(57)【要約】腫瘍関連抗原、ＮＫＧ２Ｄ受容体、およびＣＤ１６に結合する多重特異性結合タンパク質、ならびにがんの処置に有用な医薬組成物および治療方法が記載される。上記多重特異性結合タンパク質は、がん細胞における腫瘍関連抗原ならびにナチュラルキラー細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体およびＣＤ１６受容体に結合してナチュラルキラー細胞を活性化させ、２種類以上のＮＫ活性化受容体と会合することができ、天然リガンドのＮＫＧ２Ｄへの結合を阻止し得る。
2020506971.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位と、
（ｂ）腫瘍関連抗原に結合する第２の抗原結合部位と、
（ｃ）ＣＤ１６に結合するに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部分、またはＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位と
を含むタンパク質。
【請求項２】
前記第１の抗原結合部位が、ヒト、非ヒト霊長類、およびげっ歯動物のＮＫＧ２Ｄに結合する、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
前記第１の抗原結合部位が、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む、請求項１または２に記載のタンパク質。
【請求項４】
前記重鎖可変ドメインおよび前記軽鎖可変ドメインが、同じポリペプチド上に存在する、請求項３に記載のタンパク質。
【請求項５】
前記第２の抗原結合部位も、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む、請求項３または４に記載のタンパク質。
【請求項６】
前記第１の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有する、請求項５に記載のタンパク質。
【請求項７】
前記第１の抗原結合部位が、単一ドメイン抗体である、請求項１または２に記載のタンパク質。
【請求項８】
前記単一ドメイン抗体が、ＶＨＨ断片またはＶＮＡＲ断片である、請求項７に記載のタンパク質。
【請求項９】
前記第２の抗原結合部位が、単一ドメイン抗体である、請求項１から４または７から８のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１０】
前記第２の抗原結合部位が、ＶＨＨ断片またはＶＮＡＲ断片である、請求項９に記載のタンパク質。
【請求項１１】
前記第２の抗原結合部位が、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む、請求項１、２、７または８に記載のタンパク質。
【請求項１２】
前記第１の抗原結合部位が、配列番号１と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインを含む、先行する請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１３】
前記第１の抗原結合部位が、配列番号４１と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインと、配列番号４２と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１から１１のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項１４】
前記第１の抗原結合部位が、配列番号４３と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインと、配列番号４４と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１から１１のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項１５】
前記第１の抗原結合部位が、配列番号６９と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインと、配列番号７０と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１から１１のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項１６】
前記第１の抗原結合部位が、配列番号７１と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインと、配列番号７２と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１から１１のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項１７】
前記腫瘍関連抗原が、ＨＥＲ２、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＢＣＭＡ、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ２、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ７０、ＥＧＦＲ／ＥＲＢＢ１、ＩＧＦ１Ｒ、ＨＥＲ３／ＥＲＢＢ３、ＨＥＲ４／ＥＲＢＢ４、ＭＵＣ１、ｃＭＥＴ、ＳＬＡＭＦ７、ＰＳＣＡ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＣＴＬＡ４、およびＰＤ１からなる群から選択される、先行する請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１８】
前記タンパク質が、ＣＤ１６に結合するに十分な抗体Ｆｃドメインの一部分を含み、前記抗体Ｆｃドメインが、ヒンジおよびＣＨ２ドメインを含む、先行する請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１９】
ヒトＩｇＧ１抗体のアミノ酸２３４〜３３２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項２０】
先行する請求項のいずれか一項に記載のタンパク質および薬学的に許容される担体を含む製剤。
【請求項２１】
請求項１から１９のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする１つまたは複数の核酸を含む細胞。
【請求項２２】
請求項１から１９のいずれか一項に記載のタンパク質に腫瘍およびナチュラルキラー細胞を曝露することを含む、腫瘍細胞死を直接的または間接的に増強する方法。
【請求項２３】
請求項１から１９のいずれか一項に記載のタンパク質または請求項２０に記載の製剤を患者に投与することを含む、がんを処置する方法。
【請求項２４】
前記がんが、急性骨髄性白血病、急性骨髄単球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、膀胱がん、乳がん、大腸がん、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、食道がん、ユーイング肉腫、濾胞性リンパ腫、胃がん、消化管がん、消化管間質腫瘍、神経膠芽腫、頭頸部がん、黒色腫、中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、腎細胞癌、神経芽細胞腫、非小細胞肺がん、神経内分泌腫瘍、卵巣がん、および膵がん、前立腺がん、肉腫、小細胞肺がん、Ｔ細胞リンパ腫、精巣がん、胸腺癌、甲状腺がん、尿路上皮がん、骨髄由来抑制細胞が浸潤したがん、細胞外マトリックス沈着を伴うがん、高レベルの反応性間質を伴うがん、ならびに血管新生を伴うがんからなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１７年２月８日に出願された米国仮特許出願番号第６２／４５６，５３５号に基づく利益および優先権を主張しており、この仮特許出願の全体の内容は、すべての目的のために本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子提出された配列表を含み、その全体は、参照により本明細書に組み込まれている。前記ＡＳＣＩＩコピーは２０１８年２月６日に作成され、ＤＦＹ−００１ＰＣ＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、７１，１６９バイトのサイズである。
【０００３】
発明の分野
本発明は、腫瘍関連抗原、ＮＫＧ２Ｄ受容体、およびＣＤ１６に結合する多重特異性結合タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
がんは、この疾患を処置するための文献に報告されている十分な研究努力および科学進歩にもかかわらず、重大な健康問題であり続けている。最も頻繁に診断されるがんの中には、前立腺がん、乳がん、および肺がんが含まれる。前立腺がんは、男性におけるがんの最も一般的な形態である。乳がんは依然として女性における主要な死因である。これらのがんに対する現在の処置選択肢は、すべての患者に効果的というわけではなく、および／または実質的な有害副作用を有する可能性がある。他の種類のがんも、既存の治療選択肢を使用して処置することが依然として困難である。
【０００５】
がん免疫療法は、それらが非常に特異的であり、患者自身の免疫系を使用してがん細胞の破壊を促進することができるので望ましい。二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーなどの融合タンパク質は、腫瘍細胞の破壊を促進するために腫瘍細胞およびＴ細胞に結合する、文献に記載されているがん免疫療法である。ある特定の腫瘍関連抗原およびある特定の免疫細胞に結合する抗体は文献に記載されている。例えば、ＷＯ２０１６／１３４３７１およびＷＯ２０１５／０９５４１２を参照されたい。
【０００６】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、先天性免疫系の構成要素であり、循環リンパ球の約１５％を構成する。ＮＫ細胞は実質的にすべての組織に浸潤し、最初は、事前感作を必要とせずに腫瘍細胞を効果的に殺傷するそれらの能力によって特徴付けられた。活性化されたＮＫ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞と同様の手段によって、すなわち、パーフォリンおよびグランザイムを含有する細胞傷害性顆粒を介して、ならびに死受容体経路を介して、標的細胞を殺傷する。活性化されたＮＫ細胞はまた、標的組織への他の白血球の動員を促進するＩＦＮ−ガンマおよびケモカインなどの炎症性サイトカインを分泌する。
ＮＫ細胞は、それらの表面における様々な活性化受容体および阻害受容体を介してシグナルに応答する。例えば、ＮＫ細胞が健康な自己細胞に遭遇すると、それらの活性は、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）の活性化によって阻害される。あるいはＮＫ細胞が外来細胞またはがん細胞に遭遇すると、それらは、それらの活性化受容体（例えば、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＣＲ、ＤＮＡＭ１）を介して活性化される。ＮＫ細胞はまた、それらの表面におけるＣＤ１６受容体を介していくつかの免疫グロブリンの定常領域によって活性化される。活性化に対するＮＫ細胞の全体的な感受性は、刺激シグナルおよび阻害シグナルの合計に依存する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２０１６／１３４３７１号
【特許文献２】国際公開第２０１５／０９５４１２号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
要旨
本発明は、がん細胞における腫瘍関連抗原ならびにナチュラルキラー細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体およびＣＤ１６受容体に結合してナチュラルキラー細胞を活性化させる多重特異性結合タンパク質、かかる多重特異性結合タンパク質を含む医薬組成物、ならびに、がんの処置などのためにかかる多重特異性タンパク質および医薬組成物を使用する治療方法を提供する。かかるタンパク質は２種類以上のＮＫ活性化受容体と会合することができ、天然リガンドのＮＫＧ２Ｄへの結合を阻止し得る。ある特定の実施形態では、タンパク質は、ヒトならびにげっ歯動物およびカニクイザルなどの他の種においてＮＫ細胞を刺激し得る。本発明の様々な態様および実施形態を以下にさらに詳細に記載する。
【０００９】
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位と、腫瘍関連抗原に結合する第２の抗原結合部位と、ＣＤ１６に結合するに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部分、またはＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位とを組み込むことができる。
【００１０】
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は三価であり、これは、両方とも同じ腫瘍関連抗原に結合する第１および第２の抗原結合部位と、ＮＫＧ２Ｄに結合する第３の抗原結合部位と、ＣＤ１６に結合するに十分な抗体Ｆｃドメイン、その一部分とを含む。
【００１１】
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は四価であり、これは、両方とも同じ腫瘍関連抗原に結合する第１および第２の抗原結合部位と、両方ともＮＫＧ２Ｄに結合する第３および第４の抗原結合部位と、ＣＤ１６に結合するに十分な抗体Ｆｃドメイン、その一部分とを含む。
【００１２】
抗原結合部位は各々、抗体重鎖可変ドメインおよび抗体軽鎖可変ドメイン（例えば、抗体のように配列されるか、またはｓｃＦｖを形成するために一緒に融合される）を組み込んでいてもよいか、または抗原結合部位の１つもしくは複数は、ラクダ科抗体のようなＶＨＨ抗体もしくは軟骨魚類に見出されるもののようなＶＮＡＲ抗体などの単一ドメイン抗体であってもよい。一部の例では、腫瘍関連抗原は、ＨＥＲ２、ＣＤ２０、ＣＤ３３、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ２、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ７０、ＥＧＦＲ／ＥＲＢＢ１、ＩＧＦ１Ｒ、ＨＥＲ３／ＥＲＢＢ３、ＨＥＲ４／ＥＲＢＢ４、ＭＵＣ１、ｃＭＥＴ、ＳＬＡＭＦ７、ＰＳＣＡ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＣＴＬＡ４、およびＰＤ１からなる群から選択されてもよい。
【００１３】
本発明の別の態様は、患者におけるがんを処置する方法を提供する。方法は、がんを処置するために、本明細書に記載の治療有効量の多重特異性結合タンパク質を、それを必要とする患者に投与することを含む。多重特異性結合タンパク質を使用する処置のための例示的ながんには、例えば、ＨＥＲ２を発現する癌腫が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（右アーム）、腫瘍関連抗原結合ドメイン（左アーム）およびＣＤ１６に結合するＦｃドメインまたはその一部分を含有する多重特異性結合タンパク質の図である。
【００１５】
【図２】図２は、ｓｃＦｖフォーマットにおけるＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（右アーム）、腫瘍関連抗原結合ドメイン（左アーム）およびＣＤ１６に結合するＦｃドメインまたはその一部分を含有する多重特異性結合タンパク質の図である。
【００１６】
【図３】図３は、ＩｇＧ様形状を維持する三機能性の二重特異性抗体であるＴｒｉｏｍａｂ形態におけるＴｒｉＮＫＥＴの図である。このキメラは、２つの親抗体に由来する２つの半抗体からなり、各半抗体が１本の軽鎖および１本の重鎖を有する。Ｔｒｉｏｍａｂ形態は、ラット抗体の１／２およびマウス抗体の１／２を含有するヘテロ二量体構築物であり得る。
【００１７】
【図４】図４は、ノブ・イントゥ・ホール（ＫＩＨ：ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）技術を用いるＫｉＨ共通軽鎖（ＬＣ）形態におけるＴｒｉＮＫＥＴの図である。ＫｉＨは、標的１および２に結合する２つのＦａｂ、ならびにヘテロ二量体化突然変異によって安定化されたＦｃを含有するヘテロ二量体である。ＫｉＨフォーマットにおけるＴｒｉＮＫＥＴは、２つの異なる重鎖と、両方のＨＣと対合する共通の軽鎖とを含有する、標的１および標的２に結合する２つのｆａｂを有するヘテロ二量体構築物であり得る。
【００１８】
【図５】図５は、自然起源の可動性リンカーを介して２つのモノクローナル抗体の標的結合ドメインを組み合わせ、四価のＩｇＧ様分子をもたらす、二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ−Ｉｇ（商標））形態におけるＴｒｉＮＫＥＴの図である。ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）とは、抗原２を標的とする可変ドメインが、抗原１を標的とするＦａｂの可変ドメインのＮ末端に融合しているホモ二量体構築物である。構築物は通常のＦｃを含有する。
【００１９】
【図６】図６は、Ｆｃに融合した標的１および標的２に結合する２つのＦａｂを含有するヘテロ二量体構築物である、直交性Ｆａｂ界面（オルト−Ｆａｂ）形態におけるＴｒｉＮＫＥＴの図である。ＬＣ−ＨＣの対合は、直交界面によって確実になっている。ヘテロ二量体化は、Ｆｃにおける突然変異によって確実になっている。
【００２０】
【図７】図７は、２ｉｎ１  ＩｇフォーマットにおけるＴｒｉｎＫＥＴの図である。
【００２１】
【図８】図８は、Ｆｃに融合した標的１および標的２に結合する２つの異なるＦａｂを含有するヘテロ二量体構築物である、ＥＳ形態におけるＴｒｉＮＫＥＴの図である。ヘテロ二量体化は、Ｆｃにおける静電的ステアリング突然変異によって確実になっている。
【００２２】
【図９】図９は、Ｆａｂアーム交換形態におけるＴｒｉＮＫＥＴ、すなわち、重鎖（ＨＣ）および結合した軽鎖（ＬＣ）（半分子）を別の分子の重−軽鎖対とスワップすることによりＦａｂアームを交換した結果、二重特異性抗体となった抗体の図である。Ｆａｂアーム交換形態（ｃＦａｅ）は、標的１および２に結合する２つのＦａｂ、ならびにヘテロ二量体化突然変異によって安定化されたＦｃを含有するヘテロ二量体である。
【００２３】
【図１０】図１０は、標的１および２に結合する２つのＦａｂ、ならびにヘテロ二量体化突然変異によって安定化されたＦｃを含有するヘテロ二量体である、ＳＥＥＤ  Ｂｏｄｙ形態におけるＴｒｉＮＫＥＴの図である。
【００２４】
【図１１】図１１は、２つの異なるＨＣのヘテロ二量体化を誘導するためにロイシンジッパーを使用する、ＬｕＺ−Ｙ形態におけるＴｒｉＮＫＥＴの図である。ＬｕＺ−Ｙ形態は、Ｆｃに融合した標的１および２に結合する２つの異なるｓｃＦａｂを含有するヘテロ二量体である。ヘテロ二量体化は、ＦｃのＣ末端に融合したロイシンジッパーモチーフによって確実になっている。
【００２５】
【図１２】図１２は、Ｃｏｖ−Ｘ−Ｂｏｄｙ形態におけるＴｒｉＮＫＥＴの図である。
【００２６】
【図１３】図１３Ａおよび１３Ｂは、ヘテロ二量体化突然変異によって安定化されたＦｃに融合した２つの異なるＦａｂを有するヘテロ二量体構築物である、κλ−Ｂｏｄｙ形態におけるＴｒｉＮＫＥＴの図である。抗原１を標的とするＦａｂ１はカッパＬＣを含有し、一方、抗原２を標的とする第２のＦａｂはラムダＬＣを含有する。図１３Ａは、κλ−Ｂｏｄｙの一形態の例示的な図であり、図１３Ｂは、別のκλ−Ｂｏｄｙの例示的な図である。
【００２７】
【図１４】図１４は、ＥＬＩＳＡアッセイにおけるヒト組換えＮＫＧ２Ｄに対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）の結合親和性を示すグラフである。
【００２８】
【図１５】図１５は、ＥＬＩＳＡアッセイにおけるカニクイザル組換えＮＫＧ２Ｄに対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）の結合親和性を示すグラフである。
【００２９】
【図１６】図１６は、ＥＬＩＳＡアッセイにおけるマウス組換えＮＫＧ２Ｄに対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）の結合親和性を示すグラフである。
【００３０】
【図１７】図１７は、バックグラウンドに対する平均蛍光強度（ＭＦＩ）倍率を示すフローサイトメトリーによる、ヒトＮＫＧ２Ｄを発現するＥＬ４細胞に対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）の結合を示すグラフである。
【００３１】
【図１８】図１８は、バックグラウンドに対する平均蛍光強度（ＭＦＩ）倍率を示すフローサイトメトリーによる、マウスＮＫＧ２Ｄを発現するＥＬ４細胞に対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）の結合を示すグラフである。
【００３２】
【図１９】図１９は、天然リガンドのＵＬＢＰ−６と競合することによる、組換えヒトＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃに対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）の特異的結合親和性を示すグラフである。
【００３３】
【図２０】図２０は、天然リガンドのＭＩＣＡと競合することによる、組換えヒトＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃに対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）の特異的結合親和性を示すグラフである。
【００３４】
【図２１】図２１は、天然リガンドのＲａｅ−１デルタと競合することによる、組換えマウスＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃに対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）の特異的結合親和性を示すグラフである。
【００３５】
【図２２】図２２は、ヒトＮＫＧ２Ｄ−ＣＤ３ゼータ融合タンパク質を発現するＴＮＦ−アルファ陽性細胞のパーセンテージを定量することにより、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）によるヒトＮＫＧ２Ｄの活性化を示すグラフである。
【００３６】
【図２３】図２３は、マウスＮＫＧ２Ｄ−ＣＤ３ゼータ融合タンパク質を発現するＴＮＦ−アルファ陽性細胞のパーセンテージを定量することにより、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）によるマウスＮＫＧ２Ｄの活性化を示すグラフである。
【００３７】
【図２４】図２４は、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）によるヒトＮＫ細胞の活性化を示すグラフである。
【００３８】
【図２５】図２５は、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）によるヒトＮＫ細胞の活性化を示すグラフである。
【００３９】
【図２６】図２６は、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）によるマウスＮＫ細胞の活性化を示すグラフである。
【００４０】
【図２７】図２７は、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）によるマウスＮＫ細胞の活性化を示すグラフである。
【００４１】
【図２８】図２８は、腫瘍細胞に対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）の細胞傷害効果を示すグラフである。
【００４２】
【図２９】図２９は、示差走査型蛍光定量法によって測定された、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）の融解温度を示すグラフである。
【００４３】
【図３０】図３０は、多重特異性結合タンパク質によるヒトＮＫ細胞の増強された活性化を示すグラフである。
【００４４】
【図３１】図３１は、ヒトＮＫ細胞によって腫瘍標的細胞に対してより高いレベルの細胞傷害性を誘導した多重特異性結合タンパク質を示すグラフである。
【００４５】
【図３２】図３２は、ヒトＮＫ細胞によって腫瘍標的細胞に対してより高いレベルの細胞傷害性を誘導した多重特異性結合タンパク質を示すグラフである。
【００４６】
【図３３】図３３は、ヒトＮＫ細胞によって腫瘍標的細胞に対してより高いレベルの細胞傷害性を誘導した多重特異性結合タンパク質を示すグラフである。
【００４７】
【図３４】図３４は、ヒトＮＫ細胞によって腫瘍標的細胞に対してより高いレベルの細胞傷害性を誘導した多重特異性結合タンパク質を示すグラフである。
【００４８】
【図３５】図３５は、マウスＮＫ細胞によって腫瘍標的細胞に対してより高いレベルの細胞傷害性を誘導した多重特異性結合タンパク質を示すグラフである。
【００４９】
【図３６】図３６は、マウスＮＫ細胞によって腫瘍標的細胞に対してより高いレベルの細胞傷害性を誘導した多重特異性結合タンパク質を示すグラフである。
【００５０】
【図３７】図３７は、ＥＬ４細胞において発現したＮＫＧ２Ｄに対するＣＤ３３を標的とするＴｒｉＮＫＥＴの結合プロファイルである。図３７は、ＣＤ３３結合ドメインが第２の標的化アームとして使用される場合の２つのＴｒｉＮＫＥＴの結合を示す。
【００５１】
【図３８】図３８は、ＥＬ４細胞において発現したＮＫＧ２Ｄに対するＨＥＲ２を標的とするＴｒｉＮＫＥＴの結合プロファイルである。図３８は、同じ２つのＮＫＧ２Ｄ結合ドメインがここでＨＥＲ２の第２の標的化アームと対合したことを示す。
【００５２】
【図３９】図３９は、ＥＬ４細胞において発現したＮＫＧ２Ｄに対するＢＣＭＡを標的とするＴｒｉＮＫＥＴの結合プロファイルである。
【００５３】
【図４０】図４０は、ＥＬ４細胞において発現したＮＫＧ２Ｄに結合するＣＤ２０を標的とするＴｒｉＮＫＥＴのヒストグラムである。未染色のＥＬ４細胞を蛍光シグナルについての陰性対照として使用した。未染色：黒塗り；ＣＤ２０−ＴｒｉＮＫＥＴ−Ｆ０４：実線；ＣＤ２０−ＴｒｉＮＫＥＴ−Ｃ２６：破線。
【００５４】
【図４１】図４１は、ＭＶ４−１１ヒトＡＭＬ細胞において発現したＣＤ３３に対するＣＤ３３を標的とするＴｒｉＮＫＥＴの結合プロファイルである。
【００５５】
【図４２】図４２は、ヒト７８６−Ｏ腎細胞癌細胞において発現したＨＥＲ２に対するＨＥＲ２を標的とするＴｒｉＮＫＥＴの結合プロファイルである。
【００５６】
【図４３】図４３は、ＭＭ．１Ｓヒト骨髄腫細胞において発現したＢＣＭＡに対するＢＣＭＡを標的とするＴｒｉＮＫＥＴの結合プロファイルである。
【００５７】
【図４４】図４４は、Ｒａｊｉヒトリンパ腫細胞において発現したＣＤ２０に結合するＣＤ２０を標的とするＴｒｉＮＫＥＴのヒストグラムである。未染色の細胞を蛍光シグナルについての陰性対照として使用した。未染色：黒塗り；ＣＤ２０−ＴｒｉＮＫＥＴ−Ｆ０４：実線；ＣＤ２０−ＴｒｉＮＫＥＴ−Ｃ２６：破線。
【００５８】
【図４５】図４５Ａ〜４５Ｃは、ＣＤ１６およびＮＫＧ２Ｄを使用したＮＫ細胞の相乗的活性化の棒グラフである。図４５Ａは、ＣＤ１０７ａのレベルを示し、図４５Ｂは、ＩＦＮγのレベルを示し、図４５Ｃは、ＣＤ１０７ａおよびＩＦＮγのレベルを示す。グラフは平均（ｎ＝２）±ＳＤを示す。データは、５人の異なる健康なドナーを使用した５つの独立した実験の代表的なものである。
【００５９】
【図４６】図４６は、ＮＫＧ２ＤおよびＣＤ１６を標的とするＴｒｉＮＫＥＴを使用したＮＫ細胞の活性化を示す棒グラフである。試験した抗体はヒトＩｇＧ１アイソタイプであった。グラフは平均（ｎ＝２）±ＳＤを示す。
【００６０】
【図４７−１】図４７Ａ〜４７Ｃは、ＴｒｉＮＫＥＴおよびトラスツズマブが、ＨＥＲ２陽性ヒト腫瘍細胞との共培養において初代ヒトＮＫ細胞を活性化することができたことを示す棒グラフであり、ＣＤ１０７ａ脱顆粒およびＩＦＮγサイトカイン産生の増加によって示される。モノクローナル抗体トラスツズマブと比較して、両方のＴｒｉＮＫＥＴは、様々なヒトＨＥＲ２がん細胞でヒトＮＫ細胞の優れた活性化を示した。図４７Ａは、ヒトＮＫ細胞が、ＳｋＢｒ−３細胞と培養された場合、ＴｒｉＮＫＥＴによって活性化されることを示す。図４７Ｂは、ヒトＮＫ細胞が、Ｃｏｌｏ２０１細胞と培養された場合、ＴｒｉＮＫＥＴによって活性化されることを示す。
【図４７−２】図４７Ｃは、ヒトＮＫ細胞が、ＨＣＣ１９５４細胞と培養された場合、ＴｒｉＮＫＥＴによって活性化されることを示す。
【００６１】
【図４８】図４８Ａおよび４８Ｂは、ＣＤ３３発現ヒトＡＭＬ細胞株ＭＶ４−１１との共培養における休止ヒトＮＫ細胞またはＩＬ−２活性化ヒトＮＫ細胞のＴｒｉＮＫＥＴ媒介活性化を示す線グラフである。図４８Ａは、休止ヒトＮＫ細胞のＴｒｉＮＫＥＴ媒介活性化を示す。図４８Ｂは、同じドナー由来のＩＬ−２活性化ヒトＮＫ細胞のＴｒｉＮＫＥＴ媒介活性化を示す。
【００６２】
【図４９】図４９Ａおよび４９Ｂは、ＩＬ−２活性化ヒトＮＫ細胞および休止ヒトＮＫ細胞を使用した細胞傷害活性のＴｒｉＮＫＥＴ増強を示すグラフである。図４９Ａは、休止ヒトＮＫ細胞によるＳｋＢｒ−３腫瘍細胞の特異的溶解率（パーセント）を示す。図４９Ｂは、ＩＬ−２活性化ヒトＮＫ細胞によるＳｋＢｒ−３腫瘍細胞の特異的溶解率（パーセント）を示す。
【００６３】
【図５０】図５０Ａおよび５０Ｂは、ＴｒｉＮＫＥＴが、トラスツズマブと比較して、ＨＥＲ２が中程度のがんおよび低いがんに対してより大きな利点を提供することを示すグラフである。図５０Ａは、ＨＥＲ２高−ＳｋＢｒ−３腫瘍細胞の活性化ヒトＮＫ細胞の殺傷を示す。図５０Ｂは、ＨＥＲ２低−７８６−Ｏ腫瘍細胞のヒトＮＫ細胞の殺傷を示す。ＴｒｉＮＫＥＴは、低いＨＥＲ２発現を有するがん細胞に対してトラスツズマブと比較してより大きな利点を提供する。
【００６４】
【図５１】図５１Ａ〜５１Ｃは、３種のヒトＡＭＬ細胞株、Ｍｏｌｍ−１３細胞株（図５１Ａ）、Ｍｖ４−１１細胞株（図５１Ｂ）、およびＴＨＰ−１細胞株（図５１Ｃ）における高親和性ＦｃＲγＩ（ＣＤ６４）の発現を示すヒストグラムである。
【００６５】
【図５２】図５２Ａおよび５２Ｂは、Ｍｏｌｍ−１３細胞（図５２Ｂ）またはＴＨＰ−１細胞（図５２Ａ）のいずれかとの共培養におけるヒトＮＫ細胞のモノクローナル抗体またはＴｒｉＮＫＥＴ媒介活性化の線グラフである。
【００６６】
【図５３−１】図５３Ａ〜５３Ｃは、標的として３種のヒトＡＭＬ細胞株を使用したヒトＮＫ細胞傷害性アッセイの線グラフである。図５３Ａは、ＣＤ６４を発現するが、ＴＨＰ−１より低いレベルであるＭｖ４−１１細胞が、モノクローナル抗ＣＤ３３で減少した効力を示したことを示す。図５３Ｂは、ＣＤ３３に対するモノクローナル抗体が、ＣＤ６４を発現しないＭｏｌｍ−１３細胞に対して良好な効力を示すことを示す。
【図５３−２】図５３Ｃは、ＴＨＰ−１細胞が、モノクローナル抗ＣＤ３３単独で効果を示さなかったことを示す。図５３Ｃに示される線グラフの同一性は、図５３Ａおよび５３Ｂにおける線グラフにも適用可能である。
【００６７】
【図５４−１】図５４Ａおよび５４Ｂは、健康なドナー由来のＢ細胞が、ＴｒｉＮＫＥＴ媒介溶解に感受性があることを示す棒グラフである。
【００６８】
【図５４−２】図５４Ｃおよび５４Ｄは、骨髄細胞が、ＴｒｉＮＫＥＴ媒介溶解に対して耐性があることを示す棒グラフである。
【００６９】
【図５５】図５５は、長期共培養におけるＳｋＢｒ−３腫瘍細胞のＴｒｉＮＫＥＴ媒介ｈＰＢＭＣ殺傷の線グラフである。
【００７０】
【図５６】図５６は、ＲＭＡ／Ｓ−ＨＥＲ２皮下ＳＣ２．２の有効性の研究デザインのフローチャートである。
【００７１】
【図５７】図５７は、ＳＣ２．２が、皮下ＲＭＡ／Ｓ−ＨＥＲ２腫瘍成長に影響を及ぼさないことを示す線グラフである。
【００７２】
【図５８】図５８Ａおよび５８Ｂは、ｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９  ＴｒｉＮＫＥＴによるｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合を示すグラフである。４倍希釈した６０μｇ／ｍＬの示した抗体を、２×１０５個のＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞（図５８Ａ）またはＥＬ４−ｍＮＫＧ２Ｄ細胞（図５８Ｂ）に添加した。ヤギ抗マウスＰＥ二次抗体を使用して結合を評価した後、フローサイトメトリー分析を行った。
【００７３】
【図５９】図５９は、ｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９  ＴｒｉＮＫＥＴによって媒介されたＮＫ細胞傷害性の増加を示すグラフである。
【００７４】
【図６０】図６０Ａおよび６０Ｂは、Ｂ１６Ｆ１０  ｓ．ｃ．モデルにおけるｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９  ＴｒｉＮＫＥＴの抗腫瘍効果を示す。マウスを、１５０μｇの用量（６、８、１０、１２、１４、１６および２１日目）で注射した、（図６０Ａ）アイソタイプ対照マウスＩｇＧ２ａ  ｍａｂ  Ｃ１．１８．４およびマウス抗Ｔｙｒｐ−１モノクローナル抗体または（図６０Ｂ）アイソタイプ対照マウスＩｇＧ２ａ  ｍａｂ  Ｃ１．１８．４およびｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９  ＴｒｉＮＫＥＴを用いて腹腔内処置した。腫瘍成長を２８日間評価した。グラフは、個々のマウスの腫瘍成長曲線を示す。
【００７５】
【図６１】図６１Ａおよび６１Ｂは、Ｂ１６Ｆ１０  ｉ．ｖ．モデルにおけるｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９  ＴｒｉＮＫＥＴの抗腫瘍効果を示す。図６１Ａは、抗体が１５０μｇ用量（４、６、８、１１、１３、１５日目）で投与された場合の腫瘍負荷を表す。図６１Ｂは、抗体が１５０μｇ用量（７、９、１１、１３、１５日目）で投与された場合の腫瘍負荷を表す。腫瘍チャレンジの１８日後、マウスを安楽死させ、表面肺転移をスコア化した。
【００７６】
【図６２】図６２は、ヒトＮＫ細胞が、ＣＤ２０＋  Ｒａｊｉ細胞と培養された場合に、ＴｒｉＮＫＥＴによって活性化されることを示す棒グラフである。
【００７７】
【図６３】図６３は、ＢＣＭＡ陽性ＭＭ．１Ｓヒト骨髄腫細胞との培養におけるヒトＮＫ活性化を示す棒グラフである。
【００７８】
【図６４】図６４は、ＴｒｉＮＫＥＴが、ＫＭＳ１２−ＰＥ骨髄腫細胞のヒトＮＫ細胞溶解を増強することを示すグラフである。
【００７９】
【図６５】図６５は、異なるＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを有するＢＣＭＡを標的とするＴｒｉＮＫＥＴが、ＫＭＳ１２−ＰＥ骨髄腫細胞のヒトＮＫ細胞溶解を増強することを示すグラフである。
【００８０】
【図６６】図６６は、１つの分子における三重特異的結合が、最大ＮＫ細胞活性にとって重要であることを示す線グラフである。
【００８１】
【図６７】図６７は、Ｆｃに融合した、標的１に結合するＦａｂと、標的２に結合するｓｃＦａｂとを含む、Ｏａｓｃ−Ｆａｂヘテロ二量体構築物である。ヘテロ二量体化は、Ｆｃにおける突然変異によって確実になっている。
【００８２】
【図６８】図６８は、抗原１および２に結合する２つの異なるＦａｂ、ならびにヘテロ二量体化突然変異によって安定化されたＦｃを含有するヘテロ二量体構築物である、ＤｕｅｔＭａｂである。Ｆａｂ  １および２は、ＬＣおよびＨＣの正確な対合を確実にする特異な（differential）Ｓ−Ｓ架橋を含有する。
【００８３】
【図６９】図６９は、ヘテロ二量体化によって安定化されたＦｃに融合した標的１および２に結合する２つの異なるＦａｂを有するヘテロ二量体構築物である、ＣｒｏｓｓｍＡｂである。ＣＬドメインおよびＣＨ１ドメインと、ＶｈドメインおよびＶＬドメインとが切り換わっており、例えば、ＣＨ１は、ＶＬとインラインで融合しており、一方、ＣＬは、ＶＨとインラインで融合している。
【００８４】
【図７０】図７０は、抗原２に結合するＦａｂが、抗原１に結合するＦａｂのＨＣのＮ末端に融合しているホモ二量体構築物である、Ｆｉｔ−Ｉｇである。この構築物は、野生型Ｆｃを含有する。
【発明を実施するための形態】
【００８５】
詳細な説明
本発明は、がん細胞における腫瘍関連抗原ならびにナチュラルキラー細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体およびＣＤ１６受容体に結合してナチュラルキラー細胞を活性化させる多重特異性結合タンパク質、かかる多重特異性結合タンパク質を含む医薬組成物、ならびに、がんの処置などのためにかかる多重特異性タンパク質および医薬組成物を使用する治療方法を提供する。本発明の様々な態様を複数のセクションに分けて以下に記述する。しかしながら、１つの特定のセクションに記載される本発明の態様は、いずれかの特定のセクションに限定されるものではない。
【００８６】
本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語および句を以下に定義する。
【００８７】
本明細書で使用される場合、「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」という用語は、「１つまたは複数」を意味し、文脈が不適切でない限り、複数を含む。
【００８８】
本明細書で使用される場合、「抗原結合部位」という用語は、抗原結合に関与する免疫グロブリン分子の一部分を指す。ヒト抗体において、抗原結合部位は、重（「Ｈ」）鎖および軽（「Ｌ」）鎖のＮ末端可変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基によって形成される。重鎖および軽鎖のＶ領域内の３つの高度に分岐したストレッチは、「フレームワーク領域」または「ＦＲ」として公知である、より保存された隣接するストレッチの間に介在している「超可変領域」と称される。したがって、「ＦＲ」という用語は、免疫グロブリンにおける超可変領域の間におよびそれに隣接して天然に見出されるアミノ酸配列を指す。ヒト抗体分子において、軽鎖の３つの超可変領域および重鎖の３つの超可変領域は、抗原結合表面を形成するように三次元空間において互いに対して配置される。抗原結合表面は、結合した抗原の三次元表面と相補的であり、重鎖および軽鎖の各々の３つの超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」と称される。ラクダおよび軟骨魚類などのある特定の動物において、抗原結合部位は、「単一ドメイン抗体」を提供する単一抗体鎖によって形成される。抗原結合部位は、インタクトな抗体中、抗原結合表面を保持する抗体の抗原結合断片中、またはｓｃＦｖなどの組換えポリペプチド中に存在し、ペプチドリンカーを使用して単一ポリペプチドにおいて重鎖可変ドメインを軽鎖可変ドメインに連結することができる。
【００８９】
本明細書で使用される場合、「腫瘍関連抗原」という用語は、がんに関連するタンパク質、糖タンパク質、ガングリオシド、炭水化物、脂質を含むがこれらに限定されない、任意の抗原を意味する。このような抗原は、悪性細胞において、または腫瘍関連血管、細胞外マトリックス、間葉系間質、もしくは免疫浸潤物におけるような腫瘍微小環境中で発現され得る。
【００９０】
本明細書で使用される場合、「対象」および「患者」という用語は、本明細書に記載の方法および組成物によって処置される生物を指す。かかる生物には、好ましくは、限定されないが、哺乳動物（例えば、ネズミ、サル、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコなど）が含まれ、より好ましくはヒトが含まれる。
【００９１】
本明細書中で使用される場合、「有効量」という用語は、有益なまたは所望の結果をもたらすのに十分な化合物（例えば、本発明の化合物）の量を指す。有効量は、１回または複数回の投与、適用または投薬量で投与されてもよく、特定の製剤または投与経路に限定されることを意図しない。本明細書中で使用される場合、「処置する」という用語は、何らかの効果、例えば、状態、疾患、障害などの好転をもたらす、減少、低減、モジュレート、改善もしくは除去、またはそれらの症状の改善を含む。
【００９２】
本明細書で使用される場合、「医薬組成物」という用語は、組成物を、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでの診断的使用または治療的使用に特に適切にする、活性剤と、不活性または活性な担体との組合せを指す。
【００９３】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、エマルション（例えば、油／水または水／油エマルションなど）、および種々の種類の湿潤剤などの標準的な医薬担体のいずれかを指す。組成物はまた、安定剤および保存剤を含んでもよい。担体、安定剤およびアジュバントの例に関しては、例えば、Martin、Remington's  Pharmaceutical  Sciences、第１５版、Mack  Publ.Co.、Easton、PA［１９７５年］を参照されたい。
【００９４】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される塩」という用語は、対象に投与すると、本発明の化合物またはその活性代謝産物もしくは残留物を提供することができる、本発明の化合物の任意の薬学的に許容される塩（例えば、酸または塩基）を指す。当業者に公知であるように、本発明の化合物の「塩」は、無機または有機の酸および塩基から誘導され得る。例示的な酸には、限定されないが、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、リン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、コハク酸、トルエン−ｐ−スルホン酸、酒石酸、酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ベンゼンスルホン酸などが含まれる。シュウ酸などの他の酸は、それら自体では薬学的に許容されないが、本発明の化合物およびそれらの薬学的に許容される酸付加塩を得る際の中間体として有用な塩の調製に利用され得る。
【００９５】
例示的な塩基には、限定されないが、アルカリ金属（例えば、ナトリウム）水酸化物、アルカリ土類金属（例えば、マグネシウム）水酸化物、アンモニアおよび式ＮＷ４＋（式中、ＷはＣ１〜４アルキルである）の化合物などが含まれる。
【００９６】
例示的な塩には、限定されないが、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、ショウノウ酸塩、ショウノウスルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、フルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パルモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩、ウンデカン酸塩などが含まれる。塩の他の例には、Ｎａ＋、ＮＨ４＋およびＮＷ４＋（式中、ＷはＣ１〜４アルキル基である）などの適切なカチオンと配合された本発明の化合物のアニオンが含まれる。
【００９７】
治療的使用のために、本発明の化合物の塩は、薬学的に許容されると意図される。しかしながら、薬学的に許容されない酸および塩基の塩も、例えば、薬学的に許容される化合物の調製または精製において使用することができる。
【００９８】
組成物が特定の成分を有する、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、もしくは含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）と記載されているか、またはプロセスおよび方法が特定のステップを有する、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、もしくは含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）と記載されている説明全体にわたって、さらに、列挙された成分から本質的になる、またはそれからなる本発明の組成物が存在すること、ならびに列挙されたプロセスステップから本質的になる、またはそれからなる本発明によるプロセスおよび方法が存在することが意図される。
【００９９】
一般的事項として、パーセンテージを特定する組成物は、特に明記しない限り、重量による。さらに、変数が定義を伴わない場合、変数の以前の定義が優先する。
Ｉ．タンパク質
【０１００】
本発明は、がん細胞における腫瘍関連抗原ならびにナチュラルキラー細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体およびＣＤ１６受容体に結合してナチュラルキラー細胞を活性化させる多重特異性結合タンパク質を提供する。多重特異性結合タンパク質は、本明細書に記載の医薬組成物および治療方法において有用である。ナチュラルキラー細胞のＮＫＧ２Ｄ受容体およびＣＤ１６受容体に多重特異性結合タンパク質が結合すると、がん細胞の破壊を目的としたナチュラルキラー細胞の活性が増強される。がん細胞の腫瘍関連抗原に多重特異性結合タンパク質が結合すると、がん細胞がナチュラルキラー細胞に近接するため、ナチュラルキラー細胞によるがん細胞の直接的および間接的な破壊が容易になる。例示的な多重特異性結合タンパク質のさらなる記載を以下に提供する。
【０１０１】
多重特異性結合タンパク質の第１の構成要素は、ＮＫ細胞、γδＴ細胞およびＣＤ８＋αβＴ細胞を含み得るがこれらに限定されない、ＮＫＧ２Ｄ受容体発現細胞に結合する。多重特異性結合タンパク質は、ＮＫＧ２Ｄに結合すると、ＵＬＢＰ６およびＭＩＣＡなどの天然リガンドがＮＫＧ２Ｄに結合することを阻止し得る。
【０１０２】
多重特異性結合タンパク質の第２の構成要素は、ＨＥＲ２、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＢＣＭＡ、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ２、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ７０、ＥＧＦＲ／ＥＲＢＢ１、ＩＧＦ１Ｒ、ＨＥＲ３／ＥＲＢＢ３、ＨＥＲ４／ＥＲＢＢ４、ＭＵＣ１、ｃＭＥＴ、ＳＬＡＭＦ７、ＰＳＣＡ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＣＴＬＡ４、およびＰＤ１を含み得るがこれらに限定されない、１つまたは複数の腫瘍関連抗原に結合する。
【０１０３】
多重特異性結合タンパク質の第３の構成要素は、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、マスト細胞、および濾胞性樹状細胞を含む白血球の表面にあるＦｃ受容体であるＣＤ１６を発現する細胞に結合する。
【０１０４】
多重特異性結合タンパク質は、以下の実施例に示されるがこれらに限定されない、いくつかのフォーマットをとることができる。１つのフォーマットは、第１の免疫グロブリン重鎖、第２の免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖を含む、ヘテロ二量体の多重特異性抗体である。第１の免疫グロブリン重鎖は、第１のＦｃ（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）ドメインと、第１の重鎖可変ドメインと、必要に応じて第１のＣＨ１重鎖ドメインとを含む。免疫グロブリン軽鎖は、軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む。免疫グロブリン軽鎖は、第１の免疫グロブリン重鎖と一緒に、ＮＫＧ２Ｄに結合する抗原結合部位を形成する。第２の免疫グロブリン重鎖は、第２のＦｃ（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）ドメインと、第２の重鎖可変ドメインと、必要に応じて第２のＣＨ１重鎖ドメインとを含み、この第２のＣＨ１重鎖ドメインは、免疫グロブリン軽鎖が第２の免疫グロブリン重鎖と対合する場合、得られる抗原結合部位が腫瘍抗原に結合することを除いて、第１の免疫グロブリン重鎖と対合するものと同一の免疫グロブリン軽鎖と対合し得る。第１のＦｃドメインおよび第２のＦｃドメインは一緒にＣＤ１６に結合することができる（図１）。
【０１０５】
別の例示的なフォーマットは、第１の免疫グロブリン重鎖、免疫グロブリン軽鎖および第２の免疫グロブリン重鎖を含む、ヘテロ二量体の多重特異性抗体に関する。第１の免疫グロブリン重鎖は、ＮＫＧ２Ｄに結合する一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）とリンカーまたは抗体ヒンジのいずれかを介して融合している、第１のＦｃ（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）ドメインを含む。様々なリンカーが、ｓｃＦｖを第１のＦｃドメインに連結するか、またはｓｃＦｖ自体内で連結するために使用され得る。さらに、ｓｃＦｖは、ｓｃＦｖ構造全体を安定化させるためにジスルフィド結合の形成を可能にする突然変異を組み込んでいてもよい。ｓｃＦｖはまた、第１の免疫グロブリン重鎖全体の等電点を修飾するために、および／またはより容易な下流の精製を可能にするために突然変異を組み込んでいてもよい。第２の免疫グロブリン重鎖は、第２のＦｃ（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）ドメインと、第２の重鎖可変ドメインと、必要に応じて第２のＣＨ１重鎖ドメインとを含む。免疫グロブリン軽鎖は、軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む。第２の免疫グロブリン重鎖は、免疫グロブリン軽鎖と対合し、腫瘍抗原に結合する。第１のＦｃドメインおよび第２のＦｃドメインは一緒にＣＤ１６に結合することができる（図２）。
【０１０６】
ヘテロ二量体多重特異性タンパク質の代替のフォーマットは、第１の免疫グロブリン重鎖と、第２の免疫グロブリン重鎖と、第１の免疫グロブリン軽鎖と、第２の免疫グロブリン軽鎖とを含む。第１の免疫グロブリン重鎖は、第１のＦｃ（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）ドメインと、第１の重鎖可変ドメインと、必要に応じて第１のＣＨ１重鎖ドメインとを含む。第１の免疫グロブリン軽鎖は、軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む。第１の免疫グロブリン軽鎖は、第１の免疫グロブリン重鎖と一緒に、腫瘍抗原に結合する抗原結合部位を形成する。第２の免疫グロブリン重鎖は、第２のＦｃ（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）ドメインと、第２の重鎖可変ドメインと、必要に応じて第２のＣＨ１重鎖ドメインとを含む。第２の免疫グロブリン軽鎖は、軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む。免疫グロブリン軽鎖は、第２の免疫グロブリン重鎖と一緒に、同じ腫瘍抗原に結合する抗原結合部位を形成する。第２の免疫グロブリン重鎖は免疫グロブリン軽鎖と対合することができ、この免疫グロブリン軽鎖は、免疫グロブリン軽鎖が第２の免疫グロブリン重鎖と対合する場合、得られる抗原結合部位が腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合部位であることを除いて、第１の免疫グロブリン重鎖と対合する免疫グロブリン軽鎖と同一であってもよい。ある特定の実施形態では、第１のＦｃドメインおよび第２のＦｃドメインは一緒にＣＤ１６に結合することができる（図１）。
【０１０７】
１つまたは複数のさらなる結合モチーフが、必要に応じてリンカー配列を介して、定常領域ＣＨ３ドメインのＣ末端に融合され得る。ある特定の実施形態では、抗原結合部位は、一本鎖もしくはジスルフィド安定化可変領域（ＳｃＦｖ）であり得るか、または四価もしくは三価の分子を形成し得る。
【０１０８】
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、ＩｇＧ様形状を維持する三機能性の二重特異性抗体である、Ｔｒｉｏｍａｂ形態である。このキメラは、２つの親抗体に由来する２つの半抗体からなり、各半抗体が１本の軽鎖および１本の重鎖を有する。
【０１０９】
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、ノブ・イントゥ・ホール（ＫＩＨ）技術を用いるＫｉＨ共通軽鎖（ＬＣ）形態である。ＫＩＨは、ヘテロ二量体化を促進するために、ＣＨ３ドメインを工学操作して各重鎖に「ノブ」または「ホール」のいずれかを作出することを伴う。「ノブ・イントゥ・ホール（ＫｉＨ）」Ｆｃ技術の背後にある概念は、小さな残基を嵩高の残基で置換することにより、１つのＣＨ３ドメイン（ＣＨ３Ａ）に「ノブ」（すなわち、ＥＵ付番でＴ３６６ＷＣＨ３Ａ）を導入することであった。この「ノブ」に適応するように、他方のＣＨ３ドメイン（ＣＨ３Ｂ）において、ノブに最も近い隣接残基をより小さな残基に置き換えること（すなわち、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７ＶＣＨ３Ｂ）により、相補的な「ホール」表面が作出された。「ホール」突然変異は、構造情報に基づくファージライブラリスクリーニング（Atwell  S、Ridgway  JB、Wells  JA、Carter  P.、Stable  heterodimers  from  remodeling  the  domain  interface  of  a  homodimer  using  a  phage  display  library、J  Mol  Biol（１９９７年）２７０巻（１号）：２６〜３５頁）によって最適化された。ＫｉＨ  Ｆｃ変異体のＸ線結晶構造（Elliott  JM、Ultsch  M、Lee  J、Tong  R、Takeda  K、Spiess  Cら、Antiparallel  conformation  of  knob  and  hole  aglycosylated  half-antibody  homodimers  is  mediated  by  a  CH2-CH3  hydrophobic  interaction.  J  Mol  Biol（２０１４年）４２６巻（９号）：１９４７〜５７頁、Mimoto  F、Kadono  S、Katada  H、Igawa  T、Kamikawa  T、Hattori  K.  Crystal  structure  of  a  novel  asymmetrically  engineered  Fc  variant  with  improved  affinity  for  FcgammaRs.  Mol  Immunol（２０１４年）５８巻（１号）：１３２〜８頁）は、ＣＨ３ドメイン間のコア界面では、立体的相補性によって推進される疎水性相互作用がヘテロ二量体化に熱力学的に有利に働くが、ノブ−ノブおよびホール−ホールの界面は、それぞれ立体障害および好ましい相互作用の妨害が原因でホモ二量体化に有利に働かないことを示した。
【０１１０】
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、自然起源の可動性リンカーを介して２つのモノクローナル抗体の標的結合ドメインを組み合わせ、四価のＩｇＧ様分子をもたらす、二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ−Ｉｇ（商標））形態におけるものである。
【０１１１】
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、直交性Ｆａｂ界面（オルト−Ｆａｂ）形態におけるものである。オルト−Ｆａｂ  ＩｇＧアプローチ（Lewis  SM、Wu  X、Pustilnik  A、Sereno  A、Huang  F、Rick  HLら、Generation  of  bispecific  IgG  antibodies  by  structure-based  design  of  an  orthogonal  Fab  interface.  Nat.  Biotechnol.（２０１４年）３２巻（２号）：１９１〜８頁）では、構造に基づく領域デザインにより、一方のＦａｂにおけるＬＣおよびＨＣＶＨ−ＣＨ１の界面にのみ相補的突然変異が導入され、他方のＦａｂが変化することはない。
【０１１２】
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、２ｉｎ１  Ｉｇフォーマットにおけるものである。一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、Ｆｃに融合した標的１および標的２に結合する２つの異なるＦａｂを含有するヘテロ二量体構築物である、ＥＳ形態におけるものである。ヘテロ二量体化は、Ｆｃにおける静電的ステアリング突然変異によって確実になっている。一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、ヘテロ二量体化突然変異によって安定化されたＦｃに融合した２つの異なるＦａｂを有するヘテロ二量体構築物である、κλ−Ｂｏｄｙ形態におけるものである。抗原１を標的とするＦａｂ１はカッパＬＣを含有し、一方、抗原２を標的とする第２のＦａｂはラムダＬＣを含有する。図１３Ａは、κλ−Ｂｏｄｙの一形態の例示的な図であり、図１３Ｂは、別のκλ−Ｂｏｄｙの例示的な図である。
【０１１３】
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、Ｆａｂアーム交換形態（重鎖および結合した軽鎖（半分子）を別の分子の重鎖−軽鎖対とスワップすることによりＦａｂアームを交換した結果、二重特異性抗体となった抗体）である。一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、ＳＥＥＤ  Ｂｏｄｙ形態におけるものである。ＳＥＥＤ（ｓｔｒａｎｄ−ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｄｏｍａｉｎ）プラットフォームは、天然抗体の治療用途を広げる可能性がある非対称かつ二重特異性抗体様の分子を生成するためにデザインされた。このタンパク質工学操作プラットフォームは、保存されたＣＨ３ドメインにおける免疫グロブリンの構造的に関連した配列の交換に基づく。ＳＥＥＤデザインは、ＡＧおよびＧＡ  ＳＥＥＤ  ＣＨ３ドメインのホモ二量体化を回避しつつ、ＡＧ／ＧＡヘテロ二量体の効果的な生成を可能にする（Muda  M.ら、Protein  Eng.  Des.  Sel.（２０１１年、２４巻（５号）：４４７〜５４頁））。一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、２つの異なるＨＣのヘテロ二量体化を誘導するためにロイシンジッパーを使用する、ＬｕＺ−Ｙ形態におけるものである（Wranik,  BJ.ら、J.  Biol.  Chem.（２０１２年）、２８７巻：４３３３１〜９頁）。
【０１１４】
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、Ｃｏｖ−Ｘ−Ｂｏｄｙ形態におけるものである。二重特異性ＣｏｖＸ−Ｂｏｄｙでは、分枝状のアゼチジノンリンカーを使用して２つの異なるペプチドをひとつに結合させ、温和な条件下にてスキャフォールド抗体に部位特異的様式で融合させる。機能的活性に関与するのはファルマコフォアだが、抗体スキャフォールドは長い半減期およびＩｇ様の分布をもたらす。最適化された、または独特の二重特異性抗体を生成するために、ファルマコフォアは化学的に最適化するか、または他のファルマコフォアに置き換えることができる（Doppalapudi  VRら、PNAS（２０１０年）、１０７巻（５２号）；２２６１１〜２２６１６頁）。
【０１１５】
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、Ｆｃに融合した、標的１に結合するＦａｂと、標的２に結合するｓｃＦａｂとを含む、Ｏａｓｃ−Ｆａｂヘテロ二量体形態におけるものである。ヘテロ二量体化は、Ｆｃにおける突然変異によって確実になっている。
【０１１６】
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、抗原１および２に結合する２つの異なるＦａｂ、ならびにヘテロ二量体化突然変異によって安定化されたＦｃを含有するヘテロ二量体構築物である、ＤｕｅｔＭａｂ形態におけるものである。Ｆａｂ１および２は、ＬＣおよびＨＣの正確な対合を確実にする特異なＳ−Ｓ架橋を含有する。
【０１１７】
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、ヘテロ二量体化によって安定化されたＦｃに融合した、標的１および２に結合する２つの異なるＦａｂを有するヘテロ二量体構築物である、ＣｒｏｓｓｍＡｂ形態におけるものである。ＣＬドメインおよびＣＨ１ドメインと、ＶＨドメインおよびＶＬドメインとが切り換わっており、例えば、ＣＨ１は、ＶＬとインラインで融合しており、ＣＬは、ＶＨとインラインで融合している。
【０１１８】
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、抗原２に結合するＦａｂが、抗原１に結合するＦａｂのＨＣのＮ末端に融合しているホモ二量体構築物である、Ｆｉｔ−Ｉｇ形態におけるものである。この構築物は、野生型Ｆｃを含有する。
【０１１９】
表１は、組み合わせてＮＫＧ２Ｄと結合することができる重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのペプチド配列を記載している。
【表１−１】
2020506971.tif 000003
【表１−２】
2020506971.tif 000004
【表１−３】
2020506971.tif 000005
【表１−４】
2020506971.tif 000006
【表１−５】
2020506971.tif 000007
【表１−６】
2020506971.tif 000008
【０１２０】
代替的に、ＵＳ９，２７３，１３６において説明されているように、配列番号６９によって定義される重鎖可変ドメインを、配列番号７０によって定義される軽鎖可変ドメインと対合させて、ＮＫＧ２Ｄに結合することができる抗原結合部位を形成してもよい。
【化１】
2020506971.tif 000009
【化２】
2020506971.tif 000010
【０１２１】
代替的に、ＵＳ７，８７９，９８５において説明されているように、配列番号７１によって定義される重鎖可変ドメインを、配列番号７２によって定義される軽鎖可変ドメインと対合させて、ＮＫＧ２Ｄに結合することができる抗原結合部位を形成してもよい。
【化３】
2020506971.tif 000011
【０１２２】
Ｆｃドメイン内で、ＣＤ１６結合はヒンジ領域およびＣＨ２ドメインによって媒介される。例えば、ヒトＩｇＧ１内で、ＣＤ１６との相互作用は主に、アミノ酸残基Ａｓｐ２６５〜Ｇｌｕ２６９、Ａｓｎ２９７〜Ｔｈｒ２９９、Ａｌａ３２７〜Ｉｌｅ３３２、Ｌｅｕ２３４〜Ｓｅｒ２３９、およびＣＨ２ドメインにおける炭水化物残基Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンに焦点が当てられている（Sondermannら、Nature、４０６巻（６７９３号）：２６７〜２７３頁を参照されたい）。既知のドメインに基づいて、突然変異は、ファージディスプレイライブラリもしくは酵母表面ディスプレイｃＤＮＡライブラリを使用することなどによって、ＣＤ１６に対する結合親和性を増強もしくは低減させるように選択され得るか、または相互作用の既知の三次元構造に基づいてデザインされ得る。
【０１２３】
ヘテロ二量体抗体重鎖の構築は、同じ細胞内で２つの異なる抗体重鎖配列を発現させることによって達成することができ、これにより、各抗体重鎖のホモ二量体の構築およびヘテロ二量体の構築をもたらすことができる。ヘテロ二量体の選択的構築の促進は、ＵＳ１３／４９４８７０、ＵＳ１６／０２８８５０、ＵＳ１１／５３３７０９、ＵＳ１２／８７５０１５、ＵＳ１３／２８９９３４、ＵＳ１４／７７３４１８、ＵＳ１２／８１１２０７、ＵＳ１３／８６６７５６、ＵＳ１４／６４７４８０、ＵＳ１４／８３０３３６に示されているように、各抗体重鎖定常領域のＣＨ３ドメイン内に異なる突然変異を組み込むことによって達成することができる。例えば、突然変異は、ヒトＩｇＧ１に基づき、これらの２つの鎖が互いに選択的にヘテロ二量体化することを可能にする第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド内にアミノ酸置換の異なる対を組み込んでいるＣＨ３ドメイン内で作製され得る。以下に例示したアミノ酸置換の位置は、Ｋａｂａｔにおけるように、すべてＥＵインデックスに従って番号付けしている。
【０１２４】
１つの状況では、第１のポリペプチドにおけるアミノ酸置換は、元のアミノ酸を、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）またはトリプトファン（Ｗ）から選択される、より大きなアミノ酸で置換し、第２のポリペプチドにおける少なくとも１つのアミノ酸置換は、元のアミノ酸を、より大きなアミノ酸置換（突出）が、より小さなアミノ酸置換（空洞）の表面に適合するように、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、またはバリン（Ｖ）から選択される、より小さなアミノ酸で置換する。例えば、一方のポリペプチドはＴ３６６Ｗ置換を組み込むことができ、他方のポリペプチドは、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖを含む３つの置換を組み込むことができる。
【０１２５】
本発明の抗体重鎖可変ドメインは、必要に応じて、ＣＨ１ドメインを有するまたは有さないヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含むＩｇＧ定常領域などの、抗体定常領域と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列と連結され得る。一部の実施形態では、定常領域のアミノ酸配列は、ヒトＩｇＧ１定常領域、ＩｇＧ２定常領域、ＩｇＧ３定常領域、またはＩｇＧ４定常領域などの、ヒト抗体定常領域と少なくとも９０％同一である。一部の他の実施形態では、定常領域のアミノ酸配列は、ウサギ、イヌ、ネコ、マウス、またはウマなどの別の哺乳動物由来の抗体定常領域と少なくとも９０％同一である。１つまたは複数の突然変異が、ヒトＩｇＧ１定常領域と比較して、例えば、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１および／またはＫ４３９において定常領域に組み込まれ得る。例示的な置換には、例えば、Ｑ３４７Ｅ、Ｑ３４７Ｒ、Ｙ３４９Ｓ、Ｙ３４９Ｋ、Ｙ３４９Ｔ、Ｙ３４９Ｄ、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｋ、Ｌ３５１Ｄ、Ｌ３５１Ｙ、Ｓ３５４Ｃ、Ｅ３５６Ｋ、Ｅ３５７Ｑ、Ｅ３５７Ｌ、Ｅ３５７Ｗ、Ｋ３６０Ｅ、Ｋ３６０Ｗ、Ｑ３６２Ｅ、Ｓ３６４Ｋ、Ｓ３６４Ｅ、Ｓ３６４Ｈ、Ｓ３６４Ｄ、Ｔ３６６Ｖ、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｍ、Ｔ３６６Ｋ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ｅ、Ｌ３６８Ａ、Ｌ３６８Ｄ、Ｋ３７０Ｓ、Ｎ３９０Ｄ、Ｎ３９０Ｅ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｆ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｔ３９４Ｆ、Ｔ３９４Ｗ、Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｖ、Ｓ４００Ｋ、Ｓ４００Ｒ、Ｄ４０１Ｋ、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｙ４０７Ｉ、Ｙ４０７Ｖ、Ｋ４０９Ｆ、Ｋ４０９Ｗ、Ｋ４０９Ｄ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ、Ｋ４３９Ｄ、およびＫ４３９Ｅが含まれる。
【０１２６】
ある特定の実施形態では、ヒトＩｇＧ１定常領域のＣＨ１に組み込まれ得る突然変異は、アミノ酸Ｖ１２５、Ｆ１２６、Ｐ１２７、Ｔ１３５、Ｔ１３９、Ａ１４０、Ｆ１７０、Ｐ１７１、および／またはＶ１７３であり得る。ある特定の実施形態では、ヒトＩｇＧ１定常領域のＣκに組み込まれ得る突然変異は、アミノ酸Ｅ１２３、Ｆ１１６、Ｓ１７６、Ｖ１６３、Ｓ１７４、および／またはＴ１６４であり得る。
【０１２７】
代替的に、アミノ酸置換は以下の表２にされる置換のセットから選択され得る。
【表２】
2020506971.tif 000012
【０１２８】
代替的に、アミノ酸置換は以下の表３に示される置換のセットから選択され得る。
【表３】
2020506971.tif 000013
【０１２９】
代替的に、アミノ酸置換は以下の表４に示される置換のセットから選択され得る。
【表４−１】
2020506971.tif 000014
【表４−２】
2020506971.tif 000015
【０１３０】
代替的に、各ポリペプチド鎖における少なくとも１つのアミノ酸置換は表５から選択され得る。
【表５】
2020506971.tif 000016
【０１３１】
代替的に、以下の表６における置換のセットから少なくとも１つのアミノ酸置換を選択してもよく、ここで「第１のポリペプチド」欄に示される位置は、任意の公知の負に帯電したアミノ酸によって置き換えられ、「第２のポリペプチド」欄に示される位置は、任意の公知の正に帯電したアミノ酸に置き換えられる。
【表６】
2020506971.tif 000017
【０１３２】
代替的に、以下の表７におけるセットから少なくとも１つのアミノ酸置換を選択してもよく、ここで「第１のポリペプチド」欄に示される位置は、任意の公知の負に帯電したアミノ酸によって置き換えられ、「第２のポリペプチド」欄に示される位置は、任意の公知の負に帯電したアミノ酸によって置き換えられる。
【表７】
2020506971.tif 000018
【０１３３】
代替的に、以下の表８におけるセットからアミノ酸置換を選択してもよい。
【表８】
2020506971.tif 000019
【０１３４】
代替的にまたは付加的に、ヘテロ多量体タンパク質の構造安定性は、第１または第２のポリペプチド鎖のいずれかにＳ３５４Ｃを導入し、反対のポリペプチド鎖にＹ３４９Ｃを導入することによって増加させることができ、これにより、２つのポリペプチドの界面内で人工ジスルフィド架橋が形成する。
【０１３５】
上記の多重特異性タンパク質は、当業者に周知の組換えＤＮＡ技術を使用して作製され得る。例えば、第１の免疫グロブリン重鎖をコードする第１の核酸配列を第１の発現ベクターにクローニングすることができ、第２の免疫グロブリン重鎖をコードする第２の核酸配列を第２の発現ベクターにクローニングすることができ、免疫グロブリン軽鎖をコードする第３の核酸配列を第３の発現ベクターにクローニングすることができ、第１、第２および第３の発現ベクターを一緒に宿主細胞に安定にトランスフェクトして多量体タンパク質を産生することができる。
【０１３６】
多重特異性タンパク質の最も高い収率を達成するために、第１、第２および第３の発現ベクターの異なる比率を調べて宿主細胞へのトランスフェクションのための最適比率を決定することができる。トランスフェクション後、限界希釈、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、顕微鏡法、またはＣｌｏｎｅｐｉｘなどの当技術分野において公知の方法を使用して、細胞バンク生成のために単一クローンを単離することができる。
【０１３７】
クローンは、バイオリアクタスケールアップに適した条件下で培養することができ、多重特異性タンパク質の発現を維持することができる。多重特異性タンパク質は、遠心分離、深層濾過、細胞溶解、均質化、凍結融解、親和性精製、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用交換クロマトグラフィー、およびミックスモードクロマトグラフィーを含む、当技術分野において公知の方法を使用して単離され、精製され得る。
ＩＩ．ＴｒｉＮＫＥＴの特徴
【０１３８】
ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインおよび腫瘍関連抗原に対する結合ドメインを含む、本明細書に記載のＴｒｉＮＫＥＴは、ヒトＮＫＧ２Ｄを発現する細胞に結合する。ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインおよび腫瘍関連抗原に対する結合ドメインを含む、ＴｒｉＮＫＥＴは、同じ腫瘍関連抗原結合ドメインを有するモノクローナル抗体のものと比較可能なレベルで腫瘍関連抗原に結合する。例えば、トラスツズマブ由来のＮＫＧ２Ｄ結合ドメインおよびＨＥＲ２結合ドメインを含むＴｒｉＮＫＥＴは、トラスツズマブのものと比較可能なレベルで細胞において発現されたＨＥＲ２に結合することができる。
【０１３９】
しかしながら、本明細書に記載のＴｒｉＮＫＥＴは、腫瘍成長を低減させ、がん細胞を殺傷するのにより有効である。例えば、ＨＥＲ２発現腫瘍／がん細胞を標的とする本開示のＴｒｉＮＫＥＴは、ＮＫＧ２Ｄに対するリガンドである、ＵＬＢＰ−６に連結したトラスツズマブに由来するｓｃＦｖから構築された一本鎖二重特異性分子であるＳＣ２．２よりも効果的である。ＳＣ２．２は、ＨＥＲ２＋がん細胞およびＮＫＧ２Ｄ＋ＮＫ細胞に同時に結合する。したがって、ＨＥＲ２＋がん細胞の数の減少におけるＳＣ２．２の有効性を調べた。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性化および細胞傷害性アッセイにより、ＳＣ２．２がＮＫ細胞を活性化させ、殺傷するのに有効であることが示された。しかしながら、ＳＣ２．２は、ＲＭＡ／Ｓ−ＨＥＲ２皮下腫瘍モデルにおいて有効性を示すことができなかった。ＳＣ２．２の有効性も、ＲＭＡ／Ｓ−ＨＥＲ２過剰発現同系マウスモデルを使用してｉｎ  ｖｉｖｏで試験した。このマウスモデルにおいて、ＳＣ２．２は、ビヒクル対照と比較して腫瘍成長の制御を示すことができなかった。したがって、ＳＣ２．２はＮＫ細胞を活性化させ、殺傷し、ＨＥＲ２＋がん細胞に結合するが、これらの特性はＨＥＲ２＋腫瘍成長を効果的に制御するには不十分であった。
【０１４０】
ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインおよび腫瘍関連抗原に対する結合ドメインを含む、本明細書に記載のＴｒｉＮＫＥＴは、抗原を発現する腫瘍細胞と共に培養すると初代ヒトＮＫ細胞を活性化させる。ＮＫ細胞の活性化は、ＣＤ１０７ａの脱顆粒およびＩＦＮγサイトカイン産生量の増加によって示される。さらに、腫瘍関連抗原結合ドメインを含むモノクローナル抗体と比較して、ＴｒｉＮＫＥＴは、抗原を発現する腫瘍細胞の存在下において、ヒトＮＫ細胞の優れた活性化を示す。例えば、モノクローナル抗体トラスツズマブと比較して、ＨＥＲ２結合ドメインを有する本開示のＴｒｉＮＫＥＴは、ＨＥＲ２発現がん細胞の存在下においてヒトＮＫ細胞の優れた活性化を有する。
【０１４１】
ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインおよび腫瘍関連抗原に対する結合ドメインを含む、本明細書に記載のＴｒｉＮＫＥＴは、抗原を発現する腫瘍細胞の存在下において、休止ヒトＮＫ細胞およびＩＬ−２活性化ヒトＮＫ細胞の活性を増強する。休止ＮＫ細胞は、ＩＬ−２活性化ＮＫ細胞よりも少ないバックグラウンドＩＦＮγ産生およびＣＤ１０７ａの脱顆粒を示した。ある特定の実施形態では、休止ＮＫ細胞は、ＩＬ−２活性化ＮＫ細胞と比較して、ＩＦＮγ産生およびＣＤ１０７ａの脱顆粒においてより大きな変化を示す。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２活性化ＮＫ細胞は、ＴｒｉＮＫＥＴでの刺激後、より多くのパーセンテージの細胞がＩＦＮγ＋；ＣＤ１０７ａ＋になることを示す。
【０１４２】
ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインおよび腫瘍関連抗原（ＣＤ２０、ＢＣＭＡ、およびＨＥＲ２を含む腫瘍関連抗原の非限定的な例）に対する結合ドメインを含む、本明細書に記載のＴｒｉＮＫＥＴは、抗原を発現する腫瘍細胞の存在下において、休止ヒトＮＫ細胞およびＩＬ−２活性化ヒトＮＫ細胞の細胞傷害活性を増強する。さらに、腫瘍関連抗原（ＣＤ２０、ＢＣＭＡ、およびＨＥＲ２を含む腫瘍関連抗原の非限定的な例）に対する結合ドメインを含む、ＴｒｉＮＫＥＴ（例えば、Ａ４０−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ａ４４−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ａ４９−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ｃ２６−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ｆ０４−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ｆ４３−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ｆ４７−ＴｒｉＮＫＥＴ、およびＦ６３−ＴｒｉＮＫＥＴ）は、同じ腫瘍関連抗原結合部位を含むモノクローナル抗体と比較して、腫瘍細胞に対する活性化ＮＫ細胞応答および休止ＮＫ細胞応答をより強力に指向する。ある特定の実施形態では、ＴｒｉＮＫＥＴは、同じ腫瘍抗原結合部位を含むモノクローナル抗体と比較して、中程度および低度の腫瘍抗原を発現する腫瘍細胞に対する利点を提示する。したがって、ＴｒｉＮＫＥＴを含む治療は、モノクローナル抗体治療よりも優れている可能性がある。
【０１４３】
ある特定の実施形態では、腫瘍関連抗原（ＣＤ２０、ＢＣＭＡ、およびＨＥＲ２を含む腫瘍関連抗原の非限定的な例）に対する結合ドメインを含む、本明細書に記載のＴｒｉＮＫＥＴ（例えば、Ａ４０−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ａ４４−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ａ４９−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ｃ２６−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ｆ０４−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ｆ４３−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ｆ４７−ＴｒｉＮＫＥＴ、およびＦ６３−ＴｒｉＮＫＥＴ）は、モノクローナル抗体と比較して、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を高発現するがん、またはＦｃＲのレベルが高い腫瘍微小環境に存在するがんを処置するのに有利である。モノクローナル抗体は、とりわけＡＤＣＣ、ＣＤＣ、食作用、およびシグナル遮断を含む複数の機構により、腫瘍成長に対するそれらの効果を発揮する。ＦｃγＲの中でも、ＣＤ１６がＩｇＧ  Ｆｃに対して最も低い親和性を有し、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）は、ＣＤ１６の約１０００倍強くＩｇＧ  Ｆｃに結合する高親和性ＦｃＲである。ＣＤ６４は通常、骨髄系列などの多くの造血系列で発現し、これらの細胞型に由来する腫瘍、例えば急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）で発現する場合がある。ＭＤＳＣおよび単球などの腫瘍に浸潤する免疫細胞もＣＤ６４を発現し、腫瘍微小環境に浸潤することが公知である。腫瘍による、または腫瘍微小環境におけるＣＤ６４の発現は、モノクローナル抗体療法に有害作用を及ぼし得る。抗体は高親和性受容体に優先的に結合するため、腫瘍微小環境でＣＤ６４が発現すると、これらの抗体がＮＫ細胞表面上のＣＤ１６と会合することが困難になる。ＴｒｉＮＫＥＴは、ＮＫ細胞の表面にある２つの活性化受容体を標的とすることにより、ＣＤ６４発現（腫瘍におけるものか腫瘍微小環境におけるものかを問わない）がモノクローナル抗体療法に及ぼす有害作用を克服することができる。ＮＫ細胞にある２つの活性化受容体の二重標的化により、ＮＫ細胞に対するより強い特異的結合がもたらされるため、腫瘍細胞におけるＣＤ６４発現にかかわらず、ＴｒｉＮＫＥＴは、あらゆる腫瘍細胞に対するヒトＮＫ細胞応答を媒介することができる。
【０１４４】
一部の実施形態では、腫瘍関連抗原（ＣＤ２０、ＢＣＭＡ、およびＨＥＲ２を含む腫瘍関連抗原の非限定的な例）に対する結合ドメインを含む、本明細書に記載のＴｒｉＮＫＥＴ（例えば、Ａ４０−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ａ４４−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ａ４９−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ｃ２６−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ｆ０４−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ｆ４３−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ｆ４７−ＴｒｉＮＫＥＴ、およびＦ６３−ＴｒｉＮＫＥＴ）は、オンターゲット・オフ腫瘍（on-target  off-tumor）副作用の低減によって、より良好な安全性プロファイルをもたらす。ナチュラルキラー細胞およびＣＤ８  Ｔ細胞が腫瘍細胞から正常な自己を認識する機構は異なるが、ＮＫ細胞およびＣＤ８  Ｔ細胞はいずれも、腫瘍細胞を直接的に溶解させることができる。ＮＫ細胞の活性は、活性化受容体（ＮＣＲ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１６など）および阻害性受容体（ＫＩＲ、ＮＫＧ２Ａなど）からのシグナルのバランスによって調節される。これらの活性化シグナルおよび阻害性シグナルのバランスにより、ＮＫ細胞が、ストレスを受けた自己細胞、ウイルスに感染した自己細胞、または形質転換した自己細胞から健康な自己細胞を判定することが可能になる。この「内蔵された」自己寛容機構は、正常で健康な組織をＮＫ細胞応答から保護するのに役立つ。この原理を拡大適用すると、ＮＫ細胞の自己寛容により、ＴｒｉＮＫＥＴが、腫瘍外の副作用を伴わず、または治療域の増加を伴って、自己および腫瘍の両方で発現する抗原を標的とすることが可能になる。ナチュラルキラー細胞とは異なり、Ｔ細胞は、活性化およびエフェクター機能のために、ＭＨＣ分子によって提示される特定のペプチドの認識を必要とする。Ｔ細胞は免疫療法の主要な標的であり、腫瘍に対するＴ細胞応答を再指向するために多くの方策が立てられてきた。Ｔ細胞二重特異性薬、チェックポイント阻害剤、およびＣＡＲ−Ｔ細胞はすべてＦＤＡに承認されているが、用量制限毒性を有することが多い。Ｔ細胞二重特異性薬およびＣＡＲ−Ｔ細胞は、結合ドメインを使用して腫瘍細胞の表面にある抗原を標的とすること、および工学操作されたシグナル伝達ドメインを使用して活性化シグナルをエフェクター細胞に伝達することにより、ＴＣＲ−ＭＨＣ認識システムを回避する。これらの療法は、抗腫瘍免疫応答を誘発するのに効果的ではあるが、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）およびオンターゲット・オフ腫瘍副作用を伴うことが多い。これに関連して、ＴｒｉＮＫＥＴが独特であるのは、ＮＫ細胞の活性化および阻害の天然のシステムを「無効化」しないからである。むしろＴｒｉＮＫＥＴは、このバランスを傾け、ＮＫの健康な自己に対する寛容性を維持しながら、さらなる活性化シグナルをＮＫ細胞にもたらすようにデザインされている。
【０１４５】
一部の実施形態では、腫瘍関連抗原（ＣＤ２０、ＢＣＭＡ、およびＨＥＲ２を含む腫瘍関連抗原の非限定的な例）に対する結合ドメインを含む、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（例えば、Ａ４０−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ａ４４−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ａ４９−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ｃ２６−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ｆ０４−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ｆ４３−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ｆ４７−ＴｒｉＮＫＥＴ、およびＦ６３−ＴｒｉＮＫＥＴ）を含む本明細書に記載のＴｒｉＮＫＥＴは、同じ腫瘍抗原結合ドメインを含むモノクローナル抗体より効果的に腫瘍の進行を遅延させる。一部の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインおよび腫瘍抗原結合ドメインを含むＴｒｉＮＫＥＴは、同じ腫瘍抗原結合ドメインを含むモノクローナル抗体よりがん転移に対して効果的である。
【０１４６】
上記の説明は本発明の複数の態様および実施形態を記載している。本出願は特に、態様および実施形態のすべての組合せおよび置換を意図する。
ＩＩＩ．治療用途
【０１４７】
本発明は、腫瘍関連抗原（ＣＤ２０、ＢＣＭＡ、およびＨＥＲ２を含む腫瘍関連抗原の非限定的な例）に対する結合ドメインを含む、本明細書に記載の多重特異性結合タンパク質（例えば、Ａ４０−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ａ４４−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ａ４９−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ｃ２６−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ｆ０４−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ｆ４３−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ｆ４７−ＴｒｉＮＫＥＴ、およびＦ６３−ＴｒｉＮＫＥＴ）および／または本明細書に記載の医薬組成物を使用してがんを処置するための方法を提供する。方法は、固形腫瘍、リンパ腫、および白血病を含む、様々ながんを処置するために使用され得る。処置されるがんの種類は、望ましくは、多重特異性結合タンパク質が結合するがん細胞の種類と一致する。例えば、多重特異性結合タンパク質に結合する、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）を発現する結腸がんなどの、ＥｐＣＡＭを発現するがんの処置は、望ましくは、本明細書に記載の多重特異性結合タンパク質を使用して処置される。治療方法のさらなる態様および実施形態を以下に記載する。
【０１４８】
したがって、本発明の一態様は、がんを処置するために腫瘍関連抗原（ＣＤ２０、ＢＣＭＡ、およびＨＥＲ２を含む腫瘍関連抗原の非限定的な例）に対する結合ドメインを含む、本明細書に記載の治療有効量の多重特異性結合タンパク質（例えば、Ａ４０−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ａ４４−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ａ４９−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ｃ２６−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ｆ０４−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ｆ４３−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ｆ４７−ＴｒｉＮＫＥＴ、およびＦ６３−ＴｒｉＮＫＥＴ）を、それを必要とする患者に投与することを含む、患者におけるがんを処置する方法を提供する。処置のための例示的ながんには、固形腫瘍、白血病、およびリンパ腫が含まれる。
【０１４９】
治療方法は、処置されるがんによって特徴付けられ得る。例えば、特定の実施形態では、がんは固形腫瘍である。ある特定の他の実施形態では、がんは、脳がん、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、白血病、肺がん、肝がん、黒色腫、卵巣がん、膵がん、前立腺がん、直腸がん、腎がん、胃がん、精巣がん、または子宮がんである。さらに他の実施形態では、がんは、血管新生化腫瘍、扁平上皮癌、腺癌、小細胞癌、黒色腫、神経膠腫、神経芽細胞腫、肉腫（例えば、血管肉腫または軟骨肉腫）、喉頭がん、耳下腺がん、胆道がん（bilary  tract  cancer）、甲状腺がん、末端黒子型黒色腫、日光角化症、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、腺様嚢胞癌（adenoid  cycstic  carcinoma）、腺腫、腺肉腫、腺扁平上皮癌、肛門管がん、肛門がん、肛門直腸がん、星細胞系腫瘍、バルトリン腺癌、基底細胞癌、胆管がん、骨がん、骨髄がん、気管支がん、気管支腺癌、カルチノイド、胆管細胞癌、軟骨肉腫（chondosarcoma）、脈絡叢乳頭腫（choriod  plexus  papilloma）／細胞腫、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、明細胞癌、結合組織がん、嚢胞腺腫、消化器系がん、十二指腸がん、内分泌系がん、卵黄嚢腫瘍、子宮内膜増殖症、子宮内膜間質肉腫、類内膜腺癌、内皮細胞がん、上衣がん、上皮細胞がん、ユーイング肉腫、眼および眼窩のがん、女性性器がん、限局性結節性過形成、胆嚢がん、胃噴門がん、胃底部がん、ガストリン産生腫瘍、神経膠芽腫、グルカゴン産生腫瘍、心臓がん、血管芽腫（hemangiblastoma）、血管内皮腫、血管腫、肝腺腫、肝腺腫症、肝胆道がん、肝細胞癌、ホジキン病、回腸がん、インスリノーマ、上皮内新生物（intaepithelial  neoplasia）、上皮間扁平細胞新生物（interepithelial  squamous  cell  neoplasia）、肝内胆管がん、浸潤性扁平上皮癌、空腸がん、関節がん、カポジ肉腫、骨盤がん、大細胞癌、大腸がん、平滑筋肉腫、悪性黒子由来黒色腫、リンパ腫、男性生殖器がん、悪性黒色腫、悪性中皮腫、髄芽腫、髄上皮腫、髄膜がん、中皮がん、転移性癌、口がん、粘表皮癌、多発性骨髄腫、筋肉がん、鼻腔がん、神経系がん、神経上皮腺癌結節性黒色腫、非上皮性皮膚がん、非ホジキンリンパ腫、燕麦細胞癌、乏突起膠細胞がん、口腔がん、骨肉腫、漿液性乳頭腺がん、陰茎がん、咽頭がん、下垂体腫瘍、形質細胞腫、偽肉腫、肺芽腫、直腸がん、腎細胞癌、呼吸器系がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、漿液性細胞腫、副鼻腔がん、皮膚がん、小細胞癌、小腸がん、平滑筋がん、軟部組織がん、ソマトスタチン分泌腫瘍、脊椎がん、扁平上皮癌、横紋筋がん、中皮下がん、表在拡大型黒色腫、Ｔ細胞白血病、舌がん、未分化癌、尿管がん、尿道がん、膀胱がん、泌尿器系がん、子宮頸部がん、子宮体がん、ぶどう膜黒色腫、膣がん、疣状癌、ＶＩＰ産生腫瘍、外陰部がん、高分化癌、またはウィルムス腫瘍である。
【０１５０】
ある特定の他の実施形態では、がんは、Ｂ細胞リンパ腫またはＴ細胞リンパ腫などの非ホジキンリンパ腫である。ある特定の実施形態では、非ホジキンリンパ腫は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、縦隔原発Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、有毛細胞白血病、または原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫などのＢ細胞リンパ腫である。ある特定の他の実施形態では、非ホジキンリンパ腫は、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、節外性ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫、腸症型Ｔ細胞リンパ腫、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、または末梢Ｔ細胞リンパ腫などのＴ細胞リンパ腫である。
【０１５１】
処置されるがんは、がん細胞の表面で発現する特定の抗原の存在によって特徴付けられ得る。ある特定の実施形態では、がん細胞は、以下：ＨＥＲ２、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＢＣＭＡ、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ２、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ７０、ＥＧＦＲ／ＥＲＢＢ１、ＩＧＦ１Ｒ、ＨＥＲ３／ＥＲＢＢ３、ＨＥＲ４／ＥＲＢＢ４、ＭＵＣ１、ｃＭＥＴ、ＳＬＡＭＦ７、ＰＳＣＡ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＣＴＬＡ４、およびＰＤ１のうちの１つまたは複数を発現する。
【０１５２】
ある特定の実施形態では、本開示のタンパク質は、腫瘍関連抗原（ＣＤ２０、ＢＣＭＡ、およびＨＥＲ２を含む腫瘍関連抗原の非限定的な例）に対する結合ドメインを含む、本開示のタンパク質（例えば、Ａ４０−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ａ４４−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ａ４９−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ｃ２６−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ｆ０４−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ｆ４３−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ｆ４７−ＴｒｉＮＫＥＴ、およびＦ６３−ＴｒｉＮＫＥＴ）に腫瘍またはがん細胞およびナチュラルキラー細胞を曝露することによって、腫瘍細胞死（溶解、殺傷、アブレーション、生存または細胞増殖の低減などと同義）を直接的もしくは間接的に増強する方法、または腫瘍細胞死（溶解、殺傷、アブレーション、生存または細胞増殖の低減などと同義）を直接的もしくは間接的に増強する方法に使用するための医薬の製造において使用される。上記のように、タンパク質に応答する腫瘍細胞は、タンパク質の第２の抗原結合部位が結合する腫瘍関連抗原を発現する。例えば、例示的な実施形態では、Ｃ２６−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＣＤ２０は、ＣＤ２０発現腫瘍またはがん細胞（休止または活性化のいずれか）を標的とするために使用され、別の例示的な実施形態では、Ｃ２６−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＭＣＡは、ＢＭＣＡ発現腫瘍またはがん細胞（休止または活性化のいずれか）を標的とするために使用される。
【０１５３】
ある特定の実施形態では、本開示のタンパク質は、それを必要とする対象におけるがんを処置する方法、またはそれを必要とする対象におけるがんを処置する方法に使用するための医薬の製造において使用され、この方法は、腫瘍関連抗原（ＣＤ２０、ＢＣＭＡ、およびＨＥＲ２を含む腫瘍関連抗原の非限定的な例）に対する結合ドメインを含む、本開示のタンパク質（例えば、Ａ４０−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ａ４４−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ａ４９−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ｃ２６−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ｆ０４−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ｆ４３−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ｆ４７−ＴｒｉＮＫＥＴ、およびＦ６３−ＴｒｉＮＫＥＴ）を含むタンパク質または製剤の対象への投与を含む。上記のように、タンパク質に応答するがん細胞は、タンパク質の第２の抗原結合部位が結合する腫瘍関連抗原を発現する。例えば、例示的な実施形態では、Ｃ２６−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＣＤ２０はＣＤ２０発現がん細胞（休止または活性化のいずれか）を標的とするために使用され、別の例示的な実施形態では、Ｃ２６−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＭＣＡはＢＭＣＡ発現腫瘍またはがん細胞（休止または活性化のいずれか）を標的とするために使用される。
ＩＶ．併用療法
【０１５４】
本発明の別の態様は併用療法を提供する。本明細書に記載の多重特異性結合タンパク質は、がんを処置するためにさらなる治療剤と組み合わせて使用される。
【０１５５】
がんを処置する際の併用療法の一部として使用され得る例示的な治療剤には、例えば、放射線、マイトマイシン、トレチノイン、リボムスチン、ゲムシタビン、ビンクリスチン、エトポシド、クラドリビン、ミトブロニトール、メトトレキサート、ドキソルビシン、カルボコン、ペントスタチン、ニトラクリン、ジノスタチン、セトロレリクス、レトロゾール、ラルチトレキセド、ダウノルビシン、ファドロゾール、フォテムスチン、チマルファシン、ソブゾキサン、ネダプラチン、シタラビン、ビカルタミド、ビノレルビン、ベスナリノン、アミノグルテチミド、アムサクリン、プログルミド、酢酸エリプチニウム、ケタンセリン、ドキシフルリジン、エトレチナート、イソトレチノイン、ストレプトゾシン、ニムスチン、ビンデシン、フルタミド、ドロゲニル、ブトシン、カルモフール、ラゾキサン、シゾフィラン、カルボプラチン、ミトラクトール、テガフール、イホスファミド、プレドニムスチン、ピシバニール、レバミゾール、テニポシド、インプロスルファン、エノシタビン、リスリド、オキシメトロン、タモキシフェン、プロゲステロン、メピチオスタン、エピチオスタノール、ホルメスタン、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−２アルファ、インターフェロン−ベータ、インターフェロン−ガンマ、コロニー刺激因子−１、コロニー刺激因子−２、デニロイキンディフティトックス、インターロイキン−２、黄体形成ホルモン放出因子、ならびにその同種受容体に対して特異な結合、および増加したまたは減少した血清半減期を示し得る上述の薬剤の変形型が含まれる。
【０１５６】
がんを処置する際の併用療法の一部として使用され得る薬剤のさらなるクラスは免疫チェックポイント阻害剤である。例示的な免疫チェックポイント阻害剤には、（ｉ）細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）、（ｉｉ）プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）、（ｉｉｉ）ＰＤＬ１、（ｉｖ）ＬＡＧ３、（ｖ）Ｂ７−Ｈ３、（ｖｉ）Ｂ７−Ｈ４、および（ｖｉｉ）ＴＩＭ３のうちの１つまたは複数を阻害する薬剤が含まれる。ＣＴＬＡ４阻害剤であるイピリムマブは、黒色腫を処置するために米国食品医薬品局によって承認されている。
【０１５７】
がんを処置する際に併用療法の一部として使用され得るさらに他の薬剤は、非チェックポイント標的を標的とするモノクローナル抗体薬剤（例えば、ハーセプチン）および非細胞傷害剤（例えば、チロシンキナーゼ阻害剤）である。
【０１５８】
抗がん剤のさらに他のカテゴリーには、例えば、（ｉ）ＡＬＫ阻害剤、ＡＴＲ阻害剤、Ａ２Ａアンタゴニスト、塩基除去修復阻害剤、Ｂｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼ阻害剤、ブルトン型チロシンキナーゼ阻害剤、ＣＤＣ７阻害剤、ＣＨＫ１阻害剤、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤、ＤＮＡ−ＰＫおよびｍＴＯＲの両方の阻害剤、ＤＮＭＴ１阻害剤、ＤＮＭＴ１阻害剤＋２−クロロ−デオキシアデノシン、ＨＤＡＣ阻害剤、ヘッジホッグシグナル伝達経路阻害剤、ＩＤＯ阻害剤、ＪＡＫ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＭＥＬＫ阻害剤、ＭＴＨ１阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、ホスホイノシチド３−キナーゼ阻害剤、ＰＡＲＰ１およびＤＨＯＤＨの両方の阻害剤、プロテアソーム阻害剤、トポイソメラーゼ−ＩＩ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、ＶＥＧＦＲ阻害剤、ならびにＷＥＥ１阻害剤から選択される阻害剤；（ｉｉ）ＯＸ４０、ＣＤ１３７、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＴＮＦＲＳＦ２５、またはＩＣＯＳのアゴニスト；ならびに（ｉｉｉ）ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＧ−ＣＳＦから選択されるサイトカインが含まれる。
【０１５９】
本発明のタンパク質はまた、原発病巣の外科的除去の補助として使用され得る。
【０１６０】
多重特異性結合タンパク質およびさらなる治療剤の量ならびに投与の相対的タイミングは、所望の併用療法効果を達成するために選択され得る。例えば、このような投与を必要とする患者に併用療法を投与する場合、組み合わせる治療剤、または治療剤を含む１つもしくは複数の医薬組成物は、例えば、連続的に、併せて、一緒に、同時になどの任意の順序で投与され得る。さらに、例えば、多重特異性結合タンパク質は、さらなる治療剤がその予防効果または治療効果を発揮する時間の間投与されてもよく、またはその逆であってもよい。
Ｖ．医薬組成物
【０１６１】
本開示はまた、腫瘍関連抗原（ＣＤ２０、ＢＣＭＡ、およびＨＥＲ２を含む腫瘍関連抗原の非限定的な例）に対する結合ドメインを含む、治療有効量の本明細書に記載のタンパク質（例えば、Ａ４０−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ａ４４−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ａ４９−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ｃ２６−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ｆ０４−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ｆ４３−ＴｒｉＮＫＥＴ、Ｆ４７−ＴｒｉＮＫＥＴ、およびＦ６３−ＴｒｉＮＫＥＴ）を含有する医薬組成物を特徴とする。組成物は、種々の薬物送達系で使用されるように製剤化することができる。適切な製剤を作るために、１種または複数の生理学的に許容される賦形剤または担体を組成物に含めることもできる。本開示で使用される好適な製剤は、Remington's  Pharmaceutical  Sciences、Mack  Publishing  Company、Philadelphia、Pa.、第１７版、１９８５年に見出される。薬物送達のための方法に関する簡潔な概説については、例えば、Langer（Science、２４９巻：１５２７〜１５３３頁、１９９０年）を参照されたい。
【０１６２】
本開示の静脈内薬物送達製剤は、バッグ、ペン、または注射器に含有されてもよい。ある特定の実施形態では、バッグはチューブおよび／または針を含むチャネルに接続されてもよい。ある特定の実施形態では、製剤は凍結乾燥製剤または液体製剤であってもよい。ある特定の実施形態では、製剤はフリーズドライ（凍結乾燥）されてもよく、約１２〜６０個のバイアルに含有されてもよい。ある特定の実施形態では、製剤はフリーズドライされてもよく、４５ｍｇのフリーズドライされた製剤が１個のバイアルに含有されてもよい。ある特定の実施形態では、約４０ｍｇ〜約１００ｍｇのフリーズドライされた製剤が１個のバイアルに含有されてもよい。ある特定の実施形態では、１２、２７、または４５個のバイアルからのフリーズドライされた製剤は、静脈内薬物製剤中に治療用量のタンパク質を得るために組み合わされてもよい。ある特定の実施形態では、製剤は液体製剤であってもよく、約２５０ｍｇ／バイアル〜約１０００ｍｇ／バイアルとして保存されてもよい。ある特定の実施形態では、製剤は液体製剤であってもよく、約６００ｍｇ／バイアルとして保存されてもよい。ある特定の実施形態では、製剤は液体製剤であってもよく、約２５０ｍｇ／バイアルとして保存されてもよい。
【０１６３】
本開示は、製剤を形成する緩衝溶液中に治療有効量のタンパク質を含む液体水性医薬製剤中に存在することができる。
【０１６４】
これらの組成物は従来の滅菌技術によって滅菌されてもよく、または濾過滅菌されてもよい。得られた水溶液はそのままで使用するためにパッケージ化されてもよく、または凍結乾燥されてもよく、凍結乾燥された調製物は投与前に滅菌水性担体と組み合わされる。調製物のｐＨは、典型的に、３から１１の間、より好ましくは５から９の間または６から８の間、最も好ましくは７から８の間、例えば７〜７．５である。得られた固形の組成物は複数の単回用量単位でパッケージ化されてもよく、各々は一定量の上述の１つまたは複数の薬剤を含有する。固形の組成物はまた、柔軟な量のための容器にパッケージ化されてもよい。
【０１６５】
ある特定の実施形態では、本開示は、マンニトール、クエン酸一水和物、クエン酸ナトリウム、リン酸二ナトリウム二水和物、リン酸二水素ナトリウム二水和物、塩化ナトリウム、ポリソルベート８０、水、および酸化ナトリウムと組み合わせて本開示のタンパク質を含む、延長された貯蔵寿命を有する製剤を提供する。
【０１６６】
ある特定の実施形態では、ｐＨ緩衝溶液中に本開示のタンパク質を含む水性製剤が調製される。本発明の緩衝液は、約４〜約８、例えば、約４．５〜約６．０、もしくは約４．８〜約５．５の範囲のｐＨを有してもよく、または約５．０〜約５．２のｐＨを有してもよい。上記に列挙したｐＨの中間の範囲も、本開示の一部であることが意図される。例えば、上限および／または下限として上記に列挙した値のいずれかの組合せを使用する値の範囲が含まれることが意図される。ｐＨをこの範囲内に制御する緩衝液の例には、酢酸塩（例えば、酢酸ナトリウム）、コハク酸塩（コハク酸ナトリウムなど）、グルコン酸塩、ヒスチジン、クエン酸塩および他の有機酸緩衝液が含まれる。
【０１６７】
ある特定の実施形態では、製剤は、ｐＨを約４〜約８の範囲に維持するためにクエン酸塩およびリン酸塩を含有する緩衝系を含む。ある特定の実施形態では、ｐＨの範囲は、約４．５〜約６．０、または約ｐＨ４．８〜約５．５、または約５．０〜約５．２のｐＨ範囲であってもよい。ある特定の実施形態では、緩衝系には、クエン酸一水和物、クエン酸ナトリウム、リン酸二ナトリウム二水和物、および／またはリン酸二水素ナトリウム二水和物が含まれる。ある特定の実施形態では、緩衝系は、約１．３ｍｇ／ｍｌのクエン酸（例えば、１．３０５ｍｇ／ｍｌ）、約０．３ｍｇ／ｍｌのクエン酸ナトリウム（例えば、０．３０５ｍｇ／ｍｌ）、約１．５ｍｇ／ｍｌのリン酸二ナトリウム二水和物（例えば、１．５３ｍｇ／ｍｌ）、約０．９ｍｇ／ｍｌのリン酸二水素ナトリウム二水和物（例えば、０．８６）、および約６．２ｍｇ／ｍｌの塩化ナトリウム（例えば、６．１６５ｍｇ／ｍｌ）を含む。ある特定の実施形態では、緩衝系は、１〜１．５ｍｇ／ｍｌのクエン酸、０．２５〜０．５ｍｇ／ｍｌのクエン酸ナトリウム、１．２５〜１．７５ｍｇ／ｍｌのリン酸二ナトリウム二水和物、０．７〜１．１ｍｇ／ｍｌのリン酸二水素ナトリウム二水和物、および６．０〜６．４ｍｇ／ｍｌの塩化ナトリウムを含む。ある特定の実施形態では、製剤のｐＨは水酸化ナトリウムを用いて調整される。
【０１６８】
トニシファイヤー（tonicifier）として作用し、抗体を安定化させることができるポリオールも、製剤に含めることができる。ポリオールは、製剤の所望の等張性に関して変化し得る量で製剤に添加される。ある特定の実施形態では、水性製剤は等張性であってもよい。添加されるポリオールの量も、ポリオールの分子量に関して変化し得る。例えば、二糖（トレハロースなど）と比較して、少量の単糖（例えば、マンニトール）が添加されてもよい。ある特定の実施形態では、等張化剤として製剤に使用され得るポリオールはマンニトールである。ある特定の実施形態では、マンニトール濃度は約５〜約２０ｍｇ／ｍｌであってもよい。ある特定の実施形態では、マンニトールの濃度は約７．５〜１５ｍｇ／ｍｌであってもよい。ある特定の実施形態では、マンニトールの濃度は約１０〜１４ｍｇ／ｍｌであってもよい。ある特定の実施形態では、マンニトールの濃度は約１２ｍｇ／ｍｌであってもよい。ある特定の実施形態では、ポリオールソルビトールを製剤に含めることができる。
【０１６９】
洗剤または界面活性剤もまた、製剤に添加してもよい。例示的な洗剤としては、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０、８０など）またはポロクサマー（例えば、ポロクサマー１８８）などの非イオン性洗剤が挙げられる。添加される洗剤の量は、製剤化された抗体の凝集を低減させ、かつ／または製剤中の微粒子の形成を最低限に抑え、かつ／または吸着を低減させるようなものである。ある特定の実施形態では、製剤は、ポリソルベートである界面活性剤を含み得る。ある特定の実施形態では、製剤は、洗剤のポリソルベート８０またはＴｗｅｅｎ  ８０を含有し得る。Ｔｗｅｅｎ  ８０は、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエートを表すために使用される用語である（Fiedler、Lexikon  der  Hifsstoffe、Editio  Cantor  Verlag  Aulendorf、第４版、１９９６年を参照されたい）。ある特定の実施形態では、製剤は、約０．１ｍｇ／ｍＬから約１０ｍｇ／ｍＬの間のポリソルベート８０、または約０．５ｍｇ／ｍＬから約５ｍｇ／ｍＬの間を含有し得る。ある特定の実施形態では、約０．１％のポリソルベート８０が製剤に添加され得る。
【０１７０】
実施形態では、本開示のタンパク質産物は、液体製剤として製剤化される。液体製剤は、ゴム栓で閉じ、アルミニウムクリンプシールクロージャで密封した、ＵＳＰ／Ｐｈ  ＥｕｒいずれかのタイプＩ  ５０Ｒバイアルにおいて、１０ｍｇ／ｍＬの濃度で提供され得る。栓は、ＵＳＰおよびＰｈ  Ｅｕｒに準拠したエラストマーで作られていてもよい。ある特定の実施形態では、６０ｍＬの採取容量を可能にするために、バイアルに６１．２ｍＬのタンパク質産物溶液が充填され得る。ある特定の実施形態では、液体製剤は、０．９％の生理食塩水で希釈され得る。
【０１７１】
ある特定の実施形態では、本開示の液体製剤は、安定化レベルで糖と組み合わせた１０ｍｇ／ｍＬ濃度溶液として調製され得る。ある特定の実施形態では、液体製剤は水性担体中で調製され得る。ある特定の実施形態では、安定剤は、静脈内投与に望ましくないまたは不適切な粘度をもたらし得る量以下の量で添加され得る。ある特定の実施形態では、糖は、二糖、例えば、スクロースであり得る。ある特定の実施形態では、液体製剤はまた、緩衝剤、界面活性剤、および保存剤のうちの１つまたは複数を含み得る。
【０１７２】
ある特定の実施形態では、液体製剤のｐＨは薬学的に許容される酸および／または塩基の添加によって設定され得る。ある特定の実施形態では、薬学的に許容される酸は塩酸であり得る。ある特定の実施形態では、塩基は水酸化ナトリウムであり得る。
【０１７３】
凝集に加えて、脱アミドは、発酵、採取／細胞清澄化、精製、薬物物質／薬物製品貯蔵の間および試料分析の間に発生し得るペプチドおよびタンパク質の一般的な産物のバリアントである。脱アミドは、加水分解を受け得るスクシンイミド中間体を形成するタンパク質からのＮＨ３の喪失である。スクシンイミド中間体は、親ペプチドの１７ダルトンの質量減少をもたらす。その後の加水分解は、１８ダルトンの質量増加をもたらす。スクシンイミド中間体の単離は、水性条件下での不安定性に起因して困難である。したがって、脱アミドは、典型的に１ダルトンの質量増加として検出可能である。アスパラギンの脱アミドは、アスパラギン酸またはイソアスパラギン酸のいずれかを生じる。脱アミドの速度に影響を及ぼすパラメータには、ｐＨ、温度、溶媒誘電率、イオン強度、一次配列、局所ポリペプチド立体配座および三次構造が含まれる。ペプチド鎖におけるＡｓｎに隣接するアミノ酸残基は、脱アミド化速度に影響を及ぼす。タンパク質配列におけるＡｓｎに続くＧｌｙおよびＳｅｒは、脱アミドに対してより高い感受性を生じる。
【０１７４】
ある特定の実施形態では、本開示の液体製剤は、タンパク質産物の脱アミノを阻止するためのｐＨおよび湿度の条件下で保存され得る。
【０１７５】
本明細書における目的の水性担体は、薬学的に許容され（ヒトへの投与に安全かつ無毒であり）、液体製剤の調製に有用であるものである。例示的な担体には、注射用滅菌水（ＳＷＦＩ）、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩水、リンガー液またはデキストロース溶液が含まれる。
【０１７６】
保存剤は必要に応じて、細菌作用を低減させるために本明細書における製剤に添加することができる。保存剤の添加は、例えば、多数回使用（複数回投与）製剤の製造を容易にすることができる。
【０１７７】
静脈内（ＩＶ）製剤は、患者が、移植後に入院しており、ＩＶ経路を介してすべての薬物を受けている場合などの特定の場合に好ましい投与経路であり得る。ある特定の実施形態では、液体製剤は、投与前に０．９％の塩化ナトリウム溶液により希釈される。ある特定の実施形態では、注射のための希釈された薬物製品は等張であり、静脈内注入による投与に適している。
【０１７８】
ある特定の実施形態では、塩または緩衝成分は１０ｍＭ〜２００ｍＭの量で添加することができる。塩および／または緩衝液は薬学的に許容され、「塩基形成」金属またはアミンを用いて種々の公知の酸（無機および有機）から誘導される。ある特定の実施形態では、緩衝液はリン酸緩衝液であり得る。ある特定の実施形態では、緩衝液は、グリシネート、炭酸、クエン酸緩衝液であってもよく、これらの場合、ナトリウム、カリウムまたはアンモニウムイオンが対イオンとして機能し得る。
【０１７９】
保存剤は必要に応じて、細菌作用を低減させるために本明細書における製剤に添加することができる。保存剤の添加は、例えば、多数回使用（複数回投与）製剤の製造を容易にすることができる。
【０１８０】
本明細書における目的の水性担体は、薬学的に許容され（ヒトへの投与に安全かつ無毒であり）、液体製剤の調製に有用であるものである。例示的な担体には、注射用滅菌水（ＳＷＦＩ）、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩水、リンガー液またはデキストロース溶液が含まれる。
【０１８１】
本開示は、タンパク質およびリオプロテクタントを含む凍結乾燥製剤として存在することもできる。リオプロテクタントは糖、例えば二糖であり得る。ある特定の実施形態では、リオプロテクタント（lycoprotectant）は、スクロースまたはマルトースであり得る。凍結乾燥製剤は、緩衝剤、界面活性剤、増量剤、および／または保存剤のうちの１つまたは複数を含んでもよい。
【０１８２】
凍結乾燥された薬物製品の安定化に有用なスクロースまたはマルトースの量は、少なくとも１：２のタンパク質対スクロースまたはマルトースの重量比であり得る。ある特定の実施形態では、タンパク質対スクロースまたはマルトースの重量比は１：２〜１：５であり得る。
【０１８３】
ある特定の実施形態では、凍結乾燥前の製剤のｐＨは、薬学的に許容される酸および／または塩基の添加によって設定され得る。ある特定の実施形態では、薬学的に許容される酸は塩酸であり得る。ある特定の実施形態では、薬学的に許容される塩基は水酸化ナトリウムであり得る。
【０１８４】
凍結乾燥前に、本開示のタンパク質を含有する溶液のｐＨは６から８の間に調整され得る。ある特定の実施形態では、凍結乾燥した薬物製品についてのｐＨ範囲は７〜８であり得る。
【０１８５】
ある特定の実施形態では、塩または緩衝成分は１０ｍＭ〜２００ｍＭの量で添加することができる。塩および／または緩衝液は薬学的に許容され、「塩基形成」金属またはアミンを用いて種々の公知の酸（無機および有機）から誘導される。ある特定の実施形態では、緩衝液はリン酸緩衝液であり得る。ある特定の実施形態では、緩衝液は、グリシネート、炭酸、クエン酸緩衝液であってもよく、これらの場合、ナトリウム、カリウムまたはアンモニウムイオンが対イオンとして機能し得る。
【０１８６】
ある特定の実施形態では、「増量剤」を添加することができる。「増量剤」は、凍結乾燥混合物に質量を付加し、凍結乾燥ケーキの物理的構造に寄与する（例えば、開放気孔構造を維持する本質的に均一な凍結乾燥ケーキの製造を容易にする）化合物である。例示的な増量剤には、マンニトール、グリシン、ポリエチレングリコールおよびソルビトールが含まれる。本発明の凍結乾燥製剤はこのような増量剤を含有し得る。
【０１８７】
保存剤は必要に応じて、細菌作用を低減させるために本明細書における製剤に添加することができる。保存剤の添加は、例えば、多数回使用（複数回投与）製剤の製造を容易にすることができる。
【０１８８】
ある特定の実施形態では、凍結乾燥薬物製品は水性担体で構成され得る。本明細書における目的の水性担体は、薬学的に許容され（例えば、ヒトへの投与に安全かつ無毒であり）、凍結乾燥後、液体製剤の調製に有用であるものである。例示的な希釈剤には、注射用滅菌水（ＳＷＦＩ）、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩水、リンガー液またはデキストロース溶液が含まれる。
【０１８９】
ある特定の実施形態では、本開示の凍結乾燥薬物製品は、注射用滅菌水、ＵＳＰ（ＳＷＦＩ）または０．９％の塩化ナトリウム注射液、ＵＳＰのいずれかで再構成される。再構成の間、凍結乾燥粉末は溶液に溶解する。
【０１９０】
ある特定の実施形態では、本開示の凍結乾燥タンパク質製品は、約４．５ｍＬの注射用水に構成され、０．９％の生理食塩水溶液（塩化ナトリウム溶液）により希釈される。
【０１９１】
本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投薬量レベルは、患者に毒性を生じず、特定の患者、組成物、および投与様式に対して所望の治療応答を達成するのに有効である活性成分の量を得るように変化し得る。
【０１９２】
特定の用量は、各患者に対して均一な用量、例えば、５０〜５０００ｍｇのタンパク質であってもよい。代替的に、患者の用量は、患者のおおよその体重または表面積に合わせられ得る。適切な投薬量を決定する際の他の要因には、処置または予防される疾患または状態、疾患の重症度、投与経路、ならびに患者の年齢、性別および医学的状態が含まれ得る。処置のための適切な投薬量を決定するために必要な計算のさらなる改良は、特に、本明細書に開示される投薬量情報およびアッセイを考慮して当業者によって慣用的になされる。投薬量はまた、適切な用量応答データと併せて使用される投薬量を決定するための公知のアッセイの使用によって決定することができる。個々の患者の投薬量は、疾患の進行がモニターされるにつれて調節されてもよい。患者における標的化可能な構築物または複合物の血中レベルは、有効濃度に達するか、または有効濃度を維持するように投薬量が調節される必要があるかどうかを調べるために測定され得る。どの標的化可能な構築物および／または複合物、ならびにそれらの投薬量が、所与の個体に対して効果的である可能性が高いかを決定するために薬理ゲノム学が使用され得る（Schmitzら、Clinica  Chimica  Acta  ３０８巻：４３〜５３頁、２００１年；Steimerら、Clinica  Chimica  Acta  ３０８巻：３３〜４１頁、２００１年）。
【０１９３】
一般に、体重に基づく投薬量は、約０．０１μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、例えば、約０．０１μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約１００μｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約５０μｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約１０μｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約１μｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約０．１μｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ〜約１００μｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ〜約１０μｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ〜約１μｇ／ｋｇ体重、約１μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇ〜約１００μｇ／ｋｇ体重、約１μｇ〜約５０μｇ／ｋｇ体重、約１μｇ〜約１０μｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ〜約１００μｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ〜約５０μｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ〜約１００μｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１０ｍｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１０ｍｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約５０ｍｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重である。
【０１９４】
用量は、１日に１回もしくは複数回、１週間に１回もしくは複数回、１ヶ月に１回もしくは複数回または１年に１回もしくは複数回、またはさらに２〜２０年に１回与えられ得る。当業者は、体液または組織中の標的化可能な構築物または複合体の測定された滞留時間および濃度に基づいて投薬のための反復率を容易に推定することができる。本発明の投与は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、胸膜内、髄腔内、腔内であってもよく、カテーテルを介する潅流によってでもよく、または直接的な病巣内注射によってでもよい。これは、１日に１回または複数回、１週間に１回または複数回、１ヶ月に１回または複数回、および１年に１回または複数回、投与され得る。
【０１９５】
上記の説明は本発明の複数の態様および実施形態を記載している。本出願は特に、態様および実施形態のすべての組合せおよび置換を意図する。
【実施例】
【０１９６】
ここで概して記載されている本発明は、以下の実施例を参照することによってより容易に理解され、これらの実施例は本発明のある特定の態様および実施形態の例示の目的のためにのみ含まれ、本発明を限定することを意図していない。
（実施例１）
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインはＮＫＧ２Ｄに結合する
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインは精製した組換えＮＫＧ２Ｄに結合する
【０１９７】
ヒト、マウスまたはカニクイザルＮＫＧ２Ｄ細胞外ドメインの核酸配列を、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインをコードする核酸配列と融合させ、発現させる哺乳動物細胞に導入した。精製後、ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ融合タンパク質をマイクロプレートのウェルに吸着させた。非特異的結合を防ぐためにウシ血清アルブミンでウェルを阻止した後、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを滴定し、ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ融合タンパク質を予め吸着させたウェルに添加した。一次抗体結合を、西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートし、Ｆｃ交差反応を回避するためにヒトカッパ軽鎖を特異的に認識する二次抗体を使用して検出した。西洋ワサビペルオキシダーゼに対する基質である３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）をウェルに添加して結合シグナルを可視化し、その吸光度を４５０ｎＭにて測定し、５４０ｎＭにて補正した。ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインクローン、アイソタイプ対照または陽性対照（配列番号４５〜４８、またはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅにて入手可能な抗マウスＮＫＧ２ＤクローンＭＩ−６およびＣＸ−５から選択した）を各ウェルに添加した。
【０１９８】
アイソタイプ対照は組換えＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃタンパク質に対してわずかな結合を示したが、陽性対照が組換え抗原に対して最も強く結合した。クローン毎に親和性は異なったが、すべてのクローンによって産生されたＮＫＧ２Ｄ結合ドメインが、ヒト（図１４）、マウス（図１６）、およびカニクイザル（図１５）の組換えＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃタンパク質のすべてで結合を示した。概して、各抗ＮＫＧ２Ｄクローンは、ヒト（図１４）およびカニクイザル（図１５）の組換えＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃに同様の親和性で結合したが、マウス（図１６）の組換えＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃに対する親和性は比較的低かった。
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインはＮＫＧ２Ｄを発現する細胞に結合する
【０１９９】
ＥＬ４マウスリンパ腫細胞株を、ヒトまたはマウスのＮＫＧ２Ｄ−ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインキメラ抗原受容体を発現するように工学操作した。ＮＫＧ２Ｄ結合クローン、アイソタイプ対照または陽性対照を１００ｎＭ濃度にて使用して、ＥＬ４細胞において発現した細胞外ＮＫＧ２Ｄを染色した。フルオロフォアコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ二次抗体を使用して抗体結合を検出した。細胞をフローサイトメトリーによって分析し、親ＥＬ４細胞と比較したＮＫＧ２Ｄ発現細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を使用してバックグラウンドに対する倍率（ＦＯＢ）を計算した。
【０２００】
すべてのクローンによって産生されたＮＫＧ２Ｄ結合ドメインが、ヒトおよびマウスのＮＫＧ２Ｄを発現するＥＬ４細胞に結合した。陽性対照抗体（配列番号４５〜４８、またはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅにて入手可能な抗マウスＮＫＧ２ＤクローンＭＩ−６およびＣＸ−５から選択される）が最も良好なＦＯＢ結合シグナルをもたらした。各クローンのＮＫＧ２Ｄ結合親和性は、ヒトＮＫＧ２Ｄを発現する細胞（図１７）とマウスＮＫＧ２Ｄを発現する細胞（図１８）との間で同様であった（それぞれ図１７〜１８）。
（実施例２）
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインはＮＫＧ２Ｄへの天然リガンドの結合を阻止する
ＵＬＢＰ−６との競合
【０２０１】
組換えヒトＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃタンパク質をマイクロプレートのウェルに吸着させ、非特異的結合を低減させるためにウシ血清アルブミンでウェルを阻止した。飽和濃度のＵＬＢＰ−６−Ｈｉｓ−ビオチンをウェルに添加し、続いてＮＫＧ２Ｄ結合ドメインクローンを添加した。２時間のインキュベーション後、ウェルを洗浄し、ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃでコーティングされたウェルに結合したままであったＵＬＢＰ−６−Ｈｉｓ−ビオチンを、西洋ワサビペルオキシダーゼおよびＴＭＢ基質とコンジュゲートしたストレプトアビジンによって検出した。吸光度を４５０ｎＭにて測定し、５４０ｎＭにて補正した。バックグラウンドを差し引いた後、ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃタンパク質へのＮＫＧ２Ｄ結合ドメインの特異的結合を、ウェル中のＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃタンパク質への結合を阻止されたＵＬＢＰ−６−Ｈｉｓ−ビオチンのパーセンテージから計算した。陽性対照抗体（配列番号４５〜４８から選択される）および種々のＮＫＧ２Ｄ結合ドメインは、ＮＫＧ２ＤへのＵＬＢＰ−６結合を阻止したが、アイソタイプ対照はＵＬＢＰ−６との競合をほとんど示さなかった（図１９）。
ＭＩＣＡとの競合
【０２０２】
組換えヒトＭＩＣＡ−Ｆｃタンパク質をマイクロプレートのウェルに吸着させ、非特異的結合を低減させるためにウシ血清アルブミンでウェルを阻止した。ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ−ビオチンをウェルに添加し、続いてＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを添加した。インキュベーションおよび洗浄後、ＭＩＣＡ−Ｆｃでコーティングされたウェルに結合したままであったＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ−ビオチンを、ストレプトアビジン−ＨＲＰおよびＴＭＢ基質を使用して検出した。吸光度を４５０ｎＭにて測定し、５４０ｎＭにて補正した。バックグラウンドを差し引いた後、ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃタンパク質へのＮＫＧ２Ｄ結合ドメインの特異的結合を、ＭＩＣＡ−Ｆｃでコーティングされたウェルへの結合を阻止されたＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ−ビオチンのパーセンテージから計算した。陽性対照抗体（配列番号４５〜４８から選択される）および種々のＮＫＧ２Ｄ結合ドメインはＮＫＧ２ＤへのＭＩＣＡ結合を阻止したが、アイソタイプ対照はＭＩＣＡとの競合をほとんど示さなかった（図２０）。
Ｒａｅ−１デルタとの競合
【０２０３】
組換えマウスＲａｅ−１デルタ−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した）をマイクロプレートのウェルに吸着させ、非特異的結合を低減させるためにウェルをウシ血清アルブミンで阻止した。マウスＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ−ビオチンをウェルに添加し、続いてＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを添加した。インキュベーションおよび洗浄後、Ｒａｅ−１デルタ−Ｆｃでコーティングされたウェルに結合したままであったＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ−ビオチンを、ストレプトアビジン−ＨＲＰおよびＴＭＢ基質を使用して検出した。吸光度を４５０ｎＭにて測定し、５４０ｎＭにて補正した。バックグラウンドを差し引いた後、ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃタンパク質へのＮＫＧ２Ｄ結合ドメインの特異的結合を、Ｒａｅ−１デルタ−Ｆｃでコーティングされたウェルへの結合を阻止されたＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ−ビオチンのパーセンテージから計算した。陽性対照抗体（配列番号４５〜４８、またはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅにて入手可能な抗マウスＮＫＧ２ＤクローンＭＩ−６およびＣＸ−５から選択される）および種々のＮＫＧ２Ｄ−結合ドメインクローンはマウスＮＫＧ２ＤへのＲａｅ−１デルタ結合を阻止したが、アイソタイプ対照抗体はＲａｅ−１デルタとの競合をほとんど示さなかった（図２１）。
（実施例３）
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインクローンはＮＫＧ２Ｄを活性化させる
【０２０４】
ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインをコードする核酸配列に、ヒトおよびマウスＮＫＧ２Ｄの核酸配列を融合させて、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）構築物を得た。次に、ギブソンアセンブリを使用してＮＫＧ２Ｄ−ＣＡＲ構築物をレトロウイルスベクターにクローニングし、レトロウイルス産生のためにｅｘｐｉ２９３細胞にトランスフェクトした。８μｇ／ｍＬのポリブレンと共にＮＫＧ２Ｄ−ＣＡＲを含有するウイルスにＥＬ４細胞を感染させた。感染の２４時間後、ＥＬ４細胞中のＮＫＧ２Ｄ−ＣＡＲの発現レベルをフローサイトメトリーによって分析し、細胞表面で高レベルのＮＫＧ２Ｄ−ＣＡＲを発現するクローンを選択した。
【０２０５】
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインがＮＫＧ２Ｄを活性化させるかどうかを判定するために、それらをマイクロプレートのウェルに吸着させ、抗体断片でコーティングされたウェルにおいてＮＫＧ２Ｄ−ＣＡＲ  ＥＬ４細胞をブレフェルジン−Ａおよびモネンシンの存在下で４時間にわたって培養した。ＮＫＧ２Ｄ活性化の指標である細胞内ＴＮＦ−アルファ産生をフローサイトメトリーによってアッセイした。陽性対照で処置した細胞に対してＴＮＦ−アルファ陽性細胞のパーセンテージを正規化した。すべてのＮＫＧ２Ｄ結合ドメインがヒトＮＫＧ２Ｄ（図２２）およびマウスＮＫＧ２Ｄ（図２３）の両方を活性化させた。
（実施例４）
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインはＮＫ細胞を活性化させる
初代ヒトＮＫ細胞
【０２０６】
密度勾配遠心分離を使用し、ヒト末梢血軟膜から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。磁気ビーズを用いたネガティブセレクションを使用してＰＢＭＣからＮＫ細胞（ＣＤ３−ＣＤ５６＋）を単離した。単離されたＮＫ細胞の純度は典型的には＞９５％であった。次に、単離されたＮＫ細胞を、１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２を含有する培地中で２４〜４８時間にわたって培養した後、それらを、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを吸着させたマイクロプレートのウェルに移し、フルオロフォアコンジュゲート抗ＣＤ１０７ａ抗体、ブレフェルジン−Ａ、およびモネンシンを含有する培地中で培養した。培養後、ＣＤ３、ＣＤ５６、およびＩＦＮ−ガンマに対するフルオロフォアコンジュゲート抗体を使用したフローサイトメトリーによってＮＫ細胞をアッセイした。ＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞におけるＣＤ１０７ａおよびＩＦＮ−ガンマの染色を分析して、ＮＫ細胞の活性化を評価した。ＣＤ１０７ａ／ＩＦＮ−ガンマ二重陽性細胞の増加は、１つの受容体ではなく２つの活性化受容体の会合による、より良好なＮＫ細胞の活性化を示す。ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインおよび陽性対照（配列番号４５〜４８から選択される）は、アイソタイプ対照よりも高いパーセンテージのＮＫ細胞がＣＤ１０７ａ＋およびＩＦＮ−ガンマ＋になることを示した（図２４および図２５は、ＮＫ細胞の調製のために異なるドナーのＰＢＭＣをそれぞれ使用した、２つの独立した実験を表す）。
初代マウスＮＫ細胞
【０２０７】
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスから脾臓を得、７０μｍのセルストレイナーを通して押しつぶして、単一細胞懸濁液を得た。細胞をペレット化し、ＡＣＫ溶解緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した、＃Ａ１０４９２０１；１５５ｍＭ塩化アンモニウム、１０ｍＭ炭酸水素カリウム、０．０１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に再懸濁して赤血球を除去した。残りの細胞を１００ｎｇ／ｍＬのｈＩＬ−２と共に７２時間にわたって培養し、その後採取し、ＮＫ細胞単離の準備をした。次に、磁気ビーズを用いたネガティブディプリーション技術を使用し、典型的には＞９０％の純度で脾臓細胞からＮＫ細胞（ＣＤ３−ＮＫ１．１＋）を単離した。精製されたＮＫ細胞を、１００ｎｇ／ｍＬのｍＩＬ−１５を含有する培地中で４８時間にわたって培養した後、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを吸着させたマイクロプレートのウェルに移し、フルオロフォアコンジュゲート抗ＣＤ１０７ａ抗体、ブレフェルジン−Ａ、およびモネンシンを含有する培地中で培養した。ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインでコーティングされたウェルにおいて培養した後、ＣＤ３、ＮＫ１．１、およびＩＦＮ−ガンマに対するフルオロフォアコンジュゲート抗体を使用したフローサイトメトリーによってＮＫ細胞をアッセイした。ＣＤ３−ＮＫ１．１＋細胞におけるＣＤ１０７ａおよびＩＦＮ−ガンマの染色を分析して、ＮＫ細胞の活性化を評価した。ＣＤ１０７ａ／ＩＦＮ−ガンマ二重陽性細胞の増加は、１つの受容体ではなく２つの活性化受容体の会合による、より良好なＮＫ細胞の活性化を示す。ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインおよび陽性対照（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手可能な抗マウスＮＫＧ２ＤクローンＭＩ−６およびＣＸ−５から選択される）は、アイソタイプ対照よりも高いパーセンテージのＮＫ細胞がＣＤ１０７ａ＋およびＩＦＮ−ガンマ＋になることを示した（図２６および図２７は、ＮＫ細胞の調製のために異なるマウスをそれぞれ使用した、２つの独立した実験を表す）。
（実施例５）
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインは標的腫瘍細胞の細胞傷害性を可能にする
【０２０８】
ヒトおよびマウス初代ＮＫ細胞活性化アッセイは、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインとのインキュベーション後、ＮＫ細胞にある増加した細胞傷害性マーカーを示す。これが腫瘍細胞溶解の増加につながるかどうかに対処するために、各ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインが単一特異的抗体になる細胞ベースのアッセイを利用した。Ｆｃ領域を１つの標的化アームとして使用し、一方、Ｆａｂ領域（ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン）はＮＫ細胞を活性化するための別の標的化アームとして作用した。ヒト起源であり、高レベルのＦｃ受容体を発現するＴＨＰ−１細胞を腫瘍標的として使用し、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＤＥＬＦＩＡ細胞傷害性キットを使用した。ＴＨＰ−１細胞をＢＡＴＤＡ試薬で標識化し、１０５／ｍＬにて培養培地に再懸濁した。次に、標識化したＴＨＰ−１細胞をＮＫＧ２Ｄ抗体と合わせ、マイクロタイタープレートのウェル中で３７℃にて３時間、マウスＮＫ細胞を単離した。インキュベーション後、２０μｌの培養上清を取り出し、２００μｌのユーロピウム溶液と混合し、暗所で１５分間振盪しながらインキュベートした。時間分解蛍光モジュール（励起３３７ｎｍ、発光６２０ｎｍ）を備えたＰｈｅｒａＳｔａｒプレートリーダーによって蛍光を経時的に測定し、キットの説明書に従って特異的溶解率を計算した。
【０２０９】
ＮＫＧ２Ｄに対する天然リガンドである陽性対照のＵＬＢＰ−６は、マウスＮＫ細胞によるＴＨＰ−１標的細胞の特異的溶解率の増加を示した。ＮＫＧ２Ｄ抗体も、ＴＨＰ−１標的細胞の特異的溶解率を増加させたが、アイソタイプ対照抗体は特異的溶解率の低減を示した。点線は、抗体を添加していないマウスＮＫ細胞によるＴＨＰ−１細胞の特異的溶解率を示す（図２８）。
（実施例６）
ＮＫＧ２Ｄ抗体は高い熱安定性を示す
【０２１０】
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインの融解温度を、示差走査型蛍光定量法を使用してアッセイした。外挿した見かけの融解温度は典型的なＩｇＧ１抗体と比較して高い（図２９）。
（実施例７）
多重特異性結合タンパク質はＮＫ細胞を活性化させる能力の増強を示す
【０２１１】
密度勾配遠心分離を使用し、ヒト末梢血軟膜から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。磁気ビーズを用いたネガティブセレクションを使用してＰＢＭＣからＮＫ細胞（ＣＤ３−ＣＤ５６＋）を単離した。単離されたＮＫ細胞の純度は典型的には＞９５％であった。次に、単離されたＮＫ細胞を、１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２を含有する培地中で２４〜４８時間にわたって培養した後、それらを、多重特異性および二重特異性結合タンパク質をそれぞれ吸着させたマイクロプレートのウェルに移し、フルオロフォアコンジュゲート抗ＣＤ１０７ａ抗体、ブレフェルジン−Ａ、およびモネンシンを含有する培地中で培養した。培養後、ＣＤ３、ＣＤ５６、およびＩＦＮ−ガンマに対するフルオロフォアコンジュゲート抗体を使用したフローサイトメトリーによってＮＫ細胞をアッセイした。ＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞におけるＣＤ１０７ａおよびＩＦＮ−ガンマの染色を分析して、ＮＫ細胞の活性化を評価した。ＣＤ１０７ａ／ＩＦＮ−ガンマ二重陽性細胞の増加は、より良好なＮＫ細胞の活性化を示す。ＡＬ２．２は、ＨＥＲ２結合ドメイン（トラスツズマブ）、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（ＵＬＢＰ−６）およびヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含有する多重特異性結合タンパク質である。それは、トラスツズマブホモ二量体およびＵＬＢＰ−６−Ｆｃホモ二量体から開始する、制御されたＦａｂアーム交換反応（ｃＦＡＥ）によって作製した（Labrijnら、Nature  Protocols  ９巻、２４５０〜２４６３頁を参照されたい）。ＳＣ２．２は、トラスツズマブに由来するｓｃＦｖ、およびＵＬＢＰ−６（配列番号７３）を含む一本鎖タンパク質である。
【化４】
2020506971.tif 000020
【０２１２】
ＣＤ１０７ａおよびＩＦＮ−ガンマ染色の分析により、アイソタイプ対照ＩｇＧはＮＫ細胞の活性化を示さなかったが、多重特異性結合タンパク質での刺激後、二重特異性タンパク質と比較して、より高いパーセンテージのＮＫ細胞がＣＤ１０７ａ＋およびＩＦＮガンマ＋になることが示され、ただ１つ（ＮＫＧ２Ｄ）よりもむしろ２つの活性化受容体（ＮＫＧ２ＤおよびＣＤ１６）の会合による、より強力なＮＫ細胞の活性化が示された（図３０）。ＮＫ細胞活性化のこの増加は、より強力な腫瘍細胞殺傷につながると予想される。
（実施例８）
多重特異性結合タンパク質は標的腫瘍細胞に対して増強した細胞傷害性を示す
初代ヒトＮＫ細胞傷害性アッセイ
【０２１３】
密度勾配遠心分離を使用し、ヒト末梢血軟膜から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。磁気ビーズを用いたネガティブセレクションを使用してＰＢＭＣからＮＫ細胞（ＣＤ３−ＣＤ５６＋）を単離した。単離されたＮＫ細胞の純度は典型的には＞９５％であった。次に、ＮＫ細胞を、１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２を含有する培地中で一晩培養し、その後、細胞傷害性アッセイに使用した。翌日、ＮＫ細胞を５×１０５／ｍＬにて新鮮な培養培地に再懸濁した。ヒト乳がん細胞ＳｋＢｒ−３細胞を、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＤＥＬＦＩＡ細胞傷害性キットに従ってＢＡＴＤＡ試薬で標識化し、５×１０４／ｍＬにて培養培地に再懸濁した。多重特異性結合タンパク質の種々の希釈を培養培地中で行った。次に、ＮＫ細胞、標識化したＳｋＢｒ−３細胞および多重特異性結合タンパク質をマイクロタイタープレートのウェル内で合わせ、３７℃にて３時間インキュベートした。インキュベーション後、２０μｌの培養上清を取り出し、２００μｌのユーロピウム溶液と混合し、暗所で１５分間振盪しながらインキュベートした。時間分解蛍光モジュール（励起３３７ｎｍ、発光６２０ｎｍ）を備えたＰｈｅｒａＳｔａｒプレートリーダーによって蛍光を経時的に測定し、キットの説明書に従って特異的溶解率を計算した。ＡＬ０．２は、ＨＥＲ２結合ドメイン（トラスツズマブ）、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（配列番号１〜４４から選択される））およびヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含有する多重特異性結合タンパク質である。それは、トラスツズマブホモ二量体および抗ＮＫＧ２Ｄホモ二量体から開始する、制御されたＦａｂアーム交換反応（ｃＦＡＥ）によって作製した。ＡＬ０．２ｓｉはＡＬ０．２に基づき、ＣＤ１６結合を無効にするＦｃドメイン内のさらなるＤ２６５Ａ突然変異を含有する。トラスツズマブ−ｓｉはトラスツズマブに基づき、ＣＤ１６結合を無効にするＦｃドメイン内のさらなるＤ２６５Ａ突然変異を含有する。ＡＬ２．２は、ＨＥＲ２結合ドメイン（トラスツズマブ）、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（ＵＬＢＰ−６）およびヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含有する多重特異性結合タンパク質である。ＳＣ２．２は、トラスツズマブに由来するｓｃＦｖ、およびＵＬＢＰ−６を含む一本鎖タンパク質である。
【０２１４】
ＡＬ０．２は、用量依存的にトラスツズマブよりヒトＮＫ細胞によるＳｋＢｒ−３標的細胞の増強した溶解を示し、ＥＣ５０において０．０３１１のｐ値であった（図３１）。ＡＬ０．２ｓｉ（図３２）およびトラスツズマブ−ｓｉ（図３３）は、ＡＬ０．２と比較してＳｋＢｒ−３細胞の効力および最大特異的溶解率の両方の低減を示し、それぞれＥＣ５０において０．０００２、および０．０００１のｐ値であった（図３２〜３３）。さらに、ＡＬ０．２は、用量依存的にＡＬ２．２よりＳｋＢｒ−３細胞の増強した溶解を示した（図３４）。アイソタイプ対照ＩｇＧは、試験した濃度のいずれにおいても特異的溶解率の増加を示さなかった。データを合わせると、ＮＫ細胞における２つの活性化受容体および１つの腫瘍抗原と会合する多重特異性結合タンパク質は、ＮＫ細胞における１つの活性化受容体および１つの腫瘍抗原と会合する二重特異性タンパク質と比較して、ヒトＮＫ細胞による腫瘍細胞のより強力な殺傷を誘導することが示された。
初代マウスＮＫ細胞の細胞傷害性アッセイ
【０２１５】
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスから脾臓を得、７０μｍのセルストレイナーを通して押しつぶして、単一細胞懸濁液を得た。細胞をペレット化し、ＡＣＫ溶解緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した、＃Ａ１０４９２０１；１５５ｍＭ塩化アンモニウム、１０ｍＭ炭酸水素カリウム、０．０１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に再懸濁して赤血球を除去した。残りの細胞を１００ｎｇ／ｍＬのｈＩＬ−２と共に７２時間にわたって培養し、その後採取し、ＮＫ細胞単離の準備をした。次に、磁気ビーズを用いたネガティブディプリーション技術を使用し、典型的には＞９０％の純度で脾臓細胞からＮＫ細胞（ＣＤ３−ＮＫ１．１＋）を単離した。精製されたＮＫ細胞を、１００ｎｇ／ｍＬのｍＩＬ−１５を含有する培地中で４８時間にわたって培養した後、細胞傷害性アッセイのために１０６／ｍＬにて培養培地に再懸濁した。ＨＥＲ２およびｄＴｏｍａｔｏを発現するように工学操作されたマウス腫瘍細胞株であるＲＭＡ−ＨＥＲ２−ｄＴｏｍａｔｏ、ならびにその対照対応物である、ｚｓＧｒｅｅｎを発現するＲＭＡ細胞を標的として使用した。それらを２×１０５／ｍＬにて培養培地に再懸濁し、１：１の比にてマイクロプレートのウェルに播種した。多重特異性タンパク質の希釈を培養培地中で行い、ＮＫ細胞と共にＲＭＡ細胞に添加した。３７℃にて５％ＣＯ２での一晩のインキュベーション後、ＲＭＡ−ＨＥＲ２−ｄＴｏｍａｔｏおよびＲＭＡ−ｚｓＧｒｅｅｎ細胞のパーセンテージを、蛍光レポータを使用するフローサイトメトリーによって決定して２つの細胞型を同定した。特異的標的細胞死＝（１−（（処置群におけるＲＭＡ−Ｃａ２Ｔ−ｄＴｏｍａｔｏ細胞の％＊対照群におけるＲＭＡ−ｚｓＧｒｅｅｎ細胞の％）／（対照群におけるＲＭＡ−Ｃａ２Ｔ−ｄＴｏｍａｔｏ細胞の％＊処置群におけるＲＭＡ−ｚｓＧｒｅｅｎ細胞の％）））＊１００％。
【０２１６】
ＡＬ２．２は、ＳＣ２．２（図３６）およびトラスツズマブ（図３５）よりも腫瘍標的に対するＮＫ細胞応答の再指向においてより強力である。対照タンパク質は、特異的標的死にほとんど影響を与えないことが示された。これらのデータは、ＮＫ細胞における２つの活性化受容体および１つの腫瘍抗原と会合する多重特異性結合タンパク質が、ＮＫ細胞における１つの活性化受容体および１つの腫瘍抗原と会合する二重特異性タンパク質と比較して、マウスＮＫ細胞による腫瘍細胞のより強力な殺傷を誘導することを示す。
（実施例９）
多重特異性結合タンパク質はＮＫＧ２Ｄに結合する
【０２１７】
図１に示すように、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン、腫瘍関連抗原結合ドメイン（ＣＤ３３結合ドメイン、ＨＥＲ２結合ドメイン、ＣＤ２０結合ドメイン、またはＢＣＭＡ結合ドメインなど）、およびＣＤ１６に結合するＦｃドメインを各々含有するヒトＮＫＧ２Ｄ三重特異性結合タンパク質（ＴｒｉＮＫＥＴ）を発現するように、ＥＬ４マウスリンパ腫細胞株を工学操作し、ＥＬ４細胞において発現した細胞外ＮＫＧ２Ｄに対するそれらの親和性について試験した。ＮＫＧ２Ｄへの多重特異性結合タンパク質の結合を、フルオロフォアコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ二次抗体を使用して検出した。細胞をフローサイトメトリーによって分析し、親ＥＬ４細胞と比較したＮＫＧ２Ｄ発現細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を使用してバックグラウンドに対する倍率（ＦＯＢ）を計算した。
【０２１８】
試験したＴｒｉＮＫＥＴには、ＣＤ３３−ＴｒｉＮＫＥＴ−Ｃ２６（ＡＤＩ−２８２２６およびＣＤ３３結合ドメイン）、ＣＤ３３−ＴｒｉＮＫＥＴ−Ｆ０４（ＡＤＩ−２９４０４およびＣＤ３３結合ドメイン）、ＨＥＲ２−ＴｒｉＮＫＥＴ−Ｃ２６（ＡＤＩ−２８２２６およびＨＥＲ２結合ドメイン）、ＨＥＲ２−ＴｒｉＮＫＥＴ−Ｆ０４（ＡＤＩ−２９４０４およびＨＥＲ２結合ドメイン）、ＣＤ２０−ＴｒｉＮＫＥＴ−Ｃ２６（ＡＤＩ−２８２２６およびＣＤ２０結合ドメイン）、ＣＤ２０−ＴｒｉＮＫＥＴ−Ｆ０４（ＡＤＩ−２９４０４およびＣＤ２０結合ドメイン）、ＢＣＭＡ−ＴｒｉＮＫＥＴ−Ｃ２６（ＡＤＩ−２８２２６およびＢＣＭＡ結合ドメイン）、ＢＣＭＡ−ＴｒｉＮＫＥＴ−Ｆ０４（ＡＤＩ−２９４０４およびＢＣＭＡ結合ドメイン）、ＢＣＭＡ−ＴｒｉＮＫＥＴ−Ｆ４３（ＡＤＩ−２９４４３およびＢＣＭＡ結合ドメイン）、およびＢＣＭＡ−ＴｒｉＮＫＥＴ−Ｆ４７（ＡＤＩ−２９４４７およびＢＣＭＡ結合ドメイン）が含まれる。試験した分子に使用したＨＥＲ２結合ドメインは、トラスツズマブの重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインから構成された。ＣＤ３３結合ドメインは、以下に列記した重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインから構成された。
【化５】
2020506971.tif 000021
試験した分子に使用したＣＤ２０結合ドメインは、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインから構成された。試験した分子に使用したＢＣＭＡ結合ドメインは、以下に列記したように重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインから構成された。
ＥＭ−８０１重鎖可変ドメイン（配列番号８２）：
【化６】
2020506971.tif 000022
ＥＭ−８０１軽鎖可変ドメイン（配列番号８３）：
【化７】
2020506971.tif 000023
ＥＭ−９０１重鎖可変ドメイン（配列番号７６）
【化８】
2020506971.tif 000024
ＥＭ−９０１軽鎖可変ドメイン（配列番号７７）
【化９】
2020506971.tif 000025
【０２１９】
データは、タンパク質がＣＤ３３、ＨＥＲ２、ＣＤ２０、およびＢＣＭＡなどの腫瘍抗原結合ドメインを含む場合、本開示のＴｒｉＮＫＥＴがＮＫＧ２Ｄに結合することを示す。
（実施例１０）
多重特異性結合タンパク質はヒト腫瘍抗原に結合する
三重特異性結合タンパク質はＣＤ３３、ＨＥＲ２、ＣＤ２０およびＢＣＭＡに結合する
【０２２０】
ＣＤ３３を発現するヒトＡＭＬ細胞株ＭＶ４−１１を使用して、腫瘍関連抗原へのＴｒｉＮＫＥＴの結合をアッセイした。ＴｒｉＮＫＥＴおよび親抗ＣＤ３３モノクローナル抗体を細胞とインキュベートし、フルオロフォアコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ二次抗体を使用して結合を検出した。細胞をフローサイトメトリーによって分析し、バックグラウンドに対する倍率（ＦＯＢ）を、二次抗体対照に対して正規化したＴｒｉＮＫＥＴおよび親モノクローナル抗ＣＤ３３抗体からの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を使用して計算した。ＣＤ３３−ＴｒｉＮＫＥＴ−Ｃ２６、およびＣＤ３３−ＴｒｉＮＫＥＴ−Ｆ０４は、親抗ＣＤ３３抗体と比較してＣＤ３３への結合の同等のレベルを示す（図４１）。
【０２２１】
ＨＥＲ２を発現するヒトがん細胞株を使用して、腫瘍関連抗原へのＴｒｉＮＫＥＴの結合をアッセイした。腎細胞癌細胞株７８６−Ｏは低レベルのＨＥＲ２を発現する。ＴｒｉＮＫＥＴおよび必要に応じて親抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体（トラスツズマブ）を細胞とインキュベートし、フルオロフォアコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ二次抗体を使用して結合を検出した。細胞をフローサイトメトリーによって分析し、バックグラウンドに対する倍率（ＦＯＢ）を、二次抗体対照に対して正規化したＴｒｉＮＫＥＴおよびトラスツズマブからの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を使用して計算した。ＨＥＲ２−ＴｒｉＮＫＥＴ−Ｃ２６、およびＨＥＲ２−ＴｒｉＮＫＥＴ−Ｆ０４は、トラスツズマブと比較して７８６−Ｏ細胞において発現したＨＥＲ２への結合の同等のレベルを示す（図４２）。
【０２２２】
ＢＣＭＡを発現するＭＭ．１Ｓヒト骨髄腫細胞を使用して、腫瘍関連抗原ＢＣＭＡへのＴｒｉＮＫＥＴの結合をアッセイした。ＴｒｉＮＫＥＴおよび必要に応じて親抗ＢＣＭＡモノクローナル抗体（ＥＭ−８０１）を細胞とインキュベートし、フルオロフォアコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ二次抗体を使用して結合を検出した。細胞をフローサイトメトリーによって分析し、バックグラウンドに対する倍率（ＦＯＢ）を、二次抗体対照に対して正規化したＴｒｉＮＫＥＴおよびＥＭ−８０１からの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を使用して計算した。Ｃ２６−−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＣＭＡ、Ｆ０４−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＣＭＡ、Ｆ４３−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＣＭＡ、およびＦ４７−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＣＭＡは、ＥＭ−８０１と比較してＭＭ．１Ｓ細胞において発現したＢＣＭＡへの結合の同等のレベルを示す（図４３）。
【０２２３】
ＣＤ２０を発現するＲａｊｉヒトリンパ腫細胞を使用して、腫瘍関連抗原ＣＤ２０へのＴｒｉＮＫＥＴの結合をアッセイした。ＴｒｉＮＫＥＴを細胞とインキュベートし、フルオロフォアコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ二次抗体を使用して結合を検出した。細胞をフローサイトメトリーによって分析し、ヒストグラムをプロットした。図４４に示すように、ＣＤ２０−ＴｒｉＮＫＥＴ−Ｃ２６およびＣＤ２０−ＴｒｉＮＫＥＴ−Ｆ０４は、ＣＤ２０に同様に良好に結合する。
（実施例１１）
多重特異性結合タンパク質はＮＫ細胞を活性化させる
【０２２４】
密度勾配遠心分離を使用し、ヒト末梢血軟膜から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。磁気ビーズを用いたネガティブセレクションを使用してＰＢＭＣからＮＫ細胞（ＣＤ３−ＣＤ５６＋）を単離した。単離されたＮＫ細胞の純度は典型的には＞９０％であった。単離されたＮＫ細胞を、活性化のために１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２を含有する培地中で培養したか、またはサイトカインなしで一晩休止させた。ＩＬ−２活性化ＮＫ細胞を、活性化後２４〜４８時間以内に使用した。
【０２２５】
腫瘍抗原を発現するヒトがん細胞を採取し、２×１０６／ｍＬにて培養培地に再懸濁した。腫瘍抗原を標的とするモノクローナル抗体またはＴｒｉＮＫＥＴを培養培地中で希釈した。活性化ＮＫ細胞を採取し、洗浄し、培養培地に２×１０６／ｍＬにて再懸濁した。次に、がん細胞をモノクローナル抗体／ＴｒｉＮＫＥＴと混合し、ＩＬ−２の存在下でＮＫ細胞を活性化させた。ブレフェルジン−Ａおよびモネンシンも混合培養物に添加して、細胞内サイトカイン染色のために細胞からのタンパク質輸送を阻止した。フルオロフォアコンジュゲート抗ＣＤ１０７ａを混合培養物に添加し、培養物を４時間インキュベートした後、ＣＤ３、ＣＤ５６およびＩＦＮ−ガンマに対するフルオロフォアコンジュゲート抗体を使用したＦＡＣＳ分析のために試料を調製した。ＣＤ１０７ａおよびＩＦＮ−ガンマ染色をＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞において分析してＮＫ細胞活性化を評価した。ＣＤ１０７ａ／ＩＦＮ−ガンマ二重陽性細胞の増加は、１つの受容体よりもむしろ２つの活性化受容体の会合による、より良好なＮＫ細胞活性化を示す。
【０２２６】
ＴｒｉＮＫＥＴは、ＣＤ１０７ａ脱顆粒およびＩＦＮ−ガンマ産生の増加によって示されるように、ＨＥＲ２を発現する、ＳｋＢｒ−３細胞（図４７Ａ）、Ｃｏｌｏ２０１細胞（図４７Ｂ）、およびＨＣＣ１９５４細胞（図４７Ｃ）のそれぞれと共培養したヒトＮＫ細胞の活性化を媒介する。ＳｋＢｒ−３細胞およびＨＣＣ１９５４細胞は高レベルの表面ＨＥＲ２を発現し、Ｃｏｌｏ２０１は中程度のＨＥＲ２を発現する。モノクローナル抗体トラスツズマブと比較して、ＴｒｉＮＫＥＴはヒトがん細胞の存在下でヒトＮＫ細胞の優れた活性化を示す。ＮＫ細胞単独、ＮＫ細胞＋ＳｋＢｒ−３細胞を陰性対照として使用する。
【０２２７】
ＴｒｉＮＫＥＴ（Ｃ２６−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＨＥＲ２およびＦ０４−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＨＥＲ２）は、ＣＤ３３発現ヒトＡＭＬ  Ｍｖ４−１１細胞と共培養したヒトＮＫ細胞の活性化を媒介し、ＣＤ１０７ａ脱顆粒およびＩＦＮ−ガンマ産生の増加を示した。モノクローナル抗ＣＤ３３抗体と比較して、ＴｒｉＮＫＥＴ（Ｃ２６−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＨＥＲ２およびＦ０４−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＨＥＲ２）は、ＨＥＲ２を発現するヒトがん細胞の存在下でヒトＮＫ細胞の優れた活性化を示した（図４７Ａ〜４７Ｃ）。
初代ヒトＮＫ細胞は、標的発現ヒトがん細胞株との共培養においてＴｒｉＮＫＥＴによって活性化される
【０２２８】
初代ヒトＮＫ細胞をＣＤ２０陽性ヒトがん細胞と共培養すると、初代ヒトＮＫ細胞のＴｒｉＮＫＥＴ媒介活性化が生じた（図６２）。ＣＤ２０を標的とするＴｒｉＮＫＥＴ（例えば、Ｃ２６−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＣＤ２０およびＦ０４−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＣＤ２０）は、ＣＤ１０７ａ脱顆粒およびＩＦＮγサイトカイン産生の増加によって示されるように、ＣＤ２０陽性Ｒａｊｉ細胞と共培養したヒトＮＫ細胞の活性化を媒介した（図６２）。モノクローナル抗体リツキシマブと比較して、両方のＴｒｉＮＫＥＴ（例えば、Ｃ２６−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＣＤ２０およびＦ０４−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＣＤ２０）はヒトＮＫ細胞の優れた活性化を示した（図６２）。
【化１０】
2020506971.tif 000026
【０２２９】
初代ヒトＮＫ細胞をＢＣＭＡ陽性ＭＭ．１Ｓ骨髄腫細胞と共培養すると、初代ヒトＮＫ細胞のＴｒｉＮＫＥＴ媒介活性化が生じた。ＢＣＭＡを標的とするＴｒｉＮＫＥＴ（例えば、Ｃ２６−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＭＣＡおよびＦ０４−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＭＣＡ）は、ＣＤ１０７ａ脱顆粒およびＩＦＮγサイトカイン産生の増加によって示されるように、ＭＭ．１Ｓ骨髄腫細胞と共培養したヒトＮＫ細胞の活性化を媒介した（図６３）。アイソタイプＴｒｉＮＫＥＴと比較して、ＢＣＭＡを標的とするＴｒｉＮＫＥＴ（例えば、Ａ４４−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＭＣＡ、Ａ４９−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＭＣＡ、Ｃ２６−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＭＣＡ、Ｆ０４−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＭＣＡ、Ｆ４３−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＭＣＡ、Ｆ４３−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＭＣＡ、Ｆ４７−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＭＣＡ、およびＦ６３−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＢＭＣＡ）は、増加したＮＫ細胞活性を示した（図６３）。
（実施例１２）
三重特異性結合タンパク質は標的がん細胞の細胞傷害性を可能にする
【０２３０】
密度勾配遠心分離を使用し、ヒト末梢血軟膜から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。磁気ビーズを用いたネガティブセレクションを使用してＰＢＭＣからＮＫ細胞（ＣＤ３−ＣＤ５６＋）を単離した。単離されたＮＫ細胞の純度は典型的には＞９０％であった。単離されたＮＫ細胞を、活性化のために１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２を含有する培地中で培養したか、またはサイトカインなしで一晩休止させた。ＩＬ−２活性化ＮＫ細胞または休止ＮＫ細胞を、翌日、細胞傷害性アッセイにおいて使用した。
【０２３１】
ＴｒｉＮＫＥＴの存在下でがん細胞を溶解するヒトＮＫ細胞の能力を試験するために、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｇ１７８０）からのｃｙｔｏ  Ｔｏｘ  ９６非放射性細胞傷害性アッセイを製造業者の説明書に従って使用した。簡潔に述べると、腫瘍抗原を発現するヒトがん細胞を採取し、洗浄し、１〜２×１０５／ｍＬにて培養培地に再懸濁した。休止ＮＫ細胞および／または活性化ＮＫ細胞を採取し、洗浄し、がん細胞の培養培地と同じ培養培地に１０５〜２．０×１０６／ｍＬにて再懸濁した。９６ウェルプレートの各ウェルにおいて、５０μｌのがん細胞懸濁液を、がん細胞において発現した腫瘍抗原を標的とするＴｒｉＮＫＥＴを有するか、または有さない５０μｌのＮＫ細胞懸濁液と混合した。３７℃にて５％ＣＯ２での３時間および１５分間のインキュベーション後、１０×溶解緩衝液を、がん細胞のみを含有するウェル、ならびに最大限の溶解および陰性試薬対照のための培地のみを含有するウェルにそれぞれ添加した。次に、プレートをインキュベーターにさらに４５分間戻して合計４時間のインキュベーションを達成した。次に、細胞をペレット化し、培養上清を新たな９６ウェルプレートに移し、発色のために基質と混合した。新たなプレートを室温にて３０分間インキュベートし、吸光度をＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ｉ３ｘにおいて４９２ｎｍにて読み取った。がん細胞の特異的溶解率（パーセンテージ）を以下のように計算した：特異的溶解％＝（（実験的溶解−ＮＫ細胞単独からの自発的溶解−がん細胞単独からの自発的溶解）／（最大溶解−陰性試薬対照））×１００％。
【０２３２】
ＴｒｉＮＫＥＴは、ＣＤ３３陽性Ｍｏｌｍ−１３ヒトＡＭＬ細胞株に対するヒトＮＫ細胞の細胞傷害性を媒介する。図５３Ｂに示すように、休止ヒトＮＫ細胞をＭｏｌｍ−１３がん細胞と混合すると、ＴｒｉＮＫＥＴ（例えば、Ｃ２６−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＣＤ３３およびＦ０４−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＣＤ３３）は、がん細胞に対して用量応答的に休止ヒトＮＫ細胞の細胞傷害活性を増強することができる。点線はＴｒｉＮＫＥＴを有さない休止ＮＫ細胞の細胞傷害活性を示す。活性化ヒトＮＫ細胞をＭｏｌｍ−１３がん細胞と混合すると、ＴｒｉＮＫＥＴは、抗ＣＤ３３抗体と比較して、がん細胞に対して用量応答的に活性化ヒトＮＫ細胞の細胞傷害活性をさらにもっと増強する（図５３Ｂ）。
【０２３３】
ＴｒｉＮＫＥＴは、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体であるトラスツズマブの細胞傷害活性と比較して低い表面発現で標的に対するＮＫ細胞の細胞傷害性を増強する。休止ヒトＮＫ細胞を高ＨＥＲ２発現ＳｋＢｒ腫瘍細胞および低ＨＥＲ２発現７８６−Ｏがん細胞と混合し、高および低ＨＥＲ２発現がん細胞に対する休止ヒトＮＫ細胞の細胞傷害活性を用量応答的に増強するＴｒｉＮＫＥＴの能力をアッセイした。図５０Ａおよび図５０Ｂの点線は、ＴｒｉＮＫＥＴの非存在下でのがん細胞に対する休止ＮＫ細胞の細胞傷害活性を示す。図５０Ｂに示すように、活性化ヒトＮＫ細胞を低ＨＥＲ２発現７８６−Ｏ細胞、およびＴｒｉＮＫＥＴ（例えば、ＣＤ２６−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＨＥＲ２およびＦ０４−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＨＥＲ２）と混合すると、がん細胞に対する活性化ヒトＮＫ細胞の用量応答性細胞傷害活性が観察された。
【０２３４】
ＢＣＭＡ陽性骨髄腫細胞のＴｒｉＮＫＥＴ媒介溶解をアッセイした。図６４は、休止ヒトＮＫエフェクター細胞によるＢＣＭＡ陽性ＫＭＳ１２−ＰＥ骨髄腫細胞のＴｒｉＮＫＥＴ媒介溶解を示す。同じＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（Ａ４９）であるが、異なるＢＣＭＡを標的とするドメインを使用する２つのＴｒｉＮＫＥＴ（ｃＦＡＥ−Ａ４９．８０１およびｃＦＡＥ−Ａ４９．９０１）を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの有効性について試験した。両方のＴｒｉＮＫＥＴはＫＭＳ１２−ＰＥ細胞のＮＫ細胞溶解を同程度増強したが、ＥＭ−９０１を標的とするドメインを使用するＴｒｉＮＫＥＴは効力の増加をもたらした。
【０２３５】
図６５は、異なるＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（Ａ４０、Ａ４４、Ａ４９、Ｃ２６、およびＦ４７）を使用するが、同じＢＣＭＡを標的とするドメインを使用するいくつかのＴｒｉＮＫＥＴの細胞傷害活性を示す。ＢＣＭＡを標的としたＴｒｉＮＫＥＴのＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを変化させると、ＴｒｉＮＫＥＴの最大殺傷および効力に変動が生じた。すべてのＴｒｉＮＫＥＴは、ＥＭ−９０１モノクローナル抗体と比較してＫＭＳ１２−ＰＥ標的細胞の増加した殺傷を示した（図６５）。
（実施例１３）
【０２３６】
ＮＫＧ２ＤおよびＣＤ１６の架橋によるヒトＮＫ細胞の相乗的活性化を調べた。
初代ヒトＮＫ細胞活性化アッセイ
【０２３７】
密度勾配遠心分離を使用し、末梢ヒト血液軟膜から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。ネガティブ磁気ビーズ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  ＃１７９５５）を使用してＰＢＭＣからＮＫ細胞を精製した。ＮＫ細胞は、フローサイトメトリーによって決定して＞９０％のＣＤ３−ＣＤ５６＋であった。次に、細胞を、活性化アッセイに使用する前に１００ｎｇ／ｍＬのｈＩＬ−２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ  ＃２００−０２）を含有する培地中で４８時間増殖させた。抗体を、１００μｌの滅菌ＰＢＳ中で２μｇ／ｍｌ（抗ＣＤ１６、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  ＃３０２０１３）および５μｇ／ｍＬ（抗ＮＫＧ２Ｄ、Ｒ＆Ｄ  ＃ＭＡＢ１３９）の濃度にて４℃で一晩、９６ウェル平底プレート上にコーティングし、続いてウェルを十分に洗浄して過剰の抗体を除去した。脱顆粒の評価のために、ＩＬ−２活性化ＮＫ細胞を、１００ｎｇ／ｍＬのｈＩＬ２および１μｇ／ｍＬのＡＰＣコンジュゲート抗ＣＤ１０７ａ  ｍＡｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  ＃３２８６１９）を補充した培養培地に５×１０５個の細胞／ｍＬにて再懸濁した。次に、１×１０５個の細胞／ウェルを、抗体でコーティングされたプレート上に添加した。タンパク質輸送阻害剤であるブレフェルジンＡ（ＢＦＡ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  ＃４２０６０１）およびモネンシン（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  ＃４２０７０１）を、それぞれ１：１０００および１：２７０の最終希釈にて添加した。播いた細胞を、３７℃にて４時間にわたって５％ＣＯ２においてインキュベートした。ＩＦＮ−γの細胞内染色のために、ＮＫ細胞を、抗ＣＤ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  ＃３００４５２）および抗ＣＤ５６  ｍＡｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  ＃３１８３２８）で標識化し、続いて固定し、透過処理し、抗ＩＦＮ−γ  ｍＡｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  ＃５０６５０７）で標識化した。ＮＫ細胞を、生ＣＤ５６＋ＣＤ３−細胞においてゲーティングした後、フローサイトメトリーによってＣＤ１０７ａおよびＩＦＮ−γの発現について分析した。
【０２３８】
受容体の組合せの相対的効力を調査するため、プレート結合刺激により、ＮＫＧ２ＤまたはＣＤ１６の架橋および両受容体の共架橋を行った。図４５（図４５Ａ〜４５Ｃ）に示したように、ＣＤ１６およびＮＫＧ２Ｄの組み合わせた刺激は、ＣＤ１０７ａ（脱顆粒）レベル（図４５Ａ）および／またはＩＦＮ−γ産生レベル（図４５Ｂ）の大きな上昇をもたらした。点線は、各受容体の個々の刺激の相加効果を表す。
【０２３９】
抗ＣＤ１６、抗ＮＫＧ２Ｄまたは両方のモノクローナル抗体の組合せを用いた４時間のプレート結合刺激の後、ＩＬ−２活性化ＮＫ細胞のＣＤ１０７ａレベルおよび細胞内ＩＦＮ−γ産生を分析した。グラフは平均（ｎ＝２）±ＳＤを示している。図４５ＡはＣＤ１０７ａのレベルを示し、図４５ＢはＩＦＮγのレベルを示し、図４５ＣはＣＤ１０７ａおよびＩＦＮ−γ産生のレベルを示す。図４５Ａ〜４５Ｃに示したデータは、５名の異なる健康なドナーを使用した、５つの独立した実験を代表するものである。
【０２４０】
トラスツズマブ、抗ＮＫＧ２Ｄ、またはトラスツズマブおよび抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の結合ドメインに由来するＴｒｉＮＫＥＴを用いた４時間のプレート結合刺激の後、ＩＬ−２活性化ＮＫ細胞のＣＤ１０７ａ脱顆粒および細胞内ＩＦＮ−γ産生を分析した（図４６）。すべての場合において、試験した抗体はヒトＩｇＧ１アイソタイプのものであった。グラフは平均（ｎ＝２）±ＳＤを示す。
（実施例１４）
細胞により発現されたヒトＮＫＧ２ＤへのＴｒｉＮＫＥＴ結合の評価
【０２４１】
ヒトＮＫＧ２Ｄを形質導入したＥＬ４細胞を使用して、細胞により発現されたヒトＮＫＧ２Ｄへの結合を試験した。ＴｒｉＮＫＥＴを２０μｇ／ｍＬに希釈し、次に連続希釈した。ｍＡｂまたはＴｒｉＮＫＥＴ希釈液を使用して細胞を染色し、フルオロフォアコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ二次抗体を使用してＴｒｉＮＫＥＴまたはｍＡｂの結合を検出した。細胞をフローサイトメトリーによって分析し、結合ＭＦＩを二次抗体対照に対して正規化してバックグラウンド値に対する倍率を得た。
細胞により発現されたヒトがん抗原へのＴｒｉＮＫＥＴ結合の評価
【０２４２】
ＣＤ３３またはＨＥＲ２のいずれかを発現するヒトがん細胞株を使用して、異なるＮＫＧ２Ｄを標的とするクローンに由来するＴｒｉＮＫＥＴの腫瘍抗原結合を評価した。ヒトＡＭＬ細胞株ＭＶ４−１１を使用して、細胞により発現されたＣＤ３３へのＴｒｉＮＫＥＴの結合を評価した。ヒト腎細胞癌細胞株７８６−Ｏは低レベルのＨＥＲ２を発現し、細胞により発現されたＨＥＲ２へのＴｒｉＮＫＥＴ結合を評価するために使用した。ＴｒｉＮＫＥＴを２０μｇ／ｍＬに希釈し、それぞれの細胞とインキュベートした。ＴｒｉＮＫＥＴの結合を、フルオロフォアコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ二次抗体を使用して検出した。細胞をフローサイトメトリーによって分析し、細胞により発現されたＣＤ３３およびＨＥＲ２への結合ＭＦＩを二次抗体対照に対して正規化してバックグラウンド値に対する倍率を得た。
ヒトＨＥＲ２陽性がん細胞株の抗体結合能の決定
【０２４３】
ＨＥＲ２陽性ヒトがん細胞株の抗体結合能（ＡＢＣ）を測定した。Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂ製のＱｕａｎｔｕｍ  Ｓｉｍｐｌｙ  Ｃｅｌｌｕｌａｒキットを使用し（＃８１５）、製造業者の説明書に従って抗体標識化ビーズを準備した。簡潔に述べると、ビーズの４つの集団の各々を飽和量の抗ＨＥＲ２抗体で染色し、細胞集団も飽和量の同じ抗体で染色した。試料データを各ビーズ集団、および細胞集団について獲得した。キットに備えられたＱｕｉｃｋＣａｌワークシートを、標準曲線の作成および細胞株の各々についてのＡＢＣ値の外挿のために使用した。
ＴｒｉＮＫＥＴによる初代ＮＫ細胞の活性化
【０２４４】
密度勾配遠心分離を使用し、ヒト末梢血軟膜からＰＢＭＣを単離した。単離されたＰＢＭＣを洗浄し、ＮＫ細胞単離のために準備した。磁気ビーズを用いたネガティブセレクション技術を使用してＮＫ細胞を単離した。単離されたＮＫ細胞の純度は典型的には＞９０％のＣＤ３−ＣＤ５６＋であった。単離されたＮＫ細胞を、活性化のために１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２を含有する培地中で培養したか、またはサイトカインなしで一晩休止させた。ＩＬ−２活性化ＮＫ細胞を２４〜４８時間後に使用した。休止ＮＫ細胞は常に精製の翌日に使用した。
【０２４５】
目的のがん標的を発現するヒトがん細胞株を培養物から採取し、細胞を２×１０６／ｍＬに調整した。目的のがん標的を標的とするモノクローナル抗体またはＴｒｉＮＫＥＴを培養培地中で希釈した。休止ＮＫ細胞および／または活性化ＮＫ細胞を培養物から採取し、細胞を洗浄し、２×１０６／ｍＬにて培養培地に再懸濁した。ＩＬ−２、およびフルオロフォアコンジュゲート抗ＣＤ１０７ａを、活性化培養のためにＮＫ細胞に添加した。ブレフェルジン−Ａおよびモネンシンを培養培地中で希釈して、細胞内サイトカイン染色のために細胞からのタンパク質輸送を阻止した。９６ウェルプレートに、５０μｌの腫瘍標的、ｍＡｂ／ＴｒｉＮＫＥＴ、ＢＦＡ／モネンシン、およびＮＫ細胞を２００μｌの総培養体積で添加した。プレートを４時間培養した後、試料をＦＡＣＳ分析のために準備した。
【０２４６】
４時間の活性化培養後、細胞を、ＣＤ３、ＣＤ５６およびＩＦＮγに対するフルオロフォアコンジュゲート抗体を使用したフローサイトメトリーによる分析のために準備した。ＣＤ１０７ａおよびＩＦＮγ染色をＣＤ３−ＣＤ５６＋集団において分析してＮＫ細胞活性化を評価した。
初代ヒトＮＫ細胞の細胞傷害性アッセイ
【０２４７】
密度勾配遠心分離を使用し、ヒト末梢血軟膜からＰＢＭＣを単離した。単離されたＰＢＭＣを洗浄し、ＮＫ細胞単離のために準備した。磁気ビーズを用いたネガティブセレクション技術を使用してＮＫ細胞を単離した。単離されたＮＫ細胞の純度は典型的に＞９０％のＣＤ３−ＣＤ５６＋であった。単離されたＮＫ細胞を、１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２を含有する培地中で培養したか、またはサイトカインなしで一晩休止させた。翌日、ＩＬ−２活性化ＮＫ細胞または休止ＮＫ細胞を細胞傷害性アッセイに使用した。
Ｃｙｔｏ  Ｔｏｘ９６  ＬＨＤ放出アッセイ：
【０２４８】
腫瘍細胞を溶解するヒトＮＫ細胞の能力を、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｇ１７８０）製のｃｙｔｏ  Ｔｏｘ９６非放射性細胞傷害性アッセイを使用して、ＴｒｉＮＫＥＴを添加してまたは添加せずに測定した。目的のがん標的を発現するヒトがん細胞株を培養物から採取し、細胞をＰＢＳで洗浄し、標的細胞として使用するために１〜２×１０５／ｍＬにて成長培地に再懸濁した。５０μｌの標的細胞懸濁液を各ウェルに添加した。目的のがん抗原を標的するモノクローナル抗体またはＴｒｉＮＫＥＴを培養培地中で希釈し、５０μｌの希釈したｍＡｂまたはＴｒｉＮＫＥＴを各ウェルに添加した。休止ＮＫ細胞および／または活性化ＮＫ細胞を培養物から採取し、細胞を洗浄し、所望のＥ：Ｔ比に応じて培養培地に１０５〜２．０×１０６／ｍＬにて再懸濁した。５０μｌのＮＫ細胞をプレートの各ウェルに添加して合計１５０μｌの培養体積にした。プレートを３７℃にて５％ＣＯ２で３時間および１５分にわたってインキュベートした。インキュベーション後、１０×溶解緩衝液を、最大溶解および体積調節のために標的細胞のみのウェルおよび培地のみを含有するウェルに添加した。次に、プレートをインキュベーターにさらに４５分間戻し、発色前に合計４時間のインキュベーションを行った。
【０２４９】
インキュベーション後、プレートをインキュベーターから取り出し、細胞を２００ｇにて５分間の遠心分離によってペレット化した。５０μｌの培養上清を清浄なマイクロプレートに移し、５０μｌの基質溶液を各ウェルに添加した。プレートを光から保護し、室温にて３０分にわたってインキュベートした。５０μｌの停止溶液を各ウェルに添加し、吸光度をＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ｉ３ｘにおいて４９２ｎｍにて読み取った。特異的溶解％を以下のように計算した：特異的溶解％＝（（実験的放出−エフェクターからの自然放出−標的からの自然放出）／（最大放出−自然放出））＊１００％。
ＤＥＬＦＩＡ細胞傷害性アッセイ：
【０２５０】
目的の標的を発現するヒトがん細胞株を培養物から採取し、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＢＡＴＤＡ試薬（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＡＤ０１１６）で標識化するために１０６／ｍＬにて成長培地に再懸濁した。製造業者の説明書に従って標的細胞を標識化した。標識化後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、０．５〜１．０×１０５／ｍＬにて培養培地に再懸濁した。バックグラウンドウェルを準備するために、標識化した細胞のアリコートを取っておき、細胞を培地からスピンアウトした。１００μｌの培地を、ペレット化した細胞を乱さないように３連でウェルに注意深く添加した。１００μｌのＢＡＴＤＡ標識化細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。ウェルを標的細胞からの自然放出のために保存し、ウェルを１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘの添加による標的細胞の最大溶解のために準備した。目的の腫瘍標的に対するモノクローナル抗体またはＴｒｉＮＫＥＴを培養培地で希釈し、５０μｌの希釈したｍＡｂまたはＴｒｉＮＫＥＴを各ウェルに添加した。休止ＮＫ細胞および／または活性化ＮＫ細胞を培養物から採取し、細胞を洗浄し、所望のＥ：Ｔ比に応じて培養培地に１０５〜２．０×１０６／ｍＬにて再懸濁した。５０μｌのＮＫ細胞をプレートの各ウェルに添加して合計２００μｌの培養体積にした。アッセイの発色前にプレートを３７℃にて５％ＣＯ２で２〜３時間にわたってインキュベートした。
【０２５１】
２〜３時間培養した後、プレートをインキュベーターから取り出し、細胞を２００ｇにて５分間の遠心分離によってペレット化した。２０μｌの培養上清を、製造業者から提供された清浄なマイクロプレートに移し、２００μｌの室温ユーロピウム溶液を各ウェルに添加した。プレートを光から保護し、プレートシェーカーにおいて２５０ｒｐｍにて１５分にわたってインキュベートした。プレートを、Ｖｉｃｔｏｒ  ３またはＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ｉ３Ｘ機器のいずれかを使用して読み取った。特異的溶解％を以下のように計算した：特異的溶解％＝（（実験的放出−自然放出）／（最大放出−自然放出））＊１００％。
長期のヒトＰＢＭＣ細胞傷害性アッセイ：
【０２５２】
ＳｋＢｒ−３標的細胞を、ＢａｃＭａｍ  ３．０  ＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｇｒｅｅｎ（＃４６２２）で標識化して標的細胞の追跡を可能にした。製造業者のプロトコルに従って、ＳｋＢｒ−３標的細胞を標識化した。アネキシンＶレッド（Ｅｓｓｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＃４６４１）を希釈し、製造業者の説明書に従って準備した。モノクローナル抗体またはＴｒｉＮＫＥＴを培養培地中で希釈した。５０μｌのｍＡｂまたはＴｒｉＮＫＥＴ、アネキシンＶ、および休止ＮＫ細胞を、既に標識化したＳｋＢｒ−３細胞を含有する９６ウェルプレートのウェルに添加した。５０ｕｌの完全培養培地を合計２００μｌの培養体積で添加した。
【０２５３】
画像収集をＩｎｃｕＣｙｔｅ  Ｓ３においてセットアップした。フェーズ、緑色、および赤色チャネルについての画像を１時間毎に収集し、ウェル当たり２つの画像を得た。画像分析はＩｎｃｕＣｙｔｅ  Ｓ３ソフトウェアを使用して行った。緑色および赤色チャネルのためのマスクを作製して、腫瘍細胞、およびアネキシンＶ陽性細胞の数をそれぞれ計数した。アネキシンＶ陽性Ｍｖ４−１１標的細胞の％を計算するために以下の式を使用した。アネキシンＶ陽性ＳｋＢｒ−３細胞の％＝（（重複物体数）／（緑色物体数））＊１００％。
ＨＥＲ＋がん細胞を標的とするＴｒｉＮＫＥＴとＳＣ２．２との比較
【０２５４】
ＨＥＲ２を標的とするＴｒｉＮＫＥＴは、ＳｋＢｒ−３細胞数を低減させるのにトラスツズマブより効果的であり、時間ゼロからの細胞の６０％のみが６０時間後に残っていた。ＨＥＲ２発現腫瘍／がん細胞を標的とする本開示のＴｒｉＮＫＥＴは、ＮＫＧ２Ｄに対するリガンドであるＵＬＢＰ−６に連結したトラスツズマブに由来するｓｃＦｖから構築された一本鎖二重特異性分子であるＳＣ２．２より効果的である。ＳＣ２．２は、ＨＥＲ２＋がん細胞およびＮＫＧ２Ｄ＋ＮＫ細胞に同時に結合する。したがって、ＨＥＲ２＋がん細胞数を低減させる際のＳＣ２．２の有効性を調査した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性化および細胞傷害性アッセイは、ＳＣ２．２がＮＫ細胞を活性化させ、殺傷するのに効果的であることを示した。しかしながら、ＳＣ２．２は、ＲＭＡ／Ｓ−ＨＥＲ２皮下腫瘍モデルにおいて有効性を示すことができなかった。ＳＣ２．２の有効性をまた、ＲＭＡ／Ｓ−ＨＥＲ２過剰発現同系マウスモデルを使用してｉｎ  ｖｉｖｏで試験した。このマウスモデルにおいて、ＳＣ２．２は、ビヒクル対照と比較して腫瘍成長の制御を示すことができなかった。したがって、ＳＣ２．２は、ＮＫ細胞を活性化させ、殺傷することができ、ＨＥＲ２＋がん細胞に結合するが、これらの特性はＨＥＲ２＋腫瘍成長を効果的に制御するには不十分であった。
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおけるＳＣ２．２血清半減期の評価
【０２５５】
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおけるＳＣ２．２の血清半減期を判定するために、ＳＣ２．２を蛍光タグで標識化してｉｎ  ｖｉｖｏでその濃度を追跡した。ＳＣ２．２をＩＲＤｙｅ  ８００ＣＷ（Ｌｉｃｏｒ  ＃９２９−７００２０）で標識化した。標識化したタンパク質を３匹のＣ５７Ｂｌ／６マウスに静脈内注射し、示した時点において各マウスから血液を採取した。採取後、血液を１０００ｇにて１５分間遠心分離し、血清を各試料から採取し、すべての時点が採取されるまで４Ｃにて保存した。
【０２５６】
血清を、Ｏｄｙｓｓｅｙ  ＣＬｘ赤外線イメージングシステムを使用して画像化し、８００チャネルからの蛍光シグナルをＩｍａｇｅ  Ｊソフトウェアを使用して定量した。画像強度を第１の時点に正規化し、データを二相減衰方程式に適合させた。この実験系では、ＳＣ２．２のベータ半減期は約７時間であると計算した。
ＲＭＡ／Ｓ−ＨＥＲ２皮下腫瘍に対するＳＣ２．２のｉｎ  ｖｉｖｏ試験
【０２５７】
皮下ＲＭＡ／Ｓ−ＨＥＲ２腫瘍に対するＳＣ２．２の有効性を試験するために、ｉｎ  ｖｉｖｏ研究を図５６に従って設計した。ヒトＨＥＲ２を形質導入した１０６個のＲＭＡ／Ｓ細胞を、２０匹のＣ５７Ｂｌ／６マウスの脇腹に皮下注射した。腫瘍接種（innoculation）の２日後から開始して、ＳＣ２．２をＩＰ注射により毎日投与した。ＳＣ２．２をビヒクル対照と共に高濃度および低濃度にて投与した。腫瘍接種の４日後から開始して、腫瘍を、研究期間中、月曜日、水曜日、および金曜日に測定した。腫瘍体積を以下の式を使用して計算した：腫瘍体積＝長さ×幅×高さ。
ＴｒｉＮＫＥＴはヒトＮＫＧ２Ｄを発現する細胞に結合する
【０２５８】
ヒトＮＫＧ２Ｄを発現する細胞に結合するＴｒｉＮＫＥＴの能力を決定した。図３７および図３８は、異なるＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを含有する２つのＴｒｉＮＫＥＴの用量応答結合を示す。図３７は、ＣＤ３３結合ドメインが第２の標的化アームとして使用される場合の２つのＴｒｉＮＫＥＴの結合を示す。図３８は、同じ２つのＮＫＧ２Ｄ結合ドメインがここでＨＥＲ２の第２の標的化アームと対合したことを示す。６つのＮＫＧ２Ｄ結合ドメインは、両方の腫瘍標的化ドメインと同じ結合プロファイルを保持する。
ＴｒｉＮＫＥＴはヒトがん抗原を発現する細胞に結合する
【０２５９】
ヒトがん抗原を発現する細胞に結合するＴｒｉＮＫＥＴの能力を決定した。図４１および図４２は、細胞により発現されたＣＤ３３（図４１）およびＨＥＲ２（図４２）へのＴｒｉＮＫＥＴの結合を示す。細胞により発現された抗原へのＴｒｉＮＫＥＴ結合はＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン間で一致した。ＴｒｉＮＫＥＴは親モノクローナル抗体と同等のレベルで結合した。
ヒトＨＥＲ２陽性がん細胞株の抗体結合能
【０２６０】
表９はＨＥＲ２表面定量の結果を示す。ＳｋＢｒ−３およびＨＣＣ１９５４細胞は高い（＋＋＋）レベルの表面ＨＥＲ２を有することが確認された。ＺＲ−７５−１およびＣｏｌｏ２０１は中レベル（＋＋）の表面ＨＥＲ２を示し、７８６−Ｏは最も低いレベルのＨＥＲ２（＋）を示した。
【０２６１】
【表９】
2020506971.tif 000027
初代ヒトＮＫ細胞は、様々なレベルのＨＥＲ２を発現するヒトがん株との共培養においてＴｒｉＮＫＥＴによって活性化される
【０２６２】
図４７Ａ〜４７Ｃは、ＴｒｉＮＫＥＴおよびトラスツズマブがＨＥＲ２陽性ヒト腫瘍細胞との共培養において初代ヒトＮＫ細胞を活性化させることができたことを示し、このことはＣＤ１０７ａ脱顆粒およびＩＦＮγサイトカイン産生の増加によって示される。モノクローナル抗体トラスツズマブと比較して、両方のＴｒｉＮＫＥＴは、様々なヒトＨＥＲ２がん細胞でヒトＮＫ細胞の優れた活性化を示した。
【０２６３】
図４７Ａは、ヒトＮＫ細胞が、ＳｋＢｒ−３細胞と培養された場合、ＴｒｉＮＫＥＴによって活性化されることを示す。図４７Ｂは、ヒトＮＫ細胞が、Ｃｏｌｏ２０１細胞と培養された場合、ＴｒｉＮＫＥＴによって活性化されることを示す。図４７Ｃは、ヒトＮＫ細胞が、ＨＣＣ１９５４細胞と培養された場合、ＴｒｉＮＫＥＴによって活性化されることを示す。
ＴｒｉＮＫＥＴは休止ヒトＮＫ細胞およびＩＬ−２活性化ヒトＮＫ細胞の活性を増強する
【０２６４】
図４８Ａ〜４８Ｂは、ＣＤ３３発現ヒトＡＭＬ細胞株ＭＶ４−１１との共培養における休止ヒトＮＫ細胞またはＩＬ−２活性化ヒトＮＫ細胞のＴｒｉＮＫＥＴ媒介活性化を示す。図４８Ａは、休止ヒトＮＫ細胞のＴｒｉＮＫＥＴ媒介活性化を示す。図４８Ｂは、同じドナー由来のＩＬ−２活性化ヒトＮＫ細胞のＴｒｉＮＫＥＴ媒介活性化を示す。休止ＮＫ細胞は、ＩＬ−２活性化ＮＫ細胞より少ないバックグラウンドＩＦＮγ産生およびＣＤ１０７ａ脱顆粒を示した。休止ＮＫ細胞は、ＩＬ−２活性化ＮＫ細胞と比較してＩＦＮγ産生およびＣＤ１０７ａ脱顆粒において、より大きな変化を示した。ＩＬ−２活性化ＮＫ細胞は、ＴｒｉＮＫＥＴでの刺激後、より多くのパーセンテージの細胞がＩＦＮγ＋；ＣＤ１０７ａになることを示した。
ＴｒｉＮＫＥＴは休止ヒトＮＫ細胞およびＩＬ−２活性化ヒトＮＫ細胞の細胞傷害性を増強する
【０２６５】
図４９Ａ〜４９Ｂは、ＩＬ−２活性化ヒトＮＫ細胞および休止ヒトＮＫ細胞を使用した細胞傷害活性のＴｒｉＮＫＥＴ増強を示す。図４９Ａは、休止ヒトＮＫ細胞によるＳｋＢｒ−３腫瘍細胞の特異的溶解パーセントを示す。図４９Ｂは、ＩＬ−２活性化ヒトＮＫ細胞によるＳｋＢｒ−３腫瘍細胞の特異的溶解パーセントを示す。ＩＬ−２活性化ＮＫ細胞集団および休止ＮＫ細胞集団は同じドナーに由来した。トラスツズマブと比較して、ＴｒｉＮＫＥＴは、活性化ＮＫ細胞集団または休止ＮＫ細胞集団のいずれかによるＳｋＢｒ−３細胞に対する応答をより強力に指向する。
ＴｒｉＮＫＥＴは表面発現が低い標的に対するＮＫ細胞の細胞傷害性を増強する
【０２６６】
図５０Ａ〜５０Ｂは、ＴｒｉＮＫＥＴが、トラスツズマブと比較してＨＥＲ２が中程度のがんおよび低度のがんに対して、より大きな利点をもたらすことを示す。図５０Ａは、ＨＥＲ２高ＳｋＢｒ−３腫瘍細胞の活性化されたヒトＮＫ細胞殺傷を示す。図５０Ｂは、ＨＥＲ２低７８６−Ｏ腫瘍細胞のヒトＮＫ細胞殺傷を示す。ＴｒｉＮＫＥＴは、ＨＥＲ２発現が低いがん細胞に対してトラスツズマブと比較して、より大きな利点をもたらす。ＴｒｉＮＫＥＴは、表面発現が低い標的に対して最大の利点をもたらす。
ＦｃＲの発現が高いがんを処置する際のＴｒｉＮＫＥＴの利点、または高レベルのＦｃＲを有する腫瘍微小環境におけるＴｒｉＮＫＥＴの利点
【０２６７】
モノクローナル抗体療法は、血液系腫瘍および固形腫瘍の両方を含む、多くのがんの種類の処置のために承認されている。がんの処置におけるモノクローナル抗体の使用は患者の転帰を改善したが、依然として限界がある。機構研究により、モノクローナル抗体が、とりわけ、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、食作用、およびシグナル遮断を含む複数の機構を介して腫瘍成長に対してそれらの効果を発揮することが示されている。
【０２６８】
中でも注目すべきは、ＡＤＣＣは、モノクローナル抗体がそれらの効果を発揮する主要な機構であると考えられている。ＡＤＣＣは、腫瘍細胞の直接溶解を媒介するナチュラルキラー細胞の表面における低親和性ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）の抗体Ｆｃ会合に依存する。ＦｃγＲの中で、ＣＤ１６はＩｇＧ  Ｆｃに対して最も低い親和性を有し、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）は高親和性ＦｃＲであり、ＣＤ１６よりもＩｇＧ  Ｆｃに対して約１０００倍強く結合する。
【０２６９】
ＣＤ６４は、通常、骨髄細胞系列などの多くの造血系列において発現され、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）などの、これらの細胞型に由来する腫瘍において発現され得る。ＭＤＳＣおよび単球などの、腫瘍に浸潤する免疫細胞も、ＣＤ６４を発現し、腫瘍微小環境に浸潤することが知られている。腫瘍による、または腫瘍微小環境におけるＣＤ６４の発現は、モノクローナル抗体療法に対して有害な効果を有し得る。腫瘍微小環境におけるＣＤ６４の発現は、抗体が高親和性受容体に結合することを好むので、これらの抗体がＮＫ細胞の表面におけるＣＤ１６と会合することを困難にする。ＮＫ細胞の表面における２つの活性化受容体を標的とすることにより、ＴｒｉＮＫＥＴは、モノクローナル抗体療法に対するＣＤ６４発現の有害な効果を克服することができる。
３つのＡＭＬ細胞株におけるＦｃＲγＩ（ＣＤ６４）発現
【０２７０】
高レベルおよび低レベルのＣＤ６４を表面発現する腫瘍に対するＴｒｉＮＫＥＴおよびモノクローナル抗体の活性を試験するためにｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養系を開発した。Ｍｏｌｍ−１３およびＴＨＰ−１は、表面ＣＤ３３と同様に発現する２つのヒトＡＭＬ細胞株であるが、Ｍｏｌｍ−１３細胞はＣＤ６４を発現せず、一方で、ＴＨＰ−１細胞はそれらの表面においてＣＤ６４を発現する（図５１Ａ〜５１Ｃ）。ＣＤ３３を標的とするように指向されたモノクローナル抗体またはＴｒｉＮＫＥＴを使用して、モノクローナル抗体またはＴｒｉＮＫＥＴ療法に対する腫瘍によるＣＤ６４発現の効果を試験した。図５１Ａ〜５１Ｃは、３つのヒトＡＭＬ細胞株である、Ｍｏｌｍ−１３細胞株（図５１Ａ）、Ｍｖ４−１１細胞株（図５１Ｂ）、およびＴＨＰ−１細胞株（図５１Ｃ）における高親和性ＦｃＲγＩ（ＣＤ６４）の発現を示す。Ｍｏｌｍ−１３細胞はＣＤ６４を発現せず、一方で、Ｍｖ４−１１細胞は低レベルの細胞表面ＣＤ６４を有し、ＴＨＰ−１は高レベルの細胞表面ＣＤ６４を有する。
ＴｒｉＮＫＥＴはＦｃＲの表面発現が高い腫瘍細胞を標的とするのに有利である
【０２７１】
図５２Ａ〜５２Ｂは、Ｍｏｌｍ−１３細胞（図５２Ｂ）またはＴＨＰ−１細胞（図５２Ａ）のいずれかとの共培養におけるヒトＮＫ細胞のモノクローナル抗体またはＴｒｉＮＫＥＴ媒介活性化を示す。ヒトＣＤ３３に対するモノクローナル抗体は、増加したＣＤ１０７ａ脱顆粒およびＩＦＮγ産生によって証明されるようにＭｏｌｍ−１３共培養系において、ヒトＮＫ細胞の良好な活性化を示した。モノクローナル抗体は、高レベルのＣＤ６４が腫瘍に存在するＴＨＰ−１共培養系において効果を有さない。興味深いことに、ＴｒｉＮＫＥＴはＭｏｌｍ−１３細胞（図５２Ｂ）およびＴＨＰ−１細胞（図５２Ａ）の両方に対して効果的であったが、モノクローナル抗体はＦｃＲ−Ｈｉ  ＴＨＰ−１細胞との培養においてＮＫ細胞を活性化することができず、このことは、ＴｒｉＮＫＥＴが腫瘍におけるＣＤ６４への結合を克服し、活性化のためにＮＫ細胞を効果的に標的とすることができることを示す。ＮＫ細胞における２つの活性化受容体の二重標的化により、ＮＫ細胞に対するより強い特異的結合がもたらされた。ＮＫ細胞におけるＣＤ１６のみを標的とするモノクローナル抗体は、他の高親和性ＦｃＲに結合することができ、ＮＫ細胞におけるＣＤ１６の会合を阻止する。
【０２７２】
Ｍｏｌｍ−１３およびＴＨＰ−１共培養系を使用するヒトＮＫ細胞の細胞傷害性アッセイは、高レベルのＣＤ６４の存在下でＴｒｉＮＫＥＴの有効性を支持するさらなる証拠を提供する。これらの細胞傷害性アッセイにおいて、第３のヒトＡＭＬ細胞株である、Ｍｖ４−１１を使用した。Ｍｖ４−１１細胞（図５１Ｂ）は低レベルのＣＤ６４を発現し、それらの表面におけるＣＤ６４のレベルについてはＴＨＰ−１細胞（図５１Ｃ）とＭｏｌｍ−１３細胞（図５１Ａ）との間にある。
ＴｒｉＮＫＥＴは、ＦｃγＲＩ発現にかかわらず、ＡＭＬ細胞株に対する有効性を示す
【０２７３】
図５３Ａ〜５３Ｃは、標的として３つのヒトＡＭＬ細胞株を使用するヒトＮＫ細胞傷害性アッセイを示す。ＣＤ３３に対するモノクローナル抗体は、ＣＤ６４を発現しないＭｏｌｍ−１３細胞に対して良好な有効性を示す（図５３Ｂ）。ＣＤ６４を発現するが、ＴＨＰ−１より低いレベルであるＭｖ４−１１細胞（図５３Ａ）はモノクローナル抗ＣＤ３３で低減した有効性を示した。ＴＨＰ−１細胞（図５３Ｃ）は、モノクローナル抗ＣＤ３３単独では効果を示さなかった。腫瘍細胞におけるＣＤ６４発現にかかわらず、ＴｒｉＮＫＥＴは、ここで試験したすべての腫瘍細胞に対してヒトＮＫ細胞応答を媒介することができた。
【０２７４】
図５３Ａ〜５３Ｃは、ＴＨＰ−１細胞が、それらの表面における高レベルの高親和性ＦｃＲ発現に起因して、モノクローナル抗体療法に対して保護されたことを示す。ＴｒｉＮＫＥＴは、ＮＫ細胞の表面における２つの活性化受容体を標的とすることによってこの保護を回避した。細胞傷害性データは、共培養活性化実験において見られたものと直接相関した。ＴｒｉＮＫＥＴは、ＴＨＰ−１細胞で見られたｍＡｂ療法からの保護を回避することができ、高レベルのＦｃＲにもかかわらず、ＮＫ細胞媒介溶解を誘導することができた。
ＰＢＭＣ培養における正常な骨髄細胞および正常なＢ細胞の殺傷：ＴｒｉＮＫＥＴは、少ないオンターゲット・オフ腫瘍副作用によって、より良好な安全性プロファイルを提供する
【０２７５】
ナチュラルキラー細胞およびＣＤ８  Ｔ細胞は両方とも腫瘍細胞を直接的に溶解させることができるが、ＮＫ細胞およびＣＤ８  Ｔ細胞が腫瘍細胞から正常な自己を認識する機構は異なる。ＮＫ細胞の活性は、活性化受容体（ＮＣＲ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１６など）および阻害受容体（ＫＩＲ、ＮＫＧ２Ａなど）からのシグナルのバランスによって調節される。これらの活性化シグナルおよび阻害シグナルのバランスにより、ＮＫ細胞が、ストレスを受けた自己細胞、ウイルスに感染した自己細胞、または形質転換した自己細胞から健康な自己細胞を判定することが可能になる。この「内蔵された」自己寛容機構は、正常で健康な組織をＮＫ細胞応答から保護するのに役立つ。この原理を拡大適用すると、ＮＫ細胞の自己寛容により、ＴｒｉＮＫＥＴが、腫瘍外の副作用を伴わず、または治療域の増加を伴って、自己および腫瘍の両方で発現する抗原を標的とすることが可能になる。
【０２７６】
ナチュラルキラー細胞とは異なり、Ｔ細胞は、活性化およびエフェクター機能のために、ＭＨＣ分子によって提示される特定のペプチドの認識を必要とする。Ｔ細胞は免疫療法の主要な標的であり、腫瘍に対するＴ細胞応答を再指向するために多くの方策が立てられてきた。Ｔ細胞二重特異性薬、チェックポイント阻害剤、およびＣＡＲ−Ｔ細胞はすべてＦＤＡに承認されているが、用量制限毒性を有することが多い。Ｔ細胞二重特異性薬およびＣＡＲ−Ｔ細胞は、結合ドメインを使用して腫瘍細胞の表面にある抗原を標的とすること、および工学操作されたシグナル伝達ドメインを使用して活性化シグナルをエフェクター細胞に伝達することにより、ＴＣＲ−ＭＨＣ認識システムを回避する。これらの療法は、抗腫瘍免疫応答を誘発するのに効果的であるが、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）およびオンターゲット・オフ腫瘍副作用を伴うことが多い。これに関連して、ＴｒｉＮＫＥＴが独特であるのは、それらが、ＮＫ細胞の活性化および阻害の天然のシステムを「無効化」しないからである。むしろＴｒｉＮＫＥＴは、このバランスを傾け、ＮＫの健康な自己に対する寛容性を維持しながら、さらなる活性化シグナルをＮＫ細胞にもたらすようにデザインされている。
【０２７７】
密度勾配遠心分離によって全血からＰＢＭＣを単離した。あらゆる混入赤血球を、ＡＣＫ溶解緩衝液中でのインキュベーションによって溶解した。ＰＢＭＣをＰＢＳ中で３回洗浄し、総ＰＢＭＣを計数した。ＰＢＭＣを初代細胞培養培地中で１０６／ｍＬに調整した。１ｍＬのＰＢＭＣを２４ウェルプレートのウェルに播種し、示したＴｒｉＮＫＥＴまたはｍＡｂを１０ｕｇ／ｍＬにてＰＢＭＣ培養物に添加した。細胞を３７Ｃにて５％ＣＯ２で一晩培養した。翌日（２４時間後）、ＰＢＭＣを培養物から採取し、ＦＡＣＳ分析のために調製した。ＣＤ４５＋；ＣＤ１９＋Ｂ細胞およびＣＤ４５＋；ＣＤ３３＋；ＣＤ１１ｂ＋骨髄細胞のパーセンテージを、異なる処置群にわたって分析した。
【０２７８】
図５４Ｂおよび５４Ｄは、自己骨髄細胞がＴｒｉＮＫＥＴ媒介ＮＫ細胞応答から保護されることを示す。図５４Ａおよび５４Ｂは、健康なドナー由来のＢ細胞がＴｒｉＮＫＥＴ媒介溶解に対して感受性があり、一方で、骨髄細胞がＴｒｉＮＫＥＴ溶解に対して耐性があることを示す。ＣＤ２０を標的とするＴｒｉＮＫＥＴで処置したＰＢＭＣは、ＣＤ４５＋リンパ球集団を有するＣＤ１９＋Ｂ細胞の低減した頻度を示したが（図５４Ａ）、ＣＤ４５＋、ＣＤＤ３−、ＣＤ５６−リンパ球集団では効果がなかった（図５４Ｃ）。これらの培養物では、ＣＤ４５＋、ＣＤ１９＋骨髄細胞の頻度（図５４Ｂ）、またはＣＤ３３＋、ＣＤ３３＋、ＣＤ１１ｂ＋骨髄細胞の頻度（図５４Ｄ）は変化しなかった。
ＴｒｉＮＫＥＴは長期の共培養においてＳｋＢｒ−３腫瘍細胞のｈＰＢＭＣ殺傷を媒介する
初代ヒトＰＢＭＣ細胞傷害性アッセイ
【０２７９】
図５５は、ヒトＰＢＭＣとの培養におけるＳｋＢｒ−３細胞の長期殺傷を示す。単独で培養すると、ＳｋＢｒ−３細胞は増殖し、６０時間でほぼ倍増する。ヒトＰＢＭＣを培養物中のＳｋＢｒ−３細胞に添加すると、増殖速度が遅くなり、ＣＤ３３を標的とするアイソタイプ対照ＴｒｉＮＫＥＴを添加しても、比較的程度は少ないが、増殖が遅くなる。培養物をトラスツズマブＳｋＢｒ−３で処置すると、もはや増殖せず、６０時間後、時間ゼロからの細胞の８０％のみが残る。ＳｋＢｒ−３細胞はＨＥＲ２シグナル遮断に対して感受性があるので、ＳｋＢｒ−３細胞成長に対する効果は、ＨＥＲ２シグナル遮断によって、またはＡＤＣＣなどのＦｃエフェクター機能を介して媒介され得る。
（実施例１５）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９  ＴｒｉＮＫＥＴの抗腫瘍効果
【０２８０】
ネズミｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９  ＴｒｉＮＫＥＴの結合活性を検証するために、Ｔｙｒｐ−１陽性Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞（図５８Ａ）およびネズミＮＫＧ２Ｄを過剰発現するＥＬ４株（ＥＬ４−ｍＮＫＧ２Ｄ、図５８Ｂ）に対するフローサイトメトリーアッセイによって、そのモノクローナル抗体と比較して直接結合を測定した。
【０２８１】
ｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９  ＴｒｉＮＫＥＴが細胞傷害性を媒介する能力を保持しているかどうかを試験するために、ネズミＩＬ−２活性化ＮＫ細胞によるＴｙｒｐ−１陽性Ｂ１６Ｆ１０腫瘍標的の殺傷を測定した。図５９に示すように、ネズミＮＫ細胞は、ｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９の存在下でそれらの細胞傷害活性を増加させた。重要なことに、抗Ｔｙｒｐ−１モノクローナル抗体ＴＡ９９は、わずかな効果しか示さなかった。
ｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９  ＴｒｉＮＫＥＴによって媒介されるＮＫ細胞傷害性の増加
【０２８２】
１つのウェル当たり約５×１０３個のＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞をアッセイの２日前に播種した。実験の日に、５×１０４個のネズミＩＬ−２活性化ＮＫ細胞を、ＴＡ９９  ｍａｂまたはｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９  ＴｒｉＮＫＥＴの存在下で添加した（ｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９は、ＦｃとしてマウスＩｇＧ２ｃを有するｍＣ２６およびＴＡ９９のヘテロ二量体である。Ｇｍ突然変異とは、ヘテロ二量体を生成するために使用されるヘテロ二量体化突然変異を指す）。４倍希釈した２０μｇ／ｍＬの抗体を使用した。共培養の４時間後、細胞傷害性のパーセンテージを、ＬＤＨ放出についてのＣｙｔｏＴｏｘ９６キットを使用して評価した。点線は、抗体の非存在下でのベースライン細胞傷害性を表す。
【化１１−１】
2020506971.tif 000028
【化１１−２】
2020506971.tif 000029
（実施例１６）
ｉｎ  ｖｉｖｏでのｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９  ＴｒｉＮＫＥＴの抗腫瘍効果
【０２８３】
ｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９が、ｉｎ  ｖｉｖｏで抗腫瘍機能を引き起こすかどうかを試験するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに２×１０５個のＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞を皮下注射した。マウスを、アイソタイプ対照であるモノクローナルＴＡ９９抗体またはｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９  ＴｒｉＮＫＥＴのいずれかで処置した。モノクローナルＴＡ９９抗体での処置は、アイソタイプで処置した対照群におけるものと同様の腫瘍進行を示した。しかしながら、ｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９  ＴｒｉＮＫＥＴの投与の結果、アイソタイプ処置群と比較して腫瘍進行が遅延した。約２×１０５個のＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスの脇腹に皮下注射した。腫瘍接種の６日後に、マウスを無作為化した（ｎ＝１０／群）。マウスを、１５０μｇの用量（６、８、１０、１２、１４、１６、および２１日目）にて注射した、（図６０Ａ）アイソタイプ対照マウスＩｇＧ２ａ  ｍａｂ  Ｃ１．１８．４およびマウス抗Ｔｙｒｐ−１モノクローナル抗体または（図６０Ｂ）アイソタイプ対照マウスＩｇＧ２ａ  ｍａｂ  Ｃ１．１８．４およびｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９  ＴｒｉＮＫＥＴで腹腔内処置した。腫瘍成長を２８日間評価した。グラフは個々のマウスの腫瘍成長曲線を示す。
【０２８４】
皮下Ｂ１６Ｆ１０腫瘍モデルに加えて、ｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９  ＴｒｉＮＫＥＴもまた、播種性腫瘍環境におけるその腫瘍効果について試験した。１×１０５個のＢ１６Ｆ１０細胞をマウスに静脈内注射した。低い抗体用量（３００μｇ／注射）および高い抗体用量（６００μｇ／注射）で４日目または７日目のいずれかに処置を開始した。腫瘍接種後の１８日目に、肺転移を計数した。ＴＡ９９モノクローナル抗体またはｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９  ＴｒｉＮＫＥＴを、アイソタイプ処置した対照群と比較して高濃度で使用した場合、腫瘍接種後の４日目および７日目に開始した処置の結果、肺転移の数が低減した。低濃度では、ｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９  ＴｒｉＮＫＥＴのみが腫瘍負荷を減少させた（図６１Ａ）。同様の効果が、抗体を腫瘍接種後の７日目に開始して投与した場合にも見られた。全体として、ｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９  ＴｒｉＮＫＥＴ療法の結果、すべての試験した条件においてモノクローナルＴＡ９９抗体と比較して肺転移の数が少なくなった。約１×１０５個のＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスの尾静脈に静脈内注射した（ｎ＝８／群）。マウスを未処置のままにしたか、または対照ｍａｂ（アイソタイプ、クローンＣ１．１８．４）、モノクローナルＴＡ９９抗体もしくはＴＡ９９  ＴｒｉＮＫＥＴ（ｍｃＦＡＥ−Ｃ２６．９９）で腹腔内処置した。図６１Ａは、抗体を１５０μｇ用量（４、６、８、１１、１３、１５日目）で投与した場合の腫瘍負荷を表す。図６１Ｂは、抗体を１５０μｇ用量（７、９、１１、１３、１５日目）で投与した場合の腫瘍負荷を表す。腫瘍チャレンジの１８日後、マウスを安楽死させ、表面肺転移をスコア化した（図６１Ｂ）。
（実施例１７）
ＨＥＲ２陽性細胞に対する、ＴｒｉＮＫＥＴ、モノクローナル抗体、または二重特異性抗体によって媒介される休止ヒトＮＫ細胞の細胞傷害活性
【０２８５】
密度勾配遠心分離を使用し、ヒト末梢血軟膜からＰＢＭＣを単離した。単離されたＰＢＭＣを洗浄し、ＮＫ細胞単離の準備をした。磁気ビーズを用いたネガティブセレクション技術を使用してＮＫ細胞を単離した。単離されたＮＫ細胞の純度は典型的には＞９０％のＣＤ３−ＣＤ５６＋であった。単離されたＮＫ細胞を、１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２を含有する培地中で培養したか、またはサイトカインなしで一晩休止させた。ＩＬ−２活性化ＮＫ細胞または休止ＮＫ細胞を、翌日、細胞傷害性アッセイに使用した。
【０２８６】
ＤＥＬＦＩＡ細胞傷害性アッセイ：
【０２８７】
目的の標的を発現するヒトがん細胞株を培養物から採取し、細胞をＨＢＳで洗浄し、ＢＡＴＤＡ試薬（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＡＤ０１１６）で標識化するために１０６／ｍＬにて成長培地に再懸濁した。製造業者の説明書に従って標的細胞を標識化した。標識化後、細胞をＨＢＳで３回洗浄し、０．５〜１．０×１０５／ｍＬにて培養培地に再懸濁した。バックグラウンドウェルを準備するために、標識化した細胞のアリコートを取っておき、細胞を培地からスピンアウトした。１００μｌの培地を、ペレット化した細胞を乱さないように３連でウェルに注意深く添加した。１００μｌのＢＡＴＤＡ標識化細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。ウェルを標的細胞からの自然放出のために保存し、ウェルを１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘの添加による標的細胞の最大溶解のために準備した。目的の腫瘍標的に対するモノクローナル抗体またはＴｒｉＮＫＥＴを培養培地中で希釈し、５０μｌの希釈したｍＡｂまたはＴｒｉＮＫＥＴを各ウェルに添加した。休止ＮＫ細胞および／または活性化ＮＫ細胞を培養物から採取し、細胞を洗浄し、所望のＥ：Ｔ比に応じて培養培地に１０５〜２．０×１０６／ｍＬにて再懸濁した。５０μｌのＮＫ細胞をプレートの各ウェルに添加して合計２００μｌの培養体積にした。アッセイの発色前にプレートを３７℃にて５％ＣＯ２で２〜３時間にわたってインキュベートした。
【０２８８】
２〜３時間培養した後、プレートをインキュベーターから取り出し、細胞を２００ｇにて５分間の遠心分離によってペレット化した。２０μｌの培養上清を、製造業者から提供された清浄なマイクロプレートに移し、２００μｌの室温ユーロピウム溶液を各ウェルに添加した。プレートを光から保護し、プレートシェーカーにおいて２５０ｒｐｍにて１５分にわたってインキュベートした。プレートを、Ｖｉｃｔｏｒ  ３またはＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ｉ３Ｘ機器のいずれかを使用して読み取った。特異的溶解％を以下のように計算した：特異的溶解％＝（（実験的放出−自然放出）／（最大放出−自然放出））＊１００％。
モノクローナル抗体および二重特異性ＮＫ細胞エンゲージャーの組合せはＴｒｉＮＫＥＴ活性を再現しない：
【０２８９】
図６６は、ＨＥＲ２陽性Ｃｏｌｏ−２０１細胞株に対するＴｒｉＮＫＥＴ、モノクローナル抗体、または二重特異性抗体によって媒介される休止ヒトＮＫ細胞の細胞傷害活性を示す。ＨＥＲ２を標的とするＴｒｉＮＫＥＴ（ＡＤＩ−２９４０４（Ｆ０４））は、休止ヒトＮＫ細胞によるＣｏｌｏ−２０１細胞の最大溶解を誘導した。Ｄ２６５Ａ突然変異をＴｒｉＮＫＥＴのＣＨ２ドメインに導入してＦｃＲ結合を無効にした。ＨＥＲ２−ＴｒｉＮＫＥＴ（ＡＤＩ−２９４０４（Ｆ０４））−Ｄ２６５ＡはＣｏｌｏ−２０１細胞の溶解を媒介することができず、ＮＫ細胞に対するＣＤ１６およびＮＫＧ２Ｄの二重標的化の重要性が示される。ＮＫ細胞に対する二重標的化の重要性をさらに実証するために、モノクローナル抗体トラスツズマブを使用してＨＥＲ２を標的とし、ＮＫ細胞によりＡＤＣＣを媒介した。トラスツズマブ単独ではＣｏｌｏ−２０１細胞のＮＫ細胞溶解を増加させることができたが、トラスツズマブ単独によって達成された最大溶解はＴｒｉＮＫＥＴと比較して約４分の１だった。ＣＤ１６およびＮＫＧ２Ｄが同じ分子を標的とすることの重要性を理解するために、ＴｒｉＮＫＥＴ（ＡＤＩ−２９４０４（Ｆ０４））活性を、トラスツズマブと組み合わせたＨＥＲ２およびＮＫＧ２Ｄを標的とする二重特異性抗体の活性と比較した。等モル濃度で使用した場合、二重特異性およびトラスツズマブの組合せは、休止ヒトＮＫ細胞によるＣｏｌｏ−２０１細胞の最大溶解を媒介することができなかった。トラスツズマブ＋二重特異性の組合せの不成功は、１つの分子中にＴｒｉＮＫＥＴの三重特異性結合を含有することの重要性を示す。
参照による組み込み
【０２９０】
本明細書で参照される特許文献および科学論文の各々の開示全体は、すべての目的のために参照により組み込まれる。
等価物
【０２９１】
本発明は、その精神または本質的な特徴から逸脱せずに他の特定の形態で実現されてもよい。したがって、前述の実施形態は、本明細書で記載している本発明を限定するのではなく、すべての点で例示的であると見なされるべきである。したがって、本発明の範囲は、前述の記載によってではなく、添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の等価の意味および範囲内に入るすべての変更はその中に包含されることが意図される。
【図１】
2020506971.tif 000030
【図２】
2020506971.tif 000031
【図３】
2020506971.tif 000032
【図４】
2020506971.tif 000033
【図５】
2020506971.tif 000034
【図６】
2020506971.tif 000035
【図７】
2020506971.tif 000036
【図８】
2020506971.tif 000037
【図９】
2020506971.tif 000038
【図１０】
2020506971.tif 000039
【図１１】
2020506971.tif 000040
【図１２】
2020506971.tif 000041
【図１３Ａ】
2020506971.tif 000042
【図１３Ｂ】
2020506971.tif 000043
【図１４】
2020506971.tif 000044
【図１５】
2020506971.tif 000045
【図１６】
2020506971.tif 000046
【図１７】
2020506971.tif 000047
【図１８】
2020506971.tif 000048
【図１９】
2020506971.tif 000049
【図２０】
2020506971.tif 000050
【図２１】
2020506971.tif 000051
【図２２】
2020506971.tif 000052
【図２３】
2020506971.tif 000053
【図２４】
2020506971.tif 000054
【図２５】
2020506971.tif 000055
【図２６】
2020506971.tif 000056
【図２７】
2020506971.tif 000057
【図２８】
2020506971.tif 000058
【図２９】
2020506971.tif 000059
【図３０】
2020506971.tif 000060
【図３１】
2020506971.tif 000061
【図３２】
2020506971.tif 000062
【図３３】
2020506971.tif 000063
【図３４】
2020506971.tif 000064
【図３５】
2020506971.tif 000065
【図３６】
2020506971.tif 000066
【図３７】
2020506971.tif 000067
【図３８】
2020506971.tif 000068
【図３９】
2020506971.tif 000069
【図４０】
2020506971.tif 000070
【図４１】
2020506971.tif 000071
【図４２】
2020506971.tif 000072
【図４３】
2020506971.tif 000073
【図４４】
2020506971.tif 000074
【図４５Ａ】
2020506971.tif 000075
【図４５Ｂ】
2020506971.tif 000076
【図４５Ｃ】
2020506971.tif 000077
【図４６】
2020506971.tif 000078
【図４７−１】
2020506971.tif 000079
【図４７−２】
2020506971.tif 000080
【図４８】
2020506971.tif 000081
【図４９】
2020506971.tif 000082
【図５０】
2020506971.tif 000083
【図５１Ａ−５１Ｃ】
2020506971.tif 000084
【図５２】
2020506971.tif 000085
【図５３−１】
2020506971.tif 000086
【図５３−２】
2020506971.tif 000087
【図５４−１】
2020506971.tif 000088
【図５４−２】
2020506971.tif 000089
【図５５】
2020506971.tif 000090
【図５６】
2020506971.tif 000091
【図５７】
2020506971.tif 000092
【図５８Ａ】
2020506971.tif 000093
【図５８Ｂ】
2020506971.tif 000094
【図５９】
2020506971.tif 000095
【図６０】
2020506971.tif 000096
【図６１】
2020506971.tif 000097
【図６２】
2020506971.tif 000098
【図６３】
2020506971.tif 000099
【図６４】
2020506971.tif 000100
【図６５】
2020506971.tif 000101
【図６６】
2020506971.tif 000102
【図６７】
2020506971.tif 000103
【図６８】
2020506971.tif 000104
【図６９】
2020506971.tif 000105
【図７０】
2020506971.tif 000106
【配列表】
2020506971000001.app
【国際調査報告】
2020506971.tif 000107
2020506971.tif 000108