(57)【要約】本発明は、少なくとも１種類の医薬薬剤に結合される「ジスインテグリン及びメタロプロテイナーゼドメインを含有するタンパク質９」（「ＡＤＡＭ９」）に特異的に結合することが可能な抗体またはそのフラグメントを含む免疫コンジュゲートに関する。本発明は、特に、ヒトＡＤＡＭ９及び非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）のＡＤＡＭ９と交差反応する、このような免疫コンジュゲートに関する。本発明は、更に、レシピエント対象にこのような免疫コンジュゲートを投与すると免疫原性の低下を示すようなヒト化及び／または脱免疫化された軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン及び／または重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含む、全てのこのような免疫コンジュゲートに関する。本発明はまた、このような免疫コンジュゲートのいずれかを含有する医薬組成物、並びにがん及び他の疾患及び状態の治療において、このような免疫コンジュゲートのいずれかの使用を伴う方法に関する。【選択図】１Ａ
2020504607.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントを含む免疫コンジュゲートであって、
（Ｉ）前記抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントは、医薬薬剤に結合されており、
（ＩＩ）前記抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントは、軽鎖可変（ＶＬ）ドメインと重鎖可変（ＶＨ）ドメインとを含み、前記重鎖可変ドメインは、ＣＤＲＨ１ドメイン、ＣＤＲＨ２ドメイン及びＣＤＲＨ３ドメインを含み、前記軽鎖可変ドメインは、ＣＤＲＬ１ドメイン、ＣＤＲＬ２ドメイン及びＣＤＲＬ３ドメインを含み、
（Ａ）前記ＣＤＲＨ１ドメイン、ＣＤＲＨ２ドメイン及びＣＤＲＨ３ドメインは、ＭＡＢ−Ａの最適化された変異体の重鎖可変（ＶＨ）ドメインのＣＤＲＨ１ドメイン、ＣＤＲＨ２ドメイン及びＣＤＲＨ３ドメインのアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲＬ１ドメイン、ＣＤＲＬ２ドメイン及びＣＤＲＬ３ドメインは、ＭＡＢ−Ａの軽鎖可変（ＶＬ）ドメインのＣＤＲＨ１ドメイン、ＣＤＲＨ２ドメイン及びＣＤＲＨ３ドメインのアミノ酸配列を有するか、または
（Ｂ）前記ＣＤＲＨ１ドメイン、ＣＤＲＨ２ドメイン及びＣＤＲＨ３ドメインは、ＭＡＢ−Ａの重鎖可変（ＶＨ）ドメインのＣＤＲＨ１ドメイン、ＣＤＲＨ２ドメイン及びＣＤＲＨ３ドメインのアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲＬ１ドメイン、ＣＤＲＬ２ドメイン及びＣＤＲＬ３ドメインは、ＭＡＢ−Ａの最適化された変異体の軽鎖可変（ＶＬ）ドメインのＣＤＲＬ１ドメイン、ＣＤＲＬ２ドメイン及びＣＤＲＬ３ドメインのアミノ酸配列を有するか、または
（Ｃ）前記ＣＤＲＨ１ドメイン、ＣＤＲＨ２ドメイン及びＣＤＲＨ３ドメインは、ＭＡＢ−Ａの最適化された変異体の重鎖可変（ＶＨ）ドメインのＣＤＲＨ１ドメイン、ＣＤＲＨ２ドメイン及びＣＤＲＨ３ドメインのアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲＬ１ドメイン、ＣＤＲＬ２ドメイン及びＣＤＲＬ３ドメインは、ＭＡＢ−Ａの最適化された変異体の軽鎖可変（ＶＬ）ドメインのＣＤＲＬ１ドメイン、ＣＤＲＬ２ドメイン及びＣＤＲＬ３ドメインのアミノ酸配列を有する、前記免疫コンジュゲート。
【請求項２】
前記抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントが、
（Ａ）（１）ＭＡＢ−Ａの重鎖可変（ＶＨ）ドメインのＣＤＲＨ１ドメイン、ＣＤＲＨ２ドメイン及びＣＤＲＨ３ドメイン、及び
（２）ＭＡＢ−Ａのヒト化変異体のＶＨドメインのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４、または
（Ｂ）（１）ＭＡＢ−Ａの軽鎖可変（ＶＬ）ドメインのＣＤＲＬ１ドメイン、ＣＤＲＬ２ドメイン及びＣＤＲＬ３ドメイン、及び
（２）ＭＡＢ−Ａのヒト化変異体のＶＬドメインのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４、または
（Ｃ）（１）ＭＡＢ−Ａの最適化された変異体の重鎖可変（ＶＨ）ドメインのＣＤＲＨ１ドメイン、ＣＤＲＨ２ドメイン及びＣＤＲＨ３ドメイン、及び
（２）ＭＡＢ−Ａのヒト化変異体のＶＨドメインのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４、または
（Ｄ）（１）ＭＡＢ−Ａの最適化された変異体の軽鎖可変（ＶＬ）ドメインのＣＤＲＬ１ドメイン、ＣＤＲＬ２ドメイン及びＣＤＲＬ３ドメイン、及び
（２）ＭＡＢ−Ａのヒト化変異体のＶＬドメインのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４、または
（Ｅ）（１）ＭＡＢ−Ａのヒト化／最適化された変異体の重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、
（２）ＭＡＢ−Ａのヒト化／最適化された変異体のＶＬ軽重鎖可変（ＶＬ）ドメイン
を含む、請求項１に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項３】
ＭＡＢ−Ａの前記最適化された変異体の前記重鎖可変（ＶＨ）ドメインのＣＤＲＨ１ドメイン、ＣＤＲＨ２ドメイン及びＣＤＲＨ３ドメインは、それぞれ、以下のアミノ酸配列：
（１）配列番号４７（ＳＹＷＸ１Ｈ）
（ここで、Ｘ１は、ＭまたはＩである）、
（２）配列番号４８（ＥＩＩＰＩＸ２ＧＨＴＮＹＮＥＸ３ＦＸ４Ｘ５）
（ここで、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４及びＸ５は、独立して選択され、
Ｘ２は、ＮまたはＦであり；Ｘ３は、ＫまたはＲであり；
Ｘ４は、ＫまたはＱであり、
Ｘ５は、ＳまたはＧである）、
（３）配列番号４９（ＧＧＹＹＹＹＸ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１ＤＹ）
（ここで、Ｘ６は、Ｐ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｔ、ＧまたはＤであり、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０及びＸ１１は、
（Ａ）Ｘ６がＰである場合、
Ｘ７は、ＫまたはＲであり；Ｘ８は、ＦまたはＭであり；Ｘ９は、Ｇであり；
Ｘ１０は、ＷまたはＦであり；Ｘ１１は、Ｍ、ＬまたはＫであり；
（Ｂ）Ｘ６が、Ｆ、ＹまたはＷである場合、
Ｘ７は、ＮまたはＨであり；Ｘ８は、ＳまたはＫであり；Ｘ９は、ＧまたはＡであり；
Ｘ１０は、ＴまたはＶであり；Ｘ１１は、Ｍ、ＬまたはＫであり；
（Ｃ）Ｘ６が、Ｉ、ＬまたはＶである場合、
Ｘ７は、Ｇであり；Ｘ８は、Ｋであり；Ｘ９は、ＧまたはＡであり；
Ｘ１０は、Ｖであり；Ｘ１１は、Ｍ、ＬまたはＫであり；
（Ｄ）Ｘ６がＴである場合、
Ｘ７は、Ｇであり；Ｘ８は、Ｋ、ＭまたはＮであり；Ｘ９は、Ｇであり；
Ｘ１０は、ＶまたはＴであり；Ｘ１１は、ＬまたはＭであり；
（Ｅ）Ｘ６がＧである場合、
Ｘ７は、Ｇであり；Ｘ８は、Ｓであり；Ｘ９は、Ｇであり；
Ｘ１０は、Ｖであり；Ｘ１１は、Ｌであり、
（Ｆ）Ｘ６がＤである場合、
Ｘ７は、Ｓであり；Ｘ８は、Ｎであり；Ｘ９は、Ａであり；
Ｘ１０は、Ｖであり；Ｘ１１は、Ｌであるように選択される）を有する、請求項１または２のいずれか一項に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の免疫コンジュゲートであって、ＭＡＢ−Ａの前記最適化された変異体の前記重鎖可変（ＶＨ）ドメインは、配列番号１５のアミノ酸配列を含み、
【化１】
2020504607.tif 000208
ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５及びＸ６は、独立して選択され、
Ｘ１は、ＭまたはＩであり；Ｘ２は、ＮまたはＦであり；
Ｘ３は、ＫまたはＲであり；Ｘ４は、ＫまたはＱであり；
Ｘ５は、ＳまたはＧであり、Ｘ６は、Ｐ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｔ、ＧまたはＤであり；
Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０及びＸ１１は、
Ｘ６がＰである場合、Ｘ７は、ＫまたはＲであり；Ｘ８は、ＦまたはＭであり；Ｘ９は、Ｇであり；Ｘ１０は、ＷまたはＦであり；Ｘ１１は、Ｍ、ＬまたはＫであり；
Ｘ６が、Ｆ、ＹまたはＷである場合、Ｘ７は、ＮまたはＨであり；Ｘ８は、ＳまたはＫであり；Ｘ９は、ＧまたはＡであり；Ｘ１０は、ＴまたはＶであり；Ｘ１１は、Ｍ、ＬまたはＫであり；
Ｘ６が、Ｉ、ＬまたはＶである場合、Ｘ７は、Ｇであり；Ｘ８は、Ｋであり；Ｘ９は、ＧまたはＡであり；Ｘ１０は、Ｖであり；Ｘ１１は、Ｍ、ＬまたはＫであり；
Ｘ６がＴである場合、Ｘ７は、Ｇであり；Ｘ８は、Ｋ、ＭまたはＮであり；Ｘ９は、Ｇであり；Ｘ１０は、ＶまたはＴであり；Ｘ１１は、ＬまたはＭであり；
Ｘ６がＧである場合、Ｘ７は、Ｇであり；Ｘ８は、Ｓであり；Ｘ９は、Ｇであり；Ｘ１０は、Ｖであり；Ｘ１１は、Ｌであり；
Ｘ６がＤである場合、Ｘ７は、Ｓであり；Ｘ８は、Ｎであり；Ｘ９は、Ａであり；Ｘ１０は、Ｖであり；Ｘ１１は、Ｌであるように選択される、前記免疫コンジュゲート。
【請求項５】
ＭＡＢ−Ａの前記最適化された変異体の前記重鎖可変（ＶＨ）ドメインは、
（１）ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＨ（１）（配列番号１６）；
（２）ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＨ（２）（配列番号１７）；
（３）ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＨ（３）（配列番号１８）；
（４）ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＨ（４）（配列番号１９）；
（５）ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＨ（２Ａ）（配列番号２０）；
（６）ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＨ（２Ｂ）（配列番号２１）；
（７）ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＨ（２Ｃ）（配列番号２２）；
（８）ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＨ（２Ｄ）（配列番号２３）；
（９）ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＨ（２Ｅ）（配列番号２４）；
（１０）ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＨ（２Ｆ）（配列番号２５）；
（１１）ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＨ（２Ｇ）（配列番号２６）；
（１２）ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＨ（２Ｈ）（配列番号２７）；
（１３）ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＨ（２Ｉ）（配列番号２８）；及び
（１４）ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＨ（２Ｊ）（配列番号２９）からなる群から選択される、請求項４に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項６】
ＭＡＢ−Ａの前記最適化された変異体の前記軽鎖可変（ＶＬ）ドメインの前記ＣＤＲＬ１ドメイン、ＣＤＲＬ２ドメイン及びＣＤＲＬ３ドメインは、それぞれ、
（１）配列番号６６（Ｘ１２ＡＳＱＳＶＤＹＸ１３ＧＤＳＹＸ１４Ｎ）
（ここで、Ｘ１２、Ｘ１３、Ｘ１４は、独立して選択され、
Ｘ１２は、ＫまたはＲであり；Ｘ１３は、ＤまたはＳであり；Ｘ１４は、ＭまたはＬである）；
（２）配列番号１３（ＡＡＳＤＬＥＳ）；及び
（３）配列番号６７（ＱＱＳＸ１５Ｘ１６Ｘ１７ＰＦＴ）
（ここで、Ｘ１５、Ｘ１６及びＸ１７は独立して選択され、
Ｘ１５は、ＨまたはＹであり；Ｘ１６は、ＥまたはＳであり；Ｘ１７は、ＤまたはＴである）
のアミノ酸配列を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の免疫コンジュゲートであって、前記軽鎖可変（ＶＬ）ドメインは、配列番号５３のアミノ酸配列を含む、
【化２】
2020504607.tif 000209
（ここで、Ｘ１２、Ｘ１３、Ｘ１４、Ｘ１５、Ｘ１６及びＸ１７は、独立して選択され、
Ｘ１２は、ＫまたはＲであり；Ｘ１３は、ＤまたはＳであり；
Ｘ１４は、ＭまたはＬであり；Ｘ１５は、ＨまたはＹであり；
Ｘ１６は、ＥまたはＳであり；Ｘ１７は、ＤまたはＴである）
前記免疫コンジュゲート。
【請求項８】
ＭＡＢ−Ａの前記最適化された変異体の前記軽鎖可変（ＶＬ）ドメインが、
（１）ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＬ（１）（配列番号５４）；
（２）ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＬ（２）（配列番号５５）；
（３）ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＬ（３）（配列番号５６）；
（４）ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＬ（４）（配列番号５７）；
（５）ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＬ（２Ａ）（配列番号２０）からなる群から選択される、請求項７に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項９】
前記ＣＤＲＨ１ドメインが、アミノ酸配列ＳＹＷＭＨ（配列番号８）を含み、前記ＣＤＲＨ２ドメインが、アミノ酸配列ＥＩＩＰＩＦＧＨＴＮＹＮＥＫＦＫＳ（配列番号３５）を含み、前記ＣＤＲＨ３ドメインが、アミノ酸配列ＧＧＹＹＹＹＰＲＱＧＦＬＤＹ（配列番号４５）を含む、請求項１に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項１０】
前記ＣＤＲＬ１ドメインが、アミノ酸配列ＫＡＳＱＳＶＤＹＳＧＤＳＹＭＮ（配列番号６２）を含み、前記ＣＤＲＬ２ドメインが、アミノ酸配列ＡＡＳＤＬＥＳ（配列番号１３）を含み、前記ＣＤＲＬ３ドメインが、アミノ酸配列ＱＱＳＨＥＤＰＦＴ（配列番号１４）を含む、請求項１または９のいずれか一項に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項１１】
前記免疫コンジュゲートが、
（Ａ）ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）の重鎖可変（ＶＨ）ドメイン（配列番号２８）；または
（Ｂ）ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）の軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン（配列番号５５）；または
（Ｃ）ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）の重鎖可変（ＶＨ）ドメイン（配列番号２８）及びｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）の軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン（配列番号５５）
を含む、請求項９または１０のいずれか一項に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項１２】
前記免疫コンジュゲートが、Ｆｃ領域を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項１３】
前記Ｆｃ領域が、
（ａ）ＦｃγＲに対する変異体Ｆｃ領域のアフィニティを下げる１つ以上のアミノ酸改変、及び／または
（ｂ）システイン残基を導入する１つ以上のアミノ酸改変
を含む変異体Ｆｃ領域である、請求項１２に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項１４】
ＦｃγＲに対する変異体Ｆｃ領域のアフィニティを下げる前記１つ以上のアミノ酸改変が、
（Ａ）Ｌ２３４Ａ；
（Ｂ）Ｌ２３５Ａ；または
（Ｃ）Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ
を含み、前記番号付けが、ＫａｂａｔにあるＥＵインデックスの番号付けである、請求項１３に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項１５】
システイン残基を導入する前記１つ以上のアミノ酸改変が、Ｓ４４２Ｃを含み、前記番号付けが、ＫａｂａｔにあるＥＵインデックスの番号付けである、請求項１３または１４のいずれか一項に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項１６】
前記免疫コンジュゲートが、ヒトＡＤＡＭ９及びｃｙｎｏＡＤＡＭ９に特異的に結合するヒト化抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントを含み、前記ヒト化抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントが、前記医薬薬剤に結合される、請求項１に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項１７】
前記ヒト化抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントが、
（ａ）それぞれ、配列番号８、３５及び１０及び配列番号６２、１３、１４；
（ｂ）それぞれ、配列番号８、３５及び１０及び配列番号６３、１３、１４；
（ｃ）それぞれ、配列番号８、３６及び１０及び配列番号６３、１３、１４
（ｄ）それぞれ、配列番号３４、３６及び１０及び配列番号６４、１３、６５
からなる群から選択される配列を有する、ＣＤＲＨ１ドメイン、ＣＤＲＨ２ドメイン及びＣＤＲＨ３と、ＣＤＲＬ１ドメイン、ＣＤＲＬ２ドメイン及びＣＤＲＬ３ドメインとを含む、請求項１６に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項１８】
前記ヒト化抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントが、
（ａ）それぞれ、配列番号１７及び配列番号５５；
（ｂ）それぞれ、配列番号１７及び配列番号５６；
（ｃ）それぞれ、配列番号１８及び配列番号５６；及び
（ｄ）それぞれ、配列番号１９及び配列番号５７
からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％の同一性を有する配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、請求項１６または１７に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項１９】
前記ヒト化抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントが、
（ａ）それぞれ、配列番号１７及び配列番号５５；
（ｂ）それぞれ、配列番号１７及び配列番号５６；
（ｃ）それぞれ、配列番号１８及び配列番号５６；及び
（ｄ）それぞれ、配列番号１９及び配列番号５７
からなる群から選択される配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、請求項１８に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項２０】
前記ヒト化抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントは、キメラまたはマウス親抗体と比較して、ｃｙｎｏＡＤＡＭ９に対する結合アフィニティが少なくとも１００倍向上し、ヒトＡＤＡＭ９に対する高いアフィニティを保持しているように最適化される、請求項１６に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項２１】
前記抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントが、
（ａ）それぞれ、配列番号８、３５及び３７及び配列番号６２、１３、１４；
（ｂ）それぞれ、配列番号８、３５及び３８及び配列番号６２、１３、１４；
（ｃ）それぞれ、配列番号８、３５及び３９及び配列番号６２、１３、１４；
（ｄ）それぞれ、配列番号８、３５及び４０及び配列番号６２、１３、１４；
（ｅ）それぞれ、配列番号８、３５及び４１及び配列番号６２、１３、１４；
（ｆ）それぞれ、配列番号８、３５及び４２及び配列番号６２、１３、１４；
（ｇ）それぞれ、配列番号８、３５及び４３及び配列番号６２、１３、１４；
（ｈ）それぞれ、配列番号８、３５及び４４及び配列番号６２、１３、１４；
（ｉ）それぞれ、配列番号８、３５及び４５及び配列番号６２、１３、１４；及び
（ｊ）それぞれ、配列番号８、３５及び４６及び配列番号６２、１３、１４
からなる群から選択される配列を有する、ＣＤＲＨ１ドメイン、ＣＤＲＨ２ドメイン及びＣＤＲＨ３ドメインと、ＣＤＲＬ１ドメイン、ＣＤＲＬ２ドメイン及びＣＤＲＬ３ドメインを含む、請求項２０に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項２２】
前記ヒト化抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントが、
（ａ）それぞれ、配列番号２０及び配列番号５５；
（ｂ）それぞれ、配列番号２１及び配列番号５５；
（ｃ）それぞれ、配列番号２２及び配列番号５５；
（ｄ）それぞれ、配列番号２３及び配列番号５５；
（ｅ）それぞれ、配列番号２４及び配列番号５５；
（ｆ）それぞれ、配列番号２５及び配列番号５５；
（ｇ）それぞれ、配列番号２６及び配列番号５５；
（ｈ）それぞれ、配列番号２７及び配列番号５５；
（ｉ）それぞれ、配列番号２８及び配列番号５５；及び
（ｊ）それぞれ、配列番号２９及び配列番号５５
からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％の同一性を有する配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、請求項２１に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項２３】
前記ヒト化抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントが、
（ａ）それぞれ、配列番号２０及び配列番号５５；
（ｂ）それぞれ、配列番号２１及び配列番号５５；
（ｃ）それぞれ、配列番号２２及び配列番号５５；
（ｄ）それぞれ、配列番号２３及び配列番号５５；
（ｅ）それぞれ、配列番号２４及び配列番号５５；
（ｆ）それぞれ、配列番号２５及び配列番号５５；
（ｇ）それぞれ、配列番号２６及び配列番号５５；
（ｈ）それぞれ、配列番号２７及び配列番号５５；
（ｉ）それぞれ、配列番号２８及び配列番号５５；及び
（ｊ）それぞれ、配列番号２９及び配列番号５５
からなる群から選択される配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、請求項２２に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項２４】
前記ヒト化抗ＡＤＡＭ９抗体が、Ｆｃ領域を含む全長抗体である、請求項１６〜２３のいずれか一項に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項２５】
前記ヒト化抗ＡＤＡＭ９抗体が、
（ａ）それぞれ、配列番号５０及び配列番号６８；
（ｂ）それぞれ、配列番号５１及び配列番号６８；及び
（ｃ）それぞれ、配列番号５２及び配列番号６８からなる群から選択される配列を有する重鎖と軽鎖とを含む、請求項２４に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項２６】
前記Ｆｃ領域が、以下を含む変異体Ｆｃ領域である、請求項１６〜２５のいずれか一項に記載の免疫コンジュゲート：
（ａ）Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ並びにＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａからなる群から選択される、ＦｃγＲに対する前記変異体Ｆｃ領域のアフィニティを下げる１つ以上のアミノ酸改変；及び／または
（ｂ）Ｓ４４２にシステイン残基を導入するアミノ酸改変を含む変異体Ｆｃ領域（前記番号付けは、ＫａｂａｔにあるＥＵインデックスの番号付けである）及び／または
（ｃ）Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅからなる群から選択されるＦｃＲｎに対する前記変異体Ｆｃ領域の半減期を延ばす１つ以上のアミノ酸置換。
【請求項２７】
前記ヒト化抗ＡＤＡＭ９抗体が、
（ａ）それぞれ、配列番号１４１及び配列番号６８；
（ｂ）それぞれ、配列番号１４２及び配列番号６８；
（ｃ）それぞれ、配列番号１４３及び配列番号６８；
（ｄ）それぞれ、配列番号１５１及び配列番号６８；
（ｅ）それぞれ、配列番号１５２及び配列番号６８；
（ｆ）それぞれ、配列番号１５３及び配列番号６８；及び
（ｇ）それぞれ、配列番号１５４及び配列番号６８
からなる群から選択される配列を有する重鎖と軽鎖とを含む、請求項２１に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項２８】
配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３または配列番号１５４のＸがリシンである、請求項２７に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項２９】
配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３または配列番号１５４のＸが存在しない、請求項２７に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項３０】
前記免疫コンジュゲートは、以下の式によって表され、
【化３】
2020504607.tif 000210
ここで、
ＣＢＡは、リシン残基を介してＣｙＬ１に共有結合する、請求項１〜１４及び１６〜２９のいずれか一項に記載の抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントであり；
ＷＬは、１〜２０の整数であり、
ＣｙＬ１は、以下の式
【化４】
2020504607.tif 000211
によって表されるか、またはその医薬的に許容される塩であり、
ＮとＣとの間の二重線
【化５】
2020504607.tif 000212
は、単結合または二重結合を表し、但し、二重結合である場合には、Ｘは存在せず、Ｙは、−Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ４）アルキルであり；単結合である場合には、Ｘは、−Ｈまたはアミン保護部分であり、Ｙは、−ＯＨまたは−ＳＯ３Ｈであるか、またはこれらの医薬的に許容される塩であり；
Ｗ’は、−ＮＲｅ’であり、
Ｒｅ’は、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−Ｒｋであり；
ｎは、２〜６の整数であり；
Ｒｋは、−Ｈまたは−Ｍｅであり；
Ｒｘ３は、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり；
Ｌ’は、以下の式
−ＮＲ５−Ｐ−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＲａＲｂ）ｍ−Ｃ（＝Ｏ）−  （Ｂ１’）；または
−ＮＲ５−Ｐ−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＲａＲｂ）ｍ−Ｓ−Ｚｓ１−  （Ｂ２’）
によって表され、
Ｒ５は、−Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ３）アルキルであり；
Ｐは、アミノ酸残基または２〜２０個のアミノ酸残基を含有するペプチドであり；
Ｒａ及びＲｂは、それぞれの場合に、それぞれ独立して、−Ｈ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、または帯電した置換基またはイオン化可能な基Ｑであり；
ｍは、１〜６の整数であり、
Ｚｓ１は、以下の式
【化６】
2020504607.tif 000213
【化７】
2020504607.tif 000214
のいずれか１つから選択され、
ｑは、１〜５の整数である、請求項１〜１４及び１６〜２９のいずれか一項に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項３１】
Ｒａ及びＲｂが両方ともＨであり；Ｒ５が、ＨまたはＭｅである、請求項３０に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項３２】
Ｐが、２〜５個のアミノ酸残基を含むペプチドである、請求項３０または３１に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項３３】
Ｐが、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ａｌａ、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｃｉｔ、Ｌｅｕ−Ｃｉｔ、Ｉｌｅ−Ｃｉｔ、Ｔｒｐ、Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ｐｈｅ−Ｎ９−トシル−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ｎ９−ニトロ−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号１４４）、β−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号１４５）、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ（配列番号１４６）、Ｖａｌ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ｖａｌ、Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ｖａｌ−Ｄ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｄ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ−Ｄ−Ａｒｇ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｖａｌ−Ａｒｇ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｃｉｔ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｄ−Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ａｒｇ、Ａｌａ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ−Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｍｅｔ、Ｍｅｔ−Ａｌａ、Ｇｌｎ−Ｖａｌ、Ａｓｎ−Ａｌａ、Ｇｌｎ−Ｐｈｅ及びＧｌｎ−Ａｌａから選択される、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項３４】
Ｐが、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ａｌａ−Ｖａｌ、Ａｌａ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ−ＡｌａまたはＤ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａである、請求項３３に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項３５】
Ｑが、−ＳＯ３Ｈまたはその医薬的に許容される塩である、請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項３６】
前記免疫コンジュゲートが、以下の式
【化８】
2020504607.tif 000215
【化９】
2020504607.tif 000216
【化１０】
2020504607.tif 000217
【化１１】
2020504607.tif 000218
【化１２】
2020504607.tif 000219
によって表されるか、またはその医薬的に許容される塩であり、ＷＬは、１〜１０の整数であり；ＮとＣとの間の二重線
【化１３】
2020504607.tif 000220
は、単結合または二重結合を表し、但し、二重結合である場合には、Ｘは存在せず、Ｙは−Ｈであり；単結合である場合には、Ｘは、−Ｈであり、Ｙは、−ＯＨまたは−ＳＯ３Ｈであるか、またはこれらの医薬的に許容される塩である、請求項３０に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項３７】
前記免疫コンジュゲートが、以下の式によって表され
【化１４】
2020504607.tif 000221
ここで、
ＣＢＡは、リシン残基を介してＣｙＬ２に共有結合する、請求項１〜１４及び１６〜２９のいずれか一項に記載の抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントであり；
ＷＬは、１〜２０の整数であり、
ＣｙＬ２は、以下の式
【化１５】
2020504607.tif 000222
によって表されるか、またはその医薬的に許容される塩であり、
ＮとＣとの間の二重線
【化１６】
2020504607.tif 000223
は、単結合または二重結合を表し、但し、二重結合である場合には、Ｘは存在せず、Ｙは、−Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ４）アルキルであり；単結合である場合には、Ｘは、−Ｈまたはアミン保護部分であり、Ｙは、−ＯＨまたは−ＳＯ３Ｈであり；
Ｒｘ１及びＲｘ２は、独立して、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり；
Ｒｅは、−Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり；
Ｗ’は、−ＮＲｅ’であり、
Ｒｅ’は、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−Ｒｋであり；
ｎは、２〜６の整数であり；
Ｒｋは、−Ｈまたは−Ｍｅであり；
Ｚｓ１は、以下の式
【化１７】
2020504607.tif 000224
【化１８】
2020504607.tif 000225
のいずれか１つから選択され、
ｑは、１〜５の整数である、請求項１〜１４及び１６〜２９のいずれか一項に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項３８】
Ｒｅが、ＨまたはＭｅであり；Ｒｘ１及びＲｘ２が、独立して、−（ＣＨ２）ｐ−（ＣＲｆＲｇ）−であり、Ｒｆ及びＲｇは、それぞれ独立して、−Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ４）アルキルであり；ｐが、０、１、２または３である、請求項３７に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項３９】
Ｒｆ及びＲｇが同じであるか、または異なっており、−Ｈ及び−Ｍｅから選択される、請求項３８に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項４０】
前記免疫コンジュゲートが、以下の式
【化１９】
2020504607.tif 000226
【化２０】
2020504607.tif 000227
によって表されるか、またはその医薬的に許容される塩であり、ＷＬは、１〜１０の整数であり；ＮとＣとの間の二重線
【化２１】
2020504607.tif 000228
は、単結合または二重結合を表し、但し、二重結合である場合には、Ｘは存在せず、Ｙは−Ｈであり；単結合である場合には、Ｘは、−Ｈであり、Ｙは、−ＯＨまたは−ＳＯ３Ｈであるか、またはこれらの医薬的に許容される塩である、請求項３７に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項４１】
ＮとＣとの間の二重線
【化２２】
2020504607.tif 000229
が二重結合を表し、Ｘが存在せず、Ｙが−Ｈである、請求項３０〜４０のいずれか一項に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項４２】
ＮとＣとの間の二重線
【化２３】
2020504607.tif 000230
が単結合を表し、Ｘが−Ｈであり、Ｙが−ＳＯ３Ｈであるか、またはその医薬的に許容される塩である、請求項３０〜４０のいずれか一項に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項４３】
Ｙが、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３Ｎａまたは−ＳＯ３Ｋである、請求項４２に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項４４】
Ｙが、−ＳＯ３Ｎａである、請求項４２に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項４５】
前記免疫コンジュゲートが、以下の式によって表され、
【化２４】
2020504607.tif 000231
ここで、
ＣＢＡは、リシン残基を介してＣｙＬ３に共有結合する、請求項１〜１４及び１６〜２９のいずれか一項に記載の抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントであり；
ＷＬは、１〜２０の整数であり、
ＣｙＬ３は、以下の式
【化２５】
2020504607.tif 000232
によって表され、
ｍ’は、１または２であり；
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ３）アルキルであり；
Ｚｓ１は、以下の式
【化２６】
2020504607.tif 000233
【化２７】
2020504607.tif 000234
のいずれか１つから選択され、
ｑは、１〜５の整数である、請求項１〜１４及び１６〜２９のいずれか一項に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項４６】
ｍ’が１であり、Ｒ１及びＲ２が両方ともＨである、請求項４５に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項４７】
ｍ’が２であり、Ｒ１及びＲ２が両方ともＭｅである、請求項４５に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項４８】
前記免疫コンジュゲートが、以下の式
【化２８】
2020504607.tif 000235
によって表されるか、またはその医薬的に許容される塩であり、ここで、ＷＬは、１〜１０の整数である、請求項４５に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項４９】
前記免疫コンジュゲートが、以下の式
【化２９】
2020504607.tif 000236
によって表されるか、またはその医薬的に許容される塩であり、
ここで、
ＷＬは、１〜１０の整数であり、
ＣＢＡは、それぞれ配列番号８、３５及び４５及び配列番号６２、１３、１４の配列を有するＣＤＲＨ１ドメイン、ＣＤＲＨ２ドメイン及びＣＤＲＨ３ドメインと、ＣＤＲＬ１ドメイン、ＣＤＲＬ２ドメイン及びＣＤＲＬ３ドメインとを含む、ヒト化抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントである、請求項４５に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項５０】
前記ヒト化抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントが、それぞれ配列番号２８及び配列番号５５の配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む、請求項４９に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項５１】
前記ヒト化抗ＡＤＡＭ９抗体が、それぞれ配列番号５２及び配列番号６８の配列を有する重鎖と軽鎖とを含む、請求項５０に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項５２】
前記ヒト化抗ＡＤＡＭ９抗体が、それぞれ配列番号１５１及び配列番号６８の配列を有する重鎖と軽鎖とを含む、請求項４９に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項５３】
前記免疫コンジュゲートが、以下の式によって表され、
【化３０】
2020504607.tif 000237
ここで、
ＣＢＡは、システイン残基を介してＣｙＣ１に共有結合する、請求項１〜２４及び２６〜２９のいずれか一項に記載の抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントであり；
ＷＣは、１または２であり、
ＣｙＣ１は、以下の式
【化３１】
2020504607.tif 000238
によって表されるか、またはその医薬的に許容される塩であり、
ＮとＣとの間の二重線
【化３２】
2020504607.tif 000239
は、単結合または二重結合を表し、但し、二重結合である場合には、Ｘは存在せず、Ｙは、−Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ４）アルキルであり；単結合である場合には、Ｘは、−Ｈまたはアミン保護部分であり、Ｙは、−ＯＨまたは−ＳＯ３Ｈであるか、またはこれらの医薬的に許容される塩であり；
Ｒ５は、−Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ３）アルキルであり；
Ｐは、アミノ酸残基または２〜２０個のアミノ酸残基を含有するペプチドであり；
Ｒａ及びＲｂは、それぞれの場合に、独立して、−Ｈ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルまたは帯電した置換基またはイオン化可能な基Ｑであり；
Ｗ’は、−ＮＲｅ’であり、
Ｒｅ’は、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−Ｒｋであり；
ｎは、２〜６の整数であり；
Ｒｋは、−Ｈまたは−Ｍｅであり；
Ｒｘ３は、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり；
ＬＣは、
【化３３】
2020504607.tif 000240
によって表され、ｓ１は、ＣＢＡに共有結合した部位であり、ｓ２は、ＣｙＣ１上の−Ｃ（＝Ｏ）−基に共有結合した部位であり；
Ｒ１９及びＲ２０は、それぞれの場合に、独立して、−Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ３）アルキルであり；
ｍ”は、１〜１０の整数であり；
Ｒｈは、−Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ３）アルキルである、請求項１〜２４及び２６〜２９のいずれか一項に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項５４】
Ｒａ及びＲｂが両方ともＨであり；Ｒ５が、ＨまたはＭｅである、請求項５３に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項５５】
Ｐが、２〜５個のアミノ酸残基を含むペプチドである、請求項５３または５４に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項５６】
Ｐが、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ａｌａ、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｃｉｔ、Ｌｅｕ−Ｃｉｔ、Ｉｌｅ−Ｃｉｔ、Ｔｒｐ、Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ｐｈｅ−Ｎ９−トシル−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ｎ９−ニトロ−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号１４４）、β−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号１４５）、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ（配列番号１４６）、Ｖａｌ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ｖａｌ、Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ｖａｌ−Ｄ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｄ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ−Ｄ−Ａｒｇ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｖａｌ−Ａｒｇ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｃｉｔ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｄ−Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ａｒｇ、Ａｌａ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ−Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｍｅｔ、Ｍｅｔ−Ａｌａ、Ｇｌｎ−Ｖａｌ、Ａｓｎ−Ａｌａ、Ｇｌｎ−Ｐｈｅ及びＧｌｎ−Ａｌａから選択される、請求項５３〜５５のいずれか一項に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項５７】
Ｐが、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ａｌａ−Ｖａｌ、Ａｌａ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ−ＡｌａまたはＤ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａである、請求項５６に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項５８】
Ｑが、−ＳＯ３Ｈまたはその医薬的に許容される塩である、請求項５３〜５７のいずれか一項に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項５９】
Ｒ１９及びＲ２０が、両方ともＨであり、ｍ”が、１〜６の整数である、請求項５３〜５８のいずれか一項に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項６０】
−ＬＣ−は、以下の式
【化３４】
2020504607.tif 000241
によって表される、請求項５９に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項６１】
以下の式
【化３５】
2020504607.tif 000242
によって表されるか、またはその医薬的に許容される塩であり、ＮとＣとの間の二重線
【化３６】
2020504607.tif 000243
は、単結合または二重結合を表し、但し、二重結合である場合には、Ｘは存在せず、Ｙは−Ｈであり；単結合である場合には、Ｘは、−Ｈであり、Ｙは、−ＯＨまたは−ＳＯ３Ｈであるか、またはこれらの医薬的に許容される塩である、請求項５３に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項６２】
以下の式
【化３７】
2020504607.tif 000244
によって表されるか、またはその医薬的に許容される塩であり、
ここで、
ＮとＣとの間の二重線
【化３８】
2020504607.tif 000245
は、単結合または二重結合を表し、但し、二重結合である場合には、Ｘは存在せず、Ｙは−Ｈであり；単結合である場合には、Ｘは、−Ｈであり、Ｙは、−ＳＯ３Ｈであるか、またはこれらの医薬的に許容される塩であり、
ＣＢＡは、それぞれ配列番号８、３５及び４５及び配列番号６２、１３、１４の配列を有するＣＤＲＨ１ドメイン、ＣＤＲＨ２ドメイン及びＣＤＲＨ３ドメインと、ＣＤＲＬ１ドメイン、ＣＤＲＬ２ドメイン及びＣＤＲＬ３ドメインとを含む、ヒト化抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントである、請求項５３に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項６３】
前記ヒト化抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントが、それぞれ配列番号２８及び配列番号５５の配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む、請求項６２に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項６４】
前記ヒト化抗ＡＤＡＭ９抗体が、それぞれ配列番号１４２及び配列番号６８の配列を有する重鎖と軽鎖とを含む、請求項６３に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項６５】
前記免疫コンジュゲートが、以下の式によって表され、
【化３９】
2020504607.tif 000246
ここで、
ＣＢＡは、システイン残基を介してＣｙＣ２に共有結合する、請求項１〜２４及び２６〜２９のいずれか一項に記載の抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントであり；
ＷＣは、１または２であり、
ＣｙＣ２は、以下の式
【化４０】
2020504607.tif 000247
によって表されるか、またはその医薬的に許容される塩であり、
ＮとＣとの間の二重線
【化４１】
2020504607.tif 000248
は、単結合または二重結合を表し、但し、二重結合である場合には、Ｘは存在せず、Ｙは、−Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ４）アルキルであり；単結合である場合には、Ｘは、−Ｈまたはアミン保護部分であり、Ｙは、−ＯＨまたは−ＳＯ３Ｈであるか、またはこれらの医薬的に許容される塩であり；
Ｒｘ１は、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり；
Ｒｅ’は、−Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり；
Ｗ’は、−ＮＲｅ’であり、
Ｒｅ’は、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−Ｒｋであり；
ｎは、２〜６の整数であり；
Ｒｋは、−Ｈまたは−Ｍｅであり；
Ｒｘ２は、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり；
ＬＣ’は、以下の式
【化４２】
2020504607.tif 000249
によって表され、
ここで、
ｓ１は、ＣＢＡに共有結合した部位であり、ｓ２は、ＣｙＣ２上の−Ｓ−基に共有結合した部位であり；
Ｚは、Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ９−または−ＮＲ９−Ｃ（＝Ｏ）−であり；
Ｑは、−Ｈ、帯電した置換基またはイオン化可能な基であり；
Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１９、Ｒ２０、Ｒ２１及びＲ２２は、それぞれの場合に、それぞれ独立して、−Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ３）アルキルであり；
ｑ及びｒは、それぞれの場合に、独立して、０〜１０の整数であり；
ｍ及びｎは、それぞれ独立して、０〜１０の整数であり；
Ｒｈは、−Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ３）アルキルであり；
Ｐ’は、アミノ酸残基または２〜２０個のアミノ酸残基を含有するペプチドである、請求項１〜２４及び２６〜２９のいずれか一項に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項６６】
Ｐ’が、２〜５個のアミノ酸残基を含むペプチドである、請求項６５に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項６７】
Ｐ’が、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ａｌａ、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｃｉｔ、Ｌｅｕ−Ｃｉｔ、Ｉｌｅ−Ｃｉｔ、Ｔｒｐ、Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ｐｈｅ−Ｎ９−トシル−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ｎ９−ニトロ−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号１４４）、β−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号１４５）、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ（配列番号１４６）、Ｖａｌ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ｖａｌ、Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ｖａｌ−Ｄ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｄ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ−Ｄ−Ａｒｇ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｖａｌ−Ａｒｇ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｃｉｔ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｄ−Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ａｒｇ、Ａｌａ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ−Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｍｅｔ、Ｍｅｔ−Ａｌａ、Ｇｌｎ−Ｖａｌ、Ａｓｎ−Ａｌａ、Ｇｌｎ−Ｐｈｅ及びＧｌｎ−Ａｌａから選択される、請求項６５または６６のいずれか一項に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項６８】
Ｐ’が、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ａｌａ−Ｖａｌ、Ａｌａ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ−ＡｌａまたはＤ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａである、請求項６７に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項６９】
−ＬＣ’−は、以下の式
【化４３】
2020504607.tif 000250
によって表される、請求項６５に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項７０】
Ｒｅが、ＨまたはＭｅであり；Ｒｘ１が、−（ＣＨ２）ｐ−（ＣＲｆＲｇ）−であり、Ｒｘ２が、−（ＣＨ２）ｐ−（ＣＲｆＲｇ）−であり、Ｒｆ及びＲｇは、それぞれ独立して、−Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ４）アルキルであり；ｐが、０、１、２または３である、請求項６５〜６９のいずれか一項に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項７１】
Ｒｆ及びＲｇが同じであるか、または異なっており、−Ｈ及び−Ｍｅから選択される、請求項７０に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項７２】
以下の式
【化４４】
2020504607.tif 000251
によって表されるか、またはその医薬的に許容される塩であり、ＮとＣとの間の二重線
【化４５】
2020504607.tif 000252
は、単結合または二重結合を表し、但し、二重結合である場合には、Ｘは存在せず、Ｙは−Ｈであり；単結合である場合には、Ｘは、−Ｈであり、Ｙは、−ＯＨまたは−ＳＯ３Ｈであるか、またはこれらの医薬的に許容される塩である、請求項６５に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項７３】
ＮとＣとの間の二重線
【化４６】
2020504607.tif 000253
が二重結合を表し、Ｘが存在せず、Ｙが−Ｈである、請求項５３〜７２のいずれか一項に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項７４】
ＮとＣとの間の二重線
【化４７】
2020504607.tif 000254
が単結合を表し、Ｘが−Ｈであり、Ｙが−ＳＯ３Ｈであるか、またはその医薬的に許容される塩である、請求項５３〜７２のいずれか一項に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項７５】
Ｙが、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３Ｎａまたは−ＳＯ３Ｋである、請求項７４に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項７６】
Ｙが、−ＳＯ３Ｎａである、請求項７４に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項７７】
前記免疫コンジュゲートが、以下の式によって表され、
【化４８】
2020504607.tif 000255
ここで、
ＣＢＡは、システイン残基を介してＣｙＣ３に共有結合する、請求項１〜２４及び２６〜２９のいずれか一項に記載の抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントであり；
ＷＣは、１または２であり、
ＣｙＣ３は、以下の式
【化４９】
2020504607.tif 000256
によって表され、
ここで、
ｍ’は、１または２であり；
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、−Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ３）アルキルであり；
ＬＣ’は、以下の式
【化５０】
2020504607.tif 000257
によって表され、
ここで、
ｓ１は、ＣＢＡに共有結合した部位であり、ｓ２は、ＣｙＣ３上の−Ｓ−基に共有結合した部位であり；
Ｚは、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ９−または−ＮＲ９−Ｃ（＝Ｏ）−であり；
Ｑは、Ｈ、帯電した置換基またはイオン化可能な基であり；
Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１９、Ｒ２０、Ｒ２１及びＲ２２は、それぞれの場合に、それぞれ独立して、−Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ３）アルキルであり；
ｑ及びｒは、それぞれの場合に、独立して、０〜１０の整数であり；
ｍ及びｎは、それぞれ独立して、０〜１０の整数であり；
Ｒｈは、−Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ３）アルキルであり；
Ｐ’は、アミノ酸残基または２〜２０個のアミノ酸残基を含有するペプチドである、請求項１〜２４及び２６〜２９のいずれか一項に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項７８】
Ｐ’が、２〜５個のアミノ酸残基を含むペプチドである、請求項７７に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項７９】
Ｐ’が、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ａｌａ、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｃｉｔ、Ｌｅｕ−Ｃｉｔ、Ｉｌｅ−Ｃｉｔ、Ｔｒｐ、Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ｐｈｅ−Ｎ９−トシル−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ｎ９−ニトロ−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号１４４）、β−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号１４５）、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ（配列番号１４６）、Ｖａｌ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ｖａｌ、Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ｖａｌ−Ｄ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｄ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ−Ｄ−Ａｒｇ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｖａｌ−Ａｒｇ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｃｉｔ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｄ−Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ａｒｇ、Ａｌａ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ−Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｍｅｔ、Ｍｅｔ−Ａｌａ、Ｇｌｎ−Ｖａｌ、Ａｓｎ−Ａｌａ、Ｇｌｎ−Ｐｈｅ及びＧｌｎ−Ａｌａから選択される、請求項７７または７８のいずれか一項に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項８０】
Ｐ’が、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ａｌａ−Ｖａｌ、Ａｌａ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ−ＡｌａまたはＤ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａである、請求項７９に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項８１】
−ＬＣ’−は、以下の式
【化５１】
2020504607.tif 000258
によって表され、Ｍは、Ｈ＋またはカチオンである、請求項７７に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項８２】
ｍ’が１であり、Ｒ１及びＲ２が両方ともＨである、請求項７７〜８１のいずれか一項に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項８３】
ｍ’が２であり、Ｒ１及びＲ２が両方ともＭｅである、請求項７７〜８１のいずれか一項に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項８４】
前記免疫コンジュゲートが、以下の式
【化５２】
2020504607.tif 000259
によって表されるか、またはその医薬的に許容される塩であり、ここで、ＤＭは、以下の式
【化５３】
2020504607.tif 000260
によって表される薬物部分である、請求項７７に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項８５】
以下の式
【化５４】
2020504607.tif 000261
によって表されるか、またはその医薬的に許容される塩であり、
ここで、
ＷＬは、１〜１０の整数であり、
ＣＢＡは、それぞれ配列番号８、３５及び４５及び配列番号６２、１３、１４の配列を有するＣＤＲＨ１ドメイン、ＣＤＲＨ２ドメイン及びＣＤＲＨ３ドメインと、ＣＤＲＬ１ドメイン、ＣＤＲＬ２ドメイン及びＣＤＲＬ３ドメインとを含む、ヒト化抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントである、免疫コンジュゲート。
【請求項８６】
前記ヒト化抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントが、それぞれ配列番号２８及び配列番号５５の配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む、請求項８５に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項８７】
前記ヒト化抗ＡＤＡＭ９抗体が、それぞれ配列番号５２及び配列番号６８の配列を有する重鎖と軽鎖とを含む、請求項８６に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項８８】
前記ヒト化抗ＡＤＡＭ９抗体が、それぞれ配列番号１５１及び配列番号６８の配列を有する重鎖と軽鎖とを含む、請求項８６に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項８９】
配列番号５２または配列番号１５１のＸがリシンである、請求項８７または８８に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項９０】
配列番号５２または配列番号１５１のＸが存在しない、請求項８７または８８に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項９１】
以下の式
【化５５】
2020504607.tif 000262
によって表されるか、またはその医薬的に許容される塩であり、
ここで、
ＮとＣとの間の二重線
【化５６】
2020504607.tif 000263
は、単結合または二重結合を表し、但し、二重結合である場合には、Ｘは存在せず、Ｙは−Ｈであり；単結合である場合には、Ｘは、−Ｈであり、Ｙは、−ＳＯ３Ｈであるか、またはこれらの医薬的に許容される塩であり、
ＣＢＡは、それぞれ配列番号８、３５及び４５及び配列番号６２、１３、１４の配列を有するＣＤＲＨ１ドメイン、ＣＤＲＨ２ドメイン及びＣＤＲＨ３ドメインと、ＣＤＲＬ１ドメイン、ＣＤＲＬ２ドメイン及びＣＤＲＬ３ドメインとを含む、ヒト化抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントである、免疫コンジュゲート。
【請求項９２】
前記ヒト化抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントが、それぞれ配列番号２８及び配列番号５５の配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む、請求項９１に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項９３】
前記ヒト化抗ＡＤＡＭ９抗体が、それぞれ配列番号１４２及び配列番号６８の配列を有する重鎖と軽鎖とを含む、請求項９２に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項９４】
前記ヒト化抗ＡＤＡＭ９抗体が、それぞれ配列番号１５２及び配列番号６８の配列を有する重鎖と軽鎖とを含む、請求項９２に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項９５】
配列番号１４２または配列番号１５２のＸがリシンである、請求項９３または９４に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項９６】
配列番号１４２または配列番号１５２のＸが存在しない、請求項９３または９４に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項９７】
以下の式
【化５７】
2020504607.tif 000264
によって表されるか、またはその医薬的に許容される塩であり、
ここで、
ｗＣが、１または２であり；
ＤＭは、以下の式
【化５８】
2020504607.tif 000265
によって表される薬物部分であり、
ＣＢＡは、それぞれ配列番号８、３５及び４５及び配列番号６２、１３、１４の配列を有するＣＤＲＨ１ドメイン、ＣＤＲＨ２ドメイン及びＣＤＲＨ３ドメインと、ＣＤＲＬ１ドメイン、ＣＤＲＬ２ドメイン及びＣＤＲＬ３ドメインとを含む、ヒト化抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントである、免疫コンジュゲート。
【請求項９８】
以下の式
【化５９】
2020504607.tif 000266
によって表されるか、またはその医薬的に許容される塩であり、
ここで、
ｗＣが、１または２であり；
ＤＭは、以下の式
【化６０】
2020504607.tif 000267
によって表される薬物部分であり、
ＣＢＡは、それぞれ配列番号８、３５及び４５及び配列番号６２、１３、１４の配列を有するＣＤＲＨ１ドメイン、ＣＤＲＨ２ドメイン及びＣＤＲＨ３ドメインと、ＣＤＲＬ１ドメイン、ＣＤＲＬ２ドメイン及びＣＤＲＬ３ドメインとを含む、ヒト化抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントである、免疫コンジュゲート。
【請求項９９】
前記ヒト化抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントが、それぞれ配列番号２８及び配列番号５５の配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む、請求項９７または９８に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項１００】
前記ヒト化抗ＡＤＡＭ９抗体が、それぞれ配列番号１４２及び配列番号６８の配列を有する重鎖と軽鎖とを含む、請求項９７または９８に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項１０１】
前記ヒト化抗ＡＤＡＭ９抗体が、それぞれ配列番号１５２及び配列番号６８の配列を有する重鎖と軽鎖とを含む、請求項９７または９８に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項１０２】
配列番号１４２または配列番号１５２のＸがリシンである、請求項１００または１０１に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項１０３】
配列番号１４２または配列番号１５２のＸが存在しない、請求項１００または１０１に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項１０４】
前記医薬的に許容される塩が、ナトリウム塩またはカリウム塩である、請求項３０〜１０３のいずれか一項に記載の免疫コンジュゲート。
【請求項１０５】
有効量の請求項１〜１０４のいずれか一項に記載の免疫コンジュゲートと、医薬的に許容される担体、賦形剤または希釈剤とを含む、医薬組成物。
【請求項１０６】
ＡＤＡＭ９の発現と関連するか、またはＡＤＡＭ９の発現によって特徴付けられる疾患または状態の治療における、請求項１〜１０４のいずれか一項に記載の免疫コンジュゲートまたは請求項１０５に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１０７】
ＡＤＡＭ９と関連するか、またはＡＤＡＭ９によって特徴付けられる前記疾患または状態が、がんである、請求項１０６に記載の使用。
【請求項１０８】
前記がんが、非小細胞肺癌、大腸癌、膀胱癌、胃癌、膵臓癌、腎細胞癌、前立腺癌、食道癌、乳癌、頭頸部癌、子宮癌、卵巣癌、肝臓癌、子宮頸癌、甲状腺癌、精巣癌、骨髄がん、黒色腫及びリンパがんからなる群から選択される、請求項１０７に記載の使用。
【請求項１０９】
前記非小細胞肺癌が、扁平上皮癌、腺癌または大細胞未分化癌である、請求項１０８に記載の使用。
【請求項１１０】
前記大腸癌が、腺癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、原発性大腸リンパ腫、平滑筋肉腫または扁平上皮癌である、請求項１０８に記載の使用。
【請求項１１１】
対象において、ＡＤＡＭ９の発現と関連するか、またはＡＤＡＭ９の発現によって特徴付けられる疾患または状態を治療するための方法であって、前記対象に、有効量の請求項１〜１０４のいずれか一項に記載の免疫コンジュゲートまたは請求項１０５に記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項１１２】
ＡＤＡＭ９と関連するか、またはＡＤＡＭ９によって特徴付けられる前記疾患または状態が、がんである、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
前記がんが、非小細胞肺癌、大腸癌、膀胱癌、胃癌、膵臓癌、腎細胞癌、前立腺癌、食道癌、乳癌、頭頸部癌、子宮癌、卵巣癌、肝臓癌、子宮頸癌、甲状腺癌、精巣癌、骨髄がん、黒色腫及びリンパがんからなる群から選択される、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
前記非小細胞肺癌が、扁平上皮癌、腺癌または大細胞未分化癌である、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
前記大腸癌が、腺癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、原発性大腸リンパ腫、平滑筋肉腫または扁平上皮癌である、請求項１１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年１２月２３日に出願された米国特許出願番号第６２／４３８，４８８号、２０１７年３月３１日に出願された米国特許出願第６２／４８０，２０１号に対する優先権を主張し、これらの出願は、その全体が本明細書に参考として組み込まれる。
【０００２】
本発明は、少なくとも１種類の医薬薬剤に結合される「ジスインテグリン及びメタロプロテイナーゼドメインを含有するタンパク質９」（「ＡＤＡＭ９」）に特異的に結合することが可能な抗体またはそのフラグメントを含む免疫コンジュゲートに関する。本発明は、特に、ヒトＡＤＡＭ９及び非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）のＡＤＡＭ９と交差反応する、このような免疫コンジュゲートに関する。本発明は、更に、レシピエント対象にこのような免疫コンジュゲートを投与すると免疫原性の低下を示すようなヒト化及び／または脱免疫化された軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン及び／または重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含む、全てのこのような免疫コンジュゲートに関する。本発明はまた、このような免疫コンジュゲートのいずれかを含有する医薬組成物、並びにがん及び他の疾患及び状態の治療において、このような免疫コンジュゲートのいずれかの使用を伴う方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＡＤＡＭは、種々の生理学的プロセス及び疾病プロセスに関与するタンパク質の一ファミリーである（Ａｍｅｎｄｏｌａ，Ｒ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２０１５）  「ＡＤＡＭ９  Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ  Ｄｏｍａｉｎ  Ａｃｔｉｖａｔｅｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ  Ｔｈｒｏｕｇｈ  Ａｎ  Ａｕｔｏｃｒｉｎｅ  Ｃｉｒｃｕｉｔ  Ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ  Ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ  Ａｎｄ  ＣＸＣＲ２」，  Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌ．９７（５）：９５１−９６２；Ｅｄｗａｒｓ，Ｄ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（２００８）「Ｔｈｅ  ＡＤＡＭ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅｓ」  Ｍｏｌｅｃ．Ａｓｐｅｃｔｓ  Ｍｅｄ．２９：２５８−２８９）。このファミリーの少なくとも４０の遺伝子群が同定されており、このような群のうち、少なくとも２１が、ヒトにおいて機能性であると考えられている（Ｌｉ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２０１６）「Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＡＤＡＭ９  Ｐｒｏｍｏｔｅｓ  Ｃｏｌｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌｓ  Ｉｎｖａｓｉｏｎ」  Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｓｕｒｇ．２６（３）：１２７−１３３；Ｄｕｆｆｙ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２０１１）「Ｔｈｅ  ＡＤＡＭｓ  Ｆａｍｉｌｙ  Ｏｆ  Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ：Ｎｅｗ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｔａｒｇｅｔｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ？」Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ８：９：１−１３；米国特許出願公開第２０１３／００４５２４４号も参照）。
【０００４】
ＡＤＡＭファミリーメンバーは、８個のドメインを有する十分に保存された構造を有し、特に、メタロプロテアーゼドメイン及びインテグリン結合（ジスインテグリン）ドメインを有する（Ｄｕｆｆｙ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２００９）「Ｔｈｅ  Ｒｏｌｅ  Ｏｆ  ＡＤＡＭ  ｓ  Ｉｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ」  Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ４０３：３１−３６）。ＡＤＡＭメタロプロテアーゼドメインは、シェダーゼ（ｓｈｅｄｄａｓｅ）として作用し、膜貫通タンパク質を開裂させることによって一連の生体プロセスを調整することが報告されており、次いで、可溶性リガンドとして作用し、細胞シグナル伝達を制御することができる（Ａｍｅｎｄｏｌａ，Ｒ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２０１５）  「ＡＤＡＭ９  Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ  Ｄｏｍａｉｎ  Ａｃｔｉｖａｔｅｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ  Ｔｈｒｏｕｇｈ  Ａｎ  Ａｕｔｏｃｒｉｎｅ  Ｃｉｒｃｕｉｔ  Ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ  Ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ  Ａｎｄ  ＣＸＣＲ２」  Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌ．９７（５）：９５１−９６２；Ｉｔｏ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）  「ＡＤＡＭｓ，Ａ  Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ  Ａｎｄ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ，  Ｍｅｄｉａｔｅ  Ｓｈｅｄｄｉｎｇ  Ｏｆ  Ｏｘｙｔｏｃｉｎａｓｅ」  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３１４（２００４）１００８−１０１３）。
【０００５】
ＡＤＡＭ９は、分子のＡＤＡＭファミリーの一メンバーである。不活性な形態として合成され、タンパク質分解により開裂し、活性な酵素を生成する。上流部位での処理は、酵素前駆体の活性化にとって特に重要である。ＡＤＡＭ９は、線維芽細胞で発現し（Ｚｉｇｒｉｎｏ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（２０１１）「Ｔｈｅ  Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ−Ｌｉｋｅ  Ａｎｄ  Ｃｙｓｔｅｉｎｅ−Ｒｉｃｈ  Ｄｏｍａｉｎｓ  Ｏｆ  ＡＤＡＭ  −９  Ｍｅｄｉａｔｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  Ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ」  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８６：６８０１−６８０７）、活性化された血管平滑筋細胞（Ｓｕｎ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（２０１０）「ＡＤＡＭ１５  Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  Ａｎｄ  Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  Ｖｉａ  Ｓｒｃ／ＥＲＫｌ／２  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ」  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．８７：３４８−３５５）、単球（Ｎａｍｂａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）「Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  Ｏｆ  ＡＤＡＭ９  Ｉｎ  Ｍｕｌｔｉｎｕｃｌｅａｔｅｄ  Ｇｉａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ」  Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１３：１０４−１１３）、活性化されたマクロファージ（Ｏｋｓａｌａ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（２００９）「ＡＤＡＭ−９，  ＡＤＡＭ−１５，  Ａｎｄ  ＡＤＡＭ−１７  Ａｒｅ  Ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄ  Ｉｎ  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  Ｉｎ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｈｕｍａｎ  Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ  Ｐｌａｑｕｅｓ  Ｉｎ  Ａｏｒｔａ  Ａｎｄ  Ｃａｒｏｔｉｄ  Ａｎｄ  Ｆｅｍｏｒａｌ  Ａｒｔｅｒｉｅｓ  −  Ｔａｍｐｅｒｅ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｓｔｕｄｙ」，Ａｎｎ．Ｍｅｄ．４１：２７９−２９０）で発現する。
【０００６】
ＡＤＡＭ９のメタロプロテアーゼ活性は、マトリックス構成要素の変成に関与し、それにより、腫瘍細胞の移動が可能になる（Ａｍｅｎｄｏｌａ，Ｒ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２０１５）「ＡＤＡＭ９  Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ  Ｄｏｍａｉｎ  Ａｃｔｉｖａｔｅｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ  Ｔｈｒｏｕｇｈ  Ａｎ  Ａｕｔｏｃｒｉｎｅ  Ｃｉｒｃｕｉｔ  Ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ  Ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ  Ａｎｄ  ＣＸＣＲ２」  Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌ．９７（５）：９５１−９６２）。そのジスインテグリンドメインは、多くのヘビ毒ジスインテグリンに対して高度に相同性であり、ＡＤＡＭ９及びインテグリンと相互作用が可能であり、ＡＤＡＭ９が細胞接着事象を正または負に調整することができる（Ｚｉｇｒｉｎｏ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（２０１１）「Ｔｈｅ  Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ−Ｌｉｋｅ  Ａｎｄ  Ｃｙｓｔｅｉｎｅ−Ｒｉｃｈ  Ｄｏｍａｉｎｓ  Ｏｆ  ＡＤＡＭ−９  Ｍｅｄｉａｔｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  Ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ」  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８６：６８０１−６８０７；Ｋａｒａｄａｇ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２００６）「ＡＤＡＭ−９  （ＭＤＣ−９／Ｍｅｌｔｒｉｎｇａｍｍａ），Ａ  Ｍｅｍｂｅｒ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ａ  Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ  Ａｎｄ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｆａｍｉｌｙ，Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  Ｍｙｅｌｏｍａ−Ｃｅｌｌ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｉｎ  Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ  Ｂｙ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｔｈｅ  Ａｌｐｈａ（ｖ）Ｂｅｔａ５  Ｉｎｔｅ  ｇｒｉｎ」  Ｂｌｏｏｄ  １０７：３２７１−３２７８；Ｃｏｍｉｎｅｔｔｉ，Ｍ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（２００９）「Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ  Ａｎｄ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｂｙ  Ｔｈｅ  Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  ＡＤＡＭ９  Ｔｏ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｉ  Ｕｎｄｅｒ  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｆｌｏｗ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ」，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，９１：１０４５−１０５２）。ＡＤＡＭ９ジスインテグリンドメインは、α６β１、α６β４、ανβ５及びα９β１インテグリンと相互作用することが示されている。
【０００７】
ＡＤＡＭ９の発現は、疾患、特に、がんと関係があることがわかっている。ＡＤＡＭ９は、腫瘍化及び血管新生において重要な役割を有する多くの分子、例えば、ＴＥＫ、ＫＤＲ、ＥＰＨＢ４、ＣＤ４０、ＶＣＡＭ１及びＣＤＨ５を開裂させ、放出することがわかっている。ＡＤＡＭ９は、乳癌、結腸癌、胃癌、グリオーマ、肝臓癌、非小細胞肺癌、黒色腫、骨髄腫、膵臓癌及び前立腺癌の腫瘍細胞を含め、多くの腫瘍細胞型によって発現する（Ｙｏｓｈｉｍａｓｕ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）「Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｆ  ＡＤＡＭ９  Ｉｎ  Ｎｏｎ−Ｓｍａｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  Ｗｉｔｈ  Ｂｒａｉｎ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ」  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４：４１９０−４１９６；Ｐｅｄｕｔｏ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）「Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  Ｆｏｒ  ＡＤＡＭ９  Ｉｎ  Ｍｏｕｓｅ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ」  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６５：９３１２−９３１９；Ｚｉｇｒｉｎｏ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）「ＡＤＡＭ−９  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  Ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｋｉｎ  Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ａｎｄ  Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ」，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １１６：８５３−８５９；Ｆｒｉｔｚｓｃｈｅ，Ｆ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（２００８）「ＡＤＡＭ９  Ｉｓ  Ｈｉｇｈｌｙ  Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  Ｉｎ  Ｒｅｎａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ａｎｄ  Ｉｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｗｉｔｈ  Ｔｕｍｏｕｒ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ」，ＢＭＣ  Ｃａｎｃｅｒ  ８：１７９：１−９；Ｆｒｙ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２０１０）「Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  Ａｎｄ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ−Ｂｏｕｎｄ  Ｉｓｏｆｏｒｍｓ  Ｏｆ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  ＡＤＡＭ９  Ｈａｖｅ  Ｏｐｐｏｓｉｎｇ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  Ｏｎ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ」，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７０，８１８７−８１９８；Ｃｈａｎｇ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２０１６）「Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ｒｎａｉ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｔａｔ３  Ａｎｄ  ＡＤＡＭ９  Ａｓ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｆｏｒ  Ｎｏｎ  Ｓｍａｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ」，Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １１：１２４２−１２５０；Ｆａｎ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ．（２０１６）「ＡＤＡＭ９  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｉｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅ  ｗｉｔｈ  Ｇｌｉｏｍａ  Ｔｕｍｏｒ  Ｇｒａｄｅ  ａｎｄ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｙｐｅ，ａｎｄ  Ａｃｔｓ  ａｓ  ａ  Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  Ｌｏｗｅｒ−Ｇｒａｄｅ  Ｇｌｉｏｍａｓ」，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．１７：１２７６：１−１１）。
【０００８】
顕著なことに、ＡＤＡＭ９発現の増加は、腫瘍の悪性度及び転移能と正の相関関係にあることがわかっている（Ａｍｅｎｄｏｌａ，Ｒ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２０１５）「ＡＤＡＭ９  Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ  Ｄｏｍａｉｎ  Ａｃｔｉｖａｔｅｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ  Ｔｈｒｏｕｇｈ  Ａｎ  Ａｕｔｏｃｒｉｎｅ  Ｃｉｒｃｕｉｔ  Ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ  Ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ  Ａｎｄ  ＣＸＣＲ２」，Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌ．９７（５）：９５１−９６２；Ｆａｎ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ．（２０１６）「ＡＤＡＭ９  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｉｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅ  ｗｉｔｈ  Ｇｌｉｏｍａ  Ｔｕｍｏｒ  Ｇｒａｄｅ  ａｎｄ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｙｐｅ，ａｎｄ  Ａｃｔｓ  ａｓ  ａ  Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  Ｌｏｗｅｒ−Ｇｒａｄｅ  Ｇｌｉｏｍａｓ」，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．１７：１２７６：１−１１；Ｌｉ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２０１６）「Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ’  ＡＤＡＭ９  Ｐｒｏｍｏｔｅｓ  Ｃｏｌｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌｓ  Ｉｎｖａｓｉｏｎ」  Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｓｕｒｇ．２６（３）：１２７−１３３）。更に、ＡＤＡＭ９及びその分泌した可溶性アイソフォームは、がん細胞の播種にとって重要なようである（Ａｍｅｎｄｏｌａ，Ｒ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２０１５）「ＡＤＡＭ９  Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ  Ｄｏｍａｉｎ  Ａｃｔｉｖａｔｅｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ  Ｔｈｒｏｕｇｈ  Ａｎ  Ａｕｔｏｃｒｉｎｅ  Ｃｉｒｃｕｉｔ  Ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ  Ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ  Ａｎｄ  ＣＸＣＲ２」  Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌ．９７（５）：９５１−９６２；Ｆｒｙ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２０１０）「Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  Ａｎｄ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ−Ｂｏｕｎｄ  Ｉｓｏｆｏｒｍｓ  Ｏｆ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  ＡＤＡＭ９  Ｈａｖｅ  Ｏｐｐｏｓｉｎｇ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  Ｏｎ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ；Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７０，８１８７−８１９８；Ｍａｚｚｏｃｃａ，Ａ．（２００５）  「Ａ  Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  Ｆｏｒｍ  Ｏｆ  ＡＤＡＭ９  Ｐｒｏｍｏｔｅｓ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  Ｉｎｖａｓｉｏｎ  Ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｔｕｍｏｒ−Ｓｔｒｏｍａｌ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６５：４７２８−４７３８；また、米国特許第９，１５０，６５６号、第７，５８５，６３４号、第７，８２９，２７７号、第８，１０１，３６１号及び第８，４４５，１９８号、米国特許出願公開第２００９／００２３１４９号も参照）。
【０００９】
従って、多くの研究が、抗がん治療のための潜在的な標的としてＡＤＡＭ９を特定してきた（Ｐｅｄｕｔｏ，  Ｌ．（２００９）  「ＡＤＡＭ９  Ａｓ  Ａ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ」  Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．１５：２２８２−２２８７；Ｄｕｆｆｙ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２００９）  「Ｒｏｌｅ  Ｏｆ  ＡＤＡＭ  ｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ」，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１５：１１４０−１１４４；Ｄｕｆｆｙ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２０１１）  「Ｔｈｅ  ＡＤＡＭｓ  Ｆａｍｉｌｙ  Ｏｆ  Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ：Ｎｅｗ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｔａｒｇｅｔｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ！」，  Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ８：９：１−１３；Ｊｏｓｓｏｎ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２０１１）  「Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＡＤＡＭ９  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｉｎｄｕｃｅｓ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ」  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ７１（３）：２３２−２４０；また、米国特許出願公開第２０１６／０１３８１１３号、第２０１６／００６８９０９号、第２０１６／００２４５８２号、第２０１５／０３６８３５２号、第２０１５／０３３７３５６号、第２０１５／０３３７０４８号、第２０１５／００１０５７５号、第２０１４／０３４２９４６号、第２０１２／００７７６９４号、第２０１１／０１５１５３６号、第２０１１／０１２９４５０号、第２０１０／０２９１０６３号、第２０１０／０２３３０７９号、第２０１０／０１１２７１３号、第２００９／０２８５８４０号、第２００９／０２０３０５１号、第２００４／００９２４６６号、第２００３／００９１５６８号、第２００２／００６８０６２号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１６／０７７５０５号、第ＷＯ２０１４／２０５２９３号、第ＷＯ２０１４／１８６３６４号、第ＷＯ２０１４／１２４３２６号、第ＷＯ２０１４／１０８４８０号、第ＷＯ２０１３／１１９９６０号、第ＷＯ２０１３／０９８７９７号、第ＷＯ２０１３／０４９７０４号及び第ＷＯ２０１１／１００３６２号も参照）。更に、ＡＤＡＭ９の発現は、肺疾患及び炎症にも関連があることがわかってきた（例えば、米国特許出願公開第２０１６／００６８９０９号、第２０１２／０１４９５９５号、第２００９／０２３３３００号、第２００６／０２７０６１８号及び第２００９／０１４２３０１号を参照）。ＡＤＡＭ９に結合する抗体は、Ａｂｅａｍ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ及びその他の企業から市販されている。
【００１０】
しかし、従来の全ての進歩にもかかわらず、正常組織への結合は最小限を示し、同様の高いアフィニティでヒトＡＤＡＭ９及び非ヒトＡＤＡＭ９に結合することが可能な、免疫コンジュゲートを標的とする高アフィニティＡＤＡＭ９が依然として必要である。本発明は、この需要及びがんの改良された治療薬の需要に対処するものである。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、少なくとも１種類の医薬薬剤に結合される「ジスインテグリン及びメタロプロテイナーゼドメインを含有するタンパク質９」（「ＡＤＡＭ９」）に特異的に結合することが可能な抗体またはそのフラグメントを含む免疫コンジュゲートに関する。本発明は、特に、ヒトＡＤＡＭ９及び非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）のＡＤＡＭ９と交差反応する、このような免疫コンジュゲートに関する。本発明は、更に、レシピエント対象にこのような免疫コンジュゲートを投与すると免疫原性の低下を示すようなヒト化及び／または脱免疫化された軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン及び／または重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含む、全てのこのような免疫コンジュゲートに関する。本発明はまた、このような免疫コンジュゲートのいずれかを含有する医薬組成物、並びにがん及び他の疾患及び状態の治療において、このような免疫コンジュゲートのいずれかの使用を伴う方法に関する。
【００１２】
詳細には、本発明は、抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントを含む免疫コンジュゲートであって、
（Ｉ）抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントは、医薬薬剤に結合されており、
（ＩＩ）抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントは、軽鎖可変（ＶＬ）ドメインと重鎖可変（ＶＨ）ドメインとを含み、前記重鎖可変ドメインは、ＣＤＲＨ１ドメイン、ＣＤＲＨ２ドメイン及びＣＤＲＨ３ドメインを含み、前記軽鎖可変ドメインは、ＣＤＲＬ１ドメイン、ＣＤＲＬ２ドメイン及びＣＤＲＬ３ドメインを含み、
（Ａ）前記ＣＤＲＨ１ドメイン、ＣＤＲＨ２ドメイン及びＣＤＲＨ３ドメインは、ＭＡＢ−Ａの最適化された変異体の重鎖可変（ＶＨ）ドメインのＣＤＲＨ１ドメイン、ＣＤＲＨ２ドメイン及びＣＤＲＨ３ドメインのアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲＬ１ドメイン、ＣＤＲＬ２ドメイン及びＣＤＲＬ３ドメインは、ＭＡＢ−Ａの軽鎖可変（ＶＬ）ドメインのＣＤＲＬ１ドメイン、ＣＤＲＬ２ドメイン及びＣＤＲＬ３ドメインのアミノ酸配列を有するか、または
（Ｂ）前記ＣＤＲＨ１ドメイン、ＣＤＲＨ２ドメイン及びＣＤＲＨ３ドメインは、ＭＡＢ−Ａの重鎖可変（ＶＨ）ドメインのＣＤＲＨ１ドメイン、ＣＤＲＨ２ドメイン及びＣＤＲＨ３ドメインのアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲＬ１ドメイン、ＣＤＲＬ２ドメイン及びＣＤＲＬ３ドメインは、ＭＡＢ−Ａの最適化された変異体の軽鎖可変（ＶＬ）ドメインのＣＤＲＬ１ドメイン、ＣＤＲＬ２ドメイン及びＣＤＲＬ３ドメインのアミノ酸配列を有するか、または
（Ｃ）前記ＣＤＲＨ１ドメイン、ＣＤＲＨ２ドメイン及びＣＤＲＨ３ドメインは、ＭＡＢ−Ａの最適化された変異体の重鎖可変（ＶＨ）ドメインのＣＤＲＨ１ドメイン、ＣＤＲＨ２ドメイン及びＣＤＲＨ３ドメインのアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲＬ１ドメイン、ＣＤＲＬ２ドメイン及びＣＤＲＬ３ドメインは、ＭＡＢ−Ａの最適化された変異体の軽鎖可変（ＶＬ）ドメインのＣＤＲＬ１ドメイン、ＣＤＲＬ２ドメイン及びＣＤＲＬ３ドメインのアミノ酸配列を有する、免疫コンジュゲートを提供する。
【００１３】
特定の実施形態では、抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントは、
（Ａ）（１）ＭＡＢ−Ａの重鎖可変（ＶＨ）ドメインのＣＤＲＨ１ドメイン、ＣＤＲＨ２ドメイン及びＣＤＲＨ３ドメイン、及び
（２）ＭＡＢ−Ａのヒト化変異体のＶＨドメインのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４、または
（Ｂ）（１）ＭＡＢ−Ａの軽鎖可変（ＶＬ）ドメインのＣＤＲＬ１ドメイン、ＣＤＲＬ２ドメイン及びＣＤＲＬ３ドメイン、及び
（２）ＭＡＢ−Ａのヒト化変異体のＶＬドメインのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４、または
（Ｃ）（１）ＭＡＢ−Ａの最適化された変異体の重鎖可変（ＶＨ）ドメインのＣＤＲＨ１ドメイン、ＣＤＲＨ２ドメイン及びＣＤＲＨ３ドメイン、及び
（２）ＭＡＢ−Ａのヒト化変異体のＶＨドメインのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４、または
（Ｄ）（１）ＭＡＢ−Ａの最適化された変異体の軽鎖可変（ＶＬ）ドメインのＣＤＲＬ１ドメイン、ＣＤＲＬ２ドメイン及びＣＤＲＬ３ドメイン、及び
（２）ＭＡＢ−Ａのヒト化変異体のＶＬドメインのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４、または
（Ｅ）（１）ＭＡＢ−Ａのヒト化／最適化された変異体の重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、及び
（２）ＭＡＢ−Ａのヒト化／最適化された変異体のＶＬ軽重鎖可変（ＶＬ）ドメイン
を含む。
【００１４】
特定の実施形態では、ＭＡＢ−Ａの最適化された変異体の重鎖可変（ＶＨ）ドメインのＣＤＲＨ１ドメイン、ＣＤＲＨ２ドメイン及びＣＤＲＨ３ドメインは、それぞれ、以下のアミノ酸配列：
（１）配列番号４７（ＳＹＷＸ１Ｈ）
（ここで、Ｘ１は、ＭまたはＩである）、
（２）配列番号４８（ＥＩＩＰＩＸ２ＧＨＴＮＹＮＥＸ３ＦＸ４Ｘ５）
（ここで、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４及びＸ５は、独立して選択され、
Ｘ２は、ＮまたはＦであり；Ｘ３は、ＫまたはＲであり；
Ｘ４は、ＫまたはＱであり、
Ｘ５は、ＳまたはＧである）、
（３）配列番号４９（ＧＧＹＹＹＹＸ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１ＤＹ）
（ここで、Ｘ６は、Ｐ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｔ、ＧまたはＤであり、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０及びＸ１１は、
（Ａ）Ｘ６がＰである場合、
Ｘ７は、ＫまたはＲであり；Ｘ８は、ＦまたはＭであり；Ｘ９は、Ｇであり；
Ｘ１０は、ＷまたはＦであり；Ｘ１１は、Ｍ、ＬまたはＫであり；
（Ｂ）Ｘ６が、Ｆ、ＹまたはＷである場合、
Ｘ７は、ＮまたはＨであり；Ｘ８は、ＳまたはＫであり；Ｘ９は、ＧまたはＡであり；
Ｘ１０は、ＴまたはＶであり；Ｘ１１は、Ｍ、ＬまたはＫであり；
（Ｃ）Ｘ６が、Ｉ、ＬまたはＶである場合、
Ｘ７は、Ｇであり；Ｘ８は、Ｋであり；Ｘ９は、ＧまたはＡであり；
Ｘ１０は、Ｖであり；Ｘ１１は、Ｍ、ＬまたはＫであり；
（Ｄ）Ｘ６がＴである場合、
Ｘ７は、Ｇであり；Ｘ８は、Ｋ、ＭまたはＮであり；Ｘ９は、Ｇであり；
Ｘ１０は、ＶまたはＴであり；Ｘ１１は、ＬまたはＭであり；
（Ｅ）Ｘ６がＧである場合、
Ｘ７は、Ｇであり；Ｘ８は、Ｓであり；Ｘ９は、Ｇであり；
Ｘ１０は、Ｖであり；Ｘ１１は、Ｌであり、
（Ｆ）Ｘ６がＤである場合、
Ｘ７は、Ｓであり；Ｘ８は、Ｎであり；Ｘ９は、Ａであり；
Ｘ１０は、Ｖであり；Ｘ１１は、Ｌであるように選択される）を有する。
【００１５】
特定の実施形態では、ＭＡＢ−Ａの最適化された変異体の重鎖可変（ＶＨ）ドメインは、配列番号１５のアミノ酸配列を含み、
【化１】
2020504607.tif 000003
ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５及びＸ６は、独立して選択され、
Ｘ１は、ＭまたはＩであり；Ｘ２は、ＮまたはＦであり；
Ｘ３は、ＫまたはＲであり；Ｘ４は、ＫまたはＱであり；
Ｘ５は、ＳまたはＧであり、Ｘ６は、Ｐ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｔ、ＧまたはＤであり；
Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０及びＸ１１は、
Ｘ６がＰである場合、Ｘ７は、ＫまたはＲであり；Ｘ８は、ＦまたはＭであり；Ｘ９は、Ｇであり；Ｘ１０は、ＷまたはＦであり；Ｘ１１は、Ｍ、ＬまたはＫであり；
Ｘ６が、Ｆ、ＹまたはＷである場合、Ｘ７は、ＮまたはＨであり；Ｘ８は、ＳまたはＫであり；Ｘ９は、ＧまたはＡであり；Ｘ１０は、ＴまたはＶであり；Ｘ１１は、Ｍ、ＬまたはＫであり；
Ｘ６が、Ｉ、ＬまたはＶである場合、Ｘ７は、Ｇであり；Ｘ８は、Ｋであり；Ｘ９は、ＧまたはＡであり；Ｘ１０は、Ｖであり；Ｘ１１は、Ｍ、ＬまたはＫであり；
Ｘ６がＴである場合、Ｘ７は、Ｇであり；Ｘ８は、Ｋ、ＭまたはＮであり；Ｘ９は、Ｇであり；Ｘ１０は、ＶまたはＴであり；Ｘ１１は、ＬまたはＭであり；
Ｘ６がＧである場合、Ｘ７は、Ｇであり；Ｘ８は、Ｓであり；Ｘ９は、Ｇであり；Ｘ１０は、Ｖであり；Ｘ１１は、Ｌであり；
Ｘ６がＤである場合、Ｘ７は、Ｓであり；Ｘ８は、Ｎであり；Ｘ９は、Ａであり；Ｘ１０は、Ｖであり；Ｘ１１は、Ｌであるように選択される。
【００１６】
特定の実施形態では、ＭＡＢ−Ａの最適化された変異体の重鎖可変（ＶＨ）ドメインは、
（１）ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＨ（１）（配列番号１６）；
（２）ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＨ（２）（配列番号１７）；
（３）ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＨ（３）（配列番号１８）；
（４）ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＨ（４）（配列番号１９）；
（５）ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＨ（２Ａ）（配列番号２０）；
（６）ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＨ（２Ｂ）（配列番号２１）；
（７）ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＨ（２Ｃ）（配列番号２２）；
（８）ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＨ（２Ｄ）（配列番号２３）；
（９）ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＨ（２Ｅ）（配列番号２４）；
（１０）ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＨ（２Ｆ）（配列番号２５）；
（１１）ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＨ（２Ｇ）（配列番号２６）；
（１２）ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＨ（２Ｈ）（配列番号２７）；
（１３）ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＨ（２Ｉ）（配列番号２８）；及び
（１４）ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＨ（２Ｊ）（配列番号２９）からなる群から選択される。
【００１７】
特定の実施形態では、ＭＡＢ−Ａの最適化された変異体の軽鎖可変（ＶＬ）ドメインのＣＤＲＬ１ドメイン、ＣＤＲＬ２ドメイン及びＣＤＲＬ３ドメインは、それぞれ、
（１）配列番号６６（Ｘ１２ＡＳＱＳＶＤＹＸ１３ＧＤＳＹＸ１４Ｎ）
（ここで、Ｘ１２、Ｘ１３、Ｘ１４は、独立して選択され、
Ｘ１２は、ＫまたはＲであり；Ｘ１３は、ＤまたはＳであり；Ｘ１４は、ＭまたはＬである）；
（２）配列番号１３（ＡＡＳＤＬＥＳ）；及び
（３）配列番号６７（ＱＱＳＸ１５Ｘ１６Ｘ１７ＰＦＴ）
（ここで、Ｘ１５、Ｘ１６及びＸ１７は独立して選択され、
Ｘ１５は、ＨまたはＹであり；Ｘ１６は、ＥまたはＳであり；Ｘ１７は、ＤまたはＴである）
のアミノ酸配列を有する。
【００１８】
特定の実施形態では、軽鎖可変（ＶＬ）ドメインは、配列番号５３のアミノ酸配列を含み、
【化２】
2020504607.tif 000004
ここで、Ｘ１２、Ｘ１３、Ｘ１４、Ｘ１５、Ｘ１６及びＸ１７は、独立して選択され、
Ｘ１２は、ＫまたはＲであり；Ｘ１３は、ＤまたはＳであり；
Ｘ１４は、ＭまたはＬであり；Ｘ１５は、ＨまたはＹであり；
Ｘ１６は、ＥまたはＳであり；Ｘ１７は、ＤまたはＴである。
【００１９】
特定の実施形態では、ＭＡＢ−Ａの最適化された変異体の軽鎖可変（ＶＬ）ドメインが、
（１）ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＬ（１）（配列番号５４）；
（２）ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＬ（２）（配列番号５５）；
（３）ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＬ（３）（配列番号５６）；
（４）ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＬ（４）（配列番号５７）；
（５）ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＬ（２Ａ）（配列番号２０）からなる群から選択される。
【００２０】
特定の実施形態では、ＣＤＲＨ１ドメインは、アミノ酸配列ＳＹＷＭＨ（配列番号８）を含み、ＣＤＲＨ２ドメインは、アミノ酸配列ＥＩＩＰＩＦＧＨＴＮＹＮＥＫＦＫＳ（配列番号３５）を含み、ＣＤＲＨ３ドメインは、アミノ酸配列ＧＧＹＹＹＹＰＲＱＧＦＬＤＹ（配列番号４５）を含む。
【００２１】
特定の実施形態では、ＣＤＲＨ１ドメインは、アミノ酸配列ＫＡＳＱＳＶＤＹＳＧＤＳＹＭＮ（配列番号６２）を含み、ＣＤＲＨ２ドメインは、アミノ酸配列ＡＡＳＤＬＥＳ（配列番号１３）を含み、ＣＤＲＬ３ドメインは、アミノ酸配列ＱＱＳＨＥＤＰＦＴ（配列番号１４）を含む。
【００２２】
特定の実施形態では、免疫コンジュゲートは、
（Ａ）ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）の重鎖可変（ＶＨ）ドメイン（配列番号２８）；または
（Ｂ）ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）の軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン（配列番号５５）；または
（Ｃ）ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）の重鎖可変（ＶＨ）ドメイン（配列番号２８）及びｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）の軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン（配列番号５５）
を含む。
【００２３】
特定の実施形態では、免疫コンジュゲートは、Ｆｃ領域を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、
（ａ）ＦｃγＲに対する変異体Ｆｃ領域のアフィニティを下げる１つ以上のアミノ酸改変、及び／または
（ｂ）システイン残基を導入する１つ以上のアミノ酸改変
を含む変異体Ｆｃ領域である。いくつかの実施形態では、ＦｃγＲに対する変異体Ｆｃ領域のアフィニティを下げる１つ以上のアミノ酸改変は、
（Ａ）Ｌ２３４Ａ；
（Ｂ）Ｌ２３５Ａ；または
（Ｃ）Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ
を含み、前記番号付けが、ＫａｂａｔにあるＥＵインデックスの番号付けである。いくつかの実施形態では、システイン残基を導入する１つ以上のアミノ酸改変は、Ｓ４４２Ｃを含み、前記番号付けが、ＫａｂａｔにあるＥＵインデックスの番号付けである。
【００２４】
特定の実施形態では、免疫コンジュゲートは、ヒトＡＤＡＭ９及びｃｙｎｏＡＤＡＭ９に特異的に結合するヒト化抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントを含み、ヒト化抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントは、前記医薬薬剤に結合される。
【００２５】
いくつかの実施形態では、ヒト化抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントは、
（ａ）それぞれ、配列番号８、３５及び１０及び配列番号６２、１３、１４；
（ｂ）それぞれ、配列番号８、３５及び１０及び配列番号６３、１３、１４；
（ｃ）それぞれ、配列番号８、３６及び１０及び配列番号６３、１３、１４
（ｄ）それぞれ、配列番号３４、３６及び１０及び配列番号６４、１３、６５
からなる群から選択される配列を有する、ＣＤＲＨ１ドメイン、ＣＤＲＨ２ドメイン及びＣＤＲＨ３と、ＣＤＲＬ１ドメイン、ＣＤＲＬ２ドメイン及びＣＤＲＬ３ドメインとを含む。
【００２６】
いくつかの実施形態では、ヒト化抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントは、
（ａ）それぞれ、配列番号１７及び配列番号５５；
（ｂ）それぞれ、配列番号１７及び配列番号５６；
（ｃ）それぞれ、配列番号１８及び配列番号５６；及び
（ｄ）それぞれ、配列番号１９及び配列番号５７
からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％の同一性を有する配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。
【００２７】
特定の実施形態では、ヒト化抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントは、
（ａ）それぞれ、配列番号１７及び配列番号５５；
（ｂ）それぞれ、配列番号１７及び配列番号５６；
（ｃ）それぞれ、配列番号１８及び配列番号５６；及び
（ｄ）それぞれ、配列番号１９及び配列番号５７
からなる群から選択される配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。
【００２８】
特定の実施形態では、ヒト化抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントは、キメラまたはマウス親抗体と比較して、ｃｙｎｏＡＤＡＭ９に対する結合アフィニティが少なくとも１００倍向上し、ヒトＡＤＡＭ９に対する高いアフィニティを保持しているように最適化される。
【００２９】
特定の実施形態では、抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントは、
（ａ）それぞれ、配列番号８、３５及び３７及び配列番号６２、１３、１４；
（ｂ）それぞれ、配列番号８、３５及び３８及び配列番号６２、１３、１４；
（ｃ）それぞれ、配列番号８、３５及び３９及び配列番号６２、１３、１４；
（ｄ）それぞれ、配列番号８、３５及び４０及び配列番号６２、１３、１４；
（ｅ）それぞれ、配列番号８、３５及び４１及び配列番号６２、１３、１４；
（ｆ）それぞれ、配列番号８、３５及び４２及び配列番号６２、１３、１４；
（ｇ）それぞれ、配列番号８、３５及び４３及び配列番号６２、１３、１４；
（ｈ）それぞれ、配列番号８、３５及び４４及び配列番号６２、１３、１４；
（ｉ）それぞれ、配列番号８、３５及び４５及び配列番号６２、１３、１４；及び
（ｊ）それぞれ、配列番号８、３５及び４６及び配列番号６２、１３、１４
からなる群から選択される配列を有する、ＣＤＲＨ１ドメイン、ＣＤＲＨ２ドメイン及びＣＤＲＨ３ドメインと、ＣＤＲＬ１ドメイン、ＣＤＲＬ２ドメイン及びＣＤＲＬ３ドメインを含む。
【００３０】
特定の実施形態では、ヒト化抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントは、
（ａ）それぞれ、配列番号２０及び配列番号５５；
（ｂ）それぞれ、配列番号２１及び配列番号５５；
（ｃ）それぞれ、配列番号２２及び配列番号５５；
（ｄ）それぞれ、配列番号２３及び配列番号５５；
（ｅ）それぞれ、配列番号２４及び配列番号５５；
（ｆ）それぞれ、配列番号２５及び配列番号５５；
（ｇ）それぞれ、配列番号２６及び配列番号５５；
（ｈ）それぞれ、配列番号２７及び配列番号５５；
（ｉ）それぞれ、配列番号２８及び配列番号５５；及び
（ｊ）それぞれ、配列番号２９及び配列番号５５
からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％の同一性を有する配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。
【００３１】
特定の実施形態では、ヒト化抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントは、
（ａ）それぞれ、配列番号２０及び配列番号５５；
（ｂ）それぞれ、配列番号２１及び配列番号５５；
（ｃ）それぞれ、配列番号２２及び配列番号５５；
（ｄ）それぞれ、配列番号２３及び配列番号５５；
（ｅ）それぞれ、配列番号２４及び配列番号５５；
（ｆ）それぞれ、配列番号２５及び配列番号５５；
（ｇ）それぞれ、配列番号２６及び配列番号５５；
（ｈ）それぞれ、配列番号２７及び配列番号５５；
（ｉ）それぞれ、配列番号２８及び配列番号５５；及び
（ｊ）それぞれ、配列番号２９及び配列番号５５
からなる群から選択される配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。
【００３２】
特定の実施形態では、ヒト化抗ＡＤＡＭ９抗体は、Ｆｃ領域を含む全長抗体である。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、（ａ）Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ並びにＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａからなる群から選択される、ＦｃγＲに対する変異体Ｆｃ領域のアフィニティを下げる１つ以上のアミノ酸改変；及び／または（ｂ）Ｓ４４２にシステイン残基を導入するアミノ酸改変を含む変異体Ｆｃ領域であり、前記番号付けは、ＫａｂａｔにあるＥＵインデックスの番号付けである。
【００３３】
いくつかの実施形態では、ヒト化抗ＡＤＡＭ９抗体は、
（ａ）それぞれ、配列番号５０及び配列番号６８；
（ｂ）それぞれ、配列番号５１及び配列番号６８；及び
（ｃ）それぞれ、配列番号５２及び配列番号６８からなる群から選択される配列を有する重鎖と軽鎖とを含む。
【００３４】
特定の実施形態では、ヒト化抗ＡＤＡＭ９抗体は、
（ａ）それぞれ、配列番号１４１及び配列番号６８；
（ｂ）それぞれ、配列番号１４２及び配列番号６８；
（ｃ）それぞれ、配列番号１４３及び配列番号６８；
（ｄ）それぞれ、配列番号１５１及び配列番号６８；
（ｅ）それぞれ、配列番号１５２及び配列番号６８；
（ｆ）それぞれ、配列番号１５３及び配列番号６８；及び
（ｇ）それぞれ、配列番号１５４及び配列番号６８
からなる群から選択される配列を有する重鎖と軽鎖とを含む。
【００３５】
特定の実施形態では、本発明の免疫コンジュゲートは、以下の式によって表され、
【化３】
2020504607.tif 000005
ここで、
ＣＢＡは、リシン残基を介してＣｙＬ１に共有結合する、本明細書に記載の本発明の抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントであり；
ＷＬは、１〜２０の整数であり、
ＣｙＬ１は、以下の式
【化４】
2020504607.tif 000006
によって表されるか、またはその医薬的に許容される塩であり、
ＮとＣとの間の二重線
【化５】
2020504607.tif 000007
は、単結合または二重結合を表し、但し、二重結合である場合には、Ｘは存在せず、Ｙは、−Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ４）アルキルであり；単結合である場合には、Ｘは、−Ｈまたはアミン保護部分であり、Ｙは、−ＯＨまたは−ＳＯ３Ｈであるか、またはこれらの医薬的に許容される塩であり；
Ｗ’は、−ＮＲｅ’であり、
Ｒｅ’は、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−Ｒｋであり；
ｎは、２〜６の整数であり；
Ｒｋは、−Ｈまたは−Ｍｅであり；
Ｒｘ３は、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり；
Ｌ’は、以下の式
−ＮＲ５−Ｐ−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＲａＲｂ）ｍ−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｂ１’）；または
−ＮＲ５−Ｐ−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＲａＲｂ）ｍ−Ｓ−Ｚｓ１−（Ｂ２’）
によって表され、
Ｒ５は、−Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ３）アルキルであり；
Ｐは、アミノ酸残基または２〜２０個のアミノ酸残基を含有するペプチドであり；
Ｒａ及びＲｂは、それぞれの場合に、それぞれ独立して、−Ｈ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、または帯電した置換基またはイオン化可能な基Ｑであり；
ｍは、１〜６の整数であり、
Ｚｓ１は、以下の式
【化６】
2020504607.tif 000008
【化７】
2020504607.tif 000009
のいずれか１つから選択され、
ｑは、１〜５の整数である。
【００３６】
特定の実施形態では、本発明の免疫コンジュゲートは、以下の式によって表され、
【化８】
2020504607.tif 000010
ここで、
ＣＢＡは、リシン残基を介してＣｙＬ２に共有結合する、本明細書に記載の本発明の抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントであり；
ＷＬは、１〜２０の整数であり、
ＣｙＬ２は、以下の式
【化９】
2020504607.tif 000011
によって表されるか、またはその医薬的に許容される塩であり、
ＮとＣとの間の二重線
【化１０】
2020504607.tif 000012
は、単結合または二重結合を表し、但し、二重結合である場合には、Ｘは存在せず、Ｙは、−Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ４）アルキルであり；単結合である場合には、Ｘは、−Ｈまたはアミン保護部分であり、Ｙは、−ＯＨまたは−ＳＯ３Ｈであり；
Ｒｘ１及びＲｘ２は、独立して、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり；
Ｒｅは、−Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり；
Ｗ’は、−ＮＲｅ’であり、
Ｒｅ’は、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−Ｒｋであり；
ｎは、２〜６の整数であり；
Ｒｋは、−Ｈまたは−Ｍｅであり；
Ｚｓ１は、以下の式
【化１１】
2020504607.tif 000013
【化１２】
2020504607.tif 000014
のいずれか１つから選択され、
ｑは、１〜５の整数である。
【００３７】
特定の実施形態では、本発明の免疫コンジュゲートは、以下の式によって表され、
【化１３】
2020504607.tif 000015
ここで、
ＣＢＡは、リシン残基を介してＣｙＬ３に共有結合する、本明細書に記載の本発明の抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントであり；
ＷＬは、１〜２０の整数であり、
ＣｙＬ３は、以下の式
【化１４】
2020504607.tif 000016
によって表され、
ｍ’は、１または２であり；
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ３）アルキルであり；
Ｚｓ１は、以下の式
【化１５】
2020504607.tif 000017
【化１６】
2020504607.tif 000018
のいずれか１つから選択され、
ｑは、１〜５の整数である。
【００３８】
特定の実施形態では、本発明の免疫コンジュゲートは、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）２−スルホブタノエート（スルホ−ＳＰＤＢ）を介してメイタンシノイドＤＭ４に結合したヒト化抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントを含み、ヒト化抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントは、それぞれ配列番号８、３５及び４５及び配列番号６２、１３、１４の配列を有するＣＤＲＨ１ドメイン、ＣＤＲＨ２ドメイン及びＣＤＲＨ３ドメインと、ＣＤＲＬ１ドメイン、ＣＤＲＬ２ドメイン及びＣＤＲＬ３ドメインとを含む。特定の実施形態では、ヒト化抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントは、それぞれ配列番号２８及び配列番号５５の配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む。いくつかの実施形態では、ヒト化抗ＡＤＡＭ９抗体は、それぞれ配列番号５２及び配列番号６８の配列を有する重鎖と軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、ヒト化抗ＡＤＡＭ９抗体は、それぞれ配列番号１５１及び配列番号６８の配列を有する重鎖と軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、配列番号５２または配列番号１５１のＸは、リシンである。いくつかの実施形態では、配列番号５２または配列番号１５１のＸは、存在しない。
【００３９】
特定の実施形態では、本発明の免疫コンジュゲートは、以下の式
【化１７】
2020504607.tif 000019
によって表されるか、またはその医薬的に許容される塩であり、
ここで、
ＷＬは、１〜１０の整数である。
【００４０】
ＣＢＡは、それぞれ、配列番号８、３５及び４５及び配列番号６２、１３、１４の配列を有するＣＤＲＨ１ドメイン、ＣＤＲＨ２ドメイン及びＣＤＲＨ３ドメインと、ＣＤＲＬ１ドメイン、ＣＤＲＬ２ドメイン及びＣＤＲＬ３ドメインとを含むヒト化抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントである。特定の実施形態では、ヒト化抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントは、それぞれ配列番号２８及び配列番号５５の配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む。いくつかの実施形態では、ヒト化抗ＡＤＡＭ９抗体は、それぞれ配列番号５２及び配列番号６８の配列を有する重鎖と軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、ヒト化抗ＡＤＡＭ９抗体は、それぞれ配列番号１５１及び配列番号６８の配列を有する重鎖と軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、配列番号５２または配列番号１５１のＸは、リシンである。いくつかの実施形態では、配列番号５２または配列番号１５１のＸは、存在しない。いくつかの実施形態では、免疫コンジュゲートを含む組成物（例えば、医薬組成物）のＤＡＲ値は、１．０〜５．０、１．０〜４．０、１．０〜３．４、１．０〜３．０、１．５〜２．５、２．０〜２．５または１．８〜２．２の範囲である。いくつかの実施形態では、ＤＡＲは、４．０未満、３．８未満、３．６未満、３．５未満、３．０未満または２．５未満である。
【００４１】
特定の実施形態では、本発明の免疫コンジュゲートは、以下の式によって表され、
【化１８】
2020504607.tif 000020
ここで、
ＣＢＡは、システイン残基を介してＣｙＣ１に共有結合する、本明細書に記載の本発明の抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントであり；
ＷＣは、１または２であり、
ＣｙＣ１は、以下の式
【化１９】
2020504607.tif 000021
によって表されるか、またはその医薬的に許容される塩であり、
ＮとＣとの間の二重線
【化２０】
2020504607.tif 000022
は、単結合または二重結合を表し、但し、二重結合である場合には、Ｘは存在せず、Ｙは、−Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ４）アルキルであり；単結合である場合には、Ｘは、−Ｈまたはアミン保護部分であり、Ｙは、−ＯＨまたは−ＳＯ３Ｈであるか、またはこれらの医薬的に許容される塩であり；
Ｒ５は、−Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ３）アルキルであり；
Ｐは、アミノ酸残基または２〜２０個のアミノ酸残基を含有するペプチドであり；
Ｒａ及びＲｂは、それぞれの場合に、独立して、−Ｈ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルまたは帯電した置換基またはイオン化可能な基Ｑであり；
Ｗ’は、−ＮＲｅ’であり、
Ｒｅ’は、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−Ｒｋであり；
ｎは、２〜６の整数であり；
Ｒｋは、−Ｈまたは−Ｍｅであり；
Ｒｘ３は、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり；
ＬＣは、
【化２１】
2020504607.tif 000023
によって表され、ｓ１は、ＣＢＡに共有結合した部位であり、ｓ２は、ＣｙＣ１上の−Ｃ（＝Ｏ）−基に共有結合した部位であり；
Ｒ１９及びＲ２０は、それぞれの場合に、独立して、−Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ３）アルキルであり；
ｍ”は、１〜１０の整数であり；
Ｒｈは、−Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ３）アルキルである。
【００４２】
特定の実施形態では、本発明の免疫コンジュゲートは、以下の式
【化２２】
2020504607.tif 000024
によって表されるか、またはその医薬的に許容される塩であり、
ＮとＣとの間の二重線
【化２３】
2020504607.tif 000025
は、単結合または二重結合を表し、但し、二重結合である場合には、Ｘは存在せず、Ｙは−Ｈであり；単結合である場合には、Ｘは、−Ｈであり、Ｙは、−ＳＯ３Ｈであるか、またはこれらの医薬的に許容される塩であり；
【００４３】
ＣＢＡは、それぞれ、配列番号８、３５及び４５及び配列番号６２、１３、１４の配列を有するＣＤＲＨ１ドメイン、ＣＤＲＨ２ドメイン及びＣＤＲＨ３ドメインと、ＣＤＲＬ１ドメイン、ＣＤＲＬ２ドメイン及びＣＤＲＬ３ドメインとを含むヒト化抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントである。特定の実施形態では、ヒト化抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントは、それぞれ配列番号２８及び配列番号５５の配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む。いくつかの実施形態では、ヒト化抗ＡＤＡＭ９抗体は、それぞれ配列番号１４２及び配列番号６８の配列を有する重鎖と軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、配列番号１４２のＸは、リシンである。いくつかの実施形態では、ヒト化抗ＡＤＡＭ９抗体は、それぞれ配列番号１５２及び配列番号６８の配列を有する重鎖と軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、配列番号１４２または配列番号１５２のＸは、リシンである。いくつかの実施形態では、配列番号１４２または配列番号１５２のＸは、存在しない。
【００４４】
特定の実施形態では、免疫コンジュゲートは、以下の式によって表され、
【化２４】
2020504607.tif 000026
ここで、
ＣＢＡは、システイン残基を介してＣｙＣ２に共有結合する、本明細書に記載の本発明の抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントであり；
ＷＣは、１または２であり、
ＣｙＣ２は、以下の式
【化２５】
2020504607.tif 000027
によって表されるか、またはその医薬的に許容される塩であり、
ＮとＣとの間の二重線
【化２６】
2020504607.tif 000028
は、単結合または二重結合を表し、但し、二重結合である場合には、Ｘは存在せず、Ｙは、−Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ４）アルキルであり；単結合である場合には、Ｘは、−Ｈまたはアミン保護部分であり、Ｙは、−ＯＨまたは−ＳＯ３Ｈであるか、またはこれらの医薬的に許容される塩であり；
Ｒｘ１は、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり；
Ｒｅは、Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり；
Ｗ’は、−ＮＲｅ’であり、
Ｒｅ’は、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−Ｒｋであり；
ｎは、２〜６の整数であり；
Ｒｋは、−Ｈまたは−Ｍｅであり；
Ｒｘ２は、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり；
Ｌｃ’は、以下の式
【化２７】
2020504607.tif 000029
によって表され、
ここで、
ｓ１は、ＣＢＡに共有結合した部位であり、ｓ２は、ＣｙＣ２上の−Ｓ−基に共有結合した部位であり；
Ｚは、Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ９−または−ＮＲ９−Ｃ（＝Ｏ）−であり；
Ｑは、Ｈ、帯電した置換基またはイオン化可能な基であり；
Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１９、Ｒ２０、Ｒ２１及びＲ２２は、それぞれの場合に、それぞれ独立して、−Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ３）アルキルであり；
ｑ及びｒは、それぞれの場合に、独立して、０〜１０の整数であり；
ｍ及びｎは、それぞれ独立して、０〜１０の整数であり；
Ｒｈは、−Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ３）アルキルであり；
Ｐ’は、アミノ酸残基または２〜２０個のアミノ酸残基を含有するペプチドである。
【００４５】
特定の実施形態では、本発明の免疫コンジュゲートは、以下の式によって表され、
【化２８】
2020504607.tif 000030
ここで、
ＣＢＡは、システイン残基を介してＣｙＣ３に共有結合する、本明細書に記載の本発明の抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントであり；
ＷＣは、１または２であり、
ＣｙＣ３は、以下の式
【化２９】
2020504607.tif 000031
によって表され、
ここで、
ｍ’は、１または２であり；
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、−Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ３）アルキルであり；
ＬＣは、以下の式
【化３０】
2020504607.tif 000032
によって表され、
ここで、
ｓ１は、ＣＢＡに共有結合した部位であり、ｓ２は、ＣｙＣ３上の−Ｓ−基に共有結合した部位であり；
Ｚは、Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ９−または−ＮＲ９−Ｃ（＝Ｏ）−であり；
Ｑは、Ｈ、帯電した置換基またはイオン化可能な基であり；
Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１９、Ｒ２０、Ｒ２１及びＲ２２は、それぞれの場合に、それぞれ独立して、−Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ３）アルキルであり；
ｑ及びｒは、それぞれの場合に、独立して、０〜１０の整数であり；
ｍ及びｎは、それぞれ独立して、０〜１０の整数であり；
Ｒｈは、−Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ３）アルキルであり；
Ｐ’は、アミノ酸残基または２〜２０個のアミノ酸残基を含有するペプチドである。
【００４６】
特定の実施形態では、本発明の免疫コンジュゲートは、以下の式
【化３１】
2020504607.tif 000033
によって表されるか、またはその医薬的に許容される塩であり、
ここで、
ＤＭは、以下の式
【化３２】
2020504607.tif 000034
によって表される薬物部分であり、
ＷＣは、１または２である。
【００４７】
ＣＢＡは、それぞれ、配列番号８、３５及び４５及び配列番号６２、１３、１４の配列を有するＣＤＲＨ１ドメイン、ＣＤＲＨ２ドメイン及びＣＤＲＨ３ドメインと、ＣＤＲＬ１ドメイン、ＣＤＲＬ２ドメイン及びＣＤＲＬ３ドメインとを含むヒト化抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントである。特定の実施形態では、ヒト化抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントは、それぞれ配列番号２８及び配列番号５５の配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む。いくつかの実施形態では、ヒト化抗ＡＤＡＭ９抗体は、それぞれ配列番号１４２及び配列番号６８の配列を有する重鎖と軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、ヒト化抗ＡＤＡＭ９抗体は、それぞれ配列番号１５２及び配列番号６８の配列を有する重鎖と軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、配列番号１４２または配列番号１５２のＸは、リシンである。いくつかの実施形態では、配列番号１４２または配列番号１５２のＸは、存在しない。いくつかの実施形態では、ＷＣは、２である。
【００４８】
特定の実施形態では、本発明の免疫コンジュゲートは、以下の式
【化３３】
2020504607.tif 000035
によって表されるか、またはその医薬的に許容される塩であり、
ここで、
ＤＭは、以下の式
【化３４】
2020504607.tif 000036
によって表される薬物部分であり、
ＣＢＡは、それぞれ配列番号８、３５及び４５及び配列番号６２、１３、１４の配列を有するＣＤＲＨ１ドメイン、ＣＤＲＨ２ドメイン及びＣＤＲＨ３ドメインと、ＣＤＲＬ１ドメイン、ＣＤＲＬ２ドメイン及びＣＤＲＬ３ドメインとを含む、ヒト化抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントである。特定の実施形態では、ヒト化抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントは、それぞれ配列番号２８及び配列番号５５の配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む。いくつかの実施形態では、ヒト化抗ＡＤＡＭ９抗体は、それぞれ配列番号１４２及び配列番号６８の配列を有する重鎖と軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、ヒト化抗ＡＤＡＭ９抗体は、それぞれ配列番号１５２及び配列番号６８の配列を有する重鎖と軽鎖とを含み、
ＷＣは、１または２である。いくつかの実施形態では、ＷＣは、２である。
【００４９】
本発明の別の態様は、有効量の本明細書に記載の本発明の免疫コンジュゲートと、医薬的に許容される担体、賦形剤または希釈剤とを含む医薬組成物を提供する。
【００５０】
別の態様では、本発明は、対象において、ＡＤＡＭ９の発現と関連するか、またはＡＤＡＭ９の発現によって特徴付けられる疾患または状態を治療するための方法であって、前記対象に、有効量の本明細書に記載する本発明の免疫コンジュゲートまたは医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。また、本発明において提供されるのは、対象において、ＡＤＡＭ９の発現と関連するか、またはＡＤＡＭ９の発現によって特徴付けられる疾患または状態の治療における、本明細書に記載する本発明の免疫コンジュゲートまたは医薬組成物の使用である。本発明はまた、対象において、ＡＤＡＭ９の発現と関連するか、またはＡＤＡＭ９の発現によって特徴付けられる疾患または状態を治療するための医薬の製造のための本明細書に記載する本発明の免疫コンジュゲートまたは医薬組成物の使用を提供する。
【００５１】
特定の実施形態では、ＡＤＡＭ９と関連するか、またはＡＤＡＭ９によって特徴付けられる疾患または状態は、がんである。いくつかの実施形態では、癌は、非小細胞肺癌、大腸癌、胃癌、膵臓癌、腎細胞癌、前立腺癌、食道癌、乳癌、頭頸部癌、卵巣癌、肝臓癌、子宮頸癌、甲状腺癌、精巣癌、骨髄がん、黒色腫及びリンパがんからなる群から選択される。特定の実施形態では、非小細胞肺癌は、扁平上皮癌、腺癌または大細胞未分化癌である。特定の実施形態では、大腸癌は、腺癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、原発性大腸リンパ腫、平滑筋肉腫または扁平上皮癌である。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１Ａ】免疫組織化学（ＩＨＣ）試験の結果を提示し、ＭＡＢ−Ａが種々の非小細胞肺癌型を特異的に標識する能力を示し、一方、アイソタイプ対照は、これらのいずれの癌細胞型も特異的に標識することができなかった。
【図１Ｂ】免疫組織化学（ＩＨＣ）試験の結果を提示し、ＭＡＢ−Ａが乳癌細胞、前立腺癌細胞、胃癌細胞を特異的に標識する能力を示し、一方、アイソタイプ対照は、これらのいずれの癌細胞型も特異的に標識することができなかった。
【図１Ｃ】免疫組織化学（ＩＨＣ）試験の結果を提示し、ＭＡＢ−Ａが結腸癌細胞を特異的に標識する能力を示し、一方、アイソタイプ対照は、これらのいずれの癌細胞型も特異的に標識することができなかった。
【図２】細胞染色試験の結果を提示し、ＭＡＢ−ＡがヒトＡＤＡＭ９に結合し、これより少ない程度でカニクイザルＡＤＡＭ９に結合し、２９３−ＦＴ細胞及びＣＨＯ−Ｋ細胞の表面で一時的に発現することを示す（それぞれ、上側及び下側のパネル）。
【図３Ａ】ＭＡＢ−Ａのいくつかのヒト化／最適化された変異体とアラインメントされたマウス抗ＡＤＡＭ９−ＶＨドメインのアミノ酸配列（図３Ａ、配列番号７、１６、１７、１８、１９、２１、２２、２３及び２８）を示す。初期の最適化中にＣＤＲ内で置換された位置は、以下のように下線が引かれている。潜在的な脱アミド化及び異性化部位は、１本の下線で示されており、リシン残基は、二重下線で示されており、更なる不安定な残基は、二重破線下線で示されている。
【図３Ｂ】ＭＡＢ−Ａのいくつかのヒト化／最適化された変異体とアラインメントされたマウス抗ＡＤＡＭ９−ＶＬドメインのアミノ酸配列（図３Ｂ、配列番号１１、５１、５２、５３及び５４）を示す。初期の最適化中にＣＤＲ内で置換された位置は、以下のように下線が引かれている。潜在的な脱アミド化及び異性化部位は、１本の下線で示されており、リシン残基は、二重下線で示されており、更なる不安定な残基は、二重破線下線で示されている。
【図４】Ａ〜Ｂは、ＣＤＲＨ３変異体を含む１０種類の選択した最適化されたｈＭＡＢ−Ａクローン、親ｈＭＡＢ−Ａ（２．２）及びアイソタイプ対照抗体のＥＬＩＳＡ結合曲線を提示す。Ａは、ｃｙｎｏＡＤＡＭ９の結合曲線を提示し、Ｂは、ｈｕＡＤＡＭ９の結合曲線を提示する。
【図５】Ａ〜Ｂは、Ｆｃ変異体のＥＬＩＳＡ結合曲線を提示する。Ａは、ｃｙｎｏＡＤＡＭ９の結合曲線を提示し、Ｂは、ｈｕＡＤＡＭ９の結合曲線を提示する。
【図６】Ａ〜Ｂは、２０がん組織マイクロアレイにおけるＡＤＡＭ９  ＩＨＣ膜染色と、８種類の選択した適応症におけるＡＤＡＭ  ＩＨＣ膜及び細胞組織染色をそれぞれ示す。
【図７】Ａ〜Ｂは、種々の抗ＡＤＡＭ９抗体コンジュゲートのパルスインターナリゼーション及び連続インターナリゼーションを示す。
【図８】Ａ〜Ｄは、ｃｈＭＡＢ−Ａ、ｈＭＡＢ−Ａ（２．２）、ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｃ．２）及びｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）抗体、及びこれらの対応する免疫コンジュゲートのＦＡＣＳ結合曲線を示す。
【図９】Ａ〜Ｈは、ＡＤＡＭ９陽性腫瘍細胞株の広範囲にわたるパネルについて、種々の抗ＡＤＡＭ９免疫コンジュゲート（ｈＭＡＢ−Ａ（２．２）−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４、ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４、ｈＭＡＢ−Ａ（２．２）−ＤＧＮ５４９及びｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）−Ｓ４４２Ｃ−ＤＧＮ５４９）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性を示す。標的ではないＩｇＧ１由来のコンジュゲートは、陰性対照として含まれる。
【図１０】Ｃａｌｕ−３ヒト非小細胞肺腺癌異種移植モデルにおいて、ｈＭＡＢ−Ａ（２．２）−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４（１．２５ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、抗体による）及びｃｈＭＡＢ−Ａ−ＤＧＮ５４９（１０μｇ／ｋｇ、ペイロードによる）の抗腫瘍活性を示す。
【図１１】Ｃａｌｕ−３ヒト非小細胞肺腺癌異種移植モデルにおいて、ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）−Ｓ４４２Ｃ−ＤＧＮ５４９（０．５μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ、３μｇ／ｋｇ及び１０μｇ／ｋｇ、ペイロードによる）の抗腫瘍活性を示す。
【図１２】Ｈ１７０３非小細胞肺扁平上皮癌異種移植モデルにおいて、ｈＭＡＢ−Ａ（２．２）−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４（１．２５ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、抗体による）の抗腫瘍活性を示す。
【図１３】Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２頭頸部扁平上皮細胞癌モデル（腫瘍体積が９５．７６〜４５０．８３ｍｍ３）におけるｃｈＭＡＢ−Ａ−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４（１．２５ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ）の抗腫瘍活性を示す。
【図１４】Ｄｅｔｒｏｉ５６２頭頸部扁平上皮細胞癌モデル（腫瘍体積が２７７．５１〜５０３．４９ｍｍ３）におけるｃｈＭＡＢ−Ａ−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４（１．２５ｍｇ／ｋｇ及び５ｍｇ／ｋｇ）の抗腫瘍活性を示す。
【図１５】ＳＮＵ−５胃癌異種移植モデルにおけるｈｕＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）−Ｓ４４２Ｃ−ＤＧＮ５４９の抗腫瘍活性を示す。
【図１６】ＳＮＵ−５胃癌異種移植モデルにおけるｈｕＭＡＢ−Ａ（２．２）−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４の抗腫瘍活性を示す。
【図１７】ＳＷ４８大腸癌異種移植モデルにおけるｈｕＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）−Ｓ４４２Ｃ−ＤＧＮ５４９の抗腫瘍活性を示す。
【図１８】ＳＷ４８大腸癌異種移植モデルにおけるｈｕＭＡＢ−Ａ（２．２）−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４の抗腫瘍活性を示す。
【図１９】Ａは、ｐＨ６．０でのＹＴＥ突然変異がある状態及びない状態において、捕捉された抗ＡＤＡＭ９抗体に対する２５０ｎＭ及び１０００ｎΜ  ｈｕＦｃＲｎの結合を示す。Ｂは、ｐＨ６．０で固定されたＦｃＲｎに対する、ＹＴＥ突然変異がある状態及びない状態において、２５ｎＭ及び１００ｎΜ  抗ＡＤＡＭ９抗体の結合を示す。
【図２０】４ｍｇ／ｋｇ及び１２ｍｇ／ｋｇ（抗体投薬量）でのカニクイザルにおけるｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４及びｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）−ＹＴＥ−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４の抗体−薬物コンジュゲートＰＫデータを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
本発明は、少なくとも１種類の医薬薬剤に結合される「ジスインテグリン及びメタロプロテイナーゼドメインを含有するタンパク質９」（「ＡＤＡＭ９」）に特異的に結合することが可能な抗体またはそのフラグメントを含む免疫コンジュゲートに関する。本発明は、特に、ヒトＡＤＡＭ９及び非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）のＡＤＡＭ９と交差反応する、このような免疫コンジュゲートに関する。本発明は、更に、レシピエント対象にこのような免疫コンジュゲートを投与すると免疫原性の低下を示すようなヒト化及び／または脱免疫化された軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン及び／または重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含む、全てのこのような免疫コンジュゲートに関する。本発明はまた、このような免疫コンジュゲートのいずれかを含有する医薬組成物、並びにがん及び他の疾患及び状態の治療において、このような免疫コンジュゲートのいずれかの使用を伴う方法に関する。
Ｉ．抗体及びその結合ドメイン
【００５４】
本発明の免疫コンジュゲートは、ＡＤＡＭ９またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントに結合する抗体を含む。「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変ドメインに位置する少なくとも１つの抗原認識部位を介し、標的（例えば、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなど）に特異的に結合することが可能な免疫グロブリン分子である。本明細書で使用される場合、「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」及び「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」との用語は、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、合成抗体、キメラ抗体、ポリクローナル抗体、ラクダ化抗体、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、イントラボディ、及び上述のいずれかのエピトープ結合フラグメントを指す。特に、「抗体」との用語は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性なフラグメント、すなわち、エピトープ結合部位を含有する分子を含む。免疫グロブリン分子は、任意の型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）またはサブクラスであってもよい。ここ数十年間は、抗体の治療薬への潜在能力についての関心が再び起こっており、抗体は、バイオテクノロジーに基づく薬物のリーディング群の１つになってきている（Ｃｈａｎ，Ｃ．Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．（２００９）  「Ｔｈｅ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ」，Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ  Ｍｅｄ．Ｊ．５０（７）：６６３−６６６）。診断でのこれらの使用に加え、抗体は、治療薬剤として有用であることが示されている。２００を超える抗体由来の薬物が、使用承認されているか、または開発中である。
【００５５】
抗体は、特定のドメインまたは部分または配座を有するこのような分子（「エピトープ」）の存在に起因して、ポリペプチドまたはタンパク質または非タンパク質分子に「免疫特異的に結合する」ことが可能である。エピトープ含有分子は、免疫原性活性を有していてもよく、その結果、動物において、抗体産生応答を誘発する。このような分子は、「抗原」と呼ばれる。本明細書で使用される場合、抗体は、代替的なエピトープと比較して、そのエピトープと、より頻繁に、より迅速に、より長い継続時間で、及び／またはより大きなアフィニティで反応するか、または会合する場合、別の分子（すなわちエピトープ）の領域に「免疫特異的に」結合すると言われる。例えば、ウイルスエピトープに免疫特異的に結合する抗体は、他のウイルスエピトープまたは非ウイルス性エピトープに対して免疫特異的に結合するよりも、より大きなアフィニティ、アビデティで、より容易に、及び／またはより長い継続時間で、そのウイルスエピトープに結合する抗体である。例えば、第１の標的に免疫特異的に結合する抗体（または部分またはエピトープ）が、第２の標的に特異的または優先的に結合してもよく、または結合しなくてもよいことが、この定義を読むことによっても理解される。このように、特定のエピトープに「免疫特異的に結合する」ことは、そのエピトープに対する排他的な結合を必ずしも必要とするわけではない（が、含まれていてもよい）。一般的に、必ずそうというわけではないが、結合に対する言及は、「免疫特異的な」結合を意味する。２つの分子は、このような結合が、それぞれのリガンドに結合する特異性を示す場合、「生理学的に特異的な」様式で互いに結合することが可能であると言われる。
【００５６】
「モノクローナル抗体」との用語は、均一な抗体集合を指し、モノクローナル抗体は、ある抗原への選択的に結合に関与するアミノ酸（天然に存在するか、または天然に存在しない）で構成される。モノクローナル抗体は、非常に特異的であり、１つのエピトープ（または抗原部位）に指向する。「モノクローナル抗体」との用語は、インタクトなモノクローナル抗体及び全長モノクローナル抗体だけではなく、そのフラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２Ｆｖ）、単鎖（ｓｃＦｖ）、これらの突然変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化モノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、及び所望な特異性と抗原に対する結合能を有する抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の改変した構成を包含する。この用語は、抗体の供給源または製造様式（例えば、ハイブリドーマ、ファージ選択、組換え発現、トランスジェニック動物など）に関して限定することを意図していない。この用語は、「抗体」の定義の下で、免疫グロブリン全体及び上に記載したフラグメントなどを含む。モノクローナル抗体を製造する方法は、当該技術分野で既知である。使用可能な１つの方法は、Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（１９７５）  「Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  Ｏｆ  Ｆｕｓｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｏｆ  Ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ」  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７の方法、またはその改変法である。典型的には、モノクローナル抗体は、マウス、ラットまたはウサギで開発されている。抗体は、動物に、免疫原になる量の所望のエピトープを含む細胞、細胞抽出物またはタンパク質調製物を用いて免疫付与することによって作られる。免疫原は、限定されないが、初代細胞、培養した細胞株、がん細胞、タンパク質、ペプチド、核酸または組織であってもよい。免疫付与に使用される細胞は、免疫原として使用する前に、所定時間（例えば、少なくとも２４時間）培養されてもよい。細胞は、それ自体で、または非変成アジュバント（例えば、Ｒｉｂｉ）と組み合わせて免疫原として使用されてもよい（例えば、Ｊｅｎｎｉｎｇｓ，Ｖ．Ｍ．（１９９５）  「Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔｓ  Ｕｓｅｄ  ｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ」  ＩＬＡＲ  Ｊ．３７（３）：１１９−１２５）。一般的に、細胞は、インタクトなまま保持されるべきであり、好ましくは、免疫原として使用されるとき、生存可能であるべきである。インタクトな細胞は、免疫付与された動物によって破壊された細胞よりも、抗原をよりよく検出し得る。変成アジュバントまたは過酷なアジュバント（例えば、フロイントのアジュバント）の使用は、細胞を破壊し得るため、推奨されない。免疫原は、周期的な間隔（例えば、隔週または毎週）で複数回投与されてもよく、または動物において（例えば、組織組換えにおいて）生存率を維持する様式で投与されてもよい。または、所望の病原性エピトープに免疫特異的な既存のモノクローナル抗体及び任意の他の等価な抗体は、配列決定され、当該技術分野で知られている任意の手段によって組換えによって作られてもよい。一実施形態では、このよう��抗体は、配列決定され、次いで、ポリヌクレオチド配列を、発現または繁殖のためにベクター内にクローン化する。目的の抗体をコードする配列は、宿主細胞中のベクター内に維持されてもよく、次いで、宿主細胞は、次いで、宿主細胞は、膨張し、将来的な使用のために凍結されてもよい。このような抗体のポリヌクレオチド配列は、最適化されたアフィニティ、キメラ抗体、ヒト化抗体及び／またはラクダ化抗体を作成するため、アフィニティまたは抗体の他の特徴、及び本発明の免疫コンジュゲートを向上させるために、遺伝子操作に使用されてもよい。抗体をヒト化する一般的な原理は、抗体の抗原結合部位の基本配列を保持しつつ、抗体の残りの非ヒト部分をヒト抗体配列と交換することを含む。
【００５７】
天然抗体（例えば、天然ＩｇＧ抗体）は、２つの「重鎖」と複合体化する２つの「軽鎖」で構成される。各軽鎖は、可変ドメイン（「ＶＬ」）と定常ドメイン（「ＣＬ」）とを含む。各重鎖は、可変ドメイン（「ＶＨ」）と、３つの定常ドメイン（「ＣＨ１」、「ＣＨ２」及び「ＣＨ３」）と、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間に位置する「ヒンジ」領域（「Ｈ」）とを含む。対照的に、ｓｃＦｖは、短い連結ペプチドを介し、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインを連結することによって作られる単鎖分子である。
【００５８】
従って、天然に存在する免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ）の基本的な構造単位は、２つの軽鎖と２つの重鎖を有するテトラマーであり、通常は、約１５０，０００Ｄａの糖タンパク質として発現する。各鎖のアミノ末端（「Ｎ末端」）部分は、主に抗原認識に関与する約１００〜１１０、またはもっと多いアミノ酸の可変ドメインを含む。各鎖のカルボキシ末端（「Ｃ末端」）部分は、定常領域を規定し、軽鎖は、１つの定常ドメインを有し、重鎖は、通常、３つの定常ドメインとヒンジ領域とを有する。従って、ＩｇＧ分子の軽鎖の構造は、ｎ−ＶＬ−ＣＬ−ｃであり、ＩｇＧ重鎖の構造は、ｎ−ＶＨ−ＣＨ１−Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３−ｃである（ここで、ｎ及びｃは、それぞれ、ポリペプチドのＮ末端及びＣ末端を表す）。
Ａ．抗体可変ドメインの特性決定
【００５９】
ＩｇＧ分子の可変ドメインは、１、２、最も一般的には３の相補性決定領域（「ＣＤＲ」、すなわち、それぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）からなり、これらは、エピトープと接触する残基と、フレームワーク領域（「ＦＲ」）と呼ばれる非ＣＤＲセグメントとを含み、ＦＲは、一般的に、その構造を維持し、このような接触を可能にするように、ＣＤＲ領域の位置を決定する（しかし、特定のフレームワーク残基も、エピトープと接触してもよい）。従って、ＶＬドメイン及びＶＨドメインは、典型的には、ｎ−ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４−ｃの構造を有する（ここで、「ｎ」は、Ｎ末端を示し、「ｃ」は、Ｃ末端を示す）。抗体の軽鎖の第１、第２、第３及び第４のＦＲである（か、またはこれらとして作用し得る）ポリペプチドは、本明細書ではそれぞれ、ＦＲＬ１ドメイン、ＦＲＬ２ドメイン、ＦＲＬ３ドメイン及びＦＲＬ４ドメインと呼ばれる。同様に、抗体の重鎖の第１、第２、第３及び第４のＦＲである（か、またはこれらとして作用し得る）ポリペプチドは、本明細書ではそれぞれ、ＦＲＨ１ドメイン、ＦＲＨ２ドメイン、ＦＲＨ３ドメイン及びＦＲＨ４ドメインと呼ばれる。抗体の軽鎖の第１、第２及び第３のＣＤＲである（か、またはこれらとして作用し得る）ポリペプチドは、本明細書ではそれぞれ、ＣＤＲＬ１ドメイン、ＣＤＲＬ２ドメイン及びＣＤＲＬ３ドメインと呼ばれる。同様に、抗体の重鎖の第１、第２及び第３のＣＤＲである（か、またはこれらとして作用し得る）ポリペプチドは、本明細書ではそれぞれ、ＣＤＲＨ１ドメイン、ＣＤＲＨ２ドメイン及びＣＤＲＨ３ドメインと呼ばれる。従って、ＣＤＲＬ１ドメイン、ＣＤＲＬ２ドメイン、ＣＤＲＬ３ドメイン、ＣＤＲＨ１ドメイン、ＣＤＲＨ２ドメイン及びＣＤＲＨ３ドメインとの用語は、抗体に組み込まれると、抗体が特定のエピトープに結合することができる、ポリペプチドに関する。
【００６０】
本明細書全体で、免疫グロブリンの成熟重鎖及び軽鎖の可変ドメイン中の残基の番号付けは、鎖中のアミノ酸の位置によって命名される。Ｋａｂａｔは、抗体の多くのアミノ酸配列を記載し、各サブグループのアミノ酸コンセンサス配列を同定し、各アミノ酸に残基の数を割り当て、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔによって定義されるように同定される（ＣＤＲＨ１は、Ｃｈｏｔｈｉａ，  Ｃ．＆  Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．（（１９８７）  「Ｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ」  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７）に定義されるように、初期に５つの残基を開始することが理解されるだろう）。Ｋａｂａｔの番号付けスキームは、問題となっている抗体と、保存されたアミノ酸を参照することによるＫａｂａｔにおけるコンセンサス配列の１つとをアラインメントすることによって、その概要に含まれない抗体にまで拡張可能である。残基の番号を割り当てるための方法は、当該技術分野で標準的なものとなっており、キメラ変異体またはヒト化変異体を含め、異なる抗体での等価な位置にあるアミノ酸を容易に同定する。例えば、ヒト抗体軽鎖の５０位にあるアミノ酸は、マウス抗体軽鎖の５０位にあるアミノ酸と等価な位置を占める。
【００６１】
抗体が抗原のエピトープに結合する能力は、抗体のＶＬドメイン及びＶＨドメインの存在及びアミノ酸配列に依存して変わる。抗体の軽鎖及び重鎖の相互作用、特に、そのＶＬドメイン及びＶＨドメインの相互作用は、天然抗体（例えばＩｇＧ）の２つのエピトープ結合部位の１つを形成する。天然抗体は、たった１つのエピトープ種に結合することができる（すなわち、天然抗体は、一重特異性である）が、そのエピトープ種の複数のコピーに結合することができる（すなわち、二価または多価を示す）。
【００６２】
従って、本明細書で使用される場合、「エピトープ結合フラグメント」との用語は、エピトープに免疫特異的に結合することが可能な抗体のフラグメントを意味し、「エピトープ結合部位」との用語は、エピトープ結合フラグメントを含む分子の部分を指す。エピトープ結合フラグメントは、抗体の任意の１つ、２つ、３つ、４つ、または５つのＣＤＲドメインを含んでいてもよく、または抗体の６つのＣＤＲドメイン全てを含んでいてもよく、このようなエピトープに免疫特異的に結合することが可能であるが、このような抗体とは異なる、このようなエピトープに対する免疫特異性、アフィニティまたは選択制を示してもよい。しかし、好ましくは、エピトープ結合フラグメントは、このような抗体の６個全てのＣＤＲドメインを含むだろう。抗体のエピトープ結合フラグメントは、単鎖ポリペプチドであってもよく（例えば、ｓｃＦｖ）、または２つ以上のポリペプチド鎖を含んでいてもよく、それぞれがアミノ末端とカルボキシ末端を有している（例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ２フラグメントなど）。特に明記されない限り、本明細書に記載のタンパク質分子のドメインの順序は、「Ｎ末端からＣ末端に向かう」方向である。
【００６３】
本発明はまた、本発明の抗ＡＤＡＭ９−ＶＬ及び／またはＶＨドメインを含む単鎖可変ドメインフラグメント（「ｓｃＦｖ」）を含む免疫コンジュゲートを包含する。単鎖可変ドメインフラグメントは、ＶＬドメインとＶＨドメインとを含み、これらが短い「リンカー」ペプチドを用い、一緒に連結する。このようなリンカーは、更なる機能を与えるように、例えば、薬物の接続を可能にするように、または固体支持体の接続を可能にするように、改変されてもよい。単鎖変異体は、組換えによって、または合成によって製造することができる。ｓｃＦｖの合成による製造のために、自動化された合成機を使用してもよい。ｓｃＦｖの組換え産生のために、ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドを含有する適切なプラスミドが、適切な宿主細胞、真核、例えば、酵母、植物、昆虫または哺乳動物細胞、または原核、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのいずれかに導入されてもよい。目的のｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのライゲーションなどの通常の操作によって作られてもよい。得られたｓｃＦｖは、当該技術分野で既知の標準的なタンパク質精製技術を用いて単離することができる。
【００６４】
本発明はまた、特に、本発明の抗ＡＤＡＭ９抗体のヒト化／最適化された変異体のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３ドメインと、任意の１つ、２つまたは３つのこのようなＣＤＲＬを含むＶＬドメインと、任意の１つ、２つまたは３つのこのようなＣＤＲＨを含むＶＨドメインとを含む免疫コンジュゲート、及びこれらを含む多重結合分子を包含する。「ヒト化」抗体は、非ヒト主由来の免疫グロブリンのエピトープ結合部位と、ヒト免疫グロブリンの構造及び／または配列に基づく残りの免疫グロブリン構造とを有するキメラ分子を指す。ヒト化抗体は、一般的に、組換え技術を用いて調製される。本発明の免疫コンジュゲートは、本明細書で「ＭＡＢ−Ａ」と呼ばれる抗体のヒト化変異体、キメラ変異体またはラクダ化変異体を含んでいてもよい。ＭＡＢ−Ａの可変ドメインをコードするポリヌクレオチド配列は、改良または変更された特徴（例えば、アフィニティ、交差反応性、特異性など）を有するＭＡＢ−Ａ誘導体を作成するための遺伝子操作に使用されてもよい。抗体をヒト化する一般的な原理は、抗体のエピトープ結合部位の基本配列を保持しつつ、抗体の残りの非ヒト部分をヒト抗体配列と交換することを含む。モノクローナル抗体をヒト化するために、４つの一般的な工程が存在する。これらは、（１）出発原料である抗体軽鎖及び重鎖可変ドメインのヌクレオチド及び予想アミノ酸配列を決定することと、（２）ヒト化抗体またはラクダ化抗体を設計すること、すなわち、ヒト化またはラクダ化プロセスの間にどの抗体フレームワーク領域を使用するかを決定することと、（３）実際にヒト化またはラクダ化する方法論／技術を使用することと、（４）ヒト化抗体をトランスフェクトし、発現させることである。例えば、米国特許第４，８１６，５６７号、第５，８０７，７１５号、第５，８６６，６９２号及び第６，３３１，４１５号を参照。「最適化された」抗体との用語は、軽鎖または重鎖可変領域の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）において親抗体とは異なる少なくとも１つのアミノ酸を有する抗体を指し、親抗体と比較して、ヒトＡＤＡＭ９及び／またはカニクイザルＡＤＡＭ９に対し、高い結合アフィニティ（例えば、２倍以上）を与える。本明細書に提示する教示から、本発明の抗体は、ヒト化または最適化されていてもよく、またはヒト化され、最適化されていてもよいことが理解されるだろう。
【００６５】
エピトープ結合部位は、１つ以上の定常ドメインに融合した完全可変ドメイン、または適切なフレームワーク領域に接合したこのような可変ドメインのＣＤＲのみを含んでいてもよい。エピトープ結合部位は、野生型であってもよく、または１つ以上のアミノ酸置換、挿入または欠失によって改変されていてもよい。このような操作は、レシピエント（例えばヒト個体）において定常領域が免疫原として機能する能力を部分的に、または完全になくするが、外来可変ドメインに対する免疫応答の可能性は残る（ＬｏＢｕｇｌｉｏ，Ａ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）  「Ｍｏｕｓｅ／Ｈｕｍａｎ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｍａｎ：Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  Ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ」，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８６：４２２０−４２２４）。別の手法は、ヒト由来の定常領域を与えることだけではなく、ヒト免疫グロブリンでみられる形態に可能な限り近づくように再成形するように可変ドメインも改変することに注目している。抗体の重鎖及び軽鎖の両方の可変ドメインが、問題となる抗原に対する応答が様々であり、結合能力を決定する３つのＣＤＲを含有し、このＣＤＲが、４つのフレームワーク領域によって中断され、フレームワーク領域は、所与の種において比較的保存されており、おそらくＣＤＲの足場を与えていることが知られている。非ヒト抗体が、特定の抗原に対して調製される場合、可変ドメインは、改変されるヒト抗体中に存在するＦＲに、非ヒト抗体から誘導されるＣＤＲを接合することによって、「再成形」されるか、または「ヒト化」されてもよい。種々の抗体へのこの手法の応用は、Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５３：８５１−８５６．Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９８８）  「Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９８８）  「Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｇｒａｆｔｉｎｇ  Ａｎ  Ａｎｔｉｌｙｓｏｚｙｍｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ」，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，Ｃ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）  「Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ａ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｂｙ  ＣＤＲ−Ｇｒａｆｔｉｎｇ：Ｔｈｅ  Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  Ｏｆ  Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  Ｒｅｓｉｄｕｅｓ  Ｏｎ  Ｌｏｏｐ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ」，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ４：７７３−３７８３；Ｍａｅｄａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）  「Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｒｅｓｈａｐｅｄ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｗｉｔｈ  ＨＩＶ  −Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ」，  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ２：１２４−１３４；Ｇｏｒｍａｎ，Ｓ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）  「Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ  Ａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ＣＤ４  Ａｎｔｉｂｏｄｙ」  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８８：４１８１−４１８５；Ｔｅｍｐｅｓｔ，Ｐ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）  「Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ  Ａ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｏ  Ｉｎｈｉｂｉｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  Ｖｉｒｕｓ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ」，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：２６６−２７１；Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）  「Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ」，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８８：２８６９−２８７３；Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）  「Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ａｎ  Ａｎｔｉ−ｐｌ８５ｈｅｒ２  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８９：４２８５−４２８９；及びＣｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）「Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ａｎｄ  Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｗｉｔｈ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  Ｆｏｒ  Ｔｈｅ  ＣＤ３３  Ａｎｔｉｇｅｎ」，  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１４９−１１５４によって報告されている。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、全てのＣＤＲ配列を保存している（例えば、マウス抗体中に存在する６個全てのＣＤＲを含むヒト化マウス抗体）。他の実施形態では、ヒト化抗体は、元々の抗体のＣＤＲと配列が異なる１つ以上のＣＤＲ（１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つ）を有する。
【００６６】
齧歯類または改変齧歯類可変ドメインと、ヒト定常ドメインに融合する、その関連する相補性決定領域（ＣＤＲ）とを含むキメラ抗体を含め、非ヒト免疫グロブリンから誘導されるエピトープ結合部位を含む多くのヒト化抗体分子が記載されている（例えば、Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）  「Ｍａｎ−ｍａｄｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」，  Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：２９３−２９９；Ｌｏｂｕｇｌｉｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）  「Ｍｏｕｓｅ／Ｈｕｍａｎ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｍａｎ：Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  Ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ」，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８６：４２２０−４２２４；Ｓｈａｗ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）  「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ａ  Ｍｏｕｓｅ／Ｈｕｍａｎ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  （１７−１  Ａ）  Ｔｏ  Ａ  Ｃｏｌｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｕｍｏｒ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ａｎｔｉｇｅｎ」，  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：４５３４−４５３８；及びＢｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）  「Ｔｕｍｏｒ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｍｕｒｉｎｅ／Ｈｕｍａｎ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ」，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４７：３５７７−３５８３を参照）。他の参考文献は、適切なヒト抗体定常ドメインとの融合前にヒト支持フレームワーク領域（ＦＲ）に接合した齧歯類ＣＤＲを記載する（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９８８）  「Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９８８）  「Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｇｒａｆｔｉｎｇ  Ａｎ  Ａｎｔｉｌｙｓｏｚｙｍｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ」，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６；及びＪｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）  「Ｒｅｐｌａｃｉｎｇ  Ｔｈｅ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｒｅｇｉｏｎｓ  Ｉｎ  Ａ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｗｉｔｈ  Ｔｈｏｓｅ  Ｆｒｏｍ  Ａ  Ｍｏｕｓｅ」，  Ｎａｔｕｒｅ  ３２１  ：５２２−５２５を参照）。別の参考文献は、組換え操作された齧歯類フレームワーク領域によって支持される齧歯類ＣＤＲを記載する（例えば、欧州特許公開第５１９，５９６号を参照）。これらの「ヒト化」分子は、ヒトレシピエントにおけるこれらの部分の滞留時間及び有効性、治療適用を制限してしまうような、齧歯類抗ヒト抗体分子に対する望ましくない免疫応答を最小限にするように設計される。利用可能な抗体をヒト化する他の方法は、Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）  「Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ  Ｔｈｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ＣＤＲ−Ｇｒａｆｔｉｎｇ，Ａｎｄ  Ｒａｐｉｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｆ  Ａ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｔｈｅ  ＣＤ１８  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ｏｆ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｉｎｔｅ���ｒｉｎｓ」，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：２４７１−２４７６及び米国特許第６，１８０，３７７号、第６，０５４，２９７号、第５，９９７，８６７号及び第５，８６６，６９２号によって開示される。
Ｂ．抗体定常ドメインの特性決定
【００６７】
本明細書全体で、ＩｇＧ重鎖の定常領域中の残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ  ＯＦ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＩＮＴＥＲＥＳＴ，５ｔｈ  Ｅｄ．  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，  ＮＨ１，  ＭＤ  （１９９１）（「Ｋａｂａｔ」）（本明細書に明示的に参考として組み込まれる）のようなＥＵインデックスの番号付けである。「Ｋａｂａｔに記載するようなＥＵインデックス」との用語は、Ｋａｂａｔで与えられるヒトＩｇＧ１  ＥＵ抗体の定常ドメインの番号付けを指す。残基の番号を割り当てるためのこの方法は、当該技術分野で標準的なものとなっており、異なる抗体アイソタイプの定常領域内の等価な位置にあるアミノ酸を容易に同定する。
１．軽鎖の定常領域
【００６８】
上に示したとおり、抗体の各軽鎖は、可変ドメイン（「ＶＬ」）と定常ドメイン（「ＣＬ」）とを含む。
【００６９】
好ましいＣＬドメインは、ヒトＩｇＧ  ＣＬκドメインである。例示的なヒトＣＬκドメインのアミノ酸配列は、（配列番号６９）である。
【化３５】
2020504607.tif 000037
【００７０】
または、例示的なＣＬドメインは、ヒトＩｇＧ  ＣＬλドメインである。
例示的なヒトＣＬλドメインのアミノ酸配列は、（配列番号７０）である。
【化３６】
2020504607.tif 000038
２．重鎖の定常領域
ａ．天然に存在するＦｃ領域
【００７１】
本明細書に提示されるとおり、本発明の免疫コンジュゲートは、Ｆｃ領域を含んでいてもよい。本発明のこのような免疫コンジュゲートのＦｃ領域は、任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）を有していてもよい。本発明の免疫コンジュゲートは、ＣＨＩドメイン及び／またはヒンジ領域を更に含んでいてもよい。存在する場合、ＣＨＩドメイン及び／またはヒンジ領域は、任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）を有していてもよく、好ましくは、所望なＦｃ領域と同じエピトープを有する。
【００７２】
本発明のＦｃ領域を含有する免疫コンジュゲートのＦｃ領域は、完全なＦｃ領域（例えば、完全なＩｇＧ  Ｆｃ領域）またはＦｃ領域のフラグメントのみのいずれかであってもよい。場合により、本発明のＦｃ領域を含有する免疫コンジュゲートのＦｃ領域は、Ｃ末端のリシンアミノ酸残基を欠いている。
【００７３】
抗体の２つの重鎖のＣＨ１ドメインは、抗体の軽鎖「ＣＬ」定常領域と複合体を形成し、介在するヒンジドメインを介し、重鎖ＣＨ２ドメインに接続する。
【００７４】
例示的なＣＨ１ドメインは、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ１ドメインである。例示的なヒトＩｇＧ１  ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号７１）である。
【化３７】
2020504607.tif 000039
【００７５】
例示的なＣＨ１ドメインは、ヒトＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインである。例示的なヒトＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号７２）である。
【化３８】
2020504607.tif 000040
【００７６】
例示的なＣＨ１ドメインは、ヒトＩｇＧ４  ＣＨ１ドメインである。例示的なヒトＩｇＧ４  ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号７３）である。
【化３９】
2020504607.tif 000041
【００７７】
他の例示的なヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域である。例示的なヒトＩｇＧ１ヒンジ領域のアミノ酸配列は、（配列番号７４）である。
ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ
【００７８】
別の例示的なヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ２ヒンジ領域である。例示的なヒトＩｇＧ２ヒンジ領域のアミノ酸配列は、（配列番号７５）である。
ＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰ
【００７９】
別の例示的なヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ４ヒンジ領域である。例示的なヒトＩｇＧ４ヒンジ領域のアミノ酸配列は、（配列番号７６）である。
ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰ上述のとおり、ＩｇＧ４ヒンジ領域は、安定化する突然変異、例えば、Ｓ２２８Ｐ置換を含んでいてもよい。例示的な安定化されたヒトＩｇＧ４ヒンジ領域のアミノ酸配列は、（配列番号７７）である。
ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ
【００８０】
抗体の２つの重鎖のＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインが相互作用して「Ｆｃ領域」を形成し、Ｆｃ領域は、限定されないがＦｃγ受容体（「ＦｃγＲ」）を含む細胞「Ｆｃ受容体」によって認識されるドメインである。本明細書で使用される場合、「Ｆｃ領域」との用語は、重鎖のＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含むＩｇＧ重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。Ｆｃ領域は、アミノ酸配列が、他のＩｇＧアイソタイプと比較して、特定のアイソタイプに対して最も相同性である場合に、その特定のＩｇＧアイソタイプ、クラスまたはサブクラスを有すると言われる。
【００８１】
例示的なヒトＩｇＧ１のＣＨ２−ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列は、
【化４０】
2020504607.tif 000042
Ｋａｂａｔに示されるようなＥＵインデックスによって番号付けされる場合、（配列番号１）であり、ここで、Ｘは、リシン（Ｋ）であるか、または存在しない。
【００８２】
例示的なヒトＩｇＧ２のＣＨ２−ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列は、
【化４１】
2020504607.tif 000043
Ｋａｂａｔに示されるようなＥＵインデックスによって番号付けされる場合、（配列番号１）であり、ここで、Ｘは、リシン（Ｋ）であるか、または存在しない。
【００８３】
例示的なヒトＩｇＧ３のＣＨ２−ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列は、
【化４２】
2020504607.tif 000044
Ｋａｂａｔに示されるようなＥＵインデックスによって番号付けされる場合、（配列番号１）であり、ここで、Ｘは、リシン（Ｋ）であるか、または存在しない。
【００８４】
例示的なヒトＩｇＧ４のＣＨ２−ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列は、
【化４３】
2020504607.tif 000045
Ｋａｂａｔに示されるようなＥＵインデックスによって番号付けされる場合、（配列番号１）であり、ここで、Ｘは、リシン（Ｋ）であるか、または存在しない。
【００８５】
多型は、抗体定常領域内の多くの異なる位置で観察されており（例えば、Ｆｃ位置、限定されないが、Ｋａｂａｔに記載されるようなＥＵインデックスによって番号付けされる場合、位置２７０、２７２、３１２、３１５、３５６及び３５８）、そのため、従来技術で存在する１つ以上の配列間に、わずかな差が存在し得る。ヒト免疫グロブリンの多型形態は、十分に特性決定されている。現在、１８Ｇｍアロタイプが知られている。Ｇ１ｍ（１、２、３、１７）またはＧ１ｍ（ａ、ｘ、ｆ、ｚ）、Ｇ２ｍ（２３）またはＧ２ｍ（ｎ）、Ｇ３ｍ（５、６、１０、１１、１３、１４、１５、１６、２１、２４、２６、２７、２８）またはＧ３ｍ（ｂ１、ｃ３、ｂ３、ｂ０、ｂ３、ｂ４、ｓ、ｔ、ｇｌ、ｃ５、ｕ、ｖ、ｇ５）（Ｌｅｆｒａｎｃ，ｅｔ  ａｌ．，「Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  Ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ」．  Ｐｅｒｇａｍｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ，ｐｐ．４３−７８（１９９０）；Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ，１９７９，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．：５０，１９９−２１１）。本発明の抗体は、任意の免疫グロブリン遺伝子の任意のアロタイプ、イソアロタイプまたはハプロタイプを組み込んでいてもよく、本明細書で提示される配列のアロタイプ、イソアロタイプまたはハプロタイプに限定されないことが具体的に想定されている。更に、ある発現系において、ＣＨ３ドメインのＣ末端アミノ酸残基（上に太字で記載）は、翻訳後に除去されてもよい。従って、ＣＨ３ドメインのＣ末端残基は、本発明の免疫コンジュゲートの任意要素のアミノ酸残基である。特定的に本発明に包含されるのは、ＣＨ３ドメインのＣ末端残基を欠く免疫コンジュゲートである。また、特定的に本発明に包含されるのは、ＣＨ３ドメインのＣ末端リシン残基を含むこのような構築物である。
ｂ．Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）
【００８６】
従来の免疫機能において、抗体−抗原複合体と免疫系の細胞との相互作用によって、エフェクター機能、例えば、抗体依存性の細胞毒性、マスト細胞の脱顆粒及び免疫制御シグナル（例えば、制御するリンパ球増殖及び抗体分泌）に対する食作用などの広範囲の応答が得られる。これらの相互作用は全て、抗体のＦｃ領域の結合または造血細胞、特に、複数種類の免疫系細胞（例えば、Ｂリンパ球、濾胞樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球及びマスト細胞）の表面にみられる受容体（単純に、「Ｆｃγ受容体」、「ＦｃγＲ」及びまとめて「ＦｃγＲ」と呼ばれる）上の特殊な細胞表面受容体に対する免疫複合体の結合によって開始される。
【００８７】
抗体及び免疫複合体が引き金となる細胞応答の多様性は、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）の３つのＦｃ受容体の構造不均一性から生じる。
ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）は、活性化する（すなわち、免疫系を向上させる）受容体であり、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）は、阻害（すなわち、免疫系を弱める）受容体である。加えて、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）との相互作用が、エンドソームから細胞表面へのＩｇＧ分子の再循環及び血中への放出を媒介する。例示的な野生型ＩｇＧ１（配列番号１）、ＩｇＧ２（配列番号２）、ＩｇＧ３（配列番号３）及びＩｇＧ４（配列番号４）のアミノ酸配列を上に提示している。
【００８８】
異なるＦｃγＲが全く反対の機能を媒介する能力は、異なるＦｃγＲの構造差を反映したものであり、特に、結合したＦｃγＲが、免疫受容体チロシン系活性化モチーフ（「ＩＴＡＭ」）または免疫受容体チロシン系阻害モチーフ（「ＩＴＩＭ」）を有するかどうかを反映したものである。異なる細胞質酵素へのこれらの構造の動員が、ＦｃγＲが介在する細胞応答の結果を決定づける。ＩＴＡＭを含有するＦｃγＲとしては、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＡが挙げられ、Ｆｃ領域（例えば、免疫複合体中に存在する凝集したＦｃ領域）に結合すると免疫系を活性化させる。ＦｃγＲＩＩＢは、現時点で唯一知られている天然のＩＴＩＭ含有ＦｃγＲであり、凝集したＦｃ領域に結合すると、免疫系を弱めるか、または阻害するように作用する。ヒト好中球は、ＦｃγＲＩＩＡ遺伝子を発現する。免疫複合体または特定の抗体架橋によるＦｃγＲＩＩＡのクラスター化は、ＩＴＡＭを、受容体付随キナーゼと共に凝集させ、ＩＴＡＭリン酸化を容易にするように作用する。ＩＴＡＭリン酸化は、Ｓｙｋキナーゼのドッキング部位として作用し、これが活性化すると、下流の物質（例えば、ＰＩ３Ｋ）が活性化する。細胞活性化により、炎症誘発メディエーターが放出される。ＦｃγＲＩＩＢ遺伝子は、Ｂリンパ球で発現する。その細胞外ドメインは、ＦｃγＲＩＩＡと９６％同一であり、識別不可能な様式でＩｇＧ複合体に結合する。ＦｃγＲＩＩＢの細胞質ドメイン中のＩＴＩＭの存在は、このＦｃγＲの阻害性サブクラスを規定する。近年、この阻害の分子的機序が確立された。活性化するＦｃγＲと共にライゲーションする場合、ＦｃγＲＩＩＢ中のＩＴＩＭは、リン酸化され、イノシトールポリホスフェート  ５’−ホスファターゼ（ＳＨＩＰ）のＳＨ２ドメインを引き寄せ、ＩＴＡＭを含有するＦｃγＲが介在するチロシンキナーゼ活性化の結果として、ホスホイノシトールメッセンジャーを加水分解し、その結果、細胞内のＣａ＋＋の流入を防ぐ。従って、ＦｃγＲＩＩＢの架橋は、ＦｃγＲライゲーションに対する活性化応答を弱め、細胞応答を阻害する。従って、Ｂ細胞活性化、Ｂ細胞増殖及び抗体分泌が失われる。
ｃ．変異体Ｆｃ領域
【００８９】
Ｆｃ領域の改変によって、表現型が変わる場合があり、例えば、血清半減期が変わり、安定性が変わり、細胞酵素に対する感受性が変わるか、またはエフェクター機能が変わる場合がある。従って、本発明のＦｃ領域を含有する分子を、エフェクター機能の観点で、例えば、がんを治療する際のこのような分子の有効性を高めるように改変することが望ましい場合がある。エフェクター機能の減少または消滅は、特定の場合、例えば、作用機序がブロックまたは拮抗作用を含むが、標的抗原を生じる細胞を殺さない抗体の場合には、望ましい。エフェクター機能の増加は、望ましくない細胞（例えば、腫瘍細胞及び外来細胞）に指向する場合には、ＦｃγＲｓが低レベルで発現する場合、例えば、低レベルのＦｃγＲＩＩＢを有する腫瘍特異的なＢ細胞（例えば、非ホジキンリンパ腫、ＣＬＬ及びバーキットリンパ腫）では、一般的に望ましい。エフェクター機能活性がこのように付与され、または変えられた本発明の免疫コンジュゲートは、エフェクター機能活性の効力向上が望ましい疾患、障害または感染の治療及び／または予防に有用である。
【００９０】
従って、特定の実施形態では、本発明のＦｃ領域を含有する免疫コンジュゲートのＦｃ領域は、操作された変異体Ｆｃ領域であってもよい。本発明の免疫コンジュゲートのＦｃ領域が、１つ以上のＦｃ受容体（例えば、ＦｃγＲ（ｓ））に結合する能力を有していてもよく、より好ましくは、このような変異体Ｆｃ領域は、ＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）またはＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）に対する改変された結合を有し（例えば、野生型Ｆｃ領域によって示される結合に対して）、例えば、活性化受容体に対する結合が向上し、及び／または阻害受容体（複数可）に結合する能力がかなり減少しているか、またはないだろう。従って、本発明の免疫コンジュゲートのＦｃ領域は、完全Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインの一部または全て、及び／またはＣＨ３ドメインの一部または全てを含んでいてもよく、または変異体ＣＨ２及び／または変異体ＣＨ３の配列を含んでいてもよい（完全Ｆｃ領域のＣＨ２またはＣＨ３ドメインに関し、例えば、１つ以上の挿入及び／または１つ以上の欠失を含んでいてもよい）。このようなＦｃ領域は、非Ｆｃポリペプチド部分を含んでいてもよく、または非天然の完全Ｆｃ領域の一部を含んでいてもよく、または天然に存在しないＣＨ２及び／またはＣＨ３ドメインの配向を含んでいてもよい（例えば、２つのＣＨ２ドメインまたは２つのＣＨ３ドメイン、またはＮ末端からＣ末端に向かう方向で、ＣＨ２ドメインに接続するＣＨ３ドメインなど）。
【００９１】
エフェクター機能を変えるものとして同定されたＦｃ活性化受容体（例えば、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ１６Ａ）に対する結合を増やし、阻害受容体（例えば、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）に対する結合を減らす改変を含め、Ｆｃ領域改変は、当該技術分野で知られている（例えば、Ｓｔａｖｅｎｈａｇｅｎ，Ｊ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．（２００７）  「Ｆｃ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｅｎｈａｎｃｅｓ  Ｔｈｅｉｒ  Ａｂｉｌｉｔｙ  Ｔｏ  Ｋｉｌｌ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌｓ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｓ  Ｔｕｍｏｒ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｖｉａ  Ｌｏｗ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  Ｆｃｇａｍｍａ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ」，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７（１８）：８８８２−８８９０を参照）。表１は、活性化受容体への結合を増加させるか、及び／または阻害受容体への結合を減らす例示的な改変の例示的な一部位、二部位、三部位、四部位及び五部位の置換を列挙する（番号付けは、ＫａｂａｔにあるＥＵインデックスの番号付けであり、置換は、配列番号１のアミノ酸に対するものである）。
【表１−１】
2020504607.tif 000046
【表１−２】
2020504607.tif 000047
【００９２】
ＣＤ３２Ｂに対する結合が減少し、及び／またはＣＤ１６Ａに対する結合が増加したヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域の例示的な変異体は、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５ＩまたはＰ３９６Ｌ置換を含み、ここで、番号付けは、ＫａｂａｔにあるＥＵインデックスの番号付けである。これらのアミノ酸置換は、任意の組み合わせでヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域中に存在していてもよい。一実施形態では、変異体ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域は、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ及びＹ３００Ｌ置換を含む。別の実施形態では、変異体ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域は、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ及びＰ３９６Ｌ置換を含む。
【００９３】
特定の実施形態では、本発明の免疫コンジュゲートのＦｃ領域が、ＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）またはＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）に対する結合の減少（または実質的に存在しない）を示すことが好ましい（野生型ＩｇＧ１  Ｆｃ領域（配列番号１）によって示される結合に対して）。具体的な実施形態では、本発明の免疫コンジュゲートは、ＡＤＣＣエフェクター機能の減少を示すＩｇＧ  Ｆｃ領域を含む。好ましい実施形態では、免疫コンジュゲートのＣＨ２−ＣＨ３ドメインは、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｄ２６５Ａ、Ｎ２９７Ｑ及びＮ２９７Ｇの置換のうち、任意の１つ、２つ、３つまたは４つを含み、番号付けは、ＫａｂａｔにあるＥＵインデックスの番号付けである。別の実施形態では、ＣＨ２−ＣＨ３ドメインは、Ｎ２９７Ｑ置換、Ｎ２９７Ｇ置換、Ｌ２３４Ａ置換及びＬ２３５Ａ置換またはＤ２６５Ａ置換を含む。これらの突然変異が、ＦｃＲ結合を失わせるからである。または、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）に対する結合の減少（または実質的に存在しない）及び／またはエフェクター機能の減少（野生型ＩｇＧ１  Ｆｃ領域（配列番号１）によって示される結合及びエフェクター機能に対して）を固有に示す天然に存在するＦｃ領域のＣＨ２−ＣＨ３ドメインが利用される。具体的な実施形態では、本発明の免疫コンジュゲートは、ＩｇＧ２  Ｆｃ領域（配列番号２）またはＩｇＧ４  Ｆｃ領域（配列番号４）を含む。ＩｇＧ４  Ｆｃ領域が利用される場合、本発明はまた、安定化する突然変異の導入、例えば、上に記載するヒンジ領域Ｓ２２８Ｐ置換（例えば、配列番号７７を参照）を包含する。Ｎ２９７Ｇ、Ｎ２９７Ｑ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＤ２６５Ａ置換は、エフェクター機能を失わせるため、エフェクター機能が望ましい状況では、これらの置換は、好ましくは使用されないだろう。
【００９４】
エフェクター機能を減少させるか、または失わせる本発明のＦｃ領域を含有する免疫コンジュゲートのＣＨ２及びＣＨ３ドメインにとって好ましいＩｇＧ１配列は、置換Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ（下線で示される）を含むだろう（配列番号７８）。
【化４４】
2020504607.tif 000048
ここで、Ｘは、リシン（Ｋ）であるか、または存在しない。
【００９５】
本発明のＦｃ領域を含有する免疫コンジュゲートのＣＨ２及びＣＨ３ドメインにとって好ましい第２のＩｇＧ１配列は、Ｓ４４２Ｃ置換（下線で示される）を含み、２つのＣＨ３ドメインが互いにジスルフィド結合によって共有結合するのが可能になるか、または医薬薬剤の結合が可能になる。このような分子のアミノ酸配列は、（配列番号７９）であり、
【化４５】
2020504607.tif 000049
ここで、Ｘは、リシン（Ｋ）であるか、または存在しない。
【００９６】
本発明のＦｃ領域を含有する免疫コンジュゲートのＣＨ２及びＣＨ３ドメインにとって好ましい第３のＩｇＧ１配列は、
エフェクター機能を減少させるか、または失わせるＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ置換（下線で示される）と、２つのＣＨ３ドメインが互いにジスルフィド結合によって共有結合するのが可能になるか、または医薬薬剤の結合が可能になるＳ４４２Ｃ置換（下線で示される）とを含む。このような分子のアミノ酸配列は、（配列番号８０）であり、
【化４６】
2020504607.tif 000050
ここで、Ｘは、リシン（Ｋ）であるか、または存在しない。
【００９７】
Ｆｃ領域を含むタンパク質の血清半減期は、ＦｃＲｎに対するＦｃ領域の結合アフィニティを高めることによって長くなり得る。「半減期」との用語は、本明細書で使用される場合、投与後の分子の平均生存時間の指標である、分子の薬物動態特性を意味する。半減期は、対象（例えば、ヒト患者または他の哺乳動物）の体内またはその特定のコンパートメントから、例えば、血清中で測定される場合には、すなわち血中半減期であり、または他の組織から既知の量の分子の５０％を排泄するのに必要な時間として表すことができる。一般に、半減期が延びると、投与された分子の血液循環中での平均滞留時間（ＭＲＴ）が延びる。
【００９８】
いくつかの実施形態では、本発明の免疫コンジュゲートは、野生型Ｆｃ領域に対して少なくとも１つのアミノ酸改変を含む変異体Ｆｃ領域を含み、その結果、前記分子は、半減期が延びている（野生型Ｆｃ領域を含む分子に対して）。いくつかの実施形態では、本発明の免疫コンジュゲートは、変異体ＩｇＧ  Ｆｃ領域を含み、前記変異体Ｆｃ領域は、２３８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５７、２５６、２６５、２７２、２８６、２８８、３０３、３０５、３０７、３０８、３０９、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４、４２８、４３３、４３４、４３５及び４３６からなる群から選択される１つ以上の位置に、半減期を延ばすアミノ酸置換を含み、番号付けは、ＫａｂａｔにあるＥＵインデックスの番号付けである。Ｆｃ領域含有分子の半減期を長くすることが可能な多くの突然変異は、当該技術分野で知られており、例えば、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、及びこれらの組み合わせを含む。例えば、全体的に本明細書に参考として組み込まれる、米国特許第６，２７７，３７５号、第７，０８３，７８４号、第７，２１７，７９７号、第８，０８８，３７６号、米国公開第２００２／０１４７３１１号、第２００７／０１４８１６４号、及びＰＣＴ公開第ＷＯ９８／２３２８９号、第ＷＯ２００９／０５８４９２号及び第ＷＯ２０１０／０３３２７９号に記載の変異を参照。延びた半減期を有する免疫コンジュゲートは、Ｆｃ領域残基２５０、２５２、２５４、２５６、２５７、２８８、３０７、３０８、３０９、３１１、３７８、４２８、４３３、４３４、４３５及び４３６の２つ以上に置換を含む変異体Ｆｃ領域を有するものも含み、番号付けは、ＫａｂａｔにあるＥＵインデックスの番号付けである。
特に、Ｔ２５０Ｑ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｋ２８８Ｄ、Ｔ３０７Ｑ、Ｖ３０８Ｐ、Ａ３７８Ｖ、Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ａ、Ｈ４３５Ｋ及びＹ４３６Ｉから選択される２つ以上の置換。番号付けは、ＫａｂａｔにあるＥＵインデックスの番号付けである。
【００９９】
具体的な実施形態では、本発明の免疫コンジュゲートは、
（Ａ）Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ；
（Ｂ）Ｍ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ；
（Ｃ）Ｍ２５２Ｙ及びＴ２５６Ｅ；
（Ｄ）Ｔ２５０Ｑ及びＭ４２８Ｌ；
（Ｅ）Ｔ３０７Ｑ及びＮ４３４Ａ；
（Ｆ）Ａ３７８Ｖ及びＮ４３４Ａ；
（Ｇ）Ｎ４３４Ａ及びＹ４３６Ｉ；
（Ｈ）Ｖ３０８Ｐ及びＮ４３４Ａ；または
（Ｉ）Ｋ２８８Ｄ及びＨ４３５Ｋ
の置換を含む変異体ＩｇＧ  Ｆｃ領域を有する。
【０１００】
好ましい実施形態では、本発明の免疫コンジュゲートは、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅの置換のうち、任意の１つ、２つまたは３つを含む変異体ＩｇＧ  Ｆｃ領域を有する。本発明は更に、
（Ａ）エフェクター機能及び／またはＦｃγＲを変える１つ以上の突然変異と、
（Ｂ）血清半減期を延ばす１つ以上の突然変異とを含む変異体Ｆｃ領域を有する免疫コンジュゲートを包含する。
【０１０１】
本発明のＦｃ領域を含有する免疫コンジュゲートのＣＨ２及びＣＨ３ドメインにとって好ましい第４のＩｇＧ１配列は、血清半減期を延ばすように、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ置換（下線で示される）を含む。このような分子のアミノ酸配列は、（配列番号１４７）であり、
【化４７】
2020504607.tif 000051
ここで、Ｘは、リシン（Ｋ）であるか、または存在しない。
【０１０２】
本発明のＦｃ領域を含有する免疫コンジュゲートのＣＨ２及びＣＨ３ドメインにとって好ましい第５のＩｇＧ１配列は、血清半減期を延ばすように、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ置換（下線で示される）と、２つのＣＨ３ドメインが互いにジスルフィド結合によって共有結合するのが可能になるか、または薬物部分の結合が可能になるように、Ｓ４４２Ｃ置換（下線で示される）とを含む。このような分子のアミノ酸配列は、（配列番号１４８）であり、
【化４８】
2020504607.tif 000052
ここで、Ｘは、リシン（Ｋ）であるか、または存在しない。
【０１０３】
本発明のＦｃ領域を含有する免疫コンジュゲートのＣＨ２及びＣＨ３ドメインにとって好ましい第６のＩｇＧ１配列は、エフェクター機能を減少させるか、または失わせるＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ置換（下線で示される）と、血清半減期を延ばすように、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ置換（下線で示される）とを含む。このような分子のアミノ酸配列は、（配列番号１４９）であり、
【化４９】
2020504607.tif 000053
ここで、Ｘは、リシン（Ｋ）であるか、または存在しない。
【０１０４】
本発明のＦｃ領域を含有する免疫コンジュゲートのＣＨ２及びＣＨ３ドメインにとって好ましい第７のＩｇＧ１配列は、エフェクター機能を減少させるか、または失わせるＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ置換（下線で示される）と、血清半減期を延ばすように、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ置換（下線で示される）と、２つのＣＨ３ドメインが互いにジスルフィド結合によって共有結合するのが可能になるか、または薬物部分の結合が可能になるように、Ｓ４４２Ｃ置換（下線で示される）とを含む。このような分子のアミノ酸配列は、（配列番号１５０）であり、
【化５０】
2020504607.tif 000054
ここで、Ｘは、リシン（Ｋ）であるか、または存在しない。
ＩＩ．例示的な抗ＡＤＡＭ９抗体
【０１０５】
本発明は、本発明の免疫コンジュゲートの生成に有用な、ＡＤＡＭ９に特異的に結合することが可能な特定の抗体及びその抗原結合フラグメントを提供する。
【０１０６】
代表的なヒトＡＤＡＭ９ポリペプチド（ＮＣＢＩ配列ＮＰ＿００３８０７、２８アミノ酸残基シグナル配列を含む、下線が引かれた状態で示される）は、アミノ酸配列（配列番号５）を有する。
【化５１】
2020504607.tif 000055
ＡＤＡＭ９（配列番号５）の８１９のアミノ酸残基のうち、残基１〜２８は、シグナル配列であり、残基２９〜６９７は、細胞外ドメインであり、残基６９８〜７１８は、膜貫通ドメインであり、残基７１９〜８１９は、細胞内ドメインである。レプロリシン（Ｍ１２Ｂ）ファミリージンクメタロプロテアーゼドメイン（おおよそ残基約２１２−４０６）、ジスインテグリンドメイン（おおよそ残基４２３−４９７）；及びＥＧＦ様ドメイン（おおよそ残基６４４−６９７）の３つの構造ドメインは、細胞外ドメイン内に位置している。多くの翻訳後改変及びアイソフォームが同定され、血漿膜に達して成熟タンパク質を生成する前に、ｔｒａｎｓ−Ｇｏｌｇｉ網目構造内でタンパク質をタンパク質分解によって開裂させる。プロドメインの除去は、２つの異なる部位での開裂によって起こる。プロドメインと触媒ドメインとの間の境界（Ａｒｇ−２０５／Ａｌａ−２０６）で、フリンなどのプロタンパク質変換酵素によって最も処理されると思われる。更なる上流の開裂プロタンパク質変換酵素部位（Ａｒｇ−５６／Ｇｌｕ−５７）は、ＡＤＡＭ９の活性化において重要な役割をもつ。
【０１０７】
代表的なカニクイザルＡＤＡＭ９ポリペプチド（ＮＣＢＩ配列ＸＭ＿００５５６３１２６．２、おそらく２８アミノ酸残基シグナル配列を含む、下線が引かれた状態で示される）は、アミノ酸配列（配列番号６）を有する。
【化５２】
2020504607.tif 000056
タンパク質のレプロリシン（Ｍ１２Ｂ）ファミリージンクメタロプロテアーゼドメインは、おおよそ残基２１２−４０６）であり、タンパク質のジスインテグリンドメインは、おおよそ残基４２３−４９７である。
【０１０８】
特定の実施形態では、本発明の抗ＡＤＡＭ９抗体及びそのＡＤＡＭ９結合フラグメントは、以下の基準の任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、または９つによって特徴付けられる。
（１）がん細胞表面で内因性発現する場合に、ヒトＡＤＡＭ９に免疫特異的に結合する能力；
（２）同様の結合アフィニティで、ヒト及び非ヒト霊長類ＡＤＡＭ９（例えば、カニクイザルＡＤＡＭ９）に特異的に結合する；
（３）４ｎＭ以下の平衡結合定数（ＫＤ）で、ヒトＡＤＡＭ９に特異的に結合する；
（４）４ｎＭ以下の平衡結合定数（ＫＤ）で、非ヒト霊長類ＡＤＡＭ９に特異的に結合する；
（５）５×１０５Ｍ−１分−１以上のオンレート（ｋａ）で、ヒトＡＤＡＭ９に特異的に結合する；
（６）１×１０６Ｍ−１分−１以上のオンレート（ｋａ）で、非ヒト霊長類ＡＤＡＭ９に特異的に結合する；
（７）１×１０−３分−１以下のオフレート（ｋｄ）でヒトＡＤＡＭ９に特異的に結合する；
（８）９×１０−４分−１以下のオフレート（ｋｄ）で非ヒト霊長類ＡＤＡＭ９に特異的に結合する。
（９）キメラまたはマウス親抗体と比較して、ｃｙｎｏ  ＡＤＡＭ９に対する結合アフィニティ（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）分析によって決定されるような）において、少なくとも１００倍の向上（例えば、少なくとも１００倍、少なくとも１５０倍、少なくとも２００倍、少なくとも２５０倍、少なくとも３００倍、少なくとも３５０倍、少なくとも４００倍、少なくとも４５０倍、少なくとも５００倍、少なくとも５５０倍、または少なくとも６００倍の向上）を有し、ヒトＡＤＡＭ９に対する高アフィニティ結合（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）分析）を保持するように最適化される。
【０１０９】
本明細書で記載される場合抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントの結合定数は、表面プラズモン共鳴を用いて、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）分析によって決定されてもよい。表面プラズモン共鳴データは、１：１  Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデル（同時にｋａとｋｄ）にフィッティングされ、平衡結合定数ＫＤは、速度定数の比率ｋｄ／ｋａから計算された。このような結合定数は、一価抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメント（すなわち、１つのＡＤＡＭ９エピトープ結合部位を含む分子）、二価抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメント（すなわち、２つのＡＤＡＭ９エピトープ結合部位を含む分子）、またはそれより高い価数を有する抗ＡＤＡＭ９抗体及びそのＡＤＡＭ９結合フラグメント（例えば、３、４、またはもっと多くのＡＤＡＭ９エピトープ結合部位を含む分子）について決定されてもよい。
【０１１０】
本発明は、特に、ヒトＡＤＡＭ９ポリペプチドのエピトープに免疫特異的に結合する抗ＡＤＡＭ９軽鎖可変（ＶＬ）ドメインと抗ＡＤＡＭ９重鎖可変（ＶＨ）ドメインとを含む抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントを含む免疫コンジュゲートを包含する。特に示されていない限り、このような全ての抗ＡＤＡＭ９抗体及びそのＡＤＡＭ９結合フラグメントは、ヒトＡＤＡＭ９に免疫特異的に結合することができる。本明細書で使用される場合、このようなＡＤＡＭ９可変ドメインは、それぞれ「抗ＡＤＡＭ９−ＶＬ」及び「抗ＡＤＡＭ９−ＶＨ」と呼ばれる。
Ａ．マウス抗ヒトＡＤＡＭ９抗体
【０１１１】
ＡＤＡＭ９の標的タンパク質処理活性をブロックするマウス抗ＡＤＡＭ９抗体が内部移行し、抗腫瘍活性を有することが同定された（例えば、米国特許第８，３６１，４７５号を参照）。この抗体は、米国特許第７，６７４，６１９号及び第８，３６１，４７５号では、ハイブリドーマクローンＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５１７４によって産生する「抗ＫＩＤ２４」抗体と呼ばれ、本明細書では「ＭＡＢ−Ａ」と呼ばれる。ＭＡＢ−Ａは、正常組織と比べ、腫瘍に対して強く優先的な結合を示す（図７Ａ〜７Ｃを参照）。ＭＡＢ−Ａは、正常な細胞型の大きなパネルでの染色をほとんど、または全く示さなかった（表２）。
【表２−１】
2020504607.tif 000057
【表２−２】
2020504607.tif 000058
【０１１２】
図２に示すように、ＭＡＢ−Ａは、ヒトＡＤＡＭ９に高アフィニティで結合するが、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）ＡＤＡＭ９には、これより小さな程度で結合する。
【０１１３】
ＭＡＢ−ＡのＶＬドメイン及びＶＨドメインのアミノ酸配列を以下に与える。ＭＡＢ−ＡのＶＨドメイン及びＶＬドメインはヒト化されており、ＣＤＲは、アフィニティを改善し、及び／または潜在的なアミノ酸の易罹病性を取り除くために、最適化される。ＣＤＲＨ３は、ヒトＡＤＡＭ９に対する高いアフィニティを維持しつつ、非ヒト霊長類ＡＤＡＭ９に対する結合を向上させるために、更に最適化された。
【０１１４】
本発明の好ましい免疫コンジュゲートは、ＭＡＢ−Ａの最適化された変異体のＶＨドメインの１つ、２つまたは３つ全てのＣＤＲＨ、及び／またはＶＬドメインの１つ、２つまたは３つ全てのＣＤＲＬを含み、好ましくは更に、ヒト化ＭＡＢ−ＡのＶＨ及び／またはＶＬドメインのヒト化フレームワーク領域（「ＦＲ」）を含む。本発明の他の好ましい免疫コンジュゲートは、ＭＡＢ−Ａのヒト化／最適化された変異体のＶＨドメイン及び／またはＶＬドメイン全体を有する。
【０１１５】
本発明は、特に、免疫コンジュゲートであって、
（Ａ）（１）ＭＡＢ−ＡのＶＨドメインの３個のＣＤＲＨ；及び
（２）ＭＡＢ−Ａのヒト化変異体のＶＨドメインの４個のＦＲ；または
（Ｂ）（１）ＭＡＢ−ＡのＶＬドメインの３個のＣＤＲＬ；及び
（２）ＭＡＢ−Ａのヒト化変異体のＶＬドメインの４個のＦＲ；または
（Ｃ）ＭＡＢ−Ａの最適化された変異体のＶＨドメインの３個のＣＤＲＨ；及び
ＭＡＢ−ＡのＶＬドメインの３個のＣＤＲＬ；または
（Ｄ）ＭＡＢ−ＡのＶＨドメインの３個のＣＤＲＨ；及び最適化された変異体ＭＡＢ−ＡのＶＬドメインの３個のＣＤＲＬ；または
（Ｅ）ＭＡＢ−Ａの最適化された変異体のＶＨドメインの３個のＣＤＲＨ；及び最適化されたＭＡＢ−ＡのＶＬドメインの３個のＣＤＲＬ；または
（Ｆ）（１）ＭＡＢ−Ａの最適化された変異体のＶＨドメインの３個のＣＤＲＨ；及び
（２）ＭＡＢ−Ａのヒト化変異体のＶＨドメインの４個のＦＲ；または
（Ｇ）（１）ＭＡＢ−Ａの最適化された変異体のＶＬドメインの３個のＣＤＲＬ；及び
（２）ＭＡＢ−Ａのヒト化変異体のＶＬドメインの４個のＦＲ；または
（Ｈ）（１）ＭＡＢ−Ａのヒト化／最適化された変異体のＶＨドメイン；及び
（２）ＭＡＢ−Ａのヒト化／最適化された変異体のＶＬドメイン
を含む免疫コンジュゲートに関する。マウス抗体「ＭＡＢ−Ａ」
【０１１６】
マウス抗ＡＤＡＭ９抗体ＭＡＢ−ＡのＶＨドメインのアミノ酸配列は、配列番号７である（ＣＤＲＨ残基は、下線が引かれた状態で示されている）。
【化５３】
2020504607.tif 000059
【０１１７】
ＭＡＢ−ＡのＣＤＲＨ１ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号８）：ＳＹＷＭＨである。
【０１１８】
ＭＡＢ−ＡのＣＤＲＨ２ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号９）：ＥＩＩＰＩＮＧＨＴＮＹＮＥＫＦＫＳである。
【０１１９】
ＭＡＢ−ＡのＣＤＲＨ３ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号１０）：ＧＧＹＹＹＹＧＳＲＤＹＦＤＹである。
【０１２０】
マウス抗ＡＤＡＭ９抗体ＭＡＢ−ＡのＶＬドメインのアミノ酸配列は、配列番号１１である（ＣＤＲＬ残基は、下線が引かれた状態で示されている）。
【化５４】
2020504607.tif 000060
【０１２１】
ＭＡＢ−ＡのＣＤＲＬ１ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号１２）：ＫＡＳＱＳＶＤＹＤＧＤＳＹＭＮである。
【０１２２】
ＭＡＢ−ＡのＣＤＲＬ２ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号１３）：ＡＡＳＤＬＥＳである。
【０１２３】
ＭＡＢ−ＡのＣＤＲＬ３ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号１４）：ＱＱＳＨＥＤＰＦＴである。
Ｂ．例示的なヒト化／最適化された抗ＡＤＡＭ９−ＶＨドメイン及びＶＬドメイン
１．ＭＡＢ−Ａの変異体ＶＨドメイン
【０１２４】
ＭＡＢ−Ａの特定の好ましいヒト化／最適化された抗ＡＤＡＭ９−ＶＨドメインのアミノ酸配列は、ＭＡＢ−ＡのＡＤＡＭ９−ＶＨドメインの変異体（配列番号７）であり、配列番号１５によって表され（ＣＤＲＨ残基は、下線が引かれた状態で示されている）、
【化５５】
2020504607.tif 000061
ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５及びＸ６は、独立して選択され、
Ｘ１は、ＭまたはＩであり；Ｘ２は、ＮまたはＦであり；
Ｘ３は、ＫまたはＲであり；Ｘ４は、ＫまたはＱであり；
Ｘ５は、ＳまたはＧであり、及びＸ６は、Ｐ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｔ、ＧまたはＤであり；
Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０及びＸ１１は、以下になるように選択される。
【表３】
2020504607.tif 000062
【０１２５】
ＭＡＢの好ましいヒト化抗ＡＤＡＭ９  ＶＨドメイン：ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＨ（１）（配列番号１６）及びＭＡＢ−Ａの特定の好ましいヒト化／最適化された抗ＡＤＡＭ９−ＶＨドメインのアミノ酸配列：
ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＨ（２）（配列番号１７）  ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＨ（２Ｄ）（配列番号２３）
ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＨ（３）（配列番号１８）  ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＨ（２Ｅ）（配列番号２４）
ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＨ（４）（配列番号１９）  ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＨ（２Ｆ）（配列番号２５）
ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＨ（２Ａ）（配列番号２０）  ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＨ（２Ｇ）（配列番号２６）
ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＨ（２Ｂ）（配列番号２１）  ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＨ（２Ｈ）（配列番号２７）
ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＨ（２Ｃ）（配列番号２２）  ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＨ（２Ｉ）（配列番号２８）
及びｈＭＡＢ−Ａ  ＶＨ（２Ｊ）（配列番号２９）
を以下に示す（ＣＤＲＨ残基は、１本の下線が引かれた状態で示されている。ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＨ（１）（配列番号７）に関する差は、二重下線で示されている）。
【化５６】
2020504607.tif 000063
【化５７】
2020504607.tif 000064
【０１２６】
ＭＡＢ−Ａのヒト化及び／または最適化された抗ＡＤＡＭ９−ＶＨドメインのＦＲに適したアミノ酸配列は、以下である。
ＦＲＨ１ドメイン（配列番号３０）：ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ
ＦＲＨ２ドメイン（配列番号３１）：ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧ
ＦＲＨ３ドメイン（配列番号３２）：ＲＦＴＩＳＬＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＧＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ
ＦＲＨ４ドメイン（配列番号３３）：ＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
【０１２７】
抗ＡＤＡＭ９−ＶＨドメインのＣＤＲＨ１ドメインに適した代替的なアミノ酸配列としては、以下のものが挙げられる。
配列番号８：ＳＹＷＭＨ
配列番号３４：ＳＹＷＩＨ
【０１２８】
抗ＡＤＡＭ９−ＶＨドメインのＣＤＲＨ２ドメインに適した代替的なアミノ酸配列としては、以下のものが挙げられる。
配列番号９：ＥＩＩＰＩＮＧＨＴＮＹＮＥＫＦＫＳ
配列番号３５：ＥＩＩＰＩＦＧＨＴＮＹＮＥＫＦＫＳ
配列番号３６：ＥＩＩＰＩＦＧＨＴＮＹＮＥＲＦＱＧ
【０１２９】
抗ＡＤＡＭ９−ＶＨドメインのＣＤＲＨ３ドメインに適した代替的なアミノ酸配列としては、以下のものが挙げられる。
配列番号１０：ＧＧＹＹＹＹＧＳＲＤＹＦＤＹ
配列番号３７：ＧＧＹＹＹＹＦＮＳＧＴＬＤＹ
配列番号３８：ＧＧＹＹＹＹＩＧＫＧＶＬＤＹ
配列番号３９：ＧＧＹＹＹＹＰＲＦＧＷＬＤＹ
配列番号４０：ＧＧＹＹＹＹＴＧＫＧＶＬＤＹ
配列番号４１：ＧＧＹＹＹＹＤＳＮＡＶＬＤＹ
配列番号４２：ＧＧＹＹＹＹＦＨＳＧＴＬＤＹ
配列番号４３：ＧＧＹＹＹＹＦＮＫＡＶＬＤＹ
配列番号４４：ＧＧＹＹＹＹＧＧＳＧＶＬＤＹ
配列番号４５：ＧＧＹＹＹＹＰＲＱＧＦＬＤＹ
配列番号４６：ＧＧＹＹＹＹＹＮＳＧＴＬＤＹ
【０１３０】
従って、本発明は、以下を含むＶＨドメインを含むＡＤＡＭ９結合分子を包含する。
（１）以下のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１ドメイン
配列番号４７：ＳＹＷＸ１Ｈ
ここで、Ｘ１は、ＭまたはＩであり；
（２）以下のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２ドメイン
配列番号４８：ＥＩＩＰＩＸ２ＧＨＴＮＹＮＥＸ３ＦＸ４Ｘ５
Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４及びＸ５は、独立して選択され、
Ｘ２は、ＮまたはＦであり；Ｘ３は、ＫまたはＲであり；
Ｘ４は、ＫまたはＱであり；Ｘ５は、ＳまたはＧである。
及び
（３）以下のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３ドメイン
配列番号４９：ＧＧＹＹＹＹＸ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１ＤＹ
ここで、Ｘ６は、Ｐ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｔ、ＧまたはＤであり、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０は、以下になるように選択される。
【表４】
2020504607.tif 000065
【０１３１】
ＭＡＢ−Ａの誘導体／変異体の第１の例示的なヒト化／最適化されたＩｇＧ１重鎖は、ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＨ（２）ドメイン（配列番号１７）を含有し、アミノ酸配列（配列番号５０）を有し、
【化５８】
2020504607.tif 000066
ここで、Ｘは、リシン（Ｋ）であるか、または存在しない。
【０１３２】
ＭＡＢ−Ａの誘導体／変異体の第２の例示的なヒト化／最適化されたＩｇＧ１重鎖は、ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＨ（２Ｃ）ドメイン（配列番号２２）を含有し、アミノ酸配列（配列番号５１）を有し、
【化５９】
2020504607.tif 000067
ここで、Ｘは、リシン（Ｋ）であるか、または存在しない。
【０１３３】
ＭＡＢ−Ａの誘導体／変異体の第３の例示的なヒト化／最適化されたＩｇＧ１重鎖は、ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＨ（２１）ドメイン（配列番号２８）を含有し、アミノ酸配列（配列番号５２）を有し、
【化６０】
2020504607.tif 000068
ここで、Ｘは、リシン（Ｋ）であるか、または存在しない。
【０１３４】
上に提示されるとおり、Ｆｃ領域のＣＨ２−ＣＨ３ドメインは、例えば、エフェクター機能を減少させ、及び／または結合部位を導入し、及び／または血清半減期を延ばすように操作されてもよい。特定の実施形態では、本発明の例示的なヒト化／最適化されたＩｇＧ１重鎖のＣＨ２−ＣＨ３ドメインは、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ及びＳ４４２Ｃから選択される１つ以上の置換を含む。
【０１３５】
従って、ＭＡＢ−Ａの誘導体／変異体の第４の例示的なヒト化／最適化されたＩｇＧ１重鎖は、ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＨ（２Ｉ）ドメイン（配列番号２８）を含有し、更に、Ｆｃ領域のＣＨ２−ＣＨ３ドメインに置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを有し（配列番号７８）、アミノ酸配列（配列番号１４１）を有し、
【化６１】
2020504607.tif 000069
ここで、Ｘは、リシン（Ｋ）であるか、または存在しない。
【０１３６】
ＭＡＢ−Ａの誘導体／変異体の第５の例示的なヒト化／最適化されたＩｇＧ１重鎖は、ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＨ（２Ｉ）ドメイン（配列番号２８）を含有し、更に、Ｆｃ領域のＣＨ２−ＣＨ３ドメインにＳ４４２Ｃ置換を有し（配列番号７９）、アミノ酸配列（配列番号１４２）を有し、
【化６２】
2020504607.tif 000070
ここで、Ｘは、リシン（Ｋ）であるか、または存在しない。
【０１３７】
ＭＡＢ−Ａの誘導体／変異体の第６の例示的なヒト化／最適化されたＩｇＧ１重鎖は、ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＨ（２Ｉ）ドメイン（配列番号２８）を含有し、更に、Ｆｃ領域のＣＨ２−ＣＨ３ドメインに置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＳ４４２Ｃを有し（配列番号８０）、アミノ酸配列（配列番号１４３）を有し、
【化６３】
2020504607.tif 000071
ここで、Ｘは、リシン（Ｋ）であるか、または存在しない。
【０１３８】
ＭＡＢ−Ａの誘導体／変異体の第７の例示的なヒト化／最適化されたＩｇＧ１重鎖は、ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＨ（２Ｉ）ドメイン（配列番号２８）を含有し、更に、Ｆｃ領域のＣＨ２−ＣＨ３ドメインに置換Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅを有し（配列番号１４７）、アミノ酸配列（配列番号１５１）を有し、
【化６４】
2020504607.tif 000072
ここで、Ｘは、リシン（Ｋ）であるか、または存在しない。
【０１３９】
ＭＡＢ−Ａの誘導体／変異体の第８の例示的なヒト化／最適化されたＩｇＧ１重鎖は、ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＨ（２Ｉ）ドメイン（配列番号２８）を含有し、更に、Ｆｃ領域のＣＨ２−ＣＨ３ドメインに置換Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ及びＳ４４２Ｃを有し（配列番号１４８）、アミノ酸配列（配列番号１５２）を有し、
【化６５】
2020504607.tif 000073
ここで、Ｘは、リシン（Ｋ）であるか、または存在しない。
【０１４０】
ＭＡＢ−Ａの誘導体／変異体の第９の例示的なヒト化／最適化されたＩｇＧ１重鎖は、ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＨ（２Ｉ）ドメイン（配列番号２８）を含有し、更に、Ｆｃ領域のＣＨ２−ＣＨ３ドメインに置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅを有し（配列番号１４９）、アミノ酸配列（配列番号１５３）を有し、
【化６６】
2020504607.tif 000074
ここで、Ｘは、リシン（Ｋ）であるか、または存在しない。
【０１４１】
ＭＡＢ−Ａの誘導体／変異体の第１０の例示的なヒト化／最適化されたＩｇＧ１重鎖は、ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＨ（２Ｉ）ドメイン（配列番号２８）を含有し、更に、Ｆｃ領域のＣＨ２−ＣＨ３ドメインに置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ及びＳ４４２Ｃを有し（配列番号１５０）、アミノ酸配列（配列番号１５４）を有し、
【化６７】
2020504607.tif 000075
ここで、Ｘは、リシン（Ｋ）であるか、または存在しない。
２．ＭＡＢ−Ａの変異体ＶＬドメイン
【０１４２】
ＭＡＢ−Ａの好ましいヒト化／最適化された抗ＡＤＡＭ９−ＶＬドメインのアミノ酸配列は、ＭＡＢ−ＡのＡＤＡＭ９−ＶＬドメインの変異体（配列番号１１）であり、配列番号５３によって表され（ＣＤＲＬ残基は、下線が引かれた状態で示されている）、
【化６８】
2020504607.tif 000076
ここで、Ｘ１２、Ｘ１３、Ｘ１４、Ｘ１５、Ｘ１６及びＸ１７は、独立して選択され、
Ｘ１２は、ＫまたはＲであり；Ｘ１３は、ＤまたはＳであり；
Ｘ１４は、ＭまたはＬであり；Ｘ１５は、ＨまたはＹであり；
Ｘ１６は、ＥまたはＳであり；Ｘ１７は、ＤまたはＴである。
【０１４３】
ＭＡＢ−Ａの好ましいヒト化抗ＡＤＡＭ９−ＶＬドメイン：ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＬ（１）（配列番号５４）及びＭＡＢ−Ａの特定の好ましいヒト化／最適化された抗ＡＤＡＭ９−ＶＬドメイン：ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＬ（２）（配列番号５５）、ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＬ（３）（配列番号５６）及びｈＭＡＢ−Ａ  ＶＬ（４）（配列番号５７）のアミノ酸配列を以下に提示する（ＣＤＲＬ残基は、１本の下線が引かれた状態で示されている。ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＬ（１）（配列番号５４）に関する差は、二重下線で示されている）。
【化６９】
2020504607.tif 000077
【０１４４】
従って、ＭＡＢ−Ａのヒト化及び／または最適化された抗ＡＤＡＭ９−ＶＬドメインのＦＲに適したアミノ酸配列は、以下である。
ＦＲＬ１ドメイン（配列番号５８）：ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＳＣ
ＦＲＬ２ドメイン（配列番号５９）：ＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹ
ＦＲＬ３ドメイン（配列番号６０）：ＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＴＹＹＣ
ＦＲＬ４ドメイン（配列番号６１）：ＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
【０１４５】
抗ＡＤＡＭ９−ＶＬドメインのＣＤＲＬ１ドメインに適した代替的なアミノ酸配列としては、以下のものが挙げられる。
配列番号１２：ＫＡＳＱＳＶＤＹＤＧＤＳＹＭＮ
配列番号６２：ＫＡＳＱＳＶＤＹＳＧＤＳＹＭＮ
配列番号６３：ＲＡＳＱＳＶＤＹＳＧＤＳＹＭＮ
配列番号６４：ＲＡＳＱＳＶＤＹＳＧＤＳＹＬＮ
【０１４６】
抗ＡＤＡＭ９−ＶＬドメインのＣＤＲＬ３ドメインに適した代替的なアミノ酸配列としては、以下のものが挙げられる。
配列番号１４：ＱＱＳＨＥＤＰＦＴ
配列番号６５：ＱＱＳＹＳＴＰＦＴ
【０１４７】
従って、本発明は、以下を含む抗ＡＤＡＭ９抗体ＶＬドメインを包含する。
（１）以下のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１ドメイン
配列番号６６：Ｘ１２ＡＳＱＳＶＤＹＸ１３ＧＤＳＹＸ１４Ｎ
ここで、Ｘ１２、Ｘ１３、Ｘ１４は、独立して選択され、
Ｘ１２は、ＫまたはＲであり；Ｘ１３は、ＤまたはＳであり；Ｘ１４は、ＭまたはＬであり；
（２）以下のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２ドメイン
配列番号１３：ＡＡＳＤＬＥＳ
及び
（３）以下のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３ドメイン
配列番号６７：ＱＱＳＸ１５Ｘ１６Ｘ１７ＰＦＴ
ここで、Ｘ１５、Ｘ１６，及びＸ１７は、独立して選択され、
Ｘ１５は、ＨまたはＹであり；Ｘ１６は、ＥまたはＳであり；Ｘ１７は、ＤまたはＴである。
【０１４８】
ＭＡＢ−Ａの誘導体／変異体の例示的なヒト化／最適化されたＩｇＧ１軽鎖は、ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＬ（２）ドメイン（配列番号５５）を含有し、アミノ酸配列（配列番号６８）を有する。
【化７０】
2020504607.tif 000078
【０１４９】
本発明は更に、明確に、ヒトＡＤＡＭ９ポリペプチドのエピトープに免疫特異的に結合し、上に提示したＭＡＢ−Ａ  ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２またはＣＤＲＬ３のいずれかを含む免疫コンジュゲートを想定しており、特に、上に提示したＭＡＢ−Ａ  ＣＤＲＨ１の１つ、上に提示したＭＡＢ−Ａ  ＣＤＲＨ２の１つ、上に提示したＭＡＢ−Ａ  ＣＤＲＨ３の１つ、上に提示したＭＡＢ−Ａ  ＣＤＲＬ１の１つ、上に提示したＭＡＢ−Ａ  ＣＤＲＬ２の１つ、及び上に提示したＭＡＢ−Ａ  ＣＤＲＬ３の１つを含む、このような免疫コンジュゲートを想定している。本発明は更に、上に提示したヒト化ＭＡＢ−Ａ  ＦＲＨ１、ＦＲＨ２、ＦＲＨ３またはＦＲＨ４、ＦＲＬ１、ＦＲＬ２、ＦＲＬ３またはＦＲＬ４のいずれかを含む、このような免疫コンジュゲートを想定しており、特に、ＦＲＨ１、ＦＲＨ２、ＦＲＨ３及びＦＲＨ４を含み、及び／またはＦＲＬ１、ＦＲＬ２、ＦＲＬ３、ＦＲＬ４及びＦＲＨ１を含む、このような免疫コンジュゲートを想定している。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、ヒト化／最適化された抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントは、
（ａ）それぞれ、配列番号８、３５及び１０及び配列番号６２、１３、１４；
（ｂ）それぞれ、配列番号８、３５及び１０及び配列番号６３、１３、１４；
（ｃ）それぞれ、配列番号８、３６及び１０及び配列番号６３、１３、１４；
（ｄ）それぞれ、配列番号３４、３６及び１０及び配列番号６４、１３、６５；
（ｅ）それぞれ、配列番号８、３５及び３７及び配列番号６２、１３、１４；
（ｆ）それぞれ、配列番号８、３５及び３８及び配列番号６２、１３、１４；
（ｇ）それぞれ、配列番号８、３５及び３９及び配列番号６２、１３、１４；
（ｈ）それぞれ、配列番号８、３５及び４０及び配列番号６２、１３、１４；
（ｉ）それぞれ、配列番号８、３５及び４１及び配列番号６２、１３、１４；
（ｊ）それぞれ、配列番号８、３５及び４２及び配列番号６２、１３、１４；
（ｋ）それぞれ、配列番号８、３５及び４３及び配列番号６２、１３、１４；
（ｌ）それぞれ、配列番号８、３５及び４４及び配列番号６２、１３、１４；
（ｍ）それぞれ、配列番号８、３５及び４５及び配列番号６２、１３、１４；及び
（ｎ）それぞれ、配列番号８、３５及び４６及び配列番号６２、１３、１４
からなる群から選択される配列を有する、ＣＤＲＨ１ドメイン、ＣＤＲＨ２ドメイン及びＣＤＲＨ３ドメインと、ＣＤＲＬ１ドメイン、ＣＤＲＬ２ドメイン及びＣＤＲＬ３ドメインを含む。
【０１５１】
具体的な実施形態では、ヒト化／最適化された抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントは、それぞれ、配列番号８、３５及び４５及び配列番号６２、１３、１４の配列を有するＣＤＲＨ１ドメイン、ＣＤＲＨ２ドメイン及びＣＤＲＨ３ドメインと、ＣＤＲＬ１ドメイン、ＣＤＲＬ２ドメイン及びＣＤＲＬ３ドメインとを含む。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、ヒト化／最適化された抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントは、
（ａ）それぞれ、配列番号１７及び配列番号５５；
（ｂ）それぞれ、配列番号１７及び配列番号５６；
（ｃ）それぞれ、配列番号１８及び配列番号５６；
（ｄ）それぞれ、配列番号１９及び配列番号５７；
（ｅ）それぞれ、配列番号２０及び配列番号５５；
（ｆ）それぞれ、配列番号２１及び配列番号５５；
（ｇ）それぞれ、配列番号２２及び配列番号５５；
（ｈ）それぞれ、配列番号２３及び配列番号５５；
（ｉ）それぞれ、配列番号２４及び配列番号５５；
（ｊ）それぞれ、配列番号２５及び配列番号５５；
（ｋ）それぞれ、配列番号２６及び配列番号５５；
（ｌ）それぞれ、配列番号２７及び配列番号５５；
（ｍ）それぞれ、配列番号２８及び配列番号５５；及び
（ｎ）それぞれ、配列番号２９及び配列番号５５
の配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％の同一性を有する配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。
【０１５３】
「実質的に同一」または「同一」とは、参照アミノ酸配列（例えば、本明細書に記載するアミノ酸のいずれか１つ）に対して少なくとも５０％の同一性を示すポリペプチドを意味する。好ましくは、このような配列は、比較のために使用される配列に対して、アミノ酸レベルで、または核酸で、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも８０％または少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または更には１００％同一である。
【０１５４】
配列同一性は、典型的には、配列分析ソフトウエア（例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ、１７１０  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｖｅｎｕｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．５３７０５、ＢＬＡＳＴ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＧＡＰ、またはＰＩＬＥＵＰ／ＰＲＥＴＴＹＢＯＸプログラム）を用いて測定される。このようなソフトウエアは、種々の置換、欠失及び／または他の改変に対するホモロジーの程度をアサインすることによって、同一または類似の配列をマッチングする。保存的置換は、典型的には、以下の群に含まれる置換を含む。グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リシン、アルギニン；及びフェニルアラニン、チロシン。同一性の程度を決定するための例示的な手法において、ＢＬＡＳＴプログラムが使用されてもよく、ｅ−３〜ｅ−１００までの確率スコア（ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ  ｓｃｏｒｅ）は、密接に関連する配列を示している。
【０１５５】
特定の実施形態では、ヒト化／最適化された抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントは、それぞれ配列番号２８及び配列番号５５の配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％の同一性を有する配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。
【０１５６】
特定の実施形態では、ヒト化／最適化された抗ＡＤＡＭ９抗体は、以下のような重鎖配列と軽鎖配列とを有する。
（ａ）それぞれ、配列番号５０及び配列番号６８；
（ｂ）それぞれ、配列番号５１及び配列番号６８；
（ｃ）それぞれ、配列番号５２及び配列番号６８；
（ｄ）それぞれ、配列番号１４１及び配列番号６８；
（ｅ）それぞれ、配列番号１４２及び配列番号６８；
（ｆ）それぞれ、配列番号１４３及び配列番号６８；
（ｇ）それぞれ、配列番号１５１及び配列番号６８；
（ｈ）それぞれ、配列番号１５２及び配列番号６８；
（ｉ）それぞれ、配列番号１５３及び配列番号６８；及び
（ｊ）それぞれ、配列番号１５４及び配列番号６８。
【０１５７】
具体的な実施形態では、ヒト化／最適化された抗ＡＤＡＭ９抗体は、配列番号５２の配列を有する重鎖と、配列番号６８の配列を有する軽鎖とを含む。他の具体的な実施形態では、ヒト化／最適化された抗ＡＤＡＭ９抗体は、配列番号１４２の配列を有する重鎖と、配列番号６８の配列を有する軽鎖とを含む。他の実施形態では、ヒト化／最適化された抗ＡＤＡＭ９抗体は、血清半減期が延びるように操作され、配列番号１５１の配列を有する重鎖と、配列番号６８の配列を有する軽鎖とを含む。他の具体的な実施形態では、ヒト化／最適化された抗ＡＤＡＭ９抗体は、血清半減期が延びるように操作され、部位特異的な結合をするように操作され、配列番号１５２の配列を有する重鎖と、配列番号６８の配列を有する軽鎖とを含む。
【０１５８】
本発明はまた、明確に、ヒトＡＤＡＭ９ポリペプチドのエピトープに免疫特異的に結合し、上に提示したヒト化／最適化された抗ＡＤＡＭ９  ＭＡＢ−Ａ  ＶＬドメインまたはＶＨドメインのいずれかを含む免疫コンジュゲートを想定している。本発明は、特に、ヒト化／最適化された抗ＡＤＡＭ９  ＶＬドメインまたはＶＨドメインの以下の組み合わせを含む、このような抗ＡＤＡＭ９抗体及びそのＡＤＡＭ９結合フラグメントを想定している。
【表５−１】
2020504607.tif 000079
【表５−２】
2020504607.tif 000080
【０１５９】
本発明は、具体的には、上に提示されるようなヒト化／最適化された抗ＡＤＡＭ９−ＶＬ及び／またはＶＨドメインを含む免疫コンジュゲートを包含する。具体的な実施形態では、本発明の免疫コンジュゲートは、（ｉ）上に提示されるようなヒト化／最適化された抗ＡＤＡＭ９−ＶＬ及び／またはＶＨドメインと、（ｉｉ）Ｆｃ領域とを含む。
【０１６０】
抗ＡＤＡＭ９  ＶＨドメイン及びＶＬドメインに対する具体的な改変が、上にまとめられ、図３Ａ〜３Ｂで比較されているが、本発明のヒト化及び／または最適化された抗ＡＤＡＭ９−ＶＨドメインまたはＶＬドメインを操作する際に、これらの残基の全てまたは大部分を改変する必要はない。本発明はまた、例えば、サブクローニングを容易にするために導入され得るＣ末端及び／またはＮ末端のアミノ酸残基のアミノ酸置換を含め、これらのＶＨ配列及びＶＬ配列の微細な変化も包含する。
ＩＩＩ．抗体薬物コンジュゲート
定義
【０１６１】
「免疫コンジュゲート」、「コンジュゲート」または「ＡＤＣ」との用語は、本明細書で使用される場合、細胞結合剤（例えば、本明細書に記載の抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメント）に結合するか、またはこれに結合される化合物またはその誘導体（例えば、医薬薬剤）を指す。
【０１６２】
「リンカー」は、ある化合物、通常は薬物、例えば、本明細書に記載の細胞毒性薬または医薬薬剤（例えば、メイタンシノイドまたは（インドリノベンゾジアゼピン）化合物）を、細胞結合剤、例えば、抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントに安定な共有結合様式で結合することが可能な任意の化学部分である。リンカーは、化合物または抗体が活性なままの状態で、酸によって誘発される開裂、光によって誘発される開裂、ペプチダーゼによって誘発される開裂、エステラーゼによって誘発される開裂及びジスルフィド結合開裂を受けやすいか、または実質的に耐性であってもよい。適切なリンカーは、当該技術分野でよく知られており、例えば、ジスルフィド基、チオエーテル基、酸に不安定な基、光に不安定な基、ペプチダーゼに不安定な基及びエステラーゼに不安定な基を含む。リンカーはまた、帯電したリンカー、本明細書に記載され、当該技術分野で既知のその親水性形態も含む。
【０１６３】
「アルキル」は、本明細書で使用される場合、１〜２０個の炭素原子を含む飽和の直鎖または分枝鎖の一価炭化水素基を指す。アルキルの例としては、限定されないが、メチル、エチル、１−プロピル、２−プロピル、１−ブチル、２−メチル−１−プロピル、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２）、２−ブチル、２−メチル−２−プロピル、１−ペンチル、２−ペンチル、３−ペンチル、２−メチル−２−ブチル、３−メチル−２−ブチル、３−メチル−１−ブチル、２−メチル−１−ブチル、１−ヘキシル）、２−ヘキシル、３−ヘキシル、２−メチル−２−ペンチル、３−メチル−２−ペンチル、４−メチル−２−ペンチル、３−メチル−３−ペンチル、２−メチル−３−ペンチル、２，３−ジメチル−２−ブチル、３，３−ジメチル−２−ブチル、１−ヘプチル、１−オクチルなどが挙げられる。好ましくは、アルキルは、１〜１０個の炭素原子を含む。より好ましくは、アルキルは、１〜４個の炭素原子を含む。
【０１６４】
ある基の炭素原子数は、本明細書では「Ｃｘ−ｘｘ」との接頭語によって明記することができ、ここで、ｘ及びｘｘは整数である。例えば、「Ｃ１−４アルキル」は、１〜４個の炭素原子を含むアルキル基である。
【０１６５】
「化合物」または「細胞毒性化合物」または「細胞毒性薬」は、相互に置き換え可能に使用される。これらは、その構造または式または任意の誘導体が本発明において開示されているか、またはこの構造または式または任意の誘導体が参考として組み込まれている化合物を含むことを意図している。この用語は、本発明に開示される全ての式の化合物の立体異性体、幾何異性体、互変異性体、溶媒和物、代謝物及び塩（例えば、医薬的に許容される塩）も含む。この用語は、任意の溶媒和物、水和物、及び上述のいずれかの多型も含む。本出願で記載される「立体異性体」、「幾何異性体」、「互変異性体」、「溶媒和物」、「代謝物」、「塩」、「コンジュゲート」、「コンジュゲート塩」、「溶媒和物」、「水和物」または「多型」という具体的な引用は、本発明の特定の態様では、「化合物」との用語がこれらの他の形態を引用することなく使用される本発明の他の態様でのこれらの形態を除外することを意図していると解釈すべきではない。
【０１６６】
「キラル」との用語は、鏡像体の相手と重ね合わせることができないという性質を有する分子を指し、一方、「アキラル」との用語は、鏡像体の相手と重ね合わせることができる分子を指す。
【０１６７】
「立体異性体」との用語は、同一の化学構成及び接続を有するが、空間中の原子向きが異なり、単結合を中心に回転させることによって相互に変換することができない化合物を指す。
【０１６８】
「ジアステレオマー」は、２つ以上のキラリティ中心を有する立体異性体であって、これらの分子が互いに鏡像体ではないものを指す。ジアステレオマーは、例えば、融点、沸点、分光特性及び反応性などの異なる物理特性を有する。ジアステレオマー混合物は、結晶化、電気泳動及びクロマトグラフィーなどの高解像度分析手段の下で分離することができる。
【０１６９】
「エナンチオマー」は、互いに重ね合わせることができない鏡像体である、化合物の２つの立体異性体を指す。
【０１７０】
本明細書で使用する立体化学の定義及び規則は、一般的に、Ｓ．Ｐ．Ｐａｒｋｅｒ編集、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｒｍｓ  （１９８４）  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｂｏｏｋ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、及びＥｌｉｅｌ，Ｅ．及びＷｉｌｅｎ，Ｓ．，Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９４に従う。本発明の化合物は、非対称中心またはキラル中心を含んでいてもよく、そのため、異なる立体異性体形態で存在してもよい。本発明の化合物の全ての立体異性体形態は、限定されないが、ジアステレオマー、エナンチオマー及びアトロプ異性体、及びラセミ体混合物などのこれらの混合物を含め、本発明の一部を形成することを意図している。多くの有機化合物は、光学的に活性な形態で存在し、すなわち、平面偏光の面を回転させる能力を有する。光学活性化合物を記述する際に、Ｄ及びＬ、またはＲ及びＳの添え字は、キラル中心（複数可）の周りの分子の絶対配置を示すために用いられる。ｄ及びＩまたは（＋）及び（−）といった添え字は、化合物による面偏光の回転の徴候を示すために使用され、（−）またはｌは、その化合物が左旋性であることを意味している。（＋）またはｄという添え字が付けられた化合物は、右旋性である。所与の化学構造について、これらの立体異性体は、互いに鏡像体であることを除けば、同じである。特定の立体異性体は、エナンチオマーと呼ばれることもあり、このような異性体の混合物は、多くは、エナンチオマー混合物と呼ばれる。エナンチオマーの５０：５０混合物は、ラセミ体混合物またはラセミ体と呼ばれ、化学反応またはプロセスで立体選択性または立体特異性がない場合に起こり得る。「ラセミ体混合物」及び「ラセミ体」との用語は、２つのエナンチオマー種の等モル混合物を指し、光学活性がない。
【０１７１】
「互変異性体」または「互変異性体形態」との用語は、低いエネルギー障壁によって互いに変換可能な異なるエネルギーの構造異性体を指す。例えば、プロトン互変異性体（プロトトロピー互変異性体としても知られる）は、プロトンの移動による相互変換を含み、例えば、ケト−エノール及びイミン−エナミンの異性化を含む。原子価互変異性体は、結合電子の一部の再組織化による相互変換を含む。
【０１７２】
「イミン反応性試薬」は、イミン基と反応可能な試薬を指す。イミン反応性試薬の例としては、限定されないが、亜硫酸塩（Ｈ２ＳＯ３、Ｈ２ＳＯ２、またはカチオンを用いて生成するＨＳＯ３−、ＳＯ３２−またはＨＳＯ２−の塩）、ピロ亜硫酸塩（Ｈ２Ｓ２Ｏ５またはカチオンを用いて生成するＳ２Ｏ５２−の塩）、モノ、ジ、トリ及びテトラ−チオホスフェート（ＰＯ３ＳＨ３、ＰＯ２Ｓ２Ｈ３、ＰＯＳ３Ｈ３、ＰＳ４Ｈ３またはカチオンを用いて生成するＰＯ３Ｓ３−、ＰＯ２Ｓ２３−、ＰＯＳ３３−またはＰＳ４３−の塩）、チオリン酸エステル（（ＲｉＯ）２ＰＳ（ＯＲｉ）、ＲｉＳＨ、ＲｉＳＯＨ、ＲｉＳＯ２Ｈ、ＲｉＳＯ３Ｈ）、種々のアミン（ヒドロキシルアミン（例えば、ＮＨ２ＯＨ）、ヒドラジン（例えば、ＮＨ２ＮＨ２）、ＮＨ２Ｏ−ＲｉＲｉ、ＮＨ−Ｒｉ、ＮＨ２−Ｒｉ）、ＮＨ２−ＣＯ−ＮＨ２、ＮＨ２−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ２’チオサルフェート（Ｈ２Ｓ２Ｏ３またはカチオンを用いて生成するＳ２Ｏ３−２−の塩）、亜ジチオン酸塩（Ｈ２Ｓ２Ｏ４またはカチオンを用いて生成するＳ２Ｏ４２−の塩）、ホスホロジチオエート（Ｐ（＝Ｓ）（ＯＲｋ）（ＳＨ）（ＯＨ）またはカチオンを用いて生成するその塩）、ヒドロキサム酸（ＲｋＣ（＝Ｏ）ＮＨＯＨまたはカチオンを用いて生成する塩）、ヒドラジン（ＲｋＣＯＮＨＮＨ２）、ホルムアルデヒドスルホキシレート（ＨＯＣＨ２ＳＯ２Ｈまたはカチオンを用いて生成するＨＯＣＨ２ＳＯ２−の塩、例えば、ＨＯＣＨ２ＳＯ２−Ｎａ＋）、糖化ヌクレオチド（例えば、ＧＤＰ−マンノース）、フルダラビンまたはその混合物が挙げられ、ここで、Ｒｉ及びＲｉ’は、それぞれ独立して、１〜１０個の炭素原子を含む直鎖または分枝鎖のアルキルであり、−Ｎ（Ｒｊ）２、−ＣＯ２Ｈ、−ＳＯ３Ｈ及び−ＰＯ３Ｈから選択される少なくとも１つの置換基で置換されており；Ｒｉ及びＲｉ’は、更に場合により、本明細書に記載するアルキルについての置換基で置換されていてもよく；Ｒｊは、１〜６個の炭素原子を含む直鎖または分枝鎖のアルキルであり；Ｒｋは、１〜１０個の炭素原子を含む直鎖、分枝鎖または環状のアルキル、アルケニルまたはアルキニル、アリール、ヘテロシクリルまたはヘテロアリールである（好ましくは、Ｒｋは、１〜４個の炭素原子を含む直鎖または分枝鎖のアルキルであり、より好ましくは、Ｒｋは、メチル、エチルまたはプロピルである）。好ましくは、カチオンは、一価カチオン、例えば、Ｎａ＋またはＫ＋である。好ましくは、イミン反応性試薬は、亜硫酸塩、ヒドロキシルアミン、尿素及びヒドラジンから選択される。より好ましくは、イミン反応性試薬は、ＮａＨＳＯ３またはＫＨＳＯ３である。
【０１７３】
「カチオン」との用語は、正電荷を有するイオンを指す。カチオンは、一価（例えば、Ｎａ＋、Ｋ＋、ＮＨ４＋など）、二価（例えば、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋など）または多価（例えば、Ａｌ３＋など）であってもよい。好ましくは、カチオンは一価である。
【０１７４】
「医薬的に許容される塩」との句は、本明細書で使用される場合、本発明の化合物の医薬的に許容される有機または無機の塩を指す。例示的な塩としては、限定されないが、硫酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硝酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、イソニコチン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、重酒石酸塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチジン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、サッカリン酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩「メシレート」、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、パモ酸塩（すなわち、１，１’−メチレン−ビス−（２−ヒドロキシ−３−ナフトエート））塩、アルカリ金属（例えば、ナトリウム及びカリウム）塩、アルカリ土類金属（例えば、マグネシウム）塩及びアンモニウム塩が挙げられる。医薬的に許容される塩は、酢酸イオン、コハク酸イオンまたは他の対イオンなどの別の分子を含んでいてもよい。対イオンは、親化合物上の電荷を安定化する任意の有機部分または無機部分であってもよい。更に、医薬的に許容される塩は、その構造に１個より多い帯電した原子を含んでいてもよい。複数の帯電した原子が、医薬的に許容される塩の一部である場合は、複数の対イオンを含んでいてもよい。従って、医薬的に許容される塩は、１つ以上の帯電した原子及び／または１つ以上の対イオンを含んでいてもよい。
【０１７５】
本発明の化合物が塩基である場合、所望な医薬的に許容される塩は、当該技術分野で利用可能な任意の適切な方法、例えば、無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、メタンスルホン酸、リン酸など）を用いた遊離塩基の処理、または有機酸（例えば、酢酸、マレイン酸、コハク酸、マンデル酸、フマル酸、マロン酸、ピルビン酸、シュウ酸、グリコール酸、サリチル酸、ピラノシド酸、例えば、グルクロン酸またはガラクツロン酸、αヒドロキシ酸、例えば、クエン酸または酒石酸、アミノ酸、例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸、芳香族酸、例えば、安息香酸またはケイ皮酸、スルホン酸、例えば、ｐ−トルエンスルホン酸またはエタンスルホン酸など）を用いた処理によって調製することができる。
【０１７６】
本発明の化合物が酸である場合、所望な医薬的に許容される塩は、任意の適切な方法、例えば、無機または有機の塩基（例えば、アミン（一級、二級または三級）、アルカリ金属水酸化物またはアルカリ土類金属水酸化物など）を用いた遊離酸の処理によって調製することができる。適切な塩の具体例としては、限定されないが、アミノ酸、例えば、グリシン及びアルギニン、アンモニア、一級、二級及び三級アミン及び環状アミン、例えば、ピペリジン、モルホリン及びピペラジンから誘導される有機塩、ナトリウム、カルシウム、カリウム、マグネシウム、マンガン、鉄、銅、亜鉛、アルミニウム及びリチウムから誘導される無機塩が挙げられる。
【０１７７】
本明細書で使用される場合、「溶媒和物」との用語は、非共有結合分子間力によって結合した、化学量論量または非化学量論量の溶媒（例えば、水、イソプロパノール、アセトン、エタノール、メタノール、ＤＭＳＯ、酢酸エチル、酢酸及びエタノールアミンジクロロメタン、２−プロパノールなど）を更に含む化合物を意味する。化合物の溶媒和物または水和物は、少なくとも１モル当量のヒドロキシル溶媒、例えば、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノールまたは水を化合物に添加し、イミン部分の溶媒和または水和を行うことによって容易に調製される。
【０１７８】
「代謝物」または「異化産物」は、体内で代謝または異化によって作られる、特定の化合物、その誘導体、またはそのコンジュゲート、またはその塩の生成物である。化合物、その誘導体、またはそのコンジュゲートの代謝物は、当該技術分野で既知の通常の技術を用いて同定することができ、その活性は、本明細書に記載するような試験を用いて決定することができる。このような生成物は、例えば、投与された化合物の酸化、ヒドロキシル化、還元、加水分解、アミド化、脱アミド化、エステル化、脱エステル化、酵素開裂などから得られ得る。従って、本発明は、本発明の化合物の代謝物、その誘導体、またはそのコンジュゲートを含み、本発明の化合物、その誘導体、またはそのコンジュゲートと、哺乳動物とを、その代謝産物が得られるのに十分な期間接触させることを含むプロセスによって作られる化合物、その誘導体、またはそのコンジュゲートを含む。
【０１７９】
「医薬的に許容される」との句は、物質または組成物が、他の成分を含む製剤及び／またはこれを用いて治療される哺乳動物と、化学的及び／または毒性的に適合性でなければならないことを示す。
【０１８０】
「保護基」または「保護部分」との用語は、化合物、その誘導体、またはそのコンジュゲートの他の官能基を反応させつつ、特定の機能をブロックするか、または保護するために一般的に使用される置換基を指す。例えば、「アミン保護基」または「アミノ保護部分」は、アミノ基に接続し、化合物のアミノ官能性をブロックするか、または保護する置換基である。このような基は、当該技術分野でよく知られており（例えば、Ｐ．Ｗｕｔｓ及びＴ．Ｇｒｅｅｎｅ，  ２００７，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｃｈａｐｔｅｒ  ７，  Ｊ．  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  ＮＪを参照）、カルバミン酸メチル及びカルバミン酸エチル、ＦＭＯＣ、置換カルバミン酸エチル、１，６−β脱離によって開裂するカルバメートなどのカルバメート（「自己犠牲型」とも呼ばれる）、尿素、アミド、ペプチド、アルキル誘導体及びアリール誘導体によって例示される。適切なアミノ保護基としては、アセチル、トリフルオロアセチル、ｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）、ベンジルオキシカルボニル（ＣＢＺ）及び９−フルオレニルメチレンオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）が挙げられる。保護器及びその使用の一般的な記載については、Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ  ＆  Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２００７を参照。
【０１８１】
「アミノ酸」との用語は、天然に存在するアミノ酸または天然に存在しないアミノ酸を指す。一実施形態では、アミノ酸は、ＮＨ２−Ｃ（Ｒａａ’Ｒａａ）−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨによって表され、ここで、Ｒａａ及びＲａａ’は、それぞれ独立して、Ｈ、場合により置換されていてもよい、１〜１０個の炭素原子を含む直鎖、分枝鎖または環状のアルキル、アルケニルまたはアルキニル、アリール、ヘテロアリールまたはヘテロシクリルであるか、Ｒａａ及びＮ末端窒素原子が合わさってヘテロ環式環を形成してもよい（例えば、プロリンのような）。「アミノ酸残基」との用語は、１個の水素原子がアミノ酸のアミン末端及び／またはカルボキシ末端から除去されたときに、対応する残基、例えば、−ＮＨ−Ｃ（（Ｒａａ’Ｒａａ）−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−を指す。
【０１８２】
「ペプチド」との用語は、ペプチド（アミド）結合によって結合したアミノ酸モノマーの短鎖を指す。いくつかの実施形態では、ペプチドは、２〜２０個のアミノ酸残基を含有する。他の実施形態では、ペプチドは、２〜１０個のアミノ酸残基を含有する。さらに他の実施形態では、ペプチドは、２〜５個のアミノ酸残基を含有する。本明細書で使用される場合、あるペプチドが、アミノ酸の特定の配列によって表される本明細書に記載の細胞毒性薬またはリンカーの一部である場合、そのペプチドは、両方向で、細胞毒性薬またはリンカーの残りの部分に結合していてもよい。例えば、ジペプチドＸ１−Ｘ２は、Ｘ１−Ｘ２及びＸ２−Ｘ１を含む。同様に、トリペプチドＸ１−Ｘ２−Ｘ３は、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３及びＸ３−Ｘ２−Ｘ１を含み、テトラペプチドＸ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４は、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４及びＸ４−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ１を含む。Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４は、アミノ酸残基を表す。
【０１８３】
「反応性エステル基」との用語は、アミン基と容易に反応してアミド結合を形成し得るエステル基を指す。例示的な反応性エステル基としては、限定されないが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシフタルイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシスルホ−スクシンイミドエステル、パラ−ニトロフェニルエステル、ジニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル及びこれらの誘導体が挙げられ、前記誘導体は、アミド結合の生成を容易にする。特定の実施形態では、反応性エステル基は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルまたはＮ−ヒドロキシスルホ−スクシンイミドエステルである。
【０１８４】
「アミン反応性基」との用語は、アミン基と反応して共有結合を形成し得る基を指す。例示的なアミン反応性基としては、限定されないが、反応性エステル基、ハロゲン化アシル、ハロゲン化スルホニル、イミドエステル、または反応性チオエステル基が挙げられる。特定の実施形態では、アミン反応性基は、反応性エステル基である。一実施形態では、アミン反応性基は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルまたはＮ−ヒドロキシスルホ−スクシンイミドエステルである。
【０１８５】
「チオール反応性基」との用語は、チオール（−ＳＨ）基と反応して共有結合を形成し得る基を指す。例示的なチオール反応性基としては、限定されないが、マレイミド、ハロアセチル、アロアセタミド、ビニルスルホン、ビニルスルホンアミドまたはビニラールピリジンが挙げられる。一実施形態では、チオール反応性基は、マレイミドである。
【０１８６】
本開示及び特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、その内容が明確に他の意味を示している場合を除き、複数形態も含む。
【０１８７】
「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という言語を用いて実施形態が本明細書に記載される場合、「〜からなる」及び／または「〜から本質的になる」という観点で記載される他の類似の実施形態も与えられていると理解される。
Ａ．例示的な免疫コンジュゲート
【０１８８】
第２の態様では、本発明は、少なくとも１種類の医薬薬剤に結合される抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントを含む免疫コンジュゲートに関する。医薬薬剤としては、限定されないが、細胞毒（例えば、細胞増殖抑制剤または細胞破壊剤）、治療薬剤及び放射性金属イオン、例えば、α−エミッターが挙げられる。細胞毒または細胞毒性薬は、細胞に有害な任意の薬剤、例えば、シュードモナス外毒素、ジフテリア毒素、ボツリヌス毒素Ａ〜Ｆ、リシナブリン、サポリン、及びこのような薬剤の細胞毒性フラグメントを含む。治療薬剤は、ある障害を予防または治療のために治療するための治療効果を有する任意の薬剤を含む。このような治療薬剤は、化学治療薬剤、タンパク質またはポリペプチド治療薬剤であってもよく、所望の生体活性を有し、及び／または所与の生体応答を改変する治療薬剤を含む。治療薬剤の例としては、アルキル化剤、血管新生阻害剤、抗有糸分裂剤、ホルモン療法剤及び細胞増殖性障害の治療に有用な抗体が挙げられる。特定の実施形態では、治療薬剤は、メイタンシノイド化合物であり、例えば、その全体が本明細書に参考として組み込まれる米国特許第５，２０８，０２０号及び第７，２７６，４９７号に記載されるものである。特定の実施形態では、治療薬剤は、ベンゾジアゼピン化合物、例えば、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）（例えば、ＷＯ２０１０／０４３８８０号、ＷＯ２０１１／１３０６１６号、ＷＯ２００９／０１６５１６号、ＷＯ２０１３／１７７４８１号及びＷＯ２０１２／１１２７０８号に記載されるもの）及びインドリノベンゾジアゼピン（ＩＧＮ）化合物（例えば、ＷＯ／２０１０／０９１１５０号及びＷＯ２０１２／１２８８６８号及び２０１６年６月２８日に出願された米国出願第１５／１９５，２６９号、表題「ＣＯＮＪＵＧＡＴＥＳ  ＯＦ  ＣＹＳＴＥＩＮＥ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＥＤ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ」に記載されるものである。これらの特許、特許刊行物及び出願の全ての教示全体が、全体的に本明細書に参考として組み込まれる。
【０１８９】
本明細書で使用される場合、「ピロロベンゾジアゼピン」（ＰＢＤ）化合物は、ピロロベンゾジアゼピンコア構造を有する化合物である。ピロロベンゾジアゼピンは、置換されていてもよく、または置換されていなくてもよい。これには、リンカーによって結合する２個のピロロベンゾジアゼピンコアを有する化合物も含まれる。インドリノベンゾジアゼピンコアの一部としてのイミン官能性（−Ｃ＝Ｎ−）は、還元されてもよい。
【０１９０】
特定の実施形態では、ピロロベンゾジアゼピン化合物は、
【化７１】
2020504607.tif 000081
によって表されるコア構造を含み、この構造は、場合により置換されていてもよい。
【０１９１】
特定の実施形態では、ピロロベンゾジアゼピン化合物は、
【化７２】
2020504607.tif 000082
によって表されるコア構造を含み、この構造は、場合により置換されていてもよい。
【０１９２】
本明細書で使用される場合、「インドリノベンゾジアゼピン」（ＩＧＮ）化合物は、インドリノベンゾジアゼピンコア構造を有する化合物である。インドリノベンゾジアゼピンは、置換されていてもよく、または置換されていなくてもよい。これには、リンカーによって結合する２個のインドリノベンゾジアゼピンコアを有する化合物も含まれる。インドリノベンゾジアゼピンコアの一部としてのイミン官能性（−Ｃ＝Ｎ−）は、還元されてもよい。
【０１９３】
特定の実施形態では、インドリノベンゾジアゼピン化合物は、
【化７３】
2020504607.tif 000083
によって表されるコア構造を含み、この構造は、場合により置換されていてもよい。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、インドリノベンゾジアゼピン化合物は、
【化７４】
2020504607.tif 000084
によって表されるコア構造を含み、この構造は、更に置換されていてもよい。
【０１９５】
医薬薬剤は、抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントに直接的に連結または結合されてもよく、または間接的に、当該技術分野で既知の技術を用い、リンカーを介して連結または結合され、「免疫コンジュゲート」、「コンジュゲート」または「ＡＤＣ」を生成してもよい。
【０１９６】
第１の実施形態では、本発明の免疫コンジュゲートは、抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメント上に位置する１つ以上のリシン残基のε−アミノ基を介して本明細書に記載の医薬薬剤に共有結合する本明細書に記載される抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントを含む。
【０１９７】
第１の実施形態の第１の具体的な実施形態では、本発明の免疫コンジュゲートは、以下の式によって表され、
【化７５】
2020504607.tif 000085
ここで、
ＣＢＡは、リシン残基を介してＣｙＬ１に共有結合する、本明細書で上に記載の抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントであり；
ＷＬは、１〜２０の整数であり、
ＣｙＬ１は、以下の式
【化７６】
2020504607.tif 000086
によって表される細胞毒性化合物であるか、またはその医薬的に許容される塩であり、
ＮとＣとの間の二重線
【化７７】
2020504607.tif 000087
は、単結合または二重結合を表し、但し、二重結合である場合には、Ｘは存在せず、Ｙは、−Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ４）アルキルであり；単結合である場合には、Ｘは、−Ｈまたはアミン保護部分であり、Ｙは、−ＯＨまたは−ＳＯ３Ｈであるか、またはこれらの医薬的に許容される塩であり；
Ｗ’は、−ＮＲｅ’であり、
Ｒｅ’は、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−Ｒｋであり；
ｎは、２〜６の整数であり；
Ｒｋは、−Ｈまたは−Ｍｅであり；
Ｒｘ３は、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり；
Ｌ’は、以下の式
−ＮＲ５−Ｐ−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＲａＲｂ）ｍ−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｂ１’）；または
−ＮＲ５−Ｐ−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＲａＲｂ）ｍ−Ｓ−Ｚｓ１−（Ｂ２’）
によって表され、
Ｒ５は、−Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ３）アルキルであり；
Ｐは、アミノ酸残基または２〜２０個のアミノ酸残基を含有するペプチドであり；
Ｒａ及びＲｂは、それぞれの場合に、それぞれ独立して、−Ｈ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、または帯電した置換基またはイオン化可能な基Ｑであり；
ｍは、１〜６の整数であり、
Ｚｓ１は、以下の式
【化７８】
2020504607.tif 000088
【化７９】
2020504607.tif 000089
のいずれか１つから選択され、
ｑは、１〜５の整数である。
【０１９８】
第２の具体的な実施形態では、式（Ｌ１）のコンジュゲートの場合、ＣｙＬ１は、式（Ｌ１ａ）または（Ｌ１ａ１）によって表され；残りの可変部分は、第１の具体的な実施形態において上に記載したとおりである。
【０１９９】
第３の具体的な実施形態では、式（Ｌ１）のコンジュゲートの場合、ＣｙＬ１は、式（Ｌ１ｂ）または（Ｌ１ｂ１）によって表され；残りの可変部分は、第１の具体的な実施形態において上に記載したとおりである。より具体的には、Ｒｘ３は、（Ｃ２−Ｃ４）アルキルである。
【０２００】
第４の具体的な実施形態では、式（Ｌ１）のコンジュゲートの場合、ＣｙＬ１は、式（Ｌ１ａ）によって表され；Ｒａ及びＲｂは、両方ともＨであり；Ｒ５は、ＨまたはＭｅであり、残りの可変部分は、第１の具体的な実施形態において上に記載したとおりである。
【０２０１】
第５の具体的な実施形態では、Ｐは、２〜５個のアミノ酸残基を含有するペプチドであり、残りの可変部分は、第１、第２または第４の具体的な実施形態において上に記載したとおりである。より具体的な実施形態では、Ｐは、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ａｌａ、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｃｉｔ、Ｌｅｕ−Ｃｉｔ、Ｉｌｅ−Ｃｉｔ、Ｔｒｐ、Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ｐｈｅ−Ｎ９−トシル−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ｎ９−ニトロ−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号１４４）、β−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号１４５）、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ（配列番号１４６）、Ｖａｌ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ｖａｌ、Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ｖａｌ−Ｄ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｄ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ−Ｄ−Ａｒｇ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｖａｌ−Ａｒｇ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｃｉｔ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｄ−Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ａｒｇ、Ａｌａ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ−Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｍｅｔ、Ｍｅｔ−Ａｌａ、Ｇｌｎ−Ｖａｌ、Ａｓｎ−Ａｌａ、Ｇｌｎ−Ｐｈｅ及びＧｌｎ−Ａｌａからなる群から選択される。より具体的には、Ｐは、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ａｌａ−Ｖａｌ、Ａｌａ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ−ＡｌａまたはＤ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａである。
【０２０２】
第６の具体的な実施形態では、Ｑは、−ＳＯ３Ｈまたはその医薬的に許容される塩であり、残りの可変部分は、第１、第２、第４または第５の具体的な実施形態またはそこに記載される任意のより具体的な実施形態において上に記載したとおりである。
【０２０３】
第７の具体的な実施形態では、第１の実施形態の免疫コンジュゲートは、以下の式
【化８０】
2020504607.tif 000090
【化８１】
2020504607.tif 000091
【化８２】
2020504607.tif 000092
【化８３】
2020504607.tif 000093
【化８４】
2020504607.tif 000094
【化８５】
2020504607.tif 000095
【化８６】
2020504607.tif 000096
【化８７】
2020504607.tif 000097
によって表されるか、またはその医薬的に許容される塩であり、ＷＬは、１〜１０の整数であり；ＮとＣとの間の二重線
【化８８】
2020504607.tif 000098
は、単結合または二重結合を表し、但し、二重結合である場合には、Ｘは存在せず、Ｙは−Ｈであり；単結合である場合には、Ｘは、−Ｈであり、Ｙは、−ＯＨまたは−ＳＯ３Ｈである。より具体的な実施形態では、ＮとＣとの間の二重線
【化８９】
2020504607.tif 000099
は、二重結合を表し、
Ｘは存在せず、Ｙは−Ｈである。別のより具体的な実施形態では、ＮとＣとの間の二重線
【化９０】
2020504607.tif 000100
が単結合を表し、Ｘは−Ｈであり、Ｙは−ＳＯ３Ｈであるか、またはその医薬的に許容される塩である。
【０２０４】
第８の実施形態では、第１の実施形態の免疫コンジュゲートは、以下の式によって表され、
【化９１】
2020504607.tif 000101
ここで、
ＣＢＡは、リシン残基を介してＣｙＬ２に共有結合する、本明細書で上に記載の抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントであり；
ＷＬは、１〜２０の整数であり、
ＣｙＬ２は、以下の式
【化９２】
2020504607.tif 000102
によって表されるか、またはその医薬的に許容される塩であり、
ＮとＣとの間の二重線
【化９３】
2020504607.tif 000103
は、単結合または二重結合を表し、但し、二重結合である場合には、Ｘは存在せず、Ｙは、−Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ４）アルキルであり；単結合である場合には、Ｘは、−Ｈまたはアミン保護部分であり、Ｙは、−ＯＨまたは−ＳＯ３Ｈであるか、またはその医薬的に許容される塩であり；
Ｒｘ１及びＲｘ２は、独立して、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり；
Ｒｅは、−Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり；
Ｗ’は、−ＮＲｅ’であり、
Ｒｅ’は、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−Ｒｋであり；
ｎは、２〜６の整数であり；
Ｒｋは、−Ｈまたは−Ｍｅであり；
Ｚｓ１は、以下の式
【化９４】
2020504607.tif 000104
【化９５】
2020504607.tif 000105
のいずれか１つから選択され、
ｑは、１〜５の整数である。
【０２０５】
第９の具体的な実施形態では、式（Ｌ２）のコンジュゲートの場合、ＣｙＬ２は、式（Ｌ２ａ）または（Ｌ２ａ１）によって表され；残りの可変部分は、第８の具体的な実施形態において上に記載したとおりである。
【０２０６】
第１０の具体的な実施形態では、式（Ｌ２）のコンジュゲートの場合、ＣｙＬ２は、式（Ｌ２ｂ）または（Ｌ２ｂ１）によって表され；残りの可変部分は、第８の具体的な実施形態において上に記載したとおりである。
【０２０７】
第１１の具体的な実施形態では、式（Ｌ２）のコンジュゲートの場合、Ｒｅは、ＨまたはＭｅであり；Ｒｘ１及びＲｘ２は、独立して、−（ＣＨ２）Ｐ−（ＣＲｆＲｇ）−であり、Ｒｆ及びＲｇは、それぞれ独立して、−Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ４）アルキルであり；ｐは、０、１、２または３であり；残りの可変部分は、第８、第９または第１０の具体的な実施形態において上に記載したとおりである。より具体的には、Ｒｆ及びＲｇが同じであるか、または異なっており、−Ｈ及び−Ｍｅから選択される。
【０２０８】
第１２の具体的な実施形態では、第１の実施形態の免疫コンジュゲートは、以下の式
【化９６】
2020504607.tif 000106
【化９７】
2020504607.tif 000107
【化９８】
2020504607.tif 000108
によって表されるか、またはその医薬的に許容される塩であり、ＷＬは、１〜１０の整数であり；ＮとＣとの間の二重線
【化９９】
2020504607.tif 000109
は、単結合または二重結合を表し、但し、二重結合である場合には、Ｘは存在せず、Ｙは−Ｈであり；単結合である場合には、Ｘは、−Ｈであり、Ｙは、−ＯＨまたは−ＳＯ３Ｈであるか、またはその医薬的に許容される塩である。より具体的な実施形態では、ＮとＣとの間の二重線
【化１００】
2020504607.tif 000110
は、二重結合を表す。別のより具体的な実施形態では、ＮとＣとの間の二重線
【化１０１】
2020504607.tif 000111
が単結合を表し、Ｘは−Ｈであり、Ｙは−ＳＯ３Ｈであるか、またはその医薬的に許容される塩である。
【０２０９】
第１３の具体的な実施形態では、第１の実施形態の免疫コンジュゲートは、以下の式によって表され、
【化１０２】
2020504607.tif 000112
ここで、
ＣＢＡは、リシン残基を介してＣｙＬ３に共有結合する、本明細書で上に記載の抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントであり；
ＷＬは、１〜２０の整数であり、
ＣｙＬ３は、以下の式
【化１０３】
2020504607.tif 000113
によって表され、
ｍ’は、１または２であり；
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ３）アルキルであり；
Ｚｓ１は、以下の式
【化１０４】
2020504607.tif 000114
【化１０５】
2020504607.tif 000115
のいずれか１つから選択され、
ｑは、１〜５の整数である。
【０２１０】
第１４の具体的な実施形態では、式（Ｌ３）のコンジュゲートの場合、ｍ’は１であり、Ｒ１及びＲ２は両方ともＨであり、残りの可変部分は、第１３の具体的な実施形態において上に記載したとおりである。
【０２１１】
第１５の具体的な実施形態では、式（Ｌ３）のコンジュゲートの場合、ｍ’は２であり、Ｒ１及びＲ２は両方ともＭｅであり、残りの可変部分は、第１３の具体的な実施形態において上に記載したとおりである。
【０２１２】
第１６の具体的な実施形態では、第１の実施形態の免疫コンジュゲートは、以下の式
【化１０６】
2020504607.tif 000116
によって表されるか、またはその医薬的に許容される塩であり、
ここで、
ＷＬは、１〜１０の整数である。
【０２１３】
第１７の具体的な実施形態では、第１の実施形態のコンジュゲートの場合、Ｙは、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３Ｎａまたは−ＳＯ３Ｋであり、残りの可変部分は、第１〜第１６の具体的な実施形態のいずれか１つ、またはそこに記載される任意のより具体的な実施形態において上に記載したとおりである。一実施形態では、Ｙは、−ＳＯ３Ｎａである。
【０２１４】
特定の実施形態では、第１の実施形態の免疫コンジュゲートを含む組成物（例えば、医薬組成物）について、または第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６または第１７の具体的な実施形態について、抗体分子あたりの細胞毒性薬の平均数（すなわち、平均値ｗＬ）、組成物中の薬物−抗体比率（ＤＡＲ）は、１．０〜８．０である。いくつかの実施形態では、ＤＡＲは、１．０〜５．０、１．０〜４．０、１．０〜３．４、１．０〜３．０、１．５〜２．５、２．０〜２．５または１．８〜２．２の範囲である。いくつかの実施形態では、ＤＡＲは、４．０未満、３．８未満、３．６未満、３．５未満、３．０未満または２．５未満である。
【０２１５】
第２の実施形態では、本発明の免疫コンジュゲートは、抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメント上に位置する１つ以上のシステイン残基のチオール基（−ＳＨ）を介して本明細書に記載の細胞毒性剤に共有結合する本明細書で上に記載される抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントを含む。
【０２１６】
第１の具体的な実施形態では、第２の実施形態の免疫コンジュゲートは、以下の式によって表され、
【化１０７】
2020504607.tif 000117
ここで、
ＣＢＡは、システイン残基を介してＣｙＣ１に共有結合する、本明細書に記載の本発明の抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントであり；
ＷＣは、１または２であり、
ＣｙＣ１は、以下の式
【化１０８】
2020504607.tif 000118
によって表されるか、またはその医薬的に許容される塩であり、
ＮとＣとの間の二重線
【化１０９】
2020504607.tif 000119
は、単結合または二重結合を表し、但し、二重結合である場合には、Ｘは存在せず、Ｙは、−Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ４）アルキルであり；単結合である場合には、Ｘは、−Ｈまたはアミン保護部分であり、Ｙは、−ＯＨまたは−ＳＯ３Ｈであるか、またはこれらの医薬的に許容される塩であり；
Ｒ５は、−Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ３）アルキルであり；
Ｐは、アミノ酸残基または２〜２０個のアミノ酸残基を含有するペプチドであり；
Ｒａ及びＲｂは、それぞれの場合に、独立して、−Ｈ、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルまたは帯電した置換基またはイオン化可能な基Ｑであり；
Ｗ’は、−ＮＲｅ’であり、
Ｒｅ’は、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−Ｒｋであり；
ｎは、２〜６の整数であり；
Ｒｋは、−Ｈまたは−Ｍｅであり；
Ｒｘ３は、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり；
ＬＣは、
【化１１０】
2020504607.tif 000120
によって表され、ｓ１は、ＣＢＡに共有結合した部位であり、ｓ２は、ＣｙＣ１上の−Ｃ（＝Ｏ）−基に共有結合した部位であり；
Ｒ１９及びＲ２０は、それぞれの場合に、独立して、−Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ３）アルキルであり；
ｍ”は、１〜１０の整数であり；
Ｒｈは、−Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ３）アルキルである。
【０２１７】
第２の具体的な実施形態では、式（Ｃ１）のコンジュゲートの場合、ＣｙＣ１は、式（Ｃ１ａ）または（Ｃ１ａ１）によって表され；残りの可変部分は、第２の実施形態の第１の具体的な実施形態において上に記載したとおりである。
【０２１８】
第３の具体的な実施形態では、式（Ｃ１）のコンジュゲートの場合、ＣｙＣ１は、式（Ｃ１ｂ）または（Ｃ１ｂ１）によって表され；残りの可変部分は、第２の実施形態の第１の具体的な実施形態において上に記載したとおりである。
【０２１９】
第４の具体的な実施形態では、式（Ｃ１）のコンジュゲートの場合、ＣｙＣ１は、式（Ｃ１ａ）または（Ｃ１ａ１）によって表され；Ｒａ及びＲｂは両方ともＨであり；Ｒ５は、ＨまたはＭｅであり；残りの可変部分は、第２の実施形態の第１または第２の具体的な実施形態において上に記載したとおりである。
【０２２０】
第５の具体的な実施形態では、式（Ｃ１）のコンジュゲートの場合、Ｐは、２〜５個のアミノ酸残基を含有するペプチドであり、残りの可変部分は、第２の実施形態の第１、第２または第４の具体的な実施形態において上に記載したとおりである。より具体的な実施形態では、Ｐは、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ａｌａ、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｃｉｔ、Ｌｅｕ−Ｃｉｔ、Ｉｌｅ−Ｃｉｔ、Ｔｒｐ、Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ｐｈｅ−Ｎ９−トシル−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ｎ９−ニトロ−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号１４４）、β−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号１４５）、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ（配列番号１４６）、Ｖａｌ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ｖａｌ、Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ｖａｌ−Ｄ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｄ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ−Ｄ−Ａｒｇ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｖａｌ−Ａｒｇ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｃｉｔ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｄ−Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ａｒｇ、Ａｌａ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ−Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｍｅｔ、Ｍｅｔ−Ａｌａ、Ｇｌｎ−Ｖａｌ、Ａｓｎ−Ａｌａ、Ｇｌｎ−Ｐｈｅ及びＧｌｎ−Ａｌａから選択される。別のより具体的な実施形態では、Ｐは、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ａｌａ−Ｖａｌ、Ａｌａ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ−ＡｌａまたはＤ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａである。
【０２２１】
第６の具体的な実施形態では、式（Ｃ１）のコンジュゲートの場合、Ｑは、−ＳＯ３Ｈまたはその医薬的に許容される塩であり、残りの可変部分は、第２の実施形態の第１、第２、第４または第５の具体的な実施形態またはそこに記載される任意のより具体的な実施形態において上に記載したとおりである。
【０２２２】
第７の具体的な実施形態では、式（Ｃ１）のコンジュゲートの場合、Ｒ１９及びＲ２０は、両方ともＨであり、ｍ”は、１〜６の整数であり、残りの可変部分は、第２の実施形態の第１、第２、第３、第４、第５または第６の具体的な実施形態またはそこに記載される任意のより具体的な実施形態において上に記載したとおりである。
【０２２３】
第８の具体的な実施形態では、式（Ｃ１）のコンジュゲートの場合、−Ｌ−ＬＣ−は、以下の式
【化１１１】
2020504607.tif 000121
によって表され、残りの可変部分は、第２の実施形態の第１、第２、第３、第４、第５、第６または第７の具体的な実施形態またはそこに記載される任意のより具体的な実施形態において上に記載したとおりである。
【０２２４】
第９の具体的な実施形態では、第２の実施形態の免疫コンジュゲートは、以下の式
【化１１２】
2020504607.tif 000122
によって表されるか、またはその医薬的に許容される塩であり、ＮとＣとの間の二重線
【化１１３】
2020504607.tif 000123
は、単結合または二重結合を表し、但し、二重結合である場合には、Ｘは存在せず、Ｙは−Ｈであり；単結合である場合には、Ｘは、−Ｈであり、Ｙは、−ＯＨまたは−ＳＯ３Ｈであるか、またはその医薬的に許容される塩である。より具体的な実施形態では、ＮとＣとの間の二重線
【化１１４】
2020504607.tif 000124
は、二重結合を表し、
Ｘは存在せず、Ｙは−Ｈである。別のより具体的な実施形態では、ＮとＣとの間の二重線
【化１１５】
2020504607.tif 000125
が単結合を表し、Ｘは−Ｈであり、Ｙは−ＳＯ３Ｈであるか、またはその医薬的に許容される塩である。
【０２２５】
第１０の具体的な実施形態では、第２の実施形態の免疫コンジュゲートは、以下の式によって表され、
【化１１６】
2020504607.tif 000126
ここで、
ＣＢＡは、システイン残基を介してＣｙＣ２に共有結合する、本明細書で上に記載の抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントであり；
ＷＣは、１または２であり、
ＣｙＣ２は、以下の式
【化１１７】
2020504607.tif 000127
によって表されるか、またはその医薬的に許容される塩であり、
ＮとＣとの間の二重線
【化１１８】
2020504607.tif 000128
は、単結合または二重結合を表し、但し、二重結合である場合には、Ｘは存在せず、Ｙは、−Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ４）アルキルであり；単結合である場合には、Ｘは、−Ｈまたはアミン保護部分であり、Ｙは、−ＯＨまたは−ＳＯ３Ｈであるか、またはこれらの医薬的に許容される塩であり；
Ｒｘ１は、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり；
Ｒｅは、Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり；
Ｗ’は、−ＮＲｅ’であり、
Ｒｅ’は、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−Ｒｋであり；
ｎは、２〜６の整数であり；
Ｒｋは、−Ｈまたは−Ｍｅであり；
Ｒｘ２は、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり；
ＬＣ’は、以下の式
【化１１９】
2020504607.tif 000129
によって表され、
ここで、
ｓ１は、ＣＢＡに共有結合した部位であり、ｓ２は、ＣｙＣ２上の−Ｓ−基に共有結合した部位であり；
Ｚは、Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ９−または−ＮＲ９−Ｃ（＝Ｏ）−であり；
Ｑは、−Ｈ、帯電した置換基またはイオン化可能な基であり；
Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１９、Ｒ２０、Ｒ２１及びＲ２２は、それぞれの場合に、それぞれ独立して、−Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ３）アルキルであり；
ｑ及びｒは、それぞれの場合に、独立して、０〜１０の整数であり；
ｍ及びｎは、それぞれ独立して、０〜１０の整数であり；
Ｒｈは、−Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ３）アルキルであり；
Ｐ’は、アミノ酸残基または２〜２０個のアミノ酸残基を含有するペプチドである。
【０２２６】
より具体的な実施形態では、ｑ及びｒは、それぞれ独立して、１〜６の整数であり、より具体的には、１〜３の整数である。更により具体的には、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２及びＲ１３は、全てＨである。
【０２２７】
別のより具体的な実施形態では、ｍ及びｎは、それぞれ独立して、１〜６の整数であり、より具体的には、１〜３の整数である。更により具体的には、Ｒ１９、Ｒ２０、Ｒ２１及びＲ２２は、全てＨである。
【０２２８】
第１１の具体的な実施形態では、式（Ｃ２）のコンジュゲートの場合、ＣｙＣ２が、式（Ｃ２ａ）または（Ｃ２ａ１）によって表され、残りの可変部分は、第２の実施形態の第１０の具体的な実施形態またはそこに記載される任意のより具体的な実施形態において上に記載したとおりである。
【０２２９】
第１２の具体的な実施形態では、式（Ｃ２）のコンジュゲートの場合、ＣｙＣ２が、式（Ｃ２ｂ）または（Ｃ２ｂ１）によって表され、残りの可変部分は、第２の実施形態の第１０の具体的な実施形態において上に記載したとおりである。
【０２３０】
第１３の具体的な実施形態では、式（Ｃ２）のコンジュゲートの場合、Ｐ’は、２〜５個のアミノ酸残基を含有するペプチドであり、残りの可変部分は、第２の実施形態の第１０、第１１または第１２の具体的な実施形態またはそこに記載される任意のより具体的な実施形態において上に記載したとおりである。より具体的な実施形態では、Ｐ’は、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ａｌａ、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｃｉｔ、Ｌｅｕ−Ｃｉｔ、Ｉｌｅ−Ｃｉｔ、Ｔｒｐ、Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ｐｈｅ−Ｎ９−トシル−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ｎ９−ニトロ−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号１４４）、β−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号１４５）、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ（配列番号１４６）、Ｖａｌ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ｖａｌ、Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ｖａｌ−Ｄ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｄ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ−Ｄ−Ａｒｇ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｖａｌ−Ａｒｇ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｃｉｔ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｄ−Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ａｒｇ、Ａｌａ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ−Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｍｅｔ、Ｍｅｔ−Ａｌａ、Ｇｌｎ−Ｖａｌ、Ａｓｎ−Ａｌａ、Ｇｌｎ−Ｐｈｅ及びＧｌｎ−Ａｌａから選択される。別のより具体的な実施形態では、Ｐ’は、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ａｌａ−Ｖａｌ、Ａｌａ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ−ＡｌａまたはＤ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａである。
【０２３１】
第１４の具体的な実施形態では、式（Ｃ２）のコンジュゲートの場合、−ＬＣ’−は、以下の式
【化１２０】
2020504607.tif 000130
によって表される。
【０２３２】
第１５の具体的な実施形態では、（Ｃ２）のコンジュゲートの場合、Ｒｅは、ＨまたはＭｅであり；Ｒｘ１は、−（ＣＨ２）ｐ−（ＣＲｆＲｇ）−であり、Ｒｘ２は、−（ＣＨ２）ｐ−（ＣＲｆＲｇ）−であり、Ｒｆ及びＲｇは、それぞれ独立して、−Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ４）アルキルであり；ｐは、０、１、２または３であり；残りの可変部分は、第２の実施形態の第１０、第１１、第１２、第１３または第１４の具体的な実施形態において上に記載したとおりである。より具体的には、Ｒｆ及びＲｇが同じであるか、または異なっており、−Ｈ及び−Ｍｅから選択される。
【０２３３】
第１６の具体的な実施形態では、第２の実施形態の免疫コンジュゲートは、以下の式
【化１２１】
2020504607.tif 000131
【化１２２】
2020504607.tif 000132
によって表されるか、またはその医薬的に許容される塩であり、ＮとＣとの間の二重線
【化１２３】
2020504607.tif 000133
は、単結合または二重結合を表し、但し、二重結合である場合には、Ｘは存在せず、Ｙは−Ｈであり；単結合である場合には、Ｘは、−Ｈであり、Ｙは、−ＯＨまたは−ＳＯ３Ｈであるか、またはその医薬的に許容される塩である。より具体的な実施形態では、ＮとＣとの間の二重線
【化１２４】
2020504607.tif 000134
は、二重結合を表し、
Ｘは存在せず、Ｙは−Ｈである。別の具体的な実施形態では、ＮとＣとの間の二重線
【化１２５】
2020504607.tif 000135
が単結合を表し、Ｘは−Ｈであり、Ｙは−ＳＯ３Ｈであるか、またはその医薬的に許容される塩である。
【０２３４】
第１７の具体的な実施形態では、第２の実施形態の免疫コンジュゲートは、以下の式によって表され、
【化１２６】
2020504607.tif 000136
ここで、
ＣＢＡは、システイン残基を介してＣｙＣ３に共有結合する、本明細書で上に記載の本発明の抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントであり；
ＷＣは、１または２であり、
ＣｙＣ３は、以下の式
【化１２７】
2020504607.tif 000137
によって表され、
ここで、
ｍ’は、１または２であり；
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、−Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ３）アルキルであり；
ＬＣ’は、以下の式
【化１２８】
2020504607.tif 000138
によって表され、
ここで、
ｓ１は、ＣＢＡに共有結合した部位であり、ｓ２は、ＣｙＣ３上の−Ｓ−基に共有結合した部位であり；
Ｚは、Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ９−または−ＮＲ９−Ｃ（＝Ｏ）−であり；
Ｑは、Ｈ、帯電した置換基またはイオン化可能な基であり；
Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１９、Ｒ２０、Ｒ２１及びＲ２２は、それぞれの場合に、それぞれ独立して、Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ３）アルキルであり；
ｑ及びｒは、それぞれの場合に、独立して、０〜１０の整数であり；
ｍ及びｎは、それぞれ独立して、０〜１０の整数であり；
Ｒｈは、−Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ３）アルキルであり；
Ｐ’は、アミノ酸残基または２〜２０個のアミノ酸残基を含有するペプチドである。
【０２３５】
より具体的な実施形態では、ｑ及びｒは、それぞれ独立して、１〜６の整数であり、より具体的には、１〜３の整数である。更により具体的には、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２及びＲ１３は、全てＨである。
【０２３６】
別のより具体的な実施形態では、ｍ及びｎは、それぞれ独立して、１〜６の整数であり、より具体的には、１〜３の整数である。更により具体的には、Ｒ１９、Ｒ２０、Ｒ２１及びＲ２２は、全てＨである。
【０２３７】
第１８の具体的な実施形態では、式（Ｃ３）のコンジュゲートの場合、Ｐ’は、２〜５個のアミノ酸残基を含有するペプチドであり、残りの可変部分は、第２の実施形態の第１７の具体的な実施形態またはそこに記載される任意のより具体的な実施形態において上に記載したとおりである。より具体的な実施形態では、Ｐ’は、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ａｌａ、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｃｉｔ、Ｌｅｕ−Ｃｉｔ、Ｉｌｅ−Ｃｉｔ、Ｔｒｐ、Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ｐｈｅ−Ｎ９−トシル−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ｎ９−ニトロ−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号１４４）、β−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号１４５）、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ（配列番号１４６）、Ｖａｌ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ｖａｌ、Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ｖａｌ−Ｄ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｄ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ−Ｄ−Ａｒｇ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｖａｌ−Ａｒｇ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｃｉｔ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｄ−Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ａｒｇ、Ａｌａ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ−Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｍｅｔ、Ｍｅｔ−Ａｌａ、Ｇｌｎ−Ｖａｌ、Ａｓｎ−Ａｌａ、Ｇｌｎ−Ｐｈｅ及びＧｌｎ−Ａｌａから選択される。別のより具体的な実施形態では、Ｐ’は、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ａｌａ−Ｖａｌ、Ａｌａ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ−ＡｌａまたはＤ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａである。
【０２３８】
第１９の具体的な実施形態では、式（Ｃ３）のコンジュゲートの場合、−ＬＣ’−は、以下の式
【化１２９】
2020504607.tif 000139
によって表され、Ｍは、Ｈ＋またはカチオンであり、残りの可変部分は、第２の実施形態の第１７または第１８の具体的な実施形態またはそこに記載される任意のより具体的な実施形態において上に記載したとおりである。
【０２３９】
第２０の具体的な実施形態では、式（Ｃ３）のコンジュゲートの場合、ｍ’は１であり、Ｒ１及びＲ２は両方ともＨであり、残りの可変部分は、第２の実施形態の第１７、第１８または第１９の具体的な実施形態またはそこに記載される任意のより具体的な実施形態において上に記載したとおりである。
【０２４０】
第２１の具体的な実施形態では、式（Ｃ３）のコンジュゲートの場合、ｍ’は２であり、Ｒ１及びＲ２は両方ともＭｅであり、残りの可変部分は、第２の実施形態の第１７、第１８または第１９の具体的な実施形態またはそこに記載される任意のより具体的な実施形態において上に記載したとおりである。
【０２４１】
第２２の具体的な実施形態では、第２の実施形態の免疫コンジュゲートは、以下の式
【化１３０】
2020504607.tif 000140
によって表されるか、またはその医薬的に許容される塩であり、ここで、ＤＭは、以下の式
【化１３１】
2020504607.tif 000141
によって表される薬物部分である。
【０２４２】
第２３の具体的な実施形態では、第２の実施形態のコンジュゲートの場合、Ｙは、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３Ｎａまたは−ＳＯ３Ｋであり、残りの可変部分は、第２の実施形態の第１〜第２２の具体的な実施形態のいずれか１つ、またはそこに記載される任意のより具体的な実施形態において上に記載したとおりである。一実施形態では、Ｙは、−ＳＯ３Ｎａである。
Ｃ．例示的なリンカー分子
【０２４３】
本発明の免疫コンジュゲートを調製する際に、当該技術分野で既知の任意の適切なリンカーを使用してもよい。特定の実施形態では、リンカーは、二官能リンカーである。本明細書で使用される場合、「二官能リンカー」との用語は、２つの反応性基を有する改変薬剤を指し、反応性基の片方は、細胞結合剤と反応することが可能であり、他方は、細胞毒性化合物と反応し、２つの部分を一緒に連結する。このような二官能クロスリンカーは、当該技術分野でよく知られている（例えば、Ｉｓａｌｍ  ａｎｄ  Ｄｅｎｔ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｃｈａｐｔｅｒ  ５，ｐ２１８−３６３，Ｇｒｏｖｅｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９９を参照）。例えば、チオエーテル結合を介して結合することが可能な二官能架橋剤としては、マレイミド基を導入するためのＮ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、またはヨードアセチル基を導入するためのＮ−スクシンイミジル−４−（ヨードアセチル）−アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）が挙げられる。細胞結合剤にマレイミド基またはハロセチル基を導入する他の二官能架橋剤は、当該技術分野で十分に知られており（米国特許出願公開第２００８／００５０３１０号、第２００５０１６９９３３号、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ  １１７、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＩＬ  ６１１０５、ＵＳＡから入手可能）、限定されないが、ビス−マレイミドポリエチレングリコール（ＢＭＰＥＯ）、ＢＭ（ＰＥＯ）２、ＢＭ（ＰＥＯ）３、Ｎ−（β−マレイミドプロピルオキシ）スクシンイミドエステル（ＢＭＰＳ）、γ−マレイミド酪酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＧＭＢＳ）、ε−マレイミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）、５−マレイミド吉草酸ＮＨＳ、ＨＢＶＳ、Ｎ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシ−（６−アミドカプロエート）（ＳＭＣＣ（ＬＣ−ＳＭＣＣ）の「長鎖」アナログである）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）−酪酸ヒドラジドまたはＨＣｌ塩（ＭＰＢＨ）、Ｎ−スクシンイミジル３−（ブロモアセトアミド）プロピオネート（ＳＢＡＰ）、Ｎ−スクシンイミジルヨードアセテート（ＳＩＡ）、κ−マレイミドウンデカン酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＫＭＵＡ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）−ブチレート（ＳＭＰＢ）、スクシンイミジル−６−（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）、スクシンイミジル−（４−ビニルスルホニル）ベンゾエート（ＳＶＳＢ）、ジチオビス−マレイミドエタン（ＤＴＭＥ）、１，４−ビス−マレイミドブタン（ＢＭＢ）、１，４−ビスマレイミジル−２，３−ジヒドロキシブタン（ＢＭＤＢ）、ビス−マレイミドヘキサン（ＢＭＨ）、ビス−マレイミドエタン（ＢＭＯＥ）、スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミド−メチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）、スルホスクシンイミジル（４−ヨード−アセチル）アミノベンゾエート（スルホ−ＳＩＡＢ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＭＢＳ）、Ｎ−（γ−マレイミドブトリルオキシ）スルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＧＭＢＳ）、Ν−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）スルホスクシイミドエステル（スルホ−ＥＭＣＳ）、Ν−（κ−マレイミドウンデカノイルオキシ）スルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＫＭＵＳ）、及びスルホスクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（スルホ−ＳＭＰＢ）が挙げられる。
【０２４４】
ヘテロ二官能架橋剤は、２つの異なる反応性基を有する二官能架橋剤である。アミン反応性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基（ＮＨＳ基）及びカルボニル反応性ヒドラジン基を両方とも含有するヘテロ二官能架橋剤を使用し、本明細書に記載の細胞毒性化合物と細胞結合剤（例えば抗体）とを連結することもできる。このような市販のヘテロ二官能架橋剤の例としては、スクシンイミジル６−ヒドラジノニコチンアミドアセトンヒドラゾン（ＳＡＮＨ）、スクシンイミジル４−ヒドラジドテレフタレート塩酸塩（ＳＨＴＨ）及びスクシンイミジルヒドラジニウムニコチネート塩酸塩（ＳＨＮＨ）が挙げられる。酸に不安定な結合を有するコンジュゲートも、本発明のヒドラジンを有するベンゾジアゼピン誘導体を用いて調製することができる。使用可能な二官能架橋剤の例としては、スクシンイミジル−ｐ−ホルミルベンゾエート（ＳＦＢ）及びスクシンイミジル−ｐ−ホルミルフェノキシアセテート（ＳＦＰＡ）が挙げられる。
【０２４５】
ジスルフィド結合を介して細胞結合剤と細胞毒性化合物との連結を可能にする二官能架橋剤は、当該技術分野で知られており、ジチオピリジル基を導入するためにＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオプロピオネート（ＳＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）２−スルホブタノエート（スルホ−ＳＰＤＢ）が挙げられる。ジスルフィド基を導入するために使用可能な他の二官能架橋剤は、当該技術分野で知られており、米国特許第６，９１３，７４８号、第６，７１６，８２１号及び米国特許出願公開第２００９０２７４７１３号及び第２０１００１２９３１４号（全て本明細書に参考として組み込まれる）に開示されている。または、架橋剤、例えば、チオール基を導入する２−イミノチオラン、ホモシステインチオラクトンまたはＳ−アセチルコハク酸無水物を使用することもできる。
特定の実施形態では、二官能リンカーは、以下に記載する式（ａ１Ｌ）〜（ａ１０Ｌ）のいずれか１つによって表される。
Ｄ．例示的な医薬薬剤
１．メイタンシノイド
【０２４６】
特定の実施形態では、医薬薬剤は、メイタンシノイド化合物であり、例えば、その全体が本明細書に参考として組み込まれる米国特許第５，２０８，０２０号及び第７，２７６，４９７号に記載されるものである。特定の実施形態では、メイタンシノイド化合物は、以下の式によって表され、
【化１３２】
2020504607.tif 000142
ここで、可変部分は、上の第１の実施形態の第１３〜１７の具体的な実施形態のいずれか１つまたはそこに記載される任意のより具体的な実施形態において上に記載したとおりである。
【０２４７】
より具体的な実施形態では、メイタンシノイド化合物は、ＤＭ４である。
【化１３３】
2020504607.tif 000143
【０２４８】
別の実施形態では、メイタンシノイド化合物は、ＤＭ１である。
【化１３４】
2020504607.tif 000144
２．ベンゾジアゼピン
【０２４９】
特定の実施形態では、医薬薬剤は、ベンゾジアゼピン化合物、例えば、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）（例えば、ＷＯ２０１０／０４３８８０号、ＷＯ２０１１／１３０６１６号、ＷＯ２００９／０１６５１６号、ＷＯ２０１３／１７７４８１号及びＷＯ２０１２／１１２７０８号に記載されるもの）及びインドリノベンゾジアゼピン（ＩＧＮ）化合物（例えば、ＷＯ／２０１０／０９１１５０号及びＷＯ２０１２／１２８８６８号及び２０１６年６月２８日に出願された米国出願第１５／１９５，２６９号、表題「ＣＯＮＪＵＧＡＴＥＳ  ＯＦ  ＣＹＳＴＥＩＮＥ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＥＤ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ」に記載されるものである。これらの特許、特許公開及び出願の全ての全教示は、その全体が本明細書に参考として組み込まれる。
【０２５０】
本明細書で使用される場合、「ベンゾジアゼピン」化合物は、ベンゾジアゼピンコア構造を有する化合物である。ベンゾジアゼピンコアは、置換されていてもよく、または置換されていなくてもよく、及び／または１つ以上の環置換基と縮合していてもよい。これには、リンカーによって結合する２個のベンゾジアゼピンコアを有する化合物も含まれる。ベンゾジアゼピンコアの一部としてのイミン官能性（−Ｃ＝Ｎ−）は、還元されてもよい。
【０２５１】
本明細書で使用される場合、「ピロロベンゾジアゼピン」（ＰＢＤ）化合物は、ピロロベンゾジアゼピンコア構造を有する化合物である。ピロロベンゾジアゼピンは、置換されていてもよく、または置換されていなくてもよい。これには、リンカーによって結合する２個のピロロベンゾジアゼピンコアを有する化合物も含まれる。インドリノベンゾジアゼピンコアの一部としてのイミン官能性（−Ｃ＝Ｎ−）は、還元されてもよい。
【０２５２】
特定の実施形態では、医薬薬剤は、以下の式
【化１３５】
2020504607.tif 000145
【化１３６】
2020504607.tif 000146
によって表されるインドリノベンゾジアゼピン化合物であるか、またはその医薬的に許容される塩であり、ここで、
Ｌｃ’は、以下の式
−ＮＲ５−Ｐ−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＲａＲｂ）ｍ−Ｃ（＝Ｏ）Ｅ  （Ｂ１）；または
−ＮＲ５−Ｐ−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＲａＲｂ）ｍ−Ｓ−Ｚｓ  （Ｂ２）
によって表され、
Ｃ（＝Ｏ）Ｅは、反応性エステル基、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、ニトロフェニル（例えば、２または４−ニトロフェニル）エステル、ジニトロフェニル（例えば、２，４−ジニトロフェニル）エステル、スルホ−テトラフルオロフェニル（例えば、４−スルホ−２，３，５，６−テトラフルオロフェニル）エステル、またはペンタフルオロフェニルエステル、好ましくはＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルであり；
Ｚｓは、以下の式
【化１３７】
2020504607.tif 000147
【化１３８】
2020504607.tif 000148
によって表され、
ここで、
ｑは、１〜５の整数であり；
Ｕは、−ＨまたはＳＯ３Ｈ、またはその医薬的に許容される塩であり、残りの可変部分は、第１の実施形態の第１〜１２及び第１７の具体的な実施形態のいずれか１つまたはそこに記載される任意のより具体的な実施形態において上に記載したとおりである。
【０２５３】
特定の実施形態では、医薬インドリノベンゾジアゼピン化合物は、以下の式：
【化１３９】
2020504607.tif 000149
【化１４０】
2020504607.tif 000150
によって表されるか、またはその医薬的に許容される塩であり、
式（Ｃ１ａ’）、（Ｃ１ａ’１）、（Ｃ１ｂ’）及び（Ｃ１ｂ’１）の−ＬＣＣは、以下の式
【化１４１】
2020504607.tif 000151
によって表され、可変部分は、第２の実施形態の第１〜９及び第２３の具体的な実施形態またはそこに記載される任意のより具体的な実施形態において上に記載したとおりであり、
式（Ｃ２ａ”）、（Ｃ２ａ”１）、（Ｃ２ｂ””）及び（Ｃ２ｂ”１）の−ＬＣＣ’は、以下の式
【化１４２】
2020504607.tif 000152
によって表され、可変部分は、第２の実施形態の第１０〜１６及び第２３の具体的な実施形態またはそこに記載される任意のより具体的な実施形態において上に記載したとおりである。
【０２５４】
特定の実施形態では、医薬薬剤は、以下の任意のいずれかのインドリノベンゾジアゼピン化合物またはその医薬的に許容される塩である。
【表６−１】
2020504607.tif 000153
【表６−２】
2020504607.tif 000154
【表６−３】
2020504607.tif 000155
【０２５５】
上に示す化合物Ｄ１、ｓＤ１、Ｄ２、ｓＤ２、ＤＧＮ４６２、ｓＤＧＮ４６２、Ｄ３及びｓＤ３は、米国特許第９，３８１，２５６号、第８，７６５，７４０号、第８，４２６，４０２号及び第９，３５３，１２７号、及び米国出願公開第ＵＳ２０１６／００８２１１４号（全てが、その全体が本明細書に参考として組み込まれる）に記載される手順に従って調製することができる。
【０２５６】
特定の実施形態では、上に示す化合物（例えば、ｓＤ１、ｓＤ２、ｓＤ４、ｓＤＧＮ４６２、ｓＤ３、ｓＤ４、ｓＤ５、ｓＤ５’、ｓＤ６またはｓＤ７）の医薬的に許容される塩は、ナトリウム塩またはカリウム塩である。より具体的には、医薬的に許容される塩は、ナトリウム塩である。
【０２５７】
具体的な実施形態では、医薬薬剤は、以下の式
【化１４３】
2020504607.tif 000156
によって表されるか、またはその医薬的に許容される塩である。具体的な実施形態では、医薬的に許容される塩は、ナトリウム塩またはカリウム塩である。
【０２５８】
別の具体的な実施形態では、医薬薬剤は、以下の式
【化１４４】
2020504607.tif 000157
によって表される。
ＩＶ．製造方法
【０２５９】
本発明の抗ＡＤＡＭ９抗体及びそのＡＤＡＭ９結合フラグメントは、最も好ましくは、当該技術分野でよく知られているように、このようなポリペプチドをコードする核酸分子の組換え発現によって作られる。
【０２６０】
本発明のポリペプチドは、固相ペプチド合成を用いて簡便に調製されてもよい（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，  Ｂ．（１９８６）  「Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２（４７４８）：３４１−３４７；Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，  Ｒ．Ａ．（１９８５）  「Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｆｏｒ  Ｔｈｅ  Ｒａｐｉｄ  Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｏｆ  Ｌａｒｇｅ  Ｎｕｍｂｅｒｓ  Ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｇｅｎ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ａｔ  Ｔｈｅ  Ｌｅｖｅｌ  Ｏｆ  Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ」  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８２（１５）：５１３１−５１３５；Ｇａｎｅｓａｎ，  Ａ．（２００６）  「Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｔｗｅｎｔｙ−Ｆｉｒｓｔ  Ｃｅｎｔｕｒｙ」  Ｍｉｎｉ  Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．６（１）：３−１０）。
【０２６１】
代替例では、抗体は、組換えによって作られ、当該技術分野で既知の任意の方法を用いて発現されてもよい。抗体は、まず、宿主動物から作られた抗体を単離し、遺伝子配列を得て、この遺伝子配列を使用し、宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）において抗体を組換えによって発現させることによって、組換えによって作られてもよい。使用可能な別の方法は、植物（例えばタバコ）またはトランスジェニック乳において抗体配列を発現させることである。植物または乳において組換えによって抗体を発現させるのに適した方法が開示されている（例えば、Ｐｅｅｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）  「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｐｌａｎｔｓ」，  Ｖａｃｃｉｎｅ  １９：２７５６；Ｌｏｎｂｅｒｇ，  Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）  「Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｒｏｍ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｍｉｃｅ」，  Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３：６５−９３；及びＰｏｌｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）  「Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｍｉｌｋ  Ａｓ  Ａ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｆｏｒ  Ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」，  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：１４７−１５７）。抗体の誘導体（例えば、ヒト化、単鎖など）を製造するのに適した方法は、当該技術分野で知られており、上に記載している。別の代替例では、抗体は、ファージディスプレイ技術によって、組換えにより作られてもよい（例えば、米国特許第５，５６５，３３２号、第５，５８０，７１７号、第５，７３３，７４３号、第６，２６５，１５０号及びＷｉｎｔｅｒ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）「Ｍａｋｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｂｙ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」，  Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２．４３３−４５５を参照）。
【０２６２】
目的のポリヌクレオチド（例えば、本発明の抗ＡＤＡＭ９抗体及びそのＡＤＡＭ９結合フラグメントのポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチド）を含むベクターは、電気穿孔、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストランまたは他の物質を使用するトランスフェクション、微粒子銃、リポフェクション及び感染（例えば、ベクターが、ワクシニアウイルスなどの感染薬剤である場合）を含む任意の多くの適切な手段によって宿主細胞に導入されてもよい。導入ベクターまたはポリヌクレオチドの選択は、多くは、宿主細胞の特徴に依存して変わるだろう。
【０２６３】
目的のポリペプチドまたはタンパク質を発現させるために、異種ＤＮＡを過剰発現することが可能な任意の宿主細胞を使用してもよい。適切な哺乳動物宿主細胞の非限定的な例としては、限定されないが、ＣＯＳ、ＨｅＬａ及びＣＨＯ細胞が挙げられる。
【０２６４】
本発明は、本発明の抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントのアミノ酸配列を含む免疫コンジュゲートを含む。本発明のポリペプチドは、当該技術分野で既知の手順によって製造することができる。ポリペプチドは、抗体のタンパク質分解または他の分解によって、上述の組換え方法（すなわち、１本のポリペプチドまたは融合ポリペプチド）によって、または化学合成によって作られてもよい。抗体のポリペプチド、特に、約５０アミノ酸までの短いポリペプチドは、化学合成によって簡便に作られる。化学合成の方法は、当該技術分野で既知であり、市販されている。
【０２６５】
本発明は、分子の特性に顕著な影響を与えない、機能的に等価なポリペプチド、及び活性が向上しているか、または減少している変異体を含め、抗ＡＤＡＭ９抗体の変異体及びそのフラグメントを含む、免疫コンジュゲートを含む。ポリペプチドの改変は、当該技術分野で通常の実施であり、本明細書で詳細に記載する必要はない。改変ポリペプチドの例としては、アミノ酸残基の保存的置換、機能活性または化学アナログの使用に顕著な悪影響を与えないアミノ酸の１つ以上の欠失または付加を有するポリペプチドが挙げられる。互いに保存的に置換され得る、互いに保存的に置換が可能なアミノ酸残基としては、限定されないが、グリシン／アラニン；セリン／トレオニン；バリン／イソロイシン／ロイシン；アスパラギン／グルタミン；アスパラギン酸／グルタミン酸；リシン／アルギニン；及びフェニルアラニン／チロシンが挙げられる。これらのポリペプチドは、グリコシル化ポリペプチド及び非グリコシル化ポリペプチド、及び例えば、異なる糖を用いたグリコシル化、アセチル化及びリン酸化などの他の翻訳後改変を有するポリペプチドも含む。
好ましくは、アミノ酸置換は、保存的であろう（すなわち、置換アミノ酸が、元々のアミノ酸と同様の化学特性を有している）。このような保存的置換は、当該技術分野で知られており、例を上に提示している。アミノ酸改変は、領域（例えば可変ドメイン）の完全な再設計のために、１つ以上のアミノ酸を交換するか、または改変するものまでの範囲であってもよい。可変ドメインを交換すると、結合アフィニティ及び／または特異性が変化する場合がある。他の改変方法は、当該技術分野で既知のカップリング技術、限定されないが、酵素手段、酸化置換及びキレート化を含む技術を用いることを含む。例えば、イムノアッセイのための標識の接続、例えば、ラジオイムノアッセイのための放射性部分の接続に、改変を使用してもよい。改変ポリペプチドは、当該技術分野で確立された手順を用いて作られ、当該技術分野で既知の標準的なアッセイを用いてスクリーニングすることができる。
【０２６６】
本発明は、本発明の抗ＡＤＡＭ９−ＶＬ及び／またはＶＨのうち１つ以上を含む融合タンパク質を含む免疫コンジュゲートを包含する。一実施形態では、軽鎖、または重鎖または軽鎖と重鎖を含む融合ポリペプチドが提供される。別の実施形態では、融合ポリペプチドは、異種免疫グロブリン定常領域を含む。別の実施形態では、融合ポリペプチドは、公的に寄託されたハイブリドーマから製造した抗体の軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインを含む。本発明の目的のために、抗体融合タンパク質は、ＡＤＡＭ９に特異的に結合する１つ以上のポリペプチドドメインと、天然の分子では接続されていない別のアミノ酸配列、例えば、異種配列または別の領域由来の同種配列とを含む。
Ｖ．薬物の結合
【０２６７】
上の第１の実施形態またはそこに記載される具体的な実施形態に記載されるように、抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメント上に位置する１つ以上のリシン残基のε−アミノ基を介して医薬薬剤に共有結合した抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントを含む免疫コンジュゲートは、当該技術分野で既知の任意の方法に従って、例えば、本明細書に参考として組み込まれる第ＷＯ２０１２／１２８８６８号及び第ＷＯ２０１２／１１２６８７号に従って調製することができる。
【０２６８】
特定の実施形態では、第１の実施形態の免疫コンジュゲートは、ＣＢＡと、アミン反応性基を有する細胞毒性薬とを反応させる工程を含む第１の方法によって調製することができる。
【０２６９】
一実施形態では、上に記載の第１の方法について、この反応は、イミン反応性試薬、例えばＮａＨＳＯ３存在下で行われる。
【０２７０】
一実施形態では、上に記載の第１の方法について、イミン反応性基を有する細胞毒性薬は、以下の式
【化１４５】
2020504607.tif 000158
によって表されるか、またはその医薬的に許容される塩であり、可変部分の定義は、式（Ｌ１ａ’）、（Ｌ１ａ’１）、（Ｌ１ｂ’）及び（Ｌ１ｂ’１）について上に記載している。
【０２７１】
特定の実施形態では、第１の実施形態の免疫コンジュゲートは、
（ａ）細胞毒性薬と、アミン反応性基及びチオール反応性基を有するリンカー化合物とを反応させ、アミン反応性基が結合した細胞毒性薬−リンカー化合物を形成する工程と、
（ｂ）ＣＢＡと、細胞毒性薬−リンカー化合物とを反応させる工程とを含む、第２の方法によって調製することができる。
【０２７２】
一実施形態では、上に記載の第２の方法について、工程（ａ）の反応は、イミン反応性試薬（例えばＮａＨＳＯ３）存在下で行われる。
【０２７３】
一実施形態では、上に記載の第２の方法について、細胞毒性薬−リンカー化合物は、精製することなくＣＢＡと反応する。または、細胞毒性薬−リンカー化合物は、ＣＢＡと反応する前に、まず精製される。
【０２７４】
特定の実施形態では、第１の実施形態の免疫コンジュゲートは、
（ａ）ＣＢＡと、アミン反応性基及びチオール反応性基を有するリンカー化合物とを反応させ、チオール反応性基が結合した改変ＣＢＡを形成する工程と、
（ｂ）改変ＣＢＡと、細胞毒性薬とを反応させる工程とを含む、第３の方法によって調製することができる。
【０２７５】
一実施形態では、上に記載の第３の方法について、工程（ｂ）の反応は、イミン反応性試薬（例えばＮａＨＳＯ３）存在下で行われる。
【０２７６】
特定の実施形態では、第１の実施形態の免疫コンジュゲートは、ＣＢＡと、細胞毒性化合物と、アミン反応性基及びチオール反応性基を有するリンカー化合物とを反応させる工程を含む第４の方法によって調製することができる。
【０２７７】
一実施形態では、第４の方法について、この反応は、イミン反応性試薬、例えばＮａＨＳＯ３存在下で行われる。
【０２７８】
特定の実施形態では、上に記載した第２、第３または第４の方法について、アミン反応性基及びチオール反応性基を有するリンカー化合物は、以下の式
【化１４６】
2020504607.tif 000159
【化１４７】
2020504607.tif 000160
によって表され、
ここで、Ｘはハロゲン；ＪＤ−ＳＨ、−ＳＳＲｄ、または−ＳＣ（＝Ｏ）Ｒｇであり；Ｒｄは、フェニル、ニトロフェニル、ジニトロフェニル、カルボキシニトロフェニル、ピリジルまたはニトロピリジルであり；Ｒｇは、アルキルであり；残りの可変部分は、式（ａ１）〜（ａ１０）について上に記載したとおりであり、細胞毒性薬は、以下の式
【化１４８】
2020504607.tif 000161
によって表されるか、またはその医薬的に許容される塩であり、可変部分は、式（Ｌ１ａ’）、（Ｌ１ａ’１）、（Ｌ１ｂ’）、（Ｌ１ｂ’１）、（Ｌ２ａ’）、（Ｌ２ａ’１）、（Ｌ２ｂ’）及び（Ｌ２ｂ’１）について上に記載したとおりである。
【０２７９】
特定の実施形態では、上に記載した第２、第３または第４の方法について、アミン反応性基及びチオール反応性基を有するリンカー化合物は、式（ａ１Ｌ）〜（ａ１０Ｌ）によって表され、細胞毒性薬は、以下の式
【化１４９】
2020504607.tif 000162
によって表され、ここで、可変部分は、上述の第１の実施形態の第１３〜第１７の具体的な実施形態のいずれか１つ、またはそこに記載される任意のより具体的な実施形態において上に記載したとおりである。
【０２８０】
具体的な実施形態では、上に記載した第２、第３または第４の方法について、リンカーは、スルホ−ＳＰＤＢであり、細胞毒性薬は、ＤＭ４であり、免疫コンジュゲートは、以下の式
【化１５０】
2020504607.tif 000163
によって表されるか、またはその医薬的に許容される塩であり、ＷＬは、１〜１０の整数である。
【０２８１】
上の第２の実施形態に記載されるように、抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメント上に位置する１つ以上のシステイン残基のチオール（−ＳＨ）基を介して細胞毒性薬に共有結合した抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントを含む免疫コンジュゲート（例えば、第１〜第２３の具体的な実施形態のいずれか１つ、またはそこに記載される任意のより具体的な実施形態の免疫コンジュゲート）は、１つ以上の遊離システインを有するＣＢＡと、本明細書に記載のチオール反応性基を有する細胞毒性薬とを反応させることによって調製することができる。
【０２８２】
好ましい実施形態では、本発明の免疫コンジュゲートは、このような化合物（例えば、配列番号７９及び８０）に対する医薬薬剤の結合を可能にするように、さらなるシステイン残基を含む変異体ＩｇＧ  Ｆｃ領域を含む。
【０２８３】
一実施形態では、チオール反応性基を有する細胞毒性薬は、以下の式：
【化１５１】
2020504607.tif 000164
によって表されるか、またはその医薬的に許容される塩であり、ここで、−ＬＣＣは、以下の式
【化１５２】
2020504607.tif 000165
によって表され、可変部分は、第２の実施形態の第１〜９及び第２３の具体的な実施形態のいずれか１つ、またはそこに記載される任意のより具体的な実施形態において上に記載したとおりである。
【０２８４】
別の実施形態では、チオール反応性基を有する細胞毒性薬は、以下の式：
【化１５３】
2020504607.tif 000166
によって表されるか、またはその医薬的に許容される塩であり、ここで、ＬＣＣ’は、以下の式
【化１５４】
2020504607.tif 000167
によって表され、可変部分は、第２の実施形態の第１０〜１６及び第２３の具体的な実施形態のいずれか１つ、またはそこに記載される任意のより具体的な実施形態において上に記載したとおりである。
【０２８５】
さらに別の実施形態では、チオール反応性基を有する細胞毒性薬は、以下の式：
【化１５５】
2020504607.tif 000168
によって表されるか、またはその医薬的に許容される塩であり、ここで、ＬＣＣ’は、上に記載されており、可変部分は、第２の実施形態の第１７〜第２３の具体的な実施形態のいずれか１つ、またはそこに記載される任意のより具体的な実施形態において上に記載したとおりである。
【０２８６】
具体的な実施形態では、チオール反応性基を有する細胞毒性薬は、以下の式：
【化１５６】
2020504607.tif 000169
によって表されるか、またはその医薬的に許容される塩である。
【０２８７】
別の具体的な実施形態では、チオール反応性基を有する細胞毒性薬は、以下の式：
【化１５７】
2020504607.tif 000170
によって表されるか、またはその医薬的に許容される塩である。
【０２８８】
特定の実施形態では、ＣＢＡと細胞毒性薬との反応に有機溶媒が使用され、細胞毒性薬を溶解する。例示的な有機溶媒としては、限定されないが、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、プロピレングリコールなどが挙げられる。一実施形態では、ＣＢＡと細胞毒性薬との反応は、ＤＭＡ及びプロピレングリコール存在下で行われる。
【０２８９】
具体的な実施形態では、以下の式
【化１５８】
2020504607.tif 000171
によって表されるか、またはその医薬的に許容される塩である細胞毒性薬は、ＣＢＡ（例えば、抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメント）と反応し、以下の式
【化１５９】
2020504607.tif 000172
によって表されるか、またはその医薬的に許容される塩である免疫コンジュゲートを形成し、
ここで、ＮとＣとの間の
二重線
【化１６０】
2020504607.tif 000173
は、単結合または二重結合を表し、但し、二重結合である場合には、Ｘは存在せず、Ｙは−Ｈであり；単結合である場合には、Ｘは、−Ｈであり、Ｙは、−ＳＯ３Ｈであるか、またはこれらの医薬的に許容される塩であり、ＷＣは、１または２である。より具体的な実施形態では、ＮとＣとの間の二重線
【化１６１】
2020504607.tif 000174
は、二重結合を表し、
Ｘは存在せず、Ｙは−Ｈである。別のより具体的な実施形態では、ＮとＣとの間の二重線
【化１６２】
2020504607.tif 000175
が単結合を表し、Ｘは−Ｈであり、Ｙは−ＳＯ３Ｈであるか、またはその医薬的に許容される塩である。更により具体的には、医薬的に許容される塩は、ナトリウム塩またはカリウム塩である。
【０２９０】
特定の実施形態では、Ｙが−ＳＯ３Ｈまたはその医薬的に許容される塩である場合、免疫コンジュゲートは、
（ａ）上述のチオール反応性基を有するイミン含有細胞毒性薬のイミン部分（すなわち、式（Ｃ１ａ’）、（Ｃ１ａ’１）、（Ｃ１ｂ’）、（Ｃ１ｂ’１）、（Ｃ２ａ”）、（Ｃ２ａ”１）、（Ｃ２ｂ”）または（Ｃ２ｂ”１）、ここで、ＮとＣとの間の二重線
【化１６３】
2020504607.tif 000176
は、二重結合を表し、Ｘは存在せず、Ｙは−Ｈである）と、ｐＨが１．９〜５．０の水溶液中、二酸化硫黄、亜硫酸水素塩またはピロ亜硫酸塩と反応させ、以下の式
【化１６４】
2020504607.tif 000177
によって表される改変イミン部分、またはその医薬的に許容される塩を含む改変細胞毒性薬を形成し、
（ｂ）改変細胞毒性薬と、本明細書に記載の抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントとを反応させ、免疫コンジュゲートを形成することによって調製することができる。
【０２９１】
第１の態様では、上述の方法について、工程（ａ）の反応は、ｐＨが１．９〜５．０で行われる。より具体的には、ｐＨは、２．５〜４．９、１．９〜４．８、２．０〜４．８、２．５〜４．５、２．９〜４．５、２．９〜４．０、２．９〜３．７、３．１〜３．５、または３．２〜３．４である。別の具体的な実施形態では、工程（ａ）の反応は、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９または５．０のｐＨで行われる。更に別の具体的な実施形態では、工程（ａ）の反応は、ｐＨ３．３で行われる。
【０２９２】
本明細書で使用される場合、具体的なｐＨ値は、その具体的な値±０．０５を意味する。
【０２９３】
いくつかの実施形態では、工程（ａ）の反応は、バッファー溶液存在下で行われる。当該技術分野で既知の任意の適切なバッファー溶液を、本発明の方法で使用することができる。適切なバッファー溶液としては、例えば、限定されないが、クエン酸バッファー、酢酸バッファー、コハク酸バッファー、リン酸バッファー、グリシン含有バッファー（例えば、グリシン−ＨＣｌバッファー）、フタル酸バッファー（例えば、フタル酸水素ナトリウムまたはフタル酸水素カリウムを含むバッファー溶液、及びこれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態では、バッファー溶液は、コハク酸バッファーである。いくつかの実施形態では、バッファー溶液は、リン酸バッファーである。いくつかの実施形態では、バッファーは、クエン酸−リン酸バッファーである。いくつかの実施形態では、バッファーは、クエン酸とＮａ２ＨＰＯ４とを含むクエン酸−リン酸バッファーである。他の実施形態では、バッファーは、クエン酸とＫ２ＨＰＯ４とを含むクエン酸−リン酸バッファーである。いくつかの実施形態では、上述のバッファー溶液の濃度は、１０〜２５０ｍＭ、１０〜２００ｍＭ、１０〜１５０ｍＭ、１０〜１００ｍＭ、２５〜１００ｍＭ、２５〜７５ｍＭ、１０〜５０ｍＭ、または２０〜５０ｍＭの範囲であってもよい。
【０２９４】
第２の態様では、反応工程（ａ）は、バッファー溶液（例えば、第１の態様で記載したバッファー）非存在下で行われる。いくつかの実施形態では、本方法は、（ａ）上述のチオール反応性基を有するイミン含有細胞毒性薬のイミン部分（すなわち、式（Ｃ１ａ’）、（Ｃ１ａ’１）、（Ｃ１ｂ’）、（Ｃ１ｂ’１）、（Ｃ２ａ”）、（Ｃ２ａ”１）、（Ｃ２ｂ”）または（Ｃ２ｂ”１）、ここで、ＮとＣとの間の二重線
【化１６５】
2020504607.tif 000178
は、二重結合を表し、Ｘは存在せず、Ｙは−Ｈである）と、水溶液中、二酸化硫黄、亜硫酸水素塩またはピロ亜硫酸塩と反応させ、以下の式
【化１６６】
2020504607.tif 000179
によって表される改変イミン部分、またはその医薬的に許容される塩を含む改変細胞毒性薬を形成し、前記水溶液がバッファーを含まない工程と、（ｂ）改変細胞毒性薬と、本明細書に記載の抗ＡＤＡＭ９抗体またはそのＡＤＡＭ９結合フラグメントとを反応させ、免疫コンジュゲートを形成することによって調製する工程とを含む。いくつかの実施形態では、工程（ａ）の反応は、有機溶媒と水の混合物中で行われる。より具体的には、工程（ａ）の反応は、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）と水の混合物中で行われる。いくつかの実施形態では、ＤＭＡと水の混合物は、６０体積％未満のＤＭＡを含む。更により具体的には、ＤＭＡと水の体積比は、１：１である。
【０２９５】
第３の態様では、上述の方法または第１または第２の態様について、工程（ａ）の反応において、１当量のイミン含有細胞毒性薬ごとに、０．５〜５．０当量の亜硫酸水素塩または０．２５または２．５当量のピロ亜硫酸塩を使用する。いくつかの実施形態では、０．５〜４．５、０．５〜４．０、０．５〜３．５、０．５〜４．０、０．５〜３．５、０．５〜３．０、０．５〜２．５、０．８〜２．０、０．９〜１．８、１．０〜１．７、１．１〜１．６、または１．２〜１．５当量の亜硫酸水素塩または０．２５〜２．２５、０．２５〜２．０、０．２５〜１．７５、０．２５〜２．０、０．２５〜１．７５、０．２５〜１．５、０．２５〜１．２５、０．４〜１．０、０．４５〜０．９、０．５〜０．８５、０．５５〜０．８、または０．６〜０．７５当量のピロ亜硫酸塩を、１当量のイミン含有細胞毒性薬ごとに使用する。他の実施形態では、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３  １．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、４．０、４．５または５．０当量の亜硫酸水素塩または０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．５５、０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、０．９５、１．０、１．０５、１．１、１．１５、１．２、１．２５、１．３、１．３５、１．４、１．４５、１．５、１．５５、１．６、１．６５、１．７、１．７５、２．０、２．２５または２．５当量のピロ亜硫酸塩を、１当量のイミン含有細胞毒性薬ごとに使用する。更に他の実施形態では、１．４当量の亜硫酸水素塩または０．７当量のピロ亜硫酸塩を、１当量のイミン含有細胞毒性薬ごとに使用する。他の実施形態では、１．２当量の亜硫酸水素塩または０．６当量のピロ亜硫酸塩を、１当量のイミン含有細胞毒性薬ごとに使用する。
【０２９６】
本明細書で使用される場合、具体的な当量は、その具体的な値±０．０５を意味する。
【０２９７】
第４の態様では、上述の方法について、工程（ａ）の反応は、２．９〜３．７のｐＨで行われ、１．０〜１．８当量の亜硫酸水素塩または０．５〜０．９当量のピロ亜硫酸塩を、１当量のイミン含有細胞毒性薬と反応させる。いくつかの実施形態では、工程（ａ）の反応は、３．１〜３．５のｐＨで行われ、１．１〜１．６当量の亜硫酸水素塩または０．５５〜０．８当量のピロ亜硫酸塩を、１当量のイミン含有細胞毒性薬と反応させる。他の実施形態では、工程（ａ）の反応は、３．２〜３．４のｐＨで行われ、１．３〜１．５当量の亜硫酸水素塩または０．６５〜０．７５当量のピロ亜硫酸塩を、１当量のイミン含有細胞毒性薬と反応させる。他の実施形態では、工程（ａ）の反応は、３．３のｐＨで行われ、１．４当量の亜硫酸水素塩または０．７当量のピロ亜硫酸塩を、１当量のイミン含有細胞毒性薬と反応させる。更に他の実施形態では、工程（ａ）の反応は、３．３のｐＨで行われ、１．４当量の亜硫酸水素ナトリウムを、１当量のイミン含有細胞毒性薬と反応させる。
【０２９８】
第５の態様では、上述の方法について、または第１、第２、第３または第４の態様において、工程（ａ）の反応は、有機溶媒と水の混合物中で行われる。任意の適切な有機溶媒が使用可能である。例示的な有機溶媒としては、限定されないが、アルコール（例えば、メタノール、エタノール、プロパノールなど）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトニトリル、アセトン、塩化メチレンなどが挙げられる。いくつかの実施形態では、有機溶媒は、水と混和性である。他の実施形態では、有機溶媒は、水と混和性ではなく、すなわち、工程（ａ）の反応は、二相溶液中で行われる。いくつかの実施形態では、有機溶媒は、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）である。有機溶媒（例えば、ＤＭＡ）は、水と有機溶媒の合計体積の１体積％〜９９体積％、１〜９５体積％、１０〜８０体積％、２０〜７０体積％、３０〜７０体積％、１〜６０体積％、５〜６０体積％、１０〜６０体積％、２０〜６０体積％、３０〜６０体積％、４０〜６０体積％、４５〜５５体積％、１０〜５０体積％または２０〜４０体積％の量で存在していてもよい。いくつかの実施形態では、工程（ａ）の反応は、ＤＭＡと水の混合物中で行われ、ＤＭＡと水の体積比は、１：１である。
【０２９９】
第６の態様では、上述の方法について、または第１、第２、第３、第４または第５の態様において、工程（ａ）の反応は、任意の適切な温度で行うことができる。いくつかの実施形態では、反応は、０℃〜５０℃、１０℃〜５０℃、１０℃〜４０℃、または１０℃〜３０℃の温度で行われる。他の実施形態では、反応は、１５℃〜３０℃、２０℃〜３０℃、１５℃〜２５℃、１６℃〜２４℃、１７℃〜２３℃、１８℃〜２２℃または１９℃〜２１℃の温度で行われる。更に他の実施形態では、反応は、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃または２５℃で行われてもよい。いくつかの実施形態では、反応は、０℃〜１５℃、０℃〜１０℃、１℃〜１０℃、５℃〜１５℃、または５℃〜１０℃で行われてもよい。
【０３００】
第７の態様では、上述の方法について、または、第１、第２、第３、第４、第５または第６の態様において、工程（ａ）の反応は、１分間〜４８時間、５分間〜３６時間、１０分間〜２４時間、３０分間〜２４時間、３０分間〜２０時間、１時間〜２０時間、１時間〜１５時間、１時間〜１０時間、２時間〜１０時間、３時間〜９時間、３時間〜８時間、４時間〜６時間、または１時間〜４時間行われる。いくつかの実施形態では、反応は、４〜６時間進められる。他の実施形態では、反応は、１０分間、１５分間、２０分間、３０分間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間などの時間進められる。他の実施形態では、反応は、４時間進められる。さらに他の実施形態では、反応は、２時間進められる。
【０３０１】
第８の態様では、本明細書に記載の本発明の方法について、または第１、第２、第３、第４、第５、第６または第７の態様において、工程（ｂ）の反応は、ｐＨが４〜９で行われる。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の反応は、４．５〜８．５、５〜８．５、５〜８、５〜７．５、５〜７、５〜６．５、または５．５〜６．５のｐＨで行われる。他の実施形態では、工程（ｂ）の反応は、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９または８．０のｐＨで行われる。
【０３０２】
いくつかの実施形態では、上述の方法について、または第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７または第８の態様において、工程（ｂ）の反応は、水と有機溶媒の混合物を含む水溶液中で行われる。上述の任意の適切な有機溶媒が使用可能である。より具体的には、有機溶媒は、ＤＭＡである。いくつかの実施形態では、水溶液は、水と有機溶媒の合計体積の５０体積％未満、４０体積％未満、３０体積％未満、２５体積％未満、２０体積％未満、１５体積％未満、１０体積％未満、５体積％未満、３体積％未満、２体積％未満、または１体積％未満の有機溶媒（例えば、ＤＭＡ）を含む。
【０３０３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法について、または第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７または第８の態様において、亜硫酸水素塩は、亜硫酸水素ナトリウムまたは亜硫酸水素カリウムであり、ピロ亜硫酸塩は、ピロ亜硫酸ナトリウムまたはピロ亜硫酸カリウムである。具体的な実施形態では、亜硫酸水素塩は、亜硫酸水素ナトリウムであり、ピロ亜硫酸塩は、ピロ亜硫酸ナトリウムである。
【０３０４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法について、または第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７または第８の態様において、改変細胞毒性薬は、工程（ｂ）で細胞結合剤と反応させる前に、精製されない。または、改変細胞毒性薬は、工程（ｂ）で細胞結合剤と反応させる前に、精製される。本明細書に記載の任意の適切な方法を使用し、改変細胞毒性薬を精製してもよい。
【０３０５】
いくつかの実施形態では、上述の方法について、工程（ａ）の反応によって、マレイミド基の実質的なスルホン化は起こらない。いくつかの実施形態では、マレイミド基の５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満または１％未満がスルホン化される。マレイミドのスルホン化率は、マレイミドスルホン化細胞毒性薬（マレイミド上のみでスルホン化している細胞毒性薬）及びジスルホン化細胞毒性薬（マレイミドとイミン部分の両方でスルホン化している細胞毒性薬）の合計量を、亜硫酸水素塩またはピロ亜硫酸塩との反応前のイミン含有細胞毒性薬の開始時の量で割り算したものと等しい。
【０３０６】
いくつかの実施形態では、上述の任意の方法によって調製される免疫コンジュゲートは、精製工程を受ける。この観点で、免疫コンジュゲートは、タンジェンシャルフローフィルトレーション（ＴＦＦ）、非吸着性クロマトグラフィー、吸着性クロマトグラフィー、吸着濾過、選択的な沈殿、または任意の他の適切な精製プロセス、及びこれらの組み合わせを用い、混合物の他の構成要素から精製することができる。
【０３０７】
いくつかの実施形態では、免疫コンジュゲートは、１回の精製工程（例えば、ＴＦＦ）を用いて精製される。好ましくは、コンジュゲートは、精製され、１回の精製工程（例えば、ＴＦＦ）を用い、適切な製剤へと交換される。本発明の他の実施形態では、免疫コンジュゲートは、２つの連続的な精製工程を用いて精製される。例えば、免疫コンジュゲートは、まず、選択的な沈殿、吸着濾過、吸着性クロマトグラフィーまたは非吸着性クロマトグラフィーを用いて精製され、その後、ＴＦＦを用いて精製することができる。当業者は、免疫コンジュゲートの精製によって、細胞毒性薬に化学的にカップリングした細胞結合剤を含む安定なコンジュゲートの単離が可能になることを理解するだろう。
【０３０８】
精製のために、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ型システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ビレリカ、マサチューセッツ）、Ｓａｒｔｏｃｏｎ  Ｃａｓｓｅｔｔｅシステム（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＡＧ、エッジウッド、Ｎ．Ｙ．）及びＣｅｎｔｒａｓｅｔｔｅ型システム（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐ．、イーストヒルズ、Ｎ．Ｙ．）を含め、任意の適切なＴＦＦシステムを利用してもよい。
【０３０９】
任意の適切な吸着性クロマトグラフィー樹脂を精製に利用してもよい。好ましい吸着性クロマトグラフィー樹脂としては、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、疎水性電荷誘導クロマトグラフィー（ＨＣＩＣ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、イオン交換クロマトグラフィー、混合モードイオン交換クロマトグラフィー、固定された金属アフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、染料リガンドクロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、及びこれらの組み合わせが挙げられる。適切なヒドロキシアパタイト樹脂の例としては、セラミックヒドロキシアパタイト（ＣＨＴ  Ｔｙｐｅ  Ｉ及びＴｙｐｅ  ＩＩ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ハーキュリーズ、カリフォルニア）、ＨＡ  Ｕｌｔｒｏｇｅｌヒドロキシアパタイト（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐ．、イーストヒルズ、Ｎ．Ｙ．）及びセラミックフルオロアパタイト（ＣＦＴ  Ｔｙｐｅ  Ｉ及びＴｙｐｅ  ＩＩ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ハーキュリーズ、カリフォルニア）が挙げられる。適切なＨＣＩＣ樹脂の一例が、ＭＥＰ  Ｈｙｐｅｒｃｅｌ樹脂である（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐ．、イーストヒルズ、Ｎ．Ｙ．）。適切なＨＩＣ樹脂の例としては、ブチル−セファロース、ヘキシル−セファロース、フェニル−セファロース及びオクチルセファロース樹脂が挙げられる（全てＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ピスカタウェイ，Ｎ．Ｊ．製）及びＭａｃｒｏ−ｐｒｅｐ  Ｍｅｔｈｙｌ及びＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  ｔ−Ｂｕｔｙｌ樹脂（Ｂｉｏｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，カリフォルニア）が挙げられる。適切なイオン交換樹脂の例としては、ＳＰ−セファロース、ＣＭ−セファロース及びＱ−セファロース樹脂（全てＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ピスカタウェイ．Ｎ．Ｊ．製）及びＵｎｏｓｐｈｅｒｅ  Ｓ樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、カリフォルニア）が挙げられる。適切なコンゴ得モードイオン交換機の例としては、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢｘ樹脂（ＪＴ  Ｂａｋｅｒ、フィリップスバーグ、Ｎ．Ｊ．）が挙げられる。適切なＩＭＡＣ樹脂の例としては、Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ピスカタウェイ、Ｎ．Ｊ．）及びＰｒｏｆｉｎｉｔｙ  ＩＭＡＣ樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ハーキュリーズ、カリフォルニア）が挙げられる。適切な染料リガンド樹脂の例としては、Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ピスカタウェイ、Ｎ．Ｊ．）及びＡｆｆｉ−ｇｅｌ  Ｂｌｕｅ樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ハーキュリーズ、カリフォルニア）が挙げられる。適切なアフィニティ樹脂の例としては、タンパク質Ａセファロース樹脂（例えば、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ピスカタウェイ、Ｎ．Ｊ．）（ここで、細胞結合剤は抗体である）、レクチンアフィニティ樹脂、例えば、Ｌｅｎｔｉｌ  Ｌｅｃｔｉｎ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ピスカタウェイ、Ｎ．Ｊ．）（ここで、細胞結合剤は、適切なレクチン結合部位を有する）が挙げられる。または、細胞結合剤に特異的な抗体を使用してもよい。このような抗体は、例えば、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ピスカタウェイ，Ｎ．Ｊ．）に固定されてもよい。適切な逆相樹脂の例としては、Ｃ４、Ｃ８及びＣ１８樹脂（Ｇｒａｃｅ  Ｖｙｄａｃ、ヘスペリア、カリフォルニア）が挙げられる。
【０３１０】
任意の適切な非吸着性クロマトグラフィー樹脂を精製に利用してもよい。適切な非吸着性クロマトグラフィーの例としては、限定されないが、ＳＥＰＨＡＤＥＸＴＭ  Ｇ−２５、Ｇ−５０、Ｇ−１００、ＳＥＰＨＡＣＲＹＬＴＭ樹脂（例えば、Ｓ−２００及びＳ−３００）、ＳＵＰＥＲＤＥＸＴＭ樹脂（例えば、ＳＵＰＥＲＤＥＸＴＭ  ７５及びＳＵＰＥＲＤＥＸＴＭ  ２００）、ＢＩＯ−ＧＥＬ（登録商標）樹脂（例えば、Ｐ−６、Ｐ−１０、Ｐ−３０、Ｐ−６０及びＰ−１００）、及び当業者に知られているその他のものが挙げられる。
ＶＩ．本発明の免疫コンジュゲートの使用
【０３１１】
本発明は、本発明の免疫コンジュゲートを含む組成物（医薬組成物を含む）を包含する。
【０３１２】
本明細書に提示されるとおり、本明細書に提示されるヒト化／最適化された抗ＡＤＡＭ９−ＶＬ及び／またはＶＨドメインを含む本発明の免疫コンジュゲートは、細胞表面に存在するＡＤＡＭ９に結合し、細胞死に介在する能力を有する。特に、医薬薬剤を含む本発明の免疫コンジュゲートは、インターナリゼーションされ、医薬薬剤の活性によって細胞死に介在する。このような細胞死活性は、抗体依存性の細胞が介在する細胞毒性（ＡＤＣＣ）及び／または相補性依存性の細胞毒性（ＣＤＣ）を誘発する免疫コンジュゲートによって強化されてもよい。
【０３１３】
従って、本明細書に提示されるヒト化／最適化された抗ＡＤＡＭ９−ＶＬ及び／またはＶＨドメインを含む本発明の免疫コンジュゲートは、ＡＤＡＭ９の発現と関連するか、またはＡＤＡＭ９の発現によって特徴付けられる任意の疾患または状態を治療する能力を有する。上述のように、ＡＤＡＭ９は、多くの血液及び個体悪性腫瘍で発現するがん性胚細胞抗原であり、ほとんど分化しない形態を示す重度腫瘍と関係があり、臨床転帰不良と相関関係がある。従って、限定されないが、本発明の免疫コンジュゲートを、がんの治療、特に、ＡＤＡＭ９の発現によって特徴付けられるがんの治療に使用してもよい。
【０３１４】
他の具体的な実施形態では、本発明の免疫コンジュゲートは、肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、大腸癌、膀胱癌、胃癌、膵臓癌、腎細胞癌、前立腺癌、食道癌、乳癌、頭頸部癌、子宮癌、卵巣癌、肝臓癌、子宮頸癌、甲状腺癌、精巣癌、骨髄がん、黒色腫及びリンパがんの治療に有用であってもよい。
【０３１５】
更なる実施形態では、本発明の免疫コンジュゲートは、非小細胞肺癌（扁平上皮癌、腺癌または大細胞未分化腺癌）及び大腸癌（腺癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、原発性大腸リンパ腫、平滑筋肉腫または扁平上皮癌）の治療に有用であってもよい。
【０３１６】
治療における有用性に加え、本発明の免疫コンジュゲートは、検出可能に標識され、がんの診断または腫瘍及び腫瘍細胞の画像化に使用されてもよい。
ＶＩＩ．医薬組成物
【０３１７】
本発明の組成物は、医薬組成物の製造に有用なバルク薬物組成物（例えば、純粋ではないか、または滅菌していない組成物）、または単位投薬形態の調製に使用可能な医薬組成物（すなわち、対象または患者に投与するのに適した組成物）を含む。このような組成物は、予防または治療に有効な量の本発明の免疫コンジュゲート、またはこれらの薬剤の組み合わせと、医薬的に許容される担体とを含む。好ましくは、本発明の組成物は、予防または治療に有効な量の本発明の免疫コンジュゲートと、医薬的に許容される担体とを含む。本発明はまた、特定のがん抗原に特異的な第２の治療抗体（例えば、腫瘍特異性のモノクローナル抗体）と、医薬的に許容される担体とを更に含む、このような医薬組成物を包含する。
【０３１８】
具体的な実施形態では、「医薬的に許容される」との用語は、政府または州政府の規制機関によって承認されているか、または動物への使用、より特定的にはヒトへの使用について、米国薬局方または他の一般的に認識されている薬局方に列挙されていることを意味する。「担体」との用語は、治療薬と一緒に投与される希釈剤、アジュバント（例えば、フロイントのアジュバント（完全または不完全）、賦形剤、またはビヒクルを指す。一般的に、本発明の組成物の成分は、別個に供給されるか、または例えば、活性薬剤の量を示すアンプルまたは小袋などの気密密封した容器中の乾燥凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として、単位投薬形態で一緒に混合されている。組成物が、注入によって投与される場合、滅菌医薬グレード水または生理食塩水を含む注入瓶に分注してもよい。組成物が注射によって投与される場合、投与前に成分を混合することができるように、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルを与えてもよい。
【０３１９】
本発明はまた、本発明の免疫コンジュゲート単独を、またはこのような医薬的に許容される担体と共に充填した１つ以上の容器を含む医薬パックまたはキットも提供する。更に、疾患の治療に有用な１つ以上の他の予防薬剤または治療薬剤も、医薬パックまたはキットに含まれていてもよい。本発明はまた、本発明の医薬組成物の１つ以上の成分を充填した１つ以上の容器を含む医薬パックまたはキットも提供する。場合により、このような容器（複数可）に、医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって処方された形態での注意書きが付随していてもよく、この注意書きは、ヒトへの投与のための製造、使用または販売の機関による承認を反映している。
【０３２０】
本発明は、上述の方法で使用可能なキットを提供する。キットは、本発明のいずれかの免疫コンジュゲートを含んでいてもよい。キットは、１つ以上の容器中に、がんの治療に有用な１つ以上の他の予防薬剤及び／または治療薬剤を更に含んでいてもよい。
ＶＩＩＩ．投与方法
【０３２１】
本発明の組成物は、対象に有効量の本発明の免疫コンジュゲートを投与することによる、疾患、障害に関連する１つ以上の症状の治療、予防及び軽減のために与えられてもよい。好ましい態様では、このような組成物は、実質的に精製されている（すなわち、効果を制限するか、または望ましくない副作用を生じる物質を実質的に含まない）。具体的な実施形態では、対象は、動物、好ましくは、哺乳動物、例えば、非霊長類（例えば、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、齧歯類など）または霊長類（例えば、サル、例えば、カニクイザル、ヒトなど）である。好ましい実施形態では、対象は、ヒトである。
【０３２２】
例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル、抗体または融合タンパク質を発現することが可能な組換え細胞への封入、受容体が介在するエンドサイトーシス（例えば、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）  「Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｂｙ  Ａ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  ＤＮＡ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ」，  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２）、レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての核酸の構築など、種々の送達系が知られており、本発明の組成物を投与するために使用可能である。
【０３２３】
本発明の免疫コンジュゲートを投与する方法としては、限定されないが、非経口投与（例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内及び皮下）、硬膜外及び粘膜（例えば、経鼻及び口腔経路）が挙げられる。具体的な実施形態では、本発明の免疫コンジュゲートは、筋肉内投与、静脈内投与、または皮下投与される。組成物は、任意の簡便な経路によって、例えば、注入またはボーラス注射によって投与されてもよく、他の生物学的に活性な薬剤と共に投与されてもよい。投与は全身投与であってもよく、または局所投与であってもよい。
【０３２４】
本発明はまた、本発明の免疫コンジュゲートの製剤が、分子の量を示す気密密封した容器（例えば、アンプルまたは小袋）に封入されることも提供する。一実施形態では、このような分子は、気密密封した容器中の乾燥滅菌した凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として供給され、対象に投与するために、例えば、水または生理食塩水で適切な濃度になるまで再構築してもよい。好ましくは、本発明の免疫コンジュゲートは、気密密封した容器中の乾燥滅菌凍結乾燥粉末として供給される。
【０３２５】
本発明の免疫コンジュゲートの凍結乾燥した製剤は、その元々の容器中、２℃〜８℃で保存すべきであり、分子は、再構築してから１２時間以内、好ましくは６時間以内、５時間以内、３時間以内、または１時間以内に投与すべきである。代替的な実施形態では、このような分子は、分子、融合タンパク質、または結合された分子の量及び濃度を示す気密密封した容器中の液体形態として供給される。好ましくは、このような免疫コンジュゲートは、液体形態で提供される場合、気密密封された容器で供給される。
【０３２６】
本明細書で使用される場合、医薬組成物の「有効量」は、限定されないが、臨床結果、例えば、疾患から生じる症状の減少、感染の症状（例えば、ウイルスの負荷、熱、痛み、敗血症など）またはがんの症状（例えば、がん細胞の増殖、腫瘍の存在、腫瘍の転移など）の緩和によって、疾患を患う者の生活の質を上げること、疾患を治療するのに必要な他の医薬の投薬量を減らすこと、標的化及び／またはインターナリゼーションなどによって別の医薬の効果を高めること、疾患の進行を遅らせること、及び／または個人の生存時間を長くすることを含め、有益な結果または望ましい結果を与えるのに十分な量である。
【０３２７】
１回以上の投与で、有効量が投与されてもよい。本発明の目的のために、薬物、化合物または医薬組成物の有効量は、がん細胞を殺し、及び／または増殖を減らし、及び／またはがんの原発性部位からの転移をなくすか、減らすか、及び／または転移の進行を遅らせるのに十分な量である。いくつかの実施形態では、有効量の薬物、化合物または医薬組成物を、別の薬物、化合物または医薬組成物と組み合わせて達成してもよく、または組み合わせなくてもよい。従って、「有効量」は、１つ以上の化学治療薬剤を投与するという観点で考慮されてもよく、単剤が、有効量で与えられることを考慮してもよく、１つ以上の他の薬剤と組み合わせる場合には、望ましい結果が達成され得るか、または達成されるように考慮してもよい。
【０３２８】
本発明に包含される免疫コンジュゲートの場合、患者に投与される投薬量は、好ましくは、レシピエント対象の体重（ｋｇ）に基づいて決定される。
【０３２９】
本発明の免疫コンジュゲートの投薬量及び投与頻度は、例えば、脂質化などの改変によって取り込み量及び分子の組織への浸透を高めることによって減らすか、または変えてもよい。
【０３３０】
患者に投与される本発明の免疫コンジュゲートの投薬量は、単剤療法としての使用について計算されてもよい。または、分子を他の治療組成物と組み合わせて使用してもよく、及び患者に投与される投薬量は、単剤治療として前記分子を使用するときよりも少なくなる。
【０３３１】
本発明の医薬組成物は、治療が必要な領域に局所的に投与されてもよい。このことは、例えば、限定されないが、局所的な注入、注射によって、または移植手段によって達成されてもよく、前記移植は、シリコン膜などの膜または繊維を含む、多孔性、非多孔性またはゼラチン状の材料で作られている。好ましくは、本発明の免疫コンジュゲートを投与する場合、分子が吸収されない材料を使用することに注意をはらわなければならない。
【０３３２】
本発明の組成物は、小胞、特にリポソーム内に送達されてもよい（Ｌａｎｇｅｒ  （１９９０）  「Ｎｅｗ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３）；Ｔｒｅａｔ  ｅｔ  ａｌ，ＬＩＰＯＳＯＭＥＳ  ＩＮ  ＴＨＥ  ＴＨＥＲＡＰＹ  ＯＦ  ＩＮＦＥＣＴＩＯＵＳ  ＤＩＳＥＡＳＥ  ＡＮＤ  ＣＡＮＣＥＲ，Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｆｉｄｌｅｒ（編集），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３５３−３６５（１９８９）；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，前出，ｐｐ．３１７−３２７を参照）。
【０３３３】
治療または予防に有効な量の本発明の免疫コンジュゲートを用いた対象の治療は、単回治療を含んでいてもよく、または好ましくは、一連の治療を含んでいてもよい。治療に使用する分子の有効投薬量は、一連の具体的な治療期間にわたって、増加してもよく、または減少してもよいことも理解されるだろう。
【実施例】
【０３３４】
ここで本発明を一般的に記載してきたが、以下の実施例を参照することによって、本発明がさらに容易に理解されるだろう。以下の実施例は、本発明の診断方法または治療方法における組成物のための種々の方法を示す。実施例は、本発明を説明することを意図しているが、本発明の範囲をいかなる様式にも限定するものではない。
【０３３５】
実施例１
抗ＡＤＡＭ９抗体ＭＡＢ−Ａの腫瘍細胞特異性
マウス抗ＡＤＡＭ９抗体（本明細書でＭＡＢ−Ａと呼ばれる）は、（１）ＡＤＡＭ９の標的タンパク質処理活性をブロックし、（２）内部移行し、（３）抗腫瘍活性を有することが同定された（例えば、米国特許第８，３６１，４７５号を参照）。ＭＡＢ−Ａの腫瘍細胞特異性を、ＩＨＣによって観察した。腫瘍組織をＭＡＢ−Ａ（０．４μｇ／ｍＬ）と接触させるか、またはアイソタイプ対照（０．４μｇ／ｍＬ）と接触させ、染色の程度を視覚化した。ＭＡＢ−Ａは、種々の大細胞癌、扁平上皮癌及び腺癌非小細胞肺癌細胞型（図１Ａ）、乳癌細胞、前立腺癌細胞、胃癌細胞（図１Ｂ）及び結腸癌サンプル（図１Ｃ）を強く標識することがわかった。正常組織をＭＡＢ−Ａ（１．２５μｇ／ｍＬ）と接触させ、染色の程度を視覚化した。上の表２にまとめたように、ＭＡＢ−Ａは、多種多様な正常組織の染色をほとんど示さないか、または全く示さなかった。これらの試験に使用したＭＡＢ−Ａの濃度は、腫瘍細胞の染色に使用したもののほぼ３倍であったことを注記しておく。これらのＩＨＣ試験の結果は、ＭＡＢ−Ａが、正常細胞よりも腫瘍細胞に対して、強い優先的な結合を示すことを示している。
【０３３６】
実施例２
種の交差反応性
ヒトＡＤＡＭ９（ｈｕＡＤＡＭ９）及びカニクイザルＡＤＡＭ９（ｃｙｎｏＡＤＡＭ９）に対するＭＡＢ−Ａの結合を試験した。簡単に言うと、ｈｕＡＤＡＭ９、ｃｙｎｏＡＤＡＭ９、無関係の抗原を一次的に発現する２９３−ＦＴ細胞及びＣＨＯ−Ｋ細胞、またはトランスフェクトしていない親細胞をＭＡＢ−Ａと共にインキュベートし、その後、ヤギ抗マウスＰＥ二次抗体と共にインキュベートし、ＦＡＣＳによって分析した。図２に示されるように、ＭＡＢ−Ａは、両方の細胞型を一時的に発現するｈｕＡＤＡＭ９に対して強い結合を示す。ＭＡＢ−Ａは、ｃｙｎｏＡＤＡＭ９に対する良好な結合を示さない。ＭＡＢ−Ａは、親細胞または無関係な抗原を発現する細胞に結合しなかった。ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、ｃｙｎｏＡＤＡＭに対する同様の低レベルの結合がみとめられた。
【０３３７】
実施例３
ヒト化及び初期最適化
ＭＡＢ−Ａのヒト化によって、ヒト化ＶＨドメイン（本明細書で「ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＨ（１）」と呼ばれる）及びヒト化ＶＬドメイン（本明細書で「ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＬ（１）」と呼ばれる）が得られた。次いで、結合活性を高め、及び／または以下に更に詳細に記載する、潜在的に不安定なアミノ酸残基を除去するために、ヒト化可変ドメインを最適化した。この１回目の最適化によって、本明細書で「ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＨ（２）」、「ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＨ（３）」及び「ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＨ（４）」と呼ぶ３つの更なるヒト化ＶＨドメインと、本明細書で「ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＬ（２）」、「ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＬ（３）」及び「ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＬ（４）」と呼ぶ３つの更なるヒト化ＶＬドメインが得られた。これに加え、マウスＶＨドメイン及びＶＬドメインとヒト定常領域とを有するＭＡＢ−Ａのキメラ態様（「ｃｈＭＡＢ−Ａ」）を作成した。マウス及びヒト化／最適化されたＶＨ及びＶＬドメインのアミノ酸配列を上に提示しており、アラインメントを図３Ａ及び３Ｂに提示している。これらのヒト化／最適化されたＶＨ及びＶＬドメインのコンセンサス配列を上に提示している。複数のヒト化可変ドメインが作成される場合、特定の抗ＡＤＡＭ９抗体（例えば、ＭＡＢ−Ａ）のヒト化重鎖及び軽鎖可変ドメインを、任意の組み合わせで使用してもよく、ヒト化鎖の特定の組み合わせは、特定のＶＨ／ＶＬドメインを参照することによって言及され、例えば、ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＨ（１）及びｈＭＡＢ−Ａ  ＶＬ（２）を含む抗体は、具体的に「ｈＭＡＢ−Ａ（１．２）」と呼ばれる。
【０３３８】
ヒト生殖細胞系列ＶＨ３−２１及びＶＨ３−６４から誘導されるフレームワーク領域を含むｈＭＡＢ−Ａ  ＶＨ（１）を作成し、ヒト生殖細胞系列Ｂ３及びＬ６から誘導されるフレームワーク領域を含むｈＭＡＢ−Ａ  ＶＬ（１）を作成した。これらのヒト化可変ドメインに、マウスＣＤＲは保持されていた。
【０３３９】
潜在的な脱アミド化部位が、ＣＤＲＨ２で同定され（図３Ａで１本の下線で示されている）、潜在的なアスパラギン酸異性化部位が、ＣＤＲＬ１で同定された（図３Ｂで１本の下線で示されている）。これらの位置でのアミノ酸置換を調べ、結合アフィニティを維持しつつ、これらの部位を除去するための置換を特定した。ＣＤＲＨ２（ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＨ（２）中に存在）の位置５４（Ｎ５４Ｆ）でのフェニルアラニンの置換と、ＣＤＲＬ１（ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＬ（２）中に存在）の位置２８（Ｄ２８Ｓ）でのセリンでの置換を選択し、ここで、番号付けは、Ｋａｂａｔに従う。同定された置換を別個に使用してもよく、または組み合わせて使用してもよい。驚くべきことに、Ｎ５４Ｆ置換を含む抗体は、ヒトＡＤＡＭ９に対するアフィニティの約２倍の増加を示し（例えば、以下の表３を参照）、カニクイザルＡＤＡＭ９に対してわずかに向上した結合を示すことがわかった。
【０３４０】
更に、ＣＤＲ中に存在するリシン残基の数を最小限にするために、最適化された変異体を作成した。２つのリシン残基がＣＤＲＨ２に存在し（図３Ａで二重下線で示されている）、１つのリシンがＣＤＲＬ１に存在する（図３Ｂに二重下線で示されている）。これらの位置でのアミノ酸置換を調べ、結合アフィニティを維持した置換を特定した。位置６２でのアルギニンの置換（Ｋ６２Ｒ）、位置６４でのグルタミンの置換（Ｋ６４Ｑ）、及び位置６５でのセリンの置換（Ｓ６５Ｇ）をＣＤＲＨ２（ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＨ（３）中に存在）のために選択し、ここで、番号付けは、Ｋａｂａｔに従う。位置２４でのアルギニンの置換（Ｋ２４Ｒ）を、ＣＤＲＬ１（ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＬ（３）中に存在する）のために選択した。同定された置換を別個に使用してもよく、または組み合わせて使用してもよい。
【０３４１】
ＣＤＲ中に存在する他の潜在的に不安定な残基を同定し（図３Ａ〜３Ｂに点線下線で示されている）、１つは、ＣＤＲＨ１内の位置３４にあるメチオニン残基（Ｍ３４）であり、１つは、ＣＤＲＬ１内の位置３３にあるメチオニン残基（Ｍ３３）であり、ＣＤＲＬ３内の位置９２、９３及び９４にあるヒスチジン（Ｈ９３）、グルタミン酸（Ｅ９３）及びアスパラギン酸残基（Ｄ９４）であり、番号付けは、Ｋａｂａｔに従う。これらの位置でのアミノ酸置換を調べ、結合アフィニティを維持した置換を特定した。位置３４でのイソロイシンの置換（Ｍ３４Ｉ）をＣＤＲＨ１のために選択し、ＣＤＲＬ３の位置３３（Ｍ３３Ｌ）、９２（Ｈ９３Ｙ）、９３（Ｅ９３Ｓ）及び９４（Ｄ９４Ｔ）でのロイシン、チロシン、セリン及びトレオニンの置換を選択し、番号付けは、Ｋａｂａｔに従う。これらのそれぞれの位置は、上に詳細に記載した置換の全てと組み合わせて容易に置換され、ｈＭＡＢ−Ａ  ＶＨ（４）及びｈＭＡＢ−Ａ  ＶＬ（４）が得られ、これらが一緒に対になり、親マウス抗体と比較して少し向上したアフィニティを保持した抗体を生成する場合には、脱アミド化または酸化の可能性が大きく下がり、ＣＤＲ中にリシン残基が存在しない。
【０３４２】
ｈｕＡＤＡＭに対するヒト化／最適化された抗体ｈＭＡＢ−Ａ（１．１）、ｈＭＡＢ−Ａ（２．２）、ｈＭＡＢ−Ａ（２．３）、ｈＭＡＢ−Ａ（３．３）、ｈＭＡＢ−Ａ（４．４）及びキメラｃｈＭＡＢ−Ａ（マウスＶＨ／ＶＬドメインを含む）の相対的な結合アフィニティを、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）分析を用いて観察し、このとき、Ｈｉｓタグ化可溶性ヒトＡＤＡＭ９（ヒスチジンを含有するタンパク質に融合するヒトＡＤＡＭ９の細胞外部分を含む「ｓｈＡＤＡＭ９−Ｈｉｓ」）が、固定された抗体でコーティングされた表面を通過した。簡単に言うと、各抗体が、Ｆａｂ２ヤギ抗ヒトＦｃ表面に捕捉され、次いで、異なる濃度（６．２５〜１００ｎＭ）のｓｈＡＤＡＭ９−Ｈｉｓタンパク質存在下でインキュベートされた。結合の速度論は、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）分析結合（正規化された１：１  Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデル）によって決定された。これらの試験から計算したｋａ、ｋｄ及びＫＤを表３に提示している。ｃｙｎｏＡＤＡＭ９に対する結合を、上述のようにＦＡＣＳによって、また、ＥＬＩＳＡによって試験した。
【表７】
2020504607.tif 000180
【０３４３】
これらの試験の結果は、ヒト化／最適化された抗体が、親マウス抗体と比較して、ヒトＡＤＡＭ９に対して同じか、または高い結合アフィニティを有することを示している。特に、ヒト化抗体にＮ５４Ｆ突然変異を導入すると、ｈｕＡＤＡＭ９（すなわち、ｈＭＡＢ−Ａ（２．２）、ｈＭＡＢ−Ａ（２．３）及びｈＭＡＢ−Ａ（３．３））に対する結合が向上することが観察された。この突然変異は、ＦＡＣＳ及びＥＬＩＳＡによって決定されるように、ｃｙｎｏＡＤＡＭ９への結合もわずかに向上させたが、これらの抗体は、依然としてｃｙｎｏＡＤＡＭ９への良好な結合を示さなかった。
これらの試験は、アフィニティを下げることなく、ＣＤＲからリシン残基を除去するために導入し得る更なる置換も特定した。アフィニティに対する影響を最小限にしつつ、他の潜在的に不安定な残基を除去するために、更なる置換を同定した。
【０３４４】
実施例４
非ヒト霊長類ＡＤＡＭ９に対する結合の最適化
ランダム突然変異を使用し、ｈＭＡＢ−Ａ（２．２）の重鎖ＣＤＲＨ２（Ｋａｂａｔ位置５３−５８）及びＣＤＲＨ３（Ｋａｂａｔ位置９５−１００及び１００ａ−１００ｆ）ドメイン内に置換を導入した。この変異体をスクリーニングし、非ヒト霊長類ＡＤＡＭ９（例えば、ｃｙｎｏＡＤＡＭ９）への結合が向上し、ｈｕＡＤＡＭ９に対する高アフィニティ結合を保持するクローンを同定した。ＣＤＲＨ３（Ｋａｂａｔ位置１００ａ−１００ｆ）内の突然変異の２種類の独立したスクリーニングから、４８種類のクローンを選択した。表４は、２つの独立したスクリーニングからｃｙｎｏＡＤＡＭ９に対する結合の向上について選択したｈＭＡＢ−Ａ（２．２）クローンからのＣＤＲＨ３  Ｋａｂａｔ残基１００ａ−ｆのアミノ酸配列のアラインメントを提示する。更なるクローンアラインメントを表５に提示している。このような表で示されるように、各実験で、別個の置換パターンに含まれる同様のクローンが発生した。
【表８−１】
2020504607.tif 000181
【表８−２】
2020504607.tif 000182
【表９】
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【０３４５】
試験した全てのクローンについて、位置４（Ｐ４）でＧｌｙ及びＡｌａが好ましいアミノ酸残基であり、位置６（Ｐ６）でＬｅｕ、Ｍｅｔ及びＰｈｅが好ましいアミノ酸残基である。他の位置（例えば、位置２（Ｐ２）、位置３（Ｐ３）及び位置５（Ｐ５））の好ましいアミノ酸残基は、Ｐ１でみられるアミノ酸残基によって変わる。位置１（Ｐ１）にＰｒｏ残基を有するクローンについて、Ｐ２にはＬｙｓ及びＡｒｇが好ましく、Ｐ３にはＰｈｅ及びＭｅｔが好ましく、Ｐ４にはＧｌｙ、Ｐ５にはＴｒｐまたはＰｈｅが好ましい。Ｐ１にＰｈｅ、ＴｙｒまたはＴｒｐを有するクローンの場合、Ｐ２にＡｓｎ及びＨｉｓがあり、Ｐ３にＳｅｒ及びＨｉｓ、Ｐ６にＬｅｕがあることが好ましい。Ｐ１にＨｅ、ＬｅｕまたはＶａｌを有するクローンの場合、Ｐ２にはＧｌｙが好ましく、Ｐ３にはＬｙｓ、Ｐ５にはＶａｌ、Ｐ６には疎水性のものが好ましい。加えて、図４からわかるように、Ｐ１にＴｈｒ残基を有する場合、Ｐ２にはＧｌｙが好ましく、Ｐ３にはＬｙｓ、Ｍｅｔ及びＡｓｎが好ましく、Ｐ４にはＧｌｙが好ましく、Ｐ５にはＴｈｒが好ましく、Ｐ６にはＬｅｕ及びＭｅｔが好ましい。Ｐ１にＡｓｐ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、ＨｉｓまたはＳｅｒ残基を有する更なるクローンも、更に低い頻度で同定した（表４及び表５を参照）。
【０３４６】
表５に示される１０種類のクローンのＶＨドメインを使用し、ｈＭＡＢ−Ａ（２．２）の更なる最適化された変異体を作成し、これをｈＭＡＢ−Ａ（２Ａ．２）−（２Ｊ．２）と称した。選択したクローンの結合をＥＬＩＳＡアッセイによって試験した。簡単に言うと、ヒスチジン含有ペプチドに結合し、マイクロタイタープレート上にコーティングされた抗体を使用し、Ｈｉｓペプチドタグ化可溶性ｃｙｎｏＡＤＡＭ９（「ｃｙｎｏＡＤＡＭ９−Ｈｉｓ」）（１μｇ／ｍＬ）またはＨｉｓペプチドタグ化可溶性ｈｕＡＤＡＭ９（１μｇ／ｍＬ）を捕捉し、親ｈＭＡＢ−Ａ（２．２）及び１０種類のＣＤＲＨ３  ｈＭＡＢ−Ａ（２Ａ．２）変異体の段階的希釈物の結合を試験した。ｃｙｎｏＡＤＡＭ９及びｈｕＡＤＡＭ９の結合曲線は、それぞれ図４Ａ及び４Ｂに提示される。ｃｙｎｏＡＤＡＭ９とＭＡＢ−Ａ  ＶＨ（２Ｂ）、ＭＡＢ−Ａ  ＶＨ（２Ｃ）、ＭＡＢ−Ａ  ＶＨ（２Ｄ）及びＭＡＢ−Ａ  ＶＨ（２Ｉ）に対する改良された結合を示す選択されたＶＨドメインのそれぞれを含むｈＭＡＢ−Ａ（２Ａ．２）変異体は、親ｈＭＡＢ−Ａ（２．２）抗体と同様のｈｕＡＤＡＭ９に対する結合を維持しつつ、ｃｙｎｏＡＤＡＭ９結合において最も高い向上を示した。
【０３４７】
ｈｕＡＤＡＭ９−Ｈｉｓ及びｃｙｎｏＡＤＡＭ９−Ｈｉｓに対するヒト化／更に最適化された抗体ＭＡＢ−Ａ  ＶＨ（２Ｂ．２）、ＭＡＢ−Ａ  ＶＨ（２Ｃ２）、ＭＡＢ−Ａ  ＶＨ（２Ｄ．２）及びＭＡＢ−Ａ  ＶＨ（２Ｉ．２）及び親のｈＭＡＢ−Ａ（２．２）の相対的な結合アフィニティを、上に本質的に記載したように、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）分析を用いて観察した。これらの試験から計算したｋａ、ｋｄ及びＫＤを表６に提示している。
【表１０】
2020504607.tif 000184
【０３４８】
結合試験は、４種類の上位のクローンが、親抗体としてｈｕＡＤＡＭ９に対して結合する同じ高いアフィニティを維持しつつ、ｃｙｎｏＡＤＡＭ９に対する結合アフィニティにおいて、１５０〜５５０倍の向上を示したことを示す。ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｃ．２）及びｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）を、さらなる試験のために選択した。
【０３４９】
実施例５
抗体ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）の免疫組織化学試験
ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）の細胞特異性をＩＨＣによって観察した。陽性対照及び陰性対照細胞及び正常なヒト及びカニクイザル組織を、ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）（２．５μｇ／ｍＬ）またはアイソタイプ参照（２．５μｇ／ｍＬ）と接触させ、染色の程度を視覚化した。この試験の結果を表７にまとめている。
【表１１−１】
2020504607.tif 000185
【表１１−２】
2020504607.tif 000186
【０３５０】
ＩＨＣ研究も行い、ヒト化／最適化されたｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）の結合を、１２．５μｇ／ｍＬの濃度（５ｘ最適染色濃度）で評価した。陽性対照細胞及び陰性対照細胞、及び通常のヒト及びカニクイザルの組織をこの試験で使用した。この試験の結果を表８にまとめている。
【表１２−１】
2020504607.tif 000187
【表１２−２】
2020504607.tif 000188
【表１２−３】
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【０３５１】
２．５μｇ／ｍＬまたは５μｇ／ｍＬで、ｈＭＡＢ−Ａ（２．２）、ｈＭＡＢ−Ａ（２．３）、ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｃ．２）及びｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）による結合の差を評価するために、比較ＩＨＣアッセイを行った。陽性対照細胞及び陰性対照細胞、及び通常のヒト及びカニクイザルの組織をこの試験で使用した。この試験の結果を表９にまとめている。
【表１３−１】
2020504607.tif 000190
【表１３−２】
2020504607.tif 000191
【０３５２】
２．５μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬまたは１２．５μｇ／ｍＬで、ｈＭＡＢ−Ａ（２．２）、ｈＭＡＢ−Ａ（２．３）、ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｃ．２）及びｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）及びマウスＭＡＢ−Ａによる結合の差を評価するために、更なる比較ＩＨＣアッセイを行った。陽性対照細胞及び陰性対照細胞、及び通常のヒト及びカニクイザルの組織をこの試験で使用した。この試験の結果を表１０にまとめている。
【表１４−１】
2020504607.tif 000192
【表１４−２】
2020504607.tif 000193
【表１４−３】
2020504607.tif 000194
【表１４−４】
2020504607.tif 000195
【０３５３】
従って、この結果は、ｈＭＡＢ−Ａ（２．２）が、最適濃度でヒト肝細胞及び尿細管の全体的に低レベルの染色を示し、陰性対照で観察された肝細胞及び尿細管では、低い染色強度／反応頻度を有していることを示す。ｈＭＡＢ−Ａ（２．２）は、最適濃度でカニクイザルの肝細胞及び尿細管の同様の低レベルの染色を示し、陰性対照で観察された尿細管では、低い染色強度／反応頻度を有していた。
【０３５４】
この結果は、ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｃ．２）も、最適濃度でヒト肝細胞及び尿細管の全体的に低レベルの染色を示し、陰性対照で観察された肝細胞及び尿細管では、低い染色強度／反応頻度を有していることを示す。ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｃ．２）は、最適濃度でカニクイザルの肝細胞及び尿細管の同様の低レベルの染色を示した。ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｃ．２）について、カニクイザルの肺上皮、膵臓島／上皮及び膀胱上皮における更なる小さな知見は、対応するヒト組織では観察されなかった。肺上皮、尿細管、膀胱上皮、陰性対照では、低い染色強度／反応頻度が観察された。この結果は、ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）が、最適濃度でヒトまたはカニクイザルの組織を染色しないことを示し、稀な＋／−膀胱移行細胞上皮染色を伴っていたことも示す。ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）はまた、ヒト肺肺胞細胞、膵管上皮、尿細管、膀胱以降細胞上皮に、５倍の最適濃度で全体的に低レベルで低頻度の染色を示し、カニクイザルの気管支上皮及び膀胱移行細胞上皮に５倍の最適濃度で、全体的に低レベルの染色を示した。ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）は、試験したヒト正常組織で全体的に望ましいＩＨＣプロフィールを示し、対応するカニクイザル組織で同様のプロファイルを示す。
【０３５５】
実施例６
変異体Ｆｃ領域を含むｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）
ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）は、κ軽鎖定常領域を有する軽鎖（配列番号６８）と、野生型ＩｇＧ重鎖定常領域を有する重鎖（配列番号５２）とを含む。以下の置換をＦｃ領域に導入することによってＦｃ変異体を作成した。Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ（例えば、配列番号７８を参照）、ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）（ＡＡ）と呼ばれる；Ｓ４４２Ｃ（例えば、配列番号７９を参照）、ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）（Ｃ）と呼ばれる；及びＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｓ４４２Ｃ（例えば、配列番号８０を参照）、ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）（ＡＡ／Ｃ）と呼ばれる。ｈｕＡＤＡＭ９−Ｈｉｓ及びｃｙｎｏＡＤＡＭ９−Ｈｉｓに対する各Ｆｃ変異体の結合をＥＬＩＳＡアッセイによって試験した。簡単に言うと、ヒスチジン含有ペプチドに結合し、マイクロタイタープレート上にコーティングされた抗体を使用し、Ｈｉｓペプチドタグ化可溶性ｃｙｎｏＡＤＡＭ９またはＨｉｓペプチドタグ化可溶性ｈｕＡＤＡＭ９（０．５μｇ／ｍＬ）を捕捉し、親ｈＭＡＢ−Ａ（２．２）及びＦｃ変異体の段階的希釈物の結合を試験した。結合曲線ｈｕＡＤＡＭ９及びｃｙｎｏＡＤＡＭ９は、図５Ａ及び図５Ｂに提示されており、それぞれ、Ｆｃ変異体が、野生型Ｆｃ領域を有するｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）の結合アフィニティを保持していたことを示している。
【０３５６】
実施例７
標的発現分析
異なる適応症間でＡＤＡＭ９発現を評価するために、２０種類の異なる腫瘍型を用いた組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）を、まず、予備研究使用のためにＩｍｍｕｎｏＧｅｎで開発されたＡＤＡＭ９  ＩＨＣアッセイを用いて評価した。
【０３５７】
分析した全てのサンプルは、ＦＦＰＥ（ホルマリン固定及びパラフィン埋込）サンプルであった。５００コア２０がんＴＭＡをＦｏｌｉｏ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（カタログ番号ＡＲＹ−ＨＨ０２１２）から購入した。腺癌について８０コア、扁平上皮細胞癌について８０コアを有するＮＳＣＬＣ  ＴＭＡをＵＳ  Ｂｉｏｍａｘ（カタログ番号ＬＣ１９２１Ａ）から購入した。腺癌について８０コアを有する大腸癌ＴＭＡをＰａｎｔｏｍｉｃｓ  Ｉｎｃ．（カタログ番号ＣＯＣ１２６１）から購入した。胃癌サンプルは、Ａｖａｄｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。
【０３５８】
ＡＤＡＭ９の免疫組織化学染色を、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｕｌｔｒａ自動染色機を用いて行った。ＡＤＡＭ９の一次抗体は、市販のウサギモノクローナル抗体であった。全てのサンプルを評価し、スコアリングアルゴリズムで訓練を受けた広く資格のある病理学者によってスコアが付けられた。スコア付けのために、少なくとも１００の生存可能な腫瘍細胞の存在が必要であった。染色強度は、０〜３までの半定量的な整数スケールでスコアが付けられ、０は、染色がないことを表し、１は弱い染色を表し、２は中程度、３は強い染色を表す。各強度レベルでの陽性に染色した細胞の割合を記録した。スコア付けは、細胞膜のみへのＡｄａｍ９の局在化、細胞質及び膜両方への局在化の評価に基づいている。染色の結果をＨスコアによって分析し、これを染色強度の構成成分と、陽性細胞の割合と合わせた。０〜３００の値を有し、以下のように定義される。
１＊（１＋強度で染色する細胞の割合）
＋２＊（２＋強度で染色する細胞の割合）
＋３＊（３＋強度で染色する細胞の割合）
＝Ｈスコア。
【０３５９】
各腫瘍型について、５の通常組織対照を含む５００コア２０がんＴＭＡを染色し、２つの異なる様式でスコア付けした。（１）膜染色のみに基づく、または（２）膜及び細胞質染色に基づく。以下の表１１及び図６Ａは、２０全ての適応症についての膜染色に基づくＡＤＡＭ９の罹患率をまとめたものである。表１２及び図６Ｂは、８種類の選択した適応症についての膜及び細胞質染色の結果をまとめたものである。
【０３６０】
複数のがんＴＭＡからの結果に基づき、拡張した罹患率分析のために、非小細胞胚癌（ＮＳＣＬＣ）、大腸癌（ＣＲＣ）及び胃癌の３種類の適応症を選択した。ＮＳＣＬＣの場合、腺癌について８０コア、扁平上皮細胞癌について８０コアを有する１種類のＴＭＡを染色し、評価した。ＣＲＣの場合、腺癌について８０コアを有する１種類のＴＭＡを分析し、そのうち７８が評価可能であった。胃癌の場合、腺癌の１５の組織全体切片を分析した。これら全てのサンプルを、膜及び細胞質染色についてスコア付けし、結果を表１３にまとめている。これらの予備試験の結果は、ＡＤＡＭ９が、多種多様な固形がんで発現し、多くの異なるＡＤＡＭ９を発現する固形腫瘍における抗ＡＤＡＭ９薬物コンジュゲートの使用を裏付けている。
【表１５】
2020504607.tif 000196
【表１６】
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【表１７】
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【０３６１】
実施例８
抗ＡＤＡＭ９抗体インターナリゼーション試験
本発明の抗ＡＤＡＭ９抗体のインターナリゼーションを評価するためにフローサイトメトリーに基づくインターナリゼーション実験を、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８に結合されたｈＭＡＢ−Ａ（２．２）、ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）及びｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）−Ｓ４４２Ｃ抗体で行った。
【０３６２】
製造業者の指示（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）に従って、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８テトラフルオロフェニルエステルを用い、ｈＭＡＢ−Ａ（２．２）、ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）、ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）−Ｓ４４２Ｃのための抗ＡＤＡＭ９  Ａｌｅｘａ４８８抗体コンジュゲートを作成した。インターナリゼーションアッセイを実行するために、コンジュゲートをナトリウムアジドを含まないＰＢＳ（ｐＨ７．２）に溶出させた。標識の濃度及び程度は、２８０ｎｍ及び４９４ｎｍでの吸光度測定から計算された。Ａｌｅｘａ４８８標識が標的結合に悪影響を及ぼさないことを確実にするために、ＦＡＣＳ結合アッセイを行った。
【０３６３】
抗ＡＤＡＭ９−Ａｌｅｘａ４８８コンジュゲートのインターナリゼーションは、蛍光にコンジュゲートを連続的に、またはパルス状態でさらした後に決定された。連続的な実験の場合、ＮＣＩ−Ｈ１７０３細胞を、飽和濃度の所定のＡｌｅｘａ４８８標識された抗体で、氷上、または３７℃で、指定の全時間をかけて処理した。一方、パルス実験の場合、抗ＡＤＡＭ９−Ａｌｅｘａ４８８コンジュゲートを、氷上の細胞にあらかじめ結合させておき、過剰なコンジュゲートを洗い流した後、３７℃に変え、インターナリゼーションを監視した。連続的な曝露またはパルス状態の曝露後の所定の時間点で、細胞をヴェルセン（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）と共に持ち上げ、氷冷したＰＢＳで２回洗浄し、複製物のウェルを、３００ｎＭの抗Ａ４８８抗体を用いずに（クエンチしていないサンプル）または用い（クエンチしたサンプル）、氷冷したＰＢＳに再懸濁させた。全てのサンプルを、氷上で３０分間インキュベートした。次いで、細胞をペレット化し、１％パラホルムアルデイドで固定し、フローサイトメトリーによって分析した。氷上で３０分間インキュベートし、次いで、抗Ａｌｅｘａ４８８抗体と共にインキュベートした細胞の蛍光は、消光しない蛍光フラクションがあらわれ、インターナリゼーションを計算する前に、全ての他のサンプルから引き算した。インターナリゼーションの割合は、消光したサンプルの蛍光を、不完全な表面消光（細胞内蛍光）について補正し、これを消光していない細胞（全蛍光）で割り算して計算した。抗ＡＤＡＭ９抗体コンジュゲートのインターナリゼーションをグラフにし、単相指数減衰式を用いてデータをフィッティングした（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ、ｖｅｒ．５．０１）。
【０３６４】
表面に結合したＡｌｅｘａ４８８で標識された抗ＡＤＡＭ９抗体のインターナリゼーションは、ＮＣＩ−Ｈ１７０３細胞におけるパルス治療及び連続治療の後に評価した。試験した３種類全ての抗ＡＤＡＭ９−Ａｌｅｘａ４８８コンジュゲートは、迅速なインターナリゼーションを示し、コンジュゲートの約３９％が、最初の１５分でインターナリゼーションし、全部で約７７％が６時間後にインターナリゼーションした（図７Ａ）。興味深いことに、２４時間連続曝露した後、インターナリゼーションした蛍光シグナルは、３０分間細胞表面に結合した初期の全蛍光シグナルよりも約７倍強かった（図７Ｂ）。従って、ＡＤＡＭ９は、３７℃でインキュベートしている間に、細胞表面で細胞内プールから補充されるようであり、複数回の抗ＡＤＡＭ９抗体コンジュゲートインターナリゼーションを可能なものとしている。抗ＡＤＡＭ９免疫コンジュゲートの効能は、インターナリゼーション、細胞内トラフィッキング及び免疫コンジュゲートの分解に依存して変わる。抗ＡＤＡＭ９免疫コンジュゲートの効能は、一部には、抗ＡＤＡＭ９免疫コンジュゲートの高いインターナリゼーションによって説明することができ、おそらく、多量の細胞毒性異化生成物が生成する。
【０３６５】
実施例９
抗ＡＤＡＭ９抗体細胞処理試験
細胞上での標的結合、ｃｈＭＡＢ−Ａの取り込み、リポソーム分解を評価するために、既に記載した３Ｈ−プロピオンアミド標識された抗体を処理する方法を使用した（Ｌａｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．２０１５年１１月；３２（１１）：３５９３−６０３）。この方法を用い、ＡＤＡＭ９を標的とするｃｈＭＡＢ−Ａ抗体を、リシン残基を介したトリチウム化プロピオネートを用いてわずかに標識した。細胞結合、取り込み、リポソームへのトラフィッキングの時に、［３Ｈ］プロピオネート標識されたＡｂ（３Ｈ−Ａｂ）が分解し、リシン−［３Ｈ］プロピオンアミドが、細胞成長培地に放出されることが以前示されている。有機溶媒を加えると、インタクトな標識された抗体が沈殿し、リシン−［３Ｈ］プロピノアミド溶液が残り、これは、抗体処理の程度の簡便かつ正確な指標となる。
【０３６６】
ｃｈＭＡＢ−Ａを、既に記載したように、［３Ｈ］−プロピオネートで標識した。ＮＳＣＬＣ株、ＮＣＩ−Ｈ１７０３及びＣＲＣ株、ＤＬＤ−１を、結合曲線を介して抗原飽和量を決定した後、１０ｎＭ  ３Ｈ−ｃｈＭＡＢ−Ａ抗体で処理した。いくつかの細胞サンプルを、標的ではないトリチウム化アイソタイプ対照抗体３Ｈ−ｃｈＫＴＩで処理し、一方、その他は未処理のままであった。細胞を６ウェルプレートに接種し、一晩かけて成長させ、次いで、既に記載したように、試薬（複数可）でパルス処理した。簡単に言うと、細胞を３Ｈ−ｃｈＭＡＢ−Ａ抗体または３Ｈ−ｃｈＫＴＩと共に２０分インキュベートした後、新鮮な培地で３回洗浄した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２と共に一晩インキュベートした。２０〜２４時間のインキュベートの後、細胞を集め、タンパク質を、４：３体積のアセトン：培地／細胞混合物を用いて沈殿させた。サンプルを−８０℃で最小限１時間かけて凍結させた後、解凍し、遠心分離処理によって分離した。ペレットを処理してタンパク質を溶解し、Ｔｒｉ−Ｃａｒｂ液体シンチレーションカウンター（ＬＳＣ）で５分間計測した。
製造プロトコルあたり、１ｍＬのＳＯＬＶＡＢＬＥ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を各ウェルサンプルに加え、５０℃の水浴で一晩インキュベートした。サンプルを水浴から取り出し、２０ｍＬのガラスシンチレーションバイアルに移し、ＥＤＴＡ及びＨ２Ｏ２をサンプルに加え、次いで、さらに５０℃で１時間インキュベートした。サンプルをＨＣｌでクエンチし、１５ｍＬのＯｐｔｉｍａ  Ｇｏｌｄ液体シンチレーション液（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を加え、サンプルを十分にボルテックス撹拌した。ＬＳＣで計測する前に、サンプルを暗室に最短で４時間保持した。タンパク質を含まないアセトン抽出物サンプルを、高減圧下、体積が１ｍＬ未満になるまで乾燥させ、ＬＳＣ前に、上述のようなＳｏｌｖａｂｌｅを用いて処理した。得られたサンプルのＣＰＭ値から、結合し、分解し、インタクトな標識された抗体の量を計算した。
【０３６７】
３Ｈ−ｃｈＭＡＢ−Ａ抗体の処理レベルを決定した後、パルス処置を行い、３７℃で一晩インキュベートした。ＮＣＩ−Ｈ１７０３細胞は、９３％の３Ｈ−ｃｈＭＡＢ−Ａが２４時間以内に処理され、ＤＬＤ−１細胞は、９２％の３Ｈ−ｃｈＭＡＢ−Ａが同じ期間で処理された。３Ｈ−ｃｈＫＴＩの結合及び処理は、無視できるものであった（標的とされた抗体よりも全ＣＰＭが１００倍以上小さい）。これらの細胞株の処理値は高く、特に、本発明の抗ＡＤＡＭ９抗体を有効な薬物コンジュゲートとして支持する他のＡＤＣ標的／抗体について既に報告されている２４時間パルス処理値と比較すると高い。
【０３６８】
実施例１０
ヒト化／最適化された抗ＡＤＡＭ９抗体及び薬物コンジュゲートの結合アフィニティ試験
抗原結合に対する結合の結果を評価するために、ＡＤＡＭ９に対する各抗ＡＤＡＭ９免疫コンジュゲート及びそのそれぞれの結合していない抗体の相対結合アフィニティを、ＦＡＣＳ分析によって、ヒトＡＤＡＭ９またはカニクイザルＡＤＡＭ９のいずれかを異所的に発現する３００−１９細胞で決定した。簡単に言うと、ＡＤＡＭ９を発現する３００−１９細胞を、段階希釈した抗ＡＤＡＭ９抗体または免疫コンジュゲートと共に、ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、０．１％  ＢＳＡ、０．０１％  ＮａＮ３）中、４℃で３０分間インキュベートした。次いで、サンプルを洗浄し、蛍光標識した二次抗体と共に４℃で３０分間インキュベートした。各濃度での蛍光強度の正規化された平均値をプロットし、結合のＥＣ５０を、非線形回帰分析を用いて計算した（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｍｓ  ４．０）。この試験から得た結果を表１４にまとめている。
【０３６９】
試験した全ての抗ＡＤＡＭ９抗体及び免疫コンジュゲートは、同様のアフィニティでヒトＡＤＡＭ９に結合し、フローサイトメトリーで測定すると、ＥＣ５０が約１．４ｎＭであり、このことは、結合が、抗体の結合アフィニティを適切には変えなかったことを示している（図８Ａ〜８Ｄを参照）。ヒト化は、キメラ抗体（ｃｈＭＡＢ−Ａ）と比較して、カニクイザルＡＤＡＭ９に対する結合を向上させたが、更に最適化された変異体（ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｃ２）、ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）及びｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）Ｓ４４２Ｃ）及びこれらの免疫コンジュゲートは、カニクイザルＡＤＡＭ９に対し、顕著に向上した結合を示した。このカニクイザルＡＤＡＭ９に対する顕著な結合の向上により、薬物治療薬としてのＡＤＡＭ９免疫コンジュゲートの仕様を確認するための毒性及び安全性の試験が容易になる。
【表１８】
2020504607.tif 000199
【０３７０】
実施例１１
Ｎ−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル）−１１−（３−（（（（Ｓ）−８−メトキシ−６−オキソ−１１，１２，１２ａ，１３−テトラヒドロ−６Ｈ−ベンゾ［５，６］［１，４］ジアゼピノ［１，２−ａ］インドール−９−イル）オキシ）メチル）−５−（（（（Ｓ）−８−メトキシ−６−オキソ−１２ａ，１３−ジヒドロ−６Ｈ−ベンゾ［５，６］［１，４］ジアゼピノ［１，２−ａ］インドール−９−イル）オキシ）メチル）フェニル）−１３，１３−ジメチル−２，５，８−トリオキサ−１４，１５−ジチア−１１−アザノナデカン−１９−アミド（化合物Ｄ６）の合成
【化１６７】
2020504607.tif 000200
工程１：遊離チオールＤＧＮ４６２（４０ｍｇ、０．０４２ｍｍｏｌ）及びＮＨＳ  ４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（３５ｍｇ、純度８０％、０．０８５ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン（０．５ｍＬ）溶液に、無水ジイソプロピルエチルアミン（０．０１５ｍＬ、０．０８５ｍｍｏｌ）を加え、室温で１６時間撹拌した。反応混合物を飽和塩化ナトリウムでクエンチし、ジクロロメタンで希釈した。得られた混合物を分液漏斗で分離した。有機層を食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸留した。残渣を半分取逆相ＨＰＬＣ（Ｃ１８カラム、ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ）によって精製した。純粋な生成物を含むフラクションを合わせ、凍結させ、凍結乾燥し、所望のＮＨＳエステルである化合物６ａを得た（２９．７ｍｇ、６０％収率）。ＬＣＭＳ＝９．１分（１５分法）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：１１５７．３（Ｍ＋１）＋。
【化１６８】
2020504607.tif 000201
【０３７１】
工程２：ＮＨＳエステルである化合物６ａ（１２．３ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ）及びＮ−（２−アミノエチル）マレイミド塩酸塩（２．０ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン（０．３ｍＬ）溶液に、ＤＩＰＥＡ（０．００２２ｍＬ、０．０１３ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で３時間撹拌し、次いで、減圧下で蒸留した。残渣を半分取逆相ＨＰＬＣ（Ｃ１８カラム、ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ）によって精製した。純粋な生成物を含むフラクションを合わせ、凍結させ、凍結乾燥し、所望のマレイミドである化合物Ｄ６を得た（１０ｍｇ、８０％収率）。ＬＣＭＳ＝８．３分（１５分法）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：１１８１．８（Ｍ＋１）＋。
【０３７２】
実施例１２
Ｎ１−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル）−Ｎ６−（（Ｓ）−１−（（（Ｓ）−１−（（３−（（（（Ｓ）−８−メトキシ−６−オキソ−１１，１２，１２ａ，１３−テトラヒドロ−６Ｈ−ベンゾ［５，６］［１，４］ジアゼピノ［１，２−ａ］インドール−９−イル）オキシ）メチル）−５−（（（（Ｓ）−８−メトキシ−６−オキソ−１２ａ，１３−ジヒドロ−６Ｈ−ベンゾ［５，６］［１，４］ジアゼピノ［１，２−ａ］インドール−９−イル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）アジパミド（化合物Ｄ５）の合成
【化１６９】
2020504607.tif 000202
ＮＨＳエステルである化合物５ａ（８．２ｍｇ、７．６μｍｏｌ）及び１−（２−アミノエチル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン塩酸塩（２．２ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン（３０５μＬ）に室温で溶解した。ＤＩＰＥＡ（２．６６μＬ、０．０１５ｍｍｏｌ）を加え、反応物を３．５時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、ＲＰＨＰＬＣ（Ｃ１８カラム、ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ、勾配、３５％から５５％）によって精製した。所望な生成物フラクションを凍結させ、凍結乾燥し、マレイミドである化合物Ｄ５を固体白色粉末として得た（５．３ｍｇ、収率５８％）。ＬＣＭＳ＝５．１１分（８分法）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：１１００．６（Ｍ＋１）＋。
【０３７３】
実施例１３
１−（（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル）アミノ）−４−（（５−（（３−（（（（Ｓ）−８−メトキシ−６−オキソ−１１，１２，１２ａ，１３−テトラヒドロ−６Ｈ−ベンゾ［５，６］［１，４］ジアゼピノ［１，２−ａ］インドール−９−イル）オキシ）メチル）−５−（（（（Ｓ）−８−メトキシ−６−オキソ−１２ａ，１３−ジヒドロ−６Ｈ−ベンゾ［５，６］［１，４］ジアゼピノ［１，２−ａ］インドール−９−イル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ）−２−メチル−５−オキソペンタン−２−イル）１スルファニル）−１−オキソブタン−２−スルホン酸（化合物Ｄ４）の合成
【化１７０】
2020504607.tif 000203
スルホ−ＳＰＤＢ
遊離チオールＤ１（８８ｍｇ、０．１０５ｍｍｏｌ）及び１−（（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシ）−１−オキソ−４−（ピリジン−２−イルジスルファニル）ブタン−２−スルホン酸（スルホ−ＳＰＤＢ）（６４．０ｍｇ、０．１５８ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン（２．１０ｍＬ）懸濁物に、ＤＩＰＥＡ（５５．０μＬ、０．３１５ｍｍｏｌ）を窒素下、室温で加えた。混合物を１６時間撹拌し、次いで、１−（２−アミノエチル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン塩酸塩（５５．６ｍｇ、０．３１５ｍｍｏｌ）、無水ジクロロメタン（１．０ｍＬ）及びＤＩＰＥＡ（０．０５５ｍＬ、０．３１５ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で更に５時間撹拌し、その時点で、反応物を高減圧下で濃縮した。得られた残渣をＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｃ１８、ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ）によって精製した。所望の生成物を含有するフラクションを凍結させ、凍結乾燥し、マレイミドＤ４（２０ｍｇ、収率１６％）を白色固体として得た。ＬＣＭＳ＝４．９２分（８分法）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：１１５８．６（Ｍ＋１）＋。
【０３７４】
実施例１４
Ｎ−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル）−１１−（３−（（（（Ｓ）−８−メトキシ−６−オキソ−１１，１２，１２ａ，１３−テトラヒドロ−６Ｈ−ベンゾ［５，６］［１，４］ジアゼピノ［１，２−ａ］インドール−９−イル）オキシ）メチル）−５−（（（（Ｓ）−８−メトキシ−６−オキソ−１２ａ，１３−ジヒドロ−６Ｈ−ベンゾ［５，６］［１，４］ジアゼピノ［１，２−ａ］インドール−９−イル）オキシ）メチル）フェニル）−２，５，８−トリオキサ−１１−アザペンタデカン−１５−アミド（化合物Ｄ７）の合成
【化１７１】
2020504607.tif 000204
ＮＨＳエステル７ａ（５ｍｇ、４．８２μｍｏｌ）及び１−（２−アミノエチル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン塩酸塩（１．７ｍｇ、９．６４μｍｏｌ）の無水ジクロロメタン（２００μＬ）溶液に、窒素下、ＤＩＰＥＡ（１．５１２μＬ、８．６８μｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で４時間撹拌し、次いで、高減圧下で濃縮した。得られた残渣をＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｃ１８、ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ）によって精製した。所望な生成物を含有するフラクションを凍結させ、凍結乾燥し、マレイミドである化合物Ｄ７を得た（３．５ｍｇ、収率６８％）。ＬＣＭＳ＝４．６１分（１５分法）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：１０６２．８（Ｍ＋１）＋。
【０３７５】
実施例１５
抗ＡＤＡＭ９抗体ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）−Ｓ４４２Ｃ−ＤＧＮ５４９のシステイン部位特異的コンジュゲートの調製
ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）−Ｓ４４２Ｃは、配列番号６８の軽鎖配列（配列番号５５のＶＬ配列を含む）と、配列番号１４２の重鎖配列（配列番号２８のＶＨ配列を含む）とを含む、ヒト化／最適化された抗体であり、Ｘがリシンである場合、配列番号１４２の６番目から最後の残基に対応する操作されたＣｙｓを含み、またはＸが存在しない場合、配列番号１４２の５番目から最後の残基に対応する操作されたＣｙｓを含む。
【０３７６】
ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）−Ｓ４４２Ｃ抗体の２つの対になっていないシステイン残基を、標準的な手順を用いて還元した。この中間体のリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）溶液に、５ｍＭのＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）（ｐＨ６．０）を加え、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、プロピレングリコール及び１０モル当量のＤＧＮ５４９−Ｃ（化合物Ｄ５）をＤＭＡのストック溶液として加え、ＰＢＳ  ５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ６．０）中の最終溶媒組成が２％（ｖ／ｖ）ＤＭＡ及び３８％（ｖ／ｖ）プロピレングリコールである反応混合物を得て、反応を２５℃で一晩進めた。
【０３７７】
コンジュゲートを、２０ｍＭコハク酸塩、８．５％ショ糖、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ−２０、５０μΜの重硫酸ナトリウム（ｐＨ４．２）で、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５  Ｆｉｎｅ脱塩カラムを取り付けた迅速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）系を用い、流速を５ｍＬ／分に設定して精製した。次いで、コンジュゲートを０．２２μｍシリンジフィルターによって濾過した。コンジュゲートは、平均で１．９ｍｏｌ  ＤＧＮ５４９／ｍｏｌ抗体を含むことがＵＶ−ｖｉｓによって判明し、９７．６％のモノマーを含むことがＳＥＣによって判明し、０．８％の結合していないＤＧＮ５４９を含むことがタンデムＳＥＣ／ＲＰ−ＵＰＬＣによって判明した。脱グリコシル化したコンジュゲートのＬＣ−ＭＳは示していない。
【０３７８】
実施例１６
抗ＡＤＡＭ９抗体のリシンが結合したＩＧＮコンジュゲートの調製
ａ．ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）−ＤＧＮ５４９の調製
ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）は、配列番号６８の軽鎖配列と、配列番号５２の重鎖配列とを含むヒト化／最適化された抗体である。１５ｍＭの２−［４−（ヒドロキシエチル）ピペリジン−１−イル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）を用いてｐＨ８．５で緩衝化したｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）抗体を含有する溶液に、４．８当量のＤＧＮ５４９−Ｌ（化合物Ｄ２）をＤＭＡのストック溶液として加え、最終溶媒組成を１０％（ｖ／ｖ）ＤＭＡ及び９０％（ｖ／ｖ）バッファー水溶液とした。反応を２５℃で４時間進めた。
【０３７９】
コンジュゲートを、２０ｍＭのコハク酸塩、８．５％のショ糖、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ−２０、５０μΜの重硫酸ナトリウム（ｐＨ５．２）中、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５脱塩カラムで精製し、このバッファーに対し、１０ｋＤａの分子量カットオフ値を有する膜を用いて透析し、０．２２μｍシリンジフィルターで濾過した。
【０３８０】
コンジュゲートは、平均で２．８ｍｏｌ  ＤＧＮ５４９／ｍｏｌ抗体を含むことがＵＶ−ｖｉｓによって判明し、９８．６％のモノマーを含むことがＳＥＣによって判明し、０．５％未満の結合していないＤＧＮ５４９を含むことがタンデムＳＥＣ／ＲＰ−ＵＰＬＣによって判明した。脱グリコシル化したコンジュゲートのＬＣ−ＭＳは示していない。
ｂ．ｈＭＡＢ−Ａ（２．２）−ＤＧＮ５４９の調製
【０３８１】
ｈＭＡＢ−Ａ（２．２）は、配列番号６８の軽鎖配列と、配列番号５０の重鎖配列とを含むヒト化抗体である。ｈＭＡＢ−Ａ（２．２）抗体は、ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）−ＤＧＮ５４９について記載したのと同じ条件で、ＤＧＮ５４９に結合されたが、但し、４．４当量のＤＧＮ５４９−Ｌ（化合物Ｄ２）を反応物に加えた。ｈＭＡＢ−Ａ（２．２）−ＤＧＮ５４９は、ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）−ＤＧＮ５４９について記載したのと同じ様式で精製された。
【０３８２】
精製されたｈＭＡＢ−Ａ（２．２）−ＤＧＮ５４９は、平均で２．７ｍｏｌ  ＤＧＮ５４９／ｍｏｌ抗体を含むことがＵＶ−ｖｉｓによって判明し、９５．６％のモノマーを含むことがＳＥＣによって判明し、０．６％の結合していないＤＧＮ５４９を含むことがタンデムＳＥＣ／ＲＰ−ＵＰＬＣによって判明した。脱グリコシル化したコンジュゲートのＬＣ−ＭＳは示していない。
ｃ．ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｃ．２）−ＤＧＮ５４９の調製
【０３８３】
ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｃ２）は、配列番号６８の軽鎖配列と、配列番号５１の重鎖配列とを含むヒト化／最適化された抗体である。
【０３８４】
ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｃ２）抗体は、ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）−ＤＧＮ５４９について記載したのと同じ条件で、ＤＧＮ５４９に結合されたが、但し、４．９当量のＤＧＮ５４９−Ｌ（化合物Ｄ２）を反応物に加えた。ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｃ．２）−ＤＧＮ５４９は、ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）−ＤＧＮ５４９について記載したのと同じ様式で精製された。
【０３８５】
精製されたｈＭＡＢ−Ａ（２Ｃ．２）−ＤＧＮ５４９は、平均で２．８ｍｏｌ  ＤＧＮ５４９／ｍｏｌ抗体を含むことがＵＶ−ｖｉｓによって判明し、９８．６％のモノマーを含むことがＳＥＣによって判明し、０．６％未満の結合していないＤＧＮ５４９を含むことがタンデムＳＥＣ／ＲＰ−ＵＰＬＣによって判明した。脱グリコシル化したコンジュゲートのＬＣ−ＭＳは示していない。
ｄ．ｃｈＭＡＢ−Ａ−ＤＧＮ５４９、ｃｈＭＡＢ−Ａ−ｓＳＰＤＢ−ＩＧＮ１３７、ｃｈＭＡＢ−Ａ−ＩＧＮ２３及びｃｈＭＡＢ−Ａ−ｓＳＰＤＢ−ＤＧＮ４６２の調製
【０３８６】
ｃｈＭＡＢ−Ａ抗体は、ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）−ＤＧＮ５４９について記載したのと同じ条件で、ＤＧＮ５４９に結合されたが、但し、３．４当量のＤＧＮ５４９−Ｌ（化合物Ｄ２）を反応物に加えた。ｃｈＭＡＢ−Ａ（２Ｃ．２）−ＤＧＮ５４９は、ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）−ＤＧＮ５４９について記載したのと同じ様式で精製されたが、但し、コンジュゲートを、２０ｍＭヒスチジン、５０ｍＭ塩化ナトリウム、８．５％ショ糖、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０、５０μＭ重硫酸ナトリウム（ｐＨ６．２）中で精製した。精製されたｃｈＭＡＢ−Ａ−ＤＧＮ５４９は、平均で２．７ｍｏｌ  ＤＧＮ５４９／ｍｏｌ抗体を含むことがＵＶ−ｖｉｓによって判明し、９４．４％のモノマーを含むことがＳＥＣによって判明し、０．４％未満の結合していないＤＧＮ５４９を含むことがタンデムＳＥＣ／ＲＰ−ＵＰＬＣによって判明した。脱グリコシル化したコンジュゲートのＬＣ−ＭＳは示していない。
【０３８７】
ｃｈＭＡＢ−Ａ抗体は、米国特許第９，３８１，２５６号に既に記載されているように、スルホ−ＳＰＤＢリンカーを介し、ＩＧＮ１３７（化合物Ｄ１）に結合された。コンジュゲートは、ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）−ＤＧＮ５４９について記載したのと同じ様式で精製されたが、但し、コンジュゲートを、２０ｍＭヒスチジン、５０ｍＭ塩化ナトリウム、８．５％ショ糖、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ−２０、５０μΜ重硫酸ナトリウム（ｐＨ６．２）中で精製した。コンジュゲートは、平均で２．９ｍｏｌ  ＩＧＮ１３７／ｍｏｌ抗体を含むことがＵＶ−ｖｉｓによって判明し、８８．４％のモノマーを含むことがＳＥＣによって判明し、０．４％未満の結合していないＩＧＮ１３７を含むことがタンデムＳＥＣ／ＲＰ−ＵＰＬＣによって判明した。脱グリコシル化したコンジュゲートのＬＣ−ＭＳは示していない。
【０３８８】
ｃｈＭＡＢ−Ａ抗体は、米国特許第８，４２６，４０２号に既に記載されているように、ＩＧＮ２３（化合物Ｄ３）に結合された。コンジュゲートは、ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）−ＤＧＮ５４９について記載したのと同じ様式で精製されたが、但し、コンジュゲートを、２０ｍＭヒスチジン、５０ｍＭ塩化ナトリウム、８．５％ショ糖、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ−２０、５０μΜ重硫酸ナトリウム（ｐＨ６．２）中で精製し、透析は行わなかった。コンジュゲートは、平均で３．２ｍｏｌ  ＩＧＮ２３／ｍｏｌ抗体を含むことがＵＶ−ｖｉｓによって判明し、９７．９％のモノマーを含むことがＳＥＣによって判明し、１．２％の結合していないＩＧＮ２３を含むことが逆相ＨＰＬＣ分析によって判明した。脱グリコシル化したコンジュゲートのＬＣ−ＭＳは示していない。
【０３８９】
ｃｈＭＡＢ−Ａ抗体は、米国特許第８７６５７４０号に既に記載されているように、スルホ−ＳＰＤＢを介し、ＤＧＮ４６２に結合された。コンジュゲートは、ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）−ＤＧＮ５４９について記載したのと同じ様式で精製されたが、但し、コンジュゲートを、２０ｍＭヒスチジン、５０ｍＭ塩化ナトリウム、８．５％ショ糖、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ−２０、５０μΜ重硫酸ナトリウム（ｐＨ６．２）中で精製し、透析は行わなかった。コンジュゲートは、平均で２．８ｍｏｌ  ＤＧＮ４６２／ｍｏｌ抗体を含むことがＵＶ−ｖｉｓによって判明し、９５．６％のモノマーを含むことがＳＥＣによって判明し、０．５％の結合していないＤＧＮ４６２を含むことが逆相ＨＰＬＣ分析によって判明した。脱グリコシル化したコンジュゲートのＬＣ−ＭＳは示していない。
【０３９０】
実施例１７
抗ＡＤＡＭ９抗体のリシンが結合したＤＭコンジュゲートの調製
ａ．ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４の調製
ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）は、配列番号６８の軽鎖配列と、配列番号５２の重鎖配列とを含むヒト化／最適化された抗体である。
【０３９１】
ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲートを調製するために、スルホ−ＳＰＤＢ（ｓＳＰＤＢ）及びＤＭ４付加を工程ごとに進める様式で行った。第１に、ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）抗体を含み、５０ｍＭの４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンプロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）を用いてｐＨ８．１に緩衝化した溶液に、５０ｍＭの塩化ナトリウムをＤＭＡ及び１１．５当量のＤＭＡストック溶液からのｓＳＰＤＢと混合し、最終溶媒組成を１０％（ｖ／ｖ）  ＤＭＡ及び９０％（ｖ／ｖ）バッファー水溶液とした。第１の反応工程を２５℃で４時間進めた後、１７．３当量のＤＭＡストック溶液からのＤＭ４、５００ｍＭのＥＰＰＳ／５００ｍＭの塩化ナトリウム（ｐＨ８．１）バッファーを反応混合物に加え、第１の反応工程からの最終溶媒組成を１０％（ｖ／ｖ）ＤＭＡ及び９０％（ｖ／ｖ）バッファー水溶液とし、これを維持した。第２の反応工程を２５℃で一晩進めた。
【０３９２】
コンジュゲートを、１０ｍＭのコハク酸塩、２５０ｍＭのグリシン、０．５％のショ糖、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ−２０（ｐＨ５．５）中、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５脱塩カラムで精製し、このバッファーに対し、１０ｋＤａの分子量カットオフ値を有する膜を用いて透析し、０．２２μｍシリンジフィルターで濾過した。
【０３９３】
コンジュゲートは、ＵＶ−ｖｉｓにより平均で３．５ｍｏｌ  ＤＭ４／ｍｏｌ抗体であり、ＳＥＣにより９９．２％がモノマーであり、混合モードのＨＰＬＣにより、１．７％未満が結合していないＤＭ４であった。脱グリコシル化したコンジュゲートのＬＣ−ＭＳは示していない。
ｂ．ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｃ．２）−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４の調製
【０３９４】
ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｃ２）は、配列番号６８の軽鎖配列と、配列番号５１の重鎖配列とを含むヒト化／最適化された抗体である。
【０３９５】
ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｃ２）抗体は、ｓＳＰＤＢリンカーを介し、ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４について記載したのと同じ方法を用い、ＤＭ４に結合された。このコンジュゲートは、ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４について記載したのと同じ様式で精製された。
【０３９６】
コンジュゲートは、ＵＶ−ｖｉｓにより平均で３．２ｍｏｌ  ＤＭ４／ｍｏｌ抗体であり、ＳＥＣにより９８．９％がモノマーであり、混合モードのＨＰＬＣにより、２．６％が結合していないＤＭ４であった。脱グリコシル化したコンジュゲートのＬＣ−ＭＳは示していない。
ｃ．ｈＭＡＢ−Ａ（２．２）−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４の調製
【０３９７】
ｈＭＡＢ−Ａ（２．２）は、配列番号６８の軽鎖配列と、配列番号５０の重鎖配列とを含むヒト化抗体である。
【０３９８】
ｈＭＡＢ−Ａ（２．２）抗体は、ｓＳＰＤＢリンカーを介し、ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４について記載したのと同じ方法を用い、ＤＭ４に結合された。コンジュゲートを、１０ｍＭコハク酸塩、２５０ｍＭグリシン、０．５％ショ糖、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ−２０（ｐＨ５．５）で、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５  Ｆｉｎｅ脱塩カラムを取り付けた迅速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）系を用いて精製し、次いで、０．２２μｍシリンジフィルターによって濾過した。
【０３９９】
コンジュゲートは、ＵＶ−ｖｉｓにより平均で３．２ｍｏｌ  ＤＭ４／ｍｏｌ抗体であり、ＳＥＣにより９７．４％がモノマーであり、混合モードのＨＰＬＣにより、１．１％未満が結合していないＤＭ４であった。脱グリコシル化したコンジュゲートのＬＣ−ＭＳは示していない。
ｄ．ｃｈＭＡＢ−Ａ−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４及びｃｈＭＡＢ−Ａ−ＳＭＣＣ−ＤＭｌの調製
【０４００】
ｃｈＭＡＢ−Ａ抗体は、ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４について記載したのと同じ方法を用いたが、但し、６．４当量のｓＳＰＤＢ及び９．６当量のＤＭ４をそれぞれの反応工程で使用し、スルホ−ＳＰＤＢリンカーを介し、ＤＭ４に結合された。このコンジュゲートは、ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４について記載したのと同じ様式で精製されたが、但し、透析は行わなかった。コンジュゲートは、ＵＶ−ｖｉｓにより平均で３．４ｍｏｌ  ＤＭ４／ｍｏｌ抗体であり、ＳＥＣにより９７．０％がモノマーであり、混合モードのＨＰＬＣにより、４．７％が結合していないＤＭ４であった。脱グリコシル化したコンジュゲートのＬＣ−ＭＳは示していない。
【０４０１】
ｃｈＭＡＢ−Ａ抗体は、米国特許第８６２４００３号に既に記載されている方法を用い、ＳＭＣＣリンカーを介し、ＤＭ１に結合された。このコンジュゲートは、ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４について記載したのと同じ様式で精製されたが、但し、透析は行わなかった。コンジュゲートは、ＵＶ−ｖｉｓにより平均で３．９ｍｏｌ  ＤＭ１／ｍｏｌ抗体であり、ＳＥＣにより９９．７％がモノマーであり、混合モードのＨＰＬＣにより、４．９％が結合していないＤＭ１であった。脱グリコシル化したコンジュゲートのＬＣ−ＭＳは示していない。
【０４０２】
実施例１８
抗ＡＤＡＭ９抗体薬物コンジュゲートのインビトロ細胞毒性
ＡＤＡＭ９を発現する細胞株のパネルに対する種々の抗ＡＤＡＭ９抗体免疫コンジュゲートのインビトロ細胞毒性を、標的ではないＩｇＧ１コンジュゲートと比較した。具体的には、治療の２４時間前に、５００〜２０００細胞／ウェルを９６ウェルプレートに接種した。コンジュゲートを、段階的な３倍希釈を用い、培地で希釈し、ウェルあたり１００μＬを加えた。細胞を含むが、コンジュゲートを含まない対照ウェルと、培地のみを含むウェルが、各アッセイプレートに含まれていた。各データ点について、アッセイを３個ずつ実施した。プレートを加湿した５％ＣＯ２インキュベータ中、３７℃で４〜５日間インキュベートした。次いで、ＷＳＴ−８に基づくＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用い、各ウェル中の生存可能な細胞の相対数を決定した。まず、培地バックグラウンド吸光度で補正し、次いで、それぞれの値を、対照ウェル（未処理細胞）の値の平均で割り算することによって、各ウェル中の細胞の生存している分率を計算した。生存している細胞の割合を、コンジュゲート濃度に対してプロットし、活性のＥＣ５０を、非線形回帰分析（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｍｓ  ４．０）を用いて計算した。
【０４０３】
これらの結果は、抗ＡＤＡＭ９免疫コンジュゲートが、肺、膵臓、腎臓、前立腺及び結腸の腫瘍細胞株を含め、広範囲のＡＤＡＭ９陽性腫瘍細胞株を殺すことができることを示す（図９Ａ〜９Ｈ）。試験したそれぞれの場合に、良好な特異性ウィンドウが観察され、このことは、細胞毒性が、標的細胞に対する抗ＡＤＡＭ９抗体の特異的な結合の結果であることを示唆している。特に、抗ＡＤＡＭ９−ＤＧＮ５４９コンジュゲート（ｈＭＡＢ−Ａ（２．２）−ＤＧＮ５４９及びｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）−Ｓ４４２Ｃ−ＤＧＮ５４９）は、特に強力であり、ＩＣ５０値が１〜１１５ｐＭであり、標的ではないＩｇＧ１コンジュゲートよりも約３ｌｏｇ活性が高かった（表１５を参照）。
【表１９−１】
2020504607.tif 000205
【表１９−２】
2020504607.tif 000206
【表１９−３】
2020504607.tif 000207
【０４０４】
実施例１９
Ｃａｌｕ３ヒト非小細胞肺腺癌異種移植片を有するＳＣＩＤマウスにおける抗ＡＤＡＭ９抗体薬物コンジュゲートの抗腫瘍活性
種々の投薬量のｈＭＡＢ−Ａ（２．２）−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４及び１種類の投薬量のｃｈＭＡＢ−Ａ−ＤＧＮ５４９コンジュゲートの抗腫瘍活性を、ヒト肺腺癌皮下異種移植モデルであるＣａｌｕ３細胞を含む雌ＳＣＩＤマウスで評価した。
【０４０５】
接種のためにＣａｌｕ３細胞を集め、トリパンブルー排除によって９９％生存率を決定した。マウスに、０．２ｍｌの５０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ／５０％無血清培地中の５×１０６個のＣａｌｕ３細胞を、右後側の脇腹領域に、皮下注射によって接種した。８４匹の雌ＳＣＩＤマウス（６週齢）をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得た。受領したら、試験開始前に９日間、動物を観察した。動物は、到着時、または治療前に、疾患または疾病の徴候を示さなかった。
【０４０６】
８４匹のマウスを、腫瘍体積によって、８グループ（１グループあたり８匹のマウス）に無作為に分けた。腫瘍体積は、７４．０９〜１５０．２１（１０６．４１±１８．６９、平均±ＳＤ）ｍｍ３の範囲であった。マウスを測定し、移植から６日後の腫瘍体積に基づき、無作為に分けた。移植から７日目に、マウスに投薬した。マウスの体重は、１６．０５〜２１．７２（１８．６４±１．０３、平均±ＳＤ）グラムであった。各グループ中のマウスは、パンチ法によって特定した。試験薬剤及びビヒクルの投与は、２７ゲージ、１／２インチ針を取り付けた１．０ｍＬのシリンジを用いることによって、静脈内で行われた。グループを以下のように分けた。ビヒクル（ＰＢＳ）を投薬した対照グループ、ｃｈＫＴＩ−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４を５ｍｇ／ｋｇ、ｑｄｘｌ、ｈＭＡＢ−Ａ（２．２）−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４を１．２５ｍｇ／ｋｇ（抗体による）、ｑｄｘｌ、ｈＭＡＢ−Ａ（２．２）−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４を２．５ｍｇ／ｋｇ（抗体による）、ｑｄｘｌ、ｈＭＡＢ−Ａ（２．２）−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４を５ｍｇ／ｋｇ（抗体による）、ｑｄｘｌ及びｃｈＭＡＢ−Ａ−ＤＧＮ５４９を１０μｇ／ｋｇ（ペイロードによる；抗体によると０．６ｍｇ／ｋｇ）、ｑｄｘｌ。
【０４０７】
カリパスを用い、１週間に２回、腫瘍サイズを三次元で測定した。式Ｖ＝長さ×幅×高さ×１／２を用い、腫瘍体積をｍｍ単位で表した。マウスは、腫瘍体積が５０％以上減っているときに、部分的な退縮（ＰＲ）であるとされ、明白な腫瘍が消えたときに、完全な腫瘍退縮（ＣＲ）であるとされ、腫瘍のない生存者（ＴＦＳ）は、試験終了時に腫瘍のないマウスの数である。腫瘍体積及び体重は、ＳｔｕｄｙＬｏｇソフトウエアによって決定した。Ｌｏｇ１０細胞死（ＬＣＫ）は、式ＬＣＫ＝（Ｔ−Ｃ）／Ｔｄｘ３．３２を用いて計算され、ここで、（Ｔ−Ｃ）、すなわち、腫瘍成長遅れ（ＴＧＤ）は、治療グループ及び対照グループについて、腫瘍が所定のサイズである８１５ｍｍ３に達するまで（腫瘍のない生存者は除く）のメジアン時間（単位は日数）であり１、Ｔｄは、マウスにおける腫瘍倍加時間であり（対照の腫瘍成長の毎日のメジアンの非線形対数曲線フィッティングから概算）、ｘは、細胞成長のｌｏｇあたりの細胞倍加数である。％Ｔ／Ｃ（腫瘍成長阻害）は、対照の終点での対照のメジアンＴＶに対する、所定時間（すなわち、対照腫瘍のメジアンＴＶが、最大腫瘍体積に達するまでの時間、すなわち、ＴＶが１０００ｍｍ３に達するまでの時間であるか、または腫瘍が壊死状態になったため、全ての対照グループのマウスが試験から離脱する時間点である）での治療グループのメジアン腫瘍体積（ＴＶ）の比率である。
【０４０８】
全てのマウスの体重を、薬物毒性の粗い指標として週に２回測定した。マウスの体重（ＢＷ）は、以下のように、治療前の体重からの体重の変化率として表された。ＢＷ変化率％＝［（ＢＷ後／ＢＷ前）−１］ｘ１００。ここで、ＢＷ後は、治療後の体重であり、ＢＷ前は、治療前の開始時の体重である。体重減少（ＢＷＬ）の割合は、治療後の体重の平均変化として表された。腫瘍体積が１０００ｍｍ３より大きくなるか、または壊死したら、または体重が試験中の任意の時間点で２０％を超えて減少したら、動物を安楽死させた。
【０４０９】
この試験の結果は、図１０に示されている。ｈＭＡＢ−Ａ（２．２）−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲートは、試験した全ての投薬量で活性であった。ｈＭＡＢ−Ａ（２．２）−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲートは、腫瘍成長阻害（Ｔ／Ｃ）値が３９％であり、Ｔ−Ｃ値が１７であり、投薬量１．２５ｍｇ／ｋｇでＬＣＫ値が０．５であり（８匹のマウスのうち、３匹が部分的な退縮であり、さらに完全な退縮）、投薬量２．５ｍｇ／ｋｇでＴ／Ｃ値は２５％、Ｔ−Ｃ値は２２、ＬＣＫ値は０．７（８匹のマウスのうち、３匹が部分的な退縮、完全な退縮はなし）、投薬量５ｍｇ／ｋｇでＴ／Ｃ値は１４％、Ｔ−Ｃ値は３６、ＬＣＫ値は１．１（８匹のマウスのうち、４匹が部分的な退縮、８匹のマウスのうち、１匹が完全な退縮）であった。ｃｈＭＡＢ−Ａ−ＤＧＮ５４９は、１０μｇ／ｋｇ（ペイロードによる、抗体によれば０．６ｍｇ／ｋｇ）で非常に活性であり、８匹のマウスのうち、８匹が完全に退縮した。ｈＭＡＢ−Ａ（２．２）−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４、またはｃｈＭＡＢ−ＤＧＮ５４９、またはｃｈＫＴＩ−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲートのいずれも、指定の投薬量で顕著な体重減少はみられず、そのため、３種類全てのコンジュゲートは、この試験では、指定の投薬量でマウスにおいて十分に忍容性であった。この結果は、ｈＭＡＢ−Ａ（２．２）−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲートが、このモデルにおいて、種々の投薬量で活性であることを示す。この結果は、ｃｈＭＡＢ−Ａ−ＤＧＮ５４９が、１０μｇ／ｋｇ（ペイロードによる、抗体によれば０．６ｍｇ／ｋｇ）で非常に活性であることも示している。
【０４１０】
１回ｉ．ｖ．投薬したときの種々の投薬量のｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）−Ｓ４４２Ｃ−ＤＧＮ５４９の抗腫瘍活性も、ＮＳＣＬＣモデルであるＣａｌｕ−３腫瘍異種移植片を有する雌ＳＣＩＤマウスで評価した。接種から６日後、腫瘍体積によってマウスを無作為に８グループに分けた（グループあたりｎ＝８）。治療群は、ビヒクル（ＰＢＳ）を投薬した対照グループ、ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）−Ｓ４４２Ｃ−ＤＧＮ５４９コンジュゲートを０．５（ペイロードによる、抗体によれば０．０４ｍｇ／ｋｇ）、１（ペイロードによる、抗体によれば０．０８ｍｇ／ｋｇ）、３（ペイロードによる、抗体によれば０．２５ｍｇ／ｋｇ）及び１０μｇ／ｋｇ（ペイロードによる、抗体によれば０．８ｍｇ／ｋｇ）を１回、静脈内に投薬、及びｈｕＫＴＩ−Ｓ４４２Ｃ−ＤＧＮ５４９コンジュゲートの標的ではない対照を１（ペイロードによる、抗体によれば０．０８ｍｇ／ｋｇ）、３（ペイロードによる、抗体によれば０．２５ｍｇ／ｋｇ）及び１０μｇ／ｋｇ（ペイロードによる、抗体によれば０．８ｍｇ／ｋｇ）を１回、静脈内に投薬を含んでいた。
【０４１１】
腫瘍体積及び体重を上述のように測定し、結果を図１１に示している。簡単に言うと、ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）−Ｓ４４２Ｃ−ＤＧＮ５４９は、最も低い投薬量である０．５μｇ／ｋｇ（ペイロードによる、抗体によれば０．０４ｍｇ／ｋｇ）でさえ、非常に活性であり、強力な活性が、１（ペイロードによる、抗体によれば０．０８ｍｇ／ｋｇ）、３（ペイロードによる、抗体によれば０．２５ｍｇ／ｋｇ）、１０μｇ／ｋｇ（ペイロードによる、抗体によれば０．８ｍｇ／ｋｇ）の投薬量で観察された。標的ではない対照であるｈｕＫＴＩ−Ｓ４４２Ｃ−ＤＧＮ５４９は、このモデルでは、試験した全ての３種類の投薬量で不活性であった。すなわち、１（ペイロードによる、抗体によれば０．０８ｍｇ／ｋｇ）、３（ペイロードによる、抗体によれば０．２５ｍｇ／ｋｇ）及び１０μｇ／ｋｇ（ペイロードによる、抗体によれば０．８ｍｇ／ｋｇ）。ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）−Ｓ４４２Ｃ−ＤＧＮ５４９は、０．５μｇ／ｋｇ（ペイロードによる、抗体によれば０．０４ｍｇ／ｋｇ）で、Ｔ／Ｃが７％であり、試験終了時で７／８がＰＲ、０／８がＣＲであった。ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）−Ｓ４４２Ｃ−ＤＧＮ５４９は、１μｇ／ｋｇ（ペイロードによる、抗体によれば０．０８ｍｇ／ｋｇ）で、Ｔ／Ｃが２％であり、試験終了時に８／８がＰＲ、２／８がＣＲであった。ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）−Ｓ４４２Ｃ−ＤＧＮ５４９は、３μｇ／ｋｇ（ペイロードによる、抗体によれば０．２５ｍｇ／ｋｇ）で、Ｔ／Ｃが０％であり、試験終了時に８／８がＰＲ、８／８がＣＲであり、ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）−Ｓ４４２Ｃ−ＤＧＮ５４９は、１０μｇ／ｋｇ（ペイロードによる、抗体によれば０．８ｍｇ／ｋｇ）で、Ｔ／Ｃが０％であり、試験終了時に８／８がＰＲ、８／８がＣＲであった。
【０４１２】
ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）−Ｓ４４２Ｃ−ＤＧＮ５４９（０．５、１、３、１０μｇ／ｋｇ、ペイロードによる）及びｈｕＫＴＩ−Ｓ４４２Ｃ−ＤＧＮ５４９（１、３、１０μｇ／ｋｇ、ペイロードによる）は、両方とも、この試験で指定の全ての投薬量で、マウスにおいて十分に忍容性であった。ここに示した用量では、２つのコンジュゲートのいずれかを用い、顕著な体重減少はみられなかった。この試験からの結果は、ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）−Ｓ４４２Ｃ−ＤＧＮ５４９コンジュゲートが、競合する抗腫瘍活性を示し、Ｃａｌｕ−３非小細胞肺癌腫瘍異種移植片モデルにおいて非常に有効であることを示唆している。
【０４１３】
実施例２０
Ｈ１７０３ヒト非小細胞肺扁平上皮癌異種移植片を有するＳＣＩＤマウスにおける抗ＡＤＡＭ９抗体薬物コンジュゲートの抗腫瘍活性
種々の投薬量のｈＭＡＢ−Ａ（２．２）−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲートの抗腫瘍活性を、ＮＳＣＬＣ扁平上皮細胞癌異種移植片モデルである、Ｈ１７０３細胞を有する雌ＳＣＩＤマウスで評価した。
【０４１４】
接種のためにＨＩ７０３細胞を集め、トリパンブルー排除によって１００％生存率を決定した。マウスに、０．２ｍｌの５０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ／５０％無血清培地中の５×１０６個のＨ１７０３細胞を、右後側の脇腹領域に、皮下注射によって接種した。７２匹の雌Ｎｕｄｅマウス（６週齢）を３／２４／１６にＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得た。受領したら、試験開始前に８日間、動物を観察した。動物は、到着時、または治療前に、疾患または疾病の徴候を示さなかった。
４８匹のマウスを、腫瘍体積によって、８グループ（１グループあたり６匹のマウス）に無作為に分けた。腫瘍体積は、７６．１８〜１５９．００（１１５．１９±２２．０８、平均±ＳＤ）ｍｍ３の範囲であった。マウスを測定し、移植から１９日後の腫瘍体積に基づき、無作為に分けた。移植（４／２１／１６）から２０日目に、マウスに投薬した。マウスの体重は、２０．２０〜２９．１５（２３．８８±１．９５、平均±ＳＤ）グラムであった。各グループ中のマウスは、パンチ法によって特定した。試験薬剤及びビヒクルの投与は、２７ゲージ、１／２インチ針を取り付けた１．０ｍＬのシリンジを用いることによって、静脈内で行われた。グループは、以下が含まれていた。ビヒクル（ＰＢＳ）を１５０μＬ／マウスで投薬した対照グループ、ｑｄｘ１、ｃｈＫＴＩ−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４を５ｍｇ／ｋｇで、ｑｄｘｌ、ｈＭＡＢ−Ａ（２．２）−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４を１．２５ｍｇ／ｋｇで、ｑｄｘｌ、ｈＭＡＢ−Ａ（２．２）−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４を２．５ｍｇ／ｋｇで、ｑｄｘｌ、ｈＭＡＢ−Ａ（２．２）−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４を５ｍｇ／ｋｇで、ｑｄｘｌ。
【０４１５】
腫瘍サイズ及び体重の測定値は、実施例１９に記載したように決定した。この試験の結果を図１２に示している。ｈＭＡＢ−Ａ（２．２）−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４は、低い投薬量の２．５ｍｇ／ｋｇで非常に活性であり、Ｔ／Ｃは６％、Ｔ−Ｃは２８、ＬＣＫは１．４であり（６匹のマウスのうち、３匹が部分的な退縮、完全な退縮はなし）、５ｍｇ／ｋｇの投薬量で非常に活性であり、Ｔ／Ｃが１％、Ｔ−Ｃが６３、ＬＣＫが３．２であった（６匹のマウスのうち、６匹が部分的な退縮、３匹が完全な退縮、１匹が腫瘍のない生存者）。ｈＭＡＢ−Ａ（２．２）−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲートは、投薬量１．２５ｍｇ／ｋｇで不活性であり、腫瘍成長阻害（Ｔ／Ｃ）が７９％、Ｔ−Ｃが４、ＬＣＫが０．２であった（６匹のマウスのうち、１匹が部分的な退縮、完全な退縮はなし）。ｈＭＡＢ−Ａ（２．２）−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４、またはｃｈＫＴＩ−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲートのいずれも、指定の投薬量で顕著な体重減少はみられず、そのため、両コンジュゲートは、この試験では、指定の投薬量でマウスにおいて十分に忍容性であった。この結果は、ｈＭＡＢ−Ａ（２．２）−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲートが、このモデルにおいて、２．５ｍｇ／ｋｇの低い投薬量で非常に活性であることを示す。
【０４１６】
実施例２１
頭頸部異種移植片のＤｅｔｒｏｉｔ５６２扁平上皮癌を有するＳＣＩＤマウスにおける抗ＡＤＡＭ９抗体薬物コンジュゲートの抗腫瘍活性
種々の投薬量のｃｈＭＡＢ−Ａ−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲートの抗腫瘍活性を、咽頭癌異種移植片モデルである、Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２を含む雌ＣＤ−Ｉ免疫欠損マウスで評価した。
【０４１７】
マウス（６週齢）を７／１／１４にＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得た。受領したら、試験開始前に１５日間、動物を観察した。動物は、到着時、または試験開始前に、疾患または疾病の徴候を示さなかった。接種のためにＤｅｔｒｏｉｔ５６２細胞を集め、トリパンブルー排除によって９０％より大きい生存率を決定した。マウスに、０．２ｍｌの５０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ／５０％無血清培地中の５×１０６個のＤｅｔｒｏｉｔ５６２細胞を、右後側の脇腹領域に、皮下注射によって接種した。
【０４１８】
４２匹のマウスを、腫瘍体積によって、６グループ（１グループあたり７匹のマウス）に無作為に分けた。腫瘍体積は、９５．７６〜４５０．８３ｍｍ３の範囲であった。マウスを測定し、移植から２６日後の腫瘍体積に基づき、無作為に分けた。試験薬剤及びビヒクルの投与は、無作為に分けた日の次の日（試験第０日）に、２７ゲージの１／２インチ針を取り付けた１．０ｍｌシリンジを用いた腹腔内注射によって行った。このグループは、以下を含んでいた。ビヒクル（ＰＢＳ）を投薬された対照グループ、ｃｈＫＴＩ−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４を５ｍｇ／ｋｇで、ｑｄｘｌ、ｃｈＫＴＩ−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４を２．５ｍｇ／ｋｇで、ｑｄｘｌ、ｃｈＭ  ＡＢ−Ａ−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４を５ｍｇ／ｋｇで、ｑｄｘｌ、ｃｈＭ  ＡＢ−Ａ−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４を２．５ｍｇ／ｋｇで、ｑｄｘｌ、ｃｈＭＡＢ−Ａ−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４を１．２５ｍｇ／ｋｇで、ｑｄｘｌ。
【０４１９】
腫瘍サイズ及び体重の測定値は、実施例１９に記載したように決定した。この試験の結果を図１３に示している。簡単に言うと、ｃｈＭＡＢ−Ａ−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４は、試験した３種類全ての投薬レベルで、試験全体にわたって活性であった（５、２．５及び１．２５ｍｇ／ｋｇ）。ｃｈＭＡＢ−Ａ−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４は、５ｍｇ／ｋｇで、Ｔ／Ｃが３２％であり、試験終了時に６／７がＰＲ、１／７がＣＲであった。ｃｈＭＡＢ−Ａ−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４は、２．５ｍｇ／ｋｇで、Ｔ／Ｃが２７％であり、試験終了時に６／７がＰＲ、２／７がＣＲであった。ｃｈＭＡＢ−Ａ−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４は、１．２５ｍｇ／ｋｇで、Ｔ／Ｃが３７％であり、試験終了時に５／７がＰＲ、０／７がＣＲであった。ｃｈＫＴＩ−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４は、５ｍｇ／ｋｇで、Ｔ／Ｃが８９％であり、試験終了時に３／７がＰＲ、０／７がＣＲであった。ｃｈＫＴＩ−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４は、５ｍｇ／ｋｇで、Ｔ／Ｃが８０％であり、試験終了時に、３／７がＰＲ、１／７がＣＲであった。
【０４２０】
ｃｈＭＡＢ−Ａ−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４は、この試験で調べた全ての投薬量で、マウスにおいて十分に忍容性であった。ここに示した用量では、顕著な体重減少はみられなかった。この試験からの結果は、ｃｈＭＡＢ−Ａ−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲートが、抗腫瘍活性を示し、Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２咽頭癌腫瘍異種移植片モデルにおいて有効であることを示唆している。
【０４２１】
第２の試験で、種々の投薬量のｃｈＭＡＢ−Ａ−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲートの抗腫瘍活性を、もっと大きな体積のＤｅｔｒｏｉｔ５６２腫瘍異種移植片を有する雌ＣＤ−Ｉ免疫欠損マウスで評価した。
【０４２２】
マウス（５週齢）を９／１７／１４にＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得た。受領したら、試験開始前に７日間、動物を観察した。動物は、到着時、または試験開始前に、疾患または疾病の徴候を示さなかった。接種のためにＤｅｔｒｏｉｔ５６２細胞を集め、トリパンブルー排除によって９０％より大きい生存率を決定した。マウスに、０．２ｍｌの５０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ／５０％無血清培地中の５×１０６個のＤｅｔｒｏｉｔ５６２細胞を、右後側の脇腹領域に、皮下注射によって接種した。
【０４２３】
１８匹のマウスを、腫瘍体積によって、３グループ（１グループあたり６匹のマウス）に無作為に分けた。腫瘍体積は、２７７．５１〜５０３．４９ｍｍ３の範囲であった。マウスを測定し、移植から３５日後の腫瘍体積に基づき、無作為に分けた。試験薬剤及びビヒクルの投与は、無作為に分けた日の２日後（試験第１日）に、２７ゲージの１／２インチ針を取り付けた１．０ｍｌシリンジを用いた腹腔内注射によって行った。
グループには、以下が含まれていた。ビヒクル（ＰＢＳ）を投薬された対照グループ、ｃｈＭＡＢ−Ａ−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４を５ｍｇ／ｋｇ、ｑｄｘｌ及びｃｈＭＡＢ−Ａ−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４を１．２５ｍｇ／ｋｇ、ｑｄｘｌ。
【０４２４】
腫瘍サイズ及び体重の測定値は、実施例１９に記載したように決定した。この試験の結果を図１４に示している。簡単に言うと、ｃｈＭＡＢ−Ａ−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４は、試験した２種類の投薬レベルで、試験全体にわたって活性であった（５及び１．２５ｍｇ／ｋｇ）。ｃｈＭＡＢ−Ａ−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４は、５ｍｇ／ｋｇで、Ｔ／Ｃが３％であり、試験終了時に６／６がＰＲ、１／７がＣＲであった。ｃｈＭＡＢ−Ａ−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４は、１．２５ｍｇ／ｋｇで、Ｔ／Ｃが１４％であり、試験終了時に６／６がＰＲ、０／７がＣＲであった。
【０４２５】
ｃｈＭＡＢ−Ａ−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４は、この試験で調べた両方の投薬量で、マウスにおいて十分に忍容性であった。ここに示した用量では、顕著な体重減少はみられなかった。この試験からの結果は、ｃｈＭＡＢ−Ａ−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲートが、抗腫瘍活性を示し、より大きな体積のＤｅｔｒｏｉｔ５６２咽頭癌腫瘍異種移植片モデルで有効であることを示唆している。
【０４２６】
実施例２２
ＳＮＵ−５胃癌異種移植片を有するＮｕｄｅマウスにおける抗ＡＤＡＭ９抗体薬物コンジュゲートの抗腫瘍活性
種々の投薬量のｈｕＭＡＢ−Ａ（２．２）−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４及び１種類の投薬量のｈｕＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）−Ｓ４４２Ｃ−ＤＧＮ５４９コンジュゲートの抗腫瘍活性を、ヒト胃癌異種移植モデルであるＳｎｕ−５細胞を含む雌Ｎｕｄｅマウスで評価した。
【０４２７】
接種のためにＳｎｕ−５細胞を集め、トリパンブルー排除によって１００％生存率を決定した。マウスに、０．１ｍｌの５０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ／５０％無血清培地中の５×１０６個のＳｎｕ−５細胞を、右後側の脇腹領域に、皮下注射によって接種した。５６匹の雌Ｎｕｄｅマウス（６週齢）を１／２５／１７にＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得た。受領したら、試験開始前に８日間、動物を観察した。動物は、到着時、または治療前に、疾患または疾病の徴候を示さなかった。
【０４２８】
５６匹のマウスを、腫瘍体積によって、７グループ（１グループあたり８匹のマウス）に無作為に分けた。腫瘍体積は、７６．２９〜１２９．１２（１３０．５８±１３．２８、平均±ＳＤ）ｍｍ３の範囲であった。マウスを測定し、移植から１３日後の腫瘍体積に基づき、無作為に分けた。移植（２／１７／１７）から１４日目に、マウスに投薬した。マウスの体重は、１９．５０〜２６．３５（２２．６９±１．４０、平均±ＳＤ）グラムであった。各グループ中のマウスは、パンチ法によって特定した。試験薬剤及びビヒクルの投与は、２７ゲージ、１／２インチ針を取り付けた１．０ｍＬのシリンジを用いることによって、静脈内で行われた。グループは以下を含んでいた。ビヒクル（ＰＢＳ）を投薬された対照グループ、ｃｈＫＴＩ−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４を５ｍｇ／ｋｇ、ｈｕＭＡＢ−Ａ（２．２）−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４を２．５ｍｇ／ｋｇ、ｈｕＭＡＢ−Ａ（２．２）−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４を５ｍｇ／ｋｇ、ｈｕＫＴＩ−Ｓ４４２Ｃ−ＤＧＮ５４９を１０μｇ／ｋｇ、ｈｕＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）−Ｓ４４２Ｃ−ＤＧＮ５４９を３μｇ／ｋｇ及びｈｕＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）−Ｓ４４２Ｃ−ＤＧＮ５４９を１０μｇ／ｋｇ。
【０４２９】
カリパスを用い、１週間に２回、腫瘍サイズを三次元で測定した。式Ｖ＝長さ×幅×高さ×１／２を用い、腫瘍体積をｍｍ単位で表した。マウスは、腫瘍体積が５０％以上減っているときに、部分的な退縮（ＰＲ）であるとされ、明白な腫瘍が消えたときに、完全な腫瘍退縮（ＣＲ）であるとされ、腫瘍のない生存者（ＴＦＳ）は、試験終了時に腫瘍のないマウスの数である。腫瘍体積及び体重は、ＳｔｕｄｙＬｏｇソフトウエアによって決定した。Ｌｏｇ１０細胞死（ＬＣＫ）は、式ＬＣＫ＝（Ｔ−Ｃ）／Ｔｄｘ３．３２を用いて計算され、ここで、（Ｔ−Ｃ）、すなわち、腫瘍成長遅れ（ＴＧＤ）は、治療グループ及び対照グループについて、腫瘍が所定のサイズである７９８ｍｍ３に達するまで（腫瘍のない生存者は除く）のメジアン時間（単位は日数）であり１、Ｔｄは、マウスにおける腫瘍倍加時間であり（対照の腫瘍成長の毎日のメジアンの非線形対数曲線フィッティングから概算）、ｘは、細胞成長のｌｏｇあたりの細胞倍加数である。％Ｔ／Ｃ（腫瘍成長阻害）は、対照の終点での対照のメジアンＴＶに対する、所定時間（すなわち、対照腫瘍のメジアンＴＶが、最大腫瘍体積に達するまでの時間、すなわち、ＴＶが１０００ｍｍ３に達するまでの時間であるか、または腫瘍が壊死状態になったため、全ての対照グループのマウスが試験から離脱する時間点である）での治療グループのメジアン腫瘍体積（ＴＶ）の比率である。
【０４３０】
全てのマウスの体重を、薬物毒性の粗い指標として週に２回測定した。マウスの体重（ＢＷ）は、以下のように、治療前の体重からの体重の変化率として表された。ＢＷ変化率％＝［（ＢＷ後／ＢＷ前）−１］ｘ１００。ここで、ＢＷ後は、治療後の体重であり、ＢＷ前は、治療前の開始時の体重である。体重減少（ＢＷＬ）の割合は、治療後の体重の平均変化として表された。腫瘍体積が１０００ｍｍ３より大きくなるか、または壊死したら、または体重が試験中の任意の時間点で２０％を超えて減少したら、動物を安楽死させた。
【０４３１】
この試験の結果は、図１５及び図１６に示されている。ｈｕＭＡＢ−Ａ（２．２）−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲートは、試験した量投薬量で非常に活性であった。ｈｕＭＡＢ−Ａ（２．２）−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲートは、投薬量２．５ｍｇ／ｋｇで腫瘍成長阻害（Ｔ／Ｃ）値が５％であり（８匹のマウスのうち、８匹が部分的な退縮、２匹が完全な退縮）、５ｍｇ／ｋｇでＴ／Ｃ値が１％（８匹のマウスのうち、８匹が部分的な退縮、６匹が完全な退縮）であった。ｈｕＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）−Ｓ４４２Ｃ−ＤＧＮ５４９は、試験した両投薬量で非常に活性であった。ｈｕＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）−Ｓ４４２Ｃ−ＤＧＮ５４９コンジュゲートは、投薬量３μｇ／ｋｇで（Ｔ／Ｃ）値が７％（８匹のマウスのうち、８匹が部分的な退縮、４匹が完全な退縮）であり、５ｍｇ／ｋｇでＴ／Ｃ値が４％（８匹のマウスのうち、８匹が部分的な退縮、５匹が完全な退縮）であった。ｈｕＭＡＢ−Ａ（２．２）−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４、またはｈｕＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）−Ｓ４４２Ｃ−ＤＧＮ５４９、またはｃｈＫＴＩ−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４、またはｈｕＫＴＩ−Ｓ４４２Ｃ−ＤＧＮ５４９コンジュゲートのいずれも、指定の投薬量で顕著な体重減少はみられず、そのため、全てのコンジュゲートは、この試験では、指定の投薬量でマウスにおいて十分に忍容性であった。
【０４３２】
実施例２３
ＳＷ４８大腸癌細胞株異種移植片を有するマウスにおける抗ＡＤＡＭ９抗体薬物コンジュゲートの抗腫瘍活性
種々の投薬量のｈＭＡＢ−Ａ（２．２）−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４及びｈｕＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）−Ｓ４４２Ｃ−ＤＧＮ６４９コンジュゲートの抗腫瘍活性を、大腸癌細胞株異種移植モデルであるＳＷ４８細胞を含む雌Ｎｕｄｅマウスで評価した。
【０４３３】
接種のためにＳＷ４８細胞を集めた。マウスにＳＷ４８細胞を、右後側の脇腹領域に、皮下注射によって接種した。動物は、実験室から到着時、または治療前に、疾患または疾病の徴候を示さなかった。
【０４３４】
４２匹のマウスを、腫瘍体積によって、７グループ（１グループあたり６匹のマウス）に無作為に分けた。腫瘍体積は、８９〜１６９ｍｍ３の範囲であった。マウスを測定し、移植から１７日後の腫瘍体積に基づき、無作為に分け、投薬した。各グループ中のマウスは、耳タグによって特定した。試験薬剤及びビヒクルの投与を静脈内で行った。グループは以下を含んでいた。ビヒクル（ＰＢＳ）を投薬された対照グループ、ｃｈＫＴＩ−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４を１０ｍｇ／ｋｇ、ｈｕＭＡＢ−Ａ（２．２）−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４を５ｍｇ／ｋｇ、ｈｕＭＡＢ−Ａ（２．２）−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４を１０ｍｇ／ｋｇ、ｈｕＫＴＩ−Ｓ４４２Ｃ−ＤＧＮ５４９を５μｇ／ｋｇ、ｈｕＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）−Ｓ４４２Ｃ−ＤＧＮ５４９を２．５μｇ／ｋｇ及びｈｕＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）−Ｓ４４２Ｃ−ＤＧＮ５４９を５μｇ／ｋｇ。
【０４３５】
腫瘍サイズ及び体重の測定値は、実施例２２に記載したように決定した。この試験の結果を図１７及び図１８に示している。ｈｕＭＡＢ−Ａ（２．２）−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲートは、試験した両投薬量で活性であった。ｈｕＭＡＢ−Ａ（２．２）−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲートは、腫瘍成長阻害（Ｔ／Ｃ）値が、５ｍｇ／ｋｇ投薬量で１３％（部分的または完全な退縮はなし）、１０ｍｇ／ｋｇでのＴ／Ｃ値は５％（６匹のマウスのうち、６匹が部分的な退縮あり）であった。ｈｕＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）−Ｓ４４２Ｃ−ＤＧＮ５４９は、５μｇ／ｋｇの投薬量で活性であり、試験した２．５μｇ／ｋｇの投薬量では不活性であった。ｈｕＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）−Ｓ４４２Ｃ−ＤＧＮ５４９コンジュゲートは、（Ｔ／Ｃ）値が２．５μｇ／ｋｇの投薬量で９２％であり、５μｇ／ｋｇでのＴ／Ｃ値が４１％であった（６匹のマウスのうち、２匹が部分的な退縮あり）。ｈｕＭＡＢ−Ａ（２．２）−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４、またはｈｕＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）−Ｓ４４２Ｃ−ＤＧＮ５４９、またはｃｈＫＴＩ−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４、またはｈｕＫＴＩ−Ｓ４４２Ｃ−ＤＧＮ５４９コンジュゲートのいずれも、指定の投薬量で顕著な体重減少はみられず、そのため、全てのコンジュゲートは、この試験では、指定の投薬量でマウスにおいて十分に忍容性であった（ＭＧＮＸによって確認する必要がある）。
【０４３６】
実施例２４
ＦｃＲｎ結合を向上させることによって、抗ＡＤＡＭ９抗体メイタンシノイドコンジュゲートの曝露を延ばす
抗ＡＤＡＭ９抗体メイタンシノイドコンジュゲートが、効力を発揮する潜在能力を最大にするために、ＦｃＲｎ結合を向上させることによって抗体薬物コンジュゲートの曝露時間を延ばすために、置換Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ（「ＹＴＥ突然変異」）を抗ＡＤＡＭ９抗体であるｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）及びｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）−Ｓ４４２ＣのＦｃ領域に導入した。ＦｃＲｎは、血清ＩｇＧレベルの維持において、主要な役割を果たす。非特異的に取り込まれるＩｇＧは、ｐＨ依存性の相互作用に起因して、エンドソーム中のＦｃＲｎに結合する。次いで、ＦｃＲｎが結合したＩｇＧは、再循環するエンドソーム内に選別され、細胞表面に再び運ばれ、その場所で、中性ｐＨに起因して、ＩｇＧが放出される。ＦｃＲｎ結合の向上は、選別を向上させ、薬物動態を向上させることができる。
【０４３７】
ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）−ＹＴＥ−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲートは、実施例１７ａに詳細に記載したように調製された。ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）−Ｓ４４２Ｃ−ＹＴＥ−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲートは、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１７／００４０２５号で既に記載されているように調製された。図１９Ａ及び図１９Ｂからわかるように、ＹＴＥ突然変異は、ヒト及びカニクイザルのＦｃＲｎに対するｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）抗体の結合アフィニティ及びアビデティを増加させた。更に、ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）−ＹＴＥ−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲートは、親ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲートとしてのＮＣＩ−Ｈ１７０３、ＳＮＵ５及びＣａｌｕ３と同様のインビトロ活性及びインビボ活性を示した。
【０４３８】
カニクイザルＰＫ及び忍容性試験を行い、親ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲートと比較して、ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）−ＹＴＥ−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲートの忍容性及び薬物動態プロフィールを特性決定した。両コンジュゲートを、１０分間ＩＶ注入することにより、雄カニクイザルに投薬量４及び１２ｍｇ／ｋｇ（抗体投薬量）で投与し、ＰＫプロフィール及び急性忍容性を評価した。加えて、裸の抗体ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）及びｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）−ＹＴＥを、雄カニクイザルに投薬量４ｍｇ／ｋｇで投与し、ＰＫパラメータに対する結合の潜在的な効果を調べた。血液を２８日間にわたって集め、ＡＤＣ、全抗体及び遊離ペイロード濃度を測定した。生存率、臨床観察、体重及び臨床病理学に基づき、忍容性を決定した。
【０４３９】
図２０からわかるように、ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）−ＹＴＥ−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲートのカニクイザルＰＫデータを、親コンジュゲートと比較すると、ＹＴＥ突然変異が、親コンジュゲートと比較して、曝露時間を延ばすことがわかった。これに加え、裸のｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）抗体及びｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）−ＹＴＥ抗体のカニクイザルＰＫデータは、結合が、ＰＫパラメータに対して最小限の効果しかないこと、ＹＴＥ突然変異が、裸の抗体及びコンジュゲート両方のＰＫパラメータを向上させることを示した。更に、ｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４及びｈＭＡＢ−Ａ（２Ｉ．２）−ＹＴＥ−ｓＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲートは、１２ｍｇ／ｋｇの投薬量まで、最小限の皮膚臨床観察と、血液パラメータに対する用量依存性の影響がありつつ、十分に忍容性であった。
【０４４０】
本明細書で述べられるあらゆる刊行物及び特許は、個々の刊行物または特許明細書が、具体的かつ個々に、全体的に本明細書に参考として組み込まれるのと同じ程度まで、本明細書に参考として組み込まれる。本発明を、その具体的な実施形態と組み合わせて記載してきたが、さらなる改変が可能であることが理解されるだろう。本出願は、一般的に、本発明の原理に従って、本発明の任意の変形、使用または適応を包含することを意図している。本発明が属する技術分野でよく知られているか、または通常の実施内にある本開示からのこのような発展を含み、本明細書で既に示した本質的な特徴に適用してもよいからである。
【図１Ａ】
2020504607.tif 000268
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
2020504607.tif 000270
【図２】
2020504607.tif 000271
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
2020504607.tif 000275
【図６】
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【図７】
2020504607.tif 000277
【図８】
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【図９】
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【図１０】
2020504607.tif 000280
【図１１】
2020504607.tif 000281
【図１２】
2020504607.tif 000282
【図１３】
2020504607.tif 000283
【図１４】
2020504607.tif 000284
【図１５】
2020504607.tif 000285
【図１６】
2020504607.tif 000286
【図１７】
2020504607.tif 000287
【図１８】
2020504607.tif 000288
【図１９】
2020504607.tif 000289
【図２０】
2020504607.tif 000290
【国際調査報告】
2020504607.tif 000291
2020504607.tif 000292
2020504607.tif 000293
2020504607.tif 000294
2020504607.tif 000295