(57)【要約】本明細書で提供されるのは、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）提示誘導物質構築物であって、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に発現される天然刺激受容体（ＩＳＲ）に結合する少なくとも１つのＩＳＲ結合構築物と、１つ以上の他のＴＡＡを含む腫瘍細胞由来物質（ＴＣＤＭ）と物理的に会合する第１のＴＡＡに直接結合する少なくとも１つのＴＡＡ結合構築物とを含む、ＴＡＡ提示誘導物質構築物である。ＩＳＲ結合構築物及びＴＡＡ結合構築物は、互いに連結され、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、第１のＴＡＡ及び１つ以上の他のＴＡＡに対するポリクローナルＴ細胞応答を誘導する。また、ＴＡＡ提示誘導物質構築物を使用する方法、例えば、がんの治療においてＴＡＡ提示誘導物質構築物を使用する方法も提供される。【選択図】図１
2020511997.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）提示誘導物質構築物であって、
ａ）抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に発現される天然刺激受容体（ＩＳＲ）に結合する、少なくとも１つのＩＳＲ結合構築物と、
ｂ）１つ以上の他のＴＡＡを含む腫瘍細胞由来物質（ＴＣＤＭ）と物理的に会合する第１のＴＡＡに直接結合する、少なくとも１つのＴＡＡ結合構築物と
を含み、
前記ＩＳＲ結合構築物及び前記ＴＡＡ結合構築物は、互いに連結され、
前記ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、１つ以上の他のＴＡＡに対するポリクローナルＴ細胞応答を誘導する、前記ＴＡＡ提示誘導物質構築物。
【請求項２】
前記ＩＳＲが、Ｃ型レクチン受容体、腫瘍壊死因子受容体ファミリーのメンバー、またはリポタンパク質受容体である、請求項１に記載のＴＡＡ提示誘導物質構築物。
【請求項３】
前記天然刺激受容体がＣ型レクチン受容体である、請求項２に記載のＴＡＡ提示誘導物質構築物。
【請求項４】
前記Ｃ型レクチン受容体が、デクチン−１、デクチン−２、ＤＥＣ２０５、Ｍｉｎｃｌｅ、またはＤＣ−ＳＩＧＮである、請求項３に記載のＴＡＡ提示誘導物質構築物。
【請求項５】
前記天然刺激受容体が、ＣＤ４０またはＬＲＰ−１である、請求項２に記載のＴＡＡ提示誘導物質構築物。
【請求項６】
前記第１のＴＡＡが、がん細胞に高度に発現するか、低イムノスコアＴＡＡであるか、または腫瘍胎児性抗原である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＴＡＡ提示誘導物質構築物。
【請求項７】
前記第１のＴＡＡが、ＨＥＲ２、ＲＯＲ１またはＰＳＭＡである、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＴＡＡ提示誘導物質構築物。
【請求項８】
前記少なくとも１つのＩＳＲ結合構築物及び／または前記少なくとも１つのＴＡＡ結合構築物が、ペプチドまたはポリペプチドである、請求項１〜７のいずれか１項に記載のＴＡＡ提示誘導物質構築物。
【請求項９】
前記少なくとも１つのＩＳＲ結合構築物が抗原結合ドメインであり、かつ／または前記少なくとも１つのＴＡＡ結合構築物が抗原結合ドメインである、請求項８に記載のＴＡＡ提示誘導物質構築物。
【請求項１０】
前記ＴＡＡ提示誘導物質が、２つ以上のＩＳＲ結合構築物を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載のＴＡＡ提示誘導物質。
【請求項１１】
前記２つ以上のＩＳＲ結合構築物が、２つ以上の異なるＩＳＲに結合する、請求項１０に記載のＴＡＡ提示誘導物質。
【請求項１２】
前記ＴＡＡ提示誘導物質が、２つ以上のＴＡＡ結合構築物を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載のＴＡＡ提示誘導物質。
【請求項１３】
前記２つ以上のＴＡＡ結合構築物が、異なる抗原に結合する、請求項１２に記載のＴＡＡ提示誘導物質。
【請求項１４】
前記少なくとも１つのＩＳＲ結合構築物及び前記少なくとも１つのＴＡＡ結合構築物が、互いに直接連結される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のＴＡＡ提示誘導物質。
【請求項１５】
前記少なくとも１つのＩＳＲ結合構築物及び前記少なくとも１つのＴＡＡ結合構築物が、リンカーにより互いに連結される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のＴＡＡ提示誘導物質。
【請求項１６】
前記リンカーがＦｃである、請求項１５に記載のＴＡＡ提示誘導物質。
【請求項１７】
前記ＴＡＡ提示誘導物質が、ＩＳＲ及びＴＡＡに結合する二重特異性抗体である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のＴＡＡ提示誘導物質。
【請求項１８】
薬物にコンジュゲートされる、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のＴＡＡ提示誘導物質構築物。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載のＴＡＡ提示誘導物質構築物を含む、医薬組成物。
【請求項２０】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載のＴＡＡ提示誘導物質構築物をコードする、１つ以上の核酸。
【請求項２１】
請求項２０に記載の１つ以上の核酸を含む、１つ以上のベクター。
【請求項２２】
請求項２０に記載の１つ以上の核酸、または請求項２１に記載の１つ以上のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項２３】
ａ）細胞において、請求項２０に記載の１つ以上の核酸または請求項２１に記載の１つ以上のベクターを発現させることを含む、
請求項１〜１８のいずれか一項に記載の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）提示誘導物質構築物を作製する、方法。
【請求項２４】
がんを治療する方法であって、それを必要とする対象に、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）提示誘導物質構築物を投与することを含む、前記方法。
【請求項２５】
対象において、単一の天然刺激受容体発現細胞による、２つ以上の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）由来ペプチドの主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）提示を同時に誘導する方法であって、前記対象に、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のＴＡＡ提示誘導物質構築物を投与することを含む、前記方法。
【請求項２６】
対象において、天然刺激受容体発現細胞の活性化を誘導する方法であって、前記対象に、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）提示誘導物質構築物を投与することを含む、前記方法。
【請求項２７】
対象において、ポリクローナルＴ細胞応答を誘導する方法であって、前記対象に、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）提示誘導物質構築物を投与することを含む、前記方法。
【請求項２８】
２つ以上の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的なＴ細胞を同時に拡大、活性化、または分化させる方法であって、
ａ）対象からＴ細胞及び天然刺激受容体（ＩＳＲ）発現細胞を得ることと、
ｂ）腫瘍細胞由来物質（ＴＣＤＭ）の存在下で、前記Ｔ細胞及び前記ＩＳＲ発現細胞を、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のＴＡＡ提示誘導物質構築物とともに培養して、拡大、活性化または分化したＴ細胞を生成することと
を含む、前記方法。
【請求項２９】
前記ＴＣＤＭが、自己由来組織試料に由来するか、または腫瘍細胞株に由来する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
対象のがんを治療する方法であって、前記対象に、請求項２８または２９に記載の方法に従って調製された前記拡大、活性化または分化したＴ細胞を投与することを含む、前記方法。
【請求項３１】
腫瘍細胞由来物質（ＴＣＤＭ）中の腫瘍関連抗原を特定する方法であって、
ａ）対象からＴ細胞及び濃縮された天然刺激受容体（ＩＳＲ）発現細胞を単離することと、
ｂ）腫瘍細胞由来物質（ＴＣＤＭ）の存在下で、前記ＩＳＲ発現細胞及び前記Ｔ細胞を、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のＴＡＡ提示誘導物質構築物とともに培養して、ＴＡＡ提示誘導物質構築物により活性化されたＩＳＲ発現細胞を生成することと、
ｃ）前記ＴＡＡ提示誘導物質構築物により活性化されたＩＳＲ発現細胞のＭＨＣ複合体から溶出されたＴＡＡペプチドの配列を決定することと、
ｄ）前記ＴＡＡペプチドに対応するＴＡＡを特定することと
を含む、前記方法。
【請求項３２】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）標的ポリペプチドを特定する方法であって、
ａ）対象からＴ細胞及び濃縮された天然刺激受容体（ＩＳＲ）発現細胞を単離することと、
ｂ）腫瘍細胞由来物質（ＴＣＤＭ）の存在下で、前記ＩＳＲ発現細胞及び前記Ｔ細胞を、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のＴＡＡ提示誘導物質構築物とともに培養して、ＴＡＡ提示誘導物質構築物により活性化されたＩＳＲ発現細胞及び活性化Ｔ細胞を生成することと、
ｃ）前記活性化Ｔ細胞をＴＡＡ候補ライブラリーに対してスクリーニングして、ＴＣＲ標的ポリペプチドを特定することと
を含む、前記方法。
【請求項３３】
がんの治療を必要とする対象のその治療における、治療上有効な量の請求項１〜１８のいずれか１項に記載の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）提示誘導物質構築物の使用。
【請求項３４】
がんの治療を必要とする対象におけるその治療のための薬剤の調製における、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）提示誘導物質構築物の使用。
【請求項３５】
単一の天然刺激受容体発現細胞による２つ以上の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）由来ペプチドの主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）提示の同時の誘導を必要とする対象におけるその誘導のための、治療上有効な量の請求項１〜１８のいずれか１項に記載のＴＡＡ提示誘導物質構築物の使用。
【請求項３６】
単一の天然刺激受容体発現細胞による２つ以上の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）由来ペプチドの主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）提示の同時の誘導を必要とする対象におけるその誘導のための薬剤の調製における、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のＴＡＡ提示誘導物質構築物の使用。
【請求項３７】
天然刺激受容体発現細胞の活性化の誘導を必要とする対象におけるその誘導のための、治療上有効な量の請求項１〜１８のいずれか１項に記載の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）提示誘導物質構築物の使用。
【請求項３８】
天然刺激受容体発現細胞の活性化の誘導を必要とする対象におけるその誘導のための薬剤の調製における、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）提示誘導物質構築物の使用。
【請求項３９】
ポリクローナルＴ細胞応答の誘導を必要とする対象におけるその誘導のための、治療上有効な量の請求項１〜１８のいずれか１項に記載の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）提示誘導物質構築物の使用。
【請求項４０】
ポリクローナルＴ細胞応答の誘導を必要とする対象におけるその誘導のための薬剤の調製における、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）提示誘導物質構築物の使用。
【請求項４１】
がんの治療を必要とする対象のその治療における、請求項２８または２９に記載の方法に従って調製された治療上有効な量の拡大、活性化または分化したＴ細胞の使用。
【請求項４２】
がんの治療を必要とする対象におけるその治療のための薬剤の調製における、請求項２８または２９に記載の方法に従って調製された拡大、活性化または分化したＴ細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
背景
腫瘍性形質転換には常に腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の出現が伴うが、多くの場合、自己寛容機構がＴＡＡ特異性Ｔリンパ球の活性化を制限する。それゆえ、免疫チェックポイントの遮断（例えば、抗ＣＴＬＡ−４及び抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１）はがん免疫療法に革命を起こしたが、既存のＴＡＡ特異的Ｔ細胞が不足していることにより、患者の大多数がいまだ不応性である（Ｙｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１  ＰＮＡＳ  １０８：１６７２３−１６７２８（非特許文献１））。内因性のＴＡＡ指向性Ｔ細胞応答を増やす治療は、長期間にわたって広範に作用する抗腫瘍免疫に必要であり得る。
【０００２】
ＴＡＡ耐性を克服するために多数の腫瘍ワクチンアプローチが試みられてきたが、ＴＡＡの発現が不均一であることから、限られた有効性しか示していない。例えば、ＴＡＡ発現を欠失または下方制御した形質転換細胞は、ワクチン接種後も生き残り、再発を促進し得る。新生物性細胞のＴＡＡ環境は、不均一かつ動的であることから、所定のＴＡＡ混合物に依存するワクチンアプローチは、最小限の有効性しかなく、そのため、複数の異なるＴＡＡに対する免疫学的寛容を克服し、進化するＴＡＡ発現パターンに適応する治療法が必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｙｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１  ＰＮＡＳ  １０８：１６７２３−１６７２８
【発明の概要】
【０００４】
概要
本明細書に記載されるのは、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）提示誘導物質構築物及びその使用である。本開示の一態様は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）提示誘導物質構築物であって、ａ）抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に発現される天然刺激受容体（ＩＳＲ）に結合する、少なくとも１つのＩＳＲ結合構築物と、ｂ）１つ以上の他のＴＡＡを含む腫瘍細胞由来物質（ＴＣＤＭ）と物理的に会合する第１のＴＡＡに直接結合する、少なくとも１つのＴＡＡ結合構築物とを含み、ここで、当該ＩＳＲ結合構築物及び当該ＴＡＡ結合構築物は、互いに連結され、当該ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、１つ以上の他のＴＡＡに対するポリクローナルＴ細胞応答を誘導する、ＴＡＡ提示誘導物質構築物に関する。
【０００５】
本開示の別の態様は、本明細書に記載されるＴＡＡ提示誘導物質構築物を含む、医薬組成物に関する。
【０００６】
本開示の別の態様は、本明細書に記載されるＴＡＡ提示誘導物質構築物をコードする、１つ以上の核酸に関する。
【０００７】
本開示の別の態様は、本明細書に記載されるＴＡＡ提示誘導物質構築物をコードする１つ以上の核酸を含む、１つ以上のベクターに関する。
【０００８】
本開示の別の態様は、本明細書に記載されるＴＡＡ提示誘導物質構築物をコードする１つ以上の核酸、または本明細書に記載されるＴＡＡ提示誘導物質構築物をコードする１つ以上の核酸を含む１つ以上のベクターを含む、宿主細胞に関する。
【０００９】
本開示の別の態様は、本明細書に記載される腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）提示誘導物質構築物を作製する方法であって、本明細書に記載されるＴＡＡ提示誘導物質構築物をコードする１つ以上の核酸、または本明細書に記載されるＴＡＡ提示誘導物質構築物をコードする１つ以上の核酸を含む１つ以上のベクターを細胞内で発現させることを含む、方法に関する。
【００１０】
本開示の別の態様は、がんを治療する方法であって、それを必要とする対象に、本明細書に記載される腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）提示誘導物質構築物を投与することを含む、方法に関する。
【００１１】
本開示の別の態様は、対象において、単一の天然刺激受容体発現細胞による、２つ以上の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）由来ペプチドの主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）提示を同時に誘導する方法であって、本明細書に記載されるＴＡＡ提示誘導物質構築物を対象に投与することを含む、方法に関する。
【００１２】
本開示の別の態様は、対象において天然刺激受容体発現細胞の活性化を誘導する方法であって、当該対象に、本明細書に記載される腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）提示誘導物質構築物を投与することを含む、方法に関する。
【００１３】
本開示の別の態様は、対象においてポリクローナルＴ細胞応答を誘導する方法であって、当該対象に、本明細書に記載される腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）提示誘導物質構築物を投与することを含む、方法に関する。
【００１４】
本開示の別の態様は、２つ以上の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的なＴ細胞を同時に拡大、活性化、または分化させる方法であって、対象からＴ細胞及び天然刺激受容体（ＩＳＲ）発現細胞を得ることと、Ｔ細胞及びＩＳＲ発現細胞を、腫瘍細胞由来物質（ＴＣＤＭ）の存在下で、本明細書に記載されるＴＡＡ提示誘導物質構築物とともに培養して、拡大、活性化または分化したＴ細胞を生成することと、を含む、方法に関する。
【００１５】
本開示の別の態様は、対象のがんを治療する方法であって、当該対象に、本明細書に記載される方法に従って調製された拡大、活性化または分化したＴ細胞を投与することを含む、方法に関する。
【００１６】
本開示の別の態様は、腫瘍細胞由来物質（ＴＣＤＭ）中の腫瘍関連抗原を特定する方法であって、対象からＴ細胞及び濃縮された天然刺激受容体（ＩＳＲ）発現細胞を単離することと、腫瘍細胞由来物質（ＴＣＤＭ）の存在下で、ＩＳＲ発現細胞及びＴ細胞を本明細書に記載のＴＡＡ提示誘導物質構築物とともに培養して、ＴＡＡ提示誘導物質構築物により活性化されたＩＳＲ発現細胞を生成することと、ＴＡＡ提示誘導物質構築物により活性化されたＩＳＲ発現細胞のＭＨＣ複合体から溶出されたＴＡＡペプチドの配列を決定することと、ＴＡＡペプチドに対応するＴＡＡを特定することと、を含む、方法に関する。
【００１７】
本開示の別の態様は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）標的ポリペプチドを特定する方法であって、対象からＴ細胞及び濃縮された天然刺激受容体（ＩＳＲ）発現細胞を単離することと、腫瘍細胞由来物質（ＴＣＤＭ）の存在下で、ＩＳＲ発現細胞及びＴ細胞を本明細書に記載のＴＡＡ提示誘導物質構築物とともに培養して、ＴＡＡ提示誘導物質構築物により活性化されたＩＳＲ発現細胞及び活性化Ｔ細胞を生成することと、活性化Ｔ細胞をＴＡＡ候補ライブラリーに対してスクリーニングして、ＴＣＲ標的ポリペプチドを特定することと、を含む、方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】例示的なＴＡＡ提示誘導物質構築物がどのようにしてＡＰＣをＴＣＤＭに標的化し得るのか、またはＴＣＤＭをＡＰＣに標的化し得るのかについて示す。本図において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、ＡＰＣ上に発現されるＩＳＲ、及びＴＡＡ１に結合する、二重特異性抗体である。新生物性細胞は、死滅する際に、腫瘍細胞由来物質（ＴＣＤＭ）とも呼ばれる、エキソソーム及びアポトーシス性／壊死性デブリを生じる。ＴＣＤＭは、複数のＴＡＡ、例えば、ＴＡＡ１〜６及びｎｅｏＴＡＡ１〜２を含む。ＴＡＡ提示誘導物質構築物のＴＡＡ１及びＩＳＲへの結合は、ＡＰＣなどの自然免疫細胞をＴＣＤＭに（またはＴＣＤＭをＡＰＣなどの自然免疫細胞に）標的化する。次いで、ＡＰＣは、ＴＣＤＭを内在化して、ＴＡＡ２〜６及びｎｅｏＴＡＡ１〜２のうちの１つ以上に対するポリクローナルＴ細胞応答を促進し得る。いくつかの実施形態において、ＡＰＣはまた、ＴＡＡ２〜６及びｎｅｏＴＡＡ１〜２のうちの１つ以上に加えて、ＴＡＡ１に対するポリクローナルＴ細胞応答を促進し得る。前述の説明は、例示を目的にするものであり、ＴＡＡ提示誘導物質構築物の種類もしくはＴＡＡの数の種類、または本図の他の態様を限定する意図は決してない。
【図２】二重特異性抗体フォーマットである、ＴＡＡ提示誘導物質構築物の例示的な一般フォーマットを示す。図２Ａ、２Ｂ及び２Ｄ中の構築物はＦｃを含むが、図２Ｃ中の構築物はＦｃを含まない。図２Ａは、一方の抗原結合ドメインがＦａｂであり、他方がｓｃＦｖである、Ｆａｂ−ｓｃＦｖフォーマットを表す。図２Ｂは、抗原結合ドメインの両方がＦａｂである、Ｆａｂ−Ｆａｂフォーマットを表す。このフォーマットは、フルサイズフォーマット（ＦＳＡ）とも称される。図２Ｃ及び２Ｄは、デュアルｓｃＦｖフォーマットであって、２つのｓｃＦｖが互いに連結されているもの（図２Ｃ）またはＦｃに連結されているもの（図２Ｄ）を示す。
【図３】二重特異性抗体フォーマットである、ＴＡＡ提示誘導物質構築物の更なる例示的なフォーマットを示す。凡例は、構築物の異なるセグメントを識別するものであり、異なる塗りつぶし（黒色と灰色）は、異なる標的に結合するセグメントを表すか、ヘテロ二量体Ｆｃを表すために使用されている。いくつかの場合、これらのフォーマットは、ＴＡＡまたはＩＳＲの標的に対して１を超える価数を呈する。図３Ａは、フォーマットＡ：Ａ＿ｓｃＦｖ＿Ｂ＿ｓｃＦｖ＿Ｆａｂを表し、重鎖ＡはｓｃＦｖを含み、重鎖ＢはｓｃＦｖ及びＦａｂを含む。図３Ｂは、フォーマットＢ：Ａ＿ｓｃＦｖ＿Ｆａｂ＿Ｂ＿ｓｃＦｖを表し、重鎖ＡはｓｃＦｖ及びＦａｂを含み、重鎖ＢはｓｃＦｖを含む。図３Ｃは、フォーマットＣ：Ａ＿Ｆａｂ＿Ｂ＿ｓｃＦｖ＿ｓｃＦｖを表し、重鎖ＡはＦａｂを含み、重鎖Ｂは２つのｓｃＦｖを含む。図３Ｄは、フォーマットＤ：Ａ＿ｓｃＦｖ＿Ｂ＿Ｆａｂ＿Ｆａｂを表し、重鎖ＡはｓｃＦｖを含み、重鎖Ｂは２つのＦａｂを含む。図３Ｅは、フォーマットＥ：ハイブリッドを表し、重鎖ＡはＦａｂを含み、重鎖Ｂは、ｓｃＦｖを含む。図３Ｆは、フォーマットＦ：Ａ＿Ｆａｂ＿ＣＲＴ＿Ｂ＿ＣＲＴを表し、重鎖ＡはＦａｂ及びカルレティキュリンを含み、重鎖Ｂはカルレティキュリン（ＣＲＴ）を含む。図３Ｇは、フォーマットＧ：Ａ＿Ｆａｂ＿ＣＲＴ＿Ｂ＿ＣＲＴ＿ＣＲＴを表し、重鎖ＡはＦａｂ及びカルレティキュリンを含み、重鎖Ｂは２つのカルレティキュリンポリペプチドを含む。
【図４】スプリットアルブミン足場を使用して設計されたＴＡＡ提示誘導物質構築物の例示的なフォーマットを示す。図中、「Ｔ」は、トラスツズマブｓｃＦｖを表し、「ＣＲＴ」は、カルレティキュリンの残基１８〜４１７を表す。フォーマットのバリアント１５０１９、１５０２５及び２２９２３〜２２９２７を示す。
【図５】ヘテロ二量体Ｆｃを足場として使用して設計されたＴＡＡ提示誘導物質構築物の例示的なフォーマットを示す。図中、「Ｔ」は、トラスツズマブｓｃＦｖを表し、「ＣＲＴ」は、カルレティキュリンの残基１８〜４１７を表す。フォーマットのバリアント２２９７６〜２２９８２、２１４７９、２３０４４、２２２７５及び２３０８５を示す。黒色と灰色の塗りつぶしは、ヘテロ二量体Ｆｃの個々のＦｃポリペプチドを区別するために使用されている。
【図６Ａ】ＨＥＫ２９３細胞において一過性に発現されるＨＥＲ２を標的にする構築物の天然標的結合を示す。図６ＡはＨＥＲ２結合を示す。
【図６Ｂ】ＨＥＫ２９３細胞において一過性に発現されるＲＯＲ１を標的にする構築物の天然標的結合を示す。図６ＢはＲＯＲ１結合を示す。
【図６Ｃ】ＨＥＫ２９３細胞において一過性に発現されるデクチン１を標的にする構築物の天然標的結合を示す図６Ｃはデクチン−１結合を示す。
【図６Ｄ】ＨＥＫ２９３細胞において一過性に発現されるＣＤ４０を標的にする構築物の天然標的結合を示す。図６ＤはＣＤ４０結合を示す。
【図６Ｅ】ＨＥＫ２９３細胞において一過性に発現されるＤＥＣ２０５を標的にする構築物の天然標的結合を示す。図６Ｅ及び図６Ｆは両図ともＤＥＣ２０５結合を示す。
【図６Ｆ】ＨＥＫ２９３細胞において一過性に発現されるＤＥＣ２０５を標的にする構築物の天然標的結合を示す。図６Ｅ及び図６Ｆは両図ともＤＥＣ２０５結合を示す。
【図７】Ｈ２２６細胞において内因的に発現されるメソテリン（ＭＳＬＮ）を標的にする構築物の天然結合を示す。
【図８】Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓのマウス抗カルレティキュリン（ＣＲＴ）ＭＡＢ３８９８抗体の、ＣＲＴアームを含有するＴＡＡ提示誘導物質構築物への可溶性結合を示す。
【図９】ＴＡＡ提示誘導物質構築物による腫瘍細胞物質の食作用の増強を示す。
【図１０Ａ】腫瘍細胞共培養における単球サイトカイン産生を増強するＴＡＡ提示誘導物質構築物の能力を示す。図１０Ａは、サイトカイン産生を増強する構築物Ｈｅｒ２×ＣＤ４０（ｖ１８５３２）の能力を示す。
【図１０Ｂ】腫瘍細胞共培養における単球サイトカイン産生を増強するＴＡＡ提示誘導物質構築物の能力を示す。図１０Ｂは、サイトカイン産生を増強する構築物Ｈｅｒ２×ＣＲＴ（ｖ１８５３５）の能力を示す。
【図１１】ＭｅｌａｎＡ濃縮ＣＤ８＋Ｔ細胞のＩＦＮγ産生に対するＴＡＡ提示誘導物質構築物の作用を示す。図１１Ａは、ＭｅｌａｎＡペプチドを含有するＯＶＣＡＲ３細胞とともにインキュベーションしたＡＰＣにおける作用を示し、図１１Ｂは、ＭｅｌａｎＡ−ＧＦＰ融合タンパク質をコードするプラスミドを含有するＯＶＣＡＲ３細胞とともにインキュベーションしたＡＰＣにおける作用を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
詳細な説明
本明細書に記載されるのは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に発現される少なくとも１つの天然刺激受容体（ＩＳＲ）に結合し、かつ少なくとも１つの第１のＴＡＡに直接結合する、多重特異性腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）提示誘導物質構築物である。いくつかの実施形態において、ＩＳＲは、Ｃ型レクチン受容体、腫瘍壊死因子ファミリー受容体またはリポタンパク質受容体であり得る。少なくとも１つの第１のＴＡＡは、第１のＴＡＡとは異なる１つ以上の他のＴＡＡを含むか、またはそれと物理的に会合する、腫瘍細胞由来物質（ＴＣＤＭ）と物理的に会合する抗原であり得る。ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、ＡＰＣ上の少なくとも１つのＩＳＲ及び少なくとも１つの第１のＴＡＡに結合して、ＴＣＤＭと物理的に会合する少なくとも１つ以上の他のＴＡＡに対するポリクローナルＴ細胞応答を誘導することができる。一実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、ＴＣＤＭと物理的に会合する１つ以上の他のＴＡＡに対するポリクローナルＴ細胞応答だけでなく、少なくとも１つの第１のＴＡＡに対するポリクローナルＴ細胞応答も誘導することができる。ＴＡＡ提示誘導物質構築物はまた、ＡＰＣのＴＡＡクロスプレゼンテーションも促進することができる。少なくとも１つの第１のＴＡＡは、ＴＡＡ提示誘導物質構築物の存在下で、種々のＴＡＡに対するポリクローナル免疫を促進する「ハンドル」として作用し得る。一実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、ＴＣＤＭのＴＡＡ組成が変化しても、複数のＴＡＡに対するポリクローナルＴ細胞応答を誘導する能力を維持することができる。
【００２０】
ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、対象のがんを治療するために使用され得る。本明細書に記載されるＴＡＡ提示誘導物質は、２つ以上のＴＡＡに特異的なＴ細胞を同時に拡大、活性化、または分化させ、ＴＣＤＭ中のＴＡＡを特定し、Ｔ細胞受容体標的ポリペプチドを特定するためにも使用され得る。
【００２１】
定義
別途の定義がない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、特許請求される主題が属する技術分野の当業者に一般的に理解される意味と同様の意味を有する。本明細書中の用語に対して複数の定義がある場合は、本項の定義が優先する。ＵＲＬまたは他のそのような識別子もしくはアドレスへの参照がある場合、かかる識別子は変わることがあり、インターネット上の特定情報は絶えず入れ替わるが、インターネットを検索することにより、同等の情報を得ることができることは理解される。当該参照は、かかる情報の入手可能性及び公的普及を証明するものである。
【００２２】
上述の一般的な説明及び以下の詳細な説明は、例示的かつ説明的なものにすぎず、特許請求される主題を限定するものではないことを理解されたい。本出願において、単数形の使用は、特に明記しない限り、複数形を含む。
【００２３】
本発明の説明において、あらゆる濃度範囲、パーセンテージ範囲、比率範囲または整数範囲は、特に指定のない限り、列挙された範囲内のあらゆる整数値、及び該当する場合にはその端数（整数の１／１０及び１／１００など）を含むものと理解される。本明細書で使用されるとき、「約」とは、特に指定のない限り、指定された範囲、値、配列または構造の±１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％または１０％を意味する。本明細書で使用される「ａ」及び「ａｎ」という用語は、特に指定のない限り、またはその文脈で指示されない限り、列挙された要素のうちの「１つ以上」を指すことを理解されたい。選択（例えば、「または」）の使用は、その選択肢の１つ、両方またはそれらの任意の組み合わせを意味すると理解されたい。本明細書で使用されるとき、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語は、同義に使用される。
【００２４】
本明細書で使用される段落見出しは、単なる構成上の目的であり、記載される主題の限定を意図するものではない。特許、特許出願、記事、書籍、マニュアル及び論文を含むが、これらに限定されない、本出願において引用される全ての文書または文書の一部は、いかなる目的に対しても、その全体が参照により本明細書に明示的に援用される。
【００２５】
本明細書に記載される方法及び組成物は、本明細書に記載される特定の方法論、手順、細胞株、構築物及び試薬に限定されるものではなく、そのため、変わり得ることを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的にし、本明細書に記載される方法及び組成物の範囲を限定する意図はなく、当該範囲は、添付する特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解されたい。
【００２６】
本明細書で言及される全ての公開物及び特許は、例えば、本明細書に記載される方法、組成物及び化合物に関連して使用され得る、当該公開物に記載されている構築物及び方法論を説明及び開示する目的で、その全体が参照により本明細書に援用される。本明細書で考察される公開物は、本出願の出願日以前の開示についてのみ、提供される。本明細書におけるいかなる記載も、本明細書に記載される発明者らが、先行発明に基づいて、または任意の他の理由により、かかる開示に先行する権利がないという自認を構成するものではない。
【００２７】
本出願において，アミノ酸名及び原子名（例えば、Ｎ、Ｏ、Ｃなど）は、ＩＵＰＡＣ命名法（ＩＵＰＡＣ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｓｙｍｂｏｌｉｓｍ  ｆｏｒ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（ｒｅｓｉｄｕｅ  ｎａｍｅｓ，ａｔｏｍ  ｎａｍｅｓ  ｅｔｃ．）），Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３８，９−３７（１９８４）及びＥｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１５２，１（１９８５）における修正に基づいたＰｒｏｔｅｉｎ  ＤａｔａＢａｎｋ（ＰＤＢ）（ｗｗｗ．ｐｄｂ．ｏｒｇ）による定義のとおりに使用される。「アミノ酸残基」という用語は、主に、２０個の天然アミノ酸、すなわち、アラニン（ＡｌａまたはＡ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）、グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、グリシン（ＧｌｙまたはＧ）、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、リシン（ＬｙｓまたはＫ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、トレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、バリン（ＶａｌまたはＶ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）及びチロシン（ＴｙｒまたはＹ）の各残基からなる群に含まれるアミノ酸残基を指すことが意図される。
【００２８】
抗体技術分野の当業者によって理解される用語は、本明細書で明確に異なるように定義されない限り、当該技術分野において獲得されている意味がそれぞれ与えられる。抗体は、可変領域、ヒンジ領域及び定常ドメインを有することが知られている。免疫グロブリンの構造及び機能は、例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １４（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８８）に概説されている。
【００２９】
「バリアント」及び「構築物」という用語は、互換的に使用される。例えば、バリアント２２２１１、構築物２２２１１及びｖ２２２１１は、同じＴＡＡ提示誘導物質構築物を指す。
【００３０】
本明細書で使用されるとき、「抗体」及び「免疫グロブリン」または「抗原結合構築物」という用語は、互換的に使用される。「抗原結合構築物」は、アナライト（抗原）に特異的に結合する、免疫グロブリン遺伝子（複数可）、または１つ以上のその断片によって実質的にコードされるポリペプチドを指す。認識されている免疫グロブリン遺伝子には、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン及びミューの定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖は、カッパまたはラムダのいずれかに分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはイプシロンに分類され、これらは、免疫グロブリンのアイソタイプＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥをそれぞれ定義する。更に、抗体は、多数のサブタイプのうちの１つに属し得、例えば、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のサブタイプに属し得る。
【００３１】
例示的な免疫グロブリン（抗体）の構造単位は、２対のポリペプチド鎖から構成され、各対は、１本の免疫グロブリン「軽」鎖（約２５ｋＤ）と、１本の免疫グロブリン「重」鎖（約５０〜７０ｋＤ）を有する。このタイプの免疫グロブリンまたは抗体構造単位は、「天然に存在するもの」とみなされる。「軽鎖」という用語は、完全長軽鎖、及び結合特異性を付与するのに十分な可変ドメイン配列を有するその断片を含む。完全長軽鎖は、可変ドメインＶＬと、定常ドメインＣＬとを含む。軽鎖の可変ドメインは、ポリペプチドのアミノ末端に位置する。軽鎖は、カッパ鎖及びラムダ鎖を含む。「重鎖」という用語は、完全長重鎖、及び結合特異性を付与するのに十分な可変領域配列を有するその断片を含む。完全長重鎖は、可変ドメインＶＨと、３つの定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３とを含む。ＶＨドメインは、ポリペプチドのアミノ末端に位置し、ＣＨドメインは、カルボキシ末端に位置し、ＣＨ３がポリペプチドのカルボキシ末端に最も近い。重鎖は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４サブクラスを含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１及びＩｇＡ２サブクラスを含む）、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＥを含む、いずれのアイソタイプであってよい。「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、一般的に抗原認識に関与する抗体の軽鎖及び／または重鎖の一部分を指し、典型的に、重鎖（ＶＨ）のアミノ末端の約１２０〜１３０アミノ酸及び軽鎖（ＶＬ）のアミノ末端の約１００〜１１０アミノ酸を含む。
【００３２】
「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」は、抗原結合特異性及び親和性に寄与するアミノ酸配列である。「フレームワーク」領域（ＦＲ）は、抗原結合領域と抗原との間の結合を促進する、ＣＤＲの適切な立体配置を維持するのに役立ち得る。構造上、フレームワーク領域は、抗体中、ＣＤＲ間に位置し得る。可変領域は、典型的に、３つの超可変領域であるＣＤＲによって連結された比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）からなる同じ一般構造を示す。各対の２本の鎖に由来するＣＤＲは、典型的に、フレームワーク領域によって整列され、これにより、特定のエピトープに結合することができる。軽鎖及び重鎖の両可変領域は、Ｎ末端からＣ末端へ、典型的に、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４のドメインを含む。アミノ酸の各ドメインへの割り当ては、典型的に、特に指定のない限り、Ｋａｂａｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７  ａｎｄ  １９９１））の定義に従う。
【００３３】
非ヒト（例えば、齧歯類）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有するキメラ抗体である。主に、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であって、レシピエントの超可変領域に由来する残基が、所望の特異性、親和性及び能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域に由来する残基によって置き換えられている抗体である。いくつかの場合において、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）の残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にもみられない残基を含んでもよい。これらの修飾は、抗体の性能を更に改良するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的に２つの可変ドメインのほぼ全てを含み、ここで、超可変領域の全てまたはほぼ全ては、非ヒト免疫グロブリンの超可変領域に相当し、ＦＲの全てまたはほぼ全ては、ヒト免疫グロブリン配列のＦＲである。ヒト化抗体はまた、任意選択的に、免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）、典型的にヒト免疫グロブリンのＦｃの少なくとも一部分を含む。更なる詳細については、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）；及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照されたい。
【００３４】
「抗原結合構築物」または「抗体」は、少なくとも１つの異なる抗原またはエピトープを標的とするか、またはそれらに結合するものである。「二重特異性」、「デュアル特異性」または「二価」の抗原結合構築物または抗体は、２つの異なる抗原またはエピトープを標的にするか、またはそれらに結合する抗原結合構築物の一種である。一般に、二重特異性抗原結合構築物は、２つの異なる抗原結合ドメインを有し得る。二重特異性抗原結合構築物または抗体の２つの抗原結合ドメインは、同じまたは異なる分子標的上に存在し得る、２つの異なるエピトープに結合する。一実施形態において、二重特異性抗原結合構築物は、本明細書においてフルサイズ（ＦＳＡ）フォーマットとも称される、天然に存在するフォーマットである。言い換えれば、二重特異性抗原結合構築物は、天然に存在するＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤまたはＩｇＥ抗体と同じフォーマットを有する。
【００３５】
当該技術分野において知られているように、抗原結合ドメインは、異なるフォーマットのものであってもよく、いくつかの非限定的な例としては、以下に記載される、Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、ＶＨＨまたはｓｄＡｂが挙げられる。更に、抗原結合ドメインのタイプを変更する方法は、当該技術分野において知られている（例えば、Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ（２０１２）Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  １１：１１６７−１４７６に記載されているｓｃＦｖをＦａｂフォーマットに変更するための方法を参照されたい）。したがって、ある抗体が、ｓｃＦｖである抗原結合ドメインを含むフォーマットで利用可能であるが、ＴＡＡ提示誘導物質構築物がＦａｂである抗原結合ドメインを要する場合、当業者であれば、かかる変更及びその逆の変更を行うことが可能であろう。
【００３６】
「Ｆａｂ断片」（抗原結合断片とも称される）は、軽鎖及び重鎖上に、可変ドメインＶＬ及びＶＨに加えて、軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）及び重鎖の定常ドメイン１（ＣＨ１）をそれぞれ含有する。可変ドメインは、抗原結合に関与するＣＤＲを含む。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域に由来する１つ以上のシステインを含む数個のアミノ酸残基が重鎖ＣＨ１ドメインのＣ末端に付加されている点で、Ｆａｂ断片とは異なる。
【００３７】
「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」は、一本鎖のポリペプチド鎖中に、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含む。ｓｃＦｖポリペプチドは、任意選択的に、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間に、抗原結合に望ましい構造の形成を可能にするポリペプチドリンカーを更に含み得る。ｓｃＦｖの概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照されたい。
【００３８】
「単一ドメイン抗体」または「ｓｄＡｂ」フォーマットは、単一の免疫グロブリンドメインを指す。ｓｄＡｂは、例えば、ラクダ起源であり得る。ラクダ抗体は、軽鎖を欠き、その抗原結合部位は、「ＶＨＨ」と呼ばれる単一のドメインからなる。ｓｄＡｂは、抗原結合部位を形成する３つのＣＤＲ／超可変ループ：ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む。ｓｄＡｂは、かなり安定しており、抗体のＦｃ鎖と融合させた発現が容易である（例えば、Ｈａｒｍｓｅｎ  ＭＭ，Ｄｅ  Ｈａａｒｄ  ＨＪ（２００７）“Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｃａｍｅｌｉｄ  ｓｉｎｇｌｅ−ｄｏｍａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ，”  Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７７（１）：１３−２２参照）。
【００３９】
抗体重鎖は、抗体軽鎖と対合し、１つ以上の「界面」で相接するか、または互いに接触する。「界面」は、第１のポリペプチド中に、第２のポリペプチドの１つ以上の「接触」アミノ酸残基と相互作用する「接触」アミノ酸残基を１つ以上含む。例えば、界面は、二量体化したＦｃ領域の２つのＣＨ３ドメイン間、重鎖のＣＨ１ドメインと軽鎖のＣＬドメインとの間、及び重鎖のＶＨドメインと軽鎖のＶＬドメインとの間に存在する。「界面」は、ＩｇＧ抗体、例えば、ヒトＩｇＧ１抗体に由来し得る。
【００４０】
本明細書で使用される「アミノ酸修飾」という用語は、アミノ酸の挿入、欠失、置換、化学修飾、物理的修飾及び再配列を含むが、これらに限定されない。
【００４１】
免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖のアミノ酸残基は、いくつかの常法に従ってナンバリングすることができ、これらには、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ  ａｎｄ  Ｗｕ，１９９１；Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ．５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  −  ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｎｏ．９１−３２４２，ｐ  ６４７（１９９１）に記載のもの）、ＩＭＧＴ（Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．ＩＭＧＴ（登録商標），ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，３７，Ｄ１００６−Ｄ１０１２（２００９）及びＬｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．，ＩＭＧＴ，ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ  Ｐｒｏｔｏｃ．２０１１  Ｊｕｎ  １；２０１１（６）に記載のもの）、１ＪＰＴ（Ｋａｔｊａ  Ｆａｅｌｂｅｒ，Ｄａｎｉｅｌ  Ｋｉｒｃｈｈｏｆｅｒ，Ｌｅｏｎａｒｄ  Ｐｒｅｓｔａ，Ｒｏｂｅｒｔ  Ｆ  Ｋｅｌｌｅｙ，Ｙｖｅｓ  Ａ  Ｍｕｌｌｅｒ，Ｔｈｅ  １．８５  Å  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｗｉｔｈ  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ｆａｂ  ｄ３ｈ４４  ａｎｄ  ｏｆ  ｆｒｅｅ  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ｆａｂ  ｄ３ｈ４４：ｒｅｖｉｓｉｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｏｌｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ１，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ３１３，Ｉｓｓｕｅ  １，Ｐａｇｅｓ  ８３−９７に記載のもの）及びＥＵ（ＥＵ抗体ナンバリングに言及するＫａｂａｔにおけるＥＵインデックスによるもの（Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９６９，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ６３：７８−８５））が挙げられる。ＶＨ、ＣＨ１、ＣＬ及びＶＬドメインについては、特に指定のない限り、Ｋａｂａｔナンバリングが本明細書で使用される。ＣＨ３及びＣＨ２ドメインならびにヒンジ領域については、特に指定のない限り、ＥＵナンバリングが本明細書で使用される。
【００４２】
ＴＡＡ提示誘導物質構築物
本明細書に記載されるのは、互いに連結された、少なくとも１つの天然刺激受容体（ＩＳＲ）結合構築物及び少なくとも１つの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）結合構築物を含む、ＴＡＡ提示誘導物質構築物である。ＩＳＲ結合構築物は、ＡＰＣ上に発現されるＩＳＲに結合し、ＴＡＡ結合構築物は、本明細書において「１つ以上の第２のＴＡＡ」とも称される１つ以上の他のＴＡＡを含むか、またはそれと物理的に会合する、腫瘍細胞由来物質（ＴＣＤＭ）と物理的に会合する、少なくとも１つの第１のＴＡＡまたは「ハンドルＴＡＡ」に結合する。理論または機序に限定されるものではないが、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、ＡＰＣをＴＣＤＭに標的化するように作用し、またはＴＣＤＭをＡＰＣに標的化するように作用し、第２のＴＡＡのうちの１つ以上に対するポリクローナルＴ細胞応答を誘導し得る。いくつかの実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、ＡＰＣをＴＣＤＭに標的化するように作用し、またはＴＣＤＭをＡＰＣに標的化するように作用し、第２のＴＡＡのうちの１つ以上に加えて、第１のＴＡＡに対するポリクローナルＴ細胞応答を誘導し得る。図１は、ＴＡＡ提示誘導物質構築物がどのようにしてＡＰＣをＴＣＤＭに標的化し得るのか、またはＴＣＤＭをＡＰＣに標的化し得るのかについて示した図を提供する。いくつかの実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物はまた、ＡＰＣによるＴＣＤＭの獲得を誘導し得、すなわち、ＴＣＤＭがＡＰＣの表面に物理的に付着することを促進し得る。一実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、ＡＰＣによるＴＣＤＭの獲得及び内在化を誘導し得る。
【００４３】
一実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、新生物性細胞の不均質性及び動的性質に適応することができる、ポリクローナルＴ細胞応答を誘導することができる。
【００４４】
いくつかの実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、複数の異なるＴＡＡに由来する１つ以上のＴＣＤＭ由来ペプチドのＭＨＣクロスプレゼンテーションを促進することができる。一実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、ＡＰＣ活性化及び／または１つ以上のＴＣＤＭ由来ペプチドを提示するＡＰＣの成熟を誘導することができる。
【００４５】
一実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、第１のＴＡＡまたはハンドルＴＡＡと、１つ以上の第２のＴＡＡの両方に対するポリクローナルＴ細胞応答を誘導し得る。「ポリクローナルＴ細胞応答」という用語は、特定の抗原を認識する複数のＴ細胞クローンの活性化を指す。一実施形態において、ポリクローナルＴ細胞応答は、ＭＨＣクラスＩ、ＩＩまたは非古典的ＭＨＣ拘束性であり得る。種々の実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、ポリクローナルＴ細胞応答を誘導し得、ここで、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋αβＴ細胞、ＣＤ４＋αβＴ細胞、γδＴ細胞またはＮＫＴ（ナチュラルキラーＴ）細胞から選択される。いくつかの実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、クローンの拡大及び増殖を伴い、細胞傷害性及び／または「ヘルパー」機能の獲得を伴い得る、ポリクローナルＴ細胞応答を誘導し得る。ヘルパー機能は、サイトカイン、ケモカイン、成長因子及び／または共刺激細胞表面受容体の発現を伴い得る。
【００４６】
「腫瘍細胞由来物質」または「ＴＣＤＭ」という用語は、新生物性細胞または形質転換細胞を起源にする、タンパク質、脂質、炭水化物、核酸、グリカンまたはそれらの組み合わせなどの細胞成分物質を指す。ＴＣＤＭはまた、ダメージ関連分子パターン（ＤＡＭＰ）も含み得る。エキソソーム、アポトーシス性デブリ及び壊死性デブリがＴＣＤＭの非限定的な例である。したがって、ＴＣＤＭは、本明細書に記載されるハンドルＴＡＡ及び第２のＴＡＡを含む、多数のＴＡＡを含む。
【００４７】
天然刺激受容体（ＩＳＲ）結合構築物
本明細書に記載されるＴＡＡ提示誘導物質構築物の少なくとも１つのＩＳＲ結合構築物は、自然免疫細胞の表面上、またはＭＨＣクラスＩ及び／またはＭＨＣクラスＩＩを発現する他の細胞上に発現され、Ｔリンパ球の活性化を媒介することができる、ＩＳＲに結合する。ＩＳＲは、自然免疫細胞において活性化シグナルを誘導することができる細胞表面受容体であり得る。活性化シグナルは、生存、増殖、成熟、サイトカイン分泌、食作用、飲作用、受容体内在化、抗原提示のためのリガンドプロセシング、接着、管外遊出及び／またはリンパもしくは血液循環への輸送を増加させるものを含み得る。ＩＳＲは、マスト細胞、貪食細胞、好塩基球、好酸球、ナチュラルキラー細胞及びγδＴ細胞を含む、自然免疫細胞及び他の細胞種によって発現され得る。一実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、自然免疫細胞の表面上に発現されるＩＳＲに結合する、少なくとも１つのＩＳＲ結合構築物を含む。一実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、ヒト自然免疫細胞、カニクイザル自然免疫細胞、アカゲザル自然免疫細胞またはマウス自然免疫細胞の表面上に発現されるＩＳＲに結合する、少なくとも１つのＩＳＲ結合構築物を含む。
【００４８】
一実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、食作用性自然免疫細胞、またはＭＨＣクラスＩ及び／またはＭＨＣクラスＩＩを発現する他の細胞種の表面上に発現されるＩＳＲに結合する、少なくとも１つのＩＳＲ結合構築物を含む。一実施形態において、自然免疫細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）である。一実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、造血系ＡＰＣの表面上に発現されるＩＳＲに結合する、少なくとも１つのＩＳＲ結合構築物を含む。造血系ＡＰＣの例としては、樹状細胞、マクロファージまたは単球が挙げられる。一実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、リンパ起源のＡＰＣの表面上に発現されるＩＳＲに結合する、少なくとも１つのＩＳＲ結合構築物を含む。Ｂ細胞は、リンパ起源のＡＰＣの一例である。いくつかの炎症状況において、上皮細胞または内皮細胞などの非免疫細胞は、ＡＰＣの能力を獲得し得る。したがって、いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＩＳＲ結合構築物は、ＡＰＣとして作用する上皮細胞または内皮細胞の表面上に発現される受容体に結合する。
【００４９】
一実施形態において、ＡＰＣは、細胞関連ＴＡＡをクロスプレゼンテーションすることができる、ＡＰＣであり得る。
【００５０】
ＩＳＲは、ＡＰＣの表面上に発現され、自然免疫応答、多くの場合は病原体に対する応答に関与する。天然リガンドまたは人工リガンドに結合すると、ＩＳＲは、多数の細胞応答を促進することができ、これらには、ＡＰＣ活性化、サイトカイン産生、ケモカイン産生、接着、食作用、飲作用、抗原提示及び／または共刺激細胞表面受容体の上方制御が含まれるが、これらに限定されない。当該技術分野で知られているように、ＩＳＲには様々な種類がある。一実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、ＡＰＣの表面上に発現される、Ｃ型レクチン受容体、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体スーパーファミリーのメンバーまたはｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）ファミリーのメンバーに結合する、少なくとも１つのＩＳＲ結合構築物を含む。好適なＣ型レクチン受容体には、デクチン−１、デクチン−２、ＤＥＣ２０５、Ｍｉｎｃｌｅ及びＤＣ−ＳＩＧＮが含まれるが、これらに限定されない。好適なＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーのメンバーには、ＴＮＦＲＩ、ＴＮＦＲＩＩ、４−１ＢＢ、ＤＲ３、ＣＤ４０、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ及びＲＡＮＫが含まれるが、これらに限定されない。好適なＴＬＲファミリーのメンバーには、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ８及びＴＬＲ１１が含まれる。別の実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質は、例えば、ＬＲＰ−１（ＬＤＬ受容体関連タンパク質−１）、ＣＤ３６、ＬＯＸ−１またはＳＲ−Ｂ１などのリポタンパク質受容体に結合する、少なくとも１つのＩＳＲ結合構築物を含む。
【００５１】
一実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、樹状細胞上に発現されるＣ型レクチン受容体に結合する、少なくとも１つのＩＳＲ結合構築物を含む。一実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、デクチン−１に結合する、少なくとも１つのＩＳＲ結合構築物を含む。一実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、ＤＥＣ２０５に結合する、少なくとも１つのＩＳＲ結合構築物を含む。
【００５２】
一実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、ＣＬＥＣ９Ａ（ＤＮＧＲ１またはＣＤ３７０としても知られる）以外のＩＳＲに結合する、少なくとも１つのＩＳＲ結合構築物を含む。一実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質は、ＣＬＥＣ９Ａ以外のＣ型レクチン受容体に結合する、少なくとも１つのＩＳＲ結合構築物を含む。一実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、ＣＤ４０以外のＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーに結合する、少なくとも１つのＩＳＲ結合構築物を含む。一実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、Ｔｏｌｌ様受容体ファミリー以外のファミリーに由来するＩＳＲに結合する、少なくとも１つのＩＳＲ結合構築物を含む。
【００５３】
一実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、ＬＲＰ−１に結合する、少なくとも１つのＩＳＲ結合構築物を含む。
【００５４】
一実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、結合するＩＳＲの活性化を促進することができる、少なくとも１つのＩＳＲ結合構築物を含む。「ＩＳＲの活性化」は、ＩＳＲを発現するＡＰＣ内の細胞内シグナル伝達の開始を指し、これにより、抗原の取り込み、プロセシング及び提示が生じ得る。
【００５５】
少なくとも１つのＩＳＲ結合構築物は、ＩＳＲに対するリガンド、またはＩＳＲに結合することができる他の部分であり得る。したがって、一実施形態において、少なくとも１つのＩＳＲ結合構築物は、ＩＳＲに対する内因性リガンド、病原性リガンドまたは合成リガンドである。かかるリガンドは、当該技術分野において知られており，例えば、Ａｐｏｓｔｏｌｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２０１３，Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ８６９７１８またはＤｅｉｓｓｅｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２０１３  Ｆｅｂ；２０（２）：６５−９，Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ２３２３８５９３に記載されている。例えば、ＩＳＲがデクチン−１である場合、少なくとも１つのＩＳＲ結合構築物は、β−グルカンまたはビメンチンであり得る。別の例として、ＩＳＲがＤＣ−ＳＩＧＮである場合、少なくとも１つのＩＳＲ結合構築物は、マンナン、ＩＣＡＭまたはＣＥＡＣＡＭであり得る。最後に、ＩＳＲがＬＲＰ−１である場合、少なくとも１つのＩＳＲ結合構築物は、カルレティキュリンであり得る。
【００５６】
あるいは、少なくとも１つのＩＳＲ結合構築物は、ＩＳＲを標的にすることができる部分であり得、抗体または非抗体の形態であり得る。一実施形態において、少なくとも１つのＩＳＲ結合構築物は、抗体である。別の実施形態において、少なくとも１つのＩＳＲ結合構築物は、抗原結合ドメインである。「抗原結合ドメイン」という用語は、抗体断片、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ、ＶＨＨなどを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＩＳＲ結合構築物は、１つ以上のＦｃに連結された１つ以上の抗原結合ドメイン（例えば、Ｆａｂ、ＶＨＨまたはｓｃＦｖ）を含み得る。「抗体」という用語は、本明細書に別途詳述されており、少なくとも１つのＩＳＲ結合構築物の例示的な抗体フォーマットは、実施例において記載され、図２に示される。
【００５７】
ＩＳＲに結合することができる抗体は、当該技術分野において知られている。例えば、Ｃ型レクチン受容体のデクチン−１に対するモノクローナル抗体は、国際特許公開第ＷＯ２００８／１１８５８７号に記載され、ＤＥＣ２０５に対する抗体は、国際特許公開第ＷＯ２００９／０６１９９６号に記載され、ＣＤ４０に対する抗体は、米国特許出願公開第２０１０／０２３９５７５号に記載されている。他のそのような抗体は、例えば、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ及びＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈなどの企業から市販されている。ヒト抗体が望まれ、マウス抗体が利用可能である場合、そのマウス抗体を当該技術分野において知られている方法及び本明細書に別途記載する方法によって「ヒト化」することができる。
【００５８】
あるいは、目的の特定のＩＳＲに対する抗体を標準的な技術によって作製し、それをＴＡＡ提示誘導物質構築物の少なくとも１つのＩＳＲ結合構築物を調製する土台として使用してもよい。簡潔に述べれば、既知のＩＳＲに対する抗体は、精製されたＩＳＲタンパク質をウサギに免疫付与し、ウサギの血液から血清を調製し、その血清を正常血漿画分に吸収させて、ＩＳＲタンパク質に特異的な抗体を産生することによって、調製することができる。ＩＳＲタンパク質に対するモノクローナル抗体調製物は、精製されたタンパク質をマウスに注射し、脾臓及びリンパ節細胞を採取し、これらの細胞をマウス骨髄腫細胞と融合させ、得られたハイブリドーマ細胞を使用して、モノクローナル抗体を産生することによって、調製され得る。これらの方法は両方とも当該技術分野において知られている。いくつかの実施形態において、これらの方法から得られた抗体は、本明細書に別途記載するようにヒト化され得る。
【００５９】
ヒト化に代わるものとして、ヒト抗体を作製することができる。例えば、免疫化すると、内因性免疫グロブリンの産生なくヒト抗体の完全レパートリーを産生することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を使用することができる。例えば、キメラ及び生殖細胞系変異マウスにおける抗体重鎖結合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合欠失が、内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。かかる生殖細胞系変異マウスにヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイを移入すると、抗原刺激時に、ヒト抗体の産生がもたらされる。かかる生殖細胞系変異マウスにヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイを移入すると、抗原刺激時に、ヒト抗体の産生がもたらされる。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２５５１；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５−２５８；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．７：３３；ならびに米国特許第５，５９１，６６９号、同第５，５８９，３６９号、同第５，５４５，８０７号、同第６，０７５，１８１号、同第６，１５０，５８４号、同第６，６５７，１０３号及び同第６，７１３，６１０号を参照されたい。
【００６０】
あるいは、ファージディスプレイ技術（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５３参照）を使用して、免疫化されていないドナーに由来する免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーからヒト抗体及び抗体断片をｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生することができる。この技術に従って、抗体Ｖドメイン遺伝子を、Ｍ１３またはｆｄなどの繊維状バクテリオファージのメジャーまたはマイナーコートタンパク質遺伝子のいずれかにインフレームでクローニングすると、これがファージ粒子の表面上に機能性抗体断片として提示される。繊維状粒子がファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含有するので、抗体の機能的特性に基づいて選択することで、これらの特性を呈示する抗体をコードする遺伝子も選択される。したがって、ファージは、Ｂ細胞の性質の一部を再現するものである。ファージディスプレイは、種々のフォーマットで実施することができ、その概説については、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈｉｓｗｅｌｌ，１９９３，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：５６４−５７１を参照されたい。Ｖ遺伝子セグメントのいくつかの供給源をファージディスプレイに使用することができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８は、免疫化マウスの脾臓から得られたＶ遺伝子の小さなランダムコンビナトリアルライブラリーから、多種多様な抗オキサゾロン抗体アレイを単離した。Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７またはＧｒｉｆｆｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：７２５−７３４に記載の技術に本質的に従えば、免疫化されていないヒトドナーに由来するＶ遺伝子レパートリーを構築することができ、多種多様な抗原アレイ（自己抗原を含む）に対する抗体を単離することができる。米国特許第５，５６５，３３２号及び同第５，５７３，９０５号も参照されたい。ヒト抗体はまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性化Ｂ細胞によって作製することもできる（米国特許第５，５６７，６１０号及び同第５，２２９，２７５号参照）。
【００６１】
したがって、一実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、抗デクチン−１抗体に由来する、少なくとも１つのＩＳＲ結合構築物を含む。一実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、抗ＤＥＣ２０５抗体に由来する、少なくとも１つのＩＳＲ結合構築物を含む。一実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、抗ＣＤ４０抗体に由来する、少なくとも１つのＩＳＲ結合構築物を含む。一実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、抗ＬＲＰ−１抗体に由来する、少なくとも１つのＩＳＲ結合構築物を含む。
【００６２】
他の実施形態において、少なくとも１つのＩＳＲ結合構築物は、非抗体形態であり得る。いくつかの非抗体形態が当該技術分野において知られており、アフィボディ、アフィリン、アンチカリン、アトリマー、ＤＡＲＰｉｎ、ＦＮ３足場（例えば、アドネクチン及びセンチリン）、フィノマー、Ｋｕｎｉｔｚドメイン、プロネクチン及びＯＢｏｄｙなどがある。これらの非抗体形態及び他の非抗体形態は、抗体と同様の標的結合親和性及び特異性を有する分子をもたらすように工学的に操作することができる（Ｖａｚｑｕｅｚ−Ｌｏｍｂａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ  ２０：１２７１−１２８３及びＦｉｅｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）ｐｐ．４３５−４７４，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，２ｎｄ  ｅｄ．，ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｓｔｅｆａｎ  Ｄｕｂｅｌ  ａｎｄ  Ｊａｎｉｃｅ  Ｍ．Ｒｅｉｃｈｅｒｔ，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ  ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧａＡ）。
【００６３】
腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）結合構築物
本明細書に記載されるＴＡＡ提示誘導物質構築物の少なくとも１つのＴＡＡ結合構築物は、１つ以上の他のＴＡＡを含む腫瘍細胞由来物質（ＴＣＤＭ）と物理的に会合する、第１のＴＡＡに直接結合する。「他のＴＡＡ」はまた、本明細書において、「第２のＴＡＡ」と称されることもある。第２のＴＡＡもまた、ＴＣＤＭと物理的に会合し得る。「ＴＣＤＭと物理的に会合する」という用語は、第１のＴＡＡとＴＣＤＭとの間、または第２のＴＡＡとＴＣＤＭとの間の共有結合的及び／または非共有結合的相互作用を含むことが意図される。非共有結合的相互作用は、例えば、静電相互作用またはファンデルワールス相互作用を含み得る。「直接結合する」という用語は、第１のＴＡＡとＴＡＡ結合構築物との間の架橋要素がない状態における、第１のＴＡＡとＴＡＡ提示誘導物質構築物のＴＡＡ結合構築物との間の直接的相互作用を記載することが意図される。対照的に、いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＴＡＡ結合構築物は、第１のＴＡＡを介して「間接的に」１つ以上の第２のＴＡＡに結合し得、ここで、第１のＴＡＡは、架橋要素として作用し得る。
【００６４】
本明細書で使用されるとき、「腫瘍関連抗原」または「ＴＡＡ」は、がん細胞によって発現される抗原を指す。腫瘍関連抗原は、正常細胞によって発現されることもあれば、発現されないこともある。ＴＡＡが正常細胞によって発現されない場合（すなわち、腫瘍細胞に特有である場合）、ＴＡＡは、「腫瘍特異的抗原」と称されることもある。ＴＡＡが腫瘍細胞に特有でない場合、ＴＡＡは、抗原に対する免疫寛容の状態が誘導されない条件下で、正常細胞上にも発現される。腫瘍上の抗原の発現は、免疫系が抗原に応答することを可能にする条件下で生じ得る。ＴＡＡは、免疫系が未成熟で応答できない胎児発育中に正常細胞上で発現される抗原（腫瘍胎児性抗原とも呼ばれる）であってもよいし、正常細胞上に通常低レベルで存在するが、腫瘍細胞上にはるかに高レベルで発現される抗原であってもよい。臨床的関心が最も高いこれらのＴＡＡは、対応する正常組織と比べて特異的に発現され、特定のＴ細胞または免疫グロブリンによる腫瘍細胞の優先的認識を可能にする。ＴＡＡは、膜結合抗原、または腫瘍細胞内に局在する抗原を含み得る。
【００６５】
一実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、腫瘍細胞において高レベルで発現される第１のＴＡＡに結合する、少なくとも１つのＴＡＡ結合構築物を含む。例えば、腫瘍細胞は、細胞当たり約１００万コピーを超える量で、第１のＴＡＡを発現し得る。別の実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、腫瘍細胞において中レベルで発現される第１のＴＡＡに結合する、少なくとも１つのＴＡＡ結合構築物を含む。例えば、腫瘍細胞は、細胞当たり約１００，０００超〜約１００万コピーの量で、第１のＴＡＡを発現し得る。一実施形態において、第１のＴＡＡ提示誘導物質構築物は、腫瘍細胞において低レベルで発現される第１のＴＡＡに結合する、少なくとも１つのＴＡＡ結合構築物を含む。例えば、腫瘍細胞は、細胞当たり約１００，０００コピー未満の量で、第１のＴＡＡを発現し得る。一実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、浸潤性免疫細胞が比較的少ない腫瘍に存在する第１のＴＡＡ（低イムノスコアＴＡＡ）に結合する、少なくとも１つのＴＡＡ結合構築物を含む。一実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、腫瘍胎児性抗原である第１のＴＡＡに結合する、少なくとも１つのＴＡＡ結合構築物を含む。
【００６６】
上に記載されるように、本明細書に記載されるＴＡＡ提示誘導物質構築物の少なくとも１つのＴＡＡ結合構築物は、１つ以上の第２のＴＡＡを含む腫瘍細胞由来物質（ＴＣＤＭ）と物理的に会合する第１のＴＡＡに直接結合する。第２のＴＡＡは、ＴＣＤＭ内で複合体化し得る。
【００６７】
一実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質は、限定するものではないが、炭酸脱水酵素ＩＸ、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、αアクチニン−４、Ａ３、Ａ３３抗体に特異的な抗原、ＡＲＴ−４、Ｂ７、Ｂａ７３３、ＢＡＧＥ、ＢＣＭＡ、ＢｒＥ３抗原、ＣＡ１２５、ＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ−１、ＣＡＳＰ−８／ｍ、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ６４、ＣＤ６６ａ−ｅ、ＣＤ６７、ＣＤ７０、ＣＤ７０Ｌ、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ９５、ＣＤ１２３、ＣＤ１２６、ＣＤ１３２、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５４、ＣＤ１７１、ＣＤＣ２７、ＣＤＫ−４／ｍ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＴＬＡ−４、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ７、ＣＸＣＬ１２、ＨＩＦ−１ａ、結腸特異的抗原ｐ（ＣＳＡｐ）、ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６、ｃ−Ｍｅｔ、ＤＡＭ、ＤＬ３、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ−１（ＴＲＯＰ−２）、ＥＧＰ−２、ＥＬＦ２−Ｍ、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、Ｆｌｔ−１、Ｆｌｔ−３、葉酸受容体、Ｇ２５０抗原、ＧＡＧＥ、ＧＤ２、ｇｐ１００、ＧＰＣ３、ＧＲＯ−１３、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＭ１．２４、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）及びそのサブユニット、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＭＧＢ−１、低酸素誘導因子（ＨＩＦ−１）、ＨＳＰ７０−２Ｍ、ＨＳＴ−２、Ｉａ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−Ｘ、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ１３Ｒα２、ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１７Ｒ、ＩＬ−１８Ｒ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＩＬ−２５、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、ＫＣ４抗原、ＫＳ−１抗原、ＫＳ１−４、Ｌｅ−Ｙ、ＬＤＲ／ＦＵＴ、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、ＭＡＧＥ、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＲＴ−１、ＭＡＲＴ−２、ｍＣＲＰ、ＭＣＰ−１、黒色腫糖タンパク質、メソテリン、ＭＩＰ−１Ａ、ＭＩＰ−１Ｂ、ＭＩＦ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ａｃ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ１６、ＭＵＭ−１／２、ＭＵＭ−３、ＮａＰｉ２Ｂ、ＮＣＡ６６、ＮＣＡ９５、ＮＣＡ９０、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＡＭ４抗原、膵癌ムチン、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−１受容体、胎盤成長因子、ｐ５３、ＰＬＡＧＬ２、前立腺酸性ホスファターゼ、ＰＳＡ、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ、Ｐ１ＧＦ、ＩＬＧＦ、ＩＬＧＦ−１Ｒ、ＩＬ−６、ＩＬ−２５、ＲＳ５、ＲＡＮＴＥＳ、ＲＯＲ１、Ｔ１０１、ＳＡＧＥ、５１００、サバイビン、サバイビン−２Ｂ、ＴＡＣ、ＴＡＧ−７２、テネイシン、ＴＲＡＧ−３、ＴＲＡＩＬ受容体、ＴＮＦ−α、Ｔｎ抗原、Ｔｈｏｍｓｏｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原、腫瘍壊死抗原、ＶＥＧＦＲ、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン、ＷＴ−１、１７−１Ａ−抗原、補体因子Ｃ３、Ｃ３ａ���Ｃ３ｂ、Ｃ５ａ、Ｃ５、血管新生マーカー、ｂｃｌ−２、ｂｃｌ−６、Ｋｒａｓ、がん遺伝子マーカーならびにがん遺伝子産物から選択される第１のＴＡＡに結合する、少なくとも１つのＴＡＡ結合構築物を含む（例えば、Ｓｅｎｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００６，１２：５０２３−３２；Ｐａｒｍｉａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００７，１７８：１９７５−７９；Ｎｏｖｅｌｌｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ２００５，５４：１８７−２０７参照）。
【００６８】
少なくとも１つのＴＡＡ結合構築物は、第１のＴＡＡに結合するリガンド、または第１のＴＡＡに結合することができる他のある部分であり得る。したがって、一実施形態において、少なくとも１つのＴＡＡ結合構築物は、ＴＡＡに対する内因性リガンドまたは合成リガンドであり得る。例えば、ヘレグリン及びＮＲＧ−２はＨＥＲ３に対するリガンドであり、ＷＮＴ５ＡはＲＯＲ１に対するリガンドであり、葉酸は葉酸受容体に対するリガンドである。
【００６９】
あるいは、少なくとも１つのＴＡＡ結合構築物は、第１のＴＡＡを標的にすることができる部分であり得、抗体または非抗体の形態であり得る。一実施形態において、少なくとも１つのＴＡＡ結合構築物は、抗体または抗原結合ドメインである。「抗原結合ドメイン」という用語は、抗体断片、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ、ＶＨＨなどを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＴＡＡ結合構築物は、１つ以上のＦｃに連結された１つ以上の抗原結合ドメイン（例えば、Ｆａｂ、ＶＨＨまたはｓｃＦｖ）を含み得る。「抗体」という用語は、別途詳述されており、少なくとも１つのＴＡＡ結合構築物の例示的なフォーマットは、実施例において提供され、図２及び図３に示される。
【００７０】
腫瘍関連抗原を指向する抗体は、当該技術分野において知られており、多数の供給元から商業的に入手することができる。例えば、様々な抗体分泌ハイブリドーマ株がＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．））から入手可能である。様々な腫瘍関連抗原に対する多数の抗体がＡＴＣＣに寄託され、及び／または可変領域配列が公開されており、これらを使用して、ある特定の実施形態のＴＡＡ提示誘導物質構築物を調製することができる。当業者であれば、様々な腫瘍関連抗原に対する抗体配列または抗体分泌ハイブリドーマは、ＡＴＣＣ、ＮＣＢＩ及び／またはＵＳＰＴＯのデータベースの単純な検索によって得ることができることは理解するであろう。
【００７１】
本明細書に記載されるＴＡＡ提示誘導物質構築物の調製に有用であり得る特定の腫瘍関連抗原標的化抗体には、ＬＬ１（抗ＣＤ７４）、ＬＬ２またはＲＦＢ４（抗ＣＤ２２）、ベルツズマブ（ｈＡ２０、抗ＣＤ２０）、リツキシマブ（抗ＣＤ２０）、オビヌツズマブ（ＧＡ１０１、抗ＣＤ２０）、ランブロリズマブ（抗ＰＤ−１受容体）、ニボルマブ（抗ＰＤ−１受容体）、イピリムマブ（抗ＣＴＬＡ−４）、ＲＳ７（抗ＴＲＯＰ−２）、ＰＡＭ４またはＫＣ４（両方とも抗ムチン）、ＭＮ−１４（抗ＣＥＡ）、ＭＮ−１５またはＭＮ−３（抗ＣＥＡＣＡＭ６）、Ｍｕ−９（抗結腸特異的抗原ｐ）、Ｉｍｍｕ３１（抗αフェトプロテイン）、Ｒ１（抗ＩＧＦ−１Ｒ）、Ａ１９（抗ＣＤ１９）、ＴＡＧ−７２（例えば、ＣＣ４９）、Ｔｎ、Ｊ５９１、ＭＬＮ２７０４またはＨｕＪ５９１（抗ＰＳＭＡ）、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０２６（抗ＰＳＭＡ二量体）、Ｄ２／Ｂ（抗ＰＳＭＡ）、Ｇ２５０（抗炭酸脱水酵素ＩＸ）、Ｌ２４３（抗ＨＬＡ−ＤＲ）アレムツズマブ（抗ＣＤ５２）、ベバシズマブ（抗ＶＥＧＦ）、セツキシマブ（抗ＥＧＦＲ）、ゲムツズマブ（抗ＣＤ３３）、イブリツモマブチウキセタン（抗ＣＤ２０）；パニツムマブ（抗ＥＧＦＲ）；トシツモマブ（抗ＣＤ２０）；ＰＡＭ４（別名クリバツズマブ、抗ムチン）、トラスツズマブ（抗ＨＥＲ２）、ペルツズマブ（抗ＨＥＲ２）、ポラツズマブ（抗ＣＤ７９ｂ）、Ｒ２（抗ＲＯＲ１）、２Ａ２（抗ＲＯＲ１）及びアネツマブ（抗メソテリン）が含まれるが、これらに限定されない。
【００７２】
特定の実施形態において、少なくとも１つのＴＡＡ結合構築物は、既知の抗体のヒト化型またはキメラ型に由来する。一実施形態において、少なくとも１つのＴＡＡ結合構築物は、ヒト、カニクイザル、アカゲザルまたはマウスのＴＡＡに結合する抗体に由来する。
【００７３】
あるいは、目的の特定のＴＡＡに対する抗体を、精製されたＴＡＡタンパク質を使用すること以外はＩＳＲに対する抗体の調製について記載した方法と同様の方法で、標準的な技術によって作製し、それをＴＡＡ提示誘導物質構築物の少なくとも１つのＴＡＡ結合構築物を調製する土台として使用してもよい。
【００７４】
したがって、一実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質は、抗ＨＥＲ２抗体に由来する、少なくとも１つのＴＡＡ結合構築物を含む。一実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質は、トラスツズマブまたはペルツズマブに由来する、少なくとも１つのＴＡＡ結合構築物を含む。別の実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質は、抗ＲＯＲ１抗体に由来する、少なくとも１つのＴＡＡ結合構築物を含む。一実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、抗ＰＳＭＡ抗体に由来する、少なくとも１つのＴＡＡ結合構築物を含む。一実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、抗メソテリン抗体に由来する、少なくとも１つのＴＡＡ結合構築物を含む。
【００７５】
他の実施形態において、少なくとも１つのＴＡＡ結合構築物は、ＩＳＲ結合構築物に関して本明細書に別途記載するように、非抗体形態であり得る。
【００７６】
ＴＡＡ提示誘導物質構築物のフォーマット
一実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、１つのＩＳＲ結合構築物と、少なくとも１つのＴＡＡ結合構築物とを含む。種々の実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、２、３またはそれ以上のＩＳＲ結合構築物と、少なくとも１つのＴＡＡ結合構築物とを含む。いくつかの実施形態において、２、３またはそれ以上のＩＳＲ結合構築物は、互いに同じであってもよい。いくつかの実施形態において、２、３またはそれ以上のＩＳＲ結合構築物は、同じＩＳＲに結合し得るが、構築物は、抗原結合ドメインの異なるフォーマット、すなわち、ｓｃＦｖ、Ｆａｂを有するＩＳＲ結合構築物を含み得、あるいは、ＩＳＲに結合する１つ以上のリガンドを含み得る。他の実施形態において、２、３またはそれ以上のＩＳＲ結合構築物は、少なくとも２つの異なるＩＳＲに結合し得る。このような実施形態において、ＩＳＲ結合構築物は、抗原結合ドメインであってもよいし、標的ＩＳＲを認識するリガンドであってもよいし、それらの組み合わせであってもよい。
【００７７】
一実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、少なくとも１つのＩＳＲ結合構築物と、１つのＴＡＡ結合構築物とを含む。種々の実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、少なくとも１つのＩＳＲ結合構築物と、２つ以上のＴＡＡ結合構築物とを含む。これらの実施形態において、ＴＡＡ結合構築物は、互いに同じであってもよいし、互いに異なっていてもよい。ＴＡＡ結合構築物が互いに異なる実施形態において、ＴＡＡ結合構築物は、異なるＴＡＡ、または同じＴＡＡの異なる領域に結合し得、あるいは、互いに異なるＴＡＡに結合する抗原結合ドメインまたはリガンドを含み得、あるいは、ｓｃＦｖ及びＦａｂなどのフォーマットの組み合わせである抗原結合ドメインを含み得る。
【００７８】
特定の実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、多重特異性抗体であり、ここで、多重特異性抗体は、ＡＰＣ上に発現される少なくとも１つのＩＳＲと、ＴＣＤＭと物理的に会合する少なくとも１つの第１のＴＡＡとに結合することができる。この実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、Ｆｃ足場により互いに連結された、少なくとも１つのＩＳＲ結合構築物及び少なくとも１つのＴＡＡ結合構築物を含む。他の実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、ＡＰＣ上に発現されるＩＳＲ結合構築物と、１つ以上の他のＴＡＡを含むＴＣＤＭと物理的に会合する第１のＴＡＡに直接結合する少なくとも１つのＴＡＡ結合構築物とを含む、二重特異性抗体である。二重特異性抗体は、本明細書に別途記載するように、Ｆｃまたはヘテロ二量体Ｆｃを含み得る。
【００７９】
本明細書に別途記載するように、ＴＡＡ提示誘導物質構築物の少なくとも１つのＩＳＲ結合構築物及び少なくとも１つのＴＡＡ結合構築物は、リガンド、抗体、抗原結合ドメインまたは非抗体の形態であり得る。ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、これらの形態の組み合わせであるＩＳＲ結合構築物及びＴＡＡ結合構築物を含み得る。種々の実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、ＩＳＲに対するリガンドである少なくとも１つのＩＳＲ結合構築物と、ＴＡＡに対するリガンドである少なくとも１つのＴＡＡ結合構築物とを含む。関連する一実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、ＩＳＲに対するリガンドである少なくとも１つのＩＳＲ結合構築物と、抗原結合ドメインである少なくとも１つのＴＡＡ結合構築物とを含む。関連する一実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、ＩＳＲに対するリガンドである少なくとも１つのＩＳＲ結合構築物と、非抗体形態である少なくとも１つのＴＡＡ結合構築物とを含む。一実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、抗原結合ドメインである少なくとも１つのＩＳＲ結合構築物と、抗原結合ドメインである少なくとも１つのＴＡＡ結合構築物とを含む。別の実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、非抗体形態である少なくとも１つのＩＳＲ結合構築物と、抗原結合ドメインである少なくとも１つのＴＡＡ結合構築物とを含む。一実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、抗原結合ドメインである少なくとも１つのＩＳＲ結合構築物と、ＴＡＡに対するリガンドである少なくとも１つのＴＡＡ結合構築物とを含む。一実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、非抗体形態である少なくとも１つのＩＳＲ結合構築物と、リガンドである少なくとも１つのＴＡＡ結合構築物とを含む。一実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、非抗体形態である少なくとも１つのＩＳＲ結合構築物と、非抗体形態である少なくとも１つのＴＡＡ結合構築物とを含む。一実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、抗原結合ドメインである少なくとも１つのＩＳＲ結合構築物と、非抗体形態である少なくとも１つのＴＡＡ結合構築物とを含む。
【００８０】
ＴＡＡ提示誘導物質構築物が二重特異性抗体である実施形態において、ＩＳＲ結合構築物はＦａｂであり得、ＴＡＡ結合構築物はＦａｂであり得る。あるいは、ＴＡＡ提示誘導物質構築物が二重特異性抗体である実施形態において、ＩＳＲ結合構築物はＦａｂであり得、ＴＡＡ結合構築物はｓｃＦｖであり得る。ＴＡＡ提示誘導物質構築物が二重特異性抗体である他の実施形態において、ＩＳＲ結合構築物はｓｃＦｖであり得、ＴＡＡ結合構築物はｓｃＦｖであり得る。ＴＡＡ提示誘導物質構築物が二重特異性抗体である他の実施形態において、ＩＳＲ結合構築物はｓｃＦｖであり得、ＴＡＡ結合構築物はＦａｂであり得る。二重特異性抗体のフォーマット例は、図２及び図３に示される。いくつかの実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質は、フルサイズ抗体フォーマット（ＦＳＡ）の二重特異性抗体である。
【００８１】
いくつかの実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、互いに連結された、ＬＤＬ受容体に対するリガンドであるＩＳＲ及び少なくとも１つのＴＡＡ結合構築物を含む。いくつかの実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、互いに連結された、ＬＲＰ−１に対するリガンドであるＩＳＲ及び少なくとも１つのＴＡＡ結合構築物を含む。いくつかの実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、互いに連結された、カルレティキュリンであるＩＳＲ及び少なくとも１つのＴＡＡ結合構築物を含む。
【００８２】
種々の実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、Ｃ型レクチン受容体に結合する少なくとも１つのＩＳＲ結合構築物と、腫瘍細胞で高レベルで、腫瘍細胞で低レベルで、腫瘍細胞で中レベルで発現されるか、または腫瘍胎児性抗原であるか、または低イムノスコアＴＡＡである第１のＴＡＡに結合する少なくとも１つのＴＡＡ結合構築物とを含む。他の実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、ＴＮＦファミリー受容体に結合する少なくとも１つのＩＳＲ結合構築物と、腫瘍細胞で高レベルで、腫瘍細胞で低レベルで、腫瘍細胞で中レベルで発現されるか、または腫瘍胎児性抗原であるか、または低イムノスコアＴＡＡである第１のＴＡＡに結合する少なくとも１つのＴＡＡ結合構築物とを含む。いくつかの実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、ＬＤＬ受容体に結合する少なくとも１つのＩＳＲ結合構築物と、腫瘍細胞で高レベルで、腫瘍細胞で低レベルで、腫瘍細胞で中レベルで発現されるか、または腫瘍胎児性抗原であるか、または低イムノスコアＴＡＡである第１のＴＡＡに結合する少なくとも１つのＴＡＡ結合構築物とを含む。いくつかの実施形態において、第１のＴＡＡは、ＨＥＲ２、ＲＯＲ１またはＰＳＭＡである。
【００８３】
追加の実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、デクチン−１に結合するＩＳＲ結合構築物と、ＨＥＲ２、ＲＯＲ１またはＰＳＭＡのうちの１つに結合するＴＡＡ結合構築物とを含む。他の実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、ＤＥＣ２０５に結合するＩＳＲ結合構築物と、ＨＥＲ２、ＲＯＲ１またはＰＳＭＡのうちの１つに結合するＴＡＡ結合構築物とを含む。更なる実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、ＬＲＰ−１に結合するＩＳＲ結合構築物と、ＨＥＲ２、ＲＯＲ１またはＰＳＭＡのうちの１つに結合するＴＡＡ結合構築物とを含む。また更なる実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、ＣＤ４０に結合するＩＳＲ結合構築物と、ＨＥＲ２、ＲＯＲ１またはＰＳＭＡのうちの１つに結合するＴＡＡ結合構築物とを含む。
【００８４】
いくつかの実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、デクチン−１に結合するＩＳＲ結合構築物と、メソテリンに結合するＴＡＡ結合構築物とを含む。いくつかの実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、デクチン−１に結合するＩＳＲ結合構築物と、ＨＥＲ２に結合するＴＡＡ結合構築物とを含む。他の実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、ＤＥＣ２０５に結合するＩＳＲ結合構築物と、メソテリンに結合するＴＡＡ結合構築物とを含む。更なる実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、ＬＲＰ−１に結合するＩＳＲ結合構築物と、メソテリンに結合するＴＡＡ結合構築物とを含む。これらの実施形態のうちの１つにおいて、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、組み換え型のカルレティキュリンであるＩＳＲ結合構築物と、メソテリンに結合するＴＡＡ結合構築物とを含む。また更なる実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、ＣＤ４０に結合するＩＳＲ結合構築物と、メソテリンに結合するＴＡＡ結合構築物とを含む。
【００８５】
ＩＳＲ結合構築物とＴＡＡ結合構築物との間の連結
ＴＡＡ提示誘導物質構築物の少なくとも１つのＩＳＲ結合構築物及び少なくとも１つのＴＡＡ結合構築物は、直接的または間接的に互いに連結され得る。少なくとも１つのＩＳＲ結合構築物と少なくとも１つのＴＡＡ結合構築物との間の直接的連結は、２つの構築物がリンカーまたは足場なしで互いに直接接続するときに生じる。少なくとも１つのＩＳＲ結合構築物と少なくとも１つのＴＡＡ結合構築物との間の間接的連結は、リンカーまたは足場の使用を介して達成される。
【００８６】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＴＡＡ提示誘導物質構築物は、足場を含む。足場は、ペプチド、ポリペプチド、ポリマー、ナノ粒子または他の化学実体であってよい。一実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質は、ＡＰＣ上に発現されるＩＳＲに結合する少なくとも１つのＩＳＲ結合構築物と、少なくとも１つのＴＡＡ結合構築物とを含み、ここで、少なくとも１つのＩＳＲ結合構築物及び少なくとも１つのＴＡＡ結合構築物は、コヘシン・ドックリン足場以外の足場を介して互いに連結される。コヘシン・ドックリン足場は、例えば、国際特許公開第ＷＯ２００８／０９７８１７号に記載されている。ＴＡＡ提示誘導物質構築物のＩＳＲまたはＴＡＡ結合構築物は、足場のＮ末端またはＣ末端のいずれかに連結され得、ここで、足場は、Ｆｃ、例えば、二量体Ｆｃなどのポリペプチドである。二量体Ｆｃは、ホモ二量体またはヘテロ二量体であり得る。一実施形態において、足場は、ヘテロ二量体Ｆｃである。他の実施形態において、足場は、ＷＯ２０１２／１１６４５３及びＷＯ２０１４／０１２０８２に記載のスプリットアルブミンポリペプチドペアである。
【００８７】
足場がペプチドまたはポリペプチドである実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物のＩＳＲまたはＴＡＡ結合構築物は、遺伝子融合によって、足場に連結され得る。他の実施形態において、足場がポリマーまたはナノ粒子である場合、ＴＡＡ提示誘導物質構築物のＩＳＲまたはＴＡＡ結合構築物は、化学的コンジュゲーションによって、足場に連結され得る。他の実施形態において、ＩＳＲ結合構築物及びＴＡＡ結合構築物は、スチレン、プロピレン、シリカ、金属または炭素ベースのナノ粒子以外の足場によって連結される。
【００８８】
本明細書で使用される「Ｆｃ」という用語は、定常領域（「Ｆｃドメイン」または「Ｆｃ領域」とも称される）の少なくとも一部を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を指す。この用語は、天然配列のＦｃ領域及びバリアントのＦｃ領域を含む。本明細書で特に指示がない限り、Ｆｃ領域または定常領域中のアミノ酸残基のナンバリングは、Ｅｄｅｌｍａｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ，６３，７８−８５（１９６９）に記載されているように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵナンバリングシステムに従う。二量体Ｆｃの「Ｆｃポリペプチド」は、二量体Ｆｃドメインを形成する２つのポリペプチドのうちの１つを指し、すなわち、安定な自己会合を可能にする免疫グロブリン重鎖のＣ末端定常領域を含むポリペプチドを指す。例えば、二量体ＩｇＧ  ＦｃのＦｃポリペプチドは、ＩｇＧ  ＣＨ２及びＩｇＧ  ＣＨ３の定常ドメイン配列を含む。
【００８９】
Ｆｃドメインは、ＣＨ３ドメインまたはＣＨ３及びＣＨ２ドメインのいずれかを含む。ＣＨ３ドメインは、二量体Ｆｃの２つのＦｃポリペプチドのそれぞれに由来する、２つのＣＨ３配列を含む。ＣＨ２ドメインは、二量体Ｆｃの２つのＦｃポリペプチドのそれぞれに由来する、２つのＣＨ２配列を含む。
【００９０】
いくつかの実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、１つまたは２つのＣＨ３配列を含む、Ｆｃを含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃは、１つ以上のリンカーにより、またはリンカーなく、少なくとも１つのＩＳＲ結合構築物及び少なくとも１つのＴＡＡ結合構築物に結合される。いくつかの実施形態において、Ｆｃは、ヒトＦｃである。いくつかの実施形態において、Ｆｃは、ヒトＩｇＧまたはＩｇＧ１のＦｃである。いくつかの実施形態において、Ｆｃは、ヘテロ二量体Ｆｃである。いくつかの実施形態において、Ｆｃは、１つまたは２つのＣＨ２配列を含む。
【００９１】
いくつかの実施形態において、Ｆｃは、１つまたは２つのＣＨ３配列を含み、そのうちの少なくとも１つは、１つ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃは、１つまたは２つのＣＨ２配列を含み、そのうちの少なくとも１つは、１つ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃは、単一のポリペプチドから構成される。いくつかの態様において、Ｆｃは、複数のペプチド、例えば、２つのポリペプチドから構成される。
【００９２】
いくつかの実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＣＡ２０１１／００１２３８号または国際特許出願第ＰＣＴ／ＣＡ２０１２／０５０７８０号に記載されるようなＦｃを含む。当該出願のそれぞれの開示全体は、いかなる目的に対しても、その全体が参照により本明細書に援用される。
【００９３】
修飾されたＣＨ３ドメイン
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＴＡＡ提示誘導物質構築物は、修飾されたＣＨ３ドメインを含むヘテロ二量体Ｆｃを含み、ここで、修飾されたＣＨ３ドメインは、非対称に修飾されたＣＨ３ドメインである。ヘテロ二量体Ｆｃは、２つの重鎖定常ドメインポリペプチド：第１のＦｃポリペプチド及び第２のＦｃポリペプチドを含み得、これらは、Ｆｃが１つの第１のＦｃポリペプチド及び１つの第２のＦｃポリペプチドを含む限り、互換的に使用され得る。一般に、第１のＦｃポリペプチドは、第１のＣＨ３配列を含み、第２のＦｃポリペプチドは、第２のＣＨ３配列を含む。
【００９４】
非対称的に導入された１つ以上のアミノ酸修飾を含む２つのＣＨ３配列は、２つのＣＨ３配列が二量体化するとき、ホモ二量体ではなく、ヘテロ二量体Ｆｃを通常もたらす。本明細書で使用されるとき、「非対称アミノ酸修飾」とは、第１のＣＨ３配列上の特定位置にあるアミノ酸が、第２のＣＨ３配列上の同位置にあるアミノ酸と異なり、第１及び第２のＣＨ３配列が優先的に対合して、ホモ二量体ではなく、ヘテロ二量体を形成する、任意の修飾を指す。このヘテロ二量体化は、第１及び第２のＣＨ３配列の各配列上のそれぞれ同じアミノ酸位置にある２つのアミノ酸のうちの一方に対する修飾、または各配列上のそれぞれ同じ位置にある各配列上の両方のアミノ酸に対する修飾の結果であり得る。ヘテロ二量体Ｆｃの第１及び第２のＣＨ３配列は、１つまたは１つを超える非対称アミノ酸修飾を含み得る。
【００９５】
表Ａは、完全長ヒトＩｇＧ１重鎖のアミノ酸２３１〜４４７に対応する、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ配列のアミノ酸配列を提供する。ＣＨ３配列は、完全長ヒトＩｇＧ１重鎖のアミノ酸３４１〜４４７を含む。
【００９６】
典型的に、Ｆｃは、二量体化が可能である、２つの隣接する重鎖配列（Ａ及びＢ）を含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃの一方または両方の配列は、ＥＵナンバリングを使用して、次の位置：Ｌ３５１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｔ３６６、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｔ３５０、Ｓ４００及び／またはＮ３９０に１つ以上の変異または修飾を含み得る。いくつかの実施形態において、Ｆｃは、表Ｂに示されるような変異配列を含み得る。いくつかの実施形態において、Ｆｃは、バリアント１Ａ−Ｂの変異を含み得る。いくつかの実施形態において、Ｆｃは、バリアント２Ａ−Ｂの変異を含み得る。いくつかの実施形態において、Ｆｃは、バリアント３Ａ−Ｂの変異を含み得る。いくつかの実施形態において、Ｆｃは、バリアント４Ａ−Ｂの変異を含み得る。いくつかの実施形態において、Ｆｃは、バリアント５Ａ−Ｂの変異を含み得る。
【００９７】
（表Ａ）ＩｇＧ１  Ｆｃ配列
2020511997.tif 000003
【００９８】
特定の実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃに含まれる第１及び第２のＣＨ３配列は、完全長ヒトＩｇＧ１重鎖のアミノ酸２３１〜４４７に関して、本明細書に記載されるようなアミノ酸変異を含み得る。いくつかの実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃは、位置Ｆ４０５及びＹ４０７にアミノ酸修飾を有する第１のＣＨ３配列と、位置Ｔ３９４にアミノ酸修飾を有する第２のＣＨ３配列とを含む、修飾されたＣＨ３ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃは、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ及びＹ４０７Ｖから選択される１つ以上のアミノ酸修飾を有する第１のＣＨ３配列と、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｉ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｍ及びＴ３９４Ｗから選択される１つ以上のアミノ酸修飾を有する第２のＣＨ３配列とを含む、修飾されたＣＨ３ドメインを含む。
【００９９】
いくつかの実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃは、位置Ｌ３５１、Ｆ４０５及びＹ４０７にアミノ酸修飾を有する第１のＣＨ３配列と、位置Ｔ３６６、Ｋ３９２及びＴ３９４にアミノ酸修飾を有する第２のＣＨ３配列とを含み、第１または第２のＣＨ３配列の一方が更に位置Ｑ３４７にアミノ酸修飾を含み、他方のＣＨ３配列が更に位置Ｋ３６０にアミノ酸修飾を含む、修飾されたＣＨ３ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃは、位置Ｌ３５１、Ｆ４０５及びＹ４０７にアミノ酸修飾を有する第１のＣＨ３配列と、位置Ｔ３６６、Ｋ３９２及びＴ３９４にアミノ酸修飾を有する第２のＣＨ３配列とを含み、第１または第２のＣＨ３配列の一方が更に位置Ｑ３４７にアミノ酸修飾を含み、他方のＣＨ３配列が更に位置Ｋ３６０にアミノ酸修飾を含み、当該ＣＨ３配列の一方または両方が更にアミノ酸修飾Ｔ３５０Ｖを含む、修飾されたＣＨ３ドメインを含む。
【０１００】
いくつかの実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃは、位置Ｌ３５１、Ｆ４０５及びＹ４０７にアミノ酸修飾を有する第１のＣＨ３配列と、位置Ｔ３６６、Ｋ３９２及びＴ３９４にアミノ酸修飾を有する第２のＣＨ３配列とを含み、当該第１及び第２のＣＨ３配列の一方が更にＤ３９９ＲまたはＤ３９９Ｋのアミノ酸修飾を含み、他方のＣＨ３配列がＴ４１１Ｅ、Ｔ４１１Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ３９２Ｅ及びＫ３９２Ｄのうちの１つ以上を含む、修飾されたＣＨ３ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃは、位置Ｌ３５１、Ｆ４０５及びＹ４０７にアミノ酸修飾を有する第１のＣＨ３配列と、位置Ｔ３６６、Ｋ３９２及びＴ３９４にアミノ酸修飾を有する第２のＣＨ３配列とを含み、当該第１及び第２のＣＨ３配列の一方が更にＤ３９９ＲまたはＤ３９９Ｋのアミノ酸修飾を含み、他方のＣＨ３配列がＴ４１１Ｅ、Ｔ４１１Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ３９２Ｅ及びＫ３９２Ｄのうちの１つ以上を含み、当該ＣＨ３配列の一方または両方が更にアミノ酸修飾Ｔ３５０Ｖを含む、修飾されたＣＨ３ドメインを含む。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃは、位置Ｌ３５１、Ｆ４０５及びＹ４０７にアミノ酸修飾を有する第１のＣＨ３配列と、位置Ｔ３６６、Ｋ３９２及びＴ３９４にアミノ酸修飾を有する第２のＣＨ３配列とを含み、当該ＣＨ３配列の一方または両方が更にＴ３５０Ｖのアミノ酸修飾を含む、修飾されたＣＨ３ドメインを含む。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃは、次のアミノ酸修飾を含む、修飾されたＣＨ３ドメインを含み、ここで、「Ａ」は、第１のＣＨ３配列に対するアミノ酸修飾を表し、「Ｂ」は、第２のＣＨ３配列に対するアミノ酸修飾を表す。
2020511997.tif 000004
【０１０３】
１つ以上の非対称アミノ酸修飾は、ヘテロ二量体ＣＨ３ドメインが野生型ホモ二量体ＣＨ３ドメインと同等の安定性を有する、ヘテロ二量体Ｆｃの形成を促進することができる。いくつかの実施形態において、１つ以上の非対称アミノ酸修飾は、ヘテロ二量体Ｆｃドメインが野生型ホモ二量体Ｆｃドメインと同等の安定性を有する、ヘテロ二量体Ｆｃドメインの形成を促進することができる。いくつかの実施形態において、１つ以上の非対称アミノ酸修飾は、ヘテロ二量体Ｆｃドメインが示差走査熱量測定試験で融解温度（Ｔｍ）を介して観察される安定性を有する、ヘテロ二量体Ｆｃドメインの形成を促進することができ、ここで、融解温度は、対応する対称性野生型ホモ二量体Ｆｃドメインについて観察される融解温度の４℃以内である。いくつかの実施形態において、Ｆｃは、ＣＨ３配列のうちの少なくとも１つに、野生型ホモ二量体Ｆｃと同等の安定性を有するヘテロ二量体Ｆｃの形成を促進する１つ以上の修飾を含む。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、ＣＨ３ドメインの安定性は、例えば、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって、ＣＨ３ドメインの融解温度を測定することによって評価することができる。したがって、種々の実施形態において、ＣＨ３ドメインは、約６８℃以上、約７０℃以上、約７２℃以上、７３℃以上、約７５℃以上または約７８℃以上の融解温度を有し得る。いくつかの実施形態において、二量体化ＣＨ３配列は、約６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７７．５、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、または８５℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有する。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、修飾されたＣＨ３配列を含むヘテロ二量体Ｆｃは、発現産物中のホモ二量体Ｆｃと比較して、少なくとも約７５％の純度で形成され得る。いくつかの実施形態において、ヘテロ二量体Ｆｃは、約８０％超、約８５％超、約９０％超、約９５％超または約９７％超の純度で形成される。いくつかの実施形態において、Ｆｃは、発現されたとき、約７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％を超える純度で形成されるヘテロ二量体である。いくつかの実施形態において、Ｆｃは、単一の細胞を介して発現されたとき、約７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％を超える純度で形成されるヘテロ二量体である。
【０１０６】
単量体Ｆｃポリペプチドを修飾してヘテロ二量体Ｆｃの形成を促進するための更なる方法は、当該技術分野において知られており、例えば、国際特許公開第ＷＯ９６／０２７０１１号（ｋｎｏｂｓ  ｉｎｔｏ  ｈｏｌｅｓ）、Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２８５，１９６３７−４６，ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  ｄｅｓｉｇｎ  ｔｏ  ａｃｈｉｅｖｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）、Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｄａｖｉｓ，ＪＨ．ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｐｒｏｔ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ  ；２３（４）：１９５−２０２，ｓｔｒａｎｄ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｄｏｍａｉｎ（ＳＥＥＤ）ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）及びＬａｂｒｉｊｎ  ｅｔ  ａｌ  ［Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔａｂｌｅ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＩｇＧ１  ｂｙ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｆａｂ−ａｒｍ  ｅｘｃｈａｎｇｅ．  Ｌａｂｒｉｊｎ  ＡＦ，  Ｍｅｅｓｔｅｒｓ  ＪＩ，  ｄｅ  Ｇｏｅｉｊ  ＢＥ，  ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｒｅｍｅｒ  ＥＴ，  Ｎｅｉｊｓｓｅｎ  Ｊ，  ｖａｎ  Ｋａｍｐｅｎ  ＭＤ，  Ｓｔｒｕｍａｎｅ  Ｋ，  Ｖｅｒｐｌｏｅｇｅｎ  Ｓ，  Ｋｕｎｄｕ  Ａ，  Ｇｒａｍｅｒ  ＭＪ，  ｖａｎ  Ｂｅｒｋｅｌ  ＰＨ，  ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ  ＪＧ，  Ｓｃｈｕｕｒｍａｎ  Ｊ，  Ｐａｒｒｅｎ  ＰＷ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．  ２０１３  Ｍａｒ  ２６；１１０（１３）：５１４５−５０に記載されるものが含まれる。
【０１０７】
ＣＨ２ドメイン
いくつかの実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、ＣＨ２ドメインを含むＦｃを含む。ＦｃのＣＨ２ドメインの一例は、表Ａに示される配列のアミノ酸２３１〜３４０である。いくつかのエフェクター機能は、抗体のＦｃに結合する、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）によって媒介される。
【０１０８】
「Ｆｃ受容体」及び「ＦｃＲ」という用語は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を記載するために使用される。例えば、ＦｃＲは、天然配列のヒトＦｃＲであり得る。一般に、ＦｃＲは、ＩｇＧ抗体に結合するもの（ガンマ受容体）であり、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体を含み、これらの受容体のアレルバリアント及び選択的スプライシングによる形態を含む。ＦｃγＲＩＩ受容体は、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性型受容体」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「抑制型受容体」）を含み、これらは、主にその細胞質ドメインが異なる、類似のアミノ酸配列を有する。他のアイソタイプの免疫グロブリンも、ある特定のＦｃＲによって結合され得る（例えば、Ｊａｎｅｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ，（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．，ＮＹ）（４ｔｈ  ｅｄ．，１９９９）参照）。活性型受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシン活性化モチーフ（「ＩＴＡＭ」）を含有する。抑制型受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシン抑制性モチーフ（「ＩＴＩＭ」）を含有する（Ｄａｅｒｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３−２３４（１９９７）に概説）。ＦｃＲについては、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４５７−９２（１９９１）；Ｃａｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２５−３４（１９９４）；及びｄｅ  Ｈａａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０−４１（１９９５）に概説されている。今後同定されるＦｃＲを含む、他のＦｃＲも、本明細書における「ＦｃＲ」という用語に包含される。この用語はまた、母親由来ＩｇＧの胎児への輸送を担う、胎児性受容体ＦｃＲｎも含む（Ｇｕｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）；及びＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））。
【０１０９】
ＣＨ２ドメイン中の修飾は、ＦｃＲのＦｃへの結合に影響し得る。異なるＦｃガンマ受容体に対するＦｃの親和性を選択的に変更するためのＦｃ領域中の多数のアミノ酸修飾は、当該技術分野において知られている。いくつかの態様において、Ｆｃは、Ｆｃγ受容体の選択的結合を促進する１つ以上の修飾を含む。
【０１１０】
ＦｃＲのＦｃへの結合を変更する例示的な変異を以下に列挙する：
Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ／Ｋ３２６Ａ（Ｌｕ  Ｙ，Ｖｅｒｎｅｓ  ＪＭ，Ｃｈｉａｎｇ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１１  Ｆｅｂ  ２８；３６５（１−２）：１３２−４１）；
Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｌ２３５Ｖ／Ｐ３９６Ｌ（Ｓｔａｖｅｎｈａｇｅｎ  ＪＢ，Ｇｏｒｌａｔｏｖ  Ｓ，Ｔｕａｉｌｌｏｎ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００７  Ｓｅｐ  １５；６７（１８）：８８８２−９０；Ｎｏｒｄｓｔｒｏｍ  ＪＬ，Ｇｏｒｌａｔｏｖ  Ｓ，Ｚｈａｎｇ  Ｗ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１１  Ｎｏｖ  ３０；１３（６）：Ｒ１２３）；
Ｆ２４３Ｌ（Ｓｔｅｗａｒｔ  Ｒ，Ｔｈｏｍ  Ｇ，Ｌｅｖｅｎｓ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ．２０１１  Ｓｅｐ；２４（９）：６７１−８．）
Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ（Ｓｈｉｅｌｄｓ  ＲＬ，Ｎａｍｅｎｕｋ  ＡＫ，Ｈｏｎｇ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００１  Ｍａｒ  ２；２７６（９）：６５９１−６０４）；
Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ（Ｌａｚａｒ  ＧＡ，Ｄａｎｇ  Ｗ，Ｋａｒｋｉ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００６  Ｍａｒ  １４；１０３（１１）：４００５−１０）；
Ｓ２３９Ｄ／Ｓ２６７Ｅ、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ（Ｃｈｕ  ＳＹ，Ｖｏｓｔｉａｒ  Ｉ，Ｋａｒｋｉ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８  Ｓｅｐ；４５（１５）：３９２６−３３）；
Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２６５Ｓ／Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ／Ｓ２９８Ａ／Ｋ３２６Ａ／Ａ３２７Ｈ、Ｇ２３７Ｆ／Ｓ２９８Ａ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ｓ２９８Ａ、Ｓ２３９Ｄ／Ｋ３２６Ｅ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ／Ｓ２９８Ａ、Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２７０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ／Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｄ、Ｌ２３４Ｆ／Ｓ２６７Ｅ／Ｎ３２５Ｌ、Ｇ２３７Ｆ／Ｖ２６６Ｌ／Ｓ２６７Ｄならびに本明細書に参照により援用されるＷＯ２０１１／１２０１３４及びＷＯ２０１１／１２０１３５に列挙されている他の変異。
Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｒ．Ｓｔｒｏｈｌ  ａｎｄ  Ｌｉｌａ  Ｍ．Ｓｔｒｏｈｌ，Ｗｏｏｄｈｅａｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ｓｅｒｉｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｎｏ  １１，ＩＳＢＮ  １  ９０７５６８  ３７  ９，Ｏｃｔ  ２０１２）は、２８３ページに変異を列挙している。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＴＡＡ提示誘導物質構築物は、同じ二量体Ｆｃを含まないＴＡＡ提示誘導物質構築物に対して、優れた生物物理学的特性、例えば、安定性及び／または易製造性を有する二量体Ｆｃを含む。いくつかの実施形態において、二量体Ｆｃは、１つ以上の非対称アミノ酸修飾を含む、ＣＨ２ドメインを含む。例示的な非対称変異は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＣＡ２０１４／０５０５０７号に記載されている。
【０１１２】
エフェクター機能を改善する追加の修飾
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＦｃを含むＴＡＡ提示誘導物質構築物は、Ｆｃに対し、エフェクター機能を媒介する能力を改善する修飾を含む。かかる修飾は、当該技術分野において知られており、非フコシル化、または活性化型受容体、主に、ＡＤＣＣではＦＣｇＲＩＩＩａ及びＣＤＣではＣ１ｑに対するＦｃの親和性の工学的操作が含まれる。以下の表Ｂは、エフェクター機能の工学的操作に関する文献に報告された各種設計をまとめたものである。
【０１１３】
Ｆｃグリコシル化部位（Ａｓｎ２９７  ＥＵナンバリング）上にフコースを全くまたはほとんど含まない抗体Ｆｃ領域を、アミノ酸配列を変えることなく産生する方法は、当該技術分野においてよく知られている。ＧｌｙｍａＸ（登録商標）技術（ＰｒｏＢｉｏＧｅｎ  ＡＧ）は、フコース生合成に関する細胞経路を他の経路に変える酵素遺伝子を、抗体Ｆｃ領域産生に使用される細胞に導入することに基づいている。これにより、Ｎ結合抗体炭水化物部分となる細胞による糖「フコース」の付加が阻害される（ｖｏｎ  Ｈｏｒｓｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ．２０（１２）：１６０７−１８）。フコシル化レベルの低いＦｃ領域を含むＴＡＡ提示誘導物質構築物を得る別のアプローチは、米国特許第８，４０９，５７２号に見出すことができ、当該特許は、抗体に対して低レベルのフコシル化を生じる能力に基づいて、抗体産生のための細胞株を選択することを教示している。ＴＡＡ提示誘導物質のＦｃは、完全に非フコシル化にすることもできるし（検出可能なフコースを含有しないことを意味する）、部分的に非フコシル化されていてもよい。これは、二重特異性抗体フォーマットのＴＡＡ提示誘導物質が、哺乳動物発現系によって産生される類似の抗体について通常検出されるフコースの量の９５％未満、８５％未満、７５％未満、６５％未満、５５％未満、４５％未満、３５％未満、２５％未満、１５％未満または５％未満のフコースを含有することを意味する。
【０１１４】
したがって、いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＴＡＡ提示誘導物質構築物は、改善されたエフェクター機能を付与する表Ｂに示されるような１つ以上のアミノ酸修飾を含む、二量体Ｆｃを含み得る。いくつかの実施形態において、構築物は、エフェクター機能を改善するために、非フコシル化され得る。
【０１１５】
（表Ｂ）ＣＨ２ドメイン及びエフェクター機能の工学的操作
2020511997.tif 000005
【０１１６】
ＦｃγＲ結合及び／または補体結合及び／またはエフェクター機能を低下させるＦｃ修飾は、当該技術分野において知られている。エフェクター活性が低減または抑制された抗体を工学的に操作するために使用される方法は、様々な公開物が記載している（Ｓｔｒｏｈｌ，ＷＲ（２００９），Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２０：６８５−６９１及びＳｔｒｏｈｌ，ＷＲ  ａｎｄ  Ｓｔｒｏｈｌ  ＬＭ，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｆｏｒ  ｏｐｔｉｍａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ”  Ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ：Ｗｏｏｄｈｅａｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０１２），ｐｐ  ２２５−２４９参照）。これらの方法は、グリコシル化の修飾、ＩｇＧ２／ＩｇＧ４足場の使用、またはヒンジもしくはＦｃのＣＨ２領域への変異導入による、エフェクター機能の低減が含まれる。例えば、米国特許出願公開第２０１１／０２１２０８７号（Ｓｔｒｏｈｌ）、国際特許公開第ＷＯ２００６／１０５３３８号（Ｘｅｎｃｏｒ）、米国特許出願公開第２０１２／０２２５０５８号（Ｘｅｎｃｏｒ）、米国特許出願公開第２０１２／０２５１５３１号（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）及びＳｔｒｏｐ  ｅｔ  ａｌ（（２０１２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２０：２０４−２１９）は、ＦｃγＲまたは補体のＦｃ結合を減少させる具体的な修飾について記載している。
【０１１７】
ＦｃγＲまたは補体のＦｃ結合を減少させる既知のアミノ酸修飾の非限定的な具体例としては、表Ｃに特定されるものが挙げられる。
【０１１８】
（表Ｃ）ＦｃγＲまたは補体のＦｃ結合を減少させる修飾
2020511997.tif 000006
【０１１９】
いくつかの実施形態において、Ｆｃは、表Ｃに特定される少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃは、Ｌ２３４、Ｌ２３５またはＤ２６５のうちの少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃは、Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＤ２６５にアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃは、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＤ２６５Ｓのアミノ酸修飾を含む。
【０１２０】
リンカー及びリンカーポリペプチド
いくつかの実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、リンカーにより互いに連結された、少なくとも１つのＩＳＲ結合構築物及び少なくとも１つのＴＡＡ結合構築物を含む。リンカーは、リンカーペプチド、リンカーポリペプチドまたは非ポリペプチドリンカーであり得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＴＡＡ提示誘導物質構築物は、それぞれリンカーポリペプチドに作動可能に連結された少なくとも１つのＩＳＲ結合構築物及び少なくとも１つのＴＡＡ結合構築物を含み、ここで、リンカーポリペプチドは、互いに複合体または界面を形成することができる。いくつかの実施形態において、リンカーポリペプチドは、互いに共有結合的連結を形成することができる。リンカーポリペプチドを含む構築物の空間立体配置は、２つの抗原結合ポリペプチド構築物を含むＴＡＡ提示誘導物質構築物との関係ではあるが、パパイン消化によって生成されるＦ（ａｂ’）２断片のパラトープに対応する空間立体配置に類似している。
【０１２１】
一実施形態において、リンカーポリペプチドは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のヒンジ領域から選択される。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、リンカーポリペプチドは、Ｆ（ａｂ’）断片のパラトープに対応する空間立体配置を維持し、ＩｇＧのコアヒンジ中のジスルフィド結合と同等の共有結合を形成することができるように選択される。好適なリンカーポリペプチドには、ＩｇＧヒンジ領域、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４に由来するヒンジ領域などが含まれる。これらの例示的なリンカーの修飾型も使用することができる。例えば、ＩｇＧ４のヒンジの安定性を改善するための修飾は、当該技術分野において知られている（例えば、Ｌａｂｒｉｊｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２７，７６７−７７１参照）。
【０１２３】
一実施形態において、リンカーポリペプチドは、本明細書に記載されるような足場、例えば、Ｆｃに作動可能に連結される。いくつかの態様において、Ｆｃは、１つ以上のリンカーにより、１つ以上の抗原結合ポリペプチド構築物に結合される。いくつかの態様において、Ｆｃは、リンカーによって、各抗原結合ポリペプチドの重鎖に結合される。
【０１２４】
他の実施形態において、リンカーポリペプチドは、Ｆｃ以外の足場に作動可能に連結される。代替タンパク質または分子ドメインに基づく多数の足場が当該技術分野において知られており、２つの異なる標的結合ポリペプチドの選択的ペアを形成するために使用することができる。かかる代替ドメインの例は、ＷＯ２０１２／１１６４５３及びＷＯ２０１４／０１２０８２に記載されているスプリットアルブミン足場である。更なる例は、選択的に対合するＦｏｓ及びＪｕｎ［Ｓ  Ａ  Ｋｏｓｔｅｌｎｙ，Ｍ  Ｓ  Ｃｏｌｅ，ａｎｄ  Ｊ  Ｙ  Ｔｓｏ．Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｌｅｕｃｉｎｅ  ｚｉｐｐｅｒｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９２  １４８：１５４７−５３；Ｂｅｒｎｄ  Ｊ．Ｗｒａｎｉｋ，Ｅｒｉｎ  Ｌ．Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｇａｂｒｉｅｌｅ  Ｓｃｈａｅｆｅｒ，Ｊａｎｅｔ  Ｋ．Ｊａｃｋｍａｎ，Ａｎｄｒｅｗ  Ｃ．Ｖｅｎｄｅｌ，ａｎｄ  Ｄａｎ  Ｅａｔｏｎ．ＬＵＺ−Ｙ，ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ＩｇＧ−ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０１２  ２８７：４３３３１−４３３３９］などのロイシンジッパードメインである。あるいは、ｂａｒｎａｓｅ  ｂａｒｓｔａｒペア［Ｄｅｙｅｖ，Ｓ．Ｍ．，Ｗａｉｂｅｌ，Ｒ．，Ｌｅｂｅｄｅｎｋｏ，Ｅ．Ｎ．，Ｓｃｈｕｂｉｇｅｒ，Ａ．Ｐ．，ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．（２００３）．Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｂａｒｎａｓｅ＊ｂａｒｓｔａｒ  ｍｏｄｕｌｅ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２１，１４８６−１４９２］、ＤＮＡ鎖対［Ｚａｈｉｄａ  Ｎ．Ｃｈａｕｄｒｉ，Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｂａｒｔｌｅｔ−Ｊｏｎｅｓ，Ｇｅｏｒｇｅ  Ｐａｎａｙｏｔｏｕ，Ｔｈｏｍａｓ  Ｋｌｏｎｉｓｃｈ，Ｉｖａｎ  Ｍ．Ｒｏｉｔｔ，Ｔｏｒｂｅｎ  Ｌｕｎｄ，Ｐｅｔｅｒ  Ｊ．Ｄｅｌｖｅｓ，Ｄｕａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｂｒｉｄｇｅ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌｕｍｅ  ４５０，Ｉｓｓｕｅｓ  １−２，３０  Ａｐｒｉｌ  １９９９，Ｐａｇｅｓ  ２３−２６］、スプリット蛍光タンパク質ペア［Ｕｌｒｉｃｈ  Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ，Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  Ｈａａｓ．Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ｉｔｓ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｕｓｅ，ＷＯ２０１１１３５０４０  Ａ１］などの他の選択的対合分子ペアを採用することもできる。
【０１２５】
ＴＡＡ提示誘導物質構築物の調製方法
本明細書に記載されるＴＡＡ提示誘導物質構築物は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されているような組み換え法及び組成物を使用して作製することができる。
【０１２６】
したがって、ある特定の実施形態は、本明細書に記載されるＴＡＡ提示誘導物質構築物をコードする、１つ以上の核酸に関する。かかる核酸は、少なくとも１つのＩＳＲ結合構築物及び／または少なくとも１つのＴＡＡ結合構築物に相当するアミノ酸配列をコードすることができ、また、ＴＡＡ提示誘導物質構築物中に存在するのであれば、リンカー及び足場を更に含み得る。
【０１２７】
ある特定の実施形態は、本明細書に記載されるＴＡＡ提示誘導物質構築物をコードする核酸を含む、１つ以上のベクター（例えば、発現ベクター）に関する。いくつかの実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物をコードする核酸は、マルチシストロン性ベクターに含まれる。他の実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物の各ポリペプチド鎖は、別個のベクターによってコードされる。更に、ベクターの組み合わせが単一のＴＡＡ提示誘導物質構築物をコードする核酸を含み得ることも企図される。
【０１２８】
ある特定の実施形態は、かかる核酸または当該核酸を含む１つ以上のベクターを含む、宿主細胞に関する。いくつかの実施形態において、例えば、ＴＡＡ提示誘導物質構築物が多重特異性抗体または二重特異性抗体である場合、宿主細胞は、（１）抗原結合ドメインのＶＬを含むアミノ酸配列及び抗原結合ドメインのＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または（２）抗原結合ドメインのＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１のベクター及び抗原結合ドメインのＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第２のベクターを含む（例えば、形質転換されている）。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、真核生物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはヒト胎児腎（ＨＥＫ）細胞、またはリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。
【０１２９】
ある特定の実施形態は、ＴＡＡ提示誘導物質構築物を作製する方法であって、上記のようなＴＡＡ提示誘導物質構築物をコードする核酸を含む宿主細胞を、ＴＡＡ提示誘導物質構築物の発現に好適な条件下で培養することと、任意選択的に、宿主細胞（または宿主細胞の培地）からＴＡＡ提示誘導物質構築物を回収することと、を含む、方法に関する。
【０１３０】
ＴＡＡ提示誘導物質構築物の組み換え産生の場合、例えば、上記のようなＴＡＡ提示誘導物質構築物をコードする核酸を単離し、その核酸を、宿主細胞における更なるクローニング及び／または発現のために、１つ以上のベクター中に挿入する。かかる核酸は、従来の手順を使用して、容易に単離し、配列決定することができる（例えば、ＴＡＡ提示誘導物質構築物の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）。
【０１３１】
「実質的に精製された」という用語は、本明細書に記載される構築物またはそのバリアントが、その自然に生じる環境、すなわち、天然細胞、または組み換え産生構築物の場合は宿主細胞にみられるように、当該タンパク質に通常付随し、または相互作用する要素を実質的にまたは本質的に含んでいないことを指す。特定の実施形態において、細胞物質を実質的に含まない構築物は、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満または約１％未満（乾燥重量）の夾雑タンパク質を有するタンパク質調製物を含む。構築物が宿主細胞によって組み換え的に産生される場合、ある特定の実施形態のタンパク質は、乾燥重量で、細胞の約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％、約５％、約４％、約３％、約２％または約１％以下で存在する。構築物が宿主細胞によって組み換え的に産生される場合、タンパク質は、特定の実施形態において、乾燥重量で、細胞の約５ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ、約７５０ｍｇ／Ｌ、約５００ｍｇ／Ｌ、約２５０ｍｇ／Ｌ、約１００ｍｇ／Ｌ、約５０ｍｇ／Ｌ、約１０ｍｇ／Ｌまたは約１ｍｇ／Ｌ以下で培地中に存在する。
【０１３２】
特定の実施形態において、ヘテロ多量体Ｆｃを含み、本明細書に記載される方法によって産生される構築物に適用される、「実質的に精製された」という用語は、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ解析、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＳＥＣ及びキャピラリー電気泳動などの適切な方法によって決定したとき、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％の純度レベル、具体的には、少なくとも約７５％、８０％、８５％の純度レベル、より具体的には、少なくとも約９０％の純度レベル、少なくとも約９５％の純度レベル、少なくとも約９９％またはそれ以上の純度レベルを有する。
【０１３３】
ＴＡＡ提示誘導物質構築物コードベクターのクローニングまたは発現に好適な宿主細胞には、本明細書に記載される原核細胞または真核細胞が含まれる。
【０１３４】
「組み換え宿主細胞」または「宿主細胞」は、挿入に使用される方法、例えば、直接取り込み、形質導入、ｆ接合または当該技術分野において知られている他の組み換え宿主細胞の作製方法にかかわらず、外因性ポリヌクレオチドを含む細胞を指す。外因性ポリヌクレオチドは、非組み込みベクター、例えば、プラスミドとして維持され得、あるいは、宿主ゲノムに組み込まれ得る。
【０１３５】
本明細書で使用されるとき、「真核生物」という用語は、動物（限定するものではないが、哺乳動物、昆虫、爬虫類、鳥類などを含む）、繊毛虫、植物（限定するものではないが、単子葉類、双子葉類、海藻などを含む）、真菌、酵母、鞭毛虫、微胞子虫、原生生物などの、系統発生ドメイン真核生物（Ｅｕｃａｒｙａ）に属する生物を指す。
【０１３６】
本明細書で使用されるとき、「原核生物」という用語は、原始的細胞核を持つ生物を指す。例えば、非真核生物は、真正細菌（限定するものではないが、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）などを含む）、系統発生ドメインまたは古細菌（限定するものではないが、メタノコックス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）、ハロバクテリア、例えば、ハロフェラックス・ボルカニ（Ｈａｌｏｆｅｒａｘ  ｖｏｌｃａｎｉｉ）及びハロバクテリア種ＮＲＣ−１、アーケオグロブス・フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、パイロコッカス・ホリコシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）、アエロパイラム・ペルニクス（Ａｅｕｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ）などを含む）系統発生ドメインに属し得る。
【０１３７】
例えば、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、特に、グリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要とされない場合、細菌中で産生され得る。細菌での抗原結合構築物断片及びポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号、同第５，７８９，１９９号及び同第５，８４０，５２３号を参照されたい（Ｃｈａｒｌｔｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，２００３），ｐｐ．２４５−２５４（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における抗体断片の発現に関する記載）も参照）。発現後、抗原結合構築物は、可溶性画分中の細菌細胞ペーストから単離され得、更に精製することができる。
【０１３８】
原核生物に加えて、糸状菌または酵母などの真核微生物は、ＴＡＡ提示誘導物質構築物コードベクターに好適なクローニングまたは発現宿主であり、これらには、グリコシル化経路が「ヒト化」され、部分的または完全にヒトグリコシル化パターンを有する抗原結合構築物の産生を生じる、真菌株及び酵母株を含む。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２：１４０９−１４１４（２００４）及びＬｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４：２１０−２１５（２００６）を参照されたい。
【０１３９】
グリコシル化された抗原結合構築物の発現に好適な宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）にも由来する。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。昆虫細胞、特に、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクションとともに使用することができる、多数のバキュロウイルス株が同定されている。
【０１４０】
植物細胞培養物もまた、宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、同第６，０４０，４９８号、同第６，４２０，５４８号、同第７，１２５，９７８号及び同第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物中で抗原結合構築物を産生するためのＰＬ抗体（商標）技術に関する記載）を参照されたい。
【０１４１】
脊椎動物細胞もまた、宿主として使用され得る。例えば、懸濁液中で成長するように適合された哺乳動物細胞株が、有用であり得る。有用な宿主哺乳動物細胞株の他の例は、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７）；ヒト胚性腎臓株（２９３細胞または例えばＧｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７）に記載されているような２９３細胞）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０）に記載のＴＭ４細胞）；サル腎臓細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）；ヒト子宮頸がん細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ科腎臓細胞（ＭＤＣＫ；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２）；例えば、Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２）に記載のＴＲＩ細胞；ＭＲＣ５細胞；及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株には、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６（１９８０））；ならびにＹ０、ＮＳ０及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株が含まれる。抗原結合構築物の産生に好適な特定の哺乳動物宿主細胞株の概説については、例えば、Ｙａｚａｋｉ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．），ｐｐ．２５５−２６８（２００３）を参照されたい。
【０１４２】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＴＡＡ提示誘導物質構築物は、ＴＡＡ提示誘導物質構築物をコードする核酸を少なくとも１つの安定な哺乳動物細胞に所定の比率でトランスフェクションすることと、少なくとも１つの哺乳動物細胞で当該核酸を発現させることと、を含む方法によって、安定な哺乳動物細胞で産生される。いくつかの実施形態において、核酸の所定の比率は、一過性トランスフェクション実験において決定され、発現産物のうち、抗原結合構築物のパーセンテージが最大になる、投入核酸の相対比率を求める。
【０１４３】
いくつかの実施形態において、安定な哺乳動物細胞でＴＡＡ提示誘導物質構築物を産生する方法では、安定な哺乳動物細胞の発現産物は、単量体の重鎖もしくは軽鎖ポリペプチドまたは他の抗体と比較して、所望のグリコシル化抗原結合構築物をより大きいパーセンテージで含む。
【０１４４】
必要であれば、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、発現後に、精製または単離することができる。タンパク質は、当業者に知られている様々な方法で単離または精製され得る。標準的な精製方法には、ＦＰＬＣ及びＨＰＬＣなどのシステムを使用して大気圧または高圧で実施される、イオン交換、疎水性相互作用、親和性、サイズまたはゲル濾過及び逆相を含む、クロマトグラフィー技術が含まれる。精製方法はまた、電気泳動、免疫、沈殿、透析及びクロマトフォーカシング技術も含む。タンパク質濃度と組み合わせた限外濾過及びダイアフィルトレーション技術もまた有用である。当該技術分野においてよく知られているように、様々な天然タンパク質がＦｃ及び抗体に結合し、これらのタンパク質を抗原結合構築物の精製に使用することができる。例えば、細菌プロテインＡ及びＧは、Ｆｃ領域に結合する。同様に、細菌プロテインＬは、いくつかの抗体のＦａｂ領域に結合する。精製は、多くの場合、特定の融合パートナーによって可能になり得る。例えば、抗体は、ＧＳＴ融合が利用される場合は、グルタチオン樹脂を使用して、Ｈｉｓタグが利用される場合は、Ｎｉ＋２親和性クロマトグラフィーを使用して、またはｆｌａｇタグが使用される場合は、固定化された抗ｆｌａｇ抗体を使用して、精製され得る。好適な精製技術の一般的なガイダンスについては、例えば、参照により全体が援用される、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｓｃｏｐｅｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ，１９９４を参照されたい（参照により全体が援用される）。必要な精製度は、抗原結合構築物の使用に応じて変わり得る。いくつかの場合において、精製は必要でない。
【０１４５】
特定の実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、限定するものではないが、Ｑ−セファロース、ＤＥＡＥセファロース、ｐｏｒｏｓ  ＨＱ、ｐｏｒｏｓ  ＤＥＡＦ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｑ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＱＡＥ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＤＥＡＥ、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ／Ｓｏｕｒｃｅ  Ｑ及びＤＥＡＥ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  Ｑ及びＤＥＡＥカラム上でのクロマトグラフィーを含む、アニオン変換クロマトグラフィーを使用して精製され得る。
【０１４６】
いくつかの実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、限定するものではないが、ＳＰ−セファロース、ＣＭセファロース、ｐｏｒｏｓ  ＨＳ、ｐｏｒｏｓ  ＣＭ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＳＰ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＣＭ、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ／Ｓｏｕｒｃｅ  Ｓ及びＣＭ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  Ｓ及びＣＭカラムならびにそれらの等価物及び同等物を含む、カチオン変換クロマトグラフィーを使用して精製される。
【０１４７】
加えて、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、当該技術分野において知られている技術を使用して、化学的に合成することができる（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，１９８３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ及びＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１０：１０５−１１１（１９８４）参照）。例えば、ポリペプチドの断片に相当するポリペプチドは、ペプチド合成装置の使用により合成することができる。更に、所望により、非古典的アミノ酸または化学的アミノ酸類似体をポリペプチド配列に置換または付加として導入することができる。非古典的アミノ酸には、一般的なアミノ酸のＤ−異性体、２，４ジアミノ酪酸、α−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、ｇ−Ａｂｕ、ｅＡｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、フルオロ−アミノ酸、人工設計アミノ酸、例えば、α−メチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸、Ｎα−メチルアミノ酸、及び一般的なアミノ酸類似体が含まれるが、これらに限定されない。更に、アミノ酸は、Ｄ（右旋性）またはＬ（左旋性）であり得る。
【０１４８】
翻訳後修飾
特定の実施形態において、本明細書に記載されるＴＡＡ提示誘導物質構築物は、翻訳中、または翻訳後に、様々に修飾される。
【０１４９】
本明細書で使用される「修飾された」という用語は、ポリペプチドの長さ、ポリペプチドのアミノ酸配列、化学構造、同時翻訳修飾または翻訳後修飾に対する変更などの、所与のポリペプチドに対してなされる任意の変更を指す。
【０１５０】
「翻訳後修飾された」という用語は、ポリペプチド鎖に組み込まれた後に天然または非天然アミノ酸に生じる、当該アミノ酸の任意の修飾を指す。この用語は、ほんの一例として、ｉｎ  ｖｉｖｏ同時翻訳修飾、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ同時翻訳修飾（無細胞翻訳系におけるものなど）、ｉｎ  ｖｉｖｏ翻訳後修飾及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳後修飾を包含する。
【０１５１】
いくつかの実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、抗体分子もしくは抗原結合構築物もしくは他の細胞リガンドに対するグリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解による切断もしくは連結である修飾、またはこれらの修飾の組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、限定するものではないが、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ４による特異的化学切断；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元；及びツニカマイシンの存在下における代謝合成を含む、既知の技術によって化学的に修飾される。
【０１５２】
抗原結合構築物の更なる任意選択の翻訳後修飾には、例えば、Ｎ−結合またはＯ−結合炭水化物鎖、Ｎ末端またはＣ末端のプロセシング）、アミノ酸主鎖への化学部分の結合、Ｎ−結合またはＯ−結合炭水化物鎖の化学修飾、及び原核宿主細胞発現の結果としてのＮ末端メチオニン残基の付加または欠失が含まれる。本明細書に記載される抗原結合構築物は、タンパク質の検出及び単離を可能にする、酵素標識、蛍光標識、同位体標識または親和性標識などの検出可能な標識により修飾される。特定の実施形態において、好適な酵素標識の例としては、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ、好適な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジンビオチン及びアビジン／ビオチンが挙げられ、好適な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、イソチオシアン酸フルオレセイン、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられ、発光物質の例としてはルミノールが挙げられ、生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン及びエクオリンが挙げられ、好適な放射性物質の例としては、ヨウ素、炭素、硫黄、トリチウム、インジウム、テクネチウム、タリウム、ガリウム、パラジウム、モリブデン、キセノン、フッ素が挙げられる。
【０１５３】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗原結合構築物は、放射性金属イオンと会合する大環状キレート剤に取り付けることができる。
【０１５４】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＴＡＡ提示誘導物質構築物は、翻訳後プロセシングなどの天然プロセス、または当該技術分野においてよく知られている化学修飾技術のいずれかによって修飾され得る。特定の実施形態において、所与のポリペプチドのいくつかの部位に、同程度または異なる程度で同じ種類の修飾が存在してもよい。特定の実施形態において、本明細書に記載される抗原結合構築物由来のポリペプチドは、例えば、ユビキチン化の結果として分岐しており、いくつかの実施形態において、分岐を伴うまたは分岐のない環状である。環状、分岐及び分岐環状ポリペプチドは、翻訳後の天然プロセスから生じるか、合成方法によってなされ得る。修飾としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボース化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有架橋結合の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリスチル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化などのタンパク質へのアミノ酸のトランスファーＲＮＡ媒介付加、及びユビキチン化が含まれる（例えば、ＰＲＯＴＥＩＮＳ−ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）；ＰＯＳＴ−ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ  ＣＯＶＡＬＥＮＴ  ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｇｓ．１−１２（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２：６２６−  ６４６（１９９０）；Ｒａｔｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６３：４８−６２（１９９２）参照）。
【０１５５】
特定の実施形態において、本明細書に記載される抗原結合構築物は、固体支持体に取り付けることができ、当該支持体は、ポリペプチドのイムノアッセイまたは精製に特に有用であり、本明細書に記載されるタンパク質が結合するか、当該タンパク質に結合するか、または会合する。かかる固体支持体には、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンが含まれるが、これらに限定されない。
【０１５６】
ＴＡＡ提示誘導物質構築物が、ペプチドまたはポリペプチドではない少なくとも１つのＩＳＲ結合構築物または少なくとも１つのＴＡＡ結合構築物を含む場合、ＩＳＲ結合構築物及び／またはＴＡＡ結合構築物は、互いに結合されてもよいし、または存在する場合はリンカーもしくは足場に化学的にコンジュゲートされ得る。
【０１５７】
追加の任意修飾
一実施形態において、本明細書に記載されるＴＡＡ提示誘導物質構築物は、共有結合がＴＡＡ提示誘導物質のＩＳＲまたはＴＡＡへの結合能力と干渉せず、もしくは影響しないように、またはその安定性に悪影響を及ぼさないように、更に修飾され得る（すなわち、様々な種類の分子の共有結合によって）。そのような修飾としては、例えば、限定するものではないが、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質への連結などが挙げられる。多数の化学修飾はいずれも、限定するものではないが、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含む、既知の技術によって実施することができる。
【０１５８】
別の実施形態において、本明細書に記載されるＴＡＡ提示誘導物質構築物は、所与の生物学的応答を変更する治療薬または薬物部分にコンジュゲートすることができる（直接的または間接的に）。ある特定の実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、薬物、例えば、毒素、化学療法剤、免疫調節剤または放射性同位体にコンジュゲートされる。ポリペプチドを薬物または小分子にコンジュゲートするいくつかの方法は、当該技術分野において知られている。例えば、ＡＤＣ（抗体−薬物コンジュゲート）の調製方法が、例えば、米国特許第８，６２４，００３号（ポット法）、同第８，１６３，８８８号（１ステップ）及び同第５，２０８，０２０号（２ステップ法）に記載されている。いくつかの実施形態において、薬物は、マイタンシン、アウリスタチン、カリケアミシンまたはその誘導体から選択される。他の実施形態において、薬物は、ＤＭ１及びＤＭ４から選択されるマイタンシンである。いくつかの実施形態において、薬物部分は、微小管重合阻害剤またはＤＮＡインターカレーターであってもよい。他の実施形態において、薬物部分は、ＴＬＲ（ｔｏｌｌ様受容体）アゴニストまたはＳＴＩＮＧ（インターフェロン遺伝子刺激因子）アゴニストなどの免疫促進剤であってもよい。
【０１５９】
いくつかの実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、細胞傷害剤にコンジュゲートされる。本明細書で使用される「細胞傷害剤」という用語は、細胞の機能を抑制または阻害し、及び／または細胞の破壊を引き起こす物質を指す。この用語は、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２及びＬｕ１７７）、化学療法剤、及び細菌、真菌、植物または動物起源の小分子毒素または酵素活性毒素などの毒素を含み、その断片及び／またはバリアントを含むことが意図される。
【０１６０】
治療薬または薬物部分は、古典的な化学治療薬に限定されると解釈されるべきではない。例えば、薬物部分は、所望の生物活性を有するタンパク質またはポリペプチドであり得る。そのようなタンパク質としては、例えば、アブリン、リシンＡ、Ｏｎｃｏｎａｓｅ（または別の細胞傷害性ＲＮａｓｅ）、シュードモナス外毒素、コレラ毒素もしくはジフテリア毒素などの毒素；腫瘍壊死因子、αインターフェロン、βインターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、アポトーシス剤、例えば、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＡＩＭ  Ｉ（国際公開第ＷＯ９７／３３８９９号参照）、ＡＩＭ  ＩＩ（国際公開第ＷＯ９７／３４９１１号）、Ｆａｓリガンド（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６：１５６７）、及びＶＥＧＩ（国際公開第ＷＯ９９／２３１０５号参照）、抗血栓薬もしくは抗血管新生剤、例えば、アンギオスタチンもしくはエンドスタチンなどのタンパク質；または、例えば、リンフォカイン（例えば、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）及び顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」））もしくは成長因子（例えば、成長ホルモン（「ＧＨ」））などの生物学的応答調節物質を挙げることができる。
【０１６１】
更に、代替的実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、放射性物質または放射性金属イオンのコンジュゲートに有用な大環状キレート剤などの治療部分にコンジュゲートされ得る（放射性物質の例については上記参照）。特定の実施形態において、大環状キレート剤は、リンカー分子を介して抗体に取り付けることができる、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）である。そのようなリンカー分子は、当該技術分野において一般に知られており、Ｄｅｎａｒｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４：２４８３；Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１０：５５３；及びＺｉｍｍｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２６：９４３に記載されている。
【０１６２】
いくつかの実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、精製及び／または試験などを容易にするためのタグを含む融合タンパク質として発現され得る。本明細書で言及される場合、「タグ」は、タンパク質の同定または精製に寄与する、Ｃ末端、Ｎ末端または内部のいずれかでタンパク質にもたらされる、任意に付加された一連のアミノ酸である。好適なタグには、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、グルタチオン−ｓ−トランスフェラーゼ、赤血球凝集素（ＨＡ）及びマルトース結合タンパク質などの、精製及び／または試験に有用であることが当業者に知られているタグが含まれるが、これらに限定されない。そのようなタグ付きタンパク質はまた、精製の前、その間、又その後にタグの除去を容易にするための切断部位、例えば、トロンビン、エンテロキナーゼまたは第Ｘ因子切断部位を含むように工学的に操作することもできる。
【０１６３】
ＴＡＡ提示誘導物質構築物の試験
ＴＡＡ提示誘導物質構築物のＩＳＲ及び／またはＴＡＡに対する結合能力は、当該技術分野で知られている方法に従って試験することができる。ＴＡＡ提示誘導物質構築物のＴＡＡまたはＩＳＲに結合する能力は、抗原結合アッセイ（ＩＳＲ結合構築物及び／またはＴＡＡ結合構築物が抗体またはその断片である場合）または細胞結合アッセイによって評価することができる。抗原結合アッセイは、精製状態または混合物中のいずれかで、ＴＡＡ提示誘導物質構築物を抗原（ＩＳＲまたはＴＡＡ）とインキュベーションし、抗原に結合したＴＡＡ提示誘導物質の量を対照と比較して評価することによって実施される。抗原に結合したＴＡＡ提示誘導物質構築物の量は、例えば、ＥＬＩＳＡまたはＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）によって評価することができる。細胞結合アッセイは、ＴＡＡ提示誘導物質構築物を、目的のＩＳＲまたはＴＡＡを発現する細胞とインキュベーションすることによって実施される（当該細胞は市販されている）。細胞に結合したＴＡＡ提示誘導物質構築物の量は、フローサイトメトリーによって、例えば、対照の存在下で観察された結合と比較して、評価することができる。これらの種類のアッセイを実施する方法は、当該技術分野においてよく知られている。
【０１６４】
ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、ＡＰＣによるＴＣＤＭ獲得を促進するかどうかを決定するために試験され得る。好適なアッセイは、目的のＴＡＡを発現する標識された腫瘍細胞と、目的のＩＳＲを発現する細胞を共培養でインキュベーションすることを伴い得る。いくつかの場合、標識された腫瘍細胞は、トランスウェルチャンバーを使用して、目的のＩＳＲを発現する細胞から物理的に分離される。共培養開始後の様々な時点で、ＩＳＲ発現細胞を回収し、標識量をフローサイトメトリーまたはハイコンテントイメージングによって評価する。そのような方法は、当該技術分野において記載されており、例示的な方法については、実施例に記載される。
【０１６５】
ＴＡＡ提示誘導物質構築物はまた、目的のＩＳＲを発現する細胞のＴＣＤＭ依存性活性化を促進するかどうかを決定するために試験され得る。例示的なアッセイにおいて、ＴＡＡ提示誘導物質構築物によって誘導されたＴＣＤＭ由来ペプチドのＭＨＣ提示は、ＩＳＲ発現細胞と目的のＴＡＡを発現する腫瘍細胞との共培養後に、ＩＳＲ発現細胞がＴ細胞を刺激する能力を評価することによって、評価される。ＩＳＲアゴニズムは、共培養開始後の複数時点における、上清サイトカインまたは細胞表面活性化マーカーの定量を介して、評価することができる。サイトカイン産生は、市販のＥＬＩＳＡまたはビーズによるマルチプレックスシステムを介して定量することができ、細胞表面活性化マーカーの発現は、フローサイトメトリーまたはハイコンテントイメージングを介して定量することができる。ＩＳＲ発現細胞のＴＣＤＭ依存性活性化を評価する方法は、よく知られており、例示的な方法については、実施例に記載される。
【０１６６】
ＴＡＡ提示誘導物質構築物はまた、ＭＨＣのＴＡＡ提示及びポリクローナルＴ細胞の活性化を誘導するかどうかを決定するために試験され得る。例えば、ＩＳＲ発現細胞とＴＡＡ発現腫瘍細胞の共培養は、前述の段落に記載のとおりに実施される。共培養は、上記のとおりに実施されるが、抗原提示は、様々な時点で、ＩＳＲ発現細胞を二次Ｔ細胞活性化共培養に移すことによって評価される。数日後、ＴＡＡ特異的Ｔ細胞応答を、蛍光ペプチドＭＨＣマルチマー（ＩｍｍｕＤｅｘ）によるフローサイトメトリー染色によって定量する。いくつかの場合、Ｔ細胞は、その後、ペプチドパルス同種異系ＡＰＣを含有する三次培養に移され、ＴＡＡ応答頻度をサイトカイン特異的ＥＬＩＳｐｏｔにより更に評価することができる。
【０１６７】
ＴＡＡ提示誘導物質構築物のｉｎ  ｖｉｖｏ作用はまた、標準的な技術によっても評価することができる。例えば、腫瘍成長に対するＴＡＡ提示誘導物質構築物の作用は、様々な腫瘍モデルで実験することができる。候補治療薬が、がん、例えば、乳癌または胃癌などを治療する能力を試験するためのいくつかの好適な動物モデルが当該技術分野において知られている。いくつかのモデルは、市販されている。一般に、これらのモデルは、マウス異種移植モデルであり、細胞株由来腫瘍または患者由来腫瘍がマウスに移植される。試験される構築物は、通常、腫瘍が動物内で定着した後に投与されるが、いくつかの場合、構築物は、細胞株とともに投与され得る。構築物が腫瘍を治療することができるかどうかを決定するために、腫瘍の体積及び／または動物の生存率がモニタリングされる。構築物は、静脈内（ｉ．ｖ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）または皮下（ｓ．ｃ．）投与することができる。投与スケジュール及び量は、様々であるが、当業者によって容易に決定され得る。例示的な用量は、週１回、１０ｍｇ／ｋｇであり得る。腫瘍成長は、標準的な手順によってモニタリングすることができる。例えば、標識した腫瘍細胞を使用した場合、腫瘍成長は、適切なイメージング技術によってモニタリングされ得る。固形腫瘍では、腫瘍サイズを測径器で測定してもよい。
【０１６８】
医薬組成物
ある特定の実施形態は、本明細書に記載されるＴＡＡ提示誘導物質構築物と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物に関する。
【０１６９】
「薬学的に許容される」という用語は、動物、より具体的にはヒトにおける使用について、連邦政府もしくは州政府の規制当局によって承認されていること、または米国薬局方もしくは他の一般に認められた薬局方に記載されていることを意味する。
【０１７０】
「担体」という用語は、希釈剤、アジュバント、賦形剤、ビヒクルまたはそれらの組み合わせを指し、構築物とともに投与される。そのような薬学的担体は、水及び油などの滅菌液体であってよく、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などの、石油、動物、植物または合成起源のものを含む。いくつかの態様において、担体は、天然に存在しない人工の担体である。医薬組成物が静脈内投与される場合、担体として、水を使用することができる。生理食塩水ならびにデキストロース及びグリセロール水溶液もまた、特に、注射剤用の液体担体として利用することができる。好適な薬学的賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが含まれる。組成物はまた、所望により、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含有し得る。好適な薬学的担体の例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。
【０１７１】
医薬組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、徐放性製剤などの形態であってよい。組成物は、トリグリセリドなどの従来の結合剤及び担体とともに、坐剤として製剤化することもできる。経口製剤は、薬学等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的な担体を含み得る。
【０１７２】
医薬組成物は、患者に適した投与形態をもたらすように、治療上有効な量のＴＡＡ提示誘導物質構築物を、適量の担体とともに含み得る。製剤は、投与形態に適したものであるべきである。
【０１７３】
特定の実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物を含む組成物は、慣例的手順に従って、ヒトへの静脈内投与に適した医薬組成物として、製剤化される。典型的に、静脈内投与用組成物は、滅菌等張性水性緩衝液中の溶液である。必要に応じて、組成物は、可溶化剤、及び注射部位の痛みを和らげるためのリグノカインなどの局所麻酔薬を含み得る。一般に、各成分は、別々に、または単位剤形で一緒に混合されて、例えば、活性剤の量が示されているアンプルまたはサシェなどの密閉容器中の凍結乾燥粉末または無水濃縮物として、提供される。組成物が注入によって投与される場合、当該組成物は、医薬品グレードの滅菌水または生理食塩水が入った注入ボトルにより投薬することができる。組成物が注射によって投与される場合、各成分が投与前に混合され得るように、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルが提供され得る。
【０１７４】
特定の実施形態において、本明細書に記載される組成物は、中性形態または塩形態で製剤化される。薬学的に許容される塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するものなどのアニオンと形成される塩、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄  イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するものなどのカチオンと形成される塩が含まれる。
【０１７５】
ＴＡＡ提示誘導物質構築物の使用方法
本明細書に記載されるＴＡＡ提示誘導物質構築物は、対象において、単一のＩＳＲ発現細胞による、１つ以上の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）由来ペプチドの主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）提示を同時に誘導するために使用され得る。１つ以上のＴＡＡは、ＴＡＡ提示誘導物質構築物が直接結合するＴＡＡ（すなわち、第１のＴＡＡ）に加えて、ＴＣＤＭの一部であり、第１のＴＡＡと物理的に会合する追加のＴＡＡ（すなわち、第２のＴＡＡ）を含み得る。したがって、一実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、対象において、単一のＩＳＲ−発現細胞による、１つ以上の第２のＴＡＡ由来ペプチドのＭＨＣ提示を同時に誘導する方法に使用することができる。代替的な実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、対象において、単一のＩＳＲ発現細胞による、第１のＴＡＡ及び１つ以上の第２のＴＡＡ由来のペプチドのＭＨＣ提示を同時に誘導する方法に使用することができる。
【０１７６】
一実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物はまた、対象において、ＩＳＲ発現細胞の活性化を誘導するために使用することもできる。ＴＡＡ提示誘導物質と接触させると、ＩＳＲ発現細胞は、活性化され、続いて、サイトカインを産生し、及び／または共刺激リガンドを上方制御する。したがって、一実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、対象において、ＩＳＲ発現細胞の活性化を誘導する方法に使用することができる。
【０１７７】
一実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、対象において、ポリクローナルＴ細胞応答を誘導するために使用され得る。一実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、新生物性細胞の不均質性及び動的性質に適応することができる、ポリクローナルＴ細胞応答を誘導するために使用され得る。例えば、所定の腫瘍抗原に対するいくつかの抗腫瘍治療法は、当該腫瘍に対する免疫応答が抑制されるため、または腫瘍細胞の変化により所定の腫瘍抗原が喪失するため、有効性を失うことがある。本明細書に記載されるＴＡＡ提示誘導物質構築物は、ＴＣＤＭをＡＰＣに向かわせることができるので、当該ＴＡＡ提示誘導物質は、ＴＣＤＭのＴＡＡ組成が変化しても、抗腫瘍治療法としての有効性を維持することが可能であり得る。
【０１７８】
別の実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、２つ以上のＴＡＡ（２つ以上の第２のＴＡＡ、または第１のＴＡＡ及び１つ以上の第２のＴＡＡのいずれか）に特異的なＴ細胞を同時に拡大、活性化、または分化させる方法に使用され得、当該方法は、対象からＴ細胞及び天然刺激受容体（ＩＳＲ）発現細胞を得る工程と、腫瘍細胞由来物質（ＴＣＤＭ）の存在下で、Ｔ細胞及びＩＳＲ発現細胞をＴＡＡ提示誘導物質構築物とともに培養して、拡大、活性化または分化したＴ細胞を生成する工程とを含む。更なる実施形態において、ＴＣＤＭは、自己由来原発腫瘍及び／または自己由来転移性組織試料、同種異系腫瘍試料に由来するか、または腫瘍細胞株に由来する。
【０１７９】
更なる実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで拡大、活性化、または分化したＴ細胞集団は、当該治療法を必要とするがんを有する対象に投与され得る。したがって、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、本明細書に記載される方法によってｉｎ  ｖｉｔｒｏで拡大、活性化、または分化したＴ細胞集団を調製するために使用することができ、かかるＴ細胞集団は、がんを有する対象に投与される。
【０１８０】
更に別の実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、腫瘍細胞由来物質（ＴＣＤＭ）中の腫瘍関連抗原を特定する方法で使用され得、当該方法は、対象からＴ細胞及び濃縮された天然刺激受容体（ＩＳＲ）発現細胞を単離することと、腫瘍細胞由来物質（ＴＣＤＭ）の存在下で、ＩＳＲ発現細胞及びＴ細胞をＴＡＡ提示誘導物質構築物とともに培養して、ＴＡＡ提示誘導物質構築物により活性化されたＩＳＲ発現細胞を生成することと、ＴＡＡ提示誘導物質構築物により活性化されたＩＳＲ発現細胞のＭＨＣ複合体から溶出されたＴＡＡペプチドの配列を決定することと、ＴＡＡペプチドに対応するＴＡＡを特定することと、を含む。
【０１８１】
別の実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）標的ポリペプチドを特定する方法に使用され得、当該方法は、対象からＴ細胞及び濃縮された天然刺激受容体（ＩＳＲ）発現細胞を単離することと、腫瘍細胞由来物質（ＴＣＤＭ）の存在下で、ＩＳＲ発現細胞及びＴ細胞をＴＡＡ提示誘導物質構築物とともに培養して、ＴＡＡ提示誘導物質構築物により活性化されたＩＳＲ発現細胞及び活性化Ｔ細胞を生成することと、活性化Ｔ細胞をＴＡＡ候補ライブラリーに対してスクリーニングして、ＴＣＲ標的ポリペプチドを特定することと、を含む。
【０１８２】
上記の方法は、当該技術分野においてよく知られている工程の実施を伴う。例えば、Ｔ細胞及び／またはＩＳＲ発現細胞を単離する工程は、実施例に記載されるとおりに、または当該技術分野において知られている他の方法、例えば、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｊ．ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ．４（１）：１−１４に記載の方法によって、実施することができる。ペプチドの配列決定は、当該技術分野において知られている多数の方法によって実施することができる。ＴＣＲ標的を特定するための活性化Ｔ細胞のスクリーニングもまた、当該技術分野において知られている多数の方法によって達成することができる。
【０１８３】
特定の実施形態において、提供されるのは、がんを治療する方法であって、かかる治療、予防または改善が望まれる対象に、本明細書に記載されるＴＡＡ提示誘導物質構築物を、当該がんの治療、予防または改善に有効な量で投与することを含む、方法である。他の実施形態において、対象のがんの治療、予防または改善のための薬剤の調製において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物を使用する方法が提供される。
【０１８４】
「対象」という用語は、治療、観察または実験の対象となる動物を指し、いくつかの実施形態において、哺乳動物である。動物は、ヒト、非ヒト霊長類、コンパニオンアニマル（例えば、イヌ、ネコなど）、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマなど）または実験動物（例えば、ラット、マウス、モルモットなど）であり得る。
【０１８５】
本明細書で使用される「哺乳動物」という用語は、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ネズミ、ウシ、ウマ及びブタを含むが、これらに限定されない。
【０１８６】
「治療」は、治療がなされる個体または細胞の自然な経過を変更させようとする臨床的介入を指し、予防目的または臨床病理経過中のいずれかで実施され得る。望ましい治療効果には、疾患の発生または再発の防止、症状の軽減、疾患の任意の直接的または間接的な病理学的帰結の軽減、転移の予防、疾患進行速度の低下、疾患状態の改善または一時的緩和、及び寛解または改善した予後が含まれる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＴＡＡ提示誘導物質構築物は、疾患または障害の発生を遅らせるために使用される。一実施形態において、本明細書に記載されるＴＡＡ提示誘導物質構築物及び方法は、腫瘍退縮をもたらす。一実施形態において、本明細書に記載されるＴＡＡ提示誘導物質構築物及び方法は、腫瘍／がん成長の阻害をもたらす。
【０１８７】
望ましい治療効果には、疾患の発生または再発の防止、症状の軽減、疾患の任意の直接的または間接的な病理学的帰結の軽減、転移の予防、疾患進行速度の低下、疾患状態の改善または一時的緩和、生存率の改善、及び寛解または改善した予後のうちの１つ以上が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＴＡＡ提示誘導物質構築物は、疾患の発生を遅らせるため、または疾患の進行を遅らせるために使用される。
【０１８８】
本明細書で使用されるとき、「有効量」という用語は、列挙される方法の目的を達成する、例えば、治療がなされる疾患の症状、状態または障害のうちの１つ以上をある程度緩和する、構築物の投与量を指す。治療タンパク質の異常発現及び／または活性に関連する疾患または障害の治療、抑制及び予防に有効である本明細書に記載される組成物の量は、標準的な臨床技術によって決定することができる。加えて、任意選択的に、最適な用量範囲の特定に役立てるために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを利用してもよい。製剤に採用される正確な投与量は、投与経路及び疾患または障害の重症度にも依存し、医師の判断及び各患者の状況に従って決定されるものとする。有効量は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは動物モデル試験系から得られた用量反応曲線から推定される。
【０１８９】
ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、対象に投与される。様々な送達系が知られており、本明細書に記載されるＴＡＡ提示誘導物質構築物製剤を投与するために使用することができる。例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセルへの封入、化合物を発現することができる組み換え細胞、受容体媒介エンドサイトーシス（例えば、Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２（１９８７）参照）、レトロウイルスベクターまたは他のベクターの一部としての核酸の構築などがある。導入方法には、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外及び経口の各経路が含まれるが、これらに限定されない。化合物または組成物は、任意の簡便な経路によって、例えば、注入またはボーラス注射によって、上皮または皮膚粘膜内膜（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜及び腸粘膜など）を介した吸収によって投与され得、生物学的に活性な剤とともに投与されてもよい。投与は、全身性または局所的であってよい。加えて、特定の実施形態において、本明細書に記載されるＴＡＡ提示誘導物質構築物組成物を、脳室内及び髄腔内注射を含む任意の好適な経路によって中枢神経系に導入することが望ましい。脳室内注射は、例えば、Ｏｍｍａｙａリザーバなどのリザーバに取り付けた脳室内カテーテルによって容易になされ得る。経肺投与、例えば、吸入器またはネブライザ及びエアロゾル化剤を含む製剤の使用による経肺投与を採用することもできる。
【０１９０】
具体的な一実施形態において、本明細書に記載されるＴＡＡ提示誘導物質構築物または組成物は、治療を必要とする領域に局所的に投与することが望ましい。これは、例えば、限定するものではないが、手術中の局所注入、局所適用、例えば、手術後の創傷包帯と組み合わせて、注射により、カテーテルにより、坐剤により、またはインプラントにより、達成され得、当該インプラントは、多孔質、非多孔質またはゼラチン状材料のものであり、シラスティック膜などの膜、または繊維を含む。好ましくは、本明細書に記載されるＴＡＡ提示誘導物質構築物を含むタンパク質を投与する場合、タンパク質を吸収しない材料を使用することに留意しなければならない。
【０１９１】
別の実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物または組成物は、小胞，特に、リポソームで送達することができる（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）；Ｔｒｅａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｆｉｄｌｅｒ（ｅｄｓ．），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３５３−３６５（１９８９）；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，ｉｂｉｄ．，ｐｐ．３１７−３２７参照；概ね同書参照）。
【０１９２】
更に別の実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物または組成物は、制御放出系で送達することができる。一実施形態において、ポンプが使用され得る（Ｌａｎｇｅｒ、上掲；Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４（１９８９）参照）。別の実施形態において、ポリマー材料が使用され得る（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．），ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，Ｓｍｏｌｅｎ  ａｎｄ  Ｂａｌｌ（ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４）；Ｒａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｐｅｐｐａｓ，Ｊ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１（１９８３）参照；またＬｅｖｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１９０（１９８５）；Ｄｕｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１（１９８９）；Ｈｏｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５（１９８９）も参照）。更に別の実施形態において、制御放出系を治療標的、例えば、脳の近傍に配置することができ、これにより、全身投与量のごくわずかな量のみしか必要とされない（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５−１３８（１９８４）参照）。
【０１９３】
本明細書に記載されるＴＡＡ提示誘導物質構築物をコードする核酸を含む特定の実施形態において、核酸は、コードされたタンパク質の発現を促進するために、核酸を適切な核酸発現ベクターの一部として構築し、それが細胞内になるように、例えば、レトロウイルスベクターの使用（米国特許第４，９８０，２８６号参照）もしくは直接注射もしくはマイクロパーティクルガンの使用（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ、Ｄｕｐｏｎｔ）により投与することによって、または脂質もしくは細胞表面受容体もしくはトランスフェクション剤でのコーティング、または核移入することが知られているホメオボックス様ペプチド（例えば、Ｊｏｌｉｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１８６４−１８６８（１９９１）参照）に連結させて投与することなどによって、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与することができる。あるいは、核酸は、細胞内に導入し、相同組み換えによって発現用の宿主細胞ＤＮＡ内に組み込むことができる。
【０１９４】
疾患または障害の治療、抑制及び予防に有効であるＴＡＡ提示誘導物質構築物の量は、標準的な臨床技術によって決定することができる。加えて、任意選択的に、最適な用量範囲の特定に役立てるために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを利用してもよい。製剤に採用される正確な投与量は、投与経路及び疾患または障害の重症度にも依存し、医師の判断及び各患者の状況に従って決定されるものとする。有効量は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは動物モデル試験系から得られた用量反応曲線から推定される。
【０１９５】
本明細書に記載されるＴＡＡ提示誘導物質構築物は、単独で、または他の種類の治療法（例えば、放射線療法、化学療法、ホルモン療法、免疫療法及び抗腫瘍剤）と組み合わせて、投与され得る。一般に、患者の種と同じ種である種に起源する産物の投与または同じ種反応性（抗体の場合）が好ましい。
【０１９６】
本明細書に記載されるＴＡＡ提示誘導物質構築物は、がんの治療に使用することができる。いくつかの実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、１つ以上の代替形態の抗がん治療法を受けたことのある患者の治療に使用され得る。いくつかの実施形態において、患者は、再発したか、１つ以上の代替形態の抗がん治療法に応答しなかった。他の実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、１つ以上の代替形態の抗がん治療法と組み合わせて、患者に投与される。他の実施形態において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、１つ以上の代替形態の抗がん治療法による治療に対して不応性になった患者に投与される。
【０１９７】
キット及び製品
また、本明細書に記載されるのは、１つ以上のＴＡＡ提示誘導物質構築物を備えるキットである。キットの個々の構成要素は、別個の容器に包装され、かかる容器は、医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形式の注意書きを添付することができ、この注意書きは、製造、使用または販売の機関による承認を反映するものである。キットは、任意選択的に、ＴＡＡ提示誘導物質構築物の使用方法または投与レジメンを概説する説明書または指示書を含み得る。
【０１９８】
キットの１つ以上の構成成分が溶液、例えば、水溶液または滅菌水溶液として提供される場合、容器手段自体は、吸入器、シリンジ、ピペット、点眼器または他のそのような同様の装置であってよく、そこから溶液を対象に投与するか、またはキットの他の構成成分に適用して混合することができる。
【０１９９】
キットの構成成分はまた、乾燥形態または凍結乾燥形態で提供され得、キットは、凍結乾燥された構成成分を再構成するのに好適な溶媒を追加で含み得る。容器の数または種類にかかわらず、本明細書に記載されるキットはまた、患者への組成物の投与を補助する器具を含み得る。そのような器具は、吸入器、鼻腔スプレー装置、シリンジ、ピペット、鉗子、計量スプーン、点眼器または同様の医学的に承認された送達媒体であり得る。
【０２００】
ある特定の実施形態は、本明細書に記載されるような患者の治療に有用である物質を含む、製品に関する。製品は、容器と、当該容器上または当該容器に付随したラベルまたは添付文書とを含む。好適な容器には、例えば、瓶、バイアル瓶、シリンジ、静脈注射用溶液バッグなどが含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。容器は、ＴＡＡ提示誘導物質構築物を含む組成物を、それ自体でまたは患者の治療に有効な別の組成物と組み合わせて保持し、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射針が貫通できる栓を有する、静脈注射用溶液バッグまたはバイアルであってよい）。ラベルまたは添付文書は、組成物が、選択した状態を治療するために使用されることを示す。いくつかの実施形態において、製品は、（ａ）組成物が入った第１の容器であって、組成物は、本明細書に記載されるＴＡＡ提示誘導物質構築物である、容器と、（ｂ）組成物が入った第２の容器であって、第２の容器中の組成物は、更なる細胞傷害剤または別の治療薬を含む、容器とを含み得る。このような実施形態において、製品は、組成物が特定の状態を治療するために使用され得ることを示す添付文書を更に含み得る。代替的または追加的に、製品は、静菌性注射用水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液及びデキストロース液などの薬学的に許容される緩衝液を含む、第２（または第３）の容器を更に含み得る。製品は、任意選択的に、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む、商業的観点及びユーザの観点から望ましい他の材料を更に含んでもよい。
【０２０１】
ポリペプチド及びポリヌクレオチド
本明細書に記載される場合、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、少なくとも１つのポリペプチドを含む。ある特定の実施形態は、本明細書に記載されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。
【０２０２】
本明細書に記載されるＴＡＡ提示誘導物質構築物、ポリペプチド及びポリヌクレオチドは、典型的に、単離されている。本明細書で使用されるとき、「単離された」とは、その天然細胞培養環境の構成成分から特定及び分離及び／または回収された作用物質（例えば、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド）を意味する。天然環境の夾雑成分は、ＴＡＡ提示誘導物質構築物の診断上または治療上の使用を妨げない物質であり、酵素、ホルモン及び他のタンパク質性または非タンパク質性の溶質を含み得る。単離されたとはまた、例えば、ヒトの介入により、合成的に生成された作用物質も指す。
【０２０３】
「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、本明細書において、アミノ酸残基からなる高分子を指すために、互換的に使用される。すなわち、ポリペプチドに関する説明は、ペプチドの説明にもタンパク質の説明にも等しく当てはまり、逆も同様である。本用語は、天然に存在するアミノ酸ポリマーだけでなく、１つ以上のアミノ酸残基が天然にコードされていないアミノ酸であるアミノ酸ポリマーに適用される。本明細書で使用される場合、本用語は、完全長タンパク質を含む任意の長さのアミノ酸鎖を包含し、ここで、アミノ酸残基は、ペプチド共有結合によって連結されている。
【０２０４】
「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸及び非天然アミノ酸だけでなく、天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣体を指す。天然にコードされているアミノ酸は、２０の一般的なアミノ酸（アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリン）ならびにピロリシン及びセレノシステインである。アミノ酸類似体は、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムなどの、天然アミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基及びＲ基に結合している炭素を有する化合物を指す。そのような類似体は、修飾されたＲ基（ノルロイシンなど）または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を保持している。アミノ酸への言及は、例えば、天然に生じるタンパク質合成性Ｌ−アミノ酸；Ｄ−アミノ酸、アミノ酸バリアント及び誘導体などの化学修飾されたアミノ酸；β−アラニン、オルニチンなどの天然に生じる非タンパク質合成性アミノ酸；アミノ酸に特徴的であることが当該技術分野において知られている性質を有する化学合成化合物を含む。非天然アミノ酸の例としては、α−メチルアミノ酸（例えば、α−メチルアラニン）、Ｄ−アミノ酸、ヒスチジン様アミノ酸（例えば、２−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン）、側鎖に追加のメチレンを有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸）、及び側鎖中のカルボン酸官能基がスルホン酸基で置き換えられているアミノ酸（例えば、システイン酸）が挙げられるが、これらに限定されない。合成非天然アミノ酸、置換アミノ酸または１つ以上のＤ−アミノ酸を含む非天然アミノ酸を本明細書に記載されるＴＡＡ提示誘導物質構築物に組み込むことは、多数の様々な点で有利であり得る。Ｄ−アミノ酸含有ペプチドなどは、Ｌ−アミノ酸含有対応物と比較して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで安定性の増大を示す。したがって、より高い細胞内安定性が望まれるか、または必要とされる場合、Ｄ−アミノ酸を組み込んだペプチドなどの構築が特に有用であり得る。より具体的には、Ｄ−ペプチドなどは、内因性ペプチダーゼ及びプロテアーゼに抵抗性があり、これにより、かかる特性が望まれる場合には、当該分子のバイオアベイラビリティの改善及びｉｎ  ｖｉｖｏでの寿命延長がもたらされる。更に、Ｄ−ペプチドなどは、ヘルパーＴ細胞への主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩ拘束性提示に関して有効的にプロセシングされないため、生物全体において、体液性免疫応答を誘導する可能性が低い。
【０２０５】
アミノ酸は、本明細書において、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨される、一般に知られている３文字記号または１文字記号のいずれかによって言及され得る。同様に、ヌクレオチドは、一般に認められている１文字コードによって言及され得る。
【０２０６】
ＴＡＡ提示誘導物質構築物のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた本明細書に含まれる。「ポリヌクレオチド」または「ヌクレオチド配列」という用語は、２つ以上のヌクレオチド分子の連続するストレッチを示すことが意図される。ヌクレオチド配列は、ゲノム、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、半合成もしくは合成起源、またはそれらの任意の組み合わせのものであり得る。
【０２０７】
「ヌクレオチド配列」または「核酸配列」という用語は、２つ以上のヌクレオチド分子の連続するストレッチを示すことが意図される。ヌクレオチド配列は、ゲノム、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、半合成もしくは合成起源、またはそれらの任意の組み合わせのものであり得る。
【０２０８】
「細胞」、「宿主細胞」、「細胞株」及び「細胞培養物」は、互換的に使用され、これらの用語は全て、細胞の成長または培養から得られる子孫を含むことが理解されるものとする。「形質転換」及び「トランスフェクション」は、細胞内に核酸配列を導入するプロセスを指すために、互換的に使用される。
【０２０９】
「核酸」という用語は、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態のデオキシリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシドまたはリボヌクレオチド及びその高分子を指す。特に限定されない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、天然ヌクレオチドと同様に代謝される、天然ヌクレオチドの既知の類似体を含有する核酸を包含する。他に特に限定されない限り、この用語はまた、ＰＮＡ（ペプチド核酸）を含むオリゴヌクレオチド類似体、アンチセンス技術に使用されるＤＮＡ類似体（ホスホロチオエート、ホスホロアミデートなど）を指す。特に指定のない限り、特定の核酸配列はまた、その保存的修飾バリアント（限定するものではないが、縮退コドン置換を含む）及び相補配列ならびに明示的に示された配列を暗黙的に包含する。具体的に、縮退コドン置換は、１つ以上の選択されたコドン（または全てのコドン）の３番目の位置が混合塩基及び／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８（１９９４））。
【０２１０】
「保存的修飾バリアント」は、アミノ酸配列及び核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、「保存的修飾バリアント」は、同一のアミノ酸配列または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を指し、あるいは、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一の配列を指す。遺伝コードの縮重のため、機能的に同一である多数の核酸が任意の所与のタンパク質をコードする。例えば、ＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ及びＧＣＵのコドンは全てアミノ酸のアラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンによって特定される各位置において、当該コドンは、コードされたポリペプチドを変えることなく、記載された対応するコドンのいずれかに変更することができる。そのような核酸変異は、「サイレント変異」であり、これは、保存的修飾変異の一種である。ポリペプチドをコードする本明細書中のあらゆる核酸配列はまた、核酸のあらゆる可能なサイレント変異を包含する。当業者であれば、核酸中の各コドン（通常はメチオニンに対する唯一のコドンであるＡＵＧ、及び通常はトリプトファンに対する唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を、機能的に同一の分子を得るように改変することができることを認識するであろう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、それぞれ記載される配列に暗黙的に示される。
【０２１１】
アミノ酸配列に関して、当業者であれば、コード配列中の単一のアミノ酸またはわずかな割合のアミノ酸を変更、付加または欠失させる、核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質配列に対する個々の置換、欠失または付加は、当該変更がアミノ酸の欠失、アミノ酸の付加、または化学的に類似するアミノ酸によるアミノ酸の置換をもたらす場合、「保存的修飾バリアント」であることを認識するであろう。
【０２１２】
機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的置換の表は、当業者に知られている。そのような保存的修飾バリアントは、本明細書に記載される多型バリアント、種間ホモログ及びアレルに加えられるものであり、それらを除外しない。次の８つのグループはそれぞれ、互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；及び［０１３９］８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ  Ｈ  Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．；２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  １９９３）参照。
【０２１３】
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列との関係における「同一」という用語は、２つ以上の配列または部分配列が同じであることを指す。配列は、以下の配列比較アルゴリズム（または当業者が利用可能な他のアルゴリズム）のうちの１つを使用して、または手動アラインメント及び目視確認によって測定されるように、比較ウインドウまたは指定領域にわたって最も一致するように比較配列した際に、アミノ酸残基またはヌクレオチドのあるパーセンテージが同じである場合（すなわち、特定の領域にわたって、約６０％の同一性、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％の同一性）、「実質的に同一」である。この定義は、試験配列の相補体も指す。同一性は、長さが少なくとも約５０アミノ酸もしくはヌクレオチドである領域にわたって、または長さが７５〜１００アミノ酸もしくはヌクレオチドである領域にわたって、または指定しない場合はポリヌクレオチドもしくはポリペプチドの配列全体にわたって、存在し得る。本明細書に記載されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ヒト以外の種に由来するホモログを含め、本明細書に記載されるポリヌクレオチド配列またはその断片を有する標識プローブを用いて、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でライブラリーをスクリーニングする工程と、当該ポリヌクレオチド配列を含有する完全長ｃＤＮＡ及びゲノムクローンを単離する工程とを含むプロセスによって得ることができる。そのようなハイブリダイゼーション技術は、当業者によく知られている。
【０２１４】
配列比較に関して、典型的に１つの配列が参照配列として機能し、試験配列はこれに対して比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及び参照配列をコンピュータに入力し、必要であれば部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムのパラメータを指定する。初期設定のプログラムパラメータを使用してもよいし、代替パラメータを指定してもよい。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを算出する。
【０２１５】
「比較ウインドウ」は、本明細書で使用されるとき、２０〜６００、一般的に約５０〜約２００、より一般的には約１００〜約１５０からなる群から選択される任意の数の連続する位置のセグメントへの言及を含み、ある配列は、同数の連続する位置の参照配列と、２つの配列を最適にアラインメントさせた後、比較することができる。比較のための配列アラインメント方法は、当業者に知られている。比較のための配列最適アラインメントは、例えば、限定するものではないが、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９７０）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２ｃの局所的相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４の類似性検索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ処理（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）によって、または手動アラインメント及び目視確認（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）参照）によって実施することができる。
【０２１６】
配列同一性パーセント及び配列類似性パーセントを決定するのに好適なアルゴリズムの一例は、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２及びＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０に記載されている。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、米国立生物工学情報センターから公的に入手可能であり、ワールド・ワイド・ウェブ（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）で入手できる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータのＷ、Ｔ及びＸは、アラインメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、初期設定として、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４及び両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列の場合，ＢＬＡＳＴＰプログラムは、初期設定として、ワード長３及び期待値（Ｅ）１０、ならびにＢＬＯＳＵＭ６２  スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５参照）アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０，Ｍ＝５、Ｎ＝−４及び両鎖の比較を使用する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、典型的に、「低複雑度」フィルターをオフにして実施される。
【０２１７】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性についての統計解析を行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、最小和確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列間の一致が偶然により生じ得る確率の指標を与える。例えば、試験核酸を参照核酸と比較した際の最小和確率が約０．２未満、または約０．０１未満、または約０．００１未満である場合、核酸は、参照配列と類似しているとみなされる。
【０２１８】
「選択的に（または特異的に）ハイブリダイズする」という文言は、その配列が複雑な混合物（限定するものではないが、全細胞またはライブラリーＤＮＡまたはＲＮＡを含む）中に存在する場合、ある分子が、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、特定のヌクレオチド配列のみに対して、結合、二重鎖形成、またはハイブリダイズすることを指す。
【０２１９】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という文言は、当該技術分野において知られているように、低イオン強度及び高温の条件下でのＤＮＡ、ＲＮＡもしくは他の核酸配列またはその組み合わせのハイブリダイゼーションを指す。典型的に、ストリンジェントな条件下で、プローブは、核酸の複雑な混合物（限定するものではないが、全細胞またはライブラリーＤＮＡまたはＲＮＡを含む）中のその標的部分配列にハイブリダイズするが、複雑な混合物中の他の配列にはハイブリダイズしない。ストリンジェントな条件は、配列に依存するため、様々な状況によって異なる。より長い配列は、より高温で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに関する広範な手引きは、Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ｐｒｏｂｅｓ，“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｓｓａｙｓ”（１９９３）に見出される。
【０２２０】
本明細書で使用されるとき、「工学的に操作する」という用語及びその文法上の変形は、ペプチド骨格の任意の操作または天然もしくは組み換えポリペプチドもしくはその断片の翻訳後修飾を含むものとみなされる。工学的操作には、アミノ酸配列、グリコシル化パターンまたは個々のアミノ酸の側鎖基の修飾、及びこれらの手法の組み合わせが含まれる。工学的に操作されたタンパク質は、標準的な分子生物学技術によって、発現及び産生される。
【０２２１】
誘導体またはバリアントのアミノ酸配列が、元のポリペプチド由来の１００個のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有する場合、ポリペプチドの誘導体またはバリアントは、そのポリペプチドに対して「相同性」を有し、またはそれと「相同」であると言われる。特定の実施形態において、誘導体またはバリアントは、誘導体と同じ数のアミノ酸残基を有するポリペプチドまたはポリペプチド断片のいずれかと少なくとも７５％同じである。種々の実施形態において、誘導体またはバリアントは、誘導体と同じ数のアミノ酸残基を有するポリペプチドまたはポリペプチド断片のいずれかと少なくとも８５％、９０％、９５％または９９％同じである。
【０２２２】
いくつかの態様において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、本明細書で開示される表またはアクセッション番号に記載される関連アミノ酸配列またはその断片に対して、少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、単離されたＴＡＡ提示誘導物質構築物は、本明細書で開示される表またはアクセッション番号に記載される関連ヌクレオチド配列またはその断片に対して、少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一であるポリヌクレオチドによってコードされたアミノ酸配列を含む。
【０２２３】
本開示は、本明細書に記載される特定のプロトコル、細胞株、構築物及び試薬に限定されるものではなく、これらは変わり得ることを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的にしており、保護の範囲を限定する意図はないことも理解されたい。
【０２２４】
本明細書で言及される全ての公開物及び特許は、例えば、本記載のＴＡＡ提示誘導物質構築物に関連して使用され得る、当該公開物に記載されている構築物及び方法論を説明及び開示する目的で、参照により本明細書に援用される。本明細書で考察される公開物は、本出願の出願日以前の開示についてのみ、提供される。本明細書におけるいかなる記載も、発明者らが、先行発明に基づいて、または任意の他の理由により、かかる開示に先行する権利がないという自認を構成するものではない。
【実施例】
【０２２５】
以下は、本明細書に記載されるＴＡＡ提示誘導物質構築物に関する具体的な実施形態の例である。これらの実施例は、例示のみを目的に提供するものであり、本開示の範囲を限定する意図は決してない。使用した数（例えば、量、温度など）に関しては、正確さを確保するように努めたが、ある程度の実験誤差及び偏差は、当然のことながら、許容されるものである。
【０２２６】
本発明の実施には、特に指定のない限り、当該技術分野の範囲内である、タンパク質化学、生化学、組み換えＤＮＡ技術及び薬理学の従来法が採用される。かかる技術は、文献において十分に説明されている。例えば、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９３）；Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，ｃｕｒｒｅｎｔ  ａｄｄｉｔｉｏｎ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ  ａｎｄ  Ｎ．Ｋａｐｌａｎ  ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）；Ｃａｒｅｙ  ａｎｄ  Ｓｕｎｄｂｅｒｇ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３ｒｄＥｄ．（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ）Ｖｏｌｓ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ（１９９２）を参照されたい。
【０２２７】
実施例１：ＴＡＡ提示誘導物質構築物の説明
１）二重特異性抗原結合構築物であるＴＡＡ提示誘導物質構築物を、次の例示的なフォーマットで調製する。
ａ）一方の抗原結合ドメインがｓｃＦｖであり、他方の抗原結合ドメインがＦａｂである、ハイブリッド抗体フォーマット（ハイブリッドフォーマット）。これらの二重特異性抗原結合構築物は、２つのＦｃポリペプチド成分ＦｃＡ及びＦｃＢのヘテロ二量体会合を誘導するＣＨ３ドメインアミノ酸置換を有する、ＩｇＧ１ヘテロ二量体Ｆｃを更に含む。ＦｃＡは、次のアミノ酸置換：Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖを含み、ＦｃＢは、アミノ酸置換：Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗを含む。これらの構築物は、ＦｃのＦｃＧＲへの結合を減少させるアミノ酸修飾を更に含み得る。
Ｆｃ領域中のアミノ酸残基は、ＥＵ抗体ナンバリングに言及するＫａｂａｔにおけるＥＵインデックスに従って特定される（Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９６９，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ６３：７８−８５）。本実施例に記載されるハイブリッド抗体フォーマット構築物は、１つの標的に結合するｓｃＦｖに融合した１つのＦｃポリペプチドと、ＶＨ−ＣＨ１ドメイン融合した第２のＦｃポリペプチドと、軽鎖（ここで、ＶＨ−ＣＨ１ドメイン及び軽鎖は、第２の標的に結合するＦａｂ領域を形成する）の３つのポリペプチド鎖を含む。
ｂ）抗原結合ドメインの両方がＦａｂである、フルサイズ抗体（ＦＳＡ）フォーマット。これらの二重特異性抗原結合構築物はまた、上記のヘテロ二量体Ｆｃを含む。記載されるＦＳＡフォーマット構築物は、ＶＨ−ＣＨ１ドメインに融合したＦｃポリペプチドと、軽鎖（ここで、ＶＨ−ＣＨ１ドメイン及び軽鎖は、１つの標的に結合するＦａｂ領域を形成する）；及びＶＨ−ＣＨ１ドメインに融合した第２のＦｃポリペプチドと、第２の軽鎖（ここで、ＶＨ−ＣＨ１ドメイン及び軽鎖は、第２の標的に結合するＦａｂ領域を形成する）の４つのポリペプチド鎖を含み得る。あるいは、単一の共通する軽鎖が標的結合パラトープのそれぞれに使用されてもよい。
ｃ）抗原結合ドメインの両方がｓｃＦｖである、デュアルｓｃＦｖフォーマット。これらの二重特異性抗原結合構築物はまた、上記のヘテロ二量体Ｆｃを含む。デュアルｓｃＦｖフォーマットの構築物は、１つの標的に結合するＶＬ−ＶＨ配列に融合した１つのＦｃポリペプチドと、第２の標的に結合する第２のＶＬ−ＶＨ配列に融合した第２のＦｃポリペプチドとを含む。
【０２２８】
２）ＩＳＲに対するリガンドであるＩＳＲ結合構築物と、抗原結合ドメインであるＴＡＡ結合構築物とを有するＴＡＡ提示誘導物質構築物もまた調製する。
【０２２９】
上記フォーマットのうちの１つ以上の例示的なＴＡＡ提示誘導物質構築物の説明を表１に提供する。Ｈｅｒ２、ＲＯＲ１及びＰＳＭＡは、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である。ＲＳＶ１は、酵母にみられるＤＮＡ結合タンパク質であり、表１に記載されるように、ＴＡＡ提示誘導物質構築物のＴＡＡ結合部分またはＩＳＲ結合部分に対する陰性対照として含まれる。
【０２３０】
（表１）例示的なＴＡＡ提示誘導物質構築物の種類
2020511997.tif 000007
【０２３１】
実施例２：ＴＡＡ提示誘導物質構築物の調製及び精製
実施例１に記載されるＴＡＡ提示誘導物質構築物の具体例を、以下に記載するとおりに、調製及び精製した。調製した特定のＴＡＡ提示誘導物質構築物の説明及び配列を表２に提供する。構築物のそれぞれは、３つのポリペプチドＡ、Ｂ及びＣを含む。各ポリペプチドのクローン番号を表２に列挙し、各クローンのポリペプチド及びＤＮＡ配列を表ＺＺに示す。以下に示すように、カルレティキュリン（ＣＲＴ）を含有しない構築物については、ＩＳＲ結合構築物はＦａｂであり、ＴＡＡ結合構築物はｓｃＦｖである。ＣＲＴを含む構築物については、ＴＡＡ結合構築物はＦａｂである。全ての構築物は、ＦｃのＦｃγＲへの結合を減少させるアミノ酸修飾Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｄ２６５Ｓとともに、ヘテロ二量体Ｆｃ形成を誘導する実施例１のアミノ酸修飾を含む、ヘテロ二量体Ｆｃを含む。
【０２３２】
（表２）調製したＴＡＡ提示誘導物質構築物の説明
2020511997.tif 000008
【０２３３】
抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子は、ヒト／哺乳動物発現に最適化されたコドンを使用した遺伝子合成により構築した。ｓｃＦｖ及びＦａｂ配列は、表３に特定される既知の抗体の配列から生成した。
【０２３４】
（表３）ＴＡＡ提示誘導物質構築物配列に関する参考文献
2020511997.tif 000009
【０２３５】
上に列挙する抗体クローンのいくつかについて、ＩＭＧＴナンバリングシステムによって決定されるＣＤＲ配列を表ＹＹに示す。
【０２３６】
最終遺伝子産物を哺乳動物発現ベクターにサブクローニングし、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞（または機能的等価物）で発現させた（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ，Ｙ．，Ｐｅｒｒｅｔ，Ｓ．＆Ｋａｍｅｎ，Ａ．Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ  ａｎｄ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ−ｇｒｏｗｉｎｇ  ＣＨＯ  ｃｅｌｌｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３０，Ｅ９（２００２））。
【０２３７】
ＣＨＯ細胞のトランスフェクションは、指数増殖期に行った。ヘテロ二量体を形成するのに最適な濃度範囲を決定するために、ヘテロ二量体形成を可能にする様々なＦｃＡ、軽鎖（ＬＣ）及びＦｃＢのＤＮＡ比でＤＮＡをトランスフェクトした。ＦｃＡ：ＬＣ：ＦｃＢベクターのトランスフェクションの比は、ｓｃＦｖ含有バリアントの場合、１：１：１であった。カルレティキュリン融合バリアントの場合、ＦｃＡ：ＬＣ：ＦｃＢの比は、２：１：１であった。トランスフェクトした細胞培地を数日後に回収し、４０００ｒｐｍで遠心分離し、０．４５マイクロメートルのフィルターを使用して清澄化した。
【０２３８】
ＴＡＡ提示誘導物質構築物を確立された方法により培地から精製した。清澄化した培地をＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）プロテインＡカラムにロードし、ｐＨ７．２のＰＢＳ緩衝液で洗浄し、ｐＨ３．６のクエン酸緩衝液で溶出し、ｐＨ１１のＴＲＩＳで中和した画分をプールした。Ｅｃｏｎｏ−Ｐａｃ１０ＤＧカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用してタンパク質を脱塩した。いくつかの場合、タンパク質は、プロテインＬクロマトグラフィーまたはゲル濾過によって更に精製した。精製したタンパク質の濃度は、１〜４ｍｇ／ｍＬの範囲であり、合計収率は、１Ｌの一過性トランスフェクションから１０〜５０ｍｇの範囲であった。
【０２３９】
実施例３：ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によるＴＣＤＭ獲得を促進する
ＡＰＣによるＴＣＤＭ捕捉を促進するＴＡＡ提示誘導物質構築物の能力を腫瘍細胞ＡＰＣ共培養系で評価する。これらの共培養系で使用される腫瘍細胞は、ＳＫＢｒ３（ＴＡＡ  ＨＥＲ２を発現）、ＳＫＯＶ３（ＴＡＡ  ＨＥＲ２及びＲＯＲ１を発現）、またはＬＮＣａＰ（ＴＡＡ  ＰＳＭＡを発現）などの市販の腫瘍細胞株からのものである。ＴＣＤＭは、これらの細胞株の培養中に自然に生成され、いくつかの場合、ＴＣＤＭの量は、ドセタキセル及び／またはシクロホスファミドなどの外因性薬剤の添加によって更に増加する。ＡＰＣは、ヒト血液（例えば、ＰＢＭＣまたは精製された単球）から調製されるか、または精製された単球をサイトカインもしくはサイトカイン混合物（ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＴＮＦ及び／またはＩＦＮなど）と前培養することによって、血液単球から得られる。
【０２４０】
いくつかの場合、ＣＦＳＥ（カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル］）標識腫瘍細胞が、トランスウェルチャンバー（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＨＴＳ  Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ  ＃ＣＬＳ３３８５など）により、ＡＰＣ（単球、マクロファージまたは樹状細胞など）から物理的に分離される。ＡＰＣは、腫瘍細胞とともに、１ウェル当たり腫瘍細胞１：ＡＰＣ  ０．１、０．３、１．０、３．０、または１０などの様々な比で、複数連で培養される。共培養開始後の様々な時点で、ＡＰＣを回収し、ＣＦＳＥ含有量をフローサイトメトリーまたはハイコンテントイメージングなどの技術により評価する。いくつかの場合、腫瘍細胞−ＡＰＣ共培養物はまた、Ｔ細胞も含有しており（例えば、腫瘍細胞−ＰＢＭＣ培養物）、実施例５に記載されるようなＴ細胞応答評価が可能である。
【０２４１】
Ｈｅｒ２を介してＳＫＢＲ３  ＴＣＤＭ（腫瘍細胞由来物質）に結合し、様々なＩＳＲクラス（表１参照）を介してＡＰＣに結合する構築物８〜１１（表１）などのＴＡＡ提示誘導物質構築物は、ＡＰＣ  ＣＦＳＥ陽性（ＴＣＤＭ獲得）を促進することができる。ＡＰＣ−ＳＫＯＶ３またはＡＰＣ−ＬＮＣａＰ腫瘍株共培養では、それぞれＲＯＲ１結合（構築物１２〜１５）構築物及びＰＳＭＡ結合（構築物１６〜１９）構築物について、類似の結果が観察される。最小のＴＣＤＭ獲得は、ＴＡＡまたはＩＳＲのいずれかに結合することができるが、両方には結合しない（すなわち、非結合陰性対照パラトープ含有）陰性構築物（構築物１〜７）によって誘導される。
【０２４２】
実施例４：ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、ＴＣＤＭ依存性ＡＰＣ活性化を促進する
ＡＰＣ−腫瘍細胞共培養において、ＴＡＡ提示誘導物質構築物のＴＣＤＭに対するＴＡＡ媒介性蓄積がＩＳＲアゴニズムを促進する能力は、以下のように評価することができる。ＡＰＣ共培養は、実施例３に記載するとおりに実施される。ＩＳＲアゴニズムは、ＡＰＣ−腫瘍細胞共培養の開始後に、上清サイトカインまたは細胞表面活性化マーカーの定量を複数回行うことにより評価することができる。サイトカイン産生は、市販のＥＬＩＳＡまたはビーズによるマルチプレックスシステムを介して定量することができ、細胞表面活性化マーカーの発現は、フローサイトメトリーまたはハイコンテントイメージングを介して定量することができる。
【０２４３】
Ｈｅｒ２を介してＳＫＢＲ３  ＴＣＤＭに結合し、様々なＩＳＲクラス（表１参照）を介してＡＰＣに結合する構築物８〜１１（表１）などのＴＡＡ提示誘導物質構築物は、ＡＰＣサイトカイン産生及び／または共刺激リガンドの上方制御を促進することができる。ＡＰＣ−ＳＫＯＶ３またはＡＰＣ−ＬＮＣａＰ腫瘍株共培養では、それぞれＲＯＲ１結合（構築物１２〜１５）構築物及びＰＳＭＡ結合（構築物１６〜１９）構築物について、類似の結果が観察される。最小のＡＰＣ活性化は、ＴＡＡもしくはＩＳＲのいずれかに結合することができるが、両方には結合しない（すなわち、非結合陰性対照パラトープ含有）陰性対照構築物（構築物１〜７）、またはＴＣＤＭの不存在下におけるＴＡＡ提示誘導物質構築物によって誘導される。
【０２４４】
実施例５：ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、ＭＨＣのＴＡＡ提示及びポリクローナルＴ細胞活性化を誘導する
ＴＡＡ提示誘導物質構築物によって誘導されたＴＣＤＭ由来ペプチドのＭＨＣ提示は、ＡＰＣ−腫瘍細胞共培養後に、ＡＰＣ  Ｔ細胞刺激能力を評価することによって、評価される。ＡＰＣ−腫瘍細胞共培養は、実施例３に記載するとおりに実施する。抗原提示は、単離された一次ＡＰＣ−腫瘍細胞共培養後の様々な時点で、ＴＣＤＭ＋ＴＡＡ提示誘導物質構築物で処理したＡＰＣを二次Ｔ細胞活性化共培養に移すことによって評価される。数日後、ＴＡＡ特異的Ｔ細胞応答を、蛍光ペプチドＭＨＣマルチマー（ＩｍｍｕＤｅｘ）によるフローサイトメトリー染色によって定量する。いくつかの場合、Ｔ細胞を、その後、ペプチドパルス同種異系ＡＰＣを含有する三次培養に移し、ＴＡＡ応答頻度をサイトカイン特異的ＥＬＩＳｐｏｔにより更に評価する。
【０２４５】
最初のＡＰＣ−腫瘍細胞共培養をトランスウェルプレートで実施する場合、腫瘍細胞が入ったプレートインサートを廃棄し、Ｔ細胞をＡＰＣ含有ウェルに加える。直接的ＡＰＣ−腫瘍細胞共培養（トランスウェル以外）の場合、後続の二次Ｔ細胞共培養のために、ＡＰＣを磁気ビーズによる単離によって腫瘍細胞から分離する。Ｔ細胞は、ヒト血液、疾患組織、または定義されたペプチドによって一次細胞を繰り返し刺激することによって維持された抗原特異的株に由来し得る。上述したように、いくつかの場合、「一次」インキュベーションは、腫瘍細胞−ＰＢＭＣ共培養（腫瘍細胞、ＡＰＣ及びＴ細胞を含む）である。かかる場合において、ＡＰＣの単離及び別個単離されたＴ細胞との二次培養は実施されないが、Ｔ細胞応答は一次培養系で直接評価される。
【０２４６】
Ｈｅｒ２を介してＳＫＢＲ３  ＴＣＤＭに結合し、様々なＩＳＲクラス（表１参照）を介してＡＰＣに結合する構築物８〜１１（表１）などのＴＡＡ提示誘導物質構築物は、Ｔ細胞に対する、複数のＴＡＡに由来するペプチドのＭＨＣ提示を促進することができる（例えば、Ｈｅｒ２、ＭＵＣ１、ＷＴ１ペプチド）。ＡＰＣ−ＳＫＯＶ３またはＡＰＣ−ＬＮＣａＰ腫瘍株共培養では、それぞれＲＯＲ１結合（構築物１２〜１５）構築物及びＰＳＭＡ結合（構築物１６〜１９）構築物について、類似の結果が観察される。最小のＴＡＡ提示は、ＴＡＡもしくはＩＳＲのいずれかに結合することができるが、両方には結合しない（すなわち、非結合陰性対照パラトープ含有）対照構築物（構築物１〜７）、またはＴＣＤＭの不存在下におけるＴＡＡ提示誘導物質構築物によって誘導される。
【０２４７】
実施例６：追加のＴＡＡ提示誘導物質構築物の調製
追加の例示的なＴＡＡ提示誘導物質構築物を設計して、ＩＳＲ及び／またはＴＡＡ結合に関する多価の影響を調べた。これらの追加の構築物の大部分は、実施例２に記載されるものと同じ標的及びパラトープに基づくが、いくつかの構築物は、ＴＡＡメソテリンを標的にした。これらの構築物を表４に列挙する。これらは、以下に記載し、図３に示す多数の一般フォーマットで設計した。
フォーマットＡ：Ａ＿ｓｃＦｖ＿Ｂ＿ｓｃＦｖ＿Ｆａｂ。重鎖ＡはｓｃＦｖを含み、重鎖ＢはｓｃＦｖ及びＦａｂを含む。このフォーマットの図を図３Ａに示す。
フォーマットＢ：Ａ＿ｓｃＦｖ＿Ｆａｂ＿Ｂ＿ｓｃＦｖ。重鎖ＡはｓｃＦｖ及びＦａｂを含み、重鎖ＢはｓｃＦｖを含む。このフォーマットの図を図３Ｂに示す。
フォーマットＣ：Ａ＿Ｆａｂ＿Ｂ＿ｓｃＦｖ＿ｓｃＦｖ。重鎖ＡはＦａｂを含み、重鎖Ｂは２つのｓｃＦｖを含む。このフォーマットの図を図３Ｃに示す。
フォーマットＤ：Ａ＿ｓｃＦｖ＿Ｂ＿Ｆａｂ＿Ｆａｂ。重鎖ＡはｓｃＦｖを含み、重鎖Ｂは２つのＦａｂを含む。このフォーマットの図を図３Ｄに示す。
フォーマットＥ：ハイブリッド。重鎖ＡはＦａｂを含み、重鎖Ｂは、ｓｃＦｖを含む。このフォーマットの図を図３Ｅに示す。
フォーマットＦ：Ａ＿Ｆａｂ＿ＣＲＴ＿Ｂ＿ＣＲＴ。重鎖ＡはＦａｂ及びカルレティキュリンを含み、重鎖Ｂはカルレティキュリンを含む。このフォーマットの図を図３Ｆに示す。
フォーマットＧ：Ａ＿Ｆａｂ＿ＣＲＴ＿Ｂ＿ＣＲＴ＿ＣＲＴ。重鎖ＡはＦａｂ及びカルレティキュリンを含み、重鎖Ｂは２つのカルレティキュリンポリペプチドを含む。このフォーマットの図を図３Ｇに示す。
【０２４８】
本実施例に記載される構築物の全ては、ＦｃのＦｃγＲへの結合を減少させる、実施例２に記載のＦｃ領域と同じ対称性アミノ酸置換（Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｄ２６５Ｓ）を含むように調製した。全ての場合において、表４に示すように、実施例１に記載されるようなヘテロ二量体Ｆｃを構築物に使用した。
【０２４９】
本実施例に記載される追加の構築物のいくつかは、ＩＳＲアームに使用され得るカルレティキュリンのポリペプチドバリアントを試験するために設計した。これらの構築物に２２２５２、２２２５３及び２２２５４の番号を付ける。構築物２２２５２は、残基１６３の遊離システインをセリンで置換した完全長カルレティキュリンポリペプチド（残基１８〜４１３、ＵｎｉＰｒｏｔ配列ＩＤ  Ｐ２７７９７に従ったナンバリング）を含む。構築物２２２５３は、カルレティキュリンのＮ−ドメイン（残基１８から開始）を含み、ここで、Ｐ−ドメイン（残基２０５〜３０１）は、ＧＳＧリンカーによって置き換えられ、３６９〜４１７のＣ末端アミノ酸残基は、欠失された（Ｃｈｏｕｑｕｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ６（３）：ｅ１７８８６．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００１７８８６参照）。構築物２２２５４は、残基１８〜３６８に対応するＮ−ドメイン及びＰ−ドメインを含有する。
【０２５０】
（表４）追加の構築物、多価
2020511997.tif 000010
2020511997.tif 000011
【０２５１】
ｓｃＦｖ及びＦａｂ配列は、表５に特定される既知の抗体の配列から生成した。ＬＲＰ−１は、抗体ではなく、リガンドであるカルレティキュリン（ＣＲＴ）により推定的に標的化されることに留意されたい。
【０２５２】
（表５）ＴＡＡ提示誘導物質構築物配列に関する参考文献
2020511997.tif 000012
【０２５３】
上に列挙する抗体クローンについて、ＩＭＧＴナンバリングシステムによって決定されるＣＤＲ配列を表ＹＹに示す。
【０２５４】
表６に特定される構築物を対照として設計した。
【０２５５】
（表６）対照構築物
2020511997.tif 000013
【０２５６】
表７は、本実施例に記載される構築物のアミノ酸及びＤＮＡ配列を特定する。各構築物は、２または３クローンからなり、各クローンのアミノ酸及びＤＮＡ配列を表ＺＺに示す。
【０２５７】
（表７）構築物及びクローン番号
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2020511997.tif 000016
【０２５８】
表４及び６中の構築物は、実施例２に記載するとおりに調製し、発現させた。構築物２２１５４〜２２１５６は、クローニングエラーにより、発現しなかった。残りの構築物については、精製したタンパク質の濃度は、０．１〜１．２ｍｇ／ｍＬの範囲であり、合計収率は、２００ｍＬ〜５００ｍＬの一過性トランスフェクションから１〜８ｍｇの範囲であった。
【０２５９】
実施例７：ＨＥＲ２及びＬＲＰ−１を標的にする追加のＴＡＡ提示誘導物質構築物の調製
追加の例示的なＴＡＡ提示誘導物質構築物を設計して、ＩＳＲ及び／またはＴＡＡ結合に関する多価の影響を調べた。ただし、Ｆｃ足場の代わりにスプリットアルブミン足場を組み込んだ構築物を調製した。これらの構築物は、ＴＡＡ  ＨＥＲ２及びＩＳＲ  ＬＲＰ−１を標的にし、ＨＥＲ２結合構築物は、位置ｖＨ４４−ｖＬ１００（Ｋａｂａｔナンバリング使用）にあるジスルフィドにより安定化されたトラスツズマブ（ＴｓｃＦｖ）に由来するｓｃＦｖであり、ＬＲＰ−１結合構築物は、カルレティキュリン（ＣＲＴ）の残基１８〜４１７を有するポリペプチドであった。これらの構築物は、図４（スプリットアルブミン足場）及び図５（Ｆｃ足場）に示すように、多数の幾何学的形状で設計した。
【０２６０】
上記分子に使用されるスプリットアルブミン足場は、国際特許公開第ＷＯ２０１４／０１２０８２に記載されているＡｌｂｕＣＯＲＥ（商標）３足場に基づくものであり、結合構築物のＮ末端融合は、リンカー（いくつかの場合、ＡＡＧＧ（配列番号１５６）リンカー）によりアルブミン断片に連結され、結合構築物のＣ末端融合は、リンカー（いくつかの場合、ＧＧＧＳ（配列番号１５７）リンカー）によりアルブミン断片に連結される。加えて、アルブミンのＮ末端断片は、Ｃ３４Ｓの点変異を含んだ。
【０２６１】
本実施例のＦｃリンカーの全ては、ＦｃのＦｃγＲへの結合を減少させる、実施例２に記載のＦｃ領域と同じ対称性アミノ酸置換（Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｄ２６５Ｓ）を含んだ。全ての場合において、表４に示すように、実施例１に記載されるようなヘテロ二量体Ｆｃを構築物に使用した。トラスツズマブｓｃＦｖは、ＧＧＧＧ（配列番号１５８）リンカーを用いて、ＦｃポリペプチドのＣ末端に融合させた。
【０２６２】
表８は、スプリットアルブミン足場を用いて調製した構築物の構成成分に関する詳細を提供する。一方、表９は、Ｆｃ足場を用いて調製した構築物の構成成分に関する詳細を提供する。各構築物は、２つのポリペプチドから構成され、各ポリペプチドのクローン番号を表８及び表９に記載する。各クローンのアミノ酸配列及びＤＮＡ配列を表ＺＺに示す。
【０２６３】
（表８）
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【０２６４】
（表９）
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【０２６５】
Ｆｃベースの構築物は、実施例２に記載するとおりに発現させ、精製した。
【０２６６】
ＡｌｂｕＣＯＲＥ（商標）ベースの構築物は、以下のように精製した。ＡｌｂｕＰｕｒｅ（登録商標）樹脂を用いる親和性クロマトグラフィーによって、細胞培地（２００ｍＬ〜２．５Ｌ）からバリアントをバッチ式で精製した。内毒素レベルは、全ての試料で０．２ＥＵ／ｍｌ未満であることを確認した。前もって保存液中に保持され、及び／または適合する手順を使用して清浄化したＡｌｂｕＰｕｒｅ（登録商標）親和性樹脂を平衡させ、次いで、１：１の比のｐＨ６．０のリン酸ナトリウム緩衝液に再懸濁した。培養上清のｐＨを１Ｍリン酸ナトリウム一塩基性緩衝液で６．０に調整する。抗体（または抗体断片）含有量及び樹脂の結合能力（樹脂１ｍＬ当たりヒト血清アルブミン３０ｍｇ）に基づいて、必要量の樹脂スラリーを培養上清供給物に添加した。オービタルシェーカーを使用して、樹脂を２〜８℃で一晩、懸濁状態を維持した。供給物をクロマトグラフィーカラムに移し、通過画分を回収する。次いで、樹脂を樹脂平衡緩衝液で洗浄した後、潜在的な非特異的結合物質を取り除くために、ｐＨ７．８のリン酸ナトリウム緩衝液を使用して洗浄した。オクタン酸ナトリウム溶液を使用してタンパク質生成物を溶出し、画分で回収した。各溶出画分のタンパク質含有量は、Ｎａｎｏｄｒｏｐを使用するか、または相対比色タンパク質アッセイによって、２８０ｎｍの吸光度測定で決定した。最も濃度が高い画分をプールし、次いで、ＰＢＳ緩衝液中で１６ｍｍのＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラムを使用するサイズ排除クロマトグラフィーによって更に精製した。最も濃度が高い画分をプールし、ＣＥ−ＳＤＳ、ＵＰＬＣ−ＳＥＣ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価した。
【０２６７】
精製したタンパク質の濃度は、０．２〜６ｍｇ／ｍＬの範囲であり、合計収率は、２００ｍＬ〜２５００ｍＬの一過性トランスフェクションから０．３〜１２０ｍｇの範囲であった。
【０２６８】
実施例８：ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、細胞上に一過性に発現した標的（複数可）に結合することができる
選択したＴＡＡ提示誘導物質構築物のその目的標的への天然標的結合を評価するために、ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔ（商標）プラットフォーム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用したハイコンテントスクリーニングにより、均質細胞結合アッセイを実施した。試験構築物は、実施例６に記載するものであり、そこに記載されるとおり、フォーマットＡ〜Ｇの構築物を含む。要約すると、構築物は、次の腫瘍関連抗原：ＨＥＲ２、ＲＯＲ１またはメソテリン（ＭＳＬＮ）のうちの１つに対するｓｃＦｖまたはＦａｂ形態である少なくとも１つのＴＡＡ結合構築物と、デクチン−１、ＤＥＣ２０５またはＣＤ４０を標的にするｓｃＦｖまたはＦａｂ形態である少なくとも１つのＩＳＲ結合構築物とを含有した。試験構築物のいくつかは、Ｆａｂ形態のＴＡＡ結合構築物と、ＩＳＲ結合構築物として１つ以上の組み換えＣＲＴポリペプチドとを含有した。構築物の標的への結合を、目的の標的を一過性に発現するＨＥＫ２９３−６ｅ細胞で評価した。
【０２６９】
目的の標的を一過性に発現するＨＥＫ２９３−６ｅ細胞の調製
目的の標的を一過性に発現する細胞を調製するために、ＨＥＫ２９３−６ｅ細胞（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ）の懸濁液を、１％ＦＢＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３５−０１５ＣＶ）を含む２９３ Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  Ｍｅｄｉａ（Ｇｉｂｃｏ、１２３３８０１８）で培養した。親細胞を、２５０ｍＬの三角フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、４３１１４４）中、ロータリー加湿インキュベータ内、１１５ｒｐｍ、３７℃、５％ＣＯ２で維持した。トランスフェクションの前に、ＨＥＫ２９３−６ｅ細胞を新しいＦｒｅｅｓｔｙｌｅ培地に１×１０６細胞／ｍＬまで再懸濁した。Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（商標）Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ、３１９８５０７０）中の２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）トランスフェクション試薬（Ｇｉｂｃｏ、１２３４７０１９）を１μｇ／１０６細胞の比で用いて細胞にトランスフェクションした。目的の標的を発現するために使用したＤＮＡベクターは、ヒトデクチン−１、ヒトＤＥＣ２０５、ヒトＣＤ４０、ヒトＨＥＲ２、ヒトＲＯＲ１を含む完全長の目的の標的を含むｐＴＴ５ベクターと、ＧＦＰを含有するモックベクターであった。細胞を、ロータリー加湿インキュベータ内、１１５ｒｐｍ、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベーションした。
【０２７０】
結合アッセイ
構築物試料を、エッペンドルフチューブ中で、ＦＡＣＳ緩衝液または１×ＰＢＳ  ｐＨ７．４（Ｇｉｂｃｏ、１００１０２３）＋２％ＦＢＳ中、最終４０ｎＭの出発濃度で調製した。試料を、３８４ウェル黒色光学底アッセイプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、１４２７６１）中、１：４で０．０４ｎＭまでデュプリケートで直接滴定した。目的の標的を発現するＨＥＫ２９３−６ｅ細胞を採取し、３０μｌ当たり１０，０００細胞でＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した。細胞核を焦点チャネルとして可視化するために、細胞に、Ｖｙｂｒａｎｔ（商標）ＤｙｅＣｙｃｌｅ（商標）Ｖｉｏｌｅｔ核染色（ＬｉｆｅＴｅｃｈ、Ｖ３５００３）を２μＭの最終濃度で添加した。試験構築物試料の細胞への結合を検出するために、細胞に、ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ Ａ６４７（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、１１５−６０５−０７１）を最終０．６μｇ／ｍＬで添加した。細胞を短時間ボルテックスして混合し、１０，０００細胞／ウェルでプレーティングした。プレートを室温で３時間インキュベーションし、スキャンした。データ解析は、ＨＣＳハイコンテントスクリーニングプラットフォームを備えたＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上で、１０倍対物レンズを用いるＢｉｏＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ「ＣｅｌｌＶｉａｂｉｌｉｔｙ」を使用して、実施した。試料を３８５ｎｍチャネルでスキャンして核染色を可視化し、チャネル６５０ｎｍで細胞結合を評価した。Ａ６４７の平均対象物平均蛍光強度をチャネル２で測定して、全ての細胞条件に関して、結合強度を決定した。ＨＥＫ２９３特異的細胞に対するＡ６４７強度をＨＥＫ２９３モックのＡ６４７強度で除算することによって、モックに対する倍数を決定した。結果を確認するために、全てのウェルを目視で確認した。全てのグラフデータは、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ７ソフトウェアを使用して作成した。
【０２７１】
結合アッセイの結果を、図６Ａ（ＨＥＲ２結合）、図６Ｂ（ＲＯＲ１結合）、図６Ｃ（デクチン−１結合）、図６Ｄ（ＣＤ４０結合）ならびに図６Ｅ及び図６Ｆ（両方ともＤＥＣ２０５結合）に示す。これらの図は、１０ｎＭの試験構築物から得られた平均Ａ６４７蛍光強度（モックに対する倍数）を示す。これらの図に示すように、全ての構築物が、ＨＥＫ２９３−６ｅ細胞上に一過性に発現される各標識に結合した。予想されたとおり、いずれの構築物もＨＥＫ２９３モック細胞に結合しなかった。
【０２７２】
実施例９：メソテリンを標的にするＴＡＡ提示誘導物質構築物は、メソテリン陽性ＮＣＩ−Ｈ２２６細胞に結合することができる
メソテリンを天然に発現する細胞に結合する能力について、メソテリンを標的にするＴＡＡ提示誘導物質構築物を試験した。試験構築物は、実施例６に記載されており、ＭＳＬＮに対するｓｃＦｖまたはＦａｂ形態である少なくとも１つのＴＡＡ結合構築物と、デクチン−１、ＤＥＣ２０５またはＣＤ４０を標的にするｓｃＦｖまたはＦａｂ形態である少なくとも１つのＩＳＲ結合構築物とを含有した。試験構築物のうちの１つは、Ｆａｂ形態の抗ＭＳＬＮ  ＴＡＡ結合構築物と、ＩＳＲ結合構築物である２つの組み換えＣＲＴポリペプチドを含有した。構築物のＭＳＬＮへの結合は、メソテリン陽性ＮＣＩ−Ｈ２２６細胞で評価した。
【０２７３】
ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔ（商標）プラットフォーム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用するハイコンテントスクリーニングにより均質細胞結合アッセイを実施して、設計された構築物の天然結合を評価した。メソテリン陽性ＮＣＩ−Ｈ２２６細胞（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ、ＣＲＬ−５８２６）は、１０％ＦＢＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３５−０１５ＣＶ）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、Ａ１０４９１０１）で培養し、Ｔ１７５フラスコ中、３７℃、５％ＣＯ２に維持した。実施例８に記載するとおり、構築物試料を調製し、細胞、核染色及び二次試薬とインキュベーションした。α−メソテリン結合部分を持たない無関係の抗体を陰性対照として含めた。データ解析は、ＨＣＳハイコンテントスクリーニングプラットフォームを備えたＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上で、１０倍対物レンズを用いるＢｉｏＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ「ＣｅｌｌＶｉａｂｉｌｉｔｙ」を使用して、実施した。試料を３８５ｎｍチャネルでスキャンして核染色を可視化し、チャネル６５０ｎｍで細胞結合を評価した。Ａ６４７の平均対象物平均蛍光強度をチャネル２で測定して、ＮＣＩ−Ｈ２２６及びＨＥＫ２９３−６ｅ対照細胞に対する結合強度を決定した。ＮＣＩ−Ｈ２２６に対するＡ６４７強度をＨＥＫ２９３モックのＡ６４７強度で除算することによって、モックに対する倍数を決定した。結果を確認するために、全てのウェルを目視で確認した。全てのグラフデータは、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ７ソフトウェアを使用して作成した。
【０２７４】
結果を図７に示す。１０ｎＭの試験構築物から得られた平均Ａ６４７蛍光強度（モックに対する倍数）を提供する。α−メソテリン結合構築物を持つ全ての構築物が、メソテリン陽性ＮＣＩ−Ｈ２２６細胞に結合した。予想したとおり、α−メソテリン結合構築物を含まない抗体は、ＮＣＩ−Ｈ２２６細胞に結合しなかった。いずれの試料もＨＥＫ２９３モック陰性対照細胞に結合しなかった。
【０２７５】
実施例１０：組み換えカルレティキュリンを含有するＴＡＡ提示誘導物質構築物は、ＥＬＩＳＡによって測定したとき、抗カルレティキュリン抗体に結合する
マウスα−ヒトカルレティキュリン（ＣＲＴ）抗体ＭＡＢ３８９８（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、３２６２０３）を用いたＥＬＩＳＡによるカルレティキュリン検出によって、ＬＲＰ−１標的部分として組み換えカルレティキュリンを含有するＴＡＡ提示誘導物質構築物に対して品質管理を行った。簡潔に述べれば、構築物を、９６ウェル培地結合ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ３３６８）で、５０μｌ／ウェルの１×ＰＢＳ中、３μｇ／ｍＬでコーティングした。ｖ２２１５２（ＲＯＲ１×デクチン１）を陰性対照として含めた。市販のカルレティキュリンを陽性対照（Ａｂｃａｍ、ａｂ９１５７７）としてコーティングした。カルレティキュリンを含まない無関係の構築物を陰性対照として用いた。プレートを４℃で一晩インキュベーションした。翌日、プレート洗浄機（ＢｉｏＴｅｋ、４０５  ＬＳ）を使用して、プレートを蒸留水で洗浄した（３×２００μｌ）。プレートを２００μｌ／ウェルのＰＢＳ中２％ミルクでブロッキングし、室温で１時間インキュベーションした。プレートを先に記載するとおりに洗浄した。ＭＡＢ３８９８の一次抗体を、２％ミルク中、１０μｇ／ｍＬから４工程で２μｇ／ｍＬ、０．４μｇ／ｍＬ、及び０．０８μｇ／ｍＬを得て、最終５０μｌ／ウェルで、１：５で滴定した。緩衝液のみを含む空のウェルを含めた。室温で１時間の一次インキュベーション後、プレートを先に記載するとおりに洗浄した。ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ  ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、１１５−０３５−０７１）を使用して、マウスα−カルレティキュリン結合を検出した。ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ  ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、１０９−０３５−０９８）を使用して、構築物のプレートへのコーティングを確認した。両方の二次試薬を５０μｌ／ウェルで、室温で３０分間インキュベーションした。インキュベーション後，プレートを先に記載するとおりに洗浄し、５０μｌ／ウェルのＴＭＢ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、７００４）を使用して結合を可視化した。５分後、１．０Ｎ塩酸（ＶＷＲ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ、ＢＤＨ７２０２−１）を５０μｌ／ウェルで添加して、反応を中和した。プレートをＳｙｎｅｒｇｙ  Ｈ１プレートリーダーでスキャンして、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【０２７６】
結果を図８Ａ及び８Ｂに示す。ＭＡＢ３８９８は、ＣＲＴ含有構築物中のカルレティキュリンを首尾よく検出することができ、これは、組み換えクローニング、発現及び精製プロトコルが正常なドメイン構造を維持することを示している。ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ  ＨＲＰにより、抗体のプレートへの均一なコーティングが確認された。陽性対照のＡｂｃａｍカルレティキュリンもＭＡＢ３８９８を用いて検出された。
【０２７７】
実施例１１：ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、腫瘍細胞物質の食作用を誘導することができる
腫瘍細胞物質の食作用を誘導するＴＡＡ提示誘導物質構築物の能力を評価するために、代表数の構築物を食作用アッセイで評価した。簡潔に述べれば、アッセイにより、標識したＳＫＢＲ３細胞に由来する物質を食作用するＴＨＰ−１単球細胞の能力を測定した。試験構築物は、ＨＥＲ２×ＣＤ４０標的構築物１８５３２、ＨＥＲ２×ＤＥＣ２０５標的構築物１８５２９、及びＨＥＲ２×ＬＲＰ−１標的構築物１８５３５であった。構築物１８５３２及び１８５２９は、実施例８に記載の方法に従って、適切な標的に特異的に結合することが実証された（データ示さず）。構築物１８５３５中の組み換えＣＲＴは、実施例１０に記載する市販の抗カルレティキュリン抗体への実証された結合により、品質管理がなされた（データ示さず）。
【０２７８】
ｐＨｒｏｄｏ標識ＳＫＢＲ３細胞は、５０ｍｌのＳＫＢＲ３細胞懸濁液に１μｌの１ｍｇ／ｍｌ（１０６個の細胞に対して２０ｎｇ／ｍｌ）ｐＨｒｏｄｏデキストランを加え、室温で３０分間インキュベーションし、続いて、ＰＢＳで３回洗浄することによって、調製した。３８４ウェルマイクロタイタープレートで、２ｘ１０３個のｐＨｒｏｄｏ標識ＳＫＢＲ３細胞を２×１０４個のＴＨＰ−１細胞に添加し、１０％ウシ胎児血清及び構築物を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中、３７℃で７２時間培養した。２μＭのＤｙｅＣｙｃｌｅ（商標）Ｖｉｏｌｅｔを含む２０μｌの検出培地を各ウェルに添加し、プレートを３７℃で２．５時間インキュベーションした。ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔ（商標）Ｂｉｏａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）の装置及びソフトウェアを使用して、プレートを画像化し、食作用を定量した。
【０２７９】
結果を図９に示す。ＴＡＡ提示誘導物質構築物Ｈｅｒ２×ＣＤ４０（１８５３２）、Ｈｅｒ２×Ｄｅｃ２０５（１８５２９）及びＨｅｒ２×ＣＲＴ（１８５３５）は、ＳＫＢＲ３腫瘍物質に対するＴＨＰ−１細胞の食作用を増強した。
【０２８０】
実施例１２：ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、単球サイトカイン産生を誘導することができる
細胞に対する最適で生産的な抗原提示に必要とされる単球サイトカイン産生（ＡＰＣ活性化の尺度として）を誘導するＴＡＡ提示誘導物質構築物の能力を、実施例１１に記載するものと同様の系で評価した。
【０２８１】
ｐＨｒｏｄｏ標識ＳＫＢＲ３細胞は、５０ｍｌのＳＫＢＲ３細胞懸濁液に１μｌの１ｍｇ／ｍｌ（１０６個の細胞に対して２０ｎｇ／ｍｌ）ｐＨｒｏｄｏデキストランを加え、室温で３０分間インキュベーションし、続いて、ＰＢＳで３回洗浄することによって、調製した。３８４ウェルマイクロタイタープレートで、２×１０３個のｐＨｒｏｄｏ標識ＳＫＢＲ３細胞を２×１０４個の初代ヒト単球に添加し、１０％ウシ胎児血清及び指定の構築物を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中、３７℃で７２時間培養した。Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（商標）イムノアッセイを製造元の推奨プロトコルに従って使用して、上清サイトカインを定量した。
【０２８２】
結果を図１０Ａ（Ｈｅｒ２×ＣＤ４０（ｖ１８５３２））及び図１０Ｂ（Ｈｅｒ２×ＣＲＴ（ｖ１８５３５））に示す。両構築物は、ＳＫＢＲ３腫瘍細胞の存在下で、初代単球のサイトカイン産生を増強した。
【０２８３】
実施例１３：ＴＡＡ提示誘導物質構築物は、細胞内ＴＡＡのＭＨＣ提示を促進し、抗原特異的Ｔ細胞応答を誘発する
ＴＡＡ提示誘導物質構築物によって誘導された細胞内ＴＡＡのＭＨＣ提示を、抗原特異的Ｔ細胞に対するＡＰＣの刺激作用を評価することによって、評価した。まず、ＡＰＣを構築物及び腫瘍細胞とインキュベーションして、ＡＰＣの活性化、外因的に導入された細胞内ＴＡＡであるＭｅｌａｎＡの取り込み、及びＭＨＣ  Ｉ複合体上でのＭｅｌａｎ  Ａペプチドのクロスプレゼンテーションを行わせた。その後、Ｍｅｌａｎ  Ａ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が濃縮されたＴ細胞集団を培養物に導入し、上清中に分泌されたＩＦＮγのレベルを測定することによってＴ細胞応答を定量した。試験したＴＡＡ提示誘導物質構築物は、ＴＡＡとしてＨＥＲ２またはメソテリン（ＭＳＬＮ）を標的にするもの、及びＩＳＲとしてデクチン−１またはＬＲＰ−１（ＣＲＴを介する）を標的にするものを含む。ＡＰＣ−腫瘍細胞共培養の次にＡＰＣ−Ｔ細胞共培養が続く、２つの共培養系を以下のように実施した。
【０２８４】
ＡＰＣ−腫瘍細胞の共培養
Ｗｏｌｆｌ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１４）Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．９（４）：９５０−９６６に記載されている方法を使用して、ヒトＰＢＭＣ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ｃａｔ：７００２５．３）からＡＰＣ（未成熟ＤＣ）を調製した。ＯＶＣＡＲ３細胞を腫瘍細胞株として使用した。Ｍｅｌａｎ  Ａペプチド（ＥＬＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号１５９）、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）を代用の細胞内ＴＡＡとして使用した。ＯＶＣＡＲ３細胞は、ＨＥＲ２発現プロファイルが低いので、ヒト完全長ＨＥＲ２をコードするプラスミドを、共培養の２４時間前に、一過性トランスフェクションした。ＭｅｌａｎＡは、２つの方法を使用してＯＶＣＡＲ３細胞に導入した：１つのバッチのＨＥＲ２トランスフェクト細胞に、ＭｅｌａｎＡ−ＧＦＰ融合タンパク質をコードするプラスミドを、共培養の２４時間前に、一過性コトランスフェクションし、一方、もう１つのバッチのＨＥＲ２トランスフェクト細胞には、共培養の３０分前にＭｅｌａｎＡペプチド（５０μｇ／ｍｌ）をエレクトロポレーションした。非特異的抗原対照については、ＯＶＣＡＲ３細胞に、ＧＦＰプラスミドまたはＫ−ｒａｓペプチド（ＫＬＶＶＶＧＡＧＧＶ（配列番号１６０）、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）をそれぞれトランスフェクションまたはエレクトロポレーションした。プラスミドのトランスフェクションとペプチドのエレクトロポレーションの両方を、Ｎｅｏｎ（登録商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、次のパラメータ：１０５０ｍＶ、３０ｍｓ、２パルスで実施した。
【０２８５】
共培養を次の順序で設定した：構築物を、５０ｎｇ／ｍｌのｈｕＩＬ−７（ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ｃａｔ：２００−００７）を含むＡｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＡＩＭ−Ｖ  Ｓｅｒｕｍ  Ｆｒｅｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ｃａｔ：１２０５５０８３）＋０．５％ヒトＡＢ血清（Ｚｅｎ−Ｂｉｏ、ｃａｔ：ＨＳＥＲ−ＡＢＰ−１００ＭＬ））中に希釈し、３８４ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｎｕｎｃ、ｃａｔ：１４２７６１）に３０μｌ／ウェルでアリコートした。セルスクレーパーを使用して未成熟ＤＣを回収し、Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒ中に６．６７×１０５細胞／ｍｌで再懸濁した。Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ｃａｔ：１３１５１０１４）を使用してＯＶＣＡＲ３細胞を回収し、Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒ中に１．３３×１０５細胞／ｍｌで再懸濁した。未成熟ＤＣとＯＶＣＡＲ３細胞懸濁液を１：１の体積比で混合し、３０μｌの混合物を、バリアントを含むプレートに加えた。細胞を３７℃＋５％ＣＯ２で一晩インキュベーションした。
【０２８６】
ＡＰＣ−Ｔ細胞共培養
以前のプロトコルに修正を加えて使用して、ＭｅｌａｎＡ濃縮ＣＤ８＋Ｔ細胞を調製した（Ｐａｔｈａｎｇｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。簡潔に述べれば、ＰＢＭＣを解凍し、ＰＢＳ中で洗浄し、４０ｎｇ／ｍＬのｈｕＧＭ−ＣＳＦを含むＡｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒ中に６．０×１０６細胞／ｍＬで再懸濁し、４８ウェルプレートに０．５ｍＬ／ウェルで播種した。培養２日目に、ＭｅｌａｎＡペプチドを５０μｇ／ｍＬでウェルに加えた。４時間後、Ｒ８４８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｔｌｒｌ−ｒ−８４８）を最終濃度３μｇ／ｍＬになるように培養物に添加した。Ｒ８４８の添加から３０分後、ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ、Ｌ５２９３）を最終濃度５ｎｇ／ｍＬになるように培養物に添加した。３日目に、細胞をＰＢＳで洗浄し、２％ヒトＡＢ血清及び５０ｎｇ／ｍＬのｈｕＩＬ−７を含む、１２培養容量のＡＩＭ−Ｖ培地で再懸濁した。細胞を新しい４８ウェルプレートに１ｍｌ／ウェルで再播種して、１×１０６細胞／ウェルにした。細胞を３７℃＋５％ＣＯ２でインキュベーションし、培地が黄変したら更に継代した。１４日目に細胞をプールし、ＣＤ８＋Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、ｃａｔ：１３０−０９６−４９５）を使用してＣＤ８＋画分を単離した。次に、細胞を３７℃＋５％ＣＯ２で一晩静置し、翌日、Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒ中に１．６７×１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。共培養のために、ＡＰＣ−腫瘍細胞共培養プレートから２０μｌの上清を除去し、２０μｌのＴ細胞懸濁液を添加した。細胞を３７℃＋５％ＣＯ２で４８時間インキュベーションし、培養上清を採取し、ヒトＩＦＮγアッセイキット（Ｃｉｓｂｉｏ、ｃａｔ：６２ＨＩＦＮＧＰＥＨ）を使用して、ＩＦＮγ産生を評価した。
【０２８７】
結果を図１１Ａ（ＭｅｌａＡペプチドをエレクトロポレーションしたＯＶＣＡＲ細胞）及び図１１Ｂ（ＭｅｌａｎＡ−ＧＦＰ融合タンパク質をコードするプラスミドをトランスフェクションしたＯＶＣＡＲ細胞）に示す。構築物は、１０μｇ／ｍｌで試験した。エラーバーは、少なくとも２回の反復実験の平均標準誤差を表す。ＭＳＬＮ×デクチン−１構築物ｖ２２１５３は、ＭｅｌａｎＡペプチド含有腫瘍細胞及びＭｅｌａｎＡ−ＧＦＰタンパク質含有腫瘍細胞を使用すると、その両方で、上清中に約１０００ｐｇ／ｍｌのＩＦＮγが分泌され、最も強いＭｅｌａｎＡ特異的Ｔ細胞応答を惹起した。応答は、対照ペプチドを含有する培養系よりもＭｅｌａｎＡでより強かった。ＭｅｌａｎＡペプチド含有細胞を使用すると、１つのＨＥＲ２×デクチン−１バリアント（ｖ２２１５１）及び２つのＨＥＲ２×ＣＲＴバリアント（ｖ２２２５０及びｖ２２２５４）は、バックグラウンドまたは対照ペプチド条件を上回る抗原特異的Ｔ細胞活性化を示した。更に、ＭｅｌａｎＡ−ＧＦＰタンパク質含有細胞を使用すると、３つのＨＥＲ２×デクチン−１バリアント（ｖ２２２６２、ｖ２２３００及びｖ２２１５１）が、同活性化を示した。したがって、Ｈｅｒ２またはＭＳＬＮに特異的なＴＡＡ提示誘導物質多重特異性バリアントは、細胞内腫瘍細胞ＴＡＡ（ＭｅｌａｎＡ）のＡＰＣ獲得を促進し、抗デクチン−１またはＣＲＴを介したＴ細胞への提示を促進した。
【０２８８】
複数の異なる標的ペアに関して、これらの結果は、抗ＴＡＡ×ＩＳＲ構築物がＡＰＣによるＴＣＤＭ獲得を促進し、免疫応答を、ＴＡＡ提示誘導物質構築物自体に物理的に結合したものとは異なる腫瘍由来抗原に向かうように変更することを実証している。
【０２８９】
本明細書において言及される全ての特許、特許出願、公開物及びデータベースエントリの開示は、それぞれ個々の特許、特許出願、公開物及びデータベースエントリが具体的かつ個別に参照により援用されることが示された場合と同様に、その全体が参照により本明細書に具体的に援用される。
【０２９０】
当業者に明らかであろう本明細書に記載される特定の実施形態の変更は、以下の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
【０２９１】
（表ＹＹ）ＣＤＲ
2020511997.tif 000019
2020511997.tif 000020
【０２９２】
（表ＺＺ）配列
2020511997.tif 000021
2020511997.tif 000022
2020511997.tif 000023
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2020511997.tif 000124
【図１】
2020511997.tif 000125
【図２】
2020511997.tif 000126
【図３】
2020511997.tif 000127
【図４】
2020511997.tif 000128
【図５】
2020511997.tif 000129
【図６Ａ】
2020511997.tif 000130
【図６Ｂ】
2020511997.tif 000131
【図６Ｃ】
2020511997.tif 000132
【図６Ｄ】
2020511997.tif 000133
【図６Ｅ】
2020511997.tif 000134
【図６Ｆ】
2020511997.tif 000135
【図７】
2020511997.tif 000136
【図８】
2020511997.tif 000137
【図９】
2020511997.tif 000138
【図１０Ａ】
2020511997.tif 000139
【図１０Ｂ】
2020511997.tif 000140
【図１１】
2020511997.tif 000141
【配列表】
2020511997000001.app
【国際調査報告】
2020511997.tif 000142
2020511997.tif 000143
2020511997.tif 000144