除去する変異を含む抗ＬＥＰＲ抗体バリアントを含み得る。
種選択性および種交差反応性
【００８８】
ある特定の実施形態によれば、本発明は、ヒトＬＥＰＲに結合するが他の種からのＬＥＰＲに結合しない抗ＬＥＰＲ抗体を提供する。本発明はまた、ヒトＬＥＰＲおよび１つまたは複数の非ヒト種からのＬＥＰＲに結合する抗ＬＥＰＲ抗体を含む。例えば、本発明の抗ＬＥＰＲ抗体は、ヒトＬＥＰＲに結合してよく、かつ、場合により、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、アレチネズミ、ブタ、ネコ、イヌ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラクダ、マカクザル（ｃｙｎｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）、マーモセット、アカゲザルまたはチンパンジーのＬＥＰＲの１つまたは複数に結合してもよいし、または結合しなくてもよい。本発明のある特定の例示的な実施形態によれば、ヒトＬＥＰＲおよびマカクザル（例えば、カニクイザル）ＬＥＰＲに特異的に結合する抗ＬＥＰＲ抗体が提供される。本発明の他の抗ＬＥＰＲ抗体は、ヒトＬＥＰＲに結合するがマカクザルＬＥＰＲに結合せず、または弱くのみ結合する。
多重特異的抗体
【００８９】
本発明の抗体は、単一特異的であってよく、または多重特異的（例えば、二重特異的）であってよい。多重特異的抗体は、１つの標的ポリペプチドの異なるエピトープに特異的であってよく、または１つより多くの標的ポリペプチドに特異的な抗原結合ドメインを含有してよい。例えば、Ｔｕｔｔら（１９９１年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４７巻：６０〜６９頁；Ｋｕｆｅｒら（２００４年）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２２巻：２３８〜２４４頁を参照。本発明の抗ＬＥＰＲ抗体は、別の機能分子、例えば、別のペプチドまたはタンパク質に連結することができ、またはそれと共発現させることができる。例えば、抗体またはその断片を、１つまたは複数の他の分子実体、例えば別の抗体または抗体断片などに（例えば、化学結合、遺伝子融合、非共有会合またはその他により）機能的に連結させて、第２の結合特異性を有する二重特異的または多重特異的抗体を製造することができる。
【００９０】
本発明は、免疫グロブリンの１つのアームがヒトＬＥＰＲに結合し、免疫グロブリンの他のアームが第２の抗原に特異的である二重特異的抗体を含む。ＬＥＰＲ結合アームは、本明細書の表１に記載されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲまたはＣＤＲのアミノ酸配列のいずれかを含むことができる。
【００９１】
本発明の文脈において使用できる例示的な二重特異的抗体フォーマットは、第１の免疫グロブリン（Ｉｇ）ＣＨ３ドメインおよび第２のＩｇ  ＣＨ３ドメインの使用を伴い、第１および第２のＩｇ  ＣＨ３ドメインは、少なくとも１つのアミノ酸により互いに異なり、かつ、少なくとも１つのアミノ酸の差異は、該アミノ酸の差異を欠く二重特異的抗体と比較してプロテインＡへの二重特異的抗体の結合を低減させる。一実施形態では、第１のＩｇ  ＣＨ３ドメインはプロテインＡに結合し、第２のＩｇ  ＣＨ３ドメインは、プロテインＡ結合を低減または無効化させる変異、例えば、Ｈ９５Ｒの改変（ＩＭＧＴエクソンナンバリングによる；ＥＵナンバリングによるＨ４３５Ｒ）を含有する。第２のＣＨ３はＹ９６Ｆの改変（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるＹ４３６Ｆ）をさらに含んでよい。第２のＣＨ３内に見出され得るさらなる改変としては以下が挙げられる：ＩｇＧ１抗体の場合、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるＤ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、およびＶ４２２Ｉ）；ＩｇＧ２抗体の場合、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ；ＥＵによるＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、およびＶ４２２Ｉ）；ＩｇＧ４抗体の場合、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、およびＶ４２２Ｉ）。上記に記載される二重特異的抗体フォーマットのバリエーションは、本発明の範囲内に想定される。
【００９２】
本発明の文脈において使用できる他の例示的な二重特異的フォーマットとしては、例えば、ｓｃＦｖベースのまたはダイアボディの二重特異的フォーマット、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ融合物、デュアル可変ドメイン（ＤＶＤ）−Ｉｇ、Ｑｕａｄｒｏｍａ、ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ、共通軽鎖（例えば、ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓを有する共通軽鎖など）、ＣｒｏｓｓＭａｂ、ＣｒｏｓｓＦａｂ、（ＳＥＥＤ）ボディ、ロイシンジッパー、Ｄｕｏｂｏｄｙ、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２、二重作用性Ｆａｂ（ＤＡＦ）−ＩｇＧ、およびＭａｂ２二重特異的フォーマット（以上のフォーマットの総説について、例えば、Ｋｌｅｉｎら（２０１２年）ｍＡｂｓ  ４巻：６号、１〜１１頁、およびそこで引用される参考文献を参照）が挙げられるがこれらに限定されない。二重特異的抗体はまた、ペプチド／核酸コンジュゲーションを使用して構築することができ、例えば、直交化学反応性を有する非天然のアミノ酸を使用して部位特異的抗体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを生成させ、次にそれを、定義された組成、価数および幾何学形状を有する多量体複合体に自己集合させる（例えば、Ｋａｚａｎｅら、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．［Ｅｐｕｂ：２０１２年１２月４日］を参照）。
治療用配合物および投与
【００９３】
本発明は、本発明の抗ＬＥＰＲ抗体またはその抗原結合性断片を含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、好適な担体、賦形剤、および向上した移入、送達、寛容性などを提供する他の剤と共に配合される。全ての薬剤師に公知の処方書：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡにおいて数多くの適切な配合物を見出すことができる。これらの配合物としては、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質、脂質（カチオン性またはアニオン性）含有小胞（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡなど）、ＤＮＡコンジュゲート、無水吸収ペースト、水中油および油中水エマルション、エマルションカーボワックス（様々な分子量のポリエチレングリコール）、半固形ゲル、およびカーボワックスを含有する半固形混合物が挙げられる。Ｐｏｗｅｌｌら、「Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ」、ＰＤＡ（１９９８年）Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  ５２巻：２３８〜３１１頁も参照。
【００９４】
患者に投与される抗体の用量は、患者の年齢およびサイズ、標的疾患、状態、投与経路などに応じて変化させてよい。好ましい用量は、典型的に、体重または身体表面積に従って算出される。成人患者において、通常、約０．０１〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約０．０２〜約７、約０．０３〜約５、または約０．０５〜約３ｍｇ／ｋｇ体重の単回用量で本発明の抗体を静脈内に投与することが有利であり得る。状態の重篤度に応じて、治療の頻度および継続期間を調整することができる。抗ＬＥＰＲ抗体を投与するために効果的な投与量およびスケジュールを経験的に決定することができ、例えば、患者の進展を定期的な評価によりモニターし、それに従って用量を調整することができる。さらに、当該技術分野において周知の方法を使用して投与量の種間スケーリングを行うことができる（例えば、Ｍｏｒｄｅｎｔｉら（１９９１年）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．  Ｒｅｓ．  ８巻：１３５１頁）。
【００９５】
例えば、リポソーム中へのカプセル化、マイクロ粒子、マイクロカプセル、変異体ウイルスを発現できる組換え細胞、受容体媒介性のエンドサイトーシスといった様々な送達システムが公知であり、これらを本発明の医薬組成物を投与するために使用することができる（例えば、Ｗｕら（１９８７年）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６２巻：４４２９〜４４３２頁を参照）。導入の方法としては、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、および経口経路が挙げられるがこれらに限定されない。任意の簡便な経路により、例えば、注入またはボーラス注射により、上皮または粘膜皮膚の裏打ち（例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜など）を通じた吸収により、組成物を投与することができ、他の生物活性剤と共に投与してもよい。投与は全身性または局所的なものであり得る。
【００９６】
本発明の医薬組成物は、標準的な針および注射器を用いて皮下または静脈内に送達することができる。加えて、皮下送達に関して、ペン送達デバイスは本発明の医薬組成物を容易に送達するために適用される。そのようなペン送達デバイスは、再使用可能または使い捨て可能なものであってよい。再使用可能なペン送達デバイスは、通常、医薬組成物を含有する交換可能なカートリッジを利用する。カートリッジ内の全ての医薬組成物が投与されるとカートリッジは空になり、空になったカートリッジを容易に廃棄して、医薬組成物を含有する新たなカートリッジと交換することができる。その後、ペン送達デバイスを再使用することができる。使い捨て可能なペン送達デバイスには交換可能なカートリッジはない。むしろ、使い捨て可能なペン送達デバイスは、デバイス内のリザーバー中に保持された医薬組成物を予め充填されている。リザーバーから医薬組成物がなくなると、デバイス全体が廃棄される。
【００９７】
多数の再使用可能なペンおよび自動注入装置の送達デバイスが本発明の医薬組成物の皮下送達に適用される。例としてごく少数を挙げれば、ＡＵＴＯＰＥＮ（商標）（Ｏｗｅｎ  Ｍｕｍｆｏｒｄ，  Ｉｎｃ．、Ｗｏｏｄｓｔｏｃｋ、ＵＫ）、ＤＩＳＥＴＲＯＮＩＣ（商標）ペン（Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｅｒｇｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＨＵＭＡＬＯＧ  ＭＩＸ  ７５／２５（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＯＧ（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＩＮ  ７０／３０（商標）ペン（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）、ＮＯＶＯＰＥＮ（商標）Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＮＯＶＯＰＥＮ  ＪＵＮＩＯＲ（商標）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＢＤ（商標）ペン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）、ＯＰＴＩＰＥＮ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ  ＰＲＯ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ  ＳＴＡＲＬＥＴ（商標）、およびＯＰＴＩＣＬＩＫ（商標）（ｓａｎｏｆｉ−ａｖｅｎｔｉｓ、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）が挙げられるがこれらに限定されない。本発明の医薬組成物の皮下送達に応用される使い捨て可能なペン送達デバイスの例としてごく少数を挙げれば、ＳＯＬＯＳＴＡＲ（商標）ペン（ｓａｎｏｆｉ−ａｖｅｎｔｉｓ）、ＦＬＥＸＰＥＮ（商標）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）、およびＫＷＩＫＰＥＮ（商標）（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、ＳＵＲＥＣＬＩＣＫ（商標）  Ａｕｔｏｉｎｊｅｃｔｏｒ（Ａｍｇｅｎ、Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ、ＣＡ）、ＰＥＮＬＥＴ（商標）（Ｈａｓｅｌｍｅｉｅｒ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＥＰＩＰＥＮ（Ｄｅｙ，  Ｌ．Ｐ．）、およびＨＵＭＩＲＡ（商標）Ｐｅｎ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ  ＩＬ）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００９８】
ある特定の状況において、医薬組成物は、制御放出システムで送達することができる。一実施形態では、ポンプを使用してもよい（Ｌａｎｇｅｒ、上掲；Ｓｅｆｔｏｎ（１９８７年）ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｆ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｅｎｇ．  １４巻：２０１頁を参照）。別の実施形態では、ポリマー材料を使用することができる。Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、ＬａｎｇｅｒおよびＷｉｓｅ（編）（１９７４年）ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌｏｒｉｄａを参照。さらに別の実施形態では、制御放出システムは組成物の標的に近接して置くことができ、したがって全身用量の一部のみを必要とする（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ（１９８４年）Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、上掲、２巻、１１５〜１３８頁を参照）。他の制御放出システムは、Ｌａｎｇｅｒ（１９９０年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９巻：１５２７〜１５３３頁による総説において論じられている。
【００９９】
注射用調製物は、静脈内、皮下、皮内および筋肉内注射、点滴などのための投与剤形を含んでよい。これらの注射用調製物は、公知の方法により調製することができる。例えば、注射用調製物は、例えば、上記される抗体またはその塩を注射のために従来使用されている滅菌水性媒体または油性媒体中に溶解させ、懸濁させまたは乳化させることにより調製することができる。注射用の水性媒体としては、例えば、生理食塩水、グルコースおよび他の助剤を含有する等張溶液などがあり、これらを適切な可溶化剤、例えば、アルコール（例えば、エタノール）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤［例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（水添ヒマシ油のポリオキシエチレン（５０ｍｏｌ）付加物）］などと組み合わせて使用することができる。油性媒体としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、これらを可溶化剤、例えば、安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと組み合わせて使用することができる。このように調製された注射液は、好ましくは、適切なアンプル中に充填される。
【０１００】
有利には、上記される経口または非経口での使用のための医薬組成物は、活性成分の用量に適合させた単位用量の投与剤形に調製される。単位用量のそのような投与剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射液（アンプル）、坐剤などが挙げられる。含有される上記の抗体の量は、通常、単位用量の投与剤形当たり約５〜約５００ｍｇであり、特に注射液の形態では、上記の抗体は約５〜約１００ｍｇ、他の投与剤形については約１０〜約２５０ｍｇで含有されることが好ましい。
抗体の治療的使用
【０１０１】
本発明は、それを必要とする対象にアンタゴニスト抗ＬＥＰＲ抗体（例えば、本明細書の表１に記載されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲまたはＣＤＲの配列のいずれかを含む抗ＬＥＰＲ抗体）を含む治療用組成物を投与することを含む方法を含む。治療用組成物は、本明細書に開示される抗ＬＥＰＲ抗体のいずれか、またはその抗原結合性断片、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含むことができる。
【０１０２】
本発明の抗体は、とりわけ、過剰のＬＥＰＲシグナル伝達を結果としてもたらす上昇したレプチンレベル（高レプチン血症）および／またはＯＢ−Ｒレプチン受容体の上昇した発現に関連するまたはそれにより媒介される任意の疾患または障害の治療、予防および／または改善のために有用である。様々な実施形態では、疾患または障害は、以下に限定されないが、無食欲または他の精神医学的摂食障害、慢性腎臓疾患悪液質、他の悪液質、例えば、鬱血性心不全悪液質、肺悪液質、放射線悪液質、およびがん悪液質、自己免疫障害、例えば、炎症性腸疾患、ループスエリテマトーデス、多発性硬化症、乾癬、心臓血管疾患、高血圧、鬱病、神経変性障害、がん、例えば、肝細胞癌、黒色腫および乳がんから選択される。
【０１０３】
本発明はまた、正常なまたは高いレプチンレベルを発現する細胞、組織および臓器においてＬＥＰＲシグナル伝達をアンタゴナイズするために有用な抗ＬＥＰＲ抗体およびその抗原結合性断片を含む。本明細書で使用される場合、レプチンの存在下で（野生型ＬＥＰＲと比較して）増進したシグナル伝達を呈するＬＥＰＲ変異体を「シグナル伝達増進型ＬＥＰＲ変異体」と称する。例示的なシグナル伝達増進型ＬＥＰＲ変異はＬＥＰＲ−Ｑ２２３Ｒである（Ｃｈａｇｎｏｎら（２００９年）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ＆  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ８５巻（１号）：２９〜３４頁）。したがって、本発明は、増進されたシグナル伝達のＬＥＰＲ変異体により引き起こされるまたはそれに関連する疾患および障害の治療、予防および／または改善のために有用な抗ＬＥＰＲ抗体およびその抗原結合性断片を含む。
【０１０４】
本明細書に記載される治療の方法の文脈において、抗ＬＥＰＲ抗体は、単剤療法（すなわち、唯一の治療剤として）としてまたは１つもしくは複数の追加の治療剤（その例は本明細書の別の箇所に記載される）と組み合わせて投与することができる。
組合せ療法および配合物
【０１０５】
本発明は、１つまたは複数の追加の治療活性成分と組み合わせて本明細書に記載される抗ＬＥＰＲ抗体のいずれかを含む組成物および治療用配合物、ならびにそれを必要とする対象にそのような組合せを投与することを含む治療の方法を含む。
【０１０６】
本発明の抗ＬＥＰＲアンタゴニスト抗体は、１つまたは複数の追加の治療活性成分、例えば、鬱血性心不全悪液質、肺悪液質およびがん悪液質、自己免疫障害、例えば、炎症性腸疾患、ループスエリテマトーデス、多発性硬化症、乾癬、心臓血管疾患、高血圧、神経変性障害、鬱病、がん、例えば、肝細胞癌、黒色腫、乳がん、ならびに減少したレプチンシグナル伝達に関連するまたはそれにより引き起こされる他の疾患および障害の治療のために処方される医薬製品などと組み合わせて一緒に配合しかつ／または投与することができる。そのような追加の治療活性成分の例としては、例えば、アンギオテンシン変換酵素阻害剤（例えば、ＡＣＥ、ＡＣＥ−Ｉ、ベナゼプリル、カプトプリル、エナラプリル、フォシノプリル、リシノプリル、モエキシプリル、ペリンドプリル、キナプリル、ラミプリル（ｒａｍａｐｒｉｌ）、トランドラプリル）、アンギオテンシン受容体ブロッカー（例えば、ＡＲＢ）、平滑筋弛緩剤（例えば、ヒドララジン）、長期作用性硝酸塩（例としては、例えばＡＣＥ−ＩおよびＡＲＢを含むまたは含まない二硝酸イソソルビド）、利尿剤（例えば、ループ利尿剤、チアジド様利尿剤およびカリウム保持性利尿剤）、鉄欠乏性貧血治療（例えば、非経口性の鉄）、長期または短期作用性気管支拡張剤（例えば、β２アゴニスト、例えば、アルホルモテロール、ブフェニン、クレンブテロール、ドペキサミン、エピネフリン、フェノテロール（ｆｅｎｔｏｔｅｒｏｌ）、ホルモテロール、イソエタリン（ｉｓｏｅｔａｒｉｎｅ）、イソプレナリン、イソプロテレノール、レボサルブタモール、オルシプレナリン、ピルブテロール、プロカテロール、リトドリン、サルブタモール、アルブテロール、テルブタリン、チオトロピウムなど）、抗コリン剤（例えば、ヒヨスチアミン、アトロピン、フェノバルビタール、スコポラミン、ジサイクロミン、フェノバルビタール、メペンゾラートおよび組合せ、例えば、アトロピン、ヒヨスチアミン、フェノバルビタールおよびスコポラミンなど）、コルチコステロイド（例えば、ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン−１７−バレレート、ヒドロコルチゾン−１７−ブチレート、プレドニゾン、プレドニゾロン、トリアムシノロンアセトニド、トリアムシノロンアルコール、ベタメタゾン、デキサメタゾン、フルオコルトロン、フルニソリド、ブデソニド）、長期抗生物質（例えば、マクロライド、例えば、エリスロマイシン、アジスロマイシンなど、およびメチルキサンチン、例えばテオフィリンなど）、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）（例えば、アスピリン、セレコキシブ、ジクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ナプロキセン、オキサプロジン、ピロキシカム、サルサレート、スリンダク、トルメチンなど）、５−アミノサリチル酸（５−ＡＳＡ）（例えば、メサラジン）、免疫抑制剤（ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｎｔｓ）（例えば、プレドニゾン、ＴＮＦ阻害剤、アザチオプリン、メトトレキサート、６−メルカプトプリン）、再発寛解型多発性硬化症療法（例えば、インターフェロンベータ−１ａ、インターフェロンベータ−１ｂ、グラチラマー酢酸塩、ミトキサントロン、ナタリズ���ブ、フィンゴリモド、テリフルノミド、フマル酸ジメチル、アレムツズマブ、ダクリズマブ、ＣＤ２０モノクローナル抗体、例えば、リツキシマブ、オクレリズマブおよびオファツムマブなど）、乾癬治療用の外用剤（例えば、パラアミノ安息香酸、ココナッツ油、コールタール、ジスラノール、コルチコステロイド、例えば、デソキシメタゾン、フルオシノニドなど、ビタミンＤ３および他のビタミンＤアナログ、ソラレンなどの外用剤、ならびに、メトトレキサート、シクロスポリン、ヒドロキシカルバミド、フマル酸ジメチルなどのフマレートおよびレチノイドなどの全身剤など）、ＴＮＦ−αアンタゴニスト（例えば、インフリキシマブ、アダリムマブ、ゴリムマブおよびセルトリズマブペゴル）、Ｔ細胞を標的化する乾癬治療（例えば、エファリズマブおよびアレファセプト）、高血圧および心臓血管疾患の治療（例えば、アスピリン、スタチン、例えば、アトルバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチンおよび組合せ、例えば、シンバスタチン＋エゼチミブ、ロバスタチン＋ナイアシン、およびアトルバスタチン＋アムロジピンなど）、神経変性障害の療法（例えば、ジメボン、およびプロリンリッチペプチド（ＰＲＰ）−１）、抗うつ剤（例えば、セルトラリン、シタロプラム、フルオキセチン、エスシタロプラム、トラゾドン、ベンラファキシン、ブプロピオン、デュロキセチン、パロキセチン、アミトリプチリン、ベンラファキシン（ｖｅｎｌａｆａｃｉｎｅ）、デスベンラファキシン、およびノルトリプチリン）、および抗がん療法（例えば、ソラフェニブ、ＪＸ−５９４、インターロイキン−２、イピリムマブ（ヤーボイ）、ニボルマブ（オプジーボ）、ペムブロリズマブ（キイトルーダ）、ベムラフェニブ（ゼルボラフ）、ダブラフェニブ（タフィンラー）、トラメチニブ（メキニスト）、アントラサイクリン、例えば、ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標））、エピルビシン（Ｅｌｌｅｎｃｅ（登録商標））など、タキサン、例えば、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））およびドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））など、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標））、カルボプラチン（Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ（登録商標））またはこれらの組合せ）が挙げられるがこれらに限定されない。
投与レジメン
【０１０７】
本発明のある特定の実施形態によれば、複数回用量の抗ＬＥＰＲアンタゴニスト抗体（または抗ＬＥＰＲアンタゴニスト抗体と本明細書に記載される追加の治療活性剤のいずれかとの組合せを含む医薬組成物）は、定義された時間経過にわたって対象に投与されてよい。本発明のこの態様による方法は、対象に複数回用量の本発明の抗ＬＥＰＲ抗体を逐次的に投与することを含む。本明細書で使用される場合、「逐次的に投与する」は、抗ＬＥＰＲ抗体の各用量が異なる時点に、例えば、予め決定された間隔（例えば、時間、日、週または月）で隔てられた異なる日に、対象に投与されることを意味する。本発明は、患者に単回の開始用量の抗ＬＥＰＲ抗体、その後に１つまたは複数の二次用量の抗ＬＥＰＲ抗体、および任意選択でその後に１つまたは複数の三次用量の抗ＬＥＰＲ抗体を逐次的に投与することを含む方法を含む。
【０１０８】
「開始用量」、「二次用量」、および「三次用量」という用語は、本発明の抗ＬＥＰＲ抗体の投与の時間的配列を指す。したがって、「開始用量」は治療レジメンの始めに投与される用量であり（「ベースライン用量」、「ローディング用量」、「出発用量」などとも称される）、「二次用量」は開始用量の後に投与される用量であり、「三次用量」は二次用量の後に投与される用量である。開始、二次、および三次用量の全ては、同じ量の抗ＬＥＰＲ抗体を含有してもよいが、通常、投与の頻度の点で互いに異なってよい。しかしながら、ある特定の実施形態では、開始、二次および／または三次用量に含有される抗ＬＥＰＲ抗体の量は、治療の経過の間に互いから変化させられる（例えば、適宜、上方または下方に調整される）。ある特定の実施形態では、２つまたはそれより多く（例えば、２、３、４、または５）の用量が「ローディング用量」として治療レジメンの始めに投与された後、その後の用量がより低い頻度で投与される（例えば、「維持用量」）。
抗体の診断および解析的使用
【０１０９】
本発明の抗ＬＥＰＲ抗体はまた、例えば診断目的のために、試料中のＬＥＰＲ、またはＬＥＰＲ発現細胞を検出および／または測定するために使用することができる。例えば、抗ＬＥＰＲ抗体、またはその断片は、ＬＥＰＲの異常な発現（例えば、過剰発現、過少発現、発現の欠如など）により特徴付けられる状態または疾患を診断するために使用することができる。ＬＥＰＲの例示的な診断アッセイは、例えば、患者から得られた試料を本発明の抗ＬＥＰＲ抗体と接触させることを含んでよく、抗ＬＥＰＲ抗体は検出可能な標識またはレポーター分子で標識されている。あるいは、非標識の抗ＬＥＰＲ抗体を、それ自体検出可能に標識された二次抗体と組み合わせて診断応用において使用することができる。検出可能な標識またはレポーター分子は、放射性同位体、例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、もしくは１２５Ｉなど；蛍光もしくは化学発光部分、例えば、フルオレセインイソチオシアネート、もしくはローダミンなど；または酵素、例えば、アルカリホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、もしくはルシフェラーゼなどであってよい。試料中のＬＥＰＲを検出または測定するために使用できる特定の例示的なアッセイとしては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）が挙げられる。
【０１１０】
本発明によるＬＥＰＲ診断アッセイにおいて使用できる試料としては、正常または病的な条件下で検出可能な量のＬＥＰＲタンパク質、またはその断片を含有する患者から得られ得る任意の組織または液体試料が挙げられる。一般に、健常患者（例えば、異常なＬＥＰＲレベルまたは活性に関連する疾患または状態に罹患していない患者）から得られる特定の試料中のＬＥＰＲのレベルが最初にベースラインの、または標準のＬＥＰＲのレベルを確立するために測定される。次に、ＬＥＰＲのこのベースラインレベルを、ＬＥＰＲに関連する疾患または状態を有することが疑われる個体から得られた試料において測定されたＬＥＰＲのレベルに対して比較することができる。
【実施例】
【０１１１】
以下の実施例は、本発明の方法および組成物をどのように行いまたは作り、使用するかの完全な開示および説明を当業者に提供するように提案されるものであり、本発明者らが彼らの発明とみなしているものの範囲を限定することを意図するものではない。使用される数（例えば、量、温度など）に関して正確性を確実にするための努力が為されているが、何らかの実験誤差および逸脱が考慮されるべきである。別に指し示さない限り、部は質量部であり、分子量は平均分子量であり、温度はセ氏度であり、圧力は大気圧またはその近くである。
（実施例１）
レプチン受容体（ＬＥＰＲ）に特異的に結合する抗原結合タンパク質の生成
【０１１２】
抗ＬＥＰＲ抗体は、ＬＥＰＲの細胞外ドメインを含む免疫原でＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス（すなわち、ヒト免疫グロブリン重鎖およびカッパー軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを含む操作されたマウス）を免疫化することにより得られた。抗体免疫反応は、ＬＥＰＲ特異的イムノアッセイによりモニターした。以前に記載された技術を使用して、完全にヒトの抗ＬＥＰＲ抗体を単離および精製した。
【０１１３】
この実施例の方法に従って生成された例示的な抗ＬＥＰＲ抗体のある特定の生物学的特性を以下に記載する実施例において詳細に説明する。
（実施例２）
重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸および核酸配列
【０１１４】
表１は、本発明の選択された抗ＬＥＰＲ抗体の重鎖および軽鎖可変領域ならびにＣＤＲのアミノ酸配列特定番号を示す。対応する核酸配列特定番号を表２に記載する。
【表１】
2020504078.tif 000002
【表２】
2020504078.tif 000003
【０１１５】
抗体は、通常、本明細書において以下の命名法に従って呼称する：Ｆｃの接頭部（例えば、「Ｈ４Ｈ」、「Ｈ１Ｍ」、「Ｈ２Ｍ」など）、その後に識別数値（例えば、「１７３２２」、「１８４５７」など）、その後に「Ｐ」または「Ｎ」の接尾部。したがって、この命名法によれば、抗体は本明細書において例えば「Ｈ４Ｈ１７３２２Ｐ２」、「Ｈ４Ｈ１８４５７Ｐ２」などのように呼称することができる。本明細書で使用される抗体名のＦｃの接頭部（Ｈ４Ｈ、Ｈ１ＭおよびＨ２Ｍ）は、抗体の特定のＦｃ領域アイソタイプを指し示す。例えば、「Ｈ４Ｈ」抗体はヒトＩｇＧ４  Ｆｃを有する一方、「Ｈ１Ｍ」抗体はマウスＩｇＧ１  Ｆｃを有する（全ての可変領域は、抗体名中の最初の「Ｈ」により示される通り、完全にヒトのものである）。当業者により理解されるように、特定のＦｃアイソタイプを有する抗体を異なるＦｃアイソタイプを有する抗体に変換することができるが（例えば、マウスＩｇＧ１  Ｆｃを有する抗体をヒトＩｇＧ４を有する抗体に変換することができるなど）、いずれの場合においても、表１および２に示される識別数値により指し示される可変ドメイン（ＣＤＲを含む）は同じままであり、Ｆｃドメインの性質にかかわらず結合特性は同一または実質的に類似であると予想される。
【０１１６】
比較用抗体。以下の実施例において使用される比較用抗体は、Ｆａｚｅｌｉら（２００６年）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３１２巻：１９０〜２００頁およびＣａｒｐｅｎｔｅｒら（２０１２年）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２０巻（３号）：４８７〜９７頁に記載されるＦａｂ  ９Ｆ８を指す。
（実施例３）
ヒトモノクローナル抗ＬＥＰＲ抗体の表面プラズモン共鳴由来の結合親和性および速度定数
【０１１７】
精製された本発明の抗ＬＥＰＲモノクローナル抗体への抗原結合についての平衡解離定数（ＫＤ値）は、Ｂｉａｃｏｒｅ  ４０００機器を使用し、リアルタイム表面プラズモン共鳴バイオセンサーを使用して決定した。全ての結合試験は、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、および０．０５％ｖ／ｖの界面活性剤Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するｐＨ７．４のランニングバッファー（ＨＢＳ−ＥＴランニングバッファー）中、２５℃および３７℃で行った。Ｂｉａｃｏｒｅセンサー表面を最初に、抗ＬＥＰＲモノクローナル抗体を捕捉するためにモノクローナルマウス抗ヒトＦｃ抗体（ＧＥ、＃ＢＲ−１００８−３９）とのアミンカップリングにより誘導体化した。抗ＬＥＰＲモノクローナル抗体への結合について試験したＬＥＰＲ試薬は、Ｃ末端のｍｙｃ−ｍｙｃ−ヘキサヒスチジンタグと共に発現される組換えヒトＬＥＰＲ細胞外ドメイン（ｈＬＥＰＲ．ＭＭＨ；配列番号９０）、Ｃ末端のｍｙｃ−ｍｙｃ−ヘキサヒスチジンタグと共に発現される組換えマカクザルＬＥＰＲ細胞外ドメイン（ｍｆＬＥＰＲ．ＭＭＨ；配列番号９３）、Ｃ末端のｍｙｃ−ｍｙｃ−ヘキサヒスチジンタグと共に発現される組換えマウスＬＥＰＲ細胞外ドメイン（ｍＬＥＰＲ．ＭＭＨ；配列番号９４）、Ｃ末端のｍｙｃ−ｍｙｃ−ヘキサヒスチジンタグと共に発現される組換えラットＬＥＰＲ細胞外ドメイン（ｒＬＥＰＲ．ＭＭＨ；配列番号９５）、およびＣ末端のマウスＩｇＧ２ａ  Ｆｃタグと共に発現される組換えヒトＬＥＰＲ細胞外ドメイン（ｈＬＥＰＲ．ｍＦｃ；配列番号９１）を含んでいた。ＭＭＨタグを含むＬＥＰＲ構築物は単量体ＬＥＰＲ構築物であり、ｍＦｃタグを含むＬＥＰＲ構築物は二量体ＬＥＰＲ構築物である。異なる濃度のＬＥＰＲ試薬を最初に、３倍連続希釈液中の１００ｎＭ〜３．７ｎＭに及ぶ最終濃度でＨＢＳ−ＥＴランニングバッファー中で調製した後、３０μＬ／分の流速で４分間表面に捕捉させた抗ＬＥＰＲモノクローナル抗体上に注入した。モノクローナル抗体に結合したＬＥＰＲ試薬の解離をＨＢＳ−ＥＴランニングバッファー中で１０分間モニターした。Ｓｃｒｕｂｂｅｒ  ２．０ｃ曲線フィッティングソフトウェアを使用してマストランスポートリミテーションを有する１：１結合モデルに対してリアルタイム結合センサーグラムをフィッティングすることにより速度論的会合（ｋａ）および解離（ｋｄ）速度定数を決定した。結合解離平衡定数（ＫＤ）および解離半減期（ｔ１／２）は、以下のように速度論的速度定数から算出した：
【数１】
2020504078.tif 000004
【０１１８】
２５℃および３７℃での本発明の異なる抗ＬＥＰＲモノクローナル抗体へのｈＬＥＰＲ−ＭＭＨ、ｍｆＬＥＰＲ−ＭＭＨ、ｈＬＥＰＲ．ｍＦｃ、ｍＬＥＰＲ−ＭＭＨまたはｒＬＥＰＲ−ＭＭＨの結合についての結合速度論的パラメーターを表３〜１３に示す。
【表３−１】
2020504078.tif 000005
【表３−２】
2020504078.tif 000006
【表４−１】
2020504078.tif 000007
【表４−２】
2020504078.tif 000008
【０１１９】
表３に示すように、２５℃において、本発明の抗ＬＥＰＲモノクローナル抗体の全てが、５．１１ｎＭ〜１９４ｎＭに及ぶＫＤ値でｈＬＥＰＲ−ＭＭＨに結合した。表４に示すように、３７℃において、本発明の抗ＬＥＰＲモノクローナル抗体の全てが、１１．７ｎＭ〜２４８ｎＭに及ぶＫＤ値でｈＬＥＰＲ−ＭＭＨに結合した。
【表５−１】
2020504078.tif 000009
【表５−２】
2020504078.tif 000010
【表６−１】
2020504078.tif 000011
【表６−２】
2020504078.tif 000012
【０１２０】
表５に示すように、２５℃において、本発明の抗ＬＥＰＲモノクローナル抗体の全てが、４．１６ｎＭ〜１７９ｎＭに及ぶＫＤ値でｍｆＬＥＰＲ−ＭＭＨに結合した。表６に示すように、３７℃において、本発明の抗ＬＥＰＲモノクローナル抗体の全てが、７．７２ｎＭ〜２６１ｎＭに及ぶＫＤ値でｍｆＬＥＰＲ−ＭＭＨに結合した。
【表７】
2020504078.tif 000013
【表８】
2020504078.tif 000014
【０１２１】
表７に示すように、２５℃において、本発明の抗ＬＥＰＲモノクローナル抗体の全てが、４４３ｐＭ〜１１．９ｎＭに及ぶＫＤ値でｈＬＥＰＲ−ｍＦｃに結合した。表８に示すように、３７℃において、本発明の抗ＬＥＰＲモノクローナル抗体の全てが、５２７ｐＭ〜１５．１ｎＭに及ぶＫＤ値でｈＬＥＰＲ−ｍＦｃに結合した。
【表９】
2020504078.tif 000015
【表１０−１】
2020504078.tif 000016
【表１０−２】
2020504078.tif 000017
【０１２２】
表９に示すように、２５℃において、本発明の抗ＬＥＰＲモノクローナル抗体の９つのうち２つが、２１８ｎＭおよび２６４ｎＭのＫＤ値でｍＬＥＰＲ−ＭＭＨに結合した。表１０に示すように、３７℃において、本発明の抗ＬＥＰＲモノクローナル抗体の９つのうち２つが、２０５ｎＭおよび１．１６μＭのＫＤ値でｍＬＥＰＲ−ＭＭＨに結合した。
【表１１−１】
2020504078.tif 000018
【表１１−２】
2020504078.tif 000019
【表１２−１】
2020504078.tif 000020
【表１２−２】
2020504078.tif 000021
【０１２３】
表１１に示すように、２５℃において、本発明の抗ＬＥＰＲモノクローナル抗体の９つのうち５つが、３２８ｎＭ〜９４３ｎＭに及ぶＫＤ値でｒＬＥＰＲ−ＭＭＨに結合した。表１２に示すように、３７℃において、本発明の抗ＬＥＰＲモノクローナル抗体の９つのうち５つが、１６８ｎＭ〜７７１ｎＭに及ぶＫＤ値でｒＬＥＰＲ−ＭＭＨに結合した。
（実施例４）
本発明の抗ＬＥＰＲ抗体はｈＬｅｐｔｉｎに対するｈＬＥＰＲ−ｈＦｃの結合をブロックしない
【０１２４】
本発明の抗ＬＥＰＲモノクローナル抗体が二量体ヒトＬＥＰＲのその天然リガンドであるヒトレプチンへの結合をブロックする能力を競合サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して測定した。
【０１２５】
ＥＬＩＳＡのために、ヒトレプチン（ｈＬｅｐｔｉｎ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃３９８−ＬＰ−０１Ｍ）をＰＢＳ中５μｇ／ｍＬの濃度で９６ウェルのマイクロタイタープレートに４℃で終夜コーティングした。その後、ＰＢＳ中のＢＳＡの０．５％（ｗ／ｖ）溶液を使用して非特異的結合部位をブロックした。Ｃ末端のヒトＦｃタグと共に発現させたＬＥＰＲタンパク質（ｈＬＥＰＲ．ｈＦｃ；配列番号９２）の一定量（１０ｎＭ）の細胞外ドメイン部分を段階希釈の８．５ｐＭ〜５００ｎＭに及ぶ抗ＬＥＰＲ抗体、ｈＬｅｐｔｉｎタンパク質、またはアイソタイプ対照抗体を用いて滴定した。次に、これらの抗体−タンパク質またはタンパク質−タンパク質複合体を室温（ＲＴ）で１．５時間インキュベートした。その後、ｈＬｅｐｔｉｎをコーティングしたマイクロタイタープレートに複合体を移し、ＲＴで２時間インキュベートし、ウェルを洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ、＃１０９−０３５−０９８）を用いてプレート結合ｈＬＥＰＲ−ｈＦｃを検出した。ＴＭＢ溶液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、＃５５５２１４；製造者の説明書の通り、基質ＡおよびＢを１：１の比で混合）を用いて試料の発色を行って比色反応を生じさせた後、１Ｍの硫酸で中和させた後にＶｉｃｔｏｒ  Ｘ５プレートリーダーにより４５０ｎｍで吸光度を測定した。Ｐｒｉｓｍ（商標）ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）内のシグモイド用量応答モデルを使用してデータ解析を行った。プレート上のヒトレプチンへの１０ｎＭのｈＬＥＰＲ−ｈＦｃの結合をブロックする抗体の能力を指標として、試験した抗体の最大濃度でのブロックパーセントを算出した。算出において、抗体の存在なしでの１０ｎＭのｈＬＥＰＲ−ｈＦｃの結合シグナルを１００％の結合または０％のブロックとする参照とし、ｈＬＥＰＲ−ｈＦｃの存在なしでの緩衝液単独でのベースラインシグナルを０％の結合または１００％のブロックとする参照とした。５００ｎＭの抗体濃度でのブロックデータを表１３に要約する。
【表１３】
2020504078.tif 000022
【０１２６】
表１３に示すように、本発明の抗ＬＥＰＲ抗体のいずれも、ｈＬｅｐｔｉｎをコーティングした表面へのｈＬＥＰＲ−ｈＦｃの結合の４０％より多くのブロックを実証しなかった。しかしながら、陽性対照として比較用抗体およびｈＬｅｐｔｉｎは、ｈＬｅｐｔｉｎをコーティングした表面へのｈＬＥＰＲ−ｈＦｃの結合の９９％をブロックすることができた。アイソタイプ対照抗体は、５００ｎＭまでの濃度において測定可能なブロックを実証しなかった。
（実施例５）
ＨＥＫ２９３／Ｍｙｃｘ２−ｈＬＥＰＲ（エクト）−ＧＰＩアンカー細胞を用いるＦＡＣＳ分析による細胞結合
【０１２７】
レプチン受容体ＬＥＰＲは、大きい、８１８アミノ酸長の細胞外ドメインを有するクラスＩサイトカイン受容体ファミリーの１回膜貫通型受容体である（Ｔａｒｔａｇｌｉａ（１９９７年）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ  ７：２７２巻（１０号）：６０９３〜６頁）。ＬＥＰＲは、摂食および代謝の調節に関与する脂肪組織により主に発現されるタンパク質であるレプチンに結合することができる（Ｆｒｉｅｄｍａｎ（２０１４年）Ｊ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  ２２３巻（１号）：Ｔ１〜８頁）。異なるアイソフォームのＬＥＰＲが存在して可溶型または膜結合型の受容体をもたらし、膜結合型はそれらの細胞内ドメインの長さが異なる。最も長い細胞内ドメインを有するアイソフォームは、肥満症に関するレプチンの作用の重要な部位である視床下部において高発現される（ＦｒｉｅｄｍａｎおよびＨａｌａａｓ（１９９８年）Ｎａｔｕｒｅ  ３９５巻（６７０４号）：７６３〜７０頁）。ＬＥＰＲは、主に細胞体内、そしてより低い程度で細胞表面上に局在する。ＬＥＰＲはリガンド誘導性の内部移行を起こして、レプチンシグナル伝達の追加のレベルの調節を加える（Ｓｗｅｅｎｅｙ（２００２年）Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ  １４巻（８号）：６５５〜６３頁）。
【０１２８】
本発明の抗ＬＥＰＲ抗体による細胞結合を評価するために、Ｎ末端のｍｙｃ−ｍｙｃタグ、および、タンパク質を膜にグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）で固着できるようにＧＰＩの付加をガイドするヒトカルボキシペプチダーゼＭのＣ末端ペプチド配列を有するヒトＬＥＰＲ（ｈＬＥＰＲ；受託番号Ｐ４８３５７のアミノ酸２２〜８３９、アイソフォームＢ）の細胞外ドメインを安定に発現するＨＥＫ２９３細胞株を生成させた（Ｍａｒｃｉｃら（２０００年）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２７５巻（２１号）：１６１１０〜８頁）。細胞株中のｈＬＥＰＲは細胞内ドメインを持たないので、リガンド結合により内部移行せず、抗体および／またはリガンド結合のために利用可能なＬＥＰＲの量を大きく増加させる。１０％のＦＢＳ、ＮＥＡＡ、ペニシリン／ストレプトマイシン、および５００μｇ／ｍＬのＧ４１８を含有するＤＭＥＭ中で細胞株を選択した後、抗Ｍｙｃ抗体を使用して受容体の高い発現について選別した。ＨＥＫ２９３／ｈＬＥＰＲ−ＧＰＩと称する結果として得られた安定な細胞株を、１０％のＦＢＳ、ＮＥＡＡ、およびペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ中に維持した。
【０１２９】
ＦＡＣＳ分析のために、ＨＥＫ２９３親細胞およびＨＥＫ２９３／ｈＬＥＰＲ−ＧＰＩ細胞を解離させ、９６ウェルｖ底プレート上の２％のＦＢＳを含有するＰＢＳ（ＦＡＣＳ緩衝液）中に５×１０５細胞／ウェルでプレートした。細胞への抗ｈＬＥＰＲ抗体の結合がレプチンの存在により影響されるかどうかを試験するために、１μＭのヒトレプチン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃３９８−ＬＰ）を含むまたは含まないＦＡＣＳ緩衝液を細胞と４℃で３０分間インキュベートした後、ＦＡＣＳ緩衝液中に１０ｎＭで抗ＬＥＰＲ抗体または対照抗体を加えた。その後に細胞を４℃で３０分間インキュベートした後、洗浄し、１６μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）−６４７コンジュゲート二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、＃１０９−５４７−００３）と４℃で３０分間インキュベートした。その後、ＢＤ  ＣｙｔｏＦｉｘ（商標）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、＃５５４６５５）を使用して細胞を固定し、濾過し、ＨｙｐｅｒＣｙｔ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）で解析した。全ての細胞株について非染色および二次抗体単独の対照も試験した。ＦｏｒｅＣｙｔ（ＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔ）およびＦｌｏｗＪｏバージョン１０ソフトウェアを使用して結果を解析して生存細胞の蛍光の幾何平均を決定した。次に、各試料の蛍光の幾何平均を非染色細胞の幾何平均に対して正規化して、「結合比」と称する条件当たりの相対結合を得、試験した各抗体についてこれらの結合比を表１４に記録した。
【０１３０】
表１４に示すように、１０ｎＭで試験した本発明の９つの抗ＬＥＰＲ抗体は、レプチンなしで８２４倍〜３１８７倍、１μＭのレプチンの存在下で３９８倍〜３５９０倍に及ぶ結合比でＨＥＫ２９３／ｈＬＥＰＲ−ＧＰＩ細胞への結合を実証した。これらの結合比の類似性に基づけば、細胞上に発現されたＬＥＰＲに結合する本発明の抗ＬＥＰＲ抗体の能力は１μＭの過剰のレプチンの存在により大きく影響されないらしく、ＬＥＰＲ上の抗ＬＥＰＲ抗体の結合部位はＬＥＰＲ上のレプチン結合部位と重なり合わないことを示唆する。本発明の抗ＬＥＰＲ抗体は、１〜９倍に及ぶ１μＭのレプチンありおよびなしでの結合比を有してＨＥＫ２９３親細胞へのいかなる有意な結合も実証しなかった。ＧＰＩアンカーＬＥＰＲを発現する細胞への比較物の結合はレプチンの存在下で有意に低減した。アイソタイプ対照抗体および二次抗体単独の試料もまた、１〜６倍に及ぶ結合比で、レプチンありまたはなしのいずれかの細胞株に有意な結合を実証しなかった。
【表１４−１】
2020504078.tif 000023
【表１４−２】
2020504078.tif 000024
（実施例６）
本発明の抗ＬＥＰＲ抗体はｈＬｅｐｔｉｎの存在下でレプチンシグナル伝達の完全な阻害を実証した
【０１３１】
ヒト神経芽腫細胞株であるＩＭＲ−３２細胞株中でルシフェラーゼレポーターと共に全長ヒトＬＥＰＲ（ｈＬＥＰＲ；受託番号ＮＰ＿００２２９４．２のアミノ酸１〜１１６５）を安定に発現するレポーター細胞株を使用してＬＥＰＲ活性化を介するＳＴＡＴ３の転写活性化（ＳＴＡＴ３−Ｌｕｃ；Ｑｉａｇｅｎ、＃ＣＬＳ−６０２８Ｌ）を検出するためのバイオアッセイを開発した。ＩＭＲ−３２／ＳＴＡＴ３−Ｌｕｃ／ｈＬＥＰＲと称する結果として得られた安定な細胞株を単離し、１０％のＦＢＳ、ＮＥＡＡ、１ｕｇ／ｍＬのピューロマイシン、１００ｕｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢおよびペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ−グルタミンを添加したＭＥＭ−Ｅａｒｌ培地（完全培地）中に維持した。
【０１３２】
結果として得られたバイオアッセイを使用して、レプチンの存在または非存在下でのＬＥＰＲシグナル伝達に対する本発明の抗ＬＥＰＲ抗体の効果を測定した。バイオアッセイのために、９６ウェルフォーマットで２０，０００細胞／１００ｕｌ／ウェルの密度で完全培地中にＩＭＲ−３２／ＳＴＡＴ３−Ｌｕｃ／ｈＬＥＰＲ細胞をプレートし、翌日に培地を１％のＢＳＡおよび０．１％のＦＢＳを添加した適切な体積のＯｐｔｉ−ＭＥＭ（アッセイ緩衝液）に３０分間置き換えた。レプチンの非存在下での本発明の抗体の効果を測定するために、アッセイ緩衝液中で１００ｎＭ〜３００ｆＭに及ぶ最終濃度まで抗ＬＥＰＲ抗体またはアイソタイプ対照抗体を半ログで段階希釈してから細胞に加えた後、５％のＣＯ２中３７℃で終夜インキュベートした。レプチンの存在下での本発明の抗体の効果を測定するために、アッセイ緩衝液中２００ｐＭの固定した濃度のヒトレプチン（ｈＬｅｐｔｉｎ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃３９８−ＬＰ）を細胞に加えた直後、１００ｎＭ〜３００ｆＭに及ぶ最終濃度まで半ログで段階希釈した抗ＬＥＰＲ抗体またはアイソタイプ対照抗体を加えた。次に、試料を５％のＣＯ２中３７℃で終夜インキュベートした。次にＯｎｅＧｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｅ６０５１）を試料に加え、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ  Ｍｕｌｔｉｌａｂｌｅ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）によりＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔモードでルシフェラーゼ活性を測定した。相対光単位（ＲＬＵ）値を得、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用い非線形回帰を使用して結果を解析した。ｈＬｅｐｔｉｎ用量応答から得られた最大ＲＬＵ値をＩＭＲ−３２／ＳＴＡＴ３−Ｌｕｃ／ｈＬＥＰＲアッセイにおいて１００％の活性として定義した。
【０１３３】
表１５に示すように、ｈＬｅｐｔｉｎの非存在下で試験した抗ＬＥＰＲ抗体は、ｈＬｅｐｔｉｎ用量応答から得られた最大活性化のそれぞれ４％〜８％の最大活性化を有してＩＭＲ−３２／ＳＴＡＴ３−Ｌｕｃ／ｈＬＥＰＲ細胞の弱い刺激を実証した。弱い刺激を有する１つの抗体は１．２７ｎＭのＥＣ５０値を有した一方、別の抗体Ｈ４Ｈ１８４４０Ｐ２は測定可能なＥＣ５０値を有しなかった。２００ｐＭのｈＬｅｐｔｉｎの存在下で、試験した抗ＬＥＰＲ抗体の３つは７２３ｐＭ（抗体Ｈ４Ｈ１８４５７Ｐ２）〜１．８３ｎＭ（抗体Ｈ４Ｈ１７３２２Ｐ２）または２．９ｎＭ（抗体Ｈ４Ｈ１８４６４Ｐ２）に及ぶＩＣ５０値でＩＭＲ−３２／ＳＴＡＴ３−Ｌｕｃ／ｈＬＥＰＲ細胞においてレプチンの完全な阻害を実証した。試験した抗ＬＥＰＲ抗体の６つは、２００ｐＭのヒトレプチンの存在下でいかなる測定可能な阻害も実証しなかった。アイソタイプ対照抗体は、いずれのアッセイにおいてもＩＭＲ−３２／ＳＴＡＴ３−Ｌｕｃ／ｈＬＥＰＲ細胞のいかなる測定可能な刺激も実証しなかった。
【表１５−１】
2020504078.tif 000025
【表１５−２】
2020504078.tif 000026
（実施例７）
異なる抗ＬＥＰＲモノクローナル抗体間のＯｃｔｅｔ交差競合
【０１３４】
Ｏｃｔｅｔ  ＨＴＸバイオセンサープラットフォーム（Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｃｏｒｐ．）上でリアルタイムの標識フリーバイオレイヤー干渉法アッセイを使用して異なる抗ＬＥＰＲモノクローナル抗体のパネル間の結合競合を決定した。全実験は、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、および０．０５％ｖ／ｖの界面活性剤Ｔｗｅｅｎ−２０、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含有するｐＨ７．４の緩衝液（ＨＢＳ−ＥＢＴ）中、１０００ｒｐｍの速度でのプレートの振とうと共に２５℃で行った。
【０１３５】
Ｃ末端のｍｙｃ−ｍｙｃ−ヘキサヒスチジンタグと共に発現される組換えヒトＬＥＰＲ（ｈＬＥＰＲ．ＭＭＨ；配列番号９０）への結合について２つの抗体が互いに競合できるかどうかを評価するために、２０μｇ／ｍＬのｈＬＥＰＲ−ＭＭＨを含有するウェル中にバイオセンサーチップを５分間浸漬することにより、約０．２５ｎｍのｈＬＥＰＲ−ＭＭＨを最初に、抗ペンタＨｉｓ抗体をコーティングしたＯｃｔｅｔバイオセンサーチップ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ  Ｉｎｃ、＃１８−５１２２）に捕捉させた。次に、５０μｇ／ｍＬの第１の抗ＬＥＰＲモノクローナル抗体（以下、ｍＡｂ−１と称する）の溶液を含有するウェル中に２１０秒間浸すことにより、抗原を捕捉したバイオセンサーチップをｍＡｂ−１で飽和させた。その後に、５０μｇ／ｍＬの第２の抗ＬＥＰＲモノクローナル抗体（以下、ｍＡｂ−２と称する）の溶液を含有するウェル中にバイオセンサーチップを１５０秒間浸した。実験のあらゆるステップの間にバイオセンサーチップをＨＢＳ−ＥＢＴ緩衝液中で洗浄した。実験の過程全体の間、リアルタイム結合応答をモニターし、あらゆるステップの最後に結合応答を記録した。ｍＡｂ−１を予め複合体化させたｈＬＥＰＲ−ＭＭＨへのｍＡｂ−２の結合の応答を比較し、表１６に示すように、異なる抗ＬＥＰＲモノクローナル抗体の競合的／非競合的挙動を決定した。
【表１６】
2020504078.tif 000027
【０１３６】
表１６に示すように、抗体Ｈ４Ｈ１８４３９Ｐ２およびＨ４Ｈ１８４４０Ｐ２は、それらの各々のエピトープへの結合について互いに競合する。ＬＥＰＲ抗体Ｈ４Ｈ１８４５７Ｐ２、Ｈ４Ｈ１８４６２Ｐ２、Ｈ４Ｈ１８４３７Ｐ２、Ｈ４Ｈ１８４６６Ｐ２およびＨ４Ｈ１８５０８Ｐ２は、それらの各々のエピトープへの結合について互いに競合する。抗体Ｈ４Ｈ１７３２２Ｐ２およびＨ４Ｈ１８４６４Ｐ２は、Ｈ４Ｈ１８４３９Ｐ２、Ｈ４Ｈ１８４４０Ｐ２、Ｈ４Ｈ１８４５７Ｐ２、Ｈ４Ｈ１８４６２Ｐ２、Ｈ４Ｈ１８４３７Ｐ２、およびＨ４Ｈ１８４６６Ｐ２の各々のエピトープへの結合について競合しない。
（実施例８）
ヒト化ＬＥＰＲマウスにおけるＬＥＰＲアンタゴニスト抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性試験
【０１３７】
摂食、体重および脂肪過多に対する本発明の３つの特異的アンタゴニスト抗ＬＥＰＲ抗体Ｈ４Ｈ１７３２２Ｐ２、Ｈ４Ｈ１８４５７Ｐ２およびＨ４Ｈ１８４６４Ｐ２の効果を、マウスＬＥＰＲエクトドメイン配列の代わりにヒトＬＥＰＲエクトドメイン配列から構成されるレプチン受容体を発現する一匹飼いした遺伝子操作ＬＥＰＲＨｕ／Ｈｕマウスにおいて決定した。
【０１３８】
処置の５日前から１日前（−５日目および−１日目）の間にベースラインの１日摂食量を測定した。処置の４日前および処置の６日後（−４日目および−６日目）の脂肪過多を含む身体組成をμＣＴにより定量化した。０日目に３２匹の１２〜１３週齢の雄ＬＥＰＲＨｕＨｕマウスを、１日の予備処置（−１日目）からの体重に基づいて８匹のマウスの４つの群に無作為化した。０日目に、単回用量の３０ｍｇ／ｋｇアイソタイプ対照抗体、３０ｍｇ／ｋｇのＨ４Ｈ１７３２２Ｐ２、３０ｍｇ／ｋｇのＨ４Ｈ１８４５７Ｐ２、または３０ｍｇ／ｋｇのＨ４Ｈ１８４６４Ｐ２のいずれかを皮下注射を介して各群に与えた。アイソタイプ対照抗体はいかなる公知のマウスタンパク質にも結合しない。各動物について試験の継続期間にわたって摂食量および体重を測定した。図１は、各時点における各処置群についての平均のベースラインの１日摂食量からの摂食量の変化のパーセントを要約する。０日目からの体重の変化のパーセントを各時点において各動物について算出した。図２は、各処置群の動物についての体重の変化の平均パーセントを要約する。図３は、抗体処置の６日前および６日後のμＣＴにより定量化した各抗体処置群の動物についての平均脂肪量を要約する。全ての結果を平均±ＳＥＭとして表す。
【０１３９】
図１および図２に示すように、抗ＬＥＰＲアンタゴニスト抗体で処置したマウスは、摂食量の変化のパーセントおよび体重の変化のパーセントの増加を実証した。これらの増加は、アイソタイプ対照抗体処置では観察されなかった。図１に示すように、３０ｍｇ／ｋｇのＨ４Ｈ１７３２２Ｐ２で処置したマウスは、アイソタイプ対照抗体を注射したマウスと比較して処置の１日後（１日目）に始まりその後の時点において摂食量の有意な増加を呈した。３０ｍｇ／ｋｇのＨ４Ｈ１８４５７Ｐ２で処置したマウスは、アイソタイプ対照抗体を注射したマウスと比較して２日目に始まりその後の時点において摂食量の有意な増加を呈した。３０ｍｇ／ｋｇのＨ４Ｈ１８４６４Ｐ２で処置したマウスは、アイソタイプ対照抗体を注射したマウスと比較して２日目に始まり４日目以外のその後の時点において摂食量の有意な増加を呈した。図２に示すように、３０ｍｇ／ｋｇのＨ４Ｈ１７３２２Ｐ２で処置したマウスは、アイソタイプ対照抗体を注射したマウスと比較して治療の４日後（４日目）に始まりその後の時点において体重変化のパーセントの有意な増加を呈した。３０ｍｇ／ｋｇのＨ４Ｈ１８４５７Ｐ２で処置したマウスは、アイソタイプ対照抗体を注射したマウスと比較して３日目に始まりその後の時点において体重変化のパーセントの有意な増加を呈した。３０ｍｇ／ｋｇのＨ４Ｈ１８４６４Ｐ２で処置したマウスは、アイソタイプ対照抗体を注射したマウスと比較して４日目に始まりその後の時点において体重変化のパーセントの有意な増加を呈した。図３に描写されるように、処置前（−４日目）の群間で脂肪量の差異はなかった。３０ｍｇ／ｋｇのＨ４Ｈ１７３２２Ｐ２、Ｈ４Ｈ１８４５７Ｐ２およびＨ４Ｈ１８４６４Ｐ２抗体で処置したマウスは、アイソタイプ対照抗体と比較して処置の６日後（６日目）の脂肪量の有意な増加を実証した。結論として、アイソタイプ対照抗体はそうでなかったが、ＬＥＰＲアンタゴニスト抗体での処置は、マウスにおける摂食量、体重および脂肪過多を増加させた。
（実施例９）
本発明の抗ＬＥＰＲ抗体が結合するヒトＬＥＰＲのエピトープの決定
【０１４０】
本発明の抗ＬＥＰＲ抗体が結合するヒトＬＥＰＲのエピトープを決定するために、Ｌｕｍｉｎｅｘ  ＦＬＥＸＭＡＰ（ＦＭ３ＤＤ、ＬｕｍｉｎｅｘＣｏｒｐ）フローサイトメトリーベースの解析を利用して組換えヒトＬＥＰＲタンパク質ドメインとの抗ＬＥＰＲ抗体の相互作用を特徴付けた。アッセイのために、約３百万のカルボキシル化Ｍｉｃｒｏｐｌｅｘ（登録商標）ミクロスフェア（Ｌｕｍｉｎｅｘ、商品番号ＬＣ１０００Ａ）を洗浄し、ボルテックスし、ｐＨ６．２の０．１ＭのＮａＰＯ４中（活性化緩衝液）中で超音波処理した後、遠心分離して上清を除去した。ミクロスフェアを１２０μＬの活性化緩衝液中に再懸濁し、１５μＬの５０ｍｇ／ｍＬのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、商品番号２４５００）の後、１５μＬの５０ｍｇ／ｍＬの１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド（ＥＤＣ、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、商品番号２２９８０）を２５℃で加えることにより、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）を活性化した。１０分後、６００μＬの５０ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ５）（結合緩衝液）を加えて反応液のｐＨを５．０に低下させ、ミクロスフェアをボルテックスし、遠心分離して上清を除去した。結合緩衝液中、マウスＩｇＧまたはヒトＩｇＧのいずれかを有する５００μＬの２０μｇ／ｍＬのモノクローナル抗ｍｙｃ抗体と活性化されたビーズを直ちに混合し、２５℃で２時間インキュベートした。５０μＬの１Ｍのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を加えることにより結合反応を停止させ、ミクロスフェアを迅速にボルテックスし、遠心分離し、１ｍＬのＤＰＢＳで４回洗浄して、非結合のタンパク質および他の反応成分を除去した。
【０１４１】
一時的に発現されたＬＥＰＲタンパク質は、Ｃ末端のｍｙｃ−ｍｙｃヘキサヒスチジンタグと共に発現されたヒトＬＥＰＲ細胞外ドメイン（ヒトＬＥＰＲ−ＭＭＨ、配列番号８９）、Ｃ末端のｍｙｃ−ｍｙｃヘキサヒスチジンタグと共に発現されたヒトＬＥＰＲ  ＣＲＨ１（Ｄ１）（ヒトＬＥＰＲ  ＣＲＨ１（Ｄ１）−ＭＭＨ、アミノ酸２０９〜２３６のｍｙｃ−ｍｙｃヘキサヒスチジンタグと共に配列番号８９のアミノ酸１〜２０８）、Ｃ末端のｍｙｃ−ｍｙｃヘキサヒスチジンタグと共に発現されたヒトＬＥＰＲ  ＣＲＨ１（Ｄ１，Ｄ２）ドメイン（ヒトＬＥＰＲ  ＣＲＨ１（Ｄ１，Ｄ２）−ＭＭＨ、アミノ酸３１９〜３４６のｍｙｃ−ｍｙｃヘキサヒスチジンタグと共に配列番号８９のアミノ酸１〜３１８）、Ｃ末端のｍｙｃ−ｍｙｃヘキサヒスチジンタグと共に発現されたヒトＬＥＰＲ  ＣＲＨ１−Ｉｇ（Ｄ１，Ｄ２，Ｄ３）ドメイン（ヒトＬＥＰＲ  ＣＲＨ１（Ｄ１，Ｄ２，Ｄ３）−ＭＭＨ、アミノ酸２７９〜３０６のｍｙｃ−ｍｙｃヘキサヒスチジンタグと共に配列番号８９のアミノ酸１〜２７８）、Ｃ末端のｍｙｃ−ｍｙｃヘキサヒスチジンタグと共に発現されたヒトＬＥＰＲ  ＣＲＨ１−Ｉｇ（Ｄ２，Ｄ３）ドメイン（ヒトＬＥＰＲ  ＣＲＨ１−Ｉｇ（Ｄ２，Ｄ３）−ＭＭＨ、アミノ酸１９９〜２２６のｍｙｃ−ｍｙｃヘキサヒスチジンタグと共に配列番号８９のアミノ酸１〜１９８）、Ｃ末端のｍｙｃ−ｍｙｃヘキサヒスチジンタグと共に発現されたヒトＬＥＰＲ  Ｉｇ（Ｄ３）ドメイン（ヒトＬＥＰＲ  Ｉｇ（Ｄ３）−ＭＭＨ、アミノ酸８９〜１１６のｍｙｃ−ｍｙｃヘキサヒスチジンタグと共に配列番号８９のアミノ酸１〜８８）、Ｃ末端のｍｙｃ−ｍｙｃヘキサヒスチジンタグと共に発現されたヒトＬＥＰＲ  ＣＲＨ２ドメイン（ヒトＬＥＰＲ  ＣＲＨ２−ＭＭＨ、アミノ酸２０８〜２３５のｍｙｃ−ｍｙｃ−ヘキサヒスチジンタグと共に配列番号８９のアミノ酸１〜２０７）、Ｃ末端のｍｙｃ−ｍｙｃヘキサヒスチジンタグと共に発現されたヒトＬＥＰＲ  ＦＮＩＩＩドメイン（ヒトＬＥＰＲ  ＦＮＩＩＩ−ＭＭＨ、アミノ酸２０５〜２３２のｍｙｃ−ｍｙｃヘキサヒスチジンタグと共に配列番号８９のアミノ酸１〜２０４）、およびＣ末端のｍｙｃ−ｍｙｃヘキサヒスチジンタグと共に発現されたヒトＬＥＰＲ  Ｉｇ−ＣＲＨ２−ＦＮＩＩＩドメイン（ヒトＬＥＰＲ  Ｉｇ−ＣＲＨ２−ＦＮＩＩＩ−ＭＭＨ、アミノ酸５１１〜５３８のｍｙｃ−ｍｙｃ−ヘキサヒスチジンタグの配列番号８９のアミノ酸１〜５１０）を含み、これらを無血清ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ  ＩＩ培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、商品番号３１０３３０２０）中に懸濁させた後、遠心分離により透明化させた。上記の通りに調製した固定化された抗ｍｙｃモノクローナル抗体を有するミクロスフェアのアリコートをこれらのタンパク質上清のそれぞれ（１ｍＬ）に個々に加えた。ミクロスフェアを穏やかに混合し、２５℃で２時間インキュベートし、１ｍＬのＤＢＰＳで２回洗浄し、遠心分離して上清を除去し、最後に１ｍＬのＤＰＢＳ緩衝液中に再懸濁させた。全長ヒトＬＥＰＲおよび各ヒトＬＥＰＲドメインタンパク質との個々の反応からの４８μＬの抗ｍｙｃ  ＩｇＧ結合ミクロスフェアを回収し、３．６ｍＬのＰＢＳ＋２０ｍｇ／ｍＬ��ＢＳＡ＋０．０５％のナトリウムアジド（ブロッキング緩衝液）中で一緒に混合した。
【０１４２】
この混合プールから、７５μＬのミクロスフェアを９６ウェルフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、商品番号：ＭＳＢＶＮ１２５０）上にウェル毎にプレートし、２５μＬの個々の抗ヒトＬＥＰＲモノクローナル抗体（０．５または５μｇ／ｍＬ）と混合し、２５℃で２時間インキュベートした後、０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０を含む２００μＬのＤＰＢＳ（洗浄緩衝液）で２回洗浄した。個々のミクロスフェアに結合した抗ＬＥＰＲ抗体レベルの量を検出および定量化するために、ブロッキング緩衝液中の２．５μｇ／ｍＬのＲ−ＰｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎコンジュゲートヤギＦ（ａｂ’）２抗ヒトカッパー（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、商品番号２０６３−０９）（１００μＬ）またはブロッキング緩衝液中の１．２５μｇ／ｍＬのＲ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ  ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）（１００μＬ）またはブロッキング緩衝液中の１．２５μｇ／ｍＬのＲ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ  ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、商品番号：１１５−１１６−０７２）（１００μＬ）を加え、２５℃で３０分間インキュベートした。３０分後、試料を２００μＬの洗浄緩衝液で２回洗浄し、１５０μＬの洗浄緩衝液中に再懸濁させた。ミクロスフェアのメジアン蛍光強度（ＭＦＩ）をＬｕｍｉｎｅｘ  Ａｎａｌｙｚｅｒで測定した。
【０１４３】
Ｌｕｍｉｎｅｘベースの解析の結果を表１７にまとめる。Ｌｕｍｉｎｅｘ  ＭＦＩシグナル強度は、本発明の９つの抗ＬＥＰＲ抗体が完全なヒトＬＥＰＲ細胞外ドメインに結合したことを指し示す。抗ＬＥＰＲ抗体Ｈ４Ｈ１８４３９Ｐ２およびＨ４Ｈ１８４４０Ｐ２は、ヒトＬＥＰＲのＣＲＨ１  Ｄ２ドメイン内のエピトープに結合した。抗ＬＥＰＲ抗体Ｈ４Ｈ１７３２２Ｐ２およびＣＯＭＰ３５５１は、ヒトＬＥＰＲのＣＲＨ２ドメイン内のエピトープに結合した。抗ＬＥＰＲ抗体Ｈ４Ｈ１８４３７Ｐ２、Ｈ４Ｈ１８４５７Ｐ２、Ｈ４Ｈ１８５０８Ｐ２、Ｈ４Ｈ１８４６６Ｐ２およびＨ４Ｈ１８４６２Ｐ２は、ヒトＬＥＰＲのＦＮＩＩＩドメイン内のエピトープに結合した。抗ＬＥＰＲ抗体Ｈ４Ｈ１８４６４Ｐ２は、ヒトＬＥＰＲのＩｇ（Ｄ３）ドメイン内のエピトープに結合した。
【表１７】
2020504078.tif 000028
【０１４４】
本発明の範囲は、本明細書に記載される特定の実施形態により限定されない。実際、本明細書に記載されるものに加えて本発明の様々な改変が以上の記載および添付の図面から当業者に明らかとなるであろう。そのような改変は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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