(57)【要約】  本明細書では、農業利用のための、例えば宿主線虫又は節足動物（例えば、ミツバチ又はカイコ）に常在する１つ以上の微生物のレベル、活動又は代謝を変化させるための薬剤、組成物及び方法であって、この変化は、宿主の適応度の増加をもたらす、薬剤、組成物及び方法が提供される。本発明は、宿主にとって有益な方式で宿主の微生物叢を変化させることができる薬剤（例えば、ファージ、ペプチド、小分子、抗生物質又はこれらの組み合わせ）を含む組成物を特徴とする。好ましい微生物レベル、微生物活動、微生物代謝及び／又は微生物多様性を促進することにより、本明細書に記載される薬剤は、ハチ及びカイコなど、農業及び商業で利用される種々の有益線虫又は節足動物の適応度を増加させるために使用され得る。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミツバチの適応度を増加させる方法であって、
昆虫が摂食可能な担体と共に製剤化されている、有機リン酸系殺虫剤を代謝する細菌の有効量を含む組成物を前記ミツバチに投与すること
を含む方法。
【請求項２】
前記投与は、ミツバチの巣又は前記ミツバチが成長、生活、繁殖若しくは摂餌する少なくとも１つの生息場所に前記組成物を送達することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組成物は、液体、固体、エアロゾル、ペースト、ゲル又は気体である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記有機リン酸系殺虫剤は、フェニトロチオンである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記担体は、種子コーティングである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ミツバチは、ミツバチコロニーにいる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
液体、固体、エアロゾル、ペースト、ゲル又は気体としての、昆虫が摂食可能な担体と共に製剤化されている、有機リン酸系殺虫剤を代謝する細菌の有効量を含む組成物。
【請求項８】
前記有機リン酸系殺虫剤を代謝する細菌は、フェニトロチオンを代謝する、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記担体は、種子コーティングである、請求項７又は８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記有機リン酸系殺虫剤を代謝する細菌は、少なくとも１００，０００細胞／ｍｌの濃度である、請求項７〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１７年１月２４日に出願された米国仮特許出願第６２／４５０，０１７号明細書及び２０１７年１１月９日に出願された米国仮特許出願第６２／５８３，７３６号明細書に対する優先権を主張し、これらの仮特許出願の内容は、本明細書によって全体として参照により本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
線虫及び節足動物などのある種の無脊椎動物（例えば、昆虫、例えばヨーロッパミツバチ（アピス・メリフェラ（Ａｐｉｓ  ｍｅｌｌｉｆｅｒｉａ））又はカイコ（ボンビックス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）））は、農業で受粉作業及び病害虫防除に利用され、且つ商業で蜂蜜又は絹などの商業生産物の生産に利用されている。農業上又は商業上の産業使用に有益な線虫及び節足動物を育てるため、当該技術分野では、有益な無脊椎動物の成長及び適応度を促進する方法が必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本明細書では、農業用又は商業用無脊椎動物の適応度を調節するための組成物及び方法が開示される。本組成物は、宿主に常在する１つ以上の微生物のレベル、活動又は代謝を変化させる薬剤であって、この変化は、宿主の適応度の調節をもたらす、薬剤を含む。
【０００４】
一態様において、本明細書では、ミツバチの適応度を増加させる方法であって、昆虫が摂食可能な担体と共に製剤化されている、有機リン系殺虫剤を代謝する細菌の有効量を含む組成物をミツバチに投与することを含む方法が提供される。
【０００５】
一部の実施形態において、この投与は、ミツバチの巣又はミツバチが成長、生活、繁殖若しくは摂餌する少なくとも１つの生息場所に組成物を送達することを含む。
【０００６】
一部の実施形態において、本組成物は、液体、固体、エアロゾル、ペースト、ゲル又は気体であり得る。
【０００７】
一部の実施形態において、有機リン系殺虫剤は、フェニトロチオンであり得る。
【０００８】
一部の実施形態において、担体は、種子コーティングであり得る。
【０００９】
一部の実施形態において、ミツバチは、ミツバチコロニーにいることができる。
【００１０】
別の態様において、本明細書では、液体、固体、エアロゾル、ペースト、ゲル又は気体としての、昆虫が摂食可能な担体と共に製剤化されている、有機リン系殺虫剤を代謝する細菌の有効量を含む組成物が提供される。
【００１１】
第２の態様の一部の実施形態において、有機リン系殺虫剤を代謝する細菌は、フェニトロチオンを代謝する。
【００１２】
第２の態様の一部の実施形態において、担体は、種子コーティングである。
【００１３】
第２の態様の一部の実施形態において、有機リン系殺虫剤を代謝する細菌は、少なくとも１００，０００細胞／ｍｌ（例えば、少なくとも約１００，０００細胞／ｍｌ、少なくとも約１５０，０００細胞／ｍｌ、少なくとも約２００，０００細胞／ｍｌ、少なくとも約２５０，０００細胞／ｍｌ、少なくとも約３００，０００細胞／ｍｌ、少なくとも約３５０，０００細胞／ｍｌ、少なくとも約４００，０００細胞／ｍｌ、少なくとも約４５０，０００細胞／ｍｌ又は少なくとも約５００，０００細胞／ｍｌ）の濃度である。
【００１４】
更に別の態様において、本組成物は、昆虫宿主に常在する１つ以上の微生物のレベル、活動又は代謝を変化させる薬剤であって、この変化は、昆虫宿主の適応度の増加をもたらす、薬剤を含む。
【００１５】
別の例では、本組成物は、線虫宿主に常在する１つ以上の微生物のレベル、活動又は代謝を変化させる薬剤であって、この変化は、線虫宿主の適応度の増加をもたらす、薬剤を含む。
【００１６】
上記の任意の組成物の一部の実施形態において、１つ以上の微生物は、宿主に常在する細菌又は真菌であり得る。一部の実施形態において、宿主に常在する細菌は、カンディダトゥス属種（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  ｓｐｐ）、ブフネラ属種（Ｂｕｃｈｅｎｅｒａ  ｓｐｐ）、ブラッタバクテリウム属種（Ｂｌａｔｔａｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ）、バウマンニア属種（Ｂａｕｍａｎｉａ  ｓｐｐ）、ウィグルスウォーチア属種（Ｗｉｇｇｌｅｓｗｏｒｔｈｉａ  ｓｐｐ）、ボルバキア属種（Ｗｏｌｂａｃｈｉａ  ｓｐｐ）、リケッチア属種（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｓｐｐ）、オリエンティア属種（Ｏｒｉｅｎｔｉａ  ｓｐｐ）、ソーダリス属種（Ｓｏｄａｌｉｓ  ｓｐｐ）、バークホルデリア属種（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐｐ）、カプリアビダス属種（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｓｐｐ）、フランキア属種（Ｆｒａｎｋｉａ  ｓｐｐ）、シノリゾビウム属種（Ｓｎｉｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐｐ）、ストレプトコッカス属種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ）、ウォリネラ属種（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ  ｓｐｐ）、キシレラ属種（Ｘｙｌｅｌｌａ  ｓｐｐ）、エルウィニア属種（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｓｐｐ）、アグロバクテリウム属種（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ）、バチルス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ）、パエニバチルス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ）、ストレプトミセス属種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ）、ミクロコッカス属種（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ）、コリネバクテリウム属種（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ）、アセトバクター属種（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ）、シアノバクテリア属種（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｓｐｐ）、サルモネラ属種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ）、ロドコッカス属種（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ）、シュードモナス属種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ）、ラクトバチルス属種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ）、エンテロコッカス属種（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ）、アルカリゲネス属種（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐｐ）、クレブシエラ属種（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ）、パエニバチルス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ）、アルスロバクター属種（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ）、コリネバクテリウム属種（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ）、ブレビバクテリウム属種（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ）、サーマス属種（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｐｐ）、シュードモナス属種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ）、クロストリジウム属種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ）及び大腸菌属種（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｓｐｐ）からなる群から選択される少なくとも１つである。一部の実施形態において、宿主に常在する真菌は、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、メチニコウイア属（Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ）、デバロマイセス属（Ｄｅｂａｒｏｍｙｃｅｓ）、スターメレラ属（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードジマ属（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）、シンビオタフリナ・ブフネリ（Ｓｙｍｂｉｏｔａｐｈｒｉｎａ  ｂｕｃｎｅｒｉ）、シンビオタフリナ・コッホイ（��ｙｍｂｉｏｔａｐｈｒｉｎａ  ｋｏｃｈｉｉ）、シェフェルソマイセス・シェハテ（Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓｏｍｙｃｅｓ  ｓｈｅｈａｔａｅ）、シェフェルソマイセス・スティピティス（Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓｏｍｙｃｅｓ  ｓｔｉｐｉｔｅｓ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、アミロステレウム・アレオラツム（Ａｍｙｌｏｓｔｅｒｅｕｍ  ａｒｅｏｌａｔｕｍ）、エピクロエ属種（Ｅｐｉｃｈｌｏｅ  ｓｐｐ）、ピキア・ピヌス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｎｕｓ）、ハンゼヌラ・カプスラタ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｃａｐｓｕｌａｔｅ）、ダルディニア・デシピエンス（Ｄａｌｄｉｎｉａ  ｄｅｃｉｐｉｅｎ）、セラトシスチス属種（Ｃｅｒａｔｏｃｙｔｉｓ  ｓｐｐ）、オフィオストマ属種（Ｏｐｈｉｏｓｔｏｍａ  ｓｐｐ）及びアッタマイセス・ブロマティフィカス（Ａｔｔａｍｙｃｅｓ  ｂｒｏｍａｔｉｆｉｃｕｓ）からなる群から選択される少なくとも１つである。
【００１７】
上記の任意の組成物において、薬剤（以下では調節薬剤とも称され得る）は、宿主に常在する微生物の成長、分裂、生存能、代謝及び／又は寿命を変化させることができる。任意の上記実施形態において、調節薬剤は、宿主に常在する１つ以上の微生物の生存能を低下させることができる。一部の実施形態において、調節薬剤は、宿主に常在する１つ以上の微生物の成長又は生存能を増加させる。
【００１８】
任意の上記実施形態において、調節薬剤は、ファージ、ポリペプチド、小分子、抗生物質、細菌又はこれらの任意の組み合わせである。
【００１９】
一部の実施形態において、ファージは、宿主に常在する細菌上の細胞表面タンパク質に結合する。一部の実施形態において、ファージは、宿主に常在する細菌に対してビルレントである。一部の実施形態において、ファージは、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）、サイフォウイルス科（Ｓｉｐｈｏｖｉｒｉｄａｅ）、ポドウイルス科（Ｐｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、リポスリクスウイルス科（Ｌｉｐｏｔｈｒｉｘｖｉｒｉｄａｅ）、ルディウイルス科（Ｒｕｄｉｖｉｒｉｄａｅ）、アンピュラウイルス科（Ａｍｐｕｌｌａｖｉｒｉｄａｅ）、ビカウダウイルス科（Ｂｉｃａｕｄａｖｉｒｉｄａｅ）、クラバウイルス科（Ｃｌａｖａｖｉｒｉｄａｅ）、コルチコウイルス科（Ｃｏｒｔｉｃｏｖｉｒｉｄａｅ）、シストウイルス科（Ｃｙｓｔｏｖｉｒｉｄａｅ）、フセロウイルス科（Ｆｕｓｅｌｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、グロブロウイルス科（Ｇｌｕｂｏｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、グッタウイルス科（Ｇｕｔｔａｖｉｒｉｄａｅ）、イノウイルス科（Ｉｎｏｖｉｒｉｄａｅ）、レビウイルス科（Ｌｅｖｉｖｉｒｉｄａｅ）、ミクロウイルス科（Ｍｉｃｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、プラズマウイルス科（Ｐｌａｓｍａｖｉｒｉｄａｅ）及びテクティウイルス科（Ｔｅｃｔｉｖｉｒｉｄａｅ）からなる群から選択される少なくとも１つである。
【００２０】
一部の実施形態において、ポリペプチドは、バクテリオシン、Ｒ型バクテリオシン、根粒Ｃリッチペプチド、抗微生物ペプチド、溶解素又はバクテリオサイト調節性ペプチドの少なくとも１つである。
【００２１】
一部の実施形態において、小分子は、代謝産物である。
【００２２】
一部の実施形態において、抗生物質は、広域抗生物質である。
【００２３】
一部の実施形態において、調節薬剤は、天然に存在する細菌である。一部の実施形態において、細菌は、バルトネラ・アピス（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  ａｐｉｓ）、パラサッカリバクター・アピウム（Ｐａｒａｓａｃｃｈａｒｉｂａｃｔｅｒ  ａｐｉｕｍ）、フリシェラ・ペララ（Ｆｒｉｓｃｈｅｌｌａ  ｐｅｒｒａｒａ）、スノッドグラセラ・アルビ（Ｓｎｏｄｇｒａｓｓｅｌｌａ  ａｌｖｉ）、ギリアメラ・アピコラ（Ｇｉｌｌｉａｍｅｌａ  ａｐｉｃｏｌａ）、ビフィドバクテリウム属種（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ）及びラクトバチルス属種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ）からなる群から選択される少なくとも１つである。一部の実施形態において、細菌は、カンディダトゥス属種（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  ｓｐｐ）、ブフネラ属種（Ｂｕｃｈｅｎｅｒａ  ｓｐｐ）、ブラッタバクテリウム属種（Ｂｌａｔｔａｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ）、バウマンニア属種（Ｂａｕｍａｎｉａ  ｓｐｐ）、ウィグルスウォーチア属種（Ｗｉｇｇｌｅｓｗｏｒｔｈｉａ  ｓｐｐ）、ボルバキア属種（Ｗｏｌｂａｃｈｉａ  ｓｐｐ）、リケッチア属種（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｓｐｐ）、オリエンティア属種（Ｏｒｉｅｎｔｉａ  ｓｐｐ）、ソーダリス属種（Ｓｏｄａｌｉｓ  ｓｐｐ）、バークホルデリア属種（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐｐ）、カプリアビダス属種（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｓｐｐ）、フランキア属種（Ｆｒａｎｋｉａ  ｓｐｐ）、シノリゾビウム属種（Ｓｎｉｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐｐ）、ストレプトコッカス属種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ）、ウォリネラ属種（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ  ｓｐｐ）、キシレラ属種（Ｘｙｌｅｌｌａ  ｓｐｐ）、エルウィニア属種（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｓｐｐ）、アグロバクテリウム属種（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ）、バチルス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ）、パエニバチルス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ）、ストレプトミセス属種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ）、ミクロコッカス属種（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ）、コリネバクテリウム属種（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ）、アセトバクター属種（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ）、シアノバクテリア属種（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｓｐｐ）、サルモネラ属種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ）、ロドコッカス属種（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ）、シュードモナス属種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ）、ラクトバチルス属種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ）、エンテロコッカス属種（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ）、アルカリゲネス属種（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐｐ）、クレブシエラ属種（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ）、パエニバチルス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ）、アルスロバクター属種（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ）、コリネバクテリウム属種（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ）、ブレビバクテリウム属種（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ）、サーマス属種（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｐｐ）、シュードモナス属種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ）、クロストリジウム属種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ）及び大腸菌属種（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｓｐｐ）か��なる群から選択される少なくとも１つである。特定の例では、細菌は、有機リン系殺虫剤（例えば、ホスホロチオエート、例えばフェニトロチオン）などの農薬の分解能を有する天然に存在する細菌である。
【００２４】
上記の任意の組成物において、宿主適応度は、宿主の生存、生殖又は代謝によって測定され得る。一部の実施形態において、調節薬剤は、宿主の農薬感受性（例えば、表１２に挙げられる農薬に対する感受性）を低下させることにより宿主の適応度を調節する。一部の実施形態において、農薬感受性は、殺菌剤又は殺真菌剤感受性である。一部の実施形態において、農薬感受性は、殺虫剤又は殺線虫剤感受性である。
【００２５】
上記の任意の組成物において、本組成物は、複数の異なる調節薬剤を含み得る。一部の実施形態において、本組成物は、調節薬剤と農薬用薬剤（例えば、表１２に挙げられる農薬）とを含む。一部の実施形態において、農薬用薬剤は、殺菌性又は殺真菌性薬剤である。一部の実施形態において、農薬用薬剤は、殺虫性又は殺線虫性薬剤である。
【００２６】
上記の任意の組成物において、本組成物は、調節薬剤と、作物成長を増加させる薬剤とを含み得る。
【００２７】
上記の任意の組成物において、調節薬剤は、第２の部分に連結され得る。一部の実施形態において、第２の部分は、調節薬剤である。
【００２８】
上記の任意の組成物において、調節薬剤は、ターゲティングドメインに連結され得る。一部の実施形態において、ターゲティングドメインは、調節薬剤を宿主の標的部位に標的化させる。一部の実施形態において、ターゲティングドメインは、調節薬剤を宿主に常在する１つ以上の微生物に標的化させる。
【００２９】
上記の任意の組成物において、調節薬剤は、プレ配列又はプロ配列を不活性化し、それにより前駆調節薬剤を形成することを含み得る。一部の実施形態において、前駆調節薬剤は、宿主体内で活性型に変換される。
【００３０】
上記の任意の組成物において、調節薬剤は、リンカーを含み得る。一部の実施形態において、リンカーは、切断可能リンカーである。
【００３１】
上記の任意の組成物において、本組成物は、担体を更に含み得る。一部の例では、担体は、農業的に許容可能な担体であり得る。
【００３２】
上記の任意の組成物において、本組成物は、宿主用ベイト、粘着性薬剤又はこれらの組み合わせを更に含み得る。一部の実施形態において、宿主用ベイトは、摂食可能な薬剤及び／又は化学誘引剤である。
【００３３】
上記の任意の組成物において、本組成物は、宿主適応度を調節するのに有効な用量であり得る。
【００３４】
上記の任意の組成物において、本組成物は、宿主の腸に生息する微生物への送達のために製剤化され得る。
【００３５】
上記の任意の組成物において、本組成物は、宿主のバクテリオサイト及び／又は宿主の腸に生息する微生物への送達のために製剤化され得る。一部の実施形態において、本組成物は、植物への送達のために製剤化され得る。一部の実施形態において、本組成物は、宿主の餌場での使用向けに製剤化され得る。
【００３６】
上記の任意の組成物において、本組成物は、液体、粉末、顆粒又はナノ粒子として製剤化され得る。一部の実施形態において、本組成物は、リポソーム、ポリマー、細菌分泌ペプチド及び合成ナノカプセルからなる群から選択されるものとして製剤化される。一部の実施形態において、合成ナノカプセルは、宿主の標的部位に本組成物を送達する。一部の実施形態において、標的部位は、宿主の腸である。一部の実施形態において、標的部位は、宿主のバクテリオサイトである。
【００３７】
更なる態様において、本明細書では、上記の任意の組成物を含む宿主も提供される。一部の実施形態において、宿主は、昆虫である。一部の実施形態において、昆虫は、病害虫防除、受粉、商業生産物の産生又はこれらの組み合わせに役立つ。一部の実施形態において、昆虫は、テントウムシ科（Ｃｏｃｃｉｎｅｌｌｉｄａｅ）、オサムシ科（Ｃａｒａｂｉｄａｅ）、カマキリ科（Ｍａｎｔｉｄａｅ）、ハナアブ科（Ｓｙｒｐｈｉｄａｅ）、ホタル科（Ｌａｍｐｙｒｉｄａｅ）、ウスバカゲロウ科（Ｍｙｒｍｅｌｉｏｎｔｉｄａｓｅ）、クサカゲロウ科（Ｃｈｒｙｓｏｐｉｄａｅ）、ヒメカゲロウ科（Ｈｅｍｅｒｏｂｉｉｄａｅ）、コマユバチ科（Ｂｒａｃｈｏｎｉｄａｅ）、ヒメバチ科（Ｉｃｈｎｅｕｍｏｎｉｄａｅ）又はトンボ目（Ｏｄｏｎａｔａ）に属する種である。一部の実施形態において、昆虫は、ヒメハナバチ科（Ａｎｄｒｅｎｉｄａｅ）、ミツバチ科（Ａｐｉｄａｅ）、ムカシハナバチ科（Ｃｏｌｌｅｔｉｄａｅ）、コハナバチ科（Ｈａｌｉｃｉｔｄａｅ）又はハキリバチ科（Ｍｅｇａｈｌｉｄａｅ）に属する種である。一部の実施形態において、昆虫は、カイコガ科（Ｂｏｍｂｙｃｉｄａｅ）又はヤママユガ科（Ｓａｔｕｒｎｉｉｄａｅ）に属する種である。特定の実施形態において、昆虫は、ミツバチ又はカイコである。
【００３８】
一部の実施形態において、宿主は、線虫である。一部の実施形態において、線虫は、ヘテロラブディティス属（Ｈｅｔｅｒｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ）又はスタイナーネマ属（Ｓｔｅｉｎｅｒｎｅｍａ）に属する種である。
【００３９】
更に別の態様において、本明細書では、宿主の適応度に必要な微生物を標的とする調節薬剤を含む宿主の適応度の調節システムも提供され、ここで、このシステムは、宿主の適応度を調節するのに有効であり、宿主は、昆虫又は線虫である。調節薬剤は、本明細書に記載される組成物のいずれを含むこともできる。一部の実施形態において、調節薬剤は、粉末として製剤化される。一部の実施形態において、調節薬剤は、溶媒として製剤化される。一部の実施形態において、調節薬剤は、濃縮物として製剤化される。一部の実施形態において、調節薬剤は、希釈剤として製剤化される。一部の実施形態において、調節薬剤は、前出の任意の組成物を担体と組み合わせることにより送達のために調製される。
【００４０】
別の態様において、本明細書では、本明細書に記載される任意の組成物を使用した昆虫又は線虫の適応度の調節方法も提供される。１つの例では、昆虫又は線虫宿主の適応度を調節する方法は、前出の請求項のいずれか１つの組成物を宿主に送達することを含み、ここで、調節薬剤は、宿主に常在する１つ以上の微生物を標的とし、それにより宿主の適応度を調節する。別の例では、昆虫又は線虫宿主の微生物多様性を調節する方法は、前出の請求項のいずれか１つの組成物を宿主に送達することを含み、ここで、調節薬剤は、宿主に常在する１つ以上の微生物を標的とし、それにより宿主の微生物多様性を調節する。
【００４１】
上記の任意の方法の一部の実施形態において、調節薬剤は、宿主に常在する１つ以上の微生物のレベルを変化させることができる。上記の任意の方法の一部の実施形態において、調節薬剤は、宿主に常在する１つ以上の微生物の機能を変化させることができる。一部の実施形態において、１つ以上の微生物は、細菌及び／又は真菌であり得る。一部の実施形態において、１つ以上の微生物は、宿主適応に必要である。一部の実施形態において、１つ以上の微生物は、宿主生存に必要である。
【００４２】
上記の任意の方法の一部の実施形態において、送達するステップは、１つ以上の微生物に影響を及ぼし、それにより宿主の微生物多様性を調節するのに十分な用量及び時間で調節薬剤を提供することを含み得る。一部の実施形態において、送達するステップは、植物への前出の任意の組成物の局所施用を含む。一部の実施形態において、送達するステップは、遺伝子操作された植物を介して調節薬剤を提供することを含む。一部の実施形態において、送達するステップは、宿主に調節薬剤を摂食可能物として提供することを含む。一部の実施形態において、送達するステップは、調節薬剤を保有している宿主を提供することを含む。一部の実施形態において、調節薬剤を保有している宿主は、調節薬剤を１つ以上の別の宿主に伝播させることができる。
【００４３】
上記の任意の方法の一部の実施形態において、組成物は、宿主の健康及び／又は生存を増加させるのに有効である。一部の実施形態において、本組成物は、宿主適応度の増加、宿主寿命の増加、有効な受粉の増加、宿主生産物の産生の増加、宿主繁殖の増加又はこれらの組み合わせに有効である。一部の実施形態において、本組成物は、農薬用薬剤（例えば、表１２に挙げられる農薬）に対する宿主の感度を低下させるのに有効である。特定の実施形態において、農薬用薬剤は、ネオニコチノイド（例えば、イミダクロプリド）である。特定の実施形態において、農薬用薬剤は、有機リン系殺虫剤（例えば、ホスホロチオエート、例えばフェニトロチオン）である。一部の実施形態において、本組成物は、植物によって生産されるアレロケミカル薬剤に対する宿主の抵抗性を増加させるのに有効である。一部の実施形態において、本組成物の送達前に、アレロケミカル薬剤は、宿主にとって毒性である。一部の実施形態において、アレロケミカル薬剤は、カフェイン、大豆シスタチンＮ、モノテルペン類、ジテルペン酸類又はフェノール化合物である。
【００４４】
上記の任意の方法の一部の実施形態において、宿主は、昆虫である。一部の実施形態において、昆虫は、病害虫防除、受粉、商業生産物の産生、廃棄物分解又はこれらの組み合わせに役立つ。一部の実施形態において、昆虫は、テントウムシ科（Ｃｏｃｃｉｎｅｌｌｉｄａｅ）、オサムシ科（Ｃａｒａｂｉｄａｅ）、カマキリ科（Ｍａｎｔｉｄａｅ）、ハナアブ科（Ｓｙｒｐｈｉｄａｅ）、ホタル科（Ｌａｍｐｙｒｉｄａｅ）、ウスバカゲロウ科（Ｍｙｒｍｅｌｉｏｎｔｉｄａｓｅ）、クサカゲロウ科（Ｃｈｒｙｓｏｐｉｄａｅ）、ヒメカゲロウ科（Ｈｅｍｅｒｏｂｉｉｄａｅ）、コマユバチ科（Ｂｒａｃｈｏｎｉｄａｅ）、ヒメバチ科（Ｉｃｈｎｅｕｍｏｎｉｄａｅ）又はトンボ目（Ｏｄｏｎａｔａ）に属する種である。一部の実施形態において、昆虫は、ヒメハナバチ科（Ａｎｄｒｅｎｉｄａｅ）、ミツバチ科（Ａｐｉｄａｅ）、ムカシハナバチ科（Ｃｏｌｌｅｔｉｄａｅ）、コハナバチ科（Ｈａｌｉｃｉｔｄａｅ）又はハキリバチ科（Ｍｅｇａｈｌｉｄａｅ）に属する種である。一部の実施形態において、昆虫は、カイコガ科（Ｂｏｍｂｙｃｉｄａｅ）又はヤママユガ科（Ｓａｔｕｒｎｉｉｄａｅ）に属する種である。特定の実施形態において、昆虫は、ミツバチ又はカイコである。
【００４５】
一部の実施形態において、宿主は、線虫である。一部の実施形態において、線虫は、ヘテロラブディティス属（Ｈｅｔｅｒｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ）又はスタイナーネマ属（Ｓｔｅｉｎｅｒｎｅｍａ）に属する種である。
【００４６】
上記の任意の方法の一部の実施形態において、送達するステップは、前出の任意の組成物を植物に送達することを含む。一部の実施形態において、植物は、農業作物である。一部の実施形態において、作物は、送達時点で収穫されていない作物である。一部の実施形態において、作物は、送達時点で収穫されている作物である。一部の実施形態、作物は、収穫後の果実又は野菜を含む。一部の実施形態において、本組成物は、作物の成長を増加させるのに有効な量で且つ有効な時間にわたって送達される。一部の実施形態において、作物には、トウモロコシ、ダイズ又はコムギ植物が含まれる。
【００４７】
別の態様において、本明細書では、宿主の適応度を調節する調節薬剤を同定するスクリーニングアッセイも提供される。１つの例では、宿主の適応度を調節する調節薬剤を同定するスクリーニングアッセイは、（ａ）宿主に常在することができる微生物を１つ以上の候補調節薬剤に曝露するステップ、及び（ｂ）宿主の適応度を増加させる調節薬剤を同定するステップを含む。
【００４８】
本スクリーニングアッセイの一部の実施形態において、調節薬剤は、宿主に常在する微生物である。一部の実施形態において、微生物は、細菌である。一部の実施形態において、細菌は、宿主に常在するとき、宿主適応度を増加させる。一部の実施形態において、細菌は、農薬（例えば、表１２に挙げられる農薬）を分解する。特定の実施形態において、農薬は、ネオニコチノイド（例えば、イミダクロプリド）又は有機リン系殺虫剤（例えば、ホスホロチオエート、例えばフェニトロチオン）である。一部の実施形態において、細菌は、アミノ酸を分泌する。特定の実施形態において、ここで、アミノ酸は、メチオニンである。
【００４９】
本スクリーニングアッセイの一部の実施形態において、調節薬剤は、アレロケミカル分解微生物に影響を及ぼす。一部の実施形態において、調節薬剤は、ファージ、抗生物質又は試験化合物である。特定の実施形態において、抗生物質は、チメンチン又はアジスロマイシンである。
【００５０】
本スクリーニングアッセイの一部の実施形態において、宿主は、無脊椎動物であり得る。一部の実施形態において、無脊椎動物は、昆虫又は線虫である。特定の実施形態において、昆虫は、ミツバチである。他の詳細な実施形態において、昆虫は、カイコである。
【００５１】
本スクリーニングアッセイの任意の上記実施形態において、宿主適応度は、宿主の微生物叢を変化させることにより調節され得る。
【００５２】
定義
本明細書で使用されるとき、用語「バクテリオシン」は、抗微生物特性を備えたペプチド又はポリペプチドを指す。天然に存在するバクテリオシンは、ある種の原核生物によって生産されるものであり、その生産株に関連する生物に対抗して作用するが、生産株自体に対抗しない。本明細書で企図されるバクテリオシンとしては、限定はされないが、天然に存在するバクテリオシン、例えば細菌によって生産されるバクテリオシン又はその誘導体、例えば改変バクテリオシン、組換え発現バクテリオシン又は化学合成バクテリオシンが挙げられる。一部の例では、バクテリオシンは、本明細書に記載されるバクテリオシンの機能的に活性な変異体である。一部の例では、バクテリオシンの変異体は、例えば、特定の領域にわたり又は配列全体にわたり、本明細書に記載されるバクテリオシン又は天然に存在するバクテリオシンの配列と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する。
【００５３】
本明細書で使用されるとき、用語「バクテリオサイト」は、共生細菌特性を備えた細胞内細菌が常在するある種の昆虫に見られる特殊化した細胞を指す。
【００５４】
本明細書で使用されるとき、用語「有効量」は、記載される結果を生じさせるのに十分である、例えば宿主生物（例えば、昆虫）の適応度を増加させるか又は促進するのに十分である、標的宿主の内部で目標レベル（例えば、所定又は閾値レベル）の調節薬剤濃度に達するのに十分である、標的宿主の腸の内部で目標レベル（例えば、所定又は閾値レベル）の調節薬剤濃度に達するのに十分である、標的宿主のバクテリオサイトの内部で目標レベル（例えば、所定又は閾値レベル）の調節薬剤濃度に達するのに十分である、標的宿主の１つ以上の微生物（例えば、内部共生体）のレベル又は活動を調節するのに十分である調節薬剤（例えば、ファージ、溶解素、バクテリオシン、小分子又は抗生物質）又は前記薬剤を含む組成物の量を指す。
【００５５】
本明細書で使用されるとき、用語「適応度」は、宿主生物が生存し、成長する能力及び／又は生存能力のある子孫を生産する能力を指す。生物の適応度は、限定はされないが、寿命、繁殖率、移動性、体重及び／又は代謝率を含めた１つ以上のパラメータによって測定され得る。適応度は、加えて、活動（例えば、受粉）又は生産物の産出力（例えば、蜂蜜又は絹）の尺度に基づいて測定され得る。
【００５６】
本明細書で使用されるとき、用語「腸」は、宿主の前腸、中腸又は後腸を含め、宿主の腸の任意の一部分を指す。
【００５７】
本明細書で使用されるとき、用語「宿主」は、常在性微生物（例えば、内因性微生物、内部共生微生物（例えば、一次又は二次内部共生体）、片利共生生物及び／又は病原微生物）を保有している生物（例えば、昆虫）を指す。
【００５８】
本明細書で使用されるとき、「宿主適応度を増加させる」又は「宿主適応度を促進する」は、限定はされないが、以下の所望の効果：（１）宿主の個体群の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、１００％又はそれを超える増加；（２）宿主（例えば、昆虫、例えばハチ又はカイコ）の繁殖率の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、１００％又はそれを超える増加；（３）宿主（例えば、昆虫、例えばハチ又はカイコ）の移動性の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、１００％又はそれを超える増加；（４）宿主（例えば、昆虫、例えばハチ又はカイコ）の体重の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、１００％又はそれを超える増加；（５）宿主（例えば、昆虫、例えばハチ又はカイコ）の代謝率又は活動の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、１００％又はそれを超える増加；（６）宿主（例えば、昆虫、例えばハチ又はカイコ）による受粉（例えば、所与の時間量で受粉する植物の数）の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、１００％又はそれを超える増加；（７）宿主（例えば、昆虫、例えばハチ又はカイコ）副産物（例えば、ミツバチからの蜂蜜又はカイコからの絹）の生産の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、１００％又はそれを超える増加；（８）宿主（例えば、昆虫）の栄養分（例えば、タンパク質、脂肪酸又はアミノ酸）の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、１００％又はそれを超える増加；又は（９）農薬（例えば、ネオニコチノイド（例えば、イミダクロプリド）又は有機リン系殺虫剤（例えば、ホスホロチオエート、例えばフェニトロチオン））に対する宿主抵抗性の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、１００％又はそれを超える増加のいずれか１つ以上を含め、調節薬剤の投与がもたらす結果としての宿主生理又は前記宿主によって行われる任意の活動の任意の好ましい変化を指す。宿主適応度の増加は、調節薬剤が投与されていない宿主生物と比較して決定することができる。
【００５９】
用語「昆虫」には、任意の発育段階にある、即ち幼虫又は成虫の、節足動物門（Ａｒｔｈｒｏｐｏｄａ）及び昆虫綱（Ｉｎｓｅｃｔａ）又は蛛形綱（Ａｒａｃｈｎｉｄａ）に属する任意の生物が含まれる。
【００６０】
本明細書で使用されるとき、エンドリシン、自己溶解素、ムレイン加水分解酵素、ペプチドグリカン加水分解酵素又は細胞壁加水分解酵素としても知られる「溶解素」は、細菌の細胞壁のペプチドグリカンを切断することにより細菌を溶解させることができる加水分解酵素を指す。本明細書で企図される溶解素としては、限定はされないが、天然に存在する溶解素、例えばファージによって生産される溶解素、細菌によって生産される溶解素又はその誘導体、例えば改変溶解素、組換え発現溶解素又は化学合成溶解素が挙げられる。バクテリオシンの機能的に活性な変異体は、例えば、特定の領域にわたり又は配列全体にわたり、本明細書に記載されるいずれかを含め、合成、組換え又は天然由来のバクテリオシンの配列と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有し得る。
【００６１】
本明細書で使用されるとき、用語「微生物」は、細菌又は真菌を指す。微生物は、調節薬剤としての役割を果たし得るものを含め、宿主生物に常在する微生物（例えば、内因性微生物、内部共生微生物（例えば、一次又は二次内部共生体））又は宿主にとって外因性の微生物を指し得る。本明細書で使用されるとき、用語「標的微生物」は、宿主に常在し、且つ直接又は間接的のいずれかで調節薬剤の影響を受ける微生物を指す。
【００６２】
本明細書で使用されるとき、用語「薬剤」又は「調節薬剤」は、宿主生物（例えば、昆虫）に常在する微生物のレベル及び／又は機能を変化させ、それにより宿主生物（例えば、昆虫）の適応度を調節する（例えば、増加させる）能力を有する薬剤を指す。
【００６３】
本明細書で使用されるとき、用語「農薬」又は「農薬用薬剤」は、農業、環境又は家庭／住居の病害虫、例えば昆虫、真菌、細菌又はウイルスの防除に使用することができる物質を指す。用語「農薬」は、天然に存在する又は合成の殺虫剤（幼虫駆除剤又は成虫駆除剤）、昆虫成長調節物質、殺ダニ剤（ダニ駆除剤）、殺線虫剤、外部寄生生物撲滅薬、殺菌剤、殺真菌剤又は除草剤（農業において植物成長を制御又は変更するために使用することができる物質）を包含するものと理解される。農薬又は農薬用薬剤の更なる例は、表１２に挙げられる。一部の例では、農薬は、アレロケミカルである。本明細書で使用されるとき、「アレロケミカル」又は「アレロケミカル薬剤」は、別の生物（例えば、宿主昆虫又は線虫）の生理学的機能（例えば、発芽、成長、生存又は繁殖）に影響を及ぼすことができる生物によって生産される物質である。
【００６４】
本明細書で使用されるとき、用語「ペプチド」、「タンパク質」又は「ポリペプチド」は、長さ（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、４０、５０、１００アミノ酸又はそれを超える）、翻訳後修飾（例えば、グリコシル化又はリン酸化）の有無又は例えばペプチドに共有結合的に連結した１つ以上の非アミノアシル基（例えば、糖、脂質等）の存在に関わらず、天然に存在する又は天然に存在しないアミノ酸鎖（Ｄ−アミノ酸又はＬ−アミノ酸のいずれも）を包含し、例えば天然タンパク質、合成若しくは組換えのポリペプチド及びペプチド、ハイブリッド分子、ペプトイド又はペプチドミメティクスが含まれる。
【００６５】
本明細書で使用されるとき、２つの配列間の「パーセント同一性」は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０）に記載されるＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムによって決定される。ＢＬＡＳＴ解析の実行用ソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を通じて公的に利用可能である。
【００６６】
本明細書で使用されるとき、用語「ファージ」又は「バクテリオファージ」は、細菌に感染して複製するウイルスを指す。バクテリオファージは、細菌内でそのゲノムを細胞質に注入した後に複製し、これは、細菌細胞溶解をもたらす溶菌サイクル又は細菌細胞をインタクトなまま残す溶原（非溶菌）サイクルのいずれかを用いて行われる。ファージは、天然に存在するファージ分離株であるか、又は部分的なファージゲノム（例えば、宿主細菌の内部でファージのライフサイクルを行うのに必要な全ての必須遺伝子を少なくとも含む）若しくは完全なファージゲノムのいずれかをコードするベクター若しくは核酸を含めた改変ファージであり得る。
【００６７】
本明細書で使用されるとき、用語「植物」は、全植物、植物器官、植物組織、種子、植物細胞、種子及びその子孫を指す。植物細胞には、限定なしに、種子、浮遊培養物、胚、分裂組織領域、カルス組織、葉、根、シュート、配偶体、胞子体、花粉又は小胞子の細胞が含まれる。植物部位には、限定はされないが、以下：根、茎、シュート、葉、花粉、種子、腫瘍組織並びに様々な形態の細胞及び培養物（例えば、単一細胞、プロトプラスト、胚又はカルス組織）を含めた、分化した又は未分化の組織が含まれる。植物組織は、植物のものであるか、又は植物器官、組織若しくは細胞培養物のものであり得る。加えて、植物は、例えば、本明細書に記載される方法又は組成物における任意の調節薬剤の異種タンパク質又はＲＮＡを産生するように遺伝子操作され得る。
【００６８】
用語「〜によって入手可能」、「〜によって作製可能」などは、特許請求の範囲又は実施形態が化合物、組成物、製品等自体を指すこと、即ち化合物、組成物、製品等が、その化合物、組成物、製品等の製造について記載されている方法によって入手又は作製できるが、但し、化合物、組成物、製品等が同様に記載されているもの以外の他の方法によって入手又は作製され得ることを指示して使用される。用語「〜によって入手可能」、「〜によって作製可能」などは、化合物、組成物、製品が、記載される具体的な方法によって入手又は作製されることを指示する。用語「〜によって入手可能」、「〜によって作製可能」などは、「〜によって入手可能」、「〜によって作製可能」などの好ましい実施形態として用語「〜によって入手される」、「〜によって作製される」なども開示することが理解されるべきである。
【００６９】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
【００７０】
図は、本発明の１つ以上の特徴、態様又は実施形態の例示を目的とするものであり、限定することを意図されない。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】ドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）が胚から成虫期に達するまでの時間を示すグラフである。ドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）の胚は、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）（グルタミン酸を生産する株  −  Ｃ．グルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｇｌｕ）を播種した食餌又はいかなる細菌も含まない純粋培養のための食餌のいずれかで飼育した。その蛹から羽化した成虫の割合を、最初の成虫が羽化した時点から１２時間毎に測定した。細菌を補充した食餌で飼育した生物は、その細菌不含の対応生物と比べて成虫期に達するのが早い。
【図２Ａ】ドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）において雄性が発育速度の違いに及ぼす効果を示すグラフである。図１からの羽化した成虫を雌雄鑑別し、羽化率をプロットした。
【図２Ｂ】ドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）において雌性が発育速度の違いに及ぼす効果を示すグラフである。図１からの羽化した成虫を雌雄鑑別し、羽化率をプロットした。食餌中に細菌が存在することに起因する雌における発育速度の亢進は、その対応する雄よりも有意に大きい。ハエの食餌中に細菌が存在することの利益は、雄と比較して雌で高い。
【図３】Ｃ．グルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）株が幼虫の生物量を増進したことを示すグラフである。グルタミン酸又はメチオニンのいずれかを生産するＣ．グルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）株を補充した食餌で飼育した幼虫は、無菌食餌又は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）を補充した食餌で飼育した幼虫よりも大きい。幼虫の表面積は、幼虫の画像のピクセル数として測定する。中央値及び９５％信頼区間をグラフ上に線として示す。
【図４】細菌の呼吸に関するＳｅａｈｏｒｓｅフラックスアッセイの結果を示すグラフのパネルである。方法に記載されるとおり、細菌を対数期まで成長させ、Ｓｅａｈｏｒｓｅ  ＸＦｅ９６プレートにロードして酸素消費速度（ＯＣＲ）及び細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）を経時的に測定した。約２０分後にウェルに処理剤を注入し、細菌をモニタして成長の変化を検出した。リファンピシン＝１００μｇ／ｍＬ；クロラムフェニコール＝２５μｇ／ｍＬ；ファージ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）についてＴ７及びセラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）についてΦＳｍＶＬ−Ｃ１）は、ＳＭ緩衝液中１：２希釈又は１：１００希釈のいずれかのライセートであった。各線上のマーカーは、単に各線の対応する条件を表示するものとして提供され、データ点を表しているわけではない。
【図５】Ｓ．マルセセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）に対するファージがハエの死亡率を低下させたことを示すグラフである。Ｓ．マルセセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）を穿刺したハエは、全て１日以内に死亡した一方、Ｓ．マルセセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）及びファージの両方を穿刺したハエは、かなりの割合が処置後５日間生存した。いかなる処置も行わなかった対照ハエのほぼ全てが実験終了まで生存した。統計的有意性について、ログ・ランク検定を用いて曲線を比較した。アスタリスクは、ｐ＜０．０００１を表す。
【発明を実施するための形態】
【００７２】
本明細書では、農業利用のための、例えば宿主線虫又は節足動物（例えば、ミツバチ又はカイコ）に常在する１つ以上の微生物のレベル、活動又は代謝を変化させるための方法及び組成物であって、この変化は、宿主の適応度の増加をもたらす、方法及び組成物が提供される。本発明は、宿主にとって有益となるように宿主の微生物叢を変化させることができる調節薬剤（例えば、ファージ、ペプチド、小分子、抗生物質又はこれらの組み合わせ）を含む組成物を特徴とする。好ましい微生物レベル、微生物活動、微生物代謝及び／又は微生物多様性を促進することにより、本明細書に記載される調節薬剤は、ハチ及びカイコなど、農業及び商業で利用される種々の有益線虫又は節足動物の適応度を増加させるために使用され得る。
【００７３】
本明細書に記載される方法及び組成物は、一部には、ミツバチ又はショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）などの昆虫宿主において種々の薬剤、例えばイミダクロプリド分解微生物、フェニトロチオン分解微生物及び種々のファージをどのように使用すればこれらの宿主体内の微生物のレベル、活動又は代謝を変化させ、それによりこれらの宿主の健康を間接的に改善し得るかを説明する例に基づく。イミダクロプリド分解微生物は、ネオニコチノイド分解微生物の代表例であり、より一般的には殺虫剤又は農薬分解微生物の代表である。同様に、フェニトロチオン分解微生物は、有機リン系殺虫剤分解微生物の代表例であり、より一般的には殺虫剤又は農薬分解微生物の代表である。これに基づき、本開示は、宿主に常在する１つ以上の微生物のレベル、活動又は代謝を変化させる薬剤を使用する種々の異なる手法であって、この変化は、宿主の適応度の調節をもたらす、種々の異なる手法について記載する。
【００７４】
Ｉ．宿主
ｉ．宿主
本明細書に記載される任意の組成物又は方法の宿主は、線形動物門（Ｎｅｍａｔｏｄａ）（例えば、線虫、例えば有益線虫）又は本明細書に記載される任意の節足動物を含め、節足動物門（Ａｒｔｈｒｏｐｏｄａ）（例えば、昆虫、例えば有益昆虫）に属する任意の生物であり得る。一部の例では、宿主は、有益昆虫又は線虫（例えば、花粉媒介者、病害虫の天然競合者又はヒトにとって有用な物質の生産者）である。用語「有益昆虫」又は「有益線虫」は、本明細書で使用されるとき、ヒト、動物、生態系及び／又は環境に（例えば、経済的及び／又は生態学的）利益を与える昆虫又は線虫を指す。例えば、宿主は、限定はされないが、食品（例えば、ミツバチ、例えばアピス・メリフェラ（Ａｐｉｓ  ｍｅｌｌｉｆｅｒａ）からの蜂蜜）、材料（ボンビックス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）からの絹など）及び／又は物質（例えば、ラッキフェル・ラッカ（Ｌａｃｃｉｆｅｒ  ｌａｃｃａ）からのラック又はコチニールカイガラムシ（Ｄａｃｔｙｌｏｐｉｕｓ  ｃｏｃｃｕｓ）及びタマバチ科（Ｃｙｎｉｐｉｄａｅ）からの色素）の生産のために育てられる昆虫を含め、商業生産物の生産に関わる昆虫であり得る。加えて、宿主には、作物の受粉、種子の拡散又は病害虫防除に役立つ昆虫を含め、農業適用に使用される昆虫又は線虫が含まれ得る。更に、一部の例では、宿主は、廃棄物処理及び／又は有機リサイクルに有用な昆虫（例えば、ミミズ、シロアリ又は双翅目（Ｄｉｐｔｅｒａ）の幼虫）であり得る。
【００７５】
一部の例では、宿主は、有用な産物（例えば、蜂蜜、絹、蜜ろう又はシェラック）を生産する。一部の例では、宿主は、ハチである。例示的ハチの属としては、限定はされないが、ミツバチ属（Ａｐｉｓ）、マルハナバチ属（Ｂｏｍｂｕｓ）、ハリナシバチ属（Ｔｒｉｇｏｎａ）及びツツハナバチ属（Ｏｓｍｉａ）が挙げられる。一部の例では、ハチは、ミツバチ（例えば、ミツバチ属（Ａｐｉｓ）に属する昆虫）である。一部の例では、ミツバチは、アピス・メリフェラ（Ａｐｉｓ  ｍｅｌｌｉｆｅｒａ）（ヨーロッパ又はセイヨウミツバチ）、アピス・ケラナ（Ａｐｉｓ  ｃｅｒａｎａ）（アジア、トウヨウ又はヒマラヤミツバチ）、アピス・ドルサタ（Ａｐｉｓ  ｄｏｒｓａｔａ）（「ｇｉａｎｔ」オオミツバチ）、アピス・フロレア（Ａｐｉｓ  ｆｌｏｒｅａ）（「ｒｅｄ  ｄｗａｒｆ」ヒメミツバチ）、アピス・アンドレニフォルミス（Ａｐｉｓ  ａｎｄｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（「ｂｌａｃｋ  ｄｗａｒｆ」クロコミツバチ）又はアピス・ニグロシンクタ（Ａｐｉｓ  ｎｉｇｒｏｃｉｎｃｔａ）の種である。一部の例では、宿主は、カイコである。カイコは、カイコガ科（Ｂｏｍｂｙｃｉｄａｅ）又はヤママユガ科（Ｓａｔｕｒｎｉｉｄａｅ）の種であり得る。一部の例では、カイコは、ボンビックス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）である。一部の例では、宿主は、ラック虫である。ラック虫は、ラックカイガラムシ科（Ｋｅｒｒｉｉｄａｅ）の種であり得る。一部の例では、ラック虫は、ケリア・ラッカ（Ｋｅｒｒｉａ  ｌａｃｃａ）である。
【００７６】
一部の例では、宿主は、植物の受粉に役立つ（例えば、ハチ、カブトムシ、スズメバチ、ハエ、チョウ又はガ）。一部の例において、植物の受粉に役立つ宿主は、カブトムシである。一部の例では、カブトムシは、タマムシ科（Ｂｕｐｒｅｓｔｉｄａｅ）、ジョウカイボン科（Ｃａｎｔｈａｒｉｄａｅ）、カミキリムシ科（Ｃｅｒａｍｂｙｃｉｄａｅ）、ハムシ科（Ｃｈｒｙｓｏｍｅｌｉｄａｅ）、カッコウムシ科（Ｃｌｅｒｉｄａｅ）、テントウムシ科（Ｃｏｃｃｉｎｅｌｌｉｄａｅ）、コメツキムシ科（Ｅｌａｔｅｒｉｄａｅ）、ナガクチキムシ科（Ｍｅｌａｎｄｒｙｉｄａｅ）、ツチハンミョウ科（Ｍｅｌｏｉｄａｅ）、ジョウカイモドキ科（Ｍｅｌｙｒｉｄａｅ）、ハナノミ科（Ｍｏｒｄｅｌｌｉｄａｅ）、ケシキスイムシ科（Ｎｉｔｉｄｕｌｉｄａｅ）、カミキリモドキ科（Ｏｅｄｅｍｅｒｉｄａｅ）、コガネムシ科（Ｓｃａｒａｂａｅｉｄａｅ）又はハネカクシ科（Ｓｔａｐｈｙｌｌｉｎｉｄａｅ）の種である。一部の例では、植物の受粉に役立つ宿主は、チョウ又はガ（例えば、鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ））である。一部の例では、チョウ又はガは、シャクガ科（Ｇｅｏｍｅｔｒｉｄａｅ）、セセリチョウ科（Ｈｅｓｐｅｒｉｉｄａｅ）、シジミチョウ科（Ｌｙｃａｅｎｉｄａｅ）、ヤガ科（Ｎｏｃｔｕｉｄａｅ）、タテハチョウ科（Ｎｙｍｐｈａｌｉｄａｅ）、アゲハチョウ科（Ｐａｐｉｌｉｏｎｉｄａｅ）、シロチョウ科（Ｐｉｅｒｉｄａｅ）又はスズメガ科（Ｓｐｈｉｎｇｉｄａｅ）の種である。一部の例では、植物の受粉に役立つ宿主は、ハエ（例えば、双翅目（Ｄｉｐｔｅｒａ））である。一部の例では、ハエは、ハナバエ科（Ａｎｔｈｏｍｙｉｉｄａｅ）、ケバエ科（Ｂｉｂｉｏｎｉｄａｅ）、ツリアブ科（Ｂｏｍｂｙｌｉｉｄａｅ）、クロバエ科（Ｃａｌｌｉｐｈｏｒｉｄａｅ）、タマバエ科（Ｃｅｃｉｄｏｍｉｉｄａｅ）、ヌカカ科（Ｃｅｒｔｏｐｏｇｏｎｉｄａｅ）、ユスリカ科（Ｃｈｒｉｏｎｏｍｉｄａｅ）、メバエ科（Ｃｏｎｏｐｉｄａｅ）、カ科（Ｃｕｌｉｃｉｄａｅ）、アシナガバエ科（Ｄｏｌｉｃｈｏｐｏｄｉｄａｅ）、オドリバエ科（Ｅｍｐｉｄｉｄａｅ）、ミギワバエ科（Ｅｐｈｙｄｒｉｄａｅ）、ヤリバエ科（Ｌｏｎｃｈｏｐｔｅｒｉｄａｅ）、イエバエ科（Ｍｕｓｃｉｄａｅ）、キノコバエ科（Ｍｙｃｅｔｏｐｈｉｌｉｄａｅ）、ノミバエ科（Ｐｈｏｒｉｄａｅ）、ブユ科（Ｓｉｍｕｌｉｉｄａｅ）、ミズアブ科（Ｓｔｒａｔｉｏｍｙｉｄａｅ）又はハナアブ科（Ｓｙｒｐｈｉｄａｅ）である。一部の例では、受粉に役立つ宿主は、アリ（例えば、アリ科（Ｆｏｒｍｉｃｉｄａｅ））、ハバチ（例えば、ハバチ科（Ｔｅｎｔｈｒｅｄｉｎｉｄａｅ））又はスズメバチ（例えば、アナバチ科（Ｓｐｈｅｃｉｄａｅ）又はスズメバチ科（Ｖｅｓｐｉｄａｅ））である。一部の例では、植物の受粉に役立つ宿主は、ハチである。一部の例では、ハチは、ヒメハナバチ科（Ａｎｄｒｅｎｉｄａｅ）、ミツバチ科（Ａｐｉｄａｅ）、ムカシハナバチ科（Ｃｏｌｌｅｔｉｄａｅ）、コハナバチ科（Ｈａｌｉｃｔｉｄａｅ）又はハキリバチ科（Ｍｅｇａｃｈｉｌｉｄａｅ）である。
【００７７】
一部の例では、宿主は、病害虫防除に役立つ。一部の例では、病害虫防除に役立つ宿主は、捕食性線虫である。詳細な例では、線虫は、ヘテロラブディティス属（Ｈｅｔｅｒｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ）又はスタイナーネマ属（Ｓｔｅｉｎｅｒｎｅｍａ）の種である。一部の例では、病害虫防除に役立つ宿主は、昆虫である。例えば、病害虫防除に役立つ宿主は、コマユバチ科（Ｂｒａｃｏｎｉｄａｅ）（例えば、捕食寄生性スズメバチ）、オサムシ科（Ｃａｒａｂｉｄａｅ）（例えば、オサムシ）、クサカゲロウ科（Ｃｈｒｙｓｏｐｉｄａｅ）（例えば、ミドリクサカゲロウ）、テントウムシ科（Ｃｏｃｃｉｎｅｌｌｉｄａｅ）（例えば、テントウムシ）、ヒメカゲロウ科（Ｈｅｍｅｒｏｂｉｉｄａｅ）（例えば、ヒメカゲロウ）、ヒメバチ科（Ｉｃｈｎｅｕｍｏｎｉｄａｅ）（例えば、ヒメバチ）、ホタル科（Ｌａｍｐｙｒｉｄａｅ）（例えば、ホタル）、カマキリ科（Ｍａｎｔｉｄａｅ）（例えば、カマキリ）、ウスバカゲロウ科（Ｍｙｒｍｅｌｅｏｎｔｉｄａｅ）（例えば、ウスバカゲロウ）、トンボ目（Ｏｄｏｎａｔａ）（例えば、トンボ及びイトトンボ）又はハナアブ科（Ｓｙｒｐｈｉｄａｅ）（例えば、ハナアブ）に属する種であり得る。他の例では、病害虫防除に役立つ宿主は、病害虫（例えば、農業病害虫）と考えられる昆虫と競合する昆虫である。例えば、チチュウカイミバエのケラティティス・カピタタ（Ｃｅｒａｔｉｔｉｓ  ｃａｐｉｔａｔａ）は、世界中でよく見られる果実及び野菜の病害虫である。Ｃ．カピタタ（Ｃ．ｃａｐｔｉｔａｔａ）の１つの防除方法は、不妊化した雄の昆虫を環境中に放すことにより、野生の雄と競合して雌と交尾させることである。このような例では、宿主は、典型的に病害虫と考えられる種に属する不妊化した雄であり得る。
【００７８】
一部の例では、宿主は、廃棄物又は有機材料の分解に役立つ。一部の例において、廃棄物又は有機材料の分解に役立つ宿主は、甲虫目（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）又は双翅目（Ｄｉｐｔｅｒａ）に属する。一部の例では、双翅目（Ｄｉｐｔｅｒａ）に属する宿主は、クロバエ科（Ｃａｌｌｉｐｈｏｒｉｄａｅ）、セダカショウジョウバエ科（Ｃｕｒｔｏｎｏｔｉｄａｅ）、ショウジョウバエ科（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌｉｄａｅ）、ヒメイエバエ科（Ｆａｎｎｉｉｄａｅ）、トゲハネバエ科（Ｈｅｌｅｏｍｙｚｉｄａｅ）、クロコバエ科（Ｍｉｌｉｃｈｉｉｄａｅ）、イエバエ科（Ｍｕｓｃｉｄａｅ）、ノミバエ科（Ｐｈｏｒｉｄａｅ）、チョウバエ科（Ｐｓｙｃｈｏｄｉｄａｅ）、ニセケバエ科（Ｓｃａｔｏｐｓｉｄａｅ）、ツヤホソバエ科（Ｓｅｐｓｉｄａｅ）、ハヤトビバエ科（Ｓｐｈａｅｒｏｃｅｒｉｄａｅ）、ミズアブ科（Ｓｔｒａｔｉｏｍｙｉｄａｅ）、ハナアブ科（Ｓｙｒｐｈｉｄａｅ）、ミバエ科（Ｔｅｐｈｒｉｔｉｄａｅ）又はハネフリバエ科（Ｕｌｉｄｉｉｄａｅ）である。一部の例では、甲虫目（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）に属する宿主は、オサムシ科（Ｃａｒａｂｉｄａｅ）、ガムシ科（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｄａｅ）、ヒメハナムシ科（Ｐｈａｌａｃａｒｉｄａｅ）、ムクゲキノコムシ科（Ｐｔｉｌｉｉｄａｅ）又はハネカクシ科（Ｓｔａｐｈｙｌｉｎｉｄａｅ）である。
【００７９】
詳細な例では、本明細書に開示される調節薬剤は、ミツバチ又はカイコ宿主の適応度を増加させるために使用し得る。
【００８０】
ｉｉ．宿主適応度
本明細書に提供される方法及び組成物を使用して、本明細書に記載される任意の宿主の適応度を増加させることができる。適応度の増加は、宿主に常在する微生物における任意の変化から生じることができ、ここで、変化は、調節薬剤の投与がもたらす結果であり、宿主に有益又は有利な効果を及ぼし得る。
【００８１】
一部の例では、宿主適応度の増加は、調節薬剤の投与がもたらす結果としての宿主の生理の向上（例えば、向上した健康又は生存）として現れ得る。一部の例では、生物の適応度は、限定はされないが、繁殖率、寿命、移動性、生殖能力、体重、代謝率又は活動又は生存を含めた１つ以上のパラメータにより、調節薬剤を投与されていない宿主生物との比較で測定し得る。例えば、本明細書に提供される方法又は組成物は、調節薬剤を投与されていない宿主生物と比較して宿主の全般的な健康を向上させるか又は宿主の全生存を向上させるのに有効であり得る。一部の例では、宿主の生存の向上は、参照レベル（例えば、調節薬剤の投与を受けない宿主で見られるレベル）と比べて約２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超大きい。一部の例では、本方法及び組成物は、調節薬剤を投与されていない宿主生物と比較して宿主の繁殖（例えば、繁殖率）を増加させるのに有効である。一部の例では、本方法及び組成物は、移動性、体重、寿命、生殖能力又は代謝率などの他の生理学的パラメータを参照レベル（例えば、調節薬剤の投与を受けない宿主で見られるレベル）と比べて約２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超増加させるのに有効である。
【００８２】
一部の例では、宿主適応度の増加は、調節薬剤を投与されていない宿主生物と比較した、前記宿主によって産生される生産物の生産量の増加として現れ得る。一部の例では、本明細書に提供される方法又は組成物は、本明細書に記載されるとおりの、宿主によって産生される生産物（例えば、蜂蜜、蜜ろう、蜂パン、プロポリス、絹又はラック）の生産量を参照レベル（例えば、調節薬剤の投与を受けない宿主で見られるレベル）と比べて約２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超増加させるのに有効であり得る。
【００８３】
一部の例では、宿主適応度の増加は、調節薬剤を投与されていない宿主生物と比較した、宿主によって行われる所望の活動（例えば、受粉、病害虫の捕食、種子拡散又は廃棄物若しくは有機材料の分解）の頻度又は有効性の増加として現れ得る。一部の例では、本明細書に提供される方法又は組成物は、宿主によって行われる所望の活動（例えば、受粉、病害虫の捕食、種子拡散又は廃棄物若しくは有機材料の分解）の頻度又は有効性を参照レベル（例えば、調節薬剤の投与を受けない宿主で見られるレベル）と比べて約２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超増加させるのに有効であり得る。
【００８４】
一部の例では、宿主適応度の増加は、調節薬剤を投与されていない宿主生物と比較した、宿主における１つ以上の栄養素（例えば、ビタミン、炭水化物、アミノ酸又はポリペプチド）の生産の増加として現れ得る。一部の例では、本明細書に提供される方法又は組成物は、宿主における栄養素（例えば、ビタミン、炭水化物、アミノ酸又はポリペプチド）の生産量を参照レベル（例えば、調節薬剤の投与を受けない宿主で見られるレベル）と比べて約２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超増加させるのに有効であり得る。一部の例では、本明細書に提供される方法又は組成物は、宿主の１つ以上の微生物（例えば、内部共生体）による栄養素の生産量を増加させることにより宿主における栄養素を増加させ得る。
【００８５】
一部の例では、宿主適応度の増加は、調節薬剤を投与されていない宿主生物と比較した、農薬用薬剤（例えば、表１２に挙げられる農薬）に対する宿主の感度の低下及び／又は農薬用薬剤（例えば、表１２に挙げられる農薬）に対する宿主の抵抗性の増加として現れ得る。一部の例では、本明細書に提供される方法又は組成物は、農薬用薬剤（例えば、表１２に挙げられる農薬）に対する宿主の感度を参照レベル（例えば、調節薬剤の投与を受けない宿主で見られるレベル）と比べて約２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超低下させるのに有効であり得る。一部の例では、農薬用薬剤に対する宿主の感度は、農薬用薬剤を分解する調節薬剤（例えば、農薬分解細菌、例えばネオニコチノイド分解細菌又は有機リン系殺虫剤分解細菌）を投与することにより変化する。農薬用薬剤は、殺虫性薬剤を含め、当該技術分野において公知の任意の農薬用薬剤であり得る。一部の例では、農薬用薬剤は、ネオニコチノイド（例えば、イミダクロプリド）又は有機リン系殺虫剤（例えば、ホスホロチオエート、例えばフェニトロチオン）である。一部の例では、本明細書に提供される方法又は組成物は、農薬用薬剤を利用可能な基質に代謝又は分解する宿主の能力を増加させることにより、農薬用薬剤（例えば、表１２に挙げられる農薬）に対する宿主の感度を低下させることができる。
【００８６】
一部の例では、農薬用薬剤に対する宿主の感度は、生体異物を解毒する調節薬剤を投与することにより変化する。
【００８７】
一部の例では、宿主適応度の増加は、調節薬剤を投与されていない宿主生物と比較した、アレロケミカル薬剤に対する宿主の感度の低下及び／又はアレロケミカル薬剤に対する宿主の抵抗性の増加として現れ得る。一部の例では、本明細書に提供される方法又は組成物は、アレロケミカル薬剤に対する宿主の抵抗性を参照レベル（例えば、調節薬剤の投与を受けない宿主で見られるレベル）と比べて約２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超増加させるのに有効であり得る。一部の例では、アレロケミカル薬剤は、カフェイン、大豆シスタチンＮ、モノテルペン類、ジテルペン酸又はフェノール化合物である。一部の例では、本明細書に提供される方法又は組成物は、宿主がアレロケミカル薬剤を利用可能な基質に代謝又は分解する能力を増加させることにより、アレロケミカル薬剤に対する宿主の感度を低下させ得る。
【００８８】
一部の例では、本明細書に提供される方法又は組成物は、調節薬剤を投与されていない宿主生物と比較して、寄生虫又は病原体（例えば、真菌性、細菌性又はウイルス性病原体；又は寄生ダニ（例えば、ミツバチにおけるミツバチヘギイタダニ（Ｖａｒｒｏａ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ）））に対する宿主の抵抗性を増加させるのに有効であり得る。一部の例では、本明細書に提供される方法又は組成物は、病原体又は寄生虫（例えば、真菌性、細菌性又はウイルス性病原体；又は寄生ダニ（例えば、ミツバチにおけるミツバチヘギイタダニ（Ｖａｒｒｏａ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ）））に対する宿主の抵抗性を参照レベル（例えば、調節薬剤の投与を受けない宿主で見られるレベル）と比べて約２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又は１００％超増加させるのに有効であり得る。
【００８９】
一部の例では、宿主適応度の増加は、調節薬剤を投与されていない宿主生物と比較した、ある種の環境因子に対する耐性（例えば、高温又は低温耐性）の向上、ある種の生息場所で生き延びる能力の向上又はある種の食餌を持続させる能力の向上（例えば、ダイズ対トウモロコシを代謝する能力の向上）など、他の適応上の利点として現れ得る。一部の例では、本明細書に提供される方法又は組成物は、本明細書に記載される任意の複数の方法で宿主適応度を増加させるのに有効であり得る。更に、調節薬剤は、任意の数の宿主綱、目、科、属又は種（例えば、１つの宿主種、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２００、２５０、５００又はそれを超える宿主種）における宿主適応度を増加させることができる。一部の例では、調節薬剤は、単一の宿主綱、目、科、属又は種に作用する。
【００９０】
宿主適応度は、当該技術分野における任意の標準方法を用いて判定され得る。一部の例では、宿主適応度は、個々の宿主を評価することにより判定され得る。或いは、宿主適応度は、宿主個体群を評価することにより判定され得る。例えば、宿主適応度の増加は、他の昆虫との競合の成功の増加として現れ、それが宿主個体群サイズの増加につながり得る。
【００９１】
ｉｉｉ．農業における宿主無脊椎動物
本明細書に提供される調節薬剤は、有益線虫又は昆虫の適応度を増加させることにより、前記宿主から利益を受ける植物の成長を促進するのに有効であり得る。調節薬剤は、本明細書に記載される任意の製剤及び送達方法を用いて、目的の宿主の適応度を増加させるのに有効な量で且つ有効な継続期間にわたって送達され、それにより植物に利益を与える（例えば、作物成長を増加させ、作物収穫量を増加させ、病害虫の寄生を低減し、且つ／又は植物への被害を低減する）ことができる。これは、植物への調節薬剤の直接施用を含むことも又は含まないこともある。例えば、宿主の主要生息場所が植物成長域と異なる例では、調節薬剤は、宿主の主要生息場所、目的の植物又は両方の組み合わせのいずれにも施用され得る。
【００９２】
一部の例では、植物は、穀類、穀粒、マメ科植物、果実又は野菜作物などの農業作物であり得る。本明細書に記載される組成物は、穀類、穀粒、マメ科植物、果実又は野菜の収穫前又は収穫後のいかなる時点でも作物に送達され得る。作物収穫量は、例えば、穀類、穀粒又はマメ科植物に使用されることの多い測定値であり、通常、メートルトン毎ヘクタール（又はキログラム毎ヘクタール）で測定される。作物収穫量は、植物からの実際の種子形成も指し得る。一部の例では、調節薬剤は、参照レベル（例えば、調節薬剤を投与されていない作物と比較して約２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又はそれを超えて作物収穫量を増加させる（例えば、１ヘクタール当たりの穀類、穀粒、マメ科植物、果実又は野菜のメートルトン数を増加させる及び／又は種子形成を増加させる）のに有効であり得る。
【００９３】
一部の例では、植物（例えば、作物）は、病害虫寄生（例えば、昆虫による）が発生するリスクがあることもあり、又は病害虫寄生が既に発生していることもある。本明細書に記載される方法及び組成物を使用して農業病害虫を捕食する有益昆虫の適応度を促進することにより、かかる作物における病害虫寄生を低減又は予防し得る。一部の例では、調節薬剤は、参照レベル（例えば、調節薬剤を投与されていない作物）と比較して約２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又はそれを超えて作物寄生を低減する（例えば、寄生を受ける植物の数を低減する、病害虫の個体群の大きさを低減するか又は植物への被害を低減する）のに有効であり得る。他の例では、調節薬剤は、作物寄生の可能性を参照レベル（例えば、調節薬剤を投与されていない作物）と比較して約２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又はそれを超えて予防又は低減するのに有効であり得る。
【００９４】
任意の好適な植物組織は、限定はされないが、体細胞胚、花粉、葉、茎、カルス、匍匐根、マイクロチューバ及びシュートを含め、本明細書に記載される組成物及び方法から利益を受け得る。本明細書に記載される方法は、アカシア、アルファルファ、リンゴ、アンズ、チョウセンアザミ、トネリコの木、アスパラガス、アボカド、バナナ、オオムギ、マメ類、テンサイ、カバノキ、ブナノキ、クロイチゴ、ブルーベリー、ブロッコリー、芽キャベツ、キャベツ、キャノーラ、カンタループ、ニンジン、キャッサバ、カリフラワー、ヒマラヤスギ、穀物、セロリ、クリ、サクランボ、ハクサイ、柑橘類、クレメンタイン、クローバ、コーヒー、トウモロコシ、綿、ササゲ、キュウリ、イトスギ、ナス、ニレ、エンダイブ、ユーカリ、ソラマメ、ウイキョウ、イチジク、モミ、ゼラニウム、ブドウ、グレープフルーツ、ラッカセイ類、ホオズキ、ガムヘムロック（ｇｕｍ  ｈｅｍｌｏｃｋ）、ヒッコリー、ケール、キーウィフルーツ、コールラビ、カラマツ、レタス、ニラ、レモン、ライム、ニセアカシア、マツ、アジアンタム、トウモロコシ、マンゴー、カエデ、メロン、キビ、キノコ、カラシナ、堅果類、オーク、カラスムギ類、オクラ、タマネギ、オレンジ、観賞のための植物又は花又は木、パパイヤ、ヤシ、パセリ、パースニップ、エンドウマメ、モモ、ピーナッツ、セイヨウナシ、ピート、コショウ、カキ、キマメ、マツ、パイナップル、オオバコ、セイヨウスモモ、ザクロ、ジャガイモ、カボチャ、赤チコリ、ダイコン、菜種、キイチゴ、コメ、ライムギ、モロコシ、サルヤナギ、ダイズ、ホウレンソウ、エゾマツ、カボチャ、イチゴ、サトウダイコン、サトウキビ、ヒマワリ、サツマイモ、スイートコーン、タンジェリン、茶、タバコ、トマト、樹木、ライコムギ、芝草、カブ、ブドウの木、クルミ、オランダガラシ、スイカ、コムギ、ヤムイモ、イチイ及びズッキーニなどの被子植物及び裸子植物の処理を含み得る。
【００９５】
ＩＩ．標的微生物
本明細書に記載される調節薬剤の標的となる微生物には、限定はされないが、本明細書に記載される任意の細菌及び／又は真菌を含め、宿主内又は宿主上に常在する任意の微生物が含まれ得る。宿主に常在する微生物には、例えば、共生微生物（例えば、宿主に有益な栄養素又は酵素を提供する内部共生微生物）、片利共生微生物、病原性微生物又は寄生性微生物が含まれ得る。共生微生物（例えば、細菌又は真菌）は、宿主の偏性共生体又は宿主の通性共生体であり得る。宿主に常在する微生物は、垂直伝播、水平伝播又は複数の伝播起源を含め、任意の伝播様式によって獲得され得る。
【００９６】
ｉ．細菌
本明細書に提供される方法及び組成物において標的となり得る例示的細菌としては、限定はされないが、ゼノラブダス属種（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ  ｓｐｐ）、フォトラブダス属種（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ  ｓｐｐ）、カンディダトゥス属種（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  ｓｐｐ）、ブフネラ属種（Ｂｕｃｈｎｅｒａ  ｓｐｐ）、ブラッタバクテリウム属種（Ｂｌａｔｔａｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ）、バウマンニア属種（Ｂａｕｍａｎｉａ  ｓｐｐ）、ウィグルスウォーチア属種（Ｗｉｇｇｌｅｓｗｏｒｔｈｉａ  ｓｐｐ）、ボルバキア属種（Ｗｏｌｂａｃｈｉａ  ｓｐｐ）、リケッチア属種（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｓｐｐ）、オリエンティア属種（Ｏｒｉｅｎｔｉａ  ｓｐｐ）、ソーダリス属種（Ｓｏｄａｌｉｓ  ｓｐｐ）、バークホルデリア属種（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐｐ）、カプリアビダス属種（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｓｐｐ）、フランキア属種（Ｆｒａｎｋｉａ  ｓｐｐ）、シノリゾビウム属種（Ｓｎｉｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐｐ）、ストレプトコッカス属種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ）、ウォリネラ属種（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ  ｓｐｐ）、キシレラ属種（Ｘｙｌｅｌｌａ  ｓｐｐ）、エルウィニア属種（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｓｐｐ）、アグロバクテリウム属種（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ）、バチルス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ）、パエニバチルス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ）、ストレプトミセス属種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ）、ミクロコッカス属種（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ）、コリネバクテリウム属種（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ）、アセトバクター属種（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ）、シアノバクテリア属種（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｓｐｐ）、サルモネラ属種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ）、ロドコッカス属種（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ）、シュードモナス属種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ）、ラクトバチルス属種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ）、エンテロコッカス属種（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ）、アルカリゲネス属種（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐｐ）、クレブシエラ属種（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ）、パエニバチルス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ）、アルスロバクター属種（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ）、コリネバクテリウム属種（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ）、ブレビバクテリウム属種（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ）、サーマス属種（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｐｐ）、シュードモナス属種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ）、クロストリジウム属種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ）及び大腸菌属種（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｓｐｐ）が挙げられる。本明細書に提供される方法及び組成物による標的となり得る細菌の非限定的な例を表１に示す。
【００９７】
【表１】
2020505067.tif 000003
【００９８】
【表２】
2020505067.tif 000004
【００９９】
【表３】
2020505067.tif 000005
【０１００】
【表４】
2020505067.tif 000006
【０１０１】
【表５】
2020505067.tif 000007
【０１０２】
【表６】
2020505067.tif 000008
【０１０３】
【表７】
2020505067.tif 000009
【０１０４】
【表８】
2020505067.tif 000010
【０１０５】
【表９】
2020505067.tif 000011
【０１０６】
【表１０】
2020505067.tif 000012
【０１０７】
【表１１】
2020505067.tif 000013
【０１０８】
【表１２】
2020505067.tif 000014
【０１０９】
【表１３】
2020505067.tif 000015
【０１１０】
任意の数の細菌種は、本明細書に記載される組成物又は方法の標的となり得る。例えば、一部の例では、調節薬剤は、単一の細菌種を標的とし得る。一部の例では、調節薬剤は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、５００又はそれを超えるもののいずれかの異なる細菌種を標的とし得る。一部の例では、調節薬剤は、約１〜約５、約５〜約１０、約１０〜約２０、約２０〜約５０、約５０〜約１００、約１００〜約２００、約２００〜約５００、約１０〜約５０、約５〜約２０又は約１０〜約１００のいずれか１つの異なる細菌種を標的とし得る。一部の例では、調節薬剤は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００又はそれを超えるもののいずれかの細菌門、綱、目、科又は属を標的とし得る。
【０１１１】
一部の例では、調節薬剤は、調節薬剤を投与されていない宿主生物と比較して、宿主における１つ以上の細菌（例えば、共生細菌）の個体群を少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれを超えるもののいずれかだけ増加させることができる。一部の例では、調節薬剤は、調節薬剤を投与されていない宿主生物と比較して、宿主における１つ以上の細菌（例えば、病原性又は寄生性細菌）の個体群を少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれを超えるもののいずれかだけ低減することができる。一部の例では、調節薬剤は、宿主における細菌（例えば、病原性又は寄生性細菌）の個体群を根絶することができる。一部の例では、調節薬剤は、調節薬剤を投与されていない宿主生物と比較して、宿主における１つ以上の共生細菌のレベルを少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれを超えるもののいずれかだけ増加させることができ、及び／又は宿主における１つ以上の病原性細菌のレベルを少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれを超えるもののいずれかだけ低下させる。
【０１１２】
一部の例では、調節薬剤は、宿主の細菌多様性及び／又は細菌組成を変化させることができる。一部の例では、調節薬剤は、調節薬剤を投与されていない宿主生物と比較して、宿主における出発時の多様性と比べた細菌多様性を少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれを超えるもののいずれかだけ増加させることができる。一部の例では、調節薬剤は、調節薬剤を投与されていない宿主生物と比較して、宿主における出発時の多様性と比べた細菌多様性を少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれを超えるもののいずれかだけ低下させることができる。
【０１１３】
一部の例では、調節薬剤は、１つ以上の細菌細胞の機能、活動、成長及び／又は分裂を変化させることができる。例えば、調節薬剤は、細菌の１つ又は遺伝子の発現を変化させることができる。一部の例では、調節薬剤は、細菌の１つ以上のタンパク質の機能を変化させることができる。一部の例では、調節薬剤は、細菌の１つ以上の細胞構造（例えば、細胞壁、外膜又は内膜）の機能を変化させることができる。一部の例では、調節薬剤は、細菌を死滅（例えば、溶解）させることができる。
【０１１４】
標的細菌は、昆虫の１つ以上の部位に常在し得る。更に、標的細菌は細胞内又は、細胞外であり得る。一部の例では、細菌は、例えば、前腸、中腸及び／又は後腸を含め、宿主の腸の１つ以上の部位内又は部位上に常在する。例えば、ミツバチ（例えば、アピス・メリフェラ（Ａｐｉｓ  ｍｅｌｌｉｆｅｒａ））では、成虫が蛹期から羽化した後最初の数日間でコロニー内の他の成虫働きバチとの社会的相互作用を通じて成虫の後腸に限定される細菌共生体が獲得される。ミツバチの腸内生息菌は、ミツバチのみに見られる、また他のミツバチ属（Ａｐｉｓ）の種及びマルハナバチ属（Ｂｏｍｂｕｓ）の種（マルハナバチ）にも見られる少数の特徴的な系統に属する。一部の例では、標的細菌は、ミツバチに常在する。一部の例では、ミツバチで標的となる１つ以上の細菌は、スノッドグラセラ属種（Ｓｎｏｄｇｒａｓｓｅｌｌａ  ｓｐｐ．）（例えば、スノッドグラセラ・アルビ（Ｓｎｏｄｇｒａｓｅｌｌａ  ａｌｖｉ））、ギリアメラ属種（Ｇｉｌｌｉａｍｅｌｌａ  ｓｐｐ．）（例えば、ギリアメラ・アピコラ（Ｇｉｌｌｉａｍｅｌｌａ  ａｐｉｃｏｌａ））、バルトネラ属種（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．）（例えば、バルトネラ・アピス（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  ａｐｉｓ））、パラサッカリバクター属種（Ｐａｒａｓａｃｃｈａｒｉｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．）（例えば、パラサッカリバクター・アピウム（Ｐａｒａｓａｃｃｈａｒｉｂａｃｔｅｒ  ａｐｉｕｍ））又はラクトバチルス属種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）（例えば、ラクトバチルス・クンケエイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｕｎｋｅｅｉ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）Ｆｉｒｍ−４）である。
【０１１５】
一部の例では、細菌は、宿主昆虫の細胞内に細胞内細菌として常在する。一部の例では、細菌は、宿主昆虫のバクテリオサイトに常在する。
【０１１６】
宿主における細菌の個体群の変化は、マイクロアレイ、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ、フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡法、透過電子顕微鏡法、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（例えば、ＦＩＳＨ）、分光測定法、マトリックス支援レーザー脱離イオン化−質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）及びＤＮＡシーケンシングなど、当該技術分野において公知の任意の方法によって決定され得る。一部の例では、調節薬剤で処理した宿主のサンプルがシーケンシング（例えば、１６Ｓ  ｒＲＮＡ又はｒＤＮＡのメタゲノミクスシーケンシングにより）され、調節薬剤の送達又は投与後の宿主のマイクロバイオームが決定される。一部の例では、調節薬剤の投与を受けなかった宿主のサンプルもシーケンシングされ、参照が提供される。
【０１１７】
ｉｉ．真菌
本明細書に提供される方法及び組成物において標的となり得る例示的真菌としては、限定はされないが、アミロステレウム・アレオラツム（Ａｍｙｌｏｓｔｅｒｅｕｍ  ａｒｅｏｌａｔｕｍ）、エピクロエ属種（Ｅｐｉｃｈｌｏｅ  ｓｐｐ）、ピキア・ピヌス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｎｕｓ）、ハンゼヌラ・カプスラタ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｃａｐｓｕｌａｔｅ）、ダルディニア・デシピエンス（Ｄａｌｄｉｎｉａ  ｄｅｃｉｐｉｅｎ）、セラトシスチス属種（Ｃｅｒａｔｏｃｙｔｉｓ  ｓｐｐ）、オフィオストマ属種（Ｏｐｈｉｏｓｔｏｍａ  ｓｐｐ）及びアッタマイセス・ブロマティフィカス（Ａｔｔａｍｙｃｅｓ  ｂｒｏｍａｔｉｆｉｃｕｓ）が挙げられる。昆虫に見られる酵母及び酵母様共生体の非限定的な例としては、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、メチニコウイア属（Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ）、デバロマイセス属（Ｄｅｂａｒｏｍｙｃｅｓ）、シェフェルソマイセス・シェハテ（Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓｏｍｙｃｅｓ  ｓｈｅｈａｔａｅ）及びシェフェルソマイセス・スティピティス（Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓｏｍｙｃｅｓ  ｓｔｉｐｉｔｅｓ）、スターメレラ属（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードジマ属（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）及びチャワンタケ亜門（Ｐｅｚｉｚｏｍｙｃｏｔｉｎａ）からの酵母様共生者（例えば、シンビオタフリナ・ブクネリ（Ｓｙｍｂｉｏｔａｐｈｒｉｎａ  ｂｕｃｎｅｒｉ）及びシンビオタフリナ・コッホイ（Ｓｙｍｂｉｏｔａｐｈｒｉｎａ  ｋｏｃｈｉｉ））が挙げられる。本明細書の方法及び組成物による標的となり得る酵母の非限定的な例を表２に挙げる。
【０１１８】
【表１４】
2020505067.tif 000016
【０１１９】
【表１５】
2020505067.tif 000017
【０１２０】
【表１６】
2020505067.tif 000018
【０１２１】
【表１７】
2020505067.tif 000019
【０１２２】
【表１８】
2020505067.tif 000020
【０１２３】
【表１９】
2020505067.tif 000021
【０１２４】
【表２０】
2020505067.tif 000022
【０１２５】
任意の数の真菌種は、本明細書に記載される組成物又は方法の標的となり得る。例えば、一部の例では、調節薬剤は、単一の真菌種を標的とし得る。一部の例では、調節薬剤は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、５００又はそれを超えるもののいずれかの異なる真菌種を標的とし得る。一部の例では、調節薬剤は、約１〜約５、約５〜約１０、約１０〜約２０、約２０〜約５０、約５０〜約１００、約１００〜約２００、約２００〜約５００、約１０〜約５０、約５〜約２０又は約１０〜約１００のいずれか１つの異なる真菌種を標的とし得る。一部の例では、調節薬剤は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００又はそれを超えるもののいずれかの真菌門、綱、目、科又は属を標的とし得る。
【０１２６】
一部の例では、調節薬剤は、調節薬剤を投与されていない宿主生物と比較して、宿主における１つ以上の真菌（例えば、共生真菌）の個体群を少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれを超えるもののいずれかだけ増加させることができる。一部の例では、調節薬剤は、調節薬剤を投与されていない宿主生物と比較して、宿主における１つ以上の真菌（例えば、病原性又は寄生性真菌）の個体群を少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれを超えるもののいずれかだけ低減することができる。一部の例では、調節薬剤は、宿主における真菌（例えば、病原性又は寄生性真菌）の個体群を根絶することができる。一部の例では、調節薬剤は、調節薬剤を投与されていない宿主生物と比較して、宿主における１つ以上の共生真菌のレベルを少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれを超えるもののいずれかだけ増加させることができ、及び／又は宿主における１つ以上の病原性真菌のレベルを少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれを超えるもののいずれかだけ低下させることができる。
【０１２７】
一部の例では、調節薬剤は、宿主の真菌多様性及び／又は真菌組成を変化させることができる。一部の例では、調節薬剤は、調節薬剤を投与されていない宿主生物と比較して、宿主における出発時の多様性と比べた真菌多様性を少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれを超えるもののいずれかだけ増加させることができる。一部の例では、調節薬剤は、調節薬剤を投与されていない宿主生物と比較して、宿主における出発時の多様性と比べた真菌多様性を少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれを超えるもののいずれかだけ低下させることができる。
【０１２８】
一部の例では、調節薬剤は、１つ以上の真菌の機能、活動、成長及び／又は分裂を変化させることができる。例えば、調節薬剤は、真菌の１つ以上の遺伝子の発現を変化させることができる。一部の例では、調節薬剤は、真菌の１つ以上のタンパク質の機能を変化させることができる。一部の例では、調節薬剤は、真菌の１つ以上の細胞成分の機能を変化させることができる。一部の例では、調節薬剤は真菌を死滅させることができる。
【０１２９】
更に、標的真菌は、昆虫の１つ以上の部位に常在し得る。一部の例では、真菌は、例えば、前腸、中腸及び／又は後腸を含め、昆虫の腸の１つ以上の部位内又は部位上に常在する。一部の例では、真菌は、細胞外で血リンパ、脂肪体において、又は宿主の特殊化した構造において生活する。
【０１３０】
宿主における真菌の個体群の変化は、マイクロアレイ、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ、フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡法、透過電子顕微鏡法、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（例えば、ＦＩＳＨ）、分光測定法、マトリックス支援レーザー脱離イオン化−質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）及びＤＮＡシーケンシングなど、当該技術分野において公知の任意の方法によって決定され得る。一部の例では、調節薬剤で処理した宿主のサンプルがシーケンシング（例えば、メタゲノミクスシーケンシングにより）され、調節薬剤の送達又は投与後の宿主のマイクロバイオームが決定される。一部の例では、調節薬剤の投与を受けなかった宿主のサンプルもシーケンシングされ、参照が提供される。
【０１３１】
ＩＩＩ．調節薬剤
本明細書に提供される方法及び組成物の調節薬剤には、ファージ、ポリペプチド、小分子、抗生物質、二次代謝産物、細菌又はこれらの任意の組み合わせが含まれ得る。
【０１３２】
ｉ．ファージ
本明細書に記載される調節薬剤は、ファージ（例えば、溶菌性ファージ又は非溶菌性ファージ）を含み得る。一部の例では、本明細書に記載される任意のファージの有効濃度は、本明細書に記載される宿主に常在する１つ以上の微生物（本明細書に記載されるとおり）のレベル、活動又は代謝を変化させることができ、この変化が宿主の適応度の増加をもたらし得る。一部の例では、調節薬剤は、テクティウイルス科（Ｔｅｃｔｉｖｉｒｉｄａｅ）、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）、サイフォウイルス科（Ｓｉｐｈｏｖｉｒｉｄａｅ）、ポドウイルス科（Ｐｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、カウドウイルス目（Ｃａｕｄｏｖｉｒａｌｅｓ）、リポスリクスウイルス科（Ｌｉｐｏｔｈｒｉｘｖｉｒｉｄａｅ）、ルディウイルス科（Ｒｕｄｉｖｉｒｉｄａｅ）又はリガメンウイルス目（Ｌｉｇａｍｅｎｖｉｒａｌｅｓ）の目から選択される少なくとも１つのファージを含む。一部の例では、本組成物は、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）、サイフォウイルス科（Ｓｉｐｈｏｖｉｒｉｄａｅ）、ポドウイルス科（Ｐｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、リポスリクスウイルス科（Ｌｉｐｏｔｈｒｉｘｖｉｒｉｄａｅ）、ルディウイルス科（Ｒｕｄｉｖｉｒｉｄａｅ）、アンピュラウイルス科（Ａｍｐｕｌｌａｖｉｒｉｄａｅ）、ビカウダウイルス科（Ｂｉｃａｕｄａｖｉｒｉｄａｅ）、クラバウイルス科（Ｃｌａｖａｖｉｒｉｄａｅ）、コルチコウイルス科（Ｃｏｒｔｉｃｏｖｉｒｉｄａｅ）、シストウイルス科（Ｃｙｓｔｏｖｉｒｉｄａｅ）、フセロウイルス科（Ｆｕｓｅｌｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、グロブロウイルス科（Ｇｌｕｂｏｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、グッタウイルス科（Ｇｕｔｔａｖｉｒｉｄａｅ）、イノウイルス科（Ｉｎｏｖｉｒｉｄａｅ）、レビウイルス科（Ｌｅｖｉｖｉｒｉｄａｅ）、ミクロウイルス科（Ｍｉｃｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、プラズマウイルス科（Ｐｌａｓｍａｖｉｒｉｄａｅ）及びテクティウイルス科（Ｔｅｃｔｉｖｉｒｉｄａｅ）から選択される少なくとも１つのファージを含む。本方法及び組成物において有用なファージの更なる非限定的な例を表３に挙げる。
【０１３３】
【表２１】
2020505067.tif 000023
【０１３４】
【表２２】
2020505067.tif 000024
【０１３５】
一部の例では、調節薬剤は、溶菌性ファージを含む。従って、宿主に常在する細菌細胞への溶菌性ファージの送達後、ファージは、標的細菌細胞に溶解を引き起こす。一部の例では、溶菌性ファージが宿主昆虫に常在する細菌を標的にして死滅させることにより、宿主の適応度が増加する。代わりに又は加えて、調節薬剤のファージは、非溶菌性ファージ（溶原性又はテンペレートファージとも称される）であり得る。従って、宿主に常在する細菌細胞への非溶菌性ファージの送達後、細菌細胞は、生存可能なままであり、ファージゲノムにおいてコードされる遺伝子の発現を安定に維持することが可能である。一部の例では、非溶菌性ファージを使用して宿主昆虫に常在する細菌の遺伝子発現を変化させることにより、宿主の適応度を増加させる。一部の例では、調節薬剤は、溶菌性ファージと非溶菌性ファージとの混合物を含む。
【０１３６】
本明細書に記載される調節薬剤は、狭域又は広域のいずれかの細菌標的域を有するファージを含み得る。一部の例では、ファージは、狭域の細菌標的域を有する。一部の例では、ファージは、大きい細菌標的域を有する無差別的なファージである。例えば、無差別的なファージは、少なくとも約５、１０、２０、３０、４０、５０又はそれを超えるもののいずれかの宿主常在細菌を標的とし得る。狭域の細菌標的域を有するファージは、宿主における他の細菌、例えば非標的細菌には影響を与えることなく、宿主の特定の細菌株を標的とし得る。例えば、ファージは、約５０、４０、３０、２０、１０、８、６、４、２又は１のいずれか以下の宿主常在細菌を標的とし得る。例えば、本明細書に記載される組成物は、ミツバチの細菌性病原体パエニバチルス・ラルバエ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｒｖａｅ）を標的とし得るが、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）Ｆｉｒｍ４、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）Ｆｉｒｍ５、ビフィドバクテリウム属種（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ）、スノッドグラセラ・アルビ（Ｓｎｏｄｇｒａｓｓｅｌｌａ  ａｌｖｉ）、ギリアメラ・アピコラ（Ｇｉｌｌｉａｍｅｌｌａ  ａｐｉｃｏｌａ）、バルトネラ・アピス（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  ａｐｉｓ）、パラサッカリバクター・アピウム（Ｐａｒａｓａｃｃｈａｒｉｂａｃｔｅｒ  ａｐｉｕｍ）又はラクトバチルス・クンケエイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｕｎｋｅｅｉ）を含めた他の細菌（例えば、共生細菌）を標的としないものであり得る。一部の例では、ファージは、細胞表面タンパク質（例えば、ＯｍｐＦ、ＬａｍＢ、ＢｔｕＢ、ＴｏｌＣ等）に結合するか又は別の認識分子（例えば、糖脂質、ＬＰＳ、リポタイコ酸等）に結合することによって１つ以上の特異的な細菌に感染する。
【０１３７】
本明細書に記載される組成物は、少なくとも約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、１００又はそれを超えるもののいずれか１つのファージなど、任意の数のファージを含み得る。一部の例では、本組成物は、１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれを超えるファージ）の科、１つ以上の目（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれを超えるファージ）又は１つ以上の種（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、１００又はそれを超えるファージ）からのファージを含む。１つ以上のファージを含む組成物は、本明細書では「ファージカクテル」とも称される。ファージカクテルは、より広域の宿主域の細菌を標的とすることが可能になるために有用である。更に、ファージカクテルによれば、各細菌株（即ち亜種）を複数の直交性のファージによって標的化することが可能であり、それにより抵抗性の発生が防止されるか又は大幅に遅延する。一部の例では、カクテルは、１つの細菌種を標的とする複数のファージを含む。一部の例では、カクテルは、複数の細菌種を標的とする複数のファージを含む。一部の例では、１ファージ「カクテル」は、種内の多くの株を標的とする単一の無差別的なファージ（即ち大きい宿主域のファージ）を含む。
【０１３８】
本明細書に記載される調節薬剤中のファージの好適な濃度は、ファージの有効性、生存率、感染力、組成物中にある異なるファージの数並びに／又は溶解素の種類、製剤及び組成物の施用方法などの要因に依存する。一部の例では、ファージは、液体又は固体製剤中にある。一部の例では、本明細書に記載される任意の組成物中の各ファージの濃度は、少なくとも約１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０ｐｆｕ／ｍｌ又はそれを超えるもののいずれかである。一部の例では、本明細書に記載される任意の組成物中の各ファージの濃度は、約１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９ｐｆｕ／ｍｌのいずれか以下である。一部の例では、本組成物中の各ファージの濃度は、約１０２〜約１０３、約１０３〜約１０４、約１０４〜約１０５、約１０５〜約１０６、約１０７〜約１０８、約１０８〜約１０９、約１０２〜約１０４、約１０４〜約１０６、約１０６〜約１０９又は約１０３〜約１０８ｐｆｕ／ｍｌのいずれかである。一部の例では、ここで、本組成物は、少なくとも２種類のファージを含み、ファージの各種類の濃度は、同じであるか又は異なり得る。例えば、一部の例では、カクテル中の１つのファージの濃度が約１０８ｐｆｕ／ｍｌであり、カクテル中の第２のファージの濃度が約１０６ｐｆｕ／ｍｌである。
【０１３９】
本明細書に記載されるとおりのファージを含む調節薬剤は、（ａ）標的宿主の内部で目標レベル（例えば、所定又は閾値レベル）のファージ濃度に達する；（ｂ）標的宿主の腸の内部で目標レベル（例えば、所定又は閾値レベル）のファージ濃度に達する；（ｃ）標的宿主のバクテリオサイトの内部で目標レベル（例えば、所定又は閾値レベル）のファージ濃度に達する；（ｄ）標的宿主の１つ以上の微生物（例えば、内部共生体）のレベル又は活動を調節する；又は／及び（ｅ）標的宿主の適応度を調節するのに十分な量で且つ十分な時間にわたって標的宿主と接触させることができる。
【０１４０】
実施例７及び１１によって示されるとおり、ファージは、ミツバチ又はカイコなどの昆虫宿主からセラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、エルウィニア・カロトボラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｔｏｔｏｖｏｒａ）及びシュードモナス・エントモフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｅｎｚｏｍｏｐｈｉｌａ）などの細菌性病原体を除去することにより調節薬剤として使用することができる。
【０１４１】
ｉｉ．ポリペプチド
多数のポリペプチド（例えば、バクテリオシン、Ｒ型バクテリオシン、根粒Ｃリッチペプチド、抗微生物ペプチド、溶解素又はバクテリオサイト調節性ペプチド）を、本明細書に記載される組成物及び方法に使用し得る。一部の例では、本明細書に記載される任意のペプチド又はポリペプチドの有効濃度は、宿主に常在する１つ以上の微生物（本明細書に記載されるとおり）のレベル、活動又は代謝を変化させることができ、この変化が宿主の適応度の増加をもたらし得る。本明細書に含まれるポリペプチドには、天然に存在するポリペプチド又は組換え産生された変異体が含まれ得る。例えば、ポリペプチドは、例えば、特定の領域にわたり又は配列全体にわたり、本明細書に記載されるポリペプチド又は天然に存在するポリペプチドの配列と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する本明細書に記載される任意のポリペプチドの機能的に活性な変異体であり得る。
【０１４２】
本明細書に記載されるとおりのポリペプチドを含む調節薬剤は、（ａ）標的宿主の内部で目標レベル（例えば、所定又は閾値レベル）の濃度に達する；（ｂ）標的宿主の腸の内部で目標レベル（例えば、所定又は閾値レベル）の濃度に達する；（ｃ）標的宿主のバクテリオサイトの内部で目標レベル（例えば、所定又は閾値レベル）の濃度に達する；（ｄ）標的宿主の１つ以上の微生物（例えば、内部共生体）のレベル又は活動を調節する；又は／及び（ｅ）標的宿主の適応度を調節するのに十分な量で且つ十分な時間にわたって標的宿主と接触させることができる。
【０１４３】
ミツバチ及びカイコなどの昆虫の適応度を増加させるため、以下で考察するポリペプチド調節薬剤、即ちバクテリオシン、溶解素、抗微生物ペプチド、根粒Ｃリッチペプチド及びバクテリオサイト調節性ペプチドを使用して、本節に示されるとおりの標的微生物のレベル、活動又は代謝を変化させることができる。
【０１４４】
（ａ）バクテリオシン
本明細書に記載される調節薬剤は、バクテリオシンを含み得る。一部の例では、バクテリオシンは、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）又は乳酸菌（ＬＡＢ、例えばラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ））などのグラム陽性細菌によって天然に生産される。一部の例では、バクテリオシンは、ハフニア・アルベイ（Ｈａｆｎｉａ  ａｌｖｅｉ）、シトロバクター・フロインディ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）、セラチア・プリミチクム（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｐｌｙｍｉｔｈｉｃｕｍ）、キサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）、エルウィニア・カロトボラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）、ラルストニア・ソラナケアルム（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）又は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）などのグラム陰性細菌によって天然に生産される。例示的バクテリオシンとしては、限定はされないが、クラスＩ〜ＩＶ  ＬＡＢ抗生物質（ランチビオティックなど）、コリシン、ミクロシン及びピオシンが挙げられる。バクテリオシンの非限定的な例を表４に挙げる。
【０１４５】
【表２３】
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【０１４６】
【表２４】
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【０１４７】
【表２５】
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【０１４８】
一部の例では、バクテリオシンは、グラム陰性細菌によって生産されるコリシン、ピオシン又はミクロシンである。一部の例では、バクテリオシンは、コリシンである。コリシンは、Ａ群コリシン（例えば、Ｔｏｌ系を使用して標的細菌の外膜に侵入する）又はＢ群コリシン（例えば、Ｔｏｎ系を使用して標的細菌の外膜に侵入する）であり得る。一部の例では、バクテリオシンは、ミクロシンである。ミクロシンは、クラスＩミクロシン（例えば、＜５ｋＤａ、翻訳後修飾を有する）又はクラスＩＩミクロシン（例えば、５〜１０ｋＤａ、翻訳後修飾有り又は無し）であり得る。一部の例では、クラスＩＩミクロシンは、クラスＩＩａミクロシン（例えば、機能性ペプチドの合成及びアセンブリに２つ以上の遺伝子を必要とする）又はクラスＩＩｂミクロシン（例えば、Ｃ末端の翻訳後修飾有り又は無しの線状ペプチド）である。一部の例では、バクテリオシンは、ピオシンである。一部の例では、ピオシンは、Ｒ−ピオシン、Ｆ−ピオシン又はＳ−ピオシンである。
【０１４９】
一部の例では、バクテリオシンは、グラム陽性細菌によって生産されるクラスＩ、クラスＩＩ、クラスＩＩＩ又はクラスＩＶバクテリオシンである。一部の例では、調節薬剤は、クラスＩバクテリオシン（例えば、グラム陽性細菌によって生産されるランチオニン含有抗生物質（ランチビオティック））を含む。クラスＩバクテリオシン又はランチビオティックは、低分子量ペプチド（例えば、約５ｋＤａ未満）であり得、翻訳後修飾されたアミノ酸残基（例えば、ランチオニン、β−メチルランチオニン又は脱水アミノ酸）を有し得る。
【０１５０】
一部の例では、バクテリオシンは、クラスＩＩバクテリオシン（例えば、グラム陽性細菌によって生産される非ランチビオティック）である。多くは、正電荷の非ランチオニン含有ペプチドであり、これは、ランチビオティックと異なり、大規模な翻訳後修飾を受けない。クラスＩＩバクテリオシンは、以下のサブクラスの１つに属し得る：「ペディオシン様」バクテリオシン（例えば、ペディオシンＰＡ−１及びカルノバクテリオシンＸ（クラスＩＩａ））；２ペプチドバクテリオシン（例えば、ラクタシンＦ及びＡＢＰ−１１８（クラスＩＩｂ））；環状バクテリオシン（例えば、カルノシクリンＡ（ｃａｒｎｏｃｙｃｌｉｎ  Ａ）及びエンテロシンＡＳ−４８（クラスＩＩｃ））；又は修飾されていない線状の非ペディオシン様バクテリオシン（例えば、エピデルミシンＮＩ０１及びラクトコッシンＡ（クラスＩＩｄ））。
【０１５１】
一部の例では、バクテリオシンは、クラスＩＩＩバクテリオシン（例えば、グラム陽性細菌によって生産される）である。クラスＩＩＩバクテリオシンは、１０ｋＤａより大きい分子量を有し得、熱不安定性タンパク質であり得る。クラスＩＩＩバクテリオシンは、ＩＩＩＡ群及びＩＩＩＢ群バクテリオシンに更に細分される。ＩＩＩＡ群バクテリオシンは、エンテロリシンＡなど、敏感な株を細胞の溶解によって十分に死滅させる細菌溶解酵素を含む。ＩＩＩＢ群バクテリオシンは、カゼイシン８０、ヘルベティシンＪ及びラクタシンＢなど、非溶菌性タンパク質を含む。
【０１５２】
一部の例では、バクテリオシンは、クラスＩＶバクテリオシン（例えば、グラム陽性細菌によって生産されるもの）である。クラスＩＶバクテリオシンは、活性に必要と見られる他の脂質又は炭水化物部分と会合した一群の複合タンパク質である。これは、比較的疎水性が高く、熱安定性である。クラスＩＶバクテリオシンの例は、ロイコノシンＳ、ラクトシン２７及びラクトシンＳである。
【０１５３】
一部の例では、バクテリオシンは、Ｒ型バクテリオシンである。Ｒ型バクテリオシンは、収縮性殺菌性タンパク質複合体である。一部のＲ型バクテリオシンは、収縮性ファージ尾部様構造を有する。ファージ尾繊維タンパク質のＣ末端領域は、標的結合特異性を決定する。これは、受容体結合タンパク質、例えば尾繊維を介して標的細胞に付着し得る。付着に続いて鞘が収縮し、標的細菌のエンベロープを通ってコアが入り込む。コアが侵入すると、細胞膜電位の急速な脱分極が起こり、細胞死が促進される。単一のＲ型バクテリオシン粒子との接触で細胞死が起こり得る。Ｒ型バクテリオシンは、例えば、易熱性、耐弱酸性、トリプシン耐性、遠心によって沈降可能、電子顕微鏡法によって解像可能又はこれらの組み合わせであり得る。他のＲ型バクテリオシンは、複数のタンパク質、ポリペプチド又はサブユニットを含む複合分子であり得、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）のバクテリオファージの尾部構造に類似したものであり得る。天然に存在するＲ型バクテリオシンでは、サブユニット構造は、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）又は緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）などの細菌ゲノムによってコードされ、Ｒ型バクテリオシンを形成して他の細菌に対する天然の防御としての役割を果たし得る。一部の例では、Ｒ型バクテリオシンは、ピオシンである。一部の例では、ピオシンは、Ｒ−ピオシン、Ｆ−ピオシン又はＳ−ピオシンである。
【０１５４】
一部の例では、バクテリオシンは、本明細書に記載されるバクテリオシンの機能的に活性な変異体である。一部の例では、バクテリオシンの変異体は、例えば、特定の領域にわたり又は配列全体にわたり、本明細書に記載されるバクテリオシン又は天然に存在するバクテリオシンの配列と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する。
【０１５５】
一部の例では、バクテリオシンは、標準方法に従って生物工学的に操作され得、その生物活性を調節し、例えば増加若しくは低下させるか、又は調整するか、又はその標的微生物を指定し得る。他の例では、バクテリオシンは、微生物細胞の翻訳機構（例えば、リボソーム等）によって産生される。一部の例では、バクテリオシンは、化学的に合成される。一部のバクテリオシンは、ポリペプチド前駆体に由来することができる。ポリペプチド前駆体は、切断（例えば、プロテアーゼによるプロセシング）を受けると、バクテリオシン自体のポリペプチドを生じさせることができる。このように、一部の例では、バクテリオシンは、前駆体ポリペプチドから産生される。他の一部の例では、バクテリオシンは、翻訳後修飾、例えば切断又は１つ以上の官能基の付加を受けたポリペプチドを含む。
【０１５６】
本明細書に記載されるバクテリオシンは、本明細書に記載される任意の使用のために組成物に製剤化され得る。本明細書に開示される組成物は、少なくとも約１つのバクテリオシン、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、１００又はそれを超えるバクテリオシンのいずれか１つなど、任意の数又は種類（例えば、クラス）のバクテリオシンを含み得る。本明細書に記載される組成物中の各バクテリオシンの好適な濃度は、バクテリオシンの有効性、安定性、組成物中にある異なるバクテリオシン種類の数、製剤及び組成物の施用方法などの要因に依存する。一部の例では、液体組成物中の各バクテリオシンは、約０．０１ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍＬである。一部の例では、固体組成物中の各バクテリオシンは、約０．０１ｎｇ／ｇ〜約１００ｍｇ／ｇである。一部の例では、ここで、本組成物は、少なくとも２種類のバクテリオシンを含み、各種類のバクテリオシンの濃度は、同じであるか又は異なり得る。一部の例では、バクテリオシンは、バクテリオシンを分泌する細菌細胞を含む組成物で提供される。一部の例では、バクテリオシンは、ポリペプチド（例えば、細菌細胞から単離されたポリペプチド）を含む組成物で提供される。
【０１５７】
バクテリオシンは、その細菌細胞にクローン的に関連する細胞及び他の微生物細胞を含め、そのポリペプチドを作る個別の細菌細胞以外の少なくとも１つの微生物を中和し得る（例えば、死滅させ得る）。このように、細菌細胞は、バクテリオシンを分泌することにより複数の微生物に細胞傷害効果又は成長阻害効果を及ぼし得る。一部の例では、バクテリオシンは、細胞膜孔形成、細胞壁干渉（例えば、ペプチドグリカナーゼ（ｐｅｐｔｉｄｏｇｌｙｃａｎａｓｅ）活性）又はヌクレアーゼ活性（例えば、ＤＮアーゼ活性、１６Ｓ  ｒＲＮアーゼ活性若しくはｔＲＮアーゼ活性）によって１つ以上の宿主常在細菌種を標的とし、それを死滅させる。
【０１５８】
一部の例では、バクテリオシンは、中和活性を有する。バクテリオシンの中和活性としては、限定はされないが、微生物生殖の停止又は細胞傷害性を挙げることができる。一部のバクテリオシンは、細胞傷害活性を有し、従って微生物、例えば細菌、酵母、藻類などを死滅させることができる。一部のバクテリオシンは、微生物、例えば細菌、酵母、藻類などの生殖を例えば細胞周期の停止によって阻害することができる。
【０１５９】
一部の例では、バクテリオシンは、殺傷活性を有する。バクテリオシンの殺傷機構は、各バクテリオシン群に特異的である。一部の例では、バクテリオシンは、狭域スペクトル生物活性を有する。バクテリオシンは、その標的株に対するその極めて高い効力で知られる。一部のバクテリオシン活性は、バクテリオシン生産株に近縁の株に限定されている（狭域スペクトル生物活性）。一部の例では、バクテリオシンは、幅広い属に対して広域スペクトル生物活性を有する。
【０１６０】
一部の例では、バクテリオシンは、標的細菌細胞膜上の受容体分子又はドッキング分子と相互作用する。例えば、ナイシンは、その標的細菌株に対して極めて効力が強く、１桁のナノモル濃度でも抗微生物活性を示す。ナイシン分子は、ペプチドグリカンサブユニットを細胞質から細胞壁に運ぶ主要なトランスポーターであるリピドＩＩに結合することが示されている。
【０１６１】
一部の例では、バクテリオシンは、抗真菌活性を有する。抗酵母又は抗真菌活性を有する幾つものバクテリオシンが同定されている。例えば、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）のバクテリオシンは、一部の酵母株に対して中和活性を有することが示されている（例えば、Ａｄｅｔｕｎｊｉ  ａｎｄ  Ｏｌａｏｙｅ，Ｍａｌａｙｓｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ９：１３０−１３，２０１３を参照されたい）。別の例では、フェカリス菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）ペプチドは、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）種に対して中和活性を有することが示されている（例えば、Ｓｈｅｋｈ  ａｎｄ  Ｒｏｙ，ＢＭＣ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １２：１３２，２０１２を参照されたい）。別の例では、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）のバクテリオシンは、クルブラリア・ルナータ（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｌｕｎａｔａ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種、ヘルミントスポリウム属（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ）種及びビポラリス属（Ｂｉｏｐｏｌａｒｉｓ）種などの真菌に対して中和活性を有することが示されている（例えば、Ｓｈａｌａｎｉ  ａｎｄ  Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎｅｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌｕｍｅ  ５  Ｎｕｍｂｅｒ  ２，２００８を参照されたい）。別の例では、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のボトリシジン（ｂｏｔｒｙｃｉｄｉｎ）ＡＪ１３１６及びアリリンＢ１は、抗真菌活性を有することが示されている。
【０１６２】
本明細書に記載されるとおりのバクテリオシンを含む調節薬剤は、（ａ）標的宿主の内部で目標レベル（例えば、所定又は閾値レベル）のバクテリオシン濃度に達する；（ｂ）標的宿主の腸の内部で目標レベル（例えば、所定又は閾値レベル）のバクテリオシン濃度に達する；（ｃ）標的宿主のバクテリオサイトの内部で目標レベル（例えば、所定又は閾値レベル）のバクテリオシン濃度に達する；（ｄ）標的宿主における１つ以上の微生物（例えば、内部共生体）のレベル又は活動を調節する；又は／及び（ｅ）標的宿主の適応度を調節するのに十分な量で且つ十分な時間にわたって標的宿主と接触させることができる。
【０１６３】
（ｂ）溶解素
本明細書に記載される調節薬剤は、溶解素（例えば、ムレイン加水分解酵素又はペプチドグリカン自己溶解素としても知られる）を含み得る。宿主に常在する細菌の阻害に好適な任意の溶解素を使用し得る。一部の例では、溶解素は、細菌細胞によって天然に生産され得るものである。一部の例では、溶解素は、バクテリオファージによって天然に生産され得るものである。一部の例では、溶解素は、宿主に常在する細菌を阻害するファージから入手される。一部の例では、溶解素は、天然に存在する溶解素をベースとして改変される。一部の例では、溶解素は、例えば、溶解素にシグナルペプチドを導入することにより、宿主細菌によって分泌されるように改変される。一部の例では、溶解素は、ファージホリンとの組み合わせで使用される。一部の例では、溶解素は、溶解素に敏感でない組換え細菌宿主によって発現される。一部の例では、溶解素を使用して、宿主に常在するグラム陽性又はグラム陰性細菌が阻害される。
【０１６４】
溶解素は、任意のクラスの溶解素であり得、１つ以上の基質特異性を有し得る。例えば、溶解素は、グリコシダーゼ、エンドペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ又はこれらの組み合わせであり得る。一部の例では、溶解素は、細胞壁の糖部分のβ−１−４グリコシド結合、細菌細胞壁の糖及びペプチド部分をつなぐアミド結合及び／又は細胞壁のペプチド部分間のペプチド結合を切断する。溶解素は、ペプチドグリカン内での切断部位に応じて１つ以上の特定の溶解素群に属し得る。一部の例では、溶解素は、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−ムラミダーゼ（例えば、リゾチーム）、溶解性トランスグリコシラーゼ、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニンアミダーゼ、Ｌ，Ｄ−エンドペプチダーゼ、Ｄ，Ｄ−エンドペプチダーゼ、Ｄ，Ｄ−カルボキシペプチダーゼ、Ｌ，Ｄ−カルボキシペプチダーゼ又はＬ，Ｄ−トランスペプチダーゼである。溶解素及びその活性の非限定的な例を表５に挙げる。
【０１６５】
【表２６】
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【０１６６】
【表２７】
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【０１６７】
【表２８】
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【０１６８】
【表２９】
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【０１６９】
【表３０】
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【０１７０】
【表３１】
2020505067.tif 000033
【０１７１】
【表３２】
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【０１７２】
【表３３】
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【０１７３】
【表３４】
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【０１７４】
【表３５】
2020505067.tif 000037
【０１７５】
【表３６】
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【０１７６】
【表３７】
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【０１７７】
【表３８】
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【０１７８】
【表３９】
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【０１７９】
【表４０】
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【０１８０】
【表４１】
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【０１８１】
【表４２】
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【０１８２】
【表４３】
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【０１８３】
【表４４】
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【０１８４】
一部の例では、溶解素は、本明細書に記載される溶解素の機能的に活性な変異体である。一部の例では、溶解素の変異体は、例えば、特定の領域にわたり又は配列全体にわたり、本明細書に記載される溶解素又は天然に存在する溶解素の配列と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する。
【０１８５】
一部の例では、溶解素は得生物工学的に操作され得、その生物活性を調節し、例えば増加若しくは低下させるか、又は調整するか、又は標的微生物を指定し得る。一部の例では、溶解素は、微生物細胞の翻訳機構（例えば、リボソーム等）によって産生される。一部の例では、溶解素は、化学的に合成される。一部の例では、溶解素は、ポリペプチド前駆体に由来する。ポリペプチド前駆体は、切断（例えば、プロテアーゼによるプロセシング）を受けると、溶解素自体のポリペプチドを生じさせることができる。このように、一部の例では、溶解素は、前駆体ポリペプチドから産生される。一部の例では、溶解素は、翻訳後修飾、例えば切断又は１つ以上の官能基の付加を受けたポリペプチドを含む。
【０１８６】
本明細書に記載される溶解素は、本明細書に記載される任意の使用のために組成物に製剤化され得る。本明細書に開示される組成物は、少なくとも約１つの溶解素、２、３、４、５、１０、１５、２０又はそれを超える溶解素のいずれか１つなど、任意の数又は種類（例えば、クラス）の溶解素を含み得る。組成物中の各溶解素の好適な濃度は、溶解素の有効性、安定性、異なる溶解素の数、製剤及び組成物の施用方法などの要因に依存する。一部の例では、液体組成物中の各溶解素は、約０．１ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬである。一部の例では、固体組成物中の各溶解素は、約０．１ｎｇ／ｇ〜約１００ｍｇ／ｇである。一部の例では、ここで、本組成物は、少なくとも２種類の溶解素を含み、溶解素の各種類の濃度は、同じであるか又は異なり得る。
【０１８７】
本明細書に記載されるとおりの溶解素を含む調節薬剤は、（ａ）標的宿主の内部で目標レベル（例えば、所定又は閾値レベル）の溶解素濃度に達する；（ｂ）標的宿主の腸の内部で目標レベル（例えば、所定又は閾値レベル）の溶解素濃度に達する；（ｃ）標的宿主のバクテリオサイトの内部で目標レベル（例えば、所定又は閾値レベル）の溶解素濃度に達する；（ｄ）標的宿主の１つ以上の微生物（例えば、内部共生体）のレベル又は活動を調節する；又は／及び（ｅ）標的宿主の適応度を調節するのに十分な量で且つ十分な時間にわたって標的宿主と接触させることができる。
【０１８８】
（ｃ）抗微生物ペプチド
本明細書に記載される調節薬剤は、抗微生物ペプチド（ＡＭＰ）を含み得る。宿主に常在する微生物を阻害するのに好適な任意のＡＭＰを使用し得る。ＡＭＰは、多様な分子の群であり、そのアミノ酸組成及び構造に基づいてサブ群に分けられる。ＡＭＰは、植物（例えば、コプシン）、昆虫（例えば、ドロソシン、サソリペプチド（例えば、Ｕｙ１９２、ＵｙＣＴ３、Ｄ３、Ｄ１０、Ｕｙ１７、Ｕｙ１９２）、マストパラン、ポネラトキシン、セクロピン、モリシン、メリチン）、カエル（例えば、マガイニン、ダーマセプチン、オーレイン）及び哺乳類（例えば、カテリシジン類、デフェンシン類及びプロテグリン類）に由来するＡＭＰを含め、天然でＡＭＰを生産する任意の生物に由来するか又はそれから生産され得る。例えば、ＡＭＰは、Ｕｙ１９２（５’−ＦＬＳＴＩＷＮＧＩＫＧＬＬ−３’；配列番号１９３）、ＵｙＣＴ３（５’−ＬＳＡＩＷＳＧＩＫＳＬＦ−３；配列番号１９４’）、Ｄ３（５’−ＬＷＧＫＬＷＥＧＶＫＳＬＩ−３’；配列番号１９５）及びＤ１０（５’−ＦＰＦＬＫＬＳＬＫＩＰＫＳＡＩＫＳＡＩＫＲＬ−３’；配列番号１９６）、Ｕｙ１７（５’−ＩＬＳＡＩＷＳＧＩＫＧＬＬ−３’；配列番号１９７）など、サソリペプチドであり得る。ＡＭＰの他の非限定的な例を表６に挙げる。
【０１８９】
【表４５】
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【０１９０】
【表４６】
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【０１９１】
【表４７】
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【０１９２】
ＡＭＰは、任意の数の標的微生物に対して活性があり得る。一部の例では、ＡＭＰは、抗細菌及び／又は抗真菌活性を有し得る。一部の例では、ＡＭＰは、狭域スペクトル生物活性又は広域スペクトル生物活性を有し得る。例えば、一部のＡＭＰは、少数の細菌種又は真菌種のみを標的としてそれを死滅させるが、別のＡＭＰは、グラム陰性及びグラム陽性の両方の細菌並びに真菌に対する活性がある。
【０１９３】
更に、ＡＭＰは、幾つもの既知の作用機構で機能し得る。例えば、細胞膜は、ＡＭＰの高頻度標的であるが、ＡＭＰは、ＤＮＡ及びタンパク質合成、タンパク質フォールディング及び細胞壁合成にも干渉し得る。一部の例では、正味カチオン荷電の、両親媒性の性質を有するＡＭＰは、細菌膜を破壊して細胞溶解をもたらす。一部の例では、ＡＭＰは、細胞に侵入して細胞内標的と相互作用することにより、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質又は細胞壁合成に干渉し得る。微生物を死滅させることに加えて、ＡＭＰは、宿主遺伝子発現を変化させ、ケモカインとして役割を果たし且つ／又はケモカイン産生を誘導し、リポ多糖誘発性炎症誘発性サイトカイン産生を阻害し、創傷治癒を促進し、及び樹状細胞及び適応免疫応答細胞の応答を調節する能力を含め、感染のクリアランスに関わる幾つもの免疫調節機能を実証している。
【０１９４】
一部の例では、ＡＭＰは、本明細書に記載されるＡＭＰの機能的に活性な変異体である。一部の例では、ＡＭＰの変異体は、例えば、特定の領域にわたり又は配列全体にわたり、本明細書に記載されるＡＭＰ又は天然由来のＡＭＰの配列と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する。
【０１９５】
一部の例では、ＡＭＰは、生物工学的に操作され得、その生物活性を調節し、例えば増加若しくは低下させるか、又は調整するか、又は標的微生物を指定し得る。一部の例では、ＡＭＰは、細胞の翻訳機構（例えば、リボソーム等）によって産生される。一部の例では、ＡＭＰは、化学的に合成される。一部の例では、ＡＭＰは、ポリペプチド前駆体に由来する。ポリペプチド前駆体は、切断（例えば、プロテアーゼによるプロセシング）を受けると、ＡＭＰ自体のポリペプチドを生じさせることができる。このように、一部の例では、ＡＭＰは、前駆体ポリペプチドから産生される。一部の例では、ＡＭＰは、翻訳後修飾、例えば切断又は１つ以上の官能基の付加を受けたポリペプチドを含む。
【０１９６】
本明細書に記載されるＡＭＰは、本明細書に記載される任意の使用のために組成物に製剤化され得る。本明細書に開示される組成物は、少なくとも約１つのＡＭＰ、２、３、４、５、１０、１５、２０又はそれを超えるＡＭＰのいずれか１つなど、任意の数又は種類（例えば、クラス）のＡＭＰを含み得る。組成物中の各ＡＭＰの好適な濃度は、ＡＭＰの有効性、安定性、組成物中にある異なるＡＭＰの数、製剤及び組成物の施用方法などの要因に依存する。一部の例では、液体組成物中の各ＡＭＰは、約０．１ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬである。一部の例では、固体組成物中の各ＡＭＰは、約０．１ｎｇ／ｇ〜約１００ｍｇ／ｇである。一部の例では、ここで、本組成物は、少なくとも２種類のＡＭＰを含み、ＡＭＰの各種類の濃度は、同じであるか又は異なり得る。
【０１９７】
本明細書に記載されるとおりのＡＭＰを含む調節薬剤は、（ａ）標的宿主の内部で目標レベル（例えば、所定又は閾値レベル）のＡＭＰ濃度に達する；（ｂ）標的宿主の腸の内部で目標レベル（例えば、所定又は閾値レベル）のＡＭＰ濃度に達する；（ｃ）標的宿主のバクテリオサイトの内部で目標レベル（例えば、所定又は閾値レベル）のＡＭＰ濃度に達する；（ｄ）標的宿主の１つ以上の微生物（例えば、内部共生体）のレベル又は活動を調節する；又は／及び（ｅ）標的宿主の適応度を調節するのに十分な量で且つ十分な時間にわたって標的宿主と接触させることができる。
【０１９８】
（ｄ）根粒Ｃリッチペプチド
本明細書に記載される調節薬剤は、根粒Ｃリッチペプチド（ＮＣＲペプチド）を含み得る。ＮＣＲペプチドは、ある種のマメ科植物で生産され、植物細胞が何千もの細胞内内部共生体を含有する根粒の形成をもたらすリゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）の細菌（根粒菌）との植物の相利共生的窒素固定共生において重要な役割を果たす。ＮＣＲペプチドは、細菌の不可逆的な最終分化過程を指図する抗微生物特性を備え、それにより例えば細菌膜を透過処理し、細胞分裂を破綻させるか又はタンパク質合成を阻害する。例えば、アルファルファ根粒菌（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）に感染したメディカゴ・トルンカトゥラ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）根粒細胞では、高い倍数性の窒素固定バクテロイドへの細菌の不可逆的な分化を指図する何百ものＮＣＲペプチドが生産される）。ＮＣＲペプチドの非限定的な例を表７に挙げる。
【０１９９】
【表４８】
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【０２００】
【表４９】
2020505067.tif 000051
【０２０１】
【表５０】
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【０２０２】
【表５１】
2020505067.tif 000053
【０２０３】
【表５２】
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【０２０４】
【表５３】
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【０２０５】
【表５４】
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【０２０６】
【表５５】
2020505067.tif 000057
【０２０７】
【表５６】
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【０２０８】
【表５７】
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【０２０９】
【表５８】
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【０２１０】
【表５９】
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【０２１１】
【表６０】
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【０２１２】
【表６１】
2020505067.tif 000063
【０２１３】
当該技術分野において公知の任意のＮＣＲペプチドは、本明細書に記載される方法又は組成物における使用に好適である。ＮＣＲペプチド生産植物としては、限定はされないが、ピスム・サティブム（Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ）（エンドウマメ）、アストラガルス・シニクス（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ  ｓｉｎｉｃｕｓ）（ＩＲＬＣマメ科植物）、ファセオルス・ブルガリス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）（インゲンマメ）、ビグナ・ウンギクラタ（Ｖｉｇｎａ  ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔａ）（ササゲ）、メディカゴ・トルンカトゥラ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）（タルウマゴヤシ）及びロトゥス・ジャポニクス（Ｌｏｔｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）が挙げられる。例えば、Ｍ．トルンカトゥラ（Ｍ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）のゲノム配列から６００を超える候補ＮＣＲペプチドが予測され、根粒から分離された細胞において約１５０の異なるＮＣＲペプチドが質量分析法によって検出されている。
【０２１４】
本明細書に記載されるＮＣＲペプチドは、成熟又は未成熟ＮＣＲペプチドであり得る。未成熟ＮＣＲペプチドは、小胞体への移行に必要であり且つ移行後に切断されるＣ末端シグナルペプチドを有する。ＮＣＲペプチドのＮ末端は、分泌経路への標的化のためのシグナルペプチドを含み、これは、切断可能であり得る。ＮＣＲペプチドは、概して、その構造を安定化させるジスルフィド架橋を有する小さいペプチドである。成熟ＮＣＲペプチドは、約２０〜約６０アミノ酸、約２５〜約５５アミノ酸、約３０〜約５０アミノ酸、約３５〜約４５アミノ酸の範囲又はその間にある任意の範囲の長さを有する。ＮＣＲペプチドは、システイン残基の保存配列を含み、残りのペプチド配列は、極め可変的であり得る。ＮＣＲペプチドは、概して約４つ又は８つのシステインを有する。
【０２１５】
ＮＣＲペプチドは、アニオン性、中性又はカチオン性であり得る。一部の例では、約８より高いｐＩを有する合成カチオン性ＮＣＲペプチドが抗微生物活性を有する。例えば、ＮＣＲ２４７（ｐＩ＝１０．１５、ＲＮＧＣＩＶＤＰＲＣＰＹＱＱＣＲＲＰＬＹＣＲＲＲ；配列番号１６４）及びＮＣＲ３３５（ｐＩ＝１１．２２）は、両方ともグラム陰性及びグラム陽性細菌並びに真菌に対して有効である。一部の例では、ＮＣＲ００１（ＭＡＱＦＬＬＦＶＹＳＬＩＩＦＬＳＬＦＦＧＥＡＡＦＥＲＴＥＴＲＭＬＴＩＰＣＴＳＤＤＮＣＰＫＶＩＳＰＣＨＴＫＣＦＤＧＦＣＧＷＹＩＥＧＳＹＥＧＰ；配列番号１６５）などの中性及び／又はアニオン性ＮＣＲペプチドは、約８より高いｐＩで抗微生物活性を有しない。
【０２１６】
一部の例では、ＮＣＲペプチドは細菌を死滅させるのに有効である。一部の例では、ＮＣＲペプチドは、アルファルファ根粒菌（Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ）、ゼノラブダス属種（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ  ｓｐｐ）、フォトラブダス属種（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ  ｓｐｐ）、カンディダトゥス属種（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  ｓｐｐ）、ブフネラ属種（Ｂｕｃｈｎｅｒａ  ｓｐｐ）、ブラッタバクテリウム属種（Ｂｌａｔｔａｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ）、バウマンニア属種（Ｂａｕｍａｎｉａ  ｓｐｐ）、ウィグルスウォーチア属種（Ｗｉｇｇｌｅｓｗｏｒｔｈｉａ  ｓｐｐ）、ボルバキア属種（Ｗｏｌｂａｃｈｉａ  ｓｐｐ）、リケッチア属種（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｓｐｐ）、オリエンティア属種（Ｏｒｉｅｎｔｉａ  ｓｐｐ）、ソーダリス属種（Ｓｏｄａｌｉｓ  ｓｐｐ）、バークホルデリア属種（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐｐ）、カプリアビダス属種（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｓｐｐ）、フランキア属種（Ｆｒａｎｋｉａ  ｓｐｐ）、シノリゾビウム属種（Ｓｎｉｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐｐ）、ストレプトコッカス属種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ）、ウォリネラ属種（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ  ｓｐｐ）、キシレラ属種（Ｘｙｌｅｌｌａ  ｓｐｐ）、エルウィニア属種（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｓｐｐ）、アグロバクテリウム属種（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ）、バチルス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ）、パエニバチルス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ）、ストレプトミセス属種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ）、ミクロコッカス属種（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ）、コリネバクテリウム属種（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ）、アセトバクター属種（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ）、シアノバクテリア属種（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｓｐｐ）、サルモネラ属種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ）、ロドコッカス属種（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ）、シュードモナス属種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ）、ラクトバチルス属種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ）、エンテロコッカス属種（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ）、アルカリゲネス属種（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐｐ）、クレブシエラ属種（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ）、パエニバチルス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ）、アルスロバクター属種（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ）、コリネバクテリウム属種（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ）、ブレビバクテリウム属種（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ）、サーマス属種（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｐｐ）、シュードモナス属種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ）、クロストリジウム属種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ）又は大腸菌属種（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｓｐｐ）を死滅させるのに有効である。
【０２１７】
一部の例では、ＮＣＲペプチドは、本明細書に記載されるＮＣＲペプチドの機能的に活性な変異体である。一部の例では、ＮＣＲペプチドの変異体は、例えば、特定の領域にわたり又は配列全体にわたり、本明細書に記載されるＮＣＲペプチド又は天然由来のＮＣＲペプチドの配列と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する。
【０２１８】
一部の例では、ＮＣＲペプチドは、生物工学的に操作され得、その生物活性を調節し、例えば増加若しくは低下させるか、又は調整するか、又は標的微生物を指定し得る。一部の例では、ＮＣＲペプチドは、細胞の翻訳機構（例えば、リボソーム等）によって産生される。一部の例では、ＮＣＲペプチドは、化学的に合成される。一部の例では、ＮＣＲペプチドは、ポリペプチド前駆体に由来する。ポリペプチド前駆体は、切断（例えば、プロテアーゼによるプロセシング）を受けると、ＮＣＲペプチド自体を生じさせることができる。このように、一部の例では、ＮＣＲペプチドは、前駆体ポリペプチドから産生される。一部の例では、ＮＣＲペプチドは、翻訳後修飾、例えば切断又は１つ以上の官能基の付加を受けたポリペプチドを含む。
【０２１９】
本明細書に記載されるＮＣＲペプチドは、本明細書に記載される任意の使用のために組成物に製剤化され得る。本明細書に開示される組成物は、少なくとも約１つのＮＣＲペプチド、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、１００又はそれを超えるＮＣＲペプチドのいずれか１つなど、任意の数又は種類のＮＣＲペプチドを含み得る。組成物中の各ＮＣＲペプチドの好適な濃度は、ＮＣＲペプチドの有効性、安定性、異なるＮＣＲペプチドの数、製剤及び組成物の施用方法などの要因に依存する。一部の例では、液体組成物中の各ＮＣＲペプチドは、約０．１ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬである。一部の例では、固体組成物中の各ＮＣＲペプチドは、約０．１ｎｇ／ｇ〜約１００ｍｇ／ｇである。一部の例では、ここで、本組成物は、少なくとも２種類のＮＣＲペプチドを含み、ＮＣＲペプチドの各種類の濃度は、同じであるか又は異なり得る。
【０２２０】
本明細書に記載されるとおりのＮＣＲペプチドを含む調節薬剤は、（ａ）標的宿主の内部で目標レベル（例えば、所定又は閾値レベル）のＮＣＲペプチド濃度に達する；（ｂ）標的宿主の腸の内部で目標レベル（例えば、所定又は閾値レベル）のＮＣＲペプチド濃度に達する；（ｃ）標的宿主のバクテリオサイトの内部で目標レベル（例えば、所定又は閾値レベル）のＮＣＲペプチド濃度に達する；（ｄ）標的宿主の１つ以上の微生物（例えば、内部共生体）のレベル又は活動を調節する；又は／及び（ｅ）標的宿主の適応度を調節するのに十分な量で且つ十分な時間にわたって標的宿主と接触させることができる。
【０２２１】
（ｅ）バクテリオサイト調節性ペプチド
本明細書に記載される調節薬剤は、バクテリオサイト調節性ペプチド（ＢＲＰ）を含み得る。ＢＲＰは、昆虫のバクテリオサイトに発現するペプチドである。この遺伝子は、初めに発育時点で共生体の取り込みと同時に発現し、そのバクテリオサイト特異的発現が昆虫の生涯にわたって維持される。一部の例では、ＢＲＰは、疎水性アミノ末端ドメインを有し、これは、シグナルペプチドであると予想されている。加えて、一部のＢＲＰは、システインリッチドメインを有する。一部の例では、バクテリオサイト調節性ペプチドは、バクテリオサイト特異的システインリッチ（ＢＣＲ）タンパク質である。バクテリオサイト調節性ペプチドは、長さが約４０〜１５０アミノ酸である。一部の例では、バクテリオサイト調節性ペプチドは、長さが約４５〜約１４５、約５０〜約１４０、約５５〜約１３５、約６０〜約１３０、約６５〜約１２５、約７０〜約１２０、約７５〜約１１５、約８０〜約１１０、約８５〜約１０５の範囲又はその間にある任意の範囲である。ＢＲＰ及びその活性の非限定的な例を表８に挙げる。
【０２２２】
【表６２】
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【０２２３】
【表６３】
2020505067.tif 000065
【０２２４】
一部の例では、ＢＲＰは、宿主のバクテリオサイトに常在する１つ以上の細菌の成長及び／又は活動を変化させる。一部の例では、ＢＲＰは、生物工学的に操作され得、その生物活性を調節するか（例えば、増加させるか、低下させるか、若しくは調整し）、又は標的微生物を指定し得る。一部の例では、ＢＲＰは、細胞の翻訳機構（例えば、リボソーム等）によって産生される。一部の例では、ＢＲＰは、化学的に合成される。一部の例では、ＢＲＰは、ポリペプチド前駆体に由来する。ポリペプチド前駆体は、切断（例えば、プロテアーゼによるプロセシング）を受けると、ＢＲＰ自体のポリペプチドを生じさせることができる。このように、一部の例では、ＢＲＰは、前駆体ポリペプチドから産生される。一部の例では、ＢＲＰは、翻訳後修飾、例えば切断又は１つ以上の官能基の付加を受けたポリペプチドを含む。
【０２２５】
本明細書に記載されるとおりのＢＲＰの機能的に活性な変異体も、本明細書に記載される組成物及び方法において有用である。一部の例では、ＢＲＰの変異体は、例えば、特定の領域にわたり又は配列全体にわたり、本明細書に記載されるＢＲＰ又は天然由来のＢＲＰの配列と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する。
【０２２６】
本明細書に記載されるＢＲＰは、本明細書に記載される任意の使用のために組成物に製剤化され得る。本明細書に開示される組成物は、少なくとも約１つのＢＲＰ、２、３、４、５、１０、１５、２０又はそれを超えるＢＲＰのいずれか１つなど、任意の数又は種類（例えば、クラス）のＢＲＰを含み得る。組成物中の各ＢＲＰの好適な濃度は、ＢＲＰの有効性、安定性、異なるＢＲＰの数、製剤及び組成物の施用方法などの要因に依存する。一部の例では、液体組成物中の各ＢＲＰは、約０．１ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬである。一部の例では、固体組成物中の各ＢＲＰは、約０．１ｎｇ／ｇ〜約１００ｍｇ／ｇである。一部の例では、ここで、本組成物は、少なくとも２種類のＢＲＰを含み、ＢＲＰの各種類の濃度は、同じであるか又は異なり得る。
【０２２７】
本明細書に記載されるとおりのＢＲＰを含む調節薬剤は、（ａ）標的宿主の内部で目標レベル（例えば、所定又は閾値レベル）のＢＲＰ濃度に達する；（ｂ）標的宿主の腸の内部で目標レベル（例えば、所定又は閾値レベル）のＢＲＰ濃度に達する；（ｃ）標的宿主のバクテリオサイトの内部で目標レベル（例えば、所定又は閾値レベル）のＢＲＰ濃度に達する；（ｄ）標的宿主の１つ以上の微生物（例えば、内部共生体）のレベル又は活動を調節する；又は／及び（ｅ）標的宿主の適応度を調節するのに十分な量で且つ十分な時間にわたって標的宿主と接触させることができる。
【０２２８】
ｉｉｉ．小分子
多くの小分子（例えば、抗生物質又は代謝産物）を、本明細書に記載される組成物及び方法において使用し得る。一部の例では、本明細書に記載される小分子の有効濃度は、宿主に常在する１つ以上の微生物（本明細書に記載されるとおり）のレベル、活動又は代謝を変化させることができ、この変化が宿主の適応度の増加をもたらし得る。
【０２２９】
本明細書に記載されるとおりの小分子を含む調節薬剤は、（ａ）標的宿主の内部で目標レベル（例えば、所定又は閾値レベル）の小分子濃度に達する；（ｂ）標的宿主の腸の内部で目標レベル（例えば、所定又は閾値レベル）の小分子濃度に達する；（ｃ）標的宿主のバクテリオサイトの内部で目標レベル（例えば、所定又は閾値レベル）の小分子濃度に達する；（ｄ）標的宿主の１つ以上の微生物（例えば、内部共生体）のレベル又は活動を調節する；又は／及び（ｅ）標的宿主の適応度を調節するのに十分な量で且つ十分な時間にわたって標的宿主と接触させることができる。
【０２３０】
ミツバチ及びカイコなどの昆虫の適応度を増加させるため、以下で考察する小分子、即ち抗生物質及び二次代謝産物を使用して、本節に示されるとおりの標的微生物のレベル、活動又は代謝を変化させることができる。
【０２３１】
（ａ）抗生物質
本明細書に記載される調節薬剤は、抗生物質を含み得る。当該技術分野において公知の任意の抗生物質を使用し得る。抗生物質は、通常、その作用機構、化学構造又は活性スペクトルに基づいて分類される。
【０２３２】
本明細書に記載される抗生物質は、任意の細菌機能又は成長過程を標的とし得、静菌性（例えば、細菌成長を遅らせ又は妨げる）又は殺菌性（例えば、細菌を死滅させる）のいずれであり得る。一部の例では、抗生物質は、殺菌性抗生物質である。一部の例では、殺菌性抗生物質は、細菌細胞壁を標的とするもの（例えば、ペニシリン系及びセファロスポリン系）；細胞膜を標的とするもの（例えば、ポリミキシン系）；又は必須細菌酵素を阻害するもの（例えば、リファマイシン系、リピアルマイシン系、キノロン系及びスルホンアミド系）である。一部の例では、殺菌性抗生物質は、アミノグリコシドである。一部の例では、抗生物質は、静菌性抗生物質である。一部の例では、静菌性抗生物質は、タンパク質合成を標的とする（例えば、マクロライド系、リンコサミド系及びテトラサイクリン系）。本明細書で使用し得る更なる抗生物質クラスとしては、環状リポペプチド系（ダプトマイシンなど）、グリシルサイクリン系（チゲサイクリンなど）、オキサゾリジノン系（リネゾリドなど）又はリピアルマイシン系（フィダキソマイシンなど）が挙げられる。抗生物質の例としては、リファンピシン、シプロフロキサシン、ドキシサイクリン、アンピシリン及びポリミキシンＢが挙げられる。抗生物質の非限定的な例を表９に掲載する。
【０２３３】
【表６４】
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【０２３４】
本明細書に記載される抗生物質は、任意のレベルの標的特異性を有し得る（例えば、狭域又は広域スペクトル）。一部の例では、抗生物質は、狭域スペクトル抗生物質であり、従ってグラム陰性又はグラム陽性細菌などの特異的なタイプの細菌を標的とする。或いは、抗生物質は、広範囲の細菌を標的とする広域スペクトル抗生物質であり得る。
【０２３５】
本明細書に記載される抗生物質は、本明細書に記載される任意の使用のために組成物に製剤化され得る。本明細書に開示される組成物は、少なくとも約１つの抗生物質、２、３、４、５、１０、１５、２０又はそれを超える抗生物質（例えば、リファンピシンとドキシサイクリンとの併用又はアンピシリンとリファンピシンとの併用）のいずれか１つなど、任意の数又は種類（例えば、クラス）の抗生物質を含み得る。組成物中の各抗生物質の好適な濃度は、抗生物質の有効性、安定性、異なる抗生物質の数、製剤及び組成物の施用方法などの要因に依存する。一部の例では、ここで、本組成物は、少なくとも２種類の抗生物質を含み、抗生物質の各種類の濃度は、同じであるか又は異なり得る。
【０２３６】
本明細書に記載されるとおりの抗生物質を含む調節薬剤は、（ａ）標的宿主の内部で目標レベル（例えば、所定又は閾値レベル）の抗生物質濃度に達する；（ｂ）標的宿主の腸の内部で目標レベル（例えば、所定又は閾値レベル）の抗生物質濃度に達する；（ｃ）標的宿主のバクテリオサイトの内部で目標レベル（例えば、所定又は閾値レベル）の抗生物質濃度に達する；（ｄ）標的宿主の１つ以上の微生物（例えば、内部共生体）のレベル又は活動を調節する；又は／及び（ｅ）標的宿主の適応度を調節するのに十分な量で且つ十分な時間にわたって標的宿主と接触させることができる。
【０２３７】
（ｂ）二次代謝産物
一部の例では、本明細書に記載される組成物及び方法の調節薬剤は、二次代謝産物を含む。二次代謝産物は、生物によって生産される有機分子に由来する。二次代謝産物は、（ｉ）細菌、真菌、アメーバ、植物、昆虫及び大型動物に対して使用される競合薬剤；（ｉｉ）金属運搬薬剤；（ｉｉｉ）微生物と植物、線虫、昆虫及び高等動物との間の共生薬剤；（ｉｖ）性ホルモン；及び（ｖ）分化エフェクターとして作用し得る。二次代謝産物の非限定的な例を表１０に掲載する。
【０２３８】
【表６５】
2020505067.tif 000067
【０２３９】
本明細書で使用される二次代謝産物には、任意の公知の二次代謝産物群からの代謝産物が含まれ得る。例えば、二次代謝産物は、以下の群に分類することができる：アルカロイド類、テルペノイド類、フラボノイド類、グリコシド類、天然フェノール類（例えば、ゴシポール酢酸）、エナール類（例えば、ｔｒａｎｓ−シンナムアルデヒド）、フェナジン類、ビフェノール類及びジベンゾフラン類、ポリケチド類、脂肪酸シンターゼペプチド、非リボソーム性ペプチド、リボソーム合成ペプチド及び翻訳後修飾ペプチド、ポリフェノール類、多糖類（例えば、キトサン）及びバイオポリマー類。二次代謝産物の詳細なレビューについては、例えば、Ｖｉｎｉｎｇ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４４：３９５−４２７，１９９０を参照されたい。
【０２４０】
本明細書に記載される組成物及び方法に有用な二次代謝産物としては、内部共生体（例えば、一次又は二次内部共生体）、バクテリオサイト又は細胞外共生体の天然の機能を変化させるものが挙げられる。一部の例では、本明細書に記載される１つ以上の二次代謝産物は、抗微生物化合物に関するハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）から分離される。例えば、ＨＴＳスクリーニングにより、１つの特定領域の多様な生態系で成長する生物からの３９，０００を超える粗抽出物からグラム陽性及びグラム陰性細菌に対する特異性を有する４９の抗細菌性抽出物が同定された。一部の例では、二次代謝産物は、バクテリオサイト内で輸送される。
【０２４１】
一部の例では、小分子は、ビタミン合成の阻害薬である。一部の例では、ビタミン合成阻害薬は、ビタミン前駆類似体である。特定の例では、ビタミン前駆類似体は、パントテノールである。
【０２４２】
一部の例では、小分子は、アミノ酸類似体である。特定の例では、アミノ酸類似体は、Ｌ−カナバニン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−バリン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−スレオニン、Ｄ−ロイシン、Ｌ−ＮＧ−ニトロアルギニン又はこれらの組み合わせである。
【０２４３】
一部の例では、小分子は、プロピオン酸、レブリン酸、ｔｒａｎｓ−シンナムアルデヒド、ナイシン又は低分子量キトサンなどの天然抗微生物化合物である。本明細書に記載される二次代謝産物は、本明細書に記載される任意の使用のために組成物に製剤化され得る。本明細書に開示される組成物は、少なくとも約１つの二次代謝産物、２、３、４、５、１０、１５、２０又はそれを超える二次代謝産物のいずれか１つなど、任意の数又は種類（例えば、クラス）の二次代謝産物を含み得る。組成物中の各二次代謝産物の好適な濃度は、二次代謝産物の有効性、安定性、異なる二次代謝産物の数、製剤及び組成物の施用方法などの要因に依存する。一部の例では、ここで、本組成物は、少なくとも２種類の二次代謝産物を含み、二次代謝産物の各種類の濃度は、同じであるか又は異なり得る。
【０２４４】
本明細書に記載されるとおりの二次代謝産物を含む調節薬剤は、（ａ）標的宿主の内部で目標レベル（例えば、所定又は閾値レベル）の二次代謝産物濃度に達する；（ｂ）標的宿主の腸の内部で目標レベル（例えば、所定又は閾値レベル）の二次代謝産物濃度に達する；（ｃ）標的宿主のバクテリオサイトの内部で目標レベル（例えば、所定又は閾値レベル）の二次代謝産物濃度に達する；（ｄ）標的宿主の１つ以上の微生物（例えば、内部共生体）のレベル又は活動を調節する；又は／及び（ｅ）標的宿主の適応度を調節するのに十分な量で且つ十分な時間にわたって標的宿主と接触させることができる。
【０２４５】
ｉｖ．調節薬剤としての細菌
一部の例では、本明細書に記載される調節薬剤は、１つ以上の細菌を含む。多くの細菌は、本明細書に記載される組成物及び方法に有用である。一部の例では、薬剤は、宿主に内因的に見られる細菌種である。一部の例では、細菌性調節薬剤は、内部共生細菌種である。調節薬剤として使用し得る細菌の非限定的な例としては、本明細書で詳細な説明の第ＩＩ節に記載されるあらゆる細菌種及び第１５頁から始まる表１に挙げられるものが含まれる。例えば、調節薬剤は、ガンマプロテオバクテリア綱（Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、アルファプロテオバクテリア（Ａｌｐｈａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、ベータプロテオバクテリア（Ｂｅｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）、フィルミクテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）（例えば、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）及びバチルス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．））、クロストリジウム綱（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）、放線菌類（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）、スピロヘータ門（Ｓｐｉｒｏｃｈｅｔｅｓ）、ウェルコミクロビウム門（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ）及び放線菌門（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）を含め、昆虫の腸に存在する任意の細菌門からの細菌種であり得る。
【０２４６】
一部の例では、調節薬剤は、微生物多様性を促進するか又は別様に宿主の微生物叢を好ましい方式で変化させる細菌である。１つの例では、細菌を提供してミツバチのマイクロバイオームの発育が促進され得る。例えば、調節薬剤には、例えば、バルトネラ・アピス（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  ａｐｉｓ）、パラサッカリバクター・アピウム（Ｐａｒａｓａｃｃｈａｒｉｂａｃｔｅｒ  ａｐｉｕｍ）、フリシェラ・ペララ（Ｆｒｉｓｃｈｅｌｌａ  ｐｅｒｒａｒａ）、スノッドグラセラ・アルビ（Ｓｎｏｄｇｒａｓｓｅｌｌａ  ａｌｖｉ）、ギリアメラ・アピコラ（Ｇｉｌｌｉａｍｅｌａ  ａｐｉｃｏｌａ）、ビフィドバクテリウム属種（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ）又はラクトバチルス属種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ）が含まれ得る。
【０２４７】
ミツバチ及びカイコなどの昆虫の適応度を増加させるため、本明細書で考察される細菌性調節薬剤を使用して、諸節に示されるとおりの標的微生物のレベル、活動又は代謝を変化させることができる。
【０２４８】
一部の例では、かかる細菌性調節薬剤は、殺虫剤を含めた表１２に提示されるとおりの農薬の分解能を有する細菌である。かかる殺虫剤としては、イミダクロプリドなどのネオニコチノイド系又はフェニトロチオンなどの有機リン系殺虫剤が挙げられる。一部の例では、農薬代謝細菌は、少なくとも１００，０００細胞／ｍｌ（例えば、少なくとも約１００，０００細胞／ｍｌ、少なくとも約１５０，０００細胞／ｍｌ、少なくとも約２００，０００細胞／ｍｌ、少なくとも約２５０，０００細胞／ｍｌ、少なくとも約３００，０００細胞／ｍｌ、少なくとも約３５０，０００細胞／ｍｌ、少なくとも約４００，０００細胞／ｍｌ、少なくとも約４５０，０００細胞／ｍｌ又は少なくとも約５００，０００細胞／ｍｌ）の濃度である。
【０２４９】
実施例１〜３、５及び６は、どのようにイミダクロプリド及びフェニトロチオン分解微生物を同定することができ、次にそれをミツバチなどの昆虫宿主における調節薬剤として使用して、処理を受けた昆虫宿主に競争上の優位性を与えることができるかについて記載する。かかる農薬分解微生物、例えばイミダクロプリド分解又はフェニトロチオン分解微生物をミツバチなどの昆虫宿主に投与することは、宿主に常在する１つ以上の微生物のレベル、活動又は代謝の変化に包含されるものと理解される。
【０２５０】
一部の例では、かかる細菌性調節薬剤は、アミノ酸（例えば、メチオニン又はグルタミン酸）を含めた栄養素の生産能を有する細菌である。栄養素生産細菌は、天然に存在する細菌、例えば昆虫宿主にとって外因性の天然に存在する細菌であり得る。かかる細菌は、環境サンプルに見られるものなど、細菌の個体群から分離し得る。アミノ酸生産細菌を投与されていない宿主と比べて宿主におけるアミノ酸の生産量が増加するように１つ以上のアミノ酸を生産する細菌を分離することができる。宿主中の細菌が生産し得るアミノ酸としては、メチオニン、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン又はバリンが挙げられる。特定の例では、アミノ酸生産細菌は、メチオニン生産細菌である。
【０２５１】
一部の例では、栄養素生産細菌（例えば、アミノ酸生産細菌、例えばメチオニン生産細菌）は、少なくとも１００，０００細胞／ｍｌ（例えば、少なくとも約１００，０００細胞／ｍｌ、少なくとも約１５０，０００細胞／ｍｌ、少なくとも約２００，０００細胞／ｍｌ、少なくとも約２５０，０００細胞／ｍｌ、少なくとも約３００，０００細胞／ｍｌ、少なくとも約３５０，０００細胞／ｍｌ、少なくとも約４００，０００細胞／ｍｌ、少なくとも約４５０，０００細胞／ｍｌ又は少なくとも約５００，０００細胞／ｍｌ）の濃度である。
【０２５２】
実施例８、９及び１０は、どのようにメチオニン生産微生物を同定することができ、次にそれをミツバチなどの昆虫宿主又はモデル生物ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）における調節薬剤として使用して宿主の適応度を増加させる（例えば、アミノ酸含有量（例えば、メチオニン含有量又はグルタミン酸含有量を増加させる）ことができるかについて記載する。
【０２５３】
ｖ．調節薬剤に対する修飾
（ａ）融合
本明細書に記載される調節薬剤のいずれも追加的な部分に融合又は連結し得る。一部の例では、調節薬剤には、１つ以上の追加的な部分（例えば、１つの追加的な部分、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれを超える追加的な部分）の融合物が含まれる。一部の例では、追加的な部分は、本明細書に記載される調節薬剤（例えば、ペプチド、ポリペプチド、小分子又は抗生物質）のいずれか１つである。或いは、追加的な部分は、調節薬剤自体として作用しなくてもよく、代わりに二次的機能を果たし得る。例えば、追加的な部分は、宿主の標的部位（例えば、宿主の腸又は宿主のバクテリオサイト）において又は宿主（例えば、ミツバチ又はカイコ）に常在する標的微生物において調節薬剤の到達、結合又は活性化を促進し得る。
【０２５４】
一部の例では、追加的な部分は、調節薬剤が標的宿主細胞又は宿主に常在する標的微生物に侵入することを促進し得る。例えば、追加的な部分には、細胞透過性ペプチドが含まれ得る。細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）は、タンパク質に由来する天然配列；２つの天然配列の融合によって形成されるキメラペプチド；又は構造−活性研究に基づいて合成的に設計された配列である合成ＣＰＰであり得る。一部の例では、ＣＰＰは、限られた毒性で細胞膜（例えば、原核及び真核細胞膜）を遍在的に通過する能力を有する。更に、ＣＰＰは、特定の受容体によるキラル認識の必要なしに、エネルギー依存性及び／又は非依存性機構によって細胞膜を通過する能力を有し得る。ＣＰＰは、本明細書に記載される任意の調節薬剤に結合させることができる。例えば、ＣＰＰは、細胞透過性ペプチドに融合した抗微生物ペプチド（ＡＭＰ）、例えばサソリペプチド、例えばＵＹ１９２（例えば、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＦＬＳＴＩＷＮＧＩＫＧＬＬＦＡＭ；配列番号１９８）に結合させることができる。ＣＰＰの非限定的な例を表１１に挙げる。
【０２５５】
【表６６】
2020505067.tif 000068
【０２５６】
他の例では、追加的な部分は、調節薬剤が宿主に常在する標的微生物（例えば、真菌又は細菌）に結合することを促進する。追加的な部分は、１つ以上のターゲティングドメインを含み得る。一部の例では、ターゲティングドメインは、調節薬剤を宿主の腸に常在する１つ以上の微生物（例えば、細菌又は真菌）に標的化し得る。一部の例では、ターゲティングドメインは、調節薬剤を宿主の特定の領域（例えば、宿主の腸又はバクテリオサイト）に標的化することにより、概して宿主の前記領域に存在する微生物に到達し得る。例えば、ターゲティングドメインは、調節薬剤を宿主の前腸、中腸又は後腸に標的化し得る。他の例では、ターゲティングドメインは、調節薬剤を宿主のバクテリオサイト及び／又は宿主バクテリオサイトに常在する１つ以上の特定の細菌に標的化し得る。例えば、ターゲティングドメインは、本明細書に記載される調節薬剤、例えばＡＭＰ、例えばサソリペプチド、例えばＵｙ１９２に結合したスノードロップ（Ｇａｌａｎｔｈｕｓ  ｎｉｖａｌｉｓ）レクチン又は凝集素（ＧＮＡ）であり得る。
【０２５７】
（ｂ）プレ又はプロドメイン
一部の例では、調節薬剤は、プレ又はプロアミノ酸配列を含み得る。例えば、調節薬剤は、プレ配列又はプロ配列の切断又は翻訳後修飾によって活性化され得る不活性なタンパク質又はペプチドであり得る。一部の例では、調節薬剤は、不活性化プレ配列又はプロ配列によって操作される。例えば、プレ配列又はプロ配列は、調節薬剤上の活性化部位、例えば受容体結合部位を隠し得るか又は調節薬剤のコンホメーション変化を誘導し得る。従って、プレ配列又はプロ配列の切断を受けると、調節薬剤が活性化される。
【０２５８】
或いは、調節薬剤は、プレ又はプロ小分子、例えば抗生物質を含み得る。調節薬剤は、宿主内部の標的環境で活性化され得る不活性な本明細書に記載される小分子であり得る。例えば、小分子は、宿主腸内が特定のｐＨに達したときに活性化され得る。
【０２５９】
（ｃ）リンカー
調節薬剤が追加的な部分に結び付いている例では、調節薬剤は、リンカーを更に含み得る。例えば、リンカーは、化学結合、例えば１つ以上の共有結合又は非共有結合であり得る。一部の例では、リンカーは、ペプチドリンカー（例えば、２、３、４、５、６、８、１０、１２、１４、１６、２０、２５、３０、３５、４０アミノ酸又はそれを超えて長い）であり得る。リンカーには、本明細書に記載される任意のフレキシブルリンカー、リジッドリンカー又は切断可能リンカーが含まれ得る。
【０２６０】
フレキシブルペプチドリンカーには、主にＧｌｙ及びＳｅｒ残基を有する配列を有するリンカー（「ＧＳ」リンカー）を含め、当該技術分野で一般的に使用されるもののいずれが含まれ得る。フレキシブルリンカーは、ある程度の動き又は相互作用を必要とするドメインをつなぎ合わせるのに有用となることもあり、小型の非極性（例えば、Ｇｌｙ）又は極性（例えば、Ｓｅｒ又はＴｈｒ）アミノ酸を含み得る。
【０２６１】
或いは、ペプチドリンカーは、リジッドリンカーであり得る。リジッドリンカーは、部分間を固定的な距離に保ってその独立した機能を維持するのに有用である。リジッドリンカーは、融合物中の１つ以上の構成成分の安定性又は生物活性を確保するためにドメインの空間的隔離が決定的に重要な場合にも有用であり得る。リジッドリンカーは、例えば、αヘリックス構造又はＰｒｏリッチ配列（ＸＰ）ｎ（ここで、Ｘは、任意のアミノ酸、好ましくはＡｌａ、Ｌｙｓ又はＧｌｕを意味する）を有し得る。
【０２６２】
更に他の例では、ペプチドリンカーは、切断可能リンカーであり得る。一部の例では、リンカーは、還元試薬又はプロテアーゼの存在下など、特定の条件下で切断され得る。インビボ切断可能リンカーは、ジスルフィド結合の可逆的な性質を利用し得る。一例としては、２つのＣｙｓ残基間におけるトロンビン感受性配列（例えば、ＰＲＳ）が挙げられる。インビトロでＣＰＲＳＣをトロンビン処理すると、トロンビン感受性配列の切断が起こる一方、可逆的ジスルフィド結合がインタクトなまま残る。かかるリンカーは、公知であり、例えばＣｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．６５（１０）：１３５７−１３６９，２０１３に記載されている。融合物中のリンカーの切断は、宿主の特定の細胞若しくは組織又は宿主に常在する微生物における条件下においてインビボで発現するプロテアーゼでも行われ得る。一部の例では、標的部位又は細胞への到達時、リンカーが切断されると、遊離した機能性の調節薬剤が放出され得る。
【０２６３】
本明細書に記載される融合物は、或いは、疎水性リンカー、例えば負電荷スルホン酸基；脂質、例えばポリ（−ＣＨ２−）炭化水素鎖、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基、その不飽和変種、そのアミド化された又は他にＮを含有する変種、非炭素リンカー；炭水化物リンカー；リン酸ジエステルリンカー又はその他、２つ以上の分子、例えば２つの調節薬剤を共有結合的に連結する能力を有する分子を含めた連結分子によって連結され得る。ロイシン、イソロイシン、バリン又は場合によりアラニン、フェニルアラニン又は更にはチロシン、メチオニン、グリシン又は他の疎水性残基がリッチな一連の残基など、調節薬剤の疎水性領域又は調節薬剤の疎水性伸長部を例えば介して調節薬剤が連結される疎水性脂質小球など、非共有結合リンカーも使用し得る。調節薬剤は、調節薬剤の正電荷部分が別の調節薬剤又は追加的な部分の負電荷に連結されるなど、電荷に基づいた化学を用いて連結され得る。
【０２６４】
ＩＶ．製剤及び組成物
本明細書に記載される組成物は、純粋な形態で製剤化されるか（例えば、組成物は調節薬剤のみを含む）、又は組成物の施用若しくは送達を促進するため１つ以上の追加的な薬剤（賦形剤、送達媒体、担体、希釈剤、安定剤など）と共に製剤化され得る。好適な賦形剤及び希釈剤の例としては、限定はされないが、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、生理食塩水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル及びプロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱油が挙げられる。
【０２６５】
一部の例では、本組成物は、送達媒体又は担体を含む。一部の例では、送達媒体は、賦形剤を含む。例示的賦形剤としては、限定はされないが、固体又は液体担体材料、溶媒、安定剤、徐放賦形剤、着色料及び界面活性物質（サーファクタント）が挙げられる。一部の例では、送達媒体は、安定化媒体である。一部の例では、安定化媒体は、安定化賦形剤を含む。例示的安定化賦形剤としては、限定はされないが、エポキシ化植物油、消泡剤、例えばシリコーン油、保存剤、粘性調節剤、結合剤及び粘着付与剤が挙げられる。一部の例では、安定化媒体は、調節薬剤に好適な緩衝液である。一部の例では、本組成物は、ポリマービーズ送達媒体にマイクロカプセル化される。一部の例では、安定化媒体は、調節薬剤をＵＶ及び／又は酸性条件から保護する。一部の例では、送達媒体は、ｐＨ緩衝液を含有する。一部の例では、本組成物は、例えば、５．０〜約８．０、約６．５〜約７．５又は約６．５〜約７．０のいずれか１つのｐＨ範囲を含め、約４．５〜約９．０の範囲のｐＨを有するように製剤化される。
【０２６６】
意図される目的及び優勢な状況に応じて、本組成物は、乳化性濃縮物、懸濁濃縮物、直接噴霧可能又は希釈可能な溶液、塗布可能なペースト、希釈エマルション、噴霧粉末、可溶性粉末、分散性粉末、水和性粉末、ダスト、顆粒、ポリマー物質にカプセル化されたもの、マイクロカプセル、泡、エアロゾル、二酸化炭素ガス調製物、錠剤、樹脂調製物、紙調製物、不織布調製物又は編物若しくは織物調製物に製剤化され得る。一部の例では、本組成物は、液体である。一部の例では、本組成物は、固体である。一部の例では、本組成物は、加圧エアロゾル缶などに入ったエアロゾルである。一部の例では、本組成物は、病害虫の廃棄物（糞便など）に存在する。一部の例では、本組成物は、生きている病害虫の体内又は体上に存在する。
【０２６７】
一部の例では、送達媒体は、宿主の飼料又は水である。他の例では、送達媒体は、宿主の飼料供給源である。一部の例では、送達媒体は、宿主のベイト飼料である。一部の例では、本組成物は、宿主によって摂取される摂食可能な薬剤である。一部の例では、本組成物は、宿主によって第２の宿主に送達され、第２の宿主によって摂取される。一部の例では、本組成物は、宿主又は第２の宿主によって摂取され、本組成物は、宿主又は第２の宿主の廃棄物（糞便など）を介して宿主又は第２の宿主の周囲に放出される。一部の例では、調節薬剤は、宿主が摂取するか、又はそのコロニーに持ち帰ることが意図されるベイト飼料中に含まれる。
【０２６８】
一部の例では、調節薬剤は、約０．０１％〜約１００％、約１％〜約９９．９％、約０．１％〜約１０％、約１％〜約２５％、約１０％〜約５０％、約５０％〜約９９％又は約０．１％〜約９０％のいずれか１つの活性成分（ファージ、溶解素又はバクテリオシンなど）など、組成物の約０．１％〜約１００％を占め得る。一部の例では、本組成物は、少なくとも０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又はそれを超えるもののいずれかの活性成分（ファージ、溶解素又はバクテリオシンなど）を含む。一部の例では、市販品として濃縮薬剤が好ましく、最終使用者は、通常、活性成分の濃度が実質的に低い希釈した薬剤を使用する。
【０２６９】
本明細書に記載される製剤のいずれも、ベイト、コイル、電気マット、燻煙製剤、燻蒸剤又はシートの形態で使用され得る。
【０２７０】
ｉ．液体製剤
本明細書に提供される組成物は、液体製剤であり得る。液体製剤は、概して水と混合されるが、一部の例では、担体としての作物油、ディーゼル燃料、灯油又は他の軽油と共に使用され得る。活性成分の量は、多くの場合に約０．５〜約８０重量パーセントの範囲である。
【０２７１】
乳化性濃縮製剤は、液体活性成分と、１つ以上の石油系溶媒と、製剤を水と混合してエマルションを形成することを可能にする薬剤とを含有し得る。かかる濃縮物は、農業、観賞植物及び芝生、林業、構造物、食品加工、家畜及び公衆衛生のための農薬製剤中に使用され得る。これは、小型の可搬式散布器から油圧散布器、少量地上散布器、ミストブロワ及び少量空中散布器に至る施用機器と適合性があり得る。一部の活性成分は、液体担体に易溶解性である。活性成分は、担体と混合すると、沈降又は分離しない溶液、例えば均一溶液を形成する。この種の製剤は、活性成分と、担体と、１つ以上の他の成分とを含み得る。溶液は、屋内及び屋外においていかなる種類の散布器でも使用され得る。
【０２７２】
一部の例では、本組成物は、逆エマルションとして製剤化され得る。逆エマルションは、水溶性活性成分が油担体中に分散したものである。逆エマルションは、活性成分を多量の石油系担体、通常、燃料油と混合可能にする乳化剤が必要である。逆エマルションは、ドリフトの低減に役立つ。他の製剤では、水滴が目標表面に達する前に蒸発し始めると、結果として極めて小さく軽い液滴となり、何らかの散布ドリフトが起こる。油は、水よりも蒸発が遅いため、逆エマルションの液滴は、縮小が小さく、より多くの活性成分が標的に到達する。油は、更に流亡を低減し、耐降雨性を向上させることを促進する。油は、更に表面被覆及び吸収の向上により粘着剤−展着剤としての役割を果たす。液滴は、比較的大きく重いため、葉の裏面への被覆を通じて染み込ませることは難しい。逆エマルションは、影響を受け易い標的外の場所へのドリフトが問題となり得る沿道で最も一般的に用いられる。
【０２７３】
流動性体又は液体製剤は、乳化性濃縮物及び水和性粉末の特徴の多くを合わせ持つ。製造者は、活性成分が水にも油にも溶解しない固体である場合にこれらの製剤を使用する。粘土などの物質に含浸させた活性成分を粉砕して微細粉末にする。次に、この粉末を少量の液体に懸濁する。得られる液体産物は、かなり濃厚である。流動性体及び液体は、乳化性濃縮物の特徴の多くを共有し、これらは、同様の欠点を有する。これらは、懸濁液中に保つのに適度の撹拌が必要であり、水和性粉末と同様に目に見える残渣が残る。
【０２７４】
流動性体／液体は、取り扱い及び散布が容易である。これらは、液体であるため、こぼれたり、跳ね返ったりしがちである。これらは、固体粒子を含有し、そのため、ノズル及びポンプの摩損の一因となる。流動性体及び液体懸濁物は、その容器内で沈降する。流動性体及び液体製剤は、沈降する傾向があるため、５ガロン以下の容器に詰めると混合し直し易くなる。
【０２７５】
エアロゾル製剤は、１つ以上の活性成分と溶媒とを含有する。ほとんどのエアロゾルが低率の活性成分を含有する。２つのタイプのエアロゾル製剤−加圧密閉容器に入って市販されている即時使用型と、製剤を煙又は霧として放出する電動式又はガソリン動力式エアロゾル発生器で使用される製品とがある。
【０２７６】
即時使用型エアロゾル製剤は、通常、ノズル弁の作動時に製剤を放出する小さい内蔵型ユニットである。圧力下の不活性ガスによって製剤が微細な開口部に押し通され、微細液滴を作り出す。こうした製品は、温室、建物内の狭い場所又は局所的な屋外場所に使用される。５〜５ポンドの活性成分を保持する市販のモデルは、通常、詰め替え可能である。
【０２７７】
煙又は霧エアロゾル製剤は、圧力下にない。これは、急激に回転するディスク又は加熱された表面を使用して液体製剤を微細なミスト又は霧（エアロゾル）に細かくする機械で使用される。
【０２７８】
ｉｉ．乾燥又は固体製剤
乾燥製剤は、２つのタイプ：即時使用型及び散布剤として施用するために水と混合しなければならない濃縮物に分けることができる。ほとんどのダスト製剤は、即時使用型であり、低率の活性成分（約１０重量パーセント未満）と、加えてタルク、チョーク、粘土、堅果の殻又は火山灰で作られた超微細な乾燥不活性担体とを含有する。個々のダスト粒子のサイズは、様々である。少数のダスト製剤は、濃縮物であり、高率の活性成分を含有する。これらを施用前に乾燥不活性担体と混合する。ダストは、常に乾燥して使用され、標的外の部位にドリフトし易い。
【０２７９】
ｉｉｉ．顆粒又はペレット製剤
一部の例では、本組成物は、顆粒として製剤化される。顆粒状製剤は、ダスト製剤と同様であり、但し顆粒状粒子の方が大きくて重い。粗粒子は、粘土、トウモロコシの穂軸又はクルミ殻などの材料から作られ得る。活性成分は、顆粒の外面を被覆するか、又はその中に吸収されるかのいずれかである。活性成分の量は、比較的少ないことができ、通常、約０．５〜約１５重量パーセントの範囲である。顆粒状製剤は、ほとんどの場合、土壌、土壌中で生活する昆虫又は線虫への施用に使用されるか、又は根から植物中に吸収される。顆粒状製剤は、時に、ドリフトを最小限に抑えるか、又は高密度の植生に浸透させるため、飛行機又はヘリコプターによって施用される。施用後、顆粒は、活性成分を徐々に放出し得る。一部の顆粒は、活性成分の放出に土壌水分を必要とする。顆粒状製剤は、幼虫のカ及び他の水生病害虫の防除にも使用される。顆粒は、農業、構造物、鑑賞植物、芝生、水生、道路用地及び公衆衛生（刺咬昆虫）のための病害虫防除活動において使用される。
【０２８０】
一部の例では、本組成物は、ペレットとして製剤化される。ほとんどのペレット製剤が顆粒状製剤と極めて良く類似しており、これらの用語は、同義的に使用される。しかしながら、ペレット製剤では、全ての粒子が同じ重量及び形状である。粒子が均一であるため、精密な施用機器で使用することが可能である。
【０２８１】
ｉｖ．粉末
一部の例では、本組成物は、粉末として製剤化される。一部の例では、本組成物は、水和性粉末として製剤化される。水和性粉末は、ダストに類似した微粉砕された乾燥製剤である。これは、通常、散布剤として施用するため、水と混合しなければならない。しかしながら、少数の製品は、ダストとしても、又は水和性粉末としても施用し得る  −  その選択は、施用者次第である。水和性粉末は、活性成分を約１〜約９５重量パーセント；場合により約５０パーセント超有する。粒子は、水に溶解しない。粒子は、絶えず撹拌して懸濁しない限り直ちに沈降する。粒子は、ほとんどの病害虫問題及び撹拌が可能なほとんどのタイプの散布機器で使用することができる。水和性粉末は、優れた残効性を有する。その物理的特性を理由として、大部分の製剤は、加工された多孔質材料、例えばコンクリート、石膏及び未加工木材などの表面上に留まる。そのような場合、水のみが材料に浸透する。
【０２８２】
一部の例では、本組成物は、可溶性粉末として製剤化される。可溶性粉末製剤は、水和性粉末と類似している。しかしながら、可溶性粉末は、水と混合すると容易に溶解し、真溶液を形成する。完全に混合した後に更なる撹拌は必要ない。可溶性粉末中の活性成分の量は、約１５〜約９５重量パーセントの範囲であり；場合により約５０パーセント超である。可溶性粉末は、水和性粉末のあらゆる利点を有し、且つ混合中に吸入の危険性があることを除き、不利な点が１つもない。
【０２８３】
一部の例では、本組成物は、水分散性顆粒として製剤化される。乾燥流動性体としても知られる水分散性顆粒は、代わりにダスト様であることを除いて水和性粉末に類似しており、計量が容易な小さい顆粒として製剤化される。水分散性顆粒は、施用するには水と混合しなければならない。水中に入ると、顆粒は、水和性粉末と同様に粉々に崩れて微細粒子になる。製剤を水中に懸濁しておくには絶えず撹拌する必要がある。活性成分の割合は、高く、往々にして９０重量パーセントにも上る。水分散性顆粒は、計量及び混合がより容易であることを除き、水和性粉末と同じ利点及び不利点の多くを共有する。粉立ちが少ないため、これは、取り扱い時に施用者に吸入危害を引き起こしにくい。
【０２８４】
ｖ．ベイト
一部の例では、本組成物は、ベイトを含む。ベイトは、固体、ペースト、ペレット又は粉末状形態など、任意の好適な形態であり得る。ベイトは、宿主によって運び去られ、前記宿主の個体群（例えば、コロニー又は巣箱）に持ち帰られることもある。ベイトは、次にコロニーの他のメンバーの飼料供給源としての役割を果たすことができ、従って多数の宿主、潜在的に宿主のコロニー全体に有効な調節薬剤を付与し得る。
【０２８５】
ベイトは、好適な「ハウジング」又は「トラップ」に提供することができる。かかるハウジング及びトラップは、市販されており、本明細書に記載される組成物を含むように既存のトラップを適合させることができる。ハウジング又はトラップは、例えば、箱形であり得るか、予め形成された状態で提供され得るか、又は例えば折り畳み可能なボール紙で形成され得る。ハウジング又はトラップに好適な材料としては、プラスチック及びボール紙、特に段ボール紙が挙げられる。トラップの内表面は、トラップ内に入った後の宿主の移動を制限するため粘着性物質で裏打ちされ得る。ハウジング又はトラップは、ベイトをその内部に入れて適所に保つことができる好適な陥凹部を含むことができる。宿主は、侵入後にトラップを容易に離れることができない一方、ハウジングは、「餌場」として役割を果たし、そこで宿主が摂餌し、捕食者の恐れなしに安心できる好ましい環境を宿主に提供するため、トラップは、ハウジングと区別される。
【０２８６】
ｖｉ．誘引剤
一部の例では、本組成物は、誘引剤（例えば、化学誘引剤）を含む。誘引剤は、組成物の近傍に成虫宿主又は幼若宿主（例えば、幼虫）を誘引し得る。誘引剤としては、動物、特に昆虫によって分泌される、同じ種の他の動物の行動又は発育に影響を及ぼす化学物質であるフェロモン類が挙げられる。他の誘引剤としては、糖及びタンパク質加水分解物のシロップ、酵母及び腐りかけの肉が挙げられる。誘引剤は、活性成分と組み合わされ、茎葉又は処理範囲にある他の物品にも噴霧され得る。
【０２８７】
宿主の行動、例えば宿主の餌探し、産卵又は交配場所又は交配相手に影響を及ぼす様々な誘引剤が公知である。本明細書に記載される方法及び組成物において有用な誘引剤としては、例えば、オイゲノール、プロピオン酸フェネチル、ジメチルイソブチルシクロプロパンカルボン酸エチル、ベンゾジオキサンカルボン酸プロピル、ｃｉｓ−７，８−エポキシ−２−メチルオクタデカン、ｔｒａｎｓ−８，ｔｒａｎｓ−０−ドデカジエノール、ｃｉｓ−９−テトラデセナール（加えてｃｉｓ−１１−ヘキサデセナール）、ｔｒａｎｓ−１１−テトラデセナール、ｃｉｓ−１１−ヘキサデセナール、（Ｚ）−１１，１２−ヘキサデカジエナール、酢酸ｃｉｓ−７−ドデセニル、酢酸ｃｉｓ−８−ドデセニル、酢酸ｃｉｓ−９−ドデセニル、酢酸ｃｉｓ−９−テトラデセニル、酢酸ｃｉｓ−１１−テトラデセニル、酢酸ｔｒａｎｓ−１１−テトラデセニル（加えてｃｉｓ−１１）、酢酸ｃｉｓ−９，ｔｒａｎｓ−１１−テトラデカジエニル（加えてｃｉｓ−９，ｔｒａｎｓ−１２）、酢酸ｃｉｓ−９，ｔｒａｎｓ−１２−テトラデカジエニル、酢酸ｃｉｓ−７，ｃｉｓ−１１−ヘキサデカジエニル（加えてｃｉｓ−７，ｔｒａｎｓ−１１）、酢酸ｃｉｓ−３，ｃｉｓ−１３−オクタデカジエニル、酢酸ｔｒａｎｓ−３，ｃｉｓ−１３−オクタデカジエニル、アネトール及びサリチル酸イソアミルが挙げられる。
【０２８８】
様々な波長又は色の光を含め、化学誘引剤以外の手段も昆虫の誘引に使用され得る。
【０２８９】
ｖｉｉ．ナノカプセル／マイクロカプセル化／リポソーム
一部の例では、本組成物は、マイクロカプセル化製剤で提供される。マイクロカプセル化製剤は、水と混合され、他の噴霧可能製剤と同じように噴霧される。噴霧後、プラスチックコーティングが破れ、活性成分が徐々に放出される。
【０２９０】
ｖｉｉｉ．担体
本明細書に記載される組成物のいずれも、本明細書に記載される調節薬剤と不活性担体とを含むように製剤化され得る。かかる担体は、固体担体、液体担体、ゲル担体及び／又はガス担体であり得る。特定の例では、担体は、種子コーティングであり得る。種子コーティングは、種子の表面に全面的に又は部分的に付着する任意の天然に存在しない製剤である。製剤は、アジュバント又は界面活性剤を更に含み得る。製剤は、作用域を拡大するために１つ以上の調節薬剤も含み得る。
【０２９１】
製剤に使用される固体担体としては、粘土（例えば、カオリン粘土、珪藻土、ベントナイト、フバサミ（Ｆｕｂａｓａｍｉ）粘土、酸性粘土等）、合成酸化ケイ素水和物、タルク、セラミック、他の無機ミネラル（例えば、セリサイト、石英、硫黄、活性炭、炭酸カルシウム、水和シリカ等）、昇華させることができる室温で固形の物質（例えば、２，４，６−トリイソプロピル−１，３，５−トリオキサン、ナフタレン、ｐ−ジクロロベンゼン、樟脳、アダマンタン等）；羊毛；絹；綿；麻；パルプ；合成樹脂（例えば、低密度ポリエチレン、直鎖低密度ポリエチレン及び高密度ポリエチレンなどのポリエチレン樹脂；エチレン−酢酸ビニル共重合体などのエチレン−ビニルエステル共重合体；エチレン−メタクリル酸メチル共重合体及びエチレン−メタクリル酸エチル共重合体などのエチレン−メタクリル酸エステル共重合体；エチレン−アクリル酸メチル共重合体及びエチレン−アクリル酸エチル共重合体などのエチレン−アクリル酸エステル共重合体；エチレン−アクリル酸共重合体などのエチレン−ビニルカルボン酸共重合体；エチレン−テトラシクロドデセン共重合体；プロピレンホモポリマー及びプロピレン−エチレン共重合体などのポリプロピレン樹脂；ポリ−４−メチルペンテン−１、ポリブテン−１、ポリブタジエン、ポリスチレン；アクリロニトリル−スチレン樹脂；アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン樹脂、スチレン−共役ジエンブロック共重合体及びスチレン−共役ジエンブロック共重合体水素化物などのスチレン系エラストマー；フッ素樹脂；ポリ（メタクリル酸メチル）などのアクリル樹脂；ナイロン６及びナイロン６６などのポリアミド樹脂；ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、ポリブチレンテレフタレート及びポリシクロへキシレンジメチレンテレフタレートなどのポリエステル樹脂；ポリカーボネート類、ポリアセタール類、ポリアリールスルホン類、ポリアリレート類、ヒドロキシ安息香酸ポリエステル類、ポリエーテルイミド類、炭酸ポリエステル類、ポリフェニレンエーテル樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリウレタン及び多孔質樹脂、例えば発泡ポリウレタン、発泡ポリプロピレン又は発泡エチレン等）、ガラス、金属、セラミック、繊維、布、編物、シート、紙、糸、泡、多孔性物質及びマルチフィラメントの微細粉末又は顆粒が挙げられる。
【０２９２】
液体担体としては、例えば、芳香族又は脂肪族炭化水素（例えば、キシレン、トルエン、アルキルナフタレン、フェニルキシリルエタン、ケロシン、ガス油、ヘキサン、シクロヘキサン等）、ハロゲン化炭化水素（例えば、クロロベンゼン、ジクロロメタン、ジクロロエタン、トリクロロエタン等）、アルコール類（例えば、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ブタノール、ヘキサノール、ベンジルアルコール、エチレングリコール等）、エーテル類（例えば、ジエチルエーテル、エチレングリコールジメチルエーテル、ジエチレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、プロピレングリコールモノメチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン等）、エステル類（例えば、酢酸エチル、酢酸ブチル等）、ケトン類（例えば、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、シクロヘキサノン等）、ニトリル類（例えば、アセトニトリル、イソブチロニトリル等）、スルホキシド類（例えば、ジメチルスルホキシド等）、アミド類（例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、環状イミド類（例えば、Ｎ−メチルピロリドン）、炭酸アルキリデン類（例えば、炭酸プロピレン等）、植物油（例えば、ダイズ油、綿実油等）、植物性揮発油（例えば、オレンジ油、ヒソップ油、レモン油等）又は水を挙げることができる。
【０２９３】
ガス担体としては、例えば、ブタンガス、フロンガス、液化石油ガス（ＬＰＧ）、ジメチルエーテル及び炭酸ガスを挙げることができる。
【０２９４】
ｉｘ．アジュバント
一部の例では、本明細書に提供される組成物は、アジュバントを含み得る。アジュバントは、活性を有しない化学物質である。アジュバントは、混合又は施用の向上のため、又はパフォーマンスの増強のため、製剤中に予め混合されるか又は噴霧タンクに加えられるかのいずれかである。アジュバントは、葉面施用向けに設計された製品に広く使用されている。アジュバントを使用すると、製剤を具体的な必要性に合わせてカスタマイズし、局所的条件を補うことができる。アジュバントは、濡れ、展着、粘着、蒸発の低減、揮発の低減、緩衝、乳化、分散、散布ドリフトの低減及び起泡の低減を含め、特定の機能を果たすように設計され得る。単一のアジュバントがこれらの全ての機能を果たすことはできず、多くの場合、適合性のあるアジュバントが組み合わされて複数の機能を同時に果たし得る。
【０２９５】
製剤中に含まれるアジュバントの非限定的な例の中には、結合剤、分散剤及び安定剤、具体的には例えばカゼイン、ゼラチン、多糖類（例えば、デンプン、アラビアゴム、セルロース誘導体、アルギン酸等）、リグニン誘導体、ベントナイト、糖類、合成水溶性ポリマー（例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸等）、ＰＡＰ（酸性リン酸イソプロピル）、ＢＨＴ（２，６−ジ−ｔ−ブチル−４−メチルフェノール）、ＢＨＡ（２−ｔ−ブチル−４−メトキシフェノールと３−ｔ−ブチル−４−メトキシフェノールとの混合物）、植物油、鉱油、脂肪酸及び脂肪酸エステルがある。
【０２９６】
ｘ．界面活性剤
一部の例では、本明細書に提供される組成物は、界面活性剤を含む。界面活性剤は、濡れ剤及び展着剤とも称され、噴霧液滴の表面張力を物理的に変化させる。製剤がその機能を正しく果たすには、噴霧液滴が茎葉を濡らし、葉の全面にわたって均一に広がることが可能でなければならない。界面活性剤は、製剤被覆面積を拡大し、それにより病害虫の化学物質への曝露を増加させる。界面活性剤は、製剤を蝋質の葉又は有毛の葉に施用するときに特に重要である。適切な濡れ性及び展着性がないと、往々にして噴霧液滴が流亡するか、又は葉の表面を十分に被覆することができない。しかしながら、界面活性剤が多過ぎると過剰な流亡が引き起こされ、有効性が低下し得る。
【０２９７】
界面活性剤は、イオンと呼ばれる電荷を帯びた原子又は分子へのそのイオン化の方法又は分離の方法によって分類される。負電荷の界面活性剤は、アニオン性である。正電荷のものは、カチオン性であり、及び電荷を帯びていないものは、非イオン性である。非イオン性界面活性剤の存在下における製剤活性は、カチオン性又はアニオン性界面活性剤の存在下における活性と全く異なり得る。誤った界面活性剤を選択すると、農薬製品の有効性が低下し、標的植物が傷害を受け得る。アニオン性界面活性剤は、接触性農薬（吸収されて全体に行き渡るのでなく、直接的な接触によって病害虫を防除する農薬）との使用時に最も有効である。カチオン性界面活性剤は、通常、植物毒性であるため、決して単独の界面活性剤として使用してはならない。
【０２９８】
非イオン性界面活性剤は、浸透性農薬と使用されることが多く、噴霧農薬が植物クチクラに浸透することを促進する。非イオン性界面活性剤は、ほとんどの農薬と適合性があり、界面活性剤が必要なＥＰＡ登録農薬のほとんどが非イオン性タイプを推奨している。アジュバントとしては、限定はされないが、粘着剤、増量剤、植物浸透剤、適合性薬剤、緩衝液又はｐＨ調整剤、ドリフト制御添加剤、消泡剤及び増粘剤が挙げられる。
【０２９９】
本明細書に記載される組成物に含まれる界面活性剤の非限定的な例の中には、アルキル硫酸エステル塩、スルホン酸アルキル類、スルホン酸アルキルアリール、アルキルアリールエーテル類及びそのポリオキシエチレン化生成物、ポリエチレングリコールエーテル類、多価アルコールエステル類及び糖アルコール誘導体がある。
【０３００】
ｘｉ．併用
製剤において及びこれらの製剤から調製される使用形態において、調節薬剤は、農薬用薬剤（例えば、殺虫剤、滅菌剤、殺ダニ剤、殺線虫剤、殺軟体動物剤又は殺真菌剤；例えば、表１２に挙げる農薬を参照されたい）、誘引剤、成長調整物質又は除草剤など、他の活性化合物との混合物であり得る。本明細書で使用されるとき、用語「農薬用薬剤」は、任意の病害虫を予防、駆逐、忌避又は軽減することを意図した任意の物質又は物質の混合物を指す。農薬は、食物に関してヒトと競合するか、所有物を破壊するか、疾患を蔓延させるか、又は不快害虫である昆虫、軟体動物、病原体、雑草、線虫及び微生物を含め、病害虫に対して使用される化学的物質又は生物学的薬剤であり得る。用語「農薬用薬剤」は、抗生物質、抗ウイルス薬  農薬、抗真菌薬、駆虫薬、栄養素、花粉、ショ糖及び／又は昆虫の動きを止める又は遅くする薬剤など、他の生物活性分子を更に包含し得る。
【０３０１】
調節薬剤が植物に施用される例では、除草剤、肥料、成長調節物質、毒性緩和剤、情報化学物質などの他の公知の化合物との、或いは植物特性を改善するための薬剤との混合物も可能である。
【０３０２】
Ｖ．送達
本明細書に記載される宿主は、昆虫への組成物の送達又は投与を可能にする任意の好適な方法において、本明細書に記載される組成物のいずれかに曝露され得る。調節薬剤は、単独で送達され得るか、或いは他の活性又は不活性物質と組み合わせて送達され得、有効濃度の調節薬剤を送達するように製剤化された濃縮液、ゲル、溶液、懸濁液、散布液、粉末、ペレット、ブリケット、ブリックなどの形態で例えば噴霧、マイクロインジェクション、植物経由、注入、浸漬によって施用され得る。
【０３０３】
本明細書に記載される組成物の施用量及び施用部位は、概して、宿主の習性、宿主の微生物が調節薬剤の標的となり得るのがいずれの生活環ステージであるか、施用が行われる部位並びに調節薬剤の物理的及び機能的特性によって決まる。本明細書に記載される調節薬剤は、昆虫に経口摂取によって投与され得るが、クチクラを通じた浸透又は昆虫の呼吸器系への浸透を可能にする手段によっても投与され得る。
【０３０４】
一部の例では、昆虫は、単純に調節薬剤を含む溶液に「浸漬」されるか、又はそれが「噴霧」され得る。或いは、調節薬剤を昆虫の飼料成分（例えば、摂食可能物）に連結して送達を容易にし、及び／又は昆虫による調節薬剤の取込みを増加させ得る。経口導入方法には、例えば、調節薬剤を昆虫の飼料と直接混合すること、昆虫の生息場所又は活動場所に調節薬剤を噴霧すること、並びに飼料として使用される種が調節薬剤を発現するように改変され、次に影響を与えようとする昆虫に給餌されるエンジニアリング手法が含まれる。一部の例では、例えば、調節薬剤組成物は、昆虫の食餌中に配合するか又は食餌の上にかけることができる。例えば、調節薬剤組成物は、昆虫が生息する作物畑の上に噴霧することができる。
【０３０５】
一部の例では、本組成物は、例えば、背負式散布、空中散布、作物散布／散粉等により、植物、例えば作物の上に直接噴霧される。調節薬剤が植物に送達される例では、調節薬剤を受け取る植物は、いずれの植物成長段階にもあり得る。例えば、製剤化された調節薬剤は、植物成長初期に種子コーティング又は経根処理として、又は作物サイクル後期に植物全体の処理として施用することができる。一部の例では、調節薬剤は、局所薬剤として植物に施用され得、宿主昆虫がその植物を食べるか、又は他にその植物との相互作用時に植物と接触することになる。
【０３０６】
更に、調節薬剤は、植物又は動物宿主の組織（例えば、茎又は葉）を通じて吸収され、分布する浸透性薬剤として（例えば、植物が成長する土壌中又は植物の水やりに使用される水中に）施用され得、それを餌にする昆虫が有効用量の調節薬剤を得ることになる。一部の例では、植物又は飼料生物は、調節薬剤を発現するように遺伝的に形質転換され得、その植物又は飼料生物を餌にする宿主が調節薬剤を食べることになる。
【０３０７】
遅延放出又は継続的放出も、調節薬剤又は１つ以上の調節薬剤を含む組成物をゼラチンなどの溶解性又は生体内分解性コーティング層で被覆することにより、このコーティングが使用環境内で溶解又は分解し、次に調節薬剤が利用可能になることで達成でき、又は薬剤を溶解性又は分解性マトリックス中に分散させることにより達成できる。このような継続的放出及び／又は分注手段装置が有利に用いられることにより、本明細書に記載される調節薬剤の１つ以上の有効濃度が特定の宿主生息場所において常に維持され得る。
【０３０８】
調節薬剤は、昆虫が成長、生活、繁殖、摂餌又は寄生する媒体に配合することもできる。例えば、調節薬剤は、飼料容器、餌場、保護用ラッピング材又は巣箱に配合することができる。一部の適用について、調節薬剤は、粉末形態での又は「トラップ」若しくは「餌場」における施用のための固体支持体に結合され得る。例として、組成物が特定の宿主昆虫のためのトラップにおいて又はベイトとして使用される適用について、組成物はまた、固体支持体に結合されるか、又は時限放出材料に封入され得る。例えば、宿主がミツバチである例では、本明細書に記載される組成物は、ミツバチの巣又はミツバチが成長、生活、繁殖若しくは摂餌する少なくとも１つの生息場所に組成物を送達することによって投与され得る。
【０３０９】
ＶＩ．スクリーニング
本明細書では、調節薬剤を同定するためのスクリーニングアッセイが含まれ、ここで、調節薬剤は、宿主の微生物叢を変化させ、それにより宿主適応度（例えば、昆虫又は線虫適応度）を増加させるのに有効である。例えば、スクリーニングアッセイを使用して、特定の微生物及び／又は特定の宿主を標的とする１つ以上の調節薬剤を同定し得る。更に、スクリーニングアッセイを使用して、機能が増進した１つ以上の微生物を同定し得る。例えば、スクリーニングアッセイは、農薬（例えば、表１２に挙げられる農薬又は当該技術分野において公知の殺虫剤、例えばネオニコチノイド（例えば、イミダクロプリド）又は有機リン系殺虫剤（例えば、ホスホロチオエート、例えばフェニトロチオン））又は植物アレロケミカル（例えば、カフェイン、大豆シスタチンＮ、モノテルペン類、ジテルペン酸類又はフェノール化合物）を代謝（例えば、分解）する能力が増進した１つ以上の微生物を分離するのに有効であり得る。宿主に分離微生物を送達し、コロニーが形成されることにより、農薬（例えば、表１２に挙げられる農薬）又は植物アレロケミカルに対する宿主の抵抗性が増加し、それにより宿主適応度が増加し得る。本方法は、本明細書に記載される宿主のいずれかに定着する能力が増進した微生物の分離にも有用であり得る。
【０３１０】
例えば、農薬（例えば、表１２に挙げられる農薬）に対する宿主の抵抗性を増加させる微生物をスクリーニングするには、微生物（例えば、細菌）と高濃度の農薬（例えば、表１２に挙げられる農薬又は当該技術分野において公知の殺虫剤、例えばネオニコチノイド（例えば、イミダクロプリド）又は有機リン系殺虫剤（例えば、ホスホロチオエート、例えばフェニトロチオン））とを含む出発培養物を使用し得る。一部の例では、農薬は、農薬が集積した環境サンプル（例えば、土壌サンプル）の形態で提供され得る。或いは、農薬（例えば、表１２に挙げられる農薬）は、純粋な形態で又は他の担体との組み合わせで提供され得る。更に、１つ以上の微生物分離株は、培地中に（例えば、実験室株から）直接接種され得るか、又は１つ以上の微生物種を含む環境サンプルであり得る。成長培地は、液体又は固体のいずれでもあり得る。一部の例では、培地中の微生物にとって目的の農薬が単一炭素源又は窒素源である。培養物を任意の回数だけ継代培養することにより（例えば、高レベルの農薬の新鮮培地に接種することにより）、農薬の代謝能を有する微生物株（例えば、細菌株）を集積し、及び／又は分離し得る。当該技術分野において公知の任意の方法を用いてサンプル中の農薬レベルの変化（例えば、低下）を（例えば、ＨＰＬＣを用いて）試験して、元の培養物又は継代培養物を評価し得る。農薬（例えば、表１２に挙げられる農薬又は当該技術分野において公知の農薬、例えばネオニコチノイド（例えば、イミダクロプリド）又は有機リン系殺虫剤（例えば、ホスホロチオエート、例えばフェニトロチオン））の濃度を低下させる分離株は、本明細書に記載される任意の方法又は組成物における調節薬剤として使用するために分離され得る。
【０３１１】
本方法を使用することにより、宿主（例えば、昆虫、例えばハチ）における定着及び生存能力が増進した本明細書に記載される微生物を、スクリーニングアッセイから分離されたものを含めて更に選択し得る。例えば、宿主に細菌分離株（例えば、農薬を分解する能力を有するもの）を接種し得る。次に、宿主を一定の間隔で細菌分離株の存在に関して（例えば、培養によるか、又は宿主（例えば、ミツバチ）から単離された腸の１６ｓ  ＲＮＡによって）試験し得る。宿主（例えば、ミツバチの中腸）で生き延びた細菌分離株は、本明細書に記載される任意の方法又は組成物における調節薬剤として使用するため分離され得る。
【０３１２】
【表６７】
2020505067.tif 000069
【０３１３】
【表６８】
2020505067.tif 000070
【実施例】
【０３１４】
以下は、本発明の方法の例である。上記に提供される概要を所与として、様々な他の実施形態を実施し得ることが理解される。
【０３１５】
実施例１：ニコチノイドであるイミダクロプリドを分解する微生物の分離
本例は、ネオニコチノイドであるイミダクロプリドを分解可能な微生物のライブラリの取得を実証する。
【０３１６】
実験計画：
Ｂｏｎｍａｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｓｃｉ．Ｐｏｌｌｕｔ．Ｒｅｓ．Ｉｎｔ．２２：３５−６７，２０１５）に記載されるとおり高濃度のイミダクロプリドを含む４つの土壌サンプルを収集し、カウフマン及びカーニー（Ｋａｕｆｍａｎ  ａｎｄ  Ｋｅａｒｎｅｙ）の最少塩培地（ＭＳＭ）に希釈して、イミダクロプリド分解微生物を集積する。各土壌サンプルの３種類の培養物には、以下が含まれる：単一炭素源として８３ｍｇ／Ｌイミダクロプリドを含有する５０ｍＬ炭素制限ＭＳＭ；単一窒素源としてのイミダクロプリド並びに補足炭素源として加えたクエン酸ナトリウム及びショ糖を含有する５０ｍＬ窒素制限ＭＳＭ；及び５０ｍＬ  ＭＳＭブロス、全成分＋クエン酸ナトリウム、ショ糖及びイミダクロプリド含有。２ｇの収集した土壌を各培養物に接種する。
【０３１７】
培養物は、振盪機上、１００ｒｐｍ及び２７℃で維持する。土壌不含集積物を得るため、毎月、継代培養物（１ｍＬの培養溶液を２５ｍＬの新規培地に希釈）を作成する。Ｔａｇｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｅｎｖｉｒｏｎ．２１：５８−６４，２００６）に記載されるとおり、振盪フラスコから培養物のアリコートを定期的に取り出してＨＰＬＣ分析にかける。ＨＰＬＣアッセイについて、１．０ｍＭイミダクロプリドを含有する１．０ｍＬの２０ｍＭリン酸ナトリウム−カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中で約７．０×１０７の微生物をインキュベートする。３０℃で２０分間インキュベートした後、１．０ｍＬのメタノールを加える。イミダクロプリド及びその部分的分解産物をＨＰＬＣシステム（６００Ｅポンプ及び２４８７二重吸光度検出器；Ｗａｔｅｒｓ）で定量的に分析する。ＨＰＬＣプロファイルの保持時間及びピーク面積を公知の標準と比較する、Ｂｏｎｍａｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｓｃｉ．Ｐｏｌｌｕｔ．Ｒｅｓ．Ｉｎｔ．２２：３５−６７，２０１５）。
【０３１８】
３６ｍｇ／ｋｇイミダクロプリド及びストレプトマイシンを含有する窒素制限寒天プレート上において、インキュベーション時にＨＰＬＣ分析でイミダクロプリドの低下を示す土壌からの混合集積培養物を、１０−１〜１０−６希釈を用いて平板塗抹する。
【０３１９】
２７℃で１週間インキュベートした後、互いに形態が異なる（大きさの違い）ように見えるコロニーに関してプレートをスクリーニングする。単一窒素源としてイミダクロプリドを含有する新規寒天プレートに個々のコロニーを入れて成長させる。３週間後、２５ｍｇ／Ｌイミダクロプリドを含有する２５ｍＬのトリプトソイブロス（ＴＳＢ）に単コロニーを入れる。
【０３２０】
３日間成長させた後、コニカルファルコンチューブ内の分離株の各々を６７００×ｇで１０分間遠心する。上清を取り出し、１０ｍＬの総容積について分離株を滅菌リン酸緩衝液に再懸濁する。各分離株の２ｍＬサンプルを窒素制限ＭＳＭ及び炭素制限ＭＳＭ培養液に接種する。両方の培養液とも合計２５ｍＬに３０ｍｇ／Ｌのイミダクロプリドを含有する。培地タイプの各々に２ｍＬのリン酸緩衝液を接種することにより、非接種対照も作る。サンプルは、全てアルミ箔に包み、２７℃及び１００ｒｐｍで動作する振盪機に置く。次に、サンプルのイミダクロプリド濃度をＨＰＬＣによって分析する。
【０３２１】
７日間インキュベートした後、フラスコに２５ｍＬのメタノールを加える。次に、サンプルを５０％デューティサイクルで各６分間超音波処理し、６７００×ｇで遠心する。次に、上清を分析し、本明細書に記載されるとおりＨＰＬＣによってイミダクロプリドを定量的に計測する。
【０３２２】
イミダクロプリドの濃度を低減する分離株を５０％グリセロール溶液中に−８０℃で保存する。
【０３２３】
実施例２：ハチの中腸で生き延びるイミダクロプリド分解分離株の選択
本例は、ハチ中腸で生存可能な実施例１に記載される分離株からのイミダクロプリド分解微生物を選択する能力を実証する。
【０３２４】
治療計画：実施例１に記載される１０個の分離株を１０ｍＬの５０％ショ糖シロップ中に０（陰性対照）、１０２、１０５又は１０８ｃｆｕ／ｍｌで製剤化する。
【０３２５】
実験計画：
１細菌分離株当たり約５０匹のハチを収集し、木製の籠で飼育する。前の実施例で分離された細菌株を培養し、次のとおり給餌のために調製する。各分離株からの細胞を洗浄し、５０％（ｗ／ｖ）ショ糖シロップを補充したＭＳＭ中に０．１のＯＤ６００に希釈し、３０℃でインキュベートして細胞を成長させる。４つの濃度の新鮮細菌培養物を以下のとおり餌としてハチに投与する（０〜１０８ｃｆｕ／ｍｌ）。ハチがその口吻を突き出して分離株含有溶液を摂取するための６つの小さいすぼんだ穴を備えた１５ｍｌチューブに異なる濃度の分離株を入れる。餌として使用するため、新鮮な分離株含有培養物を毎日調製し、実験の全経過中（７日間）、死亡したハチを数えて取り除くことにより毎日ハチの死亡率を記録する。７日後、分離株含有溶液を１５％（ｗ／ｖ）ショ糖に４８時間置き換える。
【０３２６】
細菌分析のため、２４時間毎に各レプリケートから１０匹のハチを取り出す。第１のサンプルは、実験開始前に取り出し、それに７つの更なるサンプリング点が続く。各サンプリング後、ハチを氷上で麻酔し、中腸を摘出する。各時点のレプリケートをプールし、１５０μｌ  １×ＰＢＳ中でホモジナイズし、次に段階希釈し、３６ｍｇ／ｋｇイミダクロプリドを含有する窒素制限寒天プレートにプレーティングして、細菌を選択的成長条件下において３０℃で２日間成長させる。
【０３２７】
ハチ中腸で生き延びる細菌分離株を、ハチのネオニコチノイド抵抗性を高めるための投与に選択する。
【０３２８】
実施例３：イミダクロプリド分解細菌の投与によってハチのネオニコチノイド抵抗性を増加させる
本例は、殺虫剤、より具体的にはネオニコチノイドに対するハチの抵抗性を増加させる能力を実証する。ハチは、顕花植物の受粉において重要な役割を果たし、顕花植物を含む多くの生態系において主要なタイプの花粉媒介者である。ヒトの食物供給の３分の１は、昆虫、鳥及びコウモリによる受粉に依存していると推定され、その大部分は、ハチ、特に家畜化されたヨーロッパミツバチによって達成されている。養蜂家が飼育するコロニー数は、都市化、浸透性農薬の使用並びにアカリンダニ及びミツバチヘギイタダニによって減少している。殺虫剤中のネオニコチノイドは、殺虫剤処理された植物からの汚染された花蜜及び花粉の直接摂取を通じて働きバチの採餌、学習及び記憶に影響を与える。イミダクロプリド分解細菌をそのマイクロバイオームに導入することにより、採餌、衛生的行動及び生存の増加など、行動の改善を通じてハチがそのネオニコチノイド抵抗性を増加させることが期待される。
【０３２９】
治療計画：実施例２で選択され、ハチの中腸で生き延びることが同定された細菌分離株を１０ｍＬの５０％ショ糖シロップ中に１０８個の生物で製剤化する。
【０３３０】
実験計画：
実施例２で選択された分離株を１０８細胞／ｍＬの濃度で調製し（実施例２を参照）、ハチがその口吻を突き出して分離株含有溶液を摂取するための６つの小さいすぼんだ穴を備えた１５ｍｌチューブに入れる。餌として使用するため、新鮮な分離株含有培養物を毎日調製する。前処理は、合計７日間続く。
【０３３１】
１０８細胞／ｍＬの濃度で調製し、ハチがその口吻を突き出して分離株含有溶液を摂取するための６つの小さいすぼんだ穴を備えた１５ｍｌチューブに入れた、実施例２で選択された分離株により、働きバチ、アピス・メリフェラ（Ａｐｉｓ  ｍｅｌｌｉｆｅｒａ）の体重（それぞれ、０．５、１及び２ポンド又は０．２３、０．４５及び０．１ｋｇ）によって推定される約１５００匹、３０００匹又は７０００匹の働きバチの巣箱を前処理する。餌として使用するため、新鮮な分離株含有培養物を毎日調製する。前処理は、合計７日間続く。
【０３３２】
７日間の前処理後、各働きバチの巣箱に２〜４グラムの花粉サプリメント及び液糖（１：１）をイミダクロプリド処理前の１〜２日間与える。小さいコロニー（１５００匹及び３０００匹のハチ）は、ガラス壁付きの観察用巣箱に入れる。大きいコロニー（７０００匹のハチ）は、４つの標準巣枠を保持する下部の箱と処理シロップが供給される分割板給餌器とを含むアルスター（Ｕｌｓｔｅｒ）観察用巣箱（Ｂｒｕｓｈｙ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｂｅｅ  Ｓｕｐｐｌｙ、ＮＣ）に入れる。観察用巣箱は、全て一定の温度及び相対湿度（２３〜２５℃及び７０％）に維持された小屋に収容する。加えて、巣箱は、全て外部に通じる入口を含むため、ハチは、周辺の農地及び都市住宅地で自由に採餌可能である。
【０３３３】
産卵が目視で確認されたところで、各コロニーを５０％ショ糖シロップ中に提供されるイミダクロプリド処理（０、１０、２０、５０及び１００ｐｐｍ）に無作為に割り付ける。コロニーには、実施例２に記載されるものと同様の分注システムにより、比例した量のイミダクロプリド含有ショ糖溶液：それぞれ１５００匹、３０００匹及び７０００匹のハチのコロニーについて８０、１６０及び３２０ｍＬが与えられる。シロップは、３週間にわたって隔日で補充する。シロップの分量は、コロニーを補完するが、存続させないように設計され、そのため、ハチは、他の供給源で自由採餌する必要がある。イミダクロプリドのストック溶液（１００ｐｐｍ）は、Ｃｈｅｍ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｉｎｃから購入した９９．５±０．５％テクニカルグレードのイミダクロプリド（ＰＳ−２０８６）を５０％ショ糖中に一晩撹拌しながら溶解したものを使用して調製する。ストック溶液は、２週間毎に調製し、処理溶液は、毎週調製する。処理溶液のサンプル（１つの用量当たり３〜６例）を無作為に選択し、残留濃度に関して試験することにより、投薬量の正確さを確認する。
【０３３４】
行動表現型の測定：
採餌活動は、１分間の観察中にハチコロニーの入口を出入りする働きバチの数を１日２回記録することにより測定する。衛生的行動は、巣箱内での働きバチの活動性を評価する尺度として用いられ、働きバチが疾患のあるダニに寄生された蜂児を見つけ出して取り除き、それにより病原体及び寄生虫のコロニー内感染を制限する能力として定義される。衛生的行動は、凍結殺処分蜂児アッセイを用いて測定され、ここで、３インチ（７．６ｃｍ）ポリ塩化ビニルチューブを巣板のうち、広い範囲にわたる蓋がされた蛹の巣房（非実験的な野外コロニーから取られる）を含む部分に静かに押し込む。空の巣房の数をカウントして記録した後、４００ｍｌの液体窒素を流し込んでおよそ１６０匹の蛹を凍結殺処分する。次に、巣枠を一時的にハチのコロニー内に置き、２４時間後に巣房から完全に又は部分的に取り除かれた蛹の割合を定量化して衛生的行動を評価する。凍結殺処分された蜂児の除去は、疾患のある寄生された蜂児の除去と相関する。
【０３３５】
実施例２で選択された細菌分離株によって前処理したハチは、対照で処理したハチと比べて高い活動性を実証する。
【０３３６】
実施例４：ハチに感染するミツバチヘギイタダニのオキシテトラサイクリン溶液処理
本例は、抗生物質溶液で処理することによりミツバチヘギイタダニを死滅させ、その適応度を低下させる能力を実証する。本例は、オキシテトラサイクリンがミツバチヘギイタダニに及ぼす効果が、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）など、オキシテトラサイクリンに感受性を有するミツバチヘギイタダニにとって内因性の細菌個体群の変化を通じて媒介されることを実証する。
【０３３７】
ミツバチヘギイタダニは、家畜化されたアピス・メリフェラ（Ａｐｉｓ  ｍｅｌｌｉｆｅｒａ）のミツバチコロニーを大量に死滅させる蜂群崩壊症候群（ＣＣＤ）が世界中で蔓延する主因と考えられている。これは、ハチの腹部に取り付いてその血液を吸うことでハチから栄養素を奪い、最終的にハチを死滅させる。ミツバチヘギイタダニは、化学合成殺ダニ剤で死滅させることができるが、この種の化学薬品は、食用の蜂蜜に近付けるべきではない。
【０３３８】
治療計画：オキシテトラサイクリン溶液は、０．５％ショ糖及び必須アミノ酸を含有する１０ｍＬの滅菌水中に０（陰性対照）、１、１０又は５０μｇ／ｍｌで製剤化する。
【０３３９】
実験計画：
繁殖期の成虫ミツバチヘギイタダニが、そのクチクラが硬化しないため便乗性ダニ又はその子孫と比較して異なる感受性を有するかどうかを決定するため、成虫ハチ、アピス・メリフェラ（Ａｐｉｓ  ｍｅｌｌｉｆｅｒａ）に寄生するミツバチヘギイタダニ並びに幼虫及び蛹に関連するダニを収集した。このアッセイは、異なる種類のダニに対する抗生物質溶液を試験し、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）などの内因性微生物を標的とすることによりその適応度がどのように変化するかを決定する。
【０３４０】
ミツバチヘギイタダニが寄生したハチコロニーの巣板（又は巣板の断片）から蜂児ダニを収集する。ダニは、ハチの幼虫が発育する巣房から収集する。
【０３４１】
ミツバチヘギイタダニは、その蜂児宿主の年齢毎に群分けし、別個にアッセイする。蜂児の年齢は、以下のとおり幼虫又は蛹の形態及び色素沈着に基づいて決定する：その巣房を動き回るのに十分に小さい吐糸幼虫から収集されるミツバチヘギイタダニは、群１に分類し；巣房内にいるには大き過ぎ、その口を巣房開口の方に向けて直立に伸び始める、伸長した幼虫から収集されるミツバチヘギイタダニは、群２に分類し；及び蛹から収集されるミツバチヘギイタダニは、群３に分類する。ダニは、５０単位を収集するまで、ガラスペトリ皿内でその宿主幼虫又は蛹の上に保存する。これにより、その摂餌ルーチン及び生理学的状態が変化しないままであることが確実になる。ダニがその宿主幼虫又は蛹からはぐれたり、又は互いの上によじ登ったりすることを防ぐため、同じディッシュには同じ発育段階の宿主のみを飼育した。
【０３４２】
器具  −  ステンレス鋼リング（５６ｍｍ内径、２〜３ｍｍ高さ）及び２枚の円形ガラス（６２ｍｍ直径）  −  をアセトン及びヘキサン又はペンタンで清浄にして、試験アリーナを形成する。アリーナのガラス円盤及びリングに一様に噴霧することにより、オキシテトラサイクリン溶液及び対照溶液を器具に適用する。このため、リザーバに１ｍｌの溶液を装填する。チューブの底端からの噴霧表面の距離は、１１ｍｍに設定し、０．０２７５インチノズルを使用する。堆積した溶液の量が１±０．０５ｍｇ／ｃｍ２になるまで圧力を調整する（通常、３５０〜５００ｈＰａの範囲）。抗生物質溶液をそのそれぞれのディッシュに対し、ディッシュの底面が全て隠れるように注ぎ、残留液体は、ドラフト下で蒸発させる。円形ガラスの間にリングを置いてケージを組み立てる。ケージは、３つ以下のアッセイのために調製から６０時間以内に使用して、抗生物質溶液へのダニの曝露を制御する。このケージに１０〜１５匹のミツバチヘギイタダニを導入し、器具のピースを溶融ワックスの液滴で共につなぎ合わせる。吐糸幼虫、伸長した幼虫、白色眼蛹及び白色乃至蒼白色の体を有する暗色眼期から収集されるダニが使用される。
【０３４３】
４時間後、餌となる２又は３匹の白色眼蛹（蓋をして４〜５日後）と共にダニを清浄なガラスペトリ皿（６０ｍｍ直径）に移す。抗生物質又は対照溶液による処理後４時間、２４時間及び４８時間でダニを解剖顕微鏡下に観察し、以下のカテゴリに従って分類する：
・可動：その脚上を針でつつかれた後かどうかに関わらず、ダニは歩き回る。
・麻痺：ダニは、１つ以上の付属器を未刺激で又は刺激後に動かすが、歩き回ることはできない。
・死亡：動けず、３回の連続した刺激に反応しない。
【０３４４】
滅菌つまようじ又は針を使用してその脚に触れることによりダニを刺激する。各群の刺激には新しいつまようじ又は滅菌針を使用して、ダニ群間での汚染を避ける。
【０３４５】
アッセイは、３２．５℃及び６０〜７０％相対湿度で実施する。対照の死亡率が３０％を超えた場合、そのレプリケートを除外する。各実験を４つの一連のケージで反復する。
【０３４６】
ミツバチヘギイタダニ群におけるバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の状態をＰＣＲによって評価する。ＤＮＡ  Ｋｉｔ（ＯＭＥＧＡ、Ｂｉｏ−ｔｅｋ）を製造者のプロトコルに従って使用して、対照（オキシテトラサイクリン処理なし）及びオキシテトラサイクリン処理した個体（全身）から全ＤＮＡを単離する。バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）のプライマー、フォワードプライマー５’−ＧＡＧＧＴＡＧＡＣＧＡＡＧＣＧＡＣＣＴＧ−３’（配列番号１８６）及びリバースプライマー５’−ＴＴＣＣＣＴＣＡＣＧＧＴＡＣＴＧＧＴＴＣ−３’（配列番号１８７）は、Ｐｒｉｍｅｒ  ５．０ソフトウェア（Ｐｒｉｍｅｒ−Ｅ  Ｌｔｄ．，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ，ＵＫ）を使用して、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ゲノム（受託番号：ＡＰ００７２０９．１）から得られる２３Ｓ−５Ｓ  ｒＲＮＡ配列（Ｔａｋｅｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９４（１７）：４７６７−４７６８，２０１２）に基づいて設計する。ＰＣＲ増幅サイクルには、９５℃で５分の初期変性ステップ、９５℃で１分、５９℃で１分、及び７２℃で２分を３５サイクル、及び７２℃で５分の最終延長ステップが含まれた。オキシテトラサイクリン処理サンプル及び対照サンプルからの増幅産物を１％アガロースゲル上で分析し、ＳＹＢＲ  ｓａｆｅで染色し、イメージングシステムを使用して可視化する。
【０３４７】
オキシテトラサイクリン溶液で処理したミツバチヘギイタダニの生存率を、陰性対照で処理したミツバチヘギイタダニと比較する。
【０３４８】
オキシテトラサイクリン溶液で処理したミツバチヘギイタダニの生存率及び移動性は、対照と比較して低下する。
【０３４９】
実施例５：有機リン系殺虫剤のフェニトロチオンを分解する微生物の分離
本例は、有機リン系殺虫剤のフェニトロチオンを分解可能な微生物のライブラリの取得を実証する。
【０３５０】
実験計画
過去に昆虫防除のためフェニトロチオンが利用された様々な地域から土壌サンプルを入手する。フェニトロチオン分解細菌は、（Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．１，５８−６４，２００６に記載されるとおり土壌サンプルから分離されることになる。簡潔に言えば、１ｇの土壌サンプルを９ｍｌの滅菌蒸留水と徹底的に混合する。次に、土壌粒子を１０００ｒｃｆで５分間遠心し、次に無機塩培地によるフェニトロチオン（０．４ｇ／ｌの酵母エキス、０．４ｇ／ｌフェニトロチオン、１５ｇ／ｌ細菌学用寒天）上に１００μｌの上清をプレーティングする。フェニトロチオンをエマルションとして調製したとき、プレートは濁っている。
【０３５１】
周囲にクリアな一帯を生じ且つフェニトロチオンを分解又は代謝するように思われるコロニー及びこれらのコロニーを分離し、ＬＢ寒天、栄養寒天、酵母グルコース寒天、ＴＳＡ寒天、ＢＨＩ寒天又はＭＲＳ寒天上で再び成長させる。ユニークな細菌コロニーが同定されたところで、ゲノムＤＮＡ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ）を製造者のプロトコルに従って使用してそれらのゲノムを抽出する。
【０３５２】
ユニバーサル細菌プライマー２７Ｆ（５’−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＭＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’；配列番号１８８）及び１４９２Ｒ（５’−ＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ−３’；配列番号１８９）を使用し、９４℃で２分と、９４℃で１分、５６℃で１分及び７２℃で２分を３０サイクルと、７２℃で５分の最終延長とのＰＣＲ条件を用いて１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を増幅する。ゲル電気泳動を用いてアンプリコンが正しいサイズ（約１５００ｂｐ）であることを確認し、ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、ＱＩＡｑｕｉｃｋ）を製造者のプロトコルに従って使用して産物をゲルから切り出し、精製する。正しいサイズのアンプリコンをサンガー法でシーケンシングし、ＢＬＡＳＴを用いて配列を１６ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列の様々なリポジトリに対してマッチさせることにより細菌を同定する。
【０３５３】
分離された細菌がフェニトロチオン分解性であるかどうかを決定するため、ＰＮＡＳ，Ｖｏｌ．１０９，Ｎｏ．２２，８６１８−８６２２，２０１２に記載されるとおり、１ｍＭフェニトロチオンを含有する１ｍｌの２０ｍＭリン酸ナトリウム−カリウム緩衝液（ｐＨ７）中で約１０７個の細菌細胞をインキュベートする。３０℃で３０分間インキュベートした後、等容積のメタノールを加えることにより反応を停止させる。次に、フェニトロチオン及びその代謝産物、３−メチル−４−ニトロフェノールをＨＰＬＣによって分析する。ＨＰＬＣプロファイルの保持時間及びピーク面積を公知の標準と比較する。
【０３５４】
次に、フェニトロチオン分解能を有するユニークな細菌分離株を−８０℃で凍結グリセロールとして保存する。
【０３５５】
実施例６：フェニトロチオン分解細菌の投与によるドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）のフェニトロチオン抵抗性の増加
本例は、昆虫モデル、ドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）をその食餌中の殺虫剤、より具体的にはフェニトロチオンの１つ以上の負の効果から保護する能力を実証する。以下の手法は、ハチ又は本明細書に開示される他の昆虫、例えば多くの顕花植物作物及び野菜にとって重要な花粉媒介者である昆虫など、他の昆虫の代わりとなるものである。フェニトロチオンを含む殺虫剤の多くは、ハチにとって有毒であることが示されている。
【０３５６】
実験計画：
治療計画：実施例５で選択された細菌分離株をフェニトロチオン含有及び不含の１００μｌのハエ飼料培地中１０９匹の生物で製剤化する。
【０３５７】
ハエの飼育に使用する培地は、コーンミール、糖蜜及び酵母培地（１１ｇ／ｌ酵母、５４ｇ／ｌイエローコーンミール、５ｇ／ｌ寒天、６６ｍｌ／ｌ糖蜜及び４．８ｍｌ／ｌプロピオン酸）である。実験手順のため、０、１０及び１００ｐ．ｐ．ｍ．のフェニトロチオン又は陰性対照としてのリン酸緩衝生理食塩水を滅菌ハエ飼料培地に注入する。
【０３５８】
発育速度アッセイ
１日目、実施例５に記載される１０９個のフェニトロチオン分解細菌を１００μｌリン酸緩衝生理食塩水又は等容積の生理食塩水（陰性対照）に懸濁し、フェニトロチオン含有又は不含の滅菌ハエ飼料培地に加える。Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．８２，Ｎｏ．２０，６２０４−６２１３，２０１６に記載されるとおり、全て２５℃で１日放置して乾燥させる。
【０３５９】
２日目、ハエから採取した受精胚を２％次亜塩素酸塩溶液で５分間処理し、次に滅菌水で洗浄して胚からあらゆる細胞外微生物を除去する。フェニトロチオン含有又は不含の細菌を播種した又は陰性対照のハエ飼料に水中１０μｌの胚懸濁液（１：３胚：水懸濁液）を加える。胚を含むハエ飼料コホートは、実験の残りにわたって１２時間明期及び１２時間暗期サイクル下２５℃に維持する。
【０３６０】
各コホートにおいて囲蛹殻形成までの時間及び形成された蛹の数を測定する。各サンプルにおいて成虫羽化までの時間及び羽化率を測定する。蛹から最初の成虫が羽化した時点から１２時間毎に羽化した成虫ハエの数をカウントし、羽化率を計算する。
【０３６１】
フェニトロチオン分解細菌を播種したフェニトロチオン注入ハエ飼料における胚は、フェニトロチオン分解細菌を含まないフェニトロチオン注入飼料上の胚と比べて速く発育するものと予想される。
【０３６２】
生存アッセイ
１日目の約１２日前、先述のとおり滅菌胚を作成し、滅菌ハエ飼料で育てる。フェニトロチオンを含まない滅菌ハエ飼料において１２時間明期及び１２時間暗期サイクル下２５℃で育てたとき、成虫は、胚採取から１１日でその蛹から羽化し始める。１日目、リン酸緩衝生理食塩水中の１０９個のフェニトロチオン分解細菌を前の実施例に記載されるとおりの滅菌ハエ飼料培地に加える。
【０３６３】
２日目、細菌を播種した又は陰性対照のフェニトロチオン含有又は不含ハエ飼料に１０匹の新たに羽化した無菌雄及び雌成虫を導入する。ハエを含むハエ飼料は、実験の残りにわたって１２時間明期及び１２時間暗期サイクル下２５℃に維持する。全てのハエが死亡するまで、生存している雄及び雌ハエの数を毎日カウントする。生存分析を行い、ハエの生存に対するフェニトロチオン分解細菌の適応度利益を評価する。
【０３６４】
フェニトロチオン分解細菌を播種したフェニトロチオン注入ハエ飼料で育てたハエは、フェニトロチオン分解細菌を含まないフェニトロチオン注入飼料で育てたハエよりも長く生きると予想される。
【０３６５】
実施例７：天然に存在するファージを使用したドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）からの昆虫病原性細菌の除去
本例は、天然に存在するファージを使用してドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）から昆虫細菌病原体（セラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、エルウィニア・カロトボラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）及びシュードモナス・エントモフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ）など）を除去する能力を実証する。この手順は、ハチなどの他の昆虫種における細菌の除去に関する代用アッセイとして有用であり得る。
【０３６６】
実験計画：
治療計画：以下のファージ科を有するファージライブラリコレクションを使用する：マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）、サイフォウイルス科（Ｓｉｐｈｏｖｉｒｉｄａｅ）、ポドウイルス科（Ｐｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、リポスリクスウイルス科（Ｌｉｐｏｔｈｒｉｘｖｉｒｉｄａｅ）、ルディウイルス科（Ｒｕｄｉｖｉｒｉｄａｅ）、アンピュラウイルス科（Ａｍｐｕｌｌａｖｉｒｉｄａｅ）、ビカウダウイルス科（Ｂｉｃａｕｄａｖｉｒｉｄａｅ）、クラバウイルス科（Ｃｌａｖａｖｉｒｉｄａｅ）、コルチコウイルス科（Ｃｏｒｔｉｃｏｖｉｒｉｄａｅ）、シストウイルス科（Ｃｙｓｔｏｖｉｒｉｄａｅ）、フセロウイルス科（Ｆｕｓｅｌｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、グロブロウイルス科（Ｇｌｕｂｏｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、グッタウイルス科（Ｇｕｔｔａｖｉｒｉｄａｅ）、イノウイルス科（Ｉｎｏｖｉｒｉｄａｅ）、レビウイルス科（Ｌｅｖｉｖｉｒｉｄａｅ）、ミクロウイルス科（Ｍｉｃｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、プラズマウイルス科（Ｐｌａｓｍａｖｉｒｉｄａｅ）、テクティウイルス科（Ｔｅｃｔｉｖｉｒｉｄａｅ）。
【０３６７】
２週間にわたって複数の環境サンプル（土壌、池底質及び下水）を滅菌１Ｌフラスコに採取し、採取後直ちに処理し、その後、４℃で保存する。固体サンプルは、最終容積が１００ｍＬとなるように２ｍＭ  ＣａＣｌ２を補充した滅菌２倍濃度ディフコルリアブロス（ＬＢ）又はトリプトソイブロス（ＴＳＢ）中でホモジナイズする。リン酸塩試験ストリップを使用してｐＨ及びリン酸塩レベルを測定する。精製のため、全てのサンプルを４℃において３０００〜６０００ｇで１０〜１５分間遠心し、０．２μｍ低タンパク質フィルタでろ過することにより、全ての残留細菌細胞を除去する。次に、ファージライブラリを含む上清をガラスボトルに入れてクロロホルムの存在下４℃で保存する。
【０３６８】
２０〜３０ｍｌのファージライブラリをＬＢブロスで３０〜４０ｍｌの容積に希釈する。標的細菌株（例えば、セラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、エルウィニア・カロトボラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）及びシュードモナス・エントモフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ））を加えて（ＬＢブロスで成長させた５０〜２００μｌ一晩培養物）、培養物中におけるこの特異的細菌株を標的とするファージを集積する。２３０ｒｐｍで振盪されるこの培養物を３７℃で一晩インキュベートする。この集積培養物から細菌を遠心（３０００〜６０００ｇ  １５〜２０分、４℃）によって除去し、ろ過する（０．２又は０．４５μｍフィルタ）。２．５ｍｌの細菌不含培養物を２．５ｍｌのＬＢブロスに加え、５０〜１００μｌの標的細菌を培養物に加え戻すことにより、ファージを更に集積する。集積培養物を上記のとおり一晩成長させる。この集積培養物からのサンプルを室温において１３，０００ｇで１５分間遠心し、１０μｌの上清を１００〜３００μｌの標的細菌及び３ｍｌの融解した０．７％軟寒天と共にＬＢ寒天ペトリ皿にプレーティングする。プレートを３７℃で一晩インキュベートする。
【０３６９】
菌叢に観察されるプラークの各々をピッキングし、５００μｌのＬＢブロスに移す。このプラークストックからのサンプルを標的細菌上に更にプレーティングする。見出される全てのファージについてプラーク精製を３回実施し、それにより不均質なファージ混合物から単一の均質なファージを分離する。
【０３７０】
コンフルエントな溶解を呈する宿主細菌株のオーバーレイプレートを回収することにより、高力価ファージ（＞１×１０＾１０  ＰＦＵ／ｍｌ）のプレートからのライセートを調製する。５ｍｌの緩衝液をあふれさせた後、軟寒天オーバーレイを浸軟させ、遠心によって清澄化し、ろ過滅菌する。得られたライセートは、４℃で保存する。高力価ファージライセートは、Ｓｕｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９２：１７９−１９０，２０１０に記載されるとおり等密度ＣｓＣｌ遠心によって更に精製する。
【０３７１】
Ｓｕｍｍｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５０２：２７−４６，２００９に記載されるとおり、ＣｓＣｌ精製ファージ懸濁液からＤＮＡを単離する。４５４パイロシーケンシング法を用いることにより２プールのファージゲノムの一部として個々の分離したファージをシーケンシングする。簡潔に言えば、ファージゲノムＤＮＡを約１００ｎｇ／Ｌの最終濃度となるように等モル量で混合する。プールＤＮＡを剪断し、プールの各々に特異的な多重識別（ＭＩＤ）タグとライゲートし、製造者のプロトコルに従ってシーケンサー（Ｒｏｃｈｅ）での全プレート反応を用いたパイロシーケンシングにより配列決定する。プールファージＤＮＡは２つのシーケンシング反応に存在する。ソフトウェア（４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用することにより、１アセンブリ当たり単一のＭＩＤを有するリードのみを含むように設定を調整することによってプールの各々に対応する出力を個別にアセンブルする。コンティグ配列に対して生成されるプライマー及び鋳型としての個々のファージゲノムＤＮＡ調製物を使用したＰＣＲにより、個々のコンティグのアイデンティティを決定する。配列ソフトウェア（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して配列アセンブリ及び編集を行う。
【０３７２】
ファージ染色体末端構造を実験的に決定する。ファージの付着（ｃｏｓ）末端は、Ｓｕｍｍｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５０２：２７−４６，２００９に記載されるとおり、ファージゲノムの末端をシーケンシングにより取り除き、環状化したゲノムＤＮＡのライゲート接合部を介した増幅によって得られるＰＣＲ産物をシーケンシングすることにより決定される。遺伝子予測ソフトウェアを使用して初めにタンパク質コード領域を予測し（Ｌｕｋａｓｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６：１１０７−１１１５，１９９８）、Ａｒｔｅｍｉｓにおける手動分析で精緻化し（Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １６：９４４−９４５，２０００）、ＢＬＡＳＴ（０．００５のＥ値カットオフ）を用いて分析する（Ｃａｍａｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １０：４２１，２００９）。特に興味深いタンパク質は、配列検索ソフトウェアによって更に分析する（Ｈｕｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．４０：Ｄ３０６−Ｄ３１２，２０１２）。
【０３７３】
ファージストックをトリプトソイブロス緩衝液で希釈することにより、ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）の病原性細菌種を溶解したＣｓＣｌ精製ファージ（＞１×１０＾１１  ＰＦＵ／ｍｌ）の電子顕微鏡法を行う。薄い４００メッシュ炭素被覆グリッドにファージを適用し、２％（ｗｔ／ｖｏｌ）酢酸ウラニルで染色し、風乾する。１００ｋＶの加速電圧で動作する透過型電子顕微鏡で標本を観察する。各ファージにつき５個のビリオンを測定し、適宜、カプシド及び尾部の寸法の平均値及び標準偏差を計算する。
【０３７４】
ミール中へのファージの配合
ハエを育てるために使用される培地は、コーンミール、糖蜜及び酵母培地（１１ｇ／ｌ酵母、５４ｇ／ｌイエローコーンミール、５ｇ／ｌ寒天、６６ｍｌ／ｌ糖蜜及び４．８ｍｌ／ｌプロピオン酸）である。ファージの最終濃度が０〜１０８ｐｆｕ／ｍｌに達するようにハエ飼料にファージ溶液を注入する。
【０３７５】
Ｓ．マルセセンス（Ｓ．Ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、エルウィニア・カロトボラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）及びシュードモナス・エントモフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｅｎｔｏｍｐｈｉｌａ）細菌を栄養ブロス又はＬＢブロス中３０℃で成長させる。
【０３７６】
ハエから採取した受精胚を２％次亜塩素酸塩溶液で５分間処理し、次に滅菌水で洗浄してあらゆる細胞外微生物を除去することにより、滅菌ハエ胚を作成する。滅菌ハエ飼料中に１０９ＣＦＵの細菌を播種し、この飼料に滅菌ハエ胚を加えることにより、標的細菌を有するハエ幼虫を作成する。２日後、１０匹のＳ．マルセセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）感染初齢ハエ幼虫を様々な（０〜１０８ｐｆｕ／ｍｌ）ファージ濃度でハエ飼料に加える。幼虫をそのまま３齢になるまでファージ含有飼料で３日間成長させる。次に、幼虫を回収し、栄養ブロス又はＬＢブロス中に個別にホモジナイズし、栄養寒天又はＬＢ寒天プレートにプレーティングし、３０℃でインキュベートする。種々のファージ濃度のハエ飼料中における幼虫から得られたＳ．マルセセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）のＣＦＵ数を記録する。これは、ハエに存在した生細菌数を示す。
【０３７７】
生細菌数は、その細菌に対するファージを含有するハエ飼料で成長した幼虫において減少すると予想される。
【０３７８】
実施例８：天然微生物ライブラリの作成
本実施例は、アミノ酸のメチオニンを天然で生産する細菌の土壌からの分離を実証する。
【０３７９】
微生物の分離に使用される培地は、デンプン−カゼイン−硝酸塩寒天（デンプン、１０．０ｇ；カゼイン、０．００３ｇ；ＫＮＯ３、０．０２ｇ；ＮａＣｌ、０．０２ｇ；ＭｇＳＯ４、０．５ｍｇ；ＣａＣＯ３、０．２ｍｇ；ＦｅＳＯ４、０．１ｍｇ；寒天、１２．０ｇ；Ｈ２Ｏ、１Ｌ；ｐＨ７．０）（Ｋｕｓｔｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，１９６４）である。各環境土壌サンプル（１．０ｇ）を９ｍｌの滅菌水に懸濁し、この懸濁液の１ｍｌを滅菌蒸留水中に１０倍で段階希釈する。１ミリリットルの１０−５希釈物を寒天培地に接種し、３０℃で７日間インキュベートする。この期間の終了時、成長に関してプレートを観察する。白色の独立した皮革様のコロニーをピッキングし、新規のデンプン−カゼイン−硝酸塩寒天プレート上で成長させて分離株のライブラリを作成する。３０℃で７日間成長させた後、プレートを４℃に保つ。
【０３８０】
実施例９：メチオニンを生産する分離株のスクリーニング
本実施例は、アミノ酸のメチオニンを天然で生産する実施例８からの分離株のスクリーニングアッセイを実証する。
【０３８１】
メチオニン生産に関するスクリーニング：
ショ糖（２０．０ｇ）及びＮＨ４Ｃｌ（１０．０ｇ）を含有する変法基礎培地（Ｋ２ＨＰＯ４、０．３ｇ；ＫＨ２ＰＯ４、０．７ｇ；Ｎａ２ＣＯ３、１．０ｇ；ＣａＣｌ２、５．０ｍｇ；ＭｇＳＯ４、０．３ｇ；ＦｅＳＯ４、１．０ｍｇ；Ｈ２Ｏ、１Ｌ）を発酵に使用する（Ｃｈａｙ，Ｂ．Ｐ．，Ｇａｌｖｅｚ，Ｆ．Ｃ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｐａｄｏｌｉｎａ，Ｗ．Ｇ．Ｐ．Ｕ．Ｌ．Ｂ．Ｐ．（１９９２）．Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｂａｔｃｈ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ（様々な炭水化物からのバッチ発酵によるメチオニン生産）．ＡＳＥＡＮ  Ｆｏｏｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ（Ｍａｌａｙｓｉａ））。培地のｐＨは、７．２である。
【０３８２】
培養条件：３０ｍｌの発酵培地が入った２５０ｍｌ三角フラスコに実施例８の７日間分離株培養物を２白金耳分接種する。フラスコを３０℃で回転式振盪機（１６０ｒｐｍ）において５日間インキュベートした後、メチオニン生産を評価する。全ての実験においてデュプリケートフラスコを調製し、接種しないフラスコを対照として供する。
【０３８３】
分離株の培養ブロス中のメチオニンの存在について、Ｋｈａｎｎａ  ａｎｄ  Ｎａｇ（Ｋｈａｎｎａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ（インビトロ組織培養でのアミノ酸生産），”Ｉｎｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９７３））の変法に従ってペーパークロマトグラフィーによって調べる。ブロス培養物を５０００×ｇで２０分間遠心し、１８ｃｍ×２２ｃｍの寸法のワットマン１番ろ紙の一縁部から１．５ｃｍ上まで２μＬの上清を適用する。上清と一緒に１μＬの容積の標準メチオニン溶液（０．１ｍｇ／ｍＬ）を適用し、ｎ−ブタノール、酢酸及び水（４：１：１）の溶媒混合物中でクロマトグラムを１８時間発色させる。クロマトグラムを室温で風乾し、ブタノール中０．１５％ニンヒドリン溶液を噴霧し、再び乾燥させた後、６０℃のオーブンで５分間加熱する。標準メチオニン溶液の値と一致する上清のニンヒドリン陽性スポット（青紫色）の値がブロス培養物中におけるメチオニンの存在を示す。分離株のブロス培養物中で生産されたメチオニンの濃度は、以下のとおり推定される。クロマトグラム上の分離株の上清のニンヒドリン陽性スポットを１０％エタノールに溶出させて、５２０ｎｍでの溶出物の分光光度読取りを記録する。標準曲線から上清中のメチオニン濃度を決定する。メチオニン溶液の種々の濃度（０．１〜０．９ｍｇ／ｍｌ）に対する光学濃度値のプロットは、標準メチオニン曲線としての役割を果たす。
【０３８４】
メチオニンを生産する分離株は、新鮮な寒天プレートに保ち、５０％グリセロール溶液のアリコートに２白金耳量の微生物を懸濁することによりストック溶液を作成する。
【０３８５】
実施例１０：ドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）に対するその発育速度を増加させるための食餌によるアミノ酸生産細菌株の投与
本例は、ドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）をアミノ酸生産細菌で処理することにより、栄養不足食で育てたときにその発育速度を増加させる能力を実証する。この実験計画は、その食餌中の栄養素が不足し得るミツバチなどの他の昆虫の発育に役立つように拡張することができる。
【０３８６】
治療計画：
ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のハエのための餌基質に混合した１０９コロニー形成単位（ＣＦＵ）の溶液を用いて、グルタミン酸又はメチオニン生産株である分離した細菌コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）を製剤化する。
【０３８７】
実験計画：
グルタミン酸又はメチオニンを生産するコリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）株を栄養ブロス中３０℃で成長させた。
【０３８８】
ハエを育てるために使用される培地は、コーンミール、糖蜜及び酵母培地（１１ｇ／ｌ酵母、５４ｇ／ｌイエローコーンミール、５ｇ／ｌ寒天、６６ｍｌ／ｌ糖蜜及び４．８ｍｌ／ｌプロピオン酸）である。プロピオン酸を除く食餌の全ての成分を一緒に脱イオン水中で絶えず混合しながら３０分間８０℃に加熱し、６０℃に放冷する。次に、プロピオン酸を入れて混合し、５０ｍｌの食餌をアリコートに分けて個別のボトルに入れ、放冷して固化させる。ハエは、２６℃、１６：８時間の明期：暗期サイクル、約６０％の湿度で飼育する。
【０３８９】
幼虫の成長速度を測定する実験セットアップには、規定食を使用した（Ｐｉｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）。規定食は、コーンミールベースの食餌に使用される原料のバッチ間変動の効果を取り除く。加えて、規定食は、個別の成分を除外して、それがハエの発育に及ぼす効果を試験することが可能である。
【０３９０】
発育速度アッセイ
１日目、１０９コロニー形成単位（ＣＦＵ）からなる栄養ブロス中１００ｕｌのコリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）懸濁液を５つのハエ飼料レプリケートに加えた。対照として、細菌を含まない栄養ブロスを５つの更なるハエ飼料ボトルに加えた。ショウジョウバエから採取した受精胚を２％次亜塩素酸塩溶液で５分間処理し、次に滅菌水で洗浄して、胚からあらゆる細胞外微生物を除去した。細菌を播種した及び対照のハエ飼料ボトルの全てに１０ｕｌの水中胚懸濁液（１：３胚：水懸濁液）を加えた。胚を含むハエ飼料は、実験の残りにわたって２６℃、１６：８時間の明期：暗期サイクル、約６０％湿度で維持した。全てのレプリケートで成虫羽化までの時間及び羽化率を測定した。蛹から最初の成虫が羽化した時点から、１２時間毎に成虫ハエの羽化数をカウントし、羽化率を計算した。
【０３９１】
幼虫体重アッセイ
アミノ酸を生産する細菌の存在が、規定食で育てたときに発育中の幼虫の体重を増加させ得るかどうかを試験するため、本発明者らは、純粋培養の、単一の細菌株が単独定着した幼虫を作製した。これらのアッセイには、３つの異なる細菌、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）  −  グルタミン酸を生産する株、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）  −  メチオニンを生産する株及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を使用した。
【０３９２】
初めに、純粋培養胚を作成した。酵母を含有するグレープジュース寒天プレート上で６時間にわたってショウジョウバエから受精胚を採取した。いかなる細菌汚染も除去するため、胚を２％次亜塩素酸塩溶液で５分間処理し、次に滅菌水で３回洗浄した。次に、１容積の胚を３容積の水に懸濁した。
【０３９３】
規定食をアリコートに分けてバイアルに入れ、試験する各条件につき９つのレプリケートを使用した。条件は、以下であった：
１．飼料への細菌の添加なし
２．グルタミン酸を生産する株であるＣ．グルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）を含有する飼料（Ｃ．ｇｌｕ−Ｇｌｕ）
３．メチオニンを生産する株であるＣ．グルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）を含有する飼料（Ｃ．ｇｌｕ−Ｍｅｔ）
４．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を含有する飼料
【０３９４】
条件２、３及び４の飼料の各バイアルに１００ｕｌの一晩定常期培養物を加えた。
【０３９５】
条件毎の９つのレプリケートの各々に１０ｕｌの滅菌胚＋水懸濁液を加えた。次に、バイアルを２６℃、６０％湿度、１６：８明期：暗期サイクルでインキュベートした。
【０３９６】
１３日後、各レプリケートから無作為に選択した１０〜１５匹の幼虫をサンプリングし、その生物量及び体重の代用としてその表面積を測定した。滅菌へらで飼料から幼虫を掬い出し、流水洗でその体から飼料を洗い落とし、各条件における全てのレプリケートについて、サンプリングした各幼虫の画像を個別に取得した。Ｉｍａｇｅ  Ｊスクリプトを使用して画像毎に幼虫を同定し、輪郭を描き、その面積を測定した。
【０３９７】
アミノ酸生産細菌処理は、昆虫の発育速度を増加させる。
【０３９８】
アミノ酸生産細菌株を播種した食餌で発育させた胚は、無菌食餌で育てた胚と比べて有意に速く成虫期に達した（図１）。更に、この効果は、雄ハエと比べて雌ハエでやや強かった（図２Ａ及び図２Ｂ）。
【０３９９】
アミノ酸生産細菌処理は、幼虫の体重を増加させる。
【０４００】
Ｃ．ｇｌｕ−Ｍｅｔを補充した食餌からの幼虫は、平均して体のサイズが最も大きく、その後にＣ．ｇｌｕ−Ｇｌｕ含有、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）含有及び細菌なしの食餌が続いた（図３）。これは、アミノ酸を生産する細菌で昆虫の食餌を増強すると、補充していない食餌よりも速く昆虫生物量が生じたことを示す。
【０４０１】
まとめると、このデータは、アミノ酸の生産能を有する細菌で昆虫の食餌を増強すると、補充していない食餌よりも速く昆虫生物量が生じたことを実証している。これをハチなどの他の昆虫に拡張すると、メチオニンの生産能を有する細菌をその食餌に補給することにより、その適応度を増加させることができる。
【０４０２】
実施例１１：精製ファージ溶液で処理した昆虫
本実施例は、特定の昆虫細菌を標的とした環境サンプルからのファージの分離及び精製を実証する。本実施例は、プラークアッセイにより、その酸素消費速度及び細胞外酸性化速度を測定することにより、分離されたファージのインビトロでの標的細菌に対する有効性も実証する。最後に、本実施例は、細菌に対して分離されたファージでハエを処理することによるハエからの標的細菌に対するファージの能力を測定することにより、インビボでのファージの有効性を実証する。本実施例は、昆虫の適応度を低下させた病原性細菌の標的化にファージを使用してその細菌を除去し得ることを実証する。具体的には、園芸コンポストから分離されたファージを使用して、ハエの病原性細菌であるセラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）を除去することができる。
【０４０３】
天然に存在する細菌性病原体に冒される有益且つ商業的に有用な昆虫が幾つかある。その一例は、ミツバチの腐蛆病の原因である細菌パエニバチルス・ラルバエ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｒｖａｅ）である。ファージを使用した腐蛆病の処理には、腐蛆病に起因する多大な損失の軽減に非常に価値があり得る。
【０４０４】
実験計画
天然サンプルからの特異的バクテリオファージの分離：
標的細菌に対するバクテリオファージを環境由来材料から分離した。簡潔に言えば、セラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）の飽和培養物を新鮮な２倍濃度トリプトソイブロス（ＴＳＢ）に希釈して２４〜２６℃で対数期初期まで約１２０分間成長させるか、又は２倍濃度ルリア−ベルターニ（ＬＢ）ブロスに希釈して３７℃で約９０分間成長させた。園芸コンポストをＰＢＳ中にホモジナイズすることにより調製し、０．２μｍろ過によって滅菌した。未処理の下水を０．２μｍろ過によって滅菌した。１容積のろ過した原材料を対数期細菌培養物に加え、インキュベーションを２４時間継続した。培養物をペレット化し、上清液を０．４５μｍメンブレンでろ過することにより、集積原材料を調製した。
【０４０５】
サンプルを２重寒天菌叢にプレーティングすることによりファージを分離した。定常期細菌培養物を融解０．６％寒天ＬＢ又はＴＳＢと合わせ、１．５％寒天ＬＢ又はＴＳＢプレートに注入した。固化後、２．５μＬのファージサンプル希釈液を２重寒天プレートにスポッティングし、吸収させた。次に、プレートを包み、２５℃（ＴＳＡ）又は３７℃（ＬＢ）で一晩インキュベートし、次に目に見えるプラークの形成に関して評価した。プラークをＳＭ緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ［ｐＨ７．４］、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１００ｍＭ  ＮａＣｌ）中にピッキングして５５℃で１５分間インキュベートし、次にプラーク懸濁液を使用して上記からの２重寒天スポッティング法を繰り返すことにより、新規に分離したプラークを標的株上の個々のプラークの連続継代によって精製した。
【０４０６】
下水及びコンポストの両方から上記に詳述したとおりバクテリオファージを分離することに成功した。集積に使用したＳ．マルセセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）細菌の菌叢上へのサンプルのスポッティング後、プラーク形成が明白に認められた。
【０４０７】
バクテリオファージの継代、定量化及び増殖：
上記のとおり分離及び精製したバクテリオファージを使用して、後続の実験に用いるファージライセートの増殖及び生成を実施した。簡潔に言えば、飽和細菌培養物を新鮮培地に１００倍希釈し、６０〜１２０分間成長させて、有効なファージ感染のための初期対数増殖状態を実現した。対数期初期培養物にファージ懸濁液又はライセートを加え、ファージ増殖及び溶菌の指標である澄明なブロスが観察されるまで又は感染後最長２４時間までインキュベーションを継続した。細胞を７，１９７×ｇで２０分間ペレット化し、次に０．４５又は０．２μｍメンブレンで上清液をろ過することによりライセートを回収した。ろ過したライセートを４℃で保存した。
【０４０８】
２重寒天スポッティング法を用いて感染性ファージ粒子の計数を実施した。簡潔に言えば、ＰＢＳでサンプルの１：１０系列希釈を実施し、上記のとおり宿主細菌で調製した固化２重寒天プレートに希釈液をスポッティングした。一晩インキュベートした後にプラーク形成単位（ＰＦＵ）をカウントし、サンプルの近似的力価を決定した。
【０４０９】
細菌の呼吸を測定する分離したファージのインビトロ分析：
Ｓｅａｈｏｒｓｅ  ＸＦｅ９６アナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して、感染中に酸素消費速度（ＯＣＲ）及び細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）をモニタすることによりファージが細菌に及ぼす効果を測定した。実験前日に、１ウェル当たり１５μＬの１ｍｇ／ｍＬ  ポリ−Ｌ−リジンストックでＸＦｅ９６プレートをコーティングし、２８℃で一晩乾燥させ、及び２００μＬのＸＦ  Ｃａｌｉｂｒａｎｔが入ったウェルに入れて暗所下室温でインキュベートすることによりＸＦｅ９６プローブを平衡化した。翌日、ポリ−Ｌ−リジンでコートしたプレートをｄｄＨ２Ｏで２回洗浄した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＬＢ、３７℃）又はＳ．マルセセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）（ＴＳＢ、２５℃）の飽和一晩培養物を同じ培地に１：１００で継代培養し、曝気しながら３０℃で約２．５時間成長させた。次に、同じ培地を使用して培養物をＯ．Ｄ．６００ｎｍ  約０．０２に希釈した。処理液は、ストックをＳＭ緩衝液に１０×最終濃度で希釈し、２０μＬの１０×溶液をプローブプレートの適切な注入ポートにロードすることにより調製した。ＸＦｅ９６フラックスアナライザーでプローブを平衡化している間、９０μＬの細菌懸濁液又は培地対照を加えることにより細菌プレートを調製し、３，０００ｒｐｍで１０分間スピンした。遠心後、ウェルに更なる９０μＬの適切な培地を、細菌付着を妨げないように静かに加え、１ウェル当たりの総容積を１８０μＬにした。
【０４１０】
ＸＦｅ９６フラックスアナライザーを１：００、０：３０、３：００の混合、待機、読取りサイクルに従って約３０℃で実行した。４サイクルを完了すると細菌の平衡化／標準化が可能となり、次に２０μＬ処理を注入して上記のとおりのサイクル処理を約６時間の総時間にわたって継続した。データは、Ｓｅａｈｏｒｓｅ  ＸＦｅ９６  Ｗａｖｅソフトウェアパッケージを使用して分析した。
【０４１１】
Ｓｅａｈｏｒｓｅ  ＸＦｅ９６アナライザーで細菌の酸素消費速度（ＯＣＲ）及び細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）を測定することにより、分離したバクテリオファージの効果をアッセイした。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）がファージＴ７に感染し、及びＳ．マルセセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）が新規に分離されたΦＳｍＶＬ−Ｃ１に感染すると、ＯＣＲの劇的な低下がこの速度の短時間のバースト後に観察された（図４）。両方の宿主生物での両方のファージについて、プラークアッセイの必要なしに、Ｓｅａｈｏｒｓｅアッセイによりファージ感染の成功を検出することが可能であった。従って、この方法は、従来のファージ検出方法に適さない宿主生物のファージ感染の検出に適用可能である。
【０４１２】
感染同定のためのＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ形質導入アッセイ：
ヌクレアーゼで前処理して、蛍光シグナル解釈を妨げ得るウイルス外核酸を取り除くことにより、バクテリオファージ調製物を染色のため調製した。簡潔に言えば、１０ｍＬのファージライセートに１０ｍＭの最終濃度でＭｇＣｌ２を加え、ＲＮａｓｅ  Ａ（Ｑｉａｇｅｎ）及びＤＮａｓｅ  Ｉ（Ｓｉｇｍａ）を両方とも１０μｇ／ｍＬの最終濃度となるように加えた。サンプルを室温で１時間インキュベートした。ヌクレアーゼ処理後、５ｍＬのライセートを１μＬのＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ（Ｔｈｅｒｍｏ、１０，０００×）と合わせ、室温で約１．５時間インキュベートした。続いて、Ａｍｉｃｏｎ限外ろ過カラムを使用してサンプルから過剰な色素を取り除いた。簡潔に言えば、１０ｍＬのＳＭ緩衝液を加え、５，０００×ｇ、４℃で５分間スピンすることにより、Ａｍｉｃｏｎカラム（１５ｍＬ、１０ｋ  ＭＷＣＯ）を洗浄した。次に、標識したファージサンプルを、カラムを通じて５，０００×ｇ、４℃でスピンして、最終的に容積を約１０倍低下させた（１５〜３０分）。サンプルを洗浄するため、各リザーバに５ｍＬ  ＳＭ緩衝液を加えてスピンを繰り返し、続いて更に２回洗浄した。３回目の洗浄後、Ａｍｉｃｏｎリザーバから保持サンプルをピペッティングにより取り除き、ＳＭ緩衝液を使用して約１ｍＬにした。より大きい夾雑物を取り除くため、洗浄及び標識したファージサンプルを１０，０００×ｇで２分間スピンし、続いて上清を０．２μｍメンブレンでろ過して黒色マイクロチューブに入れ、４℃で保存した。
【０４１３】
１ｍＬアリコートをスピンダウンし、１ｍＬ  ＰＢＳで１回洗浄した後、１ｍＬ  ＰＢＳを使用して最終的に再懸濁することにより、飽和細菌培養物（ＬＢ中３７℃で成長させた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５、ＴＳＢ中２６℃で成長させたＳ．マルセセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）及びＳ．シンビオティカ（Ｓ．ｓｙｍｂｉｏｔｉｃａ））を調製した。５００μＬの洗浄した細菌を１μＬのＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄと合わせ、暗所下室温で１時間インキュベートすることにより、陽性対照で標識した細菌を染色した。８，０００×ｇで５分間スピンすることにより細菌をペレット化し、等容積のＰＢＳで２回洗浄した後、続いて５００μＬ  ＰＢＳの最終容積に再懸濁した。２５μＬの容積の染色した細菌を２５μＬのＳＭ緩衝液と黒色マイクロチューブに合わせ、そこに５０μＬの１０％ホルマリン（５％最終容積、約２％ホルムアルデヒド）を加え、軽く叩くことにより混合した。サンプルを室温で約３時間固定し、次にＡｍｉｃｏｎ限外ろ過カラムを使用して洗浄した。簡潔に言えば、５００μＬのピコピュア（ｐｉｃｏｐｕｒｅ）水をＡｍｉｃｏｎカラム（０．５ｍＬ、１００ｋ  ＭＷＣＯ）に加え、１４，０００×ｇで５分間スピンしてメンブレンを洗浄した。４００μＬのＰＢＳを加えることにより、固定されたサンプルを希釈して、次に予め洗浄したスピンカラムに移し、１４，０００×ｇで１０分間スピンした。カラムを新鮮な収集チューブに移し、５００μＬのＰＢＳを加えて、保持液中に残る固定液を希釈して除いた。続いて、２つの更なるＰＢＳ希釈を実施して、合計３回洗浄した。最終的な保持液を約１００μＬに希釈し、次にカラムを逆さにして新鮮な収集チューブに入れ、１，０００×ｇで２分間スピンしてサンプルを回収した。洗浄したサンプルを黒色マイクロチューブに移し、４℃で保存した。
【０４１４】
形質導入実験及び対照のため、２５μＬの細菌（又はＰＢＳ）と２５μＬのＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ標識ファージ（又はＳＭ緩衝液）とを黒色マイクロチューブに合わせ、静的に室温で１５〜２０分インキュベートすることにより、レシピエント細菌へのファージの吸着及び注入を可能にした。インキュベーション後直ちにサンプルに５０μＬの１０％ホルマリンを加え、固定を室温で約４時間実施した。上記のとおりＡｍｉｃｏｎカラムを使用してサンプルをＰＢＳで洗浄した。
【０４１５】
ファージによる宿主細菌細胞の感染の成功には、バクテリオファージ核酸の注入が必要であった。大腸菌ファージＰ１ｋｃをＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄで標識し、Ｓ．マルセセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）とコインキュベートすると、顕微鏡法によって蛍光細菌の存在が明らかとなり、ファージ分離パイプラインにおけるこのアッセイの使用がバリデートされた。Ｓｅａｈｏｒｓｅアッセイと同様に、この手法は、従来のファージ方法に代わる手段を提供し、プラークアッセイに適しない生物への拡張が可能になった。加えて、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ形質導入アッセイは、細菌を成長させる必要がなかったため、ブフネラ属（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）などの内部共生体を含め、培養困難又は更には培養不可能な生物を標的とするファージの分析に適用可能である。
【０４１６】
ドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）ハエにおけるＳ．マルセセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）に対するファージのインビボ有効性の試験
Ｓ．マルセセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）培養物をトリプトソイブロス（ＴＳＢ）中３０℃において２００ｒｐｍで絶えず振盪しながら成長させた。
【０４１７】
ハエストックを育てるために使用される培地は、コーンミール、糖蜜及び酵母培地（１１ｇ／ｌ酵母、５４ｇ／ｌイエローコーンミール、５ｇ／ｌ寒天、６６ｍｌ／ｌ糖蜜及び４．８ｍｌ／ｌプロピオン酸）であった。プロピオン酸を除く食餌の全ての成分を一緒に脱イオン水中で絶えず混合しながら３０分間８０℃に加熱し、６０℃に放冷した。次に、プロピオン酸を入れて混合し、５０ｍｌの食餌をアリコートに分けて個別のボトルに入れ、放冷して固化させた。ハエは、２６℃、１６：８時間の明期：暗期サイクル、約６０％湿度で飼育した。
【０４１８】
ハエをＳ．マルセセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）に感染させるため、細針（約１０ｕｍ幅先端）を高密度一晩定常期培養物に浸漬し、ハエの胸部を穿刺した。この実験のため、ハエ死亡率の陽性対照として、針穿刺法を使用して各１０匹の雄及び１０匹の雌の４つのレプリケートをＳ．マルセセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）に感染させた。処理群について、各１０匹の雄及び１０匹の雌の４つのレプリケートをＳ．マルセセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）及び約１０８個のファージ粒子／ｍｌを含有するファージ溶液で穿刺した。最後に、いずれでも穿刺又は処理しなかった各１０匹の雄及び１０匹の雌の２つのレプリケートを死亡率の陰性対照として使用した。
【０４１９】
全ての条件のハエを飼料ボトルに入れ、２６℃、１６：８明期：暗期サイクル、６０％湿度でインキュベートした。ハエの生死の数を穿刺後４日間にわたって毎日カウントした。Ｓ．マルセセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）単独で穿刺したハエは、全て処理から２４時間以内に全て死亡した。比較すると、ファージ処理群のハエの６０％超及び未処理対照群の全てのハエがその時点で生きていた（図５）。更に、ファージ処理群及び陰性対照群のハエの大部分は、実験が終了しても更に４日間生存し続けた。
【０４２０】
ハエの死亡理由を確かめるため、Ｓ．マルセセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）を穿刺したハエ及びＳ．マルセセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）＋ファージを穿刺したハエの両方からの死亡したハエをホモジナイズし、プレートアウトした。Ｓ．マルセセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）処理及びＳ．マルセセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）＋ファージ処理の両方の４つのレプリケートの各々からの４匹の死亡したハエを１００ｕｌのＴＳＢ中にホモジナイズした。ホモジネートをＴＳＢに希釈することにより１：１００希釈液も作成した。１０ｕｌの濃縮ホモジネート並びに１：１００希釈液をＴＳＡプレートにプレートアウトし、３０℃で一晩インキュベートした。細菌成長に関してプレートを調べると、死んだＳ．マルセセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）穿刺ハエからの全てのプレートは、その上に成長する細菌の菌叢を有する一方、死亡したＳ．マルセセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）＋ファージ穿刺ハエからのプレートは、その上に細菌を有しなかった。これは、ファージが存在しないとき、Ｓ．マルセセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）がハエに敗血症性ショックを引き起こし、その致死につながった可能性があることを示す。しかしながら、ファージの存在下では、死亡は、針による穿刺によって引き起こされた外傷が原因であった可能性もある。
【０４２１】
他の実施形態
前述の本発明は、理解を明確にするために説明及び例として幾らか詳細に記載されているが、そうした記載及び例が本発明の範囲を限定するものと解釈されてはならない。本明細書に引用される全ての特許及び科学文献の開示は、全体として参照により明示的に援用される。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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