(57)【要約】本発明は、線維症を予防または治療する方法における使用のためのｍｉＲ−６７１−５ｐの阻害剤に関する。さらに、本発明は、該ｍｉＲ−６７１−５ｐの阻害剤を含むキットを包含する。本発明は、線維症を予防または治療するための化合物を同定するためのインビトロの方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
線維症を予防または治療する方法における使用のための、ｍｉＲ−６７１−５ｐの阻害剤であって、リコリン、ブファリン、ギトキシゲニン、およびアニソマイシン、ならびにそれらの塩、類似体および誘導体からなる群から選択される、阻害剤。
【請求項２】
前記類似体が以下の化合物：
2020505466.tif 000008
2020505466.tif 000009
2020505466.tif 000010
2020505466.tif 000011
2020505466.tif 000012
2020505466.tif 000013
2020505466.tif 000014
2020505466.tif 000015
2020505466.tif 000016
2020505466.tif 000017
2020505466.tif 000018
2020505466.tif 000019
から選択され得る、請求項１に記載の使用のための阻害剤。
【請求項３】
線維症が、心臓線維症、肺線維症、肝臓線維症、腎臓線維症、胃腸線維症、骨格筋線維症、全身性硬化症、多巣性線維性硬化症、骨髄移植レシピエントにおける強皮症性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、腎性全身性線維症または皮膚線維症から選択され得る、請求項１または２に記載の使用のための阻害剤。
【請求項４】
線維症が、心臓線維症、肺線維症または腎臓線維症である、請求項３に記載の使用のための阻害剤。
【請求項５】
前記使用が、２週間、３週間、４週間、５週間またはそれより長い期間にわたり、好ましくは連続２週間にわたり、１日おきに前記阻害剤を投与することを含む、先の請求項のいずれか一項に記載の使用のための阻害剤。
【請求項６】
前記阻害剤の投与が、注射または注入によって行われる、請求項５に記載の使用のための阻害剤。
【請求項７】
前記阻害剤の投与が、腹腔内、静脈内、皮下、筋肉内または経口的に行われる、請求項５または６のいずれか一項に記載の使用のための阻害剤。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のｍｉＲ−６７１−５ｐの阻害剤を含むキット。
【請求項９】
線維症を予防または治療するための化合物を同定するためのインビトロの方法であって、該方法が、
（ａ）線維症を起こしている細胞中のｍｉＲ−６７１−５ｐの量を測定するステップと、
（ｂ）該線維症を起こしている細胞を試験化合物と接触させるステップと、
（ｃ）ステップ(ｂ）の後の前記線維化細胞中のｍｉＲ−６７１−５ｐの量を、ステップ(ａ）で測定されたｍｉＲ−６７１−５ｐの量と比較するステップと
を含み、
（ｄ）ここで、ｍｉＲ−６７１−５ｐレベルの減少が、前記試験化合物が線維症を予防または治療するための化合物であることを示す、
前記方法。
【請求項１０】
投与あたりの前記試験化合物の量が、少なくとも０．５μＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、または少なくとも１０μＭである、請求項９に記載のインビトロの方法。
【請求項１１】
前記化合物が、天然化合物、合成化合物または半合成化合物である、請求項９または１０のいずれか一項に記載のインビトロの方法。
【請求項１２】
前記試験化合物が、リコリン、ブファリン、ギトキシゲニン、アニソマイシンおよびゲルダナマイシン、ならびにそれらの塩、類似体および誘導体からなる群から選択される、請求項１１に記載のインビトロの方法。
【請求項１３】
前記類似体が、請求項２に記載の化合物から選択され得る、請求項１２に記載のインビトロの方法。
【請求項１４】
線維症が、心臓線維症、肺線維症、肝臓線維症、腎臓線維症、胃腸線維症、骨格筋線維症、全身性硬化症、多巣性線維性硬化症、骨髄移植レシピエントにおける強皮症性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、腎性全身性線維症または皮膚線維症から選択され得る、請求項９〜１３のいずれか一項に記載のインビトロの方法。
【請求項１５】
前記線維症を起こしている細胞が、心臓細胞、肺細胞、肝細胞、腎臓細胞、腸細胞、骨格筋細胞または真皮細胞である、請求項９〜１４のいずれか一項に記載のインビトロの方法。
【請求項１６】
前記線維症を起こしている細胞が、ヒト心臓線維芽細胞（ＨＣＦ）、肺線維芽細胞または腎線維芽細胞である、請求項９〜１５のいずれか一項に記載のインビトロの方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、線維症を予防または治療するための方法における使用のための化合物、ならびに、該化合物を含むキットに関する。本発明はまた、線維症を予防または治療するための化合物を同定するためのインビトロの方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
線維症は、修復または反応過程における器官または組織内の過剰な線維性結合組織の形成であり（Birbrair et al. 2014）、これは、下層の器官または組織の構造および機能を破壊し得る。線維症の間、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質の病理学的な蓄積が起こり、罹患した組織の瘢痕化および肥厚がもたらされる（Neary et al. 2015）。線維症は、体内の多くの組織で起こり得、心臓線維症、肺線維症、または腎臓線維症などの器官特異的線維症、および全身性線維症に分けられる。
【０００３】
基本的に、線維症は、正常な臓器機能を妨げる、過度の創傷治癒反応と考えることができる（Neary et al. 2015）。
【０００４】
通常の創傷治癒には、傷害、炎症および修復の３つの異なる段階が含まれる：第１段階では、環境粒子、アレルゲン、感染物質、化学療法および放射線を含む多くの作用物質が、上皮細胞および内皮細胞の破壊の原因となり、結果として抗線維素溶解カスケードを引き起こす。次に、炎症の段階が、循環中の炎症細胞および線維細胞によって開始され、それらは、ケモカイン勾配を介して傷害の部位に動員され、線維芽細胞活性化サイトカインおよび増殖因子を供給する。血管新生は、損傷を受けた領域へのアクセス、ならびに炎症細胞、抗炎症細胞、および食細胞の安定した流れを提供する。最終段階である修復には、線維芽細胞が収縮して創傷の大きさを縮小させることが含まれる。最終段階では、炎症細胞は、アポトーシスを起こして、コラーゲン沈着を終結させ、食細胞によって除去される。上皮細胞および内皮細胞が再配置され、組織構造が回復する。
【０００５】
上述のように創傷治癒を成功させるために、ネガティブフィードバックループおよび再生過程のバランスを通じて、制御された応答が維持される。過剰な炎症ならびに炎症性および線維芽細胞活性化サイトカインの産生のような治癒過程における不均衡のために、正常な治癒は線維性カスケードに変換され得る。損傷の部位での線維芽細胞の動員およびα−ＳＭＡ＋細胞の頻度の増加は、過剰なコラーゲン沈着をもたらし得、それが、次に線維症を引き起こす。したがって、当技術分野において、線維症の進行を遅らせることが必要とされている（Wilson and Wynn 2009）。
【０００６】
上述のように、線維症の一例は、先進国における主要な死因の１つである心不全（ＨＦ）に関与する、心臓線維症（ＣＦ）である。心臓線維症は、心筋における常在性心臓線維芽細胞の増殖速度の増加、コラーゲン沈着を含む過剰なマトリックス沈着、またはそれら両方を特徴とする。通常、線維芽細胞はコラーゲンを分泌するが、この過程が過剰に活性化されると、心筋の異常な肥厚や柔軟性の喪失を引き起こし得る。これは、生理学的組織構造の破壊および進行性の臓器機能不全につながり、最終的に心不全を引き起こす（Thum 2014）。ＣＦは、より高い長期死亡率と相関し、かつＨＦ治療のための公式のガイドラインに従って投薬したとしても患者において持続するため、心不全の治療または予防に加えて抗線維化治療ストラテジーに焦点を当てた治療を適用することが不可欠である。
【０００７】
心不全の最も一般的な組織学的特徴の１つは、さまざまな病態生理学的メカニズムを持つ特異的線維症である心筋線維症である。心筋線維症は、心筋組織の各細胞成分に関連する複雑な過程である。原線維コラーゲンネットワークは、心筋の全ての異なる細胞型と密接に接触しており、心室の形状、大きさおよび機能の維持において重要な役割を果たす。心筋線維芽細胞は、コラーゲンおよび他の細胞外マトリックス成分の産生を増加させ、その結果、心室収縮作用、異常な心臓リモデリング、および心室スティフネスの増加をもたらす。このように、心筋線維症は、心筋組織のコラーゲン体積分率（ＣＶＦ）の著しい増加により定義される（Nathan et al. 2011）。
【０００８】
一般的に、線維症は世界中で罹患率および死亡率の重要な原因と考えられ、現在、この特定の疾患に対する許容できる治療法は存在しない（O'Reilly 2016）。ｍｉｃｒｏＲＮＡ（短縮形：ｍｉＲＮＡ）は、様々な種類の線維症と関連している可能性があり、疾患特異的バイオマーカーとして有用であり得る。さらに、ｍｉＲＮＡは、病態生理学的過程において重要な役割を果たす転写後遺伝子発現の強力な調節因子として知られている。ｍｉＲＮＡは、２０年より前に発見されて以来、研究されてきた。ｍｉＲＮＡは、標的転写における３’非翻訳領域への部分的な相補的結合によるｍＲＮＡ切断、翻訳抑制、またはｍＲＮＡ不安定化を媒介する小さな非コードＲＮＡである。さらに、ｍｉＲＮＡは、進化の過程で高度に保存された小さな一本鎖ＲＮＡであり、その長さは一般に２２〜２５ヌクレオチド程度である（O'Reilly 2016）。低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と比較して、ｍｉＲＮＡは、標的とされたｍＲＮＡの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列との不完全な塩基対形成を好ましくは通じて、それらの効果を媒介する。標的ｍＲＮＡの抑制に重要であるｍｉＲＮＡ中のこの特定の領域は「シード領域」と呼ばれる。ｍｉＲＮＡのそれらの標的への不完全な結合のために、１つのｍｉＲＮＡが多くの遺伝子を調節することができる。
【０００９】
具体的には、ｍｉＲＮＡは、タンパク質をコードしてもしなくてもよいキャップ化およびポリアデニル化一次転写物（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）の一部としてＲＮＡポリメラーゼＩＩによって転写される。さらに、該一次転写物は、リボヌクレアーゼＩＩＩ酵素Ｄｒｏｓｈａによって切断されて約７０ｎｔのステムループ前駆体ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）を生成し、これはさらに細胞質内のリボヌクレアーゼＤｉｃｅｒによって切断されて成熟ｍｉＲＮＡおよびアンチセンスｍｉＲＮＡ  ｓｔａｒ（ｍｉＲＮＡ*）産物を生成する。成熟ｍｉＲＮＡは、該ｍｉＲＮＡとの不完全な塩基対形成を通して標的ｍＲＮＡを認識するＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれ、そして最も一般的には、標的ｍＲＮＡの翻訳阻害または不安定化をもたらす。したがって、特定のｍｉＲＮＡを標的とすることにより、たとえば心臓線維症に関与する、広範囲の調節解除された遺伝子を正常化することができる。
【００１０】
具体的には、ｍｉＲＮＡは、特定の疾患単位、例えば心血管疾患、特に心不全の分野において定量的に修飾される（Schulte et al. 2015）か、または肝臓線維症の進行に関係している（Murakami et al. 2012）。さらに、ｍｉＲＮＡは、肺線維症のマーカーとして生物医学的研究の主要分野として浮上している（Rajasekaran et al. 2015）。さらに、研究により、ある特定のｍｉＲＮＡが心臓線維症において差次的に発現されることが示されている（Wang et al. 2012）。しかしながら、文献におけるｍｉＲＮＡの既知の差次的発現にもかかわらず、ｍｉＲＮＡの阻害のための特定の化合物は知られていない。
【００１１】
線維症の治療法は、現在知られていないので（O'Reilly 2016）、線維症、特に心臓線維症のための新規の薬学的化合物を開発することが極めて重要である。
【発明の概要】
【００１２】
本発明の目的は、線維症を予防または治療する方法に使用するための化合物を供することである。
【００１３】
具体的には、特定のｍｉＲＮＡが線維症において上昇制御されることが見いだされた。これらのｍｉＲＮＡの１つがｍｉＲ−６７１−５ｐである。ｍｉＲ−６７１−５ｐの阻害は、線維症、特に心臓線維症の治療のための有望な出発点である。
【００１４】
したがって、本発明は、線維症を予防または治療する方法に使用するためのｍｉＲ−６７１−５ｐの阻害剤を包含する。
【００１５】
その阻害剤は、リコリン（Lycorine）、ブファリン（Bufalin）、ギトキシゲニン（Gitoxigenin）、アニソマイシン（Anisomycin）およびゲルダナマイシン（Geldanamycin）、ならびにそれらの塩、類似体および誘導体からなる群から選択することができる。
【００１６】
本発明は、さらに、線維症の治療または予防に用いるための前記阻害剤を供する。ここで、線維症は、心臓線維症、肺線維症、肝臓線維症、腎臓線維症、胃腸線維症、骨格筋線維症、全身性硬化症、多巣性線維硬化症、骨髄移植レシピエントにおける強皮症性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、腎性全身性線維症または皮膚線維症から選択することができる。好ましい態様において、線維症は心臓線維症、肺線維症または腎臓線維症である。
【００１７】
本発明はまた、線維症を予防または治療する方法における使用のための前記阻害剤を包含し、ここで、該使用は、２週間、３週間、４週間、５週間またはそれより長い期間にわたり、好ましくは連続２週間にわたり、１日おきに阻害剤を投与することを含む。
【００１８】
さらに、本発明は、注射または注入による阻害剤の投与を供する。
【００１９】
阻害剤の投与は、腹腔内に、静脈内に、皮下に、筋肉内に、または経口的に行うことができる。
【００２０】
また、前記ｍｉＲ−６７１−５ｐの阻害剤を含むキットも記載される。
【００２１】
本発明はさらに、線維症を予防または治療するための化合物を同定するためのインビトロでの方法を供し、この方法は、(ａ）線維症を起こしている細胞中のｍｉＲ−６７１−５ｐの量を測定するステップと、(ｂ）線維症を起こしている細胞を試験化合物と接触させるステップと、(ｃ）ステップ(ｂ）の後の前記線維化細胞中のｍｉＲ−６７１−５ｐの量を、ステップ(ａ）で測定されたｍｉＲ−６７１−５ｐの量と比較するステップとを含み、(ｄ）ここで、ｍｉＲ−６７１−５ｐレベルの減少が、試験化合物が線維症を予防または治療するための化合物であることを示す。
【００２２】
本発明には、投与あたりの試験化合物の量が、少なくとも０．５μＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、または少なくとも１０μＭである、前記インビトロの方法が考慮される。
【００２３】
本発明はまた、前記化合物が天然化合物、合成化合物、または半合成化合物である、前記インビトロの方法も供する。
【００２４】
本発明には、試験化合物が、リコリン（Lycorine）、ブファリン（Bufalin）、ギトキシゲニン（Gitoxigenin）、アニソマイシン（Anisomycin）およびゲルダナマイシン（Geldanamycin）、ならびにそれらの塩、類似体および誘導体からなる群から選択される、前記インビトロの方法が考慮される。
【００２５】
さらに、線維症が、心臓線維症、肺線維症、肝臓線維症、腎臓線維症、胃腸線維症、骨格筋線維症、全身性硬化症、多巣性線維性硬化症、骨髄移植レシピエントにおける強皮症性移植片対宿主病（GVHD）、腎性全身性線維症、または皮膚線維症から選択され得る、前記インビトロの方法が供される。
【００２６】
本発明はさらに、線維症を起こしている細胞が、心臓細胞、肺細胞、肝細胞、腎臓細胞、腸細胞、骨格筋細胞または真皮細胞である、前記インビトロの方法を意図している。好ましい実施形態では、線維症を起こしている細胞は、ヒト心臓線維芽細胞（ＨＣＦ）、肺線維芽細胞または腎線維芽細胞である。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１−１】インビトロでの抗線維化天然化合物ブファリン、ギトキシゲニン、リコリン、アニソマイシンおよびゲルダナマイシンの同定。初代ヒト心臓線維芽細胞（ＨＣＦ）におけるインビトロでの４８０種の天然由来物質の機能的スクリーニングは、ＨＣＦの増殖を阻害する化合物を明らかにする。初代ＨＣＦの増殖に対するブファリン、ギトキシゲニン、リコリン、アニソマイシン、およびゲルダナマイシンの用量依存的阻害作用。これは実施例１に記載される。
【図１−２】図１−１の説明を参照のこと。
【図１−３】図１−１の説明を参照のこと。
【図１−４】図１−１の説明を参照のこと。
【図１−５】図１−１の説明を参照のこと。
【図２−１】リコリンのインビトロ試験。抗線維化リコリンは、インビトロで強力かつ特異的にＨＣＦに作用する：Ａ）アルカロイドであるリコリンの化学構造の概略図およびリコリンを産生するアマリリス種のメンバーの写真。Ｂ）初代ＨＣＦの増殖に対するリコリンの用量依存的（１μＭ、５μＭ、および１０μＭ）阻害効果は、ＢｒｄＵ−ＥＬＩＳＡを介して測定された心筋細胞株ＨＬ−１の増殖に対する同濃度のリコリンの影響がないことによって証明されるように、線維芽細胞特異的である。ＤＭＳＯは対照として示す。Ｃ）リコリンは、アネキシン−７ＡＡＤ染色の後、初代ＨＣＦにおいて細胞死を誘発しない。Ｄ）リコリンは、代表的なウエスタンブロット（ＧＡＰＤＨに対して正規化）に示されるように、初代ＨＣＦ中の細胞外マトリックス成分コラーゲン１ａ１の発現レベルを減少させる。ＤＭＳＯは対照として示す。データは、三つ組で行った３回の独立した測定の平均として示され、平均±ＳＥＭとして表される。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。これは実施例２に記載される。
【図２−２】図２−１の説明を参照のこと。
【図２−３】図２−１の説明を参照のこと。
【図３−１】ブファリンのインビトロ試験。抗線維化ブファリンは、インビトロで強力かつ特異的にＨＣＦに作用する：Ａ）強心配糖体であるブファリンの化学構造の概略図およびブファリンを産生するヒキガエルの写真。Ｂ）初代ＨＣＦの増殖に対するブファリンの用量依存的（０．１μＭ、１μＭおよび１０μＭ）阻害効果は、ＢｒｄＵ−ＥＬＩＳＡにより測定された心筋細胞株ＨＬ−１の増殖に対する同濃度のブファリンの影響がないことによって証明されるように、線維芽細胞特異的である。ＤＭＳＯは対照として示す。Ｃ）ブファリンは、アネキシン−７ＡＡＤ染色の後に初代ＨＣＦにおいて細胞死を誘発しない。Ｄ）ブファリンは、代表的なウエスタンブロット（ＧＡＰＤＨに対して正規化）に示されるように、初代ＨＣＦにおける細胞外マトリックス成分コラーゲン１ａ１の発現レベルを減少させる。ＤＭＳＯは対照として示す。データは、三つ組で行った３回の独立した測定の平均として示され、平均±ＳＥＭとして表される。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。これは実施例２に記載される。
【図３−２】図３−１の説明を参照のこと。
【図３−３】図３−１の説明を参照のこと。
【図４−１】ギトキシゲニンのインビトロ試験。抗線維化ギトキシゲニンは、インビトロで強力かつ特異的にＨＣＦに作用する：Ａ）強心配糖体であるギトキシゲニンの化学構造の概略図およびギトキシゲニンを産生するジギタリスの写真。Ｂ）初代ＨＣＦの増殖に対するジギタリス産生ギトキシゲニンの用量依存的（０．１μＭ、１μＭ、および１０μＭ）阻害効果は、ＢｒｄＵ−ＥＬＩＳＡにより測定された心筋細胞株ＨＬ−１の増殖に対する同濃度のギトキシゲニンの影響がないことによって証明されるように、線維芽細胞特異的である。ＤＭＳＯは対照として示す。Ｃ）アネキシン−７ＡＡＤ染色の後、ギトキシゲニンは初代ＨＣＦにおいて細胞死を誘発しない。Ｄ）ギトキシゲニンは、代表的なウエスタンブロット（ＧＡＰＤＨに対して正規化）に示されるように、初代ＨＣＦ中の細胞外マトリックス成分コラーゲン１ａ１の発現レベルを減少させる。ＤＭＳＯは対照として示す。データは、三つ組で行った３回の独立した測定の平均として示され、平均±ＳＥＭとして表される。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。これは実施例２に記載される。
【図４−２】図４−１の説明を参照のこと。
【図４−３】図４−１の説明を参照のこと。
【図５−１】アニソマイシンのインビトロ試験。抗線維化アニソマイシンは、インビトロで強力かつ特異的にＨＣＦに作用する：Ａ）強心配糖体であるアニソマイシンの化学構造の概略図およびアニソマイシンを産生するストレプトミセス・グリセオラス（Streptomyces griseolus）の写真。Ｂ）初代ＨＣＦの増殖に対するジギタリス産生アニソマイシンの用量依存的（０．１μＭ、１μＭおよび１０μＭ）阻害効果は、ＢｒｄＵ−ＥＬＩＳＡにより測定された心筋細胞株ＨＬ−１の増殖に対する同濃度のアニソマイシンの影響がないことによって証明されるように、線維芽細胞特異的である。ＤＭＳＯは対照として示す。Ｃ）アニソマイシンは、アネキシン−７ＡＡＤ染色の後、初代ＨＣＦにおいて細胞死を誘発しない。Ｄ）アニソマイシンは、代表的なウエスタンブロット（ＧＡＰＤＨに対して正規化）に示されるように、初代ＨＣＦ中の細胞外マトリックス成分コラーゲン１ａ１の発現レベルを減少させる。ＤＭＳＯは対照として示す。データは、三つ組で行った３回の独立した測定の平均として示され、平均±ＳＥＭとして表される。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。これは実施例２に記載される。
【図５−２】図５−１の説明を参照のこと。
【図５−３】図５−１の説明を参照のこと。
【図６】アンジオテンシンＩＩ誘発心臓線維性疾患のマウスモデル。リコリン、ブファリン、ギトキシゲニン、およびアニソマイシンの抗線維化能のインビボ検証の概略図。これは実施例３に記載される。
【図７Ａ−１】心機能に関するブファリンおよびリコリン試験。ブファリンおよびリコリンは、アンジオテンシンＩＩ誘発心臓線維性疾患のマウスモデルにおいて心機能を有意に改善する：ブファリン（Ａ）およびリコリン（Ｂ）は、心筋機能指数（ＭＰＩ）の低下、ならびに等容弛緩時間（ＩＶＲＴ）の減少およびＥ対Ａピーク比（E/A）の増加によってそれぞれ証明されるように、心臓の全体機能および拡張期機能の両方を有意に改善する。ＤＭＳＯは対照として示す。データは平均±ＳＥＭとして表す。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。これは実施例４に記載される。
【図７Ａ−２】図７Ａ−１の説明を参照のこと。
【図７Ｂ−１】図７Ａ−１の説明を参照のこと。
【図７Ｂ−２】図７Ａ−１の説明を参照のこと。
【図８Ａ】心臓線維症に対するブファリンおよびリコリン試験。ブファリンとリコリンはアンジオテンシンII誘発心臓線維性疾患のマウスモデルにおいて心臓線維症を改善する：ブファリン（Ａ）およびリコリン（Ｂ）は、心臓の組織切片の代表的画像におけるコラーゲン沈着の顕著な減少、およびピクロシリウス染色領域の定量化により示されるように、線維症の発達を防止する。ＤＭＳＯは対照として示す。データは平均±ＳＥＭとして表す。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。これは実施例４に記載される。
【図８Ｂ】図８Ａの説明を参照のこと。
【図９Ａ】心機能に対するアニソマイシンおよびギトキシゲニン試験。アニソマイシンおよびギトキシゲニンは、アンジオテンシンＩＩ誘発心臓線維性疾患のマウスモデルにおいて心機能を有意に改善する：アニソマイシン（Ａ）およびギトキシゲニン（Ｂ）は、心筋機能指数（ＭＰＩ）の低下、ならびに等容弛緩時間（ＩＶＲＴ）の減少およびＥ対Ａピーク比（Ｅ／Ａ）の増加によってそれぞれ証明されるように、心臓の全体機能および拡張期機能の両方を有意に改善する。ＤＭＳＯは対照として示す。データは平均±ＳＥＭとして表す。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。これは実施例４に記載される。
【図９Ｂ】図９Ａの説明を参照のこと。
【図１０Ａ】心臓線維症に対するアニソマイシンおよびギトキシゲニン試験。アニソマイシンおよびギトキシゲニンは、アンジオテンシンＩＩ誘発心臓線維性疾患のマウスモデルにおいて心臓線維症を改善する：アニソマイシン（Ａ）およびギトキシゲニン（Ｂ）は、心臓の組織切片の代表的画像におけるコラーゲン沈着の顕著な減少、およびピクロシリウス染色領域の定量化により示されるように、線維症の発達を防止する。ＤＭＳＯは対照として示す。データは平均±ＳＥＭとして表す。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。これは実施例４に記載される。
【図１０Ｂ】図１０Ａの説明を参照のこと。
【図１１】高血圧誘発拡張機能障害の治療用マウスモデル。リコリンとブファリンの治療的インビボ研究の概略図。これは実施例５に記載される。
【図１２−１】心臓線維症についてのブファリンおよびリコリン試験。Ａ）心臓の組織学的切片の代表的な画像におけるコラーゲン沈着の減少、およびピクロシリウス染色領域の定量化によって示されるように、ブファリンおよびリコリンは、処理により、確立された拡張期心不全における心臓線維症のさらなる発達を防止する。特に、（Ｂ）心筋機能指数（ＭＰＩ）の低下、ならびに（Ｃ）等容弛緩時間（ＩＶＲＴ）の減少および（Ｄ）Ｅ対Ａピーク比の増加、によってそれぞれ証明されるように、ブファリンは心臓の全体機能および拡張期機能の両方を有意に改善する。ＤＭＳＯは対照として示す。データは平均±ＳＥＭとして表す。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。これは実施例６に記載される。
【図１２−２】図１２−１の説明を参照のこと。
【図１２−３】図１２−１の説明を参照のこと。
【図１３】ブファリンおよびリコリンは、アンジオテンシンＩＩ注入時のマウス心臓の左心室コンプライアンスを回復する。ブファリンおよびリコリンによる拡張末期圧容量関係（ＥＤＰＶＲ）の有意な減少によって証明されるように、ブファリンおよびリコリンは、全身性高血圧によって誘発される左心室の受動的なスティフネスを減少させる。ＤＭＳＯは対照として示す。データは平均±ＳＥＭとして表す。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。これは実施例７に記載される。
【図１４】ブファリンは、アンジオテンシンＩＩ注入のマウスモデルにおいて拡張期の間の組織運動を加速する。組織ドプラ法の定量化および代表的な画像に示される、アンジオテンシンＩＩ注入により減速された（ビヒクル溶媒単独対照と比較して減少したＥ’）、拡張期における組織の運動速度を、ブファリンが回復させる（ＡｎｇＩＩ溶媒単独対照と比較して増加したＥ’）。ＤＭＳＯは対照として示す。データは平均±ＳＥＭとして表す。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。これは実施例８に記載される。
【図１５】ブファリンは、アンジオテンシンＩＩ誘発心臓線維性疾患のマウスモデルにおいて長軸方向グローバルストレイン（ＧＬＳ）を回復する。ニ次元スペックルトラッキングストレイン心エコーは、代表的な画像および定量化の両方で示されるように、ブファリンでの処理による、アンジオテンシンＩＩ注入によって引き起こされた心臓の長軸方向グローバルストレイン（ＧＬＳ）のダウンシフトの有意な逆転を明らかにした。ＤＭＳＯは対照として示す。ＨＦｐＥＦ（ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ  ｗｉｔｈ  ｐｒｅｓｅｒｖｅｄ  ｅｊｅｃｔｉｏｎ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）のマウスモデルによれば、駆出率（ＥＦ）はすべての試験群で同程度のままであった。データは平均±ＳＥＭとして表す。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。これは実施例８に記載される。
【図１６Ａ】ヒト心臓線維芽細胞におけるハイスループットｍｉＲＮＡ配列決定。ブファリンは、インビトロでHCFのｍｉＲＮＡ発現に影響を及ぼし、HCFのｍｉＲＮＡシグネチャを変化させる。対照ＤＳＭＯと比較して、ブファリンで処理した後のＨＣＦＳでは、一部のｍｉＲＮＡ、具体的には３３個のｍｉＲＮＡが下方制御され（Ａ）、一部のｍｉＲＮＡ（具体的には１４個のｍｉＲＮＡ）が上方制御されている（Ｂ）。上位３０個の有意に調節解除されたｍｉＲＮＡの表を（Ａ）に示す。データは、３回の独立した実験からプールした三つ組を表す。これは実施例９に記載される。
【図１６Ｂ】図１６Ａの説明を参照のこと。
【図１７−１】ヒト心臓線維芽細胞におけるｍｉＲＮＡ配列決定。HCFにおいて同定された抗線維性化合物によってｍｉＲ−６７１−５ｐレベルは有意に減少する：ＤＭＳＯ対照と比較して、ブファリン、ギトキシゲニン、リコリン、アニソマイシンおよびゲルダナマイシンでの処理により、初代HCFにおいてｍｉＲ−６７１−５ｐの発現レベルは減少する。それぞれの化合物によるｍｉＲ−６７１−５ｐの下方制御（ＲＮＵ４８に対して正規化）は、ｑＲＴ−ＰＣＲによって検証した。データは、三つ組で行った３回の独立した測定の平均として表され、平均±ＳＥＭとして表される。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。これは実施例１０に記載される。
【図１７−２】図１７−１の説明を参照のこと。
【図１７−３】図１７−１の説明を参照のこと。
【図１７−４】図１７−１の説明を参照のこと。
【図１７−５】図１７−１の説明を参照のこと。
【図１８Ａ−１】ヒト心臓線維芽細胞におけるｍｉＲＮＡのインビトロ実験。ｍｉＲ−６７１−５ｐはインビトロでＨＣＦの線維症および炎症を調節する：Ａ）ｍｉＲ−６７１−５ｐの過剰発現は、初代ＨＣＦにおいて、線維症のマーカー（α−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）および結合組織成長因子（ＣＴＧＦ））および炎症のマーカー（インターロイキン−６（ＩＬ−６）およびインターロイキン−８（ＩＬ−８））の活性化をもたらす。Ｂ）逆に、ｍｉＲ−６７１−５ｐの阻害は、初代ＨＣＦにおいて、線維症および炎症の上記マーカーの顕著な減少（１８Ｓ  ｒＲＮＡに対して正規化）をもたらす。データは、三つ組で行った４回の独立した測定の平均として表され、平均±ＳＥＭとして表される。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。これは実施例１１に記載される。
【図１８Ａ−２】図１８Ａ−１の説明を参照のこと。
【図１８Ｂ−１】図１８Ａ−１の説明を参照のこと。
【図１８Ｂ−２】図１８Ａ−１の説明を参照のこと。
【図１９】ヒト心臓線維芽細胞におけるｍｉＲ−６７１−５ｐの過剰発現。ｍｉＲ−６７１−５ｐの過剰発現は、制御下およびブファリンでの処理条件下の両方でＨＣＦの遊走を増強する。ｍｉＲ−６７１−５ｐの過剰発現は、抗線維化ブファリンでの処理ありおよびなしの両方で初代ＨＣＦの遊走を刺激する。データは、三つ組で行った３回の独立した測定の平均として表され、平均±ＳＥＭとして表される。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。これは実施例１１に記載される。
【図２０】心臓線維症におけるｍｉＲ−６７１−５ｐレベルのインビボ研究。ｍｉＲ−６７１−５ｐレベルは心臓線維性疾患において変化する。ｍｉＲ−６７１−５ｐの発現は、様々なマウス心不全モデル（高血圧、圧負荷および同種異系心臓移植）において増加している。ＨＦ、（Ａ）アンジオテンシンＩＩ充填ミニポンプの移植、（Ｂ）大動脈縮窄術（ＴＡＣ）、または（Ｃ）心臓の同種移植、によってマウスにおいて誘発された。Ｄ）ｍｉＲ−６７１−５ｐはヒト大動脈弁狭窄症患者の心臓において活性化されている。増加したレベルのｍｉＲ−６７１−５ｐ（マウスにおいてｓｎｏＲＮＡ−２０２に対しておよびヒト心臓組織においてＲＮＵ４８に対して正規化）を、ｑＲＴ−ＰＣＲによって研究した。データは平均±ＳＥＭとして表す。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。これは実施例１２に記載される。
【図２１−１】ｍｉＲ−６７１−５ｐの直接の標的としてのＣＤＲａｓのインビトロ研究。環状ＲＮＡ  ＣＤＲ１ａｓは、ｍｉＲ−６７１−５ｐの直接の標的である：Ａ）ヒトにおけるＣＤＲ１ａｓおよびｍｉＲ−６７１−５ｐの予測される結果的な対合（www.targetscan.org/vert_71/）。低いCT値で表されるようにHCFに極めて豊富に存在する環状ＲＮＡを特異的に増幅するためにダイバージェントプライマーを用いた。Ｂ）ＣＤＲ１ａｓの真円度は、ＧＡＰＤＨの線状転写物の耐性より１０倍高いエキソヌクレアーゼ処理に対する耐性によって証明された。Ｃ）初代ＨＣＦにおけるｍｉＲ−６７１−５ｐの過剰発現の後のｑＲＴ−ＰＣＲ（１８Ｓ  ｒＲＮＡに対して正規化）によるｍｉＲ−６７１−５ｐターゲティングＣＤＲ１ａｓの検証。データは、３回重複して行った２〜４の独立した測定の平均として示され、平均±ＳＥＭとして表される。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。これは実施例１３に記載される。
【図２１−２】図２１−１の説明を参照のこと。
【図２２−１】ヒト心臓線維芽細胞における環状ＲＮＡ  ＣＤＲ１ａｓの発現レベル。環状ＲＮＡ  ＣＤＲ１ａｓは、ＨＣＦ中の同定された抗線維化化合物での処理の後に増加する。ＣＤＲ１ａｓの発現レベルは、ｍｉＲ−６７１−５ｐと比較して反対のパターンに従って、ＤＭＳＯ対照と比較して、ブファリン、ギトキシゲニン、リコリン、アニソマイシンおよびゲルダナマイシンでの処理により初代ＨＣＦにおいて増加する。それぞれの化合物は、ｑＲＴ−ＰＣＲ（１８Ｓ  ｒＲＮＡに対して正規化）を介して検証した。データは、３回行った３回の独立した測定の平均として表し、平均±ＳＥＭとして表す。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。これは実施例１４に記載される。
【図２２−２】図２２−１の説明を参照のこと。
【図２２−３】図１７−１の説明を参照のこと。
【図２３−１】ＣＤＲ１  ｍＲＮＡに対するｍｉＲ−６７１−５ｐの効果のインビトロ研究。ＣＤＲ１ａｓの反対の鎖にコードされるＣＤＲ１  ｍＲＮＡは、ＨＣＦ中の同定された抗線維化化合物での処理の後、ｍｉＲ−６７１−５ｐに一致せずに変化する。ＣＤＲ１  ｍＲＮＡの発現レベルは、ＤＭＳＯ対照と比較して、ブファリン、ギトキシゲニン、リコリン、アニソマイシンおよびゲルダナマイシンでの処理により、初代ＨＣＦにおけるｍｉＲ−６７１−５ｐまたはＣＤＲ１ａｓと独立して変化する。ＣＤＲ１  ｍＲＮＡの発現レベルは、前記処理の際に初代ＨＣＦにおいて減少する。それぞれの化合物を、qRT-PCR（GAPDHに対して正規化）を介して検証した。データは、３回行った３回の独立した測定の平均として表し、平均±ＳＥＭとして表す。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。これは実施例１５に記載される。
【図２３−２】図２３−１の説明を参照のこと。
【図２３−３】図２３−１の説明を参照のこと。
【図２４】ＣＤＲ１ａｓのサイレンシングのインビトロ研究。ＣＤＲ１ａｓは抗線維化環状ＲＮＡである：ｓｉｓｉＲＮＡ−ケミストリーによるＣＤＲ１ａｓの鎖特異的サイレンシングは、代表的なウエスタンブロット（GAPDHに対して正規化）に示されるように初代HCFにおける細胞外マトリックス成分Ｃｏｌｌａｇｅｎ１ａ１の発現レベルの増加をもたらす。データは、３回行った１回の実験の平均として表し、平均±ＳＤとして表す。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。これは実施例１４に記載される。
【図２５】ｍｉＲ−６７１−５ｐの直接の標的としてのセレンタンパク質のインビトロ研究。セレノプロテインＰは、ｍｉＲ−６７１−５ｐの別の直接的な標的である。Ａ）ヒトにおけるセレノプロテインＰ標的領域およびｍｉＲ−６７１−５ｐの予測される結果として生じる対（www.targetscan.org/vert_71/）。Ｂ）ｍｉＲ−６７１−５ｐの過剰発現の後にルシフェラーゼ活性およびｑＲＴ−ＰＣＲ（１８Ｓ  ｒＲＮＡに対して正規化）によってアッセイされたセレノプロテインＰを標的とするｍｉＲ−６７１−５ｐの検証。データは、３回行った２〜３回の独立した測定の平均として表し、平均±ＳＥＭとして表す。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。これは実施例１６に記載される。
【図２６Ａ−１】肝臓または腎臓に対するリコリンおよびブファリンのインビボ研究。リコリンおよびブファリンの投与はインビボで腎臓および肝臓の損傷の血漿マーカーにいかなる変化も引き起こさない：アンジオテンシンＩＩ誘発ＨＦのマウスモデルにおけるリコリン（Ａ）およびブファリン（Ｂ）の毒物学的評価は、腎臓および肝臓の損傷の血漿マーカーの上昇を示さない。グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）、肝臓血漿マーカーとしてのグルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）、ならびに腎臓マーカーとしてのクレアチニンおよび尿素。データは平均±ＳＥＭとして表す。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。これは実施例１７に記載される。
【図２６Ａ−２】図２６Ａ−１の説明を参照のこと。
【図２６Ｂ−１】図２６Ａ−１の説明を参照のこと。
【図２６Ｂ−２】図２６Ａ−１の説明を参照のこと。
【図２７Ａ−１】肝臓または腎臓に対するアニソマイシンおよびギトキシゲニンのインビボ研究。アニソマイシンおよびギトキシゲニンの投与は、インビボで腎臓および肝臓の損傷の血漿マーカーにいかなる変化も引き起こさない：アンジオテンシンＩＩ誘発ＨＦのマウスモデルにおけるアニソマイシン（Ａ）およびギトキシゲニン（Ｂ）の毒性評価は、腎臓および肝臓の損傷の血漿マーカーの上昇を示さない。グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）、肝血漿マーカーとしてのグルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）、ならびに腎臓マーカーとしてのクレアチニンおよび尿素。データは平均±ＳＥＭとして表す。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。これは実施例１７に記載される。
【図２７Ａ−２】図２７Ａ−１の説明を参照のこと。
【図２７Ｂ−１】図２６Ａ−１の説明を参照のこと。
【図２７Ｂ−２】図２６Ａ−１の説明を参照のこと。
【図２８】肝臓または腎臓に対するリコリンおよびブファリンのインビボ研究。ブファリンおよびリコリンの投与は、インビボで腎臓および肝臓の形態にいかなる変化も引き起こさない：アンジオテンシンＩＩ誘発ＨＦのマウスモデルにおけるブファリンおよびリコリンの毒性学的評価は、腎臓（Ａ）および肝臓（Ｂ）のそれぞれにおいて、壊死、炎症またはいずれの形態的変化も引き起こさない。手術後１４日目に、腎臓および肝臓をヘマトキシリンおよびエオシン（ＨＥ）ならびに過ヨウ素酸−シッフ（ＰＡＳ）染色で組織学的評価にかけた（１群あたりｎ＝２〜４）。各グループの代表的な画像が示される。これは実施例１７に記載される。
【図２９】肝臓または腎臓に対するリコリンおよびブファリンのインビボ研究（治療的アプローチ）。ブファリンおよびリコリンの投与は、マウスにおいてインビボで腎臓および肝臓の形態にいかなる変化も引き起こさない：高血圧誘発ＨＦのマウスモデルを用いた治療アプローチにおけるブファリンおよびリコリンの毒性学的評価は、腎臓（Ａ）および肝臓（Ｂ）のそれぞれにおいて、壊死、炎症またはいかなる形態変化も引き起こさない。手術後８週目に、腎臓および肝臓を、ヘマトキシリンおよびエオシン（ＨＥ）ならびに過ヨウ素酸−シッフ（ＰＡＳ）染色（１群あたりｎ＝４）による組織学的評価にかけた。各グループの代表的な画像が示される。これは実施例１８に記載される。
【図３０】インビボでのブファリンおよびリコリンの心筋および血漿濃度の評価。ブファリンおよび特にリコリンは、それぞれの有効量での注射後の（Ｂ）血漿と比較して（Ａ）心筋層においてより高いレベルであることによって証明されるように、心臓によって効果的に取り込まれる。これは実施例１９に記載される。
【図３１】インビトロでのブファリンおよびリコリンの化学誘導体のスクリーニング。ヒト心臓線維芽細胞（ＨＣＦ）の増殖に対するブファリン（誘導体３、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８および２５）およびリコリン（誘導体１、２、４、１５、１９、２０、２１、２２、２３、２４、および２６）（１０μＭ）の２６種の化学誘導体の効果。溶媒対照はＤＭＳＯを指す。これは実施例２０に記載される。
【図３２Ａ】ブファリンおよびその類似体。Ａ）ブファリン構造が示される。Ｂ）ブファリン類似体の構造が示される。アグリコン類似体のみが（Ｂ）に示される。
【図３２Ｂ−１】図３２Ａの説明を参照のこと。
【図３２Ｂ−２】図３２Ａの説明を参照のこと。
【図３２Ｂ−３】図３２Ａの説明を参照のこと。
【図３２Ｂ−４】図３２Ａの説明を参照のこと。
【図３３Ａ】ギトキシゲニンおよびその類似体。Ａ）ギトキシゲニン構造が示される。Ｂ）ギトキシゲニン類似体の構造、およびジギトキシゲニン類似体の構造が示される。アグリコン類似体のみが（Ｂ）に示される。
【図３３Ｂ−１】図３３Ａの説明を参照のこと。
【図３３Ｂ−２】図３３Ａの説明を参照のこと。
【図３３Ｂ−３】図３３Ａの説明を参照のこと。
【図３３Ｂ−４】図３３Ａの説明を参照のこと。
【図３３Ｂ−５】図３３Ａの説明を参照のこと。
【図３３Ｂ−６】図３３Ａの説明を参照のこと。
【図３３Ｂ−７】図３３Ａの説明を参照のこと。
【図３３Ｂ−８】図３３Ａの説明を参照のこと。
【図３４Ａ】リコリンおよびその類似体。Ａ）リコリン構造が示される。Ｂ）リコリン類似体の構造が示され。
【図３４Ｂ−１】図３４Ａの説明を参照のこと。
【図３４Ｂ−２】図３４Ａの説明を参照のこと。
【図３５Ａ】アニソマイシンおよびその類似体。Ａ）アニソマイシン構造が示される。Ｂ）アニソマイシン類似体の構造が示される。
【図３５Ｂ−１】図３５Ａの説明を参照のこと。
【図３５Ｂ−２】図３５Ａの説明を参照のこと。
【図３６Ａ】ゲルダナマイシンおよびその類似体。Ａ）ゲルダナマイシン構造が示される。Ｂ）ゲルダナマイシン類似体の構造が示される。
【図３６Ｂ−１】図３６Ａの説明を参照のこと。
【図３６Ｂ−２】図３６Ａの説明を参照のこと。
【図３７−１】リコリンの化学誘導体。リコリンの化学誘導体がここに示される。
【図３７−２】図３７−１の説明を参照のこと。
【図３８−１】ブファリンの化学誘導体。ブファリンの化学誘導体がここに示される。
【図３８−２】図３８−１の説明を参照のこと。
【図３８−３】図３８−１の説明を参照のこと。
【図３９】非心臓線維芽細胞に対するブファリンおよびリコリンのインビトロ評価。リコリンの増殖抑制効果の用量依存性は、（Ａ）ラット腎線維芽細胞株ＮＲＫ４９Ｆにおいて明らかであり、他方、ブファリンは（Ｄ）初代ヒト肺線維芽細胞（HPF）の増殖を強力に抑制した。ＤＭＳＯは対照として参照される。データは平均±ＳＥＭとして表す。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。これは実施例２１に記載される。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
発明の詳細な記載
本発明の目的は、線維症を予防または治療する方法における使用のための化合物を供することである。
【００２９】
最大の化学的多様性のために選択された４８０種の天然の化合物の機能的なスクリーニングを、ｍｉＲＮＡの発現の変化をもたらす化合物を確認するために、初代ヒト心臓線維芽細胞（ＨＣＦ）においてインビトロで行った。このスクリーニングで得られたヒットを、ＢｒｄＵ−ＥＬＩＳＡによって測定されるように用量依存的にＨＣＦの増殖を減少させるそれらの能力についてさらに試験し、５つの最も成功した化合物ブファリン、ギトキシゲニン、リコリン、アニソマイシンおよびゲルダナマイシンを得た。次に、拡張期心不全のインビボマウスモデルを用いて、化合物ブファリン、ギトキシゲニン、リコリン、アニソマイシンを試験し、これらの化合物が心臓線維症を改善することを実証した。マウスモデルを用いたインビボの治療アプローチでは、ブファリンおよびリコリンに焦点を当てた。さらに、ブファリンおよびリコリンを、肺線維芽細胞および腎線維芽細胞についても試験し、これらの化合物が肺および腎線維症も改善することを実証した。
【００３０】
ブファリンおよびギトキシゲニンは強心配糖体であり、リコリンはアルカロイドであり、アニソマイシンおよびゲルダナマイシンは抗生物質である。
【００３１】
Prassas and Diamandis（2008）によれば、強心配糖体は、癌などのさまざまなヒトの疾患においてさらに潜在的な治療的役割を果たす。さらに、強心配糖体は、虚血性脳卒中の状況において可能な治療薬としても機能し得る。データはまた、嚢胞性線維症を治療するためのこれらの化合物の潜在的な適用を明らかにしている。強心配糖体は、細胞内へのカリウムイオンの輸送および他方で細胞外へのナトリウムイオンの輸送を行うためにＡＴＰ加水分解に由来するエネルギーを使用する遍在する膜タンパク質であるＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅに結合し、それを阻害することができる天然由来化合物の多様なファミリーとして同定されている。前記Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅの阻害は、心筋細胞中のナトリウムイオンのレベルを増加させ、カルシウムレベルおよび心臓収縮力の増加をもたらす。
【００３２】
ブファリン自体はブファジエノリド（Bufadienolide）のグループに属し、中国ヒキガエル（Chinese toad）毒から単離された強心ステロイドを意味する。それは様々な悪性腫瘍に対して抗腫瘍効果を示す。インビトロで、ブファリンは、前立腺癌または白血病の癌の種類において癌細胞の増殖抑制作用および／またはアポトーシス作用を示す（Prassas and Diamandis 2008）。
【００３３】
ギトキシゲニンは構造的にカルデノリド（Cardenolides）のグループに属し、キツネノテブクロDigitalis lanataから単離される。ギトキシゲニンは抗癌活性を示すことが見いだされており、抗増殖作用を示す乳癌の癌細胞株で既に試験されている。ギトキシゲニンの「一般的な」スキャフォールドはジギトキシゲニン由来であり、それは文献中でより一般的な化合物であり、腎臓または骨髄腫の癌細胞型において抗増殖効果のような抗癌効果も示す、（Prassas and Diamandis 2008）。図３２および３３には、ブファリンおよびギトキシゲニンの類似体だけでなく、ジギトキシゲニンも示されている。活性型はアグリコンである可能性が最も高いので、これらの図はアグリコンのみを含む。ブファリン、ギトキシゲニンおよびジギトキシゲニン類似体の他に、該類似体の立体異性体も本発明において開示される。
【００３４】
リコリンは、ヒガンバナ科（Amaryllidaceae）の植物から単離される最も豊富なアルカロイドを指す。当技術分野において知られているように、リコリンは、有望な抗癌活性を有するだけでなく、他の多様な生物学的特性、たとえば、抗マラリア、抗トリパノソーマ、抗炎症、鎮痛、および嘔吐特性も有する。さらに、リコリンならびにその誘導体および類似体は、重度の急性呼吸器症候群関連コロナウイルス、単純ヘルペスウイルスおよびポリオウイルスを含むいくつかのウイルス種を阻害することもできる（Guo et al. 2016およびWang et al. 2014）。リコリンの類似体構造を図３４に示す。類似体の他に、リコリン類似体の立体異性体も本発明において開示される。
【００３５】
Grollmann（1967）によれば、アニソマイシンは、Streptomyces griseolusから単離された抗生物質であり、真核生物のタンパク質合成を阻害することができる。タンパク質合成および部分的なＤＮＡ合成は、ペプチジルトランスフェラーゼまたは８０Ｓリボソーム系の阻害によるものである。
【００３６】
Schulte et al.（1998）によれば、ゲルダナマイシンは、自然発生の抗生物質のクラスであるベンゾキノンアンサマイシンとして同定され、もとは生物Streptomyces hygroscopicusにおいて発見された。それは、ヒートショックプロテインＨｓｐ９０のコンホメーションの調節に特異的なタンパク質のアミノ末端におけるＡＴＰ／ＡＤＰ結合部位に結合することにより、Ｈｓｐ９０の阻害剤として機能する。Ｈｓｐ９０は、ベンゾキノンアンサマイシン成分を示す薬物によってのみ結合され得る。アニソマイシンおよびゲルダナマイシンの類似体を図３５および３６に示す。類似体の他に、アニソマイシンおよびゲルダナマイシン類似体の立体異性体も本発明において開示される。
【００３７】
上述のように、抗線維化化合物を同定するインビトロの方法を本発明において用いた。第一に、４８０種の天然化合物の機能的スクリーニングを、初代ヒト心臓線維芽細胞（ＨＣＦ）中でインビトロにおいて行い、５つの最も成功した化合物ブファリン、ギトキシゲニン、リコリン、アニソマイシンおよびゲルダナマイシンを得た。次に、ＨＣＦを、ブファリン、ギトキシゲニン、リコリン、アニソマイシンまたはゲルダナマイシンからなる群から選択される有効量の化合物と接触させた。ここで、試験化合物の量は該化合物に対して０．０５μＭ〜２０μＭであった。該化合物の有効量は、０．０５、０．１０、０．１５、０．２０、０．２５、０．３０、０．３５、０．４０、０．４５、０．５０、０．５５、０．６０、０．６５、０．７０、０．７５、０．８０、０．８５、０．９０、０．９５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２．０、１２．５、１３．０、１３．５、１４．０、１４．５、１５．０、１６．０、１７．０、１８．０、１９．０および２０．０である。該化合物の有効量は０．１μＭ〜１０μＭである。好ましくは、有効量は、ブファリン、ギトキシゲニン、アニソマイシンまたはゲルダナマイシンについて、０．１μＭ、好ましくは１μＭ、より好ましくは１０μＭである。リコリンについては、好ましい有効量は、１μＭ、好ましくは５μＭ、より好ましくは１０μＭである。異なる濃度の前記化合物を、それらがHCFの増殖を減少させる能力について試験した。各化合物の最も有効な量は１０μＭである（図１を参照）。さらに、化合物、特にブファリンおよびリコリンを腎線維芽細胞および肺線維芽細胞について試験した。リコリンは、腎線維芽細胞の増殖を有意に阻害するが、肺線維芽細胞の増殖も有意に阻害することが示された。さらに、ブファリンは、肺線維芽細胞の増殖のみを有意に阻害する。ここで、リコリンおよびブファリンの最も効果な量は１０μＭである（図３９を参照）。
【００３８】
第二に、ブファリン、ギトキシゲニン、リコリンおよびアニソマイシンから選択される化合物は、Ａｎｎｅｘｉｎ−７ＡＡＤ染色によって確認される細胞死を誘導することによってその効果を発揮しないことが見出された。さらに、細胞外マトリックス成分Ｃｏｌｌａｇｅｎ１ａ１の発現レベルは、定量的リアルタイムＰＣＲおよびウエスタンブロットにより処理条件下でより低いことが観察された。当業者に既知の標準的技術を定量的リアルタイムＰＣＲ、ＰＣＲおよびウエスタンブロットに用いた。
【００３９】
さらに、心筋細胞株ＨＬ−１の増殖に対する効果は検出することができず、前記化合物の線維芽細胞特異的な効果を示した（図２〜５参照）。
【００４０】
上記の知見に加えて、本発明は、リコリン、ブファリン、ギトキシゲニン、アニソマイシン、およびゲルダナマイシン、ならびにそれらの塩、類似体および誘導体を含む群から選択される少なくとも１つの化合物を用いて、線維症、好ましくは心臓線維症、肺線維症および／または腎臓線維症、より好ましくは心臓線維症を予防または治療する方法も供する。
【００４１】
インビトロのデータのインビボでの確認のために、高血圧および心臓リモデリングを引き起こすホルモンであるアンジオテンシンＩＩを伴うミニポンプの移植を介してＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて心臓リモデリングを誘導し、前記化合物を２連続週の間、１日おきに腹腔内注射した（図６を参照）。心臓リモデリングを誘導するためのこの技術は当業者に知られており、全ての非ヒト哺乳動物において行うことができる。
【００４２】
非ヒト哺乳動物における心臓リモデリングの誘導の後、有効量の前記試験化合物を、２週間の期間にわたって１日おきに、任意に連続２週間にわたって、該非ヒト哺乳動物に適用した。前記化合物の投与は、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間または８週間にわたって、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月または６ヶ月を通して、行うこともできる。有効量は、０．００５ｍｇ／ｋｇ超、好ましくは０．００５ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇである。前記化合物の有効量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１０  ｍｇ／ｋｇである。ブファリンの有効量は、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１  ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．５ｍｇ／ｋｇである。ギトキシゲニンの有効量は、０．００５ｍｇ／ｋｇ〜０．０５  ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．０１ｍｇ／ｋｇである。リコリンの有効量は、１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは４．５ｍｇ／ｋｇである。アニソマイシンの有効量は、５ｍｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１０ｍｇ／ｋｇである。
【００４３】
上述の試験した試験化合物は、心エコー評価によって証明された心機能の寛解も誘導する（図７および９参照）。さらに、心臓の組織学的切片におけるコラーゲン染色は、前記化合物での処理により線維症発達の顕著な減少を明らかにした（図８および１０参照）。
【００４４】
さらに、実施例１７に記載された実験は、アンジオテンシンＩＩ誘発ＨＦのマウスモデルにおける前記化合物の投与が、腎臓および肝臓の損傷の血漿マーカーにおいても（図２６および２７参照）、該化合物の適用後の２つの臓器の形態においても（図２８および２９参照）、いかなる変化も誘発しなかったことを示す。これは、線維症の治療のためのｍｉＲＮＡ−６７１−５ｐの阻害の毒性学的評価の最初の有望なデータを提供する。
【００４５】
さらに、好ましい化合物リコリンおよびブファリンを用いてインビボでの治療研究を行った（図１１および実施例５参照）。これらの化合物、特にリコリンは、心臓によって効果的に取り込まれ、それは、その化合物の注射後に血漿と比較して心筋中のより高いレベルによって証明される、（図３０参照）。
【００４６】
治療剤として試験されたブファリンおよびリコリンは、マウスの拡張期心不全において、それらでの処置により、心臓線維症のさらなる発達（進行）を防ぐことが見いだされた。特に、ブファリンは、心臓のグローバルおよび拡張期の機能の両方を有意に改善することが示された（図１２参照）。さらに、ブファリンおよびリコリンはまた、全身性高血圧によって誘発される左心室の受動的な硬化度を低下させることによって、アンギオテンシンＩＩ注入時にマウス心臓の左心室コンプライアンスを回復させる（図１３参照）。
【００４７】
特に、アンジオテンシンＩＩ誘発心臓線維性疾患のマウスモデルにおいて、拡張期の組織運動の速度を回復するとともに長軸方向グローバルストレイン（ＧＬＳ）を回復するブファリンに注目が集まった（図１４および１５参照）。
【００４８】
結論として、ブファリン、ギトキシゲニン、リコリン、アニソマイシンまたはゲルダナマイシン、ならびにそれらの塩、類似体および誘導体からなる群から選択される化合物は、対象において線維症、好ましくは心臓線維症、肺線維症および／または腎臓線維症、より好ましくは心臓線維症を予防または治療する方法において抗線維化化合物として用いることができる。
【００４９】
対象は、本明細書中に定義されるような任意の対象、好ましくはヒト対象であり得る。対象は、好ましくは、前記化合物の投与を必要とする。
【００５０】
線維症を予防または治療する方法において用いるためのｍｉＲ−６７１−５ｐの阻害剤の誘導体もまた本発明において考慮され、ここで、阻害剤は、リコリン、ブファリン、ギトキシゲニン、アニソマイシンおよびゲルダナマイシンの群から選択される。
【００５１】
ブファリンおよびリコリンの誘導体が本発明において好ましい。特に、リコリンの誘導体は、Ａｍｂ２４０５１７７５、セファロタキサン（Cephalotaxine）、ジヒドロリコリン（Dihydrolycorine）、シュードリコリン（Pseudolycorine）、ホモハリントニン（Homoharringtonine）、リコベタイン（Lycobetaine）、Ａｍｂ２４１７９４７３、Ｎ−メチル−ナルタジン（N-methyl-Nartazine）、アルファ−ジヒドロリコリン（alpha-Dihydrolycorine）、Ｎ−メチル−リコリン（N-methyl-lycorine）、およびガランチン（Galanthine）からなる群から選択されるものが好ましい（図３７参照）。ブファリンの誘導体は、アレノブファジン３−ヘミスベレート（Arenobufagin 3-hemisuberate）、ペリプロゲニン（Periplogenin）、ペリプロゲニン３−［Ｏ−ベータ−グルコピラノシル−（１−４）−ベータ−サルメントピラノシド］（Periplogenin3-[O-beta-glucopyranosyl-(1-4)-beta-sarmentopyranoside]）、ラナトシドＣ（lanatoside C）、シノブファタリン（Cinobufotalin）、アレノブファジン（Arenobufagin）、シノブファジン（Cinobufagin）、ペリプロシン（Periplocin）、シラリジンＡ（Scillaridin A）、ブフォゲニンＢ（Bufogenin B）、ブファレノゲニン（Bufarenogenin）、ブフォゲニン（Bufogenin）、ガマブフォタリン（Gamabufotalin）、ブフォタリン（Bufotalin）、デアセチルシノブファジン（Deacetylcinobufagin）からなる群から選択されるものも好ましい（図３８を参照）。本発明の誘導体は、その増殖がブファリンおよびリコリン自体によって防止されるように、ＨＣＦの増殖を防止することができる（図３１を参照）。好ましくは、リコリン誘導体であるホモハリントニン（図３１のＮｏ．１９）は、ＨＣＦの増殖を最も防止する。したがって、本発明のｍｉＲ−６７１−５ｐの阻害剤だけでなく、該阻害剤の誘導体も、線維症、好ましくは心臓線維症、肺線維症および／または腎臓線維症、より好ましくは心臓線維症を予防または治療するための方法において使用するためのものである。
【００５２】
さらに、心臓線維症ばかりでなく、肺線維症および／または腎線維症も、本発明の阻害剤によって予防または治療されることが示された。好ましくは、リコリンおよび／またはブファリンは、腎臓および肺の線維芽細胞の増殖を阻害する（図３９参照）。したがって、本発明は、リコリン、ブファリン、ギトキシゲニン、アニソマイシンおよびゲルダナマイシン、ならびにそれらの塩、類似体および誘導体からなる群から選択されるｍｉＲ−６７１−５ｐの阻害剤が線維症を予防または治療できることを実証する。
【００５３】
（表１）ブファリンおよびリコリンの誘導体の概要（実施例２０および図３１を参照）。
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【００５４】
線維症の間、異なるｍｉＲＮＡが疾患特異的バイオマーカーとして重要であり、疾患の間の線維化段階が増加するにつれて上方または下方制御される。
【００５５】
したがって、本発明のさらなる態様は、同定された化合物の抗線維化能力の根底にあるメカニズムの研究であった。この点に関して、研究者らは、ＨＣＦにおけるＲＮＡディープシークエンシングを介したｍｉＲＮＡプロファイリングアプローチを行った（図１６参照）。ｑＰＣＲにより、ｍｉＲ−６７１−５ｐは前記試験化合物によって下方制御されることが見出され、このことは線維症発達におけるその潜在的な重要性を強調する（図１７参照）。
【００５６】
特に、ここでは、フォワード鎖上の染色体７、１５１、２３２、４９９〜１５１、２３８、８２７に位置するｍｉＲ−６７１−５ｐと呼ばれるヒトｍｉＲＮＡに焦点を当てる。その成熟ｍｉＲＮＡ配列は以下の通りである：
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。すでに述べたように、Murakami et al. (2012)によれば、ｍｉＲ−６７１−５ｐは肝線維症において役割を果たすことが知られている。また、Schulte et al. (2015)およびVegter et al. (2016)によれば、ｍｉＲ−６７１−５ｐは心血管疾患、主に心不全において役割を果たす。しかしながら、心臓線維症におけるｍｉＲ−６７１−５ｐレベルの上昇の有病率は先行技術において報告されていない。本発明に至った実験において、ハイスループットｍｉＲＮＡ配列決定を、ヒト心臓線維芽細胞（ＨＣＦ）において行った。ここでは、ｍｉＲ−６７１−５ｐの特異的阻害剤である抗線維化化合物ブファリンでの処理により、ほぼ５０個のｍｉＲＮＡが、促進性（ｐｒｏ−）または抗（ａｎｔｉ−）線維化ｍｉＲＮＡのいずれかと考えられると調査された（図１６参照）。HCFにおいて調査したこれらのｍｉＲＮＡは以下の通りである：ｈｓａ−ｍｉＲ−７９７４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６４８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２８−１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ−１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６０５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６７１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２６−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９６−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４０９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６７１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ−１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１１８５−１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３４３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７７０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６７５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１８−１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７９７７、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４４３。試験したｍｉＲＮＡのうち、３３のｍｉＲＮＡが、潜在的に線維化促進性（ｐｒｏ−ｆｉｂｒｏｔｉｃ）であると考えられる。ここでは、それらのｍｉＲＮＡは、ブファリンでの処理の後にHCFにおいて下方制御される。図１６に示すこれらのｍｉＲＮＡは次の通りである：ｈｓａ−ｍｉＲ−７９７４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６４８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２８−１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ−１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６０５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６７１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２６−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９６−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４０９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６７１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ−１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１１８５−１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３４３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ−３ｐ。
【００５７】
（表２）ハイスループットｍｉＲＮＡ配列決定を用いてＨＣＦのｍｉＲＮＡ発現が観察された４７の成熟ｍｉＲＮＡ配列（実施例９参照）。
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【００５８】
本発明者らはまた、驚くべきことに、ｍｉＲ−６７１−５ｐが初代ＨＣＦにおいて線維症および炎症を制御することを見出した。これは、該ｍｉＲＮＡの過剰発現の後、線維症（α−平滑筋アクチン、α−ＳＭＡおよび結合組織成長因子、ＣＴＧＦ）ならびに炎症（インターロイキン−６、ＩＬ−６およびインターロイキン−８、ＩＬ−８）のマーカーがＨＣＦ中で活性化されたことを試験することによって見出された（図１８参照）。さらに、ｍｉＲ−６７１−５ｐの過剰発現は、ＨＣＦの遊走も増強する（図１９参照）。これらのデータは、ｍｉＲ−６７１−５ｐが線維化促進性であると考えることができることを意味する。
【００５９】
さらに、ｍｉＲ−６７１−５ｐは心不全の様々なマウスモデルにおいて活性化されるだけでなく、ヒト大動脈弁狭窄症患者の心臓組織においても活性化されることが示された。これは、このｍｉＲＮＡの調節の潜在的な治療的関連性を強調する（図２０参照）。
【００６０】
さらに、本発明には、異なるウェブベースのバイオインフォマティクス標的予測ツールを用いることによるｍｉＲ−６７１−５ｐの潜在的な標的の同定が考慮される。ｍｉＲ−６７１−５ｐは、ＨＣＦに極めて豊富に存在する環状ＲＮＡ  ＣＤＲ１ａｓ、ならびに標的領域のｍｉＲ−６７１−５ｐへの結果的な対合に起因するさらなる標的としてのセレノプロテインＰを標的とすることが見出された（図２１および図２０参照）。
【００６１】
ＣＤＲ１ａｓ、および同じゲノム遺伝子座上の反対の鎖にコードされるｍＲＮＡのレベルの評価をインビトロで研究した。ＣＤＲ１ａｓレベルは、抗線維化物質での処理の後にＨＣＦにおいて増加することが見出された（図２２参照）。他方、ＣＤＲ１  ｍＲＮＡレベルは、該化合物での処理の後にＨＣＦにおいて減少した（図２３参照）。
【００６２】
ＣＤＲ１ａｓは、ｍｉＲＮＡのアンタゴニストとして機能し得、ヒトＣＤＲ１（遺伝子）座に対するアンチセンスゲノムにおいてコードされる（したがってＣＤＲ１ａｓという名前）。セレノプロテインは、セレノシステイン（Ｓｅ−Ｃｙｓ）アミノ酸残基を含む任意のタンパク質であり、抗線維化能力を有すると考えられることが十分に確立されている。
【００６３】
さらに、ＣＤＲ１ａｓは、初代ＨＣＦにおける細胞外マトリックス成分Ｃｏｌｌａｇｅｎ１ａ１の発現レベルの増加をもたらすｓｉｓｉＲＮＡ−ケミストリーにより、ＣＤＲ１ａｓのサイレンシングのためにｍｉＲ−６７１−５ｐの抗線維化標的であることが発見された（図２４を参照）。
【００６４】
したがって、本発明は、線維症、好ましくは心臓線維症、肺線維症および／または腎臓線維症、より好ましくは心臓線維症を予防または治療する方法における使用のためのＣＤＲ１ａｓのアクティベーターをさらに包含する。これに関連して、アクティベーターは、リコリン、ブファリン、ギトキシゲニン、アニソマイシンおよびゲルダナマイシン、ならびにそれらの塩、類似体および誘導体からなる群から選択される。好ましくは、アクティベーターはブファリンであり、より好ましくは、アクティベーターはリコリンである。
【００６５】
また、投与あたりの前記試験化合物の治療的に有効な量は、前記化合物について、少なくとも０．１μＭ、または０．１μＭ超かつ５０μＭ未満、または０．５μＭ〜１０μＭ、または１μＭ〜５μＭ、好ましくは１μＭである。試験化合物の量は、少なくとも０．５μＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、または少なくとも１０μＭである。ブファリン、アニソマイシン、ギトキシゲニンおよび／またはゲルダナマイシンの量は、０．５〜１０μＭ、または０．５μＭ〜５μＭ、好ましくは０．５μＭ、０．６μＭ、０．７μＭ、０．８μＭ、０．９μＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭおよび／または５μＭ、より好ましくは１μＭである。リコリンの量は、０．５〜２０μＭ、または０．５μＭ〜１０μＭ、好ましくは０．５μＭ、０．６μＭ、０．７μＭ、０．８μＭ、０．９μＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭおよび／または１０μＭ、より好ましくは５μＭである。
【００６６】
この特定の知見は、ブファリン、ギトキシゲニン、リコリン、アニソマイシンおよびゲルダナマイシンからなる群から選択される天然の化合物の別の単一の特徴と考えることができる。
【００６７】
まとめると、ｍｉＲ−６７１−５ｐはその直接的な抗線維化標的である環状ＲＮＡ  ＣＤＲ１ａｓおよびセレノプロテインＰを介して線維症および炎症を制御する。
【００６８】
したがって、本発明は、線維症を予防または治療する方法に使用するためのｍｉＲ−６７１−５ｐの阻害剤を供する。
【００６９】
この特定の発見、すなわちｍｉＲ−６７１−５ｐの阻害は、ブファリン、ギトキシゲニン、リコリン、アニソマイシンおよびゲルダナマイシンからなる群から選択される全ての天然化合物について観察された。
【００７０】
本発明は、線維症を予防または治療する方法における使用のためのｍｉＲ−６７１−５ｐの阻害剤も想定し、ここで、該使用は、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、または約２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月の期間にわたって、あるいは、半年および／もしくは１年よりもさらに長い期間にわたって、１日おきに阻害剤を投与することを含む。好ましくは、前記阻害剤は、２週間の間、好ましくは連続した２週間にわたって投与される。
【００７１】
前記阻害剤の投与は、注射または注入により、好ましくは注射により行われる。阻害剤の投与は、腹腔内、静脈内、皮下、筋肉内または経口的に、好ましくは腹腔内に行われる。
【００７２】
組成物が注入により投与される場合、それは無菌の薬学的等級の水または食塩水を含む注入ボトルで分配され得る。組成物が注射によって投与される場合、その成分が投与前に混合され得るように、注射用の滅菌水または生理食塩水のアンプルが供され得る。阻害剤は注射するのが好ましい。この注射は腹腔内投与される。
【００７３】
本発明は、阻害剤を含めて用いることができるキットも供する。キットは、ｍｉＲ−６７１−５ｐの阻害剤を含み、線維症を効果的に予防または治療するために十分な量のｍｉＲ−６７１−５ｐの阻害剤を含む。
【００７４】
一実施形態では、キットは、本発明の薬学的組成物を充填した１つまたは複数の容器を含む。さらに、線維症、好ましくは心臓線維症、肺線維症および／または腎臓線維症、より好ましくは心臓線維症の治療のために有用な１つまたは複数の追加の予防薬または治療薬も薬学的パックまたはキットに含めることができる。
【００７５】
本発明はさらに、線維症を予防または治療するための化合物を同定するためのインビトロの方法を包含する。抗線維化化合物の治療の前および後にハイスループットｍｉＲＮＡ配列決定を行った。ｍｉＲ−６７１−５ｐを一般的な標的として用いた（図１７参照）。
【００７６】
第一に、インビトロの方法は、線維症を起こしている細胞中のｍｉＲ−６７１−５ｐの量を測定し、第二に、その線維症を起こしている細胞を試験化合物と接触させ、第三に、２番目のステップの後の線維化細胞中のｍｉＲ−６７１−５ｐの量を、１番目のステップで測定したｍｉＲ−６７１−５ｐの量と比較することを含む。ここで、ｍｉＲ−６７１−５ｐレベルの減少は、試験化合物が線維症を予防または治療するための化合物であることを示す。
【００７７】
実施例１０に記載される実験は、ｍｉＲ−６７１−５ｐの発現レベルが、ＤＭＳＯ対照と比較して、リコリン、ブファリン、ギトキシゲニン、アニソマイシンおよびゲルダナマイシンでの処理により初代ＨＣＦにおいて減少することを示す。
【００７８】
これに関連して、投与あたりの試験化合物の量は、少なくとも０．１μＭである。投与あたりの試験化合物の量は、０．１μＭ、０．２μＭ、０．３μＭ、０．４μＭ、０．５μＭ、０．６μＭ、０．７μＭ、０．８μＭ、０．９μＭおよび／または１μＭである。投与あたりの試験化合物の量は、少なくとも０．５μＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、または少なくとも１０μＭである。投与あたりの前記試験化合物の量は５０μＭ未満である。投与あたりの前記試験化合物の量は、５０μＭ、４５μＭ、４０μＭ、３５μＭ、３０μＭ、２５μＭ、２０μＭ、１５μＭ、１０μＭである。投与あたりの前記試験化合物の量は、前記化合物に対して、０．１μＭ超もしくは５０μＭ未満、または０．５〜１０μＭ、または１μＭ〜５μＭ、好ましくは１μＭである。特に、ブファリン、アニソマイシン、ギトキシゲニンおよび／またはゲルダナマイシンの治療有効量は、０．５〜１０μＭ、または０．５μＭ〜５μＭ、好ましくは０．５μＭ、０．６μＭ、０．７μＭ、０．８μＭ、０．９μＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭおよび／または５μＭ、より好ましくは１μＭである。リコリンの治療有効量は、０．５〜２０μＭ、または０．５μＭ〜１０μＭ、好ましくは０．５μＭ、０．６μＭ、０．７μＭ、０．８μＭ、０．９μＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭおよび／または１０μＭ、より好ましくは５μＭである。
【００７９】
一態様では、上記のインビトロの方法のために用いられる線維症を起こしている細胞は、心臓細胞、肺細胞、肝細胞、腎臓細胞、腸細胞、骨格筋細胞または真皮細胞、好ましくはヒト心臓線維芽細胞（ＨＣＦ）、腎臓線維芽細胞、および／または初代肺線維芽細胞（ＨＰＦ）、より好ましくはヒト心臓線維芽細胞（ＨＣＦ）であり得る。
【００８０】
結論として、本発明は、線維症を予防または治療する方法における使用のためのｍｉＲ−６７１−５ｐの阻害剤を供する。ここで、その阻害剤は、リコリン、ブファリン、ギトキシゲニン、アニソマイシンおよびゲルダナマイシン、ならびにそれらの塩、類似体および誘導体からなる群から選択される。好ましくは、阻害剤はブファリンであり、より好ましくは、阻害剤はリコリンである。好ましい実施形態において、ブファリンおよびリコリンは本発明の好ましい阻害剤である。
【００８１】
線維症の治療的適用のための薬物の製造のためのｍｉＲ−６７１−５ｐの阻害剤の使用が、本発明によりさらに供される。好ましくは、その阻害剤は、リコリン、ブファリン、ギトキシゲニン、アニソマイシン、ゲルダナマイシン、ならびにそれらの塩、類似体および誘導体からなる群から選択される。
【００８２】
さらに、有効量のｍｉＲ−６７１−５ｐの阻害剤をそれを必要とする対象に投与することを含む線維症を予防または治療する方法も本発明により考慮される。好ましくは、その阻害剤は、リコリン、ブファリン、ギトキシゲニン、アニソマイシン、ゲルダナマイシン、ならびにそれらの塩、類似体および誘導体からなる群から選択される。対象は、本明細書に定義されるような任意の対象であり得る。対象は好ましくは投与を必要とする。
【００８３】
定義：
「線維症」という用語は、修復過程または反応過程における器官または組織における過剰な線維性結合組織の形成を指し、これは、下層の器官または組織の構造および機能を破壊し得る。本明細書に用いる場合、この文脈における「線維症」は、心臓線維症、肺線維症、肝臓線維症、腎臓線維症、胃腸線維症、骨格筋線維症、全身性硬化症、多巣性線維性硬化症、骨髄移植レシピエントにおける強皮性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、腎性全身性線維症または皮膚線維症から選択することができる。好ましくは、線維症は心臓線維症、肺線維症および／または腎臓線維症、より好ましくは心臓線維症（特に心筋線維症）である。
【００８４】
本明細書で使用される「阻害剤」という用語は、それに結合することによって直接的に、または間接的に分子を阻害する化合物を意味する。
【００８５】
「分子」とは、任意のアミノ酸、タンパク質、任意の核酸、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡをいう。ＲＮＡは、特に、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｉｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡ、好ましくはｍｉＲＮＡであり得る。
【００８６】
「結合することによって直接的に」との用語は、前記分子のプロモーターへの化合物（たとえば阻害剤）の結合を含むであろう。これに関連して、阻害剤は、好ましくは前記分子（例えば、ｍｉＲＮＡ）に直接的に結合しない。阻害剤は、ｍｉＲＮＡ、好ましくはその標的ｍｉＲ−６７１−５ｐを間接的に阻害し、これにより、線維症、好ましくは心臓線維症、肺線維症および／または腎臓線維症、より好ましくは心臓線維症を予防または治療する方法における使用のためのｍｉＲ−６７１−５ｐの間接的な阻害剤を有する。
【００８７】
本明細書に用いる場合、用語「治療」およびその類似用語は、患者の管理およびケア、および／または疾患もしくは障害の闘いを指す。
【００８８】
本明細書に用いる場合、用語「予防する」、「予防」および「防止」は、特に疾患を発達させやすいか、または疾患を発達させる可能性があると分析されている個体において、障害または疾患の１つまたは複数の症状の再発または発症の防止を意味する。そのような分析は、たとえば、個体の体液中の特定のマーカー物質、または既知もしくは疑わしい遺伝的素因またはそのような疾患を発達させる危険性を考慮に入れることができる。
【００８９】
「化合物」または「試験化合物」との用語は、天然化合物、合成化合物または半合成化合物を指し、好ましくは、化合物は、リコリン、ブファリン、ギトキシゲニン、アニソマイシンおよびゲルダナマイシン、それらの塩、類似体およびその誘導体、ならびに前記類似体の立体異性体からなる群から選択される。これに関連して、阻害剤として機能する化合物は天然化合物を指す。
【００９０】
本明細書で使用される「強心配糖体」という用語は、心臓に対してポジティブな変力作用を有する化合物のカテゴリーを指す。一般的なクラスの化合物として、強心配糖体は、Ｃ１７にピロンまたはブテノリド置換基のいずれかを有するステロイドコアを含む（「ピロン型」および「ブテノリド型」）。さらに、強心配糖体は、Ｃ３で任意にグリコシル化され得る。グリコシル化を伴わない強心配糖体の形態は、「アグリコン」としても知られている。大部分の強心配糖体は、３β−ＯＨ基に結合した１〜４個の糖を含む。最も一般的に用いられる糖類は、Ｌ−ラムノース、Ｄ−グルコース、Ｄ−ジギトキソース、Ｄ−ジギタロース、Ｄ−ジギノース、Ｄ−サルメントース、Ｌ−バラロース、およびＤ−フルクトースを含む。一般に、糖は、強心配糖体の薬物動態に影響を及ぼすが、生物学的活性に対するその他の影響はほとんどない。
多数の強心配糖体が当技術分野において知られている。例示的な強心配糖体としては、ブファリン、ウアバイン、ジギトキシゲニン、ジゴキシン、ラナトシドＣ、ストロファンチンＫ、ウザリゲニン、デスアセチルラナトシドＡ、ジギトキシン、アセチルジギトキシン（actyl digitoxin）、デスアセチルラナトシドＣ、ストロファントシド、シラレニン、シラレンＡ、プロシラリジン、プロシラリジンＡ、ＢＮＣ−１、ＢＮＣ−４、ジギトキソース、ギトキシン、ストロファンチジオール、オレアンドリン、アコベノシドＡ、ストロファンチジンジギラノビオシド、ストロファンチジン−Ｄ−シマロシド、ジギトキシゲニン−Ｌ−ラムノシド、ジギトキシゲニンセレトシド（digitoxigenin theretoside）、ストロファンチジン（strophanthidin）、ストロファンチジン（strophanthidine）、ストロファンチジンジギラノビオシド、ストロファンチジン−Ｄシマロシド、ジゴキシゲニン、ジゴキシゲニン３，１２−ジアセテート、ギトキシゲニン、ギトキシゲニン３−アセテート、ギトキシゲニン３，１６−ジアセテート、１６−アセチルギトキシゲニン、アセチルストロファンチン、ウアバゲニン、３−エピゴキシゲニン、ネリホリン、アセチルネリホリン、セレベリン、テベンチン、ソマリン、オドロシド、ホンヘリン、デスアセチルジギラニド、カロトロピン、カロトキシン、ラナトシドＡ、ウザリン、ストロファンチジン−３β−ジギトキソシド、ストロファンチジンａ−Ｌ−ラムノピラノシド、ならびにそれらの類似体、誘導体、薬学的に許容可能な塩、および／またはプロドラッグがある。
【００９１】
本明細書で使用される「アルカロイド」という用語は、大部分が塩基性窒素原子を含有する自然発生の化合物の群を指す。アルカロイドは、細菌、真菌、植物、および動物を含む多種多様な生物によって生産される。それらは、酸−塩基抽出によりこれらの生物の粗抽出物から精製することができる。アルカロイドは、抗マラリア、抗喘息、抗癌、コリン様、血管拡張、抗不整脈、鎮痛、抗菌および抗高血糖の活性を含む広範囲の薬理活性を有する。
【００９２】
本明細書で使用される「抗生物質」という用語は、細菌を殺すかまたはその増殖を阻害することによって、細菌感染の治療および予防に用いられる抗菌薬の型を表す。抗生物質は、通常、インフルエンザウイルスなどのウイルスにポジティブな影響を与えない。抗生物質の分類は、一般的に、主に細菌の機能を標的とする、それらの作用機序、化学構造、または活性のスペクトルに基づく。抗生物質は、細胞壁（ペニシリン）もしくは細胞膜（ポリミキシン）を標的とするか、または必須の細菌酵素を妨害する。これらの抗生物質は殺菌作用を有する。タンパク質合成を目的とするもの（アニソマイシンおよびテトラサイクリン）は、通常、静菌性である。さらなるキャラクタリゼーションための別の基準は標的特異性を含む。そのような抗生物質は、限定されたスペクトルの特定の細菌または広いスペクトルの広範囲の細菌のいずれかを標的とする。
【００９３】
本明細書で使用される「非ヒト哺乳動物」という用語は、げっ歯類動物、イヌ、ネコ、霊長類動物、ウサギ、ブタおよび反芻動物からなる群、好ましくはブタ、より好ましくはマウスを指す。
【００９４】
「対象」という用語は、哺乳動物、特にヒト、非ヒト霊長類動物、げっ歯類動物、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタおよび反芻動物を指す。好ましくは、対象はヒト対象である。
【００９５】
「類似体」または「構造的類似体」という用語は、他の化合物の構造と類似の構造を有するが、特定の成分に関してそれと異なり、他の原子、基、またはサブ構造に置き換えられた、１つまたは複数の原子、官能基、またはサブ構造が異なる化合物を指す。
【００９６】
「誘導体」という用語は、化学反応によって類似の化合物から誘導される化合物を指す。これに関連して、ｍｉＲ−６７１−５ｐの阻害剤の誘導体（ここで、阻害剤は、リコリン、ブファリン、ギトキシゲニン、アニソマイシンおよびゲルダナマイシンからなる群から選択される）は、それ自体が本発明の阻害剤と類似する構造を有し、線維症を予防または治療することもできる。
【００９７】
本明細書に用いる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないと示さない限り、複数の言及を含むことに留意されたい。したがって、たとえば、「１つの（ａ）試薬」への言及は、１つまたは複数のそのような異なる試薬を含み、「その（ｔｈｅ）方法」への言及は、本明細書に記載される方法について変更または置換され得る、当業者に知られた同等の（複数の）ステップおよび方法への言及を含む。
【００９８】
特に断らない限り、一連の要素の前にある「少なくとも」という用語は、その一連の中のそれぞれの要素を指すと理解されるべきである。当業者であれば、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識し、または慣用的な実験を用いるだけで確認することができるであろう。そのような等価物は本発明に包含されることを意図する。
【００９９】
本明細書で使用される「および／または」という用語は、「および」、「または」および「この用語によって接続された要素のすべてまたは任意の他の組合せ」の意味を含む。
【０１００】
「より小さい（未満）」または「より大きい（超）」という用語は、具体的な数を含む。たとえば、２０未満は、それ未満およびそれに等しいことを意味する。同様に、「より多い」または「より大きい」（超）は、それぞれ、「より多い」もしくは「等しい」、または、「より大きい」もしくは「等しい」を意味する。
【０１０１】
本明細書およびそれに続く特許請求の範囲を通して、文脈が他を必要としない限り、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、記述された整数もしくはステップ、または整数またはステップのグループの包含を意味すると理解されるが、任意の他の整数もしくはステップまたは整数もしくはステップのグループを除外しない。本明細書に使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、用語「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」で置き換えられてもよく、または時折、本明細書で使用される場合の用語「有する」で置き換えられてもよい。本明細書で使用される場合、「からなる」は、特定されていない任意の要素、ステップ、または成分を排除する。
【０１０２】
「含む」という用語は、「含むがこれに限定されない」を意味する。「含む」および「含むがこれらに限定されない」は交換可能に用いられる。
【０１０３】
本発明は、本明細書に記載される、特定の方法論、プロトコル、材料、試薬、および物質などに限定されず、したがって多様であり得ることを理解されたい。本明細書に用いられる用語は、特定の実施形態を記述することのみを目的としており、特許請求の範囲によってのみ規定される本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【０１０４】
本明細書の本文中に引用された全ての刊行物（全ての特許、特許出願、科学刊行物、説明書などを含む）は、前掲であろうと後掲であろうと、それらの全体が引用により本明細書に組み込まれる。本明細書中のいかなるものも、本発明が先行発明のためにそのような開示に先行する権利がないことの承認として解釈されるべきではない。引用により組み込まれた資料が本明細書と矛盾するかまたは相反する限りにおいて、本明細書はそのような資料に優先する。
【０１０５】
本明細書に引用された全ての文書および特許文書の内容は、その全体が引用により本明細書に組み込まれる。
【０１０６】
本発明およびその利点のより良い理解は、例示目的のためだけに提供される以下の実施例から得られるであろう。実施例は、決して本発明の範囲を限定することを意図しない。
【実施例】
【０１０７】
以下、実施例を引用して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、それらは本発明を限定することを意図しない。
【０１０８】
実施例１：インビトロでの抗線維化天然化合物ブファリン、ギトキシゲニン、リコリン、アニソマイシンおよびゲルダナマイシンの同定。
初代ヒト心臓線維芽細胞（ＨＣＦ）におけるインビトロでの４８０種の天然由来物質の機能的スクリーニングは、ＨＣＦの増殖を阻害する化合物を明らかにする。
ＨＣＦを、０．１μＭ、１μＭおよび１０μＭのブファリン、ギトキシゲニン、アニソマイシンおよびゲルダナマイシン、ならびに１μＭ、５μＭおよび１０μＭのリコリンとともに２４時間インキュベートし、ＨＣＦの増殖をＢｒｄＵ−ＥＬＩＳＡによって測定した（図１参照）。薬物候補としての重大な欠点のため、ゲルダナマイシンは追跡調査、特にインビボ実験に含めなかった。
【０１０９】
実施例２：抗線維化化合物はインビトロで強力かつ特異的にＨＣＦに作用する。
初代ＨＣＦの増殖に対するブファリン、ギトキシゲニン、リコリンおよびアニソマイシンの用量依存的阻害効果は、ＨＬ−１の増殖に対する同濃度の前記化合物の影響がないことによって証明されるように、線維芽細胞特異的である。
ＨＣＦおよびＨＬ−１細胞を、実施例１に示したのと同じ濃度で、２４時間、ブファリン、ギトキシゲニン、リコリンおよびアニソマイシンで処理し、ＨＣＦおよび心筋細胞株ＨＬ−１細胞の増殖をＢｒｄＵ−ＥＬＩＳＡによって測定した。ＤＭＳＯを対照として示す（図２Ｂ、３Ｂ、４Ｂ、５Ｂを参照）。細胞増殖ＥＬＩＳＡは、増殖細胞におけるＤＮＡ合成中のＢｒｄＵ取り込みの測定に基づいて細胞増殖を定量するための比色分析の代替法である。ＤＮＡに組み込まれた後、ＢｒｄＵは、ＢｒｄＵに対して極めて特異的である抗体を用いることにより免疫アッセイによって検出される。最初に、ＨＣＦおよび／またはＨＬ−１細胞を、３７℃の加湿雰囲気中で１００μＬ／ウェルの最終容量で、９６ウェル中で試験物質（たとえば、マイトジェン、成長因子、サイトカイン、ならびに上述のようなブファリン、ギトキシゲニン、リコリンおよびアニソマイシンのような試験化合物等）の様々な希釈物と共に培養する。その後、１０μＬ／ウェルのＢｒｄＵ標識溶液を、１００μＬ／ウェルで培養されている細胞に添加する（最終濃度：１０μＭ  ＢｒｄＵ）。次に、細胞をさらに２〜２４時間、３７℃で再インキュベートした。次に、標識溶液を除去し、２００μＬ／ウェルのＦｉｘＤｅｎａｔを細胞に加え、１５〜２５℃で３０分間インキュベートする。次に、ＦｉｘＤｅｎａｔを除去した後、１００μＬ／ウェルの抗ＢｒｄＵ−ＰＯＤワーキング溶液を添加し、約９０分間インキュベートする。次に、抗体コンジュゲートを除去し、ウェルを２００μＬ〜３００μＬ／ウェルの洗浄溶液（ＰＢＳ、１×）で洗浄する。洗浄溶液を除去した後、１００μＬ／ウェルの基質溶液を添加し、発色が光度検出のために十分になるまで再度インキュベートする。さらに、ＨＣＦを再び、示されたように前記化合物（リコリン：５μＭ、ブファリン：１μＭ、ギトキシゲニン：１μＭおよびアニソマイシン：１μＭ）で２４時間処理し、アネキシン−７ＡＡＤ染色の後にＦＡＣＳ分析に供した（図２Ｃ、３Ｃ、４Ｃ、５Ｃを参照）。前記化合物での処理の後、アネキシン−７ＡＡＤ染色は、当業者に知られた所望の方法により、ＨＣＦにおいてアポトーシスを誘導し始める。陰性対照（誘導および染色されていない）および陽性対照（例えば、５００μＭ  Ｈ２Ｏ２または３μＭスタウロスポリン）も必要とされる。次に、ＨＣＦを含む培地をファルコンに移し、ＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理する。すべてを３００×ｇで５分間、遠心分離し、次に、上清を吸引する。ペレットを２００μｌのアネキシンレッド／７ＡＡＤワーキング溶液（１：２０、５μｌのアネキシンレッド／７ＡＡＤ＋１９５μＬの１×アッセイ緩衝液）に再懸濁し、Ｅａｓｙ  Ｃａｐ  Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに移す。３７℃で１５分間インキュベートした後、それを室温（ＲＴ）で５分間、３００×ｇで遠心分離する。次に、上清を吸引し、ペレットを２００μＬの１×アッセイ緩衝液で１回洗浄し、ＲＴで５分間、３００×ｇで再度遠心分離する。再度、上清を吸引し、ペレットを２００μＬのアネキシンレッド／７ＡＡＤワーキング溶液に再懸濁し、暗所で５分間ＲＴで再度インキュベートする。これで、サンプルはフローサイトメーター（青色および赤色レーザー）での捕捉の準備が整う。
【０１１０】
さらに、ＨＣＦを再び、前記化合物（リコリン：５μＭ、ブファリン：１μＭ、ギトキシゲニン：１μＭおよびアニソマイシン：１μＭ）で、示されたように２４時間処理し、溶解させ、代表的なウエスタンブロットにより初代ＨＣＦ中の細胞外マトリックス成分コラーゲン１ａ１タンパク質レベルについて分析した（ＧＡＰＤＨに対して正規化）。ＤＭＳＯは対照として示す（図２Ｄ、３Ｄ、４Ｄ、５Ｄ参照）。
【０１１１】
実施例３：アンジオテンシンＩＩ誘発心臓線維性疾患のマウスモデル。
拡張期心不全（ＨＦ）を、アンジオテンシンＩＩ充填ミニポンプの移植によってＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて誘発した。８〜１０週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ−バックグラウンド（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）に基づく本発明において使用した。
【０１１２】
アンジオテンシンＩＩ充填ミニポンプの移植のために、アンジオテンシンＩＩを、２週間、浸透圧ミニポンプによって適用する（ａｌｚｅｔ（登録商標）［Ｍｏｄｅｌｌ  １００１］）。推奨される用量は、１日あたり１．５または３．０ｍｇ／ｋｇである。ミニポンプを、アンジオテンシンＩＩで、または対照物質としての役割を果たす等張食塩水で、無菌条件下で充填する。移植は腹腔内注射麻酔下で行う。麻酔薬の注射後、指間反射がもはや存在しなくなるまで一定時間待つべきである。次いで、予熱した手術台にマウスを固定し、結膜の乾燥に備えてＢｅｐａｎｔｈｅｎ眼軟膏を供する。手術野は、背部の右尾側の３分の１に位置する。そこを剃毛してＢｒａｕｎｏｌで消毒した後、０．５％のリドカイン溶液で被覆する。１時間後に移植を開始することができる。皮膚を背中ラインに対して垂直に切開し、好ましくは長さは１センチメートルである。切開線から頭蓋へのポケットが皮下に形成される。この中にミニポンプを導入する。その後、皮膚を５−０プロレン糸で断続縫合で閉じる。次に、閉じた創傷を再度Ｂｒａｕｎｏｌで被覆する。低体温症を防ぐために、マウスをケージで目覚めさせ、それは３７℃の調節された温度でテラリウム加温マットの上に３分の１まで置かれている。手術は動物あたり５分である。
【０１１３】
次に、手術後２日目から始めて連続２週間の間、天然化合物（ブファリン、ギトキシゲニン、リコリン、およびアニソマイシン）を１日おきに腹腔内注射した（図６参照）。対照としてＤＭＳＯも、心臓リモデリングを誘発したＣ５７ＢＬ／６マウスに注射した。心機能を心エコーで評価し、線維症発達を、心臓の組織切片におけるピコシリウスレッドを用いたコラーゲン染色によって評価した（実施例４）。
【０１１４】
実施例４：ブファリン、リコリン、アニソマイシンおよびギトキシゲニンは、誘発された心臓線維性疾患のマウスモデルにおいて心機能および心臓線維症を有意に改善する。
天然化合物は、インビボでアンジオテンシンＩＩ誘発心臓線維性疾患のマウスモデルにおいて心機能を改善する。
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて拡張期ＨＦを誘発し、実施例３に示したように天然化合物を注射した。手術後１４日目に、マウスを前記化合物（ブファリン：０．５ｍｇ／ｋｇ、リコリン：４．５ｍｇ／ｋｇ、アニソマイシン：１０ｍｇ／ｋｇ、およびギトキシゲニン：０．０１ｍｇ／ｋｇ）で処理することにより、マウスの心機能を心エコーで評価した（１群あたりｎ＝９〜１５）。
心筋機能指数（ＭＰＩ）の低下、ならびに等容弛緩時間（ＩＶＲＴ）の減少およびＥ対Ａピーク比（Ｅ／Ａ）（心臓の左心室の機能のマーカーとしての初期（Ｅ）対後期（Ａ）心室充満速度の比）の増加は、心臓の全体（ＭＰＩ）および拡張期（ＩＶＲＴおよびＥ／Ａ）機能の両方の改善を示す（図７および図９参照）。
【０１１５】
さらに、術後１４日目に、前記化合物（ブファリン：０．５ｍｇ／ｋｇ、リコリン４．５ｍｇ／ｋｇ、アニソマイシン：１０ｍｇ／ｋｇおよびギトキシゲニン：０．０１ｍｇ／ｋｇ）での処理の後、ピクロシリウスレッドを用いて、心臓の組織切片をコラーゲンについて染色した（１群あたりｎ＝３〜５）。心臓の組織切片の代表的画像におけるコラーゲン沈着の顕著な減少、ならびにピクロシリウス染色領域の定量化は、ブファリン、リコリン、アニソマイシンおよびギトキシゲニンによる線維症発達の防止を示す（図８および１０参照）。
【０１１６】
実施例５：アンジオテンシンＩＩ誘発心臓線維性疾患のマウスモデルＩＩ。
拡張期心不全（ＨＦ）を、アンジオテンシンＩＩ充填ミニポンプの移植によってＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスにおいて誘発した（実施例３参照）。実施例３と異なり、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスに、皮下移植したミニポンプにより、３ｍｇ／ｋｇ／日で８週間、アンジオテンシンＩＩを注入した。
【０１１７】
次に、ブファリンもしくはリコリン（ＤＭＳＯに溶解）または溶媒ＤＭＳＯ単独（対照として）を、アンジオテンシンＩＩ注入の開始から２週間後に開始して、エンドポイントまで隔日で腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した（図１１参照）。
【０１１８】
実施例６：ブファリンおよびリコリンは、誘発された心臓線維性疾患のマウスモデルにおいて心機能および心臓線維症を有意に改善する。
実施例５に示したように、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて拡張期ＨＦを誘発し、ブファリンまたはリコリンを注射した。手術後８週目に、前記化合物（ブファリン：０．５ｍｇ／ｋｇ、リコリン４．５ｍｇ／ｋｇ）でマウスを処理することにより、マウスの心機能を心エコーで評価した（１群あたりｎ＝５〜１２）。
【０１１９】
心筋機能指数（ＭＰＩ）の減少（図１２Ｂ参照）ならびに等容弛緩時間（ＩＶＲＴ）の減少（図１２Ｃ参照）およびＥ対Ａピーク比（Ｅ／Ａ）（心臓の左心室の機能のマーカーとしての早期（Ｅ）対後期（Ａ）心室充満速度の比）の増加（図１２Ｄ参照）は、特にブファリンについて、心臓の全体（ＭＰＩ）および拡張期（ＩＶＲＴおよびＥ／Ａ）機能の両方の改善を示す。
【０１２０】
さらに、手術後８週目に、ブファリンまたはリコリンで処理した後、ピクロシリウスレッドを用いて心臓の組織学的切片をコラーゲンについて染色した（１群あたりｎ＝７〜１２）。心臓の組織学的切片の代表的画像におけるコラーゲン沈着の顕著な減少、およびピクロシリウス染色領域の定量化は、ブファリンまたはリコリンによる線維症発達の防止を示す（図１２Ａ参照）。
【０１２１】
実施例７：ブファリンおよびリコリンは、アンジオテンシンＩＩ注入マウス心臓の左心室コンプライアンスを回復させる。
実施例５に示したように、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて拡張期ＨＦを誘発し、ブファリンまたはリコリンを注射した。手術後８週目に、前記化合物（ブファリン：０．５ｍｇ／ｋｇ、リコリン４．５ｍｇ／ｋｇ）でマウスを処置することにより、マウスの血行動態測定を評価した（１群あたりｎ＝６〜７）。
【０１２２】
血行動態（ここでは心臓における血流の動態）測定は、侵襲的臨床血圧測定（ＭＩＬＬＡＲと呼ばれ、特に１Ｆ、ＰＶＲ−１０００、Ｍｉｌｌａｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて行われ、ブファリンおよびリコリン処置による拡張末期圧容量関係（ＥＤＰＶＲ）の有意な減少を示した。（図１３参照）。
【０１２３】
実施例８：ブファリン処置による心機能の改善。
実施例５に示したように、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて拡張期ＨＦを誘発し、ブファリンを注射した。手術の８週間後、前記化合物（ブファリン：０．５ｍｇ／ｋｇ）でマウスを処置することにより、マウスの心機能を心エコーで評価した（１群あたりｎ＝３〜６）。
【０１２４】
心エコー測定は、組織ドプラ法（ＴＤＩ）を用いて行った。これは、反射した超音波のドップラー効果（周波数シフト）によって１つまたは複数の心拍の位相を通して心臓の筋肉すなわち心筋の速度を測定する心エコーで主に用いられる医療用超音波技術を指す。（図１４を参照）。
【０１２５】
さらに、心筋の変形を、二次元スペックルトラッキングストレイン心エコーなどのストレインイメージングを用いて評価した。拡張機能障害が存在する場合に減少する、心筋の変形の尺度である長軸方向グローバルストレイン（ＧＬＳ）を図１５に示す。ＨＦｐＥＦのマウスモデル（心臓の拡張機能障害のマウスモデル）によれば、心臓の収縮機能のパラメータ、すなわち、収縮期中にどれだけの量の血液が排出されるかである駆出率（ＥＦ）は、すべての試験した群において同等のままであった（図１５も参照）。
【０１２６】
実施例９：抗線維化化合物で処理したヒト心臓線維芽細胞におけるハイスループットｍｉＲＮＡ配列決定。
ブファリンは、インビトロでＨＣＦのｍｉＲｎｏｍｅに影響を及ぼし、ＨＣＦのｍｉＲＮＡシグネチャを変化させる。
示されるように、ＨＣＦを１μＭブファリンで２４時間処理し、全ＲＮＡを単離し、ディープシーケンシングによるハイスループットｍｉＲＮＡシーケンシングプロファイリングに供した。ＤＭＳＯは対照として示す。ハイスループットｍｉＲＮＡシーケンシングを行うために、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ＴｒｕＳｅｑ（登録商標）Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ技術を用いて、当業者に知られている様々なＲＮＡ種を調製する。前記技術を考慮すると、ほとんどの既知のｍｉｃｒｏＲＮＡ分子に共通の天然構造の利点が得られる。ほとんどの成熟型ｍｉＲＮＡは、それらを形成するために用いられる細胞経路の結果として、５’−リン酸基および３’−ヒドロキシル基を有する。このため、使用されているＩｌｌｕｍｉｎａアダプターは直接かつ特異的にｍｉＲＮＡに連結される。これにより、インプットとして全ＲＮＡを用いて、後のクラスター生成のためのライブラリーが調製される。さらに、ライブラリー産物を生成するためのアダプター連結、逆転写、ＰＣＲ増幅、およびプールされたゲル精製が、当業者に知られるように適用される。
上位３０個の有意に調節解除されたｍｉＲＮＡは、ブファリン処理の後に下方制御される潜在的な線維化促進性ｍｉＲＮＡを示す。データは、３回の独立した実験からプールした三つ組を表す。代表的な実験は、同定された全ての抗線維化天然物質を用いて同じ実験を行ったことを示す（図１６参照）。
【０１２７】
実施例１０：ｍｉＲ−６７１−５ｐレベルはＨＣＦ中の同定された抗線維化化合物によって有意に減少する。
ｍｉＲ−６７１−５ｐの発現レベルは、ＤＭＳＯ対照と比較して、ブファリン、ギトキシゲニン、リコリン、アニソマイシンおよびゲルダナマイシンでの処理により、初代ＨＣＦにおいて減少する。
ＨＣＦを、ブファリン（１μＭ）、ギトキシゲニン（１μＭ）、リコリン（５μＭ）、アニソマイシン（１μＭ）、およびゲルダナマイシン（１μＭ）と共に２４時間インキュベートし、それぞれの化合物によるｍｉＲ−６７１−５ｐの下方制御（ＲＮＵ４８に対して正規化）をｑＲＴ−ＰＣＲを介して検証した。ＤＭＳＯは対照として示す。代表的な実験は、同定された全ての抗線維化天然物質を用いて同じ実験を行ったことを示す（図１７参照）。
【０１２８】
実施例１１：ｍｉＲ−６７１−５ｐは線維症および炎症を調節し、ｍｉＲ−６７１−５ｐの過剰発現はインビトロで、基本条件下およびブファリンでの処理条件下の両方でＨＣＦの遊走を増強する。
ｍｉＲ−６７１−５ｐの過剰発現は、初代ＨＣＦにおける線維症および炎症のマーカーの活性化を導く。逆に、ｍｉＲ−６７１−５ｐの阻害は、初代ＨＣＦにおける線維症および炎症の上述のマーカーの顕著な減少（１８Ｓ  ｒＲＮＡに対して正規化）を導く。
【０１２９】
そのため、ＨＣＦをｍｉＲ−６７１−５ｐ模倣物（図１８Ａ参照）および阻害剤（ｈｓａ−ｍｉＲ−６７１−５ｐに対するｍｉｒＶａｎａ（登録商標）ｍｉＲＮＡ阻害剤、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でそれぞれトランスフェクトし（図１８Ｂ参照）、４８時間後に、α−ＳＭＡ、線維症マーカーとしてのＣＴＧＦ、ならびに炎症マーカーとしてのＩＬ−６およびＩＬ−８のｍＲＮＡ発現について、ｑＲＴ−ＰＣＲによって分析した。
【０１３０】
さらに、ｍｉＲ−６７１−５ｐの過剰発現は、抗線維化ブファリンでの処理の有無にかかわらず、初代ＨＣＦの遊走を刺激する。
そのため、ＨＣＦにｍｉＲ−６７１−５ｐ模倣物をトランスフェクトし、１μＭブファリンと共に２４時間インキュベートした。トランスフェクションの４８時間後、遊走行動をＢｏｙｄｅｎ  Ｃｈａｍｂｅｒアッセイで研究した（図１９参照）。Ｂｏｙｄｅｎ  Ｃｈａｍｂｅｒは、細胞遊走および細胞浸潤を研究するための有用なツールである。これは、細胞培養プレートのウェルの中で入れ子状態にされた円筒形の細胞培養インサートからなる。インサートは規定の孔径を伴い底部にポリカーボネート膜を含む。細胞を無血清培地中のインサートの上に播種する一方、血清または類似の化学誘引物質は下のウェルに入れる。遊走細胞は孔を通って下方の化学誘引物質に向かって移動し、プレートリーダーで染色または定量され得る。浸潤細胞は、膜の上に細胞外マトリックスタンパク質のコーティングを配置することによって同様に測定することができる。
最初に、ｍｉＲ−６７１−５ｐ模倣物およびブファリンのトランスフェクションの４８時間後に、ＨＣＦをＤＡＰＩ染色する必要がある。そのため、培地を捨て、新鮮な培地を蛍光染料と共に添加する（１ｍｌ／６ウェル；ＤＡＰＩ  １μｌ／ｍｌＭｅｄｉｕｍ（１：１０００））（明かりを消すこと）。ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で３０分〜１時間インキュベートした後、ＨＴＳ  Ｆｌｕｏｒｏ  Ｂｌｏｋインサート（８μｍサイズ、ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ  ＃３５１１５２）を調製してコーティングする。蛍光の顕微鏡での制御の後、細胞を１ｍｌのＰＢＳで洗浄する。その後、細胞をトリプシン処理し、２００×ｇ、４℃で５分間、遠心分離する。その後、上清を捨て、ペレットを２５０μｌ  Ｍｅｄｉｕｍ＋１％ＢＳＡまたは１％ＦＣＳで希釈する。その後、細胞を数え、２００μｌ  Ｍｅｄｉｕｍ＋１％ＢＳＡまたは１％ＦＣＳ中に５×１０４〜１×１０５に希釈するべきである。次に、７００μｌのＭｅｄｉｕｍ＋ＶＥＧＦ＋ＳＤＦまたはＭｅｄｉｕｍ＋１０％ＦＣＳを２４ウェルコンパニオンプレートの各ウェルに分注し、（前処理済み）インサートを培地中に吊り下げる。２００μｌの細胞懸濁液をインサートの中央にピペットで移し、ＣＯ２インキュベーター中で３７℃で４〜２４時間（最長）インキュベートする（おそらく２時間後に遊走を制御）。播種後最長２４時間で、顕微鏡検査を行うことができ、遊走した細胞の写真を撮ることができる。
【０１３１】
実施例１２：ｍｉＲ−６７１−５ｐはマウスおよびヒトの線維化心臓において活性化されている。
ｍｉＲ−６７１−５ｐの発現は、さまざまなマウス心不全（ＨＦ）モデル（高血圧、圧負荷および同種異系心臓移植）で増加する。
再び、アンジオテンシンＩＩ充填ミニポンプの移植（実施例３）、大動脈狭窄術（ＴＡＣ）または心臓の同種移植によって、マウスにおいてＨＦを誘発した。示された時点で心臓を採取した（１群あたりｎ＝３〜７）。
さらに、ｍｉＲ−６７１−５ｐは、ヒト大動脈弁狭窄症患者の心臓で活性化される。心臓生検は、大動脈弁狭窄症により大動脈弁置換術を受けた患者の左心室、または移植に使用されていない健常成人ドナー心臓から採取した（１群あたりｎ＝６）。ｍｉＲ−６７１−５ｐのレベルの増加（マウスにおいてｓｎｏＲＮＡ−２０２に対しておよびヒト心臓組織においてＲＮＵ４８に対して正規化）をｑＲＴ−ＰＣＲによって研究した（図２０参照）。
【０１３２】
実施例１３：環状ＲＮＡ  ＣＤＲ１ａｓはｍｉＲ−６７１−５ｐの直接の標的である。
ヒトにおけるＣＤＲ１ａｓおよびｍｉＲ−６７１−５ｐの予想される結果的な対合はwww.targetscan.org/vert_71/を介して行った。低いＣＴ値で表されるようにＨＣＦに極めて豊富に存在する環状ＲＮＡを特異的に増幅するために、ダイバージェントプライマーを用いた（図２１Ａ参照）。
ＣＤＲ１ａｓの真円度は、ＧＡＰＤＨの線状転写物の耐性より１０倍高いエキソヌクレアーゼ処理に対する耐性によって証明された（図２１Ｂ参照）。
ＣＤＲ１ａｓを標的とするｍｉＲ−６７１−５ｐの検証は、初代ＨＣＦにおけるｍｉＲ−６７１−５ｐの過剰発現の後にｑＲＴ−ＰＣＲ（１８Ｓ  ｒＲＮＡに対して正規化）によって行った。そのために、ＨＣＦにｍｉＲ−６７１−５ｐ模倣物をトランスフェクトし、４８時間後にｑＲＴ−ＰＣＲによりＣＤＲ１ａｓ発現（１８Ｓ  ｒＲＮＡに対して正規化）について分析した（図２１Ｃ参照）。
【０１３３】
実施例１４：環状ＲＮＡであるＣＤＲ１ａｓは、ＨＣＦで、同定された抗線維化化合物での処理後に増加し、それゆえ抗線維化環状ＲＮＡとして作用する。
ＣＤＲ１ａｓの発現レベルは、ブファリン、ギトキシゲニン、リコリン、アニソマイシンおよびゲルダナマイシンでの処理により初代ＨＣＦにおいて増加する。ＨＣＦを、ブファリン（１μＭ）、ギトキシゲニン（１μＭ）、リコリン（５μＭ）、アニソマイシン（１μＭ）およびゲルダナマイシン（１μＭ）と共に２４時間インキュベートし、それぞれの化合物によるＣＤＲ１ａｓの上方制御（１８Ｓ  ｒＲＮＡに対して正規化）をｑＲＴ−ＰＣＲによって検証した（図２２参照）。
【０１３４】
さらに、ｓｉｓｉＲＮＡの化学的性質によるＣＤＲ１ａｓの鎖特異的サイレンシングは、代表的なウエスタンブロットに示されるように、初代ＨＣＦにおいて細胞外マトリックス成分コラーゲン１ａ１の発現レベルの増加をもたらす。ｓｉｓｉＲＮＡは、ＣＤＲ１コード遺伝子に対して完全にアンチセンスな位置にあるＣＤＲ１ａｓの鎖特異的サイレンシングを可能にする小さな内部セグメント化した干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｎａｌｌｙ  ｓｅｇｍｅｎｔｅｄ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）である。トランスフェクションの４８時間後に、ＨＣＦを溶解させ、コラーゲン１ａ１タンパク質レベル（ＧＡＰＤＨに対して正規化）について分析した（図２４参照）。
【０１３５】
実施例１５：ＣＤＲ１ａｓの反対の鎖にコードされるＣＤＲ１  ｍＲＮＡは、ＨＣＦ中の同定された抗線維化化合物での処理の後、ｍｉＲ−６７１−５ｐに一致して変化しない。
ＣＤＲ１  ｍＲＮＡの発現レベルは、ブファリン、ギトキシゲニン、リコリン、アニソマイシンおよびゲルダナマイシンでの処理により、一次ＨＣＦにおいてｍｉＲ−６７１−５ｐまたはＣＤＲ１ａｓと独立して変化する。ＨＣＦを、ブファリン（１μＭ）、ギトキシゲニン（１μＭ）、リコリン（５μＭ）、アニソマイシン（１μＭ）およびゲルダナマイシン（１μＭ）と共に２４時間、インキュベートし、それぞれの化合物によるＣＤＲ１  ｍＲＮＡレベルに対する影響（ＧＡＰＤＨに対して正規化）をｑＲＴ−ＰＣＲによって検証した（図２３参照）。
【０１３６】
実施例１６：セレノプロテインＰは、ｍｉＲ−６７１−５ｐの別の直接的な標的である。
ヒトにおけるセレノプロテインP標的領域およびｍｉＲ−６７１−５ｐの予想される結果的な対合はwww.targetscan.org/vert_71/を介して行った（図２５Ａ参照）。セレノプロテインＰを標的とするｍｉＲ−６７１−５ｐの検証を、ｍｉＲ−６７１−５ｐの過剰発現の後にルシフェラーゼ活性およびｑＲＴ−ＰＣＲによってアッセイした。ＨＥＫ２９３細胞株および初代HCFにｍｉＲ−６７１−５ｐ模倣物をトランスフェクトし、それぞれ、２４時間後にルシフェラーゼ活性について、または４８時間後にセレノプロテインＰ発現について（１８Ｓ  ｒＲＮＡに対して正規化）qRT-PCRにより、分析した（図２５Ｂ参照）。
【０１３７】
実施例１７：ブファリン、ギトキシゲニン、リコリンおよびアニソマイシンの投与は、腎臓および肝臓の損傷の血漿マーカーにおいていかなる変化も引き起こさず、さらにブファリンおよびリコリンはインビボにおいて腎臓および肝臓の形態においていかなる変化も引き起こさない。
アンジオテンシンＩＩ誘発ＨＦのマウスモデルにおけるブファリン、ギトキシゲニン、リコリンおよびアニソマイシンの毒物学的評価は、腎臓（クレアチニンおよび尿素）および肝臓（グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）およびグルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ））の血漿マーカーの上昇を示さない。
マウスにおいてＨＦを誘発し（実施例３）、実施例３に示したようにブファリン（０．５ｍｇ／ｋｇ）、ギトキシゲニン（０．０１ｍｇ／ｋｇ）、リコリン（４．５ｍｇ／ｋｇ）、およびアニソマイシン（１０ｍｇ／ｋｇ）を注射した。手術後１４日目に、ＥＤＴＡ−血漿サンプルを採取した（１群あたりｎ＝２〜３）（図２６および２７参照）。
【０１３８】
さらに、アンジオテンシンＩＩ誘発ＨＦのマウスモデルにおけるブファリンおよびリコリンの毒物学的評価では、それぞれ壊死、炎症、または腎臓および肝臓のいずれの形態変化も誘発されない。
再び、ＨＦをマウスにおいて誘発し（実施例３）、実施例３に示したようにブファリン（０．５ｍｇ／ｋｇ）およびリコリン（４．５ｍｇ／ｋｇ）を注射した。手術後１４日間で、腎臓および肝臓を、ヘマトキシリンおよびエオシン（ＨＥ）ならびに過ヨウ素酸−シッフ（ＰＡＳ）染色による組織学的評価にかけた（１群あたりｎ＝２〜４）（図２８ＡおよびＢ参照）。
【０１３９】
実施例１８：ブファリンおよびリコリンはインビボで腎臓および肝臓の形態にいかなる変化も引き起こさない（治療的アプローチ）。
マウスにおいてＨＦを誘発し（実施例５）、実施例５に示したように、ブファリン（０．５ｍｇ／ｋｇ）およびリコリン（４．５ｍｇ／ｋｇ）を注射した。術後８週間で、腎臓および肝臓を、ヘマトキシリンおよびエオシン（ＨＥ）ならびに過ヨウ素酸−シッフ（PAS）染色による組織学的評価にかけた（１群あたりｎ＝４）。
【０１４０】
データは、ブファリンおよびリコリンの投与が、マウスにおいてインビボで腎臓および肝臓の形態のいかなる変化も引き起こさないことを示す（図２９参照）。
【０１４１】
実施例１９：インビボでのブファリンおよびリコリンの心筋および血漿濃度の評価。
天然物質ブファリン（０．５ｍｇ／ｋｇ）またはリコリン（４．５ｍｇ／ｋｇ）（ＤＭＳＯに溶解）の注射の９分後に、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスの血漿および心臓を採取した。物質を抽出した後、ブファリンおよびリコリンを液体クロマトグラフィー（ＬＣ）および四重極飛行時間型質量分析（ＱＴＯＦ−ＭＳ）によって定量した（図３０参照）。
【０１４２】
データは、化合物、特にリコリンが、化合物の注射後の血漿と比較して、心筋中のより高いレベルによって証明される、心臓によって効果的に取り込まれることを示す。
【０１４３】
実施例２０：インビトロでのブファリンおよびリコリンの化学誘導体のスクリーニング。
細胞を、１０μＭのブファリンおよびリコリン、ならびに１０μＭのブファリン（誘導体３、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８および２５）およびリコリン（誘導体１、２、４、１５、１９、２０、２１、２２、２３、２４および２６）の誘導体とともに、２４時間、インキュベートした。その後、ＨＣＦの増殖をＢｒｄＵ−ＥＬＩＳＡにより測定した（図３１参照）。
【０１４４】
データは、増殖がブファリンおよびリコリン自体によって防止されるように、本発明の誘導体がＨＣＦの増殖を防止することができることを示す。好ましくは、リコリン誘導体であるホモハリントニン（図３１のＮｏ．１９）がＨＣＦの増殖を最も防止する。
【０１４５】
実施例２１：非心臓線維芽細胞に対するブファリンおよびリコリンの抗線維化作用のインビトロ評価。
ラット腎線維芽細胞株ＮＲＫ４９Ｆおよび初代ヒト肺線維芽細胞（ＨＰＦ）の細胞を、２４時間、リコリン（１μＭ、５μＭおよび１０μＭ）またはブファリン（０．１μＭ、１μＭ、１０μＭ）で処理し、それぞれの線維芽細胞の増殖をＢｒｄＵ−ＥＬＩＳＡにより測定した（図３９参照）。
【０１４６】
リコリンは腎線維芽細胞の増殖を有意に阻害し、肺線維芽細胞の増殖も有意に阻害することが示された。さらに、ブファリンは肺線維芽細胞の増殖のみを有意に阻害する。ここで、リコリンおよびブファリンの最も有効な量は１０μＭである。
【０１４７】
したがって、これらの結果は、ブファリンおよびリコリンは肺および腎臓の線維症も治療または予防することを実証する。
【０１４８】
参考文献
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６】
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【図７Ａ−１】
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【図７Ａ−２】
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【図７Ｂ−１】
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【図７Ｂ−２】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１７−３】
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【図１７−４】
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【図１７−５】
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【図１８Ａ−１】
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【図１８Ａ−２】
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【図１８Ｂ−１】
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【図１８Ｂ−２】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２２−３】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２３−３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ−１】
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【図２６Ａ−２】
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【図２６Ｂ−１】
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【図２６Ｂ−２】
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【図２７Ａ−１】
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【図２７Ａ−２】
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【図２７Ｂ−１】
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【図２７Ｂ−２】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ−１】
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【図３２Ｂ−２】
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【図３２Ｂ−３】
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【図３２Ｂ−４】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ−１】
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【図３３Ｂ−２】
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【図３３Ｂ−３】
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【図３３Ｂ−４】
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【図３３Ｂ−５】
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【図３３Ｂ−６】
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【図３３Ｂ−７】
2020505466.tif 000102
【図３３Ｂ−８】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ−１】
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【図３４Ｂ−２】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ−１】
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【図３５Ｂ−２】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ−１】
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【図３６Ｂ−２】
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【図３７−１】
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【図３７−２】
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【図３８−１】
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【図３８−２】
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【図３８−３】
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【図３９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2020505466.tif 000120
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