(57)【要約】  本明細書において、生物学的組織、特に、皮膚にわたって、またはその中に、カーゴを局所的かつ制御可能に送達するためのデバイスおよび方法が提供される。これらのデバイスは、組織のより深い細胞層へのカーゴの送達を可能にする。これらのデバイスは、ナノチャネルを備えるマイクロ構造体アレイを含む。また、フレーム内に包囲された１つ以上のマイクロ構造体アレイを備えるデバイスも開示される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロ構造体アレイ（１００）であって、
上部表面（１０２）および底部表面（１０３）を有する、平面状の基板（１０１）と、
前記平面状の基板の前記上部表面と流体連通している、リザーバ（１０４）と、
前記平面状の基板の前記底部表面から突出している複数のマイクロ構造体（１０５）と、を備え、前記複数のマイクロ構造体の各々が、
ベース（１０７）から、前記平面状の基板の前記底部表面からのある高さに位置する遠位先端（１０８）にかけて先細状になっており、それによって、マイクロ構造体表面を画定する、中実の本体部分（１０６）と、
前記平面状の基板の前記上部表面から、前記マイクロ構造体表面内の第１のチャネル開口（１１０）に延在し、それによって、前記リザーバを前記第１のチャネル開口に流体接続する、第１の送達チャネル（１０９）と、
前記平面状の基板の前記上部表面から、前記マイクロ構造体表面内の第２のチャネル開口（１１２）に延在し、それによって、前記リザーバを前記第２のチャネル開口に流体接続する、第２の送達チャネル（１１１）と、を備える、マイクロ構造体アレイ。
【請求項２】
前記第１のチャネル開口が、前記平面状の基板に対して平行な第１の平面内に位置しており、前記第２のチャネル開口が、前記平面状の基板に対して平行な第２の平面内に位置しており、前記第１の平面が、前記第２の平面から遠位に離隔されている、請求項１に記載のマイクロ構造体アレイ。
【請求項３】
前記第１の平面が、前記平面状の基板の前記底部表面からの前記高さの２０％〜６０％の距離だけ前記第２の平面から遠位に離隔されている、請求項２に記載のマイクロ構造体アレイ。
【請求項４】
前記第１のチャネル開口が、前記遠位先端に位置している、請求項１〜３のいずれかに記載のマイクロ構造体。
【請求項５】
前記複数のマイクロ構造体の各々が、前記平面状の基板の前記上部表面から、前記マイクロ構造体表面内の第３のチャネル開口（１１４）に延在し、それによって、前記リザーバを前記第３のチャネル開口に流体接続する、第３の送達チャネル（１１３）をさらに備える、請求項１〜４のいずれかに記載のマイクロ構造体。
【請求項６】
前記第１のチャネル開口が、前記平面状の基板に対して平行な第１の平面内に位置しており、前記第２のチャネル開口が、前記平面状の基板に対して平行な第２の平面内に位置しており、前記第３のチャネル開口が、前記平面状の基板に対して平行な第３の平面内に位置しており、
前記第１の平面が、前記第２の平面から遠位に離隔されており、前記第２の平面が、前記第３の平面から遠位に離隔されている、請求項５に記載のマイクロ構造体アレイ。
【請求項７】
前記第１の平面が、前記平面状の基板の前記底部表面からの前記高さの２０％〜６０％の距離だけ前記第２の平面から遠位に離隔されている、請求項６に記載のマイクロ構造体アレイ。
【請求項８】
前記第２の平面が、前記平面状の基板の前記底部表面からの前記高さの２０％〜６０％の距離だけ前記第３の平面から遠位に離隔されている、請求項６または７に記載のマイクロ構造体アレイ。
【請求項９】
前記マイクロ構造体表面の前記高さが、５ミクロン〜１０００ミクロンである、請求項１〜８のいずれかに記載のマイクロ構造体アレイ。
【請求項１０】
前記マイクロ構造体の前記ベースの幅が、５ミクロン〜５００ミクロンである、請求項１〜９のいずれかに記載のマイクロ構造体アレイ。
【請求項１１】
前記マイクロ構造体の前記ベースが、略円形の形状を有する、請求項１〜１０のいずれかに記載のマイクロ構造体アレイ。
【請求項１２】
前記ベースが、略長方形の形状を有する、請求項１〜１０のいずれかに記載のマイクロ構造体アレイ。
【請求項１３】
前記複数のマイクロ構造体が、平行なリッジ、ヘリンボーンパターンに配列されたリッジ、波形パターンに配列されたリッジ、円錐、または角錐を備える、請求項１〜１２のいずれかに記載のマイクロ構造体アレイ。
【請求項１４】
前記マイクロ構造体の前記遠位先端が、尖端状、丸状、傾斜状、フレア状、先細状、先丸状、またはこれらの組み合わせである、請求項１〜１３のいずれかに記載のマイクロ構造体アレイ。
【請求項１５】
前記第１の送達チャネルおよび前記第２の送達チャネルが、各々、前記平面状の基板に対して平行な平面において、略円形の断面を有する、請求項１〜１４のいずれかに記載のマイクロ構造体アレイ。
【請求項１６】
前記第１の送達チャネルおよび前記第２の送達チャネルが、各々、前記平面状の基板に対して平行な平面において、略長方形の断面を有する、請求項１〜１４のいずれかに記載のマイクロ構造体アレイ。
【請求項１７】
前記第１の送達チャネルおよび前記第２の送達チャネルが、各々、前記平面状の基板に対して平行な平面において、略トロイド形の断面を有し、
前記第２の送達チャネルが、前記第１の送達チャネルの周囲に同軸で配置されている、請求項１〜１４に記載のマイクロ構造体アレイ。
【請求項１８】
前記第１の送達チャネルが、前記平面状の基板に対して平行な平面において、略円形の断面を有し、前記第２の送達チャネルが、前記平面状の基板に対して平行な平面において、略トロイド形の断面を有し、
前記第２の送達チャネルが、前記第１の送達チャネルの周囲に同軸で配置されている、請求項１〜１４に記載のマイクロ構造体アレイ。
【請求項１９】
前記複数のマイクロ構造体の各々が、前記ベースから前記遠位先端に段階的に先細状になる中実の本体部分を備える、請求項１〜１８のいずれかに記載のマイクロ構造体アレイ。
【請求項２０】
前記複数のマイクロ構造体の各々が、円錐台形の形状を有する中実の本体部分を備える、請求項１〜１８のいずれかに記載のマイクロ構造体アレイ。
【請求項２１】
前記複数のマイクロ構造体の各々の前記中実の本体部分が、シリコンから形成される、請求項１〜２０のいずれかに記載のマイクロ構造体アレイ。
【請求項２２】
前記平面状の基板が、シリコンから形成される、請求項１〜２１のいずれかに記載のマイクロ構造体アレイ。
【請求項２３】
前記平面状の基板が、複数の送達チャネルをさらに備え、それらの各々が、前記平面状の基板の前記上部表面から、前記平面状の基板の前記底部表面内のチャネル開口に延在し、それによって、前記リザーバを、前記平面状の基板の前記底部表面内の前記チャネル開口に流体接続する、請求項１〜２２のいずれかに記載のマイクロ構造体アレイ。
【請求項２４】
前記リザーバと電気的に接触している第１の電極と、前記平面状の基板の前記底部表面に当接して位置している組織に電気的に接触するように構成されている第２の電極と、をさらに備える、請求項１〜２３のいずれかに記載のマイクロ構造体アレイ。
【請求項２５】
組織内の細胞に物質を送達するための方法であって、
請求項１〜２４のいずれかに記載のマイクロ構造体アレイを、前記組織に適用し、前記平面状の基板の前記底部表面が、前記組織に当接して配置され、かつ前記複数のマイクロ構造体が、前記組織の中へ延在するようにすることと、
前記リザーバから、前記複数のマイクロ構造体の各々の前記第１の送達チャネルおよび前記第２の送達チャネルを通って、前記組織内の前記細胞に、物質を送達することと、を含む、方法。
【請求項２６】
前記物質が、前記組織の複数の細胞レベルに同時に送達される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記物質が、張力、手動、剪断力、拡散、注入、圧力、電気穿孔、浸透、濃度勾配、電磁界、低周波数超音波、またはこれらの組み合わせを介して送達される、請求項２５〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記物質が、電気穿孔を介して送達される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
マイクロ構造体アレイが、前記リザーバと電気的に接触している第１の電極と、前記組織と電気的に接触している第２の電極と、を備え、
電気穿孔を介する送達が、前記第１の電極および前記第２の電極にわたって電界を適用して、前記組織内の前記細胞を電気穿孔し、前記物質を、前記リザーバから、前記複数のマイクロ構造体の各々の前記第１および第２の送達チャネルを通って、かつ前記組織の前記細胞の中へ駆動する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記電界が、１Ｖ〜５００Ｖの電位で適用される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記電界が、パルス電界を含む、請求項２９〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
前記パルス電界が、０．１ミリ秒〜１００ミリ秒の持続時間を有する複数のパルスを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記パルス電界が、１〜５００パルスを含む、請求項３１〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
前記物質の送達が、フィードバックシステムによって制御される、請求項２５〜３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
前記物質が、治療薬剤を含む、請求項２５〜３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
前記治療薬剤が、核酸である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記治療薬剤が、ペプチドまたはポリペプチドである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記治療薬剤が、小分子である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記治療薬剤が、ワクチンである、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
前記治療薬剤が、リプログラムされている細胞から単離された小胞を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４１】
前記小胞が、エキソソームを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記物質が、診断用薬剤を含む、請求項２５〜３４のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
前記リザーバが、２つ以上の異なる物質を含み、前記方法が、前記２つ以上の物質を、同時に、前記組織内の前記細胞に送達することを含む、請求項２５〜４２のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
前記方法が、あるレベルで、前記組織の中に物質を注入することをさらに含み、そのレベルを超えて、前記複数のマイクロ構造体が前記組織の中に延在する、請求項２５〜４３のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１６年１２月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／４３８，２５６号の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、ナノテクノロジーに関し、より具体的には、ナノチャネルおよびナノチャネルに基づく送達方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
生物学的組織にわたってまたはその中に治療薬剤を送達するための一般的な技術は、ナノチャネルアレイの使用である。しかしながら、現在のナノチャネルに基づく送達方法は、組織の最も外側の細胞層にカーゴを直接送達することができるのみであり、この技術の作用範囲を著しく制限している。したがって、組織のより深い細胞層にカーゴを送達することができるナノチャネルに基づく送達方法に対する必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００４】
本明細書において、生物学的組織、特に、皮膚にわたって、またはその中に、カーゴを局所的かつ制御可能に送達するためのデバイスおよび方法が提供される。これらのデバイスは、組織のより深い細胞層へのカーゴの送達を可能にする。これらのデバイスは、ナノチャネルを備えるマイクロ構造体アレイを含む。
【０００５】
一部の実施形態において、マイクロ構造体アレイは、上部表面および底部表面を有する、平面状の基板と、平面状の基板の上部表面と流体連通している、リザーバと、平面状の基板の底部表面から突出している複数のマイクロ構造体と、を含む。複数のマイクロ構造体の各々は、ベースから、平面状の基板の底部からのある高さに位置する遠位先端にかけて先細状になっており、それによって、マイクロ構造体表面を画定する、中実の本体部分を備える。複数のマイクロ構造体の各々はまた、平面状の基板の上部表面から、マイクロ構造体表面内の第１のチャネル開口に延在し、それによって、リザーバを第１のチャネル開口に流体接続する、第１の送達チャネルを備える。複数のマイクロ構造体の各々はまた、平面状の基板の上部表面から、マイクロ構造体表面内の第２のチャネル開口に延在し、それによって、リザーバを第２のチャネル開口に流体接続する、第２の送達チャネルを備える。
【０００６】
一部の実施形態において、第１のチャネル開口は、平面状の表面に対して平行な第１の平面内に位置しており、第２のチャネル開口は、平面状の基板に対して平行な第２の平面内に位置している。これらの実施形態において、第１の平面は、第２の平面から遠位に離隔されている。これらの実施形態のうちの一部において、第１の平面は、遠位先端と平面状の基板の底部との間の高さの２０％〜６０％の距離だけ第２の平面から遠位に離隔されている。他の実施形態において、第１のチャネル開口は、遠位先端に位置している。
【０００７】
一部の実施形態において、複数のマイクロ構造体の各々は、平面状の基板の上部表面から、マイクロ構造体表面内の第３のチャネル開口に延在し、それによって、リザーバを第３のチャネル開口に流体接続する、第３の送達チャネルをさらに備える。これらの実施形態のうちの一部において、第１のチャネル開口は、平面状の基板に対して平行な第１の平面に位置しており、第２のチャネル開口は、平面状の基板に対して平行な第２の平面内に位置しており、第３のチャネル開口は、平面状の基板に対して平行な第３の平面内に位置している。これらの実施形態において、第１の平面は、第２の平面から遠位に離隔されており、第２の平面は、第３の平面から遠位に離隔されている。これらの実施形態のうちの一部において、第１の平面は、遠位先端と平面状の基板の底部との間の高さの２０％〜６０％の距離だけ第２の平面から遠位に離隔されており、第２の平面は、遠位先端と平面状の基板の底部との間の高さの２０％〜６０％の距離だけ第３の平面から遠位に離隔されている。
【０００８】
一部の実施形態において、遠位先端と平面状の基板の底部との間の高さは、２０ミクロン〜１０００ミクロンである。
【０００９】
一部の実施形態において、ベースは、略円形の形状を有する。他の実施形態において、ベースは、略長方形の形状を有する。
【００１０】
一部の実施形態において、中実の本体部分は、シリコンまたはシリコン系材料、例えば、窒化シリコンから形成される。他の実施形態において、平面状の基板は、シリコンまたはシリコン系材料から形成される。他の実施形態において、中実の本体部分は、陽極酸化アルミニウムから形成される。他の実施形態において、平面状の基板は、陽極酸化アルミニウムから形成される。
【００１１】
一部の実施形態において、平面状の基板は、複数の送達チャネルをさらに備え、それらの各々が、平面状の基板の上部表面から平面状の基板の底部表面内のチャネル開口に延在し、それによって、リザーバを、平面状の基板の底部表面内のチャネル開口に流体接続する。
【００１２】
また、フレーム内に包囲された１つ以上のマイクロ構造体アレイを備えるデバイスも開示される。一部の実施形態において、フレームは、柔軟性および／または可鍛性である。一部の場合において、これは、湾曲した表面への適用を可能にする。一部の場合において、フレームは、非平面状である。例えば、フレームは、円筒であり得、そのため、マイクロ構造体アレイは、円筒の周囲に円周方向に配設されている。一部の場合において、マイクロ構造体アレイは、円筒の遠位端に配置される。これらの実施形態のうちの一部において、円筒は、内腔を画定し、これは、マイクロ構造体アレイに対するリザーバとして機能することができる。これらの実施形態において、電極もまた、内腔内に配置され得る。
【００１３】
本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、添付の図面および以下の説明に記載されている。本発明の他の特徴、目的、および利点は、説明および図面から、ならびに特許請求の範囲から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】フォトリソグラフィ技術およびエッチング技術を使用するシリコン系材料からのアレイ状相互貫入ナノチャネルの製造を示す概略図である。最初に、フォトレジストパターニングおよび湿式または乾式エッチングを使用して、円錐形または角錐形の相互貫入マイクロ構造体のアレイ（高さ約２０ミクロン〜５００ミクロン）をシリコン基板上に画定する。続いて、シリコン基板は、その裏面に投影リソグラフィを使用して、ナノウェルのアレイ（直径約３００〜１０００ｎｍ）をパターニングされ、その後、シリコン基板／相互貫入マイクロ構造体を通してナノチャネルを穿設するように高異方性深堀り反応性イオンエッチング（ＤＲＩＥ）を行う。
【図２】エッチング技術を使用してシリコン系材料からアレイ状相互貫入ナノチャネルを製造する代替方法を示す概略図である。選択的表面エッチングは、予め作製されたナノチャネル化基板プラットフォーム上に相互貫入マイクロ構造体を画定するために使用される。
【図３】ナノチャネルを含むマイクロ構造体アレイの一実施形態を示す高解像度画像である。
【図４】伝統的なナノチャネルに基づく送達（例えば、ＴＮＴ）方法の適用を示す概略図である。
【図５】ナノチャネルを含む相互貫入マイクロ構造体アレイを使用する生物学的障壁内への／生物学的障壁にわたるカーゴの送達を示す概略図である。
【図６ａ−ｎ】ＴＮＴが、リプログラミング因子の送達の増強およびトランスフェクションの境界を越えた伝播を媒介することを示す。図６ａは、剥離した皮膚組織に対するＴＮＴプロセスの概略図を示す。正極は皮内に挿入され、負極はカーゴ溶液と接触される。次に、パルス電界（２５０Ｖ、１０ｍｓパルス、１０パルス）を、電極間に印加して、露出した細胞膜にナノ孔形成し、カーゴを直接サイトゾルに注入する。ナノ孔アレイを示すＴＮＴプラットフォーム表面の走査型電子顕微鏡写真（上）。図６ｂは、シミュレーション目的のための境界条件を示す概略図を示す。図６ｃは、ＴＮＴ（実線）対ＢＥＰ（破線）を受けている異なる細胞についての穿孔プロファイルのシミュレーションを示す。このプロットは、ＴＮＴが集中的な穿孔をもたらすのに対し、ＢＥＰは広範な穿孔をもたらすことを示す。図６ｄは、ＴＮＴ対ＢＥＰについてのＡＢＭ発現結果を示す。ＴＮＴは、優れたＡＢＭ発現をもたらした（ｔ＝２４時間）。図６ｅは、代表的なＩＶＩＳ蛍光を示し、図６ｆは、標識ＤＮＡおよびＡＢＭ因子を用いてそれぞれＴＮＴ処理した後のマウス皮膚の共焦点顕微鏡画像を示す。ＧＦＰは、Ａｓｃｌ１プラスミドにおけるレポータ遺伝子である。図６ｇは、表皮および真皮における遺伝子発現のレーザキャプチャーマイクロダイセクション（ＬＣＭ）およびｑＲＴ−ＰＣＲの結果（ｔ＝２４時間）を示し、遺伝子発現が、表皮トランスフェクション境界を越えて伝播したことを示す。図６ｈは、表皮から真皮へのＥＶ媒介トランスフェクション伝播の概念を例解する概略図を示す。図６ｉは、ＡＢＭ  ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡの有意なローディングを示す、ＥＶカーゴのｑＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。図６ｊは、ＥＶがトランスフェクションおよびリプログラミングを伝播させるための実行可能なビヒクルであるかどうかを確認するための実験設計を示す。図６ｋは、ＴＮＴ処理皮膚から単離されたＥＶを自発的に内在化したマウス胚性線維芽細胞を示す、共焦点顕微鏡写真を示す。図６ｌは、ＴＮＴに基づくＡＢＭの形質導入と比較した、ナイーブマウスへのＥＶ注入の１４日後の遺伝子発現分析を示す。免疫染色の結果は、Ｔｕｊｌ（４週目）の増加（ｍ）を示し、図６ｎは、ＡＢＭ  ＴＮＴ処理後の皮膚におけるニューロフィラメント（８週目）の発現を示す。Ｎ＝３匹の動物（生物学的複製）。＊ｐ＜０．０５（Ｈｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ法）、＃０．０５＜ｐ＜０．０８（片側ｔ検定）。
【図７ａ−ｋ】ＴＮＴプラットフォームの製造およびナノチャネルアレイシミュレーションを示す。図７ａは、両面研磨シリコンウェハを示す。図７ｂ〜ｄは、ナノチャネルパターニングおよびＤＲＩＥを示す。図７ｅは、エッチングされたナノチャネルの走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像を示す。図７ｆは、マイクロリザーバの裏面エッチングを示す。図７ｇは、ＳＥＭ顕微鏡写真を示し、図７ｈおよび７ｉは、それぞれ異なる条件下でのエッチングプロファイルおよびエッチング速度を示すプロットを示す。図７ｊおよび７ｋは、非対称（すなわち、Ｔ字型）ナノチャネルアレイ、対、対称（すなわち、十字型）アレイについての場分布（ｊ１、ｋ１）および放熱プロファイル（ｊ、ｋ２〜３）を示すシミュレーション結果を示す。バルク電気穿孔（ＢＥＰ）は、インビボでの非ウイルス遺伝子送達のための現在の最も基準になる判断基準である。しかしながら、ＢＥＰにおける遺伝子取り込みは、非常に確率論的なプロセスであり、これは、不均一な電界によって影響されるだけでなく、下流ならびに／またはエンドサイトーシスおよび拡散などのより受動的なプロセスによってもそれぞれ影響される（Ｇｅｎｇ，Ｔ．＆Ｌｕ，Ｃ．Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ１３，３８０３−３８２１（２０１３）；Ｂｏｕｋａｎｙ，Ｐ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ６，７４７−７５４（２０１１）；Ｇａｌｌｅｇｏ−Ｐｅｒｅｚ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ（２０１５））。そのため、インビボでより能動的かつ決定論的な遺伝子送達を容易にする単純なアプローチが明らかに必要とされている。ここでは、クリーンルームに基づく技術を実施して（すなわち、投影リソグラフィ、コンタクトフォトリソグラフィ、および深堀り反応性イオンエッチング−ＤＲＩＥ−）（図７ａ〜ｉ）、より決定論的な様式で、自然にアクセス可能な組織表面（例えば、皮膚）または外科的にアクセス可能な組織表面（例えば、骨格筋）への能動的な非ウイルス遺伝子送達のためのシリコンに基づくＴＮＴデバイスを製造する。ＴＮＴプラットフォームは、遺伝子カーゴを組織に形質導入するために保持することができるマイクロスケールのリザーバに相互接続された超並列アレイのクラスタ化ナノチャネルからなった。簡潔に述べると、最初に、投影リソグラフィおよびＤＲＩＥを使用して、厚さ約２００μｍの両面研磨シリコンウェハの表面上に約４００〜５００ｎｍのチャネルのアレイを画定した。シミュレーション研究は、そのような非対称Ｔ形状アレイが、より対称的なナノ細孔分布と比較して、電界分布および熱放散に関していくつかの固有の利点を提供することを示唆し、ナノチャネルの非対称クラスタは、同時にピークおよび谷の温度を２０〜２５％低下させながら（図７ｊ２〜３、ｋ２〜３）、不活性なゾーンがより少ないことを呈する（図７ｊ１、ｋ１、星印）。次いで、これに続いて、コンタクトリソグラフィに基づくパターニングおよびナノチャネルを並置するマイクロリザーバのアレイのＤＲＩＥ媒介穿設を行った。最後に、プラットフォーム表面を窒化ケイ素の薄い絶縁層で不動態化した。
【図８ａ−ｈ】インビボナノチャネルに基づく電気穿孔対バルク電気穿孔（ＢＥＰ）のシミュレーション結果を示す。図８ａは、実験装置を例解する概略図を示す。図８ｂおよび８ｃは、２５０Ｖの刺激下でのシミュレーションされた電圧分布を示す。図８ｄ〜ｆは、単一細胞バルク電気穿孔のための膜貫通電位のシミュレーションを示す。図８ｇは、ナノチャネルから遠く離れた細胞（細胞２および細胞３）と比較した、ナノチャネルと直接接触している細胞（細胞１）の穿孔プロファイルを示す。図８ｈは、ＴＮＴ対ＢＥＰのプロファイルを示す。
【図９ａ−ｄ】ＭＣＡＯ脳卒中マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）モデルにおいて、ＴＮＴ処理した背面皮膚から単離した自家ＡＢＭ負荷ＥＶが、神経栄養様特性を呈することを示す。図９ａは、実験装置を例解する概略図を示す。ＭＣＡＯ脳卒中が最初に誘発される。次いで、これに続いて、ＡＢＭ  ＴＮＴ処理、およびＥＶの頭蓋内注入の前の背部皮膚からのＥＶ単離を行う。図９ｂおよび９ｃは、ＥＶ注入の７日後にのみ梗塞体積の有意な減少を示すＭＲＩイメージングおよび定量化を示す。図９ｄは、脳卒中誘導の２１日後の免疫蛍光イメージングを示し、脳室下（ＳＶＺ）ゾーンから梗塞領域に向かって突出しているＤＣＸ＋細胞／突起を示している（白色矢印）。対照脳内のＤＣＸ＋細胞は、主にＳＶＺゾーンの壁を裏打ちしていることが判明した。＊ｐ＜０．０５（Ｈｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ法）。
【図１０ａ−ｂ】表皮および真皮の供給源に由来する皮膚中のｉＮを示す。図１０ａからのＡＢＭ  ＴＮＴ処理皮膚切片の蛍光顕微鏡写真は、Ｋ１４−Ｃｒｅレポータを示し、図１０ｂは、Ｔｕｊ１ニューロンマーカーもまた発現するＫ１４またはＣｏｌ１Ａ１のいずれか起源（緑色／ＧＦＰ）の皮膚細胞を示すＣｏｌ１Ａ１−ＧＦＰマウスモデルを示す。（図１０ａ．１、図１０ｂ．１）ＧＦＰトレーサとＴｕｊ１の両方について免疫反応性であった細胞要素をＬＣＭ／ｑＲＴ−ＰＣＲによってさらに分析した。結果は、そのような二重陽性要素が、有意に高いニューロンマーカー遺伝子発現、および中等度〜著しく減少した皮膚細胞マーカー遺伝子発現を有したことを示す。＊ｐ＜０．０５（Ｈｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ法）。ケラチン１４陽性（Ｋ１４＋）細胞が最終的にｔｄＴｏｍａｔｏ発現からｅＧＦＰに切り替わるＲＯＳＡ遺伝子座のｃｒｅ媒介組換えを受ける、Ｋ１４−Ｃｒｅレポータマウスモデルを用いる系統追跡実験は、新たに誘導されたニューロンが、部分的にＫ１４＋皮膚細胞に由来することを確認した。活性なＣｏｌ１Ａ１プロモータを有する細胞がｅＧＦＰを発現する、Ｃｏｌ１Ａ１−ｅＧＦＰマウスモデルを用いる実験は、Ｔｕｊ１＋への移行期において真皮からの多数のコラーゲン／ｅＧＦＰ＋細胞を示した。ＬＣＭを使用して、ＧＦＰ＋とＴｕｊ１＋の両方であったトランスジェニックマウスモデル切片から細胞要素の遺伝子発現プロファイルを捕捉し、さらに特徴付け、これらは、Ｋ１４起源の細胞であるが、今やニューロンマーカーを発現している細胞、またはニューロン運命に移行する活性コラーゲンプロモータ（例えば、線維芽細胞）を有する細胞に対応する。結果は、そのような要素が、実際に前ニューロンマーカーの発現の増加および起源細胞マーカー（すなわち、Ｋ１４、Ｃｏｌ１Ａ１）の発現の減少を呈することを示した。
【図１１】例示的なマイクロ構造体の実施形態の断面図の例解である。
【図１２】例示的なマイクロ構造体の実施形態の断面図の例解である。
【図１３】例示的なマイクロ構造体の実施形態の断面図の例解である。
【図１４Ａ−１４Ｄ】様々なマイクロ構造体アレイの配設および実施形態を示す。図１４Ａは、円錐形の微小針を有する実施形態を示す。図１４Ｂは、角錐形微小針を有する実施形態を示す。図１４Ｃは、同心円状に配設された円筒を有する実施形態を示す。図１４Ｄは、リッジ（隆起；ｒｉｄｇｅ）を有する実施形態を示す。
【図１５Ａ−１５Ｂ】ＴＮＴプラットフォーム（図１５Ａ）およびＤＴＮプラットフォーム（図１５Ｂ）を使用する、組織への例示的なリプログラミング因子の送達時に観察された遺伝子発現の相対レベルを比較するプロットである。製剤がＤＴＮプラットフォームを使用して投与された場合、組織において有意に高いレベルの遺伝子発現が観察された。
【図１６】ＤＴＮプラットフォームを使用してマウス皮膚組織を内皮系列にリプログラミングすること（すなわち、ＣＤ３１＋細胞構造、赤色に染色）を示す。対照皮膚と比較して、組織切片の全厚にわたってＣＤ３１染色の顕著な増加が観察された。
【図１７Ａ−１７Ｂ】例示的なマイクロ構造体の実施形態の断面図の実例である。
【図１８】様々なマイクロ構造体の形状を示す。
【図１９】本体部分に長いスリットを有するマイクロ構造体アレイの実施形態の斜視図である。
【図２０】本体部分に短い／アレイ状のスリットを有するマイクロ構造体アレイの実施形態の斜視図である。
【図２１】図２０のマイクロ構造体アレイの実施形態の断面図である。
【図２２Ａ−２２Ｂ】本体部分に機械加工することができるか（図２２Ａ）、または別の材料で別個に製造し、次いで本体部分と接合することができる（図２２Ｂ）リザーバを示すマイクロ構造体アレイの実施形態の斜視図である。
【図２３】断面として見た一実施形態のマイクロ構造体、および電気穿孔を使用して皮膚組織に核酸を送達するためのその使用を例解する。
【図２４Ａ−２４Ｄ】一実施形態のマイクロ構造体の製造を例解する。図２４Ａは、ナノチャネルのアレイを作製するためにリソグラフィおよび深堀り反応性イオンエッチング（ＤＲＩＥ）を介してパターニングされたシリコンウェハである（図２４Ｂ）。これらのチャネルは、直径が約１００〜９００ｎｍの間の範囲のサイズであり、直径の約１倍〜２５倍の範囲であるエッジ間のピッチを有することがあり得る。図２４Ｃは、ナノチャネルへの流体アクセスを得るためにＤＲＩＥによってエッチングされている（したがって、ナノチャネルの厚さ方向アレイを形成する）ウェハの裏面を例解する。図２Ｄは、リソグラフィパターニングおよび異方性エッチングを介して３Ｄにエッチングされているナノチャネルの２Ｄアレイを例解する。ナノチャネルのそのような３Ｄアレイは、複数の組織レベル／層で同時および段階的なカーゴ送達を可能にする。図２４Ｄの３Ｄ押出は、その中に／それにわたって収容される必要があるナノチャネルの数（およびその間の間隙）に依存して、約１〜数百ミクロンの間のサイズ（底部で）の範囲であり得る。一部の場合において、３Ｄ押出当たりのナノチャネルの最小数は、２であり、これらは、異なるレベルの組織でのカーゴの送達を可能にすることができるように異なる高さであり得る。ナノチャネルおよび／または３Ｄ押出の両方は、デバイスの活性領域を最大にするように、六方最密充填（ＨＣＰ）アレイに配設することができる。一旦３Ｄ押出が画定されると、窒化ケイ素または二酸化ケイ素であり得る絶縁層で表面を被覆することができる。耐久性を改善するために適用することができる追加のコーティングとしては（適合性シード層を伴って）、とりわけ、炭化ケイ素、窒化チタン、窒化アルミニウムチタン、および窒化ジルコニウムが挙げられる。
【図２５Ａ−２５Ｄ】別の製造アプローチを例解する。図２５Ａは、（図２５Ｂ）表面マイクロマシニング（例えば、リソグラフィアプローチ、または例えばマイクロミリングを通して）を施されて、このようなナノチャネルアレイの３Ｄ押出を作製する（図２５Ｃおよび図２５Ｄ）、既に画定されたナノチャネルを有する基板を例解する。この場合、ベース基板は、ＤＲＩＥ処理シリコン、または陽極酸化アルミナ、またはタックエッチングされた高分子膜（例えば、ＰＥＴ）で作製することができる。
【図２６Ａ−２６Ｅ】大きい／湾曲した組織表面に適用するための実施形態を例解する。図２６Ａは、処理されたＤＴＮデバイスがより小さなモジュールにダイシングされ得ることを示す。このようなモジュールは、大きい／湾曲した組織表面への適用を可能にするために柔軟なポリマーフレーム内に入れることができる。図２６Ｂの画像は、ヒトの腕に装着されている３×３モジュールのアレイを示す。図２６Ｂの大規模ＤＴＮは、大型／前臨床動物モデルおよび臨床モデルに介入するために使用することができる。この場合、ブタの虚血性皮膚弁はＥＦＦでＤＴＮされ、これは新しい血管系の形成を誘導し（図２６Ｄ）、これによって、この領域への灌流を増加させることにより（右）、皮膚弁を壊死（左）から救うことができる（図２６Ｅ）。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
定義
本出願を通して使用される用語は、当業者にとって通常のかつ典型的な意味で解釈されるべきである。しかしながら、出願人は、以下の用語が下記に定義されるような特定の定義を与えられることを所望する。
【００１６】
本明細書および特許請求の範囲で使用されているように、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」という単数形は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、複数の言及を含む。例えば、「細胞」という用語は、それらの混合物を含む複数の細胞を含む。
【００１７】
「約」および「およそ」という用語は、当業者によって理解されるように「に近い」であると定義される。非限定的な一実施形態において、この用語は、１０％以内であると定義される。別の非限定的な実施形態において、この用語は、５％以内であると定義される。さらに別の非限定的な実施形態において、この用語は、１％以内であると定義される。
【００１８】
本明細書で使用されるとき、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、組成物および方法が列挙された要素を含むが、他の要素を除外しないことを意味することを意図する。「から本質的になる」は、組成物および方法を定義するために使用される場合、その組み合わせにとって本質的に重要な他の要素を排除することを意味するものとする。したがって、本明細書で定義されるような要素から本質的になる組成物は、単離および精製の方法からの微量汚染物質、ならびにリン酸緩衝化生理食塩水、保存料などの薬学的に許容される担体を除外しない。「からなる」は、他の成分の微量元素より多くのもの、および本発明の組成物を投与するための実質的な方法工程を除外することを意味するものとする。これらの移行部の用語のそれぞれによって定義される実施形態は、本発明の範囲内にある。
【００１９】
「有効量」は、有益なまたは所望の結果をもたらすために十分な量である。有効量は、１以上の投与、適用、または投与量で投与することができる。
【００２０】
「担体」または「薬学的に許容される担体」という用語は、一般に安全でかつ無毒である医薬組成物または治療用組成物を調製する際に有用である担体または賦形剤を意味し、獣医学的および／またはヒトの薬学的使用または治療的使用のために許容される担体を含む。本明細書で使用されるように、「担体」または「薬学的に許容される担体」という用語は、リン酸緩衝化生理食塩水、水、エマルジョン（油／水エマルジョンもしくは水／油エマルジョンなど）、および／または様々な種類の湿潤剤を包含し、これらを含み得る。本明細書中で使用されるように、「担体」という用語は、任意の賦形剤、希釈剤、充填剤、塩、緩衝剤、安定剤、可溶化剤、脂質、安定剤、または医薬製剤に使用するための当該分野で周知であり、以下にさらに記載されるような他の材料を包含する。
【００２１】
本明細書では、範囲は、「約」ある特定の値から、および／または「約」別の特定の値までとして表現することができる。このような範囲が表現されるとき、別の実施形態は、ある特定の値から、および／または他の特定の値までを含む。同様に、先行詞「約」の使用により値が近似値として表現される場合、その特定の値は別の実施形態を形成することが理解される。さらに、各範囲の終点は、他の終点に関係する場合と、他の終点とは無関係の場合の両方で、有意義であることが理解される。本明細書に開示される多数の値が存在すること、および各値がまた、その値自体に加えて「約」その特定の値としても本明細書に開示されることもまた理解される。例えば、「１０」という値が開示されている場合、「約１０」もまた開示されている。
【００２２】
「治療有効量」または「治療有効用量」という用語は、グルコース結合構造に結合したグルコース修飾インスリンなどの組成物の量を指し、これは、全般的な期間にわたって研究者、獣医師、医師、または他の臨床医によって探求されている、組織、システム、動物、またはヒトの生物学的応答または医学的応答を誘発する。一部の例において、所望の生物学的応答または医学的応答は、数日、数週間、または数年の期間にわたる被験体への組成物の複数回投与量の投与後に達成される。
【００２３】
「被験体」または「レシピエント」という用語は、霊長類（例えば、ヒト）、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウスなどを含むが、これらに限定されない、哺乳動物などの動物を含むことが本明細書で定義される。一部の実施形態において、被験体は、ヒトである。
【００２４】
本明細書で使用される「治療する」、「治療すること」、「治療」という用語およびその文法的変形は、障害または状態の１つ以上の付随する症状の強度を部分的にまたは完全に遅延、緩和、軽減、または低減すること、および／あるいは、障害または状態の１つ以上の原因を緩和、軽減、または妨げることを含む。本発明に従う治療は、予防的に（ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅｌｙ）、予防的に（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃａｌｌｙ）、緩和的に（ｐａｌｌａｔｉｖｅｌｙ）、または治療的に適用されてもよい。
【００２５】
詳細な説明
本明細書に開示されるマイクロ構造体アレイおよびそれを使用する方法は、生物学的障壁内へのまたは生物学的障壁にわたる物質の輸送において有用である。本明細書に開示されるマイクロ構造体アレイは、マイクロ構造体が異なるレベルの細胞に到達することができる複数のチャネルを含むため、組織内の異なる細胞層に同時に（または順次に）物質を送達する能力を有する。これは、角度の付いたマイクロ構造体上の複数のチャネルが、マイクロ構造体内の異なる高さのチャネルを可能にするためである。マイクロ構造体が組織を貫通する場合、チャネルは、細胞の異なる層内に配置され、したがって、組織内の異なるレベルで物質を送達することができる。マイクロ構造体アレイは、皮膚（もしくはその一部）に、血液脳関門を越えて、粘膜組織（例えば、口腔、鼻、眼、膣、尿道、胃腸、呼吸器）に、血管に、リンパ管に、または細胞膜に（例えば、１つもしくは複数の細胞の内部への材料の導入のために）、使用することができる。生物学的障壁は、ヒトまたは他の種類の動物、ならびに植物、昆虫、または細菌、酵母、真菌、および胚を含む他の生物におけるものであり得る。マイクロ構造体アレイは、カテーテルまたは腹腔鏡の補助を伴って、組織の内部に適用することができる。内部組織への薬物送達などの特定の用途のために、デバイスを外科的に移植することができる。
【００２６】
図１を参照すると、マイクロ構造体アレイ（１００）は、上部表面（１０２）および底部表面（１０３）を有する、平面状の基板（１０１）と、上記平面状の基板の上記上部表面と流体連通している、リザーバ（１０４）と、上記平面状の基板の上記底部表面から突出している複数のマイクロ構造体（１０５）と、を備えることができ、上記複数のマイクロ構造体の各々が、ベース（１０７）から、上記平面状の基板の上記底部表面からのある高さに位置する遠位先端（１０８）にかけて先細状になっており、それによって、マイクロ構造体表面を画定する、中実の本体部分（１０６）と、上記平面状の基板の上記上部表面から、上記マイクロ構造体表面内の第１のチャネル開口（１１０）に延在し、それによって、上記リザーバを上記第１のチャネル開口に流体接続する、第１の送達チャネル（１０９）と、上記平面状の基板の上記上部表面から、上記マイクロ構造体表面内の第２のチャネル開口（１１２）に延在し、それによって、上記リザーバを上記第２のチャネル開口に流体接続する、第２の送達チャネル（１１１）と、を備えることができる。
【００２７】
各送達チャネルは、同じ規模または異なる規模であり得る。一部の実施形態において、送達チャネルは、例えば、約１ｎｍ〜約９９９ｎｍの内径を有するナノチャネルである。一部の実施形態において、送達チャネルは、例えば、約１μｍ〜約９９９μｍの内径を有するナノチャネルである。チャネルのサイズは、送達される薬剤のサイズおよび／または所定の用途に必要とされる流動力学に基づいて選択することができる。
【００２８】
平面状の基板（１０１）は、複数の送達チャネル（例えば、１０９、１１１）を備えることができ、それらの各々は、平面状の基板の上面から、平面状の基板の底部表面（１０３）内のチャネル開口（例えば、１１０、１１２）に延在し、それによって、平面状の基板の底部表面内のチャネル開口にリザーバ（１０４）を流体接続する。
【００２９】
図１〜２において見ることができるように、マイクロ構造体アレイ（１００）は、第１のチャネル開口（１１０）が平面状の基板（１０１）に対して平行な第１の平面内に配置され、第２のチャネル開口（１１２）が平面状の基板（１０１）に対して平行な第２の平面内に配置されるように構成することができ、第１の平面は、第２の平面から遠位に離隔している。第３のチャネル（１１３）に接続された第３のチャネル開口（１１４）もまた、存在することができる。各チャネルの平面およびそれに関連する開口は、互いに規則的な間隔で、または異なる間隔で離隔させることができる。例えば、各チャネル／チャネル開口は、他のものから等しく離隔させることができる。例えば、第１のチャネル開口および第２のチャネル開口は、マイクロ構造体の高さの１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の距離で遠位に離隔し得る。一例において、第１の平面は、第２の平面から、２０％〜６０％の距離だけ遠位に離隔させることができる。この距離は、第３の、第４の、第５の、およびそれ以上のチャネル開口にも同様に適用することができる。
【００３０】
マイクロ構造体（１０５）は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、またはそれ以上のチャネルを含むことができる。これらのチャネルは、リザーバとチャネル開口との間の導管として作用することができる。したがって、チャネルは、リザーバと流体連通することができ、その結果、リザーバ内に配置された材料は、チャネルを通って移動し、チャネル開口に送達することができる。第１のチャネル開口（１１０）は、遠位先端に隣接する追加のチャネル開口と共に、遠位先端に位置することができる。例えば、同じマイクロ構造体上に３つのチャネル開口が存在することができ、１つが遠位先端にあり、さらに２つのチャネル開口（１１２および１１４）が遠位先端のいずれかの側にある。図１および図２に示すように、マイクロ構造体（１０５）内の複数のチャネルは、互いに対して平行に延びることができ、かつマイクロ構造体の垂直面に対して平行に延びることができる。
【００３１】
図１７Ａおよび図１７Ｂに見ることができるように、マイクロ構造体（１０５）の中実の本体部分（１０６）の高さは、マイクロ構造体の遠位先端（１０８）から、平面状の基板（１０１）の底部表面（１０３）に位置するマイクロ構造体のベース（１０７）までで測定することができる。マイクロ構造体表面の高さは、５ミクロン、１０ミクロン、１５ミクロン、２０ミクロン、３０ミクロン、４０ミクロン、５０ミクロン、６０ミクロン、７０ミクロン、８０ミクロン、９０ミクロン、１００ミクロン、２００ミクロン、３００ミクロン、４００ミクロン、５００ミクロン、６００ミクロン、７００ミクロン、８００ミクロン、９００ミクロン、または１０００ミクロンの長さ、またはそれより高く、それより低く、またはそれらの間の任意の量であり得る。一例において、マイクロ構造体の高さは１００ミクロン〜５００ミクロンであり得る。図１７Ａに見ることができるように、マイクロ構造体（１０５）の高さは平面状の基板（１０１）の平面に対して垂直に延びることができる平面ｂにおいて測定される。
【００３２】
マイクロ構造体のベース（１０７）は、三角形、正方形、菱形、長方形、楕円形、または円形などの任意の形状を有することができる。特定の実施形態において、ベースは円形形状を有する。ベースが円形である場合、マイクロ構造体（１０５）のベース（１０７）の幅は、それが平面状の基板（１０１）と表面接触するマイクロ構造体のベースの直径として測定することができる。図１７Ｂに見られるように、マイクロ構造体（１０５）のベース（１０７）の平面ａは平面状の基板（１０１）と平行に延びることができる。ベースの幅は、５ミクロン、１０ミクロン、２０ミクロン、３０ミクロン、４０ミクロン、５０ミクロン、６０ミクロン、７０ミクロン、８０ミクロン、９０ミクロン、１００ミクロン、２００ミクロン、３００ミクロン、４００ミクロン、または５００ミクロンの長さ、またはそれより長く、それより短く、またはそれらの間の任意の量であり得る。ベースの幅はまた、例えば、マイクロ構造体のベースの幅が、高さの１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、または２００％、またはそれより長く、それより短く、またはそれらの間の任意の量であり得るように、マイクロ構造体の高さに関連しても測定できる。
【００３３】
マイクロ構造体の遠位先端（１０８）は、任意の形状を有することができ、図１４Ａ〜図１４Ｄに見ることができるように、尖端状、丸状、傾斜状、フレア状、先細状、先丸状、またはこれらの組み合わせであり得る。一実施形態において、マイクロ構造体は尖先状である。
【００３４】
マイクロ構造体は、規則的な間隔で、またはランダムに、のいずれかで互いに離隔することができる。規則的に離隔している場合、マイクロ構造体は、中心線ｂから測定したとき、互いに、５ミクロン、１０ミクロン、２０ミクロン、３０ミクロン、４０ミクロン、５０ミクロン、６０ミクロン、７０ミクロン、８０ミクロン、９０ミクロン、１００ミクロン、２００ミクロン、３００ミクロン、４００ミクロン、５００ミクロン、または１０００ミクロンまたはそれ以上離れることができる。マイクロ構造体の中実の本体部分（１０６）は、リッジ、ヘリンボーンパターン、波形パターン、円錐、または角錐などの任意の形状を含むことができる。円錐および角錐の例は、図１４Ａ、図１４Ｂ、および図１８に見ることができる。
【００３５】
一部の場合において、マイクロ構造体は規則正しい形状またはパターンを欠いている。例えば、開示されたマイクロ構造体は、組織／生体システムを貫通することができる鋭い先端を有するランダムに分布したマイクロ構造体／粗さを導入するためにシリコン表面の調整した／ブランクのエッチングによって作製することができる。
【００３６】
送達チャネル（１０９、１１１）は、例えば、円筒、直方体（立方体）、または長方形プリズムなどの様々な形状を有することができる。送達チャネル（１１０、１１２）の開口は、円形、長方形、楕円形、または正方形であり得、上述のように、各マイクロ構造体（１０５）は複数のチャネルを有することができ、これらはすべて同じ幾何学的形状を有することができ、または同じかもしくは異なるマイクロ構造体内で互いに異なる形状を有することができる。送達チャネルは、略同心円状のチャネルを形成する略円形形状を有することができる。
【００３７】
リザーバ（１０４）は、マイクロ構造体チャネル（１０９、１１１）を通って被験体に送達される任意の物質を含むことができる。逆に、物質は、マイクロ構造体チャネルを通って引き出されてリザーバ内に沈着する可能性がある。リザーバ（１０４）は、マイクロチャネルを通ってマイクロ構造体開口（１１０、１１２）と流体連通することができ、マイクロチャネルはマイクロ構造体を通って延びることができる。それゆえに、リザーバは、経皮投与用の任意の物質を含むことができる。一実施形態において、リザーバ（１０４）は、平面状の基板の上部表面（１０２）に取り付けられ、上記上部表面（１０２）は、平面状の基板（１０１）の底部表面（１０４）と対向しており、ここで、マイクロ構造体は、上記底部表面から突出している。
【００３８】
図２２Ａおよび図２２Ｂに示すように、リザーバは、平面状の基板（１０１）と一体化することができる（図２２Ａ）か、または、例えば、別の材料で別個に製造してから平面状の基板（１０１）と接合することができる（図２２Ｂ）。リザーバは、各々が複数のマイクロ構造体チャネルを供給するようにサイズ決定されるか、または各々が単一のマイクロ構造体を供給するように配列され得る。例えば、一部の実施形態において、マイクロ構造体アレイ（１００）は、平面状の基板（１０１）に機械加工されるか、または平面状の基板（１０１）と接合されるかのいずれかである単一の大きなリザーバを備える。
【００３９】
リザーバは、送達される物質を放出するための放出機構を備えることができ、それによって、物質がマイクロ構造体の少なくとも１つのチャネルの中へおよびそれを通って輸送されることを可能にする。放出機構は、機械的な力または剪断力を利用してもよく、これは、手動、熱、化学反応、電場、磁場、圧力場、超音波エネルギー、張力、拡散注入、浸透、濃度勾配、真空、圧力、またはそれらの組み合わせによってであり得る。一実施形態において、リザーバ（１０４）は、多孔質材料を含むことができ、投与される物質は、多孔質材料の孔に貯蔵される。別の実施形態において、リザーバは密封されている。この実施形態の一変形例において、マイクロ構造体アレイは、平面状の基板の第１の表面から延びる少なくとも１つの穿孔バーブ（棘）をさらに備え、穿孔バーブを使用して密封されたリザーバを穿孔することができる。
【００４０】
リザーバは、例えば、生物学的障壁にわたって輸送される物質の体積または量を生理学的シグナルに基づいて変えることができるように、フィードバック要素を備えることができる。フィードバック要素は、シグナルが検出されたときにリザーバがレシピエントに物質を送達することができるが、シグナルが検出されないときには物質が送達されないように、「オンおよびオフ」スイッチを備えることができる。逆に、シグナルの検出は、反対の効果を有することができ、この場合は、リザーバは、シグナルが検出されない限り、レシピエントへの物質の送達をデフォルトとし、リザーバは、レシピエントへの送達のために物質を放出しない。例として、フィードバック成分は、被験体における病原体の存在を検出することができ、物質が検出されるとき、フィードバック要素は、リザーバからの抗体の放出を可能にすることができる。
【００４１】
別の例において、フィードバック要素は、ｐＨまたは温度などの生理学的シグナルの変化を検出することができる。ｐＨまたは温度が特定の量だけ変化するか、または特定の数値（例えば、６．５未満のｐＨ、もしくは、例えば、９９．１を超える温度）に達するとき、フィードバック要素が、物質の放出、または放出された物質の量の変化を可能にし、その後レシピエントに投与されるように、フィードバック要素は、「カットオフ値」を含むことができる。
【００４２】
フィードバック要素はまた、検出されたシグナルの量に基づいて放出された物質の量または体積を調整することができ、その結果、検出されるシグナル量が多いほど、放出される物質の量をより多くすることができ、または、逆に、検出されるシグナル量が多いほど、放出される物質の量をより少なくすることができる。
【００４３】
検出される生理学的シグナルは、一態様において、マイクロ構造体アレイが投与されている被験体に存在する任意の物質であり得る。例えば、生理学的シグナルは、生物学的物質または薬物であり得る。物質は、レシピエントに生まれつき存在し得るか、または非内因性もしくは外来性の物質であり得るかのいずれかである。別の態様において、被験体における生理学的応答は、ｐＨおよび温度を含む生理学的環境因子を含むことができる。生理学的シグナルの例には、グルコース、コレステロール、ビリルビン、クレアチン、代謝酵素、ヘモグロビン、ヘパリン、凝固因子、尿酸、癌胎児性抗原または他の腫瘍抗原、生殖ホルモン、酸素、ｐＨ、温度、アルコール、タバコ代謝物、および違法薬物が挙げられるがこれらに限定されない。
【００４４】
レシピエントに送達されるリザーバ中の物質は、治療用、予防用、診断用、またはセラノスティクス用物質であり得る。一度に１種より多くの物質を送達することができ、または異なる物質を順次送達することもできる。例えば、異なる物質を、異なるチャネルを通して同時に送達することができる。２種、３種、４種、５種、６種、またはそれ以上の物質を、異なるチャネルを通して同時に送達することができる。チャネル開口は細胞の異なる層に達することができるので、本明細書に開示されるマイクロ構造体アレイを利用して、組織内の異なる細胞層に異なる物質を同時に投与することができる。具体的には、第１の物質を第１のチャネルを介して第１の細胞層に送達することができ、第２の物質を第２のチャネルを介して第２の細胞層に送達することができる。
【００４５】
送達される物質は、ペプチド、タンパク質、炭水化物、核酸分子、脂質、有機分子、生物学的に活性な無機分子、およびこれらの組み合わせからなる群より選択することができる。例えば、本発明の微小針デバイスおよび方法を用いる送達のために広範囲の薬物を製剤化してもよい。本明細書で使用されるように、「薬物」または「薬物製剤」という用語は、任意の予防薬剤、治療薬剤、診断薬剤もしくはセラノスティクス薬剤、または、医薬賦形剤、および入れ墨、化粧品などのための物質を含む生物学的組織への導入に好適であり得る他の物質を指すために広く使用されている。薬物は、生物学的活性を有する物質であり得る。薬物製剤は、溶液、ゲル、固体粒子（例えば、マイクロ粒子、ナノ粒子）、またはこれらの組み合わせなどの様々な形態を含むことができる。薬物は、小分子、巨大分子（すなわち、高分子）、またはこれらの組み合わせを含み得る。非限定的ではない代表的な実施形態において、薬物は、アミノ酸、ワクチン、抗ウイルス剤、遺伝子送達ベクター、インターロイキン阻害剤、免疫調節剤、神経保護因子、抗新生物剤、化学療法剤、多糖類、抗凝固剤、抗生物質、鎮痛剤、麻酔剤、抗ヒスタミン薬、抗炎症剤、およびウイルスの中から選択することができる。薬物は、天然に存在するもの、合成されたもの、または組み換えにより生成されたものであり得る好適なタンパク質、ペプチド、およびこれらのフラグメントから選択され得る。一実施形態において、薬物製剤は、インスリンを含む。
【００４６】
薬物製剤は、当該技術分野で公知であるｐＨ調整剤、粘度調整剤、希釈剤などを含む１種以上の薬学的に許容される賦形剤をさらに含み得る。
【００４７】
本明細書に開示されるリザーバは、それ自体放出のための物質、または生物学的障壁リザーバにわたって輸送される物質を生成するための手段を含むことができる。物質を生成するための手段の一例は、細胞である。細胞は、ヒト細胞などの哺乳動物細胞であり得るか、またはレシピエントへの投与のための物質を生成することが可能な任意の他の供給源由来の細胞であり得る。例えば、細胞は、膵臓β細胞または幹細胞分化したヒト膵臓細胞であり得る。
【００４８】
物質、または物質を生成するための手段は、例えば、半透性のリザーバに配置することができる。これにより、レシピエントとの流体の交換を可能にすることができ、その結果、フィードバック要素がレシピエントと流体連通することができ、それによってレシピエントの生理学的信号の変化を検出することができる。例えば、リザーバは、細胞を含むことができ、ここで、細胞は、レシピエントからの生理学的シグナルの変化に感応性である。レシピエントにおけるこのような生理学的変化は、フィードバック要素に関して上述したように、細胞を刺激して、物質を放出することができるか、または物質の放出を停止することができる。一例において、リザーバは、アルギン酸ミクロゲルを含むことができる。
【００４９】
本明細書に開示されるマイクロ構造体アレイ１００は、カーゴをリザーバからチャネルを通って移行させるための刺激（放出機構）をさらに含むことができる。一部の場合において、この刺激は、形成電界（例えば、電気穿孔）を含み、そこでは、穿孔電界が印加されて脂質膜を破壊／変形させ、細胞内カーゴ送達を可能にする。一部の実施形態において、系にわたって穿孔電界を印加することは、細胞膜の変形および／または破壊をもたらし、これは、細胞内空間へのカーゴ移行を可能にする。電界強度は、標的組織／系に依存して調整することができる。例えば、図２３は、電気穿孔を使用して核酸を皮膚組織に送達するための開示されたマイクロ構造体アレイ１００の使用を例解する。
【００５０】
他の実施形態において、刺激は、機械的力、剪断力、熱、化学反応、磁場、圧力場、超音波エネルギー、張力、拡散注入、浸透、濃度勾配、真空、圧力、またはこれらの組み合わせを含む。一部の実施形態において、カーゴは、タンパク質、核酸、または粒子を含む。しかしながら、一部の実施形態において、電気刺激は、送達されているカーゴである。パルス電界は、例えば、再生医療において多くの用途を有する。開示されたマイクロ構造体アレイ１００は、組織の厚さにわたって異なるレベルでパルス電界を送達するために使用することができる。
【００５１】
微小針および電気穿孔装置は、米国特許第６，３３４，８５６号、同第６，３３１，２６６号、同第６，３１２，６１２号、同第６，２４１，７０１号、同第６，２３３，４８２号、同第６，１８１，９６４、同第６，０９０，７９０号、同第６，０１４，５８４号、同第５，９２８，２０７号、同第５，８６９，３２６号、同第５，８５５，８０１号、同第５，８２３，９９３号、同第５，７０２，３５９号、同第５，６９７，９０１号、同第５，５９１，１３９号、同第５，３８９，０６９号、同第５，２７３，５２５号、および同第７，１２７，２８４号に記載されており、これらはこの教示のために参照により組み込まれる。
【００５２】
マイクロ構造体アレイは、第２の電極と電気的に接触する第１の電極を備えることができ、ここで、マイクロ構造体アレイが使用されている間、第１の電極は、リザーバと接触し、第２の電極は、組織の１つ以上の細胞と接触する。遺伝子、他の核酸、タンパク質または他の大分子、小分子薬物などであり得る物質の取り込みを増強するために、開口の反対側の離隔された電極間に電界を確立することができる。電圧、周波数、および他の電界パラメータは、主に電極間の距離に基づいて選択される。
【００５３】
電極を備えるマイクロ構造体アレイは、マイクロ構造体によって穿孔された細胞および組織と接触するように、マイクロ構造体の遠位先端（１０８）に形成された第１の電極構造を備えることができる。第２の電極構造は、リザーバに配置することができる。電極構造は、導電性パッドに接続されている同心円バンドとして形成することができる。各バンドおよびバンド状セグメントは、電気穿孔電源に一緒に配線することができ、電気穿孔電源に別個に配線することができ、かつ様々な幾何学的および時限的なパターンおよび配設で通電することができる。さらに、異なるバンドおよびバンドセグメントは、第１の電極構造に関して異なる電位（電圧）で維持することができる。物質は、遠位先端（１０８）のチャネル開口（１１０、１１２）を通って送達することができ、その結果、物質は、ある領域において組織を通って外向きに浸透する。この領域は、第１の電極構造と第２の電極構造との間に発生している電界と一致することができる。電界は、細胞透過性を増強し、それによって細胞への所望の標的物質の送達を増強する。
【００５４】
電気穿孔電源は、従来の電源であり得る。このような電源の必要条件および仕様は、文献に詳しく記載されている。例えば、Ｎｅｕｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏｆｕｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８９；Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏｆｕｓｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，１９９２；Ｊａｒｏｓｚｅｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｌｅｔｒｏｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｅｌｅｃｔｒｏｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙ，ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ：Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌｌｙ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｔｏ  Ｃｅｌｌｓ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，２０００；ａｎｄ  Ｌｙｎｃｈ  ａｎｄ  Ｄａｖｅｙ，Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｓ，Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９９６を参照のこと。これらの刊行物の各々の全開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００５５】
電気穿孔が可能なマイクロ構造体アレイは、電気穿孔電流を所望の電圧および周波数で電極構造に送達するように適合される交流電源、典型的には０．１Ｖ〜３０ｋＶの範囲の電圧で電気穿孔電流を電極に送達するように選択される交流電源を含むことができる。一部の場合において、電圧は、約３００Ｖ〜５００Ｖ未満である。特定の電圧は、少なくとも部分的に、第１の電極構造と第２の電極構造との間の間隔に依存する。周波数は、典型的には１０Ｈｚ〜１０７Ｈｚ、通常は１０４Ｈｚ〜１０６Ｈｚの範囲内にある。電流は、１ミリ秒、２ミリ秒、３ミリ秒、４ミリ秒、５ミリ秒、６ミリ秒、７ミリ秒、８ミリ秒、９ミリ秒、１０ミリ秒、１１ミリ秒、１２ミリ秒、１３ミリ秒、１４ミリ秒、１５ミリ秒、１６ミリ秒、１７ミリ秒、１８ミリ秒、１９ミリ秒、２０ミリ秒もしくはそれ以上、またはこれらの間の任意の長さ毎、などのパルス間隔で印加することができる。１ミリ秒、２ミリ秒、３ミリ秒、４ミリ秒、５ミリ秒、６ミリ秒、７ミリ秒、８ミリ秒、９ミリ秒、１０ミリ秒、１１ミリ秒、１２ミリ秒、１３ミリ秒、１４ミリ秒、１５ミリ秒、１６ミリ秒、１７ミリ秒、１８ミリ秒、１９ミリ秒、２０ミリ秒またはそれ以上のパルスは、所定の間隔で印加することができ、所望の結果が達成されるまで間隔を繰り返すことができる。
【００５６】
組織の複数の細胞レベルに１つ以上の物質を送達するための方法もまた、本明細書中で開示され、この方法は、マイクロ構造体アレイ（１００）を準備することであって、このマイクロ構造体アレイ（１００）が、上部表面（１０２）および底部表面（１０３）を有する、平面状の基板（１０１）と、上記平面状の基板の上記上部表面と流体連通しており、送達される物質を含んでいるリザーバ（１０４）と、上記平面状の基板の上記底部表面から突出している複数のマイクロ構造体（１０５）と、を備え、上記複数のマイクロ構造体の各々が、ベース（１０７）から、上記平面状の基板の上記底部表面からのある高さに位置する遠位先端（１０８）にかけて先細状になっており、それによって、マイクロ構造体表面を画定する、中実の本体部分（１０６）と、上記平面状の基板の上記上部表面から、上記マイクロ構造体表面内の第１のチャネル開口（１１０）に延在し、それによって、上記リザーバを上記第１のチャネル開口に流体接続する、第１の送達チャネル（１０９）と、上記平面状の基板の上記上部表面から、上記マイクロ構造体表面内の第２のチャネル開口（１１２）に延在し、それによって、上記リザーバを上記第２のチャネル開口に流体接続する、第２の送達チャネル（１１１）と、を備える、マイクロ構造体アレイ（１００）を準備することと、送達チャネルを通してリザーバ内の１つ以上の物質を組織の複数の細胞レベルに送達することと、を含む。
【００５７】
細胞の１つの層から細胞の別の層まで細胞外小胞を送達するための方法もまた、本明細書に開示され、この方法は、マイクロ構造体アレイを準備することであって、このマイクロ構造体アレイが、上部表面および底部表面を有する、平面状の基板と、上記平面状の基板の上記上部表面と流体連通しており、送達される物質を含んでいるリザーバと、上記平面状の基板の上記底部表面から突出している複数のマイクロ構造体と、を備え、上記複数のマイクロ構造体の各々が、ベースから、上記平面状の基板の上記底部表面からのある高さに位置する遠位先端にかけて先細状になっており、それによって、マイクロ構造体表面を画定する、中実の本体部分と、上記平面状の基板の上記上部表面から、上記マイクロ構造体表面内の第１のチャネル開口に延在し、それによって、上記リザーバを上記第１のチャネル開口に流体接続する、第１のチャネルと、上記平面状の基板の上記上部表面から、上記マイクロ構造体表面内の第２のチャネル開口に延在し、それによって、上記リザーバを上記第２のチャネル開口に流体接続する、第２の送達チャネルと、を備える、マイクロ構造体アレイを準備することと、第１のチャネルを通して細胞の第１の層から細胞外小胞を単離することと、第２のチャネルを介して細胞外小胞を細胞の第２の層に送達すること、とを含む。一例において、細胞の第１の層は、細胞の第２の層よりも外側表面に近くてもよい。
【００５８】
平面状の基板およびリザーバを含む、本明細書に開示されるマイクロ構造体アレイの中実の本体部分は、シリコンを含む様々な材料から形成することができる。マイクロ構造体アレイ（１００）を作製するための方法もまた、本明細書に開示される。これは、略平面状の基板（１０１）を形成する工程と、上記平面状の基板が位置する平面からある角度で突出する複数のマイクロ構造体（１０５）を形成する工程であって、上記マイクロ構造体は、基板に一体的に接続されたベース（１０７）と、上記ベースに接続された遠位先端（１０８）と、それらの間の本体部分（１０６）とを有し、少なくとも１つのマイクロ構造体が、実質的にベース部分から本体部分の少なくとも一部を通って延びる少なくとも１つのチャネル（１０９）を有し、上記チャネルは本体部分の少なくとも一部に沿って開口し、リザーバ（１０４）と流体連通している、複数のマイクロ構造体（１０５）を形成する工程と、を含むことができる。様々な実施形態において、マイクロ構造体を形成する工程は、エンボス加工、射出成形、キャスティング、光化学エッチング、電気化学機械加工、放電加工、精密スタンピング、高速コンピュータ数値制御ミリング、スイスねじ機械加工、ソフトリソグラフィ、指向性化学アシストイオンエッチング、またはこれらの組み合わせを含む。
【００５９】
投与を必要とする被験体に物質を投与するための方法もまた本明細書に開示され、この方法は、被験体の皮膚に上述のアレイ（１００）のマイクロ構造体（１０５）を挿入する工程と、マイクロ構造体の少なくとも１つのチャネルを通して、および皮膚の角質層を通して、リザーバ（１０４）から物質を輸送させる工程、とを含む。
【００６０】
本発明の多数の実施形態を説明してきた。それにもかかわらず、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、様々な改変を加えることができることが理解される。したがって、他の実施形態は、添付の特許請求の範囲の範囲内にある。
【実施例】
【００６１】
実施例１：リプログラミング因子の直接細胞質ゾル送達のための組織ナノトランスフェクションデバイスの使用
ナノチャネル化デバイスを通してリプログラミング因子を局所的かつ制御可能に組織に送達するためのデバイスが本明細書に開示される（図６）。このような組織ナノトランスフェクション（ＴＮＴ）アプローチは、例えば、配列されたナノチャネルを通して非常に強くかつ集中した電場を印加することによってリプログラミング因子の直接細胞質ゾル送達を可能にし（Ｇａｌｌｅｇｏ−Ｐｅｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０１５；Ｂｏｕｋａｎｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ２０１１，６（１１）：７４７−７５４）、これは、並置組織細胞膜を良性にナノポーラス化し、かつリプログラミング因子を細胞内に電気泳動的に駆動する（図６ａ〜ｄ）。ＴＮＴシステムの製造プロセスの概略図およびシミュレーション結果は、図１および図２に見出すことができる。遺伝子送達が本質的に非常に確率論的であり、有害な副作用（例えば、炎症反応、細胞死）を引き起こす可能性がある、現在のインビボトランスフェクション技術（例えば、ウイルス、従来の組織バルク電気穿孔またはＢＥＰ）とは対照的に（Ｓｅｎ  ＣＫ  ｅｔ  ａｌ．Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  ２０１５，１８５（１０）：２６２９−２６４０）、ナノチャネルに基づく送達は、単一細胞レベルで、より十分な、良性の、瞬間的な、および用量制御されたリプログラミング因子送達を可能にし、したがって、これをインビボ遺伝子トランスフェクションおよびリプログラミングのためのより安全かつより決定的なアプローチにする。
【００６２】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに対するＦＡＭ標識ＤＮＡを用いた実験は、ＴＮＴが迅速（＜１秒）かつ非侵襲的／局所的な様式でカーゴを皮膚に送達できることを立証した（図６ｅ）。次に、リプログラミング因子のＴＮＴに基づく局所送達は、Ａｓｃｌ１／Ｂｒｎ２／Ｍｙｔ１ｌ（ＡＢＭ）の過剰発現がインビトロで線維芽細胞を誘導ニューロン（ｉＮ）に直接リプログラミングすることが知られているロバストモデルを使用する皮膚リプログラミングの成功をもたらすことができる（Ｖｉｅｒｂｕｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ２０１０，４６３（７２８４）：１０３５−１０４１）。これらの知見は、ＴＮＴがリプログラミング因子の局所送達のために使用できるだけでなく（図６ｆ）、協調的反応を調整することもできることを示し、これは、おそらく標的遺伝子ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡに富む細胞外小胞（ＥＶ）のディスパッチを介して（図６ｈ、ｉ）、初期のトランスフェクション境界（すなわち、表皮）を越えた刺激伝播（すなわち、表皮から真皮へ）をリプログラミングすることをもたらす（図６ｇ〜ｉ）（Ｖａｌａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ２００７，９（６）：６５４−６５９）。ＴＮＴ処理された皮膚から単離されたＡＢＭを担持したＥＶにナイーブ細胞を曝露することで（図６ｊ〜ｌ）、これらのＥＶが遠隔細胞によって自発的に内在化できることが確立された（図６ｋ）。さらに、遺伝子発現分析は、皮内ＡＢＭ  ＥＶ注入が、対照皮膚と比較したＴｕｊ１発現の約２５倍の増加によって証明されるように、ニューロン誘導と一致する皮膚の変化を誘発したことを示した（図６ｌ）。比較すると、ＡＢＭ−ＴＮＴはＴｕｊ１発現の約９４倍の増加をもたらし、これは、ＥＶ媒介増殖と組み合わせた、直接的なリプログラミング因子の注入の正味の効果を反映する。皮膚由来のＡＢＭ負荷ＥＶの神経栄養効果は、中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）脳卒中マウスモデルにおいてさらに確認された（図９）（Ｋｈａｎｎａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｅｒｅｂ  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ２０１３，３３（８）：１１９７−１２０６）。
【００６３】
首尾よい皮膚細胞のリプログラミングは免疫蛍光法によって検証され、これは、時間経過とともにＴｕｊ１およびニューロフィラメントの発現の増加を示した（図６ｍ、ｎ）。Ｋ１４−Ｃｒｅレポータマウスモデルを用いた系統追跡実験により、新たに誘導されたニューロンは部分的にＫ１４＋皮膚細胞に由来することが確認された（図１０）。毛包もまた一貫して顕著なＴｕｊｌ免疫反応性を示し、これは、濾胞細胞がリプログラミングプロセスにおいて潜在的に役割を果たす可能性があることを示唆する（Ｈｕｎｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２００８，２６（１）：１６３−１７２；Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ２０１２，１３２（６）：１７２５−１７２７）。活性ＣｏｌｌＡｌプロモータを有する細胞（例えば、真皮線維芽細胞）がｅＧＦＰを発現するＣｏｌｌＡｌ−ｅＧＦＰマウスモデル（図１０）を用いたさらなる実験は、Ｔｕｊｌ＋への移行期において真皮中に多数のコラーゲン／ｅＧＦＰ＋細胞を示し、したがって、皮膚内のリプログラミングされた細胞の一部について線維芽細胞起源もまた示唆されている。
【００６４】
したがって、ＴＮＴを使用すると、リ再プログラミング因子を、迅速に、非常に効果的に、かつ非侵襲的に皮膚に送達することができることが本発明において実証された。このようなＴＮＴ送達は、それぞれ確立されたおよび新しく開発されたｉＮおよびｉＥＣのリプログラミングモデルで実証されるように、状況に応じた皮膚組織リプログラミングをもたらす。ＴＮＴ誘発性皮膚由来ｉＥＣは、血管ネットワークを迅速に形成し、これは親循環系と首尾よく吻合し、かつ損傷誘発性虚血の２つのマウスモデルにおいて組織肢灌流を回復した。ほんの数秒間で終わる局所的な一回限りの治療を通して強力に有利な生物学的応答を誘発および伝播する、実施することが簡単なこのＴＮＴアプローチは、多種多様な用途のための新規の介入細胞に基づく治療の開発に用途を見出すことができる。
【００６５】
方法
ＴＮＴプラットフォーム製造
ＴＮＴデバイスは、薄い（約２００μｍ）両面研磨（１００）シリコンウェハから製造した（図７）。簡潔に述べると、最初に、厚さ約ｌ．５μｍのＡＺ５２１４Ｅフォトレジスト層を、約３０００ｒｐｍでシリコンウェハ上にスピンコートした。続いて、ＧＣＡ  ６１００Ｃステッパーを使用して、フォトレジスト上にナノスケールの開口をパターニングした。１００ｍｍウェハ当たり最大１６ダイのナノスケール開口アレイをパターニングした。次に、このような開口をエッチングマスクとして使用して、深掘り反応性イオンエッチング（ＤＲＩＥ）（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｐｌａｓｍａ  Ｌａｂ１００システム）を使用してシリコン表面上に約１０μｍの深さのナノチャネルを穿設した。最適化されたエッチング条件は、ＳＦ６ガス：１３秒／１００ｓｃｃｍガス流／７０００Ｗ  ＩＣＰ出力／４０Ｗ  ＲＦ出力／３０ｍＴ  ＡＰＣ圧力、Ｃ４Ｆ８ガス条件：７秒／１００ｓｃｃｍガス流／７００Ｗ  ＩＣＰ出力／１０Ｗ  ＲＦ出力／３０ｍＴ  ＡＰＣ圧力を含んだ。次いで、マイクロスケールのリザーバを、接触フォトリソグラフィおよびＤＲＩＥを介してウェハの裏側にパターニングした。最後に、厚さ約５０ｎｍの窒化ケイ素の絶縁層／保護層をＴＮＴプラットフォーム表面に堆積させた。
【００６６】
畜産
Ｃ５７ＢＬ／６マウスはＨａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手した。Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手したＢ６．１２９（Ｃｇ）−Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ４（ＡＣＴＢ−ｔｄＴｏｍａｔｏ，−ＥＧＦＰ）Ｌｕｏ／ＪマウスをＫ１４ｃｒｅと交配させて、Ｋ１４ｃｒｅ／Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ４（ＡＣＴＢ−ｔｄＴｏｍａｔｏ−ＥＧＦＰ）Ｌｕｏ／Ｊマウスを作製した。研究の時点ではすべてのマウスはオスであり、８〜１２週齢であった。ＲＯＳＡｍＴ／ｍＧマウスの遺伝子型決定ＰＣＲは、プライマーｏＩＭＲ７３１８−ＣＴＣ  ＴＧＣ  ＴＧＣ  ＣＴＣ  ＣＴＧ  ＧＣＴ  ＴＣＴ（配列番号１）、ｏＩＭＲ７３１９−ＣＧＡ  ＧＧＣ  ＧＧＡ  ＴＣＡ  ＣＡＡ  ＧＣＡ  ＡＴＡ（配列番号２）およびｏＩＭＲ７３２０−ＴＣＡ  ＡＴＧ  ＧＧＣ  ＧＧＧ  ＧＧＴ  ＣＧＴ  Ｔ（配列番号３）を使用して実施し、一方、Ｋ−１４Ｃｒｅ導入遺伝子は、プライマーｏＩＭＲ１０８４−ＧＣＧ  ＧＴＣ  ＴＧＧ  ＣＡＧ  ＴＡＡ  ＡＡＡ  ＣＴＡ  ＴＣ（配列番号４）、ｏＩＭＲ１０８５−ＧＴＧ  ＡＡＡ  ＣＡＧ  ＣＡＴ  ＴＧＣ  ＴＧＴ  ＣＡＣ  ＴＴ（配列番号５）を使用して確認した。動物にタグを付け、コンピュータに基づくアルゴリズムを使用してランダムにグループ分けした。
【００６７】
哺乳動物細胞培養およびリインビボリプログラミング
一次ヒト成人皮膚線維芽細胞（ＡＴＣＣ  ＰＣＳ−２０１−０１２）を購入し、これはマイコプラズマを含まず、これをＡＴＣＣから直接認証した。さらなる細胞株認証は行わなかった。これらの細胞を、線維芽細胞増殖キット−無血清（ＡＴＣＣ  ＰＣＳ  ２０１−０４０）およびペニシリン／ストレプトマイシンを補充した線維芽細胞基礎培地中で増殖させた。Ｅ１２．５−Ｅ１４マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）を、１０％ウシ胎児血清を補充したＤＭＥＭ／Ｆｌ２中で培養した。非ウイルス細胞トランスフェクションおよびリプログラミング実験を、３Ｄナノチャネル電気穿孔（ＮＥＰ）を介して行った。簡潔に述べると、最初に、３Ｄ  ＮＥＰデバイス上で完全に密集するまで、細胞を一晩増殖させた。続いて、パルス電場を用いて、Ｆｌｉ１：Ｅｔｖ２：Ｆｏｘｃ２の１：１：１混合物からなる細胞に、プラスミドのカクテル（０．０５μｇ／μｌ）を送達した。次いで、細胞をプラスミド送達の２４時間後に収集し、ＥＧＭ−２ＭＶ  ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔキット（ＣＣ−４１４７，Ｌｏｎｚａ）を補充したＥＢＭ−２基礎培地（ＣＣ−３１５６，Ｌｏｎｚａ）に配置し、さらなる実験／測定のためにさらに処理した。
【００６８】
インビボリプログラミング
最初に治療する部位は、ＴＮＴの２４−４８時間前に除毛処理（ｎａｉｒｅｄ）した。次いで、皮膚を剥離して、死んだ／ケラチン細胞層を除去し、表皮中の有核細胞を露出させた。剥離した皮膚表面上に、ＴＮＴデバイスを直接配置した。ＡＢＭまたはＥＦＦプラスミドカクテルを、０．０５−０．１μｇ／μｌの濃度でリザーバにロードした。金被覆電極（すなわち、陰極）をプラスミド溶液に浸漬し、一方、２４Ｇ針対向電極（すなわち陽極）を皮内に挿入し、ＴＮＴプラットフォーム表面に並置した。次いで、パルス状電気刺激（すなわち、振幅２５０Ｖの１０パルスおよび１パルス当たり１０ｍｓの持続時間）を電極間に印加して、露出した細胞膜をナノ穿孔し、ナノチャネルを通して細胞内にプラスミドカーゴを駆動した。ＡＢＭプラスミドを２：１：１のモル比で混合した。
【００６９】
ＭＣＡＯ脳卒中手術および分析
一過性局所脳虚血はマウスにおいて中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）によって誘発され、これまでに記載された管腔内フィラメント挿入技術を使用することによって達成された（Ｋｈａｎｎａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｅｒｅｂ  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ２０１３，３３（８）：１１９７−１２０６）。浮腫を補正した後、ＭＲＩ画像を使用して、対側半球のパーセンテージとして梗塞サイズを決定した。
【００７０】
後肢虚血手術
片側後肢虚血は、閉塞およびそれに続く大腿動脈の切除を介して誘発し、その後切除を行った（Ｌｉｍｂｏｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ２００９，４（１２）：１７３７−１７４６）。簡潔に述べると、８〜１０週齢のマウスを１〜３％イソフルランで麻酔し、加熱したパッド上の実体顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  ＯＰＭＩ）下に仰向けに置いた。大腿動脈を露出させ、約１ｃｍの切開を通して大腿静脈から分離した。近位端および遠位端の閉塞を７−０絹縫合糸で誘導し、次いで、動脈の完全な処置を続けた。最後に、単回用量のブプレノルフィンを皮下投与して痛みを抑制した。レーザースペックルイメージング（ＭｏｏｒＬＤＩ−Ｍａｒｋ２）を手術の２時間後に行い、血流閉塞の成功を確認した。
【００７１】
細胞外小胞（ＥＶ）の単離
ＥＶは、ＯＣＴブロックに集められ、後で使用するために凍結保存された直径１２ｍｍの皮膚生検から単離された。簡潔に述べると、ブロックを解凍し、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄してＯＣＴを除去した。メスで脂肪組織を除去した後、皮膚組織を約１ｍｍの小片に刻み、ＰＢＳ中でマイクログラインダーを用いてホモジナイズした。３０００ｇでの遠心分離後、Ｅｘｏｑｕｉｃｋキット（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を１：５の比（Ｅｘｏｑｕｉｃｋ：上清）で使用して、上清からＥＶを４℃で１２時間単離した。ＥＶを１５００ｇで３０分間の遠心分離を介して沈殿させた。次いで、製造業者によって提供された推奨に従って、ｍｉｒｖａｎａキット（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、全ＲＮＡをペレットから抽出した。
【００７２】
ＤＮＡプラスミドの調製
ＡＢＭプラスミドおよびＥＦＦプラスミドは、プラスミドＤＮＡ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｍａｘｉ−ｐｒｅｐ、カタログ番号１２１６１、およびＣｌｏｎｔｅｃｈ  Ｎｕｃｌｅｏｂｏｎｄカタログ番号７４０４１０）を使用して調製した。ＤＮＡ濃度は、Ｎａｎｏｄｒｏｐ２０００ｃ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）から得た。プラスミドＤＮＡ構築物およびそれらの元の供給源のリストは表１に見出すことができる。
【００７３】
2020513900.tif 000003
【００７４】
ＬＣＭは、ＰＡＬＭ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｂｅｒｎｒｅｉｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）製のレーザー顕微解剖システムを使用して実施した。形態学および／または免疫染色に基づいて同定された組織切片の特定の領域を切断し、２０倍の接眼レンズの下で捕捉した。試料を２５μｌの細胞直接溶解抽出緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に放出した。約１，０００，０００μｍ＜２３９９＞２＜／２３９９＞の組織領域を各キャップに捕捉し、次いで、溶解物をさらなる処理のために−８０℃で保存した。ＬＣＭ試料のｑＲＴ−ＰＣＲは製造業者の指示に従って細胞直接溶解緩衝液から実施した。プライマーのリストは表２に見出すことができる。
【００７５】
2020513900.tif 000004
【００７６】
免疫組織化学および共焦点顕微鏡
組織免疫染色は、特異的抗体および標準的手順を用いて実行した。簡潔に述べると、ＯＣＴ包埋組織を１０μｍ厚で凍結切片化し、冷アセトンで固定し、１０％正常ヤギ血清でブロッキングし、特異的抗体とともにインキュベートした。蛍光標識でタグ化した適切な二次抗体（Ａｌｅｘａ４８８タグ化ａ−モルモット、１：２００、Ａｌｅｘａ４８８タグ化ａ−ウサギ、１：２００、Ａｌｅｘａ５６８タグ化ａ−ウサギ、１：２００）とのその後のインキュベーションによってシグナルを可視化し、ＤＡＰＩで対比染色した。画像は、レーザー走査型共焦点顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＦＶ１０００ｆｉｌｔｅｒ／ｓｐｅｃｔｒａｌ）によって捕捉された。
【００７７】
ＩＶＩＳイメージング
動物は、ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ  ＩＩ光学イメージングシステムを使用してＦＡＭ−ＤＮＡトランスフェクションの２４時間後に麻酔状態でイメージングされた。発光画像を伴うオーバーレイ画像を、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅソフトウェアを使用して作成した。
【００７８】
脳卒中脳の磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）
磁気共鳴血管造影法を用いて、マウスにおける本発明者らのＭＣＡＯモデルを検証し、効果的なＭＣＡＯのために閉塞サイズおよび内頸動脈挿入距離を最適化した。Ｔ２強調ＭＲＩは、９．４Ｔ  ＭＲＩ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｒｕｋｅｒ  ＢｉｏＳｐｉｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用してＭＣＡ再灌流の４８時間後に麻酔したマウスに対して実施した。ＭＲ画像は、以下のパラメータを使用して、緩和増強を伴う迅速取得（ＲＡＲＥ）シーケンスを用いて取得した：視野（ＦＯＶ）３０×３０ｍｍ、取得マトリックス２５６×２５６、ＴＲ３，５００ｍｓ、ＴＥ４６．９２ｍｓ、スライスギャップ１．０ｍｍ、レアファクタ８、平均数３。ｍｍあたり８．５ピクセルの解像度。生のＭＲ画像を標準のＤＩＣＯＭフォーマットに変換し処理した。Ｏｓｉｒｉｘ  ｖ３．４を使用した画像の適切なソフトウェアコントラスト強調の後、各冠状脳スライスにおける梗塞領域を描写するために、デジタル面積測定が覆面観察者（ｍａｓｋｅｄ  ｏｂｓｅｒｖｅｒ）によって行われた。梗塞体積を決定するために前述したように、脳スライスからの梗塞領域を合計し、スライス厚さを乗じ、浮腫誘発腫脹について補正して、梗塞体積を決定した（Ｋｈａｎｎａ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｅｒｅｂ  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ２０１３，３３（８）：１１９７−１２０６）。
【００７９】
筋肉エネルギーの分析
筋肉エネルギーは、ＲＦ送信用の体積コイルおよび受信用の３ｌＰコイルを使用して９．４Ｔｅｓｌａスキャナー（Ｂｒｕｋｅｒ  ＢｉｏＳｐｅｃ）でＮＭＲ分光測定を評価した（Ｆｉｅｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ＭＡＧＭＡ２０１５，２８（５）：４９３−５０１．）。カスタムメイドの１Ｈ／３１Ｐトランシーバコイルアレイでインビボイメージングを実施した。シングルパルスシーケンスを使用してデータを取得した。生データをノイズ低減のためにウィンドウ処理し、スペクトルドメインにフーリエ変換した。
【００８０】
血管の超音波ベースのイメージングおよび特徴付け
血管形成を超音波イメージングを介して並行してモニターした。簡潔に述べると、Ｖｅｖｏ２１００システム（Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｏｎｉｃｓ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）を使用して、ＭＳ２５０リニアアレイプローブを用いてＢモードで超音波画像を得た（Ｇｎｙａｗａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｖｉｓ  Ｅｘｐ２０１０（４１）。収縮期下および拡張期下での血流特性をモニタリングおよび定量化するために、ドップラーカラーフローイメージングを実施した。
【００８１】
統計分析
サンプルをコード化し、データ分析を盲検様式で実施した。動物実験については、データは３匹の動物の平均±ＳＤとして報告されている（すなわち、生物学的複製）。どの動物も、分析から除外しなかった。同様に、インビトロリプログラミングデータは、少なくとも３回の実験の平均±ＳＤとして報告されている。再現性を確認するために実験を少なくとも２回繰り返した。グループ間の比較は、分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって行った。統計的差異は、ＳｉｇｍａＰｌｏｔバージョン１３．０を用いて、必要に応じてパラメトリック／ノンパラメトリック検定によって決定した。
【００８２】
ＴＮＴに基づくアプローチを使用して開示された結果は、本明細書に開示されたマイクロ構造体アレイを含む、ナノチャネルに基づく送達を使用して達成することができるものを示している。
【００８３】
実施例２：
特定の実施形態において、フォトリソグラフィおよび湿式エッチングまたは乾式エッチングなどのクリーンルーム法を使用して、アレイ相互貫入ナノチャネルを、シリコン系材料から製造することができる。最初に、フォトリソグラフィおよび湿式または乾式エッチングを使用して、円錐形または角錐形の相互貫入マイクロ構造体（高さ約２０〜５００ミクロン）のアレイをシリコン表面上に画定する。続いて、投影リソグラフィを使用して、シリコン基板の裏面にナノウェルのアレイ（直径約３００ｎｍ〜１０００ｎｍ）をパターニングする。次に、シリコン基板および相互貫入マイクロ構造体を通してナノチャネルを穿設するための高異方性の深掘り反応性イオンエッチング（ＤＲＩＥ）を行う。
【００８４】
以下は、シリコン上でのナノチャネル微小針アレイの製造のための例示的な方法である。
【００８５】
（１）３Ｄナノチャネルアレイの製造
１．４インチシリコンウェハ：５００μｍ、ＤＳＰ、最高級品を選択する。
【００８６】
２．湿式エッチング（ＫＯＨ、４５％、８０℃）によりウェハを２５０μｍ厚まで薄くする。
【００８７】
３．ステッパー（ＮＴＷ）を使用して、ＡＺ−５２１４ナノサークルアレイ（直径４００ｎｍ、間隔：２５μｍ）をパターニングする。
【００８８】
４．ＡＺ−５２１４パターンによってマスクされたシリコンウェハをＤＲＩＥエッチングする。
システム：Ｄｒｅｅｓｅ  ＬａｂにおけるＯｘｆｏｒｄ  Ｐｌａｓｍａ  Ｌａｂ１００
レシピ名Ｌｉｎｇｑｉａｎ＿Ｂｏｓｃｈ
ＳＦ６プロトコル：１００ｓｃｃｍ／１３ｓ／ＩＣＰ７００Ｗ／ＲＦ３０Ｗ／チャンバ圧力３０ｍＴ（ダブルチェック）
Ｃ４Ｆ８プロトコル：１００ｓｃｃｍ／７ｓ／ＩＣＰ７００Ｗ／ＲＦ１０Ｗ／チャンバ圧力３０ｍＴ（ダブルチェック）
エッチング手順：４０サイクル実行、５分間停止、さらに５サイクル実行、５分間停止およびフォトレジストがまだ残っているか否かを確認する。もし「はい」である場合、さらに５サイクルを実行する。再度確認する。通常、ＰＲは５５〜６０サイクルで全体的に消失する。（４０＋５＋５＋５＋５の代わりに、６０サイクルを直接実行しないよう留意のこと。さもなくば、ＰＲは６０サイクル後に燃えてしまう）
【００８９】
５．ＴＭＰを使用してシリコンウェハ／ＡＺ５２１４を完全に洗浄し、Ｐｉｒａｎｈａ溶液中で５分間ウェハを洗浄する（１２０℃）。Ｂａｙ１（ＮＴＷ）においてＯｌｙｍｐｕｓ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅを使用して、ナノチャンネルアレイが見えるか否かを確認する。
【００９０】
６．シリコンウェハの反対側でのパターンマイクロチャネルアレイ（直径５０μｍ；中心間距離：７０μｍ）のための標準的なフォトリソグラフィ手順。フォトレジスト：ＳＰＲ２２０−７；厚さ：１０μｍ。パターニング手順において：マイクロチャネルのアレイが、ナノチャネルアレイとほぼ同じ方向を向いていることを確認のこと。
【００９１】
７．厚さ２５０μｍの別のシリコンウェハを調製する。
【００９２】
８．ナノチャネルの側面にポンプオイル（Ｂａｙ４、ＮＴＷにおいてＥＴＣ０４のために使用）を十分に塗布する。要点：液滴ではなく、シリコンウェハの表面全体にオイルを塗布する。さもなくば、油がない領域はＤＲＩＥ手順においてＳＰＲ２２０ＰＲを損ねる。
【００９３】
９．油と接している、厚さ２５０μｍのシリコンウェハをナノチャネル面に慎重にかつ完全に接着する。このやり方は、ＤＲＩＥ手順においてシリコンウェハをヘリウム力に対して十分に剛性に保ちながら、長時間のＤＲＩＥシステムにおいて熱を低減するためのものである。
【００９４】
１０．ＳＰＲ２２０−７でマスクされたシリコンウェハをＤＲＩＥエッチングする。
システム：Ｄｒｅｅｓｅ  ＬａｂにおけるＯｘｆｏｒｄ  Ｐｌａｓｍａ  Ｌａｂ１００
レシピ名：Ｌｉｎｇｑｉａｎ＿Ｂｏｓｃｈ
ＳＦ６プロトコル：１００ｓｃｃｍ／１３ｓ／ＩＣＰ７００Ｗ／ＲＦ３０Ｗ／チャンバ圧力３０ｍＴ（ダブルチェック）
Ｃ４Ｆ８プロトコル：１００ｓｃｃｍ／７ｓ／ＩＣＰ７００Ｗ／ＲＦ１０Ｗ／チャンバ圧力３０ｍＴ（ダブルチェック）
エッチング手順：２５０サイクル実行、５分間停止、さらに２０サイクル実行、５分間停止およびフォトレジストがまだ残っているか否かを確認する。もし「はい」である場合、さらに１０サイクルを実行する。再度確認する。経験上、マイクロチャネルは、約２８０サイクル後にナノチャネルを接続する。しかしながら、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｐｌａｓｍａシステムは、常にドリフトしているため、正確なサイクルを固定することは不可能である。したがって、２７０サイクル後、ＳＥＭを使用して、すべてのマイクロチャネルがナノチャネルに接続したか否かを評価するために、いずれかの停止時間内にマイクロチャネルの断面を確認するべきである（この部分は、大部分、時間がかかり、利用可能性に依存して約３〜５日を要する）
【００９５】
１１．サンプルをゆっくりとかつ慎重に取り出す。
【００９６】
１２．Ｐｉｒａｎｈａ溶液中でウェハを５分間（１２０℃）洗浄する。Ｂａｙ１（ＮＴＷ）におけるＯｌｙｍｐｕｓ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅを使用して、ナノチャネルアレイおよびマイクロチャネルアレイを確認する。
【００９７】
１３．ナノチャネルの設計に依存して、シリコンウェハを小片に切断した。
【００９８】
（２）ＤＲＩＥを使用する微小針の製造
１．１ｃｍ×１ｃｍの寸法を有する１つのシリコンサンプルをピックアップし、ｐｉｒａｎｈａ溶液でサンプルを徹底的に洗浄する。
【００９９】
２．ナノチャネル側：ＳＰＲ２２０−７フォトレジスト、厚さ１０μｍでマイクロサークルアレイをパターニングする。マイクロサイクルパターン：直径１５μｍ、これは火山形状針の寸法を最終的に決定した。間隔：中心−中心２５μｍ。理想的な条件：フォトリソグラフィにおいてマイクロサークルをナノチャネルアレイに一直線に合わせると、中空針の割合が増加する可能性がある。
【０１００】
３．少量のサンプルを新鮮な４インチウェハにオイルで固定する（オイルで全面コーティング）。
【０１０１】
４．ＤＲＩＥ手順：Ｏｘｆｏｒｄ  Ｐｌａｓｍａ  Ｌａｂ１００
レシピ：Ｌｉｎｇｑｉａｎ＿Ｉｓｏｔｒｏｐｉｃ  Ｅｔｃｈ（ダブルチェック）
プロトコル：ＳＦ６：４０ｓｃｃｍ／ＩＣＰ出力：６００Ｗ／ＲＦ出力５Ｗ〜１０Ｗ（これは火山型の形状を決定する）。エッチング時間：２分間停止、および残っているＰＲが存在するか否かを確認、もし「はい」である場合、さらに１分間およびＰＲが残っているか否かを確認、もし「はい」である場合、さらに１分間。もし消失した場合、顕微鏡またはＳＥＭを確認する。針が示されていない場合、マスクなしで１分間エッチングを続ける。
【０１０２】
５．上記の最適化されたプロトコル下で、微小針は約２＋１＋１分間で製造される。
【０１０３】
実施例３：
１つの特定の実施形態において、アレイ相互貫入ナノチャネルは、シリコンに基づくことができるか、または選択的表面エッチングを介して陽極酸化アルミナから作製することができるかのいずれかである、予め作製されたナノチャネル化基板プラットフォームから製造することができる。選択的表面エッチングを使用して相互貫入マイクロ構造体を画定する。
【０１０４】
実施例４：
好ましい実施形態において、カーゴを複数のレベルで生物学的組織に送達する方法は、相互貫入ナノチャネルアレイを使用して実施する。相互貫入ナノチャネルアレイは、剥離した皮膚組織と接触して配置される。正極を皮内に挿入し、一方、負極をカーゴ溶液と接触させる。次に、パルス電界（２５０Ｖ、１０ｍｓパルス、１０パルス）を、電極間に印加して、露出した細胞膜にナノ孔形成し、カーゴを直接サイトゾルに注入する。
【０１０５】
カーゴ溶液は、Ｅｔｖ２、Ｆｏｘｃ２およびＦｌ１をコードする３つのプラスミドの混合物を含んでいた。小さな組織生検を、送達の２４時間後に収集し、ｑＲＴ−ＰＣＲによって分析した。送達後７日目に追加の生検材料を収集し、免疫組織化学を介して内皮マーカーについて分析した。ＤＴＮに基づく送達は、優れた導入遺伝子発現、および組織厚全体にわたる広範囲に分布したリプログラミング応答をもたらす。
【０１０６】
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、開示された発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で引用した刊行物およびそれらに引用されている材料は、参照により具体的に組み込まれる。
【０１０７】
当業者であれば、本明細書に記載された発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識し、または日常的な実験を超えないものを使用してそのような等価物を確かめることができる。そのような等価物は、添付の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
【０１０８】
引用文献
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Ｍｏｒｉｔａ  Ｒ，Ｓｕｚｕｋｉ  Ｍ，Ｋａｓａｈａｒａ  Ｈ，Ｓｈｉｍｉｚｕ  Ｎ，Ｓｈｉｃｈｉｔａ  Ｔ，Ｓｅｋｉｙａ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．ＥＴＳ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＥＴＶ２  ｄｉｒｅｃｔｌｙ  ｃｏｎｖｅｒｔｓ  ｈｕｍａｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｉｎｔｏ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ２０１５，１１２（１）：１６０−１６５．
Ｇａｌｌｅｇｏ−Ｐｅｒｅｚ  Ｄ，Ｏｔｅｒｏ  ＪＪ，Ｃｚｅｉｓｌｅｒ  Ｃ，Ｍａ  Ｊ，Ｏｒｔｉｚ  Ｃ，Ｇｙｇｌｉ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｓｔｉｃ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｄｒｉｖｅｓ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｎｏｎｖｉｒａｌ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ａｎｄ  ｕｎｃｏｖｅｒｓ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｂａｒｒｉｅｒｓ．Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ２０１５．
Ｍａｒｘ  Ｖ．Ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ：ｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇ  ｔｏｕｇｈ  ｃａｒｇｏ  ｉｎｔｏ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ  Ｍｅｔｈ２０１６，１３（１）：３７−４０．Ｂｏｕｋａｎｙ  ＰＥ，Ｍｏｒｓｓ  Ａ，Ｌｉａｏ  ＷＣ，Ｈｅｎｓｌｅｅ  Ｂ，Ｊｕｎｇ  Ｈ，Ｚｈａｎｇ  Ｘ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｎｏｃｈａｎｎｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｄｅｌｉｖｅｒｓ  ｐｒｅｃｉｓｅ  ａｍｏｕｎｔｓ  ｏｆ  ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｉｎｔｏ  ｌｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ２０１１，６（１１）：７４７−７５４．
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Ｈｕｎｔ  ＤＰ，Ｍｏｒｒｉｓ  ＰＮ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ  Ｊ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ＪＡ，Ｊｏａｎｎｉｄｅｓ  Ａ，Ｊａｈｏｄａ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｈｉｇｈｌｙ  ｅｎｒｉｃｈｅｄ  ｎｉｃｈｅ  ｏｆ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ａｎｄ  ｇｌｉａｌ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ｈａｉｒ  ｆｏｌｌｉｃｌｅ  ｄｅｒｍａｌ  ｐａｐｉｌｌａ  ｏｆ  ａｄｕｌｔ  ｓｋｉｎ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ２００８，２６（１）：１６３−１７２．
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Ｈｅｌｉｓｃｈ  Ａ，Ｗａｇｎｅｒ  Ｓ，Ｋｈａｎ  Ｎ，Ｄｒｉｎａｎｅ  Ｍ，Ｗｏｌｆｒａｍ  Ｓ，Ｈｅｉｌ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｓｔｒａｉｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｉｎｎａｔｅ  ｈｉｎｄｌｉｍｂ  ｃｏｌｌａｔｅｒａｌ  ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ２００６，２６（３）：５２０−５２６．
Ｃｈａｌｏｔｈｏｒｎ  Ｄ，Ｃｌａｙｔｏｎ  ＪＡ，Ｚｈａｎｇ  Ｈ，Ｐｏｍｐ  Ｄ，Ｆａｂｅｒ  ＪＥ．Ｃｏｌｌａｔｅｒａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ，ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ，ａｎｄ  ＶＥＧＦ−Ａ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｄｉｆｆｅｒ  ｗｉｄｅｌｙ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｍｏｕｓｅ  ｓｔｒａｉｎｓ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ２００７，３０（２）：１７９−１９１．
Ｌｉｍｂｏｕｒｇ  Ａ，Ｋｏｒｆｆ  Ｔ，Ｎａｐｐ  ＬＣ，Ｓｃｈａｐｅｒ  Ｗ，Ｄｒｅｘｌｅｒ  Ｈ，Ｌｉｍｂｏｕｒｇ  ＦＰ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｓｔｎａｔａｌ  ａｒｔｅｒｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｈｉｎｄ−ｌｉｍｂ  ｉｓｃｈｅｍｉａ．Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ２００９，４（１２）：１７３７−１７４６．
Ｆｉｅｄｌｅｒ  ＧＢ，Ｍｅｙｅｒｓｐｅｅｒ  Ｍ，Ｓｃｈｍｉｄ  ＡＩ，Ｇｏｌｕｃｈ  Ｓ，Ｓｃｈｅｗｚｏｗ  Ｋ，Ｌａｉｓｔｌｅｒ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｌｏｃａｌｉｚｅｄ  ｓｅｍｉ−ＬＡＳＥＲ  ｄｙｎａｍｉｃ（３ｌ）Ｐ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｏｌｅｕｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｅｘｅｒｃｉｓｅ  ａｔ７Ｔ．ＭＡＧＭＡ２０１５，２８（５）：４９３−５０１．
Ｇｎｙａｗａｌｉ  ＳＣ，Ｒｏｙ  Ｓ，Ｄｒｉｇｇｓ  Ｊ，Ｋｈａｎｎａ  Ｓ，Ｒｙａｎ  Ｔ，Ｓｅｎ  ＣＫ．Ｈｉｇｈ−ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｅｃｈｏｃａｒｄｉｏｇｒａｐｈｙ：ｆｉｒｓｔ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｏｎ  ｎｏｎ−ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｒｅｐｅａｔｅｄ  ｍｅａｓｕｒｅ  ｏｆ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｓｔｒａｉｎ，ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｉｔｙ，ａｎｄ  ｍｉｔｒａｌ  ｒｅｇｕｒｇｉｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｓｃｈｅｍｉａ−ｒｅｐｅｒｆｕｓｅｄ  ｍｕｒｉｎｅ  ｈｅａｒｔ．Ｊ  Ｖｉｓ  Ｅｘｐ２０１０（４１）．
Ｇｅｎｇ，Ｔ．＆Ｌｕ，Ｃ．Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ１３，３８０３−３８２１（２０１３）．
Ｂｏｕｋａｎｙ，Ｐ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ６，７４７−７５４（２０１１）．
Ｍｏｒｉｔａ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ１１２，１６０−１６５（２０１５）．
Ｄｅ  Ｖａｌ，Ｓ．＆Ｂｌａｃｋ，Ｂ．Ｌ．Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ１６，１８０−１９５（２００９）．
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ−Ｉ】
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【図６Ｊ】
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【図６Ｋ】
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【図６Ｌ】
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【図６Ｍ】
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【図６Ｎ】
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【図７Ａ−Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図７Ｈ】
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【図７Ｉ】
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【図７Ｊ】
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【図７Ｋ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ−Ｃ】
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【図８Ｄ−Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図８Ｈ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３】
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【図２４Ａ−Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２４Ｄ】
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【図２５Ａ−Ｄ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２６Ｄ】
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【図２６Ｅ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２７Ｄ】
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【図２７Ｅ】
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【図２７Ｆ】
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【図２７Ｇ】
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【図２７Ｈ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2020513900.tif 000079
2020513900.tif 000080
2020513900.tif 000081