(57)【要約】  本発明は、改良された化合物、特に構造2020506934.tif 000102  を有する化合物を特徴とする。  薬物感受性と相関するバイオマーカー（例えば、PDE3A、PDE3B、SLFN12および／またはCREB3L1）を使用して癌を有する患者を識別し、その結果、層別化された患者集団を本発明の薬剤で治療する組成物および方法。
2020506934.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（I）
【化１】
2020506934.tif 000072
（式中、R1は、各出現において同じであり、ClまたはFである）の化合物、あるいはその薬学的に許容される塩、またはプロドラッグ。
【請求項２】
構造：
【化２】
2020506934.tif 000073
を有する請求項1に記載の化合物、あるいはその薬学的に許容される塩、またはプロドラッグ。
【請求項３】
構造：
【化３】
2020506934.tif 000074
および
【化４】
2020506934.tif 000075
からなる群から選択される化合物の1つ、あるいはその薬学的に許容される塩、またはプロドラッグと、1以上の薬学的に許容される担体または賦形剤とを含有する、医薬組成物。
【請求項４】
ホスホジエステラーゼ3A（PDE3A）および／または（PDE3B）モジュレーターに反応性であるとして選択された癌細胞を死滅させるかまたはその生存を減少させる方法であって、構造：
【化５】
2020506934.tif 000076
または
【化６】
2020506934.tif 000077
を有する1以上のPDE3Aおよび／またはPDE3Bモジュレーターと前記細胞を接触させるステップを含み、
前記細胞が、基準と比較してPDE3Aおよび／またはPDE3BまたはSchlafen 12（SLFN12）ポリペプチドまたはポリヌクレオチド、あるいはその組合せのレベルが増加しているとして選択されたものであって、それにより、前記癌細胞の前記生存が低下する、方法。
【請求項５】
構造：
【化７】
2020506934.tif 000078
または
【化８】
2020506934.tif 000079
を有する1以上のPDE3Aおよび／またはPDE3Bモジュレーターに反応性である癌を有するとして事前選択された対象において癌細胞増殖を減少させる方法であって、
前記対象に前記PDE3A／PDE3Bモジュレーターを投与するステップを含み、前記対象が、基準と比較して対象の癌由来の細胞中のPDE3Aおよび／またはPDE3BおよびSchlafen12（SLFN12）ポリペプチドまたはポリヌクレオチド、またはその組合せのレベルが増加していることを検出することによって事前選択され、それによって前記対象における癌細胞増殖を減少させる、方法。
【請求項６】
前記PDE3Aおよび／またはPDE3BモジュレーターがPDE3Aおよび／またはPDE3Bの活性を低下させる、請求項4または5に記載の方法。
【請求項７】
前記対象の（subjet’s）癌由来の前記細胞が、前記対象由来の生体試料に由来し、前記生体試料が癌細胞を含む組織試料である、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
過剰増殖性疾患を治療するための、
【化９】
2020506934.tif 000080
および
【化１０】
2020506934.tif 000081
からなる群から選択される化合物の1つ、あるいはその薬学的に許容される塩、またはプロドラッグを使用する、方法。
【請求項９】
前記過剰増殖性疾患が癌である、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
前記癌が、骨癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、子宮内膜癌、消化管間質腫瘍（GIST）、頭頚部癌、造血系（hematopoetic）癌、腎癌、平滑筋肉腫、肝臓癌、肺癌、リンパ系癌、黒色腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、軟部組織肉腫、甲状腺癌、または尿路癌である、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
前記化合物が
【化１１】
2020506934.tif 000082
である、請求項3に記載の組成物。
【請求項１２】
基準と比較して、CREB3L1ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの前記発現レベルが低下していないことを検出するステップをさらに含む、請求項4〜10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
SLFN12レベルの低下を検出するステップをさらに含む、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
前記PDE3Aおよび／またはPDE3Bモジュレーターが、
【化１２】
2020506934.tif 000083
である、請求項4〜13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
請求項1に記載の前記PDE3Aおよび／またはPDE3Bモジュレーターが、経口投与または静脈内投与される、投与の方法。
【請求項１６】
【化１３】
2020506934.tif 000084
および
【化１４】
2020506934.tif 000085
からなる群から選択される化合物の1つ、あるいはその薬学的に許容される塩、またはプロドラッグを含有するPDE3A／PDE3Bモジュレーターに反応性であるとして事前選択された対象における癌細胞増殖を減少させるためのキット。
【請求項１７】
請求項1に記載の化合物のPDE3A／PDE3B調節に抵抗性である癌を有する対象を識別するためのキットであって、前記キットが、CREB3L1ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと結合する捕捉試薬を含む、キット。
【請求項１８】
SLFN12ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと結合する捕捉試薬をさらに含む、請求項17に記載のキット。
【請求項１９】
前記癌治療のための薬物の製造のためのPDE3Aおよび／またはPDE3Bモジュレーターの使用であって、前記PDE3Aおよび／またはPDE3Bモジュレーターが、
【化１５】
2020506934.tif 000086
および
【化１６】
2020506934.tif 000087
からなる群から選択される化合物の1つ、あるいはその薬学的に許容される塩、またはプロドラッグである、使用。
【請求項２０】
前記癌が、骨癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、子宮内膜癌、消化管間質腫瘍（GIST）、頭頚部癌、造血系（hematopoetic）癌、腎癌、平滑筋肉腫、肝臓癌、肺癌、リンパ系癌、皮膚癌、黒色腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、軟部組織肉腫、甲状腺癌、または尿路癌である、請求項19に記載の使用。
【請求項２１】
前記癌が黒色腫または子宮頸癌である、請求項20に記載の使用。
【請求項２２】
化合物1を調製する方法であって、前記方法が、
式（IV）の化合物
【化１７】
2020506934.tif 000088
を高温下で純粋なモルホリンと反応させるか、あるいは、モルホリンおよび塩基、例えばアミンまたは炭酸塩、特にN，N−ジイソプロピルエチルアミンと、所望により還流温度の極性非プロトン性溶媒、例えばアルコール、またはCH3CN中で反応させて、化合物（V）
【化１８】
2020506934.tif 000089
を得、次にこの化合物を、極性非プロトン性溶媒中の強塩基と−78℃〜60℃などの低温で反応させた後、（C1−C4−アルキル）ブロモアセテートまたは（C1−C4−アルキル）クロロアセテートをニートでまたは極性非プロトン性溶媒中で添加し、前記混合物を最初の（intial）−78℃から室温まで温め、所望により前記粗生成物を単離し、次にヒドラジンまたはヒドラジン水和物のいずれかを極性プロトン性有機溶媒に還流温度で添加してラセミ化合物1c
【化１９】
2020506934.tif 000090
を得、その後、化合物1cのエナンチオマー分離を行って、化合物1および化合物（1a）
【化２０】
2020506934.tif 000091
および
【化２１】
2020506934.tif 000092
を得、それにより、所望により化合物（1a）が、前記エナンチオマー分離から単離された化合物1と、初期量よりも少ない量の化合物1aを得るためにその後に再度分離され得る前記ラセミ化合物（1c）に変換されるステップを含む、方法。
【請求項２３】
化合物1の調製のための方法であって、それによって化合物（IV）
【化２２】
2020506934.tif 000093
を極性非プロトン性溶媒中の強塩基と−78℃〜60℃の低温で反応させた後、（C1−C4−アルキル）ブロモアセテートまたは（C1−C4−アルキル）クロロアセテートをニートでまたは極性非プロトン性溶媒中で添加し、前記混合物を最初の（intial）−78℃から室温まで温め、所望により前記粗生成物を単離し、次にヒドラジンまたはヒドラジン水和物のいずれかを極性プロトン性有機溶媒に還流温度で添加して化合物（VII）
【化２３】
2020506934.tif 000094
を生成し、さらに化合物（VII）を高温下で純粋なモルホリンと反応させるか、あるいは、還流温度の極性非プロトン性溶媒中でモルホリンおよび塩基と反応させて、化合物1c
【化２４】
2020506934.tif 000095
を得、その後化合物1cのエナンチオマー分離を行って、化合物1および化合物（1a）
【化２５】
2020506934.tif 000096
を得、それにより、所望により化合物1aが、化合物1と、初期量よりも少ない量の化合物1aとを得るためにその後に分離され得るラセミ物質に変換される、方法。
【請求項２４】
請求項22および23に記載の化合物（IV）、（V）、（VI）、（VII）
【化２６】
2020506934.tif 000097
および／または
【化２７】
2020506934.tif 000098
および／または
【化２８】
2020506934.tif 000099
および／または
【化２９】
2020506934.tif 000100
の、化合物1
【化３０】
2020506934.tif 000101
の調製のための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府資金による研究開発の記載
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金番号3U54HG005032の下で、政府支援によってなされた。政府は本発明における一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
癌により、毎年米国では55万人以上、世界では800万人以上が死亡している。小分子、組織特異的増殖要件に影響を及ぼす分子、および免疫調節剤を含む新しい薬剤は、癌に特有のゲノム変異またはその他の特徴を有する一部の患者に利益をもたらすことが示されている。残念なことに、多くの癌患者は依然として有効な治療選択肢がない。
【０００３】
新しい抗癌剤を識別するための1つのアプローチは、癌細胞株間で強力な選択性を示す新規な小分子を発見するための表現型スクリーニングと、それに続く薬物反応に関連する細胞の特徴を識別するための予測的ケモゲノミクスである。1990年代、Weinsteinおよび同僚らは、化合物の細胞傷害性プロファイルを使用して、薬物感受性と相関する遺伝子発現プロファイルおよびDNAコピー数などの細胞特性を識別することができることを実証した。細胞株の包括的なゲノムおよび表現型の特徴付けと組み合わせた、細胞株の大きなパネルの自動化ハイスループット化学感受性試験により、小分子に対する反応を媒介する癌細胞株の特徴を識別する能力は、近年大いに増加している。小分子感受性の表現型観察は、トラスツズマブ感受性HER2増幅乳癌またはエルロチニブ感受性EGFR変異肺癌の例と同様に、発現パターンまたは体細胞の変化に関連があり得る。
【０００４】
Savaiら（Expert Opinion on investigational Drugs，Vol．19，issue 1，2010，p．117−131）は、ホスホジエステラーゼ阻害剤で癌を標的化することが、癌の治療に有望な手法であり得ることを述べた。しかし、心血管適応症および血小板凝固の阻害のためのPDE3阻害剤ミルリノン、シロスタゾールおよびレボシメンダン、ならびに血小板血症のためのPDE3阻害剤アナグレリドを含むいくつかのホスホジエステラーゼ阻害剤が臨床治療に承認されているが、癌適応のものはない。PDE阻害剤の最近の品質審査（Nature Reviews Drug Discovery 13，290−314，（2014））は、癌にほとんど言及していない。国際公開第2014／164704号から、癌の治療のためのいくつかの新しいPDE3阻害剤が公知である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第2014／164704号パンフレット
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Savaiら著、（Expert Opinion on investigational Drugs，Vol．19，issue 1，2010，p．117−131
【非特許文献２】Nature Reviews Drug Discovery 13，290−314，（2014）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
分子レベルで悪性腫瘍を特徴付ける方法は、患者を層別化し、それによって患者を有効な療法に迅速に導くために有用である。癌を有する対象の反応性を予測するための改善された方法が緊急に必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
下に記載されるように、本発明は癌治療のための化合物、その調製のための方法および癌治療のための方法を特徴とする。
【０００９】
この化合物は、癌を有する患者由来の癌細胞においてPDE3Aおよび／またはPDE3BとSchlafen 12（SLFN12）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの同時発現を検出することによる、かつ／あるいはCREB3L1ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現が低下していないことを検出することによる、ホスホジエステラーゼ3A（PDE3A）および／またはホスホジエステラーゼ3B（PDE3B）モジュレーター（例えば、化合物1および2）による治療に感受性のある癌を有する患者の治療に適している。
【００１０】
一態様では、本発明は、構造
【化１】
2020506934.tif 000003
（式中、R1は、各出現において同じであり、ClまたはFである）を有する化合物、あるいはその薬学的に許容される塩、またはプロドラッグを提供する。
【００１１】
さらなる態様では、本発明は、構造
【化２】
2020506934.tif 000004
を有する化合物、あるいはその薬学的に許容される塩、またはプロドラッグを提供する。
【００１２】
さらなる態様では、本発明は、構造
【化３】
2020506934.tif 000005
を有する化合物、あるいはその薬学的に許容される塩、またはプロドラッグを提供する。
【００１３】
もう一つの態様では、本発明は、1以上の薬学的に許容される担体または賦形剤と、式（I）
【化４】
2020506934.tif 000006
（式中、R1は、各出現において同じであり、ClまたはFである）の化合物、あるいはその薬学的に許容される塩、またはプロドラッグを含有する医薬組成物を提供する。
【００１４】
もう一つの態様では、本発明は、1以上の薬学的に許容される担体または賦形剤と、
【化５】
2020506934.tif 000007
および
【化６】
2020506934.tif 000008
からなる群から選択される化合物の1つ、あるいはその薬学的に許容される塩、またはプロドラッグを含有する医薬組成物を提供する。
【００１５】
一態様では、本発明は、ホスホジエステラーゼ3A（PDE3A）および／またはホスホジエステラーゼ3B（PDE3B）モジュレーターに反応性であるとして選択された癌細胞を死滅させるかまたはその生存を減少させる方法であって、構造：
【化７】
2020506934.tif 000009
（式中、R1は、各出現において同じであり、ClまたはFである）を有するPDE3Aおよび／またはPDE3Bモジュレーター、あるいはその薬学的に許容される塩、またはプロドラッグと細胞を接触させるステップを含む、方法を提供する。
【００１６】
一部の実施形態では、細胞は、基準と比較して、PDE3Aおよび／またはPDE3BあるいはSchlafen 12（SLFN12）ポリペプチドまたはポリヌクレオチド、あるいはその組合せのレベルが増加しているとして選択され、それにより、癌細胞の生存が低下する。
【００１７】
もう一つの態様では、本発明は、PDE3Aおよび／またはPDE3Bモジュレーターに反応性である癌を有するとして事前選択された対象における癌細胞増殖を減少させる方法であって、細胞を、構造：
【化８】
2020506934.tif 000010
（式中、R1は、各出現において同じであり、ClまたはFである）を有するPDE3Aおよび／またはPDE3Bモジュレーター、あるいはその薬学的に許容される塩、またはプロドラッグと接触させるステップを含み、対象は、基準と比較して、PDE3Aおよび／またはPDE3BあるいはSchlafen 12（SLFN12）ポリペプチドまたはポリヌクレオチド、あるいはその組合せのレベルの増加を検出することによって事前選択され、それによって前記対象における癌細胞増殖が低下する、方法を提供する。
【００１８】
一部の実施形態では、対象は、基準と比較して、PDE3Aおよび／またはPDE3Bポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルの増加を検出すること、ならびにSLFN12ポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルの増加を検出することによって事前選択され、それにより、前記対象において式（I）の化合物による治療によって癌細胞増殖が低下する。一部の実施形態では、対象は、基準と比較して、PDE3Aおよび／またはPDE3Bポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルの増加を検出すること、ならびにSLFN12ポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルの増加を検出することによって事前選択され、それにより、式（I）の化合物による治療によって前記対象における癌細胞増殖が低下する。
【００１９】
もう一つの態様では、本発明は、過剰増殖性疾患、特に癌を治療する方法であって、治療を必要とする対象に、構造
【化９】
2020506934.tif 000011
（式中、R1は、各出現において同じであり、ClまたはFである）を有する式（I）の化合物、あるいはその薬学的に許容される塩、またはプロドラッグを投与するステップを含む、方法を提供する。
【００２０】
もう一つの態様では、本発明は、過剰増殖性疾患、特に癌を治療する方法であって、治療を必要とする対象に、構造
【化１０】
2020506934.tif 000012
（式中、R1は、各出現において同じであり、ClまたはFである）を有する式（I）の化合物、あるいはその薬学的に許容される塩、またはプロドラッグを投与するステップを含み、前記癌はPDE3Aおよび／またはPDE3Bモジュレーターに反応性である、方法を提供する。
【００２１】
もう一つの態様では、本発明は、過剰増殖性疾患、特に癌を治療する方法であって、治療を必要とする対象に、構造
【化１１】
2020506934.tif 000013
（式中、R1は、各出現において同じであり、ClまたはFである）を有する化合物である式（I）の化合物、あるいはその薬学的に許容される塩、またはプロドラッグを投与するステップを含み、前記対象は、PDE3Aおよび／またはPDE3Bモジュレーターに反応性の癌と診断されている、方法を提供する。
【００２２】
もう一つの態様では、本発明は、過剰増殖性疾患、特に癌を治療する方法であって、治療を必要とする対象に、構造：
【化１２】
2020506934.tif 000014
（式中、R1は、各出現において同じであり、ClまたはFである）を有する式（I）の化合物、あるいはその薬学的に許容される塩、またはプロドラッグを投与するステップを含み、前記癌は、骨癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、子宮内膜癌、消化管間質腫瘍（GIST）、頭頚部癌、造血系（hematopoetic）癌、腎癌、平滑筋肉腫、肝臓癌、肺癌、リンパ系癌、黒色腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、皮膚癌、軟部組織肉腫、甲状腺癌、尿路癌である、方法を提供する。
【００２３】
もう一つの態様では、本発明は、構造
【化１３】
2020506934.tif 000015
（式中、R1は、各出現において同じであり、ClまたはFである）を有する化合物、あるいはその薬学的に許容される塩、またはプロドラッグを含有するPDE3Aおよび／またはPDE3Bモジュレーターに反応性であるとして事前選択された対象における癌細胞増殖を減少させるためのキットを提供する。
【００２４】
もう一つの態様では、本発明は、癌の治療のための薬物の製造のためのPDE3Aおよび／またはPDE3Bモジュレーターの使用であって、該PDE3Aおよび／またはPDE3Bモジュレーターは、構造
【化１４】
2020506934.tif 000016
（式中、R1は、各出現において同じであり、ClまたはFである）を有する式（I）の化合物、あるいはその薬学的に許容される塩、またはプロドラッグである、使用を提供する。
【００２５】
もう一つの態様では、本発明は、癌の治療で使用するためのPDE3Aおよび／またはPDE3Bモジュレーターであって、該PDE3Aおよび／またはPDE3Bモジュレーターは、構造
【化１５】
2020506934.tif 000017
（式中、R1は、各出現において同じであり、ClまたはFである）を有する式（I）の化合物、あるいはその薬学的に許容される塩、またはプロドラッグである、PDE3Aおよび／またはPDE3Bモジュレーターを提供する。
【００２６】
その他の実施形態では、本発明は、癌の治療で使用するためのPDE3Aおよび／またはPDE3Bモジュレーターであって、該PDE3Aおよび／またはPDE3Bモジュレーターは、構造
【化１６】
2020506934.tif 000018
（式中、R1は、各出現において同じであり、ClまたはFである）を有する式（I）の化合物、あるいはその薬学的に許容される塩、またはプロドラッグであり、それにより、該癌は、骨癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、子宮内膜癌、消化管間質腫瘍（GIST）、頭頚部癌、造血系（hematopoetic）癌、腎癌、平滑筋肉腫、肝臓癌、肺癌、リンパ系癌、黒色腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、皮膚癌、軟部組織肉腫、甲状腺癌、尿路癌である、PDE3Aおよび／またはPDE3Bモジュレーターを提供する。
【００２７】
本明細書において描出される態様の様々な実施形態では、PDE3Aおよび／またはPDE3Bモジュレーターは、PDE3Aおよび／またはPDE3Bの活性を低下させる。
【００２８】
様々な実施形態では、PDE3Aおよび／またはPDE3Bモジュレーターは、構造：
【化１７】
2020506934.tif 000019
および
【化１８】
2020506934.tif 000020
を有する。
【００２９】
一部のその他の実施形態では、本発明は、PDE3A／PDE3Bモジュレーターを、構造：
【化１９】
2020506934.tif 000021
を有する化合物、あるいはその薬学的に許容される塩、またはプロドラッグとして提供する。
【００３０】
様々な実施形態では、本発明は、PDE3A／PDE3Bモジュレーターが化合物1である、上記のような組成物および方法を提供する。
【００３１】
さらなる態様では、本発明は、構造
【化２０】
2020506934.tif 000022
を有する化合物、あるいはその薬学的に許容される塩、またはプロドラッグを提供する。
【００３２】
様々な実施形態では、本発明は、PDE3Aおよび／またはPDE3Bモジュレーターが化合物2である、上記のような組成物および方法を提供する。
【００３３】
本明細書に描写される任意の態様の様々な実施形態では、本方法は、基準と比較してCREB3L1ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの発現レベルが低下していないことを検出することを含む。
【００３４】
本明細書に描写される任意の態様の様々な実施形態では、本方法は、SLFN12レベルの増加を検出することを含む。
【００３５】
本明細書に描写される任意の態様の様々な実施形態では、生体試料は、癌細胞を含む組織試料である。
【００３６】
様々な実施形態では、PDE3A、PDE3B、SLFN12、またはCREB3L1ポリペプチドレベルは、免疫ブロット法、質量分析、および免疫沈降からなる群から選択される方法によって検出される。
【００３７】
様々な実施形態では、PDE3A、PDE3B、SLFN12、またはCREB3L1ポリヌクレオチドレベルは、定量的PCR、RNAシーケンシング、ノーザンブロット、マイクロアレイ、質量分析、およびインサイツハイブリダイゼーションからなる群から選択される方法によって検出される。
【００３８】
本明細書に描写される任意の態様の様々な実施形態では、ホスホジエステラーゼ3A（PDE3A）および／またはホスホジエステラーゼ3B（PDE3B）モジュレーターに反応性であるとして選択された癌細胞は、CREB3L1を発現するか、または基準と比較してCREB3L1発現の消失がない。
【００３９】
様々な実施形態では、ホスホジエステラーゼ3A（PDE3A）および／またはホスホジエステラーゼ3B（PDE3B）モジュレーターに反応性であるとして選択されている癌細胞は、骨癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、子宮内膜癌、消化管間質腫瘍（GIST）、頭頚部癌、造血系（hematopoetic）癌、腎癌、平滑筋肉腫、肝臓癌、肺癌、リンパ系癌、黒色腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、皮膚癌、軟部組織肉腫、甲状腺癌、尿路癌細胞である。
【００４０】
したがって、本明細書に描写される任意の態様の様々な実施形態では、上に開示される方法は、基準と比較してCREB3L1ポリペプチドまたはポリヌクレオチドレベルが低下していないことをさらに含む。
【００４１】
本明細書に描写される任意の態様の様々な実施形態では、ホスホジエステラーゼ3A（PDE3A）および／またはホスホジエステラーゼ3B（PDE3B）モジュレーターに反応性である癌細胞は、基準と比較してCREB3L1および／またはSLFN12の発現が低下しているか、あるいはCREB3L1および／またはSLFN12の発現が消失している。
【００４２】
様々な実施形態では、ホスホジエステラーゼ3A（PDE3A）および／またはホスホジエステラーゼ3B（PDE3B）モジュレーターに反応性であるとして選択された癌細胞は、皮膚癌（例えば黒色腫）、子宮内膜癌、肺癌、造血系（hematopoetic）／リンパ系癌、卵巣癌、子宮頸癌、軟部組織肉腫、平滑筋肉腫、尿路癌、膵癌、甲状腺癌、腎癌、神経膠芽腫、または乳癌細胞である。
【００４３】
様々な実施形態では、ホスホジエステラーゼ3A（PDE3A）および／またはホスホジエステラーゼ3B（PDE3B）モジュレーターに反応性であるとして選択されている癌細胞は、骨癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、子宮内膜癌、消化管間質腫瘍（GIST）、頭頚部癌、造血系（hematopoetic）癌、腎癌、平滑筋肉腫、肝臓癌、肺癌、リンパ系癌、黒色腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、皮膚癌、軟部組織肉腫、甲状腺癌、尿路癌細胞である。
【００４４】
本明細書に描写される任意の態様の様々な実施形態では、ホスホジエステラーゼ3A（PDE3A）および／またはホスホジエステラーゼ3B（PDE3B）モジュレーターに反応性であるとして選択された癌細胞は、PDE3Aおよび／またはPDE3BとSchlafen12（SLFN12）の発現を増加させた。
【００４５】
本明細書に描写される任意の態様の様々な実施形態では、ホスホジエステラーゼ3A（PDE3A）モジュレーターに反応性である癌細胞は、基準と比較してCREB3L1および／またはSLFN12の発現が低下しているか、あるいはCREB3L1および／またはSLFN12の発現が消失している。
【００４６】
「基準」とは、この文脈において、腫瘍細胞または腫瘍細胞株の代表的なパネルでの平均的な発現を意味する。
【００４７】
本明細書に描写される任意の態様の様々な実施形態では、癌はPDE3Aおよび／またはPDE3Bモジュレーターに反応性である。
【００４８】
様々な実施形態では、対象はPDE3Aおよび／またはPDE3Bモジュレーターに反応性である癌と診断されている。
【００４９】
様々な実施形態では、癌は、黒色腫、子宮内膜癌、肺癌、造血系（hematopoetic）／リンパ系癌、卵巣癌、子宮頸癌、軟部組織肉腫、平滑筋肉腫、尿路癌、膵癌、甲状腺癌、腎癌、神経膠芽腫、または乳癌である。
【００５０】
様々な実施形態では、癌は、皮膚癌（例えば、黒色腫）または子宮頸癌である。
【００５１】
本明細書に描写される任意の態様の様々な実施形態では、PDE3Aおよび／またはPDE3Bモジュレーターは、経口投与される。
【００５２】
本明細書に描写される任意の態様の様々な実施形態では、PDE3Aおよび／またはPDE3Bモジュレーターは静脈注射によって投与される。
【００５３】
本明細書に描写される任意の態様の様々な実施形態では、PDE3A／PDE3Bモジュレーターは経口によるかまたは静脈注射によって投与される。
【００５４】
本発明は、癌においてPDE3Aおよび／またはPDE3BとSchlafen12（SLFN12）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの同時発現ならびに／あるいはCREB3L1ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現の低下がないことを検出することによる、化合物1〜2から選択されたPDE3Aおよび／またはPDE3Bモジュレーターによる治療に反応性であるとして識別された癌を有する対象を治療する方法を提供する。
【００５５】
したがって、本発明は、バイオマーカーとしてCREB3L1ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を使用する、化合物1または化合物2による治療のための患者の層別化のためにCREB3L1ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を検出する方法をさらに提供する。
【００５６】
本発明はさらに、バイオマーカーとしてPDE3Aおよび／またはPDE3Bおよび／またはSchlafen 12（SLFN12）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を使用する、化合物1または化合物2による治療のための患者の層別化のためにPDE3Aおよび／またはPDE3Bおよび／またはSchlafen 12（SLFN12）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を検出する方法を提供する。
【００５７】
本発明によって定義される組成物および物品は、以下に提供される実施例に関連して単離または製造された。本発明の他の特徴および利点は、詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【００５８】
定義
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。以下の参考文献は、当業者に本発明で使用される用語の多くの一般的な定義を提供する：Singletonら，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology（第2版1994）；The Cambridge Dictionary of Science and Technology（Walker編、1988）；The Glossary of Genetics、第5版、R．Riegerら（編），Springer Verlag（1991）；およびHale＆Marham，The Harper Collins Dictionary of Biology（1991）。本明細書で使用される場合、以下の用語は、他に特定されない限り、以下のそれらに帰属する意味を有する。
【００５９】
「化合物1」とは、以下の構造を有する小分子阻害剤を意味する：
【化２１】
2020506934.tif 000023
【００６０】
「化合物2」とは、以下の構造を有する小分子阻害剤を意味する：
【化２２】
2020506934.tif 000024
【００６１】
描写される構造には、結合に関して全ての許容される回転が含まれる。
【００６２】
一部の実施形態では、化合物1、化合物2の化合物のいずれか1つは小分子ホスホジエステラーゼ阻害剤である。
【００６３】
一部の実施形態では、小分子ホスホジエステラーゼ阻害剤またはモジュレーターの組合せが使用されてよい。
【００６４】
一部の実施形態では、化合物1〜2の任意の組合せが使用されてよい。
【００６５】
一部の実施形態では、小分子ホスホジエステラーゼ阻害剤またはモジュレーター、特に化合物1〜2と、抗癌剤との組合せが使用されてよい。
【化２３】
2020506934.tif 000025
【００６６】
化合物1の合成の概要
化合物1を調製する方法はいくつかある。上記のスキームに示される番号は、実験項で番号が付けられ、提供されているスキームをさす。
【００６７】
一実施形態では、本発明は、化合物1を調製する方法であって、前記方法が、式（IV）の化合物
【化２４】
2020506934.tif 000026
を、高温下で純粋なモルホリンと反応させるか、あるいは、モルホリンおよび塩基、例えばアミンまたは炭酸塩、特にN，N−ジイソプロピルエチルアミンと、所望により還流温度の極性非プロトン性溶媒、例えばアルコール、またはCH3CN中で反応させて、化合物（V）
【化２５】
2020506934.tif 000027
を得、次にこの化合物を、極性非プロトン性溶媒中の強塩基と−78℃〜60℃などの低温で反応させた後、（C1−C4−アルキル）ブロモアセテートまたは（C1−C4−アルキル）クロロアセテートをニートでまたは極性非プロトン性溶媒中で添加し、混合物を最初の（intial）低温（例えば、−78℃）から室温まで温め、所望により粗生成物を単離し、次にヒドラジンまたはヒドラジン水和物のいずれかを極性プロトン性有機溶媒に還流温度で添加してラセミ化合物（1c）
【化２６】
2020506934.tif 000028
を得、その後、化合物（1c）のエナンチオマー分離を行って、化合物1および化合物（1a）
【化２７】
2020506934.tif 000029
および
【化２８】
2020506934.tif 000030
を得、それにより、所望により化合物（1a）が、エナンチオマー分離から単離された化合物1と、初期量よりも少ない量の化合物1aを得るためにその後に再度分離され得るラセミ化合物（1c）に変換されるステップを含む、方法を提供する。
【００６８】
もう一つの実施形態では、本発明は、化合物1の調製のための方法であって、それにより、化合物（IV）
【化２９】
2020506934.tif 000031
を、極性非プロトン性溶媒中の強塩基と−78℃〜−60℃の低温で反応させた後、（C1−C4−アルキル）ブロモアセテートまたは（C1−C4−アルキル）クロロアセテートをニートでまたは極性非プロトン性溶媒中で添加し、混合物を最初の低温（例えば、−78℃）から室温まで温め、所望により粗生成物を単離し、次にヒドラジンまたはヒドラジン水和物のいずれかを極性プロトン性有機溶媒に還流温度で添加して、化合物（VII）
【化３０】
2020506934.tif 000032
を生成し、さらに、化合物（VII）を高温下で純粋なモルホリンと反応させるか、あるいは、還流温度の極性非プロトン性溶媒中でモルホリンおよび塩基と反応させて、化合物（1c）
【化３１】
2020506934.tif 000033
を得、その後に化合物（1c）のエナンチオマー分離を行って、化合物1および化合物（1a）
【化３２】
2020506934.tif 000034
を得、それにより、所望により化合物（1a）が、化合物1と、初期量よりも少ない量の化合物1aとを得るためにその後に分離され得るラセミ物質に変換される、方法を提供する。
【００６９】
さらなる実施形態では、本発明は、中間体化合物（IV）、（V）、（VI）、（VII）
【化３３】
2020506934.tif 000035
および／または
【化３４】
2020506934.tif 000036
および／または
【化３５】
2020506934.tif 000037
および／または
【化３６】
2020506934.tif 000038
の、化合物1
【化３７】
2020506934.tif 000039
の調製のための使用を提供する。
【００７０】
本発明のさらなる態様は、化合物1を調製する方法であって、前記方法は、
式（IV）の化合物
【化３８】
2020506934.tif 000040
を、高温下で純粋なモルホリンと反応させるか、または、モルホリンおよび塩基、例えばアミン、例えばジイソプロピルアミン、トリエチルアミン、ジイソプロイルエチルアミンまたは炭酸塩、例えば炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム（magensiumcarbobante）、特にN，N−ジイソプロピルエチルアミンと、所望により極性溶媒中、例えばアルコール、例えばメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール（n−ブタノール、sec−ブタノール、tert−ブタノール）、メトキシイソブタノール、アセトニトリル、しかし特にCH3CN中、還流温度で反応させて化合物（V）
【化３９】
2020506934.tif 000041
を得、次にこれを極性非プロトン性溶媒中、例えばテトラヒドロフラン、ジオキサン、ヘキサン、シクロヘキサン、トルエン、特にテトラヒドロフラン中の強塩基と、例えば水素化ナトリウム、ブチルリチウム（nBuLi、sBuLi、t−BuLi）、リチウムジイソプロピルアミド（LDA）またはリチウムヘキサメチルジシラジド（LiHMDS）、特に、LiHMDSと、−78℃〜−60℃のような低温で、好ましくは−78℃で反応させた後、（C1−C4−アルキル）ブロモアセテートまたは（C1−C4−アルキル）クロロアセテート、特にブロモ酢酸エチルを、ニートでまたはテトラヒドロフラン、ジオキサン、ヘキサン、シクロヘキサン、またはトルエン中、特にテトラヒドロフラン（tetrahydofuran）またはその他の溶媒中で添加し、混合物を最初の（intial）−78℃から室温まで温め、所望により粗生成物を単離し、次にヒドラジンかまたはヒドラジン水和物のいずれかを極性プロトン性有機溶媒、例えば水、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノールまたはメトキシイソブタノールなど、好ましくはエタノールに還流温度で添加して、ラセミ化合物1c
【化４０】
2020506934.tif 000042
を得、その後に化合物1cのエナンチオマー分離を行って、化合物1および化合物（1a）
【化４１】
2020506934.tif 000043
を得、それにより、所望により化合物1aを、その後に化合物1と、初期量よりも少ない量の化合物1aとを得るために分離することのできる化合物1cに変換するステップを含む、方法である。
【００７１】
本発明のもう一つの態様は、化合物（V）および／または（VI）または（VII）
【化４２】
2020506934.tif 000044
および／または
【化４３】
2020506934.tif 000045
または
【化４４】
2020506934.tif 000046
の、化合物1
【化４５】
2020506934.tif 000047
の調製のための使用である。
【００７２】
本発明のさらなる態様は、化合物1の調製のための方法であって、それにより、化合物（IV）
【化４６】
2020506934.tif 000048
を、強塩基と、例えば水素化ナトリウム、ブチルリチウム（nBuLi、sBuLi、t−BuLi）、リチウムジイソプロピルアミド（LDA）またはリチウムヘキサメチルジシラジド（LiHMDS）、特に、LiHMDSと、極性非プロトン性溶媒中、例えばテトラヒドロフラン、ジオキサン、ヘキサン、シクロヘキサン、トルエンなど、特にテトラヒドロフラン中、−78℃〜−60℃のような低温で、好ましくは−78℃で反応させた後、（C1−C4−アルキル）ブロモアセテートまたは（C1−C4−アルキル）クロロアセテート、特にブロモ酢酸エチルを、ニートでまたはテトラヒドロフラン、ジオキサン、ヘキサン、シクロヘキサン、またはトルエン中、特にテトラヒドロフラン（tetrahydofuran）またはその他の溶媒中で添加し、
混合物を最初の（intial）−78℃から室温まで温め、所望により粗生成物を単離し、次にヒドラジンかまたはヒドラジン水和物のいずれかを極性プロトン性有機溶媒、例えば水、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノールまたはメトキシイソブタノールなど、好ましくはエタノールに還流温度で添加して、
所望により粗生成物を単離してラセミ化合物1cを得て化合物（VII）
【化４７】
2020506934.tif 000049
を生成し、さらに化合物（VII）を高温下で純粋なモルホリンと反応させるか、あるいは、モルホリンおよび塩基、例えばアミン、例えばトリエチルアミン、ジイソプロピルアミン、N，N−ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミンまたは炭酸塩、例えば炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウムなど、特にN，N−ジイソプロピルエチルアミンと、所望により極性非プロトン性溶媒、例えばアルコール例えばメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール（n−ブタノール、sec−ブタノール、tert−ブタノール）、メトキシイソブタノールまたはアセトニトリル（CH3CN）中、還流温度で反応させて、化合物1c
【化４８】
2020506934.tif 000050
を得、その後に化合物1cのエナンチオマー分離を行って化合物1および化合物（1a）
【化４９】
2020506934.tif 000051
を得、それにより、化合物1aを、所望により、化合物1と初期量よりも少ない量の化合物1aを得るためにその後に分離され得る化合物1cに変換する、方法である。
【００７３】
したがって、本発明のさらなる態様は、化合物1の調製のための化合物（IV）および（VII）の使用である。
【００７４】
「CREB3L1ポリペプチド」とは、小胞体ストレスによって切断され、転写因子活性を有する、GenBank受託番号AAH14097．1で提供される配列と少なくとも85％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質またはその断片を意味する。GenBank受託番号AAH14097．1で提供されるアミノ酸配列を下に示す。
1 mdavlepfpa drlfpgssfl dlgdlnesdf lnnahfpehl dhftenmedf sndlfssffd
61 dpvldekspl ldmeldsptp giqaehsysl sgdsapqspl vpikmedttq daehgawalg
121 hklcsimvkq eqspelpvdp laapsamaaa aamattpllg lsplsrlpip hqapgemtql
181 pvikaeplev nqflkvtped lvqmpptpps shgsdsdgsq sprslppssp vrpmarssta
241 istsplltpp hklqgtsgpl llteeekrtl iaegypiptk lpltkaeeka lkrvrrkikn
301 kisaqesrrk kkeyveclek kvetftsenn elwkkvetle nanrtllqql qklqtlvtnk
361 isrpykmaat qtgtclmvaa lcfvlvlgsl vpclpefssg sqtvkedpla adgvytasqm
421 psrsllfydd gaglwedgrs tllpmeppdg weinpggpae qrprdhlqhd hldsthettk
481 ylseawpkdg gngtspdfsh skewfhdrdl gpnttikls（配列番号：1）
【００７５】
「CREB3L1ポリヌクレオチド」とは、CREB3L1ポリペプチドまたはその断片をコードする、DNAおよびRNAを含む任意の核酸分子を意味する。代表的なCREB3L1核酸配列はNCBI参照番号：NM＿052854．3で提供される：NCBI参照番号：NM＿052854．3で提供される配列を下に再現する：
1 ccagccaggg gttcccggtt tcacagagag gaaagtgaca gaagacgtgc ggagggagac
61 gcagagacag aggagaggcc ggcagccacc cagtctcggg ggagcactta gctcccccgc
121 cccggctccc accctgtccg gggggctcct gaagccctca gccccaaccc cgggctcccc
181 atggaagcca gctgtgcccc aggaggagca ggaggaggtg gagtcggctg aatgcccacg
241 gtgcgcccgg ggcccctgag cccatcccgc tcctagccgc tgccctaagg cccccgcgcg
301 ccccgcgccc cccacccggg gccgcgccgc ctccgtccgc ccctcccccg gggcttcgcc
361 ccggacctgc cccccgcccg tttgccagcg ctcaggcagg agctctggac tgggcgcgcc
421 gccgccctgg agtgagggaa gcccagtgga agggggtccc gggagccggc tgcgatggac
481 gccgtcttgg aacccttccc ggccgacagg ctgttccccg gatccagctt cctggacttg
541 ggggatctga acgagtcgga cttcctcaac aatgcgcact ttcctgagca cctggaccac
601 tttacggaga acatggagga cttctccaat gacctgttca gcagcttctt tgatgaccct
661 gtgctggatg agaagagccc tctattggac atggaactgg actcccctac gccaggcatc
721 caggcggagc acagctactc cctgagcggc gactcagcgc cccagagccc ccttgtgccc
781 atcaagatgg aggacaccac ccaagatgca gagcatggag catgggcgct gggacacaaa
841 ctgtgctcca tcatggtgaa gcaggagcag agcccggagc tgcccgtgga ccctctggct
901 gccccctcgg ccatggctgc cgcggccgcc atggccacca ccccgctgct gggcctcagc
961 cccttgtcca ggctgcccat cccccaccag gccccgggag agatgactca gctgccagtg
1021 atcaaagcag agcctctgga ggtgaaccag ttcctcaaag tgacaccgga ggacctggtg
1081 cagatgcctc cgacgccccc cagcagccat ggcagtgaca gcgacggctc ccagagtccc
1141 cgctctctgc ccccctccag ccctgtcagg cccatggcgc gctcctccac ggccatctcc
1201 acctccccac tcctcactgc ccctcacaaa ttacagggga catcagggcc actgctcctg
1261 acagaggagg agaagcggac cctgattgct gagggctacc ccatccccac aaaactcccc
1321 ctcaccaaag ccgaggagaa ggccttgaag agagtccgga ggaaaatcaa gaacaagatc
1381 tcagcccagg agagccgtcg taagaagaag gagtatgtgg agtgtctaga aaagaaggtg
1441 gagacattta catctgagaa caatgaactg tggaagaagg tggagaccct ggagaatgcc
1501 aacaggaccc tgctccagca gctgcagaaa ctccagactc tggtcaccaa caagatctcc
1561 agaccttaca agatggccgc cacccagact gggacctgcc tcatggtggc agccttgtgc
1621 tttgttctgg tgctgggctc cctcgtgccc tgccttcccg agttctcctc cggctcccag
1681 actgtgaagg aagaccccct ggccgcagac ggcgtctaca cggccagcca gatgccctcc
1741 cgaagcctcc tattctacga tgacggggca ggcttatggg aagatggccg cagcaccctg
1801 ctgcccatgg agcccccaga tggctgggaa atcaaccccg gggggccggc agagcagcgg
1861 ccccgggacc acctgcagca tgatcacctg gacagcaccc acgagaccac caagtacctg
1921 agtgaggcct ggcctaaaga cggtggaaac ggcaccagcc ccgacttctc ccactccaag
1981 gagtggttcc acgacaggga tctgggcccc aacaccacca tcaaactctc ctaggccatg
2041 ccaagaccca ggacatagga cggacccctg gtacccagaa gaggagttct tgctcactaa
2101 cccggatccg cctcgtgccc ctgcctcctg gagcttccca ttccaggaga aaaggctcca
2161 cttcccagcc cttccttgcc cctgacattt ggactcttcc cttgggccga ccactctgtt
2221 ctcattctcc ttcccaccaa catccatccg tccttctcag acaaaccact cactgggtac
2281 cccacctcct ctctcatatg cccaacacga ccactgcctc cctgccccca cacctgcacc
2341 caaacagaca catcaacgca ccccactcac agacacccct taccccaccc ccactgtaca
2401 gagaccaaga acagaaattg tttgtaaata atgaacctta ttttttatta ttgccaatcc
2461 cctaagatat tgtattttac aaatctccct cttcccttcg cccctccctt gttttatatt
2521 ttatgaagtt agtgcgggct ttgctgctcc ctggcccagg aaagagggac tacctgaccc
2581 tcacctggca cccccctgct gctgcccaag ccgctgggcc tttttaattg ccaaactgct
2641 ctcttcatca gctcagcaca tgctttaaga aagcaaaacc aaaaaaaaaa aaaaaaagat
2701 gcagcatcaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a（配列番号：2）
【００７６】
「PDE3Aポリペプチド」とは、環状アデノシン一リン酸（cAMP）および環状グアノシン一リン酸（cGMP）の加水分解を触媒するNCBI参照番号NP＿000912．3で提供される配列と少なくとも85％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質またはその断片を意味する。代表的なヒト全長PDE3Aアミノ酸配列を以下に提供する：
MAVPGDAARVRDKPVHSGVSQAPTAGRDCHHRADPASPRDSGCRGCWGDLVLQPLRSSRKLSSALCAGSLSFLLALLVRLVRGEVGCDLEQCKEAAAAEEEEAAPGAEGGVFPGPRGGAPGGGARLSPWLQPSALLFSLLCAFFWMGLYLLRAGVRLPLAVALLAACCGGEALVQIGLGVGEDHLLSLPAAGVVLSCLAAATWLVLRLRLGVLMIALTSAVRTVSLISLERFKVAWRPYLAYLAGVLGILLARYVEQILPQSAEAAPREHLGSQLIAGTKEDIPVFKRRRRSSSVVSAEMSGCSSKSHRRTSLPCIPREQLMGHSEWDHKRGPRGSQSSGTSITVDIAVMGEAHGLITDLLADPSLPPNVCTSLRAVSNLLSTQLTFQAIHKPRVNPVTSLSENYTCSDSEESSEKDKLAIPKRLRRSLPPGLLRRVSSTWTTTTSATGLPTLEPAPVRRDRSTSIKLQEAPSSSPDSWNNPVMMTLTKSRSFTSSYAISAANHVKAKKQSRPGALAKISPLSSPCSSPLQGTPASSLVSKISAVQFPESADTTAKQSLGSHRALTYTQSAPDLSPQILTPPVICSSCGRPYSQGNPADEPLERSGVATRTPSRTDDTAQVTSDYETNNNSDSSDIVQNEDETECLREPLRKASACSTYAPETMMFLDKPILAPEPLVMDNLDSIMEQLNTWNFPIFDLVENIGRKCGRILSQVSYRLFEDMGLFEAFKIPIREFMNYFHALEIGYRDIPYHNRIHATDVLHAVWYLTTQPIPGLSTVINDHGSTSDSDSDSGFTHGHMGYVFSKTYNVTDDKYGCLSGNIPALELMALYVAAAMHDYDHPGRTNAFLVATSAPQAVLYNDRSVLENHHAAAAWNLFMSRPEYNFLINLDHVEFKHFRFLVIEAILATDLKKHFDFVAKFNGKVNDDVGIDWTNENDRLLVCQMCIKLADINGPAKCKELHLQWTDGIVNEFYEQGDEEASLGLPISPFMDRSAPQLANLQESFISHIVGPLCNSYDSAGLMPGKWVEDSDESGDTDDPEEEEEEAPAPNEEETCENNESPKKKTFKRRKIYCQITQHLLQNHKMWKKVIEEEQRLAGIENQSLDQTPQSHSSEQIQAIKEEEEEKGKPRGEEIPTQKPDQ（配列番号3）
【００７７】
3つのPDE3Aアイソフォーム、PDE3A1、PDE3A2、およびPDE3A3が知られている。PDE3A1は全長PDE3Aアミノ酸配列のアミノ酸146〜1141を含み、PDE3A2アイソフォーム2は全長PDE3Aアミノ酸配列のアミノ酸299〜1141を含み、PDE3A3は全長PDE3Aアミノ酸配列のアミノ酸483〜1141を含む。
【００７８】
「PDE3Aポリヌクレオチド」とは、PDE3Aポリペプチドまたはその断片をコードするDNAおよびRNAを含む任意の核酸分子を意味する。代表的なPDE3A核酸配列はNCBI参照番号：NM＿000921．4で提供される：
1 gggggccact gggaattcag tgaagagggc accctatacc atggcagtgc ccggcgacgc
61 tgcacgagtc agggacaagc ccgtccacag tggggtgagt caagccccca cggcgggccg
121 ggactgccac catcgtgcgg accccgcatc gccgcgggac tcgggctgcc gtggctgctg
181 gggagacctg gtgctgcagc cgctccggag ctctcggaaa ctttcctccg cgctgtgcgc
241 gggctccctg tcctttctgc tggcgctgct ggtgaggctg gtccgcgggg aggtcggctg
301 tgacctggag cagtgtaagg aggcggcggc ggcggaggag gaggaagcag ccccgggagc
361 agaagggggc gtcttcccgg ggcctcgggg aggtgctccc gggggcggtg cgcggctcag
421 cccctggctg cagccctcgg cgctgctctt cagtctcctg tgtgccttct tctggatggg
481 cttgtacctc ctgcgcgccg gggtgcgcct gcctctggct gtcgcgctgc tggccgcctg
541 ctgcgggggg gaagcgctcg tccagattgg gctgggcgtc ggggaggatc acttactctc
601 actccccgcc gcgggggtgg tgctcagctg cttggccgcc gcgacatggc tggtgctgag
661 gctgaggctg ggcgtcctca tgatcgcctt gactagcgcg gtcaggaccg tgtccctcat
721 ttccttagag aggttcaagg tcgcctggag accttacctg gcgtacctgg ccggcgtgct
781 ggggatcctc ttggccaggt acgtggaaca aatcttgccg cagtccgcgg aggcggctcc
841 aagggagcat ttggggtccc agctgattgc tgggaccaag gaagatatcc cggtgtttaa
901 gaggaggagg cggtccagct ccgtcgtgtc cgccgagatg tccggctgca gcagcaagtc
961 ccatcggagg acctccctgc cctgtatacc gagggaacag ctcatggggc attcagaatg
1021 ggaccacaaa cgagggccaa gaggatcaca gtcttcagga accagtatta ctgtggacat
1081 cgccgtcatg ggcgaggccc acggcctcat taccgacctc ctggcagacc cttctcttcc
1141 accaaacgtg tgcacatcct tgagagccgt gagcaacttg ctcagcacac agctcacctt
1201 ccaggccatt cacaagccca gagtgaatcc cgtcacttcg ctcagtgaaa actatacctg
1261 ttctgactct gaagagagct ctgaaaaaga caagcttgct attccaaagc gcctgagaag
1321 gagtttgcct cctggcttgt tgagacgagt ttcttccact tggaccacca ccacctcggc
1381 cacaggtcta cccaccttgg agcctgcacc agtacggaga gaccgcagca ccagcatcaa
1441 actgcaggaa gcaccttcat ccagtcctga ttcttggaat aatccagtga tgatgaccct
1501 caccaaaagc agatccttta cttcatccta tgctatttct gcagctaacc atgtaaaggc
1561 taaaaagcaa agtcgaccag gtgccctcgc taaaatttca cctctttcat cgccctgctc
1621 ctcacctctc caagggactc ctgccagcag cctggtcagc aaaatttctg cagtgcagtt
1681 tccagaatct gctgacacaa ctgccaaaca aagcctaggt tctcacaggg ccttaactta
1741 cactcagagt gccccagacc tatcccctca aatcctgact ccacctgtta tatgtagcag
1801 ctgtggcaga ccatattccc aagggaatcc tgctgatgag cccctggaga gaagtggggt
1861 agccactcgg acaccaagta gaacagatga cactgctcaa gttacctctg attatgaaac
1921 caataacaac agtgacagca gtgacattgt acagaatgaa gatgaaacag agtgcctgag
1981 agagcctctg aggaaagcat cggcttgcag cacctatgct cctgagacca tgatgtttct
2041 ggacaaacca attcttgctc ccgaacctct tgtcatggat aacctggact caattatgga
2101 gcagctaaat acttggaatt ttccaatttt tgatttagtg gaaaatatag gaagaaaatg
2161 tggccgtatt cttagtcagg tatcttacag actttttgaa gacatgggcc tctttgaagc
2221 ttttaaaatt ccaattaggg aatttatgaa ttattttcat gctttggaga ttggatatag
2281 ggatattcct tatcataaca gaatccatgc cactgatgtt ttacatgctg tttggtatct
2341 tactacacag cctattccag gcctctcaac tgtgattaat gatcatggtt caaccagtga
2401 ttcagattct gacagtggat ttacacatgg acatatggga tatgtattct caaaaacgta
2461 taatgtgaca gatgataaat acggatgtct gtctgggaat atccctgcct tggagttgat
2521 ggcgctgtat gtggctgcag ccatgcacga ttatgatcat ccaggaagga ctaatgcttt
2581 cctggttgca actagtgctc ctcaggcggt gctatataac gatcgttcag ttttggagaa
2641 tcatcacgca gctgctgcat ggaatctttt catgtcccgg ccagagtata acttcttaat
2701 taaccttgac catgtggaat ttaagcattt ccgtttcctt gtcattgaag caattttggc
2761 cactgacctg aagaaacact ttgacttcgt agccaaattt aatggcaagg taaatgatga
2821 tgttggaata gattggacca atgaaaatga tcgtctactg gtttgtcaaa tgtgtataaa
2881 gttggctgat atcaatggtc cagctaaatg taaagaactc catcttcagt ggacagatgg
2941 tattgtcaat gaattttatg aacagggtga tgaagaggcc agccttggat tacccataag
3001 ccccttcatg gatcgttctg ctcctcagct ggccaacctt caggaatcct tcatctctca
3061 cattgtgggg cctctgtgca actcctatga ttcagcagga ctaatgcctg gaaaatgggt
3121 ggaagacagc gatgagtcag gagatactga tgacccagaa gaagaggagg aagaagcacc
3181 agcaccaaat gaagaggaaa cctgtgaaaa taatgaatct ccaaaaaaga agactttcaa
3241 aaggagaaaa atctactgcc aaataactca gcacctctta cagaaccaca agatgtggaa
3301 gaaagtcatt gaagaggagc aacggttggc aggcatagaa aatcaatccc tggaccagac
3361 ccctcagtcg cactcttcag aacagatcca ggctatcaag gaagaagaag aagagaaagg
3421 gaaaccaaga ggcgaggaga taccaaccca aaagccagac cagtgacaat ggatagaatg
3481 ggctgtgttt ccaaacagat tgacttgtca aagactctct tcaagccagc acaacattta
3541 gacacaacac tgtagaaatt tgagatgggc aaatggctat tgcattttgg gattcttcgc
3601 attttgtgtg tatattttta cagtgaggta cattgttaaa aactttttgc tcaaagaagc
3661 tttcacattg caacaccagc ttctaaggat tttttaagga gggaatatat atgtgtgtgt
3721 gtatataagc tcccacatag atacatgtaa aacatattca cacccatgca cgcacacaca
3781 tacacactga aggccacgat tgctggctcc acaatttagt aacatttata ttaagatata
3841 tatatagtgg tcactgtgat ataataaatc ataaaggaaa ccaaatcaca aaggagatgg
3901 tgtggcttag caaggaaaca gtgcaggaaa tgtaggttac caactaagca gcttttgctc
3961 ttagtactga gggatgaaag ttccagagca ttatttgaat tctgatacat cctgccaaca
4021 ctgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgaaaga gagacagaag
4081 ggaatggttt gagagggtgc ttgtgtgcat gtgtgtgcat atgtaaagag atttttgtgg
4141 tttaagtaac tcagaatagc tgtagcaaat gactgaatac atgtgaacaa acagaaggaa
4201 gttcactctg gagtgtcttt gggaggcagc cattccaaat gccctcctcc atttagcttc
4261 aataaagggc cttttgctga tggagggcac tcaagggctg ggtgagaggg ccacgtgttt
4321 ggtattacat tactgctatg caccacttga aggagctcta tcaccagcct caaacccgaa
4381 agactgaggc attttccagt ctacttgcct aatgaatgta taggaactgt ctatgagtat
4441 ggatgtcact caactaagat caaatcacca tttaagggga tggcattctt tatacctaaa
4501 cacctaagag ctgaagtcag gtcttttaat caggttagaa ttctaaatga tgccagagaa
4561 ggcttgggaa attgtacttc agcgtgatag cctgtgtctt cttaatttgc tgcaaaatat
4621 gtggtagaga aagaaaagga aacagaaaaa tcactctggg ttatatagca agagatgaag
4681 gagaatattt caacacaggg tttttgtgtt gacataggaa aagcctgatt cttggcaact
4741 gttgtagttt gtctttcagg ggtgaaggtc ccactgacaa cccctgttgt ggtgttccac
4801 acgctgtttg ttggggtagc ttccatcggc agtctggccc attgtcagtc atgcttcttc
4861 tggccgggga gattatagag agattgtttg aagattgggt tattattgaa agtctttttt
4921 tttgtttgtt ttgttttggt ttgtttgttt atctacactt gtttatgctg tgagccaaac
4981 ctctatttaa aaagttgata ctcactttca atattttatt tcatattatt atatatgtca
5041 tgatagttat cttgatgtaa atatgaagat ttttttgttt ctgtagatag taaactcttt
5101 ttttaaaaaa ggaaaaggga aacattttta taaagttata ttttaatcac catttttata
5161 cattgtagtt ctctccaagc ccagtaagag aatgatgatt catttgcatg gaggtcgatg
5221 gacaaccaat catctacctt ttctaattta aatgataatc tgatatagtt ttattgccag
5281 ttaaatgagg atgctgcaaa gcatgttttt tcactagtaa cttttgctaa ctgaatgaat
5341 tctgggtcca tatctcccag atgaaaaact gttaaccaat accatatttt atagttggtg
5401 tccatttctt tccaacactg tttgttatga ttcttccttg agtacttata tacagacctg
5461 ctcattatct aaacaatctt accttctaag taaaccttga ttgtgatttc cagtttttat
5521 tttctctgac gtagtagaaa ggaatgttta cattaaaaat acttttgttt ctcataaatg
5581 gatattgtac tccccccttt caaagcatta ttttacaata attcatggca ttttaaaaaa
5641 taaggcaaag ataatacgac aaaaaatata catggtttca aggcaaattc tccaataagt
5701 tggaaaatgt aaaaaggatc aagtggatgc agcctctacc taaataatta aaatatattt
5761 cagtatattt ctgaattaac accaggtctt cattatttag aacttactaa attgttttca
5821 ttttcttagt tttacctgtg tatctccatg tttgcaaaaa ttactataag tcaaattttg
5881 ccagtgaatt taactatttt tctttccttg caattaaggg gaaaaaagca tttatcttat
5941 cttctcatac cccttgcatc taagtactta gcaaagtcaa tattttccca ttttccaaat
6001 gcgtccatct ctaacataaa tattaattga acatagagct atgtttggag tgagtggact
6061 ggcaggacag ttggaagtcc atcacagtct attgacagtt tcatcaaagc tgtatagtcc
6121 aactagtggg gcagcttggc tactatggtg gaagtctcag caaactgcct ggttttgttt
6181 gtttgttttg ttttaaggta caggaaataa gaggaataat agtggccaaa gcaattagaa
6241 catcttcatt ccagaactgt gttcagcaat ccaggcagat tgatacattt ttctttaaaa
6301 ataaattgct attacagcta gacgtcaatt gggataaata aagggatgaa gatccactaa
6361 gtttgtgact ttcatacaca cccagtacat ctcaaaggat gctaagggac attttctgcc
6421 agtagagttc tccccctttt tggtgacagc aatattatta tgttcacatc taactccaga
6481 gcttacttcc tgtggtgcca atgtatttgt tgcaatttac tacattttta tatgagccta
6541 tttataggtg ccattaaact caggtctttc aaatgaaaga gtttctagcc cacttaggga
6601 aaaagataat tgtttagaaa accataaaat caatggtagg aaaagttgga actggttacc
6661 tggatgccat ggttctctgt taaataaagt aagagaccag gtgtattctg agtgtcatca
6721 gtgttatttt cagcatgcta ataaatgtct ttccggttat atatctatct aaattaacct
6781 ttaaaatatt ggtttccttg ataaaagcac cacttttgct tttgttagct gtaatatttt
6841 ttgtcattta gataagacct ggtttggctc tcaataaaag atgaagacag tagctctgta
6901 cagggatata tctatattag tcttcatctg atgaatgaag aaattttctc atattatgtt
6961 caagaaagta tttacttcct aaaaatagaa ttcccgattc tgtctatttt ggttgaatac
7021 cagaacaaat ctttccgttg caatcccagt aaaacgaaag aaaaggaata tcttacagac
7081 tgttcatatt agatgtatgt agactgttaa tttgcaattt ccccatattt cctgcctatc
7141 ttacccagat aactttcttt gaaggtaaaa gctgtgcaaa aggcatgaga ctcaggccta
7201 ctctttgttt aaatgatgga aaaatataaa ttattttcta agtaataaaa gtataaaaat
7261 tatcattata aataaagtct aaagtttgaa attattaatt taaaaaaaaa aaaaaaaaa（配列番号4）
【００７９】
「Schlafen12（SLFN12）ポリペプチド」とは、本明細書に記載される化合物の1つと結合するとPDE3Aと相互作用する、NCBI参照番号NP＿060512．3で提供される配列と少なくとも85％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質またはその断片を意味する。代表的なヒトSLFN12アミノ酸配列を以下に提供する：
MNISVDLETNYAELVLDVGRVTLGENSRKKMKDCKLRKKQNESVSRAMCALLNSGGGVIKAEIENEDYSYTKDGIGLDLENSFSNILLFVPEYLDFMQNGNYFLIFVKSWSLNTSGLRITTLSSNLYKRDITSAKVMNATAALEFLKDMKKTRGRLYLRPELLAKRPCVDIQEENNMKALAGVFFDRTELDRKEKLTFTESTHVEIKNFSTEKLLQRIKEILPQYVSAFANTDGGYLFIGLNEDKEIIGFKAEMSDLDDLEREIEKSIRKMPVHHFCMEKKKINYSCKFLGVYDKGSLCGYVCALRVERFCCAVFAKEPDSWHVKDNRVMQLTRKEWIQFMVEAEPKFSSSYEEVISQINTSLPAPHSWPLLEWQRQRHHCPGLSGRITYTPENLCRKLFLQHEGLKQLICEEMDSVRKGSLIFSRSWSVDLGLQENHKVLCDALLISQDSPPVLYTFHMVQDEEFKGYSTQTALTLKQKLAKIGGYTKKVCVMTKIFYLSPEGMTSCQYDLRSQVIYPESYYFTRRKYLLKALFKALKRLKSLRDQFSFAENLYQIIGIDCFQKNDKKMFKSCRRLT（配列番号5）
【００８０】
「Schlafen12（SLFN12）ポリヌクレオチド」とは、SLFN12ポリペプチドまたはその断片をコードする、DNAおよびRNAを含む任意の核酸分子を意味する。代表的なSLFN12核酸配列はNCBI参照番号：NM＿018042．4で提供される：
1 tttgtaactt cacttcagcc tcccattgat cgctttctgc aaccattcag actgatctcg
61 ggctcctatt tcatttacat tgtgtgcaca ccaagtaacc agtgggaaaa ctttagaggg
121 tacttaaacc ccagaaaatt ctgaaaccgg gctcttgagc cgctatcctc gggcctgctc
181 ccaccctgtg gagtgcactt tcgttttcaa taaatctctg cttttgttgc ttcattcttt
241 ccttgctttg tttgtgtgtt tgtccagttc tttgttcaac acgccaagaa cctggacact
301 cttcactggt aacatatttt ggcaagccaa ccaggagaaa agaatttctg cttggacact
361 gcatagctgc tgggaaaatg aacatcagtg ttgatttgga aacgaattat gccgagttgg
421 ttctagatgt gggaagagtc actcttggag agaacagtag gaaaaaaatg aaggattgta
481 aactgagaaa aaagcagaat gaaagtgtct cacgagctat gtgtgctctg ctcaattctg
541 gagggggagt gatcaaggct gaaattgaga atgaagacta tagttataca aaagatggaa
601 taggactaga tttggaaaat tcttttagta acattctgtt atttgttcct gagtacttag
661 acttcatgca gaatggtaac tactttctga tttttgtgaa gtcatggagc ttgaacacct
721 ctggtctgcg gattaccacc ttgagctcca atttgtacaa aagagatata acatctgcaa
781 aagtcatgaa tgccactgct gcactggagt tcctcaaaga catgaaaaag actagaggga
841 gattgtattt aagaccagaa ttgctggcaa agaggccctg tgttgatata caagaagaaa
901 ataacatgaa ggccttggcc ggggtttttt ttgatagaac agaacttgat cggaaagaaa
961 aattgacctt tactgaatcc acacatgttg aaattaaaaa cttctcgaca gaaaagttgt
1021 tacaacgaat taaagagatt ctccctcaat atgtttctgc atttgcaaat actgatggag
1081 gatatttgtt cattggttta aatgaagata aagaaataat tggctttaaa gcagagatga
1141 gtgacctcga tgacttagaa agagaaatcg aaaagtccat taggaagatg cctgtgcatc
1201 acttctgtat ggagaagaag aagataaatt attcatgcaa attccttgga gtatatgata
1261 aaggaagtct ttgtggatat gtctgtgcac tcagagtgga gcgcttctgc tgtgcagtgt
1321 ttgctaaaga gcctgattcc tggcatgtga aagataaccg tgtgatgcag ttgaccagga
1381 aggaatggat ccagttcatg gtggaggctg aaccaaaatt ttccagttca tatgaagagg
1441 tgatctctca aataaatacg tcattacctg ctccccacag ttggcctctt ttggaatggc
1501 aacggcagag acatcactgt ccagggctat caggaaggat aacgtatact ccagaaaacc
1561 tttgcagaaa actgttctta caacatgaag gacttaagca attaatatgt gaagaaatgg
1621 actctgtcag aaagggctca ctgatcttct ctaggagctg gtctgtggat ctgggcttgc
1681 aagagaacca caaagtcctc tgtgatgctc ttctgatttc ccaggacagt cctccagtcc
1741 tatacacctt ccacatggta caggatgagg agtttaaagg ctattctaca caaactgccc
1801 taaccttaaa gcagaagctg gcaaaaattg gtggttacac taaaaaagtg tgtgtcatga
1861 caaagatctt ctacttgagc cctgaaggca tgacaagctg ccagtatgat ttaaggtcgc
1921 aagtaattta ccctgaatcc tactatttta caagaaggaa atacttgctg aaagcccttt
1981 ttaaagcctt aaagagactc aagtctctga gagaccagtt ttcctttgca gaaaatctat
2041 accagataat cggtatagat tgctttcaga agaatgataa aaagatgttt aaatcttgtc
2101 gaaggctcac ctgatggaaa atggactggg ctactgagat atttttcatt atatatttga
2161 taacattctc taattctgtg aaaatatttc tttgaaaact ttgcaagtta agcaacttaa
2221 tgtgatgttg gataattggg ttttgtctat tttcacttct ccctaaataa tcttcacaga
2281 tattgtttga gggatattag gaaaattaat ttgttaactc gtctgtgcac agtattattt
2341 actctgtctg tagttcctga ataaattttc ttccatgctt gaactgggaa aattgcaaca
2401 cttttattct taatgacaac agtgaaaatc tcccagcata tacctagaaa acaattataa
2461 cttacaaaag attatccttg atgaaactca gaatttccac agtgggaatg aataagaagg
2521 caaaactcat（配列番号6）
【００８１】
「PDE3Bポリヌクレオチド」とは、PDE3Bポリペプチドまたはその断片をコードするDNAおよびRNAを含む任意の核酸分子を意味する。代表的なPDE3B核酸配列はNCBI参照番号：NM＿000922．3で提供される：
ATGAGGAGGGACGAGCGAGACGCCAAAGCCATGCGGTCCCTGCAGCCGCCGGATGGGGCCGGCTCGCCCCCCGAGAGTCTGAGGAACGGCTACGTGAAGAGCTGCGTGAGCCCCTTGCGGCAGGACCCTCCGCGCGGCTTCTTCTTCCACCTCTGCCGCTTCTGCAACGTGGAGCTGCGGCCGCCGCCGGCCTCTCCCCAGCAGCCGCGGCGCTGCTCCCCCTTCTGCCGGGCGCGCCTCTCGCTGGGCGCCCTGGCTGCCTTTGTCCTCGCCCTGCTGCTGGGCGCGGAACCCGAGAGCTGGGCTGCCGGGGCCGCCTGGCTGCGGACGCTGCTGAGCGTGTGTTCGCACAGCTTGAGCCCCCTCTTCAGCATCGCCTGTGCCTTCTTCTTCCTCACCTGCTTCCTCACCCGGACCAAGCGGGGACCCGGCCCGGGCCGGAGCTGCGGCTCCTGGTGGCTGCTGGCGCTGCCCGCCTGCTGTTACCTGGGGGACTTCTTGGTGTGGCAGTGGTGGTCTTGGCCTTGGGGGGATGGCGACGCAGGGTCCGCGGCCCCGCACACGCCCCCGGAGGCGGCAGCGGGCAGGTTGCTGCTGGTGCTGAGCTGCGTAGGGCTGCTGCTGACGCTCGCGCACCCGCTGCGGCTCCGGCACTGCGTTCTGGTGCTGCTCCTGGCCAGCTTCGTCTGGTGGGTCTCCTTCACCAGCCTCGGGTCGCTGCCCTCCGCCCTCAGGCCGCTGCTCTCCGGCCTGGTGGGGGGCGCTGGCTGCCTGCTGGCCCTGGGGTTGGATCACTTCTTTCAAATCAGGGAAGCGCCTCTTCATCCTCGACTGTCCAGTGCCGCCGAAGAAAAAGTGCCTGTGATCCGACCCCGGAGGAGGTCCAGCTGCGTGTCGTTAGGAGAAACTGCAGCCAGTTACTATGGCAGTTGCAAAATATTCAGGAGACCGTCGTTGCCTTGTATTTCCAGAGAACAGATGATTCTTTGGGATTGGGACTTAAAACAATGGTATAAGCCTCATTATCAAAATTCTGGAGGTGGAAATGGAGTTGATCTTTCAGTGCTAAATGAGGCTCGCAATATGGTGTCAGATCTTCTGACTGATCCAAGCCTTCCACCACAAGTCATTTCCTCTCTACGGAGTATTAGTAGCTTAATGGGTGCTTTCTCAGGTTCCTGTAGGCCAAAGATTAATCCTCTCACACCATTTCCTGGATTTTACCCCTGTTCTGAAATAGAGGACCCAGCTGAGAAAGGGGATAGAAAACTTAACAAGGGACTAAATAGGAATAGTTTGCCAACTCCACAGCTGAGGAGAAGCTCAGGAACTTCAGGATTGCTACCTGTTGAACAGTCTTCAAGGTGGGATCGTAATAATGGCAAAAGACCTCACCAAGAATTTGGCATTTCAAGTCAAGGATGCTATCTAAATGGGCCTTTTAATTCAAATCTACTGACTATCCCGAAGCAAAGGTCATCTTCTGTATCACTGACTCACCATGTAGGTCTCAGAAGAGCTGGTGTTTTGTCCAGTCTGAGTCCTGTGAATTCTTCCAACCATGGACCAGTGTCTACTGGCTCTCTAACTAATCGATCACCCATAGAATTTCCTGATACTGCTGATTTTCTTAATAAGCCAAGCGTTATCTTGCAGAGATCTCTGGGCAATGCACCTAATACTCCAGATTTTTATCAGCAACTTAGAAATTCTGATAGCAATCTGTGTAACAGCTGTGGACATCAAATGCTGAAATATGTTTCAACATCTGAATCAGATGGTACAGATTGCTGCAGTGGAAAATCAGGTGAAGAAGAAAACATTTTCTCGAAAGAATCATTCAAACTTATGGAAACTCAACAAGAAGAGGAAACAGAGAAGAAAGACAGCAGAAAATTATTTCAGGAAGGTGATAAGTGGCTAACAGAAGAGGCACAGAGTGAACAGCAAACAAATATTGAACAGGAAGTATCACTGGACCTGATTTTAGTAGAAGAGTATGACTCATTAATAGAAAAGATGAGCAACTGGAATTTTCCAATTTTTGAACTTGTAGAAAAGATGGGAGAGAAATCAGGAAGGATTCTCAGTCAGGTTATGTATACCTTATTTCAAGACACTGGTTTATTGGAAATATTTAAAATTCCCACTCAACAATTTATGAACTATTTTCGTGCATTAGAAAATGGCTATCGAGACATTCCTTATCACAATCGTATACATGCCACAGATGTGCTACATGCAGTTTGGTATCTGACAACACGGCCAGTTCCTGGCTTACAGCAGATCCACAATGGTTGTGGAACAGGAAATGAAACAGATTCTGATGGTAGAATTAACCATGGGCGAATTGCTTATATTTCTTCGAAGAGCTGCTCTAATCCTGATGAGAGTTATGGCTGCCTGTCTTCAAACATTCCTGCATTAGAATTGATGGCTCTATACGTGGCAGCTGCCATGCATGATTATGATCACCCAGGGAGGACAAATGCATTTCTAGTGGCTACAAATGCCCCTCAGGCAGTTTTATACAATGACAGATCTGTTCTGGAAAATCATCATGCTGCGTCAGCTTGGAATCTATATCTTTCTCGCCCAGAATACAACTTCCTTCTTCATCTTGATCATGTGGAATTCAAGCGCTTTCGTTTTTTAGTCATTGAAGCAATCCTTGCTACGGATCTTAAAAAGCATTTTGATTTTCTCGCAGAATTCAATGCCAAGGCAAATGATGTAAATAGTAATGGCATAGAATGGAGTAATGAAAATGATCGCCTCTTGGTATGCCAGGTGTGCATCAAACTGGCAGATATAAATGGCCCAGCAAAAGTTCGAGACTTGCATTTGAAATGGACAGAAGGCATTGTCAATGAATTTTATGAGCAGGGAGATGAAGAAGCAAATCTTGGTCTGCCCATCAGTCCATTCATGGATCGTTCTTCTCCTCAACTAGCAAAACTCCAAGAATCTTTTATCACCCACATAGTGGGTCCCCTGTGTAACTCCTATGATGCTGCTGGTTTGCTACCAGGTCAGTGGTTAGAAGCAGAAGAGGATAATGATACTGAAAGTGGTGATGATGAAGACGGTGAAGAATTAGATACAGAAGATGAAGAAATGGAAAACAATCTAAATCCAAAACCACCAAGAAGGAAAAGCAGACGGCGAATATTTTGTCAGCTAATGCACCACCTCACTGAAAACCACAAGATATGGAAGGAAATCGTAGAGGAAGAAGAAAAATGTAAAGCTGATGGGAATAAACTGCAGGTGGAGAATTCCTCCTTACCTCAAGCAGATGAGATTCAGGTAATTGAAGAGGCAGATGAAGAGGAATAG（配列番号7）
【００８２】
「PDE3Bポリペプチド」とは、NCBI参照番号NP＿000913．2で提供される配列と少なくとも85％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質またはその断片を意味する。代表的なヒトPDE3Bアミノ酸配列を以下に提供する：
MRRDERDAKAMRSLQPPDGAGSPPESLRNGYVKSCVSPLRQDPPRGFFFHLCRFCNVELRPPPASPQQPRRCSPFCRARLSLGALAAFVLALLLGAEPESWAAGAAWLRTLLSVCSHSLSPLFSIACAFFFLTCFLTRTKRGPGPGRSCGSWWLLALPACCYLGDFLVWQWWSWPWGDGDAGSAAPHTPPEAAAGRLLLVLSCVGLLLTLAHPLRLRHCVLVLLLASFVWWVSFTSLGSLPSALRPLLSGLVGGAGCLLALGLDHFFQIREAPLHPRLSSAAEEKVPVIRPRRRSSCVSLGETAASYYGSCKIFRRPSLPCISREQMILWDWDLKQWYKPHYQNSGGGNGVDLSVLNEARNMVSDLLTDPSLPPQVISSLRSISSLMGAFSGSCRPKINPLTPFPGFYPCSEIEDPAEKGDRKLNKGLNRNSLPTPQLRRSSGTSGLLPVEQSSRWDRNNGKRPHQEFGISSQGCYLNGPFNSNLLTIPKQRSSSVSLTHHVGLRRAGVLSSLSPVNSSNHGPVSTGSLTNRSPIEFPDTADFLNKPSVILQRSLGNAPNTPDFYQQLRNSDSNLCNSCGHQMLKYVSTSESDGTDCCSGKSGEEENIFSKESFKLMETQQEEETEKKDSRKLFQEGDKWLTEEAQSEQQTNIEQEVSLDLILVEEYDSLIEKMSNWNFPIFELVEKMGEKSGRILSQVMYTLFQDTGLLEIFKIPTQQFMNYFRALENGYRDIPYHNRIHATDVLHAVWYLTTRPVPGLQQIHNGCGTGNETDSDGRINHGRIAYISSKSCSNPDESYGCLSSNIPALELMALYVAAAMHDYDHPGRTNAFLVATNAPQAVLYNDRSVLENHHAASAWNLYLSRPEYNFLLHLDHVEFKRFRFLVIEAILATDLKKHFDFLAEFNAKANDVNSNGIEWSNENDRLLVCQVCIKLADINGPAKVRDLHLKWTEGIVNEFYEQGDEEANLGLPISPFMDRSSPQLAKLQESFITHIVGPLCNSYDAAGLLPGQWLEAEEDNDTESGDDEDGEELDTEDEEMENNLNPKPPRRKSRRRIFCQLMHHLTENHKIWKEIVEEEEKCKADGNKLQVENSSLPQADEIQVIEEADEEE＊（配列番号8）
【００８３】
一部の態様では、化合物は異性体である。「異性体」は同じ分子式を有する異なる化合物である。「立体異性体」は、原子が空間に配置される方法のみが異なる異性体である。本明細書で使用される場合、「異性体」という用語は、任意のおよび全ての幾何異性体および立体異性体を含む。例えば、「異性体」は、本発明の範囲に入るものとして、E−異性体およびZ−異性体とも呼ばれる幾何学的二重結合シス−およびトランス−異性体；R−およびS−エナンチオマー；ジアステレオマー、（d）−異性体および（l）−異性体、それらのラセミ混合物；ならびにこれらの他の混合物を含む。
【００８４】
記号−−−−−は、本明細書に記載される単結合、二重結合または三重結合であり得る結合を示す。本明細書では、炭素−炭素二重結合の周りの置換基の配置または炭素環の周りの置換基の配置から生じる種々の幾何異性体およびその混合物が提供される。炭素−炭素二重結合の周りの置換基は、「Z」または「E」配置であると指定され、「Z」および「E」という用語はIUPAC基準に従って使用される。特に指定されない限り、二重結合を示す構造は、「E」異性体と「Z」異性体の両方を包含する。
【００８５】
あるいは、炭素−炭素二重結合の周りの置換基を「シス」または「トランス」と呼ぶことができ、「シス」は二重結合の同じ側の置換基を表し、「トランス」は二重結合の反対側の置換基を表す。炭素環の周りの置換基の配置を「シス」または「トランス」と呼ぶこともできる。「シス」という用語は、環の面の同じ側の置換基を表し、「トランス」という用語は、環の面の反対側の置換基を表す。置換基が環の面の同じ側と反対側の両方に配置されている化合物の混合物は、「シス／トランス」と呼ばれる。
【００８６】
「エナンチオマー」という用語は、互いに重ね合わせることができない鏡像である一対の立体異性体を指す。非対称な置換基のセットを有する原子はエナンチオマーを生じ得る。任意の割合の対のエナンチオマーの混合物は「ラセミ」混合物として知られ得る。「（±）」という用語は、適切な場合にはラセミ混合物を示すために使用される。「ジアステレオ異性体」は、少なくとも2個の不斉原子を有するが、互いに鏡像ではない立体異性体である。絶対立体化学は、カーン・インゴルド・プレローグR−Sシステムにより指定される。化合物がエナンチオマーである場合、各キラル炭素における立体化学は、RまたはSのいずれかによって指定することができる。絶対配置が未知である分割された化合物は、ナトリウムD線の波長で平面偏光を回転させる方向（右旋性または左旋性）に応じて（＋）または（−）で表すことができる。本明細書に記載される特定の化合物は、1個または複数の不斉中心を含むので、それぞれの不斉原子における絶対立体化学的な観点から、（R）−または（S）−として定義することができるエナンチオマー、ジアステレオマーおよび他の立体異性体形態を生じ得る。本化学物質、医薬組成物および方法は、ラセミ混合物、光学的に実質的に純粋な形態および中間体混合物を含む、全てのこのような可能な異性体を含むことを意味する。
【００８７】
光学活性な（R）−および（S）−異性体は、例えばキラルシントンもしくはキラル試薬を用いて調製することができるか、または慣用的な技術を用いて分割することができる。エナンチオマーは、キラル高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）、キラル塩の形成および結晶化を含む当業者に公知の任意の方法によってラセミ混合物から単離することができるか、または不斉合成によって調製することができる。
【００８８】
光学異性体は、慣用的な方法によるラセミ混合物の分割、例えばジアステレオ異性体塩の形成、光学活性酸または塩基による処理によって得ることができる。適当な酸の例には、酒石酸、ジアセチル酒石酸、ジベンゾイル酒石酸、ジトルオイル酒石酸およびカンファースルホン酸がある。結晶化によるジアステレオ異性体の混合物の分離、引き続いてこれらの塩からの光学活性塩基の遊離により、異性体が分離される。別の方法は、開示される化合物を活性化形態の光学的に純粋な酸または光学的に純粋なイソシアネートと反応させることによる共有結合ジアステレオ異性体分子の合成を含む。合成されたジアステレオ異性体は、クロマトグラフィー、蒸留、結晶化または昇華などの慣用的な手段によって分離し、次いで、加水分解してエナンチオマー濃縮化合物を得ることができる。光学活性化合物はまた、活性出発材料を使用して得ることもできる。いくつかの実施形態では、これらの異性体が遊離酸、遊離塩基、エステルまたは塩の形態であり得る。
【００８９】
一定の実施形態では、本発明の化合物は、互変異性体であり得る。本明細書で使用される場合、「互変異性体」という用語は、水素原子の少なくとも1つの正式な移動および原子価の少なくとも1つの変化（例えば、単結合が二重結合に、三重結合が単結合に、またはその逆も同様）から生じる2つ以上の相互変換可能な化合物を含む種類の異性体である。「互変異性化」には、プロトン移動またはプロトンシフト互変異性化が含まれ、これは酸−塩基化学のサブセットと考えられている。「プロトン移動互変異性化」または「プロトンシフト互変異性化」は、結合順序の変化を伴うプロトンの移動を含む。互変異性体の正確な比は、温度、溶媒およびpHを含むいくつかの因子に依存する。互変異性化が（例えば、溶液中で）可能である場合、互変異性体の化学平衡に達することができる。互変異性化（すなわち、互変異性体対をもたらす反応）は、酸もしくは塩基により触媒され得るか、または外部作用物質の作用も存在もなく起こり得る。代表的な互変異性化には、それだけに限らないが、ケト−エノール；アミド−イミド；ラクタム−ラクチム；エナミン−イミン；エナミン−（異なる）エナミン互変異性化が含まれる。ケト−エノール互変異性化の具体例は、ペンタン−2，4−ジオンと4−ヒドロキシペンタ−3−エン−2−オン互変異性体の相互変換である。互変異性化の別の例は、フェノール−ケト互変異性化である。フェノール−ケト互変異性化の具体例は、ピリジン−4−オールとピリジン−4（1H）−オン互変異性体の相互変換である。
【００９０】
具体的な立体化学または異性体形態が具体的に示されていない限り、構造の全てのキラル、ジアステレオマー、ラセミおよび幾何異性体が意図される。本発明の化合物を調製するために使用される全ての方法およびそこで生成される中間体は、本発明の一部とみなされる。示されるまたは記載される化合物の全ての互変異性体もまた、本発明の一部とみなされる。
【００９１】
「薬剤」とは、任意の小分子化学化合物、抗体、核酸分子もしくはポリペプチド、またはその断片を意味する。
【００９２】
「改善する」とは、疾患の発症または進行を減少させる、抑制する、減弱する、減らす、停止するまたは安定化することを意味する。
【００９３】
「改変」とは、本明細書に記載されるものなどの標準的な技術公知の方法によって検出される遺伝子またはポリペプチドの発現レベルまたは活性の変化（増加または減少）を意味する。本明細書で使用される場合、一実施形態では、改変は、発現レベルの約10％の変化、好ましくは約25％の変化、より好ましくは約40％の変化、最も好ましくは発現レベルの約50％以上の変化を含む。ある種の実施形態では、改変は、発現レベルの10％以下（10％を含む）の変化、好ましくは25％以下（25％を含む）の変化、より好ましくは40％以下（40％を含む）の変化、最も好ましくは50％以下（50％を含む）またはそれ以上の発現レベルの変化を含む。その他の実施形態では、改変は、発現レベルの9％〜11％（9％および11％を含む）の変化、好ましくは10％〜25％（10％および25％を含む）の変化、より好ましくは25％〜40％（25％および40％を含む）の変化、最も好ましくは40％〜50％（40％および50％を含む）または50％（50％を含む）以上の発現レベルの変化を含む。その他の特定の実施形態では、改変は、発現レベルの9％〜11％（9％および11％を含む）の変化、好ましくは22％〜28％（22％および28％を含む）の変化、より好ましくは35％〜45％（35％および45％を含む）の変化、最も好ましくは45％〜55％（45％および55％を含む）または55％以上の発現レベルの変化を含む。
【００９４】
「類似体」とは、同一ではないが、類似の機能的または構造的特徴を有する分子を意味する。例えば、ポリペプチド類似体は、対応する天然ポリペプチドの生物学的活性を保持するが、天然ポリペプチドと比較して類似体の機能を強化する一定の生化学的修飾を有する。このような生化学的修飾は、例えばリガンド結合を改変することなく、類似体のプロテアーゼ耐性、膜透過性または半減期を増加させることができるだろう。類似体は非天然アミノ酸を含むことがある。
【００９５】
本開示において、「含む（comprises）」、「含む（comprising）」、「含有する（containing）」および「有する（having）」などは、米国特許法で帰される意味を有することができて、「含む（includes）」、「含む（including）」などを意味することができる；「から本質的になる（consisting essentially of）」または「本質的になる（consists essentially）」も同様に米国特許法に帰する意味を有し、この用語はオープンエンドであり、列挙されるものよりも多く存在することによって列挙されるその基本的なまたは新規な特徴が変化しない限り、列挙されるものよりも多く存在することが可能であるが、先行技術の実施形態を除外する。
【００９６】
「検出する」は、検出される分析物の存在、不存在または量を識別することを指す。特定の実施形態では、分析物はPDE3AまたはPDE3BまたはSLFN12ポリペプチドである。
【００９７】
「疾患」とは、細胞、組織または器官の正常な機能を損なうかまたは妨げる任意の状態または障害を意味する。疾患の例としては、黒色腫、腺癌、肺癌、子宮頸癌、肝臓癌および乳癌が挙げられる。
【００９８】
「有効量」とは、未治療患者と比較して疾患の症状を改善するために必要とされる、本明細書に記載される化合物の量を意味する。疾患の治療的処置のために本発明を実施するために使用される1種または複数の活性化合物の有効量は、投与様式、対象の年齢、体重および全身の健康状態に応じて変化する。最終的に、主治医または獣医師が適切な量および投与計画を決定する。このような量は「有効」量と呼ばれる。さらにその他の実施形態では、PDE3Aおよび／またはPDE3Bモジュレーターは、化合物1、化合物2である。
【００９９】
本発明は、本明細書で描写される方法によって特徴付けられる障害を治療するための高度に特異的な薬物の開発に有用ないくつかの標的を提供する。さらに、本発明の方法は、対象に使用するために安全な治療法を識別するための容易な手段を提供する。さらに、本発明の方法は、ハイスループット、高感度および低複雑性で、本明細書に記載される疾患に対する効果について実質的に多くの化合物を分析するための経路を提供する。
【０１００】
「断片」とは、ポリペプチドまたは核酸分子の一部を意味する。この部分は、好ましくは基準核酸分子またはポリペプチドの全長の少なくとも約10％、約20％、約30％、約40％、約50％、約60％、約70％、約80％または約90％を含む。ある種の実施形態では、この部分は、好ましくは、基準核酸分子またはポリペプチドの全長の少なくとも9％〜11％（9％および11％を含む）、18％〜22％（18％および22％を含む）、27％〜33％（27％および33％を含む）、36％〜44％（36％および44％を含む）、45％〜55％（45％および55％を含む）、54％〜66％（54％および66％を含む）、63％〜77％（63％および77％を含む）、72％〜88％（72％および88％を含む）、または81％〜99％（81％および99％を含む）を含む。断片は、約10個、約20個、約30個、約40個、約50個、約60個、約70個、約80個、約90個、約100個、約200個、約300個、約400個、約500個、約600個、約700個、約800個、約900個または約1000個のヌクレオチドまたはアミノ酸を含むことができる。ある種の実施形態では、断片は、9〜11、約18〜22、27〜33、36〜44、45〜55、54〜66、63〜77、72〜88、81〜99、90〜110、180〜220、270〜330、360〜440、450〜550、540〜660、630〜770、720〜880、810〜990、または900〜1100個のヌクレオチドまたはアミノ酸を含むことができる（それぞれ言及される限界を含む、例えば「9〜11」は9および11を含む）。
【０１０１】
「血液腫瘍」には、白血病およびリンパ腫の侵襲性および低悪性度型、つまり非ホジキン病、慢性および急性骨髄性白血病（CML／AML）、急性リンパ芽球性白血病（ALL）、ホジキン病、多発性骨髄腫およびT細胞リンパ腫が含まれる。また、骨髄異形成症状群、形質細胞腫瘍、腫瘍随伴症状群、および原発部位が不明な癌ならびにAIDS関連悪性腫瘍も含まれる。
【０１０２】
「ハイブリダイゼーション」は、相補的核酸塩基間のワトソン−クリック、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン水素結合であってよい、水素結合を意味する。例えば、アデニンおよびチミンは、水素結合の形成を通して対形成する相補的な核酸塩基である。
【０１０３】
「過剰増殖性疾患」には、例えば乾癬、ケロイドおよびその他の皮膚に影響を及ぼす過形成、良性過剰増殖性疾患、造血過剰増殖性疾患（hematopoietic hyperproliferative diseases）、癌（例えば、転移性または悪性腫瘍、固形腫瘍および血液腫瘍）が含まれる。
【０１０４】
「良性過剰増殖性疾患」には、例えば、子宮内膜症、平滑筋腫および良性前立腺過形成が含まれる。
【０１０５】
「造血過剰増殖性疾患」は、骨髄増殖性疾患としても公知であり、例えば真性赤血球増加症、本態性血小板増加症、血小板増多症、原発性骨髄線維症などが含まれる。
【０１０６】
「マーカー」または「バイオマーカー」とは、疾患または障害に関連する発現レベルまたは（例えば、タンパク質またはmRNAレベルでの）活性の変化を有する任意のタンパク質またはポリヌクレオチドを意味する。特定の実施形態では、本発明のマーカーがPDE3AまたはPDE3BまたはSLFN12またはCREB3L1である。
【０１０７】
「モジュレーター」とは、ポリペプチドに結合し、そのポリペプチドの生物学的機能または活性を変化させる任意の作用物質を意味する。モジュレーターは、限定されないが、ポリペプチドの生物学的機能または活性を低下または排除する薬剤（例えば、「阻害剤」）を含む。例えば、モジュレーターはポリペプチドの触媒活性を阻害することができる。モジュレーターは、限定されないが、ポリペプチドと別の薬剤との結合を増加または減少させる薬剤を含む。例えば、モジュレーターは、ポリペプチドと別のポリペプチドとの結合を促進することができる。いくつかの実施形態では、PDE3A／PDE3BポリペプチドのモジュレーターはDNMDPである。いくつかの他の実施形態では、PDE3A／PDE3Bポリペプチドのモジュレーターはアナグレリドまたはザルダベリンである。さらにその他の実施形態では、PDE3A／PDE3Bポリペプチドのモジュレーターは、化合物1、化合物2である。
【０１０８】
「プロドラッグ」という用語は、それ自体は生物学的に活性であっても不活性であってもよいが、体内での滞留時間中に本発明による化合物に（例えば、代謝的にまたは加水分解的に）変換される化合物を示す。生物系で化合物1またはその塩に変換される化合物1およびその塩の誘導体（生物学的前駆体またはプロドラッグ）は、本発明に包含される。前記生物系は、例えば、哺乳類生物、特にヒト対象であってよい。生物学的前駆体は、例えば、代謝プロセスによって化合物1または2またはその塩に変換される。
【０１０９】
「基準」とは、標準または対照状態を意味する。
【０１１０】
本発明の方法において有用な核酸分子は、本発明のポリペプチドまたはその断片をコードする任意の核酸分子を含む。このような核酸分子は、内因性核酸配列と100％同一である必要はないが、典型的には実質的な同一性を示す。内因性配列と「実質的な同一性」を有するポリヌクレオチドは、典型的には、二本鎖核酸分子の少なくとも1つの鎖とハイブリダイズすることができる。本発明の方法において有用な核酸分子は、本発明のポリペプチドまたはその断片をコードする任意の核酸分子を含む。このような核酸分子は、内因性核酸配列と100％同一である必要はないが、典型的には実質的な同一性を示す。内因性配列と「実質的な同一性」を有するポリヌクレオチドは、典型的には、二本鎖核酸分子の少なくとも1つの鎖とハイブリダイズすることができる。
【０１１１】
「ハイブリダイズする」は、種々のストリンジェンシー条件下で、相補的ポリヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載される遺伝子）またはその一部との間で二本鎖分子を形成する対を意味する（例えば、Wahl，G．M．およびS．L．Berger（1987）Methods Enzymol．152：399；Kimmel，A．R．（1987）Methods Enzymol．152：507参照）。
【０１１２】
例えば、ストリンジェントな塩濃度は、通常、約750mM NaClおよび75mMクエン酸三ナトリウム未満、好ましくは約500mM NaClおよび50mMクエン酸三ナトリウム未満、より好ましくは約250mM NaClおよび25mMクエン酸三ナトリウム未満である。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、有機溶媒、例えばホルムアミドの非存在下で得ることができるが、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、少なくとも約35％ホルムアミド、より好ましくは少なくとも約50％ホルムアミドの存在下で得ることができる。ストリンジェントな温度条件は、通常、少なくとも約30℃、より好ましくは少なくとも約37℃、最も好ましくは少なくとも約42℃の温度を含む。ハイブリダイゼーション時間、洗剤、例えばドデシル硫酸ナトリウム（SDS）の濃度、および担体DNAの包含または排除などの付加的なパラメータを変えることは、当業者に周知である。種々のレベルのストリンジェンシーは、必要に応じてこれらの種々の条件を組み合わせることによって達成される。好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションは、750mM NaCl、75mMクエン酸三ナトリウム、および1％SDS中、30℃で行われる。より好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションは、500mM NaCl、50mMクエン酸三ナトリウム、1％SDS、35％ホルムアミドおよび100μg／ml変性サケ精子DNA（ssDNA）中、37℃で行われる。最も好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションは、250mM NaCl、25mMクエン酸三ナトリウム、1％SDS、50％ホルムアミドおよび200μg／ml ssDNA中、42℃で行われる。これらの条件の有用な変形は、当業者には容易に明らかであろう。
【０１１３】
大部分の用途では、ハイブリダイゼーションに続く洗浄ステップもストリンジェンシーが変化する。洗浄ストリンジェンシー条件は、塩濃度および温度によって定義することができる。上記のように、洗浄ストリンジェンシーは、塩濃度を低下させることによって、または温度を上昇させることによって増加させることができる。例えば、洗浄ステップのストリンジェントな塩濃度は、好ましくは約30mM NaClおよび3mMクエン酸三ナトリウム未満、最も好ましくは約15mM NaClおよび1．5mMクエン酸三ナトリウム未満である。洗浄ステップのストリンジェントな温度条件は、通常、少なくとも約25℃、より好ましくは少なくとも約42℃、さらにより好ましくは少なくとも約68℃の温度を含む。好ましい実施形態では、洗浄ステップが、30mM NaCl、3mMクエン酸三ナトリウムおよび0．1％SDS中、25℃で行われる。より好ましい実施形態では、洗浄ステップが、15mM NaCl、1．5mMクエン酸三ナトリウムおよび0．1％SDS中、42℃で行われる。より好ましい実施形態では、洗浄ステップが、15mM NaCl、1．5mMクエン酸三ナトリウムおよび0．1％SDS中、68℃で行われる。これらの条件のさらなる変形は、当業者には容易に明らかであろう。ハイブリダイゼーション技術は、当業者に周知であり、例えば、BentonおよびDavis（Science 196：180、1977）；GrunsteinおよびHogness（Proc．Natl．Acad．Sci．、USA 72：3961、1975）；Ausubelら（Current Protocols in Molecular Biology、Wiley Interscience、ニューヨーク、2001）；BergerおよびKimmel（Guide to Molecular Cloning Techniques、1987、Academic Press、ニューヨーク）；ならびにSambrookら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、ニューヨークに記載されている。
【０１１４】
「固形腫瘍」には、例えば、乳房、気道、脳、骨、中枢神経系および末梢神経系、結腸、直腸、肛門、生殖器（例えば、子宮頸部、卵巣、前立腺）、胃腸管、尿生殖路、内分泌腺（例えば、甲状腺および副腎皮質）、甲状腺、副甲状腺、食道、子宮内膜、眼、生殖細胞、頭頚部、腎臓、肝臓、喉頭および下咽頭、肺、中皮腫、膵臓、前立腺、直腸、腎臓、小腸、皮膚、軟組織、胃、精巣、尿管、膣および外陰部の腫瘍ならびにこれらの腫瘍の結合組織および転移が含まれる。悪性新生物には、網膜芽細胞腫およびウィルムス腫瘍によって例示される遺伝性癌が含まれる。
【０１１５】
治療することのできる「乳腺腫瘍」としては、例えば、ホルモン受容体陽性状態の乳癌、ホルモン受容体陰性状態の乳癌、Her2陽性乳癌、ホルモン受容体陰性およびHer2陰性乳癌、BRCA関連乳乳癌および炎症性乳癌が挙げられる。
【０１１６】
治療することのできる「気道の腫瘍」としては、例えば、非小細胞気管支癌および小細胞気管支癌、非小細胞肺癌、および小細胞肺癌が挙げられる。
【０１１７】
治療することのできる「脳腫瘍」としては、例えば、神経膠腫、神経膠芽腫、星状細胞腫、髄膜腫および髄芽細胞腫が挙げられる。
【０１１８】
治療することのできる「男性生殖器の腫瘍」としては、例えば、前立腺癌、悪性精巣上体腫瘍、悪性精巣腫瘍および陰茎癌が挙げられる。
【０１１９】
治療することのできる「女性生殖器の腫瘍」としては、例えば、子宮内膜癌、子宮頸癌、卵巣癌、膣癌および外陰癌が挙げられる。
【０１２０】
治療することのできる「胃腸管の腫瘍」としては、例えば、結腸直腸癌腫、肛門癌、胃癌、膵癌、食道癌、胆嚢癌、小腸癌、唾液腺癌、神経内分泌腫瘍および消化管間質腫瘍が挙げられる。
【０１２１】
治療することのできる「尿生殖路の腫瘍」としては、例えば、膀胱癌、腎細胞癌、ならびに腎盂および尿路の癌が挙げられる。
【０１２２】
治療することのできる「眼の腫瘍」としては、例えば、網膜芽細胞腫および眼内黒色腫が挙げられる。
【０１２３】
治療することのできる「肝臓の腫瘍」としては、例えば、肝細胞癌および胆管細胞癌が挙げられる。
【０１２４】
治療することのできる「皮膚の腫瘍」としては、例えば、悪性黒色腫、基底細胞腫、有棘細胞癌、カポジ肉腫およびメルケル細胞癌が挙げられる。
【０１２５】
治療することのできる「頭頚部の腫瘍」としては、例えば、例えば、喉頭癌ならびに咽頭および口腔の癌が挙げられる。
【０１２６】
治療することのできる「肉腫」としては、例えば、軟部組織肉腫、滑膜肉腫、ラブドイド肉腫および骨肉腫が挙げられる。
【０１２７】
治療することのできるリンパ腫としては、例えば、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、皮膚リンパ腫、中枢神経系のリンパ腫およびAIDS関連リンパ腫が挙げられる。
【０１２８】
治療することのできる白血病としては、例えば、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病およびヘアリーセル白血病（hair cell leukaemia）が挙げられる。
【０１２９】
「実質的に同一」とは、基準アミノ酸配列（例えば、本明細書に記載されるアミノ酸配列のいずれか1つ）または核酸配列（例えば、本明細書に記載される核酸配列のいずれか1つ）と少なくとも50％の同一性を示すポリペプチドまたは核酸分子を意味する。好ましくは、このような配列は、比較のために使用される配列とアミノ酸レベルまたは核酸において少なくとも60％、より好ましくは80％または85％、より好ましくは90％、95％またはさらには99％同一である。
【０１３０】
配列同一性は、一般に、配列解析ソフトウェア（例えば、Genetics Computer Group，University of Wisconsin Biotechnology Center，1710 University Avenue，Madison，Wis．53705の配列解析ソフトウェアパッケージ、BLAST、BESTFIT、GAPまたはPILEUP／PRETTYBOXプログラム）を用いて測定される。このようなソフトウェアは、種々の置換、欠失および／または他の修飾との相同性の程度を割り当てることによって、同一または類似の配列を一致させる。保存的置換は、典型的には、以下の群内の置換を含む：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。同一性の程度を決定するための代表的なアプローチでは、e−3とe−100との間の確率スコアが密接に関連する配列を示すBLASTプログラムを使用することができる。
【０１３１】
「対象」とは、それだけに限らないが、ヒトまたはヒト以外の哺乳動物、例えばウシ、ウマ、イヌ、ヒツジまたはネコを含む哺乳動物を意味する。
【０１３２】
本明細書で提供される範囲は、範囲内の値の全ての略語であると理解される。例えば、1〜50の範囲は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49または50からなる群の任意の数、数の組合せまたは部分範囲を含むと理解される。
【０１３３】
本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療すること」、「治療」などの用語は、それに関連する障害および／または症状を減少させるまたは改善することを指す。除外されないが、障害または状態を治療することは、それに関連する障害、状態または症状が完全に排除されることを必要としないことが認識されるだろう。
【０１３４】
特に明記されていない、または文脈から自明でない限り、本明細書中で使用される場合、「または」という用語は包括的であると理解される。特に明記されていない、または文脈から自明でない限り、本明細書中で使用される場合、「a」、「an」および「the」という用語は単数形または複数形であると理解される。
【０１３５】
特に明記されていない、または文脈から自明でない限り、本明細書中で使用される場合、「約」という用語は、当技術分野における通常の公差範囲内、例えば平均の2標準偏差内として理解される。約は、明記される値の10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0．5％、0．1％、0．05％または0．01％以内と理解され得る。文脈から特に明白でない限り、本明細書で提供される全ての数値は、約という用語によって修飾される。
【０１３６】
特に明記されていない、または文脈から自明でない限り、本明細書中で使用される場合、範囲が与えられる場合には、上限および下限は常にそれに含まれるものとする。
【０１３７】
本明細書における変数の任意の定義における化学基のリストの列挙は、任意の単一の基または列挙される基の組合せとしてのその変数の定義を含む。本明細書における変数または態様の実施形態の列挙は、その実施形態を任意の単一の実施形態として、または任意の他の実施形態もしくはその一部との組合せで含む。
【０１３８】
本明細書で提供される任意の組成物または方法は、本明細書で提供される他の組成物および方法のいずれかの1つまたは複数と組み合わせることができる。
【０１３９】
本発明によって定義される組成物および物品は、以下に提供される実施例に関連して単離または製造された。本発明の他の特徴および利点は、詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１４０】
【図１】実施例2に開示される方法によって得られたHeLa細胞中の化合物1および化合物2についての用量反応曲線を示す図である。
【図２】PDE3A発現を欠くが、PDE3BおよびSLFN12の上昇したレベルを発現するHuT78細胞における化合物1および化合物2についての用量反応曲線を示す図である。
【図３】HeLa細胞におけるPDE3Aの高発現とは対照的に、化合物感受性細胞株HuT78およびRVH421における内因性PDE3Aタンパク質発現の欠如を示す免疫ブロットを示す図である。ビンキュリンは負荷対照として検出される。
【図４】PDE3A−CRISPR A2058細胞におけるPDE3Aの発現の消失を示す免疫ブロットを示す図である。ビンキュリンは負荷対照として検出される。
【図５】内因性PDE3AのCRISPRノックアウトにより耐性にされた感受性細胞株A2058における化合物1についての用量反応曲線を示す図である。GFPの異所発現は、化合物1に対する応答の欠如に影響を与えなかったが、PDE3Bの異所発現により、PDE3Aを欠くA2058細胞が化合物1の細胞毒性効果に対して再感作された。
【発明を実施するための形態】
【０１４１】
本発明は、化合物1および2が、ホスホジエステラーゼ3A調節（PDE3A調節）および／またはホスホジエステラーゼ3B  PDE3B調節に対して感受性を有し、ヒト肝細胞において安定性が増加し、かつ／またはイヌにおいてクリアランスが低下するという発見に少なくとも部分的に基づく。
【０１４２】
したがって、本発明は、PDE3A／PDE3Bモジュレーター、特に化合物1および／または化合物2に応答する癌を有するとして対象を選択する方法を提供し、該選択方法は、そのような対象に由来する癌細胞において、PDE3Aおよび／またはPDE3BとSchlafen 12（SLFN12）ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの同時発現を検出することを含む。
【０１４３】
特定の一実施形態では、CREB3L1および／またはSLFN12ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現は、PDE3A／PDE3Bモジュレーターに対する耐性を獲得した癌細胞において低下しているかまたは検出不能である。
【０１４４】
PDE3A／PDE3Bモジュレーター
PDE3A／PDE3Bモジュレーターの識別を、変異型tp53バックグラウンド中の細胞傷害性小分子を識別するよう設計された表現型スクリーニングに関連して行った。予測的ケモゲノミクスアプローチは、広範なインビトロおよびインビボ標的検証からなる標的駆動型の薬物開発プログラムを補完し、逆ケモゲノミクスとも呼ばれ得る（Zhengら、Curr Issues Mol Biol 4、33〜43、2002）。こうして多くの米国食品医薬品局（FDA）承認標的療法が開発され、その中に発癌性体細胞ドライバー変異を標的とする小分子キナーゼ阻害剤がある（Moffatら、Nat Rev Drug Discov 13、588〜602、2014）。しかしながら、標的療法の発見および開発は、しばしば、標的の生物学的機能、その作用機序、および標的を選択的に阻害するための利用可能な化学物質に関する知識の限界によって妨げられる。
【０１４５】
表現型スクリーニングは、将来の研究によってその特定の分子機序がしばしば解明される癌療法のための新規な標的を発見することができる（Swinneyら、Nat Rev Drug Discov 10、507〜519、2011）。近年、不偏表現型スクリーニング研究によって見出された2つのクラスの抗癌剤がFDAによって承認されている。レナリドミドおよびポマリドミドは、その標的の親和性を変化させ、系統特異的転写因子の分解をもたらすE3−リガーゼのモジュレーターであることが分かった一方で（Kronkeら、Science 343、301〜305、2014；Luら、Science 343、305〜309、2014）、ロミデプシンおよびボリノスタットは、後に、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）阻害剤として識別された（Moffatら、Nat Rev Drug Discov 13、588〜602、2014；Nakajimaら、Exp．Cell Res．241、126〜133、1998、Marksら、Nat Biotechnol 25、84〜90、2007）。
【０１４６】
BRCA1／BRCA2変異癌のオラパリブ治療などの合成致死アプローチが有効であることが判明しているが、腫瘍抑制剤変更は、小分子では直接標的化できないため、表現型スクリーニングの適切な標的である。現在の知見によれば、tp53腫瘍抑制遺伝子は、全エキソーム配列決定を受けた4742種の癌の36％において体細胞突然変異が検出され、ヒト癌にわたって最も頻繁に変異している。多くの試みにもかかわらず、tp53変異型細胞を選択的に死滅させる化合物は識別されていない。
【０１４７】
tp53変異癌細胞において合成致死を引き起こす小分子を識別するために開発された表現型スクリーニングにより、思いがけなく、本明細書の下文に記載されるホスホジエステラーゼ3A（PDE3A）およびホスホジエステラーゼ3B（PDE3B）のモジュレーターとして作用する癌選択的細胞傷害性薬剤のクラスの発見が可能になった。環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼは、二次メッセンジャー分子である環状アデノシン一リン酸（cAMP）および環状グアノシン一リン酸（cGMP）の加水分解を触媒し、多くの生理学的過程において重要である。心血管適応症および血小板凝固の阻害のためのPDE3阻害剤ミルリノン、シロスタゾールおよびレボシメンダン、ならびに血小板血症のためのPDE3阻害剤アナグレリドを含むいくつかのホスホジエステラーゼ阻害剤が臨床治療に承認されている。さらなるPDE3A阻害剤は国際公開第2014／164704号から公知である。PDE5阻害剤、例えば、バルデナフィルは勃起不全および肺動脈高血圧を含む平滑筋障害に使用され、PDE4阻害剤ロフルミラストは慢性閉塞性肺疾患（COPD）からの憎悪を軽減する。
【０１４８】
ホスホジエステラーゼ阻害剤は、それらの標的の直接阻害またはアロステリック調節によって作用する；例えば、PDE4の構造解析は、PDE4DおよびPDE4Bアロステリックモジュレーターの設計をもたらした（Burginら、Nat Biotechnol 28、63〜70、2010；Gurneyら、Neurotherapeutics 12、49〜56、2015）。本明細書で以下に提供されるデータは、癌細胞傷害性ホスホジエステラーゼモジュレーターDNMDPが類似のアロステリック機序を介して作用する可能性が高いことを示している。
【０１４９】
したがって、本発明は、癌細胞を含む対象の生体試料中のPDE3AおよびSLFN12発現レベルに基づいて、PDE3A／PDE3Bモジュレーター治療、特に化合物1および／または化合物2による治療に反応する可能性のある悪性腫瘍を有する対象を識別する方法を提供する。
【０１５０】
特定の実施形態では、本発明は、基準と比較してCREB3L1および／またはSLFN12の発現の消失またはその発現レベルの低下に基づいて、PDE3Aモジュレーター治療、特に化合物1および／または化合物2による治療に耐性である悪性腫瘍を有する対象を識別する方法を提供する。
【０１５１】
化合物形態および塩
本発明の化合物は、化合物自体、ならびに適用可能であればそれらの塩およびそれらのプロドラッグを含む。
【０１５２】
塩は、例えば、アニオンと、本明細書に記載される化合物上の正に帯電した置換基（例えば、アミノ）との間で形成され得る。適切なアニオンには、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、トリフルオロ酢酸塩および酢酸塩が含まれる。同様に、塩は、カチオンと、本明細書に記載される化合物上の負に帯電した置換基（例えば、カルボキシレート）との間でも形成され得る。適切なカチオンには、ナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオンおよびアンモニウムカチオン（テトラメチルアンモニウムイオンなど）が含まれる。プロドラッグの例としては、対象に投与すると、活性化合物を提供することができるカルボン酸基のC1〜6アルキルエステルが挙げられる。
【０１５３】
本開示の化合物の薬学的に許容される塩は、薬学的に許容される無機および有機の酸および塩基に由来するものを含む。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される塩」という用語は、薬学的に許容される酸または塩基を本明細書で開示される化合物に添加することによって形成される塩を指す。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」という句は、毒物学的観点から医薬用途での使用に許容され、有効成分と有害に相互作用をしない物質を指す。
【０１５４】
本発明の化合物の薬学的に許容される適した塩は、例えば、十分に塩基性の、例えば鎖中または環内に窒素原子を有する本発明の化合物の酸付加塩、例えば無機酸、または「鉱酸」による酸付加塩、例えば、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、スルファミン酸、重硫酸、リン酸または硝酸など、または有機酸による酸付加塩、例えば、ギ酸、酢酸、アセト酢酸、ピルビン酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、酪酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸、ウンデカン酸、ラウリル酸、安息香酸、サリチル酸、2−（4−ヒドロキシベンゾイル）−安息香酸、ショウノウ酸、ケイヒ酸、シクロペンタンプロピオン酸、ジグルコン酸、3−ヒドロキシ−2−ナフトエ酸、ニコチン酸、パモ酸、ペクチニン酸、3−フェニルプロピオン酸、ピバル酸、2−ヒドロキシエタンスルホン酸、イタコン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、ドデシル硫酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、パラ−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、2−ナフタレンスルホン酸、ナフタリンジスルホン酸、ンファースルホン酸、クエン酸、酒石酸、ステアリン酸、乳酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸、アジピン酸、アルギン酸、マレイン酸、フマル酸、D−グルコン酸、マンデル酸、アスコルビン酸、グルコヘプタン酸、グリセロリン酸、アスパラギン酸、スルホサリチル酸、またはチオシアン酸による酸付加塩であってよい。
【０１５５】
適切な酸塩のさらなる例としては、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリコール酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、2−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、2−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、パルモエート（palmoate）、ペクチン酸塩、過硫酸塩、3−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩およびウンデカン酸塩が挙げられる。本発明の化合物およびそれらの薬学的に許容される酸付加塩を得る際の中間体として有用な塩の調製には、それ自体は薬学的に許容されるものではないシュウ酸などの他の酸を使用することができる。
【０１５６】
さらに、化合物1〜2の、特に十分に酸性の化合物1の別の適切な薬学的に許容される塩は、アルカリ金属塩、例えばナトリウムまたはカリウム塩、アルカリ土類金属塩、例えばカルシウム、マグネシウムまたはストロンチウム塩、あるいはアルミニウムまたは亜鉛塩、あるいはアンモニアまたは1〜20個の炭素原子を有する有機第一級、第二級または第三級アミンから誘導されたアンモニウム塩、例えばエチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、エチルジイソプロピルアミン、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、ジメチルアミノエタノール、ジエチルアミノエタノール、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、プロカイン、ジベンジルアミン、N−メチルモルホリン、アルギニン、リジン、1，2−エチレンジアミン、N−メチルピペリジン、N−メチル−グルカミン、N，N−ジメチル−グルカミン、N−エチル−グルカミン、1，6−ヘキサンジアミン、グルコサミン、サルコシン、セリノール、2−アミノ−1，3−プロパンジオール、3−アミノ−1，2−プロパンジオール、4−アミノ−1，2，3−ブタントリオールなど、あるいは、1〜20個の炭素原子を有する第四級アンモニウムイオンによる塩、例えばテトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、テトラ（n−プロピル）アンモニウム、テトラ（n−ブチル）アンモニウム、N−ベンジル−N，N，N−トリメチルアンモニウム、コリンまたはベンザルコニウムなどである。
【０１５７】
ある種の実施形態では、塩は、アルカリ金属（例えばナトリウム）、アルカリ土類金属（例えばマグネシウム）、アンモニウムおよびN−（アルキル）4＋塩を含む、適切な塩基から誘導される。本発明はまた、本明細書で開示される化合物の任意の塩基性窒素含有基の四級化も想定している。このような四級化によって水または油−溶性または分散性の生成物を得ることができる。本明細書中の式のいずれかの化合物の塩形態は、カルボキシル基のアミノ酸塩（例えば、L−アルギニン、−リジン、−ヒスチジン塩）であり得る。
【０１５８】
適切な塩のリストは、それぞれ全体が参照により本明細書に組み込まれる、Remington’s Pharmaceutical Sciences、第17版、Mack Publishing Company、Easton、Pa．、1985、1418頁；Journal of Pharmaceutical Science、66、2（1977）；および「Pharmaceutical Salts：Properties，Selection，and Use A Handbook；Wermuth，C．G．およびStahl，P．H．（編）Verlag Helvetica Chimica Acta、Zurich、2002［ISBN 3−906390−26−8］に見出される。当業者であれば、請求される化合物の酸付加塩が、いくつかの既知の方法のいずれかを介して化合物と適当な無機酸または有機酸の反応によって調製されることが可能であることをさらに認識するであろう。あるいは、本発明の酸性化合物のアルカリおよびアルカリ土類金属塩は、種々の既知の方法を介して本発明の化合物を適当な塩基と反応させることによって調製される。
【０１５９】
本発明は、単一の塩として、または任意の比の前記塩の任意の混合物として本発明の化合物の全ての可能な塩を含む。
【０１６０】
化合物の中性形態は、塩を塩基または酸と接触させ、親化合物を慣用的な方法で単離することによって再生することができる。化合物の親形態は、極性溶媒への溶解性などの一定の物理的特性において種々の塩形態とは異なるが、その他の点では、塩は本発明の目的のための化合物の親形態と同等である。
【０１６１】
塩形態に加えて、本発明は、プロドラッグ形態である化合物を提供する。本明細書に記載される化合物のプロドラッグは、生理学的条件下で化学変化を受けて本発明の化合物を提供する化合物である。さらに、プロドラッグを、生体外環境において化学的または生化学的方法によって本発明の化合物に変換することができる。例えば、プロドラッグを、適切な酵素または化学試薬によって、経皮パッチリザーバーに入れた場合に、本発明の化合物にゆっくりと変換することができる。プロドラッグは、状況によっては、親薬物よりも投与が容易であり得るので、しばしば有用である。これらは、例えば、親薬物より経口投与によって生物学的に利用可能である場合がある。プロドラッグはまた、親薬物よりも薬理学的組成物における改善された溶解性を有し得る。プロドラッグの加水分解的切断または酸化的活性化によるものなど、多種多様なプロドラッグ誘導体が当該分野で公知である。限定されないが、プロドラッグの一例は、エステル（「プロドラッグ」）として投与されるが、その後、代謝的に加水分解されて活性物質であるカルボン酸になる本発明の化合物であろう。さらなる例としては、本発明の化合物のペプチジル誘導体が挙げられる。
【０１６２】
本発明はまた、化合物の種々の水和物および溶媒和物形態も含む。
【０１６３】
本発明の化合物はまた、このような化合物を構成する原子の1個または複数において不自然な割合の原子同位体を含有してもよい。例えば、化合物は、例えばトリチウム（3H）、ヨウ素−125（125I）または炭素−14（14C）などの放射性同位元素で放射標識されてもよい。本発明の化合物の全ての同位体変種は、放射性であろうとなかろうと、本発明の範囲内に包含されることが意図され、特に重水素含有化合物が含まれる。
【０１６４】
化合物または試薬の「同位体変異体」という用語は、そのような化合物を構成する、不自然な比率の1または複数の同位体を示す化合物と定義される。
【０１６５】
「不自然な比率」という表現は、そのような同位体のその自然存在比よりも高い比率を意味する。この文脈に適用される同位体の自然存在比は、「Isotopic Compositions of the Elements 1997」，Pure Appl．Chem．，70（1），217−235，1998に記載されている。
【０１６６】
そのような同位体の例としては、水素、炭素、窒素、酸素、リン、硫黄、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素の安定した放射性の同位元素、例えば、それぞれ、2H（重水素）、3H（トリチウム）、11C、13C、14C、15N、17O、18O、32P、33P、33S、34S、35S、36S、18F、36Cl、82Br、123I、124I、125I、129Iおよび131Iが挙げられる。
【０１６７】
本明細書において指定される障害の処置および／または予防に関して、化合物1および2の、特に化合物1の1または複数の同位体変異体は、好ましくは重水素を含む（「重水素含有」）。1または複数の放射性同位元素、例えば、3Hまたは14Cなどが組み込まれている化合物1および2の、特に化合物1の同位体変異体は、例えば薬剤および／または基質組織分布研究に有用である。これらの同位体は、その組み込みの容易さおよび検出性のために特に好ましい。18Fまたは11Cなどのポジトロン放出同位体は、化合物1および2、特に化合物1に組み込まれることができる。化合物1および2のこれらの同位体変異体は、インビボイメージング用途に有用である。重水素含有および13C含有化合物1および2は、前臨床または臨床研究の状況において質量分析で使用されることができる。
【０１６８】
化合物1および2の同位体変異体は、前記試薬同位体変異体の代わりに試薬、好ましくは重水素含有試薬を用いることによって、当業者に公知の方法、例えば本明細書中のスキームおよび／または例に記載される方法などによって一般的に調製することができる。重水素化の望ましい場所に応じて、一部の例では、D2Oの重水素は、化合物に直接組み込まれるか、またはそのような化合物を合成するのに有用な試薬に組み込まれることができる。重水素ガスも重水素を分子に組み込むために有用な試薬である。オレフィン結合およびアセチレン結合の接触重水素化は、重水素の組み込みのための迅速な経路である。金属触媒（すなわち、Pd、Pt、およびRh）は、重水素ガスの存在下で、炭化水素を含有する官能基において重水素を水素に直接交換するために使用され得る。多様な重水素化試薬および合成ビルディングブロックが、例えばC／D／N Isotopes、ケベック、カナダ；Cambridge Isotope Laboratories Inc．、Andover、米国マサチューセッツ州；およびCombiPhos Catalysts、Inc．、Princeton、米国ニュージャージー州などの会社から市販されている。
【０１６９】
用語「重水素含有化合物1および2」は、1または複数の水素原子が1または複数の重水素原子によって置き換えられていて、化合物1および2のいずれか1つの重水素化された位置での重水素の存在比が、重水素の自然存在比（約0．015％）よりも高い化合物として定義される。特に、重水素含有化合物1〜2のいずれか1つにおいて、化合物の各々の重水素化された位置での重水素の存在比は、前記1または複数の位置で10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％または80％よりも高い、好ましくは90％、95％、96％または97％よりも高い、さらにより好ましくは98％または99％よりも高い。各々の重水素化された位置の重水素の存在比が、他の1または複数の重水素化された位置の重水素の存在比とは無関係であることは理解される。
【０１７０】
1または複数の重水素原子の化合物1および2のいずれか1つへの選択的取り込みは、分子の物理化学的特性（例えば、酸度［C．L．Perrinら、J．Am．Chem．Soc．、2007、129、4490］、塩基性度［C．L．Perrinら、J．Am．Chem．Soc．、2005、127、9641］、親油性［B．Testaら、Int．J．Pharm．、1984、19（3）、271］）および／または代謝プロフィールを変えることがあり、親化合物と代謝産物の比、または生じる代謝産物の量に変化をもたらすことがある。そのような変化は、結果としてある特定の治療上の利点となることがあり、それゆえに一部の状況で好ましいことがある。代謝産物の比率が変化している、代謝および代謝切り替えの割合の低下は報告されている（A．E．Mutlibら、Toxicol．Appl．Pharmacol．、2000、169、102）。親薬物および代謝産物への曝露におけるこれらの変化は、一般式（I）の重水素含有化合物の薬動力学、忍容性および効力に関して重要な結果を有し得る。一部の例では、重水素置換は、望ましくないかまたは有毒な代謝産物の形成を減らすかまたは無くし、望ましい代謝産物の形成を強化する（例えばNevirapine：A．M．Sharmaら、Chem．Res．Toxicol．、2013、26、410；Efavirenz：A．E．Mutlibら、Toxicol．Appl．Pharmacol．、2000、169、102）。その他の例では、重水素化の主な効果は、全身クリアランスの比率を低下させることである。結果として、化合物の生物学的半減期は増加する。有望な臨床上の利益には、ピーク値の低下およびトラフ値の増加を伴う、同様の全身曝露を維持する能力が含まれるであろう。これは、特定の化合物の薬物動態／薬力学の関係に応じて、副作用の低下および効力の増強という結果をもたらし得る。ML−337（C．J．Wenthurら、J．Med．Chem．、2013、56、5208）およびオダナカチブ（K．Kassahunら、国際公開第2012／112363号パンフレット）がこの重水素効果の例である。代謝の比率の低下の結果、全身クリアランスの比率を変えることなく薬物の露出を増加させた、さらにその他のケースが報告された（例えばロフェコキシブ：F．Schneiderら、Arzneim．Forsch／Drug．Res．、2006、56、295；テラプレビル：F．Maltaisら、J．Med．Chem．、2009、52、7993）。この効果を示す重水素化薬物は、投薬の要件の減少（例えば望ましい効果を実現するための用量数を低下または投薬量の低下）を減らすことがあり、かつ／あるいは、代謝産物量の低下を生じることがある。
【０１７１】
化合物1および2は、代謝を攻撃する、複数の可能性のある場所を有することがある。物理化学的性質および代謝プロファイルに対する上記の効果を最適化するため、ある特定のパターンの1または複数の重水素−水素交換を有する、重水素含有化合物1〜2を選択することができる。特に、1または複数の重水素含有化合物1〜2の1または複数の重水素原子は、炭素原子と結合していて、かつ／または、例えばシトクロムP450などの酵素を代謝するための攻撃の場所である、化合物1〜2の位置に位置している。
【０１７２】
医薬組成物
化合物1および2、特に化合物1は、全身および／または局所活性を有することが可能である。この目的のために、これらを適当な様式で、例えば、経口、非経口、肺、経鼻、舌下、舌、頬側、直腸、真皮、経皮、結膜、耳経路により、またはインプラントもしくはステントとして投与することができる。
【０１７３】
これらの投与経路のために、化合物1および2を適した投与形態で投与することが可能である。
【０１７４】
経口投与のために、本発明の化合物を迅速にかつ／または変更された様式で送達する当技術分野で公知の剤形に化合物1および2を製剤化することが可能であり、それは例えば、錠剤（コーティングされていないか、あるいは、例えば遅れて溶解するかまたは不溶性の腸溶もしくは制御放出コーティングによってコーティングされた錠剤）、口腔内崩壊錠、フィルム／ウエハ、フィルム／凍結乾燥物、カプセル剤（例えば硬質もしくは軟質ゼラチンカプセル剤）、糖衣錠、顆粒剤、ペレット剤、散剤、乳剤、懸濁剤、エアゾール剤または液剤である。化合物1〜2を結晶形および／または無定形および／または溶解形で前記剤形に組み込むことが可能である。
【０１７５】
非経口投与は、（例えば、静脈内、動脈内、心臓内、髄腔内もしくは腰椎内）吸収ステップを回避して、または（例えば、筋肉内、皮下、皮内、経皮もしくは腹腔内）吸収を含めることによって達成することができる。非経口投与に適した投与形態は、とりわけ、液剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥物または滅菌散剤の形態の注射および点滴用製剤が含まれる。
【０１７６】
その他の投与経路に適した例は、吸入用の剤形［特に粉末吸入器、ネブライザー］、点鼻剤、点鼻液、鼻腔スプレー；舌、舌下または頬側投与用の錠剤／フィルム／ウエハ／カプセル剤；坐剤；点眼剤、眼軟膏、洗眼器、眼球インサート、点耳剤、耳スプレー、イヤーパウダー、イヤーリンス、耳タンポン；膣カプセル剤、水性懸濁液（ローション、振盪混合物mixturae agitandae）、親油性懸濁剤、乳剤、軟膏、クリーム、経皮治療系（例えば、パッチなど）、ミルク、ペースト、フォーム、散布剤、インプラントまたはステントである。
【０１７７】
本発明による化合物は、述べた投与形態に組み込むことができる。これは、薬学的に適した賦形剤と混合することによって、それ自体は既知の方法で達成することができる。薬学的に適した賦形剤としては、とりわけ、
・増量剤および担体（例えばセルロース、微結晶性セルロース（例えば、Avicel（登録商標）など）、ラクトース、マンニトール、デンプン、リン酸カルシウム（例えば、Di−Cafos（登録商標））など）、
・軟膏基剤（例えばワセリン、パラフィン、トリグリセリド、ワックス、羊毛脂、羊毛脂アルコール、ラノリン、親水性軟膏、ポリエチレングリコール）、
・坐剤用基剤（例えばポリエチレングリコール、カカオバター、ハードファット）、
・溶媒（例えば水、エタノール、イソプロパノール、グリセロール、プロピレングリコール、中鎖長トリグリセリド脂肪油、液体ポリエチレングリコール、パラフィン）、
・界面活性剤、乳化剤、分散剤または湿潤剤（例えばドデシル硫酸ナトリウム）、レシチン、リン脂質、脂肪アルコール（例えば、Lanette（登録商標）など）、ソルビタン脂肪酸エステル（例えば、Span（登録商標）など）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（例えば、Tween（登録商標）など）、ポリオキシエチレン脂肪酸グリセリド（例えば、Cremophor（登録商標）など）、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル、グリセロール脂肪酸エステル、ポロキサマー（例えば、Pluronic（登録商標）など）、
・緩衝剤および酸および塩基（例えば、リン酸塩、炭酸塩、クエン酸、酢酸、塩酸、水酸化ナトリウム溶液、炭酸アンモニウム、トロメタモール、トリエタノールアミン）
・等張剤（例えば、グルコース、塩化ナトリウム）、
・吸着剤（例えば、高分散シリカ）
・増粘剤、ゲル形成剤、増粘剤および／または結合剤（例えばポリビニルピロリドン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、デンプン、カルボマー、ポリアクリル酸（例えば、Carbopol（登録商標）など）；アルギン酸塩、ゼラチン）、
・崩壊剤（例えば、修飾デンプン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、グリコール酸ナトリウムデンプン（例えば、Explotab（登録商標）など）、架橋ポリビニルピロリドン、クロスカルメロースナトリウム（例えば、AcDiSol（登録商標）など））
・流動調節剤、滑沢剤、磨砕剤および離型剤（例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、タルク、高分散性シリカシリカ（例えば、Aerosil（登録商標）など））、
・塗料（例えば、砂糖、セラック）および迅速にまたは変更された様式で溶解するフィルムまたは拡散膜のためのフィルム形成剤（例えばポリビニルピロリドン（例えば、Kollidon（登録商標）など）、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、エチルセルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、酢酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、例えば、Eudragit（登録商標）など））
・カプセル材料（例えば、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、
・合成ポリマー（例えば、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリアクリレート、ポリメタクリレート（例えば、Eudragit（登録商標）など）、ポリビニルピロリドン（例えば、Kollidon（登録商標）など）、ポリビニルアルコール、ポリ酢酸ビニル、ポリエチレンオキシド、ポリエチレングリコールならびにそれらの共重合体およびブロック共重合体）、
・可塑剤（例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール、トリアセチン、クエン酸トリアセチル、フタル酸ジブチル）、
・浸透促進剤、
・安定剤（例えば、アスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビル、アスコルビン酸ナトリウム、ブチルヒドロキシアニソール、ブチルヒドロキシトルエン、没食子酸プロピルなどの抗酸化剤）、
・防腐剤（例えば、パラベン、ソルビン酸、チオメルサール、塩化ベンザルコニウム、酢酸クロルヘキシジン、安息香酸ナトリウム）、
・着色剤（例えば無機顔料、例えば、酸化鉄、二酸化チタンなど）、
・香料、甘味料、風味および／または臭気マスキング剤
が挙げられる。
【０１７８】
本発明はさらに、少なくとも1つの化合物1および2、特に化合物1を、慣習的に1以上の薬学的に適した賦形剤と共に含む組成物、ならびに本発明によるそれらの使用に関する。
【０１７９】
したがって一実施形態では、本発明は、化合物1または化合物2
【化５０】
2020506934.tif 000052
および
【化５１】
2020506934.tif 000053
あるいはその薬学的に許容される塩、またはプロドラッグ、ならびに1以上の薬学的に許容される担体または賦形剤に関する。
【０１８０】
もう一つの実施形態では、本発明は、化合物1
【化５２】
2020506934.tif 000054
あるいはその薬学的に許容される塩、またはプロドラッグ、ならびに1以上の薬学的に許容される担体または賦形剤に関する。
【０１８１】
もう一つの実施形態では、本発明は、化合物2
【化５３】
2020506934.tif 000055
あるいはその薬学的に許容される塩、またはプロドラッグ、ならびに1以上の薬学的に許容される担体または賦形剤に関する。
【０１８２】
組合せ
別の態様によれば、本発明は、特に過剰増殖性疾患、特に癌の治療および／または予防のための、少なくとも1つの化合物1および2、特に化合物1と、少なくとも1または複数のさらなる有効成分を含む医薬品の組合せ、特に薬物を包含する。
【０１８３】
特に、本発明は、
・1または複数の第1の有効成分、特に上に定義される化合物1および2の1つ、特に化合物1、および、
・1または複数のさらなる有効成分、特に過剰増殖性疾患、特に癌
を含む医薬品の組合せを包含する。
【０１８４】
本発明の用語「組合せ」は、当業者に公知のように使用され、前記組合せは固定された組合せ、固定されていない組合せまたはパーツキットであることが可能である。
【０１８５】
本発明の「固定された組合せ」は、当業者に公知のように使用され、例えば、第1の有効成分、例えば1または複数の化合物1〜2と、さらなる有効成分が1つの単位用量または単一実体中に一緒に存在する組合せとして定義される。「固定された組合せ」の一例は、第1の有効成分とさらなる有効成分が同時投与用の混和物、例えば、製剤中に存在する医薬組成物である。「固定された組合せ」の別の例は、第1の有効成分とさらなる有効成分が混和していないが一単位中に存在する医薬組合せである。
【０１８６】
本発明の固定されていない組合せまたは「パーツキット」は、当業者に公知のように使用され、第1の有効成分とさらなる有効成分が2つ以上の単位中に存在する組合せとして定義される。固定されていない組合せまたはパーツキットの一例は、第1の有効成分とさらなる有効成分が別々に存在する組合せである。固定されていない組合せまたはパーツキットの成分は、別々に、順次に、同時に、同時発生的にまたは経時的に交互に投与することができる。
【０１８７】
本発明の化合物は、唯一の医薬剤として、または組合せが許容されない有害作用を引き起こさない1種または複数の他の医薬有効成分と組み合わせて投与することができる。
【０１８８】
本発明は、このような医薬品の組合せも包含する。例えば、本発明の化合物は、既知の抗癌剤およびこれらの抗癌剤が有するかもしれない潜在的な副作用を改善する薬剤と組み合わせることができる。これらの薬剤の例としては以下が挙げられる：
131I−chTNT、アバレリクス、アビラテロン、アクラルビシン、アダリムマブ、Ado−トラスツズマブ・エムタンシン、アファチニブ、アフリベルセプト、アルデスロイキン、アレクチニブ、アレムツズマブ、アレンドロン酸、アリトレチノイン、アルトレタミン、アミホスチン、アミノグルテチミド、ヘキシルアミノレブリン酸、アムルビシン、アムサクリン、アナストロゾール、アンセスチム、アネトールジチオールチオン、アネツマブ・ラブタンシン、アンギオテンシンII、アンチトロンビンIII、アプレピタント、アルシツモマブ、アルグラビン、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、アテゾリズマブ、アキシチニブ、アザシチジン、バシリキシマブ、ベロテカン、ベンダムスチン、ベシレソマブ、ベリノスタット、ベバシズマブ、ベキサロテン、ビカルタミド、ビサントレン、ブレオマイシン、ブリナツモマブ、ボルテゾミブ、ブセレリン、ボスチニブ、ブレンツキシマブベドチン、ブスルファン、カバジタキセル、カボザンチニブ、カルシトニン、ホリナートカルシウム、レボホリナートカルシウム、カペシタビン、カプロマブ、カルバマゼピン、カルボプラチン、カルボコン、カーフィルゾミブ、カルモフール、カルムスチン、カツマキソマブ、セレコキシブ、セルモロイキン、セリチニブ、セツキシマブ、クロラムブシル、クロルマジノン、クロルメチン、シドフォビル、シナカルセト、シスプラチン、クラドリビン、クロドロン酸、クロファラビン、コビメチニブ、コパンリシブ、クリサンタスパーゼ、クリゾチニブ、シクロホスファミド、シプロテロン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダラツムマブ、ダルベポエチンアルファ、ダブラフェニブ、ダサチニブ、ダウノルビシン、デシタビン、デガレリクス、デニロイキンジフチトクス、デノスマブ、デプレオチド、デスロレリン、ジアンヒドロガラクチトール、デクスラゾキサン、塩化ジブロスピジウム、ジアンヒドロガラクチトール、ジクロフェナク、ジヌツキシマブ、ドセタキセル、ドラセトロン、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、ドキソルビシン＋エストロン、ドロナビノール、エクリズマブ、エドレコロマブ、酢酸エリプチニウム、エロツズマブ、エルトロンボパグ、エンドスタチン、エノシタビン、エンザルタミド、エピルビシン、エピチオスタノール、エポエチンα、エポエチンβ、エポエチンζ、エプタプラチン、エリブリン、エルロチニブ、エソメプラゾール、エストラジオール、エストラムスチン、エチニルエストラジオール、エトポシド、エベロリムス、エキセメスタン、ファドロゾール、フェンタニル、フィルグラスチム、フルオキシメステロン、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、フルタミド、フォリン酸、フォルメスタン、ホスアプレピタント、フォテムスチン、フルベストラント、ガドブトロール、ガドテリドール、ガドテル酸メグルミン、ガドベルセタミド、ガドキセト酸、硝酸ガリウム、ガニレリクス、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ゲムツズマブ、グルカルピダーゼ、グルトキシム、GM−CSF、ゴセレリン、グラニセトロン、顆粒球コロニー刺激因子、ヒスタミン二塩酸塩、ヒストレリン、ヒドロキシカルバミド、I−125種、ランソプラゾール、イバンドロン酸、イブリツモマブ・チウキセタン、イブル���ニブ、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、イミキモド、インプロスルファン、インジセトロン、インカドロン酸、インゲノールメブテート、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、イオビトリドール、イオベングアン（123I）、イオメプロール、イピリムマブ、イリノテカン、イトラコナゾール、イクサベピロン、イキサゾミブ、ランレオチド、ランソプラゾール、ラパチニブ、ラソコリン、レナリドミド、レンバチニブ、レノグラスチム、レンチナン、レトロゾール、リュープロレリン、レバミソール、レボノルゲストレル、レボチロキシンナトリウム、リスリド、ロバプラチン、ロムスチン、ロニダミン、マソプロコール、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メラルソプロール、メルファラン、メピチオスタン、メルカプトプリン、メスナ、メタドン、メトトレキサート、メトキサレン、アミノレブリン酸メチル、メチルプレドニゾロン、メチルテストステロン、メチロシン、ミファムルチド、ミルテフォシン、ミリプラチン、ミトブロニトール、ミトグアゾン、ミトラクトール、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、モガムリズマブ、モルグラモスチム、モピダモール、塩酸モルヒネ、硫酸モルヒネ、ナビロン、ナビキシモルス、ナファレリン、ナロキソン＋ペンタゾシン、ナルトレキソン、ナルトグラスチム、ネシツムマブ、ネダプラチン、ネララビン、ネリドロン酸、ネツピタント／パロノセトロン、ニボルマブペンテトレオチド、ニロチニブ、ニルタミド、ニモラゾール、ニモツズマブ、ニムスチン、ニンテダニブ、ニトラクリン、ニボルマブ、オビヌツズマブ、オクトレオチド、オファツムマブ、オラパリブ、オララツマブ、オマセタキシン・メペサクシネート、オメプラゾール、オンダンセトロン、オプレルベキン、オルゴテイン、オリロチモド、オシメルチニブ、オキサリプラチン、オキシコドン、オキシメトロン、オゾガマイシン、p53遺伝子療法、パクリタキセル、パルボシクリブ、パリフェルミン、パラジウム103種、パロノセトロン、パミドロン酸、パニツムマブ、パノビノスタット、パントプラゾール、パゾパニブ、ペガスパルガーゼ、PEG−エポエチンβ（メトキシPEG−エポエチンβ）、ペンブロリズマブ、ペグフィルグラスチム、ペグインターフェロンα−2b、ペムブロリズマブ、ペメトレキセド、ペンタゾシン、ペントスタチン、ペプロマイシン、ペルフルブタン、ペルホスファミド（perfosfamide）、ペルツズマブ、ピシバニール、ピロカルピン、ピラルビシン、ピキサントロン、プレリキサフォール、プリカマイシン、ポリグルサム、リン酸ポリエストラジオール、ポリビニルピロリドン＋ヒアルロン酸ナトリウム、ポリサッカリド−K、ポマリドマイド、ポナチニブ、ポルフィマーナトリウム、プララトレキサート、プレドニムスチン、プレドニゾン、プロカルバジン、プロコダゾール、プロプラノロール、キナゴリド、ラベプラゾール、ラコツモマブ、塩化ラジウム−223、ラドチニブ、ラロキシフェン、ラルチトレキセド、ラモセトロン、ラムシルマブ、ラニムスチン、ラスブリカーゼ、ラゾキサン、レファメチニブ、レゴラフェニブ、リセドロン酸、レニウム−186エチドロネート、リツキシマブ、ロラピタント、ロミデプシン、ロミプロスチム、ロムルチド、ロニシクリブ、サマリウム（153Sm）レキシドロナム、サルグラモスチム、サツモマブ、セクレチン、シルツキシマブ、シプレウセル−T、シゾフィラン、ソブゾキサン、グリシダゾールナトリウム、ソニデジブ、ソラフェニブ、スタノゾロール、ストレプトゾシン、スニチニブ、タラポルフィン、タリモジーン・ラハーパレプベック、タミバロテン、タモキシフェン、タペンタドール、タソネルミン、テセロイキン、テクネチウム（99mTc）ノフェツモマブメルペンタン、99mTc−HYNIC−［Tyr3］−オクトレオチド、テガフール、テガフール＋ギメラシル＋オテラシル、テモポルフィン、テモゾロミド、テムシロリムス、テニポシド、テストステロン、テトロフォスミン、サリドマイド、チオテパ、チマルファシン、サイロトロピンα、チオグアニン、トシリズマブ、トポテカン、トレミフェン、トシツモマブ、トラベクテジン、トラメチニブ、トラマドール、トラスツズマブ、トラスツズマブエムタンシン、トレオスルファン、トレチノイン、トリフルリジン＋チピラシル、トリロスタン、トリプトレリン、トラメチニブ、トロホスファミド、トロンボポエチン、トリプトファン、ウベニメクス、バラチニブ、バルルビシン、バンデタニブ、バプレオチド、ベムラフェニブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビンフルニン、ビノレルビン、ビスモデギブ、ボリノスタット、ボロゾール、イットリウム90ガラス微小球、ジノスタチン、ジノスタチンスチマラマー、ゾレドロン酸、ゾルビシン。
【０１８９】
有用性
化合物1および化合物2は、PDE3A／PDE3Bモジュレーターであり、したがってホスホジエステラーゼモジュレーターで癌を標的化することが有望な手法であり得るという事実によれば、化合物1および化合物2、特に化合物1は、癌の治療に有用である。
【０１９０】
本発明のさらなる態様は、過剰増殖性疾患の治療で用いる化合物1および化合物2である。
【０１９１】
本発明のさらなる態様は、真性赤血球増加症、本態性血小板増加症、原発性骨髄線維症などを含む、過剰増殖性疾患または造血性過剰増殖性疾患の治療に使用するための化合物1および化合物2である。
【０１９２】
さらなる態様は、有効量の化合物1および／または化合物2、特に化合物1を投与するステップを含む、過剰増殖性疾患の予防および／または治療の方法、特に治療の方法、例えば癌の治療の方法である。
【０１９３】
なおさらなる態様は、治療を必要とする対象に、
【化５４】
2020506934.tif 000056
および
【化５５】
2020506934.tif 000057
からなる群から選択される化合物の1つ、あるいはその薬学的に許容される塩、またはプロドラッグを投与するステップを含む、過剰増殖性疾患を治療する方法である。
【０１９４】
さらなる態様では、本発明は、過剰増殖性疾患を治療するための、
【化５６】
2020506934.tif 000058
および
【化５７】
2020506934.tif 000059
からなる群から選択される化合物の1つ、あるいはその薬学的に許容される塩、またはプロドラッグを使用する方法に関する。より具体的にはこの場合の過剰増殖性疾患は癌である。
【０１９５】
本発明の一態様では、前記癌は、骨癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、子宮内膜癌、消化管間質腫瘍（GIST）、頭頚部癌、造血系（hematopoetic）癌、腎癌、平滑筋肉腫、肝臓癌、肺癌、リンパ系癌、黒色腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、軟部組織肉腫、甲状腺癌、または尿路癌である。
【０１９６】
化合物1および／または化合物2、特に化合物1は、良性過剰増殖性疾患、例えば子宮内膜症、平滑筋腫および良性前立腺過形成の予防および／または治療にも適している。
【０１９７】
したがって、さらなる態様は、過剰増殖性疾患が良性過剰増殖性疾患であることである。
【０１９８】
本発明の別の態様は、癌の治療で使用するための化合物1および／または化合物2、特に化合物1である。それらは転移性または悪性腫瘍の治療に特に有用である。
【０１９９】
したがって本発明の別の態様は、有効量の少なくとも1つの化合物1および／または2、特に化合物1を投与するステップを含む、癌の治療の方法である。
【０２００】
本発明のさらなる態様は、有効量の化合物1および／または2、特に化合物1を投与するステップを含む、転移性または悪性腫瘍の治療の方法である。
【０２０１】
本発明の別の態様は、固形腫瘍の治療のための有効量の化合物1および／または2、特に化合物1の使用である。
【０２０２】
本発明のさらなる態様は、固形腫瘍の治療で使用するための有効量の化合物1および／または2、特に化合物1である。
【０２０３】
本発明のさらなる態様は、有効量の化合物1および／または2、特に化合物1を投与するステップを含む、固形腫瘍の治療の方法である。
【０２０４】
本発明のさらなる態様は、乳房、気道、脳、骨、中枢神経系および末梢神経系、結腸、直腸、肛門、生殖器（例えば、子宮頸部、卵巣、前立腺）、胃腸管（消化管間質腫瘍を含む）、尿生殖路、内分泌腺（例えば、甲状腺および副腎皮質）、甲状腺、副甲状腺、食道、子宮内膜、眼、生殖細胞、頭頚部、腎臓、肝臓、喉頭および下咽頭、肺、中皮腫、膵臓、前立腺、直腸、腎臓、小腸、皮膚、軟組織、胃、精巣、尿管、膣および外陰部の腫瘍ならびにこれらの腫瘍の結合組織および転移として治療することのできる、固形腫瘍の治療のための化合物1および／または2、特に化合物1の使用である。悪性新生物には、網膜芽細胞腫およびウィルムス腫瘍によって例示される遺伝性癌が含まれる。
【０２０５】
本発明のさらに別の態様は、有効量の化合物1および／または2、特に化合物1を投与するステップを含む、上述の腫瘍の治療の方法である。
【０２０６】
本発明の別の態様は、血液腫瘍の治療のための化合物1および／または2、特に化合物1の使用である。
【０２０７】
本発明のさらなる態様は、血液腫瘍の治療で使用するための有効量の化合物1および／または2、特に化合物1である。
【０２０８】
本発明のさらなる態様は、有効量の化合物1および／または2、特に化合物1を投与するステップを含む、血液腫瘍の治療の方法である。
【０２０９】
本発明の別の態様は、癌の治療のための化合物1および／または2、特に化合物1の使用であり、その癌の種類は、骨癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、子宮内膜癌、消化管間質腫瘍（GIST）、頭頚部癌（例えば、頭部癌、神経膠腫、神経膠芽腫）、造血系（hematopoetic）癌、腎癌、平滑筋肉腫、肝臓癌、肺癌、リンパ系癌、黒色腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、軟部組織肉腫、甲状腺癌、尿路癌である。
【０２１０】
本発明のさらに別の態様は、黒色腫、腺癌、乳癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、神経膠芽腫、造血系（hematopoetic）／リンパ系癌、腎癌、平滑筋肉腫、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、膵癌、軟部組織肉腫、甲状腺癌、または尿路癌の治療のための化合物1および／または2、特に化合物1の使用である。
【０２１１】
本発明の別の態様は、癌の治療のための化合物1および／または2、特に化合物1の使用であり、その癌の種類は、黒色腫、子宮内膜癌、肺癌、造血系（hematopoetic）癌、リンパ系癌、卵巣癌、子宮頸癌、軟部組織肉腫、平滑筋肉腫、尿路癌、膵癌、甲状腺癌である。
【０２１２】
本発明のなお別の態様は、皮膚癌（例えば黒色腫）、肺癌（例えば肺腺癌）および子宮頸癌の治療のための化合物1および／または2の使用である。
【０２１３】
本発明のさらに別の態様は、皮膚癌（例えば、黒色腫）および子宮頸癌の治療のための化合物1および／または2、特に化合物1の使用である。
【０２１４】
本発明のさらなる態様は、骨、中枢神経系（例えば、多形神経膠芽腫および神経膠腫）、結腸、造血およびリンパ組織（例えば、赤白血病（erythroleucemia）およびT細胞リンパ腫）、肝臓、肺（例えば、肺腺癌および小細胞肺癌（SCLC））、卵巣、皮膚（例えば、黒色腫）の癌の治療のための化合物1および／または2、特に化合物1の使用である。
【０２１５】
本発明のさらなる態様は、癌の治療のための薬物の製造のためのPDE3Aおよび／またはPDE3Bモジュレーターの使用であり、PDE3Aおよび／またはPDE3Bモジュレーターは、
【化５８】
2020506934.tif 000060
および
【化５９】
2020506934.tif 000061
からなる群から選択される化合物の1つあるいはその薬学的に許容される塩、またはプロドラッグである。
【０２１６】
本発明のさらなる態様は、癌の治療のための薬物の製造のためのPDE3Aおよび／またはPDE3Bモジュレーターの使用であり、PDE3Aおよび／またはPDE3Bモジュレーターは、化合物1および化合物2からなる群から選択される化合物の1つ、あるいはその薬学的に許容される塩、またはプロドラッグであり、癌は、骨癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、子宮内膜癌、消化管間質腫瘍（GIST）、頭頚部癌、造血系（hematopoetic）癌、腎癌、平滑筋肉腫、肝臓癌、肺癌、リンパ系癌、皮膚癌、黒色腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、軟部組織肉腫、甲状腺癌、または尿路癌、より特に黒色腫または子宮頸癌である。
【０２１７】
本明細書に開示される化合物は、対象において癌細胞増殖を減少させる方法でも使用されてよい。
【０２１８】
一部の実施形態では、対象において癌細胞増殖を減少させる方法は、対象にPDE3Aおよび／またはPDE3Bモジュレーターを投与し、それにより、対象における癌の増殖を減少させることを含む。対象は、基準と比較して対象の癌由来の細胞中のPDE3Aおよび／またはPDE3Bポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルの増加を検出することにより、事前選択（例えば、投与前に選択）されてよい。
【０２１９】
一部の実施形態では、対象の事前選択は、基準と比較して対象の癌由来の細胞中のSLFN12のレベルの低下を検出することによって行われてよい。一部の実施形態では、対象の事前選択は、基準と比較して対象の癌由来の細胞中のSLFN12のレベルの増加を検出することによって行われてよい。
【０２２０】
一部の実施形態では、ホスホジエステラーゼ3A（PDE3A）および／またはPDE3Bモジュレーターに反応性であるとして選択された癌細胞の生存は、細胞を1以上のPDE3Aおよび／またはPDE3Bモジュレーターと接触させることを含む。この場合、細胞は、基準と比較して、PDE3Aおよび／またはPDE3Bポリペプチドまたはポリヌクレオチドまたはそれらの組合せのレベルが増加しているとして選択されたものであり、それにより、癌細胞の生存が低下する。
【０２２１】
一部の実施形態では、ホスホジエステラーゼ3A（PDE3A）および／またはPDE3Bモジュレーターに反応性であるとして選択された癌細胞を死滅させるかまたはその生存を減少させる方法が提供され、該方法は、細胞を1以上のPDE3Aおよび／またはPDE3Bモジュレーターと接触させることを含み、該細胞は、基準と比較して、PDE3Aおよび／またはPDE3Bポリペプチドまたはポリヌクレオチド、またはそれらの組合せのレベルが増加しているとして選択され、それにより、癌細胞の生存が低下する。一般に、PDE3Aおよび／またはPDE3Bモジュレーターは、PDE3Aおよび／またはPDE3Bの酵素活性を低下させる。
【０２２２】
一部の実施形態では、癌は、黒色腫、前立腺癌またはリンパ腫である。
【０２２３】
一部の実施形態では、対象において癌細胞増殖を減少させる方法は、対象にPDE3Aおよび／またはPDE3Bモジュレーターを投与し、それにより、対象における癌の増殖を減少させることを含む。対象は、基準と比較して対象の癌由来の細胞中のPDE3Aおよび／またはPDE3Bポリペプチドまたはポリヌクレオチドおよび／またはSchlafen 12（SLFN12）のレベルの増加を検出することにより、事前選択（例えば、投与前に選択）されてよい。
【０２２４】
一部の実施形態では、ホスホジエステラーゼ3A（PDE3A）および／またはPDE3Bモジュレーターに反応性であるとして選択された癌細胞の生存は、細胞を1以上のPDE3Aおよび／またはPDE3Bモジュレーターと接触させることを含み、この場合、細胞は、基準と比較して、PDE3Aおよび／またはPDE3BポリペプチドまたはポリヌクレオチドまたはSchlafen 12（SLFN12）あるいはそれらの組合せのレベルが増加しているとして選択されたものであり、それにより、癌細胞の生存が低下する。
【０２２５】
一部の実施形態では、ホスホジエステラーゼ3A（PDE3A）および／またはPDE3Bモジュレーターに反応性であるとして選択された癌細胞を死滅させるかまたはその生存を減少させる方法が提供され、該方法は、細胞を1以上のPDE3Aおよび／またはPDE3Bモジュレーターと接触させることを含み、該細胞は、基準と比較して、PDE3Aおよび／またはPDE3BポリペプチドまたはポリヌクレオチドまたはSchlafen 12（SLFN12）、あるいはそれらの組合せのレベルが増加しているとして選択され、それにより、治療の際の癌細胞の生存が低下する。一般に、PDE3Aおよび／またはPDE3Bモジュレーターは、PDE3Aおよび／またはPDE3Bの活性を低下させる。
【０２２６】
なおさらなる実施形態では、本明細書において言及される癌細胞を死滅させるかまたは癌細胞の生存を低下させる方法で使用される（PDE3A）および／またはPDE3Bモジュレーターは、化合物1および／または化合物2である。
【０２２７】
したがって、さらなる態様において、本発明は、対象にPDE3A／PDE3Bモジュレーターを投与するステップを含む、構造：
【化６０】
2020506934.tif 000062
を有する1以上のPDE3Aおよび／またはPDE3Bモジュレーターに反応性である癌を有するとして事前選択された対象における癌細胞増殖を減少させる方法に関し、
該対象は、基準と比較して対象の癌由来の細胞中のPDE3AまたはPDE3BまたはSchlafen12（SLFN12）ポリペプチドまたはポリヌクレオチド、またはその組合せのレベルが増加していることを検出することによって事前選択され、それにより、前記対象における癌細胞増殖が低下する。
【０２２８】
さらなる実施形態では、前記方法で使用される（PDE3A）および／またはPDE3Bモジュレーターは、PDE3Aおよび／またはPDE3Bの活性を低下させる。
【０２２９】
本明細書で言及される方法における対象の事前選択は、癌細胞を含む腫瘍の生体試料（例えば、組織試料）を得ることによって行われてよい。
【０２３０】
さらなる態様では、本明細書中で言及される方法は、基準と比較して、CREB3L1ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの発現レベルが低下していないことを検出するステップをさらに含む。
【０２３１】
さらなる態様では、本明細書で言及される方法は、SLFN12のレベルの低下を検出するステップをさらに含む、基準と比較して、CREB3L1ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの発現レベルが低下していないことを検出するステップをさらに含む。
【０２３２】
PDE3A、PDE3B、SLFN12、またはCREB3L1ポリペプチドのレベルが検出される、本明細書に開示される方法の一態様では、この検出は、免疫ブロット法、質量分析、および免疫沈降からなる群から選択される方法によって行われる。
【０２３３】
PDE3A、PDE3B、SLFN12、またはCREB3L1ポリペプチドのレベルが検出される、本明細書に開示される方法の一態様では、この検出は、定量的PCR、RNAシークエンシング、ノーザンブロット、マイクロアレイ、質量分析、およびインサイチュハイブリダイゼーションからなる群から選択される方法によって行われる。
【０２３４】
さらなる態様では、本発明は、事前選択された対象において癌細胞増殖を低下させる方法に関し、該方法は、対象に1以上のPDE3Aおよび／またはPDE3Bモジュレーターを投与するステップを含み、対象は基準と比較して、対象由来の試料中のPDE3Aおよび／またはPDE3Bポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルの増加を検出することによって事前選択され、それにより、前記対象における癌細胞増殖が低下する。
【０２３５】
さらなる態様では、本発明は、事前選択された対象において癌細胞増殖を低下させる方法に関し、該方法は、SLFN12のレベルの増加を検出するステップをさらに含む、対象が、基準と比較して、対象由来の試料中のPDE3Aおよび／またはPDE3Bポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルの増加を検出することによって事前選択される、対象に1以上のPDE3Aおよび／またはPDE3Bモジュレーターを投与するステップを含み、それにより、前記対象における癌細胞増殖が低下する。
【０２３６】
さらなる態様では、本発明は、細胞を1以上のPDE3Aおよび／またはPDE3Bモジュレーターと接触させることを含む、癌細胞を死滅させるかまたはその生存を減少させる方法に関し、細胞は、基準と比較して、PDE3Aおよび／またはPDE3Bポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルが増加しており、それにより、癌細胞の生存が低下減少する。
【０２３７】
さらなる態様では、本発明は、SLFN12のレベルの増加を検出することをさらに含む、細胞を1以上のPDE3Aおよび／またはPDE3Bモジュレーターと接触させることを含む、癌細胞を死滅させるかまたはその生存を減少させる方法に関し、細胞は、基準と比較して、PDE3Aおよび／またはPDE3Bポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルが増加しており、それにより、癌細胞の生存が低下する。
【０２３８】
さらなる態様では、本発明は、PDE3BおよびSLFN12感受性癌の治療のために化合物1および化合物2を使用する方法に関する。
【０２３９】
さらなる態様では、本発明は、黒色腫、前立腺癌、子宮頸癌、またはリンパ腫に感受性のあるPDE3BおよびSLFN12の治療のために化合物1および化合物2を使用する方法に関する。
【０２４０】
診断
本発明は、癌の特徴付けのための診断アッセイを特徴とする。一実施形態では、PDE3A、PDE3B、Schlafen 12（SLFN12）、またはCREB3L1ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのレベルは、対象試料において測定され、化合物1および／または2、より特に化合物1による治療に反応性である癌の指標として使用される。
【０２４１】
もう一つの実施形態では、CREB3L1ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのレベルは、対象の生体試料で測定される。基準と比較して対象の生体試料（例えば、癌細胞を含む生体試料）でのCREB3L1またはSLFN12ポリヌクレオチドまたはポリペプチド発現レベルの消失または低下は、その癌がPDE3Aおよび／またはPDE3Bモジュレーターによる治療に抵抗性であることを示す。PDE3A、PDE3B、SLFN12および／またはCREB3L1ポリヌクレオチドのレベルは、定量的PCR、RNAシーケンシング、ノーザンブロット、マイクロアレイ、質量分析およびインサイツハイブリダイゼーションなどの標準的な方法によって測定することができる。標準的な方法を使用して腫瘍由来の生体試料中のPDE3A、SLFN12、および／またはCREB3L1ポリペプチドのレベルを測定することができる。このような方法には、PDE3A、PDE3B、SLFN12および／またはCREB3L1に結合する抗体を用いるイムノアッセイ、ELISA、ウェスタンブロット法、ならびにラジオイムノアッセイが含まれる。基準と比較してPDE3AおよびSLFN12ポリヌクレオチドまたはポリペプチドレベルが上昇していることは、PDE3Aおよび／またはPDE3Bモジュレーターによる治療に反応性の癌の陽性指標と考えられる。CREB3L1またはSLFN12ポリヌクレオチドまたはポリペプチドレベルの低下は、化合物1および／または2、特に化合物1による治療に抵抗性である癌の指標と考えられる。
【０２４２】
生体試料の種類
化合物1および／または2、特に化合物1治療に対する対象の悪性腫瘍の反応性を特徴付ける際に、PDE3A、PDE3B、SLFN12および／またはCREB3L1発現のレベルは、様々な種類の生体試料で測定される。一実施形態では、生体試料は腫瘍試料である。
【０２４３】
PDE3A、PDE3Bおよび／またはSLFN12発現は、非反応性の対象における発現レベルよりもPDE3Aおよび／またはPDE3Bモジュレーター治療に反応性の対象から得られた試料で高い。別の実施形態では、PDE3Aおよび／またはPDE3Bおよび／またはSLFN12が、健常対照よりも悪性腫瘍を有する対象で少なくとも約5、10、20または30倍高い。倍数変化値は、当技術分野で公知の任意の方法を用いて決定される。一実施形態では、CREB3L1またはSLFN12発現は、基準と比較して低下しているかまたは検出限界以下である。
【０２４４】
特定の実施形態では、CREB3L1またはSLFN12発現は、約10％、25％、50％、75％、85％、95％またはそれ以上低下している。
【０２４５】
一実施形態では、変化は、非反応性癌細胞に存在するレベルまたは対応する健常対照細胞に存在するレベルに対する、癌細胞でのPDE3A、PDE3B、SLFN12および／またはCREB3L1の発現の差異を計算することによって求められる。
【０２４６】
治療方法の選択
本明細書で以下に報告されるように、過剰増殖性疾患に罹患している対象を、治療方法を選択する過程でPDE3A、PDE3B、SLFN12および／またはCREB3L1発現について試験することができる。基準と比較してPDE3Aおよび／またはSLFN12レベルが増加しているとして特徴付けられる患者は、PDE3Aおよび／またはPDE3Bモジュレーター、特に化合物1および／または2、より特に化合物1治療に反応性であるとして識別される。基準と比較してSLFN12またはCREB3L1発現レベルが低下しているかまたは検出不能である対象は、PDE3Aおよび／またはPDE3Bモジュレーター、特に化合物1および／または2、より特に化合物1治療に反応性であるとして識別される。
【０２４７】
キット
本発明は、PDE3Aおよび／またはPDE3Bモジュレーター、特に化合物1および／または2、より特に化合物1治療に対する対象の反応性または抵抗性を特徴付けるためのキットを提供する。
【０２４８】
例えば単位剤形で有効量のPDE3Aおよび／またはPDE3Bモジュレーターを含有する治療用組成物を含むことができるキットも本明細書で提供される。
【０２４９】
いくつかの実施形態では、キットが、治療用または診断用組成物を含む滅菌容器であって、ボックス、アンプル、ボトル、バイアル、チューブ、バッグ、パウチ、ブリスターパックまたは当技術分野で公知の他の適切な容器形態であり得る容器を含む。このような容器は、プラスチック、ガラス、積層紙、金属箔または医薬品を保持するのに適した他の材料でできていてよい。
【０２５０】
一実施形態では、本発明のキットが、PDE3A、SLFN12および／またはCREB3L1レベルを測定するための試薬を含む。所望であれば、キットは、PDE3Aおよび／またはSLFN12を測定するための指示書ならびに／あるいはPDE3A／PDE3BモジュレーターをPDE3A／PDE3Bモジュレーター治療に反応性であるとして選択された悪性腫瘍を有する対象に投与するための指示書をさらに含む。特定の実施形態では、指示書には以下のうちの少なくとも1つが含まれる：治療剤の説明；悪性腫瘍またはその症状を治療または予防するための投薬スケジュールおよび投与；注意事項；警告；適応症；禁忌；過剰投与情報；副作用；動物薬理学；臨床試験；および／または参考文献。指示書は、（存在する場合）容器に直接、または容器に貼られたラベルとして、または容器に入れられたもしくは容器と共に提供される別のシート、パンフレット、カードもしくはフォルダとして印刷され得る。
【０２５１】
一実施形態では、本発明のキットが、PDE3A／PDE3B、SLFN12および／またはCREB3L1レベルを測定するための試薬を含む。
【０２５２】
一実施形態では、本発明のキットが、SLFN12および／またはCREB3L1レベルを測定するための試薬を含む。
【０２５３】
一実施形態では、本発明のキットは、CREB3L1ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに結合する捕捉試薬および／またはSLFN12ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに結合する捕捉試薬を含む。
【０２５４】
本発明の実施は、特に指示しない限り、当業者の理解の範囲内にある分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の慣用的な技術を使用する。このような技術は、「Molecular Cloning：A Laboratory Manual」、第2版（Sambrook、1989）；「Oligonucleotide Synthesis」（Gait、1984）；「Animal Cell Culture」（Freshney、1987）；「Methods in Enzymology」「Handbook of Experimental Immunology」（Weir、1996）；「Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells」（MillerおよびCalos、1987）；「Current Protocols in Molecular Biology」（Ausubel、1987）；「PCR：The Polymerase Chain Reaction」、（Mullis、1994）；「Current Protocols in Immunology」（Coligan、1991）などの文献に十分に説明されている。これらの技術は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの製造に適用可能であり、よって、本発明の作製および実施において考慮され得る。特定の実施形態のための特に有用な技術については、以下の節で論じる。
【０２５５】
以下の実施例は、当業者に本発明のアッセイ、スクリーニングおよび治療方法の作製および使用法の完全な開示および説明を提供するために提示されており、本発明の範囲を限定することを意図していない。
【０２５６】
実施例
化学実験方法
【０２５７】
【表１】
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【０２５８】
LC−MS法：
方法1：
機器：Waters Acquity UPLCMS SingleQuad；カラム：Acquity UPLC BEH C18 1．7μm、50×2．1mm；溶離液A：水＋0．1体積％ギ酸（99％）、溶離液B：アセトニトリル、勾配：0〜1．6分1〜99％B、1．6〜2．0分99％B；流量0．8ml／分；温度：60℃；DADスキャン：210〜400nm。
【０２５９】
方法2：
機器：Waters Acquity UPLCMS SingleQuad；カラム：Acquity UPLC BEH C18 1．7μm、50×2．1mm；溶離液A：水＋0．2体積％アンモニア水（32％）、溶離液B：アセトニトリル、勾配：0〜1．6分1〜99％B、1．6〜2．0分99％B；流量0．8ml／分；温度：60℃；DADスキャン：210〜400nm。
【０２６０】
NMRデータ
選択された化合物の1H−NMRデータは、1H−NMRピークリストの形式でリストされる。そこでは、各シグナルピークについてδ値（ppm）が与えられ、それに続いてシグナル強度丸括弧内に報告される。異なるピークのδ値と信号強度のペアは、コンマで区切られている。そのため、ピークリストは、一般的な形式：δ1（強度1）、δ2（強度2）、．．．、δi（強度i）、．．．、δn（強度n）で記載される。
【０２６１】
鋭いシグナルの強度は、印刷されたNMRスペクトルのシグナルの高さ（cm）に相関する。他のシグナルと比べると、このデータはシグナル強度の実際の比に相関し得る。ブロードなシグナルの場合、2つ以上のピーク、またはスペクトルに示される最も強いシグナルと比べたその相対強度と合わせたシグナルの中心を示す。1H−NMRピークリストは古典的な1H−NMR読み取りと同様であるので、通常は、従来のNMR解釈でリストされた全てのピークが含まれる。さらに、従来の1H−NMRプリントアウトと同様に、ピークリストは溶媒シグナル、特定の標的化合物の立体異性体に由来するシグナル、不純物のピーク、13Cサテライトピーク、および／またはスピニングサイドバンドを示すことができる。立体異性体のピークおよび／または不純物のピークは、一般に、標的化合物（例えば、90％超の純度を有する）と比べて低い強度で表示される。このような立体異性体および／または不純物は特定の製造方法に典型的であり得るので、これらのピークが「副産物指紋」に基づいて製造方法の再現を識別するのに役立ち得る。既知の方法（MestReC、ACDシミュレーションまたは経験的に評価した期待値の使用）によって標的化合物のピークを計算する専門家は、場合によりさらなる強度フィルタを用いて、必要とされる標的化合物1のピークを単離することができる。このような操作は従来の1H−NMR解釈でのピークピッキングに類似する。ピークリストの形式のNMRデータの報告の詳細な説明は、「特許出願中のNMRピークリストデータの引用」（http：／／www．researchdisclosure．com／searching−disclosures、研究開示データベース番号605005、2014、2014年8月1日または参照）に見出すことができる。研究開示データベース番号605005に記載されるピークピッキング手順で、パラメータ「MinimumHeight」は1％〜4％の間で調整することができる。しかし、測定化合物の化学構造および／または濃度に応じて、パラメータ「MinimumHeight」は1％未満に設定することが妥当であろう。
【０２６２】
一般的な詳細
全ての反応は窒素（N2）雰囲気下で行った。全ての試薬および溶媒は、商業的供給業者から購入し、受け取ったまま使用した。核磁気共鳴（NMR）スペクトルは、Bruker（300または400MHz 1H、75または101MHz 13C）分光計で記録した。プロトンおよび炭素化学シフトは、NMR溶媒を基準とするppm（δ）で報告する。データを以下の通り報告する：化学シフト、多重度（br＝ブロード、s＝一重項、d＝二重項、t＝三重項、q＝四重項、m＝多重項；1つまたは複数のカップリング定数（Hz））。フラッシュクロマトグラフィーは、Teledyne Isco Combiflash Rfで40〜60μmのシリカゲル（60Åメッシュ）を用いて行った。一定の0．1％ギ酸を含む2．5分にわたり水中0〜100％CH3CNの勾配を用いるWaters Symmetry C18カラム（3．5μm、4．6X100mm）を用いて、Waters 2795分離モジュールおよび3100質量検出器で、タンデム液体クロマトグラフィー／質量分析（LC／MS）を行った。分析用薄層クロマトグラフィー（TLC）は、EM Reagent 0．25mmシリカゲル60−Fプレートで行った。元素分析は、Robertson Microlit Laboratories、Ledgewood NJによって行った。
【０２６３】
スキーム1：6−［3，5−ジフルオロ−4−（モルホリン−4−イル）フェニル］−5−メチル−4，5−ジヒドロピリダジン−3（2H）−オンの合成：
【化６１】
2020506934.tif 000064
a）モルホリン、N，N−ジイソプロピルエチルアミン、CH3CN、還流；b）LiHMDS、THF、−78℃、その後ブロモ酢酸エチル、THF、−78℃から室温まで；c）ヒドラジン、EtOH、還流。
【０２６４】
ステップa：1−［3，5−ジフルオロ−4−（モルホリン−4−イル）フェニル］プロパン−1−オン。
7．0gの1−（3，4，5−トリフルオロフェニル）プロパン−1−オン（37mmol）、32．5mLのモルホリン（372 mmol）および13．2mLのN，N−ジイソプロピルエチルアミン（77．4 mmol）の70mLのCH3CN中の溶液を、還流温度で一晩加熱した。反応物を冷却し、濃縮し、水を添加し、CH2Cl2ですすいだ。CH2Cl2を乾燥させ（MgSO4）、濃縮した。粗生成物をCH2Cl2とヘキサンの混合物に溶解した。回転蒸発により、濃縮が完了する前に多量の固体が形成され、蒸発が停止した。固体を濾過し、ヘキサンですすいで、6．06gの生成物を灰白色固体として得た。これはLCおよびNMR分析により不純物が含まれていなかった。母液を濃縮し、ヘキサンから再結晶化させて、さらに1．67gの生成物を黄色の固体として得た。総収量は7．73g（81％）であった。1H NMR（300 MHz，CDCl3）δ 7．46（d，J＝10．8 Hz，2H），3．89−3．75（m，4H），3．41−3．24（m，4H），2．90（q，J＝7．2 Hz，2H），1．21（t，J＝7．2 Hz，3H）．  19F NMR（376 MHz，CDCl3）δ −119．79．Mass 256（M＋1）．
【０２６５】
ステップb：エチル 4−［3，5−ジフルオロ−4−（モルホリン−4−イル）フェニル］−3−メチル−4−オキソブタノエート。
LiHMDSのTHF中1．0M溶液（28．8mL、28．8mmol）を30mLのTHFに添加し、ドライアイス／イソプロパノール浴で冷却した。これに、7．42gの1−［3，5−ジフルオロ−4−（モルホリン−4−イル）フェニル］プロパン−1−オン（29．2 mmol）の20mLのTHF中の溶液をシリンジを介してゆっくり添加した。1時間冷撹拌した後、3．85mL（34．6mmol）のブロモ酢酸エチルの10mLのテトラヒドロフラン中の溶液をシリンジを介してゆっくりと添加し、反応混合物を一晩室温に戻した。翌日、反応をNH4Cl（aq）でクエンチし、EtOAcを添加し、分離し、食塩水ですすいだ。乾燥および濃縮の後、生成物をヘキサン中0〜10％EtOAcによるクロマトグラフィーにかけ、6．20g（63％）の生成物を油状物質として得た。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ 7．51（d，J＝10．7 Hz，2H），4．11（q，J＝7．1 Hz，2H），3．81（dd，J＝16．8，5．0 Hz，5H），3．33（s，4H），2．96（dd，J＝16．9，8．9 Hz，1H），2．45（dd，J＝16．9，5．3 Hz，1H），1．27−1．18（m，6H）．Mass 342（M＋1）．
【０２６６】
ステップc：6−［3，5−ジフルオロ−4−（モルホリン−4−イル）フェニル］−5−メチル−4，5−ジヒドロピリダジン−3（2H）−オン。
6．20gのエチル 4−［3，5−ジフルオロ−4−（モルホリン−4−イル）フェニル］−3−メチル−4−オキソブタノエートの100mL EtOH中の溶液に、2．84mLのヒドラジン（90．5mmol）を添加し、反応物を還流温度で一晩加熱した。翌朝、溶液を室温に冷却すると白色の結晶が生じ、これを濾過し、EtOHですすいで、LCおよびNMR分析により決定される1．8gの不純物が含まれていない生成物を得た。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ 8．84（s，1H），7．28（d，J＝11．1 Hz，2H），3．91−3．79（m，4H），3．30−3．26（m，4H），3．26−3．20（m，1H），2．72（dd，J＝17．0，6．9 Hz，1H），2．50（d，J＝16．9 Hz，1H），1．25（d，J＝7．4 Hz，3H）． 19F NMR（376 MHz，CDCl3）δ −119．69． Mass 310（M＋1）．母液を半分に濃縮し、6時間還流した。冷却すると結晶が生成し、これを濾過し、EtOHですすいで、少量の不純物を含有する別の生成物910mgを得た。総収量2．71g（48％）。
【０２６７】
エナンチオマーは、キラル超臨界流体クロマトグラフィーによって分離した：カラム：ChiralPak AS−H、250×4．6mm、5um、移動相改質剤：100％メタノール、勾配：10分間にわたり5〜50％メタノール、流量：4mL／分、背圧：100bar、カラム温度：40℃。UV検出は200〜400nmであった。より活性の高い（R）−エナンチオマー（保持時間7．08分）を化合物1と名付けた。化合物1をHeLa細胞生存力アッセイで試験し、そのEC50が1．1nMであると求めた。化合物1は、PDE3Aを5nMのIC50で阻害し、化合物1は、PDE3Bを12nMのIC50で阻害した。
【０２６８】
スキーム2：（5R）−6−［3，5−ジフルオロ−4−（モルホリン−4−イル）フェニル］−5−メチル−4，5−ジヒドロピリダジン−3（2H）−オンおよび（5S）−6−［3，5−ジフルオロ−4−（モルホリン−4−イル）フェニル］−5−メチル−4，5−ジヒドロピリダジン−3（2H）−オンの合成：
【化６２】
2020506934.tif 000065
a）モルホリン、N，N−ジイソプロピルエチルアミン、CH3CN、還流；b）LiHMDS、THF、−78℃、その後ブロモ酢酸エチル、THF、−78℃から室温まで；その後ヒドラジン水和物、EtOH、還流；c）エナンチオマー分離。
【０２６９】
ステップa：1−［3，5−ジフルオロ−4−（モルホリン−4−イル）フェニル］プロパン−1−オン。2つの平行反応を次の方法で行った：窒素雰囲気下、1−（3，4，5−トリフルオロフェニル）プロパン−1−オン（110ml、740mmol）をアセトニトリル（1．4l、27mol）に溶解した。モルホリン（490ml、5．6mol）およびN，N−ジイソプロピルエチルアミン（200ml、1．1mol）を添加し、混合物を100℃で4時間撹拌した。溶媒を除去し、2つのかかる反応の粗生成物を合した。ジクロロメタン（1000ml）を添加し、H2O（400ml）および飽和塩化ナトリウム水溶液（300ml）で5回洗浄した。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、真空乾燥させて、標記化合物（383．29g、理論値の100％）を90％の純度で得た。
1H−NMR（400 MHz，DMSO−d6）δ［ppm］1．03（t，J＝7．22 Hz，3 H）2．72（q，J＝7．18 Hz，2 H）3．14（m，4 H）3．58 − 3．67（m，4 H）7．19 − 7．34（m，2 H）．
【０２７０】
ステップb：6−［3，5−ジフルオロ−4−（モルホリン−4−イル）フェニル］−5−メチル−4，5−ジヒドロピリダジン−3（2H）−オン。
【０２７１】
リチウム1，1，1，3，3，3−ヘキサメチルジシラザン−2−イド（510ml、THF中1．0M、510mmol）をTHF（560ml）に添加し、−78℃に冷却した後、THF（850ml）に溶解した1−［3，5−ジフルオロ−4−（モルホリン−4−イル）フェニル］プロパン−1−オン（128g、501mmol）をゆっくりと添加した。反応物を−70℃で1時間撹拌した。THF（110ml）に溶解したブロモ酢酸エチル（67ml、600mmol）をゆっくりと添加した。混合物を−70℃で30分間撹拌した。冷却浴を除去し、混合物を16時間撹拌した。塩化アンモニウム水溶液（100ml）および酢酸エチル（100ml）を添加した。水相を酢酸エチル（500ml）で2回抽出した回収した全ての有機相を、飽和塩化ナトリウム水溶液（500ml）および硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、真空乾燥させた。粗エチル 4−［3，5−ジフルオロ−4−（モルホリン−4−イル）フェニル］−3−メチル−4−オキソブタノエート（181g、530．6mmol、定量）を得、50gを直接次の反応に付した。このように、窒素雰囲気下で、粗エチル 4−［3，5−ジフルオロ−4−（モルホリン−4−イル）フェニル］−3−メチル−4−オキソブタノエート（50．0g、146mmol）をエタノール（310ml、5．3mol）に溶解した。ヒドラジン水和物（22ml、純度65％、290mmol）を添加し、混合物を還流下で16時間撹拌した。水（1000ml）を添加し、有機相を酢酸エチル（300ml）で3回抽出した。有機相を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、さらに真空乾燥させた。粗生成物をクロマトグラフィー（シリカ、ジクロロメタン／酢酸エチル勾配）で精製して、標記化合物（9．78g、理論値の22％）を95％の純度で得た。LC−MS（方法2）：Rt＝0．96分；MS（ESIpos）：m／z＝310［M＋H］＋．1H−NMR（400 MHz，DMSO−d6）δ［ppm］：1．03（d，J＝7．35 Hz，3 H）2．15 − 2．27（m，1 H）2．60 − 2．74（m，1 H）3．09 − 3．20（m，4 H）3．37（m，1 H）3．65 − 3．73（m，4 H）7．42（d，J＝11．66 Hz，2 H）11．04（s，1 H）．
【０２７２】
ステップc：6−［3，5−ジフルオロ−4−（モルホリン−4−イル）フェニル］−5−メチル−4，5−ジヒドロピリダジン−3（2H）−オン（8．0g、25．86mmol）の、（5R）−6−［3，5−ジフルオロ−4−（モルホリン−4−イル）フェニル］−5−メチル−4，5−ジヒドロピリダジン−3（2H）−オン（化合物1）および（5S）−6−［3，5−ジフルオロ−4−（モルホリン−4−イル）フェニル］−5−メチル−4，5−ジヒドロピリダジン−3（2H）−オン（化合物1a）への分離。
【０２７３】
機器：Labomatic HD5000、Labocord−5000；Gilson GX−241、Labcol Vario 4000、カラム：YMC Amylose SA 5μ 250×50mm；溶媒A：ジクロロメタン；溶媒B：エタノール；均一濃度：80％A＋20％B；流量100．0mL／分；UV 325nm。
（5R）−6−［3，5−ジフルオロ−4−（モルホリン−4−イル）フェニル］−5−メチル−4，5−ジヒドロピリダジン−3（2H）−オン。3．77g（純度95％、収率45％）。LC−MS（方法1）：Rt＝0．99分；MS（ESIpos）：m／z＝310［M＋H］＋．1H−NMR（500 MHz，DMSO−d6）δ［ppm］：1．024（15．88），1．038（16．00），2．209（3．09），2．242（3．49），2．357（0．46），2．361（0．65），2．365（0．48），2．514（2．20），2．518（1．98），2．522（1．56），2．631（0．54），2．635（0．75），2．643（2．60），2．657（2．91），2．676（2．45），2．690（2．28），3．146（6．85），3．154（9．80），3．163（7．30），3．352（1．66），3．354（1．66），3．366（2．32），3．369（2．28），3．381（1．56），3．382（1．47），3．395（0．40），3．679（11．05），3．688（11．70），3．697（10．24），5．758（1．59），7．395（0．53），7．400（1．00），7．412（7．35），7．434（7．49），7．446（0．94），7．451（0．61），11．038（8．10）．［α］20＝−377．7°（DMSO）WL＝589 nm．
（5S）−6−［3，5−ジフルオロ−4−（モルホリン−4−イル）フェニル］−5−メチル−4，5−ジヒドロピリダジン−3（2H）−オン。3．92g（純度95％、収率47％）。LC−MS（方法1）：Rt＝0．99分；MS（ESIpos）：m／z＝310［M＋H］＋．1H−NMR（500 MHz，DMSO−d6）δ［ppm］：1．024（15．91），1．038（16．00），2．209（3．44），2．242（3．87），2．361（0．71），2．518（2．69），2．522（2．03），2．635（0．91），2．643（2．77），2．657（2．97），2．676（2．50），2．690（2．34），3．154（11．36），3．352（2．22），3．366（2．70），3．381（1．81），3．394（0．47），3．679（11．54），3．688（13．11），3．697（10．77），5．758（0．69），7．395（0．60），7．400（1．08），7．412（7．61），7．434（7．72），7．445（1．07），7．451（0．68），11．038（8．42）．［α］20＝＋356．9°（DMSO）WL＝589 nm．
【０２７４】
スキーム3：6−［3，5−ジフルオロ−4−（モルホリン−4−イル）フェニル］−5−メチル−4，5−ジヒドロピリダジン−3（2H）−オンの合成：
【化６３】
2020506934.tif 000066
a）LiHMDS、THF、−78℃、その後ブロモ酢酸エチル、THF、−70℃から室温まで；b）モルホリン、N，N−ジイソプロピルエチルアミン、その後ヒドラジン水和物、100℃。
【０２７５】
ステップa：エチル 3−メチル−4−オキソ−4−（3，4，5−トリフルオロフェニル）ブタノエート。
リチウム1，1，1，3，3，3−ヘキサメチルジシラザン−2−イド（12ml、THF中1．0M、12mmol）をTHF（10ml）に添加し、−70℃に冷却した後、THF（8ml）に溶解した1−（3，4，5−トリフルオロフェニル）プロパン−1−オン（1．7ml、12mmol）をゆっくりと添加した。反応物を−70℃で1．5時間撹拌した。THF（3ml）に溶解したブロモ酢酸エチル（1．6ml、14mmol）をゆっくりと添加した。混合物を−70℃で30分間撹拌した。冷却浴を除去し、混合物を16時間撹拌した。混合物を塩酸水溶液（200ml、H2O中1M）に添加し、ジクロロメタンで3回抽出した。回収した全ての有機相を硫酸マグネシウムで乾燥させ、蒸発させ、真空乾燥させた。カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘキサン／酢酸エチル、勾配）による精製により、標記化合物（1．75g、理論値の46％）を85％の純度で得た。LC−MS（方法1）：Rt＝0．1．31分； MS（ESIpos）：m／z＝275．3［M＋H］＋．
【０２７６】
ステップb：6−［3，5−ジフルオロ−4−（モルホリン−4−イル）フェニル］−5−メチル−4，5−ジヒドロピリダジン−3（2H）−オン。
エチル 3−メチル−4−オキソ−4−（3，4，5−トリフルオロフェニル）ブタノエート（110mg、401μmol）のN，N−ジイソプロピルエチルアミン中の溶液に、モルホリン（70μl、800μmol）を添加した。混合物を100℃で16時間撹拌した。室温に冷却した後、ヒドラジン水和物（1：1）（240μl、純度80％、4．0mmol）を添加し、混合物を100℃で3時間撹拌した。温かい混合物に水をゆっくりと添加し、撹拌を30分間続けた。沈殿を濾過し、水で洗浄し、真空乾燥させて標記化合物（65mg、理論値の50％）を95％の純度で得た。LC−MS（方法1）：Rt＝0．99分； MS（ESIpos）：m／z＝310［M＋H］＋．
1H−NMR（400 MHz，DMSO−d6）δ［ppm］：1．022（15．91），1．040（16．00），2．205（3．14），2．245（3．67），2．322（0．60），2．326（0．84），2．332（0．60），2．518（3．03），2．522（1．99），2．637（2．53），2．655（2．96），2．664（0．77），2．668（0．96），2．673（0．86），2．679（2．51），2．697（2．25），3．143（7．04），3．154（10．24），3．166（7．62），3．348（1．74），3．351（1．77），3．366（2．35），3．370（2．34），3．384（1．61），3．403（0．41），3．677（11．35），3．689（12．18），3．700（10．28），7．388（0．58），7．395（1．07），7．409（7．78），7．438（8．13），7．452（1．03），7．459（0．68），11．038（8．33）．
【０２７７】
化合物2の合成
6−［3，5−ジクロロ−4−（モルホリン−4−イル）フェニル］−5−メチル−4，5−ジヒドロピリダジン−3（2H）−オン
【化６４】
2020506934.tif 000067
化合物2
【０２７８】
ステップ1）：
1mlのDMFに溶解した200mg（0．984mmol）の（R）−6−（4−アミノフェニル）−5−メチル−4，5−ジヒドロピリダジン−3（2H）−オンに、250μL（2．00mmol）のビス（2−ブロモエチル）エーテルおよび400mgのK2CO3を添加し、混合物を60℃で一晩撹拌した。翌日、さらに250μLのビス（2−ブロモエチル）エーテルおよび170mgのK2CO3を添加した。3時間後、EtOAcおよび水を添加し、水をEtOAcですすぎ、合したEtOAc洗液を乾燥させ、濃縮した。CH2Cl2中0〜4％MeOHによるクロマトグラフィーにより、125mg生成物の化合物3（46％）を得た。1H NMR（300 MHz，CDCl3）δ 8．61（s，1H），7．68（d，J＝8．8，2H），6．92（d，J＝8．8，2H），3．99−3．76（m，4H），3．44−3．31（m，1H），3．29−3．22（m，4H），2．70（dd，J＝6．7，16．8，1H），2．46（d，J＝16．7，1H），1．24（d，J＝7．3，3H）．13C NMR（75 MHz，CDCl3）δ 166．64，154．05，152．18，127．10，125．33，114．73，66．69，48．33，33．93，27．94，16．36．MS：274（M＋1）．Anal． Calcd．for C15H19N3O2：C，65．91；H，7．01；N，15．37；Found． 65．81，H，6．66，N，15．26．
【０２７９】
化合物2aおよび化合物2
ステップ2
5mlのHOAcに溶解した300mgの化合物3（1．10mmol）の溶液を激しく撹拌し、凍結が起こらないように約10〜15℃の冷水浴中で冷却した。これに、合計2．2mlの10〜15％NaOCl（aq）をシリンジを介して約30分にわたって添加した後、LCが化合物3の消失を示した。反応物を分液漏斗に移し、水を添加し、CH2Cl2で数回すすいだ。合したCH2Cl2をNaHSO3とNaHCO3の水溶液ですすいだ後、乾燥させ、ヘキサン中0〜60％EtOAcによるクロマトグラフィーに付して、140mgの化合物2（35％、より速く溶出する生成物）および135mg（40％）の化合物2aを分離した。各生成物をMeOHから再結晶化させた。
化合物2a：1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ 8．58（s，1H），7．80（d，J＝2．2 Hz，1H），7．60（dd，J＝8．2，2．5 Hz，1H），7．04（d，J＝8．4 Hz，1H），4．02 − 3．76（m，4H），3．38 − 3．22（m，1H），3．23 − 3．02（m，4H），2．70（dd，J＝17．0，6．8 Hz，1H），2．48（d，J＝17．6 Hz，1H），1．24（d，J＝7．3 Hz，3H）． 13C NMR（101 MHz，CDCl3）δ 166．65，152．50，150．20，130．02，128．81，128．39，125．25，119．96，66．99，51．40，33．80，27．92，16．27．Mass 308（M＋1）． Anal． Calc．for C15H18ClN3O2：C，58．54；H，5．89；N，13．65． Found：C，58．30；H，5．99；N，13．63．
化合物2：1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ 8．95（s，1H），7．67（s，2H），3．90 − 3．75（m，4H），3．35 − 3．17（m，5H），2．70（dd，J＝17．0，6．7 Hz，1H），2．49（d，J＝17．0 Hz，1H），1．24（d，J＝7．3 Hz，3H）． 13C NMR（101 MHz，CDCl3）δ 166．38，151．17，145．62，134．83，132．35，126．65，67．64，49．97，33．72，27．85，16．19．Mass 342（M＋1）． Anal． Calcd．For C15H17Cl2N3O2：C，52．64；H，5．01；N，12．28． Found：C，52．68；H，4．90；N，12．28．
【０２８０】
化合物2をHeLa細胞生存力アッセイで試験し、そのEC50が1．9nMであると求めた。化合物2は、PDE3Aを4nMのIC50で阻害し、化合物2は、PDE3Bを11nMのIC50で阻害した。
【０２８１】
化合物1および2の活性を裏付けるデータを得るために以下の方法および材料を使用した、または使用してよい：
実施例1
細胞増殖
一般式（I）の化合物の抗増殖活性を、インビトロでヒト癌細胞で調査した。この目的のために、HuT78細胞、500個のHeLa細胞、または500個のA2058細胞を含む1000個の細胞を、適切な増殖培地を含む384ウェルプレートに蒔き、37℃で一晩インキュベートした。24時間後、試験プレートの細胞を一般式（I）の化合物で処理し、37℃で72時間インキュベートした。HP D300デジタルディスペンサーを10段階（以上の）希釈系列で用いて化合物を細胞に添加した。対照として、細胞を溶媒（終濃度0．3％のDMSO）で処理した。72時間後、細胞を20μl／ウェルのPBS中50％ CTG溶液（Promega Cell Titer Glo（カタログ番号G755BおよびG756B））で処理し、室温で10分間インキュベートし、処理の終了時の細胞生存力を求めるためにVICTOR V（Perkin Elmer）を用いて発光を測定した。細胞増殖への効果率とそれから導いたIC50を、未処理ウェルの値を用いて試験物質ごとに求めた（＝生存）。4パラメータフィットを用いて、IC50値を計算した。
【０２８２】
【表２】
2020506934.tif 000068
【０２８３】
したがって本発明の別の態様は、皮膚癌、（例えば、黒色腫）、および子宮頸癌の治療のための化合物1および／または化合物2、特に化合物1の使用である。
【０２８４】
実施例2
細胞株における化合物感受性試験
1000個のHeLa（DMEM）細胞を、10％ウシ胎児血清を補充した40μlの対応する成長培地中384ウェルプレートに蒔いた。プレーティングの24時間後、示される化合物を示される濃度で添加し、48時間インキュベートした。NCI−H1734およびA549細胞株における化合物ライブラリースクリーニングに記載されるように細胞生存を評価した。図1に示すように、化合物1および2はHeLa細胞で同様の用量反応曲線を有した。化合物1をHeLa細胞生存力アッセイで試験し、そのEC50が1．1nMであると求めた。化合物1は、PDE3Aを5nMのIC50で阻害し、化合物1は、PDE3Bを12nMのIC50で阻害した。
化合物2をHeLa細胞生存力アッセイで試験し、そのEC50が1．9nMであると求めた。化合物2は、PDE3Aを4nMのIC50で阻害し、化合物2は、PDE3Bを11nMのIC50で阻害した。
図2は、PDE3A発現を欠くが、PDE3BおよびSLFN12の上昇したレベルを発現するHUT78細胞における化合物1および化合物2についての用量反応曲線を示す。
HeLa細胞におけるカスパーゼ活性
1000個のHeLa細胞を、10％ウシ胎児血清を補充した対応する40μlの対応する成長培地中384ウェルプレートに蒔いた。プレーティングの24時間後、示される化合物を示される濃度で添加し、48時間インキュベートされる（incubviabilityated）。PromegaのCaspase−Gloを追加し、製造業者の推奨に従って発光を読み取る。
感受性測定と基礎遺伝子発現の相関
Affymetrix GeneChip Human Genome U133 Plus 2．0 Arrayで測定された遺伝子中心ロバストマルチチップ平均（RMA）−正規化基礎mRNA遺伝子発現データを、癌細胞株百科事典（CCLE、ヒト癌細胞の大きな一団の詳細な遺伝的特徴付け；Barretinaら，Nature 483，603〜607，2012）からダウンロードする。ピアソン相関係数を、760個の重複するCCLにわたり遺伝子発現（18988個の転写産物）と曲線下面積（AUC）との間で計算する。異なる数のCCLに曝露された小分子間の比較のために、フィッシャーの変換を用いて相関係数を変換する。
【０２８５】
実施例3
免疫ブロット
全細胞溶解物を標準的なSDS−PAGEによって分離した。PDE3Aタンパク質は、Bethyl Laboratories製の抗PDE3A A302−740Aによって検出した。PDE3Bタンパク質は、Bethyl Laboratories製の抗PDE3B A303−743Aによって検出した。
図3は、HuT78、RVH42、およびHeLa細胞株における内因性PDE3Aタンパク質発現の免疫ブロットを示す。見て分かるように、HeLa細胞は、HuT78およびRVH42細胞と比較してPDE3Aの発現が高い。ビンキュリンは免疫ブロットにおいて負荷対照として検出される。
【０２８６】
実施例4
PDE3A酵素を阻害する方法
市販の3H−cAMPシンチレーション近接アッセイ（SPA、Perkin Elmer）系を酵素阻害研究に使用した。インビトロでの試験物質のPDE3A反応への効果を決定するために、DMSO中のそれぞれの試験化合物溶液（段階希釈）2μlをマイクロタイタープレート（Isoplate−96／200W；Perkin Elmer）のウェルに入れた。緩衝液A（50mM Tris／HCl pH7．5、8．3mM MgCl2、1．7mM EDTA、0．2％ BSA）中の、ヒト全長PDE3Aを過剰発現するSf9細胞由来のPDE3A細胞抽出物（SB Drug Discovery、UK）の希釈物50μlを添加した。PDE3A細胞抽出物の希釈物は、反応速度が線形であり、基質の70％未満が消費されるように選択した（典型的な希釈1：5000）。BSAを含まない緩衝液A中1：2000に希釈した基質［8−3H］アデノシン3’，5’−環状リン酸（1μCi／μl；Perkin Elmer）50μl（0．025μCi）を添加することによって反応を開始させた。室温で60分間のインキュベーションの後、18mg／mlイットリウムシンチレーション近接ビーズを含有する水中懸濁液（Perkin Elmer）25μlを添加して反応を停止した。マイクロタイタープレートを密封し、Microbetaシンチレーションカウンター（PerkinElmer Wallac）で測定した。IC50値は、化合物濃度に対するPDE3A活性百分率をプロットすることによってシグモイド曲線から求めた。
PDE3B酵素の阻害
市販の3H−cAMPシンチレーション近接アッセイ（SPA、Perkin Elmer）系を酵素阻害研究に使用した。インビトロでの試験物質のPDE3B反応への効果を決定するために、DMSO中のそれぞれの試験化合物溶液（段階希釈）2μlをマイクロタイタープレート（Isoplate−96／200W；Perkin Elmer）のウェルに入れた。緩衝液A（50mM Tris／HCl pH7．5、8．3mM MgCl2、1．7mM EDTA、0．2％ BSA）中の、ヒト全長PDE3Bを過剰発現するSf9細胞由来のPDE3B細胞抽出物（SB Drug Discovery、UK）の希釈物50μlを添加した。PDE3B細胞抽出物の希釈物は、反応速度が線形であり、基質の70％未満が消費されるように選択した（典型的な希釈1：6000）。BSAを含まない緩衝液A中1：2000に希釈した基質［8−3H］アデノシン3’，5’−環状リン酸（1μCi／μl；Perkin Elmer）50μl（0．025μCi）を添加することによって反応を開始させた。室温で60分間のインキュベーションの後、18mg／mlイットリウムシンチレーション近接ビーズを含有する水中懸濁液（Perkin Elmer）25μlを添加して反応を停止した。マイクロタイタープレートを密封し、Microbetaシンチレーションカウンター（PerkinElmer Wallac）で測定した。IC50値は、化合物濃度に対するPDE3B活性百分率をプロットすることによってシグモイド曲線から求めた。
化合物1について、IC50値は、それぞれ4．6 nM（PDE3A IC50）および5．6 nM（PDE3B IC50）であった。
【０２８７】
実施例5
ヒト凍結肝細胞のための方法：
凍結保存したヒト肝細胞におけるインビトロ代謝安定性の研究（肝臓インビボ血液クリアランス（CL）および最大経口バイオアベイラビリティ（Fmax）の計算を含む）
凍結保存肝細胞（例えば、Celsis InVitro Technologiesより購入）を短時間解凍し、予熱したインビトロGRO HT培地45mLで洗浄し、50xgで5分間遠心分離した。細胞ペレットをクレブス−ヘンゼライト緩衝液（KHB）5mlに再懸濁した。細胞生存をトリパンブルー排除によって決定した。
代謝安定性アッセイのために、肝細胞を、1．0×106個の生活細胞／mlの密度で、ガラスバイアルに5％FCSを含有するWME中に分配した。試験化合物を最終濃度1μMまで添加した。インキュベーション中、肝細胞懸濁物を580rpmで連続的に振盪し、一定分量を2、8、16、30、45および90分にとり、これに等体積の冷メタノールを直ちに添加した。試料を−20℃で一晩凍結し、その後3000rpmで15分間遠心分離した後、上清をLCMS／MS検出を備えるAgilent 1290 HPLCシステムによって分析した。
試験化合物の半減期を濃度−時間プロットから決定した。半減期から、固有クリアランスを計算した。追加のパラメータである肝血流、インビボおよびインビトロの肝細胞の量と一緒に。肝臓インビボ血液クリアランス（CL）および最大経口バイオアベイラビリティ（Fmax）を計算した。肝臓インビボ血液クリアランス（CLblood）および最大経口バイオアベイラビリティ（Fmax）を、以下の式を用いて計算した：CL’intrinsic［ml／（分＊kg）］＝kel［1／分］／（（cellno／インキュベーション体積［ml］）＊fu，inc）＊（cellno／肝重量［g］）＊（特異的肝重量［g肝臓／kg体重］）；CLblood well−stirred［L／（h＊kg）］＝（QH［L／（h＊kg）］＊fu，血液＊CL’intrinsic［L／（h＊kg）］）／（QH［L／（h＊kg）］＋fu，血液＊CL’intrinsic［L／（h＊kg）］）；Fmax＝1−CLblood／QHを用いておよび以下のパラメータ値：肝血流量1．32L／h／kgヒト；特異的肝重量−21g／kg体重；インビボ肝細胞−1．1×108個細胞／g肝臓、インビトロ肝細胞−1．0×106／ml；fu，incおよびfu、血液を1とみなす。
（5R）−6−［3，5−ジフルオロ−4−（モルホリン−4−イル）フェニル］−5−メチル−4，5−ジヒドロピリダジン−3（2H）−オンは、（5R）−6−［3−フルオロ−4−（モルホリン−4−イル）フェニル］−5−メチル−4，5−ジヒドロピリダジン−3（2H）−オン（平均代謝安定性安定性（Fmax）＝49％）と比較して、ヒト肝細胞において安定性の増加を示す（平均代謝安定性（Fmax）＝66％）。
【０２８８】
実施例6
非げっ歯類（例えばイヌ）におけるインビボ薬物動態
インビボ薬物動態実験のために、PEG400などの可溶化剤を十分に許容できる量で用いて溶液として製剤化した試験化合物を、非げっ歯類（例えば雌ビーグル犬）に0．1〜1mg／kgの用量で静脈内投与し、0．3〜3mg／kgの用量で胃内投与し、通常、短期輸液（15分）として提供した。
血液試料は、例えば、投与後2分、8分、15分、30分、45分、1時間、2時間、4時間、6時間、8時間および24時間に伏在静脈から採取した。予想される半減期に応じて、後の時点（例えば、48時間、72時間）で追加の試料を採取した。
胃内投与後の薬物動態のために、試験化合物を絶食した非げっ歯類（例えばイヌ）に胃内投与した。血液試料を、例えば、投与後5分、15分、30分、45分、1時間、2時間、4時間、6時間、8時間および24時間に採取した。予想される半減期に応じて、後の時点（例えば、48時間、72時間）で追加の試料を採取した。血液をリチウム−ヘパリンチューブ（Monovetten（登録商標）、Sarstedt）に回収し、3000rpmで15分間遠心分離した。上清（血漿）からの少量の一定分量（例えば100μL）を取り出し、一定分量を添加して氷冷アセトニトリル（例えば400μL）を沈殿させ、−20℃で一晩凍結させた。その後、試料を解凍し、3000rpm、4℃で20分間遠心分離した。LCMS／MS検出を伴うAgilent HPLCシステムを用いた分析試験のために、一定分量の上清を採取した。PKパラメータを、PK計算ソフトウェアを用いて非コンパートメント分析によって計算した。
静脈内投与後の濃度−時間プロファイルから導出されたPKパラメータ：CLplasma：試験化合物の総血漿クリアランス（L／kg／時間）；CLblood：試験化合物の総血液クリアランス：CLplasma＊Cp／Cb（略称：CLp）（L／kg／h）：Cp／Cbは血漿と血液の濃度の比。
胃内投与後の濃度時間プロファイルから計算したPKパラメータ：Cmax：最大血漿濃度（mg／L）；Cmaxnorm：投与量で除算したCmax（kg／L）；Tmax：Cmaxが観測された時点（時間）。パラメータは、静脈内と胃内の両方の濃度−時間プロファイルから計算した：AUCnorm：投与量で除算した、t＝0時間から無限（外挿）までの濃度−時間曲線下面積（kg＊時間／L）；AUC（0−tlast）norm：投与量で除算した、t＝0時間から血漿濃度を測定することができた最後の時点までの濃度−時間曲線下の面積（kg＊時間／L）；t1／2：終末相半減期（時間）；F：経口バイオアベイラビリティ：胃内投与後のAUCnorm／静脈内投与後のAUCnorm（％）。
（5R）−6−［3，5−ジフルオロ−4−（モルホリン−4−イル）フェニル］−5−メチル−4，5−ジヒドロピリダジン−3（2H）−オンは、（5R）−6−［3−フルオロ−4−（モルホリン−4−イル）フェニル］−5−メチル−4，5−ジヒドロピリダジン−3（2H）−オン（CLp＝1．7L／h／kg）と比較して、イヌにおいてクリアランスの低下を示す（CLp＝0．77L／h／kg）。
CRISPRを用いたPDE3A遺伝子座の標的化
CRISPR標的部位を、MIT CRISPR設計ツール（オンラインMIT CRISPR設計ポータル）を用いて識別した。sgRNAのクローニングのために、順方向および逆方向オリゴヌクレオチド（オリゴ）をアニールし、リン酸化し、BsmBI消化pXPR＿BRD001に連結した。オリゴ配列は以下の通りである：
【０２８９】
【表３】
2020506934.tif 000069
【０２９０】
レンチウイルスを産生するために、リン酸カルシウムを用いて、293個のT細胞にpXPR＿BRD001、psPAX2およびpMD2．Gを同時導入した。感染したA2058およびHeLa細胞を2μg／mlのピューロマイシンで選択した。
図4は、PDE3AのCRISPRノックアウトを行った感受性A2058細胞株と行っていない感受性A2058細胞株の免疫ブロットを示す。抗PDE3Aによる免疫ブロットは、PDE3A−CRISPR A2058細胞におけるPDE3Aタンパク質発現の大幅な減少を示す。図5に示される用量反応曲線に見られるように、PDE3Bの異所発現は、PDE3A発現がほとんどまたは全くない細胞における化合物1に対する感受性を回復させる。
表1は、感受性細胞株A2058についてPDE3Aの発現が増加し；感受性細胞株HuT78について、PDE3Aをほとんど発現しないがPDE3Bのレベルが増加し；感受性細胞株A549では、SLFN12を低いレベルでしか発現しない、PDE3A、PDE3B、およびSLFN12 RNA発現値を示す。
見て分かるように、PDE3AとSLFN12の両方は、細胞株A2058で上昇し、化合物に対する感受性を示した。さらに、非感受性細胞株A549は中程度のレベルのPDE3Aのみを発現し、SLFN12はほとんど発現しない。感受性細胞株HUT78はSLFN12発現を上昇させたが、PDE3A発現は上昇させなかった。代わりに、細胞株HUT78はSLFN12発現とPDE3B発現を上昇させた。
【０２９１】
【表４】
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【０２９２】
実施例7
インビボ異種移植モデル
化合物1の抗腫瘍活性を、ヒト癌のネズミ異種移植モデルで調べた。この目的のために、マウスの皮下に腫瘍細胞を移植した。20〜40mm2の平均腫瘍サイズで動物を治療群および対照群に無作為化し（少なくともn＝10動物／群）、治療は溶媒のみまたは化合物1で開始した（処方：90％PEG400／10％エタノール；適用経路：per os（「p．o．」）、経口）。経口適用量は10ml／kgであった。1日2回の治療の場合、1日2回の適用の時間間隔は6〜7時間であった。腫瘍サイズおよび体重は少なくとも週に1回測定した。腫瘍面積は、電子ノギスによって検出した［長さ（mm）×幅（mm）］。実験は、溶媒対照の腫瘍がドイツおよびヨーロッパの動物福祉規制に基づいて所定の倫理的エンドポイントに達した場合に終了した。インビボ抗腫瘍効力は、調査終了時のT／C比（治療／対照；治療群の平均腫瘍面積または重量／対照群の平均腫瘍面積または重量）として表7に表される。T／Cが0．5よりも低い化合物は、活性（すなわち有効）と規定される。統計分析は、SigmaStatソフトウェアを使用して評価した。一元配置分散分析を行い、対照との違いをペアワイズ比較手順（ダンの方法）によって比較した。
【０２９３】
結果（表7）：
化合物1は、単剤療法の治療時にヒト腫瘍の異なる異種移植モデルで強力な抗腫瘍効果を示した。具体的には、化合物1は、子宮頸癌および黒色腫の腫瘍面積の縮小に有効であった。
【０２９４】
【表５】
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【０２９５】
その他の実施形態
上記の説明から、種々の使用および条件に採用するために、本明細書に記載される本発明に対して変更および修正を行うことができることは明らかであろう。このような実施形態もまた、以下の特許請求の範囲の範囲内にある。
【０２９６】
本明細書における変数の任意の定義における要素のリストの列挙は、任意の単一の要素または列挙される要素の組合せ（もしくは部分的組合せ）としてのその変数の定義を含む。本明細書における実施形態の列挙は、その実施形態を任意の単一の実施形態として、または任意の他の実施形態もしくはその一部との組合せで含む。
【０２９７】
参照による組み込み
本明細書で言及した全ての特許および刊行物は、それぞれの独立した特許および刊行物が具体的かつ個別的に参照により組み込まれることが示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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