(57)【要約】  カリウムチャネルに関連する種々の疾患、障害または状態を処置するのに有用な化合物およびその薬理学的に許容される塩を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式の化合物：
【化１】
2020504165.tif 000031
またはそれらの薬学的に許容される塩。
【請求項２】
請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項３】
それを必要とする対象の小コンダクタンスカルシウム活性化カリウムチャネル（ＳＫチャネル）の調節に応答性の疾患または状態を処置する方法であって、当該対象に請求項１に記載の化合物もしくはその薬学的に許容される塩、または請求項２に記載の組成物を投与する工程を含む方法。
【請求項４】
前記疾患または状態が、ＳＫ２チャネルの調節に対する応答である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記疾患または状態が、神経変性疾患、認知症、心疾患、常用の中止に関連する離脱症状、代謝疾患、および膀胱疾患から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記疾患または状態が、運動失調、異緊張症、振戦、パーキンソン病、虚血、外傷性脳損傷、筋萎縮性側索硬化症、高血圧、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、不整脈、過敏性膀胱、およびアルコールおよび他の依存性薬物の濫用の中止によって引き起こされる離脱症状から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記疾患または状態が本態性振戦である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記疾患または状態が運動失調である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記疾患または状態が脊髄小脳失調症である、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
[0001]  本出願は２０１７年１月２３日に出願の米国特許仮出願番号第６２／４４９，２７０号の優先権を主張し、参照によりその全内容が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
[0002]  イオンチャネルのうち、カリウムチャネルは最も普遍的かつ多様であり、神経組織、筋組織、腺組織、免疫組織、生殖組織および上皮組織などの種々の動物細胞で見出される。これらのチャネルは、一定の条件下での細胞内外へのカリウム流を可能にする。これらのチャネルは、例えば、カルシウム感受性、電位ゲート開閉、二次メッセンジャー、細胞外リガンドおよびＡＴＰ感受性によって調節される。
【０００３】
[0003]  カリウムチャネルの機能障害およびこのカリウムチャネルに影響を与える他の原因による機能障害は、細胞制御の消失、生理学的機能の変化および疾患状態を引き起こすことが知られている。カリウムチャネルモジュレーターは、そのイオンチャネル機能を調節する能力および／またはイオンチャネル活性を回復する能力のために幅広い病理学的疾患の薬理学的処置に使用されており、更に多種多様な治療適応に対処する可能性を有する。
【０００４】
[0004]  小コンダクタンスカルシウム活性化カリウムチャネル（ＳＫチャネル）は、Ｃａ２＋活性化Ｋ＋チャネルのサブファミリーであり、ＳＫチャネルファミリーは、４つのメンバー、ＳＫ１、ＳＫ２、ＳＫ３およびＳＫ４（多くの場合、中間コンダクタンスと称される）を含む。ＳＫチャネルの生理学的役割は、特に、例えばそれらが神経細胞の興奮性および神経伝達物質放出の重要な制御因子である神経系、ならびにそれらが血管筋組織、気管支気管筋組織、尿道筋組織、子宮筋組織、胃腸筋組織の緊張を調整するのに重要である平滑筋において研究されてきた。
【０００５】
[0005]  これらが意味することを考慮すると、カリウムイオンチャネルの低分子モジュレーターはカリウムチャネルの機能障害およびこれらのカリウムチャネルに影響を与える他の原因による機能障害を特徴とする多種多様な疾患を処置する可能性を有し得る。
【発明の概要】
【０００６】
[0006]  カリウムイオンチャネルの機能障害およびこれらのカリウムチャネルに影響を与える他の原因による機能障害に関連する疾患の処置に有用な化合物およびその薬理学的に許容される塩ならびにそれらの医薬組成物を開示する。（例えば、表１を参照のこと）。
【０００７】
[0007]  本明細書に記載の化合物は、以下の有益な性質のうちの１つ以上を有することが見出された：高い溶解性、高い脳内遊離画分、ｈＥＲＧ阻害が殆どまたは全くない、長期のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期、良好な生物学的利用能、高い肝ミクロソーム安定性、並行人工膜透過性（ＰＡＭＰＡ）などの透過性の増加、および／または低いＣｙｐ阻害。例えば、表２および３の比較データを参照のこと。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】[0008]  ハルマリン誘発性振戦に及ぼす化合物（１）の経口（ＰＯ）投与後の効果を示す。
【図２】[0009]  ％動作パワーにおける化合物（１）の有効性および用量反応を示す。
【図３】[0010]  ＳＣＡ２  ５８Ｑトランスジェニックマウスからのｅｘ  ｖｉｖｏ切片におけるプルキンエ細胞発火不規則性に対する化合物（１）の効果を示す。
【図４】[0011]  ＥＡ２  Ｔｏｔｔｅｒｉｎｇマウスモデルのベースライン運動失調に及ぼす化合物（１）の効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
１．化合物
[0012]  本明細書において、以下の式：
【００１０】
【化１】
2020504165.tif 000002
【００１１】
の化合物またはその薬学的に許容される塩が提供される。
２．定義
[0013]  本明細書で使用する場合、用語「対象」および「患者」は、互換的に使用される場合があり、処置を必要とする哺乳動物、例えば、コンパニオン動物（例えば、イヌ、ネコなど）、家畜（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギなど）および実験動物（例えば、ラット、マウス、モルモットなど）を意味する。典型的には、対象は処置を必要とするヒトである。
【００１２】
[0014]  開示される化合物の立体化学が明示されるかまたは構造によって示される場合には、明示されるまたは示される立体異性体は、全ての他の立体異性体に対して少なくとも６０重量％、７０重量％、８０重量％、９０重量％、９９重量％または９９．９重量％純粋である。全ての他の立体異性体に対する重量％純度は、１つの立体異性体の他の立体異性体の重量に対する重量の比率である。単一の鏡像異性体が明示されるかまたは構造によって示される場合、示されるまたは明示される鏡像異性体は少なくとも６０重量％、７０重量％、８０重量％、９０重量％、９９重量％または９９．９重量％光学的に純粋である。重量％光学純度は、鏡像異性体の重量にその光学異性体の重量を加えたものに対する鏡像異性体の重量の比率である。
【００１３】
[0015]  開示される化合物が立体化学の表示なしに明示されるかまたは構造によって示され、当該化合物が１つのキラル中心を有する場合、名称または構造は、対応する光学異性体および幾何異性体を含まない化合物の１つの鏡像異性体、化合物のラセミ混合物、ならびに対応する光学異性体と比較して１つの鏡像異性体が豊富に含まれる混合物を包含することが理解される。
【００１４】
[0016]  本明細書に記載の化合物の中性型に加えて薬学的に許容される塩が含まれる。医薬品に使用するための化合物の塩とは、無毒性の「薬学的に許容される塩」を指す。薬学的に許容される塩の形態は、薬学的に許容される酸性／陰イオンまたは塩基性／陽イオンの塩を含む。薬学的に許容される塩基性／陽イオンの塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、ジエタノールアミン塩、ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン塩、Ｌ−リジン塩、Ｌ−アルギニン塩、アンモニウム塩、エタノールアミン塩、ピペラジン塩およびトリエタノールアミン塩が挙げられる。薬学的に許容される酸性／陰イオン塩としては、例えば、酢酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重炭酸塩、酒石酸水素塩、炭酸塩、クエン酸塩、二塩化水素化物、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリコリルアルサニル酸塩（ｇｌｙｃｏｌｌｙｌａｒｓａｎｉｌａｔｅ）、ヘキシルレゾルシン酸塩（ｈｅｘｙｌｒｅｓｏｒｃｉｎａｔｅ）、臭化水素酸塩、塩酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メシル酸塩、硝酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、およびトシル化物が挙げられる。
【００１５】
[0017]  用語「薬学的に許容される担体、アジュバントまたは媒体」は、一緒に製剤化される化合物の薬理活性を破壊しない無毒性の担体、アジュバントまたは媒体を指す。本明細書に記載の組成物に使用してもよい薬学的に許容される担体、アジュバントまたは媒体としては、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質、リン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウムなどの緩衝物質、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、硫酸プロタミン、リン酸一水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩などの塩または電解質、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン-ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１６】
[0018]  用語「処置」、「処置する」および「処置すること」は、本明細書で記載される通り、疾患もしくは障害またはその１つ以上の症状を、逆転させる、軽減する、発症する可能性を低下させるかまたは進行を阻害することを指す。いくつかの実施形態では、１つ以上の症状が発現した後に処置を投与してもよい（すなわち、治療的処置）。他の実施形態では、症状がない状態で処置を投与してもよい。例えば、症状発現前に（例えば、症状歴を考慮して、および／または遺伝的要因または他の感受性要因を考慮して）感受性の個体に処置を投与してもよい（すなわち、予防処置）。また、症状が消散した後に、例えば、それらの再発を防止するかまたは遅らせるために処置を継続してもよい。
【００１７】
[0019]  用語「有効量」または「治療上有効量」は、対象の生物学的または医学的な応答を引き出す本明細書に記載の化合物の量を含む。
３．使用、製剤化および投与
[0020]  一部の実施形態では、本明細書に記載の化合物および組成物は、カリウムチャネルの活性に関連する疾患および／または障害を処置するのに有用である。かかる疾患および／または障害としては、例えば、神経変性疾患および神経疾患（例えば、パーキンソン病、振戦、アルツハイマー病、認知症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、運動失調、不安、うつ病、気分障害、記憶障害および注意欠陥、双極性障害、精神病、統合失調症、外傷性脳損傷ならびにナルコレプシー）、心疾患および関連疾患（例えば、虚血性心疾患、冠動脈性心疾患、狭心症および冠動脈攣縮）、代謝疾患および膀胱疾患（例えば、膀胱痙攣、尿失禁、膀胱流出障害、胃腸障害、過敏性腸症候群および糖尿病）、常用の中止に関連する離脱症状、ならびにカリウムチャネルの調節に関連する他の状態、例えば、呼吸器疾患、癲癇、痙攣、発作、欠神発作、血管痙攣、腎障害（例えば、多発性嚢胞腎）、勃起障害、分泌性下痢、虚血、脳虚血、月経困難症、レイノー病、間欠跛行、シェーグレン症候群、不整脈、高血圧、筋強直性ジストロフィー、痙縮、口内乾燥、高インスリン血症、早産、脱毛症、癌、免疫抑制、片頭痛および疼痛などが挙げられる。
【００１８】
[0021]  本開示は、本明細書に記載の化合物を投与する工程を含む、対象のカリウムチャネルの活性を調節する方法も提供する。別の態様において、本開示は、本明細書に記載の化合物を細胞と接触させる工程を含む、細胞のＳＫ２チャネルを正に調節する方法を提供する。
【００１９】
[0022]  １つの態様では、提供される化合物および組成物は、振戦を処置するのに使用される。振戦としては、静止時振戦、活動時振戦、姿勢時振戦、運動性振戦、意図振戦、動作特異性振戦および特発性振戦が挙げられるが、これらに限定されない。１つの態様では、提供される化合物および組成物は、姿勢時振戦および活動時振戦を処置するのに使用される。姿勢時振戦および／または活動時振戦の例としては、本態性振戦、薬剤誘発性パーキンソニズム、神経障害性振戦、および毒素（例えば、アルコール離脱または重金属への曝露）により誘発される振戦が挙げられる。１つの態様では、提供される化合物および組成物は、本態性振戦を処置するのに使用される。
【００２０】
[0023]  更に本開示は、本明細書に記載の化合物もしくは薬学的に許容される塩または組成物を投与する工程を含む、対象の本態性振戦を処置する方法を提供する。
[0024]  本態性振戦は、一般集団の約０．９％に罹患する、最もよく見られる神経障害の１つである。本態性振戦は、上肢ならびに、それほど多くはないが、頭部、音声および体幹の動作時振戦を特徴とする。患者のほぼ半数において本態性振戦の家族歴を同定することができ、このことは遺伝的要素を示唆する。飲酒は、多くの場合、振戦を一時的に低減する。
【００２１】
[0025]  一部の実施形態では、本開示は、神経変性疾患、認知症、心疾患、常用の中止に関連する離脱症状、代謝疾患および膀胱疾患から選択される疾患または症状を処置する方法を提供する。他の実施形態では、本開示は、運動失調、異緊張症、パーキンソン病、虚血、外傷性脳損傷、筋萎縮性側索硬化症、高血圧、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、不整脈、過敏性膀胱、およびアルコールおよび他の依存性薬物の濫用の中止によって引き起こされる離脱症状から選択される疾患または症状を処置する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、運動失調を処置する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、脊髄小脳失調症を処置する方法を提供する。
【００２２】
[0026]  本開示は、本明細書に記載の化合物および薬学的に許容される担体を含む薬学的に許容される組成物を提供する。これらの組成物は、上記の疾患および状態のうちの１つ以上を処置するのに使用することができる。
【００２３】
[0027]  本明細書に記載の組成物は、経口的に、非経口的に、吸入スプレーにより、局所的に、直腸から、鼻腔から、口内から、膣から、または移植されたリザーバーにより投与されてもよい。本明細書で使用する場合、用語「非経口的」は、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、肝内、病巣内および頭蓋内注射または注入技術を含む。化合物の液体剤形、注射用製剤、固体分散剤形、および局所または経皮投与のための剤形が本明細書に含まれる。
【００２４】
[0028]  単回投与剤形の組成物を製造するための、担体材料と組み合わせられ得る提供される化合物の量は、処置される患者および特定の投与様式に応じて異なる。いくつかの実施形態では、提供される組成物は、例えば、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇの体重／日などの、０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の提供される化合物の投与量をこれらの組成物が与えられる患者に投与することができるように製剤化され得る。
【００２５】
[0029]  また、任意の特定の患者に特異的な投与量および治療レジメンは、年齢、体重、健康状態、性別、食事、投与時間、排出速度、薬剤の組合せ、処置を行う医師の判断および処置されている特定の疾患の重症度を含む種々の要因に依存することを理解すべきである。組成物中の提供される化合物の量はまた、組成物中の特定の化合物にも依存する。
【００２６】
例証
[0030]  以下の実施例は、本開示を例証するのを補助することを目的とし、本発明の範囲を限定することを意図せず、またそれらが本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【００２７】
Ｎ−（４，４−ジフルオロシクロヘキシル）−２−（３−メチル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）−６−モルホリノピリミジン−４−アミン
[0031]  ステップ１：
【００２８】
【化２】
2020504165.tif 000003
【００２９】
[0032]  テフロン（登録商標）被覆撹拌棒を備えた丸底フラスコにテトラヒドロフラン中の４，６−ジクロロ−２−（メチルスルホニル）ピリミジン（２０．０ｇ、８８．０８０ｍｍｏｌ、１．０当量）を−１０℃にて加え、３−メチル−１Ｈ−ピラゾール（７．２３ｇ、８８．０８０ｍｍｏｌ、１．０当量）をシリンジにより５分間にわたって滴下して添加した。反応混合物を２５℃にて１６時間撹拌し、反応の完了をＴＬＣによって決定した。反応混合物を水（５００ｍＬ）と酢酸エチル（５００ｍＬ）との間で分配した。有機層を分離し、水層を酢酸エチル（２×１００ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで脱水し、濾過し、減圧下で濃縮して粗生成物を得た。これをカラムクロマトグラフィー（溶媒系として酢酸エチル／ヘキサン）により精製して４，６−ジクロロ−２−（３−メチル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）ピリミジン（１０．０ｇ、４３．８５９ｍｍｏｌ、収率５０％）を白色固体の純粋形態として得た。ＭＳ（ＭＨ＋）：ｍ／ｚ＝２２９．１。
【００３０】
[0033]  ステップ２：
【００３１】
【化３】
2020504165.tif 000004
【００３２】
[0034]  テフロン被覆撹拌棒を備えた丸底フラスコに、アセトニトリル（２００ｍＬ）中の２，４−ジクロロ−６−メチルピリミジン（１１．０ｇ、４８．２４ｍｍｏｌ、１．０当量）、４，４−ジフルオロシクロヘキサン−１−アミン塩酸塩（９．８９ｇ、５７．８９ｍｍｏｌ、１．２当量）およびＣｓ２ＣＯ３（３９．１９ｇ、１２０．６１ｍｍｏｌ、２．５当量）を加えた。反応混合物を８０℃にて５時間撹拌し、反応の完了をＴＬＣによって決定した。反応混合物を室温まで冷却し、水（１００ｍＬ）と酢酸エチル（２００ｍＬ）との間で分配した。有機層を分離し、水層を酢酸エチル（２×１００ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで脱水し、濾過し、減圧下で濃縮して粗生成物を得た。これをカラムクロマトグラフィー（溶媒系として酢酸エチル／ヘキサン）により精製して６−クロロ−Ｎ−（４，４−ジフルオロシクロヘキシル）−２−（３−メチル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）ピリミジン−４−アミン（１１．０ｇ、３３．６２ｍｍｏｌ、７１％）をオフホワイトの固体として得た。ＭＳ（ＭＨ＋）：ｍ／ｚ＝３２８．１。
【００３３】
[0035]  ステップ３：
【００３４】
【化４】
2020504165.tif 000005
【００３５】
[0036]  テフロン被覆撹拌棒を備えた丸底フラスコにアセトニトリル（２００ｍＬ）中の６−クロロ−Ｎ−（４，４−ジフルオロシクロヘキシル）−２−（３−メチル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）ピリミジン−４−アミン（１４．０ｇ、４２．７９ｍｍｏｌ、１．０当量）、モルホリン（１４．９１ｍＬ、１７１．１９ｍｍｏｌ、４．０当量）およびトリエチルアミン（２３．８９ｍＬ、１７１．１９ｍｍｏｌ、４．０当量）を加えた。反応混合物を８０℃にて１６時間撹拌し、反応の完了をＴＬＣによって決定した。反応混合物を室温まで冷却し、水（１００ｍＬ）と酢酸エチル（３００ｍＬ）との間で分配した。有機層を分離し、水層を酢酸エチル（２×１００ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで脱水し、濾過し、減圧下で濃縮して粗生成物を得た。これをカラムクロマトグラフィー（溶媒系として酢酸エチル／ヘキサン）により精製してＮ−（４，４−ジフルオロシクロヘキシル）−２−（３−メチル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）−６−モルホリノピリミジン−４−アミン（１）（１２．８ｇ、３３．８４ｍｍｏｌ、収率７９％）をオフホワイトの固体として得た。
【００３６】
[0037]  分析データ：
[0038]  MS (MH+): m/z=379.2; 1H-NMR (400MHz, DMSO-D6): δ8.41 (d, J=2Hz, 1H), 7.07 (d, J=8.3Hz, 1H), 6.25 (d, J=2.4Hz, 1H), 5.53 (s, 1H), 3.9 (bs, 1H), 3.67 (t, J=4.4Hz, 4H), 3.49 (S, 4H), 2.23 (s, 3H), 2.23-1.97 (m, 3H), 1.92-1.90 (m, 3H), 1.55-1.53 (m, 2H).１ＨのＮＭＲは、積分により、芳香族領域に３つのプロトン共鳴およびＮ−１８の交換可能なプロトンに対応する１つの広い共鳴を示した。芳香族プロトンが２つの二重線および一重線として観察され、２つの隣接するプロトンおよび１つの離れた芳香族プロトンを示した。脂肪族領域において、２０個のプロトンに対応する共鳴が観察され、１つの明白な一重線を示した。これらの共鳴の積分は２つの高磁場の二重線−二重線の共鳴、部分的に重なり合う多重線プロトンを有する共鳴および４つの低磁場の多重線（そのうちの２つは部分的に重複する）に対応した。高磁場の脂肪族多重線は、構造のモルホリン部分に関連する。低磁場多重線は、更にこれらのプロトンがＣＦ２に近いことによって分割される。高解像度（ＨＲ）ＬＣ／ＭＳ分析において、擬分子イオン（Ｍ＋Ｈ＋）がＥＳＩ正イオンモードにおいて低いフラグメンター電圧（７０Ｖ）でｍ／ｚ  ３７９．２０５８０に観察された。ｍ／ｚ  ７７９．３８５７５に観察された他の突出したイオンは、インソース二量体付加物２Ｍ＋Ｎａ＋に起因する。
【００３７】
[0039]  １３ＣのＮＭＲデータは、１４個の分離した炭素共鳴を示し、ＣＤＣｌ３において２５℃でデカップリングされた１３Ｃ炭素スペクトルから生成した。１４個の共鳴は、１８個の炭素のうち４対が分光学的に等価である（１）の構造と一致する。１つの炭素共鳴（７７．０５ｐｐｍのＣ−１２）が、スペクトルにおけるＣＨＣｌ３共鳴によって部分的に隠されるのが観察された。この共鳴での炭素の存在をＣ６Ｄ６における１３Ｃスペクトルの収集により確認した。７９．７ｐｐｍの共鳴が溶媒のピークによる干渉なしで観察されたのに加え、全ての他の共鳴も観察された。三重線（２Ｊ＝２４４Ｈｚ）が１２２．２９のＣ−２２共鳴に観察され、更なる２つの三重線が３１．５３ｐｐｍ（Ｃ−２１およびＣ−２３、３Ｊ＝２４．９３Ｈｚ）および３１．５３ｐｐｍ（Ｃ−２０およびＣ−２４、４Ｊ＝５．３７Ｈｚ）に観察された。観察された各々の三重線は、Ｃ−２２のＦ２置換と一致し、介在する結合の数が増加するにつれてフッ素に対するカップリング定数が減少する。
【００３８】
[0040]  分子骨格の炭素−プロトン結合および炭素−炭素結合（２本および３本結合Ｃ−Ｃ−Ｈ相関による）を２次元ＮＭＲスペクトルの収集により確認した。直接的なＣ−Ｈ結合をＨＳＱＣにより確認し、２本および３本結合を介した結合をＨＭＢＣによって実証した。短距離および長距離の相互相関（２本または３本結合にわたる）が、提案された構造から予想される結合と一致する。最後に、上記に示すように割り当てられた観察された化学シフトデータは、提案された構造についてコンピュータにより予測された１Ｈおよび１３Ｃの化学シフトと一致した。
【００３９】
Ｎ−（４，４−ジフルオロシクロヘキシル）−２−（３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）−６−メトキシピリミジン−４−アミン
[0041]  ステップ１：
【００４０】
【化５】
2020504165.tif 000006
【００４１】
[0042]  ガラスロッドを取り付けたテフロン被覆撹拌ブレード（５ｃｍ）（口１）、ストッパー（口２）およびストッパー付き滴下漏斗（口３）および油で満たした窒素ガス出入口Ｕ字管アダプター（口４）を備えた火炎乾燥した５０００ｍＬの四口丸底フラスコに水素化ナトリウム（３５．２ｇ、８８０ｍｍｏｌ、１当量）のジクロロメタン（１０００ｍＬ）懸濁液を加え、３，５−ジメチルピラゾール（８４．６ｇ、８８０ｍｍｏｌ、１当量）を０℃にて添加し、反応混合物を室温にて撹拌した。３０分後、４，６−ジクロロ−２−（メチルスルホニル）ピリミジン（２００ｇ、８８０ｍｍｏｌ、１当量）（ジクロロメタン（１０００ｍＬ）中に溶解）を−７８℃にて滴下漏斗によって反応混合物に滴下して添加した。反応混合物を同じ温度で撹拌し、反応の完了をＴＬＣおよびＵＰＬＣによって決定した。２時間後、反応混合物を−７８℃にて水でクエンチして、ジクロロメタンで希釈した。５分後、ジクロロメタンをデカントし、ブライン溶液で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで脱水し、濾過し、減圧下で濃縮して粗生成物を得た。これを酢酸エチルおよび石油エーテルを溶媒として使用したカラムクロマトグラフィーによって精製して４，６−ジクロロ−２−（３、５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）ピリミジン（１３８ｇ、５６７．７１ｍｍｏｌ、６５％）をオフホワイトの固体として得た。ＭＳ（ＭＨ＋）：ｍ／ｚ＝２４４．２。
【００４２】
[0043]  ステップ２：
【００４３】
【化６】
2020504165.tif 000007
【００４４】
[0044]  テフロン被覆撹拌棒（５ｃｍ）、１つのセプタム（口１）、ストッパー（口３）、および油で満たした窒素ガス出入口Ｕ字管アダプターを備えた還流冷却器（口２）を備えた火炎乾燥した２０００ｍＬの三口丸底フラスコに４，６−ジクロロ−２−（３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）ピリミジン（１３６ｇ、５５９．４ｍｍｏｌ、１当量）のアセトニトリル（１５００ｍＬ）溶液を加え、続いて４，４−ジフルオロシクロヘキシルアミン塩酸塩（１０５．６ｇ、６１５．４ｍｍｏｌ、１．１当量）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１９４．８８ｍＬ、１１１８．８ｍｍｏｌ、２当量）を添加した。反応混合物を８０℃にて１６時間加熱した。反応の完了をＴＬＣおよびＵＰＬＣによって決定した。反応混合物を濃縮して、残留物を水（５００ｍＬ）と共に粉砕した。得られた固体を濾過し、石油エーテルで洗浄し、真空下で乾燥させて６−クロロ−Ｎ−（４，４−ジフルオロシクロヘキシル）−２−（３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）ピリミジン−４−アミン（１９１ｇ、５５６ｍｍｏｌ、＞９５％）をオフホワイトの固体として得た。ＭＳ（ＭＨ＋）：ｍ／ｚ＝３４２．０。
【００４５】
[0045]  ステップ３：
【００４６】
【化７】
2020504165.tif 000008
【００４７】
[0046]  テフロン被覆撹拌棒（２ｃｍ）、１つのセプタム（口１）、ストッパー（口３）、および油で満たした窒素ガス出入口Ｕ字管アダプターを備えた還流冷却器（口２）を備えた火炎乾燥した２５０ｍＬの三口丸底フラスコに６−クロロ−Ｎ−（４，４−ジフルオロシクロヘキシル）−２−（３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）ピリミジン−４−アミン（２０ｇ、５８．５１ｍｍｏｌ、１当量）のメタノール溶液を加え、続いてナトリウムメトキシド（メタノール中２１％、５．３７ｇ、９９．４７ｍｍｏｌ、１．７当量）を加えた。反応を６０℃に加熱し、反応の完了をＴＬＣおよびＵＰＬＣによって決定した。５時間後、反応混合物を減圧下で濃縮し、残留物を酢酸エチルで希釈し、水で洗浄し、ブライン溶液で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで脱水し、濾過し、減圧下で濃縮して粗生成物を得た。これを石油エーテル中の酢酸エチルを溶媒系として使用したカラムクロマトグラフィーによって精製してＮ−（４，４−ジフルオロシクロヘキシル）−２−（３，５−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）−６−メトキシピリミジン−４−アミン（２）（１６ｇ（１１ｇ（９９％純粋）＋５ｇ（９２％純粋））、４７．４１ｍｍｏｌ、約８０％）を白色固体として得た。ＭＳ（ＭＨ＋）：ｍ／ｚ＝３３８．１。分析データ：1H-NMR (400MHz, DMSO-d6): δ7.45 (bs, 1H), 6.06 (s, 1H), 5.72 (s, 1H), 4.01 (bs, 1H), 3.85 (s, 3H), 2.55 (s, 3H), 2.17 (s, 3H), 2.11-1.82 (m, 6H), 1.60-1.55 (m, 2H).
Ｎ−（４、４−ジフルオロシクロヘキシル）−６−メトキシ−２−（４−メチルチアゾール−２−イル）ピリミジン−４−アミン
[0047]  ステップ１：
【００４８】
【化８】
2020504165.tif 000009
【００４９】
[0048]  テフロン被覆撹拌棒を備えた三口丸底フラスコに、ジエチルエーテル（２５０ｍＬ）を加え、ｎ−ＢｕＬｉ（２４１．９８ｍＬ、６０４．９６ｍｍｏｌ、ヘキサン中２．５Ｍ）を−７８℃にて導入した。４−メチルチアゾール（５０．０ｇ、５０４．１３ｍｍｏｌ）のジエチルエーテル（２００ｍＬ）溶液を３０分間にわたって添加した。反応混合物は、淡黄色の懸濁液に変化した。１．５時間後、ＤＭＦ（５８．５４ｍＬ、７５６．２０ｍｍｏｌ）を添加し、１６時間室温にて撹拌した。反応の経過をＴＬＣによってモニタリングした。反応の完了後、混合物を撹拌下の冷ＨＣｌ水溶液（４００ｍＬ、４Ｎ）に注入し、２つの層を分離した。有機層を冷ＨＣｌ（２×８０ｍＬ、４Ｎ）水溶液で洗浄した。水層を合わせ、Ｋ２ＣＯ３（ｐＨ７）でゆっくり塩基性化し、ジエチルエーテル（３×１５０ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで脱水し、真空下で室温にて蒸発乾固して４−メチルチアゾール−２−カルバルデヒド（６０．０ｇ、粗製物）を淡黄色液体として得た。この粗製物をそれ以上精製せずに次のステップで使用した。
【００５０】
[0049]  ステップ２：
【００５１】
【化９】
2020504165.tif 000010
【００５２】
[0050]  テフロン被覆撹拌棒を備えた二口丸底フラスコにピリジン（３８．０４ｍｌ、４７２．４０ｍｍｏｌ）中の４−メチルチアゾール−２−カルバルデヒド（６０．０ｇ、粗製物）を加えた。塩酸ヒドロキシルアミン（３２．８２ｇ、４７２．４０ｍｍｏｌ）を１５分間わたって少しずつ添加した。反応混合物を、窒素雰囲気下で１６時間室温にて撹拌した。反応の経過をＴＬＣによってモニタリングした。反応の完了後、混合物を氷冷水に注入し、２０分間撹拌し、得られた固体を濾過し、真空下で乾燥して４−メチルチアゾール−２−カルバルデヒドオキシム（４０．０ｇ、２８１．６９ｍｍｏｌ、２ステップで５９％）をオフホワイトの固体として得た。ＭＳ（ＭＨ＋）：ｍ／ｚ＝１４３．０。
【００５３】
[0051]  ステップ３：
【００５４】
【化１０】
2020504165.tif 000011
【００５５】
[0052]  テフロン被覆撹拌棒を備えた二口丸底フラスコに４−メチルチアゾール−２−カルバルデヒドオキシム（３５．０ｇ、２４６．４４ｍｍｏｌ）およびピリジン（８７．３３ｍＬ、１０８４．３５ｍｍｏｌ）の１，４−ジオキサン（１４０ｍＬ）溶液を加えた。トリフルオロ酢酸無水物（５１．３８ｍＬ、３６９．６６ｍｍｏｌ）を−１０℃にてゆっくり添加し、１６時間室温にて撹拌した。反応の経過をＴＬＣによってモニタリングした。反応の完了後、混合物を水（２５０ｍＬ）で希釈し、ジエチルエーテル（３×３５０ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、水（２×２５０ｍＬ）、ブライン（１００ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水し、減圧下で濃縮して４−メチルチアゾール−２−カルボニトリル（３５．０ｇ、粗製物）を淡褐色の液体として得た。この粗製物をそれ以上精製せずに次のステップで使用した。分析データ：1H-NMR (400MHz, DMSO-d6): δ7.90 (s, 1H), 2.51 (s, 3H).
[0053]  ステップ４：
【００５６】
【化１１】
2020504165.tif 000012
【００５７】
[0054]  テフロン被覆撹拌棒を備えた二口丸底フラスコにメタノール（２８０ｍＬ）中の４−メチルチアゾール−２−カルボニトリル（３５．０ｇ、粗製物）を加え、ナトリウムメトキシド（１６．７７ｇ、３１０．４５ｍｍｏｌ）を添加した。室温にて３時間撹拌した後、塩化アンモニウム（３０．１９ｇ、５６４．６６ｍｍｏｌ）を添加し、更に１６時間撹拌した。反応の経過をＴＬＣによってモニタリングした。反応の完了後、混合物を濾過し、メタノールで洗浄した。濾液を減圧下で濃縮し、残留物をジエチルエーテル（１５０ｍＬ）と共に粉砕した。形成された固体を濾過し、真空下で乾燥して４−メチルチアゾール−２−カルボキシイミドアミド塩酸塩（３５．０ｇ、粗製物）をオフホワイトの固体として得た。この粗製物をそれ以上精製せずに次のステップで使用した。ＭＳ（ＭＨ＋）：ｍ／ｚ＝１４２．０。
【００５８】
[0055]  ステップ５：
【００５９】
【化１２】
2020504165.tif 000013
【００６０】
[0056]  テフロン被覆撹拌棒を備えた二口丸底フラスコにエタノール（３５０ｍＬ）中の４−メチルチアゾール−２−カルボキシイミドアミド塩酸塩（３５．０ｇ、粗製物）およびジエチルマロン酸（１５０．８１ｍＬ、９８８．６４ｍｍｏｌ）を加えた。ナトリウムエトキシド（３２０ｍＬ、９８８．６４ｍｍｏｌ、ＥｔＯＨ中２１％）を、室温にて滴下して添加し、８５℃に加熱した。３時間後、反応混合物を減圧下で濃縮した。水（２０ｍＬ）を添加し、１．５ＮのＨＣｌ（ｐＨ２〜３）で酸性化した。得られた固体を濾過し、真空下で乾燥して２−（４−メチルチアゾール−２−イル）ピリミジン−４、６−ジオール（２９．０ｇ、粗製物）を淡黄色の固体として得た。この粗製物をそれ以上精製せずに次のステップで使用した。ＭＳ（ＭＨ＋）：ｍ／ｚ＝２１０．０。
【００６１】
[0057]  ステップ６：
【００６２】
【化１３】
2020504165.tif 000014
【００６３】
[0058]  テフロン被覆撹拌棒を備えた二口丸底フラスコに２−（４−メチルチアゾール−２−イル）ピリミジン−４，６−ジオール（２９．０ｇ、粗製物）およびＰＯＣｌ３（２９０ｍＬ）の懸濁液を加えた。Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン（３７．８４ｍＬ、２３５．８５ｍｍｏｌ）を室温にて添加し、１００℃にて２時間加熱還流した。反応の経過をＴＬＣによってモニタリングした。過剰なＰＯＣｌ３を蒸留によって除去した。残留物を５００ｍＬの冷水で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液によって中和し、ジエチルエーテル（２×５００ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、水（３×２００ｍＬ）、ブライン（１００ｍＬ）で洗浄、硫酸ナトリウムで脱水し、減圧下で濃縮した。残留物をｎ−ペンタン（１００ｍＬ）と共に粉砕した。得られた固体を濾過し、真空下で乾燥して２−（４，６−ジクロロピリミジン−２−イル）−４−メチルチアゾール（７）（１９．５ｇ、７９．５９ｍｍｏｌ、４ステップで３２％）を淡黄色の固体として得た。ＭＳ（ＭＨ＋）：ｍ／ｚ＝２４５．９。
【００６４】
[0059]  ステップ７：
【００６５】
【化１４】
2020504165.tif 000015
【００６６】
[0060]  テフロン被覆撹拌棒を備えた二口丸底フラスコに２−（４，６−ジクロロピリミジン−２−イル）−４−メチルチアゾール（１９．０ｇ、７７．５６ｍｍｏｌ）および４，  ４−ジフルオロシクロヘキサン−１−アミノ塩酸塩（１３．３０ｇ、７７．５６ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（１９０ｍＬ）懸濁液を加えた。炭酸セシウム（３７．８９ｇ、１１６．３４ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を８０℃にて１６時間加熱した。反応の経過をＴＬＣによってモニタリングした。反応混合物を室温に冷却し、濾過し、固体を酢酸エチル（５００ｍＬ）で洗浄した。濾液を水（２×１００ｍＬ）、ブライン（１００ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水し、減圧下で濃縮した。残留物をカラムクロマトグラフィー（６０〜１２０のシリカゲル）により精製し、ヘキサン中の１５％ＥｔＯＡｃによって溶出した。必要な化合物を含有する関連する画分を合わせ、減圧下で蒸発乾固して６−クロロ−Ｎ−（４，４−ジフルオロシクロヘキシル）−２−（４−メチルチアゾール−２−イル）ピリミジン−４−アミン（２２．５ｇ、６５．２５ｍｍｏｌ、８４％）をオフホワイトの発泡固体として得た。ＭＳ（ＭＨ＋）：ｍ／ｚ＝３４４．９。
【００６７】
[0061]  ステップ８：
【００６８】
【化１５】
2020504165.tif 000016
【００６９】
[0062]  テフロン被覆撹拌棒を備えた二口丸底フラスコにメタノール（４５０ｍＬ）中の６−クロロ−Ｎ−（４，４−ジフルオロシクロヘキシル）−２−（４−メチルチアゾール−２−イル）ピリミジン−４−アミン（２７．０ｇ、７８．４７ｍｍｏｌ）を加えた。ナトリウムメトキシド（２１．１９ｇ、３９２．３６ｍｍｏｌ）を添加し、８０℃にて１６時間加熱した。反応の経過をＴＬＣによってモニタリングした。過剰なメタノールを減圧下で除去し、残留物を１０％塩化アンモニウム水溶液（１００ｍＬ）で希釈し、酢酸エチル（３×１５０ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、水（２×１００ｍＬ）、ブライン（１００ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水して、減圧下で濃縮した。残留物を、ヘキサン中の３５〜４０％ＥｔＯＡｃによって溶出するカラムクロマトグラフィー（６０〜１２０のシリカゲル）によって精製した。標的化合物を含有する関連する画分を合わせ、減圧下で蒸発乾固してＮ−（４，４−ジフルオロシクロヘキシル）−６−メトキシ−２−（４−メチルチアゾール−２−イル）ピリミジン−４−アミン（３）（２３．４ｇ、６８．８２ｍｍｏｌ、８７％）を得た。ＭＳ（ＭＨ＋）：ｍ／ｚ＝３４１．０．分析データ：1H-NMR (400MHz, DMSO-d6): δ7.41 (s, 1H), 7.40 (s, 1H), 5.81 (s, 1H), 3.87 (s, 3H), 2.43 (s, 3H), 2.08-1.89 (m, 6H), 1.61-1.52 (m, 2H).
（Ｓ）−１−（６−（（４，４−ジフルオロシクロヘキシル）アミノ）−２−（４−メチルチアゾール−２−イル）ピリミジン−４−イル）エタン−１−オール
[0063]  ステップ１：
【００７０】
【化１６】
2020504165.tif 000017
【００７１】
[0064]  テフロン被覆撹拌棒（２ｃｍ）を備えた２５０ｍＬの封管に６−クロロ−Ｎ−（４，４−ジフルオロシクロヘキシル）−２−（４−メチルチアゾール−２−イル）ピリミジン−４−アミン（４．９ｇ、１４．２４ｍｍｏｌ、１．０当量）およびトリブチル（１−エトキシビニル）スタンナン（５．６５ｇ、１５．６６ｍｍｏｌ、１．１当量）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（６０ｍＬ）溶液を加えた。反応混合物を、アルゴン気体を使用して５〜１０分間脱気した、続いてビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）二塩化物（０．２ｇ、０．２８ｍｍｏｌ、０．０２当量）を添加した。反応混合物を密閉し、８０℃にて１６時間加熱し（ＬＣＭＳにより反応の完了を決定した）、室温に冷却した。反応混合物を水（３００ｍＬ）で希釈し、酢酸エチル（２×１５０ｍＬ）で抽出した。有機物を合わせ、硫酸ナトリウムで脱水し、濾過し、蒸発させて粗生成物を淡褐色の粘着性の固体として得た。粗製物をカラムクロマトグラフィー（溶媒系として酢酸エチル／ヘキサン）により精製してＮ−（４，４−ジフルオロシクロヘキシル）−６−（１−エトキシビニル）−２−（４−メチルチアゾール−２−イル）ピリミジン−４−アミン（４．１ｇ、１０．７８ｍｍｏｌ、７５％）をオフホワイトの固体として得た。ＭＳ（ＭＨ＋）：ｍ／ｚ＝３８１．０。
【００７２】
[0065]  ステップ２：
【００７３】
【化１７】
2020504165.tif 000018
【００７４】
[0066]  テフロン被覆撹拌棒を備えた丸底フラスコにアセトン（１２０ｍＬ）中のＮ−（４，４−ジフルオロシクロヘキシル）−６−（１−エトキシビニル）−２−（４−メチルチアゾール−２−イル）ピリミジン−４−アミン（９．０ｇ、２３．６７ｍｍｏｌ、１．０当量）を加え、続いて２Ｎ塩酸水溶液（２０ｍＬ）を添加した。反応混合物を室温にて３時間撹拌し、反応の完了をＬＣＭＳにより決定した。反応混合物を濃縮してアセトンを除去し、氷冷水（１００ｍＬ）で希釈し、飽和炭酸ナトリウム溶液によって塩基性化し、酢酸エチル（２×１００ｍＬ）で抽出した。有機物を合わせ、硫酸ナトリウムで脱水して、濾過し、減圧下で蒸発させて粗生成物を淡褐色の粘着性の固体として得た。粗製物をカラムクロマトグラフィー（溶媒系として酢酸エチル／ヘキサン）により精製して１−（６−（（４，４−ジフルオロシクロヘキシル）アミノ）−２−（４−メチルチアゾール−２−イル）ピリミジン−４−イル）エタン−１−オン（６．１ｇ、１７．３２ｍｍｏｌ、７３％）をオフホワイトの固体として得た。ＭＳ（ＭＨ＋）：ｍ／ｚ＝３５３．０。
【００７５】
[0067]  ステップ３：
【００７６】
【化１８】
2020504165.tif 000019
【００７７】
[0068]  テフロン被覆撹拌棒を備えた丸底フラスコにメタノール（８０ｍＬ）中の１−（６−（（４，４−ジフルオロシクロヘキシル）アミノ）−２−（４−メチルチアゾール−２−イル）ピリミジン−４−イル）エタン−１−オン（５．６ｇ、１５．９０ｍｍｏｌ、１．０当量）を−１０℃にて加え、続いて水素化ホウ素ナトリウム（０．３０２ｇ、７．９５ｍｍｏｌ、０．５当量）を加えた。反応混合物を同じ温度で１時間撹拌し、反応の完了をＬＣＭＳによって決定した。反応混合物を水でクエンチし、減圧下で濃縮してメタノールを除去した。残留物を氷冷水（１００ｍＬ）で希釈し、酢酸エチル（２×１００ｍＬ）で抽出した。有機物を合わせ、硫酸ナトリウムで脱水して、濾過し、減圧下で蒸発させてラセミ混合物の１−（６−（（４，４−ジフルオロシクロヘキシル）アミノ）−２−（４−メチルチアゾール−２−イル）ピリミジン−４−イル）エタン−１−オール（４）（５．５ｇ、１５．５３ｍｍｏｌ、９７％）をオフホワイトの固体として得た。ＭＳ（ＭＨ＋）：ｍ／ｚ＝３５５．０。
【００７８】
[0069]  ステップ４：
【００７９】
【化１９】
2020504165.tif 000020
【００８０】
[0070]  ラセミ化合物の１−（６−（（４，４−ジフルオロシクロヘキシル）アミノ）−２−（４−メチルチアゾール−２−イル）ピリミジン−４−イル）エタン−１−オール（４）（５．５ｇ）をキラルＨＰＬＣ（カラム：Ｃｈｉｒａｌｐａｋ−ＩＣ（２５０×２０×５．０μ）；移動相Ａ：Ｎ−ヘキサン（０．１％ＤＥＡ）、移動相Ｂ：ＩＰＡ：ＤＣＭ（９０：１０）；均一濃度：５０：５０（Ａ：Ｂ）；流速：１５．０ｍｌ／分；１２０／注入；実行時間：１５分）により精製して第１の溶出画分（ピーク１、ＲＴ＝４．２４分）から（Ｓ）−１−（６−（（４，４−ジフルオロシクロヘキシル）アミノ）−２−（４−メチルチアゾール−２−イル）ピリミジン−４−イル）エタン−１−オール（５）（２．１ｇ、５．９３ｍｍｏｌ、３８％）をオフホワイトの固体として得た。1H-NMR (400MHz, DMSO-d6): δ7.59-7.57 (d, J=6.0Hz, 1H), 7.37 (s, 1H), 6.64 (s, 1H), 5.37-5.36 (d, J=4.4Hz, 1H), 4.52-4.50 (t, J=11.2Hz, 5.6Hz, 1H), 4.05 (bs, 1H), 2.43 (s, 3H), 2.10-1.96 (m, 6H), 1.62-1.59 (m, 2H), 1.35-1.33 (d, J=6.4Hz, 3H).その他の鏡像異性体：第２の溶出画分（ピーク２、ＲＴ＝６．４５分）からのオフホワイトの固体としての（Ｒ）−１−（６−（（４，４−ジフルオロシクロヘキシル）アミノ）−２−（４−メチルチアゾール−２−イル）ピリミジン−４−イル）エタン−１−オール（６）（２．０５ｇ、５．７８ｍｍｏｌ、３７％）。ＭＳ（ＭＨ＋）：ｍ／ｚ＝３５５．０。1H-NMR (400MHz, DMSO-d6): δ7.60-7.59 (d, J=5.6Hz, 1H), 7.37 (s, 1H), 6.64 (s, 1H), 5.38 (bs, 1H), 4.52-4.51 (d, J=6.8Hz, 1H), 4.10 (bs, 1H), 2.43 (s, 3H), 2.10-1.91 (m, 6H), 1.65-1.57 (m, 2H), 1.35-1.34 (d, J=6.8Hz, 3H).
２−（３−シクロプロピル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）−Ｎ−（４，４−ジフルオロシクロヘキシル）−６−モルホリノピリミジン−４−アミン
[0071]  ステップ１：
【００８１】
【化２０】
2020504165.tif 000021
【００８２】
[0072]  テフロン被覆撹拌棒（３ｃｍ）、１つのセプタム（口１）、ストッパー（口３）、および油で満たした窒素ガス出入口Ｕ字管アダプターを備えた還流冷却器（口２）を備えた火炎乾燥した１０００ｍＬの三口丸底フラスコに４，６−ジクロロ−２−（メチルチオ）ピリミジン（１５０ｇ、７６８．９４ｍｍｏｌ、１．０当量．）のアセトニトリル（１５００ｍＬ）溶液を加え、続いて４，４−ジフルオロシクロヘキシルアミン塩酸塩（１５８．３５ｇ、９２２．７３３ｍｍｏｌ）および炭酸セシウム（５２６ｇ、１６１４ｍｍｏｌ、２．１当量）を加えた。反応混合物を７５℃にて１６時間加熱した。反応混合物を濾過して炭酸セシウムを除去し、次いで濾液を減圧下で濃縮して６−クロロ−Ｎ−（４，４−ジフルオロシクロヘキシル）−２−（メチルチオ）ピリミジン−４−アミンの２１０ｇ（収率９３％）を淡黄色の固体として得た。ＭＳ（ＭＨ＋）：ｍ／ｚ＝２９４．０。
【００８３】
[0073]  ステップ２：
【００８４】
【化２１】
2020504165.tif 000022
【００８５】
[0074]  ６−クロロ−Ｎ−（４，４−ジフルオロシクロヘキシル）−２−（メチルチオ）ピリミジン−４−アミン（６０ｇ、２０４．２４ｍｍｏｌ、１．０当量）およびモルホリン（３５．６ｍＬ、４０８．４８ｍｍｏｌ、２．０当量）のアセトニトリル（６００ｍＬ）溶液を封管中で８５℃にて１６時間加熱した。反応の完了後、反応混合物を濃縮し、得られた残留物を氷冷水でクエンチした。得られた固体を濾過し、水（５００ｍＬ）、ヘキサン（２５０ｍＬ）で洗浄し、高真空下で乾燥させてＮ−（４，４−ジフルオロシクロヘキシル）−２−（メチルチオ）−６−モルホリノピリミジン−４−アミン（６２ｇ、収率８８％）をオフホワイトの固体として得た。ＭＳ（ＭＨ＋）：ｍ／ｚ＝３４５．２。
【００８６】
[0075]  ステップ３：
【００８７】
【化２２】
2020504165.tif 000023
【００８８】
[0076]  テフロン被覆撹拌棒（３ｃｍ）、１つのセプタム（口１）、ストッパー（口３）および油で満たした窒素ガス出入口Ｕ字管アダプターを備えた還流冷却器（口２）を備えた火炎乾燥した１００ｍＬの三口丸底フラスコにＮ−（４，４−ジフルオロシクロヘキシル）−２−（メチルチオ）−６−モルホリノピリミジン−４−アミン（１ｇ、２．９０ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（１５ｍＬ）溶液を加え、続いて４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（０．１ｇ、０．８７ｍｍｏｌ、０．３当量）、トリエチルアミン（１．２ｍＬ、８．７１ｍｍｏｌ、３．０当量）およびＢｏｃ無水物（３．１６ｇ、１４．５１ｍｍｏｌ、５．０当量）を加え、次いで反応混合物を８０℃にて１６時間加熱した。反応の完了後、反応混合物を水でクエンチし、酢酸エチル（２×７５ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで脱水し、濃縮してｔｅｒｔ−ブチル（４，４−ジフルオロシクロヘキシル）（２−（メチルチオ）−６−モルホリノピリミジン−４−イル）カルバメート（１．１ｇ、８５％）を黄色のゴムとして得た。ＭＳ（ＭＨ＋）：ｍ／ｚ＝４４５．２。
【００８９】
[0077]  ステップ４：
【００９０】
【化２３】
2020504165.tif 000024
【００９１】
[0078]  油で満たした窒素ガス出入口Ｕ字管アダプター、テフロン被覆撹拌棒（１ｃｍ）を備えた還流冷却器を接続した１００ｍＬの一口丸底フラスコにｔｅｒｔ−ブチル（４，４−ジフルオロシクロヘキシル）（２−（メチルチオ）−６−モルホリノピリミジン−４−イル）カルバメート（５０ｇ、１１２．４７ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（６００ｍＬ）溶液を加え、続いて３−クロロ過安息香酸（ｍ−クロロ過安息香酸）（５８．２ｇ、３３７．４２ｍｍｏｌ、３．０当量）を０℃にて加えた。反応混合物をゆっくり室温に加温し、３０分間撹拌した。反応の完了後、反応混合物を飽和重炭酸塩溶液でクエンチし、ジクロロメタン（２×２５０ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで脱水し、濃縮してｔｅｒｔ−ブチル（４，４−ジフルオロシクロヘキシル）（２−（メチルスルホニル）−６−モルホリノピリミジン−４−イル）カルバメート（５２ｇ、収率９７％）をオフホワイトのゴムとして得た。ＭＳ（ＭＨ＋）：ｍ／ｚ＝４７７．３。
【００９２】
[0079]  ステップ５：
【００９３】
【化２４】
2020504165.tif 000025
【００９４】
[0080]  油で満たした窒素ガス出入口Ｕ字管アダプター、テフロン被覆撹拌棒（２ｃｍ）を備えた還流冷却器を接続した１００ｍＬの一口丸底フラスコにｔｅｒｔ−ブチル（４，４−ジフルオロシクロヘキシル）（２−（メチルスルホニル）−６−モルホリノピリミジン−４−イル）カルバメート（０．９ｇ、１．８８ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（１０ｍＬ）溶液を加え、続いて３−シクロプロピル−１Ｈ−ピラゾール（０．３ｇ、２．８３ｍｍｏｌ、１．５当量）および炭酸セシウム（１．２３ｇ、３．７７ｍｍｏｌ、２．０当量）を加えた。反応混合物を８０℃にて１６時間加熱し、反応の完了をＴＬＣおよびＬＣＭＳによって決定した。反応混合物を濾過し、濾液を濃縮した。粗生成物を、溶媒系としての酢酸エチル−石油エーテルと共に６０〜１２０のシリカゲルを使用したカラムクロマトグラフィーによって精製した。単離された物質を真空下で乾燥させてｔｅｒｔ−ブチル（２−（３−シクロプロピル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）−６−モルホリノピリミジン−４−イル）（４，４−ジフルオロシクロヘキシル）カルバメート（０．８ｇ、８４％）をオフホワイトの固体として得た。ＭＳ（ＭＨ＋）：ｍ／ｚ＝５０５。
【００９５】
[0081]  ステップ６：
【００９６】
【化２５】
2020504165.tif 000026
【００９７】
[0082]  テフロン被覆撹拌棒（２ｃｍ）、１つのセプタム（口１）、ストッパー（口３）および油で満たした窒素ガス出入口Ｕ字管アダプター（口２）を備えた火炎乾燥した１００ｍＬの三口丸底フラスコにｔｅｒｔ−ブチル（２−（３−シクロプロピル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）−６−モルホリノピリミジン−４−イル）（４，４−ジフルオロシクロヘキシル）カルバメート（１．２ｇ、１．９８ｍｍｏｌ、１当量）のジクロロメタン（４０ｍＬ）溶液を加え、続いてトリフルオロ酢酸（２．５ｍＬ、３２．５５ｍｍｏｌ、１６．４当量）を０℃にて加えた。反応混合物を、室温にゆっくり加温し、同じ温度で６時間撹拌した。反応の完了をＴＬＣおよびＵＰＬＣによって決定した。反応混合物を濃縮し、得られた残留物を１０％飽和炭酸水素ナトリウム溶液でクエンチし、酢酸エチル（２×１００ｍＬ）で抽出し、減圧下で濃縮して粗生成物を得た。粗生成物を、６０〜１２０のシリカゲル、溶媒系として酢酸エチル−石油エーテルを使用したカラムクロマトグラフィーによって精製した。得られた固体を真空下で乾燥させて２−（３−シクロプロピル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）−Ｎ−（４，４−ジフルオロシクロヘキシル）−６−モルホリノピリミジン−４−アミン（７）（０．７３ｇ、９０％）を得た。ＭＳ（ＭＨ＋）：ｍ／ｚ＝４０５。分析データ：1H-NMR (400MHz, DMSO-d6): δ8.39 (d, J=2.4Hz, 1H), 7.08 (d, J=8.0Hz, 1H), 6.14 (d, J=2.80Hz, 1H), 5.53 (s, 1H), 3.88 (s, 1H), 3.69-3.67 (m, 4H), 3.50 (m, 4H), 1.99-1.90 (m, 7H), 1.56-1.54 (m, 2H), 0.93-0.89 (m, 2H), 0.72-0.71 (m, 2H).
生物学的アッセイ
[0083]  生物活性を以下の通りに測定した。小コンダクタンスＣａ２＋活性化Ｋ＋チャネル（ＳＫチャネル、サブタイプ２）を通るイオン電流を、Ｈｏｕｇａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １５１，６５５−６６５，Ｍａｙ  ８，２００７（その教示全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、ＳＫ２チャネルを発現するＨＥＫ２９３培養細胞を使用したパッチクランプセットアップでのホールセル構成のパッチクランプ法を使用して測定した。一態様では、化合物がこのアッセイにおいて電流を増加させる場合、例えば、このアッセイにより決定した場合の当該化合物のＳＣ１００値が１０μＭ以下である場合、当該化合物はＳＫのポジティブアロステリックモジュレーター（ＰＡＭ）であると定義される。ＳＣ１００値は、基礎電流を１００％増加させる化合物の濃度と定義される。
【００９８】
[0084]  ＳＣ１００値を表１に示す。
[0085]  ハルマリン誘発性振戦に対する化合物（１）の治療効果を調べるため、ハルマリン注射の３０分前に雄性スプラーグドーリーラットに媒体、１０または３０ｍｇ／Ｋｇの化合物（１）のいずれかを経口投与によって投与した。ハルマリン注射直後に動物を、振戦を定量化する装置に配置し、振戦事象を６０分間定量化した。振戦事象のシグナルは、動物の右前足に装着された小型の金属バンド送信器が実験用装置内のループアンテナによって発生する電磁場の中で動く際に発生した。増幅器からの出力を１，０００Ｈｚのサンプリングレートでデジタル化し、シグナルをＬａｂＶｉｅｗソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して処理および分析した。歩行およびグルーミング行動からのシグナルを最小限にするために、シグナルを１２８ｍｓの重み付けのない移動平均フィルタによってフィルタリングし、＞０．５Ｖの振幅かつ＞３００ｍｓの間続く事象を振戦事象として計算に入れた。試験にわたって１分区間でデータを分析し、６０分の試験全体にわたる振戦事象の合計として表示した。図１で示すように、振戦の有意な抑制が、３０ｍｇ／Ｋｇの化合物（１）の投与量で観察された。
【００９９】
[0086]  化合物（１）による振戦の減少は、床反力加速度計による全身振戦の頻度の測定によっても実証された。
[0087]  全身振戦は、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ社（米国カリフォルニア州サンディエゴ市）のＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｔｒｅｍｏｒ Ｍｏｎｉｔｏｒで測定された。動物に５ｍｇ／ｋｇのハルマリンを腹腔内投与する３０分前に、３、１０または３０ｍｇ／ｋｇの化合物（１）を事前に経口投与した。ハルマリン投与の後３０分間振戦を測定し、データを高速フーリエ変換によって分析し、頻度のパワースペクトルとして記録した。ハルマリンは、１０と１４Ｈｚの間の周波数バンドでパワースペクトルの有意な増加を引き起こした。この範囲では、３、１０および３０ｍｇ／ｋｇの全てが振戦を有意に低下させた。９〜１３Ｈｚのバンドのパワーをスペクトル全体（０〜３０Ｈｚ）の全パワーで除算し１００を乗算したものと定義される％動作パワー（％ＭＰ）を算出することによってデータを更に分析した。この分析によって、３、１０および３０ｍｇ／ｋｇは、ハルマリン誘発性振戦を有意に低下させた（ハルマリン＋媒体（ｎ＝１３）；ハルマリン＋３ｍｇ／ｋｇの化合物（１）（ｎ＝８）、Ｐ＜０．０１；１０ｍｇ／ｋｇの化合物（１）（ｎ＝１６）および３０ｍｇ／ｋｇの化合物（１）（ｎ＝１３）のそれぞれ、Ｐ＜０．０５）（図２）。
【０１００】
[0088]  総合すると、これらのデータは、化合物（１）が２つの異なる実験計画で測定したハルマリン誘発性振戦を有意に低下させることを示す。
[0089]  化合物がｉｎ  ｖｉｖｏでＳＫ２チャネルを調節する程度は、脳内の遊離薬物濃度の、ＳＫ２チャネルに対する化合物の測定された効力に対する比率である％ＳＫ２  ＳＣ１００として表現される。それは以下の通りに算出される：ＣＦＢ＝ＣＭＢ×ＢＦＦ（式中、ＣＭＢは、振戦の記録直後に摘出された脳から液体クロマトグラフィー質量分析により測定した化合物の濃度である（表１、「測定脳内濃度」）。ＣＦＢは、タンパク質と複合体を形成しておらず、したがって、ＳＫ２チャネルと自由に相互作用することができる遊離化合物の量である（表１、「算出遊離脳内濃度」）。ＢＦＦは、独立した実験において平衡透析により測定した化合物の平均遊離画分である（１０％のラット脳組織ホモジネート中で３７℃にて５時間インキュベートした１μＭの試験濃度）（表１、「脳内遊離画分」）。ＳＫ２チャネルと相互作用するために利用することができる脳内の遊離薬物（ＣＦＢ）を、測定脳内総レベル（ＣＭＢ）に平均遊離画分（ＢＦＦ）を乗算することによって得る。
【０１０１】
[0090]  次いで、遊離化合物の量を以下の通りにＳＫ２チャネルに対するその効力に換算して表記する：％ＳＫ２  ＳＣ１００＝ＣＦＢ／ＳＫ２  ＳＣ１００×１００（式中、ＳＫ２  ＳＣ１００（表１、「ＳＫ２  ＳＣ１００」）は、化合物のＳＫ２チャネルに関する効力の測定値であり、％ＳＫ２  ＳＣ１００（表１、「％ＳＫ２  ＳＣ１００」）は、ＳＫ２  ＳＣ１００に対して正規化した遊離脳内濃度（ＣＦＢ）である）。値を表１に示す。
【０１０２】
【表１】
2020504165.tif 000027
【０１０３】
ＳＣＡ２  ５８Ｑトランスジェニックマウスからのｅｘ  ｖｉｖｏ切片におけるプルキンエ細胞の不規則発火に対する効果
[0091]  ＳＣＡ２  ５８Ｑマウスからの小脳切片においてプルキンエ神経細胞は、活動電位間の発火間隔規則性の指標である、発火時間間隔の変動係数（ＩＳＩ  ＣＶ）の増加として測定可能な無秩序な発火を示す。野生型（Ｎ＝８）とＳＣＡ２  ５８Ｑ（Ｎ＝１１）マウス間のＩＳＩ  ＣＶの差を図３に示す（Ｐ＜０．００５）。同様に示されるように、１μＭ（Ｎ＝１１）または３μＭ（Ｎ＝１０）の化合物（１）を連続的にバスに適用すると、１１ヵ月齢のＳＣＡ２  ５８Ｑマウスからの小脳切片において観察されたＩＳＩ  ＣＶの増加を部分的に逆転させた（Ｐ＜０．０５）。これらのデータは、化合物（１）がこの脊髄小脳失調症のマウスモデルにおける発火時間間隔を部分的に回復させることによってプルキンエ細胞発火を規則化することを示す。
【０１０４】
周期性失調症２型（ＥＡ２）のＴｏｔｔｅｒｉｎｇマウスモデルにおける化合物の効果の評価
[0092]  化合物（１）は、遺伝失調症（ＥＡ２）およびＥＴ（ハルマリン誘発性振戦）の有効な動物モデルにおいて有効性を実証した。化合物（１）が疾患モデルの運動失調を軽減することができるかどうか調べるために、ＥＡ２の「Ｔｏｔｔｅｒｉｎｇ」マウスモデルにおいて評価した。このマウスはＰ／Ｑ  Ｃａ２＋チャネル（ＳＣＡ６において変異している同じタンパク質）の機能喪失変異に起因するプルキンエ細胞のペースメーカ発火の不規則性から生じる基礎運動失調を示し、これにより周期性失調症２型（ＥＡ２）を引き起こす。動物を平行なロッドフロア装置で評価した。この装置は、動物の足が均等に間隔に並んだ金属棒を滑り落ちた回数および動物が進んだ合計距離を自動的に計数する。次いで基準運動失調を、センチメートルでの動物の合計移動距離で除算した足滑りの総数である運動失調比として表記した。野生型とＥＡ２マウスとの間での運動失調比の増加を図４に示す。
【０１０５】
[0093]  この試験において、ＥＡ２マウス（８〜１０ヵ月齢；ｎ＝１８）は、平行なロッドフロア装置に配置される３０分前に、化合物（１）または媒体を腹腔内注射された。動物を、各々の動物に媒体および１０ｍｇ／ｋｇの化合物（１）を投与する交差実験法で評価した。投与間の化合物のウォッシュアウトを３日とした。化合物（１）は、この試験において投与された投与量で、野生型マウスと比較してＥＡ２マウスにおいて観察される運動失調比の増加を完全に逆転させた。これらのデータは、化合物（１）が遺伝性小脳性運動失調モデルにおけるこの運動機能の測定において正常なパフォーマンスを回復することを示す。
【０１０６】
比較優位性
[0094]  以下の研究は、本明細書において開示される化合物の更なる技術的利点を示す。
【０１０７】
[0095]  化合物の水溶解度（動力学的溶解度）試験を、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）中で実施し、フラスコ振盪法で測定した。このアッセイにおいて、試験化合物のＤＭＳＯ保存液を緩衝剤に添加し、続いて平衡化（振盪）、濾過およびＨＰＬＣ−ＵＶによる溶解量の決定を行う。アッセイで使用した条件を以下に要約する。結果を表２および表３に示す。
【０１０８】
化合物濃度：１％のＤＭＳＯを含有する２００μＭ（ｎ＝２）
水性緩衝液：０．０５Ｍのリン酸塩緩衝系（ｐＨ７．４）
平衡化時間：撹拌しながら室温（約２３℃）にて１６時間
試料調製：濾過
分析：ＨＰＬＣ−ＵＶ
基準化合物：カフェイン（高溶解性）およびジエチルスチルベストロール（難溶解性）
[0096]  化合物の代謝安定性プロファイリングを、肝ミクロソームで実施した。このアッセイでは、試験化合物を２つの時点に関してＮＡＤＰＨの存在下で肝ミクロソームと共に３７℃にてインキュベートする。インキュベーション終了後、内部標準を含有するアセトニトリルによって反応をクエンチし、残存親化合物をＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって決定した。アッセイで使用した条件を以下に要約する。結果を表２に示す。
【０１０９】
インキュベーション時間：ｐＨ７．４、３７℃にて０分および３０分
試験濃度：ｐＨ７．４の０．０２％ＤＭＳＯ中の１μＭ（ｎ＝２）
アッセイにおけるＮＡＤＰＨ濃度：１ｍＭ
アッセイにおける肝ミクロソームタンパク質濃度：０．５ｍｇ／ｍｌ
分析：ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ
報告されるデータ：％残存親化合物（％ＰＣＲ）
高クリアランスおよび低クリアランスの基準化合物を含める
試験される種：マウス、ラット、イヌ、サルおよびヒト
[0097]  本明細書において表現される化合物を、５つのアイソフォーム（３Ａ４、２Ｄ６、２Ｃ９、２Ｃ１９および１Ａ２）にわたるＣＹＰ阻害について試験した。このアッセイでは、試験化合物の存在下でＣＹＰアイソフォーム特異的基質をヒト肝ミクロソーム（ＨＬＭ）とインキュベートし、代謝産物の生成を決定する。試験化合物の異なる濃度での代謝産物生成の阻害百分率を計算して、ＩＣ５０を決定する。アッセイで使用した条件を以下に要約する。結果を表２に示す。
【０１１０】
試験薬（阻害剤）濃度：８つの異なる濃度（０．００５μＭ〜１００μＭ）
マトリックス：ヒト肝ミクロソーム（インビトロジェン、ライフテクノロジーズ）
以下に示すアイソフォームに特異的なプローブ基質を使用する：
ＣＹＰ３Ａ４：ミダゾラム
ＣＹＰ２Ｄ６：ブフラロール
ＣＹＰ２Ｃ９：ジクロフェナク
ＣＹＰ２Ｃ１９：メフェニトイン
ＣＹＰ１Ａ２：フェナセチン
コファクター：ＮＡＤＰＨ（アッセイにおいて最終１ｍＭ）
試料分析：ＬＣＭ／ＭＳ（代謝産物）
特異的な基準阻害剤を、全てのアッセイに含める
（ケトコナゾール／キニジン／スルファフェナゾール／チクロピジン／フラフィリン）
緩衝液：リン酸カリウム緩衝剤（１００ｍＭ、ｐＨ７．４）
アッセイにおけるＤＭＳＯレベル：０．１％
データ分析：対照に対する％阻害
[0098]  化合物を心臓カリウムチャネルｈＥＲＧアッセイで試験した。ｈＥＲＧは、ヒト心室における急速活性型遅延整流性電流（ＩＫｒ）を担う。ＩＫｒの阻害は、非心臓病薬による心活動電位延長の最もよく見られる原因である。例えば、Ｂｒｏｗｎ，Ａ．Ｍ．ａｎｄ Ｒａｍｐｅ，Ｄ．（２０００）．Ｄｒｕｇ-ｉｎｄｕｃｅｄ ｌｏｎｇ ＱＴ ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ｉｓ ＨＥＲＧ ｔｈｅ ｒｏｏｔ ｏｆ ａｌｌ ｅｖｉｌ? Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｎｅｗｓ ７，１５-２０を参照のこと。
【０１１１】
[0099]  ＨＥＫ−２９３細胞にｈＥＲＧのｃＤＮＡを安定的にトランスフェクトした。安定なトランスフェクタントを、発現プラスミドに組み込まれたＧ４１８耐性遺伝子との同時発現によって選択した。培養培地にＧ４１８を含めることによって、選択圧を維持した。細胞を、１０％のウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬのペニシリンＧナトリウム、１００μｇ／ｍＬの硫酸ストレプトマイシンおよび５００μｇ／ｍＬのＧ４１８を補充したダルベッコ改変イーグル培地／Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１２（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２）で培養した。細胞培養の記録は、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのファイルに保管されている。
【０１１２】
[00100]  細胞を記録チャンバーに移し、媒体対照溶液で灌流した。ホールセル記録のためのピペット溶液は以下の通りである（ｍＭでの組成）：アスパラギン酸カリウム、１３０；ＭｇＣｌ２、５；ＥＧＴＡ、５；ＡＴＰ、４；ＨＥＰＥＳ、１０；ＫＯＨによりｐＨを７．２に調整。ピペット溶液を数回に分けて調製し、等分し、凍結保存し、新鮮なアリコートを毎日解凍した。パッチピペットを、Ｐ９７マイクロピペットプラー（Ｓｕｔｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、カリフォルニア州ノバト）を使用してガラスキャピラリー管材料から作製した。市販のパッチクランプ増幅器をホールセル記録に使用した。デジタル化の前に、電流記録を１／５のサンプリング周波数でローパスフィルタを通した。
【０１１３】
[00101]  ｈＥＲＧ電流の開始および定常状態の阻害を、１０秒間隔で繰り返す固定振幅を有するパルスパターン（コンディショニングプレパルス：＋２０ ｍＶで２秒間；テストパルス：−５０ｍＶで２秒間）を使用して−８０ｍＶの保持電位から測定した。ピークテール電流を−５０ｍＶまで２秒きざみで測定した。
【０１１４】
[00102]  １つの被験物質濃度を各々の細胞（ｎ＝３）に適用した。ピーク電流を、テストランプの間で測定した。被験物質または陽性対照を適用する前に、定常状態を少なくとも３０秒間維持した。新たな定常状態に達するまでピーク電流を測定した。結果を表２に示す。
【０１１５】
[00103]  ラットにおける経口生物学的利用能のデータを以下の通りに収集した。結果を表２に示す。
ラット系統／性：スプラーグドーリー系／雄性
週齢／体重：６〜８週齢／２５０〜３００ｇｍ
群あたりの動物数：ｎ＝３
群の総数：２（１ｍｐｋ  ＩＶおよび１０ｍｐｋ  ＰＯ）
投与経路：経口（ＰＯ）／静脈内（ＩＶ）
投与液量：静脈内（２ｍｌ／ｋｇ）および経口（１０ｍｌ／ｋｇ）
製剤媒体：標準的な製剤またはスポンサーによって提案されたもの
投与量レベル（ＩＶおよびＰＯ）：１ｍｇ／ｋｇ；静脈内および１０ｍｇ／ｋｇ；経口または提案された方法
絶食／給餌：一晩絶食させた動物に経口投与を実施する
投与頻度：単回投与
採血の時点：（分析用に５７血漿試料）
ＩＶ−１０個の時点（投与前；５分；１５分；３０分；１時間；２時間；４時間；６時間；８時間；２４時間）［ｎ＝３ラット］
ＰＯ−９個の時点（投与前；１５分；３０分；１時間；２時間；４時間；６時間；８時間；２４時間）［ｎ＝３ラット］
血液試料採取：頸静脈カニューレ
抗凝固剤：０．２％のＫ２  ＥＤＴＡ
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムを使用して血漿中の試験化合物の評価するために開発された探索研究用生化学分析法による試料分析
【０１１６】
【表２】
2020504165.tif 000028
【０１１７】
[00104]  上記表２のデータが示すように、化合物（１）は、ＳＫ２に対して対照薬Ａの３倍超の効力があり、ＳＫ２に対して対照薬Ｂの１４倍超の効力がある。また化合物（１）は、対照薬Ａと比べてより良好な溶解性、より高いＢＦＦ、より高いミクロソーム安定性および高い経口生物学的利用能を有する。表３に示すように、対照薬Ａおよびフェニル誘導体である対照薬Ｃと比較したＢＦＦおよび溶解性の全体的な改善が本明細書に記載の化合物全体で実証された。比較の容易さのため、化合物（１）を上記から再掲する。
【０１１８】
【表３−１】
2020504165.tif 000029
【０１１９】
【表３−２】
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【０１２０】
[00105]  本発明者らは本発明の多数の実施形態を記載したが、本発明者らの基本例を改変して本発明の化合物および方法を利用する他の実施形態を提供してもよいことは明らかである。したがって、本発明の範囲は、一例として示されている特定の実施形態によってではなく添付の請求の範囲によって定義されることが理解されよう。
【０１２１】
[00106]  本出願を通して引用される全ての参考文献（参考文献、発行済み特許、公開特許出願および同時係属特許出願を含む）の内容は、参照によりその全体が本明細書に明示的に組み込まれる。特に定義されない限り、本願明細書において用いられる全ての科学技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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