(57)【要約】  本発明は、アレルギー疾患などを含む自己免疫疾患を予防、改善または治療することができる組成物の製造方法と、前記方法により製造された組成物に関するものである。本発明は、簡単で、容易な工程を通じて未成熟樹状細胞から免疫寛容性プラズマサイトイド樹状細胞を高い収率で誘導することができ、これを利用して、自己免疫疾患を効果的に予防、改善または治療することができる。
2020506186.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
未成熟樹状細胞にトール様受容体アゴニスト（ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｇｏｎｉｓｔ）を処理して、免疫寛容性プラズマサイトイド樹状細胞（ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ、ｐＤＣ）を製造する段階を含む、自己免疫疾患の予防または治療用薬学的組成物の製造方法。
【請求項２】
前記トール様受容体アゴニストは、前記未成熟樹状細胞の分化開始以前または分化中に処理され、免疫寛容性プラズマサイトイド樹状細胞への分化を誘導する、請求項１に記載の自己免疫疾患の予防または治療用薬学的組成物の製造方法。
【請求項３】
前記トール様受容体アゴニストは、前記未成熟樹状細胞の分化開始時点から分化完以前に処理される、請求項１に記載の自己免疫疾患の予防または治療用薬学的組成物の製造方法。
【請求項４】
前記未成熟樹状細胞の分化は、分化誘導用因子を用いて行われる、請求項２又は３に記載の自己免疫疾患の予防または治療用薬学的組成物の製造方法。
【請求項５】
前記分化誘導用因子は、ＦＭＳ−様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＭＳ−ｌｉｋｅ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ３、Ｆｌｔ３Ｌ）である、請求項４に記載の自己免疫疾患の予防または治療用薬学的組成物の製造方法。
【請求項６】
前記分化誘導用因子は、前記未成熟樹状細胞に１回以上処理される、請求項４に記載の自己免疫疾患の予防または治療用薬学的組成物の製造方法。
【請求項７】
前記トール様受容体アゴニストは、前記分化誘導用因子と同時に、前記未成熟樹状細胞に処理される、請求項１に記載の自己免疫疾患の予防または治療用薬学的組成物の製造方法。
【請求項８】
前記トール様受容体アゴニストは、１回以上処理される、請求項１に記載の自己免疫疾患の予防または治療用薬学的組成物の製造方法。
【請求項９】
前記トール様受容体アゴニストは、ＭｙＤ８８（Ｍｙｅｌｏｉｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｇｅｎｅ  ８８）シグナルを経由するものである、請求項１に記載の自己免疫疾患の予防または治療用薬学的組成物の製造方法。
【請求項１０】
前記トール様受容体アゴニストは、ＴＬＲ２アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ５アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、ＴＬＲ９アゴニスト、ＴＬＲ１１アゴニスト、ＴＬＲ１２アゴニストおよびＴＬＲ１３アゴニストからなる群から選択された１種以上を含む、請求項１に記載の自己免疫疾患の予防または治療用薬学的組成物の製造方法。
【請求項１１】
前記トール様受容体アゴニストは、ＴＬＲ１アゴニスト及びＴＬＲ６アゴニストのうち、少なくとも一つをさらに含む、請求項１０に記載の自己免疫疾患の予防または治療用薬学的組成物の製造方法。
【請求項１２】
前記分化誘導された免疫寛容性プラズマサイトイド樹状細胞にトール様受容体アゴニストを追加で処理して、免疫寛容性を活性化させる段階をさらに含む、請求項２に記載の自己免疫疾患の予防または治療用薬学的組成物の製造方法。
【請求項１３】
前記免疫寛容性を活性化させるために用いられる前記トール様受容体アゴニストは、ＴＬＲ９アゴニストである、請求項１２に記載の自己免疫疾患の予防または治療用薬学的組成物の製造方法。
【請求項１４】
前記自己免疫疾患は、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、敗血症性ショック、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、潰瘍性大腸炎、涙腺炎、アルツハイマー病、脳卒中、動脈硬化症、血管再狭窄、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、蕁麻疹、結膜炎、乾癬、全身性炎症反症候群、多発性筋炎、皮膚筋炎、結節性多発関節炎、混合性結合組織症、シェグレン症候群、痛風、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、糖尿病性網膜症、多発硬化症、クローン病、慢性甲状腺炎、セリアック病、重症筋無力症、 尋常性天疱瘡 、ウイルス疾患、細菌性疾患、放射線による障害、動脈硬化、血管腫、血管線維腫、灌流障害及び心臓肥大症からなる群から選択された１種以上である、請求項１に記載の自己免疫疾患の予防または治療用薬学的組成物の製造方法。
【請求項１５】
未成熟樹状細胞にトール様受容体アゴニストを処理して誘導された免疫寛容性プラズマサイトイド樹状細胞を含む、自己免疫疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項１６】
前記免疫寛容性プラズマサイトイド樹状細胞は、前記未成熟樹状細胞の分化の開始以前または分化中に前記トール様受容体アゴニスト処理され、分化誘導されたものである、請求項１５に記載の自己免疫疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項１７】
前記トール様受容体アゴニストは、ＴＬＲ２アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ５アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、ＴＬＲ９アゴニスト、ＴＬＲ１１アゴニスト、ＴＬＲ１２アゴニストおよびＴＬＲ１３アゴニストからなる群から選択された１種以上を含む、請求項１５に記載の自己免疫疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項１８】
前記トール様受容体アゴニストは、ＴＬＲ１アゴニスト及びＴＬＲ６アゴニストのうち、少なくとも一つを追加でさらに含む、請求項１７に記載の自己免疫疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項１９】
前記自己免疫疾患は、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、敗血症性ショック、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、潰瘍性大腸炎、涙腺炎、アルツハイマー病、脳卒中、動脈硬化症、血管再狭窄、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、蕁麻疹、結膜炎、乾癬、全身性炎症反症候群、多発性筋炎、皮膚筋炎、結節性多発関節炎、混合性結合組織症、シェグレン症候群、痛風、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、糖尿病性網膜症、多発硬化症、クローン病、慢性甲状腺炎、セリアック病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、ウイルス疾患、細菌性疾患、放射線による障害、動脈硬化、血管腫、血管線維腫、灌流障害及び心臓肥大症からなる群から選択された１種以上である、請求項１５に記載の自己免疫疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項２０】
未成熟樹状細胞にトール様受容体アゴニストを処理して誘導された免疫寛容性プラズマサイトイド樹状細胞を含む、自己免疫疾患の予防または改善用化粧料組成物。
【請求項２１】
未成熟樹状細胞にトール様受容体アゴニストを処理して誘導された免疫寛容性プラズマサイトイド樹状細胞を含む、自己免疫疾患の予防または改善用食品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自己免疫疾患を予防、改善または治療することができる組成物の製造方法と、該方法により製造された組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫システムにおける免疫反応と免疫寛容反応は、相互調和とバランスを取らなければならない。過剰免疫反応が引き起こった場合、過敏性アレルギー疾患や自己免疫疾患などが発生することがあり、これらはヒトの生存と生活の質に非常に大きな影響を与える。
【０００３】
すべての正常個体において最も重要な特性の一つは、自己（ｓｅｌｆ）を構成している抗原物質については、害する反応はしないのに対し、多くの非自己（ｎｏｎ−ｓｅｌｆ）抗原に対しては、これを認識して反応し、除去できる能力を有することである。このように自己抗原に対する生体の無反応を免疫学的無反応性（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ｕｎｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ）または寛容（ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）という。
【０００４】
こうした自己寛容を誘導したり、維持する上で問題が生じると、自己抗原に対して免疫反応が引き起きるようになり、これにより、自分の組織を攻撃する現象が発生し、かつ多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、１型糖尿病、関節リウマチ、橋本甲状腺炎などの自己免疫疾患が発生することになり、そればかりでなく、移植のような施術後、免疫拒否反応が発生するようになる。
【０００５】
具体的には自己免疫疾患は、自己細胞の異常反応として現れる疾患であって、現在の治療剤としては、Ｔ細胞における信号変換経路を遮断する免疫抑制剤が最も多く使用されているが、このような免疫抑制剤は、毒性、感染症、リンパ腫、糖尿病、振戦（ｔｒｅｍｏｒ）、頭痛、下痢、高血圧、悪心、腎機能障害などの副作用が発生する問題があった。したがって、副作用がなく、安価でありながらも、治療効果が優れた新しい治療薬の開発が必要な実情である。
【０００６】
また、前記自己免疫疾患の一種に該当する関節リウマチ（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）は、成人に最もよく発病する炎症性関節炎であって、その原因がまだ完全に知られていないが、自己免疫機転による炎症反応であると理解されている。このような関節リウマチを治療するのに用いられる抗リウマチ薬剤と生物学的製剤が、症状の調節により生活の質を改善する効果を奏するが、究極の治療目標である軟骨と骨の破壊の減少による障害を予防するにはまだ至らない。また、一部の患者においては治療効果が不完全だったり、生物学的製剤を長期間使用したとき、抗体が産生し、治療効果が劣ることもあり、多数の薬物の副作用が治療の障害となっている。
【０００７】
一方、樹状細胞は、先天性免疫だけでなく、後天的な因果によって選択的に発生される獲得免疫調節にも中枢的な役割を担う細胞であり、具体的には、主に外部から侵入した抗原の情報をＴ細胞に提示する機能を遂行する代表的な抗原提示細胞の一種である。
【０００８】
前記樹状細胞は、根源（ｏｒｉｇｉｎ）、表現型（ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）及び機能（ｆｕｎｃｔｉｏｎ）などに応じて、様々な部分母集団（ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ）からなる。具体的には、プラズマサイトイド樹状細胞（ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄｅ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ、ｐＤＣ）の場合、さまざまな病原菌由来の刺激に対応して、Ｉ型ＩＦＮを高いレベルで産生することができる。これらは表面表現型によって、一般的な樹状細胞（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ、ｃＤＣ）と区別される。前記ｐＤＣは、Ｂ２２０を発現し、ＣＤ１１ｃは、低レベルで発現するのに対し、ｃＤＣはＣＤ１１ｃおよびＣＤ１１ｂを高いレベルで発現するが、Ｂ２２０は発現しない。前記ｐＤＣ及びｃＤＣは、すべて調和のとれた免疫反応の効果的な刺激剤として作用することができるよう、未成熟樹状細胞が成熟する過程により得られる。
【０００９】
前記したように、ｐＤＣは、ＤＮＡウイルスや一本鎖ＲＮＡウイルスにより感染した時、大量のＩ型ＩＦＮｓを分泌することにより、免疫細胞を活性化させ、ウイルス感染の防御に重要な役割をすると知られている。特に抗原を提示することができる成熟した樹状細胞（ｍａｔｕｒａｔｅｄ  ＤＣｓ、ｍＤＣｓ）を強力に活性化させ、Ｔ細胞による抗ウイルス反応を増幅させるのに一助する。
【００１０】
しかし、体内でｐＤＣの分化や役割についての研究は、他の樹状細胞に比べて微々たる実情である。樹状細胞の免疫を主幹する特定の遺伝子の発現調節や免疫寛容誘発物質の発掘を通じて一貫して免疫寛容性を維持もしくは強化させた免疫寛容性樹状細胞の製造技術が早急に求められている。特に、前記ｐＤＣが、様々な自己免疫疾患において重要な役割をするという研究が多く行われているが、免疫寛容性ｐＤＣを作製する体系的で、標準化された分化方法が知られなかった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の発明者らは、未成熟樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ）にトール様受容体アゴニスト（ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｇｏｎｉｓｔ、ＴＬＲ  ａｇｏｎｉｓｔ）を処理した後、分化を誘導したり、あるいは前記未成熟樹状細胞を分化させる過程中にトール様受容体アゴニストを処理する場合、免疫寛容性プラズマサイトイド樹状細胞が誘導され、これを使用する場合、自己免疫疾患を効果的に予防、改善または治療することができることを見出し、本発明に至った。
【００１２】
本発明の一目的は、自己免疫疾患を効果的に予防、改善または治療することができる組成物を製造する方法を提供するものである。
【００１３】
本発明のもう一つの目的は、前記方法で製造され、自己免疫疾患を効果的に予防、改善または治療することができる組成物を提供するものである。
【００１４】
本発明のもう一つの目的および利点は、下記の発明の詳細な説明、請求の範囲及び図面によってより明確になる。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
前記目的を達成するために、本発明は、未成熟樹状細胞にトール様受容体アゴニスト（ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｇｏｎｉｓｔ）を処理して、免疫寛容性プラズマサイトイド樹状細胞（ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ、ｐＤＣ）を製造する段階を含む、自己免疫疾患の予防または治療用薬学的組成物の製造方法を提供する。
【００１６】
また、本発明は、未成熟樹状細胞にトール様受容体アゴニストを処理して誘導された免疫寛容性プラズマサイトイド樹状細胞を含む、自己免疫疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
【００１７】
また、本発明は、未成熟樹状細胞にトール様受容体アゴニストを処理して誘導された免疫寛容性プラズマサイトイド樹状細胞の自己免疫疾患の予防または治療用途を提供する。
【００１８】
また、本発明を未成熟樹状細胞にトール様受容体アゴニストを処理して誘導された免疫寛容性プラズマサイトイド樹状細胞の自己免疫疾患の予防または治療用薬学的組成物の製造のための用途を提供する。
【００１９】
また、本発明は、未成熟樹状細胞にトール様受容体アゴニストを処理して誘導された免疫寛容性プラズマサイトイド樹状細胞を含む、自己免疫疾患の予防または改善用化粧料組成物を提供する。
【００２０】
また、本発明は、未成熟樹状細胞にトール様受容体アゴニストを処理して誘導された免疫寛容性プラズマサイトイド樹状細胞を含む、自己免疫疾患の予防または改善用食品組成物を提供する。
【発明の効果】
【００２１】
本発明は、簡単で、容易な工程により未成熟樹状細胞から免疫寛容性を有するプラズマサイトイド樹状細胞を高い収率で誘導することができ、大量の免疫寛容性プラズマサイトイド樹状細胞の安定的な供給を可能とする。
【００２２】
また、本発明にて前記のように得られた免疫寛容性プラズマサイトイド樹状細胞は、炎症性サイトカイン及び炎症誘発因子の発現を抑制し、様々な自己免疫疾患を効果的に予防または治療することができ、人体に投与する場合は、安全である。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明の一実施例に係る未成熟樹状細胞に対して分化誘導用因子（Ｆｌｔ３Ｌ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｍｅｄｉａ）及びトール様受容体アゴニスト（ＴＬＲｓ  ａｇｏｎｉｓｔｓ）処理方法の設計図を示す図である。
【図２】実施例１において、本発明の一実施例に従って、トール様受容体アゴニスト（Ｐａｍ３）処理後、分化誘導されたプラズマサイトイド樹状細胞（ＴＬＲｓ−ｐＤＣ）の分離を示す図である。
【図３（ａ）】実施例１において、本発明の一実施例に従って、トール様受容体アゴニスト（Ｐａｍ３）処理後、分化誘導されたプラズマサイトイド樹状細胞に特異的に誘導される表面発現分子を示す図である。
【図３（ｂ）】実施例1において、未成熟樹状細胞数対本発明の一実施例に従って、トール様受容体アゴニスト（Ｐａｍ３）処理後、分化誘導されたプラズマサイトイド樹状細胞数の割合をグラフで示す図である。
【図４】実施例２において、本発明の一実施例に従って、トール様受容体（Ｐａｍ３）処理後、分化誘導されたプラズマサイトイド樹状細胞（ＴＬＲｓ−ｐＤＣ）と、一般的なプラズマサイトイド樹状細胞（ｐＤＣ）とにおいて、サイトカイン（ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１０）の発現様相を比較した結果をグラフで示す図である。
【図５】実施例３において、本発明の一実施例に従って、様々なトール様受容体アゴニスト処理後、分化誘導されたプラズマサイトイド樹状細胞と、一般的なプラズマサイトイド樹状細胞（ｎｏｎ）とにおいて、サイトカインＩＬ−１０の発現様相を比較した結果をグラフで示す図である。
【図６】実施例４において、本発明の一実施例に従って、未成熟樹状細胞に対して処理されるトール様受容体アゴニスト（Ｐａｍ３）の処理時点に応じてサイトカイン（ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１０）の発現様相を比較した結果をグラフで示す図である。
【図７】実施例５において、本発明の一実施例に従って、トール様受容体アゴニスト（Ｐａｍ３）処理後、分化誘導されたプラズマサイトイド樹状細胞（ＴＬＲｓ−ｐＤＣ）と、一般的なプラズマサイトイド樹状細胞（ｐＤＣ）とにおいて、ＭＨＣｃｏｍｐｌｅｘ分子、ＣＤ８０、及びＣＤ８６の発現様相を比較した結果をグラフで示す図である。
【図８】実施例６において、本発明の一実施例に従って、トール様受容体アゴニスト（Ｐａｍ３）処理後、分化誘導されたプラズマサイトイド樹状細胞（ＴＬＲｓ−ｐＤＣ）と、一般的なプラズマサイトイド樹状細胞（ｐＤＣ）とにおいて、ＩＤＯ、ＣＣＲ９、及びＰＤ−Ｌ１との発現様相を比較した結果をグラフで示す図である。
【図９（ａ）】実施例７において、Ｔ細胞に対して、本発明の一実施例に従って、トール様受容体アゴニスト（Ｐａｍ３）処理後、分化誘導されたプラズマサイトイド樹状細胞（ＴＬＲｓ−ｐＤＣ）又は一般的なプラズマサイトイド樹状細胞（ｐＤＣ）を処理した後、制御性Ｔ細胞への増殖有無をフローサイトメトリーＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａｘ−２０を通じて確認した結果を示す図である。
【図９（ｂ）】実施例７において、Ｔ細胞に対して、本発明の一実施例に従って、トール様受容体アゴニスト（Ｐａｍ３）処理後、分化誘導されたプラズマサイトイド樹状細胞（ＴＬＲｓ−ｐＤＣ）又は一般的なプラズマサイトイド樹状細胞（ｐＤＣ）を処理した後、制御性Ｔ細胞の増殖率を測定した結果をグラフで示す図である。
【図１０】実施例８において、野生型樹状細胞（ＷＴ）及びＴＬＲ２ノックアウトマウスから分離した樹状細胞（ＴＬＲ２−／−）のＲｖ１４１１ｃタンパク質との結合程度を示す図である。
【図１１】実施例９において、本発明の一実施例に従って、トール様受容体アゴニスト（Ｒｖ１４１１ｃタンパク質（０．１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ）処理後、分化誘導されたプラズマサイトイド樹状細胞（Ｒｖ１４１１ｃ（０．１μｇ／ｍｌ）ｐＤＣ、Ｒｖ１４１１ｃ（０．５μｇ／ｍｌ）ｐＤＣ）と、一般的なプラズマサイトイド樹状細胞（ｐＤＣ）とにおいて、サイトカイン（ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１０）の発現様相を比較した結果をグラフで示す図である。
【図１２】実施例１０において、本発明の一実施例に従って、トール様受容体アゴニスト（Ｒｖ１４１１ｃタンパク質）処理後、分化誘導されたプラズマサイトイド樹状細胞（Ｒｖ１４１１ｃ−ｐＤＣ）と、一般的なプラズマサイトイド樹状細胞（ｐＤＣ）とにおいて、ＭＨＣ  ｃｏｍｐｌｅｘ分子、ＣＤ８０、ＣＤ８６、及び免疫寛容性誘導分子（ＩＤＯ、ＣＣＲ９及びＰＤ−Ｌ１）の発現様相を比較した結果をグラフで示す図である。
【図１３】実施例１１において、Ｔ細胞と本発明の一実施例に従って、トール様受容体アゴニスト（Ｒｖ１４１１ｃタンパク質）処理後、分化誘導されたプラズマサイトイド樹状細胞（Ｒｖ１４１１ｃ−ｐＤＣ）又は一般的なプラズマサイトイド樹状細胞（ｐＤＣ）を混合培養した後、Ｔ細胞の増殖程度を比較した結果をグラフで示す図である。
【図１４】実施例１１において、Ｔ細胞と、本発明の一実施例に従って、トール様受容体アゴニスト（Ｒｖ１４１１ｃタンパク質）処理後、分化誘導されたプラズマサイトイド樹状細胞（Ｒｖ１４１１ｃ−ｐＤＣ）又は一般的なプラズマサイトイド樹状細胞（ｐＤＣ）を混合培養した後、ＩＦＮ−ｇａｍｍａの分泌様相を確認した結果をグラフで示す図である。
【図１５（ａ）】実施例１２において、Ｔ細胞に対して、本発明の一実施例に従って、トール様受容体アゴニスト（Ｒｖ１４１１ｃタンパク質）処理後、分化誘導されたプラズマサイトイド樹状細胞（Ｒｖ１４１１ｃ−ｐＤＣ）又は一般的なプラズマサイトイド樹状細胞（ｐＤＣ）を処理した後、制御性Ｔ細胞への増殖有無をフローサイトメトリーＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａｘ−２０を通して確認した結果を示す図である。
【図１５（ｂ）】実施例１２において、Ｔ細胞に対して、本発明の一実施例に従って、トール様受容体アゴニスト（Ｒｖ１４１１ｃタンパク質）処理後、分化誘導されたプラズマサイトイド樹状細胞（ＲＶｃ１４１１ｃ−ｐＤＣ）又は一般的なプラズマサイトイド樹状細胞（ｐＤＣ）を処理した後、制御性Ｔ細胞への増殖率を測定した結果をグラフで示す図である。
【図１６】実施例１３において、本発明の一実施例に従って、トール様受容体アゴニスト（Ｒｖ１４１１ｃタンパク質）処理後、誘導されたプラズマサイトイド樹状細胞（Ｒｖ１４１１ｃ−ｐＤＣ）によって分化されたＴ細胞を、ＣＤ４＋、ＣＤ２５−エフェクターＴ細胞と一緒に培養した後、ＣＤ２５−エフェクターＴ細胞対プライミングされたＴ細胞の割合に対し、Ｔ細胞の増殖能の変化を測定した結果をグラフで示す図である。
【図１７】実施例１４において、本発明の一実施例に従って、トール様受容体アゴニスト（ＲＹｖ１４１１ｃタンパク質及びＰａｍ３）処理後、誘導されたプラズマサイトイド樹状細胞（ＴＬＲａｇｏｎｉｓｔ）と、未処理後に誘導されたプラズマサイトイド樹状細胞（Ｎｏｎ）との数を比較した結果をグラフで示す図である。
【図１８】実施例１５において、コラーゲン誘導関節炎動物モデルを作製するための実験設計図を示した図である 。
【図１９】実施例１５において、コラーゲン誘導関節炎動物モデルマウスに、本発明の一実施例に従ってトール様受容体アゴニスト（Ｒｖ１４１１ｃタンパク質）処理後、分化誘導されたプラズマサイトイド樹状細胞（ＴＬＲｓ−ｔｏｌｐＤＣ）と、陰性対照群としてリン酸化緩衝水溶液（ＰＢＳ）、陽性対照群として、一般的なプラズマサイトイド樹状細胞（ｐＤＣ）とメトトレキサート（ＭＴＸ）を処理した後、関節炎スコアを評価した結果をグラフで示した図である 。
【図２０】実施例１５において、コラーゲン誘導関節炎動物モデルマウスに、本発明の一実施例に従ってトール様受容体アゴニスト（Ｒｖ１４１１ｃタンパク質）処理後、分化誘導されたプラズマサイトイド樹状細胞（ＴＬＲｓ−ｔｏｌｐＤＣ）と陰性対照群としてリン酸化緩衝水溶液（ＰＢＳ）、陽性対照群として、一般的なプラズマサイトイド樹状細胞（ｐＤＣ）とメトトレキサート（ＭＴＸ）を処理した後、関節炎の誘発率を測定した結果をグラフで示した 図である。
【図２１】実施例１６において、コラーゲン誘導関節炎動物モデルマウスに、本発明の一実施例に従って、トール様アゴニスト（Ｒｖ１４１１ｃタンパク質）処理後、分化誘導されたプラズマサイトイド樹状細胞（ＴＬＲｓ−ｐＤＣ）と陰性対照群としてリン酸化緩衝水溶液（ＰＢＳ）、陽性対照群としてメトトレキサート（ＭＴＸ）を処理した後、前記マウスの足の組織をＨ＆Ｅで染色した写真を示す図である。
【図２２】実施例１６において、コラーゲン誘導関節炎動物モデルマウスに、本発明の一実施例に従って、トール様受容体アゴニスト（Ｒｖ１４１１ｃタンパク質）処理後、分化誘導されたプラズマサイトイド樹状細胞（ＴＬＲｓ−ｐＤＣ）と陰性対照群としてリン酸化緩衝水溶液（ＰＢＳ）、陽性対照群としてメトトレキサート（ＭＴＸ）を処理した後、関節症の組織学的スコアを評価した結果をグラフで示した図である。
【図２３】実施例１７において、コラーゲン誘導関節炎動物モデルマウスに、本発明の一実施例に従って、トール様アゴニスト（Ｒｖ１４１１ｃタンパク質）処理後、分化誘導されたプラズマサイトイド樹状細胞（ＴＬＲｓ−ｐＤＣ）と陰性対照群としてリン酸化緩衝水溶液（ＰＢＳ）、陽性対照群としてメトトレキサート（ＭＴＸ）を処理した後、炎症性サイトカインである腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）およびインターロイキン−１７（ＩＬ−１７）の血中濃度を測定した結果を示した図である。
【図２４】実施例１８において、コラーゲン誘導関節炎動物モデルマウスに、本発明の一実施例に従って、トール様受容体アゴニスト（Ｒｖ１４１１ｃタンパク質）処理後、分化誘導されたプラズマサイトイド樹状細胞（ＴＬＲｓ−ｐＤＣ）と陰性対照群としてリン酸化緩衝水溶液（ＰＢＳ）、陽性対照群としてメトトレキサート（ＭＴＸ）を処理した後、様々な炎症誘発因子の発現レベルを測定した結果を示した図である。  ただし、図１乃至図２４において、＊は、Ｐ＜０．０５、＊＊は、Ｐ＜０．０１、＊＊＊は、Ｐ＜０．００５を意味する。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、下記の免疫寛容性プラズマサイトイド樹状細胞を製造する段階を含む、自己免疫疾患の予防または治療用薬学的組成物の製造方法に関する。
【００２５】
本発明において、前記免疫寛容性プラズマサイトイド樹状細胞を製造する段階は、未成熟樹状細胞にトール様受容体アゴニストを処理して行うことができる。
【００２６】
本明細書において、用語、「樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ、ＤＣ）」は、抗原を細胞内に吸収してＭＨＣ（ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ）クラスＩ複合体又はＭＨＣクラスII複合体と一緒に、様々な抗原サンプルをＴ細胞に提示する専門抗原提示細胞（ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ）を意味する。さらに、樹状細胞は、免疫原性（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ）及び免疫寛容性（ｔｏｌｅｒｏｇｅｎｉｃ）抗原提示細胞の両方を含み、成熟度に応じて、未成熟樹状細胞（ｉｍｍａｔｕｒｅ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ；「ｉｍＤＣ」）、準成熟樹状細胞（ｓｅｍｉｍａｔｕｒｅ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ；「ｍＤＣ」）及び成熟樹状細胞（ｍａｔｕｒｅｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ；「ｍＤＣ」）に分類することができる。
【００２７】
本明細書において、用語、「未成熟樹状細胞」は、樹状細胞の初期の成熟段階に発見されるものであって、単球細胞の表面表現型であるＣＤ１４が発現されず、さらに、共同刺激分子ＣＤ４０、ＣＤ５４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、及びＣＤ２７４のいずれかが成熟樹状細胞に比べて低い水準で発現される。
【００２８】
本明細書において、用語、「準成熟樹状細胞」は、未成熟樹状細胞の特性の一部を喪失し、成熟樹状細胞の表現型の一部の特性を有する樹状細胞であって、部分的に又は不完全に成熟した形態及び表現型の特性を示す樹状細胞を意味する。
【００２９】
本明細書において、用語、「成熟樹状細胞」は、未成熟樹状細胞が成熟化して形成された細胞を意味する。成熟樹状細胞は、ＤＣ−ＬＡＭＰだけでなく、ＭＨＣクラスII、ＣＤ４０、ＣＤ５４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、及びＣＤ２７４の発現が高く、抗炎症性サイトカイン（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ）を放出し、混合リンパ球反応（ｍｉｘｅｄ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）において、原始同種異系Ｔ細胞（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ）及び同種同系Ｔ細胞（ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ）の増殖の増加及び／又は樹状細胞サイトカインの増加した産生を発生させる能力を有することを特徴とする。成熟樹状細胞は、典型的にＣＣＲ７及びＣＸＣＲ４を高い水準で発現する。
【００３０】
ただし、本発明において、前記トール様受容体アゴニストが処理される樹状細胞は、分化されていない未成熟樹状細胞であることが好ましい。ここで、前記未成熟樹状細胞は、原始的な樹状細胞（ｎａｉｖｅ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ）を含むことができ、哺乳類の骨髄等から分離及び獲得されたものであってもよい。
【００３１】
また、本発明において、前記のように未成熟樹状細胞にトール様受容体アゴニストを処理して分化誘導された免疫寛容性樹状細胞は、免疫寛容性プラズマサイトイド樹状細胞（ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ、ｐＤＣ）であってもよい。
【００３２】
本明細書において、用語、「プラズマサイトイド樹状細胞（ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ）」とは、樹状細胞の一部類（ｓｕｂｓｅｔ）であって、１９５８年Ｄｒ．  ＬｅｎｎｅｒｔとＤｒ．  Ｒｅｍｍｅｌｅによってヒトのリンパ節から形質細胞（ｐｌａｓｍａ  ｃｅｌｌ）の形態を組織学的に発見したことによって初めて知られたが、Ｂ細胞の特異的マーカー（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）を発現しないという事実が知らると、一度はプラズマサイトイドＴ細胞（Ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ）と命名されたが、Ｔ細胞の共通マーカーであるＣＤ３を発現せず、かつ骨髄系抗原（ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｉｎｅａｇｅ  ａｎｔｉｇｅｎ）とＭＨＣクラスｃｌａｓｓIIを発現するという事実が知られると、プラズマサイトイド単球（ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ  ｍｏｎｏｃｙｔｅ）と命名された。その後、樹状細胞の固有の性質である同種異系混合リンパ球反応（ａｌｌｅｒｏｇｅｎｉｃ  ｍｉｘｅｄ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＭＬＲ）を誘導できる能力が確認されたことにより、改めてプラズマサイトイド樹状細胞と命名され、簡略に「ｐＤＣ」と表記することもある。
【００３３】
本明細書において、用語、「免疫寛容性」とは、特定の抗原に対して免疫反応が現れない状態のみならず、免疫反応を抑制する状態を意味する。従って、本発明において、前記の「免疫寛容性プラズマサイトイド樹状細胞」は、ＩＬ−１０などのような抗炎症性サイトカインの分泌を促し、ＩＬ−１２ｐ７０及びＴＮＦ−αなどの炎症性サイトカインの分泌は抑制し、最近、免疫寛容誘導分子として知られているインドールアミン−２，３ジオキシゲナーゼ（ｉｎｄｏｌｅａｍｉｎｅ−２，３  ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ、ＩＤＯ）の分子及び免疫寛容誘導細胞の表面分子であるＣＣＲ９が高い水準で発現され、制御性Ｔ細胞（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ）分化を誘導し、エフェクターＴ細胞（ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ）の活性を抑制することができる。
【００３４】
本発明では、前記未成熟樹状細胞の分化の開始以前又は分化中に前記トール様受容体アゴニストを処理することにより、免疫寛容性プラズマサイトイド樹状細胞を安定的に、そして大量に製造することができる。ここで、前記「分化開始以前」とは、未成熟樹状細胞に分化誘導用因子を処理する以前の時点を含むことができる。また、前記「分化中」とは、前記未成熟樹状細胞に分化誘導用因子を処理する時点から前記分化誘導用因子によって分化が完了される以前までの時点を意味する。好ましくは、分化誘導用因子を処理する時点から前記処理後、７日以内の時期を含むことができるが、これに制限されるものではない。
【００３５】
本発明において、前記トール様受容体アゴニストは、前記したように、未成熟樹状細胞の分化の開始以前又は分化中のみに処理されれば、具体的な時点を特に制限しない。ただし、本発明において、前記トール様受容体アゴニストを、未成熟樹状細胞の分化中に処理する場合には、分化開始時点から７日（１６８時間）、５日（１２０時間）又は３日（７２時間）以内に処理することができるが、これに制限されるものではない。また、本発明において、前記トール様受容体アゴニストを、未成熟樹状細胞の分化開始以前に処理する場合には、前記アゴニストを処理した時点から３６時間、好ましくは２４時間内に分化誘導用因子を用いて未成熟樹状細胞の分化を開始することができるが、これに制限されるものではない。
【００３６】
また、本発明においては、前記トール様受容体アゴニストを１回以上処理することができ、具体的な処理回数を特に制限しないが、前記トール様受容体アゴニストを、未成熟樹状細胞の分化中に処理する場合には、前記未成熟樹状細胞の分化開始時点から７日、５日又は３日以内に、前記トール様受容体アゴニストを少なくとも１回処理することができる。また、前記トール様受容体アゴニストを、未成熟樹状細胞の分化開始以前に処理する場合には、前記未成熟樹状細胞に対してトール様受容体アゴニストを少なくとも１回処理した後、ある処理時点から３６時間又は２４時間以内に前記未成熟樹状細胞の分化を開始し、その分化中に選択的に１回以上追加で処理することができる。
【００３７】
ここで、前記「分化開始」とは、未成熟樹状細胞の培養培地に分化誘導用因子を添加する、又は分化誘導用因子を含む培地に未成熟樹状細胞を接種して培養する工程を意味することができるが、分化誘導用因子を用いて未成熟樹状細胞の分化を誘導することができるものであれば、特に制限されない。
【００３８】
本明細書において、用語、「トール様受容体アゴニスト（ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｇｏｎｉｓｔ）」は、病原体（ｐａｔｈｏｇｅｎ）由来の保存された分子的物質であって、ＰＡＭＰｓ（Ｐａｔｈｏｇｅｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐａｔｔｅｒｎｓ）であってもよい。ここで、前記病原体としては、グラム−陽性菌、グラム−陰性菌、菌類又はウイルスであってもよい。また、前記トール様受容体アゴニストは、損傷したり、又は死んだ細胞から放出される内因性（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）分子であって、ＤＡＭＰｓ（Ｄａｍａｇｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐａｔｔｅｒｎｓ）であってもよい。ＤＡＭＰｓ又はＰＡＭＰｓは、ＴＬＲ信号を通じて免疫反応を開始し、信号を伝達するために、細胞の細胞質内でアダプター分子を集めるようになる。前記トール様受容体アゴニストは、フラグメント、変種、アナログ、ホモロジー（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）又はトール様受容体と結合し、ＮＦ−κＢの活動の活性化のような、ＴＬＲ−仲介による活性化を誘導するＰＡＭＰｓ又はＤＡＭＰｓの誘導体になることができる。前記トール様受容体アゴニストであるフラグメント、変種、アナログ、ホモロジー又は誘導体は、ＴＬＲ効能剤のアミノ酸の少なくとも３０〜９９％同一であり、トール様受容体−仲介による活性化を誘導するようになる。
【００３９】
本発明において、前記未成熟樹状細胞に処理されるトール様受容体アゴニストの種類は、特に制限されないが、ＰＡＭＰｓリガンドであることが好ましく、より好ましくは、ＭｙＤ８８（Ｍｙｅｌｏｉｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｇｅｎｅ  ８８）シグナルを経由することができるものが、未成熟樹状細胞から免疫寛容性プラズマサイトイド樹状細胞の分化を誘導することができる。
【００４０】
また、本発明において、前記トール様受容体アゴニストは、ＴＬＲ２アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ５アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、ＴＬＲ９アゴニスト、ＴＬＲ１１アゴニスト、ＴＬＲ１２アゴニスト及びＴＬＲ１３アゴニストからなる群から選択された１種以上を含むことができ、より具体的には、下記の表１に示すリガンドのうち、１種以上を含むことができるが、これに特に制限されるものではなく、樹状細胞のトール様受容体に結合することができるものであって、ＭｙＤ８８シグナルを経由することができるリガンドであれば、制限されることなく用いることができる。
【００４１】
また、本発明において、前記トール様受容体アゴニストとしてＴＬＲ２アゴニストを用いる場合、その補助受容体（ｃｏ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ）として作用するＴＬＲ１アゴニスト及びＴＬＲ６アゴニストのうち、１種以上を追加でさらに含むことができる。ここで、前記ＴＬＲ１アゴニスト及びＴＬＲ６アゴニストの具体的な例としては、下記の表１に示したリガンドであることができるが、前記ＴＬＲ２アゴニストの補助受容体として作用することができるリガンドであれば、特に制限されない。
【００４２】
【表１】
2020506186.tif 000003
2020506186.tif 000004
2020506186.tif 000005
2020506186.tif 000006
【００４３】
本発明において、前記トール様受容体アゴニストは、微生物、ウイルス、植物又は動物に由来するものである、又は合成されたものであることができ、根源が特に制限されない。
【００４４】
また、本発明において、前記未成熟樹状細胞の分化は、分化誘導用因子を用いて行われることができる。ここで、前記分化誘導用因子としては、ＦＭＳ−様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＭＳ−ｌｉｋｅ  ｔｙｒｏｓｉｎｅｋｉｎａｓｅ３、Ｆｌｔ３Ｌ）を用いることが好ましいが、前記未成熟樹状細胞を、プラズマサイトイド樹状細胞及び一般的な樹状細胞（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ  ｃｅｌｌｓ、ｃＤＣ）への分化を誘導することができるものであれば、特に制限されない。
【００４５】
また、本発明において、前記未成熟樹状細胞の分化は、分化誘導用因子を含む培地に、前記未成熟樹状細胞を培養したり、前記未成熟樹状細胞の培養培地に、前記分化誘導用因子を添加して行われることができる。
【００４６】
また、本発明において、選択的に、前記分化誘導用因子は、前記未成熟樹状細胞を分化する過程中に１回以上、追加で添加することができる。
【００４７】
本明細書において、用語、「ＦＭＳ−様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＭＳ−ｌｉｋｅ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ３、Ｆｌｔ３Ｌ）」は、造血前駆細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ）を活性化させ、サイトカイン及び成長因子としての機能を行う内因性低分子に該当する。
【００４８】
また、本発明において、前記未成熟樹状細胞の分化期間は、特に制限されず、用いられる培地の種類及び環境によって変わり得るが、例えば、５日〜１５日間行われることができ、好ましくは７日〜１０日間行われることができ、より好ましくは、８日〜９日間行われることができる。
【００４９】
本発明において、前記のようにトール様受容体アゴニストを処理して、未成熟樹状細胞から分化誘導された免疫寛容性プラズマサイトイド樹状細胞にトール様受容体アゴニストを追加で処理することにより、前記プラズマサイトイド樹状細胞の免疫寛容性を活性化させることができる。
【００５０】
本発明において、前記のように分化完了した免疫寛容性プラズマサイトイド樹状細胞を活性化させるに当たって、用いられるトール様受容体の種類は、特に制限されず、ＴＬＲ１アゴニスト、ＴＬＲ２アゴニスト、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ５アゴニスト、ＴＬＲ６アゴニスト，ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、ＴＬＲ９アゴニスト、ＴＬＲ１１アゴニスト、ＴＬＲ１２アゴニスト及びＴＬＲ１３アゴニストからなる群から選択された１種以上を含むことができるが、好ましくは、ＴＬＲ９アゴニストを用いることができる。
【００５１】
本発明においては、前記のような工程を通じて未成熟樹状細胞から免疫寛容性プラズマサイトイド樹状細胞への分化を効果的に誘導することができる。これにより、未成熟樹状細胞を用いて簡単かつ容易な工程を経て、大量の免疫寛容性プラズマサイトイド樹状細胞を安定的に供給することができる。
【００５２】
また、本発明にて前記のように得られた免疫寛容性プラズマサイトイド樹状 細胞は、炎症性サイトカインの発現は抑制し、抗炎症サイトカインの発現は促し、制御性Ｔ細胞（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ）への分化を誘導し、エフェクターＴ細胞（ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｔ  ｃｅｌｌ）の活性は、抑制し、免疫反応を効果的に抑制することにより、様々な自己免疫疾患を効果的に予防または治療することができ、同様の抗原による再発を抑制することができる。
【００５３】
本発明において、前記「自己免疫疾患」とは、個体自身の組織に対して引き起こり、指定された非−悪性疾患または障害である。すべての正常個体において最も重要な特性のうちの一つは、自己（ｓｅｌｆ）を構成している抗原物質については、害する反応はないのに対し、非自己（ｎｏｎ−ｓｅｌｆ）抗原については、これを認識して反応して除去することができる。自己抗原に対する生体の無反応を免疫学的無反応性（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ｕｎｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ）または寛容（ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）とする。しかし、自己寛容を誘導または維持するにおいて、異常が生じると自己抗原に対して免疫反応が起きるようになり、その結果、自己の組織を攻撃する現象が発生するが、前記過程によって発せられる疾患を自己免疫疾患という。前記自己免疫疾患は、自分の臓器組織またはその成分に対して抗体が産生される炎症性疾患であって、多数の組織や臓器に慢性的な全身炎症を引き起こす疾病を総称することができる。
【００５４】
具体的には、本発明において、前記自己免疫疾患は、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、敗血症性ショック、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、潰瘍性大腸炎、涙腺炎、アルツハイマー病、脳卒中、動脈硬化症、血管再狭窄、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、蕁麻疹、結膜炎、乾癬、全身性炎症反症候群、多発性筋炎、皮膚筋炎、結節性多発関節炎、混合結合組織症、シェグレン症候群、痛風、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、糖尿病性網膜症、多発性硬化症、クローン病、慢性甲状腺炎、セリアック病、重症筋無力症、 尋常性天疱瘡 、ウイルス疾患、細菌性疾患、放射線による障害、動脈硬化、血管腫、血管線維腫、灌流障害や心臓肥大症にからなる群から選択された１種以上であることができるが、これに限定されるものではない。
【００５５】
本発明では、「予防」は、本発明の組成物の投与により自己免疫疾患を抑制したり、進行を遅延させるすべての行為を意味する。
【００５６】
本発明において、「治療」および「改善」は、本発明の組成物の投与により自己免疫疾患の症状が好転または有益に変更されるすべての行為を意味する。
【００５７】
本発明において、前記薬学的組成物は、カプセル、錠剤、顆粒、注射剤、軟膏剤、粉末または飲料の形態であることを特徴とすることができ、前記薬学的組成物は、ヒトを対象とすることを特徴とすることができる。
【００５８】
本発明の薬学的組成物は、これらに限定されるものではないが、それぞれ通常の方法に従って散剤、顆粒剤、カプセル剤、錠剤、水性懸濁液などの経口型剤形、外用剤、坐剤、および滅菌注射溶液の形で剤形化して使用することができる。本発明の薬学的組成物は、薬剤的に許容可能な担体を含むことができる。薬学的に許容される担体は、経口投与時には結合剤、滑沢剤、崩解剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、色素、香料などを用いることができ、注射剤の場合には、緩衝剤、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張化剤、安定化剤などを混合して使用することができ、局所投与用の場合には、メカニズム、賦形剤、潤滑剤、保存剤などを使用することができる。本発明の薬学的組成物の剤形は、上述したような薬学的に許容される担体と混合して多様に製造することができる。例えば、経口投与の際には、錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル（ｅｌｉｘｉｒ）、サスペンション、シロップ、ウェーハなどの形態で製造することができ、注射剤の場合には、単位投薬アンプルまたは多数回投薬の形態で製造することができる。その他、溶液、懸濁液、錠剤、カプセル、徐放性製剤などに剤形することができる。
【００５９】
一方、製剤化に適した担体、賦形剤および希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール 、エリスリトール、マルチトール、でん粉、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウムまたは鉱物油などが用いられることができる。また、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤、防腐剤などをさらに含むことができる。
【００６０】
本発明に係る薬学的組成物の投与経路は、これらに限定されるものではないが、口腔、 静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、硬膜内、心臓内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸管、局所、舌下または直腸が含まれる。経口または非経口投与が好ましい。
【００６１】
本発明では、「非経口」は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、滑液 嚢内、胸骨内、硬膜内、病巣内および頭蓋内の注射または注入技術を含む。本発明の薬学的組成物は、また、直腸投与のための坐剤の形態で投与することができる。
【００６２】
本発明の薬学的組成物は、用いられた特定の化合物の活性、年齢、体重、一般的な健康、性別、食餌、投与時間、投与経路、排出率、薬物配合及び予防または治療する特定の疾患の重症を含むいくつかの要因によって多様な変化があり得、前記薬学的組成物の投与量は、患者の状態、体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路及び期間によって異なるが、当業者によって適宜選択されることができ、１日０．０００１〜５０ｍｇ／ｋｇまたは０．００１〜５０ｍｇ／ｋｇで投与することができる。投与は、一日に一回投与することもでき、数回に分けて投与することもできる。前記投与量は、どのような面であれ、本発明の範囲を限定するものではない。本発明に係る医薬組成物は、丸剤、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁剤で剤形することができる。
【００６３】
本発明の組成物は、単独で、あるいは従来の自己免疫疾患治療剤として、例えば、リウマチ性関節炎治療剤であるメトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ、ＭＴＸ）などと混合して使用することができ、あるいは手術、放射線治療、ホルモン治療、化学治療、および生物学的反応調整剤を用いる方法と併用して使用することができる。
【００６４】
また、本発明は、薬学的に有効な量の本発明に係る前記薬学的組成物を、自己免疫疾患に罹った個体に投与する段階を含む、自己免疫疾患の治療方法に関するものである。
【００６５】
また、本発明は、薬学的に有効な量の本発明に係る前記薬学的組成物を、自己免疫疾患に罹った個体に投与する段階を含む、自己免疫疾患の予防方法に関するものである。
【００６６】
本発明の治療方法または予防方法において投与される薬学的組成物は、前に記載したものと重複するので、明細書の記載が過度に複雑になることを避けるため、以下の記載を省略する。
【００６７】
本発明において、前記薬学的組成物の投与方法は、経口または非経口投与することができ、非経口投与時、腹腔内注射、直腸内注射、皮下注射、静脈注射、筋肉内注射、子宮内硬膜注射、脳血管内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）注射または胸部内注射によって投与することができる。また、前記組成物は、臨床投与時に経口投与が可能であり、一般的な医薬品製剤の形態で使用することができる。
【００６８】
本発明において、前記薬学的組成物の投与回数は、特に制限されるものではなく、１回以上、行うことができ、より詳細には、予防と治療の目的に応じて、１回以上、または症状があるときには反復して投与することができるが、好ましくは１回〜３回投与することができる。
【００６９】
この時、前記薬学的に有効な量とは、０．０００１〜５０ｍｇ／ｋｇ、または０．００１〜５０ｍｇ／ｋｇであり、これに制限されるものではない。前記投与量は、特定の患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与期間、投与方法、除去率、疾患の重症度などによって変化することができる。
【００７０】
本明細書において、用語、「投与」は、任意の適切な方法で、個体に所定の本発明の組成物を提供することを意味する。
【００７１】
本明細書において、用語、「個体」は、本発明の組成物を投与して自己免疫疾患が好転し得る疾患を持つヒト、猿、犬、ヤギ、ブタまたはネズミなどのすべての動物を意味する。
【００７２】
本明細書において、用語、「薬学的に有効な量」とは、医学的治療に適用可能な合理的な恩恵や危険比率であって、疾患を治療するのに十分な量を意味し、これは個体の疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物への敏感度、投与時間、投与経路、および排出比率、治療期間、同時に用いられる薬物を含む要素およびその他の医学分野でよく知られている要素に応じて決定することができる。
【００７３】
また、本発明は、前記の免疫寛容性プラズマサイトイド樹状細胞を製造する段階を含む、自己免疫疾患の予防または改善用化粧料組成物の製造方法に関する。
【００７４】
本発明において、未成熟樹状細胞にトール様受容体アゴニストを処理して、免疫寛容性プラズマサイトイド樹状細胞を誘導する方法に関する詳細な説明は、前記薬学的組成物に記載されたように重複するので、明細書の記載が過度に複雑になることを避けるため、以下の記載を省略する。
【００７５】
本発明において、化粧料組成物は、化粧水、栄養ローション、栄養エッセンス、マッサージクリーム、美容風呂水添加剤、ボディローション、ボディミルク、バスオイル、ベビーオイル、ベビーパウダー、シャワージェル、シャワークリーム、日焼け止めローション、日焼け止めクリーム、日焼けクリーム、スキンローション、スキンクリーム、紫外線防止用化粧品、クレンジングミルク、除毛剤｛化粧品｝、フェイス及びボディローション、フェイス及びボディクリーム、美白クリーム、ハンドローション、ヘアローション、化粧用クリーム、ジャスミン油、バス石鹸、水石鹸、美容石鹸、シャンプー、ハンド洗浄剤（ハンドクリーナー）、薬用石鹸｛非医療用｝、クリーム石鹸、フェイシャルウォッシュ 、全身洗浄剤、頭皮洗浄剤、ヘアリンス、化粧石鹸、歯のホワイトニング用ゲル、歯磨き粉などの形態で製造することができる。これのため、本発明の組成物は、化粧料組成物の製造に通常、用いられる溶媒や、適切な担体、賦形剤または希釈剤をさらに含むことができる。
【００７６】
本発明の化粧料組成物内にさらに追加できる溶媒の種類は、特に限定されないが、例えば、水、食塩水、ＤＭＳＯまたはこれらの組み合わせを使用することができ、担体、賦形剤または希釈剤としては、精製水、オイル、ワックス、脂肪酸、脂肪酸アルコール、脂肪酸エステル、界面活性剤、吸湿剤（ｈｕｍｅｃｔａｎｔ）、増粘剤、抗酸化剤、粘度安定化剤、キレート剤、緩衝剤、低級アルコールなどが含まれるが、これらに制限されるものではない。また、必要に応じて美白剤、保湿剤、ビタミン、紫外線防止剤、香水、染料、抗生剤、抗細菌剤、抗真菌剤を含むことができる。
【００７７】
前記オイルとしては、水素化植物性油、ヒマシ油、綿実油 、オリーブ油、ヤシ油、ホホバ油、アボカド油が用いられることができ、ワックスとしては、蜜蝋、鯨ろう、カルナバ、キャンデリラ、モンタン、セレシン、液体パラフィン、ラノリンが用いられることができる。
【００７８】
脂肪酸としては、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、オレイン酸が用いられることができ、脂肪酸アルコールとしては、セチルアルコール、オクチルドデカノール、オレイルアルコール、パンテノール、ラノリンアルコール、ステアリルアルコール、ヘキサデカノールが用いられることができ、脂肪酸エステルとしては、イソプロピルミリステート、イソプロピルパルミテート、ブチルステアレートが用いられることができる。界面活性剤としては、当業界に知られたカチオン界面活性剤、アニオン界面活性剤及び非イオン性界面活性剤が使用可能であり、なるべく天然物由来の界面活性剤が好ましい。
【００７９】
そのほかにも化粧品の分野で広く知られている吸湿剤、増粘剤、抗酸化剤などを含むことができ、これらの種類と量は、当業界に公知されたところによる。
【００８０】
また、本発明は、前記の免疫寛容性プラズマサイトイド樹状細胞を製造する段階を含む、自己免疫疾患の予防または改善用食品組成物の製造方法に関するものである。
【００８１】
本発明において、未成熟樹状細胞にトール様受容体アゴニストを処理し、免疫寛容性プラズマサイトイド樹状細胞を誘導する方法に関する詳しい説明は、前記薬学的組成物に記載されたところと重複するので、明細書の記載が過度に複雑になることを避けるために以下の記載を省略する。
【００８２】
本発明の食品組成物は、各種の食品類、例えば、飲料、ガム、お茶、ビタミン複合剤、粉末、顆粒、錠剤、カプセル、お菓子、餅、パンなどの形態で製造することができる。本発明の食品組成物は、毒性及び副作用がほとんどない植物抽出物から構成されたものであるため、予防目的で長期間服用時にも安心して使用することができる。
【００８３】
本発明の微細小胞体が食品組成物に含まれるとき、その量は全重量の０．１〜５０％の割合で添加することができる。
【００８４】
ここで、前記食品組成物が飲料の形態で製造される場合に、指示された比率で前記食品組成物を含有したこと以外に、特に制限点はなく、通常の飲料のように様々な香味剤または天然炭水化物などを追加の成分として含有することができる。すなわち、天然の炭水化物としてブドウ糖などの単糖類、果糖などの二糖類、ショ糖など、及び多糖類、デキストリン、シクロデキストリンなどのような通常の糖およびキシリトール、ソルビトール、エリスリトールなどの糖アルコールなどを含むことができる。前記香味剤としては、天然香味剤（タウマチン、ステビア抽出物（例えば、レバウジオシドＡ、グリシルリチンなど）および合成香味剤（サッカリン、アスパルテームなど）などを挙げることができる。
【００８５】
これ以外に、本発明の食品組成物は、多様な栄養剤、ビタミン、鉱物（電解質）、合成風味剤及び天然風味剤などの風味剤、着色剤、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調整剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に用いられる炭酸化剤などを含有することができる。
【００８６】
これらの成分は、独立して、または組み合わせて使用することができる。これらの添加剤の割合は、それほど重要ではないが、本発明の組成物１００重量部当たり０．１〜約５０重量部の範囲で選択されるのが一般的である。
【００８７】
［発明を実施するための形態］
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、一様に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨に基づいて、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないということは、当業界で通常の知識を有する者にとって自明であるといえる。
【実施例】
【００８８】
［実施例１］トール様受容体アゴニストのプラズマサイトイド樹状細胞への分化調節の効果
未成熟樹状細胞の分化中にトール様受容体アゴニストを処理した場合、免疫寛容性プラズマサイトイド樹状細胞への分化が誘導されるかを確認するために、図１に示す設計図に従って下記のように実験を行った。
【００８９】
具体的には、Ｃ５７ＢＬ／６マウススから骨髄採取用注射を用いて大腿部の骨髄を採取した。採取した骨髄をリン酸化緩衝水溶液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ）で洗浄した後、塩化アンモニウムを用いて赤血球を除去した。分離した細胞（３×１０６ｃｅｌｌ／ウェル）を６ウェルプレートに接種した後、１０％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ、子牛血清）、２ｍＭＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン、５０μＭマーカプトエタノール、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム及び２５０ｎｇ／ｍｌＦＬＴ３Ｌを含むＲＰＭＩ１６４０１ｍｌを添加して培養及び分化を開始した。分化開始後、３日目にＰａｍ３を１００〜５００ｎｇ／ｍｌの濃度で処理した。分化開始後、５日が経過したとき、前記のＲＰＭＩ１６４０１ｍｌをさらに補充してあげた後、８日まで培養した。培養後、得られた細胞を、プラズマサイトイド樹状細胞分離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）と自己細胞分類システム（Ｖａｒｉｏ  ＭＡＣＳ：Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）を用いて、プラズマサイトイド樹状細胞を、８５％以上の純度で分離した（図２）。前記トール様受容体アゴニスト処理がプラズマサイトイド樹状細胞の分化に影響を及ぼし得るため、プラズマサイトイド樹状細胞から特異的に誘導される表面発現分子を８日目に確認し、その結果を図３の（ａ）に示した。また、トール様受容体アゴニストを処理した場合（ＴＬＲｓ−ｐＤＣ）において、初期未成熟樹状細胞数対８日経過後に得られたプラズマサイトイド樹状細胞数の割合を測定し、その結果を図３の（ｂ）に示した。ただし、前記トール様受容体アゴニストの分化調節の効果を確認するために、トール様受容体アゴニストを処理していない場合を比較例（ｐＤＣ）に示した。
図２に示すように、トール様受容体アゴニストを処理しても、プラズマサイトイド樹状細胞に分化が誘導されたことを確認することができ、分化効率においても未処理の場合と相違が生じないことが確認できた。
【００９０】
［実施例２］分離されたプラズマサイトイド樹状細胞の刺激及びサイトカインの分泌様相の確認
前記実施例１にて分離されたプラズマサイトイド樹状細胞のサイトカイン分泌様相を確認するために、分離した細胞（５×１０５ｃｅｌｌ／ｍｌ）を４８ウェルプレートに接種した後、ＯＤＮ１８２６（１μｇ／ｍｌ）を処理し、刺激した。２４時間が経過した後、得られた上澄み液を分離し、酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ、Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）を通じてサイトカインの分泌様相を確認し、その結果を図４に示した。ただし、トール様受容体アゴニストの処理効果を確認するために、前記実施例１にて未成熟樹状細胞の分化中に、トール様受容体アゴニストを処理していない場合を比較例（ｐＤＣ）に示した。
【００９１】
図４に示すように、一般的にプラズマサイトイド樹状細胞（ｐＤＣ）からは、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ−α及びＩＦＮ−β）と代表的な炎症性サイトカインであるＴＮＦ−α及びＩＬ−１２ｐ７０が強力に誘導された。しかし、トール様受容体アゴニスト（０．５μｇ／ｍｌ）を処理して分化誘導されたプラズマサイトイド樹状細胞（ＴＬＲｓ−ｐＤＣ）の場合、ＯＤＮ１８２６で刺激すると、その発現水準が急激に減少することが確認できた。一方、免疫抑制性サイトカインであるＩＬ−１０の発現水準は、トール様受容体アゴニスト処理後に誘導されたプラズマサイトイド樹状細胞（ＴＬＲｓ−ｐＤＣ）から著しく増加したことが確認できた。
【００９２】
これにより、本発明によれば、未成熟樹状細胞にトール様受容体アゴニストを処理して分化誘導されたプラズマサイトイド樹状細胞は、一般的なプラズマサイトイド樹状細胞とは異なり、免疫寛容性を有することが分かった。
【００９３】
［実施例３］様々なトール様受容体アゴニストの処理によるプラズマサイトイド樹状細胞におけるＩＬ−１０の分泌様相の確認
様々なトール様受容体アゴニストの免疫寛容性誘導の効果を確認するために、前記実施例１と同様の方法で、プラズマサイトイド樹状細胞の分化を誘導するが、トール様受容体アゴニストとしては、下記の表２に示したリガンドを用いた。８日培養した後、プラズマサイトイド樹状細胞分離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）と自己細胞分類システム（Ｖａｒｉｏ  ＭＡＣＳ：Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）を用いて、プラズマサイトイド樹状細胞を、８５％以上の純度で分離した。分離された細胞（５×１０５ｃｅｌｌ／ｍｌ）を４８ウェルプレートに接種し、ＯＤＮ１８２６（１μｇ／ｍｌ）を処理した後、２４時間培養した。以後、上澄み液だけを分離して、免疫抑制性サイトカインＩＬ−１０の分泌様相を酵素免疫定量法で確認し、その結果を図５に示した。ただし、トール様受容体アゴニストの処理効果を確認するために、未成熟樹状細胞の分化中にトール様受容体アゴニストを処理していない場合を比較例（ｎｏｎ）に示した。
【００９４】
【表２】
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【００９５】
図５に示すように、様々なトール様受容体アゴニストのうち、ＭＹＤ８８シグナルを経由するＴＬＲ２アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト及びＴＬＲ８アゴニストで処理し、分化誘導されたプラズマサイトイド樹状細胞のみがＯＤＮ１８２６で刺激すると、ＩＬ−１０の発現水準が有意に増加したことが確認できた。
【００９６】
これにより、未成熟樹状細胞の分化中に、ＭＹＤ８８シグナルを経由するトール様受容体アゴニストを処理する場合、免疫寛容性プラズマサイトイド樹状細胞が誘導されることが分かった。
【００９７】
［実施例４］トール様受容体アゴニストの処理時点によるプラズマサイトイド樹状細胞におけるサイトカインの分泌様相の確認
トール様受容体アゴニストの処理時点による免疫寛容性誘導の効果を確認するために、前記実施例１と同様の方法で、プラズマサイトイド樹状細胞の分化を誘導するが、トール様受容体アゴニストを分化開始時点（０  ｄａｙ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）、分化開始日から３日が経過したとき（３  ｄａｙ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）、処理した。全８日間の培養後、プラズマサイトイド樹状細胞分離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）と自己細胞分類システム（Ｖａｒｉｏ  ＭＡＣＳ：Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）を用いて、プラズマサイトイド樹状細胞を、８５％以上の純度で分離した。分離された細胞（５×１０５ｃｅｌｌ／ｍｌ）を４８ウェルプレートに接種し、ＯＤＮ１８２６（１μｇ／ｍｌ）を処理した後、２４時間培養した。以後、上澄み液のみを分離した後、サイトカインの分泌様相を酵素免疫定量法で確認して、その結果を、図６に示した。ただし、トール様受容体アゴニストの処理効果を確認するために、未成熟樹状細胞の分化中にトール様受容体アゴニストを処理していない場合を比較例（ｎｏ−ｔｒｅａｔｍｅｎｔ、ｎｏｎ）として示した。
【００９８】
図６に示すように、トール様受容体アゴニストを分化開始時点（０  ｄａｙｔｒｅａｔｍｅｎｔ）又は分化開始日から３日目（３  ｄａｙ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）に処理した場合のいずれも未処理した場合（ｎｏ−ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）に比べてＩ型インターフェロン（ＩＦＮ−α及びＩＦＮ−β）と代表的な炎症性サイトカインであるＴＮＦ−α及びＩＬ−１２ｐ７０の発現は抑制され、抗炎症性サイトカインであるＩＬ−１０の発現水準は、著しく増加したことが見られた。
【００９９】
これにより、トール様受容体アゴニストを、未成熟樹状細胞の分化開始時点、すなわち、分化誘導用因子であるＦＬＴ３Ｌと同時に処理しても、分化中に処理した場合と同様に、免疫寛容性プラズマサイトイド樹状細胞の分化が誘導されることが分かった。
【０１００】
［実施例５］トール様受容体アゴニストが処理されたプラズマサイトイド樹状細胞の共同刺激因子及びＭＨＣ分子発現の確認
プラズマサイトイド樹状細胞を含む樹状細胞は、外部抗原認知時、Ｔ細胞を活性化させるために、ＭＨＣ分子を通じて抗原を提示し、ＣＤ８０及びＣＤ８６のような共同刺激因子を発現して相互作用を促進させる。
【０１０１】
これにより、前記実施例１にて分離したプラズマサイトイド樹状細胞を、ＯＤＮ１８２６で刺激した後、２４時間の間培養した後、前記細胞表面分子の発現水準を確認した。まず、プラズマサイトイド樹状細胞の表面因子発現に及ぼす影響を分析するため、プラズマサイトイド樹状細胞の特異的なマーカーである抗−ＣＤ１１ｃ（ＰＥ−Ｃｙ７、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗−ＰＤＣＡ−１（ＰｅｒＣＰ−ｅＦｌｕｏｒ  ７１０、ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と細胞表面分子に特異的な抗−ＣＤ８０（ｖ４５０、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗−ＣＤ８６（ＡＰＣ、ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗−ＭＨＣ−Ｉ（ＰＥ、ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及び抗−ＭＨＣ−ＩＩ（ＡＰＣ−ｅＦｌｕｏｒ  ７８０、ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）抗体を４℃で３０分間処理した後、フローサイトメトリーＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａｘ−２０（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を通じて分析した。その結果は、図７に示した。ただし、トール様受容体アゴニストの処理効果を確認するために、未成熟樹状細胞の分化中にトール様受容体アゴニストを処理していない場合を比較例（ｐＤＣ）に示した。
【０１０２】
図７に示すように、一般的なプラズマサイトイド樹状細胞（ｐＤＣ）では、共同刺激因子であるＣＤ８６と外因性抗原を提示するＭＨＣクラスII分子が高い水準で発現されたが、トール様受容体アゴニストを処理して分化誘導されたプラズマサイトイド樹状細胞（ＴＬＲｓ−ｐＤＣ）の場合、反応がみられなかったり、減少する特徴が見られた。一方、もう一つの共同刺激因子の一つであるＣＤ８０と内因性抗原や交差抗原を提示をするＭＨＣクラスＩ分子は、トール様受容体アゴニストで処理され、分化誘導されたプラズマサイトイド樹状細胞（ＴＬＲｓ−ｐＤＣ）が処理されていない細胞（ｐＤＣ）より、より高い水準で発現されることが確認できた。
【０１０３】
［実施例６］トール様受容体アゴニストが処理されたプラズマサイトイド樹状細胞の免疫寛容性誘導分子の発現の確認
一般的な樹状細胞は、抗原提示により、Ｔ細胞反応を起こし、天性免疫反応を活性化させるが、一部の免疫寛容性樹状細胞の場合、Ｔ細胞の反応を抑制すると報告されている。このような免疫反応の抑制は、近来、様々な免疫寛容性誘導分子により、例えば、ＰＤ−Ｌ１及びＩＤＯの誘導によりなされると報告されている。また、ＣＣＲ９＋ｐＤＣｓは、制御性Ｔ細胞の強力な誘導により様々な免疫寛容現象を誘導することができると報告されている。
【０１０４】
したがって、以下では、前記の実施例１にて、分離されたプラズマサイトイド樹状細胞から免疫寛容誘導分子の発現を確認するために、プラズマサイトイド樹状細胞に特異的なマーカーである抗−ＣＤ１１ｃ（ＰＥ−Ｃｙ７、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及び抗−ＰＤＣＡ−１（ＰｅｒＣＰ−ｅＦｌｕｏｒ  ７１０、ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と免疫寛容誘導細胞表面分子である抗−ＰＤ−Ｌ１（ＰＥ、ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及び抗−ＣＣＲ９（ＦＩＴＣ、ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）のような細胞表面因子抗体を４℃で３０分間処理した。また、細胞内で誘導されるＩＤＯの発現を測定するために、固定（ｆｉｘａｔｉｏｎ）／浸透（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を４℃で３０分間処理した後、抗−ＩＤＯ（ｅＦｌｕｏｒ  ６６０、ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を染色し、フローサイトメトリーＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａｘ−２０を利用して、発現水準を分析した後、その結果は、図８に示した。ただし、トール様受容体アゴニストの処理効果を確認するために、前記実施例１にて、未成熟樹状細胞の分化中にトール様受容体アゴニストを処理していない場合を比較例（ｐＤＣ）に示した。
【０１０５】
図８に示すように、トール様受容体にアゴニストで処理されたプラズマサイトイド樹状細胞の場合、ＯＤＮ１８２６で刺激すると、ＣＣＲ９及びＩＤＯ分子、いずれも未処理のプラズマサイトイド樹状細胞に比べて発現量が著しく増加したことを確認することができ、ＣＣＲ９の場合は、非刺激時にも未処理のプラズマサイトイド樹状細胞に比べて高い発現様相が見られた。
【０１０６】
これにより、未成熟樹状細胞の分化時、トール様受容体アゴニストを処理した場合、免疫寛容性を有するプラズマサイトイド樹状細胞が分化誘導されたことが分かった。
【０１０７】
［実施例７］トール様受容体アゴニストが処理されたプラズマサイトイド樹状細胞の制御性Ｔ細胞の誘導能力を確認
免疫寛容性プラズマサイトイド樹状細胞（Ｔｏｌｅｒｏｇｅｎｉｃ  ｐＤＣ）は、制御性Ｔ細胞（Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔｃｅｌｌ、Ｔｒｅｇ）への分化を誘導し、エフェクターＴ細胞（ｅｆｆｅｃｔｏｒＴ細胞）の活性や増殖を抑制すると報告されている。
【０１０８】
したがって、以下では、トール様受容体アゴニストを処理して分化誘導されたプラズマサイトイド樹状細胞（ＴＬＲｓ−ｐＤＣ）による制御性Ｔ細胞（Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ４＋Ｔｃｅｌｌｓ）の増殖有無を確認した。具体的には、同種異型マウスから分離した後、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色したＴ細胞を、前記実施例１にて分離されたプラズマサイトイド樹状細胞（ＴＬＲｓ−ｐＤＣ）と５：１の比率で５日間混合培養した。ただし、前記プラズマサイトイド樹状細胞として、ＯＤＮ１８２６で刺激（ＯＤＮ＋）されたプラズマサイトイド樹状細胞と未刺激（ＯＤＮ−）されたプラズマサイトイド樹状細胞を使用した。５日間培養した後、抗−ＣＤ４（Ｐｅｒｃｐ−ｃｙ５．５、ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を４℃で３０分間処理し、Ｆｏｘｐ３／転写因子染色バッファー（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ）（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を３７℃で３０分間処理した。その後、抗−Ｆｏｘｐ３（ＰＥ、ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で処理した後、制御性Ｔ細胞への増殖有無をフローサイトメトリーＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａｘ−２０を通じて確認した結果を図９の（ａ）に示し、制御性Ｔ細胞の増殖率を計算して、その結果は、図９の（ｂ）に示した。ただし、トール様受容体アゴニストの処理効果を確認するために、ＯＤＮ１８２６で刺激（ＯＤＮ＋）又は未刺激された一般的なプラズマサイトイド樹状細胞を比較例（ｐＤＣ）で示した。
【０１０９】
図９に示すように、一般的なプラズマサイトイド樹状細胞（ｐＤＣ）の場合、制御Ｔ細胞の増殖を誘導することができず、ＯＤＮ１８２６で刺激（ＯＤＮ＋）すると、却って制御性Ｔ細胞の増殖が抑制されることが確認できた。一方、トール様受容体アゴニストで処理して分化誘導されたプラズマサイトイド樹状細胞（ＴＬＲｓ−ｐＤＣ）の場合、ＯＤＮ１８２６で刺激した場合（ＯＤＮ＋）が、未刺激した場合（ＯＤＮ−）より制御性Ｔ細胞の増殖が著しく誘導されたことが確認できた。
【０１１０】
これにより、本発明に基づいて分化誘導された免疫寛容性プラズマサイトイド細胞にトール様受容体アゴニストを追加で処理した場合、免疫寛容性が活性化して制御性Ｔ細胞への分化もまた効果的に誘導することが分かった。
【０１１１】
［実施例８］Ｒｖ１４１１ｃタンパク質のトール様受容体としての活性の確認
従前の報告によれば、結核菌由来のタンパク質は、様々なトール様受容体に結合することができるという報告がある。したがって、以下では、ＴＬＲ２ノックアウトマウスと野生型マウスの骨髄から分化させた樹状細胞と、Ｒｖ１４１１ｃタンパク質との結合を確認し、Ｒｖ１４１１ｃタンパク質のトール様受容体アゴニストとしての活性を確認した。
【０１１２】
具体的には、マウス骨髄を分離して、赤血球を除去した後、樹状細胞を分化するために、１０％ＦＢＳ、１％抗生剤及び１００ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｃｏｌｏｎｙｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）が含有されたＲＰＭＩ１６４０培養液を使用して８日間培養した。８日間培養した後、野生型樹状細胞（ＷＴ）と、ＴＬＲ２ノックアウトマウス（ＴＬＲ２−／−）から分離した樹状細胞のそれぞれに５μｇ／ｍｌのＲｖ１４１１ｃタンパク質を処理した後、２時間の間、間欠的に混ぜてあげ、タンパク質の結合を容易にした。以後、Ｒｖ１４１１ｃタンパク質に標識されたＨｉｓ分子の抗原−抗体特異性を有する抗体で染色し、フローサイトメトリー分析を使用して結合の程度を測定し、その結果は、図１０に示した。
【０１１３】
図１０に示すように、野生型樹状細胞（ＷＴ）からは、ＴＬＲ２ノックアウト樹状細胞（ＴＬＲ２−／−）に比べＲｖ１４１１ｃタンパク質との結合が増加したことが確認されたが、ＴＬＲ２ノックアウト樹状細胞（ＴＬＲ２−／−）からは、Ｒｖ１４１１ｃタンパク質を処理したにもかかわらず、処理リしていない実験群と同様の結合程度を確認することができた。
【０１１４】
これにより、Ｒｖ１４１１ｃタンパク質は、ＴＬＲ２受容体に結合し、ＴＬＲ２アゴニストとして活性を有することが確認できた。
【０１１５】
［実施例９］Ｒｖ１４１１ｃタンパク質の免疫寛容性プラズマサイトイド樹状細胞の分化誘導能の確認
前記実施例１と同様の工程で免疫寛容性プラズマサイトイド樹状細胞の分化を誘導するが、トール様受容体アゴニストとしては、前記実施例８にてトール様受容体としての活性が確認されたＲｖ１４１１ｃタンパク質（Ｏ．１μｇ／ｍｌの、０．５μｇ／ｍｌ）を使用した。８日間培養した後、プラズマサイトイド樹状細胞分離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）と自己細胞分類システム（Ｖａｒｉｏ  ＭＡＣＳ：Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）を利用して、プラズマサイトイド樹状細胞を、８５％以上の純度で分離した。分離された細胞（５×１０５ｃｅｌｌ／ｍｌ）を４８ウェルプレートに接種し、ＯＤＮ１８２６（１μｇ／ｍｌ）で処理した後、２４時間培養した。培養後、得られた上澄み液を分離して酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ、ＥｎｚｙｍｅＬｉｎｋｅｄＩｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ）によりサイトカインの分泌様相を確認した結果、図１１にグラフで示した。ただし、Ｒｖ１４１１ｃタンパク質の処理効果を確認するために、Ｒｖ１４１１ｃタンパク質が未処理されたものであって、ＯＤＮ１８２６で刺激（ＯＤＮ＋）又は未刺激された（ＯＤＮ−）、一般的なプラズマサイトイド樹状細胞を比較例（ｐＤＣ）に示した。
【０１１６】
図１１に示すように、Ｒｖ１４１１ｃタンパク質で処理されたプラズマサイトイド樹状細胞（Ｒｖ１４１１ｃ（０．１μｇ／ｍｌ）−ｐＤＣ、Ｒｖ１４１１ｃ（０．５μｇ／ｍｌ）−ｐＤＣ）をＯＤＮ１８２６で刺激すると、一般的なプラズマサイトイド樹状細胞から強力に誘導されるＩ型インターフェロン（ＩＦＮ−α及びＩＦＮ−β）と代表的な炎症性サイトカインであるＴＮＦ−α及びＩＬ−１２ｐ７０の発現が、濃度依存的に急激に減少することを見ることができ、免疫抑制性サイトカインであるＩＬ−１０は、濃度依存的にその発現水準が著しく増加していることが見られた。
【０１１７】
これにより、Ｒｖ１４１１ｃタンパク質で処理されたプラズマサイトイド樹状細胞は、一般的なプラズマサイトイド樹状細胞とは異なり、免疫寛容性を有することが分かり、前記Ｒｖ１４１１ｃタンパク質の処理濃度に比例して、免疫寛容性の程度もまた増加することが分かった。
【０１１８】
［実施例１０］Ｒｖ１４１１ｃタンパク質を処理して分化誘導されたプラズマサイトイド樹状細胞の共同刺激因子、ＭＨＣ分子及び免疫寛容性誘導分子発現の確認
前記実施例９にてＲｖ１４１１ｃタンパク質において、分化誘導されたプラズマサイトイド樹状細胞から表面分子及び酵素の発現が確認された。
【０１１９】
まず、プラズマサイトイド樹状細胞の表面因子発現の影響を分析するために、プラズマサイトイド樹状細胞に特異的なマーカーである抗−ＣＤ１１ｃ（ＰＥ−Ｃｙ７、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及び抗−ＰＤＣＡ−１（ＰｅｒＣＰ−ｅＦｌｕｏｒ  ７１０、ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と、抗−ＣＤ８０（ｖ４５０、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗−ＣＤ８６（ＡＰＣ、ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗−ＭＨＣ−Ｉ（ＰＥ、ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及び抗−ＭＨＣ−ＩＩ（ＡＰＣ−ｅＦｌｕｏｒ  ７８０、ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗−ＰＤ−Ｌ１（ＰＥ、ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及び抗−ＣＣＲ９（ＦＩＴＣ、ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）のような細胞表面因子抗体を４℃で３０分間処理した。また、細胞内で誘導されるＩＤＯの発現を測定するために、固定（ｆｉｘａｔｉｏｎ）／浸透（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を４℃で３０分間処理した後、抗−ＩＤＯ（ｅＦｌｕｏｒ  ６６０、ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を処理した後、フローサイトメトリーＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａｘ−２０を通じて分析し、その結果を図１２に示した。ただし、Ｒｖ１４１１ｃタンパク質の処理効果を確認するために、Ｒｖ１４１１ｃタンパク質が未処理されたものであって、ＯＤＮ１８２６で刺激（ＯＤＮ＋）又は未刺激された（ＯＤＮ−）、一般的なプラズマサイトイド樹状細胞を比較例（ｐＤＣ）に示した。
【０１２０】
図１２に示すように、ＯＤＮ１８２６刺激時、Ｒｖ１４１１ｃタンパク質で未処理の一般的なプラズマサイトイド樹状細胞（ｐＤＣ）からは、共同刺激因子であるＣＤ８６と外因性抗原を提示するＭＨＣクラスII分子が高い水準で発現されるのに対し、Ｒｖ１４１１ｃタンパク質を処理して分化誘導されたプラズマサイトイド樹状細胞（Ｒｖ１４１１ｃ−ｐＤＣ）は、反応を見せなかったり、減少する特徴が見られた。
【０１２１】
一方、別の共同刺激因子のうちの一つであるＣＤ８０と内因性抗原や交差抗原提示をするＭＨＣクラスＩ分子の場合は、Ｒｖ１４１１ｃタンパク質を処理して分化誘導されたプラズマサイトイド樹状細胞（Ｒｖ１４１１ｃ−ｐＤＣ）が、一般的なプラズマサイトイド樹状細胞（ｐＤＣ）よりも高い水準で発現されることが確認できた。
【０１２２】
また、Ｒｖ１４１１ｃタンパク質を処理して分化誘導されたプラズマサイトイド樹状細胞（Ｒｖ１４１１ｃ−ｐＤＣ）の場合、ＯＤＮ１８２６で刺激（ＯＤＮ＋）した、ＰＤ−Ｌ１、ＣＣＲ９及びＩＤＯ分子、いずれも未刺激した場合（ＯＤＮ−）に比べて発現水準が増加することを確認することができた。また、ＣＣＲ９とＰＤ−Ｌ１の場合は、未刺激時（ＯＤＮ−）も、一般的なプラズマサイトイド樹状細胞（ｐＤＣ）に比べて高い発現様相を示すことが確認できた。
【０１２３】
［実施例１１］Ｒｖ１４１１ｃタンパク質を処理して分化誘導されたプラズマサイトイド樹状細胞のＴ細胞の活性抑制
免疫寛容性プラズマサイトイド樹状細胞の生体内での最も重要な特徴は、Ｔリンパ球の活性を抑制することである。これに、前記の実施例９にてＲｖ１４１１ｃタンパク質を処理して分化誘導されたプラズマサイトイド樹状細胞がＴ細胞の増殖と活性に及ぼす影響を確認するために下記の実験を行った。
【０１２４】
具体的には、同種異型マウスから分離してＣｅｌｌＴｒａｃｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色したＴ細胞（１．５×１０５ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）を１ＸのＰＭＡ／Ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を介して刺激を与えた。このようなＰＭＡ／Ｉｏｎｏｍｙｃｉｎの処理は、Ｔリンパ球の増殖速度を増加させ、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−ｇａｍｍａ）の分泌を促進させることになる。これらの反応がなされたとき、Ｔ細胞とＲｖ１４１１ｃタンパク質を処理して分化誘導されたプラズマサイトイド樹状細胞（Ｒｖ１４１１ｃ−ｐＤＣ）又は一般的なプラズマサイトイド樹状細胞（ｐＤＣ）の比率が１：５となるように混合して、３日間培養した。３日後、抗−ＣＤ４（Ｐｅｒｃｐ−ｃｙ５．５、ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗−ＣＤ８（Ｐｅｒｃｐ−ｃｙ５．５、ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を処理し、４℃で３０分間染色した。フローサイトメトリーＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａｘ−２０を通じてＴ細胞の増殖の程度を分析し、その結果を図１３に示した。また、前記３日間培養した後、得られた上澄み液を分離した後、酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ、ＥｎｚｙｍｅＬｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）を通じてＩＦＮ−ｇａｍｍａの分泌様相を確認し、その結果を図１４に示した。ただし、Ｒｖ１４１１ｃタンパク質の処理効果を確認するために、Ｒｖ１４１１ｃタンパク質が未処理されたものであって、ＯＤＮ１８２６で刺激（ＯＤＮ＋）又は未刺激された（ＯＤＮ−）一般的なプラズマサイトイド樹状細胞を比較例（ｐＤＣ）に示した。
【０１２５】
図１３に示すように、Ｒｖ１４１１ｃタンパク質を処理して分化誘導されたプラズマサイトイド樹状細胞（Ｒｖ１４１１ｃ−ｐＤＣ）と、一般的なプラズマサイトイド樹状細胞（ｐＤＣ）両方のＴ細胞の増殖を誘導したが、Ｒｖ１４１１ｃタンパク質を処理して分化誘導されたプラズマサイトイド樹状細胞（Ｒｖ１４１１ｃ−ｐＤＣ）が、一般的なプラズマサイトイド樹状細胞（ｐＤＣ）よりＣＤ４＋Ｔ細胞に対する増殖誘導能力がはるかに低く観察された。
【０１２６】
また、図１４に示すように、Ｒｖ１４１１ｃタンパク質を処理して分化誘導されたプラズマサイトイド樹状細胞（Ｒｖ１４１１ｃ−ｐＤＣ）が未処理された一般的なプラズマサイトイド樹状細胞（ｐＤＣ）に比べて低水準でＩＦＮ−ｇａｍｍａの分泌を誘導することが確認できた。
【０１２７】
［実施例１２］Ｒｖ１４１１ｃタンパク質を処理して分化誘導されたプラズマサイトイド樹状細胞の制御性Ｔ細胞の分化の調節
同種異型マウスから分離した後、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色したＴ細胞を、前記実施例９にてＲｖ１４１１ｃタンパク質を処理して分化誘導されたプラズマサイトイド樹状細胞（Ｒｖ１４１１ｃ−ｐＤＣ）又は一般的なプラズマサイトイド樹状細胞（ｐＤＣ）とその比率が１０：１、５：１又は１：１になるようにして、５日間培養した。ただし、前記プラズマサイトイド樹状細胞として、ＯＤＮ１８２６で刺激されたもの（ＯＤＮ＋）と未刺激されたもの（ＯＤＮ−）を使用した。培養後５日目に、細胞に抗−ＣＤ４（Ｐｅｒｃｐ−ｃｙ５．５、ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で４℃で３０分間処理し、Ｆｏｘｐ３／転写因子染色バッファー（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を３７℃で３０分間処理した。その後、抗−Ｆｏｘｐ３（ＰＥ、ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を染色してフローサイトメトリーＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａｘ−２０を通じて制御性Ｔ細胞への増殖有無を確認し、その結果は、図１５の（ａ）に示した。また、制御性Ｔ細胞の増殖率を計算し、その結果は、図１５の（ｂ）に示した。
【０１２８】
図１５に示すように、一般的なプラズマサイトイド樹状細胞（ｐＤＣ）の場合、制御性Ｔ細胞の増殖を誘導できず、ＯＤＮ１８２６で刺激した場合、むしろ制御性Ｔ細胞の増殖が抑制されることが確認できた。一方、Ｒｖ１４１１ｃタンパク質を処理して分化誘導されたプラズマサイトイド樹状細胞（Ｒｖ１４１１ｃ−ｐＤＣ）の場合、ＯＤＮ１８２６で刺激すると、（ＯＤＮ＋）未刺激の場合（ＯＤＮ−）より制御性Ｔ細胞の増殖を顕著に誘導することが確認でき、Ｔ細胞対プラズマサイトイド樹状細胞（Ｒｖ１４１１ｃ−ｐＤＣ）の比率が増加するほど制御性Ｔ細胞の増殖率もまた増加することが確認できた。
【０１２９】
これにより、本発明に基づいて分化誘導された免疫寛容性プラズマサイトイド細胞にトール様受容体アゴニストを追加で処理した場合、免疫寛容性を活性化させ制御性Ｔ細胞の増殖もまた効果的に誘導することが分かった。
【０１３０】
［実施例１３］Ｒｖ１４１１ｃタンパク質を処理して分化誘導されたプラズマサイトイド樹状細胞によるエフェクターＴ細胞の活性抑制
制御性Ｔ細胞は、免疫寛容樹状細胞を誘導し、他のＴ細胞の増殖を抑制すると報告されている。したがって、以下では、前記の実施例１２に基づいてＲｖ１４１１ｃタンパク質によって分化誘導されたＴ細胞の制御性Ｔ細胞としての活性を確認した。
【０１３１】
まず、マウスの脾臓を分離してから赤血球を除去した上、自己細胞分類システム（ＭＡＣＳ）を使って、ＣＤ４＋、ＣＤ２５−エフェクターＴ細胞を分離した後、増殖程度を調べるために紫の増殖染色剤（ｖｉｏｌｅｔ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｄｙｅ）で染色した。以後、分化されたＴ細胞をＣＤ４＋、ＣＤ２５−エフェクターＴ細胞と一緒に抗ＣＤ３ｅと抗ＣＤ２８抗体でコーティングされたウェルで２日間培養した。その結果、ＣＤ２５−エフェクターＴ細胞対プライミングされたＴ細胞の比率について、Ｔ細胞増殖能の変化を測定して図１６にグラフで示した。
【０１３２】
図１６に示すように、Ｒｖ１４１１ｃタンパク質を処理して分化誘導されたプラズマサイトイド樹状細胞のうち、ＯＤＮ１８２６で刺激された細胞（Ｒｖ１４１１ｃ−ｐＤＣ（ＯＤＮ））によって誘導されたＴ細胞のみがエフェクターＴ細胞の分化の程度を減少させることが確認できた。
【０１３３】
これにより、本発明に基づいて分化誘導された免疫寛容性プラズマサイトイド細胞にトール様受容体アゴニストを追加で処理した場合、免疫寛容性を活性化させ、エフェクターＴ細胞の活性を効果的に抑制することが確認できた。
【０１３４】
［実施例１４］トール様受容体アゴニストの処理後、分化誘導されたプラズマサイトイド樹状細胞の獲得収率
Ｃ５７ＢＬ／６マウスから骨髄採取用注射を用いて大腿部の骨髄を採取した。採取した骨髄をリン酸化緩衝水溶液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ）で洗浄した後、塩化アンモニウムを用いて赤血球を除去した。分離した細胞（５×１０５ｃｅｌｌ／ウェル）を６ウェルプレートに接種した後、１０％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ、子牛血清）、２ｍＭＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン、５０μＭメルカプトエタノール、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム及び２５０ｎｇ／ｍｌＦＬＴ３Ｌを含むＲＰＭＩ１６４０１ｍｌを添加し、培養及び分化を開始した。分化開始後３日目にトール様受容体アゴニストＲｖ１４１１ｃタンパク質とＰａｍ３を１００〜５００ｎｇ／ｍｌの濃度で処理した。分化開始後５日が経過したとき、前記のＲＰＭＩ１６４０１ｍｌをさらに補充した後、８日まで培養した。培養後、得られた細胞を、プラズマサイトイド樹状細胞分離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）と自己細胞分類システム（Ｖａｒｉｏ  ＭＡＣＳ：Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）を利用して、プラズマサイトイド樹状細胞を、８５％以上の純度で分離した。分離されたプラズマサイトイド樹状細胞の数（ＴＬＲ  ａｇｏｎｉｓｔ）を測定した結果を図１７にグラフで示した。ただし、トール様受容体アゴニストの処理効果を確認するために、未成熟樹状細胞の分化中にトール様受容体アゴニストを処理していない場合を比較例（ｎｏｎ）に示した。
【０１３５】
図１７に示すように、未成熟樹状細胞の分化中にトール様受容体アゴニストを処理した場合（ＴＬＲａｇｏｎｉｓｔ）、未処理した場合（Ｎｏｎ）と比較して分化誘導されたプラズマサイトイド樹状細胞の数が著しく増加することを確認した。
【０１３６】
これにより、未成熟樹状細胞の分化時、トール様受容体アゴニストを処理した場合、大量の免疫寛容性プラズマサイトイド樹状細胞を製造することができることを確認した。
【０１３７】
［実施例１５］トール様受容体アゴニストの処理後、分化誘導されたプラズマサイトイド樹状細胞の関節炎治療の効果
１．コラーゲン−誘導関節炎動物モデルの作製
コラーゲン−誘導動物モデルを作製するために、図１８に示す設計図に従って下記のように実験を行った。
【０１３８】
具体的には、一般的にコラーゲン誘導関節炎疾患の動物モデルとして知られた５週齢ＤＢＡ１／Ｊ雄マウスを購入し、ＳＰＦ条件下で１週間馴化させた後、６週齢時に実験を行った。１００μｇウシ由来型のコラーゲン（ｉｎ  ０．０５Ｍ  ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）に同量のプロポイント完全免疫補強剤（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ａｄｊｕｖａｎｔ）（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ  Ｉｎｃ 。、 Ｒｅｄｍｏｄ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）を混ぜて乳化液化した後、１００μｌを前記マウスの尾皮下の基底部に注入した（１ｓｔ  Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）。２１日後、ブースティング（Ｂｏｏｓｔｉｎｇ）のために、同じ乳剤を再注入した。
【０１３９】
２．免疫寛容性プラズマサイトイド樹状細胞の準備
前記実施例９において、Ｒｖ１４１１ｃタンパク質を処理して分化誘導されたプラズマサイトイド樹状細胞及び一般的なプラズマサイトイド樹状細胞を準備した後 、５μｇ／ｍｌのII型コラーゲンの抗原と１μｇ／ｍｌのＯＤＮ１８２６（ＴＬＲ９アゴニスト）を利用して３時間刺激した後、収集（ｈａｒｖｅｓｔ）した。前記のように活性化された免疫寛容性樹状細胞の注入による関節炎の治療効果を確認するために、前記のように２回目に乳剤を製造する時点に、前記製造したコラーゲン−誘導関節炎疾患動物モデルマウスの両側大腿部にプラズマサイトイド樹状細胞１ｘ１０６ｃｅｌｌ／ｍｉｃｅを分けて筋肉注射（ｉ．ｍ．）で注入した。７日後（２８日目）同種及び同量のプラズマサイトイド樹状細胞をさらに一度、再注入した。ただし、前記Ｒｖ１４１１ｃタンパク質の処理後、分化誘導されたプラズマサイトイド樹状細胞の治療効果を確認するために、陰性対照群としてリン酸化緩衝水溶液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＡ）と、陽性対照群としては、０．２  ｍｇ／ｋｇのメトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ、ＭＴＸ）を５％アラビアガム（ｉｎ  ｗａｔｅｒ）に懸濁させた懸濁液を毎日経口投与した。
【０１４０】
３．関節炎症状の評価
各群別の関節炎の重症度（Ｓｅｖｅｒｉｔｙ）は、３日ごとに、肉眼で観察して下記表３の関節症スコア（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｓｃｏｒｅ）を通じて評価し、それぞれの評価者（３名）は、ブラインド評価を行い、ブースティングした後１５日まで測定してその結果は、図１９にグラフで示す。また、各群別の関節炎の誘発率を測定し、その結果は、図２０に示した。
【０１４１】
【表３】
2020506186.tif 000008
【０１４２】
図１９から見られるように、コラーゲン−誘導関節炎動物モデルマウスに陰性対照群としてリン酸化緩衝水溶液のみを投与した場合（ＰＢＳ）と、一般的なプラズマサイトイド樹状細胞を注入した場合（ｐＤＣ）は、関節症の抑制効果がなかったが、Ｒｖ１４１１ｃタンパク質処理によって分化誘導された免疫寛容性プラズマサイトイド樹状細胞（ＴＬＲｓ−ｔｏｌｐＤＣ）を注入した場合には、関節炎の症状が陰性対照群に比べ、約８６％程度抑制されることを確認することができ、既存の関節炎治療薬として知られているメトトレキサートを投与した場合（ＭＴＸ）よりも関節炎の抑制効果が優れていることを確認した。
【０１４３】
また、図２０から見られるように、コラーゲン−誘導関節炎動物モデルマウスに、一般的なプラズマサイトイド樹状細胞を注入した場合（ｐＤＣ）は、陰性対照群に対して有病率の相違が見られなかったが、Ｒｖ１４１１ｃタンパク質処理によって分化誘導された免疫寛容性プラズマサイトイド樹状細胞（ＴＬＲｓ−ｐＤＣ）を注入した場合は、疾患の発達時期も遅延し、有病率が７５％程度減少したことを確認した。
【０１４４】
これにより、本発明により分化誘導された免疫寛容性プラズマサイトイド細胞は、関節炎の誘発を抑制し、その症状を緩和する効果があることを確認した。
【０１４５】
［実施例１６］コラーゲン誘導関節炎動物モデルの関節組織における免疫寛容性プラズマサイトイド樹状細胞の影響
前記実施例１５と同様の方法でコラーゲン誘導関節炎動物モデルを作製した後、陰性対照群としてリン酸化緩衝水溶液（ＰＢＳ）、陽性対照群としてメトトレキサート（ＭＴＸ）、または実施例９にてＲｖ１４１１ｃタンパク質処理し、分化誘導されたプラズマサイトイド樹状細胞（ｔｏｌｐＤＣ）を注入した。
【０１４６】
前記各処理されたコラーゲン誘導関節炎動物モデルマウスの後ろ足を６日間４で４％パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）で固定した後、６日間４でアンモニア水溶液（２．５２％ＮＨ４ＯＨ、１４％ＥＤＴＡ−ａｃｉｄ）に脱灰させた。組織をパラフィン化させミクロトームで組織を切片し、ヘマトキシリン（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ）とエオジン（ｅｏｓｉｎ）で染色して染色された組織の写真は、図２１に示した。また、染色された組織のスライドの結果における関節炎の症状の重症度は、下記の表４の基準に基づいて定量的に点数化し、その結果を図２２に示した。
【０１４７】
【表４】
2020506186.tif 000009
【０１４８】
図２１から見られるように、コラーゲン−誘導関節炎動物モデルマウスに陰性対照群としてリン酸化緩衝水溶液のみ投与した場合（ＰＢＳ）に比べ、Ｒｖ１４１１ｃタンパク質処理によって分化誘導された免疫寛容性プラズマサイトイド樹状細胞を処理した場合（ＴＬＲｓ−ｐＤＣ）は、マウスの関節組織で関節内において、免疫細胞の浸潤、軟骨組織の破壊、骨の腐食が相対的に大きく減少した。このことから、疾患による外形的抑制効果ばかりでなく、炎症誘発による関節組織内の病理的緩和効果が確認された。
【０１４９】
また、図２２から見られるように、コラーゲン−誘導関節炎動物モデルマウスにＲｖ１４１１ｃタンパク質処理によって分化誘導された免疫寛容性プラズマサイトイド樹状細胞を処理した場合（ＴＬＲｓ−ｐＤＣ）、リン酸化緩衝水溶液のみ投与した場合（ＰＢＳ）より関節炎重症度が大幅に減少し、陽性対照群としてメトトレキサートを処理した場合（ＭＴＸ）とほぼ同等のレベルの治療効果を示した。
【０１５０】
これにより、本発明に基づいて分化誘導された免疫寛容性プラズマサイトイド細胞は、関節炎の症状を緩和し、さらに治療効果があることを確認した。
【０１５１】
［実施例１７］コラーゲン誘導関節炎動物モデルにおける炎症性サイトカイン産生への免疫寛容性プラズマサイトイド樹状細胞の影響
前記実施例１５と同様の方法でコラーゲン誘導関節炎動物モデルを作製した後、陰性対照群としてリン酸化緩衝水溶液（ＰＢＳ）、陽性対照群としてメトトレキサート（ＭＴＸ）、または実施例９にてＲｖ１４１１ｃタンパク質を処理して分化誘導されたプラズマサイトイド樹状細胞（ＴＬＲｓ−ｐＤＣ）を注入した後、マウスの血液を抽出して、炎症性サイトカインである腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、およびインターロイキン−１７（ＩＬ−１７）の血中濃度を測定し、その結果を図２３に示した。
【０１５２】
図２３から見られるように、正常群（Ｎｏｒｍａｌ）対リン酸化緩衝水溶液のみを投与した陰性対照群（ＰＢＳ）からは、炎症性サイトカインであるＴＮＦ−α、ＩＬ−６およびＩＬ−１７の濃度が有意に増加したことを確認した。 しかし、Ｒｖ１４１１ｃタンパク質処理によって分化誘導された免疫寛容性プラズマサイトイド樹状細胞（ＴＬＲｓ−ｐＤＣ）を投与した場合には、陰性対照群（ＰＢＳ）に比べＴＮＦ−αは、約４８％、ＩＬ−６は、約４７％、ＩＬ−１７は、約３７％の程度発現レベルが有意に減少したことを確認した。
【０１５３】
これにより、本発明による分化誘導された免疫寛容性プラズマサイトイド細胞は、炎症性サイトカインの産生を抑制し、関節炎疾患を緩和させる効果があることを確認した。
【０１５４】
［実施例１８］コラーゲン誘導関節炎疾患の動物モデルにおける関節組織内の炎症誘発因子発現に対する免疫寛容性プラズマサイトイド樹状細胞の影響
前記実施例１５と同様の方法でコラーゲン誘導関節炎動物モデルからＲｖ１４１１ｃタンパク質を処理して分化誘導されたプラズマサイトイド樹状細胞の注入による関節組織内の炎症誘発因子の発現の変化を確認するために、それぞれの特異的なプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）を用いてＲＴ−ＰＣＲを実施した。
【０１５５】
具体的には、前記実施例１５と同様の方法でコラーゲン誘導関節炎動物モデルを作製した後、陰性対照群としてリン酸化緩衝水溶液（ＰＢＳ）、陽性対照群としてメトトレキサート（ＭＴＸ）、または実施例９にてＲｖ１４１１ｃタンパク質を処理して分化誘導されたプラズマサイトイド樹状細胞（ｔｏｌｐＤＣ）を注入した後、マウスの関節組織を砕いてトリゾル試薬（ｔｒｉｚｏｌｅ  ｒｅａｇｅｎｔ）に溶解させた。全ＲＮＡは、Ｅａｓｙ−ｓｐｉｎ  ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（イントロンバイオテクノロジー）を用いて、ＰＣＲを行うことにより獲得した。前記ＰＣＲで用いられたプライマーの塩基配列は、下記表５のとおりである。分析の結果は、図２４に示した。
【０１５６】
【表５】
2020506186.tif 000010
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主な炎症誘発因子パラメータは、代表的炎症性サイトカインであるＩＬ−１βとＩＬ−６、炎症性ケモカインであるＭＣＰ−１（ＣＣＬ２）、ＭＩＰ−１（ＣＣＬ３）およびＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）と、骨関節破壊に関与する炎症性基質タンパク分解酵素（ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）のＭＭＰ−１（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）に該当する。
【０１５７】
図２４から見られるように、正常群（Ｎｏｒｍａｌ）対リン酸化緩衝水溶液のみ投与した陰性対照群（ＰＢＳ）の場合、関節組織内の各炎症誘発因子の遺伝子発現が増加したことを確認した。これに対し、Ｒｖ１４１１ｃタンパク質の処理によって分化誘導された免疫寛容性プラズマサイトイド樹状細胞（ＴＬＲｓ−ｐＤＣ）を投与した場合には、循環的炎症性サイトカインの調節だけでなく、疾患のターゲットである関節部位の炎症誘発因子の発現レベルを効果的に抑制したことを確認した。
【０１５８】
これにより、本発明による分化誘導された免疫寛容性プラズマサイトイド細胞は、炎症誘発因子の発現を抑制し、関節炎疾患を緩和させる効果があることを確認した。
【０１５９】
以上、本発明の特定の部分を詳細に記述したところ、当業界の通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記述は、単なる好ましい具現例に過ぎず、これに本発明の範囲が制限されるものではないことは明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物によって定義されるといえる。
【図１】
2020506186.tif 000012
【図２】
2020506186.tif 000013
【図３（ａ）】
2020506186.tif 000014
【図３（ｂ）】
2020506186.tif 000015
【図４】
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【図５】
2020506186.tif 000017
【図６】
2020506186.tif 000018
【図７】
2020506186.tif 000019
【図８】
2020506186.tif 000020
【図９（ａ）】
2020506186.tif 000021
【図９（ｂ）】
2020506186.tif 000022
【図１０】
2020506186.tif 000023
【図１１】
2020506186.tif 000024
【図１２】
2020506186.tif 000025
【図１３】
2020506186.tif 000026
【図１４】
2020506186.tif 000027
【図１５（ａ）】
2020506186.tif 000028
【図１５（ｂ）】
2020506186.tif 000029
【図１６】
2020506186.tif 000030
【図１７】
2020506186.tif 000031
【図１８】
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【図１９】
2020506186.tif 000033
【図２０】
2020506186.tif 000034
【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【国際調査報告】
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