(57)【要約】  哺乳動物の軟骨および骨における疾患または損傷を伴う状態を、抗インテグリンα１０抗体によって単離された間葉系幹細胞を用いて予防および／または治療するための組成物ならびに方法が開示される。【選択図】図１−１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
軟骨下骨硬化症、外傷関節傷害、および／または椎間板変性症の予防および／または治療での使用のための間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の濃縮インテグリンα１０高集団であって、
前記ＭＳＣ集団の細胞の少なくとも６０％がインテグリンα１０サブユニットを発現し、ならびに
前記ＭＳＣが間葉系幹細胞、間葉系前駆細胞、および間葉系間質細胞からなる群から選択される、
ＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項２】
前記外傷関節傷害がスポーツ傷害を含む、請求項１に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項３】
前記外傷関節傷害が骨軟骨損傷、腱損傷、靭帯損傷、および筋損傷からなる群から選択される、請求項１〜２のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項４】
前記骨軟骨損傷が関節軟骨損傷および／または骨損傷を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項５】
骨折治癒を促進するまたは誘導するためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団であって、前記ＭＳＣ集団の細胞の少なくとも６０％がインテグリンα１０サブユニットを発現しおよび前記ＭＳＣが間葉系幹細胞、間葉系前駆細胞、および間葉系間質細胞からなる群から選択される、ＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項６】
前記集団に含まれる総細胞の少なくとも６５％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％がインテグリンα１０サブユニットを発現する、請求項１および２のうちのいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項７】
前記細胞がインテグリンα１０サブユニットを発現するよう誘導される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項８】
前記細胞が哺乳動物血清およびＦＧＦ−２を含む培地中で培養される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項９】
前記細胞が血小板溶解物および／または血小板溶解物成分を含む培地中で培養される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項１０】
前記細胞が血小板溶解物および／または血小板溶解物成分を含む無血清培地中で培養される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項１１】
前記細胞が増殖因子を含む無血清培地中で培養される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項１２】
前記細胞が増殖因子ＦＧＦ２および／またはＴＧＦβを含む無血清培地中で培養される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項１３】
前記細胞がＦＧＦ２ならびに血小板溶解物および／または血小板溶解物成分を含む培地中で培養される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項１４】
前記細胞が哺乳動物血清ならびに血小板溶解物および／または血小板溶解物成分を含む培地中で培養される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項１５】
前記細胞がＴＧＦβを含む培地中で培養される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項１６】
前記血清がウシ胎児血清である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項１７】
前記集団がｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養物である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項１８】
前記培地がアスコルビン酸をさらに含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項１９】
前記インテグリンα１０がインテグリンβ１サブユニットとの組み合わせでヘテロ二量体として発現される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項２０】
インテグリンα１０を発現する前記細胞が抗インテグリンα１０抗体によって単離される、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項２１】
前記抗インテグリンα１０抗体がモノクローナル抗体である、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項２２】
前記抗体がマウスをヒトインテグリンα１０ポリペプチドで免疫することによって生成される、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項２３】
前記ＭＳＣがＭＨＣＩＩおよびＣＤ４５の非存在によってさらに特徴づけられる、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項２４】
前記ＭＳＣがＣＤ４４、ＣＤ９０およびＣＤ１０５の存在によってさらに特徴づけられる、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項２５】
前記細胞が脂肪組織、骨髄、滑膜、末梢血、臍帯血（ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ）、臍帯血（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ）、ワルトン膠様質、または羊水に由来する、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項２６】
前記細胞が脂肪組織に由来する、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項２７】
前記細胞が骨髄に由来する、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項２８】
前記集団が軟骨下骨の疾患および／または骨軟骨損傷の予防の方法での使用のためである、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項２９】
前記集団が軟骨下骨の疾患および／または骨軟骨損傷の治療の方法での使用のためである、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項３０】
対象が骨軟骨損傷または関節もしくは骨への損傷もしくは傷害を有する、またはこれまでに有した、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項３１】
前記骨軟骨損傷、軟骨損傷または傷害が破損、捻挫、挫傷、裂傷、骨折または断裂である、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項３２】
前記骨軟骨損傷、軟骨損傷または傷害が軟骨亀裂である、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項３３】
前記骨軟骨損傷、軟骨損傷または傷害が軟骨微小骨折である、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項３４】
前記骨軟骨損傷、軟骨損傷または傷害が軟骨欠損である、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項３５】
前記骨軟骨損傷、軟骨損傷または傷害が腱断裂または靭帯断裂である、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項３６】
前記骨軟骨損傷、軟骨損傷または傷害が骨折である、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項３７】
前記傷害がスポーツ傷害である、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項３８】
前記対象が骨の不整列を有する、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項３９】
前記骨軟骨損傷、軟骨損傷または傷害が人工器官の装着の結果である、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項４０】
前記骨軟骨損傷、関節における軟骨損傷または傷害が筋肉、腱、骨、靭帯、軟骨、または半月板においてである、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項４１】
前記方法が軟骨下骨の疾患または骨軟骨損傷に起因する外傷後変形性関節症（ＰＴＯＡ）を予防する、請求項１〜４０のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項４２】
前記ＭＳＣが同種異系または自己由来である、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項４３】
前記ＭＳＣが関節腔に投与される、請求項１〜４２のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項４４】
前記ＭＳＣ集団が注射によって投与される、請求項１〜４３のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項４５】
前記ＭＳＣ集団が薬学的に許容される賦形剤と共に細胞懸濁液中で投与される、請求項１〜４４のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項４６】
前記ＭＳＣ集団が投与前に細胞凝集体に調製される、請求項１〜４５のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項４７】
前記ＭＳＣがジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む培地中で保管される、請求項１〜４６のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項４８】
前記ＭＳＣ集団が損傷した関節および／または骨を修復するための手術中に投与される、請求項１〜４７のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項４９】
前記ＭＳＣ集団が破損後の接骨と同時に投与される、請求項１〜４８のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項５０】
前記対象がヒト、ウマ、ポニー、雄ウシ、ロバ、ラバ、ラクダ、ネコ、イヌ、ブタ、または雌ウシである、請求項１〜４９のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項５１】
前記対象がヒトである、請求項１〜５０のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項５２】
前記対象がウマである、請求項１〜５１のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項５３】
前記対象がイヌである、請求項１〜５２のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項５４】
前記ＭＳＣおよび対象が同じ種または属に由来する、請求項１〜５３のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項５５】
前記ＭＳＣおよび対象が異なる種または属に由来する、請求項１〜５４のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項５６】
前記細胞が胎児、新生児、幼若もしくは成体のＭＳＣおよび／または前駆体細胞に由来する、請求項１〜５５のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項５７】
前記細胞が胚細胞または胚に由来しない、請求項１〜５６のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項５８】
前記投与が投与の部位での増加されたコラーゲン産生、プロテオグリカン産生、および／またはラブリシンをもたらす、請求項１〜５７のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項５９】
前記ＭＳＣと組み合わせて抗炎症剤を投与することをさらに含む、請求項１〜５８のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項６０】
前記ＭＳＣがＭＨＣＩＩおよびＣＤ４５を発現しない、請求項１〜５９のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項６１】
前記ＭＳＣがＣＤ４４、ＣＤ９０およびＣＤ１０５を発現する、請求項１〜６０のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項６２】
ＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団の使用であって、前記ＭＳＣ集団の細胞の少なくとも６０％がインテグリンα１０サブユニットを発現し、かつ軟骨下骨硬化症、外傷関節傷害、および／または椎間板変性症の予防または治療用の薬物の調製のために、前記ＭＳＣが間葉系幹細胞、間葉系前駆細胞、および間葉系間質細胞からなる群から選択される、ＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団の使用。
【請求項６３】
軟骨下骨硬化症のリスクのある、もしくは軟骨下骨硬化症を有する対象にＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団を投与することを含む、対象において軟骨下骨硬化症、外傷関節傷害、および／または椎間板変性症を治療するおよび／または予防する方法であって、前記ＭＳＣ集団の細胞の少なくとも６０％がインテグリンα１０サブユニットを発現し、ならびに前記ＭＳＣが間葉系幹細胞、間葉系前駆細胞、および間葉系間質細胞からなる群から選択され、それによって軟骨下骨硬化症および／または骨軟骨損傷を治療するおよび／または予防する、方法。
【請求項６４】
前記外傷関節傷害がスポーツ傷害を含む、請求項６２および６３のいずれか１項に記載の使用または方法。
【請求項６５】
前記外傷関節傷害が骨軟骨損傷、腱損傷、靭帯損傷、および筋損傷からなる群から選択される、請求項６２〜６４のいずれか１項に記載の使用または方法。
【請求項６６】
前記骨軟骨損傷が関節軟骨損傷および／または骨損傷を含む、請求項６２〜６５のいずれか１項に記載の使用または方法。
【請求項６７】
前記ＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団が請求項１〜６１のいずれか１項に記載されている、請求項６２〜６６のいずれか１項に記載の使用または方法。
【請求項６８】
ＭＳＣ集団の細胞の少なくとも６０％がインテグリンα１０サブユニットを発現するＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団を製造する方法であって、
ａ．脂肪組織、骨髄、滑膜、臍帯血、ワルトン膠様質、または羊水から幹細胞集団を単離すること、
ｂ．プラスチック培養容器中で前記単離された細胞を培養すること、
ｃ．非付着細胞を廃棄すること、
ｄ．培地を加えることによってインテグリンα１０発現を誘導することであって、前記培地が無血清培地または哺乳動物血清を含む培地であり、ならびに前記培地が血小板溶解物および／もしくは血小板溶解物成分、および／または増殖因子を含む、インテグリンα１０発現を誘導すること、
ｅ．インテグリンα１０を発現する前記細胞を選択すること、ならびに
ｆ．前記選択した細胞を拡張し、それによってＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団を生成すること
を含む、方法。
【請求項６９】
ステップｄ．における前記培地が増殖因子ＦＧＦ２および／またはＴＧＦβを含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記ＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団が請求項１〜６１のいずれか１項に記載されている、請求項６８および６９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物における軟骨および骨の疾患または損傷に関わる状態を、抗インテグリンα１０抗体によって単離された間葉系幹細胞を用いて予防するおよび／または治療するための組成物と方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
関節軟骨は、傷害および病理的な変性を起こす傾向が高い。一旦損傷されると、関節軟骨は一般に治癒しない、または特定の生物学的状況下で部分的のみ治癒する。損傷によって、軟骨はさらに分解され、軟骨分解生成物が炎症を引き起こし、次に炎症を進める軟骨のさらなる分解が生じ、したがって悪循環を作り出す１。例えば、スポーツ傷害由来の初期の軟骨外傷と、その後の変形性関節症（ＯＡ）の発症の間の関連はよく知られている２。
【０００３】
細胞療法は、組織再生のための有望な方法である。動物およびヒトにおける一連の試験は、多能性間葉系間質細胞（ＭＳＣ）を用いる軟骨損傷を含む種々の疾患の治療に対する安全性および有効性を示している６、７。ＭＳＣの治療効果は、多くの要素からなると考えられている。ＭＳＣは、再生される組織の特定の細胞型へと直接分化できるが、さらに細胞外基質、サイトカインおよび増殖因子を生成することによって微小環境を改変し、内在性幹細胞を補充、刺激し、および免疫抑制効果も有する８。軟骨修復と再生のためのＭＳＣの移植はしたがって、これらの細胞が軟骨細胞に分化する可能性を考えると有望な戦略である６。一般的に、幹細胞調製物は、細胞型または種々の分化能を有する細胞の複合混合物である。それらの可塑性と大きな分化能のため、前臨床試験および臨床試験は明確に定義された細胞で行われることが重要である。品質管理されたバイオマーカーによるＭＳＣの特徴づけは、良好な有効性にとって重要であるが、治療薬としての細胞の安全な使用にとっても重要である。国際細胞治療学会は、ＭＳＣとして定義されるヒト細胞の最小基準として、細胞表現型、プラスチック接着、三血球系分化能、ならびに表面マーカーＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５それぞれＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１４もしくはＣＤ１１ｂ、ＣＤ７９αもしくはＤＣ１９、ＨＬＡ−ＤＲの発現または欠如を提唱した９。
【０００４】
患畜において、現在、ＭＳＣに基づく３つの手法が、ウマまたはイヌにおいて腱、靭帯または軟骨／関節の傷害の治療のために使用されている１０。使用される３つの細胞型は、以下の通りである：骨髄（ＢＭ）穿刺液由来の培養拡張された細胞集団（ほとんどの臨床試験はこの細胞集団を使用してきた）、ＢＭ穿刺液由来の濃縮混合された細胞集団、および脂肪組織（ＡＴ）由来の混合された有核細胞集団。全３種類の細胞は、自己（自身）由来または同種（ドナー）由来であり得る。それらはいずれも、あまり明確に定義されていなかった。
【０００５】
ＭＳＣによる軟骨修復を向上させるために、注射されるＭＳＣの品質と数、および投与方法、の２つの変数が満足のいく結果にとって重要であると思われる。現在、国際細胞治療学会基準によって選択された細胞が依然として異種集団であることは、明らかである。ＭＳＣの品質問題に対する解決策は、特定の候補潜在能マーカーの発現によって定義されたＭＳＣ集団を用いることであり得る１１。
【０００６】
インテグリンアルファー１０ベータ１（α１０β１）は最初は、軟骨細胞上のＩＩ型コラーゲン結合受容体として特定され、骨格発達において重要な役割を有することが明らかにされている１２。それは軟骨細胞上で豊富に発現され、ヒトＭＳＣの亜集団中に存在する。インテグリンα１０β１を標的にする抗体を用いて、混合細胞集団からＭＳＣを特定し、識別し、単離できる（国際公開第０３／１０６４９２号を参照されたい）。軟骨細胞の拡張培養、またはトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）β１治療は軟骨細胞特異的インテグリンα１０レベルの低下を伴う脱分化をもたらす。対照的に、培地への骨形成タンパク質（ＢＭＰ）−２の投与は、軟骨形成表現型を安定化し、高レベルのインテグリンα１０発現を誘導する１３。懸濁培養において、異なる細胞周囲マトリックスとの軟骨細胞凝集体の形成は、α１０β１インテグリン−ＩＩ型コラーゲンの相互作用を必要とする１４。さらに、インテグリンα１０β１発現はヒトＢＭ由来ＭＳＣの軟骨形成分化能の改善と相関することが実証されている１５。
【０００７】
関節傷害が実質的に、外傷後変形性関節症（ＰＴＯＡ）と呼ばれる現象、変形性関節症（ＯＡ）のリスクを増加させることは知られている。しかし、ＯＡまたはＰＴＯＡの治療に関して予防的治療または疾患修飾治療はなく、現在の治療は、疾患の発症および／または疾患の進行もしくは疾患の悪化を防止することなく症状を軽減する。このように、傷害または外傷の後のＯＡの発症を予防する手段が実質的に必要である。
【発明の概要】
【０００８】
本発明者らは、骨または軟骨の傷害に苦しんでいる哺乳動物に投与されるＭＳＣのインテグリンα１０濃縮集団を用いて、それに伴う状態、またはそれから生じる状態を防止、および治療し得ることをｉｎ  ｖｉｖｏで初めて実証した。
【０００９】
したがって、一態様において、本開示は、軟骨下骨質硬化症、外傷関節損傷および／もしくは椎間板変性症の予防方法または治療方法において使用するためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団であって、ＭＳＣ集団の細胞の少なくとも６０％がインテグリンα１０サブユニットを発現し、および上記ＭＳＣが間葉系幹細胞、間葉系前駆細胞、および間葉系間質細胞からなる群から選択される、ＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団に関する。
【００１０】
本開示のさらな態様は、骨折治癒を促進するまたは誘導するためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団であって、ＭＳＣ集団の細胞の少なくとも６０％がインテグリンα１０サブユニットを発現し、および上記ＭＳＣが間葉系幹細胞、間葉系前駆細胞、および間葉系間質細胞からなる群から選択される、ＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団に関する。
【００１１】
本開示の一態様は、軟骨下骨硬化症、外傷関節損傷および／または椎間板変性症の予防または治療用の薬物の調製のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団の使用であって、ＭＳＣ集団の細胞の少なくとも６０％がインテグリンα１０サブユニットを発現し、ならびに上記ＭＳＣが間葉系幹細胞、間葉系前駆細胞、および間葉系間質細胞からなる群から選択される、ＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団の使用に関する。
【００１２】
本開示のさらなる態様は、対象において軟骨下骨硬化症および／または軟骨下骨硬化症を治療するおよび／または予防する方法に関し、方法は、軟骨下骨質硬化症のリスクのある、もしくは軟骨下骨硬化症を有する対象にＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団を投与することを含み、ＭＳＣ集団の細胞の少なくとも６０％がインテグリンα１０サブユニットを発現し、ならびに上記ＭＳＣが間葉系幹細胞、間葉系前駆細胞、および間葉系間質細胞からなる群から選択され、それによって軟骨下骨硬化症および／または骨軟骨損傷を治療するおよび／または予防する。
【００１３】
本開示の一態様は、本明細書に記載のＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団を製造する方法に関し、方法は、
ａ．脂肪組織、骨髄、滑膜、臍帯血、ワルトン膠様質、または羊水から幹細胞集団を単離すること、
ｂ．プラスチック培養容器中で単離された細胞を培養すること、
ｃ．非付着細胞を廃棄すること、
ｄ．培地を加えることによってインテグリンα１０発現を誘導することであって、培地が無血清培地、または哺乳動物血清を含む培地であり、および培地が血小板溶解物および／もしくは血小板溶解物成分、および／または増殖因子を含む、インテグリンα１０発現を誘導すること、
ｅ．インテグリンα１０を発現する細胞を選択すること、ならびに
ｆ．選択した細胞を拡張し、それによってＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団を生成すること
を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】骨髄（ＢＭ）および脂肪組織（ＡＴ）由来の間葉系間質細胞（ＭＳＣ）の代表的なＦＡＣＳプロファイルを示す。細胞を、細胞表面マーカーＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、およびＭＨＣクラスＩＩを認識する抗体で標識した。左パネルはＢＭ由来ＭＳＣを示し、右パネルはＡＴ由来ＭＳＣを示す。抗体標識細胞および陰性対照細胞（抗体で標識されない）を示す。
【図２】ＢＭ（図２Ａ）由来およびＡＴ（図２Ｂ）由来の培養ウマＭＳＣ上でのインテグリンα１０β１の代表的な発現プロファイルを示す。インテグリンα１０標識強度を側方散乱に対してプロットした。両タイプのＭＳＣは、インテグリンα１０β１を発現したが、ＢＭ由来ＭＳＣの大部分はインテグリンα１０発現について陽性であった。
【図３】特異的抗インテグリンα１０モノクローナル抗体を用いて蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳＡｒｉａ）によって２種の異なる細胞集団に選別したＡＴ由来ＭＳＣを示す。インテグリンα１０標識強度を側方散乱に対してプロットした。インテグリンα１０高としてゲートされたＭＳＣを青色（右側）で表示し、インテグリンα１０低としてゲートされたＭＳＣを黄色（左側）で表示する（図３Ａ）。インテグリンα１０高としてゲートされた細胞を続いてプラスチックに付着させ、次いでインテグリンα１０に対する抗体で染色した。細胞核をＤＡＰＩで対比染色した（図３Ｂ）。
【図４】未選別のおよび選別された（インテグリンα１０高またはインテグリンα１０低）ＡＴ−ＭＳＣ由来の凍結切片の上で行ったペレット大量培養物の免疫組織化学分析を示す。５回の分化実験からの凍結切片を抗ＩＩ型コラーゲン抗体で標識し、ＩｍａｇｅＪ  １．５０ｉソフトウェアを使用して免疫組織化学呈色反応を定量化した（図４Ａ）。代表的なＩＩ型コラーゲンの発現パターンおよびレベルを、未選別細胞（図４Ｂ）、選別インテグリンα１０高細胞（図４Ｃ）、または選別インテグリンα１０低細胞（図４Ｄ）を用いるペレット大量培養物の中央領域からの凍結切片について示す。ＩＩ型コラーゲン型標識は、未選別ペレットにおいてＩＩ型コラーゲンの中間標識化を示し、選別インテグリンα１０高ペレットにおいてＩＩ型コラーゲンの強い標識化を示し、一方でＩＩ型コラーゲンはインテグリンα１０低ペレットにおいては低く、軟骨形成分化に対するインテグリンα１０のプラス効果を示唆した。
【図５】未選別および選別（インテグリンα１０高またはインテグリンα１０低）ＡＴ−ＭＳＣ由来のＲＮＡを用いて行ったペレット大量培養物の遺伝子発現分析を示す。ＧＡＰＤＨを内在性コントロールとして使用し、未選別細胞をΔΔＣｔ計算のための標準試料として使用した。結果は、インテグリンα１０低ペレットと比較して、インテグリンα１０高ペレットでのＩ型コラーゲンのより低い発現ならびにＩＩ型コラーゲンおよびアグレカンのより高い発現を示し、インテグリンα１０高選別細胞由来のペレットにおいて軟骨形成分化が良好であることを示唆した。バーは平均値±標準偏差を示す。
【図６】無傷の軟骨または損傷軟骨への非選別細胞およびインテグリンα１０選別細胞のホーミング能を図６Ａ〜Ｄに示す。インテグリンα１０（α１０高細胞）をより高レベルで発現する細胞は、軟骨修復についての関心領域へのホーミングがより良好である。バーは平均値±標準偏差を表す。
【図７】６ヵ月の対照肢における軟骨下骨硬化成分スコアは、６ヵ月の処置肢よりもかなり高く、６週目および試験エントリー（０日目）の処置群または対照群よりもかなり高いことを示す。バーは平均値±標準偏差を表す。共通の文字を共有しない群は、ｐ＜０．０５で互いに有意に異なる。
【図８】プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ−２）レベルは、９／１１時点で対照肢と比較して、処置肢において高く、ならびに０日目、４日目、４２日目、５６日目、１２６日目、および１５４日目の時点での対照肢と比較して、術後２８日目の処置肢においてかなり高いことを示す。データは、平均値±標準偏差として示す。共通の文字を共有しない群は、ｐ＜０．０５で有意に異なる。
【図９】ＩＩ型コラーゲン合成の増加を示す、ＩＩ型プロコラーゲンＣ末端プロペプチド（ＣＰＩＩ）のレベルは、いくつかの時点で対照肢と比較して処置肢において高く、ならびに０日目および試験終了時（１５４日目）と比較して、７日目と１４日目の処置肢および対照肢においてかなり高いことを示す。データは、平均値±標準偏差として示す。共通の文字を共有しない群は、ｐ＜０．０５で有意に異なる。
【図１０】Ｃ２Ｃ  ＥＬＩＳＡの結果を示す。Ｃ２Ｃ  ＥＬＩＳＡは、コラゲナーゼによるＩＩ型コラーゲンの切断を介して生じる３／４ペプチドのＣ末端でのネオエピトープを測定する。処置群および対照群の両方において、Ｃ２Ｃは、衝撃手術から１４日目までかなり増加し、次いで、本試験を通し０日目と異ならない値まで減少した。データは、平均値±標準偏差として示す。共通の文字を共有しない群は、ｐ＜０．０５で有意に異なる。
【図１１】骨軟骨の切片の組織像を示す。距腿（足根骨）関節を組織像用に準備し、切片をＳａｆｒａｎｉｎ−Ｏ／ファストグリーンで染色した（図１１Ａ）。プロテオグリカンの正常レベルを、処置肢および対照肢の両方において軟骨の非衝撃領域で見ることができる。衝撃を受けた領域での、プロテオグリカン成分と軟骨細胞組織の差を、いくらかのウマで見ることができた。隣接している、切片をＩＩ型コラーゲンに対する抗体で標識した（図１１Ｂ）。ＩＩ型コラーゲンの正常レベルを、処置肢および対照肢の両方における軟骨の非衝撃領域で見ることができる。衝撃領域での、ＩＩ型コラーゲン成分と発現パターンの差を、いくらかのウマで見ることができた。
【図１２】軟骨細線維化は、対照肢と比較して、試験終了時（６ヵ月目）で処置肢においてかなり少なかった（良好）。バーは平均値±標準偏差、ｐ＜０．０３９、対応のあるｔ検定、片側ｔ検定で表す。
【図１３】墨汁染色を示す。死後に、墨汁を関節面に塗布し、デジタル写真を撮った。墨汁は微粒炭素を含み、軟骨完全性が損なわれている関節面の領域に付着する。矢印は、墨汁付着が損傷した軟骨上の黒色色素沈着として見られる衝撃領域を指す。墨汁は、処置肢の軟骨面よりも対照肢の軟骨面に多く付着し、処置の有益な効果を示した。
【図１４】脂肪組織から単離されたウマインテグリンα１０選択ＭＳＣが、ＭＳＣ対ＰＢＭＣの比率の上昇と共にリンパ球増殖の低下として示される、Ｔ細胞上での免疫調節能を有することを示す免疫抑制アッセイ。最大の免疫抑制効果は、ＭＳＣ対ＰＢＭＣが１：１の比率で生じた。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
定義
「抗インテグリンα１０抗体」または「抗インテグリンα１０サブユニット抗体」を本明細書では同義的に用いて、ヘテロ二量体タンパク質インテグリンα１０β１の少なくともインテグリンα１０サブユニットを認識しそれに結合することができる抗体を指す。これらの抗体は、ヘテロ二量体タンパク質インテグリンα１０β１のエピトープを認識する抗体であり得、エピトープはインテグリンα１０およびインテグリンβ１サブユニットの両方のアミノ酸残基を含む。
【００１６】
骨傷害または骨損傷に関連して、本明細書で用いる場合、用語「破損」は、骨の連続性に損傷がある医学的状態である、骨折を指す。破損は、大きな力の衝撃または応力の結果であり得るが、骨粗鬆症、骨癌、もしくは骨形成不全症などの骨を弱める特定の医学的状態の結果としての最小限の外傷の結果でもあり得、破損または骨折は、病的骨折とも呼ばれる。
【００１７】
骨傷害または骨損傷に関連して、本明細書で用いる場合、用語「挫傷」は、骨折よりも軽度である、骨の線維組織への外傷を指す。骨挫傷は、骨または関節への外傷によって、ならびに関節炎によって引き起こされることがある。
【００１８】
本明細書で用いる場合、用語「同定すること」は、細胞をある特定の細胞型、例えば、ＭＳＣまたは軟骨細胞であると認識する行為を指す。同定することの代替用語は、「検出すること」であり、本明細書では同じ意味で用いる。
【００１９】
本明細書で用いる場合、「インテグリンα１０」または「インテグリンα−１０」は、ヘテロ二量体タンパク質インテグリンα１０β１のα１０サブユニットを指す。この明示的な意味は、インテグリンα１０サブユニットに結合されしたがってインテグリンα１０β１ヘテロ二量体の四次構造を形成するインテグリンβ１サブユニットの存在を除外しない。ヒトインテグリンα１０鎖配列は知られており、ＧｅｎＢａｎｋ（商標）／ＥＢＩ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ受入番号ＡＦ０７４０１５で公表され、およびＣａｍｐｅｒらＪ．  Ｂｉｏ．  Ｃｈｅｍ．  ２７３：２０３８３−２０３８９（１９９８）に記載されている。
【００２０】
本明細書で用いる場合、用語「骨の不整列」は、関節に関して一直線でない骨の変位を指す。
【００２１】
本明細書で用いる場合、用語「単離すること」、「選別すること」、および「選択すること」は、細胞を特定の細胞型であると同定し、それを同じ細胞型または別の分化状態に属していない細胞から分離する行為を指す。通常、単離は分離の第一の段階を指すのに対して、「選択」はより特異的であり、例えば抗体の助けによって行われる。
【００２２】
本明細書で用いる場合、「間葉系幹細胞」または「ＭＳＣ」は、Ｔｈｅ  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｄｏｍｉｎｉｃｉ  Ｍら，  Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ．  ８（４）：３１５−７（２００６）を参照されたい）によって定義される多能性間質細胞を指す。ＭＳＣは、標準培養条件下で維持されるとき、プラスチック付着性である必要があり、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、およびＣＤ９０を発現する必要があり、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１４もしくはＣＤ１１ｂ、ＣＤ７９αもしくはＣＤ１９、およびＨＬＡ−ＤＲの表面分子の発現が欠如している必要がある。ＭＳＣは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで骨芽細胞、脂肪細胞、または軟骨芽細胞に分化する能力がなければならない。
【００２３】
本明細書で用いる場合、「変形性関節症」または「ＯＡ」は、関節軟骨の分解によって特徴づけられる関節疾患を指す。ＯＡはまた、消耗性関節炎、変性関節疾患、および変形性関節炎と呼ばれることもある。ＯＡの症状としては、関節腫脹、疼痛、および可動域の減少が挙げられる。ＯＡによって一般的に影響を受ける関節としては、手、足の親指、手首、頸部、背部、膝、および股の関節が挙げられる。ＯＡでは、軟骨は硬くなり、その弾性を失うことがあり得、または軟骨は一部の領域で磨滅することがあり得る。ＯＡの重度の症例において、関節面の軟骨が失われると、関節の骨が擦れ合うことがあり得る。
【００２４】
本明細書で用いる場合、「傷害後関節炎」、「外傷後関節炎」または「ＰＴＯＡ」は、以前の傷害、損傷、または外傷に起因するＯＡを指す。この状態は、いずれの関節でも起こり得る。傷害は関節の軟骨および／または骨に損傷を与えることがあり得、これにより軟骨を急速に摩耗させることがあり得る。継続する傷害もしくは過剰な体重の様な状態は、ＰＴＯＡの発症を起こす、または加速させることがあり得る。
【００２５】
本明細書で用いる場合、用語「スポーツ傷害」は、運動中に起こる傷害を指す。スポーツ傷害は、外傷性のもの、および酷使と反復応力に起因するものの両方があり得る。
【００２６】
骨傷害または骨損傷に関して本明細書で用いる場合、用語「捻挫」は、靭帯の伸びおよび／または裂傷を指す。捻挫は、通常、関節に応力を加える、支持靭帯を過度に伸ばすまたはさらに断裂する傷害、例えばねじれに起因する。
【００２７】
骨傷害または骨損傷に関して本明細書で用いる場合、用語「裂傷」は、関節中の１または複数の線維軟骨細片が断裂することを指す。裂傷は、ねじれなどの外傷の結果であり得るが、軽度の応力および長期の応力の結果でもあり得、この場合、変性断裂とも呼ばれ得る。裂傷は、靭帯断裂とも呼ばれる。
【００２８】
本明細書で用いる場合、「治療すること」または「治療」は、対象における開示される疾患、障害、および状態に対する治療薬の任意の投与、または適用を含み、ならびに疾患の進行を阻害すること、疾患またはその進行を遅らせること、その発症を抑えること、疾患を部分的にもしくは完全に緩和すること、または疾患の１もしくは複数の症状を部分的にもしくは完全に緩和することを包含する。
【００２９】
本明細書で用いる場合、「予防すること」または「予防」は、疾患、障害、または状態の発症を遅らせること、もしくは停止させることを含む。
【００３０】
組成物
本発明は、抗インテグリンα１０抗体によって混合細胞集団から単離された間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む。単離されたＭＳＣの治療有効量は、変形性関節症、亀裂形成を含む軟骨損傷、および軟骨下骨硬化症のような疾患／障害を治療するために投与されてよい。
【００３１】
本発明は、ＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団であって、細胞がインテグリンα１０サブユニットを発現するよう誘導され、およびＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団が、インテグリンα１０サブユニットを発現するＭＳＣのパーセンテージが集団の細胞の少なくとも６０％である、ＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団を含む。
【００３２】
いくつかの実施形態において、ＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団に含まれる総細胞の少なくとも６５％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば少なくとも１００％がインテグリンα１０サブユニットを発現する。
【００３３】
いくつかの実施形態において、ＭＳＣの集団中の細胞はインテグリンα１０サブユニットを発現するよう誘導される。
【００３４】
いくつかの実施形態において、インテグリンα１０はインテグリンβ１サブユニットとの組み合わせでヘテロ二量体として発現される。
【００３５】
いくつかの実施形態において、ＭＳＣの集団は脂肪組織、骨髄、滑膜、末梢血、臍帯血（ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ）、臍帯血（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ）、ワルトン膠様質、または羊水に由来する。好ましくは、いくつかの実施形態において、ＭＳＣの集団は脂肪組織に由来する。好ましくは、いくつかの実施形態において、ＭＳＣの集団は骨髄に由来する。
【００３６】
場合によっては、ＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団は、プラスチック培養皿で培養され、インテグリンα１０を発現するよう誘導される。
【００３７】
いくつかの実施形態において、細胞は哺乳動物血清およびＦＧＦ−２を含む培地中で培養される。いくつかの実施形態において、細胞は血小板溶解物および／または血小板溶解物成分を含む培地中で培養される。「血小板溶解物成分」という用語は、血小板溶解物中に通常見いだされる成分のいくつかのみを含む組成物を指す。例えば、特定の増殖因子が選択される、または選択を解除され得る。いくつかの実施形態において、細胞はＦＧＦ−２、および血小板溶解物および／または血小板溶解物成分を含む培地中で培養される。いくつかの実施形態において、細胞は哺乳動物血清、および血小板溶解物および／または血小板溶解物成分を含む培地中で培養される。いくつかの実施形態において、細胞はＴＧＦβを含む培地中で培養される。いくつかの実施形態において、細胞は無血清培地中で培養される。いくつかの実施形態において、細胞は血小板溶解物および／または血小板溶解物成分を含む無血清培地中で培養される。いくつかの実施形態において、細胞は増殖因子、例えばＦＧＦ−２および／またはＴＧＦβを含む無血清培地中で培養される。いくつかの実施形態において、細胞は哺乳動物血清を含む培地中で培養され、および哺乳動物血清はウシ胎児血清である。上記の培地の例はすべて、細胞がインテグリンα１０を発現するよう誘導するのに適している。しかし、細胞がインテグリンα１０を発現するよう誘導するのに適している他の培地も存在し、当業者に知られている。
【００３８】
いくつかの実施形態において、ＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団はｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞培養物である。
【００３９】
いくつかの実施形態において、細胞はアスコルビン酸をさらに含む培地中で培養される。
【００４０】
いくつかの実施形態において、細胞はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）をさらに含む培地中で保管される。
ＤＭＳＯは、保存目的で培地に存在してよく、総培養量の０と１２％の間、好ましくは、少なくとも１％、少なくとも２％など、例えば少なくとも３％、好ましくは少なくとも４％、少なくとも５％など、例えば少なくとも６％、好ましくは少なくとも７％、少なくとも８％など、例えば少なくとも９％、好ましくは総培養量の少なくとも１０％の量で含まれる。ＤＭＳＯは、細胞が解凍後に必要とする対象に直接投与され得るように細胞培養物の凍結および解凍を容易にするので、細胞の保存に有益である。ＤＭＳＯは、細胞を洗浄することによって解凍後に除去され得る。
【００４１】
いくつかの実施形態において、ＤＭＳＯは軟部組織腫脹、炎症、および急性外傷に伴う浮腫を減少させ、血流を上昇させ、血管拡張を増進させることによってＭＳＣの予防または治療作用を促進する。
【００４２】
いくつかの実施形態において、本発明は、インテグリンα１０、ＣＤ４４、ＣＤ９０、およびＣＤ１０５を発現し、かつＭＨＣＩＩおよびＣＤ４５が欠如しているＭＳＣを含む。
【００４３】
いくつかの実施形態において、ＭＳＣの集団は胎児、新生児、幼若、もしくは成体のＭＳＣおよび／または前駆体細胞に由来する。
【００４４】
いくつかの実施形態において、ＭＳＣの集団は胚細胞または胚に由来しない。
【００４５】
いくつかの実施形態において、本発明は、インテグリンα１０サブユニットを発現する未分化ＭＳＣを含むｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養物を包含する。
【００４６】
いくつかの実施形態において、細胞は、脂肪組織または骨髄組織由来である。いくつかの実施形態において、培養中の細胞は、軟骨細胞に分化する能力を有する。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、分化後に少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の軟骨細胞を含む。いくつかの実施形態において、細胞は、血清と、少なくとも１種の増殖誘導性増殖因子とを含有する培地中で分裂する。いくつかの実施形態において、細胞は、血清および増殖誘導性増殖因子が取り除かれると、軟骨細胞に分化する。いくつかの実施形態において、少なくとも１種の増殖誘導性増殖因子は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）−２または血小板溶解物、もしくはそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００４７】
いくつかの実施形態において、本発明は培養皿中にＭＳＣの集団を含み、細胞はインテグリンα１０の発現を誘導する成分を含有する培地と接触した、またはこれまでに接触したことがあり、およびインテグリンα１０陽性細胞のパーセンテージが総細胞の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％を含む。好ましくは、濃縮インテグリンα１０高集団に含まれるインテグリンα１０陽性細胞のパーセンテージは、総細胞の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％を含む。
【００４８】
いくつかの実施形態において、本発明は、懸濁培養液中にＭＳＣを含み、細胞はインテグリンα１０サブユニットまたはインテグリンα１０ポリペプチドを発現する。
【００４９】
いくつかの実施形態において、懸濁液中の細胞は実質的に細胞凝集体に形成される。例えば、細胞凝集体は、ペレットまたはスフェロイドの形態であり得る。いくつかの実施形態において、細胞凝集体は、増殖誘導性増殖因子を含有する培地中で維持される。
【００５０】
いくつかの実施形態において、ＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団はさらに、ＣＤ４４、ＣＤ９０、またはＣＤ１０５のうちの少なくとも１つを発現する。いくつかの実施形態において、ＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団はさらに、ＣＤ４４、ＣＤ９０の両方および／またはＣＤ１０５を発現する。いくつかの実施形態において、ＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団は、ＭＨＣＩＩまたはＣＤ４５を発現しない。
【００５１】
いくつかの実施形態において、培養物中の細胞はヒト、マウス、イヌ、またはウマの細胞である。いくつかの実施形態において、培養物中の細胞はヒトの細胞である。いくつかの実施形態において、培養物中の細胞はウマの細胞である。いくつかの実施形態において、培養物中の細胞はイヌの細胞である。
【００５２】
いくつかの実施形態において、濃縮インテグリンα１０高集団中の細胞は、間葉系幹細胞、間葉系前駆細胞、および間葉系間質細胞からなる群から選択される。
【００５３】
いくつかの実施形態において、濃縮インテグリンα１０高集団中の細胞は、ヒト胎児、新生児、幼若、またはヒト成体のＭＳＣに由来する。いくつかの実施形態において、培養物中の細胞は、ヒト胚細胞またはヒト胚に由来しない。
【００５４】
いくつかの実施形態において、ＭＳＣは、数量を増やし、かつインテグリンα１０の発現を誘導するよう培養される。
【００５５】
いくつかの実施形態において、ＭＳＣはプラスチック培養皿に付着する。いくつかの実施形態において、非付着性細胞は廃棄される。
【００５６】
いくつかの実施形態において、インテグリンα１０の発現は、規定培地を加えることによって誘導される。いくつかの実施形態において、この規定培地は、ウシ胎児血清およびＦＧＦ−２を補充したＤＭＥＭ、血小板溶解物を補充したＤＭＥＭ、またはＦＧＦ−２もしくは血小板溶解物と同じ機能を果たす因子を含む市販の合成培地である。いくつかの実施形態において、ＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＰＲＩＭＥ−ＸＶ（登録商標）ＭＳＣ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ＳＦＭまたはＳＴＥＭＭＡＣＳを含む培地中で培養される。
【００５７】
いくつかの実施形態において、インテグリンα１０を発現する細胞は抗インテグリンα１０抗体によって単離される。例えば、抗インテグリンα１０抗体はモノクローナル抗体であり得る。いくつかの実施形態において、抗体は、マウスにヒトインテグリンα１０ポリペプチドで免疫性を与えることによって生成される。いくつかの実施形態において、インテグリンα１０を発現しない細胞は廃棄される。
【００５８】
いくつかの実施形態において、ＭＳＣを発現するインテグリンα１０を濃縮したｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養物、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養物から単離したインテグリンα１０を発現するＭＳＣを、例えば、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）またはあらゆる同等の材料で作製された密閉型プラスチックバイアル中で冷凍し、保管する。それを必要とする対象に投与する前に、凍結細胞を解凍し、さらに処置せずに、または洗浄した後に投与できる。
【００５９】
いくつかの実施形態において、ＭＳＣの集団は投与前に、通常はさらに凍結する前に、細胞凝集体へと調製される。細胞凝集体はスフェロイドまたはペレットの形態であってよい。凝集体の形態で細胞を投与することは、それらが優れたホーミング能を有し軟骨をうまく模倣するので、有益である。
【００６０】
いくつかの実施形態において、インテグリンα１０発現ＭＳＣを濃縮したｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養物、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養物から単離したインテグリンα１０を発現するＭＳＣを、体細胞治療医薬品として、または組織工学製品として使用する。
【００６１】
治療の方法
本開示は、軟骨下骨硬化症および／または骨軟骨損傷を予防するおよび／または治療するための方法に関し、方法は必要とする対象にＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団を投与することを含む。
【００６２】
本開示は、変形性関節疾患（ＤＪＤ）、外傷関節傷害、および／または椎間板変性症を予防するおよび／または治療するための方法に関し、方法は必要とする対象にＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団を投与することを含む。
【００６３】
いくつかの実施形態において、ＤＪＤは、軟骨下骨硬化症、軟骨下骨の疾患、軟骨変性、外傷後変形性関節症、炎症性関節炎、および先天性奇形、および／または筋骨格系の変形からなる群から選択される。
【００６４】
いくつかの実施形態において、外傷関節傷害はスポーツ傷害を含む。
【００６５】
いくつかの実施形態において、外傷関節傷害は骨軟骨損傷、腱損傷、靭帯損傷、および筋損傷からなる群から選択される。
【００６６】
いくつかの実施形態において、骨軟骨損傷は関節軟骨損傷および／または骨損傷を含む。
【００６７】
いくつかの実施形態において、本開示の方法は、関節炎の治療または予防のために用いることができる。
【００６８】
本明細書に開示される方法で使用されるＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団は、上記「組成物」のセクションに詳述される。
【００６９】
本明細書に開示される方法の利点の１つは、ＭＳＣの濃縮インテグインα１０高集団が、インテグリンα１０発現のおかげで、高い付着性で効率的に、かつ容易に損傷した骨または軟骨に付着できることである。
【００７０】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される軟骨下骨硬化症および／または骨軟骨損傷を予防する方法は、インテグリンα１０を発現するよう誘導されるＭＳＣ細胞を、関節への傷害が生じた直後、例えば、発生当日、１週間以内、２週間以内、３週間以内、１ヵ月以内、２ヵ月以内、３ヵ月以内、または傷害の日から１年以内に投与することを含む。投与されたＭＳＣは、例えば、骨および軟骨での初期損傷を修復でき、したがって軟骨下骨硬化症の発症および進行性の軟骨分解を予防する、または最小限に抑える。さもなければこれらは、変形性関節症に進行する。実際、進行性の変形性関節障害として、変形性関節症は、軟骨損傷、軟骨下骨の変化、骨棘形成、筋力低下、および滑膜組織と腱の炎症によって特徴づけられる。変形性関節症は、関節軟骨の原発性疾患として長い間見なされてきたが、軟骨下骨に注目が高まっている。それは変形性関節症の病態形成において重要な役割を果たしていると一般的に報告されている。軟骨下骨硬化症は、進行性の軟骨分解と共に、変形性関節症の特徴と広く見なされている（Ｇｕａｎｇｙｉ  Ｌｉ，  Ｊｉｍｉｎ  Ｙｉｎ，  Ｊｕｎｊｉｅ  Ｇａｏ，  Ｔａｋ  Ｓ  Ｃｈｅｎｇ，  Ｎａｔｈａｎ  Ｊ  Ｐａｖｌｏｓ，  Ｃｈａｎｇｑｉｎｇ  Ｚｈａｎｇ，およびＭｉｎｇ  Ｈ  Ｚｈｅｎｇ；Ｓｕｂｃｈｏｎｄｒａｌ  ｂｏｎｅ  ｉｎ  ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ：ｉｎｓｉｇｈｔ  ｉｎｔｏ  ｒｉｓｋ  ｆａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｃｈａｎｇｅｓ；Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ  Ｔｈｅｒ．  ２０１３；１５（６）：  ２２３；ならびにＣａｓｔａｎｅｄａ  Ｓ，  Ｒｏｍａｎ−Ｂｌａｓ  ＪＡ，  Ｌａｒｇｏ  Ｒ，  Ｈｅｒｒｅｒｏ−Ｂｅａｕｍｏｎｔ  Ｇ；Ｓｕｂｃｈｏｎｄｒａｌ  ｂｏｎｅ  ａｓ  ａ  ｋｅｙ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ；Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ２０１２  Ｆｅｂ  １；８３（３）：３１５−２３）。さらに、骨軟骨病変または離断性骨軟骨炎は、あらゆる関節で起こり得るが、最も頻度の高いのは、膝と足首である。そのような病変は、関節中の骨の１つを覆う軟骨の裂傷または骨折である。軟骨は、引き裂かれ、押しつぶされ、または損傷を受けることがあり得、稀に嚢胞が軟骨中に形成されることがある。本開示は、軟骨下骨硬化症を治療するための方法を提供し、したがって、同方法を用いて、変形性関節症をうまく予防できる。
【００７１】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示する軟骨下骨硬化症および／または骨軟骨損傷を治療する方法は、インテグリンα１０を発現するよう誘導されるＭＳＣ細胞を軟骨下骨硬化症および／または骨軟骨損傷と診断された対象に投与することを含む。投与された、インテグリンα１０を発現するよう誘導されたＭＳＣ細胞は、関節の軟骨下層の肥厚を減少させ、および／または関節中の骨密度の増加を減少させ、それによって軟骨下骨硬化症および／または骨軟骨損傷を治療できる。
【００７２】
本明細書で用いる場合、「骨軟骨損傷または傷害」は、関節軟骨（コンドロ）と呼ばれる骨の末端上の滑面への傷害、さらにその下の骨（オステオ）への傷害である。傷害の程度は、関節内の小さいひびから、骨の一部が裂けるまでにわたる。これらの破片は大きさと深さが種々であり得、傷害を受けた領域に付着したまま（安定している）、または関節の内部で離れている（不安定である）状態であり得る。この傷害は、は青少年と若年成人で多くみられ、一般的に膝、足首、または肘で起こる。特に、骨軟骨欠損の認められる部位は、以下の通りである：大腿顆（最も頻度が高い）；上腕頭；距骨；および上腕骨小頭。この用語は、離断性骨軟骨炎を包含し、骨軟骨損傷または傷害と同義的に使われる。
【００７３】
いくつかの実施形態において、方法は対象において変形性関節症を治療することを含み、方法は、変形性関節症を有する、もしくは変形性関節症のリスクのある対象にＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団、または抗インテグリンα１０抗体を用いてＭＳＣ集団から単離されたＭＳＣを投与することを含み、それによって変形性関節症を治療する。
【００７４】
いくつかの実施形態において、方法は対象において変形性関節症の進行を遅延させること、または防止することを含み、方法は、抗インテグリンα１０抗体を用いてＭＳＣ集団から単離したＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団を、変形性関節症を有する対象に投与することを含み、変形性関節症の進行はＭＳＣを投与されていない対照と比較して遅延される。
【００７５】
いくつかの実施形態において、方法は軟骨下骨硬化症を治療することを含み、方法は、ＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団、または抗インテグリンα１０抗体を用いてＭＳＣ集団から単離した単離ＭＳＣを投与することを含み、それによって軟骨下骨硬化症を治療する。
【００７６】
いくつかの実施形態において、軟骨下骨硬化症を治療することは、関節周囲の骨形成の増加を予防すること、または後退させることを含む。いくつかの実施形態において、軟骨下骨硬化症を治療することは、関節の軟骨下層の肥厚を防止する、もしくは減少させること、または関節内の骨密度の増加を防止する、もしくは減少させることを含む。
【００７７】
いくつかの実施形態において、方法は、変形性骨および関節疾患を治療することを含み、方法は、ＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団、または抗インテグリンα１０抗体を用いてＭＳＣ集団から単離した単離ＭＳＣを投与することを含み、それによって変形性骨および関節疾患を治療する。
【００７８】
いくつかの実施形態において、方法は、変形性骨および関節疾患を予防することを含み、方法は、ＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団、または抗インテグリンα１０抗体を用いてＭＳＣ集団から単離した単離ＭＳＣを投与することを含み、それによって変形性骨および関節疾患を予防する。
【００７９】
いくつかの実施形態において、軟骨下骨硬化症または骨軟骨損傷は、変形性関節疾患、または先天性奇形、および／または筋骨格系の変形である。
【００８０】
いくつかの実施形態において、軟骨下骨硬化症または骨軟骨損傷は、変形性関節症、炎症性関節炎、椎間板変性症、スポーツ傷害、外傷関節傷害から選択される変形性関節疾患である。
【００８１】
いくつかの実施形態において、方法は、スポーツ傷害を治療することを含み、方法は、ＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団、または抗インテグリンα１０抗体を用いてＭＳＣ集団から単離した単離ＭＳＣを投与することを含み、それによってスポーツ傷害を治療する。
【００８２】
いくつかの実施形態において、方法は、外傷後変形性関節症（ＰＴＯＡ）を治療することを含み、方法は、ＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団、または抗インテグリンα１０抗体を用いてＭＳＣ集団から単離した単離ＭＳＣを投与することを含み、それによってＰＴＯＡを治療する。
【００８３】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のＭＳＣ組成物を投与することは、投与部位でのコラーゲン産生の増加をもたらす。いくつかの実施形態において、組成物の投与は、ＩＩ型コラーゲン合成の増加をもたらす。いくつかの実施形態において、ＩＩ型コラーゲン合成の増加は、コラーゲンの形成過程で放出されるカルボキシプロペプチドを測定し、したがってＩＩ型コラーゲン合成速度の変化を反映する、ＩＩ型プロコラーゲンＣ末端プロペプチド（プロコラーゲンＩＩ  Ｃ−プロペプチド）アッセイを用いて測定される。ＣＰＩＩは、対照肢と比較して治療肢からの滑液において大きい傾向があった。いくつかの実施形態において、組成物の投与は、プロテオグリカン産生の増加、および／またはラブリシンの増加をもたらす。
【００８４】
いくつかの実施形態において、対象において軟骨亀裂を治療する方法は、ＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団、または抗インテグリンα１０抗体を用いてＭＳＣ集団から単離されたＭＳＣを投与することを含み、それによって軟骨亀裂を治療する。いくつかの実施形態において、軟骨亀裂は軟骨細線維化を含む。いくつかの実施形態において、軟骨亀裂は関節軟骨または骨の末端の軟骨にある。いくつかの実施形態において、軟骨の層内に破損があると軟骨亀裂が生じ、層間に分離を引き起こす。軟骨亀裂は、骨軟骨損傷、軟骨損傷または傷害であり得る。
【００８５】
いくつかの実施形態において、軟骨亀裂を治療することは、傷害領域における構造損傷の軽減を含む。いくつかの実施形態において、軟骨亀裂を治療することは、軟骨損傷を防止することを含む。
【００８６】
いくつかの実施形態において、ＭＳＣは、細胞凝集体の形態で投与される。いくつかの実施形態において、ＭＳＣはペレットとして投与される。ペレットとしてＭＳＣを投与する手段は、当業者に知られている（ＢａｒｔｚらＪ．  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．  １４：３１７（２０１６）を参照されたい。これを参照によって本明細書に組み込む）。いくつかの実施形態において、ＭＳＣは、スフェロイドとして、またはマトリックス結合軟骨細胞インプラントとして軟骨に分化後に投与されてよい。これらの投与形態は、損害を受けた部位への細胞の容易なホーミングをもたらす。
【００８７】
いくつかの実施形態において、ＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団は、細胞懸濁液として投与される。ＭＳＣの薬学的有効量が投与される。ＭＳＣは、薬学的に許容される賦形剤と共に投与されてもよい。
【００８８】
いくつかの実施形態において、ＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団は、骨軟骨損傷、軟骨損傷、または関節もしくは骨への傷害を有する、またはこれまでに有した対象に投与される。いくつかの実施形態において、骨軟骨損傷、軟骨損傷もしくは傷害は破損、捻挫、挫傷、裂傷、骨折、または断裂である。例えば、損傷は軟骨亀裂または靭帯細線維化であり得る。いくつかの実施形態において、骨軟骨損傷、軟骨損傷または傷害は軟骨微小骨折である。いくつかの実施形態において、骨軟骨損傷、軟骨損傷または傷害は軟骨欠損である。いくつかの実施形態において、骨軟骨損傷、軟骨損傷または傷害は人工器官の装着の結果である。例えば、骨軟骨損傷、関節における軟骨損傷または傷害は、筋肉、腱、骨、靭帯、軟骨、または半月板においてである。
【００８９】
いくつかの実施形態において、ＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団は、骨の不整列を有する対象に投与される。
【００９０】
ＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団は、傷害後に疾患の発症を防止するために投与されてよい。ＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団は、傷害後に傷害を受けた関節および／または骨部位の外科的修復中に、投与されてよい。いくつかの実施形態において、ＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団は、破損後の接骨と同時に、例えば骨折した骨を修復する際に、投与される。
【００９１】
いくつかの実施形態において、ＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団は、抗炎症効果を有する。それにもかかわらず、ＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団は、別の治療の投与、例えば抗炎症剤と同時に、その前に、またはその後に投与されてよい。
【００９２】
いくつかの実施形態において、ＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団は、関節腔に投与されてよい。ＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団は、注射によって投与されてよい。
【００９３】
いくつかの実施形態において、ＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団は対象に投与され、上記対象はヒト、ウマ、ポニー、雄ウシ、ロバ、ラバ、ラクダ、ネコ、イニ、ブタ、または雌ウシである。好適な実施形態において、対象はヒトである。他の好適な実施形態において、対象はウマである。さらなる好適な実施形態において、対象はイヌである。
【００９４】
いくつかの実施形態において、投与されるＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団は同種異系または自己由来である。いくつかの実施形態において、ＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団および対象は、同じ種または属に由来する。いくつかの実施形態において、ＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団および対象は、異なる種または属に由来する。
【００９５】
いくつかの実施形態において、インテグリンα１０発現ＭＳＣを濃縮したｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養物、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養物から単離したインテグリンα１０を発現するＭＳＣは、体細胞治療医薬品として、または組織工学製品として投与される。
【００９６】
製造方法
本開示の一態様は、本明細書に開示されるＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団を製造する方法に関し、方法は、
ａ．脂肪組織、骨髄、滑膜、臍帯血、ワルトン膠様質、または羊水から幹細胞集団を単離すること、
ｂ．プラスチック培養容器中で単離された細胞を培養すること、
ｃ．非付着細胞を廃棄すること、
ｄ．培地を加えることによってインテグリンα１０発現を誘導することであって、培地が無血清培地、または哺乳動物血清を含む培地であり、および培地が血小板溶解物および／もしくは血小板溶解物成分、および／または増殖因子を含む、インテグリンα１０発現を誘導すること、
ｅ．インテグリンα１０を発現する細胞を選択すること、ならびに
ｆ．選択した細胞を拡張し、それによってＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団を生成すること
を含む。
【００９７】
いくつかの実施形態において、インテグリンα１０発現の誘導中の細胞は、上記「組成物」のセクションに記載の培地中で培養される。
【００９８】
いくつかの実施形態において、インテグリンα１０を発現する細胞は、ステップｅ．において上述の抗インテグリンα１０抗体を用いて選択される。
【００９９】
いくつかの実施形態において、得られたＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団は、上記「組成物」のセクションに記載の通りである。
【０１００】
いくつかの実施形態において、細胞は哺乳動物血清を含まない培地中で培養される。例えば、いくつかの実施形態において、細胞は、血小板溶解物または血小板溶解物成分を含む、またはこれらからなる培地中で培養される。
【０１０１】
項目
［項目１］
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の濃縮インテグリンα１０高集団であって、ＭＳＣ集団の細胞の少なくとも６０％がインテグリンα１０サブユニットを発現する、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の濃縮インテグリンα１０高集団。
［項目２］
上記集団に含まれる総細胞の少なくとも６５％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば少なくとも１００％がインテグリンα１０サブユニットを発現する、項目１に記載のＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
［項目３］
上記細胞がインテグリンα１０サブユニットを発現するよう誘導される、項目１〜２のいずれか１項に記載のＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
［項目４］
上記細胞が哺乳動物血清およびＦＧＦ−２を含む培地中で培養される、項目１〜３のいずれか１項に記載のＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
［項目５］
上記細胞が血小板溶解物および／または血小板溶解物成分を含む培地中で培養される、項目１〜４のいずれか１項に記載のＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
［項目６］
上記細胞がＦＧＦ−２、ならびに血小板溶解物および／または血小板溶解物成分を含む培地中で培養される、項目１〜５のいずれか１項に記載のＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
［項目７］
上記細胞が哺乳動物血清、ならびに血小板溶解物および／または血小板溶解物成分を含む培地中で培養される、項目１〜６のいずれか１項に記載のＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
［項目８］
上記細胞がＴＧＦβを含む培地中で培養される、項目１〜７のいずれか１項に記載のＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
［項目９］
上記細胞が血小板溶解物および／または血小板溶解物成分を含む無血清培地中で培養される、項目１〜８のいずれか１項に記載のＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
［項目１０］
上記細胞が増殖因子を含む無血清培地中で培養される、項目１〜９のいずれか１項に記載のＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
［項目１１］
上記細胞が増殖因子ＦＧＦ２および／またはＴＧＦβを含む無血清培地中で培養される、項目１〜１０のいずれか１項に記載のＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
［項目１２］
上記集団がｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞培養物である、項目１〜１１のいずれか１項に記載のＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
［項目１３］
項目１〜１２のいずれか１項の集団から抗インテグリンα１０抗体によって単離されたＭＳＣ。
［項目１４］
変形性関節疾患（ＤＪＤ）、外傷関節傷害、および／または椎間板変性症の予防または治療の方法での使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団であって、
上記ＭＳＣ集団の細胞の少なくとも６０％がインテグリンα１０サブユニットを発現し、ならびに
上記ＭＳＣが間葉系幹細胞、間葉系前駆細胞、および間葉系間質細胞からなる群から選択される、
変性関節疾患（ＤＪＤ）、外傷関節傷害、および／または椎間板変性症の予防または治療の方法での使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
［項目１５］
変形性関節疾患（ＤＪＤ）、外傷関節傷害、椎間板変性症、軟骨変性、軟骨下骨硬化症、外傷後変形性関節症、炎症性関節炎、軟骨下骨の疾患、スポーツ傷害、骨軟骨損傷、関節軟骨損傷、骨損傷、腱損傷、靭帯損傷、および／または筋損傷の予防または治療の方法での使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団であって、上記ＭＳＣ集団の細胞の少なくとも６０％がインテグリンα１０サブユニットを発現し、
上記ＭＳＣが間葉系幹細胞、間葉系前駆細胞、および間葉系間質細胞からなる群から選択される、
予防または治療の方法での使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
［項目１６］
ＤＪＤが軟骨下骨硬化症、軟骨下骨の疾患、軟骨変性、外傷後変形性関節症、炎症性関節炎、ならびに先天性奇形、および／または筋骨格系の変形からなる群から選択される、項目１４に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
［項目１７］
外傷関節傷害がスポーツ傷害を含む、項目１４および１６のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
［項目１８］
外傷関節傷害が骨軟骨損傷、腱損傷、靭帯損傷、および筋損傷からなる群から選択される、項目１４〜１７のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮イテグリンα１０高集団。
［項目１９］
骨軟骨損傷が関節軟骨損傷および／または骨損傷を含む、項目１４および１８のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮イテグリンα１０高集団。
［項目２０］
骨折治癒を促進する、または誘導するためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団であって、上記ＭＳＣ集団の細胞の少なくとも６０％がインテグリンα１０サブユニットを発現し、上記ＭＳＣが間葉系幹細胞、間葉系前駆細胞、および間葉系間質細胞からなる群から選択される、ＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
［項目２１］
上記集団に含まれる総細胞の少なくとも６５％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば少なくとも１００％がインテグリンα１０サブユニットを発現する、項目１４〜２０のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
［項目２２］
上記細胞がインテグリンα１０サブユニットを発現するよう誘導される、項目１４〜２１のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
［項目２３］
上記細胞が哺乳動物血清およびＦＧＦ−２を含む培地中で培養される、項目１４〜２２のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
［項目２４］
上記細胞が血小板溶解物および／または血小板溶解物成分を含む培地中で培養される、項目１４〜２３のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
［項目２５］
上記細胞が血小板溶解物および／または血小板溶解物成分を含む無血清培地中で培養される、項目１４〜２４のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
［項目２６］
上記細胞が増殖因子を含む無血清培地中で培養され、上記増殖因子がＦＧＦ２および／またはＴＧＦβである、項目１４〜２５のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
［項目２７］
上記細胞がＦＧＦ−２、ならびに血小板溶解物および／または血小板溶解物成分を含む培地中で培養される、項目１４〜２６のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
［項目２８］
上記細胞が哺乳動物血清、ならびに血小板溶解物および／または血小板溶解物成分を含む培地中で培養される、項目１４〜２７のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
［項目２９］
上記細胞がＴＧＦβを含む培地中で培養される、項目１４〜２８のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
［項目３０］
上記血清がウシ胎児血清である、項目１４〜２９のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
［項目３１］
上記集団がｉｎ  ｖｉｔｏ細胞培養物である、項目１４〜３０のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
［項目３２］
上記培地がアスコルビン酸をさらに含む、項目１４〜３１のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
［項目３３］
上記ＭＳＣが間葉系幹細胞、間葉系前駆細胞、および間葉系間質細胞からなる群から選択される、項目１４〜３２のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
［項目３４］
インテグリンα１０がインテグリンβ１サブユニットとの組み合わせでヘテロ二量体として発現される、項目１４〜３３のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
［項目３５］
インテグリンα１０を発現する細胞が抗インテグリンα１０抗体によって単離される、項目１４〜３４のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
［項目３６］
抗インテグリンα１０抗体がモノクローナル抗体である、項目１４〜３５のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
［項目３７］
上記抗体がマウスにヒトインテグリンα１０ポリペプチドで免疫性を与えることによって生成される、項目１４〜３６のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
［項目３８］
上記ＭＳＣがＭＨＣＩＩおよびＣＤ４５の非存在によってさらに特徴づけられる、項目１４〜３７のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
［項目３９］
上記ＭＳＣがＣＤ４４、ＣＤ９０、およびＣＤ１０５の存在によってさらに特徴づけられる、項目１４〜３８のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
［項目４０］
上記細胞が脂肪組織、骨髄、滑膜、末梢血、臍帯血（ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ）、臍帯血（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ）、ワルトン膠様質、または羊水に由来する、項目１４〜３９のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
［項目４１］
上記細胞が脂肪組織由来である、項目１４〜４０のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
［項目４２］
上記細胞が骨髄由来である、項目１４〜４１のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
［項目４３］
上記集団が軟骨下骨の疾患および／または骨軟骨損傷の予防の方法での使用のためである、項目１４〜４２のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
［項目４４］
上記集団が軟骨下骨の疾患および／または骨軟骨損傷の治療の方法での使用のためである、項目１４〜４３のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
［項目４５］
上記対象が骨軟骨損傷、軟骨損傷、または関節もしくは骨への傷害を有する、またはこれまでに有した、項目１４〜４４のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
［項目４６］
骨軟骨損傷、軟骨損傷または傷害が破損、捻挫、挫傷、裂傷、骨折、または断裂である、項目１４〜４５のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
［項目４７］
骨軟骨損傷、軟骨損傷または傷害が軟骨亀裂である、項目１４〜４６のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
［項目４８］
骨軟骨損傷、軟骨損傷または傷害が軟骨微小骨折である、項目１４〜４７のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
［項目４９］
骨軟骨損傷、軟骨損傷または傷害が軟骨欠損である、項目１４〜４８のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
［項目５０］
骨軟骨損傷、軟骨損傷または傷害が腱断裂または靭帯断裂である、項目１４〜４９のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
［項目５１］
骨軟骨損傷、軟骨損傷または傷害が骨折である、項目１４〜５０のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
［項目５２］
傷害がスポーツ傷害である、項目１４〜５１のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
［項目５３］
上記対象が骨の不整列を有する、項目１４〜５２のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
［項目５４］
骨軟骨損傷、軟骨損傷または傷害が人工器官の装着の結果である、項目１４〜５３のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
［項目５５］
骨軟骨損傷、関節における軟骨損傷または傷害が、筋肉、腱、骨、靭帯、軟骨、または半月板においてである、項目１４〜５４のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
［項目５６］
方法が軟骨下骨の疾患または骨軟骨損傷に起因する外傷後変形性関節症（ＰＴＯＡ）を予防する、項目１４〜５５のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
［項目５７］
上記ＭＳＣが同種異系または自己由来である、項目１４〜５６のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
［項目５８］
上記ＭＳＣが関節腔に投与される、項目１４〜５７のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
［項目５９］
上記ＭＳＣ集団が注射によって投与される、項目１４〜５８のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
［項目６０］
上記ＭＳＣ集団が薬学的に許容される賦形剤と共に細胞懸濁液中で投与される、項目１４〜５９のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
［項目６１］
上記ＭＳＣ集団が投与前に細胞凝集体に調製される、項目１４〜６０のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
［項目６２］
上記ＭＳＣ集団が損傷した関節および／または骨を修復するための手術中に投与される、項目１４〜６１のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
［項目６３］
上記ＭＳＣ集団が破損後の接骨と同時に投与される、項目１４〜６２のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
［項目６４］
上記対象がヒト、ウマ、ポニー、雄ウシ、ロバ、ラバ、ラクダ、ネコ、イニ、ブタ、または雌ウシである、項目１４〜６３のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
［項目６５］
上記対象がヒトである、項目１４〜６４のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
［項目６６］
上記対象がウマである、項目１４〜６５のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
［項目６７］
上記対象がイヌである、項目１４〜６６のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
［項目６８］
上記ＭＳＣおよび対象が同じ種または属に由来する、項目１４〜６７のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
［項目６９］
上記ＭＳＣおよび対象が異なる種または属に由来する、項目１４〜６８のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
［項目７０］
上記細胞が胎児、新生児、幼若、もしくは成体のＭＳＣおよび／または前駆体細胞に由来する、項目１４〜６９のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
［項目７１］
上記細胞が胚細胞または胚に由来しない、項目１４〜７０のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
［項目７２］
上記投与が投与部位でのコラーゲン産生の増加、プロテオグリカン産生の増加、および／またはラブリシンの増加をもたらす、項目１４〜７１のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
［項目７３］
上記ＭＳＣと組み合わせて抗炎症剤を投与することをさらに含む、項目１４〜７２のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
［項目７４］
上記ＭＳＣがＭＨＣＩＩおよびＣＤ４５を発現しない、項目１４〜７３のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
［項目７５］
上記ＭＳＣがＣＤ４４、ＣＤ９０、およびＣＤ１０５を発現する、項目１４〜７４のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
［項目７６］
変形性関節疾患（ＤＪＤ）、外傷関節傷害、および／または椎間板変性症の予防または治療用の薬物の調製のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団の使用であって、上記集団に含まれる総細胞の少なくとも６０％がインテグリンα１０サブユニットを発現し、上記ＭＳＣが間葉系幹細胞、間葉系前駆細胞、および間葉系間質細胞からなる群から選択される、ＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団の使用。
［項目７７］
対象において変形性関節疾患（ＤＪＤ）、外傷関節傷害、および／または椎間板変性症を治療するおよび／または予防する方法であって、軟骨下骨硬化症のリスクのある、または軟骨下骨硬化症を有する対象にＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団を投与することを含み、上記ＭＳＣ集団の細胞の少なくとも６０％がインテグリンα１０サブユニットを発現し、ならびに上記ＭＳＣが間葉系幹細胞、間葉系前駆細胞、および間葉系間質細胞からなる群から選択され、それによって変形性関節疾患（ＤＪＤ）、外傷関節傷害、および／または骨軟骨損傷を治療するおよび／または予防する方法。
［項目７８］
ＤＪＤが軟骨下骨硬化症、軟骨下骨の疾患、軟骨変性、外傷後変形性関節症、炎症性関節炎、ならびに先天性奇形、および／または筋骨格系の変形からなる群から選択される、項目７６および７７のいずれか１項目に記載の使用または方法。
［項目７９］
外傷関節傷害がスポーツ傷害を含む、項目７６〜７８のいずれか１項目に記載の使用または方法。
［項目８０］
外傷関節傷害が骨軟骨損傷、腱損傷、靭帯損傷、および筋損傷からなる群から選択される、項目７６〜７９のいずれか１項目に記載の使用または方法。
［項目８１］
骨軟骨損傷が関節軟骨損傷および／または骨損傷を含む、項目７６〜８０のいずれか１項目に記載の使用または方法。
［項目８２］
上記集団に含まれる総細胞の少なくとも６５％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば少なくとも１００％がインテグリンα１０サブユニットを発現する、項目７６〜８１のいずれか１項に記載の使用または方法。
［項目８３］
上記細胞がインテグリンα１０サブユニットを発現するよう誘導される、項目７６〜８２のいずれか１項目に記載の使用または方法。
［項目８４］
上記幹細胞が脂肪組織、骨髄、滑膜、末梢血、臍帯血（ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ）、臍帯血（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ）、ワルトン膠様質、または羊水に由来する、項目７６〜８３のいずれか１項に記載の使用または方法。
［項目８５］
上記ＭＳＣが脂肪組織に由来する、項目７６〜８４のいずれか１項に記載の使用または方法。
［項目８６］
上記ＭＳＣが骨髄に由来する、項目７６〜８５のいずれか１項に記載の使用または方法。
［項目８７］
上記対象が骨軟骨損傷、関節または骨への損傷もしくは傷害を有する、またはこれまでに有した、項目７６〜８６のいずれか１項に記載の使用または方法。
［項目８８］
骨軟骨損傷、軟骨損傷または傷害が破損、捻挫、挫傷、裂傷、骨折、または断裂である、項目７６〜８７のいずれか１項に記載の使用または方法。
［項目８９］
骨軟骨損傷、軟骨損傷または傷害が軟骨微小骨折である、項目７６〜８８のいずれか１項に記載の使用または方法。
［項目９０］
骨軟骨損傷、軟骨損傷または傷害が軟骨欠損である、項目７６〜８９のいずれか１項に記載の使用または方法。
［項目９１］
骨軟骨損傷、軟骨損傷または傷害が腱断裂または靭帯断裂である、項目７６〜９０のいずれか１項に記載の使用または方法。
［項目９２］
骨軟骨損傷、軟骨損傷または傷害が骨折である、項目７６〜９１のいずれか１項に記載の使用または方法。
［項目９３］
傷害がスポーツ傷害である、項目７６〜９２のいずれか１項に記載の使用または方法。
［項目９４］
上記対象が骨の不整列を有する、項目７６〜９３のいずれか１項に記載の使用または方法。
［項目９５］
骨軟骨損傷、軟骨損傷または傷害が人工器官の装着の結果である、項目７６〜９４のいずれか１項に記載の使用または方法。
［項目９６］
骨軟骨損傷、関節における軟骨損傷または傷害が、筋肉、腱、骨、靭帯、軟骨、または半月板においてである、項目７６〜９５のいずれか１項に記載の使用または方法。
［項目９７］
骨軟骨損傷、軟骨損傷または傷害が軟骨亀裂である、項目７６〜９６のいずれか１項に記載の使用または方法。
［項目９８］
上記使用または方法が軟骨下骨の疾患または骨軟骨損傷に起因する外傷後変形性関節症（ＰＴＯＡ）を予防する、項目７６〜９７のいずれか１項に記載の使用または方法。
［項目９９］
上記ＭＳＣが同種異系または自己由来である、項目７６〜９８のいずれか１項に記載の使用または方法。
［項目１００］
上記ＭＳＣが関節腔に投与される、項目７６〜９９のいずれか１項に記載の使用または方法。
［項目１０１］
上記ＭＳＣが注射によって投与される、項目７６〜１００のいずれか１項に記載の使用または方法。
［項目１０２］
上記ＭＳＣが薬学的に許容される賦形剤と共に細胞懸濁液中で投与される、項目７６〜１０１のいずれか１項に記載の使用または方法。
［項目１０３］
上記ＭＳＣが投与前に細胞凝集体に調製される、項目７６〜１０２のいずれか１項に記載の使用または方法。
［項目１０４］
上記ＭＳＣがジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む培地中で保管される、項目７６〜１０３のいずれか１項に記載の使用または方法。
［項目１０５］
上記ＭＳＣが損傷した関節または骨を修復するための手術中に投与される、項目７６〜１０４のいずれか１項に記載の使用または方法。
［項目１０６］
上記ＭＳＣが破損後の接骨と同時に投与される、項目７６〜１０５のいずれか１項に記載の使用または方法。
［項目１０７］
上記対象がヒト、ウマ、ポニー、雄ウシ、ロバ、ラバ、ラクダ、ネコ、イニ、ブタ、または雌ウシである、項目７６〜１０６のいずれか１項に記載の使用または方法。
［項目１０８］
上記対象がヒトである、項目７６〜１０７のいずれか１項に記載の使用または方法。
［項目１０９］
上記対象がウマである、項目７６〜１０８のいずれか１項に記載の使用または方法。
［項目１１０］
上記対象がイヌである、項目７６〜１０９のいずれか１項に記載の使用または方法。
［項目１１１］
上記ＭＳＣおよび対象が同じ種または属に由来する、項目７６〜１１０のいずれか１項に記載の使用または方法。
［項目１１２］
上記ＭＳＣおよび対象が異なる種または属に由来する、項目７６〜１１１のいずれか１項に記載の使用または方法。
［項目１１３］
上記細胞が胎児、新生児、幼若、もしくは成体のＭＳＣおよび／または前駆体細胞に由来する、項目７６〜１１２のいずれか１項に記載の使用または方法。
［項目１１４］
上記細胞が胚細胞または胚に由来しない、項目７５〜１１３のいずれか１項に記載の使用または方法。
［項目１１５］
上記投与が投与部位でのコラーゲン産生の増加、プロテオグリカン産生の増加、および／またはラブリシンの増加をもたらす、項目７６〜１１４のいずれか１項に記載の使用または方法。
［項目１１６］
上記ＭＳＣと組み合わせて抗炎症剤を投与することをさらに含む、項目７６〜１１５のいずれか１項に記載の使用または方法。
［項目１１７］
上記ＭＳＣがＭＨＣＩＩおよびＣＤ４５を発現しない、項目７６〜１１６のいずれか１項に記載の使用または方法。
［項目１１８］
上記ＭＳＣがＣＤ４４、ＣＤ９０、およびＣＤ１０５を発現する、項目７６〜１１７のいずれか１項に記載の使用または方法。
［項目１１９］
項目１〜１３のいずれか１項に記載のＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団を製造する方法であって、
ａ．幹細胞集団を脂肪組織、骨髄、滑膜、臍帯血、ワルトン膠様質、または羊水から単離すること、
ｂ．単離した細胞をプラスチック培養容器中で培養すること、
ｃ．非付着細胞を廃棄すること、
ｄ．培地を加えることによってインテグリンα１０発現を誘導することであって、培地が無血清培地、または哺乳動物血清を含む培地であり、および培地が血小板溶解物および／もしくは血小板溶解物成分、および／または増殖因子を含む、ンテグリンα１０発現を誘導すること、
ｅ．インテグリンα１０を発現する細胞を選択すること、ならびに
ｆ．選択した細胞を拡張し、それによってＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団を生成すること
を含む、方法。
［項目１２０］
ステップｄ．における培地が増殖因子ＦＧＦ２および／またｈＴＧＦβを含む、項目１１９に記載の方法。
【０１０２】
実施例
実施例１．ウマＭＳＣの特徴
ウマのＭＳＣを骨髄（ＢＭ）および脂肪組織（ＡＴ）から単離した。ＢＭ吸引液および頸部脂肪組織を、スウェーデン農業庁からの認可を得て健康なウマの死体から採取した。
【０１０３】
ＢＭ吸引液をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）−２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）５０μｇ／Ｌ、および抗生物質−抗真菌剤（Ｇｉｂｃｏ）１００Ｕ／ｍＬを補充したＤＭＥＭ−Ｆ１２培地（Ｇｉｂｃｏ）中でのプラスチック付着のために細胞培養フラスコに播種し、次いで４％Ｏ２、５％ＣＯ２の加湿インキュベーターで、３７℃でインキュベートした。２４時間後に、非付着性細胞を廃棄し、新鮮な培地を加えた。約８０％コンフルエントに達した細胞を、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｇｉｂｃｏ）を用いて継代培養し、拡張のために、Ｃｏｏｋ  Ｒｅｇｅｎｔｅｃからの５％ヒト血小板溶解物（ＰＬ）、５０μｇ／ＬのＦＧＦ−２、および抗生物質−抗真菌剤を含有するＤＭＥＭ  Ｆ−１２培地中にて１０４細胞／ｃｍ２の密度で再播種した。
【０１０４】
ウマ頸部由来のＡＴを無菌で細かく刻み、洗浄してから、３７℃で、１．５時間、穏やかに撹拌しながら０．１％Ｉ型コラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で分解消化した。試料を３００ｘｇで５分間、遠心分離し、その後、脂肪細胞層およびコラゲナーゼ上清を吸引した。残留する間質血管細胞群をＤＭＥＭ  Ｆ−１２培地で洗浄し、１００μｍのセルストレーナーを介して濾過し、次いで１０％ＦＢＳおよび抗生物質−抗真菌剤を補充したＤＭＥＭ  Ｆ−１２含有細胞培養フラスコに２００ｃｍ２あたり約３５ｍＬの脂肪組織の播種密度で播種した。細胞を４％Ｏ２、５％ＣＯ２の加湿インキュベーターで、３７℃にてインキュベートし、２４時間後に、非付着性細胞を廃棄し、ＤＭＥＭ  Ｆ−１２、５％ＰＬ、および抗生物質−抗真菌剤を含有する培地を加えた。培地を２〜３日毎に取り替え、細胞を、Ａｃｃｕｔａｓｅを用いて８０％コンフルエントで収集し、増殖のために、５％ＰＬ、５０μｇ／ＬのＦＧＦ−２、および抗生物質−抗真菌剤を含有するＤＭＥＭ  Ｆ−１２培地に５０００細胞／ｃｍ２の細胞密度で再播種した。
【０１０５】
各継代で、ＭＳＣを、表面マーカー（インテグリンα１０β１（Ｘｉｎｔｅｌａ）、ＣＤ９０（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＣＤ４４、ＣＤ１０５、ＣＤ４５およびＭＨＣクラスＩＩ（ＡｄＢ  Ｓｅｒｏｔｅｃ））のパネルを用いるフローサイトメトリー分析によって免疫表現型について決定した。手短に言えば、１００，０００の細胞を、１％ＦＢＳおよび０．１％アジ化ナトリウムを補充したＰＢＳ中で洗浄し、続いて選択的抗体とインキュベートした。インキュベーション後に、細胞を緩衝液中で２回洗浄し、ＢＤ  Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６フローサイトメーターを用いて得た。少なくとも２０，０００の細胞を得て、分析した。結果を陽性細胞のパーセンテージとして表す。
【０１０６】
細胞をＰＬおよびＦＧＦ−２と共に低酸素下で培養した。ＭＳＣは通常、幹様表現型を維持するためにＦＧＦ−２含有培地で増殖されることが多い。しかし、ＦＧＦ−２は培養物中のＭＳＣ上でＭＨＣクラスＩＩを増加させる２１。したがって、培養物には、最初にＰＬだけを補充した。ＢＭまたはＡＴから単離され血小板溶解物含有培地中で培養されたＭＳＣは、良好な増殖特性を示し、倍加時間はそれぞれ１．９日（４６時間）と１．６日（３８時間）であった。ＡＴ由来およびＢＭ由来の両細胞は、ＭＳＣに典型的な形態を示した。
【０１０７】
細胞を、フローサイトメトリーによりインテグリンα１０、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ９０、およびＣＤ１０５の発現について継続的にモニターした。ＭＳＣは、マーカーＣＤ４４、ＣＤ９０、およびＣＤ１０５を高レベルで発現し、造血細胞マーカーＣＤ４５およびＭＨＣクラスＩＩ（ＨＬＡ−ＤＲ）を欠いた（図１）。
【０１０８】
ヒトＭＳＣの場合、細胞表現型プラスチック付着性と、表面マーカーＣＤ７３、ＣＤ９０、およびＣＤ１０５の発現ならびにＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１４もしくはＣＤ１１ｂ、ＣＤ７９α、またはＣＤ１９、およびＨＬＡ−ＤＲ表面分子の非存在は、ＭＳＣ定義の最小表面抗原の基準を満たす９。ウマ細胞表面マーカーと反応する有効な抗体の欠如のため、ＣＤ７３、ＣＤ３４、ＣＤ１４もしくはＣＤ１１ｂ、ＣＤ７９α、またはＣＤ１９の発現は評価しなかった。しかし、ＡＴ由来およびＢＭ由来の両細胞は、プラスチックに付着し、検査ＭＳＣマーカーを発現し、ＣＤ４５またはＭＨＣクラスＩＩを発現せず、かつ軟骨細胞へと分化した。
【０１０９】
結論：インテグリンα１０を発現するＡＴ由来およびＢＭ由来の細胞はプラスチックに付着し、検査ＭＳＣマーカー（ＣＤ４４、ＣＤ９０、およびＣＤ１０５）を発現し、ＣＤ４５またはＭＨＣクラスＩＩを発現せずかつ軟骨細胞へと分化した。
【０１１０】
実施例２．ＭＳＣの軟骨細胞への分化
文献によれば、ウマＭＳＣは、軟骨細胞に分化するのが困難である１６〜１８。しかし、ヒトＡＴ−ＭＳＣによる試験は、これがＴＧＦβ受容体の欠如に起因し、したがって軟骨形成誘導シグナルＴＧＦβ１への無応答性による可能性があることを示す９。この欠失は、ヒトＡＴ由来ＭＳＣにおいてＴＧＦβ受容体発現を刺激するＢＭＰ−６を加えることによって克服できる２０。インテグリンα１０の発現は、ヒトＦＧＦ−２処置ＭＳＣで増加され、それに続いて軟骨形成分化能が改善される１５。ウマＡＴ由来ＭＳＣは、ウシ胎児血清含有培地中およびＦＧＦ−２含有培地中での通常の細胞培養において軟骨形成分化が起こる寸前であった。軟骨形成分化をまた、増殖因子を添加せず、ＴＧＦβ３のみ、またはＴＧＦβ３とＢＭＰ−６を２種の異なる濃度で含有する培地中での２８日間のインキュベーション後に、ペレット大量培養中のＩＩ型コラーゲン発現により比較した。ウマＢＭ由来ＭＳＣの軟骨形成分化を比較のために用いた。
【０１１１】
ウマＡＴ由来ＭＳＣを培養し、３継代に拡張した後、ＦＡＣＳＡｒｉａ（ＢＤ）によるインテグリンα１０蛍光活性化セルソーティングに供した。細胞を、モノクローナル抗インテグリンα１０（Ｘｉｎｔｅｌａ）を用いて染色し、生細胞をインテグリンα１０陽性細胞と、インテグリンα１０陰性細胞との２集団に選別した。生細胞／死細胞の識別を７−ＡＡＤ染色（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）と共に行った。選別した細胞を培地中で洗浄し、回収および１継代増殖のために再播種しその後軟骨形成分化実験を行った。
【０１１２】
非選別細胞およびインテグリンα１０選別細胞の軟骨形成分化能を決定するために、４継代のＭＳＣ２００，０００を、２０μｇ／ＬのＴＧＦβ３、２０μｇ／ＬのＢＭＰ−６、５０ｍｇ／ＬのＬ−アスコルビン酸−２−リン酸、１％インスリン・トランスフェリン・セレニウム（ＩＴＳ）、および１００ｎＭのデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充した、４．５ｇのグルコース／Ｌ（Ｇｉｂｃｏ）を含むＤＭＥＭからなる軟骨形成培地を含む１５ｍＬのポリプロピレンチューブ中でペレット化した。種々の増殖因子濃度およびこれらの組み合わせを試験して、ウマＡＴ由来ＭＳＣの軟骨形成分化の条件を最適化した。培地を１週間あたり３回変え、通常は２８日間、または軟骨形成時間研究で示されるように維持した。ペレットを、凍結切片用の最適切断温度化合物（Ｈｉｓｔｏ  Ｌａｂ）に包埋するか、またはＲＮＡ抽出のために急速凍結し−８０℃で保管した。非誘導の軟骨形成ペレット大量培養物を、以降の免疫組織学染色およびＰＣＲ実験において陰性対照として用いた。
【０１１３】
ペレットを、プロテオグリカンの検出のために凍結切片化しＡｌｃｉａｎ  Ｂｌｕｅで染色するか、または軟骨特異的タンパク質ＩＩ型コラーゲンに対する抗体（Ａｂ３０９２，Ａｂｃａｍ）およびインテグリンα１０に対する抗体（Ｘｉｎｔｅｌａ）を用いる免疫組織化学分析にかけた。
【０１１４】
結論：ＡＴ由来およびＢＭ由来ウマＭＳＣは、軟骨細胞に分化する。
【０１１５】
実施例３．インテグリンα１０の発現レベルは軟骨形成分化能と相関する
ＡＴ由来およびＢＭ由来のウマＭＳＣ上のインテグリンα１０β１の発現を検査した。ウマＡＴ由来ＭＳＣを培養し、３継代に拡張した後、ＦＡＣＳＡｒｉａ（ＢＤ）によるインテグリンα１０蛍光活性化セルソーティングに供した。細胞を、モノクローナル抗インテグリンα１０β１（Ｘｉｎｔｅｌａ）を用いて染色し、生細胞をインテグリンα１０陽性細胞と、インテグリンα１０陰性細胞との２集団に選別した。生細胞／死細胞の識別を７−ＡＡＤ染色（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）と共に行った。選別した細胞を培地中で洗浄し、回収および１継代増殖のために再播種した後軟骨形成分化実験を行った。
【０１１６】
インテグリンα１０発現のフローサイトメトリー分析は、インテグリンα１０発現がＡＴ由来ＭＳＣと比較して、ＢＭ由来ＭＳＣにおいてかなり高いことを明らかにした。ＢＭ由来ＭＳＣのほぼ１００％がインテグリンα１０陽性であり、それに比べＡＴ由来ＭＳＣの約３０％がインテグリンα１０陽性であった（図２Ａ〜Ｂ）。
【０１１７】
軟骨形成分化に対するインテグリンα１０の重要性を調べるために、ＡＴ由来ＭＳＣを、特異的モノクローナル抗体（モノクローナル抗体）を用いる蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳＡｒｉａ）によって２種の異なる細胞集団に選別した（図３Ａ）。免疫蛍光染色が示すように、すべてのインテグリンα１０高ＭＳＣはα１０β１を発現し、発現は細胞表面に局在した（図３Ｂ）。インテグリンα１０濃縮（α１０高）およびα１０枯渇（α１０低）の２種の細胞集団を次いで拡張し、ペレット大量培養で使用し、それらを未選別細胞と比較した。４種のウマドナー由来の細胞を使用した。選別した細胞をペレット大量培養に移し、２８日間分化させ、切片化し免疫組織化学によって分析した。ペレット凍結切片の免疫組織化学分析は、インテグリンα１０高で作製したペレットにおいてＩＩ型コラーゲンの強い標識を示し、一方でインテグリンα１０低ペレットにおいてはＩＩ型コラーゲンは少なかった（図４Ａ〜Ｄ）。
【０１１８】
ペレット大量培養の遺伝子発現分析を、未選別のおよび選別された（（α１０高）または（α１０低））ＡＴ由来ＭＳＣからのＲＮＡを用いて行った。ＧＡＰＤＨを内在性コントロールとして使用し、未選別細胞をΔΔＣｔ計算のための標準試料として使用した。全ＲＮＡを、Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ溶解キットビーズおよび「ホモジナイザー」を使用するＱＩＡｚｏｌ中でのペレットの均質化に続いてＲＮｅａｓｙ  Ｌｉｐｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｍｉｎｉキット（ＱＩＡＧＥＮ）によるＲＮＡ単離によって抽出した。ＲＮＡを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＶＩＬＯキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してｃＤＮＡに逆転写した。リアルタイムＰＣＲを、ＳｔｅｐＯｎｅ  Ｐｌｕｓ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でプロトコルに従ってＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ＩＩと共に、ウマ遺伝子（ＡＣＡＮ、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ２Ａ１、ＧＡＰＤＨ、ＲＵＮＸ２、およびＳＯＸ９）転写物についてＴａｑＭａｎアッセイを用いて行った。相対的ｍＲＮＡ発現を、ＧＡＰＤＨが内在性コントロール（ΔＣｔ）であり未選別細胞に対し正規化される（ΔΔＣｔ）、２−ΔΔＣｔ方法を使用して算出した。
【０１１９】
結論：遺伝子発現の結果は、インテグリンα１０低ペレットと比較してインテグリンα１０高ペレットにおけるＩＩ型コラーゲンおよびアグリカンのより高い発現を示し、インテグリンα１０高選別細胞からのペレットにおける良好な軟骨形成分化を示した。（図５）。
【０１２０】
実施例４．インテグリンα１０発現のレベルはホーミング能と相関する
非選別細胞およびインテグリンα１０選別細胞の無傷の軟骨または損傷軟骨へのホーミング能を決定するために、ＭＳＣを、回転するプラスチックチューブ中でウシ骨軟骨外植片と１時間インキュベートした。これらの外植片は２つの部位で損傷していた。１つは軟骨下骨組織を露出し、１つは軟骨だけを露出する浅い傷であった。１時間後に、付着細胞を未損傷領域、軟骨欠損、および軟骨下欠損について別々に計数した（ＩｍａｇｅＪプラグインの細胞計数によって）。２つの独立した実験からの結果を図６に示す。インテグリンα１０高細胞は、未選別細胞またはインテグリンα１０低細胞よりも全体的に良好に結合し（図６Ａ）、無傷軟骨（図６Ｂ）、軟骨欠損（図６Ｃ）、および軟骨下欠損（図６Ｄ）に良好に結合した。
【０１２１】
結論：これは、インテグリンα１０（α１０高細胞）を高レベルで発現する細胞が軟骨修復の関心領域へのホーミングが良好であり得ることを示す。
【０１２２】
実施例５．外傷後変形性関節症（ＰＴＯＡ）を有するウマにおけるインテグリンα１０β１陽性ＭＳＣの調査
本試験は、ウマＰＴＯＡモデルにおけるインテグリンα１０β１陽性ＭＳＣの安全性および有効性を評価した。
【０１２３】
Ａ．動物と手術
ウマを、年齢（２〜５年の範囲）に基づき試験に組み入れるために選択した。登録の前に、各ウマは、身体系異常、特に本試験に影響を与え得る骨格筋異常および神経学的異常を除外するために、通常の全身の健康診断および跛行評価を受けた。後脚が健全であり健康全般が良好であると決定されたウマだけを本試験に登録した。
【０１２４】
到着後、ウマを厩舎に閉じ込めた。臨床パラメータを術前に１回、術後３日間１日２回、次いで術後１０日間１日１回、評価した。毎日の健康診断は、バイタルパラメータ、粘膜の色、毛細血管再補充時間、胃腸運動、デジタルパルス、糞尿排泄量、食欲、および水分摂取を含んだ。健康診断値を各ウマの個体医療記録に記録した。麻酔を、認定獣医麻酔科医によって誘導し、維持し、モニターした。ウマを鎮静させ、次いで全身麻酔を、試験プロトコルとＩＡＣＵＣプロトコルに従って麻酔科医の裁量により誘導し維持した。さらなる薬物または輸液療法を、担当麻酔科医の裁量により、必要に応じて投与した。外科的処置の終了後、ウマを、パッドを入れた回復ボックスに横臥位に置いた。回復のためにウマに追加の鎮静剤を与えた。ウマが自発的に呼吸すると直ぐに、気管内チューブを取り外した。ウマを麻酔回復中モニターし続け、着実に立ち四肢すべてに完全に負荷がかかったならば厩舎に戻した。麻酔誘導、全身麻酔、または麻酔回復の間、重大な合併症はみられなかった。麻酔下のウマを背臥位に置き、左および右の後肢の足根骨関節を切った。皮膚の無菌処置および通常の滅菌ドレーピングを次いで行った。標準背側進入路を後肢の足根骨（距腿）関節に作成した。後述するように、１８ゲージ針を関節に配置し滑液を分析のために収集した。関節を生理食塩水で膨張させた。５ｍｍの刺切を伸筋腱の横に作成し、関節鏡を挿入した。関節を探索し、針を用いてインパクター導入のためのポータル位置を決定した。その先端が距骨の内側滑車稜の軸面に対して垂直になるようにインパクターを関節内に配置した。約１ｃｍ間隔を置いて、３回の衝撃を距骨の内側滑車稜の軸側面に適用した。衝撃力を、インパクター内のロードセルにより衝撃中に記録した。滑膜生検を組織学分析のために採取した。この方法を反対側の肢で繰り返した。関節鏡の映像をすべての手術で得た。皮膚切開を、非吸収性縫合材料を使用して簡単な中断パターンで閉じ、関節に包帯を巻き、ウマを回復のために運んだ。
【０１２５】
Ｂ．ウマインテグリンα１０選択ＭＳＣの準備および注射
実施例１〜３によって調製され、以降「Ｅｑ１２ａ１０＋．１細胞」と呼ばれる、ウマインテグリンα１０選択ＭＳＣ細胞を、これらの試験で使用した。Ｅｑ１２ａ１０＋．１細胞を、使用まで液体窒素中で保管した（衝撃外科手術後４日間）。バイアルを解凍し、細胞を計数し、生存率を、トリパンブルーを使用して評価した。細胞を次いで遠心分離し、約６×１０６細胞／ｍＬの濃度でＰＢＳに再懸濁した。細胞を、注射のために直ちに処置領域に移した。
【０１２６】
細胞懸濁液と対照ＰＢＳの両方の３ｍＬアリコートを、３インチの１８ゲージ針を通して６ｍＬシリンジに無菌的に引き込んだ。細胞を２０〜３０秒にわたりゆっくりと吸引した。注射に備えるために、ウマを必要に応じて化学的および物理的に拘束し、距腿関節の背内側嚢を両側で、無菌的に準備した。被験物質を受ける無作為の肢に最初に注射し、１９ゲージ針を距腿関節の背内側コンパートメントに挿入し、滑液を３ｍＬシリンジに吸引し、次いで充填したシリンジを取り付け、溶液をゆっくりと着実なペース（３〜５秒にわたり）で空にして百万を超える細胞を関節腔に送達した。同じ方法をで、反対側の肢への対照ＰＢＳの注射について行った。
【０１２７】
術前の準備および麻酔を、初回手術に関して上述したように行った。麻酔下のウマを背臥位に置き、左および右の足根骨関節を切り準備し、通常のドレーピングを行った。標準背外側進入路を足根骨関節に作成した。後述するように、１８ゲージ針を距腿関節に配置し滑液を分析のために収集した。関節を生理食塩水で膨張させた。５ｍｍの刺切を関節鏡スリーブ用に伸筋腱の横に作成した。関節を探索し、ＩＣＲＳスコアリング法を用いて、スコア化した。滑膜生検を組織学分析のために採取した。この方法を反対側の肢で繰り返した。皮膚切開を、非吸収性縫合材料を使用して閉じ、足根骨関節に包帯を巻き、ウマを回復のために運んだ。術後回復は、上述のとおりであった。
【０１２８】
各距腿関節からの滑液試料を、衝撃外科手術の直前、術後４日目、７日目、１４日目、２８日目、４２日目、７０日目、９８日目、１２６日目、１５４日目、ならびに安楽死時にすべてのウマから吸引した。衝撃外科手術、被験物質注射、および６週目の再検査手術以外の時点で、ウマを必要に応じて化学的および物理的に拘束し、距腿関節の背内側嚢を両側で、無菌的に準備した。１９ゲージ針を距腿関節の背内側コンパートメントに挿入し、滑液を３ｍＬシリンジに吸引した。約１ｍＬの吸引液を完全滑液評価（スメアおよび白血球百分率）のために、Ｃｏｒｎｅｌｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに提出した。残りの滑液試料を遠心分離して細胞ペレットを除去し、微小遠心管に移し、−８０℃の冷凍庫に保管した。
【０１２９】
６ヵ月目に、ウマを鎮静させ、ＡＶＭＡガイドラインに従って、バルビツレート（ペントバルビタール）の静脈内過量投与により人道的に安楽死させた。滑液を無菌方法によって採取し、標準解剖検査を認定獣医病理学者によって行った。主要器官の組織試料を組織学的検査のために収集した。距腿関節を収集し、識別用のタグを付け、冷却器での輸送のために包装した。一連の管理形態を常に関節で保った。
【０１３０】
Ｃ．分析
ＭＲＩ検査の後、距腿関節を切開して、検査した。滑膜の試料を収集し、組織学的処理のために固定した。墨汁を関節面に塗布し、デジタル写真を撮った。墨汁は微粒炭素を含み、軟骨完全性が損なわれている関節面の領域に付着する。衝撃部位ならびに非衝撃対照軟骨を含有する骨軟骨ブロックを収集し、組織学的処理のために固定した。
【０１３１】
複数のサンプリング時間による関節の健康の各評価項目（跛行、滑液分析、滑液ＥＬＩＳＡ、関節鏡スコア、滑膜組織像）について、混合効果モデルを、変量効果としてのウマのデータ、ならびに固定効果としての処置（対照または処置）と時間および処置＊時間の交互作用項のデータに適合させた。チューキーのポストホックおよび線形対比を適宜使用して、特定の目的の群間の差を検定した。対応のあるｔ検定を、軟骨組織学およびＭＲＩスコアで行った。統計分析を、ＪＭＰ  １２（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，  Ｃａｒｙ，  Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ，  ＵＳＡ）を使用して行った。有意性をｐ＜０．０５で設定した。
【０１３２】
大多数の分析のモデル適合度は、適正（調整済みＲ２＝０．２５〜０．５０）または良好（Ｒ２＝０．５０〜０．７５）であり、ｉｎ  ｖｉｖｏの動物試験に許容できると考えられる。いくつかの症例では、モデル適合度は、劣っていた（調整済みＲ２＝＜０．２５）。
【０１３３】
Ｄ．Ｘ線画像の結果
要約したＸ線画像データを表５に示す。
ベースライン（術前）所見：術前Ｘ線画像では、１症例を除くすべてのウマは、Ｘ線画像上正常な足根骨関節を有し、硬化、関節周囲骨棘、関節腔狭小化、または関節の腫れは無かった。１症例のウマに、近位中心足根骨の背内側表面に軽度の関節周囲骨棘が認められた。これは、記録され、試験の選択基準にとって重要でないと決定された。
【０１３４】
軟骨下骨硬化：６ヵ月の試験終了時に、対照群は、処置群よりもかなり多い硬化を有した（図７；ｐ＝０．００４；調整済みＲ２＝０．０３）。硬化は骨密度を上げ、それは骨を硬くし、骨が関節軟骨から離れて力を吸収し伝える能力を減じる。硬化は骨関節症の特徴であり、軟骨劣化の原因または結果であり得る。本試験は外傷後変形性関節症のためのモデル系であるので、したがって軟骨下骨質硬化の増加は関節外傷の結果であるということになり、このモデルが変形性関節症を誘導することを検証する。試験終了時での対照群における硬化の増加は、対照群において軟骨が、体重負荷中に伝達される力の吸収が増加することに起因して経時的に劣化し続けることを示唆する。
【０１３５】
結論：６ヵ月の試験終了時に、より少ないＸ線撮影軟骨下骨質硬化が、対照群と比較して処置肢で見出された。軟骨下骨質硬化はおそらく、継続する軟骨劣化および関節炎の進行をもたらし、この影響は運動に直面して増強されると予想される。
【０１３６】
Ｅ．滑液ＥＬＩＳＡの結果
６回のＥＬＩＳＡを術後０日目、４日目、７日目、１４日目、２８日目、４２日目、７０日目、９８日目、１２６日目、１５４日目、および１６９日目の時点で、左および右距腿関節から採取した滑液試料で行った。試料を遠心分離して細胞片を除去し、分析まで−８０℃で保管した。要約したデータを以下の表９に示す。
【０１３７】
プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ−２）：ＭＳＣは、ＰＧＥ−２の発現上昇を部分的に介する、免疫調節性であると考えられている。ＰＧＥ−２は、０日目〜２８日目に処置群および対照群の双方で増加した。それは次いで、急激に減少し低いままであったが、試験を通してベースライン値よりも高かった。ＰＧＥ−２濃度は、１１時点のうち９時点で、対照肢と比較して、処置群において高かった。
２８日目で、ＰＧＥ−２は、０日目、４日目、４２日目、５６日目、１２６日目、および１５４日目の時点での対照と比較して、処置肢においてかなり増加し（図８）、対照肢と比較して、処置肢において術後の関節環境の調節が向上したことを示唆している。
【０１３８】
コラーゲンＣＰＩＩ：このアッセイは、プロコラーゲンＩＩＣ末端プロペプチドアッセイとしても知られている。ＣＰＩＩアッセイは、コラーゲンの形成過程で放出されるカルボキシプロペプチドを測定し、したがってＩＩ型コラーゲン合成速度の変化を反映する。ＣＰＩＩは、対照肢と比較して処置肢からの滑液中で多い傾向があり（図９）、処置肢におけるＩＩ型コラーゲン合成の増加を示唆する。処置肢および対照肢の双方は、０時点および試験完了時と比較して、術後７日目と１４日目にＣＰＩＩが増加した。
【０１３９】
コラーゲンＣ２Ｃ：このアッセイは、コラゲナーゼによるＩＩ型コラーゲンの切断を介して（３／４ペプチドのＣ末端で）生成されるネオエピトープを測定する。Ｃ２Ｃ濃度は、術後４〜１４日目に処置関節および対照関節においてかなり増加し（図１０）、次いで試験を通して、０日目と大きく異ならない値に減少した。ＴＮＦ−αのように、これは、軽度外傷後変形性関節症の１つとしてのモデルを支持する。
【０１４０】
Ｆ．軟骨組織学的検査の結果
Ｈ＆ＥおよびＳａｆｒａｎｉｎ−Ｏファストグリーンで染色したすべての骨軟骨標本を研究者のコンセンサスによってスコア化した。研究者らはスコアリングの間、処置群に対して盲検化された。データを、表１１に要約したデータと共に図１１に示す。すべてのウマについて、各関節において軟骨の２カ所の非衝撃領域、すなわち距骨の外側滑車稜と、内側滑車稜上の衝撃領域と関節でつながる対向する関節面である脛骨の遠位中間稜とを検査した。両方の試料を検査し、次いで単一スコアを非衝撃軟骨に割り当てた。すべてのウマについて、３つの衝撃の各々を含有する内側滑車稜の病巣領域を検査し、次いで単一スコアを各関節の衝撃軟骨に割り当てた。
【０１４１】
全体的な観察−衝撃軟骨：予想どおり、軟骨のすべての衝撃領域は中等度〜重度の異常軟骨スコアを有した。
【０１４２】
総関節スコア：結果はＭＳＣ処置が亀裂形成／細線維化についてかなり良好なスコアをもたらしたことを示す。
他のすべての成分スコアならびに総スコアも、対照と比較して、処置群において良好であった（表１１）。
【０１４３】
軟骨の亀裂形成／細線維化：処置関節は、細線維化／亀裂形成（図１２、ｐ＝０．０３９、片側ｔ検定）について、およびΔ細線維化／亀裂形成（ｐ＝０．０３０、片側ｔ検定）についてかなり低い（良好な）スコアを有する。この所見は、処置関節が対照よりも傷害領域において構造損傷が少なかったことを示す。
【０１４４】
さらなる観察：軟骨の裂け目は、いくつかの標本中で、主観的に処置肢においてより多く治癒されることが認められた。この治癒タイプの反応は、これまでに外傷後変形性関節症のこの動物モデルにおいて認められていなかった。軟骨下骨質硬化は、同様に多数の標本で観察できる。
【０１４５】
【表１】
2020505916.tif 000003
【０１４６】
Ｆ．骨軟骨の免疫組織化学的検査（Ｉ型およびＩＩ型コラーゲンＩ）の結果
Ｉ型およびＩＩ型コラーゲンについての免疫組織化学的検査を骨軟骨切片で行った（図１１）。墨汁染色も行った（図１３）。本アッセイにおける本質的に高いばらつきのため、免疫組織化学切片の定量的評価は行わなかった。
【０１４７】
Ｉ型コラーゲン−非衝撃（離れた）軟骨：Ｉ型コラーゲンについての免疫組織化学は、処置対照肢および非処置対照肢の両方において離れた対照試料中でほとんど目立たず、関節軟骨のＩ型コラーゲン染色はなかった。
【０１４８】
Ｉ型コラーゲン−衝撃軟骨：Ｉ型コラーゲンの染色は、衝撃領域に限定され、全体的に関節軟骨面内の１／４〜１／２に達した。変化は極めて少なく、処置肢と対照肢の間に差は認められなかった。修復組織の領域において（上述の「さらなる主観的観察」）、染色は修復組織の１／２の深さでみられただけであった。
【０１４９】
ＩＩ型コラーゲン−非衝撃（離れた）軟骨：ＩＩ型コラーゲンについての免疫組織化学は、対照試料においてほとんど目立たず、ＩＩ型コラーゲンが軟骨全体に均一に分布していた。
【０１５０】
ＩＩ型コラーゲン−衝撃軟骨：対照関節または処置関節においてＩＩ型コラーゲンが失われた領域は少なかった。衝撃に隣接した領域において、ＩＩ型コラーゲンの染色はわずかに減少していた。Ｉ型コラーゲンと同様に、線維性修復の領域は、修復組織のより深い層で、ＩＩ型コラーゲンを染色しただけであった。
【０１５１】
免疫調節ケモカイン：本試験において最もＭＳＣ特異的な所見は、対照と比較してＥｑ１２ａ１０＋．１ＭＳＣで処置した関節においてＰＧＥ−２濃度が上昇したことであった。ＰＧＥ−２は、ケモカインおよび炎症誘導性細胞の走化性を調節し、したがって免疫病理学の重要なメディエーターである。すべての細胞はＰＧＥ−２を生成でき、ＭＳＣは、骨髄系細胞および間質細胞によってＰＧＥ−２の発現を増加させることが知られている。本試験において、滑液中のＰＧＥ−２濃度は、２８日目にピークに達し、次いで本試験の残りの期間、減少した。
【０１５２】
結論：本前臨床試験は、外傷後変形性関節症の処置のためのＥｑ１２ａ１０＋．１  ＭＳＣの使用を支持する。この処置は安全であり、関節外傷の影響を軽減する際に効果的であり得ることを示唆する強力なエビデンスがある。例えば、軟骨の裂け目は、いくつかの標本中で、主観的に処置肢においてより多く治癒されることが認められた。この治癒タイプの反応は、これまでに外傷後変形性関節症のこの動物モデルにおいて認められていなかった。
【０１５３】
実施例６．免疫抑制
脂肪組織から単離されたウマインテグリンα１０選択ＭＳＣの免疫抑制能も、検査した。免疫抑制アッセイを、異なる比率の同種異系ＭＳＣとの共培養物中で７２時間コンカナバリンＡで末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を刺激することにより行った。リンパ球増殖を、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を加えてから２４時間後にＢｒｄＵ取り込みのフローサイトメトリー分析により測定した。Ｔ細胞を発現するＢｒｄＵ陽性ＣＤ４の出現頻度を図１４に示す。
【０１５４】
結論：脂肪組織から単離されたウマインテグリンα１０選択ＭＳＣは、ＭＳＣ対ＰＢＭＣの比率の上昇を伴うリンパ球増殖の低下として示される、Ｔ細胞上での免疫調節能を有する。最大の免疫抑制効果は、ＭＳＣ対ＰＢＭＣの１：１比率で生じた。
【０１５５】
均等物
前述の文書による明細書は、当業者が実施形態を実行できるのに十分であると考えられる。前述の説明および実施例は、特定の実施形態を詳述し、本発明者らによって意図される最良の形態を述べる。しかし、前述が本文においてどんなに詳述されているように見えても、実施形態は多くの方法で行われることが可能であり、添付の特許請求の範囲、およびそのいずれの均等物に従って解釈さるべきであることが理解されよう。
【０１５６】
本明細書で用いる場合、約という用語は、明示的に示されているか否かに関わらず、例えば、整数、分数、およびパーセンテージを含む数値を指す。大体という用語は、当業者が記載された値に相当する（例えば、同じ機能または結果を有する）と考える数値の範囲（例えば、記載された範囲の±５〜１０％）を指す。少なくとも、および約などの用語が数値または範囲のリストに先行する場合、その用語はリストに記載されたすべての値または範囲を修飾する。場合によっては、約という用語は、最も近い有効数字にまるめられる数値を含み得る。
【０１５７】
参考文献
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１２．Ｌｕｎｄｇｒｅｎ−Ａｋｅｒｌｕｎｄ  Ｅ，  Ａｓｚｏｄｉ  Ａ  （２０１４）．  Ｉｎｔｅｇｒｉｎ  α１０ｂ１：  ａ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｉｎ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．  Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ  ８１９，  ６１−７１．
１３．Ｇｏｕｔｔｅｎｏｉｒｅ  Ｊ，  Ｂｏｕｇａｕｌｔ  Ｃ，  Ａｕｂｅｒｔ−Ｆｏｕｃｈｅｒ  Ｅ，  Ｐｅｒｒｉｅｒ  Ｅ，  Ｒｏｎｚｉｅｒｅ  ＭＣ，  Ｓａｎｄｅｌｌ  Ｌ，ら（２０１０）．  ＢＭＰ−２  ａｎｄ  ＴＧＦ−ｂｅｔａ１  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ  ａｎｄ  α１０  ａｎｄ  ａｌｐｈａ１１  ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ８９，  ３０７−３１４．
１４．Ｇｉｇｏｕｔ  Ａ，  Ｊｏｌｉｃｏｅｕｒ  Ｍ，  Ｎｅｌｅａ  Ｍ，  Ｒａｙｎａｌ  Ｎ，  Ｆａｒｎｄａｌｅ  Ｒ，  Ｂｕｓｃｈｍａｎｎ  ＭＤ  （２００８）．  Ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｓ  ＧＦＯＧＥＲ−ＧＰＰ−  ａｎｄ  ｂｅｔａ１  ｉｎｔｅｇｒｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８３，  ３１５２２−３１５３０．
１５．Ｖａｒａｓ  Ｌ，  Ｏｈｌｓｓｏｎ  ＬＢ，  Ｈｏｎｅｔｈ  Ｇ，  Ｏｌｓｓｏｎ  Ａ，  Ｂｅｎｇｔｓｓｏｎ  Ｔ，  Ｗｉｂｅｒｇ  Ｃ，  Ｂｏｃｋｅｒｍａｎｎ  Ｒ，  Ｊａｒｎｕｍ  Ｓ，  Ｒｉｃｈｔｅｒ  Ｊ，  Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ  Ｄ，  Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ  Ｂ，  Ｌｕｎｄｇｒｅｎ−Ａｋｅｒｌｕｎｄ  Ｅ，  Ｋｊｅｌｌｍａｎ  Ｃ  （２００７）．  Α１０  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｓ  ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｏｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−２−ｔｒｅａｔｅｄ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ．  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ  １６，  ９６５−９７８．
１６．Ｖｉｄａｌ  ＭＡ，  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ＳＯ，  Ｌｏｐｅｚ  ＭＪ，ら（２００８）  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｉｎ  Ｅｑｕｉｎｅ  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｒｏｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  Ａｄｉｐｏｓｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ．  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ｓｕｒｇｅｒｙ  ３７，  ７１３−７２４．  ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．１５３２−９５０Ｘ．２００８．００４６２．ｘ．
１７．Ｋｉｓｉｄａｙ，  Ｊ．  Ｄ．，  Ｋｏｐｅｓｋｙ，  Ｐ．  Ｗ．，  Ｅｖａｎｓ，  Ｃ．  Ｈ．，  Ｇｒｏｄｚｉｎｓｋｙ，  Ａ．  Ｊ．，  ＭｃＩｌｗｒａｉｔｈ，  Ｃ．  Ｗ．  ａｎｄ  Ｆｒｉｓｂｉｅ，  Ｄ．  Ｄ．  （２００８），  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｕｌｔ  ｅｑｕｉｎｅ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ−  ａｎｄ  ａｄｉｐｏｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ  ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｈｙｄｒｏｇｅｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ．  Ｊ．  Ｏｒｔｈｏｐ．  Ｒｅｓ．，  ２６，  ３２２−３３１．  ｄｏｉ：１０．１００２／ｊｏｒ．２０５０８
１８．Ｂｕｒｋ  Ｊ，  Ｒｉｂｉｔｓｃｈ  Ｉ，  Ｇｉｔｔｅｌ  Ｃ，  Ｊｕｅｌｋｅ  Ｈ，  Ｋａｓｐｅｒ  Ｃ，  Ｓｔａｓｚｙｋ  Ｃ，  Ｂｒｅｈｍ  Ｗ．  （２０１３）．  Ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ｅｑｕｉｎｅ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｓｏｕｒｃｅｓ．  Ｖｅｔ  Ｊ．  １９５，  ９８−１０６．  ｄｏｉ：  １０．１０１６／ｊ．ｔｖｊｌ．２０１２．０６．００４．  Ｅｐｕｂ  ２０１２  Ｊｕｌ  ２６．
１９．Ｈｅｎｎｉｇ  Ｔ，  Ｌｏｒｅｎｚ  Ｈ，  Ｔｈｉｅｌ  Ａ，  Ｇｏｅｔｚｋｅ  Ｋ，  Ｄｉｃｋｈｕｔ  Ａ，  Ｇｅｉｇｅｒ  Ｆ，  Ｒｉｃｈｔｅｒ  Ｗ  （２００７）．  Ｒｅｄｕｃｅｄ  ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ａｌｔｅｒｅｄ  ＴＧＦｂｅｔａ  βｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｄ  ＢＭＰ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ａｎｄ  ｉｓ  ｏｖｅｒｃｏｍｅ  ｂｙ  ＢＭＰ−６．  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２１１，  ６８２−６９１．
２０．Ｅｓｔｅｓ  ＢＴ，  Ｗｕ  ＡＷ，  Ｇｕｉｌａｋ  Ｆ  （２００６）．  Ｐｏｔｅｎｔ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｄｉｐｏｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ａｄｕｌｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ６．  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．５４，  １２２２−１２３２．
２１．Ｂｏｃｅｌｌｉ−Ｔｙｎｄａｌｌ  Ｃ．，  Ｚａｉａｃ  Ｐ．，  Ｄｉ  Ｍａｇｇｉｏ  Ｎ．，  Ｔｒｅｌｌａ  Ｅ．，  Ｂｅｎｖｅｎｕｔｏ  Ｆ．，  Ｉｅｚｚｉ  Ｇ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）．  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ２  ａｎｄ  ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ，  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｌｙｓａｔｅ，  ｉｎｄｕｃｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ，  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．  ６２，  ３８１５−３８２５．
２２．Ｓｕ  Ｘ，  Ｚｕｏ  Ｗ，  Ｗｕ  Ｚ，  Ｃｈｅｎ  Ｊ，  Ｗｕ  Ｎ，  Ｍａ  Ｐ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１５）．  ＣＤ１４６  ａｓ  ａ  ｎｅｗ  ｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  ａｎ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｃｈｏｎｄｒｏｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ  ｓｕｂ−ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｌａｔｅｒ  ｓｔａｇｅｓ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ．  Ｊ  Ｏｒｔｈｏｐ  Ｒｅｓ．  ３３，  ８４−９１．
２３．Ｓｃｈｒｏｂｂａｃｋ  Ｋ，  Ｗｒｏｂｅｌ  Ｊ，  Ｈｕｔｍａｃｈｅｒ  ＤＷ，  Ｗｏｏｄｆｉｅｌｄ  ＴＢ，  Ｋｌｅｉｎ  ＴＪ．  （２０１３）．  Ｓｔａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ−４  ｉｓ  ｎｏｔ  ａ  ｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ  ａｎｄ  ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  Ｐａｒｔ  Ａ．  １９，１３１６−１３２６．
２４．Ｔａｌｌｏｎｅ  Ｔ，  Ｒｅａｌｉｎｉ  Ｃ，  Ｂｏｈｍｌｅｒ  Ａ，  Ｋｏｒｎｆｅｌｄ  Ｃ，  Ｖａｓｓａｌｌｉ  Ｇ，  Ｍｏｃｃｅｔｔｉ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）．  Ａｄｕｌｔ  ｈｕｍａｎ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｏｎｔａｉｎｓ  ｓｅｖｅｒａｌ  ｔｙｐｅｓ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｒｅｓ．  ４，  ２００−２１０．
【図１−１】
2020505916.tif 000004
【図１−２】
2020505916.tif 000005
【図２Ａ】
2020505916.tif 000006
【図２Ｂ】
2020505916.tif 000007
【図３Ａ】
2020505916.tif 000008
【図３Ｂ】
2020505916.tif 000009
【図４】
2020505916.tif 000010
【図５】
2020505916.tif 000011
【図６−１】
2020505916.tif 000012
【図６−２】
2020505916.tif 000013
【図７】
2020505916.tif 000014
【図８】
2020505916.tif 000015
【図９】
2020505916.tif 000016
【図１０】
2020505916.tif 000017
【図１１】
2020505916.tif 000018
【図１２】
2020505916.tif 000019
【図１３】
2020505916.tif 000020
【図１４】
2020505916.tif 000021
【手続補正書】
【提出日】平成31年3月11日(2019.3.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
軟骨下骨硬化症、外傷関節傷害、および／または変形性関節疾患（ＤＪＤ）の予防および／または治療での使用のための間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の濃縮インテグリンα１０高集団であって、
前記ＭＳＣ集団の細胞の少なくとも６０％がインテグリンα１０サブユニットを発現し、前記ＭＳＣがＭＨＣＩＩ陰性およびＣＤ４５陰性であり、ならびに
前記ＭＳＣが間葉系幹細胞、間葉系前駆細胞、および間葉系間質細胞からなる群から選択される、ＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項２】
前記外傷関節傷害がスポーツ傷害を含む、請求項１に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項３】
前記変形性関節疾患（ＤＪＤ）が軟骨下骨の疾患、軟骨変性、外傷後変形性関節症、炎症性関節炎、および先天性奇形および／または筋骨格系の変形からなる群から選択される、請求項１に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項４】
前記外傷関節傷害が骨軟骨損傷、腱損傷、靭帯損傷、および筋損傷からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項５】
前記骨軟骨損傷が関節軟骨損傷および／または骨損傷を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項６】
骨折治癒を促進するまたは誘導する方法であって、ＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団を投与することを含み、前記ＭＳＣ集団の細胞の少なくとも６０％がインテグリンα１０サブユニットを発現し、前記ＭＳＣがＭＨＣＩＩ陰性およびＣＤ４５陰性であり、ならびに前記ＭＳＣが間葉系幹細胞、間葉系前駆細胞、および間葉系間質細胞からなる群から選択される、骨折治癒を促進する、または誘導する方法。
【請求項７】
前記集団に含まれる総細胞の少なくとも６５％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％がインテグリンα１０サブユニットを発現する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項８】
前記細胞が脂肪組織由来である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項９】
前記細胞がインテグリンα１０サブユニットを発現するよう誘導される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項１０】
前記細胞が哺乳動物血清およびＦＧＦ−２を含む培地中で培養される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項１１】
前記細胞が血小板溶解物および／または血小板溶解物成分を含む培地中で培養される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項１２】
前記細胞が血小板溶解物および／または血小板溶解物成分を含む無血清培地中で培養される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項１３】
前記細胞が増殖因子を含む無血清培地中で培養される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項１４】
前記細胞が増殖因子ＦＧＦ２および／またはＴＧＦβを含む無血清培地中で培養される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項１５】
前記細胞がＦＧＦ２ならびに血小板溶解物および／または血小板溶解物成分を含む培地中で培養される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項１６】
前記細胞が哺乳動物血清ならびに血小板溶解物および／または血小板溶解物成分を含む培地中で培養される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項１７】
前記細胞がＴＧＦβを含む培地中で培養される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項１８】
前記血清がウシ胎仔血清である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項１９】
前記集団がｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養物である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項２０】
前記培地がアスコルビン酸をさらに含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項２１】
前記インテグリンα１０がインテグリンβ１サブユニットとの組み合わせでヘテロ二量体として発現される、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項２２】
インテグリンα１０を発現する前記細胞が抗インテグリンα１０抗体によって単離される、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項２３】
前記抗インテグリンα１０抗体がモノクローナル抗体である、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項２４】
前記抗体がマウスをヒトインテグリンα１０ポリペプチドで免疫することによって生成される、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項２５】
前記ＭＳＣがＣＤ４４、ＣＤ９０およびＣＤ１０５の存在によってさらに特徴づけられる、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項２６】
前記細胞が脂肪組織、骨髄、滑膜、末梢血、臍帯血（ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ）、臍帯血（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ）、ワルトン膠様質、または羊水に由来する、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項２７】
前記細胞が骨髄に由来する、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項２８】
前記集団が軟骨下骨の疾患および／または骨軟骨損傷の予防の方法での使用のためである、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項２９】
前記集団が軟骨下骨の疾患および／または骨軟骨損傷の治療の方法での使用のためである、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項３０】
対象が骨軟骨損傷または関節もしくは骨への損傷もしくは傷害を有する、またはこれまでに有した、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項３１】
前記骨軟骨損傷、軟骨損傷または傷害が破損、捻挫、挫傷、裂傷、骨折または断裂である、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項３２】
前記骨軟骨損傷、軟骨損傷または傷害が軟骨亀裂である、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項３３】
前記骨軟骨損傷、軟骨損傷または傷害が軟骨微小骨折である、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項３４】
前記骨軟骨損傷、軟骨損傷または傷害が軟骨欠損である、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項３５】
前記骨軟骨損傷、軟骨損傷または傷害が腱断裂または靭帯断裂である、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項３６】
前記骨軟骨損傷、軟骨損傷または傷害が骨折である、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項３７】
前記傷害がスポーツ傷害である、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項３８】
前記対象が骨の不整列を有する、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項３９】
前記骨軟骨損傷、軟骨損傷または傷害が人工器官の装着の結果である、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項４０】
前記骨軟骨損傷、関節における軟骨損傷また傷害が、筋肉、腱、骨、靭帯、軟骨、または半月板においてである、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項４１】
前記方法が軟骨下骨の疾患または骨軟骨損傷に起因する外傷後変形性関節症（ＰＴＯＡ）を予防する、請求項１〜４０のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項４２】
前記ＭＳＣが同種異系または自己由来である、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項４３】
前記ＭＳＣが関節腔に投与される、請求項１〜４２のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項４４】
前記ＭＳＣ集団が注射によって投与される、請求項１〜４３のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項４５】
前記ＭＳＣ集団が薬学的に許容される賦形剤と共に細胞懸濁液中で投与される、請求項１〜４４のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項４６】
前記ＭＳＣ集団が投与前に細胞凝集体に調製される、請求項１〜４５のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項４７】
前記ＭＳＣがジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む培地中で保管される、請求項１〜４６のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項４８】
前記ＭＳＣ集団が損傷した関節および／または骨を修復するための手術中に投与される、請求項１〜４７のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項４９】
前記ＭＳＣ集団が破損後の接骨と同時に投与される、請求項１〜４８のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項５０】
前記対象がヒト、ウマ、ポニー、雄ウシ、ロバ、ラバ、ラクダ、ネコ、イヌ、ブタ、または雌ウシである、請求項１〜４９のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項５１】
前記対象がヒトである、請求項１〜５０のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項５２】
前記対象がウマである、請求項１〜５１のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項５３】
前記対象がイヌである、請求項１〜５２のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項５４】
前記ＭＳＣおよび対象が同じ種または属に由来する、請求項１〜５３のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項５５】
前記ＭＳＣおよび対象が異なる種または属に由来する、請求項１〜５４のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項５６】
前記細胞が胎児、新生児、幼若もしくは成体のＭＳＣおよび／または前駆体細胞に由来する、請求項１〜５５のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項５７】
前記細胞が胚細胞または胚に由来しない、請求項１〜５６のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項５８】
前記投与が投与の部位での増加されたコラーゲン産生、プロテオグリカン産生、および／またはラブリシンをもたらす、請求項１〜５７のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項５９】
前記ＭＳＣと組み合わせて抗炎症剤を投与することをさらに含む、請求項１〜５８のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項６０】
前記ＭＳＣがＣＤ４４、ＣＤ９０およびＣＤ１０５を発現する、請求項１〜５９のいずれか１項に記載の使用のためのＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団。
【請求項６１】
ＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団の使用であって、前記ＭＳＣ集団の細胞の少なくとも６０％がインテグリンα１０サブユニットを発現し、前記ＭＳＣがＭＨＣＩＩ陰性およびＣＤ４５陰性であり、ならびに軟骨下骨硬化症、外傷関節傷害、および／または変形性関節疾患（ＤＪＤ）の予防または治療用の薬物の調製のために、前記ＭＳＣが間葉系幹細胞、間葉系前駆細胞、および間葉系間質細胞からなる群から選択される、ＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団の使用。
【請求項６２】
軟骨下骨硬化症のリスクのある、もしくは軟骨下骨硬化症を有する対象にＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団を投与することを含む、対象において軟骨下骨硬化症、外傷関節傷害、および／または変形性関節疾患（ＤＪＤ）を治療するおよび／または予防する方法であって、前記ＭＳＣ集団の細胞の少なくとも６０％がインテグリンα１０サブユニットを発現し、前記ＭＳＣがＭＨＣＩＩ陰性およびＣＤ４５陰性であり、ならびに前記ＭＳＣが間葉系幹細胞、間葉系前駆細胞、および間葉系間質細胞からなる群から選択され、それによって軟骨下骨硬化症および／または骨軟骨損傷を治療するおよび／または予防する、方法。
【請求項６３】
前記外傷関節傷害がスポーツ傷害を含む、請求項６１および６２のいずれか１項に記載の使用または方法。
【請求項６４】
前記外傷関節傷害が骨軟骨損傷、腱損傷、靭帯損傷、および筋損傷からなる群から選択される、請求項６１〜６３のいずれか１項に記載の使用または方法。
【請求項６５】
前記骨軟骨損傷が関節軟骨損傷および／または骨損傷を含む、請求項６１〜６４のいずれか１項に記載の使用または方法。
【請求項６６】
前記ＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団が請求項１〜６０のいずれか１項に記載されている、請求項６１〜６５のいずれか１項に記載の使用または方法。
【請求項６７】
ＭＳＣ集団の細胞の少なくとも６０％がインテグリンα１０サブユニットを発現するＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団を製造する方法であって、
ａ．脂肪組織、骨髄、滑膜、臍帯血、ワルトン膠様質、または羊水から幹細胞集団を単離すること、
ｂ．プラスチック培養容器中で前記単離された細胞を培養すること、
ｃ．非付着細胞を廃棄すること、
ｄ．培地を加えることによってインテグリンα１０発現を誘導することであって、前記培地が無血清培地または哺乳動物血清を含む培地であり、ならびに前記培地が血小板溶解物を含む、インテグリンα１０発現を誘導すること、
ｅ．インテグリンα１０を発現する前記細胞を選択すること、ならびに
ｆ．前記選択した細胞を拡張し、それによってＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団を生成すること
を含む、方法。
【請求項６８】
ステップｄ．における前記培地が増殖因子ＦＧＦ２および／またはＴＧＦβを含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記ＭＳＣの濃縮インテグリンα１０高集団が請求項１〜６０のいずれか１項に記載されている、請求項６８および７０のいずれか１項に記載の方法。
【国際調査報告】
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