(57)【要約】本発明は、陽イオン性ナノ粒子とウイルスとの組み合わせ及びその使用に関する。本発明は、詳細には、生存ウイルス、好ましくは、エンベロープのない生存ウイルスの感染能力を増強するためのナノ粒子の使用に関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生存ウイルスの感染能力を増強するための陽イオン性ナノ粒子の使用。
【請求項２】
前記ウイルスが、アデノウイルス科、カリモウイルス科、ルディウイルス科、パピローマウイルス科、フィコドナウイルス科、テクティウイルス科、パポバウイルス科、サーコウイルス科、パルボウイルス科、ビルナウイルス科、レオウイルス科、アストロウイルス科、カリシウイルス科、ピコルナウイルス科、ポティウイルス科、ポリオーマウイルス科、ヘペウイルス科、アルテリウイルス科、アネロウイルス科、パピローマウイルス科、パラミクソウイルス科、トガウイルス科、ヘルペスウイルス科、オルトミクソウイルス科、フラビウイルス科、ヘパドナウイルス科、ラブドウイルス科、ポックスウイルス科、フィロウイルス科、レトロウイルス科、コロナウイルス科、バキュロウイルス科、レオウイルス科並びにファージ及びバクテリオファージ並びにこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記ウイルスが、組換えウイルス、欠陥ウイルス又は弱毒ウイルスである、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
前記ウイルスが、ノンエンベロープウイルスである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
前記ノンエンベロープウイルスが、アデノウイルス科、カリモウイルス科、マイオウイルス科、サイフォウイルス科、ポドウイルス科、ルディウイルス科、パピローマウイルス科、フィコドナウイルス科、テクティウイルス科、パポバウイルス科、サーコウイルス科、パルボウイルス科、ビルナウイルス科、レオウイルス科、アストロウイルス科、カリシウイルス科、ピコルナウイルス科、ポティウイルス科、ポリオーマウイルス科、ヘペウイルス科、アルテリウイルス科、アネロウイルス科及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記陽イオン性ナノ粒子が前記ウイルスを被覆している、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
＋１℃〜４５℃の温度の範囲における、ウイルス製剤の安定性を向上させるための陽イオン性ナノ粒子の使用。
【請求項８】
前記ナノ粒子が、陽イオン性多糖ナノ粒子、陽イオン性化合物でコーティングされたＰＬＡ、ＰＧＡ若しくはＰＬＧＡナノ粒子、キトサン及びその誘導体、又は陽イオン性ミセル若しくは陽イオン性リポソームから選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
前記ナノ粒子が、陽イオン性多糖ナノ粒子、特に、陽イオン性マルトデキストリンナノ粒子、例えば、脂質コアナノ粒子のある若しくは脂質コアナノ粒子のない多孔性マルトデキストリン等、例えば、ＮＰ＋又はＤＧＮＰ等、又は陽イオン性化合物、例えば、ＰＥＩ等、キトサン及びその誘導体、例えば、トリメチルアンモニウムキトサン等でコーティングされたＰＬＡ、ＰＧＡ若しくはＰＬＧＡナノ粒子から選択される、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
陽イオン性ナノ粒子及び生存ウイルスから本質的になる組み合わせ製品。
【請求項１１】
前記ウイルスが、アデノウイルス科、カリモウイルス科、ルディウイルス科、パピローマウイルス科、フィコドナウイルス科、テクティウイルス科、パポバウイルス科、サーコウイルス科、パルボウイルス科、ビルナウイルス科、レオウイルス科、アストロウイルス科、カリシウイルス科、ピコルナウイルス科、ポティウイルス科、ポリオーマウイルス科、ヘペウイルス科、アルテリウイルス科、アネロウイルス科、パピローマウイルス科、パラミクソウイルス科、トガウイルス科、ヘルペスウイルス科、オルトミクソウイルス科、フラビウイルス科、ヘパドナウイルス科、ラブドウイルス科、ポックスウイルス科、フィロウイルス科、レトロウイルス科、コロナウイルス科、バキュロウイルス科、レオウイルス科並びにファージ及びバクテリオファージ並びにこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１０に記載の組み合わせ製品。
【請求項１２】
前記ナノ粒子が、陽イオン性多糖ナノ粒子、陽イオン性化合物でコーティングされたＰＬＡ、ＰＧＡ若しくはＰＬＧＡナノ粒子、キトサン及びその誘導体、又は陽イオン性ミセル若しくは陽イオン性リポソームから選択される、請求項１０又は１１に記載の組み合わせ製品。
【請求項１３】
前記ナノ粒子が、陽イオン性多糖ナノ粒子、特に、陽イオン性マルトデキストリンナノ粒子、例えば、脂質コアナノ粒子のある若しくは脂質コアナノ粒子のない多孔性マルトデキストリン等、例えば、ＮＰ＋又はＤＧＮＰ等、又は陽イオン性化合物、例えば、ＰＥＩ等、キトサン及びその誘導体、例えば、トリメチルキトサン等でコーティングされたＰＬＡ、ＰＧＡ若しくはＰＬＧＡナノ粒子から選択される、請求項１２に記載の組み合わせ製品。
【請求項１４】
ウイルス生産の方法における、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の組み合わせ製品の使用。
【請求項１５】
ａ）  宿主細胞培養物を、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の組み合わせ製品と共にインキュベートするステップと、
ｂ）  前記宿主細胞によって生産された前記ウイルスを回収するステップと
を含む、ウイルスを製造するための方法。
【請求項１６】
生存ウイルスを過剰量の陽イオン性ナノ粒子と共にインキュベートするステップを含む、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の組み合わせ製品を調製する方法であって、前記過剰量が、陽イオン性ナノ粒子の量が感染性ウイルス粒子の量よりも好ましくは少なくとも１０倍多いこと（重量／重量比）を意味する、方法。
【請求項１７】
がん、心血管系疾患、神経変性疾患及び感染症を治療するための方法における使用のための、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の組み合わせ製品。
【請求項１８】
ワクチンとしての使用のための、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の組み合わせ製品。
【請求項１９】
遺伝子療法における使用のための、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の組み合わせ製品。
【請求項２０】
タンパク質生産の方法における、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の組み合わせ製品の使用。
【請求項２１】
請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の組み合わせ製品及び少なくとも１種の薬学的に許容される添加剤を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、陽イオン性ナノ粒子とウイルスとの組み合わせ及びその使用に関する。本発明は、詳細には、生存ウイルス、好ましくは、エンベロープのない生存ウイルスの感染能力を増強するためのナノ粒子の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
世界全体で毎年数百万人の死亡の原因となっているにもかかわらず、ウイルスは、いくつかの疾患の予防及び治療における有望なツールとも考えられている。ウイルスは、宿主細胞に効率良く到達し、宿主細胞の機構を利用してウイルスの複製を促進する。これらの能力は、ウイルスが、病的な細胞等の特定の群の細胞をターゲティングして作用するための極めて興味深いツールであるように見せ、又はワクチン接種に使用することができる。ウイルス療法の概念は、ウイルス感染を利用するが、複製及び毒性を導くウイルス遺伝子のその後の発現を回避する。ウイルス療法は、疾患を治療するためにウイルスを再プログラミングすることによってウイルスを治療剤に転換するためにバイオテクノロジーを使用する治療である。ウイルス療法には、以下の３つの主要な種類：抗がん腫瘍崩壊性ウイルス、遺伝子療法のためのウイルスベクター及びウイルス免疫療法がある。これらの３つのアプローチは、「改変ウイルスに基づく療法」の用語のもとにまとめることができる。
【０００３】
現在、改変ウイルスは、がん、心血管系疾患、神経変性疾患及び感染症等の病状を治療するために使用されている（Ｔｈｏｍａｓら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２００３、第４巻、３４６〜３５８を参照されたい）。しかし、こうしたウイルスは限定された感染能力を有し、治療効果を得るために大量のウイルスが通常必要とされる。
【０００４】
したがって、改変ウイルスの感染能力を改良するために、特に、改変ウイルスの治療有効性を増強するために又は改変ウイルスの生産収量を改良するために、新規経路を開発する必要性がある。
【０００５】
Ｎｉｔｔａｙａらの論文「Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｃｏａｔｉｎｇ  ｏｎ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ」には、アデノウイルス感染力に対する磁性ナノ粒子の効果が記載されている。この論文には、３種のコア−シェル型酸化鉄磁性ナノ粒子が詳述されており、それらのナノ粒子は、その表面コーティング、粒子サイズ並びに、特定のアデノウイルスの腫瘍崩壊性効力を増強するその能力及び血清又は中和抗体の阻害効果に対してその効力を安定させるその能力のための磁気特性において異なっている。磁場における磁性ナノ粒子の使用には、こうした技術の適用が制限される。
【０００６】
本発明の発明者らは、現在、生存ウイルスを特定のナノ粒子と単純に組み合わせることにより、血清の存在下であっても、その生存ウイルス、特に、エンベロープのない生存ウイルスが細胞に感染する能力を高めることが可能であることを発見した。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、生存ウイルスの感染能力を増強するためのナノ粒子の使用に関する。したがって、本発明は、生存ウイルスと組み合わされた陽イオン性ナノ粒子、その使用、生存ウイルスとナノ粒子の組み合わせを調製するための方法、及び生存ウイルスを製造するための方法に関する。さらに、本発明は、がん、心血管系疾患、神経変性疾患及び感染症の治療、並びにワクチン、遺伝子療法及びウイルス製剤安定化を含む、医学的適用におけるこうした組み合わせの使用にも関する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】陽イオン性ナノ粒子のサイズ（Ｚ平均）、多分散指数（ＰＤＩ）及びゼータ電位の例を示した図である。ＰＬＧＡ  ＰＥＩ：ＰＥＩでコーティングされたＰＬＧＡナノ粒子。ＰＬＧＡキトサン：キトサンでコーティングされたＰＬＧＡナノ粒子。ＮＰ＋：陽イオン性マルトデキストリンナノ粒子。ＤＧ７０：脂質コアのあるＮＰ＋。リポソーム＋：陽イオン性リポソーム。ＰＬＧＡ：ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）。ＰＥＩ：ポリ（エチレンイミン）。
【図２】ＤＧ７０陽イオン性ナノ粒子、ウイルス及び質量比１／３での組み合わせ製品（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔ）のサイズ及びゼータ電位の例を示した図である。ＤＧ７０：脂質コアのある陽イオン性マルトデキストリンナノ粒子。ＧＭＢ：ガンボロウイルス、ＮＤＶ：ニューカッスル病ウイルス、Ｐｏｌｉｏ：ポリオウイルス−１、Ｒｅｏ：レオウイルス、Ｒｏｔａ：ロタウイルスＳＡ−１１、ＢＶＤＶ：ウシウイルス性下痢症ウイルス、ＲＳＶ：呼吸器合胞体ウイルス、ＨＳＶ：単純ヘルペスウイルス１。
【図３】ＤＧ７０陽イオン性ナノ粒子、死滅ウイルス及び比１／１０（ｗ／ｗ）での組み合わせ製品のサイズ及びゼータ電位の例を示した図である。ＤＧ７０：脂質コアのある陽イオン性マルトデキストリンナノ粒子。ＧＭＢ：ガンボロウイルス、Ｐｏｌｉｏ：ポリオウイルス−１、Ｒｅｏ：レオウイルス、Ｒｏｔａ：ロタウイルスＳＡ−１１。
【図４】単独又は組み合わせ製品でのＵＶ不活化ウイルストランスフェクションの誘導倍率を示した図である。ＰＬＧＡ  ＰＥＩ：ＰＥＩでコーティングされたＰＬＧＡナノ粒子。ＰＬＧＡキトサン：キトサンでコーティングされたＰＬＧＡナノ粒子。ＮＰ＋：陽イオン性マルトデキストリンナノ粒子。ＤＧ７０：脂質コアのあるＮＰ＋。リポソーム＋：陽イオン性リポソーム。ＰＬＧＡ：ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）。ＰＥＩ：ポリ（エチレンイミン）。Ｐｏｌｉｏ：ポリオウイルス−１、ＨＳＶ：単純ヘルペスウイルス、ＢＶＤＶ：ウシウイルス性下痢症ウイルス、ＲＳＶ：呼吸器合胞体ウイルス、Ｒｏｔａ：ロタウイルス、Ｒｅｏ：レオウイルス、ＮＤＶ：ニューカッスル病ウイルス、ＧＭＢ：ガンボロウイルス。
【図５】死滅ウイルスエンドサイトーシスにおける、ＮＰと結合された又はされていないガンボロにおけるクロルプロマジン（ＣＰＺ）の試験を示した図である。
【図６】ＤＧ７０陽イオン性ナノ粒子、ポリオウイルス−１及び関連した組み合わせ製品のＣＰＥを示した図である。単独又はナノ粒子との組み合わせで、１０５〜１０−４  ＴＣＩＤ５０／ｍＬの範囲に及ぶポリオウイルス−１の多様な希釈物でＨｅｐ−２細胞を感染させた。６日後にＣＰＥを評価した。データは、独立した２回の実験からのものであり、平均＋ＳＤとして表している。細胞：未処理の細胞、ナノ：脂質コアのある陽イオン性マルトデキストリンナノ粒子（ＤＧ７０）。
【図７】単独又はＤＧ７０−ナノ粒子との組み合わせで、多様なウイルスＴＣＩＤ５０／ｍｌでポリオウイルス−１に感染させた細胞におけるウイルス力価の動態を示した図である。単独又は組み合わせ製品で、１０１〜１０−４  ＴＣＩＤ５０／ｍＬの範囲に及ぶポリオウイルス−１の多様な希釈物でＨｅｐ−２細胞を感染させた。接種後、異なる時間に上清を回収した。Ｈｅｐ２細胞培養物において、リード−ミュエンチの方法により、５０％組織培養感染量についての限界希釈アッセイによってポリオウイルス力価を決定した。
【図８】ウイルス単独対組み合わせ製品の感染能力の上昇倍率を示した図である。ウイルス単独又は組み合わせ製品に感染した細胞の上清を使用して細胞を再感染させた。ＣＰＥを算出し、ウイルスと組み合わせ製品との間の上昇倍率をｌｏｇ１０として表した。ＰＬＧＡ（−）：未コーティングの陰イオン性ＰＬＧＡナノ粒子。ＰＬＧＡキトサン：キトサンでコーティングされたＰＬＧＡナノ粒子。ＰＬＧＡ  ＰＥＩ：ＰＥＩでコーティングされたＰＬＧＡナノ粒子。ＮＰ＋：陽イオン性マルトデキストリンナノ粒子。ＤＧ７０：脂質コアのあるＮＰ＋。リポソーム＋：陽イオン性リポソーム。ＰＬＧＡ：ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）。ＰＥＩ：ポリ（エチレンイミン）。Ｐｏｌｉｏ：ポリオウイルス−１、ＣＰＶ：イヌパルボウイルス。Ｒｏｔａ：ロタウイルスＳＡ−１１、ＨＳＶ：単純ヘルペスウイルス１、ＲＳＶ：呼吸器合胞体ウイルス、ＢＶＤＶ：ウシウイルス性下痢症ウイルス。Ｔｏｘ：細胞毒性。Ｉｎｈｉｂ：ウイルス単独と比較した組み合わせ製品の阻害効果。
【図９】ポリオウイルス−１又はＤＧ７０−ポリオウイルス−１組み合わせ製品での６又は１８時間の感染後のＶＰ−１陽性細胞の百分率を示した図である。数字は、細胞の総数／ＶＰ１＋細胞の数（ＶＰ１＋細胞の％）を表している。ＤＧ７０：脂質コアのある陽イオン性マルトデキストリンナノ粒子。Ｐｏｌｉｏ：ポリオウイルス−１。ＭＯＩ：感染多重度。百分率は、感染細胞を指す。灰色の区画は、明白な溶解プラークの存在を指す。
【図１０】ＶＰ１免疫蛍光によるウイルスの検出の代表的な顕微鏡写真を示した図である。０．６の感染多重度で細胞を１８時間感染させ、抗ＶＰ１免疫染色（下の円）を行った。核をヘキスト（Ｈｏｅｓｃｈｔ）によって染色した（上の円）。
【図１１】Ｑ−ＰＣＲによるウイルスＲＮＡの検出を示した図である。７．１０−２の感染多重度で細胞を感染させ、４８時間後にＲＮＡを採取した。数字は、エンテロウイルスの一般的なノンコーディング領域に相対したＣｔの絶対値を表している。ＤＧ７０：脂質コアのある陽イオン性マルトデキストリンナノ粒子。Ｐｏｌｉｏ：ポリオウイルス−１。
【図１２Ａ】熱変性に対するウイルスの安定化の試験を示した図である。Ａ：５５℃で２時間３０分。
【図１２Ｂ】熱変性に対するウイルスの安定化の試験を示した図である。Ｂ：４５℃で２４時間。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明者らは、生存ウイルス、特に、ノンエンベロープウイルスをナノ粒子と、特に、陽イオン性ナノ粒子と組み合わせることによって、その生存ウイルスの感染能力を増強することが可能であることを発見した。特に、本発明者らは、陽イオン性ナノ粒子と組み合わされたノンエンベロープ生存ウイルスが、遊離ウイルスとも呼ばれる組み合わされていないウイルスに必要な濃度よりも極めて低い濃度で細胞に感染できたことを観察した。この能力は、ワクチンのためのウイルス生産又は、所望の効果を得るために大量のウイルスが現在必要とされている、遺伝子療法アプローチを含む、ウイルス療法におけるウイルス生産において特に興味深い。
【００１０】
したがって、第１の態様では、本発明は、生存ウイルスの感染能力を増強するための陽イオン性ナノ粒子の使用に関する。
【００１１】
本発明の文脈において、「ウイルスの感染能力」とは、細胞に感染するウイルスの能力を指す。好ましい実施形態では、ウイルスの感染能力は、１０倍、より好ましくは、１００倍、さらにより好ましくは、１０００倍増強される。感染能力の向上は、特定の陽イオン性ナノ粒子型とウイルス型の特定の組み合わせと連鎖している。こうした向上の例は、結果の節の３ｂ）及び図７のもとに示されている。
【００１２】
本明細書中で使用される場合、「生存ウイルス」とは、死滅していないウイルスを指す。生存ウイルスは、許容細胞内に侵入して複製することができるか又は以下の特性のうちの１つを保持していなければならない：細胞内に侵入する能力、複製する能力及び／又はゲノム内に挿入される能力。生存ウイルスは、弱毒化されていても又は弱毒化されていなくてもよく、欠陥があっても又は欠陥がなくてもよく、組換え体であっても又は組換え体でなくてもよい。組換えウイルスは、例えば、その免疫原性を高める若しくは変調させるために又はタンパク質生産を向上させるために外因性遺伝子の挿入によって改変することもできる。反対に、死滅ウイルスは、特に、ウイルスタンパク質又は核酸が、任意の方法によって、例えば、熱不活性化によって、化学的又は物理的な架橋によって、界面活性剤等の不安定化剤の使用又は他の現在及び将来のあらゆるプロセスによって変性されている場合に、全てのウイルス機能性を失っている。
【００１３】
ウイルスは、細胞内に侵入するために、異なる経路を使用することができる。これらの経路のうちの１つは、以下のエンドサイトーシスを介して侵入することにある：ウイルスは、細胞上に存在する表面受容体に結合し、それによって、エンドサイトーシス小胞を介して細胞内にエンドサイトーシスされる。本発明者らは、ナノ粒子が、ウイルスのエンドサイトーシスを増進させること及び／又はエンドサイトーシス小胞から脱出するウイルスの能力を向上させることによってウイルスの感染能力を増強すると考えている。
【００１４】
本発明によれば、ナノ粒子との組み合わせで使用されるウイルスは、生存ウイルス、例えば、アデノウイルス、レトロウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルス、バクテリオファージ、バキュロウイルス等、及びワクチン、遺伝子療法、腫瘍治療において使用される又は細胞内での組換え若しくは天然のタンパク質生産のために使用される全てのウイルスであり、ノンエンベロープウイルスの中で選択されることが好ましい。本発明において有用なウイルスには、ＤＮＡウイルス及びＲＮＡウイルスが含まれる。本発明において有用なウイルスは、以下のファミリーの中で選択されてもよいが、これらに限定されない：アデノウイルス科（Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ）、カリモウイルス科（Ｃａｕｌｉｍｏｖｉｒｉｄａｅ）、ルディウイルス科（Ｒｕｄｉｖｉｒｉｄａｅ）、パピローマウイルス科（Ｐａｐｉｌｌｏｍａｒｉｖｉｄａｅ）、フィコドナウイルス科（Ｐｈｙｃｏｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）、テクティウイルス科（Ｔｅｃｔｉｖｉｒｉｄａｅ）、パポバウイルス科（Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ）、サーコウイルス科（Ｃｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ）、パルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）、ビルナウイルス科（Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）、レオウイルス科（Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ）、アストロウイルス科（Ａｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、カリシウイルス科（Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ）、ピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）、ポティウイルス科（Ｐｏｔｙｖｉｒｉｄａｅ）、ポリオーマウイルス科（Ｐｏｌｉｏｍａｒｉｖｉｄａｅ）、ヘペウイルス科（Ｈｅｐｅｖｉｒｉｄａｅ）、アルテリウイルス科（Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｉｄａｅ）、アネロウイルス科（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｉｄｉａ）、パピローマウイルス科、パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、トガウイルス科（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄｉａｅ）、ヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）、オルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）、ヘパドナウイルス科（Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）、ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、ポックスウイルス科（Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ）、フィロウイルス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）、バキュロウイルス科（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、レオウイルス科並びに、これらに限定されないが、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）、サイフォウイルス科（Ｓｉｐｈｏｖｉｒｉｄａｅ）、ポドウイルス科（Ｐｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ）等のファージ及びバクテリオファージ。
【００１５】
より詳細には、本発明において有用なノンエンベロープウイルスには、これらに限定されないが、パロウイルス科（Ｐａｒｏｖｉｒｉｎａｅ）、ピコルナウイルス科、デンソウイルス属（Ｄｅｎｓｏｖｉｒｕｓ）、ディペンドウイルス属（Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ）、パピローマウイルス属（Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）、ポリオーマウイルス属（Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ）、マストアデノウイルス属（Ｍａｓｔａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、アデノウイルス科、エンテロウイルス属（Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ）、ヘパトウイルス属（Ｈｅｐａｔｏｖｉｒｕｓ）、ライノウイルス属（Ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ）、ノロウイルス属（Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ）、アストロウイルス属（Ａｓｔｒｏｖｉｒｕｓ）、アルテリウイルス属（Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｕｓ）、オルトレオウイルス属（Ｏｒｔｈｏｒｅｏｖｉｒｕｓ）、オルビウイルス属（Ｏｒｂｉｖｉｒｕｓ）、ロタウイルス属（Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）、コルティウイルス属（Ｃｏｌｔｉｖｉｒｕｓ）、アビビルナウイルス属（Ａｖｉｂｉｒｎａｖｉｒｕｓ）、ビルナウイルス科及びレオウイルス属（Ｒｅｏｖｉｒｕｓ）が含まれる。好ましい実施形態では、ノンエンベロープウイルスは、エンテロウイルス属（エコー（Ｅｃｈｏ）、ポリオウイルス１（Ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ  １））、ＩＢＤＶ  ガンボロ（ＩＢＤＶ  Ｇｕｍｂｏｒｏ）、ロタウイルス属（ロタウイルスＳＡ１１（ｒｏｔａｖｉｒｕｓ  ＳＡ１１））からなる群から選択される。
【００１６】
本発明によれば、本明細書中に記載の異なる適用のために、異なる型のウイルスを組み合わせて使用することができる。
【００１７】
以下に、ワクチンに使用されるウイルスの例を列挙する。
【００１８】
パラミクソウイルス科（エンベロープ）  →  モルビリウイルス  →  麻疹ウイルス
→  ルブラウイルス  →  ムンプスウイルス
→  ニューモウイルス  →  ＲＳＶ
トガウイルス科（エンベロープ）  →  ルビウイルス      →  風疹ウイルス
→  アルファウイルス  →  東部ウマ脳炎ウイルス
→  エンテロウイルス７１
ヘルペスウイルス科（エンベロープ）  →  バリセロウイルス  →  帯状疱疹ウイルス
→  ヘルペスウイルス  →  単純ヘルペス
→  サイトメガロウイルス
→  リンホクリプトウイルス  →  エプスタイン−バールウイルス
オルトミクソウイルス科（エンベロープ）  →  インフルエンザウイルス  →  インフルエンザウイルス
レオウイルス科                    →  ロタウイルス
フラビウイルス科（エンベロープ）  →  フラビウイルス  →  黄熱  
→  日本脳炎ウイルス
→  ダニ媒介脳炎ウイルス
→  デングウイルス
→  ウエストナイルウイルス
→  ジカウイルス
→  Ｃ型肝炎ウイルス
パピローマウイルス科（Ｐａｐｉｌｌｉｏｍａｖｉｒｉｄａｅ）  →  パピローマウイルス  →  ヒトパピローマウイルス
ヘパドナウイルス科（エンベロープ）  →  オルトヘパドナウイルス  →  Ｂ型肝炎ウイルス
ピコルナウイルス科                  →  ヘパトウイルス  →  Ａ型肝炎ウイルス
→  エンテロウイルス  →  ポリオウイルス
→  コクサッキーＢウイルス（Ｃｏｘｓａｋｉｅ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ）
ラブドウイルス科（エンベロープ）    →  リッサウイルス  →  狂犬病ウイルス
ポックスウイルス科（エンベロープ）  →  オルトポックスウイルス  →  天然痘ウイルス
→  ワクチニアウイルス
→  アビポックスウイルス  →  アビポックスウイルス
ヘペウイルス科                      →  オルトヘペウイルス  →  Ｅ型肝炎
フィロウイルス科（エンベロープ）    →  エボラウイルス  →  エボラウイルス
→  マールブルグウイルス  →  マールブルグウイルス
レトロウイルス科（エンベロープ）    →  レンチウイルス  →  ＨＩＶ
→  デルタレトロウイルス  →  ＨＴＬＶ−１
カリシウイルス科（Ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ）  →  ノロウイルス
コロナウイルス科（エンベロープ）  →  コロナウイルス  →  ＳＡＲＳ
アデノウイルス科                  →  アデノウイルス
バキュロウイルス科                →  バキュロウイルス
バクテリオファージ（ノンエンベロープ）
サイフォウイルス科
マイオウイルス科
ポドウイルス科
【００１９】
使用されるウイルスは、弱毒化されている又は弱毒化されていない、欠陥のある又は欠陥のない、及び組換え体である又は組換え体ではない生存ウイルスであり、例えば、ワクチン、遺伝子療法、腫瘍治療のための、又は細胞内での組換え若しくは天然のタンパク質生産のために使用される、生存ノンエンベロープウイルスであることが好ましい。
【００２０】
本発明の意味において、ナノ粒子は、１〜５００ナノメートルの間のサイズ範囲を有する粒子である。ナノ粒子は、１０〜３００ｎｍの間、特に、３０〜２５０ｎｍの間のサイズ範囲を有することがより好ましい。ナノ粒子は、有機材料若しくは無機材料又は有機化合物と無機化合物との混合物でできていてもよい。ナノ粒子は、多孔性であっても又は多孔性でなくてもよく、ナノ粒子の表面は、陰イオン性、陽イオン性、中性（疎水性若しくは親水性又はこれらの全ての特性の混合）であってもよい。さらに、本発明によるナノ粒子は、溶液中で使用されるのが有利である。したがって、ナノ粒子という用語には、溶液中でナノ粒子状の形態にある粒子又は分子、例えば、キトサン等も含まれる。溶液は、水溶液、緩衝液又は血清溶液であってもよい。発明者らは、ある直鎖分子、例えば、キトサン等が、溶液中で、従来のナノ粒子のような挙動を示す、ナノスケールコイルを形成することを実際に見出した。キトサンは、したがって、従来のナノ粒子の形態で（例えば、Ｑｉら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００４、３３９（１６）、２６９３〜２７００）、又は溶液中でそれ自体若しくは加水分解物として使用されてもよい。
【００２１】
本発明によれば、ナノ粒子は、陽イオン性ナノ粒子である。好適な陽イオン性ナノ粒子は、例えば、以下の通りである：
【００２２】
陽イオン性多糖ナノ粒子、例えば、陽イオン性マルトデキストリンナノ粒子又はキトサンナノ粒子等。陽イオン性マルトデキストリンナノ粒子は、例えば、脂質コアのある又は脂質コアのない多孔性マルトデキストリンナノ粒子である（Ｐａｉｌｌａｒｄら、Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．、２０１０、２７（１）、１２６〜１３３を参照されたい）。脂質コアのないマルトデキストリンナノ粒子は、実験的な部分においてＮＰ＋とも呼ばれている、陽イオン性網状ナノ粒子に該当する。脂質コアのあるマルトデキストリンナノ粒子では、コアは、例えば、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＧ）に該当してもよい；得られたナノ粒子は、実験的な部分においてＤＧＮＰ（又はＮＰＬ）と呼ばれる。キトサンナノ粒子は、例えば、キトサンナノ粒子及びその誘導体、例えば、（トリメチルキトサン）（Ｑｉら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００４、３３９（１６）、２６９３〜２７００を参照されたい）に該当してもよい、
（溶液中の）キトサン及びそれらの加水分解物、
陽イオン性ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）又はポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）ナノ粒子、これらは、例えば、キトサンで（例えば、Ｋｕｍａｒら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２００４、２５（１０）、１７７１〜１７７７、又はＣｕｉら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、２００１、７５（３）、４０９〜４１９を参照されたい）若しくはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）で、ＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウムブロミド）で、又は第一級、第二級、第三級若しくは第四級アミン化合物、例えば、トリメチルアンモニウムキトサン等でコーティングされていてもよい。
陽イオン性ミセル又は陽イオン性リポソーム（Ｇａｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、１９９１、１７９（１）、２８０〜２８５を参照されたい）。
【００２３】
ナノ粒子の陽イオン性電荷が陽イオン性リガンドを介して得られる場合、このリガンドは、ナノ粒子の表面に共有結合的に結合又は吸着されていてもよい。例えば、陽イオン性多糖は、架橋されたポリマーであってもよく、第四級アンモニウム等の陽イオン性リガンドで誘導体化される、デンプン、デキストラン、デキストリン、及び好ましくはマルトデキストリンの中で選択される多糖の間の反応によって得られてもよい。第一級、第二級及び第三級アミンも使用されうる。特に、陽イオン性多糖は、マルトデキストリンとグリシジル−トリメチルアンモニウムクロリドとの間の反応から得ることができる。
【００２４】
特に好ましい実施形態では、本発明に従って使用されるナノ粒子は、脂質コアナノ粒子のない又はある多孔性マルトデキストリン（それぞれＮＰ＋又はＤＧＮＰ）である。こうしたナノ粒子は、例えば、Ｐａｉｌｌａｒｄら、（Ｐａｉｌｌａｒｄら、Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．、２０１０、２７（１）、１２６〜１３３）及び国際公開２０１４／０４１４２７号に開示されており、７０ＤＧＮＰ＋ナノ粒子又はＤＧ７０ナノ粒子と呼ばれる。多孔性ナノ粒子は、キトサン及びそれらの誘導体、例えば、トリメチルキトサン等からも得ることができる。上記のように、キトサン単独又はその加水分解物も、溶液中でそれがそれ自身でナノ粒子を形成するので、使用されうる。非多孔性陽イオン性ナノ粒子、例えば、陽イオン性化合物、特に、ＰＥＩ（ポリエチレンイミン）、キトサン、ＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウムブロミド）、第一級、第二級、第三級若しくは第四級アミン化合物、又はキトサン及びその誘導体でコーティングされたＰＬＡ（ポリ乳酸）又はＰＧＡ（ポリグリコール酸）又はＰＬＧＡ（ポリ乳酸ｃｏ−グリコール酸）ナノ粒子等も使用されうる。いくつかの陽イオン性ナノ粒子の代表的なサイズ及びゼータ電位は、図１に示されている。
【００２５】
好ましい実施形態では、本発明に従って使用される陽イオン性ナノ粒子は、陽イオン性多糖ナノ粒子、特に、陽イオン性マルトデキストリンナノ粒子、例えば、脂質コアナノ粒子のある若しくは脂質コアナノ粒子のない多孔性マルトデキストリン（それぞれＮＰ＋又はＤＧＮＰ）等、又は陽イオン性化合物、例えば、ＰＥＩ等、キトサン及びその誘導体、例えば、トリメチルキトサン等でコーティングされたＰＬＡ若しくはＰＧＡ若しくはＰＬＧＡナノ粒子から選択される。
【００２６】
第２の態様では、本発明は、上記に定義されているような陽イオン性ナノ粒子及び生存ウイルス、特に、上記に定義されているようなエンベロープのない生存ウイルスから本質的になる組み合わせ製品、その調製方法及びその使用に関する。
【００２７】
１．  組み合わせ製品は、ウイルスを陽イオン性ナノ粒子と共に、特に、過剰量の陽イオン性ナノ粒子と共にインキュベートすることによって得られることが好ましい。陽イオン性ナノ粒子の量は、感染性ウイルス粒子の量よりも（重量／重量で）少なくとも１０倍、おそらく１００倍、又はさらに、１０００倍多い。タンパク質の見かけ重量は、マイクロＢＣＡ法等の感度が高いアッセイ又は他の全ての好都合な方法によって決定することができる。比が、ウイルス粒子の数に対する陽イオン性ナノ粒子の相対数に相当する場合、これらの２つの成分を、比１：１、又は１０：１又はさらに１００：１で組み合わせることができる。こうした比の算出の方法とは関係なく、陽イオン性ナノ粒子の必要量は、ウイルスの純度に依存し、ウイルスの純度は、ウイルス製剤においてウイルスと一緒に自然に混入しているタンパク質の量と連鎖している。したがって、組み合わせ製品が、ウイルスと結合しているタンパク質を含んでいてもよく、したがって、「陽イオン性ナノ粒子及び生存ウイルスから本質的になる」と言及されることに注目できる。その製剤がより純粋であればあるほど、大量の粒子の必要性は低くなる。これらの条件下で得られた組み合わせ製品の正のゼータ電位は、陽イオン性ナノ粒子がウイルスを被覆していることを示唆する。したがって、特定の実施形態では、ウイルスは、陽イオン性ナノ粒子によって覆われているべきである。しかし、この結果は、ウイルスがナノ粒子によって覆われていない場合でも、ナノ粒子がウイルスの侵入を促進するように、ナノ粒子が溶液中でウイルスと相互作用している可能性があることを排除できない。
【００２８】
２．
いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、過剰量の陽イオン性ナノ粒子がウイルスの表面へのナノ粒子の吸着を導き、したがって、ナノ粒子でコーティングされたウイルスをもたらすようであると考えている。
【００２９】
したがって、本発明は、上記に定義されている組み合わせ製品を調製する方法にさらに関し、前記方法は、生存ウイルスを陽イオン性ナノ粒子、特に、必要に応じて本発明による過剰量の陽イオン性ナノ粒子と共にインキュベートするステップを含む。
【００３０】
特定の実施形態では、インキュベーションは、培地中で３７℃で少なくとも１時間行われるのが有利である。当業者は、インキュベートされるウイルスの機能として適切な培地を選択することになる。一般に、適切な培地には、これらに限定されないが、最少必須培地及びその改変培地（ダルベッコ改変、Ｆ１２ベース、ＡＴＣＣ改変…）、イーグル培地及びその改変培地、ＲＰＭＩ１６４０培地及びその改変培地、イスコフ改変ダルベッコ培地及びその改変培地が含まれる。培地は、熱失活された血清サプリメント（ウシ胎児、ウマ、子ウシ…由来）、抗生物質、アミノ酸、緩衝試薬のような添加物を含んでいてもよい。
【００３１】
本発明による組み合わせ製品は、特に、例えば、これらに限定されないが、ワクチン、ウイルス生産、ウイルス安定化、遺伝子療法、腫瘍治療、疾患治療又はタンパク質生産等のいくつかの適用に興味深い。ウイルス単独と比較して、本発明による組み合わせ製品は、所与の効果を得るためにより少量のウイルスを使用することを可能にし、これらのウイルス適用における、生存ウイルスと組み合わされたナノ粒子の使用は、特に有利である。
【００３２】
さらに、組み合わせは、熱変性に対するウイルスの保護をもたらす（図１２）。ナノ粒子コーティングの存在のおかげでウイルス製剤の安定性が向上することが提唱される。したがって、本発明は、＋１℃〜＋４５℃の間、好ましくは、＋４℃〜＋２５℃の間、より好ましくは、＋４℃〜＋８℃の間に含まれる温度の範囲における、ウイルス製剤の安定性を向上させるための陽イオン性ナノ粒子の使用にも関する。特定の実施形態では、陽イオン性ナノ粒子と組み合わされたウイルスは、一般に＋１５℃〜＋２７℃の間に含まれる温度、より正確には約＋２０℃を意味する、室温で安定である。
【００３３】
したがって、本発明は、疾患治療の方法における使用のための上記のような本発明による組み合わせ製品にも関する。特に、本発明は、患者において疾患を治療するための方法に関し、前記方法には、薬学的有効量の本発明による組み合わせ製品をそれを必要とする患者に投与するステップが含まれる。
【００３４】
特定の実施形態では、本発明による組み合わせ製品は、腫瘍崩壊性ウイルスの使用に基づいてがんを治療するための方法において使用されてもよい。腫瘍崩壊性ウイルスは、がん性細胞の溶解を選択的に誘導することができる。換言すれば、本発明は、本発明による組み合わせ製品をそれを必要とする患者に投与することを含む、がんを治療する方法にも関する。ウイルスを介した腫瘍治療は、がん性細胞を特異的に標的にして破壊することによってがんを治療するためにウイルスが使用される、広く普及した方法である。この方法は、（自然に、又はそうするために遺伝子改変されたことによってのいずれかで）がん性細胞においてのみ複製する一部のウイルスの能力に依存している。当業者は、数種類の腫瘍崩壊性ノンエンベロープウイルスを知っており、それらを選択する方法を知っている（例えば、Ｍｅｅｒａｎｉら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１０、４０（１）、１５６〜１７１；又はＢａｒｔｌｅｔｔら  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｎｃｅｒ  ２０１３、１２：１０３を参照されたい）。したがって、本発明のこの態様では、陽イオン性ナノ粒子は、腫瘍崩壊性ノンエンベロープウイルスと組み合わされてもよい。典型的には、腫瘍崩壊性ノンエンベロープウイルスは、例えば、以下のものである：総説であるＢａｒｔｌｅｔｔら  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｎｃｅｒ  ２０１３、１２：１０３に開示されているような、パルボウイルス又はアデノウイルス、例えば、ｈＴＥＲＴ−Ａｄ及びＡｄ５／３−Ｄ２４−ＧＭＣＳＦ等。
【００３５】
本発明による組み合わせ製品は、いわゆる「ウイルス免疫療法」において、ワクチンとしても、又はワクチン組成物中にも使用されうる。ワクチン組成物は、それが対象に一度投与されると、本明細書中に含まれる１種又は複数の抗原に対して保護的な免疫応答を誘発する。それは、例えば、微生物、に対して保護的な免疫応答を誘導し、感染に対して対象を効果的に保護する。したがって、ノンエンベロープウイルスと組み合わされた陽イオン性ナノ粒子を抗原として使用することにより、所望の免疫応答を得るために必要とされるウイルスがより少量になる。典型的には、ワクチン接種に、使用されるウイルスは、弱毒化されている又は弱毒化されていない、欠陥のある又は欠陥のない、組換え体である又は組換え体ではない生存ウイルスである。
【００３６】
さらに、本発明による組み合わせ製品は、遺伝子療法組成物として使用されてもよい。遺伝子療法は、治療用遺伝子を標的細胞に送達するために、ウイルス遺伝子を治療用遺伝子によって置き換えることに依存している。ウイルスベクターをナノ粒子と組み合わせることにより、ウイルスが効率良く標的細胞に侵入するのを可能にすることになる。したがって、こうした組み合わせは、治療の有効性を向上させることになる。典型的には、遺伝子療法のために、使用されるウイルスは、組換え体である。
【００３７】
本発明は、生存ウイルス、特に、本発明によるノンエンベロープウイルスと組み合わされた陽イオン性ナノ粒子を使用することによってウイルスを製造するための方法にも関する。ウイルスは、自分自身によるウイルスの複製を持続することができず、複製するためには生存している宿主を必要とする。ウイルス製造には、ウイルスを生存細胞と共にインキュベートして、細胞機構を使用することによるウイルスの複製を可能にし、生産されたウイルスを回収することが必要とされる。ウイルスは、ウイルス脱殻による細胞からの脱出又は宿主細胞の溶解による放出のいずれかによって生産される。生存ウイルス、特に、ノンエンベロープウイルスと組み合わされた陽イオン性ナノ粒子の使用は、宿主細胞内へのウイルス粒子の侵入を改良し、それはウイルスの生産を増強し、したがって、ウイルスの生産収量を増加させる。
【００３８】
本発明によれば、ウイルスを製造するための方法には、以下のステップが含まれる：
ａ）宿主細胞培養物を、本発明による組み合わせ製品と共にインキュベートするステップ；及び
ｂ）宿主細胞によって生産されたウイルスを回収するステップ。
【００３９】
一実施形態では、インキュベーションステップａ）は、培地中で３７℃で少なくとも１時間行われる。好適な培地には、これらに限定されないが、最少必須培地及びその改変培地（ダルベッコ改変、Ｆ１２ベース、ＡＴＣＣ改変…）、イーグル培地及びその改変培地、ＲＰＭＩ１６４０培地及びその改変培地、イスコフ改変ダルベッコ培地及びその改変培地が含まれる。培地は、熱失活された血清サプリメント（ウシ胎児、ウマ、子ウシ…由来）、抗生物質、アミノ酸、及び／又は緩衝剤のような添加物を含んでいてもよい。
【００４０】
本発明は、組換えタンパク質の生産を改良するために使用することができるあらゆる組換えウイルスにも関する。例えば、ウイルスが、これに限定されないが、組換えタンパク質の生産のためのバキュロウイルスである場合の組み合わせ製品の使用である。バキュロウイルス科ファミリーからの、バキュロウイルスは、昆虫細胞に感染するエンベロープウイルスであり、外来タンパク質の生産のために広く使用されている。本発明の範囲内で、陽イオン性ナノ粒子と組換えバキュロウイルスの組み合わせは、昆虫細胞の感染を改良又は最適化することを可能にするはずであり、したがって、タンパク質生産能力を改良することを可能にするはずである。バキュロウイルス科に加えて、他のウイルスをタンパク質生産のために使用することができ、例えば、カリモウイルス科ウイルスを植物におけるタンパク質生産のために使用することができる。
【００４１】
本発明は、陽イオン性ナノ粒子及び生存ウイルス、特に、本発明によるノンエンベロープウイルスを含む組み合わせ製品並びに少なくとも１種の薬学的に許容される添加剤を含む医薬組成物にさらに関する。前記添加剤は、剤形及び必要とされる投与様式によって、当業者に知られている通常の添加剤の中で選択される。
【実施例】
【００４２】
材料及び方法
１／ナノ粒子の合成：
陽イオン性マルトデキストリンナノ粒子：マルトデキストリンを、室温で磁気的に撹拌しながら２Ｎ水酸化ナトリウムに溶解させる。エピクロロヒドリン及びＧＴＭＡの添加により陽イオン性多糖ゲルを得て、それを、次いで、酢酸で中和し、高圧ホモジナイザー（Ｅｍｕｌｓｉｆｌｅｘ  Ｃ３、Ｆｒａｎｃｅ）を使用して破砕した。このようにして得たナノ粒子を、３００ｋＤａメンブレン（ＰＡＬＬ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用してタンジェンシャルフロー限外濾過（Ｃｅｎｔｒａｍａｔｅ  Ｍｉｎｉｍ  ＩＩ、ＰＡＬＬ、Ｆｒａｎｃｅ）によって精製する。
【００４３】
ＤＧ７０ナノ粒子：脂質コアナノ粒子をベースに有する多孔性マルトデキストリン（ＤＧＮＰ）を、以前に記載されているように（国際公開第２０１４／０４１４２７号）調製した。上記のように得られた陽イオン性マルトデキストリンナノ粒子を、ゲルから液体への相転移温度を超えるジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）と混合してＤＧ７０を作製する。
【００４４】
陰イオン性ＰＬＧＡナノ粒子：負のＰＬＧＡナノ粒子（ＰＬＧＡ（−））をナノ沈澱によって作製する（Ｌｅ  Ｂｒｏｃ−Ｒｙｃｋｅｗａｅｒｔ  Ｄら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ．、２０１３）。ＰＬＧＡコポリマーを、有機相を構成しているアセトン／エタノール（８５：１５）混合物に溶解させ、次いで、撹拌下で水相に注入した。有機溶媒を真空蒸発によって除去する。
【００４５】
ＰＥＩでコーティングされた陽イオン性ＰＬＧＡ：ＰＬＧＡナノ粒子をナノ沈澱によって作製する。ＰＬＧＡコポリマーを、有機相を構成しているアセトン／エタノール（８５：１５）混合物に溶解させる。溶解したＰＬＧＡコポリマーを、１０％（ｗ／ｗ）ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）で補った水相に撹拌下で注入することにより、これらのナノ粒子をカチオン化する。有機溶媒を真空蒸発によって除去する。
【００４６】
キトサンでコーティングされた陽イオン性ＰＬＧＡ：ＰＬＧＡナノ粒子をナノ沈澱によって作製する。ＰＬＧＡコポリマーを、有機相を構成しているアセトン／エタノール（８５：１５）混合物に溶解させる。溶解したＰＬＧＡコポリマーを、１０％（ｗ／ｗ）キトサン溶液で補った水相に撹拌下で注入することにより、これらのナノ粒子をカチオン化する。有機溶媒を真空蒸発によって除去する。
【００４７】
陽イオン性リポソーム：ＤＰＰＣ及びＤＰＰＥをエタノールに可溶化し、この溶液を、次いで、８０℃で撹拌下でシリンジで水に注入することによってＤＰＰＣ／ＤＰＰＥ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン／１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）リポソームを調製する。次いで、リポソームを濾過によって精製し、残ったエタノールを真空下で除去する。
【００４８】
２／細胞株
Ｈｅｐ−２細胞株：Ｈｅｐ−２細胞は、ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ（Ｖｅｒｖｉｅｒ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）によって提供された。エンテロウイルス培養のために十分に構成された、この細胞株を、３７℃で５％ＣＯ２の空気及び加湿された空気中で、不活化された１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％Ｌ−グルタミン並びにペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）−ストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍｌ）及びファンギゾン（０．２５ｍｇ／ｍｌ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｉｎｔ  Ａｕｂｉｎ、Ｆｒａｎｃｅ）で補ったイーグル最少必須培地（ＭＥＭ）で培養した。
【００４９】
ＣＭＴ−Ｕ２７細胞株：イヌ乳房腫瘍（ＣＭＴ−Ｕ２７）細胞株は、原発性腫瘍（浸潤性腺管癌）から派生した。ＣＭＴ−Ｕ２７細胞株（Ｅｖａ  Ｈｅｌｌｍｅｎ准教授からの寄贈品）は、Ｕｐｐｓａｌａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｓｗｅｄｅｎから得られ、３７℃で５％ＣＯ２の空気及び加湿された空気中で、熱失活された１０％ウシ胎児血清、１％Ｌ−グルタミン、ペニシリン−ストレプトマイシン（５０ＩＵ／ｍＬ）で補ったＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。これらの細胞を使用してイヌパルボウイルスを生産させる。
【００５０】
ＣＲＦＫ細胞株：単層のＣｒａｎｄｅｌｌ  Ｒｅｅｓネコ腎臓（ＣＲＦＫ）細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）番号ＣＣＬ−９４（商標））を、３７℃及び５％ＣＯ２で、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％ペニシリン及びストレプトマイシン並びに非必須アミノ酸で補ったダルベコ（Ｄｕｌｂｅｃｏ）（商標）最少必須培地（ＭＥＭ）で培養した。この細胞を使用してイヌパルボウイルスを生産させる。
【００５１】
Ｖｅｒｏ細胞株：Ｖｅｒｏ細胞は、ＡＴＣＣによって提供された（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−８１（商標））。この細胞株を、３７℃で５％ＣＯ２の空気及び加湿された空気中で、不活化された１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％Ｌ−グルタミン及び１％ペニシリンストレプトマイシンで補ったダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。
【００５２】
ＭＡ１０４細胞株：細胞は、ＡＴＣＣによって提供された（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２３７８．１（商標））。この細胞株を、３７℃で５％ＣＯ２の空気及び加湿された空気中で、不活化された１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％Ｌ−グルタミン及び１％ペニシリン−ストレプトマイシンで補ったイーグル最少必須培地（ＭＥＭ）で培養した。
【００５３】
ＭＤＢＫ細胞株：細胞は、ＡＴＣＣによって提供された（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−２２（商標））。この細胞株を、３７℃で５％ＣＯ２の空気及び加湿された空気中で、１０％ウマ血清（ＨＳ）、１％Ｌ−グルタミン、１％非必須アミノ酸及び１％ペニシリン−ストレプトマイシンで補ったイーグル最少必須培地（ＭＥＭ）で培養した。
【００５４】
Ｒａｗ２６４．７細胞株：Ｒａｗ細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＴＩＢ−７１（商標））は、マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）のマクロファージ細胞である。この細胞株を、３７℃で５％ＣＯ２の空気及び加湿された空気中で、不活化された１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％Ｌ−グルタミン、１％非必須アミノ酸及び１％ペニシリンストレプトマイシンで補ったダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。
【００５５】
３／生存ウイルス
ポリオウイルス−１：この実施例において使用した１価の経口ポリオウイルス（ポリオウイルス１）は、Ｅｕｒｏｖｉｒ  Ｈｙｇｉｅｎｅ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔ（Ｌｕｃｋｅｎｗａｌｄｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって１０６  ＴＣＩＤ５０／ｍＬのウイルス力価で提供され、−２０℃で保存した。
【００５６】
イヌパルボウイルス：一本鎖ＤＮＡウイルスであり、パルボウイルス科ファミリーに属する重大な世界的な犬の病原体である、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）は、接触感染性が高く、イヌにおける出血性腸炎の主な病因となる因子である。この試験において使用した株は、ＡＴＣＣ由来（ＡＴＣＣ（登録商標）ＶＲ−２０１７（商標））であり、ＣＲＦＫ細胞及びＣＭＴ−Ｕ２７細胞内で増殖させた。
【００５７】
ロタウイルス：サルのロタウイルス（ＡＴＣＣ（登録商標）ＶＲ−１５６５（商標））ＳＡ−１１株は、レオウイルス科ファミリーの二本鎖ＲＮＡウイルスである。ロタウイルスは、小児において下痢症を引き起こす。推奨される宿主は、ＭＡ−１０４（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２３７８−１）である。
【００５８】
ヒトヘルペスウイルス１型：単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）は、ヒトに感染する、ヘルペスウイルス科ファミリーのメンバーである。これは、エンベロープのあるＤＮＡウイルスである。この試験において使用した株は、ＡＴＣＣ由来（ＡＴＣＣ（登録商標）ＶＲ−７３３（商標））であった。宿主細胞は、Ｖｅｒｏ細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−８１（商標））である。
【００５９】
ウシウイルス性下痢症ウイルス：ＢＶＤＶ（ＮＢＬ２）は、その高い罹患率、残存率及び臨床結果により、世界的に家畜業界において最も重大な感染症のうちの１つを引き起こす。ＢＶＤＶは、一本鎖ＲＮＡエンベロープウイルスである。この試験において使用した株は、ＡＴＣＣ由来（ＡＴＣＣ（登録商標）ＶＲ−５３４（商標））であった。宿主細胞は、ＭＤＢＫ細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−２２（商標））である。
【００６０】
ミューリンノロウイルス：ミューリンノロウイルスＳ９９ベルリン（ＭＮＶ）は、マウスに影響を及ぼすノロウイルスの１種であり、直鎖ポジティブセンスＲＮＡゲノムを有するノンエンベロープウイルスである。宿主細胞は、Ｒａｗ２６４．７細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＴＩＢ−７１（商標）である）。
【００６１】
ヒト呼吸器合胞体ウイルス：ニューモウイルス科（Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｉｄａｅ）ファミリーの呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）は、乳児期及び小児期に気道感染を引き起こす。ＲＳＶは、エンベロープウイルス、一本鎖ＲＮＡである。宿主細胞は、Ｈｅｐ−２細胞（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ、Ｖｅｒｖｉｅｒ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）である。
【００６２】
４／死滅ウイルス
死滅ウイルスは、不活化されてもはや感染能力を示さないウイルスである。
【００６３】
ウイルスを、「３／生存ウイルス」の節に記載のような細胞株において生産させ、微生物学的な安全作業台（ＵＶ灯）の下で３０分間、ＵＶで不活化した。ウイルスのサイズ及び純度をＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳで決定した。
【００６４】
ガンボロ、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）及びレオウイルスの精製された死滅ウイルスは、Ｉｎｔｅｒｖｅｔ（ＭＳＤ  Ｓａｎｔｅ  Ａｎｉｍａｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）によって厚意的に提供された。
【００６５】
５／死滅ウイルスの標識
死滅ウイルスをフルオレセインで共有結合的に標識する。ウイルスタンパク質濃度をマイクロＢＣＡ法によって決定する。簡単に説明すると、１ｍｇのＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート、無水ＤＭＳＯに溶解されたもの）を、０．１Ｍの重炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）に可溶化した１０ｍｇのウイルスタンパク質に添加し、溶液を暗所で室温で６時間混合した。この調製物をゲル濾過によってＰＤ−１０  Ｓｅｐｈａｄｅｘ脱塩カラム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で精製し、排除画分を回収した。
【００６６】
６／組み合わせ製品
陽イオン性ナノ粒子とウイルスとの組み合わせは、細胞株における試験用の関連した培地中で両方の成分を混合することによって行う。
【００６７】
７／サイズ及びゼータ電位分析
陽イオン性ナノ粒子、ウイルス又は組み合わせ製品の流体力学的直径を、動的光散乱により、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ−ＺＳ機器を使用して１５ｍＭ  ＮａＣｌ中で測定した（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｏｒｓａｙ、Ｆｒａｎｃｅ）。ナノ粒子調製物のゼータ電位を水中で決定した（ＺｅｔａＳｉｚｅｒ  ＮａｎｏＺＳ分析計、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）。
【００６８】
８／死滅ウイルスにおけるサイトメトリー分析
蛍光標識した死滅ウイルスを含む組み合わせ製品（材料及び方法の第６節）で細胞を処理した。３時間後、細胞を回収し、Ａｃｃｕｒｉ  ｃ６フローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｅｒｅｍｂｏｄｅｇｅｍ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）で細胞蛍光を分析した。
【００６９】
９／ＣＰＥ
細胞変性効果（ＣＰＥ）は、ウイルス感染によって生じる、宿主細胞における構造的な変化である。感染しているウイルスは、細胞形態における変化を通して宿主細胞の溶解を引き起こす。ＣＰＥの一般的な例には、感染細胞の球状化、隣接した細胞と融合しての合胞体の形成、及び核の外見又は細胞質内封入体が含まれる。倒立顕微鏡を使用してＣＰＥを決定した。
【００７０】
１０／後代及びウイルス段階希釈
ウイルスを、ナノ粒子の存在下又は非存在下で、９６ウェルプレート中に８つずつ重複させて、適切な培地に１０−１〜１０−１２まで連続的に希釈した。次いで、細胞を、５％ＣＯ２の空気中３７℃で５日間インキュベートした。その後、倒立顕微鏡を使用してプレートを調査し、細胞培養物においてウイルスに誘導された細胞変性効果（ＣＰＥ）の程度を評価した。スピアマン−カーバー法により、推定されるウイルス濃度の算出を行い、ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０として表した。各ウェルからの上清を回収し、未感作の細胞を感染させるために使用した。後代検定を行ってＭＯＩ（感染多重度＝１細胞当たりの感染ウイルスの数）を決定する。後代は、ウイルス段階希釈物である。インキュベーションの数日後、ウイルスは、細胞に感染し、ウイルス力価（ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）を生じた。
【００７１】
１１／Ｑ−ＲＴ  ＰＣＲによるウイルスＲＮＡ含有量の決定
ポリオウイルス陽性鎖ＲＮＡをＱＲＴ−ＰＣＲによって定量した。全ＲＮＡを、製造業者の説明書に従ってトリ−リージェント（Ｔｒｉ−Ｒｅａｇｅｎｔ）（登録商標）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で抽出した。Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｓｃｒｉｐｔ  ＱＰＣＲ  ｃＤＮＡ合成キット及びｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ＩＩ  ＱＰＣＲキット（Ａｇｉｌｅｎｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｆｒａｎｃｅ）でＲＮＡについての定量ＲＴ−ＱＰＣＲによって全ＲＮＡを測定した。抽出したＲＮＡにおいてリバースプライマーを使用することによって陽性鎖特有のＲＴを４２℃で１５分間行った。Ｍｘ３０００ｐ（Ａｇｉｌｅｎｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｆｒａｎｃｅ）においてユニバーサルサイクル条件（９５℃で１０分、４０サイクルの６０℃で３０秒）でＰＣＲを行った。ポリオウイルスＲＮＡを検出するために使用した、以下のプライマーは、エンテロウイルスセロタイプ間で高度に保存されている、エンテロウイルス５’非翻訳領域内に位置していた：フォワード（５’−ＣＣＣ  ＴＧＡ  ＡＴＧ  ＧＧＧ  ＣＴＡ  ＡＴＣ）、リバース（５’−ＡＴＴ  ＧＴＣ  ＡＣＣ  ＡＴＡ  ＡＧＣ  ＡＧＣ  ＣＡ）及びプローブ（５’−ＶＩＣ−ＡＡＣ  ＣＧＡ  ＣＴＡ  ＣＴＴ  ＴＧＧ  ＧＴＧ  ＴＣＣ  ＧＴＧ  ＴＴＴ−ＴＡＭＲＡ）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｆｒａｎｃｅ）。結果は、ＲＮＡレベルに反比例するサイクル閾値（Ｃｔ）として表された。
【００７２】
１２／免疫蛍光によるウイルスタンパク質含有量の決定
ＰＢＳでの洗浄後、ポリオウイルスに感染したＨｅｐ−２細胞を、新しい４％パラホルムアルデヒドで固定し、冷却したメタノール／アセトンで透過処理した。非特異的部位を、ウサギ血清／抗Ｆｃ受容体溶液（ミルテニーバイオテク（Ｍｉｌｔｅｎｙｉｂｉｏｔｅｃ）（登録商標））でブロックした。細胞を、一次抗体、マウス抗エンテロウイルスＶＰ１抗体（クローン５Ｄ８／１  ダコ（Ｄａｋｏ）（登録商標））で最初に標識し、次いで、ウサギ抗マウスａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（モレキュラープローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）（登録商標））で標識した。ヘキスト染色液（Ｓｉｇｍａ、Ｆｒａｎｃｅ）によって核を染色した。アルゴン及びヘリウム−ネオンレーザーを備えたＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ７１０共焦点レーザー走査型顕微鏡を使用することにより、スライドを載せて可視化した。
【００７３】
１３／ＤＧ７０と結合された又はされていないガンボロウイルスのクラスリンエンドサイトーシスの評価
蛍光標識した死滅ウイルスを含む組み合わせ製品（材料及び方法の第６節）でＶｅｒｏ細胞を処理した。細胞を１５μｇ／ｍｌのクロルプロマジンあり又はなしで３時間処理した。次いで、細胞を回収し、Ａｃｃｕｒｉ  ｃ６フローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｅｒｅｍｂｏｄｅｇｅｍ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）で細胞蛍光を分析した。
【００７４】
結果
１／陽イオン性ナノ粒子の合成及び特性評価
異なる陽イオン性ナノ粒子を合成し、動的光散乱によって分析した。作製した陽イオン性ナノ粒子の中には、以下のものがある：ＰＥＩ若しくはキトサンでコーティングされたＰＬＧＡ、陽イオン性マルトデキストリン（ＮＰ＋）及び脂質コアのあるもの（ＤＧ７０）、陽イオン性リポソーム又はキトサン。結果を図１に示している。
【００７５】
２／死滅ウイルスにおける試験
ａ／組み合わせ製品：陽イオン性ナノ粒子及びウイルスの製剤化
ＵＶで不活化されたウイルス（死滅ウイルス）を陽イオン性ナノ粒子と結合させ、得られた組み合わせ製品、いわゆる製剤のサイズ及びゼータ電位を動的光散乱によって決定した。
【００７６】
ウイルスよりも３倍多いナノ粒子を有する製剤（１／３の質量比、図２を参照されたい）又は１０倍多いナノ粒子を有する製剤（１／１０の質量比、図３を参照されたい）を分析した。
【００７７】
これらの組み合わせは、陽イオン性ナノ粒子単独又はウイルス単独と比較してより大きいサイズを有し、そのことによって結合が確認される。さらに、ウイルスのゼータ電位は負であるのに対して、組み合わせ製品は正であり、陽イオン性ナノ粒子がウイルスを被覆していることが示唆される。
【００７８】
生存ウイルスの実験（第３節）では、ウイルス／陽イオン性ナノ粒子の比は、少なくとも１／１０００であり、陽イオン性ナノ粒子によるウイルスのコーティングを強化している。
【００７９】
ｂ／死滅ウイルスのトランスフェクション
ＵＶで不活化させて蛍光で標識したウイルスと陽イオン性ナノ粒子の組み合わせ製品を作製した。この試験において使用した陽イオン性ナノ粒子は、主にＤＧ７０ナノ粒子であった。細胞とのインキュベーションの前に、死滅ウイルス（５μｇ）及び陽イオン性ナノ粒子（１５μｇ）を、１０％血清を含む培地に添加した。細胞内のウイルスの量をフローサイトメトリーによって分析し、代表的なデータを図４にまとめている。
【００８０】
ＵＶ不活化ウイルス単独と比較して、本発明による、組み合わせ製品は、細胞内へのウイルス侵入を極めて増加させる。これにより、生存ウイルスの感染能力を高めることができた。
【００８１】
ｃ／エンドサイトーシスの機序：
Ｖｅｒｏ細胞において、インキュベーションの３時間後に、ガンボロウイルスのエンドサイトーシスを、クラスリン阻害剤（クロルプロマジン）の存在下でＦＡＣＳによって評価した。図５は、ウイルスエンドサイトーシスの代表的な試験であり、そこで、本発明者らは、陽イオン性ナノ粒子が、クラスリン経路を介してウイルスエンドサイトーシスを主に増加させることを見出し、同じ結果が、試験した全てのウイルスで得られた。
【００８２】
３／生存ウイルスにおける試験
ａ／細胞変性効果に対する効果
細胞変性効果（ＣＰＥ）は、ウイルス感染による細胞構造及び生存率における変化、典型的には、溶解プラークとして定義される。陽イオン性ナノ粒子、ウイルス又は組み合わせ製品のＣＰＥを倒立顕微鏡で分析する。
【００８３】
図６に記載のように、陽イオン性ナノ粒子は、ウイルスのＣＰＥを、少なくとも１００００の高い効力を意味する４  ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０／ｍｌ高める。
【００８４】
ｂ／ウイルス生産に対する効果
ｉ／ポリオウイルスの後代に対する効果
ウイルス脱殻とは、宿主細胞感染中の増殖成功後のウイルス後代の排出及び放出を指す。これは、感染ウイルスの量、及び細胞機構を使用して自身を複製する感染ウイルスの能力を決定することを可能にする。決定的に重要なステップは、細胞内への侵入である。
【００８５】
ウイルス対関連した組み合わせ製品（ウイルスと組み合わせたナノ粒子）の感染能力を比較するために、ウイルス単独又は陽イオン性ナノ粒子と組み合わせたウイルスで細胞を感染させた（１回目）。次いで、細胞の上清を回収して再利用し、非感染細胞を感染させた（２回目）。その後の細胞の溶解により、ウイルス又は組み合わせ製品の感染能力が明らかにされる。図７に記載のように、ポリオウイルスの感染の能力は、ウイルス単独と比較して数ｌｏｇ１０上昇する。例えば、ＤＧ７０陽イオン性ナノ粒子と組み合わせたポリオウイルス−１は、ポリオウイルス−１単独よりも感染性が３〜４  ｌｏｇ１０（＝１０００〜１００００）高い。
【００８６】
図８に、本発明者らは、陽イオン性ナノ粒子とノンエンベロープウイルスとの異なる組み合わせによって観察される感染能力の上昇についてまとめている。ＰＬＧＡ  ＰＥＩ陽イオン性ナノ粒子と組み合わせたポリオウイルス−１、イヌパルボウイルス及びロタウイルスＳＡ−１１は、ウイルス単独よりも感染性が４  ｌｏｇ１０高いのに対して、ＰＬＧＡ  ＰＥＩ陽イオン性ナノ粒子は、エンベロープウイルスの感染能力を高めない。次いで、未コーティングの陰イオン性ＰＬＧＡナノ粒子を試験し、ウイルス感染能力の上昇は観察されなかった。
【００８７】
これらの結果により、陽イオン性ナノ粒子の使用は、ノンエンベロープ生存ウイルスの感染能力を高めることが確認される。
【００８８】
ｉｉｉ／ウイルスＲＮＡ及びタンパク質の生産に対する効果
ウイルスの生産における増加を確認するために、ポリオウイルス−１の主要タンパク質のうちの１つであるＶＰ１に対するＱ−ＰＣＲ及び免疫蛍光によってウイルスＲＮＡ及びタンパク質の測定を行った。
【００８９】
ウイルス単独と比較したＶＰ１タンパク質の検出により、ＤＧ７０組み合わせ製品は、より高くより早いウイルス発現を誘導したことが示された（図９及び図１０）。核酸レベルでは、エンテロウイルスＲＮＡの一般的なノンコーディング領域の検出により、ウイルス単独及び関連したＤＧ７０陽イオン性ナノ粒子組み合わせ製品による５．４６サイクル閾値の低下が明らかにされた。これは、ウイルスＲＮＡ生産における４４倍の増加に相当し（図１１）、陽イオン性ナノ粒子がタンパク質及び核酸レベルでウイルスの生産を促進することを意味する。
【００９０】
ｉｖ／熱変性に対するウイルス保護の試験
熱変性からウイルスを保護する陽イオン性ナノ粒子の能力を試験した。ポリオウイルスをＤＧＮＰの存在下又は非存在下で４５℃で２４時間又は５５℃で２時間３０分間のいずれかでインキュベートした。５５℃で２時間３０分のインキュベーション後には、ＤＧＮＰの存在下でも保護は観察されなかった（図１２、Ａ）のに対して、４５℃で２４時間でウイルスをナノ粒子と組み合わせたときには、本発明者らは、１０００  ＴＣＩＤ５０／ｍｌに相当するウイルスの用量のＮＰで部分的な保護を観察した（図１２、Ｂ）。この結果により、この組み合わせは、熱変性に対するウイルスの保護をもたらすことが示唆される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【国際調査報告】
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