(57)【要約】  本発明は、根管充填材、及び該根管充填材を使用することによる歯組織再生方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
乏血小板血漿（ＰＰＰ）又はスキャフォールドに封入された、多能性間質細胞の集団又は前記細胞から分泌されたセクレトームを含む組成物。
【請求項２】
前記多能性間質細胞が、前記細胞によって分泌されたセクレトームの外部培地への遊離に適した乏血小板血漿（ＰＰＰ）又はスキャフォールドに封入されていることを特徴とし、前記セクレトームが、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、及び／又はＤＭＰ−１を含む一覧から選択される増殖因子を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記多能性間質細胞の集団が、歯髄幹細胞（ＤＰＳＣ）、脱落乳歯歯髄幹細胞（ＳＨＥＤ）、歯根膜幹細胞（ＰＤＬＳＣ）、歯乳頭由来幹細胞（ＳＣＡＰ）、歯小嚢前駆細胞（ＤＦＰＣ）、胎盤ＭＳＣ（Ｐ−ＭＳＣ）、骨髄ＭＳＣ（間葉系幹細胞）、脂肪組織由来ＭＳＣ、及び臍帯血（ＵＣ−ＭＳＣ）からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記多能性間質細胞の集団が、臍帯血（ＵＣ−ＭＳＣ）である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物と、任意に、薬学的に許容可能な担体／ビヒクルと、１以上の賦形剤とを含む、医薬組成物。
【請求項６】
治療のために用いられる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
根管において、歯組織、特に歯髄組織を再生する方法の歯組織再生のために用いられる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記方法が、根尖周囲疾患に感染した根管を抜髄すること又は拡大すること、及びクリーニングすることと、前記根管の少なくとも根尖領域に、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物を注入することとを含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記根尖領域の根管の幅が、前記根管の根尖領域への前記組成物の挿入前の前記根管の拡大によって、特定のサイズに調整される、請求項７又は８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記多能性間質細胞の濃度が、１×１０３細胞／μｌ〜１×１０７細胞／μｌ、好ましくは約１×１０６細胞／μｌである、請求項７〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記方法が、根尖周囲疾患に感染した根管を抜髄すること又は拡大すること、及びクリーニングすることと、前記根管の少なくとも根尖領域に請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物を注入することとを含む、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
骨又は結合組織、好ましくは軟骨組織の再生のために用いられる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
皮膚の再生、又は皮膚の疾患若しくは傷害の治療のために用いられる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
歯周組織の再生、又は歯周病、好ましくは歯周炎の治療のために用いられる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
乏血小板血漿（ＰＰＰ）に封入された実質的に純粋な多能性間質細胞集団を含む組成物を作製する方法であって、乏血小板血漿（ＰＰＰ）中で多能性間質細胞の細胞集団を増殖させることを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、根管充填材、及び該根管充填材を使用することによる歯組織再生方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
齲蝕が歯髄に達するほど深い場合には、通常、齲蝕の治療のための抜髄が行われる。しかしながら、歯髄には、修復象牙質形成によって外部刺激を阻む機能のみならず、知覚によって細菌の更なる侵入を阻止し、硬い物質を噛むことによって引き起こされる歯牙破折を咬合の感覚により予防する機能もある。さらに、歯髄は代謝によって象牙質にタンパク質及び水を維持することができ、加えて、象牙質の引張強さ及び他の特性を維持することができる。また、歯髄は免疫系による感染防御機構を有することも知られている。
【０００３】
根管は形態学的に複雑であるため、歯内治療学ではＮｉＴｉ合金製の回転式やすり（rotary files）が広く使用される。しかしながら、完全な抜髄、根管の拡大及び根管充填は、ほぼ不可能である。そのため、抜髄は、しばしば根尖性歯周炎につながり、その結果として歯を失う可能性が高い。さらに、空になった根管における歯髄再生に関する報告は大半が、未熟な歯におけるものである。完全に根尖閉鎖がされている成熟した歯における歯髄炎又は根尖性歯周炎を伴う深在性齲食の場合、歯組織再生に対する方法又は根管充填材はまだ開発されていない。したがって、歯の寿命のためできるだけ長く歯髄を維持する方法の開発に対して、満たされていないニーズが存在する。
【０００４】
この意味で、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は歯再生分野で大いに将来性がある。ＭＳＣは、骨髄（ＢＭ）、脂肪組織、歯髄、歯肉組織、又は臍帯及び胎盤等の種々様々な供給源に由来し得る。ＭＳＣは多能性細胞であり、異なる種類（骨形成性、軟骨形成性、脂肪生成性）の細胞へと分化する能力を有する。ＭＳＣの多様な供給源にもかかわらず、主に骨髄ＭＳＣが細胞療法において広く使用されているが、骨髄由来ＭＳＣ（ＢＭ−ＭＳＣ）を使用することの主な不利な点の１つは、比較的収率が低く、したがって、大量のＢＭ−ＭＳＣを採取することが困難であることである。この意味で、別の研究によれば、臨床試験を行うためには、好成績を得るように、安定した表現型を共有する多数の細胞が必要である。この目的は、ＢＭ−ＭＳＣによって達成することが難しい。
【０００５】
一方、現時点では、５種類の異なるヒト歯幹細胞、すなわち歯髄幹細胞（ＤＰＳＣ）、脱落乳歯歯髄幹細胞（ＳＨＥＤ）、歯根膜幹細胞（ＰＤＬＳＣ）、歯乳頭由来幹細胞（ＳＣＡＰ）及び歯小嚢前駆細胞（ＤＦＰＣ）が単離され、特性評価されている。胎盤ＭＳＣ（Ｐ−ＭＳＣ）は、臍帯血（ＵＣＢ）、羊水、羊膜、ホウォートンゼリー（Wharton's jelly）、絨毛膜、絨毛膜絨毛及び脱落膜だけでなく、母体と胎児の両方の起源を含む複数の胎盤領域からも得られる。臨床試験においてＭＳＣに対して最も一般的な胎盤供給源は臍帯、より正確にはＵＣＢである。臨床報告は、非代償性肝硬変症の患者におけるＵＣＢ−ＭＳＣの移植が安全で、患者の生活の質を改善することを示した。しかしながら、ＭＳＣはＵＣＢにおいて非常に存在頻度が低いことが分かっており、これは、より大きなスケールでのＭＳＣの適用に対する制限となる。
【０００６】
さらに、乏血小板血漿（ＰＰＰ：Platelet-Poor Plasma）は、血小板数が非常に少ない（１０×１０３／μＬ未満）血漿である。慣例では、ＰＰＰは、多血小板血漿濃度を調整するとともに、対照としての役割を果たすため、血小板凝集研究における使用が推奨されている。ＰＰＰは高レベルのフィブリノゲンを有する場合があり、フィブリノゲンは、一旦活性化されるとフィブリンに富む凝血塊を形成する能力を有する。創傷治癒は、細胞の遊走及び付着を必要とし、このフィブリン凝血塊によって促進される。
【０００７】
ＰＰＰを作製する方法は、この意味で、当該技術分野においてよく知られており、例示的な方法論は以下の通りである：
−採血から２時間以内に、蓋をしたクエン酸チューブで３０００ｇ〜３５００ｇのＲＣＦ（相対遠心力）にて１５分間、遠心分離する。
−プラスチック製全量ピペットを使用して、血漿の上部３／４を取り出し、それをキャップ付プラスチック製遠心管に入れる。
−３０００ｇ〜３５００ｇで更に１５分間、（プラスチック製遠心管において）血漿を遠心分離する。
−プラスチック製全量ピペットを使用して、プラスチック製チューブに上部３／４を移す。残存血小板があるかもしれない分離させたチューブ底の血漿を乱してはならない。
−目に見える赤血球又は溶血（ピンク色の血漿）を含むアリコートは許容されない。そして、
−血漿を直ちに凍結する。大半の実験室アッセイ用試料は、採血から４時間以内に凍結されなければならない。
−血漿由来画分を増殖因子の供給源として使用した。しかしながら、それらの生物学的効果及び細胞適合性に関する限られた知識が、支持スキャフォールドとしてのそれらの適用を制限している。
【０００８】
本発明者らは、本発明において、ＭＳＣとＰＰＰとの組み合わせ、すなわちＰＰＰに封入されたＭＳＣが、歯内治療学的状態における再生可能性を相乗的に高めることを示し、このようにして歯の寿命のためできる限り長く歯髄を保存する代替的で有用な治療方法を提供する。
【発明の概要】
【０００９】
上記課題を解決するために設定された本発明の目的は、抜髄後に根尖が完全に閉鎖した成熟した歯の根管にスキャフォールドを充填することによって、歯組織の再生のための新規で独創的な根管充填材を提供すること、また、かかる根管充填材を使用することによる歯組織再生方法を提供することである。上記根管充填材は、乏血小板血漿に封入された又はそこで増殖された間葉系幹細胞（ＭＳＣ）で作製される。特に、本発明は、ＰＰＰに封入されたＭＳＣの図２（Ｅ）、（Ｆ）及び（Ｇ）に示される通り、１日目（埋め込み前）と比較して、埋め込みから１２日後の細胞数の有意な増加があることを説明する。したがって、本発明は、特に、歯組織の再生、特に歯髄の再生のための根管充填材の作製に対する、ＭＳＣの支持体及びビヒクルとしてのＰＰＰの有用性を示す。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】（Ａ）１日間、７日間及び１４日間、ＰＰＰ中で増殖されたＭＳＣの組織像を示す図である。その後、細胞を数え、供給源の異なる２種類のＭＳＣ（間葉系幹細胞）（ＵＣ−ＭＳＣ（臍帯幹細胞）及びＤＰＳＣ（歯髄幹細胞））の間で比較した。（Ｂ）空隙率の変化を示す、培養ＭＳＣを含む又は含まないＰＰＰの培養後１日目又は２１日目の電子顕微鏡分析（ＥＭ）を示す図である。
【図２】（Ａ）種々の時間点における、インキュベートされたＵＣ−ＭＳＣ間の細胞増殖の定量を示す図である。３日目及び７日目に、４℃と比較して、３７℃でのＵＣ−ＭＳＣの増殖の増加が観察された（ｐ＜０．０５）。（Ｂ、Ｃ及びＤ）３名の異なるドナーのＰＰＰとＵＣ−ＭＳＣとの間の種々のタンパク質（ＶＥＧＦ、ＦＧＦ及びＤＭＰ−１）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ放出を示す図である。結果は、ｐ＜０．０５で、ドナーＵＣ−ＭＳＣ（３７４−５）及びＰＰＰに関するドナー０８５０に対してより高いタンパク質放出を示した。（Ｅ、Ｆ及びＧ）ｉｎ  ｖｉｖｏでのＰＰＰに封入されたＵＣ−ＭＳＣの増殖速度を示す図である。（Ｅ）１日目（埋め込み前）及び（Ｆ）１２日目（埋め込み後）におけるＰＰＰに封入されたＵＣ−ＭＳＣの組織学的染色。（Ｇ）ｉｍａｇｅ  Ｊ分析に基づく細胞計数は、１日目と比較して、埋め込みから１２日後に著しい数の細胞を示した。全てのデータは、最小で４名のドナーの関連するＳＥＭ（ｎ＝３）を伴う平均として表される。
【図３】（Ａ）ＤＰＳＣとＵＣ−ＭＳＣとの間の増殖を、アラマーブルー細胞増殖アッセイを使用して調査した。それぞれ、１．２倍及び１．１倍の増加を伴って、３日目及び９日目にＤＰＳＣの増殖の有意な増加（Ｐ＜０．０００１）が観察された。（Ｂ及びＣ）は、ＵＣ−ＭＳＣが、分析された種々の時間点に対するＤＰＳＣとの比較で、より高い遊走能を持つことを示す。
【図４】（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）培養開始から５時間後に評価したチューブ形成の画像分析は、ＵＣ−ＭＳＣと比較して、ＤＰＳＣに対する毛細血管様構造のより広範囲なネットワークによって証明される、より高い血管形成能を示した。（Ｅ）画像を撮影したところ、結果は、正常酸素条件と比べて、低酸素条件下で順化培地と共にインキュベートしたＨＵＶＥＣＳでは、より高度な管状構造を示した。（Ｆ、Ｇ、Ｈ）低酸素ＤＰＳＣと低酸素ＵＣ−ＭＳＣとの間の総チューブ長、総ループ及び総分岐点の形成の間に有意差があった。（Ｉ、Ｊ）血管形成因子の定量は、低酸素条件下での８時間のインキュベーション後にＵＣ−ＭＳＣと比較したＤＰＳＣについて、ＶＥＧＦ放出に有意差がないことを明らかにした。
【図５】（Ａ）全てのプラグは、インプラントの周囲及びその内部に血管を生成した。（Ｂ）インプラントの画像分析は、ＤＰＳＣとＵＣ−ＭＳＣとの間の血管形成に有意差がないことを示した。（Ｃ）結果は、マトリゲル（陰性対照）と比較して、６．２倍変化のより高いＤＰＳＣのヘモグロビン含有量（Ｐ≦０．０００１）、及びＵＣ−ＭＳＣとマトリゲル（陰性対照）との間の５．１倍変化の差を示した。
【図６】（Ａ）ＵＣ−ＭＳＣ又はＤＰＳＣをＰＰＰスキャフォールドに封入し、様々な時間点に対してｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養した。（Ｂ）結果は、様々な時間点でＤＰＳＣ及びＵＣ−ＭＳＣがＰＰＰスキャフォールド上に付着され、増殖したことを示した。ＰＰＰに封入されたＤＰＳＣ又はＵＣ−ＭＳＣの増殖を、アラマーブルーで評価した。結果は、３日目、７日目及び１４日目においてＤＰＳＣ＋ＰＰＰ対ＰＰＰ単独の間で、それぞれ、１．５倍変化（Ｐ＜０．０５）、３．１倍変化（Ｐ≦０．０００１）及び３倍変化（Ｐ≦０．０００１）の増殖の増加を示した。また、７日目及び１４日目においてＵＣ−ＭＳＣ＋ＰＰＰ対ＰＰＰ単独の間で１．８倍変化（Ｐ≦０．０００１）及び２．８倍変化（Ｐ≦０．０００１）の増加を観察した。最後に、日にＵＣ−ＭＳＣ＋ＰＰＰとＤＰＳＣ＋ＰＰＰとの間で、有意差のある１倍（Ｐ≦０．０００１）を観察した。（Ｃ）ＵＣ−ＭＳＣ又はＤＰＳＣの組織学的切片は、増殖結果と一致する、ＤＰＳＣ及びＵＣ−ＭＳＣに対する細胞数の増加を明らかにした。（Ｄ）ＳＥＭ像は、生体材料表面近くに分布したランダムなフィブリン線維を含むＰＰＰの多孔質構造を明らかにした。ＤＰＳＣ又はＵＣ−ＭＳＣのいずれかが封入されたＰＰＰは、１４日間のインキュベーション後、空隙率の明らかな増加を示した。
【図７】（Ａ）細胞を含む又は含まないＰＰＰの放出プロファイルを調査するため、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ及びＤＭＰ−１等の種々のタンパク質因子のＥＬＩＳＡを使用した。（Ｂ）２４時間のインキュベーション後、ＰＰＰ＋ＤＰＳＣとＰＰＰ＋ＵＣ−ＭＳＣと間で、封入されたＶＥＧＦ（ＥＦ）のタンパク質発現に１．３倍の増加（Ｐ≦０．０１）があった。（Ｃ）また、ＰＰＰ＋ＤＰＳＣとＰＰＰ＋ＵＣ−ＭＳＣとの間で、２４時間後に封入されたＦＧＦ（ＥＦ）のタンパク質発現の２．１倍増の増加（Ｐ≦０．０００１）があった。（Ｄ）最後に、タンパク質ＤＭＰ−１のタンパク質発現について、２４時間のインキュベーションの後、放出された（ＲＦ）ＰＰＰと放出されたＰＰＰ＋ＤＰＳＣとの間に１．１倍変化の変動（Ｐ＜０．０５）があった。２４時間のインキュベーション後、ＰＰＰ＋ＤＰＳＣとＰＰＰ＋ＵＣ−ＭＳＣとの間で、封入された因子（ＥＦ）又は放出された因子（ＲＦ）のタンパク質発現に有意差は観察されなかった。これらの結果は、ＰＰＰに封入されたＤＰＳＣは、ＰＰＰにＵＣ−ＭＳＣを封入することと比較して、より多くのタンパク質因子を産生することを示唆した。
【図８】（Ａ）象牙質ディスク／ＰＰＰスキャフォールドを、３０日間皮下に埋め込んだ。（Ｂ）摘除する前にインプラントの画像を撮影し、象牙質象牙質ディスク／ＰＰＰ周辺の血管形成の評価を行った。（Ｃ）結果は、ＰＰＰ単独と比較して、ＰＰＰ＋ＤＰＳＣについて、象牙質ディスク周辺の血管形成において１．６倍の増加（Ｐ≦０．０１）を示した。（Ｄ）ヘマトキシリン及びエオジンの結果は、ＤＰＳＣ又はＵＣ−ＭＳＣがＰＰＰに十分組み込まれ、新たな石灰化された象牙質様組織の緻密層を形成する象牙壁へと遊走したことを示した。（Ｅ）免疫組織化学染色は、ＤＰＳＣ又はＵＣ−ＭＳＣのいずれかに対する新たな象牙質の形成及び象牙芽細胞形成を示唆する、象牙質シアロタンパク質（ＤＳＰＰ）に対する陽性染色を明らかにした。（Ｆ）結果は、ＰＰＰ単独と比較して、ＰＰＰ＋ＤＰＳＣについて２８．１倍変化（Ｐ≦０．０００１）の増加、及びＰＰＰと比較して、ＰＰＰ＋ＵＣ−ＭＳＣについて２８．５倍変化（Ｐ≦０．０００１）の差を示した。（Ｇ）大半の細胞は、これらの細胞のヒト細胞起源を確認する抗体に対して陽性に染色された。
【図９】（Ａ）両方の細胞供給源（ＵＣ−ＭＳＣ及びＤＰＳＣ）は、ＣＤ１０５、ＣＤ９０、ＣＤ７３、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１９及びＨＬＡ−ＤＲ等の共通のＭＳＣマーカーの陽性発現を示し、（Ｂ）また、ＤＰＳＣ及びＵＣ−ＭＳＣは、誘導されて中胚葉性組織（脂肪生成、軟骨形成、及び骨形成）の系統へと分化した。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、添付の図面を参照して、本発明の好ましい実施形態を具体的に説明する。
【００１２】
（実施形態１）
本実施形態では、本発明は、感染した根管の抜髄又は拡大、及びクリーニングの後に、乏血小板血漿（ＰＰＰ）に封入された多能性間質細胞の集団を根管の根尖側に注入することを特徴とする、根管における歯組織の再生のための歯組織再生方法に関する。再生される歯組織は、例えば、根管中の血管、神経、歯髄、象牙質等である。本発明において、本実施形態では、感染した根管の抜髄又は拡大、及びクリーニングの後、歯髄を除去して消毒し、根管の根尖部を切り取って開き（歯根尖切除）、根管充填材を移植する。本発明において、本実施形態では、合成充填材又は凝血塊を消毒した中空状の根管に移植しないが、歯髄組織を模倣する、有害作用を引き起こすことのない生体適合性に優れた、多能性間質細胞との免疫原性の低いスキャフォールドを使用する。根管充填材は、好ましくは根管の根尖部分の１／４〜２／５、より好ましくは根尖部分の１／３まで充填される。
【００１３】
以下、実施形態１における歯組織再生方法を図面及び実施例を参照して説明する。実施例に示されるように、細胞外マトリクス、特にＰＰＰを調製する。細胞外マトリクスは、細胞付着のためのマトリクス、いわゆるスキャフォールドである。
【００１４】
実施例に示されるように、根管充填材は、細胞外マトリクス（ＰＰＰ）中で歯髄幹細胞又は臍帯幹細胞を含む多能性間質細胞を増殖させる又は封入することによって作製される。根管充填材の歯髄幹細胞を含む細胞は、根管の根尖部分に付着される。根管充填材を製造する方法の典型例を実施例で提供する。
【００１５】
この意味で、例えば、歯髄炎を伴う歯は、本実施形態の歯組織再生方法において、抜歯に供される。次いで、標的とされた歯は、抜髄に供される。標的とされた歯は、齲蝕、歯髄炎等のため微生物感染が歯冠歯髄又は歯根歯髄に達している歯である。抜髄は、歯の中にある歯髄全体を除去する手術である。
【００１６】
抜髄後、標的とされた歯の根管の拡大によって、特定の幅に根尖孔のサイズを調整することが望ましい。以下に説明される通り、根管が拡大されると、抜髄後、根管に根管充填材を固定する際に根管充填材を充填するのが容易であり、血管及び神経が根尖歯周組織から該充填材へと容易に貫入するからである。
【００１７】
例えば、根尖孔の幅、すなわち、根管の直径は、０．７ｍｍ以上及び１．５ｍｍ以下であることが望ましい。根管の幅が０．７ｍｍ未満である場合、血管及び神経が根尖歯周組織から容易に貫入せず、根管充填材を充填するのが困難となる可能性があり、根管の幅が１．５ｍｍを超えると、根管の拡大は、標的とされた歯に対して必要以上の負荷を印加することにつながって、歯牙破折を引き起こす可能性がある。
【００１８】
標的とされた歯の抜髄後、根管充填材（乏血小板血漿（ＰＰＰ）に封入された多能性間質細胞の集団を含む組成物）を例えばピンセットで根管の根尖側に挿入する。かかる組成物は、例えばピペットマン又は注射器によって注入されてもよい。
【００１９】
上記組成物に含まれる細胞は、歯組織再生治療に供される動物から抽出された自己由来細胞であってもよく、又は歯組織再生治療に供される動物とは異なる動物から抽出された同種異型細胞であってもよい。この意味で、本発明において有用な多能性間質細胞又は間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、骨髄（ＢＭ）、脂肪組織、歯髄、歯肉組織、又は臍帯及び胎盤等の種々様々な供給源に由来し得る。ＭＳＣは多能性細胞であり、異なる種類（骨形成性、軟骨形成性、脂肪生成性）の細胞へと分化する能力を有する。特に、本発明で特に有用なＭＳＣは、歯髄幹細胞（ＤＰＳＣ）、脱落乳歯歯髄幹細胞（ＳＨＥＤ）、歯根膜幹細胞（ＰＤＬＳＣ）、歯乳頭由来幹細胞（ＳＣＡＰ）、及び歯小嚢前駆細胞（ＤＦＰＣ）等の種々のヒト歯幹細胞である。さらに、本発明を実施するのに有用な他のＭＳＣは、臍帯血（ＵＣＢ）、羊水、羊膜、ホウォートンゼリー、絨毛膜、絨毛膜絨毛及び脱落膜だけでなく、母体と胎児の両方の起源を含む多能性胎盤領域からも得られる胎盤ＭＳＣ（Ｐ−ＭＳＣ）である。
【００２０】
根管充填材中のＭＳＣ含有量は、１×１０３細胞／μｌ以上、１×１０７細胞／μｌ以下が好ましい。これは、１×１０３細胞／μｌ未満の幹細胞含有量は、根管における歯組織の不十分な再生につながる可能性があるためである。一方、１×１０６細胞／μｌ超、特に１×１０７細胞／μｌ超の歯髄幹細胞含有量は、標的とされた歯に予期しない有害反応を引き起こす可能性がある。
【００２１】
根管の根尖側への根管充填材の注入後、根管充填材の上の領域にゼラチンを注入してもよく、樹脂で根管に蓋をしてもよい。次いで、抜歯されたくぼみに抜いた歯を再度埋め込む。
【００２２】
こうすることで、根管において歯組織が再生される。再生される歯組織は、例えば根管の血管及び歯髄組織である。次いで、樹脂を一旦除去し、ＢＭＰ等のモルフォゲン、又は増殖／分化因子を、歯冠歯髄に塗布し、樹脂で根管に蓋をする。モルフォゲン又は増殖／分化因子が歯冠歯髄に塗布されると、象牙質も再生される。再生され得る組織は、それらに限定されず、神経再生も加速される。
【００２３】
標的とされた歯は、それに限定されないが、上に記載される実施形態１において、齲蝕、歯髄炎等のため、微生物感染が歯冠歯髄又は根部歯髄にまで達している歯であり、また標的とされる歯として、神経機能の低下によって咬合の感覚が弱くなった歯も挙げられる。そのような場合、抜髄後に根管充填材を注入することによって、歯髄を再生することで咬合の感覚を改善することが可能である。また、標的とされる歯として、微生物感染が根尖歯周組織に達している歯（微生物が歯髄、更には根管壁の象牙質及び根尖歯周組織に達している歯）も挙げられる。
【００２４】
（本発明の更なる実施形態）
本発明の第２の実施形態は、乏血小板血漿（ＰＰＰ）に封入された多能性間質細胞の集団を含む組成物に関するものであり、ここで、好ましくは、多能性間質細胞の集団は、歯髄幹細胞（ＤＰＳＣ）、脱落乳歯歯髄幹細胞（ＳＨＥＤ）、歯根膜幹細胞（ＰＤＬＳＣ）、歯乳頭由来幹細胞（ＳＣＡＰ）、歯小嚢前駆細胞（ＤＦＰＣ）、胎盤ＭＳＣ（Ｐ−ＭＳＣ）、骨髄ＭＳＣ（間葉系幹細胞）、脂肪組織由来ＭＳＣ、及び臍帯血（ＵＣＢ）ＭＳＣからなる群から選択される。
【００２５】
好ましい実施形態では、多能性間質細胞の集団は、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、及び／又はＤＭＰ−１を含む又はそれらからなる、細胞外小胞、サイトカイン及び増殖因子を含むパラクリン因子を分泌することができる。本発明者らは、これらの放出された分子をいずれもＭＳＣセクレトームと呼ぶ。本発明の好ましい実施形態では、多能性間質細胞は、増殖因子が徐々に分泌される生体材料スキャフォールドに封入される。したがって、本発明の好ましい実施形態は、生体材料スキャフォールドに封入された多能性間質細胞に関するものであり、該細胞はスキャフォールドによって吸収される増殖因子を分泌し、該スキャフォールドは次に外部へと増殖因子を分泌し、そのようにして、外部培地（external medium：外部媒体）への分泌された増殖因子の遊離を達成する。
【００２６】
代替的には、スキャフォールドによらずに多能性間質細胞を培養し、セクレトームを収集し、それを濃縮する、又は特定の小胞／分子を単離し、次いで、直接スキャフォールドにそれら（セクレトーム）を封入することが可能である。
【００２７】
本発明の第３の実施形態は、本発明の第２の実施形態による組成物と、任意に、薬学的に許容可能な担体／ビヒクルと、１以上の賦形剤とを含む、医薬組成物に関する。
【００２８】
本発明の第４の実施形態は、治療法又は医薬のために用いられる、特に、根管において、歯組織、特に歯髄組織を再生する方法の歯組織再生のために用いられる本発明の第３の実施形態の医薬組成物に関するものであり、より詳しくは、該方法は、根尖周囲疾患に感染した根管を、抜髄すること又は拡大すること、及びクリーニングすることと、根管の少なくとも根尖領域に、請求項１〜４のいずれかに記載の組成物を注入することとを含む。根尖領域における根管の幅は、根管の根尖領域に上記組成物を挿入する前に、根管の拡大によって特定のサイズに調整されることが好ましい。
【００２９】
好ましくは、上で言及される組成物のいずれかの多能性間質細胞の濃度は、１×１０３細胞／μｌ〜１×１０７細胞／μｌ、より好ましくは約１×１０６細胞／μｌである。
【００３０】
本発明の第５の実施形態は、骨又は結合組織、好ましくは軟骨組織の欠損の再生のために用いられる上に定義された組成物に関する。
【００３１】
本発明の第６の実施形態は、皮膚の再生、又は皮膚の疾患若しくは傷害、好ましくは急性及び慢性の潰瘍の治療のために用いられる上に定義された組成物に関する。
【００３２】
本発明の第７の実施形態は、歯周組織の再生、又は歯周病、好ましくは歯周炎の治療のために用いられる上に定義された組成物に関する。
【００３３】
本発明の第８の実施形態は、乏血小板血漿（ＰＰＰ）に封入された実質的に純粋な多能性間質細胞集団を含む組成物を作製する方法であって、乏血小板血漿（ＰＰＰ）中の多能性間質細胞の細胞集団を増殖させることを含む、方法に関する。
【００３４】
好ましくは、上記方法は、以下の工程：
１．間質細胞をＰＰＰと混合する工程と、
２．トラネキサム酸等の抗線溶剤を添加する工程と、
３．架橋剤を添加して、ゲル化プロセスを開始する工程と、
４．３７℃で３分間〜５分間インキュベートし、上記混合物がゲル化したことを確認する工程と、
を含む。
【００３５】
より好ましくは、上記方法は：
１．およそ７６０μｌのＰＰＰを含む生理食塩水組成物において、およそ１×１０６個の間質細胞を混合することと、
２．トラネキサム酸１５μｌを添加することと、
３．２％塩化カルシウム５０μｌを添加して、ゲル化プロセスを開始することと、
４．３７℃で３分間〜５分間インキュベートし、上記混合物がゲル化したことを確認することと、
を含む。
【００３６】
以下の実施例によって本発明を更に解説する。
【実施例】
【００３７】
材料及び方法
実施例１．ＷＳＴ−１細胞増殖アッセイ
種々の時間点（２時間、４時間、８時間、３日及び７日）と種々の温度（３７℃及び４℃）との間でＵＣ−ＭＳＣ（臍帯幹細胞）の増殖能を比較するために、１００００００個の細胞を、血小板に乏しい血漿（ＰＰＰ）で封入し、６ウェルプレートに蒔いて、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。応答時に、試料を直径５ｍｍのパウチを使用して元のプレートから採取し、９６ウェルプレートに移した。製造業者（米国、Roche Applied Science）の指示に従って、ＷＳＴ−１法を使用し、増殖速度を測定した。参照波長を５７０ｎｍとし、４５０ｎｍにてプレートリーダー（米国、Ｔｅｃａｎ）を使用して吸光度を測定した。
【００３８】
実施例２．増殖因子の測定
ＰＰＰの３名のドナー（０８４７、０８５０及び０８５２）とＵＣ−ＭＳＣの３名のドナー（１０８−６、３７４−５、７４５−１）との間で種々の因子の分泌レベルを比較した。血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）及び歯マトリクスタンパク質（ＤＭＰ−１）を測定した。より詳しくは、５０００００個の細胞を、増殖培地（１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン・ストレプトマイシン）中、２４時間に亘り、６ウェルプレート上でインキュベートして、培地を（２％ＦＢＳ、１％ペニシリン・ストレプトマイシン）を含むアルファ−ＭＥＭで置き換え、細胞は２４時間であった。上清を収集し、製造業者の指示に従って、ＤｕｏＳｅｔ  ＥＬＩＳＡ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（ミネアポリスのR&D Systems）を使用する測定に先立って凍結した。
【００３９】
実施例３．ｉｎ  ｖｉｖｏ生体適合性分析
全てのｉｎ  ｖｉｖｏ研究は、ロス・アンデス大学（チリ国、サンティアゴ）の動物飼育施設で行われ、「動物実験に関するロス・アンデス大学倫理委員会」による承認を受けた。具体的には、種々の濃度のＵＣ−ＭＳＣをＰＰＰ（２５００００個、５０００００個、１００００００個、及び２００００００個の細胞）で封入し、２３Ｇのシリンジを使用して８週齢のＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウス（メーン州バーハーバーのJackson Laboratories）の両脇腹の皮下に注入した。埋め込みから１２日後、マウスを安楽死させ、インプラントを摘除した。インプラントを組織学検査のため処理し、ヘマトキシリン及びエオジン（Sigma）で染色した。ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェアを使用して細胞数を決定した。
【００４０】
実施例４．ＤＰＳＣ及びＵＣ−ＭＳＣの単離及び特性評価、並びにｉｎ  ｖｉｔｒｏでの拡大
齲食の形跡がない年齢１３歳〜２６歳の健康な個体（女性及び男性）を募集し、インフォームド・コンセントに署名した後、ロス・アンデス大学の倫理承認に従って、サン・ベルナルドのロス・アンデス大学歯学部で第三大臼歯を採取した。母体ドナーによるインフォームド・コンセント、並びにチリ国のクリニカ・ダビラ病院及び「東部メトロポリタンヘルスサービス（Servicio de Salud Metropolitano Oriente）」の両倫理委員会による、倫理上の改訂及び承認の後、帝王切開分娩より収集された男児新生児の正期産ヒト胎盤から臍帯を単離した。歯髄幹細胞（ＤＰＳＣ）及び臍帯幹細胞（ＵＣ−ＭＳＣ）は、組織外植片からの直接の細胞増殖により単離した。両方の外植片を培養皿がコンフルエンスに達するまで２０日間インキュベートしたところ、線維芽細胞様の形態を有するＭＳＣを観察した。ＤＰＳＣ及びＵＣ−ＭＳＣは、遊走、増殖可能性、免疫表現型プロファイル、並びに脂肪細胞、軟骨細胞及び骨芽細胞へと分化する能力を特徴とした。
【００４１】
実施例５．フローサイトメトリー及び中胚葉分化による免疫表現型プロファイル
免疫表現型の特性評価のため、暗所で４℃にて２０分間、ＤＰＳＣ又はＵＣ−ＭＳＣを以下の抗体：ＣＤ１０５、ＣＤ９０、ＣＤ７３、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１９及びＨＬＡ−ＤＲ（米国、BD）と共にインキュベートした後、４ｍｌの１×ＰＢＳで洗浄し、１８００ｒｐｍで６分間遠心分離し、上清を除去した。データをＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーター（カリフォルニア州サンホセのBD Biosciences）を使用して収集し、ＦｌｏｗＪｏ分析ソフトウェアで分析した。脂肪生成分化のため、（５０００００個の細胞）細胞を、（α−ＭＥＭ、１０％のＦＢＳ、ペニシリン・ストレプトマイシン（１％）、デキサメタゾン（０．１１ｍＭ）、インスリン（１０ｍｇ／ｍｌ）、インドメタシン（０．０２ｍｇ／ｍｌ）を含む培地と共に４週間インキュベートした。次いで、細胞を１ｍｌの１×ＰＢＳで洗浄し、室温で１時間イソプロパノール６０体積／体積％中のオイルレッド１ｍで染色した。骨形成分化のため、（７００００個の細胞）細胞を、α−ＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、ペニシリン・ストレプトマイシン（１％）、デキサメタゾン（０．１ｍＭ）、β−グリセロリン酸（１０ｍＭ）、及びアスコルビン酸−２−リン酸（５０ｍｇ／ｍｌ）（米国、Sigma）を含む培地と共に４週間インキュベートした。その後、細胞を１ｍｌの１×ＰＢＳで洗浄し、ＮａＨ２ＰＯ４（０．１Ｍ  ｐＨ４．３）（米国、Sigma）中、１ｍのアリザリンレッド４０ｍＭで染色した。最後に、軟骨細胞分化のため、６００００個の細胞を４ウェルプレートの真ん中で１０μｌの液滴に蒔き、マイクロマスを形成させた。細胞を、（α−ＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、ペニシリン・ストレプトマイシン（１％）、デキサメタゾン（０．１ｍＭ）、インスリン（５ｍｇ／ｍｌ）、ＴＧＦ−β１（１０ｎｇ／ｍｌ）、アスコルビン酸−２−リン酸（５０ｍｇ／ｍｌ））を含む培地と共に４週間インキュベートした。その後、細胞を１ｍｌの１×ＰＢＳで洗浄し、１ｍのサフラニンＯ（０．１％）で染色した。倒立顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＣＫＸ４１）により画像を撮影した。
【００４２】
実施例６．アラマーブルー−細胞増殖アッセイ
ＤＰＳＣとＵＣ−ＭＳＣとの間で増殖能を比較するため、１０００個の細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で増殖培地α−ＭＥＭ（１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン・ストレプトマイシン）を含む２４ウェルプレート（米国、Nunc）に蒔いた。様々な時間点（１日目、３日目及び９日目）で、アラマーブルー（商標）（米国、Invitrogen）を使用して増殖速度を測定した。５７０ｎｍにおいて、プレートリーダー（米国、Tecan）を使用し、蛍光強度を測定した。
【００４３】
実施例７．ｉｎ  ｖｉｔｒｏスクラッチアッセイ
細胞遊走をスクラッチアッセイにより評価した。細胞（３５００００個）を、３７℃、５％ＣＯ２で増殖α−ＭＥＭ（１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン・ストレプトマイシン）を含む６ウェルプレートに播種した。２４時間のインキュベーションの後、１０μｌのピペットチップ（米国、Thermoscientific）でスクラッチを作製した。間隙が完全に閉じるまで、様々な時間点（０時間、４時間、８時間、１２時間及び２４時間）に倒立顕微鏡を使用して、画像を撮影した。Ｗｉｍｓｃｒａｔｃｈソフトウェア（ドイツ国、Wimasis）で画像を分析した。
【００４４】
実施例８．血管形成因子のｉｎ  ｖｉｔｒｏでのチューブ形成アッセイ及び測定
ＤＰＳＣ又はＵＣ−ＭＳＣの血管形成可能性を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのチューブ様構造（総分岐点、総チューブ長、総ループ）を形成するそれらの能力に基づいて評価した。ＤＰＳＣ又はＵＣ−ＭＳＣ（合計６００００個）を、標準マトリゲルマトリクス（米国、BD Biosciences）で予め被覆した２４ウェルプレート（米国、Nunc）に播種し、３７℃、５％ＣＯ２で５時間、ＥＧＭ培地（米国、Lonza）と共にインキュベートした。さらに、ＭＳＣ順化培地（ＣＭ）の血管形成可能性を判定するため、５０００００個の細胞（ＤＰＳＣ又はＵＣ−ＭＳＣ）を低酸素条件下（１％Ｏ２）又は正常酸素条件下で４８時間インキュベートした。その後、ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）を、マトリゲルマトリクスで被覆して、ＭＳＣ−ＣＭ、陽性対照としてのＥＧＭ−２（内皮増殖培地）、又はα−ＭＥＭ（陰性対照）と共に蒔いた。先に記載される両方のｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験において、５時間のインキュベーション後、倒立顕微鏡によって画像を撮影し、ＷｉｍＴｕｂｅソフトウェア（ドイツ国、Wimasis）で分析した。最後に、種々のＭＳＣ−ＣＭを収集し、ＶＥＧＦ及びＨＧＦの分泌レベルを、製造業者の指示に従って、ＤｕｏＳｅｔ  ＥＬＩＳＡ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（米国、R&D Systems）を使用して測定した。
【００４５】
実施例９．マトリゲルプラグアッセイ
ＤＰＳＣ及びＵＣ−ＭＳＣのｉｎ  ｖｉｖｏでの血管形成可能性を比較するため、８週齢のＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウス（メーン州バーハーバーのJackson Laboratories）においてマトリゲルプラグアッセイを行った。全てのｉｎ  ｖｉｖｏ研究は、動物実験に対するロス・アンデス大学倫理委員会による承認を受けた。さらに、著者らは、動物研究：前臨床動物研究に対するｉｎ  ｖｉｖｏ実験ガイドライン／チェックリストの報告を完了し、それに従った。具体的には、３００００００個の細胞を５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ（米国、R&D Systems）を含むマトリゲルＨＣ  ＧＦＲ（米国、BD）２５０μｌと混合し、２３Ｇのシリンジを使用して、マウスの両脇腹の皮下に注入した（マウス１匹当たり２個のマトリゲルプラグ−６００００００個の細胞）。マウス（合計２４匹のマウス）を、１）マトリゲル単独、２）ＵＣ−ＭＳＣ＋マトリゲル、３）ＤＰＳＣ＋マトリゲル、及び４）ＨＵＶＥＣＳ＋マトリゲル（陽性対照）の４つの異なる群に分けた。埋め込みから１４日後、マウスを安楽死させ、プラグを摘除した。埋め込まれたプラグの画像を撮影し、インプラント周辺に形成された新たな血管の量をｉｍａｇｅ  Ｊで定量した。マトリゲルインプラントをホモジナイズし、インプラントのヘモグロビン量をＤｒａｂｋｉｎｓ試薬キット（米国、Sigma）によって決定した。
【００４６】
実施例１０．乏血小板血漿（ＰＰＰ）スキャフォールドの作製、並びにＤＰＳＣ及びＵＣ−ＭＳＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏ生体適合性
ＰＰＰ（５００ｍｌ）をチリ国のロス・アンデス大学病院から購入した。複数回の凍結融解サイクルを回避するため、ＰＰＰをファルコンチューブ（５０ｍｌ）に等分し、更に使用するまで−８０℃で維持した。ＰＰＰスキャフォールド（合計５ｍｌのＰＰＰ）を作製するため、１×１０６細胞を、３８００μｌのＰＰＰ、８７５μｌのα−ＭＥＭ（１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン・ストレプトマイシン）、７５μｌのトラネキサム酸、及び２５０μｌの２％塩化カルシウムと混合し、６ウェルプレート（米国、Nunc）に移して、更に使用するまで３７℃に置いた。１日後、３日後、７日後及び１４日後にアラマーブルー（米国、Invitrogen）により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ生体適合性を評価した。直径５ｍｍのパンチを用いて、応答時間の幾つかのパンチをＰＰＰ中に作製した（チリ国、Dolphin Medical）。各パンチを、２００μｌの培養培地、及び２０μｌのアラマーブルー試薬を含む９６ウェルプレートに入れ、３７℃で２時間インキュベートした。インキュベーション期間の後、１００μｌの上清を新しい９６ウェルプレートに移し、製造業者の指示に従って吸光度を測定した。並行して、各時間点（１日目、３日目、７日目及び１４日目）のＰＰＰスキャフォールドのパンチを、１０％ホルマリン溶液で固定し、組織学的分析のため処理した。スキャフォールドをヘマトキシリン及びエオジン（米国、Sigma）に対して染色した。
【００４７】
実施例１１．ＰＰＰスキャフォールドの超微細構造分析
超微細構造分析を評価するため、種々の時間点で、走査型電子顕微鏡検査（ＳＥＭ）を使用して、構造、すなわち細胞を含む又は含まないＰＰＰスキャフォールドの形態を調査した。先に記載されるＰＰＰスキャフォールドの５ｍｍパンチを２．５％グルタルアルデヒド（米国、Sigma）で固定し、銀塗料を使用してアルミニウムスタブに取り付ける前に、段階的に濃度を高めた（progressive series）エタノールで脱水した。試料を、ＪＳＭ−７５００Ｆ走査型電子顕微鏡（米国、JEOL）下で検査する前に、金／パラジウムで被覆した。
【００４８】
実施例１２．ＰＰＰから放出されたタンパク質因子の測定
封入細胞（ＤＰＳＣ／ＵＣ−ＭＳＣ）を含む又は含まないＰＰＰの放出タンパク質プロファイルを評価するため、ＥＬＩＳＡを行った。先に記載される通り、ＰＰＰスキャフォールドを製造した。２４時間のインキュベーション後、上清（培養培地−ＣＭ）を収集し、ＰＰＰを注意深く剥離し、６ウェルプレートから持ち上げて、最後に、ＰＰＰの全ての滲出液が完全に除去されるまで、１６Ｇ針（米国、Hamilton）を備える１０ｍｌ容シリンジ（米国、BD）を使用して圧搾した。２種類の異なる液体（上清＋浸出液）を処理し、製造業者の指示に従い、ＤｕｏＳｅｔ  ＥＬＩＳＡ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（米国、R&D Systems）を使用して、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ及びＤＭＰ−１の分泌レベルを測定した。
【００４９】
実施例１３．象牙質ディスク／ＰＰＰスキャフォールドの作製、及びマウス皮下への埋め込み
先に記載される通り健康な個体から抜歯したヒト大臼歯を、ドレメル（チリ国、Sodimac）を使用して厚さ３ｍｍ及び長さ０．５ｍｍで水平にスライスした（根管スペースの容積は４０μｌであった）。微生物汚染がないことを確実にするため、象牙質ディスクを１０分間の１７％エチレンジアミン四酢酸及び１分間の１９％クエン酸で殺菌してスメア層を除去し、続いてのベタダインで３０分間及び５．２５％ＮａＯＣｌで１０分間〜１５分間処理した。最後に、ディスクを無菌のＰＢＳで濯ぎ、３日間〜７日間、３７℃でインキュベートした。細胞（１×１０６個）を、１．５遠心管において、７６０μｌのＰＰＰ、１７５μｌのα−ＭＥＭ（１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン・ストレプトマイシン）、１５μｌのトラネキサム酸、及び５０μｌμｌの２％塩化カルシウムと混合した。凝固に際して、１対のピンセットを使用してＰＰＰを注意深く剥離して持ち上げ、各歯根の根管スペースにフラグメントを入れ、更に使用するまで３７℃にて、増殖培地（α−ＭＥＭ）を含む６ウェルプレートに保存した。６週齢〜８週齢のＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウス（メーン州バーハーバーのJackson Laboratories）の皮下にコンストラクトを入れた。マウスをセボフルラン１５ｍｇ／ｋｇを使用して麻酔し、インプラントを皮下ポケットに入れた。マウスはそれぞれ、２つの象牙質ディスク／ＰＰＰスキャフォールドを受け、４週間インキュベートさせた。ＣＯ２を用いてマウスを安楽死させ、先に記載されるように、ｉｍａｇｅ  Ｊを使用して象牙質ディスク／ＰＰＰスキャフォールド周辺に形成された新たな血管を定量するため、マウスの皮膚に位置した状態のまま、インプラントディスクの画像を撮影した。その後、インプラントを摘除し、１０％ホルマリン（米国、Sigma）に入れた後、ギ酸（米国、Sigma）を使用して２カ月間脱灰した。最後に、インプラントをパラフィン包埋し、縦方向に４μｍの切片を作製し、ヘマトキシリン及びエオジン（米国、Sigma）に対して染色した。免疫化学分析に幾つかの切片を使用した。全ての動物の処理手順は、ロス・アンデス大学の施設内動物実験委員会によって承認されたプロトコルに従った。
【００５０】
実施例１４．免疫組織化学検査
免疫組織化学検査のため、脱パラフィン処理した切片を一連のキシロール及びアルコールで脱水した後、クエン酸バッファーを使用して抗原回復（recuperation）を行った。試料を３％Ｈ２Ｏ２に１５分間浸漬した後、ＢＳＡで３０分間ブロックした。以下の抗体：１）ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）、象牙質シアロタンパク質（ＤＳＰＰ）（いずれもABCAMから購入）を使用して、４℃で一晩、一次インキュベーションを行った後、アイソタイプが一致している対照抗体を、一次抗体と同じ条件下で使用した。酵素免疫組織化学染色のため、製造業者のプロトコルに従い、ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ（商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＡＢＣキット（米国、Vector Laboratories）。全ての切片をヘマトキシリンで対比染色して、Ｅｎｔｅｌｌａｎ（MercK）の１０μｌ液滴にマウントした。タンパク質発現の量をｉｍａｇｅ  Ｊで計算し、％面積として表す。
【００５１】
実施例１５．統計学的分析
全ての実験を、生物学的及び実験的に３回繰り返して行い、値を平均として表す。群間の比較をＡＮＯＶＡポストホックテューキー検定で行った。Ｐ＜０．０５（＊）、Ｐ≦０．０１（＊＊）、Ｐ≦０．００１（＊＊＊）及びＰ≦０．０００１（＊＊＊＊）の確率値を統計的学的に有意とした。
【００５２】
結果
実施例１６．ＰＰＰに封入されたＭＳＣの増殖能
組織から抽出されたＵＣ−ＭＳＣ及びＤＰＳＣ（歯髄幹細胞）を、３継代〜４継代に達するまで、ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン・ストレプトマイシン）で培養した。先の観察と同様に、両方の供給源に由来するＭＳＣは、本発明者らの実験室で使用された他の間葉系幹細胞と同様の線維芽細胞様の特徴を示した。ＤＰＳＣは、ＰＰＰのＨ＆Ｅ染色（図１Ａ）で数えられるように、培養後７日目及び１４日目においてより速い増殖速度を示した。電子顕微鏡検査は、使用したＭＳＣの供給源とは無関係に、培養後のＰＰＰ構造の変化を示した。細胞が添加されていない条件と比較して、空隙率の増加は、ＭＳＣを含むＰＰＰ中で７日目から検出され始めた（図１Ｂ）。さらに、種々の時間点とインキュベーション温度との間のＵＣ−ＭＳＣの増殖を、ＷＳＴ−１細胞増殖アッセイを使用して調査した。いずれの温度（３７℃及び４℃）でも２時間〜２４時間の間、ＵＣ−ＭＳＣの増殖に有意差は観察されなかった。４℃と比較して、３７℃でインキュベートしたＵＣ−ＭＳＣで、３日目及び７日目にＵＣ−ＭＳＣの増殖に有意な増加（ｐ＜０．０５）が観察された（図２Ａ）。これは、貯蔵寿命及び治療用製品の生物学的活性が変化しないまま維持される輸送条件の評価と関連する。
【００５３】
実施例１７．ＰＰＰ及びＵＣ−ＭＳＣのタンパク質含有量の測定
ＭＳＣの作用機構（ＭＯＡ）は完全には明らかではないが、それらの治療活性は、パラクリン作用によって媒介され得ることが示唆されている。セクレトーム研究の目的は、組織再生に関連する分泌因子の量を評価することであった。ＶＥＧＦは、脈管形成及び血管形成を刺激する、細胞によって分泌されるシグナルタンパク質である。ＦＧＦは、血管形成、創傷治癒及び様々な内分泌経路に関与する増殖因子である。ＤＭＰ−１（象牙基質酸性リンタンパク質）は、骨及び象牙質の適切な石灰化に極めて重要な細胞外マトリクスタンパク質であり、様々な骨及び歯組織に存在する。
【００５４】
放出されたタンパク質の量を、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ及びＤＭＰ−１に対するＥＬＩＳＡで測定した。３名の異なるドナーのＵＣ−ＭＳＣを６ウェルプレートに播種し、２％ＦＢＳと共に２４時間培養した（図１を参照されたい）。
【００５５】
実施例１８．ｉｎ  ｖｉｖｏで１２日後のＰＰＰに封入された又はＰＰＰ中で増殖されたＵＣ−ＭＳＣの増殖能
ＰＰＰ中に封入された種々の用量の細胞の増殖能を評価するため、本発明者らは、種々の濃度のＵＣ−ＭＳＣ（２５００００個、５０００００個、１００００００個及び２００００００個）を試験した。ＵＣ−ＭＳＣを１２日間ｉｎ  ｖｉｖｏで注入した。１２日後、インプラントを摘除し、組織学検査のため処理した。細胞数をｉｍａｇｅ  Ｊを使用して数えた。結果は、図２の（Ｅ）、（Ｆ）及び（Ｇ）に示されるように、１日目（埋め込み前）と比較して、埋め込みの１２日後に細胞数の有意な増加を示す。
【００５６】
実施例１９．ＤＰＳＣ及びＵＣ−ＭＳＣは速い増殖速度を示す
いずれの細胞供給源も、ＣＤ１０５、ＣＤ９０、ＣＤ７３、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１９及びＨＬＡ−ＤＲ等の共通のＭＳＣマーカーの陽性発現を示し（図９Ａ）、また、ＤＰＳＣ及びＵＣ−ＭＳＣを誘導して中胚葉性組織（脂肪生成、軟骨形成、骨形成）の系統に分化させた（図９Ｂ）。ＤＰＳＣ又はＵＣ−ＭＳＣと、またそれらの細胞の分化多能性（骨形成性、軟骨形成性、脂肪生成性）との間で明らかな差は観察されなかった。
【００５７】
ＤＰＳＣ及びＵＣ−ＭＳＣは、以前に同様の線維芽細胞様の特徴を示した。さらに、ＤＰＳＣとＵＣ−ＭＳＣとの間の増殖を、アラマーブルー細胞増殖アッセイを使用して調査した。それぞれ、１．２倍及び１．１倍の増加を伴う、３日目及び９日目のＤＰＳＣの増殖の有意な増加があった（Ｐ＜０．０００１）（図３Ａ）。
【００５８】
実施例２０．ＵＣ−ＭＳＣは、創傷スクラッチアッセイで優れた遊走能を示す
ＤＰＳＣ及びＵＣ−ＭＳＣの遊走能を評価するため、創傷スクラッチアッセイを行った。遊走能は、０時間と相関させて、各時間点（０時間、４時間、８時間及び１２時間）から評価された。４時間及び１２時間について、ＤＰＳＣと比較してＵＣ−ＭＳＣの遊走において、それぞれ１．２倍増（Ｐ＜０．０５）及び１．４倍増（Ｐ≦０．０１）の有意な増加があった。後の時間点では、両方の細胞供給源によって完全な創傷閉鎖に達した８時間及び２４時間では、有意差は観察されなかった。この実験は、分析した種々の時間点について、ＤＰＳＣと比較して、ＵＣ−ＭＳＣがより高い遊走能を持つことを示す（図３、Ｂ及びＣ）。
【００５９】
実施例２１．ＤＰＳＣ及びＵＣ−ＭＳＣは多くのチューブ様構造を形成することができた
ＤＰＳＣ及びＵＣ−ＭＳＣの管状ネットワークを形成する能力によって示される血管形成能を、半固形培地（マトリゲル）中、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで調査した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血管形成を以下の特徴により評価した：１）総分岐点、２）総チューブ長、及び３）総ループ（図４Ａ）。培養開始から５時間後に評価したチューブ形成の画像分析は、ＤＰＳＣ及びＵＣ−ＭＳＣに対する毛細血管様構造の広範囲なネットワークによって証明される高い血管形成能を示した。具体的には、１．３倍の総分岐点の増加（Ｐ≦０．００１）、１．１５倍変化の総チューブ長（Ｐ≦０．０１）、及び２．５倍変化の総ループ（Ｐ≦０．００１）（図４、Ｂ、Ｃ及びＤ）。それらの分泌されたパラクリン因子を評価するため、本発明者らは、低酸素（１％Ｏ２）又は正常酸素の条件下での４８時間のインキュベーション後にＤＰＳＣ及びＵＣ−ＭＳＣから採取された、順化培地（ＣＭ）から放出された因子の血管形成可能性を評価した。ＨＵＶＥＣＳをＣＭで再懸濁し、増殖因子減少マトリゲル（growth Factor Reduced Matrigel）で予め被覆したプレートに播種した。アルファ−ＭＥＭ（基本培地）及びＥＧＭ（血管形成培地）を、陰性及び陽性の対照としてそれぞれ使用した。チューブ形成を、５時間のインキュベーションの後に分析した。画像を撮影したところ、結果は、正常酸素条件に対して、低酸素条件下の順化培地と共にインキュベートされたＨＵＶＥＣＳについて、より高度な管状構造を示した（図４Ｅ）。低酸素ＤＰＳＣと低酸素ＵＣ−ＭＳＣとの間の総チューブ長、総ループ及び総分岐点の形成の間に有意差があった。具体的には、図４のＦ、Ｇ及びＨに示されるように、総分岐点に対する１．７倍変化の増加（Ｐ≦０．０００１）、総チューブ長に対する１．４倍変化（Ｐ≦０．０００１）、及び総ループに対する１．８倍変化（Ｐ≦０．０００１）があった。血管形成因子の定量（図４、Ｉ及びＪ）は、低酸素条件下で８時間のインキュベーション後に、ＵＣ−ＭＳＣと比較して、ＤＰＳＣについてＶＥＧＦ放出における有意差がないことを明らかにした。ＨＧＦの放出は、低酸素条件下でのインキュベーション後のＵＣ−ＭＳＣと比較して、両方のＤＰＳＣについて４８時間のインキュベーション後の１．９倍高い変化（Ｐ≦０．０００１）であった。
【００６０】
実施例２２．ｉｎ  ｖｉｖｏでのＵＣ−ＭＳＣ及びＤＰＳＣの血管形成可能性
ＤＰＳＣ及びＵＣ−ＭＳＣの血管形成可能性を比較評価するため、マトリゲルプラグをＮＳＧマウスに埋め込んだ。１５日後、インプラントを収集し、写真を撮影した。図５に示されるように、いずれのプラグも、インプラント周辺及びその内部に血管を生じた。インプラントの画像分析は、ＤＰＳＣとＵＣ−ＭＳＣとの間の血管形成に有意差がないことを示した（図５Ｂ）。さらに、インプラントを摘出し、それらのヘモグロビン量について分析した。結果は、マトリゲル（陰性対照）と比較してＤＰＳＣの６．２倍変化のより高いヘモグロビン量（Ｐ≦０．０００１）、及びＵＣ−ＭＳＣとマトリゲル（陰性対照）との間の５．１倍変化の差を示した（図５Ｃ）。
【００６１】
実施例２３．ＰＰＰスキャフォールド上に封入されたＤＰＳＣ又はＵＣ−ＭＳＣの細胞適合性、及び超微細構造分析
ＵＣ−ＭＳＣ又はＤＰＳＣをＰＰＰスキャフォールドに封入し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで様々な時間点にて培養した（図６Ａ）。結果は、様々な時間点において、ＤＰＳＣ及びＵＣ−ＭＳＣがＰＰＰスキャフォールド上に付着し、増殖したことを示した。ＰＰＰに封入されたＤＰＳＣ又はＵＣ−ＭＳＣの増殖をアラマーブルーで評価した。結果は、それぞれ、３日目、７日目及び１４日目に、ＤＰＳＣ＋ＰＰＰ対ＰＰＰ単独の間で、１．５倍変化（Ｐ＜０．０５）、３．１倍変化（Ｐ≦０．０００１）及び３倍変化（Ｐ≦０．０００１）の増殖の増加を示した。また、１．８倍変化（Ｐ≦０．０００１）及び２．８倍変化（Ｐ≦０．０００１）の増加が、７日目及び１４日目にＵＣ−ＭＳＣ＋ＰＰＰ対ＰＰＰ単独の間で観察された。最後に、１４日目にＵＣ−ＭＳＣ＋ＰＰＰとＤＰＳＣ＋ＰＰＰとの間で、有意差のある１倍（Ｐ≦０．０００１）が観察された（図６Ｂ）。
【００６２】
ＵＣ−ＭＳＣ又はＤＰＳＣの組織学的切片（図６Ｃ）は、増殖の結果と一致する、ＤＰＳＣ及びＵＣ−ＭＳＣに対する細胞数の増加を明らかにした。ＳＥＭ像（図６Ｄ）は、生体材料表面の近くに広がるランダムなフィブリン線維を含むＰＰＰの多孔質構造を明らかにした。ＤＰＳＣ又はＵＣ−ＭＳＣのいずれかが封入されているＰＰＰは、１４日間のインキュベーション後、空隙率の明らかな増加を示した。
【００６３】
実施例２４．ＤＰＳＣ／ＵＣ−ＭＳＣ封入後のＰＰＰの放出タンパク質プロファイルの定量
細胞を含む又は含まないＰＰＰの放出プロファイルを調査するため、図７Ａで示されるように、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ及びＤＭＰ−１等の種々のタンパク質因子のＥＬＩＳＡを使用した。結果は、２４時間のインキュベーション後、ＰＰＰ＋ＤＰＳＣとＰＰＰ＋ＵＣ−ＭＳＣとの間に、封入されたＶＥＧＦ（ＥＦ）のタンパク質発現の１．３倍の増加（Ｐ≦０．０１）があったことを示した（図７Ｂ）。また、ＰＰＰ＋ＤＰＳＣとＰＰＰ＋ＵＣ−ＭＳＣとの間で、２４時間後、封入されたＦＧＦ（ＥＦ）の２．１倍増（Ｐ≦０．０００１）のタンパク質発現増加（図７Ｃ）があった。最後に、タンパク質ＤＭＰ−１タンパク質発現について、２４時間のインキュベーションの後、放出された（ＲＦ）ＰＰＰと放出されたＰＰＰ＋ＤＰＳＣとの間で１．１倍変化の変動（Ｐ＜０．０５）があった。２４時間のインキュベーション後、ＰＰＰ＋ＤＰＳＣとＰＰＰ＋ＵＣ−ＭＳＣとの間で、封入された因子（ＥＦ）又は放出された因子（ＲＦ）のタンパク質発現における有意差は観察されなかった。これらの結果は、ＰＰＰに封入されたＤＰＳＣが、ＰＰＰに封入されたＵＣ−ＭＳＣと比較して、より多くのタンパク質因子をもたらすことを示唆した（図７Ｄ）。
【００６４】
実施例２５．象牙質ディスク／ＰＰＰスキャフォールドのｉｎ  ｖｉｖｏ埋め込み、並びに象牙質及び血管形成の評価
象牙質ディスク／ＰＰＰスキャフォールドを、３０日間皮下に埋め込んだ（図８Ａ）。インプラントを摘除する前の画像を撮影し（図８Ｂ）、象牙質象牙質ディスク／ＰＰＰの周辺の血管形成の評価をｉｍａｇｅ  Ｊで行った。結果は、ＰＰＰ単独と比較してＰＰＰ＋ＤＰＳＣについての１．６倍（Ｐ≦０．０１）の象牙質ディスク周辺の血管形成の増加を示した（図８Ｃ）。撮像の後、象牙質ディスク／ＰＰＰスキャフォールドを組織学検査のために摘除し、脱灰し、処理した。ヘマトキシリン及びエオジンの結果（図８Ｄ）は、ＤＰＳＣ又はＵＣ−ＭＳＣはＰＰＰに十分に組み込まれ、象牙質壁へと遊走し、新たに石灰化された象牙質様組織の緻密層を形成したことを示した。図８Ｅに示されるように、免疫組織化学染色は、ＤＰＳＣとＵＣ−ＭＳＣの両方に対して、新たな象牙質の形成及び象牙芽細胞形成を示唆する、象牙質シアロタンパク質（ＤＳＰＰ）に対する陽性染色を明らかにした。ＤＳＰＰ発現の量を定量するため、ｉｍａｇｅ  Ｊを使用した。結果は、ＰＰＰ単独と比較してＰＰＰ＋ＤＰＳＣに対する２８．１倍変化（Ｐ≦０．０００１）の増加、ＰＰＰと比較してＰＰＰ＋ＵＣ−ＭＳＣに対する２８．５倍変化（Ｐ≦０．０００１）の差を示した（図８Ｆ）。ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）を、ヒト細胞の存在を確認するために使用した。図８Ｇに示されるように、大半の細胞は、ヒト細胞起源のこれらの細胞を確認する抗体に対して陽性に染色された。Ｉｍａｇｅ  Ｊ分析は、ＰＰＰ＋ＤＰＳＣ（２４．６倍変化）及びＰＰＰ＋ＵＣ−ＭＳＣ（２５．５倍変化）に対するＨＬＡ発現の増加を明らかにした（Ｐ≦０．０００１）。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図４−５】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年11月16日(2018.11.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
乏血小板血漿（ＰＰＰ）又はスキャフォールドに封入された、多能性間質細胞の集団を含む、根管において歯髄組織を再生する方法のために用いられる組成物。
【請求項２】
前記多能性間質細胞の集団が、歯髄幹細胞（ＤＰＳＣ）、脱落乳歯歯髄幹細胞（ＳＨＥＤ）、歯根膜幹細胞（ＰＤＬＳＣ）、歯乳頭由来幹細胞（ＳＣＡＰ）、歯小嚢前駆細胞（ＤＦＰＣ）、胎盤ＭＳＣ（Ｐ−ＭＳＣ）、骨髄ＭＳＣ（間葉系幹細胞）、脂肪組織由来ＭＳＣ、及び臍帯血（ＵＣ−ＭＳＣ）からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記多能性間質細胞の集団が、臍帯血（ＵＣ−ＭＳＣ）である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記方法が、根尖周囲疾患に感染した根管を抜髄すること又は拡大すること、及びクリーニングすることと、前記根管の少なくとも根尖領域に、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物を注入することとを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記根尖領域の根管の幅が、前記根管の根尖領域への前記組成物の挿入前の前記根管の拡大によって、特定のサイズに調整される、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記多能性間質細胞の濃度が、１×１０３細胞／μｌ〜１×１０７細胞／μｌ、好ましくは約１×１０６細胞／μｌである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【国際調査報告】
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