(57)【要約】  ウシパピローマウイルスＤＮＡヘリカーゼＥ１の２つの切断型および導電性ナノポアの調製におけるその使用が提供される。
2020505043.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）単離されたウシパピローマウイルス二本鎖ＤＮＡヘリカーゼの３０６〜５７７位のアミノ酸からなり、およびその配列が配列番号３に示されている；又は
（２）（１）で定義されたタンパク質のアミノ酸配列中の少なくとも１つのアミノ酸の置換及び／若しくは欠失及び／若しくは挿入によって得られる変異体であることを特徴とする、タンパク質。
【請求項２】
（１）で定義されたタンパク質のアミノ酸配列中の１〜２０個のアミノ酸を置換及び／又は欠失及び／又は挿入することによって得られる変異体である、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
（１）で定義されたタンパク質のアミノ酸配列中の１〜３個のアミノ酸の置換及び／又は欠失及び／又は挿入によって得られる変異体である、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項４】
（１）で定義された配列番号３の配列と７５％を超えるアミノ酸配列相同性を有する相同変異体である、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項５】
（１）で定義された配列番号３の配列と９０％を超えるアミノ酸配列相同性を有する相同変異体である、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項６】
（１）で定義された配列番号３の配列と９９％を超えるアミノ酸配列相同性を有する相同変異体である、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項７】
配列番号３に示されるアミノ酸配列の変異体を含み、前記変異体が以下の突然変異：
（ａ）４７９位のアミノ酸が、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、セリン（Ｓ）、アスパラギン（Ｎ）、トレオニン（Ｔ）である；
（ｂ）４８９位のアミノ酸が、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、アスパラギン（Ｎ）、トレオニン（Ｔ）およびセリン（Ｓ）である；
（ｃ）５３０位のアミノ酸が、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、セリン（Ｓ）、アスパラギン（Ｎ）、トレオニン（Ｔ）である；
（ｄ）５２９位のアミノ酸が、グルタミン（Ｑ）およびリジン（Ｋ）である；
（ｅ）５２５位のアミノ酸が、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、セリン（Ｓ）、ロイシン（Ｌ）、トレオニン（Ｔ）である；
（ｆ）５０４位のアミノ酸が、アスパラギン（Ｎ）、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、フェニルアラニン（ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）である；
（ｇ）３２８位のアミノ酸が、グルタミン（Ｑ）、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）である；
（ｈ）３６０位のアミノ酸が、アスパラギン（Ｎ）、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）である；
（ｉ）３２２位のアミノ酸が、アスパラギン（Ｎ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、グルタミン（Ｑ）である；
（ｊ）３７２位のアミノ酸が、グルタミン（Ｑ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、プロリン（Ｐ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、アスパラギン（Ｎ）である；
（ｋ）３４２位のアミノ酸が、アスパラギン（Ｎ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、グルタミン（Ｑ）である；
（ｌ）３３４位のアミノ酸が、アスパラギン（Ｎ）、ロイシン（ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、グルタミン（Ｑ）である；
（ｍ）３９２位のアミノ酸が、アスパラギン（Ｎ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、グルタミン（Ｑ）である；
（ｎ）４０８位のアミノ酸が、アスパラギン（Ｎ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、グルタミン（Ｑ）である；
（ｏ）３９６位のアミノ酸が、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、フェニルアラニン（Ｆ）およびトリプトファン（Ｗ）、アラニン（Ａ）およびグリシン（Ｇ）である；
（ｐ）５７０位のアミノ酸が、バリン（Ｖ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）である；
（ｑ）５７４位のアミノ酸が、トリプトファン（Ｗ）、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）およびフェニルアラニン（Ｆ）である；
（ｒ）４１７位のアミノ酸が、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、アラニン（Ａ）およびグリシン（Ｇ）である；
（ｓ）４２１位のアミノ酸が、バリン（Ｖ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、ロイシン（Ｌ）およびイソロイシン（Ｉ）である；
（ｔ）３８３位のアミノ酸が、バリン（Ｖ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）である；
（ｕ）３８７位のアミノ酸が、ヒスチジン（Ｈ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）である；
（ｖ）３２３位のアミノ酸が、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（ｖ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）である；
（ｗ）３２４位のアミノ酸が、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）およびバリン（Ｖ）である；
（ｘ）５６５位のアミノ酸が、トレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）およびチロシン（Ｙ）である；
（ｙ）４２６位のアミノ酸が、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）である
の少なくとも１つを含み、
前記各突然変異位置の数は、前記ウシパピローマウイルス二本鎖ＤＮＡヘリカーゼの完全長の最初の位置から数え始め、
前記ウシパピローマウイルス二本鎖ＤＮＡヘリカーゼの完全長アミノ酸配列が配列番号５に示されている、
請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項８】
前記変異体が、配列番号３のアミノ酸配列のタンパク質と同じ又は類似の機能を有し、前記類似の機能が、多量体タンパク質細孔を形成することができる単量体であり得ることであり、前記同じ機能が、細孔を形成することができる単量体であり得ること及び形成された多量体タンパク質細孔もまたヘリカーゼ活性を有することである、請求項１〜７のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項９】
化学的に修飾されている、請求項１〜８のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項１０】
前記タンパク質が、分子を１以上のシステインに連結すること、分子を１以上のリジンに連結すること、及び分子を１以上の非天然アミノ酸に連結すること、エピトープの酵素修飾又は末端修飾によって化学的に修飾されている、請求項９に記載のタンパク質。
【請求項１１】
前記１以上のシステイン又は前記１以上の非天然アミノ酸が置換によって前記タンパク質に導入されている、請求項１０に記載のタンパク質。
【請求項１２】
前記分子が、
（ａ）導電性チャネルを含むタンパク質若しくは膜を含むナノポアと、標的被検体、標的ヌクレオチド若しくはポリヌクレオチドとの間の相互作用を促進することができる分子アプタマー；又は
（ｂ）ポリヌクレオチド結合タンパク質；
である、請求項１０又は１１に記載のタンパク質。
【請求項１３】
前記連結がリンカーによって達成される、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項１４】
前記分子が前記変異体の１以上の部位に連結されている、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の２以上のタンパク質のサブユニットを含む、多量体タンパク質。
【請求項１６】
前記多量体タンパク質を構成するサブユニットの数が４〜８である、請求項１５に記載の多量体タンパク質。
【請求項１７】
前記多量体タンパク質を構成するサブユニットの数が６である、請求項１６に記載の多量体タンパク質。
【請求項１８】
前記多量体タンパク質がホモ多量体又はヘテロ多量体である、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の多量体タンパク質。
【請求項１９】
（１）単離されたウシパピローマウイルス二本鎖ＤＮＡヘリカーゼの３０６〜６０５位のアミノ酸からなり、その配列が配列番号１に示されている；又は
（２）（１）で定義されたタンパク質のアミノ酸配列中の少なくとも１つのアミノ酸の置換及び／若しくは欠失及び／若しくは挿入によって得られる変異体である；
ことを特徴とする、タンパク質。
【請求項２０】
（１）で定義されたタンパク質のアミノ酸配列中の１〜２０個のアミノ酸を置換及び／又は欠失及び／又は挿入することによって得られる変異体である、請求項１９に記載のタンパク質。
【請求項２１】
（１）で定義されたタンパク質のアミノ酸配列中の１〜３個のアミノ基の置換及び／又は欠失及び／又は挿入によって得られる変異体である、請求項１９に記載のタンパク質。
【請求項２２】
（１）で定義された配列番号１の配列と７５％を超えるアミノ酸配列相同性を有する相同変異体である、請求項１９に記載のタンパク質。
【請求項２３】
（１）で定義された配列番号１の配列と９０％を超えるアミノ酸配列相同性を有する相同変異体である、請求項１９に記載のタンパク質。
【請求項２４】
（１）で定義された配列番号１の配列と９９％を超えるアミノ酸配列相同性を有する相同変異体である、請求項１９に記載のタンパク質。
【請求項２５】
配列番号１に示されるアミノ酸配列の変異体を含み、前記変異体が以下の突然変異：
（ｚ）４７９位のアミノ酸が、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、セリン（Ｓ）、アスパラギン（Ｎ）、トレオニン（Ｔ）である；
（ａａ）４８９位のアミノ酸が、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、アスパラギン（Ｎ）、トレオニン（Ｔ）およびセリン（Ｓ）である；
（ｂｂ）５３０位のアミノ酸が、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、セリン（Ｓ）、アスパラギン（Ｎ）、トレオニン（Ｔ）である；
（ｃｃ）５２９位のアミノ酸が、グルタミン（Ｑ）およびリジン（Ｋ）である；
（ｄｄ）５２５位のアミノ酸が、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、セリン（Ｓ）、ロイシン（Ｌ）、トレオニン（Ｔ）である；
（ｅｅ）５０４位のアミノ酸が、アスパラギン（Ｎ）、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、フェニルアラニン（ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）である；
（ｆｆ）３２８位のアミノ酸が、グルタミン（Ｑ）、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）である；
（ｇｇ）３６０位のアミノ酸が、アスパラギン（Ｎ）、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）である；
（ｈｈ）３２２位のアミノ酸が、アスパラギン（Ｎ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、グルタミン（Ｑ）である；
（ｉｉ）３７２位のアミノ酸が、グルタミン（Ｑ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、プロリン（Ｐ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、アスパラギン（Ｎ）である；
（ｊｊ）３４２位のアミノ酸が、アスパラギン（Ｎ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、グルタミン（Ｑ）である；
（ｋｋ）３３４位のアミノ酸が、アスパラギン（Ｎ）、ロイシン（ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、グルタミン（Ｑ）である；
（ｌｌ）３９２位のアミノ酸が、アスパラギン（Ｎ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、グルタミン（Ｑ）である；
（ｍｍ）４０８位のアミノ酸が、アスパラギン（Ｎ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、グルタミン（Ｑ）である；
（ｎｎ）３９６位のアミノ酸が、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、フェニルアラニン（Ｆ）およびトリプトファン（Ｗ）、アラニン（Ａ）およびグリシン（Ｇ）である；
（ｏｏ）５７０位のアミノ酸が、バリン（Ｖ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）である；
（ｐｐ）５７４位のアミノ酸が、トリプトファン（Ｗ）、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）およびフェニルアラニン（Ｆ）である；
（ｑｑ）４１７位のアミノ酸が、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、アラニン（Ａ）およびグリシン（Ｇ）である；
（ｒｒ）４２１位のアミノ酸が、バリン（Ｖ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、ロイシン（Ｌ）およびイソロイシン（Ｉ）である；
（ｓｓ）３８３位のアミノ酸が、バリン（Ｖ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）である；
（ｔｔ）３８７位のアミノ酸が、ヒスチジン（Ｈ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）である；
（ｕｕ）３２３位のアミノ酸が、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（ｖ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）である；
（ｖｖ）３２４位のアミノ酸が、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）およびバリン（Ｖ）である；
（ｗｗ）５６５位のアミノ酸が、トレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）およびチロシン（Ｙ）である；
（ｘｘ）４２６位のアミノ酸が、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）である
の少なくとも１つを含み、
前記各突然変異位置の数は、前記ウシパピローマウイルス二本鎖ＤＮＡヘリカーゼの完全長の最初の位置から数え始め、
前記ウシパピローマウイルス二本鎖ＤＮＡヘリカーゼの完全長アミノ酸配列が配列番号５に示されている、請求項１９〜２４のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項２６】
前記変異体が、配列番号３のアミノ酸配列のタンパク質と同じ又は類似の機能を有し、前記類似の機能が、多量体タンパク質細孔を形成することができる単量体であり得ることであり、前記同じ機能が、細孔を形成することができる単量体であり得ること及び形成された多量体タンパク質細孔もまたヘリカーゼ活性を有することである、請求項１９〜２５のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項２７】
前記タンパク質変異体が、配列番号１に示されているアミノ酸配列の４２１位をＫからＬに、又は３２３位をＨからＷに変異させることによって得られる、請求項１９〜２６のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項２８】
前記タンパク質変異体のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号６及び配列番号７に示されている、請求項２７に記載のタンパク質。
【請求項２９】
化学的に修飾されている、請求項１９〜２８のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項３０】
前記タンパク質が、分子を１以上のシステインに連結すること、分子を１以上のリジンに連結すること、及び分子を１つ以上の非天然アミノ酸に連結すること、エピトープの酵素修飾又は末端修飾によって化学的に修飾されている、請求項２９に記載のタンパク質。
【請求項３１】
前記１以上のシステイン又は前記１以上の非天然アミノ酸が置換によって前記タンパク質に導入されている、請求項３０に記載のタンパク質。
【請求項３２】
前記分子が、
（ａ）導電性チャネルを含むタンパク質若しくは膜を含むナノポアと、標的被検体、標的ヌクレオチド若しくはポリヌクレオチドとの間の相互作用を促進することができる分子アプタマー；又は
（ｂ）ポリヌクレオチド結合タンパク質；
である、請求項３０又は３１に記載のタンパク質。
【請求項３３】
前記連結がリンカーによって達成される、請求項３０〜３２のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項３４】
前記分子が前記変異体の１以上の部位に連結されている、請求項３０〜３２のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項３５】
請求項１９〜３４のいずれか１項に記載の２以上のタンパク質のサブユニットを含む、多量体タンパク質。
【請求項３６】
前記多量体タンパク質を構成するサブユニットの数が４〜８である、請求項３５に記載の多量体タンパク質。
【請求項３７】
前記多量体タンパク質を構成するサブユニットの数が６である、請求項３５に記載の多量体タンパク質。
【請求項３８】
前記多量体タンパク質が、ホモ多量体又はヘテロ多量体である、請求項３５〜３７のいずれか１項に記載の多量体タンパク質。
【請求項３９】
請求項１〜１４、１９〜３４、１５〜１８、及び３５〜３８のいずれか１項に記載のタンパク質又は多量体タンパク質の、導電性チャネルを含むナノポア又は膜の調製のための使用。
【請求項４０】
（１）膜層；及び
（２）前記多量体タンパク質が前記膜層に埋め込まれてチャネルを形成し、膜貫通電位が印加されたとき、前記チャネルを通して電気的に伝導され得る、請求項１５〜１８又は請求項３５〜３８のいずれか１項に記載の分離された多量体タンパク質
を含む、導電性チャネルを含む膜。
【請求項４１】
前記膜層が、脂質層又は両親媒性ポリマーで形成される単層又は二重層の膜を含む、請求項４０に記載の導電性チャネル含有膜。
【請求項４２】
前記脂質層が両親媒性脂質を含む、請求項４０又は４１に記載の導電性チャネル含有膜。
【請求項４３】
前記脂質層が平面脂質膜層又はリポソームから選択され、及び前記膜の単層がＰＭＯＸＡ−ＰＤＭＳ−ＰＭＯＸＡから形成され、ＰＭＯＸＡがジメチルジアゾリンを表し、ＰＤＭＳがポリジメチルシロキサンを表す、請求項４０〜４２のいずれか１項に記載の導電性チャネル含有膜。
【請求項４４】
電位が印加されたときに前記チャネルを通してＤＮＡ又はＲＮＡを転位させることができる、請求項４０〜４３のいずれか１項に記載の導電性チャネル含有膜。
【請求項４５】
以下の工程：
（ａ）乾燥両親媒性脂質を調製する工程；及び
（ｂ）前記乾燥両親媒性脂質を、水性溶媒、浸透剤、及び請求項１〜１１又は請求項１６〜２８のいずれか１項に記載のいくつかの分離されたタンパク質を含む溶液に再懸濁する工程であって、サブユニットとしての前記タンパク質が六量体タンパク質に自己組織化することができ、これを、特定の条件下で、導電性チャネルを含む膜を形成するのに十分な時間、脂質二重層膜に挿入することができる工程；
を含む、導電性チャネルを含む膜を作製する方法。
【請求項４６】
前記両親媒性脂質がリン脂質である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記リン脂質が、以下に列挙される１以上のリン脂質：ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、１，２−ジアスカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、および１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンから選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
標的試料を特徴付けるための単分子センサ又はキットを調製するための、請求項４０〜４４のいずれか１項に記載の導電性チャネル含有膜の使用。
【請求項４９】
前記標的試料が、無機小分子、有機小分子、ポリペプチド、アミノ酸、金属イオン、ポリヌクレオチド、一本鎖核酸、又は二本鎖核酸の少なくとも１つである、請求項４８に記載の使用。
【請求項５０】
医薬担体の調製における、請求項４０〜４４のいずれか１項に記載の導電性チャネル含有膜の使用。
【請求項５１】
請求項１〜１４、１９〜３４のいずれか１項に記載のタンパク質、又は請求項１５〜１８、３５〜３８のいずれか１項に記載の多量体タンパク質、又は請求項４０〜４４のいずれか１項に記載の導電性チャネル含有膜を含む、単分子センサ又はキット。
【請求項５２】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載のタンパク質又は請求項１９〜３４のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする、遺伝子。
【請求項５３】
前記遺伝子のヌクレオチド配列が、配列番号２又は配列番号４に示されている、請求項５２に記載の遺伝子。
【請求項５４】
請求項５２又は５３に記載の遺伝子を含む、ベクター。
【請求項５５】
請求項５４に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項５６】
導電性チャネルを含むナノポア又は膜の調製におけるウシパピローマウイルス二本鎖ＤＮＡヘリカーゼタンパク質又はその相同タンパク質の使用であって、前記ウシパピローマウイルス二本鎖ＤＮＡヘリカーゼタンパク質のアミノ酸配列が配列番号５に示されている、使用。
【請求項５７】
前記ウシパピローマウイルス二本鎖ＤＮＡヘリカーゼタンパク質の相同タンパク質が、以下の表に示されるタンパク質から選択される、請求項５６に記載の使用。
【表１】
2020505043.tif 000012
【請求項５８】
（１）膜層；及び
（２）多量体タンパク質が前記膜層に埋め込まれてチャネルを形成し、バイアス電圧が印加されたとき電気的に伝導され得る、分離されたウシパピローマウイルス二本鎖ＤＮＡヘリカーゼタンパク質又はその相同タンパク質；
を含む、導電性チャネルを含む膜。
【請求項５９】
前記ウシパピローマウイルス二本鎖ＤＮＡヘリカーゼタンパク質のアミノ酸配列が配列番号５に示されている、請求項５８に記載の導電性チャネル含有膜。
【請求項６０】
前記ウシパピローマウイルス二本鎖ＤＮＡヘリカーゼの相同タンパク質が以下の表から選択される、請求項５８に記載の導電性チャネル含有膜。
【表２】
2020505043.tif 000013
【請求項６１】
前記膜層が、脂質又は両親媒性ポリマーで形成される単層または二重層の膜を含む、請求項５８〜６０のいずれか１項に記載の導電性チャネル含有膜。
【請求項６２】
前記脂質層が両親媒性脂質を含む、請求項５８〜６１のいずれか１項に記載の導電性チャネル含有膜。
【請求項６３】
前記脂質層が平面脂質膜層又はリポソームから選択される、請求項５８〜６２のいずれか１項に記載の導電性チャネル含有膜。
【請求項６４】
電位が印加されたときに前記チャネルを通してＤＮＡ又はＲＮＡを転位させることができる、請求項５８〜６３のいずれか１項に記載の導電性チャネル含有膜。
【請求項６５】
標的試料を特徴付けるための単分子センサ又はキットの調製における、請求項５８〜６４のいずれか１項に記載の導電性チャネル含有膜の使用。
【請求項６６】
前記標的試料が、無機小分子、有機小分子、ポリペプチド、アミノ酸、金属イオン、ポリヌクレオチド、一本鎖核酸、又は二本鎖核酸の少なくとも１つである、請求項６５に記載の使用。
【請求項６７】
医薬担体の調製における、請求項５８〜６４のいずれか１項に記載の導電性チャネル含有膜の使用。
【請求項６８】
請求項５８〜６４のいずれか１項に記載の導電性チャネル含有膜を含む、単分子センサ又はキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジーの分野、特に核酸巻き戻し機能を有する膜貫通型ナノポア並びにその構築方法及び用途の分野に属する。
【背景技術】
【０００２】
生物活性物質及び化学活性物質を正確に検出することは、堅固で安定したセンサを必要とする、長年にわたる産業及び科学研究の標的の１つである。単分子検出の分野におけるα溶血素（α−ＨＬ）の最初の適用以来、単分子検出のための技術的プラットフォームとしてのナノポアはますます重要な役割を果たしてきている。
【０００３】
分子間親和性相互作用（例えば共有結合又は非共有結合誘引）を介した検出のために関心対象の被検体を結合又は「捕捉すること」は、例えば、α−ＨＬのβバレル領域にヒスチジンを挿入することによって、ニッケル、銅、及び亜鉛等の二価金属イオンを明確に区別及び定量化する；遺伝子操作を通して特定のリガンドを内部ナノポアに埋め込むことによって小さな有機分子、更にはタンパク質の画分さえも検出することができ、また、銅イオンとα−ＨＬナノポアのシステイン（１１７）を組み合わせることによってアミノ酸配置を区別することもできる。
【０００４】
α−ＨＬ以外に、他の研究されているタンパク質ナノポアは、ポリエチレングリコールの検出に使用されるアラメチシン、現在ハイスループット核酸配列決定に広く使用されているマイコバクテリウムスメグマチス（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）組換えタンパク質ＭｓｐＡ、二本鎖が通過することを可能にするバクテリオファージｐｈｉ２９  ＤＮＡパッケージングモータタンパク質等を含む。α−ＨＬ及びＭｓｐＡ等のこれらのタンパク質のナノポアは、被検体の検出を完了するのを助けるための他の酵素を必要とし、これがその更なる用途を制限している。
【０００５】
既存の研究報告から、膜貫通型βバレル領域で１．５ｎｍの最も狭い直径及び５．２ｎｍの長さを有するα−ＨＬナノポアが他の小分子の配列決定又は検出に使用された場合、ナノポアの最も狭い部分は、ナノポアを介して核酸鎖をラチェットさせるには長過ぎ、結果として、一塩基を区別することが困難であり、従って他の小分子の感知分解能が低下した。
【０００６】
ＭｓｐＡの膜貫通部の長さはα−ＨＬよりも短いが、通常はナノポアとしてのみ機能し、分子の感知においては人工カーボンナノチューブと同等であり、イオンチャネルとして存在する。例えば、Ｉａｎ  Ｍ，Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ等は、核酸中の一塩基を区別するためにＨｅｌ３０８ヘリカーゼ又はφ２９ＤＮＡポリメラーゼをＭｓｐＡと結合させた。
【０００７】
ｐｈｉ２９  ＤＮＡパッケージングモータタンパク質からの電気信号は、その電圧ゲート特性不良に起因して、微量物質を検出すると、容易に干渉される。
【０００８】
当業者は、配列決定の潜在的な用途のために合成金属又はシリコンナノポア等の他の材料を使用しているが、これらの合成ナノポアは、一貫した反復構造を生成するのに十分なだけの信頼性がなく、化学修飾の多様性を欠く。従って、より良好なナノポア又はそれらの代替物を探索することは、依然としてこの分野におけるホットスポットであり、難事である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明において解決されるべき技術的課題は、二本鎖核酸を移動させるときに活性成分を外部から巻き戻す必要がある、小さなチャネルサイズを有する既存のタンパク質ナノポアの欠点を克服することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、上記の欠点を解決するための単量体タンパク質を提供する。単量体タンパク質は、（１）単離されたウシパピローマウイルス二本鎖ＤＮＡヘリカーゼの３０６〜５７７位のアミノ酸からなり、その配列は配列番号３に示されている、又は（２）（１）で定義されたタンパク質のアミノ酸配列中の少なくとも１個のアミノ酸の置換及び／若しくは欠失及び／若しくは挿入によって得られる変異体である。
【００１１】
更に、本発明における単量体タンパク質は、（１）で定義されたタンパク質のアミノ酸配列中の１〜２０個のアミノ酸を置換及び／又は欠失及び／又は挿入することによって得られる変異体である。
【００１２】
最適には、それは、（１）で定義されたタンパク質のアミノ酸配列中の１〜１５個のアミノ酸を置換及び／又は欠失及び／又は挿入することによって得られる変異体である。
【００１３】
更に、上記タンパク質は、（１）で定義されたタンパク質のアミノ酸配列中の１０個以下のアミノ酸を置換及び／又は欠失及び／又は挿入することによって得られる、単量体タンパク質と同じ又は類似の機能を有する変異体である。
【００１４】
好ましくは、（１）で示されるタンパク質のアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ基を置換及び／又は欠失及び／又は挿入することによって得られる（１）を有する限定変異体。
【００１５】
好ましくは、（１）で示されるタンパク質のアミノ酸配列において１〜５個のアミノ基を置換及び／又は欠失及び／又は挿入することによって得られる（１）を有する限定変異体。
【００１６】
好ましくは、（１）で示されるタンパク質のアミノ酸配列において１〜３個のアミノ基を置換及び／又は欠失及び／又は挿入することによって得られる（１）を有する限定変異体。
【００１７】
更に、上記タンパク質変異体は、配列番号３のアミノ酸配列を有するタンパク質の４２１位におけるＫからＬへの変異、又は３２３位におけるＨからＷへの変異から得られるタンパク質変異体である。
【００１８】
好ましい：上記タンパク質変異体は、（１）で定義された配列番号３の配列と７５％を超えるアミノ酸配列相同性を有する相同変異体である。
【００１９】
好ましい：上記タンパク質変異体は、（１）で定義された配列番号３の配列と８０％を超えるアミノ酸配列相同性を有する相同変異体である。
【００２０】
より好ましい：上記タンパク質変異体は、（１）で定義された配列番号３の配列と９０％を超えるアミノ酸配列相同性を有する相同変異体である。
【００２１】
再最適化：上記タンパク質変異体は、（１）で定義された配列番号３の配列と９５％を超えるアミノ酸配列相同性を有する相同変異体である。
【００２２】
更なる最適化：上記タンパク質変異体は、（１）で定義された配列番号３の配列と９８％を超えるアミノ酸配列相同性を有する相同変異体である。
【００２３】
最適：上記タンパク質変異体は、（１）で定義された配列番号３の配列と９９％を超えるアミノ酸配列相同性を有する相同変異体である。
【００２４】
本発明はまた、上記タンパク質をコードする遺伝子も提供する。
【００２５】
更に、上記遺伝子のヌクレオチド配列を配列番号４に示す。
【００２６】
同時に、本発明は上記遺伝子を含むベクターも提供する。
【００２７】
言うまでもなく、本発明は上記ベクターを含む宿主細胞も提供する。
【００２８】
本発明はまた、（１）単離されたウシパピローマウイルス二本鎖ＤＮＡヘリカーゼの３０６〜６０５位のアミノ酸からなり、その配列が配列番号１に示されている；又は（２）（１）で定義されたタンパク質のアミノ酸配列中の少なくとも１個のアミノ酸の置換及び／若しくは欠失及び／若しくは挿入によって得られる変異体である、別のタンパク質を提供する。
【００２９】
更に、単量体タンパク質は、（１）で定義されたアミノ酸配列中の１〜２０個のアミノ酸を置換及び／又は欠失及び／又は挿入することによって得られる変異体である。
【００３０】
好ましくは、単量体タンパク質は、（１）で定義されたアミノ酸配列中の１〜１５個のアミノ酸を置換及び／又は欠失及び／又は挿入することによって得られる変異体である。
【００３１】
さらに、上記タンパク質は、（１）で定義されたタンパク質のアミノ酸配列中の１０個以下のアミノ酸を置換及び／又は欠失及び／又は挿入することによって得られる単量体タンパク質と同じ又は類似の機能を有するタンパク質である。
【００３２】
好ましくは、単量体タンパク質は、（１）で定義されたタンパク質のアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸を置換及び／又は欠失及び／又は挿入することによって得られる変異体である。
【００３３】
再最適化として、単量体タンパク質は、（１）で定義されたタンパク質のアミノ酸配列において１〜５個のアミノ酸を置換及び／又は欠失及び／又は挿入することによって得られる変異体である。
【００３４】
より最適には、単量体タンパク質は、（１）で定義されたタンパク質のアミノ酸配列において１〜３個のアミノ酸を置換及び／又は欠失及び／又は挿入することによって得られる変異体である。
【００３５】
好ましい：上記タンパク質変異体は、（１）で定義された配列番号１の配列と７５％を超えるアミノ酸配列相同性を有する相同変異体である。
【００３６】
好ましい：上記タンパク質変異体は、（１）で定義された配列番号１の配列と８０％を超えるアミノ酸配列相同性を有する相同変異体である。
【００３７】
より最適には、上記タンパク質変異体は、（１）で定義された配列番号１の配列と９０％を超えるアミノ酸配列相同性を有する相同変異体である。
【００３８】
再最適化として、上記タンパク質変異体は、（１）で定義された配列番号１の配列と９５％を超えるアミノ酸配列相同性を有する相同変異体である。
【００３９】
更に好ましくは、上記タンパク質変異体は、（１）で定義された配列番号１の配列と９８％を超えるアミノ酸配列相同性を有する相同変異体である。
【００４０】
最も好ましくは、上記タンパク質変異体は、（１）で定義された配列番号１の配列と９９％を超えるアミノ酸配列相同性を有する相同変異体である。
【００４１】
更に、上記タンパク質は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質の４２１位におけるＫからＬへの変異、又は３２３位におけるＨからＷへの変異から得られるタンパク質変異体である。
【００４２】
更に、タンパク質変異体のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号６及び配列番号７に示す。
【００４３】
本発明はまた、上記タンパク質をコードする遺伝子も提供する。
【００４４】
更に、上記遺伝子のヌクレオチド配列を配列番号２に示す。
【００４５】
本発明はまた、タンパク質変異体のコード遺伝子も提供する。ヌクレオチド配列をそれぞれ配列番号８及び配列番号９に示す。
【００４６】
同時に、本発明は上記遺伝子を含むベクターも提供する。
【００４７】
言うまでもなく、本発明は上記ベクターを含む宿主細胞も提供する。
【００４８】
更に、本発明はポリマータンパク質も提供する。ポリマータンパク質は、２つより多くの上記タンパク質をサブユニットとして含む。
【００４９】
更に、多量体タンパク質を構成するサブユニットの数は４〜８である。
【００５０】
好ましくは、多量体タンパク質を構成するサブユニットの数は６である。
【００５１】
ここで、上記ポリマータンパク質はホモ多量体又はヘテロ多量体である。
【００５２】
本発明はまた、導電性細孔を含むナノポア又は膜の調製における上記のタンパク質又はポリマータンパク質の使用を提供する。
【００５３】
本発明はまた、導電性細孔を含む膜を提供し、これは、（１）膜層；及び（２）膜層に埋め込まれて、膜貫通電位が印加されたときに細孔を通して電気的に伝導され得る細孔を形成する、分離された上記ポリマータンパク質を含む。
【００５４】
ここで、ナノポア内の膜層は脂質層を含む。
【００５５】
ここで、ナノポア内の脂質層は両親媒性脂質を含む。
【００５６】
ここで、ナノポア内の脂質層は、平面膜層又はリポソームであり得る。
【００５７】
更に、ナノポアに電位が印加されると、導電性細孔膜は細孔を通してＤＮＡ又はＲＮＡを移動させることができる。
【００５８】
好ましくは、上記膜層で述べた単層は、ＰＭＯＸＡ−ＰＤＭＳ−ＰＭＯＸＡによって形成され、ＰＭＯＸＡはジメチルジアゾリンであり、ＰＤＭＳはポリジメチルシロキサンである。
【００５９】
さらに、本発明はまた、以下の工程：
（ａ）乾燥両親媒性脂質を調製する工程；並びに（ｂ）乾燥両親媒性脂質を、水性溶媒、浸透剤、及び上記のいくつかの分離されたタンパク質を含む溶液に再懸濁する工程であって、サブユニットとしてのタンパク質が六量体タンパク質に自己組織化することができ、これを、特定の条件下で、導電性細孔を含む膜を形成するのに十分な時間、脂質二重層膜に挿入することができる工程を特徴とする、導電性細孔を含む膜を調製するための方法を提供する。好ましくは、ポリマータンパク質は六量体である。
【００６０】
ここで、上記の両親媒性脂質はリン脂質である。
【００６１】
ここで、上記のリン脂質は、以下に列挙されるリン脂質：ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピド、１，２−ジフィチル−ｓｎ−グリセロール−３−ホスファチジルコリン、及び１，２−ジフェニル−ｓｎ−グリセロール−３−ホスファチジルコリンの１以上から選択される。
【００６２】
本発明はまた、単分子センサ又はキットの調製におけるナノポアの使用を提供する。
【００６３】
本発明はまた、ナノポアを構成要素の１つとして含む単分子センサ又は試薬キットを提供する。
【００６４】
本発明はまた、ナノポア又は導電性細孔を含む膜の調製におけるウシパピローマウイルス二本鎖ＤＮＡヘリカーゼタンパク質又はその相同タンパク質の用途を提供する。ウシパピローマウイルス二本鎖ＤＮＡヘリカーゼタンパク質のアミノ酸配列を配列番号５に示す。更に、ウシパピローマウイルス二本鎖ＤＮＡヘリカーゼタンパク質の相同タンパク質は、以下の表１から選択される。
【００６５】
表１  相同タンパク質
【表１】
2020505043.tif 000003
【００６６】
本発明はまた、導電性細孔を含む膜を提供し、これは、（１）膜層；及び（２）多量体タンパク質が膜層に埋め込まれて細孔を形成し、バイアス電圧が印加されたとき電気的に伝導され得る、分離されたウシパピローマウイルス二本鎖ＤＮＡヘリカーゼタンパク質又はその相同タンパク質を含み、ウシパピローマウイルスの二本鎖ＤＮＡヘリカーゼタンパク質を配列番号５に示す。
【００６７】
ウシパピローマウイルス二本鎖ＤＮＡヘリカーゼタンパク質の相同タンパク質は表１から選択される。
【００６８】
哺乳動物病原性ウイルス中の重要な成分タンパク質が本発明においてタンパク質工学技術によって最初に修飾され、その結果、それは核酸及び他の物質のセンシング研究のための新規なタンパク質ナノポアを構築するために使用することができる。本発明は、原核生物発現系によってインビトロでタンパク質を発現及び精製し、同時にそれを人工リン脂質二重層膜及びポリマー膜に埋め込んでタンパク質ナノポアにする。様々な伝導率緩衝系の下でのそのコンダクタンス分布、並びに一本鎖ＤＮＡと一本鎖ＲＮＡの輸送及びそのヘリカーゼ活性を検討することによって、ポーリンの特徴とタンパク質のヘリカーゼ活性を組み合わせた新規ナノポアセンシングシステムを最初に構築し、単腕を有する二本鎖ＤＮＡの巻き戻し及び転位を脂質二重層上で実現した。
【００６９】
本発明の有益な効果は以下の通りである：
【００７０】
本発明は、ウシパピローマウイルス二本鎖ＤＮＡヘリカーゼタンパク質及びその相同タンパク質が、導電性細孔を含む膜を調製するために使用できることを見出し、これは、この分野のための新しい有効な選択を提供する。
【００７１】
本発明は、導電性細孔を含む新規で単純な膜として働くポリマーを形成する、Ｅ１−１（３０６〜５７７）タンパク質を革新的に発見し、それがリン脂質二重層膜上に安定に存在し得ること、及びそれが転位核酸の特徴を有することを実証した。
【００７２】
本発明は更に、新しいタンパク質Ｅ１−２（３０６〜６０５）を発見し、それに基づいて、ヘリカーゼ及びナノポアを結合する必要がある既存のセンシング方法に取って代わる、ナノポア及びヘリカーゼ統合型センシングシステムを成功裏に構築し、このシステムはバイオセンサとして使用することができる。現在のφ２９とＭｓｐＡ、Ｈｅｌ３０８とＭｓｐＡ、並びにφ２９とα−ＨＬの結合センシングシステムと比較して、本発明のナノポアは、細孔を通して、測定される被検体の捕捉を完了するための単一の酵素を実現することができ、これは工程を大幅に簡素化する。特に、ナノポアは、二本鎖ＤＮＡの巻き戻しとセンシングの分析、核酸多型の分析、核酸二次構造の分析、核酸長の分析等を同時に実施することができる。医薬用途に関して、その電位駆動性溶質転位は、適用のための大きな可能性を有する、リポソーム薬物送達療法（例えば薬物標的化送達）にも適用することができる。
【００７３】
本発明は更に、Ｅ１−２タンパク質の分子基盤に関する変異研究を実施し、Ｅ１−２タンパク質の変異体を得る。人工脂質膜上の突然変異Ｅ１−１（３０６〜５７７）単量体又はＥ１−２（３０６〜６０５）単量体によって形成される細孔は、野生型に比べて多くの利点を有する。具体的には、突然変異単量体から構築された細孔は、野生型よりも負に帯電した核酸及び他の小分子を捕捉する可能性が高い。更に、突然変異単量体から構築された細孔は電流範囲の増加を示し、このため細孔の内腔が野生型のものよりも狭くなり、それによって細孔検出電流がより広範囲で高感度になる。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】アガロースゲル電気泳動による検証のためのベクターとしてｐＧＥＸ−６Ｐ−１を用いて、標的遺伝子の組換えプラスミドＥ１−１（３０６〜５７７）を構築した（ｐＧＥＸ−６Ｐ−１は４９８４ｂｐの長さであり、Ｅ１−１遺伝子配列は８１６ｂｐの長さであったので、消化後に２つのバンドが得られた。それらはそれぞれ４９９０ｂｐ及び８２２ｂｐであった。）
【図２】Ｅ１−１（３０６〜５７７）タンパク質単量体（５７ＫＤ）のハイブリッドを分子ふるいに通した後、各ピークの標的タンパク質をポリアクリルアミドゲル電気泳動によって検出した。２番目のチューブをその後の電気生理学的実験に使用した。
【図３】Ｅ１−１（３０６〜６０５）タンパク質単量体（５９ＫＤ）のハイブリッドを分子ふるいに通した後に、各ピークの標的タンパク質をポリアクリルアミドゲル電気泳動によって検出した。６番目のチューブをその後の電気生理学的実験に使用した。
【図４】７０ｍＶの膜貫通電圧では、単一細孔の電流は約１０５ｐＡであり、二重細孔の電流は約２００ｐＡである。
【図５】単一細孔のコンダクタンス分布は、多数の細孔電流を分析すると約１．３±０．０７ｎＳである。
【図６】勾配電圧で得られたＩ−Ｖ曲線の勾配は約４．４３（４細孔）であるので、単一細孔コンダクタンスは約１．５である。
【図７】ＰＢＳを導電性緩衝液として使用した場合、タンパク質のコンダクタンス分布は０．２±０．０２ｎＳであり、単一細孔の電流は、−７０ｍＶの電圧で約２３ｐＡである。
【図８】５０ｍＶの膜貫通電圧で、ｓｓＤＮＡ転位は、単一細孔条件下で６５ｐＡの阻止電流を生じさせる。
【図９】ＰＢＳ緩衝液中で、細孔中のｓｓＲＮＡ転位の阻害は約８０％であり、これはＫＣｌ緩衝液と同様である。
【図１０】ＰＢＳ緩衝液中で、ｓｓＲＮＡによって生じた阻止電流は、−５０ｍＶで約８ｐＡであり、転位時間は１〜２ミリ秒である。
【図１１】８０ヌクレオチドの特定の濃度で合成した２つの相補的ｓｓＤＮＡを１０倍の濃度勾配に１０倍希釈し、定量的Ｑ−ＰＣＲ分析実験を完了するために隣接濃度の４つのｓｓＤＮＡを選択する。
【図１２】標準曲線の作成は、Ｑ−ＰＣＲから得られたＣＴ値及び上記の一定濃度のｓｓＤＮＡを用いて実施する。
【図１３】本発明における全ての二本鎖核酸はこの方法によって得られる：二本鎖アニーリングはＰＣＲ装置上で行い、変性温度は９５℃であり、時間は２分であり、勾配工程は冷却工程（毎分約１度）に設定する。これは１時間２０分を要する。得られた核酸産物をポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析する。
【図１４】ｄｓＤＮＡの一本の鎖の両端にある蛍光消光基ＢＨＱ２で発蛍光団Ｃｙ５を消光することによるＥ１−１（３０６〜５７７）のヘリカーゼ活性の検出。
【図１５】ＡＴＰ濃度、Ｍｇ２＋濃度、系の温度等を含む適切な系環境を制御することによって、分子レベルでＥ１を通る二本鎖ＤＮＡ輸送の現象を観察した。
【図１６】本発明者らは、−４０ｍＶで多数の巻き戻しｄｓＤＮＡ輸送現象を認めた。巻き戻し工程中に、二本鎖閉塞状態で電圧を＋４０ｍＶに反転させた。細孔閉塞の現象が継続し、電圧が−５０ｍＶに戻ると、巻き戻し現象が再び現れ、巻き戻しが遮断状態から再開することが認められた。
【図１７】二本鎖の長さが増加すると共にＥ１−２（３０６〜６０５）も巻き戻し時間が増加する：−１００ｍＶの電圧、Ｉ細孔＝−４００ｐＡ、Ｎ＝２０で、ｄｓＤＮＡ鎖の長さが２０００ｂｐ未満である場合、融解速度は均一に近い。ｄｓＤＮＡの鎖長がより長くなると、Ｅ１−２の巻き戻し活性が低下することが認められる。鎖長が５０００ｂｐに近づくと、巻き戻し時間は９秒に達する。
【図１８】実験は、室温（２１℃）、３７℃、３７℃未満、及び３７℃超で実施する。温度の上昇と共に、巻き戻しの発生数は明らかに比例して増加することが認められる。温度が３７℃を超えると、巻き戻し発生数は再び減少する。
【図１９】系の温度が低下するにつれて、膜上の巻き戻しが徐々に減少することが分かる。温度が低温から高温に戻ると、巻き戻しが増加することが認められる。
【図２０】同じ二本鎖ＤＮＡ基質の場合、−１００ｍＶで融解するのに約３秒かかることが分かった。電圧が−２０ｍＶになると、融解時間はほぼ３０秒である。フィッティングカーブの方向に従って、電圧駆動チェーンはＥ１−２の巻き戻し方向と同じ方向に移動する。
【図２１】Ｅ１−１（３０６〜６０５、Ｋ４２１Ｌ、Ｈ３２３Ｗ）タンパク質単量体（５９ＫＤ）及びＷＴ−Ｅ１（３０６〜６０５）タンパク質を、それぞれポリアクリルアミドゲル電気泳動によって検出した。
【図２２−２３】巨大脂質小胞膜（Ｔａｌｏｓ  Ｆ２００Ｃ、スケール９０ｎｍ）に埋め込まれた突然変異体Ｅ１（３０６〜６０５、Ｋ４２１Ｌ、Ｈ３２３Ｗ）の電子顕微鏡写真を図２２に示す；巨大脂質小胞膜（Ｔａｌｏｓ  Ｆ２００Ｃ、スケール９０ｎｍ）に埋め込まれた突然変異体Ｅ１（３０６〜６０５、Ｋ４２１Ｌ、Ｈ３２３Ｗ）の電子顕微鏡写真を図２３に示す。
【図２４】六量体Ｅ１−１（３０６〜６０５、Ｋ４２１Ｌ、Ｈ３２３Ｗ）タンパク質の単一細孔埋め込みは、０．５ＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）導電性緩衝液中、１００ｍＶで約７５ｐＡの電流の一過性上昇を誘導する。
【図２５】ｓｓＤＮＡが突然変異体Ｅ１（３０６〜６０５、Ｋ４２１Ｌ、Ｈ３２３Ｗ）の細孔を通過することによって、約７８％の遮断及び約０．５ミリ秒の転位時間が誘導される。
【図２６】巻き戻し電流シグナルは、ＰＢＳ緩衝液中の人工脂質膜上の突然変異体Ｅ１（３０６〜６０５、Ｋ４２１Ｌ、Ｈ３２３Ｗ）の巻き戻し体である、単腕を有するｄｓＤＮＡの輸送によって誘導される。二本鎖の入口遮断の単腕、巻き戻し工程、一本鎖の閉塞及び開放状態に対応する３つの工程がシグナルに現れる。総巻き戻し時間は２７０ミリ秒である。
【図２７−２８】巻き戻し電流シグナルは、突然変異体Ｅ１（３０６〜６０５、Ｋ４２１Ｌ、Ｈ３２３Ｗ）の巻き戻し作用である非定型のｄｓＤＮＡ輸送によって誘導される。巻き戻しの各工程に対応するシグナル段階は明らかではなく、開口部から次の開口部まで５０ミリ秒を要し、これは酵素の活性及びコンダクタンス環境に関連する。
【図２９−３０】５０ｍＶのバイアス電圧で、単一細孔によるｓｓＤＮＡ転位は約８２％の遮断率を生じ、転位時間は１Ｍ  ＫＣｌ導電性緩衝液中で約０．４ミリ秒である。
【発明を実施するための形態】
【００７５】
本発明を以下の図面と共に説明する。
【００７６】
本発明の目的は、ウシパピローマウイルスのゲノムＤＮＡ複製を補助する役割を果たす、ウシパピローマウイルスの六量体環状ヘリカーゼから始まる。野生型タンパク質は、ウイルス複製中に二重らせんのＤＮＡを融解させるために存在するウシパピローマウイルスのＡＴＰ依存性ヘリカーゼである。このタンパク質は一本鎖ＤＮＡに結合し、ウイルスゲノム複製の開始時に六量体形態でゲノムＤＮＡ複製開始部位に付着することが報告されている。ＡＴＰのＡＴＰアーゼ加水分解によって提供されるエネルギーの条件下で、３’−５’方向に複製フォークから一本鎖ＤＮＡに沿って融解し続ける。
【００７７】
野生型ウシパピローマウイルス二本鎖ＤＮＡヘリカーゼＥ１の完全長タンパク質アミノ酸配列（配列番号５）は、全部で６０５個のアミノ酸を有する。イタリック体で下線を引いた部分がＥ１−１（３０６〜５７７）である：
【００７８】
【化１】
2020505043.tif 000004
【００７９】
本発明は、ウシパピローマウイルス二本鎖ＤＮＡヘリカーゼタンパク質及びその相同タンパク質が、ナノポア及び導電性細孔を含む膜を調製するために使用できることを発見する。調製されたナノポア及び導電性細孔を含む膜は、標的試料を特徴付けるための単分子センサ又はキットの調製に使用することができる。それは、この分野のための新しくい有効な選択を提供する。
【００８０】
ウシパピローマウイルス二本鎖ＤＮＡヘリカーゼタンパク質の選択的な情報を以下の表２に示す：
【００８１】
表２  ウシパピローマウイルス二本鎖ＤＮＡヘリカーゼタンパク質の情報
【表２】
2020505043.tif 000005
2020505043.tif 000006
2020505043.tif 000007
【００８２】
タンパク質の結晶構造及び機能ドメインから、タンパク質の保存領域がアミノ酸１〜１２１及びアミノ酸１６６〜５７５に分布していることが分かる。２つの保存領域において、アミノ酸４０７〜５５７はＳＦ３ヘリカーゼ機能ドメインであり、４１３〜４５７アミノ酸はＡＴＰ加水分解酵素のＡＡＡ＋ファミリーに属し、１４２〜３０８アミノ酸はＤＮＡ結合ドメインである。アミノ酸８４〜８６及び１０５〜１０８はそれぞれ核酸ポジショニングシグナル領域である；本発明者らは、類似の構造及び同じ機能（ＡＴＰ加水分解エネルギーの作用下で二本鎖ＤＮＡを巻き戻す）を有する、これらのタンパク質の相同タンパク質のいくつかを同定した。これらの相同タンパク質も、記載された突然変異を採用した後に人工脂質膜上に安定な細孔を形成し、Ｅ１−１（３０６〜５７７）と同じ膜上核酸巻き戻し機能を有し、核酸及び小分子の検出のためのツールになると予想される。
【００８３】
結晶構造解析によれば、ウシパピローマウイルス二本鎖ＤＮＡヘリカーゼタンパク質の主ならせん状機能ドメインは、３０８〜５７７アミノ酸セグメントに存在する。本発明は、インビトロでＥ１の切断型ポリペプチドＥ１−１（３０６〜５７７）を構築し、精製する。短鎖二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を使用して、インビトロでその六量体中のＡＴＰ依存性ヘリカーゼの活性を特定の条件下で検証する。
【００８４】
本発明は更に、ナノポアを調製するために切断型ポリペプチドＥ１−１（３０６〜５７７）を利用する。本発明で述べるように、六量体細孔はｓｓＤＮＡの転位を完了させ、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）の転位の確率はわずかに異なる。
【００８５】
本発明は、更なる研究においてＥ１のもう１つ別の切断体Ｅ１−２（３０６〜６０５）を得る。このタンパク質は、インビトロで様々な導電性緩衝液条件下で人工脂質膜上に安定なナノポアを成功裏に形成することができる。
【００８６】
本発明はまた、パッチクランプ技術を用いて以下の核酸センシングを検討する。構造解析は、Ｅ１−２タンパク質によって形成されたナノポアの内径が約１．３ｎｍであり、膜領域の長さ及びタンパク質の開口部の直径がそれぞれ約３．２ｎｍ及び１５ｎｍであることを示す。
【００８７】
実験は、１Ｍ、０．３ｍＭ  ＫＣｌ、及びＰＢＳの緩衝条件下で、Ｅ１（３０６〜６０５）が人工脂質膜上で六量体に自己集合し、膜上にしっかりと細孔を形成することができることを示す。膜の両側に膜貫通電圧を印加した後、細孔を通過する電流を発生させる。その後のｓｓＤＮＡ輸送実験において、短鎖ｓｓＤＮＡは一連の電流遮断現象を引き起こすことができるが、ｄｓＤＮＡを使用して同じ実験を繰り返しても同様の現象を生じさせないことが分かる。膜貫通電流は安定しており、これらの現象はＥ１の直径と一致する。ｄｓＤＮＡの直径は約２ｎｍであり、一方Ｅ１の内径限界は約１．３ｎｍであるので、平滑末端を有するｄｓＤＮＡが膜貫通電圧によって駆動される場合、Ｅ１によって捕捉される。ほとんどの場合、細孔の５０％を超える閉塞による連続的な遮断、又は遮断後の細孔の即時開口のいずれかが起こる；単腕を有するｄｓＤＮＡがＰＢＳ緩衝液又はＰＢＳと等しい塩濃度の緩衝液中で膜貫通電圧によって駆動されるＥ１によって捕捉されたとき、特定の濃度のＡＴＰ及びＭｇ２＋が添加される。Ｅ１自身のヘリカーゼ活性及び生物学的ナノポアとしてのその特性と組み合わせると、Ｅ１−２（３０６〜６０５）によって形成された細孔を用いてインビトロで人工脂質膜上での二本鎖巻き戻しが完了されたことが示される。
【００８８】
Ｅ１−１（３０６〜５７７）及びＥ１−２（３０６〜６０５）の突然変異体もまた、同じ又は類似の機能を有しており、本発明の保護の範囲内である。
【００８９】
Ｅ１−１（３０６〜５７７）及びＥ１−２（３０６〜６０５）の突然変異体は、その後のナノポア組み込み及び負に帯電した核酸の捕捉及びｓｓＤＮＡ転位のための改善された特性を示すことが本試験で認められた。具体的には、突然変異体は、驚くほど容易な人工リポソーム挿入特性、脂質膜上での安定な存在を示し、非特異的な電流変動は、細孔によって引き起こされる開放電流のシグナル／ノイズ比の改善によって更に低減される。細孔のＣ末端でのｓｓＤＮＡの捕捉効率は更に改善された。核酸転位の過程で、ｓｓＤＮＡに対する細孔空洞の固有の力は弱められ、転位電流はより迅速で規則的なピークパターンを示す。突然変異体の別の利点は、突然変異がＤＮＡヘリカーゼとしての細孔それ自体の特徴に影響を及ぼさないことである。
【００９０】
従って、本発明は、配列番号１又は配列番号３に示されるアミノ酸配列の変異体を含む、突然変異Ｅ１−１（３０６〜５７７）単量体又は突然変異Ｅ１−２（３０６〜６０５）単量体を提供する。ここで、変異体は以下の突然変異の少なくとも１つを含む（以下の各突然変異部位のビット数は、ウシパピローマウイルス二本鎖ＤＮＡヘリカーゼの全長の最初の位置から計算される。ウシパピローマウイルス二本鎖ＤＮＡヘリカーゼの全長アミノ酸配列を配列番号５に示す）：
（ａ）４７９位のアミノ酸は、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、セリン（Ｓ）、アスパラギン（Ｎ）、トレオニン（Ｔ）である；
（ｂ）４８９位のアミノ酸は、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、アスパラギン（Ｎ）、トレオニン（Ｔ）及びセリン（Ｓ）である；
（ｃ）５３０位のアミノ酸は、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、セリン（Ｓ）、アスパラギン（Ｎ）、トレオニン（Ｔ）である；
（ｄ）５２９位のアミノ酸は、グルタミン（Ｑ）及びリジン（Ｋ）である；
（ｅ）５２５位のアミノ酸は、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、セリン（Ｓ）、ロイシン（Ｌ）、トレオニン（Ｔ）である；
（ｆ）５０４位のアミノ酸は、アスパラギン（Ｎ）、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、フェニルアラニン（ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）である；
（ｇ）３２８位のアミノ酸は、グルタミン（Ｑ）、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）である；
（ｈ）３６０位のアミノ酸は、アスパラギン（Ｎ）、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）である；
（ｉ）３２２位のアミノ酸は、アスパラギン（Ｎ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、グルタミン（Ｑ）である；
（ｊ）３７２位のアミノ酸は、グルタミン（Ｑ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、プロリン（Ｐ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、アスパラギン（Ｎ）である；
（ｋ）３４２位のアミノ酸は、アスパラギン（Ｎ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、グルタミン（Ｑ）である；
（ｌ）３３４位のアミノ酸は、アスパラギン（Ｎ）、ロイシン（ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、グルタミン（Ｑ）である；
（ｍ）３９２位のアミノ酸は、アスパラギン（Ｎ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、グルタミン（Ｑ）である；
（ｎ）４０８位のアミノ酸は、アスパラギン（Ｎ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、グルタミン（Ｑ）である；
（ｏ）３９６位のアミノ酸は、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、フェニルアラニン（Ｆ）及びトリプトファン（Ｗ）、アラニン（Ａ）及びグリシン（Ｇ）である；
（ｐ）５７０位のアミノ酸は、バリン（Ｖ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）である；
（ｑ）５７４位のアミノ酸は、トリプトファン（Ｗ）、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）及びフェニルアラニン（Ｆ）である；
（ｒ）４１７位のアミノ酸は、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、アラニン（Ａ）及びグリシン（Ｇ）である；
（ｓ）４２１位のアミノ酸は、バリン（Ｖ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、ロイシン（Ｌ）及びイソロイシン（Ｉ）である；
（ｔ）３８３位のアミノ酸は、バリン（Ｖ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）である；
（ｕ）３８７位のアミノ酸は、ヒスチジン（Ｈ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）である；
（ｖ）３２３位のアミノ酸は、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（ｖ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）である；
（ｗ）３２４位のアミノ酸は、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）及びバリン（Ｖ）である；
（ｘ）５６５位のアミノ酸は、トレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）及びチロシン（Ｙ）である；
（ｙ）４２６位のアミノ酸は、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）である。
【００９１】
本発明は、突然変異Ｅ１−１（３０６〜５７７）単量体又は突然変異Ｅ１−２（３０６〜６０５）単量体を提供する。上記のＥ１−１（３０６〜５７７）変異体又はＥ１−２（３０６〜６０５）変異体単量体は、本発明において導電性膜細孔を形成するために使用することができる。突然変異Ｅ１−１（３０６〜５７７）単量体又はＥ１−２（３０６〜６０５）単量体は、その配列が野生型Ｅ１−１（３０６〜５７７）単量体又はＥ１−２（３０６〜６０５）単量体と異なる単量体であり、細孔を形成する能力を保持する。細孔を形成する突然変異単量体の能力を確認するために使用される方法は、本発明で述べる方法と一致する。
【００９２】
突然変異Ｅ１−１（３０６〜５７７）単量体又はＥ１−２（３０６−６０５）単量体は、人工脂質膜上に細孔を形成することにおいて野生型単量体よりも優れた多数の利点を有する。具体的には、突然変異単量体によって構築された細孔は、野生型よりも核酸及び他の負に帯電した小分子を捕捉する可能性が高く、更に電流範囲の増加を示し、そのため細孔の内部空洞は野生型より狭くなるので、細孔内の電流検出がより広範囲で高感度である。
【００９３】
更に、突然変異Ｅ１−１（３０６〜５７７）又はＥ１−２（３０６〜６０５）単量体が人工脂質膜上に細孔を形成する場合、細孔の膜貫通領域は膜上に安定に存在する可能性がより高く、開放電流のシグナル／ノイズ比は野生型のものよりも高い。驚くべきことに、核酸が突然変異Ｅ１−１（３０６〜５７７）又はＥ１−２（３０６〜６０５）単量体によって構築されたいくつかの細孔を通って移動する場合、電流は更に減少する。これは、この細孔を使用して、核酸が細孔を通って移動するときの核酸配列と電流下降プラットフォームとの間の関係を同定することを可能にし、更にこの変異体細孔を将来の核酸配列決定に適用する可能性をもたらす。突然変異体の核酸読み取り特性の改善は、３つの主要な機構を通して、即ち以下の変化：
１．空間（変異アミノ酸残基の増減）；
２．電荷（例えば、＋ｅｖ電荷を誘導して核酸とアミノ酸との間の相互作用を増強する）；
３．非共有結合（例えば、水素結合を有する特定のヌクレオチドと結合することができるアミノ酸を誘導する）；
を通して実現され、これら３つの機構のいずれか又は複数が、将来本発明の細孔がヌクレオチド読み取り特性を有する理由となり得る。
【００９４】
本発明におけるタンパク質の部位突然変異は主に以下の理由に基づく：
野生型Ｅ１−１（３０６〜５７７）又はＥ１−２（３０６〜６０５）では、Ｎ末端はより狭い末端で開口し、Ｃ末端はより広い末端で開口しており、六量体は標準的なキノコ構造を形成する。多数のアルカリ性アミノ酸が形成細孔の内部空洞に分布しており、これがｓｓＤＮＡの負のリン酸基と結合する。従って、野生型Ｅ１−１（３０６〜５７７）又はＥ１−２（３０６〜６０５）単量体を人工脂質膜に挿入して、イオンが自由に通過できる導電性細孔を形成すると、長期間の印加膜貫通電圧で細孔が脂質膜から落下することが認められた。記録された開放電流ベースラインは変動し、測定されるべき分子が細孔を通過しない場合、小さな非特異的ピーク電流が時として出現する。
【００９５】
本発明者らは、上記の欠点を改善するために突然変異Ｅ１−１（３０６〜５７７）又はＥ１−２（３０６−６０５）単量体を使用する。例えば、細孔のＣ末端の負に帯電した核酸の捕捉効率を高めるために、４７９及び４８９位のアスパラギン酸（Ｄ）のようなより広いＣ末端のいくつかの酸性アミノ酸をヒスチジン（Ｈ）又はリジン（Ｋ）に変異させる。アスパラギン（Ｎ）に変異させると、Ｃ末端開口部における負に帯電したアミノ酸の密度が減少し、核酸（主に）又は測定すべき負に帯電した物質に対する静電拮抗作用がそれに応じて減少し、細孔の捕捉率を間接的に増加させる。
【００９６】
別の例は、５０４位のアスパラギン酸（Ｄ）、３２８位のグルタミン酸（Ｅ）等の細孔空洞内のいくつかの酸性アミノ酸をアスパラギン（Ｎ）、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、グルタミン（Ｑ）等に変異させることである。一方で、酸性アミノ酸（Ｄ、Ｅ）を中性アミノ酸に変異させると、核酸転位中の静電拮抗作用を有意に減少させることができ、他方で、中性アミノ酸が大きな立体障害を有するフェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、又はチロシン（Ｙ）である場合、形成された空洞内のより大きな空間的位置に起因して、空洞内の非制限部位の直径が有意に減少する。同時に、置換された空洞の内部のベンゼン環の密度が増加すると、π電子が蓄積してアミノ酸をより密接に整列させ、空洞の内部収縮が明らかになる。言うまでもなく、これら２つの減少は検出における両刃の剣である。中性アミノ酸がセリン（Ｓ）又はトレオニン（Ｔ）等のヒドロキシル基である場合、ヒドロキシル酸素は水素を形成することによってヌクレオチドと結合することができるので、核酸はＣ末端から空洞に入って、より緩やかに転位することができる。この機構は、その後の核酸配列決定の開発においてより有益な価値を有するであろう。
【００９７】
膜貫通領域内の３２２、３４２、３３４位のアスパラギン酸（Ｄ）、３７２位のグルタミン酸（Ｅ）、３９６、３８３位のリジン（Ｋ）、３２３位のヒスチジン（Ｈ）、及び５７４位のアルギニン（Ｒ）を中性アミノ酸ロイシン（Ｌ）、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）等に変異させると、細孔の膜貫通領域をより容易且つ安定に長い脂肪酸鎖からなる脂質二重層の疎水性層に埋め込むことを可能にし、従って開放電流ベースライン変動及び細孔挿入の不安定性によって引き起こされる低周波ノイズを大幅に減弱させる。特定の突然変異部位を以下の表３に示す：
【００９８】
表３  突然変異部位
【表３】
2020505043.tif 000008
2020505043.tif 000009
2020505043.tif 000010
2020505043.tif 000011
【実施例】
【００９９】
以下の実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。
【０１００】
実施例１；Ｅ１タンパク質及びその突然変異体組換えベクターの構築及び発現精製
【０１０１】
切断型Ｅ１−１（３０６〜５７７）のアミノ酸配列（配列番号３）：
ＬＱＴＥＫＦＤＦＧＴＭＶＱＷＡＹＤＨＫＹＡＥＥＳＫＩＡＹＥＹＡＬＡＡＧＳＤＳＮＡＲＡＦＬＡＴＮＳＱＡＫＨＶＫＤＣＡＴＭＶＲＨＹＬＲＡＥＴＱＡＬＳＭＰＡＹＩＫＡＲＣＫＬＡＴＧＥＧＳＷＫＳＩＬＴＦＦＮＹＱＮＩＥＬＩＴＦＩＮＡＬＫＬＷＬＫＧＩＰＫＫＮＣＬＡＦＩＧＰＰＮＴＧＫＳＭＬＣＮＳＬＩＨＦＬＧＧＳＶＬＳＦＡＮＨＫＳＨＦＷＬＡＳＬＡＤＴＲＡＡＬＶＤＤＡＴＨＡＣＷＲＹＦＤＴＹＬＲＮＡＬＤＧＹＰＶＳＩＤＲＫＨＫＡＡＶＱＩＫＡＰＰＬＬＶＴＳＮＩＤＶＱＡＥＤＲＹＬＹＬＨＳＲＶＱＴＦＲＦＥＱＰＣＴＤＥＳＧＥＱＰＦＮＩＴＤＡＤＷＫＳＦＦＶＲＬＷＧＲＬＤＬ。
【０１０２】
切断型Ｅ１−１（３０６〜５７７）のコード遺伝子配列（配列番号４）：
Ｔｔｇｃａｇａｃｃｇａｇａａａｔｔｃｇａｃｔｔｃｇｇａａｃｔａｔｇｇｔｇｃａａｔｇｇｇｃｃｔａｔｇａｔｃａｃａａａｔａｔｇｃｔｇａｇｇａｇｔｃｔａａａａｔａｇｃｃｔａｔｇａａｔａｔｇｃｔｔｔｇｇｃｔｇｃａｇｇａｔｃｔｇａｔａｇｃａａｔｇｃａｃｇｇｇｃｔｔｔｔｔｔａｇｃａａｃｔａａｃａｇｃｃａａｇｃｔａａｇｃａｔｇｔｇａａｇｇａｃｔｇｔｇｃａａｃｔａｔｇｇｔａａｇａｃａｃｔａｔｃｔａａｇａｇｃｔｇａａａｃａｃａａｇｃａｔｔａａｇｃａｔｇｃｃｔｇｃａｔａｔａｔｔａａａｇｃｔａｇｇｔｇｃａａｇｃｔｇｇｃａａｃｔｇｇｇｇａａｇｇａａｇｃｔｇｇａａｇｔｃｔａｔｃｃｔａａｃｔｔｔｔｔｔｔａａｃｔａｔｃａｇａａｔａｔｔｇａａｔｔａａｔｔａｃｃｔｔｔａｔｔａａｔｇｃｔｔｔａａａｇｃｔｃｔｇｇｃｔａａａａｇｇａａｔｔｃｃａａａａａａａａａｃｔｇｔｔｔａｇｃａｔｔｔａｔｔｇｇｃｃｃｔｃｃａａａｃａｃａｇｇｃａａｇｔｃｔａｔｇｃｔｃｔｇｃａａｃｔｃａｔｔａａｔｔｃａｔｔｔｔｔｔｇｇｇｔｇｇｔａｇｔｇｔｔｔｔａｔｃｔｔｔｔｇｃｃａａｃｃａｔａａａａｇｔｃａｃｔｔｔｔｇｇｃｔｔｇｃｔｔｃｃｃｔａｇｃａｇａｔａｃｔａｇａｇｃｔｇｃｔｔｔａｇｔａｇａｔｇａｔｇｃｔａｃｔｃａｔｇｃｔｔｇｃｔｇｇａｇｇｔａｃｔｔｔｇａｃａｃａｔａｃｃｔｃａｇａａａｔｇｃａｔｔｇｇａｔｇｇｃｔａｃｃｃｔｇｔｃａｇｔａｔｔｇａｔａｇａａａａｃａｃａａａｇｃａｇｃｇｇｔｔｃａａａｔｔａａａｇｃｔｃｃａｃｃｃｃｔｃｃｔｇｇｔａａｃｃａｇｔａａｔａｔｔｇａｔｇｔｇｃａｇｇｃａｇａｇｇａｃａｇａｔａｔｔｔｇｔａｃｔｔｇｃａｔａｇｔｃｇｇｇｔｇｃａａａｃｃｔｔｔｃｇｃｔｔｔｇａｇｃａｇｃｃａｔｇｃａｃａｇａｔｇａａｔｃｇｇｇｔｇａｇｃａａｃｃｔｔｔｔａａｔａｔｔａｃｔｇａｔｇｃａｇａｔｔｇｇａａａｔｃｔｔｔｔｔｔｔｇｔａａｇｇｔｔａｔｇｇｇｇｇｃｇｔｔｔａｇａｃｃｔｇ。
【０１０３】
ベクタープラスミド：ｐＧＥＸ−６ｐ−１。
二重消化：ＢａｍＨ  Ｉ、Ｘｈｏ  Ｉ
【０１０４】
プライマー（小文字は制限部位である）：
順方向プライマー：配列番号１０；
ＣＧｇｇａｔｃｃＴＴＧＣＡＧＡＣＣＧＡＧＡＡＡＴ。
逆方向プライマー：配列番号１１
ＣＣＧｃｔｃｇａｇＴＴＡＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＣＡＧＧＴＣＴＡＡＡＣＧＣＣＣＣ。
【０１０５】
切断型Ｅ１−２（３０６〜６０５）のアミノ酸配列（配列番号１）：
ＬＱＴＥＫＦＤＦＧＴＭＶＱＷＡＹＤＨＫＹＡＥＥＳＫＩＡＹＥＹＡＬＡＡＧＳＤＳＮＡＲＡＦＬＡＴＮＳＱＡＫＨＶＫＤＣＡＭＶＲＨＹＬＲＡＥＴＱＡＬＳＭＰＡＹＩＫＡＲＣＫＬＡＴＧＥＧＳＷＫＳＩＬＴＦＦＮＹＱＮＩＥＬＩＴＦＩＮＡＬＫＬＷＬＫＧＩＰＫＫＮＣＬＡＦＩＧＰＰＮＴＧＫＳＭＬＣＮＳＬＩＨＦＬＧＧＳＶＬＳＦＡＮＨＫＳＨＦＷＬＡＳＬＡＤＴＲＡＡＬＶＤＤＡＴＨＡＣＷＲＹＦＤＴＹＬＲＮＡＬＤＧＹＰＶＳＩＤＲＫＨＫＡＡＶＱＩＫＡＰＰＬＬＶＴＳＮＩＤＶＱＡＥＤＲＹＬＹＬＨＳＲＶＱＴＦＲＦＥＱＰＣＴＤＥＳＧＥＱＰＦＮＩＴＤＡＤＷＫＳＦＦＶＲＬＷＧＲＬＤＬＩＤＥＥＥＤＳＥＥＤＧＤＳＭＲＴＦＴＣＳＡＲＮ。
【０１０６】
切断型Ｅ１−２（３０６〜６０５）のコード遺伝子配列（配列番号２）：
ｔｔｇｃａｇａｃｃｇａｇａａａｔｔｃｇａｃｔｔｃｇｇａａｃｔａｔｇｇｔｇｃａａｔｇｇｇｃｃｔａｔｇａｔｃａｃａａａｔａｔｇｃｔｇａａｇａｇｔｃｔａａａａｔａｇｃｃｔａｔｇａａｔａｔｇｃｔｔｔｇｇｃｔｇｃａｇｇａｔｃｔｇａｔａｇｃａａｔｇｃａｃｇｇｇｃｔｔｔｔｔｔａｇｃａａｃｔａａｃａｇｃｃａａｇｃｔａａｇｃａｔｇｔｇａａｇｇａｃｔｇｔｇｃａａｃｔａｔｇｇｔａａｇａｃａｃｔａｔｃｔａａｇａｇｃｔｇａａａｃａｃａａｇｃａｔｔａａｇｃａｔｇｃｃｔｇｃａｔａｔａｔｔａａａｇｃｔａｇｇｔｇｃａａｇｃｔｇｇｃａａｃｔｇｇｇｇａａｇｇａａｇｃｔｇｇａａｇｔｃｔａｔｔｃｔａａｃｔｔｔｔｔｔｔａａｔｔａｔｃａｇａａｔａｔｔｇａａｔｔａａｔｔａｃｃｔｔｔａｔｔａａｔｇｃｔｔｔａａａｇｃｔｃｔｇｇｃｔａａａａｇｇａａｔｔｃｃａａａａａａａａａｃｔｇｔｔｔａｇｃａｔｔｔａｔｔｇｇｃｃｃｔｃｃａａａｃａｃａｇｇｃａａｇｔｃｔａｔｇｃｔｃｔｇｃａａｃｔｃａｔｔａａｔｔｃａｔｔｔｔｔｔｇｇｇｔｇｇｔａｇｔｇｔｔｔｔａｔｃｔｔｔｔｇｃｃａａｃｃａｔａａａａｇｔｃａｃｔｔｔｔｇｇｃｔｔｇｃｔｔｃｃｃｔａｇｃａｇａｔａｃｔａｇａｇｃｔｇｃｔｔｔａｇｔａｇａｔｇａｔｇｃｔａｃｔｃａｔｇｃｔｔｇｃｔｇｇａｇｇｔａｃｔｔｔｇａｃａｃａｔａｃｃｔｃａｇａａａｔｇｃａｔｔｇｇａｔｇｇｃｔａｃｃｃｔｇｔｃａｇｔａｔｔｇａｔａｇａａａａｃａｃａａａｇｃａｇｃｇｇｔｔｃａａａｔｔａａａｇｃｔｃｃａｃｃｃｃｔｃｃｔｇｇｔａａｃｃａｇｔａａｔａｔｔｇａｔｇｔｇｃａｇｇｃａｇａｇｇａｃａｇａｔａｔｔｔｇｔａｃｔｔｇｃａｔａｇｔｃｇｇｇｔｇｃａａａｃｃｔｔｔｃｇｃｔｔｔｇａｇｃａｇｃｃａｔｇｃａｃａｇａｔｇａａｔｃｇｇｇｔｇａｇｃａａｃｃｔｔｔｔａａｔａｔｔａｃｔｇａｔｇｃａｇａｔｔｇｇａａａｔｃｔｔｔｔｔｔｔｇｔａａｇｇｔｔａｔｇｇｇｇｇｃｇｔｔｔａｇａｃｃｔｇａｔｔｇａｃｇａｇｇａｇｇａｇｇａｔａｇｔｇａａｇａｇｇａｔｇｇａｇａｃａｇｃａｔｇｃｇａａｃｇｔｔｔａｃａｔｇｔａｇｃｇｃａａｇａａａｃａｃａａａｔｇｃａｇｔｔｇａｔｔｇａ。
【０１０７】
ベクタープラスミド：ｐＧＥＸ−６ｐ−１。
二重消化：ＢａｍＨ  Ｉ、Ｘｈｏ  Ｉ
【０１０８】
プライマー（小文字は制限部位である）：
順方向プライマー１：配列番号１２
ＡＧＴＴＣＴＧＴＴＣＣＡＧＧＧＧＣＣＣＣＴＧｇｇａｔｃｃＴＴＧＣＡＧＡＣＣＧＡＧＡＡＡＴＴＣＧＡＣＴＴＣＧ。
逆方向プライマー１：配列番号１３
ＴＣＡＧＴＣＡＧＴＣＡＣＧＡＴＧＣＧＧＣＣＧｃｔｃｇａｇＴＴＡＡＴＣＡＡＣＴＧＣＡＴＴＴＧＴＧＴＴＴＣＴＴＧＣＧＣＴＡＣＡＴＧＴＡＡＡＣＧＴＴＣＧＣＡ。
【０１０９】
Ｅ１−２突然変異体１（Ｋ４２１Ｌ）のアミノ酸配列を配列番号６に示す：
ＬＱＴＥＫＦＤＦＧＴＭＶＱＷＡＹＤＨＫＹＡＥＥＳＫＩＡＹＥＹＡＬＡＡＧＳＤＳＮＡＲＡＦＬＡＴＮＳＱＡＫＨＶＫＤＣＡＴＭＶＲＨＹＬＲＡＥＴＱＡＬＳＭＰＡＹＩＫＡＲＣＫＬＡＴＧＥＧＳＷＫＳＩＬＴＦＦＮＹＱＮＩＥＬＩＴＦＩＮＡＬＫＬＷＬＬＧＩＰＫＫＮＣＬＡＦＩＧＰＰＮＴＧＫＳＭＬＣＮＳＬＩＨＦＬＧＧＳＶＬＳＦＡＮＨＫＳＨＦＷＬＡＳＬＡＤＴＲＡＡＬＶＤＤＡＴＨＡＣＷＲＹＦＤＴＹＬＲＮＡＬＤＧＹＰＶＳＩＤＲＫＨＫＡＡＶＱＩＫＡＰＰＬＬＶＴＳＮＩＤＶＱＡＥＤＲＹＬＹＬＨＳＲＶＱＴＦＲＦＥＱＰＣＴＤＥＳＧＥＱＰＦＮＩＴＤＡＤＷＫＳＦＦＶＲＬＷＧＲＬＤＬＩＤＥＥＥＤＳＥＥＤＧＤＳＭＲＴＦＴＣＳＡＲＮＴＮＡＶＤ。
【０１１０】
Ｅ１−２突然変異体１のヌクレオチド配列を配列番号８に示す：
ＧＧＡＴＣＣＴＴＧＣＡＧＡＣＣＧＡＧＡＡＡＴＴＣＧＡＣＴＴＣＧＧＡＡＣＴＡＴＧＧＴＧＣＡＡＴＧＧＧＣＣＴＡＴＧＡＴＣＡＣＡＡＡＴＡＴＧＣＴＧＡＧＧＡＧＴＣＴＡＡＡＡＴＡＧＣＣＴＡＴＧＡＡＴＡＴＧＣＴＴＴＧＧＣＴＧＣＡＧＧＡＴＣＴＧＡＴＡＧＣＡＡＴＧＣＡＣＧＧＧＣＴＴＴＴＴＴＡＧＣＡＡＣＴＡＡＣＡＧＣＣＡＡＧＣＴＡＡＧＣＡＴＧＴＧＡＡＧＧＡＣＴＧＴＧＣＡＡＣＴＡＴＧＧＴＡＡＧＡＣＡＣＴＡＴＣＴＡＡＧＡＧＣＴＧＡＡＡＣＡＣＡＡＧＣＡＴＴＡＡＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＴＡＴＡＴＴＡＡＡＧＣＴＡＧＧＴＧＣＡＡＧＣＴＧＧＣＡＡＣＴＧＧＧＧＡＡＧＧＡＡＧＣＴＧＧＡＡＧＴＣＴＡＴＣＣＴＡＡＣＴＴＴＴＴＴＴＡＡＣＴＡＴＣＡＧＡＡＴＡＴＴＧＡＡＴＴＡＡＴＴＡＣＣＴＴＴＡＴＴＡＡＴＧＣＴＴＴＡＡＡＧＣＴＣＴＧＧＣＴＡＣＴＧＧＧＡＡＴＴＣＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣＴＧＴＴＴＡＧＣＡＴＴＴＡＴＴＧＧＣＣＣＴＣＣＡＡＡＣＡＣＡＧＧＣＡＡＧＴＣＴＡＴＧＣＴＣＴＧＣＡＡＣＴＣＡＴＴＡＡＴＴＣＡＴＴＴＴＴＴＧＧＧＴＧＧＴＡＧＴＧＴＴＴＴＡＴＣＴＴＴＴＧＣＣＡＡＣＣＡＴＡＡＡＡＧＴＣＡＣＴＴＴＴＧＧＣＴＴＧＣＴＴＣＣＣＴＡＧＣＡＧＡＴＡＣＴＡＧＡＧＣＴＧＣＴＴＴＡＧＴＡＧＡＴＧＡＴＧＣＴＡＣＴＣＡＴＧＣＴＴＧＣＴＧＧＡＧＧＴＡＣＴＴＴＧＡＣＡＣＡＴＡＣＣＴＣＡＧＡＡＡＴＧＣＡＴＴＧＧＡＴＧＧＣＴＡＣＣＣＴＧＴＣＡＧＴＡＴＴＧＡＴＡＧＡＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＣＡＧＣＧＧＴＴＣＡＡＡＴＴＡＡＡＧＣＴＣＣＡＣＣＣＣＴＣＣＴＧＧＴＡＡＣＣＡＧＴＡＡＴＡＴＴＧＡＴＧＴＧＣＡＧＧＣＡＧＡＧＧＡＣＡＧＡＴＡＴＴＴＧＴＡＣＴＴＧＣＡＴＡＧＴＣＧＧＧＴＧＣＡＡＡＣＣＴＴＴＣＧＣＴＴＴＧＡＧＣＡＧＣＣＡＴＧＣＡＣＡＧＡＴＧＡＡＴＣＧＧＧＴＧＡＧＣＡＡＣＣＴＴＴＴＡＡＴＡＴＴＡＣＴＧＡＴＧＣＡＧＡＴＴＧＧＡＡＡＴＣＴＴＴＴＴＴＴＧＴＡＡＧＧＴＴＡＴＧＧＧＧＧＣＧＴＴＴＡＧＡＣＣＴＧＡＴＴＧＡＣＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＴＡＧＴＧＡＡＧＡＧＧＡＴＧＧＡＧＡＣＡＧＣＡＴＧＣＧＡＡＣＧＴＴＴＡＣＡＴＧＴＡＧＣＧＣＡＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＴＧＣＡＧＴＴＧＡＴＴＡＡＣＴＣＧＡＧ。
【０１１１】
Ｅ１−２突然変異体２（Ｈ３２３Ｗ）のアミノ酸配列を配列番号７に示す：
ＬＱＴＥＫＦＤＦＧＴＭＶＱＷＡＹＤＷＫＹＡＥＥＳＫＩＡＹＥＹＡＬＡＡＧＳＤＳＮＡＲＡＦＬＡＴＮＳＱＡＫＨＶＫＤＣＡＴＭＶＲＨＹＬＲＡＥＴＱＡＬＳＭＰＡＹＩＫＡＲＣＫＬＡＴＧＥＧＳＷＫＳＩＬＴＦＦＮＹＱＮＩＥＬＩＴＦＩＮＡＬＫＬＷＬＬＧＩＰＫＫＮＣＬＡＦＩＧＰＰＮＴＧＫＳＭＬＣＮＳＬＩＨＦＬＧＧＳＶＬＳＦＡＮＨＫＳＨＦＷＬＡＳＬＡＤＴＲＡＡＬＶＤＤＡＴＨＡＣＷＲＹＦＤＴＹＬＲＮＡＬＤＧＹＰＶＳＩＤＲＫＨＫＡＡＶＱＩＫＡＰＰＬＬＶＴＳＮＩＤＶＱＡＥＤＲＹＬＹＬＨＳＲＶＱＴＦＲＦＥＱＰＣＴＤＥＳＧＥＱＰＦＮＩＴＤＡＤＷＫＳＦＦＶＲＬＷＧＲＬＤＬＩＤＥＥＥＤＳＥＥＤＧＤＳＭＲＴＦＴＣＳＡＲＮＴＮＡＶＤ。
【０１１２】
Ｅ１−２突然変異体２のヌクレオチド配列を配列番号９に示す：
ＧＧＡＴＣＣＴＴＧＣＡＧＡＣＣＧＡＧＡＡＡＴＴＣＧＡＣＴＴＣＧＧＡＡＣＴＡＴＧＧＴＧＣＡＡＴＧＧＧＣＣＴＡＴＧＡＴＴＧＧＡＡＡＴＡＴＧＣＴＧＡＧＧＡＧＴＣＴＡＡＡＡＴＡＧＣＣＴＡＴＧＡＡＴＡＴＧＣＴＴＴＧＧＣＴＧＣＡＧＧＡＴＣＴＧＡＴＡＧＣＡＡＴＧＣＡＣＧＧＧＣＴＴＴＴＴＴＡＧＣＡＡＣＴＡＡＣＡＧＣＣＡＡＧＣＴＡＡＧＣＡＴＧＴＧＡＡＧＧＡＣＴＧＴＧＣＡＡＣＴＡＴＧＧＴＡＡＧＡＣＡＣＴＡＴＣＴＡＡＧＡＧＣＴＧＡＡＡＣＡＣＡＡＧＣＡＴＴＡＡＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＴＡＴＡＴＴＡＡＡＧＣＴＡＧＧＴＧＣＡＡＧＣＴＧＧＣＡＡＣＴＧＧＧＧＡＡＧＧＡＡＧＣＴＧＧＡＡＧＴＣＴＡＴＣＣＴＡＡＣＴＴＴＴＴＴＴＡＡＣＴＡＴＣＡＧＡＡＴＡＴＴＧＡＡＴＴＡＡＴＴＡＣＣＴＴＴＡＴＴＡＡＴＧＣＴＴＴＡＡＡＧＣＴＣＴＧＧＣＴＡＧＧＡＡＴＴＣＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣＴＧＴＴＴＡＧＣＡＴＴＴＡＴＴＧＧＣＣＣＴＣＣＡＡＡＣＡＣＡＧＧＣＡＡＧＴＣＴＡＴＧＣＴＣＴＧＣＡＡＣＴＣＡＴＴＡＡＴＴＣＡＴＴＴＴＴＴＧＧＧＴＧＧＴＡＧＴＧＴＴＴＴＡＴＣＴＴＴＴＧＣＣＡＡＣＣＡＴＡＡＡＡＧＴＣＡＣＴＴＴＴＧＧＣＴＴＧＣＴＴＣＣＣＴＡＧＣＡＧＡＴＡＣＴＡＧＡＧＣＴＧＣＴＴＴＡＧＴＡＧＡＴＧＡＴＧＣＴＡＣＴＣＡＴＧＣＴＴＧＣＴＧＧＡＧＧＴＡＣＴＴＴＧＡＣＡＣＡＴＡＣＣＴＣＡＧＡＡＡＴＧＣＡＴＴＧＧＡＴＧＧＣＴＡＣＣＣＴＧＴＣＡＧＴＡＴＴＧＡＴＡＧＡＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＣＡＧＣＧＧＴＴＣＡＡＡＴＴＡＡＡＧＣＴＣＣＡＣＣＣＣＴＣＣＴＧＧＴＡＡＣＣＡＧＴＡＡＴＡＴＴＧＡＴＧＴＧＣＡＧＧＣＡＧＡＧＧＡＣＡＧＡＴＡＴＴＴＧＴＡＣＴＴＧＣＡＴＡＧＴＣＧＧＧＴＧＣＡＡＡＣＣＴＴＴＣＧＣＴＴＴＧＡＧＣＡＧＣＣＡＴＧＣＡＣＡＧＡＴＧＡＡＴＣＧＧＧＴＧＡＧＣＡＡＣＣＴＴＴＴＡＡＴＡＴＴＡＣＴＧＡＴＧＣＡＧＡＴＴＧＧＡＡＡＴＣＴＴＴＴＴＴＴＧＴＡＡＧＧＴＴＡＴＧＧＧＧＧＣＧＴＴＴＡＧＡＣＣＴＧＡＴＴＧＡＣＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＴＡＧＴＧＡＡＧＡＧＧＡＴＧＧＡＧＡＣＡＧＣＡＴＧＣＧＡＡＣＧＴＴＴＡＣＡＴＧＴＡＧＣＧＣＡＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＴＧＣＡＧＴＴＧＡＴＴＡＡＣＴＣＧＡＧ。
【０１１３】
突然変異体組換えプラスミドを構築し、変異ベクターをＰＣＲクローニングによってベクタープラスミドｐＧＥＸ−６Ｐ−１に挿入し、二重制限部位はそれぞれ５’ＢａｍｈＩ及び３’ＸｈｏＩである。
【０１１４】
順方向プライマー２：配列番号１４
ＡＧＴＴＣＴＧＴＴＣＣＡＧＧＧＧＣＣＣＣＴＧｇｇａｔｃｃＴＴＧＣＡＧＡＣＣＧＡＧＡＡＡＴＴＣＧＡＣＴＴＣＧ。
【０１１５】
逆方向プライマー２：配列番号１５
ＴＣＡＧＴＣＡＧＴＣＡＣＧＡＴＧＣＧＧＣＣＧｃｔｃｇａｇＴＴＡＡＴＣＡＡＣＴＧＣＡＴＴＴＧＴＧＴＴＴＣＴＴＧＣＧＣＴＡＣＡＴＧＴＡＡＡＣＧＴＴＣＧＣＡ。
【０１１６】
全ウシパピローマウイルスゲノムを上記のＰＣＲプライマーを用いて増幅し（上述したように）、次いでベクターｐＧＥＸ−６ｐ−１及び得られたＰＣＲ産物を２つの制限酵素ＢａｍＨ  Ｉ及びＸｈｏ  Ｉで消化した。ベクターは、それぞれＢａｍＨ  Ｉ及びＸｈｏ  Ｉの２つの制限部位を含むＧＳＴタグ親和性を有していた。最後に、二重消化した標的遺伝子断片及びプラスミドベクターをＴ４リガーゼによって環状組換えプラスミドに再連結した。
【０１１７】
組換えプラスミドの検出は、プラスミドを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５αに形質転換した後、組換えベクターのアンピシリン耐性を用いて組換えプラスミドが成功裏に形質転換されたか否かを予備スクリーニングすることである。コロニーＰＣＲの後、核酸ゲル電気泳動を用いて標的断片がベクターに連結されているかどうかを予備的に確認した（図１に示すように、ｐＧＥＸ−６ｐ−１は４９８４ｂｐ長であり、Ｅ１−１遺伝子配列は８１６ｂｐ長であるため、消化後にそれぞれ４９９０ｂｐ及び８２２ｂｐの２つのバンドが得られる）。次に、遺伝子配列決定によって得られた配列決定結果を用いて、組換えが完了し、突然変異が生じていないかどうかを確認した。
【０１１８】
Ｅ１タンパク質の特異的発現及び精製：組換えプラスミドｐＧＥＸ−６ｐ−１−Ｎ−ＧＳＴをタンパク質発現のために大腸菌発現株ＢＬ２１に形質転換した。上記の大腸菌を、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む１１ｍＬのＬＢ培地中、３７℃及び２２０ｒｐｍで一晩培養した。その後、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１Ｌの新鮮ＬＢ培地に１０ｍＬの培養液を注入し、細菌濃度が０．６〜０．８単位（ＯＤ６００）に達したときに０．５ｍＭ（最終濃度）のＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド）を添加して誘導した。１６℃で１６時間誘導した後、細菌を４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離することによって回収し、懸濁液をタンパク質緩衝液２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．３）、２００ｍＭ  ＮａＣｌに再懸濁した。細菌を高圧で４回破砕した後、上清を１６０００ｒｐｍで４０分間遠心分離することによって回収した。次いで、上清を０．４５μｍ細孔径のフィルタで濾過し、標的タンパク質をＧＳＴアフィニティクロマトグラフィによって精製すした。ハイブリッドタンパク質が溶出した後、標的タンパク質をＰＳＰ酵素カラムで２時間消化し、次いで標的タンパク質をタンパク質緩衝液で溶出した。
【０１１９】
ＧＳＴアフィニティクロマトグラフィによる精製後、標的タンパク質の純度は高い。最後に、分子ふるいを使用してポリマーと単量体を分離し、最初のピークタンパク質が純粋なＥ１である。同時に、分子ふるいのピーク位置の分析から、得られたＥ１は六量体の形態であり、野生型Ｅ１は非常に類似している。予想されたサイズを満たすために残りのタンパク質試料をポリアクリルアミドゲル電気泳動によって試験した。図２及び３は、それぞれＥ１−１及びＥ１−２  ５７の分子ふるいピークのポリアクリルアミドゲル電気泳動パターンである。対応する単量体分子量はそれぞれ５７ＫＤ及び５９ＫＤである。２番目のチューブ（Ｅ１−１）及び６番目のチューブ（Ｅ１−２）をその後の電気生理学的実験に使用した。
【０１２０】
２つの突然変異体の遺伝子クローニング及び発現精製のための方法は野生型Ｅ１（３０６〜６０５）を参照し、分子ふるい収集後に最初に出現したピークチューブが突然変異体Ｅ１である。残りのタンパク質試料をＷＴ−Ｅ１（３０６〜６０５）と比較してポリアクリルアミドゲル電気泳動によって試験し、１つのアミノ酸のみが突然変異しているので、突然変異体の分子量はＷＴ−Ｅ１（３０６〜６０５）タンパク質に非常に近い。更に、それらは、図２１に示すように、ゲル電気泳動ストリップ上でほぼ同じ位置にある。
【０１２１】
実施例２；タンパク質切断及びそれらの突然変異体の蛍光標識及び膜融合実験
蛍光標識切断型Ｅ１−２（３０６〜６０５）タンパク質：使用した材料は、フッ素標識フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）コンジュゲートキット（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）である。キットの説明書に従って、過剰のＦＩＴＣをカラムクロマトグラフィによって除去し、ＦＩＴＣ結合Ｅ１をタンパク質緩衝液（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．３）、２００ｍＭ  ＮａＣｌ）で溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて確認されたＦＩＴＣ標識Ｅ１（３０６〜６０５）（図省略、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上のＦＩＴＣ標識Ｅ１−２の位置は、非標識Ｅ１−２の位置よりわずかに高い）。
【０１２２】
切断体Ｅ１−２（３０６〜６０５）を含む小胞（ＳＵＶ）の調製：Ｅ１タンパク質を含む約０．１μｍのサイズの小胞を調製するために、１ｍｇ／ｍＬのＤＯＰＣをバイアルに添加した。クロロホルムを窒素ブロー乾燥した後、タンパク質Ｅ１を含む水溶液（濃度約０．５ｍｇ／ｍｌ）を添加し、次いで脂質膜を水和して懸濁液を作製し、この懸濁液を、ポリカーボネート（ＰＣ）フィルム（直径１００ｎｍ）を通してＭｉｎｉ  ｓｑｕｅｅｚｅｒ（ＡＶＡＮＴＩ  Ｃｏ．Ｌｔｄ，Ａｍｅｒｉｃａから購入）によって更に押出して、タンパク質ＳＵＶを生成した。得られたＳＵＶは、短期間は４℃で、長期間は−８０℃で保存することができる；蛍光標識されていないＳＵＶのみが、光学顕微鏡下で同じサイズの小胞と類似の形態を示す。（得られたＭｉｎｉ  ｓｑｕｅｅｚｅｒによるタンパク質ＳＵＶは良好な均一性を有する）。
【０１２３】
切断型Ｅ１−２（３０６〜６０５）を含む巨大小胞を調製する手順：一方、蛍光標識された巨大小胞も調製することができた。茶色の瓶の中で１ｍｌのＤＯＰＣ（１ｍｇ／ｍｌ）又は１ｍｌのＤＰＨＰＣ（１ｍｇ／ｍｌ）と１％のＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｃｏ．Ｌｔｄ，Ａｍｅｒｉｃａから購入）を混合した；次にこの手順では、クロロホルムを窒素で乾燥するか、又はロータリーエバポレータでクロロホルムを揮発させた；次に、上記工程から得られたＤＯＰＣ又はＤＰＨＰＣを真空乾燥機に一晩入れた；Ｅ１タンパク質を挿入したハイブリッド巨大単層小胞（ＧＵＶ）を得るために、Ｅ１を含む２００〜３００μｍのスクロース溶液（濃度約０．５ｍｇ／ｍｌ）を添加して脂質分子層を水和した。
【０１２４】
Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄで標識されたこれらの小胞は蛍光顕微鏡で観察することができる。小胞が埋め込まれた蛍光標識タンパク質複合体を調製するために、前の手順から得られたＦＩＴＣ標識Ｅ１−２をここで使用することができる。蛍光顕微鏡でＧＵＶを観察した結果は、ロータリーエバポレータによって得られるより大きな直径を有する小胞のサイズがスクイーザによって調製されるＳＵＶのものほど均一ではないことを示す。いくつかの直径５０μｍを超える小胞タンパク質複合体が人工膜トレイルを伴う後者のナノポア挿入において見出され、これらの小胞は二重層脂質膜を容易に破裂させる（人工脂質膜は、ポリアセタール樹脂からなる直径５０μｍの穴の表面に形成される、Ｗａｒｎｅｒ  Ｃｏ．Ｌｔｄ，Ａｍｅｒｉｃａから購入）。
【０１２５】
同じ方法を用いて切断型Ｅ１−２の突然変異体について膜融合実験を行い、結果は、ＷＴ−Ｅ１（３０６〜６０５）と一致して、このタンパク質も人工脂質二重層及びＰＭＯＸＡ−ＰＤＭＳ−ＰＭＯＸＡトリブロックコポリマーに安定的に挿入できることを示す。実験の手順はＷＴ−Ｅ１（３０６〜６０５）と同様であり、突然変異体Ｅ１が挿入されたＧＵＶが得られたとき、膜上に埋め込まれたタンパク質がＣｒｙｏ−ＥＭによって観察され、図２２及び図２３に示すように、ポーリンは膜上に安定して存在することができる。
【０１２６】
二重標識した小胞埋め込みタンパク質複合体（Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄ標識小胞として赤色、及びＦＩＴＣ標識Ｅ１−２タンパク質として緑色）を蛍光顕微鏡下で観察し、いくつかの標識Ｅ１−２タンパク質が小胞膜上で不規則な位置を示し、予想されるように「膜貫通領域」の一部がリン脂質二重層に挿入されて細孔を形成することが認められる。この結果はまた、導電性緩衝液中で、Ｅ１−２が電圧によって駆動される人工脂質膜上に自発的に凝集し、予想される方向に膜内に挿入されて導電性細孔を形成できることを証明する。
【０１２７】
実施例３；Ｅ１タンパク質及びその突然変異体の電気生理学的実験
電気生理学的測定：この実施例で使用される機器は、増幅器とデジタル−アナログ変換器（ＤＡＣ）とを組み込んだＨＥＫＡ  ＥＰＣ−１０  ＵＳＢであり、これは、一対の銀／塩化銀電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ）である、圧力（電圧クランプ）電極と参照電極と呼ばれる２つの電極を有する。この機器を使用して、リン脂質二重層の両側を横切る膜貫通電流を測定した。ここでの試料周波数設定は２ｋＨｚであり、ローパスフィルタの周波数は１ｋＨｚである；ソフトウェアＰａｔｃｈ−ｍａｓｔｅｒを使用してデータを収集し、Ｃｌａｍｐｆｉｔを利用して収集したデータを分析した。
【０１２８】
二重層脂質膜（ＢＬＭ）の製造：水平標準ＢＬＭファブリケータ及び垂直標準ＢＬＭチャンバ（ＢＣＨ−１３Ａ、Ｗａｒｎｅｒ．Ｃｏ．Ｌｔｄ，Ａｍｅｒｉｃａから購入；直径５０μｍの穴を含むカップは特注品である）を使用してＢＬＭを製造した。８０〜２４０μｍの開口部を有する薄いテフロン（登録商標）フィルム（Ｅａｓｔｅｒｎ  Ｓｃｉ．ＬＬＣからのＴＰ−０２）及び５０μｍの開口部を有するポリホルムアルデヒド樹脂カップを、それぞれＢＬＭファブリケータ及びＢＬＭチャンバをシス区画（作業容積２５０μＬ）とトランス区画（作業容積２．５ｍＬ）に分離するための仕切りとして使用した。確実に開口部の縁全体を完全にコーティングするために、開口部に０．５μＬ、１ｍｇ／ｍｌのＤＯＰＣ溶液又はＤＰＨＰＣ溶液（溶媒はｎ−ヘキサンである）を２回予め塗布した後、２つの区画に導電性緩衝液（５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ／ｐＨ７．５、様々な濃度のＫＣｌ溶液、又はＰＢＳ溶液を含む）で満たす；次に、５０μｍの開口部の近くに２５ｍｇ／ｍｌのＤＯＰＣ溶液又はＤＰＨＰＣ溶液（溶媒はｎ−ヘキサンである）を添加すると、電流が１０．２ｎＡから０ｐＡに低下することが分かる。
【０１２９】
Ｅ１のコンダクタンス分布：
先に調製した小胞−タンパク質複合体は、水平ｐｔｆｅ膜のマイクロポア（上述したような）又は垂直ポリホルムアルデヒド樹脂マイクロポア上にＥ１−２タンパク質ナノポア構造が埋め込まれたＢＬＭを形成する。
【０１３０】
先に調製した小胞／Ｅ１複合体のストック溶液を、使用前にＢＬＭ実験用に１０〜２０倍に希釈した。Ｅ１を挿入するために、約２μＬの希釈リポソーム溶液をシスチャンバに充填した；他の簡単な方法を以下に述べる：ピペット上部のリポソームを含む気泡を使用してシスチャンバの開口部を静かに掃引し、細孔が自然に形成される。Ｅ１タンパク質のコンダクタンスは２つの方法で測定される：第１の方法は、一定の膜貫通電圧（例えば−７０ｍＶ）下で、複数の細孔が埋め込まれ、落下したときの電流の急激な変化を測定し、次いで細孔のコンダクタンス分布を計算するためにデータをカウントする。第２の方法は、膜の両側に走査電圧（例えば−１２０ｍＶ〜１２０ｍＶ）を印加し、電流及び電圧曲線の速度を計算することによって細孔コンダクタンスを計算することである。
【０１３１】
本発明では、多数のデータをカウントし、その結果は、５ｍＭのＨＥＰＥＳ及び１ＭのＫＣｌ中の単一細孔のコンダクタンスが約１．３４±０．０７ｎＳであることを実証する（図５に示すように）；＋７０ｍＶのトランス電圧が与えられたとき（図４に示すように）、単一細孔電流レベル及び２細孔電流レベルはそれぞれ約１０５ｐＡ及び２００ｐＡである。異なる傾斜電圧の下でＩ−Ｖ曲線のプロットが得られ、単一細孔コンダクタンスは約１．５ｎＳと測定される（図６に示すように）。５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ及び０．５Ｍ  ＫＣｌのコンダクタンス緩衝液の条件下で、Ｅ１の測定された単一コンダクタンスは約０．７８ｎｓであり、５０ｍＶの膜貫通電圧で、人工脂質膜上に形成された単一Ｅ１細孔の電流は約４０ｐＡであり、二重細孔の電流は約８５ｐＡである。Ｉ−Ｖ曲線下で、測定された単一細孔コンダクタンスは約１．５７／２ｎＳである。コンダクタンス緩衝液としてのＰＢＳ中で、タンパク質のコンダクタンスは０．２±０．０２ｎＳであり（図７に示すように）、単一細孔の電流は約−７０ｍＶの電圧下で約２３ｐＡである。
【０１３２】
突然変異体Ｅ１について同じ試験を行い、その結果は、０．５Ｍ  ＫＣｌ、１０Ｍｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）の下で、＋１００ｍＶのバイアス電圧を与えた場合、単一細孔埋め込みが約７５ｐＡの電流上昇工程を引き起こすことを示し、図２４に示すように、多数の単一細孔埋め込み及び落下シグナルをカウントした後、−２００〜２００ｍＶの走査電圧の下で、単一細孔コンダクタンス分布はＷＴ−Ｅ１（３０６〜６０５）細孔のものと類似しており、両方とも約１．３±０．０７ｎＳであることが分かる。更に、走査電圧では、電圧に対する電流の散乱線形適合結果は良好であり、分散は低い。
【０１３３】
実施例４；Ｅ１タンパク質及びその突然変異体の細孔の安定性に関する試験
Ｅ１−２の細孔の安定性に関する試験：本発明では、リン脂質膜上のＥ１−２及びＥ１の突然変異体の細孔の安定性及び高電圧ゲート現象をそれぞれ正及び負の電圧下で試験した。結果は以下を示した：正の３００ｍＶ及び負の３００ｍＶの下でＥ１細孔に関してゲート現象は見られず、Ｅ１細孔は、高電圧を与えられたときリン脂質膜上に安定に存在することができた。同時に、コンダクタンス緩衝液（Ｅ１タンパク質を保存するために使用される）中のグリセロールが多すぎると、膜に埋め込まれたタンパク質複合体が異常に不安定になり、タンパク質が極めて容易に膜から脱落する又は膜が直接破裂することが認められる。
【０１３４】
高電圧でのＥ１タンパク質突然変異体（Ｋ４２１Ｌ、Ｈ３２３Ｗ）の安定性実験では、−３００〜３００ｍＶの走査電圧を採用した。より高い電圧（±３００）で、細孔は膜上で安定なままであり、コンダクタンス分布は有意に変化しないことが認められ、突然変異体Ｅ１（Ｋ４２１Ｌ、Ｈ３２３Ｗ）もＷＴ−Ｅ１（３０６〜６０５）のように安定なコンダクタンス特性を有する。
【０１３５】
実施例５；Ｅ１タンパク質及びその突然変異体の一本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡ転位試験
この実施例で使用されるｓｓＤＮＡは４８ｎｔであり、Ｔａｋａｒａ  ｃｏｍｐａｎｙから購入され、その詳細な配列は以下のように表される；電解質はＨＥＰＥＳ／１Ｍ  ＫＣｌである；一般に、この条件下で核酸輸送を達成するための２つの方法がある。
【０１３６】
方法１：Ｅ１タンパク質をＢＬＭに挿入するときに、電圧を０ｍＶに変更し、シスに輸送されるべき核酸を添加する；方法２：輸送されるべき核酸をコンダクタンス緩衝液に予め混合し、シス及びトランスを同じ量で混合する。ＤＮＡの転位は主に印加された膜貫通電圧に依存する。特別な指示がない限り、この実験では方法１をｓｓＤＮＡの転位に採用し、転位系におけるｓｓＤＮＡの濃度は１００ｎＭ／Ｌである。
【０１３７】
４８ｎｔのｓｓＤＮＡの場合、単一細孔が膜に埋め込まれており、転位によって引き起こされる電流遮断は約６５ピコアンペアである（膜貫通電圧は約５０ｍＶである）（図８に示すように）。このセグメントにおける核酸の転位によって引き起こされる電流遮断割合は約８２％である（Ｉｂ／Ｉ、Ｉｂは核酸転位によって引き起こされる電流遮断であり、単位はｐＡである；Ｉはリン脂質二重層への単一細孔タンパク質の挿入によって引き起こされる電流変化であり、単位はｐＡである）；ｓｓＤＮＡ転位の滞留時間は２ミリ秒である（図２９〜３０に示すように）。ＰＢＳ中では、ｓｓＤＮＡ転位実験は、＋１００ｍＶの膜貫通電圧下で、２４ｎｔのｓｓＤＮＡが約８０％の遮断及び１〜２ミリ秒の滞留時間を誘導するという同様の結果を示す（図９〜１０に示すように）。
【０１３８】
一方、ｓｓＲＮＡ転位実験は、上述したｓｓＤＮＡ転位実験と同様に実施した。ＲＮＡ分解を防ぐためにＤＥＰＣ溶液及びオートクレーブ滅菌を使用することに留意されたい。結果は、ｓｓＤＮＡ転位と同様に、ｓｓＲＮＡは約８０％の遮断を誘導し、−５０ｍＶの下でＰＢＳ緩衝液系中の遮断電流は約８ｐＡであり、滞留時間は１〜２ミリ秒であることを示す。
【０１３９】
比較として、核酸を含まず細孔のみを含む系における電流トレースは静的である。この細孔の１つの利点は、対照群の静電流がめったに非特異的遮断を妨げないことである。実験において、核酸をコンダクタンス緩衝液に予め混合した場合、タンパク質細孔がリン脂質膜に最初に挿入された後即座に転位の量が検出され、遮断現象はますます少なくなる。この結果は、試料タンク内に撹拌装置がない場合には、ＤＮＡ転位の発生が遅れることを示す。
【０１４０】
Ｅ１タンパク質突然変異体は、同じコンダクタンス条件及び一本鎖核酸を用いてｓｓＤＮＡ／ｓｓＲＮＡによって転位される。１Ｍ  ＫＣｌ及び１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）のコンダクタンス条件下で、１２０ｍＶのバイアス電圧を印加すると、ｓｓＤＮＡ転位の遮断率は７８％に近く、転位時間は０．５ミリ秒に近いことが認められ（図２６及び２５に示すように）、これはＷＴ−Ｅ１（３０６〜６０５）のデータに近似する。
【０１４１】
実施例６；Ｅ１内部のｄｓＤＮＡの遮断実験
ＢａｍＨＩ酵素から得られた二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）をシスチャンバに添加し、転位緩衝液は、ｓｓＤＮＡを含む１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／１Ｍ  ＫＣｌである。移動シグナルは、それぞれ５０ｍＶ、７０ｍＶ、１２０ｍＶ及び１５０ｍＶの電圧で検出され、ｄｓＤＮＡ転位は観察されない。
【０１４２】
実施例７；Ｅ１核酸転位の検証実験
Ｑ−ＰＣＲを用いて核酸増幅の標準曲線を作成した：ｄｓＤＮＡを、２つのｓｓＤＮＡ（８０ｎｔ）をアニーリングすることから調製し、２％アガロースゲルで同定し、ゲルから抽出した。ゲルから抽出されたｄｓＤＮＡの濃度をＱｕｂｉｔ（登録商標）３．０（Ｔｈｅｒｍｏ  ｆｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏ．Ｌｔｄ，Ａｍｅｒｉｃａ）によって測定した（この方法は正確度と精度において紫外分光光度計よりも優れている）；得られた既知濃度のｄｓＤＮＡを１０倍濃度勾配の１０倍に希釈し、次いで標準的な相関を得るためにＱ−ＰＣＲ（Ｐｒｅｍｉｘ  ＳＹＢＲ−Ｔａｋａｒａ  Ｃｏ．Ｌｔｄ，Ｊａｐａｎ）を用いてｄｓＤＮＡ濃度のｃｔ値の標準曲線を作成した（図１１〜１２に示すように、Ｃｔ値は各濃度勾配下で良好な再現性を有し、Ｒ２＝０．９９＋である）。従って、この標準的な相関は、その後のｓｓＤＮＡ転位実験の計算の基礎として使用することができる。
【０１４３】
上記のように、Ｅ１タンパク質をシスチャンバ内の膜に埋め込んだ後、５０ｎＭの８０ヌクレオチドＤＮＡを添加する（第一の方法）か、又は２５ｎＭの４８ヌクレオチドＤＮＡを両側のチャンバのコンダクタンス緩衝液に予め混合して（第二の方法）、Ｑ−ＰＣＲによる細孔を通るｓｓＤＮＡの定量分析を行った。陰性対照として、５０ｎＭの８０ヌクレオチドＤＮＡを、Ｅ１タンパク質を含まないシスチャンバに添加するか、又は等量の２５ｎＭの８０ヌクレオチドＤＮＡを両側のチャンバに添加した。膜の両側に−７０ｍＶの電圧を印加し、それぞれ１０分、２０分、４０分、６０分、及び９０分後にＱ−ＰＣＲ定量分析のために２つのチャンバのコンダクタンス緩衝液を収集した。
【０１４４】
転位実験に関与する全ての核酸を以下に記載する：（Ｔａｋａｒａ，Ｃｏ．Ｌｔｄ，Ｊａｐａｎから購入）
【０１４５】
４８ヌクレオチドのＤＮＡ配列を配列番号１６に示す：
３’−ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＧＧＧ  ＧＧＧ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＣＣＣ  ＣＣＣ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ−５’。
【０１４６】
４４ヌクレオチドのＤＮＡ及び４４ヌクレオチドのＤＮＡ  １の配列をそれぞれ配列番号１７及び配列番号１８に示す：
５’−ＡＧＣ  ＴＣＣ  ＡＣＣ  ＣＣＴ  ＣＣＴ  ＧＧＴ  ＡＡＣ  ＣＡＧ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴ−３’（配列番号１７）。
５’−ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴ  ＣＴＧ  ＧＴＴ  ＡＣＣ  ＡＧＧ  ＡＧＧ  ＧＧＴ  ＧＧＡ  ＧＣＴ−３’（配列番号１８）。
【０１４７】
２４ヌクレオチドのＤＮＡ配列を配列番号１９に示す：
５’−ＣＴＧ  ＧＴＴ  ＡＣＣ  ＡＧＧ  ＡＧＧ  ＧＧＴ  ＧＧＡ  ＧＣＴ−３’。
【０１４８】
標識核酸鎖及び標識核酸鎖１を配列番号２０及び配列番号２１として記載する：
５’−ＣＣＴＡＣＧＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＧＴＡＧＧ−３’（５’−Ｃｙ５、３’−ＢＨＱ２）（配列番号２０）。
５’−ＣＣＴＡＣＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣＧＴＡＧＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号２１）。
【０１４９】
ｄスペーサを有するｄｓＤＮＡ及びｄｓＤＮＡ１（ｄスペーサはリン酸骨格のみを有し、塩基を有さないヌクレオチドであり、そのため、その空間構造は通常のヌクレオチドよりも小さい）の配列を配列番号２２（３つのｄスペーサが１１番目と１２番目のビットの間に挿入されている）（詳細な配列は５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＸＸＸＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’であり、Ｘはｄスペーサを表す）及び配列番号２３に示す：
５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号２２）。
５’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ−３’（配列番号２３）。
【０１５０】
Ｑ−ＰＣＲによる定量的転位分析に使用される核酸の配列を配列番号２４及び配列番号２５に示す：
５’−ＣＡＧ  ＧＣＡ  ＧＡＧ  ＧＡＣ  ＡＧＡ  ＴＡＴ  ＴＴＧ  ＴＡＣ  ＴＴＧ  ＣＡＴ  ＡＧＴ  ＣＧＧ  ＧＴＧ  ＣＡＡ  ＡＣＣ  ＴＴＴ  ＣＧＣ  ＴＴＴ  ＧＡＧ  ＣＡＧ  ＣＣＡ  ＴＧＣ  ＡＣＡ  ＧＡＴ  ＧＡＡ  ＴＣＧ  ＧＧＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴＴ（配列番号２４）。
５’−ＣＣＣ  ＧＡＴ  ＴＣＡ  ＴＣＴ  ＧＴＧ  ＣＡＴ  ＧＧＣ  ＴＧＣ  ＴＣＡ  ＡＡＧ  ＣＧＡ  ＡＡＧ  ＧＴＴ  ＴＧＣ  ＡＣＣ  ＣＧＡ  ＣＴＡ  ＴＧＣ  ＡＡＧ  ＴＡＣ  ＡＡＡ  ＴＡＴ  ＣＴＧ  ＴＣＣ  ＴＣＴ  ＧＣＣ  ＴＧ（配列番号２５）。
【０１５１】
Ｑ−ＰＣＲによる定量的転位に使用される２つのプライマー（プライマー１及びプライマー２）をそれぞれ配列番号２６及び配列番号２７に示す：
５’−ＣＡＧ  ＧＣＡ  ＧＡＧ  ＧＡＣ  ＡＧＡ  ＴＡＴ  ＴＴ（配列番号２６）。
５’−ＣＣＣ  ＧＡＴ  ＴＣＡ  ＴＣＴ  ＧＴＧ  ＣＡＴ  ＧＧ（配列番号２７）。
【０１５２】
ｄｓＤＮＡのアニーリング手順をＰＣＲ装置で実施し、アニーリング温度は９５℃であり、アニーリング時間は２分に設定する；次に冷却の工程は、１時間２０分続く勾配（毎分ほぼ１℃）に設定した。最後に、核酸産物をアガロースゲルによって測定した（図１３に示すように）。
【０１５３】
本発明では、ＢａｍＨＩで消化した環状プラスミドＨａｇ−Ｃ１からｄｓＤＮＡを取得し、それをＱＩＡＧＥＮ  ＤＮＡ精製キットで精製し、産物である３８００ｂｐのｄｓＤＮＡの精製をＱＩＡＧＥＮ  ＤＮＡ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ，Ｃｏ．Ｌｔｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって実施した。
【０１５４】
実施例８；インビトロでのＥ１の巻き戻し実験
本発明は、インビトロでタンパク質六量体のｄｓＤＮＡのらせん活性を検証するためにＥ１（３０６〜５７７）を使用する。
【０１５５】
ヘリカーゼ実験における緩衝液は、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、０．７ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、５％グリセロール、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、３ｍＭ  ＤＴＴである；反応は２ｍＭのＡＴＰを添加することによって開始される；この試験における基質ｄｓＤＮＡは、ＤＮＡの末端を５’−フッ素及び３’−クエンチャーで２２ｂｐ標識されており、これは自然にヘアピンを形成することができる。
【０１５６】
インビトロでは、ＤＮＡ複製を補助するためにウイルス自体に含まれる他のタンパク質成分がないため、ｄｓＤＮＡの平滑末端はこのヘリカーゼによって直接巻き戻されることができない。
【０１５７】
一本鎖の腕を有する合成ｄｓＤＮＡをインビトロでの巻き戻し実験及び後述する膜上での巻き戻し実験に使用する。Ｅ１タンパク質の巻き戻しは、単腕核酸鎖が細孔に入ることから始まる。巻き戻しの工程で、励起波長は６４３ｎｍであり、発光波長は６６７ｎｍであり、巻き戻し工程を視覚的に観察するために多機能蛍光マイクロプレートリーダ（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ，Ｃｏ．Ｌｔｄ，Ａｍｅｒｉｃａ）を用いて反応系内で基質（５ｎＭ核酸基質）の蛍光を連続的にモニターする。ｄｓＤＮＡが巻き戻されると、ｓｓＤＮＡ末端の一方が自然にヘアピン構造を形成し、蛍光タグはクエンチャータグによって消光され得る。
【０１５８】
結果は、図１４に示すように、Ｅ１−２がインビトロでヘリカーゼ活性を有しており、ＡＴＰの存在下で二本鎖核酸が巻き戻され得ることを実証する。
【０１５９】
実施例９；人工脂質膜上のＥ１及びその突然変異体の巻き戻し実験
インビトロでＥ１のヘリカーゼ活性を検証した後、人工脂質膜上での巻き戻し実験を計画する：Ｅ１がＢＬＭに挿入された後、二本鎖ＤＮＡの直径がＥ１タンパク質細孔の直径よりも大きいため（上記のように）、ｄｓＤＮＡは、ＡＴＰ及びＭｇ２＋の不在下では、室温（２１℃）でＥ１タンパク質を通して転位することができなかった。
【０１６０】
しかしながら、ＡＴＰの濃度、Ｍｇ２＋濃度、及び系の温度を含む適切な系環境を制御することによって、Ｅ１を通したｄｓＤＮＡ転位が分子レベルで観察される（図１５に示すように）。比較として、本発明者らは、二本鎖ＤＮＡを転移させるために、ヘリカーゼ活性を有さない別のＭｓｐＡ（その細孔の直径はＥ１の直径と類似しており、二本鎖ＤＮＡの直径よりも小さい）を選択し、非巻き戻し系（ＡＴＰなし、Ｍｇ２＋）並びにＥ１−２と同じ温度、ＡＴＰ濃度、及びＭｇ２＋濃度の条件下で、二本鎖ＤＮＡはＭｓｐＡポーリンを通して輸送されることができない。
【０１６１】
Ｅ１ヘリカーゼ活性測定実験では低い塩濃度が必要とされるので、人工脂質膜上で巻き戻しを行うためにＰＢＳを選択する；この緩衝液中で、Ｅ１−２のコンダクタンスは約０．２±０．０２ｎＳである。
【０１６２】
この実験のスキームを以下で説明する：ＢＬＭがＰＢＳコンダクタンス緩衝液中で形成された後、Ｅ１−２をＢＬＭに安定に挿入した（上述したように）；次いで、ｄｓＤＮＡ（最終濃度１２．５ｎＭ）をシスチャンバに添加し、コンダクタンス緩衝液を加熱プレートで３７℃に加熱した；次いでＡＴＰ（最終濃度５ｍＭ）及びＭｇ２＋（最終濃度５ｍＭ）をコンダクタンス緩衝液に添加した。
【０１６３】
結果は、ＡＴＰ加水分解により、ＢＬＭに埋め込まれたＥ１−２によってｄｓＤＮＡがｓｓＤＮＡとして巻き戻され、シス側からトランス側に転位することを示す。−４０ｍＶの下で、ｄｓＤＮＡ巻き戻し現象の量を観察し、電圧を＋４０ｍＶに反転させると細孔は閉塞を保つ。しかしながら、電圧が＋４０ｍＶから−５０ｍＶに変化させると、巻き戻しが再び起こり、遮断状態から再開する（図１６に示すように）。
【０１６４】
異なる長さを有するｄｓＤＮＡの膜上での巻き戻し：
更に、本発明は、人工脂質膜上での異なる長さを有するｄｓＤＮＡの巻き戻し現象を検討する。
【０１６５】
組換えプラスミドＰＥＴ−２８ｂ＋ＭｓｐＡをＸｈｏＩ及びＥｃｏＯ１０９Ｉで５つの異なる長さの断片に消化した；両方の酵素が粘着末端を有する線状二本鎖を消化することができるので、ｄｓＤＮＡは伸長した単腕を有し（上記の理由で長さは５ｂｐである）、そのため５つの異なる長さのｄｓＤＮＡを使用して膜上での巻き戻しの際の異なる鎖の長さの影響を検討し、実験工程は上記と同じである。
【０１６６】
結果は、他の同じ条件下で、鎖の長さが増加すると共に、Ｅ１−２の巻き戻し時間も比例して増加することを示す。図１７に示すように、−１００ｍＶの下で、Ｉｐｏｒｅ＝−４００ｐＡ（Ｎ＝２０）であり、ｄｓＤＮＡの長さが２０００ｂｐ未満の場合、巻き戻しの速度は比較的一定であるが、ｄｓＤＮＡの長さが長くなるにつれて、Ｅ１−２の巻き戻し活性が減少し、長さが５０００ｂｐに近くなると、巻き戻し時間は９秒に達することが認められる。
【０１６７】
異なる温度での膜上のｄｓＤＮＡの巻き戻し：
他方で、本発明は、温度が異なることを除いて同じ条件下で膜上のｄｓＤＮＡの巻き戻し現象を観察することを試みた。上記の２４ｂｐの核酸鎖の実験を、それぞれ室温（２１℃）、３５℃未満、３５℃〜３７℃、及び３７℃超の勾配温度で実施した。
【０１６８】
結果は、巻き戻しの頻度は温度の上昇に比例して増加するが、温度が３７℃より高い場合、巻き戻しは減少し始め、これはウイルスヘリカーゼとしてのＥ１−２の特徴と一致することを示す（図１８及び１９に示すように）。
【０１６９】
異なる膜貫通電圧での膜上のｄｓＤＮＡの巻き戻し：
本発明はまた、異なる膜貫通電圧でＥ１−２が同じｄｓＤＮＡ基質を巻き戻すのに必要な時間を決定し、実験工程は上記と同じである。
【０１７０】
実験結果は、シスチャンバに核酸基質を混合すると、絶対電圧値が負電圧で徐々に低下する場合、それに応じて巻き戻し時間が延長し、非線形関数が電圧勾配及び巻き戻し時間に適合することを示す。得られた曲線は軸方向を向いており、これは、電圧の駆動力に加えて、Ｅ１−２も能動的に巻き戻しを行っており、２つの力の方向は同じであることを示し、実証する。図２０に示すように、同じｄｓＤＮＡ基質について、−１００ｍＶの電圧での巻き戻しには約３秒を要し、一方−２０ｍＶの電圧では、巻き戻し時間はほぼ３０秒に増加する。適合曲線の方向によれば、電圧駆動巻き戻しの方向は、Ｅ１−２の巻き戻しの方向と同じである。Ｅ１はキノコ構造であり、一本鎖はＤＮＡ複製中にＮ末端の開口部からタンパク質細孔に入るので、この状態のタンパク質のＮ末端開口部はシスチャンバの負極に向かっていることが分かる。
【０１７１】
膜上の特別な核酸基質の巻き戻し：
本発明はまた、ｄｓＤＮＡの一本鎖中に３つのｄスペーサ（塩基なし）を有する別の特別な核酸基質を設計し、これは単腕を有し、Ａ及びＴからなる。この特別な核酸基質を用いて巻き戻し実験を実施した。
【０１７２】
通常の巻き戻しシグナルでは、２０〜３０ｐＡのサイズの小さなステップが特定の場所に現れることが見出された。小さなステップシグナルの特定の位置は核酸中のｄスペーサのものと一致する。
【０１７３】
膜上でのＥ１巻き戻し（Ｍｇ２＋及びＡＴＰの機能に依存する）の検証：
膜上のＥ１−２の巻き戻しを検証するために、Ｍｇ２＋とキレート化した過剰のＥＤＴＡを適用してヘリカーゼを不活性化した。実験工程は上記と同じである。巻き戻しの工程で、過剰のＥＤＴＡキレート剤を反応系に添加した。
【０１７４】
結果は、ＥＤＴＡの増加と共に、巻き戻し活性が徐々に阻害され、最大阻害効率は８０％超に達することを示す。過剰のＭｇ２＋を反応系に添加した場合、巻き戻しが再び現れ、最大効率の１／２以上に回復することが明らかに観察される。
【０１７５】
同時に、ＡＴＰの別の類似体であるＡＴＰαＳを使用して、巻き戻し系におけるＡＴＰを競合的に置き換えた場合、ＡＴＰαＳはＡＴＰのように加水分解してエネルギーを供給することができず、膜上の巻き戻し活性は有意に阻害される。この阻害はＭｇ２＋をキレート化するＥＤＴＡほど可逆的ではないので、過剰のＡＴＰαＳを添加した場合、膜上の巻き戻し活性は徐々に消失する。
【０１７６】
同じ実験方法及び条件で人工脂質膜上のＥ１突然変異体の巻き戻しを検討すると、Ｅ１タンパク質の突然変異体の転位は２ｍＭ  ＡＴＰによって開始されることが分かる。図２７、２８に示すように、ＷＴ−Ｅ１（３０６〜６０５）と同様の巻き戻しシグナルが、−１００ｍＶのバイアス電圧で観察される。
【０１７７】
上記の結果は、初めて、ウシパピローマウイルスの環状六量体ヘリカーゼが、脂質二重層膜及びポリマー膜に埋め込まれたタンパク質ナノポアへと成功裏に操作されたことを示す。ナノポアは、高電圧でゲートすることなく脂質二重層上に安定に留まることができる。それは、温度特異性、及びＡＴＰ類似体による競合的阻害などの人工脂質膜上のヘリカーゼの特徴を依然として保持する。このナノポアは、膜上の一本鎖ＲＮＡ及び一本鎖ＤＮＡを受動的に転位させることができる。単腕を有するｄｓＤＮＡは、ＡＴＰ加水分解によって供給されるエネルギーを使用して膜上で巻き戻されることができ、巻き戻し時間は基質の長さに正比例する。
【０１７８】
上記の実験は、本発明が２つのタンパク質Ｅ１−１（３０６〜５７７）及びＥ１−２（３０６〜６０５）を革新的に発見し、前者は導電性細孔を含む新しい単純な膜として使用でき、核酸を脂質二重層に安定に挿入し、転位させることができ、後者は更にナノポア及びヘリカーゼの二重の作用を有することを示す。本発明は、ナノポアとヘリカーゼの特性を組み合わせたセンシングシステムを構築し、これは、カップリングナノポアであるヘリカーゼを必要とする既存のセンシング方法に取って代わるものであり、優れた応用展望を有する。
【０１７９】
更に、本発明はまた、Ｅ１−２タンパク質の突然変異体を創造的に検討し、Ｅ１−２の突然変異体を得る。変異単量体によって構築されるナノポアは、野生型タンパク質よりも核酸及び他の負に帯電した小分子を捕捉する可能性が高いことが見出されている。更に、変異タンパク質は電流範囲の増加を示し、そのため細孔の内部空洞は野生型より狭くなるので、細孔内の電流検出がより広範囲で高感度である。
【図１】
2020505043.tif 000014
【図２】
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【図３】
2020505043.tif 000016
【図４】
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【図５】
2020505043.tif 000018
【図６】
2020505043.tif 000019
【図７】
2020505043.tif 000020
【図８】
2020505043.tif 000021
【図９】
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【図１０】
2020505043.tif 000023
【図１１】
2020505043.tif 000024
【図１２】
2020505043.tif 000025
【図１３】
2020505043.tif 000026
【図１４】
2020505043.tif 000027
【図１５】
2020505043.tif 000028
【図１６】
2020505043.tif 000029
【図１７】
2020505043.tif 000030
【図１８】
2020505043.tif 000031
【図１９】
2020505043.tif 000032
【図２０】
2020505043.tif 000033
【図２１】
2020505043.tif 000034
【図２２】
2020505043.tif 000035
【図２３】
2020505043.tif 000036
【図２４】
2020505043.tif 000037
【図２５】
2020505043.tif 000038
【図２６】
2020505043.tif 000039
【図２７】
2020505043.tif 000040
【図２８】
2020505043.tif 000041
【図２９】
2020505043.tif 000042
【図３０】
2020505043.tif 000043
【配列表】
2020505043000001.app
【国際調査報告】
2020505043.tif 000044
2020505043.tif 000045
2020505043.tif 000046
2020505043.tif 000047
2020505043.tif 000048