(57)【要約】  ＴＧＦ−β結合領域および脂質アンカー領域を含むＴＧＦ−βデコイ受容体が開示される。また、ＴＧＦ−β結合領域を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）も開示される。また、ＴＧＦ−βデコイ受容体およびＣＡＲを含む組成物、およびそれらを使用する方法も開示される。
2020505069.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＧＦ−β結合領域および脂質アンカー領域を含む、ＴＧＦ−βデコイ受容体。
【請求項２】
脂質アンカー領域が脂質アンカーを含むか、またはそれから成る、請求項１に記載のＴＧＦ−βデコイ受容体。
【請求項３】
脂質アンカーがＧＰＩアンカーである、請求項２に記載のＴＧＦ−βデコイ受容体。
【請求項４】
膜貫通ドメインを欠く、請求項１から３のいずれか１項に記載のＴＧＦ−βデコイ受容体。
【請求項５】
脂質アンカー領域が、脂質アンカーシグナル配列であるアミノ酸配列を含むか、またはそれから成る、請求項１に記載のＴＧＦ−βデコイ受容体。
【請求項６】
脂質アンカーシグナル配列が、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）シグナル配列である、請求項５に記載のＴＧＦ−βデコイ受容体。
【請求項７】
ＴＧＦ−β結合領域が、ＴＧＦ−β受容体のＴＧＦ−β結合領域に対応するアミノ酸配列を含むか、またはそれから成る、請求項１から６のいずれか１項に記載のＴＧＦ−βデコイ受容体。
【請求項８】
ＴＧＦ−β受容体がＩＩ型ＴＧＦ−β受容体（ＴＧＦ−βＲ２）である、請求項７に記載のＴＧＦ−βデコイ受容体。
【請求項９】
ＴＧＦ−β結合領域が、配列番号４に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれから成る、請求項１から８のいずれか１項に記載のＴＧＦ−βデコイ受容体。
【請求項１０】
細胞膜アンカー領域が、ＣＤ４８、ＣＤ５５、ＣＤ９０、または胎盤型アルカリホスファターゼのうちの１つのＧＰＩシグナル配列に対応するアミノ酸配列を含むか、またはそれから成る、請求項１から９のいずれか１項に記載のＴＧＦ−βデコイ受容体。
【請求項１１】
脂質アンカー領域が以下を含むか、またはそれから成る、請求項１から１０のいずれか１項に記載のＴＧＦ−βデコイ受容体：
（ｉ）配列番号１５から１８のいずれか１つに対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列；または
（ｉｉ）ＧＰＩアンカー、および配列番号１９から２２のいずれか１つに対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列。
【請求項１２】
以下を含むか、またはそれから成る、請求項１から１１のいずれか１項に記載のＴＧＦ−βデコイ受容体：
（ｉ）配列番号５から８のいずれか１つに対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列；または
（ｉｉ）配列番号１１から１４のうちの１つに対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、およびＧＰＩアンカー。
【請求項１３】
ＴＧＦ−β受容体のＴＧＦ−β結合領域に対応するアミノ酸配列を含むか、またはそれから成るＴＧＦ−β結合領域を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【請求項１４】
ＴＧＦ−β受容体がＩＩ型ＴＧＦ−β受容体（ＴＧＦ−βＲ２）である、請求項１３に記載のＣＡＲ。
【請求項１５】
ＴＧＦ−β結合領域が、配列番号４に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれから成る、請求項１３または請求項１４に記載のＣＡＲ。
【請求項１６】
請求項１から１５のいずれか１項に記載のＴＧＦ−βデコイ受容体またはＣＡＲをコードする核酸。
【請求項１７】
請求項１６に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１８】
請求項１から１５のいずれか１項に記載のＴＧＦ−βデコイ受容体もしくはＣＡＲ、請求項１６に記載の核酸、または請求項１７に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項１９】
請求項１６に記載の核酸または請求項１７に記載のベクターを細胞に導入する工程、および、細胞による核酸またはベクターの発現に適した条件下で細胞を培養する工程を含む、ＴＧＦ−βデコイ受容体またはＣＡＲを発現する細胞を製造する方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法により得られる、または得られ得る細胞。
【請求項２１】
請求項１から１５のいずれか１項に記載のＴＧＦ−βデコイ受容体もしくはＣＡＲ、請求項１６に記載の核酸、請求項１７に記載のベクター、または請求項１８もしくは請求項２０に記載の細胞と、薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤、または希釈剤、とを含む医薬組成物。
【請求項２２】
疾患または状態を治療または予防する方法に使用するための、請求項１から１５のいずれか１項に記載のＴＧＦ−βデコイ受容体もしくはＣＡＲ、請求項１６に記載の核酸、請求項１７に記載のベクター、請求項１８もしくは２０に記載の細胞、または請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
疾患または状態を治療または予防するための医薬の製造における、請求項１から１５のいずれか１項に記載のＴＧＦ−βデコイ受容体もしくはＣＡＲ、請求項１６に記載の核酸、請求項１７に記載のベクター、請求項１８もしくは請求項２０に記載の細胞、または請求項２１に記載の医薬組成物、の使用。
【請求項２４】
請求項１から１５のいずれか１項に記載のＴＧＦ−βデコイ受容体もしくはＣＡＲ、請求項１６に記載の核酸、請求項１７に記載のベクター、請求項１８もしくは請求項２０に記載の細胞、または請求項２１に記載の医薬組成物、の治療的もしくは予防的有効量を対象に投与する工程を含む、疾患または状態を治療または予防する方法。
【請求項２５】
以下の工程を含む、対象における疾患または状態を治療または予防する方法：
（ａ）対象から少なくとも１つの細胞を単離する工程；
（ｂ）請求項１から１５のいずれか１項に記載のＴＧＦ−βデコイ受容体もしくはＣＡＲ、請求項１６に記載の核酸、または請求項１７に記載のベクター、を発現するか、または含むように、少なくとも１つの細胞を改変する工程、および；
（ｃ）改変された少なくとも１つの細胞を対象に投与する工程。
【請求項２６】
以下の工程を含む、対象における疾患または状態を治療または予防する方法：
（ａ）対象から少なくとも１つの細胞を単離する工程；
（ｂ）少なくとも１つの細胞に請求項１６に記載の核酸または請求項１７に記載のベクターを導入し、それにより少なくとも１つの細胞を改変する工程；および
（ｃ）改変された少なくとも１つの細胞を対象に投与する工程。
【請求項２７】
疾患または状態が癌である、請求項２２に記載の使用のためのＴＧＦ−βデコイ受容体、ＣＡＲ、核酸、ベクター、細胞、もしくは医薬組成物、請求項２３に記載の使用、または請求項２４から２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
所定量の、請求項１から１５のいずれか１項に記載のＴＧＦ−βデコイ受容体もしくはＣＡＲ、請求項１６に記載の核酸、請求項１７に記載のベクター、請求項１８もしくは請求項２０に記載の細胞、または請求項２１に記載の医薬組成物を含む部品キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）のデコイ受容体に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させた、または遺伝子改変したＴ細胞による免疫療法が、血液悪性腫瘍の治療において大きな将来性を示している。しかしながら、移植されたＴ細胞の長期的な持続性は、その活性化状態と宿主関連因子との相互作用によって制限されている。さらに、腫瘍微小環境の抑制的性質を克服することが、Ｔ細胞免疫療法の主要な課題として残されている。
【０００３】
トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）は、様々な癌で発現が上方制御される免疫抑制性サイトカインである。ＴＧＦ−βは１型および２型サブユニットで構成されるヘテロダイマー型のＴＧＦ−β受容体複合体を介してシグナルを送る。ＴＧＦ−β受容体を介したシグナル伝達は、Ｔ細胞の増殖、ｉｎ  ｖｉｖｏでの持続性、およびエフェクター機能を阻害することが示されている。
【発明の概要】
【０００４】
１つの態様では、本発明は、ＴＧＦ−β結合領域および細胞膜アンカー領域を含むか、またはそれらから成る、ＴＧＦ−βデコイ受容体を提供する。いくつかの実施形態では、細胞膜アンカー領域は、脂質アンカーを含むか、またはそれから成る。いくつかの実施形態では、脂質アンカーはＧＰＩアンカーである。
【０００５】
別の態様では、本発明は、ＴＧＦ−β結合領域および脂質アンカー領域を含む、またはそれらから成る、ＴＧＦ−βデコイ受容体を提供する。
ＴＧＦ−βデコイ受容体は、場合によりリンカーを介して、細胞膜アンカー領域に共有結合したＴＧＦ−β受容体の細胞外ドメインを含むか、またはそれから成る、融合タンパク質であってもよい。
【０００６】
いくつかの実施形態では、脂質アンカー領域は、脂質アンカーを含むか、またはそれから成る。いくつかの実施形態では、脂質アンカーはＧＰＩアンカーである。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−βデコイ受容体は膜貫通ドメインを欠いている。
【０００７】
いくつかの実施形態では、脂質アンカー領域は、脂質アンカーシグナル配列であるアミノ酸配列を含むか、またはそれから成る。いくつかの実施形態では、脂質アンカーシグナル配列は、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）シグナル配列である。
【０００８】
いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−β結合領域は、ＴＧＦ−β受容体のＴＧＦ−β結合領域に対応するアミノ酸配列を含むか、またはそれから成る。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−β受容体はＩＩ型ＴＧＦ−β受容体（ＴＧＦ−βＲ２）である。
【０００９】
いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−β結合領域は、配列番号４と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれから成る。
いくつかの実施形態では、細胞膜アンカー領域は、ＣＤ４８、ＣＤ４４、ＣＤ５５、ＣＤ９０、または胎盤型アルカリホスファターゼのうちの１つのＧＰＩシグナル配列に対応するアミノ酸配列を含むか、またはそれから成る。
【００１０】
いくつかの実施形態では、脂質アンカー領域は、以下を含むか、またはそれから成る：（ｉ）配列番号１５〜１８のいずれか１つに対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列；または、（ｉｉ）ＧＰＩアンカー、および配列番号１９〜２２のいずれか１つに対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列。
【００１１】
いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−βデコイ受容体は、以下を含むか、またはそれから成る：（ｉ）配列番号５〜８のいずれか１つに対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列；または、（ｉｉ）配列番号１１〜１４のうちの１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列およびＧＰＩアンカー。
【００１２】
別の態様では、本発明は、ＴＧＦ−β受容体のＴＧＦ−β結合領域に対応するアミノ酸配列を含むか、またはそれから成るＴＧＦ−β結合領域を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。
【００１３】
いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−β受容体はＩＩ型ＴＧＦ−β受容体（ＴＧＦ−βＲ２）である。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−β結合領域は、配列番号４と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれから成る。
【００１４】
別の態様では、本発明は、本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体またはＣＡＲをコードする核酸を提供する。
別の態様では、本発明は、本発明の核酸を含むベクターを提供する。
【００１５】
別の態様では、本発明は、本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体またはＣＡＲ、核酸またはベクター、を含む細胞を提供する。
別の態様では、本発明は、本発明に従う核酸またはベクターを細胞に導入する工程、および、細胞による核酸またはベクターの発現に適した条件下で細胞を培養する工程を含む、ＴＧＦ−βデコイ受容体またはＣＡＲを発現する細胞を製造する方法を提供する。
【００１６】
別の態様では、本発明は、本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体またはＣＡＲを発現する細胞を製造する方法により得られる、または得られ得る細胞を提供する。
別の態様では、本発明は、本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体またはＣＡＲ、核酸、ベクター、または細胞と、薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤、または希釈剤、とを含む医薬組成物を提供する。
【００１７】
別の態様では、本発明は、疾患または状態を治療または予防する方法において使用するための、本発明に従ういくつかの実施形態、ＴＧＦ−βデコイ受容体またはＣＡＲ、核酸、ベクター、細胞または医薬組成物を提供する。
【００１８】
別の態様では、本発明は、疾患または状態を治療または予防するための医薬の製造における、本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体またはＣＡＲ、核酸、ベクター、細胞または医薬組成物の使用を提供する。
【００１９】
別の態様では、本発明は、対象に治療的または予防的有効量の本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体またはＣＡＲ、核酸、ベクター、細胞または医薬組成物を投与する工程を含む、疾患または状態を治療または予防する方法を提供する。
【００２０】
別の態様では、本発明は、以下の工程を含む、対象における疾患または状態を治療または予防する方法を提供する：
（ａ）対象から少なくとも１つの細胞を単離する工程；
（ｂ）本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体もしくはＣＡＲ、核酸、もしくはベクターを発現するか、または含むように、少なくとも１つの細胞を改変する工程、および；
（ｃ）改変された少なくとも１つの細胞を対象に投与する工程。
【００２１】
別の態様では、本発明は、以下の工程を含む、対象における疾患または状態を治療または予防する方法を提供する：
（ａ）対象から少なくとも１つの細胞を単離する工程；
（ｂ）少なくとも１つの細胞に本発明に従う核酸またはベクターを導入し、それにより少なくとも１つの細胞を改変する工程；および
（ｃ）改変された少なくとも１つの細胞を対象に投与する工程。
【００２２】
本発明の様々な態様に従ういくつかの実施形態において、疾患または状態は癌である。
別の態様において、本発明は、所定量の本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体またはＣＡＲ、核酸、ベクター、細胞または医薬組成物を含む部品キットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明のＴＧＦ−βデコイ受容体構築物によってコードされるアミノ酸配列。
【図２】本発明の成熟ＴＧＦ−βデコイ受容体の概略図。
【図３Ａ】抗ヒトＴＧＦ−βＲＩＩ抗体クローンＲＥＡ９０３を使用したフローサイトメトリーにより検出された、トランスフェクトされたＨｅＬａ細胞の表面上のＴＧＦ−βデコイ受容体の発現を示す散布図。３Ａは、ＤＮ−ＴＧＦ−βＲ２（３Ａ）をコードするベクターでトランスフェクションした後、細胞表面にＴＧＦ−βＲ２外部ドメインを発現している細胞の割合を示している。
【図３Ｂ】抗ヒトＴＧＦ−βＲＩＩ抗体クローンＲＥＡ９０３を使用したフローサイトメトリーにより検出された、トランスフェクトされたＨｅＬａ細胞の表面上のＴＧＦ−βデコイ受容体の発現を示す散布図。３Ｂは、ＴＧＦ−βＲＩＩ−ＰＬＡＣ  ＡＬＫＰＨＯＳ  ＧＰＩアンカー（３Ｂ）をコードするベクターでトランスフェクションした後、細胞表面にＴＧＦ−βＲ２外部ドメインを発現している細胞の割合を示している。
【図３Ｃ】抗ヒトＴＧＦ−βＲＩＩ抗体クローンＲＥＡ９０３を使用したフローサイトメトリーにより検出された、トランスフェクトされたＨｅＬａ細胞の表面上のＴＧＦ−βデコイ受容体の発現を示す散布図。３Ｃは、ＴＧＦ−βＲＩＩ−ＣＤ４８  ＧＰＩアンカー（３Ｃ）をコードするベクターでトランスフェクションした後、細胞表面にＴＧＦ−βＲ２外部ドメインを発現している細胞の割合を示している。
【図３Ｄ】抗ヒトＴＧＦ−βＲＩＩ抗体クローンＲＥＡ９０３を使用したフローサイトメトリーにより検出された、トランスフェクトされたＨｅＬａ細胞の表面上のＴＧＦ−βデコイ受容体の発現を示す散布図。３Ｄは、ＴＧＦ−βＲＩＩ−ＣＤ５５  ＧＰＩアンカー（３Ｄ）をコードするベクターでトランスフェクションした後、細胞表面にＴＧＦ−βＲ２外部ドメインを発現している細胞の割合を示している。
【図３Ｅ】抗ヒトＴＧＦ−βＲＩＩ抗体クローンＲＥＡ９０３を使用したフローサイトメトリーにより検出された、トランスフェクトされたＨｅＬａ細胞の表面上のＴＧＦ−βデコイ受容体の発現を示す散布図。３Ｅは、ＴＧＦ−βＲＩＩ−ＣＤ９０  ＧＰＩアンカー（３Ｅ）をコードするベクターでトランスフェクションした後、細胞表面にＴＧＦ−βＲ２外部ドメインを発現している細胞の割合を示している。
【図３Ｆ】抗ヒトＴＧＦ−βＲＩＩ抗体クローンＲＥＡ９０３を使用したフローサイトメトリーにより検出された、トランスフェクトされたＨｅＬａ細胞の表面上のＴＧＦ−βデコイ受容体の発現を示す散布図。３Ｆは、抗ヒトＴＧＦ−βＲＩＩ抗体で染色（３Ｆ）された、野生型非トランスフェクションＨｅＬａ細胞の細胞表面にＴＧＦ−βＲ２外部ドメインを発現している細胞の割合を示している。
【図３Ｇ】抗ヒトＴＧＦ−βＲＩＩ抗体クローンＲＥＡ９０３を使用したフローサイトメトリーにより検出された、トランスフェクトされたＨｅＬａ細胞の表面上のＴＧＦ−βデコイ受容体の発現を示す散布図。３Ｇは、非染色（３Ｇ）の、野生型非トランスフェクションＨｅＬａ細胞の細胞表面にＴＧＦ−βＲ２外部ドメインを発現している細胞の割合を示している。
【図３Ｈ】抗ヒトＴＧＦ−βＲＩＩ抗体クローンＲＥＡ９０３を使用したフローサイトメトリーにより検出された、トランスフェクトされたＨｅＬａ細胞の表面上のＴＧＦ−βデコイ受容体の発現を示す散布図。３Ｈは、ＧＦＰをコードするベクターによるトランスフェクション後のＧＦＰを発現する細胞の割合を示している。
【図４Ａ】抗ヒトＴＧＦ−βＲＩＩ抗体クローンＲＥＡ９０３を使用したフローサイトメトリーにより検出された、形質導入された活性化Ｔ細胞の表面上におけるＴＧＦ−βデコイ受容体の発現を示す散布図。４Ａは、ＤＮ−ＴＧＦ−βＲ２（４Ａ）をコードするレンチウイルスによる形質導入後、細胞表面にＴＧＦ−βＲ２外部ドメインを発現している細胞の割合を示している。
【図４Ｂ】抗ヒトＴＧＦ−βＲＩＩ抗体クローンＲＥＡ９０３を使用したフローサイトメトリーにより検出された、形質導入された活性化Ｔ細胞の表面上におけるＴＧＦ−βデコイ受容体の発現を示す散布図。４Ｂは、ＴＧＦ−βＲＩＩ−ＰＬＡＣ  ＡＬＫＰＨＯＳ  ＧＰＩアンカー（４Ｂ）をコードするレンチウイルスによる形質導入後、細胞表面にＴＧＦ−βＲ２外部ドメインを発現している細胞の割合を示している。
【図４Ｃ】抗ヒトＴＧＦ−βＲＩＩ抗体クローンＲＥＡ９０３を使用したフローサイトメトリーにより検出された、形質導入された活性化Ｔ細胞の表面上におけるＴＧＦ−βデコイ受容体の発現を示す散布図。４Ｃは、ＴＧＦ−βＲＩＩ−ＣＤ４８  ＧＰＩアンカー（４Ｃ）をコードするレンチウイルスによる形質導入後、細胞表面にＴＧＦ−βＲ２外部ドメインを発現している細胞の割合を示している。
【図４Ｄ】抗ヒトＴＧＦ−βＲＩＩ抗体クローンＲＥＡ９０３を使用したフローサイトメトリーにより検出された、形質導入された活性化Ｔ細胞の表面上におけるＴＧＦ−βデコイ受容体の発現を示す散布図。４Ｄは、ＴＧＦ−βＲＩＩ−ＣＤ５５  ＧＰＩアンカー（４Ｄ）をコードするレンチウイルスによる形質導入後、細胞表面にＴＧＦ−βＲ２外部ドメインを発現している細胞の割合を示している。
【図４Ｅ】抗ヒトＴＧＦ−βＲＩＩ抗体クローンＲＥＡ９０３を使用したフローサイトメトリーにより検出された、形質導入された活性化Ｔ細胞の表面上におけるＴＧＦ−βデコイ受容体の発現を示す散布図。４Ｅは、ＴＧＦ−βＲＩＩ−ＣＤ９０  ＧＰＩアンカー（４Ｅ）をコードするレンチウイルスによる形質導入後、細胞表面にＴＧＦ−βＲ２外部ドメインを発現している細胞の割合を示している。
【図４Ｆ】抗ヒトＴＧＦ−βＲＩＩ抗体クローンＲＥＡ９０３を使用したフローサイトメトリーにより検出された、形質導入された活性化Ｔ細胞の表面上におけるＴＧＦ−βデコイ受容体の発現を示す散布図。図４Ｆは、抗ヒトＴＧＦ−βＲＩＩ抗体で染色された野生型の非形質導入活性化Ｔ細胞の細胞表面にＴＧＦ−βＲ２外部ドメインを発現している細胞の割合を示している。
【図４Ｇ】抗ヒトＴＧＦ−βＲＩＩ抗体クローンＲＥＡ９０３を使用したフローサイトメトリーにより検出された、形質導入された活性化Ｔ細胞の表面上におけるＴＧＦ−βデコイ受容体の発現を示す散布図。４Ｇは、抗ヒトＴＧＦ−βＲＩＩ抗体（４Ｇ）で染色された、ＧＦＰをコードするレンチウイルスによる形質導入後におけるＧＦＰ発現細胞の割合を示している。
【図４Ｈ】抗ヒトＴＧＦ−βＲＩＩ抗体クローンＲＥＡ９０３を使用したフローサイトメトリーにより検出された、形質導入された活性化Ｔ細胞の表面上におけるＴＧＦ−βデコイ受容体の発現を示す散布図。４Ｈは、非染色（４Ｈ）の活性化Ｔ細胞の、ＧＦＰをコードするレンチウイルスによる形質導入後におけるＧＦＰ発現細胞の割合を示している。
【図５】図５Ａは、フローサイトメトリーによって決定された、非形質導入活性化Ｔ細胞（ｗｔ）、またはＧＦＰ（ＧＦＰ）もしくはＴＧＦ−βＲＩＩ−ＣＤ９０  ＧＰＩアンカー（ＣＤ９０）をコードするレンチウイルスで形質導入された活性化Ｔ細胞において、異なるタンパク質を発現している白血球の割合を示すグラフである。５Ａは白血球の総数を示している。図５Ｂは、フローサイトメトリーによって決定された、非形質導入活性化Ｔ細胞（ｗｔ）、またはＧＦＰ（ＧＦＰ）もしくはＴＧＦ−βＲＩＩ−ＣＤ９０  ＧＰＩアンカー（ＣＤ９０）をコードするレンチウイルスで形質導入された活性化Ｔ細胞において、異なるタンパク質を発現している白血球の割合を示すグラフである。５ＢはＧＦＰ＋細胞の割合を示している。図５Ｃは、フローサイトメトリーによって決定された、非形質導入活性化Ｔ細胞（ｗｔ）、またはＧＦＰ（ＧＦＰ）もしくはＴＧＦ−βＲＩＩ−ＣＤ９０  ＧＰＩアンカー（ＣＤ９０）をコードするレンチウイルスで形質導入された活性化Ｔ細胞において、異なるタンパク質を発現している白血球の割合を示すグラフである。５Ｃは細胞表面にＴＧＦ−βＲ２細胞外ドメインを発現している細胞の割合を示している。
【図６】図６Ａは、フローサイトメトリーで決定された、非形質導入活性化Ｔ細胞（ｗｔ）、またはＧＦＰ（ＧＦＰ）、ＤＮ−ＴＧＦ−βＲ２（ＤＮ）、ＴＧＦ−βＲＩＩ−ＣＤ４８  ＧＰＩアンカー（ＣＤ４８）もしくはＴＧＦ−βＲＩＩ−ＣＤ９０  ＧＰＩアンカー（ＣＤ９０）をコードするレンチウイルスで形質導入された活性化Ｔ細胞において、異なるタンパク質を発現しているＣＤ３＋  Ｔ細胞の割合を、白血球集団全体の割合として示すグラフである。５ＡはＣＤ３＋  Ｔ細胞の割合を示している。図６Ｂは、フローサイトメトリーで決定された、非形質導入活性化Ｔ細胞（ｗｔ）、またはＧＦＰ（ＧＦＰ）、ＤＮ−ＴＧＦ−βＲ２（ＤＮ）、ＴＧＦ−βＲＩＩ−ＣＤ４８  ＧＰＩアンカー（ＣＤ４８）もしくはＴＧＦ−βＲＩＩ−ＣＤ９０  ＧＰＩアンカー（ＣＤ９０）をコードするレンチウイルスで形質導入された活性化Ｔ細胞において、異なるタンパク質を発現しているＣＤ３＋  Ｔ細胞の割合を、白血球集団全体の割合として示すグラフである。６ＢはＧＦＰ＋ＣＤ３＋  Ｔ細胞の割合を示している。
【図７Ａ】フローサイトメトリーによって決定された、非形質導入活性化Ｔ細胞（ｗｔ）、またはＧＦＰ（ＧＦＰ）またはＴＧＦ−βＲＩＩ−ＣＤ９０  ＧＰＩアンカー（ＣＤ９０）をコードするレンチウイルスで形質導入された活性化Ｔ細胞において、異なるタンパク質を発現するＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞サブセットの割合をＣＤ３＋細胞集団の割合として示すグラフ。７ＡはＣＤ４＋、ＧＦＰ＋細胞の割合を示している。
【図７Ｂ】フローサイトメトリーによって決定された、非形質導入活性化Ｔ細胞（ｗｔ）、またはＧＦＰ（ＧＦＰ）またはＴＧＦ−βＲＩＩ−ＣＤ９０  ＧＰＩアンカー（ＣＤ９０）をコードするレンチウイルスで形質導入された活性化Ｔ細胞において、異なるタンパク質を発現するＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞サブセットの割合をＣＤ３＋細胞集団の割合として示すグラフ。７ＢはＣＤ８＋、ＧＦＰ＋細胞の割合を示している。
【図７Ｃ】フローサイトメトリーによって決定された、非形質導入活性化Ｔ細胞（ｗｔ）、またはＧＦＰ（ＧＦＰ）またはＴＧＦ−βＲＩＩ−ＣＤ９０  ＧＰＩアンカー（ＣＤ９０）をコードするレンチウイルスで形質導入された活性化Ｔ細胞において、異なるタンパク質を発現するＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞サブセットの割合をＣＤ３＋細胞集団の割合として示すグラフ。７Ｃは、細胞表面にＴＧＦ−βＲ２外部ドメインを発現しているＣＤ４＋細胞の割合を示している。
【図７Ｄ】フローサイトメトリーによって決定された、非形質導入活性化Ｔ細胞（ｗｔ）、またはＧＦＰ（ＧＦＰ）またはＴＧＦ−βＲＩＩ−ＣＤ９０  ＧＰＩアンカー（ＣＤ９０）をコードするレンチウイルスで形質導入された活性化Ｔ細胞において、異なるタンパク質を発現するＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞サブセットの割合をＣＤ３＋細胞集団の割合として示すグラフ。７Ｄは、細胞表面にＴＧＦ−βＲ２外部ドメインを発現しているＣＤ８＋細胞の割合を示している。
【図８Ａ】フローサイトメトリーにより決定された、非形質導入ＨｅＬａ細胞（ｗｔ）、またはＧＦＰ（ＧＦＰ）もしくはＴＧＦ−βＲＩＩ−ＣＤ９０  ＧＰＩアンカー（ＣＤ９０）をコードするレンチウイルスで形質導入されたＨｅＬａ細胞において、表示の濃度のＴＧＦ−βで３０分間刺激した後、異なるタンパク質を発現しているＨｅＬａ細胞の割合を、全細胞集団の割合として示すグラフ。８Ａは、リン酸化されたＳＭＡＤ２／３について陽性に染色される細胞の割合を示す。
【図８Ｂ】フローサイトメトリーにより決定された、非形質導入ＨｅＬａ細胞（ｗｔ）、またはＧＦＰ（ＧＦＰ）もしくはＴＧＦ−βＲＩＩ−ＣＤ９０  ＧＰＩアンカー（ＣＤ９０）をコードするレンチウイルスで形質導入されたＨｅＬａ細胞において、表示の濃度のＴＧＦ−βで３０分間刺激した後、異なるタンパク質を発現しているＨｅＬａ細胞の割合を、全細胞集団の割合として示すグラフ。８Ｂは、リン酸化されたＳＭＡＤ１／５／９について陽性に染色される細胞の割合を示す。
【図８Ｃ】フローサイトメトリーにより決定された、非形質導入ＨｅＬａ細胞（ｗｔ）、またはＧＦＰ（ＧＦＰ）もしくはＴＧＦ−βＲＩＩ−ＣＤ９０  ＧＰＩアンカー（ＣＤ９０）をコードするレンチウイルスで形質導入されたＨｅＬａ細胞において、表示の濃度のＴＧＦ−βで３０分間刺激した後、異なるタンパク質を発現しているＨｅＬａ細胞の割合を、全細胞集団の割合として示すグラフ。８Ｃは、ＮＦκＢ  ｐ６５について陽性に染色される細胞の割合を示す。
【図８Ｄ】フローサイトメトリーにより決定された、非形質導入ＨｅＬａ細胞（ｗｔ）、またはＧＦＰ（ＧＦＰ）もしくはＴＧＦ−βＲＩＩ−ＣＤ９０  ＧＰＩアンカー（ＣＤ９０）をコードするレンチウイルスで形質導入されたＨｅＬａ細胞において、表示の濃度のＴＧＦ−βで３０分間刺激した後、異なるタンパク質を発現しているＨｅＬａ細胞の割合を、全細胞集団の割合として示すグラフ。８Ｄは、リン酸化ＭＡＰＫＫについて陽性に染色される細胞の割合を示す。
【図８Ｅ】フローサイトメトリーにより決定された、非形質導入ＨｅＬａ細胞（ｗｔ）、またはＧＦＰ（ＧＦＰ）もしくはＴＧＦ−βＲＩＩ−ＣＤ９０  ＧＰＩアンカー（ＣＤ９０）をコードするレンチウイルスで形質導入されたＨｅＬａ細胞において、表示の濃度のＴＧＦ−βで３０分間刺激した後、異なるタンパク質を発現しているＨｅＬａ細胞の割合を、全細胞集団の割合として示すグラフ。８Ｅは、ＣＲＥＢについて陽性に染色される細胞の割合を示す。
【図９Ａ】フローサイトメトリーにより決定された、非形質導入活性化Ｔ細胞（ｗｔ）、またはＧＦＰ（ＧＦＰ）、ＤＮ−ＴＧＦ−βＲ２（ＤＮ）、ＴＧＦ−βＲＩＩ−ＣＤ４８  ＧＰＩアンカー（ＣＤ４８）もしくはＴＧＦ−βＲＩＩ−ＣＤ９０  ＧＰＩアンカー（ＣＤ９０）をコードするレンチウイルスで形質導入された活性化Ｔ細胞において、表示の濃度のＴＧＦ−βで３０分間刺激した後、異なるタンパク質を発現しているＣＤ８＋細胞の割合を、ＣＤ３＋細胞集団の割合として示すグラフ。９Ａは、ＣＤ８およびリン酸化ＳＭＡＤ２／３について陽性に染色されるＣＤ３＋細胞の割合を示す。
【図９Ｂ】フローサイトメトリーにより決定された、非形質導入活性化Ｔ細胞（ｗｔ）、またはＧＦＰ（ＧＦＰ）、ＤＮ−ＴＧＦ−βＲ２（ＤＮ）、ＴＧＦ−βＲＩＩ−ＣＤ４８  ＧＰＩアンカー（ＣＤ４８）もしくはＴＧＦ−βＲＩＩ−ＣＤ９０  ＧＰＩアンカー（ＣＤ９０）をコードするレンチウイルスで形質導入された活性化Ｔ細胞において、表示の濃度のＴＧＦ−βで３０分間刺激した後、異なるタンパク質を発現しているＣＤ８＋細胞の割合を、ＣＤ３＋細胞集団の割合として示すグラフ。９Ｂは、ＣＤ８およびＮＦκＢ  ｐ６５について陽性に染色されるＣＤ３＋細胞の割合を示す。
【図９Ｃ】フローサイトメトリーにより決定された、非形質導入活性化Ｔ細胞（ｗｔ）、またはＧＦＰ（ＧＦＰ）、ＤＮ−ＴＧＦ−βＲ２（ＤＮ）、ＴＧＦ−βＲＩＩ−ＣＤ４８  ＧＰＩアンカー（ＣＤ４８）もしくはＴＧＦ−βＲＩＩ−ＣＤ９０  ＧＰＩアンカー（ＣＤ９０）をコードするレンチウイルスで形質導入された活性化Ｔ細胞において、表示の濃度のＴＧＦ−βで３０分間刺激した後、異なるタンパク質を発現しているＣＤ８＋細胞の割合を、ＣＤ３＋細胞集団の割合として示すグラフ。９Ｃは、ＣＤ８およびＣＲＥＢについて陽性に染色されるＣＤ３＋細胞の割合を示す。
【図１０Ａ】フローサイトメトリーにより決定された、非形質導入活性化Ｔ細胞（ｗｔ）、またはＧＦＰ（ＧＦＰ）、ＤＮ−ＴＧＦ−βＲ２（ＤＮ）、ＴＧＦ−βＲＩＩ−ＣＤ４８  ＧＰＩアンカー（ＣＤ４８）もしくはＴＧＦ−βＲＩＩ−ＣＤ９０  ＧＰＩアンカー（ＣＤ９０）をコードするレンチウイルスで形質導入された活性化Ｔ細胞において、表示の濃度のＴＧＦ−βで３０分間刺激した後、異なるタンパク質を発現しているＣＤ４＋細胞の割合を、ＣＤ３＋細胞集団の割合として示すグラフ。１０Ａは、ＣＤ４およびリン酸化ＳＭＡＤ２／３について陽性に染色されるＣＤ３＋細胞の割合を示す。
【図１０Ｂ】フローサイトメトリーにより決定された、非形質導入活性化Ｔ細胞（ｗｔ）、またはＧＦＰ（ＧＦＰ）、ＤＮ−ＴＧＦ−βＲ２（ＤＮ）、ＴＧＦ−βＲＩＩ−ＣＤ４８  ＧＰＩアンカー（ＣＤ４８）もしくはＴＧＦ−βＲＩＩ−ＣＤ９０  ＧＰＩアンカー（ＣＤ９０）をコードするレンチウイルスで形質導入された活性化Ｔ細胞において、表示の濃度のＴＧＦ−βで３０分間刺激した後、異なるタンパク質を発現しているＣＤ４＋細胞の割合を、ＣＤ３＋細胞集団の割合として示すグラフ。１０Ｂは、ＣＤ４およびＮＦκＢ  ｐ６５について陽性に染色されるＣＤ３＋細胞の割合を示す。
【図１０Ｃ】フローサイトメトリーにより決定された、非形質導入活性化Ｔ細胞（ｗｔ）、またはＧＦＰ（ＧＦＰ）、ＤＮ−ＴＧＦ−βＲ２（ＤＮ）、ＴＧＦ−βＲＩＩ−ＣＤ４８  ＧＰＩアンカー（ＣＤ４８）もしくはＴＧＦ−βＲＩＩ−ＣＤ９０  ＧＰＩアンカー（ＣＤ９０）をコードするレンチウイルスで形質導入された活性化Ｔ細胞において、表示の濃度のＴＧＦ−βで３０分間刺激した後、異なるタンパク質を発現しているＣＤ４＋細胞の割合を、ＣＤ３＋細胞集団の割合として示すグラフ。１０Ｃは、ＣＤ４およびＣＲＥＢについて陽性に染色されるＣＤ３＋細胞の割合を示す。
【図１１】非形質導入活性化Ｔ細胞（ｗｔ）、またはＴＧＦ−βＲＩＩ−ＣＤ９０  ＧＰＩアンカー（ＣＤ９０）をコードするレンチウイルスで形質導入された活性化Ｔ細胞における、表示の濃度のＴＧＦ−βによる３０分間の刺激後のリン酸化ＳＭＡＤ２／３レベルのウエスタンブロット分析の結果を示す画像。ローディング対照が示されている。
【図１２】非形質導入ＨｅＬａ細胞（ｗｔ）、またはＧＦＰ（ＧＦＰ）もしくはＴＧＦ−βＲＩＩ−ＣＤ９０  ＧＰＩアンカー（ＣＤ９０）をコードするレンチウイルスで形質導入されたＨｅＬａ細胞において、表示の濃度のＴＧＦ−βによる３０分間の刺激の後のリン酸化ＳＭＡＤ２／３レベルのウエスタンブロット分析の結果を示す画像。ローディング対照が示されている。
【図１３Ａ】ＴＧＦ−βによる刺激後に、非形質導入ＨｅＬａ細胞（ＷＴ）およびＴＧＦ−βＲＩＩ−ＣＤ４８  ＧＰＩアンカー（４８）、ＴＧＦ−βＲＩＩ−ＣＤ９０  ＧＰＩアンカー（９０）、またはＤＮ−ＴＧＦ−βＲ２（ＤＮ）をコードするレンチウイルスで形質導入されたＨｅＬａ細胞の核に局在したリン酸化ｐ３８（１３Ａ）のレベルの蛍光顕微鏡による分析結果を示すグラフ。
【図１３Ｂ】ＴＧＦ−βによる刺激後に、非形質導入ＨｅＬａ細胞（ＷＴ）およびＴＧＦ−βＲＩＩ−ＣＤ４８  ＧＰＩアンカー（４８）、ＴＧＦ−βＲＩＩ−ＣＤ９０  ＧＰＩアンカー（９０）、またはＤＮ−ＴＧＦ−βＲ２（ＤＮ）をコードするレンチウイルスで形質導入されたＨｅＬａ細胞の核に局在したリン酸化ＳＭＡＤ２（１３Ｂ）のレベルの蛍光顕微鏡による分析結果を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、ＴＧＦ−βに結合してＴＧＦ−β媒介性シグナル伝達を阻害することができるＴＧＦ−βデコイ受容体、そのようなＴＧＦ−βデコイ受容体をコードする核酸、およびそれを発現する細胞に関する。本発明のＴＧＦ−βデコイ受容体は、ＴＧＦ−βのデコイ受容体として機能する。ポリペプチド、核酸および細胞の治療的使用もまた説明される。
【００２５】
ＴＧＦ−βおよびＴＧＦ−β媒介性シグナル伝達
トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）は、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３と命名された３つの形態を有する多機能性サイトカインである。ＴＧＦ−β１〜３は、サイトカインのＴＧＦ−βスーパーファミリー内で非常に類似したタンパク質のサブファミリーを形成している。
【００２６】
ヒトＴＧＦ−β１（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿０００６５１．３）は３９０アミノ酸のタンパク質であり、ＴＧＦ−β２（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００１１２９０７１．１）は４４２アミノ酸のタンパク質であり、そしてＴＧＦ−β３（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００１３１６８６８．１）は４１２個のアミノ酸を含んでいる。ＴＧＦ−β１〜３の各々は、分泌に必要なＮ末端の２０〜３０アミノ酸のシグナルペプチド、潜在関連ペプチド（ＬＡＰ）と呼ばれるプロ領域、およびプロ領域からのタンパク質分解切断後に成熟ＴＧＦ−β分子となる１１２〜１１４アミノ酸のＣ末端領域を有している（Ｋｈａｌｉｌら  １９９９  Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｉｎｆｅｃｔ．１（１５）：１２５５−６３）。成熟した単量体のＴＧＦ−βは二量体化して、生物学的に活性な２５ＫＤａのタンパク質を生じる。ＴＧＦ−β１〜３は、同じ型のＴＧＦ−βとホモダイマーを形成するか、または別の型のＴＧＦ−βとヘテロダイマー（例えばＴＧＦ−β１：ＴＧＦ−β２ヘテロダイマー）を形成することができる。ＴＧＦ−βは９個の保存されたシステイン残基を含み、そのうち８個はジスルフィド結合を形成して、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの特徴であるシステインノット構造を形成する。残りのシステインは、別のＴＧＦ−β単量体のシステインと相互作用して二量体を形成する。５番目と６番目の保存されたシステイン残基の間の表面露出領域は、ＴＧＦ−β１〜３タンパク質間で最も保存性の低い領域であり、受容体結合とＴＧＦ−βの特異性に重要であると考えられている。
【００２７】
本明細書において、「ＴＧＦ−β」は、あらゆる種に由来するＴＧＦ−βを指し、あらゆる種に由来するＴＧＦ−βのアイソフォーム、断片、バリアントまたはホモログを含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−βは、ヒトＴＧＦ−β、霊長類ＴＧＦ−β、非ヒト霊長類ＴＧＦ−β、げっ歯類ＴＧＦ−β、マウスＴＧＦ−β、または哺乳動物ＴＧＦ−βである。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−β受容体はＴＧＦ−β１（ＴＧＦ−β１）、ＴＧＦ−β２（ＴＧＦ−β２）、またはＴＧＦ−β３（ＴＧＦ−β３）である。
【００２８】
ＴＧＦ−βは、ＴＧＦ−β受容体に結合して、それを介したシグナル伝達を活性化することにより、その機能的な結果を発揮する。ＴＧＦ−β結合領域を有する細胞外ドメイン、１回膜貫通ドメイン、およびセリン／スレオニンキナーゼドメインを含む細胞内ドメインを含むＴＧＦ−β受容体。ＴＧＦ−β受容体には３つの主要な型がある：ＴＧＦ−βＲ１（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００４６０３．１）、ＴＧＦ−βＲ２（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００１０２００１８．１）およびＴＧＦ−βＲ３（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００３２３４．２）。
【００２９】
本明細書において、「ＴＧＦ−β受容体」は、あらゆる種に由来するＴＧＦ−β受容体を指し、あらゆる種に由来するＴＧＦ−β受容体のアイソフォーム、断片、バリアントまたはホモログを含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−β受容体は、ヒトＴＧＦ−β受容体、霊長類ＴＧＦ−β受容体、非ヒト霊長類ＴＧＦ−β受容体、げっ歯類ＴＧＦ−β受容体、マウスＴＧＦ−β受容体、または哺乳動物ＴＧＦ−β受容体である。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−β受容体はＴＧＦ−β受容体１（ＴＧＦ−βＲ１）、ＴＧＦ−β受容体２（ＴＧＦ−βＲ２）、またはＴＧＦ−β受容体３（ＴＧＦ−βＲ３）である。
【００３０】
ヒトＴＧＦ−βＲ１（３３アミノ酸のシグナルペプチドを含む）は５０３アミノ酸のタンパク質であり、成熟型は４７０アミノ酸であり、９３アミノ酸の細胞外ドメイン、２１アミノ酸の膜貫通ドメイン、および３５６アミノ酸の細胞内ドメインを含む。タンパク質の細胞外ドメインは、ＴＧＦ−βＲ１のＴＧＦ−β結合領域を含む。ヒトＴＧＦ−βＲ１のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００４６０３．１）およびそのドメインを以下に示す：
ヒトＴＧＦ−βＲ１（ＮＰ＿００４６０３．１）
【００３１】
【化１】
2020505069.tif 000003
【００３２】
シグナルペプチド（下線）（残基１〜３３）；細胞外ドメイン（太字）（残基３４〜１２６）；膜貫通ドメイン（波線）（残基１２７〜１４７）；細胞内ドメイン（点線）（残基１４８〜５０３）。
【００３３】
ヒトＴＧＦ−βＲ２（２２アミノ酸のシグナルペプチドを含む）は５９２アミノ酸のタンパク質であり、成熟型は５７０アミノ酸であり、１６９アミノ酸の細胞外ドメイン、２１アミノ酸の膜貫通ドメイン、および３８０アミノ酸の細胞内ドメインを含む。タンパク質の細胞外ドメインは、ＴＧＦ−βＲ２のＴＧＦ−β結合領域を含む（Ｈａｒｔら  ２００２，Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ．９（３）：２０３−８；ｐｆａｍ０８９１７：ｅｃＴｂｅｔａＲ２）。ヒトＴＧＦ−βＲ２のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００１０２００１８．１）およびそのドメインを以下に示す：
ヒトＴＧＦ−βＲ２（ＮＰ＿００１０２００１８．１）
【００３４】
【化２】
2020505069.tif 000004
【００３５】
シグナルペプチド（下線）（残基１〜２２）；細胞外ドメイン（太字）（残基２３〜１９１）；ＴＧＦ−β結合領域（太字、二重下線）（残基７４〜１７７）；膜貫通ドメイン（波線）（残基１９２〜２１２）；細胞内ドメイン（点線）（残基２１３〜５９２）。
【００３６】
ヒトＴＧＦ−βＲ３（１８アミノ酸のシグナルペプチドを含む）は８５１アミノ酸のタンパク質であり、成熟型は８３３アミノ酸であり、７６９アミノ酸の細胞外ドメイン、２２アミノ酸の膜貫通ドメイン、および４２アミノ酸の細胞内ドメインを含む。タンパク質の細胞外ドメインは、ＴＧＦ−βＲ３のＴＧＦ−β結合領域を含む。ヒトＴＧＦ−βＲ３のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００３２３４．２）およびそのドメインを以下に示す：
ヒトＴＧＦ−βＲ３（ＮＰ＿００３２３４．２）
【００３７】
【化３】
2020505069.tif 000005
【００３８】
シグナルペプチド（下線）（残基１〜１８）；細胞外ドメイン（太字）（残基１９〜７８７）；膜貫通ドメイン（波線）（残基７８８〜８０９）；細胞内ドメイン（点線）（残基８１０〜８５１）。
【００３９】
他のＴＧＦ−β結合タンパク質が報告されている。Ｏｎｉｃｈｔｃｈｏｕｋら  １９９９，Ｎａｔｕｒｅ  ４０１（６７５２）：４８０−４８５は、細胞外ドメインにおいてＴＧＦ−βファミリーのＩ型受容体に密接に関連しているが、酵素活性の無い短い細胞内ドメインを有する膜貫通糖タンパク質である、ＢＭＰおよび活性化膜結合阻害剤（ＢＡＭＢＩ）タンパク質について記述している。ＢＡＭＢＩは、ＴＧＦ−βＲ１とＴＧＦ−βＲ２の間の相互作用をブロックすることにより、ＴＧＦ−βシグナル伝達を阻害することが示されている。Ｂｏｌｌａｒｄら  ２００２，Ｂｌｏｏｄ  ９９（９）：３１７９−３１８７およびＺｈａｎｇら  ２０１３，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２０，５７５−５８０は、ＴＧＦ−βＲ２の細胞外ドメインと膜貫通領域を含むが、シグナル伝達に必要な細胞質ドメインを欠いたドミナントネガティブＴＧＦ−βＲ２（ＤＮ−ＴＧＦ−βＲ２）を発現するように抗原反応性Ｔ細胞を改変することについて記述している。Ｐｅｎａｆｕｅｒｔｅら  ２０１１，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８６（１２）：６９３３−６９４４は、溶液中で活性なＴＧＦ−βをトラップし、ＩＬ−２反応性のリンパ球系細胞と相互作用して、ＩＬ−２Ｒを介したシグナル伝達を誘導するデコイ受容体として働く、ＩＬ−２とＴＧＦ−βＲ２の可溶性細胞外ドメインのキメラ融合タンパク質について記述している。Ｒｕｓｓｏら  ２００９，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ４１：４７２−４７６およびＺｈａｎｇら  ２０１３（上記）は、ＴＧＦ−β受容体の細胞外ＴＧＦ−β結合ドメインを含む可溶性ＴＧＦ−β受容体分子について記述している。場合によっては、可溶性ＴＧＦ−β受容体分子はＦｃドメインも含む。
【００４０】
ＴＧＦ−βを介したシグナル伝達は、胚発生と組織の恒常性に関与し、細胞増殖、分化、アポトーシス、接着、浸潤、細胞微小環境の調節を通じて、その効果を媒介し、例えば、Ｍｅｕｌｍｅｅｓｔｅｒとｔｅｎ  Ｄｉｊｋｅ  ２０１１，Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  ２２３：２０５−２１８に記述されている。
【００４１】
活性型ＴＧＦ−β二量体は、ＴＧＦ−βＩ型およびＩＩ型受容体（それぞれＴＧＦ−βＲ１およびＴＧＦ−βＲ２）を介したシグナル伝達を媒介する。ＴＧＦ−βＲ２は、ヘテロマー型ＴＧＦ−β：ＴＧＦ−βＲ１：ＴＧＦ−βＲ２受容体複合体へのＴＧＦ−βの動員、ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β３への約５ｐＭのＫＤでの結合、およびＴＧＦ−β３への約５ｎＭのＫＤでの結合を担っている（Ｄｅ  Ｃｒｅｓｃｅｎｚｏら  ２００３，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．３２８（５）：１１７３−８３）。膜に固定されたＴＧＦ−βＲ３は、ＴＧＦ−βのＴＧＦ−βＲ２への結合を補助する（Ｌｏｐｅｚ−Ｃａｓｉｌｌａｓら，Ｃｅｌｌ  １９９３；７３：１４３５−１４４４）。ＴＧＦ−βのＴＧＦ−βＲ２への高い親和性での結合は、ＴＧＦ−βＲ１とのヘテロ四量体複合体形成を導き、これは次いで、ＴＧＦ−βＲ２によるＴＧＦ−βＲ１のリン酸化をもたらす。
【００４２】
ほとんどの細胞型においてＴＧＦ−βＲ１はシグナルを伝達するが、特定の細胞型では、ＡＬＫ１または他のＴＧＦ−βスーパーファミリーＩ型受容体がシグナル伝達応答を媒介する。ＴＧＦ−βＲ１は、受容体により制御されるＳｍａｄタンパク質の動員とリン酸化によってシグナル伝達を伝播する。活性化されたＳｍａｄは、共通Ｓｍａｄ（ｃｏ−Ｓｍａｄ；哺乳動物ではＳｍａｄ４）と複合体を形成し、核内へ移動し、そこでＤＮＡ結合転写因子と相互作用して標的遺伝子の転写を調節する。Ｓｍａｄに依存しないシグナル伝達は、ＴＲＡＦ６−ＴＡＫ１−ｐ３８／ＪＮＫ経路を通して生じることもでき、また、ＴＧＦ−βＲ１はチロシンおよびセリン残基上でのＳｈｃの直接リン酸化によりＥｒｋ−ＭＡＰキナーゼシグナル伝達をも活性化する（Ｌｅｅら，２００７  ＥＭＢＯ  Ｊ  ２６：３９５７−３９６７）。ＴＧＦ−ｗβＲ２はまた、Ｐａｒ６の直接リン酸化によってＴＧＦ−βＲ１とは独立してシグナルを送ることもできる（Ｏｚｄａｍａｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ；３０７：１６０３−１６０９）。
【００４３】
本明細書において使用する場合、「ＴＧＦ−β媒介性シグナル伝達」とは、ＴＧＦ−βおよび／またはＴＧＦ−β受容体、ＴＧＦ−βおよび／またはＴＧＦ−β受容体の断片、ならびにＴＧＦ−β、ＴＧＦ−β受容体および／またはその断片を含むポリペプチド複合体によって媒介されるシグナル伝達を指す。
【００４４】
本明細書において、ＴＧＦ−β受容体とは、ＴＧＦ−βに結合することができるポリペプチドを指す。ＴＧＦ−β受容体は、あらゆる種に由来するＴＧＦ−β受容体であり得、あらゆる種に由来するＴＧＦ−β受容体のアイソフォーム、断片、バリアントまたはホモログを含む。好ましい実施形態では、種はヒト（ホモサピエンス）である。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−β受容体はＴＧＦ−βＲ１、ＴＧＦ−βＲ２、またはＴＧＦ−βＲ３であり得る。ＴＧＦ−β受容体のアイソフォーム、断片、バリアント、またはホモログは場合により、所与の種、例えばヒトのＴＧＦ−β受容体のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のうちの１つのアミノ酸配列同一性を有するものとして特徴付けられ得る。ＴＧＦ−β受容体のアイソフォーム、断片、バリアント、またはホモログは場合により、ＴＧＦ−β（好ましくは同じ種由来のもの）に結合する能力、およびＴＧＦ−β受容体を発現する細胞のシグナル伝達を刺激する能力により特徴付けられてもよい。ＴＧＦ−β受容体の断片は（アミノ酸の数による）任意の長さであり得るが、場合により、成熟ＴＧＦ−β受容体の長さの少なくとも２５％であり得、成熟ＴＧＦ−β受容体の長さの５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のうちの１つの最大長を有し得る。ＴＧＦ−β受容体断片の断片は、最小長が１０アミノ酸、最大長が１５、２０、２５、３０、４０、５０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００または８００アミノ酸のうちの１つであり得る。
【００４５】
いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−β受容体は、ＴＧＦ−βＲ２のＴＧＦ−β結合領域を含むか、またはそれから成っていてもよい。Ｈａｒｔら  ２００２，Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ．９（３）：２０３−８の定義によると、ヒトＴＧＦ−βＲ２のＴＧＦ−β結合領域は、配列番号２のアミノ酸７４〜１７７に対応する（ｐｆａｍ０８９１７：ｅｃＴｂｅｔａＲ２）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−β受容体は場合により、所与の種のＴＧＦ−βＲ２のＴＦＧ−β結合領域のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のうちの１つのアミノ酸配列同一性を有するものとして特徴付けられ得る。
【００４６】
いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−β受容体は、ＴＧＦ−βＲ２の細胞外ドメインを含むか、またはそれから成っていてもよい。ヒトＴＧＦ−βＲ２の細胞外ドメインは、配列番号２のアミノ酸２３〜１９１に対応する。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−β受容体は場合により、所与の種のＴＧＦ−βＲ２の細胞外ドメインのアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のうちの１つのアミノ酸配列同一性を有するものとして特徴付けられ得る。
【００４７】
いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−β受容体は、ＴＧＦ−βＲ１の細胞外ドメインを含むか、またはそれから成っていてもよい。ヒトＴＧＦ−βＲ１の細胞外ドメインは、配列番号１のアミノ酸３４〜１２６に対応する。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−β受容体は場合により、所与の種のＴＧＦ−βＲ１の細胞外ドメインのアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のうちの１つのアミノ酸配列同一性を有するものとして特徴付けられ得る。
【００４８】
いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−β受容体は、ＴＧＦ−βＲ３の細胞外ドメインを含むか、またはそれから成っていてもよい。ヒトＴＧＦ−βＲ３の細胞外ドメインは、配列番号３のアミノ酸１９〜７８７に対応する。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−β受容体は場合により、所与の種のＴＧＦ−βＲ３の細胞外ドメインのアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のうちの１つのアミノ酸配列同一性を有するものとして特徴付けられ得る。
【００４９】
いくつかの実施形態において、ＴＧＦ−β（例えばＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２またはＴＧＦ−β３）は、哺乳動物のものである（例えばカニクイザル、ヒトおよび／またはげっ歯類（例えばラットおよび／またはマウス）のＴＧＦ−β）。ＴＧＦ−βのアイソフォーム、断片、バリアント、またはホモログは場合により、所与の種、例えばヒトの未成熟または成熟したＴＧＦ−βのアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のうちの１つのアミノ酸配列同一性を有するものとして特徴付けられ得る。ＴＧＦ−βのアイソフォーム、断片、バリアント、またはホモログは場合により、ＴＧＦ−β受容体（例えばＴＧＦ−βＲ１、ＴＧＦ−βＲ２またはＴＧＦ−βＲ３；好ましくは同じ種由来のもの）に結合する能力、およびＴＧＦ−β受容体を発現する細胞のシグナル伝達を刺激する能力により特徴付けられてもよい。ＴＧＦ−βの断片は（アミノ酸の数による）任意の長さであり得るが、場合により、成熟ＴＧＦ−βの長さの少なくとも２５％であり得、成熟ＴＧＦ−βの長さの５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のうちの１つの最大長を有し得る。ＴＧＦ−βの断片は、最小長が１０アミノ酸、最大長が１５、２０、２５、３０、４０、５０、１００、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５または４４０アミノ酸のうちの１つであり得る。
【００５０】
ＴＧＦ−βを介したシグナル伝達と疾患
ＴＧＦ−β／ＴＧＦβ受容体シグナル伝達は、例えばＮａｃｉｆとＳｈａｋｅｒ  ２０１４，Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  ５：７３５−７４７，Ｍｅｕｌｍｅｅｓｔｅｒとｔｅｎ  Ｄｉｊｋｅ  ２０１１，Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  ２２３：２０５−２１８、およびＡｋｈｕｒｓｔとＨａｔａ  ２０１２  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．１１（１０）：７９０−８１１に記載されているように、癌にも関係付けられている。
【００５１】
ＴＧＦ−βシグナル伝達成分の変異が、多くの癌で観察されている；例えば、結腸、胃、胆道、肺、卵巣、食道、頭頸部の癌では、ＴＧＦ−β受容体の変異がマイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）を伴って多く認められ、また、Ｓｍａｄ４変異が膵臓癌と胃腸腫瘍で観察されている。ＴＧＦ−βは、例えば細胞増殖、アポトーシスの調節を通じて、および間接的に腫瘍間質を通じて、腫瘍抑制効果を発揮する。
【００５２】
ＴＧＦ−βは上皮細胞に対して、または腫瘍形成の初期の増殖感受性の段階では、保護的または腫瘍抑制的な効果を発揮するが、腫瘍の発達の後期には、癌細胞はＴＧＦ−βを介した増殖阻害に対して抵抗性となり、悪性腫瘍の後期になると、ＴＧＦ−βの過負荷によって腫瘍の進行が推進される。
【００５３】
腫瘍微小環境では、ＴＧＦ−βは血管および免疫細胞および線維芽細胞に対する腫瘍形成促進効果を介して腫瘍の進行を刺激し、浸潤と転移を促進する。腫瘍細胞がＴＧＦ−βの増殖抑制効果を弱める遺伝的および／またはエピジェネティックな変化を受けると、ＴＧＦ−β１は悪性腫瘍の進行と転移を推進し得る（Ｃｏｎｎｏｌｌｙら  ２０１２，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，８，９６４−９７８）。神経膠腫や乳癌、前立腺癌などといった異なる種類の腫瘍は、ＴＧＦ−βシグナル伝達のコアコンポーネント以外に優先的に変異を獲得し、ＴＧＦ−βシグナル伝達を活用する能力を保持して、上皮間葉転換（ＥＭＴ）、腫瘍浸潤、転移性播種、および免疫系の回避を促進する経路を誘導するように見える。
【００５４】
Ｔｏｒｒｅ−Ａｍｉｏｎｅら  １９９０，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８７：１４８６−１４９０は、腫瘍誘導性のＣＤ８＋細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を介したマウス腫瘍の拒絶を阻害するＴＧＦ−βの能力を報告しており、また、ＴＧＦ−βＲ２のドミナントネガティブ型（ＤＮ−ＴＧＦ−βＲ２）を発現するマウスでは、メラノーマまたはリンパ腫細胞株の増殖と転移が全てのＴ細胞で低減される（Ｇｏｒｅｌｉｋら  ２００１  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ  ７：１１１８−１１２２）。ＴＧＦ−βは、パーフォリン、グランザイムＡ、グランザイムＢ、ＦＡＳリガンド、およびインターフェロン−γなどといったＣＴＬのアポトーシス促進因子の産生を抑制することが示されている（Ｔｈｏｍａｓら  ２００５  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ８：３６９−３８０）。Ｂｏｌｌａｒｄら  ２００２，Ｂｌｏｏｄ  ９９（９）：３１７９−３１８７は、ＤＮ−ＴＧＦ−βＲ２を発現するように改変されたＥＢＶ特異的ＣＴＬが、ＴＧＦ−βの抗増殖および抗細胞傷害性効果に対して耐性であり、抗原刺激に応答してサイトカインを分泌し続けることを報告した；そのようなＣＴＬは、選択的な機能上および生存上の利点を有するであろう（Ｂｏｌｌａｒｄら  ２００２，Ｂｌｏｏｄ  ９９（９）：３１７９−３１８７）。可溶性ＴＧＦβ−２ＲまたはＤＮ−ＴＧＦ−βＲ２を発現するように改変されたＴ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴＧＦ−β誘導Ｓｍａｄ２リン酸化に耐性であることが示されており、抗原特異的ＣＤ８＋およびＣＤ４＋  Ｔ細胞におけるＤＮ−ＴＧＦ−βＲ２の発現は、メラノーマ腫瘍モデルにおいて腫瘍治療効率を改善することが示されている（Ｚｈａｎｇら  ２０１３，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２０，５７５−５８０）。
【００５５】
ＴＧＦ−βはまた、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性を抑制することも示されている；抗ＴＧＦ−β中和抗体を使用したＴＧＦ−βの阻害は、ＮＫ細胞活性を増加させ、よって、接種した乳癌細胞株の転移形成の抑制をもたらした（Ａｒｔｅａｇａら  １９９３，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９２：２５６９−２５７６）。ＴＧＦ−βは、ＮＫＧ２ＤおよびＮＫｐ３０の転写抑制を通じてＮＫを介した細胞傷害性（および抗腫瘍活性）を阻害する（Ｃａｓｔｒｉｃｏｎｉら  ２００３，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００：４１２０−４１２５；Ｋｏｐｐら  ２００９  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６９：７７７５−７７８３）。
【００５６】
ＴＧＦ−βを介したシグナル伝達は、例えばＮａｃｉｆとＳｈａｋｅｒ  ２０１４（上記）およびＡｋｈｕｒｓｔとＨａｔａ  ２０１２（上記）に記載されているように、他の疾患／状態の病理においても重要となる。ＴＧＦ−βシグナル伝達は、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、腎線維症、心臓線維症（例えば、心筋梗塞、虚血、拡張型および肥大性心筋症および鬱血性心不全）などの線維症、強皮症、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、冠動脈バイパス術または血管形成術後の再狭窄、マルファン症候群、（例えば、緑内障の治療のための線維柱帯切除術後、または角膜手術後の）眼の状態における術後瘢痕、糖尿病および肥満を特徴とする疾患の病理に関係付けられている。
【００５７】
ＴＧＦ−βデコイ受容体
本発明は、ＴＧＦ−βデコイ受容体を提供する。ＴＧＦ−βデコイ受容体は、ＴＧＦ−β（例えば、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２および／またはＴＧＦ−β３）に結合することができるペプチド／ポリペプチド、または複数のそれら（例えば、非共有結合性の複合体）である。「受容体」には、その断片および誘導体を含むものとする。「ＴＧＦ−βデコイ受容体」は、サイトカイン受容体がそのリガンドに結合する様にＴＧＦ−βに結合することができ、かつシグナルを伝達できないペプチド／ポリペプチドまたは複数のそれらである。したがって、デコイ受容体は、ＴＧＦ−βへ結合してシグナル伝達能力を持つＴＧＦ−β受容体への結合にリガンドを利用できないようにすることにより、ＴＧＦ−β媒介性シグナル伝達の阻害剤として作用する。
【００５８】
本発明によるＴＧＦ−βデコイ受容体は、単離された形態で提供され得る。
ＴＧＦ−βデコイ受容体は、ＴＧＦ−βに特異的な抗体または抗体の抗原結合断片ではない。ＴＧＦ−βデコイ受容体は、ＴＧＦ−βに特異的に結合できる抗体または抗原結合断片の重鎖および軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）および／または重鎖および軽鎖可変領域をコードする配列を欠いている。
【００５９】
本明細書で使用される場合、「ペプチド」は、ペプチド結合により連結された２つ以上のアミノ酸モノマーの鎖である。ペプチドは通常、約２〜５０アミノ酸の領域の長さを有する。「ポリペプチド」は、２つ以上のペプチドのポリマー鎖である。ポリペプチドは通常、約５０アミノ酸を超える長さを有している。
【００６０】
本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体は、ＴＧＦ−β（例えば、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２および／またはＴＧＦ−β３）に結合する。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−βデコイ受容体は、ヒトＴＧＦ−β（例えば、ヒトＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２および／またはＴＧＦ−β３）に結合する。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−βデコイ受容体は非ヒト霊長類ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２および／またはＴＧＦ−β３に結合する。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−βデコイ受容体はマウスＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２および／またはＴＧＦ−β３に結合する。
【００６１】
いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−βデコイ受容体は、ＴＧＦ−β：ＴＧＦ−β受容体複合体などのＴＧＦ−β含有分子／複合体に結合する。例えば、ＴＧＦ−βデコイ受容体は、例えばＴＧＦ−β複合体（例えばＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２またはＴＧＦ−β３）およびＴＧＦ−β受容体（例えばＴＧＦ−βＲ１、ＴＧＦ−βＲ２またはＴＧＦ−βＲ３）に結合し得る。
【００６２】
本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体は、ＴＧＦ−βおよびＴＧＦ−β含有複合体に結合し、それにより、これらの種をＴＧＦ−β受容体（例えば、内因性ＴＧＦ−β受容体）への結合に利用不可能とし得る。
【００６３】
本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体は、シグナル伝達能力を持たない。ＴＧＦ−βデコイ受容体は、好ましくはＴＧＦ−β受容体によるシグナル伝達に必要なアミノ酸配列を欠いている。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−βデコイ受容体は、ＴＧＦ−β受容体の機能的触媒ドメインをコードするアミノ酸配列を欠いている；例えば、ＴＧＦ−βデコイ受容体は、機能的なセリン／スレオニンキナーゼドメインをコードするアミノ酸配列を欠いていてもよい。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−βデコイ受容体は、ＴＧＦ−β受容体によるシグナル伝達に必要な因子の動員または活性化に必要なアミノ酸配列を欠いている。
【００６４】
したがって、本ＴＧＦ−βデコイ受容体は、例えばＢｏｌｌａｒｄら  ２００２，Ｂｌｏｏｄ  ９９（９）：３１７９−３１８７およびＺｈａｎｇら  ２０１３，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２０，５７５−５８０に記載されているドミナントネガティブＴＧＦ−βＲ２（すなわち、ＤＮ−ＴＧＦ−βＲ２）がＴＧＦ−βのデコイ受容体として作用するのとまさに同じ様に、ＴＧＦ−βおよびＴＧＦ−β含有複合体の「デコイ」受容体として作用する。
【００６５】
本明細書において使用される場合、「ドミナントネガティブＴＧＦ−βＲ２」および「ＤＮ−ＴＧＦ−βＲ２」は、ＴＧＦ−βＲ２のＴＧＦ−β結合領域およびＴＧＦ−βＲ２の膜貫通ドメインを含み、かつ機能的キナーゼドメインを欠いた種を指す。
【００６６】
本発明のＴＧＦ−βデコイ受容体を発現する細胞によるＴＧＦ−β媒介性のシグナル伝達は、例えばＴＧＦ−βでの処置後、本発明のＴＧＦ−βデコイ受容体を発現しない細胞によるシグナル伝達のレベルと比較して減少している。
【００６７】
本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体は、好ましくは１つまたは複数のＴＧＦ−β結合ドメインを介してＴＧＦ−βに結合する。ＴＧＦ−β結合ドメインは、天然に存在するＴＧＦ−βの受容体分子のＴＧＦ−β結合ドメインであるか、それに由来するか、またはそれに対して相同である。例えば、本発明のＴＧＦ−βデコイ受容体は、ＴＧＦ−βＲ１、ＴＧＦ−βＲ２および／またはＴＧＦ−βＲ３のＴＧＦ−β結合ドメインに由来するか、またはそれに対して相同である１つまたは複数のＴＧＦ−β結合ドメインを含むか、またはそれから成っていてもよい。
【００６８】
本明細書において説明されるように、ＴＧＦ−βおよびＴＧＦ−βを含む複合体は、細胞の表面に発現されるＴＧＦ−β受容体への結合を介してＴＧＦ−β媒介性シグナル伝達を活性化することができる。本発明のＴＧＦ−βデコイ受容体は、細胞膜結合ＴＧＦ−β受容体と相互作用するそれらの種の能力を阻害し、それによりＴＧＦ−β媒介性シグナル伝達を阻害するように、ＴＧＦ−βおよびＴＧＦ−β含有種に結合できる。
【００６９】
これは好ましくは、ＴＧＦ−β受容体（例えばＴＧＦ−βＲ１、ＴＧＦ−βＲ２および／またはＴＧＦ−βＲ３）、例えば内在的に発現されるＴＧＦ−β受容体への結合に必要なＴＧＦ−βの領域へのＴＧＦ−βデコイ受容体の結合により達成される。
【００７０】
つまり、ＴＧＦ−βデコイ受容体は、細胞によって発現される機能的に適格なＴＧＦ−β受容体（例えばＴＧＦ−βＲ１、ＴＧＦ−βＲ２および／またはＴＧＦ−βＲ３）に結合して、それよるシグナル伝達を活性化するのに利用可能なＴＧＦ−βおよびＴＧＦ−βを含む種の量を減少させる。
【００７１】
いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−βデコイ受容体は、ＴＧＦ−βＲ１、ＴＧＦ−βＲ２および／またはＴＧＦ−βＲ３が結合するＴＧＦ−βの領域においてＴＧＦ−βに結合することができる。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−βデコイ受容体は、ＴＧＦ−βＲ１、ＴＧＦ−βＲ２および／またはＴＧＦ−βＲ３が結合するＴＧＦ−βの領域と同じＴＧＦ−βの領域、または重複するＴＧＦ−βの領域に結合することができる。ＴＧＦ−βＲ１、ＴＧＦ−βＲ２、および／またはＴＧＦ−βＲ３が結合する領域と同じ領域または重複する領域においてＴＧＦ−βに結合する能力は、競合ＥＬＩＳＡなどといった競合的結合アッセイを使用して分析できる。そのようなアッセイにおいては、ＴＧＦ−βデコイ受容体の非存在下での相互作用のレベルとの比較で、ＴＧＦ−βデコイ受容体の存在下−またはＴＧＦ−βデコイ受容体の相互作用パートナーの一方もしくは両方のインキュベーション後−における、ＴＧＦ−βとＴＧＦ−β受容体（例えばＴＧＦ−βＲ１、ＴＧＦ−βＲ２および／またはＴＧＦ−βＲ３）と間の相互作用のレベルの低減／減少の観察は、ＴＧＦ−βデコイ受容体が、ＴＧＦ−β受容体が結合する領域と同じ領域または重複する領域に結合することを指し示す。また、本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体が、ＴＧＦ−βＲ１、ＴＧＦ−βＲ２および／またはＴＧＦ−βＲ３が結合する領域と同じか、または重複するＴＧＦ−βの領域においてＴＧＦ−βに結合するか否かは、受容体−リガンド複合体のＸ線共結晶解析、ペプチドスキャニング、突然変異誘発マッピング、質量分析による水素−重水素交換分析、ファージディスプレイおよびタンパク質分解に基づく「保護」法を含む、当技術分野で周知の様々な方法を使用した相互作用の分析によっても決定され得る。そのような方法は、例えば、Ｇｅｒｓｈｏｎｉら，ＢｉｏＤｒｕｇｓ，２００７，２１（３）：１４５−１５６に記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００７２】
いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−βデコイ受容体は、ＴＧＦ−β受容体のＴＧＦ−β結合領域に対応するアミノ酸配列を含む。本明細書において、「ＴＧＦ−β受容体のＴＧＦ−β結合領域に対応するアミノ酸配列」は、ＴＧＦ−β受容体のＴＧＦ−β結合領域のアミノ酸配列、またはＴＧＦ−βへの結合が可能であり、ＴＧＦ−β受容体のＴＧＦ−β結合領域のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列であり得る。ＴＧＦ−β受容体およびＴＧＦ−βは、あらゆる種に由来するＴＧＦ−β受容体であり得、あらゆる種に由来するアイソフォーム、断片、バリアントまたはホモログを含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−β受容体はＴＧＦ−βＲ１、ＴＧＦ−βＲ２、またはＴＧＦ−βＲ３である。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−βはＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、またはＴＧＦ−β３である。
【００７３】
いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−βデコイ受容体は、ＴＧＦ−β受容体のＴＧＦ−β結合領域を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−βデコイ受容体は、ＴＧＦ−β受容体のＴＧＦ−β結合領域に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００７４】
所与のＴＧＦ−β受容体のＴＧＦ−β結合領域は、例えば既知のＴＧＦ−β結合領域との比較により、および／または例えばＥＬＩＳＡアッセイによるＴＧＦ−β受容体のペプチド／ポリペプチド断片のＴＧＦ−βへ結合する能力の分析によるなど、当業者に周知の通常の方法によって同定され得る。
【００７５】
Ｈａｒｔら  ２００２，Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ．９（３）：２０３−８によると、ＴＧＦ−βＲ２のＴＧＦ−β結合領域（ｐｆａｍ０８９１７：ｅｃＴｂｅｔａＲ２）は、配列番号２に示されるヒトＴＧＦ−βＲ２（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００１０２００１８．１）の７４〜１７７の位置、すなわち、以下に対応する：
【００７６】
【化４】
2020505069.tif 000006
【００７７】
当業者は、通常の方法により、ヒトＴＧＦ−βＲ２の所与の相同体のＴＧＦ−β結合領域を十分に同定することができる。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−βデコイ受容体は、ＴＧＦ−βＲ１、ＴＧＦ−βＲ２、またはＴＧＦ−βＲ３のＴＧＦ−β結合領域に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−βデコイ受容体は、ＴＧＦ−βＲ１、ＴＧＦ−βＲ２、またはＴＧＦ−βＲ３のＴＧＦ−β結合領域に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００７８】
いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−βデコイ受容体は、ＴＧＦ−βＲ２のＴＧＦ−β結合領域に対して、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−βデコイ受容体は、ＴＧＦ−βＲ２のＴＧＦ−β結合領域に対して、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００７９】
いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−βデコイ受容体は、配列番号４に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−βデコイ受容体は、配列番号４に対して、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００８０】
アミノ酸配列間の配列同一性は、当業者に知られている方法により決定され得る。例えば、２つのアミノ酸配列のパーセント同一性を決定するために、比較する配列がアライメントされ（例えば、最適なアライメントのために第１および第２のアミノ酸配列の一方または両方にギャップが導入され得る）、対応する位置のアミノ酸が比較され得る。第１の配列の位置が第２の配列の対応する位置と同じアミノ酸で占められている場合、配列はその位置において「同一性」を有する。２つの配列間のパーセント同一性は、配列の最適なアライメントのために導入される必要があるギャップの数と各ギャップの長さを考慮した同一な位置の数の関数である。配列同一性は、好ましくは、比較されるアミノ酸配列の全長にわたって決定される。
【００８１】
いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−βデコイ受容体は、本明細書に記載のＴＧＦ−βデコイ受容体、例えば図１に示されるようなＴＧＦ−βデコイ受容体のＴＧＦ−β結合領域に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００８２】
図１に示されるＴＧＦ−βデコイ受容体は、ＴＧＦ−β結合領域を含むＴＧＦ−βＲ２に由来する領域を含む。図１のＴＧＦ−βデコイ受容体のＴＧＦ−βＲ２に由来する領域が、以下に示されている：
ＴＧＦ−β結合領域を含むＴＧＦ−βＲ２由来の領域：
ＭＧＲＧＬＬＲＧＬＷＰＬＨＩＶＬＷＴＲＩＡＳＴＩＰＰＨＶＱＫＳＤＶＥＭＥＡＱＫＤＥＩＩＣＰＳＣＮＲＴＡＨＰＬＲＨＩＮＮＤＭＩＶＴＤＮＮＧＡＶＫＦＰＱＬＣＫＦＣＤＶＲＦＳＴＣＤＮＱＫＳＣＭＳＮＣＳＩＴＳＩＣＥＫＰＱＥＶＣＶＡＶＷＲＫＮＤＥＮＩＴＬＥＴＶＣＨＤＰＫＬＰＹＨＤＦＩＬＥＤＡＡＳＰＫＣＩＭＫＥＫＫＫＰＧＥＴＦＦＭＣＳＣＳＳＤＥＣＮＤＮＩＩＦＳＥＥＹＮＴＳＮＰ（配列番号９）
その残基１〜２２は、ＴＧＦ−βＲ２のシグナルペプチドに相当するため、配列番号９の成熟配列は以下のようになる：
ＴＩＰＰＨＶＱＫＳＤＶＥＭＥＡＱＫＤＥＩＩＣＰＳＣＮＲＴＡＨＰＬＲＨＩＮＮＤＭＩＶＴＤＮＮＧＡＶＫＦＰＱＬＣＫＦＣＤＶＲＦＳＴＣＤＮＱＫＳＣＭＳＮＣＳＩＴＳＩＣＥＫＰＱＥＶＣＶＡＶＷＲＫＮＤＥＮＩＴＬＥＴＶＣＨＤＰＫＬＰＹＨＤＦＩＬＥＤＡＡＳＰＫＣＩＭＫＥＫＫＫＰＧＥＴＦＦＭＣＳＣＳＳＤＥＣＮＤＮＩＩＦＳＥＥＹＮＴＳＮＰ（配列番号１０）
いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−βデコイ受容体は、配列番号９または１０に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−βデコイ受容体は、配列番号９または１０に対して、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００８３】
本発明のＴＧＦ−βデコイ受容体は、細胞膜アンカー領域を含む。本明細書において使用される場合、「細胞膜アンカー領域」は、ＴＧＦ−βデコイ受容体を発現する細胞の細胞膜にＴＧＦ−βデコイ受容体を固定するための領域である。「固定」は可逆的または不可逆的であり得る。
【００８４】
いくつかの実施形態では、細胞膜アンカー領域はアミノ酸配列を含むか、またはそれから成り得る。いくつかの実施形態では、細胞膜アンカー領域は、脂質部分を含むか、またはそれから成り得る。
【００８５】
固定は、細胞膜アンカー領域と細胞膜またはその成分（例えば、リン脂質）との非共有結合または共有結合により直接達成され得る。いくつかの実施形態では、固定は、細胞膜アンカー領域と膜結合因子または細胞膜に局在する因子（例えば、末梢または統合細胞膜関連タンパク質）との共有結合または非共有結合により、間接的に達成され得る。
【００８６】
細胞膜アンカー領域は、領域と細胞膜／その成分／因子との共有結合または非共有結合により直接的に固定を提供し得る。
いくつかの実施形態では、細胞膜アンカー領域は、受容体のプロセシング（例えば、翻訳後修飾）を指示するシグナル配列をコードし、その結果として細胞膜／その成分／因子との共有結合または非共有結合を生じることにより固定を提供し得る。例えば、細胞膜アンカー領域は、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーを付着させるための受容体のプロセシングを指示するＧＰＩシグナル配列を含むか、またはそれから成っていてもよい。
【００８７】
細胞膜アンカー領域は、好ましくは膜貫通ドメインではない。本発明のＴＧＦ−βデコイ受容体は、好ましくは膜貫通ドメインを欠いている。すなわち、ＴＧＦ−βデコイ受容体は、膜貫通ドメインをコードするアミノ酸配列を欠いている。本明細書において、「膜貫通ドメイン」とは、生体膜、例えば細胞膜中で熱力学的に安定な三次元構造を形成するアミノ酸の配列を指す。膜貫通ドメインは典型的には、例えば疎水性アルファヘリックスまたはベータバレルとして、細胞膜の脂質二重層にまたがることができる。膜貫通ドメインは、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔ、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ、ＴｒＥＭＢＬ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ、Ｅｎｓｅｍｂｌ、ＩｎｔｅｒＰｒｏなどといったデータベースに記録されており、および／または例えば、ＴＭＨＭＭなどのアミノ酸配列分析ツールを使用して同定／予測され得る（Ｋｒｏｇｈら，２００１  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３０５：５６７−５８０）。
【００８８】
いくつかの実施形態では、本発明のＴＧＦ−βデコイ受容体に従う細胞膜アンカー領域は、脂質アンカー領域であり得る。いくつかの実施形態では、脂質アンカー領域は、脂質アンカー（例えば、ＧＰＩアンカー）を含むか、またはそれから成る。いくつかの実施形態では、脂質アンカー領域は、脂質アンカーシグナル配列を含むか、またはそれから成る。
【００８９】
本明細書において使用される場合、「脂質アンカー」とは、生体膜（例えば細胞膜）の脂質成分と（例えば共有結合で）結合することができる部分を指す。このような結合により、脂質アンカーが付着したタンパク質は細胞膜に「固定（ａｎｃｈｏｒｅｄ）」される。脂質アンカーの例は、イソプレニル、ミリストイル、パルミトイル、脂肪アシル、ジアシルグリセロール、ステロイル（ｓｔｅｒｏｙｌ）、リン脂質、およびグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーを含む。
【００９０】
いくつかの実施形態では、脂質アンカー領域は、脂質アンカーシグナル配列を含むか、またはそれから成る。本明細書において、「脂質アンカーシグナル配列」とは、タンパク質のプロセシングを指示して脂質アンカーを付着させるアミノ酸配列を指す。そのようなプロセシングの後、ＴＧＦ−βデコイ受容体は脂質アンカーを含む。
【００９１】
脂質アンカーは典型的には、親油性基を含む。脂質アンカー、その親油性基、および脂質アンカーを付着させるためのタンパク質の修飾は、例えばＲｅｓｈ  ２０１３，Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ．２３（１０）：Ｒ４３１−Ｒ４３５に記載されており、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００９２】
脂質アンカーは、イソプレニル、ミリストイル、パルミトイル、脂肪アシル、ジアシルグリセロール、ステロイル、またはリン脂質基、またはグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーを含むか、またはそれから成り得る。
【００９３】
イソプレニル基は、チオエーテル結合を介してタンパク質のＣ末端のシステイン残基に付着した１５個（ファルネシル）または２０個（ゲラニルゲラニル）の炭素原子を含み得る。また、システインのカルボキシル基はメチル化もされ得る。イソプレニル（例えばファルネシルまたはゲラニルゲラニル）基が共有結合的に付着しているタンパク質は、プレニル化タンパク質と呼ばれる場合がある。
【００９４】
ミリストイル基は、アミド結合を介してグリシン残基に付着され得る１４炭素の飽和脂肪アシル基である。ミリストル基が共有結合的に付着したタンパク質は、ミリストイル化タンパク質と呼ばれる場合がある。
【００９５】
パルミトイル基は、チオエーテル結合を介してタンパク質のシステイン残基に付着されるか、エステル結合を介してセリンまたはスレオニン残基に付着され得る１６炭素の飽和脂肪アシル基である。パルミトイル基が共有結合的に付着したタンパク質は、パルミトイル化タンパク質と呼ばれる場合がある。
【００９６】
脂肪アシルおよび１，２−ジアシルグリセリル基は、それぞれアミドおよびチオエーテル結合を介してタンパク質のシステイン残基に付着され得る。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−βデコイ受容体は、ＧＰＩアンカー型、プレニル化、ミリストイル化、パルミトイル化、脂肪アシル化、ジアシルグリセリル化、ステアロイル化またはリン脂質化タンパク質であり得る。
【００９７】
いくつかの実施形態では、脂質アンカーシグナル配列は、ＴＧＦ−βデコイ受容体の修飾を提供して、イソプレニル、ミリストイル、パルミトイル、脂肪アシル、ジアシルグリセロール、ステアロイル、またはリン脂質基、またはグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーを受容体に付着させ得る。脂質アンカーシグナル配列によって指示されるＴＧＦ−βデコイ受容体のプロセシング後、受容体は脂質または脂質含有部分を含み得る。
【００９８】
いくつかの実施形態では、「脂質アンカーシグナル配列」はＧＰＩアンカーシグナル配列である。したがって、いくつかの実施形態では、本発明の脂質アンカーはＧＰＩアンカーである。
【００９９】
「ＧＰＩシグナル配列」は、ＧＰＩアンカーをタンパク質に付着させるタンパク質の修飾を指示するアミノ酸配列である。ＧＰＩシグナル配列は、タンパク質のＣ末端へのＧＰＩアンカーの共有結合的な付着のために、タンパク質の翻訳後修飾を指示する。ＧＰＩアンカーおよびタンパク質へのその付着は、例えば、Ｖｉｄａｌ  Ｃ．Ｊ．（編）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １３，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１１の「ＧＰＩ−Ａｎｃｈｏｒｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ」と題された第２章に記載されており、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１００】
本明細書において、「ＧＰＩアンカー」は、グリコシド結合を介して四糖グリカンコアに連結されたホスファチジルイノシトール基（四糖グリカンコアはさらにホスホエタノールアミンに付着される）を含む部分を指す。
【０１０１】
四糖グリカンコアは、トリマンノシル非アセチル化グルコサミン（Ｍａｎ３−ＧｌｃＮ）コアであり得る。ホスファチジルイノシトール基の脂質尾部は、例えばアシルまたはアルキル脂肪酸、またはセラミドであり得る。
【０１０２】
ＧＰＩアンカーは、さらに脂質部分へのホスホジエステル架橋によりイノシトール環を介して連結されるコアグリカン：−６マンノース（α１−２）マンノース（α１−６）マンノース（α１−４）グルコサミン（α１−６）ｍｙｏ−イノシトールへのホスホエタノールアミン架橋を介して、タンパク質のＣ末端のアルファ−カルボキシル基に共有結合的に付着され得る。脂質部分は変動し得るが、ほとんどの哺乳類では、これは１−アルキル−２−アシルグリセロールである。コアグリカンは、エタノールアミンと糖側鎖の付加により修飾されていてもよく、イノシトール環は、脂質基で修飾されていてもよく、また、脂肪酸も改造され得る。
【０１０３】
タンパク質へのＧＰＩアンカーの直接的な付加を指示するＧＰＩシグナル配列は、アミノ酸鎖のＣ末端にある。配列は典型的には、１５〜２５のアミノ酸残基を含み、Ｃ末端に一続きの疎水性残基を伴っている。Ｃ末端疎水性配列の前には、ＧＰＩアンカーの追加を指示するコンセンサス配列がある：ω、ω＋１およびω＋２、ここで、ωは小さな側鎖を有するアミノ酸（例えば、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、ＧｌｙもしくはＳｅｒ）であり、ω＋１はＰｒｏもしくはＴｒｐを除く任意の残基であり、ω＋２はＧｌｙもしくはＡｌａ（または時折、ＳｅｒもしくはＴｈｒ）である。
【０１０４】
あらかじめ組み立てられたＧＰＩアンカーは、ω残基とω＋１残基の間でのポリペプチドの切断後に、ＥＲ中でトランスアミダーゼ酵素によってω残基のＣ末端側に付着される。トランスアミダーゼは、触媒成分であるＧｐｉ８Ｐと、その他の成分のＧａａ１ｐ、Ｇｐｉ１６ｐ（ＰＩＧ−Ｔ）およびＧｐｉ１７ｐ（ＰＩＧ−Ｓ）を含む複合タンパク質複合体である（Ｆｒａｅｒｉｎｇら  ２００１  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，１２，３２９５−３３０６）。
【０１０５】
ＧＰＩアンカーの付着後、ＧＰＩアンカータンパク質は、ω残基のＣ末端側のアミノ酸配列を有していない。例えばｂｉｇ−ＰＩ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  Ｓｅｒｖｅｒを含む、ＧＰＩ修飾部位の予測ツールが利用可能である（Ｅｉｓｅｎｈａｂｅｒら  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（１９９８）１１，Ｎｏ．１２，１１５５−１１６１；Ｓｕｎｙａｅｖら  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（１９９９）１２，Ｎｏ．５，３８７−３９４；Ｅｉｓｅｎｈａｂｅｒら  ＪＭＢ（１９９９）２９２（３），７４１−７５８；およびＥｉｓｅｎｈａｂｅｒら  ＴＩＢＳ（２０００）２５（７），３４０−３４１）。このようなツールは、ω残基を識別するために使用され得る。
【０１０６】
図１には、異なるＧＰＩシグナル配列に対してｂｉｇ−ＰＩ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  Ｓｅｒｖｅｒを使用して予測されたω残基が指し示されている。図２は、図１に示されているアミノ酸配列のプロセシングによりＧＰＩアンカーを付着させた後の、成熟ＧＰＩアンカー型タンパク質の構造を示している。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、本発明のＴＧＦ−βデコイ受容体は、例えばＧＰＩアンカーを付着させるプロセシングの前には、ＧＰＩシグナル配列を含んでいる。ＧＰＩシグナル配列は、ＧＰＩアンカーを付着させる移行後プロセシングを指示できる任意の配列である。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−βデコイ受容体は、例えばＧＰＩアンカーを付着させるためのプロセシング後には、ω残基を含むω残基までのＧＰＩシグナル配列を含む。
ＧＰＩシグナル配列とそのω残基は、多くのＧＰＩアンカー型タンパク質で知られており、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔ、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ、ＴｒＥＭＢＬ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ、Ｅｎｓｅｍｂｌ、およびＩｎｔｅｒＰｒｏなどといったデータベースに記録されており、例えばｂｉｇ−ＰＩ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  Ｓｅｒｖｅｒなどのアミノ酸配列分析ツールを使用して、識別／予測され得る（上記）。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、本発明のＴＧＦ−βデコイ受容体は、ＧＰＩシグナル配列を含むか（例えば、ＧＰＩアンカーを付着させるプロセシングの前）、またはＧＰＩアンカー型タンパク質のＧＰＩシグナル配列に対応するω残基を含むω残基までのＧＰＩシグナル配列を含む（例えば、ＧＰＩアンカーを付着させるプロセシングの後）。いくつかの実施形態では、ＧＰＩアンカー型タンパク質は、ホーミング細胞接着分子（ＨＣＡＭ；ＣＤ４４）、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ；ＣＤ５６）、５’ヌクレオチダーゼ（ＣＤ７３）、崩壊促進因子（ＤＡＦ；ＣＤ５５）、ＣＤ９０（Ｔｈｙ１）、アセチルコリンエステラーゼ（ＡｃｈＥ）、腸アルカリホスファターゼ、胎盤アルカリホスファターゼ、ＭＡＣ阻害タンパク質（ＣＤ５９）、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ２４、ＣＤ２８、ＣＤ４８、ＣＤｗ５２、ＣＤ５８、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６Ｅ、ＣＤ６７、ＣＤ８７、ＣＤ１０８、ＣＤ１５７、アセチルコリンエステラーゼ（ＡｃｈＥ）、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化受容体（ｕＰＡＲ）、ＪＭＨタンパク質、ＧＤＮＦＲ、ＣＮＴＦＲ、ＴＡＧ−１、ＰｒＰ、グリピカンタンパク質、セマフォリン７、ＣＥＡ、ＧＦＲ、Ｌｙ６Ｇ、トランスフェリン受容体、コンタクチン（Ｆ３）およびＴ−カドヘリンのうちの１つである。タンパク質は、任意の種に由来するものであり得、任意の種に由来するアイソフォーム、断片、バリアントまたはホモログを含む。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、ＧＰＩアンカー型タンパク質は、ＣＤ４８（ＢＬＡＳＴ−１）、ＣＤ４４（ＨＣＡＭ）、ＣＤ５５（ＤＡＦ）、胎盤アルカリホスファターゼおよびＣＤ９０（Ｔｈｙ１）のうちの１つである。
【０１１１】
本明細書において、「参照ＧＰＩシグナル配列に対応するＧＰＩシグナル配列」は、その配列を含むタンパク質へのＧＰＩアンカーの付着を指示することができ、参照ＧＰＩシグナル配列に対して少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性の１つを有するアミノ酸配列である。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、本発明のＴＧＦ−βデコイ受容体は、ＧＰＩシグナル配列を含むか（例えば、ＧＰＩアンカーを付着させるプロセシングの前）、または、配列番号１５から１８のうちの１つのＧＰＩシグナル配列に対応する、ω残基を含むω残基までのＧＰＩシグナル配列を含む（例えば、ＧＰＩアンカーを付着させるプロセシングの後）（ω残基には下線が引かれている）：
ＣＤ４８  ＧＰＩ：
ＤＶＣＳＰＰＣＴＬＡＲＳＦＧＶＥＷＩＡＳＷＬＶＶＴＶＰＴＩＬＧＬＬＬＴ（配列番号１５）
ＧＰＩを付着させるプロセシング後の配列：
ＤＶＣＳＰＰＣＴＬＡＲＳ（配列番号１９）
ＣＤ５５  ＧＰＩ：
ＨＥＴＴＰＮＫＧＳＧＴＴＳＧＴＴＲＬＬＳＧＨＴＣＦＴＬＴＧＬＬＧＴＬＶＴＭＧＬＬＴ（配列番号１６）
ＧＰＩを付着させるプロセシング後の配列：
ＨＥＴＴＰＮＫＧＳＧＴＴＳ（配列番号２０）
ＰＬＡＣ  ＡＬＫＰＨＯＳ  ＧＰＩ：
ＴＡＣＤＬＡＰＰＡＧＴＴＤＡＡＨＰＧＰＳＶＶＰＡＬＬＰＬＬＡＧＴＬＬＬＬＧＴＡＴＡＰ（配列番号１７）
ＧＰＩを付着させるプロセシング後の配列：
ＴＡＣＤＬＡＰＰＡＧＴＴＤ（配列番号２１）
ＣＤ９０  ＧＰＩ：
ＮＶＴＶＬＲＤＫＬＶＫＣＥＧＩＳＬＬＡＱＮＴＳＷＬＬＬＬＬＬＳＬＳＬＬＱＡＴＤＦＭＳＬ（配列番号１８）
ＧＰＩを付着させるプロセシング後の配列：
ＮＶＴＶＬＲＤＫＬＶＫＣ（配列番号２２）
配列番号１５のＣＤ４８由来配列は、配列番号１５の４〜３５位に対応する。配列番号１９のＣＤ４８由来配列は、配列番号１９の４〜１２位に対応する。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、本発明のＴＧＦ−βデコイ受容体は、配列番号１５から１８のうちの１つ、または配列番号１５の４〜３５位に対して、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するＧＰＩシグナル配列（例えば、ＧＰＩアンカーを付着させるプロセシングの前）を含む。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、本発明のＴＧＦ−βデコイ受容体は、配列番号１９から２２のうちの１つ、または配列番号１９の４〜１２位に対して、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列、およびＧＰＩアンカー（例えばＧＰＩアンカーを付着させるプロセシングの後）を含む。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、本発明のＴＧＦ−βデコイ受容体は、図１または２に示される構造を含むか、またはそれから成り得る。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−βデコイ受容体は、配列番号９または１０に対して、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＴＧＦ−β結合領域；および、配列番号１５から１８のうちの１つ、または配列番号１５の４〜３５位に対して、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性のうちの１つを有するＧＰＩシグナル配列（例えば、ＧＰＩアンカーを付着させるプロセシングの前）を含む。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−βデコイ受容体は、配列番号９または１０に対して、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＴＧＦ−β結合領域；および、配列番号１９から２２のうちの１つ、または配列番号１９の４〜１２位に対して、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列、およびＧＰＩアンカー（例えば、ＧＰＩアンカーを付着させるプロセシングの後）を含む。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、本発明のＴＧＦ−βデコイ受容体は、ＴＧＦ−β結合領域、およびＧＰＩシグナル配列を含み、そして、配列番号５から８のうちの１つに対して、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列（例えば、ＧＰＩアンカーを付着させるプロセシングの前）を含むか、またはそれから成る。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、本発明のＴＧＦ−βデコイ受容体は、ＴＧＦ−β結合領域およびＧＰＩアンカーを含むか、またはそれらから成り、そして、配列番号１１から１４のうちの１つに対して、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含む。
【０１１９】
ＧＰＩアンカー型タンパク質は、ω残基のＮ末端側にあるアミノ酸配列が細胞外空間（すなわち頂端膜側）に来るよう、細胞膜中で配向している。本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体は、ＧＰＩシグナル配列のＮ末端側にＴＧＦ−β結合領域を備えている。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体は、リーダー配列（シグナルペプチドまたはシグナル配列としても知られる）を含み得る。リーダー配列は通常、単一のアルファヘリックスを形成する５〜３０個の疎水性アミノ酸の配列から成る。分泌タンパク質および細胞表面に発現するタンパク質はしばしば、リーダー配列を含む。リーダー配列は、ＴＧＦ−βデコイ受容体のＮ末端に存在し得、新たに合成された受容体中に存在し得る（例えば、リーダー配列を除去するプロセシングの前）。リーダー配列は、ＴＧＦ−βデコイ受容体の効率的な細胞内輸送を提供する。リーダー配列はしばしば切断により除去され、したがって、成熟ＴＧＦ−βデコイ受容体中には含まれない。
【０１２１】
リーダー配列は多くのタンパク質で知られており、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔ、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ、ＴｒＥＭＢＬ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ、Ｅｎｓｅｍｂｌ、ＩｎｔｅｒＰｒｏなどといったデータベースに記録されており、および／または、例えば、ＳｉｇｎａｌＰ（Ｐｅｔｅｒｓｅｎら，２０１１  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ８：７８５−７８６）またはＳｉｇｎａｌ−ＢＬＡＳＴ（ＦｒａｎｋとＳｉｐｐｌ，２００８  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２４：２１７２−２１７６）などのアミノ酸配列分析ツールを使用して、識別／予測され得る。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、本発明のＴＧＦ−βデコイ受容体のリーダー配列は、配列番号２３のアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれから成る：
ＴＧＦ−βＲ２リーダー配列：
ＭＧＲＧＬＬＲＧＬＷＰＬＨＩＶＬＷＴＲＩＡＳ（配列番号２３）
いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−βデコイ受容体は、ＴＧＦ−β結合領域と脂質アンカー領域の間に１つまたは複数のリンカーを含み得る。リンカーは、アミノ酸配列を含むか、またはそれから成っていてもよく、ＴＧＦ−β結合領域および脂質アンカー領域のアミノ酸配列の末端に（例えばペプチド結合により）共有結合されていてもよい。
【０１２３】
リンカーは、ペプチドまたはポリペプチドリンカーであり得る。リンカーはフレキシブルなリンカーであり得る。フレキシブルなリンカーのアミノ酸配列は、当業者に知られており、例えば、Ｃｈｅｎら，Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ（２０１３）６５（１０）：１３５７−１３６９に記載されているが、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、フレキシブルなリンカー配列は、セリンおよびグリシン残基を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、１〜１００、１〜５０、１〜２０、１〜１０または１〜５個のアミノ酸残基のアミノ酸配列から成るペプチド／ポリペプチドである。
【０１２４】
本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体は、天然に存在するＴＧＦ−β結合分子、例えばＴＧＦ−βの天然に存在する受容体とは異なる。
本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体は、ＤＮ−ＴＧＦ−βＲ２とも異なる；ＤＮ−ＴＧＦ−βＲ２は、ＴＧＦ−βＲ２の膜貫通ドメインを含むが、本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体は、膜貫通ドメインを欠いている。
【０１２５】
本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体はまた、細胞膜アンカー領域を欠く、先行技術に開示された可溶性ＴＧＦ−βＲ２種とも異なる。対照的に、本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体は、脂質アンカー領域などの細胞膜アンカー領域を含む。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−βデコイ受容体は、ＴＧＦ−β受容体（例えば、ＴＧＦ−βＲ１、ＴＧＦ−βＲ２またはＴＧＦ−βＲ３）の膜貫通および／または細胞内ドメインに対応するアミノ酸配列を欠いている。
【０１２７】
本明細書において、所与のペプチド／ポリペプチドの参照領域または配列に「対応する」アミノ酸配列は、参照領域／配列のアミノ酸配列に対して、少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性のうちの１つを有する。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−βデコイ受容体は、配列番号１の残基１２７〜１４７に対応するアミノ酸配列を欠いている。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−βデコイ受容体は、配列番号２の残基１９２〜２１２に対応するアミノ酸配列を欠いている。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−βデコイ受容体は、配列番号３の残基７８８〜８０９に対応するアミノ酸配列を欠いている。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−βデコイ受容体は、配列番号１の残基１２７〜１４７に対応するアミノ酸配列を欠いている。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−βデコイ受容体は、配列番号２の残基１９２〜２１２に対応するアミノ酸配列を欠いている。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−βデコイ受容体は、配列番号３の残基７８８〜８０９に対応するアミノ酸配列を欠いている。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−βデコイ受容体は、配列番号１の残基１４８〜５０３に対応するアミノ酸配列を欠いている。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−βデコイ受容体は、配列番号２の残基２１３〜５９２に対応するアミノ酸配列を欠いている。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−βデコイ受容体は、配列番号３の残基８１０〜８５１に対応するアミノ酸配列を欠いている。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−βデコイ受容体は、配列番号１の残基１２７〜５０３に対応するアミノ酸配列を欠いている。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−βデコイ受容体は、配列番号２の残基１９２〜５９２に対応するアミノ酸配列を欠いている。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−βデコイ受容体は、配列番号３の残基７８８〜８５１に対応するアミノ酸配列を欠いている。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−βデコイ受容体は、さらなる機能的アミノ酸配列を含み得る。例えば、ＴＧＦ−βデコイ受容体は、ＴＧＦ−βデコイ受容体の発現、折りたたみ、輸送、プロセシング、精製または検出を容易にするアミノ酸配列を含んでいてもよい。例えば、ＴＧＦ−βデコイ受容体は、タンパク質タグ、例えばＦＬＡＧ、Ｈｉｓ、（例えば６ＸＨｉｓ）、Ｍｙｃ、ＧＳＴ、ＭＢＰ、ＨＡ、Ｅ、またはビオチンタグをコードする配列を、場合によりＮ末端またはＣ末端に含んでいてもよい。
【０１３３】
本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体は、検出可能に標識されていてもよく、または少なくとも検出可能であり得る。例えば、ＴＧＦ−βデコイ受容体は、放射性原子または着色分子または蛍光分子または他の方法で容易に検出され得る分子で標識されていてもよい。適切な検出可能な分子は、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、酵素基質、放射標識および結合部分を含む。標識化は、ＴＧＦ−βデコイ受容体へのコンジュゲーションによるものであり得る。ＴＧＦ−βデコイ受容体は、検出可能な標識で直接標識されていても、間接的に標識されていてもよい。いくつかの実施形態において、標識は、放射性ヌクレオチド、陽電子放出放射性核種（例えば、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）用）、ＭＲＩ造影剤または蛍光標識から選択され得る。
【０１３４】
本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体は、薬剤部分、例えば細胞傷害性の低分子にコンジュゲートされていてもよい。そのようなコンジュゲートは、抗原分子を発現する細胞を標的に定めた殺傷に有用である。
【０１３５】
キメラ抗原受容体
本発明はまた、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）も提供する。ＣＡＲは、本明細書に記載のＴＧＦ−β結合領域を含む。
【０１３６】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、抗原結合機能とＴ細胞活性化機能の両方を提供する組換え受容体である。ＣＡＲの構造および工学技術は、例えば、Ｄｏｔｔｉら，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ（２０１４）２５７（１）に概説されており、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１３７】
ＣＡＲは、細胞膜アンカー領域に連結された抗原結合領域とシグナル伝達領域を含む。オプションのヒンジ領域は、抗原結合領域と細胞膜アンカー領域との分離を提供することができ、フレキシブルなリンカーとして機能し得る。
【０１３８】
ＣＡＲの抗原結合領域は、ＣＡＲが標的とする抗原に特異的な抗体の抗原結合領域、または標的に結合できる他の薬剤に基づき得る。例えば、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、標的タンパク質に特異的に結合する抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列または完全な軽鎖および重鎖可変領域のアミノ酸配列を含み得る。ＣＡＲの抗原結合ドメインは、リガンド：受容体結合などといった他のタンパク質：タンパク質相互作用に基づいて抗原を標的化してもよい；例えば、ＩＬ−１３Ｒα２を標的とするＣＡＲが、ＩＬ−１３に基づく抗原結合ドメインを使用して開発されている（例えば、Ｋａｈｌｏｎら  ２００４  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６４（２４）：９１６０−９１６６を参照）。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、本発明のＣＡＲは、本明細書に記載のＴＧＦ−β結合領域を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−β結合領域は、ＴＧＦ−β受容体、例えば、ＩＩ型ＴＧＦ−β受容体（ＴＧＦ−βＲ２）のＴＧＦ−β結合領域に対応するアミノ酸配列を含むか、またはそれから成る。
【０１４０】
細胞膜アンカー領域は、ＣＡＲの抗原結合領域とシグナル伝達領域の間に設けられる。細胞膜アンカー領域は、細胞外空間の抗原結合領域および細胞内のシグナル伝達領域と共に、ＣＡＲを発現する細胞の細胞膜にＣＡＲを固定する。ＣＤ３−ζ、ＣＤ４、ＣＤ８またはＣＤ２８の膜貫通領域配列に由来するＣＡＲの細胞膜アンカー領域が記述されている。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、本発明のＣＡＲは、本明細書に記載の細胞膜アンカー領域を含む。細胞膜アンカー領域は、例えば脂質アンカー領域であってもよい。
いくつかの実施形態では、本発明のＣＡＲは、本明細書に記載のＴＧＦ−β結合領域および本明細書に記載の細胞膜アンカー領域を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、本明細書に記載のＴＧＦ−βデコイ受容体を含むか、またはそれから成る。
【０１４２】
シグナル伝達領域は、Ｔ細胞の活性化を可能とする。ＣＡＲシグナル伝達領域は、リン酸化のための免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）とＣＡＲ発現Ｔ細胞の活性化を提供するＣｄ３−ζの細胞内ドメインのアミノ酸配列を含んでいてもよい。ＦｃγＲＩのＩＴＡＭ含有領域を含むドメインなど、他のＩＴＡＭ含有タンパク質の配列を含むシグナル伝達領域もまた、ＣＡＲにおいて使用されている（Ｈａｙｎｅｓら，２００１  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６６（１）：１８２−１８７）。ＣＤ３−ζの細胞内ドメインに由来するシグナル伝達領域を含むＣＡＲは、しばしば第１世代のＣＡＲと呼ばれる。
【０１４３】
ＣＡＲのシグナル伝達領域は、標的タンパク質への結合に伴ってＣＡＲを発現するＴ細胞の活性化を促進するための、共刺激分子のシグナル伝達領域に由来する共刺激配列も含み得る。適切な共刺激分子は、ＣＤ２８、ＯＸ４０、４−１ＢＢ、ＩＣＯＳ、およびＣＤ２７を含む。追加の共刺激配列を含むシグナル伝達領域を有するＣＡＲは、しばしば第２世代のＣＡＲと呼ばれる。
【０１４４】
場合によっては、ＣＡＲは、異なる細胞内シグナル伝達経路の共刺激を提供するように設計される。例えば、ＣＤ２８共刺激に関連するシグナル伝達は、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（Ｐ１３Ｋ）経路を優先的に活性化するが、４−１ＢＢを介したシグナル伝達は、ＴＮＦ受容体関連因子（ＴＲＡＦ）アダプタータンパク質を介する。したがって、ＣＡＲのシグナル伝達領域は時として、複数の共刺激分子のシグナル伝達領域に由来する共刺激配列を含む。複数の共刺激配列を有するシグナル伝達領域を含むＣＡＲは、しばしば第３世代のＣＡＲと呼ばれる。
【０１４５】
オプションのヒンジ領域は、抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとの間の分離を提供することができ、フレキシブルなリンカーとして機能し得る。ヒンジ領域は、結合部分が異なる方向に配向することを可能にするフレキシブルなドメインであり得る。ヒンジ領域は、ＩｇＧ１または免疫グロブリンのＣＨ２ＣＨ３領域に由来するものであってもよい。
【０１４６】
ＣＡＲは、Ｔ細胞の効力、特異性、および安全性をさらに高めるために共刺激リガンド、キメラ共刺激受容体、またはサイトカインと組み合わされてもよい（参照により本明細書に具体的に組み込まれるＳａｄｅｌａｉｎら，Ｔｈｅ  ｂａｓｉｃ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＣＡＲ）ｄｅｓｉｇｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖ．２０１３  Ａｐｒｉｌ；３（４）：３８８−３９８．ｄｏｉ：１０．１１５８／２１５９−８２９０．ＣＤ−１２−０５４８）。
【０１４７】
また、本発明に従うＣＡＲを含む細胞も提供される。本発明に従うＣＡＲは、Ｔ細胞を生成するために使用され得る。Ｔ細胞へのＣＡＲのエンジニアリングは、養子Ｔ細胞療法のためのＴ細胞の増殖の際に生じるような、形質導入および増殖のためのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの培養中に行われ得る。
【０１４８】
ＴＧＦ−βデコイ受容体およびＣＡＲをコードする核酸
本発明は、本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体またはＣＡＲをコードする核酸を提供する。いくつかの実施形態では、核酸は、例えば他の核酸、または天然に存在する生物学的材料から精製または単離される。
【０１４９】
本発明はまた、本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体またはＣＡＲをコードする核酸を含むベクターも提供する。
本明細書において使用される「ベクター」は、外因性核酸を細胞に移すための媒体として使用される核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）である。ベクターは、細胞内での核酸の発現のための発現ベクターであり得る。そのようなベクターは、発現される配列をコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーター配列を含み得る。ベクターはまた、終止コドンおよび発現エンハンサーを含み得る。本発明に従うベクターから本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体／ＣＡＲを発現させるために、当技術分野で公知の任意の適切なベクター、プロモーター、エンハンサーおよび終止コドンが使用され得る。
【０１５０】
本明細書において、用語「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」は、選択された核酸配列および調節性核酸配列（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）がヌクレオチド配列の発現を調節配列の影響または制御下に置く（それにより発現カセットを形成する）ようなかたちで共有結合されている状況を含み得る。したがって、調節配列が核酸配列の転写をもたらすことができる場合、調節配列は、選択された核酸配列に作動可能に連結されている。適切な場合、結果として生じる転写物は、その後、所望のポリペプチドに翻訳され得る。
【０１５１】
本発明に従う核酸および／またはベクターは、好ましくは細胞、例えば初代ヒト免疫細胞への導入のために提供される。適切なベクターは、例えば、どちらも参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＭａｕｓら，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０１４）３２：１８９−２２５またはＭｏｒｇａｎとＢｏｙｅｒｉｎａｓ，Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅｓ  ２０１６  ４，９に記載されているような、プラスミド、バイナリーベクター、ＤＮＡベクター、ｍＲＮＡベクター、ウイルスベクター（例えば、ガンマレトロウイルスベクター（例えば、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）由来ベクター）、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、およびヘルペスウイルスベクター）、トランスポゾンベースのベクター、および人工染色体（例えば、酵母人工染色体）を含む。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、または単純ヘルペスウイルスベクターであり得る。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターはｐＥＬＮＳであっても、またはｐＥＬＮＳに由来するものであってもよい。いくつかの実施形態では、ベクターはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９をコードするベクターであり得る。
【０１５２】
ＴＧＦ−βデコイ受容体およびＣＡＲを含む／発現する細胞
本発明はまた、本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体またはＣＡＲを含む、または発現する細胞も提供する。また、本発明に従う核酸またはベクターを含む、または発現する細胞も提供される。
【０１５３】
細胞は真核細胞、例えば哺乳動物細胞であり得る。哺乳動物は、ヒト、または非ヒト哺乳動物（例えば、ウサギ、モルモット、ラット、マウス、または他のげっ歯類（任意のげっ歯目の動物を含む）、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ（例えば、乳牛などの雌ウシ、または任意のウシ目の動物を含む）、ウマ（ウマ目の任意の動物を含む）、ロバ、および非ヒト霊長類）であり得る。
【０１５４】
いくつかの実施形態において、細胞は、ヒト対象由来のものであるか、またはヒト対象から得られたものであり得る。
いくつかの実施形態では、細胞は通常ＴＧＦ−β（例えばＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２またはＴＧＦ−β３）に応答する細胞、例えばＴＧＦ−β受容体（例えばＴＧＦ−βＲ１、ＴＧＦ−βＲ２またはＴＧＦ−βＲ３）を発現する細胞である。
【０１５５】
細胞は免疫細胞であってもよい。細胞は、造血起源の細胞、例えば、好中球、好酸球、好塩基球、樹状細胞、リンパ球、または単球であり得る。リンパ球は、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞または自然リンパ系細胞（ＩＬＣ）、またはそれらの前駆体であり得る。細胞は、例えばＣＤ３ポリペプチド（例えばＣＤ３γ  ＣＤ３ε  ＣＤ３ζまたはＣＤ３δ）、ＴＣＲポリペプチド（ＴＣＲαまたはＴＣＲβ）、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４またはＣＤ８を発現していてもよい。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞はＣＤ３＋  Ｔ細胞である。いくつかの態様において、Ｔ細胞はＣＤ３＋、ＣＤ８＋  Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は細胞傷害性Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ））である。
【０１５７】
いくつかの実施形態において、細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む／発現する細胞、例えばＣＡＲ−Ｔ細胞であり得る。いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＡＲをコードする核酸またはベクターを含む／発現する細胞であり得る。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、抗原結合機能とＴ細胞活性化機能の両方を提供する組換え受容体である。ＣＡＲの構造および工学技術は、例えば、Ｄｏｔｔｉら，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ（２０１４）２５７（１）に概説されており、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１５８】
また、ＣＡＲを含む／発現する細胞、および本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体またはＣＡＲを含む／発現する細胞も提供される。細胞はＣＡＲ−Ｔ細胞であってもよい。Ｔ細胞へのＣＡＲのエンジニアリングは、養子Ｔ細胞療法のためのＴ細胞の増殖の際に生じるような、形質導入および増殖のためのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの培養中に行われ得る。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、細胞は抗原特異的Ｔ細胞である。本明細書の実施形態において、「抗原特異的」Ｔ細胞は、Ｔ細胞が特異的である抗原、または前記抗原を発現する細胞に応答して、Ｔ細胞の特定の機能特性を呈する細胞である。いくつかの実施形態では、特性は、エフェクターＴ細胞、例えば細胞傷害性Ｔ細胞に関連する機能的特性である。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞は、以下の特性のうちの１つまたは複数を呈し得る：例えば、Ｔ細胞が特異的である抗原を含む／発現する細胞に対する細胞傷害性；例えばＴ細胞が特異的である抗原またはＴ細胞が特異的である抗原を含む／発現する細胞に応答した増殖、ＩＦＮγ発現、ＣＤ１０７ａ発現、ＩＬ−２発現、ＴＮＦα発現、パーフォリン発現、グランザイム発現、グラニュリシン発現、および／またはＦＡＳリガンド（ＦＡＳＬ）発現。
【０１６１】
本明細書において、ＩＦＮγ、ＣＤ１０７ａ、ＩＬ−２、ＴＮＦα、パーフォリン、グランザイムおよび／またはＦＡＳＬの「発現」は、遺伝子発現またはタンパク質発現を指し得る。遺伝子発現は、当業者に公知の様々な手段、例えば、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）またはレポーターベースの方法によってｍＲＮＡのレベルを測定することにより、測定され得る。同様に、タンパク質発現は、例えばウエスタンブロット、免疫組織化学、免疫細胞化学、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴによる抗体ベースの方法、またはレポーターベースの方法などによって、当技術分野で周知の様々な方法により測定され得る。「発現の増加」は、Ｔ細胞が特異的である抗原またはＴ細胞が特異的である抗原を含む、もしくは発現する細胞と接触したことがないＴ細胞による遺伝子／タンパク質の発現レベル、あるいはＴ細胞が特異的である抗原を含まない、もしくは発現しない細胞に応答したＴ細胞による発現レベルよりも高い発現レベルを指す。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞が特異的である抗原は、ウイルス、例えばエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）であり得る。）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）またはヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）のペプチドまたはポリペプチドであり得る。
【０１６３】
また、本発明は、本発明に従う核酸またはベクターを細胞に導入する工程を含む、本発明に従う核酸またはベクターを含む細胞を製造する方法も提供する。本発明はまた、本発明に従う核酸またはベクターを細胞に導入する工程を含む、本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体またはＣＡＲを発現する細胞を製造する方法も提供する。いくつかの実施形態では、方法は、細胞による核酸またはベクターの発現に適した条件下で細胞を培養する工程を追加で含む。いくつかの実施形態では、方法はｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施される。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、本発明に従う単離された核酸またはベクターを細胞に導入する工程は、形質導入、例えばレトロウイルス形質導入を含む。したがって、いくつかの実施形態では、単離された核酸またはベクターは、ウイルスベクター中に含まれているか、またはベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、方法は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＫｏｈら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  −  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ（２０１３）２，ｅ１１４に記載されているように、エレクトロポレーションにより本発明に従う核酸またはベクターを導入する工程を含む。
【０１６５】
本発明はまた、本発明に従う細胞を製造するための方法により得られる、または得られ得る細胞も提供する。
組成物
本発明はまた、本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体、ＣＡＲ、核酸、ベクターまたは細胞、を含む組成物も提供する。
【０１６６】
本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体、ＣＡＲ、核酸、ベクターおよび細胞は、臨床使用のための医薬組成物として調合されてもよく、そして、医薬的に許容される担体、希釈剤、賦形剤またはアジュバントを含み得る。
【０１６７】
本発明に従えば、薬学的に有用な組成物の製造のための方法も提供され、そのような製造方法は、本明細書に記載のＴＧＦ−βデコイ受容体、ＣＡＲ、細胞、核酸またはベクターの単離を選択する工程；および／または、本明細書に記載のＴＧＦ−βデコイ受容体、ＣＡＲ、細胞、核酸またはベクターを薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤または希釈剤と混合する工程から選択される、１つまたは複数の工程を含み得る。
【０１６８】
例えば、本発明のさらなる態様は、癌の治療に使用するための医薬または医薬組成物を調合または製造する方法に関し、この方法は、本明細書に記載のＴＧＦ−βデコイ受容体、ＣＡＲ、細胞、核酸またはベクターを薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤または希釈剤と混合することにより、医薬組成物または医薬を調合する工程を含む。
【０１６９】
ＴＧＦ−βデコイ受容体およびＴＧＦ−βデコイ受容体を発現する細胞の特性
本発明のＴＧＦ−βデコイ受容体およびＣＡＲ、ならびにそのような受容体を発現する細胞は、特定の特性を参照することにより特徴付けられ得る。
【０１７０】
特に、本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体は、以下の特性の１つまたは複数を有し得る：
ＴＧＦ−β（例えばＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２またはＴＧＦ−β３）への結合；
ＴＧＦ−βとＴＧＦ−β受容体（例えばＴＧＦ−βＲ１、ＴＧＦ−βＲ２またはＴＧＦ−βＲ３）との間の相互作用の阻害；
ＴＧＦ−βを介したシグナル伝達の阻害；
ＴＧＦ−βのＴＧＦ−β受容体への結合により媒介されるシグナル伝達の阻害。
【０１７１】
細胞膜への付着；
脂質ラフトへの局在；
脂質ラフト凝集を誘発する能力；
脂質関連シグナル伝達を誘発する能力。
【０１７２】
本発明に従うＣＡＲもまた、そのような特性の１つまたは複数への言及によって特徴付けられてもよい。
ＴＧＦ−βに結合できるＴＧＦ−βデコイ受容体は、好ましくは、ＴＧＦ−β以外のタンパク質に結合するよりも、高い親和性で、および／または長い時間、ＴＧＦ−β（例えばＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２および／またはＴＧＦ−β３）に結合する。いくつかの実施形態では、本ＴＧＦ−βデコイ受容体は、ＴＧＦ−βに対して、ＴＧＦ−βサイトカインスーパーファミリーの１つまたは複数の他のメンバーよりも高い親和性で結合し得る。いくつかの実施形態では、本ＴＧＦ−βデコイ受容体は、ＴＧＦ−β（例えば、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２および／またはＴＧＦ−β３）に対して、ＴＧＦ−αよりも高い親和性で結合し得る。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−β以外のタンパク質への結合の程度は、例えばＥＬＩＳＡ、ＳＰＲ、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）、マイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）、またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）により測定されるＴＧＦ−βへのＴＧＦ−βデコイ受容体の結合の約１０％未満である。あるいは、ＴＧＦ−βの結合特異性は、結合親和性の観点から反映されてもよく、この場合、本発明のＴＧＦ−βデコイ受容体は、別の非標的分子に対するＫＤよりも少なくとも０．１桁大きいＫＤ（すなわち、０．１×１０ｎ、ここでｎは桁数を表す整数である）でＴＧＦ−βに結合する。これは場合により、少なくとも０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、または２．０のうちの１つであり得る。
【０１７４】
結合親和性は、解離定数（ＫＤ）で表され得る。結合親和性は、ＥＬＩＳＡ（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，第１巻（第２版），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（２０１０），第Ｖ部，ｐｐ６５７−６６５．に記載されているもの）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ；例えばＨｅａｒｔｙら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ（２０１２）９０７：４１１−４４２；もしくはＲｉｃｈら，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００８  Ｆｅｂ  １；３７３（１）：１１２−２０を参照）、バイオレイヤー干渉法（例えば、Ｌａｄら，（２０１５）Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  ２０（４）：４９８−５０７；もしくはＣｏｎｃｅｐｃｉｏｎら，Ｃｏｍｂ  Ｃｈｅｍ  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ．２００９  Ｓｅｐ；１２（８）：７９１−８００を参照）、マイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）分析（例えば、Ｊｅｒａｂｅｋ−Ｗｉｌｌｅｍｓｅｎら，Ａｓｓａｙ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１  Ａｕｇ；９（４）：３４２−３５３を参照）、または放射標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）などの当技術分野で知られている方法によって測定され得る。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体は、５μＭ以下、好ましくは≦１μＭ、≦５００ｎＭ、≦１００ｎＭ、≦７５ｎＭ、≦５０ｎＭ、≦４０ｎＭ、≦３０ｎＭ、≦２０ｎＭ、≦１５ｎＭ、≦１２．５ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦９ｎＭ、≦８ｎＭ、≦７ｎＭ、≦６ｎＭ、≦５ｎＭ、≦４ｎＭ≦３ｎＭ、≦２ｎＭ、≦１ｎＭ、≦５００ｐＭのうちの１つのＫＤでＴＧＦ−βに結合する。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体は、ＥＣ５０＝１０００ｎｇ／ｍｌ以下、好ましくは≦９００ｎｇ／ｍｌ、≦８００ｎｇ／ｍｌ、≦７００ｎｇ／ｍｌ、≦６００ｎｇ／ｍｌ、≦５００ｎｇ／ｍｌ、≦４００ｎｇ／ｍｌ、≦３００ｎｇ／ｍｌ、≦２００ｎｇ／ｍｌ、≦１００ｎｇ／ｍｌ、≦９０ｎｇ／ｍｌ、≦８０ｎｇ／ｍｌ、≦７０ｎｇ／ｍｌ、≦６０ｎｇ／ｍｌ、≦５０ｎｇ／ｍｌ、≦４０ｎｇ／ｍｌ、≦３０ｎｇ／ｍｌ、≦２０ｎｇ／ｍｌ、≦１５ｎｇ／ｍｌ、≦１０ｎｇ／ｍｌ、≦７．５ｎｇ／ｍｌ、≦５ｎｇ／ｍｌ、≦２．５ｎｇ／ｍｌ、または≦１ｎｇ／ｍｌのうちの１つの結合親和性（例えばＥＬＩＳＡにより決定される）でＴＧＦ−βに結合する。
【０１７７】
本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体は、ＴＧＦ−β媒介性シグナル伝達を阻害する。本明細書において、「阻害」とは、対照条件に対する低減、減少、または軽減を指す。例えば、ＴＧＦ−βデコイ受容体によるプロセスの阻害は、ＴＧＦ−βデコイ受容体の非存在下、および／または適切な対照受容体の存在下での、そのプロセスの範囲／程度の低減、減少、または軽減を指す。
【０１７８】
当業者は、所与のアッセイのための適切な対照条件を特定することができる。例えば、対照受容体は、アッセイで調査される特性に関与する役割を持たないことが知られている標的タンパク質に対する受容体であり得る。
【０１７９】
本明細書では、阻害は、中和または拮抗作用と呼ばれることもある。すなわち、機能またはプロセス（例えば、ＴＧＦ−βによって媒介される相互作用、シグナル伝達または他の活性）を阻害することができるＴＧＦ−βデコイ受容体は、関連する機能またはプロセスに関して「中和性」または「拮抗性」のＴＧＦ−βデコイ受容体であると言われ得る。例えば、ＴＧＦ−β媒介性シグナル伝達を阻害することができるＴＧＦ−βデコイ受容体は、ＴＧＦ−β媒介性シグナル伝達を中和することができるＴＧＦ−βデコイ受容体と呼ばれるか、またはＴＧＦ−β媒介性シグナル伝達のアンタゴニストと呼ばれてもよい。
【０１８０】
本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体は、好ましくは、ＴＧＦ−βへの結合について、ＴＧＦ−βの１つまたは複数の天然に存在する受容体、例えばＴＧＦ−βＲ１、ＴＧＦ−βＲ２、ＴＧＦ−βＲ３、またはＴＧＦ−βＲ１、ＴＧＦ−βＲ２、もしくはＴＧＦ−βＲ３のバリアント／アイソフォーム／ホモログもしくはＴＧＦ−β結合断片と競合する。いくつかの実施形態では、本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体は、ＴＧＦ−βＲ１、ＴＧＦ−βＲ２、ＴＧＦ−βＲ３、ならびにＴＧＦ−βＲ１、ＴＧＦ−βＲ２および／またはＴＧＦ−βＲ３のバリアント／アイソフォーム／ホモログおよびＴＧＦ−β結合断片のうちの１つまたは複数の結合の競合的阻害剤である。すなわち、いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−βデコイ受容体は、ＴＧＦ−βとＴＧＦ−βの１つまたは複数の天然に存在する受容体との間の相互作用を阻害できる。
【０１８１】
本明細書において使用される場合、「天然に存在する受容体」は、自然界に見られる受容体である。天然に存在する受容体および／またはその構成ペプチド／ポリペプチドは、所与の宿主種の内因性核酸からの転写、ｍＲＮＡプロセシング（例えば、スプライシング）、翻訳、および翻訳後プロセシング（例えば、タンパク質分解切断、グリコシル化）の産物であり得る。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体は、ＴＧＦ−βの１つまたは複数の天然に存在する受容体が結合する領域においてＴＧＦ−βに結合する。いくつかの実施形態において、ＴＧＦ−βデコイ受容体は、ＴＧＦ−βの１つまたは複数の天然に存在する受容体が結合する領域と同じＴＧＦ−βの領域または重複する領域に結合する。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−βの天然に存在する受容体はＴＧＦ−βＲ１、ＴＧＦ−βＲ２、ＴＧＦ−βＲ３である。いくつかの実施形態では、天然に存在するＴＧＦ−βの受容体はＴＧＦ−βＲ２である。
【０１８３】
ＴＧＦ−βデコイ受容体が、ＴＧＦ−βへの結合（すなわち、ＴＧＦ−βと天然に存在する受容体との相互作用の阻害）について、ＴＧＦ−βの天然に存在する受容体（例えば、ＴＧＦ−βＲ１、ＴＧＦ−βＲ２、ＴＧＦ−βＲ３、またはＴＧＦ−βＲ１、ＴＧＦ−βＲ２、ＴＧＦ−βＲ３のバリアント／アイソフォーム／ホモログもしくはＴＧＦ−β結合断片）と競合する能力は、例えば、ＴＧＦ−β、またはＴＧＦ−βおよび天然に存在する受容体と、ＴＧＦ−βデコイ受容体、またはＴＧＦ−βデコイ受容体を発現する細胞の存在下、またはインキュベーション後における、ＴＧＦ−βと天然に存在する受容体との間の相互作用の分析によって決定され得る。
【０１８４】
所与のＴＧＦ−βデコイ受容体がＴＧＦ−βへの結合について、ＴＧＦ−βＲ１、ＴＧＦ−βＲ２、ＴＧＦ−βＲ３、またはＴＧＦ−βＲ１、ＴＧＦ−βＲ２もしくはＴＧＦ−βＲ３のバリアント／アイソフォーム／ホモログもしくはＴＧＦ−β結合断片と競合するかどうかを判定する適切なアッセイの例は、競合ＥＬＩＳＡアッセイなどの競合結合アッセイである。
【０１８５】
所与の相互作用（例えば、ＴＧＦ−βとＴＧＦ−βＲ１、ＴＧＦ−βＲ２、またはＴＧＦ−βＲ３のうちの１つとの間）を阻害できるＴＧＦ−βデコイ受容体は、ＴＧＦ−βデコイ受容体またはＴＧＦ−βデコイ受容体を発現する細胞の非存在下（または適切な対照受容体／細胞の存在下）における相互作用のレベルと比較した、ＴＧＦ−βデコイ受容体、またはＴＧＦ−βデコイ受容体を発現する細胞の存在下−または相互作用バートナーの一方または両方のインキュベーション後−における相互作用パートナー間の相互作用のレベルの低減／減少の観察によって同定される。適切な分析は、例えば、組換え相互作用パートナーを用いて、または相互作用パートナーを発現する細胞を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施され得る。相互作用パートナーを発現する細胞は、内因的にそうであってもよく、または細胞に導入された核酸からそうであってもよい。そのようなアッセイの目的のために、相互作用パートナーおよび／またはＴＧＦ−βデコイ受容体の一方または両方は、相互作用のレベルを検出および／または測定する目的で、検出可能な要素と共に標識または使用され得る。
【０１８６】
また、そのようなアッセイは、ＴＧＦ−βデコイ受容体が、ＴＧＦ−βの１つまたは複数の天然に存在する受容体が結合する領域と同じＴＧＦ−βの領域または重複する領域に結合するかどうかを決定するのにも有用である。すなわち、ＴＧＦ−βデコイ受容体またはＴＧＦ−βデコイ受容体を発現する細胞の存在下−または相互作用パートナーの一方または両方のインキュベーション後−における、ＴＧＦ−βデコイ受容体／細胞の非存在下での相互作用のレベルと比較した、ＴＧＦ−β（例えば、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２またはＴＧＦ−β３）と、例えばＴＧＦ−βＲ１、ＴＧＦ−βＲ２またはＴＧＦ−βＲ３との間の相互作用のレベルの低減／減少の観察は、ＴＧＦ−βデコイ受容体がＴＧＦ−βの１つまたは複数の天然に存在する受容体が結合する領域と同じＴＧＦ−βの領域または重複する領域に結合することを示唆する。
【０１８７】
また、本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体が、天然に存在するＴＧＦ−βの受容体が結合する領域と同じＴＧＦ−βの領域か、または重複する領域においてＴＧＦ−βに結合するか否かは、受容体−リガンド複合体のＸ線共結晶解析、ペプチドスキャニング、突然変異誘発マッピング、質量分析による水素−重水素交換分析、ファージディスプレイおよびタンパク質分解に基づく「保護」法を含む、当技術分野で周知の様々な方法を使用した相互作用の分析によっても決定され得る。そのような方法は、例えば、Ｇｅｒｓｈｏｎｉら，ＢｉｏＤｒｕｇｓ，２００７，２１（３）：１４５−１５６に記載されており、参照により本明細書上に組み込まれる。
【０１８８】
また、２つの相互作用パートナー間の相互作用を阻害するＴＧＦ−βデコイ受容体の能力は、相互作用の下流の機能的結果、例えばＴＧＦ−β受容体シグナル伝達の分析によっても決定され得る。
【０１８９】
ＴＧＦ−βシグナル伝達のアッセイは、当技術分野で知られており、例えば、ＴＧＦ−βによる刺激に応答して転写が上方制御／下方制御される遺伝子の遺伝子発現アッセイ、ＴＧＦ−βシグナル伝達の細胞内メディエーターの活性化を分析するアッセイ（例えば、関連する因子のリン酸化の分析により決定される）、ＴＧＦ−βシグナル伝達に関連するタンパク質の発現／プロセシングの変化を分析するアッセイ、およびＴＧＦ−βシグナル伝達に関連する細胞の表現型の変化を分析するアッセイを含む。
【０１９０】
例えば、ＴＧＦ−βシグナル伝達のアッセイは、細胞をＴＧＦ−βで処置する工程、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ５、ＳＭＡＤ９およびｐ３８の１つまたは複数のリン酸化を分析する工程、および／または、ＣＲＥＢとＮＦκＢの１つまたは複数の発現を分析する工程を含み得る。ＴＧＦ−βシグナル伝達のアッセイは、例えば本開示の実施例８に記載されているようにして実施され得る。
【０１９１】
また、このようなアッセイは、ＴＧＦ−βによって媒介されるシグナル伝達、例えばＴＧＦ−β（例えばＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２またはＴＧＦ−β３）のＴＧＦ−β受容体（例えばＴＧＦ−βＲ１、ＴＧＦ−βＲ２またはＴＧＦ−βＲ３）への結合によって媒介されるシグナル伝達の分析のためにも有用である。
【０１９２】
本明細書において使用される場合、「ＴＧＦ−β媒介シグナル伝達」および／またはＴＧＦ−βにより媒介されるプロセスは、ＴＧＦ−βの断片およびＴＧＦ−βまたはその断片を含むポリペプチド複合体により媒介されるシグナル伝達を含む。ＴＧＦ−β媒介性シグナル伝達は、ヒトＴＧＦ−βおよび／またはマウスＴＧＦ−βによって媒介されるシグナル伝達であり得る。ＴＧＦ−βにより媒介されるシグナル伝達は、ＴＧＦ−βまたはＴＧＦ−β含有複合体が、ＴＧＦ−βまたは前記複合体が結合する受容体へ結合した後に起こり得る。
【０１９３】
遺伝子発現は、当業者に公知の様々な手段、例えば、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）またはレポーターベースの方法によってｍＲＮＡのレベルを測定することにより、測定され得る。同様に、タンパク質発現は、例えばウエスタンブロット、免疫組織化学、免疫細胞化学、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴによる抗体ベースの方法、またはレポーターベースの方法などによって、当技術分野で周知の様々な方法により測定され得る。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体、または受容体を発現する細胞は、ＴＧＦ−β（例えば、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２またはＴＧＦ−β３）とＴＧＦ−β受容体（例えば、ＴＧＦ−βＲ１、ＴＧＦ−βＲ２、またはＴＧＦ−βＲ３）との相互作用を、ＴＧＦ−βデコイ受容体またはＴＧＦ−βデコイ受容体を発現する細胞の非存在下（または適切なコントロール受容体／細胞の存在下）におけるＴＧＦ−βとＴＧＦ−β受容体との間の相互作用の１００％未満、例えば９９％以下、９５％以下、９０％以下、８５％以下、７５％以下、７０％以下、６５％以下、６０％以下、５５％以下、５０％以下、４５％以下、４０％以下、３５％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下、または１％以下のうちの１つのレベルにまで阻害できる。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−βデコイ受容体、または受容体を発現する細胞は、ＴＧＦ−βとＴＧＦ−β受容体との間の相互作用を、ＴＧＦ−βデコイ受容体またはＴＧＦ−βデコイ受容体を発現する細胞の非存在下（または適切な対照受容体／細胞の存在下）におけるＴＧＦ−βとＴＧＦ−β受容体との間の相互作用の１倍未満、例えば≦０．９９倍、≦０．９５倍、≦０．９倍、≦０．８５倍、≦０．８倍、≦０．８５倍、≦０．７５倍、≦０．７倍、≦０．６５倍、≦０．６倍、≦０．５５倍、≦０．５倍、≦０．４５倍、≦０．４倍、≦０．３５倍、≦０．３倍、≦０．２５倍、≦０．２倍、≦０．１５倍、≦０．１倍のうちの１つのレベルにまで阻害できる。
【０１９５】
いくつかの実施形態では、本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体は、ＴＧＦ−βの生物学的活性を阻害することができる。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−βデコイ受容体は、ＴＧＦ−βの受容体（例えばＴＧＦ−βＲ１、ＴＧＦ−βＲ２またはＴＧＦ−βＲ３）への結合に重要な領域でＴＧＦ−βに結合し、それにより、受容体への結合および／またはそれを介したシグナル伝達を妨害する。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体は、ＴＧＦ−βの受容体、例えばＴＧＦ−βＲ１、ＴＧＦ−βＲ２またはＴＧＦ−βＲ３を介するシグナル伝達により活性化される１つまたは複数のシグナル伝達経路のアンタゴニストである。いくつかの態様において、ＴＧＦ−βデコイ受容体は、ＴＧＦ−β受容体を含む１つまたは複数の免疫受容体複合体を介したシグナル伝達を阻害することができる。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体、または受容体を発現する細胞は、ＴＧＦ−β媒介性シグナル伝達を、ＴＧＦ−βデコイ受容体またはＴＧＦ−βデコイ受容体を発現する細胞の非存在下（または適切なコントロール受容体／細胞の存在下）におけるシグナル伝達の１００％未満、例えば９９％以下、９５％以下、９０％以下、８５％以下、７５％以下、７０％以下、６５％以下、６０％以下、５５％以下、５０％以下、４５％以下、４０％以下、３５％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下、または１％以下のうちの１つのレベルにまで阻害できる。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−βデコイ受容体、または受容体を発現する細胞は、ＴＧＦ−β媒介性シグナル伝達を、ＴＧＦ−βデコイ受容体またはＴＧＦ−βデコイ受容体を発現する細胞の非存在下（または適切な対照受容体／細胞の存在下）におけるシグナル伝達の１倍未満、例えば≦０．９９倍、≦０．９５倍、≦０．９倍、≦０．８５倍、≦０．８倍、≦０．８５倍、≦０．７５倍、≦０．７倍、≦０．６５倍、≦０．６倍、≦０．５５倍、≦０．５倍、≦０．４５倍、≦０．４倍、≦０．３５倍、≦０．３倍、≦０．２５倍、≦０．２倍、≦０．１５倍、≦０．１倍のうちの１つのレベルにまで阻害できる。
【０１９８】
そのようなシグナル伝達は、例えばＴＧＦ−β受容体（例えばＴＧＦ−βＲ１、ＴＧＦ−βＲ２またはＴＧＦ−βＲ３）を発現する細胞をＴＧＦ−βで処置することにより分析され得る。
【０１９９】
本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体は、例えば細胞膜アンカー領域を介して、ＴＧＦ−βデコイ受容体を発現する細胞の細胞膜に付着され得る。いくつかの実施形態では、細胞膜アンカー領域は、脂質アンカー、例えばＧＰＩアンカーを含むか、またはそれから成っていてもよい脂質アンカー領域であり得る。
【０２００】
いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−βデコイ受容体は、受容体と細胞膜またはその成分（例えばリン脂質）との会合（例えば共有結合）により、ＴＧＦ−βデコイ受容体を発現する細胞の細胞膜に付着し得る。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−βデコイ受容体は細胞膜二重層の外層に付着し得る。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−βデコイ受容体は、ＧＰＩアンカーと細胞膜またはその成分との会合を介して、ＴＧＦ−βデコイ受容体を発現する細胞の細胞膜に付着し得る。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−βデコイ受容体は、ＧＰＩアンカーの脂質成分と細胞膜の脂質成分との相互作用により、ＴＧＦ−βデコイ受容体を発現する細胞の細胞膜に付着し得る。
【０２０１】
ＧＰＩアンカータンパク質の放出は、ホスファチジルイノシトールのホスホジエステル結合を加水分解するホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）で処理することにより達成され得る。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−βデコイ受容体は、ＴＧＦ−βデコイ受容体を発現する細胞の細胞膜内の脂質ラフトに局在し得る。脂質ラフトへの局在化は、脂質アンカー領域（例えば、ＧＰＩアンカー）を介して行われ得る。
【０２０２】
脂質ラフトは、コレステロール、スフィンゴ糖脂質、スフィンゴミエリン、アシル鎖を有するリン脂質、およびＧＰＩ結合タンパク質、ならびに自然免疫受容体などの他の膜タンパク質が豊富であることにより特徴付けられる細胞膜の領域である（ＬｉｎｇｗｏｏｄとＳｉｍｍｏｎｓ  ２０１０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２７：４６−５０）。
【０２０３】
所与の因子の脂質ラフトへの局在化は、当技術分野で周知の手段により分析され得る。例えば、生細胞の脂質ラフトは、例えば蛍光標識で標識されることができ、脂質ラフトへの因子の局在化が分析および定量化され得る。脂質ラフト標識キットの１つの例は、Ｖｙｂｒａｎｔ（登録商標）ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５５５脂質ラフト標識キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｆｉｃ）である。所与の因子の脂質ラフトへの局在化は、その因子を発現する細胞からの脂質ラフト成分の分離、およびその後のその因子についての脂質ラフトの分析（例えば、抗体ベースの方法、例えばウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、免疫染色など、またはレポーターベースの方法）によっても分析され得る。脂質ラフトの単離および分析は、例えば、Ｌｅｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２０１３；１０６６：１３１−４５およびＬｅｍａｉｒｅ−Ｖｉｅｉｌｌｅら（２０１３）Ｂｉｏ−ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ３（１６）：ｅ８５４に記載されており、そのどちらもその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２０４】
いくつかの実施形態では、本発明のＴＧＦ−βデコイ受容体は、受容体を発現する細胞において脂質ラフト凝集を誘発し得る。いくつかの実施形態では、本発明のＴＧＦ−βデコイ受容体は、脂質関連シグナル伝達を誘発し得る。
【０２０５】
脂質ラフトの凝集は、例えば、Ｊａｎｅｓら  １９９９，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１４７（２）：４４７−４６１に記載されているようにして分析され得る。脂質関連シグナル伝達は、脂質シグナル伝達分子、例えばスフィンゴ脂質（セラミド、スフィンゴシン、スフィンゴシン−１−リン酸、グルコシルセラミド、セラミド−１−リン酸、ホスファチジルイノシトール二リン酸、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、血小板活性化因子（ＰＡＦ）、エンドカンナビノイド、プロスタグランジン、ヒドロキシ脂肪酸の脂肪酸エステル（ＦＡＨＦＡ）、レチノール誘導体、ステロイドホルモン、レチノイン酸またはプロスタグランジンによって媒介されるシグナル伝達であり得る。脂質関連シグナル伝達は、例えばｓｒｃ、ｒａｓまたはｒａｃの下流の活性化を伴い得る。脂質関連シグナル伝達は、例えば、脂質関連シグナル伝達により転写が上方制御／下方制御される遺伝子の遺伝子発現アッセイ、脂質関連シグナル伝達の細胞内メディエーターの活性化（例えば、関連因子のリン酸化の分析により決定される）を分析するアッセイ、脂質関連シグナル伝達に関連するタンパク質の発現／プロセシングの変化を分析するアッセイ、および脂質関連シグナル伝達に関連する細胞の表現型変化を分析するためのアッセイを用いて分析され得る。
【０２０６】
脂質ラフト凝集および脂質関連シグナル伝達は、強化されたＴ細胞受容体シグナル伝達を提供することができ、ＴＧＦ−β媒介性シグナル伝達の効果を逆転させ得る場合もある。脂質ラフト凝集および脂質関連シグナル伝達は、ｓｒｃ、ｒａｓ、ｒａｃまたはｓｏｘのうちの１つまたは複数の下流活性化を導くことができ、そのため、本発明のＴＧＦ−βデコイ受容体は、ＴＧＦ−βからの阻害シグナルをＴ細胞活性化のシグナルに変換できてもよい。このように、本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体を含む／発現する細胞に対するＴＧＦ−β処置の効果は、抑制的というよりも刺激的であり得る。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、本発明のＴＧＦ−βデコイ受容体は、別のＴＧＦ−β結合タンパク質よりも高い程度で、ＴＧＦ−βデコイ受容体を発現する細胞の脂質ラフトに局在化し得る。いくつかの実施形態において、本発明のＴＧＦ−βデコイ受容体は、ＴＧＦ−β受容体などの天然に存在するＴＧＦ−β結合タンパク質（例えば、ＴＧＦ−βＲ１、ＴＧＦ−βＲ２またはＴＧＦ−βＲ３）、ＢＡＭＢＩ（上記Ｏｎｉｃｈｔｃｈｏｕｋらに記載）、またはＤＮ−ＴＧＦ−βＲ２などのＢｏｌｌａｒｄら、Ｒｕｓｓｏら、Ｚｈａｎｇら、またはＰｅｎａｆｕｅｒｔｅら（上記）に記載のＴＧＦ−β結合タンパク質よりも高い程度でＴＧＦ−βデコイ受容体を発現する細胞の脂質ラフトに局在する。
【０２０８】
脂質ラフトへの所与の分子の局在化の程度は、例えば、関連する分子を発現している細胞の脂質ラフトおよび非脂質ラフト画分を分析し、脂質ラフトおよび／または非脂質ラフト画分に付随する分子の割合を決定することにより決定され得る。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、本発明のＴＧＦ−βデコイ受容体は、別のＴＧＦ−β結合タンパク質と比較して、受容体を発現している細胞において、より大きな程度で脂質ラフト凝集を誘導し得る。いくつかの実施形態では、本発明のＴＧＦ−βデコイ受容体は、別のＴＧＦ−β結合タンパク質と比較して、より大きな程度で脂質関連シグナル伝達を誘発し得る。
【０２１０】
本明細書において、脂質ラフトへの局在化、脂質ラフト凝集を誘導する能力、脂質関連シグナル伝達を「より大きな程度」で誘導する能力は、前記ＴＧＦ−β結合タンパク質を発現する細胞において、別のＴＧＦ−β結合タンパク質、例えばＴＧＦ−β受容体（例えばＴＧＦ−βＲ１、ＴＧＦ−βＲ２もしくはＴＧＦ−βＲ３）、ＢＡＭＢＩ（上記Ｏｎｉｃｈｔｃｈｏｕｋらに記載）、またはＤＮ−ＴＧＦ−βＲ２などといったＢｏｌｌａｒｄら、Ｒｕｓｓｏら、Ｚｈａｎｇら、もしくはＰｅｎａｆｕｅｒｔｅら（上記）に記載のＴＧＦ−β結合タンパク質によって示される局在化、脂質ラフト凝集の誘導、または脂質関連シグナル伝達の誘導の１倍より大きくてもよく、例えば、≧１．０１倍、≧１．０２倍、≧１．０３倍、≧１．０４倍、≧１．０５倍、≧１．０６倍、≧１．０７倍、≧１．０８倍、≧１．０９倍、≧１．１倍、≧１．２倍、≧１．３倍、≧１．４倍、≧１．５倍、≧１．６倍、≧１．７倍、≧１．８倍、≧１．９倍、≧２倍、≧２．１倍、≧２．２倍、≧２．３倍、≧２．４倍、≧２．５倍、≧２．６倍、≧２．７倍、≧２．８倍、≧２．９倍、≧３倍、≧３．５倍、≧４倍、≧４．５倍、≧５倍、≧６倍、≧７倍、≧８倍、≧９倍、≧１０倍、≧１５倍、≧２０倍、≧２５倍、≧３０倍、≧３５倍、≧４０倍、≧４５倍、≧５０倍、≧６０倍、≧７０倍、≧８０倍、≧９０倍、≧１００倍、≧２００倍、≧３００倍、≧４００倍、≧５００倍、≧６００倍、≧７００倍、≧８００倍、≧９００倍、≧１０００倍であり得る。
【０２１１】
いくつかの実施形態では、本発明のＴＧＦ−βデコイ受容体は、前記ＴＧＦ−β結合タンパク質を発現する細胞の表面における別のＴＧＦ−β結合タンパク質の発現レベルと比較して、ＴＧＦ−βデコイ受容体を発現する細胞の表面において増加した発現レベルを呈し得る。例えば、ＴＧＦ−βデコイ受容体は、細胞表面への輸送の改善を示したり、細胞膜とより安定して結合したり、細胞表面からの内部移行の減少を示したり、または細胞表面からの放出の減少を示したりしてもよい。
【０２１２】
ＴＧＦ−βデコイ受容体の表面発現レベルの増加は、シグナル伝達能力のあるＴＧＦ−β受容体への結合に利用可能なＴＧＦ−βの量が減少し、その結果、ＴＧＦ−β媒介性シグナル伝達の阻害が大きくなるという利点を伴う。
【０２１３】
いくつかの実施形態では、本発明のＴＧＦ−βデコイ受容体は、ＴＧＦ−β受容体（例えばＴＧＦ−βＲ１、ＴＧＦ−βＲ２もしくはＴＧＦ−βＲ３）、ＢＡＭＢＩ（上記Ｏｎｉｃｈｔｃｈｏｕｋらに記載）などの天然に生じるＴＧＦ−β結合タンパク質、またはＤＮ−ＴＧＦ−βＲ２などといったＢｏｌｌａｒｄら、Ｒｕｓｓｏら、Ｚｈａｎｇら、もしくはＰｅｎａｆｕｅｒｔｅら（上記）に記載のＴＧＦ−β結合タンパク質の、そのようなＴＧＦ−β結合タンパク質を発現する細胞における表面発現レベルと比較して、ＴＧＦ−βデコイ受容体を発現する細胞上において表面発現レベルの増加を示し得る。所与のタンパク質の細胞表面発現は、例えばウエスタンブロット、免疫組織化学、免疫細胞化学、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴによる抗体ベースの方法、またはレポーターベースの方法などによって、当技術分野で周知の様々な方法により測定され得る。
【０２１４】
例えば、ＴＧＦ−βデコイ受容体の細胞表面発現のアッセイは、デコイ受容体のＴＧＦ−β結合領域を認識することができる抗体を用いた分析を伴い得る。アッセイは、例えば本開示の実施例７に記載されているようにして実施されてもよい。
【０２１５】
細胞表面発現のレベルの増加は、前記ＴＧＦ−β結合タンパク質を発現する細胞において、別のＴＧＦ−β結合タンパク質、例えばＴＧＦ−β受容体（例えばＴＧＦ−βＲ１、ＴＧＦ−βＲ２もしくはＴＧＦ−βＲ３）、ＢＡＭＢＩ（上記Ｏｎｉｃｈｔｃｈｏｕｋらに記載）、またはＤＮ−ＴＧＦ−βＲ２などといったＢｏｌｌａｒｄら、Ｒｕｓｓｏら、Ｚｈａｎｇら、もしくはＰｅｎａｆｕｅｒｔｅら（上記）に記載のＴＧＦ−β結合タンパク質によって示される表面発現レベルの１倍より大きくてもよく、例えば、≧１．０１倍、≧１．０２倍、≧１．０３倍、≧１．０４倍、≧１．０５倍、≧１．０６倍、≧１．０７倍、≧１．０８倍、≧１．０９倍、≧１．１倍、≧１．２倍、≧１．３倍、≧１．４倍、≧１．５倍、≧１．６倍、≧１．７倍、≧１．８倍、≧１．９倍、≧２倍、≧２．１倍、≧２．２倍、≧２．３倍、≧２．４倍、≧２．５倍、≧２．６倍、≧２．７倍、≧２．８倍、≧２．９倍、≧３倍、≧３．５倍、≧４倍、≧４．５倍、≧５倍、≧６倍、≧７倍、≧８倍、≧９倍、≧１０倍、≧１５倍、≧２０倍、≧２５倍、≧３０倍、≧３５倍、≧４０倍、≧４５倍、≧５０倍、≧６０倍、≧７０倍、≧８０倍、≧９０倍、≧１００倍、≧２００倍、≧３００倍、≧４００倍、≧５００倍、≧６００倍、≧７００倍、≧８００倍、≧９００倍、≧１０００倍であり得る。
【０２１６】
いくつかの実施形態では、本発明のＴＧＦ−βデコイ受容体は、ＴＧＦ−βデコイ受容体を発現する細胞におけるＴＧＦ−β媒介シグナル伝達を、別のＴＧＦ−β結合タンパク質よりも高い程度で阻害し得る。例えば、ＴＧＦ−βデコイ受容体は、ＴＧＦ−β（例えばＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２またはＴＧＦ−β３）への結合の向上（例えば、より大きな親和性および／またはより大きな結合活性）、またはＴＧＦ−βとシグナル伝達能力のあるＴＧＦ−β受容体（例えばＴＧＦ−βＲ１、ＴＧＦ−βＲ２またはＴＧＦ−βＲ３）との相互作用を阻害する能力の向上を示し得る。
【０２１７】
所与のＴＧＦ−β結合タンパク質を発現する細胞によるＴＧＦ−β媒介性シグナル伝達は、本明細書に記載のように、例えば細胞をＴＧＦ−βで処置した後に分析され得る。
「より高い程度」でのＴＧＦ−β媒介性シグナル伝達の阻害は、別のＴＧＦ−β結合タンパク質、例えばＴＧＦ−β受容体（例えばＴＧＦ−βＲ１、ＴＧＦ−βＲ２もしくはＴＧＦ−βＲ３）、ＢＡＭＢＩ（上記Ｏｎｉｃｈｔｃｈｏｕｋらに記載）、またはＤＮ−ＴＧＦ−βＲ２などといったＢｏｌｌａｒｄら、Ｒｕｓｓｏら、Ｚｈａｎｇら、もしくはＰｅｎａｆｕｅｒｔｅら（上記）に記載のＴＧＦ−β結合タンパク質によって示されるＴＧＦ−β媒介性シグナル伝達の阻害の程度の１倍より大きくてもよく、例えば、≧１．０１倍、≧１．０２倍、≧１．０３倍、≧１．０４倍、≧１．０５倍、≧１．０６倍、≧１．０７倍、≧１．０８倍、≧１．０９倍、≧１．１倍、≧１．２倍、≧１．３倍、≧１．４倍、≧１．５倍、≧１．６倍、≧１．７倍、≧１．８倍、≧１．９倍、≧２倍、≧２．１倍、≧２．２倍、≧２．３倍、≧２．４倍、≧２．５倍、≧２．６倍、≧２．７倍、≧２．８倍、≧２．９倍、≧３倍、≧３．５倍、≧４倍、≧４．５倍、≧５倍、≧６倍、≧７倍、≧８倍、≧９倍、≧１０倍、≧１５倍、≧２０倍、≧２５倍、≧３０倍、≧３５倍、≧４０倍、≧４５倍、≧５０倍、≧６０倍、≧７０倍、≧８０倍、≧９０倍、≧１００倍、≧２００倍、≧３００倍、≧４００倍、≧５００倍、≧６００倍、≧７００倍、≧８００倍、≧９００倍、≧１０００倍であり得る。
【０２１８】
いくつかの実施形態では、本発明のＴＧＦ−βデコイ受容体は、別のＴＧＦ−β結合タンパク質を発現する細胞からのそのＴＧＦ−β結合タンパク質の分泌レベルよりも高い程度で、デコイ受容体を発現する細胞から分泌され得る。有利には、分泌されたＴＧＦ−βデコイ受容体は、可溶性ＴＧＦ−βに結合することができ、それにより、細胞シグナル伝達能力のあるＴＧＦ−β受容体に結合するために利用可能な可溶性ＴＧＦ−βのレベルを低下させる。
【０２１９】
細胞からの所与のタンパク質の分泌レベルは、タンパク質を発現する細胞の細胞培養上清中の受容体の量を測定することにより、例えば抗体ベースの方法により、例えばウエスタンブロット、免疫組織化学、免疫細胞化学、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴにより、あるいはレポーターベースの方法により分析され得る。
【０２２０】
前記ＴＧＦ−β結合タンパク質を発現する細胞からの「より高い程度」の分泌は、別のＴＧＦ−β結合タンパク質、例えばＴＧＦ−β受容体（例えばＴＧＦ−βＲ１、ＴＧＦ−βＲ２もしくはＴＧＦ−βＲ３）、ＢＡＭＢＩ（上記Ｏｎｉｃｈｔｃｈｏｕｋらに記載）、またはＤＮ−ＴＧＦ−βＲ２などといったＢｏｌｌａｒｄら、Ｒｕｓｓｏら、Ｚｈａｎｇら、もしくはＰｅｎａｆｕｅｒｔｅら（上記）に記載のＴＧＦ−β結合タンパク質の分泌の程度の１倍より大きくてもよく、例えば、≧１．０１倍、≧１．０２倍、≧１．０３倍、≧１．０４倍、≧１．０５倍、≧１．０６倍、≧１．０７倍、≧１．０８倍、≧１．０９倍、≧１．１倍、≧１．２倍、≧１．３倍、≧１．４倍、≧１．５倍、≧１．６倍、≧１．７倍、≧１．８倍、≧１．９倍、≧２倍、≧２．１倍、≧２．２倍、≧２．３倍、≧２．４倍、≧２．５倍、≧２．６倍、≧２．７倍、≧２．８倍、≧２．９倍、≧３倍、≧３．５倍、≧４倍、≧４．５倍、≧５倍、≧６倍、≧７倍、≧８倍、≧９倍、≧１０倍、≧１５倍、≧２０倍、≧２５倍、≧３０倍、≧３５倍、≧４０倍、≧４５倍、≧５０倍、≧６０倍、≧７０倍、≧８０倍、≧９０倍、≧１００倍、≧２００倍、≧３００倍、≧４００倍、≧５００倍、≧６００倍、≧７００倍、≧８００倍、≧９００倍、≧１０００倍であり得る。
【０２２１】
本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体を発現する細胞は、ＴＧＦ−βデコイ受容体を発現しない同等な細胞によるＴＧＦ−β媒介シグナル伝達のレベルと比較して、例えばＴＧＦ−βでの処置後、低減したＴＧＦ−β媒介シグナル伝達レベルを示し得る。細胞によるＴＧＦ−β媒介性シグナル伝達は、本明細書に記載されているようにして分析され得る。
【０２２２】
いくつかの実施形態では、本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体を発現する細胞は、（例えば、ＴＧＦ−βによる処置に応答して）ＴＧＦ−βデコイ受容体を発現していない同等な細胞によるシグナル伝達レベルの１００％未満、例えば９９％以下、９５％以下、９０％以下、８５％以下、７５％以下、７０％以下、６５％以下、６０％以下、５５％以下、５０％以下、４５％以下、４０％以下、３５％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下、または１％以下のうちの１つのＴＧＦ−β媒介シグナル伝達レベルを示す。いくつかの実施形態では、本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体を発現する細胞は、（例えば、ＴＧＦ−βによる処置に応答して）ＴＧＦ−βデコイ受容体を発現していない同等な細胞によるシグナル伝達レベルの１倍未満、例えば、≦０．９９倍、≦０．９５倍、≦０．９倍、≦０．８５倍、≦０．８倍、≦０．８５倍、≦０．７５倍、≦０．７倍、≦０．６５倍、≦０．６倍、≦０．５５倍、≦０．５倍、≦０．４５倍、≦０．４倍、≦０．３５倍、≦０．３倍、≦０．２５倍、≦０．２倍、≦０．１５倍、≦０．１倍のうちの１つのＴＧＦ−β媒介シグナル伝達レベルを示す。
【０２２３】
同様に、本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体を発現する細胞は、ＴＧＦ−βデコイ受容体を発現していない同等な細胞による応答のレベルと比較して、例えばＴＧＦ−βによる処置後、ＴＧＦ−β媒介性シグナル伝達に関連する応答レベルの低減を示し得る。すなわち、本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体を発現する細胞は、ＴＧＦ−βデコイ受容体を発現しない同等な細胞と比較して、ＴＧＦ−βによる処置に対する感受性の低下を示し得る。
【０２２４】
いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−βデコイ受容体を発現する細胞は、細胞の活性のＴＧＦ−β媒介抑制に対し、低下した感受性を示し得る。本発明のＴＧＦ−βデコイ受容体を発現する細胞は、ＴＧＦ−βデコイ受容体を発現しない同等な細胞と比較して、例えばＴＧＦ−βでの処置後に以下の特性のうちの１つまたは複数を示し得る：
増加した増殖速度；
１つまたは複数の増殖因子（例えばＩＬ−２）の発現増加；
生存率の上昇；
１つまたは複数の細胞傷害性／エフェクター因子（例えば、ＩＦＮγ、グランザイム、パーフォリン、グラニュリシン、ＣＤ１０７ａ、ＴＮＦα、ＦＡＳＬ）の発現増加；
増大した細胞傷害性；
抗癌効果の向上。
【０２２５】
いくつかの実施形態では、本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体を発現する細胞は、ＴＧＦ−βによる処置の非存在下における同じ細胞による特性のレベルと比較して、ＴＧＦ−βによる処置後に前の段落に記載された１つまたは複数の特性を示し得る。
【０２２６】
細胞は、造血起源の細胞、例えば、好中球、好酸球、好塩基球、樹状細胞、リンパ球、または単球であり得る。リンパ球は、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞または自然リンパ系細胞（ＩＬＣ）、またはそれらの前駆体であり得る。細胞は、例えばＣＤ３ポリペプチド（例えばＣＤ３γ  ＣＤ３ε  ＣＤ３ζまたはＣＤ３δ）、ＴＣＲポリペプチド（ＴＣＲαまたはＴＣＲβ）、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４またはＣＤ８を発現していてもよい。いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＡＲを含む、または発現することができる（またはＣＡＲをコードする核酸／ベクターを含む／発現することができる）；例えば、細胞はＣＡＲ−Ｔ細胞であってもよい。
【０２２７】
これらの特性は、当業者に周知の方法により分析され得る。
細胞または細胞集団の増殖または拡大の速度は、例えば、異なる時点での細胞数を測定することにより、または３Ｈ−チミジンの取り込みの分析、または例えば、ＦｕｌｃｈｅｒとＷｏｎｇ，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ（１９９９）７７（６）：５５９−５６４に記載されているＣＦＳＥ希釈アッセイにより、分析され得る。増殖および／または拡大は、ｉｎ  ｖｉｖｏで、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｅｘ  ｖｉｖｏの培養において測定され得る。
【０２２８】
増殖因子および細胞傷害性／エフェクター因子の遺伝子またはタンパク質の発現は、例えば、ｍＲＮＡレベルのｑＰＣＲ分析により、および／またはＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、イムノブロットなどといった関連タンパク質を検出するためのイムノアッセイに基づく方法により測定され得る。
【０２２９】
細胞の生存率／持続性（例えばｉｎ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｅｘ  ｖｉｖｏの培養での生存率／持続性）は、検出可能な標識で標識された細胞を検出することにより、経時的に細胞数をモニターすることにより決定され得る。
【０２３０】
細胞傷害性は例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＺａｒｉｔｓｋａｙａら，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ（２０１１），９（６）：６０１−６１６に概説されている方法のいずれか、例えば、５１Ｃｒ放出アッセイを使用して調査され得る。
【０２３１】
抗癌効果は、例えば、癌の細胞を殺すＴＧＦ−βデコイ受容体を発現する細胞の能力を例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏで分析することにより調査され得る。癌は、細胞に特異的な抗原を発現し得る。また、抗癌効果は、例えば、癌の動物モデルにおいて、本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体を発現する細胞の投与後、適切な対照条件との比較に基づき、癌の発生、進行または症状の重症度、および／または動物の生存率を分析することにより、ｉｎ  ｖｉｖｏで調査されてもよい。
【０２３２】
本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体を発現する細胞の遺伝子もしくはタンパク質の発現、増殖、拡大、生存率、細胞傷害性または抗癌効果の増加は、ＴＧＦ−βデコイ受容体を発現しない同等な細胞によって示される発現、増殖、拡大、生存率、細胞傷害性または抗癌効果のレベルの１倍より大きくてもよく、例えば、≧１．０１倍、≧１．０２倍、≧１．０３倍、≧１．０４倍、≧１．０５倍、≧１．０６倍、≧１．０７倍、≧１．０８倍、≧１．０９倍、≧１．１倍、≧１．２倍、≧１．３倍、≧１．４倍、≧１．５倍、≧１．６倍、≧１．７倍、≧１．８倍、≧１．９倍、≧２倍、≧２．１倍、≧２．２倍、≧２．３倍、≧２．４倍、≧２．５倍、≧２．６倍、≧２．７倍、≧２．８倍、≧２．９倍、≧３倍、≧３．５倍、≧４倍、≧４．５倍、≧５倍、≧６倍、≧７倍、≧８倍、≧９倍、≧１０倍、≧１５倍、≧２０倍、≧２５倍、≧３０倍、≧３５倍、≧４０倍、≧４５倍、≧５０倍、≧６０倍、≧７０倍、≧８０倍、≧９０倍、≧１００倍、≧２００倍、≧３００倍、≧４００倍、≧５００倍、≧６００倍、≧７００倍、≧８００倍、≧９００倍、≧１０００倍のうちの１つであり得る。
【０２３３】
いくつかの実施形態では、本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体を発現する細胞は、別のＴＧＦ−β結合タンパク質、例えば、ＴＧＦ−β受容体（例えば、ＴＧＦ−βＲ１、ＴＧＦ−βＲ２またはＴＧＦ−βＲ３）、ＢＡＭＢＩ（上記Ｏｎｉｃｈｔｃｈｏｕｋらに記載）、またはＤＮ−ＴＧＦ−βＲ２などのＢｏｌｌａｒｄら、Ｒｕｓｓｏら、Ｚｈａｎｇら、もしくはＰｅｎａｆｕｅｒｔｅら（上記）に記載のＴＧＦ−β結合タンパク質を発現する同等な細胞と比較して、細胞の活性のＴＧＦ−β媒介抑制に対し、低下した感受性を示し得る。
【０２３４】
いくつかの実施形態では、本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体を発現する細胞は、別のＴＧＦ−β結合タンパク質、例えば、ＴＧＦ−β受容体（例えば、ＴＧＦ−βＲ１、ＴＧＦ−βＲ２またはＴＧＦ−βＲ３）、ＢＡＭＢＩ（上記Ｏｎｉｃｈｔｃｈｏｕｋらに記載）、またはＤＮ−ＴＧＦ−βＲ２などのＢｏｌｌａｒｄら、Ｒｕｓｓｏら、Ｚｈａｎｇら、もしくはＰｅｎａｆｕｅｒｔｅら（上記）に記載のＴＧＦ−β結合タンパク質を発現する同等な細胞と比較して、例えば、ＴＧＦ−βによる処置後に、以下の特性の１つまたは複数を示し得る：
例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏにおける増殖または拡大の速度の増加；
１つまたは複数の増殖因子（例えばＩＬ−２）の発現増加；
生存率の上昇；
１つまたは複数の細胞傷害性／エフェクター因子（例えば、ＩＦＮγ、グランザイム、パーフォリン、グラニュリシン、ＣＤ１０７ａ、ＴＮＦα、ＦＡＳＬ）の発現増加；
増大した細胞傷害性；
抗癌効果の向上。
【０２３５】
本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体を発現する細胞の遺伝子もしくはタンパク質の発現、増殖、拡大、生存率、細胞傷害性または抗癌効果の増加は、別のＴＧＦ−β結合タンパク質、例えばＴＧＦ−β受容体（例えばＴＧＦ−βＲ１、ＴＧＦ−βＲ２もしくはＴＧＦ−βＲ３）、ＢＡＭＢＩ（上記Ｏｎｉｃｈｔｃｈｏｕｋらに記載）、またはＤＮ−ＴＧＦ−βＲ２などといったＢｏｌｌａｒｄら、Ｒｕｓｓｏら、Ｚｈａｎｇら、もしくはＰｅｎａｆｕｅｒｔｅら（上記）に記載のＴＧＦ−β結合タンパク質を発現する同等な細胞によって示される発現、増殖、拡大、生存率、細胞傷害性または抗癌効果のレベルの１倍より大きくてもよく、例えば、≧１．０１倍、≧１．０２倍、≧１．０３倍、≧１．０４倍、≧１．０５倍、≧１．０６倍、≧１．０７倍、≧１．０８倍、≧１．０９倍、≧１．１倍、≧１．２倍、≧１．３倍、≧１．４倍、≧１．５倍、≧１．６倍、≧１．７倍、≧１．８倍、≧１．９倍、≧２倍、≧２．１倍、≧２．２倍、≧２．３倍、≧２．４倍、≧２．５倍、≧２．６倍、≧２．７倍、≧２．８倍、≧２．９倍、≧３倍、≧３．５倍、≧４倍、≧４．５倍、≧５倍、≧６倍、≧７倍、≧８倍、≧９倍、≧１０倍、≧１５倍、≧２０倍、≧２５倍、≧３０倍、≧３５倍、≧４０倍、≧４５倍、≧５０倍、≧６０倍、≧７０倍、≧８０倍、≧９０倍、≧１００倍、≧２００倍、≧３００倍、≧４００倍、≧５００倍、≧６００倍、≧７００倍、≧８００倍、≧９００倍、≧１０００倍のうちの１つであり得る。
【０２３６】
治療的応用
本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体、ＣＡＲ、核酸、ベクター、細胞および医薬組成物は、治療的および予防的方法に用途を見出す。
【０２３７】
本発明は、医学的治療または予防の方法において使用するための、本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体、ＣＡＲ、核酸、ベクター、細胞または医薬組成物を提供する。また、本発明は、疾患または状態を治療または予防するための医薬の製造における、本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体またはＣＡＲ、核酸、ベクター、細胞または医薬組成物の使用も提供する。また、本発明は、対象に治療的または予防的有効量の本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体またはＣＡＲ、核酸、ベクター、細胞または医薬組成物を投与する工程を含む、疾患または状態を治療または予防する方法も提供する。
【０２３８】
特に、本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体、ＣＡＲ、核酸、ベクター、細胞および医薬組成物は、ＴＧＦ−β媒介性シグナル伝達に関連する疾患／状態を治療または予防することに用途を見出す。本明細書において説明されるように、本発明のＴＧＦ−βデコイ受容体、ＣＡＲ、核酸、細胞および組成物は、ＴＧＦ−β媒介性シグナル伝達のレベルを低下させることに用途を見出す。したがって、本発明のＴＧＦ−βデコイ受容体、ＣＡＲ、核酸、ベクター、細胞および組成物は、ＴＧＦ−β媒介性シグナル伝達のレベルの低減が治療上または予防上の利益をもたらすであろう疾患／状態の治療または予防に有用である。
【０２３９】
「治療」は、例えば、疾患／状態の発症または進行の低減、疾患／状態の症状の軽減、または疾患／状態の病理の低減であり得る。疾患／状態の治療または軽減は、疾患／状態の進行を防ぐため、例えば状態の悪化を防ぐため、または進展速度を遅くするために効果的であり得る。いくつかの実施形態では、治療または軽減は、疾患／状態の改善、例えば、疾患／状態の症状の低減、または疾患／状態の重症度／活動性の何らかの他の相関の低減をもたらし得る。疾患／状態の予防は、状態の悪化の予防、または疾患／状態の発症の予防、例えば、後期の慢性期に進展する初期段階の疾患／状態の予防を指し得る。
【０２４０】
いくつかの実施形態では、治療または予防される疾患または状態は、ＴＧＦ−β媒介性シグナル伝達に関連した疾患／状態（例えば、ＴＧＦ−β媒介性シグナル伝達が病理学的に関係付けられている疾患／状態）、および／またはＴＧＦ−β媒介性シグナル伝達がリスク要因である疾患／状態であり得る。いくつかの実施形態では、疾患／状態は、対照の状態と比較して増加したレベルのＴＧＦ−β媒介性シグナル伝達に関連していてもよい。
【０２４１】
治療は、ＴＧＦ−β媒介性シグナル伝達のレベルを低減させること、および／または、ＴＧＦ−β媒介性シグナル伝達に関連する応答のレベルを低減させることが目的とされ得る。
【０２４２】
いくつかの実施形態では、治療は、ＴＧＦ−β媒介性シグナル伝達のレベルを低減させることが目的とされ得る。本発明のＴＧＦ−βデコイ受容体、ＣＡＲ、核酸、ベクター、細胞および組成物の投与は、ＴＧＦ−βの隔離を通じて、ＴＧＦ−β媒介性シグナル伝達のレベルの低下を引き起こし得る。
【０２４３】
いくつかの実施形態では、治療は、対象、または対象の細胞、細胞集団、組織または器官におけるＴＧＦ−β媒介性シグナル伝達のレベルを低減させることが目的とされ得る。
いくつかの実施形態では、治療は、本発明のＴＧＦ−βデコイ受容体、ＣＡＲ、核酸またはベクターを含む／発現するように細胞または細胞集団を改変する工程を含むことができ、細胞または細胞集団はその後、ＴＧＦ−βに対する応答性がより低くなり得る。いくつかの実施形態では、治療は、本発明のＴＧＦ−βデコイ受容体、ＣＡＲ、核酸またはベクターを含む／発現するように改変された細胞または細胞集団を、対象に投与する工程を含み得る。
【０２４４】
いくつかの実施形態では、治療は、例えば本発明に従う細胞を投与することにより、または本発明に従う細胞を生成することにより、細胞／集団の活性のＴＧＦ−β媒介阻害に対する感受性がより低い免疫細胞または免疫細胞集団を対象に提供することが目的とされ得る。
【０２４５】
治療される対象は、任意の動物またはヒトであり得る。対象は、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトである。対象は非ヒト哺乳動物であってもよいが、より好ましくはヒトである。対象は男性でも女性でもよい。対象は患者であってもよい。対象は、治療を必要とする疾患または状態と診断されていてもよく、または、そのような疾患または状態を有している疑いがあってもよい。
【０２４６】
治療される対象は、適切なアッセイを使用して、例えば対象、または対象から得られたサンプル（例えば、細胞、組織、血液サンプル）の分析により決定されるＴＧＦ−β媒介性シグナル伝達レベルの上昇を示し得る。
【０２４７】
対象は、ＴＧＦ−β（例えばＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２および／またはＴＧＦ−β３）またはＴＧＦ−β受容体（例えば、ＴＧＦ−βＲ１、ＴＧＦ−βＲ２、および／またはＴＧＦ−βＲ３）などといったＴＧＦ−β媒介性シグナル伝達の正の調節因子／エフェクターの発現または活性レベルの増加を有していてもよく、または、ＴＧＦ−β媒介性シグナル伝達によって上方制御される因子の発現または活性レベルの増加を有していてもよい。対象は、ＴＧＦ−β媒介性シグナル伝達によって上方制御された活性レベルの増加を有していてもよい。
【０２４８】
対象は、ＴＧＦ−β媒介性シグナル伝達の負の調節因子の発現または活性レベルの低下を有していてもよく、または、ＴＧＦ−β媒介性シグナル伝達により下方制御される因子の発現または活性レベルの低下を有していてもよい。対象は、ＴＧＦ−β媒介性シグナル伝達により下方制御された活性レベルの低下を有していてもよい。
【０２４９】
増加／減少は、関連する疾患／状態の非存在下における発現／活性のレベル、例えば、健康な対照対象または健康な対照対象から得られたサンプルにおける発現／活性のレベルに比例し得る。
【０２５０】
いくつかの実施形態では、対象は、疾患または状態を発症／罹患するリスクにさらされていてもよい。
いくつかの実施形態では、治療または予防される疾患または状態は、癌であり得る。ＴＧＦ−β媒介性シグナル伝達は、様々な癌の発症／進行に関係付けられている。癌におけるＴＧＦβシグナル伝達は、例えばＮａｃｉｆとＳｈａｋｅｒ  ２０１４，ＡｋｈｕｒｓｔとＨａｔａ  ２０１２、およびＭｅｕｌｍｅｅｓｔｅｒとｔｅｎ  Ｄｉｊｋｅ  ２０１１（上記）に概説されている。
【０２５１】
癌は、望ましくない細胞増殖（または望ましくない細胞増殖により顕在化する疾患）、新生物または腫瘍、または望ましくない細胞増殖、新生物または腫瘍の増大したリスクまたは素因であり得る。癌は良性または悪性であり得、また、原発性または続発性（転移性）であり得る。
【０２５２】
新生物または腫瘍は、細胞の異常な成長または増殖であり得、任意の組織に位置し得る。組織の例は、副腎、副腎髄質、肛門、虫垂、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、盲腸、（脳を含む、または含まない）中枢神経系、小脳、子宮頸部、結腸、十二指腸、子宮内膜、上皮細胞（例えば、腎上皮）、胆嚢、食道、グリア細胞、心臓、回腸、空腸、腎臓、涙腺、喉頭、肝臓、肺、リンパ、リンパ節、リンパ芽球、上顎、縦隔、腸間膜、子宮筋層、上咽頭、大網、口腔、卵巣、膵臓、耳下腺、末梢神経系、腹膜、胸膜、前立腺、唾液腺、Ｓ状結腸、皮膚、小腸、軟部組織、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、舌、扁桃、気管、子宮、外陰部、白血球を含む。
【０２５３】
治療される腫瘍は、神経系または非神経系の腫瘍であり得る。神経系の腫瘍は、例えば、神経膠腫、髄芽腫、髄膜腫、神経線維腫、上衣腫、神経鞘腫、神経線維肉腫、星状細胞腫、および乏突起神経膠腫など、中枢神経系または末梢神経系のいずれかに起源し得る。非神経系の癌／腫瘍は、任意の他の非神経組織に起源し得、例は、黒色腫、中皮腫、リンパ腫、骨髄腫、白血病、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキンリンパ腫、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、肝癌、類表皮癌、前立腺癌、乳癌、肺癌、結腸癌、卵巣癌、膵臓癌、胸腺癌、ＮＳＣＬＣ、血液癌、および肉腫を含む。
【０２５４】
いくつかの実施形態では、治療される癌は、鼻咽頭癌（ＮＰＣ；例えば、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）陽性ＮＰＣ）、子宮頸癌（ＣＣ；例えば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）陽性ＣＣ）、中咽頭癌（ＯＰＣ；例えば、ＨＰＶ陽性ＯＰＣ）、胃癌（ＧＣ；例えば、ＥＢＶ陽性ＧＣ）、肝細胞癌（ＨＣＣ；例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）陽性ＨＣＣ）、肺癌（例えば、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ））、および頭頸部癌（例えば、唇、口、鼻、副鼻腔、咽頭または喉頭の組織に起源する癌、例えば、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ））のうちの１つまたは複数である。
【０２５５】
いくつかの実施形態では、癌はウイルスに関連するか、またはそれにより引き起こされる。いくつかの実施形態では、癌はＥＢＶ陽性癌である。いくつかの実施形態では、癌はＨＰＶ陽性癌である。
【０２５６】
いくつかの実施形態では、癌は、頭頸部癌、鼻咽頭癌（ＮＰＣ）、口腔咽頭癌（ＯＰＣ）、子宮頸癌（ＣＣ）、胃／胃癌、胃癌または肺癌のうちの１つである。
いくつかの実施形態では、癌は、ＴＧＦ−β（例えばＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２および／もしくはＴＧＦ−β３）またはＴＧＦ−β受容体（例えばＴＧＦ−βＲ１、ＴＧＦ−βＲ２および／もしくはＴＧＦ−βＲ３）を発現する癌である。癌は、当業者に周知の任意の適切な手段によって、ＴＧＦ−βまたはＴＧＦ−β受容体を発現すると決定され得る。ＴＧＦ−βまたはＴＧＦ−β受容体を発現している癌は、ＴＧＦ−βまたはＴＧＦ−β受容体の発現を検出することで識別され得る。
【０２５７】
いくつかの実施形態では、癌は、ＴＧＦ−β（例えばＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２および／またはＴＧＦ−β３）またはＴＧＦ−β受容体（例えばＴＧＦ−βＲ１、ＴＧＦ−βＲ２および／またはＴＧＦ−βＲ３）を過剰発現する。ＴＧＦ−βまたはＴＧＦ−β受容体の過剰発現は、同等な非癌細胞／非腫瘍組織によるＴＧＦ−βまたはＴＧＦ−β受容体の発現レベルよりも高いＴＧＦ−βまたはＴＧＦ−β受容体の発現レベルの検出によって決定され得る。
【０２５８】
いくつかの実施形態において、患者は、例えば対象から得られたサンプル中における、ＴＧＦ−βもしくはＴＧＦ−β受容体を発現するか、またはＴＧＦ−βもしくはＴＧＦ−β受容体を過剰発現する癌の検出に基づき、本発明に従う治療に選択され得る。
【０２５９】
発現は、遺伝子発現またはタンパク質発現であり得る。遺伝子発現は、例えば定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）による、例えばＴＧＦ−βまたはＴＧＦ−β受容体をコードするｍＲＮＡの検出により決定され得る。タンパク質発現は、例えば抗体ベースの方法、例えばウエスタンブロット、免疫組織化学、免疫細胞化学、フローサイトメトリー、またはＥＬＩＳＡによる、ＴＧＦ−βまたはＴＧＦ−β受容体タンパク質の検出により決定され得る。
【０２６０】
癌は、ＴＧＦ−β（例えばＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２および／またはＴＧＦ−β３）またはＴＧＦ−β受容体（例えば、ＴＧＦ−βＲ１、ＴＧＦ−βＲ２、および／またはＴＧＦ−βＲ３）などといったＴＧＦ−β媒介性シグナル伝達の正の調節因子／エフェクターの発現または活性レベルの増加を有していてもよく、または、ＴＧＦ−β媒介性シグナル伝達によって上方制御される因子の発現または活性レベルの増加を有していてもよい。癌は、ＴＧＦ−β媒介性シグナル伝達の負の調節因子の発現または活性レベルの低下を有していてもよく、または、ＴＧＦ−β媒介性シグナル伝達により下方制御される因子の発現または活性レベルの低下を有していてもよい。増加／減少は、同等な非癌細胞／組織における発現または活性のレベルに比較したものであり得る。
【０２６１】
いくつかの実施形態では、癌は、ＴＧＦ−β（例えばＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２および／またはＴＧＦ−β３）またはＴＧＦ−β受容体（例えばＴＧＦ−βＲ１、ＴＧＦ−βＲ２および／またはＴＧＦ−βＲ３）における変異に関連していてもよい。いくつかの実施形態では、そのような変異は、遺伝子またはタンパク質の発現レベルの増加と関連していてもよく、または、変異の非存在下で観察される発現／シグナル伝達のレベルに対して増加したＴＧＦ−β媒介性シグナル伝達レベルと関連していてもよい。
【０２６２】
いくつかの実施形態では、治療される疾患／状態は、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、腎線維症、心臓線維症（例えば、心筋梗塞、虚血、拡張型および肥大性心筋症および鬱血性心不全）などの線維症、強皮症、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、冠動脈バイパス術または血管形成術後の再狭窄、マルファン症候群、（例えば、緑内障の治療のための線維柱帯切除術後、または角膜手術後の）眼の状態における術後瘢痕、糖尿病および肥満のうちの１つであり得る。
【０２６３】
いくつかの実施形態では、疾患／状態は、Ｔ細胞機能障害であり得る。Ｔ細胞機能障害は、正常なＴ細胞機能が損なわれ、例えば、微生物、細菌、ウイルスなどといった外因性因子による感染によって、または（例えば、腫瘍関連抗原の形で）ある種の癌など、いくつかの疾患状態において宿主により生成される病原体抗原に対する対象の免疫応答の下方制御を引き起こす疾患または状態であり得る。Ｔ細胞機能障害の障害された機能は、例えば、Ｔ細胞が特異的である抗原を含む／発現する細胞に対する細胞傷害性；例えばＴ細胞が特異的である抗原またはＴ細胞が特異的である抗原を含む／発現する細胞に応答した増殖、ＩＦＮγ発現、ＣＤ１０７ａ発現、ＩＬ−２発現、ＴＮＦα発現、パーフォリン発現、グランザイム発現、グラニュリシン発現、および／またはＦＡＳリガンド（ＦＡＳＬ）発現のうちの１つまたは複数であり得る。
【０２６４】
いくつかの実施形態では、治療は、Ｔ細胞の以下の特性のうちの１つまたは複数を増加／増強することが目的とされ得る：例えば、Ｔ細胞が特異的である抗原を含む／発現する細胞に対する細胞傷害性；例えばＴ細胞が特異的である抗原またはＴ細胞が特異的である抗原を含む／発現する細胞に応答した増殖、ＩＦＮγ発現、ＣＤ１０７ａ発現、ＩＬ−２発現、ＴＮＦα発現、パーフォリン発現、グランザイム発現、グラニュリシン発現、および／またはＦＡＳリガンド（ＦＡＳＬ）発現。いくつかの実施形態では、治療は、以下の特性のうちの１つまたは複数のレベルが増加／増強されたＴ細胞またはＴ細胞集団を提供または生成することが目的とされ得る：例えば、Ｔ細胞が特異的である抗原を含む／発現する細胞に対する細胞傷害性；例えばＴ細胞が特異的である抗原またはＴ細胞が特異的である抗原を含む／発現する細胞に応答した増殖、ＩＦＮγ発現、ＣＤ１０７ａ発現、ＩＬ−２発現、ＴＮＦα発現、パーフォリン発現、グランザイム発現、グラニュリシン発現、および／またはＦＡＳＬ発現。
【０２６５】
Ｔ細胞機能障害は、感染症として、または感染症に対して効果的な免疫応答を開始できないこととして顕在化され得る。感染は、慢性、持続性、潜伏性または遅発性であり得、細菌、ウイルス、真菌または寄生虫感染の結果であり得る。よって、治療は、細菌、ウイルスまたは真菌の感染症を有する患者に提供されてもよい。細菌感染の例は、ピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）による感染を含む。ウイルス感染の例は、ＨＰＶ、ＥＢＶ、ＨＩＶ、ＨＢＶ、およびＨＣＶによる感染を含む。Ｔ細胞機能障害は、癌に関連していてもよい。
【０２６６】
治療は、Ｔ細胞機能障害の予防、例えば、感染の予防、癌の発症または進行の予防が目的とされ得る。よって、本発明のＴＧＦ−βデコイ受容体、ＣＡＲ、核酸、ベクター、細胞および組成物は、疾患または疾患状態の発症／進行に対する予防に使用され得る。これは、疾患または疾患状態の症状の発症前に行われてもよく、および／または、疾患または疾患状態の発症／進行のより高いリスクにあると考えられる対象に与えられ得る。
【０２６７】
また、医学的治療の方法はｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏを含み、自己および／または異種細胞または不死化細胞株を使用するものを含む養子免疫療法も伴い得る。
投与
投与は好ましくは、個体に対して利益を示すのに十分である「治療的有効量」である。実際に投与される量、および投与の速度と時間経過は、治療される疾患の性質と重症度に依存する。治療の処方、例えば投与量などの決定は、一般開業医および他の医師の責任の範囲内であり、通常、治療される状態、個々の患者の状態、送達の場所、投与の方法、および開業医に知られている他の因子を考慮する。上記の手法とプロトコルの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第２０版，２０００，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ出版の中に見出され得る。
【０２６８】
本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体、ＣＡＲ、核酸、ベクターおよび細胞は、臨床使用のための医薬組成物または医薬として調合されてもよく、そして、医薬的に許容される担体、希釈剤、賦形剤またはアジュバントを含み得る。組成物は、注射または注入を含み得る、局所、非経口、全身、腔内、静脈内、動脈内、筋肉内、くも膜下腔内、眼内、結膜内、腫瘍内、皮下、皮内、くも膜下、経口または経皮投与経路用に調合され得る。適切な調合物は、無菌または等張性媒体中に、ＴＧＦ−βデコイ受容体、ＣＡＲ、核酸、ベクター、または細胞を含み得る。医薬および医薬組成物は、ゲルを含む液体の形態で調合されてもよい。液体調合物は、ヒトまたは動物の体の選択された領域への（例えばカテーテルを介した）注射または注入による投与用に調合されてもよい。
【０２６９】
本発明に従えば、薬学的に有用な組成物の製造のための方法も提供され、そのような製造方法は、本明細書に記載のＴＧＦ−βデコイ受容体、ＣＡＲ、核酸、ベクター、または細胞の単離を選択する工程；および／または、本明細書に記載のＴＧＦ−βデコイ受容体、ＣＡＲ、核酸、ベクター、または細胞を薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤または希釈剤と混合する工程から選択される、１つまたは複数の工程を含み得る。
【０２７０】
例えば、本発明のさらなる態様は、医学的治療方法に使用するための医薬または医薬組成物を調合または製造する方法に関し、この方法は、本明細書に記載のＴＧＦ−βデコイ受容体、ＣＡＲ、核酸、ベクター、または細胞を薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤または希釈剤と混合することにより、医薬組成物または医薬を調合する工程を含む。
【０２７１】
本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体、ＣＡＲ、核酸、ベクター、細胞または組成物の投与は、好ましくは、対象に利益を示すのに十分である「治療的有効」または「予防的有効」量である。実際に投与される量、および投与の速度と時間経過は、病気または疾患の性質と重症度に依存する。治療の処方、例えば投与量などの決定は、一般開業医および他の医師の責任の範囲内であり、通常、治療される病気／疾患、個々の対象の状態、送達の場所、投与の方法、および開業医に知られている他の因子を考慮する。上記の手法とプロトコルの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第２０版，２０００，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ出版の中に見出され得る。
【０２７２】
投与は、治療される状態に応じて、単独または他の治療との組み合わせで、同時または逐次的のいずれかで行われ得る。本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体、ＣＡＲ、核酸、ベクター、細胞または組成物と治療薬は、同時にまたは連続して投与され得る。
【０２７３】
いくつかの実施形態では、本発明のＴＧＦ−βデコイ受容体、ＣＡＲ、核酸、ベクター、細胞または組成物による治療には、他の治療的または予防的介入、例えば化学療法、免疫療法、放射線療法、手術、ワクチン接種および／またはホルモン療法が付随してもよい。
【０２７４】
同時投与とは、ＴＧＦ−βデコイ受容体、ＣＡＲ、核酸、ベクター、細胞または組成物と治療薬を、例えば、両方の薬剤を含む医薬組成物（併用調製物）として、または互いの直後に、場合により、例えば同じ動脈、静脈、または他の血管へ同じ投与経路で、一緒に投与することを指す。連続投与とは、ＴＧＦ−βデコイ受容体、ＣＡＲ、核酸、ベクター、細胞または組成物または治療薬の１つを投与し、その後、所与の時間間隔の後、他の薬剤を別個に投与することを指す。いくつかの実施形態ではそうであるが、２つの薬剤が同じ経路で投与される必要はない。時間間隔は、任意の時間間隔であり得る。
【０２７５】
化学療法と放射線療法はそれぞれ、薬剤または電離放射線による癌の治療を指す（例えば、Ｘ線またはγ線を使用した放射線療法）。薬剤は、化学物質、例えば低分子医薬品、抗生物質、ＤＮＡインターカレーター、タンパク質阻害剤（例えばキナーゼ阻害剤）、または、生物学的因子、例えば抗体、抗体断片、核酸もしくはペプチドアプタマー、核酸（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ）、ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質であり得る。薬剤は、医薬組成物または医薬として調合され得る。調合物は、１つまたは複数の薬剤（例えば、１つまたは複数の活性薬剤）と、１つまたは複数の薬学的に許容される希釈剤、賦形剤または担体とを含んでいてもよい。
【０２７６】
治療は、複数の薬剤の投与を含み得る。薬剤は、単独または他の治療との組み合わせで、治療される状態に応じて、同時または逐次的のいずれかで投与され得る。例えば、化学療法は、２種類の薬剤の投与を伴う併用療法であり得、そのうちの１つまたは複数が癌を治療することが意図され得る。
【０２７７】
化学療法は、例えば非経口、静脈内注射、経口、皮下、皮内または腫瘍内など、１つまたは複数の投与経路で投与されてもよい。
化学療法は、治療レジメンに従って投与され得る。治療レジメンは、医師または開業医によって準備され、治療を必要とする患者に合うように調整され得る化学療法投与の予定されたタイムテーブル、計画、スキームまたはスケジュールであり得る。
【０２７８】
治療レジメンは、患者に投与する化学療法の種類；各薬剤または放射線の量；投与間の時間間隔；各治療の長さ；（もしあれば）治療の休暇の数と性質などのうちの１つまたは複数を指し示しうる。併用療法の場合、各薬剤がどのように投与されるかを指し示す単一の治療レジメンが提供され得る。
【０２７９】
化学療法剤および生物製剤は、以下から選択され得る：シスプラチン、カルボプラチン、メクロレタミン、シクロホスファミド、クロラムブシル、イホスファミドなどのアルキル化剤；アザチオプリンまたはメルカプトプリンなどのプリンまたはピリミジン代謝拮抗剤；ビンカアルカロイド（例えばビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシン）、ポドフィロトキシン、エトポシド、テニポシド、パクリタキセル（タキソール（商標））、ドセタキセルなどのタキサンなどのアルカロイドおよびテルペノイド；Ｉ型トポイソメラーゼ阻害剤カンプトテシン、イリノテカンおよびトポテカン、またはＩＩ型トポイソメラーゼ阻害剤アムサクリン、エトポシド、リン酸エトポシド、テニポシドなどのトポイソメラーゼ阻害剤；ダクチノマイシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン（商標））、エピルビシン、ブレオマイシン、ラパマイシンなどの抗腫瘍抗生物質（例えばアントラサイクリン抗生物質）；例がセツキシマブ、パニツムマブ、インフリキシマブ、バシリキシマブ、ベバシズマブ（アバスチン（登録商標））、アブシキシマブ、ダクリズマブ、ゲムツズマブ、アレムツズマブ、リツキシマブ（マブセラ（登録商標）、パリビズマブ、トラスツズマブ、エタネルセプト、アダリムマブ、ニモツズマブを含む、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＴＩＭ−３抗体、抗ＣＴＬＡ−４、抗４−１ＢＢ、抗ＧＩＴＲ、抗ＣＤ２７、抗ＢＬＴＡ、抗ＯＸ４３、抗ＶＥＧＦ、抗ＴＮＦα、抗ＩＬ−２、抗ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ、抗ＣＤ−５２、抗ＣＤ２０、抗ＲＳＶ、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ（ｅｒｂＢ２）、抗ＴＮＦ受容体、抗ＥＧＦＲ抗体、モノクローナル抗体、または抗体断片などの抗体ベースの薬剤；エルロチニブ、セツキシマブ、ゲフィチニブなどのＥＧＦＲ阻害剤；ベバシズマブ（アバスチン（登録商標））などの抗血管新生剤；シプリューセル−Ｔ（プロベンジ（登録商標））などの癌ワクチン。
【０２８０】
さらなる化学療法剤が、以下から選択されてもよい：１３−シス−レチノイン酸、２−クロロデオキシアデノシン、５−アザシチジン５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、アブラキサン、アキュタン（登録商標）、アクチノマイシン−Ｄ  アドリアマイシン（登録商標）、アドルシル（登録商標）、アフィニトール（登録商標）、アグリリン（登録商標）、アラコート（登録商標）、アルデスロイキン、アレムツズマブ、ＡＬＩＭＴＡ、アリトレチノイン、アルカバン−ＡＱ（登録商標）、アルケラン（登録商標）、オールトランスレチノイン酸、アルファインターフェロン、アルトレタミン、アメトプテリン、アミフォスチン、アミノグルテチミド、アナグレリド、アナンドロン（登録商標）、アナストロゾール、アラビノシルシトシン、アラネスプ（登録商標）、アレディア（登録商標）、アリミデックス（登録商標）、アロマシン（登録商標）、アラノン（登録商標）、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、ＡＴＲＡアバスチン（登録商標）、アザシチジン、ＢＣＧ、ＢＣＮＵ、ベンダムスチン、ベバシズマブ、ベキサロテン、ＢＥＸＸＡＲ（登録商標）、ビカルタミド、ＢｉＣＮＵ、ブレノキサン（登録商標）、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブスルファン、ブスルフェクス（登録商標）、カルシウムロイコボリン、カンパス（登録商標）、カンプトサール（登録商標）、カンプトテシン−１１、カペシタビン、カラック（商標）、カルボプラチン、カルムスチン、カソデックス（登録商標）、ＣＣ−５０１３、ＣＣＩ−７７９、ＣＣＮＵ、ＣＤＤＰ、ＣｅｅＮＵ、セルビジン（登録商標）、セツキシマブ、クロラムブシル、シスプラチン、シトロボラム因子、クラドリビン、コルチゾン、コスメゲン（登録商標）、ＣＰＴ−１１、シクロホスファミド、シタドレン（登録商標）、シタラビン  シトサール−Ｕ（登録商標）、シトキサン（登録商標）、ダコゲン、ダクチノマイシン、ダルベポエチンアルファ、ダサチニブ、ダウノマイシン、ダウノルビシン、ダウノルビシン塩酸塩、ダウノルビシンリポソーム、ダウノキソーム（登録商標）、デカドロン、デシタビン、デルタ−コルテフ（登録商標）、デルタソン（登録商標）、デニロイキン、ジフチトックス、デポサイト（商標）、デキサメタゾン、酢酸デキサゾン、デキサゾキサンリン酸ナトリウム、デキサゾン、デクスラゾキサン、ＤＨＡＤ、ＤＩＣ、ディオデクス、ドセタキセル、ドキシル（登録商標）、ドキソルビシン、ドキソルビシンリポソーム、ドロキシア（商標）、ＤＴＩＣ、ＤＴＩＣ−ドーム（登録商標）、デュラロン（登録商標）、エリガード（商標）、エレンス（商標）、エロキサチン（商標）、エルスパル（登録商標）、エムシット（登録商標）、エピルビシン、エポエチンアルファ、エルビタックス、エルロチニブ、エルウィニアＬ−アスパラギナーゼ、エストラムスチン、エトロール  エトポホス（登録商標）、エトポシド、リン酸エトポシド、ユーレキシン（登録商標）、エベロリムス、エビスタ（登録商標）、エキセメスタン、ファスロデックス（登録商標）、フェマラ（登録商標）、フィルグラスチム、フロクスウリジン、フルダラ（登録商標）、フルダラビン、フルオロプレックス（登録商標）、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド、フォリン酸、ＦＵＤＲ（登録商標）、フルベストラント、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ゲムツズマブオゾガマイシン、グリベック（商標）、グリアデル（登録商標）ウエハー、ゴセレリン、顆粒球−コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ハーセプチン（登録商標）、ヘキサドロール、ヘキサレン（登録商標）、ヘキサメチルメラミン、ＨＭＭ、ハイカムチン（登録商標）、ハイデア（登録商標）、酢酸ヒドロコルト（登録商標）、ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾンリン酸ナトリウム、ヒドロコルチゾンコハク酸ナトリウム、リン酸ヒドロコルトン、ヒドロキシ尿素、イブリツモマブ、イブリツモマブチウキセタン、イダマイシン（登録商標）、イダルビシン、Ｉｆｅｘ（登録商標）、ＩＦＮ−アルファ、イホスファミド、ＩＬ−１１、ＩＬ−２、メシル酸イマチニブ、イミダゾールカルボキサミド、インターフェロンアルファ、インターフェロンアルファ−２ｂ（ＰＥＧコンジュゲート）、インターロイキン−２、インターロイキン−１１、イントロンＡ（登録商標）（インターフェロンアルファ−２ｂ）、イレッサ（登録商標）、イリノテカン、イソトレチノイン、イキサベピロン、イクセンプラ（商標）、キドラーゼ、ラナコルト（登録商標）、ラパチニブ、Ｌ−アスパラギナーゼ、ＬＣＲ、レナリドマイド、レトロゾール、ロイコボリン、ロイケラン、ロイキン（商標）、ロイプロリド、ロイロクリスチン、ロイスタチン（商標）、リポソームＡｒａ−Ｃ、リキッドプレド（登録商標）、ロムスチン、Ｌ−ＰＡＭ、Ｌ−サルコリシン、ルプロン（登録商標）、ルプロンデポ（登録商標）、マツラン（登録商標）、マキシデックス、メクロレタミン、塩酸メクロレタミン、メドロロン（登録商標）、メドロール（登録商標）、メゲース（登録商標）、メゲストロール、酢酸メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メスネクス（商標）、メトトレキサート、メトトレキサートナトリウム、メチルプレドニゾロン、メチコルテン（登録商標）、マイトマイシン、マイトマイシン−Ｃ、ミトキサントロン、Ｍ−プレドニソル（登録商標）、ＭＴＣ、ＭＴＸ、ムスターゲン（登録商標）、ムスチン、ムタマイシン（登録商標）、ミレラン（登録商標）、ミロセル（商標）、ミロターグ（登録商標）、ナベルバイン（登録商標）、ネララビン、ネオサール（登録商標）、ノイラスタ（商標）、ノイメガ（登録商標）、ニューポゲン（登録商標）、ネクサバール（登録商標）、ニランドロン（登録商標）、ニルタミド、ニペント（登録商標）、ナイトロジェンマスタード、ノルバルデクス（登録商標）、ノバントロン（登録商標）、オクトレオチド、酢酸オクトレオチド、オンコスパー（登録商標）、オンコビン（登録商標）、オンタック（登録商標）、オンクサル（商標）、オプレルベキン、オラプレド（登録商標）、オラソン（登録商標）、オキサリプラチン、パクリタキセル、タンパク質結合パクリタキセル、パミドロネート、パニツムマブ、パンレチン（登録商標）、パラプラチン（登録商標）、ペディアプレド（登録商標）、ＰＥＧインターフェロン、ペガスパルガーゼ、ペグフィルグラスチム、ＰＥＧ−ＩＮＴＲＯＮ（商標）、ＰＥＧ−Ｌ−アスパラギナーゼ、ＰＥＭＥＴＲＥＸＥＤ、ペントスタチン、フェニルアラニンマスタード、プラチノール（登録商標）、プラチノール−ＡＱ（登録商標）、プレドニゾロン、プレドニゾン、プレロン（登録商標）、プロカルバジン、ＰＲＯＣＲＩＴ（登録商標）、プロロイキン（登録商標）、カルムスチンインプラントを伴うプロリフェプロスパン２０  プリネトール（登録商標）、ラロキシフェン、レブリミド（登録商標）、リウマトレクス（登録商標）、リツキサン（登録商標）、リツキシマブ、ロフェロン−Ａ（登録商標）（インターフェロンアルファ−２ａ）、ルベックス（登録商標）、塩酸ルビドマイシン、サンドスタチン（登録商標）、サンドスタチンＬＡＲ（登録商標）、サルグラモスチム、ソルコルテフ（登録商標）、ソルメドロール（登録商標）、ソラフェニブ、ＳＰＲＹＣＥＬ（商標）、ＳＴＩ−５７１、ストレプトゾシン、ＳＵ１１２４８、スニチニブ、スーテント（登録商標）、タモキシフェン、タルセバ（登録商標）、タルグレチン（登録商標）、タキソール（登録商標）、タキソテール（登録商標）、テモダール（登録商標）、テモゾロミド、テムシロリムス、テニポシド、ＴＥＳＰＡ、サリドマイド、タロミド（登録商標）、セラシス（登録商標）、チオグアニン、チオグアニンタブロイド（登録商標）、チオホスホアミド、チオプレックス（登録商標）、チオテパ、ＴＩＣＥ（登録商標）、トポサール（登録商標）、トポテカン、トレミフェン、トリセル（登録商標）、トシツモマブ、トラスツズマブ、トレアンダ（登録商標）、トレチノイン、トレクサール（商標）、トリセノックス（登録商標）、ＴＳＰＡ、ＴＹＫＥＲＢ（登録商標）、ＶＣＲ、ベクティビックス（商標）、ベルバン（登録商標）、ベルケード（登録商標）、ＶｅＰｅｓｉｄ（登録商標）、ベサノイド（登録商標）、ヴィアドゥール（商標）、ヴィダザ（登録商標）、ビンブラスチン、硫酸ビンブラスチン、ビンカサールＰｆｓ（登録商標）、ビンクリスチン、ビノレルビン、酒石酸ビノレルビン、ＶＬＢ、ＶＭ−２６、ボリノスタット、ＶＰ−１６、ヴモン（登録商標）、ゼローダ（登録商標）、ザノサール（登録商標）、ゼバリン（商標）、ジネカード（登録商標）、ゾラデックス（登録商標）、ゾレドロン酸、ゾリンザ、ゾメタ（登録商標）。
【０２８１】
ＴＧＦ−βデコイ受容体、ＣＡＲ、核酸、ベクター、細胞または組成物の複数回投与が提供され得る。１つまたは複数の、または各々の投与には、別の治療剤の同時または連続投与が付随してもよい。
【０２８２】
複数回投与は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、もしくは３１日、または１、２、３、４、５、もしくは６か月のうちの１つとなるように選択され得る、所定の時間間隔で分離されていてもよい。例として、投与は、７、１４、２１または２８日（プラスマイナス３、２、または１日）ごとに１回与えられてもよい。
【０２８３】
養子移植
本発明の実施形態において、治療または予防の方法は、免疫細胞の養子移植を含み得る。
【０２８４】
養子細胞移植（ＡＣＴ）は典型的には、細胞が単離される血液サンプルを採取することにより、細胞（例えば免疫細胞）が対象から得られるプロセスを一般に指す。それから、細胞は通常、何らかの方法で処理または改変され、その後、同じ対象または異なる対象のいずれかに投与される。治療は通常、特定の望ましい特徴を有する細胞集団を対象に提供すること、または、その対象においてそのような特徴を有する細胞の頻度を増やすことが目的とされる。
【０２８５】
本発明において、養子移植は、対象に細胞または細胞集団を導入すること、および／または、対象における細胞または細胞集団の頻度を増加させることを目的として実施され得る。
【０２８６】
Ｔ細胞の養子移植は、例えば、ＫａｌｏｓとＪｕｎｅ  ２０１３，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３９（１）：４９−６０に記載されており、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＮＫ細胞の養子移植は、例えば、Ｄａｖｉｓら  ２０１５，Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．２１（６）：４８６−４９１に記載されており、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２８７】
細胞は、例えば、好中球、好酸球、好塩基球、樹状細胞、リンパ球、または単球であり得る。リンパ球は、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞または自然リンパ系細胞（ＩＬＣ）、またはそれらの前駆体であり得る。いくつかの実施形態では、細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞はＣＤ３＋  Ｔ細胞である。いくつかの態様において、Ｔ細胞はＣＤ３＋、ＣＤ８＋  Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は細胞傷害性Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ））である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞はウイルス特異的Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞はＥＢＶ、ＨＰＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶまたはＨＩＶに特異的である。
【０２８８】
本発明は、対象における疾患または状態を治療または提示する方法を提供し、本方法は、本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体、ＣＡＲ、核酸またはベクターを発現または含むように、対象から得られた少なくとも１つの細胞を改変する工程、場合により、改変された少なくとも１つの細胞を増殖させる工程、および改変された少なくとも１つの細胞を対象に投与する工程を含む。
【０２８９】
いくつかの実施形態では、本方法は以下を含む：
（ａ）対象から少なくとも１つの細胞を単離する工程；
（ｂ）本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体、ＣＡＲ、核酸またはベクターを発現または含むように、少なくとも１つの細胞を改変する工程、
（ｃ）場合により、改変された少なくとも１つの細胞を増殖させる工程、および；
（ｄ）改変された少なくとも１つの細胞を対象に投与する工程。
【０２９０】
いくつかの実施形態では、細胞が単離される対象は、改変細胞が投与される対象である（すなわち、養子移植は自己細胞によるもの）。いくつかの実施形態では、細胞が単離される対象は、改変細胞が投与される対象とは異なる対象である（すなわち、養子移植は同種異系細胞によるもの）。
【０２９１】
本発明に従って改変された少なくとも１つの細胞は、当業者に周知の方法に従って改変され得る。改変は、移植された核酸の永続的または一過性の発現のための核酸移入を含み得る。
【０２９２】
いくつかの実施形態において、細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、またはＣＡＲをコードする核酸もしくはベクターを含むか発現するようにさらに改変されてもよい。
任意の適切な遺伝子工学プラットフォームが、本発明に従う細胞を改変するために使用され得る。細胞を改変するための適切な方法は、例えば、参照により本明細書上に組み込まれるＭａｕｓら，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０１４）３２：１８９−２２５に記載されているような、ガンマレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ＤＮＡトランスフェクション、トランスポゾンベースの遺伝子送達およびＲＮＡトランスフェクションなどといった遺伝子工学プラットフォームの使用を含む。
【０２９３】
いくつかの実施形態では、本方法は、以下の工程のうちの１つまたは複数を含み得る：対象から血液サンプルを採取する工程；血液サンプルから少なくとも１つの細胞を単離および／または増殖させる工程；少なくとも１つの細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏ  またはｅｘ  ｖｉｖｏの細胞培養において培養する工程；少なくとも１つの細胞に本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体、ＣＡＲ、核酸、またはベクターを導入し、それにより少なくとも１つの細胞を改変する工程；少なくとも１つの改変された細胞を増殖させる工程；少なくとも１つの改変された細胞を回収する工程；改変細胞をアジュバント、希釈剤、または担体と混合する工程；改変細胞を対象に投与する工程。
【０２９４】
いくつかの実施形態では、本方法は、ＴＧＦ−βデコイ受容体、ＣＡＲ、核酸、またはベクターの発現を誘導／増強するために細胞を処置する工程を追加で含んでいてもよい。例えば、核酸／ベクターは、特定の薬剤による処置に反応した核酸／ベクターからのＴＧＦ−βデコイ受容体またはＣＡＲの発現の誘導性上方制御のための制御要素を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、処置は、本発明に従う改変細胞を投与された対象への薬剤の投与により、ｉｎ  ｖｉｖｏで行われ得る。いくつかの実施形態では、処置は、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏの培養細胞への薬剤の投与により、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われ得る。
【０２９５】
当業者は、例えば、参照によりその全体が取り込まれるＤａｉら，２０１６  Ｊ  Ｎａｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  １０８（７）：ｄｊｖ４３９を参照することにより、本発明に従う細胞の養子移植のための適切な試薬および手順を決定することができる。
【０２９６】
関連する態様において、本発明は、本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体、ＣＡＲ、核酸またはベクターを細胞に導入し、それにより少なくとも１つの細胞を改変する工程を含む、改変細胞を調製する方法を提供する。本方法は好ましくは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで実施される。
【０２９７】
１つの態様では、本発明は、以下を含む、対象の疾患または状態を治療または予防する方法を提供する：
（ａ）対象から少なくとも１つの細胞を単離する工程；
（ｂ）少なくとも１つの細胞に本発明に従う核酸またはベクターを導入し、それにより少なくとも１つの細胞を改変する工程；および
（ｃ）改変された少なくとも１つの細胞を対象に投与する工程。
【０２９８】
いくつかの実施形態では、細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸またはベクターを導入するために、さらに改変されてもよい。
いくつかの実施形態では、本方法は、例えば癌の治療または予防のための、治療的または予防的介入を追加で含む。いくつかの実施形態では、治療的または予防的介入は、化学療法、免疫療法、放射線療法、外科手術、ワクチン接種、および／またはホルモン療法から選択される。
【０２９９】
検出方法
本明細書に記載のＴＧＦ−βデコイ受容体およびＣＡＲは、ＴＧＦ−βデコイ受容体またはＣＡＲのＴＧＦ−β（例えば、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２またはＴＧＦ−β３）への結合を伴う方法において使用され得る。そのような方法は、ＴＧＦ−βデコイ受容体またはＣＡＲとＴＧＦ−βとの結合複合体の検出を含み得る。よって、１つの実施形態では、ＴＧＦ−βを含む、または含むと疑われるサンプルを、本明細書に記載のＴＧＦ−βデコイ受容体またはＣＡＲと接触させる工程、およびβデコイ受容体／ＣＡＲ、およびＴＧＦ−βの複合体の形成を検出する工程を含む方法が提供される。
【０３００】
サンドイッチアッセイ、例えばＥＬＩＳＡなどといった免疫アッセイを含む適切な方法形式が、当技術分野で周知である。本方法は、ＴＧＦ−βデコイ受容体／ＣＡＲ、またはＴＧＦ−β、またはその両方を、検出可能な標識、例えば蛍光標識、発光標識または放射標識で標識することを含み得る。ＴＧＦ−βの発現は、例えば、生検により得られた組織サンプルの免疫組織化学（ＩＨＣ）により測定され得る。いくつかの実施形態において、標識は、放射性ヌクレオチド、陽電子放出放射性核種（例えば、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）用）、ＭＲＩ造影剤または蛍光標識から選択され得る。
【０３０１】
ＴＧＦ−βによって媒介されるプロセスのｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおける分析は、例えば適切に標識された種の検出による、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）、または蛍光画像による分析が含まれ得る。
【０３０２】
この種の方法は、ＴＧＦ−βの検出および／または定量を必要とする疾患または状態の診断方法の基礎を提供し得る。そのような方法は、患者サンプルに対して、または患者サンプルの処理後にｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施されてもよい。サンプルが回収された後は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで診断方法が実施されるため、患者が同席している必要はなく、それゆえ、本方法は、ヒトまたは動物の身体で実施されないものであり得る。
【０３０３】
そのような方法は、患者サンプル中に存在するＴＧＦ−βの量を決定することを含み得る。本方法はさらに、診断に到達するプロセスの一部として、決定された量を標準値または基準値と比較することを含み得る。他の診断テストが、診断または予後の精度を高めるため、または、本明細書で説明したテストを使用して得られた結果を確認するために、本明細書で説明したものと組み合わせて使用され得る。
【０３０４】
患者サンプル中に存在するＴＧＦ−βのレベルは、患者が本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体、ＣＡＲ、核酸、ベクター、細胞または組成物による治療に応答し得ることを指し示し得る。サンプル中の高レベルのＴＧＦ−βの存在は、例えば、本明細書に記載のＴＧＦ−βデコイ受容体、ＣＡＲ、核酸、ベクター、細胞または組成物による、本明細書に記載の治療のために、患者を選択するために使用され得る。したがって、本発明のＴＧＦ−βデコイ受容体およびＣＡＲは、本明細書に記載の治療のために患者を選択するために使用され得る。
【０３０５】
ＴＧＦ−βのサンプル中における検出は、疾患または状態、疾患または状態の素因を診断する目的で、または疾患または状態の予後を提供（予後診断）するために使用され得る。診断または予後は、既存の（以前に診断された）疾患／状態に関連し得る。
【０３０６】
サンプルは、任意の組織または体液から採取され得る。サンプルは、一定量の血液；フィブリン血餅と血球の除去後に得られた血液の液体部分を含み得る個体の血液に由来する一定量の血清；組織サンプルまたは生検；胸水；脳脊髄液（ＣＳＦ）；または前記個体から単離された細胞を含むか、またはそれに由来し得る。いくつかの実施形態では、サンプルは、疾患／状態により影響される１またはそれ以上の組織（例えば、疾患の症状が現れる組織、または疾患／状態の病因に関与する組織）から取得または抽出され得る。
【０３０７】
本発明に従う方法は、好ましくはｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施され得る。用語「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」は、培養中の細胞での実験を含むことが意図される一方、「ｉｎ  ｖｉｖｏ」は、完全な状態の多細胞生物での実験および／またはその処置を包含することが意図される。
【０３０８】
キット
本発明のいくつかの態様では、部品キット（ｋｉｔ  ｏｆ  ｐａｒｔｓ）が提供される。いくつかの実施形態では、キットは、所定量の本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体、ＣＡＲ、核酸、ベクター、細胞、または組成物を有する少なくとも１つの容器を有し得る。
【０３０９】
キットは、ＴＧＦ−βデコイ受容体、ＣＡＲ、核酸、ベクター、細胞または組成物を、特定の疾患／状態を治療するための患者への投与指示書と共に提供してもよい。ＴＧＦ−βデコイ受容体、ＣＡＲ、核酸、ベクター、細胞または組成物は、腫瘍または血液への注射または注入に適するように調合され得る。
【０３１０】
いくつかの実施形態では、キットは、本発明に従う細胞を製造するための材料を含み得る。例えば、キットは、本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体、ＣＡＲ、核酸もしくはベクターを発現するか、もしくは含むように細胞を改変するための材料、または、本発明に従う核酸もしくはベクターを細胞に導入するための材料を含んでいてもよい。
【０３１１】
いくつかの実施形態において、キットは、所定量の別の治療剤（例えば、抗感染剤または化学療法剤）を有する少なくとも１つの容器をさらに含み得る。そのような実施形態では、キットは、特定の疾患または状態に対する併用治療を提供するように２つの医薬または医薬組成物が同時にまたは別々に投与され得るように、第２の医薬または医薬組成物を含んでいてもよい。また、治療剤は、腫瘍または血液への注射または注入に適するように調合されていてもよい。
【０３１２】
タンパク質発現
細胞中で本発明に従うタンパク質（例えば、ＴＧＦ−βデコイ受容体およびＣＡＲ）を産生するのに適した分子生物学技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９に説明されているもののように、当技術分野で周知である。ポリペプチドは、核酸配列から発現され得る。核酸配列は、細胞中に存在するベクターに含まれていてもよいし、または、細胞のゲノムに組み込まれていてもよい。
【０３１３】
ポリペプチドの発現に適した任意の細胞が、本発明に従うタンパク質を製造するために使用され得る。細胞は原核生物または真核生物であり得る。適切な原核細胞は大腸菌を含む。真核細胞の例は、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞または哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）を含む。一部の原核細胞は真核生物と同じ翻訳後修飾を可能としないため、場合によっては、細胞は原核細胞ではない。加えて、真核生物では非常に高い発現レベルが可能であり、適切なタグを使用して、タンパク質が真核生物からより簡単に精製され得る。培地へのタンパク質の分泌を高める特定のプラスミドもまた利用され得る。
【０３１４】
目的のポリペプチドを製造する方法は、ポリペプチドを発現するように改変された細胞の培養または発酵を伴い得る。培養または発酵は、栄養素、空気／酸素および／または増殖因子の適切な供給を備えたバイオリアクターで実施され得る。分泌タンパク質は、細胞から培養培地／発酵ブロスを分離し、タンパク質部分を抽出し、個々のタンパク質を分離して分泌ポリペプチドを単離することにより、回収され得る。培養、発酵および分離の技術は、当業者に周知である。
【０３１５】
バイオリアクターは、細胞が培養され得る１つまたは複数の容器を含む。バイオリアクターでの培養は、リアクターへの反応物の連続的な流れ、およびリアクターからの培養細胞の連続的な流れと共に、連続的に行われ得る。あるいは、培養はバッチで行われてもよい。バイオリアクターは、培養中の細胞に最適な条件が提供されるように、ｐＨ、酸素、容器内外の流量、および容器内の攪拌などといった環境条件を監視および制御する。
【０３１６】
目的のポリペプチドを発現する細胞の培養後、そのポリペプチドは好ましくは単離される。細胞培養からポリペプチドを分離するための、当該分野で公知の任意の適切な方法が使用され得る。培養から目的のポリペプチドを単離するために、まず、目的のポリペプチドを含む培地から培養細胞を分離することが必要となり得る。目的のポリペプチドが細胞から分泌される場合、細胞は、遠心分離により、分泌されたポリペプチドを含む培養培地から分離され得る。目的のポリペプチドが細胞内に集まる場合、例えば、超音波処理、急速凍結融解または浸透圧溶解を使用して、遠心分離の前に細胞を破壊することが必要となる。遠心分離は、培養細胞または培養細胞の細胞片を含むペレット、および培養培地と目的のポリペプチドとを含む上清を生成する。
【０３１７】
それから、他のタンパク質および非タンパク質成分を含み得る上清または培養培地から、目的のポリペプチドを単離することが望ましい場合がある。上清または培地からポリペプチド成分を分離するための一般的なアプローチは、沈殿によるものである。異なる溶解度のポリペプチド／タンパク質は、硫酸アンモニウムなどの沈殿剤の異なる濃度で沈殿する。例えば、低濃度の沈殿剤では、水溶性タンパク質が抽出される。したがって、増加する濃度の沈殿剤を加えることにより、異なる溶解度のタンパク質が区別され得る。その後、分離されたタンパク質から硫酸アンモニウムを除去するために、透析が使用され得る。
【０３１８】
異なるポリペプチド／タンパク質を区別するための他の方法、例えばイオン交換クロマトグラフィーおよびサイズクロマトグラフィーが、当技術分野で知られている。これらは、沈殿の代替として使用されるか、沈殿に続いて実行されてもよい。
【０３１９】
目的のポリペプチドが培養から単離された後、タンパク質を濃縮することが必要となり得る。限外濾過または凍結乾燥など、目的のタンパク質を濃縮するための多くの方法が、当技術分野で知られている。
【０３２０】
配列同一性
２つ以上のアミノ酸または核酸の配列間のパーセント同一性を決定する目的のためのペアワイズおよび多配列アラインメントは、当業者に知られている様々な方法で、例えば、ＣｌｕｓｔａｌＯｍｅｇａ（Ｓｏｄｉｎｇ，Ｊ．２００５，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２１，９５１−９６０）、Ｔ−ｃｏｆｆｅｅ（Ｎｏｔｒｅｄａｍｅら  ２０００，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０００）３０２，２０５−２１７）、Ｋａｌｉｇｎ（ＬａｓｓｍａｎｎとＳｏｎｎｈａｍｍｅｒ  ２００５，ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，６（２９８））およびＭＡＦＦＴ（ＫａｔｏｈとＳｔａｎｄｌｅｙ  ２０１３，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，３０（４）７７２−７８０）ソフトウェアなどの一般に入手可能なコンピューターソフトウェアを使用して、達成され得る。そのようなソフトウェアを使用する場合、例えばギャップペナルティやエクステンションペナルティについて、好ましくはデフォルトパラメータが使用される。
【０３２１】
本発明は、そのような組み合わせが明らかに許されないか、または特定して回避される場合を除き、記載された態様および好ましい特徴の組み合わせを含む。
本明細書で使用されているセクションの見出しは、編成の目的のためだけのものであり、説明されている主題を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０３２２】
本発明の態様および実施形態は、これから、例として添付の図面を参照して例示される。さらなる態様および実施形態が、当業者には明らかであろう。本文で言及されている全ての文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０３２３】
後続する特許請求の範囲を含む本明細書全体を通して、文脈がそうでないことを必要としない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語、および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、述べられた整数もしくは工程または整数もしくは工程の群の包含を含意すると理解されるが、他の整数もしくは工程または整数もしくは工程の群の除外を含意するとは理解されない。
【０３２４】
明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明確に他を指示しない限り、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。範囲は、本明細書において、「およそ（ａｂｏｕｔ）」の１つの特定の値から、および／または「およそ（ａｂｏｕｔ）」の別の特定の値までとして表現され得る。そのような範囲が表現されている場合、別の実施形態は、１つの特定の値から、および／または他の特定の値までを含む。同様に、先行詞「約（ａｂｏｕｔ）」の使用により、値が近似値として表される場合、特定の値が別の実施形態を形成することが理解されよう。
【０３２５】
本発明の原理を示す実施形態および実験が、これから、添付の図面を参照して以下に説明される：
【実施例】
【０３２６】
以下の実施例において、本発明者らは、ＴＧＦ−β結合デコイ受容体分子の設計、およびそれらの機能的特徴を説明する。
実施例１：ＴＧＦ−βデコイ受容体の設計
レンチウイルスベクターを使用して、ＴＧＦ−βのＩＩ型受容体のＴＧＦ−β結合ドメインと、異なる細胞膜アンカー領域をコードするＴＧＦ−βデコイ受容体構築物を調製する。
【０３２７】
ＴＧＦ−βのＩＩ型受容体の細胞外ドメインのｃＤＮＡを、ＣＤ４８、ＣＤ４４、ＣＤ５５、ＣＤ９０または胎盤型アルカリホスファターゼのグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー配列をコードするｃＤＮＡとインフレームでクローニングする（構築物によりコードされるアミノ酸配列が図１に示されている）。
【０３２８】
実施例２：ヒトＴリンパ球を発現するＴＧＦ−βデコイ受容体の生成
レンチウイルス形質導入については、０．００２％ポリ−Ｌ−リジン（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）で事前にコーティングした１０ｃｍ２ディッシュ上に５×１０６個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞をプレーティングする。レンチウイルスベクターを、パッケージング遺伝子およびエンベロープ遺伝子をコードするプラスミドと同時にトランスフェクトし、コトランスフェクションの数日後、ウイルスを含む上清を回収し、０．４５μｍフィルターに通す。それから、上清を２５，０００ｒｐｍの超遠心分離で濃縮し、力価を測定し、その後、使用するまで−８０℃で保存する。
【０３２９】
健康なドナーから単離された初代ヒトＴリンパ球を取得する。Ｔ細胞を完全培地（１０％不活性化ＦＢＳ、ペニシリンおよび硫酸ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ１６４０）中で培養し、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ｍＡｂコーティングビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）での刺激により活性化させる。活性化の１２時間後、ポリブレンの存在下でＴ細胞にレンチウイルスベクターを形質導入する。ヒトＴリンパ球は、１日おきにＩＬ−２を添加することにより増殖および維持される。
【０３３０】
実施例３：ＴＧＦ−βデコイ受容体を発現するＴ細胞の機能的特徴付け
３．１  表面発現
ＴＧＦ−βデコイ受容体を発現するように改変されたＴ細胞を、デコイ受容体の表面発現について分析する。
【０３３１】
簡単に説明すると、本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体をコードする構築物、ネガティブコントロール構築物、またはＤＮ−ＴＧＦ−βＲ２をコードする構築物をＴ細胞に形質導入し、そして、細胞表面での発現を、ＴＧＦ−βＲ２の細胞外ドメインに特異的に結合できる抗体を使用したフローサイトメトリー分析によって分析する。
【０３３２】
本開示のＴＧＦ−βデコイ受容体をコードする構築物で形質導入したＴ細胞は、ネガティブコントロール構築物、またはＤＮ−ＴＧＦ−βＲ２をコードする構築物で形質導入したＴ細胞と比較して、抗ＴＧＦ−βＲ２抗体により、より多くの表面染色を示す。
【０３３３】
３．２  可溶性発現
ＴＧＦ−βデコイ受容体を発現するように改変されたＴ細胞を、デコイ受容体の可溶性発現について分析する。
【０３３４】
簡単に説明すると、本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体をコードする構築物、ネガティブコントロール構築物、またはＤＮ−ＴＧＦ−βＲ２をコードする構築物をＴ細胞に形質導入し、受容体の可溶性発現を、ＴＧＦ−βＲ２の細胞外ドメインに特異的に結合できる抗体を使用して、細胞培養上清のＥＬＩＳＡにより測定する。
【０３３５】
本開示のＴＧＦ−βデコイ受容体をコードする構築物で形質導入したＴ細胞は、ネガティブコントロール構築物またはＤＮ−ＴＧＦ−βＲ２をコードする構築物で形質導入したＴ細胞と比較して、より多くの可溶性受容体を分泌する。
【０３３６】
３．３  ＴＧＦ−βを介したシグナル伝達
ＴＧＦ−βデコイ受容体を発現するように改変されたＴ細胞を、ＴＧＦ−βによる刺激に応答する能力について分析する。
【０３３７】
簡単に説明すると、本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体をコードする構築物、ネガティブコントロール構築物、またはＤＮ−ＴＧＦ−βＲ２をコードする構築物をＴ細胞に形質導入する。次に、細胞をＴＧＦ−βでの処置により刺激し、ＴＧＦ−β媒介性シグナル伝達のレベルを分析する。
【０３３８】
本開示のＴＧＦ−βデコイ受容体をコードする構築物で形質導入したＴ細胞は、ネガティブコントロール構築物、またはＤＮ−ＴＧＦ−βＲ２をコードする構築物で形質導入したＴ細胞と比較して、より少ないＴＧＦ−β媒介性シグナル伝達を示す。
【０３３９】
３．４  増殖／拡大
ＴＧＦ−βデコイ受容体を発現するように改変されたＴ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖する能力について分析する。
【０３４０】
簡単に説明すると、本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体をコードする構築物、ネガティブコントロール構築物、またはＤＮ−ＴＧＦ−βＲ２をコードする構築物をＴ細胞に形質導入する。次に、細胞をＴＧＦ−βでの処置により刺激し、細胞の増殖を分析する。
【０３４１】
本開示のＴＧＦ−βデコイ受容体をコードする構築物で形質導入したＴ細胞は、ネガティブコントロール構築物、またはＤＮ−ＴＧＦ−βＲ２をコードする構築物で形質導入したＴ細胞と比較して、より多く増殖する。
【０３４２】
３．５  生存率
ＴＧＦ−βデコイ受容体を発現するように改変されたＴ細胞を、持続性／生存率について分析する。
【０３４３】
簡単に説明すると、本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体をコードする構築物、ネガティブコントロール構築物、またはＤＮ−ＴＧＦ−βＲ２をコードする構築物をＴ細胞に形質導入する。その後、細胞をＴＧＦ−βでの処置により刺激し、細胞数を経時的にモニターする。
【０３４４】
本開示のＴＧＦ−βデコイ受容体をコードする構築物で形質導入したＴ細胞は、ネガティブコントロール構築物、またはＤＮ−ＴＧＦ−βＲ２をコードする構築物で形質導入したＴ細胞と比較して、生存率が高いことがわかる。
【０３４５】
３．６  細胞傷害性
ＴＧＦ−βデコイ受容体を発現するように改変されたＴ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞傷害性について分析する。
【０３４６】
簡単に説明すると、本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体をコードする構築物、ネガティブコントロール構築物、またはＤＮ−ＴＧＦ−βＲ２をコードする構築物をＴ細胞に形質導入する。次に、細胞をＴＧＦ−βでの処置により刺激し、Ｔ細胞が特異的である抗原を発現する細胞に対する細胞傷害性を分析する。細胞はまた、細胞傷害性／エフェクター因子の遺伝子またはタンパク質発現についても分析される。
【０３４７】
本開示のＴＧＦ−βデコイ受容体をコードする構築物で形質導入したＴ細胞は、ネガティブコントロール構築物またはＤＮ−ＴＧＦ−βＲ２をコードする構築物で形質導入したＴ細胞と比較して、細胞傷害性の向上および細胞傷害性／エフェクター因子の発現増加を示す。
【０３４８】
３．７  腫瘍細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで殺す能力
ＴＧＦ−βデコイ受容体を発現するように改変されたＴ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで腫瘍細胞を殺す能力について分析する。
【０３４９】
簡単に説明すると、本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体をコードする構築物、ネガティブコントロール構築物、またはＤＮ−ＴＧＦ−βＲ２をコードする構築物をＴ細胞に形質導入する。次に、腫瘍細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで溶解する能力について、改変された細胞を分析する。
【０３５０】
本開示のＴＧＦ−βデコイ受容体を発現するＴ細胞は、ネガティブコントロール構築物、またはＤＮ−ＴＧＦ−βＲ２をコードする構築物で形質導入したＴ細胞と比較して、腫瘍細胞をより迅速に殺すことがわかる。これは、エフェクター細胞：腫瘍細胞比を標準化した後でも観察される。
【０３５１】
３．８  Ｉｎ  ｖｉｖｏにおける癌の治療  
ＴＧＦ−βデコイ受容体を発現するように改変されたＴ細胞を、マウスモデルにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで癌を治療する能力について分析する。
【０３５２】
簡単に説明すると、本発明に従うＴＧＦ−βデコイ受容体をコードする構築物、ネガティブコントロール構築物、またはＤＮ−ＴＧＦ−βＲ２をコードする構築物をＴ細胞に形質導入する。次いで、改変細胞を、確立された癌モデルを有するマウスに投与し、癌の進行および生存率をモニターする。
【０３５３】
本開示のＴＧＦ−βデコイ受容体をコードする構築物で形質導入したＴ細胞で処置したマウスは、ネガティブコントロール構築物、またはＤＮ−ＴＧＦ−βＲ２をコードする構築物で形質導入したＴ細胞と比較して、生存率の向上または疾患進行の重症度の低減を有することがわかる。
【０３５４】
実施例４：特徴付けられたＴＧＦ−βデコイ受容体
以下の実施例で特徴付けられたＴＧＦ−βデコイ受容体分子の概要を以下に提供する：
【０３５５】
【表１】
2020505069.tif 000007
【０３５６】
レンチウイルスベクターｐＤ２１０９−ＥＦｓ：ＥＦ１ａ−ＯＲＦ，Ｌｅｎｔｉ−ＥｌｅｃＤ（ＡＴＵＭ、ニューアーク、カリフォルニア州、米国）を使用して、ＴＧＦ−βデコイ受容体をコードする構築物、およびＧＦＰをコードする対照の構築物を調製した。
【０３５７】
実施例５：活性化Ｔ細胞（ＡＴＣ）の調製
ＰＢＭＣを、様々なドナーから得られた血液サンプルから、Ｆｉｃｏｌｌ勾配によって精製した。続いて、ＣＤ３磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して、ＣＤ３＋  Ｔ細胞をＰＢＭＣから陽性選択した。
【０３５８】
次に、Ｔ細胞を刺激した。簡単に述べれば、１×１０６細胞のＴ細胞を、ＩＬ−２（４０Ｕ／ｍｌ）およびＣＤ３／ＣＤ２８  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｇｉｂｃｏ）を含む１ｍｌのＣＴＬ培地（５０％ＲＰＭＩ、５０％ＣＬＩＣＫ培地、１０％ＦＢＳ）に２４〜７２時間播種して、活性化Ｔ細胞（ＡＴＣ）を得た。
【０３５９】
実施例６：レンチウイルスの製造および標的細胞の形質導入
６．１  レンチウイルスの製造
１．２〜２．４×１０６個の２９３Ｔ細胞を１０％ＦＢＳおよび抗生物質を添加したＤＭＥＭ培地１０ｍｌ中、１０ｃｍ２細胞培養ディッシュにプレーティングした。
【０３６０】
次の日、３μｇのレンチウイルスベクター構築物ＤＮＡ、１．５μｇのエンベローププラスミドｐＭＤ２．Ｇ、１．５μｇのパッケージングプラスミドｐＲＳＶ−ＲＥＶ、および１．５μｇのパッケージングプラスミドｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥを含む、ＤＮＡ混合液を調製した。１８μｌのＦｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ）と２７０μｌのＦＢＳフリーＤＭＥＭまたはＯｐｔｉ−ＭＥＭの別の混合液を調製し、１０秒間ボルテックスして混合し、遠心して、室温で５分間インキュベートした。次に、ＤＮＡとＦｕｇｅｎｅの混合液を組み合わせ、１０秒間ボルテックスして混合し、遠心して、室温で１５〜４５分間インキュベートした。次いで、混合液を２９３Ｔ細胞の培養に加えた。
【０３６１】
次の日、細胞培養培地を培養中の細胞から除去し、８〜１０ｍｌの新鮮な細胞培養培地を細胞に加えた。新鮮な細胞培養培地は、ウイルスにより形質導入される細胞の種類に従って選択した。例えば、ウイルスを使用してＴ細胞を形質導入する場合は、ＲＰＭＩ−１６４０培地を使用した。
【０３６２】
次の日、レンチウイルスを含む細胞培養培地を回収し、４℃で保存し、８〜１０ｍｌの新鮮な細胞培養培地を細胞に加えた。その翌日、レンチウイルスを含む細胞培養培地を再度回収し、前日に回収したレンチウイルス含有細胞培養培地と組み合わせた。次に、０．４５μｍニトロセルロース膜を使用して混合物を濾過し、ポリブレンを５〜８μｇ／ｍｌの最終濃度まで添加した。その後、レンチウイルスを含む培地は、形質導入にすぐに使用するか、−８０℃で保存した。
【０３６３】
場合によっては、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１００チューブ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、レンチウイルスを含む培地を１０〜２０倍に濃縮した。簡単に説明すると、チューブを１時間または一晩ＵＶ光処理により滅菌し、レンチウイルス含有培地をチューブに加え、２，５００〜３，５００ｒｐｍで１０〜３０分間遠心分離した。
【０３６４】
６．２  標的細胞の形質導入
簡単に説明すると、培養中の標的細胞を回収し、０．２５〜１×１０６個の細胞を０．５〜１ｍｌのレンチウイルス含有細胞培養培地に再懸濁した（実施例６．１を参照）。次に、混合物を２４ウェルまたは１２ウェルプレートに移し、３０〜３５℃で１．５時間、２，５００ｒｐｍで遠心分離した（「スピンフェクション」と呼ばれる）。それから、細胞をインキュベーター（５％ＣＯ２、３７℃）中で一晩培養した。次の日、細胞を回収し、５〜１０ｍｌの新鮮な細胞培養培地に再懸濁した。場合によっては、形質導入の３６〜４８時間後にピューロマイシンを培養中の細胞に添加し、形質導入体を選択した。
【０３６５】
活性化Ｔ細胞（ＡＣＴ）は、以下のようにして形質導入した。２．５×１０５個のＡＴＣを８μｇ／ｍｌのポリブレンを含む５００μｌの濃縮ウイルス上清（１０倍濃縮、最大７０００のＭＯＩ）に再懸濁し、２４ウェルプレートに播種し、８００ｇ、３２℃で９０分間遠心分離した。スピンフェクション後、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で最大２４時間インキュベートした後、上清をＩＬ−２およびＣＤ３／ＣＤ２８  Ｄｙｎａｂｅａｄｓを含むＣＴＬ培地で置換した（実施例５を参照）。
【０３６６】
Ｈｅｌａ細胞形質導入の場合、４×１０５個のＨｅＬａ細胞を８μｇ／ｍｌポリブレンを含む１ｍｌの濃縮ウイルス上清（１０倍濃縮、最大７０００のＭＯＩ）に再懸濁し、２４ウェルプレートに播種し、８００ｇ、３２℃で９０分間遠心分離した。
【０３６７】
実施例７：細胞表面におけるＴＧＦ−βデコイ受容体の発現の分析
７．１  ＴＧＦ−βデコイ受容体をコードする構築物をトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞による発現
本発明者らは、異なる構築物をトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞上におけるＴＧＦ−βデコイ受容体の表面発現を調査した。
【０３６８】
簡単に説明すると、製造業者の指示に従ってリポフェクタミンを使用して、ＨｅＬａ細胞にＴＧＦ−βデコイ受容体をコードする構築物、トランスフェクション対照としてＧＦＰをコードする構築物、またはＤＮ−ＴＧＦ−βＲ２をコードする構築物をトランスフェクトした。
【０３６９】
トランスフェクションの７２時間後、ＴＧＦ−βＲ２の細胞外ドメインに結合する抗ヒトＴＧＦ−βＲＩＩ抗体クローンＲＥＡ９０３（＃１３０−１１５、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して、細胞表面における受容体の発現について、細胞をフローサイトメトリーで分析した。トランスフェクションの対照は、ＧＦＰ発現で分析した。
【０３７０】
結果は図３Ａ〜３Ｈに示されている。ＴＧＦ−βデコイ受容体の高い発現が、トランスフェクションの７２時間後にＨｅＬａ細胞の表面で検出された（細胞の約６０〜７０％が受容体発現について陽性であった）。
【０３７１】
７．２  ＴＧＦ−βデコイ受容体をコードする構築物で形質導入した活性化Ｔ細胞（ＡＴＣ）による発現
本発明者らは次に、異なるレンチウイルス構築物で形質導入したＡＴＣ上におけるＴＧＦ−βデコイ受容体の表面発現、または非形質導入細胞上での発現を調査した。
【０３７２】
形質導入の７２時間後（実施例６．２を参照）、抗ヒトＴＧＦ−βＲＩＩ抗体クローンＲＥＡ９０３を使用して、フローサイトメトリーにより、細胞表面での受容体の発現について細胞を分析した。対照の条件は、ＧＦＰ発現について分析した。
【０３７３】
結果は図４Ａ〜４Ｈに示されている。ＣＤ４８、ＣＤ５５およびＣＤ９０  ＧＰＩアンカー配列をコードするＴＧＦ−βデコイ受容体で形質導入したＡＴＣは、細胞表面に最高レベルのＴＧＦ−βデコイ受容体発現を示すことがわかった。これらのデコイ受容体の発現は、ＤＮ−ＴＧＦ−βＲ２をコードする構築物で形質導入した細胞で検出された発現のレベルよりも高かった（図４Ａ）。
【０３７４】
本発明者らは次に、実施例６．２に記載されるようにして形質導入した７２時間後、３例の異なるドナーに由来する形質導入ＡＴＣによるＣＤ４８またはＣＤ９０  ＧＰＩアンカー配列を有するＴＧＦ−βデコイ受容体の発現について調査した。
【０３７５】
図５Ａは、形質導入細胞培養における白血球の割合を示している。図５Ｂは、形質導入細胞培養におけるＧＦＰ＋細胞の割合を示している。図５Ｃは、形質導入細胞培養におけるＴＧＦ−βＲＩＩ＋細胞の割合を示している。
【０３７６】
図６Ａは、白血球総数の割合としてのＣＤ３＋細胞の割合を示し、図６Ｂは、白血球総数の割合としてのＧＦＰ＋  ＣＤ３＋細胞の割合を示す。
図７Ａは、ＣＤ３＋細胞集団の割合としてのＣＤ４＋、ＧＦＰ＋細胞の割合を示している。図７Ｂは、ＣＤ３＋細胞集団の割合としてのＣＤ８＋、ＧＦＰ＋細胞の割合を示している。図７Ｃは、ＣＤ３＋細胞集団の割合としてのＣＤ４＋、ＴＧＦ−βＲＩＩ＋細胞の割合を示している。図７Ｄは、ＣＤ３＋細胞集団の割合としてのＣＤ８＋、ＴＧＦ−βＲＩＩ＋細胞の割合を示している。
【０３７７】
ＴＧＦ−βＲＩＩを発現する細胞の高い割合が、ＴＧＦ−βＲＩＩ−ＣＤ９０  ＧＰＩアンカーをコードするレンチウイルスで形質導入した細胞において検出された（図５Ｃ、７Ｃおよび７Ｄを参照）。
【０３７８】
実施例８：ＴＧＦ−βデコイ受容体を発現する細胞におけるＴＧＦ−β媒介性シグナル伝達の阻害の分析
本発明者らは次に、ＴＧＦ−βデコイ受容体を発現する細胞における、ＴＧＦ−βによる刺激に応答した下流シグナル伝達の活性化を調査した。
【０３７９】
細胞にＴＧＦ−βＲＩＩ−ＣＤ９０  ＧＰＩアンカーをコードするレンチウイルス、またはＧＦＰをコードする構築物を形質導入した（実施例６．２を参照）。
細胞の形質導入の７２時間後に、ピューロマイシンを最終濃度２μｇ／ｍｌで細胞培養に添加し、形質導入細胞を選択した。
【０３８０】
ピューロマイシンの存在下で７日間培養した後、細胞を新鮮な細胞培養培地に再懸濁し、異なる濃度のＴＧＦ−βでの処置による刺激の前に、２４時間培養した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で３０分間刺激した。次いで、細胞を回収し、フローサイトメトリー（実施例８．１を参照）およびウエスタンブロット（実施例８．２を参照）により、細胞内シグナル伝達タンパク質のリン酸化について分析した。フローサイトメトリーまたはウエスタンブロット分析用のサンプルの調製は、氷上で行った。
【０３８１】
８．１  Ｐｈｏｓｆｌｏｗ分析
フローサイトメトリー分析では、次の抗体を使用した：
【０３８２】
【表２】
2020505069.tif 000008
【０３８３】
刺激した細胞１００μｌ（約２００，０００細胞）を９６ウェルプレートのウェルに移した。その後、細胞を４℃において３０００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、細胞ペレットを３０μＬの１：２００生／死染色液に再懸濁し、細胞を室温で３０秒間インキュベートした。次いで、細胞を１００μＬの染色バッファーの添加により洗浄し、４℃、３０００ｒｐｍで３０秒間遠心分離した。それから、細胞ペレットを、３７℃に予熱した細胞培養培地とＢＤ  ｐｈｏｓｆｌｏｗ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｉの１：１混合液（ウェルあたり５０μｌ）に再懸濁し、３７℃で１０分間インキュベートした。次いで、細胞を１５００ｒｐｍで５分間の遠心分離により回収し、１５０μＬの染色バッファーで２回洗浄した。それから、細胞ペレットを５０μＬのＰｅｒｍ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩＩに再懸濁し、細胞を氷上で３０分間インキュベートした。次いで、細胞を１５００ｒｐｍで５分間の遠心分離により回収し、１５０μＬの染色バッファーで２回洗浄した。それから、細胞ペレットを２５μＬの抗体カクテルに再懸濁し、暗所、室温で１時間インキュベートした。次いで、細胞を１５００ｒｐｍで５分間の遠心分離により回収し、１５０μＬの染色バッファーで２回洗浄した。最後に、細胞ペレットを１５０μＬの染色バッファーに再懸濁し、細胞をフローサイトメトリーで分析した。
【０３８４】
図８Ａ〜８Ｅは、異なる濃度のＴＧＦ−βによる刺激後の非形質導入ＨｅＬａ細胞（ｗｔ）、ＴＧＦ−βＲＩＩ−ＣＤ９０  ＧＰＩアンカーをコードするレンチウイルスで形質導入したＨｅＬａ細胞（ＣＤ９０）、またはＧＦＰをコードするレンチウイルスで形質導入したＨｅＬａ細胞（ＧＦＰ）におけるシグナル伝達の分析結果を示している。ＴＧＦ−βＲＩＩ−ＣＤ９０  ＧＰＩアンカーで形質導入した細胞は、リン酸化シグナル伝達タンパク質（ＳＭＡＤ）について陽性に染色される細胞の割合の減少、およびＣＲＥＢ転写因子について陽性に染色される細胞の割合の減少により証明されるように、ＴＧＦ−βによる刺激に応答したＴＧＦ−β媒介性シグナル伝達活性化がより低くなっていた。
【０３８５】
図９および１０は、異なる濃度のＴＧＦ−βによる刺激後の非形質導入ＡＴＣ（ｗｔ）、ＴＧＦ−βＲＩＩ−ＣＤ９０  ＧＰＩアンカーをコードするレンチウイルスで形質導入したＡＴＣ（ＣＤ９０）、ＴＧＦ−βＲＩＩ−ＣＤ４８  ＧＰＩアンカーをコードするレンチウイルスで形質導入したＡＴＣ（ＣＤ４８）、ＤＮ−ＴＧＦ−βＲ２をコードするレンチウイルスで形質導入したＡＴＣ（ＤＮ）またはＧＦＰをコードするレンチウイルスで形質導入したＡＴＣ（ＧＦＰ）におけるシグナル伝達の分析結果を示している。図９Ａ〜９Ｃは、ＣＤ３＋細胞集団内の異なるマーカーに対して陽性に染色されるＣＤ８＋細胞の割合を示し、また、図１０Ａ〜１０ＣはＣＤ３＋細胞集団内の異なるマーカーに対して陽性に染色されるＣＤ４＋細胞の割合を示している。
【０３８６】
ＧＰＩアンカー配列を有するＴＧＦ−βデコイ受容体で形質導入した細胞は、ＴＧＦ−βによる刺激に応答して、ＤＮ−ＴＧＦ−βＲ２をコードするレンチウイルスで形質導入した細胞と比較して、同様または低下したＴＧＦ−β媒介性シグナル伝達レベルを示した。
【０３８７】
８．２  ウエスタンブロット
刺激した細胞を氷冷ＰＢＳに再懸濁し、４℃での遠心によりペレット化し、氷冷ＰＢＳで２回洗浄した。次いで、細胞ペレットをホスファターゼ／プロテアーゼ阻害剤カクテル（１：１００、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、＃７８４４０）を含む氷冷ＲＩＰＡ溶解バッファーに再懸濁し、時々ボルテックスしながら氷上で３０分間インキュベートした。それから、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用してタンパク質濃度を測定し、サンプル間で濃度を標準化した。次に、１０％ＭｅＥｔＯＨを含む４×Ｌａｅｍｍｌｉバッファーをサンプルに加え、９５℃で１０分間煮沸した。次いで、サンプルを氷上で冷却し、それからＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。
【０３８８】
ニトロセルロース膜を５％ミルク溶液で２時間ブロックし、１：１０００の希釈で一次抗体（ａ−Ｓｍａｄ２／３抗体、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃５６７８）と共に１２時間インキュベートした。次に、膜をＴＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄した後、１：１００００の希釈で二次抗ウサギＨＲＰ抗体と共にインキュベートした。それから、膜をＴＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄し、Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｉ−ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ（ＥＣＬ、Ｂｉｏｒａｄ）を使用して現像した。Ｃｈｅｍｉｄｏｃ  ＭＰイメージングシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して、バンドを可視化した。
【０３８９】
図１１は、抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激によって活性化され、ＴＧＦ−βＲＩＩ−ＣＤ９０  ＧＰＩアンカーをコードするレンチウイルスで形質導入した初代ヒトＴ細胞または非形質導入細胞において検出されたＴＧＦ−β刺激後のリン酸化ＳＭＡＤ２／３を示している。
【０３９０】
図１２は、ＴＧＦ−βＲＩＩ−ＣＤ９０  ＧＰＩアンカーをコードするレンチウイルス、ＧＦＰをコードするレンチウイルスで形質導入したＨｅＬａ細胞または非形質導入細胞において検出されたＴＧＦ−β刺激後のリン酸化ＳＭＡＤ２／３を示している。
【０３９１】
ＴＧＦ−βＲＩＩ−ＣＤ９０  ＧＰＩアンカーをコードするレンチウイルスを形質導入した細胞では、リン酸化ＳＭＡＤ２／３のレベルの低下が検出された。
８．３  蛍光顕微鏡
ＨｅＬａ細胞に、ＴＧＦ−βＲＩＩ−ＣＤ９０  ＧＰＩアンカー、ＴＧＦ−βＲＩＩ−ＣＤ４８  ＧＰＩアンカー、ＤＮ−ＴＧＦ−βＲ２をコードするレンチウイルスを形質導入した（実施例６．２を参照）、または、形質導入せずにおいた（ＷＴ）。次に、細胞を３８４ウェルプレートのウェルに播種し、逆タイムコース実験において１ｎｇのＴＧＦ−βにより刺激した。
【０３９２】
ｐ３８およびＳＭＡＤ２のリン酸化と細胞内局在を蛍光顕微鏡で分析した。ｐ３８のリン酸化は、ＴＧＦ−βで刺激した白血球では減少し、免疫機能が低下することが示されている。ＳＭＡＤ２リン酸化はＴＧＦ−βシグナル伝達の直接的なエフェクターであることが示されており、免疫機能の低下の原因となる。
【０３９３】
実験の結果が図１３Ａおよび１３Ｂに示されている。ＴＧＦ−βＲＩＩ−ＣＤ９０  ＧＰＩアンカーをコードするレンチウイルスで形質導入した細胞は、ＴＧＦ−βによる刺激に応答して、核に局在する最も高いレベルのリン酸化ｐ３８と、核に局在する最も低いレベルのリン酸化ＳＭＡＤ２を示すことがわかった。これは、ＴＧＦ−βＲＩＩ−ＣＤ９０デコイ受容体を発現する細胞が、ＴＧＦ−β刺激に対する反応性が最も低いことを指し示した。
【０３９４】
ＴＧＦ−βＲＩＩ−ＣＤ４８  ＧＰＩアンカーをコードするレンチウイルスで形質導入した細胞は、ＴＧＦ−βによる刺激後、ＤＮ−ＴＧＦ−βＲ２をコードするレンチウイルスで形質導入した細胞と比較して、同程度のレベルの核に局在したリン酸化ｐ３８とリン酸化ＳＭＡＤ２を示した。
【図１】
2020505069.tif 000009
【図２】
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【図３Ａ】
2020505069.tif 000011
【図３Ｂ】
2020505069.tif 000012
【図３Ｃ】
2020505069.tif 000013
【図３Ｄ】
2020505069.tif 000014
【図３Ｅ】
2020505069.tif 000015
【図３Ｆ】
2020505069.tif 000016
【図３Ｇ】
2020505069.tif 000017
【図３Ｈ】
2020505069.tif 000018
【図４Ａ】
2020505069.tif 000019
【図４Ｂ】
2020505069.tif 000020
【図４Ｃ】
2020505069.tif 000021
【図４Ｄ】
2020505069.tif 000022
【図４Ｅ】
2020505069.tif 000023
【図４Ｆ】
2020505069.tif 000024
【図４Ｇ】
2020505069.tif 000025
【図４Ｈ】
2020505069.tif 000026
【図５】
2020505069.tif 000027
【図６】
2020505069.tif 000028
【図７Ａ】
2020505069.tif 000029
【図７Ｂ】
2020505069.tif 000030
【図７Ｃ】
2020505069.tif 000031
【図７Ｄ】
2020505069.tif 000032
【図８Ａ】
2020505069.tif 000033
【図８Ｂ】
2020505069.tif 000034
【図８Ｃ】
2020505069.tif 000035
【図８Ｄ】
2020505069.tif 000036
【図８Ｅ】
2020505069.tif 000037
【図９Ａ】
2020505069.tif 000038
【図９Ｂ】
2020505069.tif 000039
【図９Ｃ】
2020505069.tif 000040
【図１０Ａ】
2020505069.tif 000041
【図１０Ｂ】
2020505069.tif 000042
【図１０Ｃ】
2020505069.tif 000043
【図１１】
2020505069.tif 000044
【図１２】
2020505069.tif 000045
【図１３Ａ】
2020505069.tif 000046
【図１３Ｂ】
2020505069.tif 000047
【配列表】
2020505069000001.app
【国際調査報告】
2020505069.tif 000048
2020505069.tif 000049
2020505069.tif 000050
2020505069.tif 000051
2020505069.tif 000052
2020505069.tif 000053
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