(57)【要約】  α２−３−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸を有するグリカンおよびα２−６−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸を有するグリカンに結合することができる変異体サブチラーゼサイトトキシンＢサブユニットタンパク質が提供される。変異体ＳｕｂＢタンパク質は、アミノ酸配列ＴＴＳＴＥのうちの１つ以上の欠失を有し、α２−３−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸を有するグリカンに結合する能力を失うことなく、α２−６−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸を有するグリカンに結合するこれまでに記載されていない能力を有する。
2020501521.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列ＴＴＳＴＥ（配列番号３）の１つ以上のアミノ酸残基が修飾されているＳｕｂＢのアミノ酸配列を含む単離されたタンパク質またはその断片、バリアントもしくは誘導体であり、前記単離されたタンパク質はα２−３−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸およびα２−６−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸に結合することができる、前記単離されたタンパク質またはその断片、バリアントもしくは誘導体。
【請求項２】
前記ＴＴＳＴＥ（配列番号３）において下線が引かれている残基のうち少なくとも１つの非保存的な置換または欠失を含む、請求項１に記載の単離されたタンパク質または断片、バリアントもしくは誘導体。
【請求項３】
前記ＴＴＳＴＥ（配列番号３）において下線が引かれている残基の欠失を含む、請求項１または２に記載の単離されたタンパク質または断片、バリアントもしくは誘導体。
【請求項４】
前記単離されたタンパク質が配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質または断片、バリアントもしくは誘導体。
【請求項５】
前記ＴＴＳＴＥ（配列番号３）において下線が引かれている残基の欠失をさらに含む、請求項２に記載の単離されたタンパク質または断片、バリアントもしくは誘導体。
【請求項６】
前記ＴＴＳＴＥ（配列番号３）において下線が引かれている残基の欠失を含む、請求項５に記載の単離されたタンパク質。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質ならびにα２−３−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸および／またはα２−６−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸を含むグリカンを含む単離された分子複合体。
【請求項８】
前記α２−３−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸および／またはα２−６−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸を含むグリカンが、腫瘍細胞またはネコ科動物の血液細胞で発現される、請求項７に記載の単離された分子複合体。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質を含む組成物。
【請求項１０】
前記組成物が担体、希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物が１つ以上の検出試薬を含む診断用組成物である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
α２−３−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸および／またはα２−６−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸を検出する方法であって、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質または請求項９もしくは１１に記載の組成物を試料と結合させて前記単離されたタンパク質ならびに前記α２−３−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸および／またはα２−６−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸を含む検出可能な複合体を形成する工程を含む、前記方法。
【請求項１３】
前記α２−３−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸および／またはα２−６−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸が、腫瘍細胞またはネコ科動物の血液細胞で発現される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記α２−３−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸および／またはα２−６−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸が、ヒト投与用の組み換えグリコシル化薬物、抗体および他の治療用生体分子を含む試料または調製物中の混入物である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
α２−３−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸および／またはα２−６−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸を含むグリカンまたは前記グリカンを発現する細胞を検出する方法であって、前記方法は、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質または請求項９もしくは１１に記載の組成物を試料と結合させて前記単離されたタンパク質ならびに前記α２−３−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸および／またはα２−６−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸を含むグリカンを含む複合体を形成する工程；ならびに前記タンパク質または細胞を単離する工程を含む、前記方法。
【請求項１６】
前記細胞が腫瘍細胞またはネコ科動物の血液細胞である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記α２−３−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸および／またはα２−６−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸を含むグリカンが、ヒト投与用の組み換え薬物、抗体および他の治療用生体分子を含む調製物または製剤中の混入物である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
対象のがんを治療する方法であって、前記方法は、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質または請求項９または１０に記載の組成物を前記対象へ投与し、α２−３−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸および／またはα２−６−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸を発現するがん細胞を選択的に標的化する工程を含む、前記方法。
【請求項１９】
前記単離されたタンパク質が細胞傷害剤と結び付いている、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記α２−３−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸および／またはα２−６−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸を発現するがん細胞を殺傷することを含む、請求項１７、１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記対象がヒトである、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質をコードする単離された核酸。
【請求項２３】
請求項２２に記載の単離された核酸を含む遺伝子構築物。
【請求項２４】
請求項２３に記載の遺伝子構築物を含む宿主細胞。
【請求項２５】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質に結合するまたは前記タンパク質に対して生じる抗体または抗体断片。
【請求項２６】
前記アミノ酸配列ＴＴＳＴＥ（配列番号３）において下線が引かれている１つ以上の修飾アミノ酸残基を含むエピトープに結合するまたは前記エピトープに対して生じる請求項２４に記載の抗体または抗体断片。
【請求項２７】
前記アミノ酸配列ＴＴＳＴＥ（配列番号３）において下線が引かれている１つ以上の修飾アミノ酸残基を含むエピトープに結合するまたは前記エピトープに対して生じる請求項２４に記載の抗体または抗体断片。
【請求項２８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離タンパク質、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の組成物、請求項２２に記載の単離された核酸、請求項２３に記載の遺伝子構築物、請求項２４に記載の宿主細胞および／または請求項２６または請求項２７に記載の抗体もしくは抗体を含むキット。
【請求項２９】
請求項１２〜２１のいずれか一項に記載の方法に従った使用のための、請求項２８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細菌の毒素タンパク質に関する。より具体的には、本発明は、α２−３−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸に結合する能力を保持しながらα２−６−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸に結合する能力を有する変異体サブチラーゼサイトトキシンＢサブユニットタンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＡＢ５毒素は２段階の過程でその効果を発揮する：（ｉ）五量体であるＢサブユニットの標的細胞表面上の特定のグリカン受容体への結合；（ｉｉ）ＡＢ５毒素の内在化、続いて、Ａサブユニットを媒介した宿主の必須機能の阻害または破壊、である１。ＡＢ５毒素のＢサブユニットは細胞表面グリカン受容体を認識し、ホロトキシンの内在化および細胞内輸送を指示する。これらのタンパク質−グリカン相互作用の特異性は、宿主の感受性および組織向性を決定するので、発症のために重要である。さらに、ＡＢ５毒素Ｂサブユニットとそれらの同族グリカンとの間の５価相互作用は非常に高い親和性の結合をもたらし、そのため、これらはグリカン検出の強力なリガンドであり、注目すべき例として、病理組織学的切片におけるガングリオシドＧＭ１の検出２および膜中の脂質ラフトの標識３のためのコレラ毒素Ｂサブユニット使用がある。
【０００３】
２００４年に、Ｐａｔｏｎらにより、サブチラーゼサイトトキシン（ＳｕｂＡＢ）と呼ばれるプロトタイプの細菌性ＡＢ５毒素の新しいサブファミリーが発見され、最初の生物学的特徴付けが行われた４。ＳｕｂＡＢの場合、Ａサブユニット（ＳｕｂＡ）は、必須となる小胞体シャペロンＢｉＰ／ＧＲＰ７８にかなり高い特異性を有するサブチラーゼファミリーのセリンプロテアーゼであることが発見された５。構造研究により、大多数のサブチラーゼとは異なり、ＳｕｂＡは活性部位に異常に深い裂け目を有し、そのためにかなり高い基質特異性を有することが分かった５。ＳｕｂＡは、多様な細胞プロセスにおけるＢｉＰの役割を調べるための強力なツールであることが証明されており、がん治療薬としての潜在能力も有する６、７。重要なことに、グリカンアレイ分析によると、毒素のＢサブユニット（ＳｕｂＢ）が、ヒトが合成できないシアル酸である、α２−３−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）を末端に有するグリカンに対してかなり高い結合特異性を有することが分かった８。アレイ上の全てのグリカンのうち、Ｎｅｕ５Ｇｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ−に対して最良の結合が生じた。Ｎｅｕ５ＧｃをＮｅｕ５Ａｃに変更した場合、標識毒素のアレイへの結合は２０倍減少し；Ｎｅｕ５Ｇｃ結合をα２−３からα２−６に変更した場合、３０倍を超えて減少し；シアル酸を除去した場合は１００倍減少した。アレイ上に表された全体的な構造結合パターンにより、ＳｕｂＢは、最後から２番目の部分についてはほとんど区別なく、末端のα２−３−結合Ｎｅｕ５Ｇｃに対して高い親和性を有することを示した。ＳｕｂＢ−Ｎｅｕ５Ｇｃ複合体の結晶構造により、この特異性の原理が明らかになった。Ｎｅｕ５ＧｃをＮｅｕ５Ａｃと区別する、Ｎ−アセチル部分のメチル基上にある付加的なヒドロキシルは、ＳｕｂＢのＴｙｒ７８ＯＨと相互作用し、Ｍｅｔ１０の主鎖と水素結合を形成する８。これらの重要な相互作用はＮｅｕ５Ａｃでは生じることが不可能であり、よって、Ｎｅｕ５Ｇｃへの顕著な偏りにつながる。構造データを用いて、予測される結合ポケット内で重要な残基の変異を誘発すると、グリカン認識、細胞結合および毒性がなくなった。ＳｕｂＢアミノ酸Ｓ１２およびＹ７８は、安定化をもたらす重要な結合をＮｅｕ５Ｇｃと形成する８。Ｓ１２Ａ変異によりグリカン結合は完全に無効となり、Ｎｅｕ５ＧｃをＮｅｕ５Ａｃと区別するＣ１１のＯＨ基との相互作用を妨げるＹ７８Ｆ変異はグリカン結合の９０％の低減をもたらし、変異体ＳｕｂＢタンパク質がＮｅｕ５ＡｃよりもＮｅｕ５Ｇｃを優先することはなくなった８。
【０００４】
ヒトのがんにおける最も顕著な形態の異常グリコシル化は、Ｎｅｕ５Ｇｃで終わるグリカンの発現である。ヒトはＣＭＡＨ遺伝子の不活性化変異のためにＮｅｕ５Ｇｃを合成できないので１３、Ｎｅｕ５Ｇｃは正常な健康なヒト細胞上では有意なレベルで発現されない９−１２。それにもかかわらず、がん患者におけるＮｅｕ５Ｇｃの提示は、Ｎｅｕ５Ｇｃの最も豊富な源である赤身肉および乳製品の食事摂取によるＮｅｕ５Ｇｃ吸収によって説明できることが研究により示唆されている１４。Ｎｅｕ５Ｇｃの存在は、その発現がしばしば侵襲性、転移および腫瘍の悪性度と相関するので、予後上重要である１０。がん細胞上にＮｅｕ５Ｇｃグリカンが優先的に観察されるのは、シアル酸のトランスポーターであるシアリンの発現を誘発し、その結果細胞表面上のＮｅｕ５Ｇｃおよび他のシアル酸の増加につながる、低酸素性腫瘍環境によるものだと少なくとも部分的に説明され得る１５。シアリル抱合体は接着を調節および細胞移動性を促進するため、そのような表面シアリル化の変化は腫瘍細胞のコロニー形成および転移能に影響を及ぼし得る１６。乳がん、卵巣がん、前立腺がん、結腸がん、および肺がんでは、Ｎｅｕ５Ｇｃなどの異常なシアル酸レベルの上昇が観察されている１１、１２。重要なことに、がん細胞へのＮｅｕ５Ｇｃの取り込みは、細胞外空間および細胞内の両方に見られる可溶性糖タンパク質において最も顕著であり、Ｎｅｕ５Ｇｃは、がん細胞から周囲組織へ分泌される糖タンパク質において主要なシアル酸である９。がんにおけるＮｅｕ５Ｇｃの発現は、Ｎｅｕ５Ｇｃに対する異種自己抗体の生産を促進することも知られている１７、１８。これらの抗Ｎｅｕ５Ｇｃ抗体は、ヒト癌腫における新規診断薬、予後診断薬および治療薬のための潜在能力を決定するために調査されている１７。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、α２−３−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸を有するグリカンおよびα２−６−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸を有するグリカンに結合することができる変異体サブチラーゼサイトトキシンＢサブユニットタンパク質（ＳｕｂＢ）に関する。したがって、変異体ＳｕｂＢタンパク質は、α２−３−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸を有するグリカンに結合する能力を失うことなく、α２−６−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸を有するグリカンに結合するこれまでに記載されていない能力を有する。これにより、以前可能であったよりも広い範囲でＮ−グリコリルノイラミン酸含有グリカンを検出および標的化するために使用することができる変異体ＳｕｂＢタンパク質が提供される。
【０００６】
本発明の一態様は、アミノ酸配列ＴＴＳＴＥ（配列番号３）の１つ以上のアミノ酸残基が修飾されているＳｕｂＢのアミノ酸配列を含む単離されたタンパク質を提供し、単離されたタンパク質はα２−３−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸およびα２−６−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸に結合することができる。
【０００７】
一実施形態では、１つ以上の修飾アミノ酸残基はアミノ酸配列ＴＴＳＴＥ（配列番号３）で下線が引かれている。
【０００８】
一実施形態では、下線を引いたアミノ酸の両方が欠失している。
【０００９】
１つの特定の実施形態では、単離されたタンパク質は配列番号１のアミノ酸配列を含む。
【００１０】
別の特定の実施形態では、単離されたタンパク質は、アミノ酸配列ＴＴＳＴＥ（配列番号３）において下線が引かれている１つ以上のアミノ酸残基の欠失を含む。この実施形態の単離されたタンパク質は、適切に、Ｎｅｕ５Ａｃ−α２−６−ｌａｃおよびＮｅｕ５Ａｃ−α２−３−ｌａｃなどのＮｅｕ５Ａｃグリカンに結合することができる。一実施形態では、下線を引いたアミノ酸の両方が欠失している。
【００１１】
この態様では、単離されたタンパク質のバリアント、断片および誘導体も提供される。
【００１２】
本発明の別の態様では、第１の態様の単離されたタンパク質と、α２−３−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸および／またはα２−６−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸を含むグリカンとを含む単離された分子複合体が提供される。
【００１３】
本発明のさらに別の態様では、第１の態様の単離されたタンパク質を含む組成物を提供する。
【００１４】
一実施形態では、組成物は医薬組成物である。
【００１５】
他の実施形態では、組成物は診断用組成物である。
【００１６】
本発明のさらに別の態様では、α２−３−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸および／またはα２−６−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸を検出する方法が提供され、前記方法は、第１の態様の単離されたタンパク質を試料と結合させて、第１の態様の単離されたタンパク質とα２−３−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸および／またはα２−６−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸とを含む検出可能な複合体を形成する工程を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態では、α２−３−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸および／またはα２−６−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸は、腫瘍細胞またはネコ科動物の血液細胞によって発現され得る。
【００１８】
別の実施形態では、α２−３−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸および／またはα２−６−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸は、ヒト投与用の組み換えグリコシル化薬物、抗体および他の治療用生体分子を含む試料または調製物中の混入物であり得る。
【００１９】
本発明の別の態様では、α２−３−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸および／またはα２−６−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸を含むグリカンまたはそのグリカンを発現する細胞を単離する方法が提供され、前記方法は、本明細書で開示される単離されたタンパク質を試料と結合させて、単離されたタンパク質とα２−３−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸および／またはα２−６−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸とを含む複合体を形成する工程；ならびにそのタンパク質または細胞を単離する工程を含む。
【００２０】
いくつかの実施形態において、細胞は腫瘍細胞またはネコ科動物の血液細胞である。
【００２１】
別の実施形態では、α２−３−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸および／またはα２−６−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸は、ヒト投与用の組み換えグリコシル化薬物、抗体および他の治療用生体分子を含む調製物または製剤中の混入物であり得る。
【００２２】
本発明の別の態様では、対象のがんを治療する方法が提供され、前記方法は、第１の態様の単離されたタンパク質または前述の態様の組成物の対象への工程を含み、α２−３−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸および／またはα２−６−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸を発現するがん細胞の選択的な標的化をもたらす。
【００２３】
第１の態様の単離されたタンパク質は適切には細胞傷害剤と結び付いている。
【００２４】
本発明のさらなる態様では、第１の態様の単離されたタンパク質をコードする単離された核酸を提供する。
【００２５】
本発明のさらに別の態様では、第２の態様の単離された核酸を含む遺伝子構築物を提供する。
【００２６】
本発明の別の態様では、上記態様の遺伝子構築物を含む宿主細胞を提供する。
【００２７】
本発明のさらに別の態様は、上記態様の単離されたタンパク質に結合するまたは上記態様の単離されたタンパク質に対して生じる抗体または抗体断片を提供する。
【００２８】
抗体または抗体断片は、適切には、アミノ酸配列ＴＴＳＴＥ（配列番号３）において下線が引かれている１つ以上の修飾アミノ酸残基を含むエピトープに結合する。
【００２９】
本発明の関連した態様では、単離されたタンパク質、単離された核酸、組成物、遺伝子構築物および／または抗体を含むキットを提供し、たとえばα２−３−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸および／またはα２−６−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸の検出、または、α２−３−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸および／またはα２−６−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸を発現する腫瘍細胞の治療的標的化における使用のためであるが、これらに限定されない。
【００３０】
本明細書を通して、特に明記しない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、排他的ではなく包括的に使用されるので、表示される整数または整数群は、１つ以上の他の非表示の整数または整数群を含み得る。
【００３１】
「から本質的になる」とは、本文脈では、単離されたタンパク質または免疫原性断片が、引用されるアミノ酸配列に加えて１、２または３以下のアミノ酸残基を有することを意味する。追加のアミノ酸残基は、引用されるアミノ酸配列のＮ末端および／またはＣ末端に存在し得るが、それらに限定されない。
【００３２】
不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、単数形として解釈されるべきではなく、または、１より上の数または不定冠詞が指す対象が１より多い場合を除外すると解釈されるべきではないことも理解される。たとえば、「ａ」タンパク質は、１つのタンパク質、１つ以上のタンパク質または複数のタンパク質を含む。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１−１】図１は、（Ａ）Ｎｅｕ５Ｇｃα２−３Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ（Ｘ線結晶構造から決定（Ｂｙｒｅｓら、２００８））および（Ｂ）Ｎｅｕ５Ｇｃα２−６Ｇａｌβ１−３Ｇｌｃ（Ｘ線結晶構造でモデル化）との複合体におけるＳｕｂＢの表面図を示す。三糖類は緑色またはシアン色の棒として示されており、赤色および青色の残基はそれぞれ酸素および窒素を表す。
【図１−２】図１−１の続き。
【図２−１】Ｎｅｕ５Ｇｃα２−６Ｇａｌβ１−３Ｇｌｃ（シアンの棒として示される）とモデル化した野生型およびＳｕｂＢ変異体の表面図を示す。変異したＳｕｂＢ残基は灰色の棒で示され、赤色および青色の残基はそれぞれ酸素および窒素を表す。
【図２−２】図２−１の続き。
【図３】ＦＩＴＣで標識したヒトおよびウシ血清に対する操作されたＳｕｂＢのＥＬＩＳＡである。ＥＬＩＳＡプレート上にコーティングしたＳｕｂＢ（Ａ）およびＳｕｂＢΔＳ１０６／ΔＴ１０７（Ｂ）は、ＦＩＴＣで標識したヒトおよびウシ血清タンパク質を捕捉することができた。エラーバーは、二重反復アッセイの平均から＋１ＳＤを示す。
【図４】レクチンオーバーレイアッセイである。ニトロセルロース上に滴下した（１スポットあたりのタンパク質の総量が示されている）ヒトまたはウシＡＧＰの段階希釈物に対するＳｕｂＢΔＳ１０６／ΔＴ１０７の結合である。
【図５−１】ヒトおよびウシのアルファ−１−酸性糖タンパク質トリプシン消化物由来のＮｅｕＡｃおよびＮｅｕＧｃオキソニウムイオンである。（Ａ）ウシアルファ−１−酸性糖タンパク質由来のペプチドＴＦＭＬＡＡＳＷＮ［Ｈｅｘ２ＨｅｘＮＡｃ２ＮｅｕＡｃ１ＮｅｕＧｃ１＋Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２］ＧＴＫに対応するｍ／ｚが１１８３．１６３＋のグリコペプチドイオンおよび（Ｂ）ヒトアルファ−１−酸性糖タンパク質由来のペプチドＱＤＱＣＩＹＮ［Ｈｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ３ＮｅｕＡｃ２＋Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２］ＴＴＹＬＮＶＱＲに対応するｍ／ｚが１１２２．２８４＋のグリコペプチドイオンのＭＳ／ＭＳスペクトルの低質量領域であり、ＮｅｕＡｃに特異的である２７４．１および２９２．１ならびにＮｅｕＧｃに特異的である２９０．１および３０８．１といった、十分に存在するオキソニウムイオンを示す。（Ｃ）ヒトおよびウシのアルファ−１−酸性糖タンパク質トリプシン消化物のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析から得た全ＭＳ／ＭＳスペクトルの合計イオン強度の割合としてのＮｅｕＡｃに特異的およびＮｅｕＧｃに特異的なオキソニウムイオンの強度を示す。（Ｄ）ＭＳ、ＥＬＩＳＡ、Ｂｉａｃｏｒｅおよびドットブロットで使用したヒトおよびウシＡＧＰのタンパク質ゲルである。
【図５−２】図５−１の続き。
【図６】Ｚ−バイオテクのアレイのＳｕｂＢ野生型（ＷＴ）およびＳｕｂＢΔＳ１０６／ΔＴ１０７欠失変異体（２Ｍ）の未加工の画像である。領域Ａ（各サブアレイの上部および右下の３つのスポット）Ｎｅｕ５Ｇｃグリカン。領域Ｂ（各サブアレイの底部）Ｎｅｕ５Ａｃグリカン。領域Ｃ（各サブアレイの右側）対称スポット。
【図７】ＳｕｂＢ  ＷＴとＺ−バイオテクのＮｅｕ５Ａｃ／Ｇｃグリカンアレイとの相互作用である。Ｎｅｕ５Ｇｃグリカンは青色で示され、Ｎｅｕ５Ａｃは赤色で示されている。
【図８】ＳｕｂＢΔＳ１０６／ΔＴ１０７欠失変異体（Ｓｕｂ２Ｍ）とＺ−バイオテクのＮｅｕ５Ａｃ／Ｇｃグリカンアレイとの相互作用である。Ｎｅｕ５Ｇｃグリカンは青色で示され、Ｎｅｕ５Ａｃは赤色で示されている。
【図９−１】Ｚ−バイオテクのアレイ上のグリカンである。
【図９−２】図９−１の続き。
【図１０】ウシＡＧＰと一緒にＳｕｂＢ  ＷＴを１％正常ヒト血清に加えた。
【図１１】ウシＡＧＰと一緒にＳｕｂＢ２Ｍ（ΔＳ１０６／ΔＴ１０７欠失変異体）を１％正常ヒト血清に加えた。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明は、アミノ酸配列ＴＴＳＴＥに１つ以上の修飾アミノ酸残基を有し、α２−３−結合またはα２−６−結合Ｎｅｕ５Ｇｃのいずれかで終わるグリカンに結合することができる、操作された変異体サブチラーゼサイトトキシンＢサブユニット（ＳｕｂＢ）タンパク質に関する。単離されたタンパク質は、特定の腫瘍細胞によって発現され、またネコ科動物のＡ型血液細胞によっても発現されるような、α２−３−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸および／またはα２−６−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸を含むグリカンを検出する方法において使用され得る。そのようなグリカンはまた、薬物および他の生体分子調製物中の混入物であり得る。したがって、本発明の他の態様は、α２−３−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸および／またはα２−６−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸を含むグリカン、または、これらのグリカンを発現する細胞を精製、除去または枯渇させることに関する。本発明のさらなる態様は、特定の腫瘍細胞への抗がん剤の標的化送達のために単離されたタンパク質を治療的に使用することに関する。
【００３５】
本発明の目的において、「単離された」とは、その自然の状態から取り除かれている、または、人間の操作を受けている材料を意味する。単離された材料は、自然の状態で通常付随する成分を部分的、実質的または本質的に含まないまたは枯渇させた状態であり得る。単離された材料は、天然の形態、化学合成の形態または組み換え形態であり得る。いく
つかの実施形態において、単離された材料は、濃縮形態、部分的に精製された形態、または精製された形態であり得る。
【００３６】
本明細書中で使用される場合、「試料」は、より大きな実体を表す任意の画分、一片、部分または一部であり得る。試料は、医薬、薬物、抗体または他の治療用製剤もしくは調製物、または、ヒト、動物もしくは他の生物学的供給源から得られるような生物学的試料であり得る。いくつかの実施形態では、生物学的試料は、限定はされないが、生検、塗抹標本、組織切片または細胞ペレットなどの細胞もしくは組織試料または尿、血清、血漿、脳脊髄液または唾液を含む液体試料であり得る。
【００３７】
一般に本明細書で使用される「組成物」は、単離されたタンパク質、核酸、遺伝子構築物、抗体または他の分子を、限定されないが、水または他の溶媒、塩、緩衝剤および／または安定剤などの１つ以上の他の成分と共に含む。ある特定の実施形態では、「診断用」組成物は、α２−３−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸および／またはα２−６−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸を含むタンパク質の検出を容易にする１つ以上の他の分子成分を含み得る。そのような成分は、以下により詳細に記載されるように、酵素基質、２次抗体、発色試薬、標識および触媒（たとえば、「検出試薬」）を含み得る。他の特定の実施形態において、「医薬」組成物は、以下により詳細に記載されるように、本明細書に開示される単離されたタンパク質の治療的投与を容易にする１つ以上の他の分子成分（たとえば、担体、希釈剤または賦形剤）を含み得る。
【００３８】
「タンパク質」とは、アミノ酸ポリマーを意味する。アミノ酸は、当技術分野でよく理解されているように、天然または非天然アミノ酸、Ｄ−またはＬ−アミノ酸であり得る。「タンパク質」という用語は、典型的には５０個以下のアミノ酸を有するタンパク質を記述するのに使用される「ペプチド」および５０個を超えるアミノ酸を有するタンパク質を記述するのに使用される「ポリペプチド」を含み、包含する。
【００３９】
本明細書で一般的に使用される「グリカン」は、糖タンパク質、糖脂質または他の炭水化物含有高分子であり、そしてペプチドグリカン、糖タンパク質、糖ペプチド、および糖リポタンパク質などと呼ばれ得る分子を含む。特定のグリカンは、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）を含む。グリカンは、α２−３−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸またはα２−６−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸を含み得る。α２−３−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸およびα２−６−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸は適切には末端シアル酸である。例として、α２−３−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸は、Ｎｅｕ５Ｇｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ−におけるような末端シアル酸であり；α２−６−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸は、Ｎｅｕ５Ｇｃα２−６Ｇａｌβ１−３Ｇｌｃ−における末端シアル酸である。
【００４０】
上記から理解されるように、本発明の好ましい態様では、アミノ酸配列ＴＴＳＴＥに１つ以上の修飾アミノ酸残基を有するＳｕｂＢタンパク質のアミノ酸配列を含む単離されたタンパク質を提供し、単離されたタンパク質はα２−３−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸を含むグリカンおよびα２−６−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸を含むグリカンに結合することができる。本発明の関連した態様では、第１の態様の単離されたタンパク質と、α２−３−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸および／またはα２−６−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸を含むグリカンとを含む単離された分子複合体が提供される。
【００４１】
本文脈において、「α２−３−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸およびα２−６−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸に結合することができる」とは、単離されたタンパク質がα２−６−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸グリカンに野生型ＳｕｂＢタンパク質よりも実質的に高い親和性で結合し、一方で、野生型ＳｕｂＢタンパク質に匹敵する親和性でα２
−３−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸グリカンにも結合することを意味する。特定の実施形態では、単離されたタンパク質は、約５〜１５ｎＭ、約７〜１２ｎＭまたは約８〜１０ｎＭの親和性で、α２−６−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸グリカンに結合する。特定の実施形態では、単離されたタンパク質は、約８〜２０ｎＭ、１０〜１８ｎＭまたは約１４〜１６ｎＭの親和性で、α２−３−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸グリカンに結合する。
【００４２】
アミノ酸配列ＴＴＳＴＥは通常野生型ＳｕｂＢタンパク質中に存在する。野生型ＳｕｂＢタンパク質は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含み得る：
【化１】
2020501521.tif 000003
【００４３】
下線を引いた残基は、成熟なＳｕｂＢには存在しないＮ末端領域である。したがって、本明細書で使用される番号付けは、グルタミン酸残基２４から始まる（すなわち、Ｇｌｕ２４＝残基１）。この番号付けを使用して、太字の残基ＴＴＳＴＥ（配列番号３）は「Ｔ１０４−Ｅ１０８ループ」に対応する。α２−６構造の３級糖はＳｕｂＢタンパク質表面に折り返され、ＳｕｂＢ残基Ｔ１０４−Ｅ１０８を含むループと密接に接触することが提案されている。このループは、Ｃ１０３とＣ１０９の間のジスルフィド結合によって安定化される。結果として生じる立体障害は、末端Ｎｅｕ５Ｇｃの結合ポケットへのドッキングを歪め、ＳｕｂＢの最初のグリカンアレイ分析で観察されたα２−６−結合Ｎｅｕ５Ｇｃ構造の結合の著しい低下の理由となる８。ループ中の１つ以上の残基の修飾は、α２−３構造への結合も可能にしながら、α２−６構造への変異体ＳｕｂＢタンパク質の結合を増強する。一般に、ループの「高さ」を減少または低下させるアミノ酸の欠失または置換は、α２−６−結合Ｎｅｕ５Ｇｃ構造への結合を改善するのに有利であり得る。本文脈において、「高さ」は、アミノ酸Ｒ基が３Ｄ空間内でペプチド骨格から突き出るまたは伸びる距離の関数であり得る（たとえば、バリンはロイシンよりも大きい高さを有する）。したがって、一実施形態では、ループのＴＴＳＴＥ（配列番号３）残基の１つ以上の欠失が好ましい（本明細書では「欠失変異体」と呼ぶ）。好ましくは、これらはＴＴＳＴＥ（配列番号３）において下線が引かれている。配列番号２における成熟なＳｕｂＢアミノ酸配列の番号付けに基づいて、残基Ｓ１０６および／またはＴ１０７が欠失されている。特に好ましい実施形態では、残基Ｓ１０６およびＴ１０７が欠失している。
【００４４】
よって、変異体ＳｕｂＢタンパク質の１つの特定の実施形態は、配列番号１のアミノ酸配列を含む：
【化２】
2020501521.tif 000004
【００４５】
別の実施形態では、単離されたタンパク質は、アミノ酸配列ＴＴＳＴＥ（配列番号３）において下線が引かれているアミノ酸残基の欠失を含む。
【００４６】
配列番号２における成熟なＳｕｂＢアミノ酸配列の番号付けに基づいて、残基Ｔ１０７およびＥ１０８が欠失されている。表１からも明らかとなるように、Ｔ１０７およびＥ１０８を欠く単離されたタンパク質「欠失変異体」は、α２−６−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸グリカンに野生型ＳｕｂＢタンパク質よりも実質的に高い親和性で結合し、一方で、α２−３−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸グリカンにも結合する。しかしながら、
Ｓ１０６およびＴ１０７欠失変異体（たとえば、配列番号１）とは対照的に、Ｔ１０７およびＥ１０８欠失変異体は、Ｎｅｕ５Ａｃ−α２−６−ｌａｃおよびＮｅｕ５Ａｃ−α２−３−ｌａｃなどのＮｅｕ５Ａｃグリカンを含むグリカンに広く結合することができる（たとえば表１を参照）。ＷＴ  ＳｕｂＢはＮｅｕ５Ａｃ−α２−６−ｌａｃに検出可能な程度に結合しないことも留意される。したがって、Ｔ１０７およびＥ１０８欠失変異体タンパク質は、α２−６−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸グリカンおよびα２−３−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸グリカンなどのＮｅｕ５ＧｃグリカンならびにＮｅｕ５Ａｃ−α２−６−ｌａｃおよびＮｅｕ５Ａｃ−α２−３−ｌａｃなどのＮｅｕ５Ａｃグリカンを結合または検出するために有用なタンパク質であり得る。
【００４７】
本明細書に開示される単離されたタンパク質のバリアント、断片および誘導体も提供される。単離されたタンパク質のバリアント、断片および誘導体は、適切には、α２−３−結合およびα２−６−結合Ｎｅｕ５Ｇｃで終わるグリカンに結合する能力を保持している。特定の実施形態では、これは、本明細書に開示される単離されたタンパク質の、単離されたタンパク質がα２−３−結合およびα２−６−結合Ｎｅｕ５Ｇｃで終わるグリカンに結合する能力の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。
【００４８】
本明細書で使用されるとき、ペプチド「バリアント」は、本明細書に開示される単離されたタンパク質のアミノ酸配列との配列同一性が少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。本明細書に開示されるペプチド「バリアント」は、異なるアミノ酸が欠失または置換された１つ以上のアミノ酸を有してもよい。当技術分野では、ペプチドの生物学的活性を変化させることなくいくつかのアミノ酸を置換または欠失させることができることがよく理解されている（保存的置換）。
【００４９】
それぞれのタンパク質と核酸との間の配列関係を説明するために本明細書で一般的に使用される用語には、「比較ウィンドウ」、「配列同一性」、「配列同一性のパーセンテージ」および「実質的同一性」が含まれる。それぞれの核酸／タンパク質は、それぞれ、（１）完全な核酸／タンパク質配列のうち核酸／タンパク質が共有する１つ以上の部分のみ、および（２）核酸／タンパク質間で分岐している１つ以上の部分を含み得るため、配列比較は、典型的に「比較ウィンドウ」に対して配列を比較し、配列類似性の局所領域を同定および比較することによって行われる。「比較ウィンドウ」とは、参照配列と比較される、典型的に６、９または１２個の隣接した残基の概念的セグメントを指す。比較ウィンドウは、それぞれの配列の最適なアラインメントに対し、参照配列と比較して約２０％以下の付加または欠失（すなわちギャップ）を含み得る。比較ウィンドウをアラインさせるための配列の最適なアラインメントは、コンピュータ化されたアルゴリズムの実行（参照により本明細書に組み入れられる、Ｇｅｎｅｗｏｒｋｓプログラム、インテリジェネティックス社；ウィスコンシンジェネティクスソフトウェアパッケージリリース７．０のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、ジェネティックスコンピューターグループ、ＵＳＡ、ウィスコンシン州マディソン５７５サイエンスドライブ）または選択された様々な方法のいずれかによってなされた検査および最良のアラインメント（すなわち、比較ウィンドウに対して最も高い割合の相同性をもたらす）によって実行され得る。
【００５０】
配列の類似性および同一性は、一般に、アルゴリズムＧＡＰ（ウィスコンシンパッケージ、アクセルリス社、ＵＳＡ、サンディエゴ）を参照して定義される。ＧＡＰは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用して、一致数を最大化し、ギャップ数を
最小化する２つの完全なシーケンスのアラインメントを行う。一般に、デフォルトパラメータが使用され、ギャップ生成ペナルティ＝１２およびギャップ拡張ペナルティ＝４である。
【００５１】
Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０５−４１０）の方法を使用するＢＬＡＳＴファミリーのアルゴリズム、ｐｓｉ−Ｂｌａｓｔアルゴリズム（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．（１９９７）  ２５  ３３８９−３４０２）、ＦＡＳＴＡ（ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８５：  ２４４４−２４４８の方法を使用）、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７）、またはＴＢＬＡＳＴＮプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）前出）も参照され、一般にデフォルトパラメータを用いる。
【００５２】
配列分析の詳細な議論は、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ）、ＮＹ、１９９５−２０１５）のユニット１９．３に記載されている。
【００５３】
本明細書に記載の関連配列の全長にわたって配列比較を行うことができる。
【００５４】
「配列同一性」という用語は、標準的なアルゴリズムを使用して適切なアラインメントを考慮し、比較ウィンドウに対して配列が同一である度合いを考慮する正確なヌクレオチドまたはアミノ酸の一致の数を含むよう、その最も広い意味で使用される。したがって、「配列同一性のパーセンテージ」は次のように計算される：比較ウィンドウに対して最適にアラインメントされた２つの配列を比較する、同一の核酸塩基（たとえば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）が両者の配列で生じる位置の数を決定して一致した位置の数を求める、一致した位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数（すなわちウィンドウサイズ）で割る、そしてその結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得る。たとえば、「配列同一性」は、ＤＮＡＳＩＳコンピュータプログラム（ウィンドウズ用バージョン２．５；ＵＳＡ、カリフォルニア州サウスサンフランシスコ、日立ソフトウェアエンジニアリング社から入手可能）によって計算された「一致率」を意味すると理解されてもよい。
【００５５】
本発明はまた、本明細書に開示される単離されたペプチドの断片を提供する。いくつかの実施形態では、断片は、本明細書中に開示される単離されたタンパク質のうち１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５個の連続アミノ酸を含んでもよい、または、それらから本質的になり得る、または、それらからなり得る。
【００５６】
本明細書に開示される単離されたペプチドの誘導体も提供される。
【００５７】
本明細書中で使用される場合、「誘導体」タンパク質またはペプチドは、当該分野で理解されるように、たとえば翻訳後修飾（たとえばリン酸化、ユビキチン化、グリコシル化）、化学修飾（たとえば架橋、アセチル化、ビオチン化、酸化還元など）による他の化学部分との抱合または複合体化によって、または、標識（たとえば、蛍光体、酵素、放射性同位体）との抱合、および／または、追加のアミノ酸配列の包含によって、改変されたものである。
【００５８】
これに関して、タンパク質の化学修飾に関するより広範な方法論について、当業者は、「ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＳＣＩＥＮＣＥ」（Ｃｏｌｉｇａｎら編（ジョン・ワイリー・アンド・サンズ、ＮＹ、１９９５−２０１５）の
第１５章を参照する。
【００５９】
追加のアミノ酸配列は、融合タンパク質を作製する融合パートナーのアミノ酸配列を含み得る。例として、融合パートナーのアミノ酸配列は、単離された融合タンパク質の検出および／または精製に役立ち得る。非限定的な例として、金属結合（たとえばポリヒスチジン）融合パートナー、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、プロテインＡ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、蛍光タンパク質配列（たとえばＧＦＰ）、ｍｙｃ、ＦＬＡＧおよびヘマグルチニンタグなどのエピトープタグが挙げられる。
【００６０】
本発明の単離されたペプチド、バリアントおよび／または誘導体は、限定されないが、化学合成および組み換えＤＮＡ技術などの当技術分野において公知の任意の方法によって製造することができる。
【００６１】
化学合成は固相および液相合成を含む。そのような方法は当技術分野において周知であり、「ＳＹＮＴＨＥＴＩＣ  ＶＡＣＣＩＮＥＳ」（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ編（ブラックウェルサイエンスパブリケーションズ（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ））の第９章および「ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＳＣＩＥＮＣＥ」（Ｃｏｌｉｇａｎら編（ジョン・ワイリー・アンド・サンズ、ＵＳＡ、ＮＹ、１９９５−２０１４）の第１５章に記載されているような化学合成技術の例が参照される。これに関して、国際公開ＷＯ９９／０２５５０号および国際公開ＷＯ９７／４５４４４号も参照される。
【００６２】
組み換えタンパク質は、たとえばＳａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（コールド・スプリング・ハーバー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ）、１９８９）、特にセクション１６および１７；ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（Ａｕｓｕｂｅｌら編（ジョン・ワイリー・アンド・サンズ、ＵＳＡ、ＮＹ、１９９５−２０１４）特に第１０章および第１６章；ならびにＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＳＣＩＥＮＣＥ（Ｃｏｌｉｇａｎら編（ジョン・ワイリー・アンド・サンズ、ＵＳＡ、ＮＹ、１９９５−２０１４）、特に第１、５および６章に記載されているような標準的なプロトコルを用いて当業者により都合がいいように調製され得る。
【００６３】
検出、精製および／または治療方法に有用であり得る単離されたタンパク質の「誘導体」の特定の実施形態を、以下に記載する。
【００６４】
本発明の一態様は、α２−３−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸および／またはα２−６−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸を検出する方法を提供し、前記方法は、本明細書に開示される単離されたタンパク質を試料と結合させて第１の態様の単離されたタンパク質と、α２−３−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸および／またはα２−６−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸とを含む検出可能な複合体を形成する工程を含む。
【００６５】
α２−３−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸および／またはα２−６−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸は、腫瘍細胞およびネコ科動物の血液細胞といった特定の血液細胞によって発現されるグリカンの成分であり得る。特定の実施形態において、α２−３−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸および／またはα２−６−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸を含むグリカンは、ヒトのがんによって発現され得、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、結腸がんおよび肺がんにおいて発現の上昇が検出される。他の特定の実施形態では、Ｎ−グリコリルノイラミン酸はネコ科動物の血液型「Ａ」を定義し、Ｎ−アセチルノイラミン酸はネコ科動物の血液型「Ｂ」を定義する。
【００６６】
したがって、単離されたタンパク質は、生検、体液試料、塗抹標本などの患者試料中のα２−３−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸および／またはα２−６−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸を発現する腫瘍細胞の存在を検出するために使用され得る。別の実施形態では、単離されたタンパク質は、ネコ科動物の血液試料中のα２−３−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸および／またはα２−６−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸などを含むＮ−グリコリルノイラミン酸グリカンを発現する血液細胞を検出することによってネコ科動物の血液型分類に使用され得る。
【００６７】
他の実施形態では、α２−３−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸および／またはα２−６−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸を含むグリカンは、ヒト投与用の薬物、抗体または他の治療用生体分子を含む調製物または製剤中に存在し得る。
【００６８】
ヒト投与のための組み換えグリコシル化薬物、抗体および他の治療用生体分子は、非ヒトシアル酸Ｎ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）を合成および／または代謝的に組み込むことができる非ヒト哺乳動物細胞株で生産されることが多い。高レベルの循環抗Ｎｅｕ５Ｇｃ抗体を有するヒトも存在する。例として、臨床的に有効な抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂセツキシマブがＮｅｕ５Ｇｃに共有結合したかもしれない。正常ヒト由来の抗Ｎｅｕ５Ｇｃ抗体は、Ｎｅｕ５Ｇｃに特異的な方法でセツキシマブと相互作用し、インビトロで免疫複合体を生成する。これらの抗体はインビボでセツキシマブ（または他の治療用抗体）のクリアランスを増強し得る。したがって、薬物、抗体および他の治療用生体分子のＮｅｕ５Ｇｃ汚染は、そのような薬物が投与された患者において半減期、有効性および免疫反応に悪影響を及ぼす可能性がある。Ｎｅｕ５Ｇｃ欠損細胞および培地を使用することによってＮｅｕ５Ｇｃ汚染を回避することは可能であり得るが、これは全ての場合において最適な解決策ではない可能性もある。したがって、本発明の特定の実施形態は、ヒト投与用の薬物、抗体または他の治療用生体分子中のα２−３−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸および／またはα２−６−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸の検出を提供する。本発明の他の実施形態は、ヒト投与用の薬物、抗体または他の治療用生体分子からのα２−３−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸および／またはα２−６−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸含有混入物の単離、枯渇または除去を提供する。
【００６９】
したがって、単離されたタンパク質（たとえば、配列番号１のアミノ酸配列を含むなどの本明細書に開示される単離されたタンパク質）またはその断片もしくはバリアントを、α２−３−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸および／またはα２−６−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸の検出を容易にする薬剤と結び付ける、結合する、固定するまたは連結することが有利であり得る。好ましい形態では、単離されたタンパク質は標識と共有結合で結び付いている。
【００７０】
他の実施形態では、α２−３−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸および／またはα２−６−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸を含むグリカンに結合したときに、抗体または抗体断片などの標識２次結合剤を用いて単離されたタンパク質を検出し得る。
【００７１】
上記の実施形態のいずれかに従って、標識は、色素原、触媒、ビオチン、アビジン、ジゴキシゲニン、酵素、蛍光色素、化学発光分子または放射性同位元素を含む群から選択され得るが、これらに限定されない。
【００７２】
蛍光色素分子は、たとえば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、Ａｌｅｘａ染料、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＬ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、テキサスレッド、ＦＡＭ、ＲＯＸ、Ｃｙ５、Ｃｙ３、またはＲ−フィコエリスリン（ＲＰＥ）であり得るがこれらに限定されない。
【００７３】
酵素は、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、β−ガラクトシダーゼまたはグルコースオキシダーゼであり得るが、これらに限定されない。適切な基質には、ジアミノバニジン（ＤＡＢ）、パーマネントレッド、３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸（ＡＢＴＳ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＮＢ）および４−クロロ−１−ナフトール（４−ＣＮ）が挙げられるが、これらに限定されない。化学発光基質の非限定的な例としては、ＨＲＰおよび過酸化水素の存在下で酸化されて励起状態の生成物（３−アミノフタレート）を形成するＬｕｍｉｎｏｌ（商標）が挙げられる。
【００７４】
放射性同位体標識は、１２５Ｉ、１３１Ｉ、５１Ｃｒおよび９９Ｔｃが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７５】
直接的な目視標識の場合には、コロイド状金属または非金属粒子、染料粒子、有機ポリマー、ラテックス粒子、リポソーム、ミニセルまたは信号発生物質を含有する他の小胞などを使用してもよい。
【００７６】
標識された単離されたタンパク質は、組織化学、フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡法およびＥＬＩＳＡ、身体画像化（たとえばＰＥＴスキャン）および核医学などの検出システムにおいて使用され得るが、それらに限定されない。
【００７７】
さらなる態様において、本発明は、グリカンまたはグリカンを発現する細胞を単離する方法を提供し、グリカンは、α２−３−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸および／またはα２−６−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸を含み、前記方法は、本明細書で開示される単離されたタンパク質を試料と結合させて、単離されたタンパク質とα２−３−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸および／またはα２−６−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸とを含む複合体を形成する工程；ならびにそのグリカンまたは細胞を単離する工程を含む。
【００７８】
本文脈において、「単離する」という用語は、好ましくは、α２−３−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸および／またはα２−６−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸を含むグリカン、またはそのグリカンを発現する細胞を精製、濃縮または枯渇もしくは除去することを指す。
【００７９】
いくつかの実施形態において、単離されたタンパク質（たとえば、配列番号１のアミノ酸配列を含む）またはその断片もしくはバリアントは、上記の通り標識と結び付いており、これにより、α２−３−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸および／またはα２−６−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸を含むグリカンまたはそのグリカンを発現する細胞の検出が容易になる。非限定的な例としては、腫瘍細胞またはネコ科動物の血液細胞のフローサイトメトリー選別を容易にする蛍光標識（上記のようなもの）が挙げられる。
【００８０】
別の実施形態では、本明細書に開示される単離されたタンパク質またはその断片もしくはバリアントは、α２−３−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸および／またはα２−６−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸を含むグリカンまたはそのグリカンを発現する細胞の単離、濃縮、精製、枯渇または除去を容易にする基質に結び付いていてもよく、または、結合、固定、連結していてもよい。
【００８１】
本明細書に開示される単離されたタンパク質またはその断片もしくはバリアントは、ビーズ、マトリックス、架橋ポリマー、ゲル、粒子、表面または他の固体もしくは半固体であり得る基質に結び付いていてもよく、または、結合、固定、連結していてもよい。特定
の実施形態では基質は、セファロース、アガロース、プロテインＡ、プロテインＧ、磁気ビーズ、常磁性粒子、またはセンサーチップ表面（たとえば、ＢＩＡＣｏｒｅまたは表面プラズモン共鳴用）であってよく、または、それらを含んでよい。適切には、試料は、α２−３−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸および／またはα２−６−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸を含み得るもしくは含むと疑われ得る分子の混合物またはその分子を発現する細胞を含み得る。
【００８２】
特定の実施形態では、基質に結び付ついた、結合した、固定されたまたは連結された本明細書に開示される単離されたタンパク質またはその断片もしくはバリアントは、クロマトグラフィー（たとえばアフィニティークロマトグラフィー）、磁気ビーズ除去またはα２−３−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸および／またはα２−６−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸を含むグリカンまたはそのグリカンを発現する細胞の単離、濃縮、精製、枯渇または除去を容易にする他の技術に適し得る。
【００８３】
特定の実施形態では、α２−３−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸および／またはα２−６−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸は、試料中の混入物として存在し得、それによって、単離されたタンパク質とα２−３−結合Ｎ−グリコシルノイミン酸および／またはα２−６−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸との間で形成される複合体は、試料から混入物を除去する。特定の例は、前述のように、ヒト投与用の組み換えグリコシル化薬物、抗体および他の治療用生体分子を含む調製物または製剤である。
【００８４】
たとえば配列番号１のアミノ酸配列を含む本明細書に開示される単離されたタンパク質またはその断片、バリアントもしくは誘導体は、α２−３−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸および／またはα２−６−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸を含むグリカンを発現する腫瘍細胞への抗がん化合物の標的化送達に適し得る。α２−３−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸および／またはα２−６−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸の両方に結合する能力は、本発明が野生型ＳｕｂＢタンパク質を用いて提供され得るよりはるかに有効な標的化送達システムを提供することを意味する。
【００８５】
したがって、本発明のさらなる態様では、対象のがんを治療する方法が提供され、前記方法は、本明細書に記載の単離されたタンパク質または組成物の対象へ投与し、α２−３−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸および／またはα２−６−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸を発現するがん細胞を選択的に標的化する工程を含む。
【００８６】
上記のように、α２−３−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸および／またはα２−６−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸を含むグリカンを発現する腫瘍細胞もいくつか存在するが、正常な細胞は通常これらの糖を発現しない。特定の実施形態において、α２−３−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸および／またはα２−６−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸を含むグリカンは、ヒト癌腫によって発現され得、限定はされないが、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、結腸がんおよび肺がんにおいて発現の上昇が検出される。
【００８７】
一実施形態では、単離されたタンパク質は、α２−３−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸および／またはα２−６−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸を発現する腫瘍細胞への結合および殺傷または無力化を促進する細胞傷害剤に結び付いていてよく、または、結合、固定、連結していてよい。
【００８８】
細胞傷害剤は、放射性核種、化学療法剤、突然変異誘発物質、毒素、有糸分裂阻害剤または他の抗増殖剤、アポトーシス促進剤、ＤＮＡ挿入剤または腫瘍細胞の殺傷または無力化を助長または引き起こす他の任意の薬剤であり得る。
【００８９】
放射性核種の非限定的な例としては２１１Ａｔ、２１２Ｂ１、２１３Ｂｉ、１２５Ｉ、１１１Ｉｎ、９０Ｙｔ、１９３Ｐｔ、１７７Ｌｕ、１３４Ｅｕおよび６７Ｇａが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９０】
化学療法剤、突然変異誘発物質、毒素、有糸分裂阻害剤、アポトーシス促進剤およびＤＮＡ挿入剤は、ドキソルビシン、Ｎ−アセチル−γ−カリケアマイシン、メイタンシノイド、タキソイド、アウリスタチンおよびデュオカルマイシンを含み得るが、これらに限定されない。化学療法薬、突然変異誘発物質、毒素、有糸分裂阻害剤、アポトーシス促進剤およびＤＮＡ挿入剤は、切断可能なまたは切断不可能なリンカーによって単離されたタンパク質と結び付き、切断可能な抱合体を形成してもよい。典型的には、切断可能な抱合体は、腫瘍細胞によって内在化され、切断可能なリンカーが切断されて薬物を細胞内に放出する。切断不可能なリンカーの場合は、薬物が完全に標的腫瘍細胞に局在し、標的腫瘍細胞から隣接する細胞、組織または体液への薬物の「漏出」がないことが必須である場合に好まれ得る。いくつかの実施形態では、化学療法薬、突然変異誘発物質、毒素、有糸分裂阻害剤、アポトーシス促進剤およびＤＮＡ挿入剤は、標的腫瘍細胞内の内在化時に活性化されるプロドラッグの形態であり得る。
【００９１】
治療的使用に関する実施形態において、単離されたタンパク質（たとえば、配列番号１のアミノ酸配列を含む）またはその断片もしくはバリアントは医薬組成物として投与され得る。
【００９２】
適切には、医薬組成物は薬剤的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む。
【００９３】
「薬剤的に許容される担体、希釈剤または賦形剤」とは、全身投与に安全に使用することができる固体または液体の充填剤、希釈剤またはカプセル化物質を意味する。特定の投与経路に応じて、当技術分野において周知の様々な担体を使用することができる。これらの担体は、糖、デンプン、セルロースおよびその誘導体、麦芽、ゼラチン、タルク、硫酸カルシウム、リポソームおよび他の脂質系担体、植物油、合成油、ポリオール、アルギン酸、リン酸緩衝液、乳化剤、等張食塩水および塩酸塩、臭化物塩および硫酸塩を含む鉱酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩およびマロン酸塩を含む有機酸といった塩ならびに発熱物質を含まない水を含む群から選択され得る。
【００９４】
薬剤的に許容される担体、希釈剤および賦形剤を記載する有用な参考文献としてＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（マックパブリッシング（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．）、ＵＳＡ、Ｎ．Ｊ．、１９９１）があり、参照により本明細書に組み込まれる。
【００９５】
本発明の組成物を患者に提供するために任意の安全な投与経路を使用され得る。たとえば、経口、直腸、非経口、舌下、口腔内、静脈内、関節内、筋肉内、皮内、皮下、吸入、眼内、腹腔内、脳室内、経皮などが使用され得る。筋肉内および皮下注射は、たとえば、免疫療法用組成物、タンパク性ワクチンおよび核酸ワクチンの投与に適している。
【００９６】
剤形としては、タブレット、分散剤、懸濁剤、注射剤、溶液、シロップ、トローチ、カプセル、坐剤、エアロゾル、経皮パッチなどが挙げられる。これらの剤形はまた、この目的のために特別に設計された徐放性デバイスの注射もしくは移植、または、この様式でさらに作用するように改変された他の移植形態を含み得る。治療薬の徐放は、たとえば、アクリル樹脂、ワックス、高級脂肪族アルコール、ポリ乳酸およびポリグリコール酸ならびにヒドロキシプロピルメチルセルロースのような特定のセルロース誘導体を含む疎水性ポリマーで治療薬をコーティングすることによって達成することができる。さらに、徐放は、他のポリマーマトリックス、リポソームおよび／またはマイクロスフェアを使用するこ
とによってもたらされ得る。
【００９７】
経口または非経口投与に適した本発明の組成物は、粉末もしくは顆粒または溶液もしくは水性液体、非水性液体、水中油型エマルジョンまたは油中水型液体エマルジョン中の懸濁液としてそれぞれ所定量の本発明の１つ以上の治療薬を含有するカプセル剤、小袋またはタブレットなどの個別の単位として提供され得る。そのような組成物は、任意の製薬方法によって調製することができるが、すべての方法は、１つ以上の必要な成分を構成する担体と１つ以上の上記薬剤を組み合わせる工程を含む。一般に、組成物は、本発明の薬剤を液体担体もしくは微粉化した固体担体または両方と均一かつ密接に混合し、次いで必要ならば生成物を所望の形状に成形することにより製造される。
【００９８】
上記組成物は、投与製剤に適合する方法で、薬剤的に有効である量で投与され得る。本発明の文脈において、患者に投与される用量は、適切な期間にわたって患者に有益な反応をもたらすのに十分であるべきである。投与されるべき薬剤の量は、年齢、性別、体重および一般的な健康状態、施術者の判断に左右される要因といった、治療されるべき対象によって変わり得る。
【００９９】
本発明の別の態様は、本明細書に開示される単離されたタンパク質に結合する抗体または抗体断片を提供する。適切には、抗体または抗体断片は、野生型ＳｕｂＢタンパク質（配列番号２のアミノ酸配列を含むなど）に結合しない、または、本明細書に開示される単離されたタンパク質（たとえば、配列番号１のアミノ酸配列を含む）に結合する親和性よりも少なくとも５または１０倍低い親和性で結合する。適切には、抗体または抗体断片は、アミノ酸配列ＴＴＳＴＥに１つ以上の修飾アミノ酸残基を含む配列番号１のエピトープに結合する。
【０１００】
本明細書中で使用される「抗体」は免疫グロブリンである、または、免疫グロブリンを含む。「免疫グロブリン」という用語は、免疫グロブリンアイソタイプＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＧおよびＩｇＥならびにそれらの抗原結合断片といった、哺乳動物免疫グロブリン遺伝子複合体の任意の抗原結合タンパク質生成物を含む。「免疫グロブリン」という用語には、天然に存在するか人間の介入で（たとえば組み換えＤＮＡ技術によって）生産されるかにかかわらず、キメラもしくはヒト化した免疫グロブリンまたは改変またはバリアントアミノ酸残基、配列および／またはグリコシル化を含む免疫グロブリンが含まれる。
【０１０１】
抗体断片には、限定はされないが、ＦａｂおよびＦａｂ’２断片、二特異性抗体および単鎖抗体断片（たとえばｓｃＶ）が含まれる。典型的には、抗体は、それぞれＣＤＲ１、２および３のアミノ酸配列をそれぞれ含む各軽鎖および重鎖可変領域を含む。抗体または抗体断片は、ＣＤＲ１、２および／または３のアミノ酸配列の少なくとも一部を含み得る。好ましい抗体断片は、少なくとも１つの全軽鎖可変領域ＣＤＲおよび／または少なくとも１つの全重鎖可変領域ＣＤＲを含む。
【０１０２】
抗体および抗体断片は、ポリクローナルまたは好ましくはモノクローナルであり得る。モノクローナル抗体は、たとえば、Ｋoｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６、４９５の論文に記載されているような標準的な方法、または、たとえばＣｏｌｉｇａｎら、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ第２章に記載されているようなより最近の改変が加わった方法により、単離されたタンパク質（たとえば、配列番号１のアミノ酸配列を含む）またはその断片もしくはバリアントを接種した生産種由来の脾臓または他の抗体産生細胞を不死化することによって生産され得る。また、抗体は、抗体または抗体断片をコードする核酸を適切な宿主細胞中で発現させることによって、組み換え合成抗体または抗体断片として生産され得ることもまた理解
される。組み換え合成抗体または抗体断片の重鎖および軽鎖は、同じ宿主細胞中で異なる発現ベクターから同時発現されてもよく、または、宿主細胞中で単鎖抗体として発現されてもよい。組み換え抗体の発現および選択技術の非限定的な例が、Ｃｏｌｉｇａｎら、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（前出）およびＺｕｂｅｒｂｕｈｌｅｒら、２００９、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ２２  １６９に提供されている。
【０１０３】
抗体および抗体断片は、「外来」抗体に対する有害な免疫応答を誘発することなく、１つの種に他の種で生産されたまたは他の種に由来する抗体および抗体断片が投与可能であるように改変され得る。ヒトに関しては、これは他の種で生産された、または、他の種に由来する抗体の「ヒト化」である。そのような方法は当技術分野において周知であり、一般に、ヒト抗体のスキャフォールドまたは骨格上への非ヒト抗体相補性決定領域（ＣＤＲ）の組み換え「移植」を含む。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、抗体または抗体断片は標識が付けられている。標識は上記の通りであり得る。
【０１０５】
本発明はまた、本明細書に開示される単離されたタンパク質またはその断片もしくはバリアントをコードする単離された核酸も提供する。一実施形態では、単離された核酸は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む単離されたタンパク質、またはその断片もしくはバリアントをコードする。
【０１０６】
本明細書で使用される「核酸」という用語は、１本鎖または２本鎖のＤＮＡおよびＲＮＡを指す。ＤＮＡはゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡを含む。ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｃＲＮＡおよび自己触媒性ＲＮＡを含む。核酸はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドでもあり得る。核酸は、典型的にはＡ、Ｇ、Ｃ、ＴまたはＵ塩基を含むヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む。しかしながら、ヌクレオチド配列は、イノシン、メチルシトシン、メチルイノシン、メチルアデノシンおよび／またはチオウリジンのような他の塩基を含み得るが、それらに限定されない。
【０１０７】
単離された核酸のバリアントも企図される。
【０１０８】
一実施形態では、核酸バリアントは、配列番号１をコードするヌクレオチド配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のヌクレオチド配列同一性を有し得る。
【０１０９】
別の実施形態では、核酸バリアントは、高ストリンジェントな条件下で配列番号１をコードするヌクレオチド配列にハイブリダイズし得る。
【０１１０】
高ストリンジェントな条件は、Ａｕｓｕｂｅｌら、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（ジョン・ワイリー・アンド・サンズ、ＮＹ、１９９５−２０１５）の第２．９章および第２．１０章、特に２．９．１から２．９．２０ページに記載されているような、当該分野で周知である。
【０１１１】
一般に、ストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄中の１つ以上の因子の濃度に依存する。そのような因子としては、当技術分野でよく理解されているように、イオン強度、洗剤の種類および／または濃度、温度、時間、変性剤の種類および／または濃度が挙げられる。
高ストリンジェントな条件の具体的および非限定的な例には、以下のものが含まれる：
（ｉ）４２℃でのハイブリダイゼーションにおいては少なくとも約３１％ｖ／ｖから少
なくとも約５０％ｖ／ｖのホルムアミドおよび少なくとも約０．０１Ｍから少なくとも約０．１５Ｍの塩、ならびに、４２℃での洗浄に対して少なくとも約０．０１Ｍから少なくとも約０．１５Ｍの塩；
（ｉｉ）６５℃でのハイブリダイゼーションにおいては１％ＢＳＡ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ＭのＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、７％ＳＤＳ、および、６５℃を超える温度で約１時間の洗浄に対して（ａ）０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ；または（ｂ）０．５％ＢＳＡ、１ｍＭのＥＤＴＡ、４０ｍＭのＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、１％ＳＤＳ；ならびに、
（ｉｉｉ）６８℃以上で約２０分間の洗浄においては０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ。
【０１１２】
一般に、洗浄はＴｍ＝６９．３＋０．４１（Ｇ＋Ｃ）％−１２℃で行われる。一般に、２本鎖ＤＮＡのＴｍは、ミスマッチ塩基数が１％増加するごとに約１℃低下する。
【０１１３】
一態様では、単離された核酸は、１つ以上の他の遺伝的構成要素に機能的に連結または結合された単離された核酸を含む遺伝子構築物中にある。遺伝子構築物は、単離された核酸の治療的送達または宿主細胞における組み換えタンパク質産生に適し得る。
【０１１４】
おおまかに言えば、遺伝子構築物は、当技術分野においてよく理解されているように、プラスミド、バクテリオファージ、コスミド、酵母または細菌人工染色体の形態であるか、またはそれらの遺伝成分を含む。遺伝子構築物は、組み換えＤＮＡ技術による操作および／または本発明の核酸もしくはコードされたタンパク質の発現のために、細菌または他の宿主細胞に単離された核酸を維持および増殖させるのに適し得る。
【０１１５】
宿主細胞発現を目的とし、遺伝子構築物は発現構築物である。適切には、発現構築物は、発現ベクター中の１つ以上の追加配列に機能的に連結された本発明の核酸を含む。「発現ベクター」は、プラスミドのような自己複製染色体外ベクターまたは宿主ゲノムに組み込まれるベクターのいずれかであり得る。
【０１１６】
「機能的に連結」とは、前記追加ヌクレオチド配列が、好ましくは転写を開始、制御または調節するよう本発明の核酸に対して位置付けられることを意味する。
【０１１７】
制御ヌクレオチド配列は一般に発現に使用される宿主細胞に適切となる。様々な宿主細胞について、多数の種類の適切な発現ベクターおよび適切な制御配列が当技術分野において公知である。
【０１１８】
典型的には、前記１つ以上の制御ヌクレオチド配列は、プロモーター配列、リーダーまたはシグナル配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、転写開始および終結配列、翻訳開始および終結配列、ならびにエンハンサーまたはアクチベーター配列を含み得るがこれらに限定されない。
【０１１９】
当技術分野において公知の構成的プロモーター、抑制性プロモーターまたは誘導性プロモーターが本発明によって企図される。
【０１２０】
発現構築物はまた、上記のように、組み換えタンパク質が融合タンパク質として発現されるように、融合パートナーをコードする追加ヌクレオチド配列（典型的には発現ベクターによって提供される）を含み得る。
【０１２１】
発現構築物はまた、ａｍｐＲ、ｎｅｏＲまたはｋａｎＲのような選択マーカーをコードする追加ヌクレオチド配列を含み得るが、これらに限定されない。
【０１２２】
創傷または対象への単離された核酸の送達に関する特定の実施形態では、発現構築物は、プラスミドＤＮＡの形態であり得、適切には動物細胞中で作動可能なプロモーター（たとえばＣＭＶ、αＡクリスタリンまたはＳＶ４０プロモーター）を含む。他の実施形態において、核酸は、アデノウイルス、ワクシニア、レンチウイルスまたはアデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルス構築物の形態であり得る。
【０１２３】
さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載の核酸分子または遺伝子構築物で形質転換した宿主細胞を提供する。
【０１２４】
発現に適した宿主細胞は原核生物または真核生物であり得る。たとえば、適切な宿主細胞としては、限定されないが哺乳動物細胞（たとえば、ＨｅＬａ、Ｃｏｓ、ＮＩＨ−３Ｔ３、ＨＥＫ２９３Ｔ、Ｊｕｒｋａｔ細胞）、酵母細胞（たとえば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、バキュロウイルス発現システムと一緒にもしくはバキュロウイルス発現システムなしで使用される昆虫細胞（たとえば、Ｓｆ９、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）、植物細胞（たとえば、クラミドモナス・レインハルディ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）、フェオダクチラム  トリコルナータム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ））または大腸菌などの細菌細胞が挙げられる。遺伝子構築物の宿主細胞への導入（原核生物であろうと真核生物であろうと）は、たとえば、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ．１９９５−２０１５）、特に第９章および第１６章に記載されている。
【０１２５】
本発明の関連した態様では、単離されたタンパク質、単離された核酸、遺伝子構築物および／または抗体を含むキットを提供し、たとえば、単離されたタンパク質の発現、α２−３−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸および／またはα２−６−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸の検出、または、α２−３−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸および／またはα２−６−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸を発現する腫瘍細胞の治療的標的化における使用のためであるが、これに限定されない。
【０１２６】
例として、α２−３−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸および／またはα２−６−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸を検出するためのキットは、標識されていてもされていなくてもよい単離されたタンパク質、任意で、単離されたタンパク質に結合する抗体といった標識２次結合剤、任意でＡＰまたはＨＲＰのような酵素のための１つ以上の基質、ならびに、使用説明書を含み得る。
【０１２７】
別の例では、単離されたタンパク質の発現用キットは、単離されたタンパク質をコードする遺伝子構築物、単離されたタンパク質のトランスフェクションおよび発現に適した宿主細胞、ならびに使用説明書を含み得る。
【０１２８】
本発明が容易に理解されそして実用的な効果がもたらされるように、以下の非限定的な実施例を参照する。
【実施例】
【０１２９】
序論
すでに公知のがんへの関与および通常の非がん性ヒト組織における低レベルを踏まえ、血清中および組織中に多量のＮｅｕ５Ｇｃが検出される場合は異常と考えられ、腫瘍の存在の指標となるであろう。これにより、Ｎｅｕ５Ｇｃに対するＳｕｂＢの特異性を利用して、一連のがんに対するハイスループット診断スクリーニング試験を開発する可能性が生
まれる。しかしながら、α２−６−結合Ｎｅｕ５Ｇｃに対する親和性が乏しいことは、そのような試験の感度に影響を及ぼし得る。本研究では、両方のタイプの構造を高い親和性で認識する能力を有するＳｕｂＢ変異体を設計することを目的に、ＳｕｂＢと、α２−３−結合またはα２−６−結合の、Ｎｅｕ５Ｇｃで終わるグリカンとの相互作用を検討した。
【０１３０】
結果
ＳｕｂＢのグリカン結合部位の構造誘導変異
α２−３−結合構造に対する偏りの分子的基礎を理解するために、我々はＳｕｂＢとＮｅｕ５Ｇｃα２−３Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ（Ｘ線結晶解析により決定）とＮｅｕ５Ｇｃα２−６Ｇａｌβ１−３Ｇｌｃとの相互作用を比較した（図１）。前に報告されたように８、前者のグリカンのサブ末端糖が溶媒中に自由に広がるのに対して、α２−６構造の３級糖はＳｕｂＢ表面に折り返され、ＳｕｂＢ残基Ｔ１０４−Ｅ１０８を含むループと密接に接触する。このループは、Ｃ１０３とＣ１０９の間のジスルフィド結合によって安定化される。結果として生じる立体障害は、末端Ｎｅｕ５Ｇｃの結合ポケットへのドッキングを歪め、最初のグリカンアレイ分析で観察されたα２−６−結合Ｎｅｕ５Ｇｃ構造の結合の著しい低下の理由となる。
【０１３１】
α２−６−結合シアル酸は結腸がんの一般的なマーカーであり１９、２０、一連のがんの予後に関連するので２１、本発明者らは分子工学を用いてＴ１０４−Ｅ１０８ループの高さを減少させるための一連の置換または欠失変異体を設計することによりＳｕｂＢへのα２−６−結合Ｎｅｕ５Ｇｃ構造の結合を改善した。図２に示すように、これらのＳｕｂＢ変異体とＮｅｕ５Ｇｃα２−６Ｇａｌβ１−３Ｇｌｃとの相互作用をモデル化し、α２−３−結合Ｎｅｕ５Ｇｃ結合に有意な影響を与えずにα２−６−結合Ｎｅｕ５Ｇｃの認識が向上すると予測した。次に、組み換えｓｕｂＢ遺伝子を構築し、Ｃ末端がＨｉｓ６でタグ付けされた融合タンパク質として様々なタンパク質を組み換え大腸菌から発現および精製した（方法参照）。単一または二重アミノ酸置換を有するＳｕｂＢタンパク質（Ｔ１０７ＡおよびＳ１０６Ａ／Ｔ１０７Ａ）、二重欠失変異体（ΔＳ１０６／ΔＴ１０７）および三重変異体（ΔＳ１０６／ΔＴ１０７／Ｅ１０８Ｄ）の精製に成功した。
【０１３２】
操作されたＳｕｂＢ変異体の表面プラズモン共鳴
次いで、精製したＳｕｂＢおよび種々の変異誘導体をＢｉａｃｏｒｅチップ上に固定化し、そして一連のＮｅｕ５ＡｃまたはＮｅｕ５Ｇｃ末端構造（遊離シアル酸、シアル酸−α２−３−ラクトースおよびシアル酸−α２−６−ラクトース）に対する結合親和性ならびにヒトおよびウシのα１−酸性糖タンパク質（ＡＧＰ）に対する結合親和性について表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて試験した（表１）。ヒトＡＧＰグリカンはＮｅｕ５Ａｃを含み２２、２３、ウシＡＧＰグリカンはＮｅｕ５ＡｃとＮｅｕ５Ｇｃの両方を含む２３。ＭＳ糖タンパク質分析（図５）を行い、ＳＰＲ研究に使用されたヒトおよびウシのＡＧＰにおけるＮｅｕ５ＡｃおよびＮｅｕ５Ｇｃ分布を確認した。グリカンアレイの結果から予測されるように、野生型ＳｕｂＢは、α２−３−結合Ｎｅｕ５Ｇｃ−ラクトースおよび遊離Ｎｅｕ５Ｇｃに対して高い親和性を有することが見出され、ナノモルレベルの結合親和性が観察された。α２−６−結合Ｎｅｕ５Ｇｃ−ラクトースでは結合は観察されず（最大濃度２５μＭまで試験）、α２−３−結合Ｎｅｕ５Ａｃでは２．２μＭの親和性が観察され、これは、同等のＮｅｕ５Ｇｃ構造と比較して３００倍超の結合の減少である。野生型ＳｕｂＢはまた、ウシＡＧＰと比較してヒトＡＧＰに対し、結合親和性が１３倍減少した。ＳｕｂＢＴ１０７Ａにおける変異は、野生型タンパク質と比較して、試験した構造のいずれへの結合にも有意な影響を及ぼさなかった。ＳｕｂＢＳ１０６Ａ／Ｔ１０７Ａはα２−６−結合構造への結合を改善したが、この改善はＮｅｕ５ＡｃとＮｅｕ５Ｇｃの両方で見られた。試験した全ての結合した糖について観察されたナノモル範囲の親和性は、ＳｕｂＢＳ１０６Ａ／Ｔ１０７Ａが優れた万能のシアル酸認識レクチンであることを明
らかにしている。ＳｕｂＢΔＳ１０６／ΔＴ１０７／Ｅ１０８Ｄ変異体は、α２−６−結合型Ｎｅｕ５Ａｃ構造への結合を変えることなくα２−６−結合型Ｎｅｕ５Ｇｃの認識を改善した。しかしながら、α２−３−結合Ｎｅｕ５Ａｃとα２−３−結合Ｎｅｕ５Ｇｃとの間の親和性の差は、野生型について観察された３００倍と比較すると５０倍まで減少した。ＳｕｂＢΔＳ１０６／ΔＴ１０７変異体は、野生型タンパク質と比較してＮｅｕ５Ｇｃ対Ｎｅｕ５Ａｃ識別が有意に改善され、２つの構造間で結合親和性の有意差なくα２−３−結合Ｎｅｕ５Ｇｃおよびα２−６−結合Ｎｅｕ５Ｇｃに結合する能力を有していた（それぞれ１５．３ｎＭ対８．５ｎＭ；Ｐ＝０．１２）。このように、ＳｕｂＢΔＳ１０６／ΔＴ１０７は、Ｎｅｕ５Ｇｃ対Ｎｅｕ５Ａｃ識別の増強ならびにα２−３−およびα２−６−結合Ｎｅｕ５Ｇｃ構造の両方を認識する能力という最適な組み合わせを示した。ＳｕｂＢΔＴ１０７／ΔＥ１０８欠失変異体は、野生型ＳｕｂＢタンパク質よりも実質的に高い親和性でα２−６−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸グリカンに結合し、同時にα２−３−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸グリカンにも結合した。しかしながら、ＳｕｂＢΔＳ１０６／ΔＴ１０７とは対照的に、ＳｕｂＢΔＴ１０７／ΔＥ１０８は、野生型ＳｕｂＢまたはＳｕｂＢΔＳ１０６／ΔＴ１０７のいずれも検出可能には結合しないＮｅｕ５Ａｃ−α２−６−ｌａｃなどのＮｅｕ５Ａｃグリカンに広く結合できる。
【０１３３】
ニワトリで産生された抗Ｎｅｕ５Ｇｃ抗体を対照として使用し、試験したいずれのＳｕｂＢタンパク質よりもＮｅｕ５Ｇｃ含有グリカンに対してより低い選択性およびより低い親和性を示した。
【０１３４】
野生型ＳｕｂＢ、ＳｕｂＢＳ１０６Ａ／Ｔ１０７ＡおよびＳｕｂＢΔＳ１０６／ΔＴ１０７のグリカンアレイ分析
好ましいＮｅｕ５Ｇｃに特異的なＳｕｂＢΔＳ１０６／ΔＴ１０７変異が非シアル化構造に対する特異性をもたらしたかどうかを評価するため（ＳＰＲ分析ではカバーされていない）、ＳｕｂＢ野生型、ＳｕｂＢΔＳ１０６／ΔＴ１０７およびＳｕｂＢＳ１０６Ａ／Ｔ１０７Ａ変異体についてグリカンアレイ分析を実施した（表４）。野生型ＳｕｂＢは、グリカンアレイ上の４０２個の構造のうち４個のみに有意な結合を示した；Ｎｅｕ５Ｇｃα２−３Ｇａｌ、Ｎｅｕ５Ｇｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ、および２つのＮｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ末端構造。これは、以前に公表されたＳｕｂＢ８のグリカンアレイ分析と一致している（ｗｗｗ．ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｇｌｙｃｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ／ｇｌｙｃｏｍｉｃｓ／ＨＳｅｒｖｌｅｔ？ｏｐｅｒａｔｉｏｎ＝ｖｉｅｗ＆ｓｉｄｅＭｅｎｕ＝ｎｏ＆ｐｓＩｄ＝ｐｒｉｍｓｃｒｅｅｎ＿１５７９＃）。ＳｕｂＢΔＳ１０６／ΔＴ１０７のみがアレイ上の４つの構造に対して有意な結合を示した。これらはＮｅｕ５Ｇｃα２−３ＧａｌまたはＮｅｕ５Ｇｃα２−６Ｇａｌで終わる構造に限られていた。ＳｕｂＢＳ１０６Ａ／Ｔ１０７Ａは、Ｎｅｕ５ＧｃおよびＮｅｕ５Ａｃを含む構造を有するアレイ上で合計１８個のグリカンに結合した。グリコサミノグリカンを含む硫酸化構造（ヘパリンおよびコンドロイチン−６−サルフェート）および硫酸化ラクトサミン構造も認識した（表４）。ＳｕｂＢＳ１０６Ａ／Ｔ１０７Ａはまた、アレイ上の負に荷電している単糖範囲（Ｎｅｕ５Ａｃ、Ｎｅｕ５Ｇｃ、９−ＮＡｃ−Ｎｅｕ５Ａｃ、３−Ｏ−Ｓｕ−ＧｌｃＮＡｃ）も認識した。
【０１３５】
ヒトおよびウシタンパク質／血清に対する操作されたＳｕｂＢのＥＬＩＳＡ
生物学的試料中のＮｅｕ５Ｇｃの存在を検出する操作された変異体の能力を評価するために、ＥＬＩＳＡアッセイを実施した。ＳｕｂＢの段階希釈物でコーティングした皿を用いて、ヒトおよびウシ由来の標識血清タンパク質を試験した。ウシ由来のＮｅｕ５Ｇｃ含有血清タンパク質の分別認識において、ＳｕｂＢΔＳ１０６／ΔＴ１０７で２倍の改善が同定された（図３）。
【０１３６】
ヒト対ウシＡＧＰの検出
ヒトとウシのＡＧＰを区別する能力（ウシのＡＧＰのみが有意なレベルのＮｅｕ５Ｇｃ末端グリカンを示す）を独立して検証するために、段階希釈糖タンパク質をニトロセルロースフィルター上に滴下し、洗浄およびブロッキング後、フィルターを精製ビオチン化ＳｕｂＢΔＳ１０６／ΔＴ１０７で覆った。次いで、結合レクチンをストレプトアビジン−ＡＰを用いて洗浄したフィルター上で検出した（図４）。ウシＡＧＰへのＳｕｂＢΔＳ１０６／ΔＴ１０７の結合は、約２００ｎｇ／スポットまで検出可能であったが、ヒトＡＧＰへの有意な結合は、最大試験量（１２．５μｇ／スポット）でも検出できなかった。この区別能力は、上記のＳＰＲデータと一致している。
【０１３７】
追加グリカンアレイ
Ｚバイオテックのグリカンアレイで分析した種々のＮｅｕ５ＡｃおよびＮｅｕ５Ｇｃグリカン構造を図９に示し、アレイの一例を図６に示す。表３は、図９のグリカンを図７および図８のアレイデータにリンクさせるコードを提供する。図７に要約されたアレイデータによると、Ｎｅｕ５Ｇｃ構造への結合は野生型ＳｕｂＢが偏りをより示すが、バックグラウンドを超えて５０００超の蛍光単位で結合するＮｅｕ５Ａｃグリカンは４／４０であり、５０００未満の結合を有するＮｅｕ５Ｇｃ構造は１４／４１である。全てのＮｅｕ５Ａｃ構造が、バックグラウンドを超えて多少の結合を記録する。図８でも明らかなように、Ｎｅｕ５Ｇｃ構造への結合は、ＳｕｂＢ２Ｍが一番強かった。バックグラウンドを超えて５０００超の蛍光単位で結合するＮｅｕ５Ａｃグリカンは観察されず、５／４１のみのＮｅｕ５Ｇｃ構造が５０００未満の結合を有する。７／１４のみのＮｅｕ５Ａｃグリカンがバックグラウンドを超える結合を有する。この結果は、Ｎｅｕ５Ｇｃに対する特異性の面でＷＴ  ＳｕｂＢを用いて得られた結果よりも決定的な改善を示し、Ｎｅｕ５Ｇｃ含有グリカンの異なる結合の認識および提示の改善された認識を示す。
【０１３８】
ＳｕｂＢ２Ｍを用いた血清中のＮｅｕ５Ｇｃ含有タンパク質のオンチップスクリーニングのさらなる開発
図１０および１１を参照しながら、すべてのアッセイは、シグマアルドリッチから入手した１％正常ヒト血清のバックグラウンドで行われた。Ｎｅｕ５Ｇｃ含有タンパク質を添加した場合、血清のみの対照を下回る値で存在する血清に起因する結合が観察されたため、野生型ＳｕｂＢを分析することはできなかった。これは、ＳｕｂＢ  ＷＴが血清よりもＮｅｕ５Ｇｃタンパク質への偏りを示したが、タンパク質の非存在下では高レベルで血清に結合したことを示している（図１０）。図１１に示すように、ＳｕｂＢ２Ｍは、３１．２５ｎＭから６２．５ｎＭの間の濃度で、血清バックグラウンドを超える応答を有し、はるかに良好であった。これは約２μｇ／ｍＬのタンパク質濃度である。
【０１３９】
考察
Ｎｅｕ５Ｇｃはヒト癌腫における重要な診断上および予後上のマーカーであり、Ｎｅｕ５Ｇｃ発現の上昇が乳がん、卵巣がん、前立腺がん、結腸がんおよび肺がんにおいて検出されている１１、１２。野生型ＳｕｂＢは、Ｎｅｕ５Ｇｃで終わるグリカンに対して前例のない特異性を有していたが、α２−６−結合Ｎｅｕ５Ｇｃとの結合性は低く、弱いながらもα２−３−結合Ｎｅｕ５Ａｃ構造を依然として認識した８。α２−６−結合Ｎｅｕ５Ｇｃに対するＳｕｂＢの認識を改善し、Ｎｅｕ５Ｇｃへの特異性を高めるために、我々は、Ｔ１０４−Ｅ１０８ループに特に焦点を当てて、構造補助修飾を用いてＳｕｂＢを設計した。
【０１４０】
このループの操作は、２つの同じアミノ酸の修飾を通して２つの具体的な結果をもたらした。まず、Ｓ１０６およびＴ１０７のアラニン置換（Ｓ１０６Ａ／Ｔ１０７Ａ）はＮｅｕ５Ｇｃに対する特異性の喪失をもたらし、結合（α２−３およびα２−６）またはシアル酸型（Ｎｅｕ５ＡｃまたはＮｅｕ５Ｇｃ）にかかわらず、試験したすべての末端シアル化グリカンに結合することができるレクチンの生産につながった。次に、同じ２つのアミ
ノ酸の欠失（ΔＳ１０６／ΔＴ１０７）により、連鎖（α２−３およびα２−６）にかかわらずＮｅｕ５Ｇｃに対してかなり高い特異性を有するレクチンの生産につながった。ＳｕｂＢΔＳ１０６／ΔＴ１０７変異体は、野生型ＳｕｂＢと比較してＮｅｕ５Ｇｃ含有構造の認識が有意に改善された。ＳｕｂＢΔＳ１０６／ΔＴ１０７もまた、α２−３−結合Ｎｅｕ５Ｇｃまたはα２−６−結合Ｎｅｕ５Ｇｃ構造に結合するその能力に差がなく、野生型タンパク質よりも有意な改善となった。Ｓ１０６およびＴ１０７アミノ酸以外のＳｕｂＢタンパク質のさらなる修飾は、特異性において有意な改善をもたらさなかった。ＳｕｂＢΔＳ１０６／ΔＴ１０７タンパク質にＥ１０８Ｄ変異も加えたＳｕｂＢΔＳ１０６／ΔＴ１０７／Ｅ１０８Ｄ変異タンパク質は、ＳｕｂＢΔＳ１０６／ΔＴ１０７よりもα２−３−結合Ｎｅｕ５Ｇｃとα２−３−結合Ｎｅｕ５Ａｃの区別能力が低く、ＳｕｂＢΔＳ１０６／ΔＴ１０７変異体よりもヒトα１−酸性糖タンパク質に強い結合性を示した（ＳｕｂＢΔＳ１０６／ΔＴ１０７よりもＳｕｂＢΔＳ１０６／ΔＴ１０７／Ｅ１０８Ｄに結合されるタンパク質は２４倍多かった）。対照的に、ＳｕｂＢΔＴ１０７／ΔＥ１０８欠失変異体は、α２−６−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸グリカンおよびα２−３−結合Ｎ−グリコリルノイラミン酸グリカンだけでなく、ＳｕｂＢΔＳ１０６／ΔＴ１０７が検出可能には結合しないＮｅｕ５Ａｃ−α２−６−ｌａｃおよびＮｅｕ５Ａｃ−α２−３−ｌａｃなどのＮｅｕ５Ａｃグリカンにも結合した。
【０１４１】
これら改良されたＳｕｂＢ変異体は、生物学的試料、特にがんを有するまたはがんを有すると疑われる個体の血清および他の体液を試験するための新しいツールを提供する。
【０１４２】
方法
ＳｕｂＢの構造モデリング
ＳｕｂＢ変異体の３次元構造は、Ｐｈｙｒｅ２を用いてモデル化した２４。Ｎｅｕ５ＧＣα２−６Ｇａｌβ１−３Ｇｌｃは、ＰＤＢ  ＩＤ：４ＥＮ８から得２５、Ｃｏｏｔを用いて手動でＳｕｂＢおよびＳｕｂＢ変異体構造にモデル化した２６。
【０１４３】
ＳｕｂＢ変異体の構築および発現
表２に記載されているフォワードプライマーｐＥＴＳｕｂＢＦとそれぞれの変異体特異的リバースプライマーを使用したハイフィデリティーＰＣＲを直接行うことにより、ｓｕｂＢコード配列に変異を導入した（３’末端近く）。ＰＣＲ産物をｐＥＴ−２３（＋）（ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ））のＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ部位にクローニングし、そして大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。ＳｕｂＢ誘導体は、以前に記載されているように４、Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーにより、Ｈｉｓ６でタグ付けした融合タンパク質として発現および精製した。タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシーブルー染色によって評価したところ純度＞９５％であった。
【０１４４】
ＳｕｂＢおよび操作されたＳｕｂＢ変異体の表面プラズモン共鳴
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）は、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００システム（ＧＥ）を用いて以前記載されたように行った２７。簡単に説明すると、ＳｕｂＢ、ＳｕｂＢ変異体および抗Ｎｅｕ５Ｇｃ  ＩｇＹ（シアマブ（ＳｉａＭａｂ）、旧シアリックス／ＧＣ−フリー（Ｓｉａｌｉｘ／ＧＣ−Ｆｒｅｅ  Ｉｎｃ．）；ＵＳＡ、カリフォルニア州サンディエゴ）を、ＮＨＳキャプチャーキットを用いてシリーズＳセンサーチップＣＭ５（ＧＥ）のフローセル２−４上に固定し、フローセル１をブランクの固定として実行した。ヒトおよびウシ由来の単糖、二糖、オリゴ糖およびα１−酸性糖タンパク質（シグマアルドリッチ；表１参照）を最初の範囲測定実験で０．０１〜１００μＭで流した。濃度を調整し、全てのデータを、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００評価ソフトウェアを用いた単一サイクル動態を用いて分析した。
【０１４５】
α１−酸性糖タンパク質の質量分析
ヒト血漿（シグマアルドリッチ、Ｇ９８８５）およびウシ血漿（シグマアルドリッチ、Ｇ３６４３）由来のＡＧＰ（６Ｍ塩化グアニジニウム、ｐＨ８の５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ中に１ｍｇ）を還元し、それぞれ１０ｍＭジチオトレイトールおよび２５ｍＭアクリルアミドでアルキル化した。次いで、タンパク質を１：１のメタノール：アセトンを４体積分添加することにより沈殿させ、−２０℃で１６時間インキュベートし、次いで遠心分離後（１８，０００ｒｃｆ、１０分）、ペレットを回収した。沈殿したタンパク質をｐＨ８の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ５０μＬに再懸濁し、１μｇのトリプシン（Ｔｒｙｐｓｉｎ  Ｇｏｌｄ、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））で消化した（３７℃、１６時間）。次いで消化したペプチドをＣ１８ＺｉｐＴｉｐｓ（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））で脱塩した。
【０１４６】
ＳｕｂＢおよび操作されたＳｕｂＢΔＳ１０６／ΔＴ１０７変異体のＥＬＩＳＡ分析
黒色９６ウェルＮＵＮＣマキシソーププレートのウェルを、１００ｍＭ重炭酸塩／炭酸塩コーティング緩衝液（ｐＨ９．６）で、１．２５μｇから始めて２倍に段階希釈したＳｕｂＢまたはＳｕｂＢΔＳ１０６／ΔＴ１０７タンパク質で、４℃で一晩かけてコーティングした。ウェルをリン酸緩衝食塩水、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄し、ブロッキング溶液（３％ＢＳＡ）を室温で１時間添加した。正常ヒト血清およびウシ血清中のタンパク質を、生の血清を１００μＭのＦＩＴＣ色素（Ｐｅｉｒｃｅ）と混合することによって、氷上で１時間インキュベートすることによって蛍光標識した。１ｋＤａサイズ排除スピンカラムを用いて過剰の色素を除去した。１００μｌのＦＩＴＣ標識正常ヒト血清またはウシ血清を、ＳｕｂＢまたはＳｕｂＢΔＳ１０６／ΔＴ１０７でコーティングしたウェルに添加し、そしてウェルを室温で１時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。１００μｌのＰＢＳを各ウェルに添加し、蛍光を４８５／５３５ｎｍで測定した。蛍光単位値は、二重反復試験の平均±ＳＤとして示され、ＳｕｂＢタンパク質を除く全ての試薬を含有するウェルについて得られた平均蛍光単位が差し引かれている。負の値は０と見なした。
【０１４７】
ＳｕｂＢオーバーレイ実験
ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ビオチン化キット（サーモサイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））を製造元の指示に従って使用して、精製したＳｕｂＢΔＳ１０６／ΔＴ１０７をビオチンで標識した。精製されたヒトおよびウシα−１酸性糖タンパク質（シグマ、カタログ番号Ｇ９８８５およびＧ３６４３）を５ｍｇ／ｍｌで水に溶解し、５μｌ容量の段階２倍希釈液をニトロセルロースフィルター上に滴下し、３７℃で一晩風乾した。次いで、フィルターを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むトリス緩衝食塩水（ＴＴＢＳ）中の５％スキムミルクで２時間ブロックした。ＴＴＢＳで３回洗浄した後、フィルターをＴＴＢＳ中１μｇ／ｍｌのビオチン−ＳｕｂＢΔＳ１０６／ΔＴ１０７で覆い、４℃で一晩インキュベートした。フィルターをＴＴＢＳで３回洗浄し、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲート（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））を用いて結合ビオチン−ＳｕｂＢΔＳ１０６／ΔＴ１０７を検出した。発色性ニトロブルーテトラゾリウム／Ｘ−ホスフェート基質システム（ロシュ）を用いてフィルターを開発した。
【０１４８】
ＳｕｂＢおよび操作されたＳｕｂＢ変異体のグリカンアレイ分析
表３に示されるデータについて、グリカンアレイスライドを、以前に記載されているように２８、Ａｒｒａｙｉｔ  Ｓｐｏｔｂｏｔ  Ｅｘｔｒｅｍｅコンタクトプリンターを使用してＳｕｐｅｒＥｐｏｘｙ３（アレイット（Ａｒｒａｙｉｔ））活性化基質上に印刷した。各サブアレイについて、２μｇのＳｕｂＢタンパク質を、抗Ｈｉｓタグ抗体（セルシグナリング（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ））ならびにＡｌｅｘａ  ５５５の２次抗体および３次抗体（ウサギ抗マウス；ヤギ抗ウサギ）と２：１：０．５：０．２５の比かつ５００μＬの最終容量で予め複合体化させた。この５００μＬの抗体−タンパク質複合体
を、カバーガラスなしで６５μＬの遺伝子フレーム（サーモサイエンティフィック）に添加した。洗浄および分析は、以前に記載されているように実施した２７。
【０１４９】
Ｎｅｕ５Ａｃ／Ｎｅｕ５Ｇｃグリカンアレイ
図６〜９に示すデータについては、Ｎｅｕ５Ａｃ／Ｎｅｕ５Ｇｃグリカンアレイは、Ｚ−バイオテク（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｚｂｉｏｔｅｃｈ．ｃｏｍ／ｎｅｕ５ｇｃ−ｅｎｏａｎｔｉｇｅｎ−ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ．ｈｔｍｌ）から入手した。製造業者の説明書に従って、各サブアレイ領域に合計２μｇのタンパク質を適用してアレイを作製した。検出は、マウス抗Ｈｉｓ  ＩｇＧ（タンパク質と１：１のモル比）、ウサギ抗マウスＡｌｅｘａ  ５５５  ＩｇＧ（０．５モル量のマウスＩｇＧ）およびヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ  ５５５  ＩｇＧ（０．５モル量のウサギＩｇＧ）を用いて行われた。タンパク質を１時間インキュベートし、１×ＰＢＳ中で３回洗浄した。スライドを４８８、５３２および６４７レーザーを用いてＩｎｎｏｓｃａｎ  １１００ＡＬでスキャンした。アレイをＭａｐｉｘソフトウェアで分析した。全てのデータは５３２レーザーチャンネルから得られ、バックグラウンドを差し引いた蛍光を分析に使用した。
【０１５０】
本明細書を通して、本発明をいずれか１つの実施形態または特定の特徴の集まりに限定することなく、本発明の好ましい実施形態を説明することが目的である。したがって、本開示に照らして、例示された特定の実施形態において本発明の範囲から逸脱することなく様々な修正および変更を行うことができることを当業者は理解するであろう。
【０１５１】
本明細書で言及されるすべてのコンピュータプログラム、アルゴリズム、特許および科学文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５２】
参考文献
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【０１５３】
【表１】
2020501521.tif 000005
【０１５４】
【表２】
2020501521.tif 000006
【０１５５】
【表３】
2020501521.tif 000007
【０１５６】
【表４−１】
2020501521.tif 000008
【０１５７】
【表４−２】
2020501521.tif 000009
【０１５８】
【表４−３】
2020501521.tif 000010
【０１５９】
【表４−４】
2020501521.tif 000011
【０１６０】
【表４−５】
2020501521.tif 000012
【０１６１】
【表４−６】
2020501521.tif 000013
【０１６２】
【表４−７】
2020501521.tif 000014
【０１６３】
【表４−８】
2020501521.tif 000015
【０１６４】
【表４−９】
2020501521.tif 000016
【０１６５】
【表４−１０】
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【０１６６】
【表４−１１】
2020501521.tif 000018
【０１６７】
【表４−１２】
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【０１６８】
【表４−１３】
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【０１６９】
【表４−１４】
2020501521.tif 000021
【０１７０】
【表４−１５】
2020501521.tif 000022
【０１７１】
【表４−１６】
2020501521.tif 000023
【図１−１】
2020501521.tif 000024
【図１−２】
2020501521.tif 000025
【図２−１】
2020501521.tif 000026
【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
2020501521.tif 000030
【図５−２】
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【図６】
2020501521.tif 000032
【図７】
2020501521.tif 000033
【図８】
2020501521.tif 000034
【図９−１】
2020501521.tif 000035
【図９−２】
2020501521.tif 000036
【図１０】
2020501521.tif 000037
【図１１】
2020501521.tif 000038
【国際調査報告】
2020501521.tif 000039
2020501521.tif 000040
2020501521.tif 000041