(57)【要約】  細菌、植物、植物細胞、組織および種子に殺線虫活性を付与するための組成物および方法が提供される。特に、有害線虫個体群、特にプラティレンクス属種(Pratylenchus spp.)、例えば、プラティレンクス・ブラキウルス(Pratylenchus brachyurus)の個体群を死滅させるかまたは防除するための方法が提供される。この方法は、有害線虫を、農薬として有効な量の、殺線虫性毒素、詳しくはPratylenchus spp.の線虫、例えばPratylenchus brachyurusに対する活性を示す殺線虫性毒素を含むポリペプチドと接触させることを含む。本発明の毒素を発現させることにより植物の収量を増加させるための方法がさらに含まれる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
プラティレンクス属種(Pratylenchus spp.)の有害線虫個体群を防除するための方法であって、該個体群を、殺線虫剤として有効な量の、配列番号1または2のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドと接触させることを含み、該ポリペプチドは該プラティレンクス属種の有害線虫個体群に対する殺線虫活性を有する、上記方法。
【請求項２】
前記プラティレンクス属種がプラティレンクス・ブラキウルス(Pratylenchus brachyurus)である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記植物がダイズ植物である、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
プラティレンクス属種(Pratylenchus spp.)の有害線虫から植物を保護するための方法であって、植物細胞内でヌクレオチド配列の発現を指令することができるプロモーターに作動可能に連結された該ヌクレオチド配列を、植物またはその細胞内で発現させることを含み、該ヌクレオチド配列は、以下(a)および(b)：
(a)配列番号3または4に記載のヌクレオチド配列、および
(b)配列番号1または2のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ここで、該ポリペプチドは前記のプラティレンクス属種の有害線虫に対する殺線虫活性を有するものとする、
からなる群より選択される、上記方法。
【請求項５】
植物の収量を増加させるための方法であって、植物細胞内でヌクレオチド配列の発現を指令することができるプロモーターに作動可能に連結された該ヌクレオチド配列を含むDNA構築物がそのゲノム内に安定して組み込まれている植物またはその種子を圃場で生育させることを含み、該ヌクレオチド配列は、以下(a)および(b)：
(a)配列番号3または4に記載のヌクレオチド配列、および
(b)配列番号1または2のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ここで、該ポリペプチドはプラティレンクス属種(Pratylenchus spp.)の有害線虫に対する殺線虫活性を有するものとする、
からなる群より選択され、前記圃場はプラティレンクス属種の有害線虫が湧いている圃場である、上記方法。
【請求項６】
前記プラティレンクス属種(Pratylenchus spp.)がプラティレンクス・ブラキウルス(Pratylenchus brachyurus)である、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
前記植物が1種以上の昆虫毒素をコードする1つ以上のヌクレオチド配列をさらに含む、請求項4〜6のいずれか1項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は米国仮出願第62／438,420号(2016年12月22日出願)の利益を主張するものであり、その記載内容は全て参照により本明細書中に組み込まれるものとする。
【０００２】
電子データにて提出した配列表の参照
配列表の公式コピーを、ASCIIフォーマット化配列表(ファイル名「APA16-6020WOSEQLIST.txt」、2017年10月3日作成、40キロバイトのサイズを有する)としてEFS-Web経由で電子データにて提出し、かつこれを本明細書と共に提出する。このASCIIフォーマット化書面に含まれる配列表は本明細書の一部であり、その全内容は参照により本明細書中に組み込まれるものとする。
【０００３】
本発明は分子生物学の分野に関するものである。Cry14を使用する有害線虫の防除のための方法が提供される。
【背景技術】
【０００４】
線虫は、活動的で、柔軟で、細長く、土壌中の水膜および他の生物内の湿潤組織を含む、湿気を含んだ面上または液体環境内に生息する生物である。多くの種の線虫は進化することにより植物および動物の非常によくできた寄生虫となり、農業および畜産における著しい経済的損失ならびにヒトの罹患および死亡の原因となっている(Whitehead (1998) Plant Nematode Control. CAB International, New York)。
【０００５】
寄生線虫は、全ての主要作物にわたる推定平均12％の年間損失に基づくと、園芸産業および農産業に世界規模で毎年780億ドルを超える損害を与えていると推定される。例えば、線虫は毎年世界規模で約32億ドルのダイズ損失をもたらすと推定される(Barkerら(1994) Plant and Soil Nematodes：Societal Impact and Focus for the Future. The Committee on National Needs and Priorities in Nematology. Cooperative State Research Service, US Department of Agriculture and Society of Nematologists)。広い作付面積(high-acreage)の作物市場では、線虫被害はダイズおよびワタで最も大きい。しかし、ジャガイモ、コショウ、タマネギ、柑橘類、コーヒー、サトウキビ、温室観葉植物およびゴルフ場の芝草を含め、深刻な線虫の寄生に悩まされている何十種ものさらなる作物が存在する。
【０００６】
線虫は作物および植物の収量、生育、および健康に影響を及ぼすことが知られている。幼虫および／または成虫の線虫により引き起こされる宿主植物の根の生理学的変化はゴールの形成をもたらす可能性があり、これが該植物の根の維管束系の破壊を引き起こす。根の伸長が完全に止まる可能性があり、また縮小した根系により提供される水分および栄養分の不十分な供給をもたらして葉の白化および／または萎凋病、ならびに生育の阻害を引き起こす可能性があり、それらはいずれも低収量または枯死をもたらしかねない。その上、線虫は、細菌および／または真菌(例えば、他の状況であれば植物が抵抗性を示すであろう細菌および／または真菌)の攻撃に対する植物根の感受性の増大につながる生理学的影響を引き起こす可能性がある。かかる攻撃は、広範囲に及ぶ二次的腐朽および腐敗をもたらす可能性がある。
【０００７】
ネグサレセンチュウであるプラティレンクス・ブラキウルス(Pratylenchus brachyurus)は、ダイズの重要な病原体となりつつある。Pratylenchus brachyurusは広範な宿主域を持ち、熱帯および亜熱帯地方、特にブラジル、アフリカ、および米国南部に広く分布している。Pratylenchus brachyurusはブラジル・セラード地域のワタおよびダイズ栽培者の間の関心事となっており、この地域のダイズの主な線虫病原体と考えられている。ダイズの場合、この線虫は収量を30〜50％減少させる可能性があり、砂質土壌ではより大きな被害が観察される。現在のところ、今日までに同定されたP.brachyurus抵抗性ダイズ品種は存在しない。幾つかのダイズの遺伝子型がPratylenchus brachyurus抵抗性について研究されており、また一部の栽培品種は増加した耐性を有すると同定されているが、P.brachyurusに対する抵抗性栽培品種の育種は、この線虫が雑食性でありかつその宿主との密接な相互作用が欠如しているという事実のために、困難である(Machado (2014) Current Agricultural Science and Technology 20：26-35；Antonioら(2012) Soil productivity losses in area infested by the nematoid of the root lesions in Vera, MT. In： Brazilian Congress of Soy, 6, 2012, Cuiaba. Abstracts. Londrina： Embrapa Soja, 4pp；Riosら(2016) Ciencia Rural 46：580-584；Limaら、2017, Chapter 6 in the book：Soybean-The Basis of Yield, Biomass and Productivity；Edited by Minobu Kasai, ISBN 978-953-51-3118-2, Print ISBN 978-953-51-3117-5, InTech；Inomotoら(2011) Sucessao de culturas sob pivo central para controle de fitonematoides： variacao populacional, patogenicidade e estimativa de perdas. Tropical Plant Pathology 36：178-185)。
【０００８】
線虫による寄生を防除するための方法は、幾つかの形で提供されている。植物検疫を含む生物学的および栽培上の防除方法が、極めて多くの例で試みられている。ある特定の線虫に対する遺伝的抵抗性は一部の市販栽培品種(例えば、ダイズ)で利用できるが、これらは数に限りがあり、また望ましい農学的特徴と抵抗性の両方を備えた栽培品種の利用可能性は制限されている。さらに、有性交雑による遺伝的組換えをベースとした従来の植物育種による線虫抵抗性市販品種の生産は、時間のかかるプロセスであり、適当な生殖質の欠如がさらなる妨げになることが多い。
【０００９】
植物寄生線虫を防除する化学的手段は、依然として、十分な天然の抵抗性をもたない多くの作物にとって不可欠である。しかし、化学物質は選択的ではないことが多く、また一部は非標的生物にその効果を発揮して、該物質の施用後の一定期間、有益な微生物の集団を効果的に破壊する。化学物質は環境に残存し、緩やかにしか代謝されない恐れがある。
【００１０】
従って、農業上重要な植物において線虫個体群を防除するためのさらなる手段が必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Whitehead (1998) Plant Nematode Control. CAB International, New York
【非特許文献２】Barkerら(1994) Plant and Soil Nematodes：Societal Impact and Focus for the Future. The Committee on National Needs and Priorities in Nematology. Cooperative State Research Service, US Department of Agriculture and Society of Nematologists
【非特許文献３】Machado (2014) Current Agricultural Science and Technology 20：26-35
【非特許文献４】Antonioら(2012) Soil productivity losses in area infested by the nematoid of the root lesions in Vera, MT. In： Brazilian Congress of Soy, 6, 2012, Cuiaba. Abstracts. Londrina： Embrapa Soja, 4pp
【非特許文献５】Riosら(2016) Ciencia Rural 46：580-584
【非特許文献６】Limaら、2017, Chapter 6 in the book：Soybean-The Basis of Yield, Biomass and Productivity；Edited by Minobu Kasai, ISBN 978-953-51-3118-2, Print ISBN 978-953-51-3117-5, InTech
【非特許文献７】Inomotoら(2011) Sucessao de culturas sob pivo central para controle de fitonematoides： variacao populacional, patogenicidade e estimativa de perdas. Tropical Plant Pathology 36：178-185
【発明の概要】
【００１２】
植物、植物細胞、組織および種子に殺線虫活性を付与するための組成物および方法が提供される。特に、有害線虫(nematode pest)個体群（集団）、詳しくはプラティレンクス属種(Pratylenchus sp)(例えば、Pratylenchus brachyurus)の個体群などの病害線虫(lesion nematode)を死滅させるかまたは防除するための方法が提供される。本発明はさらに、ネコブセンチュウ(サツマイモネコブセンチュウ(Meloidogyne incognita)、アレナリアネコブセンチュウ(Meloidogyne arenaria)、キタネコブセンチュウ(Meloidogyne hapla)、もしくはジャワネコブセンチュウ(Meloidogyne javanica)、またはその任意の組み合わせを含むがこれらに限定されないメロイドギネ属種(Meloidogyne spp.)のダイズ有害線虫)、ニセフクロセンチュウ(Rotylenchulus reniformis)ならびにヤリセンチュウ(ホプロライムス属種(Hoplolaimus spp.)、例えば、H.コルンブス(H. columbus)、H.ガレアトゥス(H. galeatus)、およびH.マグニスチルス(H. magnistylus))の防除を提供する。該方法は、有害線虫を、殺線虫性毒素、詳しくはPratylenchus spp.の線虫(例えば、Pratylenchus brachyurus)、ネコブセンチュウ、ニセフクロセンチュウ、またはヤリセンチュウに対する活性を有する殺線虫性毒素を含む、農薬（殺害虫剤）として有効な量のポリペプチドと接触させることを含む。種々の実施形態において、該殺線虫性毒素は、配列番号1もしくは2のアミノ酸配列、または農薬として有効なその変異体もしくは断片を含む。幾つかの実施形態では、有害線虫個体群、詳しくはPratylenchus spp.の線虫(例えば、Pratylenchus brachyurus)、ネコブセンチュウ、ニセフクロセンチュウ、またはヤリセンチュウから植物またはその細胞を保護するための方法は、植物またはその細胞内で、配列番号1もしくは2、またはその変異体もしくは断片をコードする核酸を発現させることを含み、該核酸は、植物細胞内で該核酸の発現を指令することができるプロモーターに作動可能に連結されている。
【００１３】
植物の収量を増加させるための方法であって、植物細胞内で核酸の発現を指令することができるプロモーターに作動可能に連結された該核酸を含むDNA構築物がそのゲノム内に安定して組み込まれている植物またはその種子を圃場で生育させることを含み、該核酸が配列番号1もしくは2、または農薬として有効なその変異体もしくは断片をコードしている該方法がさらに含まれる。
【００１４】
本発明の組成物および方法は、向上した線虫、例えばPratylenchus spp.、ネコブセンチュウ、ニセフクロセンチュウ、またはヤリセンチュウ抵抗性または耐性を有する生物の生産に有用である。これらの生物および該生物を含む組成物は、農業用として望ましい。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図1は、米国におけるPratylenchus抵抗性の温室試験を示す図である。EE-GM4を有する有望ダイズ植物は、米国の温室試験においてPratylenchus brachyurusを防除する。配列番号2を発現するダイズ植物(「EE-GM4」)を、他の有望ダイズ系統：1つのSCN感受性成熟群(MG)3系統(「THORNE」)、1つのMG3 SCN感受性系統、1つのMG 6.2 SCN感受性系統および1つのMG9 SCN感受性系統(「Susc WT」はこれら3系統の平均値を示す)、1つのMG3 SCN抵抗性系統(PI88788由来の抵抗性対立遺伝子rhg1を有する、「SCN Res (PI88788)」)、ならびにPeking由来のrhg1およびRhg4 SCN抵抗性を有する1つのMG 6.2 SCN抵抗性系統(「SCN Res (Peking)」)と比較した。プロットしたのは寄生30日後の根におけるPratylenchusの平均数(1エントリー当たり5つの植物)であり、品種全てに観察された変動も示す(温室試験では一般的にみられる)。結果は、複数のEE-GM4系統にわたるPratylenchusの最大85％の防除を示している。天然のSCN抵抗性(PekingまたはPI88788由来)を有するダイズ系統は、Pratylenchus brachyurusを防除しない。
【図２】図2は、ブラジルにおけるPratylenchus抵抗性の温室試験を示す図である。EE-GM4を有するダイズ植物(「EE-GM4」)はダイズ根におけるPratylenchus brachyurusを有意に減少させる。Pratylenchus brachyurusはブラジルの現地圃場から単離した。EE-GM4植物(2つの異なる米国有望系統(いずれも成熟群6.2、1つはSCN感受性、1つはPeking SCN抵抗性を有する(「EE-GM4」))およびわずかなPratylenchus防除を示す5つのブラジルのダイズ系統(「ブラジル系統」)、PratylenchusのRf(増殖率)が低いと分類されている1つのブラジル産系統(「BRS 7380 (低Rf)」)、SCN感受性である1つの米国有望系統(成熟群6.2)( 「SCN Susc」)およびPeking SCN抵抗性を有するMG 6.2の1つの米国有望系統(「SCN Res (Peking)」)を、ブラジルにおける温室試験においてPratylenchus防除について評価した。プロットしたのはそれらのエントリーの平均値であり、品種全てに観察された変動も示す(温室試験では一般的にみられる)。1つのブラジルのダイズ系統(BRS 7380)は、プラティレンクスの最大89％の減少を示した。EE-GM4系統はPratylenchusの最大79％の防除を提供した。SCNに対するPekingの天然の抵抗性を保有するダイズ系統は、Pratylenchus brachyurusを防除しない。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、生物、詳しくは植物または植物細胞において線虫抵抗性を調節するための方法に関する。「抵抗性」とは、線虫が本発明のポリペプチドの摂取時に死滅するか、または本発明のポリペプチドとの他の接触が線虫の移動、摂食、繁殖、もしくは他の機能において低下することを意味する。植物またはその種子における植物寄生線虫個体群の防除は、根粒着生、発芽、根の発達、出芽、および健康(例えば、細菌また真菌性の病害を含む病害に対する抵抗性または病害からの保護)を改善するが、これは本明細書に開示および記載した方法の重要な利点である。従って、本明細書中に記載した方法は、線虫個体群、詳しくはPratylenchus spp.の線虫個体群、例えばPratylenchus brachyurus、ネコブセンチュウ、ニセフクロセンチュウ、またはヤリセンチュウを防除する際に有用であり、このことは、改善された全般的な植物の健康、栄養ならびに／または植物および／もしくは種子の改善された農学的利点をもたらす。例えば、線虫の総数／面積の減少、線虫の卵／面積の減少、または植物への被害の減少などの線虫個体群防除に関するあらゆる利点は、本発明の農学的利点でありうる。線虫個体群を防除することの二次的利点としては、限定するものではないが、改善された根発達(例えば、改善された根もしくは根毛の生育)、改善された収量、より早い出芽、上昇したストレス耐性および／またはストレスからの改善された回復を含む改善された植物ストレス管理、上昇した機械的強度、改善された乾燥抵抗性、減少した真菌性病害感染、ならびに改善された植物健康が挙げられる。これらの利点の任意の組み合わせも同様に取得することができる。
【００１７】
本発明の方法は、本発明の殺線虫性タンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列を含む生物の形質転換または該生物の使用を含む。本明細書中に記載した方法は、有害線虫個体群を防除するかまたは死滅させる際、および有害線虫に対する殺線虫活性を有する組成物を製造する際に有用である。
【００１８】
「農薬毒素(殺害虫毒素、pesticidal toxin)」または「農薬タンパク質(殺害虫性タンパク質、pesticidal protein)」、または「殺線虫活性」または「殺線虫性毒素」とは、Pratylenchus spp.、例えばプラティレンクス・アレニ(Pratylenchus alleni)、Pratylenchus brachyurus、ミナミネグサレセンチュウ(Pratylenchus coffeae)、ノコギリネグサレセンチュウ(Pratylenchus crenatus)、プラティレンクス・ドゥルスクス(Pratylenchus dulscus)、キクネグサレセンチュウ(Pratylenchus fallax)、プラティレンクス・フラッケンシス(Pratylenchus flakkensis)、プラティレンクス・ゴオデイイ(Pratylenchus goodeyi)、プラティレンクス・ヘキシンシスス(Pratylenchus hexincisus)、チャネグサレセンチュウ(Pratylenchus loosi)、プラティレンクス・ミヌツス(Pratylenchus minutus)、プラティレンクス・ムルチャンディ(Pratylenchus mulchandi)、プラティレンクス・ムシコラ(Pratylenchus musicola)、ムギネグサレセンチュウ(Pratylenchus neglectus)、キタネグサレセンチュウ(Pratylenchus penetrans)、プラティレンクス・プラテンシス(Pratylenchus pratensis)、プラティレンクス・レニフォルミア(Pratylenchus reniformia)、プラティレンクス・スクリブネリ(Pratylenchus scribneri)、プラティレンクス・ソルネイ(Pratylenchus thornei)、クルミネグサレセンチュウ(Pratylenchus vulnus)、およびモロコシネグサレセンチュウ(Pratylenchus zeae)を含むがこれらに限定されない1種以上の有害線虫に対する活性を有する毒素を意味する。殺線虫性タンパク質は、本明細書中に開示した全長ヌクレオチド配列から推定されるアミノ酸配列、および代替下流開始部位の使用に起因するか、または殺線虫活性を有するより短いタンパク質を産生するプロセシングに起因する、全長配列よりも短いアミノ酸配列を含む。プロセシングは、該タンパク質がその内部で発現される生物内、または該タンパク質の摂取後の有害生物内で生じる場合がある。
【００１９】
特定の実施形態では、前記殺線虫性タンパク質はCry14タンパク質を含む。種々の実施形態において、Cry14タンパク質はCry14Aa1(GENBANKアクセッション番号AAA21516)またはCry14Ab1(GENBANKアクセッション番号KC156652)である。幾つかの実施形態では、Cry14Aa1タンパク質は、配列番号1に記載のアミノ酸配列、ならびにその変異体および断片を包含する。他の実施形態では、Cry14Ab1タンパク質は、配列番号2に記載のアミノ酸配列、ならびにその変異体および断片を包含する。配列番号1をコードする例示的なヌクレオチド配列は、配列番号3および5に記載されている。配列番号2をコードする例示的なヌクレオチド配列は、配列番号4および6に記載されている。
【００２０】
従って、本発明の殺線虫性毒素を含む組成物に、有害線虫を接触させるか、または有害線虫を曝露することを含む、有害線虫個体群、例えばPratylenchus spp.の個体群、例えば、Pratylenchus brachyurus、ネコブセンチュウ、ニセフクロセンチュウ、またはヤリセンチュウを死滅させるかまたは防除するための方法が本明細書中に提供される。特定の実施形態では、殺線虫性タンパク質は、配列番号1または2に記載のCry14タンパク質、ならびにその変異体および断片を含む。
【００２１】
単離された核酸分子、ならびにその変異体および断片
本発明の一態様は、殺線虫性タンパク質およびポリペプチドまたは生物学的に活性なその部分をコードするヌクレオチド配列を含む単離された、組換えまたはキメラ核酸分子、ならびに配列相同性の領域を有するタンパク質をコードする核酸分子を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとして使用するのに十分な核酸分子に関する。本明細書中の他の箇所で定義するストリンジェントな条件下で本発明のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列もまた、本明細書中に包含される。本明細書中で使用する場合、用語「核酸分子」は、DNA分子(例えば、組換えDNA、cDNAまたはゲノムDNA)およびRNA分子(例えば、mRNA)ならびにヌクレオチド類似体を使用して作成したDNAまたはRNAの類似体を含むことを意味する。核酸分子は一本鎖または二本鎖でありうるが、好ましくは二本鎖DNAである。用語「組換え」は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが(例えば、化学組成または構造の点で)天然に存在するものとは異なるように、天然のポリヌクレオチドまたはポリペプチドに関して操作されているポリヌクレオチドまたはポリペプチドを包含する。「単離された核酸(配列／分子)」または「単離されたDNA(配列／分子)」は、本明細書中で使用する場合、それが単離された天然の環境にはもはや存在しない核酸もしくはDNA(配列／分子)、例えば、別の細菌宿主内もしくは植物ゲノム内の核酸配列、または例えば(異種)植物で発現可能なプロモーターの制御下にあるキメラ遺伝子に含有されている場合は、別の起源から得たDNAもしくは核酸(配列／分子)に融合させた核酸もしくはDNA(配列／分子)を指す。任意のプライマーを含む本発明の任意の核酸またはDNAもまた、天然に存在しないもの、例えば、天然に存在する配列と同一の配列を持つが標識(天然に存在する対応物にはない)を有する核酸またはDNA、あるいは天然に存在するヌクレオチドと比較して少なくとも1つのヌクレオチドの付加もしくは置換または少なくとも1つの内部ヌクレオチドの欠失を有する配列を持つ核酸またはDNA、あるいは天然に存在する核酸もしくはDNAまたはその断片に対して100％未満の配列同一性を有する(同一ではない)配列を持つ核酸またはDNA、あるいは自然界では一緒に存在しない種々の起源から得たヌクレオチド配列からなる配列を持つ核酸またはDNA(キメラまたはハイブリッドDNA)、あるいは天然の核酸もしくはDNAまたはその断片とは異なる配列を持つ人工合成核酸またはDNAでありうる。
【００２２】
単離された組換えまたはキメラ核酸(またはDNA)は、その天然の環境にもはや存在しない核酸(またはDNA)、例えばin vitroでの、または組換え細菌もしくは植物宿主細胞内の核酸(またはDNA)に言及するために本明細書中で使用する。幾つかの実施形態では、単離された組換えまたはキメラ核酸は、核酸が由来する生物のゲノムDNAにおいて該核酸に本来隣接する配列(すなわち、該核酸の5’および3’末端に位置する配列)(好ましくはタンパク質コード配列)を含まない。本発明の目的のため、「単離された」は、核酸分子に言及するために使用する場合、単離された染色体を除外する。例えば、種々の実施形態では、単離されたδ-エンドトキシン・コード核酸分子は、該核酸が由来する細胞のゲノムDNAにおいて該核酸分子に本来隣接する約5 kb、4 kb、3 kb、2 kb、1 kb、0.5 kb、または0.1 kb未満のヌクレオチド配列を含有しうる。種々の実施形態では、細胞材料を実質的に含まないδ-エンドトキシンタンパク質は、(乾燥重量で)約30％、20％、10％、または5％未満の非δ-エンドトキシンタンパク質(本明細書中では「汚染タンパク質」とも称される)を有するタンパク質の調製物を含む。幾つかの実施形態では、本発明の組換え核酸は、配列番号3〜6、またはその変異体もしくは断片に関して1つ以上のヌクレオチド置換を含む。
【００２３】
本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号3〜6に記載の配列、ならびにその変異体、断片、および相補体を含む。「相補体」とは、所与のヌクレオチド配列にハイブリダイズし、それにより安定した二重鎖を形成できるような、所与のヌクレオチド配列に対して十分に相補的であるヌクレオチド配列を意味する。これらのヌクレオチド配列によりコードされる殺線虫性タンパク質の対応アミノ酸配列を配列番号1および2に記載する。
【００２４】
殺線虫性タンパク質をコードするこれらのヌクレオチド配列の断片である核酸分子もまた本発明に包含される。「断片」とは、殺線虫性タンパク質をコードするヌクレオチド配列の一部分を意味する。ヌクレオチド配列の断片は、殺線虫性タンパク質の生物学的に活性な部分をコードしていてもよく、または以下に開示する方法を利用するハイブリダイゼーションプローブもしくはPCRプライマーとして使用できる断片であってもよい。殺線虫性タンパク質をコードするヌクレオチド配列の断片である核酸分子は、意図する用途に応じて、少なくとも約50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1350、1400個の連続ヌクレオチド、または最大で、本明細書中に開示した殺線虫性タンパク質をコードする全長ヌクレオチド配列中に存在する数のヌクレオチドを含む。「連続」ヌクレオチドとは、互いに直接隣接しているヌクレオチド残基を意味する。本発明のヌクレオチド配列の断片は、殺線虫性タンパク質の生物活性を保持し、またそれ故に有害線虫に対する殺虫活性を保持する、タンパク質断片をコードする。従って、本明細書中に開示したポリペプチドの生物学的に活性な断片もまた包含される。「活性を保持する」とは、該断片が、殺線虫性タンパク質の殺虫活性の少なくとも約30％、少なくとも約50％、少なくとも約70％、80％、90％、95％またはそれ以上を有することを意味する。殺線虫活性を測定するための方法は当分野で周知であり、該方法もまた本明細書中に記載されている。
【００２５】
本発明のタンパク質の生物学的に活性な部分をコードする、殺線虫性タンパク質をコードするヌクレオチド配列の断片は、少なくとも約15、25、30、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、もしくは1150個の連続アミノ酸、または最大で本発明の全長殺線虫性タンパク質中に存在する総数のアミノ酸をコードする。幾つかの実施形態では、該断片はタンパク質分解性切断断片である。例えば、該タンパク質分解性切断断片は、配列番号1または2に関して、少なくとも約30アミノ酸、少なくとも約40アミノ酸、少なくとも約50、少なくとも約100アミノ酸、約120、約130、約140、約150、または約160アミノ酸のN末端またはC末端トランケーションを有していてもよい。幾つかの実施形態では、本明細書中に包含される断片は、例えば、タンパク質分解による、またはコード配列への終結コドンの挿入による、C末端結晶化ドメインの除去により得られる。さらなる実施形態では、本明細書中に包含される断片はN末端トランケーションを含み、また該N末端トランケーションは、そのトランケート化N-末端にメチオニン残基を含んでいてもよい。
【００２６】
種々の実施形態では、本発明の核酸は配列番号3〜6の縮重核酸を含み、その縮重ヌクレオチド配列は配列番号1または2と同じアミノ酸配列をコードする。
【００２７】
本発明の好適な殺線虫性タンパク質は配列番号3〜6のヌクレオチド配列と十分に同一であるヌクレオチド配列によりコードされるか、または該殺線虫性タンパク質は配列番号1もしくは2に記載のアミノ酸配列と十分に同一である。「十分に同一である」とは、本明細書中に記載したアラインメントプログラムのうちの1つを利用し、標準的なパラメータを使用して参照配列と比較した場合に、少なくとも約60％または65％の配列同一性、約70％または75％の配列同一性、約80％または85％の配列同一性、約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸またはヌクレオチド配列を意味する。当業者であれば、コドン縮重、アミノ酸類似性、リーディングフレームの位置などを考慮することで、2つのヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質の対応する同一性を決定するためにこれらの値を適切に調整しうることが認識されよう。
【００２８】
2つのアミノ酸配列または2つの核酸の同一性パーセントを決定するために、それらの配列を、最適な比較を目的としてアラインメントする。2配列間の同一性パーセントは、該配列により共有される同一の位置の数の関数である(すなわち、同一性パーセント＝同一の位置の数／位置の総数(例えば、重複する位置)×100)。一実施形態では、2つの配列は同じ長さである。別の実施形態では、同一性パーセントを参照配列(すなわち、配列番号1〜6のうちのいずれかとして本明細書中に開示した配列)の全体にわたって算出する。2配列間の同一性パーセントは、ギャップを許容するかまたは許容しない、以下に記載するものと同様の技術を利用して決定することができる。同一性パーセントを算出する際、典型的には、完全一致を計数する。ギャップ、すなわち、ある残基が一方の配列には存在するが他方の配列には存在しないアラインメント内の位置は、非同一残基を有する位置とみなされる。
【００２９】
2配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを利用して達成することができる。2つの配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの非限定的な例は、KarlinおよびAltschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90：5873-5877に見られるように改変された、KarlinおよびAltschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87：2264のアルゴリズムである。かかるアルゴリズムは、Altschulら(1990) J. Mol. Biol. 215：403のBLASTNおよびBLASTXプログラムに組み込まれている。BLASTヌクレオチド検索は、本発明の農薬様(pesticidal-like)核酸分子と相同的なヌクレオチド配列を取得するために、BLASTNプログラム、スコア＝100、ワード長＝12を用いて実施することができる。BLASTタンパク質検索は、本発明の殺線虫性タンパク質と相同的なアミノ酸配列を取得するために、BLASTXプログラム、スコア＝50、ワード長＝3を用いて実施することができる。比較目的でギャップ付きアラインメントを取得するためには、Altschulら(1997) Nucleic Acids Res. 25：3389に記載されているようにGapped BLAST (BLAST 2.0中)を利用することができる。あるいは、PSI-Blastを使用することにより、分子間の遠縁の関係性を検出する反復検索を実施することができる。Altschulら(1997) 前掲を参照されたい。BLAST、Gapped BLAST、およびPSI-Blastプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム(例えば、BLASTXおよびBLASTN)のデフォルトパラメータを使用することができる。アラインメントは検査により手動で実施してもよい。
【００３０】
配列の比較に利用される数学的アルゴリズム別の非限定的な例は、ClustalWアルゴリズム(Higginsら(1994) Nucleic Acids Res. 22：4673-4680)である。ClustalWは配列を比較してアミノ酸またはDNA配列の全体をアラインメントするものであり、従って全アミノ酸配列の配列保存に関するデータを提供することができる。ClustalWアルゴリズムは、幾つかの市販のDNA／アミノ酸解析ソフトウェアパッケージ、例えばVector NTI Program SuiteのALIGNXモジュール(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)に使用されている。ClustalWによるアミノ酸配列のアラインメント後に、アミノ酸同一性パーセントを評価することができる。ClustalWアラインメントの解析に有用なソフトウェアプログラムの非限定的な例は、GENEDOC(商標)である。GENEDOC(商標)(Karl Nicholas)により、複数のタンパク質間のアミノ酸(またはDNA)の類似性および同一性の評価が可能となる。配列の比較に利用される数学的アルゴリズムのもう1つの非限定的な例は、MyersおよびMiller (1988) CABIOS 4：11-17のアルゴリズムである。かかるアルゴリズムは、GCG Wisconsin Genetics Software Package, Version 10 (Accelrys, Inc., 9685 Scranton Rd., San Diego, CA, USAから入手可能)の一部である、ALIGNプログラム(バージョン2.0)に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにALIGNプログラムを利用する場合、PAM120重み付け残基表(weight residue table)、ギャップ長ペナルティー12、およびギャップペナルティー4を使用することができる。
【００３１】
他に記載しない限り、NeedlemanおよびWunsch (1970) J. Mol. Biol. 48(3)：443-453のアルゴリズムを利用するGAP Version 10を、以下のパラメータ：GAP重み50および長さ重み3、ならびにnwsgapdna.cmpスコア行列を利用したヌクレオチド配列の同一性％および類似性％；GAP重み8および長さ重み2、ならびにBLOSUM62スコアリングプログラムを利用したアミノ酸配列の同一性％または類似性％、を用いて、配列の同一性または類似性を決定するために使用する。等価なプログラムを使用してもよい。「等価なプログラム」とは、対象とする任意の2つの配列について、GAP Version 10により生成された対応アラインメントと比較した場合に同一のヌクレオチド残基の一致および同一の配列同一性パーセントを有するアラインメントを生成する、任意の配列比較プログラムを意味する。
【００３２】
本発明は、変異体核酸分子もまた包含する。前記殺線虫性タンパク質をコードするヌクレオチド配列の「変異体」としては、本明細書中に開示した殺線虫性タンパク質をコードするが、遺伝暗号の縮重のために保存的に異なるそれらの配列、ならびに上記のように十分に同一である配列が挙げられる。天然に存在するアレル変異体は、周知の分子生物学技術、例えば、以下に概説するようなポリメラーゼ連鎖反応(PCR)およびハイブリダイゼーション技術の利用により同定することができる。変異体ヌクレオチド配列は、例えば、部位特異的突然変異誘発を利用することにより作成されるが、後述するように本明細書中に開示した殺線虫性タンパク質を依然としてコードする、合成によって得られるヌクレオチド配列も含む。本発明により包含される変異体タンパク質は生物学的に活性である、すなわち、それらは天然タンパク質の所望の生物活性、すなわち、有害線虫に対する殺虫活性を保持し続ける。「活性を保持する」とは、変異体が、天然タンパク質の殺虫活性の少なくとも約30％、少なくとも約50％、少なくとも約70％、または少なくとも約80％を有することを意味する。有害線虫に対する殺虫活性を測定するための方法は当分野で周知であり、また本明細書中の他の箇所に記載されている。
【００３３】
当業者であればさらに、本発明のヌクレオチド配列の突然変異により変化を導入することにより、コード化殺線虫性タンパク質のアミノ酸配列に、該タンパク質の生物活性を変更することなく変化をもたらしうることが理解されよう。従って、変異体単離核酸分子は、1つ以上のヌクレオチドの置換、付加、または欠失を本明細書中に開示した対応ヌクレオチド配列に導入することにより作製することが可能であり、その結果、1つ以上のアミノ酸の置換、付加または欠失がそのコード化タンパク質に導入される。突然変異は、標準的な技術、例えば、部位特異的突然変異誘発およびPCR媒介突然変異誘発により導入することができる。かかる変異体ヌクレオチド配列もまた本発明により包含される。
【００３４】
例えば、保存的アミノ酸置換を、1つ以上の、予測される、非必須アミノ酸残基に実施してもよい。「非必須」アミノ酸残基は、その生物活性を変更することなく殺線虫性タンパク質の野生型配列から変更できる残基であり、一方、「必須」アミノ酸残基は生物活性に必要とされる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似した側鎖を有するアミノ酸残基と置き換えられているものである。類似した側鎖を有するアミノ酸のファミリーは当分野で定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、無電荷極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、β分岐側鎖(例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を持つアミノ酸が挙げられる。
【００３５】
δ-エンドトキシンは一般に、5つの保存された配列ドメインと、3つの保存された構造ドメインを有する(例えば、de Maagdら(2001) Trends Genetics 17：193-199を参照されたい)。第1の保存された構造ドメインは7つのαヘリックスからなり、膜挿入および孔形成に関与している。ドメインIIはグリークキーの形状に配置された3つのβシートからなり、またドメインIIIは「ゼリーロール」構造をとる2つの逆平行βシートからなる(de Maagdら、2001, 前掲)。ドメインIIおよびIIIは受容体の認識および結合に関与しており、従って、毒素特異性の決定因子と考えられている。
【００３６】
アミノ酸置換は、機能を保持する非保存領域内で実施してもよい。一般に、かかる置換は、保存アミノ酸残基、または保存モチーフ内に存在するアミノ酸残基(かかる残基はタンパク質活性に必須である)に対しては実施しない。保存され、かつタンパク質活性に必須でありうる残基の具体例としては、例えば、類似または関連毒素と本発明の配列とのアラインメントに含有される全タンパク質間で同一の残基(例えば、相同タンパク質のアラインメントにおいて同一である残基)が挙げられる。保存されているが、保存的アミノ酸置換が可能である場合があり、かつ依然として活性を保持しうる残基の具体例としては、例えば、類似または関連毒素と本発明の配列とのアラインメントに含有される全タンパク質間の保存的置換のみを有する残基(例えば、相同タンパク質のアラインメントに含有される全タンパク質間の保存的置換のみを有する残基)が挙げられる。しかし、当業者であれば、機能的変異体は、保存残基にわずかな保存的または非保存的変更を有しうることが理解されよう。
【００３７】
あるいは、変異体ヌクレオチド配列は、コード配列の全部または一部に沿って無作為に突然変異を導入することにより、例えば飽和突然変異誘発により、作製することが可能であり、得られた突然変異体を有害線虫に対する殺虫活性を付与する能力についてスクリーニングすることで、活性を保持する突然変異体を同定することができる。突然変異誘発後は、コード化タンパク質を組換えにより発現させることが可能であり、また該タンパク質の活性を標準的なアッセイ技術を利用して測定することができる。
【００３８】
PCR、ハイブリダイゼーションなどといった方法を利用して、対応する殺虫性配列を同定することが可能であり、かかる配列は、本発明の配列に対して実質的な同一性(例えば、参照配列の全体にわたり、少なくとも約70％、少なくとも約75％、80％、85％、90％、95％またはそれ以上の配列同一性)を有し、かつ有害線虫に対する殺虫活性を有するかまたは付与する。例えば、SambrookおよびRussell (2001) Molecular Cloning：A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)ならびにInnis,ら(1990) PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications (Academic Press, NY)を参照されたい。
【００３９】
ハイブリダイゼーション法では、殺虫性ヌクレオチド配列の全部または一部を使用してcDNAまたはゲノムライブラリーをスクリーニングすることができる。かかるcDNAおよびゲノムライブラリーを構築するための方法は一般に当分野で公知であり、またSambrookおよびRussell, 2001, 前掲に開示されている。いわゆるハイブリダイゼーションプローブは、ゲノムDNA断片、cDNA断片、RNA断片、または他のオリゴヌクレオチドであってもよく、また32Pなどの検出可能な基、または任意の他の検出可能なマーカー、例えば他の放射性同位体、蛍光化合物、酵素、もしくは酵素補因子で標識されていてもよい。ハイブリダイゼーション用プローブは、本明細書中に開示した公知の殺線虫性タンパク質をコードするヌクレオチド配列に基づく合成オリゴヌクレオチドを標識することにより作製できる。ヌクレオチド配列またはコード化アミノ酸配列中の保存されたヌクレオチドまたはアミノ酸残基を基に設計した縮重プライマーを、追加的に使用することもできる。プローブは、典型的には、本発明の殺線虫性タンパク質をコードするヌクレオチド配列またはその断片もしくは変異体の、少なくとも約12、少なくとも約25、少なくとも約50、75、100、125、150、175、または200個の連続ヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。ハイブリダイゼーション用プローブを調製するための方法は一般に当分野で公知であり、また参照により本明細書中に組み込まれるSambrookおよびRussell, 2001, 前掲に開示されている。
【００４０】
例えば、本明細書中に開示した全殺線虫性配列、またはその1つ以上の部分を、対応する殺線虫性タンパク質様配列およびメッセンジャーRNAに特異的にハイブリダイズすることができるプローブとして使用してもよい。様々な条件下で特異的ハイブリダイゼーションを達成するために、かかるプローブは、ユニークでありかつ好ましくは少なくとも約10ヌクレオチド長、または少なくとも約20ヌクレオチド長である配列を含む。かかるプローブを使用することで、選択した生物またはサンプルからPCRにより対応殺虫性配列を増幅してもよい。この技術を、所望の生物からさらなるコード配列を単離するために利用してもよく、または生物中のコード配列の存在を判定するための診断アッセイとして利用してもよい。ハイブリダイゼーション技術としては、平板培養したDNAライブラリーのハイブリダイゼーションスクリーニングが挙げられる(プラークまたはコロニーのいずれか；例えば、Sambrookら(1989) Molecular Cloning：A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)を参照されたい)。
【００４１】
従って、本発明は、ハイブリダイゼーション用プローブ、ならびに本発明のヌクレオチド配列の全部または一部(例えば、少なくとも約300ヌクレオチド、少なくとも約400、少なくとも約400、450、500、1000、1200、1500、2000、2500、3000、3500、または最大で、本明細書中に開示したヌクレオチド配列の全長)へのハイブリダイゼーションが可能なヌクレオチド配列を包含する。かかる配列のハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件下で実施してもよい。「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、プローブが、その標的配列に、他の配列よりも検出できるほど強い程度まで(例えば、バックグラウンドの少なくとも2倍)ハイブリダイズする条件を意味する。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、また異なる環境では違いがある。ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件のストリンジェンシーを制御することで、プローブに100％相補的である標的配列を同定することができる(相同的プロービング)。あるいは、より低い程度の類似性が検出されるように、配列における若干のミスマッチを許容するためにストリンジェンシー条件を調整することができる(非相同的プロービング)。一般に、プローブは、約1000ヌクレオチド長未満、好ましくは500ヌクレオチド長未満である。
【００４２】
典型的には、ストリンジェントな条件は、pH 7.0〜8.3での塩濃度が約1.5 M Naイオン未満、典型的には約0.01〜1.0 M Naイオン濃度(または他の塩)であり、かつ温度が短いプローブ(例えば、10〜50ヌクレオチド)の場合は少なくとも約30℃、および長いプローブ(例えば、50ヌクレオチド超)の場合は少なくとも約60℃である、条件である。またストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加により達成してもよい。例示的な低ストリンジェンシー条件としては、30〜35％ホルムアミド、1 M NaCl、1％SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)の緩衝溶液を用いる37℃でのハイブリダイゼーション、および1X〜2X SSC(20X SSC＝3.0 M NaCl／0.3 Mクエン酸三ナトリウム)中50〜55℃での洗浄が挙げられる。例示的な中ストリンジェンシー条件としては、40〜45％ホルムアミド、1.0 M NaCl、1％SDS中37℃でのハイブリダイゼーション、および0.5X〜1X SSC中55〜60℃での洗浄が挙げられる。例示的な高ストリンジェンシー条件としては、50％ホルムアミド、1 M NaCl、1％SDS中37℃でのハイブリダイゼーション、および0.1X SSC中60〜65℃での洗浄が挙げられる。場合によっては、洗浄緩衝液は、約0.1％〜約1％SDSを含んでいてもよい。ハイブリダイゼーションの期間は、一般に約24時間未満、通常は約4〜約12時間である。
【００４３】
特異性は、典型的にはハイブリダイゼーション後の洗浄の関数であり、重要な因子は最終洗浄溶液のイオン強度および温度である。DNA-DNAハイブリッドの場合、Tmは、MeinkothおよびWahl (1984) Anal. Biochem. 138：267-284の式：Tm＝81.5℃＋16.6 (log M)＋0.41(％GC)−0.61(％form)−500／L；式中のMは一価カチオンのモル濃度であり、％GCはDNA中のグアノシンおよびシトシンヌクレオチドの割合であり、％formはハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの割合であり、かつLは塩基対中のハイブリッドの長さである、から概算することができる。Tmは、相補的標的配列の50％が完全に一致したプローブにハイブリダイズする(規定のイオン強度およびpH下の)温度である。Tmは1％のミスマッチごとに約1℃低下し；従って、Tm、ハイブリダイゼーション、および／または洗浄条件を調整することで、所望の同一性の配列にハイブリダイズさせることができる。例えば、≧90％の同一性を有する配列が求められる場合、Tmを10℃低下させることができる。一般に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびpHで、特定の配列およびその相補体の熱的融点(Tm)より約5℃低くなるように選択される。しかし、極めてストリンジェントな条件は、熱的融点(Tm)より1、2、3、または4℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用することが可能であり；中程度にストリンジェントな条件は、熱的融点(Tm)より6、7、8、9、または10℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用することが可能であり；低ストリンジェンシー条件は、熱的融点(Tm)より11、12、13、14、15、または20℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用することが可能である。前記の式、ハイブリダイゼーションおよび洗浄組成、ならびに所望のTmを利用すると、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄溶液のストリンジェンシーの変動が本質的に説明されることは、当業者であれば理解されよう。所望の程度のミスマッチが45℃未満(水溶液)または32℃未満(ホルムアミド溶液)のTmをもたらす場合、より高い温度を利用できるように、SSC濃度を増加させることが好ましい。核酸のハイブ
リダイゼーションに関する詳細な指針は、Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 (Elsevier, New York)；およびAusubelら、eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York)に見出される。Sambrookら(1989) Molecular Cloning：A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)を参照されたい。
【００４４】
単離されたタンパク質ならびにその変異体および断片
殺線虫性タンパク質もまた本発明に包含される。「殺線虫性タンパク質」とは、配列番号1または2に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質を意味する。その断片、生物学的に活性な部分、および変異体もまた提供され、それらを使用することにより、本発明の方法を実践してもよい。「単離されたタンパク質」または「組換えタンパク質」は、その天然の環境にもはや存在しないタンパク質、例えばin vitroでの、または組換え細菌もしくは植物宿主細胞内のタンパク質に言及するために用いられる。幾つかの実施形態では、組換えタンパク質は配列番号1または2の変異体であり、該変異体は、配列番号1または2に関して少なくとも1つのアミノ酸の置換、欠失、または挿入を含む。
【００４５】
「断片」または「生物学的に活性な部分」は、配列番号1または2に記載のアミノ酸配列と十分に同一であるアミノ酸配列を含み、かつ有害線虫に対する殺虫活性を示すポリペプチド断片を含む。殺線虫性タンパク質の生物学的に活性な部分は、例えば、10、25、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、またはそれ以上のアミノ酸長であるポリペプチドでありうる。かかる生物学的に活性な部分は、組換え技術により調製し、さらに有害線虫に対する殺虫活性について評価することができる。有害線虫に対する殺虫活性を測定するための方法は当分野で周知であり(例えば、米国特許出願公開第US 20160066584号を参照されたい)、また本明細書中の他の箇所に記載されている。本明細書中で用いる場合、断片は、配列番号1または2の少なくとも8個の連続アミノ酸を含む。しかし、本発明は、他の断片、例えば、前記タンパク質中の、約10、20、30、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350またはそれ以上のアミノ酸長を超える任意の断片を包含する。
【００４６】
「変異体（バリアント）」は、配列番号1または2のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも約60％、65％、約70％、75％、約80％、85％、約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％または99％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質またはポリペプチドを意味する。また変異体は、ストリンジェントな条件下で、配列番号3〜6の核酸分子、またはその相補体にハイブリダイズする核酸分子によりコードされるポリペプチドも含む。変異体は、突然変異誘発が原因でアミノ酸配列が異なっているポリペプチドを含む。本発明により包含される変異体タンパク質は生物学的に活性であり、すなわち、それらは天然タンパク質の所望の生物活性を保有し続けており、すなわち、有害線虫に対する農薬活性（殺害虫活性）を保持している。幾つかの実施形態では、変異体は、天然タンパク質と比較して改善された活性を有する。有害線虫に対する殺虫活性を測定するための方法は当分野で周知であり(例えば、米国特許出願公開第US 20160066584号を参照されたい)、また本明細書中の他の箇所に記載されている。
【００４７】
細菌遺伝子は、オープンリーディングフレームの開始点に近接して複数のメチオニン開始コドンを保有していることが極めて多い。多くの場合、これらの開始コドンの1つ以上における翻訳開始は機能タンパク質の生成をもたらす。これらの開始コドンとして、ATGコドンを挙げることができる。しかし、バチルス属種(Bacillus sp.)などの細菌はコドンGTGも開始コドンとして認識し、またGTGコドンで翻訳を開始するタンパク質は第1アミノ酸位にメチオニンを含有する。稀に、細菌系での翻訳はTTGコドンから開始することがあるが、この事象ではTTGはメチオニンをコードする。さらに、これらのコドンのうちのどれが細菌中で天然に使用されるかが演繹的に決定されることはあまりない。従って、代替メチオニンコドンのうちの1つの使用が、同様に殺線虫性タンパク質の生成をもたらす場合があることは理解されよう。これらの殺線虫性タンパク質は、本発明に包含され、また本発明の方法に使用される場合がある。植物中で発現させる場合、適切な翻訳のために代替開始コドンをATGに変更する必要があることは理解されよう。
【００４８】
本発明の種々の実施形態では、殺線虫性タンパク質は、本明細書中に開示した全長ヌクレオチド配列から推定されるアミノ酸配列、および代替下流開始部位を使用したために全長配列より短いアミノ酸配列を含む。
【００４９】
本発明のポリペプチド、またはその変異体もしくは断片に対する抗体もまた包含される。抗体を産生させるための方法は当分野で周知である(例えば、HarlowおよびLane (1988) Antibodies：A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY；米国特許第4,196,265号を参照されたい)。
【００５０】
従って、本発明の一態様は、本発明のタンパク質またはペプチド分子およびそのホモログ、融合物または断片のうちの1つ以上に特異的に結合する抗体、一本鎖抗原結合分子、または他のタンパク質に関する。特に好適な実施形態では、該抗体は配列番号1もしくは2に記載のアミノ酸配列またはその断片を有するタンパク質に特異的に結合する。別の実施形態では、該抗体は、配列番号1もしくは2に記載のアミノ酸配列またはその断片から選択されるアミノ酸配列を含む融合タンパク質に特異的に結合する。種々の実施形態において、本発明のタンパク質または本発明のタンパク質を含む融合タンパク質に特異的に結合する抗体は、天然には存在しない抗体である。
【００５１】
本発明の抗体を使用することで、本発明のタンパク質もしくはペプチド分子を定量的もしくは定性的に検出するか、または該タンパク質の翻訳後修飾を検出してもよい。本明細書中で使用する場合、抗体またはペプチドが、本発明のタンパク質またはペプチド分子に「特異的に結合する」と記載されるのは、かかる結合が非関連分子の存在により競合的に阻害されない場合である。
【００５２】
本発明の抗体は、本発明のタンパク質またはペプチド分子の検出に有用なキットに含有されていてもよい。本発明は、サンプルを本発明の抗体と接触させること、および該サンプルが本発明のタンパク質またはペプチド分子を含有しているか否かを決定することを含む、本発明のタンパク質またはペプチド分子(特に、本発明の抗体に特異的に結合することができる、配列番号1または2に記載のアミノ酸配列(その変異体または断片を含む)によりコードされるタンパク質)を検出する方法をさらに含む。目的のタンパク質またはペプチドの検出に抗体を利用するための方法は、当分野で公知である。
【００５３】
改変または改良された変異体
殺線虫性タンパク質のDNA配列は様々な方法により改変しうること、およびこれらの改変は、本発明の殺線虫性タンパク質によりコードされるものとは異なるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNA配列をもたらしうることは認識されよう。このタンパク質は、様々な手法で、例えば、配列番号1または2の1つ以上のアミノ酸のアミノ酸置換、欠失、トランケーション、および挿入、例えば最大で約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約15、約20、約25、約30、約35、約40、約45、約50、約55、約60、約65、約70、約75、約80、約85、約90、約100、約105、約110、約115、約120、約125、約130、約135、約140、約145、約150、約155、またはそれ以上のアミノ酸置換、欠失または挿入の形で改変してもよい。かかる操作のための方法は、一般に当分野で公知である。例えば、殺線虫性タンパク質のアミノ酸配列変異体は、DNA中の突然変異により調製することができる。これは、突然変異誘発の幾つかの形態のうちの1つにより、および／または定向進化で、達成してもよい。幾つかの態様では、アミノ酸配列中にコードされる変化は、タンパク質の機能には実質的に影響を与えない。かかる変異体は、有害線虫に対する所望の農薬活性を保有する。しかし、殺線虫性タンパク質が有害線虫に対する殺虫活性を付与するその能力が、本発明の組成物へのかかる技術の使用により改善される場合があることは理解されよう。例えば、XL-1 Red(Stratagene, La Jolla, CA)などの、DNA複製中に高い割合の塩基の誤取込みを示す宿主細胞において殺線虫性タンパク質を発現させてもよい。かかる株での増殖後に、DNAを(例えば、プラスミドDNAを調製することにより、またはPCRにより増幅し、かつ得られたPCR断片をベクターにクローニングすることにより)単離し、殺線虫性タンパク質突然変異体を非突然変異誘発株で培養し、さらに有害線虫に対する農薬活性を有する突然変異遺伝子を、例えば有害線虫に対する農薬活性について試験するためのアッセイを実施することにより、同定することができる。かかるアッセイは、植物を1種以上の害虫と接触させること、および該植物の生存する能力および／または該害虫の死滅を引き起こす能力を判定することを含みうる。例えば、米国特許出願公開第US 20160066584号)を参照されたい。
【００５４】
あるいは、多くのタンパク質のタンパク質配列に、そのアミノまたはカルボキシ末端において、活性に実質的に影響を及ぼすことなく改変を加えてもよい。これは、近年の分子法、例えば、PCR増幅に利用するオリゴヌクレオチドにアミノ酸コード配列を包含させることによりタンパク質コード配列を改変または伸長するPCR増幅を含むPCRにより導入される、挿入、欠失、または改変を含みうる。あるいは、付加されるタンパク質配列は、全タンパク質コード配列、例えば、タンパク質融合物を作成するために当分野で一般的に使用されるものを含みうる。かかる融合タンパク質は、(1)目的のタンパク質の発現を増大させるため、(2)結合ドメイン、酵素活性、またはエピトープを導入することによりタンパク質精製、タンパク質検出、または当分野で公知の他の実験的用途のいずれかを容易にするため、(3)グラム陰性細菌のペリプラズム空間、または真核細胞の小胞体(後者はタンパク質のグリコシル化をもたらすことが多い)などの細胞内オルガネラにタンパク質の分泌または翻訳を標的化するため、に使用されることが多い。
【００５５】
本発明の変異体ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、DNAシャッフリングなどの突然変異誘発手順および組換え誘導手順で得られる配列も包含する。かかる手順を用いれば、1つ以上の異なる殺線虫性タンパク質コード領域を使用して、所望の特性を保有する新規の殺線虫性タンパク質を作出することができる。このようにして、組換えポリヌクレオチドのライブラリーを、実質的な配列同一性を有し、かつin vitroまたはin vivoで相同的に組換えることができる配列領域を含む関連配列ポリヌクレオチドの集団から作成する。例えば、この手法を利用して、目的のドメインをコードする配列モチーフを本発明の農薬遺伝子(殺害虫遺伝子、pesticidal gene)と他の公知の農薬遺伝子との間でシャッフルすることにより、目的とする改善された特性(例えば、向上した殺虫活性)を示すタンパク質をコードする新規遺伝子を取得してもよい。かかるDNAシャッフリングのための方針は当分野で公知である。例えば、Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91：10747-10751；Stemmer (1994) Nature 370：389-391；Crameriら(1997) Nature Biotech. 15：436-438；Mooreら(1997) J. Mol. Biol. 272：336-347；Zhangら(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94：4504-4509；Crameriら(1998) Nature 391：288-291；ならびに米国特許第5,605,793号および第5,837,458号を参照されたい。
【００５６】
ドメインのスワッピングまたはシャッフリングは、改変された殺線虫性タンパク質を作成するための別の機序である。ドメインは殺線虫性タンパク質間で交換してもよく、結果として、有害線虫に対する改善された農薬活性または標的スペクトルを有するハイブリッドまたはキメラ毒素が得られる。組換えタンパク質を作成するための方法およびそれらを有害線虫に対する農薬活性について試験するための方法は、当分野で周知である(例えば、Naimovら(2001) Appl. Environ. Microbiol. 67：5328-5330；de Maagdら(1996) Appl. Environ. Microbiol. 62：1537-1543；Geら(1991) J. Biol. Chem. 266：17954-17958；Schnepfら(1990) J. Biol. Chem. 265：20923-20930；Rangら 91999) Appl. Environ. Microbiol. 65：2918-2925)を参照されたい。
【００５７】
さらに別の実施形態では、変異体ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列を、エラープローンPCR、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発、アセンブリPCR、性的PCR突然変異誘発、in vivo突然変異誘発、カセット式変異誘発、再帰的アンサンブル突然変異誘発(recursive ensemble mutageneis)、指数的アンサンブル突然変異誘発(exponential ensemble mutageneis)、部位特異的突然変異誘発、遺伝子再構成、遺伝子部位飽和変異導入、置換変異誘発(permutational mutageneis)、合成的ライゲーション再構成(synthetic ligation reassembly)(SLR)、組換え、再帰的配列組換え(recursive sequence recombination)、ホスホロチオエート(phosphothioate)修飾DNA突然変異誘発、ウラシル含有鋳型突然変異誘発、ギャップ二重鎖変異導入(gapped duplex mutageneis)、点ミスマッチ修復変異導入(point mismatch repair mutageneis)、修復欠損宿主株変異誘発、化学的突然変異誘発、放射線誘発性突然変異導入(radiogenic mutageneis）、欠失突然変異誘発、制限-選択突然変異誘発、制限-精製突然変異誘発、人工遺伝子合成、アンサンブル突然変異誘発、キメラ核酸マルチマー生成などのうちの1つ以上を利用して取得することができる。
【００５８】
ベクター
本発明の農薬配列(殺害虫配列、pesticidal sequence)を、目的の宿主細胞、例えば植物細胞または微生物における発現のための発現カセット中に提供してもよい。「植物発現カセット」とは、植物細胞において、オープンリーディングフレームからタンパク質の発現を生じさせることができるDNA構築物を意味する。典型的には、これらはプロモーターおよびコード配列を含有する。多くの場合、かかる構築物は3’非翻訳領域も含有する。かかる構築物は、特定の細胞内構造体、例えば、葉緑体(もしくは他の色素体)、小胞体、またはゴルジ装置へのペプチドの翻訳時または翻訳後の輸送を促進するために「シグナル配列」または「リーダー配列」を含有していてもよい。
【００５９】
「シグナル配列」とは、細胞膜を介した翻訳時または翻訳後のペプチド輸送をもたらすことが公知であるかまたはそう考えられている配列を意味する。真核生物では、これは典型的にはゴルジ装置への分泌を伴い、一部はグリコシル化される。細菌の殺虫性毒素はプロ毒素として合成されることが多く、該プロ毒素は標的害虫の消化管内でタンパク質分解的に活性化される(Chang (1987) Methods Enzymol. 153：507-516)。本発明の幾つかの実施形態では、シグナル配列は天然配列中に位置するものであるか、または本発明の配列に由来するものであってもよい。「リーダー配列」とは、翻訳された場合に、細胞内オルガネラへのペプチド鎖の翻訳時輸送を引き起こすのに十分なアミノ酸配列を生じる、任意の配列を意味する。従って、これは、小胞体への通過、液胞、葉緑体を含む色素体、ミトコンドリアなどへの通過による輸送および／またはグリコシル化を標的とするリーダー配列を含む。従って、異種リーダーまたはシグナル配列に作動可能に連結された本発明のアミノ酸配列を含むポリペプチドが本明細書中にさらに提供される。
【００６０】
「植物形質転換ベクター」とは、植物細胞の効率的な形質転換に必要なDNA分子を意味する。かかる分子は、1つ以上の植物発現カセットから構成されていてもよく、また2つ以上の「ベクター」DNA分子に組織化されていてもよい。例えば、バイナリーベクターは、植物細胞の形質転換のための全ての必須シス-およびトランス-作用性機能をコードするために2つの非連続DNAベクターを利用する植物形質転換ベクターである(HellensおよびMullineaux (2000) Trends in Plant Science 5：446-451)。「ベクター」は、異なる宿主細胞間の運搬のために設計された核酸構築物を指す。「発現ベクター」は、外来細胞において異種DNA配列または断片を取り込み、組み込み、さらに発現させる能力を有するベクターを指す。前記カセットは、本発明の配列に作動可能に連結された5’および／または3’調節配列を含む。「作動可能に連結」とは、プロモーターと第2配列との間の機能的連結を意味しており、該プロモーターの配列は、該第2配列に対応するDNA配列の転写を開始および媒介する。一般に、作動可能に連結とは、連結される核酸配列が連続的であること、ならびに、2つのタンパク質コード配列を結合する必要がある場合には、連続的でありかつ同一リーディングフレーム内にあることを意味する。幾つかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、宿主細胞、例えば微生物宿主細胞または植物宿主細胞において該ヌクレオチド配列の発現を指令することができる異種プロモーターに作動可能に連結されている。このカセットは、生物に共形質転換すべき少なくとも1つの追加の遺伝子をさらに含有していてもよい。あるいは、追加の遺伝子(群)を、複数の発現カセット上に提供することもできる。
【００６１】
種々の実施形態では、本発明のヌクレオチド配列は、異種プロモーター、例えば、植物プロモーターに作動可能に連結されている。「プロモーター」は、下流のコード配列の転写を指令するように機能する核酸配列を指す。プロモーターは、他の転写および翻訳調節核酸配列(「制御配列」とも称される)と共に、目的のDNA配列の発現に必要である。
【００６２】
かかる発現カセットは、調節領域の転写調節下に前記農薬配列を挿入するための複数の制限部位を備えている。
【００６３】
前記発現カセットは、転写の5’-3’方向に、転写および翻訳開始領域(すなわち、プロモーター)、本発明のDNA配列、ならびに植物において機能する翻訳および転写終結領域(すなわち、終結領域)を含む。プロモーターは、植物宿主にとって、および／または本発明のDNA配列にとって、天然もしくは類似のものであっても、または外来もしくは異種のものであってもよい。さらに、プロモーターは天然配列であっても、あるいは合成配列であってもよい。プロモーターが植物宿主にとって「天然」または「同種」である場合、該プロモーターは、該プロモーターを導入する天然の植物中に見出されることを意味する。プロモーターが本発明のDNA配列にとって「外来」または「異種」である場合、該プロモーターは、作動可能に連結された本発明のDNA配列に対して天然のものではないか、または天然に存在するプロモーターではないことを意味する。プロモーターは誘導性であっても構成的であってもよい。プロモーターは、天然に存在していてもよく、種々の天然に存在するプロモーターの部分から構成されていてもよく、または部分的もしくは全体的に合成のものであってもよい。プロモーターの設計のための指針は、プロモーター構造、例えばHarleyおよびReynolds (1987) Nucleic Acids Res. 15：2343-2361のプロモーター構造の研究により提供されている。同様に、転写開始に関連するプロモーターの位置は最適化されていてもよい。例えば、Robertsら(1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76：760-764を参照されたい。植物に使用するための多くの適切なプロモーターが当分野で周知である。
【００６４】
例えば、植物に使用するための適切な構成的プロモーターとしては、以下：植物ウイルス由来のプロモーター、例えば落花生退緑条斑カリモウイルス(PClSV)プロモーター(米国特許第5,850,019号)；カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)由来の35Sプロモーター(Odellら(1985) Nature 313：810-812)；Kayら(1987) Science 236：1299-1302に記載の35Sプロモーター；クロレラウイルス・メチルトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーター(米国特許第5,563,328号)およびゴマノハグサモザイクウイルス(FMV)由来の全長転写プロモーター(米国特許第5,378,619号)；イネのアクチンなどの遺伝子に由来するプロモーター(McElroyら(1990) Plant Cell 2：163-171および米国特許第5,641,876号)；ユビキチン(Christensenら(1989) Plant Mol. Biol. 12：619-632およびChristensenら(1992) Plant Mol. Biol. 18：675-689)ならびにGrefenら(2010) Plant J, 64：355-365；pEMU (Lastら(1991) Theor. Appl. Genet. 81：581-588)；MAS (Veltenら(1984) EMBO J. 3：2723-2730および米国特許第5,510,474号)；トウモロコシH3ヒストン(Lepetitら(1992) Mol. Gen. Genet. 231：276-285およびAtanassovaら(1992) Plant J. 2(3)：291-300)；セイヨウアブラナ(Brassica napus)ALS3(PCT出願WO97／41228)；植物リブロース-ビスカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ(RuBisCO)小サブユニット遺伝子；サーコウイルス(AU 689 311)またはキャッサバ葉脈モザイクウイルス(CsVMV、米国第7,053,205号)；ダイズ由来のプロモーター(WO／2014／150449に記載のPbdc6もしくはPbdc7、または米国特許第7393948号および米国特許第8395021号に記載のユビキチン3プロモーター)；ならびに種々のAgrobacterium遺伝子のプロモーター(米国特許第4,771,002号；第5,102,796号；第5,182,200号；および第5,428,147号を参照されたい)が挙げられる。
【００６５】
植物に使用するための適切な誘導性プロモーターとしては、以下：銅に応答するACE1系に由来するプロモーター(Mettら(1993) PNAS 90：4567-4571)；ベンゼンスルホンアミド除草剤薬害軽減剤に応答するトウモロコシIn2遺伝子のプロモーター(Hersheyら(1991) Mol. Gen. Genetics 227：229-237およびGatzら(1994) Mol. Gen. Genetics 243：32-38)；ならびにTn10由来のTetリプレッサーのプロモーター(Gatzら(1991) Mol. Gen. Genet. 227：229-237)が挙げられる。植物に使用するための別の誘導性プロモーターは、植物が通常は応答しない誘導物質に応答するものである。このタイプの例示的な誘導性プロモーターは、ステロイドホルモン遺伝子由来の誘導性プロモーターであり、その転写活性は、グルココルチコステロイドホルモン(Schenaら(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88：10421)またはエストラジオールにより活性化されるエストロゲン受容体ベースの誘導性植物発現系に使用するためのキメラ転写アクチベータ-XVEの近年の応用(Zuoら(2000) Plant J., 24：265-273)により誘導される。植物に使用するための他の誘導性プロモーターは、その全内容が参照により本明細書中に組み込まれる、欧州特許第332104号、PCT WO 93／21334およびPCT WO 97／06269に記載されている。他のプロモーターの部分から構成されるプロモーター、および部分的または全体的に合成されたプロモーターを使用することもできる。例えば、植物に使用するためのかかるプロモーターを記載しているNiら(1995) Plant J. 7：661-676およびPCT WO 95／14098を参照されたい。
【００６６】
本発明の一実施形態では、植物の特定の領域または組織に特異的なプロモーター配列、例えば、種子に特異的なプロモーター(Datla, R.ら、1997, Biotechnology Ann. Rev. 3, 269-296)、特にナピンプロモーター(欧州特許第255 378 A1号)、ファゼオリンプロモーター、グルテニンプロモーター、ヘリアンチニンプロモーター(WO92／17580)、アルブミンプロモーター(WO98／45460)、オレオシンプロモーター(WO98／45461)、SAT1プロモーターまたはSAT3プロモーター(PCT／US98／06978)を使用することにより、本発明の殺線虫性タンパク質を発現させることができる。
【００６７】
フェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)、HMG-CoAレダクターゼ(HMG)、キチナーゼ、グルカナーゼ、プロテイナーゼ阻害剤(PI)、PR1ファミリー遺伝子、ノパリン合成酵素(nos)およびvspBプロモーター(米国第5 670 349号、表3)、HMG2プロモーター(米国第5 670 349号)、リンゴβガラクトシダーゼ(ABG1)プロモーターならびにリンゴアミノシクロプロパンカルボン酸合成酵素(ACC合成酵素)プロモーター(WO98／45445)から有利に選択される誘導性プロモーターを使用してもよい。複数のプロモーターを、例えば連続して、本発明の構築物に使用することができる。
【００６８】
プロモーターは、1つ以上のエンハンサーエレメントを含んでいてもよく、または含むように改変されていてもよい。幾つかの実施形態では、プロモーターは、複数のエンハンサーエレメントを含んでいてもよい。エンハンサーエレメントを含有するプロモーターは、それらを含有しないプロモーターと比較して、より高いレベルの転写をもたらす。植物に使用するための適切なエンハンサーエレメントとしては、PClSVエンハンサーエレメント(米国特許第5,850,019号)、CaMV 35Sエンハンサーエレメント(米国特許第5,106,739号および第5,164,316号)ならびにFMVエンハンサーエレメント(Maitiら(1997) Transgenic Res. 6：143-156)；出願WO87／07644に記載のタバコモザイクウイルス(TMV)の翻訳アクチベーター、またはCarringtonおよびFreed 1990, J. Virol. 64：1590-1597により記載されたタバコエッチウイルス(TEV)の翻訳アクチベーター、例えば、またはトウモロコシのadh1イントロンもしくはイネアクチンのイントロン1などのイントロンが挙げられる。PCT WO96／23898、WO2012／021794、WO2012／021797、WO2011／084370、およびWO2011／028914も参照されたい。
【００６９】
多くの場合、かかる構築物は5’および3’非翻訳領域を含有しうる。かかる構築物は、特定の細胞内構造体、例えば、葉緑体(もしくは他の色素体)、小胞体、またはゴルジ装置への目的のペプチドの翻訳時または翻訳後の輸送、または分泌を促進するために、「シグナル配列」または「リーダー配列」を含有していてもよい。例えば、該構築物を、小胞体へのペプチドの移行を促進するためのシグナルペプチドを含有するように操作することができる。「シグナル配列」とは、細胞膜を介した翻訳時または翻訳後のペプチド輸送をもたらすことが公知であるかまたはそう考えられている配列を意味する。真核生物では、これは典型的にはゴルジ装置への分泌を伴い、一部はグリコシル化される。「リーダー配列」とは、翻訳された場合に、細胞内オルガネラへのペプチド鎖の翻訳時輸送を引き起こすのに十分なアミノ酸配列を生じる、任意の配列を意味する。従って、これは、小胞体への通過、液胞、葉緑体を含む色素体、ミトコンドリアなどへの通過による輸送および／またはグリコシル化を標的とするリーダー配列を含む。イントロンのmRNAプロセシングが発現の際に必要となるように、植物発現カセットを操作してイントロンを含有させることが好ましい場合もある。
【００７０】
「3’非翻訳領域」とは、コード配列の下流に位置するポリヌクレオチドを意味する。ポリアデニル化シグナル配列、およびmRNA前駆体の3’末端へのポリアデニル酸部分の付加に影響を及ぼすことができる調節シグナルをコードする他の配列が3’非翻訳領域である。「5’非翻訳領域」とは、コード配列の上流に位置するポリヌクレオチドを意味する。
【００７１】
他の上流または下流非翻訳エレメントとしては、エンハンサーが挙げられる。エンハンサーは、プロモーター領域の発現を増大させるように作用するポリヌクレオチドである。エンハンサーは当分野で周知であり、例として、限定するものではないが、SV40エンハンサー領域および35Sエンハンサーエレメントが挙げられる。
【００７２】
終結領域は、転写開始領域に関して天然のものであってもよいし、作動可能に連結された目的のDNA配列に関して天然のものであってもよいし、植物宿主に関して天然のものであってもよいし、または別の起源に由来するもの(すなわち、プロモーター、目的のDNA配列、植物宿主、もしくはその任意の組み合わせにとって外来もしくは異種)であってもよい。オクトピン合成酵素およびノパリン合成酵素終結領域などの簡便な終結領域が、A.ツメファシエンス(A. tumefaciens)のTiプラスミドから入手可能である。Guerineauら(1991) Mol. Gen. Genet. 262：141-144；Proudfoot (1991) Cell 64：671-674；Sanfaconら(1991) Genes Dev. 5：141-149；Mogenら(1990) Plant Cell 2：1261-1272；Munroeら(1990) Gene 91：151-158；Ballasら(1989) Nucleic Acids Res. 17：7891-7903；およびJoshiら(1987) Nucleic Acid Res. 15：9627-9639も参照されたい。
【００７３】
適当である場合、遺伝子(群)を、形質転換された宿主細胞における増大した発現のために最適化してもよい(合成DNA配列)。すなわち、遺伝子は、改善された発現のために宿主細胞に好適なコドンを使用して合成することが可能であり、または宿主に好適なコドン使用頻度でコドンを使用して合成してもよい。細胞における合成DNA配列のオープンリーディングフレームの発現は、本発明のポリペプチドの産生をもたらす。合成DNA配列は、不必要な制限エンドヌクレアーゼ部位を簡単に除去するため、DNAクローニング方法を促進するため、あらゆる潜在的なコドンバイアスを変更もしくは除去するため、GC含量を変更もしくは改善するため、代替リーディングフレームを除去もしくは変更するため、および／または天然のDNA配列中に存在しうるイントロン／エキソンスプライス認識部位、ポリアデニル化部位、Shine-Delgarno配列、不必要なプロモーターエレメントなどを変更もしくは除去するために有用でありうる。一般に、遺伝子のGC含量は増加する。宿主に好適なコドン使用頻度の考察については、例えば、CampbellおよびGowri (1990) Plant Physiol. 92：1-11を参照されたい。植物に好適な遺伝子を合成するための方法が当分野で利用可能である。例えば、参照により本明細書中に組み込まれる、米国特許第5,380,831号、および第5,436,391号、米国特許公報第20090137409号、およびMurrayら(1989) Nucleic Acids Res. 17：477-498を参照されたい。
【００７４】
合成DNA配列は、DNA配列に他の改良点、例えば、イントロン配列の導入、オルガネラ標的化配列(例えば、葉緑体移行ペプチド、アポプラスト／液胞標的化ペプチド、または小胞体内への得られたペプチドの残留をもたらすペプチド配列)へのタンパク質融合物として発現されるDNA配列の作出、を取り入れるために利用できる可能性もある。従って、一実施形態では、殺線虫性タンパク質を発現のために葉緑体に標的化する。この方法では、殺線虫性タンパク質が葉緑体に直接挿入されない場合、発現カセットは、葉緑体に該殺線虫性タンパク質を誘導するためのトランジットペプチドをコードする核酸をさらに含有する。かかるトランジットペプチドは当分野で公知である。例えば、Von Heijneら(1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9：104-126；Clarkら(1989) J. Biol. Chem. 264：17544-17550；Della-Cioppaら(1987) Plant Physiol. 84：965-968；Romerら(1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196：1414-1421；およびShahら(1986) Science 233：478-481を参照されたい。
【００７５】
葉緑体に標的化される農薬遺伝子を、葉緑体における発現のために最適化することにより、植物の核とこのオルガネラの間のコドン使用頻度の差を説明してもよい。この方法では、目的の核酸を、葉緑体に好適なコドンを使用して合成してもよい。例えば、参照により本明細書中に組み込まれる、米国特許第5,380,831号を参照されたい。
【００７６】
植物の形質転換
本発明の方法は、植物にヌクレオチド構築物を導入することを含む。「導入する」とは、植物にヌクレオチド構築物を、該構築物が該植物の細胞の内部に侵入するような形で提供することを意味する。本発明の方法は、植物にヌクレオチド構築物を導入するための特定の方法を利用することを必要とせず、ヌクレオチド構築物が植物の少なくとも1つの細胞の内部に侵入することだけを必要とする。植物にヌクレオチド構築物を導入するための方法は、当分野で公知であり、それらの方法としては、限定するものではないが、安定な形質転換法、一過性形質転換法、およびウイルス媒介法が挙げられる。
【００７７】
「植物」とは、全植物、植物器官(例えば、葉、茎、根など)、種子、植物細胞、むかご（珠芽）、胚およびその子孫を意味する。植物細胞は、分化細胞または未分化細胞でありうる(例えば、カルス、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉細胞、根細胞、師部細胞、花粉)。
【００７８】
「トランスジェニック植物」または「形質転換植物」または「安定に形質転換された」植物または細胞または組織は、外来性の核酸配列またはDNA断片を植物細胞中に取り込んだ、または組み込んだ植物を指す。これらの核酸配列としては、外来性の、すなわち非形質転換植物細胞には存在しない核酸配列、ならびに内在性でありうる、すなわち非形質転換植物細胞に存在しうる核酸配列が挙げられる。「異種」は、一般に、それらが存在する細胞または天然ゲノムの一部にとって内在的なものではなく、かつ感染、トランスフェクション、微量注入、電気穿孔、マイクロプロジェクションなどにより細胞に添加された核酸配列を指す。
【００７９】
本発明のトランスジェニック植物は、本明細書中に開示した新規毒素配列のうちの1つ以上を発現する。幾つかの実施形態では、本発明のタンパク質またはヌクレオチド配列は、植物において、かかる植物に有用な農学的特性を付与するタンパク質またはRNAをコードする他の遺伝子と組み合わせると有利である。形質転換植物に有用な農学的特性を付与するタンパク質またはRNAをコードする遺伝子の中では、1種以上の除草剤に対する耐性を付与するタンパク質、およびある特定の昆虫に対する耐性を付与する他のタンパク質、ある特定の病害に対する耐性を付与するタンパク質をコードするDNA配列、線虫または昆虫の防除をもたらすRNAをコードするDNAなどを挙げることができる。かかる遺伝子は、公開PCT特許出願WO91／02071およびWO95／06128ならびに米国特許第7,923,602号および米国特許出願公開第20100166723号に詳細に記載されており、これらの文献は各々、その全内容が参照により本明細書中に組み込まれるものとする。種々の実施形態では、トランスジェニック植物は、昆虫抵抗性のための1つ以上の追加の遺伝子(例えば、Cry1、例えば、Cry1A、Cry1B、Cry1C、Cry1D、Cry1E、およびCry1Fファミリーのメンバー；Cry2、例えばCry2Aファミリーのメンバー；Cry9、例えばCry9A、Cry9B、Cry9C、Cry9D、Cry9E、およびCry9Fファミリーのメンバー；など)をさらに含む。トランスジェニック植物は目的の農学的形質を付与する任意の遺伝子を含みうることが、当業者には理解されよう。
【００８０】
形質転換植物細胞および形質転換植物にある特定の除草剤に対する耐性を付与するタンパク質をコードするDNA配列の中では、グルホシネート除草剤に対する耐性を付与するWO2009／152359に記載のbarもしくはPAT遺伝子またはストレプトミセス・セリカラー(Streptomyces coelicolor)遺伝子、グリホサートおよびその塩などの、標的としてEPSPSを有する除草剤に対する耐性を付与する適切なEPSPSをコードする遺伝子(米国第4,535,060号、米国第4,769,061号、米国第5,094,945号、米国第4,940,835号、米国第5,188,642号、米国第4,971,908号、米国第5,145,783号、米国第5,310,667号、米国第5,312,910号、米国第5,627,061号、米国第5,633,435号)、グリホサート-n-アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子(例えば、米国第8,222,489号、米国第8,088,972号、米国第8,044,261号、米国第8,021,857号、米国第8,008,547号、米国第7,999,152号、米国第7,998,703号、米国第7,863,503号、米国第7,714,188号、米国第7,709,702号、米国第7,666,644号、米国第7,666,643号、米国第7,531,339号、米国第7,527,955号、および米国第7,405,074号)、グリホサート酸化還元酵素をコードする遺伝子(例えば、米国第5,463,175号)、またはHPPD阻害剤耐性タンパク質をコードする遺伝子(例えば、WO 2004／055191、WO 199638567、米国第6791014号、WO2011／068567、WO 2011／076345、WO 2011／085221、WO 2011／094205、WO 2011／068567、WO 2011／094199、WO 2011／094205、WO 2011／145015、WO 2012／056401、およびWO2014／043435に記載のHPPD阻害剤耐性遺伝子)を挙げることができる。
【００８１】
標的としてEPSPSを有する除草剤に対する耐性を付与する適切なEPSPSをコードするDNA配列の中でも、より詳しくは、植物EPSPS、特にトウモロコシEPSPS、詳しくは2つの突然変異(具体的にはアミノ酸位置102における突然変異およびアミノ酸位置106における突然変異)を含み、かつ特許出願米国第6566587号に記載されており、以後は二重突然変異体トウモロコシEPSPSもしくは2mEPSPSと称するトウモロコシEPSPSをコードする遺伝子(WO2004／074443)、またはAgrobacteriumから単離されたEPSPSをコードしかつ米国特許第5,633,435号の配列番号2および配列番号3により記載されており、CP4とも称される遺伝子が挙げられる。
【００８２】
標的としてEPSPSを有する除草剤に対する耐性を付与する適切なEPSPSをコードするDNA配列の中でも、より詳しくは、アルスロバクター・グロビフォルミス(Arthrobacter globiformis)由来のEPSPS GRG23をコードするが、さらに突然変異体GRG23 ACE1、GRG23 ACE2、またはGRG23 ACE3、詳しくはWO2008／100353に記載のGRG23の突然変異体または変異体、例えばWO2008／100353中の配列番号29のGRG23(ace3)R173Kもコードする遺伝子が挙げられる。
【００８３】
EPSPSをコードするDNA配列、およびより詳しくは、上記遺伝子をコードするDNA配列の場合、これらの酵素をコードする配列の前に、トランジットペプチド、特に米国特許第5,510,471号または第5,633,448号に記載の「最適化されたトランジットペプチド」をコードする配列が存在していると有利である。
【００８４】
本発明の核酸配列と組み合わせることができる例示的な除草剤耐性形質としてはさらに、少なくとも1つのALS(アセト乳酸合成酵素)阻害剤(WO2007／024782)；突然変異アラビドプシス属(Arabidopsis)のALS／AHAS遺伝子(米国特許第6,855,533号)；代謝により2,4-D(2,4-ジクロロフェノキシ酢酸)に対する耐性を付与する2,4-D-モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子(米国特許第6,153,401号)；ならびに、代謝によりジカンバ(3,6-ジクロロ-2-メトキシ安息香酸)に対する耐性を付与するジカンバモノオキシゲナーゼをコードする遺伝子(米国第2008／0119361号および米国第2008／0120739号)が挙げられる。
【００８５】
種々の実施形態において、本発明の核酸は、1つ以上の除草剤耐性遺伝子、例えば、1つ以上のHPPD阻害型除草剤耐性遺伝子、ならびに／またはグリホサートおよび／もしくはグルホシネートに耐性を示す1つ以上の遺伝子と共に集積されている(stacked with)。
【００８６】
耐虫性の特性に関するタンパク質をコードするDNA配列の中では、より詳しくは、文献に広く記載されており、かつ当業者に周知であるBtタンパク質が挙げられる。同様に、フォトラブダス属(Photorhabdus)などの細菌から抽出したタンパク質も挙げられる(WO97／17432およびWO98／08932)。
【００８７】
耐虫性の新規の特性を付与する目的のタンパク質をコードするかかるDNA配列の中でも、より詳しくは、文献に広く記載されており、かつ当業者に周知であるBt CryまたはVIPタンパク質が挙げられる。これらのものとしては、Cry1Fタンパク質またはCry1Fタンパク質由来のハイブリッド(例えば、米国第6,326,169号；米国第6,281,016号；米国第6,218,188号に記載のハイブリッドCry1A-Cry1Fタンパク質、もしくはその毒性断片)、Cry1A型タンパク質またはその毒性断片、好ましくはCry1Acタンパク質またはCry1Acタンパク質由来のハイブリッド(例えば、米国第5,880,275号に記載のハイブリッドCry1Ab-Cry1Acタンパク質)あるいは欧州特許第451878号に記載のCry1AbもしくはBt2タンパク質またはその殺虫性断片、WO2002／057664に記載のCry2Ae、Cry2AfもしくはCry2Agタンパク質またはその毒性断片、WO 2007／140256に記載のCry1A.105タンパク質(配列番号7)またはその毒性断片、NCBIアクセッション番号ABG20428のVIP3Aa19タンパク質、NCBIアクセッション番号ABG20429のVIP3Aa20タンパク質(WO 2007／142840中の配列番号2)、COT202またはCOT203ワタ事象で産生されるVIP3Aタンパク質(それぞれ、WO2005／054479およびWO2005／054480)、WO2001／47952に記載のCryタンパク質、Estruchら(1996), Proc Natl Acad Sci U S A. 28;93(11)：5389-94および米国第6,291,156号に記載のVIP3Aaタンパク質またはその毒性断片、ゼノラブダス属(Xenorhabdus)種の菌株由来の殺虫性タンパク質(WO98／50427に記載)、セラチア属(Serratia)種の菌株由来(特にS.エントモフィラ(S. entomophila)由来)の殺虫性タンパク質またはフォトラブダス属(Photorhabdus)種の菌株由来の殺虫性タンパク質、例えば、WO98／08932に記載のPhotorhabdus由来のTcタンパク質(例えば、Waterfieldら、2001, Appl Environ Microbiol. 67(11)：5017-24；Ffrench-ConstantおよびBowen, 2000, Cell Mol Life Sci.；57(5)：828-33)が挙げられる。同様に、上記配列、詳しくはその毒性断片の配列のうちのいずれかと一部(1〜10個、好ましくは1〜5個)のアミノ酸が異なるか、あるいは色素体トランジットペプチドなどのトランジットペプチド、または別のタンパク質もしくはペプチドに融合されたこれらのタンパク質のいずれか1つの任意の変異体または突然変異体も本明細書中に含まれる。
【００８８】
種々の実施形態では、本発明の核酸を、植物において、望ましい形質、例えば、除草剤耐性、昆虫耐性、乾燥耐性、線虫防除、水利用効率、窒素利用効率、改善された栄養価、病害抵抗性、改善された光合成、改善された繊維品質、ストレス耐性、改善された繁殖などを付与する1つ以上の遺伝子と組み合わせることができる。
【００８９】
同種の植物において(例えば、交雑により、または本発明のキメラ遺伝子を用いて、別のトランスジェニック事象を含有する植物を再形質転換することにより)本発明の遺伝子と組み合わせうる特に有用なトランスジェニック事象としては、事象BPS-CV127-9(ダイズ、除草剤耐性、NCIMB番号41603として寄託、WO2010／080829に記載)；事象DAS21606-3／1606(ダイズ、除草剤耐性、PTA-11028として寄託、WO2012／033794に記載)、事象DAS-44406-6／pDAB8264.44.06.1(ダイズ、除草剤耐性、PTA-11336として寄託、WO2012／075426に記載)、事象DAS-14536-7／pDAB8291.45.36.2(ダイズ、除草剤耐性、PTA-11335として寄託、WO2012／075429に記載)、事象DAS68416(ダイズ、除草剤耐性、ATCC PTA-10442として寄託、WO2011／066384またはWO2011／066360に記載)；事象DP-305423-1(ダイズ、品質形質、寄託せず、US-A 2008-312082またはWO2008／054747に記載)；事象DP-356043-5(ダイズ、除草剤耐性、ATCC PTA-8287として寄託、US-A 2010-0184079またはWO2008／002872に記載)；事象FG72(ダイズ、除草剤耐性、PTA-11041として寄託、WO2011／063413に記載)、事象LL27(ダイズ、除草剤耐性、NCIMB41658として寄託、WO2006／108674またはUS-A 2008-320616に記載)；事象LL55(ダイズ、除草剤耐性、NCIMB 41660として寄託、WO 2006／108675またはUS-A 2008-196127に記載)；事象MON87701(ダイズ、昆虫防除、ATCC PTA-8194として寄託、US-A 2009-130071またはWO2009／064652に記載)；事象MON87705(ダイズ、品質形質−除草剤耐性、ATCC PTA-9241として寄託、US-A 2010-0080887またはWO2010／037016に記載)；事象MON87708(ダイズ、除草剤耐性、ATCC PTA-9670として寄託、WO2011／034704に記載)；事象MON87712(ダイズ、収量、PTA-10296として寄託、WO2012／051199に記載)、事象MON87754(ダイズ、品質形質、ATCC PTA-9385として寄託、WO2010／024976に記載)；事象MON87769(ダイズ、品質形質、ATCC PTA-8911として寄託、US-A 2011-0067141またはWO2009／102873に記載)；事象MON89788(ダイズ、除草剤耐性、ATCC PTA-6708として寄託、US-A 2006-282915またはWO2006／130436に記載)；事象SYHT0H2／SYN-000H2-5(ダイズ、除草剤耐性、PTA-11226として寄託、WO2012／082548に記載)、事象EE-GM1／LL27または事象EE-GM2／LL55(WO2011／063413A2)が集積している場合もある事象EE-GM3／FG72(ダイズ、除草剤耐性、ATCC受託番号PTA-11041)；事象DAS-68416-4(ダイズ、除草剤耐性、ATCC受託番号PTA-10442、WO 2011／066360A1)；事象DAS-68416-4(ダイズ、除草剤耐性、ATCC受託番号PTA-10442、WO 2011／066384A1)；事象DAS-21606-3(ダイズ、除草剤耐性、ATCC受託番号PTA-11028、WO 2012／033794A2)；事象MON-87712-4(ダイズ、品質形質、ATCC受託番号PTA-10296、WO 2012／051199A2)；事象DAS-44406-6(ダイズ、除草剤耐性が集積、ATCC受託番号PTA-11336、WO 2012／075426A1)；事象DAS-14536-7(ダイズ、除草剤耐性が集積、ATCC受託番号PTA-11335、WO 2012／075429A1)；事象SYN-000H2-5(ダイズ、除草剤耐性、ATCC受託番号PTA-11226、WO 2012／082548A2)；事象8264.44.06.1(ダイズ、除草剤耐性が集積、受託番号PTA-11336、WO 2012075426A2)；事象8291.45.36.2(ダイズ、除草剤耐性が集積、受託番号PTA-11335、WO 2012075429A2)；事象SYHT0H2(ダイズ、ATCC受託番号PTA-11226、WO 2012／082548A2)；事象pDAB8264.42.32.1(ダイズ、除草剤耐性が集積、ATCC受託番号PTA-11993、WO 2013／010094A1)が挙げられる。
【００９０】
さらに、例えば、配列番号1または2をコードするヌクレオチド配列を含むダイズ植物または種子を同じダイズ植物／種子に存在する別のSCN抵抗性遺伝子座／遺伝子と組み合わせて、配列番号1または2コードヌクレオチド配列および他のSCN抵抗性遺伝子座／遺伝子を含む種子を蒔くことにより、別のSCN抵抗性遺伝子座／遺伝子と組み合わせた配列番号1または2をコードするヌクレオチド配列を含むダイズ植物または種子を生産するための方法が、本明細書中に提供される。一実施形態では、本発明の植物、細胞または種子は、本発明のダイズ植物、細胞または種子に異なるSCN抵抗性起源の組み合わせを取り入れるために、ダイズに存在する1つ以上の他のSCN抵抗性遺伝子座／遺伝子を含有する。幾つかのダイズSCN抵抗性遺伝子座または遺伝子は公知であり、またそれらのうちの1つ以上、例えば、抵抗性起源PI 88788、PI 548402(Peking)、PI 437654(HartwigもしくはCystX(登録商標))由来のSCN抵抗性遺伝子／遺伝子座のうちのいずれか1つ、またはその任意の組み合わせ、あるいは天然のSCN抵抗性遺伝子座／遺伝子rhg1、rhg1-b、rhg2、rhg3、Rhg4、Rhg5、qSCN11、cqSCN-003、cqSCN-005、cqSCN-006、cqSCN-007のうちの1つ以上、あるいはダイズ染色体1、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、もしくは20のうちのいずれか1つにおいて同定されたSCN抵抗性遺伝子座のうちのいずれかまたはその任意の組み合わせ(Kimら 2016, Theor. Appl. Genet. 129(12)：2295-2311；KimおよびDiers 2013, Crop Science 53：775-785；Kaziら 2010, Theor. Appl. Gen. 120(3)：633-644；Gloverら 2004, Crop Science 44(3)：936-941；www.soybase.org；Concibidoら 2004, Crop Science 44：1121-1131；Webbら 1995, Theor. Appl. Genet. 91：574-581)を、配列番号1または2を含む植物と、同じ植物、細胞または種子において組み合わせることができる。同様に、一実施形態では、本発明の植物または種子を、ダイズにおいて、SCN抵抗性起源PI 548316、PI 567305、PI 437654、PI 90763、PI 404198B、PI 88788、PI 468916 、PI 567516C、PI 209332、PI 438489B、PI 89772、Peking、PI 548402、PI 404198A、PI 561389B、PI 629013、PI 507471、PI 633736、PI 507354、PI 404166、PI 437655、PI 467312、PI 567328、PI 22897、またはPI 494182のうちのいずれか1つから取得した1つ以上のSCN抵抗性遺伝子座と組み合わせる。
【００９１】
植物細胞の形質転換は、当分野で公知の幾つかの技術のうちの1つにより達成することができる。本発明の農薬遺伝子を改変することにより、植物細胞での発現を取得するかまたは向上させてもよい。典型的には、かかるタンパク質を発現する構築物は、遺伝子の転写を駆動するためのプロモーター、ならびに転写終結およびポリアデニル化を可能にするための3’非翻訳領域を含有する。かかる構築物の構成は、当分野で周知である。一部の例では、得られたペプチドが分泌されるか、または他の方法で植物細胞内に標的化されるように、遺伝子を操作することが有用な場合がある。例えば、遺伝子を操作することにより、小胞体へのペプチドの移行を促進するためのシグナルペプチドを含有させることができる。また、イントロンのmRNAプロセシングが発現に必要となるように、植物発現カセットを操作してイントロンを含有させることが好ましい場合もある。
【００９２】
典型的には、この「植物発現カセット」は、「植物形質転換ベクター」に挿入される。この植物形質転換ベクターは、植物形質転換を達成するために必要な1つ以上のDNAベクターからなるものであってもよい。例えば、2つ以上の連続DNAセグメントからなる植物形質転換ベクターを利用することが、当分野で一般的な方法である。これらのベクターは、当分野では「バイナリーベクター」と称されることが多い。バイナリーベクター、ならびにヘルパープラスミドを有するベクターは、Agrobacterium媒介形質転換の際に最もよく使用されており、その場合、効率的な形質転換を達成するのに必要なDNAセグメントのサイズおよび複雑度が極めて大きく、また別個のDNA分子に機能を分けると有利である。バイナリーベクターは、典型的には、T-DNA移行に必要なシス作用配列(例えば、左境界および右境界)、植物細胞で発現できるように操作された選択マーカー、ならびに「目的の遺伝子」(トランスジェニック植物の作成が望まれる植物細胞で発現できるように操作された遺伝子)を含有するプラスミドベクターを含有する。このプラスミドベクター上には、細菌の複製に必要な配列も存在する。シス作用配列は、植物細胞への効率的な移行とそこでの発現を可能にするような様式で配置される。例えば、選択マーカー遺伝子および農薬遺伝子は、左と右の境界の間に位置する。多くの場合、第2プラスミドベクターは、Agrobacteriumから植物細胞へのT-DNAの移行を媒介するトランス作用因子を含有する。このプラスミドは、当分野で理解されているように、Agrobacteriumによる植物細胞の感染、ならびに境界配列での切断によるDNAの移行およびvir媒介性のDNAの移行を可能にする病原性機能(Vir遺伝子)を含有していることが多い(HellensおよびMullineaux (2000) Trends in Plant Science 5：446-451)。幾つかのタイプのAgrobacterium菌株(例えばLBA4404、GV3101、EHA101、EHA105など)を植物形質転換に使用することができる。第2プラスミドベクターは、マイクロプロジェクション、微量注入、電気穿孔、ポリエチレングリコールなどの他の方法により植物を形質転換する際には必要ない。
【００９３】
一般に、植物形質転換法は、標的植物細胞(例えば未成熟胚または成熟胚、懸濁培養物、未分化カルス、プロトプラストなど)に異種DNAを移入し、続いて、一群の非形質転換細胞集団から形質転換された植物細胞を回収するために(選択マーカー遺伝子に応じて)最大閾値レベルの適当な選択を適用することを含む。典型的には、外植片を、同一培地の新鮮な供給物に移した後、規定通りに培養する。続いて、形質転換細胞を、最大閾値レベルの選択剤を追加した再生培地に配置した後にシュート（新芽）に分化させる。シュートをその後、選択発根培地に移植することにより、発根したシュートまたは小植物を回収する。トランスジェニック小植物をその後成熟植物へと生育させて、稔性の種子を産生させる(例えばHieiら(1994) The Plant Journal 6：271-282；Ishidaら(1996) Nature Biotechnology 14：745-750)。典型的には、外植片を、同一培地の新鮮な供給物に移植し、規定通りに培養する。トランスジェニック植物を作成するための技術および方法の概要は、AyresおよびPark (1994) Critical Reviews in Plant Science 13：219-239ならびにBommineniおよびJauhar (1997) Maydica 42：107-120に見出される。形質転換された材料は多くの細胞を含有しているので、形質転換細胞と非形質転換細胞の両方が、対象とする標的カルスまたは組織または細胞群のあらゆる小片に存在する。非形質転換細胞を死滅させて形質転換細胞が増殖できるようにする能力により、形質転換植物の培養物が得られる。多くの場合、非形質転換細胞を除去する能力は、形質転換植物細胞の迅速な回収およびトランスジェニック植物の作成の成功への制約となっている。
【００９４】
形質転換プロトコルならびに植物にヌクレオチド配列を導入するためのプロトコルは、形質転換の標的となる植物または植物細胞のタイプ、すなわち、単子葉植物か双子葉植物かに応じて変化しうる。トランスジェニック植物の作成は、微量注入、電気穿孔、直接遺伝子導入、植物細胞へのAgrobacteriumによる異種DNAの導入(Agrobacterium媒介形質転換)、粒子に付着させた異種外来DNAを用いる植物細胞のボンバードメント、弾道粒子加速(ballistic particle acceleration)、エアロゾルビーム形質転換(米国出願公開第20010026941号；米国特許第4,945,050号；国際公開WO 91／00915；米国出願公開第2002015066号)、Lec1形質転換、およびDNAを移入するための様々な他の非粒子直接媒介方法を含むがこれらに限定されない、幾つかの方法のうちの1つにより実施してもよい。
【００９５】
葉緑体の形質転換のための方法は当分野で公知である。例えば、Svabら(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87：8526-8530；SvabおよびMaliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90：913-917；SvabおよびMaliga (1993) EMBO J. 12：601-606を参照されたい。該方法は、選択マーカーを含有するDNAのパーティクルガン送達、および相同的組換えによる色素体ゲノムへのDNAの標的化に依存する。さらに、色素体形質転換は、核にコードされておりかつ色素体指向性のRNAポリメラーゼの組織選択的発現による、サイレント色素体媒介導入遺伝子のトランス活性化によって達成することができる。かかる系は、McBrideら(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91：7301-7305に報告されている。
【００９６】
植物細胞への異種外来DNAの組み込みに続き、その後、最大閾値レベルの適当な選択を培地に適用することにより、非形質転換細胞を死滅させて、この選択処理から生き残る推定形質転換細胞を新鮮な培地に定期的に移植することにより分離および増殖させる。連続継代および適当な選択による負荷により、プラスミドベクターで形質転換された細胞を同定し増殖させる。その後、分子法および生化学的方法を利用して、トランスジェニック植物のゲノムに組み込まれた目的の異種遺伝子の存在を確認することができる。
【００９７】
形質転換された細胞は、従来の方法に従って植物へと生育させてもよい。例えば、McCormickら(1986) Plant Cell Reports 5：81-84を参照されたい。これらの植物をその後生育させてから、同じ形質転換株または異なる株のいずれかを用いて受粉させて、その結果得られる、所望の表現型特徴の構成的発現を有するハイブリッドを同定してもよい。2世代以上生育させることで、所望の表現型特徴の発現が安定して維持されかつ遺伝することを保証し、その後、所望の表現型特徴の発現が達成されたことを保証するために種子を収穫してもよい。このようにして、本発明は、本発明のヌクレオチド構築物、例えば、本発明の発現カセットがそのゲノムに安定に組み込まれた形質転換種子(「トランスジェニック種子」とも称される)を提供する。
【００９８】
植物の形質転換の評価
植物細胞への異種外来DNAの導入に続いて、形質転換または植物ゲノムへの異種遺伝子の組み込みを、組込まれた遺伝子に関連する核酸、タンパク質および代謝産物の解析などの様々な方法により確認する。
【００９９】
PCR解析は、土壌に移植する前の初期段階で、組み入れた遺伝子の存在について形質転換細胞、組織またはシュートをスクリーニングするための迅速な方法である(SambrookおよびRussell (2001) Molecular Cloning：A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)。PCRは、目的の遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーまたはAgrobacteriumベクターバックグラウンドなどを使用して実施する。
【０１００】
植物形質転換は、ゲノムDNAのサザンブロット解析により確認してもよい(SambrookおよびRussell, 2001, 前掲)。一般に、全DNAを形質転換体から抽出し、適当な制限酵素で消化し、アガロースゲルで分画してから、ニトロセルロースまたはナイロン膜に移す。該膜または「ブロット」をその後、標準的な技術に従って植物ゲノム内への導入遺伝子の組み込みを確認するために、例えば、32Pで放射標識した標的DNA断片でプローブする(SambrookおよびRussell, 2001, 前掲)。
【０１０１】
ノーザンブロット解析では、当分野で常用されている標準的な手順に従って、RNAを形質転換体の特定の組織から単離し、ホルムアルデヒドアガロースゲルで分画してから、ナイロンフィルター上にブロッティングする(SambrookおよびRussell, 2001, 前掲)。農薬遺伝子によりコードされるRNAの発現を、その後、当分野で公知の方法により、該農薬遺伝子由来の放射性プローブに該フィルターをハイブリダイズさせることにより試験する(SambrookおよびRussell, 2001, 前掲)。
【０１０２】
ウエスタンブロット、生化学アッセイなどを、殺線虫性タンパク質上に存在する1つ以上のエピトープに結合する抗体を使用し、標準的な手順(SambrookおよびRussell, 2001, 前掲)によって農薬遺伝子によりコードされるタンパク質の存在を確認するために、トランスジェニック植物に対して実施してもよい。
【０１０３】
植物における農薬活性
本発明の別の態様では、有害線虫に対する農薬活性を有する殺線虫性タンパク質を発現するトランスジェニック植物を作成してもよい。例として、前述の方法を利用してトランスジェニック植物を作成してもよいが、トランスジェニック植物細胞を作成するその様式は本発明にとって重要ではない。当分野で公知であるかまたは記載されている方法、例えば、Agrobacterium媒介形質転換、微粒子銃形質転換、および非粒子媒介方法を、実験者の判断で使用してもよい。殺線虫性タンパク質を発現する植物は、当分野で記載されている一般的な方法により、例えば、カルスの形質転換、形質転換されたカルスの選択、およびかかるトランスジェニックカルスからの稔性植物の再生により、単離してもよい。かかるプロセスでは、植物細胞におけるその発現が形質転換細胞を同定または選択する能力を付与する限りは、選択マーカーとして任意の遺伝子を使用してもよい。
【０１０４】
クロラムフェニコール、アミノグリコシドG418、ハイグロマイシンなどに対する抵抗性といった多数のマーカーが、植物細胞で使用するために開発されている。また、葉緑体代謝に関与する産物をコードする他の遺伝子を選択マーカーとして使用してもよい。例えば、グリホサート、ブロモキシニル、またはイミダゾリノンなどの植物除草剤に対する抵抗性を与える遺伝子には、特定の用途が見出される。かかる遺伝子は報告されている(Stalkerら(1985) J. Biol. Chem. 263：6310-6314(ブロモキシニル抵抗性ニトリラーゼ遺伝子)；およびSathasivanら(1990) Nucl. Acids Res. 18：2188(AHASイミダゾリノン抵抗性遺伝子)。さらに、本明細書中に開示した遺伝子は、細菌細胞または植物細胞の形質転換を評価するためのマーカーとして有用である。植物、植物器官(例えば、葉、茎、根など)、種子、植物細胞、むかご、胚またはその子孫における導入遺伝子を検出するための方法は、当分野で周知である。一実施形態では、導入遺伝子の存在は、有害線虫に対する農薬活性について試験することにより検出される。
【０１０５】
殺線虫性タンパク質を発現する稔性植物を、有害線虫に対する農薬活性について試験してもよく、また最適な活性を示す植物をさらなる育種のために選択してもよい。害虫活性についてアッセイするための方法は、当分野で利用可能である。一般的には、タンパク質を混合して摂食アッセイに使用する。例えばMarroneら(1985) J. of Economic Entomology 78：290-293を参照されたい。
【０１０６】
本発明は、単子葉植物および双子葉植物を含むがこれらに限定されない、任意の植物種の形質転換のために使用してもよい。目的の植物の具体例としては、限定するものではないが、コーン(トウモロコシ)、モロコシ、小麦、ヒマワリ、トマト、アブラナ科の植物、コショウ、ジャガイモ、ワタ、イネ、ダイズ、テンサイ、サトウキビ、タバコ、大麦、およびアブラナ、アブラナ属の種(Brassica sp.)、アルファルファ、ライ麦、キビ、ベニバナ、ピーナッツ、サツマイモ、キャッサバ、コーヒー、ココナッツ、パイナップル、柑橘類の木、ココア、茶、バナナ、アボカド、イチジク、グアバ、マンゴー、オリーブ、パパイヤ、カシュー、マカダミア、アーモンド、オートムギ、野菜、観葉植物、および球果植物が挙げられる。
【０１０７】
農薬防除における使用
害虫防除において、または農薬物質として他の生物を操作する際に、本発明のヌクレオチド配列、またはその変異体を含む株を用いる一般的な方法は、当分野で公知である。例えば、米国特許第5,039,523号および欧州特許第0480762A2号を参照されたい。
【０１０８】
微生物を遺伝的に改変することにより、配列番号1もしくは2をコードするヌクレオチド配列、または殺線虫剤として活性なその変異体もしくは断片を含有させることが可能であり、またタンパク質を、害虫から農作物および農産物を保護するために使用してもよい。本発明の一態様では、毒素(農薬)産生生物の全細胞、すなわち非溶解細胞を、該細胞を標的害虫(複数種可)の環境に施用した場合に該細胞内で産生される該毒素の活性を持続させる試薬で処理する。
【０１０９】
あるいは、農薬は、農薬遺伝子を細胞宿主に導入することにより産生される。農薬遺伝子の発現は、直接的または間接的に、農薬の細胞内での産生および維持をもたらす。本発明の一態様では、これらの細胞をその後、該細胞を標的害虫(複数種可)の環境に施用した場合に該細胞内で産生される毒素の活性を持続させる条件下で処理する。得られる産物は、毒素の毒性を保持している。これらの天然に封入された農薬を、その後、標的害虫が生息する環境、例えば、土壌、水、および植物の枝葉への施用のために、従来技術に従って製剤化してもよい。例えば、欧州特許出願第0192319号、およびそこに引用されている参考文献を参照されたい。あるいは、例えば、得られる材料を農薬として施用できるようにするために、本発明の遺伝子を発現する細胞を製剤化してもよい
【０１１０】
本発明の活性成分は、通常は組成物の形態で施用され、また処理すべき作物域または植物に、他の化合物と同時に、または連続して施用することができる。これらの化合物は、肥料、除草剤、凍結保護剤、界面活性剤、洗剤、農薬石けん(pesticidal soap)、ドーマントオイル(休眠油、dormant oils)、ポリマー、および／または製剤の単回施用後に標的域の長期投薬を可能にする徐放性もしくは生分解性担体製剤でありうる。それらはまた、必要に応じて、さらなる農業上許容される担体、界面活性剤または製剤の分野で慣用されている施用促進アジュバントと併せた、選択的除草剤、化学殺虫剤、殺ウイルス剤、殺微生物剤、殺アメーバ剤、農薬、殺真菌剤、殺菌剤、殺線虫剤、軟体動物駆除剤またはこれらの調製物のうちの幾つかの混合物でありうる。適切な担体およびアジュバントは、固体または液体であってよく、それらは製剤技術において通常用いられる物質、例えば天然または再生鉱物、溶媒、分散剤、湿潤剤、粘着付与剤、結合剤または肥料に相当する。同様に、製剤は、農薬製剤の標的害虫による摂食または摂取を可能にするために、食用の「餌」に調製するか、または害虫「捕獲器」としてもよい。
【０１１１】
配列番号1または2として本明細書中に開示した殺線虫性タンパク質のうちの少なくとも1つ、または殺線虫剤として有効なその変異体もしくは断片を含有する本発明の活性成分または本発明の農薬化合物組成物（agrochemical composition）を施用する方法としては、葉施用、種子粉衣、および土壌施用が挙げられる。施用の回数および施用の割合は、対応する害虫による寄生の強度に依存する。
【０１１２】
前記組成物は、粉末、粉剤、ペレット、粒剤、噴霧剤、乳剤、コロイド、液剤、またはそのようなものとして製剤化してもよく、また前記ポリペプチドを含む細胞の培養物の乾燥、凍結乾燥、ホモジネーション、抽出、ろ過、遠心分離、沈降、または濃縮などの従来の手段により調製してもよい。少なくとも1つのかかる農薬ポリペプチドを含有する全てのかかる組成物において、該ポリペプチドは約1重量％〜約99重量％の濃度で存在していてもよい。
【０１１３】
有害線虫は、本発明の方法により所与の区域において死滅させるかもしくは数を減少させてもよいし、または感受性害虫による寄生を予防するために環境区域に予防的に施用してもよい。好ましくは、害虫に農薬として有効な量の前記ポリペプチドを摂取させるか、または害虫を農薬として有効な量の前記ポリペプチドと接触させる。「農薬として有効な量（殺害虫剤として有効な量）」または「殺線虫剤として有効な量」とは、少なくとも1種の害虫に死をもたらすことができるか、あるいは害虫の成長、摂食、または害虫もしくは該害虫が寄生する宿主植物の正常な生理学的発達を顕著に低下させることができる農薬または殺線虫剤の量を意味する。この量は、例えば、防除すべき特定の標的害虫、特定の環境、場所、植物、作物、または処理すべき農業現場、環境条件、ならびに殺線虫剤として有効なポリペプチド組成物の施用の方法、割合、濃度、安定性、および量などの因子に応じて変動する。配合は、気候条件、環境への配慮、および／または施用の頻度および／または害虫寄生の重症度に関して変動する場合もある。
【０１１４】
記載した農薬組成物は、細菌細胞、結晶および／もしくは胞子懸濁液、または単離されたタンパク質成分のいずれかを、所望の農業上許容される担体と共に製剤化することにより作製してもよい。該組成物は、投与前に、凍結乾燥、フリーズドライ、乾燥などの適当な手段で、または水性担体、溶媒もしくは適切な希釈剤、例えば生理食塩水もしくは他の緩衝液中で製剤化してもよい。製剤化した組成物は、粉塵もしくは顆粒状物質、または油(植物油もしくは鉱油)中懸濁物、または水もしくは油／水エマルションの形態、あるいは水和剤としての形態、あるいは農業利用に適した任意の他の担体物質と組み合わせた形態であってもよい。適切な農業用担体は、固体であっても液体であってもよく、それらは当分野で周知である。用語「農業上許容される担体」は、農薬製剤技術において通常使用される全てのアジュバント、不活性成分、分散剤、界面活性剤、粘着付与剤、結合剤などを包含み、これらは農薬製剤の当業者には周知である。製剤は、1つ以上の固体または液体アジュバントと混合してもよく、また様々な手段により、例えば、従来の製剤技術を利用して適切なアジュバントと共に農薬組成物を均一に混合、ブレンドおよび／または粉砕することにより、調製してもよい。適切な製剤および施用方法は、参照により本明細書中に組み込まれる、米国特許第6,468,523号に記載されている。
【０１１５】
植物収量を増加させるための方法
植物収量を増加させるための方法が提供される。該方法は、本明細書中に開示した殺線虫性ポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチドを発現する植物または植物細胞を提供すること、および該ポリペプチドが殺線虫活性を発揮する有害線虫に寄生されている(または有害線虫による寄生が起こりやすい)圃場で該植物またはその種子を生育させることを含む。幾つかの実施形態では、本明細書中に記載したCry14ポリペプチドはPratylenchus spp.に対する殺線虫活性を有し、または該圃場には該Pratylenchus spp.が湧いている(蔓延している)。種々の実施形態では、Pratylenchus spp.はPratylenchus brachyurusである。さらなる実施形態では、線虫はネコブセンチュウ、病害線虫、またはヤリセンチュウである。本明細書中で定義するように、植物の「収量」は、該植物により産生されるバイオマスの質および／または量を指す。「バイオマス」とは、任意の測定された植物生産物を意味する。バイオマス生産量の増加は、測定される植物生産物の収量の任意の改善である。植物収量の増加は、幾つかの商業的用途を有する。例えば、植物の葉のバイオマスの増加は、ヒトおよび動物が消費するための葉物野菜の収量を増加させる場合がある。さらに、葉のバイオマスの増加を利用して、植物由来の医薬製品または工業製品の生産量を増加させることができる。収量の増加は、本明細書中に記載した農薬タンパク質を発現しない植物と比較した場合の、収量の少なくとも1％の増加、少なくとも3％の増加、少なくとも5％の増加、少なくとも10％の増加、少なくとも20％の増加、少なくとも30％、少なくとも50％、少なくとも70％、少なくとも100％またはそれ以上の増加を含むがこれらに限定されない、任意の統計学的に有意な増加を含みうる。特定の方法では、植物収量は、本明細書中に開示した殺線虫性タンパク質を発現する植物の改善された線虫抵抗性の結果として増加する。殺線虫性タンパク質の発現は、害虫が寄生または摂食するその能力の低下をもたらす。種々の実施形態では、殺線虫性タンパク質の発現は、本発明の殺線虫性タンパク質を発現しない植物と比較して、改善された根発達(例えば、改善された根または根毛の生育)、改善された収量、より早い出芽、上昇したストレス耐性および／またはストレスからの改善された回復を含む改善された植物ストレス管理、上昇した機械的強度、改善された乾燥抵抗性、減少した菌類病感染、ならびに改善された植物健康をもたらす。
【０１１６】
植物は、1種以上の除草剤、殺虫剤、または殺真菌剤を含む、1種以上の化学組成物で処理することもできる。例示的な化学組成物としては、以下のものが挙げられる：果実／野菜用除草剤：アトラジン、ブロマシル、ジウロン、グリホサート、リニュロン、メトリブジン、シマジン、トリフルラリン、フルアジホップ、グルホシネート、ハロスルフロンゴワン(Halosulfron Gowan)、パラコート、プロピザミド、セトキシジム、ブタフェナシル、ハロスルフロン、インダジフラム；果実／野菜用殺虫剤：アルジカルブ、バチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuriengiensis)、カルバリル、カルボフラン、クロルピリホス、シペルメトリン、デルタメトリン、アバメクチン、シフルトリン／β-シフルトリン、エスフェンバレレート、λ-シハロトリン、アセキノシル、ビフェナゼート、メトキシフェノジド、ノバルロン、クロマフェノジド、チアクロプリド、ジノテフラン、フルアクリピリム、スピロジクロフェン、γ-シハロトリン、スピロメシフェン、スピノサド、リナキシピル、サイアジピル、トリフルムロン、スピロテトラマト、イミダクロプリド、フルベンジアミド、チオジカルブ、メタフルミゾン、スルホキサフロル、シフルメトフェン、シエノピラフェン(Cyanopyrafen)、クロチアニジン、チアメトキサム、スピネトラム(Spinotoram)、チオジカルブ、フロニカミド、メチオカルブ、エマメクチン安息香酸塩、インドキサカルブ、フェナミホス、ピリプロキシフェン、酸化フェンブタスズ；果実／野菜用殺真菌剤：アメトクトラジン、アゾキシストロビン、ベンチアバリカルブ、ボスカリド、キャプタン、カルベンダジム、クロロタロニル、銅、シアゾファミド、シフルフェナミド、シモキサニル、シプロコナゾール、シプロジニル、ジフェノコナゾール、ジメトモルフ、ジチアノン、フェンアミドン、フェンヘキサミド、フルアジナム、フルジオキソニル、フルオピコリド、フルオピラム、フルオキサストロビン、フルクサピロキサド、ホルペット、ホセチル、イプロジオン、イプロバリカルブ、イソピラザム、クレソキシムメチル、マンコゼブ、マンジプロパミド、メタラキシル／メフェノキサム、メチラム、メトラフェノン、ミクロブタニル、ペンコナゾール、ペンチオピラド、ピコキシストロビン、プロパモカルブ、プロピコナゾール、プロピネブ、プロキナジド、プロチオコナゾール、ピラクロストロビン、ピリメタニル、キノキシフェン、スピロキサミン、硫黄、テブコナゾール、チオファネートメチル、トリフロキシストロビン；穀物用除草剤：
2.4-D、アミドスルフロン、ブロモキシニル、カルフェントラゾン-E、クロロトルロン、クロルスルフロン、クロジナホップ-P、クロピラリド、ジカンバ、ジクロホップ-M、ジフルフェニカン、フェノキサプロップ、フロラスラム、フルカルバゾン-NA、フルフェナセット、フルピルスルフロン-M(Flupyrosulfuron-M)、フルロキシピル、フルルタモン、グリホサート、イオドスルフロン、イオキシニル、イソプロツロン、MCPA、メソスルフロン、メトスルフロン、ペンディメタリン、ピノキサデン、プロポキシカルバゾン、プロスルホカルブ、ピロクススラム、スルホスルフラン、チフェンスルフロン、トラルコキシジム、トリアスルフロン、トリベヌロン、トリフルラリン、トリトスルフロン；穀物用殺真菌剤：アゾキシストロビン、ビキサフェン、ボスカリド、カルベンダジム、クロロタロニル、シフルフェナミド、シプロコナゾール、シプロジニル、ジモキシストロビン、エポキシコナゾール、フェンプロピジン、フェンプロピモルフ、フルオピラム、フルオキサストロビン、フルキンコナゾール、フルクサピロキサド、イソピラザム、クレソキシムメチル、メトコナゾール、メトラフェノン、ペンチオピラド、ピコキシストロビン、プロクロラズ、プロピコナゾール、プロキナジド、プロチオコナゾール、ピラクロストロビン、キノキシフェン、スピロキサミン、テブコナゾール、チオファネートメチル、トリフロキシストロビン；穀物用殺虫剤：ジメトエート、λ-シハロトリン(Lambda-cyhalthrin)、デルタメトリン、α-シペルメトリン、β-シフルトリン、ビフェントリン、イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、チアクロプリド、アセタミプリド、ジノテフラン(Dinetofuran)、クロルピリホス、ピリミカルブ、メチオカルブ、スルホキサフロル；トウモロコシ用除草剤：アトラジン、アラクロール、ブロモキシニル、アセトクロール、ジカンバ、クロピラリド、(S-)ジメテナミド、グルホシネート、グリホサート、イソキサフルトール、(S-)メトラクロール、メソトリオン、ニコスルフロン、プリミスルフロン、リムスルフロン、スルコトリオン、ホラムスルフロン、トプラメゾン、テンボトリオン、サフルフェナシル、チエンカルバゾン、フルフェナセット、ピロキサスルホン；トウモロコシ用殺虫剤：カルボフラン、クロルピリホス、ビフェントリン、フィプロニル、イミダクロプリド、λ-シハロトリン、テフルトリン、テルブホス、チアメトキサム、クロチアニジン、スピロメシフェン、フルベンジアミド、トリフルムロン、リナキシピル、デルタメトリン、チオジカルブ、β-シフルトリン、シペルメトリン、ビフェントリン、ルフェヌロン、テブピリムホス、エチプロール、サイアジピル、チアクロプリド、アセタミプリド、ジノテフラン、アベルメクチン；トウモロコシ用殺真菌剤：アゾキシストロビン、ビキサフェン、ボスカリド、シプロコナゾール、ジモキシストロビン、エポキシコナゾール、フェニトロパン、フルオピラム、フルオキサストロビン、フルクサピロキサド、イソピラザム、メトコナゾール、ペンチオピラド、ピコキシストロビン、プロピコナゾール、プロチオコナゾール、ピラクロストロビン、テブコナゾール、トリフロキシストロビン；イネ用除草剤：ブタクロール、プロパニル、アジムスルフロン��ベンスルフロン、シハロホップ、ダイムロン、フェントラザミド、イマゾスルフロン、メフェナセット、オキサジクロメホン、ピラゾスルフロン、ピリブチカルブ、キンクロラック、チオベンカルブ、インダノファン、フルフェナセット、フェントラザミド、ハロスルフロン、オキサジクロメホン、ベンゾビシクロン、ピリフタリド、ペノキススラム、ビスピリバック、オキサジアルギル、エトキシスルフロン、プレチラクロール、メソトリオン、テフリルトリオン、オキサジアゾン、フェノキサプロップ、ピリミスルファン；イネ用殺虫剤：ダイアジノン、フェノブカルブ、ベンフラカルブ、ブプロフェジン、ジノテフラン、フィプロニル、イミダクロプリド、イソプロカルブ、チアクロプリド、クロマフェノジド、クロチアニジン、エチプロール、フルベンジアミド、リナキシピル、デルタメトリン、アセタミプリド、チアメトキサム、サイアジピル、スピノサド、スピネトラム(spinotoram)、エマメクチン安息香酸塩、シペルメトリン、クロルピリホス、エトフェンプロックス、カルボフラン、ベンフラカルブ、スルホキサフロル；イネ用殺真菌剤：アゾキシストロビン、カルベンダジム、カルプロパミド、ジクロシメット、ジフェノコナゾール、エジフェンホス、フェリムゾン、ゲンタマイシン、ヘキサコナゾール、ヒメキサゾール、イプロベンホス(IBP)、イソプロチオラン、イソチアニル、カスガマイシン、マンコゼブ、メトミノストロビン、オリサストロビン、ペンシクロン、プロベナゾール、プロピコナゾール、プロピネブ、ピロキロン、テブコナゾール、チオファネートメチル、チアジニル、トリシクラゾール、トリフロキシストロビン、バリダマイシン；ワタ用除草剤：ジウロン、フルオメツロン、MSMA、オキシフルオルフェン、プロメトリン、トリフルラリン、カルフェントラゾン、クレトジム、フルアジホップブチル、グリホサート、ノルフルラゾン、ペンディメタリン、ピリチオバックナトリウム塩、トリフロキシスルフロン、テプラロキシジム、グルホシネート、フルミオキサジン、チジアズロン；ワタ用殺虫剤：アセフェート、アルジカルブ、クロルピリホス、シペルメトリン、デルタメトリン、アバメクチン、アセタミプリド、エマメクチン安息香酸塩、イミダクロプリド、インドキサカルブ、λ-シハロトリン、スピノサド、チオジカルブ、γ-シハロトリン、スピロメシフェン、ピリダリル、フロニカミド、フルベンジアミド、トリフルムロン、リナキシピル、β-シフルトリン、スピロテトラマト、クロチアニジン、チアメトキサム、チアクロプリド、ジノテフラン(Dinetofuran)、フルベンジアミド、サイアジピル、スピノサド、スピネトラム(Spinotoram)、γシハロトリン、4-[[(6-クロロピリジン-3-イル)メチル](2,2-ジフルオロエチル)アミノ]フラン-2(5H)-オン、チオジカルブ、アベルメクチン、フロニカミド、ピリダリル、スピロメシフェン、スルホキサフロル；ワタ用殺真菌剤：アゾキシストロビン、ビキサフェン、ボスカリド、カルベンダジム、クロロタロニル、銅、シプロコナゾール、ジフェノコナゾール、ジモキシストロビン、エポキシコナゾール、フェンアミドン、フルアジナム、フルオピラム、フルオキサストロビン、フルクサピロキサド、イプロジオン、イソピラザム、イソチアニル、マンコゼブ、マンネブ、メトミノストロビン、ペンチオピラド、ピコキシストロビン、プロピネブ、プロチオコナゾール、ピラクロストロビン、キントゼン、テブコナゾール、テトラコナゾール、チオファネートメチル、トリフロキシストロビン；ダイズ用除草剤：アラクロール、ベンタゾン、トリフルラリン、クロリムロンエチル、クロランスラムメチル、フェノキサプロップ、ホメサフェン、フルアジホップ、グリホサート、イマザモックス、イマザキン、イマゼタピル、(S-)メトラクロール、メトリブジン、ペンディメタリン、テプラロキシジム、グルホシネート；ダイズ用殺虫剤：λ-シハロトリン、メソミル、イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、チアクロプリド、アセタミプリド、ジノテフラン(Dinetofuran)、フルベンジアミド、リナキシピル、サイアジピル、スピノサド、スピネトラム(Spinotoram)、エマメクチン安息香酸塩、フィプロニル、エチプロール、デルタメトリン、β-シフルトリン、γおよびλシハロトリン、4-[[(6-クロロピリジン-3-イル)メチル](2,2-ジフルオロエチル)アミノ]フラン-2(5H)-オン、スピロテトラマト、スピロジクロフェン(Spinodiclofen)、トリフルムロン、フロニカミド、チオジカルブ、β-シフルトリン；ダイズ用殺真菌剤：アゾキシストロビン、ビキサフェン、ボスカリド、カルベンダジム、クロロタロニル、銅、シプロコナゾール、ジフェノコナゾール、ジモキシストロビン、エポキシコナゾール、フルアジナム、フルオピラム、フルオキサストロビン、フルトリアホール、フルクサピロキサド、イソピラザム、イプロジオン、イソチアニル、マンコゼブ、マンネブ、メトコナゾール、メトミノストロビン、ミクロブタニル、ペンチオピラド、ピコキシストロビン、プロピコナゾール、プロピネブ、プロチオコナゾール、ピラクロストロビン、テブコナゾール、テトラコナゾール、チオファネートメチル、トリフロキシストロビン；テンサイ用除草剤：クロリダゾン、デスメディファム、エトフメセート、フェンメディファム、トリアレート、クロピラリド、フルアジホップ、レナシル、メタミトロン、キンメラック、シクロキシジム、トリフルスルフロン、テプラロキシジム、キザロホップ；テンサイ用殺虫剤：イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、チアクロプリド、アセタミプリド、ジノテフラン(Dinetofuran)、デルタメトリン、β-シフルトリン、γ／λシハロトリン、4-[[(6-クロロピリジン-3-イル)メチル](2,2-ジフルオロエチル)アミノ]フラン-2(5H)-オン、テフルトリン、リナキシピル、サイアジピル(Cyaxypyr)、フィプロニル、カルボフラン；キャノーラ用除草剤：クロピラリド、ジクロホップ、フルアジホップ、グルホシネート、グリホサート、メタザクロル、トリフルラリン、エタメトスルフロン、キンメラック、キザロホップ、クレトジム、テプラロキシジム；キャノーラ用殺真菌剤：アゾキシストロビン、ビキサフェン、ボスカリド、カルベンダジム、シプロコナゾール、ジフェノコナゾール、ジモキシストロビン、エポキシコナゾール、フルアジナム、フルオピラム、フルオキサストロビン、フルシラゾール、フルクサピロキサド、イプロジオン、イソピラザム、メピコートクロリド、メトコナゾール、メトミノストロビン、パクロブトラゾール、ペンチオピラド、ピコキシストロ��ン、プロクロラズ、プロチオコナゾール、ピラクロストロビン、テブコナゾール、チオファネートメチル、トリフロキシストロビン、ビンクロゾリン；キャノーラ用殺虫剤：カルボフラン、チアクロプリド、デルタメトリン、イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、アセタミプリド、ジノテフラン(Dinetofuran)、β-シフルトリン、γおよびλシハロトリン、τ-フルバリネート(tau-Fluvaleriate)、エチプロール、スピノサド、スピネトラム(Spinotoram)、フルベンジアミド、リナキシピル、サイアジピル、4-[[(6-クロロピリジン-3-イル)メチル](2,2-ジフルオロエチル)アミノ]フラン-2(5H)-オン。
【０１１７】
下記実施例は例示のために提供するものであり、限定するためのものではない。
（実験例）
【実施例１】
【０１１８】
実施例1.ダイズにおけるCry14Aa1の発現
Cry14Aa1(配列番号3)を発現するダイズ事象を、4-ヒドロキシ-フェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼタンパク質(HPPD)阻害剤除草剤耐性遺伝子をコードする遺伝子(WO2014043435に記載)およびCry14Aa1を含有する構築物を使用し、Thorneダイズ植物のAgrobacterium媒介形質転換により開発した。野生型Thorneダイズは非-線虫抵抗性対照としての役割を果たした。Cry14Aa1は、ダイズ植物で発現された場合、野生型植物と比較して、根で繁殖するPratylenchus brachyurusの数を減少させる。3つの独立した事象系統は、複数回の再試験で、線虫の減少を示す同一の結果を一貫して与えた。全3事象において、線虫の数が60〜85％減少した。
【実施例２】
【０１１９】
実施例2.ダイズにおけるCry14Ab1の発現
Cry14Ab1(配列番号4)を発現するEE-GM4ダイズ事象を、4-ヒドロキシ-フェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼタンパク質(HPPD)阻害剤除草剤耐性遺伝子をコードする遺伝子(WO2014043435に記載)およびCry14Ab1を含有する構築物を使用し、Thorneダイズ植物のAgrobacterium媒介形質転換により開発した。野生型Thorneダイズは非-線虫抵抗性対照としての役割を果たした。Cry14Ab1は、ダイズ植物において発現された場合、野生型植物と比較して、根で繁殖するPratylenchus brachyurusの数を減少させる。非形質転換ThorneおよびEE-GM4の種子を発芽させてから、温室に植えることにより、病害線虫Pratylenchus brachyurusの防除について調べた。Pratylenchus brachyurus線虫(＃1500／植物、種々の発生段階のもの)を、植物に、2週齢の時点で施用した。施用の30日後、Pratylenchus線虫を根から採取して計数した。EE-GM4を含有する植物の根に見出される線虫の平均数を、野生型Thorne植物根に見出されるPratylenchus線虫の平均数と比較した。Thorne対照根と比較した場合に、平均して約80〜90％少ないPratylenchus線虫がEE-GM4を含有する植物の根に見出され、このことは、ダイズ事象EE-GM4による病害線虫の有意な防除を示している。
【０１２０】
図1は、5つの有望ダイズ系統(1つはSCN感受性(MG 1)、1つはSCN抵抗性(PI88788、MG 3)、1つはSCN感受性(MG 6.2)、1つはSCN抵抗性(Peking、MG 6.2)、および1つはSCN感受性(MG 9))においてEE-GM4を有する有望系統をSCN感受性およびSCN抵抗性の米国ダイズ系統と比較する、米国におけるPratylenchus brachyurusの温室試験で得られた結果を示している。これらのダイズ植物を小さなコーンポットで生育させてから、25〜32℃の様々な温度の温室で維持した。サウスカロライナ州から取得しかつ温室で増殖させたPratylenchus brachyurus線虫を使用して、V2〜V3生育段階にある植物に接種した。約1500個の卵＋成虫を1植物当たりに接種し、各エントリーは5つの植物とした。寄生の30日後、線虫および卵を根から採取して計数した。各エントリーを2回の独立した実験に供した。SCN感受性およびSCN抵抗性の米国ダイズ系統はPratylenchusの防除を示さなかったが、EE-GM4を有する植物はPratylenchusの約85％の防除を示した。
【０１２１】
図2は、EE-GM4を有するダイズ植物を、抵抗性を示さないブラジルのダイズ系統および1つの低Rf系統、ならびにSCN感受性およびSCN抵抗性の植物と比較する、ブラジルにおけるPratylenchus brachyurusの温室試験で得られた結果を示している。該ダイズ系統を小さいコーンポットで生育させてから、25〜32℃の様々な温度の温室で維持した。ブラジルの圃場から取得しかつ温室で増殖させたPratylenchus brachyurus線虫を使用して、V2〜V3生育段階にある植物に接種した。約1000個の卵＋成虫を1植物当たりに接種し、各エントリーは5つの植物とした。寄生の30日後、線虫および卵を根から採取して計数した。図に示す結果は、単一実験で得たものである。Pratylenchusの低い増殖率を有すると分類されている1つのブラジルのダイズ系統(BRS 7380)は、Pratylenchusの約89％の減少を示した。EE-GM4を有する植物は、Pratylenchusの最大97％の防除を与えた。SCNに対する天然の抵抗性(rhg1＋Rhg4)を保有するダイズ系統は、Pratylenchus brachyurusを防除しない。
【０１２２】
同様に、EE-GM4を含有する植物を使用することにより、Meloidogyne incognitaなどのネコブセンチュウ(RKN)を防除することができる。Meloidogyne incognitaの個体群はThorne野生型ダイズにはあまり寄生しないにもかかわらず、EE-GM4を有するThorne植物は、非形質転換Thorne植物と比較した場合、平均してRKNの卵の数／根量のさらなる減少を示す。
【実施例３】
【０１２３】
実施例3.植物発現のための遺伝子のベクター化
本発明のコード領域を、植物における発現のために、適当なプロモーターおよびターミネーター配列と連結する。かかる配列は当分野で周知である。プロモーター-遺伝子-ターミネーター構築物を作製および確認するための技術もまた、当分野では周知である。
【０１２４】
本発明の一態様では、合成DNA配列を設計および作成する。これらの合成配列は、親配列と比較すると変更されているヌクレオチド配列を有するが、該親配列と本質的に同一であるタンパク質をコードしている。幾つかの実施形態では、該合成DNA配列は配列番号3または4を含む。
【０１２５】
本発明の別の態様では、得られるペプチドが植物オルガネラ、例えば小胞体またはアポプラストに標的化されるように、前記の合成遺伝子の改変型を設計する。植物オルガネラへの融合タンパク質の標的化をもたらすことが知られているペプチド配列は、当分野で公知である。例えば、シロバナルピナスのルピナスアルブス(Lupinus albus)(GENBANK(登録商標) ID GI：14276838、Millerら(2001) Plant Physiology 127：594-606)由来の酸性ホスファターゼ遺伝子のN末端領域は、異種タンパク質の小胞体標的化をもたらすことが当分野で知られている。得られる融合タンパク質がC末端にペプチドN-末端-リジン-アスパラギン酸-グルタミン酸-ロイシン(すなわち、「KDEL」モチーフ、配列番号7)を含む小胞体保持配列も含有している場合、該融合タンパク質は小胞体に標的化される。融合タンパク質がC-末端の小胞体標的化配列を欠く場合、該タンパク質は小胞体に標的化されるものの、最終的にはアポプラストに隔離される。
【０１２６】
従って、この遺伝子は、本発明のアミノ酸配列のN-末端に融合させたシロバナルピナスのLupinus albus(GENBANK(登録商標) ID GI：14276838、Millerら、2001, 前掲)由来の酸性ホスファターゼ遺伝子のN末端31アミノ酸、ならびにC末端のKDEL(配列番号7)配列を含有する融合タンパク質をコードする。従って、得られるタンパク質は、植物細胞における発現時に植物小胞体に標的化されると予想される。
【０１２７】
上記の植物発現カセットを、形質転換細胞および組織の選択を促進するための適当な植物選択マーカーと組み合わせて、これを植物形質転換ベクターに連結する。これらのものとしては、Agrobacterium媒介形質転換からのバイナリーベクターまたはエアロゾルもしくは微粒子銃形質転換用の単純なプラスミドベクターを挙げることができる。
【０１２８】
本発明では、Cry14A(配列番号1または2)をコードする合成遺伝子を含む発現カセットは、イネ(Oryza sativa)のスクロースシンターゼ1遺伝子のプロモーター領域(Wangら(1992) Plant Molecular Biology, 19, 881-885)またはカリフラワーモザイクウイルス35S転写産物のプロモーター領域(Odellら(1985) Nature 313, 810-812)およびペチュニア(Petunia hybrid)のクロロフィルa／b結合タンパク質遺伝子のリーダー配列(Harpsterら(1988) Molecular and General Genetics 212, 182-190)に作動可能に連結されている。該発現カセットはさらに、Cry14配列の3’末端に作動可能に連結された、pTiT37のT-DNAから得たノパリン合成酵素遺伝子の3’非翻訳領域(Depickerら(1982) Journal of Molecular and Applied Genetics 1, 561-573)を含んでいた。
【実施例４】
【０１２９】
実施例4：ダイズの形質転換
ダイズの形質転換は、当分野で周知の方法、例えば、Pazら(2006), Plant cell Rep. 25：206により記載されている方法を本質的に利用し、Agrobacterium tumefaciens媒介形質転換ダイズの半種子外植片を使用して記載されている方法を利用して達成する。形質転換体は、選択マーカーとしてテンボトリオンを使用して同定する。シュートの出現が観察され、これを除草剤イソキサフルトールまたはテンボトリオンに対する耐性の指標として記録した。この耐性トランスジェニックシュートは、イソキサフルトールまたはテンボトリオンで処理していない野生型ダイズのシュートと同等の正常な緑化を示すが、同量のイソキサフルトールまたはテンボトリオンで処理した野生型ダイズのシュートは完全に白化する。このことは、HPPDタンパク質の存在が、イソキサフルトールまたはテンボトリオンのようなHPPD阻害型除草剤に対する耐性を可能にすることを示している。
【０１３０】
耐性緑色シュートを発根培地に移すかまたは移植する。発根した小植物を、順化期間後に温室に移す。導入遺伝子を含有する植物に、その後、HPPD阻害型除草剤、例えば、硫酸アンモニウムメチルエステル菜種油を追加した100g AI／haの量のテンボトリオンまたは300g AI／haの量のメソトリオンを噴霧する。施用の10日後、除草剤の施用に起因する症状を評価し、同一条件下の野生型植物に関して観察される症状と比較する。
【実施例５】
【０１３１】
実施例5：ワタT0植物の確立および選抜
ワタの形質転換は、当分野で周知の方法、特にPCT特許公報WO 00／71733に記載されているものの中で好適な方法を利用して達成する。再生した植物を温室に移す。順化期間後、十分に生育させた植物に、HPPD阻害型除草剤、例えば、硫酸アンモニウムおよびメチルエステル菜種油を追加した100または200 gAI／ha相当のテンボトリオンを噴霧する。噴霧施用の7日後、除草剤による処理に起因する症状を評価し、同一条件下で同一処理に供した野生型ワタ植物に関して観察される症状と比較する。
【０１３２】
本明細書中で言及した全ての刊行物および特許出願は、本発明が関連する分野の当業者の熟練度を示すものである。全ての刊行物および特許出願は、あたかも個々の刊行物または特許出願が参照により組み込まれると明確かつ個別に示されているのと同程度まで、参照により本明細書中に組み込まれるものとする。
【０１３３】
前述の本発明は、理解を明確にする目的で説明および実施例として幾分詳しく記載したが、ある一定の変更および改変を添付の特許請求の範囲内で行いうることは明らかである。
【図１】
2020504609.tif 000002
【図２】
2020504609.tif 000003
【配列表】
2020504609000001.app
【国際調査報告】
2020504609.tif 000004
2020504609.tif 000005
2020504609.tif 000006
2020504609.tif 000007
2020504609.tif 000008