(57)【要約】  本開示は、核酸のライブラリーを調製するキットを提供する。キットは、第１および第２のオリゴヌクレオチドを含み、それぞれが、テール配列、共通配列、ならびに固有識別子配列および可変長の終点のうち少なくとも１つを有する。キットは、第１の試料識別子配列、および第１のプライマーの３’末端に第１のプライミング配列を有する第１のプライマーをさらに含む。第１のプライミング配列は、第１のオリゴヌクレオチドのテール配列を含む。キットは、第２の試料識別子配列、および第２のプライマーの３’末端に第２のプライミング配列を有する第２のプライマーをさらに含む。第２のプライミング配列は、第２のオリゴヌクレオチドの第２のテール配列に相補的である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
シーケンシングのためのアダプター配列を有する核酸のライブラリーを調製するキットであって、
第１のテール配列、第１の共通配列、ならびに、ｉ）第１の固有識別子配列、およびｉｉ）第１の可変長の終点のうち少なくとも１つを有する第１のオリゴヌクレオチド、
第２のテール配列、第１の共通配列に相補的な第２の共通配列、ならびに、ｉ）第１の固有識別子配列に相補的な第２の固有識別子配列、およびｉｉ）第１の可変長の終点に相補的な第２の可変長の終点のうち少なくとも１つを有する第２のオリゴヌクレオチド、
第１の試料識別子配列、および第１のプライマーの３’末端に第１のプライミング配列を有する第１のプライマーであって、前記第１のプライミング配列が第１のオリゴヌクレオチドの第１のテール配列を含む、前記第１のプライマー、ならびに、
第２の試料識別子配列、および第２のプライマーの３’末端に第２のプライミング配列を有する第２のプライマーであって、前記第２のプライミング配列が第２のオリゴヌクレオチドの第２のテール配列に相補的である、前記第２のプライマー、
を含む、前記キット。
【請求項２】
第１の試料識別子配列および第２の試料識別子配列が１対１マッピングを有する、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
第１の可変長の終点が２〜４ヌクレオチドの長さを有する、請求項２に記載のキット。
【請求項４】
第１の可変長の終点が、ＧおよびＣヌクレオチドのうち少なくとも１つを含む、請求項２に記載のキット。
【請求項５】
第１の固有識別子配列が少なくとも５ヌクレオチドの長さを有する、請求項１に記載のキット。
【請求項６】
第１の固有識別子配列が少なくとも３のペアワイズ編集距離を有する、請求項５に記載のキット。
【請求項７】
シーケンシングのためのアダプター配列を有する核酸のライブラリーを調製するキットであって、
複数のオリゴヌクレオチド対であって、オリゴヌクレオチド対のそれぞれが、
第１のテール配列、第１の共通配列、ならびに、ｉ）第１の固有識別子配列、およびｉｉ）第１の可変長の終点のうち少なくとも１つを有する第１のオリゴヌクレオチド、および、
第２のテール配列、第１の共通配列に相補的な第２の共通配列、ならびに、ｉ）第１の固有識別子配列に相補的な第２の固有識別子配列、およびｉｉ）第１の可変長の終点に相補的な第２の可変長の終点のうち少なくとも１つを有する第２のオリゴヌクレオチド、
を含む、前記複数のオリゴヌクレオチド対、
第１の試料識別子配列、および第１のプライマーの３’末端に第１のプライミング配列を有する第１のプライマーであって、前記第１のプライミング配列が第１のオリゴヌクレオチドの第１のテール配列を含む、前記第１のプライマー、ならびに、
第２の試料識別子配列、および第２のプライマーの３’末端に第２のプライミング配列を有する第２のプライマーであって、前記第２のプライミング配列が第２のオリゴヌクレオチドの第２のテール配列に相補的である、前記第２のプライマー、
を含む、前記キット。
【請求項８】
複数のオリゴヌクレオチド対のそれぞれの第１の固有識別子配列のそれぞれが異なる、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
複数のオリゴヌクレオチド対のそれぞれの第１のテール配列のそれぞれが同じものである、請求項７に記載のキット。
【請求項１０】
複数のオリゴヌクレオチド対のそれぞれの第２のテール配列のそれぞれが同じものである、請求項７に記載のキット。
【請求項１１】
複数のオリゴヌクレオチド対のそれぞれがアニーリングされてフォーク状アダプターを形成する、請求項７に記載のキット。
【請求項１２】
第１の試料識別子配列および第２の試料識別子配列が１対１マッピングを有する、請求項７に記載のキット。
【請求項１３】
第１の固有識別子配列のそれぞれが少なくとも５ヌクレオチドの長さを有する、請求項７に記載のキット。
【請求項１４】
第１の固有識別子配列のそれぞれが少なくとも３のペアワイズ編集距離を有する、請求項１５に記載のキット。
【請求項１５】
核酸分子のライブラリーを調製する方法であって、
複数のオリゴヌクレオチドアダプターのうち１つを標的核酸の各末端に結合させて、アダプター−標的−アダプター構築物を用意するステップであって、複数のオリゴヌクレオチドアダプターのそれぞれが、
第１のテール配列、第１の共通配列、ならびに、ｉ）第１の固有識別子配列、およびｉｉ）第１の可変長の終点のうち少なくとも１つを有する第１のオリゴヌクレオチド、および、
第２のテール配列、第１の共通配列に相補的な第２の共通配列、ならびに、ｉ）第１の固有識別子配列に相補的な第２の固有識別子配列、およびｉｉ）第１の可変長の終点に相補的な第２の可変長の終点のうち少なくとも１つを有する第２のオリゴヌクレオチド、
を有する、前記ステップ、
第１のプライマーをアダプター−標的−アダプター構築物にアニーリングさせるステップであって、前記第１のプライマーが、第１の試料識別子配列、および第１のプライマーの３’末端に第１のプライミング配列を有し、前記第１のプライミング配列が、第１のオリゴヌクレオチドの第１のテール配列を含む、前記ステップ、ならびに、
第１のプライマーおよび第２のプライマーのそれぞれを伸長させて、アダプター−標的−アダプター構築物の各鎖に相補的な伸長産物を形成するステップ、
を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[001]本開示は概して、核酸の次世代シーケンシングのための試料調製、より詳細には、核酸の単離および定性化のための系および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
[002]次世代シーケンシング（ＮＧＳ）プラットフォーム（例えば、ＩＬＬＵＭＩＮＡ  １塩基合成（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）プラットフォーム）とともに使用するフォーク状核酸アダプター（ｆｏｒｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｄａｐｔｅｒ）（Ｙ−アダプターとしても知られる）は、試料のマルチプレックス化、分子計数などを可能にする試料識別子（ｓａｍｐｌｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）（ＳＩＤ）および固有識別子（ｕｎｉｑｕｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）（ＵＩＤ）などの特性を含みうる。したがって、フォーク状アダプターは、アダプターライゲーション法による効率的なＮＧＳライブラリー調製を可能にし、ペアエンド様式でシーケンシングされうる分子の数を最大にし、一方でＵＩＤにより正確な分子計数およびエラー減少を可能にすることができる。しかし、例えば、これらのアダプターを産生および使用する際に生じうる複数の課題が存在する。
【０００３】
[003]ある状況では、オリゴ製造のコストは高い。１６種の独自ＵＩＤを有するアダプター設計では、１６種の異なる一本鎖ＳＩＤを有するアダプターを作り出すため、２７４種の異なるオリゴ配列が産生されなければならない。しかし、少数のオリゴ製造業者しか、これらの仕様を満たすのに十分な規模の大きさで、十分な高純度でこのような多数の異なるオリゴを産生することができない。
【０００４】
[004]別の態様において、最終シーケンシングライブラリー（ＮＧＳ実験におけるインプット分子の最終濃度の１０〜１５％を含みうる）へのＰｈｉＸの添加が、試料由来のＤＮＡ分子に利用可能なシーケンシングリードの数を効果的に減少させる。ＰｈｉＸ  ＤＮＡは大抵、ＮＧＳ実験の品質管理として、またはＤＮＡ試料の多様性が小さい場合に多様性を付加するため、ライブラリー調製中にスパイクイン対照として使用される。例えば、ライブラリー配列の３位および４位の塩基の１００％がＧおよびＴである場合に、ＰｈｉＸはこれらの位置での多様性を増大させることから、ＰｈｉＸが使用されてよく、ＩＬＬＵＭＩＮＡシーケンサーがクラスターを適切に区別し分子をフェージングすることを可能にする。
【０００５】
[005]さらに別の態様において、１６種の２塩基ＵＩＤ（すなわち、２ヌクレオチドの長さを有するＵＩＤ）を用いると、ＵＩＤにおける任意のエラーは、異なる許容されるＵＩＤをもたらす。これは、分子の過大計数、およびより良好に区別されうるＵＩＤと比較してエラー減少効率の低下につながりうる。
【０００６】
[006]さらなる態様において、ＮＧＳ実験において大抵観察される既知の現象は、別の試料由来の分子と結合またはそれ以外の場合は関連した、ある試料由来の分子のためのＳＩＤを伴う。これは、不正確な試料に割り当てられる分子を生じうる。アダプタースキームがアダプターの片側にＳＩＤを含むのみであり、ＳＩＤが目的の分子に直接結合していない場合、このクロスオーバー効果はバリアントコールを撹乱し、それにより不正確なバリアントコールをもたらしうる。その他の上述の課題とまとめると、ＮＧＳ実験のための核酸アダプターには改善の余地があることが明らかである。
【０００７】
[007]したがって、ＮＧＳ実験における製造コストの削減ならびに効率および精度の増大を可能にする核酸アダプターの新規の設計が必要である。
【発明の概要】
【０００８】
[008]本発明は、以下の列挙されるリストに記載される、モジュラー核酸アダプターを含むキットおよび方法を提供することにより、上述の欠点を克服する。
【０００９】
[009]１．シーケンシングのためのアダプター配列を有する核酸のライブラリーを調製するキットであって、
第１のテール配列、第１の共通配列、および、ｉ）第１の固有識別子配列、およびｉｉ）第１の可変長の終点のうち少なくとも１つを有する第１のオリゴヌクレオチド、
第２のテール配列、第１の共通配列に相補的な（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ  ｔｏ）第２の共通配列、および、ｉ）第１の固有識別子配列に相補的な第２の固有識別子配列、およびｉｉ）第１の可変長の終点に相補的な第２の可変長の終点のうち少なくとも１つを有する第２のオリゴヌクレオチド、
第１の試料識別子配列、および第１のプライマーの３’末端に第１のプライミング配列を有する第１のプライマーであって、第１のプライミング配列が第１のオリゴヌクレオチドの第１のテール配列を含む、第１のプライマー、ならびに
第２の試料識別子配列、および第２のプライマーの３’末端に第２のプライミング配列を有する第２のプライマーであって、第２のプライミング配列が第２のオリゴヌクレオチドの第２のテール配列に相補的である、第２のプライマー
を含む、キット。
[010]２．第１の試料識別子配列および第２の試料識別子配列が１対１マッピングを有する、１のキット。
[011]３．第１の可変長の終点が２〜４ヌクレオチドの長さを有する、２のキット。
[012]４．第１の可変長の終点が、ＧおよびＣヌクレオチドのうち少なくとも１つを含む、２のキット。
[013]５．第１の固有識別子配列が少なくとも５ヌクレオチドの長さを有する、１のキット。
[014]６．第１の固有識別子配列が少なくとも３のペアワイズ編集距離（ｐａｉｒｗｉｓｅ  ｅｄｉｔ  ｄｉｓｔａｎｃｅ）を有する、５のキット。
[015]７．シーケンシングのためのアダプター配列を有する核酸のライブラリーを調製するキットであって、
複数のオリゴヌクレオチド対であって、オリゴヌクレオチド対のそれぞれが、
第１のテール配列、第１の共通配列、および、ｉ）第１の固有識別子配列、およびｉｉ）第１の可変長の終点のうち少なくとも１つを有する第１のオリゴヌクレオチド、および
第２のテール配列、第１の共通配列に相補的な第２の共通配列、および、ｉ）第１の固有識別子配列に相補的な第２の固有識別子配列、およびｉｉ）第１の可変長の終点に相補的な第２の可変長の終点のうち少なくとも１つを有する第２のオリゴヌクレオチド
を含む、複数のオリゴヌクレオチド対、
第１の試料識別子配列、および第１のプライマーの３’末端に第１のプライミング配列を有する第１のプライマーであって、第１のプライミング配列が第１のオリゴヌクレオチドの第１のテール配列を含む、第１のプライマー、ならびに
第２の試料識別子配列、および第２のプライマーの３’末端に第２のプライミング配列を有する第２のプライマーであって、第２のプライミング配列が第２のオリゴヌクレオチドの第２のテール配列に相補的である、第２のプライマー
を含む、キット。
[016]８．複数のオリゴヌクレオチド対のそれぞれの第１の固有識別子配列のそれぞれが異なる、７のキット。
[017]９．複数のオリゴヌクレオチド対のそれぞれの第１のテール配列のそれぞれが同じものである、７のキット。
[018]１０．複数のオリゴヌクレオチド対のそれぞれの第２のテール配列のそれぞれが同じものである、７のキット。
[019]１１．複数のオリゴヌクレオチド対のそれぞれがアニーリングされてフォーク状アダプターを形成する、７のキット。
[020]１２．第１の試料識別子配列および第２の試料識別子配列が１対１マッピングを有する、７のキット。
[021]１３．第１の可変長の終点のそれぞれが２〜４ヌクレオチドの長さを有する、１２のキット。
[022]１４．第１の可変長の終点のそれぞれが、ＧおよびＣヌクレオチドのうち少なくとも１つを含む、１２のキット。
[023]１５．第１の固有識別子配列のそれぞれが少なくとも５ヌクレオチドの長さを有する、７のキット。
[024]１６．第１の固有識別子配列のそれぞれが少なくとも３のペアワイズ編集距離を有する、１５のキット。
[025]１７．核酸分子のライブラリーを調製する方法であって、
複数のオリゴヌクレオチドアダプターのうち１つを標的核酸の各末端に結合させて、アダプター−標的−アダプター構築物を用意するステップであって、複数のオリゴヌクレオチドアダプターのそれぞれが、
第１のテール配列、第１の共通配列、および、ｉ）第１の固有識別子配列、およびｉｉ）第１の可変長の終点のうち少なくとも１つを有する第１のオリゴヌクレオチド、および
第２のテール配列、第１の共通配列に相補的な第２の共通配列、および、ｉ）第１の固有識別子配列に相補的な第２の固有識別子配列、およびｉｉ）第１の可変長の終点に相補的な第２の可変長の終点のうち少なくとも１つを有する第２のオリゴヌクレオチド
を有する、ステップ、
第１のプライマーをアダプター−標的−アダプター構築物にアニーリングさせるステップであって、第１のプライマーが、第１の試料識別子配列、および第１のプライマーの３’末端に第１のプライミング配列を有し、第１のプライミング配列が、第１のオリゴヌクレオチドの第１のテール配列を含む、ステップ、ならびに
第１のプライマーおよび第２のプライマーのそれぞれを伸長させて、アダプター−標的−アダプター構築物の各鎖に相補的な伸長産物を形成するステップ
を含む、方法。
[026]１８．複数のオリゴヌクレオチドアダプターのそれぞれの第１の固有識別子配列のそれぞれが異なる、１７の方法。
[027]１９．複数のオリゴヌクレオチドアダプターのそれぞれの第１のテール配列のそれぞれが同じものである、１７の方法。
[028]２０．複数のオリゴヌクレオチドアダプターのそれぞれの第２のテール配列のそれぞれが同じものである、１７の方法。
[029]２１．第１の試料識別子配列および第２の試料識別子配列が１対１マッピングを有する、１７の方法。
[030]２２．第１の可変長の終点のそれぞれが２〜４ヌクレオチドの長さを有する、２１の方法。
[031]２３．第１の可変長の終点のそれぞれが、ＧおよびＣヌクレオチドのうち少なくとも１つを含む、２１の方法。
[032]２４．第１の固有識別子配列のそれぞれが少なくとも５ヌクレオチドの長さを有する、１７の方法。
[033]２５．第１の固有識別子配列のそれぞれが少なくとも３のペアワイズ編集距離を有する、２４の方法。
【００１０】
[034]本発明の上記およびその他の態様および利点が、以下の記載から明らかとなるはずである。本記載において、本明細書の一部を形成する添付の図面に言及がなされ、そこで例示のために本発明の好ましい実施形態が示される。このような実施形態は本発明の全範囲を必ずしも表すわけではないが、本発明の範囲を説明するため請求項および本明細書に言及がなされる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】[035]本開示によるモジュラー核酸アダプターの成分についての実施形態を示す概略図である。
【図２Ａ】[036]本開示によるモジュラー核酸アダプターを用いて核酸のライブラリーを調製する方法についての概略図である。方法の第１の部分では、所定の分子バーコード（ＵＩＤ）を有するアダプターオリゴ、ならびに、試料核酸ライブラリー断片へのライゲーション後のアダプターオリゴ増幅のための、ＳＩＤを有するフォワードおよびリバースプライマーの設計を含む、アダプターオリゴプールを構築することについてスキームが例示される。本例では、各試料核酸断片は、１６種の異なるアニーリングされたアダプター（アニーリングされたアダプターのそれぞれは、１６種の所定の分子バーコードまたはＵＩＤのうち１つを有する）のうち１つに、各末端においてライゲーションされる。ライゲーション後、試料中の各核酸断片は、２５６種の異なる考えられる分子バーコード配列対のうち１つを伴う。図２Ａは、登場順に、配列番号３、４、３、４、１９７および１９８についてそれぞれ開示する。
【図２Ｂ】[037]図２Ａの方法についての概略図の続きである。アニーリングされたアダプターを、核酸試料中の標的ＤＮＡ分子にライゲーションした後、図２Ａに例示されるＳＩＤを有するプライマーが、ＳＩＤおよびＮＧＳプラットフォーム特異的配列（例えば、ＩＬＬＵＭＩＮＡシーケンサーではｐ５およびｐ７配列）を組み込むため、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）実験の第１および第２のラウンドに使用される。図２Ｂは、登場順に、配列番号１９９〜２０３、１９８、１９７および２０４〜２０６についてそれぞれ開示する。
【図２Ｃ】[038]図２Ａおよび２Ｂの方法についての概略図の続きである。ＰＣＲ増幅後、例示されるＰＣＲ産物がシーケンシングにかけられる。本例では、ＩＬＬＵＭＩＮＡプラットフォーム（例えば、ＩＬＬＵＭＩＮＡ  ＨＩＳＥＱシリーズ）でのシーケンシングに適切なプライミング部位が、ＰＣＲ産物のそれぞれについて下線により示される。図２Ｃは、登場順に、配列番号２０７〜２１７についてそれぞれ開示する。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
[039]Ｉ．定義
[040]本出願では、文脈より別途明らかでない限り、（ｉ）「ａ」という語は、「少なくとも１つの」を意味するものと理解されてよく、（ｉｉ）「または」という語は、「および／または」を意味するものと理解されてよく、（ｉｉｉ）「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という語は、箇条書きされた成分またはステップを、それら単独で提示されるのか１つまたは複数のさらなる成分またはステップとともに提示されるのかに関係なく包含するものと理解されてよく、（ｉｖ）「約（ａｂｏｕｔ）」および「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という語は、当業者には理解される標準的な変動を可能にするものと理解されてよく、（ｖ）範囲が与えられる場合、端点が含まれる。
【００１３】
[041]約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）：本明細書で使用される場合、１つまたは複数の目的の値に適用される「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」または「約（ａｂｏｕｔ）」という語は、明記される参照値と類似の値を指す。ある特定の実施形態において、「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」または「約（ａｂｏｕｔ）」という語は、別途明記されるか別途文脈から明白でない限り、明記される参照値のいずれかの方向（超または未満）の２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ未満内に入る広範な値を指す（このような数が、考えられる値の１００％を上回る場合を除く）。
【００１４】
[042]関連する：２つのイベントまたは実体は、その語が本明細書で使用される場合、一方の存在、レベル、および／または形態が他方の存在、レベル、および／または形態と相関する場合、互いに「関連する」。例えば、特定の実体（例えば、ポリペプチド、遺伝子シグネチャー、代謝物など）は、その存在、レベルおよび／または形態が、特定の疾患、障害、または状態の発症率および／またはそれらに対する感受性と相関する場合（例えば、適切な集団全体で）、その疾患、障害、または状態と関連すると考えられる。一部の実施形態において、２つ以上の実体は、それらが互いに物理的に近接しているおよび／または物理的に近接したままとなるように直接または間接的に相互作用している場合、互いに物理的に「関連する」。一部の実施形態において、互いに物理的に関連する２つ以上の実体は互いに共有結合しており、一部の実施形態において、互いに物理的に関連する２つ以上の実体は互いに共有結合してはいないが、例えば水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、磁性、およびこれらの組合せにより非共有結合的に関連する。
【００１５】
[043]生物試料：本明細書で使用される場合、「生物試料」という語は、典型的には、本明細書に記載されるように、目的の生物供給源（例えば、組織または生物または細胞培養物）から得られる、またはこれら由来の試料を指す。一部の実施形態において、目的の供給源は、動物またはヒトなどの生物を含む、またはこれらからなる。一部の実施形態において、生物試料は、生物組織または生体液を含む、またはこれらからなる。一部の実施形態において、生物試料は、骨髄；血液；血液細胞；腹水；組織または穿刺生検試料；細胞含有体液；遊離浮遊核酸（ｆｒｅｅ  ｆｌｏａｔｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）；痰；唾液；尿；脳脊髄液、腹腔液；胸水；排泄物；リンパ液；婦人科体液（ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｌｕｉｄ）；皮膚スワブ；膣スワブ；口腔スワブ；鼻腔スワブ；乳管洗浄液または気管支肺胞洗浄液などの洗浄液（ｗａｓｈｉｎｇ）または洗浄液（ｌａｖａｇｅ）；吸引液；擦過物；骨髄標本；組織生検標本；手術標本；その他の体液、分泌物、および／または排出物；および／またはこれら由来の細胞などであってよい、またはこれらを含んでいてよい。一部の実施形態において、生物試料は、個体から得られる細胞を含む、またはこれからなる。一部の実施形態において、得られる細胞は、その試料が得られた個体由来の細胞である、またはこれを含む。一部の実施形態において、試料は、任意の適切な手段により目的の供給源から直接得られる「一次試料」である。例えば、一部の実施形態において、一次生物試料は、生検（例えば、穿刺吸引または組織生検）、外科手術、体液の収集（例えば、血液、リンパ液、排泄物など）などからなる群から選択される方法により得られる。一部の実施形態において、文脈から明らかであるように、「試料」という語は、一次試料を加工することにより（例えば、１つもしくは複数の成分を除去することおよび／または１つもしくは複数の因子を添加することにより）得られる調製物を指す。例えば、半透膜を使用する濾過。このような「加工された試料」は、例えば、試料から抽出された、または、ｍＲＮＡの増幅もしくは逆転写、特定の成分の単離および／もしくは精製などの技術に一次試料を供することにより得られた核酸またはタンパク質を含んでいてよい。
【００１６】
[044]を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）：１つまたは複数の指定される要素またはステップ「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と本明細書に記載される組成物または方法はオープンエンドであり、指定される要素またはステップは必須であるが、その他の要素またはステップが組成物または方法の範囲内で追加されうることを意味する。１つまたは複数の指定される要素またはステップ「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（または「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」）と記載される組成物または方法は、指定される同じ要素またはステップ「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」（または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」）、対応する、より限定される組成物または方法についても記載し、組成物または方法が、指定される必須の要素またはステップを含み、組成物または方法の基本的なおよび新規の特徴にほとんど影響を及ぼさないさらなる要素またはステップも含みうることを意味すると理解されたい。１つまたは複数の指定される要素またはステップ「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」と本明細書に記載される任意の組成物または方法は、任意のその他の指定されない要素またはステップの除外のための、指定される要素またはステップ「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」（または「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｏｆ）」）、対応する、より限定されるクローズエンドな組成物または方法についても記載することも理解される。本明細書で開示される任意の組成物または方法において、任意の指定される必須の要素またはステップについての既知のまたは開示される同等物は、その要素またはステップと置換されうる。
【００１７】
[045]設計された：本明細書で使用される場合、「設計された」という語は、（ｉ）その構造が人の手で選択されるもしくは選択された、（ｉｉ）人の手を必要とするプロセスにより産生され、かつ／または（ｉｉｉ）天然の物質およびその他の既知の因子とは別個の因子を指す。
【００１８】
[046]決定する：本明細書を読む当業者は、「決定すること」が、例えば本明細書で明確に言及される特定の技術を含む、当業者が利用可能な様々な技術のいずれかの使用を利用することができ、またはこのことにより実現されうることを理解するものである。一部の実施形態において、決定することは物理的試料の操作を伴う。一部の実施形態において、決定することは、例えば、適切な分析を実施するのに適したコンピュータまたはその他の処理装置を利用する、データまたは情報の考察および／または操作を伴う。一部の実施形態において、決定することは、供給源から適切な情報および／または物質を受け取ることを伴う。一部の実施形態において、決定することは、試料または実体の１つまたは複数の特性を、比較可能な参照と比較することを伴う。
【００１９】
[047]同一性：本明細書で使用される場合、「同一性」という語は、高分子間、例えば、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子）間および／またはポリペプチド分子間の全体的な関連性を指す。一部の実施形態において、高分子は、それらの配列が少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一である場合、互いに「実質的に同一」であると考えられる。２つの核酸またはポリペプチド配列のパーセント同一性の算出は、例えば、最適な比較のため２つの配列をアライメントすることにより実施されてよい（例えば、最適なアライメントのため第１および第２の配列の一方または両方にギャップが導入されてよく、比較のため非同一配列は無視されてよい）。ある特定の実施形態において、比較のためアライメントされる配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または実質的に１００％である。次いで、対応する位置のヌクレオチドが比較される。第１の配列のある位置が第２の配列の対応する位置と同じ残基（例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸）で占められていれば、分子はその位置において同一である。２つの配列間のパーセント同一性は、２つの配列の最適なアライメントのために導入される必要があるギャップの数、および各ギャップの長さを計算に入れた、配列により共有される同一の位置の数の関数である。配列比較および２つの配列間のパーセント同一性決定は、数学的アルゴリズムを使用して実現されうる。例えば、２つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＭｅｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ、１９８９、４：１１〜１７）のアルゴリズムを使用して決定されうる。一部の例示的な実施形態において、ＡＬＩＧＮプログラムを用いてなされる核酸配列比較は、ＰＡＭ１２０重み付け表（ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅ）、ギャップ長さペナルティ１２およびギャップペナルティ４を使用する。代わりに、２つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスを使用するＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムを使用しても決定されうる。
【００２０】
[048]試料：本明細書で使用される場合、「試料」という語は、定性的および／または定量的評価に関して目的の組成であるまたはこれを含む物質を指す。一部の実施形態において、試料は生物試料である（すなわち、生体（例えば、細胞または生物）由来である）。一部の実施形態において、試料は、地質学、水産、天文学、または農業供給源由来である。一部の実施形態において、目的の供給源は、動物またはヒトなどの生物を含むまたはこれらからなる。一部の実施形態において、法医学的分析用の試料は、生物組織、生体液、例えば衣服、汚れ、プラスチック、水などの有機物または非有機物であるまたはこれらを含む。一部の実施形態において、農業試料は、葉、花弁、樹皮、木、種子、植物、果実などの有機物を含むまたはこれらからなる。
【００２１】
[049]実質的に：本明細書で使用される場合、「実質的に」という語は、目的の特徴または特性の、完全なまたはほぼ完全な程度または度合いを示す定性的状態を指す。生物学分野の技術者は、生物学的および化学的現象が、仮にあるとしても、完了に達する、かつ／または完全性に向かう、または決定的な結果を達成もしくは回避することはめったにないことを理解するものである。したがって「実質的に」という語は、多くの生物学的および化学的現象に固有の、完全性の潜在的な欠如を表現するため、本明細書で使用される。
【００２２】
[050]合成の：本明細書で使用される場合、「合成の」という語は、人の手で産生され、ゆえに、天然には存在しない構造を有するため、または、天然には伴わない１つもしくは複数のその他の成分を伴うか、天然には伴う１つもしくは複数のその他の成分を伴わないため、天然には存在しない形態であることを意味する。
【００２３】
[051]バリアント：本明細書で使用される場合、「バリアント」という語は、参照実体と顕著な構造上の同一性を示すが、参照実体と比較して、１つまたは複数の化学的部分の存在またはレベルが参照実体と構造的に異なる実体を指す。多くの実施形態において、バリアントはその参照実体とは機能的にも異なる。概して、特定の実体が参照実体の「バリアント」であると適切に考えられるかどうかは、その、参照実体との構造上の同一性の度合いに基づく。当業者には理解されるように、任意の生物学的または化学的参照実体は、特定の特徴的な構造要素を有する。バリアントは、定義により、１つまたは複数のこのような特徴的な構造要素を共有する別個の化学的実体である。いくつかの例を挙げると、低分子は、特徴的なコア構造要素（例えば、大員環コア）および／または１つもしくは複数の特徴的なペンダント部分を有していてよく、そのため、低分子のバリアントは、コア構造要素および特徴的なペンダント部分を共有するが、その他のペンダント部分および／またはコア内に存在する結合の種類（単対二重、Ｅ対Ｚなど）が異なるものであり、ポリペプチドは、線状もしくは３次元空間において互いに対して指定される位置を有し、かつ／または特定の生物機能に寄与する複数のアミノ酸から構成される特徴的な配列要素を有していてよく、核酸は、線状または３次元空間において互いに対して指定される位置を有する複数のヌクレオチド残基から構成される特徴的な配列要素を有していてよい。例えば、バリアントポリペプチドは、アミノ酸配列における１つもしくは複数の違い、および／またはポリペプチド骨格に共有結合した化学的部分（例えば、糖、脂質など）における１つもしくは複数の違いの結果として、参照ポリペプチドとは異なりうる。一部の実施形態において、バリアントポリペプチドは、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９９％の、参照ポリペプチドとの全体的な配列同一性を示す。代わりにまたはそれに加えて、一部の実施形態において、バリアントポリペプチドは、少なくとも１つの特徴的な配列要素を参照ポリペプチドと共有しない。一部の実施形態において、参照ポリペプチドは１つまたは複数の生物活性を有する。一部の実施形態において、バリアントポリペプチドは参照ポリペプチドの生物活性のうち１つまたは複数を共有する。一部の実施形態において、バリアントポリペプチドは参照ポリペプチドの生物活性のうち１つまたは複数を欠く。一部の実施形態において、バリアントポリペプチドは、参照ポリペプチドと比較して、１つまたは複数の生物活性レベルの低下を示す。多くの実施形態において、目的のポリペプチドが、特定の位置における少数の配列変更を除いて、親のアミノ酸配列に対して同一のアミノ酸配列を有する場合、目的のポリペプチドは親または参照ポリペプチドの「バリアント」であると考えられる。典型的には、バリアントにおける残基の２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満が、親と比較して置換されている。一部の実施形態において、バリアントは、親と比較して置換された残基を１０、９、８、７、６、５���４、３、２、または１個有する。大抵、バリアントは非常にわずかな数（例えば、５、４、３、２、または１個未満）数の置換された機能性残基（すなわち、特定の生物活性に関与する残基）を有する。さらに、バリアントは典型的には、親と比較して、付加または欠失を５、４、３、２、または１個以下有し、大抵は付加も欠失も有しない。さらに、任意の付加または欠失は、典型的には、残基約２５個、約２０個、約１９個、約１８個、約１７個、約１６個、約１５個、約１４個、約１３個、約１０個、約９個、約８個、約７個、約６個未満であり、通常は約５個、約４個、約３個、または約２個未満である。一部の実施形態において、バリアントは１つもしくは複数の機能的欠損も有していてよく、かつ／または別途「突然変異体」と考えられうる。一部の実施形態において、親または参照ポリペプチドは天然に見られるポリペプチドである。当業者には理解されるように、目的の特定のポリペプチドの複数のバリアントは通常、特に目的のポリペプチドが感染因子ポリペプチドであれば、天然に見られる。
【００２４】
ＩＩ．特定の実施形態についての詳細な記載
[052]先にも論じられたように、各種状況において、ＮＧＳなどにおける核酸ライブラリー調製のためのアダプターを提供することは有用でありうる。しかし、現在のアダプター設計は、製造コスト、シーケンシング効率および下流ベースコール精度、試料特定などに関していくつかの欠点を有する。
【００２５】
[053]これらのおよびその他の課題は、本開示によるモジュラー核酸アダプターにより克服されうる。一態様において、開示されるアダプターは、それによりＵＩＤおよびＳＩＤが２つの独立したオリゴのセットに分配されるスキーム（図１）を使用して、上述の課題を克服するため実施されうる。したがって、一実施形態において、２つ以上の異なるＵＩＤ配列のセットから選択されるＵＩＤを有する各アダプターを用いて、フォーク状アダプターのプールが調製される。ＵＩＤ含有フォーク状アダプターを標的核酸にライゲーションした後、生じたライゲーション産物は、ＳＩＤ、および任意選択でＮＧＳプラットフォーム特異的配列などのその他の配列情報を含むプライマーを用いて増幅される。生じた増幅産物は、最初のアダプターライゲーションステップ由来の一対のＵＩＤ、および増幅ステップ由来のＳＩＤ（または一対のＳＩＤ）の両方を含む。特に、上述のモジュラー設計の変形形態も本開示の範囲内である。例えば、ＵＩＤおよびＳＩＤの位置は交換可能である。すなわち、フォーク状アダプターのＵＩＤはＳＩＤで置換されてよく、増幅プライマーに含まれるＳＩＤはＵＩＤで置換されてよい。結果として、ＳＩＤがライゲーションにより組み込まれ、ＵＩＤがＰＣＲ増幅により組み込まれる。さらにその他の、開示されるモジュラー核酸アダプターの変形形態が以下の開示から明らかとなるはずである。
【００２６】
[054]開示されるモジュラー核酸アダプター設計の１つの利点は、各自のＳＩＤを有し、次いでユニバーサルＰＣＲプライマー対により増幅される各アダプターの代わりに、アダプターがユニバーサルであり（例えば、１６種の異なるＵＩＤを有するアダプターが１つのアダプターチューブにプールされる）、ＰＣＲプライマーがＳＩＤを含むことである。この設計では、ＵＩＤおよびＳＩＤが分離され、産生されるべき必要なオリゴ数の減少が可能となる。１６種の異なるＵＩＤおよび１６種のＳＩＤを有するアダプター設計では、２７４種の代わりに６４種の異なるオリゴが必要である。さらに、これらのオリゴは以前の設計でのオリゴより短く、これによりオリゴ合成コストも減少し、さらにライゲーション効率（したがってアッセイ効率）も増大しうる。一態様において、異なるＵＩＤのセットは、２、４、８、１６、３２、６４、１２８種、またはそれを超える異なるＵＩＤ配列を含む。別の態様において、異なるＳＩＤのセットは、２、４、８、１６、３２、６４、１２８種、またはそれを超える異なるＳＩＤ配列を含む。特に、選択されるＵＩＤおよびＳＩＤの数は、マルチプレックス化にとって望ましい試料数、ＮＧＳプラットフォーム（すなわち、シーケンシング装置）の能力、分析される核酸試料の多様性などを含む、実験の性質によって決まる。
【００２７】
[055]開示されるモジュラー核酸アダプター設計の別の態様において、各アダプターの末端にＧＴの一定の２塩基終点を有する代わりに、終点が可変長で合成される。可変長の終点（図１）の使用により、リード内の各位置で十分な多様性が確実となり、ゆえにＰｈｉＸスパイクインまたはその他の同様の対照または多様性増強物質が必要でない。一実施形態において、終点は２〜４塩基の間で変動する。実施に際して、Ｔ−オーバーハング直前の塩基はＣヌクレオチドまたはＧヌクレオチドから選択され、それによってより強力な水素結合（すなわち、「Ｇ−Ｃクランプ」）が可能となり、このことがライゲーション効率の改善を示しうる。別の実施形態において、終点の末端塩基は任意のヌクレオチドのいずれかから選択される。一態様において終点は、シーケンシングリードにおけるいずれの位置も、その位置における選択されるパーセンテージ（例えば、６２．５％）を超えて任意の塩基を有しないように設計されてよく、開示されるアダプターを使用すれば、ＰｈｉＸまたは別の同様の因子の添加の必要性が除去される。終点および各位置での塩基％の内訳のリストが表１および２に示される。
【００２８】
[056]
【表１】
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【００２９】
[057]
【表２】
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【００３０】
[058]本開示の別の態様において、１つまたは複数のエラーがＵＩＤにおいて発生した場合、そのＵＩＤが、ＵＩＤ配列の選択されるプールにおける別のＵＩＤと同じ配列を生じないように、ＵＩＤが設計されうる。このようにして、１つまたは複数のエラーを有するＵＩＤは、修正されるかさらなる分析から除去されうる。添付の実施において、２ヌクレオチドの長さを有するＵＩＤの代わりに、少なくとも３のペアワイズ編集距離を有する、５ヌクレオチドの長さを有するＵＩＤが使用される。本明細書で定義されるように、ペアワイズ編集距離は、一方のストリングを他方のストリングに変換するのに必要な最小限の操作数を計数することにより決定される、２つの文字ストリング（例えば、ヌクレオチド配列）間の類似性の尺度である。本開示の例で使用されるように、ペアワイズ編集距離は、操作が欠失、挿入、および置換に限定されるレーベンシュタイン距離に従って決定されるが、ペアワイズ編集距離は当業者には理解されるその他の手法を使用して算出されてもよい。ペアワイズ編集距離３により、単一のエラーを有するＵＩＤが常に正確に特定されうる。これにより、最大２５種の異なるＵＩＤが可能となる（例えば、Ｆａｉｒｃｌｏｔｈ、ら  ２０１２．    ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ７（８）：ｅ４２５４３を参照のこと）。添付の実施（表３）では、１６種のＵＩＤが使用されている。異なる長さのＵＩＤも使用可能である（例えば、長さわずか２塩基および１０塩基ものＵＩＤを有する設計）。２塩基ＵＩＤ、および本明細書に記載される可変の終点の使用により、ペアワイズハミング距離２を有するＵＩＤ＋終点が生成されてよく−この実施（表４）では、ＵＩＤにおける１つの置換エラーでは、このセットにおける別のＵＩＤ＋終点と同一のＵＩＤ＋終点配列が生じない。本明細書で定義されるように、ハミング距離は、唯一許される操作が置換である、２つのストリング間の編集距離である。２つのさらなるＵＩＤスキームが以下の表５および６に示される。
【００３１】
[059]
【表３】
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【００３２】
[060]
【表４】
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【００３３】
[061]
【表５】
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【００３４】
[062]
【表６】
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【００３５】
[063]表３〜６に例示されるアダプタースキームを参照すると、ＵＩＤおよび終点は任意の適切なアダプター配列と組み合わされうる。例えば、ＩＬＬＵＭＩＮＡ  ｉ５およびｉ７アダプター配列は、それぞれＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ（配列番号１）およびＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＣＧＴＣＴＧＡＡＣＴＣＣＡＧＴＣＡＣ（配列番号２）である。表３の１列目のＵＩＤ配列（ＵＩＤ）ＣＡＧＡＴおよびｉ５終点（ｉ５  ｐｕｎｃ）Ｃは、ＩＬＬＵＭＩＮＡ  ｉ５アダプター配列と組み合わされてオリゴ配列ＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＣＡＧＡＴＣ＊Ｔ（配列番号３）をもたらすことができ、ここでアスタリスク（＊）はホスホロチオエート結合を示す。同様に、ＵＩＤのリバース相補体（ｒｃ  ＵＩＤ）ＡＴＣＴＧおよびｉ7終点（ｉ７  ｐｕｎｃ）Ｇ（ｉ５終点Ｃのリバース相補体）は、ＩＬＬＵＭＩＮＡ  ｉ７アダプター配列と組み合わされてオリゴ配列ＧＡＴＣＴＧＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＣＧＴＣＴＧＡＡＣＴＣＣＡＧＴＣＡＣ（配列番号４）をもたらすことができ、ここで配列は５’−リン酸基を含む。表３〜６のそれぞれは、１６種のオリゴヌクレオチド対のセットを調製するのに使用可能な、１６種の異なるＵＩＤ／終点組合せのセットを列挙する。
【００３６】
[064]アダプター調製では、オリゴヌクレオチド対のそれぞれが合成され、精製され、アニーリングされて、アニーリングされたアダプターの均質な集団をもたらす。次いで、１６種の異なるアニーリングされたアダプターのプールが組み合わされて、１６種の異なるＵＩＤを有する１つのアダプタープールを作製する。１６種超または未満の異なるＵＩＤを有するアダプターのプールも、記載される手法を使用して調製されうることが理解されよう。
【００３７】
[065]本開示の別の態様において、１つのシーケンシングリードのみにおけるＳＩＤの代わりに、標的核酸の、異なるＵＩＤを有するアニーリングされたアダプターとのライゲーションから生じる産物の増幅のための、一方または両方のＰＣＲプライマーにＳＩＤが組み込まれてもよい。そこに組み込まれたＳＩＤを有するプライマーを使用することにより、シーケンシングから生じる両インデックスリードがＳＩＤをもたらす。１つのプライマー対内で、一方のインデックスリード由来のＳＩＤが既知であれば他方のリード（ペアエンド由来）由来のＳＩＤが予測可能となるような１対１マッピングを有するように、ＳＩＤが設計されうる。このＳＩＤの１対１マッピングにより、第１のＳＩＤを伴うある試料由来の分子が、第２のＳＩＤを伴う別の試料由来の分子に接着しているとき、ＳＩＤにおけるリードの除去が可能となる。表７および８に示される実施では、ＳＩＤは互いのリバースである。２つの配列が逆の順序でヌクレオチドの同じ配列を共有していれば、ある配列は別の配列の「リバース」と考えられる。例えば、第１のＳＩＤが配列ＡＡＣＴを有する場合、配列ＴＣＡＡを有する第２のＳＩＤは第１のＳＩＤのリバースである。特に、配列のリバースは配列のリバース相補体とは異なる。ＳＩＤは最小限のペアワイズ編集距離３を有し、ゆえに最大１エラーで、ＳＩＤは正確なＳＩＤ配列を常に適切に伴うことができる。本開示により有用なＳＩＤの例が、Ｆａｉｒｃｌｏｔｈおよび共同研究者（Ｆａｉｒｃｌｏｔｈ、ら  ２０１２．    ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ７（８）：  ｅ４２５４３）により記載されている。表７および８の配列は９６種のＳＩＤ対を含むが、さらにその他のＳＩＤの配列、組合せ、および数が本開示の状況において使用されうることが理解されよう。
【００３８】
[066]
【表７−１】
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【００３９】
【表７−２】
2020529833.tif 000009
【００４０】
【表７−３】
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【００４１】
[067]
【表８−１】
2020529833.tif 000011
【００４２】
【表８−２】
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【００４３】
【表８−３】
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【００４４】
[068]一態様において、モジュラー核酸アダプターの実施形態が、本明細書に記載される特性の任意の組合せを含みうることが理解されよう。一例において、表５に例示されるスキームは、２ヌクレオチドの長さを有するＵＩＤおよび可変長の終点を有するアダプターを企図するが、表６に例示されるスキームは、２ヌクレオチドの長さを有するＵＩＤおよび単一ヌクレオチド終点を有するアダプターを企図する（すなわち、終点は可変長でない）。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2020529833.tif 000019
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