(57)【要約】ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）、特に誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、がん免疫療法のためのナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及びγδＴ細胞などの模倣自然免疫細胞を作製するための有望な出発材料を提供する。連続した大量生産を容易にするために、ｈＰＳＣから模倣自然免疫細胞を作る全体的な製造スキームが、設計され、実証された。特に、ＣＤ３４＋細胞富化及び回転胚様体形成を利用しない、Ｍ−ＣＳＦ発現を欠損している間質細胞株上での逐次的造血分化並びにＭ−ＣＳＦ発現を欠損しており、ＤＬＬ１を異所的に発現する間質細胞株上でのリンパ様コミットメントによってＮＫ細胞又はγδＴ細胞へとｈＰＳＣを分化させる強力なプロトコールが、確立される。この２段階プロトコールを使用して、ｈＥＳＣ、末梢血細胞由来ｉＰＳＣ（ＰＢＣ−ｉＰＳＣ）、非Ｔ細胞由来ｉＰＳＣ又はγδＴ細胞由来ｉＰＳＣを含むｈＰＳＣからの機能的模倣ＮＫ細胞及び機能的模倣γδＮＫＴ細胞の生成、並びにがん細胞を死滅させるこれらの模倣自然免疫細胞の使用が実証された。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
模倣自然免疫細胞を生成する方法であって、
（ａ）マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）発現を欠損している間質細胞株とヒト多能性幹細胞を共培養して、自然免疫細胞前駆体を生成するステップと；
（ｂ）幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）、インターロイキン７（ＩＬ７）及び／又はインターロイキン１５（ＩＬ１５）を含む培地中で、Ｍ−ＣＳＦ発現を欠損しており、Ｎｏｔｃｈリガンド、デルタ様１（ＤＬＬ１）を異所的に発現する間質細胞株と前記自然免疫細胞前駆体を共培養して、分化した模倣自然免疫細胞を生成するステップと；
（ｃ）前記分化した模倣自然免疫細胞を毎週３〜５週間継代するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
（ａ）における前記ヒト多能性幹細胞が、Ｍ−ＣＳＦ発現を欠損している前記間質細胞株と１２日間共培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記培地が、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）；アルファ最小必須培地（αＭＥＭ）若しくは他の幹細胞分化培地；又はその組合せをさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ヒト多能性幹細胞がヒト胚性幹細胞である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ヒト多能性幹細胞が末梢血細胞から誘導される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
再プログラム転写因子を、前記末梢血細胞に組み込み、成長させて、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を生成する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
再プログラム転写因子を前記末梢血細胞に組み込む前に、アミノビスホスホネート及びインターロイキン２（ＩＬ２）の存在下で末梢血細胞を拡大して、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を生成するステップをさらに含む、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
前記アミノビスホスホネートが、ゾレドロン酸又はその塩である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ｉＰＳＣが、ＴＣＲＧ遺伝子形態に配置されたＴＣＲ遺伝子又はＴＣＲＤ遺伝子形態に配置されたＴＣＲ遺伝子を含む、請求７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
幹細胞因子（ＳＣＦ）；ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）；Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）、インターロイキン１５（ＩＬ１５）及びインターロイキン７（ＩＬ７）を含む培地中で、フィーダー細胞の存在下で模倣自然免疫細胞を拡大するステップをさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ＣＤ５６、ＣＤ１６、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、ＤＮＡＭ−１、ＦＡＳＬ、ＴＲＡＩＬ、ＮＫＧ２Ａ／ＣＤ９４のうち少なくとも１つ又はその組合せを発現し、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）を低く発現する又は発現しない細胞を含む、模倣自然免疫細胞。
【請求項１２】
ＣＤ３を発現する細胞をさらに含む、請求項１１に記載の模倣自然免疫細胞。
【請求項１３】
γδＴＣＲを発現する細胞をさらに含む、請求項１１又は１２に記載の模倣自然免疫細胞。
【請求項１４】
前記γδＴＣＲが、Ｖガンマ９Ｖデルタ２（Ｖγ９Ｖδ２）を含む、請求項１３に記載の模倣自然免疫細胞。
【請求項１５】
処置に使用する、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の模倣自然免疫細胞。
【請求項１６】
がんの処置に使用する、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の模倣自然免疫細胞。
【請求項１７】
前記がんが、固形腫瘍がん又は白血病である、請求項１６に記載のがんの処置に使用する模倣自然免疫細胞。
【請求項１８】
前記固形腫瘍がんが、乳腺癌、結腸直腸腺癌、乳管癌、卵巣腺癌又は白血病を含む、請求項１７に記載のがんの処置に使用する模倣自然免疫細胞。
【請求項１９】
がんの前記処置における薬剤を製造するための請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の模倣自然免疫細胞の使用。
【請求項２０】
前記がんが固形腫瘍がん又は白血病である、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
前記固形腫瘍がんが、乳腺癌、結腸直腸腺癌、乳管癌、若しくは卵巣腺癌又は白血病を含む、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
模倣自然免疫細胞を生成するためのキットであって：
（ａ）ヒト多能性幹細胞株；
（ｂ）マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）発現を欠損している間質細胞株；
（ｃ）マクロファージコロニー刺激因子発現を欠損しており、Ｎｏｔｃｈリガンド、デルタ様１（ＤＬＬ１）を異所的に発現する間質細胞株；
（ｄ）Ｍ−ＣＳＦ発現を欠損している前記間質細胞株とヒト多能性幹細胞を共培養するための第１の単純培地；及び
（ｅ）幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）、インターロイキン７（ＩＬ７）及び／又はインターロイキン１５（ＩＬ１５）を含む第２の培地を含むキット。
【請求項２３】
前記培地が、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）；アルファ最小必須培地（αＭＥＭ）若しくは幹細胞分化培地若しくはリンパ球培養培地；又はその組合せをさらに含む、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
ＣＤ５６、ＣＤ１６、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、ＤＮＡＭ−１、ＦＡＳＬ、ＴＲＡＩＬ、ＮＫＧ２Ａ／ＣＤ９４又はその組合せのうち少なくとも１つを発現し、キラー細胞免疫グロブリン様受容体ＫＩＲを低く発現する又は発現しない模倣自然免疫細胞を患者に投与するステップを含む、がん患者を処置する方法であって、前記模倣自然免疫細胞は、
（ａ）マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）発現を欠損している間質細胞株とヒト多能性幹細胞を共培養して、自然免疫細胞前駆体を生成するステップと；
（ｂ）幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）、インターロイキン７（ＩＬ７）及び／又はインターロイキン１５（ＩＬ１５）を含む培地中で、マクロファージコロニー刺激因子発現を欠損しており、Ｎｏｔｃｈリガンド、デルタ様１（ＤＬＬ１）を異所的に発現する間質細胞株と前記自然免疫細胞前駆体を共培養して、分化した模倣自然免疫細胞を生成するステップと；
（ｃ）前記分化した模倣自然免疫細胞を毎週３〜５週間継代するステップと
により生成される、方法。
【請求項２５】
前記がんが、固形腫瘍がん又は白血病である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記固形腫瘍がんが、乳腺癌、結腸直腸腺癌、乳管癌、卵巣腺癌又は白血病を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
末梢血単核細胞から誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を生成する方法であって、
（ａ）末梢血単核細胞に再プログラム転写因子を組み込むステップと；
（ｂ）前記再プログラム転写因子を組み込んだ前記末梢血単核細胞を多能性幹細胞に成長させるステップと
を含む、方法。
【請求項２８】
前記末梢血単核細胞が、γδＴ細胞である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
再プログラム転写因子を前記γδＴ細胞に組み込む前に、アミノビスホスホネート及びインターロイキン２（ＩＬ２）の存在下で末梢血細胞を拡大するステップをさらに含む、請求項２７又は２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記アミノビスホスホネートが、ゾレドロン酸又はその塩である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ｉＰＳＣが、ＴＣＲＧ遺伝子形態に配置されたＴＣＲ遺伝子又はＴＣＲＤ遺伝子形態に配置されたＴＣＲ遺伝子を含む、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
ＴＣＲＧ遺伝子形態に配置されたＴＣＲ遺伝子又はＴＣＲＤ遺伝子形態に配置されたＴＣＲ遺伝子を含む、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）株。
【請求項３３】
模倣ＮＫ細胞を生成する方法であって、
（ａ）マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）発現を欠損している間質細胞株とヒト多能性幹細胞を共培養して、自然免疫細胞前駆体を生成するステップと；
（ｂ）幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）、インターロイキン７（ＩＬ７）及び／又はインターロイキン１５（ＩＬ１５）を含む培地中で、Ｍ−ＣＳＦ発現を欠損しており、Ｎｏｔｃｈリガンド、デルタ様１（ＤＬＬ１）を異所的に発現する間質細胞株と前記自然免疫細胞前駆体を共培養して、分化した模倣自然免疫細胞を生成するステップと；
（ｃ）前記分化した模倣自然免疫細胞を毎週３〜５週間継代するステップと
を含む、方法。
【請求項３４】
模倣ガンマデルタＴ細胞を生成する方法であって、
（ａ）マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）発現を欠損している間質細胞株とヒト多能性幹細胞を共培養して、自然免疫細胞前駆体を生成するステップと；
（ｂ）幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）、インターロイキン７（ＩＬ７）及び／又はインターロイキン１５（ＩＬ１５）を含む培地中で、Ｍ−ＣＳＦ発現を欠損しており、Ｎｏｔｃｈリガンド、デルタ様１（ＤＬＬ１）を異所的に発現する間質細胞株と前記自然免疫細胞前駆体を共培養して、分化した模倣自然免疫細胞を生成するステップと；
（ｃ）前記分化した模倣自然免疫細胞を毎週３〜５週間継代するステップと
を含む、方法。
【請求項３５】
ＣＤ５６、ＣＤ１６、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、ＤＮＡＭ−１、ＦＡＳＬ、ＴＲＡＩＬ、ＮＫＧ２Ａ／ＣＤ９４のうち少なくとも１つ又はその組合せを発現し；キラー細胞免疫グロブリン様受容体ＫＩＲを低く発現する又は発現しない細胞を含む、模倣ＮＫ細胞。
【請求項３６】
ＣＤ３を発現しない、請求項３５に記載の模倣ＮＫ細胞。
【請求項３７】
少なくともＣＤ５６、ＣＤ１６、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、ＤＮＡＭ−１、ＦＡＳＬ、ＴＲＡＩＬ、ＮＫＧ２Ａ／ＣＤ９４又はその組合せを発現し、キラー細胞免疫グロブリン様受容体ＫＩＲを低く発現する又は発現しない細胞を含む、模倣γδＴ細胞。
【請求項３８】
前記模倣γδＴ細胞が、γδＴＣＲ発現を含む、請求項３７に記載の模倣γδＴ細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0001]本出願は、２０１７年２月７日に出願のシンガポール出願第１０２０１７００９３７Ｐ号及び２０１７年７月６日に出願のシンガポール出願第１０２０１７０５５８２Ｓ号の優先権を主張し、その内容を参照により本明細書に組み込む。
【０００２】
[0002]本発明は、自然免疫細胞、好ましくはナチュラルキラー細胞又はガンマデルタＴ細胞を生成する方法及びキット、並びに処置に自然免疫細胞を使用する方法及び誘導多能性幹細胞を生成する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
[0003]２０１５年において、約９０，５００，０００人が、がんを有し、約１４，１００，０００件の新たな症例が、毎年発生している（ＧＢＤ  ２０１５年、Ｌａｎｃｅｔ．３８８（１００５３）１５４５〜１６０２頁）。がんは、放射線療法、手術、化学療法及び／又は標的療法のいくつかの組合せでしばしば処置される。利用可能な処置は多くあるが、８，８００，０００人が、がんにより毎年死亡し、新たな処置の不断の必要性が存在する。
【０００４】
[0004]自然免疫細胞を活用するがん免疫療法は、がん処置の新たな希望である（Ｗｏｏら、Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３３、４４５〜４７４頁（２０１５年））。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及びγδＴ細胞を含むこれら自然免疫細胞は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）非依存的機序によって広範囲にわたるがん細胞を認識できる（Ｓｃｈｅｐｅｒ、らＬｅｕｋｅｍｉａ  ２８、１１８１〜１１９０頁（２０１４年））。この固有の特徴により、自然免疫細胞を使用して、従来通りのαβＴ細胞に基づく戦略のＭＨＣ制限なしに多くのレシピエントにおいてがんを処置することが可能になる。現在のところ、健康なドナー由来血液細胞が、多数の自然免疫細胞を生成するために一般的に使用される細胞供給源である（Ｋｏｎｄｏ、らＣｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ  １０、８４２〜８５６頁（２００８年））。しかしながら、これらのドナー血液細胞依存的プラットフォームは、変化しやすく限られた出発材料の使用及び複雑なロジスティクスのため、集中化し、標準化した大規模生産にとって挑戦的である。
【０００５】
[0005]ガンマデルタＴ細胞（γδＴ細胞）は、主要組織適合複合体非依存的機序によってがん細胞を認識する自然免疫細胞である。この特徴により、ドナー由来γδＴ細胞を使用して、異なる患者においてがんを処置することが可能になる。γδＴ細胞は、末梢血リンパ球の１〜１０％を占める。これらの循環γδＴ細胞の中でも、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞は、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を介してリン抗原に反応する主要なサブセットであり、したがって感染細胞又は悪性細胞を認識する。ｉｎ  ｖｉｖｏ発達中の、ＴＣＲＧ及びＴＣＲＤ遺伝子の体細胞組換えは、それらのＴＣＲγ鎖及びδ鎖を得るためにγδＴ細胞にとって初期の重要なステップである。ｉＰＳＣからγδＴ細胞を生成するには、論理的戦略は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化の間のＴＣＲＧ及びＴＣＲＤ遺伝子の体細胞組換えの過程を正確に再現して、機能的γδＴＣＲを作製することになる。しかし、そのような戦略は、現在の技術にとって非常に困難なままである。
【０００６】
[0006]ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）は、広範囲の悪性細胞及びウイルス感染細胞を死滅させ得る自然免疫系のリンパ球である（Ｄｏｍｏｇａｌａ、ら、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６、２６４頁（２０１５年））。ＮＫ細胞の標的認識及び活性化は、活性化受容体並びに阻害性受容体の整列に依存し、認識及び活性化は、αβＴ細胞のＭＨＣ拘束性αβＴ細胞受容体（ＴＣＲ）依存的機序とは異なっている（Ｍｏｒｅｔｔａ、らＦｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５、８７頁（２０１４年））。したがって、同種異系ＮＫ細胞を使用して、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）をより低い可能性で引き起こすがんの処置が可能になる（Ｌｅｕｎｇ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅｒｃｈの官報、２０、３３９０〜３４００頁（２０１４））。ＮＫ細胞の明白な標的認識機序は、自家ＮＫ細胞を超えてがんの養子免疫療法に使用可能な潜在的な細胞供給源を有意に拡張する。
【０００７】
[0007]現在の臨床試験では、ＮＫ細胞５×１０６個〜５×１０７個／ｋｇ体重の大きな投薬量が必要とされる（Ｌａｐｔｅｖａら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  ｏｎｃｏｇｅｎｅｓｉｓ  １９、１２１〜１３２頁（２０１４年））。そのような大量の同種異系ＮＫ細胞を得る典型的な手法の１つは、大容量のドナー末梢血からのＮＫ細胞富化である。ドナー由来の白血球除去産物から開始して、Ｔ細胞及びＢ細胞の免疫磁気除去並びにＣＤ５６＋細胞の選択によりＮＫ細胞産物を作製するための異なるプロトコールが確立されている（Ｋｏｅｈｌら、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ、３、１１８頁（２０１３年））。そのような産物の純度は同種異系の組における臨床応用に特に重要であり、残留Ｔ細胞はＧＶＨＤを引き起こし、高投薬量の注入を妨げる可能性がある。高純度ＮＫ細胞産物の現在の生成は、ＮＫ細胞の回収を悪化させるだけでなく、細胞の生存率及び効力にも影響を及ぼす長期間の手順を必要とする。低い回収率のため、単一の白血球除去産物から充分なＮＫ細胞を得ることは困難である。ＮＫ細胞療法剤を作製する別の普及している手法は、インターロイキン（ＩＬ）１５及び４−１ＢＢリガンド（Ｋ５６２−ｍｂ１５−４１ＢＢＬ）などの膜結合性分子で修飾したＫ５６２細胞などのフィーダー細胞を使用するＮＫ細胞の拡大である（Ｆｕｊｉｓａｋｉ、ら、Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ、６９、４０１０〜４０１７頁（２００９年））。これらのフィーダー細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から２１．６倍に又は冷凍保存されたアフェレーシス産物から７０倍にＮＫ細胞を急速に拡大することができる（Ｌａｐｔｅｖａら）。さらに、そのようなＮＫ細胞産物の純度は、約７０％であり、付随するＣＤ３＋Ｔ細胞を除去する時間のかかる方法が、同種異系使用のためさらに必要である（Ｌａｐｔｅｖａら）。上述の２つの手法は、ドナー細胞からＮＫ細胞療法剤を生成するために実現可能であるが、他の任意のドナー細胞依存的製造過程のように、様々なドナーの初代細胞からＮＫ細胞産物を生成することは、様々な出発材料のため標準化が困難である。その方法は、特別な技術及び施設、複雑なロジスティクス並びに高い運用経費を要求し、したがってバルク製造に適していない。
【０００８】
[0008]現在のところ、健康なドナー由来血液細胞が、多数の自然免疫細胞を生成するために一般的に使用される細胞供給源である。しかしながら、これらのドナー血液細胞依存的プラットフォームは、変化しやすく限られた出発材料の使用及び複雑なロジスティクスのため、集中化し、標準化された大規模生産にとって挑戦的である。ＮＫ細胞生産のための現在の戦略が直面する別のハードルは、ＮＫ細胞が、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）として公知のクローン的に分布している阻害性受容体を発現することである（Ｐａｒｈａｍ、２００５年、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５、２０１〜２１４頁）。個々のＫＩＲは、ＫＩＲリガンドとして公知の特定のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩ分子を認識し、例えば、ＫＩＲ２ＤＬ１は、ＨＬＡ−Ｃ２を結合し、ＫＩＲ２ＤＬ２及びＫＩＲ２ＤＬ３は、ＨＬＡ−Ｃ１を結合し、ＫＩＲ３ＤＬ１は、ＨＬＡＢｗ４を結合し、ＫＩＲ３ＤＬ２は、ＨＬＡ−Ａ３及びＨＬＡ−Ａ１１を結合する（Ｔｈｉｅｌｅｎｓら、２０１２年Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４、２３９〜２４５頁）。阻害性ＫＩＲに対するＫＩＲリガンドの結合は、ＮＫ細胞の細胞毒性を抑制する。ＮＫ細胞に対する阻害を軽減し、したがって患者のがん細胞に対する細胞毒性を増強するために、特定の患者に対するＮＫ細胞ドナーを精巧に選択して、抗がん管理においてＫＩＲ−ＨＬＡ不整合を得ることが、きわめて重大である（Ｔｈｉｅｌｅｎｓら、２０１２年）。この選択は、ドナーＫＩＲタイピング及びレシピエントＨＬＡタイピングに基づく。阻害性ＫＩＲがドナーに存在するが、ＫＩＲリガンドがレシピエントに存在しない場合、そのドナーは適している（Ｌｅｕｎｇ、２０１４年  Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０、３３９０〜３４００頁）。ヒト免疫系における２つの大きく異なる遺伝子ファミリーであるＫＩＲ及びＨＬＡ両方の関与は、現在のドナー細胞依存的製造プラットフォームが、幅広い患者のための「レディーメイド」ＮＫ細胞産物ではなく限られた患者のための「カスタムメイド」ＮＫ細胞産物しか作製し得ないことを決定する。したがって、これらの上述した問題を回避する代わりの製造戦略を探索することが急務である。
【０００９】
[0009]多能性の時代に、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）、特に誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）が、樹状細胞（Ｚｅｎｇ、ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １８８、４２９７〜４３０４頁（２０１２年））及びＮＫ細胞（Ｗｏｌｌ、ら、Ｂｌｏｏｄ  １１３、６０９４〜６１０１頁（２００９年）の様な免疫細胞を生成するための信頼性が高く、標準化可能な出発材料として現れた。ｈＰＳＣからＮＫ細胞を生成するいくつかのプロトコールが開発されているが、ＣＤ３４＋細胞の富化（Ｗｏｌｌ、らＢｌｏｏｄ  １１３、６０９４〜６１０１頁（２００９年））又は回転胚様体（ＥＢ）形成（Ｋｎｏｒｒ，Ｄ．Ａ．ら、Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２、２７４〜２８３頁（２０１３年））の必要条件は、これら既存のプロトコールが、非常に複雑で時間がかかり、したがって産業的製造ではなく研究室使用に一層適していていることを決定する。さらに、これら現在の方法を使用して得られたＮＫ細胞は、高レベルのＫＩＲを発現し（Ｋｎｏｒｒら、２０１３年）、その発現は、特定のＨＬＡタイピングのレシピエントへの細胞の適用を制限する。今日までに、様々なｈＰＳＣ供給源から連続してＮＫ細胞を生成する強力なプロトコールは、まだ確立されていない。
【００１０】
[0010]ｈＰＳＣの造血分化を誘導するステップは、ｈＰＳＣからＮＫ細胞を生成するための重要な第１のステップである。１つの手法は、Ｓ１７及びＭ２−１０Ｂ４などの骨髄間質細胞とｈＰＳＣを共培養して、ＣＤ３４＋造血前駆細胞を得ることである（Ｗｏｌｌ、ら  Ｂｌｏｏｄ  １１３、６０９４〜６１０１頁（２００９年））。しかしながら、この方法は、最長２１日間の長期間にわたって共培養し、ＮＫ細胞へさらに分化させる前にＣＤ３４＋細胞をその後選別する必要がある。この選別ステップは、プロトコールを複雑にするだけでなく、ＮＫ細胞分化潜在性も有する他の多くの造血前駆体を排除するため、ＮＫ細胞の収量に影響を及ぼすことにもなる。造血細胞を生成する別の手法は、ＥＢ（Ｔａｂａｔａｂａｅｉ−Ｚａｖａｒｅｈ、らＰｌｏＳ  ｏｎｅ  ２、ｅ２３２頁（２００７年））及び近年は回転ＥＢ（Ｋｎｏｒｒ，Ｄ．Ａ．ら、Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２、２７４〜２８３頁（２０１３年））を形成することである。しかしながら、このランダムな分化手法は、非常にｈＰＳＣ株依存的であり、したがって様々なｈＰＳＣ供給源にとって十分に強力でない。さらに、回転ＥＢ形成は、ＴｒｙｐＬＥ消化に対するｈＰＳＣの時間のかかる適応の前に少なくとも１０継代必要とし、その継代は、あらゆるｈＰＳＣ株には作用しない可能性がある。これらのＴｒｙｐＬＥ適応させたｈＰＳＣは、１穴当たり３０００個細胞の密度で９６穴プレートに次いで播種され、回転ＥＢ形成のために遠沈される。この後、回転ＥＢを採取し、２４穴プレートに１穴当たり６回転ＥＢの密度で播種して、さらにＮＫ細胞を分化させる。明らかに、この労働集約型で技術を要求される回転ＥＢ手法は、商業生産における拡大が困難である。
【００１１】
[0011]間質細胞と共培養して造血前駆体のさらなる分化を促進するステップは、ｈＰＳＣからＮＫ細胞を生成する第２のステップである。いくつかの間質細胞株が、共培養に使用されてきた。ＭＳ−５及びＡＦＴ０２４などの間質細胞株が、ＮＫ細胞発達を支持すると証明されているが、得られる細胞は、ＣＤ５６＋とＣＤ５６−細胞を両方含有する不均一な集団である（Ｗｏｌｌ、らＢｌｏｏｄ  １１３、６０９４〜６１０１頁（２００９年））。間質細胞株ＥＬ０８−１Ｄ２は、ＮＫ細胞発達に一層優れた支持を示した（ＭｃＣｕｌｌａｒ，Ｖ．ら  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ３６、５９８〜６０８頁（２００８年））；しかしながら、その有効性は、選別されたＣＤ３４＋細胞又は回転ＥＢでしか実証されなかった（Ｗｏｌｌ、ら  Ｂｌｏｏｄ  １１３、６０９４〜６１０１頁（２００９年））。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
[0012]本発明の目的は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）など信頼性が高く、無限であり、標準化可能な出発細胞供給源のヒト多能性幹細胞を好ましくは使用することによって上記困難のいくつかを改良して、免疫療法処置に使用する模倣自然免疫細胞を生成することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
[0013]したがって、本発明の第１の態様は、模倣自然免疫細胞を生成する方法であって、
（ａ）マクロファージコロニー刺激因子発現を欠損している間質細胞株とヒト多能性幹細胞を共培養して、自然免疫細胞の前駆体を生成するステップと；
（ｂ）幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）、インターロイキン７（ＩＬ７）及び／又はインターロイキン１５（ＩＬ１５）を含む培地中で、マクロファージコロニー刺激因子発現を欠損しており、Ｎｏｔｃｈリガンド、デルタ様１（ＤＬＬ１）を異所的に発現する間質細胞株と自然免疫細胞の前駆体を共培養して、分化した模倣自然免疫細胞を生成するステップと；
（ｃ）分化した模倣自然免疫細胞を毎週３〜５週間継代するステップと
を含む、方法を含む。
【００１４】
[0014]本発明の別の態様は、ＣＤ５６、ＣＤ１６、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、ＤＮＡＭ−１、ＦＡＳＬ、ＴＲＡＩＬ、ＮＫＧ２Ａ／ＣＤ９４のうち少なくとも１つ又はその組合せを発現し、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）を低く発現する又は発現しない細胞を含む模倣自然免疫細胞を含む。
【００１５】
[0015]本発明の別の態様は、処置に使用する本明細書に記載の模倣自然免疫細胞を含む。
【００１６】
[0016]本発明の別の態様は、がんを処置するのに使用する本明細書に記載の模倣自然免疫細胞を含む。
【００１７】
[0017]本発明の別の態様は、がんの処置における薬剤を製造するための本明細書に記載の模倣自然免疫細胞の使用を含む。
【００１８】
[0018]本発明の別の態様は、模倣自然免疫細胞を生成するためのキットを含み、本キットは：
（ａ）ヒト多能性幹細胞株；
（ｂ）マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）発現を欠損している間質細胞株；
（ｃ）マクロファージコロニー刺激因子発現を欠損しており、Ｎｏｔｃｈリガンド、デルタ様１（ＤＬＬ１）を異所的に発現する間質細胞株；
（ｄ）Ｍ−ＣＳＦ発現を欠損している間質細胞株とヒト多能性幹細胞を共培養するための第１の単純培地；及び
（ｅ）幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）、インターロイキン７（ＩＬ７）及び／又はインターロイキン１５（ＩＬ１５）を含む第２の培地を含む。
【００１９】
[0019]本発明の別の態様は、ＣＤ５６、ＣＤ１６、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、ＤＮＡＭ−１、ＦＡＳＬ、ＴＲＡＩＬ、ＮＫＧ２Ａ／ＣＤ９４のうち少なくとも１つ又はその組合せを発現し、キラー細胞免疫グロブリン様受容体ＫＩＲを低く発現する又は発現しない模倣自然免疫細胞を患者に投与するステップを含む、がん患者を処置する方法であって、前記模倣自然免疫細胞は、
【００２０】
（ａ）マクロファージコロニー刺激因子発現を欠損している間質細胞株とヒト多能性幹細胞を共培養して、自然免疫細胞の前駆体を生成するステップと；
（ｂ）幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）、インターロイキン７（ＩＬ７）及び／又はインターロイキン１５（ＩＬ１５）を含む培地中で、マクロファージコロニー刺激因子発現を欠損しており、Ｎｏｔｃｈリガンド、デルタ様１（ＤＬＬ１）を異所的に発現する間質細胞株と自然免疫細胞の前駆体を共培養して、分化した模倣自然免疫細胞を生成するステップと；
（ｃ）分化した模倣自然免疫細胞を毎週３〜５週間継代するステップと
により生成される、方法を含む。
【００２１】
[0020]本発明の別の態様は、
（ａ）非Ｔ細胞に再プログラム転写因子を組み込むステップと；
（ｂ）再プログラム転写因子を組み込んだ非Ｔ細胞を成長させて、多能性幹細胞にするステップと
を含む、末梢血細胞の非Ｔ細胞から誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を生成する方法を含む。
【００２２】
[0021]本発明の別の態様は、
（ａ）γδＴ細胞に再プログラム転写因子を組み込むステップと；
（ｂ）再プログラム転写因子を組み込んだγδＴ細胞を成長させて、多能性幹細胞にするステップと
を含む、ガンマデルタ細胞（δＴＴ細胞）から誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を生成する方法を含む。
【００２３】
[0022]本発明の別の態様は、ＴＣＲＧ遺伝子形態に配置されたＴＣＲ遺伝子又はＴＣＲＤ遺伝子形態に配置されたＴＣＲ遺伝子を含む誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含む。
【００２４】
[0023]本発明の別の態様は、模倣ＮＫ細胞を生成する方法であって、
（ａ）マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）発現を欠損している間質細胞株とヒト多能性幹細胞を共培養して、刺激を受けた自然免疫細胞を生成するステップと；
（ｂ）幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）、インターロイキン７（ＩＬ７）及び／又はインターロイキン１５（ＩＬ１５）を含む培地中で、Ｍ−ＣＳＦ発現を欠損しており、Ｎｏｔｃｈリガンド、デルタ様１（ＤＬＬ１）を異所的に発現する間質細胞株と刺激を受けた自然免疫細胞を共培養して、分化した模倣自然免疫細胞を生成するステップと；
（ｃ）分化した模倣自然免疫細胞を毎週３〜５週間継代するステップと
を含む、方法を含む。
【００２５】
[0024]本発明の別の態様は、模倣γδＴ細胞を生成する方法であって、
（ａ）マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）発現を欠損している間質細胞株とヒト多能性幹細胞を共培養して、刺激を受けた自然免疫細胞を生成するステップと；
（ｂ）幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）、インターロイキン７（ＩＬ７）及び／又はインターロイキン１５（ＩＬ１５）を含む培地中で、Ｍ−ＣＳＦ発現を欠損しており、Ｎｏｔｃｈリガンド、デルタ様１（ＤＬＬ１）を異所的に発現する間質細胞株と刺激を受けた自然免疫細胞を共培養して、分化した模倣自然免疫細胞を生成するステップと；
（ｃ）分化した模倣自然免疫細胞を毎週３〜５週間継代するステップと
を含む、方法を含む。
【００２６】
[0025]本発明の別の態様は、ＣＤ５６、ＣＤ１６、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、ＤＮＡＭ−１、ＦＡＳＬ、ＴＲＡＩＬ、ＮＫＧ２Ａ／ＣＤ９４のうち少なくとも１つ又はその組合せを発現し、ＣＤ３発現がなく、キラー細胞免疫グロブリン様受容体ＫＩＲを低く発現する又は発現しない細胞を含む模倣ＮＫ細胞を含む。
【００２７】
[0026]本発明の別の態様は、（ａ）ＣＤ５６、ＣＤ１６、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、ＤＮＡＭ−１、ＦＡＳＬ、ＴＲＡＩＬ、ＮＫＧ２Ａ／ＣＤ９４のうち少なくとも１つ又はその組合せ；（ｂ）γδＴＣＲを発現し；（ｃ）キラー細胞免疫グロブリン様受容体ＫＩＲを低く発現する又は発現しない細胞を含む模倣γδＴ細胞を含む。
【００２８】
[0027]本発明の他の態様及び特徴は、本発明の特定の実施形態の以下の説明の総説を添付の図面と組み合わせることにより、当業者に明らかになろう。
【００２９】
[0028]図面において、図面は、ほんの一例として、本発明の実施形態を例示する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】ｈＰＳＣからのＮＫ細胞の生成を示す図である。（ａ）：ｈＰＳＣからのＮＫ細胞誘起の２段階プロトコールの概略図。（ｂ〜ｉ）：ＮＫ細胞へのＨ１細胞の分化の間の形態学的変化。位相差画像は、（ｂ）：未分化Ｈ１細胞；（ｃ）：Ｈ１及びＯＰ９共培養１２日目；（ｄ）：第１の分化した細胞及びＯＰ９−ＤＬＬ１共培養７日目（１９日目）；（ｅ）：第２の分化した細胞及びＯＰ９−ＤＬＬ１共培養７日目（２６日目）；（ｆ〜ｇ）：第３の分化した細胞及びＯＰ９−ＤＬＬ１共培養７日目（３３日目）；（ｈ〜ｉ）：第４の分化した細胞及びＯＰ９−ＤＬＬ１共培養７日目（４０日目）。（ｊ〜ｌ）：ＮＫ細胞へのＨ１細胞の分化の間の表現型変化を示す。フローサイトメトリー分析は、（ｊ）：Ｈ１及びＯＰ９共培養１２日目からのＣＤ３４＋細胞；（ｋ〜ｌ）：ＯＰ９−ＤＬＬ１上での第３（ｄ３３）及び第４（ｄ４０）共培養からのＣＤ５６＋ＣＤ４５＋細胞を示す。
【図２−１】ＰＢＣ由来ｉＰＳＣからのＮＫ細胞の生成を示す図である。（ａ）ＰＢＣからのｉＰＳＣの生成。ＰＢＣ由来ｉＰＳＣ（ＰＢＣ−ｉＰＳＣ）コロニー及び拡大されたｉＰＳＣの典型的な形態並びに表現型。位相差画像は、２０日目及び２５日目のＰＢＣ−ｉＰＳＣコロニー並びに継代１及び継代２の拡大されたｉＰＳＣ株を示す。蛍光画像は、ＰＢＣ−ｉＰＳＣ株におけるＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１及びアルカリホスファターゼの免疫染色を示す。（ｂ〜ｅ）ＰＢＣ−ｉＰＳＣからのＮＫ細胞の生成。ＮＫ細胞へのＰＢＣ−ｉＰＳＣ株、ＰＢＣ−ｉＰＳＣ＃９の分化の間の表現型変化が示される。フローサイトメトリー分析は、分化過程の間にＴＣＲαβ発現が無いことを示す。
【図２−２】（ｆ）は異なるサイトカインを試験してＮＫ細胞関与を増強した図である。
【図３】ＧＤＴ−ｉＰＳＣからのγδＴ細胞の生成。γδＴ細胞由来ｉＰＳＣ株、ＧＤＴＡ／ＮＦ−ｉＰＳＣ＃１が、図１ａにおいて確立されたプロトコールを使用して分化された。（ａ〜ｌ）：フローサイトメトリーによって分析した３３日目及び４７日目におけるＧＤＴＡ／ＮＦ−ｉＰＳＣ＃１株から分化した細胞の表現型。（ｍ）：４７日目におけるＧＤＴＡ／ＮＦ−ｉＰＳＣ＃１株から分化した細胞の形態。非Ｔ細胞由来ｉＰＳＣ株、ＧＤＴＡ／ＮＦ−ｉＰＳＣ＃３が、対照として分化された。（ｎ〜ｑ）：フローサイトメトリーによって分析した４７日目におけるＧＤＴＡ／ＮＦ−ｉＰＳＣ＃３株から分化した細胞の表現型。
【図４】ＰＢＣ−ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞の形態及び表現型を示す図である。（ａ〜ｂ）：ＰＢＣ−ｉＰＳＣ＃９から得られたＮＫ細胞の形態（ａ）及び表現型（ｂ）。
【図５】ｉＰＳＣ−γδＴ細胞、ＰＢ−γδＴ細胞及びＰＢ−ＮＫ細胞における活性化分子及び死誘導リガンドの発現を示す図である。ｉＰＳＣ−γδＴ細胞は、図１ａにおいて確立されたプロトコールを使用してＧＤＴＡ／ＮＦ−ｉＰＳＣ＃１株から生成された。ＰＢγδＴ細胞及びＰＢ−ＮＫ細胞は、健康なドナーのＰＢＭＣから拡大された。ｉＰＳＣ−γδＴ細胞（ａ）、拡大されたＰＢ−γδＴ細胞（ｂ）及び拡大されたＰＢ−ＮＫ細胞（ｃ）の表現型が、フローサイトメトリーによって分析された。
【図６】ｉＰＳＣ−γδＴ細胞、ＰＢ−γδＴ細胞並びにＰＢ−ＮＫ細胞における阻害性受容体及びＫＩＲの発現を示す図である。ｉＰＳＣ−γδＴ細胞は、図１ａにおいて確立されたプロトコールを使用してＧＤＴＡ／ＮＦ−ｉＰＳＣ＃１株から生成された。ＰＢγδＴ細胞及びＰＢ−ＮＫＴ細胞は、健康なドナーのＰＢＭＣから拡大された。ｉＰＳＣ−γδＴ細胞（ａ）、拡大されたＰＢ−γδＴ細胞（ｂ）並びに拡大されたＰＢ−ＮＫ細胞（ｃ）における阻害性受容体及びＫＩＲの発現が、フローサイトメトリーによって検出された。
【図７−１】ＰＢＣ−ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞の機能を示す図である。（ａ〜ｂ）：ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって検出された、Ｋ５６２及びＲａｊｉ細胞による刺激後にＰＢＣ−ｉＰＳＣ＃９から得られたＮＫ細胞によるＩＦＮγ分泌。ＥＬＩＳＰＯＴ画像（ａ）及び（ｂ）スポット計数が示される。（ｃ〜ｄ）：ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって検出された、Ｋ５６２細胞による刺激後のＰＢＣ−ｉＰＳＣ＃９由来ＮＫ細胞によるＧｒＢ分泌。ＥＬＩＳＰＯＴ画像（ｃ）及び（ｄ）スポット計数が示される。
【図７−２】ＰＢＣ−ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞の機能を示す図である。（ｅ〜ｆ）：フローサイトメトリーによって測定された、Ｋ５６２及びＲａｊｉ細胞に対するＰＢＣ−ｉＰＳＣ＃９から得られたＮＫ細胞の細胞毒性。代表的なフローサイトメトリー分析（ｅ）及び結果概要（ｆ）が、示される。（ｇ〜ｈ）：フローサイトメトリーによって測定された、抗ＣＤ２０ヒト化抗体の存在下におけるＲａｊｉ細胞に対するＮＫ細胞のＡＤＣＣ。代表的なフローサイトメトリー分析（ｇ）及び結果概要（ｈ）が、示される。
【図８】がん細胞に対するｉＰＳＣ由来γδＮＫＴ細胞の細胞毒性を示す図である。γδＮＫＴ細胞が、ＧＤＴＡ／ＮＦ−ｉＰＳＣ＃１株から生成され、様々ながん細胞株：ＭＣＦ７、ＳＷ４８０、ＢＴ４７４及びＳＫ−ＯＶ−３に対する細胞毒性アッセイに使用された。
【図９】末梢血γδＴ細胞の拡大を示す図である。ＰＢＭＣは、ゾメタ及びＩＬ−２と培養された。（ａ）：１日目及び７日目におけるＰＢＭＣ培養の形態；（ｂ）：７日目におけるＰＢＭＣ培養の表現型。
【図１０】ＧＤＴ−ｉＰＳＣの生成を示す図である。培養ＰＢＭＣが、センダイウイルスベクター又はヌクレオフェクションを使用してｉＰＳＣに再プログラムされた。（ａ〜ｆ）：ｉＰＳＣへの培養ＰＢＭＣの再プログラムの間の形態学的変化。位相差画像は、（ａ）：センダイウイルスベクターによる形質導入６日後に生存した培養ＰＢＭＣ；（ｂ）：形質導入された細胞を播種した１７日後にｍＥＦ上に現れたｉＰＳＣコロニー；（ｃ）：ｍＥＦプレートから移された後にマトリゲルコートプレートに付着しているｉＰＳＣコロニーを示す；（ｄ〜ｆ）：ヌクレオフェクションによって生成された３つのｉＰＳＣ株が、樹立された。（ｇ）：γδＴ細胞由来ｉＰＳＣ株を同定するためのＴＣＲＧ遺伝子クローンアッセイ。矢印は、ＧＤＴＡ／ＮＦ−ｉＰＳＣ＃１株における再編成されたＴＣＲＧ遺伝子の検出を示す。（ｈ）：フローサイトメトリーによる樹立された３つのｉＰＳＣ株におけるＣＤ３及びγδＴＣＲ発現の検出。
【図１１】新鮮な及び冷凍保存したＰＢＣ−ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞の拡大を示す図である。（ａ〜ｂ）：異なるＮＫ細胞数で開始する、Ｇ−Ｒｅｘ１０内でＫ５６２−ｍｂ１５−４１ＢＢＬによってＰＢＣ−ｉＰＳＣ＃９から得られた新鮮なＮＫ細胞の拡大。１４日間の拡大の間のＮＫ細胞の絶対数（ａ）及び倍率変化（ｂ）が示される。（ｃ〜ｄ）：フローサイトメトリーによって測定される１４日間の拡大後の新鮮なＮＫ細胞の表現型（ｃ）及びＫ５６２に対する細胞毒性（ｄ）。（ｅ）：凍結／解凍手順後に拡大されたＮＫ細胞の生存率。（ｆ）：冷凍保存したＮＫ細胞の拡大。（ｇ）：拡大後の、Ｋ５６２に対する冷凍保存したＮＫ細胞の細胞毒性。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
[0040]様々なｈＰＳＣ供給源から連続して自然免疫細胞を生成する強力なプロトコールはまだ確立されていない。この点において、ＣＤ３４＋細胞富化又は回転ＥＢ形成を利用せずに古典的なｈＰＳＣ供給源であるヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）からだけでなく、簡便なｈＰＳＣ供給源である末梢血細胞（ＰＢＣ）由来ｉＰＳＣ（ＰＢＣ−ｉＰＳＣ）からも機能的ＮＫ細胞を大量生産する全体的な製造スキームが設計され、実証された。
【００３２】
[0041]ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）、特に誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、がん免疫療法のための模倣ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及び模倣γδＴ細胞などの模倣自然免疫細胞を作製するための有望な出発材料を提供する。連続した大量生産を容易にするために、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）から模倣自然免疫細胞を作る全体的な製造スキームが設計され、実証された。特に、ＣＤ３４＋細胞富化及び回転胚様体形成を利用しない、ＯＰ９細胞上での逐次的造血分化並びにＯＰ９−ＤＬＬ１細胞上でのリンパ様コミットメントによってＮＫ特性を持つ模倣ＮＫ細胞又は模倣γδＴ細胞へとｈＰＳＣを分化させる強力なプロトコール。
【００３３】
[0042]したがって、本発明の第１の態様は、模倣自然免疫細胞を生成する方法であって、
（ａ）マクロファージコロニー刺激因子発現を欠損している間質細胞株とヒト多能性幹細胞を共培養して、刺激を受けた自然免疫細胞を生成するステップと；
（ｂ）幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）、インターロイキン７（ＩＬ７）及び／又はインターロイキン１５（ＩＬ１５）を含む培地中で、マクロファージコロニー刺激因子発現を欠損しており、Ｎｏｔｃｈリガンド、デルタ様１（ＤＬＬ１）を異所的に発現する間質細胞株と一緒に刺激を受けた自然免疫細胞を共培養して、分化した模倣自然免疫細胞を生成するステップと；
（ｃ）分化した模倣自然免疫細胞を毎週３〜５週間継代するステップと
を含む、方法を含む。
【００３４】
[0043]このプロトコールを使用する様々な実施形態において、ＮＫ特性を持つ機能的な模倣ＮＫ細胞及び模倣γδＴ細胞が生成された。
【００３５】
[0044]本明細書では、用語「模倣自然免疫細胞」とは、多能性幹細胞から得られ、それが模倣する自然免疫細胞と類似の特徴及びそれが模倣する自然免疫細胞と異なる特徴をいくつか有する細胞のことを指す。様々な実施形態において、模倣自然免疫細胞は、ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞と呼ばれる。例えば、様々な実施形態において、ＰＢＣ−ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞又はｉＰＳＣ由来γδＮＫＴ細胞などの模倣自然免疫細胞は、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、ＤＮＡＭ−１、ＦＡＳＬ、ＴＲＡＩＬ及び／若しくはＮＫＧ２Ａ／ＣＤ９４の発現などＮＫ細胞の特徴だけでなく、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）を発現しない又は低く発現するなど天然に存在するＮＫ細胞若しくはγδＴ細胞に存在しない新たな特徴も有する。様々な実施形態において、ＰＢＣ−ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞などの模倣自然免疫細胞は、ＣＤ５６、ＣＤ１６、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、ＤＮＡＭ−１、ＦＡＳＬ、ＴＲＡＩＬ、ＮＫＧ２Ａ／ＣＤ９４のうち少なくとも１つ又はその組合せの発現などＮＫ細胞の特徴を有する。これらの特徴は、広範囲のがん細胞を認識するという利点を有する。この実施形態において、細胞は、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）を発現しない又は低く発現するなど新たな特徴も有する。模倣自然免疫細胞の他の様々な実施形態において、そのようなｉＰＳＣ由来γδＮＫＴ細胞は、ＰＢＣ−ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞に存在する上述の特徴のいずれか１つを有するのに加えてリン抗原を認識できるγδＴＣＲを発現する。様々な実施形態において、低ＫＩＲとは、ＫＩＲの２０％未満発現；又はＫＩＲの１０％未満発現；又はＫＩＲの５％未満発現のことを指す。様々な実施形態において、模倣自然免疫細胞は、５％以下のＫＩＲ２ＤＬ１を発現する。様々な実施形態において、模倣自然免疫細胞は、１３％以下のＫＩＲ３ＤＬ１を発現する。様々な実施形態において、模倣自然免疫細胞は、７％以下のＫＩＲ３ＤＬ１を発現する。様々な実施形態において、模倣自然免疫細胞は、１８％以下のＫＩＲ２ＤＬ２を発現する。ＫＩＲ陰性又はＫＩＲ低発現模倣自然免疫細胞は、そのＨＬＡ遺伝子型に注意を払わずに広範囲にわたるレシピエントに役立ち得るという利点を有する。興味深いことに、自家ＰＢＣ−ｉＰＳＣ株で開始すると、自家ＫＩＲ陰性又はＫＩＲ低発現模倣自然免疫細胞供給源を生成して、自己ＨＬＡ分子によって強いられる阻害について心配することなく自家の組で使用することが可能になる。免疫拒絶リスクの減少と共に、自家ＰＢＣ−ｉＰＳＣ−ＮＫ細胞などこれら模倣自然免疫細胞は、より長く生存でき、したがって長期間にわたって抗腫瘍活性を提供し得る。
【００３６】
[0045]様々な実施形態において、ｉＰＳＣ由来γδＮＫＴ細胞などの模倣自然免疫細胞は、ＣＤ５６、ＣＤ１６、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、ＤＮＡＭ−１、ＦＡＳＬ、ＴＲＡＩＬ、ＮＫＧ２Ａ／ＣＤ９４のうち少なくとも１つ又はその組合せの発現などＮＫ細胞の特徴、並びにキラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）を発現しない又は低く発現するなどの新たな特徴だけでなくＣＤ３＋などのγδＴ細胞及び／若しくはＶガンマ９Ｖデルタ２（Ｖγ９Ｖδ２）などのγδＴ細胞受容体の特徴も有する。
【００３７】
[0046]マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）発現を欠損している間質細胞株は、発現されない若しくは非機能的変異体を発現するかいずれかの欠損遺伝子を有してもよく又はアンチセンス、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ若しくはタンパク質発現をノックダウンするために当業者に公知の他の任意の方法など公知の任意の方法を使用してノックダウンされてもよい。様々な実施形態において、Ｍ−ＣＳＦ発現を欠損している間質細胞株は、骨髄間葉系幹細胞などの間葉系幹細胞でもよい。様々な実施形態において、Ｍ−ＣＳＦ発現を欠損している間質細胞株は、ＯＰ９細胞でもよい。様々な実施形態において、Ｍ−ＣＳＦの機能的ｃＤＮＡは、核酸配列配列番号２によって表され、機能的Ｍ−ＣＳＦタンパク質は、アミノ酸配列配列番号３によって表される。機能不全Ｍ−ＣＳＦをもたらすこれら配列に対する任意の突然変異は、充分になる。
【００３８】
[0047]産業に適合する分化プロトコールを開発するための様々な実施形態において、古典的なＭ−ＣＳＦ欠損間質細胞株であるＯＰ９と共培養することによってｈＥＳＣとＰＢＣ−ｉＰＳＣ両方の効果的な造血分化が１２日間連続して達成され得、これが他の間質細胞株を使用するより有意に短いことが実証された。採取した造血細胞は、ＣＤ３４＋細胞を選別することなくＮＫ細胞生成に直接使用され得る。したがってＯＰ９を使用して造血分化を誘導することは、ＣＤ３４＋細胞選別及びＥＢ形成を回避することにより製造過程を有意に単純化できる。様々な実施形態において、自然免疫細胞の前駆体は、造血細胞を含む。
【００３９】
[0048]マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）発現を欠損しており、Ｎｏｔｃｈリガンド、デルタ様１（ＤＬＬ１）を異所的に発現する間質細胞株は、外因的又は異常にＤＬＬ１を発現するように操作されている前述のマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）発現を欠損している間質細胞株でもよい。Ｍ−ＣＳＦ発現を欠損している間質細胞株においてＤＬＬ１の発現を人工的に引き起こすための当業者に公知の任意の方法が、適していると予想される。様々な実施形態において、Ｍ−ＣＳＦ発現を欠損しておりＤＬＬ１を異所的に発現する間質細胞株は、ＤＬＬ１で形質導入された骨髄間葉系幹細胞などの間葉系幹細胞でもよい。様々な実施形態において、Ｍ−ＣＳＦ発現を欠損しておりＤＬＬ１を異所的に発現する間質細胞株は、ＯＰ９−ＤＬＬ１細胞であってもよい。様々な実施形態において、ＤＬＬ１  ｃＤＮＡは、核酸配列配列番号４によって表され、ＤＬＬ１タンパク質は、アミノ酸配列配列番号５によって表される。機能的ＤＬＬ１をもたらす配列の機能的変形は、充分になる。
【００４０】
[0049]ＮＫ細胞発達の強力な微環境を提供するための様々な実施形態において、ＤＬＬ１で修飾されたＯＰ９細胞株が、ＳＣＦ、ＦＬＴ３Ｌ、ＩＬ−７及びＩＬ−１５を含むＮＫ細胞促進サイトカイン混合物と一緒に使用された。そのような手法を使用してｈＰＳＣ／ＯＰ９共培養から採取される不均一な造血細胞は、ＮＫ細胞生成に直接使用され得、最終産物は、９９％超のＣＤ５６＋ＣＤ４５＋ＮＫ細胞を含む均質なリンパ集団である。そのような方法の強力さは、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の活性化による可能性が高く、その経路は、自然リンパ球様細胞の発達に重要な役割を演ずる。この分化手法は、細胞選別、ＥＢ形成、回転ＥＢ形成、Ｔ若しくはＢ細胞除去又はＮＫ細胞富化の必要性を排除する。
【００４１】
[0050]どんな理論にも限定されないが、ステップ（ａ）におけるマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）の欠損は細胞を造血細胞へと順次分化させ、ステップ（ｂ）の培地におけるマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）の欠損とＤＬＬ１の発現との組合せはリンパ様コミットメントを刺激し、次々に使用される異なる２つの間質細胞型の２相過程の組合せは固有の特徴を持つ模倣自然免疫細胞をもたらすと仮定される。様々な実施形態において、本過程は、ＣＤ５６、ＣＤ１６、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、ＤＮＡＭ−１、ＦＡＳＬ、ＴＲＡＩＬ、ＮＫＧ２Ａ／ＣＤ９４又はその組合せの発現などＮＫ細胞の特徴、及びキラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）を発現しない又は低く発現するなどＮＫ細胞に一般的でない他の特徴の発現を容易にする。
【００４２】
[0051]様々な実施形態において、ステップ（ｂ）において使用される培地は、大きい役割も演じ、様々な実施形態において、培地は幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）、インターロイキン７（ＩＬ７）を含む。様々な実施形態において、培地は幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）、インターロイキン１５（ＩＬ１５）を含む。他の様々な実施形態において、培地は幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）、インターロイキン７（ＩＬ７）及びインターロイキン１５（ＩＬ１５）を含む。一方で３つ全ての組合せが、固有の特徴を持つ模倣自然免疫細胞を生成できる。驚くべきことに、インターロイキン１５（ＩＬ１５）単独又はインターロイキン７（ＩＬ７）と組み合わせての使用は、生成される模倣自然免疫細胞のパーセンテージを有意に高めたが、インターロイキン７（ＩＬ７）単独の使用もなお、固有の特徴を持つ模倣自然免疫細胞を成功裏に生成した。当業者に公知の他のリンパ球培養培地が、基本培地としても使用され得る。
【００４３】
[0052]本明細書では用語「継代」、「継代する」、又は「継代される」とは、新鮮な培地中で細胞の一部若しくは全部を二次培養することを指す。継代は、当業者に一般に公知である又は使用される方法のいずれかを含んでもよい。様々な実施形態において、分化した模倣自然免疫細胞は、７日間毎の共培養３回後に継代され、最終的な模倣自然免疫細胞は、２１日後、好ましくは３３日までに採取される。様々な実施形態において、分化した模倣自然免疫細胞は、７日間毎の共培養４回後に継代され、最終的な模倣自然免疫細胞は、２８日後、好ましくは４０日までに採取される。様々な実施形態において、分化した模倣自然免疫細胞は、７日間毎の共培養５回後に継代され、最終的な模倣自然免疫細胞は、３５日後、好ましくは４７日までに採取される。
【００４４】
[0053]様々な実施形態において、ステップ（ａ）におけるヒト多能性幹細胞は、Ｍ−ＣＳＦ発現を欠損する間質細胞株と１２日間共培養される。様々な実施形態において、ステップ（ａ）におけるヒト多能性幹細胞は、アルファ最小必須培地（αＭＥＭ）及びウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含む単純培地中で共培養され、共培養は、３〜４日間毎に単純培地の半分を交換することによって給栄養した。当業者に公知の他の幹細胞分化培地も使用され得る。
【００４５】
[0054]様々な実施形態において、ステップ（ｂ）において使用される培地は、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）；アルファ最小必須培地（αＭＥＭ）；又はその組合せをさらに含む。
【００４６】
[0055]様々な実施形態において、ヒト多能性幹細胞は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）である。ｈＥＳＣは安全性の点で優れた選択肢であるが、ｈＥＳＣの誘起は常に倫理的議論を伴い、ｈＥＳＣ誘導体の適用は同種異形の組に限られている。
【００４７】
[0056]様々な実施形態において、ヒト多能性幹細胞は、末梢血細胞（ＰＢＣ（ｉＰＳＣ））から誘導される。ｉＰＳＣの使用は、ｉＰＳＣが、ドナー又は患者から単離される末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）など信頼性が高く、無限であり、標準化可能な出発細胞供給源から生成され得、ｉＰＳＣ誘導体が自家及び同種異系両方の適用に使用可能になるという利点を有し、さらにｈＥＳＣを使用する倫理的懸念も全くない。
【００４８】
[0057]現在では、大部分のｉＰＳＣは、成人体細胞を再プログラムすることによって生成される。出発体細胞の選択は、再プログラムの効率及び動力学だけでなく、ＧＭＰ品質ｉＰＳＣを生成する実用性にも影響を及ぼすことになる。線維芽細胞が、最も一般的に使用される体細胞であるが、それらはＧＭＰにあまり対応していない。パンチ生検による皮膚サンプル採集は侵襲性であり、皮膚生検サンプルから線維芽細胞を成長させるには時間がかかる（最長３週間）。ＧＭＰ下での線維芽細胞そのもの誘起は、すでに面倒な作業である。それに対し、末梢血採集は簡便であり、末梢血サンプルからの単核細胞の単離は１５分間しかかからないので、ＰＢＣを使用してｉＰＳＣを生成することは、より実用的な選択肢である。サンプル採集、輸送及び加工においてＧＭＰを実行する容易さのため、ＰＢＣはｉＰＳＣ誘起の魅力的な出発材料になる。最も重要なことに、２段階分化プロトコールを使用して、ＰＢＣ由来ｉＰＳＣからのＮＫ細胞など高純度で、機能的であり、拡大可能な模倣自然免疫細胞の生成が最初に実証された。
【００４９】
[0058]様々な実施形態において、再プログラム転写因子を、末梢血細胞に組み込み、成長させて、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を生成する。
【００５０】
[0059]様々な実施形態において、再プログラム転写因子には、伝統的なＹａｍａｎａｋａ転写因子であるＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−ｍｙｃがある。他の様々な実施形態において、再プログラム転写因子は、Ｏｃｔ３／４及びＳｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３又はＳｏｘ１５のうちいずれか１つを含むＳｏｘファミリーのメンバーであり得る。別法として、他の様々な実施形態において、再プログラム転写因子は、Ｏｃｔ３／４；Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３又はＳｏｘ１５のうちいずれか１つを含む転写因子のＳｏｘファミリーのメンバー；ＮＡＮＯＧ及びＬＩＮ２８であり得る。別法として、他の様々な実施形態において、再プログラム転写因子は、Ｏｃｔ３／４；Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３又はＳｏｘ１５のうちいずれか１つを含む転写因子のＳｏｘファミリーのメンバー；Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４又はＫｌｆ５を含む転写因子のＫｌｆファミリーのメンバー、及びｃ−ｍｙｃ、Ｌ−ｍｙｃ又はＮ−ｍｙｃを含む転写因子のＭｙｃファミリーのメンバーであり得る。別法として、他の様々な実施形態において、再プログラム転写因子は、Ｏｃｔ３／４；Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３若しくはＳｏｘ１５のうちいずれか１つを含む転写因子のＳｏｘファミリーのメンバー；Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４若しくはＫｌｆ５を含む転写因子のＫｌｆファミリーのメンバー並びにＧｌｉｓ１、又は分化した成体細胞から惹起される時期特異的胚抗原（ＳＳＥＡ−３及びＳＳＥＡ−４）及び／若しくはＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１抗体に認識されるエピトープを発現する多能性細胞を効果的に生成すると当業者に公知の任意の再プログラム転写因子であり得る。
【００５１】
[0060]様々な実施形態において、再プログラム転写因子は、レトロウイルス形質導入によって末梢血細胞に組み込まれてもよい。様々な実施形態において、再プログラム転写因子は、レンチウイルス発現系によって末梢血細胞に組み込まれてもよい。様々な実施形態において、再プログラム転写因子は、再プログラム因子のそれぞれが、ＳＴＥＭＣＣＡなどの自己切断性ペプチドシグナルによって分離される単一カセット再プログラムベクターを使用して末梢血に組み込まれてもよい。様々な実施形態において、再プログラム転写因子は、アデノウイルス発現系によって末梢血細胞に組み込まれてもよい。様々な実施形態において、再プログラム転写因子は、センダイウイルス発現系によって末梢血細胞に組み込まれてもよい。様々な実施形態において、再プログラム転写因子は、細胞中へのタンパク質の拡散によって末梢血細胞に組み込まれてもよい。様々な実施形態において、再プログラム転写因子は、ｍＲＮＡトランスフェクションによって末梢血細胞に組み込まれてもよい。様々な実施形態において、再プログラム転写因子は、ｍｉＲＮＡ感染又はトランスフェクションによって末梢血細胞に組み込まれてもよい。様々な実施形態において、再プログラム転写因子は、トランスポゾン系の使用を活用するＰｉｇｇｙＢａｃ系によって末梢血細胞に組み込まれてもよい。様々な実施形態において、再プログラム転写因子は、真核生物プロモータ及び発現しようとするｃＤＮＡだけを含有する小環状ベクターによって末梢血細胞に組み込まれてもよい。様々な実施形態において、再プログラム転写因子は、エピソーマルプラスミド中の再プログラム因子の一過性発現又は末梢血細胞へ再プログラム転写因子を送達して、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を効率的に生成する当業者に公知の他の任意の方法によって末梢血細胞に組み込まれてもよい。
【００５２】
[0061]様々な実施形態において、本方法は、再プログラム転写因子を末梢血細胞に組み込む前に、アミノビスホスホネート及びインターロイキン２（ＩＬ２）の存在下で末梢血細胞を拡大して、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を生成するステップをさらに含む。
【００５３】
[0062]様々な実施形態において、アミノビスホスホネート及びインターロイキン２（ＩＬ２）を使用して、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞を発現することが一般に判明しているγδＴ細胞の拡大を誘導する。どんな理論にも限定されないが、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞は、リン酸抗原に反応するので、アミノビスホスホネートは、そのようなＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の形成を刺激すると仮定される。
【００５４】
[0063]様々な実施形態において、アミノビスホスホネートは、ゾレドロナート若しくはゾレドロン酸又はゾメタとして商業的に公知であるその塩である。好ましくは、ゾレドロン酸が商業的に容易に入手できるが、任意のアミノビスホスホネートが適していると予想される。ゾレドロン酸の式は、以下の通りである。
[0064]
【化１】
2020506713.tif 000003
【００５５】
[0065]様々な実施形態において、ｉＰＳＣは、ＴＣＲＧ遺伝子形態に配置されたＴＣＲ遺伝子を含む。様々な実施形態において、ＴＣＲＧ遺伝子形態は、ＴＣＲＧへのＴＣＲの体細胞組換えを含み、ＴＣＲＤへのＴＣＲの体細胞組換えを含むＴＣＲＤ遺伝子形態も含み得る。様々な実施形態において、ＴＣＲＧ遺伝子形態は、核酸配列配列番号１によって表され、機能的ＴＣＲγの発現をもたらす配列の機能的変形も含まれることになる。様々な実施形態において、ｉＰＳＣは、ＴＣＲＤ遺伝子形態に配置されたＴＣＲ遺伝子を含む。様々な実施形態において、機能的ＴＣＲδの発現をもたらす公知の任意のＴＣＲＤ配列のＴＣＲＤへのＴＣＲの体細胞組換えを含むＴＣＲＤ遺伝子形態は、適当であると予想される。
【００５６】
[0066]本明細書では、ＴＣＲＧ遺伝子形態に配置されたＴＣＲ遺伝子は核酸分子を含み、その分子は、γＴＣＲポリペプチド、対立遺伝子バリアント、又はその断片を含む類似体を一般にコードする。ＴＣＲＧ遺伝子形態のスクリーニングに使用するＤＮＡ分子並びに（ａ）配列番号１に提示されるＤＮＡ分子又はその断片；（ｂ）（ａ）において定義されるＤＮＡ分子にハイブリダイズするＤＮＡ分子又はハイブリダイズ可能なその断片；及び（ｃ）前述のＤＮＡ分子のいずれかによってコードされるアミノ酸配列の発現をコード化するＤＮＡ分子からなる群から選択されるγＴＣＲポリペプチドの発現を確実にするＤＮＡ分子が、特に提供される。
【００５７】
[0067]ポリヌクレオチドは、その天然の状態にある場合又は当業技術者に周知の方法によって操作されているとき、ポリペプチドを「コードする」と言われ、転写並びに／又は翻訳されて、ポリペプチド若しくはその断片のためのｍＲＮＡ及び／又はポリペプチド若しくはその断片が作製され得る。アンチセンス鎖は、そのような核酸の相補体であり、コード配列はその核酸から推定され得る。
【００５８】
[0068]「ＴＣＲＧ遺伝子配列」、「ＴＣＲＧ遺伝子」、「ＴＣＲＧ核酸」又は「ＴＣＲＧポリヌクレオチド」は、正常Ｔ細胞において発現される可能性が高いポリヌクレオチドのことをそれぞれ指し、機能的ＴＣＲγポリペプチドを発現する能力があるＴＣＲＧ遺伝子配列中の突然変異が含まれる。
【００５９】
[0069]ＴＣＲＧ遺伝子配列は、コード配列、介在配列並びに転写及び／又は翻訳を制御する調節エレメントを含むものとする。ＴＣＲＧ遺伝子配列は、γＴＣＲポリペプチドを発現する能力があるＤＮＡ配列の対立遺伝子の全ての変形を含むものとする。
【００６０】
[0070]核酸又はその断片は、他の核酸（又はその相補鎖）と最適に整列された（適切なヌクレオチド挿入又は欠失を含む）場合、もう一方に対して「実質的に相同」（「又は実質的に類似」）であり、少なくとも約６０％のヌクレオチド塩基、通常少なくとも約７０％、より通常には少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５〜９８％のヌクレオチド塩基のヌクレオチド配列同一性が存在する。
【００６１】
[0071]他の好ましいポリヌクレオチドは、γＴＣＲのアミノ酸をコードする配列番号１の配列に対して４０、５０、６０又は７０％を超える同一性、より好ましくは８０、９０、９５又は９７％を超える同一性を有する連続した配列を含む。
【００６２】
[0072]ＴＣＲＧ遺伝子形態の検出は、サザンブロットハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ連鎖反応などの技術を含む当業者に公知の方法によって行われてもよく、又は他の適切な方法が使用されてもよい。
【００６３】
[0073]様々な実施形態において、これは、γδＴ細胞由来ｉＰＳＣを使用してγδＴ細胞を生成する最初の実証であるという利点を有する。γδＴ細胞からｉＰＳＣを得る並びにこれらｉＰＳＣを使用してγδＴ細胞及び新規免疫細胞型γδナチュラルキラーＴ細胞を生成する産業に適合する生産スキーム及び方法が得られる。
【００６４】
[0074]様々な実施形態において、本方法は、幹細胞因子（ＳＣＦ）；ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）；Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）、インターロイキン１５（ＩＬ１５）及びインターロイキン７（ＩＬ７）を含む培地中で、フィーダー細胞の存在下で模倣自然免疫細胞を拡大するステップをさらに含む。
【００６５】
[0075]様々な実施形態において、フィーダー細胞は、ＮＫ細胞を拡大することができる照射を受けた細胞株である。様々な実施形態において、フィーダー細胞は、ガンマ照射を受けたＫ５６２−ｍｂＩＬ１５−４１ＢＢＬである。
【００６６】
[0076]様々な実施形態において、ＰＢＣ−ｉＰＳＣ由来模倣ＮＫ細胞は、フィーダー細胞株を使用して９日間で７４倍、低温保存後に３８．５倍に拡大され得る。これらの拡大された模倣ＮＫ細胞は、Ｋ５６２細胞に対する細胞毒性の増大によって示す通り機能的により強力になった。新鮮な及び凍結したＰＢＣからｉＰＳＣを生成する可能性は、ＧＭＰ製造に一層多くの柔軟性を提供する。この目的のために、凍結ＰＢＣからｉＰＳＣを得る実現可能性が、この研究において実証された。
【００６７】
[0077]本発明の別の態様は、ＣＤ５６、ＣＤ１６、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、ＤＮＡＭ−１、ＦＡＳＬ、ＴＲＡＩＬ、ＮＫＧ２Ａ／ＣＤ９４のうち少なくとも１つ又はその組合せを発現し、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）を低く発現する又は発現しない細胞を含む、模倣自然免疫細胞を含む。これらの模倣自然免疫細胞は、任意選択でγδＴＣＲ発現が有る又はない細胞である。
【００６８】
[0078]様々な実施形態において、模倣自然免疫細胞は、ＣＤ５６を発現し、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）を低く発現する又は発現しない細胞を含む。様々な実施形態において、本明細書で上述した通り模倣自然免疫細胞は、ＣＤ１６を発現し、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）を低く発現する又は発現しない細胞を含む。様々な実施形態において、模倣自然免疫細胞は、ＮＫｐ３０を発現し、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）を低く発現する又は発現しない細胞を含む。様々な実施形態において、模倣自然免疫細胞は、ＮＫｐ４４を発現し、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）を低く発現する又は発現しない細胞を含む。様々な実施形態において、模倣自然免疫細胞は、ＮＫｐ４６を発現し、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）を低く発現する又は発現しない細胞を含む。様々な実施形態において、模倣自然免疫細胞は、ＮＫＧ２Ｄを発現し、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）を低く発現する又は発現しない細胞を含む。様々な実施形態において、模倣自然免疫細胞は、ＤＮＡＭ−１を発現し、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）を低く発現する又は発現しない細胞を含む。様々な実施形態において、模倣自然免疫細胞は、ＦＡＳＬを発現し、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）を低く発現する又は発現しない細胞を含む。様々な実施形態において、模倣自然免疫細胞は、ＴＲＡＩＬを発現し、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）を低く発現する又は発現しない細胞を含む。様々な実施形態において、模倣自然免疫細胞は、ＮＫＧ２Ａ／ＣＤ９４を発現し、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）を低く発現する又は発現しない細胞を含む。様々な実施形態において、模倣自然免疫細胞は、ＣＤ５６、ＣＤ１６、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、ＤＮＡＭ−１、ＦＡＳＬ、ＴＲＡＩＬ、ＮＫＧ２Ａ／ＣＤ９４のうちいずれか２つ、又はいずれか３つ、又はいずれか４つ、又はいずれか５つ、又はいずれか６つ、又はいずれか７つ、又はいずれか８つ、又はいずれか９つ又は全ての組合せを発現し、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）を低く発現する又は発現しない細胞を含む。
【００６９】
[0079]様々な実施形態において、細胞発現プロファイルは、タンパク質発現を測定する当業者に公知の任意の手段によって決定されてもよい。例えばＨＰＬＣのようなクロマトグラフィー方法、ＬＣＭＳ又はポリアクリルアミドゲル電気泳動。別法として、抗体方法であり、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、タンパク質免疫沈降、免疫電気泳動又はウェスタンブロッティングなどの検出用としてタグ付けされている、タンパク質にハイブリダイズする抗体。様々な実施形態において、コンジュゲートされたタグ、例えば発色タグ、磁気タグ、蛍光タグ、放射性タグ、公知の特性を持つタンパク質タグを持つ抗体は、アミノ酸配列配列番号６によって表されるタンパク質配列ＣＤ５６、アミノ酸配列配列番号７によって表されるＣＤ１６、アミノ酸配列配列番号８によって表されるＮＫｐ３０、アミノ酸配列配列番号９によって表されるＮＫｐ４４、アミノ酸配列配列番号１０によって表されるＮＫｐ４６、アミノ酸配列配列番号１１によって表されるＮＫＧ２Ｄ、アミノ酸配列配列番号１２によって表されるＤＮＡＭ−１、アミノ酸配列配列番号１３によって表されるＦＡＳＬ、アミノ酸配列配列番号１４によって表されるＴＲＡＩＬ又はアミノ酸配列配列番号１５によって表されるＮＫＧ２Ａ／ＣＤ９４のうちいずれか１つの一部にハイブリダイズできる。
【００７０】
[0080]様々な実施形態において、模倣自然免疫細胞は、γδＴＣＲ発現が有る又は無い細胞である。
【００７１】
[0081]様々な実施形態において、模倣自然免疫細胞は、本明細書に記述されるものである。
【００７２】
[0082]様々な実施形態において、模倣自然免疫細胞は、一部のＴ細胞の特徴であるＣＤ３＋の発現をさらに含む。
【００７３】
[0083]様々な実施形態において、模倣自然免疫細胞は、ガンマ／デルタＴ細胞の特徴であるガンマデルタＴＣＲの発現をさらに含む。
【００７４】
[0084]様々な実施形態において、ガンマデルタＴＣＲは、Ｖガンマ９Ｖデルタ２（Ｖγ９Ｖδ２）を含む。
【００７５】
[0085]様々な実施形態において、本技術は、ｉＰＳＣからγδＴ細胞及び新規の免疫細胞型であるγδナチュラルキラーＴ細胞を生成するための最良の方法を実証した。
【００７６】
[0086]無限の「レディーメイド」産物へとγδＴ細胞を発達させるための様々な実施形態において、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）からのγδＴ細胞の生成が初めて実証された。γδＴ細胞富化血液細胞培養から開始して、ｉＰＳＣ株が生成され、γδＴ細胞から得られた株として同定された。これらのγδＴ細胞由来ｉＰＳＣ（ＧＤＴ−ｉＰＳＣ）を使用する様々な実施形態において、γδＴ細胞が生成され、その細胞は、γδＴＣＲ＋ＣＤ３＋及びＶγ９Ｖδ２＋であった。さらに、ｉＰＳＣからＮＫ細胞を生成するために本明細書に開示されるプロトコールでＧＤＴ−ｉＰＳＣを分化させることによって生成されたγδＴ細胞は、ＮＫ細胞の多くの「抗がん」分子でさらに武装されており、それら分子には活性化受容体、天然の細胞毒性受容体及び死誘導分子がある。したがって、γδＴ細胞とＮＫ細胞両方の抗がん特徴を備えるので、これら新規のｉＰＳＣ由来「γδナチュラルキラーＴ細胞」は、広範囲のがん細胞を標的する強い療法活性を有する。
【００７７】
[0087]本発明の別の態様は、処置に使用する本明細書に記載の模倣自然免疫細胞を含む。
【００７８】
[0088]様々な実施形態において、模倣自然免疫細胞は、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、他の任意の感染症又はがんの処置に適し得る。
【００７９】
[0089]本発明の別の態様は、がんを処置するのに使用する本明細書に記載の模倣自然免疫細胞を含む。
【００８０】
[0090]様々な実施形態において、模倣自然免疫細胞は、肉腫、癌腫、及びリンパ腫、白血病、乳がん、結腸直腸がん又は卵巣がんを含めたがんの処置に適し得る。
【００８１】
[0091]様々な実施形態において、模倣自然免疫細胞は、固形腫瘍がんの処置に適し得る。様々な実施形態において、固形腫瘍には、肉腫、癌腫又はリンパ腫がある。
【００８２】
[0092]様々な実施形態において、模倣自然免疫細胞は、乳腺癌、結腸直腸腺癌、乳管癌、卵巣腺癌、乳管癌、卵巣腺癌又は白血病の処置に適し得る。
【００８３】
[0093]様々な実施形態において、白血病は、慢性骨髄性白血病又はバーキットリンパ腫を含む。
【００８４】
[0094]様々な実施形態において、模倣自然免疫細胞は、ヒト骨髄性白血病細胞、乳腺癌細胞、結腸直腸腺癌細胞、乳管癌細胞及び卵巣腺癌細胞などのがん細胞に対して有毒であることが示された。
【００８５】
[0095]本発明の別の態様は、がんの処置における薬剤を製造するための本明細書に記載の模倣自然免疫細胞の使用を含む。
【００８６】
[0096]様々な実施形態において、がんは固形腫瘍がん又は白血病である。
【００８７】
[0097]様々な実施形態において、固形腫瘍がんは、乳腺癌、結腸直腸腺癌、乳管癌又は卵巣腺癌を含む。様々な実施形態において、白血病は急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病又は慢性骨髄性白血病を含む。
【００８８】
[0098]様々な実施形態において、がんは肉腫、癌腫、リンパ腫、白血病、乳がん、結腸直腸がん又は卵巣がんを含む。
【００８９】
[0099]模倣自然免疫細胞は、ヒト骨髄性白血病細胞、乳腺癌細胞、結腸直腸腺癌細胞、乳管癌細胞及び卵巣腺癌細胞などのがん細胞に対して有毒であることが示された。
【００９０】
[00100]
本発明の別の態様は、模倣自然免疫細胞を生成するためのキットを含み、本キットは：
（ａ）ヒト多能性幹細胞株；
（ｂ）マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）発現を欠損している間質細胞株；
（ｃ）マクロファージコロニー刺激因子発現を欠損しており、Ｎｏｔｃｈリガンド、デルタ様１（ＤＬＬ１）を異所的に発現する間質細胞株；
（ｄ）Ｍ−ＣＳＦ発現を欠損している間質細胞株とヒト多能性幹細胞を共培養するための第１の単純培地；及び
（ｅ）幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）、インターロイキン７（ＩＬ７）及び／又はインターロイキン１５（ＩＬ１５）を含む第２の培地を含む。
【００９１】
[00101]様々な実施形態において、ヒト多能性幹細胞株は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を含んでもよい。他の様々な実施形態において、ヒト多能性幹細胞株は、非Ｔ細胞由来ｉＰＳＣ株又はγδＴ細胞由来ｉＰＳＣ株であり得る末梢血細胞由来ｉＰＳＣ株を含んでもよい。
【００９２】
[00102]マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）発現を欠損している間質細胞株、及びマクロファージコロニー刺激因子発現を欠損しており、Ｎｏｔｃｈリガンド、デルタ様１（ＤＬＬ１）を異所的に発現する間質細胞株について本明細書で上に記載されている。
【００９３】
[00103]様々な実施形態において、第１の単純培地は、アルファ最小必須培地（αＭＥＭ）又は他の幹細胞分化培地及びウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含む。
【００９４】
[00104]様々な実施形態において、第２の培地は幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）、インターロイキン７（ＩＬ７）を含む。様々な実施形態において、培地は幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）、インターロイキン１５（ＩＬ１５）を含む。他の様々な実施形態において、培地は幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）、インターロイキン７（ＩＬ７）及びインターロイキン１５（ＩＬ１５）を含む。一方で３つ全ての組合せが、固有の特徴を持つ模倣自然免疫細胞を生成できる。驚くべきことに、インターロイキン１５（ＩＬ１５）単独又はインターロイキン７（ＩＬ７）と組み合わせての使用は、生成される模倣自然免疫細胞のパーセンテージ及び／又は量を有意に高めたが、インターロイキン７（ＩＬ７）単独の使用もなお、固有の特徴を持つ模倣自然免疫細胞を成功裏に生成した。
【００９５】
[00105]様々な実施形態において、第２の培地は、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）；アルファ最小必須培地（αＭＥＭ）若しくは他のリンパ球培養培地；又はその組合せをさらに含む。
【００９６】
[00106]様々な実施形態において、キットは、アミノビスホスホネート及びインターロイキン２（ＩＬ２）をさらに含む。様々な実施形態において、アミノビスホスホネートは、ゾレドロン酸又はその塩である。
【００９７】
[00107]本発明の別の態様は、ＣＤ５６、ＣＤ１６、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、ＤＮＡＭ−１、ＦＡＳＬ、ＴＲＡＩＬ、ＮＫＧ２Ａ／ＣＤ９４のうち少なくとも１つ又はその組合せを発現し、キラー細胞免疫グロブリン様受容体ＫＩＲを低く発現する又は発現しない模倣自然免疫細胞を患者に投与するステップを含む、がん患者を処置する方法であって、前記模倣自然免疫細胞は、
（ａ）マクロファージコロニー刺激因子発現を欠損している間質細胞株とヒト多能性幹細胞を共培養して、自然免疫細胞の前駆体を生成するステップと；
（ｂ）Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）、インターロイキン７（ＩＬ７）及び／又はインターロイキン１５（ＩＬ１５）を含む培地中で、マクロファージコロニー刺激因子発現を欠損しており、Ｎｏｔｃｈリガンド、デルタ様１（ＤＬＬ１）を異所的に発現する間質細胞株と自然免疫細胞の前駆体を共培養して、分化した模倣自然免疫細胞を生成するステップと；
（ｃ）分化した模倣自然免疫細胞を毎週３〜５週間継代するステップと
により生成される、方法を含む。
【００９８】
[00108]様々な実施形態において、がんは、本明細書に記載の固形腫瘍がんである。様々な実施形態において、がんは、本明細書に記載の白血病である。
【００９９】
[00109]様々な実施形態において、固形腫瘍がんは、乳腺癌、結腸直腸腺癌、乳管癌又は卵巣腺癌を含む。様々な実施形態において、白血病は急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病又は慢性骨髄性白血病を含む。
【０１００】
[00110]本発明の別の態様は、末梢血単核細胞から誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を生成する方法であって、
（ａ）末梢血単核細胞に再プログラム転写因子を組み込むステップと；
（ｂ）再プログラム転写因子を組み込んだ末梢血単核細胞を多能性幹細胞に成長させるステップと
を含む、方法を含む。
【０１０１】
[00111]様々な実施形態において、単核末梢血細胞は、γδＴ細胞である。これは、γδＴ細胞からｉＰＳＣを生成する最初の実証である。他の様々な実施形態において、単核末梢血細胞は、末梢血細胞の非Ｔ細胞である。
【０１０２】
[00112]様々な実施形態において、本方法は、再プログラム転写因子をガンマデルタＴ細胞に組み込む前に、アミノビスホスホネート及びインターロイキン２（ＩＬ２）の存在下で末梢血細胞を拡大するステップをさらに含む。
【０１０３】
[00113]様々な実施形態において、アミノビスホスホネートは、ゾレドロン酸又はその塩である。
【０１０４】
[00114]様々な実施形態において、ｉＰＳＣは、ＴＣＲＧ遺伝子形態に配置されたＴＣＲ遺伝子又はＴＣＲＤ遺伝子形態に配置されたＴＣＲ遺伝子を含む。様々な実施形態において、ＴＣＲＧ遺伝子形態は、核酸配列配列番号１によって表される。機能的ＴＣＲγの発現をもたらす配列の機能的変形も十分になる。様々な実施形態において、機能的ＴＣＲδの発現をもたらす任意の公知のＴＣＲＤ配列のＴＣＲＤへのＴＣＲの体細胞組換えを含むＴＣＲＤ遺伝子形態は、適切であると予想される。
【０１０５】
[00115]本発明の別の態様は、ＴＣＲＧ遺伝子形態に配置されたＴＣＲ遺伝子又はＴＣＲＤ遺伝子形態に配置されたＴＣＲ遺伝子を含む誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含む。
【０１０６】
[00116]様々な実施形態において、再編成されたＴＣＲＧ遺伝子は、核酸配列配列番号１によって表される。機能的ＴＣＲγの発現をもたらす配列の機能的変形は、十分になる。様々な実施形態において、機能的ＴＣＲδの発現をもたらす任意の公知のＴＣＲＤ配列のＴＣＲＤへのＴＣＲの体細胞組換えを含むＴＣＲＤ遺伝子形態は、適切であると予想される。
【０１０７】
[00117]本発明の別の態様は、模倣ＮＫ細胞を生成する方法であって、
（ａ）マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）発現を欠損している間質細胞株とヒト多能性幹細胞を共培養して、自然免疫細胞の前駆体を生成するステップと；
（ｂ）幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）、インターロイキン７（ＩＬ７）及び／又はインターロイキン１５（ＩＬ１５）を含む培地中で、Ｍ−ＣＳＦ発現を欠損しており、Ｎｏｔｃｈリガンド、デルタ様１（ＤＬＬ１）を異所的に発現する間質細胞株と自然免疫細胞の前駆体を共培養して、分化した模倣自然免疫細胞を生成するステップと；
（ｃ）分化した模倣自然免疫細胞を毎週３〜５週間継代するステップと
を含む、方法を含む。
【０１０８】
[00118]本発明の別の態様は、模倣γδＴ細胞を生成する方法であって、
（ａ）マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）発現を欠損している間質細胞株とヒト多能性幹細胞を共培養して、刺激を受けた自然免疫細胞を生成するステップと；
（ｂ）幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）、インターロイキン７（ＩＬ７）及び／又はインターロイキン１５（ＩＬ１５）を含む培地中で、Ｍ−ＣＳＦ発現を欠損しており、Ｎｏｔｃｈリガンド、デルタ様１（ＤＬＬ１）を異所的に発現する間質細胞株と一緒に刺激を受けた自然免疫細胞を共培養して、分化した模倣自然免疫細胞を生成するステップと；
（ｃ）分化した模倣自然免疫細胞を毎週３〜５週間継代するステップと
を含む、模倣γδ方法を含む。
【０１０９】
[00119]本発明の別の態様は、ＣＤ５６、ＣＤ１６、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、ＤＮＡＭ−１、ＦＡＳＬ、ＴＲＡＩＬ、ＮＫＧ２Ａ／ＣＤ９４のうち少なくとも１つ又はその組合せを発現し、キラー細胞免疫グロブリン様受容体ＫＩＲを低く発現する又は発現しない細胞を含む模倣ＮＫ細胞を含む。
【０１１０】
[00120]様々な実施形態において、模倣ＮＫ細胞は、ＣＤ３又はγδＴＣＲを全く発現しない細胞を含む。
【０１１１】
[00121]本発明の別の態様は、ＣＤ５６、ＣＤ１６、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、ＤＮＡＭ−１、ＦＡＳＬ、ＴＲＡＩＬ、ＮＫＧ２Ａ／ＣＤ９４のうち少なくとも１つ又はその組合せを発現し、キラー細胞免疫グロブリン様受容体ＫＩＲを低く発現する又は発現しない細胞を含む、模倣ガンマデルタＴ細胞を含む。
【０１１２】
[00122]様々な実施形態において、模倣γδＴ細胞は、γδＴＣＲ発現又はＣＤ３発現がある細胞である。
【０１１３】
[00123]別段の規定がない限り、本明細書において使用される技術及び科学用語は全て、本明細書の主題が属する当業者によって一般に理解されるままの同じ意味を有する。本明細書では、以下の定義は、本発明の理解を容易にするために提供される。
【０１１４】
[00124]この文書の全体を通じて、それとは反対に特に明記されない限り、用語「含む」、「からなる」、「有する」等は、非限定的な、換言すれば、「を含むがそれだけには限らない」意味として解釈されることになる。
【０１１５】
[00125]さらにまた、明細書の全体を通じて議論を別途必要としない限り、単語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」又は「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」若しくは「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」のような変形は、記載されている整数又は整数の群を内包するが、他の任意の整数又は整数の群を排除しないことを意味すると理解されるものとする。
【０１１６】
[00126]本明細書及び添付の特許請求の範囲に使用される、単数形「１つの（ａ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈に別段の明確な指図がない限り複数の言及を含む。
【実施例】
【０１１７】
[00127]ｈＰＳＣから自然免疫細胞を大規模生産するための全体のスキームが、記述される。既存のプロトコールと比較すると、本手法は、より産業に対応しており、ＮＫ細胞療法剤を作製するのに必要とされる利便性を提供し：（１）出発材料ＰＢＣ−ｉＰＳＣが、簡便で、非常に利用しやすく、ＧＭＰ適合しているｈＰＳＣ供給源であり；（２）分化過程が、細胞選別、ＥＢ形成及び回転ＥＢ形成を除外することによって単純化され；（３）生成されたＰＢＣ−ｉＰＳＣ由来細胞がすでに高純度で、機能的な集団であり、Ｔ細胞及びＢ細胞除去又は自然免疫細胞富化の必要性を不要にし；（４）新鮮な及び冷凍保存したＮＫ細胞の両方が、短期間で拡大され得、このことが、輸送のロジスティクス及びＮＫ細胞療法剤の製造を簡単にし；（５）さらなる機能的成熟が、拡大後に達成され得；（６）ほとんどのＰＢＣ−ｉＰＳＣ由来自然免疫細胞が、ＫＩＲ陰性であり、このことは、これらの自然免疫細胞が、細胞毒性を減少させる可能性がある阻害性シグナル伝達を懸念することなく様々なレシピエントに対する普遍的な細胞供給源として役立ち得ることを意味する。したがって、ＰＢＣ−ｉＰＳＣを使用して、自然免疫細胞を得ることは、自然免疫細胞療法剤の大規模生産に適したプラットフォームである。
【０１１８】
模倣自然免疫細胞の生成
[00128]様々なｈＰＳＣ供給源から連続して自然免疫細胞を生成する強力なプロトコールは、まだ確立されていない。この点において、ＣＤ３４＋細胞富化又は回転ＥＢ形成を利用せずに古典的なｈＰＳＣ供給源であるヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）からだけでなく、簡便なｈＰＳＣ供給源である末梢血細胞（ＰＢＣ）由来ｉＰＳＣ（ＰＢＣ−ｉＰＳＣ）からも機能的ＮＫ細胞を大量生産する全体的な製造スキームが、設計され、実証された。
【０１１９】
[00129]ｈＥＳＣからのＮＫ細胞の生成。
[00130]細胞培養。ｈＰＳＣ株、Ｈ１（ＷｉＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｉｃｅｌｌ．ｏｒｇ）を、マトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｄｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ）コーティングした６穴プレート上でｍＴｅＳＲ１（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ、Ｃａｎａｄａ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｔｅｍｃｅｌｌ．ｃｏｍ）で培養した。ＯＰ９細胞（アメリカンタイプカルチャーコレクション［ＡＴＴＣ］、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）及びＯＰ９／Ｇ−ＤＬＬ１細胞（理研ＢＲＣ細胞バンク、茨城、日本、ｈｔｔｐ：／／ｃｅｌｌ．ｂｒｃ．ｒｉｋｅｎ．ｊｐ／ｅｎ／）を、２０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（ＨｙＣｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｙｃｌｏｎｅ．ｃｏｍ）で補充したαＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ｈｔｔｐ：／／ｃｏｒｐｏｒａｔｅ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ）で培養した。
【０１２０】
[00131]２段階プロトコール。第１の段階において、ＯＰ９細胞を、０．１％ゼラチン（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）コーティングしたＴ７５フラスコに播種した。コンフルエンスになったら、ＯＰ９細胞培養を、培地の半分を交換することによって給栄養し、４〜６日間過剰に成長させた。ｈＥＳＣ  １〜１．５×１０６個を、１０％ＦＢＳで補充したαＭＥＭ中で過剰に成長させたＯＰ９細胞上に次いで播種し、１２日間分化させた。ｈＥＳＣ／ＯＰ９共培養を、培地の半分を交換することによって４日間毎に給栄養した。第２の段階において、分化した細胞を、１ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼＩＶ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してｈＥＳＣ／ＯＰ９共培養から採取した。ＯＰ９細胞を、プラスチック付着４５分間によって除去し、細胞集塊を、１００μｍセルストレイナー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によってさらに除去した。残った非接着細胞を、１０％  ＦＢＳ、１０ｎｇ／ｍＬ  ＳＣＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、ＮＪ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ．ｃｏｍ）、５ｎｇ／ｍＬ  ＦＬＴ３Ｌ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）を５ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ−７（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）及び／又は１０ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ−１５（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）と合わせて含有するαＭＥＭを使用してＴ７５フラスコ上で成長させたＯＰ９−ＤＬＬ１と７日間次いで共培養した。この後、分化した細胞を、ベルセン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して採取し、６穴プレートで成長させた新たなＯＰ９−ＤＬＬ１上で週１回の基準でさらに３〜４週間共培養した。
【０１２１】
[00132]ｈＰＳＣからのＮＫ細胞誘起の強力な２段階プロトコールを確立するために（図１ａ）、広く使用されているｈＥＳＣ株、Ｈ１（図１ｂ）を使用した。第１の段階において、造血分化を誘導するために、Ｈ１細胞を、過剰に成長させたＯＰ９細胞、骨髄間質細胞株と共培養した。共培養１２日目に、多くの分化したコロニー（図１ｃ）及びＣＤ３４＋細胞の小さい集団（図１ｊ）を連続して観察した。第２の段階において、リンパ様コミットメントを誘導するために、これらの分化した細胞を採取し、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）及びＩＬ−７の存在下で、週に１回の基準で、Ｎｏｔｃｈリガンド、デルタ様１（ＤＬＬ１）で修飾したＯＰ９細胞株であるＯＰ９−ＤＬＬ１と共培養した（図１ａ）。ＯＰ９−ＤＬＬ１との第１の共培養の７日後（１９日目）に、分化した細胞のほとんどが付着細胞としてなお成長し（図１ｄ）；第２の共培養後（２６日目）、いくつかの明るい、円形の、半付着細胞が現れ始め（図１ｅ）；第３の共培養後（３３日目）、これら細胞は分離し、穴の中心に集合し（図１ｆ、図１ｇ）；第４の共培養後（４０日目）、さらに多くの懸濁細胞が現れた（図１ｈ、図１ｉ）。形態学的には、これらの懸濁細胞は、小さい、円形の、明るいリンパ球様細胞であり（図１ｇ、図１ｉ）；表現型的には、それら細胞は、散布図上で定義した集団であり（図１ｋ、図１ｌ）；それら細胞のほとんどは、ＣＤ４５＋ＣＤ５６＋であるが、ＣＤ３−ＴＣＲαβ−ＣＤ４−ＣＤ８−であり（図１ｋ、図１ｌ）、これは、ＮＫ細胞に典型的である。したがって、造血分化及びリンパ様コミットメントを経ることによって、ＮＫ細胞を、ＣＤ３４＋細胞を富化する又は回転ＥＢを形成することなくｈＥＳＣから得ることができる。
【０１２２】
[00133]ｉＰＳＣからのＮＫ細胞の生成。
[00134]細胞培養。ＯＰ９細胞（アメリカンタイプカルチャーコレクション［ＡＴＴＣ］、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）及びＯＰ９／Ｇ−ＤＬＬ１細胞（理研ＢＲＣ細胞バンク、茨城、日本、ｈｔｔｐ：／／ｃｅｌｌ．ｂｒｃ．ｒｉｋｅｎ．ｊｐ／ｅｎ／）を、２０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（ＨｙＣｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｙｃｌｏｎｅ．ｃｏｍ）で補充したαＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ｈｔｔｐ：／／ｃｏｒｐｏｒａｔｅ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ）で培養した。
【０１２３】
[00135]２段階プロトコール。第１の段階において、ＯＰ９細胞を、０．１％ゼラチン（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）コーティングしたＴ７５フラスコに播種した。コンフルエンスになったら、ＯＰ９細胞培養を、培地の半分を交換することによって給栄養し、４〜６日間過剰に成長させた。ｈＥＳＣ  １〜１．５×１０６個を、１０％ＦＢＳで補充したαＭＥＭ中で過剰に成長させたＯＰ９細胞上に次いで播種し、１２日間分化させた。ｈＥＳＣ／ＯＰ９共培養を、培地の半分を交換することによって４日間毎に給栄養した。第２の段階において、分化した細胞を、１ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼＩＶ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してｈＥＳＣ／ＯＰ９共培養から採取した。ＯＰ９細胞を、プラスチック付着４５分間によって除去し、細胞集塊を、１００μｍセルストレイナー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によってさらに除去した。残った非接着細胞を、１０％  ＦＢＳ、１０ｎｇ／ｍＬ  ＳＣＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、ＮＪ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ．ｃｏｍ）、５ｎｇ／ｍＬ  ＦＬＴ３Ｌ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）を５ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ−７（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）及び／又は１０ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ−１５（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）と合わせて含有するαＭＥＭを使用してＴ７５フラスコ上で成長させたＯＰ９−ＤＬＬ１と７日間次いで共培養した。この後、分化した細胞を、ベルセン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して採取し、６穴プレートで成長させた新たなＯＰ９−ＤＬＬ１上で週１回の基準でさらに３〜４週間共培養した。
【０１２４】
[00136]ＰＢＣ−ｉＰＳＣからのＮＫ細胞の生成。適正製造基準（ＧＭＰ）下でｈＰＳＣからのＮＫ細胞の生産をさらに容易にするには、ＧＭＰ適合している簡便なｈＰＳＣ供給源から開始することが重要である。線維芽細胞又は臍帯血ＣＤ３４＋細胞から生成されたｈＥＳＣ及びｉＰＳＣを使用して、ＮＫ細胞を得たとはいえ、末梢血細胞から生成されるｉＰＳＣ（ＰＢＣ−ｉＰＳＣ）は新規であるが、製造の見地からより利用しやすく、実用可能な選択肢である。ＮＫ細胞生成にＰＢＣ−ｉＰＳＣを使用する実現可能性を実証するために、再プログラム因子を保有しているセンダイウイルスベクターを使用してＰＢＣ由来ｉＰＳＣ株を最初に生成し（図２ａ）、以下に記述した。これらの得られたＰＢＣ−ｉＰＳＣは、典型的なｈＰＳＣ形態及び表現型を示した（図２ａ）。
【０１２５】
[00137]次に、ＮＫ細胞生成の２段階プロトコールを検討して、本方法がこれらのＰＢＣ−ｉＰＳＣになお適用可能かどうか決定した。ＰＢＣ−ｉＰＳＣ＃９株（図２ｂ）を使用して、有意なＣＤ３４＋集団を含有する分化した細胞を、ＯＰ９との共培養１２日後に得た（図２ｃ）。ＣＤ３４＋細胞を選別せずにこれらの分化した細胞を採取し、ＯＰ９−ＤＬＬ１と直接共培養した。小さいＣＤ４５＋ＣＤ５６＋集団が、２回目の共培養（２６日間）後に現れ（図２ｄ）；この集団は、第５の共培養後（４７日目）にさらに明瞭になり、リンパ球様細胞を６１％含んだ（図２ｅ）。ＴＣＲαβもＣＤ３発現も、分化過程の全体を通じて：多能性幹細胞（図２ｂ）、造血細胞（図２ｃ）又はリンパ球様細胞（図２ｄ、図２ｅ）に観察されなかった。さらに、明らかなＣＤ４又はＣＤ８発現が、リンパ球様細胞に存在せず（図２ｄ、図２ｅ）、このことからまた、２段階プロトコールを使用して、ＰＢＣ−ｉＰＳＣからＮＫ細胞を生成するできることを確認した。
【０１２６】
[00138]ＰＢＣ−ｉＰＳＣから得られたＮＫ細胞の純度及び収量を改善する。ＧＭＰ適合している出発ｈＰＳＣ供給源に加えて、ＰＢＣ−ｉＰＳＣから得られるＮＫ細胞の純度及び収量のさらなる改善が、この新規のＮＫ細胞供給源の生産及び翻訳使用を容易にすることになる。この目的のために、異なるサイトカインを試験してＮＫ細胞関与を増強した（図２ｆ）。結果（表１）は、リンパ様コミットメントの間にＳＣＦ及びＦＬＴ３Ｌと一緒にＩＬ−７を使用することにより、分化４０日目に純度６１％及びＰＢＣ−ｉＰＳＣ  ３×１０６個からＣＤ５６＋ＣＤ４５＋細胞０．２１×１０６個の収量がもたらされ；ＩＬ−１５を使用した場合純度９９％及び収量０．７５×１０６個に増大し；一方で、ＩＬ−７及びＩＬ−１５の併用使用は、４０日目に純度９９％及び収量７．９３×１０６個を与え、４７日目に１５×１０６個にさらに増大したことを示した。
【０１２７】
[00139]
【表１】
2020506713.tif 000004
【０１２８】
[00140]ｉＰＳＣからのγδＮＫＴ細胞の生成。
[00141]細胞培養。生成されたｉＰＳＣ株を、マトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｄｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ）コーティングした６穴プレート上でｍＴｅＳＲ１（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ、Ｃａｎａｄａ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｔｅｍｃｅｌｌ．ｃｏｍ）で培養した。細胞株：ＯＰ９、（アメリカンタイプカルチャーコレクション［ＡＴＴＣ］、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）を、ＡＴＣＣによって推奨される通り培養した。細胞株ＯＰ９−ＤＬＬ１（理研ＢＲＣ細胞バンク、茨城、日本、ｈｔｔｐ：／／ｃｅｌｌ．ｂｒｃ．ｒｉｋｅｎ．ｊｐ／ｅｎ／）を、２０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（ＨｙＣｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｙｃｌｏｎｅ．ｃｏｍ）で補充したαＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ｈｔｔｐ：／／ｃｏｒｐｏｒａｔｅ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ）中で培養した。
【０１２９】
[00142]ＧＤＴ−ｉＰＳＣからのγδＴ細胞の生成。ＧＤＴ−ｉＰＳＣからγδＴ細胞を生成するために、ｉＰＳＣからＮＫ細胞を生成するために上述した、これまでに確立されている２段階プロトコールを、使用した。第１の段階において、ｉＰＳＣ  １〜１．５×１０６個を、２０％ＦＢＳで補充したαＭＥＭ中で過剰に成長させたＯＰ９又はＯＰ９−ＤＬＬ１細胞上に播種し、１２日間分化させた。共培養を、半分の培地を交換することによって、４日毎に給栄養した。第２の段階において、分化した細胞を、１ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼＩＶ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して共培養から採取した。ＯＰ９又はＯＰ９−ＤＬＬ１細胞を、プラスチック付着４５分間によって除去し、細胞集塊を、１００μｍセルストレイナー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によってさらに除去した。残った非接着細胞を、２０％  ＦＢＳ、１０ｎｇ／ｍＬ  ＳＣＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、ＮＪ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ．ｃｏｍ）、５ｎｇ／ｍＬ  ＦＬＴ３Ｌ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）を５ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ−７（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）及び／又は１０ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ−１５（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）と合わせて含有するαＭＥＭを使用してＴ７５フラスコ上で成長させたＯＰ９−ＤＬＬ１細胞と７日間次いで共培養した。この後、分化した細胞を、ベルセン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して採取し、６穴プレートで成長させた新たなＯＰ９−ＤＬＬ１細胞と週１回の基準でさらに３〜４週間共培養した。
【０１３０】
[00143]γδＴ細胞を生成するために、これまでに上述したプロトコールを使用してｉＰＳＣからＮＫ細胞を生成し、それにより後述するγδＴ細胞由来ＧＤＴＡ／ＮＦ−ｉＰＳＣ＃１株を分化させた。分化３３日目に均質なリンパ集団が観察され（図３ａ）、そのうち５３％がγδＴＣＲ＋ＣＤ３＋であった（図３ｂ）。これらγδＴＣＲ＋ＣＤ３＋細胞のほとんどは、Ｖγ９Ｖδ２＋（図３ｃ）及びＣＤ５６＋（図３ｄ）でもあり、このことは、これらのｉＰＳＣ由来γδＴ細胞が独占的に、ＮＫ細胞様表現型を有し得るＶγ９Ｖδ２サブセットであることを示した。この結果は、リンパ集団の５３％がＣＤ３＋ＣＤ５６＋であり、４５％がＣＤ３−ＣＤ５６＋（図３ｅ）であり、５４％がＶδ２＋（図３ｆ）であった発見とよく符合した。４７日目に、リンパ集団は、より明らかになった（図３ｇ、図３ｍ）。より多くのγδＴＣＲ＋ＣＤ３＋細胞が現れ（図３ｈ）、依然としてＶγ９Ｖδ２＋（図３ｉ）及びＣＤ５６＋（図３ｊ）のままであった。この変化は、ＣＤ３＋ＣＤ５６＋集団及びＶδ２＋集団の増大並びにＣＤ３−ＣＤ５６＋集団の減少によってさらに確認された（図３ｋ、図３ｌ）。同様に、分化に非Ｔ細胞由来ＧＤＴＡ／ＮＦ−ｉＰＳＣ＃３を使用する場合、明らかなリンパ集団が４７日目に依然として観察され（図３ｎ）；しかしながら、この集団はＣＤ３−ＣＤ５６＋であり（図３ｐ）、γδＴＣＲ＋ＣＤ３＋細胞（図３ｏ）又はＶδ２＋細胞（図３ｑ）は全く観察されなかった。これらの発見は、γδＴ細胞由来ｉＰＳＣ株からのＣＤ５６＋Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞の生成が起こることを強く示唆した。
模倣自然免疫細胞の特徴付け
【０１３１】
[00144]模倣ＮＫ細胞
[00145]フローサイトメトリー。ｈＰＳＣ分化の間の表現型の変化を研究するために、細胞を採取し、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＴＣＲαβ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ａ、ＣＤ９４、ＣＤ１５８ｅ１／ｅ２、Ｃｄ１５８ｉ、ＣＤ１５８ａ，ｈに対する抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ及びＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｂｅｃｋｍａｎｃｏｕｌｔｅｒ．ｃｏｍ）を使用して染色し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。
【０１３２】
[00146]ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ。ＩＦＮγ分泌を検出するために、ヒトＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔＰｒｏキット（ＭＡＢＴＥＣＨ、Ｎａｃｋａ  Ｓｔｒａｎｄ、Ｓｗｅｄｅｎ、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｍａｂｔｅｃｈ．ｃｏｍ）を使用した。手短に言えば、ＰＢＣ−ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞０〜１０×１０４個及びＫ５６２又はＲａｊｉ細胞５×１０４個を、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴプレート上で終夜共インキュベートした。ＩＦＮγスポットを、製造業者の手引きにしたがって染色した。ＧｒＢ分泌を測定するために、Ｈｕｍａｎ  Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ  ＥＬＩＳｐｏｔキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｒｎｄｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ）を使用した。手短に言えば、ＰＢＣ−ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞０〜１．２×１０４個を、Ｋ５６２細胞５×１０４個の有り又は無しでヒトＧｒＢマイクロプレート上で４時間インキュベートした。ＧｒＢスポットを、製造業者の手引きに記載の通り次いで染色した。ＩＦＮγ及びＧｒＢスポットを、ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＣＴＬ、Ｓｈａｋｅｒ  Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＯＨ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ．ｃｏｍ）を使用して計数した。
【０１３３】
[00147]ＩＬ７及びＩＬ１５サイトカインの組合せを使用して生成されるＮＫ細胞。最適化されたサイトカインの組合せを使用して、高純度のリンパ球様細胞を、ＰＢＣ−ｉＰＳＣ＃９から得た（図４）。これら細胞は、典型的なＮＫ細胞形態を示した（図４ａ）。それら細胞は、細胞画像（図４ａ）及び散布図（図４ｂ）によって示される通り、均質な集団であった。それら細胞のほとんどは、典型的なＮＫ細胞表現型であるＣＤ５６＋ＣＤ４５＋ＣＤ３−である（図４ｂ）。これら細胞は、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６及びＮＫＧ２Ｄのような活性化受容体並びにＣＤ９４：ＮＫＧ２Ａのような阻害性受容体も発現した（図４ｂ）。それら細胞は、ＣＤ１６＋（図４ｂ）でもあり、ＣＤ１６＋は、ＮＫ細胞の抗体依存細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に重要である。キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）に関しては、それら細胞は、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ４及びＫＩＲ３ＤＳ１の発現がない又は低いことを示した。ごくわずかな細胞しか、ＣＤ１５８ｂ（１８％）又はＣＤ１５８ｅ／ｋ（１３％）抗体によって染色されず、このことは、ＮＫ細胞のほとんどがＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ３ＤＬ１及びＫＩＲ３ＤＬ２について陰性であることを示唆した（図４ｂ）。この阻害性ＫＩＲ陰性表現型は、これらＮＫ細胞の細胞毒性に潜在的に有益であり得る。したがって、最適化された２段階プロトコールを使用して、ＰＢＣ−ｉＰＳＣから多数の高純度ＮＫ細胞が、連続して生成され得る。
【０１３４】
[00148]模倣γδＮＫＴ細胞
[00149]フローサイトメトリー。ｉＰＳＣ分化の間の表現型変化を研究するために、細胞を採取し、ＣＤ３、ＣＤ５６、γδＴＣＲ、Ｖγ２ＴＣＲ、Ｖγ９ＴＣＲ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ａ、ＣＤ９４、ＣＤ１６、ＦａｓＬ、ＴＲＡＩＬ、ＤＮＡＭ−１、ＣＤ１５８ａ、ｈ（ＫＩＲ２ＤＬ１／Ｓ１）、ＣＤ１５８ｂ（ＫＩＲ２ＤＬ２／Ｌ３／Ｓ２）、ＣＤ１５８ｆ（ＫＩＲ２ＤＬ５）、ＣＤ１５８ｉ（ＫＩＲ２ＤＳ４）、ＣＤ１５８ｅ１／ｅ２（ＫＩＲ３ＤＬ１／Ｓ１）及びＣＤ１５８ｅ／ｋ（ＫＩＲ３ＤＬ１／Ｌ２）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｂｅｃｋｍａｎｃｏｕｌｔｅｒ．ｃｏｍ；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｌｔｅｎｙｉｂｉｏｔｅｃ．ｃｏｍ）に対する抗体を使用して染色し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。
【０１３５】
[00150]ドナー由来ＰＢ−ＮＫ細胞の拡大。ＰＢ−ＮＫ細胞を得るために、健康なドナーのＰＢＭＣ  ２×１０６個を、立位でＴ７５フラスコを使用して１０％ＦＢＳ及び５０ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ−２で補充したＣｅｌｌＧｒｏ  ＳＣＧＭ無血清培地においてγ照射した（１００Ｇｙ）Ｋ５６２−ｍｂＩＬ１５−４１ＢＢＬ細胞４×１０６個と共培養した。半分の培地を新鮮な培地と置き換え、新鮮なＩＬ−２を７日目まで２〜３日間毎に補給した。この後、細胞２×１０６個を、Ｋ５６２−ｍｂＩＬ１５−４１ＢＢＬ細胞２×１０６個でさらに２週間毎週再刺激した。細胞を、実験ために２１日目に採取した。
【０１３６】
[00151]ＣＤ５６は、ＮＫ細胞の典型的な表面マーカーである。そのような生成されたｉＰＳＣ由来模倣γδＴ細胞（ｉＰＳＣ−γδＴ細胞）が、ＮＫ細胞の他の表面分子も発現するかどうか解明するために、詳細な表現型タイピングを実行した（図５ａ）。フローサイトメトリー分析は、ほとんどのｉＰＳＣ−γδＴ細胞が、活性化受容体：ＮＫＧ２Ｄ及びＤＮＡＭ−１；天然の細胞毒性受容体（ＮＣＲ）：ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４及びＮＫｐ４６；並びに死誘導リガンド：ＴＲＡＩＬを高度に発現したことを示した（図５ａ）。加えて、４１％が、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する表面分子であるＣＤ１６を発現し；５％が、別の死誘導リガンドであるＦａｓＬを発現した（図５ａ）。ｉＰＳＣ−γδＴ細胞のこの表面分子発現プロファイルは、ＴＲＡＩＬ発現が低レベルである拡大された末梢血ＮＫ（ＰＢ−ＮＫ）細胞のプロファイル（図５ｃ）と密接に似ていた。それに対し、拡大された末梢血γδＴ（ＰＢ−γδＴ）細胞は、ＮＫＧ２Ｄ及びＤＮＡＭ−１も発現したが、ＮＣＲ、死誘導リガンド及びＣＤ１６を発現しなかった（図５ｂ）。阻害性受容体及びキラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）に関しては、ｉＰＳＣ−γδＴ細胞は、ＰＢ−ＮＫ細胞及びＰＢ−γδＴ細胞の様にＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ受容体を発現し；しかしながら、ｉＰＳＣ−γδＴ細胞は、ＰＢ−ＮＫ細胞及びＰＢ−γδＴ細胞とは異なりＫＩＲを発現せず（図６ａ〜図６ｃ）、レシピエントのＨＬＡ表現型による制限をなくす。したがって、ｉＰＳＣ−γδＴ細胞は、ＰＢ−γδＴ細胞及びＰＢ−ＮＫ細胞の両方の組に観察される「抗がん」分子で武装しており、そのような新規のＧＤＴ−ｉＰＳＣ由来「γδＮＫＴ細胞」は、広範囲のがん細胞と戦い得る。
模倣自然免疫細胞を使用するがん免疫療法
【０１３７】
[00152]模倣ＮＫ細胞による処置
[00153]細胞培養。Ｋ５６２細胞（ＡＴＣＣ）、Ｋ５６２−ｍｂ１５−４１ＢＢＬ細胞（Ｄａｒｉｏ  Ｃａｍｐａｎａ教授、Ｐａｅｄｉａｔｒｉｃｓ学部、シンガポール国立大学、シンガポール、によって快く提供された）及びＲａｊｉ細胞（ＡＴＣＣ）を、１０％  ＦＢＳで補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で培養した。
【０１３８】
[00154]細胞毒性及びＡＤＣＣアッセイ。標的細胞に対するＰＢＣ−ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞の直接細胞毒性を検出するために、フローサイトメトリー方法を使用した。手短に言えば、ＮＫ細胞０〜０．５×１０６個を、カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）標識したＫ５６２又はＲａｊｉ細胞２×１０４個と４〜６時間同時インキュベートした。サンプルを、７−アミノ−アクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で、氷上で次いで１０分間染色した。洗浄後に、標的細胞死を、ＣＦＳＥ陽性集団中の７−ＡＡＤ染色細胞のパーセンテージに基づいてＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターによって評価した。ＰＢＣ−ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞のＡＤＣＣ機能を評価するために、ＮＫ細胞及びＣＦＳＥ標識Ｒａｊｉ細胞の共培養を、様々な濃度のヒトＩｇＧ１（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、抗ＣＤ２０−ｍＩｇＧ１（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ．ｃｏｍ）又は抗ＣＤ２０−ｈＩｇＧ１（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）の存在下で準備し、標的細胞死を、上記の通りフローサイトメーターによって測定した。
【０１３９】
[00155]ＰＢＣ−ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞の機能。活性化に応じてインターフェロンγ（ＩＦＮγ）などのサイトカインを分泌することは、ＮＫ細胞の重要な機能的特徴である。ＩＦＮγ分泌を調査するために、ＰＢＣ−ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞を刺激細胞と共培養し、酵素結合ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイを次いで使用して、ＩＦＮγ分泌ＮＫ細胞を検出した。図７ａ及び図７ｂに示すように、ＮＫ細胞感受性細胞株であるＫ５６２は、ＰＢＣ−ｉＰＳＣ＃９から得られたＮＫ細胞によるＩＦＮγ分泌を効率的に刺激し；それに対し、ＮＫ細胞耐性細胞株であるＲａｊｉは、非常に低い効率を示し、このことは、これらのＰＢＣ−ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞が、刺激に応答してサイトカインを分泌することができることを示唆した。
【０１４０】
[00156]細胞毒性は、ＮＫ細胞を保証する別の特徴であり、グランザイムＢ（ＧｒＢ）の様な細胞傷害性分子の分泌に依存する。ＥＬＩＳＰＯＴ結果は、高頻度のＰＢＣ−ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞が、Ｋ５６２による刺激に応じてＧｒＢを分泌することを示し（図７ｃ、図７ｄ）、これにより、これらｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞の機能的能力がさらに確認される。より重要なことに、これらｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞は、初代ＮＫ細胞と類似の直接死滅プロファイルを示した。図７ｅ及び図７ｆにおいて実証された通り、ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞は、ＮＫ感受性白血病細胞Ｋ５６２を直接死滅させ得るが、ＮＫ非感受性リンパ腫細胞Ｒａｊｉを死滅し得ない。興味深いことに、これらｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞のＡＤＣＣ機能を活用することによって、Ｒａｊｉ細胞を死滅させることがなおできた（図７ｇ、図７ｈ）。図７ｇ及び図７ｈに示すように、ＮＫ細胞単独では、Ｒａｊｉ細胞を死滅させることができず；ヒトＩｇＧ１又は抗ＣＤ２０−ｍＩｇＧ１添加のいずれでもできず；しかしながら、抗ＣＤ２０−ｈＩｇＧ１の存在下で、Ｒａｊｉ細胞に対する明らかな細胞毒性が観察された。したがって、これらＰＢＣ−ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞のＡＤＣＣ機能は、悪性細胞の死滅範囲を有意に広げることができる。
【０１４１】
[00157]模倣γδＮＫＴ細胞による処置
[00158]細胞培養。細胞株：ＳＫ−ＯＶ−３、ＳＷ４８０、ＭＣＦ−７及びＢＴ４７４（アメリカンタイプカルチャーコレクション［ＡＴＴＣ］、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）を、ＡＴＣＣによって推奨される通り培養した。
【０１４２】
[00159]細胞毒性アッセイ。標的細胞に対するｉＰＳＣ由来γδＮＫＴ細胞の細胞毒性を検出するために、フローサイトメトリーに基づく方法を使用した。手短に言えば、γδＮＫＴ細胞０〜０．５×１０６個を、カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）標識したがん細胞２×１０４個と、様々なエフェクター対標的比（Ｅ：Ｔ）で４〜６時間共培養した。サンプルを、７−アミノ−アクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で、氷上で次いで１０分間染色した。洗浄後に、標的細胞死を、ＣＦＳＥ陽性集団中の７−ＡＡＤ染色細胞のパーセンテージによってフローサイトメーターで評価した。
【０１４３】
[00160]γδＮＫＴ細胞の細胞毒性を検査するために、４つの異なる固形腫瘍細胞株：ＭＣＦ７（乳腺癌）、ＳＷ４８０（結腸直腸腺癌）、ＢＴ４７４（乳管癌）及びＳＫ−ＯＶ−３（卵巣腺癌）を標的細胞として使用した。結果は、γδＮＫＴ細胞がこれらがん細胞株を死滅させ得ることを示した（図８）。いくつかの事例において、細胞毒性が、非常に低いＥ：Ｔ比で観察されても（図８）、γδＮＫＴ細胞の高い有効性を示唆した。
末梢血細胞からのｉＰＳＣの生成
【０１４４】
[00161]ＰＢＣからのｉＰＳＣの生成。ＰＢＣからｉＰＳＣを生成するために、健康なドナー由来凍結末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を解凍し、完全ＲＰＭＩ１６４０培地中で、５μｇ／ｍＬフィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ）と２日間培養した。完全ＲＰＭＩ１６４０培地は、ＲＰＭＩ１６４０（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１０％熱不活化ヒト血清ＡＢ（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｗｅｓｔ  Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ、ＣＡ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｍｂｉｏ．ｃｏｍ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、０．１ｍＭ非必須アミノ酸（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び０．１ｍＭ  ２メルカプトエタノール（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で構成される。培養した血液細胞を、１０ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ−２、ＩＬ−７及びＩＬ−１５を含有する完全ＲＰＭＩ１６４０培地中で、ＭＯＩ  ５：５：３（ＫＯＳ、ｈｃ−Ｍｙｃ、ｈＫｌｆ４）で、ＣｙｔｏＴｕｎｅ  ｉＰＳ  ２．０  Ｓｅｎｄａｉ  Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のセンダイ再プログラムベクターで次いで終夜形質導入した。形質導入した細胞を、次いで洗浄し、マイトマイシンＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）処理したマウス胚線維芽細胞（ｍＥＦ）と成長させる６穴プレートに播種する前に５日間培養した。培地の半分を、播種後１〜３日目にｉＰＳＣ培地で置き換え、培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、２０％ノックアウト血清代替物（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１％非必須アミノ酸、０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール及び５ｎｇ／ｍＬ塩基性線維芽細胞成長因子（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）で構成される。播種３〜４週間後、得られたｉＰＳＣを、ｉＰＳＣ培地中のｍＥＦ上で最初に、その後ｍＴｅＳＲ１中のマトリゲルコートプレート上で拡大した。
【０１４５】
[00162]免疫染色。多能性マーカーを検出するために、ＰＢＣ−ｉＰＳＣを、４％パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中で、室温で１５分間固定し、続いて５％ウシ血清アルブミンで１時間ブロッキングした。細胞を、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１に対する一次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と室温で１時間次いでインキュベートした。洗浄後に、細胞を、蛍光顕微鏡下で可視化するために、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と室温で１時間インキュベートした。アルカリホスファターゼ（ＡＰ）を検出するために、Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｌｉｖｅ  Ｓｔａｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造業者のプロトコールにしたがって使用した。ＮＫ細胞生成にＰＢＣ−ｉＰＳＣを使用する実現可能性を実証するために、再プログラム因子を保有しているセンダイウイルスベクターを使用してＰＢＣ由来ｉＰＳＣ株を最初に生成した（図２ａ）。これらの得られたＰＢＣ−ｉＰＳＣは、典型的なｈＰＳＣ形態及び表現型を示した（図２ａ）。
【０１４６】
[00163]γδＴ細胞の拡大。ｉＰＳＣ生成用のγδＴ細胞を拡大するために、健康なドナー由来凍結ＰＢＭＣ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を解凍し、５μＭゾメタ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）を含有するＰＢＭＣ培養培地［１０％熱不活化ヒトＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｗｅｓｔ  Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ、ＣＡ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｍｂｉｏ．ｃｏｍ）及び１０ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ−２（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で補充したＯｐＴｍｉｚｅｒ  ＣＴＳ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ＳＦＭ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）］中で培養した。半分の培地を、ゾメタを含まない新鮮なＰＢＭＣ培養培地で２〜３日毎に置き換えた。
【０１４７】
[00164]ＧＤＴ−ｉＰＳＣの生成。拡大したγδＴ細胞からｉＰＳＣを生成するために、培養したＰＢＭＣを、７日目にＭＯＩ  ５：５：３（ＫＯＳ、ｈｃ−Ｍｙｃ、ｈＫｌｆ４）で、ＣｙｔｏＴｕｎｅ  ｉＰＳ  ２．０  Ｓｅｎｄａｉ  Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のセンダイ再プログラムベクターで終夜形質導入した。形質導入した細胞を、次いで洗浄し、マイトマイシンＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）処理ｍＥＦと成長させる６穴プレートに播種する前に５日間培養した。半分の培地を、播種後１〜３日目にｉＰＳＣ培地で置き換え、培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、２０％ノックアウト血清代替物（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１％非必須アミノ酸、０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール及び５ｎｇ／ｍＬ塩基性線維芽細胞成長因子（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）で構成される。播種３〜４週間後、得られたｉＰＳＣコロニーを取り上げ、ｍＴｅＳＲ１中のマトリゲルコートプレート上で拡大した。
【０１４８】
[00165]非ウイルス方法を使用してγδＴ細胞からｉＰＳＣを生成するために、ＰＢＭＣを、上述の通りゾメタ及びＩＬ−２と培養し、７日目又は１３日目に使用した。０日目に、Ｅｐｉ５  Ｅｐｉｓｏｍａｌ  ｉＰＳＣ  Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のエピソーマル再プログラムベクターを、Ａｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ２ｂ（Ｌｏｎｚａ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌｏｎｚａ．ｃｏｍ）を使用するヌクレオフェクションにより、培養したＰＢＭＣに送達した。ヌクレオフェクトした細胞を、マイトマイシンＣ不活化ｍＥＦ上に次いで播種した。２日目に、細胞をＰＢＭＣ培養培地：ｉＰＳＣ培地の１：１混合物に適合させた。３日目から、細胞をｉＰＳＣ培地中で培養し、培地を１日おきに交換した。播種２〜４週間後、ｉＰＳＣコロニーを取り上げ、ｍＴｅＳＲ１中のマトリゲルコートプレート中で拡大した。
【０１４９】
[00166]ＴＣＲＢ及びＴＣＲＧ遺伝子クローンアッセイ。ゲノムＤＮＡを、製造業者の指示にしたがってＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅキット（Ｑｉａｇｅｎ、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｑｉａｇｅｎ．ｃｏｍ）を使用してｉＰＳＣから単離した。ゲノムＤＮＡ中のＴＣＲβ及びＴＣＲγ遺伝子再構成を検出するために、ＴＣＲＢ  ａｎｄ  ＴＣＲＧ  Ｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎａｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙキット（Ｉｎｖｉｖｏｓｃｒｉｂｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｖｉｖｏｓｃｒｉｂｅ．ｃｏｍ）に提供されるマスター混合物及びＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、以下のプログラム：９５℃  ７分間；３５増幅サイクル（９５℃  ４５秒間、６０℃  ４５秒間、７２℃  ９０秒間）；及び１５℃で保持する前に７２℃  １０分間の最後の伸長、を使用してＰＣＲを実施した。ＰＣＲ産物を、２％  ＭｅｔａＰｈｏｒアガロース（Ｌｏｎｚａ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌｏｎｚａ．ｃｏｍ）ゲル中で電気泳動によって分離した。
【０１５０】
[00167]ｉＰＳＣ生成用のγδＴ細胞を活性化及び拡大するために、健康なドナー由来末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ゾメタ及びＩＬ−２を使用して培養した。ＰＢＭＣ培養中の総細胞数及び細胞凝集塊は経時的に増大し（図９ａ）、γδＴ細胞の成功した拡大を示した。フローサイトメトリー分析により、培養７日目において最大６１％のリンパ球がγδＴ細胞であることがさらに確認された（図９ｂ）。このγδＴ細胞富化ＰＢＭＣ培養を、ｉＰＳＣ生成に次いで使用した。
【０１５１】
[00168]γδＴ細胞からｉＰＳＣ株を得るために、２つの再プログラムプロトコールを使用した。一プロトコールにおいて、培養したＰＢＭＣを形質導入するために再プログラム因子遺伝子を保有する組み込まれないセンダイウイルスベクターを初めに使用した。形質導入６日後に観察された通り、ほとんどの形質導入細胞が生存した（図１０ａ）。これら細胞を、マイトマイシンＣ処理したマウス胚線維芽細胞（ｍＥＦ）上に次いで播種した。ｉＰＳＣコロニー（図１０ｂ）が、播種９日後という早い時期に現れ始めた。これらのコロニーを、播種３週間後に取り上げ、ｍＴｅＳＲ１培地中のマトリゲルコートプレート上に直接拡大することができた（図１０ｃ）。
【０１５２】
[00169]別のプロトコールにおいて、ヌクレオフェクションを使用して、培養したＰＢＭＣにエピソーマル再プログラムベクターを送達し、３つのｉＰＳＣ株：ＧＤＴＡ／ＮＦ−ｉＰＳＣ＃１、ＧＤＴＡ／ＮＦ−ｉＰＳＣ＃２及びＧＤＴＡ／ＮＦ−ｉＰＳＣ＃３を樹立した（図１０ｄ〜図１０ｆ）。γδＴ細胞から得たｉＰＳＣ株を同定するために、ＴＣＲＧ遺伝子クローンアッセイ（図１０ｇ）及びＴＣＲＢ遺伝子クローンアッセイを実行した。再編成されたＴＣＲＧ遺伝子の存在により２つのｉＰＳＣ株、ＧＤＴＡ／ＮＦ−ｉＰＳＣ＃１及びＧＤＴＡ／ＮＦ−ｉＰＳＣ＃２が、γδＴ細胞から得られたと確認され、一方で再編成されたＴＣＲＢとＴＣＲＧ遺伝子両方が存在しないため１つのｉＰＳＣ株、ＧＤＴＡ／ＮＦ−ｉＰＳＣ＃３は、非Ｔ細胞由来であった。非Ｔ細胞由来ＧＤＴＡ／ＮＦ−ｉＰＳＣ＃３の様に、γδＴ細胞由来ＧＤＴＡ／ＮＦ−ｉＰＳＣ＃１並びにＧＤＴＡ／ＮＦ−ｉＰＳＣ＃２は、γδＴＣＲ及びＣＤ３を発現せず（図９ｈ）、γδＴ細胞の完全な再プログラムを示唆した。
【０１５３】
[00170]γδＴ細胞からのｉＰＳＣの誘起及びそのようなγδＴ細胞由来ｉＰＳＣ（ＧＤＴ−ｉＰＳＣ）を使用するγδＴ細胞の生成を最初に実証した。さらに、これら新規のＧＤＴ−ｉＰＳＣ株をｉＰＳＣからＮＫ細胞を生成する上記の分化プロトコールと組み合わせることによって、ＮＫ細胞の「抗がん」分子を高発現するγδＴ細胞を生成し、この固有の細胞型を「γδナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞」と呼んだ。
模倣自然免疫細胞の拡大
【０１５４】
[00171]新鮮な及び冷凍保存したＰＢＣ−ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞の拡大。充分な機能的細胞を生成することは、これらｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞を臨床用途に翻訳する必須条件である。ｉＰＳＣから療法規模のＮＫ細胞を得るための考え得る一方法は、分化培養を規模拡大することである、しかしながら、この方法は費用効率が悪い。より実用的な方法は、フィーダー細胞を使用してｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞を拡大することである。この可能性を調査するために、ＰＢＣ−ｉＰＳＣ＃９から生成したＮＫ細胞の様々な数を、気体透過性Ｇ−Ｒｅｘ１０フラスコ中で、ＮＫ細胞：フィーダー比１：１０で照射を受けたＫ５６２−ｍｂ１５−４１ＢＢＬ細胞と共培養した。結果は、これらｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞が、１４日間の共培養の間に速やかに拡大したことを示した（図１１ａ、図１１ｂ）。１０６個の出発ＮＫ細胞数では、９日目に７４倍の拡大が観察された、しかしさらなる拡大は、共培養を１４日間に延長しても達成されなかった（図１１ａ）。興味深いことに、ＣＤ１６発現の下方調節（図１１ｃ）以外は表現型に明らかな変化はなかったが、これら拡大されたＮＫ細胞は、おそらく拡大の間のさらなる機能的成熟のため、Ｋ５６２細胞をより強力に死滅させるようになった（図１１ｄ）。これらのデータは、フィーダー細胞による拡大によって臨床規模で機能的ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞を作製することが実現可能であることを示す。
【０１５５】
[00172]産物品質を損なうことなく、集中製造拠点から注射のための臨床現場へ細胞療法剤を出荷することは、生細胞産物の臨床的有効性にとって重要である。冷凍保存した形状で従来通りのＮＫ細胞産物を輸送することは、ＮＫ細胞の生存率及び効力を有意に減少させ得る。これは、ＰＢＣ−ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞に対しても当てはまった（図１１ｅ、図１１ｇ）。凍結／解凍手順は、拡大したＰＢＣ−ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞の生存率に有意に影響を及ぼした（図１１ｅ）、しかしこれら拡大したＮＫ細胞の効力は、凍結／解凍手順後にある程度保たれていた（図１１ｇ）。低温保存によって引き起こされるこれら生存率及び効力の問題を解決するために、考え得る解決策として：ＰＢＣ−ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞を、集中製造現場で拡大する前に先ず冷凍保存し、冷凍保存した形状で臨床現場に出荷することが提唱され；これら冷凍保存したＮＫ細胞を、臨床現場で次いで解凍し、拡大し、注射する。そのような解決策の実現可能性は、冷凍保存されたＮＫ細胞を拡大する能力に依存する。図１１ｆに示すように、冷凍保存したＮＫ細胞は、大いに拡大可能なままであり；１０６個の冷凍保存したＮＫ細胞から開始して、３８．５倍の拡大が、９日目になお達成され得た。最も重要なことに、これらの拡大した冷凍保存したＮＫ細胞は、冷凍保存していない新鮮なＮＫ細胞から拡大した細胞と同程度の細胞傷害性効力を示した（図１１ｇ）。これらの結果は、拡大前ＮＫ細胞を輸送することが、ＰＢＣ−ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞療法剤のロジスティクスの実用的な解決策であることを示唆している。
【０１５６】
[00173]収量は、ＰＢＣ−ｉＰＳＣ  ３×１０６個当たり純度９９％でＮＫ細胞１５×１０６個に達した。これらのＰＢＣ−ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞は、フィーダー細胞株を使用して９日間で７４倍、低温保存後に３８．５倍に拡大され得る。これらの拡大されたＮＫ細胞は、Ｋ５６２細胞に対する細胞毒性の増大によって示す通り機能的により強力になった。したがって、産業に適合する生産スキームを使用してＰＢＣ−ｉＰＳＣからＮＫ細胞療法剤を生成する実現可能性が、実証される。
【０１５７】
[00174]代替物又は代用物でない上述した特徴の変形及び組合せを組み合わせて、本発明の意図する範囲に含まれるさらに他の実施形態を形成し得ることは、当技術に熟達した者によってさらに認識されるべきである。
【図１】
2020506713.tif 000005
【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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