(57)【要約】本発明は、癌細胞でのIR媒体細胞捕食を促進するための、表１および２に示した化合物およびその類似体の使用に関する。該化合物は、本明細書で「IR媒体細胞捕食の促進剤」と称する。該化合物は、放射線療法を受けるであろうまたは放射線療法を受けた対象において腫瘍免疫原性を促進し、および/または有意の防御的抗癌免疫応答を誘導するのに用いることができる。換言すると、該化合物は、放射線療法を必要とする対象において該療法を強化するのに用いることができる。該化合物は、好ましくは、メブヒロリン1,5-ナフタレンジスルホン酸塩、フルルビプロフェン、ミナプリン二塩酸塩、ミリセチン、ジゴキシン、ジギトキシン、ラナトシド、LOPA87、VP331、RN-1-026、SG6163F、VP450およびVP43よりなる群から選ばれる。
2020505039.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における放射線療法治療を強化することのできる化合物を同定するインビトロ方法であって、該方法は下記工程：
(a)候補化合物を腫瘍細胞培養物に加え、
(b)該腫瘍細胞培養物を1〜20グレイの線量で処置し、
(c)該細胞培養物で起きた放射線照射媒体細胞捕食を測定する
を含み、
ここで、対照レベルと比較して放射線照射媒体細胞捕食を促進する化合物は放射線療法治療を強化することができる、方法。
【請求項２】
癌細胞におけるIR-媒体細胞捕食を促進するための、表１および２に示す化合物およびその類似体のインビトロ使用。
【請求項３】
癌を罹患する患者におけるIR-媒体細胞捕食の促進剤として使用するための表１および２に開示されている化合物またはその類似体または該化合物または類似体を含む医薬組成物。
【請求項４】
放射線療法治療を受けるまたは受けた対象における腫瘍免疫原性を促進するために使用するためのIR-媒体細胞捕食の促進剤。
【請求項５】
放射線療法治療を受けるまたは受けた対象における有意な防御的抗癌免疫応答を誘発するのに使用するためのIR-媒体細胞捕食の促進剤。
【請求項６】
それを必要とする対象における放射線療法治療を強化するのに使用するためのIR-媒体細胞捕食の促進剤。
【請求項７】
それを必要とする対象において放射線療法と組み合わせて癌を治療するのに使用するためのIR-媒体細胞捕食の促進剤。
【請求項８】
表１および２に開示されている化合物またはその類似体であり、好ましくは、メブヒロリン1,5-ナフタレンジスルホン酸塩、フルルビプロフェン、ミナプリン二塩酸塩、ミリセチン、ジゴキシン、ジギトキシン、ラナトシド、LOPA87、VP331、RN-1-026、SG6163F、VP450およびVP43よりなる群から選ばれる、請求項４〜７に記載の促進剤。
【請求項９】
ミナプリン二塩酸塩、LOPA87、VP331およびSG6163Fよりなる群から選ばれる、請求項４〜７に記載の促進剤。
【請求項１０】
該対象または患者が、脳癌（例えば、神経膠腫）、胃癌、頭頸部癌、膵臓癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、前立腺癌、結腸癌、非ホジキンリンパ腫、肉腫、精巣癌、急性非リンパ球性白血病または乳癌に罹患している、請求項４〜９に記載の促進剤。
【請求項１１】
放射線療法治療の前に、好ましくは放射線療法治療の24時間前に投与する、請求項４〜１０に記載の促進剤。
【請求項１２】
放射線療法治療の後に投与する、請求項４〜１０に記載の促進剤。
【請求項１３】
放射線療法治療と同時に投与する、請求項４〜１０に記載の促進剤。
【請求項１４】
それを必要とする対象において癌を予防または治療するのに使用するためのミナプリン二塩酸塩。
【請求項１５】
放射線療法治療と組み合わせて癌を治療するのに使用するための、請求項１４に記載のミナプリン二塩酸塩。
【請求項１６】
該対象が、脳癌（例えば、神経膠腫）、胃癌、頭頸部癌、膵臓癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、前立腺癌、結腸癌、非ホジキンリンパ腫、肉腫、精巣癌、急性非リンパ球性白血病または乳癌に罹患している、請求項１４または１５に記載のミナプリン二塩酸塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌細胞でのIR媒体細胞捕食（IR-mediated cellular cannibalism）を促進するための、表１および２に示した化合物およびその類似体の使用に関する。該化合物は、本明細書で「IR媒体細胞捕食の促進剤」と称する。該化合物は、放射線療法を受けるであろうまたは放射線療法を受けた対象において腫瘍免疫原性を促進し、および/または有意の防御的抗癌免疫応答を誘導するのに用いることができる。換言すると、該化合物は、放射線療法を必要とする対象において該療法を強化する（potentiate）のに用いることができる。該化合物は、好ましくは、メブヒロリン1,5-ナフタレンジスルホン酸塩（Mebhydroline 1,5-napthalene disulfonate salt）、フルルビプロフェン（Flurbiprofen）、ミナプリン二塩酸塩（Minaprine dihydrochloride）、ミリセチン（Myricetin）、ジゴキシン、ジギトキシン、ラナトシド（Lanatoside）、LOPA87、VP331、RN-1-026、SG6163F、VP450およびVP43よりなる群から選ばれる。
【背景技術】
【０００２】
放射線療法は癌治療に用いられる最も一般的な抗癌戦略である。癌患者の半数以上が放射線療法で治療されている。放射線療法の使用（単独または外科手術および化学療法と組み合わせて）は、頭頸部癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、消化器癌および子宮頸癌の管理の中核である[1]。電離放射線（ionizing radiation; IR）への腫瘍組織の暴露は、アポトーシス、自食作用性細胞死（autophagic cell death）、有糸分裂破局（mitotic catastrophe）または老化などの様々な致死プロセスの引き金となる。これらメカニズムは、放射線照射された組織中の癌細胞の破壊に貢献するが、放射線照射された腫瘍細胞の免疫原性をも誘発し得[2,3]、腫瘍のマクロ環境を修飾し危険なシグナル（アデノシン三リン酸およびHMGB1タンパク質）の放出[4,5]、プリン受容体（とりわけ、P2X7およびP2Y2）[4]、TLR4受容体[2,3]およびNLRP3インフラマソーム[4]の活性化を含む抗腫瘍免疫応答を展開し得る。局所腫瘍応答と免疫系の刺激との関係は、放射線照射された癌細胞への遠隔効果を記載することによって説明される。この逆説的な効果（遠達効果（abscopal effect）としても知られる）は、異なるマウス腫瘍モデル並びに患者で多年にわたって研究されてきた[6-9]。その検出は多量の炎症性サイトカイン（TNFアルファなど）の存在、T細胞を産生するインターフェロン（IFN）ガンマの存在と正の相関があり、観察すべき有効な免疫応答の開発が必要である[10,11]。この効果はまた、免疫修飾剤（イピリムマブ（Ipilimumab）やインターロイキン-2）と組み合わせて放射線療法で治療された患者においても観察される[12]。遠達効果の記載は、放射線療法への応答に対する免疫系の多くの成員の主たる貢献に関する多くの動物モデルでの最近の記載を強固にする。免疫細胞（腫瘍関連マクロファージ、T細胞および樹状細胞を含む）の中心的役割が最近研究されており、免疫チェックポイントのモヂュレーター（CTLA4またはPD1に対するモノクローナル抗体の使用など）または（CSF1Rに対するモノクローナル抗体での）マクロファージ活性化による免疫細胞の治療的変調（therapeutic modulation）の影響によって強調されている。抗腫瘍治療での放射線療法の中心的役割にも拘らず、腫瘍細胞の除去に関与する生物学的プロセスは依然として部分的にしか解明されておらず、論争が多い。放射線により誘導された腫瘍細胞死に関する初期の研究は割合に古く、新しい細胞死プロセスや放射後の腫瘍細胞の除去における免疫系の中心的役割の発見よりも前のものである。
【０００３】
近年の科学技術の発達は、細胞死の幾つかのプロセスの存在を明らかにした。主として形態学的および機能的基準に基づく細胞死の様式の分類が提案されており[13]、致死プロセスを３つの異なる型に細分している：I型細胞死（アポトーシスとしても知られる）、II型細胞死（またはオートファジー）およびIII型細胞死（ネクローシス）。最初は、I型とIII型の細胞死の様式の間での、制御されたものと事故誘発されたものとの間での明らかな区別に基づいて、またはインビボでのバイスタンダー（by-stander）炎症応答の誘発と関係する細胞死をサイレントな（silent）または免疫寛容原性の細胞死と区別することにより体系づけていたが、II型細胞死を依然としてオートファジー（これは主として細胞ホメオスタシスの維持に必要な細胞内生存メカニズムである）と誤称しているこの分類は、最近のネクロプトーシスの分子的特徴づけによって明らかになったように、遺伝的に制御されるまたは免疫原性であるネクローシスの才能を反映していなかった[14,15]。加えて、これらの紋切り型の形態学的、代謝的および生化学的修飾を明らかにしないか部分的に明らかにした細胞死サブルーチン（分裂死や角質化（cornification）など）は殆ど研究されておらず、よく定められていない細胞死の下位群（非典型細胞死の下位群としても知られる）にグループ分けされていた[13]。
【０００４】
近年、幾つかの新たな細胞死の様式（エントーシス（entosis）やエンペリトーシス（emperitosis）など）が記載されており、この無視されてきた細胞死の様式の下位群と関係付けられている[16,17]。これら非典型細胞死の様式の特徴づけは、細胞自律的な仕方では（in a cell autonomous manner）典型細胞死の様式のようには達成されないが、隣接する細胞による生きた細胞の貪食（engulfment）の後で引き出される細胞死プロセスの存在を強調した。何十年もの間、非細胞自立性細胞死（non-cell autonomous deaths (NCADs)）が偶発的に観察され研究されてきた。最初、ファゴプトーシス（phagoptosis）[18,19]またはエンペリポレシス（emperipolesis）[20]と呼ばれていたが、これらプロセスは赤血球、好中球、血小板またはT細胞のホメオスタシスの制御に関与しており[18],[21],[22]、それゆえ生体における細胞死の主たる生理形態であると提唱されている[18]。セルインセル構造（cell-in-cell structures）として検出されるNCADsはまた、初代細胞のエクスビボ培養に際して[23]、または生理プロセス（胚移植[24]および自己反応性T細胞の肝内枯渇（intrahepatic depletion）[25]など）の組織学的分析に際して、またはヒト疾患（癌[23]、炎症性症候群（inflammatory syndromes）[23]、感染性疾患[26,27]を含む）においても観察されている。NCADsはヒト腫瘍（乳癌、子宮頸癌、結腸癌または黒色腫を含む）での悪性細胞間の同型相互反応（homotypic interactions）の後で主として検出されるが、腫瘍細胞と間質細胞[28]、腫瘍細胞と免疫エフェクター（リンパ球[29]およびNK細胞[30]など）の間の異型相互反応（heterotypic interactions）の後でも検出され、免疫エフェクターと上皮細胞の間の相互反応の後でも観察される（胸腺ナース細胞でのT細胞の破壊[31]または肝臓での自己反応性T細胞の破壊[25]によって示されるように）。最近、NCADはまた感染性疾患と関係していた。非感染細胞によるヒト免疫不全ウイルス１(HIV-1)またはエプスタインバーウイルス(EBV)感染細胞の貪食がインビトロ共生培養で観察されており、内在化された感染細胞の分解が、感染細胞と宿主細胞間の新たな細胞間モードの（cell-to-cell mode）ウイルス感染の第一ステップとして提唱されており[26,27]、微生物病因に寄与するNCADsの能力が強調されている。
【０００５】
非細胞自立性細胞死プログラムの第一ステップは、膜接着受容体（E-またはP-カドヘリンなど）またはストレス受容体（リポタンパク質受容体関連タンパク質など）を介した２つの細胞パートナーの相互反応で始まり、両方の相互反応細胞上のシグナル伝達経路を活性化し、低分子量GTPアーゼ（Rho[32]およびCdc42[33]など）およびROCKキナーゼ[16]が関与する、相互反応細胞間での接着接合の形成がそれに続く。ついで、「標的」細胞のレベルでの（on the level of）アクトミオシン収縮の調節およびアクチン細胞骨格の再構成が、宿主細胞へのその侵入に有利であることが示された[32,34]。このプロセスは細胞捕食とは区別されるものであり、細胞捕食は、宿主細胞での特定のシグナル伝達経路（細胞骨格リモデリング細胞分裂サイクル42(CDC42)、ケモカイン(C-X-Cモチーフ)リガンド1(CXCL1)またはケモカイン(C-X-Cモチーフ)リガンド6(CXCL6)が関与する食作用関連シグナル伝達経路など）の活性化によりNCADsを引き起こすことができ、標的細胞の活性な貪食に導くものである[33]。内在化されたら、貪食された細胞は「宿主」のリソゾーム酵素（カテプシンおよびグランザイムなど）の標的となり、典型細胞死のいくつかのモデュレイター（チトクロームc、カスパーゼまたはオートファジー関連(ATG)タンパク質など）が関与する別個の致死メカニズムにより除去される。エントーシス、非細胞自立性細胞死は、最初、乳癌細胞間での同型相互反応の後に記載されたが、貪食された細胞を除去するためのカスパーゼの活性化を必要としないセルインセル侵入メカニズムである[16]。逆に、腫瘍細胞によるナチュラルキラー(NK)細胞の貪食はエンペリトーシス、カスパーゼ3活性化およびDNA断片化を必要とするプログラムされたセルインセル細胞死[30]を開始し、貪食された細胞はカスパーゼ依存的なプロセスまたはカスパーゼ独立のプロセスによって除去され得ることが明らかとなっている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
相当な努力にも拘らず、放射線療法の有効性を高めるべく過去１０年以上にもわたって開発されてきたアプローチは、所期の臨床的成功を収めていない。これまでのアプローチが失敗した理由のうち、これまで開発されてきた大抵のアプローチが、現在のプロジェクトとは異なる特性を有することを指摘することができる。さらに、これらのアプローチは、細胞死のメカニズムの特徴付けおよび療法に対する耐性に基づいた合理的なアプローチを用いては開発されてこなかった。とりわけ、これらのアプローチは腫瘍細胞の除去における免疫系の影響を考慮に入れることは決してなかった。最後に、これらのアプローチは放射線照射後の細胞死の特別のメカニズムを考慮に入れることなく、医療腫瘍学の分野に由来する応用を放射線療法に単に移し替えたにすぎない。
【０００７】
このようなことから、何が放射線療法後の細胞死のモデュレイターであるかを同定および特徴付けること、および癌患者にこれらモデュレイターを投与後にどのような免疫学的結果となるかを評価することの必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
抗癌治療に関連する細胞プロセスおよび生化学プロセスをより上手く特徴付けるべく行われてきた集約的な生物学的および薬学的研究にも拘らず、臨床において最も頻繁に用いられている抗癌治療の一つである放射線療法の治療効果の原因である致死メカニズムは依然としてわかっていない。電離放射線に応答して検出されてきた致死プロセス（アポトーシスおよび有糸分裂破局など）は治療の効率と直接には関係付けられておらず[35]、未だ知られていない細胞死の様式が放射線療法の治療効果に寄与しているかもしれないことが示唆されている。
【０００９】
本プロジェクトは、RIまたは他の抗癌治療の後に他のプロジェクトによっては検出されたことのない新たな細胞死メカニズム（細胞捕食）の発見に基づいている。通常、腫瘍ワクチン接種実験では、原形質膜の外葉（outer leaflet）上に癌細胞の70%がホスファチジルセリンを暴露するまで癌細胞は細胞障害性癌治療にインビトロで暴露された[48]。興味深いことに、本発明の結果は、IR媒体細胞捕食(IR-mediated cellular cannibalism;IRCCE)を促進する能力に基づいて選択した化合物が、抗腫瘍免疫応答を刺激するワクチンに癌細胞を変えることを明らかにしている。さらに詳細には、本発明の結果は初めて、IRCCE+IRの組合せが、治療し放射線照射した細胞の死の有意な上昇なしに、IR媒体抗腫瘍免疫応答を示すことを明らかにしており（図5A）、細胞捕食または細胞捕食関連シグナル伝達経路が放射線照射後の腫瘍免疫原性の誘発に寄与することが示唆されている。
【００１０】
放射線照射は癌の治療に一般的に用いられている。しばしば化学療法および/または外科手術と併用される放射線療法は、局所および全身投与並びに幾つかの新たな進歩（放射免疫療法を含む）を包含する。新生細胞への放射線照射の細胞障害作用は、放射線照射が細胞内部のDNA分子の一方または両方の鎖の切断を引き起こす能力によるものである。細胞周期の全ての相にある細胞もこの作用を受ける。しかしながら、DNA損傷は癌細胞においてより致死的であり得る、なぜなら癌細胞はDNA損傷を修復することがうまくできないからである。機能する細胞周期チェックポイントタンパク質および修復酵素を備えた健全な細胞は、はるかに放射線照射損傷を修復することができ、治療後も正常に機能することができる。そうであっても、放射線照射は患者の負担となる副作用をもたらす。放射線照射の副作用は化学療法の副作用と同様であって、同じ理由、すなわち、健全な組織の損傷から生じる。放射線照射は通常、化学療法よりも局所化されているが、この治療はなお以前健全であった組織への損傷を伴う。副作用の多くは不快なものであり、放射線照射もまた、それ自体で変異原性、発癌性および催奇形性であるという欠点を化学療法と共有する。正常な細胞は治療後2時間以内に治療から回復し始めるが、健全な細胞の遺伝子に突然変異が誘発され得る。これらリスクは、生殖系の組織などのある種の組織では上昇する。また、異なる人々が異なって放射線照射に対する耐性を示すことがわかっている。ある個体では新たな癌に導くことのない投与量が、実際、他の個体ではさらなる癌を引き起こす。これは細胞周期チェックポイントタンパク質または修復酵素に前もって突然変異が存在することによるものであるが、現在の実務ではどのような特定の投与量で特定の個人がリスクにあるかを予測することはできない。放射線照射の一般的な副作用には、膀胱刺激、疲労、下痢、低血球数、口腔刺激、味覚変化、食欲不振、脱毛症、皮膚刺激、肺機能の変化、腸炎、睡眠障害その他がある。
【００１１】
放射線照射との相乗効果を引き起こす増強剤を患者に提供することは非常に有利であり、それにより、患者が放射線療法にさらされることが少なくなる。このことは実際、改善された有利な結果を達成しながら、上記の副作用を減らすであろう。このことはまた、本発明の一つの側面である。
【００１２】
以上をまとめると、放射線照射した癌細胞に対する細胞捕食の強調すべき重要性および放射線照射への腫瘍応答における免疫応答のますますの重要性があるので、放射線照射した癌細胞を効率的に除去するために細胞捕食は癌治療の際に支持されるべき「望ましい」死である。このことは、下記実験部分で本発明者らが示すような細胞捕食促進剤を患者に投与することによって達成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】定量的イメージングフローサイトメトリーによる細胞死プロファイリングを示す図である。(A)定量的イメージングフローサイトメトリーによる細胞死プロファイリングの原理。(B)ガンマ線照射により誘発された定量的イメージングフローサイトメトリーによる細胞死の様式のマルチパラメトリックおよび同時検出の検証。共培養の前に、処理したHCT116細胞および非処理のHCT116細胞をそれぞれCMFDA(緑/薄い灰色)またはCMTMR(赤/濃い灰色)蛍光バイタルプローブで標識した。24時間共培養後、HCT116細胞を、非細胞自立性細胞死(NCAD)について(CMTMR-またはCMFDA-標識HCT116細胞の貪食を検出することにより)、ホスファチジルセリン(PS)暴露について(ビオチン-アネキシンVおよびBV786-ストレプトアビジンを用い)、血漿完全性(plasma integrity)の喪失について(DRAQ7取込みを追跡することにより)およびDNA含量について(Hoechst 33342を用いて)分析した。定量的フローサイトメトリーを用い、非処理および処理したHCT116細胞でのNCA細胞死および典型細胞死(I型、II型およびIII型)の同時検出は、癌治療後に得られる細胞死プロファイリングを決定するであろう。代表的なイメージを示す(スケール、20μm)。
【図２】定量的イメージングフローサイトメトリーによるガンマ線照射により誘発された細胞自立性細胞死の様式の検出を示す図である。(A-E)非処理の(赤/濃い灰色)CMTMR-標識HCT116細胞および非処理の(緑/薄い灰色)CMFDA-標識HCT116細胞(A, C-E)の24時間共培養後、臨時に（extemporally）混合した非処理の(赤/濃い灰色)CMTMR-標識HCT116細胞および非処理の(緑/薄い灰色)CMFDA-標識HCT116細胞(C-E)の24時間共培養後、または4グレイのγ電離放射線照射した非処理の(赤/濃い灰色)CMTM-標識HCT116細胞および(緑/薄い灰色)CMFDA-標識HCT116細胞(緑)(B-E)の24時間共培養後に観察した原形質膜完全性（plasma membrane integrity）の喪失およびPS暴露の検出および定量。共培養は、指定の薬理学的細胞死エフェクター阻害剤(pharmacological death effector inhibitors)の存在下または不在下で行った。原形質膜完全性の喪失(DRAQ7にて)およびPS暴露(BV786-ストレプトアビジン/アネキシンVビオチン)の検出を、非処理の(赤/濃い灰色)CMTMR+ HCT116細胞について、非処理の(緑/薄い灰色)CMFDA+ HCT116細胞について、処理した(緑/薄い灰色)CMFDA+HCT116細胞について、および全細胞集団(CMTMR+またはCMFDA+ HCT116細胞)について分析した。代表的なドットプロット(A,B)および定量データ(C-E)を示す(平均±SEM, n=3)。(F,G)非処理の(赤/濃い灰色)CMTMR-標識HCT116細胞および非処理の(緑/薄い灰色)CMFDA-標識HCT116細胞(F,H-J)の24時間共培養後、臨時に混合した非処理の(赤/濃い灰色)CMTMR-標識HCT116細胞および非処理の(緑/薄い灰色)CMFDA-標識HCT116細胞(H-J)の24時間共培養後、または4グレイのγ電離放射線照射した非処理の(赤/濃い灰色)CMTM-標識HCT116細胞および(緑/薄い灰色)CMFDA-標識HCT116細胞(緑/薄い灰色)(G-J)の24時間共培養後に得られた、非処理の(赤/濃い灰色)CMTMR+ HCT116細胞、非処理の(緑/薄い灰色)CMFDA+ HCT116細胞、処理した(緑/薄い灰色)CMFDA+HCT116細胞、および全細胞集団(CMTMR+またはCMFDA+ HCT116細胞)の代表的な細胞周期寄与を示す。細胞周期分析の定量データを(H-J)に示す(平均±SEM, n=3)。*または#または$はp<0.05を、##または$$はp<0.01を、***または###はp<0.001を示す。
【図３】定量的イメージングフローサイトメトリーおよび共焦点蛍光顕微鏡によるガンマ線照射により誘発された非細胞自立性細胞死の様式の検出を示す図である。(A-G)4グレイのγ電離放射線照射した非処理の(赤/濃い灰色)CMTM-標識HCT116細胞および(緑/薄い灰色)CMFDA-標識HCT116細胞(A)の24時間共培養後、非処理の(赤/濃い灰色)CMTMR-標識HCT116細胞および非処理の(緑/薄い灰色)CMFDA-標識HCT116細胞(B,C)の24時間共培養後、または臨時に混合したCMTMR-標識(赤/濃い灰色)HCT116細胞および非処理の(緑/薄い灰色)CMFDA-標識HCT116細胞(B,C)の24時間共培養後に定量的イメージング(A-C)および共焦点蛍光顕微鏡(D-G)により決定したセルインセル構造および標的細胞分解（target cell degradation）。上記に記載のように、細胞を共培養後、BV786-ストレプトアビジン-アネキシンVビオチン、DRAQ7、およびHoechst33342のような特異的蛍光プローブで順次標識した。ついで、(緑/薄い灰色)CMFDA-標識HCT116細胞を内在化する(赤/濃い灰色)CMTMR-標識HCT116細胞(R(G)と表示)、および(赤/濃い灰色)CMTMR-標識HCT116細胞を内在化する(緑/薄い灰色)CMFDA-標識HCT116細胞(G(R)と表示)を検出した。代表的な像を(A)に示す(スケール、20μm)。セルインセル構造の頻度(B)および標的細胞分解(C)を報告する(平均±SEM、n=3)。非処理の(赤)CMTMR-標識HCT116細胞および非処理またはガンマ線照射した(緑)CMFDA-標識HCT116細胞の共培養で検出されたセルインセル構造（白い矢印）(D)および標的細胞分解（白い点矢印）(E)の代表的な共焦点像を示す(スケールバー=10μm)。(F-G)(緑/薄い灰色)CMFDA-標識細胞を内在化する(赤/濃い灰色)CMTMR-標識細胞(R(G)と表示)、および(赤/濃い灰色)CMTMR-標識細胞を内在化する(緑/薄い灰色)CMFDA-標識細胞(G(R)と表示)を示すセルインセル構造の頻度(F)および標的細胞分解(G)を決定した(平均±SEM、n=3)；#または$はp<0.05を、##または$$はp<0.01を、***または$$$または###はp<0.001を示す。
【図４】電離放射線照射により引き起こされた捕食モデュレイター(cannibalism modulators)の同定。Prestwick(A)およびCEA(F)ライブラリーからの化合物を、電離放射線照射後に細胞捕食を誘発する能力について試験した。10μMのPrestwick(A)およびCEA(F)ライブラリー化合物の存在下または不在下、8グレイのγ電離放射線照射したHCT116細胞の同型培養(homotypic cultures)後に捕食細胞を検出した。各ドットは一つの化合物を表す。代表的な像を(B,G)に示す。(C,H)HCT116細胞を呈示の薬剤で処理した。処理の24時間後、3,3ジヘキシルオキサカルボシアニンヨージド(DiOC6(3))およびPIで染色することにより細胞死をモニターし、死につつある細胞(DiOC6(3)lowPI-、白いバー)および死んだ細胞(DiOC6(3)lowPI+、黒いバー)を細胞蛍光測定により決定した。蛍光顕微鏡による捕食誘導物質(cannibalism inducers)の検証。代表的な像(D,I)および定量(E,J)を示す。結果は3回の測定の平均±標準偏差（s.e.m.）である。
【図５】免疫原性細胞死誘導物質(immunogenic cell death inducers)としての捕食モデュレイターの同定。MCA205(A)またはCT26(E,I,M,Q)細胞を呈示の薬剤で処理した。呈示の処理での共培養の24時間後、DiOC6(3)およびPIで染色することにより細胞死をモニターし、死につつある細胞(DiOC6(3)lowPI-、白いバー)および死んだ細胞(DiOC6(3)lowPI+、黒いバー)を細胞蛍光測定により決定した。呈示の化合物とともにX線照射後に共培養した(B-D)MCA205細胞または(F-H,J-L,N-P,R-T)CT26細胞を、それぞれ、C56BL/6またはBALB/cマウスの右脇腹に皮下注入した。7日後、マウスの反対側の脇腹に生きた細胞で再攻撃し、腫瘍増殖をモニターした（1群当たり5匹のマウス）。
【図６】腫瘍ワクチン接種実験。CT26細胞を24時間、10μM VP331(A,F,K)、10μMミナプリン(B,G,L)、10μM Lopa87(C,H,M)、10μM SG6163F(D,I,N)、10μMアザグアニン-8(8-aza)(E,J,O)単独または8グレイの電離放射線照射と組み合わせて処理し、免疫適格BALB/cマウスに注入し（皮下）、7日後に反対側の脇腹に同じ癌細胞で再攻撃した。その後38日間、1週間に3回、腫瘍のないマウスのパーセントを評価した。腫瘍のないマウス全体(A-E)、第一の注射部位での腫瘍のないマウス(F〜J,P)または第二の注射部位での腫瘍のないマウス(K〜O,Q)のパーセントを示す(*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001、２要因の分散分析(two-way ANOVA))。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
［定義］
「放射線療法（irradiation therapy）」なる語は、内部および外部放射線療法、放射免疫療法、並びにX線、ガンマ線、アルファ粒子、ベータ粒子、光子、電子、中性子、放射性同位体、およびその他の形態の電離放射線を含む各種放射線の使用を含む、複数の種類の放射線療法（radiation therapy）を称するものとして当該技術分野で一般に用いられている。本明細書において、「放射線療法（irradiation therapy）」、「放射線療法（radiation therapy）」、「放射線照射（radiation）」および「放射線照射（irradiation）」は、特に断らない限り、これら全てのタイプの放射線療法を包含する。放射線治療器には様々な種類があり、それらはわずかに異なる仕方で動作する。放射線療法セッションの数と期間は、癌の種類と癌が体内のどこにあるかによる。表在性皮膚癌では、数回の短い治療しか必要としないが、体内の深部の癌ではより長期の治療が必要である。
【００１５】
「腫瘍増殖を抑制する」、「腫瘍増殖を治療する」および「癌を治療する」などの語は、本願で開示の組成物、キットまたは方法を用いた治療により、腫瘍の増殖速度を低下させる、腫瘍の増殖を完全に停止させる、既存の腫瘍のサイズの退行を引き起こす、既存の腫瘍を根絶する、および/またはさらなる腫瘍の発生を防ぐことをいう。腫瘍細胞の増殖を「抑制する」とは、以下の状態のいずれかまたは全てを意味する：腫瘍増殖の速度を落とす（slowing）、遅らせる（delaying）、および停止させる（stopping）、並びに腫瘍の縮小。腫瘍の「発生を遅らせる（Delaying development）」とは、該疾患の発生を延期（defer）、妨害（hinder）、遅延（slow）、遅延（retard）、安定化（stabilize）、および/または延期（postpone）することを意味する。この遅らせることは、治療すべき疾患および/または個体の病歴に応じて様々な長さの時間であってよい。腫瘍細胞の増殖は、当該技術分野で公知の手段（腫瘍サイズの測定、3H-チミジン取り込みアッセイを用いた腫瘍細胞が増殖しているか否かの決定、または腫瘍細胞数の測定を含むが、これらに限られない）により評価することができる。
【００１６】
本明細書において、放射線照射とともに本発明の化合物の組合せ投与に言及する場合の「相乗」または「相乗効果」とは、化合物の投与および放射線照射単独の場合の付加よりも該組合せの効果が大きいことを意味する。
【００１７】
「強化する（Potentiate）」とは、本願との関連においては、例えば、放射線療法治療の効果を促進または増大させること、または、例えば、生化学的または生理学的作用または効果を促進または増強することを意味する。
【００１８】
「有効量」とは、本願の開示と関連した癌を治療するのに治療学的に有効な本明細書に記載の化合物の量をいう。必要とされるこれら化合物の正確な量は、使用する特定の化合物またはその誘導体、治療すべき対象の年齢および状態、および状態の性質および重篤度により変わるであろう。しかしながら、有効量は当業者により日常的な実験によるだけで決定することができる。放射線照射の有効量は、当業者により不当な実験なしで決定することができる。投与量および頻度などの放射線照射パラメーターは、当技術分野で周知である。
【００１９】
「薬理学的に許容しうる」とは、健全な医学的な判断の範囲において、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または合理的な利益/リスク比に見合った他の問題の合併症なしに、ヒトおよび動物の組織と接触するのに適した化合物、材料、組成物、および/または剤型をいう。
【００２０】
「薬理学的に許容しうる塩」とは、本明細書に開示した化合物の誘導体であって、親化合物がその酸塩または塩基塩を作製することにより変更されたものをいう。本明細書に開示した化合物は多種多様な有機酸および無機酸および塩基と酸および塩基の付加塩を生成し、製薬化学でしばしば用いられる生理学的に許容しうる塩を含む。そのような塩も本明細書の開示の一部である。そのような塩を形成するために使用される典型的な無機酸には、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸、次リン酸などが含まれる。脂肪族モノおよびジカルボン酸、フェニル置換アルコン酸、ヒドロキシアルカン酸およびヒドロキシアルカン二酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸などの有機酸から誘導される塩も使用できる。それゆえ、そのような薬理学的に許容される塩には、酢酸塩、フェニル酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、アクリレート、アスコルビン酸塩、安息香酸塩、クロロ安息香酸塩、ジニトロ安息香酸塩、ヒドロキシ安息香酸塩、メトキシ安息香酸塩、安息香酸メチル、o-アセトキシ安息香酸塩、ナフタレン-2-安息香酸塩、臭化物、イソ酪酸塩、フェニル酪酸塩、β-ヒドロキシ酪酸塩、ブチレン-1,4-ジオエート、ヘキシン-1,4-ジオエート、カブラート、カプリレート、塩化物、ケイ皮酸塩、クエン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グリコール酸塩、ヘプタン酸、馬尿酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、ヒドロキシマレイン酸塩、マロン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、ニコチン酸塩、イソニコチン酸塩、硝酸塩、シュウ酸塩、フタル酸塩、テレフタル酸塩、リン酸塩、リン酸一水素塩、リン酸二水素塩、メタリン酸塩、ピロリン酸塩、プロピオレート、プロピオン酸塩、フェニルプロピオン酸塩、サリチル酸塩、セバケート、コハク酸塩、スベリン酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、ピロ硫酸塩、亜硫酸塩、重亜硫酸塩、スルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、p-ブロモブテンゼンスルホン酸塩、クロロベンゼンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、2-ヒドロキシエタンスルホン酸塩、メタンスルホン酸塩、ナフタレン-1-スルホン酸塩、ナフタレン-2-スルホン酸塩、p-トルエンスルホン酸塩、キシレンスルホン酸塩、酒石酸塩などが含まれる。塩の形成に一般的に使用される塩基には、水酸化アンモニウム、アルカリおよびアルカリ土類金属の水酸化物、炭酸塩、ならびに脂肪族および一級、二級および三級アミン、脂肪族ジアミンが含まれる。付加塩の調製に特に有用な塩基には、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、炭酸カリウム、メチルアミン、ジエチルアミン、およびエチレンジアミンが含まれる。
【００２１】
別の態様は、制御された、瞬時ではない方法、時間に依存した方法で、有効成分を周囲に放出することのできる「徐放性製剤（slow-release formulation）」の投与を含む、記載の放射線療法のがん治療を強化する方法を提供する。この徐放性製剤は、例えば、乳酸のホモポリマー；グリコール酸のホモポリマー；ポリ-D,L,-乳酸とグリコール酸との共重合体；黄体形成ホルモン放出ホルモン（LHRH）類似体の水不溶性ペプチド塩；ポリ（ホスホエステル）；セバシン酸共重合体を含むビス（p-カルボキシフェノキシ）プロパン（CPP）；ポリ無水物ポリマー；ポリ（ラクチド）-co-グリコリド）ポリエチレングリコール共重合体；およびエチレン酢酸ビニル共重合体からなる群から選択される生分解性ポリマーを含んでいてよい。
【００２２】
本発明の方法の幾つかの特定の態様において、徐放性製剤は、4週間以上、あるいは1週間以上、あるいは数時間以上にわたってIRCCE薬を放出する。
【００２３】
本明細書に記載の方法、組成物、製剤および使用は、ヒトおよび動物の両方、好ましくは哺乳動物に適している。
【００２４】
それゆえ、本明細書において「対象」なる語は、マウス、ラット、ブタ、サルおよびウマを含むいかなる哺乳動物にも関する。本発明との関連での「それを必要とする対象」または「患者」は、本発明の方法および医薬組成物から利益を受けるであろうまたは利益を受ける可能性のあるいかなる対象をも包含することを意図している。対象は、いかなるステージの癌を罹患していてよく、初期の非侵襲癌であってもよいし、すでに体内に転移を形成した後期ステージの癌であってもよい。
本明細書において「患者」とは、哺乳動物、好ましくはヒトを含む動物をいう。
【００２５】
本明細書において「癌」なる語は、いかなる形態の癌または腫瘍をも包含することを意図する。癌の非限定的な例には、脳癌（例えば、神経膠腫）、胃癌、頭頸部癌、膵臓癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、前立腺癌、結腸癌、非ホジキンリンパ腫、肉腫、精巣癌、急性非リンパ球性白血病および乳癌が含まれる。特定の態様において、脳癌は星状細胞腫であり、より具体的には多形性膠芽腫であり；肺癌は小細胞肺癌または非小細胞肺がのいずれかであり；頭頸部癌は扁平上皮癌または腺癌である。
【００２６】
本発明は、既知または未知の薬剤がインビトロでおよび腫瘍を有する動物においてインビボでIR-媒体細胞捕食を促進することができるとの発見に基づくものである。
【００２７】
本明細書において「細胞捕食を誘発する薬剤（cellular cannibalism inducing drugs）」、「細胞捕食を誘発する剤（cellular cannibalism inducing agents）」、「細胞捕食を誘発する化合物（cellular cannibalism inducing compounds）」および「細胞捕食促進剤（cellular cannibalism enhancers）」なる語は、細胞捕食を引き起こす放射線照射の能力を促進することのできる化合物をいう。これら語により、IR-媒体細胞捕食（以下、「IRCCE」という）を促進することのできる化合物が示される。選択された細胞捕食モデュレイターの化学構造を表１および表２に示す。
【００２８】
【表１】
2020505039.tif 000003
2020505039.tif 000004
2020505039.tif 000005
【００２９】
【表２】
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【００３０】
本発明者らは、合計１６の有効な細胞捕食促進剤化合物、すなわち、8-アザグアニン、メブヒドロリン1,5-ナフタレンジスルホネート塩（Mebhydroline 1,5-napthalene disulfonate salt）、フルルビプロフェン（Flurbiprofen）、ミナプリン二塩酸塩（Minaprine dihydrochloride）、ミリセチン（Myricetin）、ジゴキシン（Digoxin）、ジギトキシン（Digitoxin）、ラナトシド（Lanatoside）、ドキソルビシン塩酸塩（Doxorubicine hydrochloride）、LOPA87、VP331、RN-1-026、SG6163F、VP450、VP43を見出した。数多くの興味深い化合物もまた同定した。それらは、例えば、LOPA87の類似体(LOPA90、LOPA93、LOPA94、LOPA101、LOPA104、LOPA105、LOPA106)およびSG6143Fの類似体(SG6144、SG6146およびSG6149)である。それゆえ、好ましい態様において本発明の細胞捕食促進剤は、8-アザグアニン、メブヒドロリン1,5-ナフタレンジスルホネート塩、フルルビプロフェン、ミナプリン二塩酸塩、ミリセチン、ジゴキシン、ジギトキシン、ラナトシド、ドキソルビシン塩酸塩、LOPA87、VP331、RN-1-026、SG6163F、VP450、およびVP43からなる群より選ばれ、これら化合物の構造は表１および表２に示してある。さらに好ましい態様において、本発明の細胞捕食促進剤は、メブヒドロリン1,5-ナフタレンジスルホネート塩、フルルビプロフェン、ミナプリン二塩酸塩、ミリセチン、ジゴキシン、ジギトキシン、ラナトシド、LOPA87、VP331、RN-1-026、SG6163F、VP450、およびVP43からなる群より選ばれる。さらに好ましい態様において、本発明の細胞捕食促進剤は、8-アザグアニン、ミナプリン二塩酸塩、LOPA87、VP331、およびSG6163Fからなる群より選ばれる。
【００３１】
本発明の細胞捕食促進剤はまた、LOPA90、LOPA93、LOPA94、LOPA101、LOPA104、LOPA105、およびLOPA106などのLOPA87の類似体であってもよい。
【００３２】
本発明の細胞捕食促進剤はまた、SG6144、SG6146およびSG6149などのSG6163Fの類似体であってもよい。
【００３３】
8-アザグアニン（Ｃ４Ｈ４Ｎ６Ｏ、プリン類似体）：
8-アザグアニンは潜在的な抗腫瘍活性を有するプリン類似体である。8-アザグアニンは、酵素のtRNA-グアニンリボシルトランスフェラーゼ(tRNA-グアニントランスグリコシラーゼ)によって触媒される転移リボ核酸（tRNA）への取込みに対してグアニンと競合することによってtRNAの修飾を妨害する。tRNAの改変されたグアニン修飾は、細胞分化および腫瘍性形質転換に関係している。8-アザグアニンはまた、43Sおよび80S開始因子複合体の生成を抑制し、それによって翻訳の開始を妨害しタンパク質合成を抑制する。この剤は、腫瘍細胞の増殖を抑制し、細胞分化を刺激する。
【００３４】
メブヒドロリン1,5-ナフタレンジスルホネート塩(C19H20N2・1/2C10H8O6S2、H1ヒスタミン受容体アンタゴニスト)：
メブヒドロリン（ナパジシル酸塩）は、鼻アレルギーやアレルギー性皮膚症を含む、ヒスタミン放出によるアレルギー症状の症状緩和に用いられる抗ヒスタミン薬である。
【００３５】
フルルビプロフェン(C15H13FO2、非ステロイド系抗炎症薬（NSAIDs）のフェニルアルカン酸誘導体ファミリー)：
フルルビプロフェンは、変形性関節症（関節の内層の破壊に起因する関節炎）および関節リウマチ（関節の内層の腫脹に起因する関節炎）に起因する痛み、圧痛、腫れ、および硬直を緩和するために使用される。フルルビプロフェンは、NSAIA（非ステロイド系抗炎症薬）と呼ばれる薬のクラスに含まれている。それは、痛み、発熱、炎症を引き起こす物質の生体の生産を止めることによって働く。プロピオン酸類のこの非ステロイド性抗炎症剤は、構造的および薬理学的にフェノプロフェン、イブプロフェン、およびケトプロフェンに関連しており、他のプロトタイプNSAIAと同様の薬理学的作用を持っている。フルルビプロフェンは、抗炎症作用、鎮痛作用、および解熱作用を示す。市販のフルルビプロフェンは、（+）S-および（-）R-鏡像異性体のラセミ混合物である。S-鏡像異性体はほとんどの抗炎症作用を保有しているようだが、両方の鏡像異性体は鎮痛作用を持っている。他のNSAIAと同様に、フルルビプロフェンの抗炎症作用は、プロスタグランジン合成経路におけるアラキドン酸のプロスタグランジンG2（PGG2）への変換およびPGG2からプロスタグランジンH2（PGH2）への変換に関与する酵素であるシクロオキシゲナーゼ（COX）の可逆的阻害を介して起こる。これにより、炎症、痛み、腫れおよび発熱に関与するプロスタグランジンの濃度が効果的に低下する。フルルビプロフェンは非選択的COX阻害剤であり、COX-1および-2の両方の活性を阻害する。フルルビプロフェンはまた、プロスタグランジン阻害活性の点で最も強力なNSAIAの1つである。
【００３６】
ミナプリン二塩酸塩(C17H22N4O、アミノ-フェニルピリダジン抗鬱薬)：
ミナプリン二塩酸塩は向精神薬であり、様々な抑鬱状態の治療に有効であることが証明されている。大抵の抗鬱薬のように、ミナプリンは行動の絶望（behavioral despair）に拮抗する。ミナプリンは、心毒性、眠気、および体重増加が比較的少ないと報告されているアミノ-フェニルピリダジン系抗鬱薬である。さらに詳細には、ミナプリンは、心毒性、眠気、および体重増加が比較的少ないと報告されているアミノ-フェニルピリダジン系抗鬱薬である。他の抗鬱薬治療と同様、ミナプリンはベータアドレナリン受容体機能を減衰させる。また、研究により、ミナプリンが記憶の強化を改善し、薬物の投与を繰り返すとこの効果が増強されることが示されている。さらに、記憶強化に対するミナプリンの効果は、ドーパミン作動性作用に関連している。ミナプリンは、セロトニン2型受容体とドーパミンD1およびD2型受容体に結合する。ミナプリンはまた、セロトニン再取り込みポンプにも結合する。それゆえ、ミナプリンはドーパミンとセロトニンの両方の再摂取をブロックする。ミナプリンはまた、わずかな程度だがコリン作動薬でもある。それゆえ、ミナプリンは、気分を明るくする特性と向知性特性の両方を示す。ミナプリンはまた、MAO-Aの可逆的阻害剤（RIMA）としても機能する。ミナプリンはまた、アセチルコリンエステラーゼを阻害することがわかっている。
【００３７】
ミリセチン(C15H10O8、ベンゾピラン、小分子)：
ホスファチジルイノシトール4,5-ビスリン酸3-キナーゼ触媒サブユニットガンマイソ形は、細胞標的として提唱されている。
【００３８】
ジゴキシン(C41H64O14、強心配糖体)：
ジギトキシンに類似した強心配糖体であるジゴトキシンは、リエントリー機構（reentry mechanisms）による鬱血性心不全と上室性不整脈の治療、および慢性心房細動の治療における心拍数の制御に使用される。
【００３９】
ジギトキシン(C41H64O13、強心配糖体)：
ジギトキシン
は脂溶性強心配糖体であり、細胞膜ナトリウムカリウムATPアーゼを阻害し、細胞内ナトリウムおよびカルシウムレベルの増加と細胞内カリウムレベルの減少をもたらす。研究では、細胞内カルシウムの増加は細胞死に先行し、細胞内カリウムの減少はカスパーゼ活性化とDNA断片化を増加させ、アポトーシスと癌細胞増殖の阻害を引き起こす。
【００４０】
ラナトシドC(C49H76O20、強心配糖体)：
様々なジギタリス種から分離されるラナトシドCは、鬱血性心不全と不整脈の治療に使用される。
【００４１】
ドキソルビシン塩酸塩(C27H29NO11、癌化学療法)：
ドキソルビシン塩酸塩は、抗腫瘍活性を持つアントラサイクリン系抗生物質であるドキソルビシンの塩酸塩です。細菌Streptomyces peucetius var. caesiusから単離されるドキソルビシンは、ダウノルビシンのヒドロキシル化同族体である。ドキソルビシンはDNAヘリックスの塩基対間に挿入され、それによってDNA複製を防ぎ、最終的にタンパク質合成を阻害する。さらに、ドキソルビシンは、トポイソメラーゼIIを阻害し、その結果、DNA複製中に切断酵素とDNAが結合した複合体の増加と安定化をもたらし、その後、二本鎖切断後のヌクレオチド鎖の連結を防ぐ。ドキソルビシンは酸素フリーラジカルも形成し、細胞膜脂質の脂質過酸化に続く細胞毒性をもたらす。酸素フリーラジカルの形成はまた、アントラサイクリン系抗生物質の毒性、すなわち心臓および皮膚の血管への影響にも寄与する。
【００４２】
スクリーニングされたライブラリーから得られた化合物：
LOPA87、VP331、RN-1026、SG6163F、VP450およびVP43はCEAライブラリーから得られた。LOPA87の7の類似体(LOPA90、LOPA93、LOPA94、LOPA101、LOPA104、LOPA105、LOPA106)およびSG6163Fの3の類似体(SG6144、SG6146およびSG6149)も同定した。
【００４３】
本発明の態様：
第一の態様において、本発明は、癌細胞のIR-媒体細胞捕食(IRCCE)を促進するための上記化合物（表１および表２に強調表示）のインビトロでの使用に関する。
【００４４】
この態様での本発明はインビトロで行う。本明細書において「インビトロ」および「エクスビボ」の語は等価であり、通常の宿主生物（例えば、動物またはヒト）から単離した生物学的成員（例えば、細胞または細胞の集団）を用いて行う研究または実験をいう。そのような単離した細胞はさらに精製し、培養しまたは直接分析して変異タンパク質の存在を評価することができる。これらの実験は、例えば、チューブ、フラスコ、ウエル、エッペンドルフなどの実験室材料での実践に還元できる。対照的に、「インビボ」の語は全生物で行う研究をいう。
【００４５】
IR-媒体細胞捕食は、従来の手段によって評価することができる。とりわけ、この活性は顕微鏡下で細胞を調べることによって（免疫蛍光または免疫組織化学によって）、および細胞の貪食事象またはセルインセル系を視認により検出することによって、評価することができる。別法として、IR-媒体細胞捕食は、WO2014/006227（参照のため本明細書中に引用する）に開示されるように、上記細胞において、p53、p53β、p53γ、およびN末端トランス活性化ドメインを欠くp53のN末端イソ型（Δ40TP53およびΔ133TP53など）からなる群より選択されるタンパク質の発現レベルを測定することにより、またはプリン作動性P2Y2受容体の発現レベルまたは活性を測定することにより、および/または前記細胞により分泌される細胞外ATPを測定することにより、評価することができる。
【００４６】
本発明の化合物はまたインビボでも用いることができる。この場合、本発明の化合物は好ましくは薬理学的に許容しうるアジュバントをさらに含む医薬組成物において患者に投与する。それゆえ、「本発明の医薬組成物」は、有効量の本発明の化合物の少なくとも一つ（上記表１および表２を参照）、またはその類似体、および薬理学的に許容しうるアジュバントまたは担体を含む。非水性アジュバントの例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。他の薬理学的に許容しうるアジュバントには、水溶液および塩、防腐剤、緩衝液などを含む非毒性の賦形剤が含まれる。静脈内投与媒体には、液体および栄養補給剤が含まれる。組成物はまた、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤および不活性ガスなどの防腐剤を含んでいてもよい。医薬組成物の様々な成分のpHおよび正確な濃度は、周知のパラメーターに従って調整することができる。
【００４７】
本発明の化合物（または本発明の組成物）のインビボ投与は、放射線療法治療を受けるまたは受けた対象の腫瘍免疫原性を促進することを意図している。特定の理論に拘束されるものではないが、これらの化合物は、細胞捕食を促進しそれによって有意な防御的抗癌免疫応答を誘発する特定のエピトープの露出を促進することにより、放射線療法と相乗的に作用すると考えられる。
【００４８】
本開示は、放射線療法の前または後にそれを必要とする対象に投与することを意図した医薬組成物を製造するための上記表１および２に開示された化合物またはそれらの類似体の使用を対象とする。
【００４９】
本開示はまた、それを必要とする対象に対する放射線療法治療を強化することを目的とする医薬組成物を製造するための、上記の表1および2に開示されている化合物またはそれらの類似体の使用に関する。
【００５０】
最後に、本開示は、それを必要とする対象における放射線療法と組み合わせて癌を治療することを目的とする医薬組成物を製造するための、上記の表1および2に開示されている化合物またはそれらの類似体の使用に関する。
【００５１】
第二の態様において、本発明は、
・癌を罹患する患者においてIR-媒体細胞捕食を促進するために使用するための
・放射線療法治療を受けるまたは受けた対象における腫瘍免疫原性を促進するために使用するための
・放射線療法治療を受けるまたは受けた対象における有意な防御的抗癌免疫応答を誘発するのに使用するための
・それを必要とする対象における放射線療法治療を強化するのに使用するための
・それを必要とする対象において放射線療法と組み合わせて癌を治療するのに使用するための
上記の表1および2に開示されている化合物またはそれらの類似体、またはそれを含む医薬組成物に関する。
【００５２】
重要なことには、本発明の組成物を投与することにより、放射線照射の線量を減らすことが可能になり、それゆえ、放射線療法治療によって被る副作用が軽減される。
【００５３】
本発明の医薬組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかとして、注射可能な組成物の形態で（例えば、静脈内、筋肉内、皮下および関節内）投与することができ、注射前の液体中の溶液または懸濁液に適した固体形態も調製され得る。これらの製剤は乳化されてもよい。
【００５４】
前記医薬組成物は、経口、経鼻、直腸、局所、静脈内、筋肉内、皮下、舌下、くも膜下腔内、腹腔内、関節内または皮内などの他の経路によって投与することもできる。好ましくは、投与経路は静脈内、動脈内または経口である。好ましくは、医薬組成物は静脈内または動脈内に投与される。
【００５５】
特定の実施形態では、本発明の組成物が経口投与用である場合、本発明の組成物は、錠剤、溶液、または例えばソフトゲルカプセルなどのカプセルの形態である。他の特定の実施形態では、本発明の組成物が経口投与用である場合、腸溶コーティングを有する。他の特定の実施形態では、本発明の組成物が経口投与用である場合、それは油ベースのシロップである。
【００５６】
特定の実施形態では、本発明の化合物は徐放性製剤で投与される。
【００５７】
本発明の組成物は、放射線療法治療と組み合わせて、癌を治療するのに十分な量および頻度で投与される。対象の経過は、癌マーカーの濃度の変化を測定および観察することにより、経時的に腫瘍の実際のサイズを測定することにより、および/または当技術分野で周知の他の関連する臨床マーカーを決定することにより、決定することができる。そのような特性および臨床的経過に関連するマーカーの決定、測定、および評価は当業者に周知である。
【００５８】
一実施形態では、本発明の組成物は、放射線療法の前に投与される。投与時間は、特定の製剤と、細胞捕食促進剤が標的細胞に到達するのに必要な時間に依存する。投与の時間は、放射線照射時に細胞捕食促進剤の最適な濃度を提供するように選択される。
【００５９】
別の実施形態では、本発明の組成物は、放射線療法治療が患者に適用された後に投与される。
【００６０】
別の実施形態において、本発明の組成物の投与および放射線療法治療は、患者に同時に適用された。
【００６１】
本発明者らは、ミナプリン二塩酸塩単独の投与が腫瘍発生に対して固有の防御効果を有することを観察した（図6B、6G、6L、6Pおよび6Qを参照）。その結果、ミナプリン二塩酸塩は放射線療法治療と組み合わせる必要がなく、それ自体で有効である。これは驚くべき結果である、なぜなら、ミナプリン二塩酸塩は抗鬱薬として知られており、この薬について抗腫瘍効果は報告されていないからである。
【００６２】
それゆえ、第三の態様において、本発明は、
・癌を罹患する患者を治療するのに使用するための
・癌患者における有意な防御的抗癌免疫応答を誘発するのに使用するための
・放射線療法または化学療法または免疫療法治療と組み合わせて癌を治療するのに使用するための
ミナプリン二塩酸塩、またはそれを含む医薬組成物に関する。
【００６３】
医薬組成物について開示した上記全ての態様は、この特定の用途に置き換え可能である。
【００６４】
治療方法：
本開示はまた、それを必要とする対象において、放射線療法と組み合わせて、癌を罹患する患者においてIR-媒体細胞捕食(IRCCE)を促進するための、放射線療法治療を受けるまたは受けた対象における腫瘍免疫原性を促進するための、放射線療法治療を受けるまたは受けた対象における有意な防御的抗癌免疫応答を誘発するのための、それを必要とする対象における放射線療法治療を強化するための、および/または癌を治療するための、方法をも提供する。
【００６５】
これらの方法において、本発明の化合物（上記に詳述したように表１、表２およびその類似体を参照）または本発明の医薬組成物（上記に開示）は、放射線療法での治療の前、後または同時に前記対象に投与される。
【００６６】
本発明はまた、癌患者に有効量のミナプリン二塩酸塩、またはそれを含む医薬組成物を投与することを含む、癌患者の治療方法に関する。実際、該抗鬱薬は本発明者らによってそれ自体有意な防御的抗癌免疫応答を有することが示された。
【００６７】
スクリーニング法：
他の態様において、本発明は、対象における放射線療法治療を強化することのできる化合物を同定する他のインビトロ方法に関し、該方法は、
(a)候補化合物を腫瘍細胞培養物に加え、
(b)該腫瘍細胞培養物を1〜20グレイ(Gray)の線量で処置し、
(c)該細胞培養物で起きた放射線照射媒体細胞捕食を測定する
工程を含み、
ここで、対照レベルと比較して放射線照射媒体細胞捕食を促進する化合物は放射線療法治療を強化することができる。
【００６８】
上記のように、IR-媒体細胞捕食は、従来の手段によって評価することができる。とりわけ、この活性は顕微鏡下で細胞を調べることによって（免疫蛍光または免疫組織化学によって）、および細胞の貪食事象またはセルインセル系を視認により検出することによって、評価することができる。別法として、IR-媒体細胞捕食は、WO2014/006227（参照のため本明細書中に引用する）に開示されるように、上記細胞において、p53、p53β、p53γ、およびN末端トランス活性化ドメインを欠くp53のN末端イソ型（Δ40TP53およびΔ133TP53など）からなる群より選択されるタンパク質の発現レベルを測定することにより、またはプリン作動性P2Y2受容体の発現レベルまたは活性を測定することにより、および/または前記細胞により分泌される細胞外ATPを測定することにより、評価することができる。
【００６９】
別法として、放射線照射による細胞の処置は、細胞培養物に候補化合物を加える前に行うことができる。
【００７０】
好ましい態様において、工程（b）で使用する放射線の線量は、1〜10グレイ、典型的には8グレイである。
【００７１】
好ましい態様において、腫瘍細胞培養物は、放射線照射の前または後に、候補化合物で少なくとも12時間、さらに好ましくは少なくとも20時間、さらに一層好ましくは24時間処理する。
【００７２】
前記腫瘍細胞培養物は、HCT116細胞、CT26癌細胞、MCA205線維肉腫細胞の培養物であり得る。
【００７３】
候補化合物の増強効果の確認は、以下の実施例で説明するように、すなわち、適当な腫瘍細胞培養物を該化合物で少なくとも12時間処理し、ついで放射線照射処理を適用し、次に防御免疫応答が誘発されたことを確認するために、これらの細胞を免疫適格マウスに注射することにより行うことができる。
【００７４】
以下の実験部分によれば、上記表１および２に開示された化合物およびそれらの類似体は「IR-媒体細胞捕食の促進剤」の例として本明細書に示される。
【実施例】
【００７５】
Ｉ．材料および方法
化学物質、細胞株および培養条件：
特に断らない限り、化学物質はSigma-Aldrichから購入した。抗生物質、培地、細胞培養のための添加剤はLife Technologiesから得た。ベンジルオキシカルボニル-Val-Ala-Asp(OMe)-フルオロメチルケトン(Z-VAD-fmk)はBachemから、組換えマウスTNF-アルファはR&D systemsから得た。ヒト結腸癌HCT116細胞はMcCoy's 5A培地で培養し、マウス線維肉腫細胞株L929はDulbecco変法イーグル培地で培養した。全ての培地に10%加熱不活化ウシ胎仔血清(FBS)、10mM HEPES緩衝液、2mM L-グルタミン、10U/mLペニシリンナトリウムおよび10μg/mL硫酸ストレプトマイシンを添加した。
【００７６】
放射線照射：
細胞を6-ウエルプレート、12-ウエルプレートまたは25cm2フラスコに播種し、ガンマ線照射器IBL-637(Cs137、1Gy/分、gamma CIS-BioInternational, IBA, Saclay, France)で呈示の線量で放射線照射した。
【００７７】
CellTrackerTM蛍光プローブ標識：
培養培地を除去後、HCT116細胞を、10μMの5-クロロメチルフルオレセインジアセタート(CMFDA、緑色蛍光)または5-(および-6)-(((4-クロロメチル)ベンゾイル)アミノ)テトラメチルローダミン(CMTMR、赤色蛍光)(Molecular Probes-Life Technologie)を含有する前もって温めた培地で37℃にて45分間インキュベートした。その後、HCT116細胞を前もって温めた培地で2回濯ぎ、37℃にて1時間インキュベートした。染色した細胞を呈示のごとく処理し、細胞死プロファイリング分析のため培養した。
【００７８】
定量フローイメージング(quantitative Flow Imaging)による細胞死プロファイリング：
非処理のHCT116細胞をCMFDA(緑色の蛍光、CMFDA+)またはCMTMR(赤色の蛍光、CMTMR+)で標識し、処理したHCT116細胞をCMFDA(緑色の蛍光、CMFDA+)で標識した。以下の細胞混合を行った：非処理のCMTMR+ HCT116細胞を非処理のCMFDA+ HCT116細胞と、または非処理のCMTMR+ HCT116細胞を処理したCMFDA+ HCT116細胞と混合した。ついで、ROCKの薬理学的阻害剤、Y27632(30μM)、パン−カスパーゼ阻害剤(pan-caspase inhibitor)、Z-VAD-fmk(ZVAD、100μM)、カスパーゼ-1の阻害剤、Ac-YVAD-cmk(YVAD、100μM)、ネクロプトーシス阻害剤、ネクロスタチン-1(Necrostatin-1)(NEC1、30μM)、オートファジーを阻害する液胞型プロトンATPアーゼ(vacuolar type H(+)-ATPase)(V-ATPase)阻害剤、バフィロマイシン(Bafilomycin)A1(BafA1、50nM)、抗有糸分裂活性を有するCdksの阻害剤、ロスコビチン(Roscovitine)(Rosco、10μM)の存在下または不在下、24時間共培養した。24時間共培養後、剥離細胞および接着細胞の両者を回収し、温めた完全培地中、37℃で1時間、Hoechst 33345(10μg/mL)で染色した。ホスファチジルセリン(PS)暴露および原形質膜の透過性を検出するため、標識したHCT116細胞をビオチン-アネキシンV(BD Pharmingen；製造業者による推奨)、0.5μg BV786-ストレプトアビジン(BD Biosciences)および3μM DRAQ7(BioStatus)とともに連続的に25℃で15分間インキュベートした。PBS溶液で洗浄後、イメージングフローサイトメーターFlowSightR(AmnisR, EMD Milliporeの一部)を用いて直ちに試料を分析した。データはINSPIREソフトウェアを用いて20×倍率で得た。励起のため、405nm、488nm、および561nmのレーザーを用いた。それぞれ、420-480nm、745-800nm、642-745nm、480-560nm、595-642nmおよび430-505nmのチャネルを用い、明視野、アネキシンV-BV786、DRAQ7、CMFDA、CMTMRおよびHoechst 33345染色を検出した。試料当たり細胞の少なくとも1000の事象を分析した。異なるチャネルにわたって蛍光シグナルを正規化するため、追加の単一標識した対照を調製した。得られたデータをIDEAS分析ソフトウェア(v6.1; Merck-Millipore)を用いて分析した。ゲーティング戦略は以下の通りであった。焦点を合わせた細胞(focused cells)についてグラジエントRMS特性(Gradient RMS feature)を用いて細胞をゲーティングした。単一細胞についてアスペクト比と面積の特徴(aspect ratio and area features)を用いて細胞をゲーティングした。捕食検出のため、二重陽性CMFDA+およびCMTMR+染色で細胞をゲーティングした。
【００７９】
フローサイトメトリーおよび共焦点蛍光顕微鏡：
PS暴露、原形質膜透過性および細胞周期の進行を検出するため、共培養後、細胞を特定の蛍光プローブ（FITC-結合アネキシンV、ヨウ化プロピジウム、およびHoechst 33342）で順次標識し、フローサイトメトリーにより分析した。剥離細胞および接着細胞の両者を回収し、温めた完全培地中、37℃で1時間、Hoechst 33345(10μg/mL)で染色した。PBSで洗浄後、HCT116細胞を、製造業者の指示に従ってフルオレセインイソチオシアネート(FITC)-結合アネキシンV(BD Biosciences)およびヨウ化プロピジウム(PI, 1μg/mL)(Sigma)を添加した1X結合緩衝液に懸濁した。ついで、LSRIIフローサイトメーター(Becton Dickinson)およびFlowJoソフトウェアv10を用いて試料を分析した。共焦点蛍光顕微鏡のため、3,7%パラホルムアルデヒド-PBS中で15分間共培養後にHCT116細胞を固定し、1μg/mLのHoechst 33342(Invitrogen)で15分間対比染色した。ついで、Apochromat 63×1.3NAおよび63× 1.15NA油浸レンズを備えた共焦点SPE顕微鏡により細胞を分析した。Leica Aplication Suite (LAS)ソフトウェアを用いた(Leica Microsystems)。
【００８０】
ウエスタンブロット：
全細胞タンパク質を溶解緩衝液(1%NP40、20mmol/L HEPES、10mmol/L KCl、1mmol/L EDTA、10%グリセロール、プロテアーゼおよびホスファターゼインヒビタータブレットを含む)で抽出した。タンパク質抽出物(30μg)を4-12%NuPAGERNovexR Bis-Trisゲル(Life Technologies)にかけ、4℃でImmobilonポリフッ化ビニル(PVDF)膜(Thermo Scientific)に移した。ブロッキング後、膜を4℃で一夜、カスパーゼ-3(#9662)、開裂したカスパーゼ-3(Asp175)(#9661)、ミオシン軽鎖2(MLC2)(#3672)、ホスホ-MLC2(Ser19)(#3675)、LC3A/B(#4108)、p-(S)-CDKs Substrate (#9477)(Cell Signaling Technologyから得た)に特異的な一次抗体とインキュベートした。GAPDH(#MAB374)はMilliporeから購入した。ついで、西洋わさびペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスまたは抗ウサギ(Southern Biotechnology)抗体を1時間インキュベートし、ImageQuant LAS 4000ソフトウェア支援イメージャー(GE Healthcare)を用いてSuperSignal West PicoR試薬(Thermo Fisher Scientific)またはECLTM Prime Western Blotting Detection System (GE Healthcare)で暴露した。
【００８１】
統計解析：
各実験を少なくとも3回繰り返して比較できる結果を得た。特に断らない限り、数字は一つの代表的な実験からの定量データを示す(平均±SEM、n=3)。データをPrism v.5.03(GraphPad Software, La Jolla, CA, USA)により解析した。統計的有意性は両側スチューデントt検定により評価した。全ての実験において、p値<0.05は統計的に有意であるとした。
【００８２】
II．結果
マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーを用いた細胞死プロファイリングは非細胞自立性細胞死の様式および細胞自立性細胞死の様式の同時検出を可能にする：
細胞がNCAプロセスにより死ぬ能力は、細胞死プロセスを考慮する本発明者らの方法論的アプローチを概念的な視点から再考するよう本発明者らを導いた。実際、考慮すべき形態学的および/または生化学的パラメーターの選択並びに細胞死を検出するのに用いる技術アプローチは、予想される結果を前もって事前に定義しており、細胞捕食やエントーシスなどの新たな致死プロセスの特定を可能にしないかまたは非常にまれに特定する。放射線療法の分野もまたこの問題に直面している。実際、別の研究で、放射線照射がアポトーシス、オートファジー細胞死、ネクローシスまたは有糸分裂死などの多くの致死的プロセスを引き起こすことが明らかになっている[35,36]。最近、別の研究で、同じ細胞型に同じ線量を照射するとアポトーシスを引き起こす可能性があることが示されたが[37]、有糸分裂死も引き起こした[38]。以前の研究では、放射線照射後に非常に急速に観察されるアポトーシスの開始および有糸分裂死は、長期的に観察されるクローン形成生存率(clonogenic survival)と相関しないことが明らかにされた[35]。これらの研究は、放射線照射された細胞の除去に関与する未知の致死プロセスの存在を強調した。さらに、腫瘍増殖の制御および転移細胞の排除における細胞捕食およびエントーシスの影響を明らかにする出版物の増加は、NCADのこのプロセスの開始を追跡することを促している。
【００８３】
非細胞自立性細胞死の様式および細胞自立性細胞死の様式の両方を開始する可能性のある致死刺激の多様性と、両方のプロセスを制御するシグナル伝達経路（カスパーゼ、カテプシンまたはグランザイムを含む（または含まない））の複雑さを考慮して、IRによって誘発された非細胞自立性細胞死の様式および細胞自立性細胞死の様式を同時に検出することが決定された。致死損傷(lethal insults)の後、細胞自立性または非細胞自立性の仕方で実行され得る直接または/およびバイスタンダー細胞致死(by-stander-cell killing)を細胞集団が同時に受けるか否かを決定するため、5-クロロメチルフルオレセインジアセタート(CMFDA、緑色)蛍光バイタルプローブで標識し電離放射線照射(γ線)により処理したHCT116細胞と、5-(および-6)-(((4-クロロメチル)ベンゾイル)アミノ)テトラメチルローダミン(CMTMR、赤色)蛍光バイタルプローブで標識したアイソジェニックHCT116細胞との共培養に基づいて細胞死プロファイリング分析をデザインした。24時間共培養後、処理したCMFDA+細胞、非処理のCMTMR+細胞および全(CMFDA+細胞およびCMTMR+細胞)細胞集団を、ホスファチジルセリン(PS)暴露、原形質膜完全性の喪失およびDNA含量について分析して処理細胞および（非処理の）隣接細胞の両者の細胞死誘発を同時に検出した。検出した細胞死の様式の実行に関与する分子メカニズムを特徴付けるため、ROCK1阻害剤(Y27632)、パン−カスパーゼ阻害剤(Z-VAD-fmk)、カスパーゼ-1阻害剤(YVAD-fmk)、ネクロスタチン(NEC1)、バフィロマイシンA1(BafA1)およびロスコビチン(Rosco)などの細胞死モデュレイターの存在下で共培養した。これら細胞死モデュレイターは、それぞれ、細胞の貪食（エントーシス[16]、エンペリトーシス(emperiptosis)[17]および細胞捕食[16]を開始するプロセス）、カスパーゼ-3またはカスパーゼ-7のタンパク分解（アポトーシス[39]、有糸分裂死[38,40]またはエンペリトーシス[17]の実行に寄与する）またはカスパーゼ-1のタンパク分解（ピロトーシス(pyroptosis)に必要である[41]）、ネクローシス促進(pro-necroptotic)キナーゼRIP1キナーゼ(RIPK1)の活性化（ネクロプトーシスに寄与する[42]）、オートファゴソームとリソゾームとの融合（それゆえ、オートファジーおよびオートファジー関連細胞死の際の自食作用胞(autophagic vacuoles)の成熟を障害する[43]）、および最後に、サイクリン依存性キナーゼ1(Cdk1)-サイクリンB活性および有糸分裂の進行（有糸分裂死などの有糸分裂関連死に必要である[40,44]）を阻害することが知られている。細胞死モデュレイターの薬理学的阻害と組み合わせた細胞パートナーのPS暴露、原形質膜完全性の喪失、DNA含量の同時検出は、共培養においてマルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーを用いることにより、標的細胞および隣接細胞において少なくとも9の細胞死の様式（アポトーシス、有糸分裂死、ピロトーシス、オートファジー細胞死、ネクローシス、ネクロプトーシス、エントーシス、エンペリトーシスおよび細胞捕食を含む）の検出が可能となり（図1,A-B）、それゆえ、細胞自立性細胞死から非細胞自立性細胞死を、およびバイスタンダー致死効果から直接細胞致死を区別することができた。この方法により、IRによって引き起こされた細胞死プロファイリングを定義することが可能となった。
【００８４】
電離放射線照射によって引き起こされた細胞死プロファイリングは、放射線照射した癌細胞および放射線照射していない癌細胞の両者で細胞死の誘発を強調する：
抗癌治療に関連する細胞プロセスおよび生化学プロセスをよりよく特徴付けるために実施された徹底的な生物学的および薬理学的研究にも拘らず、放射線療法（臨床で最も頻繁に用いられる抗癌治療の一つである）の治療効果の致死メカニズムは未だ知られていない。電離放射線に反応して検出された致死プロセス（アポトーシスや有糸分裂破局など）は、治療効率に直接関係しておらず[35]、未だ知られていないさらなる細胞死の様式が放射線療法の治療効果に寄与しているかもしれないことが示唆された。この文脈で放射線照射した癌細胞の細胞死プロファイリングが決定された。上記方法により、CMFDA-標識細胞を4グレイで放射線照射しまたはせず、24時間後にCMTMR-標識細胞と1:1比で混合し、呈示した各阻害剤の存在下で培養した（補足図1A-1E）。ついで、アネキシンV-BV786、DRAQ7およびHoechst33342染色を用いて、各細胞パートナーのPS暴露、原形質膜完全性およびDNA含量をそれぞれ決定した。隣接細胞集団（CMTMR+細胞、図2A,2Bおよび2D）および非処理対照細胞集団（図2A,2Dおよび2E）でアポトーシス細胞死およびネクローシス細胞死(necrotic cell deaths)の有意の増加が観察されなかったにも拘らず（アネキシンV+DRAQ7-およびDRAQ7+細胞の分析により明らかなように）、全細胞集団（CMFDA+およびCMTMR+細胞集団を考慮することにより明らかなように；図2A-2C）および放射線照射した細胞集団（CMFDA+細胞；図2Bおよび2E）においてこれら両タイプの細胞死の有意な増加が24時間の共培養後に検出されたのであり、本発明の方法が放射線照射しない細胞および放射線照射した細胞の両者の細胞死の様式の検出を可能にすることが示された。また、パン−カスパーゼ阻害剤であるZ-VAD-fmkおよび薬理学的サイクリン依存性キナーゼ阻害剤であるロスコビチン(Rosco)が、放射線照射したCMFDA+細胞の原形質膜の外葉上のPS暴露を阻害し（図2E）、以前に文献に記載されたように[45,46]、放射線照射したCMFDA+細胞は死ぬのにカスパーゼ活性化と有糸分裂の進行の両方を必要とすることが確認された。さらに、バフィロマイシンA1(BafA1)によるオートファジーフラックス(autophagic flux)の障害は、全細胞集団（CMFDA+およびCMTMR+細胞；図2C）、放射線照射していないCMTMR+細胞（図2D）および放射線照射したCMFDA+細胞（図2E）での死につつある細胞（アネキシンV+DRAQ7-およびDRAQ7+細胞）の頻度を増大させ、それゆえ、オートファジーが、放射線照射していない細胞および放射線照射した細胞の両者を死から救済する、電離放射線照射によって引き起こされた生存のための細胞メカニズム(survival cellular mechanism)であることが明らかとなった。さらに、処理した細胞および非処理細胞の細胞周期での進行の同時分析は、細胞死の誘発がG1停止から放射線照射した細胞が逃れてSおよびG2/M期での蓄積に導くことと関係があることを示した（図2F、2Gおよび2J）。全細胞集団またはCMTMR+細胞集団では細胞周期に変化は検出されず、細胞周期の変化は放射線照射した細胞でのみ検出されたことが明確に示された（図2F、2Gおよび2I）。これらの結果は古典的なフローサイトメトリー分析によっても確認されたが（補足図2A-2B）、電離放射線照射後に放射線照射した癌細胞および放射線照射していない癌細胞の両者がカスパーゼ-1依存性細胞死を受けることを示した。これらを総合すると、これらの結果は直���細胞致死およびバイスタンダー効果により癌細胞を同時に排除する抗癌剤の能力を強調した。
【００８５】
電離放射線照射によって引き起こされた細胞死プロファイリングはまた非細胞自立性細胞死の様式の誘発を明らかにする：
並行して、同じ共培養において、放射線照射したCMFDA+細胞が隣接細胞を貪食または侵入する能力、細胞捕食関連細胞死（細胞捕食、エンペリトーシスまたはファゴプトーシスなど）またはセルインセル侵入により引き起こされた細胞死（エントーシスなど）の誘発に必要な２つの細胞プロセスを決定した。マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリー分析は、ガンマ照射したCMFDA+細胞が隣接細胞の貪食を引き起こすことを明らかにした（ガンマ照射したCMFDA+細胞による「標的」CMTMR+細胞の内在化により明らかなように；図3Aおよび3B）。このプロセスはパン−カスパーゼ阻害剤であるZ-VAD-fmkにより影響を受けなかったが、ROCK1の阻害剤(Y27632)によって抑制され（図3B）、それゆえ、このことは、検出されたセルインセル内在化がアポトーシス細胞のファゴサイトーシス取込み(phagocytic uptake of apoptotic cells)とは区別されるものであり、内在化が起こるにはROCK1活性が必要であることを明らかにした。ガンマ照射した細胞の捕食活性はまた、共焦点顕微鏡によっても確認された（図3D-3F）。興味深いことに、細胞死プロファイリング分析はまた、生きたCMTMR+細胞によるアポトーシスCMFDA+細胞のファゴサイトーシス（バフィロマイシンA1処理によるアポトーシス誘発に引き続いて起こる）から生きた細胞の貪食を区別することを可能にした（図3B）。ついで、貪食されたCMTMR+細胞および放射線照射した貪食するCMFDA+細胞の細胞運命を評価した。貪食されたCMTMR+細胞の殆ど全てが細胞分解の形跡を示すことが観察された（マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリー（図3A）および共焦点顕微鏡（図3Dおよび3E）で検出された内在化された細胞のDNA含量の損失により明らかなように）。このプロセスは、パン−カスパーゼ阻害剤であるZ-VAD-fmkおよびカスパーゼ-1の阻害剤であるYVAD-fmkの存在下では有意に低下し、貪食された細胞のIR-媒体死が起こるにはカスパーゼが必要であり、カスパーゼ-1依存性アポトーシス（ピロトーシスとしても知られる）によって実行されることが明らかになった。さらに、捕食細胞の90%はPSを暴露しないかまたは原形質膜の完全性の喪失を示すことが明らかになったが（補足図2C）、このことはIR-媒体細胞貪食の後、内在化された細胞が捕食細胞の生存能力を変更することなく沈殿して死に至ることを強調していた。これらを総合すると、これらの結果は電離放射線照射が直接細胞致死、バイスタンダー致死効果および細胞捕食関連細胞死の組合せ効果によって癌細胞を同時に排除することを示していた。これらの結果は、致死プロセスの際に非細胞自立性細胞死と細胞自立性細胞死との誘発に同時に対処する緊急の必要性を強調している。
【００８６】
化学ライブラリースクリーニングはIR-媒体細胞捕食促進剤の同定に導く：
ついで、IR-媒体細胞捕食を誘発することのできる化合物を同定するため、化合物のライブラリーのスクリーニングを開発した。それゆえ、8グレイの放射線量で処理しておいたHCT116細胞をオレンジ色のCMTMR細胞追跡剤(cell tracker)または緑色のCMFDA細胞追跡剤のいずれかで染色し、10μMの化合物の存在下で培養した。24時間培養後、細胞を核染色剤(nuclear dye)で染色し（5μg/mlのHoechst 33342；37℃で1時間）、FlowSightR Imaging Flow Cytometerを用いて細胞捕食を分析した。これら各化合物をZ-スコア[47]に従って分類し、それぞれ、13および11の候補化合物を同定した（図4A,4B,4Fおよび4G）。ついで、同定した化合物を、フローサイトメトリー法（処理した細胞のミトコンドリア内膜の脱分極および原形質膜の透過性を同時にモニターすることにより細胞毒性の化合物を排除するため）を共焦点顕微鏡法（候補化合物によるIR-誘発細胞捕食の変調を確認するため）と組み合わせることにより確認した（図4C-Eおよび4H-J）。３つの独立した実験の完了後、効果のない化合物（フェンベンダゾールやカルビマゾールなど）または高い細胞毒性を示した化合物（RN-1-183など）を排除した。最後に、細胞捕食を引き起こすIRの能力を高めることのできる16の化合物が同定された（図4Eおよび4J；表1&2）。
【００８７】
IRCCEとIRとの組合せは効率的な抗腫瘍免疫を誘発する：
免疫原性細胞死(ICD)誘導物質がIRCCEとして同定されている（ジゴキシン、ジギトキシン、ラナトシドCまたはドキソルビシン塩酸塩など[3,4,48-51]）ことを考慮して、放射線療法後にこれら化合物が抗腫瘍免疫を引き起こす能力を評価した。まず、癌腫の２つのマウスモデル（直腸CT26癌腫および線維肉腫MCA205）に対するIRCCEの免疫学的効果を調べるため、前臨床法を開発した。最初に、免疫適格マウスを用い、抗腫瘍ワクチン接種アッセイによりIRCCE+IRの組合せが特異的な抗腫瘍免疫応答を引き起こす能力を評価した。以前に刊行された研究によれば[52]、免疫原性細胞死（ICD）に陥った癌細胞の免疫適格マウスへの注入は、腫瘍抗原に特異的な防御免疫応答を引き起こすに違いない。それゆえ、3x105 MCA205細胞をまず10μMのSG6163Fで24時間処理した。ついで、処理した細胞を200μlのPBS中で8週齢の雌C57BL/6マウスの下腹部に皮下接種した。1週間後、3x104の非処理対照細胞をマウスの反対側腹部に接種した。腫瘍を一般的なキャリパーを使用して毎週評価した。体重が20〜25％を超える腫瘍を持つ動物は安楽死させた。IRまたはSG6163Fのみで処理されたマウスは、インビトロで細胞死の有意な増加を誘発できないことが観察された（図5A）。実際には、それらは非処理細胞の接種後に防御応答を示さず、使用した放射線量およびSG6163Fの濃度が抗癌免疫応答を刺激するのに十分ではないことがわかった（図5B）。これら結果は、防御応答は癌細胞の70%がホスファチジルセリンを原形質膜の外葉上に暴露するまで癌細胞が細胞障害性癌治療にインビトロで暴露されたときに初めて検出されることを示す以前に刊行された結果と一致した[48]。驚くべきことに、MCA205細胞の8グレイのIRと10μMのSG6163Fとの組合せ処理が、注射した5匹のマウスのうち3匹で防御応答を誘発したことが観察された（図5B）。これら結果から初めて、処理および放射線照射した細胞の死の有意の増加なしにIRCCE+IRの組合せがIR-媒体抗癌免疫応答を誘発することが明らかになり（図5A）、細胞捕食または細胞捕食関連シグナル伝達経路が腫瘍免疫原性の誘発に寄与しているかもしれないことが示唆された。ついで、10μMのSG6163F（図5Eおよび5F）、VP331（図5Iおよび5J）、ミナプリン二塩酸塩（図5Mおよび5N）またはLOPA87（図5Qおよび5R）の存在下、3x106のCT26細胞を8グレイにて24時間放射線照射した。ついで、以前に記載されたように、細胞を200μlのPBS中で8週齢の雌BALB/cマウスの下腹部に皮下接種した。1週間後、5x105の非処理対照細胞をマウスの反対側腹部に接種し、腫瘍を一般的なキャリパーを使用して毎週評価した。以前に記載されたように、体重が20〜25％を超える腫瘍を持つ動物は安楽死させた。各条件の死につつある細胞のパーセントをDiOC(6)3/IP染色で決定することにより評価した（図5E、5I、5Mおよび5Q）。最後に、これら化合物が放射線照射および処理した癌細胞の注射の7日後に注射された癌細胞の増殖を抑制する能力を評価した。IRおよび化合物で処理した癌細胞の注射後に防御応答を示すマウスの頻度の有意の増加が観察された（図5H、5L、5Pおよび5T）。
【００８８】
第二の抗腫瘍ワクチン接種アッセイを以前に記載されたように癌腫のCT26マウスモデルで行った。簡単に説明すると、10μMのVP331（図6A、6F、6K）、ミナプリン二塩酸塩（図6B、6G、6L）、LOPA87（図6C、6H、6M）、SG6163F（図6D、6I、6N）、またはアザグアニン-8(8-aza)（図、6E、6J、6O）の存在下、CT26細胞を8グレイにて24時間放射線照射した。ついで、以前に記載されたように、細胞を免疫適格BALB/cマウスに接種した。最後に、これら化合物が放射線照射および処理した癌細胞の注射の7日後に注射された癌細胞の増殖を抑制する能力を評価した。以前の効果が確認された。IRおよび化合物で処理した癌細胞の注射後に防御応答を示すマウスの頻度の有意の増加が観察された（図6Pおよび6Q）。興味深いことに、ミナプリン二塩酸塩（図6B、6G、6L、6Pおよび6Q）およびアザグアニン-8（図6E、6J、6O、6Pおよび6Q）は単独で癌細胞の注射後に防御応答の増大を引き起こす。
【００８９】
以上から、これらの結果は、本発明により同定された化合物の防御抗癌免疫応答を誘発する能力を明らかにした。
【００９０】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【国際調査報告】
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