(57)【要約】  本発明は、ＮＫｐ４６ポリペプチドに結合できる抗原結合タンパク質を提供する。この抗原結合タンパク質は、ＮＫｐ４６発現細胞、特に腫瘍細胞を特徴とする障害の治療において増大した活性を有する。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のＮＫｐ４６ポリペプチドに対する結合に関し、８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂおよび１７Ｅ１からなる群より選択される抗体と競合する抗体または抗体フラグメント。
【請求項２】
下記：
ｉ．配列番号７０のアミノ酸残基１０１〜１１８または１０１〜１０５または１００〜１０５、または配列番号７０のアミノ酸残基１０１〜１１８または１０１〜１０５または１００〜１０５に対応する哺乳動物ＮＫｐ４６タンパク質上のアミノ酸残基；
ｉｉ．配列番号７０のアミノ酸残基１５０〜１６９、または配列番号７０のアミノ酸残基１５０〜１６９に対応する哺乳動物ＮＫｐ４６タンパク質上のアミノ酸残基；
ｉｉｉ．配列番号７０のアミノ酸残基１３５〜１５１または１３３〜１５１、または配列番号７０のアミノ酸残基１３５〜１５１または１３３〜１５１に対応する哺乳動物ＮＫｐ４６タンパク質上のアミノ酸残基；
ｉｖ．配列番号７０のアミノ酸残基１７８〜１８７または１７７〜１８７、または配列番号７０のアミノ酸残基１７８〜１８７または１７７〜１８７に対応する哺乳動物ＮＫｐ４６タンパク質上のアミノ酸残基；
ｖ．配列番号７０のアミノ酸残基１０１〜１１８または１００〜１０５または１０１〜１０５および１５０〜１６９、または配列番号７０のアミノ酸残基１０１〜１１８または１００〜１０５または１０１〜１０５および１５０〜１６９に対応する哺乳動物ＮＫｐ４６タンパク質上のアミノ酸残基
からなる群より選択されるアミノ酸残基内の１個または複数のアミノ酸と結合する抗体または抗体フラグメント。
【請求項３】
下記：
（ａ）（ｉ）配列番号３の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む重鎖および（ｉｉ）配列番号４の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む軽鎖、を含む高頻度可変領域；
（ｂ）（ｉ）配列番号３の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む重鎖および（ｉｉ）配列番号２１の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む軽鎖、を含む高頻度可変領域；
（ｃ）（ｉ）配列番号２９の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む重鎖および（ｉｉ）配列番号３０の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む軽鎖、を含む高頻度可変領域；
（ｄ）（ｉ）配列番号２９の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む重鎖および（ｉｉ）配列番号４７の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む軽鎖、を含む高頻度可変領域；
（ｅ）（ｉ）配列番号５５の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む重鎖および（ｉｉ）配列番号５６の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む軽鎖、を含む高頻度可変領域
からなる群から選択される高頻度可変領域を含む抗体または抗体フラグメント。
【請求項４】
請求項３に記載の高頻度可変領域を含むモノクローナル抗体または抗体フラグメント。
【請求項５】
前記抗体が、細胞傷害薬に結合されている、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体または抗体フラグメント。
【請求項６】
前記抗体または抗体フラグメントが、構造体：
（Ｑ）−Ｌ”−Ｙ−Ｚ
または薬学的に許容可能なその塩または溶媒和物を含む官能化アクセプターグルタミン残基（Ｑ）を含み、
式中、
Ｑは、前記抗体または抗体フラグメントの定常領域内のまたは定常領域に付加されたグルタミン残基であり；
Ｌ”は、窒素原子がＱのγ炭素に２級アミンとして共有結合しているリシンベースリンカーであり；
Ｙは、スペーサー系であり；および
Ｚは、細胞傷害薬である、
請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体または抗体フラグメント。
【請求項７】
前記細胞傷害薬が、ＤＮＡ副溝結合剤である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体または抗体フラグメント。
【請求項８】
前記細胞傷害薬が、ピロロベンゾジアゼピン部分を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体または抗体フラグメント。
【請求項９】
前記抗体が、ヒトＦｃγＩＩＩＡ受容体ポリペプチドに実質的に結合しないヒト重鎖定常領域を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１０】
前記抗体が、改変を含まない同じアイソタイプの抗体に比べて、ヒトＦｃγＩＩＩＡ受容体に対する結合を低減させるアミノ酸改変を含むヒト重鎖定常領域を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１１】
前記抗体が、ヒトＦｃγＩＩＩＡ受容体ポリペプチドに結合するヒト重鎖定常領域を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１２】
前記抗体が、ヒトフレームワークアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖可変領域を有する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体または抗体フラグメント。
【請求項１３】
前記抗体が、配列番号２の非ヒト霊長類ＮＫｐ４６ポリペプチドに結合する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の抗体または抗体フラグメント。
【請求項１４】
前記抗体が、ＮＫｐ４６ポリペプチドに対する結合に対し、１０−９Ｍ未満の二価Ｋｄを有する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗体または抗体フラグメント。
【請求項１５】
前記抗体または抗体フラグメントが、キメラ、ヒトまたはヒト化抗体または抗体フラグメントである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体または抗体フラグメント。
【請求項１６】
前記抗体が、四量体抗体である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１７】
前記抗体が、配列番号１のＮＫｐ４６ポリペプチドに対する結合に関し、８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂおよび１７Ｅ１からなる群より選択される抗体と競合する、請求項３〜１６に記載の抗体または抗体フラグメント。
【請求項１８】
請求項１〜１６に記載の抗体フラグメントを含むタンパク質。
【請求項１９】
前記タンパク質が、キメラ細胞表面レセプタータンパク質である、請求項１８に記載のタンパク質。
【請求項２０】
前記タンパク質が、Ｆｃドメインを含む、請求項１８に記載のタンパク質。
【請求項２１】
前記抗体フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ダイアボディ、単鎖抗体フラグメント、または複数の異なる抗体フラグメントを含む多重特異的抗体からなる群より選択される、請求項１〜１８に記載の抗体。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれか１項に記載の抗体、抗体フラグメント、高頻度可変領域またはタンパク質をコードする核酸または一連の核酸。
【請求項２３】
請求項１〜２２のいずれか１項に記載の抗体、抗体フラグメント、高頻度可変領域、核酸またはタンパク質、および薬学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載の前記抗体、抗体フラグメント、高頻度可変領域またはタンパク質、必要に応じ、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の抗体を特異的に認識する標識二次抗体をさらに含む、キット。
【請求項２５】
請求項１〜２１に記載の前記抗体、抗体フラグメント、高頻度可変領域またはタンパク質を産生する組換え宿主細胞。
【請求項２６】
治療または予防を必要としている個体の疾患の治療または予防方法であって、有効量の、前記個体に請求項１〜２１に記載の抗体、抗体フラグメント、高頻度可変領域もしくはタンパク質または請求項２３に記載の組成物を投与することを含む、方法。
【請求項２７】
前記疾患が癌である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
個体のＮＫｐ４６発現細胞の存在を特定する方法であって、個体から細胞を含む生物試料を取得すること、前記細胞を、請求項１〜２１に記載の抗体、抗体フラグメント、高頻度可変領域またはタンパク質と接触させること、および抗体が前記細胞に結合するかどうかを評価すること、を含む、方法。
【請求項２９】
請求項１〜２１に記載の抗体、抗体フラグメント、高頻度可変領域もしくはタンパク質または請求項２３に記載の組成物による治療に応答する疾患を有する個体を選択する方法であって、前記個体の腫瘍細胞がＮＫｐ４６ポリペプチドを発現しているかどうか、ＮＫｐ４６ポリペプチドの発現が、奏効対象の指標となるかどうかを判定することを含む、方法。
【請求項３０】
請求項１〜２３に記載の組成物を、奏効者個体に投与することをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記疾患がリンパ腫である、請求項２６〜３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記個体が、難治性セリアック病、場合により、ＲＣＤＩまたはＲＣＤＩＩを有する、請求項２６〜３１に記載の方法。
【請求項３３】
治療または予防を必要としている個体のリンパ腫の治療または予防方法であって、前記個体に有効量の、請求項１〜２１に記載の抗体、抗体フラグメント、高頻度可変領域もしくはタンパク質または請求項２３に記載の組成物を投与することを含む、方法。
【請求項３４】
前記リンパ腫が、末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＰＴＣＬが、ＰＴＣＬ−ＮＯＳ、ＡＩＴＬ、またはＡＬＣＬ（ＡＬＫ＋またはＡＬＫ−）、ＡＴＬ、ＮＫ−／Ｔ細胞リンパ腫、節外性ＮＫ−／Ｔ細胞性リンパ腫、鼻型、およびＥＡＴＬからなる群より選択される、請求項３４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、全ての図面および配列表を含め、参照により全内容が本明細書に組み入れられる、２０１７年１月２４日出願の米国仮特許出願第６２／４４９，６１７号、および２０１７年７月１０日出願の米国仮特許出願第６２／５３０，４４３号の利益を主張するものである。
【０００２】
配列表の参照
本出願は、電子データによる配列リストと共に出願されている。この配列表は、２０１８年１月２２日に作成された２７ＫＢのサイズの「ＮＫｐ４６−８    ＰＣＴ＿ＳＴ２５    ｔｘｔ」という名称のファイルとして提供される。配列リストの電子データ中の情報は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
発明の分野
本発明は、ＮＫｐ４６ポリペプチドに結合できる抗原結合タンパク質を提供する。この抗原結合タンパク質は、ＮＫｐ４６発現細胞、特に腫瘍細胞を特徴とする障害の治療において増大した活性を有する。
【背景技術】
【０００４】
ＮＫ細胞の活性は、活性化および阻害シグナルの両方を伴う複雑な機構により調節される。ＨＬＡクラスＩ欠損標的細胞のＮＫ細胞媒介認識および殺作用において、重要な役割を果たすいくつかの異なるＮＫ特異的受容体が特定されている。天然の細胞傷害性受容体（ＮＣＲ）は、レセプタータンパク質活性化クラスおよびそれらを発現している遺伝子を意味し、これらはＮＫ細胞中で特異的に発現している。ＮＣＲの例には、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、およびＮＫｐ４６が含まれる（例えば、Ｌａｎｉｅｒ（２００１）Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２：２３−２７，Ｐｅｎｄｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１９０：１５０５−１５１６，Ｃａｎｔｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１８９：７８７−７９６，Ｓｉｖｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ（１９９７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：１１２９−１１３６，Ｐｅｓｓｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１８８（５）：９５３−６０；Ｍａｎｄｅｌｂｏｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：１０５５−１０６０、を参照されたい。これらの文献の全開示は、参照により本明細書に組み込まれる）。これらの受容体は、Ｉｇスーパーファミリーのメンバーであり、特異的ｍＡｂにより誘導されるそれらの架橋は、細胞内Ｃａ＋＋のレベルを上昇させる強力なＮＫ細胞の活性化をもたらし、細胞障害性、およびリンホカインの放出、および多くの型の標的細胞に対するＮＫ細胞傷害性の活性化を誘発する。ＮＣＲ、特にＮＫｐ４６の発現は、通常、ＮＫ細胞に限定されていることが報告されている。
【０００５】
西欧諸国では、ＰＣＴＬは、中悪性度リンパ腫の１５％〜２０％を占め、全非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の７％〜１０％を占める。それらは通常、中年から高齢患者で発生し、提示特徴は、６８％の患者で播種性疾患であり、患者のほぼ半分（４５％）で全身性症状を有し、１／４の患者（２５．８％）で骨髄（ＢＭ）併発があり、１／３の患者（３７％）で節外性病変を伴う。積極的治療にもかかわらず、半分を超える患者がこの疾患で死亡する。特定の特徴的疾病は、治療されれば予後を改善したが、多くの高悪性度ＰＴＣＬの場合、第二世代および第三世代化学療法計画の使用では、予後は概して変わらず、５年全生存期間（ＯＳ）は、例えば、ＰＴＣＬ−ＮＯＳでは、いまだ、２５％〜４７％のままである。したがって、当該技術分野において、ＰＴＣＬの患者の利益を改善することが求められている。
【発明の概要】
【０００６】
ＮＫｐ４６は、健常者では、ＮＫ細胞選択的細胞表面タンパク質であるが、ＮＫｐ４６は、特定の悪性病変でＴ細胞により発現され得る。免疫組織化学は、ＮＫｐ４６が、末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）中で、抗ＮＫｐ４６抗体により標的化を可能とする発現レベルで発現され得ることを示す。
【０００７】
本発明は、特に、抗体、特に免疫複合体による除去のための、高度に効果的な標的化を可能とするヒトＮＫｐ４６上のエピトープの発見に起因する。一連の抗ＮＫｐ４６抗体候補の研究により、発明者らは、ＮＫｐ４６＋腫瘍細胞除去を媒介する特に高い能力を有する抗体（抗体８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂおよび１７Ｅ１）を特定した。本明細書で提供したアッセイは、精密な数の細胞傷害薬を抗体に結合させることを可能とする薬物結合法を用いて実施し、それにより、混合物中の実質的に全ての抗体が同じ数の細胞傷害性部分を有している（例えば、薬物：抗体比（ＤＡＲ）＝２または４）。この方法は、異なる抗体試料内のＤＡＲの種々の分布に由来する偏りなしに、抗体およびそれらのエピトープの比較を可能とする。
【０００８】
興味深いことに、最高の活性を示した抗体は全て、細胞表面ＮＫｐ４６ポリペプチド上の単一の領域／エピトープに対する結合に関し、競合した。この抗体は、既知の抗ＮＫｐ４６抗体と競合しなかったが、これは、特に、免疫複合体による標的化に好適するＮＫｐ４６上の領域を示唆している。
【０００９】
さらに、ヒトＮＫｐ４６に対する結合により選択された多くの抗体は、ＮＫ細胞を、ヒトＮＫｐ４６を発現するように作製されたラージ腫瘍細胞株を溶解するように誘導できないが、抗体８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂおよび１７Ｅ１は、腫瘍細胞に対するＡＤＣＣを誘導する有望な能力を示した。免疫複合体としてのそれらの高い能力を考慮すると、この抗体のＡＤＣＣ誘導因子としての効力は、特に注目に値する（高活性免疫複合体は、細胞内内部移行を受けるそれらの能力を考慮すると、不十分なＡＤＣＣ誘導因子である場合が多い）。
【００１０】
特に免疫複合体としての高活性を考慮すると（ＡＤＣＣ０を媒介する能力なしで試験して）、抗体は、好都合にも、Ｆｃγ媒介エフェクター活性を欠く（例えば、ＡＤＣＣを媒介しない）免疫複合体として使用できる。
【００１１】
しかし、抗体はまた、Ｆｃγ媒介エフェクター活性（例えば、ＡＤＣＣを媒介する）をさらに有し、それにより２つの作用方式を組み合わせた免疫複合体としても使用できることは理解されよう。あるいは、抗体は、毒性部分に結合されない、「裸の」ＡＤＣＣ媒介抗体として使用できる。
【００１２】
一態様では、混合物中の実質的に全ての抗体が特定のＤＡＲ（例えば、２または４のＤＡＲ）を有する、化学量論的に官能化されたアクセプターグルタミンを有する抗ＮＫｐ４６抗体免疫複合体を用いた実施例の抗体に関して、本明細書で示されるように、抗体は、Ｆｃ媒介エフェクター機能を欠いているにもかかわらず、免疫複合体として腫瘍細胞死を強力に誘導できる。本開示の抗体は、１つまたは複数のヒトＦｃγ受容体（例えば、ＣＤ１６Ａ、ＣＤ１６Ｂ、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ６４）に対する結合を低減または止めるように改変されたヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプのＦｃドメイン（またはその部分）を含めることができる。このような抗体は、非腫瘍性Ｆｃγ受容体発現細胞による溶解を最小化する。したがって、高い効力／毒性を有する細胞傷害薬（例えば、実施例に示されるように、ピロロベンゾジアゼピン薬剤などのＤＮＡ副溝結合剤）に結合する場合、抗体は、他の方法で可能な量より高い投与量で使用でき、したがって、癌治療において、ＡＤＣＣ媒介免疫複合体より大きな効力を生じ得る。場合により、本明細書の実施例中に示されているように、抗体は、ヒトＦｃＲｎタンパク質に対する結合を保持し、それにより、ビボ半減期を提供する。
【００１３】
好都合にも、抗体により結合されたエピトープは、細胞表面上に発現されるように、ヒトおよび非霊長類ＮＫｐ４６ポリペプチドの両方上に、ならびに、癌細胞により発現されるＮＫｐ４６上に存在する。
【００１４】
一態様では、提供されるのは、８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂおよび１７Ｅ１のいずれかと、ＮＫｐ４６に対する結合に関し競合する、および／または８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂおよび１７Ｅ１のいずれかと、ＮＫｐ４６上の同じエピトープに結合する抗体または抗体フラグメントである。
【００１５】
一態様では、提供されるのは、細胞の表面上に発現した配列番号１のヒトＮＫｐ４６ポリペプチド、および細胞の表面上に発現した配列番号２の非ヒト霊長類ＮＫｐ４６ポリペプチドに結合するいくつかのモノクローナル抗体であり、場合により、抗体はヒトＦｃドメインを含み、除去抗体である。
【００１６】
一態様では、提供されるのは、モノクローナル抗体８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂおよび１７Ｅ１のいずれか１個、またはいずれかの組み合わせと、同じエピトープに結合するおよび／またはＮＫｐ４６ポリペプチドに対する結合に関し競合する、抗原結合化合物である。一実施形態では、提供されるのは、下記からなる群より選択される抗体と、同じエピトープに結合するおよび／またはＮＫｐ４６ポリペプチドに対する結合に関し競合する、抗原結合化合物である。
（ａ）配列番号３および４（８Ｂ６Ａ）のＶＨおよびＶＬ領域をそれぞれ有する抗体；
（ｂ）配列番号３および２１（８Ｂ６Ｂ）のＶＨおよびＶＬ領域をそれぞれ有する抗体；
（ｃ）配列番号２９および３０（９Ｈ１１Ａ）のＶＨおよびＶＬ領域をそれぞれ有する抗体；
（ｄ）配列番号２９および４７（９Ｈ１１Ｂ）のＶＨおよびＶＬ領域をそれぞれ有する抗体；
（ｅ）配列番号５５および５６（１７Ｅ１）のＶＨおよびＶＬ領域をそれぞれ有する抗体。
【００１７】
発明者らは、抗体により結合されるヒトＮＫｐ４６上のエピトープをさらに特定した。細胞外ドメイン中のヒトＮＫｐ４６に結合する抗体は、「Ｄ２」ドメインと呼ばれる。したがって、一態様では、本発明は、抗原結合ドメイン、またはこれを含むタンパク質またはポリペプチド、例えば、配列番号７０のＮＫｐ４６ポリペプチドの残基１００〜１８７に対応するＮＫｐ４６のセグメントに特異的に結合する抗体または抗体フラグメントを提供する。別の態様では、抗体は、配列番号７０のＮＫｐ４６ポリペプチドの残基１０１〜１１８または１０１〜１０５または１００〜１０５に対応するＮＫｐ４６のセグメントに結合する。別の態様では、抗体は、配列番号７０のＮＫｐ４６ポリペプチドの残基１５０〜１６９に対応するＮＫｐ４６のセグメントに結合する。別の態様では、抗体は、配列番号７０のＮＫｐ４６ポリペプチドの残基１３３〜１５１または１３５〜１５１に対応するＮＫｐ４６のセグメントに結合する。別の態様では、抗体は、残基１７８〜１８７または１７７〜１８７に対応するＮＫｐ４６のセグメントに結合する。一実施形態では、抗体は、野生型ＮＫｐ４６アミノ酸配列に比較して、本明細書で開示の残基のセグメント中にアミノ酸置換を有するＮＫｐ４６ポリペプチドに対し低減した結合を有する。このような抗体は、本明細書で記載のいずれかの特性を有することをさらに特徴とし得る。
【００１８】
一態様では、ＮＫｐ４６ポリペプチドに結合する本発明のタンパク質（例えば、抗体または抗体フラグメント）は、配列番号７０のＮＫｐ４６ポリペプチドの残基１００〜１８７に対応するセグメント中の少なくとも１個の残基に結合する。一実施形態では、抗体は、残基１０１〜１１８（または１０１〜１０５または１００〜１０５）に対応するセグメント中の少なくとも１個の残基に結合し、場合により、配列番号７０のＮＫｐ４６ポリペプチドのセグメント１５０〜１６９中の少なくとも１個の残基とさらに組み合わせて結合する。場合により、抗体は、ＮＫｐ４６の残基１３５〜１５１（または１３３〜１５１）に対応するセグメント中の少なくとも１個の残基および／または配列番号７０のポリペプチドの残基１７８〜１８７（または１７７〜１８７）に対応するセグメント中の少なくとも１個の残基に結合する。
【００１９】
一態様では、提供されるのは、ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに結合する抗原結合ドメインまたは抗原結合タンパク質（例えば、高頻度可変領域またはこれを含むタンパク質、抗体または抗体フラグメント、免疫複合体、など）であり、ドメインまたはタンパク質は、下記からなる群から選択される重鎖可変領域および軽鎖可変領域の組み合わせを含む：
（ａ）配列番号３の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む重鎖可変ドメインおよび（ｉｉ）配列番号４の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む軽鎖可変領域；
（ｂ）配列番号３の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む重鎖可変ドメインおよび（ｉｉ）配列番号２１の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む軽鎖可変領域；
（ｃ）配列番号２９の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む重鎖可変ドメインおよび（ｉｉ）配列番号３０の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む軽鎖可変領域；
（ｄ）配列番号２９の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む重鎖可変ドメインおよび（ｉｉ）配列番号４７の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む軽鎖可変領域；
（ｅ）配列番号５５の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む重鎖可変ドメインおよび（ｉｉ）配列番号５６の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む軽鎖可変領域。
【００２０】
場合により、抗原結合化合物は、表面ヒトＮＫｐ４６（配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチド）または配列番号２の非ヒト霊長類ＮＫｐ４６（例えば、カニクイザル）で発現するように作製された細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）に対する結合のための、２μｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０を有し、場合により、１μｇ／ｍｌ以下、０．５μｇ／ｍｌ以下、０．１μｇ／ｍｌ以下または０．０５μｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０を有する。
【００２１】
一実施形態では、抗ＮＫｐ４６抗体は、８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂまたは１７Ｅ１により結合されるＮＫｐ４６上のアミノ酸残基からなる群より選択される１、２または３個のアミノ酸残基を含むエピトープに結合する。
【００２２】
一実施形態では、抗体は、抗体Ｂａｂ２８１、９Ｅ２または１９５３１４（ＮＫ細胞中のＮＫｐ４６機能を中和すると報告されている）と、ＮＫｐ４６への結合に関して競合しない。一実施形態では、提供されるのは、ＮＫｐ４６の天然のリガンド（例えば、ＮＫｐ４６およびその天然リガンドはそれぞれ細胞表面に発現される）との相互作用を実質的に遮断することなく、ヒトＮＫｐ４６に結合する抗体である。
【００２３】
好ましくは、化合物は抗体であり、場合により、２つのＩｇ重鎖および２つのＩｇ軽鎖を含む四量体抗体である。好ましくは、抗体は、結合親和性（ＫＤ）を有し、場合により、結合親和性は、二価であり、場合により、結合親和性は一価であり、ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに対し、例えば、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）スクリーニングにより（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）ＳＰＲ分析装置による分析により）測定して、１０−８Ｍ未満、好ましくは１０−９Ｍ未満、好ましくは１０−１０Ｍ未満、または好ましくは１０−１１Ｍ未満である。一実施形態では、抗体は、除去抗体であり、場合により、抗体は、細胞傷害性部分を含む免疫複合体であり、場合により、抗体は、ＮＫｐ４６発現腫瘍細胞に対して、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣを誘導する。
【００２４】
本明細書のいずれかの実施形態の一態様では、抗体は、腫瘍細胞の表面上のＮＫｐ４６に結合時に、細胞内内部移行を受けることができる。
【００２５】
本明細書のいずれかの実施形態の一態様では、抗体がＮＫｐ４６発現細胞上のＮＫｐ４６に結合する場合、ＮＫｐ４６発現細胞中で、実質的に低減した量の細胞表面ＮＫｐ４６が観察される。
【００２６】
一実施形態では、抗体は、高親和性を有し、オフレートを遅らせ、カニクイザルおよび／またはアカゲザルＮＫｐ４６と交差反応し、例えば、ヒトＩｇＧ１などのアイソタイプを削除する。
【００２７】
一態様では、提供されるのは、式Ｉ：
Ａｂ−（Ｘ−Ｚ）ｍ        （式Ｉ）
により表される抗ＮＫｐ４６免疫複合体であり、式中、
Ａｂは、本開示の抗ＮＫｐ４６抗体または抗体フラグメント、例えば、抗体８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂおよび１７Ｅ１のいずれかの重鎖および軽鎖ＣＤＲ１、２および３を含む抗体、またはＮＫｐ４６上の同じエピトープに結合する抗体または抗体フラグメントであり；
Ｘは、ＡｂおよびＺに連結する部分であり、例えば、ＡｂおよびＺの片方または両方に共有結合後のリンカーの残基であり、
Ｚは、薬剤、場合により、細胞傷害薬であり、例えば、これは、ＮＫｐ４６発現細胞に供給され；および
ｍは約１〜約１５の範囲であり、場合により、ｍは２または４である。
【００２８】
一実施形態では、Ｘは、細胞内ペプチダーゼまたはプロテアーゼ酵素、場合により、リソソームまたはエンドソームプロテアーゼにより切断されるリンカー（例えば、ペプチジルリンカー）を含む。
【００２９】
一実施形態では、細胞傷害薬は、タキサン、アントラサイクリン、カンプトテシン、エポチロン、マイトマイシン、コンブレタスタチン、ビンカアルカロイド、ナイトロジェンマスタード、マイタンシノイド、カリケアマイシン、デュオカルマイシン、チューブリシン、ドラスタチン、オーリスタチン、エンジイン、ピロロベンゾジアゼピン、エチレンイミン、放射性同位元素、およびペプチド毒素またはそのフラグメントからなる群より選択される。
【００３０】
本明細書のいずれかの態様の一実施形態では、免疫複合体は、抗体のＦｃ領域内のまたは抗体のＦｃ領域に付加されたアクセプターグルタミン残基（Ｑ）（例えば、重鎖および／または軽鎖のＣ末端に融合したＴＧａｓｅ認識タグ内のＱ）に共有結合した細胞傷害薬を含む。一実施形態では、Ｆｃ領域内のアクセプターグルタミンは、重鎖の残基位置２９５および／または２９７（Ｋａｂａｔ  ＥＵナンバリング）にある。
【００３１】
一態様では、提供されるのは、本開示のいずれかの態様の抗ＮＫｐ４６抗体または抗体フラグメントであり、抗体（または抗体フラグメント）は、構造体：
（Ｑ）−Ｌ”−Ｙ−Ｚ
または薬学的に許容可能なその塩または溶媒和物、を含む官能化アクセプターグルタミン残基（Ｑ）を含み、
式中、
Ｑは、抗体または抗体フラグメントの定常領域内のまたは定常領域に付加されたグルタミン残基であり；
Ｌ”は、窒素原子がＱのγ炭素に２級アミンとして共有結合しているリシンベースリンカーであり；
Ｙは、スペーサー系であり；および
Ｚは、細胞傷害薬、場合により、ＤＮＡ副溝結合剤である。
【００３２】
一態様では、提供されるのは、本開示のいずれかの態様の複数の抗ＮＫｐ４６抗体または抗体フラグメントを含む組成物であり、該組成物中の抗体または抗体フラグメントの少なくとも９０％は、抗体またはフラグメント当たり、（ｍ）官能化アクセプターグルタミン残基（Ｑ）を有し、ｍは、２または４からから選択される整数であり、官能化アクセプターグルタミン残基のそれぞれは、構造体：
（Ｑ）−Ｌ”−Ｙ−Ｚ
または薬学的に許容可能なその塩または溶媒和物、を有し、
式中、
Ｑは、抗体または抗体フラグメントの定常領域内のまたは定常領域に付加されたグルタミン残基であり；
Ｌ”は、窒素原子がＱのγ炭素に２級アミンとして共有結合しているリシンベースリンカーであり；
Ｙは、スペーサー系であり；および
Ｚは、細胞傷害薬、場合により、ＤＮＡ副溝結合剤である。
【００３３】
一態様では、提供されるのは、本開示のいずれかの態様の抗ＮＫｐ４６抗体または抗体フラグメントであり、抗体（または抗体フラグメント）は、構造体：
（Ｑ）−Ｌ”−ＲＲ’−Ｙ−Ｚ
または薬学的に許容可能なその塩または溶媒和物、を含む官能化アクセプターグルタミン残基（Ｑ）を含み、
式中、
Ｑは、抗体または抗体フラグメントの定常領域内のまたは定常領域に付加されたグルタミン残基であり；
Ｌ”は、窒素原子がＱのγ炭素に２級アミンとして共有結合しているリシンベースリンカーであり；
（ＲＲ’）は、反応性部分Ｒと相補的な反応性部分Ｒ’との間の付加生成物であり；
Ｙは、スペーサー系であり；および
Ｚは、ピロロベンゾジアゼピン（例えば、ピロロベンゾジアゼピンマルチマー、ピロロベンゾジアゼピン二量体、ピロロベンゾジアゼピン三量体）である。
【００３４】
一態様では、提供されるのは、本開示のいずれかの態様の複数の抗ＮＫｐ４６抗体または抗体フラグメント（例えば、抗体８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂおよび１７Ｅ１のいずれかの重鎖および軽鎖ＣＤＲ１、２および３を含む複数の抗体）を含む組成物であり、該組成物中の抗体または抗体フラグメントの少なくとも９０％は、抗体またはフラグメント当たり、（ｍ）官能化アクセプターグルタミン残基（Ｑ）を有し、ｍは、２または４からから選択される整数であり、官能化アクセプターグルタミン残基のそれぞれは、構造体：
（Ｑ）−Ｌ”−ＲＲ’−Ｙ−Ｚ
または薬学的に許容可能なその塩または溶媒和物、を有し、
式中、
Ｑは、抗体または抗体フラグメントの定常領域内のまたは定常領域に付加されたグルタミン残基であり；
Ｌ”は、窒素原子がＱのγ炭素に２級アミンとして共有結合しているリシンベースリンカーであり；
（ＲＲ’）は、反応性部分Ｒと相補的な反応性部分Ｒ’との間の付加生成物であり；
Ｙは、スペーサー系であり；および
Ｚは、ピロロベンゾジアゼピン（例えば、ピロロベンゾジアゼピンマルチマー、ピロロベンゾジアゼピン二量体、ピロロベンゾジアゼピン三量体）である。
【００３５】
上記構造体の一実施形態では、抗体または抗体フラグメントは、８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂまたは１７Ｅ１のそれぞれのＶＨおよびＶＬを含む抗体と、同じエピトープに結合する、および／またはＮＫｐ４６ポリペプチドに対する結合に関して競合する。上記構造体のいずれかの一実施形態では、抗体または抗体フラグメントは、下記からなる群から選択される重鎖可変領域および軽鎖可変領域の組み合わせを含む：
（ａ）配列番号３の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む重鎖可変ドメインおよび（ｉｉ）配列番号４の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む軽鎖可変領域；
（ｂ）配列番号３の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む重鎖可変ドメインおよび（ｉｉ）配列番号２１の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む軽鎖可変領域；
（ｃ）配列番号２９の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む重鎖可変ドメインおよび（ｉｉ）配列番号３０の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む軽鎖可変領域；
（ｄ）配列番号２９の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む重鎖可変ドメインおよび（ｉｉ）配列番号４７の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む軽鎖可変領域；
（ｅ）配列番号５５の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む重鎖可変ドメインおよび（ｉｉ）配列番号５６の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む軽鎖可変領域。
【００３６】
一態様では、提供されるのは、ＮＫｐ４６に特異的に結合する抗体であり、抗体は、次の特性の内の１つまたは複数（その任意の組み合わせ、またはその全て、を含む）を有する：
（ａ）例えば、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）スクリーニングにより（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）ＳＰＲ分析装置による分析により）測定して、１０−８Ｍ未満、または好ましくは１０−９Ｍ未満のＮＫｐ４６ポリペプチドに対する結合の一価Ｋｄを有する；
（ｂ）本明細書に記載のＮＫｐ４６上のエピトープに結合する（抗体８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂおよび／または１７Ｅ１により結合されるヒトＮＫｐ４６上の１個または複数のアミノ酸残基、および／または抗体８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂおよび／または１７Ｅ１と、ＮＫｐ４６ポリペプチドに対する結合に関し競合する、および／または配列番号７０のＮＫｐ４６ポリペプチドの残基１００〜１８７に対応するセグメント中の少なくとも１個の残基（または残基１０１〜１０５に対応するセグメント中の残基および／または残基１５０〜１６９に対応するセグメント中の残基）に結合する）；
（ｃ）非ヒト霊長類ＮＫｐ４６に結合する（例えば、配列番号２のアミノ酸配列を有するカニクイザルポリペプチド）；
（ｄ）腫瘍細胞表面上に発現したＮＫｐ４６に結合する；および／または
（ｅ）細胞（例えば、悪性細胞）の表面に発現したＮＫｐ４６ポリペプチドに結合時に、細胞内内部移行を受けることができる。
【００３７】
本明細書の実施形態のいずれかでは、本明細書のいずれかの抗体は、上記（ａ）〜（ｅ）の内のいずれか１つまたは複数の特性を特徴とし得る。
【００３８】
一実施形態では、抗体は、表面上にＮＫｐ４６を発現している細胞に対し、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）および／または抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する、または媒介できる。
【００３９】
一実施形態では、抗体（例えば、免疫複合体）は、表面上にＮＫｐ４６を発現している細胞に対し、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介しない、または媒介できない。例えば、抗体は、その重鎖中のアミノ酸残基Ｎ２９７（Ｋａｂａｔ  ＥＵナンバリング）の位置にＮ結合型グリコシル化を欠き得る、および／またはＦｃドメイン中に、ヒトＣＤ１６Ａおよび／またはその他のヒトＦｃγ受容体に対する結合を低減または中止するアミノ酸改変を含み得る。
【００４０】
一実施形態では、提供されるのは、抗ＮＫｐ４６抗体の作製および／または試験方法であり、該方法は、（ｉ）抗体が、本明細書に記載のＮＫｐ４６上のエピトープまたは領域に結合する（抗体８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂおよび／または１７Ｅ１により結合されるＮＫｐ４６上の１個または複数のアミノ酸残基、および／または抗体８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂおよび／または１７Ｅ１と、ＮＫｐ４６ポリペプチドに対する結合に関し競合する、および／または配列番号１のＮＫｐ４６ポリペプチドの残基１００〜１８７に対応するセグメント中の少なくとも１個の残基に結合する）かどうかを評価するステップ；および／または（ｉｉ）抗体が、表面上にＮＫｐ４６を発現している細胞に対し、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）および／または抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導するかどうかを評価するステップ、を含む。ステップ（ｉ）は、場合により、ＮＫｐ４６ポリペプチドに結合する抗体を、ＮＫｐ４６ポリペプチド（例えば、単離ポリペプチドまたは細胞の表面上に発現したポリペプチド）と接触させることを含み得、場合により、ＮＫｐ４６ポリペプチドは、変異ポリペプチドである。ステップ（ｉｉ）は、場合により、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）の存在下で、ＮＫｐ４６ポリペプチドに結合する抗体を、ＮＫｐ４６ポリペプチドを発現している細胞（例えば、腫瘍細胞）と接触させることを含み得る。
【００４１】
別の実施形態では、提供されるのは、哺乳動物対象中の、場合により、癌の治療のために、ＮＫｐ４６ポリペプチドに結合する抗体または免疫複合体を作製、評価、選択またはスクリーニングする方法であり、該方法は、下記のステップを含む：
ａ）細胞傷害性部分に結合したヒトＮＫｐ４６に結合する抗体を含む複数の免疫複合体を用意するステップであって、免疫複合体が、その高頻度可変領域アミノ酸配列が異なるが、同じ細胞傷害性部分を有し、抗体当たり同じ数の細胞傷害性部分を共有するステップ；および
ｂ）複数から抗体または免疫複合体を選択するための選択ステップを実施するステップであって、
（ｉ）免疫複合体が表面上にＮＫｐ４６を発現している細胞を（直接的に）削除できるかどうかを評価する（例えば、エフェクター機能を欠く免疫複合体として、免疫エフェクター細胞の非存在下で、ＮＫｐ４６＋発現細胞以外の細胞の非存在下で、および／または非腫瘍細胞の非存在下で）ことを含むステップ。一実施形態では、各免疫複合体は、高頻度可変領域を共有する複数の免疫複合体を含む組成物であり、各組成物中の免疫複合体の少なくとも９０％は、抗体またはフラグメント当たり、（ｍ）細胞傷害性部分を有し、ｍは、２または４からから選択される整数である。一実施形態では、各細胞傷害性部分は、抗体の一次アミノ酸配列内のアクセプターグルタミンに結合される。
【００４２】
場合により、方法は、（ｉｉ）抗体が、本明細書に記載のＮＫｐ４６上の領域またはエピトープに結合する（抗体８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂおよび／または１７Ｅ１により結合されるＮＫｐ４６上の１個または複数のアミノ酸残基、および／または抗体８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂおよび／または１７Ｅ１と、ＮＫｐ４６ポリペプチドに対する結合に関し競合する、および／または配列番号１のＮＫｐ４６ポリペプチドの残基１００〜１８７に対応するセグメント中の少なくとも１個の残基に結合する）かどうかを評価するステップ；および／または（ｉｉｉ）抗体が、表面上にＮＫｐ４６を発現している細胞に対し、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導するかどうかを評価するステップ、をさらに含む。
【００４３】
一実施形態では、方法は、表面上にＮＫｐ４６を発現している細胞を（直接的に）除去できる免疫複合体を選択するステップをさらに含む。一実施形態では、方法は、本明細書に記載のＮＫｐ４６上のエピトープに結合する（抗体８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂおよび／または１７Ｅ１により結合されるＮＫｐ４６上の１個または複数のアミノ酸残基、および／または抗体８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂおよび／または１７Ｅ１と、ＮＫｐ４６ポリペプチドに対する結合に関し競合する、および／または配列番号１のＮＫｐ４６ポリペプチドの残基１００〜１８７に対応するセグメント中の少なくとも１個の残基に結合する）免疫複合体を選択するステップをさらに含む。一実施形態では、方法は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導する免疫複合体を選択するステップをさらに含む。一実施形態では、方法は、選択免疫複合体をさらに処理するステップ、一定量の選択免疫複合体を作製するステップ、および／または選択免疫複合体のインビトロまたはインビボ生物活性をさらに試験するステップをさらに含む。
【００４４】
別の実施形態では、提供されるのは、ＮＫｐ４６ポリペプチドに結合する抗体を作製する方法であり、該方法は、本明細書で記載の抗ＮＫｐ４６を発現している組換え宿主細胞を培養するステップ、および該宿主細胞により作製された抗ＮＫｐ４６抗体を回収するステップを含み、場合により、該抗体をヒト対象への投与のために処方する（例えば、医薬賦形剤と共に）ことをさらに含む。
【００４５】
場合により、本明細書のいずれかの実施形態の化合物は抗体であり、場合により、２つのＩｇ重鎖および２つのＩｇ軽鎖を含む四量体抗体である。
【００４６】
一実施形態では、抗ＮＫｐ４６抗体は、「裸の抗体」であり、毒剤とは結合しておらず、場合により、裸の抗体は、Ｆｃγ受容体、例えば、ＣＤ１６に対する結合を増大させるように改変されたＦｃ領域を含む。一実施形態では、裸のまたは結合した抗体は、Ｆｃγ受容体（例えば、ＣＤ１６）に結合するヒトＦｃ領域（例えば、ＩｇＧ１）を含む重鎖を含む。場合により、このような抗体は、表面上にＮＫｐ４６を発現している細胞に対し、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）および／または抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導する。
【００４７】
本明細書のいずれかの実施形態の一態様では、抗体は、抗体８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂおよび１７Ｅ１からなる群より選択される抗体のそれぞれの重鎖および／または軽鎖の１、２または３個のＣＤＲを有する重鎖および／または軽鎖を有する。
【００４８】
一実施形態では、抗体はキメラであり、例えば、非マウス、場合により、ヒト定常領域を含む。一実施形態では、抗体は、ヒトフレームワークアミノ酸配列を含む可変領域を有する。一実施形態では、抗体はヒト抗体であるか、またはヒト化されている。いずれかの実施形態の一態様では、抗体のアイソタイプは、ヒトＩｇＧ、場合により、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４である。一実施形態では、抗体は、ヒトＦｃドメインを含み、またはヒトＦｃγＲ（例えば、ＦｃγＲＩＩＩＡ）、例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ３アイソタイプの抗体により結合されたアイソタイプのＦｃドメインである。
【００４９】
一実施形態では、抗体は、細胞傷害薬に結合された抗体を含む免疫複合体であり、抗体は、天然では、ヒトＦｃγＲ（例えば、ＦｃγＲＩＩＩＡ）により結合されるが、ヒトＦｃγＲポリペプチド（例えば、ＣＤ１６Ａ、ＣＤ１６Ｂ、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂ、ＣＤ６４）に対する結合を低減するための１個または複数のアミノ酸改変を含むアイソタイプのヒトＦｃドメインを含む。一実施形態では、抗体は、天然では、ヒトＦｃγＲ（例えば、ＦｃγＲＩＩＩＡ）により結合されるが、そのＦｃドメインは、Ｎ２９７−連結グリコシル化（Ｋａｂａｔ  ＥＵナンバリング）を欠き、ヒトＦｃγＲポリペプチド（例えば、ＣＤ１６Ａ、ＣＤ１６Ｂ、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂ、ＣＤ６４）に対し結合しない／低結合であるアイソタイプのヒトＦｃドメインを含む。
【００５０】
いずれかの実施形態の一態様では、抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ダイアボディ、単鎖抗体フラグメント、または複数の異なる抗体フラグメントを含む多重特異的抗体（例えば、二重特異性抗体、三重特異性抗体）から選択される抗体フラグメントであるかまたはこれを含む。場合により、抗体は、四量体（２つの重鎖および２つの軽鎖）であり、二価形式（例えば、ＩｇＧ抗体）でＮＫｐ４６に結合する。
【００５１】
一実施形態では、抗体は、例えば、インビトロで、ＮＫｐ４６発現細胞の少なくとも２０％、３０％、４０％または５０％の細胞死を、直接的に誘導できる（例えば、免疫エフェクター細胞の非存在下で）。
【００５２】
一態様では、提供されるのは、ＮＫｐ４６に特異的に結合する除去抗体を用いた治療方法である。抗体は、予防または治療処置薬として使用でき、本明細書のいずれかの実施形態では、治療有効量の抗体は、予防有効量の抗体と置き換え可能である。一態様では、提供されるのは、増殖性ＮＫｐ４６発現細胞を特徴とする癌またはその他の増殖性疾患の患者の治療方法であり、該方法は、患者に薬学的有効量の本開示の抗体を投与することを含む。一実施形態では、癌はリンパ腫である。一実施形態では、癌または疾患は、ＰＴＣＬ−ＮＯＳ、ＡＩＴＬ、またはＡＬＣＬ（ＡＬＫ＋またはＡＬＫ−）、ＡＴＬ、ＮＫ−／Ｔ細胞リンパ腫、節外性ＮＫ−／Ｔ細胞性リンパ腫、鼻型、ＥＡＴＬ、セリアック病、難治性セリアック病Ｉ型（ＲＣＤＩ）および難治性セリアック病ＩＩ型（ＲＣＤＩＩ）からなる群より選択される。一実施形態では、抗体は、抗体８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂおよび１７Ｅ１からなる群より選択される抗体の重鎖および軽鎖ＣＤＲ（例えば、Ｋａｂａｔナンバリングスキームに従う）を含む抗体である。一実施形態では、抗体は、抗体８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂまたは１７Ｅ１と、ＮＫｐ４６に対する結合に関し競合する抗体、または前述の抗体のいずれか１個と同じエピトープに結合する抗体、および／または配列番号１のＮＫｐ４６ポリペプチドの残基１００〜１８７に対応するセグメント中の少なくとも１個の残基に結合する抗体である。
【００５３】
治療方法では、癌の治療に用いる場合、抗ＮＫｐ４６抗体を、抗癌剤（例えば、化学療法剤、腫瘍ワクチン剤、腫瘍細胞上の腫瘍特異的抗原に結合する抗体、腫瘍細胞を除去する抗体、免疫応答を増強する抗体、など）を含む第２の治療薬と組み合わせて用いて、個体を治療できる。
【００５４】
さらに提供されるのは、本開示の抗ＮＫｐ４６剤（例えば、ＮＫｐ４６ポリペプチドに結合する抗体）を用いた治療に応答する障害（例えば、癌）の対象を選択する方法であり、該方法は、該対象中の細胞（例えば、腫瘍細胞）がＮＫｐ４６ポリペプチドを発現しているかどうか、ＮＫｐ４６ポリペプチドの発現が奏効対象の指標となるかどうかを判定することを含む。一実施形態では、方法は、該対象中の細胞（例えば、腫瘍細胞、炎症促進性細胞、など）が配列番号１のアミノ酸配列を有するＮＫｐ４６ポリペプチドを発現しているがどうかを判定することを含む。一実施形態では、該対象中の細胞がＮＫｐ４６ポリペプチドを発現しているかどうかを判定するステップは、対象由来の生物試料（例えば、癌細胞、血液または任意の組織試料、などの試料を取得することによる）を本開示の抗ＮＫｐ４６抗体と接触させることを含む。
【００５５】
場合により、いずれかの方法では、方法は、奏効対象に、ＮＫｐ４６ポリペプチドに結合する抗体（例えば、本開示の抗ＮＫｐ４６抗体）を投与することをさらに含む。
【００５６】
好ましい実施形態では、疾患関連細胞中でのＮＫｐ４６ポリペプチドの発現は、ＮＫｐ４６特異的リガンドを用いて特定される。好ましくは、リガンドは抗体、またはフラグメントもしくはその誘導体である。
【００５７】
別の態様では、提供されるのは、患者が、ＮＫｐ４６ポリペプチド、例えば、本開示の抗体に結合されるＮＫｐ４６ポリペプチド（１つまたは複数のＮＫｐ４６アレル）を発現している疾患関連細胞（例えば、腫瘍細胞）を有するかどうかを判定することを含む方法（例えば、診断アッセイ、奏効者アッセイ、などを実施する方法）である。該方法は、例えば、疾患関連細胞を含む患者から生物試料を取得すること、該疾患関連細胞を前述の抗体と接触させること、および抗体が疾患関連細胞に結合するかどうかを評価することを含み得る。ＮＫｐ４６が疾患関連細胞により発現されるという知見は、患者がＮＫｐ４６発現細胞を特徴とするおよび／または本開示の抗ＮＫｐ４６抗体による治療に好適する状態を有することを示す。患者は、ＮＫｐ４６発現細胞を特徴とする特定の疾患に好適な治療薬でさらに治療され得る。場合により、患者は抗ＮＫｐ４６抗体で治療される。一実施形態では、方法は、癌を有する対象を選択するために使用され、疾患関連細胞は癌細胞である。
また、提供されるのは、個体を治療する方法であり、該方法は、下記を含む：
ａ）個体が病原性ＮＫｐ４６発現細胞を有しているかどうかを判定すること、および
ｂ）個体が病原性ＮＫｐ４６発現細胞を有する患者であると判定される場合、本開示の抗原結合化合物（例えば、抗体）を投与すること。
【００５８】
一実施形態では、提供されるのは、個体の末梢性Ｔ細胞リンパ腫を治療または予防する方法であり、該方法は、個体に治療有効量の本明細書で開示の抗ＮＫｐ４６抗原結合化合物を投与することを含む。一態様では、抗ＮＫｐ４６化合物を含む組成物を、ＬＤＧＬ（顆粒状リンパ球のリンパ増殖性疾患）、場合により、ＮＫ−ＬＤＧＬ（顆粒状リンパ球のＮＫ型リンパ増殖性疾患；ＮＫ−ＬＧＬとも呼ばれる）の治療または予防に使用できる。一態様では、抗ＮＫｐ４６化合物を含む組成物を、末梢性Ｔ細胞リンパ腫の治療または予防に使用できる。場合により、該治療または予防は、ＰＴＣＬ（ＰＴＣＬへ進行し易い状態を含む）の個体に対するＮＫｐ４６ポリペプチドに結合する化合物の投与を含む。本明細書の治療的使用またはＰＴＣＬ治療または予防方法のいずれかの一実施形態では、個体は、ＮＫ／Ｔリンパ腫を有する。本明細書の治療的使用またはＰＴＣＬ治療または予防方法のいずれかの一実施形態では、個体は、腸疾患関連Ｔ細胞リンパ腫（ＥＡＴＬ）、ＲＣＤＩまたはＲＣＤＩＩを有する。本明細書の治療的使用またはＰＴＣＬ治療または予防方法のいずれかの一実施形態では、個体は、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）を有する。本明細書の治療的使用またはＰＴＣＬ治療または予防方法のいずれかの一実施形態では、個体は、ＰＴＣＬ−ＮＯＳを有する。本明細書の治療的使用またはＰＴＣＬ治療または予防方法のいずれかの一実施形態では、個体のＰＴＣＬ（例えば、ＥＡＴＬ、ＲＣＤＩ、ＲＣＤＩＩ、ＡＬＣＬ、ＰＴＣＬ−ＮＯＳ）の治療または予防は、次記を含む：
ａ）ＰＴＣＬを有する個体中の悪性細胞のＮＫｐ４６ポリペプチド状態を判定すること、および
ｂ）患者において、ＮＫｐ４６ポリペプチドが悪性細胞の表面上に主に発現していると判断される場合、本明細書のいずれかの実施形態のＮＫｐ４６ポリペプチドに結合する化合物を個体に投与すること。
【００５９】
本明細書のいずれかの態様の一実施形態では、ＰＴＣＬは、高悪性度および／または進行型ＰＴＣＬである。一実施形態では、ＰＴＣＬは高悪性度、非皮膚性ＰＴＣＬである。一実施形態では、ＰＴＣＬはＰＴＣＬ−ＮＯＳである（ＰＣＴＬ−Ｕとも呼ばれる）。一実施形態では、ＰＴＣＬは、結節性（例えば、一次結節性）ＰＴＣＬ、例えば、ＰＴＣＬ−ＮＯＳ、ＡＩＴＬ、またはＡＬＣＬ（ＡＬＫ＋またはＡＬＫ−）である。一実施形態では、ＰＴＣＬは未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、場合により、ＡＬＫ陰性ＡＬＣＬである。一実施形態では、ＰＴＣＬは、血管免疫芽細胞性Ｔ細胞性リンパ腫（ＡＩＴＬ）であり、場合により、皮膚性ＡＩＴＬであり、場合により、非皮膚性ＡＩＴＬである。一実施形態では、ＰＴＣＬは、高悪性度、非皮膚性、一次結節性ＰＣＴＬであり得る。一実施形態では、ＰＴＣＬは結節外（例えば、一次結節外）ＰＴＣＬである。一実施形態では、ＰＴＣＬは、高悪性度、非皮膚性、結節外ＰＣＴＬであり得る。一実施形態では、ＰＴＣＬは成人Ｔ細胞白血病またはリンパ腫（ＡＴＬ）、例えば、ＨＴＬＶ＋ＡＴＬである。一実施形態では、ＰＴＣＬは、オルト（ｏｒｔｈｏ）内臓節外性疾患、例えば、ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫または腸疾患関連Ｔ細胞リンパ腫である。一実施形態では、ＰＴＣＬは結節外ＮＫ／Ｔ細胞性リンパ腫、鼻型である。一実施形態では、ＰＴＣＬは、ＲＣＤＩ、ＲＣＤＣＩＩ、腸疾患関連Ｔ細胞リンパ腫（ＥＡＴＬ）である。
【００６０】
本発明のこれらおよび追加の有利な態様および特徴は、本明細書の他の箇所でさらに説明され得る。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】ＮＫ−／Ｔ−リンパ腫細胞上の抗ＮＫｐ４６抗体による染色を示す。この図は、ＮＫｐ４６陽性細胞がＣＤ１８３（ＣＸＣＲ３）、ＣＤ５６およびＣＤ５４（ＩＣＡＭ）を発現することをさらに示す。
【図２Ａ】ＮＫｐ４６＋ＮＫ／Ｔリンパ腫細胞株、ＳＮＫ６に対するＮＫ細胞によるＡＤＣＣの誘導を示す。これらのＡＤＣＣアッセイでは、Ａ．ヒトＣＤ１６を遺伝子導入したＮＫ細胞株、Ｂ．ヒト血液から生成したＮＫ、をエフェクター細胞として使用した。いずれの場合も、ＳＮＫ６標的（Ｔ）細胞を５１Ｃｒと共に充填し、示した濃度のキメラ抗ＮＫｐ４６の存在下、エフェクター（Ｅ）細胞と、比Ｅ：Ｔ＝１０：１で混合した。４時間のインキュベーション時間後に、培地中での５１Ｃｒの放出を評価した。特異的溶解パーセントを最小および最大放出対照と比較して、計算した。
【図２Ｂ】ＮＫｐ４６＋ＮＫ／Ｔリンパ腫細胞株、ＳＮＫ６に対するＮＫ細胞によるＡＤＣＣの誘導を示す。これらのＡＤＣＣアッセイでは、Ａ．ヒトＣＤ１６を遺伝子導入したＮＫ細胞株、Ｂ．ヒト血液から生成したＮＫ、をエフェクター細胞として使用した。いずれの場合も、ＳＮＫ６標的（Ｔ）細胞を５１Ｃｒと共に充填し、示した濃度のキメラ抗ＮＫｐ４６の存在下、エフェクター（Ｅ）細胞と、比Ｅ：Ｔ＝１０：１で混合した。４時間のインキュベーション時間後に、培地中での５１Ｃｒの放出を評価した。特異的溶解パーセントを最小および最大放出対照と比較して、計算した。
【図３】ラージ異種移植片マウスモデルにおける、抗ＮＫｐ４６を用いた抗腫瘍効力を示す。高レベルのＮＫｐ４６を発現している５ｘ１０６個のラージ細胞をＳＣＩＤマウスの静脈内（ｉ．ｖ）に移植した。腫瘍細胞移植の１日後、マウスをアイソタイプ対照抗体（ＩＣ）または抗ＮＫｐ４６キメラ抗体（８Ｂ６−Ａ、９Ｈ１１−Ｂ、１７Ｅ１）を用いて、３００μｇ／マウス、週２回の投与量で３週間にわたり腹腔内治療した。マウスを週２回秤量した。カプランマイヤー生存曲線を作成し、治療マウスの生存を評価した。
【図４】８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂおよび１７Ｅ１の組み合わせ間で、ヒトＮＫｐ４６に対する結合の競合を評価する試験（表面プラズモン共鳴法による）の結果を示す。それぞれの抗体は、ＮＫｐ４６に対する結合に関し、相互に競合し、これらの抗体は全て、ＮＫｐ４６上の共通領域に結合することを示した。
【図５】抗体８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂおよび１７Ｅ１ならびに既知の抗体間で、ヒトＮＫｐ４６に対する結合の競合を評価する試験（表面プラズモンリフローサイトメトリー（ｒｅｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）による）の結果を示す。８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂおよび１７Ｅ１群は全て、ＮＫｐ４６に対し、相互に競合したが、既知の抗体とは、いずれも競合しなかった。
【図６Ａ】抗体９Ｈ１１Ａ、８Ｂ６Ａおよび１７Ｅ１により結合されたセグメントがそれぞれ示されているＮＫｐ４６の三次構造（３つの方向での）を示す。
【図６Ｂ】抗体９Ｈ１１Ａ、８Ｂ６Ａおよび１７Ｅ１により結合されたセグメントがそれぞれ示されているＮＫｐ４６の三次構造（３つの方向での）を示す。
【図６Ｃ】抗体９Ｈ１１Ａ、８Ｂ６Ａおよび１７Ｅ１により結合されたセグメントがそれぞれ示されているＮＫｐ４６の三次構造（３つの方向での）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６２】
定義
本明細書で使用される「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は１つまたは複数を意味し得る。請求項で使用され、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語と共に使用される場合、「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」という語は１つまたは２つ以上を意味し得る。本明細書で使用する場合、用語の「別の（ａｎｏｔｈｅｒ）」は、少なくとも第２番目以降を意味し得る。
【００６３】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」が使用される場合、これは、「基本的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」、または「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」で置き換えることができる。
【００６４】
「ＮＫｐ４６ポリペプチド」および「ＮＫｐ４６受容体」は、Ｎｃｒ１遺伝子またはこのような遺伝子から調製されるｃＤＮＡによって、コードされるタンパク質またはポリペプチドを意味する。天然に存在するアイソフォーム、アレル、またはバリアントのいずれかは、ＮＫｐ４６ポリペプチドという用語（例えば、配列番号１に９０％、９５％、９８％、もしくは９９％同一のＮＫｐ４６ポリペプチド、またはその少なくとも２０、３０、５０、１００、もしくは２００個のアミノ酸残基の連続した配列）に包含される。ヒトＮＫｐ４６（アイソフォームａ）の３０４個のアミノ酸残基の配列は、以下のように示される：
MSSTLPALLC VGLCLSQRIS AQQQTLPKPF IWAEPHFMVP KEKQVTICCQ GNYGAVEYQL HFEGSLFAVD RPKPPERINK VKFYIPDMNS RMAGQYSCIY RVGELWSEPS NLLDLVVTEM YDTPTLSVHP GPEVISGEKV TFYCRLDTAT SMFLLLKEGR SSHVQRGYGK VQAEFPLGPV TTAHRGTYRC FGSYNNHAWS FPSEPVKLLV TGDIENTSLA PEDPTFPADT WGTYLLTTET GLQKDHALWD HTAQNLLRMG LAFLVLVALV WFLVEDWLSR KRTRERASRA STWEGRRRLN TQTL（配列番号１）。
【００６５】
配列番号１は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿００４８２０に対応し、この開示は、参照により本明細書に組み込まれる。ヒトＮＫｐ４６  ｍＲＮＡ配列は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００４８２９に示されており、この開示は、参照により本明細書に組み入まれる。
【００６６】
本開示の特定の態様は、ヒトＮＫｐ４６、または、限定されないが、哺乳動物ＮＫｐ４６タンパク質および他の種、例えば、非ヒト霊長類、カニクイザルからのＮＫｐ４６オルソログを含む、その相同体に結合する抗ＮＫｐ４６抗体を提供する。
【００６７】
この全明細書内で、「増殖性疾患の治療」または「腫瘍の治療」、または「癌の治療」などが、抗ＮＫｐ４６結合物質（例えば、抗体）に関連して言及されるときはいつでも、下記が意図されている：（ａ）増殖性疾患の治療方法であって、抗ＮＫｐ４６結合物質（好ましくは、薬学的に許容可能な担体材料中に入れて）を、このような治療を必要としている温血動物、特にヒトに、該疾患の治療を可能とする投与量（治療有効量）で、好ましくは、本明細書で前述および本明細書中以下において好ましいと特定された投与量（量）で、投与する（少なくとも１つの治療のために）ステップを含む治療方法；（ｂ）増殖性疾患の治療のための抗ＮＫｐ４６結合物質の使用、または該治療で（特にヒトで）使用するための抗ＮＫｐ４６結合物質；（ｃ）増殖性疾患の治療用の製剤の製造のための抗ＮＫｐ４６結合物質の使用、増殖性疾患の治療用の製剤の製造のための抗ＮＫｐ４６結合物質の使用方法であって、抗ＮＫｐ４６結合物質と薬学的に許容可能な担体とを混合することを含む方法、または増殖性疾患の治療に適切な；有効量の抗ＮＫｐ４６結合物質を含む製剤または（ｄ）この出願が申請される国で許可され得る主題と一致する、ａ）、ｂ）、およびｃ）の任意の組み合わせ。
【００６８】
「ＴＧａｓｅ」または「ＴＧ」と同じ意味で用いられる用語の「トランスグルタミナーゼ」は、ペプチド結合グルタミンのγ−カルボキサミド基と、リシンのアミノペンチル基などのε−アミノ基または構造的に関連する一級アミン、例えば、ペプチド結合リシンとの間のアシル転移反応によりタンパク質を架橋して、ε−（γ−グルタミル）リシンイソペプチド結合を形成できる酵素を意味する。ＴＧａｓｅには、特に、ＥＣ参照番号ＥＣ２．３．２．１３（タンパク質−グルタミン−γ−グルタミルトランスフェラーゼ）などの細菌性トランスグルタミナーゼ（ＢＴＧ）が含まれる。
【００６９】
用語の「アクセプターグルタミン残基」は、抗体のグルタミン残基に関する場合、ＴＧａｓｅにより認識され、グルタミンとリシンまたはアミノペンチル基などの構造的に関連する一級アミンとの間の反応を介してＴＧａｓｅにより架橋され得るグルタミン残基を意味する。好ましくは、アクセプターグルタミン残基は、表面露出グルタミン残基である。
【００７０】
用語の「ＴＧａｓｅ認識タグ」は、アクセプターグルタミン残基を含むアミノ酸配列を意味し、好適な条件下で、ポリペプチド配列中に組み込まれる（例えば、それに付加される）場合、タグは、ＴＧａｓｅにより認識され、アミノ酸配列内のアミノ酸側鎖と反応パートナーとの間の反応を介してＴＧａｓｅにより架橋を生ずる。認識タグは、酵素認識を含む天然のタグポリペプチド中に存在しないペプチド配列であり得る。
【００７１】
本明細書で使用される場合、用語の「癌」および「腫瘍」は、無制御および進行性増殖を含む細胞または組織の新規増殖として定義される。特定の実施形態では、自然経過の場合、癌は致命的である。
【００７２】
本明細書で使用される場合、用語の「抗体」は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を意味する。重鎖中の定常ドメインのタイプに応じて、抗体は、５つの主要クラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ、の内の１つに割り当てられる。これらの内のいくつかは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、などのサブクラスまたはアイソタイプにさらに分割される。代表的免疫グロブリン（抗体）構造単位は、四量体を含む。四量体はそれぞれ、ポリペプチド鎖の２つの同一の対から構成され、各対は１個の「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１個の「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のＮ末端は、主に抗原認識に関与する約１００〜１１０個またはそれを超えるアミノ酸の可変領域を規定する。用語の軽鎖可変領域（ＶＬ）および重鎖可変領域（ＶＨ）は、これらの軽鎖および重鎖をそれぞれ意味する。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれアルファ、デルタ、エプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造体および三次元立体配置はよく知られている。ＩｇＧは容易に採用できる。理由は、それらは、生理学的状況下で最もよくある抗体であり、それらは実験室で最も容易に作製できるためである。抗体は、モノクローナル抗体とすることができる。が特に好ましいのは、ヒト化、キメラ、ヒト抗体または別の方法によるヒトに好適する抗体である。「抗体」はまた、本明細書で記載の抗体のいずれかの任意のフラグメントまたは誘導体も含む。
【００７３】
「超可変領域」という用語は、本明細書で使用される場合、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を意味する。超可変領域は、一般に、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」のアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変ドメインの残基２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）、および８９−９７（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメインの残基３１−３５（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）、および９５−１０２（Ｈ３）、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．１９９１）、および／または「超可変ループ」のアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変ドメインの残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）、および９１−９６（Ｌ３）および重鎖可変ドメインの残基２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）、および９６−１０１（Ｈ３）、Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ  １９８７、１９６：９０１−９１７）を含む。通常、この領域のアミノ酸残基のナンバリングは、前出のＫａｂａｔらに記載の方法により行われる。本明細書の「Ｋａｂａｔ位置」、「Ｋａｂａｔと同様の可変ドメイン残基のナンバリング」、および「Ｋａｂａｔによる」などの語句は、重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインについてのこのナンバリング方式を意味する。Ｋａｂａｔナンバリング方式を用いると、ペプチドの実際の線形アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲまたはＣＤＲの短縮またはＦＲまたはＣＤＲへの挿入に一致するより少ないまたは追加のアミノ酸を含み得る。例えば、重鎖可変ドメインは、ＣＤＲ  Ｈ２の残基５２の後の単一アミノ酸挿入（Ｋａｂａｔによる残基５２ａ）および重鎖ＦＲ残基８２の後の挿入残基（例えば、Ｋａｂａｔによる残基８２ａ、８２ｂ、および８２ｃなど）を含み得る。残基のＫａｂａｔナンバリングは、抗体の配列の相同領域と「基準」Ｋａｂａｔナンバリング配列とのアラインメントによって、所与の抗体について決定できる。
【００７４】
本明細書で使用される「フレームワーク」または「ＦＲ」残基とは、ＣＤＲとして定義される部分を除く抗体可変ドメインの領域のことである。各抗体可変ドメインフレームワークは、ＣＤＲにより分離された連続した領域にさらに細分できる（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４）。
【００７５】
抗体が、特定のモノクローナル抗体（例えば、８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂまたは１７Ｅ１）と「競合する」と言われる場合、これは、抗体が、組換えＮＫｐ４６分子または表面発現標的ＮＫｐ４６分子のいずれかを用いた結合アッセイでモノクローナル抗体と競合することを意味する。例えば、試験抗体が、結合アッセイにおいて、８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂまたは１７Ｅ１のＮＫｐ４６ポリペプチドまたはＮＫｐ４６発現細胞に対する結合性を低下させる場合、抗体は、それぞれ６８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂまたは１７Ｅ１と「競合する」と言われる。
【００７６】
本明細書で使用される場合、「親和性」という用語は、抗体のエピトープへの結合の強さを意味する。抗体の親和性は、［Ａｂ］×［Ａｇ］／［Ａｂ−Ａｇ］として定義される解離定数ＫＤにより示され、［Ａｂ−Ａｇ］は抗体−抗原複合体のモル濃度であり、［Ａｂ］は非結合抗体のモル濃度であり、および［Ａｇ］は非結合抗原のモル濃度である。親和定数Ｋａは１／Ｋｄにより定義される。ｍＡｂの親和性の決定に好ましい方法は、参照によりその全内容が本明細書に組み入れられるＨａｒｌｏｗ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８８），Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．，（１９９２，１９９３）、およびＭｕｌｌｅｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．９２：５８９−６０１（１９８３）に記載されている。ｍＡｂの親和性を決定するための当技術分野で周知の１つの好ましい標準的な方法では、（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）ＳＰＲ分析装置での分析による）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）スクリーニングを使用する。
【００７７】
「エピトープ」という用語は、抗原決定基を意味し、抗体が結合する抗原の範囲または領域である。タンパク質エピトープは、結合に直接関与するアミノ酸残基、ならびに特定の抗原結合抗体またはペプチドによって、効果的にブロックされるアミノ酸残基、即ち、抗体の「フットプリント」内のアミノ酸残基を含み得る。タンパク質エピトープは、例えば、抗体または受容体と結合できる複合抗原分子上の最も単純な形態または最も小さい構造領域である。エピトープは、線形または高次構造／構造であり得る。「線形エピトープ」という用語は、アミノ酸の線形配列（一次構造）上の連続したアミノ酸残基から構成されるエピトープとして定義される。「高次構造または構造エピトープ」という用語は、全てが連続的な（不連続な）わけではないアミノ酸残基から構成され、従って分子の折り畳み（二次、三次、および／または四次構造）によって、互いに近接するアミノ酸の線形配列の分離した部分を表すエピトープとして定義される。高次構造エピトープは三次元構造によって、決まる。従って、「高次構造の」という用語は、「構造の」という語と同義的に使用される場合が多い。
【００７８】
ＮＫｐ４６発現細胞に関する用語の「削除」は、試料または対象中に存在するＮＫｐ４６発現細胞の数を減らすように、死滅、除去、溶解させる、またはこのような死滅、排除または溶解を誘導する工程、方法、または化合物を意味する。
【００７９】
用語の「免疫複合体」および「抗体結合体」は、同じ意味で用いられ、抗原結合物質、例えば、抗体結合ポリペプチドまたは別の部分（例えば、検出可能部分、治療薬、細胞傷害薬、抗癌剤）に結合された抗体を意味する。免疫複合体が、治療薬、例えば、細胞傷害薬または抗癌剤に結合された抗原結合物質を含む場合、免疫複合体はまた、「抗体薬物複合体」または「ＡＤＣ」と呼ばれることもある。
【００８０】
本明細書で使われる場合、用語の「薬剤」は、化学化合物、化学化合物の混合物、生体高分子、または生体物質から作製された抽出物を意味する。用語の「治療薬」は、生物活性を有する薬剤を意味する。
【００８１】
用語の「毒剤」および「細胞傷害薬」は、細胞の増殖を遅らせる、停止する、または逆転させる、それらの活性をいずれかの検出可能な方法で低減させる、またはそれらを直接的にもしくは間接的に死滅させることができる任意の化合物を包含する。細胞傷害薬は、主に、細胞の機能動作を直接的に妨害することにより細胞死を引き起こし得るものであり、これには、限定されないが、アルキル化剤、腫瘍壊死因子阻害剤、ＤＮＡインターカレーター、ＤＮＡ副溝結合剤、微小管阻害剤、キナーゼ阻害剤、プロテアソーム阻害剤およびトポイソメラーゼ阻害剤が挙げられる。本明細書で使用される場合、「毒性ペイロード」は、細胞に送達された場合、細胞死をもたらす、細胞傷害薬の十分な量を意味する。毒性ペイロードの送達は、本開示の抗体または抗原結合フラグメントおよび細胞傷害薬を含む、十分な量の免疫複合体の投与により実現し得る。毒性ペイロードの送達は、細胞傷害薬を含む、十分な量の免疫複合体の投与により実現し得、免疫複合体は、本開示の抗体を認識し、結合する二次抗体またはその抗原結合断片を含む。
【００８２】
「ヒト化」または「ヒト」抗体は、１個または複数のヒト免疫グロブリンの定数および可変フレームワーク領域が、動物免疫グロブリンの結合領域、例えば、ＣＤＲと融合されている抗体を意味する。このような抗体は、結合領域が由来する非ヒト抗体の結合特異性を維持するが、非ヒト抗体に対する免疫反応は防止されるように設計されている。このような抗体は、抗原投与に応答して特異的ヒト抗体を産生するように「遺伝子改変」された遺伝子導入マウスまたはその他の動物から得ることができる（例えば、Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ  ７：１３；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６；Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６：５７９を参照されたい。この文献の全教示は、参照により本明細書に組み込まれる）。完全ヒト抗体はまた、遺伝子または染色体遺伝子導入法、ならびに、ファージディスプレイ技術により構築できる。これらの技術は全て、当技術分野において既知である（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５３を参照されたい）。ヒト抗体はまた、インビトロ活性化Ｂ細胞により生成し得る（例えば、米国特許第５，５６７，６１０号および同第５，２２９，２７５号を参照されたい。これらの特許は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【００８３】
「キメラ抗体」は、（ａ）定常領域、またはその一部が、抗原結合部位（可変領域）が異なるもしくは変更されたクラス、エフェクター機能および／または種の定常領域に、または新規特性をキメラ抗体に付与する全く異なる分子、例えば、酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬物、などに連結されるように、変更、置換もしくは交換されている；または（ｂ）可変領域、またはその一部が、異なるまたは変更された抗原特異性を有する可変領域で変更、置換もしくは交換されている、抗体分子である。
【００８４】
用語の「Ｆｃドメイン」、「Ｆｃ部分」、および「Ｆｃ領域」は、抗体重鎖のＣ末端フラグメント、例えば、ヒトγ（ガンマ）重鎖の約アミノ酸（ａａ）２３０〜ａａ４５０または抗体重鎖の他のタイプのそれの対応配列（例えば、ヒト抗体のα、δ、εおよびμ）、またはその天然のアロタイプを意味する。別段の指定がない限り、一般に是認されている免疫グロブリンのＫａｂａｔアミノ酸ナンバリングがこの開示全体を通して使用される（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  ｅｄ．，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤを参照されたい。「Ｋａｂａｔ  ＥＵ」とも呼ばれる）。
【００８５】
用語の「抗体依存性細胞傷害」または「ＡＤＣＣ」は、当該技術分野において十分に理解されている用語であり、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現している非特異的細胞傷害性細胞が標的細胞上の結合抗体を認識し、その後、標的細胞を溶解させる細胞媒介反応を意味する。ＡＤＣＣを媒介する非特異的細胞傷害性細胞には、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、単球、好中球、および好酸球が挙げられる。
【００８６】
用語の「補体依存性細胞傷害」または「ＣＤＣ」は、当該技術分野において十分に理解されている用語であり、補体の存在下で、標的を溶解する分子の能力を意味する。補体活性化経路は、同族抗原と複合化された分子（例えば、抗体）に補体系（Ｃ１ｑ）の最初の成分が結合することによって開始される。
【００８７】
「内在化」という用語は、「細胞内内部移行」と同義に用いられ、分子を細胞の細胞外表面から細胞の細胞内表面に輸送する過程に関連する分子事象、生化学的事象、および細胞事象を意味する。分子の細胞内内部移行に関与するプロセスは周知であり、特に、細胞外分子（例えば、ホルモン、抗体、および有機小分子）、膜結合分子（例えば、細胞表面受容体）、および細胞外分子に結合した膜結合分子の複合体（例えば、膜貫通受容体に結合したリガンドまたは膜結合分子に結合した抗体）の内部移行を含み得る。従って、「内部移行の誘導および／または増加」は、細胞内内部移行が開始され、かつ／または細胞内内部移行の速度および／もしくは程度が増加する事象を含む。
【００８８】
本明細書の「アミノ酸改変」とは、ポリペプチド配列におけるアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失のことである。本明細書のアミノ酸改変の一例は置換である。本明細書の「アミノ酸改変」とは、ポリペプチド配列におけるアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失のことである。本明細書の「アミノ酸置換」または「置換」とは、タンパク質配列の所与の位置のアミノ酸の別のアミノ酸での置換のことである。例えば、置換Ｙ５０Ｗは、親ペプチドのバリアントを意味し、５０位のチロシンがトリプトファンで置換されている。ポリペプチドの「バリアント」は、基準ポリペプチド、典型的にはナイーブまたは「親」ポリペプチドと実質的に同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。ポリペプチドバリアントは、天然のアミノ酸配列内の特定の位置に１個または複数のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を有し得る。
【００８９】
用語の「単離された」、「精製された」、または「生物学的に純粋な」は、天然の状態で見つかる場合に、その物質に通常付随する成分を実質的にまたは基本的に含まない物質を意味する。純度および均一性は通常、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学技術を用いて判定される。調製物中に存在する主要な種であるタンパク質が実質的に精製される。本明細書で記載のいずれかの化合物、例えば、抗体は、場合により、単離されている、精製されているまたは生物学的に純粋であると呼ばれ得る。
【００９０】
用語の「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書で同義に使用され、アミノ酸残基のポリマーを意味する。この用語は、１個または複数のアミノ酸残基が、対応する天然のアミノ酸、ならびに天然のアミノ酸ポリマーおよび非天然アミノ酸ポリマーの人工的化学模倣体であるアミノ酸ポリマーにも当てはまる。
【００９１】
例えば、細胞、または核酸、タンパク質またはベクターへの言及で使用される場合、用語の「組換え」は、細胞、核酸、タンパク質またはベクターが異種核酸またはタンパク質の導入、または天然の核酸またはタンパク質の変化により改変されていること、または細胞がそのように改変された細胞から得られていることを示す。したがって、例えば、組み換え細胞は、天然（非組み換え）型の細胞には認められない遺伝子を発現し、またはそれ以外の方法では、異常に発現される、過小発現されるまたは全く発現されない天然遺伝子を発現する。
【００９２】
本明細書で使用される場合、「ＮＫ細胞」はまた、「ナチュラルキラー細胞」とも呼ばれ、従来にない免疫に関与するリンパ球の亜集団を意味する。ＮＫ細胞は、特定の特徴および生物学的特性、例えば、ヒトＮＫ細胞のＣＤ５６および／またはＣＤ１６を含む特定の表面抗原の発現、細胞表面のα／βまたはγ／δＴＣＲ複合体の非存在、特定の細胞溶解装置の活性化によって、「自己」ＭＨＣ／ＨＬＡ抗原を発現することができない細胞に結合してその細胞を死滅させる能力、ＮＫ活性化受容体のリガンドを発現する腫瘍細胞または他の異常細胞を死滅させる能力、および免疫応答を刺激または抑制するサイトカインと呼ばれるタンパク質分子を放出する能力によって、特定できる。
【００９３】
ポリペプチドまたはエピトープに「結合する」抗体は、特異性および／または親和性を有する該決定基に結合する抗体を意味する。
【００９４】
抗ＮＫｐ４６抗体の作製
高頻度可変領域、重鎖および軽鎖ＣＤＲ、重鎖および軽鎖可変領域、およびそれらを含むタンパク質（例えば、抗体）は、細胞、例えば、腫瘍細胞、ＮＫ細胞、などの表面上に発現したヒト（および場合により、さらに非ヒト霊長類）ＮＫｐ４６に結合する。ＮＫｐ４６発現腫瘍細胞（例えば、悪性Ｔ細胞）の除去のための、またはその他の免疫細胞の除去のための治療に使用される場合、抗体は通常、例えば、細胞傷害性部分に結合している場合、ＮＫｐ４６発現腫瘍細胞死を起こさせることにより直接的に、および／または免疫エフェクター細胞（例えば、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ）、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ（抗体依存性細胞食作用）および／またはＣＤＣを腫瘍細胞に向けることにより、除去することになる。その他の用途、例えば、ヒトおよび／または非ヒト霊長類ＮＫｐ４６ポリペプチドおよび／またはＮＫｐ４６発現細胞（例えば、ＮＫ細胞）の検出のために、これらの特定のために、これらの単離のために、および／またはより一般的にはこれらに結合するために、使用する場合には、抗体は除去をする必要がない。
【００９５】
一実施形態では、抗体は、ＮＫｐ４６ポリペプチドに対する結合に関して、抗体８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂまたは１７Ｅ１の内の１個または複数と競合する。好ましくは、抗体は、ＮＫｐ４６ポリペプチド上の実質的にまたは基本的に同じ、または同じエピトープまたは「エピトープ部位」を認識し、結合し、または免疫特異性を有する。一実施形態では、抗体は、抗体Ｂａｂ２８１、９Ｅ２または１９５３１４（遮断すると報告されている）のいずれかと、ＮＫｐ４６への結合に関して競合しない。
【００９６】
本開示の抗体は、当技術分野で既知の様々な技術によって、作製され得る。通常、それらは、ＮＫｐ４６ポリペプチド、好ましくはヒトＮＫｐ４６ポリペプチドを含む免疫原による非ヒト動物、好ましくは、マウスの免疫化により作製される。ＮＫｐ４６ポリペプチドは、ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドの完全長配列、またはそのフラグメントもしくは誘導体、通常、免疫原性フラグメント、すなわち、ＮＫｐ４６ポリペプチドを発現している細胞の表面上にエピトープ、好ましくは、８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂ、または１７Ｅ１抗体により認識されるエピトープを含むポリペプチドの一部を含み得る。このようなフラグメントは通常、成熟ポリペプチド配列の少なくとも約７個の連続アミノ酸、さらにより好ましくは、その少なくとも約１０個の連続アミノ酸を含む。フラグメントは通常、実質的に受容体の細胞外ドメインから誘導される。一実施形態では、免疫原は、脂質膜中に、通常は細胞表面に、野生型ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドを含む。特定の実施形態では、免疫原は、未処理細胞、特に、未処理ヒト細胞、場合により、処理または溶解された細胞を含む。別の好ましい実施形態では、ポリペプチドは組換えＮＫｐ４６ポリペプチドである。特定の実施形態では、免疫原は、未処理のＮＫｐ４６発現細胞を含む。
【００９７】
非ヒト哺乳動物を抗原で免疫するステップは、マウスの抗体の産生を刺激するための当技術分野で周知の任意の方式で行うことができる（例えば、参照によりその全開示内容が本明細書に組み入れられるＥ．Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄ．Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８８）を参照されたい）。
【００９８】
抗体はまた、例えば、（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，３４１（１９８９）ｐ．５４４、この全開示は、参照により本明細書に組み込まれる）に開示されているように、免疫グロブリンのコンビナトリアルライブラリーからの選択により作製され得る。
【００９９】
ＮＫｐ４６、特に、実質的にまたは基本的にモノクローナル抗体８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂまたは１７Ｅ１と同じ領域に結合する１個または複数の抗体の特定は、抗体競合が評価できる種々の免疫学的なスクリーニングアッセイのいずれか１つを用いて容易に決定できる。多くのこのようなアッセイは、定常的に実施されており、当該技術分野において周知である（例えば、米国特許第５，６６０，８２７号を参照されたい。この特許は、参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１００】
例えば、試験される試験抗体が異なる動物源から得られる、またはさらには異なるＩｇアイソタイプである場合、対照（例えば、８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂまたは１７Ｅ１）および試験抗体を混合し（または予備吸着させ）、ＮＫｐ４６ポリペプチド含有試料に適用する単純な競合アッセイを採用し得る。ウェスタンブロッティングおよびＢｉａｃｏｒｅ分析の使用に基づくプロトコルが、このようなこのような競合調査への使用に好適する。
【０１０１】
特定の実施形態では、ＮＫｐ４６抗原試料を適用する前に、対照抗体（例えば、８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂまたは１７Ｅ１）が、種々の量の試験抗体と、前もって一定時間混合される（例えば、約１：１０または約１：１００の比率で）。他の実施形態では、対照および種々の量の試験抗体を、ＮＫｐ４６抗原試料に曝露中に単純に混合できる。遊離抗体から結合抗体を区別することができる（例えば、非結合抗体を除去するための分離または洗浄技術を用いて）および試験抗体から８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂまたは１７Ｅ１を区別できる（例えば、種特異的またはアイソタイプ特異的二次抗体を用いて、または８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂまたは１７Ｅ１を検出可能な標識を用いて特異的に標識することにより）限りにおいて、試験抗体が、８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂまたは１７Ｅ１の抗原に対する結合を低減させて、試験抗体が８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂまたは１７Ｅ１のエピトープの残基を含む領域を認識することを示すかどうかを判定できる。完全に無関係の抗体の非存在下で、（標識した）対照抗体の結合は、対照高値としてとして機能させることができる。対照低値は、標識（８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂまたは１７Ｅ１）抗体を、明確に同じタイプ（８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂまたは１７Ｅ１）の非標識抗体と共にインキュベートすることにより得ることができ、この場合、競合が起こり、標識抗体の結合を低減させるであろう。試験アッセイでは、試験抗体の存在下での標識抗体の反応性の大きな低下は、標識（８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂまたは１７Ｅ１）抗体と実質的に同じ領域を認識する、すなわち、上記標識抗体と「交差反応する」または競合する試験抗体の指標である。８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂまたは１７Ｅ１：試験抗体の約１：１０〜約１：１００の間のいずれかの比率で、少なくとも約５０％、例えば、少なくとも約６０％、またはより好ましくは少なくとも約８０％または９０％（例えば、約６５〜１００％）だけ、８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂまたは１７Ｅ１のＮＫｐ４６抗原に対する結合を低減させるいずれかの試験抗体は、８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂまたは１７Ｅ１と実質的に同じ領域または決定基に結合する抗体と見なされる。好ましくは、このような試験抗体は、８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂまたは１７Ｅ１のＮＫｐ４６抗原に対する結合を、少なくとも約９０％（例えば、約９５％）低下させるであろう。
【０１０２】
競合はまた、例えば、フローサイトメトリー試験によって評価できる。このような試験では、所与のＮＫｐ４６ポリペプチドを有する細胞は、最初に、例えば、８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂまたは１７Ｅ１と共にインキュベートし、その後、蛍光色素またはビオチンで標識した試験抗体とインキュベートできる。飽和量の８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂまたは１７Ｅ１とプレインキュベーション時に得られた結合が、８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂまたは１７Ｅ１とのプレインキュベーションのない場合の抗体により得られた結合の、約８０％、好ましくは約５０％、約４０％またはそれ未満（例えば、約３０％、約２０％または１０％）（蛍光平均値により測定して）である場合、抗体は、８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂまたは１７Ｅ１と競合すると言われる。あるいは、飽和量の試験抗体とプレインキュベーションした細胞上の標識（蛍光色素またはビオチンによる）８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂまたは１７Ｅ１抗体により得られた結合が、試験抗体とのプレインキュベーションのない場合に得られた結合の、約８０％、好ましくは約５０％、約４０％またはそれ未満（例えば、約３０％、約２０％または１０％）である場合、抗体は、８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂまたは１７Ｅ１と競合すると言われる。
【０１０３】
試験抗体が予備吸着され、ＮＫｐ４６抗原が固定された表面に飽和濃度で適用される単純競合アッセイも、同様に採用し得る。単純競合アッセイにおける表面は、好ましくは、Ｂｉａｃｏｒｅチップ（または表面プラズモン共鳴法分析に好適する他の媒体）である。対照抗体（例えば、８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂまたは１７Ｅ１）はその後、ＮＫｐ４６飽和濃度で表面と接触され、対照抗体のＮＫｐ４６および表面結合が測定される。対照抗体のこの結合が、試験抗体の非存在下での対照抗体のＮＫｐ４６含有表面への結合と比較される。試験アッセイでは、試験抗体の存在下での、対照抗体によるＮＫｐ４６含有表面の結合の大きな低下は、試験抗体が、対照抗体と実質的に同じＮＫｐ４６の表面上の領域を認識し、それにより、試験抗体が対照抗体と「交差反応する」ことを示す。対照（例えば、８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂまたは１７Ｅ１）抗体のＮＫｐ４６抗原に対する結合を、少なくとも約３０％以上、より好ましくは約４０％低減するいずれの試験抗体も、対照（８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂまたは１７Ｅ１）と実質的に同じ領域に結合する抗体と見なすことができる。好ましくは、このような試験抗体は、対照抗体（例えば、８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂまたは１７Ｅ１）のＮＫｐ４６抗原に対する結合を、少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、またはそれ以上）低下させるであろう。対照および試験抗体の順番は、逆転させることができ、すなわち、対照抗体を最初に表面に結合させることができ、その後に、競合アッセイで試験抗体を表面と接触させられることは理解されよう。ＮＫｐ４６抗原に対しより高い親和性を有する抗体が、最初に表面に結合されるのが好ましい。理由は、第２の抗体で認められる結合の低減の程度がより大きくなることが予測される（抗体が交差反応することを仮定して）ためである。このようなアッセイの追加の例は、例えば、Ｓａｕｎａｌ（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８３：３３−４１、で提供される。この開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０４】
抗体は、ＮＫｐ４６陽性細胞の発現を特徴とする個体（単一または複数）、すなわち、抗ＮＫｐ４６抗体を使った本明細書で記載の方法の１つで治療するための候補である個体由来のＮＫｐ４６発現細胞に結合する。したがって、細胞上のＮＫｐ４６を特異的に認識する抗体が得られると、その抗体を、必要に応じ、ＮＫｐ４６陽性細胞（例えば、癌細胞）に対する結合能力に対して試験できる。特に、本発明の抗体の１つで患者を治療する前に、必要に応じ、患者から採取した、例えば、血液試料または腫瘍生検材料中の悪性細胞に結合するその抗体の能力を試験して、療法が患者に有益となる可能性を最大化し得る。
【０１０５】
一実施形態では、抗体は、ＮＫｐ４６発現細胞、例えば、悪性細胞に結合する能力を試験するイムノアッセイで確認される。例えば、血液試料採取または腫瘍生検が実施され、腫瘍細胞が収集される。所与の抗体の細胞に結合する能力は、その後、当業者によく知られた標準的方法を用いて評価される。抗体の細胞に対する結合を評価するために、抗体は、直接的にまたは間接的に標識できる。間接的に標識する場合、二次標識抗体が通常加えられる。
【０１０６】
抗体がエピトープ領域内に結合するかどうかの判断は、当業者に既知の方法で実施できる。このようなマッピング／キャラクタリゼーション方法の一例として、抗ＮＫｐ４６抗体のエピトープ領域は、ＮＫｐ４６タンパク質中の露出アミン／カルボキシルの化学修飾を用いて、エピトープ「フットプリント法」により決定され得る。このようなフットプリント法の１つの具体例は、ＨＸＭＳ（水素−重水素交換質量分析）の使用であり、受容体およびリガンドタンパク質アミドプロトンの水素／重水素交換、結合、および逆交換が起こり、タンパク質結合に関与する主鎖アミド基が、逆交換から保護され、したがって、重水素化されたままで残される。関連領域は、この時点で、ペプシンタンパク質分解、ファストマイクロボア高速液体クロマトグラフィー分離、および／またはエレクトロスプレーイオン化質量分析により特定できる。例えば、Ｅｈｒｉｎｇ  Ｈ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２６７（２）ｐｐ．２５２−２５９（１９９９）Ｅｎｇｅｎ，Ｊ．Ｒ．ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｌ．（２００１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３，２５６Ａ−２６５Ａを参照されたい。好適なエピトープ特定技術の他の例は、核磁気共鳴エピトープマッピング（ＮＭＲ）であり、通常、遊離抗原および抗体などの抗原結合ペプチドで複合体化された抗原の二次元ＮＭＲスペクトルのシグナルの位置が比較される。抗原は通常、１５Ｎで選択的に同位体標識され、それにより、ＮＭＲスペクトル中で、抗原に対応する唯一のシグナルが認められ、抗原結合ペプチドからのシグナルは認められない。抗原結合ペプチドとの相互作用に関与するアミノ酸由来の抗原シグナルは通常、遊離抗原のスペクトルに比べて、複合体のスペクトルの位置をシフトさせており、結合に関与するアミノ酸は、このようにして特定できる。例えば、Ｅｒｎｓｔ  Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｒｅｓ  Ｆｏｕｎｄ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ．２００４；（４４）：１４９−６７；Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２８１（１）ｐｐ．６１−６７（１９９８）；ａｎｄ  Ｓａｉｔｏ  ａｎｄ  Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９９６  Ｊｕｎ；９（３）：５１６−２４を参照されたい。
【０１０７】
エピトープマッピング／キャラクタリゼーションはまた、質量分析法を用いて実施できる。プロテアーゼ消化技術はまた、エピトープマッピングおよび特定において、有用であり得る。抗原決定基関連領域／配列は、プロテアーゼ消化により、例えば、ＮＫｐ４６に対して約１：５０の比率でトリプシンを使用する、またはｐＨ７〜８で一晩の消化に続けて、ペプチド特定用の質量分析（ＭＳ）分析を用いることにより、決定できる。抗ＮＫｐ４６結合剤によるトリプシン切断から保護されたペプチドは、その後、トリプシン消化に供された試料と、抗体とインキュベートした後、例えば、トリプシンによる消化（それにより、結合剤のフットプリントを明らかにする）に供した試料との比較により特定できる。キモトリプシン、ペプシンなどのような他の酵素も、同様にまたは代わりに、類似のエピトープキャラクタリゼーション法で使用できる。さらに、酵素消化は、可能性のある抗原決定基配列が表面露出されておらず、したがって、免疫原性／抗原性の観点で適切でない可能性が高い、ＮＫｐ４６ポリペプチドの領域内にあるかどうかを分析するための迅速な方法を提供できる。
【０１０８】
部位特異的変異誘発は、別の結合エピトープの解明に有用な技術である。例えば、「アラニンスキャニング」では、タンパク質セグメント内の各残基は、アラニン残基を用いて交換され、結合親和性に対する結果が測定される。変異が結合親和性の大きな低下に繋がる場合には、結合に関与している可能性が高い。構造的エピトープに特異的なモノクローナル抗体（すなわち、アンフォールドタンパク質に結合しない抗体）は、アラニン置換がタンパク質の全体的折り畳みに影響を与えないことを検証するのに使用できる。例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９５；２６７：３８３−３８６；ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９６；９３：１−６を参照されたい。
【０１０９】
電子顕微鏡もまた、エピトープ「フットプリント法」のために使用できる。例えば、Ｗａｎｇら（Ｎａｔｕｒｅ  １９９２；３５５：２７５−２７８）は、低温電子顕微鏡、三次元画像再構成、およびＸ線結晶解析を連係適用して、天然のササゲ豆モザイクウイルスのカプシド表面上のＦａｂフラグメントの物理的フットプリントを特定した。
【０１１０】
エピトープ評価のための他の形態の「標識不含」アッセイには、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ、ＢＩＡＣＯＲＥ）および反射型干渉分光法（ＲｉｆＳ）が挙げられる。例えば、Ｆａｇｅｒｓｔａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  １９９０；３：２０８−１４；Ｎｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．１９９３；６４６：１５９−１６８；Ｌｅｉｐｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．１９９８；３７：３３０８−３３１１；Ｋｒｏｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  ２００２；１７：９３７−９４４を参照されたい。
【０１１１】
抗体と同じまたは実質的に同じエピトープに結合する抗体は、１つまたは複数の本明細書で記載の例示的競合アッセイで特定できることにも留意されたい。
【０１１２】
脊椎動物または細胞での抗体の免疫化および作製時には、特定の選択ステップを実施して、請求された抗体を単離し得る。これに関しては、特定の実施形態では、提供されるのは、このような抗体を作製する方法であり、該方法は、（ａ）非ヒト哺乳動物を、ＮＫｐ４６ポリペプチドを含む免疫原で免疫化すること；および（ｂ）該免疫された動物から抗体を調製すること；および（ｃ）ステップ（ｂ）由来のＮＫｐ４６に結合できる抗体を選択すること、を含む。
【０１１３】
一態様では、提供されるのは、例えば、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）スクリーニング（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）ＳＰＲ分析装置での分析による）により測定して、場合により一価結合の場合に、ヒトＮＫｐ４６に対して、１ｘ１０−８Ｍ未満、場合により、１ｘ１０−９Ｍ未満の平均解離定数（ＫＤ）を有する抗体である。より特定の例示的な態様では、提供されるのは、ＮＫｐ４６に対し、約１ｘ１０−８Ｍ〜約１ｘ１０−１０Ｍ、または、約１ｘ１０−９Ｍ〜約１ｘ１０−１１ＭのＫＤを有する抗ＮＫｐ４６抗体である。
【０１１４】
抗体は、例えば、約１００ナノモル、約６０ナノモル、約１０ナノモル、約５ナノモル、または１ナノモル以下、好ましくはサブナノモル以下、または、場合により、約５００ピコモル、約２００ピコモル、約１００ピコモル、または約１０ピコモル以下の平均ＫＤ（即ち、これらよりも高い親和性）によって、特徴付けることができる。ＫＤは、例えば、組換え作製されたヒトＮＫｐ４６タンパク質をチップ表面上に固定化し、続いて溶液中の試験されるべき抗体を適用することによって、決定できる。一実施形態では、方法は、ステップ（ｄ）（ｂ）から、ＮＫｐ４６に対する結合に関し、８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂまたは１７Ｅ１と競合できる抗体を選択することをさらに含む。
【０１１５】
いずれかの実施形態の一態様では、本方法により調製された抗体は、モノクローナル抗体である。別の態様では、抗体を作製するために使用される非ヒト動物は、哺乳動物、例えば、げっ歯類、ウシ、ブタ、家禽、ウマ、ウサギ、ヤギ、またはヒツジである。本発明の抗体は、場合により、抗体１９５３１４、９Ｅ２またはＢａｂ２８１、または例えば、それらのそれぞれの重鎖および軽鎖ＣＤＲまたは抗原結合領域を全体的にまたは部分的に含むその誘導体の内のいずれか以外の抗体であることを特定できる。
【０１１６】
ＮＫｐ４６ポリペプチド上に存在するエピトープに結合する抗体をコードするＤＮＡは、ハイブリドーマから単離され、適切な宿主への遺伝子導入のための適切な発現ベクターに導入される。その後、宿主は、抗体、またはそのモノクローナル抗体のヒト化型、抗体の活性フラグメント、抗体の抗原認識部分を含むキメラ抗体、または検出可能部分を含むバージョンなどのそのバリアントの組換え産生のために使用される。
【０１１７】
モノクローナル抗体、例えば、抗体８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂまたは１７Ｅ１をコードするＤＮＡは、従来の手順を使って容易に単離、配列決定できる（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使うことにより）。一態様では、提供されるのは、本明細書のいずれかの実施形態の抗ＮＫｐ４６抗体の重鎖または軽鎖をコードする核酸である。単離されると、ＤＮＡは発現ベクター中に配置することができ、これは次に、大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または他の方法では免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞などの宿主細胞中に遺伝子導入され、組換え型宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成が行われる。本明細書の別の箇所で記載のように、このようなＤＮＡ配列は、多数の目的、例えば、抗体のヒト化、フラグメントまたは誘導体の作製のために、または、例えば、抗体の結合特異性を最適化するために、抗原結合部位での抗体の配列の改変のために、の内のいずれかのために改変できる。一実施形態では、提供されるのは、抗体（例えば、８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂまたは１７Ｅ１）の軽鎖および／または重鎖をコードする単離核酸配列、ならびに、このような核酸を含む（例えば、そのゲノム中に含む）組換え宿主細胞である。
【０１１８】
抗体が得られると、通常、その抗体は、活性が評価されることになる。例えば、抗体は、ＮＫｐ４６発現標的細胞の増殖を抑制する、および／またはその標的細胞の除去を生じさせる能力の試験を行うことができる。例えば、抗体は、細胞傷害薬に、例えば、以降で本明細書に記載のように、結合でき、標的細胞を除去する能力を評価できる。別の例では、ＮＫｐ４６発現標的細胞に対して、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰまたはＣＤＣを誘導する能力が評価される。
【０１１９】
ＣＤＣ、ＡＤＣＰおよびＡＤＣＣの試験は、本明細書の実験例で記載のものを含む種々のアッセイにより実施でき、決定できる。ＡＤＣＣの試験は通常、細胞媒介細胞傷害性の評価を含み、この評価では、抗ＮＫｐ４６抗体により結合されたＮＫｐ４６発現標的細胞（例えば、癌または他のＮＫｐ４６発現細胞）が、補体の関与なしに、エフェクター細胞（例えば、Ｆｃ受容体を有する白血球）により認識される。ＮＫｐ４６抗原を発現していない細胞は、必要に応じ、対照として使用できる。ＮＫ細胞の細胞傷害性の活性化は、サイトカイン産生（例えば、ＩＦＮγの産生）または細胞傷害性マーカー（例えば、ＣＤ１０７の可動化）の増加を測定することにより評価できる。ＡＤＣＣを誘導する抗体は通常、サイトカイン産生の増加、細胞傷害性マーカーの発現、または標的（ＮＫｐ４６発現）細胞の存在下で、対照抗体（例えば、ＮＫｐ４６に結合していない抗体、マウス定常領域を有する抗ＮＫｐ４６抗体）に比べて、少なくとも５０％、８０％、１００％またはそれを超える標的細胞溶解の増加を誘導する。別の例では、標的細胞の溶解は、例えば、クロム放出アッセイで検出され、抗体は、例えば、標的細胞の少なくとも４０％または５０％の溶解を誘導できる。
【０１２０】
免疫複合体の標的細胞を除去する能力の試験は、免疫複合体が細胞分裂停止または細胞傷害性作用を目的の細胞株に対し行使するかどうかを判定するための、当該技術分野において既知の多くのアッセイの内のいずれかにより実施できる。例えば、免疫複合体の細胞傷害性または細胞分裂停止活性は、細胞培地中でＮＫｐ４６を発現している哺乳動物細胞を曝露し、細胞を約６時間〜約５日間の期間にわたり培養して、細胞生存率を測定することにより測定できる。細胞ベースのインビトロアッセイを用いて、生存率（増殖）、細胞傷害性、およびアポトーシスの誘導（カスパーゼ活性化）を測定できる。
【０１２１】
細胞生存率は、例えば、本明細書の実施例で記載のように、培養中のＮＫｐ４６発現細胞によるＡＴＰ産生を評価することにより測定できる。
【０１２２】
他の実施例では、チミジン取り込みアッセイを使用し得る。例えば、９６ウェルプレートの５，０００細胞／ウエルの密度でＮＫｐ４６を発現している癌細胞を７２時間にわたり培養して、７２時間の最後の８時間の間、０．５μＣｉの３Ｈ−チミジンに曝露し得る。３Ｈ−チミジンの細胞培養液中への取り込みが、免疫複合体の存在下および非存在下で測定される。
【０１２３】
細胞傷害性を決定する別の例では、壊死またはアポトーシス（プログラム細胞死）を測定できる。壊死は通常、細胞膜の透過性の増加；細胞の膨潤、および細胞膜の破壊が付随する。アポトーシスは通常、膜の小疱形成、細胞質の凝縮、および内在性エンドヌクレアーゼの活性化を特徴とする。癌細胞に対するこれらのいずれの効果の測定も、免疫複合体が癌の治療に有用であることを示す。
【０１２４】
細胞生存率はまた、細胞中の、ニュートラルレッド、トリパンブルー、またはＡＬＡＭＡＲ（商標）ブルーなどの色素の取り込みを判定することにより測定できる。このようなアッセイでは、細胞は色素含有培地中でインキュベートされ、細胞が洗浄され、色素の細胞取り込みを反映している残りの色素が分光測定により測定される。タンパク質結合色素スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）も、細胞傷害性の測定に使用できる。あるいは、テトラゾリウム塩、例えば、ＭＴＴまたはＷＳＴが、生細胞を検出するが、死細胞は検出しない、哺乳動物細胞生存および増殖のための定量的比色分析法で使用される。
【０１２５】
アポトーシスは、例えば、ＤＮＡフラグメント化を測定することにより定量化できる。ＤＮＡフラグメント化のインビトロ定量測定のための市販の測光法を利用できる。このようなアッセイの例には、ＴＵＮＥＬ（これは、断片化ＤＮＡ中の標識ヌクレオチドの組み込みを検出する）およびＥＬＩＳＡベースアッセイが挙げられる。アポトーシスはまた、細胞の形態学的な変化を測定することにより判定できる。例えば、壊死と同様に、特定の色素（例えば、アクリジンオレンジまたは臭化エチジウムなどの蛍光染料）の取り込みを測定することにより細胞膜完全性の低下を判定できる。細胞はまた、ＤＮＡ色素（例えば、アクリジンオレンジ、臭化エチジウム、またはヨウ化プロピジウム）により標識でき、その細胞のクロマチン凝縮および内側核膜に沿った辺縁趨向を観察できる。アポトーシスを判定するために測定できる他の形態学的変化には、例えば、細胞質凝縮、膜の小疱形成の増加、および細胞収縮が挙げられる。
【０１２６】
アポトーシス細胞の存在は、付着および「浮遊」培養区画の両方で測定できる。例えば、両区画は、上清を除去し、付着細胞をトリプシン処理し、遠心分離洗浄ステップ（例えば、２０００ｒｐｍで１０分間）後に調製物を混合して、アポトーシスを検出することにより（例えば、ＤＮＡフラグメント化を測定することにより）収集できる。（例えば、Ｐｉａｚｚａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５），Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５５：３１１０−１６を参照されたい）。
【０１２７】
抗体エピトープ
一実施形態では、抗体は、抗体８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂまたは１７Ｅ１と同じまたは実質的に同じエピトープに結合する。一実施形態では、抗体は、抗体８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂまたは１７Ｅ１により結合されるエピトープと少なくとも部分的に重なり合う、またはその中の少なくとも１個の残基を含むＮＫｐ４６のエピトープに結合する。その抗体により結合される残基は、ＮＫｐ４６ポリペプチド、例えば、細胞の表面上に発現しているＮＫｐ４６ポリペプチドの表面上に存在するとして特定できる。
【０１２８】
別の実施形態では、抗体は、配列番号７０のＮＫｐ４６ポリペプチドの残基１００〜１８７、例えば、残基１０１〜１１８（または１０１〜１０５または１００〜１０５）、残基１５０〜１６９、残基１３５〜１５１（または１３３〜１５１）および／または残基１７８〜１８７（または１７７〜１８７）に対応するセグメントと少なくとも部分的に重なり合う、またはそのセグメント中の少なくとも１個の残基を含むエピトープに結合する。一実施形態では、エピトープの全ての重要な残基は、配列番号７０のＮＫｐ４６ポリペプチドの残基１００〜１８７、または残基１０１〜１１８（または１０１〜１０５または１００〜１０５）、残基１５０〜１６９、残基１３５〜１５１（または１３３〜１５１）および／または残基１７８〜１８７（または１７７〜１８７）に対応するセグメント中にある。一実施形態では、抗体は、配列番号７０のＮＫｐ４６ポリペプチドの残基１００〜１８７、残基１０１〜１１８（または１０１〜１０５または１００〜１０５）、残基１５０〜１６９、残基１３５〜１５１（または１３３〜１５１）または残基１７８〜１８７（または１７７〜１８７）に対応するセグメント中の１、２、３、４、５、６、７個またはそれを超える残基を含むエピトープに結合する。別の実施形態では、抗体は、配列番号７０のＮＫｐ４６ポリペプチドの残基１０１〜１１８または１００〜１０５または１０１〜１０５に対応するセグメント中の１、２、３、４、５、６、７個またはそれを超える残基および配列番号７０のＮＫｐ４６ポリペプチドの残基１５０〜１６９に対応するセグメント中の１、２、３、４、５、６、７個またはそれを超える残基を含むエピトープに結合する。
【０１２９】
配列番号７０のＮＫｐ４６アミノ酸配列を基準にして示されたアミノ酸残基および／またはセグメントは、代わりに、配列番号１のＮＫｐ４６アミノ酸配列を基準にして表現できることは理解されよう。例えば、配列番号７０の残基１００〜１１８は配列番号１の残基１２１〜１３９に対応し；配列番号７０の残基１０１〜１１８は配列番号１の残基１２２〜１３９に対応し；配列番号７０の残基１０１〜１０５は配列番号１の残基１２２〜１２６に対応し；配列番号７０の残基１００〜１０５は配列番号１の残基１２１〜１２６に対応し；配列番号７０の残基１３３〜１５１は配列番号１の残基１５４〜１７２に対応し；配列番号７０の残基１３５〜１５１は配列番号１の残基１５６〜１７２に対応し；配列番号７０の残基１５０〜１６９は配列番号１の残基１７１〜１９０に対応し；配列番号７０の残基１７７〜１８７は配列番号１の残基１９８〜２０８に対応し；配列番号７０の残基１７８〜１８７は配列番号１の残基１９９〜２０８に対応する。
【０１３０】
別の実施形態では、本開示の抗体または薬剤は、アミノ酸配列ＤＴＰＴＬＳＶＨＰＧＰＥＶＩＳＧＥＫ（配列番号７１）を有するＮＫｐ４６ポリペプチドのセグメント内の１個または複数のアミノ酸残基に結合する。場合により、本開示の抗体または薬剤は、アミノ酸配列ＶＱＡＥＦＰＬＧＰＶＴＴＡＨＲＧＴＹＲＣ（配列番号７２）を有するＮＫｐ４６ポリペプチドのセグメント内の１個または複数のアミノ酸残基にさらに結合する。
【０１３１】
別の実施形態では、本開示の抗体または薬剤は、アミノ酸配列ＤＴＰＴＬ（配列番号７３）を有するＮＫｐ４６ポリペプチドのセグメント内の１個または複数のアミノ酸残基に結合する。場合により、本開示の抗体または薬剤は、アミノ酸配列ＶＱＡＥＦＰＬＧＰＶＴＴＡＨＲＧＴＹＲＣ（配列番号７２）を有するＮＫｐ４６ポリペプチドのセグメント内の１個または複数のアミノ酸残基にさらに結合する。
【０１３２】
別の実施形態では、本開示の抗体または薬剤は、アミノ酸配列ＶＱＡＥＦＰＬＧＰＶＴＴＡＨＲＧＴＹＲＣ（配列番号７２）を有するＮＫｐ４６ポリペプチドのセグメント内の１個または複数のアミノ酸残基に結合する。
【０１３３】
いずれかの実施形態では、本開示の抗体または薬剤は、場合により、アミノ酸配列ＷＳＦＰＳＥＰＶＫＬ（配列番号７４）を有するＮＫｐ４６ポリペプチドのセグメント内の１個または複数のアミノ酸残基にさらに結合し得る。
【０１３４】
いずれかの実施形態では、本開示の抗体または薬剤は、場合により、アミノ酸配列ＡＷＳＦＰＳＥＰＶＫＬ（配列番号７５）を有するＮＫｐ４６ポリペプチドのセグメント内の１個または複数のアミノ酸残基にさらに結合し得る。
【０１３５】
いずれかの実施形態では、本開示の抗体または薬剤は、場合により、アミノ酸配列ＬＫＥＧＲＳＳＨＶＱＲＧＹＧＫＶＱ（配列番号７６）を有するＮＫｐ４６ポリペプチドのセグメント内の１個または複数のアミノ酸残基にさらに結合し得る。
【０１３６】
いずれかの実施形態では、本開示の抗体または薬剤は、場合により、アミノ酸配列ＬＬＬＫＥＧＲＳＳＨＶＱＲＧＹＧＫＶＱ（配列番号７７）を有するＮＫｐ４６ポリペプチドのセグメント内の１個または複数のアミノ酸残基にさらに結合し得る。
【０１３７】
いずれかの実施形態では、本開示の抗体または薬剤は、本発明の抗ＮＫｐ４６抗体により結合されるエピトープ内のＮＫｐ４６ポリペプチドの表面上に存在する１個または複数のアミノ酸残基に結合し得る。このような一実施形態では、抗体は、配列番号７０のＮＫｐ４６ポリペプチドの１０１、１０２および１０４（配列番号１のポリペプチドの残基１２２、１２３および１２５）からなる群より選択される１、２または３個の残基に結合する。
【０１３８】
一実施形態では、抗体は、配列番号７０のＮＫｐ４６ポリペプチドのＶ１５０、Ｑ１５１、Ｅ１５３、Ｐ１５５、Ｇ１５７、Ｐ１５８、Ｔ１６０、Ｔ１６１、Ａ１６２、Ｈ１６３、Ｒ１６４、Ｔ１６６およびＲ１６８（配列番号１のポリペプチドの残基１７１、１７２、１７４、１７６、１７９、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８７および１８９）からなる群より選択される１、２、３、４、５、６、または７個またはそれを超える残基に結合する。場合により、抗体は、配列番号７０のＮＫｐ４６ポリペプチドのＹ１００、Ｄ１０１、Ｔ１０２およびＴ１０４からなる群より選択される１、２、３、４、５、６、または７個またはそれを超える残基にさらに結合する。
【０１３９】
一実施形態では、抗体は、配列番号７０のＮＫｐ４６ポリペプチドのＤ１０１、Ｔ１０２、Ｔ１０４、Ｓ１０６、Ｈ１０８、Ｐ１０９、Ｐ１１１、Ｅ１１２、Ｉ１１４、Ｓ１１５、Ｇ１１６、Ｅ１１７、Ｋ１１８、Ｖ１５０、Ｑ１５１、Ｅ１５３、Ｐ１５５、Ｇ１５７、Ｐ１５８、Ｔ１６０、Ｔ１６１、Ａ１６２、Ｈ１６３、Ｒ１６４、Ｔ１６６およびＲ１６８からなる群より選択される１、２、３、４、５、６、または７個またはそれを超える残基に結合する。別の実施形態では、抗体は、配列番号７０のＮＫｐ４６ポリペプチドのＤ１０１、Ｔ１０２、Ｔ１０４、Ｖ１５０、Ｑ１５１、Ｅ１５３、Ｐ１５５、Ｇ１５７、Ｐ１５８、Ｔ１６０、Ｔ１６１、Ａ１６２、Ｈ１６３、Ｒ１６４、Ｔ１６６およびＲ１６８からなる群より選択される１、２、３、４、５、６、または７個またはそれを超える残基に結合する。
【０１４０】
一態様では、提供されるのは、配列番号７０を基準にして１０１、１０２および１０４（配列番号１のポリペプチドの残基１２２、１２３および１２５）からなる群より選択される１、２または３個の残基の位置に変異を有するＮＫｐ４６ポリペプチドに対し、低下した結合を有する抗ＮＫｐ４６抗体である。
【０１４１】
一態様では、提供されるのは、配列番号７０を基準にしてＶ１５０、Ｑ１５１、Ｅ１５３、Ｐ１５５、Ｇ１５７、Ｐ１５８、Ｔ１６０、Ｔ１６１、Ａ１６２、Ｈ１６３、Ｒ１６４、Ｔ１６６およびＲ１６８（配列番号１のポリペプチドの残基１７１、１７２、１７４、１７６、１７９、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８７および１８９）からなる群より選択される１、２または３個またはそれを超える（または全ての）残基の位置に変異を有するＮＫｐ４６ポリペプチドに対し低下した結合を有する抗ＮＫｐ４６抗体である。
【０１４２】
一態様では、提供されるのは、配列番号７０を基準にしてＤ１０１、Ｔ１０２、Ｔ１０４、Ｓ１０６、Ｈ１０８、Ｐ１０９、Ｐ１１１、Ｅ１１２、Ｉ１１４、Ｓ１１５、Ｇ１１６、Ｅ１１７、Ｋ１１８、Ｖ１５０、Ｑ１５１、Ｅ１５３、Ｐ１５５、Ｇ１５７、Ｐ１５８、Ｔ１６０、Ｔ１６１、Ａ１６２、Ｈ１６３、Ｒ１６４、Ｔ１６６およびＲ１６８からなる群より選択される１、２または３個またはそれを超える（または全ての）残基の位置に変異を有するＮＫｐ４６ポリペプチドに対し低下した結合を有する抗ＮＫｐ４６抗体である。一態様では、提供されるのは、配列番号７０を基準にして、Ｄ１０１、Ｔ１０２、Ｔ１０４、Ｖ１５０、Ｑ１５１、Ｅ１５３、Ｐ１５５、Ｇ１５７、Ｐ１５８、Ｔ１６０、Ｔ１６１、Ａ１６２、Ｈ１６３、Ｒ１６４、Ｔ１６６およびＲ１６８からなる群より選択される１、２または３個またはそれを超える（または全ての）残基の位置に変異を有するＮＫｐ４６ポリペプチドに対し低下した結合を有する抗ＮＫｐ４６抗体である。
【０１４３】
別の態様では、提供されるのは、配列番号７０を基準にしてＦ１８０、Ｐ１８１、Ｅ１８３、Ｐ１８４およびＫ１８６（配列番号１のポリペプチドの残基２０１、２０２、２０４、２０５および２０７）からなる群より選択される１、２または３個またはそれを超える（または全ての）残基の位置に変異を有するＮＫｐ４６ポリペプチドに対し低下した結合を有する抗ＮＫｐ４６抗体である。
【０１４４】
別の態様では、提供されるのは、配列番号７０を基準にしてＥ１３７、Ｇ１３８、Ｒ１３９、Ｓ１４０、Ｓ１４１、Ｈ１４２、Ｑ１４４、Ｒ１４５、Ｙ１４７、Ｇ１４８、Ｋ１４９、Ｖ１５０およびＱ１５１（配列番号１のポリペプチドの残基１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６５、１６６、１６８、１６９、１７０、１７１および１７２）からなる群より選択される１、２または３個またはそれを超える（または全ての）残基の位置に変異を有するＮＫｐ４６ポリペプチドに対し低下した結合を有する抗ＮＫｐ４６抗体である。
【０１４５】
ＮＫｐ４６変異体を遺伝子導入した細胞に対する抗ＮＫｐ４６抗体の結合を測定でき、さらに、野生型ＮＫｐ４６ポリペプチド（例えば、配列番号１または配列番号７０）に結合する抗ＮＫｐ４６抗体の能力と比較できる。抗ＮＫｐ４６抗体と変異ＮＫｐ４６ポリペプチドとの間の結合の低下は、結合親和性の低下（例えば、既知の方法、例えば、特定の変異体を発現する細胞のＦＡＣＳ試験により、または変異ポリペプチドに対する結合のＢｉａｃｏｒｅ試験により測定される）、および／または抗ＮＫｐ４６抗体の全結合能力の低下（例えば、抗ＮＫｐ４６抗体濃度対ポリペプチド濃度のプロットにおけるＢｍａｘの減少により証明される）が存在することを意味する。結合の大きな減少は、変異残基が抗ＮＫｐ４６抗体に対する結合に直接関与するか、または抗ＮＫｐ４６抗体がＮＫｐ４６に結合するときに結合タンパク質に近接していることを示す。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、結合の大きな低下は、抗ＮＫｐ４６抗体と変異ＮＫｐ４６ポリペプチドとの間の結合親和性および／または結合能力が、この抗体と野生型ＮＫｐ４６ポリペプチドとの間の結合に比較して、４０％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、または９５％超低下していることを意味する。特定の実施形態では、結合は、検出可能な限界未満で低下する。いくつかの実施形態では、結合における大きな低下は、抗ＮＫｐ４６抗体の変異ＮＫｐ４６ポリペプチドへの結合が、抗ＮＫｐ４６抗体と野生型ＮＫｐ４６ポリペプチドとの間で観察される結合の５０％未満である（例えば、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、または１０％未満）であるときに証明される。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、抗体８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂまたは１７Ｅ１により結合されるアミノ酸残基を含むセグメント中の残基が異なるアミノ酸で置換されている変異ＮＫｐ４６ポリペプチドに対して顕著に低い結合性を示す抗ＮＫｐ４６抗体が提供される。
【０１４８】
抗体ＣＤＲ配列
抗体８Ｂ６Ａ
抗体８Ｂ６Ａの重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号３として記載されており、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号４として記載されている。特定の実施形態では、提供されるのは、モノクローナル抗体８Ｂ６Ａと基本的に同じエピトープまたは決定基に結合する抗体であり、場合により、抗体は抗体８Ｂ６Ａの高頻度可変領域を含む。本明細書のいずれかの実施形態では、抗体８Ｂ６Ａは、そのアミノ酸配列および／またはそれをコードする核酸配列を特徴とすることができる。好ましい一実施形態では、モノクローナル抗体は、８Ｂ６ＡのＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２部分を含む。また、提供されるのは、８Ｂ６Ａの重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体である。一実施形態では、モノクローナル抗体は、８Ｂ６Ａの重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含む。また、提供されるのは、８Ｂ６Ａの軽鎖可変領域または８Ｂ６Ａの軽鎖可変領域の１、２または３つのＣＤＲをさらに含むモノクローナル抗体である。場合により、該軽鎖または重鎖ＣＤＲのいずれか１個または複数は、１、２、３、４または５個以上のアミノ酸改変（例えば、置換、挿入または欠失）を含み得る。場合により、提供されるのは、抗体８Ｂ６Ａの抗原結合領域の一部または全てを含む軽鎖および／または重鎖可変領域のいずれかが、ヒトＩｇＧタイプ、場合により、ヒト定常領域、場合により、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３アイソタイプの免疫グロブリン定常領域に、融合される抗体である。
【０１４９】
別の態様では、提供されるのは抗体であり、該抗体は次記を含む：表Ａで示されるアミノ酸配列を含む８Ｂ６ＡのＨＣＤＲ１領域、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９または１０個の連続したアミノ酸の配列、場合により、これらのアミノ酸の１個または複数は異なるアミノ酸により置換されてもよく；表Ａに示されるアミノ酸配列を含む８Ｂ６ＡのＨＣＤＲ２領域、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９または１０個の連続したアミノ酸の配列、場合により、これらのアミノ酸の１個または複数は異なるアミノ酸により置換されてもよく；表Ａで示されるアミノ酸配列を含む８Ｂ６ＡのＨＣＤＲ３領域、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９または１０個の連続したアミノ酸の配列、場合により、これらのアミノ酸の１個または複数は異なるアミノ酸により置換されてもよく；表Ａで示されるアミノ酸配列を含む８Ｂ６ＡのＬＣＤＲ１領域、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９または１０個の連続したアミノ酸の配列、場合により、これらのアミノ酸の１個または複数は異なるアミノ酸により置換されてもよく；表Ａに示されるアミノ酸配列を含む８Ｂ６ＡのＬＣＤＲ２領域、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９または１０個の連続したアミノ酸の配列、場合により、これらのアミノ酸の１個または複数は異なるアミノ酸により置換されてもよく；表Ａで示されるアミノ酸配列を含む８Ｂ６ＡのＬＣＤＲ３領域、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９または１０個の連続したアミノ酸の配列、場合により、これらのアミノ酸の１個または複数は異なるアミノ酸により欠失または置換されてもよい。ＨＣＤＲ１、２、３およびＬＣＤＲ１、２、３配列は、必要に応じ、全てが（またはそれぞれ独立に）Ｋａｂａｔナンバリングシステムのものである（各ＣＤＲに対し表Ａで示されるように）、Ｃｈｏｔｉａナンバリングシステムのものである（各ＣＤＲに対し表Ａで示されるように）、ＩＭＧＴナンバリングシステムのものである（各ＣＤＲに対し表Ａで示されるように）、または任意の他の好適なナンバリングシステムであると特定され得る。
【０１５０】
抗体８Ｂ６Ｂ
抗体８Ｂ６Ｂの重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号３として記載されており、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号２１として記載されている。抗体８Ｂ６Ｂおよび８Ｂ６Ａは、同じ重鎖を共有するが、異なる軽鎖と組み合わされる。特定の実施形態では、提供されるのは、モノクローナル抗体８Ｂ６Ｂと基本的に同じエピトープまたは決定基に結合する抗体であり、場合により、抗体は抗体８Ｂ６Ｂの高頻度可変領域を含む。本明細書のいずれかの実施形態では、抗体８Ｂ６Ｂは、そのアミノ酸配列および／またはそれをコードする核酸配列を特徴とすることができる。好ましい一実施形態では、モノクローナル抗体は、８Ｂ６ＢのＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２部分を含む。また、提供されるのは、８Ｂ６Ｂの重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体である。一実施形態では、モノクローナル抗体は、８Ｂ６Ｂの重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含む。また、提供されるのは、８Ｂ６Ｂの軽鎖可変領域または８Ｂ６Ｂの軽鎖可変領域の１、２または３つのＣＤＲをさらに含むモノクローナル抗体である。場合により、該軽鎖または重鎖ＣＤＲのいずれか１個または複数は、１、２、３、４または５個以上のアミノ酸改変（例えば、置換、挿入または欠失）を含み得る。場合により、提供されるのは、抗体８Ｂ６Ｂの抗原結合領域の一部または全てを含む軽鎖および／または重鎖可変領域のいずれかが、ヒトＩｇＧタイプ、場合により、ヒト定常領域、場合により、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３アイソタイプの免疫グロブリン定常領域に、融合される抗体である。
【０１５１】
別の態様では、提供されるのは抗体であり、該抗体は次記を含む：表Ａで示されるアミノ酸配列を含む８Ｂ６ＢのＨＣＤＲ１領域、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９または１０個の連続したアミノ酸の配列、場合により、これらのアミノ酸の１個または複数は異なるアミノ酸により置換されてもよく；表Ａに示されるアミノ酸配列を含む８Ｂ６ＢのＨＣＤＲ２領域、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９または１０個の連続したアミノ酸の配列、場合により、これらのアミノ酸の１個または複数は異なるアミノ酸により置換されてもよく；表Ａで示されるアミノ酸配列を含む８Ｂ６ＢのＨＣＤＲ３領域、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９または１０個の連続したアミノ酸の配列、場合により、これらのアミノ酸の１個または複数は異なるアミノ酸により置換されてもよく；表Ａで示されるアミノ酸配列を含む８Ｂ６ＢのＬＣＤＲ１領域、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９または１０個の連続したアミノ酸の配列、場合により、これらのアミノ酸の１個または複数は異なるアミノ酸により置換されてもよく；表Ａに示されるアミノ酸配列を含む８Ｂ６ＢのＬＣＤＲ２領域、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９または１０個の連続したアミノ酸の配列、場合により、これらのアミノ酸の１個または複数は異なるアミノ酸により置換されてもよく；表Ａで示されるアミノ酸配列を含む８Ｂ６ＢのＬＣＤＲ３領域、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９または１０個の連続したアミノ酸の配列、場合により、これらのアミノ酸の１個または複数は異なるアミノ酸により欠失または置換されてもよい。ＨＣＤＲ１、２、３およびＬＣＤＲ１、２、３配列は、場合により、全てが（またはそれぞれ独立に）Ｋａｂａｔナンバリングシステムのものである（各ＣＤＲに対し表Ａで示されるように）、Ｃｈｏｔｉａナンバリングシステムのものである（各ＣＤＲに対し表Ａで示されるように）、ＩＭＧＴナンバリングシステムのものである（各ＣＤＲに対し表Ａで示されるように）、または任意の他の好適なナンバリングシステムであると特定され得る。
【０１５２】
抗体９Ｈ１１Ａ
抗体９Ｈ１１Ａの重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号２９として記載されており、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号３０として記載されている。特定の実施形態では、提供されるのは、モノクローナル抗体９Ｈ１１Ａと基本的に同じエピトープまたは決定基に結合する抗体であり、場合により、抗体は抗体９Ｈ１１Ａの高頻度可変領域を含む。本明細書のいずれかの実施形態では、抗体９Ｈ１１Ａは、そのアミノ酸配列および／またはそれをコードする核酸配列を特徴とすることができる。好ましい一実施形態では、モノクローナル抗体は、９Ｈ１１ＡのＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２部分を含む。また、提供されるのは、９Ｈ１１Ａの重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体である。一実施形態では、モノクローナル抗体は、９Ｈ１１Ａの重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含む。また、提供されるのは、９Ｈ１１Ａの軽鎖可変領域または９Ｈ１１Ａの軽鎖可変領域の１、２または３つのＣＤＲをさらに含むモノクローナル抗体である。場合により、該軽鎖または重鎖ＣＤＲのいずれか１個または複数は、１、２、３、４または５個以上のアミノ酸改変（例えば、置換、挿入または欠失）を含み得る。場合により、提供されるのは、抗体９Ｈ１１Ａの抗原結合領域の一部または全てを含む軽鎖および／または重鎖可変領域のいずれかが、ヒトＩｇＧタイプ、場合により、ヒト定常領域、場合により、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３アイソタイプの免疫グロブリン定常領域に、融合される抗体である。
【０１５３】
別の態様では、提供されるのは抗体であり、該抗体は次記を含む：表Ａで示されるアミノ酸配列を含む９Ｈ１１ＡのＨＣＤＲ１領域、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９または１０個の連続したアミノ酸の配列、場合により、これらのアミノ酸の１個または複数は異なるアミノ酸により置換されてもよく；表Ａに示されるアミノ酸配列を含む９Ｈ１１ＡのＨＣＤＲ２領域、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９または１０個の連続したアミノ酸の配列、場合により、これらのアミノ酸の１個または複数は異なるアミノ酸により置換されてもよく；表Ａで示されるアミノ酸配列を含む９Ｈ１１ＡのＨＣＤＲ３領域、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９または１０個の連続したアミノ酸の配列、場合により、これらのアミノ酸の１個または複数は異なるアミノ酸により置換されてもよく；表Ａで示されるアミノ酸配列を含む９Ｈ１１ＡのＬＣＤＲ１領域、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９または１０個の連続したアミノ酸の配列、場合により、これらのアミノ酸の１個または複数は異なるアミノ酸により置換されてもよく；表Ａに示されるアミノ酸配列を含む９Ｈ１１ＡのＬＣＤＲ２領域、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９または１０個の連続したアミノ酸の配列、場合により、これらのアミノ酸の１個または複数は異なるアミノ酸により置換されてもよく；表Ａで示されるアミノ酸配列を含む９Ｈ１１ＡのＬＣＤＲ３領域、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９または１０個の連続したアミノ酸の配列、場合により、これらのアミノ酸の１個または複数は異なるアミノ酸により欠失または置換されてもよい。ＨＣＤＲ１、２、３およびＬＣＤＲ１、２、３配列は、場合により、全てが（またはそれぞれ独立に）Ｋａｂａｔナンバリングシステムのものである（各ＣＤＲに対し表Ａで示されるように）、Ｃｈｏｔｉａナンバリングシステムのものである（各ＣＤＲに対し表Ａで示されるように）、ＩＭＧＴナンバリングシステムのものである（各ＣＤＲに対し表Ａで示されるように）、または任意の他の好適なナンバリングシステムであると特定され得る。
【０１５４】
抗体９Ｈ１１Ｂ
抗体９Ｈ１１Ｂの重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号２９として記載されており、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号４７として記載されている。抗体９Ｈ１１Ｂおよび９Ｈ１１Ａは、同じ重鎖を共有するが、異なる軽鎖と組み合わされる。特定の実施形態では、提供されるのは、モノクローナル抗体９Ｈ１１Ｂと基本的に同じエピトープまたは決定基に結合する抗体であり、場合により、抗体は抗体９Ｈ１１Ｂの高頻度可変領域を含む。本明細書のいずれかの実施形態では、抗体９Ｈ１１Ｂは、そのアミノ酸配列および／またはそれをコードする核酸配列を特徴とすることができる。好ましい一実施形態では、モノクローナル抗体は、９Ｈ１１ＢのＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２部分を含む。また、提供されるのは、９Ｈ１１Ｂの重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体である。一実施形態では、モノクローナル抗体は、９Ｈ１１Ｂの重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含む。また、提供されるのは、９Ｈ１１Ｂの軽鎖可変領域または９Ｈ１１Ｂの軽鎖可変領域の１、２または３つのＣＤＲをさらに含むモノクローナル抗体である。場合により、該軽鎖または重鎖ＣＤＲのいずれか１個または複数は、１、２、３、４または５個以上のアミノ酸改変（例えば、置換、挿入または欠失）を含み得る。場合により、提供されるのは、抗体９Ｈ１１Ｂの抗原結合領域の一部または全てを含む軽鎖および／または重鎖可変領域のいずれかが、ヒトＩｇＧタイプ、場合により、ヒト定常領域、場合により、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３アイソタイプの免疫グロブリン定常領域に、融合される抗体である。
【０１５５】
別の態様では、提供されるのは抗体であり、該抗体は次記を含む：表Ａで示されるアミノ酸配列を含む９Ｈ１１ＢのＨＣＤＲ１領域、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９または１０個の連続したアミノ酸の配列、場合により、これらのアミノ酸の１個または複数は異なるアミノ酸により置換されてもよく；表Ａに示されるアミノ酸配列を含む９Ｈ１１ＢのＨＣＤＲ２領域、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９または１０個の連続したアミノ酸の配列、場合により、これらのアミノ酸の１個または複数は異なるアミノ酸により置換されてもよく；表Ａで示されるアミノ酸配列を含む９Ｈ１１ＢのＨＣＤＲ３領域、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９または１０個の連続したアミノ酸の配列、場合により、これらのアミノ酸の１個または複数は異なるアミノ酸により置換されてもよく；表Ａで示されるアミノ酸配列を含む９Ｈ１１ＢのＬＣＤＲ１領域、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９または１０個の連続したアミノ酸の配列、場合により、これらのアミノ酸の１個または複数は異なるアミノ酸により置換されてもよく；表Ａに示されるアミノ酸配列を含む９Ｈ１１ＢのＬＣＤＲ２領域、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９または１０個の連続したアミノ酸の配列、場合により、これらのアミノ酸の１個または複数は異なるアミノ酸により置換されてもよく；表Ａで示されるアミノ酸配列を含む９Ｈ１１ＢのＬＣＤＲ３領域、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９または１０個の連続したアミノ酸の配列、場合により、これらのアミノ酸の１個または複数は異なるアミノ酸により欠失または置換されてもよい。ＨＣＤＲ１、２、３およびＬＣＤＲ１、２、３配列は、場合により、全てが（またはそれぞれ独立に）Ｋａｂａｔナンバリングシステムのものである（各ＣＤＲに対し表Ａで示されるように）、Ｃｈｏｔｉａナンバリングシステムのものである（各ＣＤＲに対し表Ａで示されるように）、ＩＭＧＴナンバリングシステムのものである（各ＣＤＲに対し表Ａで示されるように）、または任意の他の好適なナンバリングシステムであると特定され得る。
【０１５６】
抗体１７Ｅ１
抗体１７Ｅ１の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号５５として記載されており、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号５６として記載されている。特定の実施形態では、提供されるのは、モノクローナル抗体１７Ｅ１と基本的に同じエピトープまたは決定基に結合する抗体であり、場合により、抗体は抗体１７Ｅ１の高頻度可変領域を含む。本明細書のいずれかの実施形態では、抗体１７Ｅ１は、そのアミノ酸配列および／またはそれをコードする核酸配列を特徴とすることができる。好ましい一実施形態では、モノクローナル抗体は、１７Ｅ１のＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２部分を含む。また、提供されるのは、１７Ｅ１の重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体である。一実施形態では、モノクローナル抗体は、１７Ｅ１の重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含む。また、提供されるのは、１７Ｅ１の軽鎖可変領域または１７Ｅ１の軽鎖可変領域の１、２または３つのＣＤＲをさらに含むモノクローナル抗体である。場合により、該軽鎖または重鎖ＣＤＲのいずれか１個または複数は、１、２、３、４または５個以上のアミノ酸改変（例えば、置換、挿入または欠失）を含み得る。場合により、提供されるのは、抗体１７Ｅ１の抗原結合領域の一部または全てを含む軽鎖および／または重鎖可変領域のいずれかが、ヒトＩｇＧタイプ、場合により、ヒト定常領域、場合により、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３アイソタイプの免疫グロブリン定常領域に、融合される抗体である。
【０１５７】
別の態様では、提供されるのは抗体であり、該抗体は次記を含む：表Ａで示されるアミノ酸配列を含む１７Ｅ１のＨＣＤＲ１領域、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９または１０個の連続したアミノ酸の配列、場合により、これらのアミノ酸の１個または複数は異なるアミノ酸により置換されてもよく；表Ａに示されるアミノ酸配列を含む１７Ｅ１のＨＣＤＲ２領域、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９または１０個の連続したアミノ酸の配列、場合により、これらのアミノ酸の１個または複数は異なるアミノ酸により置換されてもよく；表Ａで示されるアミノ酸配列を含む１７Ｅ１のＨＣＤＲ３領域、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９または１０個の連続したアミノ酸の配列、場合により、これらのアミノ酸の１個または複数は異なるアミノ酸により置換されてもよく；表Ａで示されるアミノ酸配列を含む１７Ｅ１のＬＣＤＲ１領域、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９または１０個の連続したアミノ酸の配列、場合により、これらのアミノ酸の１個または複数は異なるアミノ酸により置換されてもよく；表Ａに示されるアミノ酸配列を含む１７Ｅ１のＬＣＤＲ２領域、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９または１０個の連続したアミノ酸の配列、場合により、これらのアミノ酸の１個または複数は異なるアミノ酸により置換されてもよく；表Ａで示されるアミノ酸配列を含む１７Ｅ１のＬＣＤＲ３領域、またはその少なくとも４、５、６、７、８、９または１０個の連続したアミノ酸の配列、場合により、これらのアミノ酸の１個または複数は異なるアミノ酸により欠失または置換されてもよい。ＨＣＤＲ１、２、３およびＬＣＤＲ１、２、３配列は、場合により、全てが（またはそれぞれ独立に）Ｋａｂａｔナンバリングシステムのものである（各ＣＤＲに対し表Ａで示されるように）、Ｃｈｏｔｉａナンバリングシステムのものである（各ＣＤＲに対し表Ａで示されるように）、ＩＭＧＴナンバリングシステムのものである（各ＣＤＲに対し表Ａで示されるように）、または任意の他の好適なナンバリングシステムであると特定され得る。
【０１５８】
本明細書の実施形態のいずれかの別の態様では、８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂまたは１７Ｅ１の重鎖および軽鎖可変領域のいずれも、および／または重鎖および軽鎖のＣＤＲ１、２、および３のいずれも、その少なくとも４、５、６、７、８、９、または１０個の連続したアミノ酸の配列により、および／または対応する配列番号に記載されている特定の可変領域、ＣＤＲまたはＣＤＲのセットと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を有するとして特徴付けられ得る。
【０１５９】
いずれかの抗体、例えば、８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂまたは１７Ｅ１では、特定された可変領域およびＣＤＲ配列は、配列改変、例えば、置換（１、２、３、４、５、６、７、８個またはそれを超える配列改変）を含み得る。一実施形態では、重鎖および軽鎖のＣＤＲ１、２および／または３は、１、２、３個またはそれを超えるアミノ酸置換を含み、置換された残基は、ヒト起源の配列中に存在する残基である。一実施形態では、置換が保存的改変である。保存的配列改変は、そのアミノ酸配列を含む抗体の結合特性に大きく影響しないまたはそれを大きく変えないアミノ酸改変を意味する。このような保存的改変には、アミノ酸置換、付加および欠失が含まれる。改変は、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発などの当該技術分野において既知の標準的な技術により抗体中に導入できる。保存的アミノ酸置換は通常、アミノ酸残基が、類似の物理化学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるアミノ酸置換である。特定の可変領域およびＣＤＲ配列は、１、２、３、４つまたはそれを超えるアミノ酸挿入、欠失または置換を含み得る。置換が行われる場合、好ましい置換は保存的改変である。類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で定義されている。これらのファミリーとしては以下が含まれる：塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）。したがって、抗体のＣＤＲ領域内の１個または複数のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリー由来の他のアミノ酸残基によって置き換えることができ、変えられた抗体は、本明細書で記載のアッセイを用いて、保持された機能（すなわち、本明細書で示された特性）に関して試験できる。
【０１６０】
２つ以上のポリペプチドの配列間の関係で使用される「同一性」または「同一の」という語は、２つ以上のアミノ酸残基の配列間の一致の数により決定される、ポリペプチド間の配列関連性の程度を意味する。「同一性」は、特定の計算モデルまたはコンピュータープログラム（即ち、「アルゴリズム」）により行われる、（存在する場合）ギャップアライメントを用いた２つ以上の配列の小さい方の間の完全な一致のパーセントを示す。関連ポリペプチド間の同一性は、既知の方法により、容易に計算できる。このような方法としては、限定されないが、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８、Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  １，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１、およびＣａｒｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．４８，１０７３（１９８８）に記載の方法が挙げられる。
【０１６１】
同一性を決定するための好ましい方法は、試験される配列間で最大マッチを得るように設計されている。同一性を決定する方法は、公表されているコンピュータープログラムに記載されている。２つの配列間の同一性を決定するための好ましいコンピュータープログラム方法は、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１２，３８７（１９８４）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０、１９９０を含む、ＧＣＧプログラムパッケージを含む。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）および他の情報源（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，前出）から公表されている。周知のＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも同一性の決定に使用できる。
【０１６２】
ＡｂＭ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ’ｓ  ＡｂＭ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ）、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａの定義システムによるＣＤＲの配列は以下の表Ａに要約されている。抗体の可変領域の配列を下表Ｂに示し（リーダー配列が存在する場合、任意の抗体鎖は、リーダー配列の終わりの直後のアミノ酸位置から開始されると特定できる）、各ＣＤＲに下線を付けた。本明細書のいずれかの実施形態では、ＶＬまたはＶＨ配列は、シグナルペプチドまたはその任意の一部を含むかまたは欠くように指定またはナンバリングできる。
【０１６３】
一実施形態では、抗体は、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３アイソタイプである。一実施形態では、抗体は、それらの結合および／または機能特性を保持している抗体フラグメントである。
【表１】
2020506720.tif 000003
2020506720.tif 000004
【表２】
2020506720.tif 000005
【０１６４】
フラグメントおよび誘導体
抗体のフラグメントおよび誘導体（別に定める場合を除き、または明確に文脈と矛盾することがない限り、これは、本出願で使用される場合、用語の「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」または「抗体（複数）（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」に包含される）、好ましくは、８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂまたは１７Ｅ１様抗体は、当技術分野において既知の技術により作成できる。「フラグメント」は、完全な抗体の一部、通常は、抗原結合部位または可変領域を含む。抗体フラグメントの例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント；ディアボディ；連続したアミノ酸残基の１個の中断されていない配列からなる一次構造を有するポリペプチドである任意の抗体フラグメント（本明細書においては、「単鎖抗体フラグメント」または「単鎖ポリペプチド」と称する）であって、限定されないが、（１）単鎖Ｆｖ分子、（２）結合重鎖部分を含まない、１個のみの軽鎖可変ドメインを含み、軽鎖可変ドメインの３つのＣＤＲを含む単鎖ポリペプチド、またはそのフラグメント、および（３）結合軽鎖部分を含まない、１個のみの重鎖可変ドメインを含み、重鎖可変ドメインの３つのＣＤＲを含む単鎖ポリペプチド、またはそのフラグメントを含む抗体フラグメント；および抗体フラグメントから形成された多重特異的抗体、が含まれる。特に、ナノボディ、ドメイン抗体、単一ドメイン抗体または「ｄＡｂ」が含まれる。
【０１６５】
本抗体のフラグメントは、標準的な方法を用いて得ることができる。例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントは、従来技術に従って、単離抗体のプロテアーゼ消化により作製し得る。免疫反応性フラグメントは、既知の方法を使用して改変でき、例えば、インビボクリアランスを遅らせて、より望ましい薬物動態プロファイルが得られ得ように、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いてフラグメントを改変し得ることは理解されよう。
【０１６６】
あるいは、抗体を産生するハイブリドーマのＤＮＡを、フラグメントをコードするように改変し得る。改変されたＤＮＡはその後、発現ベクター中に挿入され、適切な細胞を形質転換または遺伝子導入するのに使用され、その後、目的のフラグメントが発現される。
【０１６７】
特定の実施形態では、抗体を産生するハイブリドーマのＤＮＡは、発現ベクター中の挿入の前に、例えば、相同非ヒト配列の代わりに、ヒト重鎖および軽鎖定常ドメインのコード配列で置換することにより、または非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全てまたは一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合で連結することにより、改変することができる。そのようにして、元の抗体の結合特異性を有する「キメラ」または「ハイブリッド」抗体が調製される。通常、このような非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常ドメインを置換する。
【０１６８】
一実施形態では、抗体はヒト化されている。抗体の「ヒト化」型は、特異的キメラ免疫グロブリン、その免疫グロブリン鎖またはフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または抗体の他の抗原結合部分配列）であり、これらはマウス免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含む。大部分は、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、元の抗体（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基により置換され、同時に、目的の元の抗体の特異性、親和性、および能力を維持している。
【０１６９】
いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基が対応非ヒト残基よって置換され得る。さらに、ヒト抗体は、レシピエント抗体または取り込まれたＣＤＲもしくはフレームワーク配列のいずれにも見いだされない残基を含み得る。これらの改変は、抗体性能をさらに改良し、最適化するように行われる。一般に、ヒト化抗体は、実質的に、少なくとも１個、通常２個の可変ドメイン全てを有し、全てもしくは実質的に全てのＣＤＲ領域が元の抗体のものに対応し、また、全てもしくは実質的に全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。また、ヒト化抗体は、最も適切なように、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、通常はヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む。さらなる詳細は、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１，ｐｐ．５２２（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３３２，ｐｐ．３２３（１９８８）；Ｐｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２，ｐｐ．５９３（１９９２）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９，ｐｐ．１５３４；および米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい。これらの文献の全開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７０】
ヒト化抗体作製で使用されるヒト可変領域（重鎖および軽鎖の両方）の選択は、抗原性を減らす上で極めて重要である。いわゆる「最良適合」法にしたがって、抗体の可変ドメインの配列が、既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングされる。次に、マウスの配列に最も近いヒト配列を、ヒト化抗体のヒト・フレームワーク（ＦＲ）として受け入れる（Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１，ｐｐ．２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．１９６，１９８７，ｐｐ．９０１）。別の方法は、軽鎖または重鎖の特定のサブグループの全ヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークを、いくつかの異なる非ヒト抗体に用いることができる（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ８９，ｐｐ．４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１，ｐ．２６２３（１９９３））。
【０１７１】
さらに重要なことは、抗体がＮＫｐ４６受容体に対する高い親和性と他の好ましい生物学的性質とを保ちながらヒト化されることである。この目的を達成するために、好ましい方法にしたがって、親配列およびヒト化配列の三次元モデルを用いて、親配列と種々の概念上のヒト化産物とを分析する方法によって、ヒト化抗体が調製される。三次元免疫グロブリンモデルが一般的に利用可能であり、当業者によく知られている。コンピュータープログラムを利用可能であり、これにより、選択された候補免疫グロブリン配列の確度の高い三次元構造が説明および表示される。このような表示物を検証することは、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の有望な役割の分析（すなわち、抗原を結合させる候補免疫グロブリンの能力に影響を及ぼす残基の分析）を可能とさせる。このようにして、標的抗原に対する親和性の増大など、望ましい抗体特性が達成されるように、コンセンサス配列およびインポート配列から、ＦＲ残基を選択し組合せることができる。一般に、ＣＤＲ残基は直接的かつ最も実質的に、抗原結合への影響に関与している。一例では、ヒト化抗体鎖のＦＲは、非ヒトドナーの可変領域（例えば、８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂまたは１７Ｅ１抗体）と、少なくとも約６０％の全体配列同一性、および好ましくは少なくとも約８０％の全体配列同一性を有するヒト可変領域由来である。場合により、ヒト化重鎖および／または軽鎖可変領域は、非ヒトドナーのそれぞれの重鎖および／または軽鎖可変領域（例えば、８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂまたは１７Ｅ１抗体）と、少なくとも約６０％、７０％または８０％の全体配列同一性を共有する。
【０１７２】
「ヒト化」モノクローナル抗体を作製する別の方法は、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）を免疫化のために使用するマウスとして用いることである。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅは、その免疫グロブリン遺伝子が機能的ヒト免疫グロブリン遺伝子と置換されたマウス宿主である。したがって、このマウスにより、またはこのマウスのＢ細胞から作製されたハイブリドーマ中で産生された抗体は、既にヒト化されている。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅは、米国特許第６，１６２，９６３号に記載されている。この特許は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１７３】
ヒト抗体はまた、免疫化のために、ヒト抗体レパートリーを発現するように遺伝子改変されている他の遺伝子導入動物を使用する（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６２（１９９３）２５５）ことによる、またはファージディスプレイ法を使って抗体レパートリーの選択による、などの種々の他の技術により作製し得る。このような技術は、当業者に既知であり、本出願に開示のように、モノクローナル抗体から出発して、実施することができる。
【０１７４】
抗体はまた、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）に誘導体化され得、「キメラ」抗体中では、それらが目的の生物活性および結合特異性を示す限りにおいて、重鎖／軽鎖の一部は、元の抗体の対応する配列と同じであるかまたはそれに相同であり、一方、その鎖の残りの部分は、別の種由来の抗体または別の抗体種類またはサブクラスに属する抗体、ならびにこのような抗体のフラグメントに対応する配列と同じであるかまたはそれに相同である（Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，ｐｐ．６８５１（１９８４））。
【０１７５】
抗ＮＫｐ４６抗体分子を用いて、ＮＫｐ４６を発現している細胞を、例えば、検出可能な薬剤に結合した抗ＮＫｐ４６抗体を含む抗ＮＫｐ４６免疫複合体として、検出できる。抗体または抗体部分が誘導体化（または標識）され得る有用な検出可能薬剤には、蛍光化合物、種々の酵素、補欠分子団、発光材料、生物発光材料、蛍光発光金属原子、例えば、ユーロピウム（Ｅｕ）、およびその他のランタニド、および放射性物質（上記）が挙げられる。例示的蛍光検出可能薬剤には、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、５−ジメチルアミン−１−ナフタレンスルホニルクロリド、フィコエリトリン、などが挙げられる。抗体はまた、アルカリフォスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコースオキシダーゼ、などの検出可能な酵素を用いて、誘導体化され得る。抗体が検出可能な酵素で誘導体化される場合、それは、酵素が使用して検出可能な反応生成物を生成する追加の試薬を添加することにより検出される。例えば、検出可能な薬剤西洋ワサビペルオキシダーゼが存在する場合、過酸化水素およびジアミノベンジジンの添加により、着色反応生成物が生じ、これは、検出可能である。抗体はまた、補欠分子団（例えば、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチン）で誘導体化し得る。例えば、抗体は、ビオチンで誘導体化され、アビジンまたはストレプトアビジン結合の間接的測定を介して検出され得る。好適な蛍光物質の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられ；発光物質の一例には、ルミノールが挙げられ；生物発光物質の例には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられる。あるいは、抗ＮＫｐ４６抗体は、抗ＮＫｐ４６抗体に結合する第２の抗体と結合され得、第２の抗体は、検出可能な標識で誘導体化され、インビトロまたはインビボで該第２の抗体を抗ＮＫｐ４６抗体と接触させることにより、抗ＮＫｐ４６を標識抗体として機能させることができる。
【０１７６】
検出可能部分への結合は、本開示の抗体が診断目的に使用される場合に、特に有用である。このような目的には、限定されないが、生物試料、例えば、ＮＫｐ４６発現細胞の存在を調べるための、血液試料または組織生検材料のアッセイ、個体中のＮＫｐ４６発現細胞の存在、レベル、または活性の検出が挙げられる。このようなアッセイおよび検出法を、例えば、患者の細胞中のＮＫｐ４６発現を検出すること、および患者の細胞がＮＫｐ４６を発現していると判定される場合、引き続いて、本発明のＮＫｐ４６調節抗体を投与することを含む、本明細書の診断／治療方法で使用できる。
【０１７７】
特定の実施形態では、本抗体を使用して、生物試料からＮＫｐ４６発現細胞が精製される。生物試料は、例えば、診断またはエクスビボ治療目的のために患者から取得でき、または研究目的のために、このような細胞の供給源を得るために、個体または非ヒト霊長類から得ることができる。
【０１７８】
このような一実施形態では、標識抗体をＦＡＣＳ選別で用いて、生物試料からＮＫｐ４６発現細胞を精製または単離できる。あるいは、いくつかの実施形態では、本明細書の抗体の固体支持体への結合は、血液試料または個体からの組織生検試料からの細胞などの生物試料由来のそれらの細胞表面上にＮＫｐ４６受容体を有する細胞の親和性精製のためのツールとして有用であり得る。この精製方法は、そのままで、結果として生じる精製細胞集団であるので、別の代替実施形態である。
【０１７９】
ＮＫｐ４６発現細胞を単離または精製するのに使用された方法に関係なく、これを行う能力は、多数の目的に有用であり、例えば、本明細書に記載の抗ＮＫｐ４６抗体の投与の前に、例えば、ＮＫｐ４６発現細胞の数または活性を評価することにより、ＮＫｐ４６関連障害を診断するために、有用である。さらに、精製ＮＫｐ４６発現細胞は、例えば、細胞とそれらの種々の特性と行動をより良好に特徴付けるために、ならびに、それらの行動、活性、生存、または増殖を調節するために使用できる化合物または物質を特定するために、研究状況において有用である。
【０１８０】
抗体−薬物複合体
いくつかの実施形態では、抗体分子および非抗体部分は、リンカーにより連結される。このような実施形態では、免疫複合体は、式（Ｉ）：
Ａｂ−（Ｘ−（Ｚ）ｎ）ｍ        式（Ｉ）
により表され、式中、
Ａｂは、本開示の抗ＮＫｐ４６抗体であり；
Ｘは、ＡｂおよびＺに連結する部分であり、例えば、ＡｂおよびＺの片方または両方に共有結合後のリンカーの残基であり、
Ｚは、治療薬（例えば、任意の細胞傷害薬）または標識、あるいは、ＮＫｐ４６発現細胞に送達される任意の他の部分であり；および
ｎは、１〜１０の内から選択される整数であり、場合により、１、２、３、または４であり；
ｍは、１〜１５の内から選択される整数である。
【０１８１】
変数ｍは、式（Ｉ）の免疫複合体中の抗体分子当たりの−Ｘ−Ｚ部分の数を表す。種々の実施形態では、ｍは、１〜１５、１〜１０、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２の範囲である。いくつかの実施形態では、ｍは、２〜１０、２〜９、２〜８、２〜７、２〜６、２〜５、２〜４、または２〜３の範囲である。他の実施形態では、ｍは、１、２、３、４、５または６である。式（Ｉ）の複数の免疫複合体を含むいくつかの組成物では、ｍは、Ａｂ当たりの−Ｘ−（Ｚ）ｎ部分の平均数であり、平均薬物負荷とも呼ばれる。平均薬物負荷は、Ａｂ当たり１〜約１５−Ｘ−（Ｚ）ｎ部分の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、ｍが平均薬物負荷を表す場合、ｍは、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、または約８である。例示的実施形態では、ｍは約２〜約８である。一実施形態では、ｍは約８である。別の実施形態では、ｍは約４である。別の実施形態では、ｍは約２である。場合により、ｎは１である。
【０１８２】
Ａｂ当たりの−Ｘ−Ｚ部分の数は、質量分析、ＥＬＩＳＡアッセイ、およびＨＰＬＣなどの従来の手段により特徴付けされ得る。ｍの観点からの免疫複合体の定量的分布も測定し得る。いくつかの事例では、別の薬物負荷を有する免疫複合体から識別するように、ｍが特定の値である場合、均一免疫複合体の分離、精製、およびキャラクタリゼーションは、逆相ＨＰＬＣまたは電気泳動などの手段により実現し得る。
【０１８３】
式（Ｉ）の免疫複合体は、混合物として存在し得、混合物の各成分は、異なるｍ値を有する。例えば、式（Ｉ）の免疫複合体は、２、３、４種またはそれを超える別々の免疫複合体成分を含むまたはその成分からなる混合物として存在し得、混合物は、ｍが１、２、３、４、５、６、７または８である第１の免疫複合体成分およびｍが１、２、３、４、５、６、７または８である第２の免疫複合体成分、および必要に応じ、第３、および／または第４、および／またはさらなる免疫複合体を含む。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、例えば、実施例に記載のように、式（Ｉ）の免疫複合体は、実質的に均質な組成物として存在し、組成物中の少なくとも８０％、９０％または９５％の免疫複合体が同じｍ値を有し（例えば、同じｍ値および同じｎ値）；場合により、ｎは、１または２で、ｍは２または４である。
【０１８５】
種々の好適なリンカー（例えば、抗体分子を治療薬または標識に連結するためのヘテロ二機能性試薬）および免疫複合体の調製方法が当技術分野において既知である。（例えば、Ｃｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：１２７−１３１（１９９２）を参照されたい）。リンカーは、例えば、生理的条件下で、例えば、細胞内条件下で切断可能であり、リンカーの切断により、細胞内環境中で薬物（治療薬または標識）が放出される。他の実施形態では、リンカーは、切断可能ではなく、薬物は、例えば、抗体分解により放出される。
【０１８６】
リンカーは、抗体部分、例えば、遊離アミノ、イミノ、ヒドロキシル、チオールまたはカルボキシル基（例えば、ＮまたはＣ末端、１個または複数のリシン残基のイプシロンアミノ基、１個または複数のグルタミン酸もしくはアスパラギン酸残基の遊離カルボン酸基、または１個または複数のシステイニル残基のスルフヒドリル基）上の化学的反応性基に結合できる。リンカーが結合する位置は、抗体部分のアミノ酸配列中の天然残基であり得、または、例えば、ＤＮＡ組換え技術により（例えば、システインまたはアミノ酸配列中にプロテアーゼ切断部位を導入することにより）もしくはタンパク質生化学により（例えば、還元、ｐＨ調節またはタンパク質分解により）抗体部分に導入できる。
【０１８７】
最も一般的に使用されている共有結合の非特異的方法の１つは、化合物のカルボキシ（またはアミノ）基を、抗体分子のアミノ（またはカルボキシ）基に連結するカルボジイミド反応である。さらに、ジアルデヒドまたはイミドエステルなどの二官能性薬剤が、化合物のアミノ基の抗体分子のアミノ基への連結に使用されてきた。また、薬物の抗体分子への結合に利用可能なのは、シッフ塩基反応である。本方法は、グリコールまたはヒドロキシ基を含む薬物の過ヨウ素酸塩酸化によるアルデヒドの形成を含み、その後これは抗体分子と反応させられる。結合は、抗体分子のアミノ基によるシッフ塩基の形成を介して起こる。イソチオシアネートはまた、薬物を抗体分子に共有結合させるためのカップリング剤としても使用できる。その他の技術も当業者に既知である。
【０１８８】
特定の実施形態では、リンカー（Ｘ）の前駆物質である中間体は、適切な条件下で、薬物（Ｚ）と反応させられる。特定の実施形態では、薬物および／または中間体上の反応性基が使われる。薬物と中間体との反応生成物、または誘導体化薬物は、その後、適切な条件下で抗体分子と反応させられる。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、リンカーは、細胞内環境中（例えば、リソソームまたはエンドソームまたはカベオレア中）に存在する切断剤により切断される。リンカーは、限定されないが、例えば、リソソームまたはエンドソームプロテアーゼを含む細胞内ペプチダーゼまたはプロテアーゼ酵素により切断されるペプチジルリンカーであり得る。いくつかの実施形態では、ペプチジルリンカーは、少なくとも２個のアミノ酸長または少なくとも３個のアミノ酸長である。切断剤は、カテプシンＢおよびＤならびにプラスミンを含み得、これらの全ては、ジペプチド薬物誘導体を加水分解し、標的細胞内で活性薬物が放出されることが知られている。最も一般的なのは、細胞中に存在する酵素により切断されるペプチジルリンカーである。例えば、癌性組織中で高度に発現されているチオール依存性プロテアーゼカテプシン−Ｂにより切断されるペプチジルリンカーを使用できる（例えば、Ｐｈｅ−ＬｅｕまたはＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙリンカー）。このようなリンカーの他の例は、例えば、米国特許第６，２１４，３４５号に記載されている。参照によりこの特許の全体があらゆる目的のために本明細書に組み込まれる。特定の実施形態では、細胞内のプロテアーゼにより切断可能なペプチジルリンカーは、Ｖａｌ−ＣｉｔリンカーまたはＰｈｅ−Ｌｙｓリンカーである（例えば、米国特許第６，２１４，３４５号を参照されたい。この特許は、Ｖａｌ−Ｃｉｔリンカーを用いたドキソルビシンの合成について記載している）。治療薬の細胞内タンパク分解性放出を用いる利点の１つは、薬剤が通常、結合時に減弱化され、複合体の血清安定性が通常高いということである。
【０１９０】
他の実施形態では、切断可能リンカーはｐＨ感受性、すなわち、特定のｐＨ値で加水分解を受けやすい。通常、ｐＨ感受性リンカーは、酸性条件下で加水分解性である。例えば、リソソーム中で加水分解性である酸に不安定なリンカー（例えば、ヒドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、シス−アコニット酸アミド、オルトエステル、アセタール、ケタール、など）が使用できる。このようなリンカーは、血液中の条件などの中性ｐＨ条件下で比較的安定であるが、リソソームの大凡のｐＨであるｐＨ５．５または５．０未満では不安定である。特定の実施形態では、加水分解型リンカーは、チオエーテルリンカー（例えば、アシルヒドラゾン結合を介して治療薬に結合したチオエーテル）である（例えば、米国特許第５，６２２，９２９号を参照されたい）。
【０１９１】
さらに他の実施形態では、リンカーは、還元条件下で切断可能である（例えば、ジスルフィドリンカー）。種々のジスルフィドリンカーが当技術分野において既知であり、これには、例えば、ＳＡＴＡ（Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオ酢酸）、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸）、ＳＰＤＢ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）ブチレート）およびＳＭＰＴ（Ｎ−スクシンイミジル−オキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジル−ジチオ）トルエン）を用いて形成できるものが挙げられる。
【０１９２】
さらに他の特異的実施形態では、リンカーはマロネートリンカー（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９５，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１５：１３８７−９３）、マレイミドベンゾイルリンカー（Ｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，ＢｉｏｏｒｇＭｅｄ  Ｃｈｅｍ．３（１０）：１２９９−１３０４）、または３’−Ｎ−アミド類似体（Ｌａｕ  ｅｔ  ａｌ，１９９５，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３（１０）：１３０５−１２）である。
【０１９３】
さらに他の実施形態では、リンカー単位は、切断可能ではなく、薬物は、抗体分解により放出される。（例えば、米国特許出願公開第２００５／０２３８６４９号を参照されたい。この特許は参照によりその全体があらゆる目的のために本明細書に組み込まれる）。
【０１９４】
一実施形態では、リンカーは、細胞外環境に対して実質的に敏感ではない。本明細書で使用される場合、リンカーの文脈における「細胞外環境に対して実質的に敏感ではない」は、免疫複合体の試料中で、約２０％以下、通常約１５％以下、より典型的には約１０％以下、およびさらにより典型的には約５％以下が、免疫複合体が細胞外環境中（例えば、プラズマ中）に存在する場合に切断されることを意味する。リンカーが細胞外環境に対し実質的に敏感であるかどうかは、例えば、プラズマと共に免疫複合体を所定の時間にわたり（例えば、２、４、８、１６、または２４時間にわたり）インキュベートし、その後、プラズマ中に存在する遊離薬物の量を定量することにより、判定できる。
【０１９５】
他の実施形態では、リンカーは、結合能力との干渉を避けるために、薬剤から抗体を離すためのスペーサーとして機能し得る。一実施形態では、リンカーは、ストレッチャー単位、例えば、抗体のイオウ原子、一級または二級二級アミノ基または炭水化物基と結合を形成する分子を含み得、このストレッチャーは、抗体を治療薬または標識（Ｚ）に、またはアミノ酸単位に結合し、次には、Ｚに結合する。ストレッチャーがアミノ酸単位に結合する場合、アミノ酸単位は、Ｚに直接的に結合できるかまたはアミノ酸単位とＺを連結するスペーサー要素（例えば、非自壊性または自壊性スペーサー）を含むことができる。アミノ酸単位は、単一アミノ酸またはペプチド、例えば、バリン−シトルリンまたはフェニルアラニン−リシンであり得る。
【０１９６】
特定の実施形態では、酵素触媒法が、細胞傷害薬の、抗体のアミノ酸残基への結合に使用される。
【０１９７】
好都合にも、トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）酵素は、抗体上のアクセプターグルタミンの細胞傷害薬による官能化を化学量論的に触媒するのに用いられる。例えば、ＴＧａｓｅ触媒法は、抗体を大きなおよび／または疎水性基質（例えば、高度疎水性有機分子であるピロロベンゾジアゼピン二量体）で官能化するのに使用できる。別の例では、ソルターゼ酵素は、抗体上の、例えば、抗体の定常領域内でまたはそれに付加された遺伝子改変ソルターゼ認識ペプチドタグ内の、受容体アミノ酸残基の官能化を触媒するのに用いられる。ＴＧａｓｅ−触媒法およびしたがって、好適なリンカーを用いた、細胞傷害性部分の抗体定常領域上のアクセプターグルタミンに対するカップリングは、国際公開第２０１３／３０９２８３号および同第２０１４／２０２７７５号（Ｉｎｎａｔｅ  Ｐｈａｒｍａ）に記載されている。これらの特許の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。ＴＧファミリーの酵素は、１個のタンパク質のリシンドナー残基と、別のタンパク質のアクセプターグルタミン残基との間のプロテイナーゼ耐性イソペプチド結合形成による共有結合タンパク質架橋を触媒し、アンモニアが放出される。トランスグルタミナーゼの触媒機構は以下のように提案されている。グリシン含有第１の基質（アクセプターグルタミン）が酵素に結合後、それは、ＴＧａｓｅの活性中心にシステイン残基を有し、アシル酵素中間体として知られる、γ−グルタミルチオエステルを形成し、アンモニアの放出が伴う。その後、第２の基質（ドナーまたはＫ−基質）が、アシル酵素中間体に結合し、チオエステル結合を攻撃する。生成物（Ｎε（γ−グルタミル）リシンイソペプチド架橋により架橋される２つのタンパク質）が形成され、放出される。これは、酵素の活性中心Ｃｙｓ残基をその元の形態に回復し、それを別の触媒サイクルに関与可能にする。共有結合アシル酵素中間体の形成は、これらの反応の律速ステップと考えられる。多くのトランスグルタミナーゼの触媒三残基は、パパイン様であり、Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ａｓｐを含み（ここで、Ｈｉｓはヒスチジン、Ａｓｐはアスパラギン酸である）、極めて重要なのは、トリプトファン（Ｔｒｐ）残基が活性中心のＣｙｓから３６残基離れて位置することである。対照的に、ストレプトベルチキリウム属種（ｖｉｄｅ：前出）からの単離物細菌性ＴＧは、非定型触媒三残基を有し、他のＴＧａｓｅのパパイン様触媒三残基と配列相同性を示さない。
【０１９８】
ＴＧａｓｅは、グルタミンタンパク質基質の認識で、厳密な特異性を示す。しかし、ＴＧａｓｅは、アシル−アクセプターアミン基の認識に対し、広範な特異性を示し、前述アミン基は、ペプチジルリシンのε−アミノ基または低分子量一級アミン（多くの場合ポリアミン）であり得る（例えば、Ｆｏｌｋ，ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５，３６９５−３７００を参照されたい）。したがって、広範囲のリシンベースリンカーが想定できる。例えば、リシンに加えて、小さいリシン模倣一級アミン５−ペンチルアミン（カダベリン）およびバリアントまたはそのフラグメントが、アシル酵素中間体に効果的に結合でき、グルタミン含有タンパク質と疑似イソペプチド結合が形成される。例えば、Ｌｏｒａｎｄ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９７９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １８，１７５６−１７６５（１９７９）；Ｍｕｒｔｈｙ，Ｓ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，２２９０７−２２９１１（１９９４）；Ｍｕｒｔｈｙ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００９）を参照されたい。
【０１９９】
細菌、古細菌および真核生物のＴＧａｓｅが、特性を明らかにされており、哺乳動物ＴＧａｓｅとはいくつかの点で異なる（Ｌｏｒａｎｄ，Ｌ．＆  Ｇｒａｈａｍ，Ｒ．Ｍ．（２００３）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．４，１４０−１５６）。ＢＴＧおよびさらに一般的には、微生物ＴＧａｓｅ（ＥＣ．２．３．２．１３、タンパク質−グルタミン−γ−グルタミルトランスフェラーゼ）例えば、ストレプトミセス・モバラエンシスは、カルシウムに依存せず、哺乳動物ＴＧとは全く異なるアミノ酸配列を有する（Ａｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５３，２６１３−２６１７）。ＢＴＧは、さらに、遙かに小さい（モルモット肝臓ＴＧの７６．６ｋＤａに比べて３７．８ｋＤａ）。さらに、ＢＴＧは、タンパク質中のアミンアクセプターグルタミン基質に対し、哺乳動物ＴＧａｓｅより広い基質特異性を示す。これらの特性は、より高い反応速度、低コスト製造、および脱アミド化を触媒する傾向の減少と一緒に、ＢＴＧを本明細書で用いるのに好ましい酵素にしている。
【０２００】
抗体は、好適な位置で抗体に導入されたアクセプターグルタミンに結合できる。例えば、１つまたはいくつかの目的のアクセプターグルタミンを含むグルタミン認識タグは、一連のペプチド配列の中から選択し、抗体重鎖および／または軽鎖のＣ末端に融合できる。
【０２０１】
アクセプターグルタミンが、残基Ｑ２９５の位置の天然に存在するグルタミン残基（Ｋａｂａｔ  ＥＵナンバリング）および／または近くの位置の残基、例えば、残基Ｎ２９７である場合、リシンベースリンカーに結合される抗体は通常、残基Ｎ２９７（Ｋａｂａｔ  ＥＵナンバリング）の位置にＮ結合型グリコシル化を含まないであろう。完全長野生型ＩｇＧ抗体は、重鎖の残基２９７の位置にＮ結合型グリコシル化を天然で含み、これは、ＣＨ２ドメイン中に天然で存在する残基Ｑ２９５に対するＴＧａｓｅ媒介結合と干渉し、結合を阻止する。したがって、抗体は、Ｎ２９７結合グリコシル化を欠くように、調製され得る。酵素的脱グリコシル化は、本明細書に記載のように、または任意の好適な方法により実施できる。例えば、ＰＢＳ緩衝液（０．１ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌおよび０．０５ｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４）中の抗体（１ｍｇ）を１００単位（０．２μＬ）のフラボバクテリウム・メニンゴセプチカム（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＵＫ）由来のＮ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ  Ｆ）と共に３７℃で一晩インキュベートした。その後、遠心分離−透析（Ｖｉｖａｓｐｉｎ  ＭＷＣＯ  ５０  ｋＤａ，Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗｉｎｋｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）により、酵素が取り出される。生成物をＬＣ／ＭＳにより分析できる。あるいは、抗体Ｆｃドメインを、Ｎ結合型グリコシル化を阻止するアミノ酸置換を導入するように遺伝子改変することができる。例えば、Ｎ２９７Ｘ置換を抗体の重鎖に導入でき、Ｘは、アスパラギン以外の任意のアミノ酸である。Ｘがグルタミン残基の場合、残基２９７の位置のグルタミンは、アクセプターグルタミンとして機能し、ＴＧａｓｅによりリンカーに結合される。
【０２０２】
抗体は、所望数のアクセプターグルタミンを有するように遺伝子改変できる。一例では、抗体は、各重鎖の残基２９５の位置に単一アクセプターグルタミンを含み（例えば、抗体はＮ２９７Ｘ置換を含み、Ｘはアスパラギンまたはグルタミン以外の任意のアミノ酸であるか、または抗体は酵素的に脱グリコシル化されている）、抗体は、合計２つのアクセプターグルタミンを有することになる。一例では、抗体は、各重鎖の残基２９７の位置に単一アクセプターグルタミンを含み（例えば、抗体は、Ｑ２９５Ｘ置換およびＮ２９７Ｑ置換を含み、Ｘはグルタミン以外の任意のアミノ酸である）、抗体は、合計２つのアクセプターグルタミンを有することになる。一例では、抗体は、各重鎖の残基２９５および２９７の位置に単一アクセプターグルタミンを含み（例えば、抗体は、Ｎ２９５Ｑ置換を含む）、抗体は、合計４つのアクセプターグルタミンを有することになる。一例では、抗体は、場合により、介在アミノ酸残基を介して、軽鎖および／または重鎖のＣ末端に融合されたＴＧａｓｅ認識タグ内に１個または複数のアクセプターグルタミンを含む。
【０２０３】
一実施形態では、生成物に対し、薬物負荷（例えば、抗体当たりの複合体の数）の分析が行われる。このような方法を用いて、抗体当たりの複合体の平均数（例えば、平均ＤＡＲ）ならびに、組成物中の抗体当たりの複合体の数の分布、すなわち、任意の所与のレベルの薬物負荷またはＤＡＲを有する合計抗体のパーセンテージを決定できる。複合体化アクセプターグルタミンの数（ｎ）を有する抗体（例えば、ｎ＝１、２、３、４、５、６、など）の比率を決定できる。このような測定およびより一般的には、薬物負荷の測定に応用される１つの技術は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）であり、ＨＩＣは、例えば、Ｈａｍｂｌｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１０：７０６３−７０７０；Ｗａｋａｎｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）ｍＡｂｓ  ３（２）：１６１−１７２；ａｎｄ  Ｌｙｏｎ  ｅｔ  ａｌ（２０１２）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５０２：１２３−１３８に記載されているようにして実施できる。この文献の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２０４】
有用なＴＧａｓｅの例には、例えば、ストレプトマイセス・モバレンス、ストレプトマイセス・シンナモネウムおよびストレプトマイセス・グリセオカルネウム由来などの微生物トランスグルタミナーゼが挙げられる（好適なＴＧａｓｅの考察に関しては、例えば、国際公開第２０１３／３０９２８３号および同第２０１４／２０２７７５号を参照されたい）。好ましいＴＧａｓｅは、細菌性トランスグルタミナーゼ（ＢＴＧ）である（例えば、ＥＣ２．３．２．１３  タンパク質−グルタミン−γ−グルタミルトランスフェラーゼを参照されたい）。より好ましい実施形態では、ＴＧａｓｅは、ストレプトマイセス・モバレンス由来である。別の実施形態では、ＴＧａｓｅは、天然のＴＧａｓｅに対し、少なくとも８０％配列相同性を有する変異体ＴＧａｓｅである。好ましい例は、ストレプトミセス・モバラエンシス由来の組換え細菌性トランスグルタミナーゼである（Ｚｅｄｉｒａ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙから入手可能）。
【０２０５】
ＴＧａｓｅ触媒反応は、数時間〜１日（例えば、一晩）の穏やかな条件下で実施できる。ストレプトミセス・モバラエンシス由来の組換えＢＴＧ（ＥＣ２．３．２．１３）（Ｚｅｄｉｒａ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を１〜２０Ｕ／ｍＬ、好ましくは、６Ｕ／ｍＬ〜２０Ｕ／ｍＬの濃度で使用できる。リシンベースリンカー基質を、抗体（１ｍｇ／ｍＬ）と、リガンド濃度４００〜６００ｍｏｌ／Ｌで反応させて、抗体に比べて６０〜９０倍過剰の基質、または、場合により、より低い過剰度の基質、例えば、１〜２０倍、または１０〜２０倍過剰の基質が得られる。反応は、カリウム不含リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ８）中３７℃で実施される。４時間〜数日（抗体およびリガンドに応じて）後、定常状態条件が達成される。その後、遠心分離−透析（Ｖｉｖａｓｐｉｎ  ＭＷＣＯ  ５０  ｋＤａ，Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗｉｎｋｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、過剰なリガンドおよび酵素が取り出される。反応はＬＣ／ＭＳによりモニターされる。より多量のＴＧａｓｅを、異なるリシン誘導体および基質に応じて使用できる。
【０２０６】
抗体（例えば、例えば、ペプチドタグを有する抗体または抗体フラグメントを含む抗体一次構造の一部）上に存在するアクセプターグルタミンは、好適な条件下で、ＴＧａｓｅにより認識され、リシンベースリンカーに共有結合される。得られた抗体複合体は、任意の好適な方法を使用して分析できる。リシンベースリンカーの数および／または該当する場合には、抗体に結合した目的の部分の数、および特に、組成物の均一性を評価するために、好ましくはコンジュゲート抗体の化学量論は、トップダウンアプローチを用いて、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ／ＭＳ）により特徴付けされ得る。複合体は、ＬＣ／ＭＳ分析の前に還元され、軽鎖および重鎖が別々に測定される。
【０２０７】
一態様では、提供されるのは、目的の部分（Ｚ）を抗体に結合する方法であり、該方法は、次のステップを含む：
ａ）本開示の抗体を用意するステップであって、抗体が、重鎖および／または軽鎖定常領域中に、またはこれに付加された少なくとも１個のアクセプターグルタミン残基を含むステップ；および
ｂ）該抗体と、一級アミンを含み、目的の部分（Ｚ）を含むリンカー（リシンベースリンカー）とを、ＴＧａｓｅの存在下、目的の部分（Ｚ）に該リンカーを介して連結（共有結合）されたアクセプターグルタミンを含む抗体を得るのに十分な条件下で、反応させるステップ。
【０２０８】
本開示の特定の態様は、ＴＧａｓｅの作用により、結合され得る連結試薬を、抗体（Ａｂ）の配列内のグルタミン残基（Ｑ）の位置でポリペプチドに連結することに関する。連結試薬は、リシン誘導体（Ｌｙｓ）またはその機能的等価物を含み、少なくとも１個の反応性基（Ｒ）または目的の部分（Ｚ）に連結される。リシン誘導体（Ｌｙｓ）または機能的等価物は通常、ＴＧａｓｅの基質である、例えば、アルキルアミン、オキソアミンを含む、任意の一級アミン鎖を含み得る。一実施形態では、複数の反応性基、好ましくは非相補的反応性基が、連結試薬に結合され得る。反応性基は、水に非感受性であるが、相補的な試薬と極めて高い変換付加反応を選択的に起こす官能基であるのが好ましい。リシン誘導体の機能的等価物は、炭素鎖の１個または複数の末端に位置するＨ２Ｎまたはアミノメチレンから誘導できるＨ２ＮまたはＨ２ＮＣＨ２（アミノメチレン）基、または保護Ｈ２ＮまたはＨ２ＮＣＨ２基を有する２〜２０炭素鎖、またはその機能的等価物を含み得る。炭素鎖の機能的等価物は、３〜２０原子の鎖を含み得、一級アミン以外の１個または複数の原子は、炭素以外の原子、例えば、酸素、硫黄、窒素、または他の原子であり得、例えば、炭素鎖の１個または複数の末端に位置するＨ２ＮＯＣＨ２基、または保護Ｈ２ＮＯＣＨ２基を有する。酸素、硫黄、または窒素原子は、炭素鎖内のエーテル、エステル、チオエーテル、チオエステル、アミノ、アルキルアミノ、アミドまたはアルキルアミド官能基のものであり得る。好適なリンカーは、例えば、国際公開第２０１３／３０９２８３号および同第２０１４／２０２７７５号に記載されている。
【０２０９】
１つの例示的炭素鎖の機能的等価物は、オリゴ（エチレンオキシド）鎖である。炭素鎖内の官能基は、反応性基をＨ２Ｎ、Ｈ２ＮＯＣＨ２もしくはＨ２ＮＣＨ２基または保護Ｈ２Ｎ、Ｈ２ＮＯＣＨ２もしくはＨ２ＮＣＨ２基に結合させるために含まれ得る。炭素鎖、またはその機能的等価物は、置換もしくは非置換であり得る。例えば、炭素鎖、またはその機能的等価物は、複数の（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）基、場合により、（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）ｎ基を含むことができ、ｎは、１〜６の範囲内から選択される整数である。置換基は、アルキル基、アリール基、アルキルアリール基、カルボン酸基、アミド基、ヒドロキシ基、またはタンパク質のグルタミン残基に関しアミノ基と競合しない、またはタンパク質のグルタミン残基を阻害、それと結合しない任意の他の基であり得る。通常、置換基が存在する場合、その存在は、例えば、リシン誘導体が得られるリシンのカルボン酸基などの、都合のよい出発材料中である。炭素鎖の末端のアミンまたは機能的等価物は、必然的に、連結試薬中に含まれる。
【０２１０】
リシンの機能的等価物の出発材料の例は、α、ω−ジアミノアルカン、例えば、１，２−ジアミノエタン、１，３−ジアミノプロパン、１，４−ジアミノブタン、１，５−ジアミノペンタン、１，６−ジアミノヘキサン、１，７−ジアミノヘプタン、１，８−ジアミノオクタン、１，９−ジアミノノナン、１，１０−ジアミノデカン、１，１１−ジアミノウンデカン、または１，１２−ジアミノドデカンであり得る。リシン誘導体の機能的等価物のほかの出発材料は、α、ω−ジアミノオリゴ（エチレンオキシド）、例えば、Ｈ２Ｎ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２であり得、ｘは、１〜６の範囲内から選択される整数である。α、ω−ジアミノオリゴ（エチレンオキシド）は、単一オリゴマーであり得、またはそれは、ｘが平均サイズを規定するオリゴマーの混合物であり得る。例示的保護Ｈ２ＮＣＨ２は、ｔｅｒｔ−ブチルカルバメート保護アミンのｔｅｒｔ−ブチル  Ｎ−（５−アミノペンチル）カルバメート（Ｎ−Ｂｏｃ−カダベリン）である。
【０２１１】
目的の部分（Ｚ）の抗体への直接（一段階）連結に使用される連結試薬は、好都合にも、大きな、荷電した疎水性の有機の目的部分（Ｚ）をアクセプターグルタミンから離すためのスペーサーとして機能する要素を含む。スペーサーは、リシン誘導体またはその機能的等価物として、またはリンカーの追加の要素（例えば、本明細書で以降に記載のように、Ｌ、Ｖおよび／またはＹ基）として、実現され得る。一実施形態では、スペーサーとして機能する要素は、構造ＮＨ−（Ｃ）−を有するリシン誘導体（Ｌｙｓ）またはその機能的等価物であり、（Ｃ）は、置換もしくは非置換アルキルまたはヘテロアルキル鎖であり、鎖の任意の炭素は、アルコキシ、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アルキル−Ｓ−、チオール、アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、アミン、アルキルアミン、アミド、またはアルキルアミドで任意に置換されてもよく、鎖長は、１０原子より大きい整数、１０〜２０の範囲内の整数である。例えば、Ｃは、１個または複数の原子で置換された１０〜２０原子の炭素含有フレームワークであり得る。一実施形態では、連結試薬は、スペーサーとして機能し、ＮＨ−（Ｃ）−基と目的の部分（Ｚ）との間に配置されるＬ、Ｖおよび／またはＹ基を含み、Ｌは、１個または複数の原子の位置で置換された１〜２００原子の炭素含有フレームワークであり、場合により、炭素含有フレームワークは、直鎖炭化水素、対称的にまたは非対称に分岐した炭化水素、単糖、グリカン、二糖、直鎖または分岐鎖オリゴ糖（非対称に分岐または対称的に分岐した）、他の天然の直鎖または分岐鎖オリゴマー（非対称に分岐または対称的に分岐した）、アミノ酸残基、ジ、トリ、またはオリゴペプチド、または例えば、鎖成長または段階成長重合法のいずれかから生じた任意の二量体、三量体、またはより高次のオリゴマー（直鎖、非対称に分岐または対称的に分岐した）；Ｖは、場合により、前の条件的変換の後に、非切断可能部分または条件的切断可能な部分であり、これは、化学的、光化学的、物理的、生物学的、酵素処理により切断または変換できる（例えば、Ｖの切断は、最終的に１つまたは複数の部分のその後の放出に繋がるかまたは最終的にＶ、例えば、Ｚ部分に連結される）。いくつかの実施形態では、Ｖは、好ましくは、ジ、トリ、テトラ、またはオリゴペプチド（例えば、バリン−シトルリン含有ペプチド、など）およびＹは、スペーサー系（例えば、自己脱離型スペーサー系または非自己脱離型スペーサー系）であり、これは、１個または複数のスペーサーからなる。スペーサー系Ｙは、自己脱離型または自己脱離型であってよい。「自己脱離型」スペーサー単位は、別の加水分解ステップなしで、薬物部分の放出を可能とする。自己脱離型スペーサーが用いられる場合、Ｖ切断または変換後に、Ｖに連結したＹの側は、障害物が除去された状態になり、１つまたは複数の部分Ｚの最終的な放出に至る。Ｙは、例えば、任意の直鎖、分岐および／または環状Ｃ２−３０アルキル、Ｃ２−３０アルケニル、Ｃ２−３０アルキニル、Ｃ２−３０ヘテロアルキル、Ｃ２−３０ヘテロアルケニル、Ｃ２−３０ヘテロアルキニルであり得、場合により、１つまたは複数のホモ環式芳香族化合物ラジカルまたはヘテロ環式化合物ラジカルが挿入され得る；特に、任意の直鎖または分岐鎖Ｃ２−５アルキル、Ｃ５−１０アルキル、Ｃ１１−２０アルキル、−Ｏ−Ｃ１−５アルキル、−Ｏ−Ｃ５−１０アルキル、−Ｏ−Ｃ１１−２０アルキル、または（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）１−２４または（ＣＨ２）ｘ１−（ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２）１−２４−（ＣＨ２）ｘ２基（式中、ｘ１およびｘ２は、独立に、０〜２０の範囲内から選択される整数であり）、アミノ酸、オリゴペプチド、グリカン、サルフェート、またはカルボキシレートであり得る。場合により、Ｙは存在しない。いくつかの実施形態では、ＹはＣ２−６アルキル基である。自己脱離型スペーサー系は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第０２／０８３１８０号および同第２００４／０４３４９３号に記載のもの、ならびに当業者に既知のその他の自己脱離型スペーサーであり得る。特定の実施形態では、リンカーのスペーサー単位は、ｐ−アミノベンジル単位を含む。このような一実施形態では、ｐ−アミノベンジルアルコールは、アミド結合を介してアミノ酸単位に結合され、カルバメート、メチルカルバメート、またはカーボネートがベンジルアルコールと細胞傷害薬との間で作製される。一実施形態では、スペーサー単位は、ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ＰＡＢ）である。自己脱離型スペーサー単位の例には、限定されないが、電子的にｐ−アミノベンジルアルコールに類似の芳香族化合物（例えば、米国特許出願公開第２００５／０２５６０３０Ａ１を参照されたい）、例えば、２−アミノイミダゾール−５−メタノール誘導体（Ｈａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．９：２２３７）およびオルトまたはパラアミノベンジルアセタールがさらに挙げられる。アミド結合加水分解時に環化される、置換および非置換４−アミノ酪酸アミド（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５，２，２２３）および２−アミノフェニルプロピオン酸アミド（Ａｍｓｂｅｒｒｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９０，５５．５８６７）などのスペーサーを使用できる。グリシンのα位置で置換されているアミン含有薬物の脱離（Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９８４，２７，１４４７）はまた、自壊性スペーサーの例である。
【０２１２】
Ｖは、例えば、１個または複数の原子の位置で置換された、１〜２００原子の炭素含有フレームワーク、場合により、少なくとも１０原子、例えば、１０〜１００原子または２０〜１００原子の炭素含有フレームワークを含み得、場合により、炭素含有フレームワークは、直鎖炭化水素であり、または環状基、対称的にまたは非対称に分岐した炭化水素、単糖、二糖、直鎖または分岐鎖オリゴ糖（非対称に分岐または対称的に分岐した）、他の天然の直鎖または分岐鎖オリゴマー（非対称に分岐または対称的に分岐した）、アミノ酸、ジ、トリ、テトラ、またはオリゴペプチド、またはより一般的には、鎖成長または段階成長重合法のいずれかから生じた、任意の二量体、三量体、またはより高次のオリゴマー（直鎖、非対称に分岐または対称的に分岐した）を含む。Ｖは、例えば、任意の直鎖、分岐および／または環状Ｃ２−３０アルキル、Ｃ２−３０アルケニル、Ｃ２−３０アルキニル、Ｃ２−３０ヘテロアルキル、Ｃ２−３０ヘテロアルケニル、Ｃ２−３０ヘテロアルキニルであり得、場合により、１つまたは複数のホモ環式芳香族化合物ラジカルまたはヘテロ環式化合物ラジカルが挿入され得る；特に、任意の直鎖または分岐鎖Ｃ２−５アルキル、Ｃ５−１０アルキル、Ｃ１１−２０アルキル、−Ｏ−Ｃ１−５アルキル、−Ｏ−Ｃ５−１０アルキル、−Ｏ−Ｃ１１−２０アルキル、または（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）１−２４または（ＣＨ２）ｘ１−（ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２）１−２４−（ＣＨ２）ｘ２基（式中、ｘ１およびｘ２は、独立に、０〜２０の範囲内から選択される整数であり）、アミノ酸、オリゴペプチド、グリカン、サルフェート、またはカルボキシレートであり得る。場合により、Ｖは、存在しなくてもよい。いくつかの実施形態では、ＶはＣ２−６アルキル基である。
【０２１３】
特定の実施形態では、Ｖは、プロテアーゼにより認識されるアミノ酸配列からなる、ジ、トリ、テトラ、またはオリゴペプチドを含む。トリペプチドは、そのＣ末端を介してＹに連結し得る。一実施形態では、トリペプチドのＣ末端アミノ酸残基は、アルギニン、シトルリン、およびリシンから選択され、トリペプチドの中位アミノ酸残基は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、シクロヘキシルグリシン、トリプトファンおよびプロリンから選択され、およびトリペプチドのＮ末端アミノ酸残基は、任意の天然または非天然アミノ酸から選択される。一実施形態では、本開示は、Ｖがジペプチドを含む化合物を提供する。ジペプチドは、そのＣ末端を介してＹに連結し得る。一実施形態では、ジペプチドのＣ末端アミノ酸残基は、アラニン、アルギニン、シトルリンおよびリシンから選択され、およびジペプチドのＮ末端アミノ酸残基は、任意の天然または非天然アミノ酸から選択される。一実施形態では、Ｖは、フェニルアラニン−リシンおよびバリン−シトルリンから選択される。
【０２１４】
一実施形態では、提供されるのは、官能化アクセプターグルタミン残基を含む抗体または抗体フラグメントであり、官能化アクセプターグルタミン残基は、式ＩＩ、
（Ｑ）−ＮＨ−Ｃ−Ｘ−Ｌ−（Ｖ−（Ｙ−（Ｚ）ｚ）ｑ）ｒ        式ＩＩ
または薬学的に許容可能なその塩または溶媒和物を有し、
式中、
Ｑは、抗体または抗体フラグメント中に存在するグルタミン残基であり；
Ｃは、置換もしくは非置換アルキルまたはヘテロアルキル鎖であり、鎖の任意の炭素は、アルコキシ、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アルキル−Ｓ−、チオール、アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、アミン、アルキルアミン、アミド、またはアルキルアミドで任意に置換されてもよく；
Ｘは、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、非存在、または結合であり；
Ｌは、独立に、非存在、結合または結合の延長、または１個または複数の原子の位置で置換された５〜２００原子の炭素含有フレームワークであり、場合により、炭素含有フレームワークは、１個または複数の原子の位置で任意に置換されてもよい５〜３０炭素原子の直鎖フレームワークを含み、場合により、炭素含有フレームワークは、直鎖炭化水素、対称的にまたは非対称に分岐した炭化水素、単糖、二糖、直鎖または分岐鎖オリゴ糖（非対称に分岐または対称的に分岐した）、他の天然の直鎖または分岐鎖オリゴマー（非対称に分岐または対称的に分岐した）、または鎖成長または段階成長重合法のいずれかから生じた、二量体、三量体、またはより高次のオリゴマー（直鎖、非対称に分岐または対称的に分岐した）を含み；
ｒは、１、２、３、または４の中から選択される整数であり；
ｑは、１、２、３、または４の中から選択される整数であり；
ｚは、１、２、３、または４の中から選択される整数であり；および
Ｖは、独立に、非存在、非切断可能部分または条件的切断可能部分であり；
Ｙは、独立に、非存在、結合または結合の延長、または１つまたは複数のスペーサーからなるスペーサー系であり；
Ｚは、細胞傷害薬である。
【０２１５】
いくつかの実施形態では、高度に疎水性薬物が抗体に結合される場合は特に、有機溶媒は通常、溶解度を維持することおよび凝集抗体−薬物複合体の形成を回避することが必要である。疎水性のリンカー基質が高濃度の有機溶媒なしでは可溶化できない場合（例えば、ピロロベンゾジアゼピン部分を含むリンカーは、高度に均質なＤＡＲ２の結合を可能とするために５０％もの溶媒が必要となる）、反応性部分を有するリンカーを利用する多段カップリング法を用いて、高度に均質な組成物を実現できる。しかし、５％以上の有機溶媒は、抗体がＮ２９７Ｑ変異を含む場合に反応性部分を有するリンカーが抗体に、例えば、残基Ｑ２９５および／または残基２９７の位置で結合される場合、ＴＧａｓｅの効率的に結合する能力を阻害し、不完全な結合を生じる（９０％未満のアクセプターグルタミンしか官能化されない）。したがって、結合は、トランスグルタミナーゼ酵素の存在下で、アクセプターグルタミン残基を含む抗体と、反応性部分（Ｒ）を有する連結試薬と反応させることにより実施でき、溶媒（例えば、有機溶媒、極性溶媒、非極性溶媒、ＤＭＳＯ）は、存在しないかまたは１０％（ｖ／ｖ）未満、場合により、さらに５％、４％、３％、または２％（ｖ／ｖ）未満で存在する。得られた抗体はその後、相補的反応性基（Ｒ’）および疎水性薬物（例えば、ピロロベンゾジアゼピン部分）を含むリンカーと反応させられ、疎水性薬物（またはほかの目的の部分（Ｚ））に結合した（例えば、ＲおよびＲ’を生成する反応を介して）抗体が得られる。相補的反応性基（Ｒ’）および疎水性の薬物を含むリンカーとの反応ステップは、溶媒の存在下で実施でき、例えば、溶媒（例えば、有機溶媒、極性溶媒、非極性溶媒、ＤＭＳＯ）が反応混合物内に存在し、溶媒は、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、４０％または５０％（ｖ／ｖ）超で存在する。例えば、本明細書の実施例１１を参照されたい。
【０２１６】
Ｒおよび相補的Ｒ’反応性基は、それぞれ、任意の好適な反応性部分、例えば、非保護または保護バイオ直交性反応適合性反応性基、例えば、非保護または保護チオール、エポキシド、マレイミド、ハロアセトアミド，ｏ−フォスフェン芳香族エステル、アジド、フルミネート、スルホネートエステル、アルキン、シアニド、アミノチオール、カルボニル、アルデヒド、オキシムおよびヒドラジン形成できる一般的な任意の基、１，２，４，５−テトラジン、ノルボルネン、その他の染色または別の方法で電子的に活性化されたアルケン、置換もしくは非置換シクロアルキン、バイオ直交性付加環化反応を介して形成する一般的な任意の反応性基、１，３−または１，５−二置換トリアゾール、逆電子要求ディールスアルダー反応を介して反応できる任意のジエンまたは歪んだアルケン求ジエン体、保護または非保護アミン、カルボン酸、アルデヒド、またはオキシアミンであり得る。
【０２１７】
反応性基は、例えば、チオマレイミド（またはハロアセトアミド）付加、シュタウディンガーライゲーション、ヒュスゲン１，３−環化付加（クリック反応）、または治療薬部分、診断部分、または目的の機能のための任意の他の部分を含む薬剤に結合した相補的反応性基を用いたディールスアルダー環化付加を受けるように選択できる。一実施形態では、反応性基は、ハロアセトアミド（例えば、ブロモアセトアミド、アセトアミド、クロルアセトアミド）である。このような反応性基は、マレイミド基に比べてインビボで（および血清中で）より安定であると思われる。
【０２１８】
有利な一実施形態では、反応性基ＲおよびＲ’は、「クリック」反応を行うことができる相補的試薬である。例えば、環化反応において、好ましくは、添加触媒（例えば、Ｃｕ（Ｉ））の実質的非存在下で、１，３−双極子機能性化合物をアルキンと反応させて、ヘテロ環式化合物形成できる。少なくとも１個の結合した１，３−双極子基を有する種々の化合物（３個の原子上に局在化した４電子を含む３原子π電子システムを有する）を用いて、本明細書で開示のアルキンと反応させることができる。例示的１，３−双極子基には、限定されないが、アジド、ニトリル酸化物、ニトロン、アゾキシ基、およびアシルジアゾ基が挙げられる。例には、ｏ−フォスフェン芳香族エステル、アジド、フルミネート、アルキン（任意の歪んだシクロアルキンを含む）、シアニド、アントラセン、テトラジン（例えば、１，２，４，５−テトラジン）、またはノルボルネン（または他の歪んだシクロアルケン）が挙げられる。一実施形態では、ＲおよびＲ’の１個は、アジドであり、ＲおよびＲ’の残りは、歪んだシクロアルキン（例えば、シクロオクチン）である。一実施形態では、ＲおよびＲ’の１個は、テトラジンであり、ＲおよびＲ’の残りは、歪んだシクロアルケン（例えば、トランスシクロオクテン）である。
【０２１９】
一態様では、本開示は、目的の部分（Ｚ）（例えば、疎水性の高分子量および／または荷電有機化合物）を、本開示の抗ＮＫｐ４６抗体に結合する方法であり、該方法は、次のステップを含む：
ａ）少なくとも１個のアクセプターグルタミン残基を含む、本開示の抗ＮＫｐ４６抗体を用意するステップ；および
ｂ）該抗体と、反応性基（Ｒ）を含む一級アミンを含むリンカー（リシンベースリンカー）とを、ＴＧａｓｅの存在下、反応性基（Ｒ）に該リンカーを介して連結（共有結合）されたアクセプターグルタミンを含む抗体を得るのに十分な条件下で、反応させるステップであって、反応混合物が有機溶媒不含であるかまたは１０％（ｖ／ｖ）未満の有機溶媒を含む、もしくは５％、４％、３％または２％（ｖ／ｖ）未満の有機溶媒を含み；および
ｃ）場合により、有機溶媒（例えば、少なくとも、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、２５％、４０％、または５０％（ｖ／ｖ）の有機溶媒）の存在下で：
（ｉ）リンカー（リシンベースリンカー）を介して反応性基（Ｒ）に連結したアクセプターグルタミンを含むステップ（ｂ）の抗体と、
（ｉｉ）目的の部分（Ｚ）および反応性基Ｒと反応できる反応性基（Ｒ’）を含む化合物とを、
目的の部分（Ｚ）（例えば、細胞傷害薬）に一級アミンを含むリンカー（リシンベースリンカー）を介して連結されたアクセプターグルタミンを含む抗体を得るのに十分な条件下で、反応させるステップ。得られた抗体は、式ＩＩＩの構造を特徴とし得る。一実施形態では、提供されるのは、官能化アクセプターグルタミン残基を含む抗体または抗体フラグメントであり、官能化アクセプターグルタミン残基は、式ＩＩＩ、
（Ｑ）−ＮＨ−Ｃ−Ｘ−Ｌ−（Ｖ−（Ｙ−（Ｍ）ｚ）ｑ）ｒ        式ＩＩＩ
または薬学的に許容可能なその塩または溶媒和物の構造を有し、
式中、
Ｑは、抗体または抗体フラグメント中に存在するグルタミン残基であり；
Ｃは、置換もしくは非置換アルキルまたはヘテロアルキル鎖であり、鎖の任意の炭素は、アルコキシ、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アルキル−Ｓ−、チオール、アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、アミン、アルキルアミン、アミド、またはアルキルアミドで任意に置換されてもよく；
Ｘは、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、非存在、または結合であり；
Ｌは、独立に、非存在、結合または結合の延長、または１個または複数の原子の位置で置換された１〜２００原子の炭素含有フレームワークであり、場合により、炭素含有フレームワークは、１個または複数の原子の位置で任意に置換されてもよい３〜３０炭素原子の直鎖フレームワークを含み、場合により、炭素含有フレームワークは、直鎖炭化水素、対称的にまたは非対称に分岐した炭化水素、単糖、二糖、直鎖または分岐鎖オリゴ糖（非対称に分岐または対称的に分岐した）、他の天然の直鎖または分岐鎖オリゴマー（非対称に分岐または対称的に分岐した）、または鎖成長または段階成長重合法のいずれかから生じた、二量体、三量体、またはより高次のオリゴマー（直鎖、非対称に分岐または対称的に分岐した）を含み；
ｒは、１、２、３、または４の中から選択される整数であり；
ｑは、１、２、３、または４の中から選択される整数であり；
ｚは、１、２、３、または４の中から選択される整数であり；
Ｖは、独立に、非存在、結合または結合の延長、非切断可能部分または条件的切断可能部分であり；
Ｙは、独立に、非存在、結合または結合の延長、または１個または複数のスペーサーからなるスペーサー系であり；
Ｍは、独立に：Ｒまたは（ＲＲ’）−Ｌ’−（Ｖ’−（Ｙ’−（Ｚ）ｚ’）ｑ’）ｒ’であり、式中、
Ｒは、反応性部分であり；
（ＲＲ’）は、Ｒと、相補的な反応性部分Ｒ’との間の付加生成物であり；
Ｌ’は、独立に、非存在、結合または結合の延長、または１個または複数の原子の位置で置換された１〜２００原子の炭素含有フレームワークであり、場合により、炭素含有フレームワークは、１個または複数の原子の位置で任意に置換されてもよい３〜３０炭素原子の直鎖フレームワークを含み、場合により、炭素含有フレームワークは、直鎖炭化水素、対称的にまたは非対称に分岐した炭化水素、単糖、二糖、直鎖または分岐鎖オリゴ糖（非対称に分岐または対称的に分岐した）、他の天然の直鎖または分岐鎖オリゴマー（非対称に分岐または対称的に分岐した）、または鎖成長または段階成長重合法のいずれかから生じた、二量体、三量体、またはより高次のオリゴマー（直鎖、非対称に分岐または対称的に分岐した）を含み；
Ｖ’は、独立に、非存在、結合または結合の延長、非切断可能部分または条件的切断可能部分であり；
Ｙ’は、独立に、非存在、結合または結合の延長、または１個または複数のスペーサーからなるスペーサー系であり；
Ｚは、細胞傷害薬であり、各Ｚは、Ｙが存在しない場合はＹまたはＶに、またはＹおよびＶの両方が存在しない場合はＬに、直接的に結合され、および
ｚ’、ｑ’およびｒ’はそれぞれ、１、２、３、または４の中から選択される整数である。一実施形態では、Ｖは、非存在、結合または結合の延長であり、Ｖ’は、非切断可能部分または条件的切断可能部分である。一実施形態では、Ｙは、非存在、結合または結合の延長であり、Ｙ’は、１個または複数のスペーサーからなるスペーサー系である。
【０２２０】
免疫複合体は、当業者に公知の方法、例えば、カラムクロマトグラフィー（例えば、親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、疎水性相互作用クロマトグラフィー）、透析、透析濾過または沈殿を用いて、反応物質から精製できる。免疫複合体は、当業者に周知の方法、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、質量分析、またはキャピラリー電気泳動法を用いることにより評価できる。
【０２２１】
１個または複数のＺは、例えば、タキサン、アントラサイクリン、カンプトテシン、エポチロン、マイトマイシン、コンブレタスタチン、ビンカアルカロイド、ナイトロジェンマスタード、マイタンシノイド、カリケアマイシン、デュオカルマイシン、チューブリシン、ドラスタチンおよびオーリスタチン、エンジイン、ピロロベンゾジアゼピン、エチレンイミン、放射性同位元素、治療用タンパク質およびペプチド、および毒素またはそのフラグメントであり得る。
【０２２２】
一実施形態では、Ｚは、ＤＮＡ副溝結合剤であるかまたはこれを含む。一実施形態では、Ｚ部分は、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）を含む。一実施形態では、Ｚは、ピロロベンゾジアゼピンモノマーである。一実施形態では、Ｚは、２つのピロロベンゾジアゼピン単位を含むピロロベンゾジアゼピン二量体である。一実施形態では、Ｚは、３つのピロロベンゾジアゼピン単位を含むピロロベンゾジアゼピン三量体である。一実施形態では、Ｚは、３つを超えるピロロベンゾジアゼピン単位を含むピロロベンゾジアゼピンマルチマーである。ＰＢＤの構造、ならびに式およびそれらの製造方法は、例えば、国際公開第２０１３／１７７４８１号、同第２０１１／１３０６１６号、同第２００４／０４３８８０号、同第２００５／０８５２５１号、同第２０１２／１１２６８７号および同第２０１１／０２３８８３号に記載されている。これらのそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２２３】
ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピンは、グアニン残基に共有結合する配列選択的、副溝結合ＤＮＡ相互作用剤のファミリーである。ＰＢＤのＣ１１ａ位置の（Ｓ）キラリティーは、ＰＢＤに、ＤＮＡ副溝に完全に適合する適切な三次元形状を付与することが報告されている。ＰＢＤは、異なる作用効果およびモードを有し得る。ＰＢＤは、ＤＮＡの架橋を生じないＤＮＡ結合剤またはＤＮＡアルキル化剤であり得るか、またはＰＢＤは架橋剤であり得る。
【０２２４】
ピロロベンゾジアゼピン単位またはモノマーは、以下の一般的構造を有し得る：
【化１】
2020506720.tif 000006
ＰＢＤは、芳香族Ａ環およびピロロＣ環の両方で、異なる数、タイプおよび位置の置換を有することができ、また、Ｃ環の飽和度を変えることができる。Ｂ環中には、ＤＮＡアルキル化に関与する求電子中心であるＮ１０−Ｃ１１位置に、イミン（Ｎ＝Ｃ）、カルビノールアミン（ＮＨ−ＣＨ（ＯＨ））、またはカルビノールアミンメチルエーテル（ＮＨ−ＣＨ（ＯＭｅ））が存在する。
【０２２５】
ＰＢＤの生物活性は、２つのＰＢＤモノマーまたは単位を一緒に、通常はそれらのＣ８／Ｃ８’−ヒドロキシル官能基を経由して可撓性アルキレンリンカーを介して結合することにより増強することができる。
【０２２６】
本明細書の実施形態のいずれかの一態様では、ピロロベンゾジアゼピンモノマーまたは単位は、ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピンである。本明細書の実施形態のいずれかの一態様では、ピロロベンゾジアゼピン二量体は、Ｃ８／Ｃ８’連結ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン二量体である。
【０２２７】
ＰＢＤは、任意の好適な位置を介してリンカーに結合できる。例えば、ＰＢＤは、欠きに示すＰＢＤ単位のいずれかの位置を介して、リンカーに（例えば、式ＩＩの化合物では、Ｙに、もしくはＶに、または存在しないときはＬに；または式ＩＩＩの化合物では、Ｙ’に、もしくはＶ’に、または存在しないときはＬ’に）連結できる。
【化２】
2020506720.tif 000007
【０２２８】
一実施形態では、ＰＢＤ二量体は、以下の一般式の構造を含み、式ＩＩまたはＩＩＩの化合物内の他の置換基または官能基に対する矢印で示す例示的結合点を有する：
【化３】
2020506720.tif 000008
式中、
Ｒ１２およびＲ１２’、および／またはＲ２およびＲ２’は一緒に、それぞれに二重結合＝ＣＨ２または＝ＣＨ−ＣＨ３を形成し；または
Ｒ２’およびＲ１２’は存在せず、Ｒ２およびＲ１２は次記から独立に選択され：
（ｉｉａ）Ｃ１−５飽和脂肪族アルキル；
（ｉｉｂ）Ｃ３−６飽和シクロアルキル；
（ｉｉｃ）
【化４】
2020506720.tif 000009
、式中、それぞれのＲ２１、Ｒ２２およびＲ２３は、Ｈ、Ｃ１−３飽和アルキル、Ｃ２−３アルケニル、Ｃ２−３アルキニルおよびシクロプロピルから独立に選択され、Ｒ１２基中の炭素原子の合計数は５以下であり；
（ｉｉｄ）
【化５】
2020506720.tif 000010
、式中、Ｒ２５ａおよびＲ２５ｂの内の一方はＨであり、他方は、
フェニル（このフェニルは、ハロ、メチル、メトキシから選択される基により任意に置換されてもよい）；ピリジル；およびチオフェニルから選択され；および
（ｉｉｅ）
【化６】
2020506720.tif 000011
、式中、Ｒ２４は、Ｈ；Ｃ１−３飽和アルキル；Ｃ２−３アルケニル；Ｃ２−３アルキニル；シクロプロピル；フェニル（このフェニルは、ハロ、メチル、メトキシから選択される基により任意に置換されてもよい）；ピリジル；およびチオフェニルから選択され；
Ｒ６およびＲ９は、Ｈ、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ニトロ、Ｍｅ３Ｓｎおよびハロから独立に選択され；ＲおよびＲ’は、任意に置換されてもよいＣ１−１２アルキル、Ｃ３−２０ヘテロシクリルおよびＣ５−２０アリール基から独立に選択され；
Ｒ７は、Ｈ、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＨＲＲ’、ニトロ、Ｍｅ３Ｓｎおよびハロから選択され；
（ａ）Ｒ１０はＨであり、およびＲ１１はＯＨ、ＯＲＡであり、ＲＡはアルキルであるか；
（ｂ）Ｒ１０およびＲ１１は、それらが結合している窒素と炭素原子との間で窒素−炭素二重結合を形成するか；または
（ｃ）Ｒ１０はＨであり、およびＲ１１はＳＯｚＭであり、ｚは２または３であり、Ｍは一価の薬学的に許容可能なカチオンであるか；のいずれかであり、
Ｒ”は、Ｃ３−１２アルキレン基であり、この鎖は、１個または複数の異種原子、例えば、Ｏ、Ｓ、ＮＲＮ２（ＲＮ２はＨまたはＣ１−４アルキルである）、および／または芳香環、例えば、ベンゼンまたはピリジン、により割り込まれてもよく；
ＹおよびＹ’は、Ｏ、Ｓ、またはＮＨから選択され；および
Ｒ６’、Ｒ７’、Ｒ９’は、Ｒ６、Ｒ７およびＲ９と同じ群からそれぞれに選択され、Ｒ１０’およびＲ１１’は、Ｒ１０およびＲ１１と同じであり、Ｒ１１およびＲ１１がＳＯｚＭである場合、Ｍは、二価の薬学的に許容可能なカチオンを表し得る。
【０２２９】
別の例では、ＰＢＤ二量体は、以下の一般式の構造を含む：
【化７】
2020506720.tif 000012
式中、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ６’、Ｒ７’、Ｒ９’、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１０’およびＲ１１’は、上記で定義した通りであり、「Ｋ」環は、置換もしくは非置換芳香族または非芳香環であり、場合により、６員環、場合により、フェニルである。
【０２３０】
ＰＢＤ二量体の例には、次記が含まれる：
【化８】
2020506720.tif 000013
2020506720.tif 000014
【０２３１】
定常領域
一態様では、抗ＮＫｐ４６抗体のＡＤＣＣを誘導する能力を考慮して、抗体は、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３アイソタイプのＦｃドメイン（またはその一部）、例えば、野生型Ｆｃドメイン、または場合により、改変されたヒトＣＤ１６Ａに結合するＦｃドメイン、および場合により、さらに、ほかのヒトＦｃγ受容体を含むことができ、それにより、抗体が免疫エフェクター細胞を動員すること、およびＮＫｐ４６発現悪性細胞に対するＡＤＣＣを媒介することを可能とする。このような抗体が追加で細胞傷害薬に結合される場合、抗体は、（少なくとも）２つの作用機序：ＡＤＣＣおよび直接細胞傷害性、を介して、ＮＫｐ４６発現標的細胞を除去できる。
ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域（ジェンバンク受入番号：Ｊ００２２８）のアミノ酸配列（位置２３０〜４４７配列）の例は、次に示す通りである：
PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号６９）.
【０２３２】
一態様では、混合物中の実質的に全ての抗体が特定のＤＡＲ（例えば、２または４のＤＡＲ）を有する、化学量論的に官能化されたアクセプターグルタミンを有する抗ＮＫｐ４６抗体免疫複合体を用いた実施例の抗体に関して、本明細書で示されるように、抗体は、Ｆｃ媒介エフェクター機能を欠いているにもかかわらず、免疫複合体として腫瘍細胞死を強力に誘導できる。したがって、本開示の抗体は、１個または複数のヒトＦｃγ受容体（例えば、ＣＤ１６Ａ、ＣＤ１６Ｂ、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ６４）に対する結合を低減または止めるように改変されたヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプのＦｃドメイン（またはその部分）を含めることができる。このような抗体は、非腫瘍性Ｆｃγ受容体発現細胞により取り込まれるのを回避する。したがって、高い効力／毒性を有する細胞傷害薬（例えば、ピロロベンゾジアゼピン部分を含む薬剤）に結合する場合、抗体は、他の方法なら可能となると思われるより高い投与量で使用でき、したがって、癌治療において、ＡＤＣＣ媒介免疫複合体より大きな効力を生じ得る。場合により、本明細書の実施例中に示されているように、抗体は、ヒトＦｃＲｎタンパク質に対する結合を保持し、それにより、ビボ半減期を提供する。
【０２３３】
一実施形態では、抗体は、エフェクター細胞と最小限の相互作用を有する「Ｆｃサイレント」抗体を生ずるＦｃ領域中に１個または複数の特異的変異を含み得る。サイレント化されたエフェクター機能は、抗体のＦｃ領域中の変異により得ることができ、当該技術分野において記載されてきた：Ｎ２９７Ｘ変異（Ｘは、Ｎ以外の任意のアミノ酸）、ＬＡＬＡ変異（Ｓｔｒｏｈｌ，Ｗ．，２００９，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，Ｖｏｌ．２０（６）：６８５−６９１）；およびＤ２６５Ａ（Ｂａｕｄｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８１  ：６６６４−６９）。また、Ｈｅｕｓｓｅｒらの国際公開第２０１２／０６５９５０号も参照されたい。これらの開示は、参照により、本明細書に組み込まれる。一実施形態では、抗体は、ヒンジ領域中に、１、２、３個またはそれを超えるアミノ酸置換を含む。一実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２であり、残基２３３〜２３６の位置、場合により、２３３〜２３８の位置（ＥＵナンバリング）に、１、２または３つの置換を含む。一実施形態では、抗体は、ＩｇＧ４であり、残基３２７、３３０および／または３３１の位置（ＥＵナンバリング）に、１、２または３つの置換を含む。サイレントＦｃ  ＩｇＧ１抗体の例は、ＩｇＧ１  Ｆｃアミノ酸配列中にＬ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ変異を含むＬＡＬＡ変異体である。Ｆｃサイレント変異の別の例は、例えば、ＤＡＰＡ（Ｄ２６５Ａ、Ｐ３２９Ａ）変異（米国特許第６，７３７，０５６号）としてＩｇＧ１抗体で使用されるような、残基Ｄ２６５の位置の、またはＤ２６５およびＰ３２９の位置の変異である。別のサイレントＩｇＧ１抗体は、残基Ｎ２９７（例えば、Ｍ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｓ変異）の位置の変異を含み、これは、アグリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）／非グリコシル化抗体を生ずる。
【０２３４】
診断および治療での使用
特定の実施形態では、本抗体を使用して、生物試料中のＮＫｐ４６陽性細胞が精製または特定される。生物試料は、例えば、診断またはエクスビボ治療目的のために患者から取得でき、または研究目的のために、このような細胞の供給源を得るために、個体または非ヒト霊長類から得ることができる。
【０２３５】
ＮＫｐ４６陽性細胞は、多くの標準的方法の内のいくつかと共に、本抗体を用いて精製または特定できる。例えば、末梢血細胞は、ＮＫｐ４６特異的標識抗体を使ってＦＡＣＳスキャナーを用いて、場合により、細胞上に通常存在する他の表面分子に対して、選別できる。
【０２３６】
分ＮＫｐ４６陽性細胞の単離、精製または特定に使用される方法に関係なく、それを行う能力は、多数の目的、例えば、ＮＫｐ４６発現細胞の病原性増殖を特徴とする障害を、ＮＫｐ４６陽性細胞の数または活性またはその他の特性を評価することにより、診断するために、または抗体、またはそのフラグメントもしくは誘導体の能力を評価するために、例えば、１つの本明細書で記載の治療の前に、抗体を使用して患者の細胞の活性または挙動を調節するために、有用である。さらに、精製ＮＫｐ４６陽性細胞は、例えば、細胞とそれらの種々の特性と行動をより良好に特徴付けるために、ならびに、それらの行動、活性、生存、または増殖を調節するために使用できる化合物または物質を特定するために、研究状況に置いて有用である。抗体はまた、診断法に、例えば、細胞、例えば、患者由来の疾患細胞上のＮＫｐ４６ポリペプチドの検出方法に有用であり得る。
【０２３７】
同様に提供されるのは、細胞の表面上のＮＫｐ４６ポリペプチドに特異的に結合する本開示の抗原結合物質（例えば、抗体）を含む医薬組成物である。抗体は、細胞の増殖または活性を抑制し、および／またはＮＫｐ４６陽性細胞の除去をもたらす。組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含む。
【０２３８】
さらに提供されるのは、ＮＫｐ４６陽性細胞の増殖または活性の抑制、および／またはその陽性細胞の除去を必要としている患者において、それらの処置を行う方法であり、該方法は、該患者に本開示による組成物を投与するステップを含む。このような治療方法は、限定されないが、癌の治療を含む多くの障害のために使用できる。
【０２３９】
一態様では、本開示の治療方法は、治療有効量でＮＫｐ４６に結合する抗原結合化合物を含む組成物を個体に投与することを含む。治療有効量は、例えば、インビボでＮＫｐ４６発現細胞（例えば、腫瘍細胞）の除去を増大させるのに十分であり得る。
【０２４０】
本開示の方法は、ＮＫｐ４６発現細胞を特徴とする、限定されないが、リンパ腫、例えば、ＣＴＣＬ、ＰＴＣＬを含む、癌および他の増殖性疾患の治療に有利に利用される。
【０２４１】
いくつかの実施形態では、抗ＮＫｐ４６抗体または組成物の投与の前に、患者の細胞（例えば、腫瘍細胞）上のＮＫｐ４６の存在が、評価され、例えば、患者中のＮＫｐ４６陽性細胞の相対的レベルおよび活性を判定され、ならびに患者の細胞に対する抗体の結合効力が確認される。腫瘍細胞がＮＫｐ４６を発現している患者は、その後、抗ＮＫｐ４６抗体または組成物で治療され得る。これは、障害の部位からＰＢＬまたは腫瘍細胞の試料を取得し、例えば、イムノアッセイを使って、試験し、細胞上のＮＫｐ４６および場合により、さらに他のマーカーの相対的量を決定することにより達成できる。ＲＮＡをベースにした方法、例えば、ＲＴ−ＰＣＲまたはノーザン法などの他の方法も、ＮＫｐ４６および他の遺伝子の発現を検出するために使用できる。
【０２４２】
一実施形態では、患者ＮＫｐ４６陽性細胞の活性または増殖を抑制、またはこの陽性細胞を除去しようとする場合、患者のＮＫｐ４６陽性細胞の増殖を阻害する抗ＮＫｐ４６抗体の能力または患者のＮＫｐ４６陽性細胞除去する能力が必要に応じ評価できる。ＮＫｐ４６陽性細胞が抗ＮＫｐ４６抗体または組成物により除去される場合、患者は、抗ＮＫｐ４６抗体または組成物を用いた療法に応答性であると決定され、必要に応じ、患者は、抗ＮＫｐ４６抗体または組成物で治療される。
【０２４３】
治療は、複数ラウンドの抗体または化合物投与を含み得る。例えば、初期ラウンドの投与後に、患者のＮＫｐ４６発現細胞（例えば、悪性腫瘍細胞上の）のレベルおよび／または活性が通常、再測定され、まだレベルが高い場合には、追加のラウンドの投与が実施される。このように、複数回のラウンドのＮＫｐ４６検出および抗体または化合物の投与を、例えば、障害が制御されるまで、実施できる。
【０２４４】
いくつかの実施形態では、方法は、免疫調節剤、ホルモン剤、化学療法剤、またはＮＫｐ４６発現細胞上に存在するポリペプチドに結合する第２の抗体（例えば、除去抗体）から選択される該患者に適切な追加の（第２の）治療薬を投与する追加のステップを含み得る。このような追加の薬剤は、該抗体と一緒に単一剤形として、または別々の剤形として該患者に投与できる。抗体の投与量（または抗体および追加の治療薬の投与量をまとめて）は、患者の治療反応を検出可能なように誘導、促進および／または強化するのに十分である。別々に投与される場合は、抗体、フラグメント、または誘導体および追加の治療薬は、検出可能な合わせた治療効果を患者にもたらす条件下で（例えば、タイミング、投与回数、などに関して）投与されるのが望ましい。
【０２４５】
腫瘍治療に関しては、例えば、抗ＮＫｐ４６組成物の投与は、手術、放射線療法、化学療法剤などの古典的な手法と組み合わせて使用し得る。提供されるのは、併用療法であり、この場合、抗ＮＫｐ４６抗体は、手術または放射線療法と同時に、その前に、またはその後に使用され；または従来の化学療法剤、放射線療法剤もしくは抗血管新生薬、または標的化免疫毒素もしくはコアグリガンド（ｃｏａｇｕｌｉｇａｎｄ）と共に、その前に、またはその後で、患者に投与される。
【０２４６】
抗ＮＫｐ４６化合物は、例えば、顆粒状リンパ球のリンパ増殖性疾患（ＬＤＧＬ）、特に、ＮＫ−ＬＤＧＬ（顆粒状リンパ球のＮＫ型リンパ増殖性疾患；ＮＫ−ＬＧＬとも呼ばれる）の治療に有用であり得る。ＮＫ−ＬＤＧＬは、ＮＫ細胞またはＮＫ様細胞、すなわち、大型顆粒リンパ球のクローン増殖に起因する増殖性障害のクラスを意味し、表面抗原発現の特徴的な組み合わせを湿す（例えば、ＣＤ３−、ＣＤ５６＋、ＣＤ１６＋、など）。
【０２４７】
抗ＮＫｐ４６化合物は、例えば、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫（ＣＴＣＬ）、例えば、セザリー症候群または菌状息肉腫などのＣＤ４＋Ｔ細胞リンパ腫を治療するのに有用であり得る。
【０２４８】
抗ＮＫｐ４６化合物は、一般に、種々のＰＴＣＬの治療に有用であり得る。本明細書の治療的使用またはＰＴＣＬ治療または予防方法のいずれかの一実施形態では、個体は、ＮＫ／Ｔリンパ腫を有する。本明細書の治療的使用またはＰＴＣＬ治療または予防方法のいずれかの一実施形態では、個体は、腸疾患関連Ｔ細胞リンパ腫（ＥＡＴＬ）ＲＣＤＩまたはＲＣＤＩＩを有する。本明細書の治療的使用またはＰＴＣＬ治療または予防方法のいずれかの一実施形態では、個体は、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）を有する。本明細書の治療的使用またはＰＴＣＬ治療または予防方法のいずれかの一実施形態では、個体は、ＰＴＣＬ−ＮＯＳ（ＰＴＣＬ−特定不能）を有する。これは、ＰＣＴＬ−ＵまたはＰＴＣＬ−不特定とも呼ばれる；ＰＴＣＬ−ＮＯＳは、中悪性度リンパ腫のタイプで、主として結節散在型であるが、節外性病変もよくある。結節性症例の大部分は、ＣＤ４＋およびＣＤ８−であり、ＣＤ３０は、大細胞バリアントで発現され得る。
【０２４９】
一実施形態では、本開示の抗体を用いて、セリアック病および進行型または難治性セリアック病ステージを含むセリアック病（セリアック病（ｃｏｅｌｉａｃ  ｄｉｓｅａｓｅ）；ＣＤ）の個体が治療される。一実施形態では、個体は、難治性、進行中または進行したセリアック病を有し、場合により、セリアック病は、ＲＣＤ、ＲＣＤＩ、またはＲＣＤＩＩである。
【０２５０】
本明細書の治療的使用またはＰＴＣＬ治療または予防方法のいずれかの一実施形態では、個体のＬＤＧＬまたはＰＴＣＬ（例えば、ＥＡＴＬ、ＡＬＣＬ、ＰＴＣＬ−ＮＯＳ、または前癌状態）の治療または予防は、次記を含む：
ａ）リンパ腫または前癌状態（例えば、ＣＴＣＬ、ＬＤＧＬ、ＰＴＣＬ、セリアック病、など）を有する個体中の悪性（または前癌）細胞のＮＫｐ４６ポリペプチド状態を判定すること、および
ｂ）患者において、ＮＫｐ４６ポリペプチドが悪性細胞の表面上に発現していると判断される（例えば、主に発現している；基準に比べて、高いレベルでおよび／または抗ＮＫｐ４６抗体による高強度の染色で発現している）場合、本明細書のいずれかの実施形態のＮＫｐ４６ポリペプチドに結合する化合物を個体に投与すること。
【０２５１】
本明細書でのいずれかの治療方法または使用の一実施形態では、ＮＫ／Ｔリンパ腫、鼻型が治療され、その方法は、ＮＫｐ４６ポリペプチドに結合する化合物の投与の前に、ＰＴＣＬを有する個体内の悪性細胞のＮＫｐ４６ポリペプチド状態の判定のステップを必要としない（例えば、ＮＫｐ４６ポリペプチド不含である、またはこれを使用しない、または含まない）。
【０２５２】
さらなる態様では、ＮＫｐ４６陽性ＰＴＣＬ−ＮＯＳを有する患者は、ＣＤ３０陰性（腫瘍細胞はそれらの表面上にＣＤ３０を発現していない）である腫瘍を有し得ることが明らかになった。したがって、用意されるのは、ＣＤ３０陰性ＰＴＣＬ、例えば、ＰＴＣＬ−ＮＯＳを治療する方法であり、該方法は、ＮＫｐ４６ポリペプチドに結合する化合物を、ＣＤ３０陰性ＰＴＣＬを有する患者に投与することを含む。ＰＴＣＬを有する個体を治療する別の実施形態では、方法は、ＮＫｐ４６ポリペプチドに結合する化合物を、抗ＣＤ３０抗体を用いた治療に抵抗性のＰＴＣＬを有する個体に投与することを含む。他の実施形態では、ＰＴＣＬがＣＤ３０陽性である場合（例えば、広範にＣＤ３０を発現する未分化大細胞リンパ腫、特定のＰＴＣＬ−ＮＯＳ）、ＮＫｐ４６ポリペプチドに結合する化合物が、抗ＣＤ３０抗体（例えば、除去抗ＣＤ３０抗体、例えば、毒性部分に結合した抗ＣＤ３０抗体）と組み合わせて投与できる。
【０２５３】
一実施形態では、提供されるのは、個体のリンパ腫、例えば、末梢性Ｔ細胞リンパ腫を検出する方法であり、該方法は、個体由来の生物試料（例えば、細胞の）中のＮＫｐ４６核酸またはポリペプチドを検出することを含む。一実施形態では、提供されるのは、個体の高悪性度または進行型（例えば、ステージＩＶまたはさらに高いステージ）末梢性Ｔ細胞リンパ腫を検出する方法であり、該方法は、個体由来の生物試料（例えば、細胞の）中のＮＫｐ４６核酸またはポリペプチドを検出することを含む。生物試料がＮＫｐ４６を発現しているという判断は、患者がリンパ腫（例えば、末梢性Ｔ細胞リンパ腫（または進行型／高悪性度ＰＴＣＬ））を有することを示す。一実施形態では、方法は、生物試料中のＮＫｐ４６核酸またはポリペプチドの発現のレベルを決定し、健康な個体に対応する基準レベル（例えば、弱い細胞表面染色、など）に対しレベルを比較することを含む。生物試料が、基準レベルに比較して、増大したレベルでＮＫｐ４６核酸またはポリペプチドを発現しているという決定は、患者がリンパ腫（例えば、末梢性Ｔ細胞リンパ腫）を有することを示す。場合により、生物試料中のＮＫｐ４６ポリペプチドの検出は、悪性のリンパ球の表面上に発現したＮＫｐ４６ポリペプチドを検出することを含む。
【０２５４】
場合により、いずれかの実施形態では、細胞のＮＫｐ４６ポリペプチド状態の決定は、個体由来の試料を用いて、免疫組織化学アッセイを実施することを含む。場合により、細胞のＮＫｐ４６ポリペプチド状態の決定は、個体由来の試料を用いて、フローサイトメトリーアッセイを実施することを含む。ＩＨＣおよびフローサイトメトリーの両方は、ＮＫｐ４６の表面発現を検出できる。
【０２５５】
場合により、ＮＫｐ４６ポリペプチドに結合する化合物は、１日１回〜月１回投与される。場合により、組成物は、単剤療法として投与される。場合により、組成物は、第２の治療薬と組み合わせて投与される。場合により、組成物は、抗癌剤と組み合わせて投与される。
【０２５６】
一実施形態では、提供されるのは、末梢性Ｔ細胞リンパ腫の治療のための組成物を製造する方法、または哺乳動物対象の末梢性Ｔ細胞リンパ腫の予防における使用のための方法であり、該方法は、ａ）本開示の抗ＮＫｐ４６抗体を含む複数の試験組成物を用意するステップ；ｂ）各化合物をＮＫｐ４６に結合する、および／またはＮＫｐ４６発現細胞の除去を引き起こす能力に関し化合物を試験するステップ；およびｃ）ＮＫｐ４６ポリペプチドに結合するおよび／またはＮＫｐ４６発現細胞の除去を引き起こす化合物を、末梢性Ｔ細胞リンパ腫（または前癌状態）の治療に好適するとして、または末梢性Ｔ細胞リンパ腫の予防（例えば、前癌状態を治療することにより）における使用に好適するとして選択するステップを含む。
【０２５７】
必要に応じ、方法は、ステップｃ）で選択された一定量の化合物の作製および／または薬学的に許容可能な賦形剤を用いたステップｃ）で選択された一定量の化合物の形成をさらに含む。
【０２５８】
一実施形態では、提供されるのは、（ａ）個体が末梢性Ｔ細胞リンパ腫であるかどうかを判定すること；（ｂ）個体が末梢性Ｔ細胞リンパ腫を有する場合、その個体をＮＫｐ４６ポリペプチドに結合する治療有効量の本開示の化合物で治療すること、を含む方法である。
【０２５９】
一実施形態では、個体が末梢性Ｔ細胞リンパ腫であるかどうかを判定することは、標準的な治療指針に従って行われる。
【０２６０】
一実施形態では、個体が末梢性Ｔ細胞リンパ腫であるかどうかを判定することは、異常な細胞または異常な数の細胞の集団を特定することを含む。場合により、該特定は、フローサイトメトリーによる。場合により、方法は、異常な細胞の集団を選別または単離することをさらに含む。
【０２６１】
一実施形態では、個体が末梢性Ｔ細胞リンパ腫であるかどうかを判定することは、細胞遺伝学的異常を検出すること（例えば、核型を評価すること）を含む。
【０２６２】
一実施形態では、個体が末梢性Ｔ細胞リンパ腫であるかどうかを判定することは、異常な細胞の集団を選別すること；および選別された細胞から単離させた細胞を１種または複数のオリゴヌクレオチドと接触させることを含み、該接触させることにより、腫瘍性遺伝子マーカーの存在を判定し；それにより、末梢性Ｔ細胞リンパ腫の存在を検出する。
【０２６３】
一実施形態では、個体が末梢性Ｔ細胞リンパ腫であるかどうかを判定することは、個体の血清タンパク質のレベルを評価することを含む。
【０２６４】
場合により、方法は、ＮＫｐ４６ポリペプチドに結合する化合物で治療後、個体で末梢性Ｔ細胞リンパ腫の改善があるかどうかを、例えば、個体の末梢性Ｔ細胞リンパ腫細胞の数が減少しているかどうか、を評価するステップをさらに含む。
【０２６５】
本明細書のいずれかの態様の一実施形態では、ＰＴＣＬは、高悪性度および／または進行型ＰＴＣＬである。一実施形態では、ＰＴＣＬは高悪性度、非皮膚性ＰＴＣＬである。一実施形態では、ＰＴＣＬはＰＴＣＬ−ＮＯＳである。一実施形態では、ＰＴＣＬは、結節性（例えば、一次結節性）ＰＴＣＬ、例えば、ＰＴＣＬ−ＮＯＳ、ＡＩＴＬ、またはＡＬＣＬ（ＡＬＫ＋またはＡＬＫ−）である。一実施形態では、ＰＴＣＬは未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、場合により、ＡＬＫ陰性ＡＬＣＬである。一実施形態では、ＰＴＣＬは、血管免疫芽細胞性Ｔ細胞性リンパ腫（ＡＩＴＬ）であり、場合により、皮膚性ＡＩＴＬであり、場合により、非皮膚性ＡＩＴＬである。一実施形態では、ＰＴＣＬは、高悪性度、非皮膚性、一次結節性ＰＣＴＬである。一実施形態では、ＰＴＣＬは結節外（例えば、一次結節外）ＰＴＣＬである。一実施形態では、ＰＴＣＬは、高悪性度、非皮膚性、結節外ＰＣＴＬである。一実施形態では、ＰＴＣＬは成人Ｔ細胞白血病またはリンパ腫（ＡＴＬ）、例えば、ＨＴＬＶ＋ＡＴＬである。一実施形態では、ＰＴＣＬは、オルト（ｏｒｔｈｏ）内臓節外性疾患、例えば、ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫または腸疾患関連Ｔ細胞リンパ腫である。一実施形態では、ＰＴＣＬは結節外ＮＫ／Ｔ細胞性リンパ腫、鼻型である。一実施形態では、ＰＴＣＬは、腸疾患関連Ｔ細胞リンパ腫（ＥＡＴＬ）である。
【０２６６】
本明細書のいずれかの態様の一実施形態では、ＰＴＣＬは、ＣＤ３０陽性ＰＴＣＬ（例えば、ＡＬＫ陰性ＡＬＣＬ）であり、抗ＮＫｐ４６抗体が抗ＣＤ３０抗体と組み合わせて投与される。本明細書のいずれかの態様の一実施形態では、ＰＴＣＬは、ＣＤ４陽性ＰＴＣＬであり、抗ＮＫｐ４６抗体が抗ＣＤ４抗体と組み合わせて投与される。
【０２６７】
本明細書のいずれかの態様の一実施形態では、ＰＴＣＬは、ＮＫ細胞関連またはＮＫ特異的マーカー、例えば、ＣＤ５６および／またはＣＤ５７の非存在を特徴とする。本明細書のいずれかの態様の一実施形態では、ＰＴＣＬは、ＮＫ細胞関連またはＮＫ特異的マーカー、例えば、ＣＤ５６および／またはＣＤ５７の存在を特徴とする。
【０２６８】
抗原結合化合物をキットに含めることができる。このキットは、必要に応じ、任意の数の抗体および／または他の化合物、例えば、１、２、３、４個、またはいずれか他の数の抗ＮＫｐ４６抗体および／または任意の他の化合物をさらに含み得る。キットの内容についてのこの記載は、決して限定するものではないことが理解されよう。例えば、キットは、他のタイプの治療または診断薬を含み得る。好ましくは、キットはまた、抗体および／または薬剤の使用についての説明書、例えば、本明細書に記載の方法の詳細を記述した説明書も含む。
【０２６９】
剤形
化合物の治療用配合物は、目的の程度の純度を有する化合物（例えば、抗体）と、任意の薬学的に許容可能な担体、賦形剤、または安定剤を凍結乾燥配合物または水溶液の形態に混合することにより調製される。製剤に関する一般的な情報に関しては、例えば、Ｇｉｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，８ｔｈ  Ｅｄ．（Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，１９９０）；Ｇｅｎｎａｒｏ（ｅｄ．），Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９０）；Ａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３）；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ（Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９０）；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９０）；およびＷａｌｔｅｒｓ（ｅｄ．），Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ（Ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ），Ｖｏｌ  １１９（Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００２）を参照されたい。
【０２７０】
許容可能な担体、賦形剤、または安定化剤は、用いられる用量および濃度で受容者に非毒性であり、リン酸、クエン酸、および他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸およびメチオニンを含む酸化防止剤；保存料（例えば塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール；ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリン類を含む単糖類、二糖類、および他の炭水化物；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート化剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；および／またはツイーン（商標）、プルロニック（商標）またはＰＥＧなどの非イオン性界面活性剤を含む。
【０２７１】
皮下投与に適した凍結乾燥製剤は、例えば、米国特許第６，２６７，９５８号（Ａｎｄｙａ  ｅｔ  ａｌ．）に記載されている。このような凍結乾燥製剤は好適な希釈剤で高タンパク質濃度に再構成され得、また再構成製剤は本明細書に従って治療される哺乳動物に皮下投与され得る。
【０２７２】
本明細書の製剤はまた、２種以上の活性化合物（上記の第２の薬物）、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的作用を持つものを含めてもよい。このような薬物の種類と有効量は、例えば、製剤中に存在する化合物の量と種類、対象の臨床的パラメーターに依存する。好ましいこのような第２の薬物は、上記している。
【０２７３】
また有効成分は、例えば、コアセルべーション技術または界面重合化により調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、コロイド状のドラッグデリバリーシステム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）またはマクロエマルジョンにおける、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中に封入し得る。このような技術は、例えば前出のレミントン薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）において開示されている。
【０２７４】
徐放製剤を調製し得る。徐放製剤の好適例には、化合物を含む固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、成形品、例えば、フィルム、またはマイクロカプセルの形である。徐放性基質の例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸およびγＬ−グルタミン酸エチルの共重合体、非分解性のエチレンビニル酢酸塩、分解性の乳酸・グリコール酸共重合体、例えばＬｕｐｒｏｎ  Ｄｅｐｏｔ（商標）（乳酸・グリコール酸共重合体およびロイプロリド酢酸塩からなる注射可能なミクロスフィア）、およびポリＤ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。
【０２７５】
インビボ投与に用いられる製剤は無菌でなければならない。無菌化は、無菌濾過膜で濾過することによって、容易に達成される。これらの組成物で使用し得る薬学的に許容可能な担体には、限定されないが、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質、燐酸塩などの緩衝物質、グリシン、ソルビン酸もしくはソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、硫酸プロタミン、リン酸一水素二ナトリウム、カリウムリン酸水素、塩化ナトリウム、亜鉛塩などの塩もしくは電解質、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂が挙げられる。
【０２７６】
本発明のさらなる態様および利点は、次の実験のセクションで開示される。この開示は、例示と見なされるべきであり、本出願の範囲を限定するものではない。
【０２７７】
実施例
実施例１−ＮＫｐ４６はＰＴＣＬで発現される。
腫瘍生検材料を取得し、凍結試料に対し染色を実施した。ＮＫｐ４６は、抗ヒトＮＫｐ４６抗体クローン「９Ｅ２」（ｍＩｇＧ１）、Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ、製品参照番号５５７９１１、を用いて、ＢｅｎｃｈＭａｒｋ  ＸＴ  Ｖｅｎｔａｎａ  Ｒｏｃｈｅによる免疫染色法に適合した標準的プロトコルに従ってＤＡＢ発色性の検出により検出した。全線色について、対照アイソタイプ（ｍＩｇＧ１）および対照ＤＡＢ染色を実施した。ＣＤ３０を追加で染色した。腫瘍３、４および５は、同じ患者由来である。腫瘍１〜５は、特定不能のＰＴＣＬの患者由来である。腫瘍６〜８は、菌状息肉腫試料、皮膚性Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）である。
【０２７８】
腫瘍試料３、４および５を得た患者由来の試料のそれぞれからのＰＴＣＬは、高い比率のＮＫｐ４６陽性細胞を有する強い膜染色であった。試料３〜５を得た患者は、進行型（ステージＩＶ）疾患であった。他方では、進行歩より少ない疾患（ステージＩまたはＩＩ）を示す試料１、２、６、７および８は全て、染色がないか、または低い比率のＮＫｐ４６＋腫瘍細胞であった。したがって、一部の腫瘍が、ＮＫｐ４６を高レベルで発現でき、従って、ＮＫｐ４６結合物質による標的化に好適するが、腫瘍細胞は、より進行した疾患ステージ、またはより高悪性度疾患で、ＮＫマーカーＮＫｐ４６を取得し得る。したがって、ＮＫｐ４６は、進行型疾患の治療のための、疾患の進行段階への進行の予防のための特に好適な標的となり得る。さらに、初期段階疾患のＮＫｐ４６結合物質を用いた治療は、腫瘍細胞の表面上にＮＫｐ４６の顕著な発現を有する患者を特定するための診断（例えば、セラノスティックな）アッセイから恩恵を受け得る。ＮＫｐ４６陽性腫瘍は、ＣＤ３０陰性であり、したがって、ＮＫｐ４６は、抗ＣＤ３０抗体が使用できない場合（または腫瘍が抗ＣＤ３０抗体に対し抵抗性である場合）に、追加の治療標的となり得る。
【０２７９】
実施例２−ＮＫｐ４６はＡＬＣＬおよびオルト（ｏｒｔｈｏ）内臓節外性疾患（ＮＫ／Ｔリンパ腫およびＥＡＴＬ）試料中で発現される。
ＭＥＣ０４およびＳＮＫ６  ＮＫ／Ｔリンパ腫細胞をＮＫｐ４６発現に関し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）を用いて染色した。また同時に、種々の細胞表面マーカーのキャラクタリゼーションも実施した。ＮＫｐ４６を、フィコエリトリン（ＰＥ）に連結した抗ＮＫｐ４６抗体で染色した。評価した追加のマーカーは、ｈＣＤ５６  ＰＥ、ｈＣＤ１８３／ＣＸＣＲ３  ＰＥ、ｈＣＤ３  ＰＥ、ｈＣＤ４  ＰＥ、ｈＣＤ８  ＰＥおよびＣＤ５４／ＩＣＡＭ  ＰＥであった。細胞を採取し、ＰＥ標識した抗体を用いて染色した。２回の洗浄後、染色物をＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩで得て、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて分析した。
【０２８０】
結果を図１に示す。抗ＮＫｐ４６抗体は、ＭＥＣ０４およびＳＮＫ６細胞に対し染色を示したが、ＳＮＫ６上の発現がより大きかった。ＭＥＣ０４およびＳＮＫ６細胞を、ＣＤ１８３（ＣＸＣＲ３）、ＣＤ５６およびＣＤ５４（ＩＣＡＭ）でさらに強力に染色されたが、ＣＤ３、ＣＤ４またはＣＤ８（節外性ＮＫ／Ｔリンパ腫の最も一般的な表現型は、ＣＤ３−およびＣＤ５６＋である）ではそうではなかった。
【０２８１】
ＮＫ／Ｔリンパ腫細胞、および特に、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、鼻型は、ＮＫｐ４６を発現でき、それにより、抗ＮＫｐ４６抗体でＮＫ／Ｔリンパ腫を治療する可能性を提供する。さらに、ＮＫｐ４６陽性ＮＫ／Ｔリンパ腫腫瘍は、ＣＤ１８３（ＣＸＣＲ３）、ＣＤ５６およびＣＤ５４（ＩＣＡＭ）を発現していることが見つかり、これは、予後不良患者、特に、通常、疾患不良予後に関連するＣＸＣＲ３発現を有する患者への抗ＮＫｐ４６の投与を可能にし得る。
【０２８２】
ヒト患者由来の原発腫瘍の凍結組織切片を標識抗ＮＫｐ４６抗体で染色することにより、免疫組織化学（ＩＨＣ）を実施して、患者試料に対する確認、および種々の適応症に関する確認を行った。手短に説明すると、ＮＫｐ４６発現に対し陽性および陰性であることが既知である細胞株を、それぞれ、陽性および陰性対照として用いた。次に、健康なドナー由来の凍結造血組織切片をＮＫｐ４６発現に関して染色した。これらの全てで、ＮＫｐ４６発現が陰性であった。ＮＫ／Ｔリンパ腫、鼻型の６個の患者試料を試験し、その内の５個の試料は、解釈可能であった。全５個の解釈可能試料は染色陽性であり、ＮＫ／Ｔリンパ腫がＮＫｐ４６を発現することが確認された。腸疾患関連Ｔ細胞リンパ腫（ＥＡＴＬ）と診断された患者由来の試料の、６個の患者試料中の５個の試料が解釈可能であり、さらにその内の２個が染色陽性であり、３個が染色陰性であり、ＥＡＴＬ細胞がＮＫｐ４６を発現可能であることが確認された。未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）と診断された患者由来の試料の、４個の解釈可能患者試料の内の、３個が染色陽性で、１個が染色陰性であり、ＡＬＣＬ細胞がＮＫｐ４６を発現可能であることが確認された。ＮＫｐ４６染色陽性のＡＬＣＬの内の、２個の試料がＡＬＫ＋であり、１個がＡＬＫ−であった。
【０２８３】
実施例３−抗ｈｕＮＫｐ４６抗体の生成
組換えヒトＮＫｐ４６細胞外ドメイン組換えＦｃタンパク質を作製し、これを用いて、Ｂａｌｂ／ｃマウスを免疫した。マウスは、５０μｇのＮＫｐ４６タンパク質と完全フロイントアジュバントのエマルションの腹腔内投与により１回目の免疫を行い、５０μｇのＮＫｐ４６タンパク質と不完全フロイントアジュバントのエマルションの腹腔内投与により２回目の免疫を行い、最後に、１０μｇのＮＫｐ４６タンパク質の静脈投与により追加免疫した。免疫脾細胞を追加免疫の３日後にＸ６３．Ａｇ８．６５３不死化Ｂ細胞に融合し、これを照射脾細胞の存在下で培養した。
【０２８４】
一次選別：増殖しているクローンの上清（ＳＮ）を、細胞表面でヒトＮＫｐ４６構築物を発現するレポーター細胞株を用いるフローサイトメトリーによって、一次選別試験を実施した。マウスＣＤ３ζの細胞質内ドメインをヒトＮＫｐ４６の細胞外の部分に融合したキメラタンパク質をコードするレトロウイルス粒子によるＤＯ．１１．１０マウスＴ細胞ハイブリドーマの形質導入によりレポーター細胞を生成した。ＦＡＣＳスクリーニングのために、上清中の反応抗体の存在を、ＰＥ標識ヤギ抗マウスポリクローナル抗体（ｐＡｂ）により明らかにした。
【０２８５】
ＮＫｐ４６に結合した１２０個の抗体をさらなる評価のために選択し、これには、特に、８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂおよび１７Ｅ１が含まれた。その後、抗体をキメラヒトＩｇＧ１抗体として作製した。
【０２８６】
実施例４−ヒトＮＫｐ４６発現細胞に対する抗ＮＫｐ４６抗体の結合試験
抗体（８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂおよび１７Ｅ１を含む）のヒトＮＫｐ４６（ｈＮＫｐ４６）タンパク質に対する結合に関し、試験した。データは、フローサイトメトリーにより分析した。
【０２８７】
フローサイトメトリー：細胞を採取し、抗ＮＫｐ４６  ｍＡｂの用量範囲を用いて、ＰＢＳ  １Ｘ／ＢＳＡ０．２％／ＥＤＴＡ  ２ｍＭ緩衝液中で３０分間にわたり４℃で染色した。染色緩衝液中で２回洗浄した後、抗ＮＫｐ４６抗体とインキュベートした細胞を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉのマウス抗ヒトＩｇＧ１−ＰＥモノクローナル抗体（希釈１／１０）を用いて、４℃で、３０分間染色した。２回の洗浄後、染色物をＨＴＦＣ  Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ装置に取得し、ＦｏｒｅＣｙｔソフトウェアを用いて分析した。
【０２８８】
８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂおよび１７Ｅ１は、良好なＥＣ５０で、ヒトＮＫｐ４６に結合することが明らかになった。結果を表１に示す。
【表３】
2020506720.tif 000015
【０２８９】
実施例５−ＮＫｐ４６に対する抗ＮＫｐ４６の結合親和性
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による競合および親和性試験
Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００の一般的な手順および試薬
ＳＰＲ測定をＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００装置（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により、２５℃で行った。全てのＢｉａｃｏｒｅ実験では、ＨＢＳ−ＥＰ＋（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）およびＮａＯＨ  １０ｍＭ  ＮａＣｌ  ５００ｍＭがそれぞれランニングバッファーおよび再生緩衝液としての役割を果たした。センサーグラムをＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアで分析した。プロテインＧをＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから、抗Ｈｉｓ抗体をＱｉａｇｅｎから購入した。ヒト６ｘＨｉｓ標識ＮＫｐ４６組換えタンパク質（ＮＫｐ４６−Ｈｉｓ）をクローニングし、産生し、かつＩｎｎａｔｅ  Ｐｈａｒｍａで精製した。
【０２９０】
プロテインＧおよび抗Ｈｉｓタグ抗体の固定化
タンパク質Ａおよび抗Ｈｉｓ抗体をＳｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＣＭ５上のデキストラン層のカルボキシル基に共有結合により固定した。チップ表面をＥＤＣ／ＮＨＳ（Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））で活性化した。プロテインＡおよび抗Ｈｉｓ抗体をカップリングバッファー（１０ｍＭアセテート、ｐＨ５．６）で１０μｇ／ｍｌに希釈し、適切な固定化レベル（即ち、２０００〜２５００ＲＵ）に達するまで注入した。残りの活性化基の不活性化を、１００ｍＭのエタノールアミン  ｐＨ８（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて行った。
【０２９１】
親和性試験
タンパク質Ｇチップを用いて親和性試験を実施した。一価親和性試験をＳｉｎｇｌｅ  Ｃｙｃｌｅ  Ｋｉｎｅｔｉｃ（ＳＣＫ）プロトコルに従って行った。５段階希釈の１２．５〜２００ｎＭの可溶性ＮＫｐ４６Ｈｉｓ組換えタンパク質を捕捉抗ＮＫｐ４６抗体（再生なしで）上に注入し、再生前に１０分間、解離させた。各抗体に対し、全てのセンサーグラムを、１：１  ＳＣＫ結合モデルを用いてフィッティングした。結果を表２に示す。
【表４】
2020506720.tif 000016
【０２９２】
実施例６−抗ＮＫｐ４６抗体とカニクイザルＮＫｐ４６タンパク質との交差反応
抗体（８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂおよび１７Ｅ１を含む）のカニクイザルＮＫｐ４６（ｃｙｎｏ  ＮＫｐ４６）タンパク質に対する結合に関し、試験した。ｃｙｎｏ  ＮＫｐ４６の配列（以下に示す）をカニクイザルｃＤＮＡからクローニングし、ＣＨＯ細胞株に遺伝子導入した。ＣＨＧ１−Ｍ−Ｈ４６のＣＨＯ−ｃｙｎｏＮＫｐ４６に対する結合をフローサイトメトリーにより分析した。
カニクイザルＮＫｐ４６アミノ酸配列：
M S S T L R A L L C L G L C L S Q R I S A P K Q T L P K P I I R A E S T Y M V P K E K Q A T L C C Q G S Y G A V E Y Q L H F E G S L F A V E R P K P P E R I N G V K F H I P D M N S R K A G R Y S C I Y R V G E L W S E R S D L L D L V V T E M Y D T P T L S V H P G P E V T S G E K V T F Y C R L D T A T S M F L L L K E G R S R D V Q R S Y G K V Q A E F P M G P V T T A H R G S Y R C F G S Y N N Y A W S F P S E P V K L L V T G D I E N T S L A P T D P T F P D S W D T C L L T R E T G L Q K D L A L W D H T A Q N L L R M G L A F L V L V A L V C L L V E D W L S R K R T R E Q A S R A S T W E G R R R L N K H K D S E E（配列番号２）
【０２９３】
フローサイトメトリー：ＣＨＯ細胞を採取し、抗ＮＫｐ４６  ｍＡｂの用量範囲を用いて、ＰＢＳ  １Ｘ／ＢＳＡ０．２％／ＥＤＴＡ  ２ｍＭ緩衝液中で３０分間にわたり４℃で染色した。染色緩衝液中で２回洗浄した後、抗ＮＫｐ４６抗体とインキュベートした細胞を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉのマウス抗ヒトＩｇＧ１−ＰＥモノクローナル抗体（希釈１／１０）を用いて、４℃で、３０分間染色した。２回の洗浄後、染色物をＨＴＦＣ  Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔに取得し、ＦｏｒｅＣｙｔソフトウェアを用いて分析した。
【０２９４】
８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂおよび１７Ｅ１は、良好なＥＣ５０で、カニクイザルＮＫｐ４６に結合する。結果を表３に示す。
【表５】
2020506720.tif 000017
【０２９５】
実施例７：ＮＫｐ４６＋ＮＫ／Ｔリンパ腫細胞株に対するＮＫ細胞によるＡＤＣＣの誘導
ＮＫｐ４６に対する結合により選択された抗体は、ＮＫ細胞を、ヒトＮＫｐ４６を発現するように作製されたラージ腫瘍細胞株を溶解するように誘導する機能的能力に関し、ヒトＩｇＧ１と同様に試験した。このアッセイでは、多くの抗体は、細胞傷害性を誘導しなかったが、いくつかの抗体（８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂおよび１７Ｅ１）は、ＡＤＣＣの誘導に効果的であった。
【０２９６】
抗体８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂおよび１７Ｅ１の、ＮＫｐ４６陽性腫瘍標的ＳＮＫ６  ＮＫ／Ｔリンパ腫細胞に対し、ＡＤＣＣを媒介するようにＮＫ細胞を誘導する機能的能力に関し、試験した。手短に説明すると、ＣＤ１６（Ｖアイソフォーム）または精製ＮＫを遺伝子導入したヒトＮＫ細胞株ＫＨＹＧ−１の細胞溶解活性を、Ｇｒｅｉｎｅｒの９６ウェルプレートＵ中での典型的な４時間の５１Ｃｒ放出アッセイで評価した。ＳＮＫ６細胞を５１Ｃｒ（１００μＣｉ（３．７ＭＢｑ）／１×１０６細胞）で標識した後、ｈＣＤ１６遺伝子導入ＫＨＹＧ（残基１５８の位置のＶアレル）（ヒトＩｇＧ１と結合するために）または１０のエフェクター／標的比率でＮＫ細胞と、示した濃度の抗体の存在下で、混合した。短時間の遠心分離および３７℃で４時間のインキュベーション後、５０μＬの上清を取り出し、５１Ｃｒの放出をＴｏｐＣｏｕｎｔ  ＮＸＴベータ検出器（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）で測定した。全ての実験群を３回繰り返し分析し、特異的溶解のパーセンテージを以下のように決定した：１００ｘ（平均ｃｐｍ実験放出−平均ｃｐｍ自然放出）／（平均ｃｐｍ総放出−平均ｃｐｍ自然放出）。総放出のパーセンテージは、２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００（Ｓｉｇｍａ）での標的細胞の溶解によって得た。
【０２９７】
図２の結果は、陰性対照（無関係のキメラＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体）に比べて、８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂおよび１７Ｅ１が、ヒトＫＨＹＧ−１  ｈＣＤ１６Ｖ  ＮＫ細胞または精製ＮＫ細胞によるＳＮＫ６リンパ腫細胞の特異的溶解を誘導したことを示し、それにより、これらの抗体がＮＫｐ４６発現標的細胞に対するＡＤＣＣを誘導することを示す。
【０２９８】
実施例８−裸の抗ＮＫｐ４６抗体は、ラージ異種移植片マウスモデルにおいて抗腫瘍効力を示す
抗体を、ラージ細胞が高レベルのＮＫｐ４６を発現しているマウス長期ラージ−ｈＮＫｐ４６腫瘍モデルで試験した。ＳＣＩＤマウスの静脈内（ｉ．ｖ．）に５ｘ１０６ラージ−ｈＮＫｐ４６を移植し、アイソタイプ対照抗体（ＩＣ）またはキメラ抗体８Ｂ６−Ａ、９Ｈ１１−Ｂまたは１７Ｅ１の３００μｇ／マウスの投与量で、腫瘍細胞移植の日から３週間にわたり週２回の腹腔内（ｉ．ｐ．）治療をした。
【０２９９】
ラージ−ｈＮＫｐ４６を、１０％の加熱不活性化ウシ胎仔血清、１％のＬ−グルタミン、１％のナトリウム／ピルベートを補充し、マウスへの注入の前には抗体を含まない、完全ＲＰＭＩ  １６４０培地中で培養した。マウスを週２回秤量した。カプランマイヤー生存曲線を作成し、治療マウスの生存を評価した。
【０３００】
結果を図３に示す。全てのキメラ抗体は、抗腫瘍活性を示した。アイソタイプ対照を受けた動物は、２７日の生存期間中央値であった。８Ｂ６−Ａ、９Ｈ１１−Ｂまたは１７Ｅ１抗体で治療されたマウスは、７０日目で５０％を超える動物がまだ生存を示し、これは、生存期間中央値の計算ができないようにし、極めて強力な抗腫瘍効果を示している。
【０３０１】
実施例９：抗ＮＫｐ４６のＮＫｐ４６に対する結合のためのエピトープマッピング
抗体８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂおよび１７Ｅ１の間の競合試験を、抗Ｈｉｓ抗体チップを用いて、実施例５で記載の方法に従って実施した。全ての可溶性分析物を１０μｇ／ｍＬの一定濃度で注入した。
【０３０２】
抗ＮＫｐ４６抗体の任意の所与の対に対し、競合的結合阻害サイクルを４ステップで実施した。第１ステップでは、ＮＫｐ４６−Ｈｉｓ組換えタンパク質を抗ヒスチップ上に捕捉した。その後、第１の抗体を捕捉ＮＫｐ４６−Ｈｉｓ上に２回注入し、それ自体のエピトープのほぼ完全な飽和を確実にした。第４および最終ステップでは、第２の抗体を第１の抗体／ＮＫｐ４６複合体上に注入した。第２の抗体のシグナルをモニターし、第２の抗体が裸の捕捉抗原上に注入されたときに得られたシグナルと比較した。各サイクル後に、再生バッファーの短時間の注入により抗Ｈｉｓチップを生成した。
【０３０３】
競合マトリックスが図４に示されている。全ての抗体８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂおよび１７Ｅ１は、ＮＫｐ４６に対する結合に関し、相互に競合し、これらの抗体は全て、ＮＫｐ４６上の共通領域に結合することを示した。
【０３０４】
実施例１０：フローサイトメトリーによる抗ＮＫｐ４６の既存のｍＡｂとの競合のためのエピトープマッピング
抗体（８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂおよび１７Ｅ１を含む）を、ＳＮＫ６細胞株上の既知抗ＮＫｐ４６  ｍＡｂ  １９５３１４（Ｒ＆Ｄ）、９Ｅ２（ＢＤ）、およびＢａｂ２８１（ＢＣ）との結合の競合に関し、評価した。Ｂａｂ２８１、ｍＩｇＧ１は、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．（Ｂｒｅａ，ＣＡ，ＵＳＡ）（クロム放出細胞傷害性アッセイについて記載している、Ｐｅｓｓｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ，１９９８，１８８（５）：９５３−９６０およびＳｉｖｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９９．２９：１６５６−１６６６を参照されたい）から、市販品として入手可能である。９Ｅ２、ｍＩｇＧ１は、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）およびＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ（Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｋ，Ｇｅｒｍａｎｙ）（Ｂｒａｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ，（２００５）Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．７８：３５９−３７１；およびＥｌ−Ｓｈｅｒｂｉｎｙ  ｅｔ  ａｌ，（２００７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６７（１８）：８４４４−９を参照されたい）から、市販品として入手可能である。１９５３１４、ｍＩｇＧ２ｂは、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＵＳＡ）（Ｎｏｌｔｅ−’ｔ  Ｈｏｅｎ  ｅｔ  ａｌ，（２００７）Ｂｌｏｏｄ  １０９：６７０−６７３を参照されたい）から、市販品として入手可能である。クローン１９５３１４、９Ｅ２およびＢａｂ２８１は、以前に、ＮＫｐ４６と天然のリガンドとの相互作用を遮断すると報告されている。
【０３０５】
結合の競合は、フローサイトメトリーにより分析された。各市販ｍＡｂの準最適投与量を予め決定した。
【０３０６】
市販ｍＡｂの準最適投与量の決定ＳＮＫ６細胞を採取し、ＰＥで標識した市販抗ＮＫｐ４６  ｍＡｂの用量範囲を用いて、ＰＢＳ  １Ｘ／ＢＳＡ  ０．２％／ＥＤＴＡ  ２ｍＭ緩衝液中で３０分間にわたり４℃で染色した。２回の洗浄後、染色物をＨＴＦＣ  Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ装置に取得し、ＦｏｒｅＣｙｔソフトウェアを用いて分析した。飽和プラトー未満の投与量を競合アッセイ用に選択した。
【０３０７】
結合競合アッセイ：ＳＮＫ６細胞を採取し、ＰＢＳ  １Ｘ／ＢＳＡ  ０．２％／ＥＤＴＡ  ２ｍＭ緩衝液中で染色した。ＰＥで標識した市販ｍＡｂ（準最適投与量の）を、用量範囲非標識ＣＨＧ１−Ｍ−Ｈ４６と同時に加え、４℃で３０分間インキュベートした。２回の洗浄後、染色物をＨＴＦＣ  Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ装置に取得し、ＦｏｒｅＣｙｔソフトウェアを用いて分析した。
【０３０８】
競合マトリックスが図５に示されている。１μｇ／ｍＬの抗体をプロテインＡチップ上に捕捉し、組換えヒトＮＫｐ４６タンパク質を、５μｇ／ｍＬで、第２の試験抗体と一緒に注入した。抗体８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂおよび１７Ｅ１は、ＮＫｐ４６タンパク質に対する結合に関し、相互に競合した。しかし、抗体８Ｂ６Ａ、８Ｂ６Ｂ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂまたは１７Ｅ１のいずれも、既知抗体１９５３１４、９Ｅ２またはＢａｂ２８１のいずれとも、ＮＫｐ４６タンパク質に対する結合に関し、競合しなかった。
【０３０９】
実施例１１−ＡＤＣの作製
ＰＢＳ中の実施例３で得た抗体（ＩＰＨ１、ＩＰＨ２、ＩＰＨ３、８Ｂ６Ａ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂおよび１７Ｅ１を含む）をＰＮＧａｓｅＦ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ、８００Ｕ／ｍｇのｍＡｂ）を用いて３７℃で一晩、脱グリコシル化した。反応の完了をＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳによって制御した。
【０３１０】
クリックケミストリー反応性基の使用に基づく２段階法を用いた。この方法は、反応性基を有するリシンベースリンカーが最初に抗体のアクセプターグルタミンに結合され（有機溶媒の非存在下で）、続いて、ＰＢＤおよび相補的反応性基を含む第２の化合物との反応が行われる（有機溶媒の存在下で）。反応性リンカーに結合した中間体抗体を得るために、１ｍｇ／ｍＬの脱グリコシル化ｍＡｂを、カップリングの部位当たり、２０当量の反応性リシンベースリンカー（以下の構造、アミノ−ＰＥＧ−アジド）および５Ｕ／ｍＬのＢＴＧと共にＰＢＳ中、３７℃で一晩インキュベートした。抗体は全て、重鎖のアミノ酸残基２９５（Ｋａｂａｔ  ＥＵナンバリング）の位置に、アクセプターグルタミンを含み、それにより、反応性リンカーが抗体の各重鎖上の残基Ｑ２９５に結合された（各抗体は、２つの結合部分を有する；ＤＡＲ＝２）。
【０３１１】
反応性リンカーの構造は、次の通り：
ＮＨ２−ＰＥＧ−Ｎ３スペーサー：
【化９】
2020506720.tif 000018
【０３１２】
ｍＡｂ反応性リンカー複合体をｐｒｏｔＡ上の親和性クロマトグラフィーにより精製した。
【０３１３】
ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）二量体を含む最終ＡＤＣを作製するために、その後、上記のアジド官能化抗体（ＰＢＳ／１，２−プロパンジオール  ５０／５０  ｖ／ｖ中の２ｍｇ／ｍＬ）を、カップリング部位当たり１．７５モル当量のＤＢＣＯ誘導体化ＰＢＤと共にインキュベートした（ＤＢＣＯがアジドと反応する）。混合物を室温で、４８〜７２時間、緩やかに撹拌しながらインキュベートした。反応の完了をＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳによって制御した。過剰の誘導体化ＰＢＤを透析（ＭＷＣＯ＝１０ｋＤａ）で除去し、続けて、サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００ＧＬカラム、ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）により精製した。最終化合物をＡｍｉｃｏｎ３０Ｋ装置で濃縮した。
【０３１４】
ＤＢＣＯ誘導体化ＰＢＤ化合物の構造は、次に示す通りである：
ＤＢＣＯ−ｖａｌ−ａｌａ−ＰＢＤ：
【化１０】
2020506720.tif 000019
【０３１５】
グルタミン（「ｍＡｂ」で表される）に連結された化合物の最終構造は次の通り：
ｍＡｂ−ＰＥＧ−ＤＢＣＯ−ＰＢＤ：
【化１１】
2020506720.tif 000020
【０３１６】
実施例１２−リンパ腫モデルにおけるＡＤＣとしての抗体の比較評価
実施例１１のＤＡＲ＝２のｐｄｂ二量体を有する抗ＮＫｐ４６抗体−薬物複合体を、第１に、天然またはＮＫｐ４６形質導入（高ＮＫｐ４６発現）ヒトラージ細胞（それぞれ、ラージおよびラージ−ＮＫｐ４６）を用いて、種々の腫瘍モデルで試験し、高ＮＫｐ４６発現に関する効力を評価した。第２のモデルでは、抗ＮＫｐ４６  ＡＤＣを、天然でＮＫｐ４６を発現しているヒトＮＫ−Ｔ−リンパ腫、鼻型由来のヒトＳＮＫ６細胞株で試験した。
【０３１７】
材料および方法
細胞株および培地：
ラージおよびラージ−ＮＫｐ４６を、１０％脱補体ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＳＡＳ）＋２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＳＡＳ）＋１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＳＡＳ）を補充した、ＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＳＡＳ）中、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。
【０３１８】
ＳＮＫ６細胞を、１５％脱補体ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＳＡＳ）＋２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＳＡＳ）＋１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＳＡＳ）＋１００Ｕ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−２を補充した、ＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＳＡＳ）中、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。
【０３１９】
抗体薬物複合体（ＡＤＣ）：
抗ヒトＮＫｐ４６または陰性対照抗体（Ａｂ）を、実施例１１で、薬物／Ａｂ比２でＰＢＤ毒素と結合させた。使用したＡｂクローンは：８Ｂ６Ａ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂ、１７Ｅ１、およびＮＫｐ４６上の別々のエピトープに結合するＮＫｐ４６に対し高親和性の抗体：Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、およびＡｂ陰性対照、とした。
【０３２０】
細胞傷害性実験：
ＰＢＤ結合抗ＮＫｐ４６（または対照）抗体（ＡＤＣ）の効力を、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、細胞のＡＴＰ産生の測定（細胞生存率を反映）により評価した。１００００ラージまたはラージ−ＮＫｐ４６または７５００  ＳＮＫ６細胞を、不透明平底９６ウェルプレート（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のウエル当たり８０μＬの培地中に播種した。ウエル当たり２０μＬの５Ｘ濃縮ＡＤＣを加え（三つ組で）、１０μｇ／ｍｌ〜０．０１ｐｇ／ｍｌ＋０μｇ／ｍｌの対照（実験に応じて）の範囲の４または８種の異なる最終濃度を得た。３７℃、５％ＣＯ２下で７２時間のインキュベーション後、ウエル当たり１００μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加えた。室温、暗所でのインキュベーションの１０分後、生物発光シグナルを各ウエル中で、Ｇｌｏｍａｘ  Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。データをＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して解析した。
【０３２１】
細胞数測定実験：
１０００００細胞／ポイントを用いて、細胞のＮＫｐ４６発現を細胞傷害性実験の始めに評価した。１／１０のＰＥ標識抗ｈＮＫｐ４６（クローン９Ｅ２／ＮＫｐ４６、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）または１／１０のＰＥ標識マウスＩｇＧ１アイソタイプ対照（クローンＭＯＰＣ−２１、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を含む１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ  １Ｘ、ＳＶＦ  ０．２％、ＥＤＴＡ  ２ｍＭ、０．２２μｍ濾過）中、細胞を氷上でインキュベートした。血球計数器（ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  １０−Ｃｏｌｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ−ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）使用の直前に、細胞を２回洗浄し、１／１００００  ＳＹＴＯＸ  Ｂｌｕｅ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を含むＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した。データを、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して解析した。
【０３２２】
結果
腫瘍細胞に対する細胞傷害性の最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）を、それぞれの免疫複合体に対し決定した。
【０３２３】
ラージ−ＮＫｐ４６（高発現）
高発現ラージ−ＮＫｐ４６細胞で、抗体８Ｂ６Ａ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂ、１７Ｅ１をベースにした免疫複合体を、ＮＫｐ４６上の別々のエピトープに結合する抗体：Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、およびＡｂ陰性対照、をベースにした免疫複合体と比較した。全ての免疫複合体が高い効力および類似のＩＣ５０値を示したが、８Ｂ６Ａ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂおよび１７Ｅ１のＡＤＣは、少々低いＩＣ５０値を示した（Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３の最良のＩＣ５０値に比べて１５％〜３倍（ｍＡｂ  １７Ｅ１）の範囲の改善）。ＮＫｐ４６を発現していないラージ（非形質導入）細胞では、全ての免疫複合体のＩＣ５０値は、陰性対照を含めて、類似であった。
【０３２４】
ＳＮＫ６  ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫
天然でＮＫｐ４６を発現しているＳＮＫ６細胞では、抗体８Ｂ６Ａ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂ、１７Ｅ１をベースにした免疫複合体を、ＮＫｐ４６上の別々のエピトープに結合する抗体：Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、およびＡｂ陰性対照、をベースにした免疫複合体と比較した。この設定では、８Ｂ６Ａ、９Ｈ１１Ａ、９Ｈ１１Ｂ、１７Ｅ１のＡＤＣは、ｍＡｂ  Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３のいずれよりも遙かに低いＩＣ５０値であった。このＡＤＣは、ｍＡｂ  Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３より最高５０倍低いＩＣ５０であった（９Ｈ１１Ａ：ＩＣ５０＝０．００００２μｇ／ｍｌ；９Ｈ１１Ｂ：ＩＣ５０＝０．００００１μｇ／ｍｌ；１７Ｅ１：ＩＣ５０＝０．００００１μｇ／ｍｌ；Ａｂ１：ＩＣ５０＝０．０００５９μｇ／ｍｌ；Ａｂ２：ＩＣ５０＝０．０００７μｇ／ｍｌ；Ａｂ３：ＩＣ５０＝０．０００１μｇ／ｍｌ）。
【０３２５】
実施例１３−抗体は、ＮＫｐ４６発現Ｂ細胞リンパ腫およびＮＫ／Ｔリンパ腫（鼻型）において内部移行する
抗ＮＫｐ４６抗体８Ｂ６Ａまたは陰性対照（ＮＫｐ４６に結合しない抗体）の内部移行を、ＣｙｐＨｅｒ５Ｅ標識抗体を用いてフローサイトメトリーにより試験した。ＣｙｐＨｅｒ５Ｅ色素は、赤色励起性、ｐＨ感受性シアニン色素誘導体であり、塩基性ｐＨ（細胞表面のような）でわずかに蛍光性であり、酸性ｐＨ（内部的に酸性のエンドソームのような）で最大蛍光性である。蛍光シグナルの増大は、ＣｙｐＨｅｒ５標識抗体の内部移行と相関する。ＣｙｐＨｅｒ５Ｅ  ＮＨＳ  Ｅｓｔｅｒキット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、製造業者の説明書に従って、抗体をＣｙｐＨｅｒ５Ｅと結合した。
【０３２６】
ウエル当たり５０，０００細胞（ラージ（表面ＮＫｐ４６を欠く）、ラージ−ＮＫｐ４６およびＳＮＫ６）を９６ウェルプレートに播種し、５％ＣＯ２下、３７℃で２４時間インキュベートした。ＣｙｐＨｅｒ５結合抗体（１μｇ／ｍｌ）を、種々の時点で細胞含有ウエルに加えて、０、１５、３０、６０、１２０、２４０分および２４時間での細胞と抗体とのインキュベーションの反応速度を得た。２４時間後、プレートを氷上に１０分間置いた（内部移行を停止するために）。その後、ＣｙｐＨｅｒ５Ｅ−抗体を０分時点に対応するウエルに加えた。細胞を低温のＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、１／１００００  ＳＹＴＯＸ  Ｂｌｕｅ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を含む低温のＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、血球計数器（ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  １０−Ｃｏｌｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ−ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の使用まで、氷上で保持した。データを、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して解析した。
【０３２７】
結果は、抗体８Ｂ６Ａは、ＮＫｐ４６発現腫瘍細胞（ラージ−ＮＫｐ４６およびＳＮＫ６）中で顕著な細胞内内部移行を受けた（対照抗体は内部移行せず）が、ＮＫｐ４６を発現していないラージ細胞では細胞内内部移行を受けなかった。対照抗体は、いずれの細胞株でも内部移行されなかった。
【０３２８】
実施例１４−Ｈ／Ｄ交換によるエピトープマッピング
ＨＸ−ＭＳ技術は、タンパク質の水素交換（ＨＸ）が、質量分析（ＭＳ）により容易に追跡できることを利用している。水素含有水溶液を重水素含有水性溶媒で置換することによる、タンパク質中の所与の位置での重水素原子の取り込みが１Ｄａの質量の増大をもたらす。この質量増加は、交換反応のクエンチした試料中の質量分析法により、時間の関数として、モニターできる。重水素標識情報は、クエンチ条件下でペプシン消化によりタンパク質中の領域に、得られたペプチドの質量増加に従って、副局在化（ｓｕｂ−ｌｏｃａｌｉｚｅ）できる。
【０３２９】
１つのＨＸ−ＭＳの使用は、タンパク質−タンパク質複合体形成時に、低減した水素交換の領域を特定することによる、分子相互作用に関与する部位の検出のためである。通常、結合境界は、溶媒の立体排除に起因する水素交換の顕著な低減により明らかにされる。タンパク質−タンパク質複合体形成は、それぞれの結合相手の非存在下および存在下で、時間の関数としていずれかのタンパク質メンバー中での重水素取り込みの合計量を測定することにより、ＨＸ−ＭＳによって容易に検出され得る。ＨＸ−ＭＳ技術は、天然の成分、すなわち、Ｆａｂフラグメントのタンパク質および抗体を使用し、溶液中で実施される。したがって、ＨＸ−ＭＳは、インビボ条件を模倣する可能性をもたらす（最近のＨＸ−ＭＳ技術の概説としては、Ｗａｌｅｓ  ａｎｄ  Ｅｎｇｅｎ，Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．Ｒｅｖ．２５，１５８（２００６）を参照されたい）。
【０３３０】
材料および方法：
ＮＫｐ４６：ＮＫｐ４６−Ｈｉｓタンパク質を作製し、ＰＢＳ中の２０μＭ溶液として配合した。
ｍＡｂ：８Ｂ６Ａ、９Ｈ１１Ａおよび１７Ｅ１をＰＢＳ中の２０μＭ溶液として配合した。
【０３３１】
ＨＸ−ＭＳ実験：交換の開始および中断、温度制御および消化の持続時間、重水素化ペプチドの注入、注入および洗浄バルブの制御および質量分析計およびＨＰＬＣの取得の起動を可能とするＰＡＬ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＴＣ  Ａｎａｌｙｔｉｃｓ）ロボットを用いて、ＨＤＸ実験を自動化した。ペルチエ効果により４℃に冷却したポリスチレンボックスは、２つのＲｈｅｏｄｙｎｅ  ｖａｌｖｅ（注入用に６チャネル、脱塩用に１０チャネル）、脱塩カートリッジ（Ｍｉｃｈｒｏｍマイクロトラップ）およびＵＰＬＣカラム（商標）ＲＲＨＤ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｐｌｕｓ  Ｃ１８、２．１ｘ５０ｍｍ、１．８ｕ）を含む。２００μｌ／分の０．４％ギ酸を用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣポンプで脱塩後、ペプチドをＡｇｉｌｅｎｔ  ＵＰＬＣポンプを用いて、１５〜７０％Ｂ（Ａ：０．４％ギ酸、Ｂ：９５％アセトニトリル、０．０８％ＦＡ）の勾配液を５０μｌ／分の速度で、ＵＰＬＣカラムにより分離した。質量分析計は、エレクトロスプレー−ＴＯＦ（６２１０  Ａｇｉｌｅｎｔ）であった。Ｂｒｕｋｅｒ  Ｓｏｌａｒｉｘ  ＸＲ（１５Ｔ）質量分析計を用いて、タンデム型質量分析（ＭＳ−ＭＳ）によりマッピング実験を実施した。ＢｒｕｋｅｒおよびＡｇｉｌｅｎｔソフトウェアに加えて、Ｍａｇｔｒａｎ（２）およびＨＤＥｘａｍｉｎｅｒ（Ｓｉｅｒｒａ  Ａｎａｌｙｔｉｃｓ）をデータ処理に使用した。
【０３３２】
水素−重水素交換を、重水素化ＰＢＳ中、抗体の存在下はたは非存在下で、１０μＬのＮＫｐ４６（２０μＭ）で開始した。交換は、４℃で１５秒間実施した。１０μＬのＮＫｐ４６（２０μＭ）および１０μＬの抗体（２０μＭ）を４℃で少なくとも３０分間混合することにより、抗原−抗体複合体を形成した。塩酸グアニジニウムの溶液（３Ｍ）をＴＣＥＰ（４００ｍＭ）とグリシン−ＨＣｌ（１Ｍ）中溶液を、最終ｐＨ２．５で混合することにより交換を停止させた。還元および変性を４℃で５分間実施した。各実験を少なくとも３回繰り返した。
【０３３３】
結果：８Ｂ６Ａ、９Ｈ１１Ａおよび１７Ｅ１のエピトープマッピング。
下記配列番号７０に示されるＮＫｐ４６ポリペプチド配列の一次配列の実質的部分をカバーするペプチドのＨＸ時間経過を、８Ｂ６Ａ、９Ｈ１１Ａ、または１７Ｅ１の存在下および非存在下で１５秒間モニターした。
QQQTLPKPF IWAEPHFMVP KEKQVTICCQ GNYGAVEYQL HFEGSLFAVD RPKPPERINK VKFYIPDMNS RMAGQYSCIY RVGELWSEPS NLLDLVVTEM YDTPTLSVHP GPEVISGEK VTFYCRLDTAT SMFLLLKEGR SSHVQRGYGK VQAEFPLGPV TTAHRGTYRC FGSYNNHAWS FPSEPVKLLV TGDIENTSLA PEDPTFPADT WGTYLLTTET GLQKDHALWD HTAQN
（配列番号７０）
【０３３４】
これらの抗体の存在下または非存在下で観察された重水素取り込みは、２つのグループに分割できる：１つのグループのペプチドは、抗体のＮＫｐ４６に対する結合により影響を受けない重水素取り込みを示す。対照的に、別のグループのＮＫｐ４６のペプチドは、より少ない重水素取り込みを示し、これは、複合体型では、非複合体型よりも重水素取り込みが少ないので、複合体が形成されていることを反映している。領域１００〜１１８、１３３〜１５１、１５０〜１６９、１７７〜１８７のペプチドに関しては、遊離ＮＫｐ４６と、抗体との複合体型との間で、重水素化の差異が観察された。
【０３３５】
８Ｂ６Ａの存在下または非存在下、１５秒の交換で測定された、観察重水素取り込み（パーセンテージによる）は、次のＮＫｐ４６の４種のペプチドの８Ｂ６ＡのＮＫｐ４６への結合により重水素取り込みが影響を受けることを示した：８Ｂ６Ａ結合時に、約２倍少ない重水素取り込みが領域１０１〜１０５ならびに領域１５０〜１６９で観察され、一方、より小さい差異が領域１３３〜１５１および領域１７７〜１８７で観察された。
【０３３６】
９Ｈ１１Ａの存在下または非存在下で観察された重水素取り込みは、次のＮＫｐ４６の４種のペプチドの９Ｈ１１ＡのＮＫｐ４６への結合により重水素取り込みが影響を受けることを示した：重水素取り込みのパーセンテージが約４倍少ない重水素取り込みがペプチドの存在下で領域１０１〜１１８および領域１５０〜１６９で約２倍小さい取り込みが観察され、一方、より小さい差異が領域１３５〜１５１および領域１７８〜１８７で観察された。
【０３３７】
１７Ｅ１の存在下または非存在下で観察された重水素取り込みは、次のＮＫｐ４６の４種のペプチドの１７Ｅ１のＮＫｐ４６への結合により重水素取り込みが影響を受けることを示す：約２倍超少ない重水素取り込みが領域１５０〜１６９観察され、約１／３小さい取り込みが領域１００〜１０５で観察され、一方、より小さい差異が領域１３３〜１５１および領域１７８〜１８７で観察された。
【０３３８】
結論
残基１０１〜１１８（または１０１〜１０５または１００〜１０５）内のエピトープ領域ならびに残基１５０〜１６９内のエピトープ領域は、３種のｍＡｂ  ８Ｂ６Ａ、９Ｈ１１Ａおよび１７Ｅ１のいずれか１個の結合時に比較的強力な保護を示す。残基１３５〜１５１（または１３３〜１５１）および１７８〜１８７（または１７７〜１８７）を含む領域は、ｍＡｂに結合時に、より小さい（９Ｈ１１Ａ、８Ｂ６Ａ、１７Ｅ１）交換保護を示した。
【０３３９】
抗体９Ｈ１１Ａ
２つのＮＫｐ４６ペプチドは、９Ｈ１１Ａの存在下で強力に影響を受ける：
ＮＫｐ４６＿１０１−１１８：DTPTLSVHPGPEVISGEK（配列番号７１）
ＮＫｐ４６＿１５０−１６９：VQAEFPLGPVTTAHRGTYRC（配列番号７２）
ペプチドの分子表面に顕著に寄与する残基は下記の通り：
【表６】
2020506720.tif 000021
【０３４０】
２つのＮＫｐ４６ペプチドは、９Ｈ１１Ａの存在下で小さい影響を受ける：
ＮＫｐ４６_１７８−１８７：WSFPSEPVKL（配列番号７４）
ＮＫｐ４６＿１３５−１５１：LKEGRSSHVQRGYGKVQ（配列番号７６）
ペプチドの分子表面に顕著に寄与する残基は下記の通り：
【表７】
2020506720.tif 000022
【０３４１】
抗体８Ｂ６Ａ
２つのＮＫｐ４６ペプチドは、８Ｂ６Ａの存在下で顕著な影響を受ける：
ＮＫｐ４６＿１０１−１０５：DTPTL（配列番号７３）
ＮＫｐ４６＿１５０−１６９：VQAEFPLGPVTTAHRGTYRC（配列番号７２）
ペプチドの分子表面に顕著に寄与する残基は下記の通り：
【表８】
2020506720.tif 000023
【０３４２】
２つのＮＫｐ４６ペプチドは、８Ｂ６Ａの存在下で小さい影響を受ける：
ＮＫｐ４６＿１７７−１８７：AWSFPSEPVKL（配列番号７５）
ＮＫｐ４６＿１３３−１５１：LLLKEGRSSHVQRGYGKVQ（配列番号７７）
ペプチドの分子表面に顕著に寄与する残基は下記の通り：
【表９】
2020506720.tif 000024
【０３４３】
抗体１７Ｅ１
１個のＮＫｐ４６ペプチドは、１７Ｅ１の存在下で強力に影響を受ける：
ＮＫｐ４６＿１５０−１６９：VQAEFPLGPVTTAHRGTYRC（配列番号７２）
ペプチドの分子表面に顕著に寄与する残基は下記の通り：
【表１０】
2020506720.tif 000025
【０３４４】
１個のＮＫｐ４６ペプチドは、１７Ｅ１の存在下で顕著に影響を受ける：
ＮＫｐ４６＿１００−１０５：YDTPTL（配列番号７８）
ペプチドの分子表面に顕著に寄与する残基は下記の通り：
【表１１】
2020506720.tif 000026
【０３４５】
２つのＮＫｐ４６ペプチドは、１７Ｅ１の存在下で小さい影響を受ける：
ＮＫｐ４６＿１７８−１８７：WSFPSEPVKL（配列番号７４）
ＮＫｐ４６＿１３３−１５１：LLLKEGRSSHVQRGYGKVQ（配列番号７７）
ペプチドの分子表面に顕著に寄与する残基は下記の通り：
【表１２】
2020506720.tif 000027
【０３４６】
図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃは、抗体９Ｈ１１Ａ、８Ｂ６Ａおよび１７Ｅ１により結合されたセグメントがそれぞれ示されている、ＮＫｐ４６の三次構造（３つの方向での）を示す。図に示すように、抗体は、ＮＫｐ４６のＤ２ドメインに結合する。
【０３４７】
見出しおよび小見出しは全て本明細書では単に便宜上使用され、本発明を何ら限定すると解釈されるべきでない。別段の指示がない限り、あるいは文脈上明らかに矛盾するということがない限り、全ての可能性な変形例における上記要素のいずれの組み合わせも本発明に包含される。本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書で別段の指示がない限り、その範囲内に入る個別の各値を個々に表すことの簡略法として用いることを意図したものにすぎず、個別の各値は、それが本明細書に個々に列挙されているかのうように本明細書に組み込まれる。特段の記載がない限り、本明細書に記載される全ての正確な値は、対応するおおよその値を代表する（例えば、特定の因子または測定値に関して記載される全ての正確な例示的な値は、適切な場合は「約」により変更される、対応するおおよその測  定値を示すものと見なすことができる）。
【０３４８】
本明細書で記載の全ての方法は、本明細書で別段の指示がない限り、または文脈上明らかに矛盾することがない限り、任意の好適な順序で実施することができる。
【０３４９】
本明細書に記載されるあらゆる例または例示的な語（例えば、「など」）の使用は、単に本発明をより明確にするためのものであり、特段の記載がない限り、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書中の文言は、明示的に示されない限り、任意の要素が本発明の実施に不可欠であることを示すと解釈すべきではない。
【０３５０】
本明細書での特許文献の引用および組み込みは単に便宜上行われるものであり、このような特許文献の妥当性、特許性および／または実施可能性のいずれをも反映するものではない。用語、例えば、１つまたは複数の要素を指す語を用いた、本発明の任意の態様または実施形態の本明細書の説明は、特段の記載がない限り、または文脈から明確に他の旨である場合を除き、その１つまたは複数の特定の要素「からなる」、「から実質的になる」、または「を実質的に含む」本発明の同様の態様または実施形態を支援するためである（例えば、特定の要素を含むとして本明細書に記載される組成物は、特段の記載がない限り、または文脈から明確に他の旨である場合を除き、その要素からなる組成物の記載でもあることを理解されたい）。
【０３５１】
本発明は、本明細書に示される態様または特許請求の範囲に列挙される主題のすべての修正物および等価物を適用法令が許す最大の限度で含む。
【０３５２】
本明細書で述べられる全ての刊行物および特許出願は、それぞれの個々の刊行物または特許出願が、参照により含まれると具体的かつ個別に示されたかのように、参照によりそれらの全内容が本明細書に組み入れられる。
【０３５３】
前述の発明は、理解を明確にする目的で図および例を用いて詳細に記載されているが、本発明の教示に照らして、添付の請求項の趣旨または範囲から逸脱することなく、特定の変更および修正を行ってもよいことは、当業者に容易に明らかとなろう。
【図１】
2020506720.tif 000028
【図２Ａ】
2020506720.tif 000029
【図２Ｂ】
2020506720.tif 000030
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
2020506720.tif 000034
【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年10月4日(2019.10.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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