(57)【要約】  １つまたは複数の実施形態では、本発明は、重合後に好ましくは多数ある容易な「クリック反応」のうちの１つによって生物活性材料またはその他の官能性種で修飾するための官能基を付加するために末端官能化および／またはモノマー官能化したポリ（プロピレンフマラート）ポリマーおよびそれから作製されるポリマー構造体（およびそれに関連する方法）に関するものである。いくつかの実施形態では、重合時に使用する官能化開始アルコールにより末端基の官能化を遂行する。いくつかの実施形態では、酸化プロピレンモノマー前駆体の官能化によって上記のポリ（プロピレンフマラート）ポリマーの官能化を遂行し、それにより、得られたポリ（プロピレンフマラート）ポリマー上に官能化側鎖が形成される。【選択図】図１
2020506990.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
末端官能化またはモノマー官能化ポリ（プロピレンフマラート）ポリマー。
【請求項２】
無水マレイン酸モノマーの異性化残基と官能化酸化プロピレンモノマーの残基とを含む、請求項１に記載の末端官能化またはモノマー官能化ポリ（プロピレンフマラート）ポリマー。
【請求項３】
官能化開始アルコールの残基をさらに含む、請求項１または２に記載の末端官能化またはモノマー官能化ポリ（プロピレンフマラート）ポリマー。
【請求項４】
式：
【化４８】
2020506990.tif 000065
を有し、式中、ｎが１〜１０００の整数であり、Ｒが、官能基または前記官能基を含むアルキル基もしくはアリール基であり、前記官能基が、ベンジル基、アルキン基、プロパルギル基、アリル基、アルケン基、４−ジベンジオシクロオクチン（ｄｉｂｅｎｚｙｏｃｙｃｌｏｏｃｔｙｎｅ）基、シクロオクチン基、ケトン基、アルデヒド基、第三級ハロゲン基およびその組合せからなる群より選択される、請求項１または３に記載の末端官能化またはモノマー官能化ポリ（プロピレンフマラート）ポリマー。
【請求項５】
式：
【化４９】
2020506990.tif 000066
を有し、式中、ｎが１〜１０００の整数である、請求項１、３または４に記載の末端官能化またはモノマー官能化ポリ（プロピレンフマラート）ポリマー。
【請求項６】
前記官能化開始アルコールが、プロパルギルアルコール、アリルアルコール、４−ジベンジオシクロオクチノール（ｄｉｂｅｎｚｙｏｃｙｃｌｏｏｃｔｙｎｏｌ）、４−ヒドロキシブタン−２−オン、３−ヒドロキシプロパン−２−オン、５−ヒドロキシペンタン−２−オン、６−ヒドロキシヘキサン−２−オン、７−ヒドロキシヘプタン−２−オン、８−ヒドロキシオクタン−２−オン、５−ノルボルネン−２−オール、α−ブロモイソブチリル４−メタノールベンジルメタノアートおよびその組合せからなる群より選択される請求項１、３、４または５に記載の末端官能化またはモノマー官能化ポリ（プロピレンフマラート）ポリマー。
【請求項７】
前記官能化酸化プロピレンモノマーが、アルキン官能化酸化プロピレン、ｏ−ベンジル官能化酸化プロピレン、２−［［（２−ニトロフェニル）メトキシ］メチル］オキシラン（ＮＭＭＯ）、グリシジルプロパルギルエーテル、（±）−エピクロロヒドリンおよびその組合せからなる群より選択される、請求項２または３に記載の末端官能化またはモノマー官能化ポリ（プロピレンフマラート）ポリマー。
【請求項８】
前記官能化開始アルコールが、アルキン基、プロパルギル基、アリル基、アルケン基、４−ジベンジオシクロオクチン（ｄｉｂｅｎｚｙｏｃｙｃｌｏｏｃｔｙｎｅ）基、シクロオクチン基、ケトン基、アルデヒド基、第三級ハロゲン基およびその組合せからなる群より選択される官能基を含む、請求項２、３、４、５または６に記載の末端官能化またはモノマー官能化ポリ（プロピレンフマラート）ポリマー。
【請求項９】
末端官能基とモノマー官能基をともに含む、請求項１〜３、６、７または８に記載の末端官能化またはモノマー官能化ポリ（プロピレンフマラート）ポリマー。
【請求項１０】
式：
【化５０】
2020506990.tif 000067
を有し、式中、ｎが１〜１００の整数であり；Ｒが、第一の官能基または前記第一の官能基を含むアルキル基もしくはアリール基であり、前記第一の官能基が、アルキン基、プロパルギル基、アリル基、アルケン基、４−ジベンジオシクロオクチン（ｄｉｂｅｎｚｙｏｃｙｃｌｏｏｃｔｙｎｅ）基、シクロオクチン基、ケトン基、アルデヒド基、第三級ハロゲン基およびポリ（エチレングリコール）基ならびにその組合せからなる群より選択され；Ｒ’が、第二の官能基または前記第二の官能基を含むアルキル基もしくはアリール基であり、前記第二の官能基が、アルキン基、アルケン基、ヒドロキシル基、保護ヒドロキシル基、チオール基、ハロゲン化物基およびその組合せからなる群より選択される、請求項１、２、３、６、７、８または９に記載の末端官能化またはモノマー官能化ポリ（プロピレンフマラート）ポリマー。
【請求項１１】
【化５１】
2020506990.tif 000068
から選択される式を有し、式中、ｎが約１〜約１００の整数である、請求項１、２、３、６、７、８、９または１０に記載の末端官能化またはモノマー官能化ポリ（プロピレンフマラート）ポリマー。
【請求項１２】
数平均分子量が約０．７ｋＤａ〜約１００，０００ｋＤａである、請求項１〜１１に記載の末端官能化またはモノマー官能化ポリ（プロピレンフマラート）ポリマー。
【請求項１３】
多分散指数（ＤＭ）が約１．０１〜約１．８である、請求項１〜１２に記載の末端官能化またはモノマー官能化ポリ（プロピレンフマラート）ポリマー。
【請求項１４】
請求項１〜３、６〜１２および１３に記載のモノマー官能化ポリ（プロピレンフマラート）ポリマーを形成するための官能化酸化プロピレンモノマーであって、エーテル結合を介して対応する官能基とのクリック反応に入ることが可能な官能基を含むアルキル基またはアリール基と結合したグリシジル基を含む、官能化酸化プロピレンモノマー。
【請求項１５】
前記対応する官能基とのクリック反応に入ることが可能な官能基を含むアルキル基またはアリール基が、アルキン基、アルケン基、ヒドロキシル基、保護ヒドロキシル基またはその組合せからなる群より選択される、請求項１４に記載の官能化モノマー。
【請求項１６】
グリシジルプロパルギルエーテルである、請求項１４または１５に記載の官能化モノマー。
【請求項１７】
式：
【化５２】
2020506990.tif 000069
を有する、請求項１４〜１６に記載の官能化モノマー。
【請求項１８】
２−［［（２−ニトロフェニル）メトキシ］メチル］オキシラン（ＮＭＭＯ）である、請求項１４または１５に記載の官能化モノマー。
【請求項１９】
式：
【化５３】
2020506990.tif 000070
を有する、請求項１４、１５または１８に記載の官能化モノマー。
【請求項２０】
式：
【化５４】
2020506990.tif 000071
を有し、式中、Ｒが、官能基または官能基を含むアルキル基もしくはアリール基であり、前記官能基が、アルキン基、アルケン基、ヒドロキシル基、保護ヒドロキシル基、チオール基、ハロゲン化物基およびその組合せから選択される、請求項１４に記載の官能化モノマー。
【請求項２１】
請求項１〜１３に記載の官能化ポリ（プロピレンフマラート）ポリマーを含む、３Ｄプリントしたポリマー足場。
【請求項２２】
前記官能化ポリ（プロピレンフマラート）ポリマーと結合した複数の生物活性材料または官能性部分をさらに含む、請求項２１に記載の３Ｄプリントしたポリマー足場。
【請求項２３】
請求項１〜１３に記載の末端官能化またはモノマー官能化ポリ（プロピレンフマラート）ポリマーを作製する方法であって、
Ａ．官能性末端基をさらに含む開始アルコールを調製することと、
Ｂ．前記開始アルコール、マグネシウム触媒、無水マレイン酸および酸化プロピレンを適切な容器内で組合せ、適切な溶媒を加えることと、
Ｃ．前記容器を密閉し、次いで加熱して、前記開始アルコールによって開始される前記無水マレイン酸と前記酸化プロピレンとの間の開環重合反応を引き起こし、かつ／またはこれを維持し、それにより、前記官能性末端基を含むポリ（プロピレンマレアート）ポリマーを形成することと、
Ｄ．前記官能性末端基を含む前記ポリ（プロピレンマレアート）ポリマーを収集し精製することと、
Ｅ．前記官能性末端基を含む前記ポリ（プロピレンマレアート）ポリマーを異性化して、前記官能性末端基を含むポリ（プロピレンフマラート）ポリマーを形成することと
を含む、方法。
【請求項２４】
段階Ｂの組合せにおける前記開始アルコールと前記マグネシウム触媒のモル比が約１：１である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
段階Ｂの組合せにおける前記開始アルコールのモル数と前記無水マレイン酸および前記酸化プロピレンの総モル数の比が約１：５〜約１：１０００である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
段階Ｂの溶液中の前記無水マレイン酸と前記酸化プロピレンの総濃度が約０．５Ｍ〜約５．０Ｍである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記適切な溶媒がトルエンまたはヘキサンである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記加熱の段階が、前記容器を約４０℃〜約１００℃の温度に加熱することを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記適切な溶媒がヘキサンであり、前記加熱の段階が、前記容器を約４５℃の温度に加熱することを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
前記開始アルコールが、ベンジルアルコール、プロパルギルアルコール、アリルアルコール、４−ジベンジオシクロオクチノール（ｄｉｂｅｎｚｙｏｃｙｃｌｏｏｃｔｙｎｏｌ）、４−ヒドロキシブタン−２−オン、３−ヒドロキシプロパン−２−オン、５−ヒドロキシペンタン−２−オン、６−ヒドロキシヘキサン−２−オン、７−ヒドロキシヘプタン−２−オン、８−ヒドロキシオクタン−２−オン、５−ノルボルネン−２−オール、α−ブロモイソブチリル４−メタノールベンジルメタノアートおよびその組合せから選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項３１】
前記開始アルコールの前記官能性末端基が、ベンジル基、アルキン基、プロパルギル基、アリル基、アルケン基、４−ジベンジオシクロオクチン（ｄｉｂｅｎｚｙｏｃｙｃｌｏｏｃｔｙｎｅ）基、シクロオクチン基、ケトン基、アルデヒド基、第三級ハロゲン基、ポリ（エチレングリコール）基およびその組合せを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３２】
前記マグネシウム触媒がＭｇ（ＢＨＴ）２（ＴＨＦ）２を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３３】
請求項１〜３、６〜１２および１３に記載の官能化ポリ（プロピレンフマラート）ポリマーを作製する方法であって、
Ａ．官能化酸化プロピレンを調製することと、
Ｂ．前記官能化酸化プロピレンをマグネシウム触媒の存在下で無水マレイン酸および開始アルコールと反応させて、官能化ポリ（プロピレンマレアート）ポリマーを形成することと、
Ｃ．前記官能化ポリ（プロピレンマレアート）ポリマーを塩基と反応させることにより異性化して、請求項１に記載の官能化ポリ（プロピレンフマラート）ポリマーを形成することと
を含む、方法。
【請求項３４】
前記官能化酸化プロピレンが、アルキン官能化酸化プロピレン、ｏ−ベンジル官能化酸化プロピレン、２−［［（２−ニトロフェニル）メトキシ］メチル］オキシラン（ＮＭＭＯ）、グリシジルプロパルギルエーテル、（±）−エピクロロヒドリンおよびその組合せから選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記開始アルコールが、ベンジルアルコール、プロパルギルアルコール、アリルアルコール、４−ジベンジオシクロオクチノール（ｄｉｂｅｎｚｙｏｃｙｃｌｏｏｃｔｙｎｏｌ）、４−ヒドロキシブタン−２−オン、３−ヒドロキシプロパン−２−オン、５−ヒドロキシペンタン−２−オン、６−ヒドロキシヘキサン−２−オン、７−ヒドロキシヘプタン−２−オン、８−ヒドロキシオクタン−２−オン、５−ノルボルネン−２−オール、α−ブロモイソブチリル４−メタノールベンジルメタノアートおよびその組合せから選択される官能化開始アルコールである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記金属触媒がマグネシウム２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルフェノキシド（Ｍｇ（ＢＨＴ）２（ＴＨＦ）２）である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
請求項１６または１７に記載の官能化モノマーを作製する方法であって、
Ａ．水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、水酸化カリウム（ＫＯＨ）およびその組合せからなる群より選択される塩基を含有する水溶液にプロパルギルアルコールを加えることと、
Ｂ．（±）−エピクロロヒドリンおよび硫酸水素テトラブチルアンモニウムを適切な有機溶媒に溶解させることと、
Ｃ．段階Ｂの溶液およびＨ２Ｏを段階Ａのプロパルギルアルコール溶液に加えることと、
Ｄ．不活性雰囲気下で反応を進行させてグリシジルプロパルギルエーテルを得ることと
を含む、方法。
【請求項３８】
プロパルギルアルコールを加える段階（段階Ａ）が、攪拌しながら約−１０℃〜約３０℃の温度で前記プロパルギルアルコールを水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）水溶液に滴加することを含み、前記水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）水溶液が約２０重量％〜約５０重量％のＮａＯＨを含み、
前記溶解の段階（段階Ｂ）の前記有機溶媒がヘキサンを含み、
前記反応を進行させる段階（段階Ｄ）が、Ｎ２ブランケット下、反応温度を周囲温度まで上昇させ、前記反応を約１時間〜約２４時間継続させることを含む、
請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
Ｅ．前記反応を停止させることと、
Ｆ．適切な有機溶媒で粗生成物を抽出することと、
Ｇ．カラムクロマトグラフィーまたは蒸留によって段階Ｆの前記粗生成物を精製して、精製グリシジルプロパルギルエーテルを得ることと
をさらに含む、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４０】
請求項１８または１９に記載の官能化モノマーを作製する方法であって、
Ａ．ｏ−ニトロベンジルアルコールを適切な有機溶媒に溶解させることと、
Ｂ．硫酸水素テトラブチルアンモニウムおよび塩基を含有する水溶液を段階Ａのｏ−ニトロベンジルアルコール溶液に加え、前記塩基が、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、水酸化カリウム（ＫＯＨ）およびその組合せからなる群より選択されるものであることと、
Ｃ．（±）−エピクロロヒドリンを加えることと、
Ｄ．反応を進行させて２−［［（２−ニトロフェニル）メトキシ］メチル］オキシラン（ＮＭＭＯ）を得ることと
を含む、方法。
【請求項４１】
Ｅ）適切な有機溶媒で粗生成物を抽出することと、
Ｆ）カラムクロマトグラフィーまたは蒸留によって段階Ｄの前記粗生成物を精製して、精製２−［［（２−ニトロフェニル）メトキシ］メチル］オキシラン（ＮＭＭＯ）を得ることと
をさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、２０１７年２月２日に出願された「Ｂｌｏｃｋ  Ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  Ｏｆ  Ｌａｃｔｏｎｅｓ  Ａｎｄ  Ｐｏｌｙ（Ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  Ｆｕｍａｒａｔｅ）」と題する米国仮特許出願第６２／５４３，７８６号、２０１７年２月２日に出願された「Ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  Ｏｘｉｄｅ  Ａｎｄ  Ｍａｌｅｉｃ  Ａｎｈｙｄｒｉｄｅ  ｕｓｉｎｇ  Ｍｇ  Ｃａｔａｌｙｓｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｉｔｉａｔｏｒｓ」と題する米国仮特許出願第６２／４５３，７２４号、２０１７年５月３日に出願された「Ｐｏｓｔ−３Ｄ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ  ｆｏｒ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ」と題する米国仮特許出願第６２／５００，７７７号、２０１７年５月２２日に出願された「Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  Ｐｏｌｙ（Ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  Ｆｕｍａｒａｔｅ）Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｉｒ  Ｍａｋｉｎｇ」と題する米国仮特許出願第６２／５０９，３４０号、２０１７年８月７日に出願された「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｗｅｌｌ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｐｏｌｙ（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｆｕｍａｒａｔｅ）ａｎｄ  Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）Ｂｌｏｃｋ  Ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ」と題する米国仮特許出願第６２／５４１，８８９号、２０１７年９月２２日に出願された「Ｍｇ  Ｃａｔａｌｙｚｅｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｌｙ（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｆｕｍａｒａｔｅ）ｉｎ  Ｈｅｘａｎｅｓ」と題する米国仮特許出願第６２／５６１，７２２号および２０１８年２月２日に本出願者によってここに出願される「Ｂｌｏｃｋ  Ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｏｆ  Ｌａｃｔｏｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｏｌｙ（Ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  Ｆｕｍａｒａｔｅ）」と題する米国特許出願の利益を主張するものであり、上記出願はいずれも、その全体が参照により本明細書に組み込まれる．
【０００２】
（共同研究契約の関係者の名称）
本願は、オハイオ州アクロンのアクロン大学とオハイオ州アクロンの２１ｓｔ  Ｃｅｎｔｕｒｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社との間の共同研究契約に従うものである。
【０００３】
（発明の分野）
本発明の１つまたは複数の実施形態は、新規なポリ（プロピレンフマラート）ポリマーおよびポリ（プロピレンフマラート）ポリマーの作製方法に関する。ある特定の実施形態では、本発明は、明確に定められた生分解性ポリ（プロピレンフマラート）ポリマーおよびそれを作製および官能化するための拡大可能な方法に関する。ある特定の実施形態では、本発明は、様々な再生医療用途に使用するための明確に定められた生分解性ポリ（プロピレンフマラート）ポリマーに関する。
【背景技術】
【０００４】
理解されるように、組織工学は、組織機能を回復、維持または改善し、血管、神経および骨治療などの様々な治療目的に適用可能な生体代替物の開発に工学と生命科学の原理を応用する学際的分野の１つである。組織工学によく用いられる方法には２つある。１つの方法は、足場と呼ばれる支持構造装置の中に細胞を埋め込むものである。もう１つの方法は、細胞に足場を自然な組織に再構成させた後に患者の体内に埋め込むものである。上記の組織工学原理に基づき、足場は組織工学応用に極めて重要な役割を果たしている。このため、足場を構成する材料も組織工学に重要なものとなる。骨組織工学のすべてまたはほぼすべての必要条件を満たし、かつ足場に加工することができる材料が必要とされている。一般的な組織工学の材料は、足場を形成する際に目的組織の膨大な機械的および構造的要件を満たし、組織治癒を促進する細胞との分子的相互作用を可能にするものでなければならない。さらに、毒性が低く迅速に生分解されるというのも材料がもつべき基本的な特性である。
【０００５】
既に足場として用いられている材料、例えば金属、セラミック、天然ポリマーおよび合成ポリマーなどはいずれも、未だ上記の必要条件を満たしてはいない。しかし、上記の材料のうち合成ポリマーは、その機械的特性および物理的特性を調整することが可能であることから、適切な足場材料への道筋となる可能性を秘めている。例えば、これまで骨組織工学を目的にポリエステルの一種であるポリ（プロピレンフマラート）（ＰＰＦ）が合成され研究されている。
【０００６】
さらに、積層造形（３Ｄプリンティングなど）の進歩が様々な理由で組織工学に大きな変化をもたらす可能性を秘めており、その理由のなかでもとりわけ重要なのが、これらの技術が患者に特異的な必要条件を満たす足場を迅速に設計しプリントすることを可能にする可能性を秘めているということである。ただし、このような進歩は、特定の用途の化学的、機械的および生物学的必要条件を満たすプリント可能な材料が得られるかどうかに大きく依存する。より口語的には３Ｄプリンティングとして知られている様々な形態の積層造形がこれまでに文献に示されてきた。熱溶解積層法（ＦＤＭ）は、ポリ（ウレタン）（ＰＵ）、ポリ（Ｌ−乳酸）（ＰＬＬＡ）またはポリ（エステル尿素）（ＰＥＵ）などの固体のフィラメントを１層ずつ押出成形する方法である。高解像度ステレオリソグラフィーにより特定の領域に光架橋を生じさせる連続デジタルライトプロセッシング（ｃＤＬＰ）を用いてポリマーレジンをプリントすることもできる。３Ｄプリンティングではインクジェット法も実証されており、粉末またはレジンのいずれかで用いることができる。
【０００７】
生体系と適合性のある３Ｄ足場を作製するには、ポリマーは、無毒性であり、埋植しても拒絶反応を引き起こさず、分解されて完全に吸収されるものであるべきである。最初の２つの基準は多数のポリマー系で達成されているが、生体吸収性も備えている例は、ポリラクチド、ポリ（ε−カプロラクトン）（ＰＣＬ）およびポリ（プロピレンフマラート）（ＰＰＦ）と比較的少ない。これらの例はそれぞれポリエステルであり、したがって、ｉｎ  ｖｉｖｏで酵素または加水分解によって分解することができる。しかし、ＰＬＬＡが短時間で分解されることにより、周辺組織領域のアシドーシスおよび炎症がよくみられる。これとは逆に、ＰＣＬはヒト体内で徐々に分解されるため、特に血管組織を再編成させる組織修復にこれが使用されることは少ない。
【０００８】
ＰＬＬＡおよびＰＣＬはともに、ＦＤＭによって押し出して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで分解させることが可能な３Ｄ足場を作製することが可能である。これらの材料は適度な機械的特性および引張特性を示し、その欠点の大部分が重なった層と層の間の境界面にみられる。さらに、ＦＤＭで達成可能な押出しノズルの幅があるため、３Ｄプリントされる足場の解像度が制限される。
【０００９】
一方、ｃＤＬＰなどのステレオリソグラフィー法は、使用する材料よりはむしろプリンタの光源による制約を受けるため、ＦＤＭ技術よりはるかに高い解像度を示すことが明らかにされている。これにより、生理的条件に合わせて調節することができる制御された多孔度で３Ｄ足場をプリントすることが可能になる。
【００１０】
ＰＰＦは、ｉｎ  ｖｉｖｏで分解して、天然に分泌されるフマル酸とプロピレングリコールを形成する不飽和ポリエステルである。ＰＰＦはこれまで、血管ステント、神経移植片、軟骨、薬物放出媒体、血管工学および骨組織工学などの様々な医療用途に使用されてきた。ポリマー主鎖内に不飽和アルケンがあるため、分子間架橋を生じさせて材料の機械的特性を強化することができる。溶媒としても架橋剤としても作用する反応性希釈剤のフマル酸ジエチル（ＤＥＦ）にポリマーを溶解させることによるプリント可能なＰＰＦレジンの開発が精力的に研究され、骨に匹敵する圧縮弾性率を示す３Ｄ足場の作製が可能であることが明らかにされている。
【００１１】
ＰＰＦ生産に現在用いられている方法は、ＤＥＦとプロピレングリコールの逐次重縮合によるものである（スキーム１）。しかし、これは３Ｄプリンティングを目的としてＰＰＦを生産するのに工業的に実現可能な方法ではない。鎖長とともに結晶化度が増大することにより、小さい分子質量でみられる流体オリゴマーではなく溶解度の低い固体ポリマーが生じるため、ｃＤＬＰシステムでは分子質量の小さいＰＰＦ（３０００Ｄａ未満）のみが示されている。したがって、逐次重縮合によって３Ｄプリンティング用のＰＰＦをスケールアップし商業化するのは困難であることが明らかにされている。逐次法は高い末端基忠実度および狭い分子質量分布の維持につながるものではない。分子質量分布を制御できないことは、材料の分解特性に直接影響を及ぼす。逐次重縮合条件の副生成物である残留エタノールおよび未反応モノマーもＰＰＦの工業的拡大に精製上の問題点をもたらしている。
スキーム１
ポリ（プロピレンフマラート）作製のための重合方法
【化１】
2020506990.tif 000003
【００１２】
これまでに、無水マレイン酸（ＭＡｎ）と酸化プロピレン（ＰＯ）の開環（共）重合（ＲＯＣＯＰ）によりＰＰＦのシス−アルケン異性体ポリ（プロピレンマレアート）（ＰＰＭ）を生成し、低温（約６０℃）で弱塩基を用いてそれをＰＰＦに変換することができることが報告されている。ＲＯＣＯＰは、モノマー（１種類または複数種類）とアルコール開始剤の比を変化させることによって分子質量分布と末端基忠実度を高度に制御することが可能である点で有利である。接触細胞毒性試験および細胞培養の結果を含めたＲＯＰによるＰＰＦ合成に関する最近の研究では、ＲＯＰによって生成したＰＰＦポリマーが無毒性であり、その薄膜上に細胞が十分に付着し増殖することが明らかにされている。ＲＯＣＯＰを用いて生成されるＰＰＭに関しては文献に例が既に存在するが、これらの系は、開始末端基に使用するアルコールに関して選択肢が限られる金属アルコキシド触媒／連鎖移動剤の使用に基づくものであった。
【００１３】
これまでに、マグネシウムエトキシド（Ｍｇ（ＯＥｔ）２）がＰＰＭのＲＯＣＯＰ形成に対して触媒挙動を示すことが明らかにされている。マグネシウムは通常、その反応性のため触媒作用に使用されることはないが、末端酸化産物である酸化マグネシウムが食品添加物として使用されているという点で生体材料合成には魅力的なものである。しかし、Ｍｇ（ＯＥｔ）２の場合、弱く配位したエトキシド配位子が連鎖移動種としても作用するため、末端基忠実度が得られない。生じるポリマーはエトキシ末端種またはヒドロキシ末端種のいずれかである。マグネシウム２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルフェノキシド（Ｍｇ（ＢＨＴ）２（ＴＨＦ）２）は、これまでにラクトンに対する「永久」ＲＯＰ触媒であることが示されている触媒であり、少ない触媒投入量で高末端基忠実度のポリエステルを生産するのに用いることができる。この触媒は、「空気」条件下で相対的安定性を示し、水の存在下で開始／エステル転移反応の副反応を促進することはないという点で有利である。重要なのは、２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルフェノキシド（ＢＨＴ）は、食品および包装の酸化防止剤および安定剤として使用されていたため、最初は配位子系として選択されたことである。このことが生体適合性に関する懸念を減らした。
【００１４】
ＰＰＦの有用性に極めて重要なのは、官能基の化学量および分解特性をともに制御できることである。ＰＰＦが完全に生体吸収性の材料となるためには、ＭＡｎとＰＯが完全に交互に組み込まれて、容易に加水分解され得るポリエステルが生じ、連続するＰＯ反復単位の間に容易に分解されないポリエーテル結合が組み込まれ得る副反応が回避されなければならない。分解の制御は多くの用途で、組織の成長に伴い足場を分解させて、足場の機械的寄与を最大にし、骨組織が効果的に置換されるようにするのに不可欠なものである。分子質量分布（ＤＭ）の小さいポリマーの方が、高ＤＭポリマーよりも均一に分解し、より優れた足場分解の制御を可能にすることがわかっている。
【００１５】
埋植物に対する身体の拒絶反応を最小限に抑え、修復過程を促進するため、重合後に埋植物表面をバイオコンジュゲートで修飾することが精力的に検討されてきた。足場表面に小分子およびポリペプチドを付加することにより、足場表面への細胞の付着および拡散が促進されることが明らかにされている。さらに、ポリペプチドを精選することにより、これらの細胞の分化を特定の組織の成長（例えば、骨組織）に向けることができる。しかし、組織の成長修復のための足場は、所望の組織のみが確実に形成されるよう細胞の付着、増殖および分化に影響を及ぼすことが可能なものでなければならず、官能化ＰＰＦを用いてこのことが実証されたことは未だない。厳しい光化学架橋条件は大部分の官能基を破壊するものであり、これまでに記載されている方法を用いて生物活性種を組み込むことができる可能性を制限してきた。
【００１６】
一方、現在用いられているＰＰＦポリマーの問題点の１つに、非官能化ＰＰＦには良好な生体材料に極めて重要な必要条件である細胞との相互作用がみられないという点がある。このため、ＰＰＦの合成方法は改善されており、そのＰＰＦは完全に生体吸収性であり、観察可能な毒性がないことから、骨組織工学の基本的な必要条件の一部を既に満たしているものの、ＰＰＦ特性をさらに改善する必要がある。理解されるように、合成ポリマーの生物活性特性を改善する一般的な経路は、所望の特性を有するか、これを得ることができるものでポリマーを官能化することである。最終目標がＰＰＦの生物活性を改善することであるため、ＰＰＦに「クリック」型反応またはその他の反応を受け得る１つまたは複数の官能基を付加することが可能であり、それにより、プリント後にＰＰＦが表面修飾を受け、有用な生物活性分子を付着させることが可能であることが望まれる。
【００１７】
したがって、当該技術分野で必要とされているのは、調節可能な機械的特性を有し、「クリック」型反応またはその他の反応を受け得るＰＰＦへの１つまたは複数の官能基で官能化されており、それにより、３Ｄプリンティング後に表面修飾を受け、有用な生物活性分子を付着させることが可能になる、明確に定められた無毒性の生分解性ＰＰＦポリマーならびにそのようなポリマーの作製方法および使用方法である。
【発明の概要】
【００１８】
１つまたは複数の実施形態では、本発明は、調節可能な機械的特性を有し、「クリック」型反応またはその他の反応を受け得るＰＰＦへの１つまたは複数の官能基で官能化されており、それにより、３Ｄプリンティング後に表面修飾を受け、有用な生物活性分子を付着させることが可能になる、明確に定められた無毒性の生分解性ＰＰＦポリマーならびにそのようなポリマーの作製方法および使用方法を提供する。いくつかの実施形態では、２段階の工程を用いてこれらの官能化ＰＰＦポリマーを形成し、この工程では、第一の段階で官能末端基を有する開始アルコールおよびマグネシウム触媒を用いる無水マレイン酸と酸化プロピレンの開環重合によって末端官能化ポリ（プロピレンマレアート）（ＰＰＭ）ポリマー中間体を形成する。次いで、第二の段階でＰＰＭポリマー中間体を異性化して末端官能化ＰＰＦポリマーを形成する。いくつかの他の実施形態では、本発明は、ＲＯＰによるＰＰＦの合成に使用するコモノマーのうちの１つを官能化して、これらのＰＰＦ材料がいくつかの生物活性小分子と結合することができるようにする官能性部分を付加することによって新規な官能化ＰＰＦポリマーを得るものである。無水マレイン酸のアルケン結合がポリマーの光架橋部位として作用するため、無水マレイン酸コモノマーを官能化するための反応部位を見つけるのが困難であることから、本発明のこれらの実施形態での官能化には酸化プロピレンコモノマーを選択した。
【００１９】
これらの実施形態では、最初に相間移動化学を用いて酸化プロピレン官能化コモノマーを得て精製した後、マグネシウム触媒を用いて無水マレイン酸および開始アルコール（官能化されていてもされていなくてもよい）と重合して新規な官能化ポリ（プロピレンマレアート）ポリマーを形成し、次いでこれを異性化して本発明の新規な官能化ＰＰＦポリマーを形成する。１Ｈ  ＮＭＲ、１３Ｃ  ＮＭＲおよび１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹ分光測定法により本発明の様々な実施形態による官能化コモノマーおよびポリマーの化学構造を特徴付けた。ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ質量分光測定法によりポリマーの末端基忠実度が高いことを示した。本発明の様々な実施形態では、本発明の官能化ＰＰＦポリマーは分子量が約１０００〜２０００Ｄａであり、この値はＰＰＦ足場を作製する３Ｄプリンティングに適したものである。これらの新規な官能化ＰＰＦポリマーは低い分散度も示した。さらに、これらの官能化ＰＰＦポリマーと結合した官能基の数は、従来の光架橋法による３Ｄプリンティングを耐えてＰＰＦ構造体となり、完全な骨組織工学および／またはその他の組織工学の装置に合わせて確実に修正することが可能な官能化ＰＰＦ足場となるのに十分なものであることがわかった。
【００２０】
第一の態様では、本発明は末端官能化またはモノマー官能化ポリ（プロピレンフマラート）ポリマーに関するものである。１つまたは複数の実施形態では、本発明の官能化ポリ（プロピレンフマラート）ポリマーは、無水マレイン酸モノマーの異性化残基と、官能化酸化プロピレンモノマーの残基とを含む。これらの実施形態の１つまたは複数のものでは、本発明の末端官能化またはモノマー官能化ポリ（プロピレンフマラート）ポリマーは、官能化開始アルコールの残基を含む。
【００２１】
１つまたは複数の実施形態では、本発明の末端官能化またはモノマー官能化ポリ（プロピレンフマラート）ポリマーは、式：
【化２】
2020506990.tif 000004
を有する、本発明の第一の態様の上記実施形態のうちのいずれか１つまたは複数のものを含み、式中、ｎは１〜１０００の整数であり；Ｒは、アルキン基、プロパルギル基、アリル基、アルケン基、４−ジベンジオシクロオクチン（ｄｉｂｅｎｚｙｏｃｙｃｌｏｏｃｔｙｎｅ）基、シクロオクチン基、ケトン基、アルデヒド基、第三級ハロゲン基およびその組合せからなる群より選択される官能基である。１つまたは複数の実施形態では、本発明の末端官能化またはモノマー官能化ポリ（プロピレンフマラート）ポリマーは、式：
【化３】
2020506990.tif 000005
を有する、本発明の第一の態様の上記実施形態のうちのいずれか１つまたは複数のものを含み、式中、ｎは１〜１０００の整数である。
【００２２】
１つまたは複数の実施形態では、本発明の末端官能化またはモノマー官能化ポリ（プロピレンフマラート）ポリマーは、本発明の第一の態様の上記実施形態のうちのいずれか１つまたは複数のものを含み、官能化開始アルコールは、プロパルギルアルコール、アリルアルコール、４−ジベンジオシクロオクチノール（ｄｉｂｅｎｚｙｏｃｙｃｌｏｏｃｔｙｎｏｌ）、４−ヒドロキシブタン−２−オン、３−ヒドロキシプロパン−２−オン、５−ヒドロキシペンタン−２−オン、６−ヒドロキシヘキサン−２−オン、７−ヒドロキシヘプタン−２−オン、８−ヒドロキシオクタン−２−オン、５−ノルボルネン−２−オール、α−ブロモイソブチリル４−メタノールベンジルメタノアートまたはその組合せから選択される。
【００２３】
１つまたは複数の実施形態では、本発明の末端官能化またはモノマー官能化ポリ（プロピレンフマラート）ポリマーは、本発明の第一の態様の上記実施形態のうちのいずれか１つまたは複数のものを含み、官能化酸化プロピレンモノマーは、アルキン官能化酸化プロピレン、２−［［（２−ニトロフェニル）メトキシ］メチル］オキシラン（ＮＭＭＯ）、グリシジルプロパルギルエーテル、（±）−エピクロロヒドリンまたはその組合せから選択される。１つまたは複数の実施形態では、本発明の末端官能化またはモノマー官能化ポリ（プロピレンフマラート）ポリマーは、本発明の第一の態様の上記実施形態のうちのいずれか１つまたは複数のものを含み、官能化開始アルコールは、アルキン基、プロパルギル基、アリル基、アルケン基、４−ジベンジオシクロオクチン（ｄｉｂｅｎｚｙｏｃｙｃｌｏｏｃｔｙｎｅ）基、シクロオクチン基、ケトン基、アルデヒド基、第三級ハロゲン基およびその組合せから選択される官能基を含む。
【００２４】
１つまたは複数の実施形態では、本発明の末端官能化またはモノマー官能化ポリ（プロピレンフマラート）ポリマーは、式：
【化４】
2020506990.tif 000006
を有する、本発明の第一の態様の上記実施形態のうちのいずれか１つまたは複数のものを含み、式中、ｎは１〜１００の整数であり；Ｒは、ベンジル基、アルキン基、プロパルギル基、アリル基、アルケン基、４−ジベンジオシクロオクチン（ｄｉｂｅｎｚｙｏｃｙｃｌｏｏｃｔｙｎｅ）基、シクロオクチン基、ケトン基、アルデヒド基、第三級ハロゲン基およびポリ（エチレングリコール）基またはその組合せから選択される官能基であり；Ｒ’は、官能基または官能基を有するアルキル基もしくはアリール基であり、官能基はアルキン基、アルケン基、ヒドロキシル基、保護ヒドロキシル基、チオール基、ハロゲン化物基またはその組合せである。１つまたは複数の実施形態では、本発明の末端官能化またはモノマー官能化ポリ（プロピレンフマラート）ポリマーは、
【化５】
2020506990.tif 000007
から選択される式を有する、本発明の第一の態様の上記実施形態のうちのいずれか１つまたは複数のものを含み、式中、ｎは約１〜約１００の整数である。
【００２５】
１つまたは複数の実施形態では、本発明の末端官能化またはモノマー官能化ポリ（プロピレンフマラート）ポリマーは、約０．７ｋＤａ〜約１００，０００ｋＤａの数平均分子量（Ｍｎ）を有する、本発明の第一の態様の上記実施形態のうちのいずれか１つまたは複数のものを含む。１つまたは複数の実施形態では、本発明の末端官能化またはモノマー官能化ポリ（プロピレンフマラート）ポリマーは、約１．０１〜約１．８の多分散指数（ＤＭ）を有する、本発明の第一の態様の上記実施形態のうちのいずれか１つまたは複数のものを含む。
【００２６】
第二の態様では、本発明は、官能基と直接もしくはエーテル結合を介して結合したグリシジル基または官能基を含むアルキル基もしくはアリール基を含む、モノマー官能化ポリ（プロピレンフマラート）ポリマーを形成するための官能化酸化プロピレンモノマーに関するものであり、官能基は、対応する官能基とのクリック反応に入ることが可能である。これらの実施形態の１つまたは複数のものでは、官能基は、アルキン基、アルケン基、ヒドロキシル基、保護ヒドロキシル基またはその組合せから選択される。
【００２７】
１つまたは複数の実施形態では、本発明の官能化モノマーは、本発明の第二の態様の上記実施形態のうちのいずれか１つまたは複数のものを含み、官能化モノマーはグリシジルプロパルギルエーテルである。１つまたは複数の実施形態では、本発明の官能化モノマーは、式：
【化６】
2020506990.tif 000008
を有する、本発明の第二の態様の上記実施形態のうちのいずれか１つまたは複数のものを含む。
【００２８】
１つまたは複数の実施形態では、本発明の官能化モノマーは、本発明の第二の態様の上記実施形態のうちのいずれか１つまたは複数のものを含み、官能化モノマーは２−［［（２−ニトロフェニル）メトキシ］メチル］オキシラン（ＮＭＭＯ）である。１つまたは複数の実施形態では、本発明の官能化モノマーは、式：
【化７】
2020506990.tif 000009
を有する、本発明の第二の態様の上記実施形態のうちのいずれか１つまたは複数のものを含む。
【００２９】
第三の態様では、本発明は、式：
【化８】
2020506990.tif 000010
を有する、本発明の第一の態様のモノマー官能化ポリ（プロピレンフマラート）ポリマーを形成するための官能化酸化プロピレンモノマーに関するものであり、式中、Ｒは、アルキン基、アルケン基、ヒドロキシル基、保護ヒドロキシル基、チオール基、ハロゲン化物基もしくはその組合せから選択される官能基または官能基を含むアルキル基もしくはアリール基である。これらの実施形態の１つまたは複数のものでは、官能化酸化プロピレンモノマーは式：
【化９】
2020506990.tif 000011
を有する。
【００３０】
第四の態様では、本発明は、式：
【化１０】
2020506990.tif 000012
を有する、本発明の第一の態様のモノマー官能化ポリ（プロピレンフマラート）ポリマーを形成するための官能化酸化プロピレンモノマーに関するものである。
【００３１】
第五の態様では、本発明は、本発明の第一の態様の末端官能化またはモノマー官能化ポリ（プロピレンフマラート）ポリマーを作製する方法であって、官能性末端基をさらに含む開始アルコールを調製することと；開始アルコール、マグネシウム触媒、無水マレイン酸および酸化プロピレンを適切な容器の中で組合せ、適切な溶媒を加えることと；容器を密閉し、次いで加熱して、開始アルコールによって開始される無水マレイン酸と酸化プロピレンとの間の開環重合反応を引き起こし、かつ／または維持し、それにより官能性末端基を含むポリ（プロピレンマレアート）ポリマーを形成することと；官能性末端基を含むポリ（プロピレンマレアート）ポリマーを収集し精製することと；官能性末端基を含むポリ（プロピレンマレアート）ポリマーを官能性末端基を含むポリ（プロピレンフマラート）ポリマーに異性化することとを含む、方法に関するものである。これらの実施形態の１つまたは複数のものでは、組み合わせる開始アルコールとマグネシウム触媒のモル比は約１：１である。
【００３２】
１つまたは複数の実施形態では、本発明の方法は、本発明の第五の態様の上記実施形態のうちのいずれか１つまたは複数のものを含み、組み合わせる開始アルコールのモル数とモノマー（無水マレイン酸と官能化および／または非官能化酸化プロピレン）の総モル数の比は、約１：５〜約１：１０００である。１つまたは複数の実施形態では、本発明の方法は、本発明の第五の態様の上記実施形態のうちのいずれか１つまたは複数のものを含み、溶液中の総モノマー濃度（無水マレイン酸と官能化および／または非官能化酸化プロピレン）は、約０．５Ｍ〜約５．０Ｍである。１つまたは複数の実施形態では、本発明の方法は、本発明の第五の態様の上記実施形態のうちのいずれか１つまたは複数のものを含み、適切な溶媒はトルエンまたはヘキサンである。
【００３３】
１つまたは複数の実施形態では、本発明の方法は、本発明の第五の態様の上記実施形態のうちのいずれか１つまたは複数のものを含み、加熱の段階は、容器を約４０℃〜約１００℃の温度に加熱することを含む。１つまたは複数の実施形態では、本発明の方法は、本発明の第五の態様の上記実施形態のうちのいずれか１つまたは複数のものを含み、適切な溶媒はヘキサンであり、加熱の段階は容器を約４５℃の温度に加熱することを含む。
【００３４】
１つまたは複数の実施形態では、本発明の方法は、本発明の第五の態様の上記実施形態のうちのいずれか１つまたは複数のものを含み、開始アルコールは、ベンジルアルコール、プロパルギルアルコール、アリルアルコール、４−ジベンジオシクロオクチノール（ｄｉｂｅｎｚｙｏｃｙｃｌｏｏｃｔｙｎｏｌ）、４−ヒドロキシブタン−２−オン、３−ヒドロキシプロパン−２−オン、５−ヒドロキシペンタン−２−オン、６−ヒドロキシヘキサン−２−オン、７−ヒドロキシヘプタン−２−オン、８−ヒドロキシオクタン−２−オン、５−ノルボルネン−２−オール、α−ブロモイソブチリル４−メタノールベンジルメタノアートおよびその組合せから選択される。１つまたは複数の実施形態では、本発明の方法は、本発明の第五の態様の上記実施形態のうちのいずれか１つまたは複数のものを含み、開始アルコールの官能性末端基は、アルキン基、プロパルギル基、アリル基、アルケン基、４−ジベンジオシクロオクチン（ｄｉｂｅｎｚｙｏｃｙｃｌｏｏｃｔｙｎｅ）基、シクロオクチン基、ケトン基、アルデヒド基、第三級ハロゲン基、ポリ（エチレングリコール）基およびその組合せを含む。１つまたは複数の実施形態では、本発明の方法は、本発明の第五の態様の上記実施形態のうちのいずれか１つまたは複数のものを含み、マグネシウム触媒はＭｇ（ＢＨＴ）２（ＴＨＦ）２を含む。
【００３５】
第六の態様では、本発明は、本発明の第一の態様の官能化ポリ（プロピレンフマラート）ポリマーを作製する方法であって、官能化酸化プロピレンを調製することと；マグネシウム触媒の存在下で官能化酸化プロピレンを無水マレイン酸および開始アルコールと反応させて官能化ポリ（プロピレンマレアート）ポリマーを形成することと；官能化ポリ（プロピレンマレアート）ポリマーを塩基と反応させることによって異性化して、本発明の第一の態様の官能化ポリ（プロピレンフマラート）ポリマーを形成することとを含む、方法に関するものである。これらの実施形態の１つまたは複数のものでは、官能化酸化プロピレンは、アルキン官能化酸化プロピレン、２−［［（２−ニトロフェニル）メトキシ］メチル］オキシラン（ＮＭＭＯ）、グリシジルプロパルギルエーテル、（±）−エピクロロヒドリンまたはその組合せから選択される。これらの実施形態のいくつかでは、開始アルコールは、ベンジルアルコール、プロパルギルアルコール、アリルアルコール、４−ジベンジオシクロオクチノール（ｄｉｂｅｎｚｙｏｃｙｃｌｏｏｃｔｙｎｏｌ）、４−ヒドロキシブタン−２−オン、３−ヒドロキシプロパン−２−オン、５−ヒドロキシペンタン−２−オン、６−ヒドロキシヘキサン−２−オン、７−ヒドロキシヘプタン−２−オン、８−ヒドロキシオクタン−２−オン、５−ノルボルネン−２−オール、α−ブロモイソブチリル４−メタノールベンジルメタノアートおよびその組合せから選択される官能化開始アルコールである。これらの実施形態の１つまたは複数のものでは、金属触媒はマグネシウム２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルフェノキシド（Ｍｇ（ＢＨＴ）２（ＴＨＦ）２）である。
【００３６】
第七の態様では、本発明は、本発明の第一の態様の官能化モノマーを作製する方法であって、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、水酸化カリウム（ＫＯＨ）およびその組合せからなる群より選択される塩基を含有する水溶液にプロパルギルアルコールを加えることと；（±）−エピクロロヒドリンおよび硫酸水素テトラブチルアンモニウムを適切な有機溶媒に溶解させることと；この溶液およびＨ２Ｏをプロパルギルアルコール溶液に加えることとと；不活性雰囲気下で反応を進行させてグリシジルプロパルギルエーテルを得ることとを含む、方法に関するものである。
【００３７】
これらの実施形態のいくつかでは、プロパルギルアルコールを加える段階は、攪拌しながら約−１０℃〜約３０℃の温度でプロパルギルアルコールを水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）水溶液に滴加することを含み、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）水溶液は約２０重量％〜約５０重量％のＮａＯＨを含み；溶解の段階の有機溶媒はヘキサンを含み；反応を進行させる段階は、Ｎ２ブランケット下、反応温度を周囲温度まで上昇させ、反応を約１時間〜約２４時間継続させることを含む。いくつかの他の実施形態では、この方法は、反応を停止させることと；適切な有機溶媒で粗生成物を抽出することと；カラムクロマトグラフィーまたは蒸留によって粗生成物を精製して精製グリシジルプロパルギルエーテルを得ることとをさらに含む。
【００３８】
第八の態様では、本発明は、官能化モノマーを作製する方法であって、適切な有機溶媒にｏ−ニトロベンジルアルコールを溶解させることと；ｏ−ニトロベンジルアルコール溶液に硫酸水素テトラブチルアンモニウムおよび塩基を含有する水溶液を加え、塩基が、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、水酸化カリウム（ＫＯＨ）およびその組合せからなる群より選択されるものであることと；（±）−エピクロロヒドリンを加えることと；反応を進行させて２−［［（２−ニトロフェニル）メトキシ］メチル］オキシラン（ＮＭＭＯ）を得ることとを含む、方法に関するものである。これらの実施形態の１つまたは複数のものでは、この方法は、適切な有機溶媒で粗生成物を抽出することと；カラムクロマトグラフィーまたは蒸留によって粗生成物を精製して精製２−［［（２−ニトロフェニル）メトキシ］メチル］オキシラン（ＮＭＭＯ）を得ることとをさらに含む。
【００３９】
さらに別の態様では、本発明は、本発明の第一の態様の官能化ポリ（プロピレンフマラート）ポリマーを含む、３Ｄプリントしたポリマー足場に関するものである。これらの実施形態の１つまたは複数のものでは、３Ｄプリントしたポリマー足場は、官能化ポリ（プロピレンフマラート）ポリマーと結合した複数の生物活性材料をさらに含む。
【００４０】
これより、本発明の特徴および利点がより完全に理解されるよう添付の図面とともに本発明の詳細な説明に言及する。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】触媒にＭｇ（ＢＨＴ）２（ＴＨＦ）２を用いたＤＰ１０のベンジルアルコール開始ポリ（プロピレンマレアート）（表２、エントリー１）の１Ｈ  ＮＭＲスペクトル（３００ＭＨｚ，３０３Ｋ，ＤＭＳＯ−ｄ６）である。
【図２】触媒にＭｇ（ＢＨＴ）２（ＴＨＦ）２を用いたＤＰ２５のプロパルギルアルコール開始ポリ（プロピレンマレアート）（表２、エントリー６）の１Ｈ  ＮＭＲスペクトル（３００ＭＨｚ，３０３Ｋ，ＤＭＳＯ−ｄ６）である。
【図３】触媒にＭｇ（ＢＨＴ）２（ＴＨＦ）２を用いたＤＰ２５の４−ヒドロキシブタン−２−オン開始ポリ（プロピレンマレアート）（表２、エントリー１０）の１Ｈ  ＮＭＲスペクトル（３００ＭＨｚ，３０３Ｋ，ＤＭＳＯ−ｄ６）である。
【図４】ヘキサン中で生成したＤＰ２５のプロパルギルアルコール開始ＰＰＭ前駆体（上）（表２、エントリー６）と異性化後に得られたプロパルギルアルコール開始ＰＰＦ（下）の１Ｈ  ＮＭＲスペクトル（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，３０３Ｋ）の比較を示す図である。
【図５Ａ】［ＭＡｎ］０：［ＰＯ］０：［ＢｎＯＨ］０：［触媒］０＝２５：２５：１：１、開始総モノマー濃度＝２Ｍとし、トルエン中、８０℃で実施した無水マレイン酸と酸化プロピレンの共重合の速度論プロット（図５Ａ）である。
【図５Ｂ】［ＭＡｎ］０：［ＰＯ］０：［ＢｎＯＨ］０：［触媒］０＝２５：２５：１：１、開始総モノマー濃度＝２Ｍとし、トルエン中、８０℃で実施した無水マレイン酸と酸化プロピレンの共重合に関してＳＥＣによりポリ（スチレン）標準品に対して求めたモノマー変換率に伴うＭｎ（菱形）およびＤＭ（四角形）の変化を示すグラフ（図５Ｂ）である。
【図６】様々な開始種を用いた様々な重合度のＰＰＦのＭｎ（塗りつぶした図形）およびＤＭ（中空の図形）を示すグラフである。分子質量は、ＴＨＦを溶離液に用いたＳＥＣによりポリ（スチレン）標準品に対して求めたものである。
【図７】ＤＰ１０のベンジルアルコール開始ＰＰＭ（表２、エントリー１）の１３Ｃ  ＮＭＲスペクトル（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，３０３Ｋ）である。
【図８】ＤＰ２５のベンジルアルコール開始ＰＰＭ（表２、エントリー２）のＳＥＣクロマトグラムである。分子質量はポリ（スチレン）標準品に対して求めたものである。
【図９】ＤＰ２５のプロパルギルアルコール開始ＰＰＭ（表２、エントリー６）の１３Ｃ  ＮＭＲスペクトル（１２５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ３，３０３Ｋ）である。
【図１０】ＤＰ２５のプロパルギルアルコール開始ＰＰＭ（表２、エントリー６）のＳＥＣクロマトグラムである。分子質量はポリ（スチレン）標準品に対して求めたものである。
【図１１】ＤＰ２５の４−ヒドロキシブタン−２−オン開始ＰＰＭ（表２、エントリー１０）の１３Ｃ  ＮＭＲスペクトル（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，３０３Ｋ）である。
【図１２】ＤＰ２５の４−ヒドロキシブタン−２−オン開始ＰＰＭ（表２、エントリー１０）のＳＥＣクロマトグラムである。分子質量はポリ（スチレン）標準品に対して求めたものである。
【図１３】ヘキサン中、６０℃で重合したＤＰ２５のベンジルアルコール開始ＰＰＭ（表３、エントリー２）の１Ｈ  ＮＭＲスペクトル（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，３０３Ｋ）である。
【図１４】ヘキサン中、６０℃で重合したＤＰ２５のベンジルアルコール開始ＰＰＭ（表３、エントリー２）の１３Ｃ  ＮＭＲスペクトル（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，３０３Ｋ）である。
【図１５】ヘキサン中、４５℃で重合したＤＰ２５のベンジルアルコール開始ＰＰＭ（表３、エントリー２）のＳＥＣクロマトグラムである。分子質量はポリ（スチレン）標準品に対して求めたものである。
【図１６】アジド官能化ＧＲＧＤＳ（Ｎ３−ＧＲＧＤＳ）ポリペプチド配列のＥＳＩスペクトルである。
【図１７】Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ（登録商標）アッセイによって求めたプロパルギルアルコール官能化ＰＰＦ、プロパルギルアルコール官能化ＰＰＦ上に物理的に吸着させたＮ３−ＧＲＤＧＳおよびＧＲＧＤＳ−ＰＰＦバイオコンジュゲート膜の細胞生存率を示すグラフである。
【図１８】グリシジルプロパルギルエーテル（下）、プロパルギルアルコール（中央）およびエピクロロヒドリン（上）の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルである。
【図１９】２−［［（２−ニトロフェニル）メトキシ］メチル］オキシランの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルである。
【図２０】トランス−ポリ（グリシジルプロパルギルエーテル−ｃｏ−無水マレイン酸）の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルである。
【図２１】トランス−ポリ（グリシジルプロパルギルエーテル−ｃｏ−無水マレイン酸）の定量的１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルである。
【図２２】異性化前（下）および異性化後（上）のポリ（２−［［（２−ニトロフェニル）メトキシ］メチル］オキシラン−ｃｏ−無水マレイン酸）の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルである。
【図２３】トランス−ポリ（２−［［（２−ニトロフェニル）メトキシ］メチル］オキシラン−ｃｏ−無水マレイン酸）の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルである。
【図２４】トランス−ポリ（２−［［（２−ニトロフェニル）メトキシ］メチル］オキシラン−ｃｏ−無水マレイン酸）の１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルである。
【図２５】グリシジルプロパルギルエーテル（ＧＰＥ）と無水マレイン酸（ＭＡ）の共重合に関する短時間の速度論試験のプロットである。
【図２６】グリシジルプロパルギルエーテル（ＧＰＥ）と無水マレイン酸（ＭＡ）の共重合に関する長時間の速度論試験のプロットである。
【図２７】２−［［（２−ニトロフェニル）メトキシ］メチル］オキシラン（ＮＭＭＯ）と無水マレイン酸（ＭＡ）の共重合に関する速度論試験のプロットである。
【図２８】ポリ（ＥＣＨ−ｃｏ−ＭＡ）の１Ｈ  ＮＭＲスペクトル（３００ＭＨｚ，３０３Ｋ，ＣＤＣｌ３）である。
【図２９】ポリ（ＥＣＨ−ｃｏ−ＭＡ）の定量的１３Ｃ  ＮＭＲスペクトル（１２５ＭＨｚ，３０３Ｋ，ＣＤＣｌ３）である。
【図３０】Ｐ（ＥＣＨ−ｃｏ−ＭＡ）の分子量分布のＳＥＣクロマトグラムである。
【図３１】ポリ（ＧＰＥ−ｃｏ−ＭＡ）の１Ｈ  ＮＭＲスペクトル（３００ＭＨｚ，３０３Ｋ，ＣＤＣｌ３）である。
【図３２】ポリ（ＧＰＥ−ｃｏ−ＭＡ）の定量的１３Ｃ  ＮＭＲスペクトル（１２５ＭＨｚ，３０３Ｋ，ＣＤＣｌ３）である。
【図３３】ポリ（ＮＭＭＯ−ｃｏ−ＭＡ）の１Ｈ  ＮＭＲスペクトル（３００ＭＨｚ，３０３Ｋ，ＣＤＣｌ３）である。
【図３４】ポリ（ＮＭＭＯ−ｃｏ−ＭＡ）の１３Ｃ  ＮＭＲスペクトル（１２５ＭＨｚ，３０３Ｋ，ＣＤＣｌ３）である。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
（例示的実施形態の詳細な説明）
上記の通り、ポリ（プロピレンフマラート）（ＰＰＦ）は細胞毒性が低く、生分解性に優れ、機械的特性が調節可能であることから、骨組織工学またはその他の組織工学の足場を作製するのに理想的な合成ポリエステルである。しかし、組織工学の必要条件に基づけば、ＰＰＦは思想的には、細胞と分子的に相互作用して細胞を付着、増殖および分化させるのに役立つものであるべきである。したがって、ＰＰＦを骨組織工学用途に使用する場合、それを官能化して生物活性分子（すなわち、生物活性薬物、ペプチド、タンパク質、糖）と結合させることが極めて重要な段階となる。合成ポリマーを修飾する比較的容易な方法の１つが重合後修飾で官能基を付加することであり、これによりポリマーの化学構造が修飾される。ＰＰＦの化学構造およびその合成経路（すなわち、ＲＯＣＯＰ）に基づけば、官能化には２つの方法が考えられる。１つは官能化開始アルコールを介する末端基の官能化であり、もう１つは、モノマー前駆体を官能化し、次いで、重合時にＰＰＭ／ＰＰＦポリマー上に官能化側鎖を形成する（「モノマー官能化」ＰＰＭ／ＰＰＦ）ことによるものである。
【００４３】
本明細書で使用される「官能化」という用語は、官能基を含むか、これを含むよう修飾されたポリマー、生物活性材料またはその他の物質を指し、さらに広義の「官能化」という用語は、官能基をポリマー、生物活性材料またはその他の物質に付加する工程、方法および／または反応、特に、生物活性材料またはその他の官能性種をＰＰＦポリマーに付加する目的で官能基をＰＰＦポリマー（異性化の前に付加する場合でも）および／または生物活性材料もしくはその他の官能性種に付加することを指す。さらに、本明細書で使用される「官能基」および「官能性部分」という用語は、化学活性種または化学活性種を含む基を指すのに互換的に使用される。本明細書で使用される「官能化ポリ（プロピレンフマラート）ポリマー」は、ポリマーにその他の官能性種の生物活性材料を付加する目的で１つまたは複数の官能基を含む、ポリ（プロピレンフマラート）ポリマーを指す。
【００４４】
したがって、「末端基官能化（された）」（ｅｎｄ−ｇｒｏｕｐ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ、ｅｎｄ  ｇｒｏｕｐ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ）または「末端官能化（された）」という用語は、ポリマー鎖の末端に官能基を有するか、これを有するよう修飾されたポリマーを指すのに互換的に使用され、「末端基官能化」（ｅｎｄ−ｇｒｏｕｐ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ、ｅｎｄ  ｇｒｏｕｐ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）または「末端官能化」という用語は、ポリマー鎖の末端に官能基を付加する工程、方法および／または反応を指すのに互換的に使用される。本明細書で使用される「モノマー官能化」という用語は、重合時に官能化モノマー、特に官能化酸化プロピレンモノマーを介して付加された１つまたは複数の官能基、を有するＰＰＭまたはＰＰＦポリマーを指す。同様に、本明細書で使用される「官能性末端基」という用語は、ポリマー鎖の末端に位置する官能基を指す。「官能化開始アルコール」という用語は、本明細書では、マグネシウム触媒の存在下で無水マレイン酸モノマーと官能化または非官能化ポリプロピレンオキシドモノマーの開環共重合を開始させることが可能なアルコールを指すのに使用される。
【００４５】
本明細書で使用される「生物活性分子（１つまたは複数）」および「生物活性材料（１つまたは複数）」という用語は、細胞機能に影響を及ぼす物質を指すのに互換的に使用される。生物活性分子としては、特に限定されないが、ペプチド、炭水化物、タンパク質、オリゴヌクレオチドおよび小分子薬物が挙げられる。
【００４６】
異性化という用語は、本明細書では、触媒の存在下でシス異性体（ＰＰＭ）をトランス異性体（ＰＰＦ）形態に変換する反応を指すのに使用される。
【００４７】
本発明のＰＰＦポリマー上の官能基と結合させ得る生物活性種またはその他の官能性種は、それがポリマー上の少なくとも１つの官能基と結合することが可能な部分を含むか、これを含むよう官能化されている限り、特に限定されるものではない。本明細書で使用される生物活性分子（１つまたは複数）および生物活性材料（１つまたは複数）という用語は、細胞機能に影響を及ぼす物質を指すのに互換的に使用され、特に限定されないが、ペプチド、炭水化物、タンパク質、オリゴヌクレオチドおよび小分子薬物がこれに含まれ得る。本発明の官能化ＰＰＦポリマーと結合させ得る物質との関連で使用される「官能性種」という用語は、本発明の官能化ＰＰＦポリマーに付加して有用性を増大させ得る、生物活性材料以外の物質を指し、蛍光マーカーおよびその他のマーカー、小分子色素ならびに／あるいはハロゲン化物原子などがこれに含まれ得る。結合させる生物活性種またはその他の官能性種の大きさには制限はないが、一般に約４０，０００Ｄａ未満の比較的小さなものであり、結合することが可能になるように、プリントもしくは形成されるポリマー構造体の内表面に容易に到達すること、および／またはＰＰＦポリマー上の官能基に容易に到達することが不可能な大きさであってはならない。様々な実施形態では、結合させる生物活性種またはその他の官能性種としては、特に限定されないが、短鎖ペプチド、ペプチド、タンパク質、糖、炭水化物、生物活性薬物、オリゴヌクレオチド、小分子薬物、蛍光マーカーもしくはその他のマーカー、小分子色素および／またはハロゲン化物原子が挙げられる。
【００４８】
本発明を実施するのに必要であるというわけではないが、本発明のＰＰＦポリマー上の官能基は、よく知られた「クリック」反応に入って、重合後のポリマーへの生物活性化合物などの所望の材料の付加を促進することが可能な官能基であるのが好ましい。本明細書で使用される「クリック反応」、「クリックケミストリー」、「クリックケミストリー法」および「クリックケミストリー反応」という用語は、当該技術分野では一般に「クリック反応」と呼ばれ、以下の必要条件、すなわち、（ｉ）高収率で、ほぼ定量的な変換であること；（ｉｉ）生物学的に無害な条件（水溶液、周囲温度およびほぼ生理的なｐＨ）であること；（ｉｉｉ）残留副生成物が少ないか、全くないことを満たす、一群の直交性共役反応を指すのに互換的に使用される。これらの反応は通常、実施しやすく、収率が高く、立体特異的であり、範囲が広く、クロマトグラフィーを用いずに除去することができる副生成物のみが生じ、除去が容易な溶媒または無害な溶媒中で実施することができるものである。同様に、「クリック可能な」という用語は、クリック反応を介して結合することが可能な分子または官能基を指す。
【００４９】
上記の通り、「クリック」ケミストリーの概念は現在、強固で、選択的で、効率的かつ高収率な多数の直交反応を表すものとなっている。様々な実施形態では、適切なクリック反応として、特に限定されないが、銅（Ｉ）触媒アジド−アルキン付加環化（ＣｕＡＡＣ）反応（ヒュスゲン付加環化反応としても知られる）、チオール−エンラジカル付加反応、オキシムライゲーション反応、マイケル付加反応、チオール−マイケル付加反応、マンニッヒ型付加反応、「エン型」付加反応、チオール−エンラジカル付加、歪み促進型アジド−アルキン付加環化（ＳＰＡＡＣ）反応、非無痕跡型シュタウディンガーライゲーション、無痕跡型シュタウディンガーライゲーション、ディールス・アルダー反応、ヘテロディールス・アルダー反応、逆電子要請型ディールス・アルダー反応、タンデム型［３＋２］付加環化レトロディールス・アルダー（タンデムｃｒＤ−Ａ）反応、チオール−アルキン反応、チオール−ピリジルジスルフィド反応、チオール−ハロゲンライゲーション、ネイティブケミカルライゲーションおよびチアゾリジンライゲーションが挙げられる。１つまたは複数の実施形態では、適切な「クリック可能な」部分としては、特に限定されないが、アルキン基、アルケン基、アジド基、ケトンまたは歪みシクロオクチン基が挙げられる。１つまたは複数の実施形態では、生物活性種またはその他の官能性種の官能性部分と本発明の官能化ＰＰＦポリマー上の官能基との間のチオール−エン反応、チオール−イン反応、アルキン−アジド間の１，３−双極付加環化またはケトン−アミン間のオキシムライゲーション型の反応によって生物活性種またはその他の官能性種を本発明のＰＰＦポリマー上の官能基と結合させ得る。
【００５０】
末端官能化ＰＰＦポリマー
第一の態様では、本発明は、無毒性であり、反応開始剤を用いて３Ｄプリントするのに適した制約された予測可能な材料特性を有し、プリントまたはその他の方法でポリマー構造体にした後、生物活性基で誘導体化することができる、末端官能化ポリ（プロピレンフマラート）ポリマーに関するものである。上記の通り、いくつかの実施形態では、本発明のＰＰＦポリマーは、官能性種をポリマーに付加する重合後反応に有用な官能性末端基を含み、官能性種は、上に概説した第一の段階でＰＰＭ中間体を形成するのに使用した開始アルコールによってこのＰＰＦポリマーに導入される。「開始アルコール」（ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ａｌｃｏｈｏｌおよびｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ  ａｌｃｏｈｏｌ）という用語は、官能性末端基と直接的または間接的に結合しＭｇ触媒の存在下で無水マレイン酸と酸化プロピレンの開環重合反応を開始させるヒドロキシル基を含む、分子を指すのに互換的に使用される。これらの官能性末端基のうちの一部または全部が、本発明のＰＰＦポリマーを形成する重合反応（段階１）および異性化反応（段階２）の両方に耐え、重合後に１つまたは複数の官能性種、例えば生物活性材料、マーカー、小分子色素、短鎖ペプチド、薬物および／またはハロゲン化物原子などを付加するのに有用なものである。本明細書で使用される「異性化」という用語は広義には、シス異性体（ＰＰＭ）からそのトランス異性体（ＰＰＦ）形態への変換を指し、また化学反応もしくは化学工程（「異性化反応」）との関連においては、シス異性体（ＰＰＭ）をそのトランス異性体（ＰＰＦ）形態に変換する反応もしくは工程を指す。
【００５１】
使用し得る官能性末端基は、重合反応および異性化反応後もその反応性の少なくとも一部が維持される限り、特に限定されるものではない。１つまたは複数の実施形態では、本発明の末端官能化ＰＰＦポリマー上の官能基としては、特に限定されないが、ベンジル基、アルキン基、プロパルギル基、アリル基、アルケン基、４−ジベンジオシクロオクチン（ｄｉｂｅｎｚｙｏｃｙｃｌｏｏｃｔｙｎｅ）基、シクロオクチン基、ケトン基、アルデヒド基、第三級ハロゲン基およびポリ（エチレングリコール）基、ラクトン基、保護ヒドロキシル基またはその組合せが挙げられる。本明細書で使用される「保護ヒドロキシル基」という用語は、所望の反応が起こるまで不必要な反応が起こらないようにするため水素原子を保護基で置換したヒドロキシル基を指し、所望の反応が起こるとき、保護基がプロトンに置換されてヒドロキシル基が再形成される。特に限定されないが、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）基、トリメチルシリルエーテル（ＴＭＳ）基、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルエーテル（ＴＢＤＭＳ）またはフルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）基を含めた当該技術分野で公知の任意の適切な保護基（１つまたは複数）を使用し得る。
【００５２】
１つまたは複数の実施形態では、本発明のＰＰＦポリマーは、２種類以上の異なる末端官能基を有し得る。いくつかの実施形態では、２種類以上の官能基を有する開始アルコールを用いることによって、これを達成し得る。ただし、この方法では、単一の官能化開始アルコールを使用する場合より多分散度に幅のあるポリマー混合物が生じ、ポリマーの特性も制御しにくくなることが多い。したがって、２種類以上の異なる末端官能基を有する本発明のＰＰＦポリマーの生産はそれぞれが異なる所望の末端官能基を有する別個のバッチのポリマーを２つ以上作製し、次いでそれを合わせて均一な混合物とし、２種類以上の異なる末端官能基を有し得る本発明のＰＰＦポリマーを形成することによって達成するのが好ましい。
【００５３】
様々な実施形態では、本発明の末端官能化ＰＰＦポリマーは、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって測定される数平均分子量（Ｍｎ）が約０．７ｋＤａ〜約１００，０００ｋＤａとなり、多分散指数（ＤＭ）が約１．０１〜約１．８となる。いくつかの実施形態では、末端官能化ＰＰＦポリマーは、Ｍｎが１．０ｋＤａ以上、他の実施形態では約５ｋＤａ以上、他の実施形態では約８ｋＤａ以上、他の実施形態では約１０ｋＤａ以上、他の実施形態では約１０００ｋＤａ以上、他の実施形態では約１０，０００ｋＤａ以上となる。いくつかの実施形態では、末端官能化ＰＰＦポリマーは、Ｍｎが９０，０００ｋＤａ以下、他の実施形態では約８０，０００ｋＤａ以下、他の実施形態では約７０，０００ｋＤａ以下、他の実施形態では約６０，０００ｋＤａ以下、他の実施形態では約５０，０００ｋＤａ以下、他の実施形態では約４０，０００ｋＤａ以下となる。
【００５４】
いくつかの実施形態では、末端官能化ＰＰＦポリマーは、多分散指数（ＤＭ）が１．０３以上、他の実施形態では約１．０５以上、他の実施形態では約１．１０以上、他の実施形態では約１．２０以上、他の実施形態では約１．３０以上、他の実施形態では約１．４０以上となる。いくつかの実施形態では、末端官能化ＰＰＦポリマーは、ＤＭが１．７０以下、他の実施形態では約１．６０以下、他の実施形態では約１．５０以下、他の実施形態では約１．４０以下、他の実施形態では約１．３０以下、他の実施形態では約１．２０以下となる。
【００５５】
様々な実施形態では、本発明の末端官能化ポリ（プロピレンフマラート）ポリマーは、式：
【化１１】
2020506990.tif 000013
を有し得るものであり、式中、ｎは１〜１０００の整数であり、Ｒは、重合後に生物活性化合物などの所望の材料をポリマーに付加するのに有用な官能基である。これらの実施形態のいくつかでは、ｎは１００〜１０００、他の実施形態では２００〜１０００、他の実施形態では３００〜１０００、他の実施形態では４００〜１０００、他の実施形態では１〜９００、他の実施形態では１〜８００、他の実施形態では１〜７００、他の実施形態では１〜６００の整数である。様々な実施形態では、Ｒはとしては、特に限定されないが、ベンジル基、アルキン基、プロパルギル基、アリル基、アルケン基、４−ジベンジオシクロオクチン（ｄｉｂｅｎｚｙｏｃｙｃｌｏｏｃｔｙｎｅ）基、シクロオクチン基、ケトン基、アルデヒド基、第三級ハロゲン基およびポリ（エチレングリコール）基ならびにその組合せが挙げられる。これらの実施形態のいくつかでは、Ｒは、上で定義したクリック可能な部分を含み得る。
【００５６】
いくつかの実施形態では、本発明のポリ（プロピレンフマラート）ポリマーは、式：
【化１２】
2020506990.tif 000014
を有し得るものであり、式中、ｎは上に明記した通りのものである。
【００５７】
上記の通り、本発明のＰＰＦの末端官能基は、重合後に生物活性などの官能性種またはその他の有用な材料をポリマーに付加するのに使用され得る。これらの実施形態の１つまたは複数のものでは、本発明のＰＰＦポリマーに結合させる官能性種は、所望の官能性を失わずにクリック型またはその他のタイプの反応によってＰＰＦの末端官能基に結合することができる官能基を本来含むものである。一方、いくつかの他の実施形態では、本発明のＰＰＦポリマーと結合させる官能性種を最初に、使用する末端官能基と好ましくはクリック反応を介して結合することがわかっている部分で官能化しなければならない。選択する具体的なクリック可能な部分およびそれを官能性種と結合させる手段は、当然のことながら、結合させる生物活性材料またはその他の材料および用いる具体的なクリック反応によって決まる。当業者であれば、過度の実験を実施せずに適切なクリック可能な部分と、結合させる生物活性材料またはその他の材料とを結合させることが可能であろう。例えば、ヒュスゲン１，３付加環化反応を用いて、アジド基で官能化したペプチドと足場のアルキン末端官能化ＰＰＦ鎖とをカップリングすることが可能である。例えば、チオレン反応を用いて、チオール基またはシステイン残基で官能化したペプチドと足場のアルケンまたはノルボルネン末端官能化ＰＰＦ鎖とをカップリングすることが可能である。
【００５８】
本発明のＰＰＦポリマーへの末端官能基の付加が、本明細書に開示および記載される分子量でポリマーの所望の機械的特性、熱特性、分解特性および／または毒性特性に大きな影響を及ぼすことはないことがわかっている。
【００５９】
モノマー官能化ＰＰＦポリマー
第二の態様では、本発明は、ポリマーの形成に使用する無水マレイン酸モノマーの異性化残基と官能化酸化プロピレンモノマーの残基とを含む、新規な官能化ＰＰＦポリマーに関するものである。明らかになるように、無水マレイン酸モノマーと官能化酸化プロピレンモノマーの残基が反応してポリマーを形成するとき、無水マレイン酸モノマーと酸化プロピレンがＰＰＭ／ＰＰＦポリマーの主鎖を形成し、官能化酸化プロピレンモノマーの官能基が活性な側鎖を形成する。
【００６０】
本明細書で使用される「残基（１つまたは複数）」という用語は、ポリマーまたは巨大分子に組み込まれたモノマーまたはその他の化学物質単位の一部を広く指すのに使用される。この延長線上で、「無水マレイン酸モノマーの残基」および「官能化酸化プロピレンモノマーの残基」という用語は、ＰＰＭおよびＰＰＦポリマーに組み込まれた無水マレイン酸モノマーおよび官能化酸化プロピレンモノマーの一部をそれぞれ指すのに使用される。「無水マレイン酸モノマーの異性化残基」という用語は、具体的には、官能化ＰＰＦポリマーの形成とともに二重結合がシス立体配置からトランス立体配置に異性化された無水マレイン酸モノマーの残基を指す。「開始アルコールの残基」または「開始アルコール残基」などの用語は、重合を開始させた後もＰＰＭ／ＰＰＦポリマー鎖の末端に結合した状態にある開始アルコールの一部を指す。同様に、「官能化開始アルコールの残基」または「官能化開始アルコール残基」などの用語は、官能化開始アルコールが重合を開始させた後もポリマー鎖の末端に結合した状態にある官能化開始アルコールの官能基およびその他の部分を指す。
【００６１】
様々な実施形態では、官能化酸化プロピレンモノマーの残基上の官能基としては、特に限定されないが、アルキン基、プロパルギル基、アルケン基、ヒドロキシル基、ケトン基、チオール基、ハロゲン化物基、ニトロベンジル基またはハロゲン化物基、ニトロベンジル基もしくはヒドロキシル基などの官能基に容易に変換し得る基が挙げられる。モノマー官能化法を用いると、末端基の官能化のみの場合と比較して、処理に耐える官能基の数が少なくなっても利用可能な官能基の量が増大することがわかっている。また、本発明のＰＰＦポリマーのモノマーが、少なくとも本明細書に開示および記載される分子量でポリマーの所望の機械的特性、熱特性、分解特性および／または毒性特性に大きな影響を及ぼすことはないこともわかっている。
【００６２】
様々な実施形態では、本発明の新規な官能化ＰＰＦポリマーの官能化酸化プロピレンモノマー残基は、クリック反応に合わせた対応する官能基を有するか、これを有するよう官能化された生物活性化合物との「クリック反応」に入ることが可能な官能基を含む。例えば、これらの実施形態の１つまたは複数のものでは、官能化酸化プロピレン上の官能基は、アルキン基、アルケン基、ヒドロキシル基、ケトン基、チオール基またはこのような官能基に容易に変換し得る基であり得る。いくつかの実施形態では、官能化酸化プロピレンは（±）−エピクロロヒドリンであり得る。１つまたは複数の実施形態では、官能化酸化プロピレンはアルキン官能化酸化プロピレンであり得る。いくつかの実施形態では、本発明の新規な官能化ＰＰＦポリマーはグリシジルプロパルギルエーテルの残基を含む。
【００６３】
これらの実施形態のいくつかでは、本発明の新規な官能化ＰＰＦポリマーは、２−［［（２−ニトロフェニル）メトキシ］メチル］オキシラン（ＮＭＭＯ）の残基を含む。これらの実施形態では、ＮＭＭＯ上のニトロベンジル基は、特定のＵＶ波長に曝露すると容易にヒドロキシル基に置換され得るＵＶ感受性保護基であることを理解するべきである。いくつかの他の実施形態では、本発明の新規な官能化ＰＰＦポリマーはハロゲン化物官能化酸化プロピレンの残基を含む。これらの実施形態のいくつかでは、本発明の新規な官能化ＰＰＦポリマーは（±）−エピクロロヒドリンの残基を含む。これらの実施形態では、（±）−エピクロロヒドリン上のハロゲン化物基は、のちに任意の適切な求核剤で置換される保護基であることを理解するべきである。適切な求核剤としては、特に限定されないが、アミン、アルコール、チオールおよびヒドロキシルアミンが挙げられる。
【００６４】
同じく明らかなはずであることとして、様々な実施形態では、本発明の官能化ＰＰＦポリマーは、上記のように開始アルコールを介して付加された末端官能基も含み得る。したがって、１つまたは複数の実施形態では、本発明の官能化ＰＰＦポリマーは、式：
【化１３】
2020506990.tif 000015
を有し得るものであり、式中、ｎは１〜１００の整数であり；Ｒは、アルキン基、プロパルギル基、アリル基、アルケン基、４−ジベンジオシクロオクチン（ｄｉｂｅｎｚｙｏｃｙｃｌｏｏｃｔｙｎｅ）基、シクロオクチン基、ケトン基、アルデヒド基、第三級ハロゲン基およびポリ（エチレングリコール）基、ラクトン基および非官能性開始アルコール残基から選択される基を含む官能基であり；Ｒ’は、対応する官能基とのクリック反応またはその他の反応に入ることが可能であり、とりわけアルキン基、アルケン基、ヒドロキシル基、保護ヒドロキシル基、チオール基、ハロゲン化物基またはヒドロキシル基を含み得る、官能基または官能基を有するアルキル基もしくはアリール基である。上記の通り、「保護ヒドロキシル基」という用語は、所望の反応が起こるまで不必要な反応が起こらないようにするため水素原子を保護基で置換したヒドロキシル基を指し、所望の反応が起こるとき、保護基がプロトンに置換されてヒドロキシル基が再形成される。特に限定されないが、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）基、トリメチルシリルエーテル（ＴＭＳ）基、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルエーテル（ＴＢＤＭＳ）またはフルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）基を含めた当該技術分野で公知の任意の適切な保護基（１つまたは複数）を使用し得る。これらの実施形態のいくつかでは、ｎは約５〜約１００、他の実施形態では１５〜１００、他の実施形態では２５〜１００、他の実施形態では４０〜１００、他の実施形態では１〜８０、他の実施形態では１〜７０、他の実施形態では１〜６０、他の実施形態では１〜４０の整数であり得る。
【００６５】
いくつかの実施形態では、本発明の官能化ＰＰＦポリマーは、式：
【化１４】
2020506990.tif 000016
を有し得るものであり、式中、ｎは約１〜約１００の整数である。これらの実施形態のいくつかでは、ｎは約５〜約１００、他の実施形態では１５〜１００、他の実施形態では２５〜１００、他の実施形態では４０〜１００、他の実施形態では１〜８０、他の実施形態では１〜７０、他の実施形態では１〜６０、他の実施形態では１〜４０の整数であり得る。
【００６６】
いくつかの他の実施形態では、本発明の官能化ポリ（プロピレンフマラート）ポリマーは、式：
【化１５】
2020506990.tif 000017
を有し得るものであり、式中、ｎは約１〜約１００の整数である。これらの実施形態のいくつかでは、ｎは、約５〜約１００、他の実施形態では１５〜１００、他の実施形態では２５〜１００、他の実施形態では４０〜１００、他の実施形態では１〜８０、他の実施形態では１〜７０、他の実施形態では１〜６０、他の実施形態では１〜４０の整数であり得る。
【００６７】
いくつかの他の実施形態では、本発明の官能化ポリ（プロピレンフマラート）ポリマーは、式：
【化１６】
2020506990.tif 000018
を有し得るものであり、式中、ｎは約１〜約１００の整数である。これらの実施形態のいくつかでは、ｎは約５〜約１００、他の実施形態では１５〜１００、他の実施形態では２５〜１００、他の実施形態では４０〜１００、他の実施形態では１〜８０、他の実施形態では１〜７０、他の実施形態では１〜６０、他の実施形態では１〜４０の整数であり得る。
【００６８】
様々な実施形態では、本発明のモノマー官能化ＰＰＦポリマーは、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって測定される数平均分子量（Ｍｎ）が約０．７ｋＤａ〜約１００，０００ｋＤａとなり、多分散指数（ＤＭ）が約１．０１〜約１．８となる。いくつかの実施形態では、モノマー官能化ＰＰＦポリマーは、Ｍｎが１．０ｋＤａ以上、他の実施形態では約５ｋＤａ以上、他の実施形態では約８ｋＤａ以上、他の実施形態では約１０ｋＤａ以上、他の実施形態では約１０００ｋＤａ以上、他の実施形態では約１０，０００ｋＤａ以上となる。いくつかの実施形態では、モノマー官能化ＰＰＦポリマーは、Ｍｎが９０，０００ｋＤａ以下、他の実施形態では約８０，０００ｋＤａ以下、他の実施形態では約７０，０００ｋＤａ以下、他の実施形態では約６０，０００ｋＤａ以下、他の実施形態では約５０，０００ｋＤａ以下、他の実施形態では約４０，０００ｋＤａ以下となる。
【００６９】
いくつかの実施形態では、モノマー官能化ＰＰＦポリマーは、多分散指数（ＤＭ）が１．０３以上、他の実施形態では約１．０５以上、他の実施形態では約１．１０以上、他の実施形態では約１．２０以上、他の実施形態では約１．３０以上、他の実施形態では約１．４０以上となる。いくつかの実施形態では、モノマー官能化ＰＰＦポリマーは、ＤＭが１．７０以下、他の実施形態では約１．６０以下、他の実施形態では約１．５０以下、他の実施形態では約１．４０以下、他の実施形態では約１．３０以下、他の実施形態では約１．２０以下となる。
【００７０】
官能化酸化プロピレンモノマー
第三の態様では、本発明は、上記の新規な官能化ＰＰＦポリマーを形成するのに使用する新規な官能化コモノマーに関するものである。様々な実施形態では、本発明の官能化ポリ（プロピレンフマラート）ポリマーを形成するための官能化モノマーは、エーテル結合を介して対応する官能基とのクリック反応に入ることが可能な官能基を有するアルキル基またはアリール基と結合したグリシジル基を含む。これらの実施形態のいくつかでは、アルキル基またはアリール基は、アルキン基、アルケン基、ヒドロキシル基、保護ヒドロキシル基、チオール基またはハロゲン化物基を含む。いくつかの他の実施形態では、官能基はグリシジル基と直接結合していてよい。
【００７１】
いくつかの実施形態では、本発明の新規な官能化コモノマーは、式：
【化１７】
2020506990.tif 000019
を有し得るものであり、式中、Ｒは、ＰＰＦポリマーに付加する生物活性化合物（すなわち、上記の生物活性薬物、ペプチド、タンパク質、糖など）、官能性種またはその他の化合物上の対応する官能基との「クリック」反応またはその他の反応に入ることが可能な官能基または官能基を含むアルキル基もしくはアリール基である。いくつかの実施形態では、生物活性化合物を変性させることも、あるいは別の方法で、ＰＰＦポリマーに付加する生物活性化合物、官能性種またはその他の化合物をその意図する目的に対して無効にすることもない限り、対応する官能基を付加するため目的の生物活性化合物を官能化し得る。１つまたは複数の実施形態では、Ｒは、アルキン官能基、アルケン官能基、ヒドロキシル官能基、保護ヒドロキシル官能基、チオール官能基またはハロゲン化物官能基を含むアルキル基またはアリール基である。
【００７２】
１つまたは複数の実施形態では、本発明の官能化モノマーはグリシジルプロパルギルエーテルである。いくつかの実施形態では、本発明の官能化モノマーは、式：
【化１８】
2020506990.tif 000020
を有するものであり得る。
【００７３】
１つまたは複数の他の実施形態では、本発明の官能化モノマーは２−［［（２−ニトロフェニル）メトキシ］メチル］オキシラン（ＮＭＭＯ）である。いくつかの実施形態では、本発明の官能化モノマーは、式：
【化１９】
2020506990.tif 000021
を有するものであり得る。
【００７４】
いくつかの他の実施形態では、官能化酸化プロピレンは（±）−エピクロロヒドリンであり得る。いくつかの実施形態では、本発明の官能化モノマーは、式：
【化２０】
2020506990.tif 000022
を有するものであり得る。
【００７５】
結合を有する官能化ＰＰＦポリマー
別の態様では本発明は、上記のようにＰＰＦポリマー上の官能基に結合した１つまたは複数の生物活性種またはその他の官能性種をさらに含む、上記のような官能化ＰＰＦポリマーに関するものである。１つまたは複数の実施形態では、本発明は、下のスキーム３に示す通りに、ならびに／あるいは下の実施例１３および１４に記載する通りに本発明の官能化ＰＰＦポリマーに結合させた短鎖ペプチド、色素またはその他の生物活性化合物もしくは官能性種を含み得る。これらの実施形態のいくつかでは、アジド官能化した色素、生物活性化合物またはその他の官能性種を、ＣｕＳＯ４触媒およびアスコルビン酸ナトリウムと合わせたイソプロピルアルコール／Ｈ２Ｏ混合物などの適切な溶媒に溶解させ、アルキン官能基を有する末端またはモノマー官能化ＰＰＦポリマーと約１時間反応させる。これらの実施形態では、官能化した色素、生物活性化合物またはその他の官能性種を銅アシスト１，３ヒュスゲン付加環化クリック反応によって末端またはモノマー官能化ＰＰＦポリマーに付加する。次いで、色素、生物活性化合物またはその他の官能性種が結合した末端またはモノマー官能化ＰＰＦポリマーをイソプロピルアルコールおよびＨ２Ｏで洗浄して、係留していないあらゆる色素、生物活性化合物またはその他の官能性種および触媒を除去する。
【００７６】
いくつかの他の実施形態では、アジド官能化ペプチドを以下の通りに合成し得る。最初に、ＣＥＭ  Ｌｉｂｅｒｔｙ１ペプチド合成機に標準的なＦｍｏｃ化学条件およびＷａｎｇレジンを用いて、マイクロ波支援固相ペプチド合成（ＳＰＳＳ）により所望のペプチドを合成し得る。次いで、ペプチド（未だＷａｎｇレジン上にある）とブロモヘキサン酸（１ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）およびヒドロキシベンゾトリアゾールとを合わせ、約２時間反応させてＢｒ官能化ペプチドを得、次いで、従来の方法を用いてこれを切断する。次いで、固体のＢｒ官能化ペプチドを精製した後、１０％エタノール水溶液に再び溶解させる。ＮａＮ３および１８−クラウン−６の添加によってアジド官能基の付加を実施し、溶液を約１２時間反応させてアジド官能化ペプチドを得る。
【００７７】
官能化したＰＰＦ足場またはその他のポリマー構造体
また別の態様では、本発明は、上記の官能化ＰＰＦポリマーを含む、３Ｄプリントした足場またはその他の構造体に関するものである。これらの実施形態の１つまたは複数のものでは、本発明の官能化ＰＰＦポリマーを３Ｄプリント可能なレジンにする。これらの実施形態のいくつかでは、３Ｄプリント可能なレジンは、Ｌｕｏ，Ｙ．；Ｄｏｌｄｅｒ，Ｃ．Ｋ．；Ｗａｌｋｅｒ，Ｊ．Ｍ．；Ｍｉｓｈｒａ，Ｒ．；Ｄｅａｎ，Ｄ．；Ｂｅｃｋｅｒ，Ｍ．Ｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２０１６，１７，６９０−６９７に報告されている組成を有するものとなり、上記の開示はその全体が本明細書に組み込まれる。これらの実施形態では、末端またはモノマー官能化ＰＰＦを等質量のフマル酸ジエチル（ＤＥＦ）に溶解させ、光重合開始剤と光散乱剤の混合物をレジン全体に均一に混合する。次いで、レジンを３Ｄプリントし、ｃＤＬＰプリンタまたはその他の適切な３Ｄプリンタで光架橋して、生物活性化合物またはその他の官能性種の付加に利用可能な官能基を有する足場またはその他のポリマー構造体を形成する。
【００７８】
また別の態様では、本発明は、上記の官能化ＰＰＦポリマーと複数の生物活性種またはその他の官能性種とを含み、足場またはその他の構造体の形成後に複数の生物活性種またはその他の官能性種をＰＰＦポリマー上の利用可能な官能基と結合させた、３Ｄプリントした足場またはその他のポリマー構造体に関するものである。
【００７９】
末端官能化ＰＰＦポリマーの作製方法
第二の態様では、本発明は、上記の末端官能化ＰＰＦポリマーを形成する方法にも関するものである。この方法は極めて直接的なものである。最初に、開始アルコール、マグネシウム触媒、好ましくはＭｇ（ＢＨＴ）２（ＴＨＦ）２またはＭｇ（ＯＥｔ）２、無水マレイン酸および酸化プロピレンをアンプルまたはその他の適切な乾燥した密閉容器に入れ、モノマー（無水マレイン酸および酸化プロピレン）の濃度が約０．５Ｍ〜約５Ｍになるようトルエンまたはヘキサンなどの適切な溶媒に溶解させる。明らかなように、望ましくない副反応を回避するため、反応は乾燥した密閉環境下で実施することが重要である。いくつかの実施形態では、いずれの試薬も不活性雰囲気下で、好ましくはＮ２ブランケット下で加える。
【００８０】
上記の通り、本発明のこれらの実施形態の１つまたは複数のものでは、官能化開始アルコールは、無水マレイン酸と酸化プロピレンモノマーの開環重合反応を開始させるヒドロキシル基と、重合後の反応に有用であり、重合反応（段階１）および異性化反応（段階２）の両方に耐える官能性末端基とを含む。適切な官能化開始アルコールとしては、特に限定されないが、プロパルギルアルコール、アリルアルコール、４−ジベンジオシクロオクチノール（ｄｉｂｅｎｚｙｏｃｙｃｌｏｏｃｔｙｎｏｌ）、４−ヒドロキシブタン−２−オン、３−ヒドロキシプロパン−２−オン、５−ヒドロキシペンタン−２−オン、６−ヒドロキシヘキサン−２−オン、７−ヒドロキシヘプタン−２−オン、８−ヒドロキシオクタン−２−オン、５−ノルボルネン−２−オール、ＰＥＧジオール、α−ブロモイソブチリル４−メタノールベンジルメタノアート、ヒドロキシル末端基を有する直鎖状ポリマーまたはその組合せが挙げられる。
【００８１】
無水マレイン酸と酸化プロピレンのＲＯＰ重合のための触媒は有機金属触媒であり得、好ましくはマグネシウム触媒である。適切なマグネシウム触媒としては、Ｍｇ（ＢＨＴ）２（ＴＨＦ）２およびＭｇ（ＯＥｔ）２が挙げられる。１つまたは複数の実施形態では、触媒はＭｇ（ＢＨＴ）２（ＴＨＦ）２である。この反応に適した溶媒は一般に、非極性アルキル炭素鎖であり、特に限定されないが、ペンタン、ヘキサン、混合ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナン、デカン、ドデカン、トルエン、ジオキサンまたはその組合せがこれに含まれ得る。いくつかの実施形態では、溶媒はトルエンである。いくつかの他の実施形態では、溶媒はヘキサンまたは混合ヘキサンである。
【００８２】
上記の通り、溶液中のモノマー（無水マレイン酸および（官能化および／または非官能化）酸化プロピレン）濃度は、約０．５Ｍ〜約５Ｍである。当業者に理解されるように、モノマー濃度が高いほどモノマーの変換速度が速く、必要な溶媒が少なくなる。いくつかの実施形態では、溶液中のモノマー濃度は約０．５Ｍ〜約４Ｍ、他の実施形態では約０．５Ｍ〜約３Ｍ、他の実施形態では約０．５Ｍ〜約２Ｍ、他の実施形態では約１Ｍ〜約５Ｍ、他の実施形態では約１．５Ｍ〜約５Ｍ、他の実施形態では約２Ｍ〜約５Ｍ、他の実施形態では約２．５Ｍ〜約５Ｍである。
【００８３】
これらの実施形態では、開始アルコールとマグネシウム触媒のモル比は約１：１〜約１：１０００であり、開始アルコールとモノマーのモル比は約１：５〜約１：１０００である。いくつかの実施形態では、開始アルコールとマグネシウム触媒のモル比は約１：１〜１：５００、他の実施形態では１：１〜１：３００、他の実施形態では１：１〜１：２００、他の実施形態では１：１〜１：１００、他の実施形態では１：１〜１：７５、他の実施形態では１：１〜約１：５０、他の実施形態では約１：５〜約１：２０、他の実施形態では約１：５〜約１：２５、他の実施形態では約１：１〜約１：１５、他の実施形態では１：１０〜１：１０００、他の実施形態では１：５０〜１：１０００、他の実施形態では１：１００〜１：１０００、他の実施形態では１：２００〜１：１０００である。いくつかの実施形態では、開始アルコールとモノマーのモル比は約１：５〜約１：５００、他の実施形態では約１：５〜約１：３００、他の実施形態では約１：５〜約１：２５０、他の実施形態では約１：５〜約１：１５０、他の実施形態では約１：５〜約１：５０、他の実施形態では約１：５〜約１：１０、他の実施形態では約１：２５〜約１：１０００、他の実施形態では約１：１００〜約１：１０００、他の実施形態では約１：２００〜約１：１０００の範囲内にある。
【００８４】
当業者に明らかなように、無水マレイン酸と酸化プロピレンは、モノマーの浪費を防ぐため、溶液中に約１：１のモル比で存在するべきである。このような反応条件下では、無水マレイン酸も酸化プロピレンも単独重合することはないことを理解するべきである。
【００８５】
次いで、アンプルまたはその他の容器を密閉し、溶液を約１時間〜約９６時間、約４０℃〜約１００℃の温度に加熱して、開始アルコールが開始させマグネシウム触媒を触媒とする無水マレイン酸と酸化プロピレンとの間の開環重合反応を開始および／または維持し末端官能化ＰＰＭポリマー中間体を形成する。いくつかの実施形態では、溶液を約４０℃〜約９０℃、他の実施形態では約４０℃〜約７０℃、他の実施形態では約４０℃〜約５０℃、他の実施形態では約４５℃〜約１００℃、他の実施形態では約６０℃〜約１００℃、他の実施形態では約７０℃〜約１００℃の温度に加熱して末端官能化ＰＰＭポリマー中間体を形成する。
【００８６】
いくつかの実施形態では、溶液を約１時間〜約６時間、他の実施形態では約１時間〜約１２時間、他の実施形態では約１時間〜約２４時間、他の実施形態では約１時間〜約４８時間、他の実施形態では約１時間〜約７２時間、他の実施形態では約１時間〜約９６時間加熱してＰＰＭ中間体を得る（図１〜３を参照されたい）。
【００８７】
いくつかの実施形態では、無水マレイン酸、酸化プロピレン、開始アルコールおよびＭｇ（ＢＨＴ）２（ＴＨＦ）２触媒をすべて窒素ブランケット下でトルエンに溶解させ、次いで約１〜約３０時間、約８０℃の温度に加熱してＰＰＭ中間体を得る。これらの実施形態のいくつかでは、反応時間は約６時間〜約２４時間、他の実施形態では約１２時間〜約２４時間、他の実施形態では約１８時間〜約２４時間、他の実施形態では約２０時間〜約２４時間、他の実施形態では約１時間〜約２４時間、他の実施形態では約１時間〜約２０時間、他の実施形態では約１時間〜約１８時間となる。
【００８８】
いくつかの他の実施形態では無水マレイン酸、酸化プロピレン、開始アルコールおよびＭｇ（ＢＨＴ）２（ＴＨＦ）２触媒をすべて窒素ブランケット下でヘキサンに溶解させ、次いで約１時間〜約１００時間、約４５℃の温度に加熱してＰＰＭ中間体を得る。これらの実施形態のいくつかでは、反応時間は約１２時間〜約９６時間、他の実施形態では約２４時間〜約９６時間、他の実施形態では約３６時間〜約９６時間、他の実施形態では約４８時間〜約９６時間、他の実施形態では約６０時間〜約９６時間、他の実施形態では約７２時間〜約９６時間、他の実施形態では約８４時間〜約９６時間、他の実施形態では約９０時間〜約１００時間、他の実施形態では約１時間〜約９０時間、他の実施形態では約１時間〜約８０時間、他の実施形態では約１時間〜約７０時間となる。この系では温度が低く抑えられるため、必要とされる重合時間が長くなるが、この方法はスケールアップ反応の観点から言えば有利であり得ることがわかっている。ポリマー以外の全試薬のヘキサンへの溶解性は、重合後に単にヘキサン溶液を傾瀉するだけで大部分の不純物がポリマーから除去され、したがって、純粋なＰＰＭポリマー中間体の回収に必要な沈殿操作の回数が少なくなることを意味する。傾瀉した溶液を室温まで冷却すると未反応のＭＡｎが再結晶化し、それを回収してさらに使用することが可能である点で有利である。
【００８９】
ＰＰＭポリマー中間体は、任意の既知の方法を用いて収集し精製し得る。当業者であれば、従来の技術を用いて、過度の実験を実施することなくＰＰＭポリマーを回収し精製することが可能であろう。１つまたは複数の実施形態では、得られたＰＰＭポリマー中間体を不混和性の溶媒、例えば過剰のジエチルエーテル、ヘキサン、ヘキサン類、ヘプタン、オクタンまたはクロロホルムなどへの沈殿を反復して回収し得る。
【００９０】
第二の段階では、目的に合った当該技術分野で公知の任意の方法を用いて、ＰＰＭポリマー中間体をそのトランス異性体形態（ＰＰＦ）に異性化する。１つまたは複数の実施形態では、米国特許出願公開第２０１６／０２３７２１２号（その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている方法を用いてＰＰＭポリマーを異性化し得る。異性化段階でポリマーにほかに何らかの変化が起こるが、最初の反応で本発明の実施形態の末端官能化ＰＰＦポリマーの最も一般的な態様、例えばＭｎ、ＤＭおよびＴｇのおおよその範囲などが決まることが明らかなはずである。
【００９１】
これらの実施形態の１つまたは複数のものでは、次いでＰＰＭポリマー中間体を丸底フラスコなどの適切な容器に入れ、不活性雰囲気下で適切な溶媒、例えばクロロホルム、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジオキサン、ジエチルエーテルまたはその組合せなどに溶解させる。いずれの溶媒を選択しても、過度の困難も労力もなくそれを除去することが可能であるものと考えられ、いくつかの実施形態では、溶媒はクロロホルムである。ＰＰＭポリマー中間体を溶解させた後、触媒、好ましくはジエチルアミンを加える。次いで、容器を冷却器に接続した後、約５℃〜約８０℃の反応温度に加熱する。いくつかの実施形態では、反応温度は約５５℃〜約６５℃であり得る。これらの実施形態では、溶液を約５〜約１００時間加熱する。いくつかの実施形態では、溶液を約２４〜約４８時間加熱する。
【００９２】
ＰＰＦポリマー中に比較的少量のＰＰＭポリマー鎖が残っていても、ポリマーの架橋能に悪影響を及ぼし、ポリマーが３Ｄプリンティングおよびその他の同様の用途に適さないものとなることがわかっている。したがって、実質的にすべてのＰＰＭをＰＰＦに変換するか、除去することが重要である（図４を参照されたい）。いくつかの実施形態では、ＰＰＭからＰＰＦへの変換率は約９６質量パーセント〜約１００質量パーセントである。いくつかの実施形態では、ＰＰＭからＰＰＦへの変換率は約９８質量パーセント〜約１００質量パーセントである。いくつかの実施形態では、ＰＰＭからＰＰＦへの変換率は約９９質量パーセント〜約１００質量パーセントである。いくつかの実施形態では、本発明のＰＰＦポリマーは、紫外可視分光測定（ＵＶ−Ｖｉｓ）スペクトル、フーリエ変換赤外分光測定（ＦＴＩＲ）スペクトル、プロトン核磁気共鳴（１Ｈ  ＮＭＲ）分光測定またはマトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分光測定による測定で残留ＰＰＭポリマー鎖を一切含まない。
【００９３】
異性化反応終了時、目的に適した当該技術分野で公知の任意の方法によって末端官能化ＰＰＦポリマーを単離し精製し得る。１つまたは複数の実施形態では、ヘキサンからの沈殿により末端官能化ＰＰＦポリマーを回収し、ジエチルアミンを完全に除去するためリン酸緩衝液（ｐＨ＝６）で洗浄することによって末端官能化ＰＰＦポリマーを単離し精製した。回転蒸発または目的に合った当該技術分野で公知の他の任意の方法によって溶媒を除去し得る。
【００９４】
実施する本発明の実施形態をさらに明確にして数を絞るため、Ｍｇ（ＢＨＴ）２（ＴＨＦ）２を触媒に用い、アルコール開始剤および目標ＤＰを変えて、無水マレイン酸と酸化プロピレンの等モル混合物の開環共重合を検討した。これらの実験の反応条件および収率を下の表１に示す：
【表１】
2020506990.tif 000023
ａ４−ヒドロキシ−２−ブタノン。
【００９５】
最初に、第一級アルコールの開始剤としてベンジルアルコール（ＢｎＯＨ）を使用し、トルエン中の試薬の総濃度を２Ｍとした。密閉した乾燥Ｎ２雰囲気下、８０℃で反応を実施した（スキーム２）。重合を２４時間継続させた後、過剰のクロロホルムで反応を停止させ、次いで、ジエチルエーテル中の沈殿物からポリマーを回収した。
スキーム２．
様々な開始剤を用いた無水マレイン酸と酸化プロピレンの開環共重合によるポリ（プロピレンマレアート）の形成
【化２１】
2020506990.tif 000024
【００９６】
粗反応混合物の１Ｈ  ＮＭＲ分光分析およびモノマーのプロトン共鳴（δ＝７．０１ｐｐｍ）と対応するポリマーのプロトン共鳴（δ＝６．２６ｐｐｍ）との比較によりＭＡｎのモノマー変換をモニターした。ＰＯのモノマー変換については、ＰＯの蒸気圧および沸点が低いため１Ｈ  ＮＭＲ分光測定を用いた積分が信頼性を欠くことから、特徴付けは実施しなかった。回収物質の１Ｈ  ＮＭＲ分光分析から、ポリマーがポリ（プロピレンマレアート）であり、ベンジルアルコールに対応するプロトン共鳴もみられることが明らかになった（図１）。注目すべきなのは、ＰＯの単独重合で観察されるメチレンプロトンに対応すると思われるプロトン共鳴（δ＝３．３〜３．５ｐｐｍ）が全くみられなかったことである。共重合時にＭＡｎの単独重合は観察されなかったが、ＰＯは環歪みが大きいためＰＯの反応性が増大し、触媒の選択性が低下した結果、単独重合がこれまでに観察されている。ポリマー主鎖に組み込まれるＭＡｎとＰＯの比はほぼ等モルで維持されており、このため、起こったことが観察された副反応（組み込まれるＭＡｎのアルケンでの分岐または架橋など）はほとんどない。
【００９７】
マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ  ＭＳ）を用いて鎖の末端基忠実度を確認した。交互共重合系から予想される通り、完全なポリマー反復単位または半ポリマー反復単位（すなわち、鎖端に余分に組み込まれた１つの無水マレイン酸または酸化プロピレン）に起因する２つの主要な分布が観察された。この２つの主要な分布の末端基はＢｎＯＨによる開始に対応すると算出され、小さな分布は観察されなかった。したがって、触媒にＭｇ（ＢＨＴ）２（ＴＨＦ）２を用いるＭＡｎとＰＯの共重合は、第一級アルコール源から選択的に開始する。これまでの有機触媒を用いる共重合は、アルケン結合での架橋を含めた不必要な副反応および不必要な超分岐コポリマーの形成が生じるものであった。ＰＰＭのＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ質量スペクトルでは、ＰＯ単独重合はなく、別のＰＯ反復単位に隣接したＰＯ付加に起因する連続的な質量の差はみられないことも確認された。ＭＡｎとＰＯの共重合の機序は、二金属亜鉛触媒を用いる無水物とエポキシドのＲＯＣＯＰと同じように起こる可能性が高く、ここでは、無水マレイン酸の配位挿入がアルコール鎖末端によってのみ開始され、エポキシドの配位挿入がカルボン酸鎖末端によってのみ開始され、それにより交互共重合が起こるものと思われる。
【００９８】
同じ条件下、目標とする重合度（ＤＰ）を２５反復単位としてＭＡｎとＰＯのＲＯＣＯＰの擬一次速度論を追跡した。アリコートを８時間にわたって採取し、粗混合物の１Ｈ  ＮＭＲ分光分析によりＭＡｎのモノマー変換率を求めた（図５Ａ）。沈殿後、ＳＥＣにより各アリコートの分子質量分布を求めた（図５Ｂ）。ＭＡｎのモノマー変換率は二次速度論を示し、成長の速度定数（ｋ’ｐ）はｋ’ｐ＝１．３６×１０−５ｓ−１であることが観察された。擬一次速度論の結果として、重合全体を通して活性な鎖の数が維持され、停止副反応が一切起こらないものと考えられる。それぞれについて、モノマー変換率の増大に伴う線形的な分子質量増大および低いＤＭも観察され、ＲＯＣＯＰが制御されたことを示すさらなる証拠が得られた。
【００９９】
共重合動態の制御の程度を定量化するため、様々なＤＰを目標とした。開始剤とコモノマーの比に基づき、１０、２５、５０および１００のＤＰを目標としてＰＰＭを合成した（図６）。１Ｈ  ＮＭＲ分光測定およびＳＥＣを用いて最終的なコポリマーの分子質量を特徴付けた。ベンジルアルコールのメチレンプロトン共鳴（δ＝５．０１ｐｐｍ）と開環酸化プロピレンのメチンプロトン共鳴（δ＝５．２５ｐｐｍ）および開環無水マレイン酸のアルケンプロトン共鳴（δ＝６．２６ｐｐｍ）の比に基づき、得られたコポリマーのＤＰを算出した。目標とするＤＰとともに分子質量が線形的に増大するのが観察され、全体を通じて低いＤＭが観察された。
【０１００】
ベンジル鎖末端は本来、重合後またはプリント後の生物活性種による修飾に理想的な末端基ではない。この目的に向けて、第一級アルコール開始剤にプロパルギルアルコールを用いて、ＭＡｎとＰＯのＲＯＣＯＰを同じ条件下で実施した（スキーム３）。得られたＰＰＭの１Ｈ  ＮＭＲ分光分析では、プロパルギルアルコールのメチレンプロトンおよびアルキンプロトンにそれぞれ対応するδ＝４．７８ｐｐｍおよび２．２７ｐｐｍにプロトン共鳴の存在が明らかになった。ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ  ＭＳではさらに、プロパルギルアルコールからの開始が確認された。２つの分布、すなわち、１つの主要な分布と１つの小さな分布が観察され、ともに分子質量がプロパルギルアルコール鎖末端に対応するものであった。ベンジルアルコール開始で観察されたように、主要な分布は完全な反復単位を有するＰＰＭであり、小さな分布には、鎖末端と推定される部分に酸化プロピレン単位がさらに含まれていた。これ以外に分布は観察されず、このことは、高い鎖末端基忠実度が達成されることを示している。
スキーム３
開始剤にプロパルギルアルコールを用いた無水マレイン酸と酸化プロピレンのＲＯＣＯＰからの色素およびペプチド官能化ポリ（プロピレンフマラート）足場の合成。
【化２２】
2020506990.tif 000025
【０１０１】
同じ条件下で開始種に第一級アルコールの４−ヒドロキシ−２−ブタノン（４ＨＢ）を用いて、ＭＡｎとＰＯのＲＯＣＯＰをさらに検討した。プリント後のアミンまたはヒドロキシルアミンによる官能化を促進するため、４ＨＢを開始剤に選択した。得られたＰＰＭ材料の１Ｈ  ＮＭＲ分光測定により４ＨＢからの開始が確認され、δ＝４．４５ｐｐｍおよび２．１９ｐｐｍでそれぞれ観察されたアシルメチレン基およびメチル基に特徴的なプロトン共鳴がみられた。ここでも、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ  ＭＳを用いてポリマーの鎖末端忠実度を確認した。しかし、必要とされるイオン化エネルギーのため切断副反応が起こり、末端基が切断されて副生成物のアクロレインが遊離した。その結果、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ  ＭＳでは末端基が水開始であるように思われ、これは同じ材料の１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲ分光測定では観察されない。これまでの文献では、重合時の水の存在は重合を開始させるよりもむしろ、触媒に有害であることが示されている。ベンジルアルコールおよびプロパルギルアルコールで開始させる系とは異なり、１つ、２つまたは３つの追加のＰＯ反復単位を有する完全なＰＰＭ反復単位に対応する３つの分布が観察された。しかし、各分布には４ＨＢ鎖末端がみられたことから、ＰＯ組込みの優先度が増大するにもかかわらず、鎖末端忠実度が保存されるものと考えられる。
【０１０２】
末端基が修飾可能なＰＰＦを作製するには、末端基種の切断を引き起こす副反応またはその他の副反応が起こらないようにＰＰＭの異性化を実施しなければならない。既に報告されている方法（開示全体が参照により本明細書に組み込まれるＤｉＣｉｃｃｉｏ，Ａ．Ｍ．；Ｃｏａｔｅｓ，Ｇ．Ｗ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２０１１，１３３，１０７２４−１０７２７を参照されたい）に従い、触媒にジエチルアミン（１アルケン当たり０．１５ｅｑ．）を用いて、ＣＨＣｌ３中０．５Ｍの濃度で２４時間、ベンジルアルコール開始ＰＰＭの異性化を還流下で実施した。ジエチルアミンを完全に除去するため溶液をリン酸ナトリウム緩衝液（３：１ｖ／ｖ）で洗浄した後、回転蒸発により溶媒を除去した。回収したポリマーの１Ｈ  ＮＭＲ分光測定では、シス−アルケンプロトンに起因するプロトン共鳴（δ＝６．２ｐｐｍ）の完全な減少およびトランス−アルケンプロトンに起因する新たなプロトン共鳴（δ＝６．７ｐｐｍ）がみられ、このことは、シス−アルケンを含むＰＰＭがトランス−アルケンを含むＰＰＦに完全に異性化されたことを示している。
【０１０３】
１Ｈ  ＮＭＲスペクトルをさらに分析したところ、各末端基のプロトン共鳴が異性化前のポリマーにマッチする積分値で維持されていることが明らかになり、したがって、末端基が異性化工程による影響を受けないことがわかった。このことは、異性化の前と後のポリマーについてＳＥＣ分析を実施し、同様の分子質量分布がみられたことによりさらに確認された。
【０１０４】
これらの実験で得られたＰＰＦポリマーの特性を下の表２にまとめる：
【表２】
2020506990.tif 000026
ａ１Ｈ  ＮＭＲ分光測定によりモノマー変換率を求めた。ｂ１Ｈ  ＮＭＲ分光測定による末端基分析により求めた。ｃＳＥＣによりＴＨＦ中、ポリスチレン標準品に対して求めた。ｄ４−ヒドロキシ−２−ブタノン。
図１〜３、７〜１２も参照されたい。
【０１０５】
他の有機金属触媒を用いたさらに低い温度でのＰＰＭ作製に対する比較として、開始剤にベンジルアルコールを用い、触媒にＭｇ（ＢＨＴ）２（ＴＨＦ）２を用いて、ヘキサン中の総モノマー濃度２Ｍ、４５℃にてＭＡｎとＰＯのＲＯＣＯＰを実施した。温度を低くした結果、さらに長い重合時間が必要になったため、重合を９６時間継続させた後、反応を停止させた。トルエン中での重合とは異なり、溶液を加熱する前にＭＡｎが溶解するのは観察されなかった。同様に、ポリマーは重合の大部分を通してヘキサン溶液と混和しないことが観察され、このことも１Ｈ  ＮＭＲ分光測定によってモノマー変換をモニターするのを妨げた。しかし、得られたポリマーの１Ｈ  ＮＭＲ分光測定による分析では、最初の開始剤とモノマーのモル比に基づく目標ＤＰでＰＰＭが合成されることが明らかになった（表３）。ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ  ＭＳではさらに、重合過程で末端基忠実度が維持され、水開始およびまたは水によるエステル転移副反応に起因する分布はみられないことが示された。ポリマーのＳＥＣ分析では、分子質量が理論的Ｍｎおよび１Ｈ  ＮＭＲ分光測定に基づくＭｎの両方に対応し、ポリマーの大部分が反応溶液と混和しなくてもＤＭが低い（１．１７）ことが明らかになった。
【０１０６】
【表３】
2020506990.tif 000027
図４、１３〜１５も参照されたい。
【０１０７】
上記の通り、この系では温度が低く抑えられるため、必要とされる重合時間が長くなるが、この方法はスケールアップ反応の観点から言えば有利であり得る。ポリマー以外の全試薬のヘキサンへの溶解性は、重合後に単にヘキサン溶液を傾瀉するだけで大部分の不純物がポリマーから除去され、したがって、純粋なＰＰＭの回収に必要な沈殿操作の回数が少なくなることを意味する。傾瀉した溶液を室温まで冷却すると未反応のＭＡｎが再結晶化し、それを回収してさらに使用することが可能である点で有利である。トルエン中で作製したＰＰＭとヘキサン中で作製したＰＰＭは化学的に同一であるため、ＰＰＦへの異性化を同一条件下で実施し、全シス−アルケンがトランス−アルケンに完全に変換された（図４）。
【０１０８】
上記の通り、３Ｄ足場をプリントするため、末端官能化ＰＰＦを既に報告されている組成でレジンと混合した。開示全体が本明細書に組み込まれるＬｕｏ，Ｙ．；Ｄｏｌｄｅｒ，Ｃ．Ｋ．；Ｗａｌｋｅｒ，Ｊ．Ｍ．；Ｍｉｓｈｒａ，Ｒ．；Ｄｅａｎ，Ｄ．；Ｂｅｃｋｅｒ，Ｍ．Ｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２０１６，１７，６９０−６９７を参照されたい。簡潔に述べれば、末端官能化ＰＰＦを等質量のフマル酸ジエチル（ＤＥＦ）に溶解させ、光重合開始剤と光散乱剤の混合物（４．１重量％）をレジン全体に均一に混合した。ＥｎｖｉｓｉｏｎＴＥＣ  Ｍｉｃｒｏ  ｃＤＬＰプリンタを用いて薄膜をプリントした。プロパルギルアルコール官能化ＰＰＦディスク（φ＝６ｍｍ）をプリントし、表面積を算出した。銅介在アジド−アルキン付加環化（ＣｕＡＡＣ）を用いてＣｈｒｏｍｅｏ（登録商標）５４６−アジド色素をディスクに付着させ、減算濃度法によりプロパルギルアルコール末端基の表面濃度を算出した。つまり、膜を溶液に浸した後、ＵＶ／可視光および蛍光分光法により色素溶液の濃度の減少を測定した。触媒の存在下および触媒の不在下で膜をコートし、元の溶液と比較した。表面への色素の物理的吸着は、ＣｕＡＡＣによる表面付着濃度３０．０（±３．３）ｐｍｏｌ／ｃｍ−２に対し０．１（±０．１）ｐｍｏｌ／ｃｍ−２の濃度であることが明らかになった。これ以外の表面官能化材料、例えばＰＥＧ−ペプチドヒドロゲルおよびペプチド架橋ポリ（エステル尿素）などは、細胞生存能増大に関する実証的研究と同程度の表面濃度を示した。マスクとしての役割を果たす六角格子の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）グリッドで覆った薄膜上へのＭｅｇａｓｔｏｋｅｓ（登録商標）６７３−アジド色素のＣｕＡＡＣによってアジド官能化色素の選択的付着がさらに明らかになった。この覆われた膜を硫酸銅とアスコルビン酸ナトリウムをイソプロピルアルコールと水の混合物に溶かした溶液に１時間浸した。膜を脱イオン水で３回洗浄し、６７３ｎｍフィルタを装着した蛍光顕微鏡下に置いて撮像した。
【０１０９】
末端官能化ポリマーを生物活性ペプチドで誘導体化することができることを確認するため、マウスＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を用いて細胞試験を実施し、表面官能化後にペプチドが生物活性を示すかどうかを評価した。ペプチド配列ＧＲＧＤＳはＲＧＤ配列の類似体であり、生体材料表面への細胞接着を増大させるのに広く用いられてきた。この目的のために固相ペプチド合成法によりアジド官能化ＧＲＧＤＳ（Ｎ３−ＧＲＧＤＳ）を合成し、ＣｕＡＡＣを用いてプロパルギルアルコール末端官能化ＰＰＦディスクに付着させた（図１６を参照されたい）。対照標本としての役割を果たすようＮ３−ＧＲＧＤＳの付加も硫酸銅触媒の添加も実施していないディスクも調製した。直径６ｍｍの円形のディスクをプリントし、副生成物の光重合開始剤を除去するため、クロロホルム、アセトンおよびエタノールで洗浄した。７０％エタノールおよびＵＶ光による滅菌の後、ディスクの細胞毒性を試験した。ＰＰＦディスク上でＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を２５０細胞／ｍｍ２で培養した。３７℃、５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした後、ディスクを、蛍光顕微鏡下で緑色のカルセインＡＭ色素によって生細胞を識別し、赤色のエチジウムホモ二量体色素によって死細胞を識別することができるＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ（登録商標）アッセイに供した。ディスクを３連で定量化し、対照に前培養したスライドガラスを用いた（図１７）。ＧＲＧＤＳペプチドで誘導体化を実施したディスクは、末端官能化ＰＰＦ（ＲＧＤ溶液を添加していない）および物理的に吸着させた末端官能化ＰＰＦ（銅を添加せずにＲＧＤ溶液を添加した）の対照ディスクと同程度の細胞生存率を示した。生存率をスライドガラス対照に対して正規化したところ、いずれの膜も細胞生存率が９０％を上回った。したがって、末端官能化ＰＰＦの細胞毒性は低く、逐次重合で作製したＰＰＦおよびＲＯＣＯＰ触媒にＭｇ（ＯＥｔ）２を用いて作製したＰＰＦの両方に直接匹敵するものである。
【０１１０】
細胞付着を可視化するため、アクチンおよび核の組織化学染色も実施した。ＧＲＧＤＳ官能化ディスクでは、播種後の拡散が増大し、インテグリンによって促進される接着と一致する両方の末端官能化ＰＰＦ対照より広い領域にわたって明確なアクチン線維形成がみられた。これらの最初の細胞試験で収集したデータは、ＧＲＧＤＳペプチドをプロパルギルアルコール開始ＰＰＦディスクに係留しても生物活性および生体利用能が保持され、ほかのペプチドまたは生物活性分子でもさらなる官能化が実現可能であることを示唆している。配位子、濃度および分解に関してさらに進んだ研究が、関連する前臨床モデルで進められている。
【０１１１】
ここまで、ＲＯＣＯＰおよび官能性第一級アルコール開始剤を用いることによって、本発明の末端基が修飾可能なポリ（プロピレンフマラート）（ＰＰＦ）を合成してきた。ＲＯＣＯＰの性質から、重合または異性化の過程でエステル転移副反応または環化によって末端基の官能性が喪失することなく、末端基が修飾可能なＰＰＦを任意の目標分子質量になるよう作製することができる。さらに、小分子色素および短鎖ペプチドの付着を用いて、重合後およびプリント後にＰＰＦ足場の表面を修飾することが可能であることを示した。それに続く細胞アッセイで細胞毒性が低いことが観察されたことにより、このＰＰＦ作製方法がこれまでの方法と比較しても遜色がなく、材料のペプチド官能化によって細胞分化に方向性が与えられる可能性を秘めていることが明らかになった。
【０１１２】
官能化酸化プロピレンモノマーの作製方法
また別の態様では、本発明は、上記の官能化酸化プロピレンコモノマーを形成するための新規な方法に関するものである。概要を述べれば、これらの反応は、相間移動化学を用いて酸化プロピレンコモノマーに官能基を付加するものである。これらの反応では、所望の官能基を含む１つまたは複数のアルコール、例えばプロパルギルアルコールなどを、ＮａＯＨまたはＫＯＨなどの塩基を含有する水溶液に溶解させ、（±）−エピクロロヒドリンなどのハロゲン化酸化プロピレン、硫酸水素テトラブチルアンモニウムなどの相間移動剤および有機溶媒を含有する溶液と反応させる。反応の過程で、官能基を含む分子が水相から有機相に移動し、そこで酸化プロピレンの末端とエーテル結合により結合する。したがって、のちにさらに詳細に記載するように、第一級ハロゲン化物においてエーテル結合を形成することにより、様々なタイプの官能化酸化プロピレンが得られ、金属触媒を用いる開環共重合によって官能化ＰＰＦを合成するのにそれを使用し得る。
【０１１３】
様々な実施形態では、アルコール上の官能基は、ＰＰＦポリマーに付加する生物活性化合物（すなわち、生物活性薬物、ペプチド、タンパク質、糖など）または任意のその他の化合物上の対応する官能基との「クリック」反応またはその他の反応に入ることが可能な官能基を含む、アルキル基またはアリール基であり得る。様々な実施形態では、本発明の官能化酸化プロピレンコモノマーの形成に使用するアルコールとしては、特に限定されないが、プロパルギルアルコール、ｏ−ニトロベンジルアルコール、（±）−エピクロロヒドリンまたはその組合せが挙げられる。
【０１１４】
これらの実施形態の１つまたは複数のものでは、適切な塩基としては、特に限定されないが、ＮａＯＨまたはＫＯＨが挙げられる。これらの実施形態のいくつかでは、ハロゲン化酸化プロピレンは、特に限定されないが、（±）−エピクロロヒドリンであり得る。様々な実施形態では、相間移動剤は、硫酸水素テトラブチルアンモニウム、硫酸水素テトラヘキシルアンモニウム、硫酸水素テトラオクチルアンモニウム、硫酸水素テトラデシルアンモニウムであり得る。これらの実施形態の１つまたは複数のものでは、適切な有機溶媒としては、特に限定されないが、トルエン、ヘキサン、混合ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ジオキサン、ペンタン、ノナン、デカン、ドデカンまたはその組合せが挙げられる。
【０１１５】
１つまたは複数の実施形態では、官能化酸化プロピレンコモノマーを下のスキーム４に従って調製することができ：
スキーム４
【化２３】
2020506990.tif 000028
式中、Ｒは、ＰＰＦポリマーに付加する生物活性化合物（すなわち、生物活性薬物、ペプチド、タンパク質、糖など）、官能性種または任意のその他の化合物上の対応する官能基との「クリック」反応またはその他の反応に入ることが可能な官能基または官能基を含むアルキル基もしくはアリール基である。いくつかの実施形態では、生物活性化合物を変性させることも、あるいは別の方法で、付加する生物活性化合物、官能性種またはその他の化合物をその意図する目的に対して無効にすることもない限り、対応する官能基を付加するため目的の生物活性化合物を官能化し得る。１つまたは複数の実施形態では、Ｒは、アルキン官能基、アルケン官能基、ヒドロキシル官能基、保護ヒドロキシル官能基、チオール官能基もしくはハロゲン化物官能基またはこのような官能基を含むアルキル基もしくはアリール基である。
【０１１６】
様々な実施形態では、本発明の官能化酸化プロピレンコモノマーを形成する方法は、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、水酸化カリウム（ＫＯＨ）およびその組合せからなる群より選択される塩基を含有する水溶液にプロパルギルアルコールを加えることから始まる。これらの実施形態のいくつかでは、約−１０℃〜約３０℃の温度で攪拌しながらプロパルギルアルコールを約２０重量％〜約５０重量％のＮａＯＨを含有する水溶液に滴加する。これらの実施形態のいくつかでは、水溶液は約２０重量％〜約４５重量％、他の実施形態では約２０重量％〜約４０重量％、他の実施形態では約２０重量％〜約３５重量％、他の実施形態では約２０重量％〜約３０重量％、他の実施形態では約３０重量％〜約５０重量％、他の実施形態では約３５重量％〜約５０重量％、他の実施形態では約４０重量％〜約５０重量％のＮａＯＨを含有する。いくつかの実施形態では、水溶液を約−１０℃〜約２０℃、他の実施形態では約−１０℃〜約１５℃、他の実施形態では約−１０℃〜約１０℃、他の実施形態では約−１０℃〜約５℃、他の実施形態では約−１０℃〜約０℃、他の実施形態では約−５℃〜約３０℃、他の実施形態では約０℃〜約３０℃、他の実施形態では約１０℃〜約３０℃の温度で形成する。
【０１１７】
次に、不活性雰囲気下で（±）−エピクロロヒドリンおよび硫酸水素テトラブチルアンモニウムをヘキサンなどの適切な有機溶媒に溶解させ、水とともにプロパルギルアルコール水溶液に加える。温度を周囲温度に戻し、Ｎ２ブランケットなどの不活性雰囲気下で約１時間〜約２４時間反応を進行させてグリシジルプロパルギルエーテルを得る。いくつかの実施形態では、反応を約５〜約２４時間、他の実施形態では約１０時間〜約２４時間、他の実施形態では約１２時間〜約２４時間、他の実施形態では約１時間〜約２０時間、他の実施形態では約１時間〜約１５時間、他の実施形態では約１時間〜約１０時間進行させる。
【０１１８】
次いで、反応を停止させ、得られた粗生成物を当該技術分野で公知の任意の適切な手段によって精製する。いくつかの実施形態では、ブラインで反応を停止させる。これらの実施形態のいくつかでは、粗生成物を適切な有機溶媒で抽出し、カラムクロマトグラフィーまたは蒸留により精製して、精製グリシジルプロパルギルエーテルを得る。これらの実施形態のいくつかでは、抽出段階は、３部のジクロロメタン（ＤＣＭ）で粗生成物を抽出し、合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、Ｎａ２ＳＯ４をろ過除去し、回転蒸発によって粗生成物を濃縮することを必然的に伴う。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、下の実施例１８に記載する通りに官能化酸化プロピレンコモノマーを調製し得る。
【０１２０】
いくつかの他の実施形態では実質的に同じ反応を用いてｏ−ニトロベンジルアルコールから官能化酸化プロピレンコモノマー２−［［（２−ニトロフェニル）メトキシ］メチル］オキシラン（ＮＭＭＯ）を作製し得る。これらの実施形態では、ｏ−ニトロベンジルアルコールを１，４−ジキソアン（ｄｉｘｏａｎｅ）またはＴＨＦなどの適切な溶媒および硫酸水素テトラブチルアンモニウムなどの移動剤および水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）または水酸化カリウム（ＫＯＨ）などの塩基を含有する水溶液に溶解させる。これらの実施形態のいくつかでは、水溶液は約２０重量％〜約５０重量％のＮａＯＨを含有する。これらの実施形態のいくつかでは、水溶液は約２０重量％〜約４５重量％、他の実施形態では約２０重量％〜約４０重量％、他の実施形態では約２０重量％〜約３５重量％、他の実施形態では約２０重量％〜約３０重量％、他の実施形態では約３０重量％〜約５０重量％、他の実施形態では約３５重量％〜約５０重量％、他の実施形態では約４０重量％〜約５０重量％のＮａＯＨを含有する。
【０１２１】
次に、混合物に（±）−エピクロロヒドリンを約−１０℃〜約３０℃の温度で攪拌しながら加える。いくつかの実施形態では、混合物に（±）−エピクロロヒドリンを−１０℃〜約２０℃、他の実施形態では約−１０℃〜約１５℃、他の実施形態では約−１０℃〜約１０℃、他の実施形態では約−１０℃〜約５℃、他の実施形態では約−１０℃〜約０℃、他の実施形態では約−５℃〜約３０℃、他の実施形態では約０℃〜約３０℃、他の実施形態では約１０℃〜約３０℃の温度で滴加する。
【０１２２】
次いで、温度を周囲温度に戻し、Ｎ２ブランケットなどの不活性雰囲気下で反応を約１時間〜約９６時間（または試薬が完全に反応するまで）進行させて、２−［［（２−ニトロフェニル）メトキシ］メチル］オキシラン（ＮＭＭＯ）を得る。いくつかの実施形態では、反応を約１〜約７２時間、他の実施形態では約１時間〜約４８時間、他の実施形態では約１時間〜約２４時間、他の実施形態では約６時間〜約９６時間、他の実施形態では約１２時間〜約９６時間、他の実施形態では約２４時間〜約７２時間進行させる。
【０１２３】
得られた粗生成物を当該技術分野で公知の任意の適切な手段によって精製する。いくつかの実施形態では、ジエチルエーテルまたはＴＨＦなどの有機溶媒の添加によって２−［［（２−ニトロフェニル）メトキシ］メチル］オキシラン（ＮＭＭＯ）を有機相中に２回以上抽出する。毎回、有機相を分離し収集する。次いで、合わせた有機相を過剰のＨ２Ｏ、飽和炭酸水素ナトリウムおよび飽和塩化ナトリウムで２回以上洗浄する。ここでも、洗浄するごとに有機層を分離して収集し、次いで、これを合わせてＭｇＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、回転蒸発により濃縮し、カラムクロマトグラフィーまたは蒸留により精製して、精製２−［［（２−ニトロフェニル）メトキシ］メチル］オキシラン（ＮＭＭＯ）を得る。
【０１２４】
モノマー官能化ＰＰＦポリマーの作製方法
別の態様では、本発明は、上記の官能化ＰＰＦポリマーを作製する新規な方法に関するものである。ＰＰＦを合成するＲＯＰ方法では通常、コモノマーとして無水マレイン酸および酸化プロピレンを使用し、これに有機金属触媒を用いて交互開環共重合（ＲＯＣＯＰ）を実施した後、異性化してＰＰＦを形成する。的確な反応条件下では、有機金属触媒を用いる交互開環共重合（ＲＯＣＯＰ）によるＰＰＦ合成は、高い末端基忠実度、重合時の分子量の正確な制御、線形的な分子量増大および狭い単峰性の分子質量分布を示す。このＲＯＰ反応に上記の官能化酸化プロピレンを用いることにより、官能化された側鎖を有するモノマー官能化ＰＰＦポリマーが得られる。１つまたは複数の実施形態では、これらのモノマー官能化ＰＰＦポリマーを上記のように官能化開始アルコールによって末端官能化してもよい。
【０１２５】
制御重合に必要な特徴は２つあり、１つは停止が起こらないこと、もう１つは連鎖移動が起こらないことである。この２つの特徴によって、制御重合が明確に定められた分子量のポリマーの合成に理想的なものとなる。環状ポリエステルでは通常、制御重合を用いる一般的な方法は、触媒を用いてＲＯＰを開始させることである。しかし、骨組織工学の臨床用足場または任意のその他の生体材料製品のためのＰＰＦを作製するには、材料によるｉｎ  ｖｉｖｏの影響を考慮に入れなければならない。骨組織工学に理想的な材料は、穏やかな工程を用い、無害な方法で処理し、最後に無毒性の足場にプリントして作製される。合成段階では、反応系に加える試薬はいずれも、無毒性であるか、のちの工程によって容易に除去されるものでなければならない。ＰＰＦ合成に現在用いられているＲＯＰ方法に基づけば、最終的なポリマーに毒性をもたらす可能性があるのは触媒および溶媒のみである。溶媒は容易に除去することができるため、特に考慮しなければならないのは触媒のみである。有機金属化合物は、材料から微量のものを除去する完璧な方法がないため、毒性の低いものでなければならない。この必要条件を満たすためには、人体への使用に関して中心の金属および周囲の配位子の両方を考慮することが必要である。
【０１２６】
上記のいずれの必要条件も満たすことがわかっているＲＯＰのための有機金属触媒の例にマグネシウム２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルフェノキシド（Ｍｇ（ＢＨＴ）２（ＴＨＦ）２）がある。中心のマグネシウムイオンは人体に対して細胞毒性を示さない成分であり、配位子の２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルフェノキシド（ブチル化ヒドロキシトルエン、すなわち、ＢＨＴ）は、１９５４年に食品添加物および安定剤として米国食品医薬品局による承認を受けており、一般構造
【化２４】
2020506990.tif 000029
を有する。
【０１２７】
このマグネシウム触媒は無毒性であるばかりでなく、ＲＯＰ工程およびＲＯＣＯＰ工程を十分に制御することができ、空気に対して感受性を示さず、触媒活性に影響を及ぼすことなく様々な開始剤を使用することが可能である。
【０１２８】
様々な実施形態では、本発明の官能化ＰＰＦポリマーを下のスキーム５に示す通りに合成することができ：
スキーム５
【化２５】
2020506990.tif 000030
式中、Ｒは、ＰＰＦポリマーに付加する生物活性化合物（すなわち、生物活性薬物、ペプチド、タンパク質、糖など）または任意のその他の化合物上の対応する官能基との「クリック」反応またはその他の反応に入ることが可能な官能基または官能基を含むアルキル基もしくはアリール基であり；Ｒ’は上記の末端官能基である。様々な実施形態では、Ｒ’は、特に限定されないが、１つまたは複数のベンジル基、アルキン基、プロパルギル基、アリル基、アルケン基、４−ジベンジオシクロオクチン（ｄｉｂｅｎｚｙｏｃｙｃｌｏｏｃｔｙｎｅ）基、シクロオクチン基、ケトン基、アルデヒド基、第三級ハロゲン基またはその組合せであり得る。
【０１２９】
様々な実施形態では、本発明の官能化ＰＰＦポリマーを下のスキーム６に示す通りに合成することができ：
スキーム６
【化２６】
2020506990.tif 000031
式中、Ｒは、ＰＰＦポリマーに付加する生物活性化合物（すなわち、生物活性薬物、ペプチド、タンパク質、糖など）、官能性種またはその他の化合物上の対応する官能基との「クリック」反応またはその他の反応に入ることが可能な官能基または官能基を含むアルキル基もしくはアリール基である。
【０１３０】
本発明の方法の１つまたは複数の実施形態では、最初に上記の官能化酸化プロピレンを調製する。次に、標準的なシュレンクライン技術を用いて、官能化酸化プロピレン、上記の開始アルコール（例えばベンジルアルコール、プロパルギルアルコール、４−ヒドロキシブタン−２−オンまたは５−ノルボネン（ｎｏｒｂｏｎｅｎ）−２−オールなど）、Ｍｇ（ＢＨＴ）２（ＴＨＦ）２などの金属触媒および無水マレイン酸をトルエンまたはヘキサンなどの適切な溶媒に溶解させる。様々な実施形態では、開始アルコールは官能化開始アルコールであっても、そうでなくてもよい。これらの実施形態のいくつかでは、溶液の総モノマー濃度は約１Ｍ〜約６Ｍ、他の実施形態では約１Ｍ〜約５Ｍ、他の実施形態では約１Ｍ〜約４Ｍ、他の実施形態では約１Ｍ〜約３Ｍ、他の実施形態では約２Ｍ〜約６Ｍ、他の実施形態では約３Ｍ〜約６Ｍ、他の実施形態では約４Ｍ〜約６Ｍである。
【０１３１】
様々な実施形態では、官能化酸化プロピレンは、使用する酸化プロピレンモノマー全体（すなわち、官能化酸化プロピレンと酸化プロピレンの合計モル数）のうち約３０モルパーセント〜約５０モルパーセントを占める。いくつかの実施形態では、官能化酸化プロピレンは、使用する酸化プロピレンモノマー全体（すなわち、官能化プロピレンと酸化プロピレンの合計モル数）のうちモノマー全体の約３５モルパーセント〜約５０モルパーセント、他の実施形態では約４０モルパーセント〜約５０モルパーセント、他の実施形態では約４５モルパーセント〜約５０モルパーセント、他の実施形態では約３０モルパーセント〜約４５モルパーセント、他の実施形態では約３０モルパーセント〜約４０モルパーセント、他の実施形態では約３０モルパーセント〜約３５モルパーセントを占める。無水マレイン酸は、使用するモノマー全体（すなわち、官能化酸化プロピレン、酸化プロピレンおよび無水マレイン酸の合計モル数）のうち約５０モルパーセントを占める。
【０１３２】
これらの実施形態の１つまたは複数のものでは、反応容器を密閉し、約１時間〜約４８時間（または実質的に全部のモノマーが消費されるまで）、約４０℃〜約８０℃の温度に加熱して、本発明の官能化ＰＰＦポリマーのシス異性体（官能化ポリ（プロピレンマレアート））中間体を得る。いくつかの実施形態では、反応容器を約４０℃〜約７５℃、他の実施形態では約４０℃〜約７０℃、他の実施形態では約４０℃〜約６５℃、他の実施形態では約４０℃〜約６０℃、他の実施形態では約５０℃〜約８０℃、他の実施形態では約５５℃〜約８０℃、他の実施形態では約６０℃〜約８０℃の温度に加熱する。いくつかの実施形態では、反応容器を約１時間〜約５０時間、他の実施形態では約１時間〜約３６時間、他の実施形態では約１時間〜約３０時間、他の実施形態では約１時間〜約２４時間、他の実施形態では約６時間〜約４８時間、他の実施形態では約１２時間〜約４８時間、他の実施形態では約２４時間〜約４８時間加熱する。ポリ（プロピレンマレアート）中間体は、目的に適切した当該技術分野で公知の任意の方法によって回収し得る。これらの実施形態のいくつかでは、ジエチルエーテルなどの適切な有機溶媒中での沈殿によって官能化ポリ（プロピレンマレアート）中間体を回収する。
【０１３３】
これらの実施形態の１つまたは複数のものでは、次いで、この官能化ポリ（プロピレンマレアート）中間体を異性化して本発明の官能化ＰＰＦポリマーを形成する。これらの実施形態では、次いで、回収した官能化ポリ（プロピレンマレアート）中間体を適切な有機溶媒、好ましくはクロロホルムに溶解させ、ジエチルアミンまたはピリジンなどの有機塩基を加える。次いで、得られた溶液を不活性雰囲気下で約１時間〜約５０時間（または実質的に全部のポリ（プロピレンマレアート）中間体が異性化されるまで）還流温度まで加熱して、本発明の官能化ＰＰＦポリマーを得る。いくつかの実施形態では、溶液を約１時間〜約３６時間、他の実施形態では約１時間〜約３０時間、他の実施形態では約１時間〜約２４時間、他の実施形態では約６時間〜約４８時間、他の実施形態では約１２時間〜約４８時間、他の実施形態では約１８時間〜約４８時間、他の実施形態では約２４時間〜約４８時間、他の実施形態では約３６時間〜約４８時間還流して、本発明の官能化ＰＰＦポリマーを得る。
【０１３４】
官能化ＰＰＦポリマーは、目的に適した当該技術分野で公知の任意の方法によって精製し得る。これらの実施形態のいくつかでは、過剰のリン酸緩衝生理食塩液または適切な酸溶液で繰り返し洗浄し、上記の有機層を合わせ、生じたポリマーを真空下で乾燥させて精製ポリマーにすることによって官能化ＰＰＦポリマーを精製する。
【０１３５】
実施する本発明の実施形態をさらに明確にして数を絞るため、モノマー前駆体を官能化するのに３種類の異なる「クリック反応」可能な官能基を選択し、下の実施例の節に記載する通りに調製した。第一の官能基は、１，３−双極付加環化を可能にするアルキン基とした。第二の官能基は、オキシムライゲーション反応を受けることができるカルボニル基とした。最後の官能基は、ＰＰＦの親水性を調節し、水素結合を形成することができ、さらに官能化する可能性のあるヒドロキシル基とした。
【０１３６】
官能化酸化プロピレンコモノマーの特徴付け
１．グリシジルプロパルギルエーテル（ＧＰＥ）
相間移動試薬（すなわち、硫酸水素テトラブチルアンモニウム）を用い、プロパルギルアルコールをＨ２Ｏからヘキサンに移動させてグリシジルプロパルギルエーテル（ＧＰＥ）を合成した（実施例１８を参照されたい）。精製後、純粋な生成物を１Ｈ  ＮＭＲ分光測定によって特徴付けし、データを出発物質と比較して生成物の化学構造を明らかにした。１Ｈ  ＧＰＥ  ＮＭＲによるＧＰＥの分光測定データと出発物質のデータとの比較から、エポキシ環およびアルキン官能基がインタクトの状態であることがわかる（図１８）。さらに、１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹ  ＮＭＲ分光測定データから、エポキシ構造の５つのプロトン共鳴がカップリングし、複雑なゴーシュカップリングが生じていることがわかる。
【０１３７】
２．２−［［（２−ニトロフェニル）メトキシ］メチル］オキシラン（ＮＭＭＯ）
これらの実験では、ルイス塩基にＮａＯＨを用いて（±）−エピクロロヒドリンとのエーテル結合を形成することにより２−［［（２−ニトロフェニル）メトキシ］メチル］オキシランを合成した。精製後の最終生成物の１Ｈ  ＮＭＲ分光測定データから、ｏ−ニトロベンジル基とエポキシド構造との結合が成功し、開環反応もその他の有害な副反応も起こらなかったことがわかる（図１９）。
【０１３８】
モノマー官能化ＰＰＭポリマー中間体の特徴付け。
１．ポリ（グリシジルプロパルギルエーテル−ｃｏ−無水マレイン酸）（ポリ（ＧＰＥ−ｃｏ−ＭＡ））
グリシジルプロパルギルエーテルと無水マレイン酸の開環共重合によりポリ（グリシジルプロパルギルエーテル−ｃｏ−無水マレイン酸）を合成した。沈殿および異性化の後、１Ｈ  ＮＭＲおよび１３Ｃ  ＮＭＲ分光測定によってトランス−立体配置のポリ（ＧＰＥ−ｃｏ−ＭＡ）を特徴付けし、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ  ＭＳおよびＳＥＣによって分子量分布を特徴付けした。
【０１３９】
ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ  ＭＳデータに基づけば、近似するピーク間の規則的な分子量減少（２１０．１０Ｄａ）はポリマー反復単位の分子量と同じであり、このことは、官能化ＰＰＦが得られたことを示しており、同様に、１Ｈ  ＮＭＲスペクトルには６つの異なるプロトン共鳴がみられ、これらは反復単位中の６つの異なるプロトンに対応している（図２０）。得られたＰＰＦの１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルには、無水マレイン酸コモノマーおよび官能化エポキシドコモノマー由来の炭素共鳴がみられ（図２１）、このことは、交互コポリマーが得られたことを意味する。
【０１４０】
この系がどの程度制御され得るかを試験するため、４つの異なる目標ＤＰ重合をコモノマーと触媒の投入比に基づき試験した。同じ反応条件下での結果は、目標ＤＰが２５前後である場合、重合は高い精度で特定のＤＰを目標とすることが可能であることを示している（表４）。一方、目標ＤＰが２５を超えると、ポリマーの溶解度が低いため、この系は最終的に制御を失い、２５未満の目標ＤＰであれば制御可能である。ＳＥＣの結果は、系が制御を失っても、目標ＤＰ５０のポリマー分散度は従来のエステル転移反応法と比較して依然として良好である。このことは、触媒を用いるＲＯＰが重合を精密に制御する内部特性を有することを示唆している。
【０１４１】
【表４】
2020506990.tif 000032
【０１４２】
２．ポリ（２−［［（２−ニトロフェニル）メトキシ］メチル］オキシラン−ｃｏ−無水マレイン酸）（ポリ（ＮＭＭＯ−ｃｏ−ＭＡ））
ポリ（ＧＰＥ−ｃｏ−ＭＡ）と類似した方法でポリ（２−［［（２−ニトロフェニル）メトキシ］メチル］オキシラン−ｃｏ−無水マレイン酸）の合成を実施した（下の実施例１９を参照されたい）。ＣＨＣｌ３中、ジエチルアミン（１アルケン当たり０．１５ｍｏｌ．ｅｑｕｉｖ．）との還流時のアルケン基の異性化度を求めるため、異性化前および異性化後のポリマーの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを用いた。異性化前および異性化後のＮＭＲスペクトルに観察されるように、異性化後にアルケン基のプロトン共鳴の化学シフトに明らかな変化（δ＝６．２７ｐｐｍからδ＝６．８９ｐｐｍ）がみられ、この変化はシス立体配置からトランス立体配置への変化によるものである（図２２）。この過程はポリ（ＧＰＥ−ｃｏ−ＭＡ）の異性化でも同じようにみられた。
【０１４３】
さらに、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ  ＭＳデータから、プロパルギルアルコールによって開始したポリマーでのみポリ（ＮＭＭＯ−ｃｏ−ＭＡ）の高い末端基忠実度が得られることがわかり、このことは、使用した触媒が望ましくない副反応を起こさずに様々なエポキシドに耐えることが可能であることを意味する。ほぼ２ピーク毎にみられる等しい重量減少（３０７．２１Ｄａ）および明確な１Ｈ  ＮＭＲ、１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルは、官能化された化学構造が存在することを示している（図２３〜２４）。
【０１４４】
ＳＥＣ分析では、ポリ（ＮＭＭＯ−ｃｏ−ＭＡ）の数平均分子量（Ｍｎ）が約２．６ＫＤａであることがわかり、重量平均分子量（Ｍｗ）が２．７ＫＤａであることがわかり、１．０４の分散度（ＤＭ）が得られた。制御重合に理想的な分散度は１であり、ＳＥＣの結果は、ポリ（ＮＭＭＯ−ｃｏ−ＭＡ）の分散度が理想的な分散度に極めて近いことを示しており、このことは、この重合が良好に制御されることを意味する。
【０１４５】
１Ｈ  ＮＭＲ分光測定データによって示されたＮＭＭＯとＭＡの共重合に関する完璧な特性としてほかにも、ＮＭＭＯとＭＡの共重合の変換率が高く（９９％）、ＤＰが目標ＤＰ（すなわち、２５）とほぼ一致するということがある。その理由として、側基のニトロベンジルによってポリマーの反応溶媒（すなわち、トルエン）への溶解度が変化することが考えられ、この変化は重合時の固体沈殿の減少に対応する。他のエポキシドを用いると、モノマーの溶解度または沸点が低いことが重合速度に大きな影響を及ぼし得る。例えば、酸化プロピレンは３４℃で沸騰し、このため、重合の過程で溶液から沸騰してなくなることがある（図２４を参照されたい）。
【０１４６】
重合の速度論試験
共重合過程および共重合時の様々な官能化モノマーの影響をさらに理解するため、擬一次速度論試験を実施した。ここでは、２種類の合成したエポキシドモノマーを試験し、速度論試験では、ＧＰＥとＮＭＭＯの間に共重合速度の差がみられた。
【０１４７】
１．グリシジルプロパルギルエーテルと無水マレイン酸の共重合に関する速度論試験
ＧＰＥとＭＡの共重合では、ＧＰＥとＭＡのモノマー消費速度はほぼ同じであり、このことは、この２つのモノマーが極めて良好に交互共重合することを示している（図２５）が、長時間にわたる重合を考慮に入れると、ＧＰＥの成長速度の方がＭＡ成長速度より速く（図２６）、このことは、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ  ＭＳデータによる末端基の分析によって説明することができる。ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ  ＭＳデータに基づけば、ＧＰＥで終わるポリマー鎖が少量存在し、ここでは、鎖切断副反応によってエーテル結合が除去されている。これらのＧＰＥ末端基が、比較的長時間にわたって変換率が高く消費速度が速いことに関与している（表５を参照されたい）。
【０１４８】
【表５】
2020506990.tif 000033
【０１４９】
２．２−［［（２−ニトロフェニル）メトキシ］メチル］オキシランと無水マレイン酸の共重合に関する速度論試験
【表６】
2020506990.tif 000034
【０１５０】
ＮＭＭＯとＭＡの共重合では、ＮＭＭＯの成長速度がＭＡの消費速度より速い（表６；図２７）。ＧＰＥとＭＡの共重合の成長速度と比較すると、ＮＭＭＯの成長速度はＭＡの成長速度より速くなり、ＮＭＭＯ反復単位の方が多いポリマー鎖が得られ、共重合は厳密には交互共重合とはならない。ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ  ＭＳデータによる末端基の分析によれば、この現象は、ポリマー鎖の大部分が末端基として２つの連続するＮＭＭＯを有することによって説明することもできる（図２４）。
【０１５１】
その他のモノマー合成工程に関する考察
上記の通り、モノマー官能化によるポリ（プロピレンフマラート）の官能化の実現に成功した。カルボニル基は「クリック」型オキシム反応およびその他の効果的な有機反応を受ける可能性があることから、エーテル化反応による小分子結合の詳細な計画に基づきカルボニル官能化エポキシドの合成を試みた。エポキシドの化学的特性を考慮すれば、官能化モノマーの合成が成功するには、エポキシドの開環を防止しなければならず、このため、エポキシドをＧＰＥの合成に使用した活性なルイス塩基と分離する相間移動反応を選択した。しかし、相間移動反応はカルボニルのエポキシドへの付加合成に十分な効果を発揮しないことがわかった。
【０１５２】
上に示した通り、アルキン基およびｏ−ニトロベンジル基によるＰＰＦの官能化を実現し、２種類の新規なコモノマー、グリシジルプロパルギルエーテル（ＧＰＥ）および２−［［（２−ニトロフェニル）メトキシ］メチル］オキシラン（ＮＭＭＯ）がそれぞれ得られた。１Ｈ  ＮＭＲおよび１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹ  ＮＭＲ分光測定データから、ＧＰＥおよびＮＭＭＯの合成がともに成功したがわかる。１Ｈ  ＮＭＲおよび１３Ｃ  ＮＭＲ分光測定の結果は、無水マレイン酸と官能化コモノマーの共重合後に官能化ＰＰＦが得られることを示しており、このことは、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ  ＭＳデータによってさらに裏付けられる。ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ  ＭＳデータから、両種の官能化ＰＰＦの末端基忠実度が高いことも明らかになった。ＳＥＣデータから、２種類の官能化ＰＰＦバリアントは分散度が低いことがわかる。さらに、速度論試験のデータに基づけば、マグネシウム触媒を用いる開環共重合が制御重合であり、重合時に連鎖移動副反応も停止副反応も起こらない。異なる官能化コモノマーによって成長速度が異なることが観察された。官能化ＰＰＦは、ステレオリソグラフィー技術を用いるプリントを実施することが可能であり、その足場には、ＰＰＦの細胞との分子相互作用を増強することができる表面修飾を施すことが可能である。
【０１５３】
官能化ＰＰＦ足場またはその他の構造体を作製する方法
さらに別の態様では、本発明は、上記の官能化ＰＰＦポリマーを含む、上記の官能化ＰＰＦ足場およびその他のポリマー構造体を作製する方法に関するものである。上記の通り、本発明の官能化ＦＦＰポリマーは、３Ｄプリンティングのレジンに使用するのに十分に適したものである。１つまたは複数の実施形態では、官能化ＰＰＦを既に報告されている組成で用いて、レジンを用いた３Ｄ足場またはその他のポリマー構造体が形成された。開示全体が本明細書に組み込まれるＬｕｏ，Ｙ．；Ｄｏｌｄｅｒ，Ｃ．Ｋ．；Ｗａｌｋｅｒ，Ｊ．Ｍ．；Ｍｉｓｈｒａ，Ｒ．；Ｄｅａｎ，Ｄ．；Ｂｅｃｋｅｒ，Ｍ．Ｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２０１６，１７，６９０−６９７を参照されたい。簡潔に述べれば、官能化ＰＰＦを等質量のフマル酸ジエチル（ＤＥＦ）に溶解させ、光重合開始剤と光散乱剤の混合物（４．１重量％）をレジン全体に均一に混合した。次いで、従来のステレオリソグラフィー技術またはｃＤＬＰ法を用いてレジンをプリントし、光架橋して官能化ＰＰＦポリマー構造体を形成する。
【０１５４】
１つまたは複数の実施形態では、電界紡糸、押出または成形などの従来技術を用いて、数平均分子量の大きい（約４０００Ｄａ以上の）本発明によるＰＰＦポリマーを官能化ＰＰＦ足場およびその他のポリマー構造体に形成し、次いで光化学的に架橋する。当業者であれば、過度の実験を実施せずにこれらのポリマーから官能化ＰＰＦ足場およびその他のポリマー構造体を構築することが可能であろう。
【０１５５】
官能化ＰＰＦ足場／構造体に官能性種を結合させる方法
さらに別の態様では、本発明は、上記の官能化ＰＰＦポリマーに生物活性材料またはその他の官能性種を結合させる方法に関するものである。これらの実施形態のいくつかでは、上記のＰＰＦポリマーに付加する官能基は、ポリマーに付加する生物活性材料またはその他の官能性種上の対応する官能基と結合するよう選択する。明らかなように、生物活性材料またはその他の官能性種は、上記のＰＰＦポリマー上の官能基との結合に利用可能な官能基を有するか、これを有するよう官能化されたものでなければならず、そのことが、上記の官能化ＰＰＦポリマーと結合しても、これと結合するよう官能化しても、生物活性材料またはその他の官能性種を結合させるための所望の特性または使用を損なうことも過度に阻害することもないようにしなければならない。
【０１５６】
上記の通り、生物活性材料またはその他の官能性種を結合させるには、それが本発明の官能化ＰＰＦポリマー上の１つまたは複数の官能基と結合することが可能な官能基／部分を含むものでなければならない。１つまたは複数の実施形態では、生物活性材料またはその他の官能性種は、それを結合させるのに望ましい特性または使用を損なうことも過度に阻害することもなく本発明の官能化ＰＰＦポリマー上の１つまたは複数の官能基と結合することが可能な官能基／部分を本来含むものである。明らかなように、本発明の官能化ＰＰＦポリマー上の１つまたは複数の官能基と結合することが可能な官能基／部分は、本発明の官能化ＰＰＦポリマー上の官能基と自由に相互作用するその他の官能性種の生物活性化合物の領域に位置していなければならない。これらの官能化生物活性材料またはその他の官能性種の例としては、特に限定されないが、利用可能なチオール基を有するシステイン残基を有するペプチド、オリゴマーまたはタンパク質；チオール官能基を有するか、これを有するよう官能化されたペプチド、オリゴマーまたはタンパク質；アルケン官能基またはアリール官能基を有するか、これを有するよう官能化されたペプチド、オリゴマーまたはタンパク質；アルキン官能基またはプロパルギル官能基を有するか、これを有するよう官能化されたペプチド、オリゴマーまたはタンパク質；アジド官能基を有するか、これを有するよう官能化されたペプチド、オリゴマーまたはタンパク質（例えば、スキーム３、実施例１４を参照されたい）；ケトン官能基またはアミン官能基を有するか、これを有するよう官能化されたペプチド、オリゴマーまたはタンパク質；ヒドロキシル基または保護ヒドロキシル官能基を有するか、これを有するよう官能化されたペプチド、オリゴマーまたはタンパク質；シクロオクチン官能基または４−ジベンジオシクロオクチン（ｄｉｂｅｎｚｙｏｃｙｃｌｏｏｃｔｙｎｅ）官能基を有するか、これを有するよう官能化されたペプチド、オリゴマーまたはタンパク質；蛍光原子もしくは化合物またはその他のマーカーを含み、アルキン基、アルケン基、ヒドロキシル基、保護ヒドロキシル基、チオール基またはハロゲン化物基を有するか、これを有するよう官能化されたアルキル基またはアリール基；およびアルキン基、アルケン基、ヒドロキシル基、保護ヒドロキシル基、チオール基またはハロゲン化物基を有するか、これを有するよう官能化された短鎖色素（例えば、実施例１３を参照されたい）が挙げられる。
【０１５７】
一方、いくつかの他の実施形態では、結合させる生物活性材料またはその他の官能性種は、本発明の官能化ＰＰＦポリマー上の官能基との結合に利用可能な官能基を全く有さないか、本発明の官能化ＰＰＦポリマー上の官能基との結合に適した官能基を全く有さない。これらの実施形態では、結合させる生物活性材料またはその他の官能性種は、適切な官能基を有するよう官能化するか、別の方法で修飾しなければならない。本明細書で使用される「適切な」官能基または部分とは、結合させる官能化ＰＰＦポリマーまたは生物活性材料／官能性種の他方にある対応する官能基／部分と、好ましくはクリック反応を介して結合することが可能な官能基または部分のことである。明らかなように、結合させる生物活性材料またはその他の官能性種を官能化するための具体的な機序は、結合させる具体的な材料およびそれを結合させる官能化ＰＰＦポリマー上の１つまたは複数の官能基と結合する官能基の範囲によって決まる。１つまたは複数の実施形態では、上のスキーム３に示した通りに、結合させる生物活性材料またはその他の官能性種に官能基を付加し得る。当業者であれば、過度の実験を実施せずに、結合させる生物活性種またはその他の官能性種に適切な官能基／部分を結合させることが可能であろう。
【０１５８】
本発明を実施するのに必要とされるわけではないが、官能化ＰＰＦポリマーおよびそれと結合させる生物活性材料またはその他の官能性種上の官能基は、上記の多数の「クリック反応」のいずれか１つが利用されるよう選択するべきである。上記の通り、既知の「クリック反応」は、モジュール式であり、範囲が広く、立体特異的であり、収率がきわめて高く、副生成物が最小限に抑えられ、それを再結晶または蒸留などのクロマトグラフィー以外の方法によって除去することが可能であり、酸素および水に非感受性であり、入手が容易な出発物質および試薬を使用し、存在しても無害であるか除去が容易である溶媒を使用することがわかっているため、この目的には好ましいものである。
【０１５９】
この目的に特に有用なクリック反応の例には、生物活性種またはその他の官能性種の官能基／部分と本発明の官能化ＰＰＦポリマー上の官能基との間で起こるチオール官能基とアルケン官能基の間のチオレン反応、チオール官能基とアルキン官能基の間のチオリン反応、アルキン官能基とアジド官能基の間の１，３−双極付加環化反応および／またはケトン官能基とアミン官能基の間のオキシムライゲーション反応があるが、ほかにも多数の適切な組合せが可能であり、本発明の範囲内に含まれる。例えば、生物活性材料またはその他の官能性種の官能基／部分がチオール基である場合、本発明の官能化ＰＰＦポリマー上の官能基はアルケン基またはアルキン基であり得る。この例では、生物活性材料またはその他の官能性種をチオール官能基とアルケン官能基の間のチオレン反応またはチオール官能基とアルキン官能基の間のチオイン（ｔｈｉｏｙｎｅ）反応によって結合させ得る。同様に、本発明の官能化ＰＰＦポリマーの官能基がアルキン基である場合、アルキン官能基／部分またはアジド官能基／部分を有するか、これを有するよう官能化された生物活性材料またはその他の官能性種を使用し得る。これらの実施形態では、チオール官能基とアルキン官能基の間のチオイン（ｔｈｉｏｙｎｅ）反応またはアルキン官能基とアジド官能基の間の１，３−双極付加環化反応によって生物活性材料またはその他の官能性種を結合させ得る。
【０１６０】
これらの実施形態のいくつかでは、上記のＰＰＦポリマー上の官能基は、実際には保護基またはその他の中間体であり、生物活性材料またはその他の官能性種を付加する反応が進行できるようにするには、これを除去または修飾しなければならない。例えば、これらの実施形態のいくつかでは、上記のＰＰＦポリマーに付加する官能基は、（±）−エピクロロヒドリン上のハロゲン化物基などのハロゲン化物基または２−［［（２−ニトロフェニル）メトキシ］メチル］オキシラン（ＮＭＭＯ）などのニトロベンジル基である。これらの実施形態では、ＮＭＭＯ上のニトロベンジル基は、特定のＵＶ波長に曝露するとヒドロキシル基で容易に置換され得るＵＶ感受性保護基であり、（±）−エピクロロヒドリン上のハロゲン化物基は、のちに任意の適切な求核剤で置換される保護基である。適切な求核剤としては、特に限定されないが、アミン、アルコール、チオールおよびヒドロキシルアミンが挙げられる。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、本発明のポリ（プロピレンフマラート）ポリマーは、式：
【化２７】
2020506990.tif 000035
を有し得るものであり、式中、ｎは上に明記したものである。これらの実施形態の１つまたは複数のものでは、生物活性化合物またはその他の官能性種、例えばアジド分子で官能化した官能化ペプチド、短鎖ペプチド、タンパク質、短鎖色素、薬物またはマーカーなどを上記の１，３ヒュスゲン付加環化クリック反応によって末端のプロパルギル官能基に付加し得る。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、本発明のポリ（プロピレンフマラート）ポリマーは、式：
【化２８】
2020506990.tif 000036
を有し得るものであり、式中、ｎは上に明記したものである。これらの実施形態では、生物活性化合物またはその他の官能性種、例えばアミン官能基またはヒドロキシルアミン官能基を含むよう官能化したペプチド、短鎖ペプチド、タンパク質、短鎖色素、薬物またはマーカーなどをシッフ塩基結合またはオキシムライゲーションクリック反応によって末端のケトン官能基に付加し得る。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、本発明のポリ（プロピレンフマラート）ポリマーは、式：
【化２９】
2020506990.tif 000037
を有し得るものであり、式中、ｎは上に明記したものである。これらの実施形態の１つまたは複数のものでは、生物活性化合物またはその他の官能性種、例えばチオール官能基を含むよう官能化したペプチド、短鎖ペプチド、タンパク質、短鎖色素、薬物またはマーカーなどをチオレンクリック反応によって末端のノルボルニル官能基に付加し得る。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、本発明の官能化ＰＰＦポリマーは、式：
【化３０】
2020506990.tif 000038
を有し得るものであり、式中、ｎは約１〜約１００の整数である。これらの実施形態では、その他の官能性種の生物活性化合物、例えばペプチド、短鎖ペプチド、タンパク質、短鎖色素、薬物またはマーカーなどをチオリンクリック反応によってプロパルギル官能基に付加し得る。
【０１６５】
いくつかの他の実施形態では、請求項１の官能化ポリ（プロピレンフマラート）ポリマーは、式：
【化３１】
2020506990.tif 000039
を有し、式中、ｎは約１〜約１００の整数である。これらの実施形態では、光化学を用いてＮＭＭＯ官能基を切断して遊離ヒドロキシル基を得、次いで、これを求電子剤または酸ハロゲン化物化合物もしくは活性エステルなどの他の適切な基と反応する求核剤として反応する官能基として使用することができる。
【０１６６】
いくつかの他の実施形態では、請求項１の官能化ポリ（プロピレンフマラート）ポリマーは、式：
【化３２】
2020506990.tif 000040
を有し、式中、ｎは約１〜約１００の整数である。これらの実施形態では、任意の求核剤などの官能性種をＳｎ２置換反応によってクロリル基に付加し得る。様々な実施形態では、適切な求核剤としては、特に限定されないが、アミン、アルコール、チオールおよびヒドロキシルアミンが挙げられる。
【０１６７】
様々な実施形態では、本発明の官能化ＰＰＦは、分散度が低く、空いている末端基を有し、重合は制御重合である。これらの特性は、１Ｈ  ＮＭＲ分光測定、１３Ｃ  ＮＭＲ分光測定、ＳＥＣ、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ質量分析および速度論試験のデータによって示すことができる。官能化ＰＰＦ合成の成功は、コモノマーの官能化によってＰＰＦの化学的特性を変化させる手段が存在することを意味する。さらに、官能化ＰＰＦ足場にＰＰＦと比較して何らかの改善された特性がみられれば、この拡大可能な官能化法によって、様々な用途に合わせてＰＰＦの化学構造を変化させるのに優れた経路が得られることになる。
【実施例】
【０１６８】
以下の実施例は本発明をさらに詳細に説明するために記載するものであるが、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。さらに、実施例の一部には本発明が機能し得る方法に関する結論が含まれるが、本発明者はこれらの結論に束縛されることを意図するのではなく、単に可能な説明としてそれらを記載する。さらに、過去時制を用いて記載されない限り、実施例の提示は、ある実験または方法を実施したかどうかも、実際に結果が得られたかどうかも示すものではない。使用する数値（例えば、量、温度）に関しては正確さを期するよう努力したが、実験上の誤差および偏差がいくらかみられることがある。特に明示されない限り、部とは重量部のことであり、分子量とは重量平均分子量のことであり、温度はセ氏度で表され、圧力は大気圧またはその付近の圧力である。
【０１６９】
略語
ＢＨＴ、２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルフェノキシド；ｃＤＬＰ、連続デジタルライトプロセッシング；ＣｕＡＡＣ、銅アシストアジド−アルキン付加環化；ＤＥＦ、フマル酸ジエチル；ＤＭ、分散度；ＤＰ、重合度；ＤＳＣ、示差走査熱量測定；ＦＤＭ、熱溶解積層法；ＧＰＣ、ゲル浸透クロマトグラフィー；Ｉ、開始剤；ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ  ＭＳ、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析；ＭＡｎ、無水マレイン酸；Ｍｎ、数平均分子質量；Ｍｗ、重量平均分子質量；ＮＭＲ、核磁気共鳴；ＰＣＬ、ポリ（ε−カプロラクトン）；ＰＥＵ、ポリ（エステル尿素）；ＰＯ、酸化プロピレン；ＰＬＬＡ、ポリ（Ｌ−乳酸）；ＰＰＦ、ポリ（プロピレンフマラート）；ＰＰＭ、ポリ（プロピレンマレアート）；ＰＵ、ポリ（ウレタン）；ＲＩ、屈折率；ＲＯＣＯＰ、開環共重合；ＲＯＰ、開環重合；ＳＥＣ、サイズ排除クロマトグラフィー；ＴＥＭ、透過型電子顕微鏡；ＴＨＦ、テトラヒドロフラン；４ＨＢ、４−ヒドロキシブタン−２−オン。
【０１７０】
実施例１〜１７の材料
試薬はいずれも、Ａｃｒｏｓ社（ヘール、ベルギー）から購入した２，６−ジ−ｔｅｒｔ−４−メチルフェノールを除きＭｉｌｌｉｐｏｒｅ−Ｓｉｇｍａ社から購入した。Ｍｇ（ＢＨＴ）２（ＴＨＦ）２は既に報告されている通りに合成した。開示全体が参照により本明細書に組み込まれるＷｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ａ．；Ｈｏｐｋｉｎｓ，Ｓ．Ａ．；Ｗｒｉｇｈｔ，Ｐ．Ｍ．；Ｄｏｖｅ，Ａ．Ｐ．，Ｐｏｌｙｍ．Ｃｈｅｍ．，２０１４，５，２６９１−２６９４を参照されたい。溶媒はいずれもＦｉｓｈｅｒ社から購入し、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社のＰｕｒｅ  Ｓｏｌｖ  ＭＤ−３溶媒精製システムを用いて乾燥させた。ベンジルアルコール、プロパルギルアルコール、４−ヒドロキシブタン−２−オンおよび酸化プロピレンは水素化カルシウムで２４時間乾燥させた後、減圧蒸留した。無水マレイン酸は真空下、Ｐ２Ｏ５で１週間乾燥させた。その他の試薬はいずれも受け取ったままの状態で使用した。
【０１７１】
実施例１〜１７の機器による方法
Ｖａｒｉａｎ  Ｍｅｒｃｕｒｙ  ３００分光計を用いてプロトン（１Ｈ）ＮＭＲスペクトルを記録した。Ｖａｒｉａｎ  ＮＭＲＳ  ５００分光計を用いて炭素（１３Ｃ）ＮＭＲスペクトルを記録した。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルおよび１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルについて、全化学シフトをそれぞれδ＝７．２６およびδ＝７７．１６ｐｐｍでのクロロホルム溶媒の参照ピークに対して百万分率（ｐｐｍ）で記録した。Ｔｏｓｏｈ  ＥｃｏＳＥＣ  ＨＬＣ−８３２０ＧＰＣに屈折率（ＲＩ）検出と直列したＴＳＫｇｅｌ  ＧＭＨＨＲ−Ｍカラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により分子質量を求めた。溶離液のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を１．０ｍＬ／分−１で流し、試料濃度を１０．０ｍｇ／ｍＬ−1としたポリ（スチレン）標準品から求めた検量曲線を用いて分子質量を算出した。３５５ｎｍで照射するＮｄ：ＹＡＧレーザーを備えたＢｒｕｋｅｒ  Ｕｌｔｒａ−Ｆｌｅｘ  ＩＩＩ  ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ／ＴｏＦ質量分析計を用いてＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ質量スペクトルを記録した。同機器は陽イオンモードで操作した。試料はいずれもＴＨＦに最終濃度１０ｍｇ／ｍＬ−１で溶解させた。マトリックスとしての役割を果たすトランス−２−［３−（４−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル）−２−メチル−２−プロペニリデン］マロノニトリル（ＤＣＴＢ）（２０ｍｇ／ｍＬ−１）およびカチオン化剤のトリフルオロ酢酸ナトリウム（ＮａＴＦＡ）（１０ｍｇ／ｍＬ−１）を調製し、１０：１の比で混合した。マトリックスおよび試料溶液をサンドイッチ法によりＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ標的プレート上に塗布した。ＦｌｅｘＡｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを用いてＭＡＬＤＩ−ＴｏＦデータを分析した。Ｅｎｖｉｓｉｏｎｔｅｃ（商標）Ｍｉｃｒｏ  Ｐｌｕｓ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）連続デジタルライトプロセッシング（ｃＤＬＰ）プリンタを用いてＰＰＦ膜をプリントした。ＦＩＴＣフィルタおよびＴＲＩＴＣフィルタを備えたＯｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ８１蛍光顕微鏡で蛍光顕微鏡観察を実施した。
【実施例１】
【０１７２】
末端官能化ポリ（プロピレンマレアート）（ＰＰＭ）の合成
（全般的方法）
標準的なシュレンクライン技術を用いて、アンプルをＭｇ（ＢＨＴ）２（ＴＨＦ）２、開始アルコール、酸化プロピレンおよび無水マレイン酸で満たす。溶液をトルエンに溶解させて総モノマー濃度を２Ｍにする。アンプルを密閉し、８０℃で一定時間にわたって加熱する。得られたポリマーを過剰のジエチルエーテル中で沈殿させて回収する。
【実施例２】
【０１７３】
末端官能化ポリ（プロピレンマレアート）の合成
（ヘキサンを用いる全般的方法）
標準的なシュレンクライン技術を用いて、アンプルをＭｇ（ＢＨＴ）２（ＴＨＦ）２、開始アルコール、酸化プロピレンおよび無水マレイン酸で満たす。溶液をヘキサンに溶解させて総モノマー濃度を２Ｍにした。アンプルを密閉し、４５℃で一定時間にわたって加熱した。次いで、溶液を傾瀉し、ろ液をクロロホルムに溶解させる。得られたポリマーを過剰のジエチルエーテル中で沈殿させて回収する。
【実施例３】
【０１７４】
ベンジルアルコール開始末端官能化ポリ（プロピレンマレアート）の合成
実施例１に記載した方法に、下のスキーム７に示す通りに開始アルコールのベンジルアルコールおよびマグネシウム触媒を使用し、下の表７に示す反応パラメータを用いて末端官能化ポリ（プロピレンマレアート）を合成した。
スキーム７
ベンジルアルコールによって開始しＭｇ（ＢＨＴ）２（ＴＨＦ）２を触媒とする無水マレイン酸と酸化プロピレンの共重合
【化３３】
2020506990.tif 000041
【０１７５】
【表７】
2020506990.tif 000042
【０１７６】
ベンジル末端ポリ（プロピレンマレアート）生成物の存在を１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，３０３Ｋ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝７．３７（ｍ，Ｃ６Ｈ５）、６．５２−６．４４（ｍ，ＯＣ（＝Ｏ）Ｈ＝ＣＨ（＝Ｏ）Ｏ）、５．１６−５．１０（ｍ，ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏおよび（Ｃ６Ｈ５）ＣＨ２Ｏ）、４．２１−４．１４（ｍ，ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）および１．３０−１．１５（ｍ，ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）ｐｐｍ（図１を参照されたい）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，２９８Ｋ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１６４．６０および１６４．３０（ＭＡｎ＊−ＰＯ，ＯＣＯＣＨ２）、１３０．５８および１３０．１４（ＭＡｎ＊−ＰＯ，Ｏ（Ｏ）Ｃ＊ＣＨ＝ＣＨ）、１３０．００および１２９．５１（ＭＡｎ＊−ＰＯ，Ｏ（Ｏ）Ｃ＊ＣＨ＝ＣＨ）、１２８．４０および１２８．１９（芳香族Ｃｓ）、６８．７６（ＭＡｎ＊−ＰＯ，ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２）、６６．９８（ＭＡｎ＊−ＰＯ，ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２）、６５．８０（（Ｃ６Ｈ５）ＣＨ２Ｏ）および１５．７３（ＰＯ，ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）ｐｐｍ；ならびにサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）（ＤＭＦ）：Ｍｎ＝３．７ｋＤａ、Ｍｗ＝４．６ｋＤａ、ＤＭ＝１．３により確認した。収率＝８４％。
【実施例４】
【０１７７】
ヘキサンを用いたベンジルアルコール開始末端官能化ポリ（プロピレンマレアート）の合成
上の実施例２に記載した方法に、下のスキーム８に示す通りに開始アルコールのベンジルアルコール、ヘキサンおよびマグネシウム触媒を使用し、下の表８に示す反応パラメータを用いて末端官能化ポリ（プロピレンマレアート）を合成した。
スキーム８
ベンジルアルコールによって開始しＭｇ（ＢＨＴ）２（ＴＨＦ）２を触媒とする無水マレイン酸と酸化プロピレンの共重合。
【化３４】
2020506990.tif 000043
【０１７８】
【表８】
2020506990.tif 000044
【０１７９】
ベンジル末端ポリ（プロピレンマレアート）生成物の存在を１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，３０３Ｋ，ＣＤＣｌ３）：δ＝７．３５（ｍ，Ｃ６Ｈ５）、６．５０−６．１５（ｍ，ＯＣ（＝Ｏ）Ｈ＝ＣＨ（＝Ｏ）Ｏ）、５．２５−５．１６（ｍ，ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏおよび（Ｃ６Ｈ５）ＣＨ２Ｏ）、４．２４−４．１２（ｍ，ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）および１．３９−１．１１（ｍ，ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）ｐｐｍにより確認した。１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，２９８Ｋ，ＣＤＣｌ３）：δ＝１６４．６０および１６４．３０（ＭＡｎ＊−ＰＯ，ＯＣＯＣＨ２）、１３０．５８および１３０．１４（ＭＡｎ＊−ＰＯ，Ｏ（Ｏ）Ｃ＊ＣＨ＝ＣＨ）、１３０．００および１２９．５１（ＭＡｎ＊−ＰＯ，Ｏ（Ｏ）Ｃ＊ＣＨ＝ＣＨ）、１２８．４０および１２８．１９（芳香族Ｃｓ）、６８．７６（ＭＡｎ＊−ＰＯ，ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２）、６６．９８（ＭＡｎ＊−ＰＯ，ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２）、６５．８０（（Ｃ６Ｈ５）ＣＨ２Ｏ）および１５．７３（ＰＯ，ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）ｐｐｍ。ＳＥＣ（ＤＭＦ）：Ｍｎ＝３．７ｋＤａ、Ｍｗ＝４．６ｋＤａ、ＤＭ＝１．３。（図２７を参照されたい）。
【実施例５】
【０１８０】
プロパルギルアルコール開始末端官能化ポリ（プロピレンマレアート）の合成
実施例１に記載した方法に、下のスキーム９に示す通りに開始アルコールのプロパルギルアルコールおよびマグネシウム触媒を使用し、下の表９に示す反応パラメータを用いて末端官能化ポリ（プロピレンマレアート）を合成した。
スキーム９
プロパルギルアルコールによって開始しＭｇ（ＢＨＴ）２（ＴＨＦ）２を触媒とする無水マレイン酸と酸化プロピレンの共重合。
【化３５】
2020506990.tif 000045
【０１８１】
【表９】
2020506990.tif 000046
【０１８２】
プロパルギル末端ポリ（プロピレンマレアート）生成物の存在を１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，３０３Ｋ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝６．５４−６．２７（ｍ，ＯＣ（＝Ｏ）Ｈ＝ＣＨ（＝Ｏ）Ｏ）、５．３９−５．２１（ｍ，ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）、４．８８（ｓ，ＨＣ≡ＣＣＨ２Ｏ）、４．７８（ｓ，ＨＣ≡ＣＣＨ２Ｏ）、４．３８−４．２１（ｍ，ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）、２．２７（ｓ，ＨＣ≡Ｃ）および１．３８−１．１９（ｍ，ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）ｐｐｍ；１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，２９８Ｋ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１６４．６０および１６４．２９（ＭＡｎ＊−ＰＯ，ＯＣＯＣＨ２）、１３０．５８および１３０．１４（ＭＡｎ＊−ＰＯ，Ｏ（Ｏ）Ｃ＊ＣＨ＝ＣＨ）、１３０．００および１２９．５１（ＭＡｎ＊−ＰＯ，Ｏ（Ｏ）Ｃ＊ＣＨ＝ＣＨ）、８３．５６（ＨＣ≡ＣＣＨ２）、６８．９０（ＨＣ≡ＣＣＨ２）６８．７６（ＭＡｎ＊−ＰＯ，ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２）、６６．９８（ＭＡｎ＊−ＰＯ，ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２）、６５．８３（ＨＣ≡ＣＣＨ２Ｏ）および１５．７２（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）ｐｐｍ；ならびにＳＥＣ（ＤＭＦ）：Ｍｎ＝３．４ｋＤａ、Ｍｗ＝３．５ｋＤａ、ＤＭ＝１．１により確認した。収率＝８３％。
【実施例６】
【０１８３】
ヘキサンを用いたプロパルギルアルコール開始末端官能化ポリ（プロピレンマレアート）の合成
上の実施例２に記載した方法に、下のスキーム１０に示す通りに開始アルコールのベンジルアルコール、ヘキサンおよびマグネシウム触媒を使用し、下の表１０に示す反応パラメータを用いて末端官能化ポリ（プロピレンマレアート）を合成した。
スキーム１０
プロパルギルアルコールによって開始しＭｇ（ＢＨＴ）２（ＴＨＦ）２を触媒とする無水マレイン酸と酸化プロピレンの共重合。
【化３６】
2020506990.tif 000047
【０１８４】
プロパルギル末端ポリ（プロピレンマレアート）の生成物の存在を１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，３０３Ｋ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝６．５４−６．２７（ｍ，ＯＣ（＝Ｏ）Ｈ＝ＣＨ（＝Ｏ）Ｏ）、５．３９−５．２１（ｍ，ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）、４．８８（ｓ，ＨＣ≡ＣＣＨ２Ｏ）、４．７８（ｓ，ＨＣ≡ＣＣＨ２Ｏ）、４．３８−４．２１（ｍ，ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）、２．２７（ｓ，ＨＣ≡Ｃ）および１．３８−１．１９（ｍ，ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）ｐｐｍにより確認した。１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，２９８Ｋ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１６４．６０および１６４．２９（ＭＡｎ＊−ＰＯ，ＯＣＯＣＨ２）、１３０．５８および１３０．１４（ＭＡｎ＊−ＰＯ，Ｏ（Ｏ）Ｃ＊ＣＨ＝ＣＨ）、１３０．００および１２９．５１（ＭＡｎ＊−ＰＯ，Ｏ（Ｏ）Ｃ＊ＣＨ＝ＣＨ）、８３．５６（ＨＣ≡ＣＣＨ２）、６８．９０（ＨＣ≡ＣＣＨ２）６８．７６（ＭＡｎ＊−ＰＯ，ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２）、６６．９８（ＭＡｎ＊−ＰＯ，ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２）、６５．８３（ＨＣ≡ＣＣＨ２Ｏ）および１５．７２（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）ｐｐｍ。ＳＥＣ（ＤＭＦ）：Ｍｎ＝７５０Ｄａ、Ｍｗ＝１１７０Ｄａ、ＤＭ＝１．５５。（図１を参照されたい）。
【実施例７】
【０１８５】
４−ヒドロキシブタン−２−オン開始末端官能化ポリ（プロピレンマレアート）の合成
実施例１に記載した方法に、下のスキーム１１に示す通りに開始アルコールの４−ヒドロキシブタン−２−オンおよびマグネシウム触媒を使用し、下の表１０に示す反応パラメータを用いて末端官能化ポリ（プロピレンマレアート）を合成した。
スキーム１１
４−ヒドロキシブタン−２−オンによって開始しＭｇ（ＢＨＴ）２（ＴＨＦ）２を触媒とする無水マレイン酸と酸化プロピレンの共重合
【化３７】
2020506990.tif 000048
【０１８６】
【表１０】
2020506990.tif 000049
【０１８７】
４−ヒドロキシブタン−２−オン末端ポリ（プロピレンマレアート）生成物の存在を１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，３０３Ｋ，ＣＤＣｌ３）：δ＝６．４２−６．２８（ｍ，ＯＣ（＝Ｏ）Ｈ＝ＣＨ（＝Ｏ）Ｏ）、５．３３−５．２５（ｍ，ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）、４．３２−４．１８（ｍ，ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）、４．０８（ｍ，ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）、３．６４および３．５３（ｍ，ＣＨ３Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２），および１．３８−１．１３（ｍ，ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＯおよびＣＨ３Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２）ｐｐｍ（図３を参照されたい）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，３０３Ｋ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１６５．４２（ＣＨ３Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２）、１６４．６０および１６４．３０（ＭＡｎ＊−ＰＯ，ＯＣＯＣＨ２）、１３０．５５および１３０．１６（ＭＡｎ＊−ＰＯ，Ｏ（Ｏ）Ｃ＊ＣＨ＝ＣＨ）、１２９．８１および１２９．８４（ＭＡｎ＊−ＰＯ，Ｏ（Ｏ）Ｃ＊ＣＨ＝ＣＨ）、１２８．１５、６８．７７（ＭＡｎ＊−ＰＯ，ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２）、６６．９７（ＭＡｎ＊−ＰＯ，ＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２）、６５．８１（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）、３０．６３（Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２）、２５．０８（ＣＨ３Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２）および１５．７４（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）ｐｐｍ；ならびにＳＥＣ（ＴＨＦ）：Ｍｎ＝１．５ｋＤａ、Ｍｗ＝２．０ｋＤａ、ＤＭ＝１．３により確認した。収率＝８８％。
【実施例８】
【０１８８】
ＰＰＭ異性化の全般的方法
末端官能化ポリ（プロピレンフマラート）をクロロホルムに溶解させた。この溶液にジエチルアミンを加え、窒素雰囲気下で２４時間還流した。室温まで冷却した後、有機溶液をリン酸緩衝液（ｐＨ＝６）で洗浄し、ヘキサンからの沈殿によりポリマーを回収した。
【実施例９】
【０１８９】
ＰＰＭの異性化
末端官能化ポリ（プロピレンマレアート）（１１ｇ、８ｍｏｌ．ｅｑ．オレフィン）をクロロホルム（１１２５ｍｌ）に溶解させた。この溶液にジエチルアミン（１０．０１ｍｌ、０．１５ｍｏｌ．ｅｑ．オレフィン）を加え、窒素雰囲気下で２４時間還流した。室温まで冷却した後、有機溶液をリン酸緩衝液（１３５０ｍｌ、ｐＨ６）で洗浄し、ヘキサンからの沈殿によりＰＰＦポリマーを回収した（図２を参照されたい）。
【実施例１０】
【０１９０】
ベンジル官能化ＰＰＭの異性化
上の実施例８および９に示した方法を用いて、下のスキーム１２に示す通りにベンジル官能化ポリ（プロピレンマレアート）をベンジル末端ポリ（プロピレンフマラート）に異性化した。
スキーム１２
ポリ（プロピレンマレアート）の異性化によるポリ（プロピレンフマラート）の形成。
【化３８】
2020506990.tif 000050
【０１９１】
ベンジル官能化ポリ（プロピレンマレアート）から対応するベンジル官能化ポリ（プロピレンフマラート）への異性化を１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，３０３Ｋ，ＣＤＣｌ３）：δ＝７．３２（ｍ，Ａｒ）、６．８７（ｍ，ＯＣ（＝Ｏ）Ｈ＝ＣＨ（＝Ｏ）Ｏ）、５．３６（ｍ，ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）、５．０９（ｓ，Ｃ＝ＯＯＣＨ２−Ａｒ）、４．０４（ｍ，ＣＨ２ＯＣ＝Ｏ）、２．２８（ｓ，εＣＬ  ＣＨ２Ｃ＝ＯＯ）、１．２６（ｍ，ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）、１．６０および１．３３（全残留水素）ｐｐｍにより確認した。
【実施例１１】
【０１９２】
プロパルギル−官能化ポリ（プロピレンフマラート）の異性化
上に記載した全般的方法を用いて、下のスキーム１３に示す通りにプロパルギルポリ（プロピレンマレアート）を異性化してプロパルギル末端ポリ（プロピレンフマラート）を形成した。
スキーム１３
【化３９】
2020506990.tif 000051
【０１９３】
プロパルギルポリ（プロピレンマレアート）が異性化されてプロパルギル末端ポリ（プロピレンフマラート）が形成されたことを１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，３０３Ｋ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝６．８４−６．６４（ｍ，ＯＣ（＝Ｏ）Ｈ＝ＣＨ（＝Ｏ）Ｏ）、５．２７−５．０７（ｍ，ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）、４．８５（ｓ，ＨＣ≡ＣＣＨ２Ｏ）、４．７８（ｓ，ＨＣ≡ＣＣＨ２Ｏ）、４．４４−４．１４（ｍ，ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）、２．３２（ｓ，ＨＣ≡Ｃ）および１．３８−１．１０（ｍ，ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）ｐｐｍにより確認した。収率＝９８％。プロパルギルポリ（プロピレンフマラート）（上）と前駆体プロパルギルポリ（プロピレンマレアート）（下）の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルの比較（３００ＭＨｚ，３０３Ｋ，ＤＭＳＯ  ｄ−６）を図４に示す。
【実施例１２】
【０１９４】
表面濃度を求める減算方法
ＰＰＦの薄膜（１ｃｍ×１ｃｍ）を色素溶液（０．５μＭ  Ｃｈｒｏｍｅｏ（登録商標）５４６−アジド色素、ＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏの５０％ｖ／ｖ溶液中ＣｕＳＯ４  ２．５ｍｇ、アスコルビン酸ナトリウム３．２ｍｇ）に１時間浸漬し、蛍光分光法を用いて溶液の濃度を求めた。未使用の溶液を膜への色素結合を測定するための標準品として使用した。
【実施例１３】
【０１９５】
Ｍｅｇａｓｔｏｋｅｓ（登録商標）６７３−アジド色素のプロパルギル官能化ＰＰＦへの銅によるアジド−アルキン付加環化
Ｍｅｇａｓｔｏｋｅｓ（登録商標）６７３−アジド溶液（イソプロピルアルコールとＨ２Ｏ（５０：５０）の５０％ｖ／ｖ溶液中、色素１ｍＭ、ＣｕＳＯ４  ０．５ｍｇ、アスコルビン酸ナトリウム１．５ｍｇ）をピペットでＰＰＦ膜の上に滴下し、１時間放置した後、イソプロピルアルコールおよびＨ２Ｏで洗浄して、係留していないあらゆる色素および触媒を除去した。
【実施例１４】
【０１９６】
Ｎ３−ＧＲＧＤＳペプチドの合成
ＣＥＭ  Ｌｉｂｅｒｔｙ１ペプチド合成機に標準的なＦｍｏｃ化学条件（０．２５ｍｍｏｌスケール）を用いて、マイクロ波支援固相ペプチド合成（ＳＰＳＳ）によりＧＲＧＤＳを合成した。６−ブロモヘキサン酸（１ｍｍｏｌ）をＧＲＧＤＳ  Ｗａｎｇレジン（０．２５ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ、１．１ｍｍｏｌ）およびヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ、１．１ｍｍｏｌ）とともに加え、２時間反応させた。次いで、トリフルオロ酢酸、トリイソプロピルシランおよび水（９５：２．５：２．５体積％）の溶液１５ｍＬを用いてＢｒ官能化ペプチドをレジンから切断した。ジエチルエーテルでの研和を３サイクル実施した後、得られた白色の固体を真空下で一晩乾燥させた。次いで、固体を１０％エタノール水溶液に再溶解させた。マイクロ波合成後、アジド基のカップリングを実施した。ＷａｎｇレジンにＮａＮ３（１．２５ｍｍｏｌ）および１８−クラウン−６（０．０６２５ｍｍｏｌ）を加え、１２時間反応させてＮ３−ＧＲＧＤＳ（ＥＳＩ  ｍ／ｚ：Ｃ２３Ｈ４０Ｎ１１Ｏ１０の［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値６３０．２９；実測値６３０．１５７）を得た。
【実施例１５】
【０１９７】
ポリ（プロピレンフマラート）ディスク上へのＭＣ３Ｔ３−Ｅ１の播種
プロパルギルアルコール開始ポリ（プロピレンフマラート）ディスク（φ＝６ｍｍ）をクロロホルム、アセトンおよびエタノールでそれぞれ１時間洗浄した後、１×ＰＢＳに１２時間浸漬した。そののち、膜を７０％ＥｔＯＨに浸漬した後、ＵＶ光に１５分間曝露することにより滅菌した。細胞播種の前に膜をＡｌｐｈａ−ＭＥＭに２時間浸漬した。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００単位／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬ−１ストレプトマイシンを添加したＡｌｐｈａ−ＭＥＭ培地でマウス頭蓋冠幹細胞（ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１）を培養し、３日毎に継代した。第８継代のＭＣ３Ｔ３を２５０細胞／ｍｍ−２で播種し、のちのあらゆる実験を細胞播種の４８時間後に実施した。
【実施例１６】
【０１９８】
ポリ（プロピレンフマラート）ディスク上でのＭＣ３Ｔ３細胞の生存能
４８時間後にＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ生存能細胞毒性キットを用いて細胞生存能を評価した。簡潔に述べれば、ＰＢＳ  １０ｍＬに４ｍＭカルセイン−ＡＭストック溶液５μＬおよび２ｍＭエチジウムホモ二量体１（ＥｔｈＤ−１）ストック溶液１０μＬを加えてＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ染色溶液を調製した。試料を１×ＰＢＳ（１ｍＬ）で３回洗浄した。各試料にストック溶液（２００μＬ）を加え、１５分間インキュベートした。次いで染色溶液を除去し、ＩＸ８１蛍光顕微鏡にＦＩＴＣ発光フィルタおよびＴＲＩＴＣ発光フィルタを用いて試料を観察した。分析には、膜１枚当たり無作為領域を１０か所選択し、それぞれの膜について３連で実施した。値をスライドガラス上で算出した細胞生存率に正規化した。
【実施例１７】
【０１９９】
ポリ（プロピレンフマラート）ディスク上でのＭＣ３Ｔ３細胞拡散
細胞播種の４８時間後、細胞骨格のアクチンを染色することにより細胞拡散を評価した。試料をＣＳ緩衝溶液中３．７％のパラホルムアルデヒドで１時間、前固定し、１×ＰＢＳで３回洗浄し、染色まで−８０℃で保管した。染色には、試料をＣＳ緩衝溶液中０．５％ｖ／ｖのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で１０分間インキュベートし、１×ＰＢＳで３回洗浄した。次に、試料を１×ＰＢＳ溶液中０．１重量％のＮａＢＨ４溶液で１０分間インキュベートし、１×ＰＢＳで３回洗浄した。次いで、試料にローダミンファロイジン（１×ＰＢＳ中１：４０ｖ／ｖ）を加え、１時間インキュベートした。１×ＰＢＳで３回洗浄した後、試料にＤＡＰＩ溶液（ＰＢＳ  １０ｍＬ中５μｇ／ｍＬ−１のＤＡＰＩ  ６μＬ）を加え、２０分間インキュベートした。１×ＰＢＳで３回洗浄した後、蛍光マウント培地を用いて試料をマウントし、蛍光顕微鏡を用いて撮像した。
【０２００】
実施例１８〜２６の材料および装置
ここで使用した材料および装置を下の表１１および表１２に記載する。
【０２０１】
【表１１】
2020506990.tif 000052
【０２０２】
【表１２】
2020506990.tif 000053
【０２０３】
実施例１８〜２６の特徴付け
Ｖａｒｉａｎ  Ｍｅｒｃｕｒｙ−３００  ＮＭＲ分光計を用いてプロトン（１Ｈ）ＮＭＲスペクトルを記録した。Ｖａｒｉａｎ  Ｍｅｒｃｕｒｙ−５００  ＮＭＲ分光計を用いて炭素（１３Ｃ）ＮＭＲスペクトルを記録した。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルおよび１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルについて、全化学シフトをそれぞれδ＝７．２６およびδ＝７７．１６ｐｐｍでのクロロホルム溶媒の参照ピークに対して百万分率（ｐｐｍ）で記録した。Ｔｏｓｏｈ  ＥｃｏＳＥＣ  ＨＬＣ−８３２０に屈折率（ＲＩ）検出と直列したＰＬｇｅｌ  Ｍｉｘｅｄ−Ｃ型カラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により分子量を求めた。溶離液のＤＭＦ（０．１％ＬｉＢｒ）を０．５ｍＬ／分−１で流し、試料濃度を２０ｍｇ／ｍＬ−１としたポリ（スチレン）標準品から求めた検量曲線を用いて重量を算出した。Ｂｒｕｋｅｒ  ＵｌｔｒａＦｌｅｘ  ＩＩＩ  ＭＡＬＤＩ  ｔａｎｄｅｍ  Ｔｉｍｅ−ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔ（ＴＯＦ／ＴＯＦ）質量分析計を用いてＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型）質量スペクトルを記録した。
【実施例１８】
【０２０４】
グリシジルプロパルギルエーテル（ＧＰＥ）の合成
下のスキーム１４に示す通りにグリシジルプロパルギルエーテル（ＧＰＥ）を合成した。
【０２０５】
スキーム１４
グリシジルプロパルギルエーテル（ＧＰＥ）の合成
【化４０】
2020506990.tif 000054
攪拌している４０％水酸化ナトリウム水溶液（Ｈ２Ｏ  ８５ｇ中ＮａＯＨ  ５６．５ｇ）にプロパルギルアルコール（７．６ｍｌ、０．１３５ｍｏｌ）を０℃で滴加した。この混合物を３０分間攪拌した。（±）−エピクロロヒドリン（２５ｇ、０．２７ｍｏｌ）、ヘキサン（９０ｍｌ）、硫酸水素テトラブチルアンモニウム（２．２９ｇ、６．７５ｍｍｏｌ）およびＨ２Ｏ（１２．５ｍｌ）の溶液を反応系に加えた。反応物を室温に温まるまで放置し、Ｎ２ブランケット下で反応を８時間継続した。ブライン（１２５ｍｌ）で反応を停止させ、３部の１２５ｍＬのジクロロメタン（ＤＣＭ）で粗生成物を抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、回転蒸発により濃縮した。カラムクロマトグラフィー（１：３のヘキサン／ＤＣＭからＤＣＭ）によって最終生成物を得、ＧＰＥを収量７．３ｇ（４８．１％）で得た（スキーム３．１）。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，３０３Ｋ，ＣＤＣｌ３）：δ＝３．９８（ｔ，ＯＣＨ２Ｃ≡ＣＨ）、３．６１−３．５６（ｑ，ＣＨＣＨ２ＯＣＨ２）、３．２６−３．２０（ｑ，ＣＨＣＨ２ＯＣＨ２）、２．９５−２．８９（ｍ，ＣＨＣＨ２ＯＣＨ２）、２．５７−２．５４（ｔ，ＣＨ２（Ｏ）ＣＨＣＨ２Ｏ）、２．３９−２．３５（ｍ，ＣＨ２（Ｏ）ＣＨＣＨ２Ｏ，Ｃ≡ＣＨ）ｐｐｍ。
【実施例１９】
【０２０６】
２−［［（２−ニトロフェニル）メトキシ］メチル］オキシラン（ＮＭＭＯ）の合成
下のスキーム１５に示す通りに２−［［（２−ニトロフェニル）メトキシ］メチル］オキシラン（ＮＭＭＯ）を合成した。
【０２０７】
スキーム１５
２−［［（２−ニトロフェニル）メトキシ］メチル］オキシラン（ＮＭＭＯ）の合成
【化４１】
2020506990.tif 000055
ｏ−ニトロベンジルアルコール（１０ｇ、０．０６５ｍｏｌ）を１，４−ジキソアン（ｄｉｘｏａｎｅ）３０ｍＬに溶解させた後、硫酸水素テトラブチルアンモニウム（１．１１ｇ、３．２７ｍｍｏｌ）および４０％水酸化ナトリウム水溶液（Ｈ２Ｏ  １２ｇ中ＮａＯＨ  ８ｇ）を加えた。次いで、この混合物に（±）−エピクロロヒドリン（２０ｍＬ、０．２６ｍｏｌ）を０℃で滴加し、反応物を室温に温まるまで放置した。Ｎ２下で４８時間攪拌した後、反応混合物を２部の５０ｍＬのジエチルエーテルで抽出した。合わせたエーテル画分を過剰の水、飽和炭酸水素ナトリウムおよび飽和塩化ナトリウムで洗浄した。合わせた有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、回転蒸発により濃縮した。カラムクロマトグラフィー（５：３の石油エーテル／ジエチルエーテル）によって最終生成物を得、ＮＭＭＯを収量３．７ｇ（２７．２％）を得た（スキーム３．２）。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，３０３Ｋ，ＣＤＣｌ３）：δ＝７．９５−７．３２（ｍ，Ａｒ）、４．８５（ｓ，ＡｒＣＨ２ＯＣＨ２）、３．８４−３．７９（ｑ，ＣＨＣＨ２ＯＣＨ２）、３．４５−３．３９（ｑ，ＣＨＣＨ２ＯＣＨ２）、３．１６−３．１１（ｍ，ＣＨＣＨ２ＯＣＨ２）、２．７４−２．７１（ｔ，ＣＨ２（Ｏ）ＣＨＣＨ２Ｏ）、２．５８−２．５５（ｑ，ＣＨ２（Ｏ）ＣＨＣＨ２Ｏ）ｐｐｍ。
【実施例２０】
【０２０８】
マグネシウム２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルフェノキシド（Ｍｇ（ＢＨＴ）２（ＴＨＦ）２）の合成
標準的なシュレンクライン技術を用いて、シュレンクを２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルフェノール（ＢＨＴ）（６．６６ｇ、３０ｍｍｏｌ）で満たし、カニューレ転送によって加えた乾燥トルエン（３０ｍｌ）に溶解させた。攪拌しながら反応物にジ−ｎ−ブチルマグネシウム（ヘキサン中１Ｍ、１５ｍｌ、１５ｍｍｏｌ）を滴加した。反応物をさらに２時間攪拌した後、溶媒を除去した。反応容器にヘキサン（１２．５ｍｌ）を加えた後、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（２．５ｍｌ）を加えた。Ｎ２下で２時間攪拌した後、溶媒を除去することができ、最終生成物を固体として得た（スキーム１６）。
スキーム１６
マグネシウム２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルフェノキシド（Ｍｇ（ＢＨＴ）２（ＴＨＦ）２）の合成
【化４２】
2020506990.tif 000056
【実施例２１】
【０２０９】
官能化ＰＰＦを重合する全般的方法
標準的なシュレンクライン技術を用いて、アンプルにＭｇ（ＢＨＴ）２（ＴＨＦ）２（１２１．４ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）、ベンジルアルコール（０．０２ｍＬ、０．２ｍｍｏｌ）、エポキシド（０．５ｍｍｏｌ）および無水マレイン酸（４９０．３ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）を満たした。試薬をトルエンに溶解させて総モノマー濃度を２Ｍにした。アンプルを密閉し、８０℃で２４時間加熱した。得られたポリマーを過剰のジエチルエーテル中での沈殿によって回収した。遠心分離後、粗生成物をクロロホルムに溶解させ、次いで、混合物にジエチルアミンを加えた後、Ｎ２下で２４時間還流した。最後に、混合物を過剰のリン酸緩衝生理食塩水（０．５Ｍ）で洗浄した。有機層を合わせ、乾燥させてポリマーを回収した。
【実施例２２】
【０２１０】
ポリ（エピクロロヒドリン−ｃｏ−無水マレイン酸）の合成
下のスキーム１７に示す通りに（±）−エピクロロヒドリンと無水マレイン酸からポリ（エピクロロヒドリン−ｃｏ−無水マレイン酸）を合成した。
【０２１１】
スキーム１７
エピクロロヒドリンと無水マレイン酸の共重合およびポリ（ＥＣＨ−ｃｏ−ＭＡ）の異性化
【化４３】
2020506990.tif 000057
標準的なシュレンクライン技術を用いて、アンプルをＭｇ（ＢＨＴ）２（ＴＨＦ）２（１２１．４ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）、ベンジルアルコール（０．０２ｍＬ、０．２ｍｍｏｌ），（±）−エピクロロヒドリン（０．５ｍｍｏｌ）および無水マレイン酸（４９０．３ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）で満たした。試薬をトルエンに溶解させて総モノマー濃度を２Ｍにした。アンプルを密閉し、８０℃で２４時間加熱した。得られたポリマーを過剰のジエチルエーテル中での沈殿によって回収した。遠心分離後、粗生成物をクロロホルムに溶解させ、次いで、混合物にジエチルアミンを加えた後、Ｎ２下で２４時間還流した。最後に、混合物を過剰のリン酸緩衝生理食塩水（０．５Ｍ）で洗浄した。有機層を合わせ、乾燥させてポリマーを回収した。
【０２１２】
得られたポリマーを１Ｈ  ＮＭＲによって特徴付けし、その結果をここ、表５および図２８に報告する。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，３０３Ｋ，ＣＤＣｌ３）：δ＝７．３６（ｍ，Ａｒ）、６．８６（ｍ，ＣＯＨＣ＝ＣＨＣＯ）、５．３５（ｍ，ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ２Ｃ≡ＣＨ）Ｏ）、５．２２（ｓ，ＡｒＣＨ２Ｏ）、４．８０−４．４０（ｍ，ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ２Ｃ≡ＣＨ）Ｏ）、４．１８（ｍ，ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ２Ｃ≡ＣＨ）Ｏ）、３．７４（ｄ，ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ２Ｃ≡ＣＨ）Ｏ）、２．４９（ｓ，ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ２Ｃ≡ＣＨ）Ｏ）ｐｐｍ。得られたポリマーを１３Ｃ  ＮＭＲによっても特徴付けし、その結果をここおよび図２９に報告する。１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，３０３Ｋ，ＣＤＣｌ３）：δ＝１６４．３０（Ｏ−Ｃ＝Ｏ）、１３０．０３（ＨＣ＝ＣＨ）、１２８．７４（Ａｒ  Ｃ）、７１．２８（ＯＣＨ２ＣＨ）、６７．３６（（Ｃ６Ｈ５）ＣＨ２Ｏ）、６３．０１（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２Ｃｌ）Ｏ）、４１．８９（ＣＨＣＨ２Ｃｌ）ｐｐｍ。ＳＥＣ（ＤＭＦ）：Ｍｎ＝６．０ｋＤａ、Ｍｗ＝７．０ｋＤａ、ＤＭ＝１．１６。得られたポリマーをサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によっても特徴付けし、その結果をここおよび図３０に報告する。ＳＥＣ（ＤＭＦ）：Ｍｎ＝６．０ｋＤａ、Ｍｗ＝７．０ｋＤａ、ＤＭ＝１．１６。
【０２１３】
実施例２２の結果を下の表１３にまとめる。
【０２１４】
【表１３】
2020506990.tif 000058
【実施例２３】
【０２１５】
ポリ（グリシジルプロパルギルエーテル−ｃｏ−無水マレイン酸）の合成
下のスキーム１８に示す通りにグリシジルプロパルギルエーテル（上の実施例１８に示した通りに調製した）と無水マレイン酸からポリ（グリシジルプロパルギルエーテル−ｃｏ−無水マレイン酸）を合成した。
【０２１６】
スキーム１８
グリシジルプロパルギルエーテルと無水マレイン酸の共重合およびポリ（ＧＰＥ−ｃｏ−ＭＡ）の異性化
【化４４】
2020506990.tif 000059
標準的なシュレンクライン技術を用いて、アンプルをＭｇ（ＢＨＴ）２（ＴＨＦ）２（１２１．４ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）、ベンジルアルコール（０．０２ｍＬ、０．２ｍｍｏｌ）、グリシジルプロパルギルエーテル（０．５ｍｍｏｌ）および無水マレイン酸（４９０．３ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）で満たした。試薬をトルエンに溶解させて総モノマー濃度を２Ｍにした。アンプルを密閉し、８０℃で２４時間加熱した。得られたポリマーを過剰のジエチルエーテル中での沈殿によって回収した。遠心分離後、粗生成物をクロロホルムに溶解させ、次いで、混合物にジエチルアミンを加えた後、Ｎ２下で２４時間還流した。最後に、混合物を過剰のリン酸緩衝生理食塩水（０．５Ｍ）で洗浄した。有機層を合わせ、乾燥させてポリマーを回収した。
【０２１７】
得られたポリマーを１Ｈ  ＮＭＲによって特徴付けし、その結果をここ、表１４および図３１に報告する。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，３０３Ｋ，ＣＤＣｌ３）：δ＝７．３６（ｍ，Ａｒ）、６．８６（ｍ，ＣＯＨＣ＝ＣＨＣＯ）、５．３５（ｍ，ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ２Ｃ≡ＣＨ）Ｏ）、５．２２（ｓ，ＡｒＣＨ２Ｏ）、４．８０−４．４０（ｍ，ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ２Ｃ≡ＣＨ）Ｏ）、４．１８（ｍ，ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ２Ｃ≡ＣＨ）Ｏ）、３．７４（ｄ，ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ２Ｃ≡ＣＨ）Ｏ）、２．４９（ｓ，ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ２Ｃ≡ＣＨ）Ｏ）ｐｐｍ。得られたポリマーを１３Ｃ  ＮＭＲによっても特徴付けし、その結果をここおよび図３２に報告する。１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，３０３Ｋ，ＣＤＣｌ３）：δ＝１６４．２０（Ｏ−Ｃ＝Ｏ）、１３３．７９（ＨＣ＝ＣＨ）、７９．１２（Ｈ２Ｃ≡ＣＨ）、７５．５７（Ｈ２Ｃ≡ＣＨ）、７１．１７（ＯＣＨ２ＣＨ）、６７．５９（ＣＨ２ＯＣＨ２Ｃ≡ＣＨ）、６３．５１（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ２Ｃ≡ＣＨ）Ｏ）、５８．７６（ＣＨ２ＯＣＨ２Ｃ≡ＣＨ）ｐｐｍ。ポリマーをサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によっても特徴付けした。ＳＥＣ（ＤＭＦ）：Ｍｎ＝７．６ｋＤａ、Ｍｗ＝１０．６ｋＤａ、ＤＭ＝１．４０。実施例２３の結果を下の表１４にまとめる。
【０２１８】
【表１４】
2020506990.tif 000060
【実施例２４】
【０２１９】
ポリ（グリシジルプロパルギルエーテル−ｃｏ−無水マレイン酸）（ポリ（ＧＰＥ−ｃｏ−ＭＡ））７の合成
標準的なシュレンクライン技術を用いて、アンプルをＭｇ（ＢＨＴ）２（ＴＨＦ）２（１２１．４ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）、ベンジルアルコール（０．０２ｍＬ、０．２ｍｍｏｌ）、グリシジルプロパルギルエーテル（０．５８ｍＬ、０．５ｍｍｏｌ）および無水マレイン酸（４９０．３ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）で満たした。試薬をトルエンに溶解させて総モノマー濃度を２Ｍにした。アンプルを密閉し、８０℃で２４時間加熱した。得られたポリマーを過剰のジエチルエーテル中での沈殿によって回収した。遠心分離後、粗生成物をクロロホルムに溶解させ、次いで、混合物にジエチルアミンを加えた後、Ｎ２下で２４時間還流した。最後に、混合物を過剰のリン酸緩衝生理食塩水（０．５Ｍ）で洗浄し、有機層を合わせ、乾燥させて官能化ポリ（ＧＰＥ−ｃｏ−ＭＡ）を得た（スキーム１９）。
スキーム１９
ポリ（グリシジルプロパルギルエーテル−ｃｏ−無水マレイン酸）（ポリ（ＧＰＥ−ｃｏ−ＭＡ））の合成および異性化
【化４５】
2020506990.tif 000061
【０２２０】
また、得られたポリマーを１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，３０３Ｋ，ＣＤＣｌ３）：δ＝７．３６（ｍ，Ａｒ）、６．８６（ｍ，ＣＯＨＣ＝ＣＨＣＯ）、５．３５（ｍ，ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ２Ｃ≡ＣＨ）Ｏ）、５．２２（ｓ，ＡｒＣＨ２Ｏ）、４．８０−４．４０（ｍ，ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ２Ｃ≡ＣＨ）Ｏ）、４．１８（ｍ，ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ２Ｃ≡ＣＨ）Ｏ）、３．７４（ｄ，ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ２Ｃ≡ＣＨ）Ｏ）、２．４９（ｓ，ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ２Ｃ≡ＣＨ）Ｏ）ｐｐｍおよび１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，３０３Ｋ，ＣＤＣｌ３）：δ＝１６４．２０（ｍ，Ｏ−Ｃ＝Ｏ）、１３３．７９（ｍ，−Ｃ＝Ｃ−）、７９．１２（ｓ，−Ｃ≡ＣＨ）、７５．５７（ｓ，−Ｃ≡ＣＨ）、７１．１７（ｓ，−ＯＣＨ２ＣＨ−）、６７．５９（ｓ，−ＣＨ２ＯＣＨ２Ｃ≡ＣＨ）、６３．５１（ｓ，ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ２Ｃ≡ＣＨ）Ｏ）、５８．７６（ｓ，−ＣＨ２ＯＣＨ２Ｃ≡ＣＨ）ｐｐｍによって特徴付けした（図３０〜３２を参照されたい）。
【実施例２５】
【０２２１】
ポリ（２−［［（２−ニトロフェニル）メトキシル］メチル］オキシラン−ｃｏ−無水マレイン酸）の合成
下のスキーム２０に示す通りに、（上の実施例１９に記載した通りに）調製した２−［［（２−ニトロフェニル）メトキシ］メチル］オキシラン（ＮＭＭＯ）と無水マレイン酸からポリ（２−［［（２−ニトロフェニル）メトキシル］メチル］オキシラン−ｃｏ−無水マレイン酸）を合成した。
スキーム２０
２−［［（２−ニトロフェニル）メトキシル］メチル］オキシランと無水マレイン酸の共重合およびポリ（ＮＭＭＯ−ｃｏ−ＭＡ）の異性化
【化４６】
2020506990.tif 000062
【０２２２】
得られたポリマーを１Ｈ  ＮＭＲによって特徴付けし、その結果を表１５および図３３に報告する。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，３０３Ｋ，ＣＤＣｌ３）：δ＝７．９８−７．３８（ｍ，Ａｒ）、６．２７（ｍ，ＣＯＨＣ＝ＣＨＣＯ）、５．５４−５．３４（ｄ，ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ２ＡｒＮＯ２）Ｏ）、４．８６（ｓ，ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ２ＡｒＮＯ２）Ｏ）、４．４１（ｓ，ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ２ＡｒＮＯ２）Ｏ）、３．７６（ｍ，ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ２ＡｒＮＯ２）Ｏ）ｐｐｍ。得られたポリマーを１３Ｃ  ＮＭＲによっても特徴付けし、その結果をここおよび図３４に報告する。１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，３０３Ｋ，ＣＤＣｌ３）：δ＝１６３．９９（Ｏ−Ｃ＝Ｏ）、１４７．４７（Ａｒ  Ｃ）、１３３．６８（ＨＣ＝ＣＨ）、１２９．１９−１２４．７６（ｍ，Ａｒ  Ｃ）、７１．９３−７１．２２（ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ２Ａｒ）Ｏ）、７０．１６（ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ２Ａｒ）Ｏ）、６９．１９−６８．６７（ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ２Ａｒ）Ｏ）、６３．５１（ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ２Ａｒ）Ｏ）ｐｐｍ。
【０２２３】
得られたポリマーをサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって特徴付けした。ＳＥＣ（ＤＭＦ）：Ｍｎ＝２．６ｋＤａ、Ｍｗ＝２．７ｋＤａ、ＤＭ＝１．０４。
【０２２４】
実施例２５の結果を下の表１５にまとめる。
【０２２５】
【表１５】
2020506990.tif 000063
【実施例２６】
【０２２６】
ポリ（２−［［（２−ニトロフェニル）メトキシ］メチル］オキシラン−ｃｏ−無水マレイン酸）（ポリ（ＮＭＭＯ−ｃｏ−ＭＡ））７の合成
下のスキーム２１に示す通りにポリ（２−［［（２−ニトロフェニル）メトキシ］メチル］オキシラン−ｃｏ−無水マレイン酸）（ポリ（ＮＭＭＯ−ｃｏ−ＭＡ））を合成した。
【０２２７】
スキーム２１
ポリ（２−［［（２−ニトロフェニル）メトキシ］メチル］オキシラン−ｃｏ−無水マレイン酸）（ポリ（ＮＭＭＯ−ｃｏ−ＭＡ））の合成および異性化
【化４７】
2020506990.tif 000064
標準的なシュレンクライン技術を用いて、アンプルをＭｇ（ＢＨＴ）２（ＴＨＦ）２（１２１．４ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）、プロパルギルアルコール（０．０１ｍＬ、０．２ｍｍｏｌ）、ｏ−ニトロベンジルアルコール（２．４８ｍＬ、０．５ｍｍｏｌ）および無水マレイン酸（４９０．３ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）で満たした。試薬をトルエンに溶解させて総モノマー濃度を２Ｍにした。アンプルを密閉し、８０℃で２４時間加熱した。得られたポリマーを過剰のジエチルエーテル中での沈殿によって回収した。遠心分離後、粗生成物をクロロホルムに溶解させ、次いで、混合物にジエチルアミンを加えた後、Ｎ２下で２４時間還流した。最後に、混合物を過剰のリン酸緩衝生理食塩水（０．５Ｍ）で洗浄し、有機層を合わせ、乾燥させてポリ（ＮＭＭＯ−ｃｏ−ＭＡ）を得た（スキーム２１）。
【０２２８】
得られたポリマーを１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，３０３Ｋ，ＣＤＣｌ３）：δ＝７．９８−７．３８（ｍ，Ａｒ）、６．２７（ｍ，ＣＯＨＣ＝ＣＨＣＯ）、５．５４−５．３４（ｄ，ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ２ＡｒＮＯ２）Ｏ）、４．８６（ｓ，ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ２ＡｒＮＯ２）Ｏ）、４．４１（ｓ，ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ２ＡｒＮＯ２）Ｏ）、３．７６（ｍ，ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ２ＡｒＮＯ２）Ｏ）ｐｐｍによって特徴付けした。得られたポリマーを１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，３０３Ｋ，ＣＤＣｌ３）：δ＝１６３．９９（ｍ，Ｏ−Ｃ＝Ｏ）、１４７．４７（ｍ，Ａｒ）、１３３．６８（ｍ，−Ｃ＝Ｃ−）、１２９．１９−１２４．７６（ｍ，Ａｒ）、７１．９３−７１．２２（ｄ，ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ２Ａｒ）Ｏ）、７０．１６（ｓ，ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ２Ａｒ）Ｏ）、６９．１９−６８．６７（ｄ，ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ２Ａｒ）Ｏ）、６３．５１（ｄ，ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ２Ａｒ）Ｏ）ｐｐｍによっても特徴付けした。
【０２２９】
上記を踏まえ、本発明が多くの点で構造的にも機能的にも改善された官能化ポリ（プロピレンフマラート）ポリマーを提供することによって当該技術を大幅に進歩させるものであることを理解するべきである。本明細書には本発明の特定の実施形態が詳細に開示されているが、本明細書の本発明に対する変形形態が当業者によって容易に理解されることから、本発明がそのような詳細な開示に限定されることも、これによる制約を受けることもないことを理解するべきである。本発明の範囲は、のちの請求項から理解されるものとする。
【図１】
2020506990.tif 000072
【図２】
2020506990.tif 000073
【図３】
2020506990.tif 000074
【図４】
2020506990.tif 000075
【図５Ａ】
2020506990.tif 000076
【図５Ｂ】
2020506990.tif 000077
【図６】
2020506990.tif 000078
【図７】
2020506990.tif 000079
【図８】
2020506990.tif 000080
【図９】
2020506990.tif 000081
【図１０】
2020506990.tif 000082
【図１１】
2020506990.tif 000083
【図１２】
2020506990.tif 000084
【図１３】
2020506990.tif 000085
【図１４】
2020506990.tif 000086
【図１５】
2020506990.tif 000087
【図１６】
2020506990.tif 000088
【図１７】
2020506990.tif 000089
【図１８】
2020506990.tif 000090
【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【国際調査報告】
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