(57)【要約】  本発明は、鳥類の対象における受精および性の決定および識別の方法に関する。より具体的には、本発明は、少なくとも１つの性染色体ＺまたはＷに取り込まれた少なくとも１つのレポーター遺伝子、具体的にはＲＦＰを含むトランスジェニック鳥類動物を使用する非侵襲的方法を提供する。本発明のトランスジェニック鳥類動物は、孵化していない鳥類卵内での胚の性決定および選択に使用される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
鳥類の孵化していない受精卵の性決定方法であって、
（ａ）性染色体ＺおよびＷのうちの少なくとも一方内の少なくとも１つの位置または場所に取り込まれた少なくとも１つの外因性レポーター遺伝子を含む少なくとも１つのトランスジェニック鳥類対象を提供するステップと、
（ｂ）前記トランスジェニック鳥類対象からまたはその任意の細胞の少なくとも１つの受精卵を得るステップと、
（ｃ）少なくとも１つの検出可能なシグナルが検出されたかを前記卵において決定するステップであって、前記少なくとも１つの検出可能なシグナルの検出は、前記少なくとも１つのレポーター遺伝子の発現を示し、それにより、前記孵化していない受精卵内に含まれる鳥類胚における前記Ｚ染色体またはＷ染色体の存在が示される、ステップと、を含む、方法。
【請求項２】
前記レポーター遺伝子が少なくとも１つの蛍光レポーター遺伝子である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記レポーター遺伝子が赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
検出可能なシグナルが検出されたかを判定することは、前記卵を光源に曝露するステップを含む、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１つのトランスジェニック鳥類対象が、雌の鳥類の対象であり、前記少なくとも１つのレポーター遺伝子が、雌染色体Ｚの少なくとも１つの位置に取り込まれ、それにより、検出可能なシグナルが検出されることは、前記孵化していない卵内の胚が雄であることを示す、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つのトランスジェニック鳥類対象が、雌の鳥類の対象であり、前記少なくとも１つのレポーター遺伝子が、雌染色体Ｗの少なくとも１つの位置に取り込まれ、それにより、検出可能なシグナルが検出されることは、前記孵化していない卵の胚が雌であることを示す、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１つのレポーター遺伝子が、少なくとも１つのプログラム可能な遺伝子操作されたヌクレアーゼ（ＰＥＮ）を使用して、前記トランスジェニック鳥類動物の前記性染色体に取り込まれる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＰＥＮが、クラスター化された規則的間隔の短い回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）ＩＩ型システムである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも１つのレポーター遺伝子が、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ／ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ９（Ｃａｓ９）システムにより媒介される相同性指向性修復（ＨＤＲ）により前記トランスジェニック鳥類対象の前記性染色体に取り込まれる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記鳥類対象の少なくとも１つの細胞または前記鳥類動物に導入された少なくとも１つの細胞が、
（ａ）少なくとも１つのＣａｓ９タンパク質、または前記少なくとも１つのＣａｓ９タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列を含む少なくとも１つの第１の核酸配列；ならびに少なくとも１つの性染色体Ｚおよび／またはＷ内の少なくとも１つのプロトスペーサーを標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、または前記少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする少なくとも１つの核酸配列；
ならびに（ｂ）少なくとも１つの前記レポーター遺伝子を含む少なくとも１つの第２の核酸配列に接触するか、または同時トランスフェクトすることにより、前記少なくとも１つのレポーター遺伝子が、前記トランスジェニック鳥類対象の性染色体に取り込まれる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記第２の核酸配列中の前記少なくとも１つのレポーター遺伝子が、前記取り込み部位でのＨＤＲ用相同腕とその５’および３’において隣接している、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記第２の核酸配列中の前記少なくとも１つのレポーター遺伝子が、性特異的プロモーター、胚特異的プロモーターおよび誘導性プロモーターのうちのいずれか１つに作動可能に連結される、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１つのレポーター遺伝子が、前記性染色体の少なくとも１つの非コード領域に取り込まれる、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記少なくとも１つのレポーター遺伝子が、性Ｚ染色体遺伝子座４２１７２７４８〜４２１７７７４８の少なくとも１つの部位に取り込まれる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記少なくとも１つのｇＲＮＡが、配列番号２６で示される核酸配列を含む、請求項１０および１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記第２の核酸配列内に含まれる前記少なくとも１つのレポーター遺伝子が、それぞれ配列番号３１および３２で示される核酸配列を含む相同腕とその５’および３’において隣接している、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記少なくとも１つのレポーター遺伝子が、性Ｗ染色体遺伝子座１０２２８５９〜１０２４２１５の少なくとも１つの部位に取り込まれ、
（ａ）前記ｇＲＮＡが配列番号１で示される核酸配列を含み、前記第２の核酸配列内に含まれる前記少なくとも１つのレポーター遺伝子が、それぞれ配列番号４および５で示されるアミノ酸配列を含む相同腕とその５’および３’において隣接しているか、
（ｂ）前記ｇＲＮＡが配列番号２で示される核酸配列を含み、前記第２の核酸配列内に含まれる前記少なくとも１つのレポーター遺伝子が、それぞれ配列番号６および７で示されるアミノ酸配列を含む相同腕とその５’および３’において隣接しているか、のいずれか１つである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
性染色体ＺおよびＷのうちの少なくとも一方内の少なくとも１つの遺伝子座に取り込まれた少なくとも１つの外因性レポーター遺伝子を含む鳥類トランスジェニック対象。
【請求項１９】
前記レポーター遺伝子が少なくとも１つの蛍光レポーター遺伝子である、請求項１８に記載の鳥類トランスジェニック対象。
【請求項２０】
前記レポーター遺伝子が赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）である、請求項１９に記載の鳥類トランスジェニック対象。
【請求項２１】
前記少なくとも１つのトランスジェニック鳥類動物が雌であり、前記少なくとも１つのレポーター遺伝子が雌染色体Ｚの少なくとも１つの位置に取り込まれている、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の鳥類トランスジェニック対象。
【請求項２２】
前記少なくとも１つのトランスジェニック鳥類動物が雌であり、前記少なくとも１つのレポーター遺伝子が雌染色体Ｗの少なくとも１つの位置に取り込まれている、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の鳥類トランスジェニック対象。
【請求項２３】
前記少なくとも１つのレポーター遺伝子が、少なくとも１つのＰＥＮを用いて前記トランスジェニック動物の前記性染色体に取り込まれる、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の鳥類トランスジェニック対象。
【請求項２４】
前記ＰＥＮがＣＲＩＳＰＲＩＩ型システムである、請求項２３に記載の鳥類トランスジェニック対象。
【請求項２５】
前記少なくとも１つのレポーター遺伝子が、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムにより媒介されるＨＤＲにより前記トランスジェニック鳥類対象の前記性染色体に取り込まれる、請求項２４に記載の鳥類トランスジェニック対象。
【請求項２６】
前記鳥類動物の少なくとも１つの細胞または前記鳥類の対象に導入された少なくとも１つの細胞を
（ａ）少なくとも１つのＣａｓ９タンパク質、または前記少なくとも１つのＣａｓ９タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列を含む少なくとも１つの第１の核酸配列；ならびに少なくとも１つの性染色体Ｚおよび／またはＷ内の少なくとも１つのプロトスペーサーを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ、または前記少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする少なくとも１つの核酸配列；
ならびに（ｂ）少なくとも１つの前記レポーター遺伝子を含む少なくとも１つの第２の核酸配列に接触するか、または同時トランスフェクトすることにより、前記少なくとも１つのレポーター遺伝子が、前記トランスジェニック鳥類対象の性染色体に取り込まれる、請求項２５に記載の鳥類トランスジェニック対象。
【請求項２７】
前記第２の核酸配列中の少なくとも１つのレポーター遺伝子が、前記取り込み部位でのＨＤＲ用相同腕とその５’および３’において隣接している、請求項２６に記載の鳥類トランスジェニック対象。
【請求項２８】
前記第２の核酸配列中の少なくとも１つのレポーター遺伝子が、性特異的プロモーター、胚特異的プロモーターおよび誘導性プロモーターのうちのいずれか１つに作動可能に連結される、請求項２６または２７に記載の鳥類トランスジェニック対象。
【請求項２９】
前記少なくとも１つのレポーター遺伝子が、前記性染色体の少なくとも１つの非コード領域に取り込まれる、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の鳥類トランスジェニック対象。
【請求項３０】
前記少なくとも１つのレポーター遺伝子が、性Ｚ染色体遺伝子座４２１７２７４８〜４２１７７７４８の少なくとも１つの部位に取り込まれる、請求項２９に記載のトランスジェニック動物。
【請求項３１】
前記少なくとも１つのｇＲＮＡが、配列番号２６で示される核酸配列を含む、請求項２６〜３０のいずれか一項に記載の鳥類トランスジェニック対象。
【請求項３２】
前記第２の核酸配列内に含まれる少なくとも１つのレポーター遺伝子が、それぞれ配列番号３１および３２で示されるアミノ酸配列を含む相同腕とその５’および３’において隣接している、請求項３１に記載の鳥類トランスジェニック対象。
【請求項３３】
前記少なくとも１つのレポーター遺伝子が、性Ｗ染色体遺伝子座１０２２８５９〜１０２４２１５の少なくとも１つの部位に取り込まれ、
（ａ）前記ｇＲＮＡが配列番号１で示される核酸配列を含み、前記第２の核酸配列内に含まれる前記少なくとも１つのレポーター遺伝子が、それぞれ配列番号４および５で示されるアミノ酸配列を含む相同腕とその５’および３’において隣接しているか、
（ｂ）前記ｇＲＮＡが配列番号２で示される核酸配列を含み、前記第２の核酸配列内に含まれる前記少なくとも１つのレポーター遺伝子が、それぞれ配列番号６および７で示されるアミノ酸配列を含む相同腕とその５’および３’において隣接しているか、のいずれか１つである、請求項２６〜２９のいずれか一項に記載の鳥類トランスジェニック対象。
【請求項３４】
性染色体ＺおよびＷのうちの少なくとも一方内の少なくとも１つの遺伝子座に取り込まれた少なくとも１つの外因性レポーター遺伝子を含む細胞。
【請求項３５】
前記細胞が鳥類細胞である、請求項３４に記載の細胞。
【請求項３６】
前記鳥類細胞が始原生殖細胞（ＰＧＣ）である、請求項３５に記載の細胞。
【請求項３７】
前記細胞が
（ａ）少なくとも１つのＣａｓ９タンパク質、または前記少なくとも１つのＣａｓ９タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列を含む少なくとも１つの第１の核酸配列；ならびに少なくとも１つの性染色体Ｚおよび／またはＷ内の少なくとも１つのプロトスペーサーを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ、または前記少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする核酸配列；
ならびに（ｂ）少なくとも１つの前記レポーター遺伝子を含む少なくとも１つの第２の核酸配列に接触するか、または同時トランスフェクトすることにより、前記少なくとも１つのレポーター遺伝子が、前記細胞の性染色体に組み込まれる、請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３８】
前記第２の核酸配列中の前記少なくとも１つのレポーター遺伝子が、前記取り込み部位でのＨＤＲ用相同腕とその５’および３’において隣接している、請求項３７に記載の細胞。
【請求項３９】
前記ｇＲＮＡは、配列番号２６で示される核酸配列を含み、前記第２の核酸配列内に含まれる前記少なくとも１つのレポーター遺伝子が、それぞれ配列番号３１および３２で示されるアミノ酸配列を含む相同腕とその５’および３’において隣接している、請求項３７または３８に記載の細胞。
【請求項４０】
（ａ）前記ｇＲＮＡが配列番号１で示される核酸配列を含み、前記第２の核酸配列内に含まれる前記少なくとも１つのレポーター遺伝子が、それぞれ配列番号４および５で示されるアミノ酸配列を含む相同腕とその５’および３’において隣接しているか、
（ｂ）前記ｇＲＮＡが配列番号２で示される核酸配列を含み、前記第２の核酸配列内に含まれる前記少なくとも１つのレポーター遺伝子が、それぞれ配列番号６および７で示されるアミノ酸配列を含む相同腕とその５’および３’において隣接しているか、のいずれか１つである、請求項３７または３８に記載の細胞。
【請求項４１】
（ａ）少なくとも１つのＣａｓ９タンパク質、または前記少なくとも１つのＣａｓ９タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列を含む少なくとも１つの第１の核酸配列；ならびに少なくとも１つの性染色体Ｚおよび／またはＷ内の少なくとも１つのプロトスペーサーを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ、または前記少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする核酸配列；
ならびに（ｂ）少なくとも１つの前記レポーター遺伝子を含む少なくとも１つの第２の核酸配列を含む、キット。
【請求項４２】
前記第２の核酸配列中の前記少なくとも１つのレポーター遺伝子が、前記取り込み部位でのＨＤＲ用相同腕とその５’および３’において隣接している、請求項４１に記載のキット。
【請求項４３】
前記第２の核酸配列中の前記少なくとも１つのレポーター遺伝子が、性特異的プロモーター、胚特異的プロモーターおよび誘導性プロモーターのうちのいずれか１つに作動可能に連結される、請求項４１または４２に記載のキット。
【請求項４４】
前記少なくとも１つのレポーター遺伝子が、前記性染色体の少なくとも１つの非コード領域への取り込みに適合している、請求項４１〜４３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４５】
前記第２の核酸配列内に含まれる前記少なくとも１つのレポーター遺伝子が、それぞれ配列番号３１および３２で示されるアミノ酸配列を含む相同腕とその５’および３’において隣接し、前記少なくとも１つのｇＲＮＡが、配列番号２６で示される核酸配列を含む、請求項４４に記載のキット。
【請求項４６】
（ａ）前記ｇＲＮＡが配列番号１で示される核酸配列を含み、前記第２の核酸配列内に含まれる前記少なくとも１つのレポーター遺伝子が、それぞれ配列番号４および５で示されるアミノ酸配列を含む相同腕とその５’および３’において隣接しているか、
（ｂ）前記ｇＲＮＡが配列番号２で示される核酸配列を含み、前記第２の核酸配列内に含まれる前記少なくとも１つのレポーター遺伝子が、それぞれ配列番号６および７で示されるアミノ酸配列を含む相同腕とその５’および３’において隣接しているか、のいずれか１つである、請求項４１〜４３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４７】
前記レポーター遺伝子が少なくとも１つの蛍光レポーター遺伝子である、請求項４１〜４６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４８】
性染色体ＺおよびＷのうちの少なくとも一方内の少なくとも１つの遺伝子座に取り込まれた少なくとも１つの外因性レポーター遺伝子を含む少なくとも１つのトランスジェニック鳥類動物の調製に使用するための、請求項４１〜４７のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、鳥類の対象における性の決定および識別の方法に関する。より具体的には、本発明は、孵化していない鳥類の卵内での胚の性決定および選択のための非侵襲的方法およびトランスジェニック鳥類動物を提供する。
【背景技術】
【０００２】
背景として、現在開示されている主題に関連すると考えられる参考文献を以下に列挙する：
−国際公開第２０１０／１０３１１１号
−国際公開第２０１４／０２９６７０７号
−米国特許第６２４４２１４号
−第０６１２４４５６号（Ａ２）
−米国特許第２０１４０６９３３６号（Ａ）
−国際公開第１６００５５３９号
−国際公開第９６／３９５０５号
−国際公開第９７／４９８０６号
−Ｑｕａｎｓａｈ，Ｅ．、Ｌｏｎｇ，Ｊ．Ａ．、Ｄｏｎｏｖａｎ，Ｄ．Ｍ．、Ｂｅｃｋｅｒ，Ｓ．Ｃ．、Ｔｅｌｕｇｕ，Ｂ．、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｆｒｅｙ，Ｊ．Ａ．、Ｕｒｗｉｎ，Ｎ．（２０１４年）Ｓｐｅｒｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｃｈｉｃｋｅｎ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ＰｉｇｇｙＢａｃ  ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｐｏｕｌｔｒｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ａｂｓｔｒａｃｔ．ＢＡＲＣ  Ｐｏｓｔｅｒ  Ｄａｙ．
−Ｊｉｎｅｋ，Ｍ．、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ，Ｋ．、Ｆｏｎｆａｒａ，Ｉ．、Ｈａｕｅｒ，Ｍ．、Ｄｏｕｄｎａ，Ｊ．Ａ．＆Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ，Ｅ．（２０１２年）Ａ  ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  ｄｕａｌ−ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ＤＮＡ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｎ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ、３３７（６０９６）、８１６−８２１．
−Ｃｏｎｇ，Ｌ．、＆Ｚｈａｎｇ，Ｆ．（２０１５年）Ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｓｙｓｔｅｍ．Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ、１９７−２１７．
−米国特許第６，２４４，２１４号
−国際公開第２０１４／０２９６７０７号
−国際公開第０６１２４４５６号（Ａ２）、
−国際公開第１６００５５３９号
−Ｖｅｒｏｎ  Ｎ．、Ｑｕ  Ｚ．、Ｋｉｐｅｎ  ＰＡ．、Ｈｉｒｓｔ  ＣＥ．、Ｍａｒｃｅｌｌｅ  Ｃ．（２０１５年）ＣＲＩＳＰＲ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｈｉｃｋｅｎ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．４０７（１）：６８−７４．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｙｄｂｉｏ．２０１５．０８．００７．Ｅｐｕｂ２０１５年８月１３日
−カナダ国特許出願公開第２２６４４５０号
−Ｎｉｕ，Ｙ．、Ｂ．Ｓｈｅｎ、Ｙ．Ｃｕｉ、Ｙ．Ｃｈｅｎ、Ｊ．Ｗａｎｇら（２０１４年）Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  ｍｏｎｋｅｙ  ｖｉａ  ｃａｓ９／ｒｎａ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｉｎ  ｏｎｅ−ｃｅｌｌ  ｅｍｂｒｙｏｓ．Ｃｅｌｌ、１５６（４）：８３６−８４３．
−Ｈｗａｎｇ，Ｗ．Ｙ．、Ｙ．Ｆｕ、Ｄ．Ｒｅｙｏｎ、Ｍ．Ｌ．Ｍａｅｄｅｒ、Ｓ．Ｑ．Ｔｓａｉら（２０１３年）Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｉｎ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１（３）：２２７−２２９．
−Ｎａｄｅｇｅ，Ｖ．、Ｑ．Ｚｈｅｎｇｄｏｎｇ、Ｐ．Ａ．Ｓ．Ｋｉｐｅｎ、Ｃ．Ｅ．Ｈｉｒｓｔ、Ｍ．Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅら（２０１５年）ＣＲＩＳＰＲ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｈｉｃｋｅｎ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．４０７（１）：６８−７４．
−Ｂａｉ，Ｙ．、Ｌ．Ｈｅ、Ｐ．Ｌｉ、Ｋ．Ｘｕ、Ｓ．Ｓｈａｏら（２０１６年）Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｉｎ  ｃｈｉｃｋｅｎ  ＤＦ−１  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ｓｙｓｔｅｍ．Ｇ３（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）ｐｉｉ：ｇ３．１１６．０２７７０６．
−Ｄｏｒａｎ  Ｔ．ら（２０１６年）Ｓｅｘ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｌａｙｅｒ  ｃｈｉｃｋｅｎｓ．ＡＳＡＰ  Ａｎｉｍａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、Ａｄｅｌａｉｄｅ．
−Ｔｉｚａｒｄ  Ｍ．ａｎｄ  Ｄｏｒａｎ  Ｔ．（２０１４年）Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｈｉｃｋｅｎ：Ｔｈ  ｇａｐ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｍａｒｋｅｔ  ｐｌａｃｅ．Ａ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｔ  ＩＷＲＡＢ−ＩＩ、ｉｎ  Ｂｒａｓｉｌｉａ．
【０００３】
本明細書における上記の参照の承認は、これらが現在開示されている主題の特許性に何らかの形で関連があることを意味するものとして推論されるべきではない。
発明の背景
【０００４】
食品業界では、雛は窒息または粉砕により毎日数十億匹ずつ殺処分されている。雄は、産卵には有用でないか、または食用肉にするのには有用でないため屠殺し、雌も弱い場合または健康でない場合に同様に屠殺する。したがって、孵化前の卵内、または胚での性別決定方法は、倫理的および経済的考慮の両方の点で非常に望ましい。
【０００５】
具体的には、家禽の受精卵を視覚的に識別することは、未受精卵の除去が可能になり、孵化コストが節約され（未受精卵の孵化を防ぐことにより）、これらの汚染されやすい未受精卵を受精卵と共に継続してインキュベートことに伴うバイオセキュリティリスクを低下させるために重要である。
【０００６】
胚の初期段階で孵化していない卵の内部において卵子の受精を視覚的に識別することは、外部光源に透かして調べることを伴い、初期胚段階では困難であり、実質的に不可能であり得る。さらに大きな課題は、胚の性別を識別することであり、現在では、受精していることがわかっている孵化していない卵で、雄と雌とを区別するための方法は存在していない。しかし、初期胚段階での受精の識別および家禽の性別決定は、鳥類養殖、科学研究、および保存に不可欠である。形態学的特徴により、若鳥の性別を決定することは、ほとんどの種にとって非常に困難である。性は、個々の腔の雌雄鑑別によって決定でき、これには、雛から糞を手動で絞り出すことを伴う。この決定法では、雛の肛門をわずかに開いて、雛が小さい「突起」を有するかを確認できる。この突起は、雛が雄であることを示すものである。しかし、この方法は、訓練を受けた個人が手作業で行う面倒な作業とともに、鳥の外傷および性別決定の間違いのリスクが高いことを表す。
【０００７】
腔の雌雄鑑別または雛の雌雄鑑別は、通常、雛の雌雄鑑別者または鶏の雌雄鑑別者と呼ばれる訓練された人によって、鶏および他の孵化の性別を区別する方法である。鶏の雌雄鑑別は、大規模な商業的孵化場で主に行われ、鶏を性別グループに分けるため、およびさまざまなプログラムに参加させるために性別の違いを知る必要がある。これには、所望のグループを成長させること、および商業的ニーズを満たさない望ましくないグループを殺処分することを含み得る。産卵の商業品種から生まれた卵から孵化した雄が例として挙げられる。この雄は、肉の産生が良好でなく、卵を産まないので、雌雄鑑別後に殺処分される。雌雄鑑別時には、関連する性別は、目的を果たすためにその過程を継続するが、他の性別またはそのほとんどは、産卵に関係がないので孵化から数日以内に殺処分される。
【０００８】
卵を生産する農場では、雄は不要であり、不要な性別の雛は、ブリーダーに対するコストを削減するためにほぼ即座に屠殺される。雛は、コンベヤーベルトに沿って移動し、そこでは、雛の雌雄鑑別者が雄を分離し、シュートに放り込み、通常は肉挽き器で生存したまま粉砕する。
【０００９】
孵化前に卵の受精および卵内での胚の性別を識別し、決定することにより、未受精卵、および卵中での不要な型の胚の除去が可能になり、このため、インキュベーションコスト（大気汚染およびエネルギー消費に加えて、エネルギーおよび効率のコストを含む）の大幅な削減となる。さらに、雛の苦しみがなくなり、殺処分による汚染が防がれる。さらに、自動雌雄鑑別デバイスは、結果として、雛の雌雄鑑別者を必要としないことにより、卵の生産コストが削減され、初期段階で卵の５０％がプロセスから差し引かれるので、必要とされる孵化場のサイズが縮小され、このため、これらの卵の孵化コストの削減、およびその後のあらゆる精巧な屠殺手順の必要性の低下となる。
【００１０】
繁殖、産卵、または肉の生産を目的とするすべての商業的な種類の鳥において、受精および胚の性別を決定する必要がある。これには、エネルギーの節約、バイオセキュリティリスクの低下、ごみ処理、雌雄鑑別の人件費、および雌雄鑑別エラー、殺処分コストおよび処分、ならびに動物福祉における、高い経済的利益がある。
【００１１】
国際公開第２０１０／１０３１１１号には、一連のステップを含む侵襲的方法が記載されており、それらのステップでは、具体的には、胚の性別特異的抗原に一致するように設計された標識抗体を卵に導入する。
【００１２】
国際公開第２０１４／０２９６７０７号は、鳥の卵に注入されるワクチン接種の効率を定量化または評価するためのバイオマーカーとして機能するように設計された輝度組成物について記載している。この開示では、性別の決定については記載されておらず、示唆さえされていない。卵内注入装置および検出方法は、米国特許第６，２４４，２１４号により開示された。
【００１３】
国際公開第０６１２４４５６号（Ａ２）には、鳥類の卵からの胚液（例えば、尿膜液または血液）のサンプル中でのエストロゲン性ステロイド化合物の存在を決定することにより、鳥類の胚の卵内性別決定を行う侵襲的方法を開示している。この化合物の存在の決定は、蛍光顕微鏡を利用した競合免疫測定法により、鳥類の卵から得たサンプル中の検体を測定することにより行われる。
【００１４】
分光学的アプローチは、とりわけ、鳥類の胚の羽の色のスクリーニング（孵化前）および羽の色に基づく鳥類の胚の性別の決定に基づく米国特許第２０１４０６９３３６号（Ａ）または入射光信号に対する殻固有のスペクトル応答を得るデバイスについて開示している国際公開第１６００５５３９号にも記載されている。
【００１５】
卵内での雌雄鑑別に対処するさらなる遺伝的アプローチとしては、鳥のＺおよびＷ染色体に配置された２つの特定の遺伝子を検出するための受精卵から得られたＤＮＡサンプルのＤＮＡ配列決定（国際公開第９６／３９５０５号）、または雌のＷ染色体の特定の配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブの使用（国際公開第９７／４９８０６号）が挙げられる。これらの方法は侵襲的であるため、安全な戦略とはならない。
【００１６】
クラスター化された規則的間隔の短い回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）システムは、最先端の遺伝子編集システムであり、高い成功率でシンプルな構造設計が可能になる（Ｍ．Ｊｉｎｅｋ、２０１２年）。
【００１７】
Ｎｉｕら（２０１４年）は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）およびＣａｓ９  ＲＮＡをサルの卵母細胞に注入して、３つの標的遺伝子を改変した。Ｈｗａｎｇら（２０１３年）は、ゼブラフィッシュ胚のｄｒｄ３遺伝子およびｇｓｋ３ｂ遺伝子を改変して、２遺伝子座突然変異体を得た。ＣｏｎｇとＺｈａｎｇ（２０１５年）は、ＣＲＩＳＰＲシステムを改変して、生細胞内の任意の遺伝子を編集した。
【００１８】
Ｖｅｒｏｎおよび共同者（２０１５年）は、鶏胚内での体細胞の発現レベルが、ＰＡＸ７転写因子（Ｎａｄｅｇｅら、２０１５年）に対して向けられたＣＲＩＳＰＲ  ｇＲＮＡプラスミドのエレクトロポレーションによって改変されたことを実証した。Ｂａｉおよび共同者は、ＰＰＡＲ−ｇ、ＡＴＰシンターゼイプシロンサブユニット（ＡＴＰ５Ｅ）を編集した。
【００１９】
Ｑｕａｎｓａｈ，Ｅ．らは、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンシステムを使用した鶏における精子媒介トランスジェネシスを開示した。特に、Ｑｕａｎｓａｈ，Ｅ．らは、ＧＦＰプラスミドとＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸＴＭ  ９ＬＰＸ）との組み合わせが、鶏精子の生存率、可動性、または受精能力にいかなる影響も及ぼさないことを開示している。
【００２０】
カナダ国特許出願公開第２２６４４５０号には、細胞胚中の異種性別染色体に選択的に取り込まれた蛍光タンパク質マーカーをコードする核酸配列を含む多能性細胞、および多能性細胞を使用して作製されたトランスジェニック動物、およびそのような細胞、胚、および動物の使用が開示されている。この公開は、特に哺乳類細胞のＧＦＰに関するものである。
【００２１】
Ｄｏｒａｎ  Ｔ．らは、一般に、ＡＳＡＰ  Ａｎｉｍａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ２０１６年（Ａｄｅｌａｉｄｅ）において、生物学的マーカー、ＧＦＰレポーター遺伝子を性別染色体に追加することにより、孵化前に雄と雌とを区別する戦略について記載している。ＣＲＩＳＰＲ技術を使用した雛の性別染色体へのＧＦＰレポーター遺伝子の取り込みは、２０１４年にＩＷＲＡＢ−ＩＩでのプレゼンテーション（Ｂｒａｓｉｌｉａ）でも説明された。しかし、この一般的な刊行物では、卵を紫外線に曝露することにより、卵内において、標識された染色体が可視化されることを開示しているため、検出可能なシグナルは卵の自己蛍光のために期待されていない。
【００２２】
したがって、雛の孵化前の卵期での性別識別のための有効かつ非侵襲的な方法は現在利用できない。したがって、孵化していない卵内での胚の正確かつ安全な性別識別を可能にする方法が長年にわたって必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
本発明の第１の態様は、孵化していない卵、具体的には孵化していない受精卵中の鳥類、または鳥類の胚の性決定方法に関する。いくつかの特定の実施形態では、方法は以下のステップを含み得る：
まず、ステップ（ａ）では、性染色体ＺおよびＷのうちの少なくとも一方内の少なくとも１つの位置または場所（本明細書では遺伝子座とも呼ばれる）に取り込まれた少なくとも１つの外因性レポーター遺伝子を含む少なくとも１つのトランスジェニック鳥類対象または動物を提供または取得する。第２のステップ（ｂ）では、トランスジェニック鳥類対象からまたはその任意の細胞の少なくとも１つの受精卵を得る。
【００２４】
次のステップ（ｃ）は、少なくとも１つの検出可能なシグナルが検出されたかを卵内で判定することを伴う。より具体的な実施形態では、少なくとも１つの検出可能なシグナルの検出は、少なくとも１つのレポーター遺伝子の発現を示し、それにより鳥類の胚におけるＷ染色体またはＺ染色体の存在が示される。いくつかの特定の実施形態では、取り込まれたレポーター遺伝子は、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）をコードし得る。
【００２５】
第２の態様では、本発明は、その少なくとも１つの細胞において、性染色体ＺおよびＷのうちの少なくとも一方内の少なくとも１つの位置または場所に取り込まれた少なくとも１つの外因性レポーター遺伝子を含む鳥類トランスジェニック動物に関する。いくつかの特定の実施形態では、取り込まれたレポーター遺伝子は、ＲＦＰをコードし得る。
【００２６】
さらに別の態様では、本発明は、性染色体ＺおよびＷの少なくとも一方内の少なくとも１つの位置または遺伝子座に取り込まれた少なくとも１つの外因性レポーター遺伝子を含む細胞に関する。
【００２７】
さらに別の態様では、本発明は、
（ａ）少なくとも１つのＣａｓ９タンパク質またはその断片もしくは誘導体、または少なくとも１つのＣａｓ９タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列を含む少なくとも１つの第１の核酸配列；および性染色体ＺまたはＷ内に配置されている少なくとも１つのプロトスペーサーを標的とする少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つの核酸配列；ならびに（ｂ）少なくとも１つのレポーター遺伝子を含む少なくとも１つの第２の核酸配列を含むキットを提供する。
【００２８】
さらに、本発明は、孵化していない卵の受精を決定し、検出する方法を提供する。より具体的には、そのような方法は以下のステップを含む：
まず、ステップ（ａ）では、雌対象の場合性染色体ＺおよびＷの両方において、および雄の性染色体Ｚの両方において、少なくとも１つの位置または場所に取り込まれた、少なくとも１つの外因性レポーター遺伝子を含む少なくとも１つのトランスジェニック鳥類対象または動物を提供するまたは得る。第２のステップ（ｂ）では、トランスジェニック鳥類対象からまたはその任意の細胞の少なくとも１つの受精卵を得る。次のステップ（ｃ）は、少なくとも１つの検出可能なシグナルが検出されたかを卵内で判定することを伴う。より具体的な実施形態では、少なくとも１つの検出可能なシグナルが検出されることにより、少なくとも１つのレポーター遺伝子の発現が示され、それにより、鳥類の胚において、標識された母性Ｗ染色体またはＺ染色体（雌の場合、または標識された父性Ｚ染色体の存在が示される。
【００２９】
本発明のこれらおよびさらなる実施形態は、以下の図によって明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
本明細書に開示される主題をよりよく理解し、実際にそれがどのように実行され得るかを例示するために、添付の図面を参照して、非限定的な例としてのみ、実施形態をここで説明する：
【図１】図１Ａ−図１Ｂ。卵の蛍光を評価するための完全な設定を示す図である。図１Ａには、卵内で性を決定するために本発明の方法により使用されるデバイスの写真を示す。完全な設定は、レーザー源（ｈ）、レーザー源ホルダー（ｇ）、卵用スタンド（ｅ）、卵（ｆ）、レンズ（ｄ）、フィルター（ｃ）、検出器用スタンド（ｂ）および検出器（ａ）から構成される。様々な構成要素が固体支持体（ｉ）に配置される。図１Ｂは、図１Ａに示される本発明のデバイスの概略図を示す。このデバイスは、レーザー源（ｈ）、レーザー源ホルダー（ｇ）、卵用スタンド（ｅ）、卵（ｆ）、レンズ（ｄ）、フィルター（ｃ）、検出器用スタンド（ｂ）、および検出器（ａ）を備える。様々な構成要素が固体支持体（ｉ）に配置される。
【図２】フルオレセインの有無にかかわらず、青色レーザー（４７３ｎｍ）を使用した蛍光強度を示す図である。蛍光強度［Ｐｏｕｔ］は、１０μＭまたは１ｍＭフルオレセイン（ｆｌ）の有無にかかわらず、完全な卵を青色レーザーに曝露したときに検出器で受信されたものであり、この強度は、光源強度［Ｐｉｎ］に対応して表す。
【図３】ローダミンの有無にかかわらず緑色レーザー（５３２ｎｍ）を使用した蛍光強度を示す図である。蛍光強度［Ｐｏｕｔ］は、ローダミンの有無にかかわらず、完全な卵を緑色レーザーに曝露したときに検出器で受信されたものであり、この強度は、光源強度［Ｐｉｎ］に対応して表す。
【図４】ｄｉｒの有無にかかわらず緑色レーザー（５３２ｎｍ）を使用した蛍光強度を示す図である。蛍光強度［Ｐｏｕｔ］は、ｄｉｒの有無にかかわらず、完全な卵を緑色レーザーに曝露したときに検出器で受信されたものであり、この強度は、光源強度［Ｐｉｎ］に対応して表される。
【図５】ｄｉｒの有無にかかわらず赤色レーザー（６３２．８ｎｍ）を使用した蛍光強度を示す図である。蛍光強度［Ｐｏｕｔ］は、ｄｉｒの有無にかかわらず、完全な卵を赤色レーザーに曝露したときに検出器で受信されたものであり、この強度は、光源強度［Ｐｉｎ］に対応して表す。
【図６】ＧＦＰ発現細胞ＧＦＰを発現するＧＦＰベクターをトランスフェクトしたＨＥＫ細胞の蛍光シグナルを示す写真である。
【図７】ＲＦＰ発現細胞ＲＦＰを発現するＲＦＰベクターをトランスフェクトした蛍光シグナルＨＥＫ細胞を示す写真である。
【図８】対照の測定緑色レーザーおよび赤色フィルターを使用した異なる位置の卵の蛍光強度を示す図である。検出器で受信された蛍光強度［Ｐｏｕｔ］は、光源強度［Ｐｉｎ］に対応させて表される。
【図９】ＲＦＰの測定緑色レーザーおよび赤色フィルターを使用して、異なる濃度のＲＦＰ発現細胞を注入した卵の蛍光強度の測定を示す図である。検出器で受信された蛍光強度［Ｐｏｕｔ］は、光源強度［Ｐｉｎ］に対応させて表される。
【図１０】ＲＦＰ角度緑色レーザーおよび赤色フィルターを使用して、卵の決定された最適位置において励起された卵のＲＦＰ蛍光強度測定を示す図である。検出器で受信された蛍光強度［Ｐｏｕｔ］は、光源強度［Ｐｉｎ］に対応させて表される。
【図１１】図１１Ａ−図１１Ｂ。ＰＢＳまたはグリセロールを有するＲＦＰ発現細胞緑色レーザーを使用して、ＰＢＳまたはグリセロールを含む異なる濃度のＲＦＰ発現細胞を注入した卵の蛍光強度を示す図である。図１１Ａは、共にＰＢＳ中での異なる濃度のＲＦＰ発現細胞を含む卵の蛍光強度を示す図である。図１１Ｂは、グリセロール中での異なる濃度のＲＦＰ発現細胞を含む卵の蛍光強度を示す図である。検出器で受信された蛍光強度［Ｐｏｕｔ］は、光源強度［Ｐｉｎ］に対応させて表される。
【図１２】ＰＢＳまたはグリセロールを有するＧＦＰ発現細胞図は、青色レーザーを使用して、３０，０００個のＰＢＳまたはグリセロールを有するＧＦＰ発現細胞を注入した卵の蛍光強度を示す図である。検出器で受信された蛍光強度［Ｐｏｕｔ］は、光源強度［Ｐｉｎ］に対応させて表される。
【図１３】ＲＦＰ対ＧＦＰＧＦＰ発現細胞またはＲＦＰ発現細胞のいずれかからの蛍光タンパク質強度と自己蛍光強度の比を示す図である。蛍光と自己蛍光との比を表すパラメーターＲは、光源強度［Ｐｉｎ］を対応させて表される。
【図１４】雌のＺ染色体へのＲＦＰの組み込み鶏のＣｈＺの左腕および右腕を有するｐＤｓＲｅｄ、ならびにＣＭＶ−ｈｓｐＣａｓ９−Ｈ１−ｇＲＮＡを含むＲＦＰトランスフェクト雌鶏細胞株を示す図である。
【図１５】図１５Ａ−図１５Ｂ。雌鶏細胞株の染色体Ｚに取り込まれた配列の概略図を示す図である。太字の配列は、Ｚ染色体の隣接する左腕および右腕を表し、それぞれ配列番号６０および配列番号６１で示されている。イタリック体でマークされた配列（１０１７ｂｐ）は、左腕を表し、配列番号６２で示される。下線付き配列（６２９ｂｐ）は、ＣＭＶエンハンサー、プロモーター、およびＭＣＳを表し、配列番号６３で示される。太字のイタリック体配列（７１４ｂｐ）は、ｄｓＲＥＤ２レポーター遺伝子を表し、配列番号６４で示される。色のない３３３２ｂｐ配列は、ｄｓＲＥＤプラスミドの内容を表す。下線のイタリック体配列（１０２６ｂｐ）は、右腕を表し、配列番号６５で示される。配列の左側部分は、配列番号６６（図１５Ａに示す、ベクター配列のすべての５’部分）で示され、配列の右側部分は、配列番号６７（図１５Ｂに示す、ベクター配列のすべての３’部分）で示される。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
毎日、数十億羽の雄の雛が、産卵、または食用肉にするのに有用でないため、窒息または粉砕によって屠殺されている。孵化前に胚の性別を決定できることは、倫理的および財政的の両方において非常に重要である。
【００３２】
鶏では、性別染色体の遺伝子構成は、雄ではＺＺ、雌ではＺＷである。Ｗ染色体の意味は、雌の性を決定することである。これは、雄を決定するのは父性のＹであるヒトの場合とは異なる。
【００３３】
本発明は、トランスジェニック鳥類対象の性特異的染色体に取り込まれているレポーター遺伝子を用いて、性を決定するための非侵襲的で効率的な方法を提供する。孵化していない卵の胚でこのレポーター遺伝子が発現することにより、胚の性が明確かつ正確に識別される。
【００３４】
したがって、本発明の第１の態様は、性決定方法、および任意により、孵化していない卵、具体的には孵化していない受精卵における鳥類または鳥類の胚の選択方法に関する。いくつかの特定の実施形態では、方法は以下のステップを含み得る：
まず、ステップ（ａ）では、性染色体ＺおよびＷのうちの少なくとも一方内の少なくとも１つの位置または場所に取り込まれた少なくとも１つの外因性レポーター遺伝子を含む少なくとも１つのトランスジェニック鳥類対象または動物を提供するか、または取得する。第２のステップ（ｂ）では、トランスジェニック鳥類対象、具体的には動物から、またはその任意の細胞の少なくとも１つの受精卵を得る。
【００３５】
次のステップ（ｃ）は、少なくとも１つの検出可能なシグナルが検出されたかを卵内で判定することを伴う。より具体的な実施形態では、少なくとも１つの検出可能なシグナルの検出は、少なくとも１つのレポーター遺伝子の発現を示し、それにより鳥類の胚におけるＷ染色体またはＺ染色体の存在が示される。したがって、レポーター遺伝子が雌のトランスジェニック鳥類のＺ染色体に取り込まれている場合、調査された卵において、検出可能なシグナルが識別されることにより、卵内に含まれる胚が、内部にレポーター遺伝子が取り込まれている母性Ｚ染色体を有していることが示され、これにより胚が雄として識別される。さらに他のいくつかの実施形態では、レポーター遺伝子が雌トランスジェニック鳥類のＷ染色体に取り込まれている場合、調査された卵において検出可能なシグナルが識別されることにより、卵内に含まれる胚が、母性Ｗ染色体を保有し、したがって雌として決定されることが示され、それにより胚の性の決定がなされる。
【００３６】
本発明によって提供されるトランスジェニック鳥類は、以下により詳細に記載されるように、雌または雄のいずれかであり得ることを理解されたい。さらにいくつかのさらなる特定の実施形態では、トランスジェニック動物は、２つの異なる性染色体を有する性、特に異型配偶子対象であり得る。いくつかの特定の実施形態では、異型配偶子動物は雌であってもよい。より具体的な実施形態では、トランスジェニック鳥類対象が雌である場合、本発明の方法により識別された卵は、本発明により提供されるトランスジェニック雌鳥類により産卵される。より具体的な実施形態では、トランスジェニック雌は、トランスジェニック雄によって、またはいくつかの他の実施形態では、野生型鳥類雄によって受精され得る。なおさらに、受精は、トランスジェニック鳥類の雌とトランスジェニックまたは野生型鳥類の雄から得られた精子との交配または授精のいずれかによって起こり得る。トランスジェニック鳥類が雄であるさらにいくつかの他の実施形態では、本発明の方法により同定された卵は、本発明により提供されるトランスジェニック雄と交配するか、またはその任意の細胞（具体的には、その性染色体に取り込まれている本発明の外因性レポーター遺伝子を含む精子細胞）により授精される、野生型またはトランスジェニック雌のいずれかにより産卵され得る。
【００３７】
したがって、本発明は、孵化していない受精卵内の鳥類胚の性を検出する方法を提供する。本発明の方法は、鳥類胚の任意の胚段階の孵化していない卵に適用され得ることを理解されたい。
【００３８】
本明細書で使用する「胚発生段階または鳥類の胚段階」とは、以下を指すことに留意のこと：胚盤が胚盤葉期にあり、分割腔が暗いリングの形をとる１日目の段階；最初の溝が胚盤葉の中心に現れ、卵黄膜が現れる２日目の段階；血液循環が開始し、頭および体幹、ならびに脳および鼓動を開始する心臓の構造を識別できる３日目の段階；胚を囲むように羊膜腔が発達し、尿膜嚢胞が出現する４日目の段階；胚がＣ形をとり、四肢が延在している５日目の段階；上肢と下肢の指が明確になる６日目の段階；首により、頭が身体から明確に分離され、くちばしが形成され、脳が次第に頭部に進入する７日目の段階；目の色素沈着が容易に見え、翼と脚とが区別され、外耳道が開く８日目の段階；爪が現れ、最初の羽嚢が出芽する９日目の段階；鼻孔が存在し、眼瞼が成長し、卵歯が現れる１０日目の段階；眼瞼開口部が楕円形を有し、胚が雛の形態を有する１１日目の段階；羽嚢が外耳道を囲んで上眼瞼を覆い、下眼瞼が角膜の大部分を覆う１２日目の段階；尿膜が絨毛尿膜になり、爪および脚の鱗が現れる１３日目の段階；全身が急速に成長し、卵黄の収縮が加速し、卵白が徐々に消失する１４〜１６日の段階；腎系が尿酸塩を産生し、くちばしが気室を指し、卵白が完全に吸収される１７日目の段階；卵黄が内面化し、羊水量が減少する１８日目の段階；卵黄の吸収が加速し、くちばしが内殻膜を貫通する準備ができている１９日目の段階；卵黄が完全に吸収され、臍が閉じられ、雛が内殻膜を貫通し、気室内で呼吸し、孵化する準備ができている２０日目の段階；雛が卵歯によって殻に円形に穴を開け、１２〜１８時間で殻から外に出て、乾燥させる２１日目の段階。
【００３９】
より具体的には、本発明の方法は、胚発生プロセスのあらゆる段階で、卵内（卵の内部）での鳥類の胚の性の決定に適用可能であり得る。具体的には、１日目から、２日目から、３日目から、４日目から、５日目から、６日目から、７日目から、８日目から、９日目から、１０日目から、１１日目から、１２日目から、１３日目から、１４日目から、１５日目から、１６日目から、１７日目から、１８日目から、１９日目から、２０日目から、２１日目からである。より具体的には、本発明の方法は、胚の性の早期検出、具体的には、１日目〜１０日目までに適用可能であり得る。いくつかの実施形態では、本発明の方法により、胚発生の初日に胚の性を決定することが可能になり得る。いくつかのさらなる実施形態では、本発明の方法により、２日目に胚の性を決定することが可能になり得る。いくつかのさらなる実施形態では、本発明の方法により、３日目に胚の性を決定することが可能になり得る。さらなる実施形態では、本発明の方法により、４日目に胚の性を決定することが可能になり得る。さらにいくつかのさらなる実施形態では、本発明の方法により、５日目に胚の性を決定することが可能になり得る。さらなる実施形態では、本発明の方法により、６日目に胚の性を決定することが可能になり得る。さらなる実施形態では、本発明の方法により、７日目に胚の性を決定することが可能になり得る。さらなる実施形態では、本発明の方法により、８日目に胚の性を決定することが可能になり得る。いくつかのさらなる実施形態では、本発明の方法により、９日目に胚の性を決定することが可能になり得る。さらにいくつかのさらなる実施形態では、本発明の方法により、１０日目に胚の性を決定することが可能になり得る。いくつかの特定では、本発明の方法により、胚発生の１日目〜５日目までの胚の性を決定することが可能になり得る。
【００４０】
上記のように、本発明の方法は、孵化していない受精卵に適用可能であり得る。「受精卵」という用語は、以下、２週間以内に雄鶏と交配させた雌鶏が産卵した卵を指し、これにより、雄の精子が雌の卵管漏斗に沈着し、卵巣から卵子が放出されるときに受精事象が起こり得る。本明細書で使用される「孵化していない卵」は、構造的に一体の（破壊されていない）殻内の胚含有卵（本明細書では受精卵とも呼ばれる）に関する。
【００４１】
本発明の方法は、調査される卵を産むトランスジェニック鳥類の雌または雄の特定の遺伝子座に取り込まれたレポーター遺伝子により形成される検出可能なシグナルの決定に基づく。
【００４２】
本明細書で使用される「外来または外因性ＤＮＡ／遺伝子の染色体への取り込み」は、以後、生物染色体のヌクレオチド配列の永久的な改変を指す。この改変は、細胞分裂中にさらに伝達され、胚細胞株で発生した場合、子孫にも伝達される。この場合、取り込まれたレポーター遺伝子は、孵化していない卵内の胚に移され得る。本明細書で使用される「外因性」という用語は、例えば、特別に操作されたベクター、ウイルスまたは任意の他のビヒクルでの形質転換またはトランスフェクションにより生物に導入された生物の外部から生じることを指す。ある実施形態による取り込まれた外因性遺伝子は、レポーター遺伝子であり得る。用語「レポーター遺伝子」は、ポリペプチドをコードする遺伝子に関し、その発現は様々な既知のアッセイで検出でき、検出されたシグナルのレベルは報告されたものが存在することを示すものである。
【００４３】
上記のように、外因性レポーター遺伝子は、鳥類の性染色体ＺまたはＷに取り込まれ得る。本明細書で使用される鳥類の「性染色体ＺまたはＷ」は、雄が同型配偶子の性別（ＺＺ）であり、雌が異型配偶子の性別（ＺＷ）である鶏の子孫の性別を決定する染色体系を指す。卵子内にＷ染色体が存在することにより、子孫の性別が決定され、Ｚ染色体は、より大きく、より多くの遺伝子を有することが知られている。
【００４４】
本発明の方法は、レポーター遺伝子の存在、したがって特定の性染色体の存在を示し、反映する検出可能なシグナルが検出されることに基づく。「検出可能なシグナル」とは、以後、観測または機器のいずれかにより知覚可能な変化を指す。シグナルは、制限なく、直接検出できる。いくつかの実施形態では、検出可能な応答は光シグナルである。
【００４５】
いくつかの特定の実施形態では、本発明の方法により提供される少なくとも１つのトランスジェニック鳥類対象は、少なくとも２つの異なるレポーター遺伝子を含み得、各レポーター遺伝子は、性染色体ＺまたはＷのうちの一方内での少なくとも１つの位置または場所に取り込まれ得ることを理解されたい。少なくとも２つの異なるレポーター遺伝子の場合、いくつかの実施形態では、性染色体のそれぞれは異なる標識が行われてもよい。形成された検出可能なシグナルの評価により、調査された胚の性別が示され得る。
【００４６】
さらにいくつかの特定の実施形態では、本発明のトランスジェニック鳥類に含まれるレポーター遺伝子は、少なくとも１つの蛍光レポーター遺伝子であり得る。したがって、いくつかの実施形態では、発現されたポリペプチドは蛍光タンパク質であり、したがって、アッセイでは、励起時に、具体的には適切な光源により放出される光のレベルを測定する。
【００４７】
「蛍光」という用語は、光または他の電磁放射を照射され、吸収した物質による光の放出を指す。これは、発光の一形態であり、すなわち、熱によるものではなく、ある物質による光の放出である。
【００４８】
「蛍光タンパク質」とは、光に曝露されると明るい蛍光を呈するタンパク質を指す。蛍光タンパク質は、照射励起強度のピークの特定の波長、および蛍光発光強度のピークの波長を有する。励起とは、蛍光タンパク質の照射を指す。いくつかの実施形態では、励起は、レーザーによって提供され得る。さらにいくつかの実施形態では、シグナルは、適切な光学フィルターの使用時に検出され得る。
【００４９】
ある実施形態では、蛍光レポーター遺伝子は、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、および青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）などの自己蛍光タンパク質であり得る。
【００５０】
いくつかのさらなる特定の実施形態では、任意の蛍光タンパク質を本発明において適用できることに留意されたい。より具体的には、元となるオワンクラゲの緑色蛍光タンパク質に突然変異を誘発させる試みにより、本発明のいくつかの実施形態に従って適用可能であり得る、青色から黄色の範囲の新しい蛍光プローブが得られている。オレンジ色および赤色のスペクトル領域で発光する、より長い波長の蛍光タンパク質は、花虫綱に属する海洋アネモネ、Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ  ｓｔｒｉａｔａ、および珊瑚礁から開発された。さらに他の種が採掘されて、シアン、緑色、黄色、オレンジ色、および深紅の蛍光発光を有する同様のタンパク質が生産されている。
【００５１】
いくつかの実施形態では、本発明の方法、トランスジェニック鳥類対象、構築物、細胞およびキットに適用され得るレポーター遺伝子は、黄色蛍光タンパク質であり得る。より具体的には、黄色蛍光タンパク質のファミリーは、緑色蛍光タンパク質の結晶構造により、トレオニン残基２０３（Ｔｈｒ２０３）が発色団の近くにあることが明らかになった後に開始された。この残基のチロシンへの突然変異は、発色団の励起状態の双極子モーメントを安定化するために導入され、その結果、励起および発光スペクトルの両方について、より長い波長への２０ナノメートルのシフトとなった。さらなる改良により、最も明るく最も広く使用されている蛍光タンパク質のうちの１つである増強黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）の開発となった。
【００５２】
黄色蛍光タンパク質のシトリン多様体は、ＥＹＦＰに対して非常に明るく、本発明のいくつかの実施形態にも適用可能であり得る。Ｖｅｎｕｓという名前の別の誘導体は、最も早く成熟し、これまでに開発された最も明るい黄色の多様体のうちの１つである。サンゴ礁タンパク質であるＺｓＹｅｌｌｏｗ１は、もともとインド洋および太平洋原産のゾアンサス種（Ｚｏａｎｔｈｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）からクローニングされ、真の黄色発光を生成し、本発明にも適用可能である。
【００５３】
さらにいくつかのさらなる実施形態では、本発明の方法、トランスジェニック鳥類対象、構築物、細胞およびキットに適用可能であり得るレポーター遺伝子は、青色蛍光タンパク質であり得る。緑色蛍光タンパク質の青色およびシアンの多様体は、天然の蛍光団の６６位のチロシン残基（Ｔｙｒ６６）の直接改変によるものである。このアミノ酸をヒスチジンへ変換することにより、４５０ナノメートルにおいて最大波長を有する青色発光がもたらされるが、トリプタミンへ変換することにより、約５００ナノメートルのピークを伴う肩部とともに約４８０ナノメートルの主要な蛍光ピークが得られる。より具体的には、導入された改良シアン蛍光タンパク質の中で、ＡｍＣｙａｎ１およびセルリアンと呼ばれる増強されたシアン多様体が最も有望であることが示されている。サンゴ礁、Ａｎｅｍｏｎｉａ  ｍａｊａｎｏ由来のＡｍＣｙａｎ１蛍光タンパク質多様体も、本発明に適用可能であり得る。
【００５４】
いくつかの特定の実施形態では、本発明の方法、トランスジェニック鳥類対象、構築物、細胞およびキットに適用され得るレポーター遺伝子は、赤色蛍光タンパク質であり得る。広く利用されている最初のサンゴ由来の蛍光タンパク質は、Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ  ｓｔｒｉａｔａに由来し、一般にＤｓＲｅｄと呼ばれている。完全に成熟すると、ＤｓＲｅｄの蛍光発光スペクトルは５８３ナノメートルにおいてピークを有し、励起スペクトルは、５５８ナノメートルにおいて大きいピーク、約５００ナノメートル付近において小さいピークを有する。さらに、本発明において適用可能であり得る他の変形形態としては、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、およびＲｅｄＳｔａｒが挙げられるが、これらに限定されない。かなりの量の有望性を示すいくつかの追加の赤色蛍光タンパク質は、サンゴ礁の生物から単離されている。本発明において適用可能であり得るこれらのタンパク質のうちの１つは、シライトイソギンチャク（Ｈｅｔｅｒａｃｔｉｓ  ｃｒｉｓｐａ）から単離され、現在市販されているＨｃＲｅｄ１であり得る。ＨｃＲｅｄ１は、その原型が非蛍光色素タンパク質から誘導され、突然変異誘発により赤色光を吸収し、５８８ナノメートルにおいて最大吸収、６１８ナノメートルにおいて最大発光を有する弱蛍光偏性二量体を生成するものである。
【００５５】
さらに、いくつかの実施形態では、本発明の方法、トランスジェニック鳥類対象、構築物、細胞およびキットに適用可能であり得るレポーター遺伝子は、そのようなタンパク質がＧＦＰではないことを条件として、任意の蛍光タンパク質であり得、いくつかのより特定の実施形態では、野生型ＧＦＰではない。しかし、いくつかの実施形態では、５５５および５８５ｎｍで励起および発光最大を伴う赤色発光スペクトル種を形成するＧＦＰのいくつかの突然変異体および多様体も本発明において適用可能であり得る。さらにいくつかのさらなる特定の実施形態では、こうした突然変異体または多様体は、セリン６５および／またはアスパラギン６８残基を含み得る。さらにいくつかのさらなる実施形態では、こうしたＧＦＰの突然変異体または多様体は、Ｆ４６Ｌ、Ｖ１６３ＡおよびＩ１６７Ｖのうちの少なくとも１つの突然変異を含み得る。さらにいくつかのさらなる実施形態では、多様体は、Ｓｅｒ６５、Ａｓｎ６８、Ｆ４６Ｌ、Ｖ１６３ＡおよびＩ１６７Ｖの任意の組み合わせを含み得る。
【００５６】
さらにいくつかのさらなる実施形態において、本発明の方法、トランスジェニック鳥類対象、構築物、細胞およびキットに適用可能であり得るレポーター遺伝子は、以下の表１に開示される蛍光タンパク質のうちのいずれかであり得ることを理解されたい。さらにいくつかのさらなる実施形態では、本発明の方法、トランスジェニック鳥類対象、構築物、細胞およびキットに適用可能であり得るレポーター遺伝子は、蛍光タンパク質が野生型ＧＦＰではないという条件で、表１に開示された蛍光タンパク質のうちのいずれかであり得る。さらに他のいくつかの実施形態では、本発明の方法、トランスジェニック鳥類対象、構築物、細胞およびキットに適用可能であり得るレポーター遺伝子は、表１に開示された蛍光タンパク質のいずれかであり得、こうしたレポーター遺伝子は、表１によって開示された緑色蛍光タンパク質のいずれか、より具体的には、ＥＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ  ＧＦＰ、Ａｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ、ｍＷａｓａｂｉ、ＴａｇＧＦＰ、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、ＡｃＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅのうちのいずれか１つでないものとする。
【表１】
2020520669.tif 000002
2020520669.tif 000003
【００５７】
驚くべきことに実施例１および２により示されるように、本発明により明らかにされた卵の自己蛍光特性は、ＲＦＰを発現する細胞を保有する胚の検出のみを可能にする。
【００５８】
したがって、より具体的な実施形態では、レポーター遺伝子は赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）であり得る。「赤色蛍光タンパク質」または「ＲＦＰ」という用語は、これ以降、花虫類（サンゴ）およびイソギンチャクおよびそれらの任意の多様体から単離されたオレンジ色、赤色、および遠赤色の蛍光を発する蛍光タンパク質を指す。ＲＦＰタンパク質には、２つの主要なタイプＤｓＲｅｄおよびＫａｅｄｅがある。ＤｓＲｅｄ様ＲＦＰは、Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ  ｓｔｒｉａｔａに由来し、これらに限定されないが、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｚＦＰ５３８、ｍＫＯ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＲｏｕｇｅ、Ｅ２−Ｃｒｉｍｓｏｎ、ｍＮｅｐｔｕｎｅ、ＴａｇＲＦＰ６５７、Ｋｅｉｍａ、ｍＫａｔｅ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＢａｎａｎａ、ｍＨｏｎｅｙｄｅｗ、ｎｉＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＰｌｕｍ、ｍＲＦＰｍａｒｓ、およびｍＲＦＰｒｕｂｙが挙げられる。
【００５９】
一方、Ｋａｅｄｅは、イシサンゴＴｒａｃｈｙｐｈｙｌｌｉａ  ｇｅｏｆｆｒｏｙｉに見られる天然の蛍光タンパク質であり、約４００ｎｍで照射する時に発光波長が緑（５１８ｎｍ）から赤（５８２ｎｍ）に不可逆的に変化する。Ｋａｅｄｅファミリーのメンバーとしては、例えば、オオハナガタサンゴ（Ｌｏｂｏｐｈｙｌｌｉａ  ｈｅｍｐｒｉｃｈｉｉ）、デンドロネフチア（Ｄｅｎｄｒｏｎｅｐｈｔｈｙａ）、Ｍｏｎａｓｔｒｅａ  ｃａｖｅｒｎｏｓａ、およびＲｉｃｏｒｄｅａ  ｆｌｏｒｉｄａのサンゴにそれぞれ見られるＥｏｓＦＰ、ｄｅｎｄＦＰ、ｍｃａｖＲＦＰ、およびｒｆｌｏＲＦＰが挙げられる。
【００６０】
当技術分野で知られているあらゆる供給源の本明細書に記載されているＲＦＰのいずれも、本発明の方法、トランスジェニック動物、細胞、キットおよびデバイスに適用可能であり得ることを理解されたい。
【００６１】
さらにいくつかの特定の実施形態では、本発明の方法によって使用され得るＲＦＰは、新規赤色蛍光タンパク質をコードするｐＤｓＲｅｄ１−Ｎ１で使用されるＲＦＰであってもよい［ＲＦＰ；Ｍａｔｚ，Ｍ．Ｖ．，ら（１９９９年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：９６９−９７３］。これは、哺乳類細胞で高発現するために最適化されている（励起最大値＝５５８ｎｍ、発光最大値＝５８３ｎｍ）。ＲＦＰは、インド洋イソギンチャク関連のイソギンチャクモドキ（Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ）種から単離されたものであり、ＤｓＲｅｄ１のコーディング配列は１４４個のサイレントな塩基対の変化を含む。これは、哺乳類細胞での高発現に対するヒトのコドン使用頻度の優先性に対応する。
【００６２】
いくつかの実施形態では、本発明の方法およびキットによって使用されるＲＦＰは、配列番号２０で示される配列を含む核酸配列によってコードされ得る。さらにいくつかのさらなる実施形態では、こうしたＲＦＰは、配列番号２１で示されるアミノ酸配列、またはその相同体、多様体、突然変異体または誘導体を含み得る。
【００６３】
さらにいくつかの特定の代替的実施形態では、本発明により使用されるＲＦＰは、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦ２７２７１１．１により開示される核酸配列によりコードされ、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＧ１６２２４．１により開示されるアミノ酸配列を有するＲＦＰであり得る。さらにいくつかのさらなる特定の実施形態では、本発明の方法およびキットによって使用されるＲＦＰは、配列番号２２によって示される配列を含む核酸配列によってコードされ得る。さらにいくつかのさらなる実施形態では、こうしたＲＦＰは、配列番号２３によって示されるアミノ酸配列、またはその任意の相同体、突然変異体もしくは誘導体を含み得る。
【００６４】
いくつかの実施形態では、本発明の方法によって使用されるレポーター遺伝子は、蛍光タンパク質が緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ではないという条件で、任意の蛍光タンパク質であり得ることに留意すべきである。換言すれば、いくつかの特定の実施形態では、本発明の方法によって提供されるトランスジェニック動物の性染色体に取り込まれたレポーター遺伝子は、蛍光タンパク質がＧＦＰではないという条件で、任意の蛍光タンパク質であり得る。
【００６５】
さらに、いくつかの具体的な特定の実施形態では、レポーター遺伝子がＲＦＰである場合、いくつかの実施形態では、ＲＦＰの励起波長は約５００〜６５０ｎｍであり、発光波長は約５５０〜６５０ｎｍであり得ることに留意されたい。
【００６６】
いくつかの他の実施形態では、本発明の方法によって検出可能なシグナルを検出することは、卵を適切な光源に曝露するステップをさらに含み得る。さらにいくつかのさらなる実施形態では、約４００〜約６５０の間の波長を含む適切な光源に卵をさらすこと。さらにいくつかのさらなる実施形態では、光源が紫外線（ＵＶ）光（波長１０〜４００ｎｍ）ではないという条件で、任意の波長の光を使用することができる。
【００６７】
いくつかの特定の実施形態では、卵を光源に曝露するステップは、蛍光タンパク質の励起である。いくつかの特定の実施形態では、励起波長は約５００ｎｍ〜約６５０ｎｍである。いくつかのさらなる実施形態では、励起波長は、約５１０ｎｍ、５１５ｎｍ、５２０ｎｍ、５２５ｎｍ、５３０ｎｍ、５３５ｎｍ、５４０ｎｍ、５４５ｎｍ、５５０ｎｍ、５５５ｎｍ、５６０ｎｍ、５６５ｎｍ、５７０ｎｍ、５７５ｎｍ、５８０ｎｍ、５８５ｎｍ、５９０ｎｍ、５９５ｎｍ、６００ｎｍ、６０５ｎｍ、６１０ｎｍ、６１５ｎｍ、６２０ｎｍ、６２５ｎｍ、６３０ｎｍ、６３５ｎｍ、６４０ｎｍである。
【００６８】
いくつかのより具体的な実施形態では、励起波長は、約５１５〜約５５５の範囲であり得る。さらにいくつかのさらなる実施形態では、波長は５３２ｎｍであり得る。
【００６９】
いくつかの具体的かつ非限定的な実施形態では、光源はレーザーによって提供されてもよい。
【００７０】
本明細書で使用される「レーザー」という用語は、放射の誘導放出によって増幅される任意の周波数の電磁放射を指す。また、レーザーは、誘導放出と呼ばれるプロセスを介して電磁放射を放出するデバイスを指す。レーザー光は通常、空間的にコヒーレントである。これは、光が、狭い低発散ビームで放出されるか、またはレンズなどの光学部品の助けを借りて光に変換され得るかのいずれか一方であることを意味する。
【００７１】
いくつかの他の実施形態では、レーザーは青色レーザーまたは赤色レーザーであってもよい。より具体的な実施形態では、光源は緑色レーザーである。
【００７２】
ある実施形態では、レーザーはフィルターとともに使用されてもよい。
【００７３】
本明細書で使用する「フィルター」という用語は、異なる波長の光を選択的に透過するデバイスに対応する「光学フィルター」を指し、通常、バルクで染色されているか、または干渉コーティングを有する光路内の平面ガラスまたはプラスチックデバイスとして実装される。
【００７４】
いくつかの実施形態では、フィルターは、５００ｎｍ超を透過する緑色フィルター、または５４０ｎｍ〜５８０ｎｍを透過する暗緑色フィルター、または５９０ｎｍ〜６５０ｎｍを透過する赤色フィルター、または６５０ｎｍ超または６６０ｎｍ超を透過する赤色フィルターであり得る。
【００７５】
いくつかの特定の実施形態では、光源は、５３２ｎｍの波長を有する緑色レーザーであり得る。いくつかのさらなる実施形態では、こうしたレーザーは、６５０ｎｍ超を透過する赤色フィルターを備えていてもよい。
【００７６】
鶏の生殖系列は、始原生殖細胞の小さい集団から発生し、生殖腺外部位から生殖隆起に移動するが、能動的な移動および血流中の受動的な循環の段階を経る。ＰＧＣは、新たに産卵されたインキュベートしていない卵の胚盤葉上層の中心にあり、ステージＸと呼ばれる発育段階である。インキュベート中、ＰＧＣは前方に移動し、血管内侵入の主要な部位と考えられているステージ１０ＨＨ胚の生殖三日月環に蓄積する（約３３〜３８時間のインキュベーション）。その後、ＰＧＣは、循環期において、ステージ１２ＨＨからステージ１７ＨＨ（およそ４５〜６４時間のインキュベーション）で見られ、ステージ１４ＨＨ（およそ５０〜５３時間のインキュベーション）でピーク濃度に達する。ＰＧＣは、中間中胚葉において、生殖腺の原基に隣接する部位で循環を離れ、早ければステージ１５ＨＨ（インキュベーションの５５〜５５時間）において発見され得る。ＰＧＣは、総背側腸間膜に沿って能動的な移動により生殖隆起に到達し、両方の生殖腺に定着し、その後、精原細胞または卵原細胞に分化する。
【００７７】
胚は、卵黄嚢の最上部に位置付けられる。卵黄は、卵の中で自由に回転しており、胚は常に卵黄の上側を向いている。インキュベーション中、卵の鈍端（空気嚢が配置されている場所）が上を向いており、卵は時々９０°回転する。胚が発達すると、胚外組織が形成されることにより胚が卵殻から後退し、胚へ到達しにくくなる。
【００７８】
したがって、いくつかの特定の実施形態では、卵は光源に曝露される。さらにいくつかのさらなる実施形態では、卵は、任意の段階において、胚の光源への曝露を容易にする位置に配置させる。さらにいくつかのさらなる実施形態では、卵のステージＸにおいて卵黄の上面を含む領域が光源により励起される。
【００７９】
いくつかのさらなる実施形態では、卵を光源に曝露するステップは、レーザー源、卵用スタンド、レンズ、フィルター、検出器用スタンド、および検出器を備え得るシステム、装置またはデバイスによって提供される。
【００８０】
本明細書で使用されるとき、用語「検出器」は、光を検出および／または測定する任意のタイプのデバイスを指す。いくつかの実施形態では、検出可能なシグナル、具体的には蛍光シグナルは、好適な蛍光手段を使用して検出され得ることに留意されたい。いくつかの実施形態では、ＲＦＰレポーター遺伝子によって形成される検出可能なシグナルは、改変光学顕微鏡（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）または電荷結合素子（ＣＣＤ）、高感度光子検出器などの感光装置によって検出され得る。
【００８１】
さらにいくつかのさらなる実施形態では、本発明の方法は、少なくとも１つの光源、少なくとも１つの検出器、少なくとも１つのフィルター、および本発明のレポーター遺伝子を発現する細胞を光源に曝露することを容易にする、適切な位置に卵を置く少なくとも１つの保持アームを提供する任意のデバイス、装置またはシステムを使用して実行され得る。いくつかの特定の非限定的な実施形態では、本発明の方法は、図１に例解するデバイスを使用してもよい。さらにいくつかのさらなる実施形態では、卵ホルダーとレンズおよび／またはレンズと検出器との間の距離は、約１〜１００ｃｍの範囲、具体的には、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、および１００ｃｍ、具体的には約５〜２５ｃｍ、より具体的には約２０ｃｍであり得る。
【００８２】
したがって、いくつかの実施形態では、本発明の方法は、例えば、本明細書で説明するように、調査された卵内での検出可能なシグナルの存在を判定するように適合されたシステムまたはデバイスを提供するステップをさらに含むことができることを理解されたい。具体的には、レーザー源、卵用スタンド、レンズ、フィルター、検出器用スタンドおよび検出器を備える装置またはデバイスである。上記のように、こうしたデバイスのいくつかの実施形態では、約５３２ｎｍの励起波長を示す緑色レーザー源が使用されてもよい。さらにいくつかのさらなる実施形態では、６５０ｎｍ超を透過するフィルター、具体的には赤色フィルターが使用されてもよい。
【００８３】
なおさらなる実施形態では、本発明の方法によって提供される少なくとも１つのトランスジェニック鳥類対象または動物は、雌の鳥類の対象または動物であり得る。少なくとも１つのレポーター遺伝子が雌染色体Ｚの少なくとも１つの位置に取り込まれているより具体的な実施形態では、検出可能なシグナルが検出されることは、孵化していない卵内の胚が雄であることを示すものである。より具体的には、胚は、父性の非標識Ｚ性染色体を含み、母性の標識Ｚ染色体をさらに含み、２つのＺ染色体を含み、したがって雄である。
【００８４】
さらにいくつかのさらなる実施形態では、本発明の方法によって提供される少なくとも１つのトランスジェニック鳥類対象または動物は、雌鳥類の対象または動物であり得る。少なくとも１つのレポーター遺伝子が雌染色体Ｗの少なくとも１つの位置に取り込まれているいくつかの特定の実施形態では、検出可能なシグナルが検出されることは、孵化していない卵内の胚が雌であることを示す。より具体的には、胚は、標識されていない親のｚ染色体および標識された母性Ｗ染色体を含み、雌であるＷＺ染色体を含む異型配偶子胚である。
【００８５】
さらにいくつかのさらなる実施形態では、本発明の方法により提供されるトランスジェニック動物は、そのＺ染色体に取り込まれたレポーター遺伝子を有する雄対象であり得る。こうした場合、こうしたトランスジェニック雄またはその任意の精子によって受精された卵内で決定される検出可能なシグナルは、胚がトランスジェニックレポーター遺伝子を含む父性Ｚ染色体を保有しており、したがって雄であることを示す。なおさらなる実施形態では、トランスジェニック雄鳥類により受精したトランスジェニック雌鳥類（両方ともそのＺ染色体に取り込まれた本発明のレポーター遺伝子を保有している）により産卵された卵内で検出可能なシグナルが検出されることは、強いシグナルの場合には、胚が、その雌および雄のＺ染色体に取り込まれたレポーター遺伝子の２つのコピーを運んでいることを示し得る。強度が低いシグナルの場合、例えば、約５０％の強度が低下したシグナル。卵は、雌と判定され得る。
【００８６】
本明細書で前述したとおり、本発明の方法は、トランスジェニック鳥類動物の提供を伴う。トランスジェニック鳥類動物の調製には、特定の遺伝子編集化合物または構成要素を使用し得る遺伝子工学的アプローチの使用を必要とする。遺伝子編集構成要素の非限定的例は、いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼの使用を含み得る。
【００８７】
いくつかの具体的な実施形態では、本発明の方法において適用可能なヌクレアーゼは、ＲＮＡ誘導ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼであり得る。
【００８８】
本明細書で使用されるように、ＲＮＡ誘導ＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼは、ＲＮＡ分子によりその切断部位（あるいは、任意の他の代替活性の部位）に誘導されるヌクレアーゼである。このＲＮＡ分子は、ガイドＲＮＡと呼ばれる。
【００８９】
したがって、さらにより具体的な実施形態では、少なくとも１つのレポーター遺伝子は、少なくとも１つのプログラム可能な遺伝子操作されたヌクレアーゼ（ＰＥＮ）を使用する本発明の方法により提供されるトランスジェニック鳥類対象または動物の性染色体に取り込まれ得る。本明細書で使用する「プログラム可能な遺伝子操作されたヌクレアーゼ（ＰＥＮ）」という用語は、二本鎖ＤＮＡ損傷のＤＮＡ修復に関与し、かつ直接ゲノム編集を可能にする天然のヌクレアーゼに由来する特定のＤＮＡ配列を切断する合成酵素を指す。
【００９０】
いくつかのより具体的な実施形態では、本発明の方法によって使用されるＰＥＮは、クラスター化された規則的間隔の短い回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）クラス２またはクラス１システムのうちのいずれか１つであり得る。
【００９１】
より具体的には、クラスター化された規則的間隔の短い回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）ＩＩ型システムは、ゲノム遺伝子操作のために改変された細菌性免疫システムである。
【００９２】
しかし、本明細書では、すべてのゲノム標的の特定のヌクレアーゼペアの設計および生成に必要とされるカスタマイズ可能なＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼの使用に依存するジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）などの他のゲノム遺伝子操作アプローチも適用可能であることを理解されたい。
【００９３】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、２つのクラスに分類される。クラス１システムでは、複数のＣａｓタンパク質の複合体を使用して外来核酸を分解する。クラス２システムでは、同じ目的で単一の大きいＣａｓタンパク質を使用する。より具体的には、クラス１はＩ型、ＩＩＩ型、およびＩＶ型に分類され得、クラス２はＩＩ型、Ｖ型、およびＶＩ型に分類され得る。
【００９４】
本明細書で使用されるように、ＳＰＩＤＲ（Ｓｐａｃｅｒ  Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｒｅｐｅａｔｓ、スペーサー散在型ダイレクトリピート）としても知られるＣＲＩＳＰＲアレイは、通常、特定の細菌種に特異的である、近年記載されたＤＮＡ遺伝子座のファミリーを構成する。ＣＲＩＳＰＲアレイは、大腸菌で最初に認識された散在するショート配列リピート（ＳＳＲ）の明確なクラスである。その後、結核菌、Ｈａｌｏｆｅｒａｘ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ、メタノカルドコックス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、テルモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）、他の細菌および古細菌で同様のＣＲＩＳＰＲアレイが発見された。本発明は、既知のＣＲＩＳＰＲシステムのいずれか、特に本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲシステムの使用を企図することを理解されたい。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、外来ＤＮＡまたはＲＮＡを標的とすることにより、ファージの攻撃および望ましくないプラスミド複製から保護するために原核生物において進化している。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、リピート間に存在するスペーサーと呼ばれる短い相同ＤＮＡ配列に基づいてＤＮＡ分子を標的にする。これらのスペーサーは、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質を、プロトスペーサーと呼ばれる外来ＤＮＡ内の一致する（および／または相補的な）配列に誘導して、続いてこの配列を切断する。スペーサーは、あらゆるＤＮＡ配列を標的とするよう合理的に設計され得る。さらに、この認識要素は、任意の所望の標的を認識して標的にするために個別に設計されてもよい。当業者によって認識されるように、ＣＲＩＳＰＲシステムに関して、天然に存在するＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の構造は、一般に「リピート」と呼ばれる複数の短い反復配列を含む。リピートは、クラスター中で発生し、通常、「スペーサー」と呼ばれる固有の介在配列によって規則的に間隔が空けられる。典型的には、ＣＲＩＳＰＲリピートは、約２４〜４７塩基対（ｂｐ）の長さで変化し、部分的に回文構造である。スペーサーは、２つのリピートの間に配置され、典型的には、各スペーサーは約２０ｂｐ以下〜７２ｂｐ以上の長さの固有の配列を有する。したがって、ある実施形態では、本発明の方法およびキットの少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする配列で使用されるＣＲＩＳＰＲスペーサーは、それぞれ１０〜７５ヌクレオチド（ｎｔ）を含み得る。より具体的には、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５またはそれ以上である。いくつかの特定の実施形態では、スペーサーは、約２０〜２５個のヌクレオチド、より具体的には約２０個の核酸塩基を含む。
【００９５】
少なくとも１つのリピートおよび少なくとも１つのスペーサーに加えて、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座はまた、リーダー配列および任意により少なくとも１つのｔｒａｃｒＲＮＡをコードする配列を含む。リーダー配列は、典型的には、最初のリピートの５’末端に直接隣接する５５０ｂｐ以下のＡＴリッチ配列である。
【００９６】
いくつかの特定の実施形態では、本発明の方法によって使用されるＰＥＮは、ＣＲＩＳＰＲクラス２システムであり得る。さらにいくつかのさらなる特定の実施形態では、こうしたクラス２システムは、ＣＲＩＳＰＲＩＩ型システムであり得る。
【００９７】
より具体的には、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの３つの主要な型：Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型を描いている。
【００９８】
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムには、「ＨＮＨ」型システム（連鎖球菌様；髄膜炎菌血清型Ａ株Ｚ２４９１またはＣＡＳＳ４のサブタイプＮｍｅｎｉとしても公知である）が含まれ、その中で、単一の非常に大きいタンパク質であるＣａｓ９は、遍在するＣａｓ１およびＣａｓ２に加えて、ｃｒＲＮＡの生成および標的ＤＮＡの切断に十分であると考えられている。Ｃａｓ９は、少なくとも２つのヌクレアーゼドメイン、アミノ末端近くのＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメイン、およびタンパク質の中央にあるＨＮＨ（またはＭｃｒＡ様）ヌクレアーゼドメインを含むが、これらのドメインの機能は依然として解明されていない。しかし、ＨＮＨヌクレアーゼドメインは、制限酵素に豊富にあり、標的切断の原因となるエンドヌクレアーゼ活性を有している。
【００９９】
ＩＩ型システムは、ｔｒａｃｒＲＮＡとｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ内のリピートの一部との間の二重鎖形成を伴う独特なメカニズムを通じて、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡを切断する。ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡプロセシング経路での最初の切断は、このリピート領域において続いて生じる。さらに、ＩＩ型システムは、ｃａｓ９、ｃａｓ１、ｃａｓ２、ｃｓｎ２、およびｃａｓ４遺伝子のうちの少なくとも１つを含むことに留意されたい。任意のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム、具体的には、ＩＩ−Ａ型またはＩＩ−Ｂ型のうちのいずれか１つが本発明において適用可能であることを理解されたい。
【０１００】
したがって、さらにいくつかのさらなる代替的実施形態では、本発明の方法およびキットで使用される少なくとも１つのｃａｓ遺伝子は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステム（ＩＩ−Ａ型またはＩＩ−Ｂ型）のうちの少なくとも１つのｃａｓ遺伝子であり得る。より特定の実施形態では、本発明の方法およびキットによって使用されるＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのうちの少なくとも１つのｃａｓ遺伝子は、ｃａｓ９遺伝子であり得る。こうしたシステムは、ｃａｓ１、ｃａｓ２、ｃｓｎ２およびｃａｓ４遺伝子のうちの少なくとも１つをさらに含み得ることを理解されたい。
【０１０１】
Ｃａｓ９による二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）切断は、「ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ」免疫システムの特徴である。ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質Ｃａｓ９は、ＲＮＡ：ＤＮＡ相補性を使用して、配列特異的二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）切断の標的部位を特定し、それにより、結果として特定の標的配列、例えば鳥類の性染色体ＷおよびＺ内の特定の標的にレポーター遺伝子を取り込むＨＤＲに必要な二本鎖破壊（ＤＳＢ）を作製するＲＮＡ誘導ＤＮＡエンドヌクレアーゼである。標的ＤＮＡ配列は、短い回文リピートによって分離された約３０〜４０ｂｐの一連のスペーサーであるＣＲＩＳＰＲアレイによって指定される。このアレイは、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡとして転写され、処理されて、プロトスペーサーとして公知である相補的ＤＮＡ配列を標的とするＣａｓタンパク質複合体と連結している短いｃｒＲＮＡとなる。これらのプロトスペーサー標的は、標的認識に必要なプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）として公知である追加の隣接配列も有する必要がある。結合後、Ｃａｓタンパク質複合体は、ＤＮＡエンドヌクレアーゼとして機能し、標的において両方の鎖を切断して、その後にＤＮＡ分解はエキソヌクレアーゼ活性を介して生じる。
【０１０２】
本明細書で使用されるＣＲＩＳＰＲＩＩ型システムは、２つの必須構成要素：「ガイド」ＲＮＡ（ｇＲＮＡ）および非特異的ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ９）の包含を必要とする。ｇＲＮＡは、Ｃａｓ９結合に必要な「足場」配列と、改変されるゲノム標的を定義する約２０ヌクレオチド長の「スペーサー」または「ターゲティング」配列で構成される短い合成ＲＮＡである。したがって、ｇＲＮＡ中に存在するターゲティング配列を変更するのみで、Ｃａｓ９のゲノム標的を変更できる。本明細書で使用するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、内因性細菌ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの合成融合を指す。これにより、Ｃａｓ９ヌクレアーゼの標的特異性および足場／結合能力の両方がもたらされる。「単一ガイドＲＮＡ」または「ｓｇＲＮＡ」とも呼ばれる。ＣＲＩＳＰＲは元々、様々な細胞タイプおよび生物内の標的遺伝子を「ノックアウト」するために使用されていたが、Ｃａｓ９酵素への改変により、標的遺伝子の「ノックイン」、標的遺伝子の選択的活性化または抑制、ＤＮＡの特定領域の精製、および蛍光顕微鏡を使用する生細胞内のＤＮＡのイメージングにさえも、ＣＲＩＳＰＲの適用が拡張された。さらに、ｇＲＮＡの生成は容易であるため、ＣＲＩＳＰＲは最も拡張性のあるゲノム編集技術の１つとなり、近年では、ゲノム全体のスクリーニングに利用されている。
【０１０３】
編集するゲノム内の標的、具体的には、本発明のレポーター遺伝子が取り込まれる性染色体ＺまたはＷ内の特定の標的遺伝子座は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）のすぐ上流に存在するものとする。
【０１０４】
ＰＡＭ配列は、標的結合に絶対に必要であり、正確な配列はＣａｓ９の種に依存する（化膿連鎖球菌Ｃａｓ９の５’ＮＧＧ  ３’）。ある実施形態では、化膿連鎖球菌由来のＣａｓ９が本発明の方法およびキットで使用される。それにもかかわらず、任意の既知のＣａｓ９が適用可能であることを理解されたい。本開示において有用なＣａｓ９の非限定的な例としては、これらに限定されないが、本明細書においてＳｐＣａｓ９としても示される化膿連鎖球菌（ＳＰ）、本明細書においてＳａＣａｓ９としても示される黄色ブドウ球菌（ＳＡ）、本明細書においてＮｍＣａｓ９としても示される髄膜炎菌（ＮＭ）、本明細書においてＳｔＣａｓ９としても示されるストレブトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（ＳＴ）、および本明細書においてＴｄＣａｓ９としても示されるトレポネーマ・デンティコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）（ＴＤ）が挙げられる。いくつかの特定の実施形態では、化膿連鎖球菌Ｍ１  ＧＡＳのＣａｓ９、具体的にはタンパク質ｉｄ：ＡＡＫ３３９３６．１のＣａｓ９は、本発明の方法およびキットにおいて適用可能であり得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、配列番号２４によって示される核酸配列によりコードされ得る。さらなる特定の非限定的な実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、配列番号２５によって示されるアミノ酸配列、またはその誘導体、突然変異体または多様体を含んでもよい。一旦発現すると、Ｃａｓ９タンパク質およびｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの「足場」ドメインとＣａｓ９の表面に露出した正電荷の溝との相互作用により、リボタンパク質複合体を形成する。Ｃａｓ９は、ｇＲＮＡが結合するときに立体構造の変化を受け、分子を不活性な非ＤＮＡ結合立体構造から活性なＤＮＡ結合立体構造に変化させる。重要なことは、ｇＲＮＡの「スペーサー」配列が、依然として、標的ＤＮＡと自由に相互作用することである。Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体は、ＰＡＭを有するあらゆるゲノム配列と結合するが、ｇＲＮＡスペーサーが標的ＤＮＡと一致する程度により、Ｃａｓ９が切断するかが決まる。Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体が推定上のＤＮＡ標的に結合すると、ｇＲＮＡターゲティング配列の３’末端の「シード」配列が、標的ＤＮＡへのアニールを開始する。シードおよび標的ＤＮＡ配列が一致する場合、ｇＲＮＡは、３’から５’方向に標的ＤＮＡに対してアニールし続ける。
【０１０５】
Ｃａｓ９は、ｇＲＮＡスペーサーと標的配列との間に十分な相同性が存在する場合にのみ標的を切断する。さらに、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、２つの機能的なエンドヌクレアーゼドメイン：ＲｕｖＣおよびＨＮＨを有する。Ｃａｓ９は、標的ＤＮＡの反対側の鎖を切断するためにヌクレアーゼドメインを位置付ける標的結合時に、２番目の立体構造変化を受ける。Ｃａｓ９を介したＤＮＡ切断の最終結果は、ＰＡＭ配列の約３〜４ヌクレオチド上流で発生する標的ＤＮＡ内の二本鎖破壊（ＤＳＢ）である。
【０１０６】
結果として生じるＤＳＢは、その後、２つの一般的な修復経路（効率的だがエラーを起こしやすい非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路、および効率は低いが忠実度の高い相同性指向性修復（ＨＤＲ）経路）のうちの１つによって修復され得る。いくつかの実施形態では、性染色体ＷまたはＺ内の特定の標的遺伝子座に対して本発明のレポーター遺伝子の特異的取り込みとなる挿入は、Ｃａｓ９によって引き起こされるＤＳＢの修復の結果である。いくつかの特定の実施形態では、本発明のレポーター遺伝子は、ＨＤＲにより標的遺伝子座に取り込まれるか、またはノックインされる。
【０１０７】
本明細書で使用される「相同性指向性修復（ＨＤＲ）」という用語は、二本鎖ＤＮＡ損傷を修復する細胞内でのメカニズムを指す。ＨＤＲの最も一般的な形式は、相同組換えである。ＨＤＲ修復メカニズムは、主に細胞周期のＧ２期およびＳ期において、核内にＤＮＡの相同片が存在する場合にのみ、細胞により使用され得る。相同体ＤＮＡ片が存在しない場合には、代わりに非相同末端結合（ＮＨＥＪ）と呼ばれる別のプロセスを実行できる。ゲノム編集のためのプログラム可能な遺伝子操作されたヌクレアーゼ（ＰＥＮ）戦略は、特定の二本鎖ＤＮＡ切断後のＨＤＲメカニズムの細胞活性化に基づく。
【０１０８】
前述のとおり、Ｃａｓ９により、２つのヌクレアーゼドメイン、ＲｕｖＣとＨＮＨとの複合活性により、二本鎖破壊（ＤＳＢ）が生成される。エンドヌクレアーゼ活性に重要である、各ヌクレアーゼドメイン内の正確なアミノ酸残基（化膿連鎖球菌Ｃａｓ９のＨＮＨについてはＤ１０Ａ、およびＲｕｖＣについてはＨ８４０Ａ）は公知であり、活性触媒ドメインを１つのみ含むＣａｓ９酵素の改変型（「Ｃａｓ９ニッカーゼ」と呼ばれる）が生成されている。Ｃａｓ９ニッカーゼは、依然としてｇＲＮＡ特異性に基づいてＤＮＡに結合するが、ニッカーゼはＤＮＡ鎖のうちの１つのみを切断できるため、ＤＳＢの代わりに「ニック」または一本鎖破壊が生じる。ＤＮＡニックは、完全な相補的ＤＮＡ鎖を鋳型として使用して、ＨＤＲ（相同性指向性修復）によって迅速に修復される。したがって、標的ＤＮＡ内でＤＳＢを生成するには、反対の鎖を標的とする２つのニッカーゼが必要である（多くの場合、「ダブルニック」または「デュアルニッカーゼ」ＣＲＩＳＰＲシステムと呼ばれる）。この要件により、ＤＳＢを引き起こすのに十分な近さで２つのオフターゲットニックが生成される可能性が低いため、標的の特異性が劇的に向上する。したがって、本発明は、特異性を高め、オフターゲット効果を低減するために、ダブルニックにより誘導されたＤＳＢを作製するためのデュアルニッカーゼアプローチの使用をさらに包含することを理解されたい。
【０１０９】
したがって、ある実施形態では、少なくとも１つのレポーター遺伝子は、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ／ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ９（Ｃａｓ９）システムによって媒介される相同性指向性修復（ＨＤＲ）によって、トランスジェニック鳥類対象、特に動物の性染色体に取り込まれ得る。
【０１１０】
上記のように、ＣＲＩＳＰＲ  ＩＩ型システムは、少なくとも２つの要素、ヌクレアーゼ、具体的にはＣａｓ９およびガイドＲＮＡを含む。したがって、本発明で使用されるレポーター遺伝子をトランスジェニック鳥類対象の性染色体に組み込み、取り込むために、Ｃａｓ９またはＣａｓ９をコードする任意の核酸配列に加えて、本発明では、特定の性染色体内の標的部位に対して、Ｃａｓ９を標的にするガイドＲＮＡまたはこうしたｇＲＮＡをコードする任意の核酸配列をさらに提供する。いくつかのさらなる実施形態では、本発明のキットのｇＲＮＡは、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）および少なくとも１つのトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含み得る。
【０１１１】
いくつかの代替的実施形態では、本発明のキットは、少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする核酸配列を含んでもよい。こうした核酸配列は、標的ゲノムＤＮＡ配列中の少なくとも１つのプロトスペーサーを標的とし、かつそのために、それと同一である少なくとも１つのスペーサー配列を含むＣＲＩＳＰＲアレイを含んでもよい。核酸配列は、少なくとも１つのｔｒａｃｒＲＮＡをコードする配列をさらに含むことに留意されたい。
【０１１２】
さらに、いくつかの実施形態では、少なくとも１つのレポーター遺伝子は、鳥類の対象もしくは動物の少なくとも１つの細胞、または鳥類の対象もしくは動物に導入された少なくとも１つの細胞に（ａ）ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ９システムの要素、具体的には、少なくとも１つのＣａｓ９タンパク質、または少なくとも１つのＣａｓ９タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列を含む少なくとも１つの第１の核酸配列；および性染色体ＺまたはＷ内のプロトスペーサーを標的とする少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、または少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする少なくとも１つの核酸配列；ならびに（ｂ）少なくとも１つのレポーター遺伝子を含む少なくとも１つの第２の核酸配列を接触するか、もしくは同時トランスフェクトすることにより、トランスジェニック鳥類対象、特に動物の性染色体に取り込まれ得る。いくつかの実施形態では、（ａ）のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ９システムの要素が核酸配列の形態で提供される場合、異なる要素を含む１つの核酸分子内で提供され得るか（本明細書では「第１の核酸配列」と称する、または各々が上記の要素のうちの１つ、具体的にはｇＲＮＡおよびＣａｓ９をコードする配列を含む２つ以上の核酸分子内で提供され得ることに留意されたい。
【０１１３】
したがって、本発明の方法によって使用されるトランスジェニック鳥類動物の調製のために、少なくとも２つの核酸分子が提供されるものとする。
【０１１４】
さらに、「ｇＲＮＡ」または「ターゲティングＲＮＡ」は、それをコードするＣＲＩＳＰＲシステムの一部分から転写されたときに、本明細書ではプロトスペーサーと呼ばれる標的ゲノムＤＮＡ中のＤＮＡ配列と同一（ＲＮＡの場合、ＴがＵに置き換わっていることを除く）であるか、または相補的（したがって「標的」）であるＲＮＡ配列の少なくとも１つのセグメントを含むＲＮＡである。本開示のＣＲＩＳＰＲシステムは、任意により２つ以上のターゲティングＲＮＡをコードしてもよく、ターゲティングＲＮＡはゲノムＤＮＡ中の１つ以上の標的配列に向けられてもよい。本明細書で使用される「プロトスペーサー」は、標的染色体内の標的配列を指す。こうしたプロトスペーサーは、本発明の方法およびキットのｇＲＮＡをコードする核酸配列内に含まれるＣＲＩＳＰＲスペーサーによってコードされるターゲティングＲＮＡに対して、十分な相補性を有する核酸配列を含む。
【０１１５】
本発明の方法、ならびに本明細書の以下に記載されるキットは、核酸配列を提供する。本明細書で使用する「核酸または核酸分子」は「ポリヌクレオチド（複数可）」という用語と同義があり、一般にポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを指し、これは非修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡまたは修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはそれらの任意の組み合わせであり得る。「核酸」としては、限定されないが、一本鎖および二本鎖核酸が挙げられる。本明細書で使用される場合、「核酸（複数可）」という用語には、１つ以上の修飾塩基を含む上記のＤＮＡまたはＲＮＡも含まれる。本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」という用語は、２つ以上の、好ましくは３つ以上のデオキシリボヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドから構成される分子として定義される。その正確なサイズは、多くの要因に依存し、かつオリゴヌクレオチドの最終的な機能および使用に依存する。オリゴヌクレオチドは、約８〜約１，０００ヌクレオチド長であり得る。より具体的には、本発明のキットにより使用されるオリゴヌクレオチド分子は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００塩基以上の長さのいずれか１つを含み得る。
【０１１６】
核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡなど）であるモノマー、または天然に存在するヌクレオチドの類似体（例えば、天然に存在するヌクレオチドのアルファ鏡像体）、または修飾ヌクレオチドまたはそれらの任意の組み合わせで構成され得る。本明細書では、この用語は、逆転写酵素（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）の作用によりＲＮＡ鋳型から生成された相補ＤＮＡまたはコピーＤＮＡであるｃＤＮＡも包含する。
【０１１７】
これに関連して、「単離されたポリヌクレオチド」は、生物のゲノムから分離された核酸分子である。例えば、本発明の方法およびキットによって使用されるレポーター遺伝子またはその誘導体または相同体をコードするＤＮＡ分子、ならびに本発明の方法およびキットのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９およびｇＲＮＡをコードし、細胞のゲノムＤＮＡから分離されている配列は、単離ＤＮＡ分子である。単離核酸分子の別の例は、生物のゲノムに取り込まれていない化学合成された核酸分子である。特定の種から単離された核酸分子は、その種からの染色体の完全なＤＮＡ分子よりも小さい。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、本発明の方法およびキット（以下に記載）によって使用される核酸配列、具体的には、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡ、または代替的に本発明のレポーター遺伝子をコードする配列を含む核酸配列は、ベクター、カセット、または任意の他のビヒクル内で構築されたものが提供されてもよい。したがって、本発明は、さらに、本発明のポリヌクレオチド、および任意により、本発明の核酸配列に作動可能に連結されたプロモーター、調節および制御要素、翻訳、発現および他のシグナルなどのさらなる追加要素を含む組換えＤＮＡ構築物に関する。本発明によって提供されるベクターの非限定的な例は、Ｃａｓ９をコードする核酸配列およびレポーター遺伝子を標的性染色体へ取り込むために必要とされる特定のｇＲＮＡを含む任意のベクターであり得る。いくつかの特定の実施形態では、本発明は、配列番号２５によって示されるＣａｓ９、および性染色体Ｚに対してレポーター遺伝子をターゲティングする、配列番号２６によって示されるｇＲＮＡ７をコードする核酸配列を含むＤＮＡ構築物またはベクターを提供する。さらにいくつかのさらなる実施形態では、本発明は、性染色体内、具体的には、性染色体Ｚの標的遺伝子座への組換えおよび取り込みに必要な左右の腕と隣接する本発明のレポーター遺伝子、具体的にはＲＦＰをコードする核酸配列を含むベクターまたはＤＮＡ構築物をさらに提供する。こうしたベクターの非限定的例は、図１５に開示される核酸配列を含むベクターであり得る。さらにいくつかのさらなる実施形態では、配列番号６６および／または配列番号６７の少なくとも１つによって示される核酸配列を含む核酸配列である。
【０１１９】
なおさらに、本発明は、本発明のベクターおよびＤＮＡ構築物、具体的には本発明によって記載されるベクターのいずれかを含むかつ／または発現する任意の宿主細胞をさらに包含する。
【０１２０】
本明細書で使用する場合、「組換えＤＮＡ」、「組換え核酸配列」または「組換え遺伝子」という用語は、本発明のＣＲＩＳＰＲシステムのうちの１つ、具体的には、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ＩＩ型をコードするオープンリーディングフレームを、鳥類染色体Ｚおよび／またはＷ内の特定の遺伝子座内の対応するプロトスペーサーに対してＣａｓ９をターゲティングする本発明のｇＲＮＡとともに含む核酸を指す。さらにいくつかの他の実施形態では、本明細書で使用される組換えＤＮＡは、本発明のレポーター遺伝子、具体的には導入遺伝子をコードするオープンリーディングフレームを含む核酸をさらに指す。
【０１２１】
本明細書で言及される「遺伝子」または「導入遺伝子」という用語は、タンパク質産物をコードする天然または合成のいずれかである核酸を意味する。「核酸」という用語は、ヌクレオチドおよびヌクレオシド、例えばｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、ｍＲＮＡ、およびＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、およびそれらの誘導体の天然および／または合成の直線、環状、および連続アレイを意味することを意図している。
【０１２２】
「作動可能に連結された」という語句は、導入遺伝子の転写が可能である方法で付着することを意味することを意図している。上記のように、本発明の方法によって使用される導入遺伝子は、性染色体ＺまたはＷに組み込まれる導入遺伝子、具体的には、レポーター遺伝子、および遺伝子編集システム（例えば、ＣＲＩＳＰ／Ｃａｓ９システム）をコードする核酸配列を提供することによって調製される。「コードする」という用語は、例えば、対象の核酸が、好適なベクター（発現ベクターなど）においてプロモーター要素およびエンハンサー要素などの適切な制御配列に連結している場合、およびベクターが、適切なシステムまたは細胞に導入される場合、対象の核酸が、適切な発現システムにおいて所望のポリペプチドまたは対象タンパク質のいずれかに転写され、かつ翻訳され得ることを意味することを意図するものである。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、本発明の方法およびキットによって提供され、かつ使用される第１および第２の核酸配列のうちの少なくとも１つを構築し、ベクター内に含め得ることを理解されたい。本明細書で使用する「ベクター」または「ビヒクル」は、プラスミド、ファージミド、ウイルス、取り込み可能なＤＮＡ断片、および他のビヒクルなどのベクターを包含し、これらにより、宿主のゲノムへのＤＮＡ断片の取り込みが可能になるか、または代替的には取り込まれていない遺伝的要素の発現が可能になる。ベクターは、典型的には、所望の核酸配列と、好適な宿主細胞で認識され、所望のスペーサーの翻訳をもたらす作動可能に連結された遺伝子制御要素とを含む自己複製ＤＮＡまたはＲＮＡ構築物である。一般に、遺伝子制御要素は、原核生物プロモーターシステムまたは真核生物プロモーター発現制御システムを含むことができる。こうしたシステムは、典型的には、転写プロモーター、ＲＮＡ発現のレベルを上昇させる転写エンハンサーを含む。ベクターには、通常、ベクターが宿主細胞とは独立して複製できる複製起点を含む。さらにいくつかの代替的実施形態では、本発明で使用される発現ベクターは、本発明の所望のレポーター遺伝子を鳥類の性特異的染色体Ｗおよび／またはＺに取り込むために必要な要素を含んでもよい。
【０１２４】
したがって、「制御および調節要素」という用語には、プロモーター、ターミネーター、および他の発現制御要素が含まれる。こうした調節要素は、Ｇｏｅｄｄｅｌ；［Ｇｏｅｄｄｅｌ．，ら、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０年）］に記載されている。例えば、本発明の方法を使用して、任意の所望のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を発現させるために、それらに作動可能に連結されたときにＤＮＡ配列の発現を制御する多種多様な発現制御配列のいずれかをこれらのベクター内で使用してもよい。
【０１２５】
ベクターは、追加的に、適切な制限部位、抗生物質耐性、またはベクター含有細胞の選択のための他のマーカーを含んでもよい。プラスミドは、最もよく使用されるベクターの形態であるが、同等の機能を果たし、当技術分野で公知であるか、または公知になる他の形態のベクターが本明細書での使用には好適である。例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓら、Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８５年および追補）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．；およびＲｏｄｒｉｑｕｅｚら（編）Ｖｅｃｔｏｒｓ：ａ  Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅｓ、Ｂｕｔｔｅｒｓｗｏｒｔｈ、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓ（１９８８年）を参照されたい。これらは参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２６】
本発明の方法によって使用されるトランスジェニック鳥類動物を作製するには、その性染色体ＺまたはＷ内の特定の遺伝子座内に取り込まれたレポーター遺伝子を含む鳥類細胞を調製する必要がある。こうした細胞は、いくつかの実施形態では、鳥類の対象の細胞もしくは鳥類の対象に導入された任意の細胞を、本発明の方法およびキットによって提供される第１および第２の核酸配列と、または同じものを含む任意の構築物、ベクター、ビヒクルと、接触、導入または同時トランスフェクトすることにより調製され得る。いくつかの実施形態では、遺伝子編集要素をコードする核酸配列、および標的レポーター遺伝子、具体的にはＲＦＰをコードする核酸配列である。本明細書で使用される「トランスフェクション」は、ＤＮＡおよび二本鎖ＲＮＡなどの遺伝物質を哺乳類細胞に挿入するプロセスを意味する。ＤＮＡを細胞に挿入することにより、細胞自身の機構を使用したタンパク質の発現または産生が可能になる。したがって、本明細書で使用される同時トランスフェクションとは、少なくとも２つの異なる核酸分子またはそれらを含む任意のベクターを各単一細胞へ同時にトランスフェクトすることを指す。なおさらに、トランスフェクトされる核酸配列は、短期間一時的に発現されることができるか、またはゲノムＤＮＡに組み込まれ、分裂するにつれて細胞から細胞へとその変化が伝えられることが可能になる。
【０１２７】
したがって、本発明は、それらの性染色体（具体的には、Ｚおよび／またはＷ）に取り込まれたレポーター遺伝子、具体的には赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）の発現に基づく卵内での鳥類胚の卵内の性決定のための方法を提供する。「発現」とは一般に、遺伝子にコードされた情報が細胞内に存在し、細胞内で機能する構造に変換されるプロセスを指す。したがって、本発明によれば、レポーター遺伝子の「発現」は、具体的には、ポリヌクレオチドへの転写、タンパク質への翻訳、またはタンパク質の翻訳後修飾さえも指し得る。
【０１２８】
トランスジェニック鳥類対象の性染色体内での特定の標的遺伝子座にレポーター遺伝子を挿入することおよび特異的に取り込みを行うことは、いくつかの実施形態では、特定のｇＲＮＡおよび取り込むべきレポーター遺伝子の核酸配列を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを提供することを伴い得る。取り込みを容易にし、かつ可能にするためには、いくつかの実施形態では、レポーター遺伝子は、標的にされた取り込み部位に隣接する配列と相同であり得る配列と隣接している必要があり、それにより組換えが可能になる。したがって、さらにいくつかのさらなる特定の実施形態では、第２の核酸配列中の少なくとも１つのレポーター遺伝子は、相同腕とその５’および３’において隣接していてもよい。いくつかの実施形態では、これらの腕が必要であり、このため、取り込み部位でのレポーター遺伝子のＨＤＲが容易になることを理解されたい。
【０１２９】
より具体的な実施形態では、本発明の方法によって使用される第２の核酸配列中のレポーター遺伝子は、性染色体ＺまたはＷ内の標的遺伝子座内に含まれ、ＨＤＲを介した特異的取り込みを容易にする取り込み部位として機能する全体の、全ての、もしくは完全な少なくとも１つの核酸配列に対して相同であるか、または約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の相同性または同一性を示す２つの腕に隣接し得る。ある実施形態では、標的配列は、本明細書では、本発明によって使用されるｇＲＮＡの一部であり、かつ第１の核酸配列によって提供される「スペーサー」配列によって認識され、少なくとも１つの「プロトスペーサー」とも呼ばれる。
【０１３０】
本明細書で使用される「相同腕」という用語は、特定のベクターまたはウイルスに導入され、特定の突然変異または遺伝子への新しい要素の挿入を作り出すために使用されるＨＤＲ鋳型を指し、これらは、（使用されるＰＥＮに応じて）改変される標的配列を取り囲む一定量の相同性を有する。ＣＲＩＳＰＲがＰＥＮとして使用されるさらにいくつかのさらなる特定の実施形態では、これらの腕の配列（左、上流および右、下流）は約１０〜５０００ｂｐ、具体的には、約５０〜１０００ｂｐ、１００〜５００、具体的には、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００ｂｐを含んでもよい。
【０１３１】
さらにいくつかのさらなる実施形態では、本明細書で「スペーサー」配列とも呼ばれる、本発明の方法およびキットによって提供される第１の核酸配列によってコードされるｇＲＮＡ内のターゲティング配列は、本明細書で「プロトスペーサー」と呼ばれる、性染色体ＺまたはＷ内の標的遺伝子座内に含まれる全て、完全、または全体の少なくとも１つの核酸配列に対して、約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の相同性または同一性を呈する。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、第２の核酸配列中の少なくとも１つのレポーター遺伝子は、性特異的プロモーター、胚特異的プロモーター（例えば、α−グロビンプロモーター）および誘導性プロモーター（例えば、ダイズＳＳＵ遺伝子に由来する、またはパセリカルコンシンターゼＣＨＳプロモーターに由来する光誘導性プロモーター、または青色光を照射されたときに発現を活性化する細菌の光−酸素−電圧タンパク質であるＥＬ２２２の遺伝子操作型）のうちのいずれか１つに作動可能に連結され得る。さらにより特定の実施形態では、レポーター遺伝子は、胚性プロモーターの制御下にあり、それによりトランスジェニックレポーター遺伝子の発現が胚期に制限され、成鶏では発現しない場合がある。こうした実施形態では、レポーター導入遺伝子は、診断目的のために、胚の段階でのみ使用され、かつ発現され得る。
【０１３３】
より具体的には、本明細書で使用される「プロモーター」は、下流に配置される遺伝子の発現を制御する能力を有するＤＮＡの特定の領域を指す。
【０１３４】
したがって、「鶏の性に特異的なプロモーター」とは、以下、特定の鶏の性（すなわち、雄または雌）でのみ遺伝子の発現を活性化するプロモーターを指す。さらに、「鶏の発育に特異的なプロモーター」とは、鶏の発育の特定の段階でのみ遺伝子の発現を活性化するプロモーターを指す。
【０１３５】
いくつかの特定の実施形態では、少なくとも１つのレポーター遺伝子を挿入し、それにより標的性染色体の少なくとも１つの非コード領域に取り込んでもよい。こうしたアプローチは、孵化していない胚の発生および成熟に必要とされ得る遺伝子が破壊されるのを回避する。
【０１３６】
本明細書で使用される「非コード領域」は、タンパク質配列をコードしない生物のＤＮＡの構成成分を指す。いくつかの非コーディングＤＮＡ領域は、機能的な非コーディングＲＮＡ分子に転写され、非コーディングＤＮＡ領域の他の機能としては、タンパク質コーディング配列の転写および翻訳調節、足場付着領域、ＤＮＡ複製起源、セントロメアおよびテロメアが挙げられる。仮説上の非機能的部分（または未知の機能のＤＮＡ）は、多くの場合、「ジャンクＤＮＡ」と呼ばれる。
【０１３７】
さらにいくつかの特定の実施形態では、トランスジェニック鳥類動物を調製するための本発明の方法によって使用される少なくとも１つのレポーター遺伝子は、性Ｚ染色体の少なくとも１つの部位に取り込まれ得る。より具体的な実施形態では、Ｚ染色体内の特定の遺伝子座は、雌鶏の染色体Ｚの配列番号１５で示される領域９１５６８７４〜９１６１８７４、配列番号１６で示される２７７６４９４３〜２７７６９９４３、配列番号１７で示される４２１７２７４８〜４２１７７７４８、配列番号１８で示される６３３６３６５６〜６３３６８６５６、および配列番号１９で示される７８７７７４７７〜７８７８２４７７のうちのいずれか１つであり得る。
【０１３８】
いくつかの特定の実施形態では、少なくとも１つのレポーター遺伝子は、具体的には、配列番号１７で示される、性Ｚ染色体遺伝子座４２１７２７４８〜４２１７７７４８の少なくとも１つの部位に取り込まれ得る。さらにいくつかのさらなる特定の実施形態では、Ｚ染色体内の特定の遺伝子座へ取り込むのに好適であるｇＲＮＡ配列としては、Ｚ染色体遺伝子座ｃｈｒＺ＿４２１７４５１５＿−１内に配置されているプロトスペーサーに向けられたｇＲＮＡ７が挙げられ得るが、これらに限定されない。いくつかの特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡ７と呼ばれるｇＲＮＡであってもよい。より具体的な実施形態では、こうしたｇＲＮＡ７は、配列番号２６によっても示されるように、核酸配列ＧＴＡＡＴＡＣＡＧＡＧＣＴＡＡＡＣＣＡＧを含み得る。さらにいくつかのさらなる実施形態では、本発明のレポーター遺伝子をＺ染色体内の特定の遺伝子座に取り込むために、本発明により提供されるレポーター遺伝子、具体的には、ＲＦＰをコードする配列は、その５’では左腕、およびその３’では右腕に隣接してもよい。さらにいくつかのさらなる特定の実施形態では、左腕は、配列番号３１で示される核酸配列を含んでもよく、配列番号３２で示される核酸配列を含む右腕を使用して、本発明のレポーター遺伝子を配列番号２６のｇＲＮＡ７によって指示される特定の遺伝子座に取り込み得る。
【０１３９】
さらにいくつかのさらなる特定の実施形態では、レポーター遺伝子をＺ染色体内のこれらの特定の場所に対してターゲティングするのに必要とする少なくとも１つのｇＲＮＡは、次のいずれかによって示される核酸配列を含んでもよい；配列番号１１で示されるｇＲＮＡ３：ＡＣＡＧＡＣＣＴＡＴＧＡＴＡＴＧＴ、配列番号１２で示されるｇＲＮＡ４：ＣＧＡＴＴＡＴＣＡＣＴＣＡＣＡＡＧ、配列番号１３で示されるｇＲＮＡ５：ＣＴＧＧＴＴＡＧＣＡＴＧＧＧＧＡＣ、配列番号１４で示されるｇＲＮＡ６：ＧＴＡＡＡＧＡＧＴＣＡＧＡＴＡＣＡ。
【０１４０】
さらにいくつかのさらなる実施形態では、本発明のレポーター遺伝子をＺ染色体内の特定の遺伝子座に取り込むために、配列番号４１で示される核酸配列を含む左腕および配列番号４２で示される核酸配列を含む右腕を使用して、本発明のレポーター遺伝子を配列番号１１のｇＲＮＡ３によって指示される特定の遺伝子座に取り込み得る。さらなる実施形態では、本発明のレポーター遺伝子をＺ染色体内の特定の遺伝子座に取り込むために、配列番号４３で示される核酸配列を含む左腕および配列番号４４で示される核酸配列を含む右腕を使用して、本発明のレポーター遺伝子を配列番号１２のｇＲＮＡ４により指示される特定の遺伝子座に取り込み得る。なおさらなる実施形態では、本発明のレポーター遺伝子をＺ染色体内の特定の遺伝子座に取り込むために、配列番号４５で示される核酸配列を含む左腕および配列番号４６で示される核酸配列を含む右腕を使用して、本発明のレポーター遺伝子を配列番号１３のｇＲＮＡ５により指示される特定の遺伝子座に取り込み得る。いくつかのさらなる実施形態では、本発明のレポーター遺伝子をＺ染色体内の特定の遺伝子座に取り込むために、配列番号４７で示される核酸配列を含む左腕および配列番号４８で示される核酸配列を含む右腕を使用して、本発明のレポーター遺伝子を配列番号１４のｇＲＮＡ６により指示される特定の遺伝子座に取り込み得る。
【０１４１】
Ｚ染色体内の特定の遺伝子座への取り込みに好適であるｇＲＮＡ配列のさらなる非限定的な例としては、これらに限定されないが、配列番号２７でも示される核酸配列ＡＣＡＧＡＣＣＴＡＴＧＡＴＡＴＧＴＧＡＧを含むＺ染色体遺伝子座ｃｈｒＺ＿９１５７０９１＿１のｇＲＮＡ８、配列番号２８でも示される核酸配列ＧＡＧＣＴＴＧＴＧＡＧＴＧＡＴＡＡＴＣＧを含むＺ染色体遺伝子座ｃｈｒＺ＿２７７６７６０２＿−１のｇＲＮＡ９、配列番号２９でも示される核酸配列ＧＴＡＡＡＧＡＧＴＣＡＧＡＴＡＣＡＣＡＧを含むＺ染色体遺伝子座ｃｈｒＺ＿７８７７９９２７＿１のｇＲＮＡ１０、および配列番号３０でも示される核酸配列ＣＡＧＴＧＧＧＴＡＣＴＧＡＡＧＣＴＧＴＧを含むＺ染色体遺伝子座ｃｈｒＺ＿６３３６４９４６＿−１のｇＲＮＡ１１が含まれ得る。
【０１４２】
さらなる実施形態では、本発明のレポーター遺伝子をＺ染色体内の特定の遺伝子座に取り込むために、配列番号３３で示される核酸配列を含む左腕および配列番号３４で示される核酸配列を含む右腕を使用して、本発明のレポーター遺伝子を配列番号２７のｇＲＮＡ８によって指示される特定の遺伝子座に取り込み得る。なおさらなる実施形態では、本発明のレポーター遺伝子をＺ染色体内の特定の遺伝子座に取り込むために、配列番号３５で示される核酸配列を含む左腕および配列番号３６で示される核酸配列を含む右腕を使用して、本発明のレポーター遺伝子を配列番号２８のｇＲＮＡ９によって指示される特定の遺伝子座に取り込み得る。さらなる実施形態では、本発明のレポーター遺伝子をＺ染色体内の特定の遺伝子座に取り込むために、配列番号３７で示される核酸配列を含む左腕および配列番号３８で示される核酸配列を含む右腕を使用して、本発明のレポーター遺伝子を配列番号２９のｇＲＮＡ１０によって指示される特定の遺伝子座に取り込み得る。さらなる実施形態では、本発明のレポーター遺伝子をＺ染色体内の特定の遺伝子座に取り込むために、配列番号３９で示される核酸配列を含む左腕および配列番号４０で示される核酸配列を含む右腕を使用して、本発明のレポーター遺伝子を配列番号３０のｇＲＮＡ１１によって指示される特定の遺伝子座に取り込み得る。
【０１４３】
さらにいくつかの代替的実施形態では、少なくとも１つのレポーター遺伝子は、性Ｗ染色体での少なくとも１つの部位に取り込まれ得る。より具体的な実施形態では、Ｗ染色体の特定の遺伝子座は、場所１０２２８５９〜１０２４２１５であってもよい。いくつかの特定の実施形態では、標的遺伝子座は、配列番号３で示される核酸配列を含んでもよい。
【０１４４】
より具体的な実施形態では、レポーター遺伝子をＷ染色体内のこうした特定の場所に対してターゲティングするのに必要な少なくとも１つのｇＲＮＡは、配列番号１および２のいずれか１つで示される核酸配列を含んでもよく、これらのｇＲＮＡは、本明細書ではそれぞれｇＲＮＡ１およびｇＲＮＡ２として示す。
【０１４５】
さらにいくつかのより具体的な実施形態では、トランスジェニック鳥類の雌を調製するために本発明の方法によって使用されるｇＲＮＡは、配列番号１（ｇＲＮＡ１）で示される核酸配列を含んでもよい。こうした場合、第２の核酸配列内に含まれる少なくとも１つのレポーター遺伝子は、その５’および３’において、それぞれＷ染色体内の特定の遺伝子座に対するその取り込みを容易にする配列番号４および５で示されるアミノ酸配列を含む相同腕と隣接し得る。本明細書では、これらの腕は、それぞれ左腕および右腕とも呼ばれることを理解されたい。
【０１４６】
さらにいくつかの代替的実施形態では、本発明のトランスジェニック鳥類の雌を調製するために使用されるｇＲＮＡは、配列番号２で示される核酸配列（ｇＲＮＡ２）を含んでもよい。こうした場合、第２の核酸配列内に含まれる少なくとも１つのレポーター遺伝子は、それぞれ配列番号６および７で示されるアミノ酸配列を含む相同腕とその５’および３’において隣接する。本明細書では、これらの腕は、それぞれ左腕および右腕とも呼ばれることを理解されたい。
【０１４７】
鳥類宿主の接合体細胞の遺伝子座が外因性配列、具体的には本発明で使用されるレポーター遺伝子で標的化および／またはトランスフェクトされた場合、こうした細胞を使用してトランスジェニック動物を生成することが望ましい場合がある。こうした手順では、胚性幹（ＥＳ）細胞に標的化構築物を導入した後、その細胞を、適切な培地、例えば成長因子およびサイトカイン、ウシ胎児血清および抗生物質を補充したＤＭＥＭにおいて、フィーダー層に播種してもよい。胚性幹細胞は、単一の標的遺伝子座（ヘテロ接合）または両方の標的遺伝子座（ホモ接合）を有してもよい。この構築物を含む細胞は、選択培地を使用することにより検出され、コロニーが成長するにあたって十分な時間の後、コロニーが採取され、遺伝子の標的化の発生について分析され得る。いくつかの特定の実施形態では、ＰＣＲを用いることで、構築物配列内外のプライマーを使用して、所望の外因性配列が標的遺伝子座に取り込まれていることを検証することができる。次いで、遺伝子の標的化を示すコロニーは、鳥類胚への注入に使用され得る。次に、ＥＳ細胞をトリプシン処理し、この改変した細胞を卵の側面に作られた開口部から注入し得る。卵を密封した後、孵化するまで適切な条件下で卵をインキュベートすることができる。新たに孵化した鳥類は、例えばその生物学的サンプル、例えば血液サンプルを調べることにより、標的構築物配列が存在しているかについて試験を行うことができる。鳥類が成熟に到達し、繁殖した後、その子孫を調べて、取り込まれた外因性配列が生殖系列を介して伝達されているかを判定してもよい。
【０１４８】
生殖系列を介して遺伝的改変を伝達することができる、改変された胚性幹細胞または接合体細胞に部分的に由来するキメラ鳥類が産生される。外因性配列、具体的には本発明で使用されるレポーター遺伝子またはその一部分を含む鳥類系統と、鳥類の野生型遺伝子座またはその一部分が復元されている系統との交配により、子孫が卵内で検出可能な性を示すようになるものとする。
【０１４９】
なおさらに、トランスジェニック鳥類は、他の方法によって産生することもでき、そのいくつかを以下で論じる。トランスジェニック動物を産生するための形質転換に好適である鳥類細胞には、始原生殖細胞（ＰＧＣ）、精子細胞および接合体細胞（胚性幹細胞など）がある。精子細胞は、エレクトロポレーション、微粒子衝撃、リポフェクションなどの任意の好適な方法によってＤＮＡ構築物により形質転換され得る。精子は、鳥類の人工授精に使用できる。授精した鳥の子孫は、上記のように外因性配列を調べることができる。
【０１５０】
あるいは、始原生殖細胞は、鳥類の卵から単離し、任意の適切な方法により本発明の外因性レポーター遺伝子でトランスフェクトし、新しい胚に移入または挿入してもよく、これにより、発育中の生殖腺に組み込むことができる。孵化した鳥類およびそれらの子孫は、本発明に記載される外因性レポーター遺伝子配列について調査され得る。
【０１５１】
さらに別のアプローチでは、卵から単離された分散胚盤葉細胞は、性特異的染色体ＺまたはＷに取り込まれた外因性レポーター遺伝子配列またはその一部分を任意の適切な手段でトランスフェクトし、その後無処置の卵の胚下腔に注入することができる。孵化した鳥類の対象およびその子孫は、上記のように外因性レポーター遺伝子について調査できる。
【０１５２】
鶏の始原生殖細胞（ＰＧＣ）は、卵子および精子の前駆体である。したがって、そのいくつかの態様において、本発明は、レポーター遺伝子構築物およびレポーター遺伝子の性特異的染色体Ｗおよび／またはＺへの取り込みを指示するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ｇＲＮＡ構築物により同時トランスフェクトされたＰＧＣを使用する生殖系列伝達系を介するトランスジェニック鶏の産生をもたらす。ＰＧＣは選別され、生殖系列伝達のために２．５日目のレシピエント胚の血流に移される。
【０１５３】
ＰＧＣは配偶子の前駆体であり、哺乳類と比較した場合、鳥の初期胚形成中に独特の移動活性を示す。鳥類の胚では、ＰＧＣはまず胚盤葉上層から発生し、インキュベーションの約１８〜１９時間後にステージ４（ＨＨ）で生殖三日月環の胚盤葉下層に移動する。ステージ１０とステージ１２（ＨＨ）との間で、ＰＧＣは生殖三日月環から血流に移動し、生殖隆起に到達して発育中の生殖腺にコロニーを形成するまで循環系を通って移動する。これは、ＰＧＣが発育中の生殖腺に到達するために胚組織を通って移動する哺乳類とは対照的である。鶏の遺伝的改変の大きい進歩を容易にしたのは、鳥類のＰＧＣが血流を介して移動するこの固有の特徴である。
【０１５４】
したがって、いくつかの特定の実施形態では、「トランスジェニック鳥類動物の調製」は、ゲノム改変を伴う鶏を生産するための遺伝子工学技術を伴う多段階法を指す。ａ）始原生殖細胞（ＰＧＣ）を、２日齢の鶏胚の血液から単離する、ｂ）例えば、レンチウイルスシステム、Ｐｉｇｇｙｂａｃトランスポゾンベクター、ＴＡＬＥＮＳまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を使用することにより、導入遺伝子構築物を培養ＰＧＣに組み込む、（ｃ）トランスジェニックＰＧＣが特定され、胚の循環系に注入され、発育中の生殖腺に移動する、ｄ）レシピエント胚は、３７℃で孵化するまでインキュベートさせる、（ｄ）孵化した雄は性別が成熟に到達するまで飼育され、野生型の雌鶏と交配される、（ｅ）子孫は、トランスジェニックＰＧＣに由来するものを識別するためにスクリーニングされる。
【０１５５】
したがって、第２の態様では、本発明は、性染色体ＺおよびＷの少なくとも１つにおいて、少なくとも１つの位置または場所（本明細書では遺伝子座とも称されている）に取り込まれた少なくとも１つの外因性レポーター遺伝子をその少なくとも１つの細胞に含む、鳥類トランスジェニック動物または対象に関する。
【０１５６】
「鳥類」という用語は、羽毛、歯のないくちばしをした顎、硬い殻付きの卵の産卵、高い代謝率、四室の心臓および軽量であるが頑強な骨格を特徴とする鳥に由来するあらゆる種に関する。鳥類の種としては、鶏、ウズラ、七面鳥、アヒル、Ｇａｌｌｉｎａｃｅａ種、ガチョウ、キジ、および他の家禽が挙げられるが、これらに限定されない。「雌鶏」という用語は、鳥類のすべての雌を含む。「トランスジェニック鳥類」とは一般に、異種ＤＮＡ配列、または鳥類の生殖細胞に染色体により取り込まれた、鳥類に対して通常内因性である１つ以上の追加のＤＮＡ配列（本明細書では総称して「導入遺伝子」と称する）を有する鳥類を指す。こうした移入および取り込みの結果として、移入された配列は、生殖細胞を介してトランスジェニック鳥類の子孫に伝達され得る。トランスジェニック鳥類（その子孫を含む）も、体細胞の性染色体に取り込まれた導入遺伝子を有する。
【０１５７】
いくつかの特定の実施形態では、本発明の少なくとも１つのトランスジェニック動物は、少なくとも２つの異なるレポーター遺伝子を含み得る。こうした場合、各レポーター遺伝子は、性染色体Ｚおよび／またはＷの一方内の少なくとも１つの位置または場所に取り込まれ得る。さらにいくつかのさらなる実施形態では、各レポーター遺伝子は、性染色体Ｚおよび／またはＷの一方において、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０以上の位置または場所に取り込まれてもよい。
【０１５８】
さらにいくつかのさらなる実施形態では、本発明のトランスジェニック動物に含まれるレポーター遺伝子は、少なくとも１つの蛍光レポーター遺伝子であり得る。本発明によって提供されるトランスジェニック鳥類対象に関しては、あらゆるレポーター遺伝子、具体的には、本発明により開示されている、具体的には、本発明の他の態様に関連して、本明細書の上記表１によって開示されているあらゆる蛍光レポーター遺伝子も適用され得ることを理解されたい。
【０１５９】
より具体的な実施形態では、そのような蛍光レポーター遺伝子は、少なくとも１つの赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）を含むか、またはＲＦＰであり得る。しかし、いくつかの実施形態では、本発明のトランスジェニック鳥類対象によって導入遺伝子として発現するレポーター遺伝子は、蛍光タンパク質が緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ではないという条件で、ＲＦＰ、ＹＦＰ、ＢＦＰなどの任意の蛍光タンパク質であってもよいことに留意されたい。換言すれば、いくつかの特定の実施形態では、本発明により提供されるトランスジェニック動物の性染色体に取り込まれたレポーター遺伝子は、蛍光タンパク質がＧＦＰではないという条件で、任意の蛍光タンパク質であり得る。
【０１６０】
ある実施形態では、本発明によって提供される少なくとも１つのトランスジェニック鳥類動物は雌であり得る。より具体的な実施形態では、こうしたトランスジェニック鳥類の雌の少なくとも１つのレポーター遺伝子は、雌染色体Ｚの少なくとも１つの位置に取り込まれ得る。
【０１６１】
さらにいくつかの代替的実施形態では、少なくとも１つのトランスジェニック鳥類動物は雌であり得、雌染色体Ｗの少なくとも１つの位置に取り込まれている少なくとも１つのレポーター遺伝子を有する。
【０１６２】
さらにいくつかのさらなる代替的実施形態では、本発明によって提供されるトランスジェニック動物は、その２つの性Ｚ染色体のうちの少なくとも１つに取り込まれた導入遺伝子レポーター遺伝子を保有するトランスジェニック雄対象であり得る。いくつかのさらなる実施形態では、本発明によって提供されるトランスジェニック動物は、その２つの性Ｚ染色体のうちの１つに取り込まれた導入遺伝子レポーター遺伝子を保有するトランスジェニック雄対象であり得る。さらなる代替的実施形態では、本発明により提供されるトランスジェニック動物は、その２つの性Ｚ染色体のうちの２つに取り込まれた導入遺伝子レポーター遺伝子を保有するトランスジェニック雄対象であり得る。
【０１６３】
いくつかの特定の実施形態において、少なくとも１つのレポーター遺伝子は、少なくとも１つのＰＥＮを使用して本発明のトランスジェニック動物の性染色体に取り込まれ得る。本発明の方法に関連して上述したように、任意の遺伝子工学システムまたは任意のＰＥＮ、具体的には任意のＲＮＡ誘導システム、例えば、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮなどのうちの１つを使用してもよい。
【０１６４】
より具体的には、こうしたＰＥＮは、ある実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムが使用され得る。より具体的な実施形態では、ＣＲＩＳＰＲクラス２システムを使用して、本発明のトランスジェニック動物を作製してもよい。さらにいくつかのさらなる特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲＩＩ型システムを使用することができる。
【０１６５】
さらにより具体的な実施形態では、少なくとも１つのレポーター遺伝子は、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムにより媒介されるＨＤＲにより、本発明のトランスジェニック鳥類動物の性染色体に取り込まれ得る。
【０１６６】
より具体的な実施形態では、少なくとも１つのレポーター遺伝子は、この鳥類動物／対象の少なくとも１つの細胞、または少なくとも２つの核酸配列を有する鳥類動物に導入される少なくとも１つの細胞に接触または同時トランスフェクトすることにより、本発明のトランスジェニック鳥類動物の性染色体に取り込まれ得る。より具体的には、こうした細胞は、（ａ）遺伝子編集システムの少なくとも１つの構成要素、具体的には、少なくとも１つのＣａｓ９タンパク質、または少なくとも１つのＣａｓ９タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列を含む少なくとも１つの第１の核酸配列；および少なくとも１つの性染色体ＺまたはＷ内の少なくとも１つのプロトスペーサーを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ、または少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする少なくとも１つの核酸配列であって、それによりＣＲＩＳＰＲ媒介取り込みを提供する核酸配列、ならびに（ｂ）少なくとも１つのレポーター遺伝子またはその任意の断片を含む少なくとも１つの第２の核酸配列と接触または同時トランスフェクトされ得る。
【０１６７】
より具体的な実施形態では、第２の核酸配列中の少なくとも１つのレポーター遺伝子は、相同腕とその５’および３’において隣接していてもよい。これらの腕は、標的性染色体内の取り込み標的部位に対して相同性を示し、それにより取り込み部位でのＨＤＲが容易になる。
【０１６８】
さらにより具体的な実施形態では、第２の核酸配列中の少なくとも１つのレポーター遺伝子は、性特異的プロモーター、胚特異的プロモーターおよび誘導性プロモーターのうちのいずれか１つに作動可能に連結され得る。こうしたプロモーターにより、いくつかの実施形態では、本発明のレポーター遺伝子の発現が特定の所望の性（性特異的プロモーターの場合）、特定の胚段階（胚特異的プロモーター）または特定の条件（誘導性条件）に制限され得る。
【０１６９】
さらにいくつかのさらなる特定の実施形態では、本発明のトランスジェニック鳥類動物内に含まれる少なくとも１つのレポーター遺伝子は、その性染色体の１つの少なくとも１つの非コード領域に取り込まれ得る。
【０１７０】
さらにいくつかのさらなる代替的実施形態では、本発明のトランスジェニック鳥類動物は、性Ｚ染色体の少なくとも１つの部位に取り込まれた少なくとも１つのレポーター遺伝子を含み得る。いくつかの特定の非限定的な実施形態では、こうした鳥類トランスジェニック動物は、Ｚ染色体に取り込まれたトランスジェニックレポーター遺伝子を保有する雌であり得る。より具体的な実施形態では、Ｚ染色体内の特定の遺伝子座は、雌鶏の染色体Ｚの配列番号１５で示される９１５６８７４〜９１６１８７４、配列番号１６で示される２７７６４９４３〜２７７６９９４３、配列番号１７で示される４２１７２７４８〜４２１７７７４８、配列番号１８で示される６３３６３６５６〜６３３６８６５６、および配列番号１９で示される７８７７７４７７〜７８７８２４７７の領域のうちのいずれか１つであり得る。
【０１７１】
いくつかの特定の実施形態では、少なくとも１つのレポーター遺伝子は、具体的には、配列番号１７で示される性Ｚ染色体遺伝子座４２１７２７４８〜４２１７７７４８において、少なくとも１つの部位に取り込まれてもよい。さらにいくつかのさらなる特定の実施形態では、Ｚ染色体内の特定の遺伝子座へ取り込むのに好適であるｇＲＮＡ配列としては、Ｚ染色体遺伝子座ｃｈｒＺ＿４２１７４５１５＿−１内に配置されているプロトスペーサーに向けられたｇＲＮＡ７が挙げられるが、これに限定されない。いくつかの特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡ７と呼ばれるｇＲＮＡであってもよい。より具体的な実施形態では、こうしたｇＲＮＡ７は、配列番号２６によっても示されるように、核酸配列ＧＴＡＡＴＡＣＡＧＡＧＣＴＡＡＡＣＣＡＧを含み得る。さらにいくつかのさらなる実施形態では、本発明のレポーター遺伝子をＺ染色体内の特定の遺伝子座に取り込むために、レポーター遺伝子、具体的には、本発明により提供されるＲＦＰをコードする配列は、その５’では左腕、およびその３’では右腕に隣接してもよい。さらにいくつかのさらなる特定の実施形態では、左腕は、配列番号３１で示される核酸配列を含んでもよく、配列番号３２で示される核酸配列を含む右腕を使用して、本発明のレポーター遺伝子を配列番号２６のｇＲＮＡ７により指示される特定の遺伝子座に取り込み得る。
【０１７２】
さらにいくつかのより具体的な実施形態では、レポーター遺伝子を、トランスジェニック鳥類対象のＺ染色体内のそのような特定の場所にターゲティングするのに必要な少なくとも１つのｇＲＮＡは、配列番号１１で示されるｇＲＮＡ３：ＡＣＡＧＡＣＣＴＡＴＧＡＴＡＴＧＴ、配列番号１２で示されるｇＲＮＡ４：ＣＧＡＴＴＡＴＣＡＣＴＣＡＣＡＡＧ、配列番号１３で示されるｇＲＮＡ５：ＣＴＧＧＴＴＡＧＣＡＴＧＧＧＧＡＣ、配列番号１４で示されるｇＲＮＡ６：ＧＴＡＡＡＧＡＧＴＣＡＧＡＴＡＣＡのうちのいずれか１つによって示される核酸配列を含んでもよい。
【０１７３】
さらにいくつかのさらなる実施形態では、本発明のレポーター遺伝子をＺ染色体内の特定の遺伝子座に取り込むために、配列番号４１で示される核酸配列を含む左腕、および配列番号４２で示される核酸配列を含む右腕を使用して、発明のレポーター遺伝子を配列番号１１のｇＲＮＡ３によって指示される特定の遺伝子座に取り込み得る。さらなる実施形態では、本発明のレポーター遺伝子をＺ染色体内の特定の遺伝子座に取り込むために、配列番号４３で示される核酸配列を含む左腕、および配列番号４４で示される核酸配列を含む右腕を使用して、本発明のトランスジェニック鳥類対象のレポーター遺伝子を配列番号１２のｇＲＮＡ４によって指示される特定の遺伝子座に取り込み得る。なおさらなる実施形態では、本発明のレポーター遺伝子を、トランスジェニック鳥類対象のＺ染色体内の特定の遺伝子座に取り込むために、配列番号４５で示される核酸配列を含む左腕、および配列番号４６で示される核酸配列を含む右腕を使用して、本発明のレポーター遺伝子を配列番号１３のｇＲＮＡ５によって指示される特定の遺伝子座に取り込み得る。いくつかのさらなる実施形態では、本発明のレポーター遺伝子をＺ染色体内の特定の遺伝子座に取り込むために、配列番号４７で示される核酸配列を含む左腕、および配列番号４８で示される核酸配列を含む右腕を使用して、本発明のレポーター遺伝子を配列番号１４のｇＲＮＡ６によって指示される特定の遺伝子座に取り込み得る。
【０１７４】
本発明のトランスジェニック鳥類対象のＺ染色体内の特定の遺伝子座への取り込みに好適であるｇＲＮＡ配列のさらなる非限定的な例としては、これらに限定されないが、配列番号２７でも示される核酸配列ＡＣＡＧＡＣＣＴＡＴＧＡＴＡＴＧＴＧＡＧを含むＺ染色体遺伝子座ｃｈｒＺ＿９１５７０９１＿１のｇＲＮＡ８、配列番号２８でも示される核酸配列ＧＡＧＣＴＴＧＴＧＡＧＴＧＡＴＡＡＴＣＧを含むＺ染色体遺伝子座ｃｈｒＺ＿２７７６７６０２＿−１のｇＲＮＡ９、配列番号２９でも示される核酸配列ＧＴＡＡＡＧＡＧＴＣＡＧＡＴＡＣＡＣＡＧを含むＺ染色体遺伝子座ｃｈｒＺ＿７８７７９９２７＿１のｇＲＮＡ１０、および配列番号３０でも示される核酸配列ＣＡＧＴＧＧＧＴＡＣＴＧＡＡＧＣＴＧＴＧを含むＺ染色体遺伝子座ｃｈｒＺ＿６３３６４９４６＿−１のｇＲＮＡ１１を挙げることができる。
【０１７５】
さらなる実施形態では、本発明のレポーター遺伝子を本発明のトランスジェニック鳥類対象のＺ染色体内の特定の遺伝子座に取り込むために、配列番号３３で示される核酸配列を含む左腕、および配列番号３４で示される核酸配列を含む右腕を使用して、本発明のレポーター遺伝子を配列番号２７のｇＲＮＡ８によって指示される特定の遺伝子座に取り込み得る。なおさらなる実施形態では、本発明のレポーター遺伝子をＺ染色体内の特定の遺伝子座に取り込むために、配列番号３５で示される核酸配列を含む左腕、および配列番号３６で示される核酸配列を含む右腕を使用して、本発明のレポーター遺伝子を配列番号２８のｇＲＮＡ９によって指示される特定の遺伝子座に取り込み得る。さらなる実施形態では、本発明のレポーター遺伝子をＺ染色体内の特定の遺伝子座に取り込むために、配列番号３７で示される核酸配列を含む左腕、および配列番号３８で示される核酸配列を含む右腕を使用して、本発明のレポーター遺伝子を配列番号２９のｇＲＮＡ１０によって指示される特定の遺伝子座に取り込み得る。さらなる実施形態では、本発明のレポーター遺伝子をＺ染色体内の特定の遺伝子座に取り込むために、配列番号３９で示される核酸配列を含む左腕、および配列番号４０で示される核酸配列を含む右腕を使用して、本発明のレポーター遺伝子を配列番号３０のｇＲＮＡ１１によって指示される特定の遺伝子座に取り込み得る。
【０１７６】
さらにいくつかのさらなる代替的実施形態では、少なくとも１つのレポーター遺伝子は、本発明のトランスジェニック鳥類対象の性Ｗ染色体の少なくとも１つの部位に取り込まれてもよい。いくつかの特定の実施形態では、取り込み部位は、Ｗ染色体の遺伝子座１０２２８５９〜１０２４２１５、具体的には染色体ＷのｇａｌＧａｌ５＿ｄｎａ範囲：１０２２８５９〜１０２４２１５に配置されていてもよい。さらにいくつかのさらなる特定の実施形態では、こうした遺伝子座は、配列番号３で示される核酸配列を含む。
【０１７７】
上記の遺伝子座内の任意の位置での本発明のレポーター遺伝子の特定の取り込みのために、特定のｇＲＮＡが必要であり得る。したがって、いくつかの特定の非限定的な実施形態では、本発明のトランスジェニック鳥類動物の調製に使用される適切なｇＲＮＡは、配列番号１および２のいずれか１つで示される核酸配列を含み得る。いくつかの特定の実施形態では、これらのｇＲＮＡは、本明細書ではそれぞれｇＲＮＡ１およびｇＲＮＡ２と称される。
【０１７８】
いくつかの特定の実施形態では、本発明によって提供されるトランスジェニック鳥類動物は、配列番号１で示される核酸配列を含むｇＲＮＡ１を使用して調製した。こうした特定の場所での本発明のレポーター遺伝子の取り込みを可能にするため、取り込まれるべきレポーター遺伝子は、ある実施形態では、使用されるｇＲＮＡによって指示される標的取り込み部位でのその取り込みを容易にする特定の腕を保有している必要がある。したがって、いくつかの特定の実施形態では、少なくとも１つのレポーター遺伝子は、第２の核酸配列内に含まれてもよく、このレポーター遺伝子は、それぞれ配列番号４および５で示されるアミノ酸配列を含む相同腕とその５’および３’において隣接する。
【０１７９】
さらにいくつかの代替的実施形態では、本発明によって提供されるトランスジェニック鳥類動物は、配列番号２で示される核酸配列を含むｇＲＮＡ２を使用して調製することができる。こうした場合、本発明のレポーター遺伝子をｇＲＮＡ２によって認識される特定の部位に取り込むことができるように、第２の核酸配列内に含まれる少なくとも１つのレポーター遺伝子は、特定の実施形態によれば、それぞれ配列番号６および７で示されるアミノ酸配列を含む相同腕と、その５’および３’において隣接していてもよい。
【０１８０】
さらに、本発明は、本発明の方法のいずれかにおいて、具体的には本明細書に記載の卵内で性を決定するための方法において使用するための本明細書に記載のトランスジェニック鳥類対象のいずれかをさらに包含することを理解されたい。
【０１８１】
さらにいくつかの追加の実施形態では、本発明は、本発明の方法のいずれかにおいて使用するための、具体的には上記で開示した、本発明によってもたらされるトランスジェニック鳥類対象のいずれかにより産卵されたあらゆる卵の使用をさらに包含する。さらに別の態様では、本発明は、性染色体ＺおよびＷの少なくとも一方内の少なくとも１つの位置または場所に取り込まれた少なくとも１つの外因性レポーター遺伝子を含む細胞に関する。
【０１８２】
いくつかの特定の実施形態では、本発明により提供される細胞は鳥類細胞であり得る。
【０１８３】
いくつかの特定の実施形態では、本発明によって提供される鳥類細胞は、始原生殖細胞（ＰＧＣ）であり得る。
【０１８４】
「生殖細胞」という用語は、別の生殖細胞と接合する時点で配偶子に発達する胚細胞を指す。本明細書で使用される「始原生殖細胞（ＰＧＣ）」は、配偶子の前駆体として働き、多能性胚性幹細胞を生じさせる生殖系列幹細胞に関する。胚形成中にＰＧＣになるように合図され、生殖腺になる生殖隆起に移動し、成熟した配偶子に分化する原腸形成胚の細胞。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、本発明の細胞の少なくとも１つの性染色体に取り込まれているレポーター遺伝子は、蛍光タンパク質、具体的にはＲＦＰ、ＹＦＰ、ＢＦＰなど、または表１に開示された蛍光タンパク質のいずれかであり得る。さらにいくつかのさらなる実施形態では、本発明の細胞に取り込まれたレポーター遺伝子は、蛍光タンパク質が緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）でないという条件で、任意の蛍光タンパク質であり得る。換言すれば、いくつかの特定の実施形態では、本発明によって提供されるトランスジェニック細胞の性染色体に取り込まれたレポーター遺伝子は、蛍光タンパク質がＧＦＰではないという条件で、任意の蛍光タンパク質であり得る。
【０１８６】
さらにより具体的な実施形態では、少なくとも１つのレポーター遺伝子は、少なくとも１つのプログラム可能な遺伝子操作されたヌクレアーゼ（ＰＥＮ）を使用する本発明の細胞により提供されるトランスジェニック鳥類対象または動物の性染色体に取り込まれ得る。本明細書で使用する「プログラム可能な遺伝子操作されたヌクレアーゼ（ＰＥＮ）」という用語は、二本鎖ＤＮＡ損傷のＤＮＡ修復に関与し、直接ゲノム編集を可能にする天然のヌクレアーゼに由来する、特定のＤＮＡ配列を切断する合成酵素を指す。より具体的な実施形態では、ＰＥＮは、クラスター化された規則的間隔の短い回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）クラス２、具体的にはＩＩ型システムであり得る。
【０１８７】
さらにいくつかのさらなる実施形態では、本発明によって提供された細胞は、細胞の性染色体に取り込まれた少なくとも１つのレポーター遺伝子を含んでもよい。より具体的な実施形態では、レポーター遺伝子のそのような特定の取り込みは、細胞を（ａ）少なくとも１つのＣａｓ９タンパク質または少なくとも１つのＣａｓ９タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列を含む少なくとも１つの第１の核酸配列、および少なくとも１つの性染色体Ｚおよび／またはＷ内の少なくとも１つのプロトスペーサーを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡまたは少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする少なくとも１つの核酸配列を含む少なくとも１つの遺伝子編集システム；ならびに（ｂ）少なくとも１つのレポーター遺伝子を含む少なくとも１つの第２の核酸配列と接触させるか、または同時トランスフェクトすることにより可能になり得る。
【０１８８】
ある実施形態では、本発明の細胞に同時トランスフェクトされた第２の核酸配列中の少なくとも１つのレポーター遺伝子は、取り込み部位でのＨＤＲ用相同腕とその５’および３’において隣接し得る。
【０１８９】
さらにいくつかの特定の実施形態では、本発明によってもたらされる細胞は、本発明の少なくとも１つのレポーター遺伝子を細胞のＺ染色体に取り込むことによって調製され得る。ある実施形態では、本発明の細胞を調製するために、少なくとも１つのレポーター遺伝子を性Ｚ染色体の少なくとも１つの部位に取り込まれてもよい。より具体的な実施形態では、Ｚ染色体内の特定の遺伝子座は、雌鶏の染色体Ｚの配列番号１５で示される９１５６８７４〜９１６１８７４、配列番号１６で示される２７７６４９４３〜２７７６９９４３、配列番号１７で示される４２１７２７４８〜４２１７７７４８、配列番号１８で示される６３３６３６５６〜６３３６８６５６、および配列番号１９で示される７８７７７４７７〜７８７８２４７７の領域のうちのいずれか１つであり得る。
【０１９０】
さらにいくつかのさらなる代替的実施形態では、本発明により提供される細胞は、性Ｚ染色体遺伝子座４２１７２７４８〜４２１７７７４８の少なくとも１つの部位、具体的には配列番号１７への取り込みを容易にするｇＲＮＡを使用することにより調製され得る。さらにいくつかのさらなる特定の実施形態では、Ｚ染色体内の特定の遺伝子座への取り込みに好適であるｇＲＮＡ配列としては、これに限定されないが、配列番号２６でも示される核酸配列ＧＴＡＡＴＡＣＡＧＡＧＣＴＡＡＡＣＣＡＧを含むＺ染色体遺伝子座ｃｈｒＺ＿４２１７４５１５＿−１のｇＲＮＡ７を挙げることができる。さらにいくつかのさらなる実施形態では、本発明のレポーター遺伝子をＺ染色体内の特定の遺伝子座に取り込むために、配列番号３１で示される核酸配列を含む左腕、および配列番号３２で示される核酸を含む右腕を使用して、本発明のレポーター遺伝子を配列番号２６のｇＲＮＡ７により指示される特定の遺伝子座に取り込み得る。
【０１９１】
より具体的な実施形態では、本発明の細胞のＺ染色体内のそのような特定の場所にレポーター遺伝子をターゲティングするために必要な少なくとも１つのｇＲＮＡは、配列番号１１で示されるｇＲＮＡ３：ＡＣＡＧＡＣＣＴＡＴＧＡＴＡＴＧＴ、配列番号１２で示されるｇＲＮＡ４：ＣＧＡＴＴＡＴＣＡＣＴＣＡＣＡＡＧ、配列番号１３で示されるｇＲＮＡ５：ＣＴＧＧＴＴＡＧＣＡＴＧＧＧＧＡＣ、配列番号１４で示されるｇＲＮＡ６：ＧＴＡＡＡＧＡＧＴＣＡＧＡＴＡＣＡのいずれか１つによって示される核酸配列を含み得る。
【０１９２】
さらにいくつかのさらなる実施形態では、本発明のレポーター遺伝子を本発明の細胞のＺ染色体内の特定の遺伝子座に取り込むために、配列番号４１で示される核酸配列を含む左腕、および配列番号４２で示される核酸配列を含む右腕を使用して、本発明のレポーター遺伝子を配列番号１１のｇＲＮＡ３によって指示される特定の遺伝子座に取り込み得る。さらなる実施形態では、本発明のレポーター遺伝子をＺ染色体内の特定の遺伝子座に取り込むために、配列番号４３で示される核酸配列を含む左腕、および配列番号４４で示される核酸配列を含む右腕を使用して、本発明のレポーター遺伝子を配列番号１２のｇＲＮＡ４によって指示される特定の遺伝子座に取り込み得る。なおさらなる実施形態では、本発明のレポーター遺伝子を本発明の細胞のＺ染色体内の特定の遺伝子座に取り込むために、配列番号４５で示される核酸配列を含む左腕、および配列番号４６で示される核酸配列を含む右腕を使用して、本発明のレポーター遺伝子を配列番号１３のｇＲＮＡ５によって指示される特定の遺伝子座に取り込み得る。いくつかのさらなる実施形態では、本発明のレポーター遺伝子をＺ染色体内の特定の遺伝子座に取り込むために、配列番号４７で示される核酸配列を含む左腕、および配列番号４８で示される核酸配列を含む右腕を使用して、本発明のレポーター遺伝子を配列番号１４のｇＲＮＡ６によって指示される特定の遺伝子座に取り込み得る。
【０１９３】
Ｚ染色体内の特定の遺伝子座への取り込みに好適であるｇＲＮＡ配列のさらなる非限定的な例としては、これらに限定されないが、配列番号２７でも示される核酸配列ＡＣＡＧＡＣＣＴＡＴＧＡＴＡＴＧＴＧＡＧを含むＺ染色体遺伝子座ｃｈｒＺ＿９１５７０９１＿１のｇＲＮＡ８、配列番号２８でも示される核酸配列ＧＡＧＣＴＴＧＴＧＡＧＴＧＡＴＡＡＴＣＧを含むＺ染色体遺伝子座ｃｈｒＺ＿２７７６７６０２＿−１のｇＲＮＡ９、配列番号２９でも示される核酸配列ＧＴＡＡＡＧＡＧＴＣＡＧＡＴＡＣＡＣＡＧを含むＺ染色体遺伝子座ｃｈｒＺ＿７８７７９９２７＿１のｇＲＮＡ１０、および配列番号３０でも示される核酸配列ＣＡＧＴＧＧＧＴＡＣＴＧＡＡＧＣＴＧＴＧを含むＺ染色体遺伝子座ｃｈｒＺ＿６３３６４９４６＿−１のｇＲＮＡ１１を挙げることができる。
【０１９４】
さらなる実施形態では、本発明のレポーター遺伝子を本発明の細胞のＺ染色体内の特定の遺伝子座に取り込むために、配列番号３３で示される核酸配列を含む左腕、および配列番号３４で示される核酸配列を含む右腕を使用して、本発明のレポーター遺伝子を配列番号２７のｇＲＮＡ８によって指示される特定の遺伝子座に取り込み得る。なおさらなる実施形態では、本発明のレポーター遺伝子を本発明の細胞のＺ染色体内の特定の遺伝子座に取り込むために、配列番号３５で示される核酸配列を含む左腕、および配列番号３６で示される核酸配列を含む右腕を使用して、本発明のレポーター遺伝子を配列番号２８のｇＲＮＡ９によって指示される特定の遺伝子座に取り込み得る。さらなる実施形態では、本発明のレポーター遺伝子をＺ染色体内の特定の遺伝子座に取り込むために、配列番号３７で示される核酸配列を含む左腕、および配列番号３８で示される核酸配列を含む右腕を使用して、本発明のレポーター遺伝子を配列番号２９のｇＲＮＡ１０によって指示される特定の遺伝子座に取り込み得る。さらなる実施形態では、本発明のレポーター遺伝子をＺ染色体内の特定の遺伝子座に取り込むために、配列番号３９で示される核酸配列を含む左腕、および配列番号４０で示される核酸配列を含む右腕を使用して、本発明のレポーター遺伝子を配列番号３０のｇＲＮＡ１１によって指示される特定の遺伝子座に取り込み得る。
【０１９５】
いくつかの特定の実施形態では、本発明により提供される細胞内の染色体Ｗへのレポーター遺伝子の取り込みを標的とするために、特定のｇＲＮＡが使用されるものとする。さらなる特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、本明細書でｇＲＮＡ１と呼ばれる配列番号１で示される核酸配列を含み得る。こうした場合、第２の核酸配列内に含まれる少なくとも１つのレポーター遺伝子は、それぞれ配列番号４および５で示されるアミノ酸配列を含む相同腕と、その５’および３’において隣接していてもよい。
【０１９６】
さらにいくつかのさらなる代替的実施形態では、本発明によって提供される細胞は、本明細書でｇＲＮＡ２と呼ばれるｇＲＮＡを使用することにより調製され得る。ある実施形態では、ｇＲＮＡ２は、配列番号２で示される核酸配列を含み得る。こうした特定の実施形態では、第２の核酸配列内に含まれる少なくとも１つのレポーター遺伝子は、配列番号６および７でそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む相同腕とその５’および３’において隣接していてもよい。
【０１９７】
さらに、本発明は、孵化していない卵の受精を検出する方法を提供する。いくつかの特定の実施形態では、こうした方法は、（ａ）提供されたトランスジェニック動物が雌の対象である場合、性染色体ＺおよびＷの両方での少なくとも１つの位置または場所、ならびに提供されたトランスジェニック動物が雄である場合、両方の性染色体Ｚに取り込まれた少なくとも１つの外因性レポーター遺伝子を含む少なくとも１つのトランスジェニック鳥類対象または動物を提供または取得するステップを含み得る。第２のステップ（ｂ）では、トランスジェニック鳥類対象から、具体的には動物からまたはその任意の細胞の少なくとも１つの受精卵を得る。次のステップ（ｃ）は、少なくとも１つの検出可能なシグナルが検出されたかを卵内で判定することを伴う。より具体的な実施形態では、少なくとも１つの検出可能なシグナルが検出されることにより、少なくとも１つのレポーター遺伝子の発現が示され、それにより、鳥類の胚において、標識された母性Ｗ染色体またはＺ染色体（雌の場合、または標識された父性Ｚ染色体の存在が示される。
【０１９８】
さらにいくつかのさらなる実施形態では、本発明の方法によって提供されるトランスジェニック動物は、その両方のＺ染色体に取り込まれているレポーター遺伝子を有する雄対象であり得る。こうした場合、こうしたトランスジェニック雄またはその任意の精子によって受精された卵内で決定される検出可能なシグナルは、胚がトランスジェニックレポーター遺伝子を含む父性Ｚ染色体を保有しており、したがって卵が受精していることを示す。なおさらなる実施形態において、本発明の方法によって提供されるトランスジェニック動物は、そのＺ染色体およびＷ染色体の両方に取り込まれているレポーター遺伝子を有する雌対象であり得る。こうした場合、こうしたトランスジェニック雌が保有している、卵内で判定される検出可能なシグナルは、胚がトランスジェニックレポーター遺伝子を含む母性のＺまたはＷ染色体を保有していることを示しており、したがって卵は受精している。さらなる実施形態では、受精卵を検出するために、レポーター遺伝子、具体的にはＲＦＰ遺伝子を任意の染色体の２つのコピーに挿入して、ホモ接合トランスジェニック鳥類対象、具体的には雄対象を作製できることを理解されたい。受精卵は、ＲＦＰレポーター遺伝子を保有するものとして検出される。
【０１９９】
さらに別の態様では、本発明は、
（ａ）少なくとも１つの遺伝子編集システムの少なくとも１つの構成要素、具体的には、少なくとも１つのＣａｓ９タンパク質または少なくとも１つのＣａｓ９タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列を含む少なくとも１つの第１の核酸配列、および少なくとも１つの性染色体Ｚおよび／またはＷ内の少なくとも１つのプロトスペーサーを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡまたは少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする少なくとも１つの核酸配列を含み得るＣＲＳＰＲ／Ｃａｓ９システム；ならびに（ｂ）少なくとも１つのレポーター遺伝子を含む少なくとも１つの第２の核酸配列を含むキットを提供する。
【０２００】
いくつかのさらなる実施形態では、本方法および本発明のキット（以下に記載）によって使用されるｇＲＮＡは、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）および少なくとも１つのトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含み得る。
【０２０１】
いくつかの代替的実施形態では、本発明のキットは、少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする核酸配列を含んでもよい。こうした核酸配列は、標的ゲノムＤＮＡ配列中の少なくとも１つのプロトスペーサーを標的とし、およびそのために、それと相同であるか、または同一である少なくとも１つのスペーサー配列を含むＣＲＩＳＰＲアレイを含んでもよい。核酸配列は、少なくとも１つのｔｒａｃｒＲＮＡをコードする配列をさらに含み得ることに留意されたい。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、本開示によるＣＲＩＳＰＲアレイは、少なくとも１つのスペーサーおよび少なくとも１つのリピートを含む。さらに別の実施形態では、本発明は、同一または異なる標的を標的とし得るいくつかの最終ｇＲＮＡ産物に処理することができるｐｒｅ−ｃｒＲＮＡを提供する選択肢をさらに包含する。
【０２０３】
さらにいくつかのより特定の実施形態では、本発明のｇＲＮＡ内に含まれるｃｒＲＮＡは、標的ゲノムＤＮＡ配列に相補的な一本鎖リボ核酸（ｓｓＲＮＡ）配列であり得る。いくつかの特定の実施形態では、標的ゲノムＤＮＡ配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列のすぐ上流およびその先に配置されてもよい。
【０２０４】
本明細書に示されるように、本発明のキットおよび方法のｇＲＮＡは、標的ゲノムＤＮＡ、この場合、本明細書で「プロトスペーサー」と称される性染色体ＺまたはＷ内の標的遺伝子座に少なくとも部分的に相補的であり得る。ある実施形態では、「相補性」とは、それぞれがロックアンドキー原理（ｌｏｃｋ−ａｎｄ−ｋｅｙ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ）に従う２つの構造間の関係を指す。自然界では、２つのＤＮＡまたはＲＮＡ配列間で共有される特性であるため、相補性はＤＮＡの複製および転写の基本原理であり、互いに反平行に整列させると、配列内の各位置でのヌクレオチド塩基は相補的になる（例えば、ＡとＴまたはＵ、ＣとＧ）。
【０２０５】
上記のように、本発明のキットのｇＲＮＡが標的とするゲノムＤＮＡ配列は、ＰＡＭ配列のすぐ上流に配置されている。いくつかの実施形態では、こうしたＰＡＭ配列は、核酸配列ＮＧＧの配列であり得る。
【０２０６】
ある実施形態では、本発明で言及されるＰＡＭ配列は、Ｎ、すなわち任意のヌクレオチド、具体的にはアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）またはチミン（Ｔ）のうちのいずれか１つを含み得る。さらにいくつかのさらなる実施形態では、本発明によるＰＡＭ配列は、Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴおよび２つのグアニンから構成される。
【０２０７】
一実施形態によれば、本発明のｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、少なくとも１つのスペーサーおよび任意により少なくとも１つのリピートを含み得る。さらにいくつかのさらなる実施形態では、本発明のｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、少なくとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、またはそれ以上、具体的には１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、またはそれ以上のスペーサーを含み得る。いくつかの実施形態では、各スペーサーは２つのリピート間に配置される。本発明のｇＲＮＡをコードする核酸配列のスペーサーは、同一スペーサーであるかまたは異なるスペーサーであり得ることはさらに理解されよう。より多くの実施形態において、これらのスペーサーは、同一または異なる標的ゲノムＤＮＡを標的とし得る。さらに他のいくつかの実施形態では、こうしたスペーサーは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００またはそれ以上の標的ゲノムＤＮＡ配列を標的とし得る。これらの標的配列は、単一の遺伝子座またはいくつかの標的遺伝子座に由来してもよい。
【０２０８】
本明細書で使用される「スペーサー」という用語は、特定の配列を標的とするように設計され、ＣＲＩＳＰＲアレイの複数の短い直接リピート（すなわちＣＲＩＳＰＲリピート）間に配置されている非反復スペーサー配列を指す。いくつかの特定の実施形態では、スペーサーは約１５〜約３０ヌクレオチド、具体的には約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０以上のヌクレオチドを含むことができる。より具体的には、約２０〜２５のヌクレオチド。
【０２０９】
本発明のＣＲＩＳＰＲシステムによりコードされるガイドまたはターゲティングＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含み得る。ＣＲＩＳＰＲスペーサーによってコードされるターゲティングＲＮＡの配列は、本明細書では「プロトスペーサー」とも呼ばれる、鳥類ゲノムＤＮＡ内、具体的には、性染色体ＺまたはＷ内の標的遺伝子座内の標的配列に向ける（すなわち、これらの標的配列に対して同じであるか、または相補的であるセグメントを有する）必要があることを除いて、特に限定されない。こうしたプロトスペーサーは、本発明の方法およびキットのｇＲＮＡをコードする核酸配列内に含まれるＣＲＩＳＰＲスペーサーによってコードされるターゲティングＲＮＡに対して十分な相補性を有する核酸配列を含む。
【０２１０】
いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡは、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０ｎｔのスペーサー（ターゲティング）配列とそれに続く１９〜３６ｎｔのリピート配列を含むかまたはそれらからなる。特定の非限定的な実施形態では、ターゲティングスペーサーは、代表的なスペーサー配列が本明細書に示されているゲノムＤＮＡ配列のうちのいずれか１つを標的とするセグメントを含むか、またはそれからなってもよい。
【０２１１】
いくつかの特定の実施形態では、本発明のＣＲＩＳＰＲシステムのスペーサーは、ターゲティングガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードし得ることに留意すべきである。「ｇＲＮＡ」または「ターゲティングＲＮＡ」とは、それをコードするＣＲＩＳＰＲシステムの一部分から転写されたときに、標的ゲノムＤＮＡ内のＤＮＡ配列と同一である（ただし、ＲＮＡの場合、ＴをＵに置き換えることを除く）か、または相補的（したがって「標的」）であるＲＮＡ配列の少なくとも１つのセグメントを含むＲＮＡである。本開示のＣＲＩＳＰＲシステムは、任意により２つ以上のターゲティングＲＮＡをコードしてもよく、ターゲティングＲＮＡはゲノムＤＮＡ中の１つ以上の標的配列に向けられてもよい。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、本発明のキットにより提供されるＣａｓ９タンパク質は、配列番号２４で示される核酸配列によりコードされてもよい。さらなる特定の非限定的な実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、配列番号２５によって示されるアミノ酸配列、またはその誘導体、突然変異体または多様体を含んでもよい。
【０２１３】
「アミノ酸配列」または「ペプチド配列」は、ペプチド結合によって接続されたアミノ酸残基が、ペプチドおよびタンパク質内の鎖にある順序であることに留意されたい。配列は一般に、遊離アミノ基を含むＮ末端からアミドを含むＣ末端まで報告される。アミノ酸配列は多くの場合、ペプチドと呼ばれ、タンパク質の一次構造を表す場合はタンパク質配列であるが、タンパク質は、特定の三次元配置に折り畳まれ、典型的には、リン酸化、アセチル化、グリコシル化、マンノシル化、アミド化、カルボキシル化、スルフヒドリル結合形成、切断などの翻訳後修飾を受けたアミノ酸配列として定義されているため、「アミノ酸配列」または「ペプチド配列」および「タンパク質」という用語を区別する必要がある。
【０２１４】
「断片またはペプチド」とは、Ｃａｓ９またはＲＦＰ（本明細書の以下に記載）分子の一区画を意味する。本発明の任意のアミノ酸配列などの分子の「断片」は、Ｃａｓ９またはＲＦＰ分子の任意のアミノ酸サブセットを指すことを意味する。これには、その「多様体」または「誘導体」も含まれ得る。「ペプチド」は、機能的活性を有する特定のアミノ酸サブセットを指すことを意味する。「機能的」とは、同じ生物学的機能を有すること、例えば、Ｃａｓ  ９として遺伝子編集を行う能力、またはＲＦＰとして検出可能なシグナルを生成する能力を有することを意味する。
【０２１５】
本発明は、本発明のＲＦＰまたはＣａｓ９分子の任意の多様体または誘導体、および実質的に同一または相同である任意のポリペプチドを包含することを理解されたい。「誘導体」という用語は、元のポリペプチドの活性を変えることのないアミノ酸配列（ポリペプチド）への任意の挿入、欠失、置換および修飾を伴うアミノ酸配列（ポリペプチド）を定義するために使用される。これに関連して、本発明のＣａｓ９またはＲＦＰ分子の誘導体または断片は、具体的には、配列番号２５、２１、２３によって示される、Ｃａｓ９またはＲＦＰ分子の活性を低下または変化させることのないＣａｓ９またはＲＦＰ分子の任意の誘導体または断片であってもよい。「誘導体」という用語は、その相同体、多様体および類似体も指す。具体的には、本発明による目的のタンパク質、例えば、配列番号２５、２１、２３で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質のいずれかの全配列と比較して、具体的には、少なくとも５０％、少なくとも６０％、具体的には６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、またはそれ以上を共有し得る、本発明による目的のタンパク質と配列相同性または同一性を有するタンパク質のオルソログまたは相同体。具体的には、配列番号２１、２３、２５、具体的には配列番号２１、２３、２５で示される配列全体と少なくとも５０％、少なくとも６０％、具体的には、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含むまたはそれらからなる相同体。
【０２１６】
いくつかの実施形態では、誘導体は、アミノ酸残基の挿入、欠失、または置換により本発明において具体的に定義されるポリペプチドとは異なるポリペプチドを指す。本明細書で使用される「挿入」、「欠失」または「置換」という用語は、それぞれ、本発明によって開示されるポリペプチドに対する、アミノ酸残基（１〜５０個のアミノ酸残基、２０〜１個のアミノ酸残基、具体的には１〜１０個のアミノ酸残基）のあらゆる追加、欠失または置換を意味することを理解されたい。より具体的には、挿入、欠失、または置換は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個のアミノ酸のいずれか１つであり得る。本発明に包含される挿入、欠失または置換は、修飾ペプチドの任意の位置、ならびにそのＮ’またはＣ’末端のいずれにおいても起こり得ることに留意すべきである。
【０２１７】
アミノ酸配列に関しては、当業者は、コード化された配列内の単一のアミノ酸またはわずかな割合のアミノ酸が変更、追加、または削除される核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列への個々の置換、欠失または追加が、その変化が化学的に類似したアミノ酸によるアミノ酸の置換をもたらす「保存的に改変された多様体」であることを認識するであろう。機能的に類似であるアミノ酸をもたらす保存的置換表は、当技術分野において周知である。このように保存的に改変された多様体は、本発明の多型多様体、種間相同体、および対立遺伝子に加えられ、除外されるものではない。
【０２１８】
例えば、脂肪族アミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｌ、またはＶ）がその基の別のメンバーで置換される置換、またはリジンの場合はアルギニン、アスパラギン酸の場合はグルタミン酸、またはアスパラギンの場合はグルタミンなど別のものについては、１つの極性残基の置換などの置換を行ってもよい。次の８つの群のそれぞれには、互いに保存的置換である他の例示的なアミノ酸が含まれている：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；および
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）。
【０２１９】
したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、Ｃａｓ９またはＲＦＰ分子またはその任意の誘導体、具体的には、配列番号２１、２３、２５のいずれかによって示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の保存的置換を含む誘導体を包含する。より具体的には、アミノ酸の「置換」は、１つのアミノ酸を類似の構造的および／または化学的性質を有する別のアミノ酸で置換した結果であり、すなわち保存的アミノ酸置換である。アミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、および／または両親媒性の類似性に基づいて行われ得る。例えば、非極性の「疎水性」アミノ酸は、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、システイン（Ｃ）、アラニン（Ａ）、チロシン（Ｙ）、ヒスチジン（Ｈ）、トレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、プロリン（Ｐ）、グリシン（Ｇ）、アルギニン（Ｒ）およびリジン（Ｋ）からなる群から選択され、「極性」アミノ酸は、アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）からなる群から選択され、「正に帯電した」アミノ酸は、アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）およびヒスチジン（Ｈ）からなる群から選択され、「酸性」アミノ酸は、アスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン酸（Ｅ）およびグルタミン（Ｑ）からなる群から選択される。
【０２２０】
本発明のポリペプチドの多様体は、アミノ酸レベルで、本発明の様々なポリペプチドなどの目的のタンパク質と、少なくとも８０％の配列類似性または同一性、多くの場合、少なくとも８５％の配列類似性または同一性、９０％の配列類似性または同一性、または少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列類似性または同一性を有し得る。
【０２２１】
いくつかの実施形態では、本発明のキット内に含まれる第２の核酸配列中の少なくとも１つのレポーター遺伝子は、取り込み部位でのＨＤＲ用相同腕とその５’および３’において隣接し得る。
【０２２２】
さらにいくつかのさらなる特定の実施形態では、本発明のキットの第２の核酸配列中の少なくとも１つのレポーター遺伝子は、性特異的プロモーター、胚特異的プロモーターおよび誘導性プロモーターのうちのいずれか１つに作動可能に連結され得る。
【０２２３】
さらにいくつかの代替的実施形態では、少なくとも１つのレポーター遺伝子は、性Ｚ染色体での少なくとも１つの部位に取り込まれてもよい。より具体的な実施形態では、Ｚ染色体内の特定の遺伝子座は、雌鶏の染色体Ｚの配列番号１５で示される９１５６８７４〜９１６１８７４、配列番号１６で示される２７７６４９４３〜２７７６９９４３、配列番号１７で示される４２１７２７４８〜４２１７７７４８、配列番号１８で示される６３３６３６５６〜６３３６８６５６、および配列番号１９で示される７８７７７４７７〜７８７８２４７７の領域のうちのいずれか１つであり得る。
【０２２４】
いくつかの特定の実施形態では、少なくとも１つのレポーター遺伝子は、性Ｚ染色体遺伝子座４２１７２７４８〜４２１７７７４８の少なくとも１つの部位に取り込まれてもよい。本発明のキットの第１の核酸配列の非限定的な例は、配列番号２６でも示される核酸配列ＧＴＡＡＴＡＣＡＧＡＧＣＴＡＡＡＣＣＡＧを含むＺ染色体遺伝子座ｃｈｒＺ＿４２１７４５１５＿−１のｇＲＮＡ７のうちの少なくとも１つであるｇＲＮＡを含み得る。より具体的には、本発明のレポーター遺伝子をＺ染色体内の特定の遺伝子座に取り込むために、配列番号３１で示される核酸配列を含む左腕、および配列番号３２で示される核酸配列を含む右腕を使用して、本発明のレポーター遺伝子を配列番号２６のｇＲＮＡ７によって指示される特定の遺伝子座に取り込み得る。
【０２２５】
したがって、より具体的な実施形態では、本発明のキットの第１の核酸配列は、配列番号１１で示されるｇＲＮＡ３：ＡＣＡＧＡＣＣＴＡＴＧＡＴＡＴＧＴ、配列番号１２で示されるｇＲＮＡ４：ＣＧＡＴＴＡＴＣＡＣＴＣＡＣＡＡＧ、配列番号１３で示されるｇＲＮＡ５：ＣＴＧＧＴＴＡＧＣＡＴＧＧＧＧＡＣ、配列番号１４で示されるｇＲＮＡ６：ＧＴＡＡＡＧＡＧＴＣＡＧＡＴＡＣＡのうちの少なくとも１つであるｇＲＮＡを含むことができる。
【０２２６】
さらなる実施形態では、本発明のキットの第２の核酸配列内に含まれる少なくとも１つのレポーター遺伝子は、配列番号４１〜４８のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む相同腕とその５’および３’において隣接していてもよい。より具体的には、本発明のレポーター遺伝子をＺ染色体内の特定の遺伝子座に取り込むために、配列番号４１で示される核酸配列を含む左腕、および配列番号４２で示される核酸配列を含む右腕を使用して、本発明のレポーター遺伝子を配列番号１１のｇＲＮＡ３によって指示される特定の遺伝子座に取り込み得る。さらなる実施形態では、本発明のレポーター遺伝子をＺ染色体内の特定の遺伝子座に取り込むために、配列番号４３で示される核酸配列を含む左腕、および配列番号４４で示される核酸配列を含む右腕を使用して、本発明のレポーター遺伝子を配列番号１２のｇＲＮＡ４によって指示される特定の遺伝子座に取り込み得る。なおさらなる実施形態では、本発明のレポーター遺伝子をＺ染色体内の特定の遺伝子座に取り込むために、配列番号４５で示される核酸配列を含む左腕、および配列番号４６で示される核酸配列を含む右腕を使用して、本発明のレポーター遺伝子を配列番号１３のｇＲＮＡ５によって指示される特定の遺伝子座に取り込み得る。いくつかのさらなる実施形態では、本発明のレポーター遺伝子をＺ染色体内の特定の遺伝子座に取り込むために、配列番号４７で示される核酸配列を含む左腕、および配列番号４８で示される核酸配列を含む右腕を使用して、本発明のレポーター遺伝子を配列番号１４のｇＲＮＡ６によって指示される特定の遺伝子座に取り込み得る。
【０２２７】
本発明のキットの第１の核酸配列のさらなる非限定的な例は、配列番号２７でも示される核酸配列ＡＣＡＧＡＣＣＴＡＴＧＡＴＡＴＧＴＧＡＧを含むＺ染色体遺伝子座ｃｈｒＺ＿９１５７０９１＿１のｇＲＮＡ８、配列番号２８でも示される核酸配列ＧＡＧＣＴＴＧＴＧＡＧＴＧＡＴＡＡＴＣＧを含むＺ染色体遺伝子座ｃｈｒＺ＿２７７６７６０２＿−１のｇＲＮＡ９、配列番号２９でも示される核酸配列ＧＴＡＡＡＧＡＧＴＣＡＧＡＴＡＣＡＣＡＧを含むＺ染色体遺伝子座ｃｈｒＺ＿７８７７９９２７＿１のｇＲＮＡ１０、および配列番号３０でも示される核酸配列ＣＡＧＴＧＧＧＴＡＣＴＧＡＡＧＣＴＧＴＧを含むＺ染色体遺伝子座ｃｈｒＺ＿６３３６４９４６＿−１のｇＲＮＡ１１のうちの少なくとも１つであるｇＲＮＡを含み得る。
【０２２８】
さらなる実施形態では、本発明のキットの第２の核酸配列内に含まれる少なくとも１つのレポーター遺伝子は、配列番号３１〜４０のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む相同腕とその５’および３’において隣接していてもよい。より具体的には、本発明のレポーター遺伝子をＺ染色体内の特定の遺伝子座に取り込むために、配列番号３３で示される核酸配列を含む左腕、および配列番号３４で示される核酸配列を含む右腕を使用して、本発明のレポーター遺伝子を配列番号２７のｇＲＮＡ８によって指示される特定の遺伝子座に取り込み得る。なおさらなる実施形態では、本発明のレポーター遺伝子をＺ染色体内の特定の遺伝子座に取り込むために、配列番号３５で示される核酸配列を含む左腕、および配列番号３６で示される核酸配列を含む右腕を使用して、本発明のレポーター遺伝子を配列番号２８のｇＲＮＡ９によって指示される特定の遺伝子座に取り込み得る。さらなる実施形態では、本発明のレポーター遺伝子をＺ染色体内の特定の遺伝子座に取り込むために、配列番号３７で示される核酸配列を含む左腕、および配列番号３８で示される核酸配列を含む右腕を使用して、本発明のレポーター遺伝子を配列番号２９のｇＲＮＡ１０によって指示される特定の遺伝子座に取り込み得る。さらなる実施形態では、本発明のレポーター遺伝子をＺ染色体内の特定の遺伝子座に取り込むために、配列番号３９で示される核酸配列を含む左腕、および配列番号４０で示される核酸配列を含む右腕を使用して、本発明のレポーター遺伝子を配列番号３０のｇＲＮＡ１１によって指示される特定の遺伝子座に取り込み得る。
【０２２９】
ある実施形態では、本発明のキットによって提供される少なくとも１つのレポーター遺伝子は、性染色体、具体的には、染色体Ｗの少なくとも１つの非コード領域に取り込まれ得る。こうした場合、本発明のキットの第１の核酸配列は、本明細書でそれぞれｇＲＮＡ１およびｇＲＮＡ２とも称される配列番号１および２のいずれか１つによって示される核酸配列を含む少なくとも１つのｇＲＮＡをコードし得る。
【０２３０】
いくつかの特定の実施形態では、本発明のキットの第１の核酸配列は、ｇＲＮＡ１であるｇＲＮＡを含んでもよい。いくつかの実施形態では、こうしたｇＲＮＡ１は、配列番号１で示される核酸配列を含み得る。こうした場合、本発明のキットの第２の核酸配列内に含まれるレポーター遺伝子は、それぞれ配列番号４および５で示されるアミノ酸配列を含む相同腕とその５’および３’において隣接していてもよい。
【０２３１】
さらにいくつかのさらなる代替的実施形態では、本発明のキットは、その第１の核酸配列に、ｇＲＮＡ２をコードする配列を含み得る。いくつかの特定の実施形態では、こうした配列は、配列番号２で示される核酸配列をコードする。さらにいくつかのさらなる実施形態では、本発明のキットの第２の核酸配列内に含まれる少なくとも１つのレポーター遺伝子は、それぞれ、配列番号６および７で示されるアミノ酸配列を含む相同腕とその５’および３’において隣接していてもよい。
【０２３２】
いくつかの実施形態では、本発明のキットの第２の核酸配列内に含まれるレポーター遺伝子は、少なくとも１つの蛍光レポーター遺伝子であり得る。さらに、いくつかの実施形態では、本発明のキットによって提供されるレポーター遺伝子は、任意の蛍光タンパク質、具体的には、ＲＦＰ、ＹＦＰ、および本発明によって開示される蛍光タンパク質のいずれか、または表１によって開示される蛍光タンパク質のうちのいずれかであり得る。いくつかの実施形態では、本発明のキットによって使用されるレポーター遺伝子は、蛍光タンパク質が緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）でないという条件で、任意の蛍光タンパク質であり得る。換言すれば、いくつかの特定の実施形態では、本発明のキットにより提供されるトランスジェニック動物の性染色体に取り込まれたレポーター遺伝子は、蛍光タンパク質がＧＦＰではないという条件で、任意の蛍光タンパク質であり得る。さらにいくつかのさらなる実施形態では、レポーター遺伝子は、ＲＦＰであってもよい。より具体的な実施形態では、こうしたＲＦＰは、配列番号２１で示されるアミノ酸配列、またはその任意の相同体、多様体、突然変異体、または誘導体を含んでもよい。さらにいくつかの代替的特定の実施形態では、本発明によって使用されるＲＦＰは、配列番号２３で示されるアミノ酸配列、またはその任意の相同体、突然変異体、もしくは誘導体を含み得るＲＦＰであり得る。
【０２３３】
さらにいくつかのさらなる実施形態では、本発明のキットは、性染色体ＺおよびＷのうちの少なくとも一方内の少なくとも１つの位置または場所に取り込まれた少なくとも１つの外因性レポーター遺伝子を含むトランスジェニック鳥類動物の調製における使用に好適であり得る。
【０２３４】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、本明細書に記載の本発明のキットのいずれかを使用してもよい。
【０２３５】
さらに、本発明のキットは、本発明のトランスジェニック鳥類動物の調製に必要な任意の試薬、緩衝液、培地または材料をさらに含み得ることを理解されたい。本発明のキットは、指示書ならびにその異なる構成成分の容器をさらに含み得る。
【０２３６】
いくつかの実施形態では、本発明のキットは、本発明のトランスジェニック鳥類対象のいずれか、または本発明による任意のその細胞の調製において使用され得る。さらにいくつかのさらなる実施形態では、本発明のキットを使用して調製されたトランスジェニック鳥類対象および細胞は、本明細書に開示のシステムおよびデバイスのいずれかを使用して、本発明の方法のいずれかによって使用され得る。さらに、いくつかの実施形態では、本発明のキットは、本発明の方法によって調査される卵内胚内でのレポーター遺伝子の存在を判定するために適合された任意の装置、システム、および／またはデバイスをさらに備え得る。いくつかの特定の実施形態では、こうした装置またはデバイスは、具体的には図１に示すように、本発明によって開示されるデバイスのいずれかであり得る。
【０２３７】
そのさらに別の態様では、本発明は、具体的には、卵内の胚内におけるレポーター遺伝子を検出するように適合されたシステム、装置またはデバイスを提供する。いくつかの実施形態では、本発明のデバイスは、レーザー源、卵用スタンド、レンズ、フィルター、検出器用スタンドおよび検出器を備えてもよい。本発明のデバイスは、いくつかの実施形態において、例えば図１に示されるように、本発明のシステムのすべての構成要素を保持する固体支持体を任意により備えてもよい。本明細書で使用されるとき、用語「検出器」は、光を検出および／または測定する任意の型のデバイスを指す。
【０２３８】
いくつかの実施形態では、検出可能なシグナル、具体的には蛍光シグナルは、好適な蛍光手段を用いて、本発明のデバイスによって検出され得ることに留意すべきである。いくつかの実施形態では、ＲＦＰレポーター遺伝子によって形成される検出可能なシグナルは、改変光学顕微鏡（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）または電荷結合素子（ＣＣＤ）、高感度光子検出器などの感光装置によって検出され得る。
【０２３９】
さらにいくつかのさらなる実施形態では、本発明のデバイス、装置、またはシステムは、少なくとも１つの光源、少なくとも１つの検出器、少なくとも１つのフィルター、および本発明のレポーター遺伝子を発現する細胞を光源に曝露することを容易にする、適切な位置に卵を置く少なくとも１つの保持アームを備えてもよい。いくつかの実施形態では、こうした卵は、孵化していない鳥類の受精卵であってもよい。さらにいくつかのさらなる実施形態では、こうした卵は、本発明のトランスジェニック鳥類対象のいずれかによって産卵され得る。いくつかの特定の非限定的な実施形態では、本発明のこうしたデバイスは、図１に例解されるようなものであり得る。さらにいくつかのさらなる実施形態では、卵ホルダーとレンズおよび／またはレンズと検出器との間の距離は、約１〜１００ｃｍの範囲、具体的には、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、および１００ｃｍ、具体的には約５〜２５ｃｍ、より具体的には約２０ｃｍであり得る。
【０２４０】
したがって、いくつかの実施形態では、本発明のシステムまたはデバイスは、本発明によって開示される方法のいずれかを実行するように適合され得ることを理解されたい。
【０２４１】
いくつかの特定の実施形態では、本発明のデバイスは、調査された卵中のレポーター遺伝子の検出を可能にする適切な光源を備え得る。さらにいくつかのさらなる実施形態では、光源は、約４００〜約６５０の波長を含むことができる。さらにいくつかのさらなる実施形態では、光源が紫外線（ＵＶ）光（波長１０〜４００ｎｍ）ではないという条件で、任意の波長の光を使用することができる。
【０２４２】
いくつかの特定の実施形態では、適切な光源は、蛍光タンパク質の励起に好適である。いくつかの特定の実施形態では、励起波長は約５００ｎｍ〜約６５０ｎｍであり得る。いくつかのさらなる実施形態では、励起波長は、約５１０ｎｍ、５１５ｎｍ、５２０ｎｍ、５２５ｎｍ、５３０ｎｍ、５３５ｎｍ、５４０ｎｍ、５４５ｎｍ、５５０ｎｍ、５５５ｎｍ、５６０ｎｍ、５６５ｎｍ、５７０ｎｍ、５７５ｎｍ、５８０ｎｍ、５８５ｎｍ、５９０ｎｍ、５９５ｎｍ、６００ｎｍ、６０５ｎｍ、６１０ｎｍ、６１５ｎｍ、６２０ｎｍ、６２５ｎｍ、６３０ｎｍ、６３５ｎｍ、６４０ｎｍである。
【０２４３】
いくつかのより具体的な実施形態では、励起波長は、約５１５〜約５５５の範囲であり得る。さらにいくつかのさらなる実施形態では、波長は５３２ｎｍであり得る。いくつかの具体的かつ非限定的な実施形態では、光源はレーザーによって提供されてもよい。いくつかの他の実施形態では、本発明のデバイスのレーザーは、青色レーザーまたは赤色レーザーであり得る。より具体的な実施形態では、光源は緑色レーザーである。
【０２４４】
ある実施形態では、レーザーはフィルターとともに使用されてもよい。いくつかの実施形態では、フィルターは、５００ｎｍ超を透過する緑色フィルター、または５４０ｎｍ〜５８０ｎｍを透過する暗緑色フィルター、または５９０ｎｍ〜６５０ｎｍを透過する赤色フィルター、または６５０ｎｍ超または６６０ｎｍ超を透過する赤色フィルターであり得る。
【０２４５】
いくつかの特定の実施形態では、光源は、５３２ｎｍの波長を有する緑色レーザーであり得る。いくつかのさらなる実施形態では、こうしたレーザーは、６５０ｎｍ超を透過する赤色フィルターを備えていてもよい。
【０２４６】
したがって、本発明は、本発明の方法のいずれか、具体的には、本発明のトランスジェニック鳥類対象のいずれかを使用する、本明細書で論じられている卵内性決定方法で使用するための本明細書に記載されるデバイスをさらに包含することをさらに理解されたい。
【０２４７】
ある実施形態では、本発明のキットおよび方法によって使用されるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、単離および／または精製された分子であることを理解されたい。本明細書で使用される場合、核酸に関して使用される場合の「単離された」または「精製された」とは、天然に存在する配列がその通常の細胞（例えば、染色体）環境から取り出されたか、または非天然環境で合成されている（例えば、人工的に合成された）ことを意味する。したがって、「単離された」または「精製された」配列は、無細胞溶液中にあるか、または異なる細胞環境に置かれてもよい。「精製された」という用語は、配列が、存在する唯一のヌクレオチドであることを意味するものではなく、その配列に天然で関連している非ヌクレオチド材料を本質的に含まず（純度約９０〜９５％）、このため、単離された染色体と区別されていることを意味する。
【０２４８】
本明細書で使用されるすべての科学用語および技術用語は、特に明記しない限り、当技術分野で一般的に使用される意味を有する。本明細書で提供される定義は、本明細書で頻繁に使用されるある用語の理解を容易にするためのものであり、本開示の範囲を限定するものではない。
【０２４９】
本発明の特定の態様および実施形態を詳細に記載する前に、本発明は特定の方法および記載された実験条件に限定されるものではなく、こうした方法および条件は変動し得ることを理解されたい。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ制限されるため、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を記載することのみを目的としており、限定することを意図するものではないことも理解されたい。
【０２５０】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないことを指示しない限り、複数の言及を含む。したがって、例えば、「方法」への言及は、１つ以上の方法、および／または本明細書に記載されたタイプのステップ、および／または本開示などを読むときに、当業者にとって明らかになるものを含む。
【０２５１】
別に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の任意の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法および材料が本明細書に記載されている。
【０２５２】
本明細書および以下の特許請求の範囲を通して、文脈が特に必要としない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語、および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、記述された整数もしくはステップ、または整数もしくはステップのグループを包含するが、他の整数もしくはステップ、または整数もしくはステップのグループを除外するものではないことを意味すると理解される。より具体的には、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「備える（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「備えている（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」およびそれらの活用形は、「含むがこれらに限定されない」ことを意味する。この用語には、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」および「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という用語を包含する。「本質的に〜からなる」という語句は、追加の成分および／またはステップが特許請求された組成物または方法の基本的および新規の特徴を実質的に変更することのない場合のみ、組成物または方法が追加の成分および／またはステップを含むことができることを意味する。
【０２５３】
本明細書で使用される「約」という用語は、言及した値よりも最大で１％、より具体的には５％、より具体的には１０％、より具体的には１５％、場合によっては最大で２０％以上、またはそれ以下逸脱し得る値を示し、整数値などの偏差範囲、および該当する場合は非整数値も含み、連続範囲を構成する。本明細書で使用される「約」という用語は、±１０％を指す。
【０２５４】
本発明の様々な実施形態は、範囲形式で提示され得ることに留意されたい。範囲形式での記述は、単に便宜上および簡潔にするためのものであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない制限として解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の説明は、すべての可能なサブ範囲およびその範囲内の個々の数値を具体的に開示したと見なされるべきである。例えば、１〜６などの範囲の記述は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などのサブ範囲、ならびにその範囲内の個々の数字（例えば、１、２、３、４、５、および６）を具体的に開示していると見なされるものとする。これは、範囲の幅に関係なく適用される。本明細書において数値範囲が示される場合は常に、示された範囲内に引用された任意の数字（小数または整数）を含むことを意味する。第１に指し示す番号および第２に指し示す番号の「範囲（ｒａｎｇｉｎｇ）／範囲（ｒａｎｇｅｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ）」と第１に指し示す番号から第２に指し示す番号までの「範囲（ｒａｎｇｉｎｇ）／範囲（ｒａｎｇｅｓ  ｆｒｏｍ）」という語句は、本明細書では同義的に使用され、第１および第２の指し示された番号およびそれらの間のすべての小数および整数の数字を含むことを意味する。
【０２５５】
以下の実施例は、本発明の方法および組成物を作成および使用する方法の完全な開示および説明を当業者に提供するために提示されており、発明者が本発明とみなす範囲を制限することを意図するものではない。使用された数字（量、温度など）に関して正確性を確保するための努力が行われたが、いくつかの実験誤差および偏差を考慮する必要がある。別段の指示がない限り、部は重量部、分子量は平均分子量、温度は摂氏温度、圧力は大気圧または大気圧付近である。
【０２５６】
これらの例は、本発明の態様を実施する際に本発明者らによって採用された技術の代表例である。これらの技術は、本発明の実施のための好ましい実施形態の例示であるが、当業者は、本開示を考慮して、本発明の趣旨および意図された範囲から逸脱することなく多くの変更を行うことができることを認識するであろうことを理解されたい。
【０２５７】
明確にするため別の実施形態の文脈で説明されている本発明の特定の特徴は、単一の実施形態において、組み合わせて提供し得ることも理解されるであろう。逆に、簡潔にするために単一の実施形態の文脈で記載されている本発明の様々な特徴は、別に、または任意の好適な下位の組み合わせで、または記載されている本発明の任意の他の実施形態において好適であるものとして提供されてもよい。様々な実施形態の文脈で記載される特定の特徴は、これらの実施形態がそれらの構成要素を含まずに動作不能である場合を除き、それらの実施形態の本質的な特徴と見なされるべきではない。
【０２５８】
上記で説明され、以下の特許請求の範囲の項で請求される本発明の様々な実施形態および態様は、以下の実施例において実験的裏付けを見出す。
【０２５９】
開示および記載されている本発明は、本明細書に開示されている特定の例、方法のステップ、および組成物に限定されるものではなく、こうした方法のステップおよび組成物は、若干異なり得ることを理解されたい。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲およびその均等物によってのみ制限されるものであるため、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明する目的で使用され、限定することを意図しないものであることも理解されたい。
【０２６０】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、その内容が明確に別の指示をしない限り、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。
実施例
【０２６１】
さらに詳述することなく、当業者は、前述の説明を使用して、本発明を最大限に利用できると考えられる。したがって、以下の好ましい特定の実施形態は、単なる例示として解釈されるべきであり、特許請求される本発明を決して限定するものではない。
【０２６２】
本明細書に具体的に記載されていない当技術分野で公知である標準的な分子生物学プロトコルは、一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ−Ｙｏｒｋ（１９８９年、１９９２年）、およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８８年）に本質的に準拠する。
試薬
動物：
【０２６３】
市販のホワイトレグホーン鶏は、Ｈｅｎｄｒｉｘ  ＩＳＡおよびＭｉｎｎｅｓｏｔａから入手する。
マーカーライン鶏は、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ａｇｒｉ−Ｆｏｏｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｒｅ（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ａｇｒｉ−Ｆｏｏｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｒｅ、Ａｇａｓｓｉｚ、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｃｏｌｕｍｂｉａ、Ｃａｎａｄａ）から入手する。
【０２６４】
動物実験は、ＩＡＣＵＣ承認のプロトコルに厳密に従って行われ、Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＩＡＣＵＣ委員会の監督下で、実験過程中に動物が罹患すること、または死亡することのないようにした。
ベクター：
【０２６５】
ＰｒｅｃｉｓｉｏｎＸ（商標）Ｃａｓ９  ＳｍａｒｔＮｕｃｌｅａｓｅ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍは、Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．のカタログ番号ＣＡＳ８／９ｘｘシリーズで注文している。
Ｃｌｏｎｔｅｃｈ＃６９２１−１のｐＤｓＲｅｄ１−Ｎ１
ＧＦＰプラスミド−ＦＵＧＷ−Ｈ１−ＧＦＰ−ネオマイシン（Ａｄｄｇｅｎｅ）、カタログ番号３７６３２
【０２６６】
細胞株：雌細胞は、ＡＴＣＣ（登録商標）番号：ＣＲＬ−１２１３５（商標）で注文した、鶏（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ）のリンパ芽球雌細胞株Ｃｏｎ  Ａ−Ｃ１−ＶＩＣＫである。鶏細胞培養実験では、ＡＴＣＣの鶏線維芽細胞の雌細胞株ＵＭＮＳＡＨ／ＤＦ−１（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１２２０３（商標））を使用した。雄細胞は、ＡＴＣＣ（登録商標）番号：ＣＲＬ−２１１８（商標）で注文した鶏（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ）の上皮雄細胞株ＬＭＨ／２Ａのものである。
始原生殖細胞（ＰＧＣ）株
ヒト胎児腎臓２９３（ＨＥＫ−２９３）細胞株（ＡＴＴＣ）
鳥類トランスジェニック対象を調製するために必要な試薬および材料
ＰＧＣの単離
【０２６７】
１．微小電極ピペットプラー（Ｓｈｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ．）
２．マイクログラインダー（ＮＡＲＩＳＨＩＧＥ）
３．小径（２５μｍ）ガラス製マイクロピペット
４．マウス制御ピペット（Ｍｏｕｔｈ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｉｐｅｔｔｅ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）
５．ＣａＣｌ２またはＭｇＣｌ２非含有ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）ｘ１（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）
６．Ｃａ２またはＭｇ２非含有１ｘダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ）
７．トリプシン／エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）（Ｇｉｂｃｏ）
８．ＨａｍｂｕｒｇｅｒおよびＨａｍｉｌｔｏｎ（ＨＨ）ステージ１４〜１７の鶏胚
９．磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）緩衝液
０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および２ｍＭ  ＥＤＴＡを補充した１ｘＰＢＳ
１０．ＭｉｎｉＭＡＣＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）
１１．ステージ特異的胚抗原１（ＳＳＥＡ−１）抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）
１２．抗マウスＩｇＭ  ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）
ＰＧＣ培養
１．ＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）
２．ＨＢＳＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）
３．ＰＧＣ培地（５０ｍＬ）。３．７５ｍＬのウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１．２５ｍＬの鶏血清（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、５００μＬのＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉサプリメント（１００ｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５００μＬのヌクレオシド（１００ｘ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、５００μＬの抗生物質／抗真菌薬（ＡＢＡＭ；１００ｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５００μＬのインスリントランスフェリンセレンサプリメント（１００ｘ、Ｇｉｂｃｏ）、５００μＬの非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ；１００ｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５０μＬのβ−メルカプトエタノール（１０００ｘ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１０μＬの５０ｎｇ／μＬヒト塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、およびノックアウトダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を５０ｍＬまで添加。４℃で保管する。
４．Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）
生殖系列キメラの産生およびトランスジェネシス
鶏ＰＧＣへの遺伝子導入
１．Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
２．Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
３．トランスフェクション培地（ＡＢＡＭ非含有ＰＧＣ培地；５０ｍＬ）：３．７５ｍＬのＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１．２５ｍＬの鶏血清（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、５００μＬのＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉサプリメント（１００ｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５００μＬのヌクレオシド（１００ｘ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、５００μＬのインスリントランスフェリンセレンサプリメント（１００ｘ、Ｇｉｂｃｏ）、５００μＬのＮＥＡＡ（１００ｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５０μＬのβ−メルカプトエタノール（１０００ｘ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、および１０μＬの５０ｎｇ／μＬ  ｂＦＧＦ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、かつノックアウトＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を５０ｍＬまで添加。４℃で保管する。
４．ＰＢＳ、Ｃａ２またはＭｇ２非含有
５．ＨＢＳＳ、Ｃａ２またはＭｇ２非含有
６．１μｇ／μＬのプラスミドＤＮＡを調製する。
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの増殖およびトランスジェニックＰＧＣの選択
１．ＨＢＳＳ、Ｃａ２またはＭｇ２非含有（Ｈｙｃｌｏｎｅ）
２．血球計
３．トリパンブルー、０．４％（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
４．倒立蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）
５．Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）選択的抗生物質（Ｇｉｂｃｏ）
レシピエント卵へのＰＧＣ移植
１．小径（２５μｍ）ガラス製マイクロピペット（微小電極ピペットプラー（Ｓｈｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ．）およびマイクログラインダー（ＮＡＲＩＳＨＩＧＥ）で作られている
２．マウス制御ピペット
３．ＨＢＳＳ、ＣａＣｌ２またはＭｇＣｌ２非含有（Ｈｙｃｌｏｎｅ）
４．ＨＨステージ１４〜１７のレシピエント鶏胚
５．ＰＢＳ、Ｃａ２またはＭｇ２非含有（Ｈｙｃｌｏｎｅ）
６．ピペット洗浄液。０．１％過酸化水素（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むオートクレーブした蒸留水
７．鉗子
８．照明付き実体顕微鏡
９．ホットメルト接着剤スティックおよびグルーガン
１０．パラフィルム
１１．ＨＢＳＳ中３＿１０３細胞／μＬに調製されたドナーＰＧＣ
交差試験
１．野生型Ｋｏｒｅａｎ  Ｏｇｙｅ（ＫＯ）雌鶏
２．１ｍＬシリンジ
３．ＰＢＳ、Ｃａ２またはＭｇ２非含有（Ｈｙｃｌｏｎｅ）
ドナー由来の子孫およびトランスジェニック鶏の検証
１．ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅキット（Ｑｉａｇｅｎ）
２．ドナーＰＧＣ固有のプライマーセット
３．導入遺伝子特異的プライマーセット
４．ＰＣＲ機
５．ＰＣＲ試薬：ＰＣＲ緩衝液、ｄＮＴＰ、Ｔａｑポリメラーゼ
６．アガロース
７．ＴＡＥ緩衝液
８．電気泳動機
実験手順
蛍光アッセイ
【０２６８】
実験の完全なセットアップは、図１に示すような、レーザー源、適切な位置に卵を位置付けて、卵内のレポーター遺伝子を発現する細胞のレーザー源への曝露が可能になるホルダーまたはスタンド、レンズ、フィルター、検出器用スタンド、および検出器を備える。サンプルとレンズ、およびレンズと検出器の距離は、約２０ｃｍである。レンズの焦点面は約１０ｃｍであり、そこにフィルターを配設する。
【０２６９】
最適条件は、検出器の前にフィルターを配置することにより、かつ散乱光が確実にフィルターをバイパスすることのないように検出器の周囲領域をすべて覆うことにより検出された。
【０２７０】
以下の表２に示すように、初期出力Ｉ０およびフィルターを有する３種類のレーザーを使用した：
【表２】
2020520669.tif 000004
トランスフェクトされたＧＦＰまたはＲＦＰ発現細胞の卵への注入
【０２７１】
ＨＥＫ細胞は、１％Ｌ−グルタミン、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、および１％ＰｅｎＳｔｒｅｐ（ペニシリン＋ストレプトマイシン）（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｉｓｒａｅｌ）を補充したＤＭＥＭ培地で維持した。細胞は、３７℃、５％ＣＯ２の加湿インキュベーターで増殖させた。培地を週に２〜３回新しくし、細胞数を１ｘ１０５〜３ｘ１０５細胞／ｍＬに維持した。細胞を継代培養し、次のように新鮮な培地に再懸濁した：
１．細胞がフラスコの表面に付着するように、上清をフラスコから取り除いた。
２．取り出された細胞を５ｍＬの新鮮な培地に再懸濁した。
【０２７２】
２回目の継代培養後、ＰｏｌｙＪｅｔ（商標）インビトロＤＮＡトランスフェクション試薬（ＳｉｇｎａＧｅｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＭＤ、ＵＳＡ）を製造元のプロトコルに従って使用して、プラスミドの２μｇＤＮＡを細胞にトランスフェクトした。２つのプラスミド（上記のＧＦＰプラスミドおよびＲＦＰプラスミド）を別々に細胞にトランスフェクトした。
【０２７３】
続いて、トランスフェクト細胞（ＲＦＰ）を１０６細胞／ｍｌの濃度で調製した。次に、表３および４に従って、新鮮な鶏卵の中央に総量１００μｌの細胞を注入した。
【表３】
2020520669.tif 000005
【０２７４】
２番目の実験では、前述のように細胞を成長させてトランスフェクトした。次に、細胞をＰＢＳまたは５０％グリセロール（分散を制御するため）のいずれかに移し、新鮮な鶏卵の中央に注入した。注入されたさまざまな卵は、表４に開示されている。
【表４】
2020520669.tif 000006
雄鶏細胞株
【０２７５】
雄細胞、具体的には、鶏（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ）（肝臓；化学的に誘導された；鶏エストロゲン受容体遺伝子をトランスフェクト）は、１％Ｌ−グルタミン、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、および１％ＰｅｎＳｔｒｅｐ（ペニシリン＋ストレプトマイシン）（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｉｓｒａｅｌ）を補充したウェイマウスのＭＢ  ７５２／１培地で増殖させた。培養フラスコ（Ｔ２５）に０．１％ゼラチンをコーティングした）。培地は３日ごとに新しくした。細胞は、３７℃、５％ＣＯ２の加湿インキュベーターで増殖させた。
雌鶏細胞株
【０２７６】
ＡＴＣＣの鶏線維芽細胞の雌細胞株ＵＭＮＳＡＨ／ＤＦ−１（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１２２０３（商標））を使用した。細胞に関するさらなる詳細を表５に示す：
【表５】
2020520669.tif 000007
【０２７７】
雌細胞は、１％Ｌ−グルタミン、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、および１％ＰｅｎＳｔｒｅｐ（ペニシリン＋ストレプトマイシン）（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｉｓｒａｅｌ）を補充したＤＭＥＭ培地で増殖させた。細胞は、３７℃、５％ＣＯ２の加湿インキュベーターで増殖させた。培地は週２〜３回新しくした。
ＰＧＣ細胞培養
【０２７８】
胚生殖腺は、６．５日間のインキュベーションでホワイトレグホーン（ＷＬ）胚から回収され、次に、回収された生殖腺細胞は、全胚生殖腺細胞内のＰＧＣを分離するために磁気活性化セルソーター（ＭＡＣＳ）で処理される。ＰＧＣは、ＫＯ−ＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で増殖し、そのうちの４０％はｂｕｆｆａｌｏ系ラット肝細胞（ＢＲＬ、ＡＴＣＣ）により事前調整し、７．５％ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、２．５％照射鶏血清、１ｘ非−必須アミノ酸、２ｍＭグルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭβ−メルカプトエタノール（すべてＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）、４ｎｇ／ｍｌ組換えヒト線維芽細胞成長因子、６ｎｇ／ｍｌ組換えマウス幹細胞因子（両方ともＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製）を補充し、ＢＲＬ細胞の照射フィーダー層で増殖させる。細胞は、新鮮なフィーダー層上に週に３回継代される。
無制限（ＲＦ）クローニング
【０２７９】
Ｃａｓ９−ＳｍａｒｔＮｕｃｌｅａｓｅ（商標）ベクターへのｇＲＮＡの挿入は、制限なし法を適用することにより実行される［Ｐｅｌｅｇ  Ｙら、Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１７２（１）：３４−４４（２０１０年）２０１０］。プライマーはＳｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｒｅｈｏｖｏｔ、Ｉｓｒａｅｌ）に注文し、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｈｕｄｓｏｎ、ＮＨ、ＵＳＡ）を使用してその続のＲＦ反応を実行した。プラスミド精製は、ＭＥＧＡｓｐｉｎキットおよびＤＮＡ−ｓｐｉｎプラスミドＤＮＡ精製キット（Ｉｎｔｒｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｅｊｏｅｎ、Ｓｏｕｔｈ  Ｋｏｒｅａ）をそれぞれ使用して実行する。
鶏の染色体ＷまたはＺへのトランスフェクション
【０２８０】
ＰｏｌｙＪｅｔ（商標）を使用して、細胞に各プラスミドの２μｇＤＮＡを同時トランスフェクトする（以下の詳細を参照）。製造元のプロトコルによるＩｎ  ｖｉｔｒｏ  ＤＮＡトランスフェクション試薬（ＳｉｇｎａＧｅｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＭＤ、ＵＳＡ）。２つのプラスミドの同時トランスフェクションは次のように実行する：
１．鶏染色体Ｚ左腕および右腕または染色体Ｗ左腕および右腕ならびにＣＭＶ−ｈｓｐＣａｓ９−Ｈ１−ｇＲＮＡを含むｐＤｓＲｅｄ（アッセイ）。
２．鶏染色体Ｚ左および右腕または染色体Ｗ左および右腕ならびにＣＭＶ−ｈｓｐＣａｓ９−Ｈ１−ｇＲＮＡを含むｐＣＭＶＧｌｕｃ（対照）。
【０２８１】
次に、細胞をネオマイシン耐性と共にプレートし、１０５個／ウェルの細胞密度で４８ウェルプレートに播種する。３日後、４０μｇ／ｍｌのネオマイシンを添加して、レポーター遺伝子が安定して取り込まれた細胞を選択する。
染色体ＺまたはＷへの取り込みのためのＤＮＡ分析
【０２８２】
染色体の取り込みを検証するために、次の戦略を用いた。細胞を単離し、その半分のＤＮＡを抽出し、寒天ゲル（１％）で泳動させた。（プラスミドＤＮＡをゲルに残して）ゲノムＤＮＡを切断し、洗浄した。以下のプライマーを使用して、ＰＣＲアッセイを実施した。産物をゲル上で分離し、次いで、配列を決定した。インサートが非常に長く、ＰＣＲアッセイでは検出できないため、最初のＰＣＲ産物で開始するスライドウィンドウＰＣＲアッセイを設計した。
ａ．インサートを含む細胞株のアッセイ（左腕の一部、ＣＭＶエンハンサー、プロモーター、およびＭＣＳ、およびｄｓＲＥＤ２の一部を含む）：
配列番号４９で示す左プライマー−ＴＴＧＧＴＧＴＧＴＧＣＴＡＡＴＡＧＧＣＡＧＴ；配列番号５０で示す右プライマー−ＴＡＧＴＣＣＴＣＧＴＴＧＴＧＧＧＡＧＧＴ、産物サイズ：１４８９ｂｐ。
ｂ．インサートを含む細胞株のアッセイ（（腕に）隣接するＺ染色体の一部、左腕、およびＣＭＶエンハンサー、プロモーターの一部を含む）：
配列番号５１で示す左プライマー−ＧＣＡＴＴＧＡＴＣＴＧＴＣＣＡＧＴＴＧＣ、配列番号５２で示す右プライマー−ＴＡＣＴＧＣＣＡＡＡＡＣＣＧＣＡＴＣＡＣ、産物サイズ：１４６２ｂｐ。
トランスジェニック鶏の調製
【０２８３】
濃縮ビヒクル（力価が約１０７ＭＯＩのレンチウイルス）またはプラスミドＤＮＡのいずれかであり得る）を、新しい産卵卵の２５個の胚に注入する。注入は、３回／週行う。注入された胚は、注入の３週間後に孵化する。これらはＧ０鳥である。孵化直後に、孵化した雛のＣＡＭサンプルからＤＮＡを抽出し、ベクターＤＮＡの有無の検出を半定量ＰＣＲにより行う。２〜３週齢のＧ０雛の血液サンプル、およびリピートＰＣＲスクリーニング。Ｇ０鳥は、性的成熟するまで、雄で１６〜２０週間、雌で２０〜２４週間発育させる。若雄鶏は、約１６週間から精液の産生の試験を行う。
【０２８４】
雌鶏は授精させ、毎日受精卵を収集する。Ｇ１雛は、３週間後に孵化し、個々の雛の羽にバンドをつけ、鶏絨毛尿膜（ＣＡＭ）サンプルは殻から採取する。ＣＡＭサンプルからＤＮＡを抽出し、シングルコピーレベルであることが予測される導入遺伝子の存在についてＰＣＲスクリーニングを実行する。２〜３週間後に血液サンプルからのＤＮＡを確認し、雛の雌雄鑑別をするためにスクリーニングを繰り返す。
【０２８５】
数週齢の時点で、Ｇ１鳥から血液サンプルを採取して、ＰＣＲ分析用のゲノムＤＮＡを調製する。Ｇ１鳥は、Ｇ２の繁殖に使用する。
ＰＧＣの単離
【０２８６】
１．血液ＰＧＣの単離のために、新鮮な鶏卵（ＥＧＫステージＸ）、例えばＫｏｒｅａｎ  Ｏｇｙｅ（ＫＯ）を３７℃で５０〜５４時間（ＨＨステージ１４〜１７）インキュベートする。インキュベートした卵を卵皿の上に水平に置き、７０％エタノールを含む消毒綿を用いて卵殻を静かに拭く。
２．鋭鉗子を使用して、全血細胞を単離するために卵殻（直径１ｃｍ未満）を慎重に割る。
３．胚性背部大動脈から、２５μｍの細く研磨したガラス針およびマウスピペットを用いて約２〜３μＬの全血細胞を収集する。５００μＬＰＢＳと混合する。ＰＧＣのマイクロインジェクションには、マウスピペットおよび直径２０〜２５μｍのガラス製マイクロピペットを使用してもよい。ガラス製マイクロピペットは微小電極ピペットプラー（Ｓｈｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ．）で作製され、マイクログラインダー（ＮＡＲＩＳＨＩＧＥ）を使用して２５度に研磨される。
４．全血細胞を１．５ｍＬ滅菌チューブに移し、遠心分離（２５０ｘｇ、５分）して、上清を除去する。
５．生殖腺ＰＧＣを単離するために、新鮮な鶏卵を３７℃で５．５日間インキュベートする（ＨＨ２０〜２６）。ＨＨステージ２０〜２６の胚から鋭鉗子で胚生殖腺を抽出し、３７℃インキュベーターで５００μＬの０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡを用いて５分間インキュベートさせる。
６．不活性化のために５０μＬのＦＢＳを追加し、遠心分離（２５０ｘｇ、５分）して上清を除去する。
７．全血細胞または解離した生殖腺細胞を１ｍＬのＰＢＳに再懸濁し、１：２００希釈の抗ＳＳＥＡ−１抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＳＣ−２１７０２）を適用し、次いで、混合物を室温（ＲＴ）で１５分間インキュベートする。
８．細胞を洗浄して、総細胞１０７個あたり５ｍＬのＭＡＣＳ緩衝液（０．５％ＢＳＡおよび２ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳ、ｐＨ７．２）を添加し、遠心（２５０ｘｇ、５分）により、未結合の一次抗体を除去する。
９．上清を完全に吸引し、総細胞１０７個あたりＭＡＣＳ緩衝液８０μＬ中で細胞ペレットを再懸濁する。
１０．総細胞１０７個あたり２０μＬのラット抗マウスＩｇＭ  ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ．１３０−０４７−３０１）を添加する。細胞数がより多い場合には、それに応じて緩衝液量を増量する。
１１．細胞を抗体と２〜８℃で２０分間インキュベートする。
１２．総細胞１０７個あたり２ｍＬのＭＡＣＳ緩衝液を添加して細胞を洗浄し、遠心分離する（２５０ｘｇ、５分）。
１３．上清を完全に吸引し、５００μＬＭＡＣＳ緩衝液に最大で総細胞１０８個を再懸濁する。
１４．好適なＭＡＣＳセパレーターの磁場にカラムを置く。
１５．５００μＬＭＡＣＳ緩衝液ですすぐことにより、カラムを調製する。
１６．カラムに細胞懸濁液を加え、５００μＬの緩衝液でカラムを３回洗浄する。カラムリザーバーが空になったときに、新しい緩衝液を追加する。
１７．セパレーターからカラムを取り外し、好適な収集チューブに置く。
１８．１ｍＬのＭＡＣＳ緩衝液をカラムに添加し、プランジャーをカラムに確実に押し込むことにより、磁気標識された細胞をすぐに洗い流す。
１９．ＰＧＣを含む単離された細胞を、事前に加温したＰＧＣ培地（１ｘ１０５精製ＰＧＣあたり１ｍＬのＰＧＣ培地）に移す。
ＰＧＣ培養
【０２８７】
１．ＰＧＣを含む単離した細胞を、事前に加温したＰＧＣ培地（１ｘ１０５精製ＰＧＣあたり１ｍＬ  ＰＧＣ培地）に移し、３７℃でインキュベートする。
２．増殖の７〜１４日後、初代培養ＰＧＣのほとんどがコロニーを形成し、細胞コロニーの凝集体を消失させる。
３．懸濁ＰＧＣコロニーは、穏やかなピペッティングおよび遠心分離（２００ｘｇ、５分）の後、培地と共に穏やかに回収し得る。
４．Ａｃｃｕｔａｓｅ（約５ｘ１０５ＰＧＣあたり１ｍＬ  Ａｃｃｕｔａｓｅ溶液）を用いて、細胞ペレットを分解する。
５．遠心（２００ｘｇ、５分）し、ＰＧＣ培地に細胞ペレットを再懸濁する。
６．１２ウェルプレートに懸濁したＰＧＣを播種する（１ｍＬ／ウェルの１２ウェルプレートのＰＧＣ培地に１ｘ１０５の培養したＰＧＣ）。
７．ＰＧＣは、３〜４日ごとに定期的に継代培養できる。
鶏ＰＧＣへの遺伝子導入、生殖系列キメラの産生、およびトランスジェネシス
鶏ＰＧＣへの遺伝子導入
【０２８８】
１．ＣＡＧＧ−ＰＢａｓｅ（ｐＣｙＬ４３Ｂ）を含むヘルパープラスミド４μｇおよびレポーター遺伝子（ＲＦＰ）および任意により選択可能マーカー（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子）を含むｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン（ｐＣｙＬ５０）６μｇを１００μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）と混合し、ＲＴで５分間インキュベートする。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓトランスフェクションの場合、２．５μｇＣＭＶＲＦＰ発現プラスミドベクター、２．５μｇＣａｓ９、およびガイドＲＮＡ発現プラスミドベクターを１００μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）と混合し、ＲＴで５分間インキュベートする。
２．１０μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１００μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭと混合し、ＲＴで５分間インキュベートする。
３．Ｏｐｔｉ−ＭＥＭを含むプラスミドを、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭを含むＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００試薬と混合し、ＲＴで２０分間インキュベートする。
４．インキュベーション中に、培養ＰＧＣを採取し、遠心分離する（２００ｘｇ、５分）。上清を廃棄する。
５．採取したＰＧＣにＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）１ｍＬを加えて、３７℃で１０分間インキュベートする。
６．血球計（Ｍａｒｉｅｎｆｅｌｄ）を使用してＰＧＣの数を決定し、抗生物質非含有１ｍＬ  ＰＧＣ培地を含む１２ウェルプレートに５ｘ１０５ＰＧＣを播種する。
７．ＤＮＡ−Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ複合体をＰＧＣに加え、ＣＯ２インキュベーターで３７℃で１日間インキュベートする。
８．トランスフェクトされたＰＧＣを採取し、遠心分離する（２００ｘｇ、５分）。上清を除去する。
９．１ｍＬ  ＨＢＳＳでＰＧＣを３回洗浄し、抗生物質を含むＰＧＣ培地で懸濁する。
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの増殖およびトランスジェニックＰＧＣの選択
【０２８９】
１．トランスフェクションの翌日に、１００μｇ／ｍＬ  Ｇ４１８（ネオマイシン耐性遺伝子用）を含むＰＧＣ培地でトランスフェクトしたＰＧＣを選択する。
２．蛍光顕微鏡を使用して、レポーター遺伝子の発現をモニターする。
３．３〜４日ごとにＰＧＣを継代培養する。完全な選択期間には最長３週間を要する。
４．トランスフェクトされたプラスミドベクター中に薬物選択マーカーが存在しない場合、蛍光タンパク質を発現するＰＧＣをＦＡＣＳにより選別できる。
レシピエント卵へのＰＧＣ移植
【０２９０】
１．レシピエント卵を、相対湿度６０〜７０％の空気中、３７℃でＨＨステージ１４〜１７までインキュベートする。
２．トランスフェクトされたＰＧＣを採取し、遠心分離（２００ｘｇ、５分）し、上清を除去する。
３．採取したＰＧＣにＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）１ｍＬを加えて、３７℃で１０分間インキュベートする。
４．遠心分離する（２００ｘｇ、５分）。上清を廃棄する。
５．ＨＢＳＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）にＰＧＣを懸濁する。
６．レシピエント卵の尖端に小さい窓を作り、レシピエント胚の背部大動脈にマイクロピペットで３，０００超のＰＧＣを含む２μＬのアリコートをマイクロインジェクションする。
７．グルーガンを使用してレシピエント胚の卵ウィンドウをパラフィルムで密封し、相対湿度６０〜７０％の空気中で３７℃で、孵化するまで尖端を下げた状態で卵をインキュベートする。
胚生殖腺における遺伝子組み換えＰＧＣのモニタリング
【０２９１】
１．レシピエント卵を、相対湿度６０〜７０％の空気中、３７℃でＨＨステージ２８〜３０までインキュベートする。
２．胚の６日目に生殖腺を切開する。
３．蛍光顕微鏡を使用して、胚生殖腺の蛍光タンパク質発現をモニターする。
交差試験
【０２９２】
１．性的に成熟したレシピエントおよび野生型（ＷＴ）鶏から１週間に２回精液を収集する。
２．成熟した雄のレシピエントおよびＷＴの雄鶏由来の５０μＬの精液をそれぞれＷＴの産卵雌鶏および成熟した雌のレシピエントに導入する。
３．人工授精の翌日にＷＴ産卵雌鶏および成熟雌のレシピエントから卵を収集し、相対湿度６０〜７０％の空気中で３７℃で孵化するまで尖端を下げた状態で卵をインキュベートする。
実施例１
家禽の視覚による性識別のための異なる色のレーザーおよびフィルターを使用する蛍光分析
光学蛍光システム
【０２９３】
卵内の家禽の性を視覚的に識別することの実現可能性を実証するために、青色蛍光または赤色蛍光レポーター遺伝子と比較して、緑色蛍光の使用を評価した。
【０２９４】
完全な卵または卵白、卵黄、および殻に分離された卵の自己蛍光を、青色レーザー、緑色レーザー、または赤色レーザーを使用して判定した。空の卵（殻）を完全な卵と比較すると、自己蛍光レベルに有意差がないことが示されている（データは示さず）。
【０２９５】
卵のさまざまな構成成分および部分によってもたらされる散乱強度および自己蛍光強度を表６に示す。
【０２９６】
重要なことに、バックグラウンドノイズ（レーザーなし）は約４ｎＷであったが、レーザー（５３２ｎｍ）の存在下では、フィルター（６６０ｎｍ超を通過させるローパスフィルター）をバイパスする光散乱により約１２ｎＷであったことに留意されたい。
【表６】
2020520669.tif 000008
【０２９７】
異なる濃度のフルオレセイン（１μＭ、１０ｍＭ）を完全な卵に添加している場合と、添加していない場合の青色レーザー（４７３ｎｍ）および緑色（＋５００ｎｍ）または赤色フィルター（５９０〜６５０ｎｍ）の使用を分析し、図２に要約する。大きい緑色の自己蛍光があるように見えるが、高フルオレセイン濃度を使用することで、蛍光強度を検出できる。
【０２９８】
完全な卵にローダミンＢ（１０μＭ）を添加した場合と添加しない場合の緑色レーザー（５３２ｎｍ）と暗緑色（５４０〜５８０ｎｍ）または赤色フィルター（＋６６０ｎｍ）の使用を分析し、図３に要約する。４０ｍＷを超えると、緑色フィルターを用いることで、色素の蛍光発光がかなり検出できるように見える（ほぼ２倍大きい）。しかし、赤いフィルターを用いた場合には、違いは観察できなかった。
【０２９９】
完全な卵にｄｉｒ（１０μＭ）を添加した場合と添加しない場合の緑色レーザー（５３２ｎｍ）と赤色フィルターＡ（５９０〜６５０ｎｍ）または赤色フィルターＢ（＋６６０ｎｍ）の使用を分析し、図４に要約する。８０ｍＷを超えると、赤色フィルターＡを使用した場合には、色素の蛍光発光を検出でき、赤色フィルターＢ（＋６６０ｎｍ）を使用した場合には、わずかな差のみ観察できることがわかる。
【０３００】
完全な卵にｄｉｒ（１０μＭ）を添加した場合と添加しない場合の赤色レーザー（６３２．８ｎｍ）と赤色フィルター（＋６６０ｎｍ）または緑色フィルター（５４０〜５８０ｎｍ）の使用を分析し、図５に要約する。蛍光色素の有無にかかわらず、強度の差はほとんど示されなかった。
【０３０１】
これらの実験はすべて、卵殻のみを使用して繰り返した。同様の結果が観察された（データは示さず）。
【０３０２】
これらの観察結果は、卵殻を介してＲＦＰが検出される実現可能性を実証するものである。
実施例２
ＲＦＰまたはＧＦＰをトランスフェクトした細胞の卵への蛍光
【０３０３】
胚におけるＲＦＰ発現細胞の卵内検出の実現可能性を示すために、本発明者らは次に、蛍光タンパク質、具体的にはＲＦＰまたはＧＦＰでトランスフェクトした細胞が完全な卵への注入時に検出できるかを調べた。
【０３０４】
より具体的には、実験手順に記載しているように、ＨＥＫ細胞にＧＦＰまたはＲＦＰベクターのいずれかをトランスフェクトした。ＧＦＰおよびＲＦＰをトランスフェクトした細胞の両方の蛍光を、励起後に調べた。図６（ＧＦＰ）および図７（ＲＦＰ）は、ＧＦＰおよびＲＦＰの両方がトランスフェクトされた細胞で発現し、かつ蛍光シグナルが観察できることを明確に実証するものである。
【０３０５】
次に、実験手順に記載したように、ＨＥＫをトランスフェクトした細胞を新鮮な卵に注入し、卵の蛍光強度を分析した。
【０３０６】
まず、赤色蛍光タンパク質ＲＦＰ発現細胞の有無にかかわらず、緑色レーザー（５３２ｎｍ）および＋６５０ｎｍの赤色フィルターを用いて、卵を励起することにより卵の蛍光強度の特徴を明らかにした。図８は、５つの異なる位置の卵により測定したＲＦＰを含まない卵の蛍光強度が非常に類似していることを示すものである。図９は、卵が中心で励起されたときのＲＦＰ発現細胞の異なる濃度を使用して測定された蛍光強度を示すものである。ＲＦＰ濃度と検出器の強度との相関が明確に観察された。
【０３０７】
ＲＦＰ発現細胞の存在下で、卵の位置、すなわち、レーザーによって提供される励起の正確な場所が蛍光強度に影響を与えているかを確認するために、いくつかの試験を実施した。検出器の強度は、励起中の卵の位置によって大きく変化することがわかる。これは、ＲＦＰ発現細胞を卵に注入した後、ＲＦＰが均一に分布していないために予想されていたものであった。図１０は、励起中に卵の特定の位置で観察される最大強度を示している。これは、ＲＦＰ発現細胞の濃度が最も高い位置に対応している。この図は、最低約３０００個の細胞を検出できることを実証するものである。
【０３０８】
胚では、性細胞、ＰＧＣが卵の発育段階Ｘで産卵直後の卵の胚盤葉上層の中心に位置付けられることが当技術分野で公知である。胚が、卵黄袋の上側に常に面していることに留意されたい。
【０３０９】
上記で詳述した結果は、卵殻の数ミリメートル後方および卵黄の近くに位置する領域を励起すると、最大ＲＦＰ放射が検出され得ることを示唆するものである。
【０３１０】
卵にＲＦＰ発現細胞を注入した１週間後にこの実験を繰り返し行った。これらの結果は同様であり、ＲＦＰ色素が卵の内部に拡散しなかったことを実証するものである。
【０３１１】
緑色レーザー（５３２ｎｍ）および＋６５０ｎｍの赤色フィルターを使用した卵の蛍光強度に対するＰＢＳおよびグリセロールの影響を、ＲＦＰ発現細胞の有無により調べた。図１１Ａおよび１１Ｂに示すように、グリセロールまたはＰＢＳはいずれも、ＲＦＰ発現細胞の卵への蛍光強度測定に影響を与えないことがわかる。
【０３１２】
次に、青色レーザー（４８３ｎｍ）および＋５００ｎｍのフィルターを使用して、卵の蛍光強度に対するＰＢＳおよびグリセロールの影響を、ＧＦＰ発現細胞の存在下または非存在下で調べた。ＧＦＰ発現細胞は、任意の所定の濃度（１０００個、３０００個、１０，０００個、３０，０００個の細胞）（例えば、図１２に示すようにＧＦＰ発現細胞３０，０００個）では検出できなかったことがわかる。３つの異なるフィルター：＋５００ｎｍ、５３０〜５５０ｎｍ、および５４０〜５８０ｎｍを使用して同じ結果が得られた。
【０３１３】
レポーター遺伝子としてＲＦＰを使用する驚くべき利点をさらに評価するために、ＧＦＰおよびＲＦＰ発現細胞の蛍光を図１３に示すように最終的に比較した。パラメーターＲは、蛍光タンパク質（ＦＰ）強度（ＩＦＰ）と自己蛍光強度（Ｉ自己蛍光）の比を示すために定義した。
【数１】
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Ｒパラメーターは、ＧＦＰおよびＲＦＰ発現細胞の両方の異なる濃度に対して算出した。図に示すように、ＧＦＰ発現細胞は、所定の濃度のいずれにおいても検出できないことがわかる（図１３に示すように、１０００および３０，０００個の細胞）。
【０３１４】
一方、ＲＦＰ発現細胞は、低濃度であっても有意なＲパラメーター値をもたらした（１０００個のＲＦＰ発現細胞）。高濃度のＲＦＰ発現細胞（３００００個のＲＦＰ発現細胞）では、Ｒ値は３に達し、ＲＦＰレポーター遺伝子が励起させた卵内で容易に検出できることを明確に示すものである。
【０３１５】
主な所見は、以下に要約する：
１．青には強い自己蛍光があるが、緑および赤には自己蛍光はない。
２．主な自己蛍光は、卵殻に由来する。
３．このシステムでは、比較的低い色素濃度および低い励起力により、緑および赤の蛍光色素を検出できる。
４．青色蛍光は、自己蛍光のためほとんど検出されない（色素濃度ｍＭのみ）。
５．ＲＦＰは、卵の内部で非常に容易に、かつ有意に検出できる。
６．ＧＦＰの型は、このシステムでは検出できない。
７．卵の内部でのＲＦＰ発現細胞の正確な場所は、励起領域を定義するために重要である。
８．ＲＦＰ色素は、注入から１４日間、卵内に拡散していなかった。
９．ＰＢＳまたはグリセロールも、ＲＦＰの検出に影響を与えていない。
これらの結果は、性染色体に取り込まれているＲＦＰ遺伝子を発現する胚が初期発生段階において検出できることを明らかに示すものである。ここでは、約１０００個の細胞がＲＦＰを発現している。
実施例３
ガイドＲＮＡベクターの設計
【０３１６】
ＲＦＰレポーター遺伝子を性染色体ＷまたはＺに組み込むために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介ＨＤＲ法が選択される。次に、両方の性染色体から関連するｇＲＮＡ部位を探索する。
雌Ｚ染色体の取り込み
【０３１７】
雌鶏の染色体Ｚの配列番号１５で示される９１５６８７４〜９１６１８７４、配列番号１６で示される２７７６４９４３〜２７７６９９４３、配列番号１７で示される４２１７２７４８〜４２１７７７４８、配列番号１８で示される６３３６３６５６〜６３３６８６５６、および配列番号１９で示される７８７７７４７７〜７８７８２４７７の領域をガイドＲＮＡを設計するために分析する。より具体的には、ＲＦＰのＺ染色体への取り込みを指示するために、次に、配列番号２６でも示される核酸配列ＧＴＡＡＴＡＣＡＧＡＧＣＴＡＡＡＣＣＡＧを含む、Ｚ染色体遺伝子座ｃｈｒＺ＿４２１７４５１５＿−１のｇＲＮＡ７と呼ばれるｇＲＮＡを調製した。
【０３１８】
この手順は、「ＰｒｅｃｉｓｉｏｎＶ  Ｃａｓ９  ＳｍａｒｔＮｕｃｌｅａｓｅ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ」ユーザーマニュアルに従って実行した。より具体的には、クローニング用に２つのプライマーを設計した：
ＣｈＺｇＲＮＡ＿フォワード：配列番号５３で示すＴＧＴＡＴＧＡＧＡＣＣＡＣＧＴＡＡＴＡＣＡＧＡＧＣＴＡＡＡＣＣＡＧ、ＣｈＺｇＲＮＡ＿リバース：配列番号５４で示すＡＡＡＣＣＴＧＧＴＴＴＡＧＣＴＣＴＧＴＡＴＴＡＣＧＴＧＧＴＣＴＣＡ
【０３１９】
プライマーをアニールして、各プライマー５μＭを含む反応ミックスで二重鎖を生成した。混合物を９５℃で５分間インキュベートし、取り出して、室温まで冷却した。
【０３２０】
その後、以下のように設定したライゲーション反応により、提供された線形化Ｃａｓ９ベクターに二重鎖をクローニングした：１μｌの線形化ベクター、３μｌのアニールされたオリゴミックス、１μｌのライゲート緩衝液、および０．２５μｌのＦａｓｔリガーゼ。混合物を２５℃で５〜７分間インキュベートした。
【０３２１】
混合物をＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換して、細胞を５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢプレート上で培養し、３７℃で一晩インキュベートした。
【０３２２】
翌日、２つのコロニーを無作為に選出し、振盪しながら３７℃で一晩ＬＢ／カナマイシン培地で増殖させた。
【０３２３】
翌日、Ｑｉａｇｅｎ  ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐキットを使用してプラスミドＤＮＡを調製し、提供されたシーケンスプライマーを使用して配列決定を行った。
【０３２４】
さらにいくつかのさらなる実施形態では、非制限クローニングプロトコルにより、野生型Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（Ｈｏｒｉｚｏｎ）を含むＣａｓ９  ＳｍａｒｔＮｕｃｌｅａｓｅベクターに４つの追加のガイドＲＮＡ：配列番号１１で示されるｇＲＮＡ３：ＡＣＡＧＡＣＣＴＡＴＧＡＴＡＴＧＴ、配列番号１２で示されるｇＲＮＡ４：ＣＧＡＴＴＡＴＣＡＣＴＣＡＣＡＡＧ、配列番号１３で示されるｇＲＮＡ５：ＣＴＧＧＴＴＡＧＣＡＴＧＧＧＧＡＣ、配列番号１４で示されるｇＲＮＡ６：ＧＴＡＡＡＧＡＧＴＣＡＧＡＴＡＣＡを選択、合成し、個別にクローニングする。
【０３２５】
Ｚ染色体内の特定の遺伝子座への取り込みに好適であるｇＲＮＡ配列のさらなる非限定的な例としては、これらに限定されないが、配列番号２７でも示される核酸配列ＡＣＡＧＡＣＣＴＡＴＧＡＴＡＴＧＴＧＡＧを含むＺ染色体遺伝子座ｃｈｒＺ＿９１５７０９１＿１のｇＲＮＡ８、配列番号２８でも示される核酸配列ＧＡＧＣＴＴＧＴＧＡＧＴＧＡＴＡＡＴＣＧを含むＺ染色体遺伝子座ｃｈｒＺ＿２７７６７６０２＿−１のｇＲＮＡ９、配列番号２９でも示される核酸配列ＧＴＡＡＡＧＡＧＴＣＡＧＡＴＡＣＡＣＡＧを含むＺ染色体遺伝子座ｃｈｒＺ＿７８７７９９２７＿１のｇＲＮＡ１０、および配列番号３０でも示される核酸配列ＣＡＧＴＧＧＧＴＡＣＴＧＡＡＧＣＴＧＴＧを含むＺ染色体遺伝子座ｃｈｒＺ＿６３３６４９４６＿−１のｇＲＮＡ１１を含み得る。
【０３２６】
これらのｇＲＮＡには、予測されるオフターゲット部位は少数あるが、いずれも既知のコード配列中ではない。
雌Ｗ染色体の取り込み
【０３２７】
配列番号３で示される核酸配列を含む雌鶏の染色体Ｗの１０２２８５９〜１０２４２１５の領域は、ガイドＲＮＡを設計するために分析する。２つのガイドＲＮＡ：配列番号１で示されるｇＲＮＡ１：ＧＣＡＣＴＡＧＧＡＡＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧ、および配列番号２で示されるｇＲＮＡ２：ＧＴＡＧＣＣＣＣＡＡＧＡＧＧＧＣＴＡＧＧを選択し、合成し、非制限クローニングプロトコルにより、野生型Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（Ｈｏｒｉｚｏｎ）を含むＣａｓ９  ＳｍａｒｔＮｕｃｌｅａｓｅベクターに個別にクローニングする。
【０３２８】
これらの２つのｇＲＮＡの予測パラメーターを表７に示す：
【表７】
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実施例４
ＲＦＰターゲティングベクターの設計
【０３２９】
雌Ｗ染色体または雌Ｚ染色体遺伝子座の上記の適切な隣接配列と相同である隣接配列は、ＲＦＰ発現ベクター、具体的にはｐＤｓＲｅｄ１−Ｎ１プラスミドに導入する。
【０３３０】
本発明のレポーター遺伝子をＺ染色体内の特定の遺伝子座に取り込むために、配列番号３１で示される核酸配列を含む左腕、および配列番号３２で示される核酸配列を含む右腕を使用して、本発明のレポーター遺伝子を配列番号２６のｇＲＮＡ７によって指示される特定の遺伝子座に取り込み得る。
【０３３１】
より具体的には、本発明のレポーター遺伝子を、配列番号２６で示されるように、ｇＲＮＡ７、具体的にはＧＴＡＡＴＡＣＡＧＡＧＣＴＡＡＡＣＣＡＧによって指示される特定の遺伝子座に取り込むために、ＲＦ方法論を用いて、「左腕」のクローニングをｐＤｓＲｅｄ１−Ｎ１プラスミドのＣＭＶエンハンサーの上流で行った。
【０３３２】
次のプライマーを使用した：
フォワードプライマー：配列番号５５により示されるＡＣＧＧＧＧＴＣＡＴＴＡＧＴＴＣＡＴＡＧＣＣＣＡＴＡＴＡＴＧＧＴＧＡＡＣＧＧＡＴＡＧＧＣＡＧＣＡＡＧＣ（５’左腕配列およびプラスミド内の取り込む部位の３０ヌクレオチドを含む）。
リバースプライマー：配列番号５６により示されるＧＧＣＧＧＧＣＣＡＴＴＴＡＣＣＧＴＡＡＧＴＴＡＴＧＴＡＡＣＧＴＧＡＧＧＡＡＧＧＧＴＣＴＧＴＴＡＣＴＧＧＡ。
【０３３３】
右腕は、以下のプライマーを使用して、ネオ耐性遺伝子の下流にクローニングした。
フォワードプライマー：配列番号５７によって示されるＴＴＣＴＡＴＣＧＣＣＴＴＣＴＴＧＡＣＧＡＧＴＴＣＴＴＣＴＧＡＧＴＣＡＴＧＴＣＧＧＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＡ（緑色でマークされた３’ネオ耐性配列）
リバースプライマー：配列番号５８によって示されるＧＴＧＡＴＧＧＣＡＧＧＴＴＧＧＧＣＧＴＣＧＣＴＴＧＧＴＣＧＧＧＣＡＴＧＧＧＡＴＧＴＴＡＡＡＧＡＧＡＡＧＣＴ（ネオ遺伝子に対して３’側のオレンジ色のベクター配列）。
【０３３４】
適切な取り込みを確保するために、配列決定によってクローニングを検証した。
【０３３５】
取り込み部位に隣接するエンハンサー領域には１６個のヌクレオチドの繰り返し（配列番号５９で示されるＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣ）により、ＣＭＶエンハンサーから１９３個のヌクレオチドの欠失が存在していることに留意されたい。
【０３３６】
さらにいくつかのさらなる実施形態では、ＲＦＰレポーター遺伝子は、配列番号１１で示されるｇＲＮＡ３、配列番号１２で示されるｇＲＮＡ４、配列番号１３で示されるｇＲＮＡ５、配列番号１４で示されるｇＲＮＡ６のいずれかを用いるためにクローニングされ得る。
【０３３７】
ｇＲＮＡ３を使用するクローニングのために、配列番号４１で示される核酸配列を含む「左腕」、および配列番号４２で示される核酸配列を含む「右腕」が提供される。ｇＲＮＡ４を使用するクローニングのために、配列番号４３で示される核酸配列を含む「左腕」、および配列番号４４で示される核酸配列を含む「右腕」が提供される。ｇＲＮＡ５を使用するクローニングのために、配列番号４５で示される核酸配列を含む「左腕」、および配列番号４６で示される核酸配列を含む「右腕」が提供される。ｇＲＮＡ６を使用するクローニングのために、配列番号４７で示される核酸配列を含む「左腕」、および配列番号４８で示される核酸配列を含む「右腕」が提供される。
【０３３８】
さらなる実施形態では、本発明のレポーター遺伝子をＺ染色体内の特定の遺伝子座に取り込むために、配列番号３３で示される核酸配列を含む左腕、および配列番号３４で示される核酸配列を含む右腕を使用して、本発明のレポーター遺伝子を配列番号２７のｇＲＮＡ８によって指示される特定の遺伝子座に取り込み得る。なおさらなる実施形態では、本発明のレポーター遺伝子をＺ染色体内の特定の遺伝子座に取り込むために、配列番号３５で示される核酸配列を含む左腕、および配列番号３６で示される核酸配列を含む右腕を使用して、本発明のレポーター遺伝子を配列番号２８のｇＲＮＡ９によって指示される特定の遺伝子座に取り込み得る。さらなる実施形態では、本発明のレポーター遺伝子をＺ染色体内の特定の遺伝子座に取り込むために、配列番号３７で示される核酸配列を含む左腕、および配列番号３８で示される核酸配列を含む右腕を使用して、本発明のレポーター遺伝子を配列番号２９のｇＲＮＡ１０によって指示される特定の遺伝子座に取り込み得る。さらなる実施形態では、本発明のレポーター遺伝子をＺ染色体内の特定の遺伝子座に取り込むために、配列番号３９で示される核酸配列を含む左腕、および配列番号４０で示される核酸配列を含む右腕を使用して、本発明のレポーター遺伝子を配列番号３０のｇＲＮＡ１１によって指示される特定の遺伝子座に取り込み得る。
【０３３９】
雌Ｗ染色体の場合、レポーター遺伝子、具体的にはＲＦＰは、配列番号１で示されるガイド１（ｇＲＮＡ１）または配列番号２で示されるガイド２（ｇＲＮＡ２）のいずれかを使用するためにクローニングされ得る。ｇＲＮＡ１を使用するクローニングのために、配列番号４で示される核酸配列を含む「左腕」、および配列番号５で示される核酸配列を含む「右腕」が提供される。ｇＲＮＡ２を使用するクローニングのために、配列番号６で示される核酸配列を含む「左腕」、および配列番号７で示される核酸配列を含む「右腕」が提供される。
【０３４０】
さらに、ＣＭＶプロモーターの上流の領域の「左腕」は、配列番号８で示される核酸配列を含み、ネオマイシン耐性の下流の領域の「右腕」は、配列番号９で示される核酸配列を含むか、またはポリＡ部位の下流の領域については配列番号１０で示される核酸配列を含んでもよい。
実施例５
雌鶏細胞株のＺ染色体へのＲＦＰレポーター遺伝子の取り込み
【０３４１】
雌鶏細胞株に、実験手順の項で詳述したように、２つのプラスミド（すなわち、鶏染色体Ｚ左腕および右腕を含むｐＤｓＲｅｄとＣＭＶ−ｈｓｐＣａｓ９−Ｈ１−ｇＲＮＡを含むプラスミド）を同時トランスフェクトした。
【０３４２】
用いられたｇＲＮＡ配列は、配列番号２６で示されるようにｇＲＮＡ  ７であった。表８に、使用したガイドＲＮＡの詳細を示す。
【表８】
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【０３４３】
次に、トランスフェクトされた細胞を赤色蛍光で励起させた。図１４に見られるように、トランスフェクションは陽性であった。明るくなった細胞を収集し、ゲノムＤＮＡを抽出し、スライディングＰＣＲアッセイ（実験手順に記載）を実施した。次に、ＰＣＲ断片をＳＡＮＧＥＲシーケンスのために送り、図１５に示す取り込まれた配列を得た。これは、ＲＦＰ遺伝子がＺ染色体へ上手く取り込まれたことを示すものである。
【０３４４】
結論として、これらの結果は次のことを示すものである：
−雌鶏細胞株の成功した増殖手順が確立された。
−ＲＦＰレポーター遺伝子およびＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ９システムの雌鶏細胞株へのトランスフェクションの成功が確立した。
−赤色励起において、強い蛍光シグナルが生成された。
−ＲＦＰレポーター遺伝子のＺ染色体への取り込みの成功点が確立された。
実施例６
ＣＲＩＳＰＲ処理細胞の生殖系列伝達
【０３４５】
トランスジェニック鶏を産生するための始原生殖細胞（ＰＧＣ）の使用には、動物のバイオテクノロジーおよびバイオモデリングにおいて多くの利点がある。鶏胚は卵生であるため、初期段階でのＰＧＣは容易に入手可能であり、遺伝物質の修復、ゲノム編集、およびトランスジェニック研究など、実用的な応用のためにｉｎ  ｖｉｔｒｏで操作できる。さまざまな胚起源由来の鶏ＰＧＣの培養システムを確立するために多くの努力が払われており、その特性を失うことなく鶏ＰＧＣのみをｉｎ  ｖｉｔｒｏで無期限に維持できることが実証されている。
【０３４６】
より具体的には、鶏では、ＰＧＣは最初にＥｙａｌ−ＧｉｌａｄｉおよびＫｏｃｈａｖ（ＥＧＫ）のステージＸ胚の胚盤葉上層で分離し、次に透明領域の胚盤葉下層を下に移動し、続いて生殖三日月環に移動して血流に入る。循環系を通って移動した後、生殖隆起に到達する。
【０３４７】
生殖細胞系列の発達におけるこれらの固有の特徴により、遺伝子操作されたＰＧＣをレシピエント卵の血管に注入することにより、それらを使用したトランスジェニック鶏の生産が可能になる。
【０３４８】
上記の２つのベクター、具体的には、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９およびレポーター遺伝子ベクターは、実験手順で詳述しているようにＰＧＣに同時トランスフェクトされる。安定したクローンが特定された後、細胞は拡大して、ＰＣＲによってＲＦＰの取り込みを確認する。確認されたクローンは、ステージ１４〜１６（Ｈ＆Ｈ）でレシピエントの鶏胚に注入する。注入を受けた胚を代理殻に移し、孵化するまで３７℃でインキュベートする。雛の性別は、孵化後にＷまたはＺ染色体のＰＣＲにより判定する。
【０３４９】
雌および雄のキメラは、性的に成熟するまで成長させ、野生型の雄鶏および雌鶏と交配させる。孵化した雛は、ＲＦＰの発現について評価し、生殖細胞系列の子孫をＰＣＲで確認して、標的ＲＦＰを保有させる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2020520669.tif 000020
【図９】
2020520669.tif 000021
【図１０】
2020520669.tif 000022
【図１１】
2020520669.tif 000023
【図１２】
2020520669.tif 000024
【図１３】
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【図１４】
2020520669.tif 000026
【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【国際調査報告】
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2020520669.tif 000030
2020520669.tif 000031
2020520669.tif 000032