(57)【要約】  本発明は、獣医学的ウイルス学およびワクチンの分野において有用な新規ペスチウイルスに関する。特に、本発明は、ペスチウイルスから生じる単離ポリヌクレオチドおよびペスチウイルスに、ワクチンおよびその医学的使用に、該ポリヌクレオチドを含むキメラウイルスに、そしてポリペプチドの異種発現のための発現ベクターに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１または配列番号２のヌクレオチド配列、あるいは該配列に少なくとも６０％、特に少なくとも７０％の同一性を持つ配列を含む、単離ポリヌクレオチド。
【請求項２】
感染性ポリヌクレオチドである、請求項１のポリヌクレオチド。
【請求項３】
細胞中に存在する、請求項１または２記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが、該ポリヌクレオチドに機能可能であるように連結されている、請求項１〜３のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
外因性ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
ベクター中に存在する、請求項１〜５のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
配列番号１のｃＤＮＡポリヌクレオチド。
【請求項８】
配列番号１に対して、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の相同性を有する、ｃＤＮＡポリヌクレオチド。
【請求項９】
配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９またはその任意の組み合わせ、あるいは該配列に少なくとも９５％の同一性を有する配列の群より選択される配列を含む、感染性ポリヌクレオチド。
【請求項１０】
配列番号１または配列番号２のヌクレオチド配列、あるいは該配列に少なくとも６０％、特に少なくとも７０％の同一性を持つ配列を有するブタペスチウイルスを含む、組成物。
【請求項１１】
配列番号３のアミノ酸配列、または該配列に少なくとも６０％の同一性を有する配列を含むブタペスチウイルスを含む、組成物。
【請求項１２】
配列番号４（Ｎｐｒｏ）、配列番号５（コア）、配列番号６（Ｅｒｎｓ）、配列番号７（Ｅ１）、配列番号８（Ｅ２）、配列番号９（Ｐ７）、配列番号１０（ＮＳ２）、配列番号１１（ＮＳ３）、配列番号１２（ＮＳ４Ａ）、配列番号１３（ＮＳ４Ｂ）、配列番号１４（ＮＳ５Ａ）および配列番号１５（ＮＳ５Ｂ）からなる群より選択される１またはそれより多いアミノ酸配列を含むブタペスチウイルスを含む、組成物。
【請求項１３】
該ブタペスチウイルスが不活性化されているかまたは弱毒化されている、請求項１０〜１２のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１４】
前記ペスチウイルスが化学的に不活性化されたウイルスであって、特に、バイナリーエチレンイミン、エチレンイミン、アセチルエチレンイミン、ベータ−エチレンイミン、ベータ−プロピオラクトン、グルタルアルデヒド、オゾン、およびホルムアルデヒドからなる群より選択される不活性化剤での処理によって不活性化されている、請求項１３の組成物。
【請求項１５】
該ペスチウイルスが物理的に不活性化されたペスチウイルスであって、ＵＶ照射、Ｘ線照射、ガンマ照射、凍結融解、および／または加熱での処理によって不活性化されている、請求項１３の組成物。
【請求項１６】
該ペスチウイルスが、Ｎｐｒｏ、ＥｒｎｓまたはＮ２−３遺伝子を修飾することによって弱毒化されている、請求項１３の組成物。
【請求項１７】
凍結乾燥型の該ペスチウイルスを含む、請求項１０〜１６のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１８】
少なくとも約１０４のＴＣＩＤ５０を含む、請求項１０〜１７のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１９】
請求項１０〜１８のいずれか一項記載の組成物を含む、薬学的組成物。
【請求項２０】
配列番号２のヌクレオチド配列、または該配列に少なくとも６０％、特に少なくとも７０％の同一性を有する配列、および異種配列をコードする配列を含む、ブタペスチウイルスベクター。
【請求項２１】
該異種配列が、ＡＰＰＶ、ＮＲＰＶ、ブタサーコウイルス２（ＰＣＶ２）、ボンゴワナウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）、特にＢＶＤＶ−１、ＢＶＤＶ−２、豚コレラウイルス（ＣＳＦＶ）、ＲａＰＶおよびボーダー病ウイルスからなる群より選択されるウイルスから選択され、特に、前記異種配列が前記ウイルス由来の表面抗原をコードする、請求項２０のベクター。
【請求項２２】
異種配列がＮｐｒｏの５’または３’端に挿入される、請求項２０または２１のいずれか一項記載のベクター。
【請求項２３】
該異種配列が、ペスチウイルスのＮｐｒｏ、Ｅ２またはＥ１タンパク質との融合ペプチドをコードする、請求項２０〜２２のいずれか一項記載のベクター。
【請求項２４】
配列番号１または配列番号２に対して少なくとも６０％、特に少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列、および外来ポリペプチドを含む、キメラペスチウイルス。
【請求項２５】
請求項１〜９のいずれか一項記載のポリヌクレオチド、または請求項１０〜１８のいずれか一項記載の組成物、または請求項２０〜２３のいずれか一項記載のベクター、または請求項２４記載のキメラペスチウイルスを含む、動物用ワクチン。
【請求項２６】
動物におけるブタペスチウイルス感染に対する免疫反応を誘導するためのキットであって、請求項１０〜１８のいずれか一項記載の組成物、および前記動物に前記組成物を投与するための使用説明書を含む、前記キット。
【請求項２７】
ペスチウイルスと関連する疾患に対して、仔ブタを防御するための方法であって、妊娠雌ブタ、離乳後の仔ブタ、未経産ブタ、あるいは交配前の雌ブタまたは未経産ブタに、仔ブタを防御するために十分な量の請求項１０〜１８のいずれか一項の組成物を投与する工程を含む、前記方法。
【請求項２８】
該疾患が、先天性振戦、特に先天性振戦Ａ−ＩＩである、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
該組成物を、非経口投与、特に、針およびシリンジ、または無針注射デバイスを用いて、筋内、皮下、皮内または静脈内で；あるいは粘膜投与を通じて、特に経鼻または経口で投与する、請求項２７または２８記載の方法。
【請求項３０】
配列番号３２および配列番号３３より選択されるプライマーの少なくとも１つを用いたＲＴ  ＰＣＲで試料を試験する、ペスチウイルスを検出するための方法。
【請求項３１】
配列番号３２および配列番号３３より選択されるプライマーの少なくとも１つを含む、ペスチウイルスを検出するための診断アッセイ。
【請求項３２】
配列番号３のアミノ酸配列または少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するペスチウイルス抗原を、生物学的試料において検出するための方法であって：
生物学的試料を、モノクローナル抗体６Ａ５抗体と接触させ、前記ペスチウイルス抗原が前記試料に存在する場合、前記モノクローナル抗体が前記ペスチウイルス抗原に特異的に結合し；そして前記試料において、前記抗原に対する抗体結合を検出する
工程を含む、前記方法。
【請求項３３】
請求項３２記載のワクチンを調製するための方法であって、
ａ）請求項１〜９のいずれか一項記載のポリヌクレオチド、請求項２０〜２３のいずれか一項記載のベクター、または請求項２４記載のキメラペスチウイルスで、宿主細胞培養を感染させ、
ｂ）ウイルス増殖のため、前記宿主細胞培養をインキュベーションし、
ｃ）宿主細胞培養を採取し、そして場合によって
ｄ）培養からウイルスを単離し、そして
ｅ）薬学的に許容されうるキャリアーと培養を混合する
連続工程を含む、前記方法。
【請求項３４】
動物用ワクチンを調製するための、請求項１〜９のいずれか一項記載のポリヌクレオチド、または請求項１０〜１８のいずれか一項記載の組成物、または請求項２０〜２３のいずれか一項記載のベクター、または請求項２４記載のキメラペスチウイルス、あるいはその任意の組み合わせの使用。
【請求項３５】
動物用ワクチンにおいて使用するための、請求項１〜８のいずれか一項記載のポリヌクレオチド、または請求項１０〜１８のいずれか一項記載の組成物、または請求項２０〜２３のいずれか一項記載のベクター、または請求項２４記載のキメラペスチウイルス、あるいはその任意の組み合わせ。
【請求項３６】
請求項２５記載のワクチンを、請求項２６記載の診断キットと組み合わせる、動物におけるペスチウイルス感染を管理するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、獣医学的ウイルス学およびワクチンの分野において有用な新規ペスチウイルスに関する。特に、本発明は、ペスチウイルスから生じる単離ポリヌクレオチドに、ワクチンおよびその医学的使用に、該ポリヌクレオチドを含むキメラウイルスに、そして異種ポリペプチドの発現のためのウイルスベクターとしての前記ウイルスの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ペスチウイルスは、一本鎖のプラスセンスＲＮＡウイルスである。ペスチウイルスゲノムは、約１１．５〜１２．５ｋｂの長さを有し、そして１つの巨大なオープンリーディングフレームを含有し、この５’および３’ゲノム端に非翻訳領域（ＮＴＲ）が隣接する。生じる巨大ポリタンパク質は、翻訳と同時におよび翻訳後にプロセシングされて、１２の成熟ウイルスタンパク質：ゲノム位置および触媒残基に関して、ペスチウイルス間で保存されている、自己プロテアーゼ（Ｎｐｒｏ）、カプシドタンパク質（Ｃ）、３つのエンベロープタンパク質（Ｅｒｎｓ、Ｅ１、Ｅ２）および非構造タンパク質（ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、ＮＳ５Ｂ）を生じる。
【０００３】
ペスチウイルス属は、フラビウイルス科内に分類され、そして国際ウイルス分類委員会によって認可された４つの種からなる。ペスチウイルスの分類は、ヌクレオチド配列、宿主範囲および血清学的差異に基づく。５’ＮＴＲは、ペスチウイルスの系統発生学的分析に最も頻繁に用いられる領域であるが、より多様な遺伝子（ＮｐｒｏまたはＥ２）もまた使用されてきている。にもかかわらず、全ゲノム配列の比較によって、最も正確な系統発生学的分類が可能になる。ウシウイルス性下痢ウイルス−１（ＢＶＤＶ−１）およびＢＶＤＶ−２、ボーダー病ウイルス（ＢＤＶ）および豚コレラウイルス（ＣＳＦＶ）に加えて、いくつかの割り当てられていない株および／または暫定（ｔｅｎｔａｔｉｖｅ）種は、いわゆる非定型（ａｔｙｐｉｃａｌ）ペスチウイルス株に代表される。非定型ペスチウイルスは、偶蹄目、特にウシ、ヒツジおよびブタ宿主内の外来種から単離されてきている。近年の研究は、ラットおよびコウモリにおいてペスチウイルス配列を検出しており、ペスチウイルスの宿主範囲がより広いことが示唆される。しかし、今日まで単離されたペスチウイルスはすべて、有蹄動物由来である。
【０００４】
ブタにおけるもっとも危険なウイルス伝染病の１つであるＣＳＦＶは、数十年来、大部分の先進国の家畜ブタ集団からは根絶されている。他のペスチウイルス種でのブタの感染が検出されてきており、例えば特定のＢＤＶおよびＢＶＤＶ株が導入されており、これは馴化する能力があることを示す。「非定型」ブタペスチウイルスは、オーストラリアの商業的養豚農場で２００３年に同定され、後にボンゴワナウイルスと名付けられた。このよく研究されたウイルスは、生殖障害、死産、および心筋炎による仔ブタの突然死を引き起こした。このウイルスには顕著な配列多様性があり、これによって確立された汎ペスチウイルス診断法（ＥＬＩＳＡ、交差中和試験、ＲＴ−ＰＣＲ）による検出の失敗を生じた。ボンゴワナウイルスの病原性が実証され、潜在的に経済的な影響を有するため、養豚産業に警鐘を鳴らした。オーストラリアの２つの罹患農場のみで、約５０，０００頭の動物の損害が報告された。ボンゴワナウイルスは、なお１つの農場に存在しているが、このウイルスまたは近縁種は、他の場所では見つけられたことがない。
【０００５】
ごく近縁のブタペスチウイルスの新規群が、最近発見され、「非定型ブタペスチウイルス（ＡＰＰＶ）」の暫定種を形成している。これらのウイルスは、北米で最初に同定され、そして続いて、ドイツ、オランダおよびオーストリアでもまた発見された（Ｓｃｈｗａｒｚら，  ２０１７．  Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｔｙｐｉｃａｌ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓ  （ＡＰＰＶ）  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  ｖｉｒａｌ  ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ．  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４８：１）。ＡＰＰＶが仔ブタのＡ−ＩＩ型先天性振戦（ＣＴ）症候群の背後にある感染性病原体を代表することを示す強い証拠がある。Ａ−ＩＩ  ＣＴは世界中に蔓延しており、そして新生仔ブタにおける一般的な症候群である。ＡＰＰＶは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの増殖が非常に困難であり、そしてしたがって、コッホの原則は部分的にしか満たされていない。にもかかわらず、罹患仔ブタから妊娠雌ブタへの病原体の伝染は臨床的徴候を再現した。臨床的特徴は、一般化された軽度から重度の全身の振戦によって特徴付けられ、これは病理組織学的に脳および脊髄の多様なミエリン形成不全と関連付けられる。ミエリン形成不全は、ＢＤＶ、ＢＶＤＶおよびＣＳＦＶによる子宮感染における後期妊娠状態後のヒツジ、ウシおよびブタの脳において明らかな特徴的な病変であり、新生「ヘアリーシェーカー（ｈａｉｒｙ  ｓｈａｋｅｒ）」仔ヒツジ、振戦する仔ウシおよびＡ−Ｉ  ＣＴ罹患仔ブタを生じる。妊娠期間中のペスチウイルスによる感染のすべてではないとしても大部分は、胚または胎児に有害な影響を有し、死産、形成異常または神経学的欠損を引き起こしうる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｓｃｈｗａｒｚら，  ２０１７．  Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｔｙｐｉｃａｌ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓ  （ＡＰＰＶ）  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  ｖｉｒａｌ  ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ．  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４８：１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ペスチウイルス感染の有効で、そして安全、ならびに検出可能な予防および治療の重要性の観点から、優れたウイルス複製および免疫誘導の高い潜在能力を持つ、免疫原性ペスチウイルスに対する、強く、そして満たされていない必要性がなお存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
この目的は、請求するような発明の主題によって満たされる。
新規単離ペスチウイルスは、動物において低い病原性を有し、そして天然感染経路の後であっても、迅速で、そして信頼性がある血清転換を導きうる。したがって、該ウイルスは、ワクチン接種目的に非常に適用可能である。
【０００９】
本発明者らは、新規ペスチウイルスをリンダウイルスと名付けた。
本発明にしたがって、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド配列、あるいは該配列に少なくとも６０％、特に少なくとも７０％の同一性を持つ配列を含む、単離ポリヌクレオチドを提供する。
【００１０】
特に、前記ポリヌクレオチドは感染性ポリヌクレオチドである。
本発明の１つの態様において、該ポリヌクレオチドは細胞中、特に宿主細胞中に存在する。
【００１１】
本発明にしたがって、該ポリヌクレオチドに機能可能であるように連結されたＲＮＡポリメラーゼプロモーターも提供する。
さらなる態様にしたがって、該ポリヌクレオチドは外因性異種ポリヌクレオチドをさらに含む。
【００１２】
１つの態様にしたがって、該ポリヌクレオチドはベクター中に存在する。
さらなる態様において、配列番号１のｃＤＮＡポリヌクレオチドを提供する。
さらなる態様において、配列番号１に対して、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％の同一性を有する、ｃＤＮＡポリヌクレオチドを提供する。
【００１３】
さらなる態様において、配列番号１または配列番号２に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、９９．５％の同一性を有するポリヌクレオチドを提供する。
【００１４】
また、本明細書において、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９またはその任意の組み合わせ、あるいは該配列またはその任意の組み合わせに少なくとも９０％、特に少なくとも９５％の同一性を持つ配列の群より選択される配列を含む、ポリヌクレオチドも提供する。
【００１５】
本発明のペスチウイルスが、他のウイルス、例えばボンゴワナウイルスまたはＡＰＰＶとは明らかに異なることは非常に好適である。本発明のペスチウイルスは、馴化の必要なしに、宿主細胞、例えばＳＫ−６またはＰＫ−１５上で、高力価、例えば＞１０７ＴＣＩＤ５０の力価に、容易に増殖しうる。
【００１６】
また、本明細書において、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド配列、あるいは配列番号１または配列番号２に少なくとも６０％、特に少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％の同一性を有する配列を有するブタペスチウイルスを含む、組成物も提供する。特定の態様にしたがって、配列番号１または配列番号２に対する少なくとも６０％、特に少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％の同一性は、配列全長に渡って提供される。
【００１７】
また、本発明にしたがって、配列番号３のアミノ酸配列、または配列番号３に少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、９９．５％の同一性を有する配列を含むブタペスチウイルスを含む、組成物も提供する。特定の態様にしたがって、配列番号３に対する少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、９９．５％の同一性は、配列全長に渡って提供される。
【００１８】
また、本発明にしたがって、配列番号４（Ｎｐｒｏ）、配列番号５（コア）、配列番号６（Ｅｒｎｓ）、配列番号７（Ｅ１）、配列番号８（Ｅ２）、配列番号９（Ｐ７）、配列番号１０（ＮＳ２）、配列番号１１（ＮＳ３）、配列番号１２（ＮＳ４Ａ）、配列番号１３（ＮＳ４Ｂ）、配列番号１４（ＮＳ５Ａ）、配列番号１５（ＮＳ５Ｂ）、またはその任意の組み合わせより選択されるアミノ酸配列を有するブタペスチウイルスを含む、組成物もまた提供する。
【００１９】
特に、該組成物は、配列番号４（Ｎｐｒｏ）、配列番号５（コア）、配列番号６（Ｅｒｎｓ）、配列番号７（Ｅ１）、配列番号８（Ｅ２）、配列番号９（Ｐ７）、配列番号１０（ＮＳ２）、配列番号１１（ＮＳ３）、配列番号１２（ＮＳ４Ａ）、配列番号１３（ＮＳ４Ｂ）、配列番号１４（ＮＳ５Ａ）、配列番号１５（ＮＳ５Ｂ）のうちの２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１または１２の配列を含む。
【００２０】
本発明のさらなる態様にしたがって、ブタペスチウイルスが不活性化されているかまたは弱毒化されている組成物を提供し、特に、バイナリーエチレンイミン、エチレンイミン、アセチルエチレンイミン、ベータ−エチレンイミン、ベータ−プロピオラクトン、グルタルアルデヒド、オゾン、およびホルムアルデヒドからなる群より選択される不活性化剤での処理によって不活性化されている、化学的に不活性化されたウイルスを提供する。
【００２１】
また、ペスチウイルスが物理的に不活性化されたペスチウイルスであり、特に、ＵＶ照射、Ｘ線照射、ガンマ照射、凍結融解、および／または加熱での処理によって不活性化されている、本発明のペスチウイルスを含有する組成物も提供する。
【００２２】
本発明の別の態様にしたがって、ペスチウイルスは、Ｎｐｒｏ、ＥｒｎｓまたはＮ２−３遺伝子を修飾することによって弱毒化されている。
特定の態様にしたがって、ペスチウイルスは凍結乾燥型である。
【００２３】
投与のため、組成物は、用量あたり少なくとも約１０４、特に少なくとも１０５、１０６、１０７、１０８のＴＣＩＤ５０の力価を含む。
また、本発明のさらなる態様にしたがって、本明細書に記載するようなポリヌクレオチド、組成物、ベクターまたはキメラペスチウイルスを含む、薬学的組成物も提供する。
【００２４】
本発明はまた、配列番号１のヌクレオチド配列、または配列番号１に少なくとも６０％、特に少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％の同一性を有する配列、および異種配列をコードする配列を含む、ブタペスチウイルスベクターも提供する。
【００２５】
本発明はまた、配列番号２のヌクレオチド配列、または配列番号２に少なくとも６０％、特に少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％の同一性を有する配列、および異種配列をコードする配列を含む、ブタペスチウイルスベクターも提供する。前記異種配列は、任意の制御配列または選択マーカーをコードする配列であってもよい。特に、異種配列は、ウシウイルス性下痢ウイルス−１（ＢＶＤＶ−１）およびＢＶＤＶ−２、ボーダー病ウイルス（ＢＤＶ）、豚コレラウイルス（ＣＳＦＶ）、非定型ペスチウイルス（ＡＰＰＶ）、特にＮＲＰＶ、ＰＥＤＶ、ＲａＰＶ、ボーダー病ウイルス、トナカイ（ｒｅｉｎｄｅｅｒ）、キリン（ｇｉｒａｆｆｅ）からの単離体、ＨｏＢｉペスチウイルスおよびボンゴワナウイルスの群からなる１またはそれより多いウイルスより選択される。
【００２６】
特に、前記異種配列は、前記ウイルス由来の表面抗原をコードする。より具体的には、異種配列は、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７および配列番号４８、あるいはその任意の組み合わせまたは断片または部分を含む配列の群より選択される表面抗原をコードする。
【００２７】
別の態様にしたがって、前記異種配列は、限定されるわけではないが、ＰＥＤＶ、アフリカブタ発熱ブタサーコウイルスおよびＰＲＲＳＶなどの、関心対象の任意のウイルス由来の表面抗原をコードする。
【００２８】
特に、異種配列は、ＮｐｒｏまたはＥ２の５’または３’末端領域内、あるいは５’または３’末端に挿入される。
別の態様にしたがって、異種配列は、ペスチウイルスのＮｐｒｏ、Ｅ２またはＥ１タンパク質を含む融合ペプチドをコードする。
【００２９】
本発明はまた、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド配列、あるいは配列番号１または配列番号２に対して少なくとも６０％、特に少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％の同一性を有する配列、および外来ポリペプチドを含む、キメラペスチウイルスも提供する。
【００３０】
本発明にしたがって、本明細書に記載するようなポリヌクレオチド、組成物、ベクター、またはキメラペスチウイルスを含む、動物用ワクチンを提供する。
さらに本明細書に提供するのは、動物、特にブタにおけるブタペスチウイルス感染に対する免疫反応を誘導するためのキットであって、本明細書に記載するような組成物またはワクチン、および前記動物に前記組成物を投与するための使用説明書を含む、前記キットである。
【００３１】
本明細書にさらに提供するのは、ペスチウイルスと関連する疾患に対して、動物、特にブタ、特に仔ブタを防御するための方法であって、妊娠雌ブタ、成熟雄ブタ（ｂｏａｒ）、離乳後の仔ブタまたは未経産ブタ（ｇｉｌｔ）、あるいは交配前の雌ブタまたは未経産ブタに、動物を防御するために、特に先天性振戦、特に先天性振戦Ａ−ＩＩに対して動物を防御するかまたは治療するために十分な量の、本明細書に記載するような組成物またはワクチンを投与する工程を含む、前記方法である。
【００３２】
本発明の特定の態様にしたがって、組成物を、非経口投与、特に、針およびシリンジ、または無針注射デバイスを用いて、筋内、皮下、皮内または静脈内で；そして経鼻または経口で粘膜投与する。
【００３３】
本発明の態様にしたがって、５’−ＧＴＫＡＴＨＣＡＡＴＡＣＣＣＴＧＡＲＧＣ−３’（配列番号３２）および５’−ＧＧＲＴＴＣＣＡＧＧＡＲＴＡＣＡＴＣＡ−３’（配列番号３３）より選択されるプライマーの少なくとも１つを用いたＲＴ  ＰＣＲで試料を試験する、ペスチウイルスを検出するための方法を提供する。
【００３４】
本明細書にさらに提供するのは、配列番号３２および配列番号３３より選択されるプライマーの少なくとも１つを含む、ペスチウイルスを検出するための診断アッセイである。
本明細書にやはり提供するのは、配列番号３２および配列番号３３より選択されるプライマーの少なくとも１つを含み、さらにデバイスおよび使用説明書を含む、ペスチウイルスを検出するための診断キットである。
【００３５】
また、さらなる態様にしたがって、配列番号３のアミノ酸配列または少なくとも６０％の同一性のアミノ酸配列を有するペスチウイルス抗原を、生物学的試料において検出するための方法であって、生物学的試料、特に血液、臓器または排出試料を、前記ペスチウイルスの抗原が前記試料中に存在する場合、該抗原に特異的に結合する抗体と接触させ；そして前記試料において、前記抗原に結合している前記抗体を検出する工程を含む、前記方法も提供する。
【００３６】
特定の態様にしたがって、抗体はモノクローナル抗体であり、特に、抗体は、Ｇｉｌｍａｒｔｉｎ  Ａ．Ａ．ら，  ２０１２，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ  ２５に記載されるようなモノクローナル抗体６Ａ５である。
【００３７】
また、本発明にしたがって、本発明のワクチンを調製するための方法であって、
ａ）本明細書に記載するようなポリヌクレオチド、ベクター、またはキメラペスチウイルスで、宿主細胞培養を感染させ、
ｂ）ウイルス増殖のため、前記宿主細胞培養をインキュベーションし、
ｃ）宿主細胞培養を採取し、そして場合によって
ｄ）培養からウイルスを単離し、そして
ｅ）薬学的に許容されうるキャリアーと培養を混合する
連続工程を含む、前記方法も提供する。
【００３８】
本発明の態様はまた、動物用ワクチンを調製するための、本明細書に記載するようなポリヌクレオチド、ベクター、組成物、またはキメラペスチウイルスの使用も提供する。
本明細書にさらに提供するのは、ワクチンにおいて、または動物の治療のために使用するための、本明細書に記載するようなポリヌクレオチド、ベクター、組成物、またはキメラペスチウイルス、あるいはその任意の組み合わせである。
【００３９】
本明細書にやはり提供するのは、本明細書に記載するようなワクチンを、本明細書に記載するような診断キットまたはアッセイと組み合わせる、動物におけるペスチウイルス感染を管理するための方法である。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】先天性振戦（ＣＴ）を有する仔ブタにおける組織病理学的検査。
【図２】リンダウイルス、非定型ペスチウイルス株およびペスチウイルス基準株の系統発生ゲノム分析。
【図３】ペスチウイルスポリタンパク質の系統発生分析。
【図４−１】リンダウイルスＥ２タンパク質のアミノ酸比較。リンダウイルス（配列番号８）、ボンゴワナウイルス（配列番号３６）、エダツノレイヨウ（ｐｒｏｎｇｈｏｒｎ）（配列番号３７）、キリン（配列番号３８）、ＢＤＶ（配列番号３９）、トナカイ（配列番号４０）、ヒツジ（配列番号４１）、ＣＳＦＶ（配列番号４２）、ＢＶＤＶ−１（配列番号４３）、ＢＶＤＶ−２（配列番号４４）、ＢＶＤＶ−３のＥ２配列（配列番号４５）、ラットＥ２（配列番号４６）、コウモリＥ２（配列番号４７）、ＡＰＰＶ  Ｅ２（配列番号４８）。
【図４−２】リンダウイルスＥ２タンパク質のアミノ酸比較。リンダウイルス（配列番号８）、ボンゴワナウイルス（配列番号３６）、エダツノレイヨウ（ｐｒｏｎｇｈｏｒｎ）（配列番号３７）、キリン（配列番号３８）、ＢＤＶ（配列番号３９）、トナカイ（配列番号４０）、ヒツジ（配列番号４１）、ＣＳＦＶ（配列番号４２）、ＢＶＤＶ−１（配列番号４３）、ＢＶＤＶ−２（配列番号４４）、ＢＶＤＶ−３のＥ２配列（配列番号４５）、ラットＥ２（配列番号４６）、コウモリＥ２（配列番号４７）、ＡＰＰＶ  Ｅ２（配列番号４８）。
【図５】細胞培養におけるリンダペスチウイルスの増殖。
【図６】交差反応性モノクローナル抗体の検証
【図７−１】リンダウイルスの全長ＤＮＡ配列（配列番号１）。
【図７−２】リンダウイルスの全長ＤＮＡ配列（配列番号１）。
【図７−３】リンダウイルスの全長ＤＮＡ配列（配列番号１）。
【図７−４】リンダウイルスの全長ＤＮＡ配列（配列番号１）。
【図７−５】リンダウイルスの全長ＤＮＡ配列（配列番号１）。
【図８−１】リンダウイルスの全長ＲＮＡ配列（配列番号２）。
【図８−２】リンダウイルスの全長ＲＮＡ配列（配列番号２）。
【図８−３】リンダウイルスの全長ＲＮＡ配列（配列番号２）。
【図８−４】リンダウイルスの全長ＲＮＡ配列（配列番号２）。
【図９−１】リンダウイルスのアミノ酸配列（配列番号３）、太字のアミノ酸は、ありうる挿入部位を示す。Ｎｐｒｏ配列をイタリックの文字で示す。
【図９−２】リンダウイルスのアミノ酸配列（配列番号３）、太字のアミノ酸は、ありうる挿入部位を示す。Ｎｐｒｏ配列をイタリックの文字で示す。
【図１０−１】リンダウイルスのアミノ酸配列。ａ）Ｎｐｒｏ（配列番号４）、ｂ）コア（配列番号５）、ｃ）Ｅｒｎｓ（配列番号６）、ｄ）Ｅ１（配列番号７）、ｅ）Ｅ２（配列番号８）、ｆ）Ｐ７（配列番号９）。
【図１０−２】リンダウイルスのアミノ酸配列。ｇ）ＮＳ２（配列番号１０）、ｈ）ＮＳ３（配列番号１１）、ｉ）ＮＳ４Ａ（配列番号１２）、ｊ）ＮＳ４Ｂ（配列番号１３）。
【図１０−３】リンダウイルスのアミノ酸配列。ｋ）ＮＳ５Ａ（配列番号１４）、ｌ）ＮＳ５Ｂ（配列番号１５）。
【図１１−１】リンダウイルスタンパク質および非翻訳領域のＤＮＡ配列。ａ）５’−ＵＴＲ（配列番号１６）、ｂ）Ｎｐｒｏ（配列番号１７）、ｃ）コア（配列番号１８）、ｄ）Ｅｒｎｓ（配列番号１９）。
【図１１−２】リンダウイルスタンパク質および非翻訳領域のＤＮＡ配列。ｄ）Ｅｒｎｓ（配列番号１９）、ｅ）Ｅ１（配列番号２０）、ｆ）Ｅ２（配列番号２１）。
【図１１−３】リンダウイルスタンパク質および非翻訳領域のＤＮＡ配列。ｇ）Ｐ７（配列番号２２）、ｈ）ＮＳ２（配列番号２３）、ｉ）ＮＳ３（配列番号２４）。
【図１１−４】リンダウイルスタンパク質および非翻訳領域のＤＮＡ配列。ｉ）ＮＳ３（配列番号２４）、ｊ）ＮＳ４Ａ（配列番号２５）、ｋ）ＮＳ４Ｂ（配列番号２６）。
【図１１−５】リンダウイルスタンパク質および非翻訳領域のＤＮＡ配列。ｋ）ＮＳ４Ｂ（配列番号２６）、ｌ）ＮＳ５Ａ（配列番号２７）。
【図１１−６】リンダウイルスタンパク質および非翻訳領域のＤＮＡ配列。ｌ）ＮＳ５Ａ（配列番号２７）、ｍ）ＮＳ５Ｂ（配列番号２８）。
【図１１−７】リンダウイルスタンパク質および非翻訳領域のＤＮＡ配列。ｍ）ＮＳ５Ｂ（配列番号２８）、ｎ）３’−ＵＴＲ（配列番号２９）。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
本明細書全体で用いるような特定の用語は、以下の意味を有する。
用語「含む」、「含有する」、「有する」および「含まれる」は、本明細書において、同義に使用可能であり、そして開放（ｏｐｅｎ）定義と理解されるべきであり、さらなるメンバーまたは部分または要素が可能である。「からなる」は、それらからなる定義の特徴のさらなる要素を伴わない、最も厳密な定義と見なされる。したがって、「含む」はより広く、そして「からなる」定義を含有する。
【００４２】
用語「約」は、本明細書において、同じ値または所定の値の＋／−５％異なる値を指す。
本明細書に提示する配列識別子において、ヌクレオチドは、ＤＮＡの標準的ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢコードで示される。しかし、当業者が理解するであろうように、天然のペスチウイルスゲノム配列はＲＮＡ型であり、この場合、ＴはＵであろう。本発明のペスチウイルスＲＮＡ配列は、特に、配列番号２である。
【００４３】
用語「感染性」は、宿主細胞または動物において完全に複製可能である、配列番号２あるいはその少なくとも部分または断片、例えばＮＳＰコード領域の配列を有するポリヌクレオチドを指す。
【００４４】
用語「相同性」または「同一性」は、交換可能に使用可能であり、そしてそれぞれの核酸残基の同一性を指す。同一残基の割合（同一性パーセント）を用いて、相同性／同一性を定量化する。
【００４５】
用語「弱毒化」は、本明細書において、配列番号１または配列番号２あるいはその少なくとも部分または断片のヌクレオチド配列を有するペスチウイルスに由来するかまたは該ウイルスから生じるポリヌクレオチド配列を有するウイルスを指し、ここで、該ウイルスは、同じ種または単離体の別のウイルス、例えば野生型ウイルスまたは単離体に比較した際、減少した病原性を有する。実際、弱毒化は、例えば胎児感染のように、感染ターゲット動物の体全体で、減少した伝播を示し；疾患（の徴候）など、より低い病原性を提供し；そして／または環境への減少した蔓延を示すことを意味する。ペスチウイルスが弱毒化されているかどうか、そして例えば、生ワクチンにおける使用に関して、弱毒化のレベルが本発明にしたがう使用に十分であるかどうかは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏいずれかの標準法を用いて決定可能である。例えば、ウイルスを比較することによって、細胞培養における、または感染した動物における、ウイルス複製速度に対する修飾の効果を、前記動物の異なる組織または臓器あるいは糞便におけるウイルスの存在をチェックすることによって、比較し、そして動物または胎児において、疾患の臨床的、巨視的、または微視的徴候を監視する。
【００４６】
限定されるわけではないが、本発明のウイルスのＮｐｒｏ遺伝子またはＮＳ２−３遺伝子を修飾し、それによってＮＳ２−３切断が増進されるように、ペスチウイルスが修飾、特にＮｐｒｏタンパク質、ＮＳ２タンパク質に位置するエピトープの突然変異、または特定のゲノム領域の複製を有するようにすることによって、弱毒化を確立可能である。これは、ＮＳ３タンパク質のヘリカーゼドメインに位置するエピトープの突然変異によって影響を受けず、したがって、野生型ペスチウイルスに比較して、エピトープが、そのエピトープに対する抗体と反応しないかまたは反応性がより低い。
【００４７】
用語「不活性化」は、本明細書において、配列番号１または配列番号２あるいはその少なくとも部分または断片のヌクレオチド配列を有するペスチウイルスに由来するかまたは該ウイルスから生じるポリヌクレオチド配列を有するウイルスであって、化学薬品、熱、または放射線でウイルスを殺すことにより、同じ種または単離体の別のウイルス、例えば野生型ウイルスまたは単離体に比較した際、病原性を喪失している、前記ウイルスを指す。
【００４８】
不活性化は、限定されるわけではないが、バイナリーエチレンイミン、エチレンイミン、アセチルエチレンイミン、ベータ−エチレンイミン、ベータ−プロピオラクトン、グルタルアルデヒド、オゾン、およびホルムアルデヒドからなる群より選択される不活性化剤での処理などの方法によって確立可能である。
【００４９】
代替法として、例えば、限定されるわけではないが、ＵＶ照射、Ｘ線照射、ガンマ照射、凍結融解、および／または加熱での処理などの物理的不活性化を実行してもよい。
ポリヌクレオチド分子は、鎖状に共有結合される１３またはそれより多いヌクレオチド単量体で構成されるバイオポリマーである。ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）およびＲＮＡ（リボ核酸）は、ポリヌクレオチドの例である。本明細書において、用語「外因性ポリヌクレオチド」または「異種ポリヌクレオチド」は、本発明の配列によってコードされるペスチウイルスに天然に存在しない任意のポリヌクレオチド配列を指す。
【００５０】
本出願において、用語「アミノ酸」は、タンパク質が構成される天然存在アミノカルボン酸の１つを意味する。用語「ポリペプチド」は、本明細書において、天然にまたは合成で産生されるかいずれかの、ペプチド結合によって連結されるアミノ酸残基のポリマーを指す。約１０アミノ酸残基未満のポリペプチドは、一般的に、「ペプチド」と称される。
【００５１】
「タンパク質」は、１またはそれより多いポリペプチド鎖を含む巨大分子である。タンパク質はまた、非ペプチド性構成要素、例えば炭水化物基も含んでもよい。炭水化物および他の非ペプチド性置換基は、タンパク質を産生する細胞によってタンパク質に付加されることも可能であり、そして細胞のタイプで多様であろう。タンパク質は、本明細書において、そのアミノ酸主鎖構造に関して定義され；炭水化物基などの置換基は、一般的に明記されないが、にもかかわらず存在することも可能である。
【００５２】
示す核酸配列「に由来する」ポリペプチドまたはアミノ酸配列は、配列中にコードされるポリペプチドのものと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、あるいは、少なくとも１５アミノ酸、特に少なくとも２０アミノ酸、より具体的には少なくとも３０アミノ酸、より具体的には少なくとも５０アミノ酸からなるか、または配列中にコードされるポリペプチドと、免疫学的に同定可能である、その部分を指す。この用語にはまた、示す核酸配列から発現されるポリペプチドも含まれる。
【００５３】
特に、異種ポリペプチドは免疫原性ポリペプチドである。
一般的に、免疫系細胞と抗原の相互作用を通じて、抗原に対する免疫反応が生じる。免疫反応は、広く２つのカテゴリー：体液性および細胞仲介性免疫反応に分類可能である（例えば、それぞれ、防御における抗体機構および細胞性エフェクター機構によって伝統的に特徴付けられる）。これらの反応カテゴリーは、Ｔｈ１型反応（細胞仲介性反応）、およびＴｈ２型免疫反応（体液性反応）と称されてきている。免疫反応の刺激は、免疫原への曝露に対する免疫系の細胞または構成要素の直接または間接的反応から生じうる。免疫反応は、免疫系の細胞（例えばＢ細胞、Ｔ細胞、樹状細胞、ＡＰＣ、マクロファージ、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞等）の活性化、増殖または分化；マーカーおよびサイトカインの上方制御または下方制御された発現；ＩｇＡ、ＩｇＭ、またはＩｇＧ力価の刺激；脾腫（脾臓細胞充実度の増加を含む）；多様な臓器における過形成および混合細胞浸潤を含む多くの方法で測定可能である。免疫刺激に関して評価可能である免疫系の他の反応、細胞、および構成要素が当該技術分野に知られる。
【００５４】
本発明にしたがう「ＲＮＡポリメラーゼプロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）によって特に認識される配列を含有する任意の領域であってもよい。プロモーターを、ターゲットＲＮＡをコードする配列に機能可能であるように連結してもよい。本態様の１つの特徴は、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターおよびＲＮＡポリメラーゼ、例えば当該技術分野に知られる任意のＲＮＡポリメラーゼおよびプロモーターの使用である。本明細書の特定の例は、限定する意図はないが、Ｔ７  ＲＮＡＰおよびＴ７  ＲＮＡＰプロモーターである。ポリメラーゼとプロモーターの他の例には、Ｔ７  ＲＮＡＰとＴ７クラスＩＩＩ  ＲＮＡＰプロモーターまたはＴ７ファイ２．５  ＲＮＡＰプロモーター、ＳＰ６  ＲＮＡＰとＳＰ６  ＲＮＡＰプロモーター、Ｔ３  ＲＮＡＰとＴ３  ＲＮＡＰプロモーター、Ｓｙｎ５  ＲＮＡＰとＳｙｎ５  ＲＮＡＰプロモーター、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）ＲＮＡＰとＴ５プロモーターが含まれる。
【００５５】
用語、ベクターまたはプラスミドベクターは、本明細書において、宿主細胞の形質転換、トランスフェクションまたは形質導入に適した少なくとも１つのベクターを含む系を定義する。ベクター自体は、したがって、関心対象の宿主細胞内への生体分子の送達のための乗り物を意味し、生体分子には、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびｃＤＮＡを含む核酸分子、またはトランスフェクション系の場合はベクター、アミノ酸分子、あるいはその組み合わせが含まれる。本発明のペスチウイルスは、複製に必要なすべての制御要素を含有するため、本発明にしたがうベクターとして使用可能である。本発明にしたがう別のベクターは、環状または直鎖であってもよいプラスミドまたは発現ベクターである。発現ベクターは、宿主細胞内に導入しようとする少なくとも１つのターゲット分子、好ましくは核酸分子をコードする１つのベクターを含むことも可能である。ベクター系のベクターはまた、導入しようとする１より多いターゲット分子も含んでもよい。あるいは、ベクター系は、導入しようとする少なくとも１つのターゲット分子を所持するいくつかの個々のベクターから構築されていてもよい。発現ベクターは、さらに、発現ベクターがそのために設計されている宿主細胞において、関心対象の配列の転写および／または翻訳を駆動するために必要なすべての要素を含む。これらの要素は、とりわけ、関心対象の宿主細胞において機能性であるプロモーター等を含む、転写の制御に関与する制御要素を含む。さらに、発現ベクターは、複製起点、ならびに場合によってベクターのタイプおよび意図される使用に応じて、選択可能マーカー遺伝子、マルチクローニングサイト、関心対象の配列に付着させようとするタグ、染色体組込みカセット等を含む。それぞれの宿主細胞および発現ベクター内に挿入しようとする関心対象の配列と共に使用するために適した発現ベクターの選択およびありうる修飾は、十分に当業者の能力の範囲内である。
【００５６】
用語「ｃＤＮＡ」は、相補ＤＮＡを示し、そしてＲＮＡ分子からの逆転写によって得られる核酸配列／分子を指す。実際、所定の配列からｃＤＮＡを得て、そしてこのｃＤＮＡをさらに使用するか、または関心対象のベクター、好ましくはプラスミドベクター内に前記ｃＤＮＡをクローニングすることは、当業者には標準的な方法である。
【００５７】
本明細書において、用語「機能可能であるように連結された」は、制御要素および遺伝子またはそのコード領域間の連結を記載するために用いられる。典型的には、遺伝子発現は、１またはそれより多い制御要素、例えば、限定なしに、恒常性または誘導性プロモーター、組織特異的制御要素、およびエンハンサーの制御下に置かれる。遺伝子またはコード領域は、制御要素「に機能的に連結された」または「機能可能であるように連結された」または「と機能可能であるように関連する」と言われ、これは、遺伝子またはコード領域が、制御要素に調節されるかまたはその影響を受けることを意味する。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現を達成するならば、プロモーターはコード配列に機能可能であるように連結されている。
【００５８】
本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１または配列番号２に対して、少なくとも６０％、特に少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００５９】
特定の態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド配列からなる。
本明細書にさらに提供するのは、配列番号１または配列番号２に対して、少なくとも６０％、特に少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または１００％の同一性を持つヌクレオチド配列を有するブタペスチウイルスを含む組成物である。
【００６０】
本発明のポリヌクレオチド配列を、ペスチウイルスタンパク質またはポリペプチド、特に、本発明のペスチウイルスのＮｐｒｏ、コア、Ｅｒｎｓ、Ｅ１、Ｅ２、Ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、ＮＳ５Ｂをコードするために用いてもよい。
【００６１】
本明細書に提供するのは、配列番号３に対して少なくとも５５％の同一性を持つ、特に配列番号３に対して、少なくとも５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリタンパク質を含む、ブタペスチウイルスである。
【００６２】
また、本明細書に提供するのは、配列番号４のアミノ酸配列（Ｎｐｒｏ）または配列番号４に対して少なくとも６５％、特に少なくとも６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００６３】
また、本明細書に提供するのは、配列番号５のアミノ酸配列（コアタンパク質）または配列番号５に対して少なくとも８５％、特に少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００６４】
また、本明細書に提供するのは、配列番号６のアミノ酸配列（Ｅｒｎｓタンパク質）または配列番号６に対して少なくとも７５％、特に少なくとも７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００６５】
また、本明細書に提供するのは、配列番号７のアミノ酸配列（Ｅ１タンパク質）または配列番号７に対して少なくとも７５％、特に少なくとも７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００６６】
また、本明細書に提供するのは、配列番号８のアミノ酸配列（Ｅ２）または配列番号８に対して少なくとも５５％、特に少なくとも５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００６７】
また、本明細書に提供するのは、配列番号９のアミノ酸配列（Ｐ７）または配列番号９に対して少なくとも６５％、特に少なくとも６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００６８】
また、本明細書に提供するのは、配列番号１０のアミノ酸配列（ＮＳ２）または配列番号１０に対して少なくとも６５％、特に少なくとも６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００６９】
また、本明細書に提供するのは、配列番号１１のアミノ酸配列（ＮＳ３）または配列番号１１に対して少なくとも９０％、特に少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００７０】
また、本明細書に提供するのは、配列番号１２のアミノ酸配列（ＮＳ４Ａ）または配列番号１２に対して少なくとも８５％、特に少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００７１】
また、本明細書に提供するのは、配列番号１３のアミノ酸配列（ＮＳ４Ｂ）または配列番号１３に対して少なくとも８０％、特に少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００７２】
また、本明細書に提供するのは、配列番号１４のアミノ酸配列（ＮＳ５Ａ）または配列番号１４に対して少なくとも５５％、特に少なくとも５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００７３】
また、本明細書に提供するのは、配列番号１５のアミノ酸配列（ＮＳ５Ｂ）または配列番号１５に対して少なくとも７５％、特に少なくとも７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００７４】
本明細書において、本発明のペスチウイルスおよび前記ウイルスをコードするポリヌクレオチドを、１またはそれより多い異種配列を発現するために用いてもよい。
前記異種配列は、本発明のペスチウイルス、あるいは配列番号１または配列番号２のポリヌクレオチドから生じずまたはこれらに由来しない、任意の配列であってもよい。前記異種配列は、ブタサーコウイルス２（ＰＣＶ２）、ウシウイルス性下痢ウイルス−１（ＢＶＤＶ−１）およびＢＶＤＶ−２、ボーダー病ウイルス（ＢＤＶ）、豚コレラウイルス（ＣＳＦＶ）、非定型ペスチウイルス（ＡＰＰＶ）、特にＮＲＰＶ、ＲａＰＶおよびボーダー病ウイルス由来の異種ポリペプチドまたはタンパク質あるいはその一部をコードしてもよい。異種配列は、上に列挙するような任意のウイルス由来の表面抗原またはそれらに由来する合成配列をコードしてもよい。特に、異種配列をＮｐｒｏまたはＥ２の５’または３’端に挿入する。より具体的には、異種配列は、ペスチウイルスのＮｐｒｏ、Ｅ２またはＥ１、あるいはＮｐｒｏ、Ｅ２またはＥ１の部分または断片との融合ペプチドをコードする。
【００７５】
さらにより具体的には、配列は、上に列挙するペスチウイルスいずれかのＮｐｒｏ、コア、Ｅｒｎｓ、Ｅ１、Ｅ２、Ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂタンパク質をコードするそれぞれの配列の配列番号６１（ボンゴワナ）、配列番号４９（エダツノレイヨウ）、配列番号５０（キリン）、配列番号５１（ＢＤＶ）、配列番号５２（トナカイ）、配列番号５３（ヒツジ）、配列番号５４（ＣＳＦＶ）、配列番号５５（ＢＶＤＶ−１）、配列番号５６（ＢＶＤＶ−２）、配列番号５７（ＢＶＤＶ−３）、配列番号５８（ラット）、配列番号５９（コウモリ）、配列番号６０（ＡＰＰＶ）のいずれか１つ、あるいはその任意の組み合わせまたは部分を含むことも可能である。したがって、配列番号４８〜配列番号６０のいずれかに全長アミノ酸配列を提供するが、当業者は、関心対象のタンパク質のそれぞれの部分配列を容易に決定可能である。したがって、本発明の範囲内にはまた、配列番号４８〜６０のＮｐｒｏ、コア、Ｅｒｎｓ、Ｅ１、Ｅ２、Ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂタンパク質の配列を有する、本発明のウイルスによってコードされる異種タンパク質またはポリペプチド、あるいはこれらに少なくとも９０％、特に少なくとも９５％、より具体的には少なくとも９９％の同一性を有する配列もある。
【００７６】
異種配列を、本発明の配列番号１または配列番号２のポリヌクレオチド内に挿入してもよい。挿入は、当業者に知られる任意の方法によって実行可能である。
１つの態様にしたがって、異種ポリペプチドをＮ末端またはＣ末端領域内に挿入する。
【００７７】
本明細書において、用語「領域」は、Ｎ末端と関連して、特に、ポリペプチドが最初の１５個、特に１０個、特に５個のＮ末端アミノ酸内に挿入されることを意味する。Ｃ末端と関連して、異種配列は、Ｃ末端アミノ酸における１５個、特に１０個、特に５個以内に挿入される。
【００７８】
本発明に関して、異種ポリペプチドを、ＮｐｒｏのＮ末端配列ＭＥＦＫ（配列番号３０）またはＮｐｒｏのＣ末端配列ＳＣＳＤ（配列番号３１）内に挿入してもよい。異種配列をまた、ＮｐｒｏのＮ末端メチオニンおよびグルタミン酸（ＭＥ）の間、ならびに／あるいはＣ末端システインおよびセリン（ＣＳ）の間に挿入してもよい。
【００７９】
異種ポリペプチドの十分な切断を可能にするため、異種ポリペプチドのＣ末端領域に、増殖配列をさらに挿入し、例えば限定されるわけではないが、ユビキチンまたはピコルナウイルス２Ａタンパク質をさらに挿入する。
【００８０】
あるいはまた、異種ポリペプチドをＥ２配列のＮ末端１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２アミノ酸内、特にＮ末端アミノ酸ロイシンおよびグルタミン酸の間に挿入してもよい。
【００８１】
遺伝子は、元来連結されていなかった部分の集合である場合、「キメラ」である。例えば、異なるウイルス単離体または種由来の同じ遺伝子の部分の集合である。キメラ遺伝子は、事実上、融合タンパク質である、キメラタンパク質をコードする。
【００８２】
本発明にしたがう用語「キメラペスチウイルス」は、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９のうちの１つ以上またはその任意の組み合わせ、あるいは該配列に少なくとも９０％、特に少なくとも９５％、少なくとも９９％の同一性を持つ配列あるいはその任意の組み合わせを含み、さらに、外来ポリペプチド由来のヌクレオチド配列を含む、本発明のペスチウイルスを指す。前記外来ポリペプチドは、遺伝的に異なるペスチウイルスから生じてもよい。外来ポリペプチドは、限定されるわけではないが、ウシウイルス性下痢ウイルス−１（ＢＶＤＶ−１）およびＢＶＤＶ−２、ボーダー病ウイルス（ＢＤＶ）、豚コレラウイルス（ＣＳＦＶ）、非定型ペスチウイルス（ＡＰＰＶ）、特にＮＲＰＶ、ＰＥＤＶ、ＲａＰＶ、ボーダー病ウイルス、トナカイ、キリンからの単離体、ＨｏＢｉペスチウイルスならびにボンゴワナウイルス、あるいはその任意の断片または誘導体であってもよい。
【００８３】
薬学的組成物、特にワクチンを調製するため、本明細書に記載するようなペスチウイルス、組成物、ベクターまたはキメラウイルスを用いてもよい。
「ワクチン」は、固有の医学的効果を有する、免疫原性組成物である。ワクチンは、免疫学的に活性である構成要素、および薬学的に許容されうるキャリアーを含む。「免疫学的に活性である構成要素」は、ターゲットの免疫系によって認識される、１またはそれより多い抗原性分子（単数または複数）、すなわち本発明にしたがうペスチウイルスそれ自体、あるいは本明細書に記載するようなベクターまたはキメラペスチウイルスであり、そして防御性免疫反応を誘導するものである。ワクチンは、一般的に、例えば宿主動物におけるウイルス負荷を減少させるかまたはウイルス複製期間を短縮させることによって、感染のレベルまたは度合いを減少させる際に有効である。また、ワクチンは、一般的に、疾患の症状を減少させるかまたは改善させる際に有効であり、これはこうしたウイルス感染または複製によって、あるいはその感染に対する動物の反応によって、引き起こされてもよいし、あるいはこれらの結果であってもよい。
【００８４】
本発明にしたがうワクチンの効果は、免疫学的反応の誘導、例えばウイルス中和性抗体の誘導、および／または細胞性免疫反応の誘導を通じた、ペスチウイルスによる感染、および／またはこうしたウイルス感染または複製に関連する疾患の徴候の、動物における防止または減少である。
【００８５】
該ワクチン、特に生弱毒化または不活性化ワクチンを、凍結乾燥型で調製してもよい。凍結乾燥法は、当該技術分野に周知である。凍結乾燥型は、限定されるわけではないが、ケーキまたはリオスフェア（ｌｙｏｓｐｈｅｒｅ）であってもよい。再構築のため、ワクチンを生理学的に許容されうる希釈剤中で再懸濁してもよい。希釈剤は、さらなる化合物、例えばアジュバントを含有してもよい。
【００８６】
本発明にしたがうワクチンが意図される「動物」は、ペスチウイルス感染に感受性である動物である。主に、これらは哺乳動物（非ヒト）であり、そして偶蹄目のメンバーであろう。本発明にしたがうワクチンに好ましいターゲット動物は、反芻動物およびブタであり；特に仔ブタである。用語、仔ブタは、離乳後の仔ブタ、より具体的には、約１０日〜３週齢で約４〜５ｋｇを有する初期離乳後仔ブタ、または約３〜５週齢で約５〜１０ｋｇを有する慣用的離乳後仔ブタを指す。しかし、離乳後仔ブタはまた、約１２週齢であってもよい。
【００８７】
用語「成熟雄ブタ」は、非去勢雄ブタを指す。
用語「未経産ブタ」は、若い雌ブタを指す。本明細書において、未経産ブタは、わずか数ヶ月齢であるかまたは１歳に近付いているかのいずれであっても、まだ交配させていないブタである。未経産ブタは、未交配である（ｉｎｔａｃｔ）か、または交配および出産可能であり、そして生殖器が外科的にまたは化学的に改変されていない。用語「雌ブタ」は成体雌ブタを指す。
【００８８】
本発明にしたがうワクチンは、生、生弱毒化、不活性化、またはサブユニットワクチン、あるいはその組み合わせであってもよい。
あるいは、本発明にしたがうワクチンまたはその部分は、サブユニットワクチンであってもよい。これは、生または不活性化ウイルスのいずれかから、ウイルス粒子の１またはそれより多い部分の分画または単離のための１またはそれより多い（さらなる）工程を適用することによって、調製可能である。これは、例えば、すべて当該技術分野に周知の抽出、分画、ホモジネート、または超音波処理産物を調製する工程を含む。
【００８９】
本発明のワクチンはまた、生ワクチンであってもよい。本発明に関して、用語「生」は、複製可能な本発明のペスチウイルスを指す。
本発明にしたがうワクチンはまた、アジュバントも含んでもよい。これは、ワクチンが不活性化ワクチンまたはサブユニットワクチンである場合、特に有用である。しかしまた、生ワクチンはアジュバントも含んでもよいが、ワクチンウイルスの生存度、さらには長期間の貯蔵に際しての生存度を減少させないように、注意深く選択しなければならない。
【００９０】
「アジュバント」は、周知のワクチン成分であり、一般的に、非特異的方式で、ターゲットの免疫反応を刺激する物質である。不活性化／サブユニットワクチンのためのアジュバントの例は、限定されるわけではないが、フロイントの完全または不完全アジュバント、ビタミンＥ、アルミニウム組成物、例えばリン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウム、ＰｏｌｙｇｅｎＴＭ、非イオン性ブロックポリマーおよびポリアミン、例えば硫酸デキストラン、ポリアクリル酸、サポニンである。さらに、ペプチド、例えばムラミルジペプチド、ジメチルグリシン、タフトシンは、しばしばアジュバントとして用いられ、そしてミネラルオイルまたは軽油（パラフィン油）；あるいは非ミネラルオイル、例えばスクアレン、スクアラン、または植物油、例えばオレイン酸エチルを用いた油エマルジョンが用いられる。ワクチンエマルジョンは、油中水（ｗ／о）、水中油（о／ｗ）、水中油中水（ｗ／о／ｗ）、または二重油エマルジョン（ＤＯＥ）等の形であってもよい。あるいは、そして生ワクチンで用いるためにより適切には、他の免疫刺激性構成要素、例えばサイトカインまたは免疫刺激性オリゴデオキシヌクレオチドを本発明にしたがうワクチンに付加してもよい。免疫刺激性オリゴデオキシヌクレオチドは、好ましくは、免疫刺激性非メチル化ＣｐＧ含有オリゴデオキシヌクレオチド（ＩＮＯ）である。
【００９１】
ワクチンを注射可能液、例えば：懸濁物、溶液、分散物、またはエマルジョンとして配合してもよい。あるいは、ワクチンを凍結乾燥型で配合してもよい。一般的にワクチンは無菌で調製される。適切な配合は、選択した投与経路などの多様な要因に応じうる。
【００９２】
動物に、特に妊娠雌ブタ、成熟雄ブタ、離乳後の仔ブタ、未経産ブタ、あるいは交配前の雌ブタまたは未経産ブタに、仔ブタを防御するために十分な量の、本明細書記載の組成物を投与することによって、動物、特に仔ブタを、ワクチン接種によって、ペスチウイルスと関連するいかなる疾患に対しても防御することも可能である。
【００９３】
疾患は、ペスチウイルスによって引き起こされる任意の疾患であり、特に、疾患は、先天性振戦、より具体的には先天性振戦Ａ−ＩＩ、豚コレラおよびウシ下痢である。
投与のため、組成物、例えばワクチンは、少なくとも約１ｘ１０４、特に少なくとも１ｘ１０５、１ｘ１０６、１ｘ１０７、１ｘ１０８のＴＣＩＤ５０のウイルス力価を含んでもよい。投薬量、すなわち投与されるウイルスの量の決定は、投与様式に応じうる。例えば、ウイルスを経口または鼻内経路によって投与する場合、用量あたり少なくとも１ｘ１０６のＴＣＩＤ５０を投与しなければならず、ウイルスを筋内経路によって投与する場合、用量あたり少なくとも１ｘ１０４のＴＣＩＤ５０を投与しなければならないが、より高い力価、例えば１ｘ１０５、１ｘ１０６、１ｘ１０７またはそれより高い力価もまた包含される。それぞれの用量は、当業者によって決定可能である。
【００９４】
本発明はさらに、ＡＰＰＶ、ＢＤＶ、ＣＳＦＶ、ＢＶＤＶ−１、ＢＶＤＶ−２、およびリンダウイルスの検出のための新規汎ペスチウイルスＲＴ−ＰＣＲアッセイを提供する。特に、ゲノムの検出は、ペスチウイルス特異的遺伝子（ＮｐｒｏおよびＥｒｎｓ）の存在、ならびに保存されたゲノム領域（ＮＳ３およびＮＳ５Ｂ）における他のペスチウイルスに対する配列相同性に関する。本発明の単離ペスチウイルス（リンダウイルス）および最も近縁の既知のペスチウイルス（ボンゴワナウイルス）の間の全体的なヌクレオチド同一性は、６８．０％未満である。
【００９５】
代替法として、本発明にしたがうペスチウイルスを陽性マーカーとして特異的に検出し、有効なワクチン接種をスクリーニングするためのアッセイを考案してもよい。こうしたアッセイは、本発明にしたがうペスチウイルスによって発現されるタンパク質に対する抗体を用いるか、または抗体に関する検出抗原としてペスチウイルスを用いるであろう。
【００９６】
本発明に関して、「抗体」は、エピトープに特異的に結合可能な免疫グロブリンタンパク質またはその部分である。血清診断のため、抗体は、典型的にはＩｇＧまたはＩｇＭ型であろう。抗体は、損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）または部分抗体、例えば一本鎖抗体、または抗原結合領域を含有する免疫グロブリンの部分であってもよい。抗体部分がなお抗原結合部位を含有する限り、これらは異なる型：こうした部分の（合成）構築物であってもよい。免疫グロブリンの周知の下位断片は：Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄＡｂ、またはＦｄ断片、Ｖｈドメイン、あるいはこうした断片またはドメインの多量体である。また、抗体は、検出を促進するかまたは増幅するため、１またはそれより多い方法で標識されていてもよい。
【００９７】
したがって、方法の態様において、本明細書記載のプライマー、抗体６Ａ５またはリンダウイルスおよび感受性細胞培養を使用した血清中和アッセイのいずれかを用いて、ワクチン接種動物および非ワクチン接種動物、または感染動物および非感染動物を区別することが可能である。免疫診断アッセイの任意の適切な方法を用いて、本発明にしたがって区別するための方法を実行してもよい。しばしば、こうした免疫診断アッセイは、シグナル強度を増幅するための工程、および未結合の、非特異的なまたは望ましくない構成要素を洗い流すための１またはそれより多い工程を有するであろう。色変化、蛍光、または粒子サイズの変化を検出することによって光学的に、あるいは免疫複合体中の放射標識抗原または抗体の検出によるなどの多様な方法で、陽性シグナルの検出を行ってもよい。同様に、試験の物理的な型は非常に多様であってもよく、そして例えば、マイクロタイタープレート、メンブレン、ディップスティック、バイオセンサーチップ、ゲルマトリックス、あるいは（マイクロ）キャリアー粒子、例えばラテックス、金属、またはポリスチレン等を含む溶液を使用してもよい。
【００９８】
こうした免疫診断アッセイの特定のセットアップに関する選択は、通常、投入試料のタイプ、望ましい試験感度（陽性試料を正しく同定する）、および試験特異性（真の陽性および真の陰性試料の間を正しく区別する）によって決定される。こうした特性は、免疫反応の強度およびタイミング、または微生物の存在に応じる。さらに、試験経済、例えば大規模での適用可能性およびコストに関する必要条件は、特定の形式の選択を決定しうる。
【００９９】
周知の免疫診断試験は：ラジオイムノアッセイ、免疫拡散法、免疫蛍光、免疫沈降、凝集、溶血、中和、および「酵素連結免疫吸着アッセイ」またはＥＬＩＳＡである。特に大規模試験のため、液体取り扱い、および／または結果読み取りおよびプロセシングの自動化が必要でありうる。ＥＬＩＳＡは容易に拡張可能であり、そして非常に高感度でありうる。さらなる利点は、その結果のダイナミックレンジであり、これは試料を希釈範囲で試験可能であるためである。結果は、試験特性および読み取りに用いた技術的装置の設定に応じて、吸光度の任意単位、典型的には０．１〜２．５光学密度（ＯＤ）単位で、または「ブロッキング％」として表される。ルーチンに、適切な陽性および陰性対照試料を含め、そして大部分の場合、試料を多数回試験する。標準化は、定義する参照試料（の希釈範囲）を含めることによって得られ、これによってまた、特定のスコアを、陽性または陰性を決定するためにあらかじめ設定した値にマッチさせることが可能になり、そして生物学的な意味との相関、例えば：強度に対する抗原の量、または免疫防御レベルに対する抗体の量の相関が可能になる。
【０１００】
ＥＬＩＳＡセットアップの多くの変形が知られるが、典型的には、これらは、抗原または抗体を固相に、例えばマイクロタイタープレートのウェルに固定して使用する。抗体を固定する場合、試験は、「捕捉」または「サンドイッチ」ＥＬＩＳＡと呼ばれる。次に、試験試料を添加し、リガンド（例えば検出しようとする抗原または抗体）が結合するのを可能にする。次いで、検出剤（抗体、抗原、または他の結合構成要素）を添加し、これはしばしば標識、例えば分光光度測定で読み取り可能である呈色反応を誘導可能である酵素にコンジュゲート化されている。他のタイプの標識は、発光、蛍光、または放射性を用いてもよい。試験感度を増進するため、シグナル強度の増幅を提供する、標識検出剤の使用が意図されるが、これはまたバックグラウンドシグナルを導入し、シグナル対ノイズ比を減少させる可能性もある。
【０１０１】
試料の収集および調製のための方法は、当該技術分野に周知である。こうした試料は、検出しようとするウイルスまたは抗体の十分な量が存在する、任意のタイプの生物学的試料であってもよい。典型的には、これらの試料は：血液、血清、母乳、精液、尿、糞便、または組織試料、例えば耳穿刺であってもよい。
【０１０２】
例えば非ワクチンペスチウイルスの検出のための「適切なイムノアッセイ」を構成するものは、試料、ウイルス、または実行しようとする試験の他のパラメータの詳細に応じうる。
【０１０３】
診断アッセイを実行するための「診断キット」もまた提供し、そしてこれはどちらも本発明にしたがった、区別のための方法または診断のための方法を実行するための部分のキットに関する。該キットは、方法を適用するための１またはそれより多い構成要素、特にＲＴ−ＰＣＲを実行するために必要なすべての部分、ならびに配列番号２６および配列番号２７より選択されるプライマーを含む。場合によって、方法をいかに実行するか、そして結果をどのように読み取り、そして解釈するかの使用説明書がキットに含まれる。
【０１０４】
上述のように、本発明のペスチウイルスは、細胞培養中で効率的に増殖可能である。
本発明にしたがう方法において、そして本発明にしたがうペスチウイルスの増幅のため、適切な宿主細胞においてウイルスを産生する。これは、宿主細胞への接種、および天然複製による増幅によってもよい。
【０１０５】
宿主細胞は、動物組織から調製されるような初代細胞であってもよい。ペスチウイルス複製のための適切な宿主細胞は当該技術分野に周知であり、そして一般的に公的に入手可能である。本発明にしたがう宿主細胞を調製し、そして培養するための方法、培地、および材料は、当該技術分野に周知である。適切な宿主細胞の例は、細胞株、例えばウシ細胞株、例えば：ＭＤＢＫ（メイディン・ダービーウシ腎臓）；ブタ細胞株、例えば：ＰＫ１５またはＳＫ−６（ブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）腎臓、ブタ（ｓｗｉｎｅ）腎臓）、またはＳＴＥ（ブタ精巣類上皮）；または汎用細胞株、例えば：Ｖｅｒｏ（アフリカミドリザル（Ａｆｒｉｃａｎ  ｇｒｅｅｎ  ｍｏｎｋｅｙ）腎臓細胞）、ＭＤＣＫ（メイディン・ダービーイヌ腎臓）、またはＰＴ細胞（ヒツジ上皮腎臓細胞）である。好ましい宿主細胞は、ＳＫ−６またはＰＫ−１５細胞である。特に、本発明のペスチウイルスは、ＳＫ−６またはＰＫ−１５細胞上で、馴化の必要を伴わず、高力価（＞１０７）に容易に増殖可能である。これは、本発明のペスチウイルスを、ワクチン構成要素を効率的に調製するために、ならびにウイルスベクターとして使用するために、非常に好適なものにする。
【０１０６】
ウイルス複製周期における特定の時点で、こうした宿主細胞は、本発明のペスチウイルスを含有するであろう。したがって、さらなる側面において、本発明は、本発明にしたがった、または本発明の方法によって得られうる、ペスチウイルスを含む宿主細胞に関する。
【０１０７】
増殖のため、宿主細胞培養を、本明細書に記載するようなポリヌクレオチド、ベクター、またはキメラペスチウイルスに感染させ、適切な条件下で宿主細胞培養をウイルス増殖のためにインキュベーションし、宿主細胞培養を完全にまたは部分的に採取し、そして細胞培養またはその上清からウイルスを単離する。場合によって、薬学的に許容されうるキャリアーをウイルスまたは細胞培養に添加する。
【０１０８】
本発明はまた、以下の項目に関する：
１．  配列番号１または配列番号２のヌクレオチド配列、あるいは該配列に少なくとも６０％、特に少なくとも７０％の同一性を持つ配列を含む、単離ポリヌクレオチド。
【０１０９】
２．  感染性ポリヌクレオチドである、項目１のポリヌクレオチド。
３．  細胞中に存在する、項目１または２記載のポリヌクレオチド。
４．  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが、ポリヌクレオチドに機能可能であるように連結されている、項目１〜３のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。
【０１１０】
５．  外因性ポリヌクレオチドをさらに含む、項目１〜４のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。
６．  ベクター中に存在する、項目１〜４のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。
【０１１１】
７．  配列番号１のｃＤＮＡポリヌクレオチド。
８．  配列番号１に対して、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の相同性を有する、ｃＤＮＡポリヌクレオチド。
【０１１２】
９．  配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９またはその任意の組み合わせあるいは該配列に少なくとも９５％の同一性を持つ配列の群より選択される配列を含む、感染性ポリヌクレオチド。
【０１１３】
１０．  配列番号１または配列番号２のヌクレオチド配列、あるいは該配列に少なくとも６０％、特に少なくとも７０％の同一性を持つ配列を有するブタペスチウイルスを含む、組成物。
【０１１４】
１１．  配列番号３のアミノ酸配列、または該配列に少なくとも６０％の同一性を有する配列を含むブタペスチウイルスを含む、組成物。
１２．  配列番号４（Ｎｐｒｏ）、配列番号５（コア）、配列番号６（Ｅｒｎｓ）、配列番号７（Ｅ１）、配列番号８（Ｅ２）、配列番号９（Ｐ７）、配列番号１０（ＮＳ２）、配列番号１１（ＮＳ３）、配列番号１２（ＮＳ４Ａ）、配列番号１３（ＮＳ４Ｂ）、配列番号１４（ＮＳ５Ａ）および配列番号１５（ＮＳ５Ｂ）からなる群より選択される１またはそれより多いアミノ酸配列を含むブタペスチウイルスを含む、組成物。
【０１１５】
１３．  ブタペスチウイルスが不活性化されているかまたは弱毒化されている、項目１０〜１２のいずれか一項記載の組成物。
１４．  前記ペスチウイルスが化学的に不活性化されたウイルスであって、特に、バイナリーエチレンイミン、エチレンイミン、アセチルエチレンイミン、ベータ−エチレンイミン、ベータ−プロピオラクトン、グルタルアルデヒド、オゾン、およびホルムアルデヒドからなる群より選択される不活性化剤での処理によって不活性化されている、項目１３の組成物。
【０１１６】
１５．  ペスチウイルスが物理的に不活性化されたペスチウイルスであって、ＵＶ照射、Ｘ線照射、ガンマ照射、凍結融解、および／または加熱での処理によって不活性化されている、項目１３の組成物。
【０１１７】
１６．  ペスチウイルスが、Ｎｐｒｏ、ＥｒｎｓまたはＮ２−３遺伝子を修飾することによって弱毒化されている、項目１３の組成物。
１７．  凍結乾燥型のペスチウイルスを含む、項目１０〜１６のいずれか一項記載の組成物。
【０１１８】
１８．  少なくとも約１ｘ１０４のＴＣＩＤ５０を含む、項目１０〜１７のいずれか一項記載の組成物。
１９．  項目１０〜１８のいずれか一項記載の組成物を含む、薬学的組成物。
【０１１９】
２０．  配列番号２のヌクレオチド配列、または該配列に少なくとも６０％、特に少なくとも７０％の同一性を有する配列、および異種配列をコードする配列を含む、ブタペスチウイルスベクター。
【０１２０】
２１．  異種配列が、ＡＰＰＶ、ＮＲＰＶ、ブタサーコウイルス２（ＰＣＶ２）、ボンゴワナウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）、特にＢＶＤＶ−１、ＢＶＤＶ−２、豚コレラウイルス（ＣＳＦＶ）、ＲａＰＶおよびボーダー病ウイルスからなる群より選択されるウイルスから選択され、特に、前記異種配列が前記ウイルス由来の表面抗原をコードする、項目２０のベクター。
【０１２１】
２２．  異種配列がＮｐｒｏの５’または３’端に挿入される、項目２０または２１のいずれか一項記載のベクター。
２３．  異種配列が、ペスチウイルスのＮｐｒｏ、Ｅ２またはＥ１タンパク質との融合ペプチドをコードする、項目２５または２７のいずれか一項記載のベクター。
【０１２２】
２４．  配列番号１または配列番号２に対して少なくとも６０％、特に少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列、および外来ポリペプチドを含む、キメラペスチウイルス。
【０１２３】
２５．  項目１〜９のいずれか一項記載のポリヌクレオチド、または項目１０〜１８のいずれか一項記載の組成物、または項目２０〜２３のいずれか一項記載のベクター、または項目２４記載のキメラペスチウイルスを含む、動物用ワクチン。
【０１２４】
２６．  ブタにおけるブタペスチウイルス感染に対する免疫反応を誘導するためのキットであって、項目１０〜１８のいずれか一項記載の組成物、および前記ブタに前記組成物を投与するための使用説明書を含む、前記キット。
【０１２５】
２７．  ペスチウイルスと関連する疾患に対して、仔ブタを防御するための方法であって、妊娠雌ブタ、成熟雄ブタ、離乳後の仔ブタ、未経産ブタ、あるいは交配前の雌ブタまたは未経産ブタに、仔ブタを防御するために十分な量の項目１０〜１８のいずれか一項の組成物を投与する工程を含む、前記方法。
【０１２６】
２８．  疾患が、先天性振戦、特に先天性振戦Ａ−ＩＩである、項目２７記載の方法。
２９．  組成物を、非経口投与、特に、針およびシリンジ、または無針注射デバイスを用いて、筋内、皮下、皮内または静脈内で；あるいは粘膜投与を通じて、特に経鼻または経口で投与する、項目２７または２８記載の方法。
【０１２７】
３０．  配列番号３２および配列番号３３より選択されるプライマーの少なくとも１つを用いたＲＴ  ＰＣＲで試料を試験する、ペスチウイルスを検出するための方法。
３１．  配列番号３２および配列番号３３より選択されるプライマーの少なくとも１つを含む、ペスチウイルスを検出するための診断アッセイ。
【０１２８】
３２．  配列番号３のアミノ酸配列または少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するペスチウイルス抗原を、生物学的試料において検出するための方法であって：
生物学的試料を、モノクローナル抗体６Ａ５抗体と接触させ、前記ペスチウイルス抗原が前記試料に存在する場合、前記モノクローナル抗体が前記ペスチウイルス抗原に特異的に結合し；そして前記試料において、前記抗原に対する抗体結合を検出する
工程を含む、前記方法。
【０１２９】
３３．  項目３２記載のワクチンを調製するための方法であって、
ａ）項目１〜９のいずれか一項記載のポリヌクレオチド、項目２０〜２３のいずれか一項記載のベクター、または項目２４記載のキメラペスチウイルスで、宿主細胞培養を感染させ、
ｂ）ウイルス増殖のため、前記宿主細胞培養をインキュベーションし、
ｃ）宿主細胞培養を採取し、そして場合によって
ｄ）培養からウイルスを単離し、そして
ｅ）薬学的に許容されうるキャリアーと培養を混合する
連続工程を含む、前記方法。
【０１３０】
３４．  動物用ワクチンを調製するための、項目１〜９のいずれか一項記載のポリヌクレオチド、または項目１０〜１８のいずれか一項記載の組成物、または項目２０〜２３のいずれか一項記載のベクター、または項目２４記載のキメラペスチウイルス、あるいはその任意の組み合わせの使用。
【０１３１】
３５．  動物用ワクチンにおいて使用するための、項目１〜８のいずれか一項記載のポリヌクレオチド、または項目１０〜１８のいずれか一項記載の組成物、または項目２０〜２３のいずれか一項記載のベクター、または項目２４記載のキメラペスチウイルス、あるいはその任意の組み合わせ。
【０１３２】
３６．  項目２５記載のワクチンを、項目２６記載の診断キットと組み合わせる、動物におけるペスチウイルス感染を管理するための方法。
本発明は、限定されることなく、以下の実施例によってさらに例示される。
【実施例】
【０１３３】
実施例１：
オーストリアの仔ブタ産出農場は、新生仔ブタにおいて、重度の反復性ミオクローヌスのアウトブレイクを記録した。罹患仔ブタの中枢神経系（ＣＮＳ）の組織学的検査によって、小脳および脊髄における白質のミエリン形成不全が明らかになった。罹患仔ブタにおける非定型ブタペスチウイルス（ＡＰＰＶ）ゲノムに関する検索中、仮に「リンダウイルス」と称される、以前は知られていなかったペスチウイルス株が発見された。このウイルスは、血清試料から単離され、そして培養ブタ細胞において容易に増殖可能であった。サンガー配列決定およびＲＡＣＥ−ＰＣＲとともに、プライマーウォーキングを用いて、全長ゲノム配列を決定した。リンダ配列と他の既知のペスチウイルス種および割り当てられていない株との対整列によって、最も近縁のボンゴワナウイルスに対して、６８％未満のヌクレオチド同一性および７０％未満のアミノ酸同一性が明らかになった。ペスチウイルス種であるＢＶＤＶ−１、ＢＶＤＶ−２、ＣＳＦＶおよびボンゴワナウイルスに対して作製された、１００を超えるモノクローナル抗体の広いパネル内で、リンダウイルスに対して反応性である１つのＥ２特異的抗体が同定された。Ｅ２特異的抗体を用いて、病変部位での罹患仔ブタのＣＮＳにおいて、リンダの存在が確認された。結論として、近年発見されたＡＰＰＶとは明らかに異なる、欧州家畜ブタにおける先天性振戦を引き起こす、推定上の新規ペスチウイルス種を本明細書に記載する。
【０１３４】
本明細書において、仮に「リンダ」と称され、そしてＡＰＰＶに関連しない、新規ブタペスチウイルス株の発見および分子特徴付けを報告する。該ウイルスは、オーストリア養豚場で発見され、「振戦仔ブタ」症候群による多大な損失を報告した。疾患経過は近年のオーストリアにおけるＡＰＰＶアウトブレイク（Ｓｃｈｗａｒｚら、２０１６、上記）と類似であったが、臨床的徴候および病理学的病変はより顕著であった。組織病理学的検査によって、重度の臨床徴候は、小脳および脊髄における明らかなミエリン形成不全に関連することが示された。リンダペスチウイルスは、罹患仔ブタの血清および組織試料から単離され、そしてブタ細胞株上で高力価に増殖した。感染組織培養を用いて、リンダウイルスに対して反応性であるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を同定した。これらのｍＡｂを用いて、中枢神経系（ＣＮＳ）における病変部位で、免疫組織化学によって、リンダウイルスのタンパク質発現を検出した。リンダ株の全ゲノム配列をＲＴ−ＰＣＲによって決定し、リンダウイルスがペスチウイルス属に属することを実証した。系統発生分析によって、リンダウイルスがボンゴワナウイルスに最も近縁であることが示された。しかし、リンダおよびボンゴワナウイルス間で観察される相違（ｄｉｖｅｒｇｅｎｃｅ）は、認可されたペスチウイルス種であるＢＤＶ、ＢＶＤＶおよびＣＳＦＶ間よりも大きかった。したがって、リンダ株は、ペスチウイルス属内の新規種として提唱される。
【０１３５】
２．  材料および方法
２．１．  試料収集
本研究で使用するすべての動物使用プロトコルは、施設倫理動物福祉委員会および国内当局によって認可され、絶滅危惧種または保護種は本研究に関与しなかった。試料収集には、もっぱら私有の土地を用い、そして所有者の許可を得た後にのみアクセスした。２０１５年、ＣＴによる多大な仔ブタの損失を報告した小規模オーストリア仔ブタ産出農場から契約獣医によって試料を得た。農場Ｌは、オーストリア法令にしたがって、ＣＳＦＶまたは他のペスチウイルスに対するいかなるワクチンも用いていなかった。ウィーンの大学ブタクリニックの獣医が農場Ｌを訪問し、そして診断評価のため、さらなる試料を収集した。
【０１３６】
２．２  農場Ｌの説明
農場Ｌは、オーストリア南部のスティリアに位置する仔ブタ産出場である。総数２５のラージ・ホワイト×ランドレース交雑雌ブタが、連続出産サイクルで管理されている。ＣＴ罹患同腹仔は、未経産ブタでのみ生じ、そして続く同腹仔には観察されなかった。該未経産ブタは未経産ブタ生産者から得られ、該生産者はＣＴの問題を報告していなかった。すべての未経産ブタは、パルボウイルス症および丹毒に対してワクチン接種され（Ｐａｒｖｏｒｕｖａｃ（登録商標）、Ｍｅｒｉａｌ  ＳＡＳ、フランス・リヨン）、そして別に、ヒゼンダニ症および線形動物の導入を防止するため、フェンベンダゾール（Ｐａｎａｃｕｒ  ４％、Ｉｎｔｅｒｖｅｔ、ウィーン）およびイベルメクチン（Ｉｖｏｍｅｃ、Ｍｅｒｉａｌ  ＳＡＳ、フランス・リヨン）で交互に処理された。この群れは、ＣＴの発生前および発生後、ＰＲＲＳＶを生じなかった。
【０１３７】
２．３．  病理学
２頭の異なる同腹仔から生じる農場Ｌの８頭の仔ブタに対して、完全剖検を行った。６頭の臨床的に罹患した仔ブタおよび症状を示さない２頭の健康な同腹仔からの知見を比較した。仔ブタを安楽死させ；巨視的病理学的検査を行い、そして試料を採取した。組織学的検査のため、すべての仔ブタおよびＣＴの問題を伴わない農場由来の健康な対照動物の脳、脊髄、および臓器試料を１０％中性緩衝ホルマリン中で固定した。ホルマリン固定した脳を、２〜３ｍｍの厚さの冠状（ｃｏｒｏｎａｒｙ）切片にカットし、そしてパラフィン蝋中に包埋した。頸髄、胸髄および腰髄の臓器試料、ならびに冠状および縦断切片もまたカットし、そしてパラフィン蝋中に包埋した。すべての包埋した臓器で、１．５μｍ厚切片をカットし、そしてヘマトキシリンおよびエオジン（ＨＥ）で染色した。さらに、脳および脊髄試料を、ルクソール・ファースト・ブルーおよびＨＥ（ＬＦＢ−ＨＥ）の組み合わせで染色し、ミエリン形成の度合いを決定した。リンダ検出のため、自動染色装置（Ｌａｂ  Ｖｉｓｉｏｎ  ＡＳ  ３６０、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国ウォルサム）上で、一次抗汎ペスチウイルスＥ２抗体（ｍＡｂ  ６Ａ５、希釈１：１０００）を用いて、免疫組織化学検査を自動で行った。簡潔には、仔ブタの脳および脊髄の２μｍパラフィン包埋切片をコーティングしたスライドに乗せ、そして組織接着を増進させるために乾燥させた。クエン酸緩衝液（ｐＨ６）中で加熱することによって、脱パラフィン処理し、そして再水和した切片上で、抗原回収を行った。Ｈ２Ｏ２中でインキュベーションすることによって、内因性ペルオキシダーゼ活性を遮断した。一次抗体を適用した後、酵素標識ポリマーにコンジュゲート化された普遍的二次抗体配合物からなる、ポリマー検出系（ＵｌｔｒａＶｉｓｉｏｎ  ＬＰ大量検出系；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国ウォルサム）を用いた。次いで、ポリマー複合体を、適切な基質／色素原（ジアミノベンジジン［ＤＡＢ］；Ｌａｂｖｉｓｉｏｎ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国ウォルサム）で可視化した。続いて、すべての切片をヘマトキシリンで対比染色し、脱水し、そしてマウンティングした。
【０１３８】
２．４．  ＡＰＰＶゲノムの検出
製造者の指示にしたがってＱＩＡａｍｐウイルスＲＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ・ヒルデン）を用いて、フィールド血清または組織試料から総ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡを６０μｌ  ＲＮアーゼ不含蒸留水中で溶出し、そして直接、ＲＴ−ＰＣＲに用いたか、または続く分析のため、−８０℃で保存した。製造者の指示にしたがって、Ｏｎｅ  Ｔａｑ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲキット（ＮＥＢ、米国イプスウィッチ）またはＯｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ・ヒルデン）を用いて、ＲＴ−ＰＣＲを行った。汎ペスチウイルスＲＴ−ＰＣＲプロトコルを開発して、オリゴヌクレオチドＰＰＦ（５’−ＧＴＫＡＴＨＣＡＡＴＡＣＣＣＴＧＡＲＧＣ−３’、配列番号３２）およびＰＰＲ（５’−ＧＧＲＴＴＣＣＡＧＧＡＲＴＡＣＡＴＣＡ−３’、配列番号３３）、５５℃のアニーリング温度、ならびに１分間の伸長時間を用いて、非定型ペスチウイルスを検出した。
【０１３９】
２．５．  ウイルス単離および増殖
ウイルス単離のため、罹患農場Ｌ由来の疾患仔ブタの５０μｌ血清または５０μｌのホモジナイズ組織試料を用いて、６ウェルプレート上、５ｘ１０６（５ｘ１０６）個のＳＫ−６細胞に接種した。３日後、細胞培養上清を採取し、遠心分離によって清澄にし、そして新鮮なＳＫ−６細胞上で継代した。１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ  Ｇｏｌｄ  Ｐｌｕｓ、Ｂｉｏ＆Ｓｅｌｌ、ドイツ・フォイヒト）を補充したダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）中ですべての細胞を増殖させ、そして３７℃および５％ＣＯ２で維持した。ＲＴ−ＰＣＲおよび免疫蛍光によって、ウイルス感染および継代を分析した。
【０１４０】
２．６．  リンダ株に対するモノクローナル抗体
以前の研究において、ＣＳＦＶおよびＢＶＤＶの大部分のタンパク質に対して、モノクローナル抗体が生成された。さらに、ボンゴワナウイルスのＥ２およびＮＳ３に対して抗体が作製された（未公表データ）。簡潔には、血清転換が観察されるまで、ＢＡＬＢ／ｃマウスを組換えタンパク質で免疫した。脾臓細胞を調製し、そしてｓｐ２／０−ＡＧ１４骨髄腫細胞と融合させて、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを生成した。ＥＬＩＳＡ、イムノブロット（ｍｍｕｎｏｂｌｏｔ）および免疫蛍光アッセイを必要に応じて用いて、生じたｍＡｂを評価した。これらの融合実験各々は、最大１００の異なる反応性モノクローナル抗体を生じ、ペスチウイルスタンパク質に対する広範な抗体コレクションを生成した。リンダウイルス感染細胞培養を用いた間接的免疫蛍光アッセイによって、交差反応性抗体のいくつかのＥ２特異的およびＮＳ３特異的パネルをスクリーニングした。
【０１４１】
２．７．  全ゲノム配列の決定
ＧｅｎＢａｎｋにおいて入手可能な公開配列にしたがって、異なるペスチウイルス種（ＢＶＤＶ、ＢＤＶ、ＣＳＦＶ、ボンゴワナ、およびＡＰＰＶ）中の非常に保存された領域とハイブリダイズするいくつかのプライマー対（要請に応じて入手可能）を設計した。最５’および３’末端の配列を決定するため、ＲＡＣＥ−ＰＣＲを行った。Ｔ４  ＲＮＡリガーゼＩ（ＮＥＢ、米国イプスウィッチ）を用いて、ウイルス感染細胞培養から精製した総ＲＮＡを２つの異なるアダプターオリゴヌクレオチドに連結した。非リン酸化標準オリゴヌクレオチド（ＡＤ１、５’−ＧＧＣＣＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＡＧＴＡＣ−３’−ＯＨ、配列番号３４）を５’−ＲＡＣＥに用い、そしてアミン基によって３’端でブロッキングされているリン酸化オリゴヌクレオチドを３’−ＲＡＣＥに用いた（ＡＤ２、ＰＯ３−５’−ＧＧＣＣＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＡＧＴＡＣ−３’−ＡｍＣ３、配列番号３５）。ｃＤＮＡ生成およびそれに続くＰＣＲ増幅のため、リンダウイルス特異的配列にハイブリダイズするプライマーおよびアダプタープライマー（ＡＤ１またはＡＤ１ｒｅｖ）を、逆転写酵素（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および高忠実度Ｔａｑポリメラーゼ（Ｏｎｅ  Ｔａｑ、ＮＥＢ）とともに適用した。アダプターオリゴヌクレオチド（ＡＤ１またはＡＤ１ｒｅｖ）を、入れ子（ｎｅｓｔｅｄ）リンダ配列特異的プライマーと共に用いた第二のＰＣＲを使用して、望ましい５’および３’末端を増幅した。ＰＣＲアンプリコンをゲル電気泳動に供し、ｐｅｑＧＯＬＤゲル抽出キット（Ｐｅｑｌａｂ、ドイツ・エアランゲン）によって精製し、そして商業的供給業者（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、ドイツ・エーバースベルグ）によって配列決定した。さらに、すべてのリンダｃＤＮＡ断片を、ｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国マディソン）にサブクローニングし、そしてプラスミドから再配列決定して、高品質の配列決定結果を得た。ペスチウイルスであるリンダ株の配列をＧｅｎＢａｎｋに提出し、そして該配列を配列番号１として以下に列挙する。ＮＣＢＩのヌクレオチド（ＢＬＡＳＴｎ）およびタンパク質（ＢＬＡＳＴｐ）のための基本的局所整列検索ツールを用いて、最初の分析を行った。ＣＬＣ  Ｍａｉｎ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ  ７．６（ＣＬＣＢＩＯ、デンマーク・オーフス）で、系統発生対比較および同一性計算を行った。１，０００回の複製に基づくブートストラップ値で、ソフトウェアＣＬＣ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｖｉｅｗｅｒ  ７．６（ＣＬＣＢＩＯ、デンマーク・オーフス）を用いて、整列および系統発生樹を生成した。系統発生樹の構築のため、ＧｅｎＢａｎｋに寄託されている他のペスチウイルス種の配列を、示すとおりに用いた。
【０１４２】
３．  結果
３．１．  罹患農場Ｌにおける臨床徴候の説明
２０１５年７月、ＣＴの最初の徴候が、初めて出産した雌ブタの新生仔ブタで観察された：これらの同腹仔由来の新生仔ブタの２０％〜１００％が、全身を伴う水平振戦（ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ  ｓｈａｋｉｎｇ）を示した。多くの新生仔ブタは、母乳を吸うことができず、そして離乳前に死亡した。振戦は、単一の罹患仔ブタにおいて、徐々に消滅し、疑わしくない離乳後仔ブタを生じた。ＣＴのアウトブレイクは、新規出産雌ブタの最後の同腹仔とともに、２０１５年９月に終わった。
【０１４３】
３．２．  病理学
２頭のＣＴ罹患同腹仔由来の仔ブタは、巨視的検査に際して、まったく病変を示さないかまたは軽度の病変しか示さなかった。脚の擦りむき、肺胞性肺浮腫および肺気腫が見られた。ＣＴ罹患仔ブタの何頭かは、腎皮質および脊髄に安楽死とは関連しない散在性点状出血を示した。ＣＴ罹患仔ブタの脊髄は、わずかに発育不全を示した。ＨＥ−ＬＦＢ染色において、すべての臨床的罹患動物の小脳白質に、目立つ液胞が存在し（ｎ＝６／６）、一方、非罹患同腹仔にはより少ない液胞が見られた（図１Ａ、Ｂ）。ミエリン形成不全および低形成は、健康な対照に比較して、罹患仔ブタおよび非罹患同腹仔の小脳白質および脊髄において明らかであった（図１）。
【０１４４】
３．３．  リンダウイルスの検出
新規プライマーセットを用いて、非定型ペスチウイルスを検出するため、よく保存されたＮＳ５Ｂ領域をターゲティングする汎ペスチウイルスＲＴ−ＰＣＲを開発した。このアッセイは、ＢＶＤＶ−１、ＢＶＤＶ−２、ＣＳＦＶ、ＢＤＶ、ボンゴワナウイルスおよび最近単離されたＡＰＰＶ株（Ｓｃｈｗａｒｚら、２０１６）の培養を用いて、成功と評価された。このＲＴ−ＰＣＲアッセイおよび農場ＬのＣＴ罹患仔ブタの臨床試料を用いて、適切な長さのアンプリコンが得られた。該ＰＣＲプライマーを用いて、８１５ｂｐのアンプリコンを配列決定し、中断されないオープンリーディングフレームを含む未知の配列を生じた。最初のＢＬＡＳＴｎ検索結果では、「有意な類似性は見られなかった」が、２７０アミノ酸の翻訳されたアミノ酸配列を異なるペスチウイルスと整列させた。整列は、ボンゴワナウイルス（ＹＰ＿００８９９２０９２．１、同一性８４％、Ｅ値１ｅ−１５４）、ＣＳＦＶ（ＮＰ＿７７７５０６．１、同一性７８％、Ｅ値２ｅ−１５３）、ＢＤＶ（ＮＰ＿７７７５４５．１、同一性７７％、Ｅ値９ｅ−１５１）、およびＢＶＤＶ−１（１Ｓ４Ｆ＿Ａ、同一性７５％、Ｅ値６ｅ−１５０）をカバーした。ＣＴに罹患していてもいなくても、農場Ｌ由来の調べたＣＴ同腹仔由来のすべての仔ブタにおける臨床試料（血清、扁桃腺、肺、肝臓、脾臓およびＣＮＳ材料）において、ウイルスＲＮＡ配列が見出された。対照的に、リンダ株核酸の存在に関する、農場Ｌの母雌ブタの血清試料の試験結果は陰性であった。
【０１４５】
３．４．  ゲノム配列および系統発生ゲノム分析
標準的プライマーウォーキングＲＴ−ＰＣＲアプローチを、最５’および３’末端を同定するＲＡＣＥ−ＰＣＲと共に用いて、リンダの全ゲノムを決定した。リンダウイルスに関して、総数１２，６１４ヌクレオチド（ｎｔ）を決定し、これは５’−ＮＴＲの３８１ｎｔ、３’−ＮＴＲの４６１ｎｔおよびコード領域（ＯＲＦ）の１１，７７２ｎｔに相当した。リンダおよびその最近縁種ボンゴワナウイルスの間のヌクレオチド同一性は、６８．０％未満であり、配列整列包括度はわずか８８％であった。他のペスチウイルス間で保存される遺伝子内において非常に類似したヌクレオチド整列は短いストレッチのみが得られ、ゲノムの４２％未満しかカバーしなかった。その結果、リンダおよびＢＶＤＶ−１、ＢＶＤＶ−２、ＢＤＶ、ＡＰＰＶまたはＣＳＦＶの間の同一性は６０％未満であった。明らかであるように、ボンゴワナウイルスへの、ならびに古典的ペスチウイルス種への距離はかなりのものである。リンダウイルス、非定型ペスチウイルス株およびペスチウイルス基準株の系統発生ゲノム分析を図２に示す。
【０１４６】
３．５．  ＯＲＦ分析
リンダのＯＲＦは３，９２４コドンを含有し；これは、外来遺伝子挿入を含むＢＶＤＶ株を除けば、いかなる他の既知のペスチウイルスゲノムのＯＲＦよりも多いコドンである。リンダのアミノ酸配列と、ＧｅｎＢａｎｋで入手可能な他のペスチウイルスとの比較は、各々０．０の期待値で、ボンゴワナウイルス（ＹＰ＿００８９９２０９２．１）と６９％、ＢＶＤＶ−３（ＢＡＯ０４４５３．１）と５３％、ＢＤＶ（ＡＨＭ８８３９６．１）と５３％、ＣＳＦＶ（ＡＧＥ８９８４３．１）と５３％、ＢＶＤＶ−２（ＣＤＨ３０７１７．１）と５２％、そしてＢＶＤＶ−１（ＡＥＷ４６２４１．１）と５２％のアミノ酸同一性を生じる。ペスチウイルスポリタンパク質の系統発生分析を図３に示す。リンダウイルスのすべての仮説上のポリタンパク質プロセシング産物は、ボンゴワナウイルスの成熟タンパク質と最もよくマッチする。ボンゴワナウイルスに対する同一性スコアは、Ｎｐｒｏ（ＡＡ１−１８２）に関して６３％、コア（ＡＡ１８３−２８３）に関して８３％、Ｅｒｎｓ（ＡＡ２８４−５０４）に関して７４％、Ｅ１（ＡＡ５０５−７０２）に関して６７％、Ｅ２（ＡＡ７０３−１０７７）に関して５３％、Ｐ７（ＡＡ１０７８−１１５２）に関して５９％、ＮＳ２（ＡＡ１１５３−１６０８）に関して６３％、ＮＳ３（ＡＡ１６０９−２２９１）に関して８５％、ＮＳ４Ａ（ＡＡ２２９２−２３５４）に関して８１％、ＮＳ４Ｂ（ＡＡ２３５５−２７０１）に関して７８％、ＮＳ５Ａ（ＡＡ２７０２−３２０５）に関して５３％、そしてＮＳ５Ｂ（ＡＡ３２０６−３９２３）に関して７３％と決定された。シグナルペプチド切断部位は、古典的ペスチウイルスの実験的に決定されたタンパク質境界と同様に注釈付けされ、そしてインシリコ予測を用いて確認された。他のペスチウイルスと異なり、非構築タンパク質ＮＳ４ＡおよびＮＳ４Ｂの間でＮＳ３が仲介する切断は、ボンゴワナウイルスとちょうど同様に、リンダウイルス中のロイシン／セリン部位で行われる。ＮＳ３内で、プロテアーゼおよびヘリカーゼドメインを分離する特定の分子内ロイシン／アラニン切断部位（Ｌ１８３４／Ａ１８３５）がリンダウイルスに存在する。
【０１４７】
３．６．  リンダウイルスＥ２の分析
ペスチウイルス・エンベロープタンパク質Ｅ２は、ウイルス表面上にホモ二量体およびＥ１−Ｅ２ヘテロ二量体を形成し、受容体仲介性エンドサイトーシスを通じた、宿主細胞への付着および進入を仲介する。回復期宿主は、Ｅ２タンパク質に対する抗体反応を発展させ、これはウイルス中和に非常に重要である。Ｅ２タンパク質は、ペスチウイルス種特異的宿主指向性の原因であり、そしてすべてのペスチウイルスタンパク質の間で、最大の多様性量を示す。リンダウイルスＥ２は、ボンゴワナウイルスＥ２に５３％同一であった（図４）。わずか２４１〜２４４アミノ酸しか持たない、より短いラットペスチウイルスおよびＡＰＰＶ  Ｅ２を除いて、すべてのＥ２タンパク質は、同等の長さ（３７３〜３７８ＡＡ）を示し、そして３ドメイン構造を共有した。ＡＰＰＶおよびコウモリペスチウイルスＥ２は、８つのシステインを含有し、ＣＳＦＶ  Ｅ２は１５のシステイン、リンダウイルスＥ２は１６のシステイン、ＢＶＤＶ−１、ＢＶＤＶ−２、ＢＶＤＶ−３、ヒツジ、トナカイ、キリン、ラットペスチウイルスおよびＢＤＶ  Ｅ２は１７のシステイン、エダツノレイヨウペスチウイルスＥ２は１８のシステイン、そしてボンゴワナウイルスは１９のシステインを含有する。最大８までの分子内ジスルフィド結合が、Ｅ２タンパク質ドメインの構造単位を形成し、そして未結合システインは、Ｅ２−Ｅ２ホモ二量体またはＥ１−Ｅ２ヘテロ二量体の分子間二量体化を仲介する。典型的なシステイン位は、リンダウイルスにおいて保存され、そしてＢＶＤＶ同様、２９６位のリンダウイルスのＥ２におけるシステインは、ヘテロ二量体形成を仲介する。Ｎ連結グリコシル化（ＮＬＧ）、アスパラギン残基へのオリゴ糖の付加は、コンセンサス配列モチーフＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒの認識を必要とする。ペスチウイルスＥ２は、エダツノレイヨウペスチウイルスの場合、３つのＮＬＧ部位、ＢＶＤＶ−１、ＢＶＤＶ−２、ラットペスチウイルス、キリンペスチウイルスおよびボンゴワナウイルスの場合、４つのＮＬＧ部位、ＢＶＤ、ＡＰＰＶおよびヒツジペスチウイルスの場合、５つのＮＬＧ部位を含有するが、ＣＳＦＶ、ＢＶＤＶ−３、トナカイペスチウイルスおよびコウモリペスチウイルスの場合、最大６のＮＬＧ部位を含有する。高度にグリコシル化されると、グリカン付着により、分子量増加が引き起こされ、そして免疫原性タンパク質表面がマスキングされる。すべての既知のペスチウイルス種とは対照的に、リンダペスチウイルスの配列には、２つの潜在的なＮＬＧ部位しか含まれない。リンダペスチウイルスＥ２は、古典的ペスチウイルスのＥ２分子と配列類似性を示したが、別個の特徴を示す。
【０１４８】
３．６．  リンダ株の単離および増殖
ＲＴ−ＰＣＲアッセイが利用可能であることで、培養細胞のリンダ感染の検出が可能になった。ＳＫ−６細胞に、ＣＴ罹患仔ブタの血清をまず接種し、そして細胞培養上清を継代した後、リンダウイルスの単離に成功したことがＲＴ−ＰＣＲによって示された。ＳＫ−６またはＰＫ−１５細胞のリンダによる感染は、見かけ上、細胞傷害性の影響を導かなかった。確立された血清学的試薬および免疫蛍光を用いて、感染後のＳＫ−６、ＰＫ−１５およびＭＤＢＫ細胞におけるリンダ抗原の存在をさらに示した。リンダのかなり高い感染力価が、感染ブタ細胞培養上清で測定された（１ｍｌあたり＞１０７  ＴＣＩＤ５０（１０７  ＴＣＩＤ５０）、図５）。さらに、ブタおよびウシ細胞株を使用した病巣サイズアッセイによって、ＭＤＢＫ細胞におけるよりも、ＳＫ−６細胞において、約１０倍のより大きい抗原陽性病巣が明らかになった（図５Ｂ）。
【０１４９】
３．７．  リンダ株に対する血清学的試薬
以前の研究によって確立された、免疫蛍光陽性ペスチウイルス特異的ｍＡｂのパネルを、リンダウイルス感染細胞培養に対する反応性に関してスクリーニングした。ＢＶＤＶ  Ｅ２に対して生成されたＥ２特異的抗体６Ａ５を用いると、リンダ感染細胞に対する強い反応が見られた（図６）。この抗体の免疫蛍光は、小胞体膜の優勢な染色を伴う細胞質シグナルを生じる。この染色パターンはまた、他のペスチウイルスの相同タンパク質にも関しても立証されてきている。
【０１５０】
４．  考察
ＡＰＰＶの存在に関して、ＣＴの典型的な症例を調べる過程で、ＴａｑＭａｎプローブに基づくＲＴ−ＰＣＲアッセイ（Ｓｃｈｗａｒｚら、２０１６）を用いてもＡＰＰＶが検出されなかったため、仔ブタ産出農場Ｌは目を引いた。これは、臨床的観察が明らかであり、そして感染動物の脊髄および小脳における病変が顕著であったため、驚くべきことであった。
【０１５１】
以前記載されたＡＰＰＶ、ＢＤＶ、ＢＶＤＶ−１、およびＢＶＤＶ−２の検出を確実にするように、新規汎ペスチウイルスＲＴ−ＰＣＲアッセイを設計した。農場Ｌ由来の６頭のＣＴ罹患仔ブタのアンプリコンの配列分析によって、これまでに知られていないペスチウイルスの配列が明らかになった。組み立てられたゲノムのさらなる分析によって、ペスチウイルス特異的遺伝子（ＮｐｒｏおよびＥｒｎｓ）の存在、ならびに保存されたゲノム領域（ＮＳ３およびＮＳ５Ｂ）における他のペスチウイルスに対する配列相同性の両方に関して、ペスチウイルス属内のリンダウイルスの明白な割り当てが可能になった。リンダおよび最も近縁の既知のペスチウイルス（ボンゴワナウイルス）の間の全体的なヌクレオチド同一性は、６８．０％未満であり、リンダウイルスが新規ペスチウイルス種に相当することが示唆された。リンダペスチウイルスが、ボンゴワナウイルスと共通の祖先を共有する可能性が非常に高いという知見は、非常に興味深い。約１０年前におけるその記載の後、世界中でボンゴワナウイルスに関して徹底的に検索されたが、該ウイルスはオーストラリアの外では検出されなかった。リンダペスチウイルスの別の特徴は顕著であり、そしてＡＰＰＶとは明らかに異なった。ＡＰＰＶは、培養細胞をほとんど感染させず、そして単離は困難である。リンダペスチウイルスは、ボンゴワナウイルスおよびＣＳＦＶに関して報告されているのと同様、馴化の必要なしに、ＳＫ−６またはＰＫ−１５細胞上で、高力価（＞１０７（１０７））に、容易に増殖しうる。ＭＤＢＫ細胞は、リンダペスチウイルスに対して許容的であるが、その増殖は、ブタ細胞株に比較して、顕著に減少した事実には言及する価値がある。これによって、リンダペスチウイルスは、真正のブタ病原体であることが示唆される。
【０１５２】
ＩＣＴＶにしたがって、ペスチウイルスの分類は、主に、宿主範囲、配列相同性および疾患に基づく。ＣＳＦＶの天然宿主はブタであり、ＢＤＶの天然宿主はヒツジであり、ＢＶＤＶの天然宿主はウシであり、そしていくつかの非定型ペスチウイルス株は、異なる野生動物種に生態学的ニッチを見出した。しかし、大部分のペスチウイルス種は、新規の偶蹄宿主種に馴化可能であり、そして実験室感染後、広い宿主範囲を示す。認定された種に加えて、非定型ペスチウイルスの３群が記載されてきており、そして天然宿主に関連して分類されている。第１群はウシ起源のすべてのペスチウイルスを含む。第２群には、非ウシおよび非ヒツジ起源のペスチウイルスが含まれ、エダツノレイヨウウイルスのような野生動物病原体およびまたボンゴワナウイルスのようなブタ病原体を含む。第３群は、チュニジアペスチウイルスとも称されるヒツジ単離体をカバーする。ボンゴワナウイルス、ＡＰＰＶの発見およびリンダの記載は、「ブタペスチウイルス群」としての第４群の確立を要する。これらのカテゴリーに関して、確立された種の包含は論理的であるようである。
【０１５３】
異なる株間の遺伝的関連に基づく種所属または分界は、基準株の定義に応じる。古典的ペスチウイルスには基準株が存在する（ＢＶＤＶ−１、ＮＡＤＬ株；ＢＶＤＶ−２、８９０株；ＢＤＶ、Ｘ８１８株；ＣＳＦＶ、Ａ１８７株）が、非定型ペスチウイルスの暫定株には基準株がなかった。確立されたペスチウイルス種およびさらなる暫定種（キリンペスチウイルス、エダツノレイヨウウイルス、ＢＶＤＶ−３、ヒツジペスチウイルス、ラットペスチウイルス、ボンゴワナウイルス、およびＡＰＰＶ）の完全ゲノム間におけるヌクレオチド配列相違は２５％を超え、それによって、新規株の所属または分界のためのロバストな最低閾値（２５％）を提供する。現実的なアプローチにおいて、ＡＰＰＶが発見される前には、総数９のペスチウイルス種（ＢＶＤＶ−１、ＢＶＤＶ−２、ＢＶＤＶ−３、キリンペスチウイルス、ＣＳＦＶ、ＢＤＶ、ヒツジペスチウイルス、レイヨウ（ａｎｔｅｌｏｐｅ）ペスチウイルスおよびボンゴワナペスチウイルス）が提唱されてきていた。配列変動の結果として、異なるペスチウイルス種間の顕著な抗原性変動がある。回復期動物の血清は、異種由来のペスチウイルス株に対するよりも、同種由来のペスチウイルス株に対して、はるかにより高い中和力価を示すため、種の関連はまた、免疫血清の交差反応性を考慮に入れた血清型によっても分類可能である。リンダウイルスの場合、定義された回復期動物の血清は、農場Ｌからは入手不能であり、そしてしたがって、交差種中和試験は実行できなかった。リンダ感染動物由来の免疫血清が、他のペスチウイルス種を中和可能であるかどうかの疑問に答えるには、対照実験室感染研究が必要であろう。ＣＳＦＶおよびＢＶＤＶ診断のための利用可能なＥＬＩＳＡ系がリンダウイルス感染との干渉を示すかどうか調べるよう計画されている。ネズミモノクローナル抗体のコレクションを、ＢＤＶを除く、異なる種の異なるペスチウイルスタンパク質に対して試験し、そして大部分の確立された試薬はリンダに対して反応性でないことが見出された。ＣＳＦＶ、ＢＶＤＶ−１、ＢＶＤＶ−２、およびＢＤＶに対して反応性であるｍＡｂ  ８．１２．７のような汎ペスチウイルス特異的ＩｇＧでさえ、リンダ感染細胞の検出に失敗した（データ未提示）。興味深いことに、ボンゴワナ特異的ｍＡｂはいずれも、リンダウイルスとは交差反応しなかった。これらの分析によって、リンダウイルスは、確立されたペスチウイルス種、およびボンゴワナウイルスとは、かなりの抗原性相違を示すことが示唆された。
【０１５４】
リンダウイルスは、臨床徴候が停止して数か月後、ウイルス不含と試験された単一の農場において、遡及的に検出された。中枢神経系欠損から年を経て改善したＡＰＰＶ罹患仔ブタのＣＴにおける大部分の軽度の型とは対照的に、リンダウイルスに関連する臨床徴候は、大部分の仔ブタで重度であり、そしてしばしば死につながった。リンダウイルスがＣＮＳ損傷およびミエリン形成不全の原因病原体であるという強い証拠は、軸索周囲空間の病変におけるリンダウイルスＥ２の明らかな検出に由来する。現在、ブタにおける疾患の他の型との関連はなく、したがって、該新規ウイルスの病原性および毒性を評価するには、実験的感染が必要である。リンダウイルス増殖が実現可能であることによって、コッホの原則を検証し、そして対照動物試験において、病原性を定義することが可能になる。群れへのリンダウイルス導入の供給源は推測でしかありえないため、オーストリアにおけるリンダウイルスの蔓延および疫学に関するさらなる研究が必要である。
【０１５５】
実施例２：
動物試験リンダウイルス
リンダウイルス病原性および排出を調べるため、動物試験をセットアップした。２１頭の離乳後仔ブタ（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ、１２週齢）を３つの異なる群にして生物学的安全装置（ＢＳＬ２）中で飼育した。１週後、１ｘ１０＾７組織感染性用量５０％（ＴＣＩＤ５０）のリンダウイルスで、５頭の動物に鼻内、そして５頭の動物に筋内感染させた。５頭の動物群に偽感染させ、そしてこれは分離された対照としての役割を果たした一方、３頭の歩哨動物を感染日（ｔｈｅ  ｄａｙ  ｐｏｓｔ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）に感染群に含めた。すべての動物の健康状態を毎日評価し、そして体重を測定した。感染後、第０日（感染日）、第３日、第５日、第７日、第１４日、第２１日、および第２８日に、血清試料、鼻および経口スワブ、ならびに糞便試料を分析して、ウイルス血症およびウイルス排出を評価した。動物試験は、以下を示した：
１．  リンダは、離乳後動物には低病原性である（明らかな発熱なし、明らかな増殖遅延なし、体重獲得のわずかな減少）
２．  リンダは、天然感染経路後であっても（感染歩哨動物において、ＳＮＴ力価＞１：１００）、迅速でそして信頼性がある血清変換を導く（鼻内５頭、および筋内５頭の１０頭の感染ブタのうち、１０頭で中和抗体が検出可能−すべてＳＮＴ力価＞１：２５６）
３．  リンダはブタに関して伝染性病原体である（６頭の歩哨のうち１頭が感染）
４．  リンダは、短期持続性ウイルス血症を引き起こす（感染性ウイルスは、２頭の筋内動物および歩哨でのみ、各々、単一の試験時点で観察された。試験スキーム：ｄ３、ｄ７、ｄ１４、ｄ２１、ｄ２８）
５．  リンダは口腔鼻液を通じて分泌される（第７日および／または第１４日に３頭の感染動物でＲＴ−ＰＣＲ陽性を通じてウイルス検出）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図７−５】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【図１１−５】
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【図１１−６】
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【図１１−７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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