(57)【要約】  本明細書で記載されるのは、３Ｄマトリックス中で分岐ＬＢＯを培養すること、または免疫欠損マウスの腎被膜下へＬＢＯを移植することにより、哺乳動物、好ましくは、胚性幹細胞（ＥＳＣ）および誘導多能性幹細胞（ＩＰＳＣ）を含むヒトの多能性幹細胞から、少なくとも部分的にヒト肺発生を再現する、分岐気道および肺胞構造に発達する能力を有する肺芽オルガノイド（ＬＢＯ）を作製する新規方法である。分岐ＬＢＯは、肺間葉と適合性がある肺内胚葉および中胚葉を含み、分岐形態が形成される。線維性表現型を誘導する特定の変異を有するＬＢＯ、およびこれを作製する方法も記載される。変異（Ｂ）ＬＢＯは、肺線維症治療の可能性のある薬剤のスクリーニングに使用できる。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
３Ｄマトリックス中で哺乳動物多能性幹細胞から分岐肺芽オルガノイド（ＢＬＢＯ）を作製する方法であって、
ａ）前方前腸内胚葉細胞から折り畳み構造を有するｄ２０〜ｄ２５肺芽オルガノイド（ＬＢＯ）を選択するステップであって、前記前方前腸内胚葉細胞が、前記多能性幹細胞から産生されているステップ、ならびに
ｂ）前記ＬＢＯを３Ｄマトリックス内に埋め込み、前記ＬＢＯからの分岐ＬＢＯ（ＢＬＢＯ）の形成を可能とする条件下でおよびその条件が持続している時間の間に、分岐を誘導する培地の存在下で前記ＬＢＯを培養するステップ、ならびに
ｃ）必要に応じ、前記３Ｄマトリックス中の前記ＢＬＢＯを使用することまたは前記分岐ＬＢＯを単離するステップ
を含む、方法。
【請求項２】
前記多能性幹細胞が、胚性幹細胞または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＥＳＣが、ＲＵＥＳ２細胞株または任意の他の変異細胞株のものである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＥＳＣまたはｉＰＳＣが、肺疾患関連変異を有するように変異導入されている、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記ＥＳＣまたはｉＰＳＣが、ＨＰＳ１、ＨＰＳ２、ＨＰＳ４、ｈＴＥＲＴ、ｈＴＥＲＣ、ジスケリン、ＣＦＴＲ、ＤＫＣ１、ＳＦＰＴＢ、ＳＦＴＰＣ、ＳＦＴＰＡ１、ＳＦＴＰＡ２、ＭＵＣ５Ｂ、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ、ＳＭＯ遺伝子、もしくはＡＢＣＡ３の多型、またはこれらの内のいずれかの組み合わせの完全欠失またはその中に変位を有するように変異導入されている、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記３Ｄマトリックスが、マトリゲルである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記分岐培地が、ＣＨＩＲ９９０２１、ＦＧＦ７、ＢＭＰ４およびレチノイン酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記分岐培地が、ＦＧＦ１０をさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記折り畳み構造を有するＬＢＯが、ｉ）胚様体を形成する条件下で前記多能性幹細胞を培養するステップ；ｉｉ）前記胚様体を前方化培地中、ＬＢＯを形成する条件下で培養するステップ、およびｉｉｉ）腹側化培地中、折り畳み構造を有するＬＢＯを形成する条件下で前記ＬＢＯを培養するステップ、により作製される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ステップｂ）での培養が、２０〜２７０日にわたり行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ステップｂ）での培養が、少なくとも１００日間にわたり行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ステップｂ）での条件が、正常酸素圧インキュベーター中での培養を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記３Ｄマトリックスが、マトリゲルであり、前記ＬＢＯが、マトリゲルサンドイッチ中に埋め込まれる、請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
埋め込みが、（ｉ）容器中で第１の量のマトリゲルを固化して、固化マトリゲルの低位部を形成するステップ；（ｉｉ）折り畳み構造を有するＬＢＯおよびマトリゲルの混合物を前記低位部の上で固化して、固化中央部を形成するステップ；ならびに（ｉｉｉ）第２の量のマトリゲルを前記固化した中央部上で固化して、上部を形成するステップ、を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
哺乳動物多能性幹細胞から分岐肺芽オルガノイド（ＢＬＢＯ）を作製する方法であって、
ａ）前方前腸内胚葉細胞から折り畳み構造を有するｄ２０〜ｄ２５肺芽オルガノイド（ＬＢＯ）を選択するステップであって、前記前方前腸内胚葉細胞が、前記多能性幹細胞から産生されているステップ；
ｂ）前記折り畳み構造を有するＬＢＯを、免疫欠損マウスの腎被膜下に移植することにより、前記折り畳み構造を有するＬＢＯを異種移植するステップ、および
ｃ）前記異種移植ＬＢＯを前記マウス中、約３０日〜２７０日間にわたりインビボで培養し、異種移植ＢＬＢＯを得るステップ
を含む、方法。
【請求項１６】
ｄ）前記分岐気道および肺胞構造を有する異種移植ＬＢＯを単離するステップをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記多能性幹細胞が、胚性幹細胞またはｉＰＳＣである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１に記載の方法により作製された哺乳動物単離ＢＬＢＯ。
【請求項１９】
異種移植されているかまたはマトリゲル中に埋め込まれている、哺乳動物ＢＬＢＯ。
【請求項２０】
前記多能性細胞が、ＨＰＳ１、ＨＰＳ２、ＨＰＳ４、ＨＰＳ５、ＨＰＳ８、ＬＹＳＴ  ｈＴＥＲＴ、ｈＴＥＲＣ、ジスケリン、ＣＦＴＲ、ＤＫＣ１、ＳＦＰＴＢ、ＳＦＴＰＣ、ＳＦＴＰＡ１、ＳＦＴＰＡ２、ＭＵＣ５Ｂ、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ、ＳＭＯ遺伝子変異、もしくはＡＢＣＡ３遺伝子の多型、またはこれらの内のいずれかの組み合わせを有する、請求項１または１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＬＢＯまたはＢＬＢＯが、ＥＰＣＡＭ陰性間葉細胞の存在の増大、間葉細胞マーカーの発現の増大、および／または非変異導入したＬＢＯまたはＢＬＢＯと比較した細胞外マトリックス沈着の増大、からなる群より選択される１つまたは複数の線維症の特徴を発現する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項２０に記載の方法により作製された哺乳動物単離ＢＬＢＯ。
【請求項２３】
肺疾患を治療する薬剤の特定のための細胞ベースアッセイであって、対照および請求項２０に記載の１つまたは複数の変異ＬＢＯまたはＢＬＢＯ試験試料を用意すること；前記試験試料を試験薬剤と接触させること；前記対照および前記試験試料中の、（ａ）肺および気道上皮細胞マーカーの発現のレベル、（ｂ）細胞外マトリックス沈着のレベル、（ｃ）代謝のレベル、（ｄ）エンドソーム輸送のレベル、（ｅ）細胞ストレス応答のレベル、（ｆ）小胞体ストレス応答のレベル、（ｇ）マイトファジーのレベル、（ｈ）オートファジーのレベル、（ｉ）サーファクタント分泌のレベル、もしくは（ｊ）リサイクルのレベル、またはこれらの組み合わせのレベルを測定すること；ならびに前記試験試料中のいずれかの決定されたレベルが前記対照とは有意に異なる場合に、前記試験薬剤を選択することを含む、アッセイ。
【請求項２４】
変異ＬＢＯまたはＢＬＢＯの第２の対照試料をさらに含み、前記ＬＢＯまたはＢＬＢＯが、ＬＹＳＴ、ＨＰＳ３、ＨＰＳ５、またはＨＰＳ８変異を有する、請求項２３に記載のアッセイ。
【請求項２５】
前記多能性細胞が、サーファクタント分泌障害に関連する変異を有する、請求項１または１５に記載の方法。
【請求項２６】
前記サーファクタント分泌疾患に関連する変異が、ＳＦＴＰＡ、ＳＦＴＰＣ、ＳＦＴＰＢまたはＡＢＣＡ３変異である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
請求項２５または２６に記載の方法に従って作製された哺乳動物ＬＢＯまたはＢＬＢＯ。
【請求項２８】
前記ＢＬＢＯに、呼吸器疾患を引き起こすＲＳＶまたはその他のウイルス種を感染させることをさらに含む、請求項１または１５に記載の方法。
【請求項２９】
請求項２８に従って作製された哺乳動物ＢＬＢＯ。
【請求項３０】
肺疾患を治療する薬剤の特定のための細胞ベースアッセイであって、（ａ）１）間葉細胞の存在の増大；２）細胞外マトリックスの沈着の増大；３）上皮ストレスの増大；または４）異常なオルガノイド形態、を含む線維症の１つまたは複数の特徴を有する請求項２０に記載の変異ＬＢＯまたはＢＬＢＯの対照および試験試料を用意すること；（ｂ）前記試験試料を試験薬剤と接触させること；ｃ）前記試験薬剤との接触が、間葉細胞の存在の低減；細胞外マトリックスの沈着の低減；上皮ストレスの低減の証拠；または前記オルガノイド形態の完全または部分的正常化、の内の１つまたは複数をもたらすかどうかを判定すること、を含む、アッセイ。
【請求項３１】
前記ｉＰＳＣ細胞が、肺疾患遺伝子変異を有する対象由来であり、前記ｉＰＳＣ細胞が、前記遺伝子変異を訂正するように遺伝子改変されている、請求項２または１７に記載の方法。
【請求項３２】
前記ｉＰＳＣが、Ｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓシステムにより遺伝子改変されている、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
請求項３１に従って作製された哺乳動物ＬＢＯ。
【請求項３４】
ＣＨＩＲ９９０２１、ＦＧＦ７、ＢＭＰ４およびレチノイン酸を含む、分岐培地。
【請求項３５】
前記分岐培地が、ＦＧＦ１０をさらに含む、請求項３４に記載の分岐培地。
【請求項３６】
請求項２０に記載の方法により作製された細胞。
【請求項３７】
前記間葉細胞の存在の増大が、ＥＰＣＡＭ陰性間葉細胞の存在の増大を含む、請求項３０に記載のアッセイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年３月２４日出願の米国特許仮出願第６２／４７６，３３５号に対する優先権を主張する。この内容は、本明細書に組み込まれる。
【０００２】
政府の権利に関する記載
本発明は、米国国立衛生研究所により授与された認可番号第ＨＬ１３４７６０号に基づく政府の支援によりなされた。米国政府は本発明に対し一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
特発性肺線維症（ＩＰＦ）は、３〜４年の生存期間中央値を有する制御困難な間質性肺疾患であり、線維芽細胞巣ならびに肺胞のリモデリングおよび閉塞を特徴とする１、２。唯一の最も確実な治療は、肺移植であり、その介入は、ドナーの臓器の低い入手可能性および重篤な外科的、医学的、および免疫学的合併症により阻まれる３。したがって、革新的手法が緊急に必要である。このような手法の開発は、この大被害を及ぼす、蔓延しつつある疾患の病因に対する著しく欠けている洞察および薬物発見のプラットホームの確立が必要となる。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、添付図面により例示されるが、限定されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１Ａ−１Ｅ】肺芽オルガノイドの生成。（図１Ａ）ｄ６〜ｄ８のＡＦＥの腹側化の間に、浮遊培養（ｄ１０、ｄ２０）中で増殖され得る接着構造体の発生（プロトコル図６ｂ参照）。５０種を超える独立した実験（ＥＳＣおよびｉＰＳＣ）の代表例。スケールバー  ２５０μｍ。（図１Ｂ）ＬＢＯ生成中の細胞増殖。ＲＵＥＳ２  ＥＳＣ中のＮ＝３の独立した３回の繰り返し実験。（図１Ｃ）ｄ２５  ＬＢＯ中のＥＰＣＡＭ、ＫＲＴ８、ＮＫＸ２．１、ＦＯＸＡ１、およびＰ６３の発現。ＥＳＣおよびｉＰＳＣ中の１０種を超える独立した実験の代表例。スケールバー  １００μｍ。（図１Ｄ）ＥＣＡＤＨおよびＰＤＧＦＲＡのためのｄ２５  ＬＢＯの染色。ＲＵＥＳ２  ＥＳＣ中の独立した３種の実験の代表例。スケールバー  ２５０μｍ。（図１Ｅ）ＲＮＡｓｅｑにより決定されたｄ２５  ＬＢＯのＥＰＣＡＭ＋およびＥＰＣＡＭ−画分中の内胚葉および中胚葉マーカーの発現（３回の独立した生物学的反復実験、ＲＵＥＳ２  ＥＳＣ）。
【図２Ａ−２Ｇ】ＬＢＯのインビボ潜在能力。（図２Ａ）ＮＳＧマウスの腎被膜下へのマトリゲル中に埋め込まれた１０６個のＬＢＯ細胞の移植後、１．５ヶ月の増殖の巨視的観察。スケールバー  １ｃｍ。（図２Ｂ）移植の１．５ヶ月後のＬＢＯからの増殖のＨＥ染色。スケールバー  ５００μｍ。（図２Ｃ）移植の１．５ヶ月後のＬＢＯからの増殖時の示したマーカーの免疫蛍光。スケールバー  １００μｍ。（図２Ｄ）移植の５ヶ月後のＬＢＯからの増殖のＨＥ染色。スケールバー  ２５０μｍ。（図２Ｅ）移植の５ヶ月後のＬＢＯからの増殖時の示したマーカーの免疫蛍光。スケールバー  ２５０μｍ。（図２Ｆ）移植の５ヶ月後のＬＢＯからの増殖時の細管からの吸引物中の左側に標識したタンパク質に対するドットブロット。（図２Ｇ）移植の７ヶ月後のＬＢＯからの増殖時の示したマーカーのＨＥ染色および免疫蛍光。スケールバー  １００μｍ。全てのパネルでＲＵＥＳ２  ＥＳＣを使用した、４種の独立した実験の代表例。
【図３Ａ−３Ｂ】ｄ７０でのマトリゲル中のＬＢＯ分化。（図３Ａ）マトリゲル中に播種後、分岐構造体中のＬＢＯの発生の明視野像。ＲＵＥＳ２  ＥＳＣ。５０種を超える独立した実験の代表例。スケールバー  ５００μｍ。（図３Ｂ）ｄ２５でマトリゲル中で播種したｄ７０  ＲＵＥＳ２由来ＬＢＯ中の示したマーカーの免疫蛍光染色。独立した４種の実験の代表例。スケールバー  ２５０μｍ。
【図４Ａ−４Ｇ】インビトロでのＬＢＯの長期発生。（図４Ａ）ｄ２５でマトリゲル内に埋め込まれたｄ１７０  ＲＵＥＳ２  ＬＢＯの巨視的外観。５０種を超える独立した実験の代表例。スケールバー  ５ｍｍ。（図４Ｂ）ｄ２５でマトリゲルに埋め込んだｄ１７０  ＲＵＥＳ２およびＣ１２  ＬＢＯの明視野像。５０種を超える独立した実験の代表例。スケールバー  ５００μｍ。（図４Ｃ）ｄ２５でマトリゲル内に埋め込まれたｄ１７０  ＲＵＥＳ２  ＬＢＯの示したマーカーの免疫蛍光。独立した３種の実験の代表例。ＭＵＣ１＋ＳＦＴＰＢおよびＨＴ２−２８０のスケールバー  １００μｍ。ＳＦＴＰＣのスケールバー  １０μｍ。（図４Ｄ）ＲＵＥＳ２  ＥＳＣおよびＨＤＦ  ＳＶ  ｉＰＳＣ中のｄ２５でマトリゲル内に埋め込まれたｄ１７０  ＬＢＯの電子顕微鏡観察。矢印は、ＬＢを示す。独立した３種の実験の代表例。（図４Ｅ）ｄ２５でマトリゲル内に埋め込まれたＳＦＴＰＢ−ボディピー（緑）のｄ１７０  ＬＢＯへの取り込み。独立した４種の実験の代表例。スケールバー  １００μｍ。（図４Ｆ）ｄ２５でマトリゲル内に埋め込まれたｄ１７０  ＬＢＯへのＳＦＴＰＢ−ボディピーの取り込みの時間経過（平均±平均の標準誤差、ｎ＝４のＲＵＥＳ２  ＥＳＣ中の独立した実験）。（図４Ｇ）２番目の三半期ヒト肺との最良一致を示す、ＫｅｙＧｅｎｅｓデータベースを用いたｈＥＳＣおよびｈｉＰＳＣ由来ｄ１７０  ＬＢＯにおけるゲノムワイド発現の比較（１２種の生物学的に独立した試料）。
【図５Ａ−５Ｄ】ヒト疾患のモデリングにおけるＬＢＯの適用の可能性。（図５Ａ）ＲＳＶ感染の１日および２日後で、抗ＲＳＶ（全抗原）抗体を用いて染色後のホールマウントｄ１７０  ＬＢＯ共焦点像。矢印：内腔中の感染細胞。独立した３種の実験の代表例。スケールバー  １００μｍ。（図５Ｂ）ＲＵＥＳ２およびＲＵＥＳ２−ＨＰＳ１細胞からのｄ５０  ＬＢＯ由来マトリゲルコロニーの明視野像。独立した６種の実験の代表例。スケールバー  ５００μｍ。（図５Ｃ）ＲＵＥＳ２およびＲＵＥＳ２−ＨＰＳ１細胞の３Ｄマトリゲル培養物中のｄ５０  ＬＢＯ由来コロニー中のＥＰＣＡＭ＋およびＥＰＣＡＭ−細胞の比率（ｎ＝６、２種の実験の３回の技術的反復の平均±平均値の標準誤差；＊Ｐ＜０．０００１；両側スチューデントのｔ検定）。（図５Ｄ）ＲＵＥＳ２およびＲＵＥＳ２−ＨＰＳ１細胞の３Ｄマトリゲル培養での間充組織マーカーおよびＥＣＭ成分の免疫蛍光染色。独立した３種の実験の代表例。スケールバー  ５００μｍ。
【図６Ａ−６Ｅ】肺芽オルガノイドの特性評価。（図６Ａ）肺および気道上皮細胞の生成のための発表された２Ｄ分化プロトコル。（図６Ｂ）ＬＢＯ生成および分化のためのプロトコルの概略模式図。（図６Ｃ）ｄ２５  ＲＵＥＳ２  ＬＢＯから単離したＥＰＣＡＭ＋およびＥＰＣＡＭ−細胞からのＲＮＡｓｅｑデータ生成の管理されていないクラスタリング（３回の独立した生物学的反復実験）。（図６Ｄ）肺および気道中の、およびその他のｄ２５  ＬＢＯのＡＦＥ由来系統中の、ＡＦＥ中で発現した遺伝子のＳＨＨおよびその転写標的、ＧＬＩ１、ＰＴＣＨおよびＨＨＩＰの発現（図６（ｃ）で示したＲＮＡｓｅｑデータから抽出；ｎ＝３の独立したＲＵＥＳ２  ＥＳＣ中の実験）。（図６Ｅ）ｄ１５、ｄ２０およびｄ２５でのＬＢＯ中のＳＨＨのＩＳＨ。ＲＵＥＳ２  ＥＳＣ中の独立した３種の実験の代表例。スケールバー  ２５０μｍ。
【図７Ａ−７Ｅ】インビボでのＬＢＯの可能性。（図７Ａ）ＮＳＧマウスの腎被膜下移植の１．５ヶ月後のヒト核のＲＵＥＳ２  ＥＳＣ  ＬＢＯからの増殖の染色。スケールバー  ５００μｍ。（図７Ｂ）マウスＣＤ３１（ｍＣＤ３１）の移植の５ヶ月後のＬＢＯからの増殖の染色。スケールバー  ５０μｍ。（図７Ｃ）ＳＭＡおよびＥＰＣＡＭの移植の５ヶ月後のＬＢＯからの増殖の染色。スケールバー  ５００μｍ。（図７Ｄ）ＮＳＧマウスの腎被膜下移植の５ヶ月後の、繊毛性細胞を示すＬＢＯからの増殖のヘマトキシリン−エオシン染色。スケールバー  ２５μｍ。（図７Ｅ）ＮＳＧマウスの腎被膜下移植の５ヶ月後の粘膜下腺を示すＬＢＯからの増殖のヘマトキシリン−エオシン染色。スケールバー  １００μｍ。全てのパネルでＲＵＥＳ２  ＥＳＣを使用した、４種の独立した実験の代表例。
【図８Ａ−８Ｅ】ｉＰＳおよびＥＳ  ＬＢＯ中の分岐および分岐に対する中胚葉の必要性。（図８Ａ）ＲＵＥＳ２由来ＬＢＯのｄ７０培養物中の分岐コロニーおよびＣＨＩＲ９９０２１、ＢＭＰ４、ＦＧＦ７、ＦＧＦ１０、およびＲＡの存在下、ｄ２５でマトリゲル３Ｄ培養物中に播種した３種の異なるｉＰＳ株。１０種を超える独立した実験の代表例。スケールバー１００μｍ。（図８Ｂ）６．４ｍｍウェル当たり、１ＬＢＯ（上段）または４ＬＢＯ（下段）でマトリゲル中にＲＵＥＳ２  ＬＢＯを播種の９０日後の分岐コロニー。スケールバー  ２．５ｍｍ。全ての画像は、１０種を超える独立した実験の代表例である。（図８Ｃ）ＬＢＯ中のＥＰＣＡＭ−細胞の比率（ＲＵＥＳ２  ＥＳＣ中のｎ＝３の独立した実験）。（図８Ｄ）ＬＢＯの単細胞由来の、ＬＢＯから単離したＥＰＣＡＭ＋およびＥＰＣＡＭ−細胞由来のコロニー。５種の実験の代表例。スケールバー  ５００μｍ。（図８Ｅ）マトリゲル３Ｄ培養物中のＬＢＯ由来の単細胞から生成したコロニーのＩＦ。５種の実験の代表例。スケールバー  ＳＦＴＰＢおよびＳＦＴＰＣに対し、５００μｍ、２５μＭ。
【図９Ａ−９Ｅ】ｄ１７０でのマトリゲル中のＬＢＯ成熟。（図９Ａ）ｄ２５でＣＨＩＲ９９０２１、ＢＭＰ４、ＦＧＦ７、ＦＧＦ１０、およびＲＡの存在下、ｄ２５でマトリゲル中に播種した３種のｉＰＳ株由来のＬＢＯのｄ１７０培養物の形態。１０種を超える独立した実験の代表例。スケールバー  ２５０μｍ。（図９Ｂ）表示したマーカーの低倍率の免疫蛍光像（タイルスキャン）。ＣＨＩＲ９９０２１、ＢＭＰ４、ＦＧＦ７、ＦＧＦ１０、およびＲＡの存在下、ｄ２５でマトリゲル中に播種したＣ１２  ｉＰＳ株由来のＬＢＯのｄ１７０培養物の連続切片に対し染色を実施した。独立した４種の実験の代表例。スケールバー  １ｍｍ。（図９Ｃ）ＨＤＦ  ｍＲＮＡ  ｉＰＳＣ中のｄ２５でマトリゲル内に埋め込まれたｄ１７０  ＬＢＯの電子顕微鏡観察。矢印は、ＬＢを示す。独立した３種の実験の代表例。スケールバー  １μｍ。（図９Ｄ）１４週目の遠位ヒト胎児肺（ＨＦＬ）のヘマトキシリン−エオシン染色（左）およびＳＯＸ２およびＳＯＸ９の発現。ＳＯＸ２およびＳＯＸ９（矢印）を同時発現する管に留意されたい。独立した３種の実験の代表例。スケールバー  ２５０μｍ。（図９Ｅ）ＫｅｙＧｅｎｅｓデータベースからの２番目の三半期のヒト臓器および組織のゲノムワイド発現プロファイルを有する、ｄ１７０  ＬＢＯ中のゲノムワイド発現プロファイルの階層型クラスタリング。
【図１０Ａ−１０Ｊ】肺線維症のモデリング。（図１０Ａ）ＨＰＳ１遺伝子、およびｇＲＮＡに相補的な配列の位置の略図（上段）。ｇＲＮＡにより標的とされる領域中の、ＲＵＥＳ２中の野生型アレルおよびＲＵＥＳ２−ＨＰＳ１細胞中の両方の標的化アレルのヌクレオチド配列（中段）。ＲＵＥＳ２−ＨＰＳ１細胞の標的化アレル中の欠失および未成熟停止コドンを示すＨＰＳ１のエキソン１５および１６のヌクレオチドおよびアミノ酸配列（下段）。（図１０Ｂ）ＲＵＥＳ２およびＲＵＥＳ２−ＨＰＳ１細胞の３Ｄマトリゲル培養物中のｄ５０  ＬＢＯ由来コロニー中のＥＰＣＡＭ＋およびＥＰＣＡＭ−細胞のフローサイトメトリー分析の代表例（２種の実験からの３回の技術的反復のｎ＝６、平均±平均の標準誤差；＊Ｐ＜０．０００１；両側スチューデントのｔ検定）。（図１０Ｃ）親ＲＵＥＳ２細胞およびＲＵＥＳ２−ＨＰＳ１細胞から生成された３Ｄマトリゲル培養物中のＬＢＯ由来分岐コロニーのＥＰＣＡＭおよびＰＤＧＦＲＡの免疫蛍光染色のタイルスキャン像。独立した５種の実験の代表例。スケールバー  １ｍｍ。（図１０Ｄ）親ＲＵＥＳ２および変異体ＲＵＥＳ２−ＨＰＳ１細胞由来のｄ４０  ＬＢＯのＥＰＣＡＭ＋およびＥＰＣＡＭ−細胞中の増殖抗原Ｋｉ６７の発現の代表例。３つの独立した実験の代表例。（図１０Ｅ）ＲＵＥＳ２およびＲＵＥＳ２−ＨＰＳ１細胞の３Ｄマトリゲル培養物中のＬＢＯ由来コロニー中のヒドロキシプロリン含量（ｎ＝３の独立した実験の平均±平均値の標準誤差；＊Ｐ＜０．０５；両側スチューデントのｔ検定）。（図１０Ｆ）免疫蛍光法を用いた、ＤＡＰＩに対する、ＲＵＥＳ２およびＲＵＥＳ２−ＨＰＳ１細胞の３Ｄマトリゲル培養物中のコラーゲンＩおよびＩＩＩならびにフィブロネクチンの定量化（平均±平均値の標準誤差、ｎ＝３の独立した実験；＊フィブロネクチンに対してＰ＜０．０５、コラーゲンに対して＊Ｐ＜０．０１；各実験でＲＵＥＳ２対照を１に正規化後、両側スチューデントのｔ検定）。（図１０Ｇ）図６Ｂで示すプロトコルのｄ４またはｄ１０でＺｓＧｒｅｅｎ＋およびｍＣｈｅｒｒｙ＋  ＲＵＥＳ２由来細胞を混合後、ｄ２５での浮遊培養物のＬＢＯ。５種を超える独立した実験の代表例。（図１０Ｈ）培養プロトコルのｄ４またはｄ１０で細胞を混合後、ｄ４０培養物中の親ＲＵＥＳ２または変異体ＲＵＥＳ２−ＨＰＳ１細胞由来のＥＰＣＡＭ−細胞の比率（平均±平均値の標準誤差、ｎ＝３の独立した実験；＊親ＲＵＥＳ２と、およびｄ１０でＲＵＥＳ２−ＨＰＳ１と混合した親ＲＵＥＳ２と比較して、Ｐ＜０．０１；一元配置分散分析）。図１０Ｉは、変異上皮細胞を示す写真であり、図１０Ｊは、ＨＳＰ１細胞がより高いパーセンテージのＥＰＣＡＭ−細胞を有したことを示すグラフである。
【図１１】肺の発生。呼吸器系は、前方前腸内胚葉（ＡＦＥ）の腹側に生ずる芽が起源である。これらは、型通りの分岐プロセスを通して近位気道および遠位肺胞前駆細胞に発達する（偽腺状期）。管状期中に、細胞周期活動が低下し、茎部気道上皮の分化が起こり、基底細胞、杯細胞、クラブ細胞、繊毛細胞、およびその他の細胞型が出現する（図１１）。この段階に続いて、嚢状期があり、ここでは、細管が広がって小嚢を形成し、原始肺胞を生ずることになる９５〜９７。未成熟小嚢のさらなる分化、肺胞の成熟および二次的隔壁形成による肺胞数の増大は、主に出生後に継続される９８。
【図１２】ｄ２０でのＬＢＯの形態。左パネルは、折り畳み構造を有するオルガノイドを示し、これは、マトリゲル中で分岐構造を生成するより高い可能性を有する。右パネルは、ｄ４のかなり少ない細胞数で開始される準最適なオルガノイド（矢印）を示し、これは、マトリゲル中で分岐構造を生成する可能性はより低い。ＲＵＥＳ２、ＥＳＣのｄ２０でのオルガノイドの代表的画像。スケールバー：５００μｍ。
【図１３Ａ−１３Ｃ】ＡＰ３Ｂ１の標的化変異。図１３Ａは、Ｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓシステムを用いて変異導入した標的ＡＰ３Ｂ１（エキソン４）配列を示す。配列の最後のより黒っぽい灰色のボックスは、ジェノタイピングプライマー配列を表し、配列内の中間の灰色配列は、ｇＲＮＡ配列を表す。図１３Ｂは、得られた選択ＨＰＳ２クローンの変異配列を示す。図１３Ｃは、変異クローンがもはやＨＰＳ２を産生しないことを示すウェスタンブロットである。
【図１４Ａ−１４Ｃ】ＢＬＯＣ１Ｓ３の標的化変異。図１４Ａは、Ｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓシステムを用いて変異導入した標的ＢＬＯＣ１Ｓ３（エキソン２）配列を示す。配列の最後のより黒っぽい灰色のボックスは、ジェノタイピングプライマー配列を表し、配列内の中間の灰色配列は、ｇＲＮＡ配列を表す。図１４Ｂは、得られた選択ＨＰＳ８クローンの変異配列を示す。図１４Ｃは、変異クローンがもはやＨＰＳ８を産生しないことを示すウェスタンブロットである。
【図１５】Ｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓシステムを用いて変異導入した標的ＳＦＴＰＣ（エキソン２）配列を示す。配列の最後のより黒っぽい灰色のボックスは、ジェノタイピングプライマー配列を表し、配列内の中間の灰色配列は、ｇＲＮＡ配列を表す。
【図１６Ａ−１６Ｂ】ＴＥＲＣの標的化変異。図１６Ａは、Ｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓシステムを用いて変異導入した標的ＴＥＲＣ（エキソン１）配列を示す。配列の最後のより黒っぽい灰色のボックスは、ジェノタイピングプライマー配列を表し、配列内の中間の灰色配列は、ｇＲＮＡ配列を表す。囲み配列は、テロメアテンプレート配列を表す。図１６Ｂは、得られた選択ＴＥＲＣクローンの変異配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
我々は、これまでに、３Ｄマトリックス中でＬＢＯを培養すること（ＬＢＯ−３Ｄ）、または免疫欠損マウスの腎被膜下などへＬＢＯ異種移植すること（ＬＢＯ−ｘｅｎｏ）により、哺乳動物、好ましくは、胚性幹細胞（ＥＳＣ）および誘導多能性幹細胞（ＩＰＳＣ）を含むヒトの多能性幹細胞から、少なくとも部分的にヒト肺発生を再現する、分岐気道および肺胞構造に発達する能力を有する肺芽オルガノイド（ＬＢＯ）を作製する新規方法を開発した。分岐ＬＢＯ（ＢＬＢＯ）は、肺間葉と適合性がある肺内胚葉および中胚葉を含み、分岐形態が形成される。それらは、主に遠位肺、すなわち、肺胞上皮細胞を含む肺胞構造と適合性がある構造に発達するが、いくつかのより近位の、すなわち、気道細胞も同様に含む。３Ｄ培養により作製される分岐ＬＢＯは、ＢＬＢＯ−３Ｄと呼ばれることもあり、異種移植によりインビボで作製されたものは、ＢＬＢＯ−ＸＥＮＯとも呼ばれる。
【０００７】
結果で示され、実施例で説明されるように、ＬＢＯの発生は、基本的には次の３つの段階で起こる：
段階１：インビトロで生成された前方前腸細胞浮遊培養で、折り畳まれた上皮を有する球状構造体であるＬＢＯを形成する（ｄ２５まで）。
段階２：凡そｄ２５で開始される３Ｄマトリゲル培養では、非分岐鎖ＬＢＯスフェアが１週間以内に分岐を始める。免疫欠損マウスの腎被膜下異種移植後、分岐は長時間を要し、移植後約２ヶ月間観察される。
段階３：最後に、異種移植または３Ｄマトリゲル培養として長期間培養される場合、ＢＬＢＯは、肺胞構造の形態を有する拡張された先端部を示し始める。
【０００８】
ＬＢＯの培養時間（３Ｄまたは異種移植の）が長いほど、分岐形態形成がより多くなる。ＢＬＢＯ−３Ｄ培養物は、１８０日にもわたり増殖され、ＢＬＢＯ−ｘｅｎｏは、７ヶ月まで追跡が行われた。ＢＬＢＯが長く増殖されるほど、より多くの成熟した肺胞細胞が存在し、オルガノイドはより大きくなるが、ＨＰＳ１細胞（ＬＢＯ−ＨＰＳ１ＤＥＬ）中では、ｄ４０で線維症表現型が既に明らかである。
【０００９】
ＢＬＢＯ−３ＤまたはＢＬＢＯ−ｘｅｎｏのいずれが使用される場合でも、薬物スクリーニングは通常、ＢＬＢＯ−３Ｄを用いてインビトロにより、およびそれに続けてＢＬＢＯ−ｘｅｎｏを用いてインビボ検証により実施される。
【００１０】
定義
本明細書で使用される場合、用語の「ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）」は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）および誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含み得るヒト多能性幹細胞を意味する。胚盤胞の内側細胞集団に由来するＥＳＣは、多能性状態でインビトロで維持でき、生物中で全ての細胞型を生成する潜在能力を有する５。ｉＰＳＣは、体細胞をＥＳＣに類似の多能性状態にリプログラミングすることにより生成され、したがって、患者特異的である。特定の実施例では、胚性幹細胞またはｉＰＳ細胞は、未分化多能性幹細胞であり、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、およびＳＳＥＡ４を発現している。
【００１１】
本明細書で使用される場合、「前方前腸内胚葉」（ＡＦＥ）は、肝臓を生じさせる内胚葉の前側にある内胚葉を意味する。したがって、当業者なら、「前方前腸内胚葉」は、例えば、咽頭内胚葉または肺内胚葉などのより高度に分化した内胚葉細胞集団を含むことを容易に理解するであろう。胚組織は、一連の特徴的な分子マーカーを発現する。用語の「前方前腸内胚葉」により包含される種々の細胞型は、分子マーカーの種々の発現パターンを示し得る。当業者なら、「前方前腸内胚葉」が種々の組織、例えば、扁桃腺、鼓膜、甲状腺、副甲状腺、胸腺、気管、食道、胃、肺および喉頭／咽頭などを生ずることを理解するであろう。前方前腸内胚葉は、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ１、ＳＯＸ２およびＥＰＣＡＭを発現するが、遠位内胚葉マーカーＣＤＸ２に対しては陰性である。
【００１２】
本明細書で使用される場合、胚体内胚葉（ＤＥ）は、腸管、肝臓、膵臓、胃および上記のＡＦＥ由来の全てのその他の臓器を生ずる原腸形成後に生ずる３つの胚葉の１つである。ＤＥは、マーカー：ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ１、ｃＫＩＴ、ＣＸＣＲ４、ＥＰＣＡＭを発現する。
【００１３】
肺芽オルガノイド（ＬＢＯ）は、ヒト多能性幹細胞から浮遊状態で誘導され、肺上皮細胞（ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ１、ＮＫＸ２．１およびＥＰＣＡＭを発現している）および間葉系前駆細胞（ＰＤＧＦＲａ、ＣＤ９０、ＴＢＸ４、ＨＯＸＡ５を発現している）を含む。
肺芽オルガノイドは、マトリゲルに埋め込まれた後で分岐コロニーを生成する。インビトロ浮遊培養で前方前腸細胞から生成した場合、ＬＢＯは通常、球状である。ＬＢＯは通常、ｄ２０〜ｄ２５に形成され、オルガノイド内に折り畳み構造を含む（図１２参照）。
【００１４】
本明細書で使用される場合、用語の「分岐ＬＢＯ」（ＢＬＢＯ）は、分岐形態形成に関連する構造を有するＬＢＯを意味する。ＢＬＢＯがさらに発達すると、拡張された先端部を示し、これは、胎生期の肺胞構造の形態を有する。
【００１５】
本明細書で使用される場合、用語の「マトリゲルサンドイッチ」は、ＬＢＯのＢＬＢＯへの３次元増殖を可能とするマトリゲルおよびＬＢＯの配置を意味する。特定の一例では、この配置は、固化マトリゲルの底部分、混合マトリゲル／ＬＢＯ中間部分および固化マトリゲルの上部を含み、そのためにサンドイッチ構造に似ている。
【００１６】
本発明の実施形態
特定の実施形態は、新規に発見した、肺分岐形態形成の特徴を有する肺芽オルガノイド（ＬＢＯ）に関する。本明細書で開示のＬＢＯは、胚性幹（ＥＳ）細胞または誘導多能性細胞（ｉＰＳＣ）などの多能性細胞から発生し、一連の異なる培養ステップに供されて、多能性細胞の胚体内胚葉（ＤＥ）、前方前腸上皮（ＡＦＥ）細胞、その後、最終的に、折り畳み構造を有するＬＢＯ（ＬＢＯｆ）への分化が行われる。ＬＢＯｆ（浮遊培養中の約２０〜２５日まで）は、出芽上皮構造の先端にソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）を発現するが、分岐構造を欠いている。ＬＢＯｆはその後、異種移植されるか、または３Ｄマトリゲル内に埋め込まれる。ＢＬＢＯ−３Ｄは、ＬＧＯ−３Ｄではインビトロでこれまで観察されなかったＩ型肺胞上皮細胞および神経上皮小体を含む分岐気道および初期肺胞構造を示すＢＬＢＯ−異種移植で観察される分岐より形態学的に進行度合いが少ない上述したような分岐構造を有する。３Ｄおよび異種移植の両方のＢＬＢＯは、中胚葉および肺内胚葉を含む。他の実施形態は、これらのＬＢＯの作製方法に関する。
【００１７】
他の実施形態は、ＬＢＯおよびＢＬＢＯの作製方法および、例えば、線維症の原因であることが知られているＨＰＳ１、ＨＰＳ２、ＳＦＴＰＣおよびＴＥＲＣなどの変異を有するＬＢＯまたはＢＬＢＯを用いてモデル化された線維症を治療できる試験薬剤のスクリーニング方法に関する。ＨＰＳ３、５、８およびＬＹＳＴの変異を有する細胞株は、リソソーム関連オルガネラに作用するが、臨床的線維症に関連しないので、これらの株を対照として使用できる。
【００１８】
肺疾患関連遺伝子変異を生成または訂正するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの使用。
クラスター化され、規則的に間隔があいた短い回文構造の繰り返し（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｅｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔ）の略語として本明細書で使用される場合、用語の「ＣＲＩＳＰＲ」は、病原体防御で使用される細菌ゲノム中の領域である。本明細書で使用される場合、用語の「Ｃａｓ」は、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質の略後を意味する；Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムの活性酵素である。本明細書で使用される場合、用語の「ｇＲＮＡ」は、ガイドＲＮＡを意味し、これは、標的化特異性およびＣａｓ９ヌクレアーゼの足場／結合能力の両方を提供する。本明細書で使用される場合、用語の「ｇＲＮＡ」は、標的化ゲノムＤＮＡ中のＰＡＭ配列の前にある２０個のヌクレオチドを意味する。本明細書で使用される場合、用語の「ＰＡＭ」は、フォトスペーサー隣接モチーフ（Ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ  Ａｄｊａｃｅｎｔ  Ｍｏｔｉｆ）を意味し、これは、ｇＲＮＡ配列の直ぐ後に続くことが必要な配列である。したがって、本明細書で使用される場合、用語の「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム」は、遺伝子を編集するために、ｇＲＮＡによりｇＲＮＡ配列に向けられるＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ、Ｃａｓの使用を含むシステムを意味する。遺伝的に訂正または変異導入された細胞株はその後、本明細書で記載の技術に従って、ＬＢＯに成長する。
【００１９】
ＢＬＢＯはまた、ＨＰＳ１遺伝子の欠失を有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いて作製された変異により遺伝子改変された肺ＲＵＥＳ２幹細胞（以後、「ＲＵＥＳ２−ＨＰＳ１ＤＥＬ」細胞）（図１０）から生成されており、これは、細胞を高浸透度でＩＰＦに罹患しやすくし２２、４４、したがって、ｈＰＳＣ中で線維症のインビトロ反復発生を可能とする。ゲノム編集ＥＳＣの使用により、通常、ｉＰＳＣに関連する不完全なリプログラミングおよび背後に存在する遺伝的変異の問題が回避された４５。異常な形態を有する変異ＬＢＯ型は、ＨＰＳ１変異を有する、線維症の対象で見られるような線維化表現型を示す。
【００２０】
線維症、サーファクタント分泌疾患、例えば、ＡＢＣＡ３変異、または嚢胞性線維症を含む肺疾患を研究するために他の変異細胞株が作製された。ＨＰＳ２、ＨＰＳ３、ＨＰＳ５、ＨＰＳ８およびテロメラーゼ変異多能性細胞を有する細胞株は、以下で記載される。これらの細胞株から増殖されたＬＢＯはまた、本発明の実施形態である。
【００２１】
ＨＰＳ１（ＯＭＩＭ＃６０４９８２）：ＨＰＳ１は、ＢＬＯＣ３の一部であり、この変異は、ＰＦに対し最も浸透性が高い（現時点で８０％）２１。複数の変異が記載されており、それらの全てがＢＬＯＣ３を除去する。コドン３２１〜３２２の位置に、フレームシフトホットスポットが存在する１４３〜１４４。我々は、既にこの領域の標的化に成功しており、この株を使って、線維症がインビトロで誘発できることを実証した。
【００２２】
ＨＰＳ２（ＯＭＩＭ＃６０８２３３）：ＨＰＳ２変異はＡＰ３複合体を不安定化し、また、線維症にかかりやすくする。ＡＰ３Ｂ１中の複数の欠失およびフレームシフトは、ナンセンス変異によるｍＲＮＡ分解を生じさせ、したがって、全体タンパク質およびＡＰ３複合体を除去する５９、１４５ので、我々は、５’領域中に欠失を導入した。光学顕微鏡観察により、ＨＰＳ２変異ＬＢＯ−３Ｄ培養物は、予測結果を模倣する線維症に見える。
【００２３】
ＨＰＳ８（ＯＭＩＭ＃６１４０７７）：ＢＬＯＣ１複合体の一部のＢＬＯＣ１Ｓ３の変異は、ＩＰＦに関連しないＨＰＳの形成を生じ、対照として機能する。記載される初期変異は、ナンセンス変異によるｍＲＮＡ分解が観察されなかったときに、異常な２４４ａａタンパク質を理論的に生ずる１ｂｐフレームシフト欠失である１４６。しかし、別のヒト変異は、ナンセンス変異によるｍＲＮＡ分解を示し、ｍＲＮＡは検出不能であった１４７。したがって、フレームシフト変異のために、５’領域を標的とすることによる遺伝子の欠失が実施された。光学顕微鏡検査により、ＬＢＯ−３Ｄオルガノイドは、拡張された分岐先端部を発生しているように見え、これは、異常なサーファクタント分泌を想起させ得る。全てのＨＰＳ遺伝子は、ＩＩ型肺胞上皮細胞の層状体を含むリソソーム関連オルガネラの生合成に関与し、ＨＰＳ８は、インビトロサーファクタント分泌表現型を有し得る。
【００２４】
テロメラーゼ（ＯＭＩＭ＃６１４７４２）：テロメラーゼ成分中の変異は、細胞がリプログラミングされた患者の臨床的表現型と相関する、ｉＰＳ細胞中のテロメアの短縮を引き起こす１５１、１５２。重要なのは、他のテロメアの短縮は、ｈＰＳＣでは起こるようには見えないことである１５１。ＩＰＦは、最もよくあるテロメラーゼ遺伝子の変異の臨床症状であるため１３３、テロメラーゼ変異のｈＥＳＣへの導入は、テロメア病のＡＴＩＩ細胞機能に対する影響を研究するための有効な戦略である。ｈＴＥＲＴおよびｈＴＥＲＣの両方における広範な変異は、臨床的識別不能で、主要な臨床症状の決定因子は実際のテロメア長さである、短テロメア症候群に関連する１３３。我々は、ｈＴＥＲＣのＮ末端領域中にヘテロ接合およびダブルヘテロ接合インデルを導入した。テロメアＦＩＳＨにより連続的継代に対するテロメアの長さを検証した。初期および顕著なテロメアの短縮を示す後期継代（＞１５）由来の細胞１５２を使用した。ＴＥＲＣ欠失株を作製した。光学顕微鏡検査で線維症に見える非常に小さい形態のＬＢＯは予測通りであった。
【００２５】
次の株もまた、本明細書の教示に従って開発した。
ＨＰＳ５（ＯＭＩＭ＃６０７５２１）。ＨＰＳ５は、間質性肺疾患と関連しておらず、対照として機能し、ＨＰＳ３と同様に、ＢＬＯＣ２複合体のタンパク質をコードする。ヒトで既知の唯一の変異は、コドンｌｅｕ６７５〜ｖａｌ６７６の位置のホモ接合４−ｂｐ欠失（ＡＧＴＴ）である。変異は、コドン６８２の位置のナンセンスポリペプチドの短縮によるフレームシフトをもたらし、Ｃ末端の４０％のタンパク質の減少を生じた。
【００２６】
ＨＰＳ３（ＯＭＩＭ＃０６０１１８）：ＨＰＳ３は、間質性肺疾患と関連せず、対照として機能する。ＨＰＳ３は、特に、ＨＰＳ３遺伝子の大きな欠失により生じ、これは、ＢＬＯＣ２複合体の一部である５７。対応するｍＲＮＡおよびＢＬＯＣ２複合体が存在しないので５７、５’領域の完全削除が行われた。
【００２７】
ＬＹＳＴ：（ＯＭＩＭ＃６０６８９７）：白血球およびメラノサイト中に確証された巨大顆粒を有する重度小児期発症ＣＨＳを生ずる複数フレームシフト変異が記載された６４、１４８〜１５０。我々は、Ｌｙｓ６３３／Ｌｙｓ６３４の位置にインデルを形成し、これは、未成熟停止コドン６３８を生じる。
【００２８】
ＳＦＴＰＣ（ＯＭＩＭ＃１７８６２０）：我々は、ガイドＲＮＡおよび点変異を含む相同単鎖８０ｂｐ  ＤＮＡセグメントを用いて、エキソン５のヌクレオチド１２８にヘテロ接合Ｔ−＞Ａ塩基転換を導入する。このヘテロ接合変異は、オランダ人ファミリーで高度に浸透性ＩＰＦを生じた１１。ＳＦＴＰＣの場合は、より挑戦的でより効果が少ないが、タンパク質の非存在ではなく、異常に折り畳まれたタンパク質により生ずるタンパク質毒性が疾患の原因なので、患者で観察される特異的変異を導入することが不可欠である４、５、６７。
【００２９】
逆に、遺伝子変異関連肺疾患を有する患者由来の、上述したＣ１２株などのｉＰＳＣは、Ｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓシステムを用いてインビトロで訂正して、遺伝的に訂正された細胞株を産生できる。遺伝的欠陥を訂正するという意図した目的のために遺伝子改変された細胞を用いたＬＢＯの産生は、疾患表現型を訂正するそれらの能力に関して、このような遺伝的変化を試験する有効な方法を提供する。
【００３０】
本明細書で使用される場合、用語の「変異関連肺疾患」は、肺疾患表現型をもたらすことが既知の遺伝子変異または多型に関連する。例えば、特定の肺疾患は、次の非包括的遺伝子リスト中の遺伝子変異が原因である：ＨＰＳ１、２、４、ｈＴＥＲＴ、ｈＴＥＲＣ、ジスケリン（ｄｙｓｋｅｒｉｎ）、ＣＦＴＲ、ＤＫＣ１、ＳＦＰＴＢ、ＳＦＴＰＣ、ＳＦＴＰＡ１、ＳＦＴＰＡ２、ＭＵＣ５Ｂ、ＳＨＨ、ＰＴＣＨ、ＳＭＯ、ＡＢＣＡ３。これらの遺伝子に対する遺伝子ＩＤ番号は、以下に提供される：
【表１】
2020511968.tif 000003
さらに、嚢胞性線維症は、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）遺伝子および多型関連ナトリウムチャネル上皮１アルファ（ＳＣＮＮ１Ａ）遺伝子の遺伝子変異に関連し、このような変異／多型は、大きく変化する。このような遺伝子の発現タンパク質に関連して、変異は、ＣＦＴＲタンパク質中のＦ５０８、ＣＦＴＲタンパク質中のＧ５５１、ＣＦＴＲタンパク質中のＧ５４２、ＣＦＴＲタンパク質中のＮ１３０３、ＣＦＴＲタンパク質中のＲ１１７、ＣＦＴＲタンパク質中のＷ１２８２、ＣＦＴＲタンパク質中のＲ５５３、ＣＦＴＲタンパク質中のｃ．３８４９＋１０ｋｂ、ＣＦＴＲタンパク質中のｃ．２６５７＋５、ＣＦＴＲタンパク質中のｃ．３１４０−２６、およびＳＣＮＮ１Ａタンパク質中のＶ１１４を含む。さらに、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎｔｏ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｌｕｎｇ  Ａｌｖｅｏｌａｒ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓと題する、Ａｎｊａｌｉ  Ｊａｃｏｂらによる刊行物のＣｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ２１，１−１７  ，Ｏｃｔｏｂｅｒ  ５，２０１７では、このようなＣｒｉｓｐｒ／ｃａｓシステムを用いて、ホモ接合サーファクタント変異（ＳＦＴＰＢ１２１ｉｎｓ２）を訂正して、肺胞上皮２型細胞中のサーファクタント処理を回復している。Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ａｉｒｗａｙ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ  ｆｒｏｍ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ｖｉａ  Ｔｅｍｐｏｒａｌ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｗｎｔ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇと題する、Ｋａｔｈｅｒｉｎｅ  Ｂ．ＭｃＣａｕｌｅｙらによる別の刊行物の、２０１７、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ２０，８４４−８５７では、ＣＲＩＳＰＲを、フォルスコリン誘導膨潤における欠陥を訂正するために使用して、化合物ヘテロ接合ＣＦＴＲ遺伝子型ＤＦ５０８／ＤＦ５０８に関連する疾患変異を訂正するように遺伝子編集することにより、この障害が救済される。
【００３１】
限定されないが、上記に記載のものを含む変異遺伝子を有する細胞は、当該技術分野において既知の技術（例えば、米国特許出願公開第２０１７００２２５０７号を参照）および本明細書で記載の技術に従ってＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに供することができる。通常、細胞は、多能性段階などの成長および増殖段階でＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ誘導遺伝子訂正に供せられる。これらの細胞は、その後、本明細書で教示したように、ＬＢＯに発達し、表現型の変化および／またはバイオマーカー発現が観察される。
【００３２】
概要
ＩＰＦおよび家族性ＰＦにおけるＩＩ型肺胞上皮細胞の中心的役割。
肺線維症は、肺中の過剰な線維状結合組織の形成または発生（線維化）であり、「肺の瘢痕形成」とも呼ばれる。肺線維症は、他の疾患の副作用であり得る。これらのほとんどは、間質性肺疾患として分類される。例には、自己免疫障害、ウイルス感染、またはその他の肺に対する微視的損傷が含まれる。しかし、肺線維症はまた、いずれかの既知の原因がないように見える場合があり（「特発性」と呼ばれる）、いずれの免疫抑制治療にも応答しないという点で、他の形態の線維症とは異なる。
【００３３】
特発性肺線維症（ＩＰＦ）は、３〜４年の生存期間中央値を有する制御困難な、発症例が増大している間質性肺疾患であり、線維芽細胞巣ならびに肺胞のリモデリングおよび閉塞を特徴とする１、２。唯一の最も確実な治療は、肺移植であり、その介入は、ドナーの臓器の低い入手可能性および重篤な外科的、医学的、および免疫学的合併症により阻まれる３。
【００３４】
ヘルマンスキー・パドラック症候群（ＨＰＳ）におけるＡＴＩＩ細胞の役割
ＡＴＩＩ細胞中の欠陥がＩＰＦの根底にあるという考えは、ヘルマンスキー・パドラック症候群（ＨＰＳ）の患者の一部は、高いＩＰＦ発生率を示し、ＨＰＳ関連間質性肺炎（ＨＰＳＩＰ）とも呼ばれるという事実によりさらに裏付けられる５６。ＨＰＳは、異常な生合成およびリソソーム関連オルガネラ（ＬＲＯ）の異常な輸送が原因であり、色素沈着異常性ならびにメラノソームおよび血小板デルタ顆粒（両方ともＬＲＯ）それぞれの機能障害に関連する出血性素因を特徴とする。サーファクタントが貯蔵、分泌およびリサイクルされる場合、ＡＴＩＩ細胞の層状体（ＬＢ）もまた、ＬＲＯである２１、２２。ＨＰＳを引き起こす変異は、４種の別々のタンパク質複合体：リソソーム関連オルガネラ複合体（ＢＬＯＣ）１（ＨＰＳ７、８、９）、ＢＬＯＣ２（ＨＰＳ３、５、６）、ＢＬＯＣ３（ＨＰＳ１、４）およびＡＰ３（ＨＰＳ２）の生合成に影響を与える。これらの複合体の機能は明らかではないが、それらは全て、タンパク質輸送およびＬＲＯ生合成に関与している２１、２２。９つの既知の変異の内で、３つ（ＨＰＳ１およびＨＰＳ４はＢＬＯＣ３に影響を与え、ＨＰＳ２はＡＰ３を無能力化する）は、３０年の寿命に関し、ＩＰＦと関連する。この寿命は、臨床的に、予後的に、放射線学的におよび組織学的に、ＩＰＦに極めて類似している２１、２２。ＨＰＳ１では、ＩＰＦの発生率は、８０％超であり、このことが、ＨＰＳ１を最も浸透性の高いＩＰＦ変異にしている２１。いくつかの自然変異を有するマウス系統は、種々のサブグループのヒトＨＰＳの色素沈着欠陥および血小板異常性を模写し、ヒトの原因遺伝子を特定する手段になった５７〜６２。いずれも自然発生的ＩＰＦを示さなかったが、ブレオマイシン誘導線維症に対する感受性は、ヒトＨＰＳサブグループのＩＰＦの発生率と関連する１９。ＨＰＳ２ｍｔマウスでは、ＡＴＩＩ細胞中の遺伝子導入訂正は、線維症感受性を元に戻し、ＡＴＩＩ機能障害の病因における重要な役割を実証した１９。ＰＦは、高齢のｅｐ／ｐｅマウスで起こり、このマウスは、ＨＰＳ１およびＨＰＳ２に変異を有し、したがって、おそらく、最良のＩＰＦマウスモデルを提供する１８、６３。チェディアック・東症候群（ＣＨＳ）はまた、ＬＲＯの疾患であり、患者およびベージュ色（ｂｅ）のマウスのＬＹＳＴの変異により引き起こされ６４、自然免疫不全および神経変性が主な症状である４。ＬＹＳＴは、小胞融合体または分裂に関与するが、その正確な機能は未知である６５。ベージュ色のマウスおよびＣＨＳ患者では、ＬＢは、拡大され４、１９、３３、３４、ＨＰＳＩＰで死亡した患者６６およびｅｐ／ｐｅマウスに類似しているが、ＣＨＳはＰＦに関連しない１８、５８。これらの知見は、全てのＡＴＩＩ損傷が線維症を引き起こすわけではないことを示す。
【００３５】
ＡＴＩＩ細胞の役割をさらに裏付けるのは、ｅｐ／ｐｅマウスのＡＴＩＩ細胞で観察される増大したアポトーシスおよびリソソームＥＲストレスという、限られた一連のヒトＨＳＰＩＰ試料で確認された知見である１８。類似のタイプのストレスは、散発性ＩＰＦのＡＴＩＩ細胞で観察され、これには、小胞体の小胞体ストレス応答（ＵＰＲＥＲ、ＳＦＴＰＣ変異にも関連する）４、５、６７、低オートファジー６、８、９、６８、ミトコンドリアの機能障害７、およびアポトーシスが含まれる。ＩＰＦにおけるＡＴＩＩ細胞の役割は、おそらく、サーファクタントの産生、分泌およびリサイクルといったそれらの最も特異的な機能に関連しているのであろう。リソソームの基礎構造は、細胞の品質管理機序にとって不可欠であり、これには、ストレスに応答したオートファジーおよびマイトファジーが含まれる３５〜３８。
【００３６】
しかし、ヒトＡＴＩＩ細胞の単離と維持は難題である。重要なのは、診断後の患者から単離されたＡＴＩＩ細胞の特徴は、多くの観察された変化が二次的なものであり得るので、疾患素因に関し情報価値のあるものではない可能性があることである。さらに、疾患の開始は、臨床症状の数年前に発生していると考えられている１、２。ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の分化により生成されたＡＴＩＩ細胞は、線維症に繋がる損傷または変異によりＡＴＩＩ細胞に誘導された機能的およびトランスクリプトームの共通性の発見を容易にすると思われる。哺乳動物の胚盤胞の内側細胞集団に由来する、胚性幹細胞（ＥＳＣ）は、多能性状態でインビトロで維持でき、生物中で全ての細胞型を生ずることができる８０。誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、体細胞のリプログラミングにより、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＭＹＣおよびＳＯＸ２の一時的な発現を介して、ＥＳＣに類似のまたは同一の多能性状態を産生する８０〜８９。いまでは、ＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓ９媒介ゲノム編集は、ｈＰＳＣ中の目的の変異の設計を可能とする９０〜９４。ｈＰＳＣ由来ＡＴＩＩ細胞は、未発症状態にあり、したがって、既存の異常性の検出を可能とする。
【００３７】
ＩＰＦのｈＰＳＣベースモデルに関する発表された研究は存在しない。マウスモデルは、この広く蔓延し、被害の大きい疾患の病因を根本的に明らかにすることができなかった。ここで、提供される結果が示すように、ｈＰＳＣからの遠位肺細胞および間葉の生成、ＩＰＦに関連する変異を導入するためのｈＥＳＣのゲノム改変、およびＡＴＩＩ細胞に影響を与えるがＩＰＦに関連しない変異をＩＰＦになりやすい変異を有する細胞で共通の機能的または発現上の特性を探索してＩＰＦの病因に対する不可欠な洞察を得るための対照としての使用を含む、いくつかの技術的におよび概念的に革新的でユニークな手法が組み合わされた。
【００３８】
呼吸器系は、前方前腸内胚葉（ＡＦＥ）の腹側に生ずる芽から始まり、型通りの分岐プロセスを通して近位気道および遠位の肺胞前駆細胞へと発達する（偽腺状期）。管状期中に、細胞周期活動が低下し、茎部気道上皮の分化が起こり、基底細胞、杯細胞、クラブ細胞、繊毛細胞、およびその他の細胞型が出現する。この段階に続いて、嚢状期があり、ここでは、細管が広がって小嚢を形成し、原始肺胞を生ずることになる６〜７（図１１）。
【００３９】
以前に、我々は、ｈＰＳＣ（胚性幹細胞（ＥＳＣ）およびリプログラミングされた誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ））を、２Ｄでの逐次発達ステップを通して、胚体内胚葉（ＤＥ）からＡＦＥ、肺野前駆細胞、および最終的に肺および気道上皮細胞へ分化させる戦略を報告した。これらの発達は、米国特許出願公開第２０１６０１６８５３５号および同第２０１５０２４７１２４号に開示されている。（図６Ａ）１０〜１２。
【００４０】
前述のように、新規方法の実施形態は、肺間葉と適合性がある肺内胚葉および中胚葉を含み、分岐形態が形成され、３Ｄ培養で遠位肺が発生するＬＢＯを作製するために開発された。新規方法の実施形態はまた、免疫欠損マウスの腎被膜下などへのＬＢＯの異種移植による最も進行した形態形成を有するＬＢＯを作製するためにも記載されている。異種移植されているＬＢＯは、ヒト肺発生を少なくとも部分的に再現し、したがって、ＩＰＦ様表現型がインビボで生ずるかどうかを含む、肺発生に影響を与える因子のモデルを作製し、その因子を評価するために使用できる。他の実施形態では、ＢＬＢＯ−３ＤおよびＢＬＢＯ−ｘｅｎｏが、ｈＥＳＣｓｈ中で高浸透度でＩＰＦに罹患しやすくするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９で設計された変異をＨＰＳ１中に有するＲＵＥＳ２−ＨＰＳ１ＤＥＬ細胞から作製され２２、４４；これらの変異体ＬＢＯは、インビトロでの線維症の反復発生を可能とし、異種移植を介してインビボでも同じことが行えることが期待される。ゲノム編集ＥＳＣにより、ｉＰＳＣに関連する不完全なリプログラミングおよび背後に存在する遺伝的変異の問題が回避される４５。
【００４１】
疾患のモデリングでのほとんどの取り組みは、ｉＰＳ細胞を使用している４５、１３４、１３５。ｉＰＳ生成の間、成熟細胞のエピジェネティックな特性が消去され、ＥＳＣに対応する多能性状態で細胞を維持する多能性ネットワークおよびエピエピジェネティックマークが確立される４５、１３６、１３７。ｉＰＳＣはＥＳＣと同一とは言わないまでも、極めて類似した、不完全なリプログラミングおよびｉＰＳＣのそれらが元々由来した細胞型への分化に適し得るエピジェネティックな記憶の持続性が記載されてきたが、問題点が議論されている４５、１３８、１３９。さらに、遺伝的背景は、ｉＰＳ株中の変異に対する最も重要な寄与因子であり４５、１４０、統計的検出力を得るために、十分な数の患者からの複数のクローンを必要とする。今日では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介ゲノム編集技術を利用できることにより、ＥＳＣ中への患者の変異の導入が可能となる９１〜９３。これは、遺伝的背景の変動を大きく排除し、加えて、不完全なリプログラミングおよびエピジェネティックな記憶（これらが存在する場合）により生ずるバイアスおよび変動を排除する。しかし、家族性素因が存在し得るが、関連変異が特定されない、または複数の座位が含まれ得る、散発性ＩＰＦでは、ｉＰＳＣの使用が好ましい。
【００４２】
１つのグループがヒト肺オルガノイドを報告し８、９、これらの小型構造体は、肺および気道８細胞のマーカーを発現している細胞を含み、マウス中での皮下異種移植後にいくつかの気道になる潜在能力を有した９が、それらは、肺発生の特徴、特に、分岐形態形成および中心部から周辺部への特異化も、機能も観察されなかったので、上述のオルガノイドの基準を満たしていない。したがって、現時点まで、正常なまたは異常な線維症などの肺のモデルを作るために使用できる肺オルガノイド培養物は存在していない。
【００４３】
結果
Ａ．中胚葉の存在下での３Ｄ肺発生
ＩＰＦは、多数の間充組織成分を有する線維性疾患であるので、我々は、間葉が存在するモデルを目的とした。ＬＢＯを培養物中のヒト多能性幹細胞から生成した。以下に記載の戦略は、例えば、センダイウイルスまたは改変ｍＲＮＡを用いて健康なヒト皮膚線維芽細胞７、９（継代１６〜２５）およびＩＲＦ７−欠損Ｃ１２  ｈｉＰＳＣ株から生成された、ＥＳ細胞（例えば、ＲＵＥＳ２細胞）またはｉＰＳにも適用できる２８。胞を、１５，０００〜１８，０００細胞／ｃｍ２で播種したマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）上で維持した。
【００４４】
図１〜４に記載の結果では、正常なＲＵＥＳ２胚性幹細胞（ＥＳＣ）で実験を実施したが、ｉＰＳＣと類似のデータが得られた。マウス胚性線維芽細胞（ｍｆｅ）を枯渇させた後、胚様体／原始線条形成培地中で、続けて、内胚葉誘導培地に切り替えてｈＰＳＣを培養することにより、内胚葉が誘導された。前に記載のように９、前方前腸内胚葉が誘導され、その後、ＡＦＥが腹側化培地（分岐培地）で４８時間処理され、３次元集塊形成が観察された。凝集塊はその後、ウェルの周囲で静かにピペット操作することにより懸濁させた。腹側化培地／分岐培地の存在下での前方前腸上皮（ＡＦＥ）からの腹側肺の予定された誘導の間の早期に、容易に剥離され、肺発生のために必要とされることが以前に示された因子６、７の、ＢＭＰ４、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ７、レチノイン酸（ＲＡ）およびＧＳＫ３βアンタゴニスト、ＣＨＩＲ９９２０１（図６Ｂ）の存在下で、細胞凝集塊として浮遊培養で増殖される接着構造体が形成された（図１Ａ〜１Ｂ）。７．５ｘ１０５の胚体内胚葉（ＤＥ）細胞から、２４９０＋１２９個の凝集塊が生成された（ｎ＝３．ＲＵＥＳ２  ＥＳＣ）。以降では肺芽オルガノイド（ＬＢＯ）と呼ばれる、ＡＦＥの浮遊凝集塊を非組織培養物で処理したマルチウェルプレート中で、分岐培地中に浸して維持し、それらが１００％マトリゲル内に埋め込まれる、またはＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ．Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスの腎被膜下に移植される時間のｄ２０〜ｄ２５まで１日おきに供給した。
【００４５】
ＬＢＯの浮遊培養相中、構造体は、ＥＰＣＡＭ＋ＫＲＴ８＋ＥＣＡＤ＋ＦＯＸＡ１／２＋ＡＦＥ細胞の折り畳みシートを形成した（ＦＯＸＡ２：８９．０７％±３．３６％、ＥＰＣＡＭ＋：９２．０８％±１．８８％、ｎ＝３；ＲＵＥＳ２  ＥＳＣ）（図１Ｃ）。ｄ２５までに、細胞の５１．２６±４．３７％（ｎ＝３；ＲＵＥＳ２  ＥＳＣ）が肺マーカーＮＫＸ２．１＋を発現した（図１Ｃ）。上皮前駆細胞マーカー、ｐ６３（１８．５９％±１．４９％、ｎ＝３；ＲＵＥＳ２  ＥＳＣ、図１Ｃ）を除いて、成熟肺および気道細胞のマーカーは存在しなかった（ＥＣＲｔは示されず）。細胞は、中胚葉ＰＤＧＦＲＡ＋ＥＣＡＤ−細胞に取り囲まれていた（図１Ｄ）。ＲＮＡｓｅｑ（図６Ｃ）は、ＥＰＣＡＭ＋細胞中で内胚葉／肺遺伝子（ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ２、ＮＫＸ２．１）の強い濃縮を確証した（図１Ｅ）。ＥＰＣＡＭ−細胞は中胚葉遺伝子を発現し（図１ｅ）、その内のＴＢＸ４およびＨＯＸ５パラログなどのいくつかは、肺中胚葉中で発現している１３、１４。成熟肺および気道中および他のＡＦＥ由来系統中での遺伝子発現は、ＥＰＣＡＭ＋画分中では、ほとんど検出不能であった（図６Ｄ）。ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）は、内胚葉細胞、および中胚葉中のその転写標的１５、ＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１およびＨＨＩＰ中で発現した（図６Ｄ）。インサイツハイブリダイゼーションにより、ｄ１５での内胚葉画分中のＳＨＨ発現を確認した。ｄ２５では、ＳＨＨは、出芽上皮構造の先端で最も強力に発現した（図６Ｅ）。これらの知見は、早期発生マウス肺と一致し、この場合、ＳＨＨは、最初は、肺内胚葉全体を通して発現するが、分岐形態形成中に次第に分岐部先端に限定される１５〜１７。それらは、インビボで発達している肺芽と類似して空間的に組織化されている複数の細胞型を含むので、我々は、これらの構造を肺芽オルガノイド（ＬＢＯ）と呼ぶ。
【００４６】
Ｂ．異種移植後のヒト肺芽オルガノイドのインビボ潜在能力。
約２０〜２５日目に、手術の前に、約百万個のｄ２０〜ｄ２５  ＬＢＯ細胞を５μｌのマトリゲルと混合し、ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ．Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスの腎臓下に移植した。免疫不全のＮＳＧマウスの腎被膜下に移植したとき、ヒトＲＵＥ２細胞由来のＬＢＯ−ｘｅｎｏは、平滑筋、疎性結合組織および希少軟骨を含む多量の間充組織と共に増殖した（図２Ａ）。ＬＢＯ−ｘｅｎｏは、約１．５ヶ月後に、間充組織に取り囲まれた管状構造を含んでいた（図２Ｂ）。管は、基底層にＰ６３＋細胞を有するＭＵＣ５ＡＣ＋（杯）細胞含有ＦＯＸＡ２＋ＮＫＸ２．１＋ＳＯＸ２＋上皮により均一に覆われており（図２Ｃ）、これは、気道上皮と適合性がある。全ての細胞は、マウス起源であった内皮細胞（図７Ｂ）を除き、ヒトであった（図７ａ）。５ヶ月後、ＳＭＡ＋胚葉細胞に取り囲まれた分岐構造（図２Ｄ、図７Ｃ）が現れる（図７Ｃ）。全ての上皮細胞は、ＮＫＸ２．１＋であり、一方、肺発達の後期の近位マーカー１８、１９であるＳＯＸ２は、分岐部先端から排除され、そこには、サーファクタント産生ＩＩ型肺胞の上皮（ＡＴＩＩ）細胞のマーカーである、ＳＦＴＰＢおよびＳＦＴＰＣを発現した（図２Ｅ）２０。茎部および中央細管は、近位（気道）マーカーＦＯＸＪ１（繊毛性細胞）、ＣＣ１０（クラブ細胞）およびムチン（杯細胞）を発現した（図２Ｅ）。ヘマトキシリン−エオシン染色は、多くの多繊毛細胞を示し（図２Ｄ）、一方、ライブイメージングは、繊毛叩解を実証した。さらに、粘膜下腺がより大きな管状構造の近くに観察された（図７Ｅ）。全体として、増殖中の形態および発現パターンは、肺の分岐形態形成６、７中の中心部から周辺部への特異化と一致した。管状構造中の流体は、全ての試験した肺および気道の分泌生成物を含んでいたが、細胞表面ムチン２１、ＭＵＣ１に関しては陰性であり、分泌タンパク質を検出し、脱落細胞に関連するタンパク質は検出しないことを示し、機能に関する証拠を提供する（図２Ｆ）。７ヶ月後、神経上皮小体２２と適合性があるドーム形状群のＣＧＲＰ＋ＰＧＰ９．５＋細胞が気道様構造体中に存在した（図２Ｇ）。さらに、増殖領域は、ＡＴＩＩ細胞マーカー（ＳＦＴＰＣ、ＡＢＣＡ３、ＨＴ２−２８０）２３を発現している細胞およびＩ型肺胞上皮細胞（ＡＴＩ）マーカー（ＨＴ１−５６、ＨＯＰＸ、ＰＤＰＮ、ＣＡＶ１、ＳＣＮＮ１Ａ、ＡＫＡＰ５、ＣＬＩＣ５）２０を有する細胞を含む薄い細胞層（図２Ｇ）のネットワークに発達したが、成熟ＡＴＩ細胞の他のマーカー（ＲＡＧＥ、ＡＱＰ５）２０は検出されなかった（図２Ｇ）。しかし、肺胞毛細管ネットワークおよび気管支肺胞管は、観察されなかった。我々は、完全な表現型のおよび構築上の肺胞成熟は達成されなかったが、可能な限り、異所配置のために少なくとも一部では、ＬＢＯは、多くの肺発生の本質的な特徴を再現しており、これらには、異種移植後の、分岐形態形成および中心部から周辺部への特異化が含まれる。
【００４７】
Ｃ．長期ＢＬＢＯ−３Ｄインビトロ発生およびＡＴＩＩ機能：３Ｄマトリックス中のＬＢＯは、分岐コロニーを生成でき、これらの培養条件では分岐のために間葉細胞は必要ではない。
ＣＨＩＲ９９０２１、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ７、ＢＭＰ４、およびＲＡ（図６Ｂ参照）の存在下、RUES2からのｄ２５  ＬＢＯをマトリゲル中に埋め込んだ後、９５％超が急速に増殖している分岐構造をもたらした（Ｃ１２、インフルエンザ感染後、急性呼吸窮迫症候群を生ずるＩＲＦ７変異を有する患者由来の株を含む、ＲＵＥＳ２に関しては図３Ａを、ｉＰＳＣに関しては図８Ａを参照）２４。ＲＵＥＳ２細胞は、肺内胚葉のマーカーを発現する（ＦＯＸＡ２＋：９５．１７％±１．５４％、ＮＫＸ２．１＋：７４．９７％±４．３７％、ＥＰＣＡＭ＋：９６．８３％±０．６２％、ＳＯＸ９＋：９２．４２％±３．８１％、ｄ７０でｎ＝３；ＲＵＥＳ２  ＥＳＣ）（図３Ｂ）。ＭＵＣ１の均一な管腔発現は、偏光を示す（図３Ｂ）。ＡＴＩＩマーカーＳＦＴＰＣ、ＳＦＴＰＢおよびＡＢＣＡ３を発現している細胞が、全ての構造体中に存在した（図３Ｂ）。気道杯細胞（ＭＵＣ５ＢまたはＭＵＣ５ＡＣ）は希であったが、一方、他の気道細胞（クラブ細胞（ＳＣＧＢ３Ａ２）、繊毛性細胞（ＦＯＸＪ１）および基底細胞（ＫＲＴ５およびＰ６３））は検出されなかった（図示せず）。単独で播種したＲＵＥＳ２  ＬＢＯは、あらゆる方向にランダムに分岐し、６．４ｍｍウェルを９０日以内に満たしたが、それらは、近接して一緒に播種した場合、ウェルの一部を占めるのみである分岐の木を形成した（図８Ｂ）。これらの知見は、正常なＲＵＥＳ２細胞の分岐構造は、インビトロで操作でき、分岐構造間の反発相互作用がそれらの構造の決定に一定の役割を果たし得ることを示す。
【００４８】
ビメンチンおよびＣＤ９０を発現しているＲＵＥＳ２中の間葉細胞は、ＬＢＯ−３Ｄ構造を取り囲んで存在した（図３Ｂ）。しかし、ＥＰＣＡＭ−細胞のフローサイトメトリーにより決定したそれらの比率は、マトリゲル培養中に総集団の２％未満にまで低下した（図８Ｃ）。EPCAM-細胞を除いて、ｄ２５  ＬＢＯから精製したＥＰＣＡＭ＋細胞は、低いクローニング効率（０．３０±０．０３１６％）にもかかわらず、マトリゲル中で播種後に分岐コロニーを生成した（図８Ｄ）。これらの分岐コロニーは、未処理ＬＢＯから生成したマトリゲルコロニーとしてのマーカー発現と類似のパターンを示した（図８Ｅ）。これらの知見は、ＬＢＯ中の希な前駆細胞は、分岐コロニーを生成でき、これらの培養条件では分岐のために間葉細胞は必要ではないことを示す。
【００４９】
Ｄ．ＲＵＥＳ２  ＬＢＯは、ヒト妊娠期間の後期の２番目の三半期までインビトロでヒト肺発生を再現する
ＲＵＥＳ２  ＬＢＯ−３Ｄ培養の１７０日超後に、肺発生の嚢状期中に形成される小嚢を想起させる、拡張された先端部を有する枝管からなる巨視的組織（図４Ａ）を開発し（図４Ｂ、図９Ａ）、８４．８６％＋５．２１％の細胞は、ＮＫＸ２．１＋であったが、ほとんどの細胞はＳＯＸ９＋（７６．７５＋６．８９％）であり、少数（２３．７８＋５．２１％）はＳＯＸ２＋（図９Ｂ）（ｎ＝４、１種のＥＳＣ株および３種のｉＰＳ株）であった。ほとんどの管腔細胞は、ＨＴ２−２８０、ＭＵＣ１、ＳＦＴＰＢ、ＳＦＴＰＣおよびＡＢＣＡ３を発現し（ＲＵＥＳ２  図４Ｃ、ｉＰＳＣ  図９Ｂ）、これらをＡＴＩＩ細胞と特定した。電子顕微鏡観察は、多数の層状体（ＬＢ）、サーファクタントが貯蔵されているオルガネラ２５を示した（図４Ｄ、図９Ｃ）。
【００５０】
ＡＴＩＩ細胞機能を調査するために、蛍光脂質に共有結合されたＳＦＴＰＢである、ボディピーを加えた。数分以内に、ＳＦＴＰＢ−ボディピーがＲＵＥＳ２  ＬＧＯ細胞に取り込まれ、内腔中に分泌された（図４Ｅ、図４Ｆ）。マウス中のＡＴＩ細胞およびマウスの推定二分化能肺胞前駆細胞２０、２６のマーカーである、ＨＯＰＸは、広範に発現した（図９Ｂ）が、他のＡＴＩマーカー（ＡＱＰ５、ＣＬＩＣ５、ＡＫＡＰ５、ＣＡＶ１、ＡＧＥＲ）は検出できなかった。遠位先端部のマーカーで、肺胞成熟に伴い下方制御され、生後に検出不能になるＳＯＸ９は、インビトロで、分岐構造の先端部および外縁部で主に発現し、マウスの発生と一致し、ＳＯＸ９は遠位肺マーカー２７〜２９である（図９Ｂ）。
【００５１】
気道マーカー（ＭＵＣ５ＡＣ、ＳＣＧＢ３Ａ２）のマトリゲル  ＬＢＯ−３Ｄ  ＲＵＥＳ２コロニー中での発現は、ＳＯＸ２およびＳＯＸ９を同時発現している構造体に限定され（図９Ｂ）、したがって、より近位に該当するものと考えられた。ＳＯＸ２およびＳＯＸ９の同時発現は、マウスでは例外的である１９が、多数のより大きなＳＯＸ２＋ＳＯＸ９＋構造体がヒト２番目の三半期の胎生期の遠位肺で特定されており（図９Ｄ）、ＬＢＯ−３Ｄが、ヒト肺発生を再現することを示唆している。ＳＯＸ９の発現、主にＡＴＩＩマーカーを発現している嚢状構造の形成、および成熟ＡＴＩ細胞の非存在は、肺発生の管状期と一致し、マウスの妊娠期間最後に起こるが、ヒトでは２番目の三半期の後期中に起こる。ｄ１７０マトリゲルＬＢＯ−３Ｄ培養の発育段階をさらに検証するために、我々は、ＲＵＥＳ２細胞由来および３種のｉＰＳＣ株由来の１２種の独立した試料に対し、ＲＮＡｓｅｑを実施した。妊娠期間の１番目と２番目の三半期および成人期中30のヒト臓器の発現プロファイルを含む、ＫｅｙＧｅｎｅｓデータベースを用いた相互参照プログラムは、２番目の三半期の胎生期の肺と最良の一致を示し、その他の臓器とは何ら一致がなかった（図４Ｇ、図９Ｅ）。まとめると、構造的タンパク質発現およびトランスクリプトームデータは、ｄ１７０マトリゲルＲＵＥＳ２  ＬＢＯオルガノイドが、ヒト妊娠期間の２番目の三半期の後期まで到達したことを示す。
【００５２】
Ｅ．ヒト疾患のモデリングにおけるＬＢＯ−３Ｄの適用の可能性
１．ＬＢＯモデルは、遠位肺におけるＲＳＶ感染症の形態学的特徴を再現する
我々は次に、選択感染性および線維性肺疾患が再現され得るかどうかを調査した。我々は、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）感染ＬＢＯ−３Ｄが、ヒト肺感染症の特徴を示すかどうかの答えを求めた。ＲＳＶは、乳幼児の下気道感染症の主要な原因であり、小気道の通過障害による細気管支炎を引き起こす２、３１。現時点では、認可されたワクチンまたは効果的抗ウイルス薬は存在せず、また、感染後の免疫も短寿命である３２。ヒトにおけるＲＳＶ向性には、繊毛性細胞および肺胞上皮細胞が含まれる２、３。以前のヒト気道上皮細胞株での研究は、ＲＳＶ感染細胞が膨潤して上皮から剥離し３３、アーカイブ病態供試体中の感染細胞による小気道の通過障害および臨床的細気管支炎症候群と一致する結果を示した３。ｄ１７０マトリゲルＬＢＯ−３Ｄ培養物のＲＳＶ感染の２日後に、共焦点顕微鏡は、膨潤した感染細胞の分岐構造の内腔中への脱落を示した（図５Ａ、矢印）。ウイルス感染の証拠があるのにもかかわらず、１日目には脱落は認められなかった。したがって、ＬＢＯのＲＳＶ感染は、ヒトの感染の重要な特徴を再現する。
【００５３】
２．ＲＵＥＳ２−ＨＰＳ１ＤＥＬ  ＬＢＯ−ｘｅｎｏモデルは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を用いて作製したＨＰＳ１−変異体細胞株中の間葉細胞の蓄積を示した。
ＲＵＥＳ２株は、適切な変異を誘導するために神経芽腫株中でスクリーニングされたＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓ９構築物を遺伝子導入された。クローンは採取され、ＣＲＩＳＰＲ相同性領域にまたがるプライマーを用いてＰＣＲにより分析され、続けて、プラスミドクローニングおよび塩基配列決定が実施され、目的の変異またはインデルを有する株が検出された。欠失を確認する古典的な手法（ＰＣＲ、塩基配列決定）に加えて、各変異はコードされているタンパク質が属する複合体全体を不安定化することが示されているので１４１、１４２、ＨＰＳ変異に対して、ＷＢにより関与複合体の非存在が確認された（ＢＬＯＣ１−３およびＡＰ３複合体が広範に発現している）２１、６０、１４１。変異のための標的化配列は、図１３〜１６に提供されている。
【００５４】
Ｆ．ＲＵＥＳ２細胞（ＲＵＥＳ２−ＨＰＳ１ＤＥＬ）および線維症の証拠
次に、我々は、いくつかの形態のヘルマンスキー・パドラック症候群（ＨＰＳ）５に関連する肺線維症をモデル化することを試みた。ＨＰＳは、血小板密顆粒およびメラノソーム３４を含む、リソソーム関連オルガネラ（ＬＲＯ）の異常な生合成および輸送に起因する色素沈着および出血異常を特徴とする。いくつかの形態、特にＨＰＳ１は、臨床的に類似の特発性肺線維症（ＩＰＦ）５である、早期発症型の制御困難な肺線維症（ＨＰＳ間質性肺炎（ヘルマンスキー・パドラック症候群関連間質性肺炎またはＨＰＳＩＰ））に関連し、肺胞の線維性閉塞を特徴とし、３〜４年の生存期間中央値３５を有する。ＡＴＩＩ細胞のＬＢはまた、ＬＲＯであるという事実３４は、可能性として、ＨＰＳの原因となるいくつかの変異を有するＩＰＦの関連性を説明する５。
【００５５】
ＨＰＳ１のＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ９誘導欠失を有するＲＵＥＳ２細胞（以降では、ＲＵＥＳ２−ＨＰＳ１ＤＥＬ）（図１０Ａ）からのＬＢＯ−３Ｄ作製由来のマトリゲルコロニーは、親ＲＵＥＳ２株（図５Ｂ）からのＬＢＯより、明確さの程度が低いマトリゲル培養物中の分岐構造を示し、ＥＰＣＡＭ−間葉細胞の比率が増加し（図５Ｃ、図１０Ｂ）、間充組織マーカー、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＳＭＡ、ビメンチンおよびＣＤ９０を不均一に発現している（図５Ｄ、図１０Ｃの低倍率タイルスキャン）。ＥＰＣＡＭ−集団は、親細胞に比べて、培養物中でのＲＵＥＳ２−ＨＰＳ１ＤＥＬ細胞の極めて高められた増殖を示した（図１０Ｄ、図Ｅ）が、ＥＰＣＡＭ＋集団はそうではなく、従って、間葉細胞の増殖は、ＥＰＣＡＭ−細胞の比率の増大を説明する。しかし、驚くべきことに、ＥＰＣＡＭ−の過剰増殖は、早くもｄ１５浮遊培養で、何らかのＡＴＩＩマーカーの検出の前にも、ＲＵＥＳ２−ＨＰＳ１ＤＥＬ  ＬＢＯにおいて認められていた。さらに、ＲＵＥＳ２−ＨＰＳ１ＤＥＬ細胞中の、増大したヒドロキシプロリン含量（図１０Ｆ）ならびに増強された細胞外マトリックス（ＥＣＭ）自発蛍光（図１０Ｃ）およびコラーゲン１および３ならびにフィブロネクチン（図５Ｄ、図１０Ｇ）の免疫蛍光染色は、増大したＥＣＭ沈着を示した。混合実験（図１０Ｈ〜図１０Ｊ）は、という、ＨＰＳＩＰ３６および可能性としてはその他の形態のＩＰＦ４が上皮損傷により引き起こされ得るという考えと一致する知見である、間葉細胞の蓄積は変異体上皮細胞により推進され、変異体間葉細胞の細胞固有の特性ではない考えと一致した。まとめると、これらの知見は、ＬＢＯを用いて、少なくとも一部の線維性肺疾患のモデル化を行うことができることを示唆している。
【００５６】
特定の変異を有する他の細胞株（すなわち、ＨＰＳ２、ＨＰＳ８、ＳＦＰＴＣおよびテロメラーゼ）の発生に関する情報および関連データは、下記実施例３で提供される。変異を有するそれぞれの細胞株を作製する技術は、実施例１および３で示されるＨＰＳ１細胞株のものと類似である。各遺伝子変異の配列ならびに細胞ゲノム中の挿入するためのｇＲＮＡ標的配列は、図１３〜１６に提供されている。ＨＰＳ２およびテロメラーゼを有するＬＢＯは、ＨＰＳ１−ＬＢＯで観察されるものと類似の線維性異常を示す。
【００５７】
考察
マトリゲル中のＬＢＯおよびＬＢＯ由来インビトロ分岐コロニーおよびマウス腎被膜下の異種移植後の増殖は、真のオルガノイド１の定義を満たし、したがって、これらのコロニーは、肺芽オルガノイド（ＬＢＯ）と命名される。以前に報告した「ヒト肺オルガノイド」は、オルガノイドでは全くなかった。理由は、インビトロでもまたは異種移植後でも分岐を示さなかったためである８、９。さらに、本ＬＢＯと対照的に、以前に記載した肺オルガノイドは、血清の存在下であるが、インビトロでの肺特異化のために不可欠であることを我々が示した１０、ＢＭＰ４、ＲＡおよびＷｎｔアゴニズムの非存在下で生成された。最終的には、皮下移植後に気道上皮細胞を生成するために必要とされる生体工学により作製した足場上での前培養がなければ、免疫不全マウスの腎被膜下移植後、これらの構造は発達しなかった９。対照的に、現時点で人感染を再現するモデルが存在しない、遠位の肺のＲＳＶ感染症の形態学的特徴は、ＲＳＶに感染したＲＵＥＳ２細胞のＬＢＯ−３Ｄモデルで初めて再現された。ＲＵＥＳ２−ＨＰＳ１ＤＥＬ  ＬＢＯ−３Ｄモデルはまた、ＨＰＳ１欠損細胞中で、線維症（間質性肺炎またはＨＰＳＩＰ関連ヘルマンスキー・パドラック症候群）の証拠を示し、このＨＰＳ１欠損は、臨床的に、予後的に、放射線学的におよび病理学的にＩＰＦと識別不能の、最も浸透性型の肺線維症を引き起こす変異である４、５、３６。しかし、疾患ＨＰＳＩＰは通常、３０〜４０才代に発症するが、線維性表現型は、ＲＵＥＳ２−ＨＰＳ１ＤＥＬ  ＬＢＯモデルでは、分化の４０日以内にインビトロで再現され得ることが優れている。理論に束縛されるものではないが、年齢およびテロメア機能障害がＩＰＦの主要なリスク因子であることから、インビトロ培養のストレスが老化により誘導される変化を再現し、表現型の急速な出現に繋がったことが考えられる３５、３７。ＬＢＯモデルは、マトリゲル中での６ヶ月の培養後、オルガノイドは、構造、マーカー発現およびゲノムワイド発現特性の観点から、ヒト妊娠期間の２番目の三半期に一致するという点で限界がある。これらの知見は、ＬＢＯ系でモデル化された肺発生は、子宮内でのヒト肺発生と歩調を合わせることを示唆する。したがって、完全な最終成熟は、オルガノイドの分野で課題として残されている１。第２の制約は、まだ証明されていない、分岐形態形成の「空間充填」モデルと一致する知見である、分岐がランダムに表れることである３８。しかし、ＬＢＯ−３Ｄ分岐は、マトリゲル中で相互に極めて接近していくつかのＬＢＯを播種することにより誘導され得ることが示されており、この場合、オルガノイドは、相互から離れて分岐し、分岐がインビトロで操作できることを示唆する。３つ目の制約は、ＬＢＯ中に存在する間葉の正確な性質およびパターニングが明らかになっていないことである。インビボ異種移植は、ＬＢＯ−ｘｅｎｏ関連中胚葉細胞は、内皮細胞、骨または骨格筋を生成する潜在能力を有さず、間葉は、ある程度特定化されていることが明らかになった。肺中の種々の間充組織系統およびそれらの個体発生学はまだ純分に特性が明らかになっていない６。しかし、肺性血管系は、肺間葉から誘導されそうにない。近位の肺血��は、高頻度心肺間充組織前駆細胞から誘導され、一方、肺胞毛細管ネットワークの発生起源は、既存躯幹血管で生じたＶＥ−カドヘリン＋前駆細胞である可能性がある６、３９。４つ目の制約は、インビトロ培養は、大きく遠位の肺の方向に偏っており、ＳＯＸ２およびＳＯＸ９を共発現しているいくつかの領域は、杯細胞およびクラブ細胞前駆物質のより近位のマーカーを発現したが、成熟クラブ細胞、繊毛細胞または基底細胞は観察されなかったという点である。我々はまた、インビボ移植後、ＡＴＩの潜在能力は存在しているが、ＡＴＩマーカーのインビトロ誘導を達成できなかった。
【００５８】
まとめると、この研究は、特定の制約にもかからず、ＬＢＯ（３Ｄおよびｘｅｎｏの両方）は、ヒト肺発生、肺疾患のモデリングおよび正常なＬＢＯに対するおよびＲＳＶ感染症および線維症などの肺疾患のモデルとなるＬＢＯに対する薬物の作用に関する薬物のスクリーニングの研究の有用なツールとなることを示している。
【００５９】
薬物スクリーニング
本発明は、試験薬剤、特に、本明細書に記載のような、肺および気道細胞スフェア中のコラーゲンの形成を防止または低減する試験薬剤を提供する。しかし、フィブロネクチンおよび任意の他の細胞外マトリックスタンパク質としてのコラーゲンの防止または低減に限定されず、さらには、全てのタイプの間葉細胞（線維芽細胞、リポ線維芽細胞、筋線維芽細胞、など）も同様に低減できる。
【００６０】
別のスクリーニング実施形態は、本方法により作製された細胞集団中のサーファクタントの産生を増加または低減させる試験薬剤を特定する。
【００６１】
この薬剤の例には、タンパク質、ペプチド、非ペプチド化合物、合成化合物、発酵生成物、細胞抽出物、植物抽出物、動物組織抽出物など、核酸、ペプチド、タンパク質、非ペプチド化合物、合成化合物、発酵成物、細胞抽出物、細胞培養上清、植物抽出物、哺乳動物組織抽出物、プラズマ、などが挙げられる。試験物質は、新規物質または既知物質であってよい。試験物質は、塩の形態であってよく、このような塩は、生理学的に許容可能な酸または塩基との塩であり得る。これらの物質は、新規または既知であってよい。さらに、コンビナトリアル化学技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成またはファージディスプレイにより作製されたランダムペプチドライブラリー、などはまた、試験物質の好ましい例である。
【００６２】
本明細書で使用される場合、「試験薬剤」という用語は、非常に広い範囲にわたる（後述のように）、本明細書に記載の肺および気道細胞のスフェア中のコラーゲン形成を阻止する能力、またはコラーゲン発現スフェアの崩壊を防止する能力で評価される薬学的または非薬学的化合物または基質を意味し得る。
【００６３】
一実施形態では、ＢＬＢＯは、細胞膜を通って輸送できる小分子量試験試薬で処理される。このような薬剤の量は、当業者により決定され得るが、通常は、約０．０１ミクロモル（０．０１ｕＭ）〜１ｍＭでよい。培養したスフェアまたはその他の試験細胞と試験化合物との接触の時間は、変化し得る。ＢＬＢＯ中の線維形成を低減するまたは防止するための化合物の能力の測定は、試験物質の投与の開始後であり限りにおいて、任意の時間に行ってよい。
【００６４】
本発明の方法を用いてスクリーニングされるライブラリーは、種々のタイプの化合物を含み得る。いくつかの実施形態では、化合物は、ペプチド分子である。非限定的例では、ペプチド分子はファージディスプレイライブラリー中に存在できる。他の実施形態では、化合物のタイプには、限定されないが、非天然アミノ酸、例えば、Ｄ−アミノ酸、α−アミノリン酸、または非ペプチド結合を有するアミノ酸などのアミノ酸の亜リン酸類似体を含むペプチドを含むペプチド類似体、ホスホロチオエートおよびＰＮＡなどの核酸類似体、ホルモン、抗原、合成または天然薬物、オピエート、ドーパミン、セロトニン、カテコールアミン、トロンビン、アセチルコリン、プロスタグランジン、有機分子、フェロモン、アデノシン、スクロース、グルコース、ラクトースおよびガラクトースが挙げられる。ポリペプチドまたはタンパク質のライブラリーも同様に使用できる。
【００６５】
ある実施形態では、コンビナトリアルライブラリーは、限定されないが、ベンゾジアゼピン、イソプレノイド、チアゾリジノン、メタチアザノン、ピロリジン、モルホリノ化合物、およびジアゼピンジオンなどの小有機分子ライブラリーである。別の実施形態では、コンビナトリアルライブラリーは、ペプトイド；ランダムバイオオリゴマー；ベンゾジアゼピン；ヒダントイン、ベンゾジアゼピンおよびジペプチドなどのダイバーソマー；  ビニルポリペプチド；非ペプチドペプチド模倣体；オリゴカルバメート；ペプチジルホスホネート；ペプチド核酸ライブラリー；抗体ライブラリー；または炭水化物ライブラリーを含む。コンビナトリアルライブラリーそれ自体は市販されている（例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｌｔｄ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅｓｈｉｒｅ，ＵＫ；ＡＳＩＮＥＸ，Ｍｏｓｃｏｗ  Ｒｕｓｓｉａ；ＢｉｏＦｏｃｕｓ  ｐｌｃ，Ｓｉｔｔｉｎｇｂｏｕｒｎｅ，ＵＫ；Ｂｉｏｎｅｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ａ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｋｅｙ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ），Ｃａｍｅｌｆｏｒｄ，ＵＫ；ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．；ＣｈｅｍＤｉｖ  Ｉｎｃ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．；ＣｈｅｍＲｘ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆ．；ＣｏｍＧｅｎｅｘ  Ｉｎｃ．，Ｂｕｄａｐｅｓｔ，Ｈｕｎｇａｒｙ；Ｅｖｏｔｅｃ  ＯＡＩ  Ｌｔｄ，Ａｂｉｎｇｄｏｎ，ＵＫ；ＩＦ  ＬＡＢ  Ｌｔｄ．，Ｋｉｅｖ，Ｕｋｒａｉｎｅ；Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ  ｐｌｃ，Ｃｏｒｎｗａｌｌ，ＵＫ；ＰｈａｒｍａＣｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｎｏｒｔｈ．Ｃａｒｏｌｉｎａ；ＳＩＤＤＣＯ  Ｉｎｃ，Ｔｕｃｓｏｎ，Ａｒｉｚ．；ＴｉｍＴｅｃ  Ｉｎｃ，Ｎｅｗａｒｋ，Ｄｅｌ．；Ｔｒｉｐｏｓ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌｔｄ，Ｂｕｄｅ，ＵＫ；Ｔｏｓｌａｂ，Ｅｋａｔｅｒｉｎｂｕｒｇ，Ｒｕｓｓｉａ、を参照されたい）。
【００６６】
一実施形態では、本発明の方法のためのコンビナトリアル化合物ライブラリーは、合成され得る。
【００６７】
本明細書での使用を意図した例示的合成低分子量の生物学的に活性な分子には、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ（ＭｏｌＢｉｏ）からのＭａｘｉＶｅｒｓｅ（商標）、ＬＯＰＡＣ１２８０（Ｓｉｇｍａからの）、薬物様のスクリーニング化合物のＭｙｒｉａＳｃｒｅｅｎ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｓｉｇｍａからの）、ｂｉｏｆｏｃｕｓ．ｃｏｍ／ｏｆｆｅｒｉｎｇｓ／ｃｏｍｐｏｕｎｄ−ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．ｈｔｍ？ｇｃｌｉｄ＝ＣＭＸＹｚｏｒｅｊｐ４ＣＦＳＺｄａｇｏｄｈ−ｋｔｍｓｗからのワールドワイドウェブ上で利用可能な化合物ライブラリーなど、ならびにこれらの任意の２つ以上の組み合わせが挙げられる。
【００６８】
本明細書での使用を意図した例示的抗体には、ヒト細胞型と機能的に相互作用できる任意の抗体（またはそのフラグメント）が含まれ、該抗体はモノクローナルまたはポリクローナルである。例示的抗体には、免疫グロブリンサブタイプの抗体、Ｆａｂフラグメント、など、例えば、標的ＬＢＯに特有の細胞表面マーカーを認識する抗体；発現が多因子培地への曝露により誘導される、任意の細胞表面タンパク質を認識する抗体または既知のシグナル伝達経路を阻害する抗体；または既知シグナル伝達経路を活性化する抗体、など、ならびにこれらの任意の２つ以上の組み合わせが含まれる。
【００６９】
本明細書での使用が意図される例示的核酸には、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、など、ならびにこれらの任意の２つ以上の組み合わせが含まれる。
【００７０】
本明細書での使用が意図される例示的ＤＮＡ分子には、ジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするＤＮＡプラスミド／ベクター、ジンクフィンガー転写因子、ｃＤＮＡ過剰発現ライブラリーなど、ならびにこれらの任意の２つ以上の組み合わせが含まれる。
【００７１】
本明細書での使用が意図されるＲＮＡ分子には、ｓｉＲＮＡ（例えば、ワールドワイドウェブ上で利用できるｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ／ｌｉｆｅ−ｓｃｉｅｎｃｅ／ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ−ｇｅｎｏｍｉｃｓ−ａｎｄ−ｍａｉ／ｓｉｍａ．ｈｔｍｌを参照）、ｓｈＲＮＡ（例えば、ワールドワイドウェブ上で利用できるｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ／ｌｉｆｅ−ｓｃｉｅｎｃｅ／ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ−ｇｅｎｏｍｉｃｓ−ａｎｄ−ｍａｉ．ｈｔｍｌおよびｏｐｅｎｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ／ＲＮＡｉ／ｓｈｒｎａＬｉｂｒａｒｉｅｓ／を参照）、マイクロＲＮＡ（例えば、ワールドワイドウェブ上で利用できるｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ／ｉｎｄｅｘ．ｓｈｔｍｌを参照）など、ならびにこれらの任意の２つ以上の組み合わせが含まれる。当業者なら容易にわかるように、ＲＮＡ分子は、直接的に（例えば、ｓｉＲＮＡまたはマイクロＲＮＡを用いて）、または目的のＲＮＡ分子（例えば、マイクロＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ）を含むウイルス発現ベクターを含むウイルスとして、アレイ上にスポットできる。
【００７２】
試験化合物のライブラリーをスクリーニングするための本発明のスクリーニング方法は、好ましくは、試験化合物を標的ＬＢＯと、好ましくは生理的条件下で接触させることを含む。
【００７３】
分岐形態形成による肺組織の形成
肺芽オルガノイドは、以下の実施例２に記載の技術により作製される。プロトコルは、３つの段階を含む。第１に、誘導多能性幹細胞または胚性幹細胞などのヒト多能性細胞が、多能性細胞の胚体内胚葉（ＤＥ）への分化を誘導する条件下で、胚様体／原始線条形成培地に晒される。この第１段階は通常、４日間（ｄ０〜ｄ４）を要し、ＣＸＣＲ４の発現およびｃ−ｋｉｔにより特定される内胚葉を有する胚様体を形成する。第２段階、（ｄ５〜ｄ６）では、胚様体は、胚様体が前方前腸パターニングを形成する条件下で、前方化培地に晒される。その後、第３段階、（ｄ６〜ｄ２０〜２５）では、細胞は、腹側化および最終的な肺芽オルガノイド（ＬＢＯ）の産生を誘導する条件下で、腹側化培地／分岐培地に晒される。ＬＢＯ形成は、出芽上皮構造の先端部上のソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）発現により特定される（図６Ｅ参照）。
【００７４】
培養物プロセスのｄ２０〜ｄ２５のＬＢＯの産生時は、その後、折り畳み構造を有するオルガノイドが選択され、マトリゲル内にサンドイッチ構造で埋め込まれる。折り畳み構造には、ＥＰＣＡＭ＋ＫＲＴ８＋ＥＣＡＤ＋ＦＯＸＡ１／２＋ＡＦＥ細胞の折り畳みシート（ＦＯＸＡ２：８９．０７％±３．３６％、ＥＰＣＡＭ＋：９２．０８％±１．８８％、ｎ＝３；ＲＵＥＳ２  ＥＳＣ）が含まれる（図１Ｃ）。サンドイッチの形成は、ウェルまたは他の好適する容器中に第１の量のマトリゲルを加え、固化させてサンドイッチの底部分を形成することを含む。折り畳み構造を有する選択オルガノイドを、マトリゲルと混合して、底部分の上に配置し、固化させて中央細胞層を形成する。細胞不含の別の量のマトリゲルを細胞埋め込み層の上に配置し、固化させてサンドイッチの上部を形成する。腹側化培地／分岐培地をウェル中に入れ、定期的に補充する。オルガノイドからの分岐出芽の生成は、マトリゲル埋め込み後、１週間で起こる。埋め込み後２〜３週間で、広範囲に分岐したオルガノイドが観察される。
【００７５】
上述したマトリゲルの代わりに、Ｇｊｏｒｅｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ．２０１６  Ｎｏｖ  ２４；５３９（７６３０）：５６０−５６４．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ２０１６８およびＤｉＭａｒｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒ  Ｓｃｉ．２０１５  Ｏｃｔ  １５；３（１０）：１３７６−８５に記載のものなどの他のゲルマトリックスを組み込むことができる。
【００７６】
実施例
実施例１：方法
試薬
使用した試薬は、下表１に記載されている。
【００７７】
ヒト試料
Ｈｕｍａｎ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｃｏｒｅ  ａｔ  Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙから調達したヒト胎児組織の使用は、Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＣＵＭＣ）ヒト研究審査委員会により承認され、実験は、承認プロトコルに従って実施された。
【００７８】
培地
ｈＰＳＣ維持培地は、２０％のノックアウト血清代替物、０．１ｍＭ  β−メルカプトエタノール、１ｍｌ  Ｐｒｉｍｏｃｉｎ、５ｍｌ  非必須アミノ酸、５ｍｌ  ＧｌｕｔａＭａｘ、および２０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ−２を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）から構成した。無血清分化（ＳＦＤ）培地は、Ｎ２、Ｂ２７、０．０５％ウシ血清アルブミン、１％ペニシリン−ストレプトマイシン、５０  ｕｇ／ｍｌ  アスコルビン酸、２ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ，０．４ｕＭ  モノチオグリセロールおよび表２に示した種々の成長因子の混合物を補充したＩＭＤＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２（３：１）から構成した。
【００７９】
ｈＰＳＣ維持
Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  ２（ＲＵＥＳ２、ＮＩＨ承認番号ＮＩＨｈＥＳＣ−０９−００１３、登録番号００１３、継代１７〜２８）、センダイウイルスおよび改変ｍＲＮＡにより作製した健康なヒト皮膚線維芽細胞由来ｈｉＰＳＣ株７、９（継代１６〜２５）およびＩＲＦ７−欠損Ｃ１２  ｈｉＰＳＣ株２８を、１５，０００〜１８，０００細胞／ｃｍ２で播種したマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）上で維持した。細胞をｈＰＳＣ維持培地中で培養し、培地を毎日交換した。ｈＰＳＣをアクターゼ／ＥＤＴＡを通して洗浄し、１：４８の希釈で再播種した。培養物を加湿５％ＣＯ２雰囲気中、３７℃で維持した。株の核型を決定し、ＰＣＲを用いて６ヶ月毎にマイコプラズマ混入を検証した。
【００８０】
内胚葉誘導
以前に記載のように９、内胚葉の誘導を実施した。手短に説明すると、ｈＰＳＣ維持培地を加えたマトリゲル上で２４時間にわたり培養することによりＭＥＦを枯渇させ、加湿５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で維持した。ＭＥＦ枯渇後、原始線条および胚様体誘導を胚様体／原始線条形成培地（表２）中、低接着性プレートで、１２〜１６時間実施し、続けて、内胚葉誘導培地（表２）に切り替えて３６〜４０時間誘導を実施した。胚様体を毎日供給し、加湿５％ＣＯ２／５％Ｏ２雰囲気下、３７℃で維持した。内胚葉収率は、ＣＸＣＲ４の発現およびｃ−ｋｉｔにより決定した。ｉＰＳ株の場合、内胚葉細胞をヒトＣＤ１８４（ＣＸＣＲ４）マイクロビーズキットを用いて精製した。全ての実験で使用した細胞は、９０％超の内胚葉収率であった。
【００８１】
前方前腸内胚葉誘導
以前に記載のように９、前方前腸内胚葉を誘導した。４日目に、胚様体を０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡで剥がし、フィブロネクチンコートマルチウェルプレートに、８０，０００〜１０５，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種した。細胞を、前方化培地−１中で２４時間インキュベートし、続けて、前方化培地−２に切り替えて、さらに２４時間インキュベートした。
【００８２】
肺芽オルガノイドの形成
前方前腸内胚葉の誘導の終わりに、細胞を腹側化培地（分岐培地）で４８時間処理し、３次元集塊形成が観察された。凝集塊はその後、ウェルの周囲で静かにピペット操作することにより懸濁させた。懸濁凝集塊は、以降では、肺芽オルガノイド（ＬＢＯ）と呼ばれる。ＬＢＯを非組織培養物で処理したマルチウェルプレート中で、分岐培地中に浸して維持し、ｄ２０〜ｄ２５まで１日おきに供給した。
【００８３】
マトリゲル中の分岐形態形成
ｄ２０〜ｄ２５  ＬＢＯを２４ウェルトランスウェルインサート中で１００％マトリゲル内に埋め込み、マトリゲルが固化するまでインキュベーター中でインキュベートした。分岐培地をウェルに加え、その後、トランスウェルを挿入し、トランスウェルインサート中にさらに分岐培地を添加した。培地を１日おきに交換した。マトリゲル中でのＬＢＯおよびＬＢＯ由来分岐コロニーの生成を記載するステップバイステッププロトコルは、実施例２で見つけることができる。
【００８４】
免疫蛍光染色
ＬＢＯおよび分岐マトリゲル培養物を最適切断温度（ＯＣＴ）で新しく埋め込んだ。試料からを５〜８μｍの薄片を作製した後、２時間空気乾燥させた。切片を４％パラホルムアルデヒドで２０分間、室温で固定し、ＤＰＢＳで５分間洗浄した。切片を０．３％トリトンＸ−１００／ＰＢＳで３０分間透過処理し、続けて、５％ロバ血清で１時間ブロッキングした。一次抗体（表３）を４℃で一晩インキュベートした。翌日、切片をＤＰＢＳで３ｘ５分間洗浄し、続けて、二次抗体（表３）で室温下２時間インキュベートし、ＤＰＢＳで３ｘ１０分間洗浄した後、蛍光封入剤含有ＤＡＰＩを用いて取り付けた。３Ｄ画像化のために、Ｄ２５  ＬＢＯを上述のように染色したが、未処理オルガノイドとして染色した。
【００８５】
ＥＰＣＡＭ＋およびＥＰＣＡＭ−集団のＬＢＯからの単離
０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡによりＬＢＯを剥がした。細胞をＡＰＣ標識ＥＰＣＡＭを用いて４℃で２０分間染色した。ＥＰＣＡＭ＋およびＥＰＣＡＭ−細胞を、ＢＤ  Ｉｎｆｌｕｘ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）により単離した。
【００８６】
ＲＮＡｓｅｑ
ＬＢＯ由来の総ＲＮＡを、Ｄｉｒｅｃｔ−ｚｏｌ（商標）ＲＮＡ  ＭｉｃｒｏＰｒｅｐキットを用いて精製した。２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を使って、Ａｇｉｌｅｎｔ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ＲＮＡ  ６０００  Ｎａｎｏ  Ｃｈｉｐキット（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）により、ＲＮＡ濃度およびＲＮＡ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  ｎｕｍｂｅｒ（ＲＩＮ値）を測定した。９より大きいＲＩＮ値を有する試料をＲＮＡｓｅｑに使用した。Ｐｏｌｙ−Ａ−ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ法を用いて、総ＲＮＡ試料からｍＲＮＡを濃縮した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＴｒｕＳｅｑ  ＲＮＡプレップキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いてライブラリーを作製した。その後、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ２０００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて、Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｃｅｎｔｅｒで、ライブラリーの配列を決定した。試料を各レーンで多重化し、各サンプルについて、全レーンに対する１８０百万リードの一部として、目標数のシングルエンド／ペアエンド１００ｂｐリードを得た。ベースコーリングのために、ＲＴＡ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用い、また、ＢＣＬをＦＡＳＴＱフォーマットへの変換のために、アダプタートリミングと連動する、ｂｃｌ２ｆａｓｔｑ（バージョン１．８．４）を用いた。Ｔｏｐｈａｔ（バージョン２．０．４）を用いて、ミスマッチ数４および最大マルチヒット１０で、リードを参照ゲノム（ＮＣＢＩ／ビルド３７．２）にマッピングした。エキソン−エキソン接合由来のリードのマッピング捕捉するために、Ｔｏｐｈａｔは、新規エキソン−エキソン接合を最初から推測し、それらを、参照アノテーションとして、既知ｍＲＮＡ配列からの接合と組み合わせる。我々は、ｃｕｆｆｌｉｎｋｓ（バージョン２．０．２）をデフォルト設定で用いて、遺伝子の相対存在量およびスプライスアイソフォームを推定した。我々は、ＲＮＡｓｅｑ実験および発現差異のための試験からのリード数をモデル化する負の二項分布に基づくＲパッケージであるＤＥｓｅｑを用いて、各種条件下で差次的に発現した遺伝子を試験した。
【００８７】
インサイツハイブリダイゼーション
ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）−ＵＴＰ−標識ＳＨＨリボプローブを用いて、凍結切片（５〜８μｍ）に対しインサイツハイブリダイゼーションを実施した。手短に説明すると、ヒト成人肺組織ｃＤＮＡをテンプレートとして用いて、Ｔ７またはＴ３プロモーター配列（順方向プライマー：ＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＣＡＧＣＴＣＧＧＡＡＧＴＣＡＴＣＡＧＴＴ；逆方向プライマー：ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＧ  ＣＣＴＣＴＧＡＧＴＧＧＴＧＧＣＣＡＴＣＴＴ）を含む、ＳＨＨ  ＰＣＲ産物を生成した。ＰＣＲ産物をテンプレートとして使用し、Ｔ７  ＭＡＸＩｓｃｒｉｐｔキット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてＳＨＨリボプローブを生成し、続けて、ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｃｒｏキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、リボプローブを浄化した。種々の段階のＬＢＯをＯＣＴ中に新しく埋め込んだ。試料を５〜８μｍに薄片化し、続けて、４％パラホルムアルデヒドを用いて室温で２０分間固定した。切片をＤＥＰＣ−ＤＰＢＳで３ｘ５分間洗浄し、アセチル化バッファー（５８４μｌのトリエタノールアミン／５０ｍｌのＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏ／１２５μｌの無水酢酸）中で１０分間アセチル化した。０．１％トリトンＸ−１００／ＰＢＳで３０分間の透過処理を実施し、続けて、ＤＥＰＣ−ＤＰＢＳで３ｘ５分間洗浄した。切片をハイブリダイゼーションバッファー（５％デキストラン硫酸塩／４ｘ  ＳＳＣ／５０％フォルムアミド／１ｘデンハルト溶液／５％魚の精子ＤＮＡ）と共に、室温で少なくとも２時間インキュベートした後、２００ｎｇ／ｍｌのＤＩＧ標識ＳＨＨプローブと共にハイブリダイゼーションバッファー中、７２℃で一晩インキュベートした。翌日、切片を、７２℃に予熱した０．２ｘ  ＳＳＣと共に２時間、インキュベートした後、続けて、３０分間で室温まで冷却した。切片を新しい０．２ｘ  ＳＳＣで５分間洗浄し、その後、ＰＢＳでさらに５分間洗浄した。切片をブロッキング溶液（２％ヒツジ血清／ＴＢＳＴ）と共に１時間インキュベートし、続けて、抗ＤＩＧ−ＡＰ  Ｉｇと共に４℃で一晩インキュベートした。切片をＴＢＳＴで３ｘ１０分間洗浄し、呈色反応バッファー（１００ｍＭトリス、ｐＨ９．５／０．１％ツイーン−２０／１００ｍＭ  ＮａＣｌ／５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）で１０分間濯いだ。切片をＢＭ−ｐｕｒｐｌｅと共にインキュベートすることにより発色させた。
【００８８】
マウス腎被膜移植
ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｅＳｃｉｄ．Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスを特殊な病原体不含マウス設備に収容した。全マウスは、１０〜１３週齡で使用し、性別では選択しなかった。実験は、時点当たり５〜７匹のマウスを使用するように設定した。標本数を設定する統計的方法は使用しなかった。実験はランダム化しなかった。実験および動物飼育は、Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ学内実験動物委員会により承認されたプロトコルに従って実施した。手術の前に、百万個のｄ２０〜ｄ２５  ＬＢＯ細胞を５μｌのマトリゲルと混合し、腎被膜下に移植した。増殖物を摘出し、免疫蛍光法のために新しくＯＣＴ中に埋め込むか、またはパラフィン包埋のために４％パラホルムアルデヒドで固定した。ヘマトキシリン／エオシン染色を用いて組織分析を行った。
【００８９】
ドットブロット
５ヶ月の移植片の管状構造物から吸引した３マイクロリットルの体液をニトロセルロースブロッティング膜（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）上にスポッティングした。ドットブロット膜を５分間風乾し、５％ミルク／ＰＢＳ中で１時間ブロッキング後、示した一次抗体（表３）を使って４℃で一晩検出した。ＨＲＰ標識二次抗体を膜に適用し、続けて、ＥＣＬウェスタンブロッティング検出試薬を用いてシグナル検出を行い、Ｘ線フィルムに露光した。
【００９０】
画像化
電動Ｌｅｉｃａ  ＤＭＩ６０００  Ｂ（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｕｆｆａｌｏ  Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ）またはＤＭｉ８（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｕｆｆａｌｏ  Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ）倒立顕微鏡または２光子共焦点レーザー走査型顕微鏡Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰ８（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｕｆｆａｌｏ  Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ）を用いて試料を画像化した。巨視的な画像（図３Ａおよび図５Ａ）をｉＰｈｏｎｅ６（モデル：ＭＧ５Ａ２ＬＬ／Ａ，Ａｐｐｌｅ，Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ，ＣＡ）を使って取得した。
【００９１】
生存ＬＢＯ中へのＳＰＢ−ボディピーの取り込みおよび定量化
ｄ１７０  ＬＢＯをＣｅｌｌＭａｓｋ（商標）Ｄｅｅｐ  Ｒｅｄ  Ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｓｔａｉｎで１０分間染色し、５回の洗浄に続けて、ＳＰＢ−ボディピーのロード前の画像取得を行い、バックグラウンド蛍光レベルを得た（０分）。その後、培養物に２０ｎｇ／ｍｌの精製ヒトＳＰＢ−ボディピータンパク質（培養物当たり全体で１０ｎｇ）をマトリゲルの上に直接加えた。２光子共焦点レーザー走査型顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰ８）を用いて２分ごとに画像を取得し、ＬｅｉｃａアプリケーションスイートＸを使って蛍光強度を定量化した。統計分析前に、全ての測定値からバックグラウンド蛍光値を差し引いた。
【００９２】
免疫蛍光法の定量化
各核マーカーの画像をＩｍａｇｅＪを用いて定量化した。手短に説明すると、画像を８ビット画像に変換し、核染色に対応するように閾値を調整し、全領域の測定を可能にした。全領域をＩｍａｇｅＪの「Ａｎａｌｙｚｅ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ」機能により分析した。陽性細胞の全領域をＤＡＰＩの全領域で除算することにより、陽性細胞のパーセンテージを計算した。細胞外マトリックス定量化の場合には、蛍光強度をＬｅｉｃａアプリケーションスイートＸを用いて定量化した。統計分析前に、値を各個別の実験のＲＵＥＳ２対照に対し正規化した。
【００９３】
透過型電子顕微鏡
ＮＹＵ  Ｌａｎｇｏｎｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｃｏｒｅで、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）観察を実施した。ＬＢＯを０．１Ｍのカコジル酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．２）中の２．５％グルタルアルデヒドで２時間固定し、１％四酸化オスミウムで室温で１．５時間、後固定を行った後、標準的方法で処理し、ＥＭｂｅｄ  ８１２（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈａｔｆｉｅｌｄ，ＰＡ）中に埋め込んだ。厚切りの切片を１ｍｍに切り出し、１％トルイジンブルーで染色し、保存品質を評価し、目的の領域を見つけた。極薄の切片（６０ｎｍ）を切り出し、銅グリッド上に取り付け、酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で標準的方法により染色した。染色したグリッドを、Ｐｈｉｌｉｐｓ  ＣＭ−１２電子顕微鏡で調査し、Ｇａｔａｎ（４ｋ  ｘ２．７ｋ）デジタルカメラ（Ｇａｔａｎ，Ｉｎｃ．，Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ，ＣＡ）で撮影した。
【００９４】
呼吸器多核体ウイルス調製および感染
組換え赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）発現ＲＳＶ  Ａ２（ｒｒＲＳＶ）を、高感度緑色蛍光タンパク質をｐＤｓＲｅｄ由来野性型Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ  ＲＦＰ遺伝子で置換することにより、完全長ＲＳＶプラスミド１、ＭＰ２２４から生成した。細胞維持のために、ＨＥｐ−２細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−２３）およびベロ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−８１）を単層培養で増殖させ、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）および２ｍＭのＬ−グルタミンを補充したＤＭＥＭ中、５％ＣＯ２含有加湿雰囲気下、３７℃で維持した。ＨＥｐ−２細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−２３）中で、ウイルスストックを調製した。手短に説明すると、ＨＥｐ−２細胞を一晩増殖し、ＯｐｔｉＭＥＭで洗浄し、ｒｒＲＳＶで接種した。２．５時間の吸着期間後、細胞を、１％ＦＣＳを補充したＤＭＥＭ中で３日間インキュベートした。凍結−解凍の１サイクルとそれに続く、３，５００ｒｐｍの清澄化遠心分離によりウイルスを採取し、−８０℃で貯蔵した。２％メチルセルロースオーバーレイ、５％（ｖ／ｖ）ホルムアルデヒド固定、および５日間のクリスタルバイオレット染色（０．０１５％ｗ／ｖ）を用いた、ベロ細胞中のプラークアッセイによりウイルス力価を測定した。ｄ１７０  ＬＢＯのＲＳＶ感染に関しては、１ｍｌ中１０７プラーク形成単位（ＰＦＵ）のＲＳＶをウェル中の各マトリゲル培養物上に直接加え、３７℃で３時間インキュベートした。その後、ＲＳＶ接種材料を取り除き、培養物をＳＦＤ培地で５回、５分間にわたり洗浄し、分岐培地中で維持した。ホールマウント染色のために、抗ＲＳＶ（全抗原）抗体（Ｍｅｒｉｄｉａｎ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂ６５８９０Ｇ）を使って、培養物を示した時点で収集した。倒立顕微鏡または２光子共焦点レーザー走査型顕微鏡Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰ８（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｕｆｆａｌｏ  Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ）を用いて画像を取得した。
【００９５】
データ入手可能性
本研究の知見を裏付けるＲＮＡ塩基配列決定データセットは、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅａｄ  Ａｒｃｈｉｖｅ（ＳＲＡ）から入手可能である。ｄ２５  ＬＢＯ塩基配列決定のＳＲＡ受入番号は、ＳＲＰ０７３７４９であり、ｄ１７０  ＬＢＯは、ＳＲＲ４２９５２６９である。
【００９６】
統計および再現性
対応のない両側スチューデントのｔ検定または１元配置分散分析を用い、適用できる場合にはＰｒｉｓｍ７を使用して、統計分析を実施した。結果は、平均±平均の標準誤差で示し、ｐ値＜０．０５を統計的に有意と見なした。別段の定めがある場合を除き、Ｎ値は、生物学的に独立した反復実験回数を意味する。統計解析を実施しなかったので、研究者を、実験中の割り付けおよび動物試験の結果評価に対し盲検とはしなかった。実施例１に関する追加の参考文献：
１．Ｈａｌｌａｋ  ＬＫ，Ｓｐｉｌｌｍａｎｎ  Ｄ，Ｃｏｌｌｉｎｓ  ＰＬ，Ｐｅｅｐｌｅｓ  ＭＥ．Ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ  ｓｕｌｆａｔｉｏｎ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ２０００；７４：１０５０８−１０５１３．
【００９７】
実施例２：３次元肺芽オルガノイドおよびそれ由来分岐コロニーの生成のための詳細プロトコル。
このプロトコルは、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の分岐形態形成ができる３次元肺芽オルガノイド（ＬＢＯ）への分化について記載する。我々のグループにより以前に発表された２Ｄプロトコル１〜３をベースにして、我々は、３Ｄシステムを設計し、この場合、ｈＰＳＣが順次胚体内胚葉（ＤＥ）、前方前腸内胚葉（ＡＦＥ）および、接着２Ｄ培養における腹側ＡＦＥ、に順次分化し、続けて、浮遊培養によりＬＢＯ形成が可能となる。ｄ２５でマトリゲル中に播種すると、ＬＢＯは、強い外側への分岐を起こし、最終的に、肺発生の嚢状期中に形成される小嚢を想起させる拡張された先端部を形成した。これらの培養物は、ヒト肺発生および分岐形態形成の研究に使用できる。
【００９８】
オルガノイドは、臓器と同様に空間的に組織化され、少なくとも一部の特異的臓器機能を再現する４、複数の細胞型からなる構造体である。成人組織および多能性幹細胞の両方由来の、いくつかのタイプのオルガノイドについて説明されてきた。この技術は、発達生物学、臓器生理学および機能ならびに疾患モデリング５、６に研究に関して大きな影響を有すると思われる。しかし、真のヒト肺オルガノイドモデルは、まだ実現されていない。呼吸系は、漸進的により小さい気道になり、ガス交換が行われる肺胞７、８で終わる複雑な分岐系から構成される。ヒト肺オルガノイドの生成は、以前に報告された９、１０。しかし、記載オルガノイドは、分岐形態形成または中心部から周辺部への特異化を示さず、機能も実証されなかった。現在のプロトコルで記載の肺芽オルガノイド（ＬＢＯ）モデルは、分岐形態形成、中心部から周辺部への特異化およびインビボおよびインビトロ両方での初期肺胞形成の証拠を示す。それらの発生は、ヒト発生の２番目の三半期と等価の段階に到達している。マトリゲル中のＬＢＯ由来分岐構造体は、多数の層状体を有する２型肺胞上皮細胞（ＡＴ２）を含み、サーファクタントタンパク質のインビトロ取り込みおよび放出を行うことができる。さらに、ムチンおよびサーファクタントタンパク質の分泌、ならびに繊毛運動が、異種移植後に実証された。したがって、このプロトコルにより生成されたＬＢＯは、真のオルガノイドの定義を満たし、ヒト肺発生および可能性として、ヒト肺疾患のモデリングのために有用であると思われる。
【００９９】
【表２】
2020511968.tif 000004
2020511968.tif 000005
【表３】
2020511968.tif 000006
2020511968.tif 000007
【０１００】
装置：
正常酸素圧インキュベーター（９５％空気／５％ＣＯ２）
低酸素インキュベーター（５％Ｏ２／５％ＣＯ２）
遠心分離機
血球計数器
採取フード
【０１０１】
手順：
＊マトリゲル上のＭＥＦ枯渇（ｄ−１）＊
１．マトリゲルを氷上で解凍し、マトリゲルを含むアイスバケットを４℃で一晩放置する。
２．マトリゲルを冷ＩＭＤＭ中に希釈する（１：３０）。
３．６ｍｌの希釈したマトリゲル溶液を各１０ｃｍ２の組織培養物処理ディッシュに加え、室温で少なくとも３時間または４℃で一晩放置する。
４．１つ６ウェルプレート胚様体（ＥＢ）を作製するために、１ｍｌ／ウェルのアクターゼを用いてヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の２つの集密的ウェルを（６ウェルプレートから）剥がし、正常酸素圧インキュベーター中で２〜３分間インキュベートする。
５．アクターゼを吸引する。
６．停止培地で酵素を中和する。
７．１，４００ｒｐｍで４分間遠心分離し、剥離細胞をペレット化する。
８．酵素および停止培地を可能な限り吸引する。
９．１０〜１２ｍｌのｈＰＳＣ維持培地で細胞を再懸濁する。
１０．ディッシュから上清を吸引後、マトリゲルコートディッシュ中に細胞を播種する（ステップ３参照）。
１１．正常酸素圧インキュベーター中で細胞を一晩インキュベートする。
【０１０２】
内胚葉誘導（ｄ０〜ｄ４）
１．ｄ０で、マトリゲルコートディッシュからｈＰＳＣ維持培地を取り出し、３ｍｌのトリプシンを加える。正常酸素圧インキュベーター中でディッシュを１〜１．５分間インキュベートする。
２．トリプシン溶液を吸引し、１０ｍｌの停止培地を加えることにより、残りの酵素を停止させる。
３．剥離細胞を集め、１，４００ｒｐｍで４分間の遠心分離によりペレット化する。
４．酵素および停止培地を吸引する。
５．細胞を１２ｍｌの胚様体／原始線条形成培地に再懸濁し、６ウェル低接着性プレートに分配する（２ｍｌ／ウェル）。
６．低接着性プレートを低酸素インキュベーター中に置き、胚様体（ＥＢ）の形成を行わせる。
７．１２〜１６時間後、全ＥＢを１５ｍｌのチューブに集め、８００ｒｐｍで１分間遠心分離する。
８．胚様体／原始線条形成培地を吸引する。
９．ＥＢを１２ｍｌの内胚葉誘導培地に静かに再懸濁し、それらを低接着性プレートに均等に分配して戻す（２ｍｌ／ウェル）。
１０．プレートを低酸素インキュベーターに戻す。
１１．ｄ２で、１ｍｌの新しい内胚葉誘導培地を各ウェルに加える。
１２．ｄ３で、２ｍｌの新しい内胚葉誘導培地を各ウェルに加える。
１３．ｄ４．１〜ｄ４．３で、ＣＸＣＲ４およびｃ−ｋｉｔ発現のフローサイトメトリー分析により、内胚葉収率をチェックする。内胚葉収率が９０％超の場合、分化を継続する。
【０１０３】
前方化（ｄ５〜ｄ６）
１．フィブロネクチンを、ＤＰＢＳ中の０．２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ、１：５００、４ｕｇ／ｍｌ）に希釈することにより、フィブロネクチンコート６ウェルプレートを調製する。２ｍｌのフィブロネクチン／ＤＰＢＳ溶液を各ウェルに加え、正常酸素圧インキュベーター中でプレートを少なくとも３０分間または４℃で一晩インキュベートする。
２．トリプシン（最大４分間の消化に対し、ＥＢの６ウェルプレート当たり、３ｍｌのトリプシン）を用いて、ＥＢを単細胞に剥離させる。
３．停止培地で酵素を中和する。
４．血球計数器を使って細胞を計数する。
５．１，４００ｒｐｍで４分間の遠心分離により、解離細胞をペレット化する。
６．停止培地を吸引する。
７．細胞を７．５ｘ１０５細胞／２ｍｌで前方化培地−１に再懸濁する。
８．２ｍｌの細胞混合物を各ウェル（６ウェルプレート、フィブロネクチンコート、ステップ１参照）に加える。
９．正常酸素圧インキュベーター中でプレートをインキュベートする。
１０．２４時間（±１時間）後、前方化培地−１を前方化培地−２（２ｍｌ／ウェル）で置換する。
１１．プレートを正常酸素圧インキュベーターに戻す。
【０１０４】
腹側化および肺芽オルガノイド（ＬＢＯ）形成（ｄ６〜ｄ２５）
１．２４時間（±１時間）後、前方化培地−２を腹側化培地／分岐培地（２ｍｌ／ウェル）で置換する。
２．プレートを正常酸素圧インキュベーターに戻す。
３．４８時間後、全ての腹側化培地／分岐培地を吸引し、２ｍｌの新しい腹側化培地／分岐培地を各ウェルに加える。
４．ウェル全体に対して、Ｐ１０００チップでピペッティングによる下層での吸引と上層での吐出を静かに行いオルガノイドを懸濁させる。
５．懸濁オルガノイドを非組織培養物処理プレートに移す。
６．プレートを正常酸素圧インキュベーターに戻す。
７．プレートを傾かせて、オルガノイドを下端に沈下させることにより、オルガノイドを１日おきに供給する。オルガノイドに接触することを回避しながら、古い培地を取り出す。２ｍｌの新しい腹側化培地／分岐培地を各ウェルに加える。
【０１０５】
オルガノイドの分岐（ｄ２０〜実験の終わり）
１．ｄ２０〜ｄ２５の間に、採取フード中で、折り畳み構造を有するオルガノイドを選択する。
２．インサート当たりの所望の数のオルガノイドを各ウェル（ウェル当たり１００μｌの新しい腹側化培地／分岐培地を含む９６ウェルＵ底プレート）に入れる。通常、１〜４オルガノイドがインサート当たり播種される（２４ウェルインサート）。
３．２４ウェルインサートを非組織培養物治療プレート中に入れる。
４．５０μｌの１００％の冷マトリゲルを各インサートの底部に置く。
５．５分間またはマトリゲルが固化するまで待つ。
６．１回につき１つのウェルの腹側化培地／分岐培地を取り出す。
７．オルガノイドと３０μｌの１００％の冷マトリゲルとを静かに混合し、気泡生成を回避する。
８．直ちに、オルガノイド−マトリゲル混合物をインサートに中央に置く。
９．マトリゲルが固化する５分間待ち、オルガノイドをインサートの中央に固定する。
１０．さらなる５０μｌの１００％冷マトリゲルをインサートに加え、マトリゲルサンドイッチを形成する。
１１．プレートを正常酸素圧インキュベーター中に１０分間入れ、全てのマトリゲルが固化したことを保証する。
１２．５００μｌの腹側化培地／分岐培地をインサートに加え、別の５００μｌの腹側化培地／分岐培地をウェル中に加える。
１３．正常酸素圧インキュベーターで培養物をインキュベートし、培地を２〜３日毎に置換する。
【０１０６】
タイミング：
各ステップのハンズオン時間：
マトリゲル上のＭＥＦ枯渇（ｄ−１）：２０分
内胚葉誘導（ｄ０〜ｄ４）：２時間
前方化（ｄ５〜ｄ６）：１時間
腹側化および肺芽オルガノイド（ＬＢＯ）形成：３０分＋オルガノイドの懸濁：５分／プレート
オルガノイドの分岐：２４インサートの埋め込み、およびそれらの培地への供給を終わるまで、おおよそ２時間。
【０１０７】
予測結果：
この分化プロトコルを用いて、オルガノイドになる接着凝集塊は、腹側化培地／分岐培地に切り替えた２日後に形ができる（プロトコルのｄ８）。懸濁オルガノイド内の折り畳み構造は、早くもｄ１０〜ｄ１２に生ずる。オルガノイドからの分岐出芽の生成は、マトリゲル埋め込み後、１週間で起こる。埋め込み後２〜３週間で、広範囲に分岐したオルガノイドが観察される。異なる細胞株は、初期オルガノイド形成の間、異なった挙動をする。いくつかのｉＰＳ株は、オルガノイド懸濁の前、ｄ８に明白な接着凝集塊を有する傾向がなかった。しかし、それらは、懸濁後オルガノイドを形成し、それらは、マトリゲル中で分岐しなかった。
【０１０８】
実施例２に関する追加の参考文献：
１．Ｇｒｅｅｎ，Ｍ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｆｏｒｅｇｕｔ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２９，２６７−２７２，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．ｌ７８８（２０１１）．
２．Ｈｕａｎｇ，Ｓ．Ｘ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｕｎｇ  ａｎｄ  ａｉｒｗａｙ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ  １０，４１３−４２５，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１５．０２３（２０１５）．
３．Ｈｕａｎｇ，Ｓ．Ｘ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｕｎｇ  ａｎｄ  ａｉｒｗａｙ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３２，８４−９１，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２７５４（２０１４）．
４．Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，Ｍ．Ａ．＆  Ｋｎｏｂｌｉｃｈ，Ｊ．Ａ．Ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ａ  ｄｉｓｈ：ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｕｓｉｎｇ  ｏｒｇａｎｏｉｄ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４５，１２４７１２５，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２４７１２５（２０１４）．
５．Ｆａｔｅｈｕｌｌａｈ，Ａ．，Ｔａｎ，Ｓ．Ｈ．＆  Ｂａｒｋｅｒ，Ｎ．Ｏｒｇａｎｏｉｄｓ  ａｓ  ａｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １８，２４６−２５４，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｂ３３１２（２０１６）．
６．Ｃｌｅｖｅｒｓ，Ｈ．Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ｗｉｔｈ  Ｏｒｇａｎｏｉｄｓ．Ｃｅｌｌ  １６５，１５８６−１５９７，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１６．０５．０８２（２０１６）．
７．Ｈｅｒｒｉｇｅｓ，Ｍ．＆  Ｍｏｒｒｉｓｅｙ，Ｅ．Ｅ．Ｌｕｎｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：ｏｒｃｈｅｓｔｒａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｏｒｇａｎ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １４１，５０２−５１３，ｄｏｉ：１０．１２４２／ｄｅｖ．０９８１８６（２０１４）．
８．Ｍｏｒｒｉｓｅｙ，Ｅ．Ｅ．＆  Ｈｏｇａｎ，Ｂ．Ｌ．Ｐｒｅｐａｒｉｎｇ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ｂｒｅａｔｈ：ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｉｎ  ｌｕｎｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ  １８，８−２３，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｄｅｖｃｅｌ．２００９．１２．０１０（２０１０）．
９．Ｄｙｅ，Ｂ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｎｉｃｈｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｌｕｎｇ  ｏｒｇａｎｏｉｄｓ．Ｅｌｉｆｅ  ５，ｄｏｉ：１０．７５５４／ｅＬｉｆｅ．１９７３２（２０１６）．
１０．Ｄｙｅ，Ｂ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｌｕｎｇ  ｏｒｇａｎｏｉｄｓ．Ｅｌｉｆｅ  ４，ｄｏｉ：１０．７５５４／ｅＬｉｆｅ．０５０９８（２０１５）．
【０１０９】
実施例３：ＲＵＥＳ２−ＨＰＳ１株の生成と特性評価
ＲＵＥＳ２−ＨＰＳ１株をＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＣｅｎｔｅｒのＳｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙで生成した。手短に説明すると、ＲＵＥＳ２細胞（継代２５）をマトリゲルでコートした６ウェルプレートで７０〜８０％コンフルエンスまで培養した。細胞を、６ウェルプレートのウェル当たり、７．５μｇのＨＰＳ１ガイドＲＮＡプラスミド（ｐＸ３３０、Ａｄｄｇｅｎｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＃４２２３０）＋２．５μｇのＣａｓ９ｍＣｈｅｒｒｙで、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ４Ｄを用いて電気穿孔処理した。Ｃａｓ９ｍＣｈｅｒｒｙ由来ｍＣｈｅｒｒｙを、遺伝子導入された細胞を選別するための蛍光マーカーとして使用した。遺伝子導入の２４時間後、細胞をＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｓ３ｅセルソーターを用いてＦＡＣＳにより選別し、約２，０００細胞／６ｃｍディッシュでＭＥＦフィーダーに播種した。コロニーを選別後７〜１０日に採取した。個々のクローン由来のゲノムＤＮＡを単離し、ＨＰＳ１特異的ＰＣＲプライマー（ＨＰＳ１−Ｆ−１（ＧＴＡＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧＡＴＣＣＡＡＧＡＧＧ）およびＨＰＳ１−Ｒ−１（ＧＡＡＣＡＡＧＧＴＧＧＴＣＣＡＣＡＣＡ）、予測される４２０ｂｐバンド）を用いて遺伝子型判定を実施した。ＰＣＲ産物を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ反応（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を用いて、適切な配列のプラスミドに挿入した。塩基配列決定は、各アレル中の未成熟停止コドンを明らかにした（図１０）。上記技術を実施し、ＨＰＳ２（図１３、ＡＰ３Ｂ１、エキソン４）、ＨＰＳ８（図１４、ＢＬＯＣ１Ｓ３  エキソン２）、ＳＦＰＴＣ（図１５、ＳＦＴＰＣ  エキソン２）またはテロメラーゼ（図１６、ＴＥＲＣ、エキソン１）遺伝子に変異を有する細胞株を作製した。本明細書の教示を考慮すると、当業者なら、目的の変異を有する多くの他の細胞株が作製でき、その後、さらなる研究、評価、およびスクリーニングのためのＬＢＯに成長させ得ることを理解するであろう。
【０１１０】
ヒドロキシプロリン含量
製造業者のプロトコル（Ｓｉｇｍａ、ＭＡＫ００８−１ＫＴ）に従って、ヒドロキシプロリン含量を測定した。手短に説明すると、ＲＵＥＳ２またはＲＵＥＳ２−ＨＰＳ１培養物由来の試料をガラス／テフロン・ダンス型組織ホモジナイザーによりホモジナイズし（１００μｌ中の１０ｍｇ試料）、耐圧性バイアルに移し、続けて、１０ｍｇの試料当たり、１００μｌの濃塩酸（約１２Ｍ）を加えた。混合物を１２０℃で３時間加水分解した。
試料を９６ウェルプレート中、６０℃で乾燥し、続けて、クロラミンＴ／酸化バッファー混合物を用いて室温で５分間およびＤＭＡＢ試薬を用いて６０℃でさらに９０分間インキュベートした。ヒドロキシプロリン含量は、５６０ｎｍで測定した。同じ量のマトリゲルを対照として使用した。
【０１１１】
鍵遺伝子を用いた比較分析
鍵遺伝子を用いて、ＲＵＥＳ２、Ｃ１２、ＨＤＦ  ＳＶおよびＨＤＦ  ｍＲＮＡ株由来のｄ１７０  ＬＢＯから得たＲＮＡｓｅｑデータを、他の１番目と２番目の三半期および肺を含む成人臓器と比較した。LBOとｄ１７０の１２試料および２番目の三半期からの１９臓器由来の７５試料の階層型クラスタリングをＣｌｕｓｔｅｒ３．０を用いて実施し、ツリー表示で調べた。８７関連遺伝子が鍵遺伝子により計算された。
【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
2020511968.tif 000016
【０１１２】
参考文献
上付き文字の文献は参考文献リスト１に記載され、下付き文字の文献は参考文献リスト２に記載されている。
参考文献リスト１：
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５．Ｖｉｃａｒｙ，Ｇ．Ｗ．，Ｖｅｒｇｎｅ，Ｙ．，Ｓａｎｔｉａｇｏ−Ｃｏｍｉｅｒ，Ａ．，Ｙｏｕｎｇ，Ｌ．Ｒ．＆  Ｒｏｍａｎ，Ｊ．Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｉｎ  Ｈｅｒｍａｎｓｋｙ−Ｐｕｄｌａｋ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ａｎｎ  Ａｍ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｓｏｃ，ｄｏｉ：１０．１５１３／ＡｎｎａｌｓＡＴＳ．２０１６０３−１８６ＦＲ（２０１６）．
６．Ｈｅｒｒｉｇｅｓ，Ｍ．＆  Ｍｏｒｒｉｓｅｙ，Ｅ．Ｅ．Ｌｕｎｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：ｏｒｃｈｅｓｔｒａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｏｒｇａｎ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １４１，５０２−５１３，
ｄｏｉ：１０．１２４２／ｄｅｖ．０９８１８６（２０１４）．
７．Ｍｏｒｒｉｓｅｙ，Ｅ．Ｅ．＆  Ｈｏｇａｎ，Ｂ．Ｌ．Ｐｒｅｐａｒｉｎｇ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ｂｒｅａｔｈ：ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｉｎ  ｌｕｎｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ  １８，８−２３，ｄｏｉ：Ｓ１５３４−５８０７（０９）００５２７−９  ［ｐｉｉ］１０．１０１６／ｊ  ．ｄｅｖｃｅｌ．２００９．１２．０１０（２０１０）．
８．Ｄｙｅ，Ｂ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｌｕｎｇ  ｏｒｇａｎｏｉｄｓ．ｅＬｉｆｅ  ４，ｄｏｉ：１０．７５５４／ｅＬｉｆｅ．０５０９８（２０１５）．
９．Ｄｙｅ，Ｂ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｎｉｃｈｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｌｕｎｇ  ｏｒｇａｎｏｉｄｓ．ｅＬｉｆｅ  ５，ｄｏｉ：１０．７５５４／ｅＬｉｆｅ．１９７３２（２０１６）．
１０．Ｈｕａｎｇ，Ｓ．Ｘ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｕｎｇ  ａｎｄ  ａｉｒｗａｙ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３２，８４−９１，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２７５４（２０１４）．．
１１．Ｇｒｅｅｎ，Ｍ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｆｏｒｅｇｕｔ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２９，２６７−２７２，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．ｌ７８８（２０１１）．
１２．Ｈｕａｎｇ，Ｓ．Ｘ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｕｎｇ  ａｎｄ  ａｉｒｗａｙ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  １０，４１３−４２５，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１５．０２３（２０１５）．
１３．Ｋｕｍａｒ，Ｍ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｃｅｌｌｓ．Ｄｅｆｉｎｉｎｇ  ａ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｎｉｃｈｅ  ａｔ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４６，１２５８８１０，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ｌ２５８８１０（２０１４）．
１４．Ｈｒｙｃａｊ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｈｏｘ５  Ｇｅｎｅｓ  Ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｔｈｅ  Ｗｎｔ２／２ｂ−Ｂｍｐ４−Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ａｘｉｓ  ｄｕｒｉｎｇ  Ｌｕｎｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｃｅｌｌ  ｒｅｐｏｒｔｓ  １２，９０３−９１２，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｒｅｐ．２０１５．０７．０２０（２０１５）．
１５．Ｌｉｕ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｈｅｄｇｅｈｏｇ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｎｅｏｎａｔａｌ  ａｎｄ  ａｄｕｌｔ  ｌｕｎｇ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｃｅｌｌ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ４８，７０３−７１０，ｄｏｉ：１０．１１６５／ｒｃｍｂ．２０１２−０３４７０Ｃ（２０１３）．
１６．Ｂｅｌｌｕｓｃｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ（Ｓｈｈ）ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｌｕｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２４，５３−６３（１９９７）．
１７．Ｐｅｐｉｃｅｌｌｉ，Ｃ．Ｖ．，Ｌｅｗｉｓ，Ｐ．Ｍ．＆  ＭｃＭａｈｏｎ，Ａ．Ｐ．Ｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｂｒａｎｃｈｉｎｇ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｌｕｎｇ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ：ＣＢ  ８，１０８３−１０８６（１９９８）．
１８．Ｑｕｅ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｏｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｒｏｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｓｏｘ２  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｆｏｒｅｇｕｔ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３４，２５２１−２５３１，ｄｏｉ：１０．１２４２／ｄｅｖ．００３８５５（２００７）．
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１０．Ｌａｗｓｏｎ，Ｗ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ  ａｒｅ  ａ  ｒａｒｅ  ｃａｕｓｅ  ｏｆ  ｓｐｏｒａｄｉｃ  ｃａｓｅｓ  ｏｆ  ＩＰＦ．Ｔｈｏｒａｘ  ５９，９７７−９８０（２００４）．
１１．Ｎｏｇｅｅ，Ｌ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ  ｇｅｎｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｆａｍｉｌｉａｌ  ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｌｕｎｇ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３４４，５７３−５７９（２００１）．
１２．Ｔｈｏｍａｓ，Ａ．Ｑ．ｅｔ  ａｌ．Ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ  ｆｏｒ  ａ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ  ｇｅｎｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｕｓｕａｌ  ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｐｎｅｕｍｏｎｉｔｉｓ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｎｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｐｎｅｕｍｏｎｉｔｉｓ  ｉｎ  ｏｎｅ  ｋｉｎｄｒｅｄ．Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  １６５，１３２２−１３２８（２００２）．
１３．Ｗａｎｇ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｅｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ２  ａｒｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８４，５２−５９（２００９）．
１４．Ａｒｍａｎｉｏｓ，Ｍ．Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ａｎｄ  ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７３０，５２−５８（２０１２）．
１５．Ｌｏｙｄ，Ｊ．Ｅ．Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｉｎ  ｆａｍｉｌｉｅｓ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｃｅｌｌ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ２９，Ｓ４７−５０（２００３）．
１６．Ｐｉｅｒｓｏｎ，Ｄ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｉｎ  ｈｅｒｍａｎｓｋｙ−ｐｕｄｌａｋ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ，ａ  ｃａｓｅ  ｒｅｐｏｒｔ  ａｎｄ  ｒｅｖｉｅｗ．Ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ；ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｏｒａｃｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ７３，３８２−３９５（２００６）．
１７．Ｍａｈａｖａｄｉ，Ｐ．，Ｇｕｅｎｔｈｅｒ，Ａ．＆  Ｇｏｃｈｕｉｃｏ，Ｂ．Ｒ．Ｈｅｒｍａｎｓｋｙ−Ｐｕｄｌａｋ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ：ｉｔ’ｓ  ｔｈｅ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ，ｓｔｕｐｉｄ！  Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  １８６，９３９−９４０（２０１２）．
１８．Ｍａｈａｖａｄｉ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｓｔｒｅｓｓ  ａｎｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｕｎｄｅｒｌｉｅ  Ｈｅｒｍａｎｓｋｙ−Ｐｕｄｌａｋ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ．Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  １８２，２０７−２１９（２０１０）．
１９．Ｙｏｕｎｇ，Ｌ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ａｌｖｅｏｌａｒ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  ｌｕｎｇ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｉｎ  Ｈｅｒｍａｎｓｋｙ−Ｐｕｄｌａｋ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  １８６，１０１４−１０２４（２０１２）．
２０．Ｙｏｕｎｇ，Ｌ．Ｒ．，Ｐａｓｕｌａ，Ｒ．，Ｇｕｌｌｅｍａｎ，Ｐ．Ｍ．，Ｄｅｕｔｓｃｈ，Ｇ．Ｈ．＆  ＭｃＣｏｒｍａｃｋ，Ｆ．Ｘ．Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｅｒｍａｎｓｋｙ−Ｐｕｄｌａｋ  ｍｉｃｅ  ｔｏ  ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｃｅｌｌ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｃｅｌｌ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ３７，６７−７４（２００７）．
２１．Ｈｕｉｚｉｎｇ，Ｍ．，Ｈｅｌｉｐ−Ｗｏｏｌｅｙ，Ａ．，Ｗｅｓｔｂｒｏｅｋ，Ｗ．，Ｇｕｎａｙ−Ａｙｇｕｎ，Ｍ．＆  Ｇａｈｌ，Ｗ．Ａ．Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｏｆ  ｌｙｓｏｓｏｍｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｏｒｇａｎｅｌｌｅ  ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ：ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ９，３５９−３８６（２００８）．
２２．Ｌｕｚｉｏ，Ｊ．Ｐ．，Ｈａｃｋｍａｎｎ，Ｙ．，Ｄｉｅｃｋｍａｎｎ，Ｎ．Ｍ．＆  Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｇ．Ｍ．Ｔｈｅ  ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｌｙｓｏｓｏｍｅｓ  ａｎｄ  ｌｙｓｏｓｏｍｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｏｒｇａｎｅｌｌｅｓ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｉｎ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ６，ａ０１６８４０（２０１４）．
２３．Ａｌｄｅｒ，Ｊ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｅｌｏｍｅｒｅ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｃａｕｓｅｓ  ａｌｖｅｏｌａｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆａｉｌｕｒｅ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １１２，５０９９−５１０４（２０１５）．
２４．Ｂａｒｋａｕｓｋａｓ，Ｃ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｙｐｅ  ２  ａｌｖｅｏｌａｒ  ｃｅｌｌｓ  ａｒｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ａｄｕｌｔ  ｌｕｎｇ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ（２０１３）．
２５．Ｄｅｓａｉ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｒｏｗｎｆｉｅｌｄ，Ｄ．Ｇ．＆  Ｋｒａｓｎｏｗ，Ｍ．Ａ．Ａｌｖｅｏｌａｒ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ａｎｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｌｕｎｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｒｅｎｅｗａｌ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔｕｒｅ  ５０７，１９０−１９４（２０１４）．
２６．Ａｒｍａｎｉｏｓ，Ｍ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｆａｍｉｌｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３５６，１３１７−１３２６（２００７）．
２７．Ａｌｄｅｒ，Ｊ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｈｏｒｔ  ｔｅｌｏｍｅｒｅｓ  ａｒｅ  ａ  ｒｉｓｋ  ｆａｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０５，１３０５１−１３０５６（２００８）．
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３０．Ａｒｍａｎｉｏｓ，Ｍ．Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ−ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｆａｉｌｕｒｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３６７，３８４；ａｕｔｈｏｒ  ｒｅｐｌｙ  ３８４（２０１２）．
３１．Ｃａｒｍｏｎａ−Ｒｉｖｅｒａ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ，ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｎｏｎ−Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃａｎ  Ｈｅｒｍａｎｓｋｙ−Ｐｕｄｌａｋ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｈｉｓｐａｎｉｃ  ｄｅｓｃｅｎｔ．Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  １３１，２３９４−２４００（２０１１）．
３２．Ｗａｎｇ，Ｌ．＆  Ｌｙｅｒｌａ，Ｔ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｈａｎｇｅｓ  ａｃｃｏｍｐａｎｙｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｐｐｅａｒａｎｃｅ  ｏｆ  ｌｕｎｇ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｉｎ  ａｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  Ｈｅｒｍａｎｓｋｙ  Ｐｕｄｌａｋ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  １３４，２０５−２１３（２０１０）．
３３．Ｓｍｉｔｈ，Ｌ．Ｊ．，Ｋａｐｌａｎ，Ｎ．Ｂ．＆  Ｂｒｏｄｙ，Ｊ．Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｏｆ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｂｅｉｇｅ  ｍｏｕｓｅ  ａｌｖｅｏｌａｒ  ｔｙｐｅ  ２  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｌｕｎｇ  ｉｎｊｕｒｙ．Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ  １２２，９４７−９５７（１９８０）．
３４．Ｃｈｉ，Ｅ．Ｙ．，Ｌａｇｕｎｏｆｆ，Ｄ．＆  Ｋｏｅｈｌｅｒ，Ｊ．Ｋ．Ａｂｎｏｒｍａｌｌｙ  ｌａｒｇｅ  ｌａｍｅｌｌａｒ  ｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｐｎｅｕｍｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｄｉａｋ−Ｈｉｇａｓｈｉ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｉｎ  ｂｅｉｇｅ  ｍｉｃｅ．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ；ａ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ３４，１６６−１７３（１９７６）．
３５．Ｃｌａｒｋｅ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  ｓｔｒｅｓｓ，ｔｈｅ  ｕｎｆｏｌｄｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ，ａｕｔｏｐｈａｇｙ，ａｎｄ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｆａｔｅ．Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７２，１３２１−  １３３１（２０１２）．
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３７．Ａｓｈｒａｆｉ，Ｇ．＆  Ｓｃｈｗａｒｚ，Ｔ．Ｌ．Ｔｈｅ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｏｆ  ｍｉｔｏｐｈａｇｙ  ｆｏｒ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  ｃｌｅａｒａｎｃｅ  ｏｆ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ．Ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ２０，３１−４２（２０１３）．
３８．Ｗｏｌｆｆ，Ｓ．，Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｊ．Ｓ．＆  Ｄｉｌｌｉｎ，Ａ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｃａｌｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｃｅｌｌ  １５７，５２−６４（２０１４）．
３９．Ｒｏｏｎｅｙ，Ｓ．Ａ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．Ｐａｒｔ  Ａ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １２９，２３３−２４３（２００１）．
４０．Ｗｈｉｔｓｅｔｔ，Ｊ．Ａ．，Ｗｅｒｔ，Ｓ．Ｅ．＆  Ｗｅａｖｅｒ，Ｔ．Ｅ．Ａｌｖｅｏｌａｒ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ６１，１０５−１１９（２０１０）．
４１．Ｈｕａｎｇ，Ｓ．Ｘ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｕｎｇ  ａｎｄ  ａｉｒｗａｙ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３２，８４−９１（２０１４）．
４２．Ｇｒｅｅｎ，Ｍ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｆｏｒｅｇｕｔ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２９，２６７−２７２（２０１１）．
４３．Ｈｕａｎｇ，Ｓ．Ｘ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｕｎｇ  ａｎｄ  ａｉｒｗａｙ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  １０，４１３−４２５（２０１５）．
４４．Ｏｈ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  Ｈｅｒｍａｎｓｋｙ−Ｐｕｄｌａｋ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ，ａ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ  ｏｆ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｏｒｇａｎｅｌｌｅｓ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  １４，３００−３０６（１９９６）．
４５．Ｉｎｏｕｅ，Ｈ．，Ｎａｇａｔａ，Ｎ．，Ｋｕｒｏｋａｗａ，Ｈ．＆  Ｙａｍａｎａｋａ，Ｓ．ｉＰＳ  ｃｅｌｌｓ：ａ  ｇａｍｅ  ｃｈａｎｇｅｒ  ｆｏｒ  ｆｕｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  ｊｏｕｒｎａｌ  ３３，４０９−４１７（２０１４）．
４６．  Ｒｏｃｋ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ  ｔｏ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｔｏ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０８，Ｅ１４７５−１４８３（２０１１）．
４７．Ｈｏｇａｎ，Ｂ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｐａｉｒ  ａｎｄ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ：ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ，ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ，ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｌｕｎｇ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  １５，１２３−１３８（２０１４）．
４８．Ｒｏｃｋ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｂａｓａｌ  ｃｅｌｌｓ  ａｓ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｔｒａｃｈｅａ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ａｉｒｗａｙ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０６，１２７７１−１２７７５（２００９）．
４９．Ｒａｗｌｉｎｓ，Ｅ．Ｌ．＆  Ｈｏｇａｎ，Ｂ．Ｌ．Ｃｉｌｉａｔｅｄ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｌｉｆｅｓｐａｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｔｒａｃｈｅａ  ａｎｄ  ｌｕｎｇ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．Ｌｕｎｇ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ２９５，Ｌ２３１−  ２３４（２００８）．
５０．Ｒａｗｌｉｎｓ，Ｅ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｓｃｇｂｌａｌ＋  Ｃｌａｒａ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ａｎｄ  ｒｅｐａｉｒ  ｏｆ  ｌｕｎｇ  ａｉｒｗａｙ，ｂｕｔ  ｎｏｔ  ａｌｖｅｏｌａｒ，ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ．Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ４，５２５−５３４（２００９）．
５１．Ｋｕｍａｒ，Ｐ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｄｉｓｔａｌ  ａｉｒｗａｙ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｙｉｅｌｄ  ａｌｖｅｏｌｉ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｄｕｒｉｎｇ  ｌｕｎｇ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  Ｈ１Ｎ１  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ  １４７，５２５−５３８（２０１１）．
５２．Ｋｉｍ，Ｃ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｒｏｎｃｈｉｏａｌｖｅｏｌａｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ｌｕｎｇ  ａｎｄ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃｅｌｌ  １２１，８２３−８３５（２００５）．
５３．Ｚｕｏ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．ｐ６３（＋）Ｋｒｔ５（＋）ｄｉｓｔａｌ  ａｉｒｗａｙ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｒｅ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｌｕｎｇ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ５１７，６１６−６２０（２０１５）．
５４．Ｃｈａｐｍａｎ，Ｈ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｌｐｈａ６ｂｅｔａ４  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ａｎ  ａｄｕｌｔ  ｄｉｓｔａｌ  ｌｕｎｇ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １２１，２８５５−２８６２（２０１１）．
５５．Ｖａｕｇｈａｎ，Ａ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｌｉｎｅａｇｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ｍｏｂｉｌｉｚｅ  ｔｏ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ｌｕｎｇ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ  ａｆｔｅｒ  ｍａｊｏｒ  ｉｎｊｕｒｙ．Ｎａｔｕｒｅ  ５１７，６２１−６２５（２０１５）．
５６．Ｍｕｌｕｇｅｔａ，Ｓ．，Ｎｕｒｅｋｉ，Ｓ．＆  Ｂｅｅｒｓ，Ｍ．Ｆ．Ｌｏｓｔ  ａｆｔｅｒ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ：ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｆｒｏｍ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｆｏｒ  ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ａｌｖｅｏｌａｒ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｉｎ  ｆｉｂｒｏｔｉｃ  ｌｕｎｇ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．Ｌｕｎｇ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ３０９，Ｌ５０７−５２５（２０１５）．
５７．Ａｎｉｋｓｔｅｒ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅ  ｃａｕｓｅｓ  ａ  ｕｎｉｑｕｅ  ｆｏｒｍ  ｏｆ  Ｈｅｒｍａｎｓｋｙ−  Ｐｕｄｌａｋ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｉｎ  ａ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｓｏｌａｔｅ  ｏｆ  ｃｅｎｔｒａｌ  Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２８，３７６−３８０（２００１）．
５８．Ｆｅｎｇ，Ｇ．Ｈ．，Ｂａｉｌｉｎ，Ｔ．，Ｏｈ，Ｊ．＆  Ｓｐｒｉｔｚ，Ｒ．Ａ．Ｍｏｕｓｅ  ｐａｌｅ  ｅａｒ（ｅｐ）ｉｓ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  Ｈｅｒｍａｎｓｋｙ−Ｐｕｄｌａｋ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ａｎｄ  ｃｏｎｔａｉｎｓ  ａ  ｒａｒｅ  ’ＡＴ−ＡＣ’  ｉｎｔｒｏｎ．Ｈｕｍａｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６，７９３−７９７（１９９７）．
５９．Ｆｅｎｇ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ｈｅｒｍａｎｓｋｙ−Ｐｕｄｌａｋ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  １（ＨＰＳ１）ａｎｄ  ＨＰＳ２  ｇｅｎｅｓ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｄｅｎｓｅ  ｇｒａｎｕｌｅｓ，ｍｅｌａｎｏｓｏｍｅｓ，ａｎｄ  ｌｙｓｏｓｏｍｅｓ．Ｂｌｏｏｄ  ９９，１６５１−１６５８（２００２）．
６０．Ｌｉ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．Ｈｅｒｍａｎｓｋｙ−Ｐｕｄｌａｋ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｔｙｐｅ  ７（ＨＰＳ−７）ｒｅｓｕｌｔｓ  ｆｒｏｍ  ｍｕｔａｎｔ  ｄｙｓｂｉｎｄｉｎ，ａ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｌｙｓｏｓｏｍｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｏｒｇａｎｅｌｌｅｓ  ｃｏｍｐｌｅｘ  １（ＢＬＯＣ−１）．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ３５，８４−８９（２００３）．
６１．Ｓｕｚｕｋｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｈｅｒｍａｎｓｋｙ−Ｐｕｄｌａｋ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｉｓ  ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ＨＰＳ４，ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｌｉｇｈｔ−ｅａｒ  ｇｅｎｅ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ３０，３２１−３２４（２００２）．
６２．Ｌｉ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｕｒｉｎｅ  Ｈｅｒｍａｎｓｋｙ−Ｐｕｄｌａｋ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｇｅｎｅｓ：ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｌｙｓｏｓｏｍｅ−  ｒｅｌａｔｅｄ  ｏｒｇａｎｅｌｌｅｓ．ＢｉｏＥｓｓａｙｓ  ：ｎｅｗｓ  ａｎｄ  ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ２６，６１６−６２８（２００４）．
６３．Ａｔｏｃｈｉｎａ−Ｖａｓｓｅｒｍａｎ，Ｅ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．Ｅａｒｌｙ  ａｌｖｅｏｌａｒ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｌｕｎｇ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｈｅｒｍａｎｓｋｙ−Ｐｕｄｌａｋ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  １８４，４４９−４５８（２０１１）．
６４．Ｂａｒｂｏｓａ，Ｍ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｂｅｉｇｅ  ａｎｄ  Ｃｈｅｄｉａｋ−Ｈｉｇａｓｈｉ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｇｅｎｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ３８２，２６２−２６５（１９９６）．
６５．Ｃｕｌｌｉｎａｎｅ，Ａ．Ｒ．，Ｓｃｈａｆｆｅｒ，Ａ．Ａ．＆  Ｈｕｉｚｉｎｇ，Ｍ．Ｔｈｅ  ＢＥＡＣＨ  ｉｓ  ｈｏｔ：ａ  ＬＹＳＴ  ｏｆ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｒｏｌｅｓ  ｆｏｒ  ＢＥＡＣＨ−ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｔｒａｆｆｉｃ  １４，７４９−  ７６６（２０１３）．
６６．Ｎａｋａｔａｎｉ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ  ｉｎ  Ｈｅｒｍａｎｓｋｙ−Ｐｕｄｌａｋ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ｆｌｏｒｉｄ  ｆｏａｍｙ  ｓｗｅｌｌｉｎｇ／ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ（ｇｉａｎｔ  ｌａｍｅｌｌａｒ  ｂｏｄｙ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）ｏｆ  ｔｙｐｅ−２  ｐｎｅｕｍｏｃｙｔｅｓ．Ｖｉｒｃｈｏｗｓ  Ａｒｃｈ  ４３７，３０４−３１３（２０００）．
６７．Ｗｈｉｔｓｅｔｔ，Ｊ．Ａ．，Ｗｅｒｔ，Ｓ．Ｅ．＆  Ｗｅａｖｅｒ，Ｔ．Ｅ．Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｆ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ．Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １０，３７１−３９３（２０１５）．
６８．Ｈａｗｋｉｎｓ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｎｏｎ−ＢＲＩＣＨＯＳ  ＳＦＴＰＣ  ｍｕｔａｎｔ（ＳＰ−ＣＩ７３Ｔ）ｌｉｎｋｅｄ  ｔｏ  ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｌｕｎｇ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ａ  ｌａｔｅ  ｂｌｏｃｋ  ｉｎ  ｍａｃｒｏａｕｔｏｐｈａｇｙ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｔｅｏｓｔａｓｉｓ  ａｎｄ  ｍｉｔｏｐｈａｇｙ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．Ｌｕｎｇ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ３０８，Ｌ３３−４７（２０１５）．
６９．Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｉ．Ｅ．＆  Ｅｉｃｋｅｌｂｅｒｇ，Ｏ．Ｔｈｅ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ＴＧＦ−ｂｅｔａ  ｏｎ  ｌｕｎｇ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ：ｆｒｏｍ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｏ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ．Ｐｒｏｃ  Ａｍ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｓｏｃ  ９，１１１−１１６（２０１２）．
７０．Ｃｈｉｌｏｓｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ａｂｅｒｒａｎｔ  Ｗｎｔ／ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １６２，１４９５−１５０２（２００３）．
７１．Ｂｏｌａｎｏｓ，Ａ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｓｏｎｉｃ  Ｈｅｄｇｅｈｏｇ  ｉｎ  ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．Ｌｕｎｇ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ３０３，Ｌ９７８−９９０（２０１２）．
７２．Ｃｒｅｓｔａｎｉ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｌｕｎｇ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ｐｒｏｃ  Ａｍ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｓｏｃ  ９，１５８−１６３（２０１２）．
７３．Ｋｒａｍａｎｎ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｅｒｉｖａｓｃｕｌａｒ  ｇｌｉｌ（＋）ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ａｒｅ  ｋｅｙ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｏｒｓ  ｔｏ  ｉｎｊｕｒｙ−  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｏｒｇａｎ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  １６，５１−６６（２０１５）．
７４．Ｚｈｏｎｇ，Ｑ．ｅｔ  ａｌ．Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  ｓｔｒｅｓｓ  ｉｎ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｖｅｏｌａｒ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ：ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｍｉｓｆｏｌｄｅｄ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｃｅｌｌ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ４５，４９８−５０９（２０１１）．
７５．Ｔａｎｊｏｒｅ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ａｌｖｅｏｌａｒ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｕｎｄｅｒｇｏ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ｔｏ−ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  ｓｔｒｅｓｓ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８６，３０９７２−３０９８０（２０１１）．
７６．Ｋａｇｅ，Ｈ．＆  Ｂｏｒｏｋ，Ｚ．ＥＭＴ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｌｕｎｇ  ｄｉｓｅａｓｅ：ａ  ｍｙｓｔｅｒｉｏｕｓ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １８，５１７−５２３（２０１２）．
７７．Ｓｅｉｂｏｌｄ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｃｏｍｍｏｎ  ＭＵＣ５Ｂ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ａｎｄ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３６４，１５０３−１５１２（２０１１）．
７８．Ｐｅｌｊｔｏ，Ａ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｈｅ  ＭＵＣ５Ｂ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ａｎｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ．ＪＡＭＡ  ：ｔｈｅ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ３０９，２２３２−２２３９（２０１３）．
７９．Ｆｉｎｇｅｒｌｉｎ，Ｔ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｙ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｌｏｃｉ  ｆｏｒ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ４５，６１３−６２０（２０１３）．
８０．Ｍｕｒｒｙ，Ｃ．Ｅ．＆  Ｋｅｌｌｅｒ，Ｇ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ  ｒｅｌｅｖａｎｔ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ：ｌｅｓｓｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｃｅｌｌ  １３２，６６１−６８０（２００８）．
８１．Ｈａｎｎａ，Ｊ．Ｈ．，Ｓａｈａ，Ｋ．＆  Ｊａｅｎｉｓｃｈ，Ｒ．Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ：ｆａｃｔｓ，ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ，ｕｎｒｅｓｏｌｖｅｄ  ｉｓｓｕｅｓ．Ｃｅｌｌ  １４３，５０８−５２５（２０１０）．
８２．Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．＆  Ｙａｍａｎａｋａ，Ｓ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｄ  ａｄｕｌｔ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｂｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｆａｃｔｏｒｓ．Ｃｅｌｌ  １２６，６６３−６７６（２００６）．
８３．Ｙａｍａｎａｋａ，Ｓ．Ａ  ｆｒｅｓｈ  ｌｏｏｋ  ａｔ  ｉＰＳ  ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ  １３７，１３−１７（２００９）．
８４．Ｏｋｉｔａ，Ｋ．＆  Ｙａｍａｎａｋａ，Ｓ．Ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ．Ｐｈｉｌｏｓ  Ｔｒａｎｓ  Ｒ  Ｓｏｃ  Ｌｏｎｄ  Ｂ  Ｂｉｏｌ  Ｓｃｉ  ３６６，２１９８−２２０７（２０１１）．
８５．Ｐａｒｋ，Ｉ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ  ｗｉｔｈ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｆａｃｔｏｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４５１，１４１−１４６（２００８）．
８６．Ｙｕ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８，１９１７−１９２０（２００７）．
８７．Ｆｏｘ，Ｉ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｕｓｅ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｓ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｉｎｇ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４５，１２４７３９１（２０１４）．
８８．Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，Ｍ．Ａ．＆  Ｋｎｏｂｌｉｃｈ，Ｊ．Ａ．Ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ａ  ｄｉｓｈ：ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｕｓｉｎｇ  ｏｒｇａｎｏｉｄ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４５，１２４７１２５（２０１４）．
８９．Ｒｏｂｉｎｔｏｎ，Ｄ．Ａ．＆  Ｄａｌｅｙ，Ｇ．Ｑ．Ｔｈｅ  ｐｒｏｍｉｓｅ  ｏｆ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔｕｒｅ  ４８１，２９５−３０５（２０１２）．
９０．Ｍａｌｉ，Ｐ．，Ｅｓｖｅｌｔ，Ｋ．Ｍ．＆  Ｃｈｕｒｃｈ，Ｇ．Ｍ．Ｃａｓ９  ａｓ  ａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ  １０，９５７−９６３（２０１３）．
９１．Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ｈ．＆  Ｄｏｕｄｎａ，Ｊ．Ａ．Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ’ｓ  Ｔｏｏｌｋｉｔ  ｗｉｔｈ  ＣＲＩＳＰＲ−  Ｃａｓ９．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｅｌｌ  ５８，５６８−５７４（２０１５）．
９２．Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．Ａｎ  ｉＣＲＩＳＰＲ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ，ｍｕｌｔｉｐｌｅｘａｂｌｅ，ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  １５，２１５−２２６（２０１４）．
９３．Ｚｈｕ，Ｚ．，Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｆ．＆  Ｈｕａｎｇｆｕ，Ｄ．Ｔｈｅ  ｉＣＲＩＳＰＲ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ５４６，２１５−２５０（２０１４）．
９４．Ｚｈｕ，Ｚ．＆  Ｈｕａｎｇｆｕ，Ｄ．Ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：ａｎ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｍｏｄｅｌ  ｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １４０，７０５−７１７（２０１３）．
９５．Ｈｅｒｒｉｇｅｓ，Ｍ．＆  Ｍｏｒｒｉｓｅｙ，Ｅ．Ｅ．Ｌｕｎｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：ｏｒｃｈｅｓｔｒａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｏｒｇａｎ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １４１，５０２−５１３（２０１４）．
９６．Ｍｏｒｒｉｓｅｙ，Ｅ．Ｅ．＆  Ｈｏｇａｎ，Ｂ．Ｌ．Ｐｒｅｐａｒｉｎｇ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ｂｒｅａｔｈ：ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｉｎ  ｌｕｎｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ  １８，８−２３（２０１０）．
９７．Ｗａｒｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｌｕｎｇ  ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ９０，７３−１５８（２０１０）．
９８．Ｈｅｒｒｉｎｇ，Ｍ．Ｊ．，Ｐｕｔｎｅｙ，Ｌ．Ｆ．，Ｗｙａｔｔ，Ｇ．，Ｆｉｎｋｂｅｉｎｅｒ，Ｗ．Ｅ．＆  Ｈｙｄｅ，Ｄ．Ｍ．Ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ａｌｖｅｏｌｉ  ｄｕｒｉｎｇ  ｐｏｓｔｎａｔａｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｓｔｅｒｅｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．Ｌｕｎｇ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ３０７，Ｌ３３８−３４４（２０１４）．
９９．Ｄ’Ａｍｏｕｒ，Ｋ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ．Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３，１５３４−１５４１（２００５）．
１００．Ｋｕｂｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ  ｆｒｏｍ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３１，１６５１−１６６２（２００４）．
１０１．Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ｍ．＆  Ｍｅｌｔｏｎ，Ｄ．Ａ．Ｅａｒｌｙ  ｍｏｕｓｅ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ  ｉｓ  ｐａｔｔｅｒｎｅｄ  ｂｙ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｆｒｏｍ  ａｄｊａｃｅｎｔ  ｇｅｒｍ  ｌａｙｅｒｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２７，１５６３−１５７２（２０００）．
１０２．Ｙａｓｕｎａｇａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｖｉｓｃｅｒａｌ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ＥＳ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３，１５４２−１５５０（２００５）．
１０３．Ｚｏｍ，Ａ．Ｍ．＆  Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ｍ．Ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｏｒｇａｎ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２５，２２１−２５１（２００９）．
１０４．Ｎｏｓｔｒｏ，Ｍ．Ｃ．＆  Ｋｅｌｌｅｒ，Ｇ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｅｔａ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ＆  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１２）．
１０５．Ｎｏｓｔｒｏ，Ｍ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｔａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ＴＧＦｂｅｔａ  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒｓ  ａｎｄ  ＷＮＴ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３８，８６１−８７１（２０１１）．
１０６．Ｇｏｓｓ，Ａ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｗｎｔ２／２ｂ  ａｎｄ  ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｒｅ  ｎｅｃｅｓｓａｒｙ  ａｎｄ  ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｔｏ  ｓｐｅｃｉｆｙ  ｌｕｎｇ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｏｒｅｇｕｔ．Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ  １７，２９０−２９８（２００９）．
１０７．Ｂｅｌｌｕｓｃｉ，Ｓ．，Ｇｒｉｎｄｌｅｙ，Ｊ．，Ｅｍｏｔｏ，Ｈ．，Ｉｔｏｈ，Ｎ．＆  Ｈｏｇａｎ，Ｂ．Ｌ．Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  １０（ＦＧＦ１０）ａｎｄ  ｂｒａｎｃｈｉｎｇ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｍｏｕｓｅ  ｌｕｎｇ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２４，４８６７−４８７８（１９９７）．
１０８．Ｂｅｌｌｕｓｃｉ，Ｓ．，Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｒ．，Ｗｉｎｎｉｅｒ，Ｇ．，Ｏｉｋａｗａ，Ｔ．＆  Ｈｏｇａｎ，Ｂ．Ｌ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｒｏｍ  ｎｏｒｍａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｍｉｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｔｈａｔ  ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｂｍｐ−４）ｐｌａｙｓ  ａ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｌｕｎｇ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２２，１６９３−１７０２（１９９６）．
１０９．Ｄｏｍｙａｎ，Ｅ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ＢＭＰ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｏｒｅｇｕｔ  ｖｉａ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｏｘ２．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３８，９７１−９８１（２０１１）．
１１０．Ｌｉ，Ｙ．，Ｇｏｒｄｏｎ，Ｊ．，Ｍａｎｌｅｙ，Ｎ．Ｒ．，Ｌｉｔｉｎｇｔｕｎｇ，Ｙ．＆  Ｃｈｉａｎｇ，Ｃ．Ｂｍｐ４  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｔｒａｃｈｅａｌ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ：ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｔｒａｃｈｅａｌ  ａｇｅｎｅｓｉｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ３２２，１４５−１５５（２００８）．
１１１．  Ｃｈｅｎ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｏｒｅｇｕｔ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｌｕｎｇ  ｐｒｉｍｏｒｄｉｕｍ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １２０，２０４０−２０４８（２０１０）．
１１２．Ｎｅｌｓｏｎ，ＷＪ．＆  Ｎｕｓｓｅ，Ｒ．Ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｗｎｔ，ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ，ａｎｄ  ｃａｄｈｅｒｉｎ  ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０３，１４８３−１４８７（２００４）．
１１３．Ｗｉｌｌｅｒｔ，Ｋ．＆  Ｎｕｓｓｅ，Ｒ．Ｗｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｉｎ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ４，ａ００７８６４（２０１２）．
１１４．Ｇｏｎｚａｌｅｓ，Ｌ．Ｗ．，Ｇｕｔｔｅｎｔａｇ，Ｓ．Ｈ．，Ｗａｄｅ，Ｋ．Ｃ．，Ｐｏｓｔｌｅ，Ａ．Ｄ．＆  Ｂａｌｌａｒｄ，Ｐ．Ｌ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｂｙ  ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ  ｐｌｕｓ  ｃＡＭＰ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．Ｌｕｎｇ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ２８３，Ｌ９４０−９５１（２００２）．
１１５．Ｌｏｎｇｍｉｒｅ，Ｔ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｌｕｎｇ  ａｎｄ  ｔｈｙｒｏｉｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ｆｒｏｍ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  １０，３９８−４１１（２０１２）．
１１６．Ｋｕｍａｒ，Ｍ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｃｅｌｌｓ．Ｄｅｆｉｎｉｎｇ  ａ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｎｉｃｈｅ  ａｔ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４６，１２５８８１０（２０１４）．
１１７．Ｈｒｙｃａｊ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｈｏｘ５  Ｇｅｎｅｓ  Ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｔｈｅ  Ｗｎｔ２／２ｂ−Ｂｍｐ４−Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ａｘｉｓ  ｄｕｒｉｎｇ  Ｌｕｎｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｃｅｌｌ  ｒｅｐｏｒｔｓ  １２，９０３−９１２（２０１５）．
１１８．Ｌｉｕ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｈｅｄｇｅｈｏｇ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｎｅｏｎａｔａｌ  ａｎｄ  ａｄｕｌｔ  ｌｕｎｇ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｃｅｌｌ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ４８，７０３−７１０（２０１３）．
１１９．Ｖｏｋｅｓ，Ｓ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｌｉ−ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｉｎ  ｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｎｅｕｒａｌ  ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３４，１９７７−１９８９（２００７）．
１２０．Ｂｅｌｌｕｓｃｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ（Ｓｈｈ）ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｌｕｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２４，５３−６３（１９９７）．
１２１．Ｐｅｐｉｃｅｌｌｉ，Ｃ．Ｖ．，Ｌｅｗｉｓ，Ｐ．Ｍ．＆  ＭｃＭａｈｏｎ，Ａ．Ｐ．Ｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｂｒａｎｃｈｉｎｇ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｌｕｎｇ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ：ＣＢ  ８，１０８３−１０８６（１９９８）．
１２２．Ｑｕｅ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｏｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｒｏｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｓｏｘ２  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｆｏｒｅｇｕｔ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３４，２５２１−２５３１（２００７）．
１２３．Ｔｒｅｕｔｌｅｉｎ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ  ｌｉｎｅａｇｅ  ｈｉｅｒａｒｃｈｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｉｓｔａｌ  ｌｕｎｇ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ  ｕｓｉｎｇ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ＲＮＡ−ｓｅｑ．Ｎａｔｕｒｅ  ５０９，３７１−３７５（２０１４）．
１２４．Ｓａｋｕｒａｉ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ  ｆｏｒｍｓ  ｏｆ  ＭＵＣ１  ｄｕｒｉｎｇ  ｌｕｎｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  ５１，９５−１０２（２００７）．
１２５．  Ｂａｎ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．ＡＢＣＡ３  ａｓ  ａ  ｌｉｐｉｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ｉｎ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８２，９６２８−９６３４（２００７）．
１２６．Ａｌａｎｉｓ，Ｄ．Ｍ．，Ｃｈａｎｇ，Ｄ．Ｒ．，Ａｋｉｙａｍａ，Ｈ．，Ｋｒａｓｎｏｗ，Ｍ．Ａ．＆  Ｃｈｅｎ，Ｊ．Ｔｗｏ  ｎｅｓｔｅｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｗａｖｅｓ  ｄｅｍａｒｃａｔｅ  ａ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ  ｂｏｕｎｄａｒｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｌｕｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ５，３９２３（２０１４）．
１２７．Ｊａｉｎ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｏｐｘ（＋）ｔｙｐｅ  Ｉ  ａｌｖｅｏｌａｒ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｌｕｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ６，６７２７（２０１５）．
１２８．Ｌａｂｂａｄｉａ，Ｊ．＆  Ｍｏｒｉｍｏｔｏ，Ｒ．Ｉ．Ｔｈｅ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｏｓｔａｓｉｓ  ｉｎ  ａｇｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ８４，４３５−４６４（２０１５）．
１２９．Ｗｅｌｌｓ，Ｒ．Ｇ．Ｆｉｂｒｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｖ．ＴＧＦ−ｂｅｔａ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ａｎｄ  ｌｉｖｅｒ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ２７９，Ｇ８４５−８５０（２０００）．
１３０．Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ，Ｊ．Ｎ．，Ｍａｒｚｌｕｆｆ，Ｗ．Ｆ．＆  Ｓｔｅｆａｎｏｖｉｃ，Ｂ．Ｆｉｂｒｏｇｅｎｅｓｉｓ．ＩＩＩ．Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｃｏｌｌａｇｅｎ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ａｎｄ  ｌｉｖｅｒ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ２７９，Ｇ４７１−４７６（２０００）．
１３１．Ｉｓｈｉｄａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｙｐｅ  Ｉ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｉｎ  Ｈｓｐ４７−ｎｕｌｌ  ｃｅｌｌｓ  ｉｓ  ａｇｇｒｅｇａｔｅｄ  ｉｎ  ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  ａｎｄ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｉｎ  Ｎ−ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ａｎｄ  ｆｉｂｒｉｌｌｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ  １７，２３４６−２３５５（２００６）．
１３２．Ｈｏｓｏｋａｗａ，Ｎ．，Ｈｏｈｅｎａｄｌ，Ｃ．，Ｓａｔｏｈ，Ｍ．，Ｋｕｈｎ，Ｋ．＆  Ｎａｇａｔａ，Ｋ．ＨＳＰ４７，ａ  ｃｏｌｌａｇｅｎ−  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｐｅｒｏｎｅ，ｄｅｌａｙｓ  ｔｈｅ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｙｐｅ  ＩＩＩ  ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ２９３：ａ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ＨＳＰ４７  ｉｎ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １２４，６５４−６６２（１９９８）．
１３３．Ａｒｍａｎｉｏｓ，Ｍ．Ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ  ｏｆ  ｔｅｌｏｍｅｒｅ  ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  １０，４５−６１（２００９）．
１３４．Ｐａｒｋ，Ｉ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｄｉｓｅａｓｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ  １３４，８７７−８８６（２００８）．
１３５．Ｕｎｔｅｍａｅｈｒｅｒ，Ｊ  Ｊ．＆  Ｄａｌｅｙ，Ｇ．Ｑ．Ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｐｈｉｌｏｓ  Ｔｒａｎｓ  Ｒ  Ｓｏｃ  Ｌｏｎｄ  Ｂ  Ｂｉｏｌ  Ｓｃｉ  ３６６，２２７４−２２８５（２０１１）．
１３６．Ｄｅ  Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ，Ａ．，Ｌｏｈ，Ｙ．Ｈ．，Ｔｅｓａｒ，ＰＪ．＆  Ｄａｌｅｙ，Ｇ．Ｑ．Ａｃｃｅｓｓｉｎｇ  ｎａｉｖｅ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ＆  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２２，２７２−２８２（２０１２）．
１３７．Ｆｅｒｒａｒｉ，Ｆ．，Ａｐｏｓｔｏｌｏｕ，Ｅ．，Ｐａｒｋ，ＰＪ．＆  Ｈｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒ，Ｋ．Ｒｅａｒｒａｎｇｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｆｏｒ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ．Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  １３，１６７−１６８（２０１４）．
１３８．Ｋｉｍ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ｍｅｍｏｒｙ  ｉｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４６７，２８５−  ２９０（２０１０）．
１３９．Ｈｉｌｅｒ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｔｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ３Ｄ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  Ｒｅｖｅａｌｓ  Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍｅｍｏｒｙ  ａｎｄ  Ｈｉｇｈｅｒ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｉｎ  ｉＰＳＣｓ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｒｏｄ  Ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  １７，１０１−１１５（２０１５）．
１４０．Ｒｏｕｈａｎｉ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  ｄｒｉｖｅｓ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．ＰＬｏＳ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １０，ｅｌ００４４３２（２０１４）．
１４１．Ｎａｚａｒｉａｎ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ  ａｓｓａｙ  ｔｏ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ  ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｈｅｒｍａｎｓｋｙ−Ｐｕｄｌａｋ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｍｅｔａｂ  ９３，１３４−１４４（２００８）．
１４２．Ｄｅｌｌ’Ａｎｇｅｌｉｃａ，Ｅ．Ｃ．，Ｓｈｏｔｅｌｅｒｓｕｋ，Ｖ．，Ａｇｕｉｌａｒ，Ｒ．Ｃ．，Ｇａｈｌ，Ｗ．Ａ．＆  Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏ，Ｊ．Ｓ．Ａｌｔｅｒｅｄ  ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ  ｏｆ  ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｈｅｒｍａｎｓｋｙ−Ｐｕｄｌａｋ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｄｕｅ  ｔｏ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｅｔａ  ３  Ａ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＰ−３  ａｄａｐｔｏｒ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｅｌｌ  ３，１１−２１（１９９９）．
１４３．Ｃｏｒｒａｌ，Ｊ．，Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｃｏｎｅｊｅｒｏ，Ｒ．，Ｐｕｊｏｌ−Ｍｏｉｘ，Ｎ．，Ｄｏｍｅｎｅｃｈ，Ｐ．＆  Ｖｉｃｅｎｔｅ，Ｖ．Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＨＰＳ１，ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｍｕｔａｔｅｄ  ｉｎ  Ｈｅｒｍａｎｓｋｙ−Ｐｕｄｌａｋ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ，ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｄｅｎｓｅ−ｇｒａｎｕｌｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ  ８９，３２５−３２９（２００４）．
１４４．Ｏｈ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｈｅｒｍａｎｓｋｙ−Ｐｕｄｌａｋ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ａ  ｆｒａｍｅｓｈｉｆｔ  ｈｏｔ  ｓｐｏｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＨＰＳ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ａｐｐａｒｅｎｔ  ｌｏｃｕｓ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６２，５９３−５９８（１９９８）．
１４５．Ｈｕｉｚｉｎｇ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｏｎｓｅｎｓｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ＡＤＴＢ３Ａ  ｃａｕｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｅｔａ３Ａ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ａｄａｐｔｏｒ  ｃｏｍｐｌｅｘ−３  ａｎｄ  ｓｅｖｅｒｅ  Ｈｅｒｍａｎｓｋｙ−Ｐｕｄｌａｋ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｔｙｐｅ  ２．
Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｒｅｓ  ５１，１５０−１５８（２００２）．
１４６．Ｍｏｒｇａｎ，Ｎ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ＢＬＯＣｌＳ３／ｒｅｄｕｃｅｄ  ｐｉｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｃａｕｓｅｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｖａｒｉａｎｔ  ｏｆ  Ｈｅｒｍａｎｓｋｙ−Ｐｕｄｌａｋ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ（ＨＰＳ８）．Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７８，１６０−１６６（２００６）．
１４７．Ｃｕｌｌｉｎａｎｅ，Ａ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  ＢＬＯＣ−１  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｓｃｒｅｅｎ  ｒｅｖｅａｌｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ＢＬＯＣ１Ｓ３  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｈｅｒｍａｎｓｋｙ−Ｐｕｄｌａｋ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｔｙｐｅ  ８．Ｐｉｇｍｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ｒｅｓ  ２５，５８４−５９１（２０１２）．
１４８．Ｎａｇｌｅ，Ｄ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  Ｃｈｅｄｉａｋ−Ｈｉｇａｓｈｉ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  １４，３０７−３１１（１９９６）．
１４９．Ｆｕｋａｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｈｏｍｏｚｙｇｏｓｉｔｙ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  Ｃｈｅｄｉａｋ−Ｈｉｇａｓｈｉ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｔｏ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  Ｉｑ４２−ｑ４４  ｉｎ  ａ  ｓｅｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｓｙｎｔｅｎｙ  ｔｈａｔ  ｉｎｃｌｕｄｅｓ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｂｅｉｇｅ  ｌｏｃｕｓ（ｂｇ）．Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ５９，６２０−６２４（１９９６）．
１５０．Ｋａｒｉｍ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐａｒｅｎｔ  ｇｅｎｏｔｙｐｅ−ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ，ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔ，ａｎｄ  ａｄｕｌｔ  Ｃｈｅｄｉａｋ−Ｈｉｇａｓｈｉ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ  １０８，１６−２２（２００２）．
１５１．Ｗｉｎｋｌｅｒ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｔｅｌｏｍｅｒｅ  ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ  ｆｒｏｍ  ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ−  ｍｕｔａｎｔ  ａｐｌａｓｔｉｃ  ａｎｅｍｉａ  ｉＰＳＣｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １２３，１９５２−１９６３（２０１３）．
１５２．Ｂａｔｉｓｔａ，Ｌ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｅｌｏｍｅｒｅ  ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ  ｉｎ  ｄｙｓｋｅｒａｔｏｓｉｓ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４７４，３９９−４０２（２０１１）．
１５３．Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｒ．Ｆ．，Ａｌｌｅｎ，Ｌ．，Ｇｏｎｚａｌｅｓ，Ｌ．，Ｂａｌｌａｒｄ，Ｐ．Ｌ．＆  Ｄｏｂｂｓ，Ｌ．Ｇ．ＨＴＩＩ−２８０，ａ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｏ  ｔｈｅ  ａｐｉｃａｌ  ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｌｕｎｇ  ａｌｖｅｏｌａｒ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ：ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ５８，８９１−９０１（２０１０）．
１５４．Ｃｈｉｌｏｓｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ａｂｎｏｒｍａｌ  ｒｅ−ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｌｕｎｇ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｉｎ  ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ：ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｄｅｌｔａＮ−ｐ６３．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ；ａ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ８２，１３３５−１３４５（２００２）．
１５５．Ｌｕｃｈｓｉｎｇｅｒ，Ｌ．Ｌ．，ｄｅ  Ａｌｍｅｉｄａ，Ｍ．Ｊ．，Ｃｏｒｒｉｇａｎ，Ｄ．Ｊ．，Ｍｕｍａｕ，Ｍ．＆  Ｓｎｏｅｃｋ，Ｈ．Ｗ．Ｍｉｔｏｆｕｓｉｎ  ２  ｍａｉｎｔａｉｎｓ  ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ．Ｎａｔｕｒｅ（２０１６）．
１５６．Ｂａｒｔｈ，Ｓ．，Ｇｌｉｃｋ，Ｄ．＆  Ｍａｃｌｅｏｄ，Ｋ．Ｆ．Ａｕｔｏｐｈａｇｙ：ａｓｓａｙｓ  ａｎｄ  ａｒｔｉｆａｃｔｓ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ２２１，１１７−１２４（２０１０）．
１５７．Ｚｈｕ，Ｊ．，Ｄａｇｄａ，Ｒ．Ｋ．＆  Ｃｈｕ，Ｃ．Ｔ．Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｍｉｔｏｐｈａｇｙ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ７９３，３２５−３３９（２０１１）．
１５８．Ｎａｒｅｎｄｒａ，Ｄ．，Ｔａｎａｋａ，Ａ．，Ｓｕｅｎ，Ｄ．Ｆ．＆  Ｙｏｕｌｅ，ＲＪ．Ｐａｒｋｉｎ  ｉｓ  ｒｅｃｒｕｉｔｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｔｏ  ｉｍｐａｉｒｅｄ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ  ａｎｄ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｔｈｅｉｒ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  １８３，７９５−  ８０３（２００８）．
１５９．Ｐｉｃｋｒｅｌｌ，Ａ．Ｍ．＆  Ｙｏｕｌｅ，ＲＪ．Ｔｈｅ  ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ＰＩＮＫ１，ｐａｒｋｉｎ，ａｎｄ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ｉｎ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎｅｕｒｏｎ  ８５，２５７−２７３（２０１５）．
１６０．Ｙｏｕｌｅ，ＲＪ．＆  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｌｉｅｋ，Ａ．Ｍ．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｆｉｓｓｉｏｎ，ｆｕｓｉｏｎ，ａｎｄ  ｓｔｒｅｓｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７，１０６２−１０６５（２０１２）．
１６１．Ｌａｍｂ，Ｃ．Ａ．，Ｙｏｓｈｉｍｏｒｉ，Ｔ．＆  Ｔｏｏｚｅ，Ｓ．Ａ．Ｔｈｅ  ａｕｔｏｐｈａｇｏｓｏｍｅ：ｏｒｉｇｉｎｓ  ｕｎｋｎｏｗｎ，ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  １４，７５９−７７４（２０１３）．
１６２．Ｓａｎｔａｇｕｉｄａ，Ｓ．，Ｖａｓｉｌｅ，Ｅ．，Ｗｈｉｔｅ，Ｅ．＆  Ａｍｏｎ，Ａ．Ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｔｒｅｓｓｅｓ  ｌｉｍｉｔ  ａｕｔｏｐｈａｇｉｃ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ２９，２０１０−２０２１（２０１５）．
１６３．Ｋｏｒｆｅｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  ｓｔｒｅｓｓ  ａｎｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｓｐｏｒａｄｉｃ  ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  １７８，８３８−８４６（２００８）．
１６４．Ｈａｎ，Ｊ．＆  Ｋａｕｆｍａｎ，ＲＪ．Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｕｎｆｏｌｄｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ  ｉｔｓ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ａｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｏｂｅｓｉｔｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ５３８，１３５−１５０（２０１４）．
１６５．Ｓｈａｎｇ，Ｊ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｅｖｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｕｎｆｏｌｄｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ４９１，２９３−３０８（２０１１）．
１６６．Ｃａｒｒｏｌｌ，Ｔ．Ｐ．，Ｇｒｅｅｎｅ，Ｃ．Ｍ．＆  ＭｃＥｌｖａｎｅｙ，Ｎ．Ｇ．Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｕｎｆｏｌｄｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ（ＵＰＲ）ｉｎ  ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ４８９，８３−９５（２０１１）．
１６７．Ｍｏｅｌｌｅｒ，Ａ．，Ａｓｋ，Ｋ．，Ｗａｒｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．，Ｇａｕｌｄｉｅ，Ｊ．＆  Ｋｏｌｂ，Ｍ．Ｔｈｅ  ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ  ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌ：ａ  ｕｓｅｆｕｌ  ｔｏｏｌ  ｔｏ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｐｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ？  Ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ４０，３６２−３８２（２００８）．
１６８．Ｍｏｏｒｅ，Ｂ．Ｂ．＆  Ｈｏｇａｂｏａｍ，Ｃ．Ｍ．Ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．Ｌｕｎｇ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ２９４，Ｌ１５２−１６０（２００８）．
１６９．Ｍａｔｕｔｅ−Ｂｅｌｌｏ，Ｇ．，Ｆｒｅｖｅｒｔ，Ｃ．Ｗ．＆  Ｍａｒｔｉｎ，Ｔ．Ｒ．Ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ｌｕｎｇ  ｉｎｊｕｒｙ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．Ｌｕｎｇ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ２９５，Ｌ３７９−３９９（２００８）．
１７０．Ｍｏｒｉｍｏｔｏ，Ｒ．Ｉ．＆  Ｃｕｅｒｖｏ，Ａ．Ｍ．Ｐｒｏｔｅｏｓｔａｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ａｇｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｔｈｅ  ｊｏｕｒｎａｌｓ  ｏｆ  ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ．Ｓｅｒｉｅｓ  Ａ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ６９  Ｓｕｐｐｌ  １，Ｓ３３−３８（２０１４）．
１７１．Ｒａｇｈｕ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．Ａｎ  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ＡＴＳ／ＥＲＳ／ＪＲＳ／ＡＬＡＴ  ｓｔａｔｅｍｅｎｔ：ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ．Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．１８３，７８８−８２４（２０１１）．
１７２．Ｌｏｈ，Ｙ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｏｆ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ．Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ７，１５−１９（２０１０）．
１７３．Ｓｔａｅｒｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ７，２０−２４（２０１０）．
１７４．Ｂｒｏｗｎ，Ｍ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ５，ｅｌ  １３７３（２０１０）．
１７５．Ｓｅｋｉ，Ｔ．，Ｙｕａｓａ，Ｓ．＆  Ｆｕｋｕｄａ，Ｋ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｓｍａｌｌ  ａｍｏｕｎｔ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｓｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ７，７１８−７２８（２０１２）．
【図１Ａ−Ｅ】
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【図２Ａ−Ｄ】
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【図２Ｅ−Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ−Ｄ】
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【図４Ｅ−Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ−Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ−Ｅ】
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【図７Ａ−Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１０Ｇ】
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【図１０Ｈ】
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【図１０Ｉ】
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【図１０Ｊ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ−Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ−Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【国際調査報告】
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