(57)【要約】本発明は、薬学的に許容されるマーカーＭと、最大で３０個のアミノ酸残基を有するとともに低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）に結合可能なペプチド又は疑似ペプチドＰとを含むコンジュゲート化合物、並びに対象にコンジュゲート化合物を投与すること及びマーカーの存在及び／又は量を分析することによって対象におけるがん細胞を標識する及び／又は検出する及び／又は処置する方法におけるその使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象にコンジュゲート化合物を投与すること並びにマーカーの存在及び／又は量を分析することによって前記対象におけるがん細胞を標識する及び／又は検出する方法に使用する、化学式（Ｉ）のコンジュゲート化合物であって、
Ｍ−Ｃ−Ｐ（Ｉ）、
式中、Ｍは薬学的に許容されるマーカーを示し、
Ｃは、Ｍとともにキレートを形成するキレーターを示し、
Ｐは、最大で３０個のアミノ酸残基を有するとともに低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）に結合可能なペプチド又は疑似ペプチドを示す、コンジュゲート化合物。
【請求項２】
前記化合物は、複数の化学式（Ｉ）の単量体を含む多量体である、請求項１に記載の使用のためのコンジュゲート化合物。
【請求項３】
Ｐはアミノ酸配列（ＩＩ）を含み、
Ａ１−Ｍｅｔ−Ａ２−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａ３−Ａ４（ＩＩ）、
配列中、Ａ１及びＡ４は、独立してシステイン又はそのアナログ若しくはイソスターを示し、Ａ２は、プロリン又はそのアナログ若しくはイソスターを示し、Ａ３は、グリシン又はそのアナログ若しくはイソスターを示す、請求項１又は２に記載の使用のためのコンジュゲート化合物。
【請求項４】
Ａ１及びＡ４は、独立してシステイン（Ｃｙｓ）若しくは（Ｄ）−ｃｙｓ、ペニシラミン（Ｐｅｎ）、及び（Ｄ）−ペニシラミン（（Ｄ）−Ｐｅｎ）から選択されるそのアナログを示し、並びに／又はＡ２は、プロリン（Ｐｒｏ）若しくはピペコリン酸（Ｐｉｐ）及びチアゾリジン−４−カルボン酸（Ｔｈｚ）から選択されるそのアナログを示し、並びに／又はＡ３は、Ｇｌｙ又はサルコシン（Ｓａｒ）を示す、請求項３に記載の使用のためのコンジュゲート化合物。
【請求項５】
Ｐは、配列番号１〜配列番号９のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用のためのコンジュゲート化合物。
【請求項６】
Ｍは、放射性核種又は蛍光マーカーを示す、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用のためのコンジュゲート化合物。
【請求項７】
Ｍは１８Ｆ又は６８Ｇａである、請求項６に記載の使用のためのコンジュゲート化合物。
【請求項８】
Ｍは、直接的に又は非直接的に、共有結合又はイオン結合によってＰに結合する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用のためのコンジュゲート化合物。
【請求項９】
前記キレーターＣは、ＮＯＤＡＧＡ、ＤＯＴＡ、ＤＯＴＡ−ＧＡ、ＮＯＴＡ、及びその機能的誘導体から選択される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用のためのコンジュゲート化合物。
【請求項１０】
前記キレーターＣは、スペーサーＳを介してＰに結合する、請求項９に記載の使用のためのコンジュゲート化合物。
【請求項１１】
前記化合物は、ＬＤＬＲとは異なる分子に結合する第２標的基Ｔをさらに含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用のためのコンジュゲート化合物。
【請求項１２】
Ｍは放射性核種を示し、前記方法は、
ａ）  前記コンジュゲート化合物を対象に投与するステップと、
ｂ）  イメージング方法を行うステップと、
ｃ）  ステップｂ）において得た信号を分析するステップとを含み、
信号の存在は、前記対象におけるがん細胞の存在及び／又はがん進展のステージ分類を示す、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の使用のためのコンジュゲート化合物。
【請求項１３】
ＬＤＬＲを過剰発現するがん細胞を標識する及び／又は検出するための、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の使用のためのコンジュゲート化合物。
【請求項１４】
前記がんは、膵がん、副腎がん、又は膠芽腫から選択される、請求項１３に記載の使用のためのコンジュゲート化合物。
【請求項１５】
化学式（ＩＩＩ）のコンジュゲート化合物であって、
Ｍ−Ｃ−Ｓ−Ｐ（ＩＩＩ）、
式中、Ｍは、薬学的に許容される放射性核種を示し、
Ｃは、Ｍとともにキレートを形成するキレーターを示し、
Ｓは、スペーサーを示し、
Ｐは、最大で３０個のアミノ酸残基を有するとともに低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）に結合可能なペプチド又は疑似ペプチドを示す、コンジュゲート化合物。
【請求項１６】
下記化学式のコンジュゲート化合物であって、
Ｍ−Ｃ−Ｐ、
式中、Ｍは、薬学的に許容される放射性核種を示し、
Ｃは、Ｍとともにキレートを形成するキレーターを示し、
Ｐは、最大で３０個のアミノ酸残基を有するとともに低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）に結合可能なペプチド又は疑似ペプチドを示す、コンジュゲート化合物。
【請求項１７】
前記化合物は、ＬＤＬＲとは異なる分子に結合する第２標的基Ｔをさらに含む、請求項１５又は１６に記載のコンジュゲート化合物。
【請求項１８】
前記化合物は、Ｐ基若しくはＭ基の複数のコピー、又はその両方の複数のコピーを含む多量体である、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載のコンジュゲート化合物。
【請求項１９】
前記化合物は、複数の化学式（ＩＩＩ）の単量体を含む多量体である、請求項１８に記載のコンジュゲート化合物。
【請求項２０】
Ｐはアミノ酸配列（ＩＩ）を含み、
Ａ１−Ｍｅｔ−Ａ２−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａ３−Ａ４（ＩＩ）、
配列中、Ａ１及びＡ４は、独立してシステイン（Ｃｙｓ）若しくは（Ｄ）−ｃｙｓ、ペニシラミン（Ｐｅｎ）、及び（Ｄ）−ペニシラミン（（Ｄ）−Ｐｅｎ）から選択されるそのアナログを示し、並びに／又はＡ２は、プロリン（Ｐｒｏ）若しくはピペコリン酸（Ｐｉｐ）及びチアゾリジン−４−カルボン酸（Ｔｈｚ）から選択されるそのアナログを示し、並びに／又はＡ３は、Ｇｌｙ又はサルコシン（Ｓａｒ）を示し、好ましくは、Ｐは、配列番号１〜配列番号９のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１５〜１９のいずれか１項に記載のコンジュゲート化合物。
【請求項２１】
Ｍは、好ましくは１８Ｆ、６８Ｇａ、９０Ｙ、１７７Ｌｕ、及び１１１Ｉｎから選択される、マーカー又は放射線治療剤である、請求項１５〜２０のいずれか１項に記載のコンジュゲート化合物。
【請求項２２】
Ｃは、ＮＯＤＡＧＡ、ＤＯＴＡ、ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡ−ＧＡ、及びその機能的誘導体から選択される、請求項１５〜２１のいずれか１項に記載のコンジュゲート化合物。
【請求項２３】
６８Ｇａ−ＮＯＤＡＧＡ−配列番号１又は
６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−配列番号１又は
１７７Ｌｕ−ＤＯＴＡ−配列番号１又は
６８Ｇａ−ＮＯＤＡＧＡ−Ｓ−配列番号１又は
６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−Ｓ−配列番号１又は
１７７Ｌｕ−ＤＯＴＡ−Ｓ−配列番号１であり、
式中、Ｓはスペーサーである、請求項１５〜２２のいずれか１項に記載のコンジュゲート化合物。
【請求項２４】
がんをイメージングする、標識する、検出する、診断する、又は放射線治療する方法に使用される、請求項１５〜２３のいずれか１項に記載のコンジュゲート化合物。
【請求項２５】
請求項１５〜２０のいずれか１項に記載のコンジュゲート化合物と適切な希釈剤又は賦形剤とを含む組成物。
【請求項２６】
Ｍを含まない、請求項１５〜２３のいずれか１項に記載のコンジュゲート化合物。
【請求項２７】
図１４に示される化合物ＶＨｄ。
【請求項２８】
放射性核種をさらに含む、請求項２７に記載の化合物ＶＨｄ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がんイメージング、がん検出、及びがん放射線治療のための組成物及び方法に関する。本発明は、特に、ＬＤＬＲ標的ペプチドと薬学的に許容されるマーカーを含むコンジュゲート化合物、及びがん、特に低密度リポタンパク質受容体（Low-DensityLipoprotein Receptor、LDLR）を過剰発現するがんの標識、検出、ステージ分類、又は処置のためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんは、英国や世界保健機関のがん調査によると２０１２年には約１，４００万の新規症例と８２０万のがん関連死を伴い、世界的な疾病及び死亡の主な原因のなかでも重要な要因となるものである。
【０００３】
今では多くの形態のがんを処置することが可能であるが、その一部は未だ処置が困難である。例として、膵がんは、１年内で７５％の死亡率と６％ほどの５年生存率とを伴う、死に至らせるがんの１つである。仏国では毎年約１２，０００人が、世界的には約３４０，０００人が、膵がんと診断されている。このがんは、２０３０年までにがん死亡の第２の原因になると予測される。膵がんは、５０歳を超える男性と女性の両方に影響し、特に処置が困難である。同様に、最も多く最も高悪性の悪性原発性脳腫瘍である多形性膠芽腫（glioblastomamultiforme、GBM）は、まれではあるが重篤な疾患である。欧州連合では、毎年、約２５，０００の新規症例が診断されている（www.pubcan.org/cancer）。現在の処置では十分に効果がないことから、重大な臨床的課題として残っている。実際に、現在のところ、５年後の生存は約３％であり、腫瘍発生の基本的な理解は大きく進んでいるものの、患者の総生存中央値は過去２５年で３．３か月（１１．３か月から１４．６か月）しか増加していない（Patel MA,等.2014 Sep29;6(4):1953-85）。
【０００４】
がんにみられる死の大部分は、早期診断がなされた場合に避けられ得るものである。様々ながんの５年生存率が検出時の腫瘍ステージにより大きく下がることを考慮すると、可能な限り早期に腫瘍を特定可能な非侵襲性イメージングツールの開発と、治療介入に効果があると考えられる患者の特定とが強く求められている。がんの死亡率及び疾病率は、有効なイメージング剤及び治療剤の開発により大きく改善可能である。
【０００５】
がんの早期且つ正確な診断のための新規の方法の開発に対して多くの取り組みがなされている。様々なイメージング技術が使用されており、陽電子放射断層撮影（PETスキャン）、単一光子放射型コンピュータ断層撮影（SPECT）、Ｘ線コンピュータ断層撮影（CTスキャン）、核スキャン、超音波、及び磁気共鳴イメージ法（MRI）が含まれる。これらのイメージング技術は十分に発達しているが、大部分は、分析する器官の非特定的な肉眼による生理学的な変化に基づくものである。現在腫瘍学で最も広く使用されているＰＥＴトレーサーは、グルコース利用を測定するプローブであるとともに、がん診断及びステージ分類の認知されているツールである１８Ｆ−ＦＤＧである。しかしながら、１８Ｆ−ＦＤＧには、一部の腫瘍における中程度の吸収（例えば前立腺）と特定の正常な組織（例えば脳）における高程度のバックグランド吸収を含む、重大な制限がある。
【０００６】
選択的受容体標的ペプチド系薬剤は、その標的に対する高親和性及び特異性などのその固有の特性から、対応するペプチド受容体を過剰発現する腫瘍細胞の分子イメージングにおいて少なからぬ注目を集めている。実際に、腫瘍に多く発現される受容体を標的とすることは、受容体標的ペプチドが病的な組織を正常な組織と区別することから、より良好ながん診断が得られると考えられる。
【０００７】
がん処置において、化学療法、免疫療法、又は放射線療法などの多くの手法が、単独又は組合せで用いられている。
【０００８】
放射線療法（放射線治療、Ｘ線療法、又は照射法とも呼称される）は、がん細胞を死滅させて腫瘍を縮小させるため電離放射線を使用することに基づく。放射線療法は、治癒的及び緩和的症状の両方を得るために多様な腫瘍に使用されている。放射線療法の作用は局所的であり、処置される領域に限られる。放射線療法は、その遺伝物質を傷害することで、処置される領域（「標的組織」）において損傷をもたらす又は細胞を破壊し、これらの細胞が成長及び分割し続けることをできなくする。放射線は、がん細胞と正常な細胞との両方を傷害するが、大部分の正常な細胞は、放射線の作用から回復して適切に機能することができる。放射線療法の目的は、近接する健康な組織への害を抑えながら、可能な限り多くのがん細胞を傷害することである。電離放射線は、がんの組織のＤＮＡを傷害することで作用して細胞死をもたらす。
【０００９】
いくつかのタイプの放射線療法が存在する。
−放射線治療の最も多い形態である外部照射放射線治療（External BeamRadiotherapy、EBRT）。患者は寝いすに座るか又は横になり、電離放射線の外部ソースを身体の特定の部分に向ける。Ｘ線及び電子ビームは外部ビーム放射線治療に最も広く使用されるソースである。
−密封放射線源が要処置領域内に又は隣接して配置される小線源治療。
−放射性医薬品と呼称される固体、液体、気体、又は他の形態の放射性物質（実質的に放射性薬剤）を使用する非密封線源放射線治療（又は非密封線源放射性核種療法）。これは、多様な手段（主に注入又は服用）で身体に取り入れられ、その特性及び投与経路に対応して特定の位置、器官、又は組織に局在化される。これには、ヨウ化物イオンを捕捉することで甲状腺を特定するヨウ化ナトリウムなどの単純な化合物から、放射性核種に付着して細胞表面の特定抗原を認識する組換え抗体などの複雑なバイオ医薬品までのいずれも含む。この技術は、放射線処置のために身体領域を標的とする放射性医薬品の物理的、化学的、及び生物学的特性に基づくものである。
【００１０】
放射線治療にはいくつかの副作用がある。副作用の特徴、重症度、及び期間は、放射線を受ける器官、その処置自体（放射線のタイプ、用量、分割、併用される化学療法）、及び患者の状態に対応したものである。急性副作用（悪心、嘔吐、腸の不快感、膨満感、不妊等）と遅発性副作用（線維症、抜け毛、乾燥、心臓疾患、認知低下等）とが存在する。ゆえに、引き起こされる副作用の少ない標的化放射線治療の開発が求められている。
【００１１】
ペプチド受容体放射性核種療法（Peptide receptorradionuclide therapy、PRRT）は、神経内分泌がんなどの特定のがんの処置に使用される分子治療（放射性同位元素治療とも呼ばれる）である。ＰＲＰＴでは、細胞標的タンパク質（又はペプチド）が小量の放射性材料又は放射性核種と組み合わせられて、放射性ペプチドと呼ばれる特別なタイプの放射性医薬品を創出する。この放射性ペプチドは、患者の血流に注射されると移動して特定の腫瘍細胞と結合し、正常な組織を保持しながらがん組織に高用量の放射線を送達する。
【００１２】
有効なイメージング剤及び標的剤の分野において明らかに未だ対処されていない医療ニーズがある。腫瘍において多く発現される受容体を標的とすることは、受容体標的ペプチドが病的な組織を正常な組織と区別することから、より良好ながん診断及び治療が得られると考えられる。
【００１３】
本願は、ＬＤＬＲ標的剤に基づくがんイメージング及びがん放射線治療のための新規の組成物及び方法に関する。本発明は、ＬＤＬＲに結合するとともにイメージング剤及び放射線治療剤に対応するように最適化されたＬＤＬＲコンジュゲート化合物を提供し、そうした化合物がＬＤＬＲ過剰発現がん細胞の有効、確実、且つ選択的な標識を可能にすることを示し、そうしたがんの有効な診断又は放射線治療に最も適切である、ということを示す。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、ＬＤＬＲを発現するがんの有効なイメージング、診断、検出、又は放射線治療のための新規の組成物及び方法を提供する。本発明は、特に、ＬＤＬＲを過剰発現するがん細胞に結合するとともにイメージングすることが可能なコンジュゲート化合物を提供する。本発明は、そうしたがんのインビボでの検出、及びその有効かつ選択的な放射線治療を可能にする。本発明は、実際に、本発明のコンジュゲート剤ががん細胞と非がん細胞との区別をすることができるとともに、健康な組織に影響を及ぼすことなく、がん細胞に十分なレベルの照射を行うために使用され得ることを示す。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
つまり、本発明のひとつの目的は、対象にコンジュゲート化合物を投与すること並びにマーカーの存在及び／又は量を分析することによって対象におけるがん細胞を標識する及び／又は検出する方法に使用する、化学式（Ｉ）のコンジュゲート化合物に関し、
Ｍ−Ｐ  （Ｉ）、
式中、Ｍは、薬学的に許容されるマーカーを示し、
Ｐは、最大で３０個のアミノ酸残基を有するとともにＬＤＬＲに結合可能なペプチド又は疑似ペプチドを示す。
【００１６】
本発明のさらなる目的は、対象におけるＬＤＬＲ過剰発現がんを標識する又は検出する方法であって、
ｉ）化学式（Ｉ）の化合物を対象に投与すること、
Ｍ−Ｐ  （Ｉ）、
式中、Ｍは、薬学的に許容されるマーカーを示し、
Ｐは、最大で３０個のアミノ酸残基を有するとともにＬＤＬＲに結合可能なペプチド又は疑似ペプチドを示し、並びに、
ｉｉ）マーカーの存在及び／又は量を分析することを含む。
【００１７】
特定の実施形態において、コンジュゲート化合物は、複数の化学式（Ｉ）の単量体を含む多量体化合物である。
【００１８】
好ましい実施形態において、Ｍは放射性核種又は蛍光マーカーを示し、Ｐはアミノ酸配列（ＩＩ）を含み、
Ａ１−Ｍｅｔ−Ａ２−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａ３−Ａ４  （ＩＩ）、
配列中、Ａ１及びＡ４は、独立してシステイン又はそのアナログ若しくはイソスターを示し、Ａ２は、プロリン又はそのアナログ若しくはイソスターを示し、Ａ３は、グリシン又はそのアナログ若しくはイソスターを示す。
【００１９】
さらに、Ｍ及びＰは、共有結合的に又は非共有結合性相互作用によって、直接的に又はスペーサーによって、互いに連結することができる。特定の実施形態において、Ｍは、補欠分子族を使用してＰに連結される、又はＮＯＤＡＧＡ、ＤＯＴＡ、ＤＯＴＡ−ＧＡ若しくはＮＯＴＡ、若しくはその機能的誘導体などのキレート基を使用して閉じ込められる。
【００２０】
本発明の他の目的は、化学式（ＩＩＩ）のコンジュゲート化合物に関し、
Ｍ−Ｃ−Ｓ−Ｐ  （ＩＩＩ）、
式中、Ｍは、薬学的に許容される放射性核種を示し、
Ｃは、Ｍとともにキレートを形成するキレーターを示し、
Ｓは、スペーサーを示し、
Ｐは、最大で３０個のアミノ酸残基を有するとともにＬＤＬＲに結合可能なペプチド又は疑似ペプチドを示す。
【００２１】
本発明のさらなる目的は、上述のようなコンジュゲート化合物を含む組成物と、医療イメージング又は放射線治療におけるその使用に関する。
【００２２】
本発明のさらなる目的は、対象におけるＬＤＬＲ過剰発現がんを処置する方法であって、化学式（ＩＩＩ）のコンジュゲート化合物を対象に投与することを含み、
Ｍ−Ｃ−Ｓ−Ｐ  （ＩＩＩ）、
式中、Ｍは、放射線治療における使用に適する薬学的に許容される放射性核種を示し、
Ｃは、Ｍとともにキレートを形成するキレーターを示し、
Ｓは、スペーサーを示し、
Ｐは、最大で３０個のアミノ酸残基を有するとともにＬＤＬＲに結合可能なペプチド又は疑似ペプチドを示す。
【００２３】
本発明は、膵がん、副腎がん、膠芽腫、前立腺がん、結腸がん、肝がん、膵がん、卵巣がん、肺がん、又は胃がんなどの任意のＬＤＬＲ過剰発現がんを検出又は処置するために使用することができる。本発明は、ヒト対象などの任意の哺乳動物対象に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、種々のがん細胞株におけるヒト及びマウスのＬＤＬＲ発現を示すウエスタンブロットである。（Ａ）は、ＣＨＯ９５（ｅＧＦＰと融合させてヒトＬＤＬＲを過剰発現する細胞株）、Ｈｅｌａ（子宮頸がん）、ＮＣＩ−Ｈ２９５Ｒ（副腎腺がん）、Ｃａｐａｎ、ＢｘＰＣ３、及びＰａｎｃ１（膵がん）、ＭＣＦ−７及びＭＤＡ−ＭＢ２３１（乳がん）を示す。右側のパネルでは、マウスの膵臓細胞株ＰＫ４におけるＬＤＬＲの発現がマウスの正常な膵臓と比較される。（Ｂ）において、膠芽腫細胞株Ｕ８７ＭＧ（２列）、前立腺がん細胞株ＰＣ３、及びＮＣＩ−Ｈ２９５Ｒが示される。
【図２】図２は、ＧＦＰと結合したヒトＬＤＬＲを発現するＣＨＯ細胞における、コンジュゲートＡ（Ａ）、コンジュゲートＢ（Ｂ）、コンジュゲートＣ（Ｃ）、コンジュゲートＤ（Ｄ）の結合・エンドサイトーシスを示す。ＬＤＬＲ−ＧＦＰ信号は２列目に可視化され、コンジュゲート信号は、Ａ６８０蛍光法を使用して４列目に、又は抗ｈＦｃ−Ａ５９４コンジュゲート２次抗体を使用して３列目に直接的に可視化されている。細胞核をヘキストでブルー染色し、その信号は１列目に可視化されている。ＬＤＬＲ−ＧＦＰ及びコンジュゲートの共標識は、統合イメージにおいて５列目に強調された信号として可視化されている。
【図３】図３において、Ａでは、ＰＫ４Ａ腫瘍をインプラントされてコンジュゲートＡを尾静脈に注射したマウスの膵臓、膵臓腫瘍、及び腎臓（コントロール）におけるコンジュゲートＡの組織体内分布を示し、Ｂでは、コンジュゲートＣを注射したマウスの膵臓及び膵臓腫瘍におけるコンジュゲートＣの組織体内分布を示す。体内分布をＥＬＩＳＡによる定量化を使用して評価した。
【図４】図４において、Ａでは、ＰＫ４Ａ腫瘍をインプラントして、コンジュゲートＣ又はコンジュゲートＤ（コントロール）の静脈内注射後１５分、３０分、６０分、及び１２０分において分析したマウスの全身蛍光イメージングを示し、Ｂでは、コンジュゲートＣ又はコンジュゲートＤ（コントロール）の静脈内注射後４時間で採取した膵臓腫瘍、健康な膵臓及び肝臓のエクスビボイメージングを示す。
【図５】図５は、ケージ−βＡｌａ−ＰＥＧ１２−ペプチド−ＮＨ２化合物の合成の反応スキームを示す。このスキームでは、ＮＯＤＡＧＡ−βＡｌａ−ＰＥＧ１２−配列番号１−ＮＨ２の合成を例として示す。
【図６Ａ−Ｃ】図６Ａ−Ｃは、ＮＣＩ−Ｈ２９５Ｒ細胞のインプラント後の１４日目に１８Ｆ−ＦＤＧ（Ａ）、６８Ｇａ−ＣＨ４４（Ｂ）、及び６８Ｇａ−ＣＨ４０（Ｃ）を投与したマウスのＰＥＴイメージングを示す。副腎腫瘍を丸で示す。
【図７】図７は、ＮＣＩ−Ｈ２９５Ｒ細胞のインプラント後の３２日目に６８Ｇａ−ＣＨ４４（Ａ）及び６８Ｇａ−ＣＨ４０（Ｂ）を投与したマウスのＰＥＴイメージングを示す。副腎腫瘍を丸で示す。
【図８】図８は、ＮＣＩ−Ｈ２９５Ｒ細胞のインプラント後の３７日目に６８Ｇａ−ＦＧ７７０（Ａ）及び６８Ｇａ−ＦＧ７６９（Ｂ）を投与したマウスのＰＥＴイメージングを示す。
【図９Ａ−Ｃ】図９Ａ−Ｃは、Ｐｋ４ａ細胞のインプラント後の４日目に１８Ｆ−ＦＤＧ（Ａ）、６８Ｇａ−ＣＨ４４（Ｂ）、及び６８Ｇａ−ＣＨ４０（Ｃ）を投与したマウスのＰＥＴイメージングを示す。膵臓腫瘍を丸で示す。
【図１０Ａ−Ｂ】図１０Ａ−Ｂは、Ｐｋ４ａ細胞のインプラント後の１２日目に６８Ｇａ−ＣＨ４４（Ａ）及び６８Ｇａ−ＣＨ４０（Ｂ）を投与したマウスのＰＥＴイメージングを示す。膵臓腫瘍を丸で示す。
【図１１Ａ−Ｅ】図１１Ａ−Ｅは、Ｕ８７ＭＧ細胞の大脳インプラント後の１４日目に６８Ｇａ−ＣＨ４４（Ａ）、１６日目に６８Ｇａ−ＣＨ４０（Ｂ）、２１日目に６８Ｇａ−ＣＨ４４（Ｃ）、２１日目に６８Ｇａ−ＣＨ４０（Ｄ）、及び２１日目に６８Ｇａ−ＲＧＤ（Ｅ）、を投与したマウスのＰＥＴイメージングを示す。
【図１２】図１２は、対照比における腫瘍として表した、２１日目にＵ８７ＭＧをインプラントした動物における６８Ｇａ−ＣＨ４４、６８Ｇａ−ＣＨ４０、６８Ｇａ−ＲＧＤの定量化を示す。
【図１３】図１３は、ＮＣＩ−Ｈ２９５Ｒ細胞のインプラント後の４８日目に６８Ｇａ−ＣＨ４４（Ａ）及び６８Ｇａ−ＣＨ４０（Ｂ）を投与したマウスのＰＥＴイメージングを示す。
【図１４】図１４は、化合物ＶＨｄの構造を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明は、ＬＤＬＲ標的剤に基づくがんイメージング及びがん放射線治療のための組成物及び方法に関する。本発明は、ＬＤＬＲ結合部分と薬学的に許容されるマーカーとを含むコンジュゲート化合物を提供する。本発明は、さらに、そうした化合物がインビトロ及びインビボにおいてがん細胞を有効に標識可能であり、その効果的なイメージング、検出、ステージ分類、又は放射線治療を可能にすることを示す。
【００２６】
より具体的には、本発明の目的は、化学式（Ｉ）のコンジュゲート化合物を使用してがん又は腫瘍又はがん・腫瘍細胞を標識する方法にあり、
Ｍ−Ｐ  （Ｉ）、
式中、Ｍは、薬学的に許容されるマーカーを示し、
Ｐは、最大で３０個のアミノ酸残基を有するとともに低密度リポタンパク質受容体（LDLR）に結合可能なペプチド又は疑似ペプチドを示す。
【００２７】
ヒトＬＤＬＲは、細胞外領域（１〜７６８）、膜貫通領域（７６８〜７９０）、及び細胞質領域（７９０〜８３９）である３つの領域を含む８３９個のアミノ酸の膜貫通タンパク質である。細胞外領域は、ＬＤＬ結合領域（１〜３２２）とＬＤＬ結合領域外領域（３２２〜７６８）の２つの小領域に分けれらる。ＬＤＬＲは、大部分の有核細胞によって発現されると報告されており、１０００〜３０００個のＬＤＬＲが非病的細胞の表面に存在すると一般に認められている。がん細胞におけるＬＤＬＲの量は、１００，０００以上まで大きく増加しうる。ＬＤＬＲを過剰発現すると報告されている腫瘍細胞は、前立腺がん（Chen等、2001、Int. J. Cancer、91、41-45）、結腸がん（Niendorf等、1995、Int. J. Cancer、61、461-464）、白血病（Tatidis等、2002、Biochem. Pharmacol.、63、2169-2180）、結腸直腸がん（Caruso等、2001、Anticancer Res.、21、429-433）、乳がん（Graziani等、2002、Gynecol. Oncol.、85、493-497）の細胞、膠芽腫脳腫瘍細胞（Malentiska等、2000、Cancer Res.、60、2300-2303;Nikanjam等、2007、Int. J.Pharm.、328、86-94）、並びに肝臓がん、膵臓がん、卵巣がん、肺がん、及び胃がんの細胞を含む。しかしながら、そうした発現の増大が受容体の構成・利用度、特に細胞外領域３２２〜７６８に影響を及ぼし得るかは知られていない。実際に、受容体の高発現は、凝集又は構造変化をもたらし得ることが観察されている。そうした凝集は、細胞外領域３２２〜７６８に結合するＬＤＬＲ標的剤を使用してそうした細胞に対して薬剤を標的化する能力を変化させることがある。
【００２８】
興味深いことに、またＬＤＬＲの偏在的発現にもかかわらず、本発明のコンジュゲートは、ＬＤＬＲを過剰発現する細胞、特にＬＤＬＲを過剰発現するがん細胞を有効に標識可能にし、そうしたＬＤＬＲ発現がん細胞の有効な標的化を可能にする。そうした作用は、適切な受容体密度、ＬＤＬＲに対するコンジュゲート結合親和性、及び作用機序（非競合性）によるものであり得る。
【００２９】
本発明は、本発明のコンジュゲートがＬＤＬＲ過剰発現がん細胞を有効に結合する能力を保持することを示す。
【００３０】
本発明は、ＬＤＬＲ過剰発現細胞（例えばがん細胞）の、通常レベルのＬＤＬＲを有する細胞（例えば正常細胞）からの区別に適するように、本発明のコンジュゲートによって薬学的に許容されるマーカーがＬＤＬＲ過剰発現細胞を対象とすることができることを示す。
【００３１】
本発明は、ＬＤＬＲの密度及び再構築の可能にもかかわらず、本発明のコンジュゲートがＬＤＬＲ過剰発現細胞に対して十分なレベルに標識することが可能であることを示す。
【００３２】
このように、本発明は、安全かつ有効な標識剤及び放射線治療剤を提供し、有効ながん診断及びがん治療方法のデザインを可能にする。
【００３３】
つまり、本発明の目的は、対象にコンジュゲート化合物を投与すること並びにマーカーの存在及び／又は量を分析することによって対象におけるがん細胞を標識する及び／又は検出する方法に使用する、化学式（Ｉ）のコンジュゲート化合物に関し、
Ｍ−Ｐ  （Ｉ）、
式中、Ｍは、薬学的に許容されるマーカーを示し、
Ｐは、最大で３０個のアミノ酸残基を有するとともにＬＤＬＲに結合可能なペプチド又は疑似ペプチドを示す。
【００３４】
また、本発明は、上述で規定されるようなコンジュゲート化合物を使用して対象におけるがんを標識化、イメージング、診断、又はステージ分類する方法にも関する。
【００３５】
特定の実施形態において、本発明のコンジュゲート化合物は、ＬＤＬＲとは異なる分子に結合する第２標的基Ｔをさらに含む。そうしたデュアルコンジュゲート化合物の例は、以下の化学式（ＩＶ）の化合物であり、
Ｍｎ−Ｐ−Ｔ−Ｍｍ  （ＩＶ）、
式中、Ｍ及びＰは上述のとおりであり、Ｔは第２標的基を示し、ｎは１又は０であり、ｍは１又は０である。好ましくは、ｍ＋ｎ＝１である。
【００３６】
さらなる特定の実施形態において、デュアルコンジュゲート化合物は以下の構造を有し、
（Ｍ−Ｃ−）ｎＰ−Ｔ（−Ｃ−Ｍ）ｍ、
式中、Ｍ、Ｃ、及びＰは上述のとおりであり、Ｔは第２標的基を示し、ｎは１又は０であり、ｍは１又は０である。好ましくは、ｍ＋ｎ＝１である。
【００３７】
Ｔは、ＬＤＬＲとは異なる標的分子に（又はそうした分子を発現する細胞に）結合する任意の基であり得る。好ましくは、そうした標的分子は、膵がん細胞又は前立腺がん細胞又は卵巣がん細胞又は副腎がんなどの細胞がん細胞によって発現される分子である。そうした標的基の例は、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）、ニューロテンシン、ソマトスタチンのアナログ、及びそれらの誘導体を限定することなく含む。
【００３８】
［コンジュゲート］
本発明は、特定のＬＤＬＲ標的コンジュゲートの使用及び新規コンジュゲートのデザインを開示するものである。そうしたコンジュゲートは、以下に記載される、化学式（Ｉ）の単量体、又は多量体構造であり得る。
【００３９】
特定の実施形態において、コンジュゲートは、上述で規定されるような化学式Ｍ−Ｐ（Ｉ）の化合物である。好ましくは、Ｐはアミノ酸配列（ＩＩ）を含み、
Ａ１−Ｍｅｔ−Ａ２−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａ３−Ａ４  （ＩＩ）、
配列中、Ａ１及びＡ４は、独立してシステイン又はそのアナログ若しくはイソスターを示し、Ａ２は、プロリン又はそのアナログ若しくはイソスターを示し、Ａ３は、グリシン又はそのアナログ若しくはイソスターを示す。
【００４０】
より具体的には、Ａ１及びＡ４は、互いに独立して、Ｄ配置若しくはＬ配置のシステイン（Cys、C）、又は、Ｌ配置若しくはＤ配置の２−アミノ−３−メルカプトプロパン酸及びそのＳ位置換誘導体、Ｓ−アセチルシステイン若しくは２−アミノ−３−（アセチルチオ）プロパン酸、セレノシステイン（Sec、U）若しくは２−アミノ−３−（セレノ）プロパン酸、システイノール（cysteinol）、３−メルカプトプロパン酸（Mpa）、若しくはペニシラミン（Pen）から選択されるその誘導体、から選択されるアミノ酸残基を示す。
【００４１】
好ましい実施形態において、Ａ１及びＡ４は、互いに独立して、システイン（Cys）、（Ｄ）−ｃｙｓ、ペニシラミン（Pen）、及び（Ｄ）−ペニシラミン（(D)-Pen）から選択される。
【００４２】
Ａ２は、より好ましくは、プロリン（Pro、P）、ピロリジン又−２−カルボン酸、ホモプロリン、２−（２−ピロリジニル）エタン酸、３−ヒドロキシプロリン（3Hyp）、４−ヒドロキシプロリン（4Hyp）、３−メチルプロリン、３，４−デヒドロプロリン、３，４−メタノプロリン（3,4-methanoproline）、４−アミノプロリン（4-aminoproline）、４−オキソプロリン、チオプロリン、チアゾリジン−４−カルボン酸（Thz）、２−オキソチアゾリジン−４−カルボン酸、インドリン−２−カルボン酸（Idc）、ピペコリン酸（Pip）、ピペリジン−２−カルボン酸、ニペコ酸（Nip）、ピペリジン−３−カルボン酸、４−オキソピペコリン酸、４−ヒドロキシピペコリン酸、アミノ−１−シクロヘキサンカルボン酸、又はプロリノールから選択される残基を示す。
【００４３】
好ましい実施形態において、Ａ２は、プロリン、ピペコリン酸（Pip）、又はチアゾリジン−４−カルボン酸（Thz）から選択される。
【００４４】
Ａ３は、より好ましくは、グリシン（Gly、G）、２−アミノエタン酸、サルコシン（Sar）、Ｎ−メチルグリシン（MeGly）、Ｎ−エチルグリシン（EtGly）、アリルグリシン（allylGly）、２−アミノペント−４−エン酸、２−シクロペンチルグリシン（Cpg）、２−シクロヘキシルグリシン（Chg）、２，２−ジプロピルグリシン（Dpg）、２−（３−インドリル）グリシン（IndGly）、２−インダニルグリシン（Igl）、２−ネオペンチルグリシン（NptGly）、２−オクチルグリシン（OctGly）、２−プロパルギルグリシン（Pra）又は２−アミノペント−４−イン酸、２−フェニルグリシン（Phg）、２−（４−クロロフェニル）グリシン、アザグリシン（AzGly）、グリシノール（glycinol）、又は２−アミノエタノールから選択される残基を示す。
【００４５】
好ましい実施形態において、Ａ３は、グリシン又はサルコシンである。
【００４６】
好ましい実施形態において、Ｐは、
配列番号１：（Ｄ）−Ｃｙｓ−Ｍｅｔ−Ｔｈｚ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｅｎ；
配列番号２：（Ｄ）−Ｃｙｓ−Ｍｅｔ−Ｔｈｚ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｓａｒ−Ｐｅｎ；
配列番号３：（Ｄ）−Ｃｙｓ−Ｍｅｔ−Ｐｉｐ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｓａｒ−Ｃｙｓ；
配列番号４：（Ｄ）−Ｃｙｓ−Ｍｅｔ−Ｐｉｐ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｅｎ；
配列番号５：（Ｄ）−Ｃｙｓ−Ｍｅｔ−Ｐｉｐ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｓａｒ−Ｐｅｎ；
配列番号６：Ｃｙｓ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ；
配列番号７：（Ｄ）−Ｃｙｓ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ；
配列番号８：Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ；
配列番号９：（Ｄ）−Ｐｅｎ−Ｍｅｔ−Ｔｈｚ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ、である配列番号１〜９のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含む、又はそれらから実質的になる、又はそれらからなる。
【００４７】
発明者らによって得られた結果は、本発明のコンジュゲートが、配列番号１３又は配列番号１４のアミノ酸配列を含むスクランブルペプチドと比較してＬＤＬＲに対する親和性（ＫＤ）を向上させたものであるということを示す（実施例３参照）。加えて、本発明のコンジュゲートは、健康な膵臓と比較して膵臓腫瘍においてより良好に蓄積する（実施例４参照）。特に、実施例に示すように、がん組織の標識が非がん組織の標識に対して１０〜５０倍優れたものであり得る。この蓄積レベルは、イメージにおける確実で明確な区別を可能にするために十分なものである。さらに、放射線治療における使用の場合に、コンジュゲートが健康な細胞と比較して腫瘍細胞に非常に良好な特異性を有することを意味する。
【００４８】
上述のように、マーカーＭは、任意の放射性核種又は蛍光マーカーであり得る。
【００４９】
使用され得る蛍光マーカーは、例えば、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０、ＣＦ６８０、ＡＴＴＯ６８０、Ｆｌｕｏｒｏｐｒｏｂｅｓ６８２、Ｃｙａｎｉｎｅ５．５、ＩＲＤｙｅ６８０、又はＶｉｖｏｔａｇである。一般的な方法において、すべての近赤外線（IR）蛍光マーカーが、最小組織自己蛍光を可能にすることから、イメージングに使用することができる。より具体的には、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６８０は、スペクトルにおいてＣｙ５．５色素に類似する、明るく光安定性の近赤外線色素である。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６８０色素は、イメージング及びフローサイトメトリーにおける安定的な信号生成に使用され、水溶性で、ｐＨ４〜ｐＨ１０においてｐＨ非感受性である。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６８０のＮＨＳエステル（又はスクシンイミジルエステル）は、この色素をタンパク質又は抗体にコンジュゲートするために最も一般的なツールである。色素のＮＨＳエステルは、タンパク質の一級アミン（R-NH2）、アミン変性オリゴヌクレオチド、及び他のアミン含有分子を標識するために使用可能である。
【００５０】
最も好ましい実施形態において、Ｍは、医療イメージングにおける使用、例えば、陽電子放射断層撮影（PET）イメージング、シンチグラフィー、陽電子放射断層撮影−コンピュータ断層撮影、又は単一光子放射コンピュータ断層撮影における使用に対応した放射性核種である。好ましくは、Ｍは、ＰＥＴにおける使用に対応した放射性核種である。
【００５１】
本発明における使用に適した放射性核種の例には、１８Ｆ、１１Ｃ、１５Ｏ、１３Ｎ、６８Ｇａ、８２Ｒｂ、及び８９Ｚｒを限定することなく含む。イメージングに使用される好ましい放射性核種は、短期間の半減期（例えば３０分から３日又は４日）、及び低いエネルギー放出量（例えば３００ｋｅＶガンマ放出放射性核種より劣る）を有し得る。好ましくは、放射性核種は６８Ｇａである。６８Ｇａは、短期間の半減期（６８分）を有し、陽電子放射同位体である。
【００５２】
放射線治療における使用では、放射性核種は、通常、好ましくはより長期間の半減期（例えば、１日〜７５日）を有する、ベータ−、又は高エネルギーガンマ放射放射性核種である。放射線治療に使用される好ましい放射性核種は、９０Ｙ、１１１Ｉｎ、１３１Ｉ、及び１７７Ｌｕから選択される。好ましい実施形態において、９０Ｙ、１７７Ｌｕ、又は１１１Ｉｎが使用される。
【００５３】
本発明のコンジュゲートは、当業者に既知の任意の技術（化学的、生物学的又は遺伝子的合成等）によって合成可能である。化学合成では、天然アミノ酸、並びに例えばＤエナンチオマー及びそれらの天然相同体のものとは疎水性及び立体障害が異なる側鎖を有する残基等の非天然のアミノ酸（いわゆる外来（exotic）の、すなわち非コードアミノ酸）、又はメチレン（-CH2-）基若しくはホスフェート（-PO2-）基、第２級アミン（-NH-）若しくは酸素（-O-）若しくはＮ−アルキルペプチドの挿入をとりわけ含み得る１つ以上のペプチド様結合を含むペプチド配列を導入可能な市販の構築物が使用される。また、ペプチド若しくは疑似ペプチド、又はそのタンパク質部分は、それらをコードする核酸配列から得ることもできる。これらの核酸配列はＤＮＡ又はＲＮＡであり得、コントロール配列と組み合わせる、及び／又は生物学的発現ベクターに挿入することができる。
【００５４】
本発明のコンジュゲート化合物において、ＭとＰと（及び／又はＰとＴ）の結合は、関連する薬剤の化学的性質、障害、及び数を考慮して、任意の許容される結合手段によって行うことができる。つまり、結合は、１つ以上の共有結合、イオン結合、水素結合、疎水結合、又はファンデルワールス結合によって行うことができる。また、結合は、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＯ２Ｈ、−ＮＨ２、−ＳＯ３Ｈ、−ＣＮ、−Ｎ３、−ＮＣＳ、−ＰＯ３Ｈ、アルキン、マレイミド、又はスクシンイミドエステルなどの官能基が自然に存在する又は導入されたペプチド又は疑似ペプチドの任意の部位で行うことができる。つまり、Ｍは、ペプチド又は疑似ペプチドに、Ｎ末端若しくはＣ末端で、そのペプチド配列の天然又は非天然のアミノ酸側鎖が有する反応基で、又は補欠分子族を介してのいずれかで、共有結合によって結合（カップリング）することができる。同様に、結合は、イメージング剤又は放射線治療剤の任意の部位で行うことができる。
【００５５】
相互作用は十分に強力なものであって、Ｍがその作用部位に到達してしまう前にペプチドから解離せず、イメージング方法を行う又はＭが治療的作用を有するのに必要な時間、Ｍとペプチドが結合していることが好ましい。この理由のため、本発明の好ましい結合は、共有結合又はイオン結合である。イメージング剤又は放射線治療剤は、その末端の一方（Ｎ末端又はＣ末端）、又はその配列の構成的アミノ酸の１つにおける側鎖のいずれかにおいてペプチドに直接的に結合可能である。また、イメージング剤又は放射線治療剤は、ペプチドの末端の一方、又はその配列の構成的アミノ酸の１つにおける側鎖のいずれかにおいて、リンカー又はスペーサーにより非直接的に結合可能である。特定の実施形態において、Ｍは例えばキレート剤を使用して閉じ込めることでペプチドに結合させる。
【００５６】
これに関して、好ましい実施形態において、コンジュゲート化合物は、Ｍとともにキレートを形成可能なキレーターＣを含む。そうしたコンジュゲートは、Ｍ−Ｃ−Ｐ構造を有する。各種キレーターを使用することができる。好ましくは、Ｃは、ＮＯＤＡＧＡ（1,4,7-トリアザシクロノナン-1-グルタル酸-4,7-２酢酸）、ＤＯＴＡ（テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-４酢酸）、ＮＯＴＡ（1,4,7-トリアザシクロノナン-３酢酸）、ＤＯＴＡ−ＧＡ（2,2',2''-(10-(2,6-ジオキソテトラヒドロ-2H-ピラン-3-イル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7トリイル)３酢酸）、及びその機能的誘導体から選択される。ＮＯＤＡＧＡ及びＮＯＴＡはイメージングに好ましく、ＤＯＴＡは放射線治療に好ましい。
【００５７】
「機能的誘導体」という用語は、キレート機能を損なうことなくその１つ以上の官能基（すなわちキレート機能に関与する基）を他の官能基で置換することで、並びに／又は、キレート機能を損なうことなくキレート機能に関与しない基を付加及び／若しくは欠失させることで、上述のキレーターから誘導される任意の化合物を意味する。
【００５８】
キレーターＣは、ペプチドＰ（又はＴ）に直接的に、又は、通常Ｐ及びＣ（又はＴ及びＣ）に共有結合するスペーサーＳを介して、結合することができる。これに関して、特定の実施形態において、コンジュゲートはＭ−Ｃ−Ｐ構造を含み、式中、Ｍ、Ｃ及びＰは上述のとおりであり、ＣはペプチドＰに直接的に結合する。他の特定の実施形態において、コンジュゲートはＭ−Ｃ−Ｓ−Ｐ構造を含み、式中、Ｍ、Ｃ、Ｓ及びＰは上述のとおりである。さらに特定の実施形態において、コンジュゲートは、Ｍ−Ｃ−Ｐ−Ｔ、又はＰ−Ｔ−Ｃ−Ｍ、又はＭ−Ｃ−Ｓ−Ｐ−Ｔ、又はＰ−Ｔ−Ｓ−Ｃ−Ｍ構造を含み、式中、Ｍ、Ｃ、Ｓ、Ｐ、及びＴは上述のとおりである。さらなる実施形態において、Ｐ及びＴはスペーサー基を介して結合する。
【００５９】
Ｓは、アルキル、アリール、ＰＥＧ、又はペプチド性であり、アミン、エステル、アルデヒド、アルキル又はアリール酸、無水物、スルフヒドリル、又はカルボキシル基、臭化シアン若しくは塩化シアン、カルボニルジイミダゾール、スクシンイミドエステル、スルホン酸ハライド、マレイミド、アジド、イソチオシアネート、アルキンから誘導される基、などの官能基をその末端に有する、２官能性又は多官能性の薬剤から選択することができる。特定の実施形態において、Ｓは、好ましくはその一端にベータ−アラニンを有する１つ又は複数のＰＥＧを含む。例として、Ｓは、その鎖の一端にベータ−アラニンを有する１２個のＰＥＧのオリゴマーである。他の実施形態において、Ｓは、Ｇ３又はＧ４Ｓなどの複数のＧｌｙ残基を含む。その他の特定の実施形態において、Ｓは、複数のＨｉｓ−Ｇｌｕの繰り返し単位（２又は３単位）などのＤ配置又はＬ配置のアミノ酸を包含する親水性の負電荷を帯びたペプチド配列、又はＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−ＡｓｎなどのＤ配置又はＬ配置のアミノ酸を包含する親水性の中性配列を含む。他の実施形態において、血漿において安定的だが近位管状刷子縁膜においてヒドロラーゼによって腎臓で特異的に切断される代謝可能な基が、腎臓における貯留を低減するために使用可能である。例として、グリシル−リジン結合を使用可能である。つまり、Ｓは、任意の薬物動態学的調節剤であり得る。
【００６０】
特定の実施形態において、本発明は、化学式（ＩＩＩ）のコンジュゲート化合物に関し、
Ｍ−Ｃ−Ｓ−Ｐ  （ＩＩＩ）、
式中、Ｍは、薬学的に許容される放射性核種を示し、
Ｃは、Ｍとともにキレートを形成するキレーターを示し、
Ｓは、スペーサーを示し、
Ｐは、最大で３０個のアミノ酸残基を有するとともに低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）に結合可能なペプチド又は疑似ペプチドを示す。
【００６１】
特定の実施形態において、本発明は、第２標的基Ｔをさらに含む上述で規定されるようなコンジュゲート化合物に関する。
【００６２】
本発明の好ましいコンジュゲート化合物は、化学式（ＩＩＩ）の化合物であり、
式中、Ｍは、薬学的に許容される放射性核種を示し、
Ｃは、ＮＯＤＡＧＡ、ＤＯＴＡ、ＮＯＴＡ、及びＤＯＴＡ−ＧＡから選択され、
Ｓは、２官能性の薬剤、ＰＥＧ又はペプチドを含むスペーサーを示し、又はＳは存在せず、
Ｐは、最大で３０個のアミノ酸残基を有するとともに低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）に結合可能なペプチド又は疑似ペプチドを示す。
【００６３】
本発明の最も好ましい化合物において、ＣはＮＯＤＡＧＡ又はＤＯＴＡであり、Ｐは配列番号１〜９から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００６４】
本発明のコンジュゲート化合物の具体的な例は、
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を含み、Ｓは上述で規定されるようなスペーサーである。
【００６５】
特定の実施形態において、本発明のコンジュゲート化合物は、多量体形態である、すなわちＰ基若しくはＭ基の複数のコピー、又はその両方の複数のコピーを含むことができる。より具体的には、コンジュゲート化合物は、Ｍ−Ｐ−Ｘｉ−Ｐｊ−Ｍｋ構造を含むことができ、式中、Ｍ及びＰは上述のとおりであり、Ｘは架橋剤であり、ｉは０又は１から選択される整数であり、ｊは０、１、２、３、４、又は５から選択される整数であり、ｋは０、１、２、３、４、又は５から選択される整数である。そうした多量体構造において、ｉ＝０であるとき、ｊ及びｋはまた通常０である。さらに、ｋはｊと等しい、又はｊより小さくともよい。また、そうした多量体構造において、Ｍは、上述のように（つまり、直接的に又はキレーター及び／若しくはスペーサーを使用してのいずれかで）Ｐと結合することができる。
【００６６】
そうした多量体化合物の特定の例は、Ｍ−Ｐ−Ｘ−Ｐｊ−Ｍｋ構造を有し、式中、Ｍ及びＰは上述のとおりであり、Ｘは架橋剤であり、ｊは１であり、ｋは０である。
【００６７】
架橋剤Ｘは、医薬又は獣医学の領域における使用に適合する任意の化学架橋基であり得る。基は、好ましくは、生物学的活性及び毒性を有しない。架橋剤のサイズは当業者により調節することができる。Ｘ基の好ましい例は、ポリリジン若しくはポリグルタミン酸プラットフォーム（直鎖、環状、若しくは分岐状ブロック）である、又は１つのアミノ官能基及び４つのアジド官能基を含むＰＥＧ（３）−ペントリマー−Ｇ１−（ＮＨ２＋４ｘＮ３）＊４ＨＣｌなどの多官能性有機化合物である。特定の実施形態において、架橋剤は、少なくとも２つの、好ましくは少なくとも３つの反応性官能基を含み、少なくとも２つのペプチドの結合を可能にする。反応性官能基の例は、例えば、アミン、酸、チオール、アジド、アルキン、カルボニル、又はヒドラジンを含む。ペプチドは、薬剤の反応性官能基で共有結合によって直接的に、又は例えばグリシン若しくは一連のグリシン、ＰＥＧ分子、若しくはアミノヘキサン酸から構成され得るスペーサーを介して、のいずれかでＸと結合することができる。
【００６８】
本発明のそうした多量体化合物の具体的な例は、図１４に示すような化合物ＶＨｄ：ＤＯＴＡ−ＰＥＧ２−Ｅ（ＰＥＧ２−配列番号１）−ＰＥＧ２−Ｅ（ＰＥＧ２−配列番号１）−ＮＨ２である。
【００６９】
また、本発明は、マーカー基Ｍを有しない上述のコンジュゲート化合物のいずれか１つにも関する。そうした化合物は、最終標識化コンジュゲート化合物の調製における中間体である。実際に、実施例に示すように、コンジュゲートはまず調製されて、その後、通常投与前に標識化を行う。つまり、本発明は、Ｍを有しない上述で規定されるような任意のコンジュゲートにも関する。本発明は、特にＣ−（Ｓ−）ｎＰ構造の化合物に関し、式中、Ｃ、Ｓ、Ｐ及びｎは上述のように規定されて結合し、並びにさらに上述で規定されるようなＴ基を含むその変異体、並びに／又はその多量体に関する。
【００７０】
また、本発明は、上述で規定されるような少なくとも１つのコンジュゲート化合物を含む医薬組成物にも関する。組成物は、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤又は希釈剤を含むことができる。
【００７１】
また、本発明は、上述で規定されるようなコンジュゲート化合物から構成される診断用又は医療用イメージング剤を含むことを特徴とする診断用組成物に関する。
【００７２】
［イメージング・診断における使用］
本発明のコンジュゲートは、任意の哺乳動物対象、特にヒト対象においてインビボでＬＤＬＲ発現がんを標識化、検出、又は診断するために使用可能である。
【００７３】
これに関して、特定の実施形態において、Ｍは、イメージングにおける使用に対応した放射性核種又は蛍光性色素であり、その標識及び／又は検出の方法は、
ａ）  コンジュゲート化合物を対象に投与するステップと、
ｂ）  イメージング方法を行うステップと、
ｃ）  ステップｂ）において得た信号を分析するステップとを含み、
信号の存在は、対象におけるがん細胞の存在及び／又はがん進展のステージ分類を示す。
【００７４】
コンジュゲートは種々の経路によって投与することができる。好ましくは、コンジュゲートは、全身、非経口、又は局所注射によって注入される。特に、注射は、静脈内、皮下、筋肉内、動脈内、又は腫瘍内に行うことができる。特定の実施形態において、本発明のコンジュゲート化合物は静脈内に注射される。そうした投与モードにより、生体における化合物の適切な拡散、及び対象の組織への到達が可能になる。他の実施形態において、投与は腫瘍内注射によって行われる。そうしたモードは、腫瘍の存在が既知である又はその疑いが高いときに適切であり、この方法によって例えば腫瘍のステージ分類、その進行又は処置の有効性の評価が行われる。
【００７５】
投与される化合物の量は、方法の目的（イメージング、検出、モニタリング）及び対象に対応して当業者によって調節することができる。
【００７６】
本発明の化合物は、当該分野においてそれ自体既知の種々のイメージング方法に使用することができ、これは例えば、限定することなく、シンチグラフィー、陽電子放射断層撮影（PET）、陽電子放射断層撮影−コンピュータ断層撮影（PET-CT）、又は単一光子放射コンピュータ断層撮影（SPECT）などである。好ましい方法はＰＥＴである。
【００７７】
得られる信号は、方法によって、定量的マーカー値、イメージ、分布曲線、陽電子消滅事象の数等であり得る。ステップｃ）において、そうした信号は、対象におけるがんの存在、ステージ分類、又は進行を測定するために分析される。「分析」という用語は、信号が正常な信号に対応しているかどうかの測定を可能にする任意の方法を指す。分析は、視覚的であるだけでなく定量的分析にも関与し得る。分析には、イメージングによって得られた信号値を、同じ対象又は他の対象における既知の健康な組織の信号値と比較するステップを含むことができる。また、信号値は参照値と比較することもできる。
【００７８】
参照値又は健康な組織からのコントロールよりも重要であるステップｂ）において得られた値は、がん細胞の存在を示す。がんの進展のステージ分類は、同じ対象において、時間を隔てた２つの異なるイメージングセッション後に得られた信号を比較することで評価することができる。
【００７９】
本発明のコンジュゲート化合物は、ＬＤＬＲを過剰発現するがん細胞の標識及び／又は検出に特に対応している。これに関して、「ＬＤＬＲを過剰発現する細胞」という用語は、標準レベルの発現に対して少なくとも１０％多いＬＤＬＲを発現する細胞を指す。通常、１０００〜３０００のＬＤＬＲが、「正常な」細胞の表面に存在する。ＬＤＬＲ過剰発現細胞は、少なくとも２０％多いＬＤＬＲ、より具体的には少なくとも５０％、７５％、１００％、又は１５０％多いＬＤＬＲを発現する細胞である。
【００８０】
本方法を使用して検出可能なＬＤＬＲ過剰発現がんの具体的な例は、膵がん、副腎がん、膠芽腫、前立腺がん、結腸がん、肝がん、膵がん、卵巣がん、肺がん、又は胃がんを含む。
【００８１】
［放射線治療］
さらなる態様において、本発明はまた、放射線治療によってがんを処置するための本発明のコンジュゲート化合物の使用にも関する。
【００８２】
「処置」、「処置すること」、「処置する」という用語、及び他の同様の表現は、薬理及び／又は生理的作用を得ることを指し、例えばがん細胞成長を阻害、又はがん細胞死を促進することを指す。
【００８３】
これに関して、処置方法には、処置方法を必要とする対象に上述で規定するようなコンジュゲート化合物を投与することを含む。
【００８４】
好ましくは、コンジュゲート化合物は、好ましくはより長期間の半減期（例えば、１日〜７５日）を有する、ベータ−、又は高エネルギーガンマ放射放射性核種などの放射線治療に適する放射性核種を含む。放射線治療に使用される好ましい放射性核種は、９０Ｙ、１１１Ｉｎ、１３１Ｉ、及び１７７Ｌｕから選択される。好ましい実施形態において、９０Ｙ、１７７Ｌｕ、又は１１１Ｉｎが使用される。
【００８５】
コンジュゲートは種々の経路によって投与することができる。好ましくは、コンジュゲートは、全身、非経口、又は局所注射によって注入される。特に、注射は、静脈内、皮下、筋肉内、動脈内、又は腫瘍内に行うことができる。特定の実施形態において、本発明のコンジュゲート化合物は静脈内に注射される。そうした投与モードにより、生体における化合物の適切な拡散、及び対象の組織への到達が可能になる。他の実施形態において、投与は腫瘍内注射によって行われる。
【００８６】
化合物は、腫瘍を照射するために十分な量で投与される必要がある。そうした量は当業者により調節することができる。
【００８７】
処置は、単独又は例えば化学療法などの他のがん治療との組合せ（例えば交互に又は併用して）で行うことができる。
【００８８】
方法は、膵がん、副腎がん、膠芽腫、前立腺がん、結腸がん、肝がん、膵がん、卵巣がん、肺がん、又は胃がんなどの任意のＬＤＬＲ過剰発現がんを処置するために使用することができる。方法は、任意の哺乳動物対象、特にヒト対象において、がんの発症の任意のステージで使用することができる。通常、複数の連続的な処置治療計画が行われる。治療における使用において、本発明のコンジュゲート化合物は、任意の薬学的に許容される塩の形態であり得る。「薬学的に許容される塩」という表現は、例えば及び非限定的に、医薬的に許容される塩基又は酸付加塩、水和物、エステル、溶媒和物、前駆体、代謝物又は立体異性体を指す。「薬学的に許容される塩」という表現は、遊離塩基を適する有機酸又は無機酸とを反応させることによって一般に調製することができる非毒性塩を指す。これらの塩は、遊離塩基の生物学的有効性及び特性を保持する。そうした塩の代表的な例は、水溶性及び水不溶性塩、例えば、酢酸塩、Ｎ−メチルグルカミンアンモニウム、アムソナート（４，４−ジアミノスチルベン−２，２’−ジスルホン酸塩）、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重炭酸塩、重硫酸塩、重酒石酸塩、ホウ酸塩、臭化水素酸塩、ブロミド、酪酸塩、カンシラート、炭酸塩、塩酸塩、クロリド、クエン酸塩、クラブラン酸塩、ジクロルヒドラート、二リン酸塩、エデト酸塩、エデト酸カルシウム、エジシラート、エストラート、エシラート、フマル酸塩、グルセプト酸塩、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリコリルアルサニル酸塩、ヘキサフルオロリン酸塩、ヘキシルレゾルシン酸塩、ヒドラバミン、ヒドロキシナフトエ酸塩、ヨージド、イソチオン酸塩、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、ラウリン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メシラート、メチルブロミド、メチル硝酸塩、メチル硫酸塩、ムカート、ナプシル酸塩、硝酸塩、３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩（１，１−メチレン−ビス−２−ヒドロキシ−３−ナフトエ酸塩、又はエンボン酸塩）、パントテン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ポリガラクツロン酸塩、プロピオン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、塩基性酢酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、スルホサリチル酸塩、スラマート、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクル酸塩、トシラート、トリエチオジド、トリフルオロ酢酸塩及び吉草酸塩を含む。
【００８９】
また、コンジュゲート化合物は、任意の適切な医薬的賦形剤、担体、又は希釈剤とともに製剤化することができる。これに関して、本発明はまた、上述で規定されるような化合物及び薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む組成物にも関する。薬学的に許容される担体は、各投与モードに対応して従来より使用される担体から選択することができる。考慮される投与モードに対応して、化合物は固体形態、半固体形態、又は液体形態であり得る。固体組成物、例えば錠剤、ピル、纏まっていない又はゼラチンカプセル内に含められた粉末又は顆粒については、活性物質を、ａ）希釈剤、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロース及び／若しくはグリシン、ｂ）滑沢剤、例えば、シリカ、タルク、ステアリン酸、そのマグネシウム若しくはカルシウム塩、及び／若しくはポリエチレングリコール、ｃ）結合剤、例えば、ケイ酸マグネシウム及びケイ酸アルミニウム、デンプンペースト、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム及び／若しくはポリビニルピロリドン、ｄ）崩壊剤、例えば、デンプン、カンテン、アルギン酸若しくはそのナトリウム塩、若しくは発泡性混合物、並びに／又は、ｅ）吸着剤、色素、着香剤及び甘味料と組み合わせることができる。賦形剤は、例えば、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム及び医薬品質の類似体であり得る。半固体組成物、例えば坐剤については、賦形剤は、例えば、エマルジョン若しくは油性懸濁液、又はポリアルキレングリコール、例えばポリプロピレングリコール系のものであり得る。液体組成物、特に、注射剤又はソフトカプセル内に含めるものは、例えば、水、生理食塩水、デキストロース水溶液、グリセロール、エタノール、油及びそれらの類似体などの医薬的に純粋な溶媒への活性物質の溶解、分散などによって調製することができる。
【００９０】
本発明の組成物又はコンジュゲートを、任意の適する経路によって投与することができ、例えば、静脈内、点滴、皮下又は筋肉内の経路を介して注射することができる製剤の形態などで非経口経路によって、例えばコーティング錠若しくは素錠、ゼラチンカプセル、粉末、ペレット、懸濁液または経口溶液の形態（１つのそのような経口投与形態は、即時放出を伴う場合もあり、または長期もしくは遅延放出を伴う場合もある）などで経口経路（又はper os）によって、例えば坐剤の形態などで直腸経路によって、例えばパッチ、ポマード又はゲルの形態などで局所経路によって、特に経皮経路によって、例えばエアロゾル及びスプレー形態などで鼻腔内経路によって、経舌経路によって、又は、眼内経路によって投与することができるがこれら経路に限らない。
【００９１】
また、本発明は、好ましくはキレート剤Ｃを使用して、マーカーＭをペプチドＰに結合させるステップを含む、上述で規定されるようなコンジュゲート化合物を調製又は作製する方法にも関する。
【００９２】
また、本発明は、上述で規定されるようなコンジュゲート化合物を準備するステップと、該化合物を適切な賦形剤又は希釈剤とともに製剤化するステップとを含む、医薬組成物を作製する方法にも関する。
【００９３】
本発明の他の態様及び利点は、本質的に例示であるのみであるとともに本願の範囲を限定することのない以下の実施例を考慮して明白になる。
【実施例】
【００９４】
＜実施例１：マウス及びヒト組織におけるＬＤＬ−受容体（ＬＤＬＲ）発現＞
対象のマウス及びヒト細胞株におけるＬＤＬＲの膜発現を評価するために、ＰｒｏｔｅｏＥｘｔｒａｃｔ  Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Calbiochem, LaJolla, CA, USA）を使用して、ヒト及びマウスがん細胞株からの膜抽出物を調製した。
【００９５】
製造者の指示に従ってＢｉｏＲａｄ  ＤＣ  Ｐｒｏｔｅｉｎアッセイ（Bio-Rad,Hercules, CA, USA）を使用して、膜抽出物を定量化した。まず、１０μｇ又は２０μｇの膜細胞タンパク質をドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）によって４〜１２％ポリアクリルアミドゲル上に分離して、ニトロセルロース膜（AmershamBiosciences）上に移動した。ヤギ抗ＬＤＬＲ抗体（R&D Systems、(1/500)）で、その後ペルオキシダーゼコンジュゲートロバ抗ヤギ２次抗体（JacksonImmunoresearch）で、膜をプローブした。最後に、化学発光を使用してタンパク質を検出した。
【００９６】
図１Ａに示すように、ＬＤＬＲ発現は副腎がん（NCI-H295R）、膠芽腫（U87MG）、乳がん（MDA-MB-231）、及び前立腺（PC3）のヒトがん細胞において増強される。ＣＨＯ９５（ＧＦＰと融合したｈＬＤＬＲを安定的に発現する改変チャイニーズハムスター卵巣細胞（hLDLR-GFP））をポジティブコントロールとして使用する。ヒト膵がん細胞（Capan、BxPC3及びPanc1）では、ＬＤＬＲレベルは変化する。Ｈｅｌａ（子宮頸がん）又はＭＣＦ７乳がんなどの他の細胞型では、ＬＤＬＲの発現レベルは顕著に低く、ほとんど検出されない。ＬＤＬＲ発現は、マウスの膵臓細胞株ＰＫ４Ａ（膵臓に自然発生腫瘍を発症したマウス由来）において、正常な膵臓組織と比較して増大する。
【００９７】
＜実施例２：蛍光ＬＤＬＲ標的コンジュゲートであるコンジュゲートＡ、コンジュゲートＢ、コンジュゲートＣ、及びコンジュゲートＤの合成＞
以下の実施例において、コンジュゲートＡ、Ｂ、Ｃ及びＤの作製及び使用を開示する。コンジュゲートＡ、Ｂ、Ｃ及びＤは、以下に示すペプチドＡ（配列番号１）、ペプチドＢ（配列番号１３）、ペプチドＣ（配列番号６）、及びペプチドＤ（配列番号１４）をそれぞれ含む。
【表１】
2020506921.tif 000002
【００９８】
［コンジュゲートＣ及びコンジュゲートＤ融合タンパク質作製］
ペプチドＣ及びペプチドＤをＩｇＧ１のＦｃフラグメントと融合させてクローニングした。
【００９９】
ペプチドＣ又はペプチドＤに融合させたＦｃフラグメントを作製するために、テンプレートとして使用したプラスミドｐＩＮＦＵＳＥ  ｈＩｇＧ１−Ｆｃ２(InvivoGen)に基づいてプラスミド構築物を構築した。プライマーＣ又はプライマーＤと呼称されるメガプライマーはオリゴヌクレオチドを使用してＰＣＲによって合成した：
−フォワードプライマー
CTTGGCATTATGCACCTCCA（配列番号１０）
−ペプチドＣをコードする配列を含むリバースプライマー 
CTGGCCAGCTAGCACTCAGCAACCGCGAAGACGAGGCATACAAGCACCTTTACCCGGAGACAGGGAG（配列番号１１）
−ペプチドＤをコードする配列を含むリバースプライマー
CTGGCCAGCTAGCACTCGCAGGGTCTGCCCAGCATTCTGCAAGCACCTTTACCCGGAGACAGGGAG（配列番号１２）
【０１００】
ＰＣＲ反応の作製物を精製し、ＤｐｎＩ（親のメチル化ＤＮＡを消化する酵素）で消化し、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Agilent）を使用して基質として使用されるｐＩＮＦＵＳＥ  ｈＩｇＧ１−Ｆｃ２プラスミドで行う第２のＰＣＲ反応においてメガプライマーとして使用した。コンピテントな細菌の形質転換後、単離したコロニーを取得し、プラスミドＤＮＡを調製し、確認のためｃＤＮＡ構築物を両鎖においてシーケンシングした。ｐコンジュゲート−Ｃ及びｐコンジュゲート−Ｄと呼称されるベクターに、哺乳動物細胞の遺伝子導入後にＣ末端においてペプチドＣ及びペプチドＤと融合させたＦｃフラグメントを発現させる。Ｅｘｐｉ２９３発現系（Thermo Fischer）を、培養上清における融合タンパク質コンジュゲートＣ及びコンジュゲートＤの一時的発現のために使用した。遺伝子導入の７２時間後、上清を回収し、製造者の推奨に従ってＭｏｎｔａｇｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＰＲＯＳＥＰ  Ａキット（Millipore）を使用して精製した。
【０１０１】
［コンジュゲートＡ及びコンジュゲートＢタンパク質合成］
コンジュゲートＡ及びコンジュゲートＢのヒトＩｇＧ１  Ｆｃフラグメント（Merck Millipore）へのコンジュゲーションを、２ステップの方法で、ヘテロ２官能性スペーサーであるスルホ−ＳＭＣＣ（PierceBiotechnology, Rockford, IL, USA）を使用して行った。まず、Ｆｃフラグメントをスルホ−ＳＭＣＣと反応させて、チオール部分に対する反応性タンパク質を取得し、第２ステップにおいて、チオール官能基化ペプチドＡ又はＢをリジン結合Ｆｃ−ＳＭＣＣタンパク質にコンジュゲートした。
【０１０２】
［チオール官能基化ペプチド合成］
ペプチドＡ及びペプチドＢのアミノ酸配列はそれぞれｃＭＴｈｚＲＬＲＧＰｅｎ（配列番号１）及びｃＲＰＬＧＲＭＣ（配列番号１３）であり、「Ｔｈｚ」はチアゾリジン、「Ｐｅｎ」はペニシラミンを示す。
【０１０３】
Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−保護アミノ酸を標準的な直交側鎖保護に選択した：Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（Ｄ配置又はＬ配置）、Ｆｍｏｃ−Ｐｅｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｚ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、及びＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ。これらの全てを、ピペリジン、トリフルオロ酢酸（TFA）、ジイソプロピルエチルアミン（DIEA）、エタンジチオール（EDT）、トリイソプロピルシラン（TIS）、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（PyBop）、１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−１Ｈ−１、２、３、−トリアゾロ［４、５−β］ピリジニウム３−オキシドヘキサフルオロホスフェート（HATU）、及び２−トリチルチオ−１−エチルアミンヒドロクロリド（Trt-システアミン）とともにＩｒｉｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈから購入した。
【０１０４】
ジメチルホルムアミド（DMF）、無水プロピオン酸、ＡｃＯＨ、Ｋ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］、炭酸アンモニウム、及びジクロロメタン（DCM）をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。
【０１０５】
Ｐｒ−ペプチドＡ−Ｇ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＳＨとＰｒ−ペプチドＢ−Ｇ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＳＨとの両方をＦｍｏｃ／ｔＢｕ方法及びＩｒｉｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈから購入したＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｗａｎｇ樹脂（１００〜２００メッシュ、１％DVB、0.7mmol/g添加）を用いて固相ペプチド合成（SPPS）法によって合成した。そうした樹脂により、その側鎖において完全に脱保護されるとともにＣ末端において遊離カルボン酸を有するペプチドの合成が可能になる。Ｇｌｙ残基をＣ末端位に挿入して、ラセミ化を回避しながら官能基化させた。
【０１０６】
ｃＭＴｈｚＲＬＲＧＰｅｎ及びｃＲＰＬＧＲＭＣ配列についてＬｉｂｅｒｔｙ(CEM)マイクロ波合成装置にてペプチド合成を行った。
【０１０７】
自動合成では、０．２５ｍｍｏｌスケール合成において４／４／８当量のａａ／ＤＩＥＡ／ＨＡＴＵ（樹脂に対して）を使用してｎ＋１アミノ酸の酸性官能基のマイクロ波活性によってアミノ酸を結合させた。結合時間を１０分に調節した。チアゾリジン又はプロリン残基後に導入されるアミノ酸にはダブルカップリングを必要とする。こうして結合された新しいアミノ酸のＦｍｏｃ基の脱保護をＤＭＦ内の２０％ピペリジンを使用して行った。ペプチド伸長時に結合した最後のアミノ酸を脱保護して、無水プロピオン酸（２＊５分、Pr2O/DCM:1/1）を使用してＮ−プロピオニル化した。
【０１０８】
そして、少なくとも２時間室温（RT）で９４／２／２／２のTFA/TIS/H2O/EDTを含む溶液を使用して樹脂結合ペプチドを切断した。樹脂のグラムあたり最小で１５ｍＬの切断溶液を使用した。そして、粗ペプチドを氷冷のエーテルを使用して沈殿させ、３０００ｒｐｍで８分間遠心分離し、Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡにおいて凍結乾燥させた。白色固体を取得し、さらに精製することなく環化ステップに用いた。
【０１０９】
Ｌ配置又はＤ配置のいずれかである２つの適切に保護されたＣｙｓ又はＰｅｎにおける２つのチオール官能基から分子内環化によりジスルフィド架橋を得た。粗Ｐｒ−ｃＭＴｈｚＲＬＲＧＰｅｎ−Ｇ−ＯＨ及びＰｒ−ｃＲＰＬＧＲＭＣ-Ｇ−ＯＨをＡｃＯＨ０．５％に溶解して０．５ｍｇ／ｍＬの最終濃度を得た。炭酸アンモニウム（2N）をペプチド溶液に添加して塩基性の約ｐＨ８〜９に達するようにした。そして、明るく一定の黄色が観察されるまでＫ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］（0.01N）を反応混合物に添加した。分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって反応のモニタリングを行った。通常、反応は３０分未満で定量可能になった。反応混合物を０．４５μｍ膜でろ過して分取ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。９５％を超える純度の画分を捕集して凍結乾燥し、純白色粉末を得た（最終純度＞９５％）。純粋な合成ペプチドの均質性及び同一性を分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって評価した。ペプチドは、ポジティブモードで使用したＬＣＱ  Ｆｌｅｅｔ（ThermoFisher）のＥＳＩ質量分析によって同一性について十分に確認された。
【０１１０】
ｉ）ＤＭＦ内におけるＰｙＢｏｐ／ＤＩＥＡでの第１のＧｌｙ残基の活性化と２−トリチルチオ−１−エチルアミンヒドロクロリド（Trt-システアミン）での反応、及びｉｉ）酸性条件におけるシステアミントリチル保護の除去（DCM/TIS/TFA:3/1/1）により、Ｐｒ−ペプチドＢ−Ｇ−ＯＨ及びＰｒ−ペプチドＡ−Ｇ−ＯＨのチオール官能基化はシステアミンを使用してそのＣ末端において行った。
【０１１１】
［Ｐｒ−ペプチドＡ−Ｇ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＳＨ及びＰｒ−ペプチドＢ−Ｇ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＳＨのＦｃフラグメントへの化学コンジュゲーション］
第１のステップにおいて、ペプチドＡ及びペプチドＢをスルホ−ＳＭＣＣスペーサーで官能基化させた。ペプチドＡ−ＳＭＣＣ及びペプチドＢ−ＳＭＣＣを、Ｆｃあたりモル過剰の２５ペプチドを用いてヒトＦｃフラグメント（AG 714-Millipore）の一級アミンと反応させた。反応物をＰＢＳバッファ内において室温（RT）で１時間インキュベートした。余分なペプチドを除去するために、混合物をPierce（登録商標）デキストラン脱塩カラム（Pierce）にて精製した。Ｆｃ−ペプチドＡ及びＦｃ−ペプチドＢコンジュゲート濃縮物は抗ＦｃＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定した。
【０１１２】
［コンジュゲートＡ、Ｂ、Ｃ及びＤの化学合成］
フルオロフォアＡｌｅｘａ６８０（A680励起:679nm;放出:702nm）をＦｃ−ペプチドＡ、Ｆｃ−ペプチドＢ、Ｆｃ−ペプチドＣ、及びＦｃ−ペプチドＤにコンジュゲートするために、ＳＡＩＶＩ  Ｒａｐｉｄ抗体標識キット（S30045-ThermoFicher）を使用した。このキットは、インビボのイメージング用途（約２のDOL（degree oflabeling））において最適な標識度（DOL、色素対タンパク質比）で抗体を標識するように設計されている。各コンジュゲートのＤＯＬ（表２参照）は、吸収度（Ａ）＝吸収係数（ε）×モル濃度×経路長（ｄ）のランベルト−ベールの法則を使用して吸収分光法によって測定可能である。コンジュゲート溶液のＵＶ−ＶＩＳスペクトルを測定した。色素の吸収極大（λabs）における吸収度（Amax）及び２８０ｎｍ（タンパク質の吸収極大）における吸収度（A280）の測定により、結合色素の濃度を取得し、これはｃ（色素）＝Ａｍａｘ／εｍａｘ×ｄによって得られ、式中、εｍａｘは吸収極大における色素の吸収係数であり、また２８０ｎｍにおけるその吸収度から同様にタンパク質濃度を取得し、これはｃ（タンパク質）＝Ａｐｒｏｔ／εｐｒｏｔ×ｄによって得られ、式中、εｐｒｏｔは２８０ｎｍにおけるタンパク質の吸収係数である。そして、ＤＯＬは、ＤＯＬ＝［Ａｍａｘ／εｍａｘ］／［Ａｐｒｏｔ／εｐｒｏｔ］で算出される。
【表２】
2020506921.tif 000003
表２は、コンジュゲートのＤＯＬを示す。
コンジュゲートＡ、Ｂ、Ｃ、及びＤの濃度は抗ＦｃＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定した。
【０１１３】
＜実施例３：ＬＤＬＲに対するコンジュゲートＡ、Ｂ、Ｃ、及びＤの親和性（KD）の表面プラズモン共鳴法（SPR）測定。コンジュゲートのｈ／ｍＬＤＬＲに対する結合・エンドサイトーシス特性はＣＨＯ細胞及びがん細胞株によって安定的に発現される＞
［ＬＤＬＲに対するコンジュゲートの親和性（KD）］
組換えヒトＬＤＬＲ（Ｈｉｓタグ付き）をＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ（Beijing, China）から購入した。コンジュゲートのＬＤＬＲとの相互作用を、ＢｉａｃｏｒｅＴ２００（GE Healthcare）及びランニングバッファとして５０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．００５％のＴｗｅｅｎ−２０、５０μＭのＥＤＴＡを使用して２５℃でテストした。ｈＬＤＬＲを３０〜６０ｆｍｏｌ／ｍｍ２の密度でＮｉＨＣセンサーチップ（Xantec,Dusseldorf, Germany）に固定した。コンジュゲートのＬＤＬＲコーティングフローセルに対する結合を非コーティングフローセルに対する非特異的結合に対して補正した。単一サイクルの動態学的方法を使用してリガンドのＬＤＬＲに対する親和性を測定した。リガンドをランニングバッファに希釈し、濃度を増加させて３０μｌ/ｍｉｎで２分連続的に注入した。リガンド注入前に同様の条件でランニングバッファのブランクテスト注射を行った。ダブルサブトラクションセンサーグラムをＢｉａｃｏｒｅＴ２００評価Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎバージョン２．０の１：１のラングミュア結合モデルに全体的に適合させた。ＫＤを以下の表３にまとめる。
【表３】
2020506921.tif 000004
表３は、コンジュゲートＡ、Ｂ、Ｃ、及びＤのヒトＬＤＬＲに対する親和性を示す。
【０１１４】
［ＬＤＬＲ発現細胞による蛍光コンジュゲートの結合・エンドサイトーシス］
ＬＤＬＲによってエンドサイトーシスされるｈ／ｍＬＤＬＲ−ＧＦＰに親和性を有するコンジュゲート（コンジュゲートＡ及びＣ）とコントロールコンジュゲート（コンジュゲートＢ及びＤ）の能力を評価するために、ｈＬＤＬＲ−ＧＦＰ生細胞におけるすべてのコンジュゲートのインキュベートに関与する免疫細胞化学的実験を３７℃で１時間行い、その後共焦点顕微鏡分析を行った。
【０１１５】
これらの実験において、図２に関して、ＬＤＬＲ−ＧＦＰ信号を２列目に可視化し、コンジュゲート信号を、Ａ６８０蛍光法を使用して４列目に、又は抗ｈＦｃ−Ａ５９４コンジュゲート２次抗体を使用して３列目に直接的に可視化している。細胞核をヘキストでブルー染色し、その信号を１列目に可視化できている。ＬＤＬＲ−ＧＦＰ及びコンジュゲートの共標識は、統合イメージにおいて５列目に強調された信号として可視化できている。得られた結果は、コンジュゲートＡ及びＣがＣＨＯ−ｈＬＤＬＲ−ＧＦＰ細胞に結合してエンドサイトーシスされている一方、コントロールコンジュゲートＢ及びＤはそうではないことを示している。
【０１１６】
＜実施例４：ナイーブ又は担がんマウスに静脈注射したＬＤＬＲ標的コンジュゲートの分布のＥＬＩＳＡ定量化＞
マウス膵臓腺がんＰＫ４Ａ細胞はＳ．Ｖａｓｓｅｕｒ（Inserm U1068,Cellular Stress）から取得され、これは以前に記載されたものである（Guillaumond F等、 2013 Proc NatlAcad Sci USA 110(10):3919-3924）。細胞を、ペニシリン（100U/mL）、ストレプトマイシン（100μg/mL）、ウシ胎仔血清（10 % Gold Serum,InVitrogen）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM; Invitrogen,Carlsbad, CA）にて培養し、５％ＣＯ２を含む大気中にて３７℃でインキュベートした。細胞を腫瘍の誘導に使用した。ＰＫ４Ａ腫瘍の異種移植を生後４週のＨｓｄにおいて誘導した。胸腺欠損ヌード−Ｆｏｘｎ１ｎｕヌードマウスの雄を、Ｅｎｖｉｇｏ（Harlan,Indianapolis, IN）から、１５０μＬの完全培地に懸濁した１×１０６細胞の肩部間への皮下注射によって取得した。腫瘍サイズを一日おきに目視で評価し、動物をインビボのイメージング実験に使用した。ＰＫ４Ａ皮下腫瘍量が約７００〜１５００ｍｍ３のサイズに達すると（インプラント後１０〜１４日）、担腫瘍マウスに５ｎｍｏｌのコンジュゲートを尾静脈から注射した。コンジュゲートＡ及びＢでは２時間後、コンジュゲートＣ及びＤでは４時間後、全血をヘパリン処理チューブ（Sigma Aldrich）に採血して、５０００ｇでの１５分の遠心分離後に血漿を単離した。そして、マウスを２ｍｌ／ｍｉｎの速度で１０分間ＰＢＳ１×で灌流した。器官を取り出して、計量し、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Sigma Aldrich）を含有するＰＢＳ内のＰＢＳ／０．１％トリトン（Sigma Aldrich）にてホモジネートした。器官ホモジネートを−８０℃で１２時間凍結して音波処理３×１０ｓし、組織ライセートの清澄化を２００００ｇでの１５分間の遠心分離によって行った。単離上清のＦｃ濃度を抗ＦｃＥＬＩＳＡで測定した。図３に示す結果は、膵臓腫瘍対膵臓において、コンジュゲートＡの４０倍の蓄積及びコンジュゲートＣの３０倍の蓄積を示す。腎臓の蓄積をコントロールとして示す。
【０１１７】
＜実施例５：膵臓腫瘍及び健康な膵臓におけるコンジュゲートＣ及びそのスクランブル対照物であるコンジュゲートＤの体内分布＞
担腫瘍マウスに、コントロールとしてのコンジュゲートＤとともに、５ｎｍｏｌのコンジュゲートＣを静脈内注射した（ｎ＝５）。静脈内注射後の１５分、３０分、６０分、及び１２０分において蛍光全身イメージングをモニタリングした。実験終了時（分子の静脈内注射後４時間）に膵臓、肝臓、及び腫瘍組織を採取し、エクスビボで蛍光を測定した。図４は、コンジュゲートＣがスクランブルコンジュゲートＤと比較して膵臓腫瘍に有意に蓄積することを示す。さらに、健康な膵臓組織においては蓄積が観察されなかったので、この蓄積は膵臓腫瘍に特異的であった。
【０１１８】
＜実施例６：ＮＯＤＡＧＡ−配列番号１−ＮＨ２、ＤＯＴＡ−配列番号１−ＮＨ２、ＮＯＤＡＧＡ−βＡｌａ−ＰＥＧ１２−配列番号１−ＮＨ２、ＤＯＴＡ−βＡｌａ−ＰＥＧ１２−配列番号１−ＮＨ２、及びそのそれぞれのスクランブルコントロールＮＯＤＡＧＡ−βＡｌａ−ＰＥＧ１２−配列番号１３−ＮＨ２、及びＤＯＴＡ−βＡｌａ−ＰＥＧ１２−配列番号１３ＮＨ２の合成＞
以下の実施例において、６８Ｇａ−ＣＨ４４は６８Ｇａ−ＮＯＤＡＧＡ−βＡｌａ−ＰＥＧ１２−配列番号１−ＮＨ２の省略形として使用し、６８Ｇａ−ＦＧ７７０は６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−βＡｌａ−ＰＥＧ１２−配列番号１−ＮＨ２の省略形として使用し、６８Ｇａ−ＣＨ４０は６８Ｇａ−ＮＯＤＡＧＡ−βＡｌａ−ＰＥＧ１２−配列番号１３−ＮＨ２の省略形として使用し、６８Ｇａ−ＦＧ７６９は６８Ｇａ−ＤＯＴＡ−βＡｌａ−ＰＥＧ１２−配列番号１３−ＮＨ２の省略形として使用する。
【表４】
2020506921.tif 000005
２タイプのキレートケージをＬＤＬＲ標的ペプチドベクターにコンジュゲートした。
−ＮＯＤＡＧＡ（１、４、７−トリアザシクロノナン−１−グルタル酸−４、７−２酢酸）によりイメージングのための放射標識コンジュゲートの合成が可能になる。
−ＤＯＴＡ（テトラアザシクロドデカン-１、４、７、１０−４酢酸）を、放射線治療の可能性から放射標識コンジュゲートの調製のために導入した。
【０１１９】
大員環ＮＯＴＡ（１、４、７−トリアザシクロノナン−１、４、７−３酢酸）及びＮＯＤＡＧＡは、一般に使用される放射性トレーサーである６８ガリウムのキレート化のための最も好ましいリガンドである。これらのリガンドのなかでも、ＮＯＤＡＧＡは、このキレートケージがＮＯＴＡと比較してさらなる結合部分を含むため選択された。これは、６座配位を飽和させるためにカルボキシアームのすべてを利用可能であるということを確実にする。
【０１２０】
放射線治療では、１１１インジウム、１７７Ｌｕ、又は９０イットリウムを臨床において使用する。そうした放射性金属は、それとともに熱力学的及び動態学的に安定的な複合体を形成するＤＯＴＡ大員環キレーターに良好に適合する。実際に、ＤＯＴＡは、これらの放射性核種とともにより安定的な複合体を形成するために、８つのドナー原子及び適切な空洞サイズを提供する。
【０１２１】
ＮＯＤＡＧＡ及びＤＯＴＡの誘導体を、ＬＤＬＲ発現がんを優先的に標的化可能なイメージング剤及び受容体媒介放射線治療を開発するために調製した。
【０１２２】
ペプチドベクターにコンジュゲートした大員環キレーターの位置及び距離を評価するために、種々の構築物を設計及び調製した。キレート剤をＣ末端、Ｎ末端、又はペプチドベクター配列にさらに導入されたリジンのアミノ側鎖にコンジュゲートした。すべての誘導体は、精製ＬＤＬＲにおけるＳＰＲ分析によって評価されるように標的ＬＤＬ受容体に常に結合した。このように、Ｎ末端にキレート剤を有する構築物が選択され、これはこの合成経路がより設定しやすいことによるものである。
【０１２３】
図５は、ケージ−リンカー−ペプチド−ＮＨ２コンジュゲートの合成の反応スキームを示す。このスキームでは、ＮＯＤＡＧＡ−βＡｌａ−ＰＥＧ１２−配列番号１−ＮＨ２の合成の例を示す。
【０１２４】
合成反応の試薬及び条件は図５に関して以下のとおりである。
−ステップａ：ＡＡ（４当量（eq)））、ＨＡＴＵ（4eq）、ＤＩＥＡ（8eq）、ＤＭＦ、マイクロ波活性、
−ステップｂ：Ｆｍｏｃ−ＰＥＧ１２−ＯＨ（1.5eq）、ＤＩＣ（4eq）、ＨＯＢｔ（2eq）、ＤＭＦ、室温（RT）、２４時間、
−ステップｃ：Ｆｍｏｃ−（β）Ａｌａ−ＯＨ（3eq）、ＣＯＭＵ（3eq）、ＤＩＥＡ（8eq）、ＤＭＦ、ＲＴ、３時間、
−ステップｄ：ＤＭＦ／ピペリジン（２０％）１５分、ＴＦＡ／ＴＩＳ／Ｈ２Ｏ／ＥＤＴ（94/2/2/2）、ＲＴ、２時間、
−ステップｅ：ＡｃＯＨ（0.5%）、（ＮＨ４）２ＣＯ３、Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６、ｐＨ＝７〜８、［ペプチド］＝１ｍｇ／ｍＬ、
−ステップｆ：ＮＯＤＡＧＡ−ＮＨＳ（2eq）、ＤＩＥＡ（10eq）、ＤＭＦ、ＲＴ、３０分。
【０１２５】
分析及び精製方法
−反応進行及び純度のモニタリングをＣ１８  ＫｉｎｅｔｅｘＴＭ(5μm、150mm x 4.6mm)を備えたＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ＵｌｔｉＭａｔｅ  ３０００システムにて行った。検出を２１４ｎｍで行った。溶出系をＨ２Ｏ／０．１％ＴＦＡ（溶液Ａ）及びＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ（溶液Ｂ）から構成した。流速は２ｍＬ／ｍｉｎであり、溶液Ｂの０〜１００％の勾配は４分で行った。
−粗生成物をＣ１８  ＬｕｎａＴＭ(5 μm、100mm x 21.2mm)を備えたＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ＵｌｔｉＭａｔｅ  ３０００システムにてＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。検出を２１４ｎｍで行った。溶出系をＨ２Ｏ／０．１％ＴＦＡ（溶液Ａ）及びＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ（溶液Ｂ）から構成した。流速は２０ｍＬ／ｍｉｎであった。
【０１２６】
［Ｈ−配列番号１−ＮＨ２、Ｈ−βＡｌａ−ＰＥＧ１２−配列番号１−ＮＨ２、及びＨ−βＡｌａ−ＰＥＧ１２−配列番号１３−ＮＨ２の合成］
Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−保護アミノ酸を標準的な直交側鎖保護に選択した：Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（Ｄ配置又はＬ配置）、Ｆｍｏｃ−Ｐｅｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｚ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−βＡＬａ−ＯＨ、及びＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ。これらの全てを、ピペリジン、トリフルオロ酢酸（TFA）、ジイソプロピルエチルアミン（DIEA）、エタンジチオール（EDT）、トリイソプロピルシラン（TIS）、１−シアノ−２−エトキシ−２−オキソエチリデンアミノオキシ）ジメチルアミノ−モルフォリノ−カルベニウム  ヘキサフルオロホスフェート（COMU）、１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−１Ｈ−１、２、３、−トリアゾロ［４、５−β］ピリジニウム３−オキシドヘキサフルオロホスフェート（HATU）、Ｎ、Ｎ´−ジイソプロピルカルボジイミド（DIC）、及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾールとともにＩｒｉｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈから購入した。
【０１２７】
ジメチルホルムアミド（DMF）及びジクロロメタン（DCM）をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。
【０１２８】
Ｆｍｏｃ−２１−アミノ−４、７、１０、１３、１６、１９−ヘキサオキサヘンエイコサン酸（Fmoc-PEG12-OH）をＰｏｌｙＰｅｐｔｉｄｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。
【０１２９】
コンジュゲートＨ−配列番号１−ＮＨ２、Ｈ−βＡｌａ−ＰＥＧ１２−配列番号１−ＮＨ２、及びＨ−βＡｌａ−ＰＥＧ１２−配列番号１３−ＮＨ２を、Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ方法及びＩｒｉｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈから購入したＦｍｏｃ−Ｒｉｎｋアミド樹脂（１００〜２００メッシュ、１％DVB、0.7mmol/g添加）を用いて、固相ペプチド合成（SPPS）法によって合成した。そうした樹脂により、その側鎖において完全に脱保護されるとともにＣ末端アミドを有するペプチドの合成が可能になる。
【０１３０】
ｃＭＴｈｚＲＬＲＧＰｅｎ（配列番号１）及びｃＲＰＬＧＲＭＣ（配列番号１３）配列についてＬｉｂｅｒｔｙ(CEM)マイクロ波合成装置にてペプチド合成を行い、一方で必要であれば、リンカーＦｍｏｃ−βＡｌａ−ＯＨ及びＦｍｏｃ−ＰＥＧ１２−ＯＨを手動で結合させた。
【０１３１】
自動合成では、０．２５ｍｍｏｌスケール合成において４／４／８当量のａａ／ＤＩＥＡ／ＨＡＴＵ（樹脂に対して）を使用してｎ＋１アミノ酸の酸性官能基のマイクロ波活性によってアミノ酸を結合させた。結合時間を１０分に調節した。チアゾリジン又はプロリン残基後に導入されるアミノ酸にはダブルカップリングを必要とする。こうして結合された新しいアミノ酸のＦｍｏｃ基の脱保護をＤＭＦ内の２０％ピペリジンを使用して行った。ペプチド伸長時に結合した最後のアミノ酸を脱保護して、Ｎ末端におけるさらなる結合を可能にした。ケージとペプチドベクターとの間に導入したリンカーを有する配列において、１．５／４／２当量のａａ／ＤＩＣ／ＨＯＢｔ（樹脂に対して）を使用してＦｍｏｃ−ＰＥＧ１２−ＯＨを手動で導入した。反応を一晩室温で行った。ＴＮＢＳテストにより結合効率をモニタリングできた。ピペリジン／ＤＭＦ（20%、3*5分）溶液でのＦｍｏｃ脱保護後、Ｆｍｏｃ−βＡｌａ−ＯＨを、３／８／３当量のａａ／ＤＩＥＡ／ＣＯＭＵを使用して、室温で３時間、遊離Ｎ末端に最後にコンジュゲートした。ＴＮＢＳテストにより結合効率をモニタリングでき、ＦｍｏｃをＤＭＦ内の２０％ピペリジン溶液で除去した（3*5分）。
【０１３２】
そして、９４／２／２／２のＴＦＡ／ＴＩＳ／Ｈ２Ｏ／ＥＤＴを含む溶液を使用して少なくとも２時間室温（RT）で樹脂結合ペプチドを切断した。樹脂のグラムあたり最小で１５ｍＬの切断溶液を使用した。そして、粗ペプチドを氷冷のエーテルを使用して沈殿させ、３０００ｒｐｍで８分間遠心分離し、Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡにおいて凍結乾燥させた。白色固体を取得し、さらに精製することなく次のステップに用いた。
【０１３３】
［コンジュゲートＨ−配列番号１−ＮＨ２、Ｈ−βＡｌａ−ＰＥＧ１２−配列番号１−ＮＨ２、及びＨ−βＡｌａ−ＰＥＧ１２−配列番号１３−ＮＨ２の環化］
Ｌ配置又はＤ配置のいずれかである２つの適切に保護されたＣｙｓ又はＰｅｎにおける２つのチオール官能基から分子内環化によりジスルフィド架橋を得た。ＡｃＯＨ、Ｋ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］、及び炭酸アンモニウムをＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。Ｈ−配列番号１−ＮＨ２、Ｈ−βＡｌａ−ＰＥＧ１２−配列番号１−ＮＨ２、及びＨ−βＡｌａ−ＰＥＧ１２−配列番号１３−ＮＨ２の粗コンジュゲートをＡｃＯＨ０．５％に溶解して、０．５ｍｇ／ｍＬの最終濃度を得た。炭酸アンモニウム（2N）をペプチド溶液に添加して塩基性の約ｐＨ８〜９に達するようにした。そして、明るく一定の黄色が観察されるまでＫ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］（0.01N）を反応混合物に添加した。分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって反応のモニタリングを行った。通常、反応は３０分未満で定量可能になった。反応混合物を０．４５μｍ膜でろ過して分取ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。９５％を超える純度の画分を捕集して凍結乾燥し、純白色粉末を得た（最終純度＞９５％）。純粋な合成ペプチドの均質性及び同一性を分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって評価した。ペプチドは、ポジティブモードで使用したＬＣＱ  Ｆｌｅｅｔ（ThermoFisher）のＥＳＩ質量分析によって同一性について十分に確認された。
【０１３４】
［Ｈ−配列番号１−ＮＨ２、Ｈ−βＡｌａ−ＰＥＧ１２−配列番号１−ＮＨ２、及びＨ−βＡｌａ−ＰＥＧ１２−配列番号１３−ＮＨ２のへのＮＯＤＡＧＡ及びＤＯＴＡコンジュゲート］
ＮＯＤＡＧＡ  モノ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（NODAGA-NHS）及びＤＯＴＡ  モノ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（DOTA-NHS）の活性化エステルを使用して、キレーターをペプチドにコンジュゲートした。
【０１３５】
ＮＯＤＡＧＡ−ＮＨＳ及びＤＯＴＡ−ＮＨＳをＣｈｅｍａｔｅｃｈ（Dijon, France）から得た。
【０１３６】
ＤＭＦ（1.2mM）内のペプチド溶液にキレート剤（4eq）及びＤＩＥＡ（10eq）を添加した。反応混合物を室温で攪拌した。分析ＲＰ−ＨＰＬＣによる反応のモニタリングにより、反応が定量的であることを評価した。反応混合物を０．４５μｍ膜でろ過して分取ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。９５％を超える純度の画分を捕集して凍結乾燥し、純白色粉末を得た（最終純度＞９５％）。純粋な合成ペプチドの均質性及び同一性を分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって評価した。ペプチドは、ポジティブモードで使用したＬＣＱ  Ｆｌｅｅｔ（ThermoFisher）のＥＳＩ質量分析によって同一性について十分に確認された。
【０１３７】
＜実施例７：ＬＤＬＲに対するＭＧ０４／ＶＨ−ＤＯ３５、ＣＨ４４、ＦＧ７７０、ＣＨ４０及びＦＧ７６９の親和性（KD）の表面プラズモン共鳴法（SPR）測定＞
［ＬＤＬＲに対するコンジュゲートの親和性（KD）］
組換えヒトＬＤＬＲ（Ｈｉｓタグ付き）をＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ（Beijing, China）から購入した。コンジュゲートのＬＤＬＲとの相互作用を、ＢｉａｃｏｒｅＴ２００（GE Healthcare）及びランニングバッファとして５０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．００５％のＴｗｅｅｎ−２０、５０μＭのＥＤＴＡを使用して２５℃でテストした。ｈＬＤＬＲを３０〜６０ｆｍｏｌ／ｍｍ２の密度でＮｉＨＣセンサーチップ（Xantec,Dusseldorf, Germany）に固定した。コンジュゲートのＬＤＬＲコーティングフローセルに対する結合を非コーティングフローセルに対する非特異的結合に対して補正した。単一サイクルの動態学的方法を使用してリガンドのＬＤＬＲに対する親和性を測定した。リガンドをランニングバッファに希釈し、濃度を増加させて３０μｌ/ｍｉｎで２分連続的に注入した。リガンド注入前に同様の条件でランニングバッファのブランクテスト注射を行った。ダブルサブトラクションセンサーグラムをＢｉａｃｏｒｅＴ２００評価Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎバージョン２．０の１：１のラングミュア結合モデルに全体的に適合させた。ＫＤを以下の表５にまとめる。
【表５】
2020506921.tif 000006
表５は、コンジュゲートＣＨ４０、ＦＧ７６９、ＣＨ４４、ＦＧ７７０、及びＭＧ０４のＬＤＬＲに対する親和性を示す。
【０１３８】
＜実施例８：副腎腫瘍の皮下マウスモデルにおける６８Ｇａ−ＣＨ４４及びそのスクランブル対照物６８Ｇａ−ＣＨ４０のＰＥＴイメージング＞
この実施例の目的は、副腎がんをインプラントしたマウス（異種移植モデル）に静脈内投与した後のＬＤＬＲを標的とするコンジュゲート（68Ga-CH44）及びそのスクランブル対照物（68Ga-CH40）の体内分布を評価するためにＰＥＴスキャンを使用することであった。１８Ｆ−ＦＤＧをコントロールとして使用した。
【０１３９】
〔材料〕
［放射標識］
ＣＨ４４及びＣＨ４０は６８Ｇａ塩化物を使用して放射標識した。市販のＴｉＯ２系６８Ｇｅ／６８Ｇａジェネレータ（Obninsk）を使用して、ガリウムを６８Ｇａ３＋形態で得た。２００μＬの酢酸アンモニウムバッファ内（4M、pH6）において２５℃で１５分間、２０μｇのＮＯＤＡＧＡ−ＣＨ４４及び４０μｇのＮＯＤＡＧＡ−ＣＨ４０を７４〜１４８ＭＢｑ（２〜４mCi）の６８Ｇａと反応させることで、放射標識反応を行った。
【０１４０】
６８Ｇａ−ＣＨ４４及び６８Ｇａ−ＣＨ４０について得られた比放射能はそれぞれ１２．５Ｂｑ／ｍｍｏｌ及び５．５Ｂｑ／ｍｍｏｌであった。
【０１４１】
［腫瘍インプラント］
エクスマルセイユ倫理委員会（Comity 14）により承認されているプロトコルに従って動物の研究を行った。生後４週のＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの雄をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｉｎｃから取得した。５０％マトリゲル（Corning）を含有する１５０μＬの完全培地内のＮＣＩ−Ｈ２９５Ｒ細胞をマウスに上部側腹から皮下にインプラントした。腫瘍が７００〜１５００ｍｍ３に含まれる量に達したときマウスをイメージング実験に使用した。
【０１４２】
［投与経路、用量、及び実験設計］
動物に、１０±４ＭＢｑの６８Ｇａ−ＣＨ４４又は６８Ｇａ−ＣＨ４０の用量で静脈内の単一ボーラスによってテスト物質を投与した。
【０１４３】
６匹のマウスにＮＣＩ−Ｈ２９５Ｒ副腎がん細胞をインプラントした。インプラント後の１４日目に、動物に１８Ｆ−ＦＤＧ、６８Ｇａ−ＣＨ４４及び６８Ｇａ−ＣＨ４０をそれぞれ２４時間間隔で静脈内に投与した。インプラント後の３２日目に、動物に６８Ｇａ−ＣＨ４４、及び２４時間後に６８Ｇａ−ＣＨ４０を静脈内に投与した。各投与後、副腎がん異種移植及び他の組織の体内分布はＰＥＴイメージングを使用して評価した。
【０１４４】
［ＰＥＴスキャン］
ヌードマウスのグループ（ｎ＝５〜７）に１０±４ＭＢｑの６８Ｇａ−ＣＨ４４を静脈内投与し、ＰＥＴ／ＣＴスキャンを注射後（p.i.）１時間において得た。ＰＥＴ及びＰＥＴ／ＣＴ研究をマイクロＰＥＴ／マイクロＣＴげっ歯動物モデルスキャナー（nanoPET/CT,Mediso）で行った。麻酔を５％イソフルランで誘導し、１．５％で維持した。画質を向上させるために、静止ＰＥＴ放射スキャン毎に（エネルギーウィンドウ：400-600 keV、時間：１ＦＯＶにつき２０分）、マウスにつき２千万の同時計数イベントを得た。２様式のＰＥＴ／ＣＴでは、ＣＴイメージ（35 kVp、350nsの露出時間、中ズーム）を得て、解剖学的な位置合わせと減弱補正とを対応するＰＥＴスキャンに適用した。最初の注射後６時間において、同じヌードマウスのグループに１０±４ＭＢｑの６８Ｇａ−ＣＨ４０を投与し、ＰＥＴ／ＣＴスキャンを注射後（p.i.）１時間において得た。この一連の取得はコントロールグループをなすものであった。
【０１４５】
〔結果〕
［ＰＥＴイメージング］
３つすべての化合物について１４日目に、６８Ｇａ−ＣＨ４４及び６８Ｇａ−ＣＨ４０について３２日目に、イメージ取得を行った。１４日目において、１８Ｆ−ＦＤＧを注射した動物のイメージング画像は腫瘍部位において有意な蓄積を示さなかった（図６Ａ）。
【０１４６】
一方で、１４日目（図６Ｂ及び図６Ｃ）及び３２日目（図７Ａ及び図７Ｂ）において、イメージング画像はほとんどの動物で、６８Ｇａ−ＣＨ４０と比較して６８Ｇａ−ＣＨ４４の有意な蓄積を示した。
【０１４７】
〔結論〕
実験では、ほとんどの動物で１４日目及び３２日目において６８Ｇａ−ＣＨ４４による明確で選択的な副腎がんのイメージング及び標識化を示した。
【０１４８】
＜実施例９：副腎腫瘍の皮下マウスモデルにおける６８Ｇａ−ＦＧ７７０及びそのスクランブル対照物６８Ｇａ−ＦＧ７６９のＰＥＴイメージング＞
この実施例の目的は、副腎がんをインプラントしたマウス（異種移植モデル）に静脈内投与した後のＬＤＬＲを標的とするコンジュゲート（68Ga-FG770）及びそのスクランブル対照物（68Ga-FG769）の体内分布を評価するためにＰＥＴスキャンを使用することであった。この研究に使用したケージはＮＯＤＡＧＡではなくＤＯＴＡであった。
【０１４９】
〔材料〕
［放射標識］
ＦＧ７７０及びＦＧ７６９は６８Ｇａ塩化物を使用して放射標識した。市販のＴｉＯ２系６８Ｇｅ／６８Ｇａジェネレータ（Obninsk）を使用して、ガリウムを６８Ｇａ３＋形態で得た。１００μＬの酢酸アンモニウムバッファ内（2M、pH4.5）において９５℃で１５分間、２０μｇのＤＯＴＡ−ＦＧ７７０及び２０μｇのＤＯＴＡ−ＦＧ７６９を７４〜１４８ＭＢｑ（２〜４mCi）の６８Ｇａと反応させることで、放射標識反応を行った。
【０１５０】
６８Ｇａ−ＦＧ７７０及び６８Ｇａ−ＦＧ７６９について得られた比放射能はそれぞれ６．４５Ｂｑ／ｍｍｏｌ及び６．１６Ｂｑ／ｍｍｏｌであった。
【０１５１】
［腫瘍インプラント］
エクスマルセイユ倫理委員会（Comity 14）により承認されているプロトコルに従って動物の研究を行った。生後４週のＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの雄をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｉｎｃから取得した。５０％マトリゲル（Corning）を含有する１５０μＬの完全培地内のＮＣＩ−Ｈ２９５Ｒ細胞をマウスに上部側腹から皮下にインプラントした。腫瘍が７００〜１５００ｍｍ３に含まれる量に達したときマウスをイメージング実験に使用した。
【０１５２】
［投与経路、用量、及び実験設計］
動物に、１０±４ＭＢｑの６８Ｇａ−ＦＧ７７０又は６８Ｇａ−ＦＧ７６９の用量で静脈内の単一ボーラスによってテスト物質を投与した。
【０１５３】
６匹のマウスにＮＣＩ−Ｈ２９５Ｒ副腎がん細胞をインプラントした。インプラント後の３７日目に、動物に６８Ｇａ−ＦＧ７７０及び６８Ｇａ−ＦＧ７６９をそれぞれ２４時間間隔で静脈内に投与した。投与後、副腎がん異種移植及び他の組織の体内分布はＰＥＴイメージングを使用して評価した。
【０１５４】
［ＰＥＴスキャン］
ヌードマウスのグループ（ｎ＝３）に１０±４ＭＢｑの６８Ｇａ−ＦＧ７７０を静脈内投与し、ＰＥＴ／ＣＴスキャンを注射後（p.i.）１時間において得た。ＰＥＴ及びＰＥＴ／ＣＴ研究をマイクロＰＥＴ／マイクロＣＴげっ歯動物モデルスキャナー（nanoPET/CT,Mediso）で行った。麻酔を５％イソフルランで誘導し、１．５％で維持した。画質を向上させるために、静止ＰＥＴ放射スキャン毎に（エネルギーウィンドウ：400-600 keV、時間：１ＦＯＶにつき２０分）、マウスにつき２千万の同時計数イベントを得た。２様式のＰＥＴ／ＣＴでは、ＣＴイメージ（35kVp、350nsの露出時間、中ズーム）を得て、解剖学的な位置合わせと減弱補正とを対応するＰＥＴスキャンに適用した。
【０１５５】
最初の注射後２４時間において、同じヌードマウスのグループに１０±４ＭＢｑの６８Ｇａ−ＦＧ７６９を静脈内に投与し、ＰＥＴ／ＣＴスキャンを注射後（p.i.）１時間及び４時間において得た。ＰＥＴイメージにおける定量的対象領域（ROI）分析はＩｎｔｅｒｖｉｅｗｆｕｓｉｏｎを使用して減弱及び減衰補正ＰＥＴイメージにおいて行われた。
【０１５６】
〔結果〕
［ＰＥＴイメージング］
６８Ｇａ−ＦＧ７７０及び６８Ｇａ−ＦＧ７６９の両化合物について３７日目に、イメージ取得を行った。イメージング画像はほとんどの動物で、６８Ｇａ−ＦＧ７６９と比較して６８Ｇａ−ＦＧ７７０の有意な蓄積を示した（それぞれ図８Ａ及び図８Ｂ）。
【０１５７】
〔結論〕
実験では、ほとんどの動物で３７日目において６８Ｇａ−ＦＧ７７０による明確で選択的な副腎がんのイメージング及び標識化を示した。
【０１５８】
＜実施例１０：膵臓がんの皮下マウスモデルにおける６８Ｇａ−ＣＨ４４及びそのスクランブル対照物６８Ｇａ−ＣＨ４０のＰＥＴイメージング＞
この実施例の目的は、膵臓がんをインプラントしたマウス（異種移植モデル）に静脈内投与した後のＬＤＬＲを標的とするコンジュゲート（68Ga-CH44）及びそのスクランブル対照物（68Ga-CH40）の体内分布を評価するためにＰＥＴスキャンを使用することであった。１８Ｆ−ＦＤＧをコントロールとして使用した。
【０１５９】
〔材料〕
［放射標識］
ＣＨ４４及びＣＨ４０は６８Ｇａ塩化物を使用して放射標識した。市販のＴｉＯ２系６８Ｇｅ／６８Ｇａジェネレータ（Obninsk）を使用して、ガリウムを６８Ｇａ３＋形態で得た。２００μＬの酢酸アンモニウムバッファ内（4M、pH6）において２５℃で１５分間、２０μｇのＣＨ４４及び４０μｇのＣＨ４０を７４〜１４８ＭＢｑ（２〜４mCi）の６８Ｇａと反応させることで、放射標識反応を行った。
【０１６０】
６８Ｇａ−ＣＨ４４及び６８Ｇａ−ＣＨ４０について得られた比放射能はそれぞれ１２．５Ｂｑ／ｍｍｏｌ及び５．５Ｂｑ／ｍｍｏｌであった。
【０１６１】
［腫瘍インプラント］
エクスマルセイユ倫理委員会（Comity 14）により承認されているプロトコルに従って動物の研究を行った。生後４週のＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの雄をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｉｎｃから取得した。１５０μＬの完全培地内のＰｋ４ａ細胞（1×106）をマウスに肩部間において皮下にインプラントした。腫瘍が７００〜１５００ｍｍ３に含まれる量に達したときマウスをイメージング実験に使用した。
【０１６２】
［投与経路、用量、及び実験設計］
動物に、１０±４ＭＢｑの６８Ｇａ−ＣＨ４４及び６８Ｇａ−ＣＨ４０の用量で静脈内の単一ボーラスによってテスト物質を投与した。
【０１６３】
マウス（ｎ＝５〜６）にＰｋ４ａ膵臓がん細胞をインプラントした。インプラント後の４日目に、動物に１８Ｆ−ＦＤＧ、６８Ｇａ−ＣＨ４４及び６８Ｇａ−ＣＨ４０をそれぞれ２４時間間隔で静脈内に投与した。インプラント後の１２日目に、動物に６８Ｇａ−ＣＨ４４、及び２４時間後に６８Ｇａ−ＣＨ４０を静脈内に投与した。
【０１６４】
各投与後、膵臓がん異種移植及び他の組織の体内分布はＰＥＴイメージングを使用して評価した。
【０１６５】
［ＰＥＴスキャン］
ヌードマウスのグループ（ｎ＝５〜７）に１０±４ＭＢｑの６８Ｇａ−ＣＨ４４を静脈内投与し、ＰＥＴ／ＣＴスキャンを注射後（p.i.）１時間において得た。ＰＥＴ及びＰＥＴ／ＣＴ研究をマイクロＰＥＴ／マイクロＣＴげっ歯動物モデルスキャナー（nanoPET/CT,Mediso）で行った。麻酔を５％イソフルランで誘導し、１．５％で維持した。画質を向上させるために、静止ＰＥＴ放射スキャン毎に（エネルギーウィンドウ：400-600 keV、時間：１ＦＯＶにつき２０分）、マウスにつき２千万の同時計数イベントを得た。２様式のＰＥＴ／ＣＴでは、ＣＴイメージ（35kVp、350nsの露出時間、中ズーム）を得て、解剖学的な位置合わせと減弱補正とを対応するＰＥＴスキャンに適用した。最初の注射後６時間において、同じヌードマウスのグループに１０±４ＭＢｑの６８Ｇａ−ＣＨ４０を投与し、ＰＥＴ／ＣＴスキャンを注射後（p.i.）１時間において得た。この一連の取得はコントロールグループをなすものであった。
【０１６６】
〔結果〕
［ＰＥＴイメージング］
１８Ｆ−ＦＤＧ、６８Ｇａ−ＣＨ４４及び６８Ｇａ−ＣＨ４０について４日目に、６８Ｇａ−ＣＨ４４及び６８Ｇａ−ＣＨ４０について１２日目に、イメージ取得を行った。腫瘍サイズが小さいため、４日目において種々の化合物の有意な蓄積は示されなかった（それぞれ図９Ａ及び図９Ｂ）しかしながら、イメージング画像はほとんどの動物で、１２日目において６８Ｇａ−ＣＨ４０と比較して６８Ｇａ−ＣＨ４４の有意な蓄積を示した（それぞれ図１０Ａ及び図１０Ｂ）。
【０１６７】
〔結論〕
実験では、１２日目において６８Ｇａ−ＣＨ４４による明確で選択的な膵臓がんのイメージング及び標識化を示した。
【０１６８】
＜実施例１１：膠芽腫の同所性マウスモデルにおける６８Ｇａ−ＣＨ４４及びそのスクランブル対照物６８Ｇａ−ＣＨ４０のＰＥＴイメージング＞
この実施例の目的は、膠芽腫をインプラントしたマウス（異種移植モデル）に静脈内投与した後のＬＤＬＲを標的とするコンジュゲート（68Ga-CH44）及びそのスクランブル対照物（68Ga-CH40）の体内分布をＰＥＴスキャンの使用から評価することであった。また、膠芽腫に対するいくつかの臨床的検討に使用されているインテグリン特異的マーカーである６８Ｇａ−ＲＧＤに対して２１日目に比較を行った。
【０１６９】
〔材料〕
［放射標識］
ＣＨ４４及びＣＨ４０は６８Ｇａ塩化物を使用して放射標識した。市販のＴｉＯ２系６８Ｇｅ／６８Ｇａジェネレータ（Obninsk）を使用して、ガリウムを６８Ｇａ３＋形態で得た。２００μＬの酢酸アンモニウムバッファ内（4M、pH6）において２５℃で１５分間、２０μｇのＣＨ４４及び４０μｇのＣＨ４０を７４〜１４８ＭＢｑ（２〜４mCi）の６８Ｇａと反応させることで、放射標識反応を行った。
【０１７０】
６８Ｇａ−ＣＨ４４及び６８Ｇａ−ＣＨ４０について得られた比放射能はそれぞれ１２．５Ｂｑ／ｍｍｏｌ及び５．５Ｂｑ／ｍｍｏｌであった。６８Ｇａ−ＲＧＤの比放射能は７．３５Ｂｑ／ｍｍｏｌであった。
【０１７１】
［腫瘍インプラント］
エクスマルセイユ倫理委員会（Comity 14）により承認されているプロトコルに従って動物の研究を行った。生後６週のＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの雄をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｉｎｃから取得した。マウスには、５μＬのＰＢＳ内のＵ８７ＭＧ細胞（5×105）を脳線条体（１ｍｍ前方、ブレグマに対して２ｍｍ外側、３ｍｍの深さ）にインプラントした。マウスを注射後の１４日目及び２１日目においてイメージング実験に使用し、予期される量はそれぞれ９ｍｍ３及び５３ｍｍ３であった。
【０１７２】
［投与経路、用量、及び実験設計］
動物に、８±４ＭＢｑの６８Ｇａ−ＣＨ４４及び６８Ｇａ−ＣＨ４０の用量で静脈内の単一ボーラスによってテスト物質を投与した。
【０１７３】
マウス（ｎ＝６）にＵ８７ＭＧ膠芽腫細胞をインプラントした。インプラント後の１４日目に、動物に６８Ｇａ−ＣＨ４４及び６８Ｇａ−ＣＨ４０をそれぞれ２４時間間隔で静脈内に投与した。インプラント後の２１日目に、動物に６８Ｇａ−ＣＨ４４、６８Ｇａ−ＣＨ４０、６８Ｇａ−ＲＧＤをそれぞれ２４時間及び７２時間間隔で静脈内に投与した。
【０１７４】
各投与後、膠芽腫がん及び他の組織の体内分布はＰＥＴイメージングを使用して評価した。
【０１７５】
［ＰＥＴスキャン］
ヌードマウスのマウス（ｎ＝６）に８±４ＭＢｑの６８Ｇａ−ＣＨ４４を静脈内投与し、ＰＥＴ／ＣＴスキャンを注射後（p.i.）１時間において得た。ＰＥＴ及びＰＥＴ／ＣＴ研究をマイクロＰＥＴ／マイクロＣＴげっ歯動物モデルスキャナー（nanoPET/CT,Mediso）で行った。麻酔を５％イソフルランで誘導し、１．５％で維持した。画質を向上させるために、静止ＰＥＴ放射スキャン毎に（エネルギーウィンドウ：400-600 keV、時間：１ＦＯＶにつき２０分）、マウスにつき２千万の同時計数イベントを得た。２様式のＰＥＴ／ＣＴでは、ＣＴイメージ（35kVp、350nsの露出時間、中ズーム）を得て、解剖学的な位置合わせと減弱補正とを対応するＰＥＴスキャンに適用した。最初の注射後６時間において、同じヌードマウスのグループに８±４ＭＢｑの６８Ｇａ−ＣＨ４０を投与し、ＰＥＴ／ＣＴスキャンを注射後（p.i.）１時間において得た。この一連の取得はコントロールグループをなすものであった。
【０１７６】
〔結果〕
［ＰＥＴイメージング］
６８Ｇａ−ＣＨ４４及び６８Ｇａ−ＣＨ４０について１４日目に、６８Ｇａ−ＣＨ４４、６８Ｇａ−ＣＨ４０、及び６８Ｇａ−ＲＧＤについて２１日目に、イメージ取得を行った。イメージング画像は、６匹のマウスのうち４匹において１４日目に６８Ｇａ−ＣＨ４４の信号を示し、１６日目における６８Ｇａ−ＣＨ４０では有意な信号を示さなかった（それぞれ図１１Ａ及び図１１Ｂ）。２１日目において、６匹のマウスすべては、６８Ｇａ−ＣＨ４０又は６８Ｇａ−ＲＧＤのいずれかの弱い信号よりも有意に強い６８Ｇａ−ＣＨ４４の大きい信号を示した（それぞれ図１１Ｃ、図１１Ｄ、図１１Ｅ）。イメージング信号を定量化するために、腫瘍／対照比の分析を行った。定量化は、６８Ｇａ−ＣＨ４４が６８Ｇａ−ＣＨ４０又は６８Ｇａ−ＲＧＤよりも有意に蓄積する（約４倍）ことを示す（図１２）。
【０１７７】
〔結論〕
実験では、２１日目において６８Ｇａ−ＣＨ４４による明確で選択的な膠芽腫がんのイメージング及び標識化を示した。
【０１７８】
＜実施例１２：副腎がんの皮下マウスモデルにおける６８Ｇａ−ＣＨ４４及び６８Ｇａ−ＭＧ０４のＰＥＴイメージング＞
この実施例の目的は、副腎がんの皮下モデルをインプラントしたマウス（異種移植モデル）に静脈内投与した後の、１つはＮＯＤＡＧＡケージを含み（68Ga-CH44）、１つはＤＯＴＡケージを含みスペーサー（Ｓ）を有しない（68Ga-MG04）ＬＤＬＲを標的とする２つのコンジュゲートの体内分布はＰＥＴスキャンを使用して評価及び比較することであった。
【０１７９】
〔材料〕
［放射標識］
ＣＨ４４及びＭＧ０４は６８Ｇａ塩化物を使用して放射標識した。市販のＴｉＯ２系６８Ｇｅ／６８Ｇａジェネレータ（Obninsk）を使用して、ガリウムを６８Ｇａ３＋形態で得た。２００μＬの酢酸アンモニウムバッファ内（4M、pH6）において２５℃で１５分間、２０μｇのＣＨ４４を６８Ｇａと反応させることで、放射標識反応を行った。２００μＬの酢酸アンモニウムバッファ内（pH4）において１００℃で１０分間、２０μｇのＭＧ０４を６８Ｇａと反応させることで、放射標識反応を行った。
【０１８０】
６８Ｇａ−ＣＨ４４及び６８Ｇａ−ＭＧ０４について得られた比放射能はそれぞれ３３１．３±１０．５ＭＢｑ／ｇ及び４４９．７±１４８．１ＭＢｑ／ｇであった。複合体形成能は、６８Ｇａ−ＭＧ０４で９１±１６．９％、６８Ｇａ−ＣＨ４４で９７±１．４％であった。
【０１８１】
［腫瘍インプラント］
クレルモン−オーベルニュ大学により承認されているプロトコルに従って動物の研究を行った。生後４週のＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの雄をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｉｎｃから取得した。５０％マトリゲル（Corning）を含有する１５０μＬの完全培地内のＮＣＩ−Ｈ２９５Ｒ細胞をマウスに頸部下部において皮下にインプラントした。腫瘍が２００〜４００ｍｍ３に含まれる量に達したときマウスをイメージング実験に使用した。
【０１８２】
［投与経路、用量、及び実験設計］
動物に、２１．６±３．６ＭＢｑの６８Ｇａ−ＣＨ４４又は１５０．８±４０．３μＬ量の６８Ｇａ−ＭＧ０４の用量で静脈内の単一ボーラスによってテスト物質を投与した。
【０１８３】
６匹のマウスにＮＣＩ−Ｈ２９５Ｒ副腎がん細胞をインプラントした。インプラント後の４８日目に、動物に６８Ｇａ−ＣＨ４４及び６８Ｇａ−ＭＧ０４をそれぞれ４８時間間隔で静脈内に投与した。各投与後、副腎がん異種移植及び他の組織の体内分布はＰＥＴイメージングを使用して評価した。
【０１８４】
［ＰＥＴスキャン］
ヌードマウスのグループ（ｎ＝２）に２１．６±３．６ＭＢｑの６８Ｇａ−ＣＨ４４を静脈内投与し、ＰＥＴ／ＣＴスキャンを注射後（p.i.）１時間において得た。マイクロＰＥＴげっ歯動物モデル（eXplore Vista, GEHealthcare）及びマイクロＣＴげっ歯動物モデル（eXplore CT120, GEHealthcare）でＰＥＴ及びＣＴ研究を行った。麻酔を５％イソフルランで誘導し、１．５％で維持した。画質を向上させるために、静止ＰＥＴ放射スキャン毎に（エネルギーウィンドウ：250-700 keV、時間：１ＦＯＶにつき５分）、マウスにつき２千万の同時計数イベントを得た。２様式のＰＥＴ／ＣＴでは、ＣＴイメージ（70kVp、32nsの露出時間、中ズーム）を得て、解剖学的な位置合わせと減弱補正とを対応するＰＥＴスキャンに適用した。６８Ｇａ−ＣＨ４４注射後４８時間において、同じヌードマウスのグループに２１．６±３．６ＭＢｑの６８Ｇａ−ＭＧ０４を投与し、ＰＥＴ／ＣＴスキャンを注射後（p.i.）１時間において得た。この一連の取得は第２グループをなすものであった。
【０１８５】
〔結果〕
［ＰＥＴイメージング］
６８Ｇａ−ＣＨ４４について４８日目に、イメージ取得を行った。４８時間後に６８Ｇａ−ＭＧ０４についてイメージ取得を行った。４８日目（図１３Ａ）及び５０日目（図１３Ｂ）において、イメージング画像は、６８Ｇａ−ＣＨ４４及び６８Ｇａ−ＭＧ０４の有意な蓄積を示した（薄灰色矢印＝腫瘍、濃灰色矢印＝腎臓）。さらに、６８Ｇａ−ＭＧ０４の腫瘍取り込みは６８Ｇａ−ＣＨ４４と比較して７３％高い。イメージは同じしきい値で示す（SUVmin=0; SUVmax=1）。ＳＵＶ（標準取込値（Standardized UptakeValue））は
【数１】
2020506921.tif 000007
であり、式中、ＭＢｑはメガベクレルであり、ｇ＝グラムである。
【０１８６】
〔結論〕
実験では、２つの分子６８Ｇａ−ＭＧ０４及び６８Ｇａ−ＣＨ４４による明確で選択的な副腎がんのイメージング及び標識化を示し、６８Ｇａ−ＭＧ０４の腫瘍取り込みの利点もある（73%）。
【図１】
2020506921.tif 000008
【図２】
2020506921.tif 000009
【図３】
2020506921.tif 000010
【図４】
2020506921.tif 000011
【図５】
2020506921.tif 000012
【図６Ａ】
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【図６Ｂ−Ｃ】
2020506921.tif 000014
【図７】
2020506921.tif 000015
【図８】
2020506921.tif 000016
【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
2020506921.tif 000020
【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
2020506921.tif 000029
【配列表】
2020506921000001.app
【国際調査報告】
2020506921.tif 000030
2020506921.tif 000031
2020506921.tif 000032