(57)【要約】  本発明は、スルフェート化及び／又はスルホン化ヒドロゲルの中の異なる物質群Ａ及びＢの物質を区分して隔離し、バイオ流体から物質群Ａの物質を枯渇させると同時に別な方法で、そのスルフェート化及び／又はスルホン化ヒドロゲルからバイオ流体の中に、物質群Ａ又はＢの物質を放出するか、及び／又は、スルフェート化及び／又はスルホン化ヒドロゲルの中の物質群Ｂの物質の結合を弱めさせる方法に関する。そのスルフェート化及び／又はスルホン化されたヒドロゲルは、タイプ１、タイプ２、タイプ３、又はタイプ４のヒドロゲルの群から選択され、且つ、そのヒドロゲルは、荷電していない成分と荷電された成分とからなる。本発明においては、その荷電された成分は、繰り返し単位あたりのスルフェート基及び／又はスルホネート基の数を繰り返し単位のモル質量で割り算して、タイプ１では０．００４０〜０．００６０ｍｏｌ／ｇ、タイプ２では０．００２５〜０．００４０ｍｏｌ／ｇ、タイプ３では０．０００５〜０．００２５ｍｏｌ／ｇ、及びタイプ４では０．００４０〜０．０１００ｍｏｌ／ｇと計算されるパラメーターを特徴としている。その膨潤させたヒドロゲルは、２０ｋＰａ未満の貯蔵モジュラスを有し、且つ膨潤させたヒドロゲルの性質としては、タイプ１では０．０９〜０．２０、タイプ２では０．０５〜０．１８、タイプ３では０．０１〜０．１２、及びタイプ４では０．１６〜０．０８の、ｍｍｏｌｅ／ｍＬの単位での、スルフェート基又はスルホネート基の濃度を有している。バイオ流体中の物質群Ａの物質の濃度及び物質群Ｂの物質の濃度は、ヒドロゲルのタイプの選択によって影響される。
2020511220.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
スルフェート化及び／又はスルホン化ヒドロゲルの中の異なる物質群Ａ及びＢの物質を区分して隔離するため、及びバイオ流体から物質群Ａの物質を枯渇させ、同時に、前記スルフェート化及び／又はスルホン化ヒドロゲルから前記バイオ流体の中に物質群Ａ又はＢの物質を区分して放出するか、又は前記スルフェート化及び／又はスルホン化ヒドロゲルの中の前記物質群Ｂの物質の結合性を低下させるための方法であって、前記スルフェート化及び／又はスルホン化ヒドロゲルが、タイプ１、タイプ２、タイプ３又はタイプ４のヒドロゲルの群から選択され、且つ前記ヒドロゲルが、荷電されていない構成単位及び荷電された構成単位から構成され、前記荷電された構成単位が、タイプ１では０．００４０〜０．００６０ｍｏｌｅ／ｇ、タイプ２では０．００２５〜０．００４０ｍｏｌｅ／ｇ、タイプ３では０．０００５〜０．００２５ｍｏｌｅ／ｇ、及びタイプ４では００４０〜０．０１００ｍｏｌｅ／ｇの、繰り返し単位あたりのスルフェート基及び／又はスルホネート基の数を前記繰り返し単位のモル質量で割ったものから計算されたパラメーターを特徴とし、且つ膨潤させたヒドロゲルが、２０ｋＰａ未満の貯蔵モジュラスを有し、且つ前記膨潤させたヒドロゲルの性質が、タイプ１では０．０９〜０．２０、タイプ２では０．０５〜０．１８、タイプ３では０．０１〜０．１２、及びタイプ４では０．１６〜０．８の、ｍｍｏｌｅ／ｍＬの単位での、スルフェート基又はスルホネート基の濃度を有し、且つ、前記バイオ流体中の物質群Ａの物質の濃度及び物質群Ｂの物質の濃度への影響が、前記ヒドロゲルのタイプの選択によって定まることを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記ヒドロゲルの前記荷電された構成単位が、タイプ１では０．００５０ｍｏｌｅ／ｇ、タイプ２では０．００３５ｍｏｌｅ／ｇ又は０．００３８ｍｏｌｅ／ｇ、タイプ３では０．００１９ｍｏｌｅ／ｇ、及びタイプ４では０．００４５ｍｏｌｅ／ｇの、繰り返し単位あたりのスルフェート基及び／又はスルホネート基の数を前記繰り返し単位のモル質量で割ったものを有し、且つ前記膨潤させたヒドロゲルの性質が、タイプ１では０．１２、タイプ２では０．１２又は０．１４、タイプ３では０．０６、及びタイプ４では０．２８又は０．１６の、ｍｍｏｌｅ／ｍＬの単位での、スルフェート又はスルホネートの濃度を有することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
スルフェート化及び／又はスルホン化ヒドロゲルの中の異なる物質群Ａ及びＢの物質を区分して隔離するため、及びバイオ流体から物質群Ａの物質を枯渇させ、同時に前記スルフェート化及び／又はスルホン化ヒドロゲルから前記バイオ流体中の物質群Ｂの物質を区分して放出するためか、又は前記スルフェート化及び／又はスルホン化ヒドロゲルの中の物質群Ｂの物質の結合性を低下させるための方法であって、前記スルフェート化及び／又はスルホン化ヒドロゲルが、タイプ１、タイプ２、タイプ３、又はタイプ４のヒドロゲルの群から選択され、且つ前記ヒドロゲルが、荷電されていない構成単位及び荷電された構成単位から構成され、前記荷電された構成単位が、タイプ１では６０〜８０、タイプ２では３０〜７５、タイプ３では１０〜３０、及びタイプ４では８０〜１２０の、ポリマー１ｍｏｌｅあたりのスルフェート基又はスルホネート基のｍｏｌｅの濃度を有し、且つ前記ヒドロゲル中の前記荷電された構成単位が、タイプ１では０．００１５〜０．００２５、タイプ２では０．００１５〜０．００３０、タイプ３では０．００１０〜０．００４０、及びタイプ４では０．００１８〜０．００５０の、ｍｍｏｌｅ／ｍＬの単位での濃度のＧＢを有し、且つ前記膨潤させたヒドロゲルが、２０ｋＰａより低い貯蔵モジュラスを有しながらも、前記スルフェート基又はスルホネート基の濃度が、前記ヒドロゲル１ｍＬあたりのｍｍｏｌｅで、タイプ１では０．０９〜０．２０、タイプ２では０．０５〜０．１８、タイプ３では０．０１〜０．１２、及びタイプ４では０．１６〜０．８０であり、且つ、前記バイオ流体中の物質群Ａの物質及び物質群Ｂの物質の濃度が、前記ヒドロゲルのタイプの選択による影響を受けることを特徴とする、方法。
【請求項４】
前記荷電された構成単位が、ポリマー１ｍｏｌｅあたり、タイプ１では７０．２、タイプ２では４８．４又は７５．０、タイプ３では２３．４、及びタイプ４では９０．０の、スルフェート基又はスルホネート基のｍｏｌｅ濃度を有し、且つ前記ヒドロゲルの中の前記荷電された構成単位が、タイプ１では０．００１８、タイプ２では０．００２５又は０．００１８、タイプ３では０．００２７、及びタイプ４では０．００３１又は０．００１８の、ｍｍｏｌｅ／ｍＬの単位での濃度のＧＢを有し、且つ前記膨潤させたヒドロゲルが、２０ｋＰａ未満の貯蔵モジュラスを有し、前記ヒドロゲル中のスルフェート基又はスルホネート基の濃度が、ｍｍｏｌｅ／ｍＬの単位で、タイプ１では０．１２、タイプ２では０．１２又は０．１４、タイプ３では０．０６、及びタイプ４では０．２８又は０．１６であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ヒドロゲルに対する前記構成単位の架橋が、前記ＧＢ及び／又はＵＧＢの上への、アミン、チオール、カルボキシル、無水物、マレイミド、ビニルスルホン、アクリレート、ヒドロキシル、イソシアネート、エポキシド、及びアルデヒドのクラスからの適切な官能基の反応か、又は静電気力若しくは疎水性の相互作用、水素結合、又は双極子相互作用をベースとする非共有結合を形成することが可能な群によって起きることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記荷電された構成単位の前記ヒドロゲルに対する前記架橋が、５００ｇ／ｍｏｌｅ未満のモル質量のＵＧＢを有する、小さな二官能性架橋分子の方法による直接的な架橋を介して起きることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
天然原料から得られるスルフェート化グリコサミノグリカン、たとえばヘパリン及び選択的脱硫ヘパリン、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、スルフェート化ヒアルロン酸、さらにはマンノース、ラクトース、デキストランをベースとするスルフェート化グリコポリマー、並びに硫黄含有モノマーとして、スチレンスルホン酸（ＳＳ）、ビニルスルホン酸（ＶＳ）、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（ＡＭＰＳ）、アミノプロパンスルホン酸（ＡＰＳ）、又はアネトールスルホン酸（ＡＳ）を担持するポリスルホネート化化合物、並びにさらには、上述の結合基を含む単位を有するコポリマーが、荷電された構成単位として選択され、且つ、ポリエチレングリコール、ポリ（２−オキサゾリン）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、及び／又はポリアクリルアミド（ＰＡＭ）又は短鎖の二官能性架橋剤分子が、荷電されていない構成単位として選択されることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
タイプ１のヒドロゲルにおいて、ｂＮＧＦ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＶＥＧＦ−Ａ、エオタキシン、ＧＲＯ−アルファ、ＩＬ−８、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１アルファ、ＭＩＰ−１ベータ、Ｒａｎｔｅｓ、ＳＤＦ１−アルファ、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−４、スクレロスチン及び／又はＤＫＫ１の物質の少なくとも１つが、前記物質群Ａの物質として選択され、前記物質が前記バイオ流体から、前記溶液の初期濃度の５０％を超えて枯渇され、且つ前記ヒドロゲルの中に隔離されることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
タイプ１のヒドロゲルにおいて、ＦＧＦ−２、ＴＧＦｂ１、ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＰＬＧＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−１０、ＩＬ−６及び／又はＴＮＦ−アルファの物質の少なくとも１つが、前記物質群Ｂの物質として選択され、前記物質が、前記ヒドロゲルの中の前記溶液の初期濃度のわずか５０％まで結合されるか、又はそれから放出されることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
タイプ２のヒドロゲルにおいて、ｂＮＧＦ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＶＥＧＦ−Ａ、エオタキシン、ＧＲＯ−アルファ、ＩＬ−８、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１、Ｒａｎｔｅｓ、ＳＤＦ１−アルファ、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−４、及び／又はＤＫＫ１の物質の少なくとも１つが、物質群Ａの物質として選択され、前記物質が前記バイオ流体から、前記溶液の初期濃度の５０％を超えて枯渇され、且つ前記ヒドロゲルの中に隔離されることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
タイプ２のヒドロゲルにおいて、ＦＧＦ−２、ＴＧＦｂ１、ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＰＬＧＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−１０、ＩＬ−６、ＴＮＦ−アルファ、及び／又はスクレロスチンの物質の少なくとも１つが、物質群Ｂの物質として選択され、前記物質が、前記ヒドロゲルの中の前記溶液の初期濃度のわずか５０％まで結合されるか、又はそれから放出されることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
タイプ３のヒドロゲルにおいて、ｂＮＧＦ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＶＥＧＦ−Ａ、エオタキシン、ＧＲＯ−アルファ、ＩＰ−１０、Ｒａｎｔｅｓ、ＳＤＦ１−アルファ、ＩＦＮ−ガンマ、及び／又はＩＬ−４の物質の少なくとも１つが、物質群Ａの物質として選択され、前記物質が、前記バイオ流体から、前記溶液の初期濃度の５０％を超えて枯渇され、且つ前記ヒドロゲルの中に隔離されることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
タイプ３のヒドロゲルにおいて、ＦＧＦ−２、ＴＧＦｂ１、ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＰＬＧＦ、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１アルファ、ＭＩＰ−１ベータ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−６、ＴＮＦ−アルファ、スクレロスチン、及び／又はＤＫＫ１の物質の少なくとも１つが、物質群Ｂの物質として選択され、前記物質が、前記ヒドロゲルの中に前記溶液の初期濃度のわずか５０％まで結合されるか、又はそれから放出されることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
タイプ４のヒドロゲルにおいて、ｂＮＧＦ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＶＥＧＦ−Ａ、エオタキシン、ＧＲＯ−アルファ、ＩＬ−８、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１アルファ、ＭＩＰ−１ベータ、Ｒａｎｔｅｓ、ＳＤＦ１−アルファ、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−４、ＩＬ−６、及び／又はＴＮＦ−アルファの物質の少なくとも１つが、物質群Ａの物質として選択され、前記物質が、前記バイオ流体から、前記溶液の初期濃度の６０％を超えて枯渇され、且つ前記ヒドロゲルの中に隔離されることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
タイプ４のヒドロゲルにおいて、ＥＧＦ、ＰＬＧＦ及び／又はＧＭ−ＣＳＦの物質の少なくとも１つが、物質群Ｂの物質として選択され、前記物質が、前記ヒドロゲルの中に前記溶液の初期濃度のわずか４０％まで結合されるか、又はそれから放出されることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
タイプ１、タイプ２、タイプ３、又はタイプ４のヒドロゲルが、物質群Ａ及び／又はＢの少なくとも１種の物質を用いて高い濃度でプリチャージされ、その後で、それらの物質が、前記ヒドロゲルから、平行且つ独立して放出されて、前記バイオ流体中の濃度を変化させることを特徴とする、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ヒドロゲルが、多相材料から、すなわち、前記ヒドロゲル材料の前記異なるタイプ１〜４又は異なる加工形態（微小粒子及びバルクのヒドロゲル）の混合物から形成されるか、又は、異なる物質、又は物質の量を用いてプリチャージされることを特徴とする、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記スルフェート化及び／又はスルホン化ヒドロゲルからの物質群Ａ又はＢからの物質の前記バイオ流体の中への前記区分した放出と、前記スルフェート化及び／又はスルホン化ヒドロゲルの中の前記物質群Ｂの物質の前記低下した結合性とが、同時に起きることを特徴とする、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法を実施するための、共有結合的に架橋されたヒドロゲル材料であって、ポリ（４−スチレンスルホン酸−コ−マレイン酸）の形態にある荷電された構成単位、及び少なくとも２個のアミノ基又はチオール基を有する、アミン基又はチオール基を含むポリマー又は架橋分子の形態にある荷電されていない構成単位をベースとし、前記荷電された構成単位及び荷電されていない構成単位が、ＥＤＣ／スルホ−ＮＨＳを用いて前記ポリ（４−スチレンスルホン酸−コ−マレイン酸）のカルボキシル基を活性化させ、且つアミノ基を含むポリマーを用いるか、又は前記少なくとも２個のアミノ基を有する架橋剤分子を用いるかのいずれかで直接架橋させることにより得ることが可能なポリマーネットワークに架橋されるが、それぞれの場合において、それぞれアミノ基、及びマイケルタイプの付加を可能とする基を含む二官能性架橋剤分子の手段によるアミドの形成、又は前記活性化されたカルボキシル基の官能化を用い、次いで、前記チオール基を含むポリマー又は前記少なくとも２個のチオール基を有する前記架橋剤分子を含むポリマーを用いて、それぞれの場合においてマイケルタイプの付加を介して架橋させる、共有結合的に架橋されたヒドロゲル材料。
【請求項２０】
マイケルタイプの付加を可能とする前記基が、マレイミド基、ビニルスルホン基、又はアクリレート基から選択されることを特徴とする、請求項１９に記載の共有結合的に架橋されたヒドロゲル材料。
【請求項２１】
アミン基及びチオール基を含む前記ポリマーが、荷電されていない構成単位として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（２−オキサゾリン）（ＰＯＸ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、及び／又はポリアリールアミド（ＰＡＭ）のクラスから選択され、且つ、アミン基又はチオール基を含む前記架橋剤分子が、非ポリマー性の、二官能性架橋剤分子であることを特徴とする、請求項１９又は２０に記載の共有結合的に架橋されたヒドロゲル材料。
【請求項２２】
４−スチレンスルホン酸対マレイン酸のモル比が可変で、６：１から１：６までの範囲、且つモル質量が５，０００〜１００，０００ｇ／ｍｏｌｅの範囲であるポリ（４−スチレンスルホン酸−コ−マレイン酸）が前記荷電された構成単位として選択されることを特徴とする、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の共有結合的に架橋されたヒドロゲル材料。
【請求項２３】
前記ペプチド配列中の反応性アミノ酸としてリシン又はシステインのいずれかを有する、共役結合された酵素的に切断可能なペプチドを含むポリマーが、前記ポリマーネットワークを形成させるための荷電されていない構成単位として使用されることを特徴とする、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の共有結合的に架橋されたヒドロゲル材料。
【請求項２４】
前記酵素的に切断可能なペプチドが、ヒト又は細菌性プロテアーゼ、特にＭＭＰ、カテプシン、エラスターゼ、オーレオリシン及び／又は血液凝固酵素によって切断可能であることを特徴とする、請求項２３に記載の共有結合的に架橋されたヒドロゲル材料。
【請求項２５】
アミノ基若しくはカルボキシル基及び／又はセル−インストラクティングペプチドを有する生理活性及び／又は抗接着性分子が、前記ヒドロゲルネットワークに、配列中のリシン又はシステインを介して、前記荷電された構成単位のポリ（４−スチレンスルホン酸−コ−マレイン酸）又はマイケルタイプの付加を可能とする基を有するその誘導体に、共有結合を形成することによって結合されることを特徴とする、請求項２３又は２４に記載の共有結合的に架橋されたヒドロゲル材料。
【請求項２６】
前記生理活性分子が、抗菌物質、たとえば抗生物質若しくは消毒剤、又は医薬活性成分であることを特徴とする、請求項２５に記載の共有結合的に架橋されたヒドロゲル材料。
【請求項２７】
前記抗接着性分子が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はポリ（２−オキサゾリン）（ＰＯＸ）であることを特徴とする、請求項２５又は２６に記載の共有結合的に架橋されたヒドロゲル材料。
【請求項２８】
前記セル−インストラクティングペプチドが、細胞外マトリックス、たとえばコラーゲン、ラミニン、テネイシン、フィブロネクチン、及びビトロネクチンの、構造的及び機能的タンパク質から誘導されたペプチドであることを特徴とする、請求項２５〜２７のいずれか１項に記載の共有結合的に架橋されたヒドロゲル材料。
【請求項２９】
前記生理活性及び／又は抗接着性及び／又は細胞誘導性のペプチドが、前記ヒドロゲルネットワークに、酵素的に切断可能なペプチド配列を介して共有結合的に結合されていることを特徴とする、請求項２３〜２８のいずれか１項に記載の共有結合的に架橋されたヒドロゲル材料。
【請求項３０】
前記ヒドロゲル材料が、０．２〜２２ｋＰａの貯蔵モジュラスを有していることを特徴とする、請求項１９〜２９のいずれか１項に記載の共有結合的に架橋されたヒドロゲル材料。
【請求項３１】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法を実施するための物理的に架橋されたヒドロゲル材料であって、ポリ（４−スチレンスルホン酸−コ−マレイン酸）の形態にある荷電された構成単位と、ポリマーの形態にある荷電されていない構成単位との間の物理的相互作用をベースとし、強く正に荷電されたペプチド配列が、前記ポリマーの上に共役結合されている、物理的に架橋されたヒドロゲル材料。
【請求項３２】
前記強く正に荷電されたペプチド配列が、リシン若しくはアルギニンの少なくとも１０個の繰り返し、又はリシン及びアラニンを用いるか若しくはアルギニン及びアラニンを用いたジペプチドモチーフの少なくとも５個の繰り返しを含んでいることを特徴とする、請求項３１に記載の物理的に架橋されたヒドロゲル材料。
【請求項３３】
前記ヒドロゲルが、インビボで血管形成、免疫疾患、癌、糖尿病、神経変性疾患、クローン病、大腸潰瘍、多発性硬化症、喘息、慢性関節リウマチ、又は皮膚の創傷治癒、及び骨の再生を調節するための因子を取り扱うために使用されることを特徴とする、請求項１〜３２のいずれか１項に記載のヒドロゲルの使用。
【請求項３４】
皮膚の創傷治癒のために、タイプ２のヒドロゲルが、炎症誘発性のケモカインの、エオタキシン、ＧＲＯ−ａ、ＩＬ−８、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−３、ＭＣＤ、Ｒａｎｔｅｓ、及びＳＤＦ−１−アルファの少なくとも１つを前記ヒドロゲルの内側に隔離するために使用され、前記再生誘発因子の、ＥＧＦ、ＦＧＦ−２、ＴＧＦｂ１、ＩＬ−１０、ＨＧＦ、及びＰＬＧＦの少なくとも１つが、前記バイオ流体の中で、影響されないか又はほとんど影響されずに留まることを特徴とする、請求項３３に記載の使用。
【請求項３５】
微生物又は真核生物由来の細胞溶解物から、目標とするタンパク質を精製するための、請求項１〜３２のいずれか１項に記載のヒドロゲルの使用。
【請求項３６】
バイオ流体から、タイプ１〜３の前記ヒドロゲルに弱く結合されている、ＥＧＦ、ＦＧＦ−２、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１０、ＨＧＦ、及びＰＬＧＦのシグナル伝達分子をネガティブに選択及び分離するための、請求項１〜３２のいずれか１項に記載のヒドロゲルの使用。
【請求項３７】
胚幹細胞（ＥＳ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ−）、並びにＥＳ及びｉＰＳ−を伴わないその他の幹細胞及び前駆細胞、患者から採取した初代細胞、不死化細胞系、さらには心臓、筋肉、腎臓、肝臓、及び神経組織から、インビトロで細胞及び器官培養するための、請求項１〜３２のいずれか１項に記載のヒドロゲルの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スルフェート化及び／又はスルホン化成分を含むヒドロゲルを用いて、異なる物質群（ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  ｇｒｏｕｐ）Ａ及びＢの物質を、区分して隔離させ（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ）、スルフェート化及び／又はスルホン化成分を含むヒドロゲルから、Ａ又はＢの物質群の物質を、バイオ流体の中に区別して同時に放出して、物質群Ａの物質を枯渇させるか、及び／又はスルフェート化又はスルホン化成分を含むヒドロゲルの中の物質群Ｂの物質の結合性を低下させるための方法に関する。本発明はさらに、ネットワーク成分としてのポリ（４−スチレンスルホン酸−コ−マレイン酸）、及び、また別のネットワーク成分としてのアミン−又はチオール含有架橋分子をベースとして合成的に得ることが可能であり、且つ、異なる物質の群の物質を区分して隔離するための材料としての特徴を有し、且つ上述の方法で使用される、ヒドロゲルにも関する。物質群Ａ及びＢは、化学的に定義される物質群ではないが、ヒドロゲルのタイプに応じて、全体の系の中で、相当する集合体（ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｉｏｎ）及び組成の中での、本発明による区分した隔離を起こさせる、異なる物質を含んでいてよい。したがって、物質群Ａ及びＢは、全体の系の中での、それらの挙動によって定義される。
【背景技術】
【０００２】
本発明の適用分野は、バイオテクノロジー及び医薬の分野であるが、そこでは、ある種の物質が、バイオ流体から分子レベルで選択的に除去され、且つヒドロゲルの中に隔離され、その一方では、他の物質は、特別に隔離されることはなく、ヒドロゲルからバイオ流体の中に選択的に放出される。したがって、より広い意味合いでは、それは、分子レベルの分離プロセスである。より広い意味合いでは、本発明の適用分野は、技術的、生物医学的、及び生物学的用途のため、たとえば哺乳動物の細胞を培養するためか、又は表面の抗菌加工（ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｆｉｎｉｓｈ）のための、段階的に負に荷電した（ｇｒａｄｅｄ  ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ  ｃｈａｒｇｅｄ）ヒドロゲルの使用にある。
【０００３】
スルフェート化成分、たとえばスターＰＥＧ−グリコサミノシクロ−ヒドロゲルを含む、ヒドロゲルは、国際公開第２０１０／０６０４８５Ａ１号パンフレットからも公知であり、バイオテクノロジー的な用途における使用のためか、又はインプラント若しくは再生治療で使用するためか、又は組織置換え材料として検討されている。
【０００４】
これらの材料のキーとなる特徴は、ヒドロゲルの成分のポリマー鎖の上のスルフェート基と、可溶性タンパク質、たとえば代謝、輸送及びシグナル伝達機能を支配するタンパク質、たとえば酵素及びシグナル伝達分子との間に生じる相互作用にあるが、ここで、前者にはたとえば、プロテアーゼ、リポラーゼ、アミラーゼが含まれ、且つ後者にはたとえば、ホルモン、神経伝達物質、サイトカイン、増殖因子、及びケモカインが含まれる。
【０００５】
それらのタンパク質に対する親和性で決定的な相互作用は、主として、適用条件下では負に荷電している、ヒドロゲルのスルフェート基又はスルホン酸基と、正に荷電している、タンパク質のアミノ酸側鎖との間の静電気力に基づいている。
【０００６】
この原理は、ヒドロゲルの開発では、当業界では、シグナル伝達分子の徐放のためのスルフェート化糖（グリコサミノグリカン＝ＧＡＧ）、たとえば増殖因子ＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ＝血管内皮増殖因子）及びＦＧＦ−２（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  ２＝線維芽細胞増殖因子２）のためを含め、すでに広く使用されている。それに加えて、ＦＧＦ−２及びＶＥＧＦの放出は、その下にあるスターＰＥＧ−ＧＡＧヒドロゲルのスルフェート化の程度が低いほど、次第に多くなる可能性がある。スルホン酸基を含む合成ポリマー、たとえば、ポリスチレンスルホン酸（ＰＳＳ）（Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．，Ｂ，２００７，１１１（１３），ｐｐ．３３９１〜３３９７、ＤＯＩ：１０．１０２１／ｊｐ０６７７０７ｄ９）、又は２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（米国特許第５，４５１，６１７号明細書、及び米国特許第５，０１１，２７５号明細書、並びに米国特許出願公開第２００８／０１１４１２号明細書）は、たとえばコンタクトレンズで使用する目的のヒドロゲルを製造するためのスルホン化成分として使用されてきた。
【０００７】
しかしながら、スルホン酸基を担持する、共有結合的に架橋された、含水ポリマーネットワーク、すなわちヒドロゲルは、現在のところ知られていないが、その中で、ポリ（４−スチレンスルホン酸−コ−マレイン酸）のカルボキシル基が、アミン基含有短鎖の架橋剤又はアミン基含有ポリマーとの、架橋のための官能基として使用されてきた。
【０００８】
また別の欠点は、スルフェート化又はスルホン化成分を含むヒドロゲル（すなわち、構成単位（ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｂｌｏｃｋ））とタンパク質との間の相互作用が、ほとんどの場合、１つないしは２つのシグナル伝達分子を含む溶液からだけで、多くの場合、生理学的に関連する条件下ではないところで、ずっと検討されてきた。しかしながら、関連する生物学的文脈においては、各種の異なるタンパク質を含むバイオ流体が、各種の濃度で存在しているが、そのシグナル伝達分子は、バイオ流体中に、わずか１００ｐｇ／ｍＬ〜２０００ｎｇ／ｍＬの範囲内という極めて低いレベルであり、それに対して、その他のタンパク質、たとえばアルブミンは、約６０ｍｇ／ｍＬという高い濃度で存在している。
【０００９】
この場合、シグナル伝達分子の正に荷電した領域と、ヒドロゲルの中の負に荷電したスルフェート基又はスルホネート基との間の一次的な静電的引力が、重要な役割を果たすが、ここで多くの場合、それらの推定のためには、タンパク質の等電点（ＩＥＰ）が使用される。しかしながら、ＩＥＰに基づいて推測することが可能な、生理学的条件下における正味の電荷に加えて、電荷の分布、たとえば正に荷電した電荷クラスター（ｃｈａｒｇｅ  ｃｌｕｓｔｅｒ）の存在、さらには二次的な相互作用（これは、タンパク質のサイズ及びタンパク質の構造、並びに、より弱い非イオン性の分子間力たとえば、疎水性相互作用、水素結合、又は双極子相互作用によって影響される）が役割を果たして、そのため、タンパク質のヒドロゲルに対する、絶対的若しくは相対的な結合性を予測することが、極めて困難となる。それに加えて、多くの場合無視されてきたが、たとえば、目標のタンパク質と、浸透圧の調節及び輸送プロセスの制御を担っているアルブミンとの相互作用、さらにはアルブミンとヒドロゲルとの間の相互作用に起因する、さらなる競合プロセスも存在する。さらに、荷電したポリマーとタンパク質との間の分子的な相互作用を予測するために文献で使用されている結合定数は、溶液中での個々の分子−タンパク質複合体の相互作用を記述する場合にのみ有効であって、それに対して、ヒドロゲルにおいては、ポリマーネットワークの中での、隣接するポリマー鎖、三次元的な電荷の分布、又は親和中心（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｅｎｔｅｒ）が、得られる相互作用、従って、ヒドロゲル中へのタンパク質の結合性に強い影響力を有している。
【００１０】
したがって、スルフェート化及び／又はスルホン化成分を含むヒドロゲル（構成単位）と、複合バイオ流体（ｃｏｍｐｌｅｘ  ｂｉｏｆｌｕｉｄ）の分子成分との間の結合の選択性については、これまで、解明することができなかった。したがって、立証された方法及びプロセスでは、用途に適した（ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｒｅｌｅｖａｎｔ）バイオ流体において、スルフェート化又はスルホン化成分を含むヒドロゲル（構成単位）によってシグナル伝達分子のレベルを選択的に調節することは、極めて限られて範囲でしか可能でなかった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、バイオ流体中のある種の物質の濃度に、意識的に影響を与えることが可能となる方法を提案することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
その目的は、独立請求項に記載の特徴を有する方法及び材料によって達成される。そのプロセスを実施するのに適した材料としては、ポリ（４−スチレンスルホン酸−コ−マレイン酸）をベースとする完全に合成のヒドロゲル系を合成成分として使用したが、このものは、生理学的条件下では負に荷電しており、そのため、部分的に正に荷電した生体分子と密接な関係があって、各種の物質群から物質が区分して隔離される。その方法及び材料のさらなる展開は、従属請求項に記載されている。「完全に合成の（ｆｕｌｌｙ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ）」という用語は、ヒドロゲル化に、生物学的由来の成分がまったく必要無いということを意味している。したがって、有害な免疫原性反応の危険性を排除することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ヒドロゲル上で、ヒトの内皮細胞を２４時間培養した後の、細胞培養物の代表的な光学顕微鏡画像を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の文脈において、「物質群Ａ及びＢから物質を隔離する（ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  ｇｒｏｕｐｓ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ）」ということは、これらの物質、たとえばシグナル伝達分子、因子、又は酵素を、ヒドロゲル材料中の親和中心に結合させ、それにより、ヒドロゲルとの直接的な接触で、バイオ流体からこれらの物質の濃度を低下させるか、又は完全に除去するということを指している。ヒドロゲルは、荷電されているか、又は荷電されていない構成単位からなる。
【００１５】
本発明には、スルフェート基及び／又はスルホネート基を含むヒドロゲルとして、以下の性質及び以下の組成を有するヒドロゲルが含まれる：たとえば国際公開第２０１４０４０５９１Ａ２号パンフレットに記載されているような、２つのヒドロゲル成分又はヒドロゲル構成単位の間で、共有結合的（化学的）架橋又は物理的架橋により形成されたポリマーネットワーク。そのヒドロゲルの第一の構成単位又は成分は、生理学的条件下では荷電していない分子（荷電されていない構成単位（ｕｎｃｈａｒｇｅｄ  ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｂｌｏｃｋ＝ＵＧＢ）とも呼ばれる）であり、好ましくは２０ｇ／ｍｏｌｅ〜１００，０００ｇ／ｍｏｌｅのモル質量を有している。その荷電されていない分子は、有利には、ポリエチレングリコール、ポリ（２−オキサゾリン）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、及び／又はポリアクリルアミド（ＰＡＭ）、又は短鎖の二官能性架橋剤分子のクラスから選択又は誘導される。さらに、ＵＧＢは、少なくとも２個の官能基、好ましくは４〜８個の官能基を有していて、それらは架橋させるのに特に好都合である。（ＧＢ又はＵＧＢで）架橋のために適した官能基としては、以下のものが挙げられる：アミン、チオール、カルボキシル、無水物、マレイミド、ビニルスルホン、アクリレート、ヒドロキシル、イソシアネート、エポキシド、及びアルデヒド基、又は、静電気力、疎水性相互作用、水素結合、双極子相互作用に基づく非共有結合を形成することが可能な基。第二の構成単位（成分）は、（硫黄系の）スルフェート基又はスルホネート基を有するポリマーからなり、そのため、それは、生理学的条件下では負に荷電しており（荷電された構成単位（ｃｈａｒｇｅｄ  ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｂｌｏｃｋ＝ＧＢ））（任意に、２，０００〜２５０，０００ｇ／ｍｏｌｅのモル質量を有する）、主として静電的（イオン的）相互作用を介し、且つ程度は低いが、より弱い結合、たとえばファンデルワールス力、水素結合、又は疎水性相互作用を介して、ヒドロゲルネットワークの中でタンパク質を結合することができる。本発明においては、タンパク質の結合を顕著に規定する親和中心が、スルフェート基又はスルホン酸基であり、それらは、生理学的条件下では、大きく負に荷電している。スルフェート化又はスルホン化ポリマーは、天然原料たとえば、ヘパリン及び選択的に脱硫されたヘパリンから得られたスルフェート化グリコサミノグリカン、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、スルフェート化ヒアルロン酸、さらにはマンノース、ラクトース、デキストランをベースとするスルフェート化グリコポリマー、並びに、ポリスルホネート化化合物（硫黄含有モノマーとして含まれてもよい）、たとえば、スチレンスルホン酸（ＳＳ）、ビニルスルホン酸（ＶＳ）、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（ＡＭＰＳ）、アミノプロパンスルホン酸（ＡＰＳ）、又はアネトールスルホン酸（ＡＳ）（さらには、上述の架橋基を含む単位を有するコポリマー中）である。
【００１６】
親和中心の、負に荷電したスルフェート基又はスルホネート基は、ＧＢに沿ってのみ意識的に分散されるが、それに対して、ＵＧＢは、タンパク質の吸着を最小限にする成分である。ＧＢ上に存在し、架橋反応に使用されることがない、いずれのカルボキシル基も、ヒドロゲルの中でのタンパク質の結合には無関係であると考えられるが、その理由は、ＧＢのスルフェート基又はスルホネート基が、顕著に、より酸性化されている、したがって好ましくは脱プロトン化されているからである。
【００１７】
生理学的条件とは、ヒトの組織における生理的な塩分濃度にぴったり相当するｐＨ値及びイオン強度を組織の中で有する水溶液であり、したがって、ホスフェート緩衝剤を使用して、ｐＨ７．４と約０．９％のＮａＣｌになるように調節される。
【００１８】
本発明におけるバイオ流体は、各種の塩含量、好ましくは生理的塩分濃度及びタンパク質の混合物を有する水溶液である。
【００１９】
そのタンパク質含量は可変であり、ほとんどは、１００ｐｇ／ｍＬ〜２０００ｎｇ／ｍＬの範囲の低レベルの水溶性の球状タンパク質、たとえばシグナル伝達分子、酵素、又は因子、並びにアルブミンからなるが、アルブミンは、体内の浸透圧及び輸送プロセスを統制し、高い濃度、たとえば約６０ｍｇ／ｍＬで存在している。
【００２０】
本発明の概念に従えば、スルフェート化又はスルホン化成分（ＧＢ）を含むヒドロゲルに対する代謝、輸送、及びシグナル機能（たとえば、シグナル伝達分子及び酵素）の結合を調節するタンパク質の差は、一方では、ＧＢとタンパク質との間の静電的相互作用、さらにはタンパク質のサイズ及び構造（たとえば、特異的なタンパク質ドメインの存在）によって、他方では、そのヒドロゲルのネットワークパラメーターによって、顕著に決まってくる。ネットワークパラメーターは以下の項目から測定した：（１）生理学的条件下で膨潤させたヒドロゲルの中での、膨潤させたヒドロゲル中のスルフェート又はスルホネートの濃度（ｍｍｏｌｅのスルフェート又はスルホネート／ｍＬ）；及び（２）ＧＢの電荷の特性サイズ（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ  ｓｉｚｅ）としての、ＧＢの繰り返し単位あたりのスルフェート基又はスルホネート基の数を、ＧＢの繰り返し単位のモル質量で割ったもの（基の数／（ｇ／ｍｏｌｅ））。パラメーター（１）は、相互作用中心（三次元的に膨潤させたヒドロゲルネットワークの中の負に荷電したスルフェート基又はスルホネート基に相当）の数に関連し、従って、ヒドロゲルの中へのタンパク質（シグナル伝達分子、酵素）の結合に顕著に影響するであろう。このパラメーターには、ＧＢとタンパク質（シグナル伝達分子、酵素）との、分子間相互作用（すなわち、隣接するポリマー鎖の相互作用）が含まれる。その一方で、パラメーター（２）は、異なるＧＢ上での相互作用中心（負に荷電したスルフェート基又はスルホネート基に相当）の密度及び分布を示し、そのため、タンパク質と、それぞれ個々のＧＢとの相互作用を決めるであろうし、従って、ポリマー鎖の電荷中心の空間的な修飾を介する特異的な相互作用が含まれるが、これは、たとえば、タンパク質−グリコサミノグリカン相互作用として公知である（参照、Ｃａｐｉｌａ，Ｉ．Ｌｉｎｈａｒｄｔ，ＲＪ  Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ，２００２，４１（３），３９１〜４１２）。ヒドロゲルとタンパク質（シグナル伝達分子）との間の結合及び放出の挙動は、本発明においては、パラメーター（１）及び（２）両方から得られるヒドロゲルネットワークの性質の結果を重ね合わせることによって決められ、したがって、これらのパラメーターを特定することによって定量的に記述することができる（例示的実施形態ＵＧＢ１−ＧＢ１  ０１からＵＧＢ１−ＧＢ４  ０４の結果も参照されたい）。
【００２１】
さらに、立体的な効果も考慮しなければならないが、その理由は、タンパク質を結合及び隔離するためには、そのヒドロゲルネットワークの立体的な接近容易性（ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）が保証されていなければならない、すなわち、そのタンパク質のサイズが、そのヒドロゲルのメッシュサイズ（たとえば、ゴム弾性理論の方法によるヒドロゲルの貯蔵モジュラスから、材料及び方法に関連して、推定される）を超えてはならないからである。
【００２２】
バイオ流体を、それらのネットワーク構造及びそれらのスルフェート化度又はスルホン化度で、選択的にグレードわけすることが可能なヒドロゲルと接触させることによって、そのバイオ流体中の関連するシグナル伝達分子の濃度を、シグナル伝達分子のそのヒドロゲルに対する結合の特異的な選択性を介して調節することが可能であり、したがって、生物学的又はバイオテクノロジー的な適用に調節することができる。その生物学的適用は、医療的な文脈においては、血管形成、血管のスプラウティング、免疫応答の制御のため、とりわけ神経変性及び自己免疫性及び癌の疾患、糖尿病の治療のため、皮膚の創傷治癒及び骨再生において、腫瘍増殖の抑制のため、並びに体内及び体表での消毒及び抗菌処置のための、可溶性シグナル伝達分子の修飾に関連させることができる。バイオテクノロジー的な適用には、胚幹細胞（ＥＳ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）、その他の非ＥＳ及びｉＰＳ関連幹細胞及び前駆細胞、一次の、患者由来の細胞、不死化細胞系、並びに心臓、筋肉、腎臓、肝臓及び神経組織、さらにはタンパク質混合物、特にシグナル伝達分子混合物又は酵素混合物の濃縮又は枯渇、且つ分離における、インビトロの細胞及び器官の培養が含まれる。
【００２３】
本発明のまた別の態様は、先に述べたように、ポリ（４−スチレンスルホン酸−コ−マレイン酸）の形態にある荷電された構成単位、及びアミン基又はチオール基を含むポリマー、又は少なくとも２個のアミノ基若しくはチオール基を有する架橋剤分子の形態にある荷電されていない構成単位をベースとする、上述の方法を実施するための共有結合的に架橋されたヒドロゲル材料に関連する。それらの荷電された構成単位及び荷電されていない構成単位が架橋されて、ポリマーネットワークを形成するが、それらは、ポリ（４−スチレンスルホン酸−コ−マレイン酸）のカルボキシル基を、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）／Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）を用いて活性化し、アミン基を含むポリマー又は少なくとも２個のアミノ基を有する架橋剤分子を用いて直接的に架橋させて、それぞれアミドを形成させるか、又は、アミノ基及びマイケルタイプの付加をすることができる基をそれぞれ有する二官能性架橋剤分子の手段による活性化されたカルボキシル基の機能付与、及びそれに続けてのチオール基を含むポリマー又は少なくとも２個のチオール基を有する架橋剤分子のそれぞれマイケルタイプの付加を介して架橋させることにより、得ることができる。マイケルタイプの付加が可能な基は、マレイミド基、ビニルスルホン基、及びアクリレート基から選択するのが好ましい。荷電されていない構成単位として、アミン基又はチオール基を含むポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（２−オキサゾリン）（ＰＯＸ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）及び／又はポリアクリルアミド（ＰＡＭ）のクラスから選択するのが好ましい。それらに代わって使用される、アミン基又はチオール基を含む短鎖の架橋剤分子が、非ポリマー性の二官能性架橋剤分子であるのが好ましい。荷電された構成単位としてのポリ（４−スチレンスルホン酸−コ−マレイン酸）は、４−スチレンスルホン酸対マレイン酸のモル比が、６：１から１：６までの範囲、且つモル質量が、５，０００〜１００，０００ｇ／ｍｏｌｅの範囲で変化させて、選択するのが有利である。本発明の特に好ましい実施形態においては、ポリマーネットワーク形成のために、酵素的に切断可能なペプチドを含むポリマーが、荷電されていない構成単位として使用される。これらの酵素的に切断可能なペプチドは、好ましくは、反応性アミノ酸として、ペプチド配列の中に、リシン（側鎖の中にアミノ基）、又はシステイン（側鎖の中にチオール基）のいずれかを有している。酵素的に切断可能なペプチドは、有利には、ヒト又は細菌性プロテアーゼを利用して切断することが可能であり、具体的には、以下のものが挙げられる：応答性のマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）たとえば、ＰＱＧＩＷＧＱ、ＩＰＶＳＬＲＳＧ若しくはＶＰＭＳＭＲＧＧ、カテプシン応答性のたとえば、ＶＰＭＳＭＲＧＧ、エラスターゼ応答性のたとえば、ＡＡＰＶ若しくはＡＰＥＥＩＭＤＲＱ、血液凝固酵素応答性のたとえば、トロンビン応答性のＧＧＦ−ピペコリン酸ＲＹＳＷＧＣＧ若しくはＧＧ−シクロヘキシルアラニンＡＲＳＷＧＣＧ、ＦＸａ応答性のたとえば、ＧＧＩＥＧＲＭＧＧＷＣＧ、カリクレイン応答性たとえば、ＣＧＧＧＰＦＲＩＧＧＷＣＧ、又は細菌性−プロテアーゼ応答性の、たとえば、オーレオリシン応答性のＡＤＶＦＥＡ若しくはＡＡＥＡＡ、エラスターゼ−応答性のＡＡＰＶ、又はプロテアーゼＩＶ応答性配列の、ＭＫＡＴＫＬＶＬＧＡＶＩＬＧＳＴＬＬＡＧ。このようにして構築されたヒドロゲルでは、自己調節性の放出及び分解メカニズムが可能となる。本発明のまた別の実施形態においては、アミノ基又はカルボキシル基を有する生理活性及び／又は抗接着性（ａｎｔｉａｄｈｅｓｉｖｅ）分子、及び／又は細胞工学的（ｃｅｌｌ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）ペプチド、特に、ＫＣＷＧ−ＲＧＤＳＰ、ＫＣＷＧ−ＥＩＤＧＩＥＬＴ、ＫＣＷＧ−ＩＫＬＬＩ、ＫＧＣＷＧＧＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ、ＫＧＣＷＧＧＳＤＰＧＹＩＧＳＲＳＤＤＳＡ、ＫＧＣＷＧＧＰＱＶＴＲＧＤＶＦＴＭＰ、ＫＧＣＷＧＧＫＧＧＮＧＥＰＲＧＤＴＹＲＡＹから選択されるものが、配列中のリシン又はシステインを介して、荷電された構成単位のポリ（４−スチレンスルホン酸−コ−マレイン酸）、又はヒドロゲルネットワークにマイケルタイプの付加が可能な基を有するその誘導体に、共有結合を形成することにより結合される。それらの生理活性分子は、抗菌物質、たとえば抗生物質若しくは消毒剤、又は医薬品であってよい。抗接着性分子は、好ましくは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はポリ（２−オキサゾリン）（ＰＯＸ）である。細胞工学的ペプチドは、好ましくは、細胞外マトリックスの構造タンパク質及び機能性タンパク質から誘導されるペプチド、たとえばコラーゲン、ラミニン、テネイシン、フィブロネクチン、及びビトロネクチンから誘導されるペプチドである。有利な実施形態においては、その生理活性及び／又は抗接着性及び／又は細胞工学的なペプチドが、酵素的に切断可能なペプチド配列を介して、ヒドロゲルネットワークに共有結合的に結合されている。酵素的に切断可能なペプチドは、すでに述べたように、好ましくは、ヒト又は細菌性プロテアーゼ、たとえばＭＭＰ、カテプシン、エラスターゼ、血液凝固酵素に感受性がある。このタイプのヒドロゲルによって、ヒドロゲルネットワークを保持しながらも、自己調節性放出及び分解メカニズムが可能となる。そのヒドロゲル材料が、０．２〜２２ｋＰａの貯蔵モジュラスを有しているのが好ましい。膨潤させたネットワーク中のスルホネート濃度、及び繰り返し単位のモル質量（ＭＷ）で割り算をした繰り返し単位あたりのスルホネート基の数（ＷＥ）（単位、ｇ／ｍｏｌｅ）は、表５．１に定義される範囲に従って、互いに独立して変化させることが可能である（下記、参照）。
【００２４】
したがって、本発明は、完全に合成で、高度に水和されたヒドロゲルを提供するが、それは、荷電された構成単位（ＧＢ）としてのポリ（４−スチレンスルホン酸−コ−マレイン酸）のスルホネート基を介して物質群のための親和中心を担持しており、意識的に格付け可能な物理的及び生化学的性質を有している。この場合、ポリ（４−スチレンスルホン酸−コ−マレイン酸）は、先に記述されたヒドロゲル材料の意味合いでは、荷電された構成単位（ＧＢ）として使用される。この材料は、天然の細胞外のマトリックス（ＥＣＭ）のすべての重要な機能を、モジュール方式で、すなわちほとんど互いに独立して、マップする可能性を与える。さらに詳しくは、これらの機能は、第一の機能としては、成長している細胞のための枠組み、支持、及び保護機能であり、第二の機能としては、細胞接着の調節であり、第三の機能としては、治療的に関連するシグナル伝達分子のグレードわけした隔離及び可逆的な放出であり、且つ第四の機能としては、内殖細胞によるオンデマンド方式の再構築の可能性である。物理的性質たとえば、その材料の剛性及び水和度は、広い範囲で調節可能である。本発明の好ましい実施形態においては、この目的のために、共有結合的に架橋されたヒドロゲルが、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）／Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）を用いて活性化されたポリ（４−スチレンスルホン酸−コ−マレイン酸）のカルボキシル基を、荷電されていない構成単位としての、直鎖状若しくはｓｔａｒ−分岐状のポリエチレングリコールの末端アミノ基と、安定なアミド基を介して、反応させることにより、調製された。それに代わる実施形態においては、生細胞を包埋する場合に好ましいが、第一のステップにおいて、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）／Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）を用いて活性化させたポリ（４−スチレンスルホン酸−コ−マレイン酸）のカルボキシル基を、短鎖の二官能性架橋剤分子、Ｎ−（２−アミノエチル）マレイミドの手段でグレードわけし、すなわち、ポリ（４−スチレンスルホン酸−コ−マレイン酸）の１分子あたり、６〜１０個のＮ−（２−アミノエチル）マレイミドの分子を用いて機能付与し、次いで精製、単離する。Ｎ−（２−アミノエチル）マレイミドを用いた、ポリ（４−スチレンスルホン酸−コ−マレイン酸）のこれらの誘導体を次いで、水溶液中又は複合バイオ流体中で生細胞及び生体分子を混合したときに、自発的で、バイオオルソゴナルな（ｂｉｏ−ｏｒｏｔｈｏｇｏｎａｌ）反応をさせるが、前述のヒドロゲル構造の意味合いの内で、機能付与したポリ（４−スチレンスルホン酸−コ−マレイン酸）誘導体のマレイミド基と、荷電されていない構成単位としての、チオール基含有二官能性架橋剤分子又はチオール基含有ポリマーのチオール基との間でのマイケルタイプの付加を介してのそれらの機能変化をもたらすことはない。これらの構成単位は、たとえば、その配列の中にアミノ酸のシステイン（これは、側鎖にチオール基を有している）を有し、且つ４本アームのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の１本以上のアームに前もって共役結合された、酵素的に切断可能なペプチドであってよい（Ｔｓｕｒｋａｎ，ｅｔ  ａｌ．，２０１３（Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．，２０１３，２５，２６０６〜２６１０に記載あり）。このタイプの架橋は、マレイミドと遊離のチオール基との反応が速いために、他の生体分子、又は細胞表面のタンパク質との望ましくない副反応がなく、直接的な反応が起きて、そのために、マイケルタイプの付加反応を、重合細胞のためのバイオオルソゴナルな架橋反応として使用することが可能であるという利点を有している。細胞工学的ペプチド、たとえばアミノ酸配列ＣＷＧＲＧＤＳＰの手段により、ポリ（４−スチレンスルホン酸−コ−マレイン酸）誘導体のマレイミド基を介して、ヒドロゲルに機能付与することもまた可能である。さらに、抗菌性物質、たとえば、正に荷電した抗生物質を用いて、ヒドロゲル材料に機能付与してもよい。
【００２５】
上述の方法を実施するために、共有結合的に架橋されたヒドロゲル材料に代わるものとして、物理的に架橋されたヒドロゲル材料を適用してもよい。この、同様に完全に合成の材料は、ポリ（４−スチレンスルホン酸−コ−マレイン酸）の形態にある荷電された構成単位と、ポリマーの形態にある荷電されていない構成単位との間の物理的相互作用をベースとしているが、ここで、高度に正に荷電したペプチド配列が、ポリマーの上に共役結合されている。高度に正に荷電したペプチド配列は、好ましくは、リシン若しくはアルギニンの少なくとも１０個の繰り返し、又はリシン及びアラニンを用いるか若しくはアルギニン及びアラニンを用いたジペプチドモチーフの少なくとも５個の繰り返しを含んでいる。
【００２６】
本発明の実施形態のさらなる詳細、特徴、及び利点は、以下の例示的実施形態の記述からも明らかになるであろうが、それらは、添付した表及び図によっても、記述され、立証される。図１は、ヒドロゲル上で、ヒトの内皮細胞を２４時間培養した後の、細胞培養物の代表的な光学顕微鏡画像を示している。
【００２７】
他の有利な濃度比もまた、ネットワークの性質を慎重に変化させることにより設定することが可能であり、提案された方法によって、追加のシグナル伝達分子へ分析を拡張することによって、いかなるバイオ流体中であっても、これらの化学種の濃度を調節することが可能ともなる。
【００２８】
【表１】
2020511220.tif 000003
【００２９】
【表２】
2020511220.tif 000004
【００３０】
【表３】
2020511220.tif 000005
【００３１】
【表４】
2020511220.tif 000006
【００３２】
【表５】
2020511220.tif 000007
【００３３】
【表６】
2020511220.tif 000008
【００３４】
【表７】
2020511220.tif 000009
【００３５】
【表８】
2020511220.tif 000010
【００３６】
表５．１、表５．２、表６．１及び表６．２において、繰り返し単位（ＷＥ）あたりのスルフェート基又はスルホネート基の数を、ＷＥのモル質量（ＭＷ）で割ったものを、荷電された単位［ｍｏｌｅ／ｇ］の性質として、列Ａに示す。膨潤させたヒドロゲルの性質として、ｍｍｏｌｅ／ｍＬの単位での、スルフェート基又はスルホネート基の濃度を列Ｂに、且つｋＰａの単位での貯蔵モジュラスを列Ｃに示す。列Ｄには、荷電されていない構成単位の性質を列記する。
【００３７】
列Ｅは、荷電された構成単位の、ポリマー１ｍｏｌｅあたりのスルフェート基又はスルホネート基のモル濃度（単位：ｍｏｌｅ／ｍｏｌｅ）を示している。列Ｆは、ｍｍｏｌｅ／ｍＬの単位でのＧＢの濃度としてのヒドロゲルの性質を示し、列Ｇは、ｍｍｏｌｅ／ｍＬの単位での、スルフェート基又はスルホネート基の濃度を示し、且つ列Ｃは、貯蔵モジュラスである。
【００３８】
２０ｋＰａの貯蔵モジュラスは、この方法で示された仮定に従えば、ほぼ６ｎｍのメッシュサイズに相当し、したがって、本明細書で論じたのと構造的に類似のシグナル伝達分子の全部が、ヒドロゲルの中に、立体的に接近するのが容易となっている筈である。
【００３９】
【表９】
2020511220.tif 000011
【００４０】
表７には、バイオ流体中で関連する濃度にある物質群Ａ及びＢの物質が列記されている。
【００４１】
ここで、上に示した表の中の例示的実施形態（ＡＢ）を参照しながら、本発明を説明する。
【００４２】
たとえば、表１の中のＵＧＢ１−ＧＢ１  ０１からのヒドロゲル（ＡＢ１）は、異なるシグナル伝達分子の濃度を調節するのに特に有利であることがわかった（表３参照）。
【００４３】
ケモカインのクラスは、三次構造と高い構造的類似性を有しており、それは、ジスルフィド橋架けによる４個のシステインによる相互作用により安定化されている（ＰＲＯＳＩＴＥ  ＩＤ：ＰＳ００４７１及びＰＳ００４７２に相当）。さらに、ケモカインは、強い正の実効電荷のＩＥＰ＞９、又は正に荷電したドメインたとえばＭＩＰ１−アルファ及びＭＩＰ１−ベータと、１０ｋＤａ未満のモル質量（表３参照）とを特徴としており、ヒドロゲルの中に、このヒドロゲルのタイプにより強く結合されていて、それにより、隣接するバイオ流体から枯渇されるが（ＭＩＰ１−アルファ及びＭＩＰ１−ベータの結合は、ほぼ６０％であり、他のケモカインの、エオタキシン、ＧＲＯ−アルファ、ＩＬ−８、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳ及びＳＤＦ−１アルファは９５％以上が結合される（表３））、その一方で、驚くべきことには、次の、ＦＧＦファミリー（ＰＲＯＳＩＴＥ  ＩＤ：ＰＳ００２４７に相当）及びＴＧＦｂ１ファミリー（ＰＲＯＳＩＴＥ  ＩＤ：ＰＳ００２５０に相当）の増殖因子及び構造的に類似のタンパク質のクラスに関連する、強く正に荷電したシグナル伝達分子ＦＧＦ−２（ＩＥＰ、９．５８）及びＴＧＦｂ１（ＩＥＰ、８．５９）は、３１％及び１８％と極めて弱く結合されており、ＰＬＧＦ（ＩＥＰ、８．３７）の結合性は１０％未満とさらに弱く（表３）、且つわずかに塩基性のＩＥＰを有するサイトカイン、たとえばＩＬ−１０（ＩＥＰ、７．６５）のクラスに関連するシグナル伝達分子、さらには中性の範囲（ｐＨ、５．５〜７）にあるＩＥＰを有するシグナル伝達分子、たとえばＩＬ１−ベータ、ＩＬ６、及びＴＮＦ−アルファ、並びにＩＬ−１−ベータタンパク質ファミリー（ＰＲＯＳＩＴＥ  ＩＤ：ＰＳ００２５３に相当）、ＩＬ−１０タンパク質ファミリー（ＰＲＯＳＩＴＥ  ＩＤ：ＰＳ００５２０に相当）、インターロイキン−６／ＧＭ−ＣＳＦ／ＭＧＦファミリー（ＰＲＯＳＩＴＥ  ＩＤ：ＰＳ００２５４に相当）及びＴＮＦ−アルファタンパク質ファミリー（ＰＲＯＳＩＴＥ  ＩＤ：ＰＳ００２５１に相当）の構造的に類似のタンパク質は、複合バイオ流体（ＴＮＦ−アルファの結合、約３８％）から、ほんの弱く３０％以下で結合されており（表３）、そのため、バイオ流体の中では、ほとんど荷電されない濃度で存在している。さらに、わずかに負の実効電荷のＥＧＦ（ＩＥＰ、４．８）及び１０％未満の結合性を有する増殖因子は、ほとんど結合されない。その結果、細胞の生存に欠かすことができないシグナル伝達因子、たとえばＥＧＦ、ＦＧＦ−２、ＴＧＦβ又はＰＬＧＦは、上述のヒドロゲルの方法で実現される隔離による影響は受けないままである。
【００４４】
塩基性の強いサイトカインのＩＦＮ−ガンマ（ＩＥＰ、９．５２）、ＩＬ−４（ＩＥＰ、９．２５）、ＷＮＴ及びＢＭＰ拮抗物質のスクレロスチン（９．５７）及びＤＫＫ１（８．７２）、さらには構造的に類似のタンパク質ＩＬ−４／ＩＬ−１３ファミリー（ＰＲＯＳＩＴＥ  ＩＤ：ＰＳ００８３８に相当）、及びスクレロスチン様のファミリー（ＩｎｔｅｒＰｒｏ  ＩＤ：ＩＰＲ００８８３５に相当）、並びに塩基性の強い増殖因子のｂＮＧＦ（ＩＥＰ、９．００）、ＰＤＧＦ（ＩＥＰ、９．４）及びＶＥＧＦ（ＩＥＰ、９．２）、並びに構造的に類似のタンパク質のＮＧＦファミリー（ＰＲＯＳＩＴＥ  ＩＤ：ＰＳ００２４８に相当）及びＰＤＧＦファミリー（ＰＲＯＳＩＴＥ  ＩＤ：ＰＳ００２５０に相当）及びＩＬ−１２ｐ４０は、予想通りに（表３）５９．９％以上と強く結合され、そのため、バイオ流体から枯渇される。
【００４５】
バイオ流体を、表５．１に記載のタイプ１の特定の電荷及びネットワーク特性を有するヒドロゲルと接触させることによって、注記した配列モチーフに従って、ＤＫＫ１、ｂＮＧＦ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＶＥＧＦ、さらにはケモカイン（たとえば、エオタキシン、Ｇｒｏ−アルファ、ＩＬ−８、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１アルファ、ＭＩＰ１ベータ、Ｒａｎｔｅｓ、ＳＤＦ１アルファ）に構造的に類似のタンパク質を有する増殖因子、並びにＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ４及びスクレロスチンに構造的に類似のタンパク質を有するサイトカインを選択すると、タンパク質ファミリーをバイオ流体から枯渇させることができるか、又はヒドロゲルをあらかじめ荷電しておくことによって、バイオ流体中のそれらの濃度を高めることが可能であり、その一方で、有利なことには、上述のシグナル伝達分子ＥＧＦ、ＦＧＦ−２、ＴＧＦｂ１、ＰＬＧＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ１ベータ、ＩＬ６、及びＴＮＦアルファの濃度をほとんど変化させずに保持することができる。さらに、このヒドロゲルは、ＧＢ１と、血液凝固では重要な酵素のトロンビン及び抗トロンビンとの相互作用を有している（Ｕｗｅ  Ｆｒｅｕｄｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ：Ｏｆｆｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ），２２０，ｎｏ．Ｐａｒｔ  Ａ，（２０１５／１２／２８）：７９〜８８，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｃｏｎｒｅｌ，２０１５．１０．０２８による）。
【００４６】
また別の特に有利な例示的実施形態（ＡＢ２）は、ヒドロゲルタイプＧＢ１−ＧＢ２  ０２（表２参照）からなり、このものは、ヒドロゲルタイプＵＧＢ１：ＧＢ１  ０１（表３参照）とほぼ同じ結合及び隔離パターンを有しているが、ただし、異なっているのは、２つのケモカイン、ＭＩＰ−１アルファ及びＭＩＰ−１ベータ並びにスクレロスチンとのより弱い結合性（それぞれ約４０％、表３）、及びＩＬ−１０（１５％）、ＩＬ−６（８％）、ＴＮＦアルファ（２５％）とのさらに弱い結合性（表３参照）、さらに有利には、ＦＧＦ−２（５％）及びＴＧＦｂ１（０％）との結合性がほとんど存在せず、且つＧＢ２と血液凝固酵素トロンビン及び抗トロンビンとの相互作用が欠けていることである（参照、Ｕｗｅ  Ｆｒｅｕｄｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ：Ｏｆｆｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ），２２０，ｎｏ．Ｐａｒｔ  Ａ，（２０１５／１２／２８）：７９〜８８，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｃｏｎｒｅｌ，２０１５．１０．０２８）。また別の有利な例示的実施形態は、ＵＧＢ２−ＧＢ５  ２３（ＡＢ２３、表１参照）であるが、このものは、ＡＢ２と同様に、表５．１に従えばタイプ２に割り当てることが可能な電荷特性を有しているが、スルホネート含量が、わずかに異なって０．１４ｍｍｏｌｅ／ｍＬであり（表１又は表５．２、列Ｂ）、且つ繰り返し単位（ＷＥ）あたりのスルホネート基の数をそのＷＥのモル重量（ＭＷ）で割った数値［ｍｏｌｅ／ｇ］０．００３８がわずかに異なっているが、しかしながら、両方のパラメーターが、表５．１でタイプ２ヒドロゲルに与えられた範囲である。しかしながら、そのヒドロゲルは、また別の荷電された、合成ゲル構成単位（ＧＢ５）から異なる架橋反応（架橋タイプ２、表１）を用いて形成されたものであり、ＡＢ２（表３参照）とほぼ同一の結合及び隔離パターンを有しているが、２つのケモカイン、ＭＩＰ−１アルファ及びＭＩＰ−１ベータに、いくぶん強い結合性を有している点で異なっている。このことは、表５．１に記載の特性電荷パターンを用いたヒドロゲルの分類を立証しており、特に有利な隔離パターンも表している。
【００４７】
また別の有利な例示的実施形態（ＡＢ３）は、ヒドロゲルタイプＵＧＢ１−ＧＢ３  ０３（表２参照）で代表されるが、このものは、多くのタンパク質（シグナル伝達分子）に対して、顕著に弱い結合性を有しているが、その理由は、ＡＢ１及びＡＢ２と比較して、ヒドロゲル中のスルフェート基又はスルホネート基の濃度が顕著に低く（表５．２、列Ｂ、０．０６、ＡＢ１又はＡＢ２での０．１２ｍｍｏｌｅ／ｍＬと比較されたい）、さらにはＷＥあたりのスルフェート基又はスルホン基の数をＷＥのモル質量で割ったものが、ＡＢ１又はＡＢ２での０．００５又は０．００３５に比較して、０．００１９と低い（参照、表５．２、列Ａ）からである。このタイプのヒドロゲルでは、ｂＮＧＦ、ＰＤＧＦ−ＢＢ及びＶＥＧＦ  Ａ、エオタキシン、ＧＲＯ−アルファ、ＩＰ−１０、Ｒａｎｔｅｓ、ＳＤＦ−１アルファ、ＩＦＮ−ガンマ、並びにＩＬ−４が、ヒドロゲルによって５０％を超えて結合され、それにより、バイオ流体から枯渇される。それとは対照的に、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１及びＩＬ−１２ｐ４０は、ヒドロゲルによって約４５％しか結合されず（表３参照）、ＨＧＦ、ＭＩＰ−１アルファ、ＭＩＰ−１ベータ、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−１０、ＩＬ−６、ＴＮＦアルファ、及びＤＫＫ１は、１６〜３６％でさらに弱く（表３参照）、且つＦＧＦ−２、ＴＧＦｂ１、ＥＧＦ、ＰＬＧＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、及びスクレロスチンはほとんど結合されず（１２％未満）（表３参照）、そのため、シグナル伝達分子の大部分は、ＡＢ１及びＡＢ２よりは、顕著に少ない。このタイプのゲルを用いれば、任意のバイオ流体から、たとえばｂＮＧＦ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、及びＶＥＧＦ  Ａ、エオタキシン、ＧＲＯ−アルファ、ＩＰ−１０、Ｒａｎｔｅｓ、ＳＤＦ−１アルファ、ＩＦＮ−ガンマ、並びにＩＬ−４を、高い選択性で分離することが可能である。
【００４８】
また別の有利な実施形態は、ヒドロゲルＵＧＢ１−ＧＢ４  ０４（表１参照）であって、このものは、ヒドロゲル中でのスルフェート基又はスルホネート基の濃度が０．２８ｍｍｏｌｅ／ｍＬと高く（表５．２、列Ｂ）、同様に、ＷＥあたりのスルホネート基の数をＷＥのモル質量で割ったものが０．００４５ｍｏｌｅ／ｇと高いために、ＨＧＦ、ＰＬＧＦ、ＧＭ−ＧＳＦ、及びＥＧＦを例外として、検討したすべての因子を、ヒドロゲルの中に高効率（７２〜１００％、表３参照）で結合し、そのため、それらが、バイオ流体から枯渇される（表３参照）。
【００４９】
特に、このヒドロゲルを用いると、隣接するバイオ流体からの、検討し、構造的に類似のすべての因子（ＩＥＰ、及び構造的類似性の存在）の枯渇が起こるが、特には、次のものが挙げられる：ジスルフィド橋架けによる４個のシステインの相互作用から生じる三次構造の高い構造類似性を有し、且つ強い正の実効電荷、ＩＥＰ＞９、又はＭＩＰ１アルファ及びＭＩＰ１ベータの中におけるような正に荷電したドメイン、及び１０ｋＤａ未満の分子量を特徴とするケモカインのクラス（ＰＲＯＳＩＴＥ  ＩＤ：ＰＳ００４７１及びＰＳ００４７２に相当）（表のタンパク質性質参照）、ＦＧＦ−２（ＩＥＰ、９．５８）、ＴＧＦｂ１（ＩＥＰ、８．５９）、及び構造的に類似のＦＧＦファミリータンパク質（ＰＲＯＳＩＴＥ  ＩＤ：ＰＳ００２４７に相当）、ＴＧＦファミリー（ＰＲＯＳＩＴＥ  ＩＤ：ＰＳ００２５０に相当）及び、わずかに塩基性のＥＰを有するサイトカインたとえば、ＩＬ−１０（ＩＥＰ、７．６５）に関連するシグナル伝達分子のクラス、さらには、中性の範囲（ｐＨ、５．５〜７）にあるＩＥＰを有するシグナル伝達分子たとえば、ＩＬ１β、ＩＬ６、及びＴＮＦ、並びにＩＬ−１βタンパク質ファミリー（ＰＲＯＳＩＴＥ  ＩＤ：ＰＳ００２５３に相当）及びＩＬ−１０タンパク質ファミリー（ＰＲＯＳＩＴＥ  ＩＤ：ＰＳ００５２０に相当）の構造的に類似のタンパク質。また別の有利な例示的実施形態の、ＵＧＢ２−ＧＢ４  ２０（表１参照）は、表５．１に従えば、同じＧＢ  ５を有するＡＢ４と同様にタイプ４に属することが可能な電荷特性（参照、表５．１列Ａ：０．００４５）を有するが、ただしスルホネート濃度は０．１６ｍｍｏｌｅ／ｍＬ（参照、表１及び表５．１））と低いものの、それでもまだタイプ４に属するが、しかし異なる架橋反応（表１におけるＶＮ：２）を用いて形成されたものであって、ＵＧＢ１−ＧＢ４  ０４とほぼ同一の結合又は隔離パターンを有している（表３参照）。したがって、この結果もまた、物質の群の物質の区分した隔離のための、表５．１に記載のタイプ１〜５の電荷特性の、効果的な予知性能を立証している。
【００５０】
また別の例示的実施形態は、ＵＧＢ１及びＵＧＢ３から形成させた、荷電していないヒドロゲル（ＵＧＢ２−ＵＧＢ３  ２６）であって、このものは、予想した通り、ネガティブコントロールとして、バイオ流体からシグナル伝達分子をほとんど、全く結合しない。ＰＤＧＦ−ＢＢを１９．７±２３．１％、且つＩＰ  １０を１６．１±１６．４％と少しは隔離したことを除けば（これは標準偏差が大きいので、有意であるとは分類することができない）、このヒドロゲルでは、隔離は起きない（試験したすべてのシグナル伝達分子で、１．３％以下、表３参照）。この結果は、荷電された親和中心が存在しないこと、したがって、上述の電荷相互作用が存在しないことに、明らかに帰することができる。しかしながら、４．４ｋＰａの貯蔵モジュラス、したがってネットワークのメッシュサイズ（表１）は、ＵＧＢ１−ＧＢ２  ０２、ＵＧＢ２−ＧＢ４  ２０及びＵＧＢ２−ＧＢ５  ２３の貯蔵モジュラスとほぼ同等である、すなわち、荷電された例示的実施形態のシグナル伝達分子との立体的な相互作用は、匹敵している。これらの結果は、特に荷電していないヒドロゲル（ＵＧＢ２−ＵＧＢ３  ２６）とシグナル伝達分子との相互作用が欠落していること（すなわち、結合及び隔離効果の不在）によって、表５．１に記載の区分した隔離の主張を実証している。
【００５１】
それと同時に、個々の因子を、他の因子の隔離、したがって枯渇と平行且つ独立して、表５のタイプ１〜３のヒドロゲルを選択的にプリチャージさせることによって、バイオ流体の中に放出させることができる。したがって、各種のタイプのヒドロゲルを用いて、合バイオ流体中の個々のシグナル伝達分子のほとんどすべてのレベルを、ヒドロゲルに目標のプリチャージをすることによって調整することができるか、又は、シグナル伝達分子をほぼ定量的に隔離（枯渇）させることができる（たとえば、各種のタンパク質含有溶液からシグナル伝達分子を分離するために適用）。
【００５２】
ＵＧＢ１−ＧＢ１  ０１〜ＵＧＢ２−ＵＧＢ３  ２６の例示的実施形態に基づくと、本発明の記述において重要な、タンパク質の性質、ヒドロゲルの性質、及びヒドロゲルネットワークにおけるタンパク質の結合性の間の次の関係は明白である：表３に記載のシグナル伝達分子の強い結合性は、タンパク質の側では、正の実効電荷（ここでは、相当するパラメーターとして、高い塩基性のＩＥＰ）、さらには分子量の逆数（高いＩＥＰ及び小さい分子量は結合性を向上させる、参照、表３）に関連し、高く正に荷電し、比較的に小さいケモカイン（＜９ｋＤａ）は、最も強く結合され、且つヒドロゲルネットワークの側では、（１）ヒドロゲル中におけるスルフェート基又はスルホネート基の高い濃度（表１、及び５．２、列Ｂ）、及び（２）ＷＥあたりのスルフェート基又はスルホネート基の数をＷＥのモル質量で割ったものが大きいと、シグナル伝達分子の結合性が高くなる。これらのパラメーターに対応して、ヒドロゲルに対する、最強の結合性から最弱の結合性まで、次のような順序が得られる：ＵＧＢ１−ＧＢ４  ０４≒ＵＧＢ２−ＧＢ４  ２０＜ＵＧＢ１−ＧＢ１  ０１＜ＵＧＢ１−ＧＢ２  ０２≒ＵＧＢ２−ＧＢ５  ２３＜ＵＧＢ１−ＧＢ３  ０３＜＜ＵＧＢ２−ＵＧＢ３  ２６。この結果は、実験的に見出された結合性の値を裏付けている（表３参照）。それに加えて、上述のヒドロゲルネットワークのパラメーター（１）と（２）の組合せを変えると、文献において「特異的な相互作用（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ）」として知られている強い相互作用、すなわちタンパク質と負に荷電した多価電解質（たとえば、グリコース−アミノグリカン）との間の異なる相互作用中心の空間的なマッチングを調整することが可能であり、したがって、分子量及び実効荷電に加えて、その他の構造的な性質をタンパク質側で使用して、ヒドロゲルに対する結合性を調節することができる。これらの相関により、塩基性が強く、比較的に小さなシグナル伝達分子のＦＧＦ−２、ＴＧＦｂ１及びＰＬＧＦの、ヒドロゲルのタイプＵＧＢ１−ＧＢ１  ０１、ＵＧＢ１  ＧＢ２−０２、ＧＢ３  ＵＧＢ１−０３、及びＵＧＢ１−ＧＢ４  ０４に対する結合性が低いことも説明できる。
【００５３】
可溶性シグナル伝達分子のレベルを調節するためのさらなる可能性は、異なるヒドロゲルのタイプを順次又は組み合わせて使用することをベースとし、広く各種の特異的な隔離及び放出の性質を的確に調節することである。ネットワークの性質（特に、前述のパラメーター（１）及び（２）の目標とする変動、及びさらに、いわゆる多相ヒドロゲル材料における異なる組成物の中のヒドロゲルのミクロ粒子の組合せ（たとえば、個々のシグナル伝達分子を用いた荷電）（すなわち、異なるタイプのヒドロゲルのタイプを混合するか、又はシグナル伝達分子又はタンパク質をプリチャージすることによって）、その他の有利な濃度比を、隣接するバイオ流体の中で設定することもまた可能である。
【００５４】
分析をさらなるシグナル伝達分子にまで拡張することにより、提案されている方法により、各種のタイプのバイオ流体中のそれらの物質濃度を調節することが可能となる。
【００５５】
シグナル伝達分子の複雑な生物学的機能を、たとえば治療的なコンセプトのために、効果的に調節することを可能とするためには、細胞の直接的な（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ）生物学的環境又は生物学的適用からは異なるシグナル伝達分子を積極的に管理することが、シグナル伝達分子を用いてプリチャージされたヒドロゲルから個々のシグナル伝達分子を徐放させることに加えて、必要である。したがって、多数の関連するシグナル伝達分子との相互作用を考慮しなければならない。スルフェート化又はスルホン化成分を含むヒドロゲルを、徐放性のために、シグナル伝達分子を用いて荷電した場合、生物学的環境からのその他の治療的に重要な分子を、同時に隔離し、したがってそのシグナル伝達分子の治療的に望ましい放出を用いて、同時に不活性化する可能性があり、それにより、望ましくない副作用を呈する可能性がある。しかしながら、他方では、スルフェート化基又はスルホン化基を担持するヒドロゲルの中に、治療的に望ましくないシグナル伝達分子を特に隔離し、それにより不活性化させることもまた可能である。全体として、極めて複雑な放出及び隔離のシナリオが可能であって、それにより、全体として、生物学的効果、特に材料の分子分離性能が決められる。
【００５６】
本発明のさらに有利な実施形態には、低いトータルレベルでの生物学的に活性なタンパク質の濃度又はレベルを調節するための、表５のタイプ１〜４に従ったヒドロゲルの使用が含まれる。
【００５７】
その方法の本質的な利点は、その利用可能性が広範であるところにある。その方法は、有利には、スルフェート化成分又はスルホン化成分を含むヒドロゲルを使用することによる、バイオ流体から又はバイオ流体のバイオテクノロジー的な精製及びタンパク質混合物の分離の両方に使用することができる。
【００５８】
例示的な狭い文脈においては、因子を取り扱うその方法は、血管形成、免疫疾患、糖尿病、神経変性疾患、及び創傷治癒を調節するために、インビボで使用することができる。
【００５９】
創傷治癒においては、主として炎症誘発（ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）作用のあるケモカイン（たとえば、エオタキシン、ＧＲＯ−ａ、ＩＬ−８、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−３、ＭＣＤ、Ｒａｎｔｅｓ、及びＳＤＦ−１）をヒドロゲルの内側に隔離するが、それに対して再生誘発（ｐｒｏ−ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ）因子（たとえば、ＥＧＦ、ＦＧＦ−２、ＴＧＦｂ１、ＩＬ−１０、ＨＧＦ、及びＰＬＧＦ）は、ほとんど影響を受けないままであろう。
【００６０】
本発明の特に重要な適用分野は、バイオ流体中の物質の濃度の調節であって、これは、インビトロ及びインビボでの細胞の運命を決める役割を担っている。炎症誘発性のケモカインの調節不全及びそれに伴う慢性の炎症は、各種の疾患たとえば、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、喘息、又は慢性関節リウマチの発症の原因である。本発明による、スルフェート化成分又はスルホン化成分を含む各種のヒドロゲルを適用することにより、バイオ流体からこれらの炎症性因子の濃度を調節することを目標とするのは、可能な適用シナリオを表している。
【００６１】
より広い文脈では、本発明による、スルフェート化成分又はスルホン化成分を含むヒドロゲルを適用することによって、複合タンパク質混合物から、検討中、又は構造的に類似のシグナル伝達分子の精製を目標とすることが可能となる。したがって、記述されたゲル系は、微生物又は真核生物由来の細胞溶解物から、タンパク質を目標とする精製のために、バイオテクノロジー的に使用することができる。この場合においては、それらの細胞溶解物が、本発明におけるヒドロゲルによって促されて、シグナル伝達分子に結合する。第二のステップにおいては、その結合された物質を、高濃度の食塩溶液又は正に荷電した多価電解質（たとえば、キトサン）を用いて洗浄し、その結果分離することにより、さらなる用途のためにそのヒドロゲルから再び取り出すことができる。さらに、タイプ１〜３結合例のヒドロゲルに弱く結合されたシグナル伝達分子を分離するためのネガティブな選択もある。ＥＧＦ、ＦＧＦ−２、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１０、ＨＧＦ、及びＰＬＧＦは、２４時間結合させた後の上澄みを使用することにより、可能である。
【００６２】
本発明の関連する実用的な利点は、各種の生物学的に関連するシグナル伝達分子の、目標とする段階的な電荷特性とネットワーク構造とを有するスルフェート化又はスルホン化ヒドロゲルへの結合が、バイオ流体のような生理的電解質の中での、１ｍｇ／ｍＬ〜４５ｍｇ／ｍＬもの高いアルブミン濃度と同時に、１００ｐｇ／ｍＬ〜２０００ｎｇ／ｍＬのような低いレベルのシグナル伝達分子でも実現されること、並びに、その結果、個々のシグナル伝達分子の異なるヒドロゲルのタイプへの結合性における選択性の違いを利用することが可能であることにある。
【００６３】
表１に示したＵＧＢ１−ＧＢ１  ０１〜ＵＧＢ１−ＧＢ４  ０１１の例示的実施形態は、架橋反応１に従った共有結合的に架橋されたヒドロゲルであるが、ここで、ＧＢ４（ポリ（４−スチレンスルホン酸−コ−リンゴ酸）の分子、スチレンスルホン酸：マレイン酸モル比＝３：１、表１）の６〜２４個のカルボキシル基（４本アームのスターＰＥＧにおける１．５〜６のモル比に依存する）が、ＥＤＣ／スルホ−ＮＨＳで活性化されて、４本アームの、アミン末端のＵＧＢ１と直接反応して、ヒドロゲルを生じ（表１参照）、スルホネート濃度が０．２８〜０．０６ｍｍｏｌｅ／ｍＬで可変であり、且つ貯蔵モジュラスが４．８〜１９．６ｋＰＡで可変のヒドロゲルが得られる（表１参照）。
【００６４】
表１に示した例示的実施形態ＵＧＢ１−ＧＢ５  １２〜ＵＧＢ１−ＧＢ５  １９は、架橋原理１に従った共有結合的に架橋されたヒドロゲルであるが、ここで、スチレンスルホン酸対マレイン酸＝１：１のモル比を有するポリ（４−スチレンスルホン酸−コ−マレイン酸）の分子（ＧＢ５）の６〜２４個のカルボキシル基（４官能のスターＰＥＧの中の、モル比１．５〜６に依存する）が、ＥＤＣ／ＳＮ  ＨＳによって活性化され、且つ、４本アームの、アミン末端のＵＧＢ１（表１参照）の手段によってヒドロゲルに直接転換されて、スルホネート濃度が０．１３〜０．０５ｍｍｏｌｅ／ｍＬで可変であり、且つ貯蔵モジュラスが３〜２１．８ｋＰＡの相で可変であるヒドロゲルが得られる（表１参照）。
【００６５】
例示的実施形態のＵＧＢ２−ＧＢ４  ２０〜ＵＧＢ２−ＧＢ４  ２２は、架橋原理２に従った、共有結合的に架橋されたヒドロゲルであり、そこでは、スチレンスルホン酸：マレイン酸のモル比＝３：１で、ＥＤＣ／スルホ−ＮＨＳを用いて活性化されたＧＢ４（ポリ（４−スチレンスルホン酸−コ−マレイン酸）の８個のカルボキシル基が、第一のステップにおいて、短鎖の二官能性架橋剤分子のＮ−（２−アミノエチル）マレイミドを用いて機能付与され、その後で、精製、単離される。これらのＧＢ４の誘導体は、生理食塩液（又は血清）をＵＧＢ−２（チオール末端の４本アームのＰＥＧ）と混合することによって、ヒドロゲルに転換させると、スルホネート基の濃度が０．１６〜０．０５ｍｍｏｌｅ／ｍＬ且つ貯蔵モジュラスが３．７〜０．２ｋＰａの階調を有するヒドロゲルが得られた。
【００６６】
例示的実施形態のＵＧＢ２−ＧＢ５  ２３〜ＵＧＢ２−ＧＢ５  ２５は、架橋原理２（ＶＮ２、表１）に従った共有結合的に架橋されたヒドロゲルであって、そこでは、スチレンスルホン酸：マレイン酸＝１：１のモル比を有し、ＥＤＣ／スルホ−ＮＨＳで活性化されたＧＢ５（ポリ（４−スチレンスルホン酸−コ−マレイン酸）の８個のカルボキシル基が、第一のステップにおいて、短鎖の二官能性架橋剤分子のＮ−（２−アミノエチル）マレイミドによって機能付与され、次いで、精製、単離される。次いで、これらのＧＢ５の誘導体を、生理食塩溶液（又は血清）をＵＧＢ−２（チオール末端の４本アームのＰＥＧ）と混合することにより、ヒドロゲルに転換させると、スルホネート基の濃度が０．１４〜０．０４ｍｍｏｌｅ／ｍＬ、且つ貯蔵モジュラスが４．６〜０．３ｋＰａの階調を有するヒドロゲルが得られた。
【００６７】
例示的実施形態のＵＧＢ２−ＵＧＢ３  ２６は、荷電していないＰＥＧヒドロゲルであって、それでは、架橋原理２に従って、チオール末端の４本アームのＰＥＧ（ＵＧＢ−２）を、マレイミド末端の４本アームのＰＥＧ（ＵＧＢ−３）と反応させた。このヒドロゲルは、隔離実験において、荷電していないネガティブコントロールとして使用した。
【００６８】
驚くべきことには、広範囲の有利な性質及び性質の組合せを有し、且つ不都合な免疫原性反応を示さない完全合成のヒドロゲルが、例示的実施形態０４〜５をベースに調製することができる。したがって、膨潤させたヒドロゲルの、０．０４〜０．２８ｍｍｏｌｅ／ｍＬの広範なスルホネート基の濃度と、０．２〜２１．８ｋＰａの貯蔵モジュラスの同様に大きな変動とが、互いに独立して大幅に調節することが可能である。たとえば、ヒドロゲルのＵＧＢ２−ＧＢ４  ２１、ＵＧＢ１−ＧＢ５  １４、ＵＧＢ１−ＧＢ５  １５、及びＵＧＢ１−ＧＢ４  ０８は、膨潤させたヒドロゲルの中で一定のスルホネート基の濃度０．０８ｍｍｏｌｅ／ｍＬを有しているが、それと同時に、貯蔵モジュラスは、１．１、５．５、１２．５、及び１９．６ｋＰａと漸増している、すなわち、ヒドロゲルのスルホネート濃度と剛性は、広い範囲にわたって、互いに独立して変調させることができる。同様に、ほぼ一定の８．０〜８．５ｋＰａの貯蔵モジュラスを有するが、０．０５のスルホネート濃度を有するＵＧＢ１−ＧＢ５  １９、０．０６のスルホネート濃度を有するＵＧＢ１−ＧＢ４  １１、及び０．０９のスルホネート濃度を有するＵＧＢ１−ＧＢ４  １０の選択では、そのスルホネート濃度を、ヒドロゲルの剛性とは独立して変化させることができる（表１参照）。それに加えて、ＶＮ１の場合で、１．５〜３、及び３〜６、且つＶＮ２の場合で０．５〜０．７５、及び１〜１．５、及び１．５〜２の範囲のＵＧＢ：ＧＢのモル比のさらなる変動、且つＧＢ及びＵＧＢの濃度のさらなる変動と共に、その他多くの性能の組合せを作ることができる。
【００６９】
驚くべきことには、マレイン酸中の密に隣接している酸基の１つをＥＤＣ／スルホＮＨＳを用いて活性化させる（それは、隣接するカルボキシル基のみならず、特にはスルホネート基及び疎水性のスチレン単位によって、それらの反応性が、予測不能な様式で影響される）ことから開始する、ポリ（４−スチレンスルホン酸−コ−マレイン酸）の架橋によって、荷電されていない構成単位で定義されるヒドロゲル材料を、上述の幅広く格付け可能な性質を有するように、合成することが可能であった。この場合、精密なネットワーク形成（ＶＮ１の場合）又は誘導体化（ＶＮ２の場合）が、驚くべきことには、１分という極めて短い活性化時間（すなわちＥＤＣ／スルホＮＨＳが、ポリ（４−スチレンスルホン酸−コ−マレイン酸）に添加され（参照、表４）、その後で、アミノ基を担持した分子を、次いで、活性化されたポリ（４−スチレンスルホン酸−コ−マレイン酸）と混合し、且つその反応剤を極めて強力な撹拌をすることにより反応させる間の時間）を使用して達成された。
【００７０】
また別の例示的実施形態においては、タイプＵＧＢ１−ＧＢ１  ０１、ＵＧＢ１−ＧＢ４  ２０、ＵＧＢ１−ＧＢ５  ２３、及びＵＧＢ１−ＧＢ３  ２６のヒドロゲルを、接着ペプチドのＣＷＲＧＤＳＰを用いて機能付与し、且つＶＥＧＦ−Ａ及びＦＧＦ−２を用いてプリチャージさせ、且つヒト内皮細胞の培養のための、無血清の細胞培地のゲル表面の上で使用した。接着細胞のモルホロジーは、２４時間の培養時間の後で、図１に示すように、ＵＧＢ１−ＧＢ１  ０１、ＵＧＢ２−ＧＢ４  ２０、ＵＧＢ２−ＧＢ５  ２３、及びＵＧＢ２−ＵＧＢ３  ２６について分析した。内皮細胞は、異なるヒドロゲルの上では、異なるモルホロジーが想定され、アスペクト比と円形度の２つのパラメーターによって表すことができる。高いアスペクト比及び低い円形度は、望ましい細長い内皮細胞のモルホロジーに相当し、生物学的に望ましい筒状構造の形成における第一のステップである。ＵＧＢ１−ＧＢ１  ０１、ＵＧＢ２−ＧＢ４  ２０及びＵＧＢ２−ＧＢ５  ２３の上で培養した内皮細胞のアスペクト比は、３．４±１．０、４．１±１．１、及び４．９±１．６であったが、それに対して、荷電していない参照ゲルのＵＧＢ２−ＵＧＢ３  ２６は、２．１±１．２と、顕著に低いアスペクト比を有していた。ヒドロゲルのＵＧＢ１−ＧＢ１  ０１、ＵＧＢ１−ＧＢ４  ２０、及びＵＧＢ１−ＧＢ５  ２３、並びにＵＧＢ１−ＧＢ３  ２６の上の内皮細胞での円形度は、その逆数に相当して、０．５±０．１、０．４±０．１、０．３±０．１、並びに０．７±０．３であった。これらの差は、統計的にも、高度に有意であった。したがって、表５．１に記載の内皮細胞は、タイプ１（ＵＧＢ１−ＧＢ１  ０１）、タイプ４（ＵＧＢ２−ＧＢ４  ２０）、タイプ２（ＵＧＢ２−ＧＢ５  ２３）、並びに荷電していないタイプ５（ＵＧＢ１−ＧＢ３  ２６）の、異なる電荷及び隔離性能を有するヒドロゲルの上では、顕著に異なる挙動を示す。荷電していないヒドロゲルの上では、その細胞は、望ましくない、短いアスペクト比と高い円形度とを示すが、それに対して望ましいモルホロジーは、次の順序で高くなる：ＵＧＢ１−ＧＢ１  ０１＜ＵＧＢ１−ＧＢ４  ２０＜ＵＧＢ２−ＧＢ５  ２３。タイプ２のヒドロゲルのＵＧＢ２−ＧＢ５  ２３は、この実験では最善の結果を示す。したがって、この順序づけは、ヒト内皮細胞の培養に対して、電荷の性質及び隔離パターンが直接影響することを立証している。
【００７１】
また別の例示的実施形態においては、タイプ１（ＵＧＢ１−ＧＢ１  ０１）、タイプ４（ＵＧＢ１−ＧＢ４  ２０）、タイプ２（ＵＧＢ１−ＧＢ５  ２３）並びに荷電していないタイプ５（ＵＧＢ１−ＵＧＢ３  ２６）のヒドロゲルを、ヒト間葉細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ）の重合に使用した。それらのヒドロゲルは、細胞応答性であった、すなわち、接着媒介性のペプチドのＣＷＧＲＧＤＳＰを用いたヒドロゲルの機能付与に加えて、これらの細胞によって分泌されたマトリックスメタロプロテアーゼによって酵素的に切断可能な、切断可能なペプチド配列ＧＣＧＧＰＱＧＩＷＧＱＧＧＣＧが、それぞれの荷電されていない構成単位の上にあらかじめ抱合され、ＶＮ２による架橋に使用された。包埋された細胞の代謝活性は、２４時間後に、生存度の証拠として、ＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ（登録商標）試験で特性解析した。ヒドロゲルの中で重合したヒト間葉細胞の代謝活性は、相対蛍光単位として測定して、それぞれ、タイプ１では７１１２±３９２４、タイプ２では３７０４±２９４５、タイプ４では３１６０±６０２３、且つ荷電していないタイプ５では、２３１６±４４６であった。したがって、ヒト間葉細胞は、タイプ２ゲルの中に包埋させたときに最高の代謝活性を示し、且つ荷電していない参照ゲルのゲルの中に包埋させたときに最低の代謝活性を示した。したがって、ヒドロゲル、特にタイプ２のものが、３Ｄにおける、ヒトの生の間葉細胞の培養には特に有利であることがわかった。
【００７２】
また別の有利な例示的実施形態においては、ＵＧＢ１−ＧＢ１  ０１、ＵＧＢ２−ＧＢ４  ２０、ＵＧＢ２−ＧＢ５  ２３、及びＵＧＢ２−ＵＧＢ３  ２６を、正に荷電した基を担持する抗生物質のゲンタマイシンを用いた、区分した隔離によって、機能付与した。次いで、その阻害性を、２つの関連する病原性菌種の、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（Ｅ・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ））及びスタフィロコッカス・エピデルミジス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）（スタフ・エピデルミジス（Ｓｔａｐｈ．Ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ））を使用して、異なるヒドロゲルからゲンタマイシンを放出させることにより測定した。抗菌活性は、阻止帯のサイズ（培養プレート上、ヒドロゲルからの距離、「物質及び方法」の項参照）により測定した。ＵＧＢ１−ＧＢ１  ０１、ＵＧＢ２−ＧＢ４  ２０、ＵＧＢ２−ＧＢ５  ２３、及びＵＧＢ２−ＵＧＢ３  ２６のタイプのヒドロゲルでは、あらかじめゲンタマイシン隔離をしないと、阻止帯は検出できなかった、すなわち、それらのヒドロゲルは、抗菌効果を有していなかった。ヒドロゲルによってゲンタマイシンをあらかじめ区分して隔離した場合においては、次のようなグレードの阻止帯が測定された：ＵＧＢ１−ＧＢ１  ０１：３．０８±０．３３ｍｍ、ＵＧＢ２−ＧＢ４  ２０、Ｅ・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）：３．０８±０．３３ｍｍ、Ｓ・エピデルミジス（Ｓ．Ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）：２．９４±０．３５ｍｍ、ＵＧＢ２−ＧＢ４  ２０：Ｅ・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）：１．７８±０．２７ｍｍ、Ｓ・エピデルミジス（Ｓ．Ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）：１．７６±０．４５ｍｍ；ＵＧＢ２−ＧＢ５  ２３、Ｅ・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）：２．１８±０．３８ｍｍ、Ｓ・エピデルミジス（Ｓ．Ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）：１．８１±０．５１ｍｍ、並びに荷電していない参照ゲルＵＧＢ２  ＵＧＢ３−２６、Ｅ・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）：０．４８±０．３６ｍｍ、Ｓ・エピデルミジス（Ｓ．Ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）：０．９０±０．２８ｍｍ。したがって、予想していた通り、荷電していない参照ゲルのＵＧＢ２−ＵＧＢ３  ２６では、ゲンタマイシンの極めてわずかな量しか、非特異的に隔離されず、次いで再び放出された。他のヒドロゲルでは、以下の順で並べた、抗菌作用が見出された：ＵＧＢ２−ＧＢ４  ２０＜ＵＧＢ２−ＧＢ５  ２３＜ＵＧＢ１−ＧＢ１  ０１。この結果は、正に荷電した薬物分子の区分した隔離を立証している。それに加えて、ゲンタマイシンの硫化濃度を変化させることによって、抗菌効果が変わることも立証できた。
【実施例】
【００７３】
材料及び方法：
（ＧＢ１からのＧＢ２及びＧＢ３から製造した）ヘパリンの領域選択的脱硫（ｒｅｇｉｏｎ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｄｅｓｕｌｆａｔｉｏｎ）
領域選択的脱硫されたヘパリン（ＧＢ２及びＧＢ３）の合成のために、ヘパリン（ＭＷ：１４，０００、Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、生産者番号：３７５０９５，Ｇｅｒｍａｎｙ、ＧＢ１）を先ず脱イオン化超純水の中に溶解させ、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲ−１２０Ｈ＋イオン交換カラム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、脱塩させた。そのヘパリン溶液に、ｐＨ６に達するまでピリジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を添加することによって、ヘパリン−ピリジン塩を形成させ、それを、Ｂ−４９０ロータリーエバポレーター（Ｂｕｅｃｈｉ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中で溶媒蒸発させることによって濃縮し、次いで、−８０℃で凍結乾燥させ（ＧＥＡ  Ｌｙｏｖａｃ  ＧＴ２，Ｇｅｒｍａｎｙ）、且つさらなる加工をするまで、−２０℃で保存した。
【００７４】
Ｎ−脱硫ヘパリン（Ｎ−ＤＳＨ、ＧＢ２）を調製するために、１ｇ／Ｌのヘパリン−ピリジンを、ＤＭＳＯと脱イオン化超純水との混合物（９５：５）の中に溶解させ、５０℃で１．５時間培養した。そのようにして得られた溶液を、脱イオン化超純水を用いて、１：１で希釈し、１Ｍの水酸化ナトリウム溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてｐＨ９に調節した。脱イオン化超純水を用いて３日間、その溶液を透析（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ、ＭＷＣＯ＝８ｋＤａ）した後で、脱硫ヘパリンのＮ−アセチル化を実施した。この目的のためには、その溶液に、１０％（ｖ／ｖ）のメタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）及び５０ｍＭの炭酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を添加した。そのアセチル化反応は、４℃に冷却し、４００ｒｐｍ一定で撹拌しながら、半時間ごとに１ｍｇのヘパリンあたり４００μＬの無水酢酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を添加することにより、３時間かけて実施し、次いで２Ｍの炭酸ナトリウム溶液を添加することによって、ｐＨを７．５に調節した。
【００７５】
６Ｏ−Ｎ−脱硫ヘパリン（６ＯＮ−ＤＳＨ、ＧＢ３）を調製するために、１ｇ／Ｌのヘパリン−ピリジンを、ＤＭＳＯと脱イオン化超純水との混合物（９５：５）の中に溶解させ、９０℃で２４時間培養した。そのようにして得られた溶液を、脱イオン化超純水を用いて１：１で希釈し、１Ｍの水酸化ナトリウム溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてｐＨ９に調節した。脱イオン化超純水を用いて３日間かけて、透析チューブ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ、ＭＷＣＯ＝８ｋＤａ）で透析した後で、Ｂ−４９０（Ｂｕｅｃｈｉ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で溶媒蒸発させることにより６Ｏ−Ｎ−脱硫ヘパリンを濃縮し、その後で凍結乾燥させた（ＧＥＡ  Ｌｙｏｖａｃ  ＧＴ２，Ｇｅｒｍａｎｙ）。
【００７６】
ＧＢ及びＵＧＢの特性解析（表２参照）：
ＧＢ１〜ＧＢ３の分子量は、Ｄａｗｎ  ＨＥＬＥＯＳ  ＩＩ（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｅｕｒｏｐｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上、６９０ｎｍでの多角度光散乱法により求めた。分子量決定に必要なｄｎ／ｄｃの値は、ＲＩ検出器（Ｏｐｔｉｌａｂ  Ｔ−ｒＥＸ，Ｗｙａｔｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用い、λ＝６９０ｎｍの波長で測定した。ＧＢ１、ＧＢ２、及びＧＢ３での、０．１３５１ｍＬ・ｇ−１のＲＩの増分、ｄｎ／ｄｃが、光散乱実験の評価には必要であった。モル質量を求めるための光散乱の結果は、Ａｓｔｒａソフトウェア、バージョン６．１（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＵＳＡ）を用いて実施した。
【００７７】
ヘパリン誘導体（ＧＢ１〜ＧＢ３）のスルフェート化度は、元素分析（Ｅｌｅｍｅｎｔａｒ，Ｖａｒｉｏ  ＭＩＣＲＯ  ｃｕｂｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により、Ｓ：Ｎのモル比に基づいて求めた。それぞれの二糖類単位が、ちょうど１個のＮ原子を含んでいるので、ＧＢ１、ＧＢ２及びＧＢ３のスルフェート化度（スルフェート基の数／繰り返し単位）は、Ｓ：Ｎのモル比により求めた。さらに、繰り返し単位のモル質量も、それから求めた。繰り返し単位あたり、又はポリマー１モルあたりのスルフェート基の数を、それに基づいて計算した。
【００７８】
ＧＢ４及びＧＢ５（ポリ（４−スチレンスルホン酸−コ−マレイン酸））の分子量、及び繰り返し単位あたり、又はポリマー１モルあたりのスルフェート基の数は、生産者（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、生産者番号：４３４５６６，Ｇｅｒｍａｎｙ）からの情報に基づいている。
【００７９】
ＵＧＢ１、ＵＧＢ２、ＵＧＢ３、アミノ−、チオール−若しくはマレイミド−末端の４本アームのＰＥＧの分子量及び構造は、生産者（Ｊｅｎｋｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＵＳＡ）からの情報に基づいている。ＵＧＢ４（酵素的に切断可能なペプチド末端の４本アームのＰＥＧ）のモル質量及び構造は、Ｔｓｕｒｋａｎ  ｅｔ．ａｌ，２０１３（Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．，２０１３，２５，２６０６〜２６１０）に記載のプロセスに従って生産され、使用された。
【００８０】
ヘパリン又はヘパリン誘導体をベースとするヒドロゲルの調製（表１も参照されたい）：
ヒドロゲルを調製するために、ヘパリン（ＧＢ１）（Ｍｅｒｃｋ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、生産者番号：３７５０９５，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＧＢ１をベースとする脱硫ヘパリン誘導体を、ＧＢ２及びＧＢ３のために、荷電された成分（ＧＢ）としてのヒドロゲルのタイプ（表２参照）に従った前述の方法によって、脱イオン化超純水の中に、ボルテックスミキサー（ＩＫＡ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用い、４℃で３０秒間、５００ｒｐｍで溶解させた。それに加えて、４本アームのアミン末端のＰＥＧ（ＭＷ、１０，０００、Ｊｅｎｋｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＵＳＡ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、及びＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、同様にして、すべてのタイプのヒドロゲルのために、ＵＧＢ１として、溶解させた。ヒドロゲル構成単位の完全な溶解を確保するために、これらの溶液をさらに、超音波浴（ＲＫ  １００Ｈ、Ｂａｎｄｅｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用い、４℃で５分かけて処理した。
【００８１】
ＧＢ１〜ＧＢ３を活性化させるために、ＥＤＣ及びスルホ−ＮＨＳ（ＥＤＣ：スルホ−ＮＨＳの比率＝２：１）を、溶解させたＧＢに添加し（最終反応混合物のＵＧＢ１の１ｍｏｌｅあたり４ｍｏｌｅのスルホ−ＮＨＳ、８ｍｏｌｅのＥＤＣ）、４℃で、表４に記載した時間、培養した。ＧＢ１、ＧＢ２、ＧＢ３の活性化時間の後で、溶解させたアミノ末端の４本アームのＰＥＧ（ＵＧＢ１）をさらに加え、且つボルテックスミキサー（ＩＫＡ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、５００ｒｐｍで３０秒間混合した。
【００８２】
架橋反応１の後での、ポリ（４−スチレンスルホン酸−コ−マレイン酸）をベースとするヒドロゲルの調製（ＶＮ１、表１参照）：
４−スチレンスルホン酸：マレイン酸のモル比＝３：１のポリ（４−スチレンスルホン酸−コ−マレイン酸）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、生産者番号：４３４５６６，Ｇｅｒｍａｎｙ、ＧＢ４、表２参照）、及び４−スチレンスルホン酸：マレイン酸のモル比＝１：１のもの（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、生産者番号：４３４５５８，Ｇｅｒｍａｎｙ、ＧＢ５、表２参照）、及びＵＧＢ１（四価のＰＥＧ、アミン末端、ＭＷ＝１０，０００、Ｊｅｎｋｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＵＳＡ）を使用して、以下の方法で、共有結合的に架橋されたヒドロゲルを調製した：ＧＢ４又はＧＢ５及びＵＧＢ１をそれぞれ、脱イオン化した超純水に、ヒドロゲル混合物の全容積の１／３ずつ、表１に見られるものの、３倍の濃度で溶解させ、さらに、超音波浴（ＲＫ  １００Ｈ、Ｂａｎｄｅｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、４℃で５分間処理した。その後で、全部の溶液を、次のステップのために４℃でなじませた（ｔｅｍｐｅｒｅｄ）：１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）及びＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）もやはり、全反応混合物の１／６に溶解し、４℃でなじませた。ＵＧＢ１：ＥＤＣ：スルホＮＨＳのモル比は、１：８：４である（ＵＧＢ１のそれぞれのアミノ基では、１：２：１）。次のステップにおいて、ＧＢ４又はＧＢ５にＥＤＣ及びスルホ−ＮＨＳを添加し、ピペッティングによって混合し、且つ３０秒間の待ち時間の後に、その反応混合物を、ボルテックスシェーカー（ＶＷＲ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で１０秒間混合し、次いでまた別の待ち時間２０秒をとった。この手順の後で、全活性化時間１分で、ボルテックスシェーカー上のＵＧＢ１を、活性化させたＧＢ４又はＧＢ５にピペット移植し、次いでまた別の１０秒間、ボルテックスシェーカーを用いて混合した。最終的な反応混合物（ここでは、ＵＧＢ１及びＧＢ４又はＧＢ５の濃度は、表１に記載の濃度に相当している）は、今や、ピペッティングにより任意の型（ｆｏｒｍｓ）の中に注入することが可能であり、ゲル化は、１２時間かけて重合させることにより起こさせる。次いで、それらのヒドロゲルを、リン酸緩衝生理食塩液の溶液の中に、数時間の間溶液交換を繰り返すことにより完全に膨潤させ、その後で、そのヒドロゲルを、使用するか、又は特性解析した。
【００８３】
ヒト内皮細胞を用いた細胞培養のためのヒドロゲルの調製：
ヒト内皮細胞を培養するために、カバーガラスの上に、１ｃｍ２あたり１１μＬの最終的な反応混合物をピペッティングすることにより、約１００μｍの最終厚みを有する表面結合された（ｓｕｒｆａｃｅ−ｂｏｕｎｄ）ゲルを形成させた。そのカバーガラスは、以下の文献の手順に従って、あらかしめ、ポリ（エチレン−ｏｌｄ−無水マレイン酸）の薄膜を用いてコーティングして、ヒドロゲルの共有結合を確保しておいた：Ｐｏｍｐｅ  ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２００３，４，１０７２〜１０７９。ＲＧＤペプチドを用いた修飾をするために、ＥＤＣ／スルホ−ＮＨＳを含むリン酸緩衝生理食塩溶液の中で膨潤させた、成形したヒドロゲルを、４℃の、１／１５Ｍのリン酸緩衝生理食塩溶液の中に、５０ｍＭのＥＤＣ及び２５ｍＭのスルホ−ＮＨＳの濃度で溶解させ、且つ、ＧＢ４又はＧＢ５の残存カルボキシル基を、２０分かけて活性化させてから、ホウ酸塩緩衝剤（１００ｍＭ、ｐＨ８．０、４℃）を用いて、洗い流した。次いで、その活性化されたヒドロゲルを、ホウ酸塩緩衝剤（１００ｍＭ、ｐＨ８．０）の中に溶解させた、ペプチド配列
【化１】
2020511220.tif 000012
（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，ＫＹ，ＵＳＡ）の５０ｍｇ／ｍＬの濃度を有する溶液と、室温で２時間かけて反応させ、次いで、リン酸緩衝生理食塩液を用いて、十分すぎるくらい洗浄した。
【００８４】
細胞培養：
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ、Ｌｏｎｚａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、フィブロネクチン−コーティングした細胞培養フラスコ上のＰｒｏｍｏｃｅｌｌ  Ｃ−２２０１０を補充したＰｒｏｍｏｃｅｌｌ  Ｃ−２２０１０（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ  ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の上に、３７℃、及び５％ＣＯ２で継代培養し、８０％の密集度を達成した。継代２〜６からの細胞を、それに続く実験で使用した。
【００８５】
ＲＧＤ−機能を付与され、表面結合されたヒドロゲルを、ＶＥＧＦ−Ａ及びＦＧＦ−２と共に、ヒドロゲル表面１ｃｍ２あたり０．５６５μｇの濃度で、ＲＴで１８時間かけて培養し、次いでリン酸緩衝生理食塩液を用いて２回洗浄した。
【００８６】
Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ培地中、補助混合なしで、ＲＧＤ−及びＶＥＧＦ−１６５並びにＦＧＦ−２で機能付与させたヒドロゲルの上で、５０，０００細胞／ｃｍ２を培養した。２４時間培養した後で、細胞を洗浄し、固定し、光学顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ７３倒立顕微鏡、Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により特性解析した。アスペクト比は、Ｆｕｊｉ画像処理ソフトウェアを用いて個々の細胞を測定してから、細胞の長さを細胞の幅で割り算することにより求めた。円形度は、Ｆｉｊｉ画像処理ソフトウェアの手段により、次式に従って求めた：円形度＝４＊π＊（細胞面積／周長）２。それぞれの場合において、ｎ＝１０の独立した試料について、１画像あたり２０個の細胞を測定した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いた統計的評価及び一元配置Ａｎｏｖａ試験から、検討した全部の条件下で有意な差があることが明らかになった。
【００８７】
架橋反応２の後での、ポリ（４−スチレンスルホン酸−コ−マレイン酸）をベースとするヒドロゲルの調製（ＶＮ２、表１参照）：
マレイミド基を用いたポリ（４−スチレンスルホン酸−コ−マレイン酸）の誘導体化：
架橋反応２に従ったヒドロゲルを形成させるためには、最初にＧＢ４又はＧＢ５を、Ｎ−（２−アミノエチル）マレイミドトリフルオロアセテート（Ｓｉｇｍａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて官能化させなければならない。この目的のために、ＧＢ４又はＧＢ５それぞれの５００ｍｇ（２５μｍｏｌｅ）を、２．７ｍＬの脱イオン化超純水の中に溶解させ、氷上で、１０分間撹拌する。その試料容器は、２５ｍＬのスナップカバーガラス（ｓｎａｐ−ｃｏｖｅｒ  ｇｌａｓｓ）である。次いで、６５．１４ｍｇのＮＨＳ（０．３０ｍｍｏｌｅ）を４００μＬの中に溶解させ、且つ２００μＬの氷冷した脱イオン化超純水の中に溶解させた１１５．０２ｍｇ（０．６０ｍｍｏｌｅ）のＥＤＣを、ＧＢ４又はＧＢ５の溶液に添加して、５分間待った。次のステップにおいて、２００μＬのＭｉｌｌｉＱ水の中に溶解させた、７６．２５ｍｇ（０．３０ｍｍｏｌｅ）のＮ−（−２−アミノエチル）マレイミドトリフルオロアセテートを、ＧＢ４又はＧＢ５を活性化させる活性化時間が完了した後で４０秒かけて、滴下により添加した。その反応混合物を、氷の上で、さらにまた別の１０分間撹拌する。最後に、氷浴を外し、その混合物を、室温で一夜撹拌する。その生成物を、ＭＷＣＯ＝５ｋＤａの排除サイズの透析チューブの中に入れる。２日にわたって透析を実施する；第一日には、１モル濃度の塩化ナトリウム溶液２．５リットルを用い、６時間かけて透析を実施する。この場合、その溶液を、２時間ごとに取り替える。６時間経過後は、脱イオン化超純水に対して、透析を一晩がかりで実施する。第二日には、透析を、脱イオン化超純水に対して実施し、水は、２時間ごとに取り替える。最後のステップにおいて、その溶液を凍結乾燥させる。
【００８８】
ＧＢ４／ＧＢ５−マレイミド誘導体の特性解析のための排除体積クロマトグラフィー：
排除体積クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、ＧＢ４又はＧＢ５１分子あたりのマレイミド基を求めるために使用される。この目的のためには、ペプチドＲＧＤ−ＳＰ（Ｍ＝９９０ｇ／ｍｏｌｅ）を、各種の過剰状態で、ＧＢ４／ＧＢ５−マレイミド誘導体にカップリングさせる。検討したＲＧＤ−ＳＰの過剰モルは、この場合においては、ＧＢ４又はＧＢ５に対して、６．８、１０又は１２である。最初に試料容器の中で、３５μＬのそれぞれのＲＧＤ−ＳＰ濃度と、３５μＬのリン酸緩衝生理食塩溶液とを混合することにより、キャリブレーションを実施する。
【００８９】
この検討のためには、Ｐｈｅｎｏｍｎｅｘ（Ｇｅｒｍａｎｙ）製のＢｉｏＳＥＰ−ＳＥＣ  Ｓ２０００カラムを使用するが、この中には、ＨＰＬＣシステムＡｇｉｌｅｎｔ  １１００（Ｇｅｒｍａｎｙ）が挿入されている。溶出液はリン酸緩衝生理食塩溶液であり、流速は０．５ｍＬ／分である。注入容積は、５０μＬである。
【００９０】
同一の溶出条件で、マレイミド基の測定も実施する。それぞれの場合において、試料容器の中で、３５μＬのＲＧＤ濃縮液を、３５μＬのＧＢ４／ＧＢ５−マレイミド誘導体溶液と混合する。その方法によって、マレイミドとＧＢ４又はＧＢ５との転化率の正確な定量が可能となる。
【００９１】
架橋反応２の後のポリ（４−スチレンスルホン酸−コ−マレイン酸）誘導体をベースとするヒドロゲルの調製（ＶＮ２、表１参照）：
ＧＢ４／ＧＢ５マレイミド誘導体と４本アームで、チオール末端のＰＥＧ（ＵＧＢ２、Ｍｗ＝１０，０００Ｄａ、Ｊｅｎｃｈｅｍ，ＵＳＡ、表２）とを、表１に記載の濃度の２倍で、リン酸緩衝生理食塩溶液の中に溶解させる。その後で、両方の成分と等しい容積を、ミクロ反応容器の中にピペット移植し、ボルテックスシェーカー上で１０秒間振盪させる。次いで、その反応混合物の所定の容積を抜き出し、Ｓｉｇｍａ  Ｃｏｔｅ（登録商標）でコーティングした直径９ｍｍのカバーガラスの上に置く。Ｓｉｇｍａ  Ｃｏｔｅ（登録商標）でコーティングしたまた別のカバーガラスを、その液滴の上に置く。３０分後にカバーガラスを取り外し、そのゲルの薄片を、リン酸緩衝生理食塩溶液の中で１２時間かけて膨潤させる。高いＵＧＢ２濃度のところでは、最適なゲル化を起こさせるために、１ＭのＨＣｌを用いて、ＵＧＢ２のｐＨを５〜７のｐＨに調節することができる。
【００９２】
３Ｄ中で、ヒト間葉細胞を用いる、細胞培養のヒドロゲルの製造：
上述の方法に従い、ＵＧＢ２に代えて、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）で切断可能なヒドロゲルを、ＵＧＢ４（表４、Ｔｓｕｒｋａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．，２０１３，２５（１８），２６０６〜２６１０により記述された手順に従って合成）を使用して調製した。
【００９３】
この目的のためには、細胞をＧＢ４又はＧＢ５誘導体の中に懸濁させ、上述の方法に従って混合することによりヒドロゲルを形成させ、５分間のゲル化時間の直後に、リン酸緩衝生理食塩溶液及び細胞培養培地の中で膨潤させた。
【００９４】
細胞培養：
間葉幹細胞（ＭＳＣ、ＡＴＣＣ、脂肪組織から単離、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、ＤＭＥＭ中、１０％のシ胎血清及び１％のペニシリン／ストレプトマイシンを用い、標準培養条件下（５％ＣＯ２、３７℃）で培養した。実験には、継代２〜４のＭＳＣを使用した。
【００９５】
ＧＢ−４又はＧＢ−５誘導体及びＵＧＢを、ＧＢの１ｍｏｌｅあたり１ｍｏｌｅのＣＧＷＧＧＲＧＤＳＰと混合し、リン酸緩衝生理食塩溶液の中に溶解させた（ＧＢ４又はＧＢ５誘導体の濃度は、表１に示したものの３倍の濃度であった）。混合した後、その溶液を、３７℃で１０〜１５分間培養し、次いで、濃縮された細胞懸濁液を、最終的な反応混合物にまで外挿して６×１０６細胞／ｍＬを有する最終的なゲル容積の１／３に混ぜ込んだ。ＵＧＢ４（表１の３倍濃度）を、リン酸緩衝生理食塩溶液中全ゲル容積のまた別の１／３の中に溶解させ、ＧＢ４／５誘導体の細胞との混合物に加え、ピペッティングにより混ぜ合わせた。５分間かけてゲル化させてから、上述の細胞培養培地を加え、そのヒドロゲルを、前述のようにして、３７℃で２４時間培養した。
【００９６】
ＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ（登録商標）試験：ＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ（登録商標）試験は、ヒドロゲル中への細胞の播種に続けて、２４時間の培養時間の後に実施する。この目的のためには、ＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ（登録商標）染料の細胞培養培地中１０％溶液を、それぞれのヒドロゲル試料に添加し、マイクロタイタープレート中、３７℃で１時間かけて培養する。次いで、マイクロプレート光度計（Ｔｅｃａｎ  Ｓｐａｒｋ（登録商標），Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて蛍光を測定する。励起波長は５６０ｎｍであり、蛍光は、５９０ｎｍの波長のところで測定した。細胞の代謝活性は、相対蛍光値（ＲＦＵ）で示した。４種の主題測定（ｓｕｂｊｅｃｔ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）で、独立して１０回の実験（ｎ＝４０）で評価したが、すべての条件で、有意な差が見出された（一元配置Ａｎｏｖａ）。
【００９７】
抗菌阻止帯アッセイ：
ヒドロゲルディスク（６０μＬ）を、１ｍＬの５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の中で１８時間かけて培養し、次いでリン酸緩衝生理食塩溶液を用いて、２回洗浄した。ゲンタマイシンを導入した（ｇｅｎｔａｍｉｙｃｉｎ−ｃｈａｒｇｅｄ）ヒドロゲルの抗菌活性を、阻止帯アッセイにより測定した。この目的のためには、ルリアブロス（ＬＢ）寒天（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）プレートを、生産者の説明書に従って調節した。エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ１２  ＤＨ５（ＤＳＭＺ，Ｇｅｒｍａｎｙ）及びスタフィロコッカス・エピデルミジス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）ＰＣＩ  １２００（ＡＴＣＣ，ＵＳＡ）の１２時間成長培養菌を、０．１にまで希釈して、６００ｎｍで光学濃度（ＯＤ）を測定した。これらの細菌懸濁液の２５０μＬを、それぞれのプレートの上に塗布した。滅菌した綿布を使用して、細菌を均等に分散させた。それぞれゲンタマイシン導入又は非導入の、ヒドロゲルのＵＧＢ１−ＧＢ１  ０１、ＵＧＢ２−ＧＢ４  ２０、及びＵＧＢ２−ＧＢ５  ２３、さらにはＵＧＢ２−ＵＧＢ３  ２６を、寒天プレートの四隅に塗布し、それらのプレートを、３７℃で一夜かけて培養した。その後で、デジタルキャリパーを用いて、阻止帯の測定をした。３種の主題デフィニション（ｓｕｂｊｅｃｔ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ）で、独立して１０回の実験（ｎ＝３０）で評価したが、すべての条件で、有意な差が見出された（一元配置Ａｎｏｖａ）。
【００９８】
ヒドロゲルの物理的−化学的性質の測定：
各種のタイプのヒドロゲルの物理的性質を測定するために、６７μＬの未重合のヒドロゲル溶液を、それぞれの場合において、Ｓｉｇｍａｃｏｔｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で処理した２枚の９ｍｍのガラススライド（Ｍｅｎｚｅｌ  Ｇｌａｅｓｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の間で、室温で１６時間かけて重合させ、次いでそのようにして得られたゲルの薄片を、ガラススライドから取り外した。それらのゲルの薄片の直径を、タイプＦＬＡ−３１００（Ｆｕｊｉｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）のスキャナーを用いて光学的に測定した（非膨潤状態での直径）。その後で、それらのゲルの薄片を、０．９％ＮａＣｌ緩衝によりｐＨ７．４としたリン酸緩衝生理食塩溶液（ＰＢＳ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の中（生理学的条件下）で２４時間かけて膨潤させ、ＦＬＡタイプ３１００（Ｆｕｊｉｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）のスキャナーを用いて再度測定した（膨潤状態における直径）。測定した直径から、それらのヒドロゲルの膨潤度を、次式に従って求めた：
膨潤度＝膨潤させたヒドロゲルの直径）３／（未膨潤のヒドロゲルの直径）３。
【数１】
2020511220.tif 000013
表１を参照されたい。
【００９９】
報告されているデータはそれぞれ、少なくとも４個の独立した試料からの平均（ＭＷ）から求めたものである。それに加えて、標準偏差（ＳＤ）も示した。
【０１００】
さらに、ヒドロゲルの貯蔵モジュラス及び損失モジュラスを、ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）製のタイプＡｒｅｓの剪断レオメーターを使用して、振動式レオメトリー法で測定した（単位、キロバスカル）。この目的のためには、生理学的条件下（リン酸緩衝生理食塩溶液（ＰＢＳ、０．９％ＮａＣｌでｐＨ７．４に緩衝（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ））で２４時間かけて膨潤させたヒドロゲルから８ｍｍの薄片を打ち抜き、低変形（２％）で、室温で周波数を１〜１００ｒａｄ／ｓと上げるように設定した、９ｍｍのプレート−プレート測定器で測定し、全周波数範囲にわたっての平均値を求めた（１試料あたり、１測定値）。報告されている数値は、独立して調製した４枚のヒドロゲルディスクの平均値であり、標準偏差の±も示している。４種のヒドロゲルのタイプの貯蔵モジュラスも表１に示したが、損失モジュラスは、数桁低いものであった（データ示さず）。
【０１０１】
表１に、ヒドロゲルの物理的−化学的性質を示している。
【０１０２】
ヒドロゲルのメッシュサイズは、実験的に求めた貯蔵モジュラスから、次式を使用したゴム弾性理論に基づいて誘導することができる（Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｐｈｙｓｉｃｓ，Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｒａｌｐｈ  Ｈ．Ｃｏｌｂｙ，２００６，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）：
【数２】
2020511220.tif 000014
式中、Ｇ’は、測定された貯蔵モジュラスであり、ＮＡは、アボガドロ定数であり、Ｒは、一般ガス定数であり、且つＴは、温度（単位、ケルビン）である。
【０１０３】
各種のタイプのヒドロゲルの結合性を求めるために、未重合のヒドロゲルの溶液を、Ｓｉｇｍａｃｏｔｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）（Ｍｅｎｚｅｌ  Ｇｌａｓｓｅｓ）で処理した２枚の５ｍｍのガラススライドの間で、室温で１６時間かけて重合させ、次いで、０．９％ＮａＣｌでｐＨ７．４に緩衝させたリン酸緩衝生理食塩溶液（ＰＢＳ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の中で２４時間かけて膨潤させた。合計容積を調節し、それにより、４種のヒドロゲルのタイプの中のＧＢ１、ＧＢ２、ＧＢ３、及びＧＢ４（参照、表４）で、同じモル量となるようにした。結合（隔離）の検討のために、それぞれのヒドロゲルのディスクを、０．５ｍＬのタンパク質ＬｏＢｉｎｄ反応容器（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｔｕｂｅｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の中で、１％（ｍ／ｖ）ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）及び０．０５％（ｍ／ｖ）Ｐｒｏｃｌｉｎ  ３００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を含む、４００μＬのＰＢＳの中に溶解させた、表３に相当するタンパク質の混合物と共に、２４時間かけて培養した（インキュベーション後の溶液２に相当）。タンパク質混合物を調製するために、ＰｒｏｃａｒｔａＰｌｅｘ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ａ、Ｂ及びＣ（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、生産者の説明書に従って溶解させ、且つ、タンパク質ＤＫＫ１（生産者番号：１２０−３０、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、スクレロスチン（生産者番号：１４０６−ＳＴ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、及びＴＧＦｂ１（生産者：１００−２１、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を追加した。それら個々の濃度を、表７に示す（インキュベーション前の溶液１に相当）。
【０１０４】
タンパク質濃度を測定するまで、それらの溶液１及び２は、−８０℃で保存した。溶液１及び２の中のタンパク質濃度を測定するために、Ｂｉｏｐｌｅｘ  ２００タイプ（Ｂｉｏｒａｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の装置の上で、ＰｒｏｃａｒｔｅａＰｌｅｘ  Ｓｉｍｐｌｅｘキットに相当するものと組み合わせて、生産者の説明書に従ってＰｒｏｃａｒｔａＰｌｅｘ  Ｈｕｍａｎ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  Ｐａｎｅｌ  １（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて試料の測定をした。
【０１０５】
シグナル伝達分子の結合（隔離）は、測定した溶液１及び２の濃度から、次式に従って求めた：
結合（％）＝（溶液２における１濃度（インキュベーション後）／溶液１における濃度（インキュベーション前））×１００
【０１０６】
表４に、ＧＢ１〜４のカルボキシル基の活性化時間（単位、分）及び結合の検討のために用いたゲル容積を示している。
【０１０７】
それらのスルフェート化又はスルホン化ヒドロゲルが特徴としているのは、荷電された構成単位（ＧＢ）の電荷分布（単位、ポリマー１ｍｏｌｅあたりのスルフェート基又はスルホネート基のｍｏｌｅ数）、及び、生理学的条件下で膨潤させたヒドロゲル容積の中のスルフェート基又はスルホネート基の濃度（単位、スルフェート又はスルホネートのｍｍｏｌｅ／ｍＬのヒドロゲル）、及び、特定の領域における、ＷＥあたりのスルフェート基又はスルホネート基の数をＷＥのモル質量で割ったもの、である。その計算は、ヒドロゲル構成単位が定量的にネットワークの中に組み込まれると仮定して、ヒドロゲル化の際のヒドロゲルの構成単位のモル濃度（表１参照）及び容積膨潤（表１）をベースにして実施した。
【０１０８】
未膨潤のヒドロゲルの中のスルフェート基又はスルホネート基の濃度は、（未膨潤のヒドロゲルの中のＧＢの濃度）×（繰り返し単位の数）×（繰り返し単位あたりのスルフェート基又はスルホネート基の数）から計算した。膨潤させたゲルの中のスルフェート又はスルホネートの濃度（表１）は、未膨潤のヒドロゲルの中のスルフェート基又はスルホネート基の濃度を膨潤度（表１参照）で割り算をして計算した。
【０１０９】
抽出実験では、測定可能となるほどのゲル成分の溶出が生ずることはなく、したがって、ゲル成分が完全に組み込まれるという仮説が、妥当であると考えられる。
【０１１０】
表３に、先に論じたようにして、インキュベーションの前の可溶性因子の濃度で正規化した、ヒドロゲルの中に結合されたシグナル伝達分子の量のパーセントを示す。そのパーセントは、質量パーセントである。
【０１１１】
（シグナル物質（ｓｉｇｎａｌ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ）又は因子（ｆａｃｔｏｒｓ）とも呼ばれる）物質の分子サイズは、キロダルトン（ｋＤａ）の単位で表される。
【０１１２】
それらのタンパク質（シグナル伝達分子）は、略号よる方法（表３）及びＵｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ｄａｔａｂａｓｅ（ＵｎｉＰｒｏｔ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／）のＵｎｉＰｒｏｔ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒｓ（Ｕｎｉｐｒｏｔ  ＩＤ）で、独自に割り付けられている。
【０１１３】
等電点（ＩＥＰ）及びモル質量は、ＥｘＰＡＳｙ  ＰｒｏｔＰａｒｍ（ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ／（参考文献：Ｇａｓｔｅｉｇｅｒ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，５７１〜６０７（２００５））のプログラムを使用した、完全生物学的加工（ｆｕｌｌｙ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ）アミノ酸配列をベースにして求めた。
【０１１４】
タンパク質の構造パラメーターは、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ＮｕｍｂｅｒｓをベースとするデータベースのＥｘＰＡＳｙ  ＰＲＯＳＩＴＥを使用して決めた（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｓｉｔｅ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／；Ｓｉｇｒｉｓｔ，Ｃ．Ｊ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  ａｎｄ  ｃｏｎｔｉｎｕｉｎｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｔ  ＥｘＰＡＳｙ  ＰＲＯＳＩＴＥ；参考文献：（１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，４１，（２０１３）；（２）Ｓｉｇｒｉｓｔ，Ｃ．Ｊ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，ＰＲＯＳＩＴＥ：ａ  ｄｏｃｕｍｅｎｔｅｄ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｕｓｉｎｇ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ａｓ  ｍｏｔｉｆ  ｄｅｓｃｒｉｐｔｏｒｓ．，Ｂｒｉｅｆ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ．，３，２６５〜２７４（２００２））。
【図１】
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【国際調査報告】
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