(57)【要約】  本発明は、機能性Ｉ型またはＩＩ型ＲｕＢｉｓＣＯ酵素と機能性ホスホリブロキナーゼ（ＰＲＫ）を発現し、ペントースリン酸経路の非酸化分岐が少なくとも部分的に阻害されている遺伝的に改変された微生物に関し、当該微生物が、外因性分子を産生および／または内因性分子を過剰産生するように遺伝的に改変されている。本発明はまた、目的分子の産生または過剰産生のためにそのように遺伝的に改変された微生物の使用および目的分子の合成または生物変換のための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
機能性ＲｕＢｉｓＣＯ酵素および機能性ホスホリブロキナーゼ（ＰＲＫ）を発現し、ペントースリン酸経路の非酸化分岐が少なくとも部分的に阻害されている遺伝的に改変された微生物であって、当該微生物が、ＲｕＢｉｓＣＯ酵素および／またはホスホリブロキナーゼ（ＰＲＫ）以外の、目的の外因性分子を産生および／または目的の内因性分子を過剰産生するように遺伝的に改変されている、微生物。
【請求項２】
前記微生物が、組換えＲｕＢｉｓＣＯ酵素および／またはＰＲＫを発現するように遺伝的に改変されている、請求項１に記載の遺伝的に改変された微生物。
【請求項３】
前記微生物が、リブロース−５−リン酸産生の下流の前記ペントースリン酸経路の非酸化分岐を阻害するように遺伝的に改変されている、請求項１または２に記載の遺伝的に改変された微生物。
【請求項４】
トランスアルドラーゼ（Ｅ．Ｃ．２．２．１．２）および／またはトランスケトラーゼ（Ｅ．Ｃ．２．２．１．１）をコードする遺伝子の発現が、少なくとも部分的に阻害されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の遺伝的に改変された微生物。
【請求項５】
前記目的の外因性分子および／または前記目的の内因性分子が、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ビタミン、ステロール、フラボノイド、テルペン、テルペノイド、脂肪酸、ポリオールおよび有機酸から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の遺伝的に改変された微生物。
【請求項６】
前記微生物が真核細胞であり、酵母、真菌、微細藻類または原核細胞から選択的に選らばれ、優先的には細菌である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の遺伝的に改変された微生物。
【請求項７】
前記微生物が、機能性Ｉ型またはＩＩ型ＲｕＢｉｓＣＯと機能性ホスホリブロキナーゼ（ＰＲＫ）を発現するように遺伝的に改変されたサッカロミセス・セレビシエ属の酵母であって、ＴＡＬ１遺伝子および／またはＮＱＭ１遺伝子の発現が少なくとも部分的に阻害されている、請求項１〜６のいずれか一項に記載の遺伝的に改変された微生物。
【請求項８】
ＲｕＢｉｓＣＯ酵素および／またはホスホリブロキナーゼ（ＰＲＫ）以外のもので、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ビタミン、ステロール、フラボノイド、テルペン、テルペノイド、脂肪酸、ポリオールおよび有機酸から選択的に選らばれる目的分子の産生または過剰産生のための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の遺伝的に改変された微生物の使用。
【請求項９】
ＲｕＢｉｓＣＯ酵素および／またはホスホリブロキナーゼ（ＰＲＫ）以外の、少なくとも１つの目的分子を産生するための生物工学的方法であって、請求項１〜８のいずれか一項に記載の遺伝的に改変された微生物を、前記微生物によって前記目的分子の合成または生物変換を可能にする条件下で培養する工程と、任意に前記目的分子を回収および／または精製する工程とを含むことを特徴とする、方法。
【請求項１０】
前記微生物が、前記目的分子の生物変換または合成に関与する少なくとも１つの酵素を発現するように遺伝的に改変されている、請求項９に記載の生物工学的方法。
【請求項１１】
前記微生物が、前記目的分子の分解に関与する酵素を少なくとも部分的に阻害するように遺伝的に改変されている、請求項９または１０に記載の生物工学的方法。
【請求項１２】
ＲｕＢｉｓＣＯ酵素および／またはホスホリブロキナーゼ（ＰＲＫ）以外の目的分子を産生する方法であって、（ｉ）請求項１〜８のいずれか一項に記載の組換え微生物への前記目的分子の合成または生物変換に関与する酵素をコードする少なくとも１つの配列を挿入することと、（ｉｉ）前記酵素の発現を可能にする条件下で前記微生物を培養することと、任意に（ｉｉｉ）前記目的分子を回収および／または精製することとを含む、方法。
【請求項１３】
ＲｕＢｉｓＣＯ酵素および／またはホスホリブロキナーゼ（ＰＲＫ）以外の目的分子を産生する方法であって、（ｉ）請求項１〜８のいずれか一項に記載の組換え微生物への前記目的分子の分解に関与する酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現を阻害することと、（ｉｉ）前記酵素の発現を可能にする条件下で前記微生物を培養することと、任意に（ｉｉｉ）前記目的分子を回収および／または精製することとを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、目的分子の産生のために、少なくとも部分的な炭素源として二酸化炭素を使用することができる遺伝的に改変された微生物に関する。より具体的には、本発明は、少なくともペントースリン酸経路の非酸化分岐が少なくとも部分的に阻害されている微生物に関する。本発明はまた、そのような微生物を使用した少なくとも１つの目的分子の産生のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
過去数年間にわたって、目的分子を大量に産生できるようにするために、多くの微生物学的プロセスが開発されてきた。
【０００３】
例えば、発酵プロセスは、グルコースなどの発酵性炭素源から微生物によって分子を産生するために使用される。
【０００４】
微生物において、当該微生物によって同化され得ない補助基質を目的分子に変換することを可能にする、生物変換プロセスも開発されてきた。この場合も、目的分子の実際の産生のためにではなく、生物変換に必要の可能性がある補因子、より具体的にはＮＡＤＰＨの産生のために、炭素源が必要とされる。一般に、そのような微生物学的プロセスの産生収率は、主に補因子の必要性とレドックス代謝反応のバランスを取ることの難しさゆえに低い。微生物によって同化され得る炭素源が依然として必要であるため、そのような分子の費用コストの価格の問題もある。言い換えれば、現在、微生物学的プロセスで目的分子を産生するためには、確かに低い工業的価値の分子（グルコースまたはその他）を提供する必要があるが、それは特定の分子の産生を経済的に魅力的でないものにするのに十分である。
【０００５】
同時に、大気中への排出が絶えず増加している二酸化炭素（ＣＯ２）は、現在の微生物学的プロセスでは、仮にあったとしてもほとんど使用されておらず、他方、目的分子の産生のための微生物による消費は、産生コストを削減するだけでなく、特定の生態学的問題にも対処する。
【０００６】
したがって、現在のプロセスよりも低価格で目的分子を大量に産生できる微生物学的プロセスが依然として求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
植物や光合成微生物と同じように、ＣＯ２を捕捉し、それを主要な炭素源として使用するように遺伝的に改変された非光合成微生物を使用する利点は既に実証されている。例えば、機能性ＲｕＢｉｓＣＯ（リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ−ＥＣ４．１．１．３９）と機能性ＰＲＫ（ホスホリブロキナーゼ−ＥＣ２．７．１．１９）を発現してカルビン回路を再現し、二酸化炭素分子を捕捉することによってリブロース−５−リン酸を２つの３−ホスホグリセリン酸分子に変換するように改変された微生物が開発されてきた。
【０００８】
炭素源としてＣＯ２を使用して目的分子を産生するためにカルビン回路によって提供される解決策に取り組むことにより、本発明者らは、カルビン回路の一部（ＰＲＫ／ＲｕＢｉｓＣＯ）をペントースリン酸経路の非酸化分岐の少なくとも部分的な阻害に結びつけることによって目的分子の産生収率を増加させることが可能であることを発見した。興味深いことに、リブロース−５−リン酸の産生の下流で有利に行われるこの阻害は、微生物による外因性ＣＯ２の消費を促す。このようにして開発された微生物は、アミノ酸、有機酸、テルペン、テルペノイド、ペプチド、脂肪酸、ポリオールおよびその他などの多数の目的分子を大規模かつ工業的に魅力的な収率で産生することを可能にする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
したがって、本発明は、機能性ＲｕＢｉｓＣＯ酵素および機能性ホスホリブロキナーゼ（ＰＲＫ）を発現し、ペントースリン酸経路の非酸化分岐が少なくとも部分的に阻害されている遺伝的に改変された微生物に関し、当該微生物が、ＲｕＢｉｓＣＯおよび／またはホスホリブロキナーゼ（ＰＲＫ）酵素以外の、目的の外因性分子を産生および／または目的の内因性分子を過剰産生するように遺伝的に改変されている。
【００１０】
本発明はまた、ＲｕＢｉｓＣＯ酵素および／またはホスホリブロキナーゼ（ＰＲＫ）以外のもので、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ビタミン、ステロール、フラボノイド、テルペン、テルペノイド、脂肪酸、ポリオールおよび有機酸から優先的には選択される目的分子の産生または過剰産生のための、本発明による遺伝的に改変された微生物の使用に関する。
【００１１】
本発明はまた、ＲｕＢｉｓＣＯ酵素および／またはホスホリブロキナーゼ（ＰＲＫ）以外の、少なくとも１つの目的分子を産生または過剰産生するための生物工学的方法であって、本発明による遺伝的に改変された微生物を、当該微生物によって前記目的分子の合成または生物変換を可能にする条件下で培養する工程と、任意に前記目的分子を回収および／または精製する工程とを含んでなることを特徴とする方法に関する。
【００１２】
本発明はまた、ＲｕＢｉｓＣＯ酵素および／またはホスホリブロキナーゼ（ＰＲＫ）以外の、目的分子を産生する方法であって、（ｉ）本発明による組換え微生物における前記目的分子の合成または生物変換に関与する酵素をコードする少なくとも１つの配列を挿入することと、（ｉｉ）前記酵素の発現を可能にする条件下で前記微生物を培養することと、任意に（ｉｉｉ）前記目的分子を回収および／または精製することとを含んでなる方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明によるペントースリン酸経路の非酸化分岐の阻害を示す、解糖、Ｅｎｔｎｅｒ−Ｄｏｕｄｏｒｏｆｆ（エントナー−ドゥドロフ）経路およびペントースリン酸経路の略図である。
【図２】本発明によるペントースリン酸経路の非酸化分岐の阻害およびＰＲＫおよびＲｕＢｉｓＣＯによるリブロース−５−リン酸の管理を示す、解糖およびペントースリン酸経路の略図である。
【００１４】
発明の詳細な説明
定義
「組換え微生物」、「改変された微生物」および「組換え宿主細胞」という用語は、本明細書で互換的に使用され、内因性ヌクレオチド配列を発現もしくは過剰発現し、異種ヌクレオチド配列を発現するように遺伝的に改変された微生物、または内因性遺伝子の変化した発現を有する微生物を指す。「変化」とは、遺伝子の発現、または１つ以上のポリペプチドもしくはポリペプチドサブユニットをコードするＲＮＡ分子もしくは同等のＲＮＡ分子のレベル、または１つ以上のポリペプチドもしくはポリペプチドサブユニットの活性が調節されることを意味することから、発現、レベルまたは活性は、改変がない場合に観察されるものよりも高くなるかまたは低くなる。
【００１５】
「組換え微生物」、「改変された微生物」および「組換え宿主細胞」という用語は、特定の組換え微生物だけでなく、そのような微生物の後代または潜在的な後代も指すと理解される。突然変異または環境の影響ゆえに、後続の世代でいくつかの改変が生じることがあるため、これらの子孫は母細胞と同一ではないこともあるが、ここで使用される用語の範囲内のまま理解される。
【００１６】
本発明の文脈において、少なくとも部分的に「阻害された」または「不活性化された」代謝経路とは、（前記代謝経路を阻害するように遺伝的に改変されていない）同じ野生型微生物と比較して、考慮される微生物でもはや適切に機能することができない変化した代謝経路を指す。特に、代謝経路が中断され、中間代謝物の蓄積につながることがある。そのような中断は、例えば、考慮される代謝経路の中間代謝産物の分解に必要な酵素を阻害すること、および／またはその酵素をコードする遺伝子の発現を阻害することによって達成され得る。代謝経路は、弱化、すなわち速度を落とすこともできる。そのような弱化は、例えば、考慮される代謝経路に関与する１つ以上の酵素を部分的に阻害すること、および／またはこれらの酵素の少なくとも１つをコードする遺伝子の発現を部分的に阻害すること、および／または特定の反応に必要な補因子を活用することによって達成され得る。「少なくとも部分的に阻害された代謝経路」という表現は、考慮される代謝経路のレベルが、野生型微生物のレベルと比較して少なくとも２０％、より優先的には少なくとも３０％、４０％、５０％以上減少していることを意味する。減少はより大きくてよく、特に少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％よりも大きくてよい。本発明によれば、考慮される代謝経路が前記微生物によってもはや全く使用されないという意味で、阻害は完全であり得る。本発明によれば、そのような阻害は一時的または永続的であり得る。
【００１７】
本発明によれば、「遺伝子発現の阻害」とは、考慮される微生物で遺伝子がもはや発現されないこと、または（遺伝子発現を阻害するように遺伝的に改変されていない）野生型微生物と比較してその発現が減少しており、対応するタンパク質の産生の欠失もしくはその産生の有意な減少、特に２０％超、より優先的には３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％の減少につながることを意味する。一つの実施形態において、阻害は完全であり得、すなわち、前記遺伝子によってコードされるタンパク質はもはや全く産生されない。遺伝子発現の阻害は、考慮される遺伝子の１つ以上のヌクレオチドの欠失、突然変異、挿入および／または置換によって達成され得る。優先的には、遺伝子発現の阻害は、対応するヌクレオチド配列の完全な欠失によって達成される。本発明によれば、それ自体が当業者に知られており、微生物に適用可能な遺伝子阻害の任意の方法を使用することができる。例えば、遺伝子発現の阻害は、相同組換え（Ｄａｔｓｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０００；９７：６６４０−５；Ｌｏｄｉｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４ｔｈ  ｅｄ．２０００．Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ．ＩＳＢＮ  ０−７１６７−３１３６−３）；遺伝子発現および／またはコードされたタンパク質活性を改変するランダムまたは定方向突然変異誘発（Ｔｈｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．１９８７；５１：５０３−１２）；その発現を変化させる遺伝子のプロモーター配列の改変（Ｋａｕｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２０１１；７６５：２７５−９４．ｄｏｉ：１０．１００７／９７８−１−６１７７９−１９７−０＿１６）；ゲノム中の誘発局所病変の標的化（ＴＩＬＬＩＮＧ）；接合およびその他によって達成され得る。別の特定のアプローチは、例えば、天然または人工起源の可動性遺伝因子（トランスポゾン）を使用したトランスポゾン突然変異誘発による、外来配列の挿入による遺伝子不活性化である。別の好ましい実施形態によれば、遺伝子発現の阻害は、ノックアウト技術によって達成される。遺伝子発現の阻害はまた、干渉、リボザイムまたはアンチセンスＲＮＡを使用して遺伝子を消滅させることによって達成され得る（Ｄａｎｅｈｏｌｔ、２００６年、ノーベル生理学・医学賞）。本発明の文脈において、「干渉ＲＮＡ」または「ｉＲＮＡ」という用語は、標的遺伝子の発現を遮断および／または対応するｍＲＮＡの分解を促進することができる任意のｉＲＮＡ分子（例えば一本鎖ＲＮＡまたは二本鎖ＲＮＡ）を指す。遺伝子阻害はまた、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ；９３：１１５６−１１６０）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ、または「ＴＡＬＥＮ」（Ｏｕｓｔｅｒｏｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２０１６；１３３８：２７−４２．ｄｏｉ：１０．１００７／９７８−１−４９３９−２９３２−０＿３）、Ｃａｓ９ヌクレアーゼと、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピートとを組み合わせたシステム、または「ＣＲＩＳＰＲ」（Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，��ａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３  Ｏｃｔ；１０（１０）：９５７−６３．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．２６４９）、またはメガヌクレアーゼ（Ｄａｂｏｕｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１２．４０：６３６７−７９）を使用して、所定のゲノムの直接的な遺伝的に改変を可能にするゲノム編集方法によっても達成され得る。遺伝子発現の阻害はまた、前記遺伝子によってコードされたタンパク質を不活性化することにより達成され得る。
【００１８】
本発明の文脈において、「ＮＡＤＰＨ依存性」または「ＮＡＤＰＨ消費」生合成または生物変換とは、１つ以上の酵素がＮＡＤＰＨ補因子の酸化によって得られる電子の付随的な供給を必要とするすべての生合成または生物変換経路を意味する。「ＮＡＤＰＨ依存性」生合成または生物変換経路は、特に、アミノ酸（例えばアルギニン、リジン、メチオニン、トレオニン、プロリン、グルタミン酸、ホモセリン、イソロイシン、バリン）、テルペノイドおよびテルペン（例えばファルネセン）、ビタミンおよび前駆体（例えばパントイン酸、パントテン酸、トランスニューロスポレン、フィロキノン、トコフェロール）、ステロール（例えばスクアレン、コレステロール、テストステロン、プロゲステロン、コルチゾン）、フラボノイド（例えばフランビノン、ベスチノン（ｖｅｓｔｉｎｏｎｅ））、有機酸（例えばクマル酸、３−ヒドロキシプロピオン酸）、ポリオール（例えばソルビトール、キシリトール、グリセロール）、ポリアミン（例えばスペルミジン）、ＮＡＤＰ依存性シトクロムｐ４５０を介した立体特異的ヒドロキシル化からの芳香族分子（例えばフェニルプロパノイド、テルペン、脂質、タンニン、香料、ホルモン）の合成に関わる。
【００１９】
様々な分子（ヌクレオチド配列、ペプチド、酵素およびその他）に関して本明細書で使用される「外因性」という用語は、考慮される微生物に通常もしくは自然に見られない分子および／または考慮される微生物によって産生されない分子を指す。逆に、「内因性」または「天然」という用語は、考慮される微生物に通常もしくは自然に見られる分子および／または考慮される微生物によって産生される分子を示す様々な分子（ヌクレオチド配列、ペプチド、酵素およびその他）を指す。
【００２０】
微生物
本発明は、内因性または外因性の目的分子の産生のための遺伝的に改変された微生物を提案する。
【００２１】
「遺伝的に改変された」微生物とは、微生物のゲノムが改変されて、目的分子の生合成もしくは生物変換経路に関与する酵素、またはその生物学的に活性なフラグメントをコードする核酸配列を組み込むことを意味する。前記核酸配列は、任意の適切な分子クローニング法によって、前記微生物のゲノムまたはその祖先の１つに導入されていてもよい。本発明の文脈において、微生物のゲノムは、例えばプラスミド、エピソーム、合成染色体およびその他に含まれる染色体外遺伝物質をはじめとする、微生物に含まれるすべての遺伝物質を指す。導入された核酸配列は、異種配列、すなわち、前記微生物に自然に存在しないもの、または相同配列であってもよい。有利には、目的核酸配列を有する転写ユニットは、１つ以上のプロモーターの制御下で微生物のゲノムに導入される。そのような転写ユニットには、有利には、転写ターミネーターなどの通常の配列、および必要に応じて他の転写調節因子も含まれている。
【００２２】
本発明で使用可能なプロモーターには、構成的プロモーター、すなわち、ほとんどの細胞状態および環境条件で活性であるプロモーター、ならびに外因性の物理的または化学的刺激によって活性化または抑制され、したがってこれらの刺激の有無に応じて変動する発現状態を誘導する誘導性プロモーターが含まれている。例えば、微生物が酵母である場合、ＴＥＦ１、ＴＤＨ３、ＰＧＩ１、ＰＧＫ、ＡＤＨ１のうちの遺伝子のプロモーターなどの構成的プロモーターを使用することが可能である。酵母で使用することができる誘導性プロモーターの例は、ｔｅｔＯ−２、ＧＡＬ１０、ＧＡＬ１０−ＣＹＣ１、ＰＨＯ５である。
【００２３】
一般に、本発明による遺伝的に改変された微生物は、次の特徴を有する：
−  機能性ＲｕＢｉｓＣＯ（ＥＣ４．１．１．３９）の発現；
−  機能性ＰＲＫ（ＥＣ２．７．１．１９）の発現；
−  ペントースリン酸経路の非酸化分岐の少なくとも部分的な阻害；および
−  目的分子の合成および／もしくは生物変換に関与する少なくとも１つの遺伝子の発現、ならびに／または目的分子の合成および／もしくは生物変換と競合する活性をコードする少なくとも１つの遺伝子の阻害。
【００２４】
本発明によれば、任意の微生物を使用することができる。好ましくは、微生物は真核細胞であり、酵母、真菌、微細藻類または原核細胞から優先的には選択され、優先的には細菌またはシアノバクテリアである。
【００２５】
一つの実施形態において、本発明による遺伝的に改変された微生物は、子嚢菌（スペルモフトラ科およびサッカロミセス科）、担子菌類（ロイコスポリジウム属、ロドスポリジウム属、スポリジオボルス属、フィロバシジウム属およびフィロバシディエラ属）ならびに不完全菌類に属するデューテロミセテス酵母（スポロボロミケス科およびクリプトコッカス科）のうちから優先的には選択される酵母である。優先的には、本発明による遺伝的に改変された酵母は、ピキア属、クルイベロミセス属、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、カンジダ属、リポミセス属、ロドトルラ属、ロドスポリジウム属、ヤロウィア属またはデバリオミセス属に属する。より優先的には、本発明による遺伝的に改変された酵母は、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、クルイベロミセス・マルシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・カルスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・ディアスタチカス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロミセス・ダグラシー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロミセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロミセス・ノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・オビホルミス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）、シゾサッカロミセス・ポンペ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、ロドトルラ・グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ）、ロドスポリジウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、デバリオミセス・ハンゼニ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｈａｎｓｅｎｉｉ）およびリポミセス・スターキー（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｓｔａｒｋｅｙｉ）から選択される。
【００２６】
別の実施形態において、本発明による遺伝的に改変された微生物は真菌であり、より具体的には「糸状」真菌である。本発明の文脈において、「糸状真菌」は、ユーミコチナ亜門のすべての糸状形態を指す。例えば、本発明による遺伝的に改変された真菌は、アスペルギルス属、トリコデルマ属、ニューロスポラ属、ポドスポラ属、エンドシア属、ムコール属、コクリオボルス属またはイネいもち病菌に属する。優先的には、本発明による遺伝的に改変された真菌は、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗｏｍａｒｉ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）およびトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）から選択される。
【００２７】
別の実施形態において、本発明による遺伝的に改変された微生物は微細藻類である。本発明の文脈において、「微細藻類」は、優先的には網または上網である緑藻綱、黄金色綱、プリムネシオ藻綱、珪藻綱もしくは珪藻門、ユーグレナ藻綱、紅藻綱、またはトレボキシシオ藻綱に属する、すべての真核生物の微細藻類を指す。優先的には、本発明による遺伝的に改変された微細藻類は、ナノクロロプシス属（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓｐ．）（例えばナノクロロプシス・オクラタ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｏｃｕｌａｔｅ）、ナノクロロプシス・ガディタナ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｇａｄｉｔａｎａ）、ナノクロロプシス・サリナ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓａｌｉｎａ））、テトラセルミス属（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ  ｓｐ．）（例えばテトラセルミス・スエシカ（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ  ｓｕｅｃｉｃａ）、テトラセルミス・チュイ（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ  ｃｈｕｉｉ））、クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｐ．）（例えばクロレラ・サリナ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａ）、クロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）、クロレラ・エリプソイデア（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ）、クロレラ・エマゾーニ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）、クロレラ・ミヌチシマ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｍａ）、クロレラ・ピレノイドサ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ）、クロレラ・ソルキニアナ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）、クロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ））、クラミドモナス属（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）（例えばクラミドモナス・レインハルディ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ））、ドナリエラ属（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓｐ．）（例えばドナリエラ・テルチオレクタ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａ）、ドナリエラ・サリナ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａ））、フェオダクチラム・トリコルヌツム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｕｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）、ボツリオコッカス・ブラウニー（Ｂｏｔｒｙｃｏｃｃｕｓ  ｂｒａｕｎｉｉ）、クロオモナス・サリナ（Ｃｈｒｏｏｍｏｎａｓ  ｓａｌｉｎａ）、シクロテラ・クリプティカ（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｃｒｙｐｔｉｃａ）、シクロテラ属（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｓｐ．）、エットリア・テキセンシス（Ｅｔｔｌｉａ  ｔｅｘｅｎｓｉｓ）、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）、ギムノジニウム・ネルソニ（Ｇｙｍｎｏｄｉｎｉｕｍ  ｎｅｌｓｏｎ）、ヘマトコッカス・プルビアリス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）、イソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｇａｌｂａｎａ）、モノラフィディウム・ミヌツム（Ｍｏｎｏｒａｐｈｉｄｉｕｍ  ｍｉｎｕｔｕｍ）、モノラフィディウム属（Ｍｏｎｏｒａｐｈｉｄｉｕｍ  ｓｐ．）、ネオクロリス・オレアブンダンズ（Ｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｏｌｅｏａｂｕｎｄａｎｓ）、ニッチア・ラエビス（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ｌａｅｖｉｓ）、オノラフィディウム属（Ｏｎｏｒａｐｈｉｄｉｕｍ  ｓｐ．）、パブロバ・ルテリ（Ｐａｖｌｏｖａ  ｌｕｔｈｅｒｉ）、フェオダクチラム・トリコルヌツム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）、ポルフィリジウム・クルエンタム（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ  ｃｒｕｅｎｔｕｍ）、セネデスムス属（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ｓｐ．）（例えばセネデスムス・オブリカス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ｏｂｌｉｑｕｕｓ）、セネデスムス・クアドリカウラウラ（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ｑｕａｄｒｉｃａｕｌａｕｌａ）、セネデスムス属）、スティココッカス・バシラリス（Ｓｔｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｂａｃｉｌｌａｒｉｓ）、スピルリナ・プラテンシス（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）、タラシオシラ属（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｓｐ．）から選択される。
【００２８】
一つの実施形態において、本発明による遺伝的に改変された微生物は、優先的にはアシドバクテリア門、アクチノバクテリア門、アクウィフクス門、バクテロイデス門、クラミジア門、クロロビウム門、クロロフレクサス門、クリシオゲネス門、シアノバクテリア門、デフェリバクター門、デイノコッカス・テルムス門、ディクチオグロムス門、フィブロバクター門、フィルミクテス門、フソバクテリウム門、ゲンマティモナス門、ニトロスピラ門、プランクトミケス門、プロテオバクテリア門、スピロヘータ門、サーモデスルフォバクテリア門、テルモミクロビウム門、テルモトガ門またはウェルコミクロビウム門から選択される細菌である。好ましくは、本発明による遺伝的に改変された細菌は、アカリクロリス属、アセトバクター属、アクチノバシラス属、アグロバクテリウム属、アリシクロバシラス属、アナベナ属、アナシスティス属、アネロビオスピリウム属、アクウィフェクス属、アルスロバクター属、アルスロスピラ属、アゾバクター属、バシラス属、ブレビバクテリウム属、バークホルデリア属、クロロビウム属、クロマチウム属、クロロバキュラム属、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属、カプリアビダス属、シアノバクテリア属、エンテロバクター属、デイノコッカス属、エルウィニア属、エシェリキア属、ゲオバクター属、グロイオバクター属、グルコノバクタ−属、ハイドロゲノバクター属、クレブシエラ属、ラクトバシラス属、ラクトコッカス属、マンヘミア属、メソリゾビウム属、メチロバクテリウム属、マイコバクテリウム属、ミクロキスティス属、ニトロバクター属、ニトロソモナス属、ニトロスピナ属、ニトロスピラ属、ノストック属、フォルミディウム属、プロクロロコッカス属、シュードモナス属、ラルストニア属、リゾビウム属、ロドバクター属、ロドコッカス属、ロドシュードモナス属、ロドスピリルム属、サルモネラ属、セネデスムス属、セラチア属、シゲラ属、スタフィロコッカス属、ストレプトミセス属、シネココッカス属、シネコシスティス属、サーモシネココッカス属、トリコデスミウム属またはザイモモナス属に属する。また、好ましくは、本発明による遺伝的に改変された細菌は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス種（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、アグロバクテリウム・サクシニシプロデュセンス種（Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）、アグロバクテリウム・サクシノゲネス種（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、アクウィフェクス・エオリクス種（Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ）、アクウィフェクス・フィロフィルス種（Ａｑｕｉｆｅｘ  ｐｙｒｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・サブティリス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｎｅｓ）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス種（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、ブレビバクテリウム・イマリオフィラム種（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ）、クロストリジウム・パストゥリアヌム種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｅｕｒ���ａｎｕｍ）、クロストリジウム・リュングダリィ種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ）、クロストリジウム・アセトブチリクム種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、クロストリジウム・ベイジェリンキィ種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｇｅｒｉｎｃｋｉｉ）、コリネバクテリウム・グルタミクム種（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、カプリアビダス・ネカトール種（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ）、カプリアビダス・メタリデュランス種（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ）、エンテロバクター・サカザキ種（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓａｋａｚａｋｉｉ）、エシェリヒア・コリ種（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、グルコノバクター・オキシダンス種（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）、ハイドロゲノバクター・サーモフィルス種（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、クレブシエラ・オキシトカ種（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ）、ラクトコッカス・ラクティス種（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ラクトバチルス・プランタルム種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、マンヘミア・サクシニシプロデュセンス種（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）、メゾリゾビウム・ロティ種（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ）、シュードモナス・エルギノーザ種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・メバロニィ種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｖａｌｏｎｉｉ）、シュードモナス・プディカ種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｄｉｃａ）、シュードモナス・プチダ種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・フルオレッセンス種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、リゾビウム・エトリ種（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｅｔｌｉ）、ロドバクター・カプスラータ種（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）、ロドバクター・スフェロイデス種（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、ロドスピリルム・ルブルム種（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｒｕｂｒｕｍ）、サルモネラ・エンテリカ種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）、サルモネラ・エンテリカ種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）、サルモネラ・チフス種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）、サルモネラ・ティフィムリウム種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、シゲラ・ディセンテリアエ種（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、シゲラ・フレクスネリ種（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、シゲラ・ソンネ種（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ）、スタフィロコッカス・アウレウス種（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、ストレプトミセス・セリカラー種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ザイモモナス・モビリス種（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）、アカリクロリス・マリーナ種（Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｍａｒｉｎａ）、アナベナ・バリアビリス種（Ａｎａｂａｅｎａ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）、アルスロスピラ・プラテ���シス種（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）、アルスロスピラ・マキシマ種（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｍａｘａ）、クロロビウム・テピダム種（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ  ｔｅｐｉｄｕｍ）、クロロバキュラム属の種（Ｃｈｌｏｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ｓｐ．）、シアノバクテリア属の種（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ  ｓｐ．）、グロイオバクター・ビオラセウス種（Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｏｌａｃｅｕｓ）、ミクロキスティス・エルギノーサ種（Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ノストック・プンクチフォルメ種（Ｎｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ）、プロクロロコッカス・マリヌス種（Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ）、シネココッカス・エロンガトゥス種（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）、シネコシスティス属の種（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．）、サーモシネココッカス・エロンガトゥス種（Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）、トリコデスミウム・エリトラエウム種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ  ｅｒｙｔｈｒａｅｕｍ）およびロドシュードモナス・パルストリス種（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）から選択される。
【００２９】
機能性ＲｕＢｉｓＣＯおよび機能性ＰＲＫの発現
本発明によれば、微生物は、機能性ＲｕＢｉｓＣＯおよび機能性ＰＲＫを自然に発現することができる。これは、例えば、微細藻類および藍藻類などの光合成微生物の場合に当てはまる。
【００３０】
自然界にはＲｕＢｉｓＣＯのいくつかの形態がある（Ｔａｂｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｂｏｔ．２００８；５９（７）：１５１５−２４．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｊｘｂ／ｅｒｍ３６１）。Ｉ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型は、リブロース−１，５−二リン酸のカルボキシル化および酸素化反応を触媒する。Ｉ型は、真核生物および細菌に存在する。それは２つのタイプのサブユニットから成る：大サブユニット（ＲｂｃＬ）および小サブユニット（ＲｂｃＳ）。機能性酵素複合体は、８個のＬサブユニットと８個のＳサブユニットから成る十六量体である。これらのサブユニットの正しいアセンブリには、少なくとも１つの特定のシャペロン：ＲｂｃＸの介入も必要である（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１０  Ｊａｎ  １４；４６３（７２７８）：１９７−２０２．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０８６５１）。ＩＩ型は、主にプロテオバクテリア、古細菌および渦鞭毛藻類に見られる。その構造はずっと単純である：それは（２つの同一のＲｂｃＬサブユニットによって形成された）ホモ二量体である。生物に応じて、Ｉ型ＲｕＢｉｓＣＯをコードする遺伝子は、ｒｂｃＬ／ｒｂｃＳ（例えばシネココッカス・エロンガトゥス）、またはｃｂｘＬＣ／ｃｂｘＳＣ、ｃｆｘＬＣ／ｃｆｘＳＣ、ｃｂｂＬ／ｃｂｂＳ（例えばカプリアビダス・ネカトール）と呼ばれることもある。生物に応じて、ＩＩ型ＲｕＢｉｓＣＯをコードする遺伝子は、一般にｃｂｂＭと呼ばれる（例えばロドスピリルム・ルブルム）。ＩＩＩ型は、古細菌に存在する。一般に、ＲｂｃＬサブユニットの二量体の形態で、または二量体の五量体で見られる。生物に応じて、ＩＩＩ型ＲｕＢｉｓＣＯをコードする遺伝子は、ｒｂｃＬ（例えばサーモコッカス・コダカレンシス）、ｃｂｂＬ（例えばハロバクテリウム属）と呼ばれることもある。
【００３１】
２つのクラスのＰＲＫが知られている：プロテオバクテリアに見られるクラスＩの酵素は八量体であり、シアノバクテリアや植物に見られるクラスＩＩの酵素は四量体または二量体である。生物に応じて、ＰＲＫをコードする遺伝子は、ｐｒｋ（例えばシネココッカス・エロンガトゥス）、ｐｒｋＡ（例えばクラミドモナス・レインハルディ）、ｐｒｋＢ（例えばエシェリキア・コリ（大腸菌））、ｐｒｋ１、ｐｒｋ２（例えばレプトリングビヤ属）、ｃｂｂＰ（例えばニトロバクター・ブルガリス）またはｃｆｘＰ（例えばカプリアビダス・ネカトール）と呼ばれることもある。
【００３２】
使用される微生物が機能性ＲｕＢｉｓＣＯおよび機能性ＰＲＫを自然に発現しない場合、前記微生物は、一般に異種ＲｕＢｉｓＣＯおよびＰＲＫを発現するように遺伝的に改変されている。有利には、そのような場合、微生物は、前記タンパク質をコードする配列、および有利には適切な転写因子を統合する１つ以上の発現カセットをそのゲノムに統合するように形質転換されている。発現すべきＲｕＢｉｓＣＯのタイプに応じて、ＲｕＢｉｓＣＯを形成するサブユニットの適切なアセンブリを促進するためには、微生物によって発現された１つ以上のシャペロンタンパク質を有する必要があることもある。これは、Ｉ型ＲｕＢｉｓＣＯの場合に特に当てはまり、機能性ＲｕＢｉｓＣＯを得るには、特定のシャペロン（Ｒｂｃｘ）およびジェネラリストシャペロン（ｇｅｎｅｒａｌｉｓｔ  ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ）（例えばＧｒｏＥＳやＧｒｏＥＬ）をコードする遺伝子の導入および発現が必要である。国際公開第２０１５／１０７４９６号は、機能性Ｉ型ＲｕＢｉｓＣＯおよびＰＲＫを発現するように酵母の遺伝的な改変の仕方を詳細に説明している。ＧＵＡＤＡＬＵＰＥ−ＭＥＤＩＮＡ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｆｕｅｌｓ，６，１２５，２０１３）に記載されている方法を参照することもできる。
【００３３】
一つの実施形態において、微生物は、一般にＩ型ＲｕＢｉｓＣＯを発現するように遺伝的に改変されている。別の実施形態において、微生物は、ＩＩ型ＲｕＢｉｓＣＯを発現するように遺伝的に改変されている。別の実施形態において、微生物は、ＩＩＩ型ＲｕＢｉｓＣＯを発現するように遺伝的に改変されている。
【００３４】
以下の表１および２に、例として、微生物を形質転換して機能性ＲｕＢｉｓＣＯおよび機能性ＰＲＫを発現させるために使用することができる、ＲｕＢｉｓＣＯおよびＰＲＫをコードする配列を示す。
【００３５】
【表１】
2020506722.tif 000002
【００３６】
【表２】
2020506722.tif 000003
【００３７】
ペントースリン酸経路の非酸化分岐の阻害
本発明によれば、ペントースリン酸経路の非酸化分岐は少なくとも部分的に阻害されていることから、微生物は、ペントースリン酸経路を介して解糖経路にもはや入ることができなくなる。
【００３８】
優先的には、微生物は、リブロース−５−リン酸産生の下流のペントースリン酸経路の非酸化分岐を阻害するように遺伝的に改変されている（図１）。
【００３９】
リブロース−５−リン酸（Ｒｕ５Ｐ）産生の下流のペントースリン酸経路の非酸化分岐の中断は、微生物によって通常産生されるトランスアルドラーゼ（Ｅ．Ｃ．２．２．２．１．２）の少なくとも部分的な阻害によって有利には達成される。
【００４０】
トランスアルドラーゼは、セドヘプツロース−７−リン酸／グリセルアルデヒド−３−リン酸とエリトロース−４−リン酸／フルクトース−６−リン酸の代謝産物ペア間のトランスフェラーゼ型反応を触媒する酵素である。
【００４１】
生物に応じて、トランスアルドラーゼをコードする遺伝子は、ｔａｌ、ｔａｌＡ、ｔａｌＢ（例えば大腸菌、シネコシスティス属の）、ＴＡＬＤＯ、ＴＡＬＤＯ１、ＴＡＬＤＯＲ（例えばホモ・サピエンス、ハツカネズミ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）の）、ＴＡＬ１（例えばサッカロミセス・セレビシエの）、ＴＡＬ２（例えばノストック・プンクチフォルメ（Ｎｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ）の）、ｔａｌＡ１、ｔａｌＡ２（例えばストレプトコッカス・ガロリティカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）の）、ｔａｌＢ１、ｔａｌＢ２（例えばアゾバクター・ビネランジィ（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）の）、またはＮＱＭ１（例えばサッカロミセス・セレビシエの）と呼ばれることもある。
【００４２】
あるいはまたはさらに、リブロース−５−リン酸（Ｒｕ５Ｐ）産生の下流のペントースリン酸経路の非酸化分岐の中断は、微生物によって通常産生されるトランスケトラーゼ（Ｅ．Ｃ．２．２．２．１．１）の少なくとも部分的な阻害によって得ることができる。
【００４３】
トランスケトラーゼは、セドヘプツロース−７−リン酸／グリセルアルデヒド−３−リン酸とリボース−５−リン酸／キシルロース−５−リン酸の代謝産物ペア間、ならびにフルクトース−６−リン酸／グリセルアルデヒド−３−リン酸とエリトロース−４−リン酸／キシルロース−５−リン酸のペア間のトランスフェラーゼ型反応を触媒する酵素である。生物に応じて、トランスケトラーゼをコードする遺伝子は、ＴＫＬ、ＴＫＬ１、ＴＫＬ２（例えばサッカロミセス・セレビシエ）、ｔｋｌＡ、ｔｋｌＢ（例えばロドバクター・スフェロイデス）、ｔｋｔＡ、ｔｋｔＢ、（例えば大腸菌）、ＴＫＴ、ＴＫＴ１、ＴＫＴ２（例えばホモ・サピエンス、キイロタマホコリカビ（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ  ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ））、またはＴＫＴＬ１、ＴＫＴＬ２（例えばボス・タウルス（Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ））、またはｃｂｂＴ、ｃｂｂＴＣ、ｃｂｂＴＰ（例えばカプリアビダス・ネカトール、シネコシスティス属）と呼ばれることもある。
【００４４】
特定の一例において、微生物は、トランスアルドラーゼをコードする遺伝子の発現が少なくとも部分的に阻害されるように遺伝的に改変されている。優先的には、遺伝子発現は完全に阻害されている。あるいはまたはさらに、微生物は、トランスケトラーゼをコードする遺伝子の発現も少なくとも部分的に阻害されるように遺伝的に改変されている。優先的には、遺伝子発現は完全に阻害されている。
【００４５】
以下の表３および４は、例として、標的微生物に応じて阻害され得るトランスアルドラーゼまたはトランスケトラーゼをコードする配列を列挙する。当業者には、微生物に応じて、阻害すべき目的酵素にどの遺伝子が対応するかは公知である。
【００４６】
【表３】
2020506722.tif 000004
【００４７】
【表４】
2020506722.tif 000005
【００４８】
一般に、ペントースリン酸経路の非酸化分岐と解糖経路との間の連絡は、本発明による遺伝的に改変された微生物では、ペントースリン酸経路の非酸化分岐を介してもはや可能ではないか、または少なくとも有意に減少している。
【００４９】
特定の例示的な実施形態において、微生物は、ＮＱＭ１および／またはＴＡＬ１遺伝子の発現が少なくとも部分的に阻害されているサッカロミセス・セレビシエ属の酵母である。
【００５０】
別の特定の例示的な実施形態において、微生物は、ｔａｌＡ遺伝子の発現が少なくとも部分的に阻害されている大腸菌属の細菌である。
【００５１】
本発明によれば、機能性ＲｕＢｉｓＣＯおよび機能性ＰＲＫを発現し、そのペントースリン酸経路の非酸化分岐が少なくとも部分的に阻害される遺伝的に改変された微生物は、ペントースリン酸を介して解糖経路にもはや入ることができなくなる。一方で、追加の炭素分子を固定しながら、ＰＲＫとＲｕＢｉｓＣＯの異種発現を介して、ペントースリン酸経路の酸化分岐によって合成されたＲｕ５Ｐからグリセルアルデヒド−３−リン酸（Ｇ３Ｐ）を産生することができる（図２）。
【００５２】
したがって、遺伝的に改変された微生物は、ペントースリン酸経路の酸化分岐を介してＮＡＤＰＨを産生し、相補的な炭素源として外因性ＣＯ２、特に大気ＣＯ２を使用して、ＰＲＫとＲｕＢｉｓＣＯの異種発現を介してＧ３Ｐを産生することができる。
【００５３】
したがって、本発明による遺伝的に改変された微生物は、ＮＤＰＨおよびＧ３Ｐ（およびその後に続く目的分子）の産生のために、外因性ＣＯ２を固定および使用することによって炭素収率を増加させることを可能にする。ここでも、炭素収率が増加する。
【００５４】
Ｅｎｔｎｅｒ−Ｄｏｕｄｏｒｏｆｆ経路の阻害
特定の一つの実施形態において、本発明による遺伝的に改変された微生物は、Ｅｎｔｎｅｒ−Ｄｏｕｄｏｒｏｆｆ経路を有し、これは少なくとも部分的に阻害されている。主に細菌（特にグラム陰性菌）に見られるこの経路は、グルコースからピルビン酸を産生するための解糖およびペントース経路に代わるものである。より正確には、この経路は、Ｐ−グルコン酸でペントースリン酸経路に接続し、特にピルビン酸で解糖を供給する。
【００５５】
優先的には、微生物は、６−ホスホグルコン酸産生の下流のＥｎｔｎｅｒ−Ｄｏｕｄｏｒｏｆｆ経路反応を阻害するように遺伝的に改変されている。この阻害により、競合する可能性のある経路が排除され、ＰＲＫ／ＲｕＢｉｓＣＯエンジニアリングの基質として６−ホスホグルコン酸の利用可能性が確保される。
【００５６】
６−ホスホグルコン酸産生の下流のＥｎｔｎｅｒ−Ｄｏｕｄｏｒｏｆｆ経路の中断は、６−ホスホグルコン酸からのピルビン酸合成プロセスでの１つ以上の反応を特異的に標的とする。この合成は、２つの酵素：（ｉ）６−ホスホグルコン酸デヒドラターゼ（「ＥＤＤ」−ＥＣ．４．２．１．１２）および（ｉｉ）２−デヒドロ−３−デオキシ−ホスホグルコン酸アルドラーゼ（「ＥＤＡ」−Ｅ．Ｃ．４．１．２．１４）の連続的な作用によって開始される。
【００５７】
６−ホスホグルコン酸デヒドラターゼは、６−ホスホグルコン酸から２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸への脱水を触媒する。生物に応じて、６−ホスホグルコン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子は、ｅｄｄ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿４１６３６５、例えば大腸菌の）またはｉｌｖＤ（例えばマイコバクテリウム属の）と呼ばれることもある。
【００５８】
２−デヒドロ−３−デオキシ−ホスホグルコン酸アルドラーゼは、６−ホスホグルコン酸デヒドラターゼによって産生される２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸からのピルビン酸分子およびグリセルアルデヒド−３−リン酸分子の合成を触媒する。生物に応じて、２−デヒドロ−３−デオキシ−ホスホグルコン酸アルドラーゼをコードする遺伝子は、ｅｄａ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿４１６３６４、例えば大腸菌の）またはｋｄｇＡ（例えばサーモプロテウス・テナクスの）またはｄｇａＦ（例えばサルモネラ・ティフィムリウムの）と呼ばれることもある。
【００５９】
特定の一例において、微生物は、６−ホスホグルコン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子の発現が少なくとも部分的に阻害されるように遺伝的に改変されている。優先的には、遺伝子発現は完全に阻害されている。
【００６０】
あるいはまたはさらに、微生物は、２−デヒドロ−３−デオキシ−ホスホグルコン酸アルドラーゼをコードする遺伝子の発現が少なくとも部分的に阻害されるように遺伝的に改変されている。優先的には、遺伝子発現は完全に阻害されている。
【００６１】
以下の表５および６は、例として、標的微生物に応じて阻害され得る６−ホスホグルコン酸デヒドラターゼおよび２−デヒドロ−３−デオキシ−ホスホグルコン酸アルドラーゼをコードする配列を列挙する。当業者には、微生物に応じて、阻害すべき目的酵素にどの遺伝子が対応するかは公知である。
【００６２】
【表５】
2020506722.tif 000006
【００６３】
【表６】
2020506722.tif 000007
【００６４】
一般に、この実施形態において、ピルビン酸の産生は、Ｅｎｔｎｅｒ−Ｄｏｕｄｏｒｏｆｆ経路を介してもはや可能ではないか、少なくとも有意に減少している。
【００６５】
特定の例示的な実施形態において、微生物は、ｅｄｄ遺伝子の発現が少なくとも部分的に阻害されている大腸菌属の細菌である。
【００６６】
特定の一例において、大腸菌の細菌は、ｔａｌＡおよびｅｄｄ遺伝子の発現が少なくとも部分的に阻害されるように遺伝的に改変されている。
【００６７】
本発明によれば、機能性ＲｕＢｉｓＣＯおよび機能性ＰＲＫを発現し、そのペントースリン酸経路の非酸化分岐およびＥｎｔｎｅｒ−Ｄｏｕｄｏｒｏｆｆ経路が少なくとも部分的に阻害されている遺伝的に改変された微生物は、Ｅｎｔｎｅｒ−Ｄｏｕｄｏｒｏｆｆ経路またはペントースリン酸経路によってピルビン酸をもはや産生することができない。したがって、ＮＡＤＰＨ産生中のグルコースからの炭素フラックスは、ＰＲＫ／ＲｕＢｉｓＣＯエンジニアリングに向けられることが好ましい。
【００６８】
目的分子の産生
本発明によれば、遺伝的に改変された微生物は、目的の外因性分子の産生および／または目的の内因性分子の過剰産生を行うように形質転換されている。
【００６９】
本発明の文脈において、目的分子は、優先的には０．８ｋＤａ以下の分子量を有する小さな有機分子を指す。
【００７０】
一般に、上記のように微生物に加えられた遺伝的改変は、目的分子の合成および／または生物変換経路の炭素収率を改善する。
【００７１】
本発明の文脈において、「改善された」収率は、最終産物の量を指す。一般に、本発明の文脈において、炭素収率は、特に重量による発酵性糖の量に対する最終製品の量の比率に対応する。本発明によれば、炭素収率は、本発明による遺伝的に改変された微生物では、同一の培養条件下に置かれた野生型微生物と比較して増加する。有利には、炭素収率は、２％、５％、１０％、１５％、１８％、２０％以上増加する。本発明による遺伝的に改変された微生物は、単純にその分子を産生または過剰産生するように遺伝的に改変された微生物によって産生される異種分子よりも大量の目的分子（最終産物）を産生することができる。本発明によれば、遺伝的微生物はまた、野生型微生物と比較して内因性分子を過剰産生することができる。内因性分子の過剰産生は、主に量の観点から理解される。有利には、遺伝的に改変された微生物は、野生型微生物よりも少なくとも２０重量％、３０重量％、４０重量％、５０重量％以上の内因性分子を産生する。有利には、本発明による微生物は、アミノ酸、テルペノイド、テルペン、ビタミンおよび／またはビタミン前駆体、ステロール、フラボノイド、有機酸、ポリオール、ポリアミン、ＮＡＤＰ依存性チトクロムｐ４５０およびその他を介した立体特異的ヒドロキシル化から得られる芳香族分子のうちの少なくとも１つの分子を産生または過剰産生するように遺伝的に改変されている。
【００７２】
特定の一例において、微生物は、アルギニン、リジン、メチオニン、トレオニン、プロリン、グルタミン酸、ホモセリン、イソロイシンおよびバリンから優先的には選択される少なくとも１つのアミノ酸を過剰産生するように遺伝的に改変されている。
【００７３】
特定の一例において、微生物は、ファルネセンなどのテルペノイド経路、およびテルペン経路から分子を産生または過剰産生するように遺伝的に改変されている。
【００７４】
特定の一例において、微生物は、パントイン酸、パントテン酸、トランスニューロスポレン、フィロキノンおよびトコフェロールから優先的には選択されるビタミンまたは前駆体を産生または過剰産生するように遺伝的に改変されている。
【００７５】
特定の一例において、微生物は、スクアレン、コレステロール、テストステロン、プロゲステロンおよびコルチゾンから優先的には選択されるステロールを産生または過剰産生するように遺伝的に改変されている。
【００７６】
特定の一例において、微生物は、フラビノンおよびベスチノンから優先的には選択されるフラボノイドを産生または過剰産生するように遺伝的に改変されている。
【００７７】
特定の一例において、微生物は、クマル酸および３−ヒドロキシプロピオン酸から優先的には選択される有機酸を産生または過剰産生するように遺伝的に改変されている。
【００７８】
特定の一例において、微生物は、ソルビトール、キシリトールおよびグリセロールから優先的には選択されるポリオールを産生または過剰産生するように遺伝的に改変されている。
【００７９】
特定の一例において、微生物は、ポリアミン、優先的にはスペルミジンを産生または過剰産生するように遺伝的に改変されている。
【００８０】
特定の一例において、微生物は、フェニルプロパノイド、テルペン、脂質、タンニン、香料、ホルモンから優先的には選択される、ＮＡＤＰ依存性シトクロムｐ４５０を介した立体特異的ヒドロキシル化からの芳香族分子を産生または過剰産生するように遺伝的に改変されている。
【００８１】
目的分子が生物変換によって得られる場合、遺伝的に改変された微生物は、有利には、変換すべき基質を含む培地で培養される。一般に、本発明による遺伝的に改変された微生物による目的分子の産生または過剰産生は、当業者に知られている適切な培地で前記微生物を培養することによって得られる。
【００８２】
「適切な培地」という用語は、一般に、炭素源；硫酸アンモニウムなどのニトロゲン源；蛍光体の供給源、例えば一塩基性リン酸カリウム；微量元素、例えば銅、ヨウ化物、鉄、マグネシウム、亜鉛またはモリブデン酸の塩；ビタミン、およびアミノ酸または他の増殖促進物質などの他の増殖因子などの前記微生物の維持および／または増殖のための必須または有益な栄養素を提供する滅菌培地を指す。必要に応じてアンチフォーム剤を追加してもよい。本発明によれば、この適切な培地は、化学的に定義されたものでも複雑なものであってもよい。したがって、培地は、Ｖｅｒｄｕｙｎら（Ｙｅａｓｔ．１９９２．８：５０１−１７）によって定義され、Ｖｉｓｓｅｒら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．２００２．７９：６７４−８１）によって適合された、または酵母ニトロゲンベース（ＹＮＢ）培地（ＭＰ  ＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓもしくはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）などの市販されている合成培地と組成が同一もしくは類似していてもよい。
【００８３】
特に、培地は、グルコース、ガラクトース、スクロース、糖蜜、またはこれらの糖の副産物などの単純な炭素源を含んでいてもよく、任意に炭素共基質としてＣＯ２が補充されている。本発明によれば、単純な炭素源は、目的微生物の正常な増殖を可能にしなければならない。場合によっては、リグノセルロース系バイオマス、稲わらまたはデンプンなどの複雑な炭素源を使用することも可能である。複雑な炭素源の使用には、通常、使用前に前処理が必要とされる。
【００８４】
特定の一つの実施形態において、培地は、グルコース、キシロースまたはアラビノースなどの単糖、スクロースなどの二糖、酢酸、酪酸、プロピオン酸または吉草酸などの有機酸のうちの少なくとも１つの炭素源を含み、異なる種類のポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）、処理されたまたは未処理のグリセロールを促進する。
【００８５】
産生および／または過剰産生すべき分子に応じて、栄養因子（Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｓ、Ｋ＋、Ｍｇ２＋、Ｆｅ２＋、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｃａ、Ｓｎ：Ｋｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ，Ｇ．−Ｑ．Ｃｈｅｎ，１４：８５−１１９，（２０１０））の供給を活用することができる。これは特に、ＰＨＢをはじめとするＰＨＡの合成および細胞内蓄積を促進することに当てはまる。
【００８６】
本発明によれば、目的分子の工業規模での産生を可能にする任意の培養方法を考慮することができる。有利には、培養は、バイオリアクターで、特にバッチ、流加および／または連続培養モードで行われる。優先的には、目的分子の産生に関連する培養は、例えば濃度が２００ｇ／Ｌ〜７００ｇ／Ｌの間であり得る濃縮グルコース溶液を加えることによる、１つ以上の基質の制御された供給に対応する流加モードである。プロセス中のビタミンの制御された供給はまた、産生性にとって有益である（Ａｌｆｅｎｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００２．６０：６７−７２）。アンモニウム塩溶液を加えて、ニトロゲンの供給を制限することも可能である。
【００８７】
発酵は、一般にバイオリアクターで、エルレンマイヤーフラスコでの固体および／または液体前培養の可能な工程を伴って、目的分子の産生のために必要な少なくとも単純な炭素源および／または外因性ＣＯ２供給を含む適切な培地により行われる。
【００８８】
一般に、本発明による微生物の培養条件は、微生物および／または産生／過剰産生すべき分子に応じて、当業者によって容易に適応可能である。例えば、培養温度は、酵母の場合、２０℃〜４０℃、好ましくは２８℃〜３５℃であり、より詳細には、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の場合、約３０℃である。培養温度は、カプリアビダス・ネカトールの場合、２５℃〜３５℃、好ましくは３０℃である。
【００８９】
したがって、本発明はまた、ＲｕＢｉｓＣＯ酵素および／またはホスホリブロキナーゼ（ＰＲＫ）以外の、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ビタミン、ステロール、フラボノイド、テルペン、テルペノイド、脂肪酸、ポリオールおよび有機酸から優先的には選択される目的分子の産生または過剰産生のための、本発明による遺伝的に改変された微生物の使用に関する。
【００９０】
本発明はまた、ＲｕＢｉｓＣＯ酵素および／またはホスホリブロキナーゼ（ＰＲＫ）以外の少なくとも１つの目的分子を産生する生物工学的方法であって、本発明による遺伝的に改変された微生物を、前記微生物によって前記目的分子の合成または生物変換を可能にする条件下で培養する工程と、任意に前記目的分子を回収および／または精製する工程とを含むことを特徴とする方法に関する。
【００９１】
特定の一つの実施形態において、微生物は、前記目的分子の合成に関与する少なくとも１つの酵素を発現するように遺伝的に改変されている。
【００９２】
別の特定の実施形態において、微生物は、前記目的分子の生物変換に関与する少なくとも１つの酵素を発現するように遺伝的に改変されている。
【００９３】
本発明はまた、目的分子を産生する方法であって、（ｉ）本発明による組換え微生物への前記目的分子の合成または生物変換に関与する酵素をコードする少なくとも１つの配列を挿入することと、（ｉｉ）前記酵素の発現を可能にする条件下で前記微生物を培養することと、任意に（ｉｉｉ）前記目的分子を回収および／または精製することとを含む方法に関する。
【００９４】
例えば、酵母、例えば機能性ＰＲＫとＲｕＢｉｓＣＯ、ファルネセンシンターゼを発現するように遺伝的に改変され、かつＴＡＬ１遺伝子（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：８５１０６８）の発現が少なくとも部分的に阻害されているサッカロミセス・セレビシエの酵素によってファルネセンを過剰産生することが可能である。
【００９５】
また、細菌、例えば機能性ＰＲＫとＲｕＢｉｓＣＯを発現するように遺伝的に改変され、かつｔａｌＡ遺伝子（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：９４７００６）およびｓｕｃＡ遺伝子（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：９４５３０３）の発現が少なくとも部分的に阻害されている大腸菌属の細菌によってグルタミン酸を過剰産生することが可能である。
【実施例】
【００９６】
例１：バイオインフォマティクス解析
ａ）ペントースリン酸経路および解糖を使用する野生型株と本発明による改変株との間のグルコースからの炭素固定収率の比較
【００９７】
本発明による改変の利点を評価するために、関与する反応の化学量論に基づいて理論収率計算を行った。
【００９８】
２つのシナリオを解析した：（ｉ）ペントースリン酸経路を使用してＮＡＤＰＨ依存性生合成経路（例えばファルネセン合成）を供給する野生型株、および（ｉｉ）同じ条件下での、本発明による改変株。
【００９９】
ＮＡＤＰＨ依存生合成経路の改善の文脈において、ペントースリン酸経路を介したグルコースからのＮＡＤＰＨおよびグリセルアルデヒド−３−リン酸（Ｇ３−Ｐ）の形成の理論平衡は、次の式（１）に従って計算した：
（１）３グルコース＋５ＡＴＰ＋６ＮＡＤＰ＋＋３Ｈ２Ｏ→５Ｇ３−Ｐ＋５ＡＤＰ＋６ＮＡＤＰＨ＋１１Ｈ＋＋３ＣＯ２
Ｇ３Ｐからピルビン酸形成に進むと、次の平衡に到達する：
（２）３グルコース＋５ＡＤＰ＋６ＮＡＤＰ＋＋５ＮＡＤ＋＋５Ｐｉ→５ピルビン酸＋５ＡＴＰ＋６ＮＡＤＰＨ＋５ＮＡＤＨ＋１１Ｈ＋＋３ＣＯ２＋２Ｈ２Ｏ
１モルのグルコースの平衡を正規化すると、次の収率が得られる：
（３）グルコース＋１．６７ＡＤＰ＋２ＮＡＤＰ＋＋１．６７ＮＡＤ＋＋１．６７Ｐｉ→１．６７ピルビン酸＋１．６７ＡＴＰ＋２ＮＡＤＰＨ＋１．６７ＮＡＤＨ＋３．６７Ｈ＋＋ＣＯ２＋０．６７Ｈ２Ｏ
【０１００】
ペントースリン酸経路を介して、１モルのグルコースから１．６７モルのピルビン酸と２モルのＮＡＤＰＨが産生される。しかしながら、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．４４）によるリブロース−５−リン酸の形成中、脱炭酸によって１モルの炭素が失われる。
【０１０１】
したがって、ペントースリン酸経路により２ＮＡＤＰＨを産生したときのピルビン酸産生の理論上の最大収率は０．８２ｇピルビン酸／ｇグルコース（消費されたグルコース１ｇ当たりの合成ピルビン酸のｇ数）である。
【０１０２】
ＰＲＫ／ＲｕＢｉｓＣＯエンジニアリングをペントースリン酸経路の非酸化分岐に対して阻害された株（例えばサッカロミセス・セレビシエ酵母のΔＴＡＬ１−ΔＮＱＭ１）に統合することによって、炭素固定フラックスはペントースリン酸経路の酸化分岐からＰＲＫ／ＲｕＢｉｓＣＯエンジニアリングにリダイレクトされる（図２を参照）。このフラックスは、次の収率で、３−ホスホグリセリン酸（３ＰＧ）形成のレベルでの解糖経路の終わりに関連している：
（５）グルコース＋２ＡＴＰ＋２ＮＡＤＰ＋＋２Ｈ２Ｏ→２３ＰＧ＋２ＡＤＰ＋２ＮＡＤＰＨ＋６Ｈ＋
３ＰＧからピルビン酸形成に進むと、次の平衡に到達する：
（６）グルコース＋２ＮＡＤＰ＋→２ピルビン酸＋２ＮＡＤＰＨ＋４Ｈ＋
【０１０３】
本発明による改変を統合することにより、ペントースリン酸経路での脱炭酸によって失われる炭素分子を回収することが可能になる。したがって、エンジニアリングによる２ＮＡＤＰＨの産生中のピルビン酸合成の理論上の最大収率は０．９８ｇピルビン酸／ｇグルコースであり、ペントースリン酸経路によるピルビン酸の産生によって得られる収率が２０．５％改善される。
【０１０４】
ｂ）フラックス平衡解析による生合成収率のシミュレーション
バイオインフォマティクスによるアプローチでは、フラックス平衡解析（ＦＢＡ）も実施して、本発明に従って記載される改変が異なる生合成経路の収率に与える影響をシミュレートした。
【０１０５】
ＦＢＡは、ゲノム規模で代謝ネットワークをシミュレートする数理モデルに基づいている（Ｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１０；２８：２４５−２４８）。再構築されたネットワークには、所定の生物の既知の代謝反応が含まれ、特に細胞の維持または増殖を確保するために、細胞のニーズが統合される。ＦＢＡにより、これらのネットワークを介した代謝産物の流量を計算することが可能になるため、理論増殖速度と代謝産物の産生収率の両方の予測をすることが可能になる。
【０１０６】
ｉ）手順
ＦＢＡシミュレーションは、ＯｐｔＦｌｕｘソフトウェア（Ｒｏｃｈａ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｓｙｓｔ  Ｂｉｏｌ．２０１０  Ａｐｒ  １９；４：４５．ｄｏｉ：１０．１１８６／１７５２−０５０９−４−４５）と、サッカロミセス・セレビシエ代謝モデルｉＭＭ９０４（Ｍｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｓｙｓｔ  Ｂｉｏｌ．２００９  Ｍａｒ  ２５；３：３７．ｄｏｉ：１０．１１８６／１７５２−０５０９−３７）を用いて実施した。このモデルは、（ｉ）ＰＲＫ型反応の追加、（ｉｉ）ＲｕＢｉｓＣＯ型反応の追加を伴う異種ＣＯ２固定経路を含む、本発明に従って記載される改善を含むように改変した。
【０１０７】
特定の例示的な実施形態において、異種経路を介した分子の産生をシミュレートするのに必要な反応もモデルに追加した。
【０１０８】
特定の例示的な実施形態において、ファルネセンの異種産生のために、ファルネセンシンターゼ反応（ＥＣ４．２．３．４６またはＥＣ４．２．３．４７）を追加した。
【０１０９】
第２の特定の例示的な実施形態において、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．１．１．３６）およびポリ−β−ヒドロキシ酪酸シンターゼ（ＥＣ２．３．１．Ｂ２または２．３．１．Ｂ５）反応をモデルに追加して、ポリヒドロキシ酪酸のモノマーであるβ−ヒドロキシ酪酸の異種産生経路をシミュレートした。シミュレーションは、本発明に従って記載される条件下（例えば、培地中で無制限のグルコースの存在、好気性培養条件）でのサッカロミセス・セレビシエ株のｉｎ  ｖｉｖｏ培養条件をシミュレートすることを目的とした、当業者によって再現可能な一連の制約をモデルに適用することによって行った。
【０１１０】
シミュレーションは、本発明に従って記載される条件下（例えば、培地中で無制限のグルコースの存在、好気性培養条件）でのサッカロミセス・セレビシエ株のｉｎ  ｖｉｖｏ培養条件をシミュレートすることを目的とした、当業者によって再現可能な一連の制約をモデルに適用することによって行った。
【０１１１】
特定の例示的な実施形態において、本発明に従って記載されるペントースリン酸経路の非酸化分岐の活性の減少をシミュレートするために、トランスアルドラーゼ酵素ＴＡＬ１およびＮＱＭ１の反応を実質的に不活性化することによってシミュレーションを実施した。
【０１１２】
シミュレーションは、本発明に従って記載される改善が、試験された生合成経路の産生収率に及ぼす影響を評価するために、改変されていない「野生型株」モデルで並行して行う。
【０１１３】
ｉｉ）結果
得られた理論収率および本発明に従って提供される改善の割合を以下の表７に記載する。
【０１１４】
【表７】
2020506722.tif 000008
ＭｏｌＸ／ＭｏｌＧＬＵＣ：消費されたグルコースのモル数に対する、産生された分子Ｘのモル数
ＣＭｏｌＸ／ＣＭｏｌＧＬＵＣ：消費されたグルコースの炭素のモル数に対する、産生された分子Ｘの炭素のモル数
ｇＸ／ｇＧＬＵＣ：消費されたグルコースのｇ数に対する、産生された分子Ｘのｇ数
【０１１５】
例２：サッカロミセス・セレビシエでの異種ファルネセン産生の改善
サッカロミセス・セレビシエの酵母株である、市販の株ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＪＲＩＶ００００００００）に由来するＣＥＮ．ＰＫ  １６０５（Ｍａｔ  ａ  ＨＩＳ３  ｌｅｕ２−３．１１２  ｔｒｐ１−２８９  ｕｒａ３−５２  ＭＡＬ．２８ｃ）を、ＣＯ２損失なしでＮＡＤＰＨを産生し、ひいてはグルコースからのα−ファルネセン産生を改善するようにエンジニアリングする。
【０１１６】
ａ）ペントースリン酸経路の非酸化分岐の不活性化
ペントースリン酸経路の非酸化分岐は、ＴＡＬ１遺伝子とそのパラログＮＱＭ１の欠失によって不活性化した。
【０１１７】
ｉ）ＴＡＬ１遺伝子：ＸＩ染色体（８３６３５０〜８３７３５７、相補鎖）の不活性化
そのために、プラスミドｐＵＧ６（Ｐ３０１１４）−Ｅｕｒｏｓｃａｒｆに含まれるＫａｎＭＸカセットに由来するＧ４１８耐性遺伝子のコーディングフェーズ（ｃｏｄｉｎｇ  ｐｈａｓｅ）を、オリゴヌクレオチドＳｄｔａｌ１−Ｒｄｔａｌ１（表８）で増幅した。
【０１１８】
【表８】
2020506722.tif 000009
【０１１９】
オリゴヌクレオチドの下線部は、ＫａｎＭＸ配列と完全に相同であり、残りの配列は、ＴＡＬ１遺伝子座の相同組換え配列をその両端に含むＰＣＲアンプリコンを生成するように、サッカロミセス・セレビシエのゲノム上のＴＡＬ１遺伝子のコーディングフェーズに隣接する領域に対応する。
【０１２０】
形質転換反応のために、ＣＥＮ．ＰＫ株  １６０５を、５０ｍＬ容量の複合体リッチ培地ＹＰＤ（酵母エキス・ペプトン・デキストロース）で３０℃にて６００ｎｍの光学密度０．８に増殖させた。細胞を室温で２，５００ｒｐｍにて５分間遠心分離した。上清を除去し、細胞を２５ｍＬの滅菌水に再懸濁し、室温にて２，５００ｒｐｍで再度５分間遠心分離した。上清を除去した後、細胞を４００μＬの１００ｍＭ滅菌酢酸リチウムに再懸濁した。
【０１２１】
同時に、２ｍＬのチューブで次のようにして形質転換ミックスを調製した：２５０μＬの５０％ＰＥＧ、５ｍｇ／ｍＬで１０μＬの「キャリア」ＤＮＡ、３６μＬの１Ｍ酢酸リチウム、１０μＬの精製ＰＣＲ反応（欠失カセット）および３５０μＬの水。
【０１２２】
再懸濁した細胞（５０μＬ）を形質転換混合物に加え、水浴で４２℃にて４０分間インキュベートした。
【０１２３】
インキュベーション後、チューブを室温にて５，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清を廃棄した。細胞を２ｍＬのＹＰＤに再懸濁し、１４ｍＬのチューブに移し、２００ｒｐｍで３０℃にて２時間インキュベートした。次いで、細胞を室温にて５，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。上清を除去し、細胞を１ｍＬの滅菌水に再懸濁し、再度１分間遠心分離し、１００μＬの滅菌水に再懸濁し、ＹＰＤ＋Ｇ４１８（１８０μｇ／ｍＬ）に広げる。
【０１２４】
得られたコロニーは、ＴＡＬ１遺伝子の欠失の検証のためにジェノタイピングし、ＥＱ−０５２０（ＣＥＮ．ＰＫ  １６０５  Δｔａｌ１：：ｋａｎ）と参照した。
【０１２５】
ｉｉ）ＮＱＭ１遺伝子：ＶＩＩ染色体（５８０４３５〜５８１４３６、相補鎖）の不活性化
ｈｐｈＭＸカセット（ｌｏｘＰ−ｐＡｇＴＥＦ１−ｈｐｈＭＸ−ｔＡｇＴＥＦ１−ｌｏｘＰ）に由来し、プラスミドｐＵＧ７５（Ｐ３０６７１）−Ｅｕｒｏｓｃａｒｆに含まれるハイグロマイシンＢ耐性遺伝子のコーディングフェーズを、オリゴヌクレオチドＳｄｎｑｍ１およびＲｄｎｑｍ１（表８）で増幅する。これにより、トランスアルドラーゼＮＱＭ１遺伝子座の相同組換え配列をその両端に含むΔｎｑｍ１  ＰＣＲアンプリコンを生成することが可能になる。
【０１２６】
形質転換反応のために、株ＥＱ−０５２０（ＣＥＮ．ＰＫ１６０５  Δｔａｌ１：：ｋａｎ）を、５０ｍＬの容量の複合体リッチ培地ＹＰＤ（酵母エキス・ペプトン・デキストロース）で３０℃にて６００ｎｍの光学密度０．８まで増殖させる。細胞を室温にて２，５００ｒｐｍで５分間遠心分離する。上清を除去し、細胞を２５ｍＬの滅菌水に再懸濁し、室温にて２，５００ｒｐｍで再度５分間遠心分離する。上清を除去した後、細胞を４００μＬの１００ｍＭ滅菌酢酸リチウムに再懸濁する。同時に、２ｍＬのチューブで次のようにして形質転換ミックスを調製する：２５０μＬの５０％ＰＥＧ、５ｍｇ／ｍＬで１０μＬの「キャリア」ＤＮＡ、３６μＬの１Ｍ酢酸リチウム、１０μＬの精製ＰＣＲ反応（欠失カセット）および３５０μＬの水。
【０１２７】
再懸濁した細胞（５０μＬ）を形質転換混合物に加え、水浴で４２℃にて４０分間インキュベートした。インキュベーション後、チューブを室温にて５，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清を廃棄した。細胞を２ｍＬのＹＰＤに再懸濁し、１４ｍＬのチューブに移し、２００ｒｐｍで３０℃にて２時間インキュベートした。次いで、細胞を室温にて５，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。上清を除去し、細胞を１ｍＬの滅菌水に再懸濁し、再度１分間遠心分離し、１００μＬの滅菌水に再懸濁し、ＹＰＤ＋ハイグロマイシンＢ（２００μｇ／ｍＬ）＋Ｇ４１８（１８０μｇ／ｍＬ）に広げる。
【０１２８】
得られたコロニーは、ＴＡＬ１遺伝子の欠失の検証のためにジェノタイピングし、ＥＱＳＣ−０５２１（ＣＥＮ．ＰＫ１６０５  Δｔａｌ１：：ｋａｎ  Δｎｑｍ１：：ｈｐｈ）と参照した。
【０１２９】
ｂ）ＰＲＫ／ＲｕＢｉｓＣＯ／ファルネセンシンターゼ酵素の導入
解糖の代替経路を作成し、株ＥＱ−０５２１（ＣＥＮ．ＰＫ  １６０５  Δｔａｌ１：：ｋａｎ  Δｎｑｍ１：：ｈｐｈ）がＣＯ２を固定することによって特定の代謝産物の収率を増加させるために、株は以下を発現するように改変する：
・  リブロース−５Ｐを消費してリブロース−１．５ｂｉｓＰを与えることによってペントースリン酸経路に移植するホスホリブロキナーゼＰＲＫをコードする遺伝子ならびに
・  Ｉ型ＲｕＢｉｓＣＯ（構造遺伝子ＲｂｃＬおよびＲｂｃＳおよびシャペロンＲｂｃＸ、ＧｒｏＥＳおよびＧｒｏＥＬを有する）。ＲｕＢｉｓＣＯは、リブロース−１．５ｂｉｓＰと１モルのＣＯ２を消費して３−ホスホグリセリン酸を形成する。
【０１３０】
α−ファルネセンを産生するために、α−ファルネセンシンターゼ遺伝子（ＡＦＳ１、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１８２２４１）を酵母から欠いている。
【０１３１】
【表９】
2020506722.tif 000010
【０１３２】
エンジニアリングに必要とされる７つの遺伝子（表９）は、適合した複製起点を有し、それぞれが異なる栄養要求性の補完のための遺伝子を持つ自律複製が可能な３つのプラスミドベクターにクローニングされており、３つプラスミド構築物を含む株の選択が可能になる。これらのプラスミドのうちの２つはＡｒｓ／ＣＥＮ複製起点を有するシングルコピーであり、３つ目は２μ起点を有するマルチコピーである。
【０１３３】
ＲｂｃＬ、ＲｂｃＳ、ＲｂｃＸおよびＰＲＫなどのシネココッカス・エロンガトゥスからの遺伝子（国際公開第２０１５１０７４９６号に記載）ならびにマルス・ドメスティカ（Ｍａｌｕｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）からのα−ファルネセンシンターゼ（Ｔｉｐｐｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．  ２０１６  Ｊａｎ；１１３（１）：７２−８１）を、サッカロミセス・セレビシエ酵母でのコドンの使用に最適化した。
【０１３４】
前述のプロトコルに従って、株ＥＱ−０５２１を、３０℃にて５０ｍＬ容量の複合体リッチ培地ＹＰＤで増殖させ、次の形質転換ミックスと共に調製する：２５０μＬの５０％ＰＥＧ、５ｍｇ／ｍＬで１０μＬの「キャリア」ＤＮＡ、３６μＬの１Ｍ酢酸リチウム、１０μＬ（３μｇの以下の組合せ：ｐＦＰＰ４５＋ｐＦＰＰ５６＋ｐＦＰＰ２０またはｐＬ４＋ｐＦＰＰ５６＋ｐＦＰＰ２０またはｐＬ５＋ｐＦＬ３６＋ｐＣＭ１８５）および３５０μＬの水。
【０１３５】
再懸濁した細胞（５０μＬ）を形質転換混合物に加え、水浴で４２℃にて４０分間インキュベートする。インキュベーション後、チューブを室温にて５，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清を廃棄した。細胞を、選択マーカーに適した市販の培地ＣＳＭ（ＭＰ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を補充した２ｍＬのＹＮＢ（硫酸アンモニウム１を補充したニトロゲンベースを含まない酵母、グルコース）に再懸濁し、１４ｍＬのチューブに移し、３０℃で２時間インキュベートする。最終ミックスを、２０ｇ／Ｌのグルコースおよび２μｇ／ｍｌのドキシサイクリンでのＹＮＢ＋硫酸アンモニウム＋ＣＳＭ−ＬＵＷ（ロイシン、ウラシル、トリプトファン）に広げる。
【０１３６】
得られた株は、以下のものである：
ＥＱ−０５２３（ＣＥＮ．ＰＫ１６０５  Δｔａｌ１：：ｋａｎ  Δｎｑｍ１：：ｈｐｈ）  （ｐＦＰＰ４５＋ｐＦＰＰ５６＋ｐＦＰＰ２０）
ＥＱ−０５２４（ＣＥＮ．ＰＫ１６０５  Δｔａｌ１：：ｋａｎ  Δｎｑｍ１：：ｈｐｈ）  （ｐＬ４＋ｐＦＰＰ５６＋ｐＦＰＰ２０）
ＥＱ−０５２５（ＣＥＮ．ＰＫ１６０５）（ｐＬ５＋ｐＦＬ３６＋ｐＣＭ１８５）
【０１３７】
株ＥＱ−０５２３（ＰＲＫ／ＲｕＢｉｓＣＯ／Δｔａｌ１：：ｋａｎΔｎｑｍ１：：ｈｐｈ）、ＥＱ−０５２４（ＰＲＫ／ＲｕＢｉｓＣＯ／Δｔａｌ１：：ｋａｎ  Δｎｑｍ１：：ｈｐｈ＋ファルネセンシンターゼ）およびＥＱ−０５２５（ファルネセンシンターゼ）を、２０ｇ／Ｌグルコースおよび１０％ＣＯ２を含む液体培地ＹＮＢで増殖させる。
【０１３８】
エルレンマイヤーフラスコでのバッチ式培養を、適切な培地と１０％外因性ＣＯ２供給により、振盪インキュベーター（１２０ｒｐｍ、３０℃）で、ＥＯＮ分光光度計（ＢｉｏＴｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して測定した０．０５ＯＤ６００ｎｍで接種して行う。目的株は、ＰＲＫ発現が誘発されない条件下で、２０ｇ／Ｌのグルコースおよび１０％外因性ＣＯ２供給を含むＹＮＢ＋ＣＳＭ−ＬＵＷ培地で増殖させる。
【０１３９】
有意な増殖開始が観察された後、ＣＳＭ−ＬＵＷに含まれるアミノ酸とニトロゲンベースを含まない最小無機培地、すなわち、２０ｇ／Ｌのグルコースおよび外因性ＣＯ２供給を含むＹＮＢのみに株を適合させる。
【０１４０】
ｃ）エルレンマイヤーフラスコでのファルネセンの産生
ペントースリン酸経路の非酸化分岐がＴＡＬ１遺伝子およびＮＱＭ１遺伝子の阻害によって阻害されているサッカロミセス・セレビシエ株ＥＱ−０５２４を、外因性ＰＲＫとＲｕＢｉｓＣＯを使用してＣＯ２損失なしでＮＡＤＰＨを過剰産生することによりファルネセンを産生するために増殖させる。この目的株を、ＴＡＬ１およびＮＱＭ１の欠失または外因性ＰＲＫとＲｕＢｉｓＣＯの添加なしで、異種ファルネセンシンターゼの添加後にファルネセンを産生する参照株ＥＱ−０５２５と比較する。エルレンマイヤーフラスコでのバッチ式培養は、上記の条件下で行う。
【０１４１】
ファルネセン濃度は、発酵マストの上清から定量化する。簡単に言えば、細胞懸濁液を５０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。ドデカン相をヘキサンで１０倍希釈し、Ｔｉｐｐｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．２０１６；１１３１：７２−８１）に記載されているプロトコルに従った分析のためにＧＣ−ＭＳに注入する。
【０１４２】
株ＥＱ−０２５３と比較して、ＥＱ−０２５３株では、消費されたグルコース１グラム当たりのファルネセンのグラム数で、産生収率が３％増加した。
【０１４３】
例３：大腸菌でのグルタミン酸産生の改善
α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の欠失が、グルタミン酸産生を増加させる（Ｕｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１０  Ｍａｙ  ３；１４７（１）：１７−３０．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｂｉｏｔｅｃ．２０１０．０２．０１８）ことは既に記載した。したがって、以下に記載される実験は、ｓｕｃＡ遺伝子が欠失された大腸菌Ｋ１２株ＭＧ１６５５で行った。この株は、大腸菌の遺伝子欠失バンク（Ｂａｂａ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｓｙｓｔ  Ｂｉｏｌ．２００６；２：２００６．０００８）に由来し、Ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  ＣｅｎｔｅｒからＪＷ０７１５−２という名称で、参照番号８７８６（ＪＷ０７１５−２：ＭＧ１６５５  ΔｓｕｃＡ：：Ｋａｎ）で提供される。
【０１４４】
ａ）Ｆｌｐ組換えによるＦＴＲ領域の特異的組換えによる選択カセットの除去
上記の株ＪＷ０７１５−２の構築に使用したものと同じ欠失ストラテジーを再利用できるようにするため、リコンビナーゼを使用して選択カセットを除去する必要があった。
【０１４５】
プラスミドｐ７０７−Ｆｌｐｅ（Ｇｅｎｅ  ＢｒｉｄｇｅｓのＱｕｉｃｋ  ＆  Ｅａｓｙ  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  Ｒｅｄ（登録商標）／ＥＴ（登録商標）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｋｉｔに付属）を、キットプロトコルに従ってエレクトロポレートする。０．２％グルコース、０．０００３％テトラサイクリンを補充し、０．３％Ｌ−アラビノースを添加したＬＢ寒天上で細胞を選択する。得られたクローンの対抗選択を、それらが０．００１５％カナマイシンを補充した同じ培地でもはや増殖することができないことを検証することによって行う。
【０１４６】
得られた株はＥＱ．ＥＣ００２：ＭＧ１６５５  ΔｓｕｃＡと呼ぶ。
【０１４７】
ｂ）Ｅｎｔｎｅｒ−Ｄｏｕｄｏｒｏｆｆ代謝経路をコードするｅｄｄ−ｅｄａオペロンの欠失
ｅｄｄ−ｅｄａオペロンの欠失は、相同組換えと、サプライヤーのプロトコルに従ってＱｕｉｃｋ  ＆  Ｅａｓｙ  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  Ｒｅｄ（登録商標）／ＥＴ（登録商標）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｇｅｎｅ  Ｂｒｉｄｇｅｓ）を使用することによって実施する。
１．ＦＲＴ−ＰＫＧ−ｇｂ２−ｎｅｏ−ＦＲＴ耐性遺伝子発現カセットを増幅するように設計され、染色体上の欠失遺伝子座の隣接領域（位置１９３２０６５−１９３２１１５および１９３４６０４−１９３４６５４）に５０ヌクレオチド以上で相同な５′配列を有し、それによりオペロン全体の両側の細菌ゲノム上にカセットの組換えアームを生成するオリゴヌクレオチド。
２．大腸菌Ｋ−１２株ＥＱ．ＥＣ００２は、キットプロトコルに従ってプラスミドｐＲｅｄＥＴを用いたエレクトロポレーションにより形質転換する。得られたコロニーは、０．２％グルコース、０．０００３％テトラサイクリンを含むリッチ複合培地ＬＢ寒天上で選択する。
３．液体ＬＢ中０．３％アラビノースによって１時間誘発されたＲｅｄＥＴリコンビナーゼの存在下に第１の工程で得られたアンプリコンの形質転換。そのために、欠失カセットによるＲｅｄＥＴを発現する細胞の２回目のエレクトロポレーションを実施し、０．２％グルコース、０．０００３％テトラサイクリンを補充し、０．３％Ｌ−アラビノースおよび０．００１５％カナマイシンを添加したＬＢ寒天上でコロニーを選択する。
４．プラスミドｐ７０７−Ｆｌｐｅ（Ｇｅｎｅ  ＢｒｉｄｇｅｓのＱｕｉｃｋ  ＆  Ｅａｓｙ  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  Ｒｅｄ（登録商標）／ＥＴ（登録商標）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｋｉｔに付属）を、キットプロトコルに従ってエレクトロポレーションにより形質転換する。０．２％グルコース、０．０００３％テトラサイクリンを補充し、０．３％Ｌ−アラビノースを添加したＬＢ寒天上で細胞を選択する。得られたクローンの対抗選択を、それらが０．００１５％カナマイシンを補充した同じ培地でもはや増殖することができないことを検証することによって行う。
５．得られた株はＥＱ．ＥＣ００３：ＭＧ１６５５  ΔｓｕｃＡ  Δｅｄｄ−ｅｄａと呼ぶ。
【０１４８】
ｃ）ｔａｌＡ遺伝子の欠失
ｔａｌＡ遺伝子の欠失は、相同組換えと、サプライヤーのプロトコルに従ってＱｕｉｃｋ  ＆  Ｅａｓｙ  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  Ｒｅｄ（登録商標）／ＥＴ（登録商標）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｇｅｎｅ  Ｂｒｉｄｇｅｓ）を使用することによって実施する。
１．ＦＲＴ−ＰＫＧ−ｇｂ２−ｎｅｏ−ＦＲＴ耐性遺伝子発現カセットを増幅するように設計され、欠失遺伝子座の隣接領域、すなわち遺伝子（ｔａｌＡ）（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：９４７００６）のコーティングフェーズに５０超ヌクレオチドの相同な５′配列を有し、それにより細菌ゲノム上にカセットの組換えアームを生成するオリゴヌクレオチド。
２．大腸菌Ｋ−１２株ＥＱ．ＥＣ００３は、キットプロトコルに従ってプラスミドｐＲｅｄＥＴを用いたエレクトロポレーションにより形質転換する。得られたコロニーは、０．２％グルコース、０．０００３％テトラサイクリンを含むリッチ複合培地ＬＢ寒天上で選択する。
３．液体ＬＢ中０．３％アラビノースによって１時間誘発されたＲｅｄＥＴリコンビナーゼの存在下に第１の工程で得られたアンプリコンの形質転換。そのために、欠失カセットによるＲｅｄＥＴを発現する細胞の２回目のエレクトロポレーションを実施し、０．２％グリセロールおよび０．３％ピルビン酸、０．０００３％テトラサイクリンを補充し、０．３％Ｌ−アラビノースおよび０．００１５％カナマイシンを添加したＬＢ寒天上でコロニーを選択する。
【０１４９】
欠失は、ジェノタイピングとシーケンシングによって検証し、得られた株の名称は
・  ＥＱ．ＥＣ００２：ＭＧ１６５５  ΔｓｕｃＡ
・  ＥＱ．ＥＣ００３：ＭＧ１６５５  ΔｓｕｃＡ  Δｅｄｄ−ｅｄａ
・  ＥＱ．ＥＣ０２０：ＭＧ１６５５  ΔｓｕｃＡ  Δｅｄｄ−ｅｄｄａ  ΔｔａｌＡ：：ｋａｎ
である。
【０１５０】
ｄ）ＣＯ２固定のためのＰＲＫ／ＲｕＢｉｓＣＯエンジニアリングの挿入
大腸菌でのＩ型ＲｕＢｉｓＣＯの異なる成分の組換え発現のために、以下の表に記載される遺伝子を、以下の表に記載される遺伝子を含む合成オペロンとしてクローニングする。
【０１５１】
これらの遺伝子の発現レベルを制御するために、以下の表に示されるリボソーム結合配列（ＲＢＳ）を、Ｚｅｌｃｂｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（Ｚｅｌｃｂｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１３  Ｍａｙ；４１（９）：ｅ９８；  Ｌｅｖｉｎ−Ｋａｒｐ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  Ｓｙｎｔｈ  Ｂｉｏｌ．２０１３  Ｊｕｎ  ２１；２（６）：３２７−３６．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｓｂ４００００２ｎ）に記載される可変転写効率で各遺伝子のコーディングフェーズの間に挿入する。ＲＢＳ配列が散在する連続した各コーディングフェーズを、ＰＬｔｅｔＯ−１プロモーター、ｐ１５Ａ複製起点およびアンピシリン耐性遺伝子を含むｐＺＡ１１ベクター（Ｅｘｐｒｅｓｓｙｓ）への連続挿入によって構築する。
【０１５２】
【表１０】
2020506722.tif 000011
【０１５３】
【表１１】
2020506722.tif 000012
【０１５４】
【表１２】
2020506722.tif 000013
【０１５５】
上記の計画に従って示された異なるベクターをエレクトロポレーションすることによって、いくつかの株を産生する。
ＥＱ．ＥＣ０２０→（ＥＱ．ＥＣ００３＋ｐＺＡ１１）：ＭＧ１６５５  ΔｓｕｃＡ  Δｅｄｄ−ｅｄａ
ＥＱ．ＥＣ０２１→（ＥＱ．ＥＣ００４＋ｐＥＱＥＣ００５）：ＭＧ１６５５  ΔｓｕｃＡ  Δｅｄｄ−ｅｄａ−ｔａｌＡ：：ｋａｎ（ＲｕＢｉｓＣＯ）
ＥＱ．ＥＣ０２２→（ＥＱ．ＥＣ００４＋ｐＥＱＥＣ００６）：ＭＧ１６５５  ΔｓｕｃＡ  Δｅｄｄ−ｅｄａｔａｌＡ：：ｋａｎ（ＲｕＢｉｓＣＯ＋ＰＲＫ）
ＥＱ．ＥＣ０２４→（ＥＱ．ＥＣ００３＋ｐＥＱＥＣ００８）：ＭＧ１６５５  ΔｓｕｃＡ  Δｅｄｄ−ｅｄａ  ΔｔａｌＡ：：ｋａｎ（ＰＲＫ）
【０１５６】
１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを補充したＬＢ培地でクローンを選択する。十分な量のバイオマスを得た後、ＰＲＫ／ＲｕＢｉｓＣＯエンジニアリングの使用に株を適合させるために、最小２５０ｍＬのエルレンマイヤーフラスコで５０ｍＬ以上の容量の培養物を接種する。この適合は、２ｇ／Ｌのグルコース、上記のように３７℃で１気圧の外因性ＣＯ２供給を含むＬＢ培地で行う。
【０１５７】
ｅ）グルタミン酸産生
グルタミン酸産生のために、５００ｍＬのＬＢ培養からの細胞を、２０ｍＬのＭＳ培地（４０ｇ／Ｌのグルコース、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２０ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１０ｍｇ／ＬのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１０ｍｇ／ＬのＭｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２ｇ／Ｌの酵母エキス、３０ｇ／ＬのＣａＣＯ３、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリン）にＣＯ２雰囲気下０．１の圧力で接種する。
【０１５８】
残留するグルタミン酸とグルコースは、バイオアナライザー（サクラ精機）で測定する。炭素収率Ｙｐ／ｓは、消費されたグルコース１グラム当たりに産生されるグルタミン酸のグラム数で計算する。この収率は、対照株ＥＱ．ＥＣ０２０（空）、ＥＱ．ＥＣ０２１（ＲｕＢｉｓＣＯのみ）と比較して、株ＥＱ．ＥＣ０２２（ＲｕＢｉｓＣＯ＋ＰＲＫ）については８％大幅に増加する。対照株ＥＱ．ＥＣ０２４（ＰＲＫのみ）は生育不能である。
【０１５９】
例４：カプリアビダス・ネカトールでのＰＨＢ産生の改善
ａ）ペントースリン酸経路の非酸化分岐の阻害
還元力の増加はまた、既存の代謝経路を大幅に改善する。これは、ポリヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）を自然に産生する細菌株ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）ＡＴＣＣ  １７６９９（カプリアビダス・ネカトール）の場合に当てはまる。この細菌は、独立栄養条件と従属栄養条件の両方の条件下で成長することができる。
【０１６０】
本発明によるｔａｌ遺伝子（トランスアルドラーゼＭＦ＿００４９２）の欠失により、ＮＡＤＰＨ還元ヌクレオチドのプールを増加させることによって、代謝フラックスを酸化的ペントースリン酸経路に集結させることが可能になり、これによりＰＨＢ産生収率が増加するが、解糖経路の使用も可能になる。
【０１６１】
このカプリアビダス・ネカトール株（ラルストニア・ユートロファＨ１６）は、メガプラスミドｐＨＧ１と２つの染色体を有する。ｔａｌ遺伝子の欠失は、Ｑｕａｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．およびＬｉｎｄｅｎｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．（Ｑｕａｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ．  １９９３  Ｍａｙ  １５；１２７（１）：１５−２１；Ｌｉｎｄｅｎｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１０  Ａｕｇ；７６（１６）：５３７３−８２；Ｌｉｎｄｅｎｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１２  Ａｕｇ；７８（１５）：５３７５−８３）に記載されているように、グラム陰性菌のＳａｃＡ自殺遺伝子を含むベクターを生成することによって達成される。
【０１６２】
ｔａｌ遺伝子の隣接領域に対応する２つのＰＣＲアンプリコンは、Ｌｉｎｄｅｎｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｐｐｌ  Ａｂｏｕｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１２  Ａｕｇ；７８（１５）：５３７５−８３）に記載されている手順に従った制限により、プラスミドｐＪＱ２００ｍｐ１８Ｔｃでクローニングする。次いで、改変されたプラスミドｐｊＱ２００ｍｐ１８Ｔｃ：：Δｔａｌを、塩化カルシウム形質転換法によって大腸菌株Ｓ１７−１に形質転換する。遺伝物質の移入は、Ｓ１７−１細菌の細胞単層を含む皿で寒天上にラルストニア・ユートロファ培養物をスポットすることによる接合によって行い、選択目的で１０％スクロースの存在下に３０℃の栄養ブイヨン（ＮＴ）培地で選択を行い（Ｈｏｇｒｅｆｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １９８４  Ａｐｒ；１５８（１）：４３−８）、２５μｇ／ｍＬのテトラサイクリンを含む無機培地で検証する。
【０１６３】
欠失は、ジェノタイピングとシーケンシングによって検証する。したがって、結果として得られる株ＥＱＣＮ＿００２には、ｔａｌ遺伝子ＥＱＣＮ＿０１０：Ｈ１６  Δｔａｌが欠失している。
【０１６４】
ｂ）Ｅｎｔｎｅｒ−Ｄｏｕｄｏｒｏｆｆ代謝経路の不活性化
ｅｄｄおよびｅｄａ遺伝子の隣接領域（ｅｄｄの上流およびｅｄａの下流）に対応する２つのＰＣＲアンプリコンを、Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００２  Ｄｅｃ；６８（１２）：５９２５−３２）に記載されている手順に従った制限により、プラスミドｐＪＱ２００ｍｐ１８Ｃｍでクローニングする。
【０１６５】
次いで、改変されたプラスミドｐＪＱ２００ｍｐ１８Ｃｍ：：Δｅｄｄ−ｅｄａを、塩化カルシウム形質転換法によって大腸菌株Ｓ１７−１に形質転換する。遺伝物質の移入は、Ｓ１７−１細菌の細胞単層を含む皿で寒天上にラルストニア・ユートロファＥＱＣＮ＿０１０培養物をスポットすることによる接合によって行い、選択目的で１０％スクロースの存在下に３０℃の栄養ブイヨン（ＮＴ）培地で選択を行い（Ｈｏｇｒｅｆｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １９８４  Ａｐｒ；１５８（１）：４３−８）、５０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含む無機培地で検証する。
【０１６６】
欠失は、ジェノタイピングとシーケンシングによって検証する。したがって、結果として得られる株ＥＱＣＮ＿００３には、ｔａｌ遺伝子ＥＱＣＮ＿０１１：Ｈ１６  Δｔａｌ  Δｅｄｄ−ｅｄａが欠失している。
【０１６７】
ｃ）バイオリアクターでのＰＨＢの産生
凍結ストックからの接種物を、グルコースの存在下に３０℃で４８〜９６時間インキュベートしたクライオチューブから５０〜１００μＬの割合で固体培地に広げる。ＲｕＢｉｓＣＯおよびＰＲＫをコードする遺伝子の発現は、従属栄養好気性条件下にカプリアビダス・ネカトールで維持される（Ｒｉｅ  Ｓｈｉｍｉｚｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．２０１５；５：  １１６１７．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ２０１５  Ｊｕｌ  １．）。エルレンマイヤーフラスコでのバッチ式培養（５０ｍＬで１０ｍＬ、次いで２５０ｍＬで５０ｍＬ）を、２０ｇ／Ｌグルコースの適切な培地と１０％外因性ＣＯ２供給により、振盪インキュベーター（１００〜２００ｒｐｍ、３０℃）で、０．０１ＯＤ６２０ｎｍの最小接種量により行う。
【０１６８】
ＰＨＢ産生収率を改善する目的株ＥＱＣＮ＿０１１を、栄養制限が存在する従属栄養条件下でＰＨＢを自然に蓄積する参照株Ｈ１６と比較する。
【０１６９】
株の産生性はバイオリアクターで比較する。バイオリアクターで行われる培養に、上記の条件下で固体および／または液体増幅鎖からエルレンマイヤーフラスコに播種する。Ｍｙ−ｃｏｎｔｒｏｌ型（Ａｐｐｌｉｋｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，デルフト、オランダ国）７５０ｍＬまたはＢｉｏｓｔａｔ  Ｂ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ、ゲッティンゲン、ドイツ国）２．５Ｌのバイオリアクターを、０．０１ＯＤ６２０ｎｍに相当する最小濃度で播種する。
【０１７０】
ＰＨＢの蓄積は増殖から切り離す。培養は３０℃で調整し、通気量は、最小溶存酸素濃度を２０％（３０℃、１ｂａｒ）より高く維持するために０．１ＶＶＭ（気体体積／液体体積／分）〜１ＶＶＭの間で維持する。振盪は、使用されるバイオリアクターの規模に応じて適合させる。入口ガス流は、任意にＣＯ２を補充した空気から成る。ＣＯ２補充は１％〜１０％である。１４％または７％アンモニア溶液を加えてｐＨを７に調節する。流加培養法では、一定の炭素／リンまたは炭素／ニトロゲン比を維持しながら、リンまたはニトロゲンの制限と組み合わせた非限定的な炭素基質の供給が可能である。
【０１７１】
ＰＨＢ抽出および定量化は、Ｂｒａｎｄｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９８８  Ａｕｇ；５４（８）：１９７７−８２）の方法に従って実施する。
【０１７２】
プロトコルは、１ｍＬのクロロホルムを１０ｍｇの凍結乾燥細胞に加え、続いて８５０μＬのメタノールと１５０μＬの硫酸を加えることから成る。混合物を１００℃で２．５時間加熱し、冷却し、５００μＬの水を加える。遠心分離によって２つの相を分離し、硫酸ナトリウムを加えて有機相を乾燥させる。
【０１７３】
サンプルをろ過し、Ｍｕｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１３  Ｊｕｌ；７９（１４）：４４３３−９）によって記載されているように分析する。野生型カプリアビダス・ネカトールＨ１６と株ＥＱＣＮ＿０１１：Ｈ１６  Δｔａｌ  Δｅｄｄ−ｅｄａのそれぞれの培養の比較により、本発明による改変株に有利にＰＨＢの産生収率（消費されたグルコース１グラム当たりのＰＨＢのグラム数）が２％増加することが示される。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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