(57)【要約】本発明は、概して、腫瘍関連抗原に対して特異的に結合する能力を有する新しいフォーマットの抗原結合受容体に関する。より具体的には、本発明は、腫瘍細胞表面上の抗原と効率よくかつ特異的に結合/相互作用する抗原結合受容体、および該抗原結合受容体をトランスフェクト/形質導入したT細胞に関する。さらにまた本発明は、本発明の抗原結合受容体をコードする核酸分子およびベクターに関する。本発明は、特定の疾患の処置方法におけるT細胞の生産および使用、ならびに本発明の抗原結合受容体および/またはT細胞を含む薬学的組成物/医薬も提供する。2020511979.tif 000136
2020511979.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンカリング膜貫通ドメインと、抗原結合部分を含む細胞外ドメインとを含む、抗原結合受容体であって、該抗原結合部分がFab、crossFab、またはscFabである、抗原結合受容体。
【請求項２】
アンカリング膜貫通ドメインが、CD8、CD3z、FCGR3A、NKG2D、CD27、CD28、CD137、OX40、ICOS、DAP10、もしくはDAP12膜貫通ドメイン、またはそれらのフラグメントからなる群より選択される膜貫通ドメインである、請求項1記載の抗原結合受容体。
【請求項３】
アンカリング膜貫通ドメインがCD28膜貫通ドメインまたはそのフラグメントであり、特に、アンカリング膜貫通ドメインがSEQ ID NO:14のアミノ酸配列を含む、請求項1または2のいずれか一項記載の抗原結合受容体。
【請求項４】
少なくとも1つの刺激シグナリングドメインおよび/または少なくとも1つの共刺激シグナリングドメインをさらに含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の抗原結合受容体。
【請求項５】
少なくとも1つの刺激シグナリングドメインが、CD3zの細胞内ドメイン、FCGR3Aの細胞内ドメイン、およびNKG2Dの細胞内ドメイン、またはそれらのフラグメントからなる群より個別に選択される、請求項1〜4のいずれか一項記載の抗原結合受容体。
【請求項６】
少なくとも1つの刺激シグナリングドメインが、CD3zの細胞内ドメインまたはそのフラグメントであり、特に、少なくとも1つの刺激シグナリングドメインがSEQ ID NO:16のアミノ酸配列を含む、請求項1〜5のいずれか一項記載の抗原結合受容体。
【請求項７】
少なくとも1つの共刺激シグナリングドメインが、CD27の細胞内ドメイン、CD28の細胞内ドメイン、CD137の細胞内ドメイン、OX40の細胞内ドメイン、ICOSの細胞内ドメイン、DAP10の細胞内ドメイン、およびDAP12の細胞内ドメイン、またはそれらのフラグメントからなる群より個別に選択される、請求項1〜6のいずれか一項記載の抗原結合受容体。
【請求項８】
少なくとも1つの共刺激シグナリングドメインが、CD28の細胞内ドメインまたはそのフラグメントであり、特に、少なくとも1つの共刺激シグナリングドメインがSEQ ID NO:15のアミノ酸配列を含む、請求項1〜7のいずれか一項記載の抗原結合受容体。
【請求項９】
CD3zの細胞内ドメインまたはそのフラグメントを含む1つの刺激シグナリングドメインを含み、かつCD28の細胞内ドメインまたはそのフラグメントを含む1つの共刺激シグナリングドメインを含む、請求項1〜8のいずれか一項記載の抗原結合受容体。
【請求項１０】
抗原結合部分が重鎖定常ドメイン（CH）および軽鎖定常ドメイン（CL）を含み、該CHドメインまたは該CLドメインが、C末端において、アンカリング膜貫通ドメインのN末端へと、任意でペプチドリンカーを介して連結されている、請求項1〜9のいずれか一項記載の抗原結合受容体。
【請求項１１】
アンカリング膜貫通ドメインのC末端へとN末端において連結されている1つの共シグナリングドメインを含む、請求項4〜10のいずれか一項記載の抗原結合受容体。
【請求項１２】
共刺激シグナリングドメインのC末端へとN末端において連結されている1つの刺激シグナリングドメインをさらに含む、請求項11記載の抗原結合受容体。
【請求項１３】
抗原結合部分が、線維芽細胞活性化タンパク質（FAP）、癌胎児性抗原（CEA）、メソテリン（MSLN）、CD20、葉酸受容体1（FOLR1）、テネイシン（TNC）、およびプログラム死リガンド1（PDL1）からなる群より選択される抗原に対して特異的に結合する能力を有する、請求項1〜12のいずれか一項記載の抗原結合受容体。
【請求項１４】
少なくとも1つの抗原結合部分が、CD20に対して特異的に結合する能力を有し、該抗原結合部分が、
（i）（a）重鎖相補性決定領域（CDR H）1アミノ酸配列YSWIN（SEQ ID NO:1）、
（b）CDR H2アミノ酸配列
2020511979.tif 000124
、および
（c）CDR H3アミノ酸配列
2020511979.tif 000125
を含む重鎖可変領域（VH）と、
（ii）（d）軽鎖相補性決定領域（CDR L）1アミノ酸配列
2020511979.tif 000126
（e）CDR L2アミノ酸配列QMSNLVS（SEQ ID NO:5）、および
（f）CDR L3アミノ酸配列AQNLELPYT（SEQ ID NO:6）
を含む軽鎖可変領域（VL）と
を含む、請求項1〜13のいずれか一項記載の抗原結合受容体。
【請求項１５】
抗原結合部分が、PDL1に対して特異的に結合する能力を有し、該抗原結合部分が、
（i）（a）重鎖相補性決定領域（CDR H）1アミノ酸配列DSWIH（SEQ ID NO:68）、
（b）CDR H2アミノ酸配列
2020511979.tif 000127
、および
（c）CDR H3アミノ酸配列
2020511979.tif 000128
を含む重鎖可変領域（VH）と、
（ii）（d）軽鎖相補性決定領域（CDR L）1アミノ酸配列
2020511979.tif 000129
（e）CDR L2アミノ酸配列SASFLYS（SEQ ID NO:72）、および
（f）CDR L3アミノ酸配列QQYLYHPAT（SEQ ID NO:73）
を含む軽鎖可変領域（VL）と
を含む、請求項1〜13のいずれか一項記載の抗原結合受容体。
【請求項１６】
抗原結合部分が、CEAに対して特異的に結合する能力を有し、該抗原結合部分が、
（i）（a）重鎖相補性決定領域（CDR H）1アミノ酸配列EFGMN（SEQ ID NO:138）、
（b）CDR H2アミノ酸配列
2020511979.tif 000130
、および
（c）CDR H3アミノ酸配列
2020511979.tif 000131
を含む重鎖可変領域（VH）と、
（ii）（d）軽鎖相補性決定領域（CDR L）1アミノ酸配列
2020511979.tif 000132
（e）CDR L2アミノ酸配列SASYRKR（SEQ ID NO:142）、および
（f）CDR L3アミノ酸配列HQYYTYPLFT（SEQ ID NO:143）
を含む軽鎖可変領域（VL）と
を含む、請求項1〜13のいずれか一項記載の抗原結合受容体。
【請求項１７】
抗原結合部分が、CEAに対して特異的に結合する能力を有し、該抗原結合部分が、
（i）（a）重鎖相補性決定領域（CDR H）1アミノ酸配列DTYMH（SEQ ID NO:148）、
（b）CDR H2アミノ酸配列
2020511979.tif 000133
、および
（c）CDR H3アミノ酸配列
2020511979.tif 000134
を含む重鎖可変領域（VH）と、
（ii）（d）軽鎖相補性決定領域（CDR L）1アミノ酸配列
2020511979.tif 000135
（e）CDR L2アミノ酸配列RASNRAT（SEQ ID NO:152）、および
（f）CDR L3アミノ酸配列QQTNEDPYT（SEQ ID NO:153）
を含む軽鎖可変領域（VL）と
を含む、請求項1〜13のいずれか一項記載の抗原結合受容体。
【請求項１８】
請求項1〜17のいずれか一項記載の抗原結合受容体をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１９】
請求項18記載の単離されたポリヌクレオチドを含む、ベクター、特に発現ベクター。
【請求項２０】
請求項1〜17のいずれか一項記載の抗原結合受容体のうちの少なくとも1つを発現する能力を有する、形質導入T細胞。
【請求項２１】
Fab抗原結合部分を含む、請求項1〜17のいずれか一項記載の第1の抗原結合受容体
を含み、かつ
crossFab抗原結合部分を含む、請求項1〜17のいずれか一項記載の第2の抗原結合受容体
を含む、請求項20記載の形質導入T細胞。
【請求項２２】
医薬としての使用のための、請求項1〜17のいずれか一項記載の抗原結合受容体または請求項20もしくは請求項21のいずれか一項記載の形質導入T細胞。
【請求項２３】
抗原結合受容体を発現する形質導入T細胞の投与を含む、悪性疾患の処置
における使用のための、請求項1〜17のいずれか一項記載の抗原結合受容体または請求項20〜21のいずれか一項記載の形質導入T細胞。
【請求項２４】
悪性疾患が、上皮、内皮、または中皮起源のがんおよび血液のがんから選択される、請求項23記載の使用のための抗原結合受容体または形質導入T細胞。
【請求項２５】
請求項1〜17のいずれか一項記載の抗原結合受容体を発現する能力を有する形質導入T細胞を対象に投与する工程を含む、対象における疾患を処置する方法。
【請求項２６】
標的細胞を、請求項1〜17のいずれか一項記載の抗原結合受容体を発現する能力を有する形質導入T細胞と接触させる工程を含む、標的細胞の溶解を誘導するための方法。
【請求項２７】
医薬の製造のための、
請求項1〜17のいずれか一項記載の抗原結合受容体、請求項18記載の単離されたポリヌクレオチド、または請求項20もしくは請求項21のいずれか一項記載の形質導入T細胞
の使用。
【請求項２８】
医薬が、悪性疾患の処置のためのものである、請求項27記載の使用。
【請求項２９】
実質的に実施例のいずれか一つまたは添付の図面のいずれか一つを参照して上述した抗原結合受容体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、概して、腫瘍関連抗原に対して特異的に結合する能力を有する新しいフォーマットの抗原結合受容体に関する。より具体的には、本発明は、腫瘍細胞表面上の抗原と効率よくかつ特異的に結合/相互作用する抗原結合受容体、および該抗原結合受容体をトランスフェクト/形質導入したT細胞に関する。さらにまた本発明は、本発明の抗原結合受容体をコードする核酸分子およびベクターに関する。本発明は、特定の疾患の処置方法におけるT細胞の生産および使用、ならびに本発明の抗原結合受容体および/またはT細胞を含む薬学的組成物/医薬も提供する。
【背景技術】
【０００２】
背景
養子T細胞治療（ACT）は、がん特異的T細胞を用いる強力な処置アプローチである（Rosenberg and Restifo,Science 348（6230）（2015）,62-68（非特許文献1））。ACTでは、天然の腫瘍特異的な細胞を使用するか、キメラ抗原受容体を使って遺伝子工学によって特異的にしたT細胞を使用することができる（Rosenberg and Restifo,Science 348（6230）（2015）,62-68（非特許文献1））。ACTは、急性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫または黒色腫など、他の方法では処置不応性の進行疾患を患っている患者でさえ、うまく処置し、寛解させることができる（Dudley et al.,J Clin Oncol 26（32）（2008）,5233-5239（非特許文献2）、Grupp et al.,N Engl J Med 368（16）（2013）,1509-1518（非特許文献3）、Kochenderfer et al.,J Clin Oncol.（2015）33（6）:540-549,doi:10.1200/JCO.2014.56.2025.Epub 2014 Aug 25（非特許文献4））。
【０００３】
しかしACTは、その際立った臨床有効性にも関わらず、導入されたキメラ抗原受容体のオフ効果ゆえに、または健常組織における標的抗原の発現ゆえに、生命を脅かす毒性ももたらしうる。実際、標的となる抗原の大半は腫瘍に関連しているが、完全に腫瘍選択的であるわけではない。その結果生じるオフターゲット効果は、いくつかの治験において、重篤な毒性につながった。例えば、がん細胞によって高発現されるが健常細胞でも低レベルに発現されるErbB2を標的とするCAR T細胞は、心肺の上皮に対する急性毒性を引き起こした（Morgan et al.,Mol Ther 18（2010）,843-851（非特許文献5））。毒性を克服するための戦略の一つで、現在その評価が行われているのは、標的抗原に対するCARアフィニティーの低減である。しかしこれらのアプローチは、意図した作用部位におけるACTの有効性も制限しうる。
【０００４】
加えて、ACTは、ひとたび腫瘍部位に蓄積すると、T細胞応答がさまざまな理由で抑制されるという事実によって、さらに制限される。腫瘍微小環境では、リプレッサー細胞、腫瘍細胞または間質細胞からの可溶性分泌因子、および栄養枯渇によって、効率的な浸潤が妨げられうる。さらにまたT細胞は、例えば細胞傷害性Tリンパ球関連抗原4（CTLA-4）およびプログラム細胞死1（PD-1）など、活性化されたときにT細胞応答を抑制する複数種の免疫抑制性受容体を発現する。今後の臨床モデルは、腫瘍特異性および細胞傷害性を保ったまま、T細胞抑制に対抗し、これを克服する必要がある。
【０００５】
したがって標的腫瘍治療、特に養子T細胞治療は、がん患者のニーズを満たすために、今なお、より差別化されたツールを必要としている。したがって、ACTの安全性および有効性を改良し、上述の欠点を克服する可能性がある新しい手段を提供することが、今なお必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Rosenberg and Restifo,Science 348（6230）（2015）,62-68
【非特許文献２】Dudley et al.,J Clin Oncol 26（32）（2008）,5233-5239
【非特許文献３】Grupp et al.,N Engl J Med 368（16）（2013）,1509-1518
【非特許文献４】Kochenderfer et al.,J Clin Oncol.（2015）33（6）:540-549,doi:10.1200/JCO.2014.56.2025.Epub 2014 Aug 25
【非特許文献５】Morgan et al.,Mol Ther 18（2010）,843-851
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、概して、特徴的な標的、すなわち腫瘍関連抗原（TAA）に対して、特異的に結合する能力を有する新しい抗原結合受容体フォーマット、およびそれらの抗原結合受容体を発現するT細胞に関する。本発明の抗原結合受容体は、1つまたは複数の抗原結合受容体が標的細胞、すなわち腫瘍細胞に結合したときに、T細胞の強い選択的活性化をもたらす。
【０００８】
一局面において、本発明は、アンカリング膜貫通ドメインと、抗原結合部分を含む細胞外ドメインとを含む、抗原結合受容体であって、抗原結合部分がFab、crossFab、またはscFabフラグメントである、抗原結合受容体に関する。
【０００９】
一態様において、アンカリング膜貫通ドメインは、CD8、CD3z、FCGR3A、NKG2D、CD27、CD28、CD137、OX40、ICOS、DAP10、もしくはDAP12膜貫通ドメイン、またはそれらのフラグメントからなる群より選択される膜貫通ドメインである。
【００１０】
一態様において、アンカリング膜貫通ドメインはCD28膜貫通ドメインまたはそのフラグメントであり、特に、アンカリング膜貫通ドメインはSEQ ID NO:14のアミノ酸配列を含む。
【００１１】
一態様において、抗原結合受容体は、少なくとも1つの刺激シグナリングドメインおよび/または少なくとも1つの共刺激シグナリングドメインをさらに含む。
【００１２】
一態様において、少なくとも1つの刺激シグナリングドメインは、CD3zの細胞内ドメイン、FCGR3Aの細胞内ドメイン、およびNKG2Dの細胞内ドメイン、またはそれらのフラグメントからなる群より、個別に選択される。
【００１３】
一態様において、少なくとも1つの刺激シグナリングドメインは、CD3zの細胞内ドメインまたはそのフラグメントであり、特に、少なくとも1つの刺激シグナリングドメインはSEQ ID NO:16のアミノ酸配列を含む。
【００１４】
一態様において、少なくとも1つの共刺激シグナリングドメインは、CD27の細胞内ドメイン、CD28の細胞内ドメイン、CD137の細胞内ドメイン、OX40の細胞内ドメイン、ICOSの細胞内ドメイン、DAP10の細胞内ドメイン、およびDAP12の細胞内ドメイン、またはそれらのフラグメントからなる群より、個別に選択される。
【００１５】
一態様において、少なくとも1つの共刺激シグナリングドメインは、CD28の細胞内ドメインまたはそのフラグメントであり、特に、少なくとも1つの共刺激シグナリングドメインはSEQ ID NO:15のアミノ酸配列を含む。
【００１６】
一態様において、抗原結合受容体は、CD3zの細胞内ドメインまたはそのフラグメントを含む1つの刺激シグナリングドメインを含み、そして抗原結合受容体は、CD28の細胞内ドメインまたはそのフラグメントを含む1つの共刺激シグナリングドメインを含む。
【００１７】
一態様において、刺激シグナリングドメインはSEQ ID NO:16のアミノ酸配列を含み、共刺激シグナリングドメインはSEQ ID NO:15のアミノ酸配列を含む。
【００１８】
一態様において、細胞外ドメインは、アンカリング膜貫通ドメインへと、任意でペプチドリンカーを介して連結されている。
【００１９】
一態様において、ペプチドリンカーはアミノ酸配列GGGGS（SEQ ID NO:20）を含む。
【００２０】
一態様において、アンカリング膜貫通ドメインは、共シグナリングドメインまたはシグナリングドメインへと、任意でペプチドリンカーを介して連結されている。
【００２１】
一態様において、シグナリングドメインおよび/または共シグナリングドメインは、任意で少なくとも1つのペプチドリンカーを介して連結されている。
【００２２】
一態様において、抗原結合部分は重鎖定常（CH）ドメインおよび軽鎖定常ドメイン（CL）を含み、CHドメインまたはCLドメインは、C末端において、アンカリング膜貫通ドメインのN末端へと、任意でペプチドリンカーを介して連結されている。
【００２３】
一態様において、抗原結合受容体は1つの共シグナリングドメインを含み、共シグナリングドメインは、N末端において、アンカリング膜貫通ドメインのC末端へと連結されている。
【００２４】
一態様において、抗原結合受容体は1つの刺激シグナリングドメインをさらに含み、刺激シグナリングドメインは、N末端において、共刺激シグナリングドメインのC末端へと連結されている。
【００２５】
一態様において、抗原結合部分は、FAP、CEA、p95、BCMA、EpCAM、MSLN、MCSP、HER-1、HER-2、HER-3、CD19、CD20、CD22、CD33、CD38、CD52Flt3、FOLR1、Trop-2、CA-12-5、HLA-DR、MUC-1（ムチン）、A33抗原、PSMA、PSCA、トランスフェリン受容体、TNC（テネイシン）、CA-IX、およびPDL1からなる群より選択される抗原に対して、またはヒト主要組織適合遺伝子複合体（MHC）の分子に結合したペプチドに対して特異的に結合する能力を有する。
【００２６】
一態様において、抗原結合部分は、線維芽細胞活性化タンパク質（FAP）、癌胎児性抗原（CEA）、メソテリン（MSLN）、CD20、葉酸受容体1（FOLR1）、テネイシン（TNC）、およびプログラム死リガンド1（PDL1）からなる群より選択される抗原に対して特異的に結合する能力を有する。
【００２７】
一態様において、抗原結合部分は、CD20に対して特異的に結合する能力を有し、抗原結合部分は、
（i）（a）重鎖相補性決定領域（CDR H）1アミノ酸配列YSWIN（SEQ ID NO:1）、
（b）CDR H2アミノ酸配列
2020511979.tif 000003
、および
（c）CDR H3アミノ酸配列
2020511979.tif 000004
を含む重鎖可変領域（VH）と、
（ii）（d）軽鎖相補性決定領域（CDR L）1アミノ酸配列
2020511979.tif 000005
（e）CDR L2アミノ酸配列QMSNLVS（SEQ ID NO:5）、および
（f）CDR L3アミノ酸配列AQNLELPYT（SEQ ID NO:6）
を含む軽鎖可変領域（VL）と
を含む。
【００２８】
一態様において、抗原結合部分は、CD20に対して特異的に結合する能力を有し、抗原結合部分は、SEQ ID NO:12のアミノ酸と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）と、SEQ ID NO:10のアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（VL）とを含む。
【００２９】
一態様において、抗原結合部分はSEQ ID NO:12の重鎖可変領域（VH）とSEQ ID NO:10の軽鎖可変領域（VL）とを含む。
【００３０】
一態様において、抗原結合部分は、CD20に対して特異的に結合する能力を有するFabフラグメントであり、抗原結合受容体は、
a）SEQ ID NO:7およびSEQ ID NO:50からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％または100％同一である第1のポリペプチドと、
b）SEQ ID NO:9およびSEQ ID NO:8からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％または100％同一である第2のポリペプチドと
を含む。
【００３１】
一態様において、抗原結合部分は、CD20に対して特異的に結合する能力を有するcrossFabフラグメントであり、抗原結合受容体は、
a）SEQ ID NO:36およびSEQ ID NO:41からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％または100％同一である第1のポリペプチドと、
b）SEQ ID NO:38およびSEQ ID NO:43からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％または100％同一である第2のポリペプチドと
を含む。
【００３２】
一態様において、抗原結合部分は、CD20に対して特異的に結合する能力を有するscFabフラグメントであり、抗原結合受容体は、SEQ ID NO:51のアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％または100％同一であるポリペプチドを含む。
【００３３】
一態様において、抗原結合部分は、PDL1に対して特異的に結合する能力を有し、抗原結合部分は、
（i）（a）重鎖相補性決定領域（CDR H）1アミノ酸配列DSWIH（SEQ ID NO:68）、
（b）CDR H2アミノ酸配列
2020511979.tif 000006
、および
（c）CDR H3アミノ酸配列
2020511979.tif 000007
を含む重鎖可変領域（VH）と、
（ii）（d）軽鎖相補性決定領域（CDR L）1アミノ酸配列
2020511979.tif 000008
（e）CDR L2アミノ酸配列SASFLYS（SEQ ID NO:72）、および
（f）CDR L3アミノ酸配列QQYLYHPAT（SEQ ID NO:73）
を含む軽鎖可変領域（VL）と
を含む。
【００３４】
一態様において、抗原結合部分は、PDL1に対して特異的に結合する能力を有し、抗原結合部分は、SEQ ID NO:78のアミノ酸と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）と、SEQ ID NO:77のアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（VL）とを含む。
【００３５】
一態様において、抗原結合部分はSEQ ID NO:78の重鎖可変領域（VH）とSEQ ID NO:77の軽鎖可変領域（VL）とを含む。
【００３６】
一態様において、抗原結合部分は、PDL1に対して特異的に結合する能力を有するFabフラグメントであり、抗原結合受容体は、
a）SEQ ID NO:74およびSEQ ID NO:85からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％または100％同一である第1のポリペプチドと、
b）SEQ ID NO:76およびSEQ ID NO:75からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％または100％同一である第2のポリペプチドと
を含む。
【００３７】
一態様において、抗原結合部分は、PDL1に対して特異的に結合する能力を有するcrossFabフラグメントであり、抗原結合受容体は、
a）SEQ ID NO:79およびSEQ ID NO:82からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％または100％同一である第1のポリペプチドと、
b）SEQ ID NO:81およびSEQ ID NO:84からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％または100％同一である第2のポリペプチドと
を含む。
【００３８】
一態様において、抗原結合部分は、PDL1に対して特異的に結合する能力を有するscFabフラグメントであり、抗原結合受容体は、SEQ ID NO:86のアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％または100％同一であるポリペプチドを含む。
【００３９】
一態様において、抗原結合部分は、CEAに対して特異的に結合する能力を有し、抗原結合部分は、
（i）（a）重鎖相補性決定領域（CDR H）1アミノ酸配列EFGMN（SEQ ID NO:138）、
（b）CDR H2アミノ酸配列
2020511979.tif 000009
、および
（c）CDR H3アミノ酸配列
2020511979.tif 000010
を含む重鎖可変領域（VH）と、
（ii）（d）軽鎖相補性決定領域（CDR L）1アミノ酸配列
2020511979.tif 000011
（e）CDR L2アミノ酸配列SASYRKR（SEQ ID NO:142）、および
（f）CDR L3アミノ酸配列HQYYTYPLFT（SEQ ID NO:143）
を含む軽鎖可変領域（VL）と
を含む。
【００４０】
一態様において、抗原結合部分は、CEAに対して特異的に結合する能力を有し、抗原結合部分は、
（i）（a）重鎖相補性決定領域（CDR H）1アミノ酸配列DTYMH（SEQ ID NO:148）、
（b）CDR H2アミノ酸配列
2020511979.tif 000012
、および
（c）CDR H3アミノ酸配列
2020511979.tif 000013
を含む重鎖可変領域（VH）と、
（ii）（d）軽鎖相補性決定領域（CDR L）1アミノ酸配列
2020511979.tif 000014
（e）CDR L2アミノ酸配列RASNRAT（SEQ ID NO:152）、および
（f）CDR L3アミノ酸配列QQTNEDPYT（SEQ ID NO:153）
を含む軽鎖可変領域（VL）と
を含む。
【００４１】
一態様では、本明細書に記載の抗原結合受容体をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。
【００４２】
一態様では、第1のポリペプチドをコードする第1の単離されたポリヌクレオチドと第2のポリペプチドをコードする第2の単離されたポリヌクレオチドとを含む、本明細書に記載の抗原結合受容体をコードする組成物が提供される。
【００４３】
一態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドまたは本明細書に記載の組成物によってコードされるポリペプチドが提供される。
【００４４】
一態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチドまたは本明細書に記載の組成物を含むベクター、特に発現ベクターが提供される。
【００４５】
一態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチド、本明細書に記載の組成物、または本明細書に記載のベクターを含む形質導入T細胞が提供される。
【００４６】
一態様では、本明細書に記載の抗原結合受容体のうちの少なくとも1つを発現する能力を有する形質導入T細胞が提供される。
【００４７】
一態様では、
（i）Fab（VH-CH-ATD）抗原結合ドメインを含む、1種以下の抗原結合受容体、
（ii）Fab（VL-CL-ATD）抗原結合ドメインを含む、1種以下の抗原結合受容体、
（iii）crossFab（VL-CH-ATD）抗原結合ドメインを含む、1種以下の抗原結合受容体、および
（iv）crossFab（VH-CL-ATD）抗原結合ドメインを含む、1種以下の抗原結合受容体
を含む、本明細書に記載の形質導入T細胞が提供される。
【００４８】
一態様では、Fab抗原結合部分を含む本明細書に記載の第1の抗原結合受容体を含み、かつcrossFab抗原結合部分を含む本明細書に記載の第2の抗原結合受容体を含む、本明細書に記載の形質導入T細胞が提供される。
【００４９】
一態様では、Fab（VH-CH-ATD）抗原結合部分を含む本明細書に記載の第1の抗原結合受容体を含み、かつFab（VL-CL-ATD）抗原結合部分を含む本明細書に記載の第2の抗原結合受容体を含む、本明細書に記載の形質導入T細胞が提供される。
【００５０】
一態様では、crossFab（VL-CH-ATD）抗原結合部分を含む本明細書に記載の第1の抗原結合受容体を含み、かつcrossFab（VH-CL-ATD）抗原結合部分を含む本明細書に記載の第2の抗原結合受容体を含む、本明細書に記載の形質導入T細胞が提供される。
【００５１】
一態様では、scFab抗原結合部分を含む本明細書に記載の第1の抗原結合受容体を含み、かつscFv、Fab、またはcrossFab抗原結合部分を含む本明細書に記載の第2の抗原結合受容体を含む、本明細書に記載の形質導入T細胞が提供される。
【００５２】
一態様では、FAP、CEA、p95、BCMA、EpCAM、MSLN、MCSP、HER-1、HER-2、HER-3、CD19、CD20、CD22、CD33、CD38、CD52Flt3、FOLR1、Trop-2、CA-12-5、HLA-DR、MUC-1（ムチン）、A33抗原、PSMA、PSCA、トランスフェリン受容体、TNC（テネイシン）、CA-IX、およびPDL1からなる群より選択される抗原に対して、またはヒト主要組織適合遺伝子複合体（MHC）の分子に結合したペプチドに対して特異的に結合する能力を有する第1の抗原結合受容体を含む、本明細書に記載の形質導入T細胞が提供される。
【００５３】
一態様では、FAP、CEA、p95、BCMA、EpCAM、MSLN、MCSP、HER-1、HER-2、HER-3、CD19、CD20、CD22、CD33、CD38、CD52Flt3、FOLR1、Trop-2、CA-12-5、HLA-DR、MUC-1（ムチン）、A33抗原、PSMA、PSCA、トランスフェリン受容体、TNC（テネイシン）、CA-IX、およびPDL1からなる群より選択される抗原に対して、またはヒト主要組織適合遺伝子複合体（MHC）の分子に結合したペプチドに対して特異的に結合する能力を有する第2の抗原結合受容体を含む、本明細書に記載の形質導入T細胞が提供される。
【００５４】
一態様では、第1の腫瘍関連抗原（TAA）に対して特異的に結合する能力を有する第1の抗原結合受容体を含み、かつ、あるTAAに対して特異的に結合する能力を有する第2の抗原結合受容体を含む、本明細書に記載の形質導入T細胞が提供される。
【００５５】
一態様では、プログラム死リガンド1（PDL1）に対して特異的に結合する能力を有する第1の抗原結合受容体を含み、かつ線維芽細胞活性化タンパク質（FAP）、癌胎児性抗原（CEA）、メソテリン（MSLN）、CD20、葉酸受容体1（FOLR1）、およびテネイシン（TNC）からなる群より選択される抗原に対して特異的に結合する能力を有する第2の抗原結合受容体を含む、本明細書に記載の形質導入T細胞が提供される。
【００５６】
一態様では、PDL1に対して特異的に結合する能力を有する第1の抗原結合受容体を含み、かつCD20に対して特異的に結合する能力を有する第2の抗原結合受容体を含む、本明細書に記載の形質導入T細胞が提供される。
【００５７】
一態様では、標的抗原について特異的に結合する能力を有するT細胞受容体（TCR）が共形質導入されている、本明細書に記載の形質導入T細胞が提供される。
【００５８】
一態様では、医薬としての使用のための、本明細書に記載の抗原結合受容体または本明細書に記載の形質導入T細胞が提供される。
【００５９】
一態様では、悪性疾患の処置における使用のための、本明細書に記載の抗原結合受容体または本明細書に記載の形質導入T細胞が提供され、ここで処置は、抗原結合受容体を発現する形質導入T細胞の投与を含む。
【００６０】
一態様では、悪性疾患が、上皮、内皮、または中皮起源のがんおよび血液のがんから選択される、本明細書に記載の使用のための、抗原結合受容体または形質導入T細胞が提供される。
【００６１】
一態様では、処置される対象から単離された細胞に由来する、本明細書に記載の使用のための、形質導入T細胞が提供される。
【００６２】
一態様では、処置される対象から単離された細胞に由来しない、本明細書に記載の使用のための、形質導入T細胞が提供される。
【００６３】
一態様では、本明細書に記載の抗原結合受容体を発現する能力を有する形質導入T細胞を対象に投与する工程を含む、対象における疾患を処置する方法が提供される。一態様において、本方法は、対象からT細胞を単離する工程、および単離されたT細胞に、本明細書に記載のポリヌクレオチド、本明細書に記載の組成物、または本明細書に記載のベクターを形質導入することによって、形質導入T細胞を生成する工程をさらに含む。一態様において、T細胞は、レトロウイルスもしくはレンチウイルスベクター構築物または非ウイルスベクター構築物で形質導入される。一態様において、非ウイルスベクター構築物はスリーピング・ビューティー（sleeping beauty）ミニサークルベクターである。一態様において、形質導入T細胞は静脈内注入によって対象に投与される。一態様では、対象への投与に先だって、形質導入T細胞を抗CD3抗体および/または抗CD28抗体と接触させる。一態様では、対象への投与に先だって、形質導入T細胞を、少なくとも1つのサイトカインと、好ましくはインターロイキン-2（IL-2）、インターロイキン-7（IL-7）、インターロイキン-15（IL-15）、および/もしくはインターロイキン-21、またはそれらの変異体と、接触させる。一態様において、疾患は悪性疾患である。一態様において、疾患は、上皮、内皮、または中皮起源のがんおよび血液のがんから選択される。
【００６４】
一態様では、標的細胞を、本明細書に記載の抗原結合受容体を発現する能力を有する形質導入T細胞と接触させる工程を含む、標的細胞の溶解を誘導するための方法が提供される。一態様において、標的細胞はがん細胞である。一態様において、標的細胞は、FAP、CEA、p95、BCMA、EpCAM、MSLN、MCSP、HER-1、HER-2、HER-3、CD19、CD20、CD22、CD33、CD38、CD52Flt3、FOLR1、Trop-2、CA-12-5、HLA-DR、MUC-1（ムチン）、A33抗原、PSMA、PSCA、トランスフェリン受容体、TNC（テネイシン）、CA-IX、およびPDL1からなる群より選択される抗原を発現する。一態様において、標的細胞は、線維芽細胞活性化タンパク質（FAP）、癌胎児性抗原（CEA）、メソテリン（MSLN）、CD20、葉酸受容体1（FOLR1）、テネイシン（TNC）、およびプログラム死リガンド1（PDL1）からなる群より選択される抗原を発現する。
【００６５】
一態様では、医薬の製造のための、本明細書に記載の抗原結合受容体、本明細書に記載のポリヌクレオチド、本明細書に記載の組成物、または本明細書に記載の形質導入T細胞の使用が提供される。一態様において、医薬は、悪性疾患の処置のためのものである。一態様において、悪性疾患は、上皮、内皮、または中皮起源のがんおよび血液のがんから選択される。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１−１】図1は、本発明のさまざまな抗原結合受容体フォーマット、特にFab、crossFabおよびscFabフォーマットのアーキテクチャを示す。図1AはFabフォーマットのアーキテクチャを表す。Ig重鎖とIg軽鎖とからなる抗原結合部分を含む細胞外ドメインが示されている。重鎖に取り付けられたリンカーが、抗原認識ドメインを、細胞内共刺激シグナリングドメイン（CSD）に融合されたアンカリング膜貫通ドメイン（ATD）に連結し、そしてその細胞内共刺激シグナリングドメイン（CSD）は刺激シグナリングドメイン（SSD）に融合されている。図1Bは、重軽鎖スワップ（heavy and light chain swap）が施されたFabフォーマットのアーキテクチャを表す。Ig重鎖とIg軽鎖とからなる抗原結合部分を含む細胞外ドメインが示されている。軽鎖定常ドメインに取り付けられたリンカーが、抗原認識ドメインを、細胞内共刺激シグナリングドメイン（CSD）に融合されたアンカリング膜貫通ドメイン（ATD）に連結し、そしてその細胞内共刺激シグナリングドメイン（CSD）は刺激シグナリングドメイン（SSD）に融合されている。図1Cは、scFabフォーマットのアーキテクチャを表す。リンカーで双方連結されたIg重鎖とIg軽鎖とからなる抗原結合部分を含む細胞外ドメインが示されている。重鎖に取り付けられたリンカーが、抗原認識ドメインを、細胞内共刺激シグナリングドメイン（CSD）に融合されたアンカリング膜貫通ドメイン（ATD）に連結し、そしてその細胞内共刺激シグナリングドメイン（CSD）は刺激シグナリングドメイン（SSD）に融合されている。
【図１−２】図1は、本発明のさまざまな抗原結合受容体フォーマット、特にFab、crossFabおよびscFabフォーマットのアーキテクチャを示す。図1Dは、VH-VLスワップが施されたcrossFabフォーマットのアーキテクチャを表す。VHドメインとVLドメインとが交換されたIg重鎖とIg軽鎖とからなる抗原結合部分を含む細胞外ドメインが示されている。重鎖定常ドメインに取り付けられたリンカーが、抗原認識ドメインを、細胞内共刺激シグナリングドメイン（CSD）に融合されたアンカリング膜貫通ドメイン（ATD）に連結し、そしてその細胞内共刺激シグナリングドメイン（CSD）は刺激シグナリングドメイン（SSD）に融合されている。図1Eは、CH-CLスワップが施されたcrossFabフォーマットのアーキテクチャを表す。CHドメインとCLドメインとが交換されたIg重鎖とIg軽鎖とからなる抗原結合部分を含む細胞外ドメインが示されている。軽鎖定常ドメインに取り付けられたリンカーが、抗原認識ドメインを、細胞内共刺激シグナリングドメイン（CSD）に融合されたアンカリング膜貫通ドメイン（ATD）に連結し、そしてその細胞内共刺激シグナリングドメイン（CSD）は刺激シグナリングドメイン（SSD）に融合されている。図1Fは、リンカーで双方連結された可変重鎖と可変軽鎖とからなる細胞外抗原認識ドメインを持つ古典的scFvフォーマットのアーキテクチャを表す。可変軽鎖に取り付けられたリンカーが、抗原認識ドメインを、細胞内共刺激シグナリングドメイン（CSD）に融合されたアンカリング膜貫通ドメイン（ATD）に連結し、そしてその細胞内共刺激シグナリングドメイン（CSD）は刺激シグナリングドメイン（SSD）に融合されている。
【図２】図2は、本発明の抗原結合受容体をコードする例示的発現構築物のモジュール組成を説明する概略図である。図2Aおよび図2Bは例示的Fabフォーマットを示している。図2Cは例示的scFabフォーマットを示している。図2Dおよび図2Eは例示的crossFabフォーマットを示している。図2Fは古典的scFvフォーマットを示している。
【図３】図3はJurkat NFAT T細胞レポーターアッセイの概略図である。腫瘍関連抗原（TAA）は抗TAA抗原結合受容体発現Jurkat NFAT T細胞によって認識されうる。この認識は、発光（cps）を測定することによって検出することができる細胞の活性化をもたらす。
【図４】図4は、標的細胞としてCD20発現SUDHDL4腫瘍細胞を用いるJurkat NFAT T細胞レポーターアッセイを示している。抗CD20-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞の単一クローンをエフェクター細胞として使用した。
【図５】図5は、標的細胞としてCD20発現SUDHDL4腫瘍細胞を用いるJurkat NFAT T細胞レポーターアッセイを示している。抗CD20-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSDまたは抗CD20-crossFab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞のプールをエフェクター細胞として使用した。
【図６】図6は、標的細胞としてCD20発現SUDHDL4腫瘍細胞を用いるJurkat NFAT T細胞レポーターアッセイを示している。抗CD20-scFab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞のプールをエフェクター細胞として使用した。
【図７】図7は、標的細胞としてCD20発現SUDHDL4腫瘍細胞を用いるJurkat NFAT T細胞レポーターアッセイを示している。抗CD20-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSDまたは抗CD20-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞のプールをエフェクター細胞として使用した。
【図８】図8は、標的細胞としてCD20発現SUDHDL4腫瘍細胞を用いる殺傷アッセイを示している。抗CD20-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現T細胞のプールをエフェクター細胞として使用した。
【発明を実施するための形態】
【００６７】
詳細な説明
定義
本明細書において、用語は、以下に別段の定義がある場合を除き、当技術分野において一般に使用されているように使用される。
【００６８】
「活性化Fc受容体」は、抗体のFcドメインによる結合に続いて、エフェクター機能を遂行するように受容体保持細胞を刺激するシグナリング事象を誘発するFc受容体である。ヒト活性化Fc受容体には、FcγRIIIa（CD16a）、FcγRI（CD64）、FcγRIIa（CD32）およびFcαRI（CD89）が含まれる。
【００６９】
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（「ADCC」）は、抗体で被覆された標的細胞の、免疫エフェクター細胞による溶解につながる、免疫機序である。標的細胞は、Fc領域を含む抗体またはその誘導体が、一般的にはFc領域のN末端側にあるタンパク質部分を介して結合する細胞である。本明細書において使用する用語「低減したADCC」は、標的細胞を取り巻く培地中の所与の抗体濃度において、所与の時間内に、上に定義したADCCの機序によって溶解される標的細胞の数の低減、および/または所与の時間内に、所与の数の標的の、ADCCの機序による溶解を達成するのに必要な、標的細胞を取り巻く培地中の抗体濃度の増加と定義される。ADCCの低減は、同じ標準的生産方法、精製方法、製剤方法および貯蔵方法（当業者に公知のもの）を使って、同じタイプの宿主細胞によって生産される同じ抗体であるが、変異が導入されていないものによって媒介されるADCCとの比較である。例えば、ADCCを低減させるアミノ酸変異をそのFcドメインに含む抗体によって媒介されるADCCの低減は、Fcドメインにこのアミノ酸変異を持たない同じ抗体によって媒介されるADCCとの比較である。ADCCを測定するための適切なアッセイは当技術分野において周知である（例えばPCT公開番号WO 2006/082515またはPCT公開番号WO 2012/130831参照）。
【００７０】
作用物質の「有効量」とは、それが投与される細胞または組織に生理学的変化をもたらすのに必要な量を指す。
【００７１】
「アフィニティー」とは、ある分子（例えば受容体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えばリガンド）との間の非共有結合的相互作用の総和の強さを指す。別段の表示がある場合を除き、本明細書において使用する「結合アフィニティー」は、結合ペアのメンバー（例:抗原結合部分と抗原および/または受容体とそのリガンド）間の1:1相互作用を反映する固有の結合アフィニティーを指す。分子Xの、そのパートナーYに対するアフィニティーは、一般に、解離速度定数と会合速度定数（それぞれkoffおよびkon）の比である解離定数（KD）によって表すことができる。したがって等価なアフィニティーは、速度定数の比が同じままである限り、異なる速度定数を含みうる。アフィニティーは、本明細書に記載する方法を含む、当技術分野において公知の確立された方法によって測定することができる。アフィニティーを測定するための好ましい方法は表面プラズモン共鳴（SPR）であり、好ましい測定温度は25℃である。
【００７２】
「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸および合成アミノ酸ならびに天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸ミメティックを指す。天然アミノ酸は、遺伝暗号によってコードされているもの、および後から修飾されたアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタミン酸およびO-ホスホセリンである。アミノ酸類似体とは、天然アミノ酸と同じ基本的化学構造、すなわち水素、カルボキシル基、アミノ基およびR基に結合したα炭素を有する化合物、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。そのような類似体は修飾されたR基（例えばノルロイシン）または修飾されたペプチド主鎖を有するが、天然アミノ酸と同じ基本的化学構造は保っている。アミノ酸ミメティックとは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然アミノ酸と同様に機能する化学化合物を指す。本明細書では、一般に公知であるそれぞれの三文字記号によって、またはIUPAC-IUB生化学命名委員会の勧告による一文字記号によって、アミノ酸に言及する場合がある。
【００７３】
本明細書において使用する用語「アミノ酸変異」は、アミノ酸の置換、欠失、挿入および修飾を包含するものとする。最終構築物が所望の特徴を持つ限り、置換、欠失、挿入および修飾を任意に組み合わせて、最終構築物に到達することができる。アミノ酸配列の欠失および挿入には、アミノ末端および/またはカルボキシ末端の欠失ならびにアミノ酸の挿入が含まれる。特定のアミノ酸変異はアミノ酸置換である。例えば抗原結合部分の結合特徴などを改変するという目的には、非保存的アミノ酸置換、すなわちあるアミノ酸を構造的および/または化学的特性が異なる別のアミノ酸で置き換えることが、特に好ましい。アミノ酸置換には、非天然アミノ酸による置き換え、または20種の標準アミノ酸の天然アミノ酸誘導体（例:4-ヒドロキシプロリン、3-メチルヒスチジン、オルニチン、ホモセリン、5-ヒドロキシリジン）による置き換えが含まれる。アミノ酸変異は、当技術分野において周知の遺伝学的方法または化学的方法を使って生成させることができる。遺伝学的方法としては、部位特異的変異導入法、PCR、遺伝子合成などを挙げることができる。化学修飾など、遺伝子工学以外の方法で、アミノ酸の側鎖基を改変する方法も役立ちうると考えられる。本明細書では、同じアミノ酸変異を示すために、さまざまな名称を使用しうる。例えばFcドメインの329番目におけるプロリンからグリシンへの置換は、329G、G329、G329、P329GまたはPro329Glyと示すことができる。
【００７４】
本明細書において「抗体」という用語は、最も広義に使用され、さまざまな抗体構造、例えば限定するわけではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、および抗体フラグメントを、それらが所望の抗原結合活性を呈する限り、包含する。したがって、本発明との関連において抗体という用語は、完全な免疫グロブリン分子にも、そのような免疫グロブリン分子のパーツにも関係する。さらにまた、この用語は、本明細書において論じるとおり、修飾および/または改変された抗体分子、特に変異型抗体分子にも関係する。この用語は、組換え的にまたは合成的に作製/合成された抗体にも関係する。本発明との関連において、抗体という用語は、免疫グロブリンという用語と相互可換的に使用される。
【００７５】
「抗体フラグメント」とは、インタクト抗体のうち、インタクト抗体が結合する抗原に結合する部分を含む、インタクト抗体以外の分子を指す。抗体フラグメントの例として、Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F（ab’）2、ダイアボディ、線状抗体、単鎖抗体分子（例えばscFvまたはscFab）、および単一ドメイン抗体が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。一定の抗体フラグメントに関する総説としてHudson et al.,Nat Med 9,129-134（2003）を参照されたい。scFvフラグメントの総説として、例えばPlueckthun,in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315（1994）を参照されたい。また、WO 93/16185ならびに米国特許第5,571,894号および同第5,587,458号も参照されたい。ダイアボディは、二価であっても二重特異性であってもよい2つの抗原結合部位を持つ抗体フラグメントである。例えばEP 404,097、WO 1993/01161、Hudson et al.,Nat Med 9,129-134（2003）およびHollinger et al.,Proc Natl Acad Sci USA 90,6444-6448（1993）を参照されたい。トリアボディおよびテトラボディもHudson et al.,Nat Med 9,129-134（2003）に記載されている。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全部もしくは一部または軽鎖可変ドメインの全部もしくは一部を含む抗体フラグメントである（Domantis,Inc.、マサチューセッツ州ウォルサム、例えば米国特許第6,248,516号（B1）を参照されたい）。抗体フラグメントは、本明細書に記載するように、さまざまな技法によって、例えば限定するわけではないがインタクト抗体のタンパク質分解消化および組換え宿主細胞（例えば大腸菌（E.coli）またはファージ）による生産などによって作ることができる。
【００７６】
本明細書において使用する用語「抗原結合分子」は、その最も広い意味において、抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。抗原結合分子の例は、免疫グロブリンおよびその誘導体、例えばそのフラグメント、ならびに抗原結合受容体およびその誘導体である。
【００７７】
本明細書において使用する用語「抗原結合部分」は、抗原決定基に特異的に結合するポリペプチド分子を指す。一態様において、抗原結合部分は、それが取り付けられている実体（例:免疫グロブリンまたは抗原結合受容体）を、標的部位に、例えば抗原決定基を保持する特定タイプの腫瘍細胞または腫瘍間質に、または腫瘍細胞上の抗原決定基に結合する免疫グロブリンに、向かわせることができる。別の一態様において、抗原結合部分は、その標的抗原によるシグナリングを活性化することができる。例えば、抗原決定基がT細胞上の抗原結合受容体に結合すると、シグナリングが活性化される。本発明との関連において、抗原結合部分は、抗体およびそのフラグメント、ならびに本明細書においてさらに詳しく定義する抗原結合受容体およびそのフラグメントに含まれうる。抗原結合部分は、免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む抗原結合ドメインを含む。一定の態様において、抗原結合部分は、本明細書においてさらに詳しく定義する当技術分野において公知の免疫グロブリン定常領域を含みうる。有用な重鎖定常領域として、5種のアイソタイプ:α、δ、ε、γまたはμのいずれかが挙げられる。有用な軽鎖定常領域として、2種のアイソタイプ:κおよびλのいずれかが挙げられる。
【００７８】
本発明との関連において、用語「抗原結合受容体」は、アンカリング膜貫通ドメインと、少なくとも1つの抗原結合部分を含む細胞外ドメインとを含む、抗原結合分子に関する。抗原結合受容体は、異なる供給源からのポリペプチドパーツで構成されうる。したがって、これを「融合タンパク質」および/または「キメラタンパク質」として理解することもできる。通常、融合タンパク質は、元々は別個のタンパク質をコードしていた2つ以上の遺伝子（または好ましくはcDNA）を接合することによって作出されるタンパク質である。この融合遺伝子（または融合cDNA）の翻訳は、好ましくは元のタンパク質のそれぞれに由来する機能的特性を持つ、単一のポリペプチドをもたらす。組換え融合タンパク質は、生物学的研究または治療法において使用するための組換えDNA技術によって、人工的に作出される。本発明の抗原結合受容体のさらなる詳細は後述する。本発明との関連において、CAR（キメラ抗原受容体）は、スペーサー配列によってアンカリング膜貫通ドメインに融合された抗原結合部分を含む細胞外部分を含み、アンカリング膜貫通ドメイン自体はCD3zおよびCD28の細胞内シグナリングドメインに融合されている、抗原結合受容体であると理解される。
【００７９】
「抗原結合部位」とは、抗原結合分子のうち、抗原との相互作用を与える部位、すなわち1つまたは複数のアミノ酸残基を指す。例えば抗体または抗原結合受容体の抗原結合部位は、相補性決定領域（CDR）からのアミノ酸残基を含む。ネイティブ免疫グロブリン分子は、典型的には、2つの抗原結合部位を有し、Fab、crossFab、scFabまたはscFv分子は、典型的には、1つの抗原結合部位を有する。
【００８０】
「抗原結合ドメイン」という用語は、抗体または抗原結合受容体のうち、抗原の一部または全部に特異的に結合し抗原の一部または全部に相補的である区域を含むパーツを指す。抗原結合ドメインは、例えば1つまたは複数の免疫グロブリン可変ドメイン（可変領域ともいう）によって与えられうる。特に、抗原結合ドメインは、免疫グロブリン軽鎖可変領域（VL）および免疫グロブリン重鎖可変領域（VH）を含む。
【００８１】
「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗原結合に関与する、免疫グロブリン重鎖または軽鎖のドメインを指す。ネイティブ抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれVHおよびVL）は一般に類似する構造を有し、各ドメインは4つの保存されたフレームワーク領域（FR）と3つの超可変領域（HVR）とを含んでいる。例えばKindt et al.,Kuby Immunology,6th ed.,W.H.Freeman and Co.,page 91（2007）を参照されたい。抗原結合特異性を付与するには、単一のVHドメインまたはVLドメインで、通常は十分である。
【００８２】
本明細書において使用する用語「ATD」は、細胞の細胞膜と一体化する能力を有するポリペプチドストレッチを規定する「アンカリング膜貫通ドメイン」を指す。ATDは、さらなる細胞外および/または細胞内ポリペプチドドメインに融合することができ、その場合、これらの細胞外および/または細胞内ポリペプチドドメインもまた、細胞膜に拘束されることになる。本発明の抗原結合受容体との関連において、ATDは、本発明の抗原結合受容体の膜付着および膜拘束を与える。本発明の抗原結合受容体は、少なくとも1つのATDと抗原結合部分を含む細胞外ドメインとを含む。加えて、ATDを、さらなる細胞内シグナリングドメインに融合してもよい。
【００８３】
本発明の抗原結合受容体との関連において使用される「に結合する」という用語は、「抗原相互作用部位」と抗原との相互の結合（相互作用）を規定する。「抗原相互作用部位」という用語は、本発明の抗原結合受容体では、特異的抗原または抗原の特異的基と特異的に相互作用する能力を示す、ポリペプチドのモチーフを規定する。該結合/相互作用は「特異的認識」を規定するとも理解される。「特異的に認識する」という用語は、本発明では、抗原結合受容体が、本明細書において定義する腫瘍関連抗原（TAA）分子と特異的に相互作用しかつ/またはそれに結合する能力を有することを意味する。抗原結合受容体の抗原結合部分は、同じ分子上の異なるエピトープを認識し、それらと相互作用しかつ/またはそれらに結合することができる。この用語は、抗原結合受容体の特異性、すなわち、本明細書において定義する分子の特異的領域同士を識別するその能力に関係する。抗原相互作用部位とその特異的抗原との特異的相互作用は、例えば抗原を含むポリペプチドのコンフォメーション変化、抗原を含むポリペプチドのオリゴマー化、抗原結合受容体のオリゴマー化などの誘導により、シグナルの開始をもたらしうる。こうして、抗原相互作用部位のアミノ酸配列中の特異的モチーフと抗原とは、それらの一次、二次または三次構造の結果として、そしてまた該構造の二次修飾の結果として、互いに結合する。したがって、に結合するという用語は、線状エピトープに関係するだけでなく、コンフォメーショナルエピトープ、構造エピトープ、または標的分子もしくはそのパーツのうちの2つの領域からなる不連続エピトープにも関係する。本発明との関連において、コンフォメーショナルエピトープは、一次配列では離れているが、ポリペプチドがネイティブタンパク質に折りたたまれると分子の表面上で集合する、2つ以上の不連続なアミノ酸配列によって規定される（Sela,Science 166（1969）,1365およびLaver,Cell 61（1990）,553-536）。さらにまた、「に結合する」という用語は、本発明との関連においては、「と相互作用する」という用語と相互可換的に使用される。抗原結合受容体または抗体の抗原結合部分（例えばFab、crossFab、scFabまたはscFvドメイン）の、特異的標的抗原決定基に結合する能力は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）、または当業者によく知られている他の技法、例えば表面プラズモン共鳴（SPR）技法（BIAcore計器で分析されるもの）（Liljeblad et al.,Glyco J 17,323-329（2000））および従来の結合アッセイ（Heeley,Endocr Res 28,217-229（2002））などのいずれかによって測定することができる。一態様において、無関係なタンパク質への抗原結合部分の結合の程度は、特にSPRで測定した場合に、標的抗原への抗原結合部分の結合の約10％未満である。一定の態様において、標的抗原に結合する抗原結合部分は、≦1μM、≦100nM、≦10nM、≦1nM、≦0.1nM、≦0.01nM、または≦0.001nM（例:10-8M以下、例えば10-8M〜10-13M、例えば10-9M〜10-13M）の解離定数（KD）を有する。本発明において使用する用語「特異的結合」は、本発明の分子が、類似する構造の（ポリ）ペプチドと交差反応しないことまたは本質的には交差反応しないことを意味する。調査対象である一群の構築物の交差反応性は、例えば、関心対象の抗原および無関係な抗原への、一群の���原結合部分の結合を、従来の条件下（例えばHarlow and Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,（1988）およびUsing Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,（1999）参照）で評価することによって、試験しうる。本明細書に提供される方法では、関心対象の抗原には結合するが、無関係な抗原には結合しないか本質的には結合しない構築物（すなわちFabフラグメント、scFvなど）だけが、関心対象の抗原に特異的であるとみなされ、さらなる研究のために選択される。これらの方法は、なかんずく、構造的および/または機能的に近い関係にあるポリペプチドを使った結合研究、遮断および競合研究を含みうる。結合研究は、FACS分析、表面プラズモン共鳴（SPR、例えばBIAcore（登録商標）によるもの）、分析用超遠心法、等温滴定熱量測定、蛍光異方性、蛍光分光法または放射標識リガンド結合アッセイも含む。
【００８４】
本明細書において使用する用語「CDR」は、当技術分野において周知の「相補性決定領域」に関係する。CDRは、免疫グロブリンまたは抗原結合受容体のうち、該分子の特異性を決定し、特異的リガンドと接触するパーツである。CDRは、分子の最も可変的なパーツであり、これらの分子の抗原結合多様性に寄与する。各Vドメインには3つのCDR領域CDR1、CDR2およびCDR3が存在する。CDR-Hは可変重鎖のCDR領域を示し、CDR-Lは可変軽鎖のCDR領域に関係する。VHは可変重鎖を意味し、VLは可変軽鎖を意味する。Ig由来領域のCDR領域は、「Kabat」（Sequences of Proteins of Immunological Interest”,5th edit.NIH Publication no.91-3242 U.S.Department of Health and Human Services（1991）、Chothia J.Mol.Biol.196（1987）,901-917）または「Chothia」（Nature 342（1989）,877-883）に記載されているように決定されうる。
【００８５】
「CD3z」という用語は、「T細胞受容体T3ゼータ鎖」および「CD247」としても知られているT細胞表面糖タンパク質CD3ゼータ鎖を指す。
【００８６】
「キメラ抗原受容体」または「キメラ受容体」または「CAR」という用語は、スペーサー配列によってCD3zおよびCD28の細胞内シグナリングドメインに融合された抗原結合部分の細胞外部分（例:scFvドメイン）で構成された抗原結合受容体を指す。本発明は、抗原結合部分がFab、crossFab、またはscFabフラグメントである、抗原結合受容体も提供する。「CAR」という用語は、その最も広い形態において、CD3zおよびそのフラグメントならびにCD28およびそのフラグメントに、任意で1つまたは数個のペプチドリンカーを介して融合された、抗原結合部分を含む細胞外部分で構成された、抗原結合受容体を含むと理解される。
【００８７】
抗体または免疫グロブリンの「クラス」とは、その重鎖が持つ定常ドメインまたは定常領域のタイプを指す。抗体には5つの主要クラス、IgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMがあり、これらのうちのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2に分割することができる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γおよびμと呼ばれる。
【００８８】
「クロスオーバーFab分子」（「crossFab」または「クロスオーバーFabフラグメント」ともいう）は、Fab重鎖およびFab軽鎖の可変領域または定常領域が交換されているFab分子を意味する。すなわちcrossFabフラグメントは、軽鎖可変領域および重鎖定常領域で構成されるペプチド鎖と、重鎖可変領域および軽鎖定常領域で構成されるペプチド鎖とを含む。したがってcrossFabフラグメントは、重鎖可変領域および軽鎖定常領域で構成されたポリペプチド（VH-CL）と、軽鎖可変領域および重鎖定常領域で構成されたポリペプチド（VL-CH1）とを含む。明確な説明のために、重鎖定常領域を含むポリペプチド鎖を本明細書ではcrossFabフラグメントの重鎖といい、軽鎖定常領域を含むポリペプチド鎖を本明細書ではcrossFabフラグメントの軽鎖という。
【００８９】
「Fab」または「従来型Fab」分子とは、天然フォーマットのFab分子、すなわち重鎖可変領域および重鎖定常領域で構成される重鎖（VH-CH1）と、軽鎖可変領域および軽鎖定常領域で構成される軽鎖（VL-CL）とを含むFab分子を意味する。
【００９０】
本明細書において使用する用語「CSD」は共刺激シグナリングドメインを指す。
【００９１】
「エフェクター機能」という用語は、抗体のFc領域に帰することができる生物学的活性を指し、それらは抗体アイソタイプによってさまざまである。抗体エフェクター機能の例として、C1q結合および補体依存性細胞傷害（CDC）、Fc受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）、抗体依存性細胞貪食（ADCP）、サイトカイン分泌、免疫複合体が媒介する抗原提示細胞による抗原取り込み、細胞表面受容体（例えばB細胞受容体）のダウンレギュレーション、およびB細胞活性化が挙げられる。
【００９２】
本明細書において使用する用語「工学的に操作する（engineer）」、「工学的に操作された（engineered）」、「工学的操作（engineering）」は、天然ポリペプチドもしくは組換えポリペプチドまたはそのフラグメントのペプチド主鎖の任意の操作または翻訳後修飾を包含するとみなされる。工学的操作には、アミノ酸配列の修飾、グリコシル化パターンの修飾、または個々のアミノ酸の側鎖基の修飾、およびこれらのアプローチの組合せが含まれる。
【００９３】
「発現カセット」という用語は、標的細胞における特定核酸の転写を可能にする一連の指定された核酸要素を持つ、組換え的または合成的に作製されたポリヌクレオチドを指す。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアDNA、プラスチドDNA、ウイルス、または核酸フラグメントに組み入れることができる。通例、発現ベクターの組換え発現カセット部分は、転写される核酸配列およびプロモーターその他の配列を含む。一定の態様において、本発明の発現カセットは、本発明の抗原結合分子またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド配列を含む。
【００９４】
「Fab分子」とは、抗原結合分子の重鎖のVHドメインおよびCH1ドメイン（「Fab重鎖」）と軽鎖のVLドメインおよびCLドメイン（「Fab軽鎖」）とからなるタンパク質を指す。
【００９５】
「Fcドメイン」または「Fc領域」という用語は、本明細書では、定常領域の少なくとも一部分を含有する免疫グロブリン重鎖のC末端領域を規定するために使用される。この用語は、ネイティブ配列Fc領域および変異体Fc領域を包含する。IgG重鎖のFc領域の境界はわずかに変動する可能性があるが、ヒトIgG重鎖Fc領域は、通常、重鎖のCys226またはPro230からカルボキシル末端に及ぶと定義される。ただしFc領域のC末端リジン（Lys447）は存在しても存在しなくてもよい。本明細書に別段の指定がある場合を除き、Fc領域または定常領域中のアミノ酸残基のナンバリングは、Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991に記載の、EUインデックスとも呼ばれる「EUナンバリング」システムに従う。本明細書において使用するFcドメインのサブユニットとは、二量体型Fcドメインを形成する2つのポリペプチドのうちの一つ、すなわち安定に自己会合する能力を有する免疫グロブリン重鎖のC末端定常領域を含むポリペプチドを指す。例えば、IgG Fcドメインのサブユニットは、IgG CH2定常ドメインおよびIgG CH3定常ドメインを含む。
【００９６】
「フレームワーク」または「FR」は、超可変領域（HVR）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのFRは、一般に、4つのFRドメインFR1、FR2、FR3およびFR4からなる。したがって、HVR配列とFR配列は一般にVH（またはVL）中に、以下の順序で現れる:FR1-H1（L1）-FR2-H2（L2）-FR3-H3（L3）-FR4。
【００９７】
「完全長抗体」という用語は2つの「完全長抗体重鎖」および2つの「完全長抗体軽鎖」からなる抗体を表す。「完全長抗体重鎖」は、N末端からC末端に向かって、VH-CH1-HR-CH2-CH3と略記される抗体重鎖可変ドメイン（VH）、抗体重鎖定常ドメイン1（CH1）、抗体ヒンジ領域（HR）、抗体重鎖定常ドメイン2（CH2）および抗体重鎖定常ドメイン3（CH3）、ならびに任意で、サブクラスIgEの抗体の場合、抗体重鎖定常ドメイン4（CH4）からなるポリペプチドである。好ましくは「完全長抗体重鎖」は、N末端からC末端に向かって、VH、CH1、HR、CH2およびCH3からなるポリペプチドである。「完全長抗体軽鎖」は、N末端からC末端に向かって、VL-CLと略記される抗体軽鎖可変ドメイン（VL）および抗体軽鎖定常ドメイン（CL）からなるポリペプチドである。抗体軽鎖定常ドメイン（CL）はκ（カッパ）またはλ（ラムダ）であることができる。2本の完全長抗体鎖は、CLドメインとCH1ドメインの間および完全長抗体重鎖のヒンジ領域間で、ポリペプチド間ジスルフィド結合によって一つに連結されている。典型的な完全長抗体の例は、IgG（例えばIgG1およびIgG2）、IgM、IgA、IgDおよびIgE）のような天然抗体である。
【００９８】
「融合される」とは、構成要素（例:Fabおよび膜貫通ドメイン）が、ペプチド結合によって、直接的にまたは1つもしくは複数のペプチドリンカーを介して連結されることを意味する。
【００９９】
「宿主細胞」、「宿主細胞株」および「宿主細胞培養」という用語は、相互可換的に使用され、外因性核酸が導入されている細胞を指し、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞は「形質転換体」および「形質転換細胞」を包含し、それらは、初代形質転換細胞と、継代数を問わずそこから派生する子孫とを包含する。子孫は、核酸内容物が親細胞と完全には同一でなくて、変異を含有してもよい。最初に形質転換された細胞において選別または選択されたものと同じ機能または生物学的活性を有する変異型子孫は、ここに包含される。宿主細胞は、本発明に従って使用される抗体を生成させるために使用することができる任意のタイプの細胞系である。宿主細胞としては、ほんの一部を挙げると、培養細胞、例えばCHO細胞、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、YO骨髄腫細胞、P3X63マウス骨髄腫細胞、PER細胞、PER.C6細胞またはハイブリドーマ細胞などの哺乳動物培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、および植物細胞などが挙げられ、また、トランスジェニック動物内、トランスジェニック植物内または培養植物組織内もしくは培養動物組織内に含まれている細胞も、宿主細胞に含まれる。
【０１００】
本明細書において使用する用語「超可変領域」または「HVR」は、配列が超可変でありかつ/または構造的に明確なループ（「超可変ループ」）を形成する、抗体可変ドメインの領域のそれぞれを指す。一般に、ネイティブ四鎖抗体は6つのHVRを含み、3つはVHにあり（H1、H2、H3）、3つはVLにある（L1、L2、L3）。HVRは、一般的には、超可変ループからのアミノ酸残基および/または相補性決定領域（CDR）からのアミノ酸残基を含み、後者は配列可変性が最も高くかつ/または抗原認識に関与する。VH中のCDR1を例外として、CDRは一般に超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。超可変領域（HVR）は相補性決定領域（CDR）ともいい、本明細書では、これらの用語を、可変領域のうち抗原結合領域を形成する部分に関して、相互可換的に使用する。この特定領域は、Kabat et al.,U.S.Dept.of Health and Human Services,Sequences of Proteins of Immunological Interest（1983）およびChothia et al.,J Mol Biol 196:901-917（1987）に記載されており、これらの定義は、互いに比較すると、アミノ酸残基のオーバーラップまたはサブセットを含む。それでもなお、抗体および/もしくは抗原結合受容体またはその変異体のCDRに言及するためになされるどちらか一方の定義の適用は、本明細書において定義され使用される用語の範囲内であるものとする。上で言及した参考文献のそれぞれによって定義されるCDRを包含する適当なアミノ酸残基を、下記表1に比較として示す。ある特定CDRを包含する厳密な残基数はCDRの配列およびサイズに依存して変動するであろう。当業者は、抗体の可変領域アミノ酸配列が与えられれば、どの残基が特定CDRを構成するかを、常法によって決定することができる。
【０１０１】
（表１）CDR定義1
2020511979.tif 000015
1表1におけるすべてのCDR定義のナンバリングは、Kabatらが規定したナンバリング法に従っている（下記参照）。
2表1において使用する、「b」が小文字の「AbM」は、Oxford Molecularの「AbM」抗体モデリングソフトウェアによって定義されるCDRを指す。
【０１０２】
Kabatらは、任意の抗体に適用可能な可変領域配列用のナンバリングシステムも規定した。当業者は、配列そのもの以外には何の実験データにも頼らずに、このKabatナンバリングシステムを任意の可変領域配列に明確に割り当てることができる。本明細書において使用する「Kabatナンバリング」は、Kabat et al.,U.S.Dept.of Health and Human Services「Sequence of Proteins of Immunological Interest」（1983）に示されたナンバリングシステムを指す。別段の指定がある場合を除き、抗原結合部分可変領域中の具体的アミノ酸残基位置のナンバリングへの言及は、Kabatナンバリングシステムによる。配列表のポリペプチド配列は、Kabatナンバリングシステムに従ってナンバリングされているわけではない。しかし、配列表の配列のナンバリングをKabatナンバリングに変換することは、十分に、当業者の通常の技量の範囲内であると考えられる。
【０１０３】
「個体」または「対象」は哺乳動物である。哺乳動物としては、家畜（例:ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、およびウマ）、霊長類（例:ヒトおよび非ヒト霊長類、例えばサル）、ウサギ、および齧歯類（例:マウスおよびラット）が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。特に個体または対象はヒトである。
【０１０４】
「単離された核酸」分子またはポリヌクレオチドとは、そのネイティブ環境から取り出された核酸分子、DNAまたはRNAを意味する。例えば、ベクターに含まれているポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明においては、単離されているとみなされる。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例として、異種宿主細胞中に維持されている組換えポリヌクレオチド、または溶解した状態にある（部分的にもしくは実質的に）精製されたポリヌクレオチドが挙げられる。単離されたポリヌクレオチドには、そのポリヌクレオチド分子を通常含有する細胞に含まれているポリヌクレオチド分子であるが、染色体外に存在するか、その自然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在するポリヌクレオチド分子が包含される。単離されたRNA分子として、本発明のインビボまたはインビトロRNA転写産物、ならびにプラス鎖型、マイナス鎖型、および二本鎖型が挙げられる。本発明の単離されたポリヌクレオチドまたは核酸には、合成的に生産されたそのような分子が、さらに含まれる。また、ポリヌクレオチドまたは核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、または転写ターミネーターなどの調節要素を含んでも含まなくてもよい。
【０１０５】
本発明のリファレンスヌクレオチド配列と少なくとも例えば95％「同一」であるヌクレオチド配列を有する核酸またはポリヌクレオチドとは、ポリヌクレオチド配列がリファレンスヌクレオチド配列の100ヌクレオチドあたり最大5つの点変異を含みうる点を除けば、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列がリファレンス配列と同一であることを意味する。言い換えると、リファレンスヌクレオチド配列と少なくとも95％同一なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るには、リファレンス配列中のヌクレオチドのうちの最大5％を欠失させるか、別のヌクレオチドで置換することができ、あるいはリファレンス配列中の全ヌクレオチドのうちの5％までの数のヌクレオチドをリファレンス配列中に挿入することができる。リファレンス配列のこれらの改変は、リファレンスヌクレオチド配列の5’末端位置もしくは3’末端位置に見いだされるか、またはこれらの末端位置の間のどこにでも、リファレンス配列中の残基の間にバラバラに散在して、またはリファレンス配列内の1つまたは複数の連続群（contiguous group）に散在して見いだされうる。実際問題として、任意の特定ポリヌクレオチド配列が本発明のヌクレオチドと少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％同一であるかどうかは、公知のコンピュータプログラム、例えばポリペプチドに関して後述するもの（例:ALIGN-2）などを従来どおりに使って、決定することができる。
【０１０６】
「単離されたポリペプチド」またはその変異体もしくは誘導体とは、その自然環境にないポリペプチドを意味する。特定の精製レベルが要求されることはない。例えば単離されたポリペプチドは、そのネイティブ環境または自然環境から取り出すことができる。宿主細胞中で発現された組換え生産ポリペプチドおよびタンパク質は、本発明では、任意の適切な技法によって分離され、分画され、または部分精製もしくは実質的に精製されたネイティブまたは組換えポリペプチドと同様に、単離されているとみなされる。
【０１０７】
リファレンスポリペプチド配列に対する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、どの保存的置換も配列同一性の一部とはみなさずに、パーセント配列同一性が最大になるように配列を整列し、必要であればギャップを導入した後の、リファレンスポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージと定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定するためのアラインメントは、当技術分野における技量の範囲内にあるさまざまな方法で、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGNまたはMegalign（DNASTAR）ソフトウェアなどの公に利用できるコンピュータソフトウェアを使って、達成することができる。当業者は、配列を整列させるための適当なパラメータを、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを得るのに必要なあらゆるアルゴリズムを含めて、決定することができる。ただし、本明細書における目的には、配列比較コンピュータプログラムALIGN-2を使って、％アミノ酸配列同一性値を生成させる。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムはGenentech,Inc.によって書かれたものであり、ソースコードは米国著作権局（20559ワシントンD.C.）に利用者向け文書と共に登録申請され、米国著作権登録番号TXU510087として登録されている。ALIGN-2プログラムは、Genentech,Inc.（カリフォルニア州サウスサンフランシスコ）から公的に入手するか、またはソースコードからコンパイルすることができる。ALIGN-2プログラムは、digital UNIX V4.0DなどのUNIXオペレーティングシステム上で使用するためにコンパイルすべきである。すべての配列比較パラメータはALIGN-2プログラムによって設定され、変動しない。アミノ酸配列比較にALIGN-2が使用される場合、所与のアミノ酸配列Bに対する、または所与のアミノ酸配列Bとの、または所与のアミノ酸配列Bと対比した、所与のアミノ酸配列Aの％アミノ酸配列同一性（これは、所与のアミノ酸配列Bに対して、または所与のアミノ酸配列Bと、または所与のアミノ酸配列Bと対比して、一定の％アミノ酸配列同一性を有する、または含む、所与のアミノ酸配列Aと、言い換えることもできる）は、次のように計算される:
分率X/Y×100
ここで、Xは、配列アラインメントプログラムALIGN-2が、そのプログラムによるAとBとのアラインメントにおいて、完全一致（identical match）と記録したアミノ酸残基の数であり、YはB中のアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと等しくない場合に、Bに対するAの％アミノ酸配列同一性が、Aに対するBの％アミノ酸配列同一性と一致しなくなることは、理解されるであろう。別段の具体的言明がある場合を除き、本明細書において使用する％アミノ酸配列同一性値はすべて、すぐ上の段落で説明したように、ALIGN-2コンピュータプログラムを使って得られる。
【０１０８】
「核酸分子」という用語は、ポリヌクレオチドに含まれるプリン塩基およびピリミジン塩基を含む塩基の配列に関し、該塩基が核酸分子の一次構造を表す。本明細書において核酸分子という用語には、DNA、cDNA、ゲノムDNA、RNA、合成型DNAおよびこれらの分子のうちの2種以上を含む混合ポリマーが含まれる。また、核酸分子という用語には、センス鎖とアンチセンス鎖がどちらも含まれる。さらにまた、本明細書に記載する核酸分子は、当業者には容易に理解されるであろうように、非天然ヌクレオチド塩基または誘導体化されたヌクレオチド塩基を含有しうる。
【０１０９】
「添付文書」という用語は、治療製品の市販パッケージに通例含まれていて、当該治療製品の適応症、用法、投薬量、投与、併用治療、禁忌および/または使用上の注意に関する情報を含んでいる説明書を指すために使用される。
【０１１０】
「薬学的組成物」という用語は、そこに含有される活性成分の生物学的活性が有効であることを許すような形態にあって、その製剤を投与されることになる対象にとって、許容できないほどに毒性な追加の構成成分を含有しない調製物を指す。薬学的組成物は通常、1種または複数種の薬学的に許容される担体を含む。
【０１１１】
「薬学的に許容される担体」とは、対象にとって無毒である、活性成分以外の薬学的組成物中の成分を指す。薬学的に許容される担体としては、緩衝剤、賦形剤、安定剤または保存剤が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
【０１１２】
本明細書において使用する用語「ポリペプチド」は、アミド結合（ペプチド結合としても公知である）によって線状に連結されたモノマー（アミノ酸）で構成される分子を指す。ポリペプチドという用語は、アミノ酸が2つ以上の任意の鎖を指し、生成物の具体的長さを指すものではない。したがってペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、アミノ酸鎖、またはアミノ酸が2つ以上の鎖を指すために使用される他の任意の用語は、ポリペプチドの定義内に包含され、ポリペプチドという用語は、これらの用語のいずれかの代わりに使用することができ、またはこれらの用語のいずれとも相互可換的に使用することができる。ポリペプチドという用語は、ポリペプチドの発現後修飾、例えば限定するわけではないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護基/遮断基による誘導体化、タンパク質分解的切断、または非天然アミノ酸による修飾などの産物も指すものとする。ポリペプチドは天然の生物学的供給源から得られるか、組換え技術によって生産されうるが、必ずしも指定された核酸配列から翻訳されるわけではない。これは化学合成を含む任意の方法で生成させることができる。本発明のポリペプチドは、サイズが、アミノ酸約3個以上、5個以上、10個以上、20個以上、25個以上、50個以上、75個以上、100個以上、200個以上、500個以上、1,000個以上、または2,000個以上でありうる。ポリペプチドは明確な三次元構造を有しうるが、必ずしもそのような構造を有するわけではない。明確な三次元構造を持つポリペプチドを折りたたまれているといい、明確な三次元構造を持たず、多数の異なるコンフォメーションをとることができるポリペプチドを、折りたたまれていないという。
【０１１３】
「ポリヌクレオチド」という用語は、単離された核酸分子または核酸構築物、例えばメッセンジャーRNA（mRNA）、ウイルス由来のRNAまたはプラスミドDNA（pDNA）を指す。ポリヌクレオチドは、従来のホスホジエステル結合または非従来型の結合（例:アミド結合、例えばペプチド核酸（PNA）に見られるもの）を含みうる。核酸分子という用語は、ポリヌクレオチド中に存在する任意の1つまたは複数の核酸セグメント、例えばDNAフラグメントまたはRNAフラグメントを指す。
【０１１４】
「低減した結合」とは、例えばSPRで測定した場合の、それぞれの相互作用に関するアフィニティーの減少を指す。明確な説明のために述べると、この用語は、ゼロ（または分析方法の検出限界未満）へのアフィニティーの低減、すなわち相互作用の完全な消失も包含する。逆に「増加した結合」とは、それぞれの相互作用に関する結合アフィニティーの増加を指す。
【０１１５】
「調節配列」という用語は、それらがライゲートされたコード配列の発現を達成するのに必要なDNA配列を指す。そのような制御配列の性質は宿主細胞によって異なる。原核生物の場合、制御配列は一般に、プロモーター、リボソーム結合部位、およびターミネーターを含む。真核生物の場合、一般に制御配列は、プロモーター、ターミネーター、そして場合により、エンハンサー、トランス活性化因子または転写因子を含む。「制御配列」という用語は、最低でも、その存在が発現にとって必要な構成要素をすべて含むものとし、追加の有利な構成要素も含みうる。
【０１１６】
本明細書において使用する用語「単鎖」は、ペプチド結合によって直線的に連結されたアミノ酸単量体を含む分子を指す。一定の態様において、抗原結合部分の1つはscFvフラグメント、すなわちペプチドリンカーによって連結されたVHドメインおよびVLドメインである。一定の態様において、抗原結合部分のうちの一つは単鎖Fab分子、すなわちFab軽鎖とFab重鎖とが単一のペプチド鎖を形成するようにペプチドリンカーによって連結されたFab分子である。特定のそのような態様では、Fab軽鎖のC末端が、単鎖Fab分子中のFab重鎖のN末端に連結されている。
【０１１７】
本明細書において使用する用語「SSD」は刺激シグナリングドメインを指す。
【０１１８】
本明細書において使用する「処置」（およびその文法上の異形、例えば「処置する」または「処置すること」など）は、処置される個体における疾患の自然の過程を改変しようとする臨床的介入を指し、これは、予防のために行うか、または臨床的病変の経過中に行うことができる。処置の望ましい効果としては、疾患の発生または再発を防止すること、症状の緩和、疾患の何らかの直接的または間接的な病理学的帰結の縮減、転移の防止、疾患進行速度を減じること、疾患状態の改善または一時的軽減、および寛解または予後の改善が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。いくつかの態様において、本発明の抗原結合受容体を発現する細胞は、疾患の発達を遅延させ、または疾患の進行を遅くするために使用される。
【０１１９】
本明細書において使用する用語「標的抗原決定基」は、「標的抗原」、「標的エピトープ」、「腫瘍関連抗原」および「標的細胞抗原」と同義であり、ポリペプチド高分子上の一部位（例:連続する一続きのアミノ酸、または不連続なアミノ酸の異なる領域から構成されるコンフォメーション上の配置）であって、そこに抗体が結合して抗原結合部分-抗原複合体を形成するものを指す。有用な抗原決定基は、例えば腫瘍細胞の表面、ウイルス感染細胞の表面、他の疾患細胞の表面、免疫細胞の表面に見いだされるか、血清中および/または細胞外マトリックス（ECM）中に遊離の状態で見いだされる。本明細書において抗原と呼ぶタンパク質（例:CD20、CEA、FAP、TNC）は、別段の表示がある場合を除き、霊長類（例:ヒト）および齧歯類（例:マウスおよびラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物供給源からのタンパク質の任意のネイティブ型であることができる。特定態様において、標的抗原はヒトタンパク質である。本明細書において具体的標的タンパク質に言及する場合、この用語は、プロセシングされていない「完全長」の標的タンパク質を包含すると共に、標的細胞におけるプロセシングがもたらす任意の形態の標的タンパク質も包含する。この用語は、標的タンパク質の天然変異体、例えばスプライス変異体またはアレル変異体も包含する。抗原として有用な例示的ヒト標的タンパク質としてはCD20、CEA、FAP、TNC、MSLN、FolR1、HER1およびHER2が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。特異的標的抗原決定基に結合する抗原結合受容体の能力は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）、または当業者によく知られている他の技法、例えば表面プラズモン共鳴（SPR）技法（BIAcore計器で分析されるもの）（Liljeblad et al.,Glyco J 17,323-329（2000））および従来の結合アッセイ（Heeley,Endocr Res 28,217-229（2002））などのいずれかによって測定することができる。一態様において、無関係なタンパク質への抗原結合受容体の結合の程度は、例えばSPRで測定した場合に、標的抗原への抗体の結合の約10％未満である。一定の態様において、抗原結合受容体は、≦1μM、≦100nM、≦10nM、≦1nM、≦0.1nM、≦0.01nM、または≦0.001nM（例:10-8M以下、例えば10-8M〜10-13M、例えば10-9M〜10-13M）のアフィニティー解離定数（KD）で標的抗原に結合する。
【０１２０】
本明細書において使用する「T細胞活性化」は、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子放出、細胞傷害活性および活性化マーカーの発現から選択される、Tリンパ球の、特に細胞傷害性Tリンパ球の、1つまたは複数の細胞応答を指す。本発明の抗原結合受容体は、T細胞活性化を誘導する能力を有する。T細胞活性化を測定するための適切なアッセイは、本明細書に記載する技術分野において公知である。
【０１２１】
本発明において、「T細胞受容体」または「TCR」という用語は、当技術分野では一般に公知である。特に、本明細書における用語「T細胞受容体」は、以下の3つの基準が満たされる限り、任意のT細胞受容体を指す:（i）腫瘍特異性、（ii）（大半の）腫瘍細胞の認識、これは、抗原または標的が（大半の）腫瘍細胞において発現していなければならないことを意味する、および（iii）そのTCRが、処置される対象のHLA型と一致すること。これに関連して、上述した3つの基準を満たす適切なT細胞受容体は、NY-ESO-1（配列情報については例えばPCT/GB2005/001924を参照されたい）および/またはHER2neu（配列情報についてはWO-A1 2011/0280894を参照されたい）を認識する受容体など、当技術分野において公知である。
【０１２２】
作用物質の、例えば薬学的組成物の、「治療有効量」とは、必要な投薬量および期間で、所望の治療結果または予防結果を達成するのに有効な量を指す。作用物質の治療有効量は、例えば、疾患の有害な効果を排除し、減少させ、遅延させ、最小限に抑え、または防止する。
【０１２３】
「ベクター」または「発現ベクター」という用語は「発現構築物」と同義であり、それが機能的に関連付けられている特異的遺伝子を標的細胞に導入し、標的細胞におけるその発現を指示するために使用されるDNA分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクターも、それが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれているベクターも包含する。本発明の発現ベクターは発現カセットを含む。発現ベクターは、大量の安定mRNAの転写を可能にする。発現ベクターが標的細胞の内部にあれば、その遺伝子によってコードされるリボ核酸分子またはタンパク質は、細胞の転写および/または翻訳機構によって生産される。一態様において、本発明の発現ベクターは、本発明の抗原結合受容体またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現カセットを含む。
【０１２４】
抗原結合受容体フォーマット
本発明は、標的抗原、すなわち腫瘍関連抗原（TAA）に対して、特異的に結合する能力を有する抗原結合受容体に関する。特に本発明は、Fab、crossFab、またはscFabフラグメントである少なくとも1つの抗原結合部分を含む細胞外ドメインを含む、抗原結合受容体に関する。
【０１２５】
本発明はさらに、本明細書に記載の抗原結合受容体による、CD8＋T細胞、CD4＋T細胞、CD3＋T細胞、γδ型T細胞またはナチュラルキラー（NK）T細胞、好ましくはCD8＋T細胞などのT細胞の形質導入、およびそれらの例えば腫瘍への標的動員（targeted recruitment）に関する。
【０１２６】
添付の実施例に示すように、本発明概念の実証として、CD20に対して特異的に結合する能力を有する、アンカリング膜貫通ドメインと細胞外ドメインとを含む本発明の抗原結合受容体pETR17097（SEQ ID NO:22に示すDNA配列によってコードされるSEQ ID NO:7）を構築した。抗CD20-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSDタンパク質（SEQ ID NO:22に示すDNA配列によってコードされるSEQ ID NO:7）を発現する形質導入T細胞（Jurkat NFAT T細胞）は、CD20陽性腫瘍細胞によって強く活性化することができた。本発明者らは、腫瘍抗原に対して特異的に結合する能力を有する抗原結合受容体のフォーマットを、さらに複数用意した。本発明のFabフォーマットおよびcrossFabフォーマットは、これらのフォーマットの一つに従って抗原結合部分を含む抗原結合受容体によるT細胞の差別化された活性化ゆえに、特に好ましい。T細胞の差別化された活性化をFabフォーマットおよびcrossFabフォーマットで実証し、scFvフォーマットと比較した。本発明のFabフォーマットおよびcrossFabフォーマットは、別々の抗原結合部分の重鎖および軽鎖の正しいペアリングを保証し、驚いたことに、scFvフォーマットと比較して、T細胞の差別化された活性化をもたらした。さらにまた、同じ細胞内で、すなわち1つのT細胞内で、Fabに基づく抗原結合受容体を2種以上、本発明に従って発現させることができ、そこでは、本発明の抗原結合受容体が正しく組み立てられ、抗原結合受容体の機能的特性、例えばT細胞の活性化は強いままである。これは、結合因子のアフィニティーを変化させることなくT細胞応答をチューニングする可能性を、さらに増加させる。したがって本発明は、1つの細胞における抗原結合受容体のそのような組合せ、特に複数のFabフォーマットおよびcrossFabフォーマットの組合せを提供する。
【０１２７】
Fab抗原結合部分またはcrossFab抗原結合部分を含む本発明の抗原結合受容体が形質導入されたT細胞、好ましくはCD8＋T細胞は、腫瘍関連抗原（TAA）によって強く活性化され、腫瘍細胞に動員された。予想外であり、驚いたことに、本発明では、古典的scFvフォーマットと比較して、Fab抗原結合部分および/またはcrossFab抗原結合部分の組込みは、さらなるT細胞刺激（例えばCD3シグナリング）に依存して、T細胞の差別化された活性化と、それに続く腫瘍細胞の溶解をもたらすことが示された。さらにまた、本発明の抗原結合受容体フォーマットには、従来のscFvに基づくアプローチと比べて著しい利点がある。というのも、本発明のFabフォーマットの方が安定だからである。重要なことに、ファージディスプレイライブラリーに由来しかつ/またはファージディスプレイライブラリーを使って作製された抗原結合部分は容易に本発明の抗原結合受容体に変換することができる。
【０１２８】
したがって本発明は、腫瘍へのT細胞誘導および特異的結合後のT細胞活性化をもたらすために、公知の供給源から得られる細胞抗原を標的とする抗原結合部分または新たに開発される結合因子を、結合およびシグナリング受容体に容易に組み込むことができる、汎用性のある治療プラットフォームを提供する。重要なことに、T細胞の、例えばCD8＋T細胞の、結合および活性化のために、2種以上の抗原結合受容体を1つの細胞に組み込んで、多重特異性を与えることができる。腫瘍細胞表面の腫瘍抗原に結合した後、本明細書に記載の形質導入T細胞は活性化型になり、次いで腫瘍細胞は溶解される。本プラットフォームは、多様な（既存のまたは新たに開発される）標的結合因子の使用を可能にし、または抗原特異性が異なる複数の抗原結合受容体の同時適用を可能にすることにより、融通が効き、かつ特異的である。T細胞活性化の程度は、免疫チェックポイント阻害因子に対して特異的に結合する能力を有する1種または複数種の抗原結合部分と、腫瘍抗原に対して特異的に結合する能力を有する1種または複数種の抗原結合部分との組合せによって、および/または異なる抗原結合因子フォーマットへの切換によって、さらに調整することができる。本発明の形質導入T細胞は、本明細書に記載するとおり、指定された抗原または抗原と免疫チェックポイント阻害因子との組合せに曝露されなければ、不活性である。
【０１２９】
本発明との関連において、抗原結合受容体は、T細胞中またはT細胞上に天然には見いだされない細胞外ドメインを含む。したがって抗原結合受容体は、本発明の抗原結合受容体を発現する細胞にテーラーメードの結合特異性を与える能力を有する。本発明の抗原結合受容体が形質導入された細胞、例えばT細胞は、標的抗原を発現する細胞（例:腫瘍細胞）に対して特異的に結合する能力を有するようになるが、無関係な健常細胞には結合しないか本質的に結合しない。特異性は、前記1種または複数種の抗原結合受容体の細胞外ドメインの1つまたは数個の抗原結合部分によって与えられ、そのような抗原結合部分は、本明細書において定義される腫瘍関連抗原に特異的であるとみなされる。本発明との関連において、そして本明細書において説明するように、腫瘍抗原に対して特異的に結合する能力を有する抗原結合部分は、腫瘍細胞に結合し/腫瘍細胞と相互作用するが、健常細胞/組織との結合/相互作用はない。
【０１３０】
したがって本発明は、Fab、crossFab、またはscFabフラグメントである少なくとも1つの抗原結合部分を含む細胞外ドメインを含む、抗原結合受容体に関する。本発明の抗原結合受容体は、個々の抗原結合受容体の潜在力に影響を及ぼさずに、さまざまな組合せで組み合わせることができる。例えば、本明細書に記載のFabフラグメントを含む第1の抗原結合受容体は、crossFabフラグメントを含む第2の抗原結合受容体と組み合わせることができる。また本発明は、FabフォーマットについてもcrossFabフォーマットについても、それぞれ異なる構成を2つ記載することで、異なる受容体の考えうる組合せをさらに拡張した。さらにまた、組合せの融通性をさらに拡張するscFabフォーマットも記載される。重要なことに、本明細書に記載の異なる抗原結合受容体フォーマットの正しい組合せは、抗原結合受容体のポリペプチドサブユニットの正しいペアリング、すなわちFabフォーマットの重鎖および軽鎖の正しいアセンブリを保証する。
【０１３１】
抗原結合部分
本発明の例示的一態様では、概念実証として、アンカリング膜貫通ドメインと少なくとも1つの抗原結合部分を含む細胞外ドメインとを含み、抗原結合部分がFab、crossFab、またはscFabフラグメントである、抗原結合受容体が提供される。
【０１３２】
一定の態様において、抗原結合部分のうちの少なくとも1つは、従来のFabフラグメント、すなわちFab軽鎖とFab重鎖とからなるFab分子である。一定の態様において、抗原結合部分のうちの少なくとも1つは、crossFabフラグメント、すなわちFab軽鎖とFab重鎖とからなり、Fabの重鎖および軽鎖の可変領域または定常領域のどちらか一方が交換されているFab分子である。一定の態様において、抗原結合部分のうちの少なくとも1つはscFvフラグメントである。そのような一特定態様では、scFv分子において、可変重鎖（VH）のC末端が可変軽鎖（VL）のN末端に、任意でペプチドリンカーを介して連結される。一定の態様において、抗原結合部分のうちの少なくとも一つは単鎖Fab分子、すなわちFab軽鎖とFab重鎖とが単一のペプチド鎖を形成するようにペプチドリンカーによって連結されているFab分子である。そのような一特定態様では、単鎖Fab分子において、Fab軽鎖のC末端がFab重鎖のN末端に、任意でペプチドリンカーを介して連結される。
【０１３３】
腫瘍関連抗原に対して特異的に結合する能力を有する抗原結合部分は、例えば哺乳動物免疫系などの免疫化によって作製されうる。そのような方法は当技術分野では公知であり、例えばMethods in Molecular Biology 295:1-12（2005）にBurnsが記載している。あるいは、本発明の抗原結合部分は、1つまたは複数の所望の活性を持つ抗体について、コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離されうる。コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングするための方法については、例えばNature Reviews 16:498-508（2016）にLernerらの総説がある。例えば当技術分野では、ファージディスプレイライブラリーを作製し、所望の結合特徴を持つ抗原結合部分についてそのようなライブラリーをスクリーニングするための方法が、種々公知である。そのような方法については、例えばmAbs 8:1177-1194（2016）にFrenzelらの総説、Human Vaccines and Immunotherapeutics 8:1817-1828（2012）にBazanらの総説、Critical Reviews in Biotechnology 36:276-289（2016）にZhaoらの総説、そしてMethods in Molecular Biology 178:1-37（O’Brienら編、Human Press、ニュージャージー州トトワ、2001）にHoogenboomらの総説があり、また例えばMcCafferty et al.,Nature 348:552-554、Clackson et al.,Nature 352:624-628（1991）、Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581-597（1992）、Marks and Bradbury,Methods in Molecular Biology 248:161-175（Lo編、Human Press、ニュージャージー州トトワ、2003）、Sidhu et al.,J.Mol.Biol.338（2）:299-310（2004）、Lee et al.,J.Mol.Biol.340（5）:1073-1093（2004）、Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101（34）:12467-12472（2004）およびLee et al.,J.Immunol.Methods 284（1-2）:119-132（2004）にも、さらに記載されている。一定のファージディスプレイ法では、WinterらがAnnual Review of Immunology 12:433-455（1994）に記載しているように、VH遺伝子とVL遺伝子のレパートリーを、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって個別にクローニングし、それらをファージライブラリーでランダムに組み換えてから、抗原結合性ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは典型的には、抗体フラグメントを、一本鎖Fv（scFv）フラグメントとして、またはFabフラグメントとして、ディスプレイする。免疫化された供給源からのライブラリーは、ハイブリドーマの構築を必要とすることなく、免疫原に対する高アフィニティー抗原結合部分を与える。あるいは、GriffithsらがEMBO Journal 12:725-734（1993）に記載しているように、免疫化を一切行わずに、ナイーブレパートリーを（例えばヒトから）クローニングすることで、広範な非自己抗原に対する、そしてまた自己抗原に対する、抗原結合部分の単一の供給源とすることもできる。最後に、HoogenboomおよびWinterがJournal of Molecular Biology 227:381-388（1992）に記載しているように、幹細胞から非再編成V遺伝子セグメントをクローニングし、高度に可変なCDR3領域をコードするためおよびインビトロで再編成を行うためにランダム配列を含有するPCRプライマーを使用することにより、ナイーブライブラリーを合成的に作ることもできる。ヒト抗体ファージライブラリーを記載している特許公報には、例えば米国特許第5,750,373号、同第7,985,840号、同第7,785,903号および同第8,679,490号、ならびに米国特許出願公開第2005/0079574号、同第2007/0117126号、同第2007/0237764号、同第2007/0292936号および同第2009/0002360号がある。1つまたは複数の所望の活性を持つ抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングするための当技術分野において公知の方法のさらなる例としては、リボソームディスプレイおよびmRNAディスプレイ、ならびに細菌、哺乳動物細胞、昆虫細胞または酵母細胞上での抗体ディスプレイおよび抗体選択のための方法が挙げられる。酵母表面ディスプレイのための方法は、例えばMethods in Molecular Biology 503:135-56（2012）にSchollerらの総説が、またMethods in Molecular Biology 1319:155-175（2015）にCherfらの総説があり、さらにMethods in Molecular Biology 889:73-84（2012）にもZhaoらの総説がある。リボソームディスプレイのための方法は、例えばHeらがNucleic Acids Research 25:5132-5134（1997）に、またHanesらがPNAS 94:4937-4942（1997）に記載している。本発明の抗原結合受容体フォーマットの特別な利点は、ライブラリー由来の抗原結合部分が、フォーマットを変化させずに、直接組み込まれることであり、例えばファージディスプレイライブラリーのスクリーニングによって得られるFab抗原結合因子は、本明細書に記載のFabフォーマットおよび/またはcrossFabフォーマットに含めることができる。したがって、Fabディスプレイファージライブラリーに由来する抗原結合部分は、フォーマットを、例えばライブラリーに由来する結合因子の結合特性に負の影響を及ぼす可能性があるscFvフォーマットに変化させることなく、本発明の抗原結合受容体に含めることができる。
【０１３４】
本発明との関連において、標的抗原、すなわち腫瘍関連抗原に対して特異的に結合する能力を有する少なくとも1つの抗原結合部分を含む抗原結合受容体が、本明細書に提供される。したがって、本発明の抗原結合受容体を発現する形質導入された細胞、すなわちT細胞は、腫瘍細胞に対して特異的に結合する能力を有する。
【０１３５】
本発明の例示的一態様では、概念実証として、CD20に対して特異的に結合する能力を有する抗原結合受容体および該抗原結合受容体を発現するエフェクター細胞が提供される。標的細胞は、CD20ポリペプチドを発現するものであり、CD20ポリペプチドを特異的に発現するか過剰発現する細胞タイプである。細胞は特定細胞タイプのがん性細胞または正常細胞でありうる。細胞は自己免疫に関与する正常B細胞でありうる。一態様において、細胞はがん細胞、好ましくは悪性B細胞である。他の腫瘍関連抗原も、本発明に従って、また本明細書に記載するように、標的とすることができる。
【０１３６】
したがって、具体的一態様において、抗原結合受容体の細胞外ドメインは、CD20に対して特異的に結合する能力を有する抗原結合部分を含み、該抗原結合部分は、
（i）（a）重鎖相補性決定領域（CDR H）1アミノ酸配列YSWIN（SEQ ID NO:1）、
（b）CDR H2アミノ酸配列
2020511979.tif 000016
、および
（c）CDR H3アミノ酸配列
2020511979.tif 000017
を含む重鎖可変領域（VH）と、
（ii）（d）軽鎖相補性決定領域（CDR L）1アミノ酸配列
2020511979.tif 000018
（e）CDR L2アミノ酸配列QMSNLVS（SEQ ID NO:5）、および
（f）CDR L3アミノ酸配列AQNLELPYT（SEQ ID NO:6）
を含む軽鎖可変領域（VL）と
を含む。
【０１３７】
一態様において、抗原結合受容体の細胞外ドメインは、CD20に対して特異的に結合する能力を有する抗原結合部分を含み、該抗原結合部分は、SEQ ID NO:12のアミノ酸と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）と、SEQ ID NO:10のアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（VL）とを含む。
【０１３８】
一態様において、抗原結合受容体の細胞外ドメインはCD20に対して特異的に結合する能力を有する抗原結合部分を含み、該抗原結合部分は、SEQ ID NO:12の重鎖可変領域（VH）とSEQ ID NO:10の軽鎖可変領域（VL）とを含む。
【０１３９】
一態様において、少なくとも1つの抗原結合部分はFab、crossFab、またはscFabフラグメントである。
【０１４０】
好ましい一態様において、抗原結合受容体の細胞外ドメインは、CD20に対して特異的に結合する能力を有する抗原結合部分を含み、該抗原結合部分はFabフラグメントである。
【０１４１】
一態様において、抗原結合受容体の細胞外ドメインは、FabフラグメントがSEQ ID NO:8の重鎖とSEQ ID NO:9の軽鎖とを含む、CD20に対して特異的に結合する能力を有する抗原結合部分を含む。
【０１４２】
一態様において、抗原結合受容体の細胞外ドメインは、CD20に対して特異的に結合する能力を有する抗原結合部分を含み、少なくとも1つの抗原結合部分は、重鎖可変ドメイン（VH）、軽鎖可変ドメイン（VL）およびリンカーからなるポリペプチドであるscFvフラグメントであって、可変ドメインおよびリンカーは、N末端からC末端に向かって、以下の構成のうちの1つを有する:a）VH-リンカー-VLまたはb）VL-リンカー-VH。好ましい態様において、scFvフラグメントはVH-リンカー-VLという構成を有する。
【０１４３】
一態様において、抗原結合受容体の細胞外ドメインは、scFvフラグメントがSEQ ID NO:60のアミノ酸配列を含む、CD20に対して特異的に結合する能力を有する抗原結合部分を含む。
【０１４４】
好ましい一態様において、抗原結合受容体の細胞外ドメインは、CD20に対して特異的に結合する能力を有する抗原結合部分を含み、該抗原結合部分はcrossFabフラグメントである。
【０１４５】
好ましい一態様において、抗原結合受容体の細胞外ドメインは、crossFabフラグメントがSEQ ID NO:37のポリペプチドおよびSEQ ID NO:38のポリペプチドを含む、CD20に対して特異的に結合する能力を有する抗原結合部分を含む。
【０１４６】
一態様において、抗原結合受容体の細胞外ドメインは、CD20に対して特異的に結合する能力を有する抗原結合部分を含み、少なくとも1つの抗原結合部分は、重鎖（VH-CH1）、軽鎖（VL-CL）およびリンカーからなるポリペプチドであるscFabフラグメントであって、重鎖および軽鎖ならびにリンカーは、N末端からC末端に向かって、以下の構成のうちの1つを有する:a）VL-CL-リンカー-VH-CH1またはb）VH-CH-リンカー-VL-CL。好ましい態様において、scFabフラグメントはVL-CL-リンカー-VH-CH1という構成を有する。
【０１４７】
一態様において、抗原結合受容体の細胞外ドメインは、scFabフラグメントがSEQ ID NO:51のアミノ酸配列を含む、CD20に対して特異的に結合する能力を有する抗原結合部分を含む。
【０１４８】
代替の特定態様において、抗原結合受容体の細胞外ドメインは、プログラム死リガンド1（PDL1）に対して特異的に結合する能力を有する抗原結合部分を含む。したがって具体的一態様において、抗原結合受容体の細胞外ドメインは、PDL1に対して特異的に結合する能力を有する抗原結合部分を含み、該抗原結合部分は、
（i）（a）重鎖相補性決定領域（CDR H）1アミノ酸配列DSWIH（SEQ ID NO:68）、
（b）CDR H2アミノ酸配列
2020511979.tif 000019
、および
（c）CDR H3アミノ酸配列
2020511979.tif 000020
を含む重鎖可変領域（VH）と、
（ii）（d）軽鎖相補性決定領域（CDR L）1アミノ酸配列
2020511979.tif 000021
（e）CDR L2アミノ酸配列SASFLYS（SEQ ID NO:72）、および
（f）CDR L3アミノ酸配列QQYLYHPAT（SEQ ID NO:73）
を含む軽鎖可変領域（VL）と
を含む。
【０１４９】
一態様において、抗原結合受容体の細胞外ドメインは、PDL1に対して特異的に結合する能力を有する抗原結合部分を含み、該抗原結合部分は、SEQ ID NO:78のアミノ酸と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）と、SEQ ID NO:77のアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（VL）とを含む。
【０１５０】
一態様において、抗原結合受容体の細胞外ドメインはPDL1に対して特異的に結合する能力を有する抗原結合部分を含み、該抗原結合部分は、SEQ ID NO:78の重鎖可変領域（VH）とSEQ ID NO:77の軽鎖可変領域（VL）とを含む。
【０１５１】
一態様において、少なくとも1つの抗原結合部分はFab、crossFab、またはscFabフラグメントである。
【０１５２】
好ましい一態様において、抗原結合受容体の細胞外ドメインは、PDL1に対して特異的に結合する能力を有する抗原結合部分を含み、該抗原結合部分はFabフラグメントである。
【０１５３】
一態様において、抗原結合受容体の細胞外ドメインは、FabフラグメントがSEQ ID NO:75の重鎖とSEQ ID NO:76の軽鎖とを含む、PDL1に対して特異的に結合する能力を有する抗原結合部分を含む。
【０１５４】
一態様において、抗原結合受容体の細胞外ドメインは、PDL1に対して特異的に結合する能力を有する抗原結合部分を含み、少なくとも1つの抗原結合部分は、重鎖可変ドメイン（VH）、軽鎖可変ドメイン（VL）およびリンカーからなるポリペプチドであるscFvフラグメントであって、可変ドメインおよびリンカーは、N末端からC末端に向かって、以下の構成のうちの1つを有する:a）VH-リンカー-VLまたはb）VL-リンカー-VH。好ましい態様において、scFvフラグメントはVH-リンカー-VLという構成を有する。
【０１５５】
一態様において、抗原結合受容体の細胞外ドメインは、scFvフラグメントがSEQ ID NO:88のアミノ酸配列を含む、PDL1に対して特異的に結合する能力を有する抗原結合部分を含む。
【０１５６】
好ましい一態様において、抗原結合受容体の細胞外ドメインは、PDL1に対して特異的に結合する能力を有する抗原結合部分を含み、該抗原結合部分はcrossFabフラグメントである。
【０１５７】
好ましい一態様において、抗原結合受容体の細胞外ドメインは、crossFabフラグメントがSEQ ID NO:80のポリペプチドおよびSEQ ID NO:81のポリペプチドを含む、PDL1に対して特異的に結合する能力を有する抗原結合部分を含む。
【０１５８】
一態様において、抗原結合受容体の細胞外ドメインは、PDL1に対して特異的に結合する能力を有する抗原結合部分を含み、少なくとも1つの抗原結合部分は、重鎖（VH-CH1）、軽鎖（VL-CL）およびリンカーからなるポリペプチドであるscFabフラグメントであって、重鎖および軽鎖ならびにリンカーは、N末端からC末端に向かって、以下の構成のうちの1つを有する:a）VL-CL-リンカー-VH-CH1またはb）VH-CH-リンカー-VL-CL。好ましい態様において、scFabフラグメントはVL-CL-リンカー-VH-CH1という構成を有する。
【０１５９】
一態様において、抗原結合受容体の細胞外ドメインは、scFabフラグメントがSEQ ID NO:86のアミノ酸配列を含む、PDL1に対して特異的に結合する能力を有する抗原結合部分を含む。
【０１６０】
代替の特定態様において、抗原結合受容体の細胞外ドメインは、癌胎児性抗原（CEA）に対して特異的に結合する能力を有する抗原結合部分を含む。したがって、具体的一態様において、抗原結合受容体の細胞外ドメインは、CEAに対して特異的に結合する能力を有する抗原結合部分を含み、該抗原結合部分は、
（i）（a）重鎖相補性決定領域（CDR H）1アミノ酸配列EFGMN（SEQ ID NO:138）、
（b）CDR H2アミノ酸配列
2020511979.tif 000022
、および
（c）CDR H3アミノ酸配列
2020511979.tif 000023
を含む重鎖可変領域（VH）と、
（ii）（d）軽鎖相補性決定領域（CDR L）1アミノ酸配列
2020511979.tif 000024
（e）CDR L2アミノ酸配列SASYRKR（SEQ ID NO:142）、および
（f）CDR L3アミノ酸配列HQYYTYPLFT（SEQ ID NO:143）
を含む軽鎖可変領域（VL）と
を含む。
【０１６１】
別の具体的態様において、抗原結合受容体の細胞外ドメインは、CEAに対して特異的に結合する能力を有する抗原結合部分を含み、該抗原結合部分は、
（i）（a）重鎖相補性決定領域（CDR H）1アミノ酸配列DTYMH（SEQ ID NO:148）、
（b）CDR H2アミノ酸配列
2020511979.tif 000025
、および
（c）CDR H3アミノ酸配列
2020511979.tif 000026
を含む重鎖可変領域（VH）と、
（ii）（d）軽鎖相補性決定領域（CDR L）1アミノ酸配列
2020511979.tif 000027
（e）CDR L2アミノ酸配列RASNRAT（SEQ ID NO:152）、および
（f）CDR L3アミノ酸配列QQTNEDPYT（SEQ ID NO:153）
を含む軽鎖可変領域（VL）と
を含む。
【０１６２】
一態様において、抗原結合受容体の細胞外ドメインは、CEAに対して特異的に結合する能力を有する抗原結合部分を含み、該抗原結合部分は、SEQ ID NO:146およびSEQ ID NO:156から選択されるアミノ酸と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）と、SEQ ID NO:147およびSEQ ID NO:157から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（VL）とを含む。
【０１６３】
一態様において、抗原結合受容体の細胞外ドメインはCEAに対して特異的に結合する能力を有する抗原結合部分を含み、該抗原結合部分は、SEQ ID NO:146の重鎖可変領域（VH）とSEQ ID NO:147の軽鎖可変領域（VL）とを含む。
【０１６４】
一態様において、抗原結合受容体の細胞外ドメインはCEAに対して特異的に結合する能力を有する抗原結合部分を含み、該抗原結合部分は、SEQ ID NO:156の重鎖可変領域（VH）とSEQ ID NO:157の軽鎖可変領域（VL）とを含む。
【０１６５】
一態様において、少なくとも1つの抗原結合部分はFab、crossFab、またはscFabフラグメントである。
【０１６６】
好ましい一態様において、抗原結合受容体の細胞外ドメインは、CEAに対して特異的に結合する能力を有する抗原結合部分を含み、該抗原結合部分はFabフラグメントである。
【０１６７】
一態様において、抗原結合受容体の細胞外ドメインは、CEAに対して特異的に結合する能力を有する抗原結合部分を含み、少なくとも1つの抗原結合部分は、重鎖可変ドメイン（VH）、軽鎖可変ドメイン（VL）およびリンカーからなるポリペプチドであるscFvフラグメントであって、可変ドメインおよびリンカーは、N末端からC末端に向かって、以下の構成のうちの1つを有する:a）VH-リンカー-VLまたはb）VL-リンカー-VH。好ましい態様において、scFvフラグメントはVH-リンカー-VLという構成を有する。
【０１６８】
一態様において、抗原結合受容体の細胞外ドメインは、scFvフラグメントがSEQ ID NO:145およびSEQ ID NO:155から選択されるアミノ酸配列を含む、CEAに対して特異的に結合する能力を有する抗原結合部分を含む。
【０１６９】
一態様において、抗原結合受容体の細胞外ドメインは、CEAに対して特異的に結合する能力を有する抗原結合部分を含み、少なくとも1つの抗原結合部分は、重鎖（VH-CH1）、軽鎖（VL-CL）およびリンカーからなるポリペプチドであるscFabフラグメントであって、重鎖および軽鎖ならびにリンカーは、N末端からC末端に向かって、以下の構成のうちの1つを有する:a）VL-CL-リンカー-VH-CH1またはb）VH-CH-リンカー-VL-CL。好ましい態様において、scFabフラグメントはVL-CL-リンカー-VH-CH1という構成を有する。
【０１７０】
本発明のさらなる代替の特定態様では、CEAに対して特異的に結合する能力を有する抗原結合受容体および該抗原結合受容体を発現するエフェクター細胞が提供される。標的細胞は、CEAポリペプチドを発現するものであり、CEAポリペプチドを特異的に発現するか過剰発現する細胞タイプである。細胞は特定細胞タイプのがん性細胞または正常細胞でありうる。一態様において、細胞はがん細胞である。したがって具体的一態様において、抗原結合受容体の細胞外ドメインは、CEAに対して特異的に結合する能力を有する抗原結合部分を含み、該抗原結合部分はFab、crossFab、またはscFabである。
【０１７１】
アンカリング膜貫通ドメイン
本発明との関連において、本発明の抗原結合受容体のアンカリング膜貫通ドメインは、哺乳動物プロテアーゼのための切断部位を有しないことを特徴としうる。本発明との関連において、プロテアーゼとは、プロテアーゼのための切断部位を含む膜貫通ドメインのアミノ酸配列を加水分解することができるタンパク質分解酵素を指す。プロテアーゼという用語はエンドペプチダーゼとエキソペプチダーゼをどちらも包含する。本発明との関連において、膜貫通タンパク質、なかんずくCD命名法によって規定されるもののアンカリング膜貫通ドメインはいずれも、本明細書に定義する抗原に結合したときにT細胞、好ましくはCD8＋T細胞を活性化する本発明の抗原結合受容体を作製するために使用しうる。
【０１７２】
したがって本発明との関連において、アンカリング膜貫通ドメインは、ネズミ/マウス（murine/mouse）膜貫通ドメインのパーツ、または好ましくはヒト膜貫通ドメインのパーツを含みうる。そのようなアンカリング膜貫通ドメインの一例は、例えば本明細書ではSEQ ID NO:14に示すアミノ酸配列（SEQ ID NO:29に示すDNA配列によってコードされるもの）を有するCD28の膜貫通ドメインである。本発明との関連において、本発明の抗原結合受容体の膜貫通ドメインは、SEQ ID NO:14に示すアミノ酸配列（SEQ ID NO:29に示すDNA配列によってコードされるもの）を含む/からなることができる。
【０１７３】
本発明の例示的態様では、概念実証として、SEQ ID NO:7のアミノ酸配列（SEQ ID NO:22に示すDNA配列によってコードされるもの）を含み、本明細書ではSEQ ID NO:97（SEQ ID NO:96に示すDNA配列によってコードされるもの）として示されるCD28（ヒトCD28のUniprotエントリー番号はP10747（バージョン番号173、配列のバージョン1）である）のフラグメント/ポリペプチドパーツを含む、抗原結合受容体が提供される。あるいは、膜貫通ドメインを有する任意のタンパク質、なかんずくCD命名法によって与えられるものは、本発明の抗原結合受容体タンパク質のアンカリング膜貫通ドメインとして使用しうる。上述のとおり、本明細書に提供される抗原結合受容体は、SEQ ID NO:97に示すヒト完全長CD28タンパク質（SEQ ID NO:96に示すcDNAによってコードされるもの）の153〜179、154〜179、155〜179、156〜179、157〜179、158〜179、159〜179、160〜179、161〜179、162〜179、163〜179、164〜179、165〜179、166〜179、167〜179、168〜179、169〜179、170〜179、171〜179、172〜179、173〜179、174〜179、175〜179、176〜179、177〜179または178〜179番目のアミノ酸に位置する、CD28のアンカリング膜貫通ドメインを含みうる。したがって、本発明との関連において、アンカリング膜貫通ドメインは、SEQ ID NO:14に示すアミノ酸配列（SEQ ID NO:29に示すDNA配列によってコードされるもの）を含む/からなることができる。
【０１７４】
一態様では、アンカリング膜貫通ドメインと、CD20に対して特異的に結合する能力を有するFabフラグメントを含む細胞外ドメインとを含み、
（a）C末端においてSEQ ID NO:14のアンカリング膜貫通ドメインのN末端に任意でSEQ ID NO:20のペプチドリンカーを介して融合されたSEQ ID NO:8のアミノ酸配列を含む重鎖と、
（b）SEQ ID NO:9のアミノ酸配列を含む軽鎖と
を含む、抗原結合受容体が提供される。
【０１７５】
代替の態様では、アンカリング膜貫通ドメインと、CD20に対して特異的に結合する能力を有するFabフラグメントを含む細胞外ドメインとを含み、
（a）C末端においてSEQ ID NO:14のアンカリング膜貫通ドメインのN末端に任意でSEQ ID NO:20のペプチドリンカーを介して融合されたSEQ ID NO:9のアミノ酸配列を含む軽鎖と、
（b）SEQ ID NO:8のアミノ酸配列を含む重鎖と
を含む、抗原結合受容体が提供される。
【０１７６】
代替の態様では、アンカリング膜貫通ドメインと、CD20に対して特異的に結合する能力を有するcrossFabフラグメントを含む細胞外ドメインとを含み、
（a）C末端においてSEQ ID NO:14のアンカリング膜貫通ドメインのN末端に任意でSEQ ID NO:20のペプチドリンカーを介して融合されたSEQ ID NO:42のアミノ酸配列を含む重鎖と、
（b）SEQ ID NO:43のアミノ酸配列を含む軽鎖と
を含む、抗原結合受容体が提供される。
【０１７７】
代替の態様では、アンカリング膜貫通ドメインと、CD20に対して特異的に結合する能力を有するcrossFabフラグメントを含む細胞外ドメインとを含み、
（a）C末端においてSEQ ID NO:14のアンカリング膜貫通ドメインのN末端に任意でSEQ ID NO:20のペプチドリンカーを介して融合されたSEQ ID NO:37のアミノ酸配列を含む軽鎖と、
（b）SEQ ID NO:38のアミノ酸配列を含む軽鎖と
を含む、抗原結合受容体が提供される。
【０１７８】
一態様において、アンカリング膜貫通ドメインと、CD20に対して特異的に結合する能力を有するscFabフラグメントを含む細胞外ドメインとを含み、該scFabフラグメントが、C末端においてSEQ ID NO:14のアンカリング膜貫通ドメインのN末端に任意でSEQ ID NO:20のペプチドリンカーを介して融合されたSEQ ID NO:51のアミノ酸配列を含む、抗原結合受容体が提供される。
【０１７９】
一態様では、アンカリング膜貫通ドメインと、PDL1に対して特異的に結合する能力を有するFabフラグメントを含む細胞外ドメインとを含み、
（a）C末端においてSEQ ID NO:14のアンカリング膜貫通ドメインのN末端に任意でSEQ ID NO:20のペプチドリンカーを介して融合されたSEQ ID NO:75のアミノ酸配列を含む重鎖と、
（b）SEQ ID NO:76のアミノ酸配列を含む軽鎖と
を含む、抗原結合受容体が提供される。
【０１８０】
代替の態様では、アンカリング膜貫通ドメインと、PDL1に対して特異的に結合する能力を有するFabフラグメントを含む細胞外ドメインとを含み、
（a）C末端においてSEQ ID NO:14のアンカリング膜貫通ドメインのN末端に任意でSEQ ID NO:20のペプチドリンカーを介して融合されたSEQ ID NO:76のアミノ酸配列を含む軽鎖と、
（b）SEQ ID NO:75のアミノ酸配列を含む重鎖と
を含む、抗原結合受容体が提供される。
【０１８１】
代替の態様では、アンカリング膜貫通ドメインと、PDL1に対して特異的に結合する能力を有するcrossFabフラグメントを含む細胞外ドメインとを含み、
（a）C末端においてSEQ ID NO:14のアンカリング膜貫通ドメインのN末端に任意でSEQ ID NO:20のペプチドリンカーを介して融合されたSEQ ID NO:83のアミノ酸配列を含む重鎖と、
（b）SEQ ID NO:84のアミノ酸配列を含む軽鎖と
を含む、抗原結合受容体が提供される。
【０１８２】
代替の態様では、アンカリング膜貫通ドメインと、PDL1に対して特異的に結合する能力を有するcrossFabフラグメントを含む細胞外ドメインとを含み、
（a）C末端においてSEQ ID NO:14のアンカリング膜貫通ドメインのN末端に任意でSEQ ID NO:20のペプチドリンカーを介して融合されたSEQ ID NO:80のアミノ酸配列を含む軽鎖と、
（b）SEQ ID NO:81のアミノ酸配列を含む重鎖と
を含む、抗原結合受容体が提供される。
【０１８３】
一態様において、アンカリング膜貫通ドメインと、PDL1に対して特異的に結合する能力を有するscFabフラグメントを含む細胞外ドメインとを含み、該scFabフラグメントが、C末端においてSEQ ID NO:14のアンカリング膜貫通ドメインのN末端に任意でSEQ ID NO:20のペプチドリンカーを介して融合されたSEQ ID NO:86のアミノ酸配列を含む、抗原結合受容体が提供される。
【０１８４】
刺激シグナリングドメイン（SSD）および共刺激シグナリングドメイン（CSD）
好ましくは、本発明の抗原結合受容体は、少なくとも1つの刺激シグナリングドメインおよび/または少なくとも1つの共刺激シグナリングドメインを含む。したがって本明細書に提供される抗原結合受容体は、好ましくは、T細胞活性化をもたらす刺激シグナリングドメインを含む。本明細書に提供される抗原結合受容体は、ネズミ/マウスまたはヒトCD3z（ヒトCD3zのUniProtエントリーはP20963（バージョン番号177、配列番号2）であり;ネズミ/マウスCD3zのUniProtエントリーはP24161（プライマリー引用可能アクセッション番号）またはQ9D3G3（セカンダリー引用可能アクセッション番号）、バージョン番号143、配列番号1である）、FCGR3A（ヒトFCGR3AのUniProtエントリーはP08637（バージョン番号178、配列番号2）である）またはNKG2D（ヒトNKG2DのUniProtエントリーはP26718（バージョン番号151、配列番号1）であり;ネズミ/マウスNKG2DのUniProtエントリーはO54709（バージョン番号132、配列番号2）である）のフラグメント/ポリペプチドパーツである刺激シグナリングドメインを含みうる。
【０１８５】
したがって、本明細書に提供される抗原結合受容体に含まれる刺激シグナリングドメインは、完全長CD3z、FCGR3A、およびNKG2Dのフラグメント/ポリペプチドパーツでありうる。ネズミ/マウス完全長CD3zのアミノ酸配列は、本明細書では、SEQ ID NO:94（ネズミ/マウス、SEQ ID NO:95に示すDNA配列によってコードされるもの）として示される。ヒト完全長CD3zのアミノ酸配列は、本明細書では、SEQ ID NO:92（ヒト、SEQ ID NO:93に示すDNA配列によってコードされるもの）として示される。本発明の抗原結合受容体は、少なくとも1つのシグナリングドメインが含まれるのであれば、CD3z、FCGR3AまたはNKG2Dのフラグメントを、刺激ドメインとして含みうる。特に、CD3z、FCGR3AまたはNKG2Dのパーツ/フラグメントはいずれも、少なくとも1つのシグナリングモチーフが含まれるのであれば、刺激ドメインとして適切である。しかし、より好ましくは、本発明の抗原結合受容体は、ヒト起源由来のポリペプチドを含む。好ましくは、本明細書に提供される抗原結合受容体は、本明細書にSEQ ID NO:92（CD3z）として示すアミノ酸配列（ヒト、SEQ ID NO:93（CD3z）に示すDNA配列によってコードされるもの）を含む。例えば、本発明の抗原結合受容体に含まれうるヒトCD3zのフラグメント/ポリペプチドパーツは、SEQ ID NO:16に示すアミノ酸配列（SEQ ID NO:31に示すDNA配列によってコードされるもの）を含むか、そのアミノ酸配列からなりうる。したがって、一態様において抗原結合受容体は、SEQ ID NO:16に示す配列を含むか、SEQ ID NO:16と比較して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、23、24、25、26、27、28、29または30個の置換、欠失または挿入を有する配列であって、刺激シグナリング活性を有することを特徴とする配列を含む。刺激シグナリングドメイン（SSD）を含む抗原結合受容体の具体的構成は以下に記載すると共に、実施例および図面に記載する。刺激シグナリング活性は、例えば、ELISAによって測定されるサイトカイン放出の強化（IL-2、IFNγ、TNFα）、増殖活性の強化（細胞数の増加によって測定されるもの）、またはLDH放出アッセイによって測定される溶解活性の強化などによって決定することができる。
【０１８６】
さらにまた、本明細書に提供される抗原結合受容体は、好ましくは、T細胞に追加の活性を与える少なくとも1つの共刺激シグナリングドメインを含む。本明細書に提供される抗原結合受容体は、ネズミ/マウスまたはヒトCD28（ヒトCD28のUniProtエントリーはP10747（バージョン番号173、配列番号1）であり;ネズミ/マウスCD28のUniProtエントリーはP31041（バージョン番号134、配列番号2）である）、CD137（ヒトCD137のUniProtエントリーはQ07011（バージョン番号145、配列番号1）であり;ネズミ/マウスCD137のUniProtエントリーはP20334（バージョン番号139、配列番号1）である）、OX40（ヒトOX40のUniProtエントリーはP23510（バージョン番号138、配列番号1）であり;ネズミ/マウスOX40のUniProtエントリーはP43488（バージョン番号119、配列番号1）である）、ICOS（ヒトICOSのUniProtエントリーはQ9Y6W8（バージョン番号126、配列番号1）であり;ネズミ/マウスICOSのUniProtエントリーはQ9WV40（プライマリー引用可能アクセッション番号）またはQ9JL17（セカンダリー引用可能アクセッション番号）、バージョン番号102および配列バージョン2である）、CD27（ヒトCD27のUniProtエントリーはP26842（バージョン番号160、配列番号2）であり;ネズミ/マウスCD27のUniprotエントリーはP41272（バージョン番号137、配列バージョン1）である）、4-1-BB（ネズミ/マウス4-1-BBのUniProtエントリーはP20334（バージョン番号140、配列バージョン1）であり;ヒト4-1-BBのUniProtエントリーはQ07011（バージョン番号146、配列バージョン）である）、DAP10（ヒトDAP10のUniProtエントリーはQ9UBJ5（バージョン番号25、配列番号1）であり;ネズミ/マウスDAP10のUniProtエントリーはQ9QUJ0（プライマリー引用可能アクセッション番号）またはQ9R1E7（セカンダリー引用可能アクセッション番号）、バージョン番号101および配列番号1である）またはDAP12（ヒトDAP12のUniProtエントリーはO43914（バージョン番号146および配列番号1）であり;ネズミ/マウスDAP12のUniProtエントリーはO054885（プライマリー引用可能アクセッション番号）またはQ9R1E7（セカンダリー引用可能アクセッション番号）、バージョン番号123および配列番号1である）のフラグメント/ポリペプチドパーツである共刺激シグナリングドメインを含みうる。本発明の一定の態様において、本発明の抗原結合受容体は、本明細書において定義する共刺激シグナリングドメインのうちの1つまたは複数、すなわち1、2、3、4、5、6または7つを含みうる。したがって、本発明との関連において、本発明の抗原結合受容体は、ネズミ/マウスCD28または好ましくはヒトCD28のフラグメント/ポリペプチドパーツを第1の共刺激シグナリングドメインとして含むことができ、第2の共刺激シグナリングドメインは、ネズミ/マウスのまたは好ましくはヒトのCD27、CD28、CD137、OX40、ICOS、DAP10およびDAP12またはそれらのフラグメントからなる群より選択される。好ましくは、本発明の抗原結合受容体は、ヒト起源由来の共刺激シグナリングドメインを含む。したがって、より好ましくは、本発明の抗原結合受容体に含まれる共刺激シグナリングドメインは、SEQ ID NO:15に示すアミノ酸配列（SEQ ID NO:30に示すDNA配列によってコードされるもの）を含むか、そのアミノ酸配列からなりうる。
【０１８７】
したがって、本明細書に提供される抗原結合受容体に任意で含まれうる共刺激シグナリングドメインは、完全長CD27、CD28、CD137、OX40、ICOS、DAP10およびDAP12のフラグメント/ポリペプチドパーツである。ネズミ/マウス完全長CD28のアミノ酸配列は、本明細書では、SEQ ID NO:99（ネズミ/マウス、SEQ ID NO:98に示すDNA配列によってコードされるもの）として示される。しかし、本発明との関連においてはヒト配列が最も好ましいので、本明細書に提供される抗原結合受容体タンパク質に任意で含まれうる共刺激シグナリングドメインは、ヒト完全長CD27、CD28、CD137、OX40、ICOS、DAP10、またはDAP12のフラグメント/ポリペプチドパーツである。ヒト完全長CD28のアミノ酸配列は、本明細書では、SEQ ID NO:97（ヒト、SEQ ID NO:96に示すDNA配列によってコードされるもの）として示される。
【０１８８】
好ましい一態様において、抗原結合受容体は、CD28またはそのフラグメントを共刺激シグナリングドメインとして含む。本明細書に提供される抗原結合受容体は、少なくとも1つのCD28のシグナリングドメインが含まれるのであれば、CD28のフラグメントを共刺激シグナリングドメインとして含みうる。特に、CD28のパーツ/フラグメントはいずれも、CD28のシグナリングモチーフのうちの少なくとも1つが含まれる限り、本発明の抗原結合受容体にとって適切である。例えば、本発明の抗原結合受容体タンパク質に含まれるCD28ポリペプチドは、SEQ ID NO:15に示すアミノ酸配列（SEQ ID NO:30に示すDNA配列によってコードされるもの）を含むか、そのアミノ酸配列からなりうる。本発明において、共刺激シグナリングドメインとして機能するCD28の細胞内ドメインは、配列YMNM（SEQ ID NO:132）および/またはPYAP（SEQ ID NO:133）を有するCD28ポリペプチドの細胞内ドメインに由来する配列を含みうる。好ましくは、本発明の抗原結合受容体は、ヒト起源由来のポリペプチドを含む。例えば、本発明の抗原結合受容体に含まれうるヒトCD28のフラグメント/ポリペプチドパーツは、SEQ ID NO:15に示すアミノ酸配列（SEQ ID NO:30に示すDNA配列によってコードされるもの）を含むか、そのアミノ酸配列からなりうる。したがって、本発明との関連において、抗原結合受容体は、SEQ ID NO:15に示す配列を含むか、SEQ ID NO:15と比較して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個の置換、欠失または挿入を有する配列であって、共刺激シグナリング活性を有することを特徴とする配列を含む。共刺激シグナリングドメイン（CSD）を含む抗原結合受容体の具体的構成は以下に記載すると共に、実施例および図面に記載する。共刺激シグナリング活性は、例えば、ELISAによって測定されるサイトカイン放出の強化（IL-2、IFNγ、TNFα）、増殖活性の強化（細胞数の増加によって測定されるもの）、またはLDH放出アッセイによって測定される溶解活性の強化などによって決定することができる。
【０１８９】
上述のように、本発明の態様において、抗原結合受容体の共刺激シグナリングドメインは、ヒトCD28遺伝子（Uni Protエントリー番号:P10747（アクセッション番号、エントリーバージョン:173および配列のバージョン1））に由来することができ、形質導入T細胞のような本明細書に記載の形質導入細胞のサイトカイン生産、増殖および溶解活性として定義されるCD28活性を与える。CD28活性は、ELISAによるサイトカインの放出またはインターフェロン-ガンマ（IFN-γ）またはインターロイキン2（IL-2）などのサイトカインのフローサイトメトリー、例えばki67測定などによって測定されるT細胞の増殖、フローサイトメトリーによる細胞定量、または標的細胞のリアルタイムインピーダンス測定によって評価される溶解活性（例えばThakur et al.,Biosens Bioelectron.35（1）（2012）,503-506、Krutzik et al.,Methods Mol Biol.699（2011）,179-202、Ekkens et al.,Infect Immun.75（5）（2007）,2291-2296、Ge et al.,Proc Natl Acad Sci USA.99（5）（2002）,2983-2988、Duewell et al.,Cell Death Differ.21（12）（2014）,1825-1837、Erratum in:Cell Death Differ.21（12）（2014）,161などに記載されているようにICELLligence計器などを使用ことによる）によって測定することができる。共刺激シグナリングドメインPYAP（SEQ ID NO:133のAA208〜211）およびYMNM（SEQ ID NO:132のAA191〜194）は、CD28ポリペプチドの機能および上に列挙した機能的効果にとって有益である。YMNMドメインのアミノ酸配列をSEQ ID NO:132に示し、PYAPドメインのアミノ酸配列をSEQ ID NO:133に示す。したがって、本発明の抗原結合受容体において、CD28ポリペプチドは、好ましくは、配列YMNM（SEQ ID NO:132）および/またはPYAP（SEQ ID NO:133）を有するCD28ポリペプチドの細胞内ドメインに由来する配列を含む。本発明との関連において、配列YMNM（SEQ ID NO:132）および/またはPYAP（SEQ ID NO:133）を有するCD28ポリペプチドの細胞内ドメインは、形質導入T細胞のような本明細書に記載する形質導入細胞のサイトカイン生産、増殖および溶解活性として定義されるCD28活性を特徴とする。したがって、本発明との関連において、本発明の抗原結合受容体の共刺激シグナリングドメインは、SEQ ID NO:15のアミノ酸配列（ヒト）（SEQ ID NO:30に示すDNA配列によってコードされるもの）を有する。しかし、本発明の抗原結合受容体では、これらのドメインの一方または両方を、それぞれFMNM（SEQ ID NO:134）および/またはAYAA（SEQ ID NO:135）に変異させてもよい。これらの変異はどちらも、抗原結合受容体を含む形質導入細胞のサイトカイン放出能力をその増殖能には影響を及ぼすことなく低減し、形質導入細胞の生存率を、したがってその治療ポテンシャルを長引かせるために有利に使用することができる。すなわち、言い換えると、そのような非機能的変異は、好ましくは、本明細書に提供される抗原結合受容体が形質導入された細胞のインビボでの残留性を高める。ただし、これらのシグナリングモチーフは本明細書に提供される抗原結合受容体の細胞内ドメイン内の任意の部位に存在しうる。
【０１９０】
リンカーおよびシグナルペプチド
さらにまた、本明細書に提供される抗原結合受容体は、少なくとも1つのリンカー（または「スペーサー」）を含みうる。リンカーは、通常、最大20アミノ酸の長さを有するペプチドである。したがって、本発明との関連において、リンカーは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20アミノ酸の長さを有しうる。例えば、本明細書に提供される抗原結合受容体は、少なくとも1つの抗原結合部分を含む細胞外ドメイン、アンカリング膜貫通ドメイン、共刺激シグナリングドメインおよび/または刺激シグナリングドメインの間に、リンカーを含みうる。そのようなリンカーには、それらが抗原結合受容体の異なるポリペプチド（すなわち細胞外ドメイン、アンカリング膜貫通ドメイン、共刺激シグナリングドメインおよび/または刺激シグナリングドメイン）が独立して折りたたまれて予想どおりに挙動する確率を増加させるという利点がある。したがって本発明との関連において、少なくとも1つの有能な抗原結合部分を含む細胞外ドメイン、哺乳動物プロテアーゼのための切断部位を有しないアンカリング膜貫通ドメイン、共刺激シグナリングドメインおよび刺激シグナリングドメインが、単鎖多機能ポリペプチド鎖に含まれうる。融合構築物は、例えば、少なくとも1つの抗原結合部分を含む細胞外ドメイン、アンカリング膜貫通ドメイン、共刺激シグナリングドメインおよび/または刺激シグナリングドメインを含むポリペプチドからなりうる。好ましい態様において、抗原結合受容体は、単鎖構築物ではない抗原結合部分を含む。すなわち、抗原結合部分はFabまたはcrossFabフラグメントである。好ましくは、そのような構築物は、本明細書に記載するように、免疫グロブリンの軽鎖または重鎖と組み合わされた単鎖重鎖融合ポリペプチドまたは単鎖軽鎖融合ポリペプチドを含むと考えられる。例えば重鎖融合ポリペプチドが、免疫グロブリン重鎖、アンカリング膜貫通ドメイン、共刺激シグナリングドメインおよび/または刺激シグナリングドメインを含み、免疫グロブリン軽鎖と組み合わされるか、または軽鎖融合ポリペプチドが、免疫グロブリン軽鎖、アンカリング膜貫通ドメイン、共刺激シグナリングドメインおよび/または刺激シグナリングドメインを含み、免疫グロブリン重鎖と組み合わされる。したがって、抗原結合部分、アンカリング膜貫通ドメイン、共刺激シグナリングドメインおよび刺激シグナリングドメインは、本明細書に記載するとおり、1つまたは複数の同一のまたは異なるペプチドリンカーによって連結されうる。例えば、本明細書に提供される抗原結合受容体において、少なくとも1つの抗原結合部分を含む細胞外ドメインとアンカリング膜貫通ドメインとの間のリンカーは、SEQ ID NO:20に示すアミノおよびアミノ酸配列を含むか、またはそれからなりうる。したがって、アンカリング膜貫通ドメイン、共刺激シグナリングドメインおよび/または刺激ドメインは互いに、ペプチドリンカーによって連結されるか、またはドメインの直接的融合によって連結されうる。
【０１９１】
いくつかの態様において、細胞外ドメインに含まれる抗原結合部分は単鎖可変フラグメント（scFv）であり、これは10〜約25アミノ酸の短いリンカーペプチドで連結された抗体重鎖の可変領域（VH）と抗体軽鎖の可変領域（VL）との融合タンパク質である。リンカーは通常、可動性のためにグリシンに富むと共に、溶解性のためにセリンまたはスレオニンに富み、VHのN末端をVLのC末端と連結するか、それらを逆に連結することができる。例えば、リンカーはSEQ ID NO:19に示すアミノおよびアミノ酸配列を有しうる。
【０１９２】
本発明のいくつかの態様において、細胞外ドメインに含まれる抗原結合部分は単鎖Fabフラグメント、すなわちscFabであり、これは、重鎖可変ドメイン（VH）、抗体定常ドメイン1（CH1）、抗体軽鎖可変ドメイン（VL）、抗体軽鎖定常ドメイン（CL）およびリンカーからなるポリペプチドであって、抗体ドメインおよびリンカーは、N末端からC末端に向かって、次の順序:a）VH-CH1-リンカー-VL-CL、b）VL-CL-リンカー-VH-CH1、c）VH-CL-リンカー-VL-CH1またはd）VL-CH1-リンカー-VH-CL、のうちの1つを有し、リンカーは少なくとも30アミノ酸、好ましくは32〜50アミノ酸のポリペプチドである。単鎖Fabフラグメントは、CLドメインとCH1ドメインの間の天然ジスルフィド結合によって安定化される。
【０１９３】
本発明のいくつかの態様において、細胞外ドメインに含まれる抗原結合部分はクロスオーバー（crossover）単鎖Fabフラグメントであり、これは、重鎖可変ドメイン（VH）、抗体定常ドメイン1（CH1）、抗体軽鎖可変ドメイン（VL）、抗体軽鎖定常ドメイン（CL）およびリンカーからなるポリペプチドであって、抗体ドメインおよびリンカーは、N末端からC末端に向かって、次の順序:a）VH-CL-リンカー-VL-CH1およびb）VL-CH1-リンカー-VH-CL、のうちの1つを有し、VHとVLは全体として抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、リンカーは少なくとも30アミノ酸のポリペプチドである。
【０１９４】
本明細書に提供される抗原結合受容体またはそのパーツはシグナルペプチドを含みうる。そのようなシグナルペプチドはタンパク質をT細胞膜の表面に導くと考えられる。例えば、本明細書に提供される抗原結合受容体において、シグナルペプチドは、SEQ ID NO:136に示すアミノおよびアミノ酸配列（SEQ ID NO:137に示すDNA配列によってコードされるもの）を有しうる。
【０１９５】
T細胞活性化抗原結合受容体
本明細書に記載する抗原結合受容体の構成要素を、さまざまな構成で互いに融合することで、T細胞活性化抗原結合受容体を作製することができる。
【０１９６】
いくつかの態様において、抗原結合受容体は、重鎖可変ドメイン（VH）とアンカリング膜貫通ドメインに連結された軽鎖可変ドメイン（VL）とで構成される細胞外ドメインを含む。いくつかの態様において、VHドメインは、C末端において、VLドメインのN末端に、任意でペプチドリンカーを介して融合される。別の態様において、抗原結合受容体は刺激シグナリングドメインおよび/または共刺激シグナリングドメインをさらに含む。具体的なそのような態様において、抗原結合受容体は、本質的に、1つまたは複数のペプチドリンカーによって連結された、VHドメインおよびVLドメイン、アンカリング膜貫通ドメイン、および任意で刺激シグナリングドメインからなり、ここで、VHドメインは、C末端において、VLドメインのN末端に融合され、VLドメインは、C末端において、アンカリング膜貫通ドメインのN末端に融合され、アンカリング膜貫通ドメインは、C末端において、刺激シグナリングドメインのN末端に融合される。任意で、抗原結合受容体は共刺激シグナリングドメインをさらに含む。そのような具体的態様の一つにおいて、抗原結合受容体は、本質的に、1つまたは複数のペプチドリンカーで連結された、VHドメインおよびVLドメイン、アンカリング膜貫通ドメイン、刺激シグナリングドメインおよび共刺激シグナリングドメインからなり、ここで、VHドメインは、C末端において、VLドメインのN末端に融合され、VLドメインは、C末端において、アンカリング膜貫通ドメインのN末端に融合され、アンカリング膜貫通ドメインは、C末端において、刺激シグナリングドメインのN末端に融合され、刺激シグナリングドメインは、C末端において、共刺激シグナリングドメインのN末端に融合される。代替の態様では、共刺激シグナリングドメインが、刺激シグナリングドメインにではなくアンカリング膜貫通ドメインに連結される。好ましい態様において、抗原結合受容体は、本質的に、1つまたは複数のペプチドリンカーで連結された、VHドメインおよびVLドメイン、アンカリング膜貫通ドメイン、共刺激シグナリングドメインおよび刺激シグナリングドメインからなり、ここで、VHドメインは、C末端において、VLドメインのN末端に融合され、VLドメインは、C末端において、アンカリング膜貫通ドメインのN末端に融合され、アンカリング膜貫通ドメインは、C末端において、共刺激シグナリングドメインのN末端に融合され、共刺激シグナリングドメインは、C末端において、刺激シグナリングドメインのN末端に融合される。
【０１９７】
代替の態様において、結合部分のうちの1つはscFabフラグメントである。好ましい一態様において、抗原結合部分はscFabのC末端においてアンカリング膜貫通ドメインのN末端に、任意でペプチドリンカーを介して融合される。別の態様において、抗原結合受容体は刺激シグナリングドメインおよび/または共刺激シグナリングドメインをさらに含む。具体的なそのような態様において、抗原結合受容体は、本質的に、1つまたは複数のペプチドリンカーで連結された、scFabフラグメント、アンカリング膜貫通ドメイン、および任意で刺激シグナリングドメインからなり、ここで、scFabは、C末端において、アンカリング膜貫通ドメインのN末端に融合され、アンカリング膜貫通ドメインは、C末端において、刺激シグナリングドメインのN末端に融合される。好ましくは、抗原結合受容体は共刺激シグナリングドメインをさらに含む。そのような態様の一つにおいて、抗原結合受容体は、本質的に、1つまたは複数のペプチドリンカーで連結された、scFabフラグメント、アンカリング膜貫通ドメイン、刺激シグナリングドメインおよび共刺激シグナリングドメインからなり、ここで、scFabは、C末端において、アンカリング膜貫通ドメインのN末端に融合され、刺激シグナリングドメインは、C末端において、共刺激シグナリングドメインのN末端に融合される。好ましい態様では、共刺激シグナリングドメインが、刺激シグナリングドメインにではなくアンカリング膜貫通ドメインに連結される。最も好ましい態様において、抗原結合受容体は、本質的に、scFabフラグメント、アンカリング膜貫通ドメイン、共刺激シグナリングドメインおよび刺激シグナリングドメインからなり、ここで、scFabは、C末端において、アンカリング膜貫通ドメインのN末端にペプチドリンカーを介して融合され、アンカリング膜貫通ドメインは、C末端において、共刺激シグナリングドメインのN末端に融合され、共刺激シグナリングドメインは、C末端において、刺激シグナリングドメインのN末端に融合される。
【０１９８】
好ましい態様において、結合部分のうちの1つはFabフラグメントまたはcrossFabフラグメントである。好ましい一態様において、抗原結合部分はFabまたはcrossFab重鎖のC末端においてアンカリング膜貫通ドメインのN末端に、任意でペプチドリンカーを介して融合される。代替の態様において、抗原結合部分はFabまたはcrossFab軽鎖のC末端においてアンカリング膜貫通ドメインのN末端に、任意でペプチドリンカーを介して融合される。別の態様において、抗原結合受容体は刺激シグナリングドメインおよび/または共刺激シグナリングドメインをさらに含む。具体的なそのような態様において、抗原結合受容体は、本質的に、1つまたは複数のペプチドリンカーで連結された、FabまたはcrossFabフラグメント、アンカリング膜貫通ドメイン、および任意で刺激シグナリングドメインからなり、ここで、FabまたはcrossFabフラグメントは重鎖または軽鎖のC末端においてアンカリング膜貫通ドメインのN末端に融合され、アンカリング膜貫通ドメインは、C末端において、刺激シグナリングドメインのN末端に融合される。好ましくは、抗原結合受容体は共刺激シグナリングドメインをさらに含む。そのような態様の一つにおいて、抗原結合受容体は、本質的に、1つまたは複数のペプチドリンカーで連結された、FabまたはcrossFabフラグメント、アンカリング膜貫通ドメイン、刺激シグナリングドメインおよび共刺激シグナリングドメインからなり、ここで、FabまたはcrossFabフラグメントは重鎖または軽鎖のC末端においてアンカリング膜貫通ドメインのN末端に融合され、刺激シグナリングドメインは、C末端において、共刺激シグナリングドメインのN末端に融合される。好ましい態様では、共刺激シグナリングドメインが、刺激シグナリングドメインにではなくアンカリング膜貫通ドメインに連結される。最も好ましい態様において、抗原結合受容体は、本質的に、FabまたはcrossFabフラグメント、アンカリング膜貫通ドメイン、共刺激シグナリングドメインおよび刺激シグナリングドメインからなり、ここで、FabまたはcrossFabフラグメントは重鎖のC末端においてアンカリング膜貫通ドメインのN末端にペプチドリンカーを介して融合され、アンカリング膜貫通ドメインは、C末端において、共刺激シグナリングドメインのN末端に融合され、共刺激シグナリングドメインは、C末端において、刺激シグナリングドメインのN末端に融合される。
【０１９９】
抗原結合部分、アンカリング膜貫通ドメインおよび刺激シグナリングおよび/または共刺激シグナリングドメインは、直接的に、または1つもしくは複数のペプチドリンカーであって1つまたは複数のアミノ酸、典型的には約2〜20個のアミノ酸を含むものを介して、互いに融合されうる。ペプチドリンカーは当技術分野において公知であり、本明細書にも記載する。適切な非免疫原性ペプチドリンカーとして、例えば（G4S）n、（SG4）n、（G4S）nまたはG4（SG4）nペプチドリンカーが挙げられ、ここで、「n」は一般的には数字1〜10、典型的には2〜4である。抗原結合部分とアンカリング膜貫通部分とを連結するための好ましいペプチドリンカーは、SEQ ID NO:20のGGGGS（G4S）である。可変重鎖（VH）と可変軽鎖（VL）とを連結するのに適した例示的ペプチドリンカーは、SEQ ID NO:19の
2020511979.tif 000028
である。
【０２００】
加えて、リンカーは免疫グロブリンヒンジ領域（の一部分）を含みうる。特に、抗原結合部分がアンカリング膜貫通ドメインのN末端に融合される場合は、それを、免疫グロブリンヒンジ領域またはその一部分を介して、追加のペプチドリンカーありまたはなしで、融合することができる。
【０２０１】
本明細書に記載するように、本発明の抗原結合受容体は少なくとも1つの抗原結合部分を含む細胞外ドメインを含む。標的細胞抗原に対して特異的に結合する能力を有する単一の抗原結合部分を持つ抗原結合受容体は有用であり、特に、抗原結合受容体の高発現が必要な場合には好ましい。そのような場合、標的細胞抗原に特異的な抗原結合部分が2つ以上存在すると、それによって、抗原結合受容体の発現効率が制限されうる。しかし他の場合には、例えば標的部位へのターゲティングを最適化するために、または標的細胞抗原の架橋を可能にするために、標的細胞抗原に特異的な抗原結合部分を2つ以上含む抗原結合受容体があれば有利であると考えられる。
【０２０２】
好ましい態様において、抗原結合部分はFabフラグメントである。一態様において、抗原結合部分はFab重鎖のC末端においてアンカリング膜貫通ドメインのN末端に融合される。一態様において、アンカリング膜貫通ドメインは、CD8、CD3z、FCGR3A、NKG2D、CD27、CD28、CD137、OX40、ICOS、DAP10、もしくはDAP12膜貫通ドメイン、またはそれらのフラグメントからなる群より選択される膜貫通ドメインである。好ましい態様において、アンカリング膜貫通ドメインはCD28膜貫通ドメインまたはそのフラグメントである。特定態様において、アンカリング膜貫通ドメインは
2020511979.tif 000029
である。一態様において、抗原結合受容体は共刺激シグナリングドメイン（CSD）をさらに含む。一態様において、抗原結合受容体のアンカリング膜貫通ドメインは、C末端において、共刺激シグナリングドメインのN末端に融合される。一態様において、共刺激シグナリングドメインは、前述のとおり、CD27、CD28、CD137、OX40、ICOS、DAP10およびDAP12の細胞内ドメインまたはそれらのフラグメントからなる群より、個別に選択される。好ましい態様において、共刺激シグナリングドメインはCD28の細胞内ドメインまたはそのフラグメントである。特定態様において、共刺激シグナリングドメインは、配列
2020511979.tif 000030
を含むか、または同配列からなる。一態様において、抗原結合受容体は刺激シグナリングドメインをさらに含む。一態様において、抗原結合受容体の共刺激シグナリングドメインは、C末端において、刺激シグナリングドメインのN末端に融合される。一態様において、少なくとも1つの刺激シグナリングドメインは、CD3z、FCGR3A、およびNKG2Dの細胞内ドメインまたはそれらのフラグメントからなる群より個別に選択される。好ましい態様において、刺激シグナリングドメインはCD3zの細胞内ドメインまたはそのフラグメントである。特定態様において、刺激シグナリングドメインは、配列
2020511979.tif 000031
を含むか、または同配列からなる。
【０２０３】
一態様において、Fabフラグメントを含む抗原結合受容体は、レポータータンパク質、特にGFPまたはその強化型類似体に融合される。一態様において、抗原結合受容体は、C末端において、eGFP（強化緑色蛍光タンパク質）のN末端に、任意で、本明細書に記載するペプチドリンカーを介して融合される。好ましい態様において、ペプチドリンカーは、SEQ ID NO:21の
2020511979.tif 000032
である。
【０２０４】
特定態様において、抗原結合受容体は、アンカリング膜貫通ドメインと、少なくとも1つの抗原結合部分を含む細胞外ドメインとを含み、前記少なくとも1つの抗原結合部分はCD20に対して特異的に結合する能力を有するFabフラグメントである。一態様において、本発明の抗原結合受容体は、アンカリング膜貫通ドメイン（ATD）、共刺激シグナリングドメイン（CSD）および刺激シグナリングドメイン（SSD）を含む。そのような態様の一つにおいて、抗原結合受容体はFab-ATD-CSD-SSDという構成を有する。好ましい態様において、抗原結合受容体はFab-G4S-ATD-CSD-SSDという構成を有し、ここでG4Sは、SEQ ID NO:20の配列GGGGSを含むリンカーである。任意で、レポータータンパク質を抗原結合受容体のC末端に、任意でペプチドリンカーを介して付加することができる。
【０２０５】
特定態様において、抗原結合部分はCD20に対して特異的に結合する能力を有し、抗原結合部分は、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:3からなる群より選択される少なくとも1つの重鎖相補性決定領域（CDR）とSEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6の群から選択される少なくとも1つの軽鎖CDRとを含むFabフラグメントである。
【０２０６】
好ましい態様において、抗原結合部分はCD20に対して特異的に結合する能力を有するFabフラグメントであって、抗原結合部分は、相補性決定領域（CDR H）1アミノ酸配列YSWIN（SEQ ID NO:1）、CDR H2アミノ酸配列
2020511979.tif 000033
、CDR H3アミノ酸配列
2020511979.tif 000034
、軽鎖相補性決定領域（CDR L）1アミノ酸配列
2020511979.tif 000035
、CDR L2アミノ酸配列QMSNLVS（SEQ ID NO:5）、およびCDR L3アミノ酸配列AQNLELPYT（SEQ ID NO:6）を含む。
【０２０７】
一態様において、本発明は、N末端からC末端に向かって順に
（i）SEQ ID NO:1の重鎖相補性決定領域（CDR）1、SEQ ID NO:2の重鎖CDR2、SEQ ID NO:3の重鎖CDR3、SEQ ID NO:4の軽鎖CDR1、SEQ ID NO:5の軽鎖CDR2およびSEQ ID NO:6の軽鎖CDR3を含む、CD20に対して特異的に結合する能力を有するFab分子である抗原結合部分、
（ii）ペプチドリンカー、特にSEQ ID NO:20のペプチドリンカー、
（iii）アンカリング膜貫通ドメイン、特にSEQ ID NO:14のアンカリング膜貫通ドメイン、
（iii）共刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:15の共刺激シグナリングドメイン、および
（iv）刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:16の刺激シグナリングドメイン
を含む、抗原結合受容体を提供する。
【０２０８】
一態様において、本発明は、
a）N末端からC末端に向かって順に
（i）SEQ ID NO:1の重鎖相補性決定領域（CDR）1、SEQ ID NO:2の重鎖CDR2、SEQ ID NO:3の重鎖CDR3を含む重鎖、
（ii）ペプチドリンカー、特にSEQ ID NO:20のペプチドリンカー、
（iii）アンカリング膜貫通ドメイン、特にSEQ ID NO:14のアンカリング膜貫通ドメイン、
（iii）共刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:15の共刺激シグナリングドメイン、および
（iv）刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:16の刺激シグナリングドメイン
を含む重鎖融合ポリペプチドと、
b）SEQ ID NO:4の軽鎖CDR1、SEQ ID NO:5の軽鎖CDR2およびSEQ ID NO:6の軽鎖CDR3を含む軽鎖と
を含む、CD20に対して特異的に結合する能力を有する抗原結合受容体を提供する。
【０２０９】
代替の態様において、本発明は、
a）N末端からC末端に向かって順に
（i）SEQ ID NO:4の軽鎖相補性決定領域（CDR）1、SEQ ID NO:5の軽鎖CDR2、SEQ ID NO:6の軽鎖CDR3を含む軽鎖、
（ii）ペプチドリンカー、特にSEQ ID NO:20のペプチドリンカー、
（iii）アンカリング膜貫通ドメイン、特にSEQ ID NO:14のアンカリング膜貫通ドメイン、
（iii）共刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:15の共刺激シグナリングドメイン、および
（iv）刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:16の刺激シグナリングドメイン
を含む軽鎖融合ポリペプチドと、
b）SEQ ID NO:1の重鎖CDR1、SEQ ID NO:2の重鎖CDR2およびSEQ ID NO:3の重鎖CDR3を含む重鎖と
を含む、CD20に対して特異的に結合する能力を有する抗原結合受容体を提供する。
【０２１０】
一態様において、CD20に対して特異的に結合する能力を有する抗原結合部分は、SEQ ID NO:8のアミノ酸配列を含むか同配列からなる重鎖とSEQ ID NO:9のアミノ酸配列を含むか同配列からなる軽鎖とを含むFabフラグメントである。
【０２１１】
一態様において、本発明は、
a）N末端からC末端に向かって順に、
（i）SEQ ID NO:8の重鎖、
（ii）ペプチドリンカー、特にSEQ ID NO:20のペプチドリンカー、
（iii）アンカリング膜貫通ドメイン、特にSEQ ID NO:14のアンカリング膜貫通ドメイン、
（iii）共刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:15の共刺激シグナリングドメイン、および
（iv）刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:16の刺激シグナリングドメイン
を含む重鎖融合ポリペプチドと、
b）SEQ ID NO:9の軽鎖と
を含む、CD20に対して特異的に結合する能力を有する抗原結合受容体を提供する。
【０２１２】
代替の態様において、本発明は、
a）N末端からC末端に向かって順に、
（i）SEQ ID NO:9の軽鎖、
（ii）ペプチドリンカー、特にSEQ ID NO:20のペプチドリンカー、
（iii）アンカリング膜貫通ドメイン、特にSEQ ID NO:14のアンカリング膜貫通ドメイン、
（iii）共刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:15の共刺激シグナリングドメイン、および
（iv）刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:16の刺激シグナリングドメイン
を含む軽鎖融合ポリペプチドと、
b）SEQ ID NO:8の重鎖と
を含む、CD20に対して特異的に結合する能力を有する抗原結合受容体を提供する。
【０２１３】
特定態様において、抗原結合部分はCD20に対して特異的に結合する能力を有するFabフラグメントであって、抗原結合受容体は、SEQ ID NO:7のアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖融合ポリペプチドと、SEQ ID NO:9のアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチドとを含む。
【０２１４】
特定態様において、抗原結合部分はCD20に対して特異的に結合する能力を有するFabフラグメントであって、抗原結合受容体は、SEQ ID NO:50のアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドと、SEQ ID NO:8のアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチドとを含む。
【０２１５】
好ましい態様において、抗原結合部分はCD20に対して特異的に結合する能力を有するFabフラグメントであって、抗原結合受容体は、SEQ ID NO:7のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドと、SEQ ID NO:9のアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチドとを含む。
【０２１６】
別の特定態様において、抗原結合部分はPDL1に対して特異的に結合する能力を有し、抗原結合部分は、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69およびSEQ ID NO:70からなる群より選択される少なくとも1つの重鎖相補性決定領域（CDR）と、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73の群から選択される少なくとも1つの軽鎖CDRとを含むFabフラグメントである。
【０２１７】
好ましい態様において、抗原結合部分はPDL1に対して特異的に結合する能力を有するFabフラグメントであって、抗原結合部分は、相補性決定領域（CDR H）1アミノ酸配列DSWIH（SEQ ID NO:68）、CDR H2アミノ酸配列
2020511979.tif 000036
、CDR H3アミノ酸配列
2020511979.tif 000037
、軽鎖相補性決定領域（CDR L）1アミノ酸配列
2020511979.tif 000038
、CDR L2アミノ酸配列SASFLYS（SEQ ID NO:72）、およびCDR L3アミノ酸配列QQYLYHPAT（SEQ ID NO:73）を含む。
【０２１８】
一態様において、本発明は、N末端からC末端に向かって順に
（i）SEQ ID NO:68の重鎖相補性決定領域（CDR）1、SEQ ID NO:69の重鎖CDR2、SEQ ID NO:70の重鎖CDR3、SEQ ID NO:71の軽鎖CDR1、SEQ ID NO:72の軽鎖CDR2およびSEQ ID NO:73の軽鎖CDR3を含む、PDL1に対して特異的に結合する能力を有するFab分子である抗原結合部分、
（ii）ペプチドリンカー、特にSEQ ID NO:20のペプチドリンカー、
（iii）アンカリング膜貫通ドメイン、特にSEQ ID NO:14のアンカリング膜貫通ドメイン、
（iii）共刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:15の共刺激シグナリングドメイン、および
（iv）刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:16の刺激シグナリングドメイン
を含む、抗原結合受容体を提供する。
【０２１９】
一態様において、本発明は、
a）N末端からC末端に向かって順に
（i）SEQ ID NO:68の重鎖相補性決定領域（CDR）1、SEQ ID NO:69の重鎖CDR2、SEQ ID NO:70の重鎖CDR3を含む重鎖、
（ii）ペプチドリンカー、特にSEQ ID NO:20のペプチドリンカー、
（iii）アンカリング膜貫通ドメイン、特にSEQ ID NO:14のアンカリング膜貫通ドメイン、
（iii）共刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:15の共刺激シグナリングドメイン、および
（iv）刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:16の刺激シグナリングドメイン
を含む重鎖融合ポリペプチドと、
b）SEQ ID NO:71の軽鎖CDR1、SEQ ID NO:72の軽鎖CDR2およびSEQ ID NO:73の軽鎖CDR3を含む軽鎖と
を含む、PDL1に対して特異的に結合する能力を有する抗原結合受容体を提供する。
【０２２０】
代替の態様において、本発明は、
a）N末端からC末端に向かって順に
（i）SEQ ID NO:71の軽鎖相補性決定領域（CDR）1、SEQ ID NO:72の軽鎖CDR2、SEQ ID NO:73の軽鎖CDR3を含む軽鎖、
（ii）ペプチドリンカー、特にSEQ ID NO:20のペプチドリンカー、
（iii）アンカリング膜貫通ドメイン、特にSEQ ID NO:14のアンカリング膜貫通ドメイン、
（iii）共刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:15の共刺激シグナリングドメイン、および
（iv）刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:16の刺激シグナリングドメイン
を含む軽鎖融合ポリペプチドと、
b）SEQ ID NO:68の重鎖CDR1、SEQ ID NO:69の重鎖CDR2およびSEQ ID NO:70の重鎖CDR3を含む重鎖と
を含む、PDL1に対して特異的に結合する能力を有する抗原結合受容体を提供する。
【０２２１】
一態様において、抗原結合部分は、SEQ ID NO:75のアミノ酸配列を含むか同配列からなる重鎖とSEQ ID NO:76のアミノ酸配列を含むか同配列からなる軽鎖とを含む、PDL1に対して特異的に結合する能力を有するFabフラグメントである。
【０２２２】
一態様において、本発明は、
a）N末端からC末端に向かって順に、
（i）SEQ ID NO:75の重鎖、
（ii）ペプチドリンカー、特にSEQ ID NO:20のペプチドリンカー、
（iii）アンカリング膜貫通ドメイン、特にSEQ ID NO:14のアンカリング膜貫通ドメイン、
（iii）共刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:15の共刺激シグナリングドメイン、および
（iv）刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:16の刺激シグナリングドメイン
を含む重鎖融合ポリペプチドと、
b）SEQ ID NO:76の軽鎖と
を含む、PDL1に対して特異的に結合する能力を有する抗原結合受容体を提供する。
【０２２３】
代替の態様において、本発明は、
a）N末端からC末端に向かって順に、
（i）SEQ ID NO:76の軽鎖、
（ii）ペプチドリンカー、特にSEQ ID NO:20のペプチドリンカー、
（iii）アンカリング膜貫通ドメイン、特にSEQ ID NO:14のアンカリング膜貫通ドメイン、
（iii）共刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:15の共刺激シグナリングドメイン、および
（iv）刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:16の刺激シグナリングドメイン
を含む軽鎖融合ポリペプチドと、
b）SEQ ID NO:75の重鎖と
を含む、PDL1に対して特異的に結合する能力を有する抗原結合受容体を提供する。
【０２２４】
特定態様において、抗原結合部分はPDL1に対して特異的に結合する能力を有するFabフラグメントであって、抗原結合受容体は、SEQ ID NO:74のアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖融合ポリペプチドと、SEQ ID NO:76のアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチドとを含む。
【０２２５】
別の特定態様において、抗原結合部分はPDL1に対して特異的に結合する能力を有するFabフラグメントであって、抗原結合受容体は、SEQ ID NO:85のアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドと、SEQ ID NO:75のアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチドとを含む。
【０２２６】
好ましい態様において、抗原結合部分はPDL1に対して特異的に結合する能力を有するFabフラグメントであって、抗原結合受容体は、SEQ ID NO:74のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドと、SEQ ID NO:76のアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチドとを含む。
【０２２７】
別の好ましい態様において、抗原結合部分はcrossFabフラグメントである。後述する一定の態様において、抗原結合受容体は、抗原結合部分のFab軽鎖可変領域がカルボキシ末端ペプチド結合を抗原結合部分のFab重鎖定常領域と共有しているポリペプチドを含み（すなわち抗原結合部分は重鎖可変領域が軽鎖可変領域で置き換えられたcrossFab重鎖を含む）、そしてそのポリペプチドはカルボキシ末端ペプチド結合をアンカリング膜貫通ドメインと共有する（VL-CH1-ATD）。いくつかの態様において、抗原結合受容体は、第1の抗原結合部分のFab重鎖可変領域がカルボキシ末端ペプチド結合を第1の抗原結合部分のFab軽鎖定常領域と共有しているポリペプチド（VH-CL）を、さらに含む。一定の態様において、ポリペプチドは、例えばジスルフィド結合により、共有結合で連結される。代替の態様において、抗原結合受容体は、抗原結合部分のFab重鎖可変領域がカルボキシ末端ペプチド結合を抗原結合部分のFab軽鎖定常領域と共有しているポリペプチドを含み（すなわち抗原結合部分は重鎖定常領域が軽鎖定常領域で置き換えられたcrossFab重鎖を含む）、そしてそのポリペプチドはカルボキシ末端ペプチド結合をアンカリング膜貫通ドメインと共有する（VH-CL-ATD）。いくつかの態様において、抗原結合受容体は、抗原結合部分のFab軽鎖可変領域がカルボキシ末端ペプチド結合を抗原結合部分のFab重鎖定常領域と共有しているポリペプチド（VL-CH1）をさらに含む。一定の態様において、ポリペプチドは、例えばジスルフィド結合により、共有結合で連結される。
【０２２８】
一態様において、抗原結合部分は、重鎖定常ドメインのC末端においてアンカリング膜貫通ドメインのN末端に融合される。代替の態様において、抗原結合部分は、軽鎖定常ドメインのC末端においてアンカリング膜貫通ドメインのN末端に融合される。一態様において、アンカリング膜貫通ドメインは、CD8、CD3z、FCGR3A、NKG2D、CD27、CD28、CD137、OX40、ICOS、DAP10、もしくはDAP12膜貫通ドメイン、またはそれらのフラグメントからなる群より選択される膜貫通ドメインである。好ましい態様において、アンカリング膜貫通ドメインはCD28膜貫通ドメインまたはそのフラグメントである。特定態様において、アンカリング膜貫通ドメインは
2020511979.tif 000039
である。一態様において、抗原結合受容体は共刺激シグナリングドメイン（CSD）をさらに含む。一態様において、抗原結合受容体のアンカリング膜貫通ドメインは、C末端において、共刺激シグナリングドメインのN末端に融合される。一態様において、共刺激シグナリングドメインは、前述のとおり、CD27、CD28、CD137、OX40、ICOS、DAP10およびDAP12の細胞内ドメインまたはそれらのフラグメントからなる群より、個別に選択される。好ましい態様において、共刺激シグナリングドメインはCD28の細胞内ドメインまたはそのフラグメントである。特定態様において、共刺激シグナリングドメインは、配列
2020511979.tif 000040
を含むか、または同配列からなる。一態様において、抗原結合受容体は刺激シグナリングドメインをさらに含む。一態様において、抗原結合受容体の共刺激シグナリングドメインは、C末端において、刺激シグナリングドメインのN末端に融合される。一態様において、少なくとも1つの刺激シグナリングドメインは、CD3z、FCGR3A、およびNKG2Dの細胞内ドメインまたはそれらのフラグメントからなる群より個別に選択される。好ましい態様において、刺激シグナリングドメインはCD3zの細胞内ドメインまたはそのフラグメントである。特定態様において、刺激シグナリングドメインは、配列
2020511979.tif 000041
を含むか、または同配列からなる。
【０２２９】
一態様において、crossFabフラグメントを含む抗原結合受容体は、レポータータンパク質、特にGFPまたはその強化型類似体に融合される。一態様において、抗原結合受容体は、C末端において、eGFP（強化緑色蛍光タンパク質）のN末端に、任意で、本明細書に記載するペプチドリンカーを介して融合される。好ましい態様において、ペプチドリンカーは、SEQ ID NO:21の
2020511979.tif 000042
である。
【０２３０】
特定態様において、抗原結合受容体は、アンカリング膜貫通ドメインと、少なくとも1つの抗原結合部分を含む細胞外ドメインとを含み、前記少なくとも1つの抗原結合部分はCD20に対して特異的に結合する能力を有するcrossFabフラグメントである。一態様において、本発明の抗原結合受容体は、アンカリング膜貫通ドメイン（ATD）、共刺激シグナリングドメイン（CSD）および刺激シグナリングドメイン（SSD）を含む。そのような態様の一つにおいて、抗原結合受容体はcrossFab-ATD-CSD-SSDという構成を有する。好ましい態様において、抗原結合受容体はcrossFab-G4S-ATD-CSD-SSDという構成を有し、ここでG4Sは、SEQ ID NO:20の配列GGGGSを含むリンカーである。任意で、レポータータンパク質を抗原結合受容体のC末端に、任意でペプチドリンカーを介して付加することができる。
【０２３１】
特定態様において、抗原結合部分はCD20に対して特異的に結合する能力を有し、抗原結合部分は、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:3からなる群より選択される少なくとも1つの重鎖相補性決定領域（CDR）とSEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6の群から選択される少なくとも1つの軽鎖CDRとを含むcrossFabフラグメントである。
【０２３２】
好ましい態様において、抗原結合部分はCD20に対して特異的に結合する能力を有するcrossFabフラグメントであって、抗原結合部分は、相補性決定領域（CDR H）1アミノ酸配列YSWIN（SEQ ID NO:1）、CDR H2アミノ酸配列
2020511979.tif 000043
、CDR H3アミノ酸配列
2020511979.tif 000044
、軽鎖相補性決定領域（CDR L）1アミノ酸配列
2020511979.tif 000045
、CDR L2アミノ酸配列QMSNLVS（SEQ ID NO:5）、およびCDR L3アミノ酸配列AQNLELPYT（SEQ ID NO:6）を含む。
【０２３３】
一態様において、本発明は、N末端からC末端に向かって順に
（i）SEQ ID NO:1の重鎖相補性決定領域（CDR）1、SEQ ID NO:2の重鎖CDR2、SEQ ID NO:3の重鎖CDR3、SEQ ID NO:4の軽鎖CDR1、SEQ ID NO:5の軽鎖CDR2およびSEQ ID NO:6の軽鎖CDR3を含む、CD20に対して特異的に結合する能力を有するcrossFab分子である抗原結合部分、
（ii）ペプチドリンカー、特にSEQ ID NO:20のペプチドリンカー、
（iii）アンカリング膜貫通ドメイン、特にSEQ ID NO:14のアンカリング膜貫通ドメイン、
（iii）共刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:15の共刺激シグナリングドメイン、および
（iv）刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:16の刺激シグナリングドメイン
を含む、抗原結合受容体を提供する。
【０２３４】
一態様において、本発明は、
a）N末端からC末端に向かって順に
（i）SEQ ID NO:1の重鎖相補性決定領域（CDR）1、SEQ ID NO:2の重鎖CDR2、SEQ ID NO:3の重鎖CDR3を含む重鎖、
（ii）ペプチドリンカー、特にSEQ ID NO:20のペプチドリンカー、
（iii）アンカリング膜貫通ドメイン、特にSEQ ID NO:14のアンカリング膜貫通ドメイン、
（iii）共刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:15の共刺激シグナリングドメイン、および
（iv）刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:16の刺激シグナリングドメイン
を含む重鎖融合ポリペプチドと、
b）SEQ ID NO:4の軽鎖CDR1、SEQ ID NO:5の軽鎖CDR2およびSEQ ID NO:6の軽鎖CDR3を含む軽鎖と
を含む、抗原結合受容体を提供する。
【０２３５】
代替の態様において、本発明は、
a）N末端からC末端に向かって順に
（i）SEQ ID NO:4の軽鎖相補性決定領域（CDR）1、SEQ ID NO:5の軽鎖CDR2、SEQ ID NO:6の軽鎖CDR3を含む軽鎖、
（ii）ペプチドリンカー、特にSEQ ID NO:20のペプチドリンカー、
（iii）アンカリング膜貫通ドメイン、特にSEQ ID NO:14のアンカリング膜貫通ドメイン、
（iii）共刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:15の共刺激シグナリングドメイン、および
（iv）刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:16の刺激シグナリングドメイン
を含む軽鎖融合ポリペプチドと、
b）SEQ ID NO:1の重鎖CDR1、SEQ ID NO:2の重鎖CDR2およびSEQ ID NO:3の重鎖CDR3を含む重鎖と
を含む、抗原結合受容体を提供する。
【０２３６】
一態様において、抗原結合部分は、SEQ ID NO:38のアミノ酸配列を含むか同配列からなる重鎖とSEQ ID NO:37のアミノ酸配列を含むか同配列からなる軽鎖とを含むcrossFabフラグメントである。
【０２３７】
代替の態様において、抗原結合部分は、SEQ ID NO:42のアミノ酸配列を含むか同配列からなる重鎖とSEQ ID NO:43のアミノ酸配列を含むか同配列からなる軽鎖とを含むcrossFabフラグメントである。
【０２３８】
一態様において、本発明は、
a）N末端からC末端に向かって順に、
（i）SEQ ID NO:42の重鎖、
（ii）ペプチドリンカー、特にSEQ ID NO:20のペプチドリンカー、
（iii）アンカリング膜貫通ドメイン、特にSEQ ID NO:14のアンカリング膜貫通ドメイン、
（iii）共刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:15の共刺激シグナリングドメイン、および
（iv）刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:16の刺激シグナリングドメイン
を含む重鎖融合ポリペプチドと、
b）SEQ ID NO:43の軽鎖と
を含む、抗原結合受容体を提供する。
【０２３９】
代替の態様において、本発明は、
a）N末端からC末端に向かって順に、
（i）SEQ ID NO:37の軽鎖、
（ii）ペプチドリンカー、特にSEQ ID NO:20のペプチドリンカー、
（iii）アンカリング膜貫通ドメイン、特にSEQ ID NO:14のアンカリング膜貫通ドメイン、
（iii）共刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:15の共刺激シグナリングドメイン、および
（iv）刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:16の刺激シグナリングドメイン
を含む軽鎖融合ポリペプチドと、
b）SEQ ID NO:38の重鎖と
を含む、抗原結合受容体を提供する。
【０２４０】
特定態様において、抗原結合部分はCD20に対して特異的に結合する能力を有するcrossFabフラグメントであって、抗原結合受容体は、SEQ ID NO:41のアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖融合ポリペプチドと、SEQ ID NO:43のアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチドとを含む。
【０２４１】
特定態様において、抗原結合部分はCD20に対して特異的に結合する能力を有するFabフラグメントであって、抗原結合受容体は、SEQ ID NO:36のアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドと、SEQ ID NO:38のアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチドとを含む。
【０２４２】
好ましい態様において、抗原結合部分はCD20に対して特異的に結合する能力を有するFabフラグメントであって、抗原結合受容体は、SEQ ID NO:36のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドと、SEQ ID NO:38のアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチドとを含む。
【０２４３】
別の特定態様において、抗原結合受容体は、アンカリング膜貫通ドメインと、少なくとも1つの抗原結合部分を含む細胞外ドメインとを含み、前記少なくとも1つの抗原結合部分はPDL1に対して特異的に結合する能力を有するcrossFabフラグメントである。一態様において、本発明の抗原結合受容体は、アンカリング膜貫通ドメイン（ATD）、共刺激シグナリングドメイン（CSD）および刺激シグナリングドメイン（SSD）を含む。そのような態様の一つにおいて、抗原結合受容体はcrossFab-ATD-CSD-SSDという構成を有する。好ましい態様において、抗原結合受容体はcrossFab-G4S-ATD-CSD-SSDという構成を有し、ここでG4Sは、SEQ ID NO:20の配列GGGGSを含むリンカーである。任意で、レポータータンパク質を抗原結合受容体のC末端に、任意でペプチドリンカーを介して付加することができる。
【０２４４】
特定態様において、抗原結合部分はPDL1に対して特異的に結合する能力を有し、抗原結合部分は、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69およびSEQ ID NO:70からなる群より選択される少なくとも1つの重鎖相補性決定領域（CDR）と、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73の群から選択される少なくとも1つの軽鎖CDRとを含むcrossFabフラグメントである。
【０２４５】
好ましい態様において、抗原結合部分はPDL1に対して特異的に結合する能力を有するcrossFabフラグメントであって、抗原結合部分は、相補性決定領域（CDR H）1アミノ酸配列DSWIH（SEQ ID NO:68）、CDR H2アミノ酸配列
2020511979.tif 000046
、CDR H3アミノ酸配列
2020511979.tif 000047
、軽鎖相補性決定領域（CDR L）1アミノ酸配列
2020511979.tif 000048
、CDR L2アミノ酸配列SASFLYS（SEQ ID NO:72）、およびCDR L3アミノ酸配列QQYLYHPAT（SEQ ID NO:73）を含む。
【０２４６】
一態様において、本発明は、N末端からC末端に向かって順に:
（i）SEQ ID NO:68の重鎖相補性決定領域（CDR）1、SEQ ID NO:69の重鎖CDR2、SEQ ID NO:70の重鎖CDR3、SEQ ID NO:71の軽鎖CDR1、SEQ ID NO:72の軽鎖CDR2およびSEQ ID NO:73の軽鎖CDR3を含む、PDL1に対して特異的に結合する能力を有するcrossFab分子である抗原結合部分、
（ii）ペプチドリンカー、特にSEQ ID NO:20のペプチドリンカー、
（iii）アンカリング膜貫通ドメイン、特にSEQ ID NO:14のアンカリング膜貫通ドメイン、
（iii）共刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:15の共刺激シグナリングドメイン、および
（iv）刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:16の刺激シグナリングドメイン
を含む、抗原結合受容体を提供する。
【０２４７】
一態様において、本発明は、
a）N末端からC末端に向かって順に
（i）SEQ ID NO:68の重鎖相補性決定領域（CDR）1、SEQ ID NO:69の重鎖CDR2、SEQ ID NO:70の重鎖CDR3を含む重鎖、
（ii）ペプチドリンカー、特にSEQ ID NO:20のペプチドリンカー、
（iii）アンカリング膜貫通ドメイン、特にSEQ ID NO:14のアンカリング膜貫通ドメイン、
（iii）共刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:15の共刺激シグナリングドメイン、および
（iv）刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:16の刺激シグナリングドメイン
を含む重鎖融合ポリペプチドと、
b）SEQ ID NO:71の軽鎖CDR1、SEQ ID NO:72の軽鎖CDR2およびSEQ ID NO:73の軽鎖CDR3を含む軽鎖と
を含む、PDL1に対して特異的に結合する能力を有する抗原結合受容体を提供する。
【０２４８】
代替の態様において、本発明は、
a）N末端からC末端に向かって順に
（i）SEQ ID NO:71の軽鎖相補性決定領域（CDR）1、SEQ ID NO:72の軽鎖CDR2、SEQ ID NO:73の軽鎖CDR3を含む軽鎖、
（ii）ペプチドリンカー、特にSEQ ID NO:20のペプチドリンカー、
（iii）アンカリング膜貫通ドメイン、特にSEQ ID NO:14のアンカリング膜貫通ドメイン、
（iii）共刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:15の共刺激シグナリングドメイン、および
（iv）刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:16の刺激シグナリングドメイン
を含む軽鎖融合ポリペプチドと、
b）SEQ ID NO:68の重鎖CDR1、SEQ ID NO:69の重鎖CDR2およびSEQ ID NO:70の重鎖CDR3を含む重鎖と
を含む、PDL1に対して特異的に結合する能力を有する抗原結合受容体を提供する。
【０２４９】
一態様において、抗原結合部分は、SEQ ID NO:81のアミノ酸配列を含むか同配列からなる重鎖とSEQ ID NO:80のアミノ酸配列を含むか同配列からなる軽鎖とを含むcrossFabフラグメントである。
【０２５０】
代替の態様において、抗原結合部分は、SEQ ID NO:83のアミノ酸配列を含むか同配列からなる重鎖とSEQ ID NO:84のアミノ酸配列を含むか同配列からなる軽鎖とを含むcrossFabフラグメントである。
【０２５１】
一態様において、本発明は、
a）N末端からC末端に向かって順に、
（i）SEQ ID NO:83の重鎖、
（ii）ペプチドリンカー、特にSEQ ID NO:20のペプチドリンカー、
（iii）アンカリング膜貫通ドメイン、特にSEQ ID NO:14のアンカリング膜貫通ドメイン、
（iii）共刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:15の共刺激シグナリングドメイン、および
（iv）刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:16の刺激シグナリングドメイン
を含む重鎖融合ポリペプチドと、
b）SEQ ID NO:84の軽鎖と
を含む、PDL1に対して特異的に結合する能力を有する抗原結合受容体を提供する。
【０２５２】
代替の態様において、本発明は、
a）N末端からC末端に向かって順に、
（i）SEQ ID NO:80の軽鎖、
（ii）ペプチドリンカー、特にSEQ ID NO:20のペプチドリンカー、
（iii）アンカリング膜貫通ドメイン、特にSEQ ID NO:14のアンカリング膜貫通ドメイン、
（iii）共刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:15の共刺激シグナリングドメイン、および
（iv）刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:16の刺激シグナリングドメイン
を含む軽鎖融合ポリペプチドと、
b）SEQ ID NO:81の重鎖と
を含む、PDL1に対して特異的に結合する能力を有する抗原結合受容体を提供する。
【０２５３】
特定態様において、抗原結合部分はPDL1に対して特異的に結合する能力を有するcrossFabフラグメントであって、抗原結合受容体は、SEQ ID NO:82のアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖融合ポリペプチドと、SEQ ID NO:84のアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチドとを含む。
【０２５４】
別の好ましい態様において、抗原結合部分はPDL1に対して特異的に結合する能力を有するFabフラグメントであって、抗原結合受容体は、SEQ ID NO:82のアミノ酸配列を含む重鎖融合ポリペプチドと、SEQ ID NO:84のアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチドとを含む。
【０２５５】
特定態様において、抗原結合部分はPDL1に対して特異的に結合する能力を有するFabフラグメントであって、抗原結合受容体は、SEQ ID NO:79のアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドと、SEQ ID NO:81のアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチドとを含む。
【０２５６】
好ましい一態様において、抗原結合部分はPDL1に対して特異的に結合する能力を有するFabフラグメントであって、抗原結合受容体は、SEQ ID NO:79のアミノ酸配列を含む軽鎖融合ポリペプチドと、SEQ ID NO:81のアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチドとを含む。
【０２５７】
一定の代替の態様において、本発明の抗原結合受容体、Fab軽鎖ポリペプチドおよびFab重鎖融合ポリペプチドは、任意でリンカーペプチドを介して、互いに融合される。したがって一態様において、抗原結合部分は単鎖Fab（scFab）フラグメントである。一態様において、Fab軽鎖ポリペプチドおよびFab重鎖融合ポリペプチドはペプチドリンカーを介して互いに融合される。一態様において、ペプチドリンカーはアミノ酸配列
2020511979.tif 000049
を含む。一態様において、抗原結合部分は、scFabのC末端においてアンカリング膜貫通ドメインのN末端に、任意でペプチドリンカーを介して融合される。一態様において、ペプチドリンカーはアミノ酸配列GGGGS（SEQ ID NO:20）を含む。一態様において、アンカリング膜貫通ドメインは、CD8、CD3z、FCGR3A、NKG2D、CD27、CD28、CD137、OX40、ICOS、DAP10、もしくはDAP12膜貫通ドメイン、またはそれらのフラグメントからなる群より選択される膜貫通ドメインである。好ましい態様において、アンカリング膜貫通ドメインはCD28膜貫通ドメインまたはそのフラグメントである。特定態様において、アンカリング膜貫通ドメインは
2020511979.tif 000050
のアミノ酸配列を含むか、または同配列からなる。一態様において、抗原結合受容体は共刺激シグナリングドメイン（CSD）をさらに含む。一態様において、抗原結合受容体のアンカリング膜貫通ドメインは、C末端において、共刺激シグナリングドメインのN末端に融合される。一態様において、共刺激シグナリングドメインは、前述のとおり、CD27、CD28、CD137、OX40、ICOS、DAP10およびDAP12の各細胞内ドメインまたはそれらのフラグメントからなる群より、個別に選択される。好ましい態様において、共刺激シグナリングドメインはCD28の細胞内ドメインまたはそのフラグメントである。特定態様において、共刺激シグナリングドメインは、配列
2020511979.tif 000051
を含むか、または同配列からなる。一態様において、抗原結合受容体は刺激シグナリングドメインをさらに含む。一態様において、抗原結合受容体の共刺激シグナリングドメインは、C末端において、刺激シグナリングドメインのN末端に融合される。一態様において、少なくとも1つの刺激シグナリングドメインは、CD3z、FCGR3A、およびNKG2Dの細胞内ドメインまたはそれらのフラグメントからなる群より個別に選択される。好ましい態様において、刺激シグナリングドメインはCD3zの細胞内ドメインまたはそのフラグメントである。特定態様において、刺激シグナリングドメインは、配列
2020511979.tif 000052
を含むか、または同配列からなる。
【０２５８】
一態様において、scFabを含む抗原結合受容体は、レポータータンパク質、特にGFPまたはその強化型類似体に融合される。一態様において、抗原結合受容体は、C末端において、eGFP（強化緑色蛍光タンパク質）のN末端に、任意で、本明細書に記載するペプチドリンカーを介して融合される。好ましい態様において、ペプチドリンカーは、SEQ ID NO:21の
2020511979.tif 000053
である。
【０２５９】
特定態様において、抗原結合受容体は、アンカリング膜貫通ドメインと、少なくとも1つの抗原結合部分を含む細胞外ドメインとを含み、前記少なくとも1つの抗原結合部分はCD20に対して特異的に結合する能力を有するscFabフラグメントである。一態様において、本発明の抗原結合受容体は、アンカリング膜貫通ドメイン（ATD）、共刺激シグナリングドメイン（CSD）および刺激シグナリングドメイン（SSD）を含む。そのような態様の一つにおいて、抗原結合受容体はscFab-ATD-CSD-SSDという構成を有する。好ましい態様において、抗原結合受容体はscFab-G4S-ATD-CSD-SSDという構成を有し、ここでG4Sは、SEQ ID NO:20の配列GGGGSを含むリンカーである。任意で、レポータータンパク質を抗原結合受容体のC末端に、任意でペプチドリンカーを介して付加することができる。
【０２６０】
特定態様において、抗原結合部分はCD20に対して特異的に結合する能力を有するscFabフラグメントであって、抗原結合部分は、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:3からなる群より選択される少なくとも1つの重鎖相補性決定領域（CDR）とSEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6の群から選択される少なくとも1つの軽鎖CDRとを含む。
【０２６１】
好ましい態様において、抗原結合部分はCD20に対して特異的に結合する能力を有するscFabであって、抗原結合部分は、相補性決定領域（CDR H）1アミノ酸配列YSWIN（SEQ ID NO:1）、CDR H2アミノ酸配列
2020511979.tif 000054
、CDR H3アミノ酸配列
2020511979.tif 000055
、軽鎖相補性決定領域（CDR L）1アミノ酸配列
2020511979.tif 000056
、CDR L2アミノ酸配列QMSNLVS（SEQ ID NO:5）、およびCDR L3アミノ酸配列AQNLELPYT（SEQ ID NO:6）を含む。
【０２６２】
一態様において、本発明は、N末端からC末端に向かって順に:
（i）SEQ ID NO:1の重鎖相補性決定領域（CDR）1、SEQ ID NO:2の重鎖CDR2、SEQ ID NO:3の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域（VH）と、SEQ ID NO:4の軽鎖CDR1、SEQ ID NO:5の軽鎖CDR2およびSEQ ID NO:6の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域（VH）とを含む、CD20に対して特異的に結合する能力を有するscFabフラグメントである、抗原結合部分、
（ii）ペプチドリンカー、特にSEQ ID NO:20のペプチドリンカー、
（iii）アンカリング膜貫通ドメイン、特にSEQ ID NO:14のアンカリング膜貫通ドメイン、
（iii）共刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:15の共刺激シグナリングドメイン、および
（iv）刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:16の刺激シグナリングドメイン
を含む、抗原結合受容体を提供する。
【０２６３】
一態様において、本発明は、N末端からC末端に向かって順に:
（i）SEQ ID NO:12の重鎖可変ドメイン（VH）とSEQ ID NO:10の軽鎖可変ドメイン（VL）とを含む、CD20に対して特異的に結合する能力を有するscFab分子である、抗原結合部分、
（ii）ペプチドリンカー、特にSEQ ID NO:20のペプチドリンカー、
（iii）アンカリング膜貫通ドメイン、特にSEQ ID NO:14のアンカリング膜貫通ドメイン、
（iii）共刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:15の共刺激シグナリングドメイン、および
（iv）刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:16の刺激シグナリングドメイン
を含む、抗原結合受容体を提供する。
【０２６４】
好ましい態様において、本発明は、N末端からC末端に向かって順に
（i）重鎖可変ドメイン（VH）SEQ ID NO:12と軽鎖可変ドメイン（VL）SEQ ID NO:10とを含む、CD20に対して特異的に結合する能力を有するscFab分子である、抗原結合部分、
（ii）ペプチドリンカー、特にSEQ ID NO:20のペプチドリンカー、
（iii）アンカリング膜貫通ドメイン、特にSEQ ID NO:14のアンカリング膜貫通ドメイン、
（iii）共刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:15の共刺激シグナリングドメイン、および
（iv）刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:16の刺激シグナリングドメイン
を含む、抗原結合受容体を提供する。
【０２６５】
好ましい態様において、本発明は、N末端からC末端に向かって順に
（i）SEQ ID NO:52のアミノ酸配列を含む、CD20に対して特異的に結合する能力を有するscFab分子である、抗原結合部分、
（ii）ペプチドリンカー、特にSEQ ID NO:20のペプチドリンカー、
（iii）アンカリング膜貫通ドメイン、特にSEQ ID NO:14のアンカリング膜貫通ドメイン、
（iii）共刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:15の共刺激シグナリングドメイン、および
（iv）刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:16の刺激シグナリングドメイン
を含む、抗原結合受容体を提供する。
【０２６６】
特定態様において、抗原結合部分はCD20に対して特異的に結合する能力を有し、抗原結合受容体はSEQ ID NO:51のアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％または100％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０２６７】
好ましい態様において、抗原結合部分はCD20に対して特異的に結合する能力を有し、抗原結合受容体はSEQ ID NO:51のアミノ酸配列を含む。
【０２６８】
特定態様において、抗原結合受容体は、アンカリング膜貫通ドメインと、少なくとも1つの抗原結合部分を含む細胞外ドメインとを含み、前記少なくとも1つの抗原結合部分はPDL1に対して特異的に結合する能力を有するscFabフラグメントである。一態様において、本発明の抗原結合受容体は、アンカリング膜貫通ドメイン（ATD）、共刺激シグナリングドメイン（CSD）および刺激シグナリングドメイン（SSD）を含む。そのような態様の一つにおいて、抗原結合受容体はscFab-ATD-CSD-SSDという構成を有する。好ましい態様において、抗原結合受容体はscFab-G4S-ATD-CSD-SSDという構成を有し、ここでG4Sは、SEQ ID NO:20の配列GGGGSを含むリンカーである。任意で、レポータータンパク質を抗原結合受容体のC末端に、任意でペプチドリンカーを介して付加することができる。
【０２６９】
特定態様において、抗原結合部分はPDL1に対して特異的に結合する能力を有するscFabフラグメントであって、抗原結合部分は、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69およびSEQ ID NO:70からなる群より選択される少なくとも1つの重鎖相補性決定領域（CDR）と、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73の群から選択される少なくとも1つの軽鎖CDRとを含む。
【０２７０】
好ましい態様において、抗原結合部分はPDL1に対して特異的に結合する能力を有するscFabであって、抗原結合部分は、相補性決定領域（CDR H）1アミノ酸配列DSWIH（SEQ ID NO:68）、CDR H2アミノ酸配列
2020511979.tif 000057
、CDR H3アミノ酸配列
2020511979.tif 000058
、軽鎖相補性決定領域（CDR L）1アミノ酸配列
2020511979.tif 000059
、CDR L2アミノ酸配列SASFLYS（SEQ ID NO:72）、およびCDR L3アミノ酸配列QQYLYHPAT（SEQ ID NO:73）を含む。
【０２７１】
一態様において、本発明は、N末端からC末端に向かって順に:
（i）SEQ ID NO:68の重鎖相補性決定領域（CDR）1、SEQ ID NO:69の重鎖CDR2、SEQ ID NO:70の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域（VH）と、SEQ ID NO:71の軽鎖CDR1、SEQ ID NO:72の軽鎖CDR2およびSEQ ID NO:73の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域（VH）とを含む、PDL1に対して特異的に結合する能力を有するscFabフラグメントである、抗原結合部分、
（ii）ペプチドリンカー、特にSEQ ID NO:20のペプチドリンカー、
（iii）アンカリング膜貫通ドメイン、特にSEQ ID NO:14のアンカリング膜貫通ドメイン、
（iii）共刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:15の共刺激シグナリングドメイン、および
（iv）刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:16の刺激シグナリングドメイン
を含む、抗原結合受容体を提供する。
【０２７２】
一態様において、本発明は、N末端からC末端に向かって順に:
（i）SEQ ID NO:78の重鎖可変ドメイン（VH）とSEQ ID NO:77の軽鎖可変ドメイン（VL）とを含む、PDL1に対して特異的に結合する能力を有するscFab分子である、抗原結合部分、
（ii）ペプチドリンカー、特にSEQ ID NO:20のペプチドリンカー、
（iii）アンカリング膜貫通ドメイン、特にSEQ ID NO:14のアンカリング膜貫通ドメイン、
（iii）共刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:15の共刺激シグナリングドメイン、および
（iv）刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:16の刺激シグナリングドメイン
を含む、抗原結合受容体を提供する。
【０２７３】
好ましい態様において、本発明は、N末端からC末端に向かって順に
（i）重鎖可変ドメイン（VH）SEQ ID NO:78と軽鎖可変ドメイン（VL）SEQ ID NO:77とを含む、PDL1に対して特異的に結合する能力を有するscFab分子である、抗原結合部分、
（ii）ペプチドリンカー、特にSEQ ID NO:20のペプチドリンカー、
（iii）アンカリング膜貫通ドメイン、特にSEQ ID NO:14のアンカリング膜貫通ドメイン、
（iii）共刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:15の共刺激シグナリングドメイン、および
（iv）刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:16の刺激シグナリングドメイン
を含む、抗原結合受容体を提供する。
【０２７４】
好ましい態様において、本発明は、N末端からC末端に向かって順に
（i）SEQ ID NO:87のアミノ酸配列を含む、PDL1に対して特異的に結合する能力を有するscFab分子である、抗原結合部分、
（ii）ペプチドリンカー、特にSEQ ID NO:20のペプチドリンカー、
（iii）アンカリング膜貫通ドメイン、特にSEQ ID NO:14のアンカリング膜貫通ドメイン、
（iii）共刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:15の共刺激シグナリングドメイン、および
（iv）刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:16の刺激シグナリングドメイン
を含む、抗原結合受容体を提供する。
【０２７５】
特定態様において、抗原結合部分はPDL1に対して特異的に結合する能力を有し、抗原結合受容体はSEQ ID NO:86のアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％または100％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０２７６】
好ましい態様において、抗原結合部分はCD20に対して特異的に結合する能力を有し、抗原結合受容体はSEQ ID NO:86のアミノ酸配列を含む。
【０２７７】
記載のFab重鎖と軽鎖の融合はFab重鎖と軽鎖のペアリングを改良することができ、またいくつかの本発明抗原結合受容体の発現に必要なプラスミドの数を低減する。抗原結合受容体の発現に必要なプラスミドの数を低減するための代替の戦略は、例えば図2において説明するように、重鎖構築物と軽鎖構築物の両方を同じプラスミドから発現させることができるように、配列内リボソーム進入サイド（internal ribosomal entry side）を使用することである。
【０２７８】
一態様において、抗原結合部分はscFvフラグメントである。一態様において、抗原結合部分は、scFvフラグメントのC末端においてアンカリング膜貫通ドメインのN末端に、任意でペプチドリンカーを介して融合される。一態様において、ペプチドリンカーはアミノ酸配列GGGGS（SEQ ID NO:20）を含む。一態様において、アンカリング膜貫通ドメインは、CD8、CD3z、FCGR3A、NKG2D、CD27、CD28、CD137、OX40、ICOS、DAP10、もしくはDAP12膜貫通ドメイン、またはそれらのフラグメントからなる群より選択される膜貫通ドメインである。好ましい態様において、アンカリング膜貫通ドメインはCD28膜貫通ドメインまたはそのフラグメントである。特定態様において、アンカリング膜貫通ドメインは
2020511979.tif 000060
のアミノ酸配列を含むか、または同配列からなる。一態様において、抗原結合受容体は共刺激シグナリングドメイン（CSD）をさらに含む。一態様において、抗原結合受容体のアンカリング膜貫通ドメインは、C末端において、共刺激シグナリングドメインのN末端に融合される。一態様において、共刺激シグナリングドメインは、前述のとおり、CD27、CD28、CD137、OX40、ICOS、DAP10およびDAP12の各細胞内ドメインまたはそれらのフラグメントからなる群より、個別に選択される。好ましい態様において、共刺激シグナリングドメインはCD28の細胞内ドメインまたはそのフラグメントである。特定態様において、共刺激シグナリングドメインは、配列
2020511979.tif 000061
を含むか、または同配列からなる。一態様において、抗原結合受容体は刺激シグナリングドメインをさらに含む。一態様において、抗原結合受容体の共刺激シグナリングドメインは、C末端において、刺激シグナリングドメインのN末端に融合される。一態様において、少なくとも1つの刺激シグナリングドメインは、CD3z、FCGR3A、およびNKG2Dの細胞内ドメインまたはそれらのフラグメントからなる群より個別に選択される。好ましい態様において、刺激シグナリングドメインはCD3zの細胞内ドメインまたはそのフラグメントである。特定態様において、刺激シグナリングドメインは、配列
2020511979.tif 000062
を含むか、または同配列からなる。
【０２７９】
一態様において、scFvフラグメントを含む抗原結合受容体は、レポータータンパク質、特にGFPまたはその強化型類似体に融合される。一態様において、抗原結合受容体は、C末端において、eGFP（強化緑色蛍光タンパク質）のN末端に、任意で、本明細書に記載するペプチドリンカーを介して融合される。好ましい態様において、ペプチドリンカーは、SEQ ID NO:21の
2020511979.tif 000063
である。
【０２８０】
特定態様において、抗原結合受容体は、アンカリング膜貫通ドメインと、少なくとも1つの抗原結合部分を含む細胞外ドメインとを含み、前記少なくとも1つの抗原結合部分はCD20に対して特異的に結合する能力を有するscFvフラグメントである。一態様において、本発明の抗原結合受容体は、アンカリング膜貫通ドメイン（ATD）、共刺激シグナリングドメイン（CSD）および刺激シグナリングドメイン（SSD）を含む。そのような態様の一つにおいて、抗原結合受容体はscFv-ATD-CSD-SSDという構成を有する。好ましい態様において、抗原結合受容体はscFv-G4S-ATD-CSD-SSDという構成を有し、ここでG4Sは、SEQ ID NO:20の配列GGGGSを含むリンカーである。任意で、レポータータンパク質を抗原結合受容体のC末端に、任意でペプチドリンカーを介して付加することができる。
【０２８１】
特定態様において、抗原結合部分はCD20に対して特異的に結合する能力を有するscFvフラグメントであって、抗原結合部分は、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:3からなる群より選択される少なくとも1つの重鎖相補性決定領域（CDR）とSEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6の群から選択される少なくとも1つの軽鎖CDRとを含む。
【０２８２】
好ましい態様において、抗原結合部分はCD20に対して特異的に結合する能力を有するscFvであって、抗原結合部分は、相補性決定領域（CDR H）1アミノ酸配列YSWIN（SEQ ID NO:1）、CDR H2アミノ酸配列
2020511979.tif 000064
、CDR H3アミノ酸配列
2020511979.tif 000065
、軽鎖相補性決定領域（CDR L）1アミノ酸配列
2020511979.tif 000066
、CDR L2アミノ酸配列QMSNLVS（SEQ ID NO:5）、およびCDR L3アミノ酸配列AQNLELPYT（SEQ ID NO:6）を含む。
【０２８３】
一態様において、本発明は、N末端からC末端に向かって順に:
（i）SEQ ID NO:1の重鎖相補性決定領域（CDR）1、SEQ ID NO:2の重鎖CDR2、SEQ ID NO:3の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域（VH）と、SEQ ID NO:4の軽鎖CDR1、SEQ ID NO:5の軽鎖CDR2およびSEQ ID NO:6の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域（VH）とを含む、CD20に対して特異的に結合する能力を有するscFvフラグメントである、抗原結合部分、
（ii）ペプチドリンカー、特にSEQ ID NO:20のペプチドリンカー、
（iii）アンカリング膜貫通ドメイン、特にSEQ ID NO:14のアンカリング膜貫通ドメイン、
（iii）共刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:15の共刺激シグナリングドメイン、および
（iv）刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:16の刺激シグナリングドメイン
を含む、抗原結合受容体を提供する。
【０２８４】
一態様において、本発明は、N末端からC末端に向かって順に:
（i）SEQ ID NO:12およびSEQ ID NO:65から選択される重鎖可変ドメイン（VH）とSEQ ID NO:10およびSEQ ID NO:66から選択される軽鎖可変ドメイン（VL）とを含む、CD20に対して特異的に結合する能力を有するscFv分子である、抗原結合部分、
（ii）ペプチドリンカー、特にSEQ ID NO:20のペプチドリンカー、
（iii）アンカリング膜貫通ドメイン、特にSEQ ID NO:14のアンカリング膜貫通ドメイン、
（iii）共刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:15の共刺激シグナリングドメイン、および
（iv）刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:16の刺激シグナリングドメイン
を含む、抗原結合受容体を提供する。
【０２８５】
好ましい態様において、本発明は、N末端からC末端に向かって順に
（i）重鎖可変ドメイン（VH）SEQ ID NO:65と軽鎖可変ドメイン（VL）SEQ ID NO:66とを含む、CD20に対して特異的に結合する能力を有するscFv分子である、抗原結合部分、
（ii）ペプチドリンカー、特にSEQ ID NO:20のペプチドリンカー、
（iii）アンカリング膜貫通ドメイン、特にSEQ ID NO:14のアンカリング膜貫通ドメイン、
（iii）共刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:15の共刺激シグナリングドメイン、および
（iv）刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:16の刺激シグナリングドメイン
を含む、抗原結合受容体を提供する。
【０２８６】
好ましい態様において、本発明は、N末端からC末端に向かって順に
（i）SEQ ID NO:61のアミノ酸配列を含む、CD20に対して特異的に結合する能力を有するscFv分子である、抗原結合部分、
（ii）ペプチドリンカー、特にSEQ ID NO:20のペプチドリンカー、
（iii）アンカリング膜貫通ドメイン、特にSEQ ID NO:14のアンカリング膜貫通ドメイン、
（iii）共刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:15の共刺激シグナリングドメイン、および
（iv）刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:16の刺激シグナリングドメイン
を含む、抗原結合受容体を提供する。
【０２８７】
特定態様において、抗原結合部分はCD20に対して特異的に結合する能力を有し、抗原結合受容体はSEQ ID NO:60のアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％または100％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０２８８】
好ましい態様において、抗原結合部分はCD20に対して特異的に結合する能力を有し、抗原結合受容体はSEQ ID NO:60のアミノ酸配列を含む。
【０２８９】
特定態様において、抗原結合受容体は、アンカリング膜貫通ドメインと、少なくとも1つの抗原結合部分を含む細胞外ドメインとを含み、前記少なくとも1つの抗原結合部分はPDL1に対して特異的に結合する能力を有するscFvフラグメントである。一態様において、本発明の抗原結合受容体は、アンカリング膜貫通ドメイン（ATD）、共刺激シグナリングドメイン（CSD）および刺激シグナリングドメイン（SSD）を含む。そのような態様の一つにおいて、抗原結合受容体はscFv-ATD-CSD-SSDという構成を有する。好ましい態様において、抗原結合受容体はscFv-G4S-ATD-CSD-SSDという構成を有し、ここでG4Sは、SEQ ID NO:20の配列GGGGSを含むリンカーである。任意で、レポータータンパク質を抗原結合受容体のC末端に、任意でペプチドリンカーを介して付加することができる。
【０２９０】
一態様において、抗原結合部分はPDL1に対して特異的に結合する能力を有するscFvフラグメントであって、抗原結合部分は、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69およびSEQ ID NO:70からなる群より選択される少なくとも1つの重鎖相補性決定領域（CDR）と、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73の群から選択される少なくとも1つの軽鎖CDRとを含む。
【０２９１】
好ましい態様において、抗原結合部分はPDL1に対して特異的に結合する能力を有するscFvであって、抗原結合部分は、相補性決定領域（CDR H）1アミノ酸配列DSWIH（SEQ ID NO:68）、CDR H2アミノ酸配列
2020511979.tif 000067
、CDR H3アミノ酸配列
2020511979.tif 000068
、軽鎖相補性決定領域（CDR L）1アミノ酸配列
2020511979.tif 000069
、CDR L2アミノ酸配列SASFLYS（SEQ ID NO:72）、およびCDR L3アミノ酸配列QQYLYHPAT（SEQ ID NO:73）を含む。
【０２９２】
一態様において、本発明は、N末端からC末端に向かって順に:
（i）SEQ ID NO:68の重鎖相補性決定領域（CDR）1、SEQ ID NO:69の重鎖CDR2、SEQ ID NO:70の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域（VH）と、SEQ ID NO:71の軽鎖CDR1、SEQ ID NO:72の軽鎖CDR2およびSEQ ID NO:73の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域（VH）とを含む、PDL1に対して特異的に結合する能力を有するscFvフラグメントである、抗原結合部分、
（ii）ペプチドリンカー、特にSEQ ID NO:20のペプチドリンカー、
（iii）アンカリング膜貫通ドメイン、特にSEQ ID NO:14のアンカリング膜貫通ドメイン、
（iii）共刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:15の共刺激シグナリングドメイン、および
（iv）刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:16の刺激シグナリングドメイン
を含む、抗原結合受容体を提供する。
【０２９３】
一態様において、本発明は、N末端からC末端に向かって順に:
（i）SEQ ID NO:78およびSEQ ID NO:90から選択される重鎖可変ドメイン（VH）とSEQ ID NO:77およびSEQ ID NO:91から選択される軽鎖可変ドメイン（VL）とを含む、PDL1に対して特異的に結合する能力を有するscFv分子である、抗原結合部分、
（ii）ペプチドリンカー、特にSEQ ID NO:20のペプチドリンカー、
（iii）アンカリング膜貫通ドメイン、特にSEQ ID NO:14のアンカリング膜貫通ドメイン、
（iii）共刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:15の共刺激シグナリングドメイン、および
（iv）刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:16の刺激シグナリングドメイン
を含む、抗原結合受容体を提供する。
【０２９４】
好ましい態様において、本発明は、N末端からC末端に向かって順に
（i）重鎖可変ドメイン（VH）SEQ ID NO:90と軽鎖可変ドメイン（VL）SEQ ID NO:91とを含む、PDL1に対して特異的に結合する能力を有するscFv分子である、抗原結合部分、
（ii）ペプチドリンカー、特にSEQ ID NO:20のペプチドリンカー、
（iii）アンカリング膜貫通ドメイン、特にSEQ ID NO:14のアンカリング膜貫通ドメイン、
（iii）共刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:15の共刺激シグナリングドメイン、および
（iv）刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:16の刺激シグナリングドメイン
を含む、抗原結合受容体を提供する。
【０２９５】
好ましい態様において、本発明は、N末端からC末端に向かって順に
（i）SEQ ID NO:89のアミノ酸配列を含む、PDL1に対して特異的に結合する能力を有するscFv分子である、抗原結合部分、
（ii）ペプチドリンカー、特にSEQ ID NO:20のペプチドリンカー、
（iii）アンカリング膜貫通ドメイン、特にSEQ ID NO:14のアンカリング膜貫通ドメイン、
（iii）共刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:15の共刺激シグナリングドメイン、および
（iv）刺激シグナリングドメイン、特にSEQ ID NO:16の刺激シグナリングドメイン
を含む、抗原結合受容体を提供する。
【０２９６】
特定態様において、抗原結合部分はPDL1に対して特異的に結合する能力を有し、抗原結合受容体はSEQ ID NO:88のアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％または100％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０２９７】
好ましい態様において、抗原結合部分はPDL1に対して特異的に結合する能力を有し、抗原結合受容体はSEQ ID NO:88のアミノ酸配列を含む。
【０２９８】
上記の態様のいずれかでは、抗原結合受容体の構成要素（例:VHおよびVL、抗原結合部分、アンカリング膜貫通ドメイン、共刺激シグナリングドメイン、刺激シグナリングドメイン）を直接的に融合するか、さまざまなリンカー、特に、本明細書に記載する、または当技術分野において公知の、1つまたは複数のアミノ酸、典型的には約2〜20個のアミノ酸を含むペプチドリンカーを介して融合することができる。適切な非免疫原性ペプチドリンカーとして、例えば（G4S）n、（SG4）n、（G4S）nまたはG4（SG4）nペプチドリンカーが挙げられ、ここで、nは一般的には数字1〜10、好ましくは1〜4である。
【０２９９】
FabドメインおよびcrossFabドメインにおける修飾
別の局面において、そして本明細書に記載する同じ細胞中に、すなわち同じT細胞中に、2種以上の抗原結合受容体が含まれる場合に正しいペアリングを増進するために、第1の標的抗原に特異的に結合する第1のFabフラグメントまたは第1のcrossFabフラグメントを含む第1の抗原結合受容体と、第2の標的抗原に特異的に結合する第2のFabフラグメントまたは第2のcrossFabフラグメントを含む第2の抗原結合受容体とは、異なる荷電アミノ酸置換（いわゆる「荷電残基」）を含有することができる。これらの修飾は、交差型（crossed）または非交差型（non-crossed）のCH1ドメインおよびCLドメインに導入される。そのような修飾は、例えばWO2015/150447、WO2016/020309およびPCT/EP2016/073408に記載されている。
【０３００】
特定局面において、本発明は、定常ドメインCLにおいて124番目のアミノ酸がリジン（K）、アルギニン（R）またはヒスチジン（H）によって独立して置換され（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）、定常ドメインCH1において147番目および213番目のアミノ酸がグルタミン酸（E）またはアスパラギン酸（D）によって独立して置換されている（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）、Fabを含む抗原結合受容体に関係する。
【０３０１】
特定局面において、本発明は、CLドメインにおいて123番目のアミノ酸（EUナンバリング）がアルギニン（R）で置き換えられ、124番目のアミノ酸（EUナンバリング）がリジン（K）で置き換えられており、CH1ドメインにおいて147番目（EUナンバリング）および213番目（EUナンバリング）のアミノ酸がグルタミン酸（E）で置き換えられている、標的抗原に特異的に結合するFabフラグメントを含む抗原結合受容体に関する。
【０３０２】
さらなる局面において、本発明は、細胞、すなわちT細胞に共形質導入することができる2種の抗原結合受容体であって、重鎖と軽鎖の正しいペアリングが増進されるものに関する。そのような局面の一つにおいて、（i）第1抗原結合受容体のFabフラグメントまたはcrossFabフラグメントのCLドメインでは、124番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）が正荷電アミノ酸によって置換され、その場合、第1抗原結合受容体のFabフラグメントまたはcrossFabフラグメントのCH1ドメインでは、147番目のアミノ酸または213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）が負荷電アミノ酸によって置換され、かつ/または（ii）第2抗原結合受容体のFabフラグメントまたはcrossFabフラグメントのCLドメインでは、124番目のアミノ酸（ナンバリングはKabatに従う）が正荷電アミノ酸によって置換され、その場合、第2抗原結合受容体のFabフラグメントまたはcrossFabフラグメントのCH1ドメインでは、147番目のアミノ酸または213番目のアミノ酸（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）が負荷電アミノ酸によって置換される。
【０３０３】
別の局面において、（i）第1抗原結合受容体のFabフラグメントまたはcrossFabフラグメントのCLドメインでは、124番目のアミノ酸がリジン（K）、アルギニン（R）またはヒスチジン（H）によって独立して（好ましい一態様ではリジン（K）またはアルギニン（R）で独立して）置換され（ナンバリングはKabatに従う）、その場合、第1抗原結合受容体のFabフラグメントまたはcrossFabフラグメントのCHドメインでは、147番目のアミノ酸または213番目のアミノ酸がグルタミン酸（E）またはアスパラギン酸（D）によって独立して置換され（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）、かつ/または（ii）第2抗原結合受容体のFabフラグメントまたはcrossFabフラグメントのCLドメインでは、124番目のアミノ酸がリジン（K）、アルギニン（R）またはヒスチジン（H）（ナンバリングはKabatに従う）によって独立して（好ましい一態様ではリジン（K）またはアルギニン（R）で独立して）置換され、その場合、第2抗原結合受容体のFabフラグメントまたはcrossFabフラグメントのCHドメインでは、147番目のアミノ酸または213番目のアミノ酸がグルタミン酸（E）またはアスパラギン酸（D）（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）によって独立して置換される。
【０３０４】
一局面において、第1抗原結合受容体のFabフラグメントまたはcrossFabフラグメントのCLドメインでは、124番目および123番目のアミノ酸がKによって置換される（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）。
【０３０５】
一局面において、第2抗原結合受容体のFabフラグメントまたはcrossFabフラグメントのCLドメインでは、123番目のアミノ酸がRによって置換され、124番目のアミノ酸がKによって置換される（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）。
【０３０６】
一局面において、第2抗原結合受容体のFabフラグメントまたはcrossFabフラグメントのCHドメインでは、147番目および213番目のアミノ酸がEによって置換される（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）。
【０３０７】
一局面において、第1抗原結合受容体のFabフラグメントまたはcrossFabフラグメントのCLドメインでは、124番目および123番目のアミノ酸がKによって置換され、かつ第1抗原結合受容体のFabフラグメントまたはcrossFabフラグメントのCHドメインでは、147番目および213番目のアミノ酸がEによって置換される（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）。
【０３０８】
一局面において、第1抗原結合受容体のFabフラグメントまたはcrossFabフラグメントのCLドメインでは、123番目のアミノ酸がRによって置換され、124番目のアミノ酸がKによって置換され、かつ第1抗原結合受容体のFabフラグメントまたはcrossFabフラグメントのCHドメインでは、147番目および213番目のアミノ酸がどちらもEによって置換される（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）。
【０３０９】
一局面において、第2抗原結合受容体のFabフラグメントまたはcrossFabフラグメントのCLドメインでは、124番目および123番目のアミノ酸がKによって置換され、その場合、第2抗原結合受容体のFabフラグメントまたはcrossFabフラグメントのCHドメインでは、147番目および213番目のアミノ酸がEによって置換され、かつ第1抗原結合受容体のFabフラグメントまたはcrossFabフラグメントのVLドメインでは、38番目のアミノ酸がKによって置換され、第1抗原結合受容体のFabフラグメントまたはcrossFabフラグメントのVHドメインでは、39番目のアミノ酸がEによって置換され、第2抗原結合受容体のFabフラグメントまたはcrossFabフラグメントのVLドメインでは、38番目のアミノ酸がKによって置換され、第2抗原結合受容体のFabフラグメントまたはcrossFabフラグメントのVHドメインでは、39番目のアミノ酸がEによって置換される（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）。
【０３１０】
例示的なT細胞活性化抗原結合受容体
添付の実施例および図1Aに例示するように、本発明の概念実証として、CD20に結合し/CD20を指向し/CD20とまたはCD20において相互作用するFab抗原結合部分を1つ含む抗原結合受容体「抗CD20-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD pETR17097」（SEQ ID NO:7、9）を構築した。この構築物は、CD28膜貫通ドメイン、共刺激シグナリングドメインとしてのCD28のフラグメントおよび刺激シグナリングドメインとしてのCD3zのフラグメントをさらに含む。抗原結合受容体「抗CD20-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD pETR17097」の配列（アミノ酸およびDNA）を表2および表3に示す。
【０３１１】
本発明のさらなる概念実証として、CD20に結合し/CD20を指向し/CD20とまたはCD20において相互作用するcrossFab抗原結合部分を1つ含む抗原結合受容体「抗CD20-crossFab（VH-CL）-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD pETR17098」（SEQ ID NO:36、38）を構築した。この構築物は、CD28膜貫通ドメイン、共刺激シグナリングドメインとしてのCD28のフラグメントおよび刺激シグナリングドメインとしてのCD3zのフラグメントをさらに含む。抗原結合受容体「抗CD20-crossFab（VH-CL）-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD pETR17098」の配列（アミノ酸）を表4に示す。
【０３１２】
本発明のさらなる概念実証として、CD20に結合し/CD20を指向し/CD20とまたはCD20において相互作用するcrossFab抗原結合部分を1つ含む抗原結合受容体「抗CD20-crossFab（VL-CH）-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD」（SEQ ID NO:41、43）を構築した。この構築物は、CD28膜貫通ドメイン、共刺激シグナリングドメインとしてのCD28のフラグメントおよび刺激シグナリングドメインとしてのCD3zのフラグメントをさらに含む。抗原結合受容体「抗CD20-crossFab（VL-CH）-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD」の配列（アミノ酸およびDNA）を表5および表6に示す。
【０３１３】
本発明のさらなる概念実証として、CD20に結合し/CD20を指向し/CD20とまたはCD20において相互作用するcrossFab抗原結合部分を1つ含む抗原結合受容体「抗CD20-Fab（VL-CL）-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD」（SEQ ID NO:50、8）を構築した。この構築物は、CD28膜貫通ドメイン、共刺激シグナリングドメインとしてのCD28のフラグメントおよび刺激シグナリングドメインとしてのCD3zのフラグメントをさらに含む。抗原結合受容体「抗CD20-Fab（VL-CL）-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD」の配列（アミノ酸）を表7に示す。
【０３１４】
本発明のさらなる概念実証として、CD20に結合し/CD20を指向し/CD20とまたはCD20において相互作用するscFab抗原結合部分を1つ含む抗原結合受容体「抗CD20-scFab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD」（SEQ ID NO:51）を構築した。この構築物は、CD28膜貫通ドメイン、共刺激シグナリングドメインとしてのCD28のフラグメントおよび刺激シグナリングドメインとしてのCD3zのフラグメントをさらに含む。抗原結合受容体「抗CD20-scFab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD」の配列（アミノ酸およびDNA）を表8および表9に示す。
【０３１５】
さらなる実証および参考として、CD20に結合し/CD20を指向し/CD20とまたはCD20において相互作用する安定化scFv抗原結合部分を1つ含む抗原結合受容体「抗CD20-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD pETR17162」（SEQ ID NO:60）を構築した。この構築物は、CD28膜貫通ドメイン、共刺激シグナリングドメインとしてのCD28のフラグメントおよび刺激シグナリングドメインとしてのCD3zのフラグメントをさらに含む。抗体結合分子「抗CD20-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD pETR17162」の配列（アミノ酸およびcDNA）を表10および表11に示す。
【０３１６】
本発明のさらなる概念実証として、PDL1に結合し/PDL1を指向し/PDL1とまたはPDL1において相互作用するFab抗原結合部分を1つ含む抗原結合受容体「抗PDL1-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD」（SEQ ID NO:74、76）を構築した。この構築物は、CD28膜貫通ドメイン、共刺激シグナリングドメインとしてのCD28のフラグメントおよび刺激シグナリングドメインとしてのCD3zのフラグメントをさらに含む。抗原結合受容体「抗PDL1-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD」の配列（アミノ酸）を表12に示す。
【０３１７】
本発明のさらなる概念実証として、PDL1に結合し/PDL1を指向し/PDL1とまたはPDL1において相互作用するcrossFab抗原結合部分を1つ含む抗原結合受容体「抗PDL1-crossFab（VH-CL）-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD」（SEQ ID NO:79、81）を構築した。この構築物は、CD28膜貫通ドメイン、共刺激シグナリングドメインとしてのCD28のフラグメントおよび刺激シグナリングドメインとしてのCD3zのフラグメントをさらに含む。抗原結合受容体「抗PDL1-crossFab（VH-CL）-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD」の配列（アミノ酸）を表13に示す。
【０３１８】
本発明のさらなる概念実証として、PDL1に結合し/PDL1を指向し/PDL1とまたはPDL1において相互作用するcrossFab抗原結合部分を1つ含む抗原結合受容体「抗PDL1-crossFab（VL-CH）-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD」（SEQ ID NO:82、84）を構築した。この構築物は、CD28膜貫通ドメイン、共刺激シグナリングドメインとしてのCD28のフラグメントおよび刺激シグナリングドメインとしてのCD3zのフラグメントをさらに含む。抗原結合受容体「抗PDL1-crossFab（VL-CH）-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD」の配列（アミノ酸）を表14に示す。
【０３１９】
本発明のさらなる概念実証として、PDL1に結合し/PDL1を指向し/PDL1とまたはPDL1において相互作用するcrossFab抗原結合部分を1つ含む抗原結合受容体「抗PDL1-Fab（VL-CL）-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD」（SEQ ID NO:85、75）を構築した。この構築物は、CD28膜貫通ドメイン、共刺激シグナリングドメインとしてのCD28のフラグメントおよび刺激シグナリングドメインとしてのCD3zのフラグメントをさらに含む。抗原結合受容体「抗PDL1-Fab（VL-CL）-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD」の配列（アミノ酸）を表15に示す。
【０３２０】
本発明のさらなる概念実証として、PDL1に結合し/PDL1を指向し/PDL1とまたはPDL1において相互作用するscFab抗原結合部分を1つ含む抗原結合受容体「抗PDL1-scFab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD」（SEQ ID NO:86）を構築した。この構築物は、CD28膜貫通ドメイン、共刺激シグナリングドメインとしてのCD28のフラグメントおよび刺激シグナリングドメインとしてのCD3zのフラグメントをさらに含む。抗原結合受容体「抗PDL1-scFab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD」の配列（アミノ酸）を表16に示す。
【０３２１】
さらなる実証および参考として、PDL1に結合し/PDL1を指向し/PDL1とまたはPDL1において相互作用する安定化scFv抗原結合部分を1つ含む抗原結合受容体「抗PDL1-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD pETR17162」（SEQ ID NO:88）を構築した。この構築物は、CD28膜貫通ドメイン、共刺激シグナリングドメインとしてのCD28のフラグメントおよび刺激シグナリングドメインとしてのCD3zのフラグメントをさらに含む。抗体結合分子「抗PDL1-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD pETR17162」の配列（アミノ酸）を表17に示す。
【０３２２】
キット
本発明のさらなる局面は、本発明の抗原結合受容体をコードする核酸、および/または本発明の抗原結合受容体が形質導入された細胞、好ましくはT細胞を含む、またはそれらからなる、キットである。本発明のキットのパーツは、バイアルもしくは瓶に個別に包装するか、または組み合わせて容器もしくは多容器ユニットに包装することができる。加えて、本発明のキットは、GMP（欧州委員会がhttp://ec.europa.eu/health/documents/eudralex/index＿en.htmに公表している適正製造規範に関するガイドラインに記載されている適正製造規範）条件下で患者の細胞、好ましくは本明細書に記載のT細胞に、本発明の抗原結合受容体を形質導入し、それをインキュベートすることができる、（閉鎖型）バッグ細胞インキュベーションシステムも含みうる。一態様において、本発明のキットは、単離/取得された患者のT細胞に、GMP下で、本発明の抗原結合受容体を形質導入し、それをインキュベートすることができる（閉鎖型）バッグ細胞インキュベーションシステムを含む。さらにまた、本発明との関連において、キットは本明細書に記載の抗原結合受容体をコードするベクターも含みうる。本発明のキットは、なかんずく本発明の方法を実行するために有利に使用することができ、本明細書において言及するさまざまな応用において、例えば研究ツールとしてまたは医用ツールとして使用できる。キットの製造は、好ましくは、当業者にとって公知の標準的な手順に従う。
【０３２３】
これに関連して、患者由来の細胞、好ましくはT細胞には、上述のキットを使って、本明細書に記載する本発明の抗原結合受容体を形質導入することができる。本発明のキットを使って形質導入された患者由来の細胞は、抗原結合部分の標的、例えば腫瘍関連抗原に対して、特異的に結合する能力を獲得し、標的細胞の排除/溶解を誘導する能力を有するようになる。本明細書に記載の抗原結合受容体の細胞外ドメインの結合は、当該T細胞を活性化すると共に、それを腫瘍細胞と物理的に接触させる。したがって、本発明の抗原結合受容体分子を発現するT細胞は、本明細書に記載の標的細胞を、インビボおよび/またはインビトロで溶解する能力を有する。対応する標的細胞は、少なくとも1つの本明細書記載の抗原結合部分によって認識される、腫瘍細胞の表面に天然に存在する表面分子、すなわち腫瘍特異的抗原を発現する細胞を含む。そのような表面分子を本明細書では後で特徴づける。
【０３２４】
標的細胞の溶解は当技術分野において公知の方法によって検出することができる。したがってそのような方法は、なかんずく、生理学的インビトロアッセイを含む。そのような生理学的アッセイは、例えば細胞膜完全性の喪失（例:FACSに基づくヨウ化プロピジウムアッセイ、トリパンブルー流入アッセイ、測光的酵素放出アッセイ（LDH）、放射測定的51Cr放出アッセイ、蛍光測定的ユーロピウム放出およびカルセインAM放出アッセイ）によって、細胞死をモニターしうる。さらなるアッセイは、例えば測光的MTT、XTT、WST-1およびalamarBlueアッセイ、放射測定的3H-Thd組込みアッセイ、細胞分裂活性を測定するクロノジェニックアッセイ、およびミトコンドリア膜内外勾配を測定する蛍光測定的ローダミン123アッセイによる、細胞生存率のモニタリングを含む。また、例えばFACSに基づくホスファチジルセリン露出アッセイ、ELISAに基づくTUNEL試験、カスパーゼ活性アッセイ（測光的アッセイ、蛍光測定的アッセイまたはELISAに基づくアッセイ）によって、または変化した細胞形態（萎縮、膜の小胞化）を分析することによって、アポトーシスをモニターすることもできる。
【０３２５】
本発明の抗原結合受容体を発現する能力を有する形質導入T細胞
本発明のさらなる局面は、本発明の抗原結合受容体を発現する能力を有する形質導入T細胞である。本明細書に記載の抗原結合受容体は、本来はT細胞の中および/または表面に含まれず、正常な（非形質導入）T細胞の中または上に（内在性には）発現しない分子に関する。したがって、T細胞の中および/または上の本発明の抗原結合受容体は、T細胞に人工的に導入される。本発明との関連において、T細胞、好ましくはCD8＋T細胞は、本明細書に定義する処置されるべき対象から単離/取得されうる。したがって、T細胞の中および/または表面上に人工的に導入され、次いで提示される本明細書記載の抗原結合受容体は、腫瘍関連抗原に（インビトロまたはインビボで）アクセスできる1つまたは複数の抗原結合部分を含むドメインを含む。本発明との関連において、人工的に導入されるこれらの分子は、後述する（レトロウイルスまたはレンチウイルス）形質導入後に、T細胞の中および/または表面上に提示される。したがって、形質導入後の本発明のT細胞は、腫瘍関連抗原、好ましくは腫瘍細胞の表面上に提示され/それらの表面上で利用可能な抗原であることができる。
【０３２６】
本発明は、本発明の抗原結合受容体をコードする核酸分子を含む形質導入T細胞にも関係する。したがって本発明との関連において、形質導入細胞は、本発明の抗原結合受容体をコードする核酸分子または本発明の抗原結合受容体の発現を誘導する能力を有する本発明のベクターを含みうる。
【０３２７】
本発明との関連において、「形質導入T細胞」という用語は、遺伝子修飾されたT細胞（すなわち核酸分子が故意に導入されたT細胞）に関する。本明細書に提供される形質導入T細胞は本発明のベクターを含みうる。好ましくは、本明細書に提供される形質導入T細胞は、本発明の抗原結合受容体をコードする核酸分子および/または本発明のベクターを含む。本発明の形質導入T細胞は、外来DNA（すなわちT細胞中に導入された核酸分子）を一過性または安定に発現するT細胞でありうる。特に、本発明の抗原結合受容体をコードする核酸分子は、レトロウイルス形質導入またはレンチウイルス形質導入を使って、T細胞のゲノム中に安定に組み込むことができる。mRNA形質導入を使って、本発明の抗原結合受容体をコードする核酸分子を一過性に発現させてもよい。好ましくは、本明細書に提供される形質導入T細胞は、ウイルスベクター（例:レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター）を介してT細胞中に核酸分子を導入することにより、遺伝子修飾されている。したがって、抗原結合受容体の発現は恒常的であることができ、抗原結合受容体の細胞外ドメインは細胞表面上に検出可能でありうる。抗原結合受容体のこの細胞外ドメインは、本明細書に定義する抗原結合受容体の細胞外ドメイン全体を含みうるが、そのパーツを含むこともできる。必要な最低限のサイズは、抗原結合受容体中の抗原結合部分の抗原結合部位である。
【０３２８】
抗原結合受容体が誘導性プロモーターまたは抑制性プロモーターの制御下でT細胞に導入される場合、発現は条件付きまたは誘導性であることもできる。そのような誘導性プロモーターまたは抑制性プロモーターの例は、アルコールデヒドロゲナーゼI（alcA）遺伝子プロモーターおよび転写活性化因子タンパク質AlcRを含有する転写系であることができる。alcAプロモーターに連結された関心対象の遺伝子の発現を制御するには、さまざまな農業アルコール系製剤が使用される。さらにまた、テトラサイクリン応答性プロモーター系は、テトラサイクリンの存在下で遺伝子発現系を活性化または抑制するように機能することができる。この系の要素をいくつか挙げると、テトラサイクリンリプレッサータンパク質（TetR）、テトラサイクリンオペレーター配列（tetO）、およびTetRと単純ヘルペスウイルスタンパク質16（VP16）活性化配列の融合物であるテトラサイクリントランス活性化因子融合タンパク質（tTA）がある。さらに、ステロイド応答性プロモーター、金属調節性プロモーターまたは病原性関連（PR）タンパク質関連プロモーターを使用することができる。
【０３２９】
発現は使用する系に応じて、恒常的（constitutive）または構成的（constitutional）であることができる。本発明の抗原結合受容体は、本明細書に提供される形質導入T細胞の表面に発現されうる。抗原結合受容体の細胞外部分（すなわち、抗原結合受容体の細胞外ドメインは細胞表面に検出することができ、一方、細胞内部分（すなわち共刺激シグナリングドメインおよび刺激シグナリングドメイン）は、細胞表面には検出することができない。抗原結合受容体の細胞外ドメインの検出は、この細胞外ドメインに特異的に結合する抗体を使うことによって、または細胞外ドメインが結合することのできる抗原によって、実行することができる。細胞外ドメインは、これらの抗体または抗原を使用し、フローサイトメトリーまたは顕微鏡法によって検出することができる。
【０３３０】
本発明の形質導入細胞は任意の免疫細胞でありうる。これには、B細胞、T細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞、ナチュラルキラー（NK）T細胞、γδ型T細胞、自然リンパ系細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、または好中球などがあるが、それらに限定されるわけではない。好ましくは、該免疫細胞はリンパ球、好ましくはNK細胞またはT細胞である。該T細胞にはCD4 T細胞およびCD8 T細胞が含まれる。白血球表面における本発明の抗原結合受容体のトリガリングは、その細胞が由来する系譜とは無関係に、その細胞を、標的細胞に対して細胞傷害性にすると考えられる。細胞傷害性は、抗原結合受容体のために選んだ刺激シグナリングドメインまたは共刺激シグナリングドメインとは関係なく生じ、追加サイトカインの外からの供給に依存しない。したがって、本発明の形質導入細胞は、例えばCD4＋T細胞、CD8＋-T細胞、γδ型T細胞、ナチュラルキラー（NK）T細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞、腫瘍浸潤性（TIL）細胞、骨髄性細胞、または間葉系幹細胞でありうる。好ましくは、本明細書に提供される形質導入細胞はT細胞（例えば自家T細胞）であり、より好ましくは形質導入細胞はCD8＋T細胞である。したがって、本発明との関連において、形質導入細胞はCD8＋T細胞である。さらに、本発明との関連において、形質導入細胞は自家T細胞である。したがって、本発明との関連において、形質導入細胞は好ましくは自家CD8＋T細胞である。対象から単離された自家細胞（例えばT細胞）の使用に加えて、本発明は同種異系細胞の使用も包含する。したがって、本発明との関連において、形質導入細胞は同種異系細胞、例えば同種異系CD8＋T細胞であることもできる。同種異系細胞の使用は、特異的応答細胞集団、すなわちT細胞集団が拘束されるMHC分子クラスIまたはクラスIIを、外来抗原提示細胞（APC）が、T細胞によって認識される抗原エピトープと共に発現するのであれば、細胞、好ましくはT細胞はAPCによって提示された特異的抗原エピトープを認識することができるという事実に基づく。したがって同種異系という用語は、例えば本明細書に記載する抗原結合受容体発現形質導入細胞によって処置される予定の個体/対象とヒト白血球抗原（HLA）適合性である非血縁ドナー個体/対象から得られる細胞を指す。自家細胞とは、本明細書に記載の形質導入細胞で処置される対象から上述のように単離/取得される細胞を指す。
【０３３１】
本発明の形質導入細胞には、さらなる核酸分子、例えばT細胞受容体をコードする核酸分子を、共形質導入することができる。
【０３３２】
本発明は、T細胞に本発明のベクターを形質導入する工程、形質導入T細胞を該形質導入細胞の中または上での抗原結合受容体の発現が可能な条件下で培養する工程、および該形質導入T細胞を回収する工程を含む、本発明の抗原結合受容体を発現する形質導入T細胞の生産方法にも関係する。
【０３３３】
本発明との関連において、本発明の形質導入細胞は、好ましくは、以下のプロセスによって生産される:細胞（例:T細胞、好ましくはCD8＋T細胞）を対象（好ましくはヒト患者）から単離/取得する。患者またはドナーから細胞（例:T細胞、好ましくはCD8＋T細胞）を単離/取得するための方法は当技術分野において周知であり、本発明との関連において、患者またはドナーからの細胞（例:T細胞、好ましくはCD8＋T細胞）は採血または骨髄採取によって単離することができる。患者の試料として細胞を単離/取得した後、細胞（例:T細胞）を試料の他の成分から分離する。細胞（例:T細胞）を試料から分離するための方法はいくつか公知であり、これには、例えば患者またはドナーの末梢血から細胞を得るための白血球アフェレーシス、FACSort装置を使用することによる細胞の単離/取得、生細胞を内包する新鮮生検試料において生細胞を死細胞から手作業でまたはマイクロマニピュレーターを使って取り出すことなどがあるが、それらに限定されるわけではない（例えばDudley,Immunother.26（2003）,332-342、Robbins,Clin.Oncol.29（2011）,917-924またはLeisegang,J.Mol.Med.86（2008）,573-58参照）。単離/取得された細胞、例えばT細胞、好ましくはCD8＋T細胞は、次に、例えば抗CD3抗体を使用することによって、抗CD3モノクローナル抗体および抗CD28モノクローナル抗体を使用することによって、かつ/または抗CD3抗体、抗CD28抗体およびインターロイキン2（IL-2）を使用することによって培養され、増殖させる（例えばDudley,Immunother.26（2003）,332-342またはDudley,Clin.Oncol.26（2008）,5233-5239参照）。
【０３３４】
次の工程では、当技術分野において公知の方法により、細胞（例:T細胞）に、人工的/遺伝子的な修飾/形質導入を行う（例えばLemoine,J Gene Med 6（2004）,374-386参照）。細胞（例:T細胞）に形質導入する方法は、当技術分野において公知であり、これには、核酸または組換え核酸が形質導入される場合であれば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、カチオン性脂質法またはリポソーム法があるが、それらに限定されるわけではない。形質導入される核酸は、市販のトランスフェクション試薬、例えばLipofectamine（Invitrogen製、カタログ番号:11668027）を使用することにより、従来法で高効率に形質導入されうる。ベクターを使用する場合、そのベクターがプラスミドベクター（すなわちウイルスベクターではないベクター）である限り、ベクターは上述の核酸と同じ方法で形質導入することができる。本発明との関連において、細胞（例:T細胞）に形質導入するための方法には、レトロウイルスT細胞形質導入またはレンチウイルスT細胞形質導入、非ウイルスベクター（例:スリーピング・ビューティーミニサークルベクター）ならびにmRNAトランスフェクションが含まれる。「mRNAトランスフェクション」とは、本件の場合であれば本発明の抗原結合受容体のような関心対象のタンパク質を、形質導入される細胞において一過性に発現させるための、当業者に周知の方法を指す。簡単に述べると、本発明の抗原結合受容体をコードするmRNAを、エレクトロポレーションシステム（例えばGene-Pulser、Bio-Radなど）を使って、細胞にエレクトロポレートした後、上述の標準的細胞（例:T細胞）培養プロトコールによって培養することができる（Zhao et al.,Mol Ther.13（1）（2006）,151-159参照）。本発明の形質導入細胞はT細胞、最も好ましくはCD8＋T細胞であり、レンチウイルスT細胞形質導入、または最も好ましくはレトロウイルスT細胞形質導入によって作製される。
【０３３５】
これに関連して、T細胞に形質導入を行うための適切なレトロウイルスベクターは、SAMEN CMV/SRa（Clay et al.,J.Immunol.163（1999）,507-513）、LZRS-id3-IHRES（Heemskerk et al.,J.Exp.Med.186（1997）,1597-1602）、FeLV（Neil et al.,Nature 308（1984）,814-820）、SAX（Kantoff et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83（1986）,6563-6567）、pDOL（Desiderio,J.Exp.Med.167（1988）,372-388）、N2（Kasid et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87（1990）,473-477）、LNL6（Tiberghien et al.,Blood 84（1994）,1333-1341）、pZipNEO（Chen et al.,J.Immunol.153（1994）,3630-3638）、LASN（Mullen et al.,Hum.Gene Ther.7（1996）,1123-1129）、pG1XsNa（Taylor et al.,J.Exp.Med.184（1996）,2031-2036）、LCNX（Sun et al.,Hum.Gene Ther.8（1997）,1041-1048）、SFG（Gallardo et al.,Blood 90（1997）、およびLXSN（Sun et al.,Hum.Gene Ther.8（1997）,1041-1048）、SFG（Gallardo et al.,Blood 90（1997）,952-957）、HMB-Hb-Hu（Vieillard et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94（1997）,11595-11600）、pMV7（Cochlovius et al.,Cancer Immunol.Immunother.46（1998）,61-66）、pSTITCH（Weitjens et al.,Gene Ther 5（1998）,1195-1203）、pLZR（Yang et al.,Hum.Gene Ther.10（1999）,123-132）、pBAG（Wu et al.,Hum.Gene Ther.10（1999）,977-982）、rKat.43.267bn（Gilham et al.,J.Immunother.25（2002）,139-151）、pLGSN（Engels et al.,Hum.Gene Ther.14（2003）,1155-1168）、pMP71（Engels et al.,Hum.Gene Ther.14（2003）,1155-1168）、pGCSAM（Morgan et al.,J.Immunol.171（2003）,3287-3295）、pMSGV（Zhao et al.,J.Immunol.174（2005）,4415-4423）、またはpMX（de Witte et al.,J.Immunol.181（2008）,5128-5136）など、当技術分野において公知である。本発明との関連において、細胞（例:T細胞）に形質導入を行うための適切なレンチウイルスベクターは、例えばPL-SINレンチウイルスベクター（Hotta et al.,Nat Methods.6（5）（2009）,370-376）、p156RRL-sinPPT-CMV-GFP-PRE/NheI（Campeau et al.,PLoS One 4（8）（2009）,e6529）、pCMVR8.74（Addgeneカタログ番号:22036）、FUGW（Lois et al.,Science 295（5556）（2002）,868-872、pLVX-EF1（Addgeneカタログ番号:64368）、pLVE（Brunger et al.,Proc Natl Acad Sci USA 111（9）（2014）,E798-806）、pCDH1-MCS1-EF1（Hu et al.,Mol Cancer Res.7（11）（2009）,1756-1770）、pSLIK（Wang et al.,Nat Cell Biol.16（4）（2014）,345-356）、pLJM1（Solomon et al.,Nat Genet.45（12）（2013）,1428-30）、pLX302（Kang et al.,Sci Signal.6（287）（2013）,rs13）、pHR-IG（Xie et al.,J Cereb Blood Flow Metab.33（12）（2013）,1875-85）、pRRLSIN（Addgeneカタログ番号:62053）、pLS（Miyoshi et al.,J Virol.72（10）（1998）,8150-8157）、pLL3.7（Lazebnik et al.,J Biol Chem.283（7）（2008）,11078-82）、FRIG（Raissi et al.,Mol Cell Neurosci.57（2013）,23-32）、pWPT（Ritz-Laser et al.,Diabetologia.46（6）（2003）,810-821）、pBOB（Marr et al.,J Mol Neurosci.22（1-2）（2004）,5-11）、またはpLEX（Addgeneカタログ番号:27976）である。
【０３３６】
形質導入T細胞/本発明のT細胞は、好ましくは、制御された条件において、それらの自然環境外で生育される。特に「培養する」という用語は、多細胞真核生物（好ましくはヒト患者）に由来する細胞（例えば本発明の形質導入細胞）がインビトロで生育されることを意味する。細胞の培養は、それぞれの元の組織供給源から分離された細胞を生かし続ける実験技法である。ここでは、本発明の形質導入細胞が、該形質導入細胞の中または上での本発明の抗原結合受容体の発現が可能な条件下で培養される。移入遺伝子の（すなわち本発明の抗原結合受容体の）発現が可能な条件は当技術分野では一般に公知であり、これには、例えばアゴニスト性の抗CD3抗体および抗CD28抗体、ならびにインターロイキン2（IL-2）、インターロイキン7（IL-7）、インターロイキン12（IL-12）および/またはインターロイキン15（IL-15）などのサイトカインの添加が含まれる。培養形質導入細胞（例:CD8＋T）における本発明の抗原結合受容体の発現後に、形質導入細胞を培養から（すなわち培養培地から）回収（すなわち再抽出）する。
【０３３７】
したがって、本発明には、本発明の方法によって得ることができる本発明の核酸分子によってコードされる抗原結合受容体を発現する形質導入細胞、好ましくはT細胞、特にCD8＋Tも包含される。
【０３３８】
核酸分子
本発明のさらなる局面は、1つまたは数個の本発明の抗原結合受容体をコードする核酸およびベクターである。本発明の抗原結合受容体をコードする例示的核酸分子をSEQ ID NO:22、46、55および64に示す。本発明の核酸分子は調節配列の制御を受けうる。例えばプロモーター、転写エンハンサーおよび/または本発明の抗原結合受容体の誘導発現を可能にする配列を使用しうる。本発明との関連において、核酸分子は恒常性プロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下で発現する。適切なプロモーターは、例えばCMVプロモーター（Qin et al.,PLoS One 5（5）（2010）,e10611）、UBCプロモーター（Qin et al.,PLoS One 5（5）（2010）,e10611）、PGK（Qin et al.,PLoS One 5（5）（2010）,e10611）、EF1Aプロモーター（Qin et al.,PLoS One 5（5）（2010）,e10611）、CAGGプロモーター（Qin et al.,PLoS One 5（5）（2010）,e10611）、SV40プロモーター（Qin et al.,PLoS One 5（5）（2010）,e10611）、COPIAプロモーター（Qin et al.,PLoS One 5（5）（2010）,e10611）、ACT5Cプロモーター（Qin et al.,PLoS One 5（5）（2010）,e10611）、TREプロモーター（Qin et al.,PLoS One.5（5）（2010）,e10611）、Oct3/4プロモーター（Chang et al.,Molecular Therapy 9（2004）,S367-S367（doi:10.1016/j.ymthe.2004.06.904））、またはNanogプロモーター（Wu et al.,Cell Res.15（5）（2005）,317-24）である。それゆえに本発明は、本発明に記載の核酸分子を含むベクターにも関係する。本明細書においてベクターという用語は、それが導入された宿主細胞において（すなわち形質導入細胞において）自律的に複製することができる環状または線状の核酸分子に関する。多くの適切なベクターが分子生物学の当業者には公知であって、その選択は所望する機能に依存し、これには、遺伝子工学において従来使用されてきたプラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージおよび他のベクターが含まれる。当業者に周知の方法を使ってさまざまなプラスミドおよびベクターを構築することができる。例えば、Sambrook et al.（前掲書）およびAusubel,Current Protocols in Molecular Biology,Green Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y.（1989）,（1994）に記載の技法を参照されたい。あるいは、本発明のポリヌクレオチドおよびベクターを、標的細胞への送達のために、リポソーム中に再構成することもできる。以下にさらに詳述するように、クローニングベクターを使って個々のDNA配列を単離した。特定ポリペプチドの発現が必要な場合は、関連する配列を発現ベクターに移入することができる。典型的クローニングベクターには、pBluescript SK、pGEM、pUC9、pBR322、pGA18およびpGBT9がある。典型的発現ベクターには、pTRE、pCAL-n-EK、pESP-1、pOP13CATがある。
【０３３９】
本発明は、本明細書において定義する抗原結合受容体をコードする核酸分子に機能的に連結された調節配列である核酸分子を含むベクターにも関係する。本発明との関連において、ベクターはポリシストロニックであることができる。そのような調節配列（制御要素）は当業者には公知であり、それは、プロモーター、スプライスカセット、翻訳開始コドン、翻訳、およびベクターにインサートを導入するための挿入部位を含みうる。本発明との関連において、核酸分子は、真核細胞または原核細胞における発現を可能にする発現制御配列に、機能的に連結される。ベクターは、本明細書において定義する抗原結合受容体をコードする核酸分子を含む発現ベクターであることが考えられる。機能的に連結されるとは、そのように記載された複数の構成要素が、それらの意図どおりに機能できるような関係にある並置を指す。コード配列に機能的に連結された制御配列は、制御配列と適合する条件下でコード配列の発現が達成されるようにライゲートされている。制御配列がプロモーターである場合、二本鎖核酸が好ましく使用されることは当業者にとって自明である。
【０３４０】
本発明との関連において、具陳するベクターは発現ベクターである。発現ベクターは、選択された細胞を形質転換するために使用することができる構築物であり、選択された細胞におけるコード配列の発現をもたらす。発現ベクターは、例えばクローニングベクター、バイナリーベクターまたは組込み型ベクターであることができる。発現は、好ましくは翻訳可能なmRNAへの、核酸分子の転写を含む。原核生物および/または真核細胞における発現を保証する調節要素は当業者に周知である。真核細胞の場合、それらは、通常、転写の開始を保証するプロモーター、および任意で、転写の終結と転写産物の安定化を保証するポリAシグナルを含む。原核宿主細胞における発現を可能にする考えうる調節要素は、例えば大腸菌におけるPL、lac、trpまたはtacプロモーターを含み、真核宿主細胞における発現を可能にする調節要素の例は、酵母におけるAOX1もしくはGAL1プロモーター、または哺乳動物細胞および他の動物細胞におけるCMVプロモーター、SV40プロモーター、RSVプロモーター（ラウス肉腫ウイルス）、CMVエンハンサー、SV40エンハンサーもしくはグロビンイントロンである。
【０３４１】
転写の開始を担う要素の他に、そのような調節要素は、ポリヌクレオチドの下流にあるSV40ポリA部位またはtkポリA部位などの転写終結シグナルも含みうる。さらにまた、使用する発現系に応じて、ポリペプチドを細胞内コンパートメントに向かわせるかポリペプチドを培地中に分泌させる能力を有するシグナルペプチドをコードするリーダー配列を、具陳する核酸配列のコード配列に付加することができ、それらは当技術分野において周知である。例えば添付の実施例も参照されたい。
【０３４２】
リーダー配列は、適当な段階で、翻訳、開始および終結配列、ならびに好ましくは細胞周辺腔または細胞外培地への翻訳されたタンパク質またはその一部分の分泌を指示する能力を有するリーダー配列と組み立てられる。任意で、異種配列は、所望の特徴、例えば発現した組換え産物の安定化または簡略化された精製を与えるN末端同定ペプチドを含む抗原結合受容体をコードすることができる。上記参照。これに関連して、適切な発現ベクターは、Okayama-Berg cDNA発現ベクターpcDV1（Pharmacia）、pCDM8、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3（In-vitrogene）、pEF-DHFR、pEF-ADAまたはpEF-neo（Raum et al.Cancer Immunol Immunother 50（2001）,141-150）またはpSPORT1（GIBCO BRL）など、当技術分野において公知である。
【０３４３】
本発明との関連において、発現制御配列は、真核細胞の形質転換またはトランスフェクションを行う能力を有するベクター中の真核生物プロモーター系であるが、原核細胞用の制御配列も使用しうる。適当な細胞にベクターが組み込まれたら、その細胞を、ヌクレオチド配列の高レベル発現に適した条件下で、所望どおりに維持する。追加の調節要素は転写および翻訳エンハンサーを含みうる。上述の本発明ベクターは選択可能および/またはスコア化可能（scorable）マーカーを含むと有利である。形質転換された細胞ならびに例えば植物組織および植物の選択に有用な選択可能マーカー遺伝子は当業者には周知であり、例えば、メトトレキサートに対する耐性を付与するdhfr（Reiss,Plant Physiol.（Life Sci.Adv.）13（1994）,143-149）、アミノグリコシドであるネオマイシン、カナマイシンおよびパロマイシンに対する耐性を付与するnpt（Herrera-Estrella,EMBO J.2（1983）,987-995）およびハイグロマイシンに対する耐性を付与するhygro（Marsh,Gene 32（1984）,481-485）に関する選択の根拠として、代謝拮抗物質耐性を含む。さらなる選択可能遺伝子、すなわち、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用することができるようにするtrpB、細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノール（histinol）を利用することができるようにするhisD（Hartman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85（1988）,8047）、細胞がマンノースを利用することができるようにするマンノース-6-リン酸イソメラーゼ（WO 94/20627）およびオルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤2-（ジフルオロメチル）-DL-オルニチン、DFMOに対する耐性を付与するODC（オルニチンデカルボキシラーゼ）（McConlogue,1987,In:Current Communications in Molecular Biology,Cold Spring Harbor Laboratory ed.）またはブラストサイジンSに対する耐性を付与するアスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）由来のデアミナーゼ（Tamura,Biosci.Biotechnol.Biochem.59（1995）,2336-2338）も、記載されている。
【０３４４】
有用なスコア化可能マーカーも当業者には公知であり、市販されている。該マーカーはルシフェラーゼ（Giacomin,Pl.Sci.116（1996）,59-72、Scikantha,J.Bact.178（1996）,121）、緑色蛍光タンパク質（Gerdes,FEBS Lett.389（1996）,44-47）またはβ-グルクロニダーゼ（Jefferson,EMBO J.6（1987）,3901-3907）をコードするマーカーであれば、有利である。この態様は、具陳するベクターを含有する細胞、組織および生物の簡単かつ迅速なスクリーニングにとって、特に有用である。
【０３４５】
上述のとおり、具陳する核酸分子は、単独でまたはベクターの一部として、例えば養子T細胞治療のために、また遺伝子治療目的でも、細胞中で本発明の抗原結合受容体を発現させるために使用することができる。本明細書に記載する抗原結合受容体のいずれか1つをコードするDNA配列を含有する核酸分子またはベクターを細胞中に導入すると、その細胞が関心対象のポリペプチドを生産する。エクスビボ技法またはインビボ技法による細胞への治療遺伝子の導入に基づく遺伝子治療は、遺伝子移入の最も重要な応用の一つである。インビトロ遺伝子治療またはインビボ遺伝子治療のための適切なベクター、方法または遺伝子送達システムは文献に記載があり、当業者には公知である。例えばGiordano,Nature Medicine 2（1996）,534-539、Schaper,Circ.Res.79（1996）,911-919、Anderson,Science 256（1992）,808-813、Verma,Nature 389（1994）,239、Isner,Lancet 348（1996）,370-374、Muhlhauser,Circ.Res.77（1995）,1077-1086、Onodera,Blood 91（1998）,30-36、Verma,Gene Ther.5（1998）,692-699、Nabel,Ann.N.Y.Acad.Sci.811（1997）,289-292、Verzeletti,Hum.Gene Ther.9（1998）,2243-51、Wang,Nature Medicine 2（1996）,714-716、WO 94/29469、WO 97/00957、US 5,580,859、US 5,589,466、またはSchaper,Current Opinion in Biotechnology 7（1996）,635-640を参照されたい。具陳する核酸分子およびベクターは、細胞への直接導入用に、またはリポソームもしくはウイルスベクター（例えばアデノウイルス、レトロウイルス）による細胞への導入用に、設計することができる。本発明との関連において、細胞は、CD8＋T細胞、CD4＋T細胞、CD3＋T細胞、γδ型T細胞またはナチュラルキラー（NK）T細胞などのT細胞、好ましくはCD8＋T細胞である。
【０３４６】
上記に従い、本発明は、本明細書において定義する抗原結合受容体のポリペプチド配列をコードする核酸分子を含む、遺伝子工学において従来使用されてきたベクター、特にプラスミド、コスミドおよびバクテリオファージを得るための方法に関する。本発明との関連において、ベクターは発現ベクターおよび/または遺伝子移入ベクターもしくは遺伝子ターゲティングベクターである。レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、またはウシパピローマウイルスなどのウイルスに由来する発現ベクターは、標的とする細胞集団への具陳するポリヌクレオチドまたはベクターの送達に使用しうる。
【０３４７】
組換えベクターの構築には当業者に周知の方法を使用することができる。例えばSambrook et al.（前掲書）、Ausubel（1989、前掲書）または他の標準的教科書に記載の技法を参照されたい。あるいは、具陳する核酸分子およびベクターを、標的細胞への送達のために、リポソーム中に再構成することができる。本発明の核酸分子を含有するベクターは、細胞宿主のタイプに依存してさまざまである周知の方法によって、宿主細胞中に移入することができる。例えば、原核細胞には塩化カルシウムトランスフェクションがよく利用されるのに対し、他の細胞宿主にはリン酸カルシウム処理またはエレクトロポレーションが使用されうる。上記Sambrook参照。具陳するベクターは、なかんずく、pEF-DHFR、pEF-ADAまたはpEF-neoでありうる。ベクターpEF-DHFR、pEF-ADAおよびpEF-neoは、当技術分野では、例えばMack et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92（1995）,7021-7025およびRaum et al.Cancer Immunol Immunother 50（2001）,141-150に記載されている。
【０３４８】
本発明は、本明細書に記載のベクターによる形質転換またはトランスフェクションを受けたT細胞も提供する。該T細胞は、上述のベクターのうちの少なくとも1つまたは上述の核酸分子のうちの少なくとも1つをT細胞またはその前駆細胞中に導入することによって生産されうる。T細胞における該少なくとも1つのベクターまたは少なくとも1つの核酸分子の存在は、抗原結合部分を含む細胞外ドメインを含む上述の抗原結合受容体をコードする遺伝子の発現を媒介しうる。本発明のベクターはポリシストロニックであることができる。
【０３４９】
T細胞またはその前駆細胞に導入される記載の核酸分子またはベクターは、細胞のゲノムに組み込まれうるか、染色体外に維持されうる。
【０３５０】
腫瘍特異的抗原
上述のように、本発明の抗原結合受容体は、腫瘍細胞の表面に天然に存在する細胞表面分子、すなわち腫瘍特異的抗原に対する特異性を持つ抗原相互作用部位/抗原結合部分を含む。本発明との関連において、そのような抗原相互作用部位は、本発明の抗原結合受容体を含む本明細書に記載の形質導入T細胞を腫瘍細胞と物理的に接触させることになり、そこでは形質導入T細胞が活性型になる。本発明の形質導入T細胞の活性化は、本明細書に記載するように、腫瘍細胞の溶解をもたらすことができる。
【０３５１】
腫瘍細胞の表面に天然に存在する腫瘍マーカー/腫瘍関連抗原の例を以下に挙げる。これには、FAP（線維芽細胞活性化タンパク質）、CEA（癌胎児性抗原）、p95（p95HER2）、BCMA（B細胞成熟抗原）、EpCAM（上皮細胞接着分子）、MSLN（メソテリン）、MCSP（黒色腫コンドロイチン硫酸プロテオグリカン）、HER-1（ヒト上皮成長因子1）、HER-2（ヒト上皮成長因子2）、HER-3（ヒト上皮成長因子3）、CD19、CD20、CD22、CD33、CD38、CD52Flt3、葉酸受容体1（FOLR1）、ヒト栄養芽層細胞表面抗原2（Trop-2）がん抗原12-5（CA-12-5）、ヒト白血球抗原-抗原D関連（HLA-DR）、MUC-1（ムチン-1）、A33抗原、PSMA（前立腺特異的膜抗原）、FMS様チロシンキナーゼ3（FLT-3）、PDL1（プログラム死リガンド1）、PSMA（前立腺特異的膜抗原）、PSCA（前立腺幹細胞抗原）、トランスフェリン受容体、TNC（テネイシン）、炭酸脱水酵素（carbon anhydrase）IX（CA-IX）、および/またはヒト主要組織適合遺伝子複合体（MHC）の分子に結合したペプチドが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【０３５２】
したがって本発明との関連において、本明細書に記載の抗原結合受容体は、FAP（線維芽細胞活性化タンパク質）、CEA（癌胎児性抗原）、p95（p95HER2）、BCMA（B細胞成熟抗原）、EpCAM（上皮細胞接着分子）、MSLN（メソテリン）、MCSP（黒色腫コンドロイチン硫酸プロテオグリカン）、HER-1（ヒト上皮成長因子1）、HER-2（ヒト上皮成長因子2）、HER-3（ヒト上皮成長因子3）、CD19、CD20、CD22、CD33、CD38、CD52Flt3、葉酸受容体1（FOLR1）、ヒト栄養芽層細胞表面抗原2（Trop-2）がん抗原12-5（CA-12-5）、ヒト白血球抗原-抗原D関連（HLA-DR）、MUC-1（ムチン-1）、A33抗原、PSMA（前立腺特異的膜抗原）、FMS様チロシンキナーゼ3（FLT-3）、PDL1（プログラム死リガンド1）、PSMA（前立腺特異的膜抗原）、PSCA（前立腺幹細胞抗原）、トランスフェリン受容体、TNC（テネイシン）、炭酸脱水酵素IX（CA-IX）、および/またはヒト主要組織適合遺伝子複合体（MHC）の分子に結合したペプチドからなる群より選択される腫瘍細胞表面に天然に存在する抗原/マーカー。
【０３５３】
A33抗原、BCMA（B細胞成熟抗原）、がん抗原12-5（CA-12-5）、炭酸脱水酵素IX（CA-IX）、CD19、CD20、CD22、CD33、CD38、CEA（癌胎児性抗原）、EpCAM（上皮細胞接着分子）、FAP（線維芽細胞活性化タンパク質）、FMS様チロシンキナーゼ3（FLT-3）、葉酸受容体1（FOLR1）、HER-1（ヒト上皮成長因子1）、HER-2（ヒト上皮成長因子2）、HER-3（ヒト上皮成長因子3）、ヒト白血球抗原-抗原D関連（HLA-DR）、MSLN（メソテリン）、MCSP（黒色腫コンドロイチン硫酸プロテオグリカン）、MUC-1（ムチン-1）、PDL1（プログラム死リガンド1）、PSMA（前立腺特異的膜抗原）、PSMA（前立腺特異的膜抗原）、PSCA（前立腺幹細胞抗原）、p95（p95HER2）、トランスフェリン受容体、TNC（テネイシン）、ヒト栄養芽層細胞表面抗原2（Trop-2）の（ヒト）メンバーの配列はUniProtKB/Swiss-Protデータベースに見いだすことができ、http://www.uniprot.org/uniprot/?query＝reviewed％3Ayesで検索することができる。これらの（タンパク質）配列は注釈付きの変更された配列（annotated modified sequence）にも関係する。本発明は、本明細書に提供されるコンサイス配列（concise sequence）の相同配列および遺伝的アレル変異体などを使用する技法および方法も提供する。好ましくは、本明細書におけるコンサイス配列のそのような変異体などが使用される。好ましくは、そのような変異体は遺伝的変異体である。当業者は、ゲノムDNAおよびmRNA/cDNAのエントリーも含みうるこれらのデータバンクエントリーにおいて、これらの（タンパク質）配列の関連コード領域を容易に推定することができる。（ヒト）FAP（線維芽細胞活性化タンパク質）の配列はSwiss-ProtデータベースエントリーQ12884（エントリーバージョン168、配列バージョン5）から得ることができ、（ヒト）CEA（癌胎児性抗原）の配列はSwiss-ProtデータベースエントリーP06731（エントリーバージョン171、配列バージョン3）から得ることができ、（ヒト）EpCAM（上皮細胞接着分子）の配列はSwiss-ProtデータベースエントリーP16422（エントリーバージョン117、配列バージョン2）から得ることができ、（ヒト）MSLN（メソテリン）の配列はUniProtエントリー番号Q13421（バージョン番号132、配列バージョン2）から得ることができ、（ヒト）FMS様チロシンキナーゼ3（FLT-3）の配列はSwiss-ProtデータベースエントリーP36888（プライマリー引用可能アクセッション番号）またはQ13414（セカンダリーアクセッション番号）、バージョン番号165および配列バージョン2から得ることができ、（ヒト）MCSP（黒色腫コンドロイチン硫酸プロテオグリカン）の配列はUniProtエントリー番号Q6UVK1（バージョン番号118、配列バージョン2）から得ることができ、（ヒト）葉酸受容体1（FOLR1）の配列はUniProtエントリー番号P15328（プライマリー引用可能アクセッション番号）またはQ53EW2（セカンダリーアクセッション番号）、バージョン番号153および配列バージョン3から得ることができ、（ヒト）栄養芽層細胞表面抗原2（Trop-2）の配列はUniProtエントリー番号P09758（プライマリー引用可能アクセッション番号）またはQ15658（セカンダリーアクセッション番号）、バージョン番号172および配列バージョン3から得ることができ、（ヒト）PSCA（前立腺幹細胞抗原）の配列はUniProtエントリー番号O43653（プライマリー引用可能アクセッション番号）またはQ6UW92（セカンダリーアクセッション番号）、バージョン番号134およ��配列バージョン1から得ることができ、（ヒト）HER-1（上皮成長因子受容体）の配列はSwiss-ProtデータベースエントリーP00533（エントリーバージョン177、配列バージョン2）から得ることができ、（ヒト）HER-2（受容体チロシンプロテインキナーゼerbB-2）の配列はSwiss-ProtデータベースエントリーP04626（エントリーバージョン161、配列バージョン1）から得ることができ、（ヒト）HER-3（受容体チロシンプロテインキナーゼerbB-3）の配列はSwiss-ProtデータベースエントリーP21860（エントリーバージョン140、配列バージョン1）から得ることができ、（ヒト）CD20（Bリンパ球抗原CD20）の配列はSwiss-ProtデータベースエントリーP11836（エントリーバージョン117、配列バージョン1）から得ることができ、（ヒト）CD22（Bリンパ球抗原CD22）の配列はSwiss-ProtデータベースエントリーP20273（エントリーバージョン135、配列バージョン2）から得ることができ、（ヒト）CD33（Bリンパ球抗原CD33）の配列はSwiss-ProtデータベースエントリーP20138（エントリーバージョン129、配列バージョン2）から得ることができ、（ヒト）CA-12-5（ムチン16）の配列はSwiss-ProtデータベースエントリーQ8WXI7（エントリーバージョン66、配列バージョン2）から得ることができ、（ヒト）HLA-DRの配列はSwiss-ProtデータベースエントリーQ29900（エントリーバージョン59、配列バージョン1）から得ることができ、（ヒト）MUC-1（ムチン-1）の配列はSwiss-ProtデータベースエントリーP15941（エントリーバージョン135、配列バージョン3）から得ることができ、（ヒト）A33（細胞表面A33抗原）の配列はSwiss-ProtデータベースエントリーQ99795（エントリーバージョン104、配列バージョン1）から得ることができ、（ヒト）PDL1（プログラム死リガンド1）の配列はSwiss-ProtデータベースエントリーQ9NZQ7（エントリーバージョン148、配列バージョン1）から得ることができ、（ヒト）PSMA（グルタミン酸カルボキシペプチダーゼ2）の配列はSwiss-ProtデータベースエントリーQ04609（エントリーバージョン133、配列バージョン1）から得ることができ、（ヒト）トランスフェリン受容体の拝謁はSwiss-ProtデータベースエントリーQ9UP52（エントリーバージョン99、配列バージョン1）およびP02786（エントリーバージョン152、配列バージョン2）から得ることができ、（ヒト）TNC（テネイシン）の配列はSwiss-ProtデータベースエントリーP24821（エントリーバージョン141、配列バージョン3）から得ることができ、（ヒト）CA-IX（炭酸脱水酵素IX）の配列はSwiss-ProtデータベースエントリーQ16790（エントリーバージョン115、配列バージョン2）から得ることができる。
【０３５４】
治療的使用および処置方法
本明細書に提供される分子または構築物（すなわち抗原結合受容体、形質導入T細胞およびキット）は、医療の場で、とりわけ悪性疾患の処置に、特に有用である。例えば、本発明の抗原結合受容体を発現する形質導入T細胞を用いて、腫瘍を処置することができる。したがって一定の態様では、抗原結合受容体、形質導入T細胞またはキットが、悪性疾患の処置において使用され、特に悪性疾患は、上皮、内皮、または中皮起源のがんおよび血液のがんから選択される。
【０３５５】
処置の腫瘍特異性は、本発明の抗原結合受容体の1つまたは複数の抗原結合部分によって与えられる。
【０３５６】
これに関連して、悪性疾患は上皮、内皮、または中皮起源のがんまたは血液のがんでありうる。本発明との関連において、がん/癌は、胃腸がん、膵がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、口腔がん、胃がん、子宮頸がん、B細胞リンパ腫およびT細胞リンパ腫、骨髄性白血病、卵巣のがん、白血病、リンパ性白血病、鼻咽頭癌、大腸がん、前立腺がん、腎細胞がん、頭頸部がん、皮膚がん（黒色腫）、尿生殖路のがん、例えば精巣がん、卵巣のがん、内皮がん、子宮頸がんおよび腎がん、胆管のがん、食道がん、唾液腺のがんおよび甲状腺のがん、または血液腫瘍、神経膠腫、肉腫もしくは骨肉腫のような他の腫瘍性疾患からなる群より選択される。
【０３５７】
例えば、腫瘍性疾患および/またはリンパ腫は、これらの医学的適応に向けられた特異的構築物で処置しうる。本発明の形質導入T細胞の適応は、腫瘍抗原に対する抗原結合受容体の特異性によって与えられる。例えば、胃腸がん、膵がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がんおよび/または口腔がんは、（腫瘍細胞の表面に天然に存在する腫瘍特異的抗原としての）（ヒト）EpCAMに対する抗原結合受容体で処置しうる。
【０３５８】
胃腸がん、膵がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がんおよび/または口腔がんは、HER1、好ましくはヒトHER1に対する本発明の形質導入T細胞で処置しうる。さらにまた、胃腸がん、膵がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、膠芽腫および/または口腔がんは、MCSP、好ましくはヒトMCSPに対する本発明の形質導入T細胞で処置しうる。胃腸がん、膵がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、膠芽腫および/または口腔がんは、FOLR1、好ましくはヒトFOLR1に対する本発明の形質導入T細胞で処置しうる。胃腸がん、膵がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、膠芽腫および/または口腔がんは、Trop-2、好ましくはヒトTrop-2に対する本発明の形質導入T細胞で処置しうる。胃腸がん、膵がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、膠芽腫および/または口腔がんは、PSCA、好ましくはヒトPSCAに対する本発明の形質導入T細胞で処置しうる。胃腸がん、膵がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、膠芽腫および/または口腔がんは、EGFRvIII、好ましくはヒトEGFRvIIIに対する本発明の形質導入T細胞で処置しうる。胃腸がん、膵がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、膠芽腫および/または口腔がんは、MSLN、好ましくはヒトMSLNに対する本発明の形質導入T細胞で処置しうる。胃がん、乳がんおよび/または子宮頸がんは、HER2、好ましくはヒトHER2に対する本発明の形質導入T細胞で処置しうる。胃がんおよび/または肺がんは、HER3、好ましくはヒトHER3に対する本発明の形質導入T細胞で処置しうる。B細胞リンパ腫および/またはT細胞リンパ腫は、CD20、好ましくはヒトCD20に対する本発明の形質導入T細胞で処置しうる。B細胞リンパ腫および/またはT細胞リンパ腫は、CD22、好ましくはヒトCD22に対する本発明の形質導入T細胞で処置しうる。骨髄性白血病は、CD33、好ましくはヒトCD33に対する本発明の形質導入T細胞で処置しうる。卵巣がん、肺がん、乳がんおよび/または胃腸がんは、CA12-5、好ましくはヒトCA12-5に対する本発明の形質導入T細胞で処置しうる。胃腸がん、白血病および/または鼻咽頭癌は、HLA-DR、好ましくはヒトHLA-DRに対する本発明の形質導入T細胞で処置しうる。大腸がん、乳がん、卵巣がん、肺がんおよび/または膵がんは、MUC-1、好ましくはヒトMUC-1に対する本発明の形質導入T細胞で処置しうる。大腸がんは、A33、好ましくはヒトA33に対する本発明の形質導入T細胞で処置しうる。前立腺がんは、PSMA、好ましくはヒトPSMAに対する本発明の形質導入T細胞で処置しうる。胃腸がん、膵がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がんおよび/または口腔がんは、トランスフェリン受容体、好ましくはヒトトランスフェリン受容体に対する本発明の形質導入T細胞で処置しうる。膵がん、肺がんおよび/または乳がんは、トランスフェリン受容体、好ましくはヒトトランスフェリン受容体に対する本発明の形質導入T細胞で処置しうる。腎がんでは、CA-IX、好ましくはヒトCA-IXに対する本発明の形質導入T細胞を用いることができる。
【０３５９】
本明細書に記載するT細胞のうちの2種以上を同時適用すること、および/または本明細書に記載する抗原結合受容体のうちの2種以上を同じT細胞において同時発現させかつ/または共形質導入することができる。本発明は、単一の抗原結合受容体を本発明のT細胞において発現させかつ/または形質導入する場合と比較して単一の抗原結合受容体の活性を低減することなく、同じ細胞内で2種以上の抗原結合受容体を組み合わせるための方法を、さらに提供した。
【０３６０】
これに関連して、本発明は、疾患、上皮、内皮、または中皮起源のがんおよび/または血液のがんなどの悪性疾患の処置方法にも関係する。本発明との関連において、対象はヒトである。
【０３６１】
本発明との関連において、疾患を処置するための特定の方法は、以下の工程を含む:
（a）T細胞、好ましくはCD8＋T細胞を、対象から単離する工程、
（b）単離されたT細胞、好ましくはCD8＋T細胞に、少なくとも1つの本明細書に記載の抗原結合受容体を形質導入する工程、および
（c）形質導入されたT細胞、好ましくはCD8＋T細胞を、該対象に投与する工程。
【０３６２】
本発明との関連において、形質導入されたT細胞、好ましくはCD8＋T細胞、および/または1種もしくは複数種の治療用抗体は、静脈内注入によって対象に共投与される。
【０３６３】
さらにまた、本発明との関連において、本発明は、以下の工程を含む、疾患の処置方法を提供する:
（a）T細胞、好ましくはCD8＋T細胞を、対象から単離する工程、
（b）単離されたT細胞、好ましくはCD8＋T細胞に、少なくとも1つの本明細書に記載の抗原結合受容体を形質導入する工程、
（c）任意で、該単離されたT細胞、好ましくはCD8＋T細胞に、T細胞受容体を共形質導入する工程、
（d）抗CD3抗体および抗CD28抗体によって、前記T細胞、好ましくはCD8＋T細胞を増殖させる工程、および
（e）形質導入された前記T細胞、好ましくはCD8＋T細胞を、該対象に投与する工程。
【０３６４】
上述の工程（d）（抗CD3抗体および/または抗CD28抗体によるTILなどのT細胞の増殖工程という）は、インターロイキン2および/またはインターロイキン15（IL-15）などの（刺激性）サイトカインの存在下で行うこともできる。本発明との関連において、上述の工程（d）（抗CD3抗体および/または抗CD28抗体によるTILなどのT細胞の増殖工程という）は、インターロイキン12（IL-12）、インターロイキン7（IL-7）および/またはインターロイキン21（IL-21）の存在下で行うこともできる。
【０３６５】
本発明との関連において、形質導入T細胞の投与は静脈内注入によって行われる。本発明との関連において、形質導入T細胞は処置される対象から単離/取得することができる。
【０３６６】
組成物
さらにまた、本発明は、1種または複数種の本発明の抗原結合受容体、本発明の抗原結合受容体をコードする核酸分子およびベクターを含む形質導入T細胞を含む組成物（医薬）および/または該組成物のうちの1つまたは複数を含むキットを提供する。本発明との関連において、組成物は、任意で担体、安定剤および/または賦形剤の適切な製剤をさらに含む、薬学的組成物である。したがって、本発明との関連において、本明細書に記載の抗原結合受容体を含む形質導入T細胞を含む薬学的組成物（医薬）が提供される。
【０３６７】
本発明によれば、「薬学的組成物」という用語は、患者、好ましくはヒト患者に投与するための組成物に関する。さらにまた、本発明との関連において、患者は疾患を患っており、該疾患は悪性疾患、とりわけ上皮、内皮、または中皮起源のがん/癌または血液のがんである。本発明との関連において、がん/癌は、胃腸がん、膵がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、口腔がん、胃がん、子宮頸がん、B細胞リンパ腫およびT細胞リンパ腫、骨髄性白血病、卵巣のがん、白血病、リンパ性白血病、鼻咽頭癌、大腸がん、前立腺がん、腎細胞がん、頭頸部がん、皮膚がん（黒色腫）、尿生殖路（genitor-urinary tract）のがん、例えば精巣がん、内皮がん、子宮頸がんおよび腎がん、胆管のがん、食道がん、唾液腺のがんおよび甲状腺のがん、または血液腫瘍、神経膠腫、肉腫もしくは骨肉腫のような他の腫瘍性疾患からなる群より選択される。
【０３６８】
好ましい態様において、薬学的組成物/医薬は、非経口、経皮、管腔内、動脈内、静脈内、髄腔内投与、または組織へのもしくは腫瘍への直接注射のための、本明細書において定義する形質導入T細胞を含む。本発明との関連において、組成物/医薬は、本明細書において定義する抗原結合受容体を含む形質導入T細胞を含む。本発明との関連において、薬学的組成物/医薬は、本明細書において定義する抗原結合受容体を含む形質導入T細胞を含み、特に該T細胞は処置される対象から得られたものである。
【０３６９】
薬学的組成物/医薬が注入または注射によって患者に投与されるものであることは、特に考えられる。本発明との関連において、本明細書に記載の抗原結合受容体を含む形質導入T細胞は、注入または注射によって患者に投与されるものである。適切な組成物/医薬の投与は、さまざまな方法、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、筋肉内投与、外用投与または皮内投与によって達成されうる。
【０３７０】
本発明の薬学的組成物/医薬は薬学的に許容される担体をさらに含みうる。適切な薬学的担体の例は当技術分野において周知であり、例えばリン酸緩衝食塩水溶液、水、エマルション、例えば油/水型エマルション、さまざまなタイプの湿潤剤、無菌溶液などが挙げられる。そのような担体を含む組成物は、周知の従来法によって製剤化することができる。これらの薬学的組成物は、適切な用量で対象に投与することができる。投薬レジメンは主治医および臨床因子によって決定される。医学分野では周知のとおり、任意の一患者のための投薬量は、患者のサイズ、体表面積、年齢、投与されるその化合物、性別、投与時間および投与経路、全身の健康状態、および併用投与される他の薬物など、多くの因子に依存する。一般に、薬学的組成物の定期的投与としてのレジメンは、1日あたり1μg〜5gの範囲内にあるべきである。しかし、持続注入にとってより好ましい投薬量は、1時間あたり体重1キログラムあたり、0.01μg〜2mg、好ましくは0.01μg〜1mg、より好ましくは0.01μg〜100μg、さらに好ましくは0.01μg〜50μg、最も好ましくは0.01μg〜10μg単位の範囲にありうる。特に好ましい投薬量は後述する。進行は定期的評価によってモニターすることができる。投薬量はさまざまであるが、DNAの静脈投与の場合、好ましい投薬量はおよそ106〜1012コピーのDNA分子である。
【０３７１】
本発明の組成物は局所的にまたは全身性に投与することができる。投与は、一般的には非経口投与、例えば静脈内投与であり、形質導入T細胞は、標的部位に向けて、例えば動脈内の一部位へのカテーテルなどによって投与することもできる。非経口投与用の調製物としては、無菌の水性または非水性溶液、懸濁液およびエマルションが挙げられる。非水性溶液の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。水性担体としては、食塩水および緩衝媒質を含む、水、アルコール/水溶液、エマルションまたは懸濁液が挙げられる。非経口媒体としては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンゲルまたは固定油が挙げられる。静脈内媒体としては、水分栄養補充剤、電解質補充剤（例えばリンゲルデキストロースに基づくもの）などが挙げられる。例えば抗微生物剤、酸化防止剤、キレート材および不活性ガスなどといった、保存剤その他の添加剤も存在しうる。また、本発明の薬学的組成物は、例えば、好ましくはヒト起源の、血清アルブミンまたは免疫グロブリンのような、タンパク質性の担体を含みうる。本発明の薬学的組成物は、薬学的組成物の使用目的に応じて、細胞の他に、生物学的に活性なさらなる作用物質をさらに含みうると考えられる。そのような作用物質は、胃腸系に作用する薬物、細胞増殖抑制剤として作用する薬物、高尿酸血症を防止する薬物、免疫反応を阻害する薬物（例えばコルチコステロイド）、循環系に作用する薬物、および/または当技術分野において公知のT細胞共刺激分子もしくはサイトカインなどの作用物質でありうる。
【０３７２】
本発明の組成物/医薬の投与に関する考えうる適応は、悪性疾患、例えば上皮、内皮、または中皮起源のがんおよび血液のがん、とりわけ上皮がん/癌、例えば乳がん、大腸がん、前立腺がん、頭頸部がん、皮膚がん（黒色腫）、尿生殖路のがん、例えば卵巣のがん、精巣がん、内皮がん、子宮頸がんおよび腎がん、肺がん、胃がん、胆管のがん、食道がん、唾液腺のがん、ならびに甲状腺のがん、または血液腫瘍、神経膠腫、肉腫もしくは骨肉腫のような他の腫瘍性疾患である。
【０３７３】
本発明では、他の化合物、例えば免疫エフェクター細胞、細胞増殖または細胞刺激のための活性化シグナルを提供する能力を有する分子との共投与プロトコールが、さらに考えられる。該分子は、例えば、T細胞にとってのさらなる一次活性化シグナル（例えばさらなる共刺激分子:B7ファミリーの分子、Ox40L、4.1 BBL、CD40L、抗CTLA-4、抗PD-1）またはさらなるサイトカイン・インターロイキン（例えばIL-2）であってもよい。
【０３７４】
上述した本発明の組成物は、任意で検出手段および検出方法をさらに含む診断組成物であってもよい。
【０３７５】
したがって好ましい態様では、医薬としての使用のための、本明細書に記載のキット、抗原結合受容体または形質導入T細胞が提供される。本発明との関連において、医薬としての使用のための本発明の抗原結合受容体が提供され、ここでは、本明細書において定義する抗原結合受容体を含みかつ/または発現する形質導入T細胞、好ましくはCD8＋T細胞が対象に投与され、該T細胞、好ましくはCD8＋T細胞は、処置される対象から得られたものである。該医薬は、悪性疾患、とりわけ上皮、内皮もしくは中皮起源のまたは血液のがん/癌の処置方法において使用されうる。本発明との関連において、がん/癌は、胃腸がん、膵がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、口腔がん、胃がん、子宮頸がん、B細胞リンパ腫およびT細胞リンパ腫、骨髄性白血病、卵巣のがん、白血病、リンパ性白血病、鼻咽頭癌、大腸がん、前立腺がん、腎細胞がん、頭頸部がん、皮膚がん（黒色腫）、尿生殖路のがん、例えば精巣がん、卵巣のがん、内皮がん、子宮頸がんおよび腎がん、胆管のがん、食道がん、唾液腺のがん、ならびに甲状腺のがん、または血液腫瘍、神経膠腫、肉腫もしくは骨肉腫のような他の腫瘍性疾患からなる群より選択される。
【０３７６】
さらにまた、本発明との関連において、抗原結合受容体は、腫瘍細胞の表面に天然に存在する腫瘍特異的抗原に結合する。本発明との関連において、がん/癌は、胃腸がん、膵がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、口腔がん、胃がん、子宮頸がん、B細胞リンパ腫およびT細胞リンパ腫、骨髄性白血病、卵巣のがん、白血病、リンパ性白血病、鼻咽頭癌、大腸がん、前立腺がん、腎細胞がん、頭頸部がん、皮膚がん（黒色腫）、尿生殖路のがん、例えば精巣がん、卵巣のがん、内皮がん、子宮頸がんおよび腎がん、胆管のがん、食道がん、唾液腺のがん、ならびに甲状腺のがん、または血液腫瘍、神経膠腫、肉腫もしくは骨肉腫のような他の腫瘍性疾患からなる群より選択される。
【０３７７】
さらにまた、本発明によれば、（腫瘍細胞の表面に天然に存在する腫瘍特異的抗原としての）好ましくはヒト腫瘍関連抗原である腫瘍抗原を指向し/腫瘍抗原に結合し/腫瘍抗原と相互作用する抗原結合部分を1つまたは複数、好ましくは1つ含む細胞外ドメインを含む分子または構築物（すなわち本明細書に記載の抗原結合受容体）（ここで、本発明の抗原結合受容体の、本明細書において定義する細胞外ドメインは、腫瘍関連抗原を指向し/腫瘍関連抗原に結合し/腫瘍関連抗原と相互作用する）が、胃腸がん、膵がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がんおよび/または口腔がんの処置において使用するために提供される。したがって本発明との関連において、上皮、内皮、または中皮起源のがんおよび血液のがんの処置における使用のための、腫瘍関連抗原を指向し/腫瘍関連抗原に結合し/腫瘍関連抗原と相互作用する細胞外ドメインを含む抗原結合受容体が提供される。
【０３７８】
一態様では、胃腸がん、膵がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がんおよび/または口腔がんの処置における使用のための、腫瘍抗原を指向し/腫瘍抗原に結合し/腫瘍抗原と相互作用する本発明の抗原結合受容体が提供される。
【０３７９】
一態様において、胃腸がん、膵がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がんおよび/または口腔がんの処置における使用のための、好ましくはヒトHER1であるHER1を指向し/HER1に結合し/HER1と相互作用する本発明の抗原結合受容体が提供される。
【０３８０】
一態様において、胃がん、乳がんおよび/または子宮頸がんの処置における使用のための、好ましくはヒトHER2であるHER2を指向し/HER2に結合し/HER2と相互作用する本発明の抗原結合受容体が提供される。
【０３８１】
一態様において、胃がんおよび/または肺がんの処置における使用のための、好ましくはヒトHER3であるHER3を指向し/HER3に結合し/HER3と相互作用する本発明の抗原結合受容体が提供される。
【０３８２】
一態様において、上皮、内皮、または中皮起源のがんおよび血液のがんの処置における使用のための、好ましくはヒトCEAであるCEAを指向し/CEAに結合し/CEAと相互作用する本発明の抗原結合受容体が提供される。
【０３８３】
一態様において、上皮、内皮、または中皮起源のがんおよび血液のがんの処置における使用のための、好ましくはヒトp95であるp95を指向し/p95に結合し/p95と相互作用する本発明の抗原結合受容体が提供される。
【０３８４】
一態様において、上皮、内皮、または中皮起源のがんおよび血液のがんの処置における使用のための、好ましくはヒトBCMAであるBCMAを指向し/BCMAに結合し/BCMAと相互作用する本発明の抗原結合受容体が提供される。
【０３８５】
一態様において、上皮、内皮、または中皮起源のがんおよび血液のがんの処置における使用のための、好ましくはヒトMSLNであるMSLNを指向し/MSLNに結合し/MSLNと相互作用する本発明の抗原結合受容体が提供される。
【０３８６】
一態様において、上皮、内皮、または中皮起源のがんおよび血液のがんの処置における使用のための、好ましくはヒトMCSPであるMCSPを指向し/MCSPに結合し/MCSPと相互作用する本発明の抗原結合受容体が提供される。
【０３８７】
一態様において、上皮、内皮、または中皮起源のがんおよび血液のがんの処置における使用のための、好ましくはヒトCD19であるCD19を指向し/CD19に結合し/CD19と相互作用する本発明の抗原結合受容体が提供される。
【０３８８】
一態様において、B細胞リンパ腫および/またはT細胞リンパ腫の処置における使用のための、好ましくはヒトCD20であるCD20を指向し/CD20に結合し/CD20と相互作用する本発明の抗原結合受容体が提供される。
【０３８９】
一態様において、B細胞リンパ腫および/またはT細胞リンパ腫の処置における使用のための、好ましくはヒトCD22であるCD22を指向し/CD22に結合し/CD22と相互作用する本発明の抗原結合受容体が提供される。
【０３９０】
一態様において、上皮、内皮、または中皮起源のがんおよび血液のがんの処置における使用のための、好ましくはヒトCD38であるCD38を指向し/CD38に結合し/CD38と相互作用する本発明の抗原結合受容体が提供される。
【０３９１】
一態様において、上皮、内皮、または中皮起源のがんおよび血液のがんの処置における使用のための、好ましくはヒトCD52Flt3であるCD52Flt3を指向し/CD52Flt3に結合し/CD52Flt3と相互作用する本発明の抗原結合受容体が提供される。
【０３９２】
一態様において、上皮、内皮、または中皮起源のがんおよび血液のがんの処置における使用のための、好ましくはヒトFolR1であるFolR1を指向し/FolR1に結合し/FolR1と相互作用する本発明の抗原結合受容体が提供される。
【０３９３】
一態様において、胃腸がん、膵がん、胆管細胞がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、皮膚がん、膠芽腫および/または口腔がんの処置における使用のための、好ましくはヒトTrop-2であるTrop-2を指向し/Trop-2に結合し/Trop-2と相互作用する本発明の抗原結合受容体が提供される。
【０３９４】
一態様において、卵巣がん、肺がん、乳がんおよび/または胃腸がんの処置における使用のための、好ましくはヒトCA-12-5であるCA-12-5を指向し/CA-12-5に結合し/CA-12-5と相互作用する本発明の抗原結合受容体が提供される。
【０３９５】
一態様において、胃腸がん、白血病および/または鼻咽頭癌の処置における使用のための、好ましくはヒトHLA-DRであるDRを指向し/DRに結合し/DRと相互作用する本発明の抗原結合受容体が提供される。
【０３９６】
一態様において、大腸がん、乳がん、卵巣がん、肺がんおよび/または膵がんの処置における使用のための、好ましくはヒトMUC-1であるMUC-1を指向し/MUC-1に結合し/MUC-1と相互作用する本発明の抗原結合受容体が提供される。
【０３９７】
一態様において、大腸がんの処置における使用のための、好ましくはヒトA33であるA33を指向し/A33に結合し/A33と相互作用する本発明の抗原結合受容体が提供される。
【０３９８】
一態様において、前立腺がんの処置における使用のための、好ましくはヒトPSMAであるPSMAを指向し/PSMAに結合し/PSMAと相互作用する本発明の抗原結合受容体が提供される。
【０３９９】
一態様において、上皮、内皮、または中皮起源のがんおよび血液のがんの処置における使用のための、好ましくはヒトPSCAであるPSCAを指向し/PSCAに結合し/PSCAと相互作用する本発明の抗原結合受容体が提供される。
【０４００】
一態様において、上皮、内皮、または中皮起源のがんおよび血液のがんの処置における使用のための、好ましくはヒトトランスフェリン受容体であるトランスフェリン受容体を指向し/トランスフェリン受容体に結合し/トランスフェリン受容体と相互作用する本発明の抗原結合受容体が提供される。
【０４０１】
一態様において、上皮、内皮、または中皮起源のがんおよび血液のがんの処置における使用のための、好ましくはヒトテネイシンであるテネイシンを指向し/テネイシンに結合し/テネイシンと相互作用する本発明の抗原結合受容体が提供される。
【０４０２】
一態様において、上皮、内皮、または中皮起源のがんおよび血液のがんの処置における使用のための、好ましくはヒトXA-IXであるCA-IXを指向し/CA-IXに結合し/CA-IXと相互作用する本発明の抗原結合受容体が提供される。
【０４０３】
一態様において、上皮、内皮、または中皮起源のがんおよび血液のがんの処置における使用のための、好ましくはPDL1であるPDL1を指向し/PDL1に結合し/PDL1と相互作用する本発明の抗原結合受容体が提供される。
【０４０４】
例示的態様
1. アンカリング膜貫通ドメインと、抗原結合部分を含む細胞外ドメインとを含む、抗原結合受容体であって、該抗原結合部分がFab、crossFab、またはscFabフラグメント、特にFabフラグメントまたはcrossFabフラグメントである、抗原結合受容体。
2. アンカリング膜貫通ドメインが、CD8、CD3z、FCGR3A、NKG2D、CD27、CD28、CD137、OX40、ICOS、DAP10、もしくはDAP12膜貫通ドメイン、またはそれらのフラグメントからなる群より選択される膜貫通ドメインである、態様1の抗原結合受容体。
3. アンカリング膜貫通ドメインがCD28膜貫通ドメインまたはそのフラグメントであり、特に、アンカリング膜貫通ドメインがSEQ ID NO:14のアミノ酸配列を含む、態様1または態様2のいずれか一つの抗原結合受容体。
4. 少なくとも1つの刺激シグナリングドメインおよび/または少なくとも1つの共刺激シグナリングドメインをさらに含む、態様1〜3のいずれか一つの抗原結合受容体。
5. 少なくとも1つの刺激シグナリングドメインが、CD3zの細胞内ドメイン、FCGR3Aの細胞内ドメイン、およびNKG2Dの細胞内ドメイン、またはそれらのフラグメントからなる群より個別に選択される、態様1〜4のいずれか一つの抗原結合受容体。
6. 少なくとも1つの刺激シグナリングドメインが、CD3zの細胞内ドメインまたはそのフラグメントであり、特に、少なくとも1つの刺激シグナリングドメインがSEQ ID NO:16のアミノ酸配列を含む、態様1〜5のいずれか一つの抗原結合受容体。
7. 少なくとも1つの共刺激シグナリングドメインが、CD27の細胞内ドメイン、CD28の細胞内ドメイン、CD137の細胞内ドメイン、OX40の細胞内ドメイン、ICOSの細胞内ドメイン、DAP10の細胞内ドメイン、およびDAP12の細胞内ドメイン、またはそれらのフラグメントからなる群より個別に選択される、態様1〜6のいずれか一つの抗原結合受容体。
8. 少なくとも1つの共刺激シグナリングドメインが、CD28の細胞内ドメインまたはそのフラグメントであり、特に、少なくとも1つの共刺激シグナリングドメインがSEQ ID NO:15のアミノ酸配列を含む、態様1〜7のいずれか一つの抗原結合受容体。
9. CD3zの細胞内ドメインまたはそのフラグメントを含む1つの刺激シグナリングドメインを含み、かつCD28の細胞内ドメインまたはそのフラグメントを含む1つの共刺激シグナリングドメインを含む、態様1〜8のいずれか一つの抗原結合受容体。
10. 刺激シグナリングドメインがSEQ ID NO:16のアミノ酸配列を含み、かつ共刺激シグナリングドメインがSEQ ID NO:15のアミノ酸配列を含む、態様9の抗原結合受容体。
11. 細胞外ドメインが、アンカリング膜貫通ドメインへと、任意でペプチドリンカーを介して連結されている、態様1〜10のいずれか一つの抗原結合受容体。
12. ペプチドリンカーがアミノ酸配列GGGGS（SEQ ID NO:20）を含む、態様11の抗原結合受容体。
13. アンカリング膜貫通ドメインが、共シグナリングドメインまたはシグナリングドメインへと、任意でペプチドリンカーを介して連結されている、態様1〜12のいずれか一つの抗原結合受容体。
14. シグナリングドメインおよび/または共シグナリングドメインが、任意で少なくとも1つのペプチドリンカーを介して連結されている、態様1〜13のいずれか一つの抗原結合受容体。
15. 抗原結合部分が重鎖定常（CH）ドメインおよび軽鎖定常ドメイン（CL）を含み、該CHドメインまたは該CLドメインが、C末端において、アンカリング膜貫通ドメインのN末端へと、任意でペプチドリンカーを介して連結されている、態様1〜14のいずれか一つの抗原結合受容体。
16. アンカリング膜貫通ドメインのC末端へとN末端において連結されている1つの共シグナリングドメインを含む、態様4〜15のいずれか一つの抗原結合受容体。
17. 共刺激シグナリングドメインのC末端へとN末端において連結されている1つの刺激シグナリングドメインをさらに含む、態様16の抗原結合受容体。
18. 抗原結合部分が、FAP、CEA、p95、BCMA、EpCAM、MSLN、MCSP、HER-1、HER-2、HER-3、CD19、CD20、CD22、CD33、CD38、CD52Flt3、FOLR1、Trop-2、CA-12-5、HLA-DR、MUC-1（ムチン）、A33抗原、PSMA、PSCA、トランスフェリン受容体、TNC（テネイシン）、CA-IX、およびPDL1からなる群より選択される抗原に対して、またはヒト主要組織適合遺伝子複合体（MHC）の分子に結合したペプチドに対して特異的に結合する能力を有する、態様1〜17のいずれか一つの抗原結合受容体。
19. 抗原結合部分が、線維芽細胞活性化タンパク質（FAP）、癌胎児性抗原（CEA）、メソテリン（MSLN）、CD20、葉酸受容体1（FOLR1）、テネイシン（TNC）、およびプログラム死リガンド1（PDL1）からなる群より選択される抗原に対して特異的に結合する能力を有する、態様1〜18のいずれか一つの抗原結合受容体。
20. 抗原結合部分が、CD20に対して特異的に結合する能力を有し、該抗原結合部分が、
（i）（a）重鎖相補性決定領域（CDR H）1アミノ酸配列YSWIN（SEQ ID NO:1）、
（b）CDR H2アミノ酸配列
2020511979.tif 000070
、および
（c）CDR H3アミノ酸配列
2020511979.tif 000071
を含む重鎖可変領域（VH）と、
（ii）（d）軽鎖相補性決定領域（CDR L）1アミノ酸配列
2020511979.tif 000072
（e）CDR L2アミノ酸配列QMSNLVS（SEQ ID NO:5）、および
（f）CDR L3アミノ酸配列AQNLELPYT（SEQ ID NO:6）
を含む軽鎖可変領域（VL）と
を含む、態様1〜19のいずれか一つの抗原結合受容体。
21. 抗原結合部分が、CD20に対して特異的に結合する能力を有し、該抗原結合部分が、SEQ ID NO:12のアミノ酸と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）と、SEQ ID NO:10のアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（VL）とを含む、態様1〜20のいずれか一つの抗原結合受容体。
22. 抗原結合部分がSEQ ID NO:12の重鎖可変領域（VH）とSEQ ID NO:10の軽鎖可変領域（VL）とを含む、態様1〜21のいずれか一つの抗原結合受容体。
23. 抗原結合部分が、CD20に対して特異的に結合する能力を有するFabフラグメントであり、抗原結合受容体が、
a）SEQ ID NO:7およびSEQ ID NO:50からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％または100％同一である第1のポリペプチドと、
b）SEQ ID NO:9およびSEQ ID NO:8からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％または100％同一である第2のポリペプチドと
を含む、態様1〜22のいずれか一つの抗原結合受容体。
24. a）SEQ ID NO:7の第1のポリペプチドと、
b）SEQ ID NO:9の第2のポリペプチドと
を含む、態様23の抗原結合受容体。
25. a）SEQ ID NO:50の第1のポリペプチドと、
b）SEQ ID NO:8の第2のポリペプチドと
を含む、態様23の抗原結合受容体。
26. 抗原結合部分が、CD20に対して特異的に結合する能力を有するcrossFabフラグメントであり、抗原結合受容体が、
a）SEQ ID NO:36およびSEQ ID NO:41からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％または100％同一である第1のポリペプチドと、
b）SEQ ID NO:38およびSEQ ID NO:43からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％または100％同一である第2のポリペプチドと
を含む、態様1〜22のいずれか一つの抗原結合受容体。
27. a）SEQ ID NO:36の第1のポリペプチドと、
b）SEQ ID NO:38の第2のポリペプチドと
を含む、態様26の抗原結合受容体。
28. a）SEQ ID NO:41の第1のポリペプチドと、
b）SEQ ID NO:43の第2のポリペプチドと
を含む、態様26の抗原結合受容体。
29. 抗原結合部分が、CD20に対して特異的に結合する能力を有するscFabフラグメントであり、抗原結合受容体が、SEQ ID NO:51のアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％または100％同一であるポリペプチドを含む、態様1〜22のいずれか一つの抗原結合受容体。
30. SEQ ID NO:51のポリペプチドを含む、態様29の抗原結合受容体。
31. 抗原結合部分が、PDL1に対して特異的に結合する能力を有し、該抗原結合部分が、
（i）（a）重鎖相補性決定領域（CDR H）1アミノ酸配列DSWIH（SEQ ID NO:68）、
（b）CDR H2アミノ酸配列
2020511979.tif 000073
、および
（c）CDR H3アミノ酸配列
2020511979.tif 000074
を含む重鎖可変領域（VH）と、
（ii）（d）軽鎖相補性決定領域（CDR L）1アミノ酸配列
2020511979.tif 000075
（e）CDR L2アミノ酸配列SASFLYS（SEQ ID NO:72）、および
（f）CDR L3アミノ酸配列QQYLYHPAT（SEQ ID NO:73）
を含む軽鎖可変領域（VL）と
を含む、態様1〜19のいずれか一つの抗原結合受容体。
32. 抗原結合部分が、PDL1に対して特異的に結合する能力を有し、該抗原結合部分が、SEQ ID NO:78のアミノ酸と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）と、SEQ ID NO:77のアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（VL）とを含む、態様1〜19および31のいずれか一つの抗原結合受容体。
33. 抗原結合部分がSEQ ID NO:78の重鎖可変領域（VH）とSEQ ID NO:77の軽鎖可変領域（VL）とを含む、態様1〜19および31〜32のいずれか一つの抗原結合受容体。
34. 抗原結合部分が、PDL1に対して特異的に結合する能力を有するFabフラグメントであり、抗原結合受容体が、
a）SEQ ID NO:74およびSEQ ID NO:85からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％または100％同一である第1のポリペプチドと、
b）SEQ ID NO:76およびSEQ ID NO:75からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％または100％同一である第2のポリペプチドと
を含む、態様1〜19および31〜33のいずれか一つの抗原結合受容体。
35. a）SEQ ID NO:74の第1のポリペプチドと、
b）SEQ ID NO:76の第2のポリペプチドと
を含む、態様34の抗原結合受容体。
36. a）SEQ ID NO:85の第1のポリペプチドと、
b）SEQ ID NO:75の第2のポリペプチドと
を含む、態様34の抗原結合受容体。
37. 抗原結合部分が、PDL1に対して特異的に結合する能力を有するcrossFabフラグメントであり、抗原結合受容体が、
a）SEQ ID NO:79およびSEQ ID NO:82からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％または100％同一である第1のポリペプチドと、
b）SEQ ID NO:81およびSEQ ID NO:84からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％または100％同一である第2のポリペプチドと
を含む、態様1〜19および31〜33のいずれか一つの抗原結合受容体。
38. a）SEQ ID NO:79の第1のポリペプチドと、
b）SEQ ID NO:81の第2のポリペプチドと
を含む、態様37の抗原結合受容体。
39. a）SEQ ID NO:82の第1のポリペプチドと、
b）SEQ ID NO:84の第2のポリペプチドと
を含む、態様37の抗原結合受容体。
40. 抗原結合部分が、PDL1に対して特異的に結合する能力を有するscFabフラグメントであり、抗原結合受容体が、SEQ ID NO:85のアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％または100％同一であるポリペプチドを含む、態様1〜19および31〜33のいずれか一つの抗原結合受容体。
41. SEQ ID NO:85のポリペプチドを含む、態様40の抗原結合受容体。
42. 抗原結合部分が、CEAに対して特異的に結合する能力を有し、該抗原結合部分が、
（i）（a）重鎖相補性決定領域（CDR H）1アミノ酸配列EFGMN（SEQ ID NO:138）、
（b）CDR H2アミノ酸配列
2020511979.tif 000076
、および
（c）CDR H3アミノ酸配列
2020511979.tif 000077
を含む重鎖可変領域（VH）と、
（ii）（d）軽鎖相補性決定領域（CDR L）1アミノ酸配列
2020511979.tif 000078
（e）CDR L2アミノ酸配列SASYRKR（SEQ ID NO:142）、および
（f）CDR L3アミノ酸配列HQYYTYPLFT（SEQ ID NO:143）
を含む軽鎖可変領域（VL）と
を含む、態様1〜19のいずれか一つの抗原結合受容体。
43. 抗原結合部分が、CEAに対して特異的に結合する能力を有し、該抗原結合部分が、
（i）（a）重鎖相補性決定領域（CDR H）1アミノ酸配列DTYMH（SEQ ID NO:148）、
（b）CDR H2アミノ酸配列
2020511979.tif 000079
、および
（c）CDR H3アミノ酸配列
2020511979.tif 000080
を含む重鎖可変領域（VH）と、
（ii）（d）軽鎖相補性決定領域（CDR L）1アミノ酸配列
2020511979.tif 000081
（e）CDR L2アミノ酸配列RASNRAT（SEQ ID NO:152）、および
（f）CDR L3アミノ酸配列QQTNEDPYT（SEQ ID NO:153）
を含む軽鎖可変領域（VL）と
を含む、態様1〜19のいずれか一つの抗原結合受容体。
44. 抗原結合部分が、CEAに対して特異的に結合する能力を有し、該抗原結合部分が、SEQ ID NO:146およびSEQ ID NO:156からなる群より選択されるアミノ酸と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％または100％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）と、SEQ ID NO:147およびSEQ ID NO:157からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％または100％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（VL）とを含む、態様1〜19および42〜43のいずれか一つの抗原結合受容体。
45. 抗原結合部分がSEQ ID NO:146の重鎖可変領域（VH）とSEQ ID NO:147の軽鎖可変領域（VL）とを含む、態様1〜19および42〜44のいずれか一つの抗原結合受容体。
46. 抗原結合部分がSEQ ID NO:156の重鎖可変領域（VH）とSEQ ID NO:157の軽鎖可変領域（VL）とを含む、態様1〜19および42〜44のいずれか一つの抗原結合受容体。
47. 抗原結合部分が、CH1ドメインおよびCLドメインにおける荷電アミノ酸（荷電残基）の少なくとも1つのアミノ酸置換を含むCLドメインおよびCH1ドメインを含む、態様1〜46のいずれか一つの抗原結合受容体。
48. CLドメインにおいて124番目のアミノ酸がリジン（K）、アルギニン（R）またはヒスチジン（H）によって独立して置換され（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）、かつCH1ドメインにおいて147番目および213番目のアミノ酸がグルタミン酸（E）またはアスパラギン酸（D）によって独立して置換されている（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）、態様47の抗原結合受容体。
49. 態様1〜48のいずれか一つの抗原結合受容体をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
50. 第1のポリペプチドをコードする第1の単離されたポリヌクレオチドと第2のポリペプチドをコードする第2の単離されたポリヌクレオチドとを含む、態様1〜48のいずれか一つの抗原結合受容体をコードする組成物。
51. 態様49のポリヌクレオチドまたは態様50の組成物によってコードされる、ポリペプチド。
52. 態様49のポリヌクレオチドまたは態様50の組成物を含む、ベクター、特に発現ベクター。
53. 態様49のポリヌクレオチド、態様50の組成物、または態様52のベクターを含む、形質導入T細胞。
54. 態様1〜48のいずれか一つの抗原結合受容体のうちの少なくとも1つを発現する能力を有する、形質導入T細胞。
55. （i）Fab（VH-CH-ATD）抗原結合ドメインを含む、1種以下の抗原結合受容体、
（ii）Fab（VL-CL-ATD）抗原結合ドメインを含む、1種以下の抗原結合受容体、
（iii）crossFab（VL-CH-ATD）抗原結合ドメインを含む、1種以下の抗原結合受容体、および
（iv）crossFab（VH-CL-ATD）抗原結合ドメインを含む、1種以下の抗原結合受容体
を含む、態様54の形質導入T細胞。
56. Fab抗原結合部分を含む、態様1〜48のいずれか一つに記載の第1の抗原結合受容体
を含み、かつ
crossFab抗原結合部分を含む、態様1〜48のいずれか一つに記載の第2の抗原結合受容体
を含む、態様53〜55のいずれか一つの形質導入T細胞。
57. Fab（VH-CH-ATD）抗原結合部分を含む、態様1〜48のいずれか一つに記載の第1の抗原結合受容体
を含み、かつ
Fab（VL-CL-ATD）抗原結合部分を含む、態様1〜48のいずれか一つに記載の第2の抗原結合受容体
を含む、態様53〜55のいずれか一つの形質導入T細胞。
58. crossFab（VL-CH-ATD）抗原結合部分を含む、態様1〜48のいずれか一つに記載の第1の抗原結合受容体
を含み、かつ
crossFab（VH-CL-ATD）抗原結合部分を含む、態様1〜48のいずれか一つに記載の第2の抗原結合受容体
を含む、態様53〜55のいずれか一つの形質導入T細胞。
59. scFab抗原結合部分を含む、態様1〜48のいずれか一つに記載の第1の抗原結合受容体
を含み、かつ
scFv、Fab、またはcrossFab抗原結合部分を含む、態様1〜48のいずれか一つに記載の第2の抗原結合受容体
を含む、態様53〜55のいずれか一つの形質導入T細胞。
60. FAP、CEA、p95、BCMA、EpCAM、MSLN、MCSP、HER-1、HER-2、HER-3、CD19、CD20、CD22、CD33、CD38、CD52Flt3、FOLR1、Trop-2、CA-12-5、HLA-DR、MUC-1（ムチン）、A33抗原、PSMA、PSCA、トランスフェリン受容体、TNC（テネイシン）、CA-IX、およびPDL1からなる群より選択される抗原に対して、またはヒト主要組織適合遺伝子複合体（MHC）の分子に結合したペプチドに対して特異的に結合する能力を有する第1の抗原結合受容体を含む、態様53〜59のいずれか一つの形質導入T細胞。
61. FAP、CEA、p95、BCMA、EpCAM、MSLN、MCSP、HER-1、HER-2、HER-3、CD19、CD20、CD22、CD33、CD38、CD52Flt3、FOLR1、Trop-2、CA-12-5、HLA-DR、MUC-1（ムチン）、A33抗原、PSMA、PSCA、トランスフェリン受容体、TNC（テネイシン）、CA-IX、およびPDL1からなる群より選択される抗原に対して、またはヒト主要組織適合遺伝子複合体（MHC）の分子に結合したペプチドに対して特異的に結合する能力を有する第2の抗原結合受容体を含む、態様54〜60のいずれか一つの形質導入T細胞。
62. 第1の腫瘍関連抗原（TAA）に対して特異的に結合する能力を有する第1の抗原結合受容体を含み、かつ、あるTAAに対して特異的に結合する能力を有する第2の抗原結合受容体を含む、態様53〜61のいずれか一つの形質導入T細胞。
63. プログラム死リガンド1（PDL1）に対して特異的に結合する能力を有する第1の抗原結合受容体を含み、かつ線維芽細胞活性化タンパク質（FAP）、癌胎児性抗原（CEA）、メソテリン（MSLN）、CD20、葉酸受容体1（FOLR1）、およびテネイシン（TNC）からなる群より選択される抗原に対して特異的に結合する能力を有する第2の抗原結合受容体を含む、態様53〜62のいずれか一つの形質導入T細胞。
64. PDL1に対して特異的に結合する能力を有する第1の抗原結合受容体を含み、かつCD20に対して特異的に結合する能力を有する第2の抗原結合受容体を含む、態様53〜63のいずれか一つの形質導入T細胞。
65. 標的抗原について特異的に結合する能力を有するT細胞受容体（TCR）が共形質導入されている、態様53または態様64のいずれか一つの形質導入T細胞。
66. 医薬としての使用のための、態様1〜48のいずれか一つの抗原結合受容体または態様53〜65のいずれか一つの形質導入T細胞。
67. 抗原結合受容体を発現する形質導入T細胞の投与を含む、悪性疾患の処置
における使用のための、態様1〜48のいずれか一つの抗原結合受容体または態様53〜65のいずれか一つの形質導入T細胞。
68. 悪性疾患が、上皮、内皮、または中皮起源のがんおよび血液のがんから選択される、態様53または態様65記載の使用のための抗原結合受容体または形質導入T細胞。
69. 処置される対象から単離された細胞に由来する、態様66〜68のいずれか一つに記載の使用のための形質導入T細胞。
70. 処置される対象から単離された細胞に由来しない、態様66〜68のいずれか一つに記載の使用のための形質導入T細胞。
71. 態様1〜48のいずれか一つの抗原結合受容体を発現する能力を有する形質導入T細胞を対象に投与する工程を含む、対象における疾患を処置する方法。
72. 対象からT細胞を単離する工程、および単離されたT細胞に、態様49のポリヌクレオチド、態様50の組成物、または態様52のベクターを形質導入することによって、形質導入T細胞を生成する工程をさらに含む、態様71の方法。
73. T細胞が、レトロウイルスもしくはレンチウイルスベクター構築物または非ウイルスベクター構築物で形質導入されている、態様72の方法。
74. 非ウイルスベクター構築物がスリーピング・ビューティーミニサークルベクターである、態様73の方法。
75. 形質導入T細胞が静脈内注入によって対象に投与される、態様71〜74のいずれか一つの方法。
76. 対象への投与に先だって、形質導入T細胞を抗CD3抗体および/または抗CD28抗体と接触させる、態様71〜75のいずれか一つの方法。
77. 対象への投与に先だって、形質導入T細胞を、少なくとも1つのサイトカイン、好ましくはインターロイキン-2（IL-2）、インターロイキン-7（IL-7）、インターロイキン-15（IL-15）、および/もしくはインターロイキン-21、またはそれらの変異体と接触させる、態様71〜76のいずれか一つの方法。
78. 疾患が悪性疾患である、態様71〜77のいずれか一つの方法。
79. 疾患が、上皮、内皮、または中皮起源のがんおよび血液のがんから選択される、態様71〜78のいずれか一つの方法。
80. 標的細胞を、態様1〜48のいずれか一つの抗原結合受容体を発現する能力を有する形質導入T細胞と接触させる工程を含む、標的細胞の溶解を誘導するための方法。
81. 標的細胞ががん細胞である、態様80の方法。
82. 標的細胞が、FAP、CEA、p95、BCMA、EpCAM、MSLN、MCSP、HER-1、HER-2、HER-3、CD19、CD20、CD22、CD33、CD38、CD52Flt3、FOLR1、Trop-2、CA-12-5、HLA-DR、MUC-1（ムチン）、A33抗原、PSMA、PSCA、トランスフェリン受容体、TNC（テネイシン）、CA-IX、およびPDL1からなる群より選択される抗原を発現する、態様80または態様81のいずれか一つの方法。
83. 標的細胞が、線維芽細胞活性化タンパク質（FAP）、癌胎児性抗原（CEA）、メソテリン（MSLN）、CD20、葉酸受容体1（FOLR1）、テネイシン（TNC）、およびプログラム死リガンド1（PDL1）からなる群より選択される抗原を発現する、態様80〜82のいずれか一つの方法。
84. 医薬の製造のための、
態様1〜48のいずれか一つの抗原結合受容体、態様49のポリヌクレオチド、態様50の組成物、または態様53〜65のいずれか一つの形質導入T細胞
の使用。
85. 医薬が、悪性疾患の処置のためのものである、態様84の使用。
86. 悪性疾患が、上皮、内皮、または中皮起源のがんおよび血液のがんから選択されることを特徴とする、態様85の使用。
【０４０５】
これらの態様および他の態様は、本発明の説明および実施例によって開示され、包含される。本発明に従って使用される抗体、方法、使用および化合物のいずれか1つに関するさらなる文献は、公共の図書館およびデータベースで、例えば電子デバイスを使って検索することができる。例えばインターネット上の公共データベース「Medline」は、例えばhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.htmlで利用することができる。http://www.ncbi.nlm.nih.gov/、http://www.infobiogen.fr/、http://www.fmi.ch/biology/research＿tools.html、http://www.tigr.org/などといった他のデータベースおよびアドレスも当業者には公知であり、例えばhttp://www.lycos.comを使って入手することもできる。
【実施例】
【０４０６】
以下は本発明の方法および組成物の実施例である。上述の一般的説明を考慮すれば、他にもさまざまな態様を実施しうることは理解される。
【０４０７】
組換えDNA技法
Sambrook et al,Molecular cloning:A laboratory manual;Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989に記載されているように、標準的方法を使ってDNAを操作した。分子生物学的試薬は製造者の説明書に従って使用した。ヒト免疫グロブリン軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的情報は、Kabat,E.A.,et al.,（1991）Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Ed.,NIH Publication No 91-3242に与えられている。
【０４０８】
DNA配列決定
DNA配列は両鎖シークエンシングによって決定した。
【０４０９】
遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントは適当なテンプレートを使ってPCRで作製するか、または合成オリゴヌクレオチドおよびPCR産物から自動遺伝子合成により、Geneart AG（ドイツ・レーゲンスブルク）によって合成された。特異な制限エンドヌクレアーゼ切断部位に挟まれた遺伝子セグメントを標準的なクローニング/シークエンシングベクターにクローニングした。形質転換された細菌からプラスミドDNAを精製し、濃度をUV分光法によって決定した。サブクローニングされた遺伝子フラグメントのDNA配列はDNAシークエンシングによって確認した。遺伝子セグメントは、各発現ベクターへのサブクローニングを可能にする適切な制限部位を持つように設計した。構築物はすべて、真核細胞における分泌のためにタンパク質を対象にするリーダーペプチドをコードする5’末端DNAを持つように設計した。
【０４１０】
タンパク質精製
標準的プロトコールを参照して、濾過した細胞培養上清からタンパク質を精製した。簡単に述べると、抗体をプロテインA Sepharoseカラム（GE healthcare）に適用し、PBSで洗浄した。抗体の溶出をpH2.8で達成した後は直ちに試料を中和した。凝集したタンパク質は、PBSにおける、または20mMヒスチジン、150mM NaCl、pH6.0における、サイズ排除クロマトグラフィー（Superdex 200、GE Healthcare）によって、単量体型抗体から分離した。単量体型抗体画分をプールし、（必要であれば）例えばMILLIPORE Amicon Ultra（30MWCO）遠心濃縮器を使って濃縮し、凍結し、-20℃または-80℃で保存した。試料の一部を、例えばSDS-PAGEおよびサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）などによる、後続のタンパク質分析および分析的特徴づけに供した。
【０４１１】
SDS-PAGE
NuPAGE（登録商標）Pre-Castゲルシステム（Invitrogen）を製造者の指示に従って使用した。具体的には、10％または4-12％NuPAGE（登録商標）Novex（登録商標）Bis-TRIS Pre-Castゲル（pH6.4）およびNuPAGE（登録商標）MES（還元ゲル、NuPAGE（登録商標）酸化防止ランニング緩衝液添加剤入り）ランニング緩衝液またはMOPS（非還元ゲル）ランニング緩衝液を使用した。
【０４１２】
分析用サイズ排除クロマトグラフィー
抗体の凝集およびオリゴマー状態を決定するためのサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）はHPLCクロマトグラフィーによって行った。簡単に述べると、プロテインA精製した抗体を、Agilent HPLC 1100システムで、300mM NaCl、50mM KH2PO4/K2HPO4、pH7.5中のTosoh TSKgel G3000SWカラムに適用するか、Dionex HPLCシステムで、2×PBS中のSuperdex 200カラム（GE Healthcare）に適用した。溶出したタンパク質をUV吸光度およびピーク面積の積分によって定量した。BioRadゲル濾過標準151-1901を標準とした。
【０４１３】
Jurkat NFAT T細胞のレンチウイルス形質導入
レンチウイルスベクターを生産するために、抗原結合受容体の正しいアセンブリのための各DNA配列を、レンチウイルスポリヌクレオチドベクターの恒常的に活性なヒトサイトメガロウイルス前初期プロモーター（CMV）の下に、インフレームでクローニングした。レトロウイルスベクターはウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素（WPRE）、セントラルポリプリントラクト（cPPT）要素、pUC複製起点ならびに細菌における増殖および選択を容易にする抗生物質耐性をコードする遺伝子を含有した。
【０４１４】
機能的ウイルス粒子を生産するために、60〜70％コンフルエントのHek293T細胞（ATCC CRL3216）ならびに比が3:1:1:1のCAR含有ベクターおよびpCMV-VSV-G:pRSV-REV:pCgpV移入ベクターを使って、Lipofectamine LTX（商標）に基づくトランスフェクションを行った。48時間後に上清を収集し、細胞片を除去するために250gで5分間遠心分離し、0.45または0.22μmポリエーテルスルホンフィルターで濾過した。濃縮されたウイルス粒子（Lenti-x-Concentrator、タカラ）を使って、Jurkat NFAT細胞（Signosis）への形質導入を行った。FACSARIAソーター（BD Bioscience）を使って、陽性形質導入細胞をプールとしてまたは単一クローンとして選別した。適当な密度への細胞増殖後に、Jurkat NFAT T細胞を実験に使用した。
【０４１５】
実施例1
ここでは、CD20発現SUDHDL4腫瘍細胞を標的細胞として使用し、かつ抗CD20-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞の選別された単一クローンを標的細胞として使用する、Jurkat NFAT T細胞レポーターアッセイについて述べる（図4）。陽性対照として、96ウェルプレート（Cellstar Greiner-bio-one、カタログ番号655185）のいくつかのウェルを、10μg/ml CD3抗体（Biolegend（登録商標）製）により、リン酸緩衝食塩水（PBS）中、4℃で一晩または37℃で少なくとも1時間、コーティングした。CD3抗体でコーティングされたウェルをPBSで2回洗浄し、最終洗浄工程後に、PBSを完全に除去した。Cedex HiResを使って、Jurkat NFAT野生型細胞、または抗原結合受容体である抗CD20-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSDを発現するように工学的に操作されたJurkat NFAT CAR細胞（エフェクター細胞ともいう）を、計数し、それらの生存率についてチェックした。細胞数を生細胞1x106個/mlに調整した。それゆえに、細胞懸濁液の適当なアリコートを室温（RT）において210gで5分間ペレット化し、新鮮なRPMI-160＋10％FCS＋1％Glutamax（成長培地）に再懸濁した。関心対象の抗原を発現する標的細胞も、同様に計数し、それらの生存率についてチェックした。細胞数を、成長培地中、生細胞1x106個/mlに調整した。96ウェル浮遊培養プレート（Greiner-bio one）に、200μlの最終体積で、標的細胞およびエフェクター細胞を10:1、5:1、2:1または1:1のE:T比（1ウェルあたり合計110,000細胞）で、三つ組でプレーティングした。96ウェルプレートを室温において190gで2分間遠心分離した後、Parafilm（登録商標）でシールした。
【０４１６】
恒湿雰囲気中、37℃および5％CO2で20時間のインキュベーション後に、マルチチャンネルピペットを使って上下に10回ピペッティングすることによって各ウェルの内容物を混合した。100μlの細胞懸濁液を新しい白色透明底96ウェルプレート（Greiner-bio-one）に移し、100μlのONE-Glo（商標）ルシフェラーゼアッセイ（Promega）を加えた。300rpmのロータリーシェーカー上、室温、暗所で、15分間のインキュベーション後に、Tecan（登録商標）Spark10Mプレートリーダーを使って、1秒/ウェルの検出時間で、発光を測定した。
【０４１７】
棒グラフは、異なるE:T比に依存し、かつ標的細胞との共培養時間に依存する、抗CD20-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞の活性化を示している。Jurkat NFAT T細胞活性化は、標的細胞との共培養の継続時間に依存し、E:T比に依存することが示されている。試験したすべての条件で、20時間のインキュベーション時間が最も高い発光シグナルを呈する。さらに、異なるE:T比のうち、10:1のE:T比が最も高い検出可能な発光シグナルを示す。Jurkat NFAT野生型T細胞は、発光シグナルの時間依存的な増加だけを示し、これにより、40時間後に最も高い発光シグナルを検出することができる。検出される発光シグナルはE:T比には依存せず、概して、各時点において抗CD20-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞について検出される各発光シグナルよりも明らかに低かった。概して、最も高い発光シグナルは、細胞をCD3抗体コートウェル中で細胞をインキュベートした場合に検出することができる。抗CD20-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞は、形質導入されていないJurkat NFAT対照T細胞と比較して、高いシグナルを示す。各ポイントは技術的な二回の反復実験の平均を表す。
【０４１８】
実施例2
ここでは、CD20発現SUDHDL4腫瘍細胞を標的細胞として使用し、かつ抗CD20-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSDまたは抗CD20-crossFab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞の選別された単一クローンを標的細胞として使用する、Jurkat NFAT T細胞レポーターアッセイについて述べる（図5）。陽性対照として、96ウェルプレート（Cellstar Greiner-bio-one、カタログ番号655185）のウェルを、10μg/ml CD3抗体（Biolegend（登録商標）製）により、リン酸緩衝食塩水（PBS）中、4℃で一晩、コーティングした。CD3抗体でコーティングされたウェルをPBSで2回洗浄し、最終洗浄工程後に、PBSを完全に除去した。Cedex HiResを使って、Jurkat NFAT野生型細胞、または抗CD20-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSDもしくは抗CD20-crossFab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSDを発現するように工学的に操作されたJurkat NFAT T細胞（エフェクター細胞ともいう）を、計数し、それらの生存率についてチェックした。細胞数を生細胞1x106個/mlに調整した。それゆえに、細胞懸濁液の適当なアリコートを室温（RT）において210gで5分間ペレット化し、新鮮なRPMI-160＋10％FCS＋1％Glutamax（成長培地）に再懸濁した。関心対象の抗原を発現する標的細胞も、同様に計数し、それらの生存率についてチェックした。細胞数を、成長培地中、生細胞1x106個/mlに調整した。96ウェル浮遊培養プレート（Greiner-bio one）に、200μlの最終体積で、標的細胞およびエフェクター細胞を5:1のE:T比（1ウェルあたり合計110,000細胞）で、三つ組でプレーティングした。96ウェルプレートを室温において190gで2分間遠心分離した後、Parafilm（登録商標）でシールした。
【０４１９】
恒湿雰囲気中、37℃および5％CO2で20時間のインキュベーション後に、マルチチャンネルピペットを使って上下に10回ピペッティングすることによって各ウェルの内容物を混合した。100μlの細胞懸濁液を新しい白色透明底96ウェルプレート（Greiner-bio-one）に移し、100μlのONE-Glo（商標）ルシフェラーゼアッセイ（Promega）を加えた。300rpmのロータリーシェーカー上、室温、暗所で、15分間のインキュベーション後に、Tecan（登録商標）Spark10Mプレートリーダーを使って、1秒/ウェルの検出時間で、発光を測定した。
【０４２０】
棒グラフは、標的細胞と共培養したときの、抗CD20-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞および抗CD20-crossFab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞の活性化を示している。抗CD20-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSDまたは抗CD20-crossFab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞またはJurkat NFAT対照T細胞を標的細胞なしで培養した場合、発光シグナルは検出されなかった。最も高い発光シグナルは、抗CD20-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSDもしくは抗CD20-crossFab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞またはJurkat NFAT対照T細胞のいずれかをCD3抗体コートプレート中で標的細胞と共培養した場合に検出された。驚いたことに、CD3媒介シグナリングに関連して、crossFabフォーマットはJurkat NFAT T細胞の強い活性化をもたらした。各ポイントは技術的な三回の反復実験の平均値を表す。標準偏差はエラーバーによって示されている。
【０４２１】
実施例3
ここでは、CD20発現SUDHDL4腫瘍細胞を標的細胞として使用し、かつ抗CD20-scFab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞の選別されたプールを標的細胞として使用して行った、Jurkat NFAT T細胞レポーターアッセイについて述べる（図6）。
【０４２２】
陽性対照として、96ウェルプレート（Cellstar Greiner-bio-one、カタログ番号655185）のウェルを、10μg/ml CD3抗体（Biolegend（登録商標）製）により、リン酸緩衝食塩水（PBS）中、4℃で一晩または37℃で少なくとも1時間、コーティングした。CD3抗体でコーティングされたウェルをPBSで2回洗浄し、最終洗浄工程後に、PBSを完全に除去した。Cedex HiResを使って、Jurkat NFAT野生型T細胞、または抗CD20-scFab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSDを発現するように工学的に操作されたJurkat NFAT T細胞（エフェクター細胞ともいう）を、計数し、それらの生存率についてチェックした。細胞数を生細胞1x106個/mlに調整した。それゆえに、細胞懸濁液の適当なアリコートを室温（RT）において210gで5分間ペレット化し、新鮮なRPMI-160＋10％FCS＋1％Glutamax（成長培地）に再懸濁した。関心対象の抗原を発現する標的細胞も、同様に計数し、それらの生存率についてチェックした。細胞数を、成長培地中、生細胞1x106個/mlに調整した。96ウェル浮遊培養プレート（Greiner-bio one）に、200μlの最終体積で、標的細胞およびエフェクター細胞を10:1、5:1、2:1または1:1のE:T比（1ウェルあたり合計110,000細胞）で、三つ組でプレーティングした。96ウェルプレートを室温において190gで2分間遠心分離した後、Parafilm（登録商標）でシールした。
【０４２３】
恒湿雰囲気中、37℃および5％CO2で20時間のインキュベーション後に、マルチチャンネルピペットを使って上下に10回ピペッティングすることによって各ウェルの内容物を混合した。100μlの細胞懸濁液を新しい白色透明底96ウェルプレート（Greiner-bio-one）に移し、100μlのONE-Glo（商標）ルシフェラーゼアッセイ（Promega）を加えた。300rpmのロータリーシェーカー上、室温、暗所で、15分間のインキュベーション後に、Tecan（登録商標）Spark10Mプレートリーダーを使って、1秒/ウェルの検出時間で、発光を測定した。
【０４２４】
棒グラフは、異なるE:T比でSUDHL4標的細胞と20時間共培養した後の、抗CD20-scFab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞の活性化を示している。異なるE:T比のうち、10:1および5:1のE:T比が最も高い発光シグナルを示す（図6の黒いバー）。また、CD3抗体コートウェルにおいて10:1のE:T比で共培養した抗CD20-scFab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞も、CD3刺激がない場合の同じ条件に匹敵する高い発光シグナルを示す。
【０４２５】
さらに、Jurkat NFAT野生型細胞はE:T比と無関係にいかなる活性化も示さないが、CD3抗体コートウェルにおいて10:1のE:T比で共培養した場合には明らかな発光シグナルを検出することができ、これにより、それらの機能性が立証される。
【０４２６】
さらに、標的細胞または抗CD20-scFab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSDを発現するT細胞のみ、ならびに標的細胞を含むCD3抗体コートウェルはいかなる活性化も示さないことが、対照実験によって示される。各ポイントは技術的な三回の反復実験の平均値を表す。標準偏差はエラーバーによって示されている。
【０４２７】
実施例4
ここでは、CD20発現SUDHDL4腫瘍細胞を標的細胞として使用し、かつ抗CD20-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞または抗CD20-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞の選別されたプールを標的細胞として使用して行った、Jurkat NFAT T細胞レポーターアッセイについて述べる（図7）。
【０４２８】
陽性対照として、96ウェルプレート（Cellstar Greiner-bio-one、カタログ番号655185）のウェルを、10μg/ml CD3抗体（Biolegend（登録商標）製）により、リン酸緩衝食塩水（PBS）中、4℃で一晩または37℃で少なくとも1時間、コーティングした。CD3抗体でコーティングされたウェルをPBSで2回洗浄し、最終洗浄工程後に、PBSを完全に除去した。Cedex HiResを使って、Jurkat NFAT野生型T細胞、または抗CD20-Fab-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSDもしくは抗CD20-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSDを発現するように工学的に操作されたJurkat NFAT T細胞（エフェクター細胞ともいう）を、計数し、それらの生存率についてチェックした。細胞数を生細胞1x106個/mlに調整した。それゆえに、細胞懸濁液の適当なアリコートを室温（RT）において210gで5分間ペレット化し、新鮮なRPMI-160＋10％FCS＋1％Glutamax（成長培地）に再懸濁した。関心対象の抗原を発現する標的細胞も、同様に計数し、それらの生存率についてチェックした。細胞数を、成長培地中、生細胞1x106個/mlに調整した。96ウェル浮遊培養プレート（Greiner-bio one）に、200μlの最終体積で、標的細胞およびエフェクター細胞を10:1、5:1、2:1または1:1のE:T比（1ウェルあたり合計110,000細胞）で、三つ組でプレーティングした。96ウェルプレートを室温において190gで2分間遠心分離した後、Parafilm（登録商標）でシールした。
【０４２９】
恒湿雰囲気中、37℃および5％CO2で20時間のインキュベーション後に、マルチチャンネルピペットを使って上下に10回ピペッティングすることによって各ウェルの内容物を混合した。100μlの細胞懸濁液を新しい白色透明底96ウェルプレート（Greiner-bio-one）に移し、100μlのONE-Glo（商標）ルシフェラーゼアッセイ（Promega）を加えた。300rpmのロータリーシェーカー上、室温、暗所で、15分間のインキュベーション後に、Tecan（登録商標）Spark10Mプレートリーダーを使って、1秒/ウェルの検出時間で、発光を測定した。
【０４３０】
棒グラフは、5:1のE:T比でSUDHL4標的細胞と20時間共培養した後の、抗CD20-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞の活性化を示している。CD3抗体コートウェルにおいて標的細胞と共培養した抗CD20-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現Jurkat NFAT T細胞は、CD3刺激がない場合の同じ条件に匹敵する、最も高い発光シグナルを示した。驚いたことに、crossFabフォーマットはJurkat NFAT T細胞の差別化された活性化をもたらし、CD3媒介シグナリングに関連して強い活性化が見られる。さらに、Jurkat NFAT野生型細胞はいかなる活性化も示さないが、CD3抗体コートウェルにおいて10:1のE:T比で共培養した場合には明らかな発光シグナルを検出することができ、これにより、それらの機能性が立証される。各バーは技術的な三回の反復実験の平均値を表す。標準偏差はエラーバーによって示されている。
【０４３１】
実施例5
ここでは、CD20発現SUDHDL4腫瘍細胞を標的細胞として使用し、かつ抗CD20-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD発現T細胞のプールを標的細胞として使用して行った、殺傷アッセイについて述べる（図8）。
【０４３２】
凍結PBMCを解凍し、CD3/CD28コートウェル中のT細胞培地（CTS（商標）OpTmizer（商標）T Cell Expansion SFM、品番A1048501＋200U/ml IL-2）に播種することで、それらを2日間活性化した。並行して、ウイルス粒子を生産するために、HEK細胞を一過性にトランスフェクトした。T細胞は、スピンフェクション（spinnfection）を使って、32℃、800rpmで90分間、形質導入を行った。
【０４３３】
2 Mio SUDHL4細胞に1分59秒間5000radを照射し、96ウェルプレートに播種した。形質導入されたT細胞を上に播種し、5日間共培養した。次に細胞を収集し、さらに3日間ピューロマイシン選択（1ug/ml）にかけることで、フィーダー細胞および形質導入されていないT細胞を取り除いた。エフェクター細胞とも呼ばれる残存T細胞を収集し、計数し、それらの生存率についてチェックした。適当な細胞数を遠沈し、T細胞培地に再懸濁した。エフェクター細胞を10μlの体積で播種した。SUDHL4を収集し、計数し、それらの生存率についてチェックした。細胞数を調整して5:1のE:T比を達成した。384ウェルプレートにおける各ウェルの最終体積は20μlであった。自発的放出および最大放出に関する対照として、標的細胞だけを10μlの体積で播種し、総体積が20μlになるまで補充した。さらに、エフェクター細胞のみを10μlで播種し、T細胞培地を20μlまで補充した。
【０４３４】
20時間または40時間のインキュベーション後に、Promega製のCytoTox-Glo（商標）細胞傷害性アッセイ（品番G9291）を使って、死細胞のカスパーゼ活性を検出した。標的細胞の最大放出を決定するために、12μlの溶解緩衝液を適当なウェルに加え、プレートをロータリーシェーカー（Eppendorf、300rpm）上で15分間インキュベートした。その後、12μlアッセイ緩衝液をすべてのウェルに加え、プレートをさらに10分間、ロータリーシェーカー上でインキュベートした。発光プレートリーダー（Victor）で発光を0.5秒間測定した。
【０４３５】
殺傷データを計算するために、エフェクター細胞の自発的放出および標的細胞の自発的放出の和を計算し、次にそれを、共培養した標的細胞およびエフェクター細胞の測定値から差し引いた。それを100％の最大放出と比較することによって、殺傷百分率をさらに計算した。棒グラフは、20時間後および40時間後の抗CD20形質導入CAR T細胞による殺傷百分率を表す技術的な三回の反復実験の平均を示している。
【０４３６】
例示的配列
（表２）抗CD20 Fabアミノ酸配列
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【０４３７】
（表３）抗CD20 Fab DNA配列
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【０４３８】
（表４）抗CD20 crossFab（VH-CL-ATD）アミノ酸配列
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【０４３９】
（表５）抗CD20 crossFab（VL-CH1-ATD）アミノ酸配列
2020511979.tif 000091
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【０４４０】
（表６）抗CD20 crossFab（VH-CL-ATD）DNA配列
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【０４４１】
（表７）抗CD20 Fab（VL-CL-ATD）アミノ酸配列
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【０４４２】
（表８）抗CD20 scFabアミノ酸配列
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【０４４３】
（表９）抗CD20 scFab DNA配列
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【０４４４】
（表１０）抗CD20-ds-scFvアミノ酸配列
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【０４４５】
（表１１）抗CD20 ds scFv DNA配列
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【０４４６】
（表１２）抗PDL1 Fabアミノ酸配列
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【０４４７】
（表１３）PDL1 crossFab（VH-CL-ATD）アミノ酸配列
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【０４４８】
（表１４）抗PDL1 crossFab（VL-CH1-ATD）アミノ酸配列
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【０４４９】
（表１５）抗PDL1 Fab（VL-CL-ATD）アミノ酸配列
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【０４５０】
（表１６）抗PDL1 scFabアミノ酸配列
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【０４５１】
（表１７）抗PDL1 ds scFvアミノ酸配列
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【０４５２】
（表１８）
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【０４５３】
（表２０）抗CEA（98/99）配列
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【０４５４】
（表２１）抗CEA（T84.66）配列
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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