(57)【要約】  本発明は、免疫応答を刺激するための方法及び組成物に関する。特に、本発明は、アジュバント及び／又は免疫賦活剤として作用して作用して宿主の免疫応答を増強する、インフルエンザＡ型ウイルス核タンパク質をコードするＲＮＡ分子に由来する配列を含む免疫賦活性ＲＮＡ分子に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における免疫応答を刺激するための方法であって、対象に少なくとも一つの抗原を提供し、かつ免疫賦活性ＲＮＡ分子を提供することを含み、免疫賦活性ＲＮＡ分子がインフルエンザＡ型ウイルス核タンパク質をコードするＲＮＡ分子に由来する配列を含む、方法。
【請求項２】
インフルエンザＡ型ウイルス核タンパク質をコードするＲＮＡ分子に由来する配列が、インフルエンザＡ型ウイルス核タンパク質をコードするＲＮＡ分子の少なくとも一つの断片、又はそのバリアントを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
対象における免疫応答を刺激するための方法であって、対象に少なくとも一つの抗原を提供し、かつ免疫賦活性ＲＮＡ分子を提供することを含み、免疫賦活性ＲＮＡ分子が配列番号：１の配列又はそのバリアントを含む、方法。
【請求項４】
免疫賦活性ＲＮＡ分子が配列番号：２の配列又はそのバリアントを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
免疫賦活性ＲＮＡ分子が配列番号：３の配列又はそのバリアントを更に含む、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
免疫賦活性ＲＮＡ分子が配列番号：４の配列又はそのバリアントを更に含む、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項７】
免疫賦活性ＲＮＡ分子が配列番号：５の配列又はそのバリアントを含む、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項８】
免疫賦活性ＲＮＡ分子が配列番号：６の配列又はそのバリアントを含む、請求項３又は５に記載の方法。
【請求項９】
免疫賦活性ＲＮＡ分子が配列番号：７の配列又はそのバリアントを含む、請求項３、５及び８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
免疫賦活性ＲＮＡ分子が配列番号：８の配列又はそのバリアントを含む、請求項３から６の何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
免疫賦活性ＲＮＡ分子が配列番号：９の配列又はそのバリアントを含む、請求項３から６及び１０の何れか一項に記載の方法。
【請求項１２】
免疫賦活性ＲＮＡ分子が配列番号：１０の配列又はそのバリアントを含む、請求項３から６の何れか一項に記載の方法。
【請求項１３】
免疫賦活性ＲＮＡ分子が配列番号：１１の配列又はそのバリアントを含む、請求項３から６及び１２の何れか一項に記載の方法。
【請求項１４】
免疫賦活性ＲＮＡ分子が、対象において抗原特異的免疫応答を誘導することができる、請求項１から１３の何れか一項に記載の方法。
【請求項１５】
免疫応答がＢ細胞応答を含む、請求項１から１４の何れか一項に記載の方法。
【請求項１６】
免疫応答が、Ｔｈ１様応答に関連するＩｇＧ抗体の産生を含む、請求項１から１５の何れか一項に記載の方法。
【請求項１７】
免疫賦活性ＲＮＡ分子がトール様受容体（ＴＬＲ）アゴニストである、請求項１から１６の何れか一項に記載の方法。
【請求項１８】
ＴＬＲがＴＬＲ７である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
免疫賦活性ＲＮＡ分子がインターフェロンアルファの分泌を誘導することができる、請求項１から１８の何れか一項に記載の方法。
【請求項２０】
インターフェロンアルファの分泌には形質細胞様樹状細胞が関与する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
免疫賦活性ＲＮＡ分子が、腫瘍壊死因子アルファ、インターフェロンガンマ及びインターロイキン１０の一又は複数の分泌を実質的に誘導しない、請求項１から２０の何れか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記少なくとも一つの抗原が、がん、ウイルス、細菌、真菌、又は寄生虫抗原からなる群から選択される、請求項１から２１の何れか一項に記載の方法。
【請求項２３】
対象が哺乳動物である、請求項１から２２の何れか一項に記載の方法。
【請求項２４】
対象がヒトである、請求項１から２３の何れか一項に記載の方法。
【請求項２５】
免疫賦活性ＲＮＡ分子、少なくとも一つの抗原、及び薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物であって、免疫賦活性ＲＮＡ分子がインフルエンザＡ型ウイルス核タンパク質をコードするＲＮＡ分子に由来する配列を含む、薬学的組成物。
【請求項２６】
インフルエンザＡ型ウイルス核タンパク質をコードするＲＮＡ分子に由来する配列が、インフルエンザＡ型ウイルス核タンパク質をコードするＲＮＡ分子の少なくとも一つの断片、又はそのバリアントを含む、請求項２５に記載の薬学的組成物。
【請求項２７】
免疫賦活性ＲＮＡ分子、少なくとも一つの抗原、及び薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物であって、免疫賦活性ＲＮＡ分子が配列番号：１の配列又はそのバリアントを含む、薬学的組成物。
【請求項２８】
免疫賦活性ＲＮＡ分子が配列番号：２の配列又はそのバリアントを含む、請求項２７に記載の薬学的組成物。
【請求項２９】
免疫賦活性ＲＮＡ分子が配列番号：３の配列又はそのバリアントを更に含む、請求項２７又は２８に記載の薬学的組成物。
【請求項３０】
免疫賦活性ＲＮＡ分子が配列番号：４の配列又はそのバリアントを更に含む、請求項２７又は２８に記載の薬学的組成物。
【請求項３１】
免疫賦活性ＲＮＡ分子が配列番号：５の配列又はそのバリアントを含む、請求項２７又は２８に記載の薬学的組成物。
【請求項３２】
免疫賦活性ＲＮＡ分子が配列番号：６の配列又はそのバリアントを含む、請求項２７又は２９に記載の薬学的組成物。
【請求項３３】
免疫賦活性ＲＮＡ分子が配列番号：７の配列又はそのバリアントを含む、請求項２７、２９及び３２の何れか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項３４】
免疫賦活性ＲＮＡ分子が配列番号：８の配列又はそのバリアントを含む、請求項２７から３０の何れか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項３５】
免疫賦活性ＲＮＡ分子が配列番号：９の配列又はそのバリアントを含む、請求項２７から３０及び３４の何れか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項３６】
免疫賦活性ＲＮＡ分子が配列番号：１０の配列又はそのバリアントを含む、請求項２７から３０の何れか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項３７】
免疫賦活性ＲＮＡ分子が配列番号：１１の配列又はそのバリアントを含む、請求項２７から３０及び３６の何れか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項３８】
免疫賦活性ＲＮＡ分子がトール様受容体（ＴＬＲ）アゴニストである、請求項２５から３７の何れか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項３９】
ＴＬＲがＴＬＲ７である、請求項３８に記載の薬学的組成物。
【請求項４０】
前記少なくとも一つの抗原が、がん、ウイルス、細菌、真菌、又は寄生虫抗原からなる群から選択される、請求項２５から３９の何れか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項４１】
インフルエンザＡ型ウイルス核タンパク質をコードするＲＮＡ分子に由来する配列を含む単離されたＲＮＡ分子であって、免疫賦活活性を有する単離されたＲＮＡ分子。
【請求項４２】
インフルエンザＡ型ウイルス核タンパク質をコードするＲＮＡ分子に由来する配列が、インフルエンザＡ型ウイルス核タンパク質をコードするＲＮＡ分子の少なくとも一つの断片、又はそのバリアントを含む、請求項４１に記載の単離されたＲＮＡ分子。
【請求項４３】
配列番号：１の配列又はそのバリアントを含む単離されたＲＮＡ分子であって、免疫賦活活性を有する単離されたＲＮＡ分子。
【請求項４４】
配列番号：２の配列又はそのバリアントを含む、請求項４３に記載の単離されたＲＮＡ分子。
【請求項４５】
配列番号：３の配列又はそのバリアントを更に含む、請求項４３又は４４に記載の単離されたＲＮＡ分子。
【請求項４６】
配列番号：４の配列又はそのバリアントを更に含む、請求項４３又は４４に記載の単離されたＲＮＡ分子。
【請求項４７】
配列番号：５の配列又はそのバリアントを含む、請求項４３又は４４に記載の単離されたＲＮＡ分子。
【請求項４８】
配列番号：６の配列又はそのバリアントを含む、請求項４３又は４５に記載の単離されたＲＮＡ分子。
【請求項４９】
配列番号：７の配列又はそのバリアントを含む、請求項４３、４５及び４８の何れか一項に記載の単離されたＲＮＡ分子。
【請求項５０】
配列番号：８の配列又はそのバリアントを含む、請求項４３から４６の何れか一項に記載の単離されたＲＮＡ分子。
【請求項５１】
配列番号：９の配列又はそのバリアントを含む、請求項４３から４６及び５０の何れか一項に記載の単離されたＲＮＡ分子。
【請求項５２】
配列番号：１０の配列又はそのバリアントを含む、請求項４３から４６の何れか一項に記載の単離されたＲＮＡ分子。
【請求項５３】
配列番号：１１の配列又はそのバリアントを含む、請求項４３から４６及び５２の何れか一項に記載の単離されたＲＮＡ分子。
【請求項５４】
トール様受容体（ＴＬＲ）アゴニストである、請求項４１から５３の何れか一項に記載の単離されたＲＮＡ分子。
【請求項５５】
ＴＬＲがＴＬＲ７である、請求項５４に記載の単離されたＲＮＡ分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫応答を刺激するための方法及び組成物に関する。特に、本発明は、アジュバント及び／又は免疫賦活剤として作用して宿主の免疫応答を増強する、インフルエンザＡ型ウイルス核タンパク質をコードするＲＮＡ分子に由来する配列を含む免疫賦活性ＲＮＡ分子に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫系は、ウイルス、真菌、細菌などの微生物に対する防御において、並びに悪性細胞（腫瘍細胞）の認識と忌避において重要な役割を担う。免疫系の進化により、自然免疫と適応免疫という二種類の防御に基づく高度に効果的なネットワークが生じた。病原体に関連する共通の分子パターンを認識するインバリアントな受容体に依存する進化的に古代の自然免疫系とは対照的に、適応免疫はＢ細胞（Ｂリンパ球）及びＴ細胞（Ｔリンパ球）上の高度に特異的な抗原受容体及びクローン選択に基づく。Ｂ細胞は抗体の分泌により液性免疫応答を生じさせるが、Ｔ細胞は認識された細胞の破壊につながる細胞性免疫応答を媒介する。
【０００３】
抗原特異的免疫療法は、感染性又は悪性疾患を制御するために患者において特定の免疫応答を増強又は誘導することを目的とする。増加する病原体関連及び腫瘍関連抗原の同定により、免疫療法に適した標的の幅広い収集に至った。ワクチン接種と免疫は、非毒性抗原を対象に導入することであり、抗原が対象の免疫系を誘発して免疫応答を開始させる。多くの場合、ワクチン抗原は、疾患を引き起こす微生物の不活化又は弱毒化形態である。全罹患細胞、タンパク質、ペプチド又は免疫化ベクター、例えばＲＮＡ、ＤＮＡ、又は患者への移入後にＤＣのパルス適用によってインビトロ又はインビボで直接的に適用されうるウイルスベクターを含む様々な抗原形態をワクチン接種に使用することができる。しかし、抗原はそれ自体では十分な免疫原性を持たないことが多く、十分な免疫応答を引き起こさない。
【０００４】
抗原の免疫原性は、一又は複数のアジュバントと組み合わせて抗原を投与することにより高めることができる。アジュバントは、免疫系に直接作用するか又は抗原の薬物動態特性を変更することにより、抗原に対する応答を増加させ、抗原と免疫系の間の相互作用時間を増加させる。加えて、アジュバントの添加は、より少ない用量の抗原を使用して同様の免疫応答を刺激することを可能にし、それによりワクチンの製造コストが削減される。
【０００５】
アジュバント活性を示す多くの化合物が記載されている。これらアジュバントは有効性が異なり、時には所望の強度の免疫応答を誘導するには強さが十分でなく、また幾つかのものはその毒性効果によりヒトでの使用が制限されている。
【０００６】
従って、既存及び将来のワクチンの有効性と安全性を改善するための効果的なアジュバント系が必要とされる。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、アジュバント又は免疫賦活剤として作用して宿主免疫応答を増強する、インフルエンザＡ型ウイルス核タンパク質をコードするＲＮＡ分子に由来する配列を含む免疫賦活性ＲＮＡ分子の同定に少なくとも部分的に基づいている。これらの免疫賦活性ＲＮＡ分子は、インビボで免疫賦活薬として使用できる。
【０００８】
ここに記載されるように、インフルエンザＡ型ウイルス核タンパク質をコードするＲＮＡ分子に由来する配列を含む免疫賦活性ＲＮＡ分子は、インビトロ並びにインビボでの高レベルのＩＦＮ−α発現とインビボでの強い特異的Ｂ及びＴ細胞応答を誘導することが示された。従って、これらの免疫賦活性ＲＮＡ分子は、ワクチン接種のための強力なアジュバントであり、対象における免疫応答を刺激するための方法及び組成物において有用である。本発明の一実施態様は、ここに記載の免疫賦活性ＲＮＡ分子を、一又は複数の抗原、例えばワクチンに含まれる抗原と一緒に、対象に投与して、抗原特異的免疫応答を増強し又は促進することを含む。
【０００９】
従って、一態様では、本発明は、対象における免疫応答を刺激するための方法であって、対象に少なくとも一つの抗原を提供し、かつ免疫賦活性ＲＮＡ分子を提供することを含み、免疫賦活性ＲＮＡ分子がインフルエンザＡ型ウイルス核タンパク質をコードするＲＮＡ分子に由来する配列を含む、方法を提供する。
【００１０】
一実施態様では、インフルエンザＡ型ウイルス核タンパク質をコードするＲＮＡ分子に由来する配列は、インフルエンザＡ型ウイルス核タンパク質をコードするＲＮＡ分子の少なくとも一つの断片又はそのバリアントを含む。
【００１１】
異なる実施態様では、インフルエンザＡ型ウイルス核タンパク質をコードするＲＮＡ分子又はインフルエンザＡ型ウイルス核タンパク質をコードするＲＮＡ分子の少なくとも一つの断片、又はそのバリアントに由来する配列は、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、及び配列番号：１１からなる群から選択される。
【００１２】
更なる態様では、本発明は、対象における免疫応答を刺激するための方法であって、対象に少なくとも一つの抗原を提供し、かつ免疫賦活性ＲＮＡ分子を提供することを含み、免疫賦活性ＲＮＡ分子が配列番号：１の配列又はそのバリアントを含む、方法を提供する。一実施態様では、免疫賦活性ＲＮＡ分子は、配列番号：２の配列又はそのバリアントを含む。
【００１３】
一実施態様では、免疫賦活性ＲＮＡ分子は、配列番号：３の配列又はそのバリアントを更に含む。一実施態様では、免疫賦活性ＲＮＡ分子は、配列番号：４の配列又はそのバリアントを更に含む。
【００１４】
一実施態様では、免疫賦活性ＲＮＡ分子は、配列番号：５の配列又はそのバリアントを含む。
【００１５】
一実施態様では、免疫賦活性ＲＮＡ分子は、配列番号：６の配列又はそのバリアントを含む。一実施態様では、免疫賦活性ＲＮＡ分子は、配列番号：７の配列又はそのバリアントを含む。
【００１６】
一実施態様では、免疫賦活性ＲＮＡ分子は、配列番号：８の配列又はそのバリアントを含む。一実施態様では、免疫賦活性ＲＮＡ分子は、配列番号：９の配列又はそのバリアントを含む。
【００１７】
一実施態様では、免疫賦活性ＲＮＡ分子は、配列番号：１０の配列又はそのバリアントを含む。一実施態様では、免疫賦活性ＲＮＡ分子は、配列番号：１１の配列又はそのバリアントを含む。
【００１８】
本発明の全ての態様の一実施態様では、免疫賦活性ＲＮＡ分子は、対象において抗原特異的免疫応答を誘導することができる。
【００１９】
本発明の全ての態様の一実施態様では、免疫応答はＢ細胞応答を含む。
【００２０】
本発明の全ての態様の一実施態様では、免疫応答は、Ｔｈ１様応答に関連するＩｇＧ抗体の産生を含む。
【００２１】
本発明の全ての態様の一実施態様では、免疫賦活性ＲＮＡ分子はトール様受容体（ＴＬＲ）アゴニストである。一実施態様では、ＴＬＲはＴＬＲ７である。
【００２２】
本発明の全ての態様の一実施態様では、免疫賦活性ＲＮＡ分子は、インターフェロンアルファの分泌を誘導することができる。一実施態様では、インターフェロンアルファの分泌には形質細胞様樹状細胞が関与する。
【００２３】
本発明の全ての態様の一実施態様では、免疫賦活性ＲＮＡ分子は、腫瘍壊死因子アルファ、インターフェロンガンマ及びインターロイキン１０のうちの一又は複数の分泌を実質的に誘導しない。
【００２４】
本発明の全ての態様の一実施態様では、前記少なくとも一つの抗原は、がん、ウイルス、細菌、真菌、又は寄生虫抗原からなる群から選択される。
【００２５】
本発明の全ての態様の一実施態様では、対象は哺乳動物である。本発明の全ての態様の一実施態様では、対象はヒトである。
【００２６】
更なる態様では、本発明は、免疫賦活性ＲＮＡ分子、少なくとも一つの抗原、及び薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物であって、免疫賦活性ＲＮＡ分子がインフルエンザＡ型ウイルス核タンパク質をコードするＲＮＡ分子に由来する配列を含む、薬学的組成物を提供する。
【００２７】
一実施態様では、インフルエンザＡ型ウイルス核タンパク質をコードするＲＮＡ分子に由来する配列が、インフルエンザＡウイルス核タンパク質をコードするＲＮＡ分子の少なくとも一つの断片又はそのバリアントを含む。
【００２８】
異なる実施態様では、インフルエンザＡ型ウイルス核タンパク質をコードするＲＮＡ分子又はインフルエンザＡ型ウイルス核タンパク質をコードするＲＮＡ分子の少なくとも一つの断片、又はそのバリアントに由来する配列は、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、及び配列番号：１１からなる群から選択される。
【００２９】
更なる態様では、本発明は、免疫賦活性ＲＮＡ分子、少なくとも一つの抗原、及び薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物であって、免疫賦活性ＲＮＡ分子が配列番号：１の配列又はそのバリアントを含む薬学的組成物を提供する。一実施態様では、免疫賦活性ＲＮＡ分子は、配列番号：２の配列又はそのバリアントを含む。
【００３０】
一実施態様では、免疫賦活性ＲＮＡ分子は、配列番号：３の配列又はそのバリアントを更に含む。一実施態様では、免疫賦活性ＲＮＡ分子は、配列番号：４の配列又はそのバリアントを更に含む。
【００３１】
一実施態様では、免疫賦活性ＲＮＡ分子は、配列番号：５の配列又はそのバリアントを含む。
【００３２】
一実施態様では、免疫賦活性ＲＮＡ分子は、配列番号：６の配列又はそのバリアントを含む。一実施態様では、免疫賦活性ＲＮＡ分子は、配列番号：７の配列又はそのバリアントを含む。
【００３３】
一実施態様では、免疫賦活性ＲＮＡ分子は、配列番号：８の配列又はそのバリアントを含む。一実施態様では、免疫賦活性ＲＮＡ分子は、配列番号：９の配列又はそのバリアントを含む。
【００３４】
一実施態様では、免疫賦活性ＲＮＡ分子は、配列番号：１０の配列又はそのバリアントを含む。一実施態様では、免疫賦活性ＲＮＡ分子は、配列番号：１１の配列又はそのバリアントを含む。
【００３５】
本発明の全ての態様の薬学的組成物の一実施態様では、免疫賦活性ＲＮＡ分子は、トール様受容体（ＴＬＲ）アゴニストである。一実施態様では、ＴＬＲはＴＬＲ７である。
【００３６】
本発明の全ての態様の薬学的組成物の一実施態様では、前記少なくとも一つの抗原は、がん、ウイルス、細菌、真菌、又は寄生虫抗原からなる群から選択される。
【００３７】
ここに記載される薬学的組成物は、治療用又は予防用ワクチンでありうるワクチンの形態でありうる。
【００３８】
更なる態様では、本発明は、インフルエンザＡ型ウイルス核タンパク質をコードするＲＮＡ分子に由来する配列を含む単離されたＲＮＡ分子であって、免疫賦活活性を有する単離されたＲＮＡ分子を提供する。
【００３９】
一実施態様では、インフルエンザＡ型ウイルス核タンパク質をコードするＲＮＡ分子に由来する配列は、インフルエンザＡ型ウイルス核タンパク質をコードするＲＮＡ分子の少なくとも一つの断片又はそのバリアントを含む。
【００４０】
異なる実施態様では、インフルエンザＡ型ウイルス核タンパク質をコードするＲＮＡ分子又はインフルエンザＡ型ウイルス核タンパク質をコードするＲＮＡ分子の少なくとも一つの断片、又はそのバリアントに由来する配列は、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、及び配列番号：１１からなる群から選択される。
【００４１】
更なる態様では、本発明は、配列番号：１の配列又はそのバリアントを含む単離されたＲＮＡ分子であって、免疫賦活活性を有する単離されたＲＮＡ分子を提供する。一実施態様では、単離されたＲＮＡ分子は、配列番号：２の配列又はそのバリアントを含む。
【００４２】
一実施態様では、単離されたＲＮＡ分子は、配列番号：３の配列又はそのバリアントを更に含む。一実施態様では、単離されたＲＮＡ分子は、配列番号：４の配列又はそのバリアントを更に含む。
【００４３】
一実施態様では、単離されたＲＮＡ分子は、配列番号：５の配列又はそのバリアントを含む。
【００４４】
一実施態様では、単離されたＲＮＡ分子は、配列番号：６の配列又はそのバリアントを含む。一実施態様では、単離されたＲＮＡ分子は、配列番号：７の配列又はそのバリアントを含む。
【００４５】
一実施態様では、単離されたＲＮＡ分子は、配列番号：８の配列又はそのバリアントを含む。一実施態様では、単離されたＲＮＡ分子は、配列番号：９の配列又はそのバリアントを含む。
【００４６】
一実施態様では、単離されたＲＮＡ分子は、配列番号：１０の配列又はそのバリアントを含む。一実施態様では、単離されたＲＮＡ分子は、配列番号：１１の配列又はそのバリアントを含む。
【００４７】
本発明の全ての態様の単離されたＲＮＡ分子の一実施態様では、単離されたＲＮＡ分子はトール様受容体（ＴＬＲ）アゴニストである。一実施態様では、ＴＬＲはＴＬＲ７である。
【００４８】
本発明の一実施態様では、ここに記載の免疫賦活性ＲＮＡ分子又は単離されたＲＮＡ分子は翻訳可能ではない、すなわち、ペプチド又はタンパク質を産生するための鋳型ではない。
【００４９】
別の態様は、本発明に従って提供される薬学的組成物を対象に投与することを含む、対象において免疫応答を刺激するための方法に関する。
【００５０】
更なる態様では、本発明は、特に免疫応答を刺激するための、ここに記載の治療方法における使用のためのここに記載の薬剤及び組成物を提供する。
【００５１】
本発明の他の特徴及び利点は、次の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】インフルエンザＮＰをコードするＲＮＡ（２−２−８，ＮＰ１−１５６５）を開始配列として使用して適用された逐次断片化戦略の概略図
【図２Ａ−Ｂ】インビトロ転写によるｉｓＲＮＡの合成、ｉｓＲＮＡの組成と配列、並びに精製後の品質管理
【図２Ｃ−Ｄ】同上
【図３Ａ】製剤化ｉｓＲＮＡによるヒトＰＢＭＣにおけるサイトカイン誘導
【図３Ｂ】同上
【図４】ｐＤＣは、ｉｓＲＮＡでの刺激によるＩＦＮ−α分泌の主要なエフェクター細胞である
【図５】エンドソームに位置するＴＬＲへのヒトＰＢＭＣにおけるｉｓＲＮＡ ＮＰ７１−Ｓｅｑ４５を介したＩＦＮ−α誘導の依存性
【図６】ＮＰ７１−Ｓｅｑ４５によって活性化されるヌクレオチド感知エンドソームＴＬＲの決定
【図７】製剤化ｉｓＲＮＡによってヒトＰＢＭＣに誘導されるサイトカインプロファイルの分析
【図８】製剤化ｉｓＲＮＡによるマウス細胞でのサイトカイン誘導
【図９】製剤化ｉｓＲＮＡによるインビボでのＩＦＮ−αの時間及び用量依存的誘導
【図１０】製剤化ｉｓＲＮＡの頻繁な間隔での反復的な静脈内投与は、適応免疫化レジームによって克服できる全身性ＴＬＲ応答耐性を生じさせる
【図１１Ａ】ＨＢｃＡｇ−＃Ａ７９ＶＬＰと組み合わせた製剤化ｉｓＲＮＡは、インビボで抗原特異的なＢ及びＴ細胞応答を誘導する
【図１１Ｂ】同上
【図１２Ａ】ＨＢｃＡｇ−＃Ａ７９ＶＬＰと組み合わせた製剤化ｉｓＲＮＡを使用した免疫による抗原特異的Ｂ及びＴ細胞応答の用量依存的誘導
【図１２Ｂ】同上
【図１３】製剤化ｉｓＲＮＡとＨＢｃＡｇ−＃Ａ７９ＶＬＰによる免疫によって誘発された抗原特異的抗体は、ＣＤＣによって標的陽性細胞を死滅させる
【図１４Ａ−Ｂ】ＨＢｃＡｇ−＃Ａ７９ＶＬＰと組み合わせた製剤化ｉｓＲＮＡの免疫により、バランスの取れた抗原特異的ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１応答が得られる
【図１４Ｃ】同上
【図１５】ＨＢｃＡｇ−＃Ａ７９ＶＬＰと組み合わせた製剤化ｉｓＲＮＡによって誘導される抗原特異的抗体応答のｐＤＣへの依存性
【図１６】インビボでのＦ１２製剤化ｉｓＲＮＡによるサイトカイン誘導
【発明を実施するための形態】
【００５３】
本発明を以下に詳細に説明するが、この発明は、ここに記載の特定の方法論、プロトコル及び試薬に限定されない（これらは変わりうるので）ことを理解されたい。また、ここで使用される用語は、特定の実施態様のみを説明するためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定するものではないこともまた理解されたい。別に定義されない限り、ここで使用される全ての技術及び科学用語は、当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。
【００５４】
次に本発明の要素を説明する。これらの要素は特定の実施態様と共に列挙されるが、追加の実施態様を作成するために、それらを任意の方法及び任意の数で組み合わせることができることを理解されたい。様々に説明された実施例及び好ましい実施態様は、明示的に説明された実施態様のみに本発明を限定するように解釈されるべきではない。この説明は、明示的に説明された実施態様を任意の数の開示された及び／又は好ましい要素と組み合わせる実施態様をサポートし包含すると理解されるべきである。更に、この出願における全ての記載要素の任意の並び替え及び組み合わせは、文脈がそうでないことを示さない限り、本出願の説明により開示されているとみなされるべきである。
【００５５】
好ましくは、ここで使用される用語は、"A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel,及びH. Kolbl編, (1995) Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerlandに記載された通りに定義される。
【００５６】
本発明の実施は、特に明記しない限り、当該分野の文献において説明されている生化学、細胞生物学、免疫学、及び組換えＤＮＡ技術の一般的な方法を用いる（例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2版, J. Sambrook等編, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989を参照）。
【００５７】
この明細書及び以下の特許請求の範囲を通して、文脈が特に必要としない限り、「含む（comprise）」という単語、及び「含む（comprises）」及び「含む（comprising）」などの変形語は、述べられたメンバー、整数もしくは工程又はメンバー、整数もしくは工程の群を包含することを意味し、任意の他のメンバー、整数もしくは工程又はメンバー、整数もしくは工程の群を排除すること意味しないと理解されるが、幾つかの実施態様では、そのような他のメンバー、整数もしくは工程又はメンバー、整数もしくは工程の群は除外されうる、すなわち、主題は、述べられたメンバー、整数もしくは工程又はメンバー、整数もしくは工程の群を含めることで構成される。本発明を説明する文脈で（特に特許請求の範囲の文脈で）使用される「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」という用語及び類似の言及は、ここで特に明記しない限り又は文脈と明らかに矛盾しない限り、単数と複数の両方をカバーすると解釈される。ここでの値の範囲の記載は、単に、その範囲内に入る各別個の値に個々に言及する簡単な方法となることを意図している。ここで特に明記しない限り、各個々の値は、あたかもここで個々に記載されているかのように明細書に組み込まれている。
【００５８】
ここに記載される全ての方法は、ここで特に指示がない限り、又は文脈により明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施することができる。ここで提供される任意の全ての例又は例示的な言葉（例えば、「など」）の使用は、本発明をより良く説明することを単に意図しており、請求項に記載等された発明の範囲を限定するものではない。明細書中の言葉は、本発明の実施に不可欠な請求項に記載されていない要素を示すものと解釈されるべきではない。
【００５９】
幾つかの文書がこの明細書の本文全体に引用されている。ここに引用された各文書（全ての特許、特許出願、科学刊行物、製造業者の仕様書、説明書などを含む）は、上記か下記かにかかわらず、その全体が出典明示によりここに援用される。ここでの如何なるものも、本発明が先行発明の理由でそのような開示に先行する権利がないことを認めるものと解釈されるべきではない。
【００６０】
本発明は、疾患又は障害に関連する抗原に対する免疫応答を刺激することにより、疾患又は障害の治療又は予防を想定している。抗原に対する免疫応答は、アジュバントとして作用するここに記載の一又は複数の免疫賦活性ＲＮＡ分子と共にワクチン抗原又はワクチン抗原をコードする核酸を投与することにより増強される。
【００６１】
「アジュバント」という用語は、個体に抗原と組み合わせて投与されたときに、免疫応答を延長し又は増強し又は促進する化合物に関する。アジュバントは、抗原の表面の増加、体内での抗原の保持の延長、抗原放出の遅延、マクロファージへの抗原のターゲティング、抗原の取り込みの増加、抗原処理の亢進、サイトカイン放出の刺激、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞、Ｔ細胞などの免疫細胞の刺激と活性化、及び免疫細胞の非特異的活性化を含む、一又は複数の機序によってその生物活性を発揮すると想定される。
【００６２】
本発明は、宿主免疫応答を増強するアジュバント及び／又は免疫賦活剤として作用するインフルエンザＡ型ウイルス核タンパク質をコードするＲＮＡ分子に由来する配列を含む免疫賦活性ＲＮＡ分子を記載する。
【００６３】
「インフルエンザＡ型ウイルス核タンパク質をコードするＲＮＡ分子」という用語は、インフルエンザＡ型ウイルスの核タンパク質（ＮＰ）又はヌクレオカプシドタンパク質をコードするＲＮＡ分子に関する。
【００６４】
インフルエンザＡ型ウイルスは、１０の同定されたポリペプチドをコードするＲＮＡの８つのセグメントを含むゲノムを有している。これらのポリペプチドのうち９つがビリオンに組み込まれている。３つのウイルスポリペプチドが脂質エンベロープに挿入されている：細胞の出入りにそれぞれ関与する赤血球凝集素（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ糖タンパク質と、アンコーティングとＨＡ成熟に関与する低含量イオンチャネルであるＭ２。膜の下にあるのは、脂質エンベロープと内部ＲＮＰ粒子の間のアダプターとして作用すると考えられ、おそらくウイルス出芽の原動力となるビリオンの主要構造成分であるマトリックス又はＭ１タンパク質である。Ｍ１のシェルの内部にはＲＮＰがある：これらは、三量体ＲＮＡポリメラーゼ（ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡサブユニット）に関連するゲノムＲＮＡセグメント及び化学量論量のＮＰを含む。また、ビリオンには、少量のＮＥＰ／ＮＳ２ポリペプチドが見出されている。
【００６５】
一実施態様では、「インフルエンザＡ型ウイルス核タンパク質をコードするＲＮＡ分子」という用語は、配列表の配列番号：１２の核酸配列又はそのバリアントに関する。
【００６６】
一実施態様では、ここに記載の免疫賦活性ＲＮＡ分子は、配列番号：１の配列又はそのバリアントを含む。一実施態様では、免疫賦活性ＲＮＡ分子は、配列番号：２の配列又はそのバリアントを含む。
【００６７】
一実施態様では、免疫賦活性ＲＮＡ分子は、配列番号：３の配列又はそのバリアントを更に含む。一実施態様では、免疫賦活性ＲＮＡ分子は、配列番号：４の配列又はそのバリアントを更に含む。
【００６８】
一実施態様では、ここに記載の免疫賦活性ＲＮＡ分子は、配列番号：５の配列又はそのバリアントを含む。
【００６９】
一実施態様では、ここに記載の免疫賦活性ＲＮＡ分子は、配列番号：６の配列又はそのバリアントを含む。一実施態様では、免疫賦活性ＲＮＡ分子は、配列番号：７の配列又はそのバリアントを含む。
【００７０】
一実施態様では、ここに記載の免疫賦活性ＲＮＡ分子は、配列番号：８の配列又はそのバリアントを含む。一実施態様では、免疫賦活性ＲＮＡ分子は、配列番号：９の配列又はそのバリアントを含む。
【００７１】
一実施態様では、ここに記載の免疫賦活性ＲＮＡ分子は、配列番号：１０の配列又はそのバリアントを含む。一実施態様では、免疫賦活性ＲＮＡ分子は、配列番号：１１の配列又はそのバリアントを含む。
【００７２】
ここに記載される免疫賦活性ＲＮＡ分子は、これらの抗原と組み合わせて投与される場合、抗原に対する免疫応答を誘導する。一実施態様では、免疫応答はＢ細胞応答を含む。一実施態様では、免疫応答はＩｇＧ抗体の産生を含む。
【００７３】
一実施態様では、ここに記載の免疫賦活性ＲＮＡ分子は、インターフェロンアルファの分泌を誘導することができる。一実施態様では、インターフェロンアルファの分泌には、形質細胞様樹状細胞が関与する。
【００７４】
一実施態様では、ここに記載の免疫賦活性ＲＮＡ分子は、腫瘍壊死因子アルファ、インターフェロンガンマ及びインターロイキン１０のうちの一又は複数の分泌を実質的に誘導しない。
【００７５】
一実施態様では、ここに記載の免疫賦活性ＲＮＡ分子は組換え分子である。一実施態様では、ここに記載の免疫賦活性ＲＮＡ分子は、インビトロ転写により得られる。
【００７６】
様々な実施態様において、ここに記載の免疫賦活性ＲＮＡ分子は、２０〜４００ヌクレオチド、２０〜２００ヌクレオチド、２０〜１００ヌクレオチド、特に３０〜２００ヌクレオチド又は３０〜１００ヌクレオチドの長さを有する。
【００７７】
本発明によれば、ナノ粒子製剤、特にリポプレックス製剤などの担体又は送達ビヒクルに製剤化されたここに記載の免疫賦活性ＲＮＡ分子を投与することが好ましい。従って、ここに記載の免疫賦活性ＲＮＡ分子は、ここに記載のナノ粒子又はナノ粒子製剤、特にリポプレックス製剤などの担体又は送達ビヒクルに製剤化されて存在しうる。
【００７８】
一実施態様では、全身投与後に脾臓中の樹状細胞（ＤＣ）などの抗原提示細胞に免疫賦活性ＲＮＡ分子を送達する送達ビヒクルが使用されうる。例えば、粒子の正味電荷がゼロ又は負に近い定まった粒子サイズのナノ粒子ＲＮＡ製剤、例えばＲＮＡ及びリポソーム由来の電気中性又は負に荷電したリポプレックス、例えばＤＯＴＭＡとＤＯＰＥ又はＤＯＴＭＡとコレステロールを含むリポプレックスが、全身投与後に脾臓ＤＣへのＲＮＡの実質的な送達をもたらす。本発明において特に好ましいのは、ナノ粒子中の正電荷と負電荷の電荷比が１．４：１以下及び／又はナノ粒子のゼータ電位が０以下であるナノ粒子ＲＮＡ製剤である。一実施態様では、ナノ粒子中の正電荷と負電荷の電荷比は、１．４：１から１：８の間、好ましくは１．２：１から１：４の間、例えば１：１から１：３、例えば１：１．２から１：２、１：１．２から１：１．８、１：１．３から１：１．７、特に１：１．４から１：１．６、例えば約１：１．５である。一実施態様では、ナノ粒子のゼータ電位は、−５以下、−１０以下、−１５以下、−２０以下又は−２５以下である。様々な実施態様において、ナノ粒子のゼータ電位は、−３５以上、−３０以上、又は−２５以上である。一実施態様では、ナノ粒子は、０ｍＶから−５０ｍＶ、好ましくは０ｍＶから−４０ｍＶ又は−１０ｍＶから−３０ｍＶのゼータ電位を有する。一実施態様では、正電荷には、ナノ粒子中に存在する少なくとも一種のカチオン性脂質が寄与し、負電荷にはＲＮＡが寄与する。一実施態様では、ナノ粒子は少なくとも一種のヘルパー脂質を含む。ヘルパー脂質は、中性又は陰イオン性脂質でありうる。
【００７９】
一実施態様では、ナノ粒子は、１０：０から１：９、好ましくは８：２から３：７、より好ましくは７：３から５：５のモル比でＤＯＴＭＡとＤＯＰＥを含むリポプレックスであり、ＤＯＴＭＡの正電荷とＲＮＡの負電荷の電荷比は１．８：２から０．８：２、より好ましくは１．６：２から１：２、更により好ましくは１．４：２から１．１：２、更により好ましくは約１．２：２である。
【００８０】
一実施態様では、ナノ粒子は、１０：０から１：９、好ましくは８：２から３：７、より好ましくは７：３から５：５のモル比でＤＯＴＭＡとコレステロールを含むリポプレックスであり、ＤＯＴＭＡの正電荷とＲＮＡの負電荷の電荷比は１．８：２から０．８：２、より好ましくは１．６：２から１：２、更により好ましくは１．４：２から１．１：２、更により好ましくは約１．２：２である。
【００８１】
一実施態様では、ナノ粒子は、１０：０から１：９、好ましくは８：２から３：７、より好ましくは７：３から５：５のモル比でＤＯＴＡＰとＤＯＰＥを含むリポプレックスであり、ＤＯＴＭＡの正電荷とＲＮＡの負電荷の電荷比は１．８：２から０．８：２、より好ましくは１．６：２から１：２、更により好ましくは１．４：２から１．１：２、更により好ましくは約１．２：２である。
【００８２】
一実施態様では、ナノ粒子は、ＤＯＴＭＡとＤＯＰＥを２：１から１：２、好ましくは２：１から１：１のモル比で含むリポプレックスであり、ＤＯＴＭＡの正電荷とＲＮＡの負電荷の電荷比は１．４：１以下である。
【００８３】
一実施態様では、ナノ粒子は、ＤＯＴＭＡとコレステロールを２：１から１：２、好ましくは２：１から１：１のモル比で含むリポプレックスであり、ＤＯＴＭＡの正電荷とＲＮＡの負電荷の電荷比が１．４：１以下である。
【００８４】
一実施態様では、ナノ粒子は、ＤＯＴＡＰとＤＯＰＥを２：１から１：２、好ましくは２：１から１：１のモル比で含むリポプレックスであり、ＤＯＴＡＰの正電荷とＲＮＡの負電荷の電荷比が１．４：１以下である。
【００８５】
本発明によれば、「Ｆ１２」という用語は、ＤＯＴＭＡとＤＯＰＥを２：１のモル比で含むリポソームで、そのようなリポソームを使用して形成されるＲＮＡを含むリポプレックスを示す。
【００８６】
本発明によれば、「Ｆ５」という用語は、ＤＯＴＭＡとコレステロールを１：１のモル比で含むリポソームで、そのようなリポソームを使用して形成されるＲＮＡを含むリポプレックスを示す。
【００８７】
ここで使用される場合、「ナノ粒子」という用語は、粒子を特に核酸の全身投与、特に非経口投与に適したものにする直径、典型的には１０００ナノメートル（ｎｍ）未満の直径を有する任意の粒子を指す。幾つかの実施態様では、ナノ粒子は６００ｎｍ未満の直径を有する。幾つかの実施態様では、ナノ粒子は４００ｎｍ未満の直径を有する。幾つかの実施態様では、ナノ粒子は、約５０ｎｍから約１０００ｎｍ、好ましくは約５０ｎｍから約４００ｎｍ、好ましくは約１００ｎｍから約３００ｎｍ、例えば約１５０ｎｍから約２００ｎｍの範囲の平均直径を有する。幾つかの実施態様では、ナノ粒子は、約２００から約７００ｎｍ、約２００から約６００ｎｍ、好ましくは約２５０から約５５０ｎｍ、特に約３００から約５００ｎｍ又は約２００から約４００ｎｍの範囲の直径を有する。
【００８８】
ここで使用される場合、「ナノ粒子製剤」という用語又は類似の用語は、少なくとも一つのナノ粒子を含む任意の物質を指す。幾つかの実施態様では、ナノ粒子製剤は、ナノ粒子の均一な集合体である。幾つかの実施態様では、ナノ粒子製剤は分散液又はエマルジョンである。一般に、少なくとも二種の非混和性材料が組み合わされると、分散液又はエマルジョンが形成される。
【００８９】
「リポプレックス」又は「核酸リポプレックス」、特に「ＲＮＡリポプレックス」という用語は、脂質と核酸、特にＲＮＡの複合体を指す。しばしば中性の「ヘルパー」脂質をまた含むカチオン性リポソームが核酸と混合されると、リポプレックスが自発的に形成される。
【００９０】
本発明が正電荷、負電荷又は中性電荷のような電荷又はカチオン性化合物、負化合物又は中性化合物に言及する場合、これは一般に、言及された電荷が生理学的ｐＨなどの選択されたｐＨで存在することを意味する。例えば、「カチオン性脂質」という用語は、生理学的ｐＨなどの選択されたｐＨで正味の正電荷を有する脂質を意味する。「中性脂質」という用語は、正味の正又は負の電荷を持たない脂質を意味し、生理学的ｐＨなどの選択されたｐＨで非電荷又は中性の両性イオンの形態で存在しうる。ここでの「生理学的ｐＨ」とは、約７．５のｐＨを意味する。
【００９１】
本発明での使用が企図される脂質担体などのナノ粒子担体には、ＲＮＡなどの核酸を、例えば核酸と複合体を形成するか又は核酸が封入もしくはカプセル化された小胞体を形成することにより、関連付けることができる任意の物質又はビヒクルが含まれる。これにより、ネイキッド核酸と比較して核酸の安定性が向上する場合がある。特に、血液中の核酸の安定性が向上する場合がある。
【００９２】
カチオン性脂質、カチオン性ポリマー、及び正電荷を持つ他の物質は、負電荷を持つ核酸と複合体を形成しうる。これらのカチオン性分子は、核酸を複合化するために使用でき、それにより、例えばそれぞれいわゆるリポプレックス又はポリプレックスが形成され、これらの複合体は核酸を細胞に送達することが示されている。
【００９３】
本発明において使用されるナノ粒子核酸調製物は、様々なプロトコルにより、また様々な核酸複合体化化合物から得ることができる。脂質、ポリマー、オリゴマー、又は両親媒性物質は、典型的な複合体化剤である。一実施態様では、複合体化化合物は、プロタミン、ポリエチレンイミン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｌ−アルギニン又はヒストンからなる群から選択される少なくとも一つの薬剤を含む。
【００９４】
本発明によれば、プロタミンはカチオン性担体剤として有用である。「プロタミン」という用語は、アルギニンが豊富で、様々な動物（魚など）の精子細胞において体細胞ヒストンの代わりに特にＤＮＡに関連していることが見出されている比較的低分子量の様々な強塩基性タンパク質の任意のものを指す。特に、「プロタミン」という用語は、強塩基性で、水に可溶性で、熱によって凝固せず、加水分解時に主にアルギニンを生成する、魚の精子に見出されるタンパク質を指す。精製された形態では、それらはインスリンの長時間作用型製剤においてヘパリンの抗凝固効果を中和するために使用される。本発明によれば、ここで使用される「プロタミン」という用語は、その断片及びアミノ酸配列又はその断片の多量体型を含む天然又は生物学的供給源から得られ又はそれに由来する任意のプロタミンアミノ酸配列を含むことを意味する。更に、この用語は、人工的であり、特定の目的のために特にデザインされ、天然又は生物学的供給源から単離できない（合成された）ポリペプチドを包含する。本発明に従って使用されるプロタミンは、硫酸化プロタミン又は塩酸塩プロタミンでありうる。好ましい実施態様では、ここに記載のナノ粒子の製造に使用されるプロタミン源は、等張塩溶液中に１０ｍｇ／ｍｌ（１ｍｌ当たり５０００ヘパリン中和単位）を超えるプロタミンを含むプロタミン５０００である。
【００９５】
リポソームは、多くの場合、リン脂質などの小胞形成脂質の一又は複数の二重層を有する微視的脂質小胞であり、薬物をカプセル化することができる。限定されないが、多重膜小胞（ＭＬＶ）、小さな単膜小胞（ＳＵＶ）、大きな単膜小胞（ＬＵＶ）、立体的に安定化されたリポソーム（ＳＳＬ）、多胞小胞（ＭＶ）、及び大きな多胞小胞（ＬＭＶ）、並びに当該技術分野で知られている他の二重層形態を含む様々なタイプのリポソームを本発明のコンテクストにおいて用いることができる。リポソームのサイズと層状性は、調製方法に依存し、使用される小胞タイプの選択は、好ましい投与態様に依存する。ラメラ相、六方相及び逆六方相、立方相、ミセル、単層からなる逆ミセルを含む、水性媒体中に脂質が存在しうる他の幾つかの超分子組織形態がある。これらの相はまたＤＮＡ又はＲＮＡと組み合わせて得ることができ、ＲＮＡ及びＤＮＡとの相互作用が相状態に実質的に影響を及ぼしうる。記載された相は、本発明のナノ粒子状核酸製剤中に存在しうる。
【００９６】
核酸とリポソームからの核酸リポプレックスの形成では、それが想定される核酸リポプレックスを提供する限り、リポソームを形成する任意の適切な方法を使用することができる。リポソームは、逆蒸発法（ＲＥＶ）、エタノール注入法、脱水−再水和法（ＤＲＶ）、超音波処理又は他の適切な方法などの標準的な方法を使用して形成することができる。
【００９７】
リポソーム形成後、実質的に均一なサイズ範囲を有するリポソームの集団を得るために、リポソームをサイズ分類することができる。
【００９８】
二重層形成脂質は、典型的には、２つの炭化水素鎖、特にアシル鎖と、極性又は非極性の頭部基を有している。二重層形成脂質は、天然に生じる脂質からなるか又は合成由来であり、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチド酸、ホスファチジルイノシトール、及びスフィンゴミエリンなどのリン脂質を含み、２つの炭化水素鎖は典型的には約１４〜２２炭素原子長であり、異なる不飽和度を有する。本発明の組成物での使用に適した他の脂質には、糖脂質及びステロール、例えばコレステロール、並びにリポソーム中でまた使用されうるその様々な類似体が含まれる。
【００９９】
カチオン性脂質は、典型的には、ステロール、アシル又はジアシル鎖などの親油性部分を有し、全体として正味の正電荷を持つ。脂質の頭部基は、典型的には正電荷を帯びている。カチオン性脂質は、好ましくは１〜１０価の正電荷、より好ましくは１〜３価の正電荷、より好ましくは１価の正電荷を有する。カチオン性脂質の例には、限定されるものではないが、１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）；ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）；１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）；１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＤＡＰ）；１，２−ジアシルオキシ−３−ジメチルアンモニウムプロパン；１，２−ジアルキルオキシ−３−ジメチルアンモニウムプロパン；塩化ジオクタデシルジメチルアンモニウム（ＤＯＤＡＣ）、１，２−ジミリストイルオキシプロピル−１，３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウム（ＤＭＲＩＥ）、及び２，３−ジオレオイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパナミウムトリフルオロ酢酸（ＤＯＳＰＡ）が含まれる。好ましいものはＤＯＴＭＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＤＡＣ、及びＤＯＳＰＡである。最も好ましいものはＤＯＴＭＡである。
【０１００】
加えて、ここに記載のナノ粒子は、構造安定性などの観点から中性脂質を更に含むことが好ましい。中性脂質は、核酸−脂質複合体の送達効率を考慮して適切に選択することができる。中性脂質の例には、限定されるものではないが、１，２−ジ−（９Ｚ−オクタデセノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン（sphingoemyelin）、セファリン、ステロール、及びセレブロシドが含まれる。好ましいものはＤＯＰＥ及び／又はＤＯＰＣである。最も好ましいものはＤＯＰＥである。カチオン性リポソームがカチオン性脂質と中性脂質の双方を含む場合、カチオン性脂質と中性脂質のモル比は、リポソームの安定性などを考慮して適切に決定することができる。
【０１０１】
一実施態様によれば、ここに記載されるナノ粒子はリン脂質を含みうる。リン脂質はグリセロリン脂質でありうる。グリセロリン脂質の例には、限定されるものではないが、３種類の脂質が含まれる：（ｉ）双性イオン性リン脂質、例えば、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、卵黄ホスファチジルコリン、天然、部分水素添加又は完全水素添加形態の大豆由来ＰＣ、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）スフィンゴミエリン（ＳＭ）；（ｉｉ）負に荷電したリン脂質、例えば、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）ジパルミポイル（dipalmipoyl）ＰＧ、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）；メトキシ−ポリエチレングリコール−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ）の場合のようにコンジュゲートが双性イオン性リン脂質を負に荷電させる合成誘導体；及び（ｉｉｉ）カチオン性リン脂質、例えば、カチオン性脂質を形成するためにそのホスホモノエステルがＯ−メチル化されたホスファチジルコリン又はスフィンゴミエリン。
【０１０２】
核酸の脂質担体への結合は、例えば、担体が物理的に核酸を捕捉するように、担体の間隙空間を満たす核酸により、又は共有結合、イオン結合、もしくは水素結合により、又は非特異的結合による吸着により、起こりうる。
【０１０３】
「免疫応答」という用語は、好ましくは抗原に対する、免疫系の反応に関するものであり、好ましくは細胞性免疫応答、体液性免疫応答、又はその両方を指す。免疫応答は、保護的／予防的（preventive）／予防的（prophylactic）及び／又は治療的でありうる。本発明によれば、抗原、細胞又は組織などの標的に関する「に対する（to）免疫応答」又は「に対する（against）免疫応答」という用語は、標的に対して向けられた免疫応答に関する。
【０１０４】
「免疫応答を刺激する」とは、免疫応答を刺激する前に標的抗原などの特定の標的に対する免疫応答がなかったことを意味しうるが、免疫を刺激する前に特定の標的に対して所定のレベルの免疫応答があり、免疫応答を刺激した後、前記免疫応答が増強されることを意味する場合もある。従って、「免疫応答を刺激する」には「免疫応答を誘導する」及び「免疫応答を増強する」が含まれる。好ましくは、対象の免疫応答を刺激した後、前記対象はがん疾患などの疾患の発症から保護されるか、又は免疫応答を刺激することにより疾患状態が寛解される。例えば、腫瘍抗原に対する免疫応答は、がん疾患を有する患者、又はがん疾患を発症するリスクがある対象において刺激されうる。この場合の免疫応答の刺激は、対象の疾患状態が寛解されること、対象が転移を発症しないこと、又はがん疾患を発症するリスクのある対象ががん疾患を発症しないことを意味しうる。
【０１０５】
「細胞性免疫応答」、「細胞性応答」、「細胞性免疫」という用語又は類似の用語は、クラスＩ又はクラスＩＩ ＭＨＣを伴う抗原の発現及び／又は抗原の提示によって特徴付けられる細胞に対する細胞性応答を含むことを意味する。細胞性応答は、「ヘルパー」又は「キラー」として作用するＴ細胞又はＴリンパ球と呼ばれる細胞に関連する。ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞とも呼ばれる）は免疫応答を調節することで中心的な役割を果たし、キラー細胞（細胞傷害性Ｔ細胞、細胞溶解性Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞又はＣＴＬとも呼ばれる）は罹患細胞などの細胞を死滅させる。
【０１０６】
「体液性免疫応答」という用語は、最終的に中和及び／又は排除される、薬剤及び生物に応答して抗体が産生される、生物におけるプロセスを指す。抗体応答の特異性は、単一の特異性の抗原に結合する膜結合受容体を介してＴ及び／又はＢ細胞によって媒介される。適切な抗原の結合と様々な他の活性化シグナルの受け取りに続いて、Ｂリンパ球が分裂し、メモリーＢ細胞並びに抗体分泌形質細胞クローンを生成し、それぞれがその抗原受容体によって認識されたものと同一の抗原エピトープを認識する抗体を産生する。メモリーＢリンパ球は、その特異的抗原によって続いて活性化されるまで休止状態のままである。これらのリンパ球は、特異的抗原に再暴露された場合に、記憶の細胞学的根拠と結果として生じる抗体応答の増大をもたらす。
【０１０７】
ここで使用される「抗体」という用語は、抗原上のエピトープに特異的に結合することができる免疫グロブリン分子を指す。特に、「抗体」という用語は、ジスルフィド結合により相互連結された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質を指す。「抗体」という用語には、モノクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、及び前述の何れかの組み合わせが含まれる。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）と重鎖定常領域（ＣＨ）で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）で構成される。可変領域と定常領域は、ここではそれぞれ可変ドメインと定常ドメインとも呼ばれる。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域に更に細分できる。各ＶＨ及びＶＬは、次の順でアミノ末端からカルボキシ末端に向かって配置された３つのＣＤＲと４つのＦＲで構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。ＶＨのＣＤＲはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と呼ばれ、ＶＬのＣＤＲはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３と呼ばれる。重鎖と軽鎖の可変領域には、抗原と相互作用する結合ドメインが含まれる。抗体の定常領域は、重鎖定常領域（ＣＨ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）を含み、ＣＨは更に定常ドメインＣＨ１、ヒンジ領域、及び定常ドメインＣＨ２及びＣＨ３に更に細分されうる（アミノ末端からカルボキシ末端へ次の順序で配置される：ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えばエフェクター細胞）及び古典的補体系の第一成分（Ｃｌｑ）を含む宿主組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介しうる。抗体は、天然源又は組換え源に由来するインタクトな免疫グロブリンであり得、インタクトな免疫グロブリンの免疫活性部分でありうる。抗体は、典型的には免疫グロブリン分子の四量体である。抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆｖ、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ）２、並びに単鎖抗体及びヒト化抗体を含む様々な形態で存在しうる。
【０１０８】
ここに記載の抗体には、ＩｇＡ、例えばＩｇＡ１又はＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＭ、及びＩｇＤ抗体が含まれる。様々な実施態様では、抗体はＩｇＧ１抗体、より具体的にはＩｇＧ１、カッパ又はＩｇＧ１、ラムダアイソタイプ（すなわちＩｇＧ１、κ、λ）、ＩｇＧ２ａ抗体（例えばＩｇＧ２ａ、κ、λ）、ＩｇＧ２ｂ抗体（例えばＩｇＧ２ｂ、κ、λ）、ＩｇＧ３抗体（例えばＩｇＧ３、κ、λ）又はＩｇＧ４抗体（例えばＩｇＧ４、κ、λ）である。
【０１０９】
「免疫グロブリン」という用語は、免疫グロブリンスーパーファミリーのタンパク質、好ましくは抗原受容体、例えば抗体又はＢ細胞受容体（ＢＣＲ）に関する。免疫グロブリンは、特徴的な免疫グロブリン（Ｉｇ）フォールドを有する構造ドメイン、すなわち免疫グロブリンドメインによって特徴付けられる。この用語には、膜結合免疫グロブリン並びに可溶性免疫グロブリンが含まれる。膜結合免疫グロブリンは、表面免疫グロブリン又は膜免疫グロブリンとも呼ばれ、一般にＢＣＲの一部である。可溶性免疫グロブリンは一般的に抗体と呼ばれる。免疫グロブリンは、一般に、幾つかの鎖、典型的にはジスルフィド結合を介して連結された２つの同一の重鎖と２つの同一の軽鎖を含む。これらの鎖は、ＶＬ（可変軽鎖）ドメイン、ＣＬ（定常軽鎖）ドメイン、ＶＨ（可変重鎖）ドメイン、及びＣＨ（定常重鎖）ドメインＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４などの免疫グロブリンドメインで主に構成される。哺乳類の免疫グロブリン重鎖には５つのタイプ、すなわちα、δ、ε、γ、及びμがあり、これらは抗体の異なるクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭを構成する。可溶性免疫グロブリンの重鎖とは対照的に、膜又は表面免疫グロブリンの重鎖は、膜貫通ドメインと短い細胞質ドメインをそのカルボキシ末端に含む。哺乳動物には、２種類の軽鎖、すなわちラムダとカッパがある。免疫グロブリン鎖は、可変領域と定常領域を含む。定常領域は、免疫グロブリンの異なるアイソタイプ内で本質的に保存されており、可変部は非常に多様であり、抗原認識の主要因である。
【０１１０】
本発明によれば、「抗原」又は「免疫原」という用語は、免疫応答の標的である及び／又は免疫応答を誘発する任意の物質、好ましくはペプチド又はタンパク質を包含する。特に、「抗原」は、抗体又はＴリンパ球（Ｔ細胞）と特異的に反応する任意の物質に関する。本発明によれば、「抗原」という用語は、ワクチン接種に適したＢ細胞又はＴ細胞エピトープなどの少なくとも一つのエピトープを含む任意の分子を含む。好ましくは、本発明のコンテクストにおける抗原は、場合によっては処理後に、好ましくは抗原又は抗原を発現する細胞に特異的な免疫反応を誘導する分子である。本発明によれば、免疫反応の候補である任意の適切な抗原が使用されうる。抗原は、好ましくは、天然に生じる抗原に対応するか又は由来する産物である。そのような天然に生じる抗原は、アレルゲン、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、及び他の感染性因子及び病原体を含みうるか又はそれらに由来し得、あるいは抗原はまた腫瘍抗原でありうる。好ましい実施態様では、抗原は、表面ポリペプチド、すなわち、細胞、病原体、細菌、ウイルス、真菌、寄生虫、アレルゲン、又は腫瘍の表面に天然に提示されるポリペプチドであるか又はそれに由来する。抗原は、細胞、病原体、細菌、ウイルス、真菌、寄生虫、アレルゲン、又は腫瘍に対する免疫応答を誘発しうる。
【０１１１】
本発明によれば、抗原は、細菌抗原、ウイルス抗原、真菌抗原、アレルゲン又は寄生虫抗原などの自己抗原及び非自己抗原を含む群から選択されうる。
【０１１２】
好ましい実施態様では、抗原は疾患又は障害に関連している、すなわち、抗原は疾患関連抗原である。「疾患関連抗原」という用語は、病理学的に重要な全ての抗原を指す。特に好ましい一実施態様では、疾患関連抗原は罹患細胞、組織及び／又は器官に存在するが、健康な細胞、組織及び／又は器官には存在しないか又は減少した量で存在し、従って、罹患細胞、組織及び／又は器官を標的とするために使用されうる。一実施態様では、疾患関連抗原は、罹患細胞の表面に存在する。一実施態様では、疾患関連抗原は、宿主の免疫系を刺激して疾患に対する体液性及び／又は細胞性免疫応答を引き起こす少なくとも一つのエピトープを含む分子である。従って、疾患関連抗原は治療目的に使用されうる。疾患関連抗原は、好ましくは微生物、典型的には微生物抗原による感染に関連しているか、又はがん、典型的には腫瘍に関連している。
【０１１３】
幾つかの実施態様では、抗原は細菌抗原であるか又は細菌抗原に由来する。幾つかの実施態様では、抗原は、鳥、魚及び家畜化動物を含む哺乳動物を含む動物に感染する細菌に対する免疫応答を誘発する。好ましくは、免疫応答が誘発される細菌は病原性細菌である。
【０１１４】
幾つかの実施態様では、抗原はウイルス抗原であるか又はウイルス抗原に由来する。ウイルス抗原は、例えば、ウイルス表面タンパク質由来のペプチド、例えばカプシドポリペプチド又はスパイクポリペプチドでありうる。幾つかの実施態様では、抗原は、鳥、魚、及び家畜化動物を含む哺乳動物を含む動物に感染するウイルスに対する免疫応答を誘発する。好ましくは、免疫応答が誘発されるウイルスは病原性ウイルスである。
【０１１５】
幾つかの実施態様では、抗原は真菌由来のペプチド又はタンパク質であるか又はそれに由来する。幾つかの実施態様では、抗原は、鳥、魚、及び家畜化動物を含む哺乳動物を含む動物に感染する真菌に対する免疫応答を誘発する。好ましくは、免疫応答が誘発される真菌は病原性真菌である。
【０１１６】
幾つかの実施態様では、抗原は、単細胞真核寄生虫由来のペプチド又はタンパク質であるか又はそれに由来する。幾つかの実施態様では、抗原は、単細胞真核寄生虫、好ましくは病原性単細胞真核寄生虫に対する免疫応答を誘発する。病原性単細胞真核寄生虫は、例えばプラスモジウム属、例えば、熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）、三日熱マラリア原虫（P. vivax）、四日熱マラリア原虫（P. malariae）又は卵形マラリア原虫（P. ovale）、リーシュマニア属、又はトリパノソーマ属、例えばクルーズトリパノソーマ（T. cruzi）又はブルセイトリパノソーマ（T. brucei）由来でありうる。
【０１１７】
幾つかの実施態様では、抗原はアレルゲン性ペプチド又はアレルゲン性タンパク質であるか又はそれに由来する。アレルゲン性ペプチド又はアレルゲン性タンパク質は、減感作としても知られるアレルゲン免疫療法に適している。
【０１１８】
好ましい実施態様では、抗原は、腫瘍抗原又は腫瘍関連抗原、すなわち、細胞質、細胞表面及び細胞核に由来しうるがん細胞の構成物、特に、がん細胞上の表面抗原として、好ましくは多量に、産生される抗原である。
【０１１９】
本発明のコンテクストにおいて、「腫瘍抗原」又は「腫瘍関連抗原」という用語は、正常な条件下で限られた数の組織及び／又は器官においてあるいは特定の発達段階で特異的に発現されるタンパク質に関し、例えば腫瘍抗原は、正常な条件下で胃組織、好ましくは胃粘膜、生殖器官、例えば精巣、絨毛性組織、例えば胎盤、又は生殖系細胞で特異的に発現され得、一又は複数の腫瘍又はがん組織において発現され又は異常発現される。このコンテクストにおいて、「限られた数」とは、好ましくは３以下、より好ましくは２以下を意味する。本発明のコンテクストにおける腫瘍抗原には、例えば、分化抗原、好ましくは細胞型特異的分化抗原、すなわち所定の分化段階で所定の細胞型において正常な条件下で特異的に発現されるタンパク質、がん／精巣抗原、すなわち正常条件下で精巣において、時には胎盤において特異的に発現されるタンパク質、及び生殖系列特異的抗原が含まれる。本発明のコンテクストにおいて、腫瘍抗原は、好ましくはがん細胞の細胞表面と関連しており、好ましくは正常組織では発現されないか、希にしか発現されない。好ましくは、腫瘍抗原又は腫瘍抗原の異常な発現により、がん細胞が特定される。本発明のコンテクストにおいて、対象、例えばがん疾患に罹患している患者においてがん細胞により発現される腫瘍抗原は、好ましくは前記対象の自己タンパク質である。好ましい実施態様では、本発明のコンテクストにおける腫瘍抗原は、特に非必須の組織又は器官において、すなわち、免疫系によって損傷された場合に対象の死に至らない組織又は器官において、又は免疫系がアクセスできないか又は殆どアクセスできない身体の器官又は構造において、正常条件下で発現される。好ましくは、腫瘍抗原のアミノ酸配列は、正常組織において発現される腫瘍抗原とがん組織において発現される腫瘍抗原との間で同一である。
【０１２０】
本発明において有用でありうる腫瘍抗原の例は、ｐ５３、ＡＲＴ−４、ＢＡＧＥ、β−カテニン／ｍ、Ｂｃｒ−ａｂＬ ＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ−１、ＣＡＳＰ−８、ＣＤＣ２７／ｍ、ＣＤＫ４／ｍ、ＣＥＡ、クローディンファミリーの細胞表面タンパク質、例えばＣＬＡＵＤＩＮ−６、ＣＬＡＵＤＩＮ−１８．２及びＣＬＡＵＤＩＮ−１２、ｃ−ＭＹＣ、ＣＴ、Ｃｙｐ−Ｂ、ＤＡＭ、ＥＬＦ２Ｍ、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１、Ｇ２５０、ＧＡＧＥ、ＧｎＴ−Ｖ、Ｇａｐ１００、ＨＡＧＥ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＨＰＶ−Ｅ７、ＨＰＶ−Ｅ６、ＨＡＳＴ−２、ｈＴＥＲＴ（又はｈＴＲＴ）、ＬＡＧＥ、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、ＭＡＧＥ−Ａ、好ましくはＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ５、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ７、ＭＡＧＥ−Ａ８、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１１、又はＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＧＥ−Ｂ、ＭＡＧＥ−Ｃ、ＭＡＲＴ−１／メラン−Ａ、ＭＣ１Ｒ、ミオシン／ｍ、ＭＵＣ１、ＭＵＭ−１、−２、−３、ＮＡ８８−Ａ、ＮＦ１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＮＹ−ＢＲ−１、ｐ１９０マイナーＢＣＲ−ａｂＬ、Ｐｍ１／ＲＡＲａ、ＰＲＡＭＥ、プロテイナーゼ３、ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＲＡＧＥ、ＲＵ１又はＲＵ２、ＳＡＧＥ、ＳＡＲＴ−１又はＳＡＲＴ−３、ＳＣＧＢ３Ａ２、ＳＣＰ１、ＳＣＰ２、ＳＣＰ３、ＳＳＸ、ＳＵＲＶＩＶＩＮ、ＴＥＬ／ＡＭＬ１、ＴＰＩ／ｍ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＴＲＰ−２／ＩＮＴ２、ＴＰＴＥ及びＷＴである。特に好ましい腫瘍抗原には、ＣＬＡＵＤＩＮ−１８．２（ＣＬＤＮ１８．２）及びＣＬＡＵＤＩＮ−６（ＣＬＤＮ６）が含まれる。
【０１２１】
抗原又は抗原をコードする核酸を投与することにより、本発明に従って対象に提供される抗原、すなわちワクチン抗原は、Ｂ細胞応答及び／又はＴ細胞応答をもたらすはずである。抗体及び／又はＴ細胞は、標的抗原、特に罹患細胞、組織及び／又は器官によって又はその中で発現される標的抗原、すなわち疾患関連抗原に対して向けられるべきである。従って、ワクチン抗原は、疾患関連抗原に対応するかもしくはそれを含み得、又はそのバリアントでありうる。一実施態様では、そのようなバリアントは、疾患関連抗原と免疫学的に等価である。本発明のコンテクストにおいて、「抗原のバリアント」という用語は、特に罹患細胞、組織及び／又は器官、あるいは抗原を発現し場合によってはＭＨＣ分子のコンテクストで抗原を提示する細胞において発現される場合、抗原、すなわち疾患関連抗原を標的とするＢ細胞応答及び／又はＴ細胞応答をもたらす薬剤を意味する。従って、ワクチン抗原は、疾患関連抗原と同一であり得、疾患関連抗原又はその一部を含み得、又は疾患関連抗原又はその一部と相同の抗原を含みうる。ワクチン抗原が疾患関連抗原の一部又は疾患関連抗原に相同な抗原の一部を含む場合、前記一部はＢ細胞応答及び／又はＴ細胞が標的とされる疾患関連抗原のエピトープを含みうる。従って、本発明によれば、抗原は、疾患関連抗原のペプチド断片などの疾患関連抗原の免疫原性断片を含みうる。本発明に係る「抗原の免疫原性断片」は、好ましくは、Ｂ細胞応答及び／又はＴ細胞応答を刺激することができる抗原の一部又は断片に関する。本発明に従って投与されるワクチン抗原又はワクチン抗原をコードする核酸は、組換え抗原又は組換え核酸でありうる。
【０１２２】
「免疫学的に等価」という用語は、免疫学的に等価なアミノ酸配列などの免疫学的に等価な分子が同じ又は本質的に同じ免疫学的特性を示し、及び／又は例えば免疫学的効果のタイプに対して、同じ又は本質的に同じ免疫学的効果を発揮することを意味する。本発明のコンテクストにおいて、「免疫学的に等価」という用語は、好ましくは、免疫化に使用される抗原又は抗原バリアントの免疫学的効果又は特性に関して使用される。例えば、アミノ酸配列は、対象の免疫系にさらされたときに前記アミノ酸配列が参照アミノ酸配列と反応するという特異性を有する免疫反応を誘導する場合、参照アミノ酸配列と免疫学的に等価である。
【０１２３】
「エピトープ」という用語は、抗原などの分子中の抗原決定基、すなわち、例えば抗体又はＴ細胞受容体によって認識される免疫系によって認識され、すなわち結合される分子の一部又は断片を指す。例えば、エピトープは、免疫系によって認識される、抗原上の別々の三次元部位である。エピトープは通常、アミノ酸や糖側鎖などの化学的に活性な表面分子グループで構成され、通常は特定の三次元構造特性と特定の電荷特性を有している。立体構造エピトープと非立体構造エピトープは、変性溶媒の存在下では前者への結合が失われ、後者への結合は失われないという点で区別される。好ましくは、エピトープは、抗原又は抗原を発現する細胞に対して免疫応答を誘発することができる。好ましくは、この用語は、エピトープを含む抗原の免疫原性部分に関する。腫瘍抗原などのタンパク質のエピトープは、好ましくは前記タンパク質の連続部分又は不連続部分を含み、好ましくは５から１００、好ましくは５から５０、より好ましくは８から３０、最も好ましくは１０から２５アミノ酸長であり、例えば、エピトープは、好ましくは、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５アミノ酸長でありうる。本発明のコンテクストにおけるエピトープはＢ細胞エピトープ又はＴ細胞エピトープであることが好ましい。
【０１２４】
ここで使用される場合、「Ｔ細胞エピトープ」という用語は、Ｔ細胞受容体により認識される立体配置でのＭＨＣ分子に結合するペプチドを指す。典型的には、Ｔ細胞エピトープは抗原提示細胞の表面上に提示される。本発明に係る「Ｔ細胞エピトープ」は、好ましくは、免疫応答、好ましくは抗原の発現、好ましくは抗原の提示により特徴付けられる細胞又は抗原に対する細胞性応答を刺激することができる抗原の一部又は断片に関する。好ましくは、Ｔ細胞エピトープは、抗原の提示を特徴とする細胞に対する細胞性応答を刺激することができる。好ましくは、Ｔ細胞エピトープはＭＨＣクラスＩ及び／又はクラスＩＩ提示ペプチドである。好ましくは、Ｔ細胞エピトープは、抗原の断片のアミノ酸配列に実質的に対応するアミノ酸配列を含む。好ましくは、抗原の前記断片は、ＭＨＣクラスＩ及び／又はクラスＩＩ提示ペプチドである。ＭＨＣ分子、特にクラスＩ ＭＨＣ分子への結合に適したペプチドは、好ましくは長さが７〜２０アミノ酸、より好ましくは長さが７〜１２アミノ酸、より好ましくは長さが８〜１１アミノ酸、特に９又は１０アミノ酸長である。一実施態様では、抗原提示細胞のＭＨＣなどのＭＨＣのコンテクストで提示される場合のＴ細胞エピトープはＴ細胞受容体によって認識される。Ｔ細胞受容体によって認識される場合、Ｔ細胞エピトープは、適切な共刺激シグナルの存在下で、Ｔ細胞エピトープを特異的に認識するＴ細胞受容体を運ぶＴ細胞のクローン増殖を誘導することができる場合がある。好ましくは、特にＭＨＣ分子のコンテクストで提示される場合、Ｔ細胞エピトープは、免疫応答、好ましくはそれらが由来する抗原に対する、又は抗原の発現により特徴付けられ、好ましくは抗原の提示により特徴付けられる細胞に対する細胞性応答を刺激することができる。
【０１２５】
本発明によれば、Ｔ細胞エピトープは、ワクチン配列及び／又は１を超えるＴ細胞エピトープを含むポリペプチドなどのより大きな物質の一部としてワクチン抗原中に存在しうる。提示されたペプチド又はＴ細胞エピトープは、適切なプロセシング後に産生される。また、Ｔ細胞エピトープは、ＴＣＲ認識又はＭＨＣへの結合に必須ではない一又は複数の残基で修飾されうる。そのような修飾されたＴ細胞エピトープは免疫学的に等価であると考えられうる。
【０１２６】
ここに記載の抗原を使用する本発明によるワクチン接種は、好ましくは、疾患関連抗原又はそのエピトープに対する免疫応答をもたらす。好ましくは、そのような疾患関連抗原又はそのエピトープは、一又は複数の疾患特異的アミノ酸修飾を含み、例えばそれらは、疾患関連のネオ抗原又はネオエピトープを含むか又はネオ抗原又はネオエピトープである。好ましくは、疾患特異的アミノ酸修飾は、一又は複数の疾患特異的体細胞変異によるものである。特に好ましい一実施態様では、疾患特異的アミノ酸修飾はがん特異的アミノ酸修飾であり、疾患特異的体細胞変異はがん特異的体細胞変異である。従って、一実施態様では、ワクチン抗原は、好ましくは患者の疾患特異的アミノ酸修飾／疾患特異的体細胞変異を特徴とし、好ましくは投与時に一又は複数の変異に基づくネオエピトープを提供する。従って、ワクチン抗原は、一又は複数の変異に基づくネオエピトープを含むペプチド又はポリペプチドを含みうる。一実施態様では、疾患特異的体細胞変異を同定することにより、例えば罹患組織又は一又は複数の罹患細胞のゲノムＤＮＡ及び／又はＲＮＡを配列決定することにより、疾患特異的アミノ酸修飾が同定される。
【０１２７】
ここで使用される場合、「ネオエピトープ」という用語は、正常な非罹患（例えば非がん性）又は生殖系細胞などの参照には存在しないが、罹患細胞（例えば、がん細胞）に見出されるエピトープを指す。これには、特に、正常な非罹患又は生殖細胞において対応するエピトープが見出されるが、罹患細胞の一又は複数の変異により、エピトープの配列がネオエピトープを生じるように変化している状況が含まれる。
【０１２８】
本発明によれば、「ワクチン」という用語は、投与時に病原体又はがん細胞などの罹患細胞を認識して攻撃する免疫応答を誘導する薬学的製剤（薬学的組成物）又は製品に関する。ワクチンは、疾患の予防又は治療のために使用できる。特に、「ワクチン」という用語は、ここで定義される、抗原を含む組成物を指す。
【０１２９】
一実施態様では、本発明により提供されるワクチンは、治療的又は予防的に有用な免疫応答を刺激するためのここに記載の、ここでは単に「抗原」とも呼ばれる、ワクチン抗原、又はペプチド又はタンパク質抗原をコードする核酸、好ましくはＲＮＡを含む。
【０１３０】
ここに記載される抗原は、対象に投与される場合、好ましくは、疾患特異的免疫応答を刺激するのに適した一又は複数のエピトープをもたらす。一実施態様では、疾患特異的免疫応答は、好ましくは疾患関連抗原に対する抗原特異的免疫応答である。例えば罹患細胞又は病原体によるこれらのエピトープの提示は、免疫応答によるターゲティングのラベルとして機能する。
【０１３１】
本発明の一実施態様では、ここに記載の抗原は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）であるか又はウイルス様粒子（ＶＬＰ）の形態で提供される。ウイルス様粒子はウイルスに似ているが、ウイルス遺伝物質を含まないため、非感染性である。エンベロープやカプシドなどのウイルス構造タンパク質の発現は、ウイルス様粒子の自己組織化を引き起こす場合がある。ウイルス様粒子は、パルボウイルス科（例えば、アデノ随伴ウイルス）、レトロウイルス科（例えば、ＨＩＶ）、フラビウイルス科（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス）及びバクテリオファージ（例えば、Ｑβ、ＡＰ２０５）を含む多種多様なウイルス科の成分から生成されている。ウイルス様粒子は、細菌、哺乳動物細胞株、昆虫細胞株、酵母及び植物細胞を含む複数の細胞培養系において生成できる。ウイルス様粒子はワクチンとして有用である。ウイルス様粒子は、強力なＴ細胞及びＢ細胞の免疫応答を誘発できる立体構造ウイルスエピトープを提示するウイルス表面タンパク質の反復的な高密度ディスプレイを含む。ウイルス様粒子は複製できないため、弱毒化ウイルスに対してより安全な代替物を提供する。
【０１３２】
Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃＡｇ）に由来するウイルス様粒子などのウイルス様粒子は外来免疫エピトープの非感染性キャリアとしてまた有用である。Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃＡｇ）は、微粒子状正二十面体ヌクレオカプシドに自然に集合する。組換えＨＢｃＡｇ粒子などのウイルス様粒子を使用して、ウイルスタンパク質のエピトープ、細菌及び原生動物タンパク質エピトープ、並びに腫瘍抗原エピトープを表示することができる。挿入されたエピトープの高度に反復的な高密度表示と間隔は、Ｂ細胞受容体の架橋に最適であると思われる。
【０１３３】
本発明による免疫療法アプローチには、ペプチド又はタンパク質抗原（天然又は改変）、ペプチド又はタンパク質抗原をコードする核酸、ペプチド又はタンパク質抗原をコードする組換え細胞、ペプチド又はタンパク質抗原をコードする組換えウイルス、及びペプチド又はタンパク質抗原（天然又は改変）がパルスされ、又はペプチド又はタンパク質抗原をコードする核酸でトランスフェクトされた抗原提示細胞による免疫化が含まれる。
【０１３４】
一実施態様では、目的は、腫瘍抗原を発現するがん細胞に対する免疫応答を提供し、腫瘍抗原を発現する細胞が関与するがん疾患を治療することである。腫瘍抗原を発現する前記がん細胞は、前記がん細胞の表面上に腫瘍抗原を発現し得、及び／又はＭＨＣ分子のコンテクストにおいて細胞表面上に腫瘍抗原を提示しうる。細胞表面上に腫瘍抗原を発現するがん細胞は、腫瘍抗原、特に腫瘍抗原の細胞外部分に向けられた抗体によって標的化されうる。ＭＨＣ分子のコンテクストにおいて細胞表面に腫瘍抗原を提示するがん細胞は、腫瘍抗原のＴ細胞エピトープに向けられたＴ細胞により標的化されうる。
【０１３５】
「細胞表面」は、当該技術分野におけるその通常の意味に従って使用され、従って、タンパク質及び他の分子による結合にアクセス可能な細胞の外側を含む。抗原は、それが細胞の表面に位置し、例えば細胞に加えられた抗原特異的抗体による結合にアクセス可能である場合、細胞の表面上に発現される。一実施態様では、細胞の表面上に発現される抗原は、細胞外部分を有する膜内在性タンパク質である。
【０１３６】
本発明のコンテクストにおける「細胞外部分」又は「エキソドメイン」という用語は、細胞の細胞外空間に面し、例えば細胞外にある抗体などの分子に結合することにより、好ましくは前記細胞の外側からアクセス可能であるタンパク質などの分子の一部を指す。好ましくは、この用語は、一又は複数の細胞外ループ又はドメイン又はその断片を指す。
【０１３７】
「一部」又は「部分」という用語は、ここでは互換的に使用され、アミノ酸配列などの構造の連続的又は不連続的要素を指す。「断片」という用語は、アミノ酸配列などの構造の連続した要素を指す。構造の一部、部分又は断片は、好ましくは、前記構造の一又は複数の機能的特性、例えば抗原性、免疫学的及び／又は結合特性を含む。タンパク質配列の部分又は一部は、好ましくは、タンパク質配列の少なくとも６個、特に少なくとも８個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも５０個、又は少なくとも１００個の連続及び／又は非連続アミノ酸を含む。タンパク質配列の断片は、好ましくは、タンパク質配列の少なくとも６個、特に少なくとも８個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも５０個、又は少なくとも１００個の連続アミノ酸を含む。
【０１３８】
「免疫原性」という用語は、免疫反応を誘導する抗原の相対的有効性に関する。
【０１３９】
「免疫賦活性」という用語は、ここでは全体的な免疫応答の増加を指すために使用される。
【０１４０】
「標的」という用語は、免疫応答の標的である細胞、特にがん細胞などの薬剤を意味するものとする。標的には、抗原又は抗原エピトープ、すなわち抗原に由来するペプチド断片を提示する細胞が含まれる。一実施態様では、標的細胞は、好ましくは細胞表面に存在する標的抗原を発現する細胞である。
【０１４１】
「抗原プロセシング」とは、抗原の断片であるプロセシング生成物への抗原の分解（例えば、タンパク質のペプチドへの分解）と、細胞、好ましくは特異的Ｔ細胞に対する抗原提示細胞による提示のためのＭＨＣ分子とのこれらの断片の一又は複数の（例えば、結合による）会合である。
【０１４２】
抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、その表面に主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）のコンテクストで抗原を表示する細胞である。Ｔ細胞は、そのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を使用してこの複合体を認識しうる。抗原提示細胞は抗原を処理し、それらをＴ細胞に提示する。抗原提示細胞には、限定されるものではないが、単球／マクロファージ、Ｂ細胞及び樹状細胞（ＤＣ）が含まれる。本発明によれば、「抗原提示細胞」という用語には、プロフェッショナル抗原提示細胞及び非プロフェッショナル抗原提示細胞が含まれる。
【０１４３】
プロフェッショナル抗原提示細胞は、貪食作用又は受容体依存性エンドサイトーシスの何れかによって抗原を内部移行し、ついでクラスＩＩ ＭＨＣ分子に結合した抗原の断片をその膜上に表示するのに非常に効率的である。Ｔ細胞は、抗原提示細胞の膜上の抗原−クラスＩＩ ＭＨＣ分子複合体を認識し、それと相互作用する。次に、抗原提示細胞によって追加の共刺激シグナルが生成され、Ｔ細胞の活性化につながる。共刺激分子の発現は、プロフェッショナル抗原提示細胞を定義する特徴である。
【０１４４】
プロフェッショナル抗原提示細胞の主な種類は樹状細胞であり、それは最も広範囲の抗原提示を持ち、おそらく最も重要な抗原提示細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、及び所定の活性化上皮細胞である。
【０１４５】
非プロフェッショナル抗原提示細胞は、ナイーブＴ細胞との相互作用に必要なＭＨＣクラスＩＩタンパク質を構成的に発現しない；これらは、ＩＦＮγなどの所定のサイトカインによる非プロフェッショナル抗原提示細胞の刺激によってのみ発現される。
【０１４６】
樹状細胞（ＤＣ）は、ＭＨＣクラスＩＩ及びＩの両方の抗原提示経路を介してＴ細胞に末梢組織で捕捉された抗原を提示する白血球集団である。樹状細胞が免疫応答の強力な誘導因子であり、これらの細胞の活性化が免疫誘導の重要な工程であることはよく知られている。
【０１４７】
樹状細胞は、「未熟」細胞と「成熟」細胞に簡便に分類され、これは二つのよく特徴付けられた表現型を区別する単純な方法として使用できる。しかし、この命名法は、分化の全ての可能な中間段階を除外すると解釈されるべきではない。
【０１４８】
未熟樹状細胞は、Ｆｃγ受容体及びマンノース受容体の高発現と相関する、抗原の取り込み及びプロセシングの能力が高い抗原提示細胞として特徴付けられる。成熟表現型は、典型的には、これらのマーカーの低発現と、しかしクラスＩ及びクラスＩＩ ＭＨＣ、接着分子（例えばＣＤ５４及びＣＤ１１）及び共刺激分子（例えばＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６及び４−１ＢＢ）のようなＴ細胞活性化の原因となる細胞表面分子の高発現によって特徴付けられる。
【０１４９】
樹状細胞成熟は、そのような抗原提示樹状細胞がＴ細胞プライミングを引き起こすが、未熟樹状細胞による提示が耐性をもたらす樹状細胞活性化の状態と呼ばれる。樹状細胞成熟は、主に、自然受容体よって検出される微生物の特徴を持つ生体分子（細菌ＤＮＡ、ウイルスＲＮＡ、エンドトキシン等々）、炎症誘発性サイトカイン（ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＦＮ）、ＣＤ４０Ｌによる樹状細胞表面上のＣＤ４０のライゲーション、及びストレスの多い細胞死を被っている細胞から放出される物質によって引き起こされる。樹状細胞は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）や腫瘍壊死因子αなどのサイトカインと共にインビトロで骨髄細胞を培養することにより誘導することができる。
【０１５０】
「形質細胞様樹状細胞」又は「ｐＤＣ」という用語は、血液中を循環し、末梢リンパ器官に見出される自然免疫細胞に関連している。それらは骨髄造血幹細胞から発生し、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の＜０．４％を構成する。ヒトにおいて、形質細胞様樹状細胞は形質細胞の形態を示し、ＣＤ４、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１２３、血液由来樹状細胞抗原−２（ＢＤＣＡ−２）、トール様受容体（ＴＬＲ）７及びＴＬＲ９をエンドソーム区画内に発現するが、高レベルのＣＤ１１ｃ又はＣＤ１４は発現せず、これがそれらを一般的な樹状細胞又は単球とそれぞれ区別する。自然免疫系の成分として、形質細胞様樹状細胞は、ｓｓＲＮＡ及び非メチル化ＣｐＧ ＤＮＡ配列をそれぞれ検出する細胞内トール様受容体７及び９を発現する。刺激とその後の活性化により、これらの細胞は多量（他の細胞型の最大１０００倍）のＩ型インターフェロン（主にＩＦＮ−α（アルファ）及びＩＦＮ−β（ベータ））を産生する。
【０１５１】
「抗原の提示によって特徴付けられる細胞」又は「抗原を提示する細胞」又は類似の表現とは、例えばＭＨＣ分子、特にＭＨＣクラスＩ分子とのコンテクストにおいて、抗原のプロセシングにより、抗原又は前記抗原に由来する断片を提示する、罹患細胞などの細胞、例えばがん細胞、又は抗原提示細胞を意味する。同様に、「抗原の提示によって特徴付けられる疾患」という用語は、特にクラスＩ ＭＨＣを伴う抗原の提示によって特徴付けられる細胞が関与する疾患を示す。
【０１５２】
本発明のコンテクストにおける「免疫反応性細胞」又は「エフェクター細胞」という用語は、免疫反応中にエフェクター機能を発揮する細胞に関する。「免疫反応性細胞」は、好ましくは、抗原又はエピトープの発現及び／又は提示によって特徴付けられ、免疫応答を媒介する細胞又は抗原に結合することができる。例えば、そのような細胞は、サイトカイン及び／又はケモカインを分泌し、微生物を死滅させ、抗体を分泌し、感染細胞又はがん性細胞を認識し、場合によってはそのような細胞を排除する。例えば、免疫反応性細胞は、Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、腫瘍浸潤Ｔ細胞）、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、好中球、マクロファージ、及び樹状細胞を含む。
【０１５３】
好ましくは、「免疫反応性細胞」は、特に抗原提示細胞又は腫瘍細胞などの罹患細胞の表面などのＭＨＣ分子のコンテクストで提示される場合、ある程度の特異性で抗原又はエピトープを認識する。好ましくは、前記認識が、抗原又はエピトープを認識する細胞が応答性又は反応性になることを可能にする。細胞がＭＨＣクラスＩＩ分子のコンテクストで抗原又はエピトープを認識する受容体を担持するヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）である場合、そのような応答性又は反応性は、サイトカインの放出及び／又はＣＤ８＋リンパ球（ＣＴＬ）及び／又はＢ細胞の活性化を含みうる。細胞がＣＴＬである場合、そのような応答性又は反応性は、ＭＨＣクラスＩ分子のコンテクストで提示される細胞、すなわち、例えばアポトーシス又はパーフォリン媒介細胞溶解を介したクラスＩ ＭＨＣによる抗原の提示により特徴付けられる細胞の除去を含みうる。本発明によれば、ＣＴＬ応答性は、持続的なカルシウム流、細胞分裂、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αなどのサイトカインの産生、ＣＤ４４及びＣＤ６９などの活性化マーカーのアップレギュレーション、及び抗原発現標的細胞の特異的な細胞溶解性死滅を含みうる。ＣＴＬ応答性はまたＣＴＬ応答性を精確に示す人工レポーターを使用して決定することもできる。抗原又はエピトープを認識し、応答性又は反応性であるそのようなＣＴＬは、ここでは「抗原応答性ＣＴＬ」とも呼ばれる。細胞がＢ細胞である場合、そのような応答性は免疫グロブリンの放出を含みうる。
【０１５４】
「Ｔ細胞」又は「Ｔリンパ球」という用語は、様々な細胞性免疫反応に関与する胸腺由来細胞に関連し、Ｔヘルパー細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）と細胞溶解性Ｔ細胞を含む細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ、ＣＤ８＋Ｔ細胞）とを含む。
【０１５５】
Ｔ細胞はリンパ球として知られる白血球のグループに属し、細胞性免疫において中心的な役割を果たす。それらは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と呼ばれる細胞表面上の特別な受容体の存在により、Ｂ細胞やナチュラルキラー細胞などの他のリンパ球と区別できる。胸腺は、Ｔ細胞の成熟に関与する主要な器官である。Ｔ細胞の幾つかの異なるサブセットが発見されており、それぞれが異なる機能を有している。
【０１５６】
Ｔヘルパー細胞は、他の機能の中でも、Ｂ細胞の形質細胞への成熟、細胞傷害性Ｔ細胞及びマクロファージの活性化を含む、免疫プロセスにおいて他の白血球を支援する。これらの細胞は、その表面にＣＤ４タンパク質を発現するため、ＣＤ４＋Ｔ細胞としても知られている。ヘルパーＴ細胞は、それらが抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面に発現されるＭＨＣクラスＩＩ分子によってペプチド抗原と共に提示されると、活性化される。活性化されると、それらは急速に分裂し、能動的免疫応答を調節又は支援するサイトカインと呼ばれる低分子タンパク質を分泌する。
【０１５７】
細胞傷害性Ｔ細胞は、ウイルス感染細胞と腫瘍細胞を破壊し、移植片拒絶反応にも関与している。これらの細胞は、表面にＣＤ８糖タンパク質を発現するため、ＣＤ８＋Ｔ細胞としても知られている。これらの細胞は、体のほぼ全ての細胞の表面に存在するＭＨＣクラスＩに関連する抗原に結合することにより、その標的を認識する。
【０１５８】
Ｔ細胞の大部分は、幾つかのタンパク質の複合体として存在するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有している。実際のＴ細胞受容体は、独立したＴ細胞受容体アルファ及びベータ（ＴＣＲα及びＴＣＲβ）遺伝子から生成され、α−及びβ−ＴＣＲ鎖と呼ばれる２つの別々のペプチド鎖で構成されている。γδＴ細胞（ガンマデルタＴ細胞）は、その表面に別個のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を持つＴ細胞の小サブセットを表す。しかし、γδＴ細胞では、ＴＣＲは一つのγ鎖と一つのδ鎖で構成されている。Ｔ細胞のこのグループは、αβＴ細胞ほど一般的ではない（全Ｔ細胞の２％）。
【０１５９】
Ｔ細胞受容体の構造は、抗体アームの軽鎖と重鎖の組み合わせとして定義される領域である免疫グロブリンＦａｂ断片に非常に類似している。ＴＣＲの各鎖は免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、一つのＮ末端免疫グロブリン（Ｉｇ）可変（Ｖ）ドメイン、一つのＩｇ定常（Ｃ）ドメイン、膜貫通／細胞膜貫通領域、及びＣ末端の短い細胞質側末端を有する。ＴＣＲα鎖及びβ鎖双方の可変ドメインには、３つの超可変又は相補性決定領域（ＣＤＲ）があるが、β鎖の可変領域には、通常は抗原と接触せず、よってＣＤＲとは見なされない追加の超可変性領域（ＨＶ４）がある。α鎖のＣＤＲ１もまた抗原性ペプチドのＮ末端部分と相互作用することが示されてるが、ＣＤＲ３はプロセシングされた抗原の認識に関与する主要なＣＤＲであり、β鎖のＣＤＲ１はペプチドのＣ末端部分と相互作用する。ＣＤＲ２はＭＨＣを認識すると考えられている。β鎖のＣＤＲ４は抗原認識に関与するとは考えられていないが、スーパー抗原と相互作用することが示されている。ＴＣＲドメインの定常ドメインは、システイン残基がジスルフィド結合を形成し、２つの鎖の間に連結を形成する短い連結配列で構成されている。
【０１６０】
「Ｂ細胞」又は「Ｂリンパ球」という用語は、抗体を分泌することにより体液性免疫において機能するリンパ球サブタイプの白血球のタイプに関する。加えて、Ｂ細胞は抗原を提示し、プロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）として分類され、サイトカインを分泌する。Ｂ細胞は、その細胞膜上にＢ細胞受容体（ＢＣＲ）を発現する。ＢＣＲは、Ｂ細胞が特異的抗原に結合することを可能にし、それに対して抗体応答を開始する。Ｂ細胞受容体は、２つの部分、つまり、内在性膜ドメインの存在を除き、その分泌型と同一である一つのアイソタイプ（ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、又はＩｇＥ）の膜結合免疫グロブリン分子と、シグナル伝達部分：ジスルフィド架橋により結合されたＩｇ−α／Ｉｇ−β（ＣＤ７９）と呼ばれるヘテロ二量体とから構成されている。二量体の各メンバーは原形質膜にまたがっており、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を持つ細胞質側末端を有している。
【０１６１】
Ｂ細胞の活性化は、脾臓やリンパ節などの二次リンパ器官で起こる。Ｂ細胞は骨髄で成熟した後、血液を介して二次リンパ器官に移動し、循環リンパを通して抗原の絶えない供給を受ける。Ｂ細胞がそのＢＣＲを介して抗原に結合すると、Ｂ細胞の活性化が始まる。異なるＢ細胞サブセットが、Ｔ細胞依存性活性化又はＴ細胞非依存性活性化を受ける。
【０１６２】
「末梢血単核細胞」又は「ＰＢＭＣ」という用語は、丸い核を有する末梢血細胞に関する。これらの細胞はリンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）と単球で構成されているが、赤血球と血小板には核がなく、顆粒球（好中球、好塩基球、好酸球）には多葉の核がある。これらの細胞は、フィコール及びグラジエント遠心分離を使用して全血から抽出でき、これにより、血液が、血漿の最上層と、続くＰＢＭＣの層と多形核細胞（好中球や好酸球など）及び赤血球の底部画分に分離される。
【０１６３】
「主要組織適合遺伝子複合体」という用語と「ＭＨＣ」という略語は、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩ分子を含み、全ての脊椎動物で生じる遺伝子の複合体に関連する。ＭＨＣタンパク質又は分子は、免疫反応においてリンパ球と抗原提示細胞又は罹患細胞との間のシグナル伝達に重要であり、ＭＨＣタンパク質又は分子はペプチドに結合し、Ｔ細胞受容体による認識のためにそれらを提示する。ＭＨＣによってコードされるタンパク質は、細胞の表面に発現され、Ｔ細胞に対して自己抗原（細胞自体からのペプチド断片）と非自己抗原（例えば、侵入微生物の断片）双方を表示する。
【０１６４】
ＭＨＣ領域は、クラスＩ、クラスＩＩ、及びクラスＩＩＩの３つのサブグループに分けられる。ＭＨＣクラスＩタンパク質は、α鎖とβ２ミクログロブリン（１５番染色体にコードされるＭＨＣの部分ではない）を含む。それらは細胞傷害性Ｔ細胞に抗原断片を提示する。殆どの免疫系細胞、特に抗原提示細胞では、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質はα鎖とβ鎖を含み、それらはＴヘルパー細胞に抗原断片を提示する。ＭＨＣクラスＩＩＩ領域は、補体成分やサイトカインをコードする幾つかなど、他の免疫成分をコードする。
【０１６５】
ヒトにおいて、細胞表面上の抗原提示タンパク質をコードするＭＨＣ領域の遺伝子は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子と呼ばれる。しかし、ＭＨＣという略語が、ＨＬＡ遺伝子産物を指すためによく使用される。ＨＬＡ遺伝子には、９つのいわゆる古典的ＭＨＣ遺伝子：ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＰＡ１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＡ、及びＨＬＡ−ＤＲＢ１が含まれる。
【０１６６】
本発明の全ての態様の好ましい一実施態様では、ＭＨＣ分子はＨＬＡ分子である。
【０１６７】
本発明のコンテクストにおける「免疫エフェクター機能」又は「エフェクター機能」という用語は、例えば細胞の死滅をもたらす免疫系の成分により媒介される任意の機能を含む。好ましくは、本発明のコンテクストにおける免疫エフェクター機能は、Ｔ細胞媒介エフェクター機能である。そのような機能は、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）の場合、Ｔ細胞受容体によるＭＨＣクラスＩＩ分子のコンテクストにおける抗原又は抗原由来の抗原ペプチドの認識、サイトカインの放出、及び／又はＣＤ８＋リンパ球（ＣＴＬ）及び／又はＢ細胞の活性化と、ＣＴＬの場合、Ｔ細胞受容体によるＭＨＣクラスＩ分子のコンテクストにおける抗原又は抗原由来の抗原ペプチドの認識、例えばアポトーシス又はパーフォリン媒介細胞溶解、ＩＦＮ−γやＴＮＦ−αなどのサイトカインの産生、及び抗原発現標的細胞の特異的な細胞溶解性死滅による、ＭＨＣクラスＩ分子のコンテクストにおいて提示された細胞、すなわち、クラスＩ ＭＨＣを伴う抗原の提示により特徴付けられた細胞の除去を含む。
【０１６８】
「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性」又は「ＡＤＣＣ」は、ここに記載のエフェクター細胞、特にリンパ球の細胞死滅能力を記述し、これは好ましくは標的細胞が抗体で標識されることを必要とする。ＡＤＣＣは、抗体が腫瘍細胞上の抗原に結合し、抗体Ｆｃドメインが免疫エフェクター細胞の表面上のＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合すると生じることが好ましい。Ｆｃ受容体の幾つかのファミリーが同定されており、特定の細胞集団が定義されたＦｃ受容体を特徴的に発現する。ＡＤＣＣは、抗原提示と腫瘍指向性Ｔ細胞応答の誘導につながる様々な度合いの即時腫瘍破壊を直接誘導する機序とみなすことができる。好ましくは、ＡＤＣＣのインビボ誘導は、腫瘍指向性Ｔ細胞応答と宿主由来の抗体応答をもたらすであろう。
【０１６９】
「補体依存性細胞傷害性」又は「ＣＤＣ」は、抗体によって指向されうる別の細胞死滅法である。ＩｇＭは補体活性化に最も効果的なアイソタイプである。ＩｇＧ１とＩｇＧ３の双方とも、古典的補体活性化経路を介してＣＤＣを誘導するのに非常に効果的である。好ましくは、このカスケードでは、抗原抗体複合体の形成により、ＩｇＧ分子などの関与する抗体分子のＣＨ２ドメイン上の近接する複数のＣ１ｑ結合部位のアンクローキングが生じる（Ｃ１ｑは補体Ｃ１の３つのサブコンポーネントの一つである）。好ましくは、これらのアンクローキングＣ１ｑ結合部位が、以前は低親和性のＣ１ｑ−ＩｇＧ相互作用を高結合活性のものに変換し、これが一連の他の補体タンパク質が関与するイベントのカスケードをトリガーし、エフェクター細胞走化性／活性化剤Ｃ３ａ及びＣ５ａのタンパク質分解放出を引き起こす。好ましくは、補体カスケードは膜侵襲複合体の形成で終わり、これが、細胞へのかつ細胞からの水と溶質の自由な通過を促進する孔を細胞膜につくる。
【０１７０】
「トール様受容体」又は「ＴＬＲ」という用語は、自然免疫系で重要な役割を果たすタンパク質のクラスに関係する。それらは、微生物由来の構造的に保存された分子を認識する、マクロファージや樹状細胞などのセンチネル細胞で通常発現される単一の膜貫通型非触媒受容体である。これらの微生物が皮膚や腸管粘膜などの物理的障壁を突破すると、それらは免疫細胞応答を活性化するＴＬＲによって認識される。
【０１７１】
本発明の一実施態様では、抗原をコードするＲＮＡなどの核酸が対象に投与される。核酸の抗原翻訳産物が対象の細胞内で形成され得、その産物が免疫応答の刺激のために免疫系に提示されうる。
【０１７２】
あるいは、本発明は、ここに記載される抗原を発現する核酸がエクスビボで抗原提示細胞などの細胞に導入され、例えば患者から採取された抗原提示細胞と、場合によってはエクスビボでクローン増殖された細胞が、同じ患者に移植される実施態様を想定する。トランスフェクトされた細胞は、当該分野で知られている任意の手段を使用して、好ましくは静脈内、腔内、腹腔内又は腫瘍内投与により滅菌形態で、患者に再導入されうる。
【０１７３】
ここで使用される「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）、例えばｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、組換えにより生成され、化学合成された分子を含むものとする。核酸は一本鎖でも二本鎖でもよい。本発明によれば、ＲＮＡには、インビトロ転写ＲＮＡ（ＩＶＴ ＲＮＡ）又は合成ＲＮＡが含まれる。本発明によれば、核酸は好ましくは単離された核酸である。更に、ここに記載の核酸は組換え分子でありうる。
【０１７４】
「単離された核酸」という用語は、本発明によれば、核酸が（ｉ）例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりインビトロで増幅されたこと、（ｉｉ）クローニングにより組換えにより産生されたこと、（ｉｉｉ）例えばゲル電気泳動による切断及び分離により、精製されたこと、又は（ｉｖ）例えば化学合成により合成されたことを意味する。核酸は、例えば、ＤＮＡ鋳型からのインビトロ転写により調製されうるＲＮＡの形態で、細胞への導入、すなわち細胞のトランスフェクションに使用されうる。更に、配列の安定化、キャッピング、及びポリアデニル化により、適用前にＲＮＡを修飾できる。
【０１７５】
本発明のコンテクストにおいて、「ＤＮＡ」という用語は、デオキシリボヌクレオチド残基を含み、好ましくは完全に又は実質的にデオキシリボヌクレオチド残基から構成される分子に関する。「デオキシリボヌクレオチド」は、β−Ｄ−リボフラノシル基の２’位にヒドロキシル基を欠くヌクレオチドに関する。「ＤＮＡ」という用語は、部分的又は完全に精製されたＤＮＡ、本質的に純粋なＤＮＡ、合成ＤＮＡ、及び組換え生成ＤＮＡなどの単離されたＤＮＡを含み、一又は複数のヌクレオチドの付加、欠失、置換及び／又は変更により天然に生じるＤＮＡとは異なる修飾されたＤＮＡを含む。そのような修飾は、例えばＤＮＡの末端への、又は例えばＤＮＡの一又は複数のヌクレオチドにおける内部的な、非ヌクレオチド材料の付加を含みうる。ＤＮＡ分子中のヌクレオチドは、非天然発生ヌクレオチド又は化学的に合成されたヌクレオチドなどの非標準ヌクレオチドをまた含みうる。これらの改変されたＤＮＡは、アナログ又は天然に生じるＤＮＡのアナログと呼ばれることがある。
【０１７６】
本発明のコンテクストにおいて、「ＲＮＡ」という用語は、リボヌクレオチド残基を含み、好ましくは完全に又は実質的にリボヌクレオチド残基から構成される分子に関する。「リボヌクレオチド」は、β−Ｄ−リボフラノシル基の２’位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドに関する。この用語には、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、単離されたＲＮＡ、例えば部分的又は完全に精製されたＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換え生産されたＲＮＡ、並びに一又は複数のヌクレオチドの付加、欠失、置換及び／又は変更によって天然に生じるＲＮＡとは異なる修飾されたＲＮＡが含まれる。そのような修飾は、例えばＲＮＡの端部への、又は例えばＲＮＡの一又は複数のヌクレオチドにおける内部的な、非ヌクレオチド材料の付加を含みうる。ＲＮＡ分子中のヌクレオチドは、非天然発生ヌクレオチド又は化学的に合成されたヌクレオチド又はデオキシヌクレオチドなどの非標準ヌクレオチドをまた含みうる。これらの改変されたＲＮＡは、アナログ又は天然に生じるＲＮＡのアナログと呼ばれることがある。本発明によれば、「ＲＮＡ」という用語は、「メッセンジャーＲＮＡ」を意味する「ｍＲＮＡ」を含み、好ましくはこれに関係し、鋳型としてＤＮＡを使用して生成され得、ペプチド又はタンパク質をコードする転写物に関する。ｍＲＮＡは、典型的には、５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）、タンパク質又はペプチドコード領域、及び３’非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）を含む。ｍＲＮＡは細胞内及びインビボで限られた半減期を有する。好ましくは、ｍＲＮＡは、ＤＮＡ鋳型を使用したインビトロ転写により生成される。本発明の一実施態様では、ＲＮＡは、インビトロ転写又は化学合成により得られる。インビトロ転写方法は当業者に知られている。例えば、市販されている様々なインビトロ転写キットがある。
【０１７７】
本発明によれば、ＲＮＡの安定性及び翻訳効率は、必要に応じて改変されうる。例えば、ＲＮＡは、安定化効果を有し及び／又はＲＮＡの翻訳効率を増加させる一又は複数の修飾により安定化され、その翻訳が増加されうる。本発明に従って使用されるＲＮＡの発現を増加させるために、それは、ＧＣ含量を増加させてｍＲＮＡ安定性を高め、コドン最適化を実施し、よって細胞における翻訳を増強するように、好ましくは発現されたペプチド又はタンパク質の配列を変更することなく、コード領域内、つまり発現されたペプチド又はタンパク質をコードする配列内で修飾されうる。
【０１７８】
本発明において使用されるＲＮＡのコンテクストにおける「修飾」という用語は、前記ＲＮＡに天然には存在しないＲＮＡの任意の修飾を含む。
【０１７９】
本発明の一実施態様では、本発明に従って使用されるＲＮＡは、キャップのない５’−三リン酸を有さない。そのようなキャップのない５’−三リン酸の除去は、ＲＮＡをホスファターゼで処理することにより達成できる。
【０１８０】
本発明に係るＲＮＡは、その安定性を高め、及び／又は細胞傷害性を低下させるために、修飾されたリボヌクレオチドを有していてもよい。例えば、一実施態様では、本発明によって使用されるＲＮＡにおいて、５−メチルシチジンが、シチジンに部分的又は完全に、好ましくは完全に置換される。代替的又は追加的に、一実施態様では、本発明によって使用されるＲＮＡにおいて、プソイドウリジンが、ウリジンに部分的又は完全に、好ましくは完全に置換される。
【０１８１】
一実施態様では、「修飾」という用語は、ＲＮＡに５’キャップ又は５’キャップアナログを提供することに関する。「５’キャップ」という用語は、ｍＲＮＡ分子の５’末端に見出されるキャップ構造を指し、一般に、普通でない５’対５’三リン酸結合を介してｍＲＮＡに連結されたグアノシンヌクレオチドからなる。一実施態様では、このグアノシンは７位でメチル化されている。「一般的な５’キャップ」という用語は、天然に生じるＲＮＡ５’キャップ、好ましくは７−メチルグアノシンキャップ（ｍ７Ｇ）を指す。本発明のコンテクストにおいて、「５’キャップ」という用語は、ＲＮＡキャップ構造に類似し、ＲＮＡを安定化する能力を有するように修飾され、及び／又はそれに付着した場合、好ましくはインビボで及び／又は細胞内でＲＮＡの翻訳を増強する５’キャップアナログを含む。
【０１８２】
ＲＮＡは更なる修飾を含みうる。例えば、本発明において使用されるＲＮＡの更なる修飾は、天然に生じるポリ（Ａ）テールの伸長又は切断、又は５’−又は３’−非翻訳領域（ＵＴＲ）の改変、例えば、前記ＲＮＡのコード領域に関係していないＵＴＲの導入、例えば、グロビン遺伝子、例えばアルファ２−グロビン、アルファ１−グロビン、ベータ−グロビン、好ましくはベータ−グロビン、より好ましくはヒトベータ−グロビンに由来する３’−ＵＴＲの一又は複数、好ましくは２つのコピーの挿入又はこれらとの既存の３’−ＵＴＲの交換でありうる。
【０１８３】
アンマスクのポリＡ配列を有するＲＮＡは、マスクされたポリＡ配列を有するＲＮＡよりも効率的に翻訳される。「ポリ（Ａ）テール」又は「ポリＡ配列」という用語は、典型的にはＲＮＡ分子の３’末端に位置するアデニル（Ａ）残基の配列に関し、「アンマスクのポリＡ配列」とは、ＲＮＡ分子の３’末端のポリＡ配列がポリＡ配列のＡで終わり、ポリＡ配列の３’末端、すなわち下流に位置するＡ以外のヌクレオチドが後に続かないことを意味する。更に、約１２０塩基対の長いポリＡ配列により、ＲＮＡの最適な転写物安定性と翻訳効率が得られる。
【０１８４】
従って、本発明によって使用されるＲＮＡの安定性及び／又は発現を増加させるために、それは、好ましくは１０〜５００、より好ましくは３０〜３００、更により好ましくは６５〜２００、特に１００〜１５０のアデノシン残基長を有するポリＡ配列と共に存在するように修飾されうる。特に好ましい実施態様では、ポリＡ配列は約１２０個のアデノシン残基の長さを有する。本発明によって使用されるＲＮＡの安定性及び／又は発現を更に増加させるために、ポリＡ配列をアンマスクすることができる。
【０１８５】
ＲＮＡの「安定性」という用語は、ＲＮＡの「半減期」に関係する。「半減期」は、分子の活性、量、又は数の半分を排除するために必要な期間に関係する。本発明のコンテクストにおいて、ＲＮＡの半減期は、前記ＲＮＡの安定性の指標である。ＲＮＡの半減期は、ＲＮＡの「発現の持続時間」に影響を与えうる。長い半減期を有するＲＮＡは長い期間発現されることが期待されうる。
【０１８６】
もちろん、本発明によってＲＮＡの安定性及び／又は翻訳効率を低下させることが望ましい場合、ＲＮＡの安定性及び／又は翻訳効率を高める上述の要素の機能を妨害するようにＲＮＡを修飾することができる。
【０１８７】
ここに記載の核酸は、細胞の内部に核酸を送達するために使用できるベクターに含められうる。ここで使用される「ベクター」という用語には、プラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクター、例えばラムダファージ、ウイルスベクター、例えばアデノウイルス又はバキュロウイルスベクター、レトロ又はレンチウイルスベクター、トランスポゾン又は人工染色体ベクター、例えばバクテリア人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、又はＰ１人工染色体（ＰＡＣ）を含む当業者に知られた任意のベクターが含まれる。前記ベクターには、発現並びにクローニングベクターが含まれる。発現ベクターは、プラスミド並びにウイルスベクターを含み、一般に、特定の宿主生物（例えば、細菌、酵母、植物、昆虫、又は哺乳動物）における又はインビトロ発現系における作用可能に連結されたコード配列の発現に必要な所望のコード配列及び適切なＤＮＡ配列を含む。クローニングベクターは一般に所定の望ましいＤＮＡ断片を操作し増幅するために使用され、望ましいＤＮＡ断片の発現に必要な機能的配列を欠く場合がある。
【０１８８】
分子生物学の当業者であれば、一般に、タンパク質発現のためにプロモーター、エンハンサー、及び細胞型の組み合わせを如何に使用するかを知っている。用いられるプロモーターは、導入された核酸セグメントの高レベルの発現を方向付けるために適切な条件下で構成的、組織特異的、誘導性、及び／又は有用でありうる。プロモーターは異種性又は内因性でありうる。本発明によって使用されうる構成的プロモーター配列には、限定されるものではないが、最初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列、サルウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター、モロニーウイルスプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン・バーウイルス最初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、並びにヒト遺伝子プロモーター、例えば限定するものではないが、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、及び筋肉クレアチンプロモーターが含まれる。更に、本発明は構成的プロモーターの使用に限定されるべきではない。誘導性プロモーターもまた本発明の一部として考慮される。本発明における誘導性プロモーターの使用は、そのような発現が望まれる場合に作用可能に連結されるポリヌクレオチド配列の発現をオンにするか、又は発現が望まれない場合に発現をオフにすることができる分子スイッチを提供する。誘導性プロモーターの例には、限定されるものではないが、メタロチオニンプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、及びテトラサイクリンプロモーターが含まれる。更に、本発明は、組織特異的プロモーターの使用を含み、このプロモーターは所望の組織でのみ活性である。組織特異的プロモーターは当該技術分野で周知であり、限定されるものではないが、ＨＥＲ−２プロモーター及びＰＳＡ関連プロモーター配列が含まれる。
【０１８９】
核酸は、物理的、化学的、又は生物学的手段によって宿主細胞中に移入することができる。
【０１９０】
核酸を宿主細胞中に導入する物理的方法には、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、微粒子銃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどが含まれる。
【０１９１】
目的の核酸を宿主細胞中に導入する生物学的方法には、ＤＮＡ及びＲＮＡベクターの使用が含まれる。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、哺乳動物、例えばヒト細胞中に遺伝子を挿入するための最も広く使用される方法になった。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルスなどに由来しうる。
【０１９２】
核酸を宿主細胞中に導入する化学的手段には、コロイド分散系、例えば高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、及び水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、及びリポソームを含む脂質ベース系が含まれる。インビトロ及びインビボでの送達ビヒクルとして使用するための好ましいコロイド系はリポソーム（すなわち、人工膜小胞）である。そのような系の調製と使用は当該技術分野で周知である。
【０１９３】
「コード化」とは、定まったヌクレオチド配列又は定まったアミノ酸配列を有する生物学的プロセスにおける他のポリマー及び高分子の合成のための鋳型として機能する、核酸中のヌクレオチドの特定の配列の固有の特性を指す。従って、核酸の発現（翻訳及び場合により転写）が細胞又は他の生物系でタンパク質を産生する場合、核酸がタンパク質をコードする。
【０１９４】
「発現」という用語は、その最も一般的な意味で本発明によって使用され、ＲＮＡ及び／又は例えば転写及び／又は翻訳によるペプチド又はポリペプチドの産生を含む。ＲＮＡに関して、「発現」又は「翻訳」という用語は、特にペプチド又はポリペプチドの産生に関する。また核酸の部分発現も含む。更に、発現は一過性又は安定的でありうる。
【０１９５】
本発明のコンテクストにおいて、「転写」という用語は、ＤＮＡ配列中の遺伝暗号がＲＮＡに転写されるプロセスに関する。その後、ＲＮＡはタンパク質に翻訳されうる。本発明によれば、「転写」という用語は「インビトロ転写」を含み、ここで「インビトロ転写」という用語は、ＲＮＡ、特にｍＲＮＡが無細胞系において好ましくは適切な細胞抽出物を使用してインビトロで合成されるプロセスに関する。好ましくは、クローニングベクターは転写物の生成に適用される。これらのクローニングベクターは一般に転写ベクターと呼ばれ、本発明によれば「ベクター」という用語に含まれる。本発明によれば、本発明において使用されるＲＮＡは、好ましくはインビトロ転写ＲＮＡ（ＩＶＴ−ＲＮＡ）であり、適切なＤＮＡ鋳型のインビトロ転写により得ることができる。転写を制御するためのプロモーターは、任意のＲＮＡポリメラーゼに対する任意のプロモーターでありうる。ＲＮＡポリメラーゼの特定の例は、Ｔ７、Ｔ３、及びＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼである。好ましくは、本発明によるインビトロ転写は、Ｔ７又はＳＰ６プロモーターによって制御される。インビトロ転写のためのＤＮＡ鋳型は、核酸、特にｃＤＮＡをクローニングし、それをインビトロ転写のための適切なベクター中に導入することにより得ることができる。ｃＤＮＡは、ＲＮＡの逆転写により得ることができる。
【０１９６】
本発明による「翻訳」という用語は、メッセンジャーＲＮＡのストランドがアミノ酸配列のアセンブリを方向付けてペプチド又はポリペプチドを作製する細胞のリボソームにおけるプロセスに関する。
【０１９７】
本発明によって核酸と機能的に連結されうる発現制御配列又は調節配列は、核酸に関して相同的又は異種性でありうる。コード配列と調節配列は、それらが共有結合している場合、「機能的に」連結されており、コード配列の転写又は翻訳が調節配列の制御下又は影響下にある。コード配列が機能的タンパク質に翻訳され、調節配列がコード配列と機能的に連結されている場合、調節配列の導入は、コード配列における読み枠シフトを引き起こさずに又は所望のタンパク質もしくはペプチドへコード配列を翻訳できないようにすることなくコード配列の転写を導く。
【０１９８】
「発現制御配列」又は「調節配列」という用語は、本発明によれば、プロモーター、リボソーム結合配列、及び核酸の転写又は誘導ＲＮＡの翻訳を制御する他の調節エレメントを含む。本発明の所定の実施態様では、調節配列は制御することができる。調節配列の正確な構造は、種や細胞型によって異なりうるが、一般に、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列等、転写又は翻訳の開始に関与する５’非転写配列及び５’及び３’非翻訳配列を含む。特に、５’非転写調節配列は、機能的に結合した遺伝子の転写制御のためのプロモーター配列を含むプロモーター領域を含む。調節配列は、エンハンサー配列又は上流アクチベーター配列をまた含むことができる。
【０１９９】
本発明によれば、インビトロで又は対象に存在しうる細胞に取り込まれ又は導入された、すなわちトランスフェクト又は形質導入された、ペプチド又はタンパク質をコードするＲＮＡなどの核酸が、前記ペプチド又はタンパク質の発現をもたらすことが好ましい。細胞は、コード化されたペプチド又はタンパク質を細胞内で（例えば、細胞質及び／又は核内で）発現し得、コード化されたペプチド又はタンパク質を分泌し得、又は表面にそれを発現しうる。
【０２００】
本発明によれば、「核酸を発現する」及び「核酸をコードする」などの用語又は類似の用語は、ここでは互換的に使用され、特定のペプチド又はポリペプチドに関して、適切な環境に、好ましくは細胞内に存在する場合、核酸を発現させて前記ペプチド又はポリペプチドを生成することができることを意味する。
【０２０１】
「移入する」、「導入する」、「トランスフェクトする」又は「形質導入する」などの用語は、ここでは互換的に使用され、核酸、特にＲＮＡなどの外因性又は異種性核酸の細胞への導入に関する。本発明によれば、細胞は、インビトロ又はインビボで存在し得、例えば細胞は器官、組織及び／又は生物の一部を形成しうる。本発明によれば、トランスフェクションは一過性又は安定でありうる。トランスフェクションの幾つかの適用では、トランスフェクトされた遺伝物質が一過性にのみ発現されれば十分である。通常、トランスフェクションプロセスで導入された核酸は核ゲノム中に組み込まれないため、外来核酸は有糸分裂によって希釈され又は分解される。核酸のエピソーム増幅を可能にする細胞株は、希釈率を大幅に低下させる。トランスフェクトされた核酸が実際に細胞及びその娘細胞のゲノムに残ることが望ましい場合、安定したトランスフェクションが行われなければならない。ＲＮＡを細胞にトランスフェクトして、そのコードされたタンパク質を一過性に発現させることができる。
【０２０２】
核酸配列に関する「断片」は、核酸配列の一部、すなわち５’及び／又は３’末端で短縮された核酸配列を表す配列に関する。核酸配列の断片は、好ましくは、核酸配列の少なくとも６、特に少なくとも８、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも５０、又は少なくとも１００の連続ヌクレオチドを含む。
【０２０３】
本発明はまたここに記載の免疫賦活性ＲＮＡ分子などの核酸又は核酸配列の「バリアント」を含む。
【０２０４】
本発明によれば、核酸バリアントは、参照核酸と比較して、単一又は複数のヌクレオチド欠失、付加、変異、及び／又は挿入を含む。欠失は、参照核酸からの一又は複数のヌクレオチドの除去を含む。付加バリアントは、１、２、３、５、１０、２０、３０、５０、又はそれ以上のヌクレオチドなど、一又は複数のヌクレオチドの５’及び／又は３’末端融合を含む。変異は、限定されないが、配列内の少なくとも一つのヌクレオチドが除去され、別のヌクレオチドがその場所（トランスバージョン及びトランジションなど）、脱塩基部位、架橋部位、及び化学的に改変又は修飾された塩基に挿入される置換を含みうる。挿入は、参照核酸への少なくとも一つのヌクレオチドの付加を含む。
【０２０５】
好ましくは、与えられた核酸配列と該与えられた核酸配列のバリアントである核酸配列との間の同一性の度合は、少なくとも約６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％であろう。同一性の度合は、好ましくは参照核酸配列の全長の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％又は約１００％である核酸領域に対して与えられる。例えば、参照核酸配列が２００ヌクレオチドからなる場合、同一性の度合は、好ましくは少なくとも約２０、少なくとも約４０、少なくとも約６０、少なくとも約８０、少なくとも約１００、少なくとも約１２０、少なくとも約１４０、少なくとも約１６０、少なくとも約１８０、又は約２００ヌクレオチド、好ましくは連続ヌクレオチドに対して与えられる。同一性の度合は、好ましくは、少なくとも８０、少なくとも１００、少なくとも１２０、少なくとも１５０、少なくとも１８０、少なくとも２００又は少なくとも２５０ヌクレオチドのセグメントに対して与えられる。好ましい実施態様では、同一性の度合は、参照核酸配列の全長に対して与えられる。
【０２０６】
２つの核酸配列間の「配列同一性」は、配列間で同一であるヌクレオチドの割合を示す。
【０２０７】
「同一性％」という用語は、特に、比較される２つの配列間の最適なアライメントにおいて同一であるヌクレオチドの割合を指し、前記割合は純粋に統計的であり、２つの配列間の差は配列の全長にわたってランダムに分布し得、比較される配列は、２つの配列間の最適なアライメントを得るために、参照配列と比較して付加又は欠失を含んでもよい。通常、２つの配列の比較は、対応する配列の局所領域を識別するために、セグメント又は「比較ウィンドウ」に関して最適なアラインメントの後、前記配列を比較することにより実行される。比較のための最適なアライメントは、手作業で実行するか、又はSmith及びWaterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482のローカルホモロジーアルゴリズムを用いて、Neddleman及びWunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443のローカルホモロジーアルゴリズムを用いて、及びPearson及びLipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444による類似性検索アルゴリズムを用いて、又は前記アルゴリズムを使用するコンピュータープログラム（GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N and TFASTA in Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis）を用いて実行できる。
【０２０８】
同一性の割合は、比較される配列が対応する同一の位置の数を決定し、この数を比較される位置の数で除算し、この結果に１００を掛けることにより得られる。
【０２０９】
特定の核酸配列又は特定の核酸配列と特定の同一性度合を有する核酸配列のバリアントは、好ましくは前記特定の配列の少なくとも一つの機能特性を有し、好ましくは前記特定の配列と機能的に同等であり、例えば核酸配列は特定の核酸配列の特性と同一又は類似の特性を示す。
【０２１０】
一つの重要な特性には、特に抗原又は抗原をコードする核酸と組み合わせて投与された場合に、アジュバント又は免疫賦活剤として作用する能力が含まれる。
【０２１１】
本発明によれば、「ペプチド」という用語は、ペプチド結合により共有結合した２つ以上、好ましくは３つ以上、好ましくは４つ以上、好ましくは６つ以上、好ましくは８つ以上、好ましくは１０以上、好ましくは１３以上、好ましくは１６以上、好ましくは２１以上、好ましくは８、１０、２０、３０、４０又は５０まで、特に１００までのアミノ酸を含む物質を指す。
【０２１２】
「タンパク質」という用語は、大きなペプチド、すなわちポリペプチド、好ましくは１００個を超えるアミノ酸残基を有するペプチドを指すが、一般に「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は同義語であり、ここでは互換的に使用される。
【０２１３】
本発明は、ここに記載のペプチド、タンパク質、又はアミノ酸配列の「バリアント」をまた含む。
【０２１４】
本発明の目的では、アミノ酸配列の「バリアント」は、アミノ酸挿入バリアント、アミノ酸付加バリアント、アミノ酸欠失バリアント及び／又はアミノ酸置換バリアントを含む。
【０２１５】
アミノ酸挿入バリアントは、特定のアミノ酸配列内の単一又は２つ以上のアミノ酸の挿入を含む。挿入を有するアミノ酸配列バリアントの場合、一又は複数のアミノ酸残基がアミノ酸配列の特定の部位に挿入されるが、結果として生じる産物の適切なスクリーニングを伴うランダム挿入も可能である。
【０２１６】
アミノ酸付加バリアントは、１、２、３、５、１０、２０、３０、５０、又はそれ以上のアミノ酸など、一又は複数のアミノ酸のアミノ及び／又はカルボキシ末端融合を含む。
【０２１７】
アミノ酸欠失バリアントは、１、２、３、５、１０、２０、３０、５０、又はそれ以上のアミノ酸の除去など、配列からの一又は複数のアミノ酸の除去を特徴とする。欠失はタンパク質の何れの位置であってもよい。タンパク質のＮ末端及び／又はＣ末端に欠失を含むアミノ酸欠失バリアントは、Ｎ末端及び／又はＣ末端トランケーションバリアントとも呼ばれる。
【０２１８】
アミノ酸置換バリアントは、配列内の少なくとも一つの残基が除去され、その場所に別の残基が挿入されることを特徴とする。修飾が相同タンパク質又はペプチド間で保存されていないアミノ酸配列の位置にあり、及び／又はアミノ酸を類似の特性を有する他のものと置換することが好ましい。好ましくは、タンパク質バリアントにおけるアミノ酸変化は、保存的アミノ酸変化、すなわち、同様に荷電した又は非荷電アミノ酸の置換である。保存的アミノ酸変化には、その側鎖において関連するアミノ酸のファミリーの一つの置換が含まれる。天然に生じるアミノ酸は、一般に４つのファミリーに分類される：酸性（アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性（リジン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、及び非荷電極性（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン）アミノ酸。フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンは、芳香族アミノ酸としてまとめて分類される場合がある。
【０２１９】
好ましくは、与えられたアミノ酸配列と該与えられたアミノ酸配列のバリアントであるアミノ酸配列との間の類似性、好ましくは同一性の度合は、少なくとも約６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％であろう。類似性又は同一性の度合は、好ましくは、参照アミノ酸配列の全長の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％又は約１００％であるアミノ酸領域に対して与えられる。例えば、参照アミノ酸配列が２００アミノ酸からなる場合、類似性又は同一性の度合は、少なくとも約２０、少なくとも約４０、少なくとも約６０、少なくとも約８０、少なくとも約１００、少なくとも約１２０、少なくとも約１４０、少なくとも約１６０、少なくとも約１８０、又は約２００アミノ酸、好ましくは連続アミノ酸に対して与えられる。類似性又は同一性の度合は、好ましくは、少なくとも８０、少なくとも１００、少なくとも１２０、少なくとも１５０、少なくとも１８０、少なくとも２００又は少なくとも２５０のアミノ酸のセグメントに対して与えられる。好ましい実施態様では、類似性又は同一性の度合は、参照アミノ酸配列の全長に対して与えられる。配列類似性、好ましくは配列同一性を決定するためのアライメントは、好ましくは最良の配列アライメントを使用し、例えばＡｌｉｇｎを使用し、標準設定、好ましくはＥＭＢＯＳＳ：：ｎｅｅｄｌｅ，Ｍａｔｒｉｘ：Ｂｌｏｓｕｍ６２，Ｇａｐ Ｏｐｅｎ １０．０，Ｇａｐ Ｅｘｔｅｎｄ０．５を使用して、当該分野で既知のツールを用いて実行できる。
【０２２０】
「配列類似性」は、同一であるか、保存的アミノ酸置換を表すアミノ酸の割合を示す。２つのアミノ酸配列間の「配列同一性」は、配列間で同一であるアミノ酸の割合を示す。
【０２２１】
「同一性％」という用語は、特に、比較される２つの配列間の最適なアライメントにおいて同一であるアミノ酸残基の割合を指すことを意図し、前記割合は純粋に統計的であり、２つの配列間の差は配列の全長にわたってランダムに分布し得、比較される配列は、２つの配列間の最適なアライメントを得るために、参照配列と比較して付加又は欠失を含んでもよい。通常、２つの配列の比較は、対応する配列の局所領域を識別するために、セグメント又は「比較ウィンドウ」に関して最適なアラインメントの後、前記配列を比較することにより実行される。比較のための最適なアライメントは、手作業で実行するか、又はSmith及びWaterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482のローカルホモロジーアルゴリズムを用いて、Neddleman及びWunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443のローカルホモロジーアルゴリズムを用いて、及びPearson及びLipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444による類似性検索アルゴリズムを用いて、又は前記アルゴリズムを使用するコンピュータープログラム（GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N and TFASTA in Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis）を用いて実行できる。
【０２２２】
同一性パーセントは、比較される配列が対応する同一の位置の数を決定し、この数を比較される位置の数で除算し、この結果に１００を掛けることにより得られる。
【０２２３】
本発明によれば、相同アミノ酸配列は、アミノ酸残基の少なくとも４０％、特に少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９８又は少なくとも９９％の同一性を示す。
【０２２４】
本発明によれば、アミノ酸配列、ペプチド又はタンパク質のバリアント、断片、部分又は一部は、好ましくはそれぞれ由来するアミノ酸配列、ペプチド又はタンパク質の機能的特性を有し、すなわち、機能的に等価である。一実施態様では、アミノ酸配列、ペプチド又はタンパク質のバリアント、断片、部分又は一部は、それが由来するアミノ酸配列、ペプチド又はタンパク質とそれぞれ免疫学的に等価である。一実施態様では、機能的特性は免疫学的特性である。
【０２２５】
本発明は、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語に含まれるここに記載のペプチド又はタンパク質の誘導体を含む。本発明によれば、タンパク質及びペプチドの「誘導体」は、タンパク質及びペプチドの修飾形態である。そのような修飾は任意の化学修飾を含み、タンパク質又はペプチドに関連する任意の分子、例えば炭水化物、脂質及び／又はタンパク質の単一又は複数の置換、欠失及び／又は付加を含む。一実施態様では、タンパク質又はペプチドの「誘導体」は、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、パルミトイル化、ミリストイル化、イソプレニル化、脂質化、アルキル化、誘導体化、保護／ブロッキング基の導入、タンパク質分解性切断又は抗体もしくは別の細胞リガンドへの結合から生じる修飾アナログを含む。「誘導体」という用語はまた前記タンパク質及びペプチドの全ての機能的な化学的均等物にも拡張される。好ましくは、修飾されたペプチドは、増加した安定性及び／又は増加した免疫原性を有する。
【０２２６】
「由来する」という用語は、本発明によれば、特定の実体、特に特定の配列が、それが由来する物体、特に生物又は分子に存在することを意味する。アミノ酸又は核酸配列、特に特定の配列領域の場合、「由来する」とは、関連するアミノ酸配列又は核酸配列が、それが存在するアミノ酸配列又は核酸配列に由来することを特に意味する。
【０２２７】
「細胞」又は「宿主細胞」という用語は、好ましくはインタクトな細胞、すなわち酵素、細胞小器官、又は遺伝物質などのその正常な細胞内成分を放出していないインタクトな膜を有する細胞である。インタクトな細胞は、好ましくは、生存細胞、すなわち、その通常の代謝機能を実行できる生細胞である。好ましくは、前記用語は、本発明によれば、外因性核酸で形質転換又はトランスフェクトできる任意の細胞に関する。「細胞」という用語は、本発明によれば、原核細胞（例えば、大腸菌）又は真核細胞（例えば、樹状細胞、Ｂ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｋ５６２細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＬＡ細胞、酵母細胞、及び昆虫細胞）を含む。外因性核酸は、（ｉ）そのように自由に分散され、（ｉｉ）組換えベクターに組み込まれ、又は（ｉｉｉ）宿主細胞ゲノム又はミトコンドリアＤＮＡに組み込まれている細胞内に見出すことができる。ヒト、マウス、ハムスター、ブタ、ヤギ、及び霊長類由来の細胞など、哺乳動物細胞が特に好ましい。細胞は、多数の組織型に由来し、初代細胞及び細胞株を含みうる。
【０２２８】
核酸を含む細胞、例えば、核酸でトランスフェクトされた細胞は、好ましくは、核酸によってコードされるペプチド又はタンパク質を発現する。
【０２２９】
「増殖」という用語は、特定のエンティティが増殖されるプロセスを指す。本発明の一実施態様では、この用語は、リンパ球が抗原によって刺激され、増殖し、前記抗原を認識する特定のリンパ球が増殖される免疫学的応答のコンテクストで使用される。好ましくは、クローン増殖はリンパ球の分化をもたらす。
【０２３０】
ここで使用される「単離された」は、他の細胞物質などの他の分子を実質的に含まない分子を指すことが意図される。
【０２３１】
本発明のコンテクストにおける「組換え」という用語は、「遺伝子工学を通してなされた」ことを意味する。好ましくは、本発明のコンテクストにおける組換え細胞又は核酸などの「組換え体」は天然には生じない。
【０２３２】
ここで使用される「天然に生じる」という用語は、物質が天然に見出されうるという事実を指す。例えば、生物（ウイルスを含む）中に存在し、天然の供給源から単離することができ、実験室において人によって意図的に修飾されていないペプチド又は核酸は天然に生じる。
【０２３３】
「低減する」、「阻害する」又は「減少する」などの用語は、レベルにおいて好ましくは５％以上、１０％以上、２０％以上、より好ましくは５０％以上、最も好ましくは７５％以上の全体的な減少を引き起こす能力に関する。これらの用語には、完全又は本質的に完全な阻害、すなわちゼロ又は本質的にゼロへの低減が含まれる。
【０２３４】
「増加する」、「増強する」、「促進する」、又は「刺激する」などの用語は、レベルにおいて好ましくは５％以上、１０％以上、２０％以上、５０％以上、７５％以上、１００％以上、２００％以上、又は５００％以上の全体的な増加を引き起こす能力に関する。これらの用語は、ゼロ又は測定不能又は検出不可能なレベルからゼロを超えるレベル又は測定可能又は検出可能なレベルへの増加、増強、促進、又は刺激に関しうる。あるいは、これらの用語は、増加、増強、促進、又は刺激の前に所定のレベルがあり、増加、増強、促進、又は刺激の後にそのレベルがより高いことをまた意味しうる。
【０２３５】
ここに記載の薬剤及び組成物は、疾患、例えば、抗原又は抗原を発現する罹患細胞の存在によって特徴付けられる疾患を有する対象を治療するために使用することができる。特に好ましい疾患はがん疾患である。ここに記載の薬剤及び組成物は、ここに記載の疾患を予防するための免疫又はワクチン接種にもまた使用されうる。
【０２３６】
「疾患（disease）」という用語は、個体の身体に影響を及ぼす異常な状態を指す。疾患は多くの場合、特定の症状や徴候に関連する病状として解釈される。疾患は、感染性疾患などの外因に起因する要因によって引き起こされ得、又は自己免疫疾患などの内部機能障害によって引き起こされうる。ヒトでは、「疾患」は、より広くは、苦しむ個体に疼痛、機能障害、苦痛、社会的問題、又は死を引き起こすか、あるいは個体と接触している者に同様の問題を引き起こす任意の状態を指すためにしばしば使用される。この広い意味では、疾患は、傷害、障害（disabilities）、障害（disorders）、症候群、感染、単発症状、逸脱行動、及び構造と機能の非定型変動をしばしば含むが、他のコンテクストや他の目的では、これらは区別可能なカテゴリーと考えられうる。多くの疾患に罹患して生活することは、人生や人格に対する見方を変える可能性があるため、疾患は通常、身体的にだけでなく感情的にも個体に影響を与える。本発明によれば、「疾患」という用語には、感染性疾患とがん疾患が含まれる。ここでのがん又はがんの特定の形態への言及には、そのがん転移も含まれる。
【０２３７】
本発明によって治療される疾患は、好ましくは、抗原が関与するか抗原に関連する疾患である。
【０２３８】
「抗原に関連する疾患」又は「抗原が関与する疾患」とは、抗原に関係する任意の疾患、例えば、抗原又は抗原を発現する細胞の存在を特徴とする疾患を指す。抗原が関与する疾患は、感染性疾患、又はがん疾患、又は単にがんでありうる。上述のように、抗原は、疾患関連抗原、例えば腫瘍関連抗原、ウイルス抗原、又は細菌抗原でありうる。
【０２３９】
「感染性疾患」という用語は、個体から個体へ、又は生物から生物へ伝染する可能性があり、微生物因子によって引き起こされる任意の疾患を指す。感染性疾患は当該技術分野で知られており、例えば、ウイルス性疾患、細菌性疾患、又は寄生虫性疾患が含まれ、これらの疾患はそれぞれウイルス、細菌、及び寄生虫によって引き起こされる。これに関して、感染性疾患は、例えば、肝炎、性感染症（例えば、クラミジア又は淋病）、結核、ＨＩＶ／後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、ジフテリア、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、コレラ、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、鳥インフルエンザ、及びインフルエンザでありうる。
【０２４０】
「がん疾患」又は「がん」という用語は、典型的には未制御の細胞増殖を特徴とする個体における生理学的状態を指すか記述する。がんの例には、限定されるものではないが、がん腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が含まれる。より具体的には、そのようながんの例には、骨がん、血液がん、肺がん、肝臓がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部がん、皮膚又は眼内メラノーマ、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門部のがん、胃がん、結腸がん、乳がん、前立腺がん、子宮がん、性器及び生殖器のがん腫、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織肉腫、膀胱がん、腎臓がん、腎細胞がん、腎盂腎がん、中枢神経系（ＣＮＳ）新生物、神経外胚葉がん、脊髄軸腫瘍、神経膠腫、髄膜腫、及び下垂体腺腫が含まれる。本発明による「がん」という用語はがん転移をまた含む。好ましくは、「がん疾患」は、腫瘍抗原を発現する細胞によって特徴付けられ、がん細胞は腫瘍抗原を発現する。
【０２４１】
一実施態様では、がん疾患は、退形成、侵襲性、及び転移の特性を特徴とする悪性疾患である。悪性腫瘍は、悪性腫瘍はその増殖において自己限定的ではなく、隣接組織に侵入することができ、遠位組織に広がることができる（転移する）可能性があるという点で非がん性の良性腫瘍とは対照的である一方、良性腫瘍にはこれらの特性はない。
【０２４２】
本発明によれば、「腫瘍」又は「腫瘍疾患」という用語は、好ましくは腫脹又は病変を形成する細胞（新生細胞、腫瘍性細胞又は腫瘍細胞と呼ばれる）の異常増殖を指す。「腫瘍細胞」とは、急速な制御されない細胞増殖によって成長し、新しい成長を開始した刺激が止まった後も成長し続ける異常細胞を意味する。腫瘍は、構造的組織と正常組織との機能的協調の部分的又は完全な欠如を示し、良性、前悪性又は悪性でありうる組織の明確な塊を通常は形成する。
【０２４３】
「転移」とは、がん細胞がその元の部位から身体の別の部位に広がることを意味する。転移の形成は非常に複雑なプロセスであり、原発腫瘍からの悪性細胞の脱離、細胞外マトリックスの浸潤、内皮基底膜の貫入による体腔及び血管への進入、ついで血液による輸送後の標的器官の浸潤に依存する。最後に、標的部位での新しい腫瘍、すなわち二次腫瘍又は転移性腫瘍の増殖は、血管新生に依存する。腫瘍細胞又は成分が残って転移能を発現する可能性があるため、原発腫瘍を除去した後でさえも腫瘍転移がしばしば起こる。一実施態様では、本発明に係る「転移」という用語は、原発腫瘍及び所属リンパ節系から離れた転移に関する「遠隔転移」に関する。一実施態様では、本発明に係る「転移」という用語はリンパ節転移に関する。
【０２４４】
過去にその人が罹患した状態に人が再び罹患した場合、再燃（relapse）又は再発（recurrence）が発生する。例えば、患者が腫瘍疾患に罹患しており、前記疾患の治療に成功し、再び前記疾患を発症した場合、前記新たに発症した疾患は再燃又は再発とみなされうる。しかし、本発明によれば、腫瘍疾患の再燃又は再発は、必ずしも元の腫瘍疾患の部位で起こるとは限らない。従って、例えば、患者が卵巣腫瘍に罹患しており、成功した治療を受けた場合、再燃又は再発は、卵巣腫瘍の発生又は卵巣とは異なる部位での腫瘍の発生でありうる。腫瘍の再燃又は再発は、腫瘍が元の腫瘍の部位とは異なる部位、並びに元の腫瘍の部位で発生する状況をまた含む。好ましくは、患者が治療を受けた元の腫瘍は原発腫瘍であり、元の腫瘍の部位とは異なる部位の腫瘍は続発性又は転移性腫瘍である。
【０２４５】
「治療」又は「治療的処置」という用語は、健康状態を改善し、及び／又は個体の寿命を延ばす（増加させる）任意の治療に関する。前記治療は、個体の疾患を除去し、個体の疾患の発症を停止又は遅延させ、個体の疾患の発症を阻害又は遅延させ、個体の症状の頻度もしくは重症度を減少させ、及び／又は現在疾患に罹患しているかもしくは以前に罹患した個体における再発を減少させうる。
【０２４６】
「予防的（prophylactic）治療」又は「予防的（preventive）治療」という用語は、個体、特に疾患のリスクがある個体において疾患が発生するのを防ぐことを意図する任意の治療に関する。「予防的（prophylactic）治療」又は「予防的（preventive）治療」という用語は、ここでは互換的に使用される。
【０２４７】
「リスクがある」とは、一般集団と比較して、疾患、特にがんを発症する可能性が通常よりも高いと特定された対象、すなわち患者を意味する。加えて、疾患、特にがんに罹患した、又は現在罹患している対象は、疾患を継続して発症する可能性があるため、疾患を発症するリスクが高い対象である。現在がんに罹患しているか又は罹患したことがある対象はまたがん転移のリスクが高い。
【０２４８】
「免疫療法」という用語は、免疫応答を誘導し、又は増強することによる疾患又は症状の治療に関する。「免疫療法」という用語には、抗原免疫もしくは抗原ワクチン接種、又は腫瘍免疫もしくは腫瘍ワクチン接種が含まれる。
【０２４９】
「免疫化」又は「ワクチン接種」という用語は、例えば治療上又は予防上の理由で、免疫応答を誘導する目的で個体に抗原を提供するプロセスを記述する。
【０２５０】
「インビボ」という用語は、対象における状況に関する。
【０２５１】
「個体」又は「対象」という用語は、脊椎動物、特に哺乳動物に関係する。例えば、本発明のコンテクストにおける哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、家畜化哺乳動物、例えばイヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ブタ、ウマ等、実験動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、モルモット等、並びに動物園の動物のような飼育下の動物である。「対象」という用語は、鳥（特に鶏、アヒル、ガチョウ、七面鳥などの家畜化鳥）などの非哺乳類脊椎動物、及び魚（特にサケ又はナマズなどの養殖魚）にまた関連する。ここで使用される「動物」という用語にはヒトもまた含まれる。好ましくは、「患者」という用語は、罹患した個体に関する。
【０２５２】
「自己」という用語は、同じ対象に由来するものを記述するために使用される。例えば、「自己移植片」とは、同じ対象に由来する組織又は器官の移植片を指す。そのような手順は、そうでなければ拒絶をもたらす免疫学的障壁を克服するため、有利である。
【０２５３】
「同種異系」という用語は、同じ種の異なる個体に由来するものを記述するために使用される。二人以上の個体は、一又は複数の遺伝子座の遺伝子が同一でない場合、互いに同種異系であると言われる。
【０２５４】
「同系」という用語は、同一の遺伝子型を有する個体又は組織、すなわち、同一の近交系の同一の双子又は動物、又はそれらの組織に由来するものを記述するために使用される。
【０２５５】
「異種性」という用語は、複数の異なるエレメントからなるものを記述するために使用される。一例として、ある個体の骨髄を別の個体に移植することは、異種移植を構成する。異種遺伝子は、対象以外の供給源に由来する遺伝子である。
【０２５６】
ここに記載される薬剤は、任意の適切な薬学的組成物の形態で投与されうる。「薬学的組成物」という用語は、治療的に有効な薬剤又はその塩を、好ましくはバッファー、保存料及び浸透圧調整剤などの薬学的賦形剤と共に含有する製剤に関する。前記薬学的組成物は、前記薬学的組成物を個体に投与することにより疾患又は障害を治療又は予防するのに有用である。薬学的組成物は、薬学的製剤としても当該技術分野で知られている。薬学的組成物は局所的又は全身的に投与されうる。
【０２５７】
「全身投与」という用語は、薬剤が個体の体内に有意な量で広く分布するようになり、生物学的効果を発現するような治療的に有効な薬剤の投与を指す。本発明によれば、投与は非経口投与によるのが好ましい。
【０２５８】
「非経口投与」という用語は、薬剤が腸を通過しないような治療的に有効な薬剤の投与を指す。「非経口投与」という用語には、静脈内投与、皮下投与、皮内投与又は動脈内投与が含まれるが、これらに限定されない。
【０２５９】
特定の実施態様では、抗原又は抗原をコードする核酸は、ここに記載の免疫賦活性ＲＮＡ分子の投与前、投与と同時、及び／又は投与後に投与される。抗原又は抗原をコードする核酸と免疫賦活性ＲＮＡ分子は、共通の組成物中に存在しうる、すなわち一緒に混合されうる。更に、抗原又は抗原をコードする核酸と免疫賦活性ＲＮＡ分子が一緒に存在するが、同じ組成物には存在しない実施態様もまた本発明によって想定される。前記実施態様は、特に少なくとも２つの容器を備えたキットに関し、１つの容器は抗原又は抗原をコードする核酸を含む組成物を含み、別の容器は免疫賦活性ＲＮＡ分子を含む組成物を含む。
【０２６０】
本発明の薬学的組成物は、ここに記載の免疫賦活性ＲＮＡ分子以外のアジュバントを含んでいてもよい。そのようなアジュバントには、油乳剤（フロイントアジュバントなど）、無機化合物（ミョウバンなど）、細菌産物（百日咳菌毒素など）、又は免疫賦活複合体などの異種性化合物群が含まれる。アジュバントの例には、サポニン、不完全フロイントアジュバント、完全フロイントアジュバント、トコフェロール又はミョウバンが含まれるが、これらに限定されない。
【０２６１】
本発明に係る薬学的組成物は、一般に「薬学的に有効な量」及び「薬学的に許容される製剤」で適用される。
【０２６２】
「薬学的に有効な量」という用語は、単独で又は更なる用量と一緒に、所望の反応又は所望の効果を達成する量を指す。特定の疾患の治療の場合、所望の反応は、好ましくは疾患の経過の阻害に関する。これは、疾患の進行を遅くすること、特に、疾患の進行を中断又は逆転させることを含む。疾患の治療における所望の反応はまた前記疾患又は前記状態の発症の遅延又は発症の予防でありうる。ここに記載の組成物の有効量は、治療される状態、疾患の重症度、年齢、生理学的状態、サイズ及び体重を含む患者の個々のパラメーター、治療の期間、付随する治療（存在する場合）のタイプ、特定の投与経路及び類似の要因に依存するであろう。従って、ここに記載の組成物の投与される用量は、様々なそのようなパラメーターに依存しうる。患者の反応が初期用量では不十分である場合、より高い用量（又は異なる、より局所的な投与経路により達成される効果的により高い用量）が使用されうる。
【０２６３】
「薬学的に許容される」という用語は、薬学的組成物の活性成分の作用と相互作用しない材料の非毒性を指す。
【０２６４】
本発明の薬学的組成物は、塩、バッファー、保存剤、担体及び場合によっては他の治療薬を含んでもよい。好ましくは、本発明の薬学的組成物は、一又は複数の薬学的に許容される担体、希釈剤及び／又は賦形剤を含む。
【０２６５】
「賦形剤」という用語は、結合剤、潤滑剤、増粘剤、界面活性剤、保存料、乳化剤、バッファー、香味剤、又は着色料などの活性成分ではない薬学的組成物中の全ての物質を示すものとする。
【０２６６】
「希釈剤」という用語は、希釈する及び／又は希釈性の薬剤に関する。更に、「希釈剤」という用語には、流体、液体又は固体懸濁液及び／又は混合媒体の何れか一又は複数が含まれる。
【０２６７】
「担体」という用語は、ヒトへの投与に適した一又は複数の適合性の固体又は液体の充填剤又は希釈剤に関する。「担体」という用語は、活性成分の適用を容易にするために活性成分と組み合わされる天然又は合成の有機又は無機成分に関する。好ましくは、担体成分は、鉱油、動物、又は落花生油、大豆油、ゴマ油、ヒマワリ油などの植物に由来するものを含む水又は油などの無菌液体である。塩溶液及び水性デキストロース及びグリセリン溶液もまた水性担体化合物として使用されうる。
【０２６８】
治療用途のための薬学的に許容される担体又は希釈剤は、製薬分野で周知であり、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R Gennaro編 1985)に記載されている。適切な担体の例には、例えば、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、乳糖、ペクチン、デキストリン、デンプン、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、低融点ワックス、ココアバターなどが含まれる。適切な希釈剤の例には、エタノール、グリセロール、及び水が含まれる。
【０２６９】
薬学的担体、賦形剤又は希釈剤は、意図される投与経路及び標準的な薬務に関して選択することができる。本発明の薬学的組成物は、担体、賦形剤又は希釈剤として、又はそれらに加えて、任意の適切な結合剤、潤滑剤、懸濁剤、コーティング剤、及び／又は可溶化剤を含みうる。適切な結合剤の例には、デンプン、ゼラチン、グルコースなどの天然糖、無水乳糖、自由流動性乳糖、ベータ乳糖、コーン甘味料、天然及び合成ガム、例えばアカシア、トラガカント又はアルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース及びポリエチレングリコールが含まれる。適切な潤滑剤の例には、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどが含まれる。保存料、安定剤、色素、更には香味剤を薬学的組成物に提供してもよい。保存料の例には、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、及びｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルが含まれる。酸化防止剤と懸濁剤もまた使用されうる。
【０２７０】
一実施態様では、組成物は水性組成物である。水性組成物は、場合によっては溶質、例えば塩を含んでもよい。一実施態様では、組成物は凍結乾燥組成物の形態である。凍結乾燥組成物は、それぞれの水性組成物を凍結乾燥することにより得ることができる。
【０２７１】
ここで提供される薬剤及び組成物は、単独で、又は外科手術、放射線、化学療法及び／又は骨髄移植（自己、同系、同種異系又は無関係）などの他の治療レジメンと組み合わせて使用されうる。
【０２７２】
本発明は、発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない次の実施例によって更に例証される。
【実施例】
【０２７３】
ここで使用される技術及び方法は、ここに記載されるか、又はそれ自体既知の方法で、また例えばSambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2版 (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.に記載のようにして実施される。キット及び試薬の使用を含む全ての方法が、特に示されていない限り、製造業者の情報に従って実施される。
【０２７４】
［材料及び方法］
［対照アジュバントと合成ＲＮＡオリゴヌクレオチド］
ＴＬＲ３アゴニストのポリ（Ｉ：Ｃ）、ＴＬＲ７／８リガンドＣＬ０９７、イミダゾキノリン化合物誘導体Ｒ８４８、カチオン性脂質（ＬｙｏＶｅｃ）と複合化したヒトＴＬＲ８アゴニストｓｓＲＮＡ４０、ヒト／マウスＴＬＲ９アゴニストＣ型ＣｐＧ ＯＤＮ２３９５及びヒトＴＬＲ９アゴニストＤ型ＣｐＧ ＯＤＮ２２１６をＩｎｖｉｖｏｇｅｎから購入し、様々な実験で対照アジュバントとして使用した。バフィロマイシンＡ１（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を、ＴＬＲ活性化を遮断するエンドソーム酸性化阻害剤として使用した。完全及び不完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ／ＩＦＡ）を、製造者（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の説明書に従って皮下対照免疫に使用した。化学合成されたｉｓＲＮＡ ＮＰ７１−Ｓｅｑ４（Ｃｈｅｍ．Ｓｙｎｔｈ．）と対照としてのポリ（Ａ）ＲＮＡをＢｉｏｍｅｒｓから購入した。
【０２７５】
［キメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃＡｇ）由来のウイルス様粒子（ＶＬＰ）］
腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）クローディン−６（ＣＬＤＮ６）の選択されたエピトープ（＃Ａ７９）を表面に提示するＨＢｃＡｇ−ＶＬＰを、Klamp, T.等; Cancer Res 71(2), 1-12 (2011)に記載されているようにして産生した。
【０２７６】
［ｉｓＲＮＡのインビトロ転写及び精製］
ｉｓＲＮＡのインビトロ転写（ＩＶＴ）のためのプラスミド鋳型は、Kuhn, A.等; Gene Ther 17(8), 961-971 (2010)に記載されているｐＳＴ１−Ａ１２０ベクターに基づいた。選択したインフルエンザＮＰ断片を、標準的な分子生物学の方法を使用して、ＳｐｅＩ及びＸｈｏＩ制限部位間にクローン化した。得られたプラスミドをＸｈｏＩ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で線状化し、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅカルボン酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して磁気分離により精製した。次のＩＶＴ反応を、Kreiter, S.等; Cancer Immunol Immunother 56, 1577-1587 (2007) に以前に記載されたプロトコルに従って実施した。ＩＶＴ ＲＮＡの小規模精製を、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用し、製造者の説明書に従って、シリカベース膜で実施した。ＩＶＴ ＲＮＡの大規模精製では、弱陰イオン交換カラム（ＨｉＴｒａｐ ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用するＦＰＬＣベース法を適用した（Easton, LE.等, RNA 16(3), 647-653 (2010)）。
【０２７７】
［ｉｓＲＮＡ製剤］
インビトロ又はインビボ実験での使用に応じて、精製したインフルエンザＮＰ由来ｉｓＲＮＡを、その脂質／ヘルパー−脂質組成と表面電荷が異なるカチオン性脂質で製剤化した（Kranz, LM.等; Nature 534, 396-401 (2016)）。インビトロ実験での最適な細胞取り込みを確保するために、ｉｓＲＮＡをリポソーム組成物Ｆ５で製剤化する一方、インビボ実験には組成物Ｆ１２を使用した。Ｆ１２製剤は、静脈内投与後のｉｓＲＮＡの高い血清安定性とｉｓＲＮＡリポプレックスの脾臓ターゲティングを可能にした。
【０２７８】
［マウス］
雌Ｂａｌｂ／ｃＪＲｊ及びＣ５７ＢＬ／６マウスを、Ｊａｎｖｉｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（仏国）から入手した。Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドで飼育したＢＤＣＡ２−ＤＴＲトランスジェニックマウスは、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）において特異的にサルジフテリア毒素受容体（ＤＴＲ）を発現するが、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（米国）から購入した。マウスは実験開始時に６〜１０週齢であった。全ての動物を病原体除去条件下に維持した。
【０２７９】
［ヒトＰＢＭＣ及びｐＤＣの単離］
ヒトＰＢＭＣは、Lin, Z.等; Nature protocols 9, 1563-1577 (2014)に記載されているようにして、Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離により健康な男性又は女性ドナーの血液から新鮮に単離した。形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）は、ＭＡＣＳ分離技術とＣＤ３０４マイクロビーズキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用してヒトＰＢＭＣから単離した。
【０２８０】
［マウス骨髄細胞、脾細胞、ｐＤＣ及びｃＤＣの単離］
標準的プロトコルを使用して、マウス骨髄細胞（ＢＭＣ）をマウス大腿骨及び脛骨から採取した。赤血球を、５ｍｌの冷赤血球（ＲＢＣ）溶解バッファー（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と共に５分間インキュベートして溶解し、続いて２０ｍｌの１×ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を添加して溶解反応を停止させた。ＢＭＣを遠心分離によりペレット化し、細胞培養培地に再懸濁した。マウス脾細胞は、Kreiter, S.等; Cancer Immunol Immunother 56, 1577-1587 (2007)に記載されているようにして調製した。ｐＤＣは、マウスｐＤＣ単離キットＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用してＭＡＣＳ分離によって脾細胞から単離した。一般的なＤＣ（ｃＤＣ；ＣＤ１１ｃ高、Ｂ２２０低）は、２０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ及び２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ４（両方ともＰｅｐｒｏｔｅｃｈ製）の存在下で６日間培養することにより、マウスＢＭＣから作製した。
【０２８１】
［細胞培養］
初代ヒト及びマウス細胞を、１０％（ｖ／ｖ）の熱失活ＦＢＳ、１％（ｖ／ｖ）の非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、１％（ｖ／ｖ）のピルビン酸ナトリウム及び０．５％（ｖ／ｖ）のペニシリン／ストレプトマイシン溶液を補充したＲＰＭＩ１６４０で培養した。ヒトＣＬＤＮ６又はヒトＣＬＤＮ９を安定してトランスフェクトしたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）Ｋ１細胞をＴＲＯＮ ｇＧｍｂＨ（Mainz, Germany）から取得し、１０％（ｖ／ｖ）の熱失活ＦＢＳ、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８及び０．５％（ｖ／ｖ）のペニシリン／ストレプトマイシン溶液を補充したＤＭＥＭで培養した。ＮＦ−κＢ誘導性ルシフェラーゼレポーター遺伝子とヒトＴＬＲ３、ＴＬＲ７又はＴＬＲ８を安定して共発現する野生型ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞又はＨＥＫ２９３細胞をＩｎｖｉｖｏｇｅｎから入手し、１０％（ｖ／ｖ）の熱失活ＦＢＳ、１％（ｖ／ｖ）のＮＥＡＡ、１％（ｖ／ｖ）のピルビン酸ナトリウム及び０．５％（ｖ／ｖ）のペニシリン／ストレプトマイシン溶液を補充したＤＭＥＭで培養した。使用されるＨＥＫ２９３トランスフェクタントに応じて、培地に、全てＩｎｖｉｖｏｇｅｎ製のブラスティシジン（１０μｇ／ｍｌ）、ゼオシン（１００μｇ／ｍｌ）又はジェネティシン（２５０μｇ／ｍｌ）を追加的に補充した。ＦＢＳはＢｉｏｃｈｒｏｍから、他の全ての細胞培養試薬はＧｉｂｃｏから購入した。
【０２８２】
［ｉｓＲＮＡによる細胞のインビトロ刺激］
ｉｓＲＮＡ又は対照による細胞刺激を、総容量２００μｌで９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）において３組、実施した。特に明記しない限り、ウェルあたり５×１０５の細胞を使用し、０．１６７μｇ／ウェルの濃度のＦ５製剤化ｉｓＲＮＡ又は実施例において示された濃度を使用しての対照試薬を用いて、３７℃、５％ＣＯ２において１２〜１６時間刺激した。
【０２８３】
［サイトカイン検出］
ＩＦＮ−αと他の選択されたサイトカインは、市販のＥＬＩＳＡキット（ＰＢＬ Ａｓｓａｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して又はＢｉｏ−Ｐｌｅｘ ＰｒｏキットＩＩＩ及びサイトカイン特異的Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ結合磁気ビーズ（ＢｉｏＲａｄ）を使用して製造者の説明書に従って、ヒトもしくはマウス細胞の上清又はマウス血清において検出した。
【０２８４】
［インビボ刺激と免疫実験］
インビボ刺激実験では、Ｂａｌｂ／ｃマウスの眼球後静脈叢に、異なる量のＦ１２製剤化ｉｓＲＮＡを静脈内注射した。実験セットアップに応じて、血清調製用の血液試料を、実施例に示されているように、注射後の様々な時点で収集した。標準的プロトコルを使用する遠心分離により凝固後、血清を調製し、更に使用するまで−２０℃で保存した。免疫実験は、５０μｇの精製ＨＢｃＡｇ−＃Ａ７９ＶＬＰと混合した２０μｇのＦ１２製剤化ｉｓＲＮＡ（総量１００μｌ）の眼球後静脈叢への静脈内注射によって実施した。特に示していない限り、３回の注射を２週間間隔で行い、最後の免疫の１０日後に最終血液試料を採取した。血清の調製は前述のように実施した。
【０２８５】
［フローサイトメトリー］
アジュバント化又は非アジュバント化ＨＢｃＡｇ−＃Ａ７９ＶＬＰによる免疫後の天然ＣＬＤＮ６タンパク質に対する特異的抗体の誘導をフローサイトメトリーにより分析した。ウェル当たり２×１０５のＣＨＯ−Ｋ１ ＣＬＤＮ６又はＣＬＤＮ９細胞を、ＦＡＣＳバッファー（１×ＰＢＳ、５％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ、５ｍＭのＥＤＴＡ）で１：１００に希釈したポリクローナルマウス抗血清と共に４℃において１時間インキュベートした。３回の洗浄工程後、細胞を、ＦＡＣＳバッファーで１：６００に希釈したＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で４℃において３０分間染色した。未結合抗体を追加の洗浄工程により除去し、７−ＡＡＤ（Ｓｉｇｍａ）を使用して生存率を定量した。生細胞の蛍光シグナルは、ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩシステム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって検出した。
【０２８６】
［ＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔ分析］
５×１０５の新鮮に単離されたマウス脾細胞を、５μｇ／ｍｌの＃Ａ７９又は無関係なペプチド（ＪＰＴ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の存在下で３７℃において１８時間、抗ＩＦＮ−γモノクローナル抗体（１０μｇ／ｍｌのＡＮ１８，Ｍａｂｔｅｃｈ）でコーティングされた９６ウェルプレート（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）においてインキュベートした。プレートを、ビオチンコンジュゲート二次抗ＩＦＮ−γモノクローナル抗体（Ｒ４−６Ａ２，Ｍａｂｔｅｃｈ）及びＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ−アルカリホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と共に逐次インキュベートした後、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の添加によりサイトカイン分泌を検出した。各群に対して技術的な３組を実施した。ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ Ｓ５ Ｖｅｒｓａ ＥＬＩＳｐｏｔアナライザー、ＩｍｍｕｎｏＣａｐｔｕｒｅソフトウェア６．３及びＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔソフトウェア５．０．３（全てＣｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を使用して、プレートをスキャンし、解析した。
【０２８７】
［補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）アッセイ］
抗体を介した細胞破壊的エフェクター機能を分析するため、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）アッセイを実施した。ヒトＣＬＤＮ６を安定して発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）において１×１０４細胞／ウェルの濃度で１７．５時間、３７℃、７．５％ＣＯ２でインキュベートした。続いて、細胞を、３２μｌの培養培地に希釈した５μｌのポリクローナルマウス抗血清及び補体源としての１３μｌのヒト血清補体（Ｑｕｉｄｅｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）と共に総体積５０μｌ／ウェルで８０分間インキュベートした。マウス血清は、異なってアジュバント化されたＨＢｃＡｇ−＃Ａ７９ＶＬＰによる免疫実験から得た。６００又は１５０ｎｇ／ｍｌの濃度のＣＬＤＮ６特異的モノクローナル抗体（Ｇａｎｙｍｅｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ＡＧ，Ｍａｉｎｚ）を陽性対照として使用した。熱失活ヒト血清補体は、補体依存性抗体媒介細胞溶解効果の確認のための陰性対照となった。未処理細胞とＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ａｐｐｌｉｃｈｅｍ）で溶解した細胞を、それぞれ０％及び１００％細胞溶解のベンチマークとして使用した。製造者の説明書に従って、ＸＴＴアッセイベースの細胞増殖キットＩＩ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）で細胞生存率を分析した。４８０ｎｍでの吸収を、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ Ｐｒｏリーダー（Ｔｅｃａｎ）で測定した。抗体を介した細胞溶解活性は次式によって計算した：
細胞溶解％＝１００％−（（シグナル抗血清−シグナル１００％溶解／シグナル未処理細胞）×１００）
【０２８８】
［マウス免疫グロブリンアイソタイピングＥＬＩＳＡ］
ストレプトアビジン結合９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を、１００ｎｇ／ウェルのビオチン化＃Ａ７９−ペプチド（ＪＰＴ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で１時間コーティングした後、コーティングされていない表面を３００μｌ／ウェルの１×ＰＢＳ、２％（ｖ／ｖ）のＦＢＳで１時間ブロッキングし、ＨｙｄｒｏＳｐｅｅｄプレートウォッシャー（Ｔｅｃａｎ）を使用して１×ＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で洗浄した。ポリクローナルマウス抗血清を、１×カゼインブロッキングバッファー（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で１０倍連続希釈し、ウェル当たり１００μｌの希釈血清を加え、振とう台（Ｉｎｆｏｒｓ）で僅かに撹拌しながら１時間インキュベートした。追加の洗浄工程後、１：５０００希釈のＨＲＰコンジュゲート，ヤギ抗マウスＩｇＧアイソタイプ特異的二次抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）と共に１時間インキュベートし、最終洗浄工程と製造者の説明書に従ってのＴＭＢ基質（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の添加によって、結合抗体を検出した。４５０ｎｍでの吸収をＩｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ Ｐｒｏリーダー（Ｔｅｃａｎ）で測定した。全ての工程は室温において実施し、抗血清希釈は３組測定した。
【０２８９】
［統計解析］
全ての結果は、平均＋／−平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表される。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアバージョン６を使用して統計計算を実施した。２つの群を比較するためにＴ検定を使用した。３つ以上の群では、一元配置ＡＮＯＶＡを使用した。群間の差は、Ｐ＜０．０５で統計的に有意であるとみなされた。
【０２９０】
実施例１：インフルエンザ核タンパク質（ＮＰ）をコードするＲＮＡの逐次断片化により、明確なＴＬＲ特異性及びサイトカイン誘導プロファイルを有する低分子免疫賦活性ＲＮＡ分子（ｉｓＲＮＡ）の同定と選択が可能になる
全インフルエンザＡゲノムＲＮＡが、トール様受容体７（ＴＬＲ７）刺激によって形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）に高レベルのインターフェロンアルファ（ＩＦＮ−α）を誘導したという知見（Diebold SS.等; Science 303(5663), 1529-1531 (2004)）に基づいて、我々は、ＴＬＲ７依存性ＩＦＮ−α誘導活性に関与している明確な低分子免疫賦活性一本鎖ＲＮＡ分子（ｉｓＲＮＡ）を同定するための逐次断片化戦略を確立するために親配列としてインフルエンザＡ核タンパク質（ＮＰ）をコードするＲＮＡ（１５６５ｎｔ）を選択した。全インフルエンザＡゲノムＲＮＡ又は他のウイルス由来の全ＲＮＡとは対照的に、明確なサイトカイン誘導プロファイルと特異的適応免疫応答調節を誘導する低分子ｉｓＲＮＡ分子は、化学合成又はインビトロ転写によりＧＭＰ条件下で大規模に生産することができ、組換えタンパク質ベースのワクチンのアジュバントとしてのその臨床応用を可能にする。
図１は、インフルエンザＮＰをコードするＲＮＡ（２−２−８、ＮＰ１−１５６５）を開始配列として使用して適用された逐次断片化戦略の概要を示す。断片化は反復サイクルで実施し、選択された断片はインビトロでＲＮＡに転写し、精製後、その免疫賦活活性とＴＬＲ特異性についてインビトロでスクリーニングした。更なる断片化サイクルのために、最も高いＴＬＲ７特異性、ＩＦＮ−α誘導能、及び好ましいサイトカイン誘導プロファイルを持つ断片を選択した。逐次実施される断片化戦略により、最終的にＮＰ７１−Ｓｅｑ４、Ｉｎｎｏ７１−５Ａ、ＮＰ７１−Ｓｅｑ４４及びＮＰ７１−Ｓｅｑ４５と命名した３８〜６０ヌクレオチド長の低分子ｉｓＲＮＡを同定し選択した。
【０２９１】
実施例２：インビトロ転写によるｉｓＲＮＡの合成、ｉｓＲＮＡの組成及び配列、並びに精製後の品質管理
選択されたインフルエンザＮＰ断片をコードするＤＮＡ配列を、バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの下流で、ＳｐｅＩ及びＸｈｏＩ制限部位を使用してプラスミドｐＳＴ１中にクローニングした。ＸｈｏＩ直線化プラスミドが、次のインビトロ転写（ＩＶＴ）のためのＤＮＡ鋳型となった。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによって合成したＩＶＴ ＲＮＡは、ｐＳＴ１プラスミド鋳型に由来する短いストレッチが両側に隣接した、選択されたインフルエンザＮＰ ＲＮＡ断片で構成されていた（図２Ａ）。
最終的に選択されたｉｓＲＮＡ ＮＰ７１−Ｓｅｑ４、Ｉｎｎｏ７１−５Ａ、ＮＰ７１−Ｓｅｑ４４、及びＮＰ７１−Ｓｅｑ４５の配列と、ｐＳＴ１由来配列部分を含むそれらの全体サイズ（ヌクレオチド、ｎｔ）を図２Ｂに示す。ｐＳＴ１鋳型由来の配列には下線を付した。ｉｓＲＮＡの５’末端は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの転写開始部位を表すトリプルグアノシンによって特徴付けられる（Imburgio, D.等; Biochemistry 39(34), 10419-10430 (2000)）。
シリカベース膜又は弱陰イオン交換カラムで精製した後、ｉｓＲＮＡを、様々な分析方法を使用してデフォルトで品質管理した。精製されたｉｓＲＮＡのサイズ、均一性、及び完全性を、変性１０％ポリアクリルアミド（ＰＡＡ）ゲル電気泳動（図２Ｃ）及びＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２１００システム（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用したオンチップキャピラリー電気泳動（図２Ｄ）によって分析した。結果は、ＩＶＴによって産生されたか又は完全に化学合成（Ｃｈｅｍ．Ｓｙｎｔｈ．）されたｉｓＲＮＡ ＮＰ７１−Ｓｅｑ４に対する例である。ＮＰ７１−Ｓｅｑ４（ＩＶＴ）は、ＰＡＡゲル中における予想されたサイズの明確な単一バンドと、ＲＮＡ完全性損失の兆候なしに均一な集団を示すキャピラリー電気泳動でのシャープなピークによって特徴付けられた。対照的に、化学合成されたＮＰ７１−Ｓｅｑ４ ｉｓＲＮＡでは、より不均一なＲＮＡ集団を指す、キャピラリー電気泳動後のピークショルダーと２番目のマイナーピークが明らかになった。従って、ＩＶＴ ＲＮＡを、続く全ての実験において使用した。
【０２９２】
実施例３：製剤化ｉｓＲＮＡはヒトＰＢＭＣにおいて高レベルのＩＦＮ−αを誘導する
逐次断片化によって誘導した潜在的ｉｓＲＮＡ候補を、精製と品質管理後に細胞インビトロアッセイにおけるその免疫賦活能についてスクリーニングした。導出サイトカインＩＦＮ−α（強力な誘導）対ＴＮＦ−α（弱い誘導又は誘導欠如）を誘導するその能力の差次的挙動を、候補選択及び更なる断片化工程のための最初の重要な基準として定義した。強力な炎症誘発性サイトカインＴＮＦ−αのｉｓＲＮＡを介した誘導は、有害な全身性副作用を引き起こし、ワクチンアジュバントとして使用した場合に同定されたｉｓＲＮＡの安全性プロファイルに悪影響を及ぼす可能性があるため、最小限に抑えるべきである。
ウェル当たり１×１０６の新鮮に単離されたヒトＰＢＭＣを、Ｆ５製剤化ＮＰ７１ ＩＶＴ ＲＮＡ又はそれに由来する断片（ＮＰ７１−Ｓｅｑ１−ＮＰ７１−Ｓｅｑ４；図１も参照）で刺激し、刺激時の細胞培養上清に分泌されたＩＦＮ−α及びＴＮＦ−αのレベルをＥＬＩＳＡにより分析した。ｉｓＲＮＡ試験候補を、より大きな親ＮＰ７１ ＲＮＡ断片と同等の量又は同等のモル濃度を反映する２つの異なる濃度（０．１６７及び０．０４１μｇ／ウェル）で使用した。Ｆ５製剤化ポリ（Ｉ：Ｃ）（０．１６７μｇ／ウェル）及び未製剤化ＣＬ０９７（０．２μｇ／ウェル）をそれぞれＩＦＮ−α及びＴＮＦ−α誘導の陽性対照として使用した。培地又は空のＦ５−リポソームとの細胞のインキュベーションが陰性対照となった。試験したＩＶＴ ＲＮＡの免疫賦活活性は、ＮＰ７１ ＲＮＡ断片のリポソーム製剤（０．１６７μｇ／ウェル）により図３Ａに示されるように、適切な送達方法に依存した。親ＮＰ７１ ＲＮＡ断片は高レベルのＩＦＮ−αとＴＮＦ−αの双方を誘導した。ＮＰ７１とは対照的に、ＥＬＩＳＡアッセイでは、ｉｓＲＮＡ ＮＰ７１−Ｓｅｑ４でのヒトＰＢＭＣの刺激により、細胞上清中に高ＩＦＮ−α及び低ＴＮＦ−α量が分泌された好都合なサイトカイン誘導プロファイルが得られることが明らかになった。他の全ての試験候補では、特に高ＲＮＡ濃度（０．１６７μｇ／ウェル）を使用した場合に顕著になる両サイトカインのよりバランスの取れた誘導が引き起こされ、更なる断片化工程については無視した。この結果は、適用された逐次断片化戦略により実際に所望の免疫賦活活性を持つ明確なＲＮＡ断片を同定し選択することができることを示している。
ＮＰ７１−Ｓｅｑ４を更なる断片化のために選択し、観察されたＩＦＮ−α誘導効果の原因となる更に短いコア配列モチーフを特定した。得られた低分子ｉｓＲＮＡ断片Ｉｎｎｏ７１−５Ａ、ＮＰ７１−Ｓｅｑ４４及びＮＰ７１−Ｓｅｑ４５（図１及び図２Ｂも参照）にＦ５−リポソームを配合し、ウェル当たり１×１０６のヒトＰＢＭＣの刺激に０．１６７μｇ／ウェルの濃度で使用した（図３Ｂ）。空のＦ５−リポソーム又は培地のみとのインキュベーションが陰性対照となった。未製剤化ＣｐＧ ＯＤＮ２３９５（５μｇ／ｍｌ）を、ＥＬＩＳＡで分析されるＩＦＮ−α誘導の陽性対照として使用した。ＮＰ７１−Ｓｅｑ４の最短配列ストレッチを表すＩｎｎｏ７１−５Ａ ｉｓＲＮＡは、その親ＮＰ７１−Ｓｅｑ４と同等のＩＦＮ−αレベルを誘導した。この結果は、Ｉｎｎｏ７１−５ＡがＮＰ７１−Ｓｅｑ４の観察された免疫賦活効果に必要な主要な認識配列モチーフを含んでいることを示している。予想外に、Ｆ５製剤化ＮＰ７１−Ｓｅｑ４４、特にＮＰ７１−Ｓｅｑ４５ ｉｓＲＮＡは、親ＮＰ７１−Ｓｅｑ４よりも更に高いＩＦＮ−αレベルを誘導することができた。ＮＰ７１−Ｓｅｑ４の５’配列部分を代表するＩｎｎｏ７１−５Ａとは対照的に、ＮＰ７１−Ｓｅｑ４４及びＮＰ７１−Ｓｅｑ４５はＮＰ７１−Ｓｅｑ４の元の５’及び３’末端配列を含んでおり、ＮＰ７１−Ｓｅｑ４ ＲＮＡ配列部分の内部枯渇によって特徴付けられた（図１を参照）。
【０２９３】
実施例４：ｐＤＣはＦ５製剤化ｉｓＲＮＡによりインビトロで標的化することができ、ｉｓＲＮＡによる刺激時のＩＦＮ−α分泌の主要なエフェクター細胞である
ヒト及びマウスｐＤＣは、一本鎖（ｓｓ）ウイルスＲＮＡ又は特定の配列モチーフを含むｓｓＲＮＡで刺激すると、ＩＦＮ−αの主要な細胞性産生体であることがよく知られている。インフルエンザＮＰに由来するＦ５製剤化低分子ｉｓＲＮＡがｐＤＣを標的とし、ＩＦＮ−α産生を活性化できるかどうかを調べるため、ヒトｐＤＣを、ＭＡＣＳ技法を使用してＰＢＭＣから分離し、インビトロ刺激アッセイに使用した。空のＦ５−リポソーム及び培地のみで処理した細胞が陰性対照となった。未製剤化ＣｐＧ ＯＤＮ２２１６（５μｇ／ｍｌ）はＩＦＮ−α誘導の陽性対照となった（図４）。ＥＬＩＳＡの結果は、ｐＤＣがリポソーム製剤化ｉｓＲＮＡによって標的化でき、刺激時に多量のＩＦＮ−αを産生できることを示した。ｐＤＣが枯渇したＰＢＭＣは、全ＰＢＭＣと比較して強く減少したＩＦＮ−α誘導を示しており、ｐＤＣがリポソーム製剤化ｉｓＲＮＡが標的とする主要なＩＦＮ−α産生体である可能性が高いことを示している。全ＰＢＭＣを使用した以前の結果と一致して、最短ｉｓＲＮＡ配列を表すｉｓＲＮＡ Ｉｎｎｏ７１−５ＡによるｐＤＣ刺激が、親ｉｓＲＮＡ ＮＰ７１−Ｓｅｑ４によって誘導されたレベルと非常に類似したＩＦＮ−αレベルをもたらした。Ｆ５製剤化ｉｓＲＮＡ ＮＰ７１−Ｓｅｑ４５によるｐＤＣの刺激は、ＮＰ７１−Ｓｅｑ４よりも多量のＩＦＮ−αを誘導し、全ＰＢＭＣを使用した以前の実験を確認した（図３Ｂを参照）。これらの結果に基づいて、ｉｓＲＮＡ ＮＰ７１−Ｓｅｑ４５をリード候補として選択し、更なる実験において主に使用した。
【０２９４】
実施例５：ヒトＰＢＭＣにおけるｉｓＲＮＡ ＮＰ７１−Ｓｅｑ４５媒介ＩＦＮ−α誘導はエンドソームに位置するＴＬＲに依存している
全インフルエンザＡゲノムＲＮＡによるｐＤＣ中でのＩＦＮ−αの誘導は、エンドソームに位置するＴＬＲ７の活性化に依存している（Diebold SS.等; Science 303(5663), 1529-1531 (2004)）。Ｆ５製剤化ｉｓＲＮＡによる刺激時のＩＦＮ−α誘導が核酸感受性のエンドソームＴＬＲに依存していることを評価するために、新鮮に単離された全ヒトＰＢＭＣを２５０ｎＭのバフィロマイシンＡ１で１時間、前処理し、その後ＮＰ７１−Ｓｅｑ４５と共に１４時間インキュベートした（図５）。バフィロマイシンＡ１は、液胞型Ｈ＋ＡＴＰａｓｅを阻害することによりエンドソーム酸性化を防ぎ、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７／８又はＴＬＲ９のようなエンドソームに位置する核酸感受性ＴＬＲを遮断する。空のＦ５リポソームと培地のみと共にインキュベートした細胞を陰性対照とする一方、未製剤化ＣｐＧ ＯＤＮ２２１６（ＴＬＲ９リガンド）をバフィロマイシンＡ１処理の陽性対照とした。予想通り、バフィロマイシンＡ１前処理はＣｐＧ ＯＤＮ２１６によるＩＦＮ−αの誘導を強く減少させたが、細胞生存率は使用されたバフィロマイシンＡ１濃度に影響されなかった（データは示さず）。ＩＦＮ−α分泌の同様の強力な減少が、ＰＢＭＣをバフィロマイシンＡ１と共にインキュベートしＮＰ７１−Ｓｅｑ４５刺激を続けた場合に観察され、ｉｓＲＮＡがエンドソームＴＬＲによって認識されることを示している。
【０２９５】
実施例６：ｉｓＲＮＡ ＮＰ７１−Ｓｅｑ４５はＴＬＲ７の特異的アゴニストである
どのヌクレオチド感受性エンドソームＴＬＲがＮＰ７１−Ｓｅｑ４５によって活性化されるかを分析するために、ＮＦ−κＢ誘導性ルシフェラーゼレポーター遺伝子に加えてヒトＴＬＲ３、ＴＬＲ７又はＴＬＲ８を安定して共発現するＨＥＫ２９３細胞を、Ｆ５製剤化ｉｓＲＮＡ ＮＰ７１−Ｓｅｑ４５と共にインキュベートし、ルシフェラーゼシグナルを未処理（培地のみ）細胞と比較した（図６）。ＴＬＲ９は特異的ＤＮＡ分子を専ら認識するので、ＴＬＫ９を発現するＨＥＫ２９３細胞は除外した。陽性対照は、ＴＬＲ３に対してはＦ５製剤化ポリ（Ｉ：Ｃ）、ＴＬＲ７及びＴＬＲ８に対しては非製剤化ＣＬ０９７、ＴＬＲ８に対してはカチオン性脂質と複合したｓｓＲＮＡ４０であった。空のＦ５−リポソーム処理細胞は陰性対照となった。Ｆ５製剤化ＮＰ７１−Ｓｅｑ４５ ｉｓＲＮＡを添加すると、ヒトＴＬＲ７を共発現するＨＥＫ２９３細胞においてのみレポーター遺伝子が活性化されたが、他のＴＬＲ発現細胞ではルシフェラーゼシグナルは得られなかった。この結果は、ＮＰ７１−Ｓｅｑ４５がヒトＴＬＲ７の特異的リガンドとして作用することを示している。
これらの結果を総合すると、リポソーム製剤化ｉｓＲＮＡはインビトロでｐＤＣにおいてＩＦＮ−α産生を誘導することができ、免疫賦活活性が主にエンドソームにあるＴＬＲ７によって媒介されることが明らかになった。
【０２９６】
実施例７：Ｆ５製剤化ｉｓＲＮＡはヒトＰＢＭＣにおいて高レベルのＩＦＮ−αを誘導するが、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α及びＩＬ１０は僅かなレベルのみ誘導する
ワクチンアジュバントとしてｉｓＲＮＡを選択するための重要なパラメーターは、高レベルのＩＦＮ−αを誘導し、ワクチン接種時に有害な全身性副作用を引き起こすかもしれないＴＮＦ−αやＩＦＮ−γのような強い炎症誘発性サイトカインがないか最小レベルだけ誘導する能力であった。更に、ｉｓＲＮＡベースのアジュバントは、Ｔｈ１細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、及びマクロファージの活性を阻害し、それによって免疫応答のＴｈ２表現型を促進する、ＩＬ１０のような抗炎症性サイトカインの強力な誘導をもたらすべきではない。
ｉｓＲＮＡ ＮＰ７１−Ｓｅｑ４５及びその親断片ＮＰ７１−Ｓｅｑ４によって誘導されるサイトカインプロファイルを分析するために、マルチプレックスビーズイムノアッセイを実施した。ウェルあたり１×１０６の新鮮に単離されたヒトＰＢＭＣを、Ｆ５製剤化ｉｓＲＮＡ（０．１６７μｇ／ウェル）又は陽性対照としての非製剤化ＣｐＧ ＯＤＮ２２１６（１μｇ／ウェル）及び陰性対照としての空のＦ５−リポソームと共にインキュベートした。細胞上清中の分析されたサイトカイン濃度は、ＩＦＮ−α、ＩＬ６、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、及びＩＬ１０を含んでいた（図７）。両方のｉｓＲＮＡは高ＩＦＮ−αレベルを誘導し、ＮＰ７１−Ｓｅｑ４５は優れた効果を示し、以前の結果を確認した。検出されたＩＦＮ−α量は、強いｐＤＣＩＦＮ−α分泌を誘導することが知られているＤ型ＣｐＧ ＯＤＮ２２１６に対して観察された範囲と同様であった。ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、及びＩＬ１０では僅かなレベルのみが検出可能であったのに対し、コンテクスト依存的な炎症誘発性及び抗炎症特性を持ち、Ｂ細胞活性化及び成熟に関与するサイトカインであるＩＬ６は、ｉｓＲＮＡ又はＣｐＧ ＯＤＮ２２１６によって中程度に誘導された。
インビトロでのヒトＰＢＭＣにおけるｉｓＲＮＡによって誘導されたサイトカインプロファイルは、同定したｉｓＲＮＡが、潜在的に有害な主な炎症誘発性サイトカインの誘導を最小限に抑えながら体液性及び細胞性抗原特異的免疫応答の発生を増強する可能性を持つＴｈ１サイトカインの産生を特徴とする自然免疫応答を開始することを示している。
【０２９７】
実施例８：Ｆ５製剤化ｉｓＲＮＡでのマウス細胞のインビトロ刺激は、ＩＦＮ−αの強いｐＤＣ依存性誘導と僅かなＴＮＦ−α分泌のみをもたらす
新鮮に調製したヒトＰＢＭＣを使用した以前のインビトロ結果は、高いＩＦＮ−α誘導及び僅かなＴＮＦ−α誘導のみを示す同定されたｉｓＲＮＡの強力な免疫賦活能を明確に示すことができた。その後の実験においてマウスモデルを使用して意味のあるインビボ前臨床試験を実施するために、原因となる主要標的細胞を含む免疫賦活効果をインビトロで確認しなければならなかった。
従って、Ｂａｌｂ／ｃ骨髄由来細胞と脾細胞を単離し、Ｆ５製剤化ｉｓＲＮＡ ＮＰ７１−Ｓｅｑ４又はＮＰ７１−Ｓｅｑ４５、未製剤化ＣｐＧ ＯＤＮ２３５９（０．５μｇ／ウェル）又は空のＦ５リポソームと共にインキュベートした（図８Ａ）。未処理細胞（細胞のみ）が陰性対照となった。加えて、ｐＤＣが枯渇した脾細胞、濃縮ｐＤＣ、及び濃縮された一般的な樹状細胞（ｃＤＣ）を前述のように刺激した（図８Ｂ）。細胞上清中のサイトカイン濃度をＥＬＩＳＡにより分析した。
ヒトＰＢＭＣで得られた結果を確認し、マウス脾細胞又は骨髄由来細胞をｉｓＲＮＡで刺激すると、強力なＩＦＮ−αと僅かなＴＮＦ−α誘導のみが生じる。対照的に、ＴＬＲ９アゴニストクラスＣ ＣｐＧ ＯＤＮ２３５９とのインキュベーションは、試験した両方のサイトカインの強い誘導を誘発した。更に、ヒトＰＢＭＣインビトロ結果（図３Ｂも参照）により、ＮＰ７１−Ｓｅｑ４５は、その親ＲＮＡ断片ＮＰ７１−Ｓｅｑ４よりも強い免疫賦活能を明らかにした。ｉｓＲＮＡ刺激によるＩＦＮ−αの誘導は、ヒト細胞を使用して既に観察されているようにｐＤＣに厳密に依存していた。
新鮮に調製されたマウス細胞を使用したインビトロ結果は、同定されたｉｓＲＮＡの幅広い適用性を示し、モデル系としてマウスを使用した更なるインビボ実験を可能にした。
【０２９８】
実施例９：インビボでのＦ１２製剤化ｉｓＲＮＡ刺激は、ＩＦＮ−αの時間及び用量依存的誘導をもたらす
ｉｓＲＮＡアジュバントを適用する際の時間及び用量応答関係は、安全性評価と最適な免疫法の開発のための重要なパラメーターである。従って、Ｂａｌｂ／ｃマウスに、増大用量の製剤化ＮＰ７１−Ｓｅｑ４ ｉｓＲＮＡを１回静脈内注射した。インビトロ実験で使用したリポソーム製剤Ｆ５とは対照的に、インビボ研究で使用されるリポソーム製剤Ｆ１２を、静脈内投与時の免疫活性化の主要側である脾臓中へのｉｓＲＮＡの最適な送達に適応させた。ＥＬＩＳＡで測定したＩＦＮ−αの用量及び時間依存性誘導に関するｉｓＲＮＡのインビボ刺激効果を分析するために、マウス血清試料を注射の１、３、５、８及び２４時間後に採取した（図９）。
投与された投薬量に関係なく、インビボでの最大のＩＦＮ−α誘導が免疫の５時間後に既に達成され、その後低下して正常レベルに戻った。１０μｇのＮＰ７１−Ｓｅｑ４ ｉｓＲＮＡの静脈内投与は、最大の刺激効果のために既に十分であり、より高い用量では増加させることはできなかった。４０μｇのｉｓＲＮＡを注入した後でも、副作用は見られず、全身投与後のｉｓＲＮＡの良好な忍容性が示された。
【０２９９】
実施例１０：頻繁な間隔でのＦ１２製剤化ｉｓＲＮＡの反復的静脈内投与により、適応免疫化レジームによって克服できる全身性ＴＬＲ応答耐性がもたらされる
ＴＬＲ応答耐性はよく知られた効果であり、ＴＬＲアゴニストへの反復暴露によりサイトカイン放出応答が減少する（Broad, A.等; Curr Med Chem 13(21), 2487-2502 (2006)）。結果として、多すぎる頻度でのｉｓＲＮＡアジュバントの同時投与を伴うワクチン接種は、全体的な免疫応答に有害な影響を与えるため、避けるべきである。従って、ＴＬＲ応答耐性に至ることなくｉｓＲＮＡを投与できる時間間隔を分析することが重要であった。
Ｆ１２製剤化ＮＰ７１−Ｓｅｑ４ ｉｓＲＮＡを５日（第一群）又は７日（第二群）の間隔でＢａｌｂ／ｃマウスに２回、静脈内注射した（図１０）。両群に２０μｇのｉｓＲＮＡ／マウスを注射し、各注射の４時間後に血液試料を採取した。使用したｉｓＲＮＡ濃度と注射後の血液採取の時間は、以前の実験で最適であることが示された（図９を参照）。ＩＦＮ−αの血清レベルをＥＬＩＳＡによって検出した。５日の時間間隔でのＦ１２製剤化ＮＰ７１−Ｓｅｑ４ ｉｓＲＮＡの投与は、２回目の注射後のＩＦＮ−α分泌の強い減少を伴う顕著なＴＬＲ応答耐性効果をもたらした。しかし、ＴＬＲ応答性は、７日間の注射間隔でほぼ完全に回復することができた。従って、モデル抗原とｉｓＲＮＡアジュバントを組み合わせた続くワクチン接種実験を、最大のｉｓＲＮＡアジュバント効果を確保するために、各注射後１０〜１４日の最小時間間隔で複数の免疫を使用して実施した。
【０３００】
実施例１１：ＨＢｃＡｇ−＃Ａ７９ ＶＬＰと組み合わせたＦ１２製剤化ｉｓＲＮＡはインビボで抗原特異的Ｂ細胞及びＴ細胞応答を誘導する
以前の実験において、我々は、同定したｉｓＲＮＡが自然免疫系、特にｐＤＣを非常に効率的かつ大きくＴＬＲ７依存的に刺激し、多量のＩＦＮ−αを放出できることを実証できた。その後のインビボ免疫研究において、我々は、ｉｓＲＮＡによる自然免疫系のトリガーが、Ｂ細胞とＴ細胞両方の効率的かつ抗原特異的な適応免疫応答に変換できるかどうかの分析を望んだ。
この目的のために、我々は、選択したｉｓＲＮＡをウイルス様粒子（ＶＬＰ）ベースのモデル抗原ＨＢｃＡｇ−＃Ａ７９と組み合わせた。ＶＬＰは、高分子構造に自己集合する固有の能力を持つウイルス構造タンパク質で構成されている。ＶＬＰは、由来するウイルスに似ているが、ウイルス遺伝物質を含んでいない。従って、ＶＬＰは非感染性であり、一般に安全なワクチン型と考えられる。ＶＬＰの高い内因性免疫原性は、ＶＬＰの表面に繰り返し提示される異種性エピトープに伝達されうる。使用されたモデル抗原ＨＢｃＡｇ−＃Ａ７９は、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃＡｇ）に由来する組換え生産されたキメラＶＬＰに基づいており、細胞表面に位置する腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）ＣＬＤＮ６の遺伝的に挿入されたエピトープをその表面に提示する。ＣＬＤＮ６エピトープ＃Ａ７９は免疫化研究の理想的な候補であったが、それは、Ｂ細胞とＴ細胞の複合エピトープとして機能し、後者が、Ｂａｌｂ／ｃ近交系マウスによって発現されるＭＨＣクラスＩＨ−２Ｋｄに制限されるためである。
Ｂａｌｂ／ｃマウスを、Ｆ１２製剤化ｉｓＲＮＡ ＮＰ７１−Ｓｅｑ４又はＮＰ７１−Ｓｅｑ４５と組み合わせたＨＢｃＡｇ−＃Ａ７９ ＶＬＰを用いて２週間間隔で４回静脈内で免疫した。未処置マウス又は空のＦ１２リポソーム、Ｆ１２製剤化ポリ（Ａ）ＲＮＡ、又はＣＦＡ／ＩＦＡ（皮下で免疫）でアジュバント化したＨＢｃＡｇ−＃Ａ７９−ＶＬＰで免疫したマウスを対照とした。３回目の免疫の１０日後、フローサイトメトリーによる抗原特異的体液性免疫応答の分析のために血液試料を採取した（図１１Ａ）。４回目の免疫の５日後に動物を屠殺し、脾細胞を単離して、酵素免疫スポット（ＥＬＩＳｐｏｔ）アッセイにより特異的Ｔ細胞応答の誘導を分析した（図１１Ｂ）。
【０３０１】
フローサイトメトリー分析を、標的ＴＡＡ ＣＬＤＮ６又は特異性対照のためのその密接な相同体ＣＬＤＮ９で安定にトランスフェクトされた生存ＣＨＯ−Ｋ１細胞を使用して実施した。結合抗体の検出は、免疫血清のＭＦＩを各出血前血清のＭＦＩ（最初の免疫前）で除算することにより計算された平均蛍光強度（ＭＦＩ）シフトにより表した。２倍を超えるＭＦＩシフトが、陽性の抗原特異的抗体応答と見なされた。アジュバントを添加せずに免疫したＨＢｃＡｇ−＃Ａ７９ ＶＬＰは、少数の動物のみが陽性反応を示す弱い抗原特異的免疫応答を誘導する。抗原特異的免疫応答は、ポリ（Ａ）ＲＮＡ、ＣＦＡ／ＩＦＡ、又は空のＦ１２リポソームによるアジュバント化により僅かに増加した。しかし、この効果は非アジュバント化ＨＢｃＡｇ−＃Ａ７９ＶＬＰと比較した場合、有意（ｎｓ）ではなかった。ｉｓＲＮＡ ＮＰ７１−Ｓｅｑ４又はＮＰ７１−Ｓｅｑ４５の同時投与は、ＣＬＤＮ９への抗体の非特異的結合を増加させることなく、ＨＢｃＡｇ−＃Ａ７９ＶＬＰで免疫した際のＣＬＤＮ６抗原特異的抗体応答を強くかつ非常に有意に増加させた。ＮＰ７１−Ｓｅｑ４５ ｉｓＲＮＡをアジュバントとして使用した動物の免疫は、一般にＮＰ７１−Ｓｅｑ４よりも高い抗体ＭＦＩシフトをもたらした。
ＥＬＩＳｐｏｔ分析により、ポリ（Ａ）ＲＮＡ又はＣＦＡ／ＩＦＡでアジュバント化したＨＢｃＡｇ−＃Ａ７９ＶＬＰを使用した免疫、及び空のＦ１２リポソームの添加により、検出可能なＴ細胞応答が完全に欠如することが明らかになった。対照的に、ｉｓＲＮＡの同時投与は、ＮＰ７１−Ｓｅｑ４と比較した場合、ＮＰ７１−Ｓｅｑ４がＩＦＮ−γスポットの数を増加させる非常に有意な＃Ａ７９ペプチド特異的Ｔ細胞応答を誘導した。
ＨＢｃＡｇ−＃Ａ７９ＶＬＰをリポソーム製剤化ｉｓＲＮＡアジュバントと組み合わせてマウスを免疫して得られた結果は、生細胞上のその本来の高次構造の標的ＴＡＡを検出できる高力価及び抗原特異的抗体応答の効率的な誘導が、使用したｉｓＲＮＡアジュバントに強く依存していたことを明確に示している。更に、モデル抗原と製剤化ｉｓＲＮＡの組み合わせのみが、多数のＩＦＮ−γスポットによって反映されるＴＡＡペプチド特異的Ｔ細胞応答を同時に誘導することができた。従って、リポソーム製剤で静脈内投与された同定したｉｓＲＮＡは、組換えタンパク質ベースのワクチンと組み合わせた場合、インビボで体液性及び細胞性抗原特異的免疫応答の発生をブーストするアジュバントとして作用しうる。
【０３０２】
実施例１２：ＨＢｃＡｇ−＃Ａ７９ＶＬＰと組み合わせたＦ１２製剤化ｉｓＲＮＡの免疫により誘導される抗原特異的Ｂ及びＴ細胞応答は用量依存的である
以前の実験（図９を参照）において、我々は、製剤化ｉｓＲＮＡによるＩＦＮ−αのインビボ誘導が時間と用量に依存し、１０μｇのｉｓＲＮＡを１回注入した後に最大の効果がもう達成されていることを示すことができた。この用量依存性と、抗原特異的複合Ｂ及びＴ細胞応答のインビボ誘導との相関関係を、漸増用量（５、１０、２０、４０μｇ／注射）のＦ１２製剤化ＮＰ７１−Ｓｅｑ４５ ｉｓＲＮＡでアジュバント化したＨＢｃＡｇ−＃Ａ７９ＶＬＰをマウスに静脈内免疫して分析した。免疫スケジュールと実験セットアップは、実施例１１に記載のものと同一であった。
Ｆ１２製剤化ＮＰ７１−Ｓｅｑ４５ ｉｓＲＮＡの５μｇ／注射が、フローサイトメトリーによって示されるように、明らかに増強された抗体応答を示すのに既に十分であった（図１２Ａ）。加えて、４０μｇ／注射を適用した場合に更に増加することなく、２０μｇ／注射のｉｓＲＮＡ濃度までの用量依存性抗原特異的抗体応答が検出可能であった。この用量依存性は、Ｆ１２製剤化ｉｓＲＮＡのアジュバント活性におけるＩＦＮ−αの重要な役割に向けられたＩＦＮ−α分泌の用量依存的過程に類似していた。少なくとも１０μｇ／注射のｉｓＲＮＡを適用すると、ＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔにより＃Ａ７９ペプチド特異的Ｔ細胞応答の有意な増強が検出可能であった（図１２Ｂ）。更に、ｉｓＲＮＡトリガーＢ細胞応答に対して観察された結果とは対照的に、ｉｓＲＮＡアジュバント投薬量を最大４０μｇ／注射のＮＰ７１−Ｓｅｑ４５まで増加させることにより、ペプチド特異的Ｔ細胞応答が更に増強された。ＴＡＡ ＣＬＤＮ１８．２に由来する無関係なペプチドに対する非特異的なＴ細胞反応性は、最高ＮＰ７１−Ｓｅｑ４５用量でさえも見られなかった。
これらの結果は、ｉｓＲＮＡ誘導性Ｂ及びＴ細胞免疫応答の差次的な用量依存性挙動が、適用されるｉｓＲＮＡ用量を適応させることによりそれらの調節を可能にすることを示した。
【０３０３】
実施例１３：Ｆ１２製剤化ｉｓＲＮＡ及びＨＢｃＡｇ−＃Ａ７９ＶＬＰによる免疫により誘発された抗原特異的抗体はＣＤＣにより標的陽性細胞を死滅させる
成功裡のワクチン接種策略は、その天然の立体構造でその標的タンパク質に結合し、続いて免疫エフェクター機構を介して標的陽性細胞の死滅化を媒介することができる抗原特異的抗体の誘導に依存するかも知れない。抗体のＦｃ部分によって媒介される主要な細胞溶解性エフェクター機能の一つは、実施例１１に記載されている免疫実験に由来する１：１０希釈の未精製血清を使用して分析された補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）である。
ＣＤＣアッセイにより、ＨＢｃＡｇ−＃Ａ７９ＶＬＰ及びＦ１２製剤化ｉｓＲＮＡで免疫したマウスの血清が効率的な細胞破壊的エフェクター機能を発揮することが明らかになった（図１３）。熱不活化補体（１：１０ｈｉ）が細胞死滅を強く減少させるため、細胞溶解活性は厳密に活性な補体に依存していた。空のＦ１２リポソーム、ＣＦＡ／ＩＦＡと組み合わせた、又はＦ１２製剤化ポリ（Ａ）ＲＮＡでアジュバント化したＨＢｃＡｇ−＃Ａ７９ＶＬＰでの免疫から得られた血清は、同等のエフェクター機能を発揮することができなかった。誘導された抗体の細胞破壊的エフェクター機能は、その計算されたＭＦＩシフトと大部分相関していた。
マウスでは、アイソタイプＩｇＧ３が最良の補体活性化因子であり、ＩｇＧ２ａとＩｇＧ２ｂがそれに続く。従って、ＣＤＣアッセイの結果は、ｉｓＲＮＡアジュバントが免疫グロブリンクラススイッチを促進するインビボサイトカイン環境を誘導し、誘発された抗原特異的抗体がＣＤＣによって標的陽性細胞を死滅させることができることを示した。
【０３０４】
実施例１４：ＨＢｃＡｇ−＃Ａ７９ＶＬＰと組み合わせたＦ１２製剤化ｉｓＲＮＡの免疫は、バランスの取れた抗原特異的ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１応答をもたらした
モデル抗原ＨＢｃＡｇ−＃Ａ７９ＶＬＰと組み合わせた同定したｉｓＲＮＡのアジュバント特性のより良い理解のために、免疫グロブリン（Ｉｇ）アイソタイプスイッチの決定が、ワクチン組成が免疫応答のＴｈ１又はＴｈ２プロファイル間のバランスに影響するかどうかの洞察を提供することができる。マウス系では、ＩｇＧ２ａアイソタイプレベルの上昇の存在が、Ｔｈ１を介した免疫応答の指標となる一方、ＩｇＧ１抗体の高レベルが、Ｔｈ２を介した免疫応答の特徴である。
Ｉｇアイソタイプレベルの分析のために、実施例１１に記載のように免疫したマウスの血清を使用し、線状＃Ａ７９−ペプチドに対して特異的に反応するＩｇＧ１又はＩｇＧ２ａ抗体の力価をＥＬＩＳＡにより分析した（図１４Ａ及び１４Ｂ）。抗体価最大半量を計算し、ＩｇＧ２ａ対ＩｇＧ１の比として表した（図１４Ｃ）。非アジュバント化ＨＢｃＡｇ−＃Ａ７９ＶＬＰ又は空のＦ１２リポソームと組み合わせたＶＬＰによる免疫は、主にＴｈ２駆動免疫応答に関して、高いＩｇＧ１及び非常に低いＩｇＧ２ａ抗体力価をもたらした。対照的に、Ｆ１２製剤化ＮＰ７１−Ｓｅｑ４５でアジュバント化されたＨＢｃＡｇ−＃Ａ７９ＶＬＰでの免疫により生じた抗体は、中程度に高いＩｇＧ１を誘発し、＃Ａ７９−ペプチド特異的ＩｇＧ２ａ抗体力価を強く増強し、バランスのとれたＴｈ１／Ｔｈ２免疫応答をもたらした。
【０３０５】
実施例１５：ＨＢｃＡｇ−＃Ａ７９ＶＬＰと組み合わせたＦ１２製剤化ｉｓＲＮＡにより誘導される抗原特異的抗体応答は主にｐＤＣに依存する
以前のインビトロ実験では、同定したｉｓＲＮＡが主にｐＤＣでのエンドソームＴＬＲ活性化によりその免疫賦活効果を発揮し、高ＩＦＮ−α量の分泌をもたらすことが示された（図４及び図８参照）。
これらの結果をインビボで確認するために、ｐＤＣの枯渇をもたらすジフテリア毒素（ＤＴ）で処置されたＢＤＡＣ２−ＤＴＲマウスと未処置のＣ５７ＢＬ／６野生型マウスを、２０μｇ／注射のＦ１２製剤化ＮＰ７１−Ｓｅｑ４５ｉｓＲＮＡと組み合わせた５０μｇ／注射のＨＢｃＡｇ−＃Ａ７９ＶＬＰで１４日の間隔で３回静脈内で免疫した。対照は、単独又は空のＦ１２−リポソームと組み合わせてのＨＢｃＡｇ−＃Ａ７９ＶＬＰで免疫したＣ５７ＢＬ／６野生型マウスと、ＤＴ単独で処置したが抗原プラスｉｓＲＮＡアジュバントを投与していないＢＤＡＣ２−ＤＴＲマウスであった。ＥＬＩＳＡ（図１５Ａ）によるＩＦＮ−αの誘導を分析するために最初の免疫の４時間後に血清試料を採取し、ＣＨＯ−Ｋ１細胞を使用してフローサイトメトリーにより誘導された抗原特異的抗体応答を決定するために最後の免疫の１０日後に標的ＴＡＡ ＣＬＤＮ６又はその密接な相同体ＣＬＤＮ９でトランスフェクトした（図１４Ｂ）。ジフテリア毒素処理によるｐＤＣ除去により、ＨＢｃＡｇ−＃Ａ７９ＶＬＰと組み合わせたＦ１２製剤化ＮＰ７１−Ｓｅｑ４５の静脈内投与時にＩＦＮ−α血清レベルが強く低減された。検出可能なレベルは、ＤＴ単独で処置されたＢＤＡＣ２−ＤＴＲマウスに対して観察されたものと同様の範囲にあった。非アジュバント化ＨＢｃＡｇ−＃Ａ７９ＶＬＰ又は空のＦ１２リポソームでアジュバント化されたＨＢｃＡｇ−＃Ａ７９ＶＬＰの注射は、検出可能なＩＦＮ−α血清レベルをもたらさなかった。フローサイトメトリーによるＣＬＤＮ６特異的抗体の分析は、ＤＴを介したｐＤＣの枯渇により、Ｃ６７ＢＬ／６野生型マウスと比較してＨＢｃＡｇ−＃Ａ７９ＶＬＰと組み合わせたＦ１２製剤化ＮＰ７１−Ｓｅｑ４５ｉｓＲＮＡでの免疫時に、抗原特異的抗体応答が非常に有意に減少することが明らかになった。しかしながら、非アジュバント化ＨＢｃＡｇ−＃Ａ７９ＶＬＰで免疫したＣ５７ＢＬ／６マウスと比較した場合、ＢＤＡＣ２−ＤＴＲマウスで観察された抗体応答はまだ僅かに上昇していた。
結果は、インビボでの製剤化ｉｓＲＮＡの静脈内投与時に、ｐＤＣが主な標的であり、ＩＦＮ−α産生体であることを示し、以前のインビトロ研究を確認した。加えて、ＩＦＮ−α誘導の欠如により、抗原特異的体液性免疫応答が大幅に減少した。
【０３０６】
実施例１６：Ｆ１２製剤化ｉｓＲＮＡ刺激はインビボで実質的なＩＦＮ−α誘導とほんの僅かなＴＮＦ−α誘導をもたらす
マウス又はヒト免疫細胞を使用した以前のインビトロデータでは、高レベルのＩ型インターフェロン（ＩＦＮ−α）とほんの僅かなレベルの強い炎症誘発性サイトカインＴＮＦ−αを誘導する同定したｉｓＲＮＡ、特に配列ＮＰ７１−Ｓｅｑ４５の能力が実証された。製剤化ｉｓＲＮＡがインビボで同様のサイトカインプロファイルを誘導できるかどうかを調べるために、Ｂａｌｂ／ｃマウスにＦ１２製剤化ＮＰ７１−Ｓｅｑ４５ｉｓＲＮＡを１回静脈内投与した。その後、様々な時点（注射後４、８、及び２４時間）で血清を採取し、血清中のＩＦＮ−α又はＴＮＦ−αレベルを市販のＥＬＩＳＡキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ）で分析した。以前に得られたインビトロデータと一致して、我々は、Ｆ１２製剤化ＮＰ７１−Ｓｅｑ４５ ｉｓＲＮＡの静脈内投与が、ＩＦＮ−αの非常に高いが一過性の分泌をもたらしたが、ＴＮＦ−αレベルは非常に低いままであったことを明確に証明することができた（図１６）。
【０３０７】
ここで言及した配列は次の通りである：
配列番号：１
aacuucugga gggguga                                                      
配列番号：２
aacuucugga ggggugagaa u                                                 
配列番号：３
uugcuu  
配列番号：４
aagaauugcu u  
配列番号：５
gggcgaacua guaacuucug gaggggugag aaucucga  
配列番号：６
aacuucugga ggggugauug cuu     
配列番号：７
gggcgaacua guaacuucug gaggggugau ugcuucucga 
配列番号：８
aacuucugga ggggugagaa uggacgaaaa acaagaauug cuu    
配列番号：９
gggcgaacua guaacuucug gaggggugag aauggacgaa aaacaagaau ugcuucucga       
配列番号：１０
aacuucugga ggggugagaa uaagaauugc uu    
配列番号：１１
gggcgaacua guaacuucug gaggggugag aauaagaauu gcuucucga    
配列番号：１２
agcaaaagca ggguagauaa ucacucacug agugacauca aaaucauggc gucucaaggc       
accaaacgau cuuacgaaca gauggagacu gauggagaac gccagaaugc cacugaaauc      
agagcauccg ucggaaaaau gauuggugga auuggacgau ucuacaucca aaugugcacc      
gaacucaaac ucagugauua ugagggacgg uugauccaaa acagcuuaac aauagagaga      
auggugcucu cugcuuuuga cgaaaggaga aauaaauacc uugaagaaca ucccagugcg      
gggaaagauc cuaagaaaac uggaggaccu auauacagga gaguaaacgg aaaguggaug      
agagaacuca uccuuuauga caaagaagaa auaaggcgaa ucuggcgcca agcuaauaau      
ggugacgaug caacggcugg ucugacucac augaugaucu ggcauuccaa uuugaaugau      
gcaacuuauc agaggacaag agcucuuguu cgcaccggaa uggaucccag gaugugcucu      
cugaugcaag guucaacucu cccuaggagg ucuggagccg caggugcugc agucaaagga      
guuggaacaa uggugaugga auuggucaga augaucaaac gugggaucaa ugaucggaac      
uucuggaggg gugagaaugg acgaaaaaca agaauugcuu augaaagaau gugcaacauu      
cucaaaggga aauuucaaac ugcugcacaa aaagcaauga uggaucaagu gagagagagc      
cggaacccag ggaaugcuga guucgaagau cucacuuuuc uagcacgguc ugcacucaua      
uugagagggu cgguugcuca caaguccugc cugccugccu guguguaugg accugccgua      
gccagugggu acgacuuuga aagggaggga uacucucuag ucggaauaga cccuuucaga      
cugcuucaaa acagccaagu guacagccua aucagaccaa augagaaucc agcacacaag     
agucaacugg uguggauggc augccauucu gccgcauuug aagaucuaag aguauuaagc     
uucaucaaag ggacgaaggu gcucccaaga gggaagcuuu ccacuagagg aguucaaauu     
gcuuccaaug aaaauaugga gacuauggaa ucaaguacac uugaacugag aagcagguac     
ugggccauaa ggaccagaag uggaggaaac accaaucaac agagggcauc ugcgggccaa     
aucagcauac aaccuacguu cucaguacag agaaaucucc cuuuugacag aacaaccguu     
auggcagcau ucagugggaa uacagagggg agaacaucug acaugaggac cgaaaucaua     
aggaugaugg aaagugcaag accagaagau gugucuuucc aggggcgggg agucuucgag     
cucucggacg aaaaggcagc gagcccgauc gugccuuccu uugacaugag uaaugaagga     
ucuuauuucu ucggagacaa ugcagaggaa uacgauaauu aaagaaaaau acccuuguuu     
cuacu                                                                
【図１】
2020511504.tif 000003
【図２Ａ−Ｂ】
2020511504.tif 000004
【図２Ｃ−Ｄ】
2020511504.tif 000005
【図３Ａ】
2020511504.tif 000006
【図３Ｂ】
2020511504.tif 000007
【図４】
2020511504.tif 000008
【図５】
2020511504.tif 000009
【図６】
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【図７】
2020511504.tif 000011
【図８】
2020511504.tif 000012
【図９】
2020511504.tif 000013
【図１０】
2020511504.tif 000014
【図１１Ａ】
2020511504.tif 000015
【図１１Ｂ】
2020511504.tif 000016
【図１２Ａ】
2020511504.tif 000017
【図１２Ｂ】
2020511504.tif 000018
【図１３】
2020511504.tif 000019
【図１４Ａ−Ｂ】
2020511504.tif 000020
【図１４Ｃ】
2020511504.tif 000021
【図１５】
2020511504.tif 000022
【図１６】
2020511504.tif 000023
【配列表】
2020511504000001.app
【国際調査報告】
2020511504.tif 000024
2020511504.tif 000025
2020511504.tif 000026
2020511504.tif 000027
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