(57)【要約】  本発明は、均一な構造的及び機能的特徴を示す、ポリイノシン−ポリシチジン酸とポリエチレンイミン等のポリアルキレンイミンとによって形成される複合体を含む組成物、並びに規制上の要件を満たす上記組成物を作製するプロセスに関する。本発明は、単独での若しくは他の治療剤と組み合わせた、及び／又は特定の医学的方法における医薬（特に癌の治療のための）としての上記組成物の使用に更に関する。さらに、これらの組成物の投与は、特異的バイオマーカー及び／又は医療のための付加的な標的として用いることができる、特定の遺伝子の発現、細胞応答及び／又は免疫細胞集団の組成の変化を伴う。【選択図】図２
2020520368.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
粒子を含む水性組成物であって、
（ｉ）前記粒子の各々は、
（ａ）ポリイノシン−ポリシチジン酸（ポリ（Ｉ：Ｃ））、又はその塩若しくはその溶媒和物と、
なお、前記粒子に含まれるポリ（Ｉ：Ｃ）分子の少なくとも４０％が少なくとも８５０塩基対を有し、前記粒子に含まれるポリ（Ｉ：Ｃ）分子の少なくとも５０％が４００塩基対〜５０００塩基対を有する；
（ｂ）水溶性、直鎖ホモポリアルキレンイミン若しくはヘテロポリアルキレンイミン、又はその塩及び／又はその溶媒和物と、
なお、前記直鎖ポリアルキレンイミンの平均分子量が１７ｋＤａ〜２３ｋＤａである；
の複合体を含み、
（ｉｉ）前記粒子の少なくとも９０％は、３００ｎｍ未満の単峰性の径分布を有し、
（ｉｉｉ）前記粒子は、ＩＳＯ２２４１２：２０１７によって測定される８０±２０ｎｍのｚ平均径を有し、粒子径の多分散指数は１．５未満であり、
（ｉｖ）該組成物は、少なくとも０．５ｍｇ／ｍＬの濃度のポリイノシン−ポリシチジン酸（ポリ（Ｉ：Ｃ））を含み、
（ｖ）該組成物は、２〜４のｐＨ及び２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜６００ｍＯｓｍ／ｋｇのモル浸透圧濃度を有し、
（ｖｉ）該組成物は、ＩＳＯ１３０９９−２：２０１２による３５ｍＶ〜５０ｍＶのゼータ電位を有する、
水性組成物。
【請求項２】
前記粒子が８５±２０ｎｍの中位径（Ｄ５０％）を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記粒子に含まれる、
（ｉ）ポリ（Ｉ：Ｃ）分子の少なくとも１０％が４００塩基対未満を有し、ポリ（Ｉ：Ｃ）分子の少なくとも４０％が少なくとも８５０塩基対を有し、ポリ（Ｉ：Ｃ）分子の少なくとも７０％が４００塩基対〜５０００塩基対を有し、ポリ（Ｉ：Ｃ）分子の２０％〜４５％が４００塩基対〜８５０塩基対を有するか、又は、
（ｉｉ）ポリ（Ｉ：Ｃ）分子の５％〜６０％が４００塩基対未満を有し、ポリ（Ｉ：Ｃ）分子の１５％〜３０％が４００塩基〜８５０塩基を有し、ポリ（Ｉ：Ｃ）分子の１０％〜７０％が８５０塩基対〜５０００塩基対を有し、ポリ（Ｉ：Ｃ）分子の０％〜１０％が５０００塩基対超を有する、
請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記水溶性、直鎖ホモポリアルキレンイミン又はヘテロポリアルキレンイミンが直鎖ポリエチレンイミンである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記粒子径の多分散指数が０．２〜０．３に含まれる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体、有機溶媒、賦形剤、及び／又はアジュバントを更に含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
有機化合物、無機化合物、核酸、アプタマー、ペプチド、又はタンパク質から選択される少なくとも１つの化合物を更に含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
ノンコーディングＲＮＡ、又はタンパク質をコードするＲＮＡを更に含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
１％〜１０％（重量／体積）の濃度のグルコース又はマンニトールを更に含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記水性組成物がｐＨ３．０±０．２及び３００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇのモル浸透圧濃度を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
ポリ（Ｉ：Ｃ）分子のリンのモル数に対する前記水溶性、直鎖ホモポリアルキレンイミン又はヘテロポリアルキレンイミンの窒素のモル数の比率２．５〜４．５で前記粒子が形成される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の粒子を含む水性組成物。
【請求項１２】
前記粒子が、混合チャンバーにおいて前記ポリ（Ｉ：Ｃ）分子を含有する溶液及び前記水溶性、直鎖ホモポリアルキレンイミン又はヘテロポリアルキレンイミンを含有する溶液を別々に注入することによって形成される、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
１％〜１０％（重量／前記組成物の総容積）の濃度のグルコース又はマンニトールを添加することによって形成される、請求項１１又は１２に記載の組成物。
【請求項１４】
グルコースが、前記ポリ（Ｉ：Ｃ）を含有する溶液に添加されている、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ポリ（Ｉ：Ｃ）分子を含有する溶液及び前記水溶性、直鎖ホモポリアルキレンイミン又はヘテロポリアルキレンイミンを含有する溶液が、いずれかの溶液を注入する流速を１ｍＬ／分〜５０ｍＬ／分にして別々に注入されている、及び／又は５０ｒｐｍ〜６００ｒｐｍの速度で混合されている、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の水性組成物を凍結乾燥することによって得られ得る組成物。
【請求項１７】
医薬として使用される請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記医薬が、薬学的に許容可能な担体、賦形剤、及び／又はアジュバントを任意に含む注射用水性組成物である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
ヒト又は動物の細胞の生育異常を特徴とする細胞増殖障害の治療に使用される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記細胞増殖障害が、癌又は雌性哺乳動物の生殖器の細胞の生育異常を特徴とする婦人科障害である、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
腫瘍内又は腫瘍周囲に注射するために使用される、請求項１９又は２０に記載の組成物。
【請求項２２】
皮膚レベルで又は内臓若しくは組織に注射するために使用される、請求項１９又は２０に記載の組成物。
【請求項２３】
抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ１、抗ＰＤＬ１、ＣＡＲ−Ｔ細胞、癌抗原ワクチン、又は制御性Ｔ細胞を標的とする薬剤、代謝酵素、ＤＮＡの修復及び／又は複製、又は表Ｉの遺伝子のいずれかによって発現されるタンパク質から選択される第２の治療剤と組み合わせて使用される、請求項１９又は２０に記載の組成物。
【請求項２４】
第２の治療剤の投与量及び／又は投与頻度を減らすために該第２の治療剤と組み合わせて使用される、請求項１９又は２０に記載の組成物。
【請求項２５】
第２の治療剤に抵抗性を示す、非感受性の、又は殆ど（又は全く）応答しない患者を治療するために該第２の治療剤と組み合わせて使用される、請求項１９又は２０に記載の組成物。
【請求項２６】
医薬用組成物であって、該組成物が、
（ｉ）少なくとも第１の腫瘍内注射と、
（ｉｉ）少なくとも第２の皮下又は筋肉内注射と、
を含む投与レジメンに従って被験体に投与され、前記少なくとも１回の腫瘍内注射が前記少なくとも１回の皮下又は筋肉内注射の前に適用され、該組成物が請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組成物である、医薬用組成物。
【請求項２７】
医薬用組成物であって、該組成物が、
（ｉ）第１の病変における少なくとも第１の腫瘍内注射と、
（ｉｉ）１つ以上の付加的な病変における少なくとも第２の腫瘍内注射と、
を含む投与レジメンに従って被験体に投与され、該組成物が請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組成物である、医薬用組成物。
【請求項２８】
第２の治療剤の投与の前又は後に投与され、該第２の治療剤が同じ及び／又は他の病変（複数の場合もある）における腫瘍内若しくは腫瘍周囲への注射、皮下注射、又は筋肉内注射によって投与される、請求項２６又は２７に記載の医薬用組成物。
【請求項２９】
前記第２の治療剤が、被験体が該第２の治療剤に抵抗性を示す、非感受性の、又は殆ど（又は全く）応答しないかを判定した後に前記被験体に投与される、請求項２８に記載の医薬用組成物。
【請求項３０】
前記第２の治療剤が、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組成物の投与を受けて、統計的に有意な循環免疫細胞の数の増加及び／又は表Ｉの遺伝子のいずれかの発現の変化が見られるかを判定した後に被験体に投与される、請求項２８に記載の医薬用組成物。
【請求項３１】
前記第２の治療剤が抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ１、抗ＰＤＬ１、ＣＡＲ−Ｔ細胞、癌抗原ワクチン、又は制御性Ｔ細胞を標的とする薬剤、代謝酵素、ＤＮＡの修復及び／又は複製、又は表Ｉの遺伝子のいずれかによって発現されるタンパク質から選択される、請求項２９又は３０に記載の医薬用組成物。
【請求項３２】
前記医薬用途が、ヒト又は動物の細胞の生育異常を特徴とする細胞増殖障害の治療用途又は予防用途である、請求項２６〜３１のいずれか一項に記載の医薬用組成物。
【請求項３３】
前記医薬用途が細菌感染又はウイルス感染の治療用途又は予防用途である、請求項２６〜３１のいずれか一項に記載の医薬用組成物。
【請求項３４】
任意の前記第２の又は他の付加的な腫瘍内、腫瘍周囲、皮下又は筋肉内注射が、前記少なくとも第１の腫瘍内注射の少なくとも２４時間後に行われる、請求項２６〜３１のいずれか一項に記載の医薬用組成物。
【請求項３５】
医薬用組成物であって、該組成物が、
（ｉ）被験体から細胞を得ることと、
（ｉｉ）前記細胞と該組成物とをｅｘ  ｖｉｖｏで接触させることと、
（ｉｉｉ）かかる細胞を前記被験体に投与することと、
を含む投与レジメンに従って被験体に投与され、該組成物が請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組成物である、医薬用組成物。
【請求項３６】
前記医薬用途が、ヒト又は動物の細胞の生育異常を特徴とする細胞増殖障害の治療又用途は予防用途である、請求項３５に記載の医薬用組成物。
【請求項３７】
前記医薬用途が、細菌感染又はウイルス感染の治療用途又は予防用途である、請求項３５に記載の医薬用組成物。
【請求項３８】
前記細胞が血液、組織又は腫瘍から単離される、請求項３５〜３７のいずれか一項に記載の医薬用組成物。
【請求項３９】
前記細胞が前記組成物への曝露の前及び／又は後の１つ以上のマーカーの発現について選択される、請求項３５〜３８のいずれか一項に記載の医薬用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリリボヌクレオチド及びポリマーによって形成される粒子を含む医薬製剤、それらの製造、及びそれらの医学的使用の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、癌細胞の生育を阻害し、癌細胞のアポトーシスを誘導する効果により、腫瘍に対して免疫系を特異的に活性化するため、ウイルス二本鎖ＲＮＡを模する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の合成アナログの使用が模索されてきた。特に、二本鎖ポリイノシン−ポリシチジン酸（ポリ（Ｉ：Ｃ）又はｐＩＣとして知られる）は、免疫系の活性化、ナチュラルキラー及び／又は樹状細胞媒介活性、及び／又は腫瘍遺伝子発現及び微小環境の変化に依存してもよく、又はそれらから独立し得るように、いくつかのタイプの癌（黒色腫、肝細胞腫（hepatoma）、結腸、胃及び口腔の癌腫、子宮頸癌、乳癌、卵巣癌、尿路腫瘍、肺及び前立腺の癌）及びそれらの転移に対して治療的関心のある様々な効果を有する一種のｄｓＲＮＡとされた（非特許文献１）。
【０００３】
残念ながら、これらの初期の前臨床の報告は、不十分な細胞取り込み又は細胞質基質のＲＮアーゼによる分解等の様々な機構に起因したその低い安定性、乏しい均一性、予測不能な薬物動態、及び限定的な抗腫瘍効果が実証されているネイキッドポリ（Ｉ：Ｃ）分子を用いた臨床研究では、十分に確認されていないか、又は確認されていない（非特許文献１）。実際、有効な治療的又は予防的な効果を達成するためには、ポリ（Ｉ：Ｃ）分子を使用の直前又は少し前に再度溶解することが必要な場合があり、製剤中、低濃度で利用可能な場合があり、及び／又は頻繁に投与されなければならない（例えば２時間毎）。
【０００４】
ここ数年、免疫調節性及び／又は治療特性を有するポリ（Ｉ：Ｃ）分子の製剤化において著しい進歩があった。粉体として及び／又は標的化部分及び追加の化学リンカーを有する又は有しないポリマー系マイクロ粒子内に統合されたポリ（Ｉ：Ｃ）分子を作製及び製剤化する様々な方法が開示されている（特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７、特許文献８、非特許文献２、特許文献９、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６）。ポリ（Ｉ：Ｃ）分子が、担体ポリマーと共に、またカチオン性脂質で被覆されたリン酸カルシウムナノ粒子、リポソーム又は他の多孔質構造物内（非特許文献７、特許文献１０、特許文献１１）に封入されたポリリジン及びカルボキシメチルセルロース（特許文献１２）で安定化された経鼻投与に適合性のフォーマットで（特許文献５）、又は一本鎖ＲＮＡ及びプロタミンのようなカチオン性ペプチド（特許文献１３）と共に、製剤化されている。また代替的には、特定の細胞又は組織に対してポリ（Ｉ：Ｃ）分子を標的化することを支援し得る薬剤と共に又はその薬剤なしに、酸化鉄ナノ粒子等の固体粒子及び担体上にポリ（Ｉ：Ｃ）分子が固定化されている（非特許文献８、非特許文献９）。
【０００５】
いくつかの出版物は、他の成分及び遺伝子特異的（gene-specific）を伴う又はそれらを伴わない、ポリマー、ポリ（Ｉ：Ｃ）分子及び／又は二本鎖ＤＮＡによって形成される、マイクロメートル未満の範囲の様々な三元複合体又は四元複合体を更に開示する（非特許文献１０、特許文献１４、特許文献１５、非特許文献１１）。しかしながら、これらのアプローチは、癌細胞の選択的な殺傷ではなく、生存可能性を維持しながら、本質的に細胞へＤＮＡを投与する薬剤を提供することを目的としている。
【０００６】
キトサン、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリ−Ｌ−リジン、ポリメタクリレート、イミダゾール又はシクロデキストリンを含有するポリマー、ポリ（ベータ−アミノエステル）等のカチオン性ポリマー、及び関連するデンドリマーに基づくことが多い癌治療に対する薬物送達システムと共にポリ（Ｉ：Ｃ）分子を含む構造上複雑な抗癌性複合体を産生することによって、薬物としてポリ（Ｉ：Ｃ）分子の臨床開発を制限している落とし穴（pitfalls）、及びその規制要件を要するコンプライアンスを克服できる可能性がある。これらのポリマーシステム（ポリプレックス（Polyplex）とも呼ばれる）は、脂質ベースのシステム（リポプレックス（Lipoplex）とも呼ばれる）及び核酸の局所又は全身の送達に対して同様に使用されるハイブリッドシステム（リポポリプレックス（Lipopolyplex）とも呼ばれる）とは構造的また機能的に異なる（非特許文献１２、非特許文献１３）。ポリプレックスの中でも、ＰＥＩは、直鎖／分岐鎖の構造及びサイズ、化学結合、分解性、並びに誘導体化のレベルで変更可能であり（非特許文献１４）、細胞によるリポプレックス内部移行とは異なって、クラスリン媒介とカベオラ媒介との両方のエンドサイトーシスによって内部移行される（非特許文献１５）特定の目的のカチオン性ポリマーであるポリアルキレンイミンである。
【０００７】
ＰＥＩに会合したポリ（Ｉ：Ｃ）分子の作製及び投与を含むこの治療アプローチは、ＢＯ−１１０と呼ばれる薬剤によって文献に例示されている（非特許文献１６、非特許文献１７、特許文献１６）。［ｐＩＣ］ＰＥＩとしても同定されたこの複合体は、黒色腫及び他の腫瘍タイプ（神経膠腫又は癌腫等）のいくつかの癌細胞株におけるオートファジー及びアポトーシスの二重誘導に携わるのみならず、メラノサイト等の正常細胞の生存可能性に対して何らの影響もないか、限定的な影響を有する。ＢＯ−１１０は、重度の免疫無防備状態のマウスであっても、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて抗腫瘍及び抗転移の活性を実証するための動物モデルにおいて黒色腫の生育を阻害する。さらに、類似する［ｐＩＣ］ＰＥＩ系薬剤は、正常な膵臓上皮細胞に影響することなく、膵管腺癌細胞におけるアポトーシスを賦活し、ｉｎ  ｖｉｖｏでの［ｐＩＣ］ＰＥＩの投与は、腫瘍動物モデルにおいて腫瘍生育を阻害した（非特許文献１８）。ＢＯ−１１０投与の更なる効果は、子宮内膜症のモデルにおいて特性評価され、かかる薬剤が血管形成及び細胞増殖を減少させて、アポトーシスを増加させる（非特許文献１９）。したがって、ＢＯ−１１０及び二本鎖ポリリボヌクレオチドを含む類似する［ｐＩＣ］ＰＥＩの薬剤は、種々の系統の正常細胞の生存可能性を維持しながら、腫瘍細胞における自律的かつ選択的なオートファジー及びアポトーシスの複合的な活性化により、広域スペクトルの作用を有する新規抗癌戦略である。しかしながら、依然として、担体と会合する場合、様々な前臨床モデルにおいて効力が実証された他の二本鎖ポリリボヌクレオチド系薬剤と同様に、種々の保存条件において安定で、均一に製造されサイズ分類され、他の薬物及び療法を用いる場合に最も効果的な組み合わせ、レジメン、投与量及び臨床経過観察に関して医学的使用（特に癌に対するもの）により容易に適合される製剤においてＢＯ−１１０を提供する必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】中国特許第１０３５９９０７１号
【特許文献２】中国特許第１０２９８８３０３号
【特許文献３】国際公開第２００４０４５４９１号
【特許文献４】国際公開第２００８０５７６９６号
【特許文献５】国際公開第２０１３１６４３８０号
【特許文献６】国際公開第２０１５０６７６３２号
【特許文献７】国際公開第２０１４０５７４３２号
【特許文献８】国際公開第２０１４１６５２９６号
【特許文献９】国際公開第２０１５１７３８２４号
【特許文献１０】米国特許出願公開第２００９１１７３０６号
【特許文献１１】米国特許出願公開第２０１１００３８８３号
【特許文献１２】国際公開第２００５１０２２７８号
【特許文献１３】国際公開第２０１３０８７０８３号
【特許文献１４】国際公開第２０１３０４０５５２号
【特許文献１５】国際公開第２０１３０６３０１９号
【特許文献１６】国際公開第２０１１００３８８３号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Hafner A et al., 2013
【非特許文献２】Schaffert D et al., 2011
【非特許文献３】Kabilova T et al., 2014
【非特許文献４】Kuebler K et al., 2011
【非特許文献５】Palchetti S et al., 2013
【非特許文献６】Saheki A et al., 2011
【非特許文献７】Chen L et al., 2013
【非特許文献８】McBain S et al., 2007
【非特許文献９】Cobaleda-Siles M et al., 2014
【非特許文献１０】Kurosaki T et al., 2009
【非特許文献１１】Tutin-Moeavin I et al., 2015
【非特許文献１２】Bilensoy E, 2010
【非特許文献１３】Germershaus O and Nultsch K, 2015
【非特許文献１４】Islam M et al., 2014
【非特許文献１５】Shabani M et al., 2010
【非特許文献１６】Pozuelo-Rubio M et al., 2014
【非特許文献１７】Tormo D et al., 2009
【非特許文献１８】Bhoopathi P et al., 2014
【非特許文献１９】Garcia-Pascual C and Gomez R, 2013
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
実際、従来技術は、癌の治療に対するポリ（Ｉ：Ｃ）含有組成物の産生を可能とする構造的及び生物物理学的な基準の最も有効な組み合わせに関する課題を解決するための適切な教示を提供していない。また、規制機関は、ヒトに使用される組成物に含まれるポリ（Ｉ：Ｃ）含有粒子の再現性、保存、並びにサイズ及び濃度の均一性に対する規格に厳密に準拠していることを要求する。二本鎖ポリリボヌクレオチド系（ポリ（Ｉ：Ｃ）分子等）の製剤及び関連する薬剤、組成物（まとめてＢＯ−１１Ｘ生成物とされる）、並びにより高く、良好に制御された濃度で二本鎖ポリリボヌクレオチド分子を提供する関連プロセスの一般的特徴が国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０７８０７８号に記載されている。しかしながら、患者のコンプライアンスに合わせた臨床評価及び使用の手段を改善し、明確な安全域及び治療効果を伴いつつ二本鎖ポリリボヌクレオチド分子を投薬する頻度を減少させながら、特定の適応症、継続的治療及び／又はレジメンに関連した薬物（特に癌に対する）としてのＢＯ−１１Ｘ生成物の効果的な医学的使用を可能とするため、ＢＯ−１１Ｘ生成物の前臨床及び臨床特性評価がなおも必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、粒子を含む組成物であって、
（ｉ）上記粒子の各々は、少なくとも１つの二本鎖ポリリボヌクレオチド又はその塩若しくはその溶媒和物と、少なくとも１つのポリアルキレンイミン又はその塩及び／又はその溶媒和物との複合体を含み、
（ｉｉ）上記粒子の少なくとも９５％又は少なくとも９０％は６００ｎｍ以下、好ましくは３００ｎｍ以下（例えば１４０ｎｍ〜２５０ｎｍ）の直径を有し、
（ｉｉｉ）上記粒子は、特にＩＳＯ２２４１２：２０１７によって測定される２００ｎｍ以下、好ましくは１５０ｎｍ以下のｚ平均径を有する、
組成物に関する。
【００１２】
好ましい実施の形態において、本発明は、粒子を含む水性組成物であって、
（ｉ）上記粒子の各々は、少なくとも１つの二本鎖ポリリボヌクレオチド又はその塩若しくはその溶媒和物と、少なくとも１つの直鎖ポリアルキレンイミン又はその塩及び／又はその溶媒和物との複合体を含み、上記二本鎖ポリリボヌクレオチドはポリイノシン−ポリシチジン酸（ポリ（Ｉ：Ｃ））であり、上記直鎖ポリアルキレンイミンの平均分子量は１７ｋＤａ〜２３ｋＤａであり、
（ｉｉ）上記粒子の少なくとも９０％は３００ｎｍ未満の単峰性の径分布を有し、
（ｉｉｉ）上記粒子はＩＳＯ２２４１２：２０１７によって測定される２００ｎｍ以下のｚ平均径を有し、
（ｉｖ）上記組成物はＩＳＯ１３０９９−２：２０１２による３０ｍＶ以上、好ましくは３５ｍＶ〜５０ｍＶのゼータ電位を有する、
組成物に関する。
【００１３】
本発明はまた、本明細書に開示される粒子を含む水性組成物であって、
（ｉ）上記粒子の各々は、少なくとも１つの二本鎖ポリリボヌクレオチド又はその塩若しくはその溶媒和物と、少なくとも１つの直鎖ポリアルキレンイミン又はその塩及び／又はその溶媒和物との複合体を作製することによって形成され、上記二本鎖ポリリボヌクレオチドはポリイノシン−ポリシチジン酸（ポリ（Ｉ：Ｃ））であり、上記直鎖ポリアルキレンイミンの平均分子量は１７ｋＤａ〜２３ｋＤａであり、
（ｉｉ）上記粒子の少なくとも９０％は３００ｎｍ未満の単峰性の径分布を有し、
（ｉｉｉ）上記粒子はＩＳＯ２２４１２：２０１７によって測定される２００ｎｍ以下のｚ平均径を有し、
（ｉｖ）上記組成物はＩＳＯ１３０９９−２：２０１２による３０ｍＶ以上、好ましくは３５ｍＶ〜５０ｍＶのゼータ電位を有し、
上記組成物中の上記二本鎖ポリリボヌクレオチドのリンのモル数に対する上記ポリアルキレンイミンの窒素のモル数の比率２．５以上で上記粒子が形成される、
組成物に関する。
【００１４】
また、本発明は、本明細書に開示される水性組成物の凍結乾燥によって得られ得る組成物に関する。
【００１５】
これらの組成物は、以下の基準に関連する特徴に基づいて更に規定することができる：２〜４に含まれるｐＨ及び上記組成物の総容積１ｍＬ当たり０．５ｍｇ以上の１つの二本鎖ポリリボヌクレオチドの濃度。
【００１６】
これらの組成物は、二本鎖ポリリボヌクレオチドの量及びサイズに基づいて更に規定することができ、特に、
（ｉ）上記粒子に含まれる二本鎖ポリリボヌクレオチドの少なくとも４０％が少なくとも８５０塩基対を有し、上記粒子に含まれる二本鎖ポリリボヌクレオチドの少なくとも５０％が４００塩基対〜５０００塩基対を有し、及び／又は、
（ｉｉ）二本鎖ポリリボヌクレオチドの５％〜６０％が４００塩基対未満を有し、二本鎖ポリリボヌクレオチドの１５％〜３０％が４００塩基〜８５０塩基を有し、二本鎖ポリリボヌクレオチドの１０％〜７０％が８５０塩基対〜５０００塩基対を有し、二本鎖ポリリボヌクレオチドの０％〜１０％が５０００塩基対超を有する。
【００１７】
これらの組成物は、特に所望の使用及び方法に最適な、より再現性のある成分の組み合わせ、物理的及び／又は化学的基準、並びに関連する数値範囲（粒子又は組成物のいずれかに適用可能な）を特定することによって医薬品製造及び臨床用途について首尾よく最適化された。したがって、更なる好ましい組成物は、粒子を含む水性組成物であって、
（ｉ）上記粒子の各々は、
（ａ）ポリイノシン−ポリシチジン酸（ポリ（Ｉ：Ｃ））、又はその塩若しくはその溶媒和物と、
なお、上記粒子に含まれるポリ（Ｉ：Ｃ）分子の少なくとも４０％が少なくとも８５０塩基対を有し、上記粒子に含まれるポリ（Ｉ：Ｃ）分子の少なくとも５０％が４００塩基対〜５０００塩基対を有する；
（ｂ）水溶性、直鎖ホモポリアルキレンイミン若しくはヘテロポリアルキレンイミン、又はその塩及び／又はその溶媒和物と、
なお、上記直鎖ポリアルキレンイミンの平均分子量が１７ｋＤａ〜２３ｋＤａである；
の複合体を含み、
（ｉｉ）上記粒子の少なくとも９０％は、３００ｎｍ未満（好ましくは２５０ｎｍ未満）の単峰性の径分布を有し、
（ｉｉｉ）上記粒子は、ＩＳＯ２２４１２：２０１７によって測定される６０ｎｍ〜１３０ｎｍ径（より好ましくは８０±２０ｎｍ）のｚ平均径を有し、粒子径の多分散指数は１．５未満であり、
（ｉｖ）該組成物は、少なくとも０．５ｍｇ／ｍＬの濃度のポリ（Ｉ：Ｃ）を含み、
（ｖ）該組成物は、２〜４のｐＨ及び２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜６００ｍＯｓｍ／ｋｇのモル浸透圧濃度を有し、
（ｖｉ）該組成物は、ＩＳＯ１３０９９−２：２０１２による３５ｍＶ〜５０ｍＶのゼータ電位を有する、
組成物である。
【００１８】
上に規定される水性組成物及び粒子において特定されるこれらの範囲は、以下のように更に規定及び／又は限定することができる：
（ｉ）粒子に含まれるポリ（Ｉ：Ｃ）分子の少なくとも１０％が４００塩基対未満を有し、ポリ（Ｉ：Ｃ）分子の少なくとも４０％が少なくとも８５０塩基対を有し、ポリ（Ｉ：Ｃ）分子の少なくとも７０％が４００塩基対〜５０００塩基対を有し、ポリ（Ｉ：Ｃ）分子の２０％〜４５％が４００塩基対〜８５０塩基対を有する；
（ｉｉ）粒子に含まれるポリ（Ｉ：Ｃ）分子の５％〜６０％が４００塩基対未満を有し、ポリ（Ｉ：Ｃ）分子の１５％〜３０％が４００塩基〜８５０塩基を有し、ポリ（Ｉ：Ｃ）分子の１０％〜７０％が８５０塩基対〜５０００塩基対を有し、ポリ（Ｉ：Ｃ）分子の０％〜１０％が５０００塩基対超を有する；
（ｉｉｉ）上記粒子が７５ｎｍ〜１５０ｎｍの中位径（Ｄ５０％）を有する（好ましくは少なくとも８５±２０ｎｍの中位径を有する）；
（ｖ）水溶性、直鎖ホモポリアルキレンイミン又はヘテロポリアルキレンイミンが直鎖ポリエチレンイミンである；
（ｖｉ）上記粒子径の多分散指数が０．２〜０．３に含まれる；
（ｖｉｉ）組成物がｐＨ３．０±０．２及び３００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇのモル浸透圧濃度を有する。
【００１９】
加えて、本発明は、単独での又は他の治療剤と組み合わせた医薬として使用される本明細書に開示される組成物、すなわちＢＯ−１１Ｘ製剤又は組成物に関する。これらの組成物は、粒子自体に含まれるか、又は水性組成物に添加される、少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体、有機溶媒、賦形剤及び／又はアジュバント、例えば１％〜１０％（重量／容積）の濃度で添加されるグルコースを更に含んでいてもよい。さらに、組成物は、粒子自体に含まれるか、又は水性組成物に添加される、有機化合物、無機化合物、核酸（例えば、ノンコーディングＲＮＡ、又はタンパク質をコードするＲＮＡ）、アプタマー、ペプチド又はタンパク質から選択される少なくとも１つの化合物、特に治療用化合物を更に含んでいてもよい。
【００２０】
さらに、この組成物は、異なる投与経路（例えば、１週間以上に亘る１回以上の腫瘍内注射に続く１回以上の皮下又は筋肉内注射）、及び／又は組成物へのヒト細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ曝露後の患者への細胞の再投与を組み合わせたレジメンを用いて医学的使用のために投与することができる。この後者の場合、かかるレジメンは、組成物に曝された患者の細胞における特定の活性の誘導、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏでの該細胞によるインターフェロン産生の誘導を含む。他の点では、かかる組成物に対する免疫応答に関するｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／又はｅｘ  ｖｉｖｏ研究は、ＢＯ−１１Ｘ組成物が、腫瘍細胞死等の治療的に関連する事象、直接の（注射された腫瘍内での）又は遠隔腫瘍における局所性及び／又は全身性Ｔ細胞免疫応答の増強、並びに再発性の、他の療法に反応しない又は不応性の癌の治療に有用であり得る他の機構を促進するために利用することができる他の生物学的機構（例えば、インターフェロンに依存しない及び／又は免疫細胞を標的とする生物学的機構）を誘発することを示す。
【００２１】
組成物の用量、特に二本鎖ポリリボヌクレオチドの含有量に関する組成物の用量は、結果として、各々の投与タイプ、レジメン（例えば、腫瘍内注射で最も高く、皮下又は筋肉内注射でより低く、ｅｘ  ｖｉｖｏでの細胞の処理で更に低い）、及び／又は他の薬物（併用療法で投与する場合）に適合させることができる。
【００２２】
本発明は、ヒト又は動物の細胞の生育異常を特徴とする細胞増殖障害、好ましくは癌、最も好ましくは固形癌又はリンパ腫の治療又は予防に使用される、本明細書に開示される組成物にも関する。さらに、この組成物は、例えばアジュバントとして癌（固形又は固形ではない）若しくは感染を治療若しくは予防するため、及び／又は癌免疫療法のための薬剤を含む薬物に殆ど応答しない若しくは抵抗性を示す患者を救済するため、細胞の代謝及び／又は機能（好ましくは免疫細胞及び／又は癌細胞における）を変化させるため、ＤＮＡの発現、複製及び／又は修復を調節するため（後成的機構を標的とする薬物を含む）、又は標準療法（化学療法若しくは放射線療法、又は癌抗原若しくはウイルス抗原を用いるワクチン系療法等）のためのワクチン、サイトカイン、抗原、抗体、化学化合物、及び免疫調節活性を有する他の化合物を支持するために投与することができる。
【００２３】
本発明の他の目的は、効力、最も適切なレジメン、別の抗癌薬若しくは標準治療プロトコルとの最も適切な治療的組み合わせ、及び／又はＢＯ−１１Ｘ治療を用いた治療に対して最も良い応答を示す被験体を評価するための本明細書に開示される組成物に関する方法に関する。これらの方法は、ＢＯ−１１Ｘ組成物への曝露後の選択された細胞型（免疫細胞及び癌細胞等）における遺伝子パネルの発現の上方制御及び下方制御を測定すること、並びにその結果として、治療的効力を改善するため（例えば、更なる治療について患者を階級化若しくは選択するため、特定の生物学的標的を標的とする薬物を投与する若しくは投与しないため、及び／又はＢＯ−１１Ｘ及び／又は他の組成物の投与量を減少若しくは増加させるため）に適切な手段を適用することを含む。
【００２４】
さらに、本発明は、本明細書に開示される組成物、すなわちＢＯ−１１Ｘ製剤又は組成物を製造するプロセスであって、
（ｉ）少なくとも１つの二本鎖ポリリボヌクレオチド又はその塩若しくはその溶媒和物の水溶液、及び少なくとも１つのポリアルキレンイミン又はその塩若しくはその溶媒和物の水溶液を作製することと、
なお、いずれか又は両方の溶液が任意に薬学的に許容可能な担体、有機溶媒、賦形剤、及び／又はアジュバントを更に含み；
（ｉｉ）各溶液を５００ｎｍ以下の細孔径を有するフィルタを通して別々に濾過し、滅菌溶液を形成することと、
（ｉｉｉ）混合チャンバーにおいて上記溶液の一方をもう一方の溶液に１ｍＬ／分以上の速度で、任意に注入によって添加することによって、又は１ｍＬ／分以上の速度で任意に注入によって上記混合チャンバーへ上記溶液の各々を同時に添加することによって、得られた滅菌溶液を混合チャンバーで混合し、水性組成物を形成することと、
また、任意に、
（ｉｖ）得られた水性組成物を６００ｎｍ以下の細孔径を有するフィルタを通して濾過し、濾液を形成すること、又は２２４８０ｍ／ｓ２以上で得られた水性組成物を遠心分離し、上清を形成することと、
を含む、プロセスに関する。
【００２５】
本発明は、上記プロセスによって得られ得る水性組成物（軽い懸濁液として定義することができる組成物を含む）、並びに任意に得られた水性組成物、濾液又は上清を凍結乾燥することによって得られ、その後、他の医用化合物又はデバイス（バッファー、希釈剤、カテーテル、針、フィルタ、又は腫瘍内投与に適したデバイス等）と別々に（又はキット内で）提供及び／又は使用することができる組成物にも関する。
【００２６】
また、好ましくは、本発明は、粒子を含む組成物であって、
（ｉ）上記粒子の各々は、少なくとも１つの二本鎖ポリリボヌクレオチド又はその塩若しくはその溶媒和物と、少なくとも１つのポリアルキレンイミン又はその塩及び／又はその溶媒和物との複合体を含み、ここで、
（ａ）上記二本鎖ポリリボヌクレオチドがポリイノシン−ポリシチジン酸（ポリ（Ｉ：Ｃ））又はポリアデニル−ポリウリジル酸（ポリ（Ａ：Ｕ））であり、二本鎖ポリリボヌクレオチドの少なくとも１０％が４００塩基対未満を有し、上記二本鎖ポリリボヌクレオチドの少なくとも４０％が少なくとも８５０塩基対を有し、上記二本鎖ポリリボヌクレオチドの少なくとも７０％が４００塩基対〜５０００塩基対を有し、上記二本鎖ポリリボヌクレオチドの２０％〜４５％が４００塩基対〜８５０塩基対を有し、
（ｂ）上記ポリアルキレンイミンが少なくとも９５％のポリエチレンイミンを含み、上記ポリアルキレンイミンの重量平均分子量が１７ｋＤａ〜２３ｋＤａであり、多分散性指数が１．５未満であり、上記組成物中の上記二本鎖ポリリボヌクレオチドのリンのモル数に対する上記ポリアルキレンイミンの窒素のモル数の比率が２．５〜５．５であり、
（ｉｉ）上記粒子の少なくとも９９％が６００ｎｍ以下の直径を有し、
（ｉｉｉ）上記粒子が３０ｎｍ〜１５０ｎｍのｚ平均径を有する、
組成物に関する。
【００２７】
また、より好ましくは、本発明は、粒子を含む水性組成物であって、
（ｉ）上記粒子の各々は、少なくとも１つの二本鎖ポリリボヌクレオチド又はその塩若しくはその溶媒和物と、少なくとも１つのポリアルキレンイミン又はその塩及び／又はその溶媒和物との複合体を含み、ここで、
（ａ）上記二本鎖ポリリボヌクレオチドは、ポリイノシン−ポリシチジン酸（ポリ（Ｉ：Ｃ））であり、二本鎖ポリリボヌクレオチドの少なくとも１０％が４００塩基対未満を有し、上記ポリ（Ｉ：Ｃ）の少なくとも４０％が少なくとも８５０塩基対を有し、上記ポリ（Ｉ：Ｃ）の少なくとも７０％が４００塩基対〜５０００塩基対を有し、上記ポリ（Ｉ：Ｃ）の２０％〜４５％が４００塩基対〜８５０塩基対を有し、
（ｂ）上記ポリアルキレンイミンがポリエチレンイミン（ＰＥＩ）であり、ここで、上記ＰＥＩの重量平均分子量が１７．５ｋＤａ〜２２．６ｋＤａであり、多分散性指数が１．５未満であり、上記組成物中の上記二本鎖ポリリボヌクレオチドのリンのモル数に対する上記ポリアルキレンイミンの窒素のモル数の比率が２．５〜４．５であり、
（ｉｉ）上記粒子の少なくとも９９％が５００ｎｍ以下の直径を有し、
（ｉｉｉ）上記粒子が６０ｎｍ〜１３０ｎｍのｚ平均径を有し、
（ｉｖ）上記粒子が７５ｎｍ〜１５０ｎｍの中位径（Ｄ５０％）を有する、
組成物に関する。
【００２８】
上に規定される水性組成物の凍結乾燥によって得られ得る組成物を含む、上に規定される任意の組成物を、製造プロセスの特徴に関して更に規定することができる。例えば、前記粒子は、ポリ（Ｉ：Ｃ）分子のリンのモル数に対する前記水溶性、直鎖ホモポリアルキレンイミン又はヘテロポリアルキレンイミンの窒素のモル数の比率２．５〜４．５の間で形成される。好ましくは、前記粒子は、混合チャンバーにおいて前記ポリ（Ｉ：Ｃ）分子を含有する溶液及び前記水溶性、直鎖ホモポリアルキレンイミン又はヘテロポリアルキレンイミンを含有する溶液を別々に注入することによって形成される。水性組成物は、１％〜１０％（重量／上記組成物の総容積）の濃度のグルコースを添加すること、好ましくはポリ（Ｉ：Ｃ）を含有する溶液にグルコースを添加することによって形成することができる。さらに、前記ポリ（Ｉ：Ｃ）分子を含有する溶液及び前記水溶性、直鎖ホモポリアルキレンイミン又はヘテロポリアルキレンイミンを含有する溶液を、いずれかの溶液を注入する流速を１ｍＬ／分〜５０ｍＬ／分にして別々に注入し、及び／又は５０ｒｐｍ〜６００ｒｐｍの速度で混合する。
【００２９】
粒子に含まれるポリ（Ｉ：Ｃ）分子のサイズ、粒子の単峰性の径分布、ポリエチレンイミンである直鎖ポリアルキレンイミン、粒子径の多分散指数、組成物のモル浸透圧濃度、及び／又は組成物のｐＨ（同様に、薬学的に許容可能な担体、有機溶媒、賦形剤及び／又はアジュバントの存在、又は少なくとも１つの化合物、特に治療用化合物の存在）に関して上記（ｉ）〜（ｖｉｉ）において上で特定されるより好ましい範囲は、上に示されるように形成される粒子を含む水性組成物にも当てはまる。
【００３０】
ＢＯ−１１Ｘ製剤の形態のかかる組成物の作製に関する更なる実施形態、それらの特徴、それらの分析及びそれらの使用（単独での又は他の薬剤と組み合わせた、また特定のレジメンでの）は、特に特定の適応症について改善若しくは最適化された治療応答を得るために、及び／又は他の薬物及び療法（化学療法、放射線療法、免疫チェックポイント分子を標的とする薬剤、Ｔ細胞性応答、ＤＮＡの修復及び／又は複製、又は代謝活性を含む免疫細胞及び／又は癌細胞における活性を調節するキナーゼ及び他の酵素の阻害剤等）と組み合わせて、下記の詳細な説明及び実施例において提供される。ＢＯ−１１Ｘ製剤は、抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ１、抗ＰＤＬ１、ＣＡＲ−Ｔ細胞、癌抗原ワクチン、又は制御性Ｔ細胞を標的とする薬剤、代謝酵素、ＤＮＡの修復及び／又は複製、又は表Ｉの遺伝子のいずれかによって発現されるタンパク質（実施例４を参照されたい）から選択される第２の治療剤と組み合わせて、ヒト又は動物の細胞の生育異常を特徴とする細胞増殖障害（特に癌）を治療する方法に使用することができる。より詳しくは、ＢＯ−１１Ｘ製剤は、この第２の治療剤と投与した場合に、上記第２の治療剤の通常の投与量及び／又は投与頻度を減少させる可能性（ひいては医学的介入、薬物に対する耐性及び／又は患者の不快感を減少させる可能性）を含む、相乗的な治療効果を得るために使用することができる。さらに、この第２の治療剤と投与した場合のＢＯ−１１Ｘ製剤は、上記第２の治療剤に抵抗性を示す、非感受性の、又は殆ど（又は全く）応答しない患者の治療を可能にし、任意の特定の腫瘍耐性又は回避機構（特定の遺伝子、経路、及び／又は薬物、若しくはサイトカイン等の内因性化合物に対する応答を変化させる突然変異を含む）を克服する可能性がある。したがって、ＢＯ−１１Ｘ製剤は、ドラッグレスキュー薬物救済又は薬物感作併用治療の形態で、特に癌の治療に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】ＢＯ−１１２によって例示される、ＢＯ−１１Ｘ水性組成物のＧＭＰ製造及び構造分析を示す図である。（Ａ）ポリ（Ｉ：Ｃ）分子と、市販のＪｅｔＰＥＩ調剤と、グルコースとを含む、ＧＭＰ準拠の薬学的調剤として、ＢＯ−１１２化合物を製造する主な工程を要約するフローチャート。このアプローチは、ポリ（Ａ）、ポリ（Ｕ）、ポリ（Ｃ）及び／又はポリ（Ｇ）によって、それらのそれぞれの対合特性に従って形成される二本鎖分子を形成する他のタイプのポリリボヌクレオチドを用いることによっても適用することができる。他の点では、このアプローチは、段階１においてグルコース又は他の賦形剤と共に（又はその代替として）別の化合物（免疫関連アジュバント若しくは治療用化合物、例えばＣＤ４０Ｌ、ＩＬ１２、ウイルス抗原若しくは腫瘍抗原、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、又は他の（ノンコーディング）ＲＮＡ／核酸系薬物、又は細胞の複製、代謝若しくは生物学的機能に影響を及ぼすキナーゼ若しくは他の酵素の阻害剤等の抗癌薬である）を添加することを含み得る。（Ｂ）ＢＯ−１１２複合体の粒度分布を、３つの市販のポリ（Ｉ：Ｃ）含有製品（ポリ−ＩＣＬＣ、ＬｙｏＶｅｃ−ＨＭＷ及びＬｙｏＶｅｃ−ＬＭＷ）と比較する。粒度は、動的光散乱（ゼータサイザーナノＺＳ技術）によってナノメートル単位の粒子径（ｄ．ｎｍ）を考慮することで規定される。これらの市販の調剤は、−２０℃で保存した後に粒度分布の実質的な変化も示すが、ＢＯ−１１２調剤は変化を示さない。
【図２】別々の癌細胞モデルにおける細胞生存率に対する種々のポリ（Ｉ：Ｃ）製剤の効果を示す図である。（Ａ）ＢＯ−１１２を非処理細胞、及びポリ−ＩＣＬＣ、ＬｙｏＶｅｃ−ＬＭＷ又はＬｙｏＶｅｃ−ＨＭＷで処理した細胞と比較し、各製剤を、黒色腫（ＳＫ−ＭＥＬ−１０３）又は膵癌（ＰＡＮＣ０２．０３）の細胞モデルのいずれかにおいて複合体重量に従って決定した指定の濃度であるが、同様の含有量のポリ（Ｉ：Ｃ）分子を含む濃度で試験する。２４時間後にクリスタルバイオレットアッセイ法を使用して細胞の生存率データを生成した。このｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性アッセイを、他のマウス（４Ｔ１乳癌、ＭＣ３８結腸癌及びＢ１６−Ｆ１０−ＯＶＡ黒色腫細胞株）及びヒト（ＰＡＮ０２．０３膵癌細胞株）モデルにおいて、細胞を０．２５μｇ／ｍＬ〜１．０μｇ／ｍＬのＢＯ−１１２と共に２４時間又は４８時間インキュベートし、かかる細胞株に対する直接の細胞毒性効果を確認することによって行った。（Ｂ）インターフェロン−ベータ（ＩＦＮ−ベータ）発現等の治療的関心のあるシグナル伝達分子に対する種々のポリ（Ｉ：Ｃ）製剤の効果をＢＯ−１１２、ポリ−ＩＣＬＣ（又は非処理、ＮＴ）に８時間、１６時間及び２４時間曝したＳＫ−ＭＥＬ−１０３細胞においてＲＴ−ｑＰＣＲ法によって評価した。ＢＯ−１１２製剤及びポリ−ＩＣＬＣ製剤をポリ（Ｉ：Ｃ）分子の同様の含有量を提供する濃度で使用した。
【図３】癌細胞株に対するかかるＰＥＩ／ポリ（Ｉ：Ｃ）製剤の特異的な細胞毒性を実証する、正常、初代メラノサイト（調剤１番及び２番）及び４つの癌細胞株の生存率に対する、直鎖ＰＥＩのみ、ポリ（Ｉ：Ｃ）、及び２つの異なるＰＥＩ／ポリ（Ｉ：Ｃ）製剤（ＢＯ−１１０及びＢＯ−１１２）の効果を示す図である。適用したポリ（Ｉ：Ｃ）のみ、ＢＯ−１１０及びＢＯ−１１２の処理の調剤中に使用されるポリ（Ｉ：Ｃ）の含有量は同一である（４０時間の処理当たり１μｇ／ｍＬ）。
【図４】患者由来の黒色腫細胞（ＳＫ−Ｍｅｌ  １０３細胞株）に対するＢＯ−１１２、種々のポリ（Ｉ：Ｃ）製剤の効果を示す図である。ＢＯ−１１２をｅｘ  ｖｉｖｏで非処理細胞（ＮＴ）、及びポリ−ＩＣＬＣ、ＬｙｏＶｅｃ−ＬＭＷ又はＬｙｏＶｅｃ−ＨＭＷで処理した細胞と比較し、各製剤を、複合体重量に従って決定した濃度であるが、同様の含有量のポリ（Ｉ：Ｃ）分子を含む濃度で試験する。（Ａ）０．３５μｇ／ｍｌ濃度の各ポリ（Ｉ：Ｃ）製剤による４８時間の処理後にクリスタルバイオレットアッセイ法を使用して細胞の生存率データを生成した。（Ｂ）インターフェロン−アルファ／ベータ（ＩＦＮａ／ｂ、任意単位）の発現を、０．５μｇ／ｍｌ濃度の各ポリ（Ｉ：Ｃ）製剤による処理の１６時間後及び２４時間後に評価した。
【図５】異なるタイプの細胞死及び関連マーカーの発現に対するＢＯ−１１２、リポ多糖（ＬＰＳ）、及びＢＯ−１１２を作製するポリ（Ｉ：Ｃ）調剤の効果を示す図である。Ｂ１６−Ｆ１０−ＯＶＡ細胞（１０５細胞／ウェル）を、単独で（対照）、又はＬＰＳ、ＢＯ−１１２若しくはポリ（Ｉ：Ｃ）分子のみ（ＢＯ−１１２製剤に組み込まれたものと同じ粒度分布を有する）と共に指定の濃度で４８時間培養し、依然として生存するか、若しくは初期／後期アポトーシス、若しくはネクローシスに関するマーカーの組み合わせを提示する（アネキシンＶ及び７ＡＤＤ染色；Ａ）、又はＭＨＣ−Ｉ、ＣＤ９５若しくはカルレティキュリン等の免疫原性細胞死の特異的マーカーを発現する（Ｂ）、細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーによって測定した。
【図６】酵素ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の活性化に対するＢＯ−１１２の効果を示す図である。４Ｔ１乳癌又はＭＣ３８結腸癌細胞（３×１０６個）をＢＯ−１１２（０．５μｇ／ｍＬ）と共に培養した。ＤＮＡ修復、ゲノム安定性及びプログラム細胞死に関与する酵素であるＰＡＲＰの活性化をＢＯ−１１２刺激の０時間後、１６時間後及び２４時間後にウエスタンブロット分析によって評価した。細胞溶解物中の完全な１１６ｋＤａのＰＡＲＰタンパク質及び８５ｋＤａのアポトーシス誘導切断産物の存在を分析した。チューブリンを等タンパク質量のローディングの対照として加えた。結果から、ＢＯ−１１２製剤がＭＣ３８及び４Ｔ１癌細胞の両方においてＰＡＲＰ酵素の活性化を促進することが示され、ＰＡＲＰ阻害剤が殆ど又は全く効果的でなく、それに対して感作する必要があり得る患者におけるＰＡＲＰ阻害剤と組み合わせたＢＯ−１１２組成物の使用の根拠が得られる（図１４Ｂ及び図１５Ｂも参照されたい）。
【図７】ヒト黒色腫に対する動物モデルにおけるＢＯ−１１２の投与の効果を示す図である。（Ａ）治療のスケジュールを示すタイムライン。０日目に、全てのマウスにＢ１６−Ｆ１０マウス黒色腫細胞を皮下注射した。７日目に同様の平均サイズ（８０ｍｍ３〜１００ｍｍ３）の腫瘍を提示するマウスを５群に無作為化した後、群２、群３及び群４（Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４）では、３つの異なる濃度で腫瘍組織への直接注射（ｉ．ｔ．治療）によってＢＯ−１１２製剤（二重円）で、又は残りの２群（Ｇ１及びＧ５）ではビヒクルのみで動物を治療した。７日目の同じ濃度のＢＯ−１１２製剤の腫瘍内投与に加えて、後の治療日（１０日目、１４日目、１７日目、２１日目及び２４日目）において、Ｇ１以外の全ての群は、抗ＰＤ−Ｌ１マウス抗体（１５０μｇ／用量）の腹腔内（ｉ．ｐ．）投与を受けた。生存を毎日モニタリングし、死亡したマウスを見つけた時、又は腫瘍量が最大許容サイズに達した時に死亡として採点した。最後の治療の後、最後のマウスが死亡して実験を終了した４５日目までモニタリングを継続した。（Ｂ）対照群Ｇ１及びＧ５をＢＯ−１１２製剤が指定の３つの濃度で投与された３群と比較する生存曲線。上記群を比較すると、対照群と試験群との間に統計学的な差（ｐ＜０．０００１、Ｌｏｇ−ｒａｎｋ  Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ検定）があり、Ｇ４はビヒクル又は抗ＰＤ−Ｌ１単独に対して最も強力な生存の増加を示した。（Ｃ）ヒト黒色腫に対する更なるＢ１６−Ｆ１０モデルにおける単剤としてのＢＯ−１１２の治療効果。Ａに記載のように、Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫細胞（５×１０５細胞）を皮下注射し、ＢＯ−１１２を腫瘍内に投与する（８匹又は９匹のマウス／群；対照群、ビヒクルのみ；治療群、ＢＯ−１１２；ＢＯ−１１２用量／マウス：１００μｌ中２．５ｍｇ／Ｋｇ）。（Ｄ）腫瘍のサイズをノギスによって毎週測定し、各動物について体積を計算した（長さ×幅２／２）。スパイダープロット（Spider plots）は、対照（ビヒクル）及びＢＯ−１１２で治療したマウスについての個々の腫瘍成長曲線を示し、ＢＯ−１１２製剤がビヒクルと比較して腫瘍成長を低減することが示される。
【図８】ヒト黒色腫に対する動物モデルにおけるＢＯ−１１２投与のアブスコパル効果を示す図である。（Ａ）黒色腫Ｂ１６−Ｆ１０−ＯＶＡを移植することによって２つの癌を誘導したマウスを、図７に示す実験と同様のレジメン及び投与量を用いて（ｎ＝１０匹のマウス／群）、１つの腫瘤でのみ腫瘍内投与によって治療し（ＢＯ−１１２について）、及び／又は腹腔内投与によって全身的に治療する（抗ＰＤ−Ｌ１について）。（Ｂ）腫瘍体積の増加を対照、単剤治療又は併用治療の４つの群において、治療する場合及び治療しない遠位腫瘤の場合の両方にて測定した。腫瘍をノギスによって毎週測定し、群中の各動物について体積を計算した（長さ×幅２／２）。
【図９】ヒト乳癌に対する動物モデルにおけるＢＯ−１１２投与の効果を示す図である。（Ａ）８週齢〜１０週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスの右脇腹に皮下（ｓ．ｃ．）注射される４Ｔ１乳癌細胞（５×１０５細胞）を用いるモデル及び治療スキーム（６匹又は７匹のマウス／群；対照群、ビヒクルのみ；治療群、ＢＯ−１１２）。腫瘍体積が８０ｍｍ３〜１００ｍｍ３となった時点で治療を開始した（９日目）。ＢＯ−１１２及びビヒクルの投与を、指定の日数で右脇腹の腫瘤への単回直接注射（用量／マウス：１００μｌ中２．５ｍｇ／Ｋｇ）により腫瘍内に行った。腫瘍をノギスによって毎週測定し、群中の各動物について体積を計算し（長さ×幅２／２）、かかる動物の各々について別々に（各群についての動物の数を示す）（Ｂ）、又は各群についてまとめて（Ｃ）示されるデータを得た。ＢＯ−１１２治療群において腫瘍体積の統計的に関連した減少が観察された。
【図１０】ヒト大腸癌に対する動物モデルにおけるＢＯ−１１２投与の効果を示す図である。（Ａ）第１のモデル及び治療スキームでは、ＭＣ３８結腸癌細胞（５×１０５細胞）を８週齢〜１０週齢の雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右脇腹にｓ．ｃ．注射した（７匹又は８匹のマウス／群；Ｇ１対照群、ビヒクルのみ；Ｇ２治療群）。腫瘍体積が８０ｍｍ３〜１００ｍｍ３となった時点で治療を開始した（１６日目）。ＢＯ−１１２及びビヒクルの投与を、指定の日数で右脇腹の腫瘤への単回直接注射（用量／マウス：１００μｌ中２．５ｍｇ／Ｋｇ）により腫瘍内に行った。（Ｂ）この第１のモデルにおけるマウス生存を、カプラン−マイヤー分析を用いて評価した。腫瘍を同様にノギスによって毎週測定し、群中の各動物について体積を計算し（長さ×幅２／２）、かかる動物の各々について別々に（Ｃ）、又は各群についてまとめて（Ｄ）示されるデータを得た。ＢＯ−１１２治療群において腫瘍体積の統計的に関連した減少が観察された。
【図１１】異なる治療スキームを用いたヒト大腸癌に対する第２のモデルにおけるＢＯ−１１２投与の効果を示す図である。（Ａ）ＭＣ３８結腸癌細胞（１×１０６細胞）を８週齢〜１０週齢の雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右脇腹にｓ．ｃ．注射した（４匹〜１１匹のマウス／群；Ｇ１対照群、ビヒクルのみ；Ｇ２治療群）。腫瘍体積が８０ｍｍ３〜１００ｍｍ３となった時点で治療を開始した（１１日目）。ＢＯ−１１２及びビヒクルの投与を、指定の日数で右脇腹の腫瘤への単回直接注射（用量／マウス：１００μｌ中２．５ｍｇ／Ｋｇ）により腫瘍内に行った。ＢＯ−１１２治療後に腫瘍を有しなかった残りのマウスには、６０日目に左脇腹にｓ．ｃ．注射されるＭＣ３８細胞（２．５×１０５細胞）を用いて再チャレンジを行い、腫瘍成長及びマウス生存を追跡した。（Ｂ）この第２のモデルにおけるマウス生存を、同様にカプラン−マイヤー分析を用いて評価したが、６０日目に再チャレンジした４匹の動物が８０日目に依然として生存し、癌細胞のアポトーシスを誘発すると同時に癌細胞に対する免疫記憶を推進し得ることが示唆された。
【図１２】ヒト癌における適応免疫応答活性化に対するモデルにおけるＢＯ−１１２治療効果を示す図である。（Ａ）ヒト結腸癌に対するＭＣ３８ベースのモデルを以前に記載されているように確立するが、ＣＤ４陽性又はＣＤ８陽性Ｔ細胞のいずれかを枯渇させる抗体も投与する２つの更なる群を組み込む（治療スケジュール：ＢＯ１１２：ｄ８、ｄ１１、ｄ１５、ｄ１８、ｄ２２、ｄ２５；抗ＣＤ４又は抗ＣＤ８：ｄ７、ｄ８、ｄ１１、ｄ１５、ｄ２２、ｄ２９）。（Ｂ）ＣＤ８陽性Ｔ細胞の枯渇のみがＢＯ−１１２製剤の治療特性を損なうことを示す、ＢＯ−１１２で治療したＭＣ３８腫瘍担持マウスの腫瘍成長曲線の分析（腫瘍体積を異なる群について並行して示し、Ｎは１群当たりのマウスの数であり、点線によりｄ２５でのＢＯ−１１２治療の終了を示す）。（Ｃ）腫瘍へのＴ細胞動員及び活性化、並びに抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のプライミングに対するＢＯ−１１２療法の効果。Ｔ細胞サブセット（ＣＤ８陽性又はＣＤ４陽性）及びＴ細胞活性化（ＣＤ１３７、ＩＦＮ−γ及びＰＤ−１）についての種々の細胞マーカーの頻度を、第２のＢＯ−１１２投与後にビヒクル又はＢＯ−１１２製剤で２４時間治療したマウスに由来するＢ１６−Ｆ１０−ＯＶＡ腫瘍（四量体分析については流入領域リンパ節）においてフローサイトメトリーによって測定する。グラフから、このモデルにおいてＢＯ−１１２療法によりＣＤ８＋Ｔ細胞が顕著に増加し、腫瘍浸潤物におけるＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞活性化が促進されることが示される。（Ｄ）ＢＯ−１１２が腫瘍（ＯＶＡ及び内在性Ｔｒｐ２抗原に対する）及び流入領域リンパ節（特にＴｒｐ２抗原に対する）における抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度も顕著に高めることを示す、Ｔ細胞サブセット（ＣＤ８陽性又はＣＤ４陽性）及びＴ細胞プライミング（ＯＶＡ及びＴｒｐ２四量体）についての種々の細胞マーカーの頻度。全てのデータ（異なる実験によるものでも）により、ＢＯ−１１２製剤が抗腫瘍適応免疫応答を活性化し、全身性免疫を誘導する可能性を有することが一貫して示される。
【図１３】ヒト癌におけるインターフェロン発現への依存性を評価するモデルにおけるＢＯ−１１２治療効果を示す図である。（Ａ）ＩＦＮとは独立したｉｎ  ｖｉｔｒｏ腫瘍細胞の細胞毒性を、細胞生存率に関して２４時間、４８時間及び７２時間の時点でＭＴＳアッセイにより評価する。簡潔に述べると、各細胞株：Ｂ１６、Ｂ１６−ＩＦＮα／β（ＩＦＮγに応答しない；InvivoGenによる）及びＢ１６−ＩＦＮγ（ＩＦＮα／βに応答しない；InvivoGenによる）の細胞を、単独で、又は０．５μｇ／ｍｌのＢＯ−１１２と共に２４時間、４８時間及び７２時間に亘って、また単独で、又は代替的にはＢＯ−１１２（０．５μｇ／ｍｌ）と共に、又は２’３’ｃＧＡＭＰ  ＳＴＩＮＧアゴニスト（７μｇ／ｍｌ）と共に２４時間に亘って（参照ＳＴＩＮＧアゴニストに対するＢＯ−１１２の効力の優位性が示される）、培養した（５×１０３細胞／ウェル、９６フラットウェルプレート）。２回の独立アッセイを１条件当たり少なくとも８ウェルで行った。ヒト黒色腫に対するＩＦＮに抵抗性を示すＢ１６ベースのモデルに対するＢＯ−１１２のｉｎ  ｖｉｖｏ治療効果を、８週齢〜１０週齢の雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（７匹〜１０匹のマウス／群）の右脇腹にｓ．ｃ．注射した（５×１０５細胞）、上記のＢ１６−ＩＦＮα／β（Ｂ）及びＢ１６−ＩＦＮγ（Ｃ）癌細胞において試験した。腫瘍体積が８０ｍｍ３〜１００ｍｍ３となった時点で治療を開始した（８日目）。ＢＯ−１１２及びビヒクルの投与を、右脇腹の腫瘤への単回直接注射（ＢＯ−１１２用量／マウス：１００μｌ中２．５ｍｇ／Ｋｇ；２回の投与／週、３週間）により腫瘍内に行った。屠殺するまで腫瘍をノギスによって毎週測定し、体積を計算した。グラフから、ＢＯ−１１２で治療したマウスにおいて、ＢＯ−１１２がビヒクルと比較して腫瘍体積を低減し（個々のスパイダープロット）、生存を顕著に改善する（カプラン−マイヤー曲線）ことが示され、ＢＯ−１１２製剤がＩＦＮに抵抗性を示す癌細胞において強力な治療効果を有することが示される。
【図１４】ＢＯ−１１Ｘ投与の代替的な手段及びレジメンを示す図である。（Ａ）ＢＯ−１１２等のＢＯ−１１Ｘ製剤の投与は、毎週、２週間に１回又は３週間に１回（０．４ｍｇ〜２．４ｍｇ／回；又は臨床研究中に応答する又は安定した患者において行うことができるような最大６週間に１回のより大きな間隔で）行われる１回〜４回の腫瘍内注射（ＢＯ−１１ＸＩ．Ｔ．）で開始することができる。初期投与に続いて何回かのＢＯ−１１Ｘの皮下又は筋肉内注射（ＢＯ−１１ＸＳＱ／Ｉ．Ｍ．；０．２ｍｇ〜２ｍｇ／回）を行うことができる。他の腫瘍内治療については、このレジメンは、同じ病変（依然として存在する場合）への注射、又は元の病変がもはや存在しない場合、若しくは初期腫瘍内注射によってかかる病変が（全身免疫活性化又は他の応答により）、若しくは腫瘍量、ステージ、持続、転移及び／又は再発の他の兆候が低減しなかった場合に他の病変への注射を含み得る。（Ｂ）代替的には、ＢＯ−１１２投与は、２０週間以上に亘って徐々に間隔を空けた（毎週、２週間に１回、４週間に１回、６週間に１回又はそれ以上）腫瘍内注射、同じ（黒色の菱形）及び他の癌病変（灰色の菱形）における交互のＩ．Ｔ．投与によって、ＢＯ−１１Ｘ治療の前又は後に開始される他のレジメン及び／又は投与での化学療法、放射線療法、小分子、チェックポイント阻害剤、抗体等の並行治療（三角、例としては２週間に１回又は３週間に１回適用される）を適用して又は適用せずに遂行することができる。前者の場合は、そうでなければ殆ど（又は全く）効果的でない第２の治療剤の治療を救済又は支持するために、初期ＢＯ−１１Ｘ単剤療法レジメンＡを（例えば、ペムブロリズマブ又はイピリムマブと）組み合わせることができ、又はＢＯ−１１Ｘ単剤療法レジメンＢを（例えば、ニボルマブと）組み合わせることができる。後者の場合は、ＢＯ−１１Ｘ単剤療法レジメンＡ又は初期ＢＯ−１１Ｘ単剤療法レジメンＢのいずれか（２つのレジメンのそれぞれを先に挙げた抗体と組み合わせる）により、付加的な治療剤（特に、免疫療法）に対する腫瘍（又は患者）の感作が可能となる。（Ｃ）患者から得られた細胞に対してｅｘ  ｖｉｖｏで使用されるアジュバント（樹状細胞ＤＣのｅｘ  ｖｉｖｏ成熟のためのワクチンアジュバント等）として、治療は、正の選択によって細胞を分離する手順である血球分離によって関連細胞型を単離するために患者から血液試料を得て、樹状細胞（ＤＣ）のかかるサブセット、例えば単球由来樹状細胞（Ｍｏ−ＤＣ）、ポリ（Ｉ−Ｃ）分子等の刺激に応答したＩ型インターフェロンの主な産生細胞（producers）であるＢＤＣＡ３陽性サブセット及び樹状細胞の他のサブセット、又はＣＤ３４＋由来樹状細胞を細胞選別することによって開始することができる。次いで、これらの細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで所与の日数に亘って増殖及び／又は成熟させ、その間に細胞を様々な時間（例えば１時間、３時間、８時間、２４時間又はそれ以上）に亘ってＢＯ−１１２製剤に曝した後、ＤＣベースのワクチン接種の調剤を完成させるために抗原負荷に使用することができる。また、ＤＣのかかる活性化は、ＢＯ−１１２の筋肉内又は皮下注射、ＢＯ−１１２の腫瘍内注射及び／又は腫瘍抗原のｉｎ  ｖｉｖｏ送達による腫瘍における免疫原性細胞死の誘導によって遂行し、完了する（又は直接達成する）ことができる。
【図１５】患者においてＢＯ−１１Ｘを評価及び使用するための代替的な手段を示す図である。（Ａ）ＢＯ−１１２等のＢＯ−１１Ｘ製剤の投与を評価するための医学的に関連した読取りを要約するフローチャート。医学的状態の追跡は、例えば治療に対する応答又は再発を評価するために腫瘍量を特定及び測定し、及び／又は血中の癌特異的バイオマーカーをモニタリングする身体検査及び画像化技術によって行うことができる。一連の下位基準（sub-criteria）を、サイトカイン（個別の又は特定の組み合わせでのインターフェロン又はインターロイキン等、実施例４を参照されたい）又は循環／浸潤免疫細胞の発現及び／又はそれに対する応答の変更を含む、生検によって得られた腫瘍組織及び／又は血液試料における特定のパラメーターの評価を用いる３つの主な評価基準（すなわちフローチャートの下部の枠）の各々と関連付けることができる。（Ｂ）先のフローチャートに規定される読取り及び付加的な読取り（例えば、ＢＯ−１１２投与の前及び後の特定の細胞又は組織における遺伝子発現、タンパク質発現、変異負荷状態（mutational burden status）又はＴ細胞クローン性の分析によるもの）を用いる、ＢＯ−１１２等のＢＯ−１１Ｘ製剤の投与に続いて（それと同時に、更にはその前に開始される可能性もある）利用可能な治療機会を要約するフローチャート。この分析により、ＢＯ−１１Ｘ製剤の投与前に患者の腫瘍が殆ど応答しない、抵抗性を示す又は非感受性であることが特定された治療（例えば放射線療法、化学療法、抗ＰＤ−１又は他の免疫調節療法、癌ワクチン接種、細胞療法等）を用いる可能性を含む、ＢＯ−１１Ｘ治療の同じ若しくは異なるレジメン、又は異なるタイプの医学的追跡を用いた継続を示し得る、ＢＯ−１１２により誘導される分子署名が得られる（すなわち、フローチャートの下部の枠）。
【図１６】患者の転移性病変において生成された臨床データを示す図である。転移性平滑筋肉腫を有する４６歳の女性がいくつかの治療（特に、化学療法及び抗ＰＤ−１／抗ＬＡＧ−３の組み合わせ）を受けた後に進行性疾患を発症した。この女性は、注射に適した腹壁の癌病変を有しており、インフォームドコンセントを得てＢＯ−１１２の腫瘍内注射を行った。０．６ｍｇのＢＯ−１１２の３回の投薬後は、患者に更なる全身治療を行わず、大腿（骨）転移に対する緩和照射のみを行った。（Ａ）矢印は、画像化分析により４つの異なる位置に確立され（左列）、３ヶ月後に同様の位置に繰り返された（右列）、腫瘍ネクローシスの放射線学的兆候の増加を示す関連病変を示し、ＢＯ−１１２を注射した病変及び注射しなかった病変の両方での改善が示される。（Ｂ）ＢＯ−１１２治療の前及び後に、循環免疫細胞の集団（特定の又は組み合わせたＣＤ４、ＣＤ８又はＣＤ８等の細胞表面マーカーに基づいて規定される）をこの患者の末梢血において評価し、（最初の低減後に）ＢＯ−１１２治療により循環中の特定の細胞亜集団、特にＮＫ細胞及びＣＤ１６陽性細胞の量を増大し得ることが示された。
【図１７】進行性疾患を有する転移性黒色腫（ステージＩＶ）を呈する７２歳の女性患者において生成された臨床データを示す図である。この女性は、以前に指骨切断（phalanx amputation）及び鼠径リンパ節切除を含む複数回の手術、並びに放射線療法を受けていた。以前の全身治療は、ペムブロリズマブ及びフォテムスチン（fotemustin）治療後のインターフェロンを含むものであった。患者が腫瘍内注射に適した９ｃｍの鼠径部における病変を有すると評価された。インフォームドコンセントを得て、鼠径部病変に０．６ｍｇの１回量のＢＯ−１１２を超音波ガイド下で注射し、続いて画像化分析を行い、これを翌週以降も同様の位置で繰り返した。この１回量投与の１週間後に、標的病変のサイズが８ｃｍまで減少した。次いで、患者をイピリムマブ（抗ＣＴＬＡ４抗体、３週間に１回、４サイクルの３ｍｇ／ｋｇ）で治療し、癌病変の更なる改善が得られた。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明は、国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０７８０７８号の組成物クレームにおいて定義されるもの（国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０７８０７８号でＢＯ−１１Ｘとして定義され、その実施例１及び実施例２において例示され、Ｘが整数である）を含む組成物を開示する。国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０７８０７８号において開示されるＢＯ−１１Ｘ組成物の特徴の群がＢＯ−１１２組成物に含まれる。特に、ＢＯ−１１２組成物は、ＢＯ−１１２組成物に含まれる粒子又は水性組成物に関連する物理化学的特徴のいずれかに当てはまる特定の特徴を組み合わせることによって更に規定することができる。
【００３３】
好ましいＢＯ−１１２組成物は、粒子を含む水性組成物であって、
（ｉ）上記粒子の各々は、少なくとも１つの二本鎖ポリリボヌクレオチド、又はその塩若しくはその溶媒和物と、少なくとも１つの直鎖ポリアルキレンイミン、又はその塩及び／又はその溶媒和物との複合体を含み、ここで上記二本鎖ポリリボヌクレオチドがポリイノシン−ポリシチジン酸（ポリ（Ｉ：Ｃ））であり、上記直鎖ポリアルキレンイミンの平均分子量が１７ｋＤａ〜２３ｋＤａであり、
（ｉｉ）上記粒子の少なくとも９０％は、３００ｎｍ未満の単峰性の径分布を有し、
（ｉｉｉ）上記粒子は、ＩＳＯ２２４１２：２０１７によって測定される２００ｎｍ以下のｚ平均径を有し、
（ｉｖ）該組成物は、少なくとも０．５ｍｇ／ｍＬの濃度のポリイノシン−ポリシチジン酸（ポリ（Ｉ：Ｃ））を含み、
（ｖ）該組成物は２〜４のｐＨを有し、
（ｖｉ）該組成物は、ＩＳＯ１３０９９による３５ｍＶ〜５０ｍＶのゼータ電位を有する、
組成物である。
【００３４】
好ましい実施形態では、ＢＯ−１１２組成物は、上記粒子の少なくとも９０％が３０ｎｍ〜１５０ｎｍの単峰性の径分布を有する、上記による組成物である。
【００３５】
より好ましい実施形態では、ＢＯ−１１２組成物は、上記粒子に含まれる二本鎖ポリリボヌクレオチドの少なくとも４０％が少なくとも８５０塩基対を有し、上記粒子に含まれる二本鎖ポリリボヌクレオチドの少なくとも５０％が４００塩基対〜５０００塩基対を有する、上記による組成物である。
【００３６】
更に一層好ましい実施形態では、ＢＯ−１１２組成物は、上記組成物が３８ｍＶ〜４５ｍＶに含まれるゼータ電位を有する、上記による組成物である。
【００３７】
より一層好ましい実施形態では、ＢＯ−１１２組成物は、上記直鎖ポリアルキレンイミンが水溶性、直鎖ホモポリアルキレンイミン又はヘテロポリアルキレンイミンである、上記による組成物である。
【００３８】
更により一層好ましい実施形態では、ＢＯ−１１２組成物は、上記直鎖ポリアルキレンイミンが直鎖ポリエチレンイミンである、上記による組成物である。
【００３９】
また一層好ましい実施形態では、ＢＯ−１１２組成物は、粒子径の多分散指数が１．５未満である、上記による組成物である。
【００４０】
上記の更に好ましい実施形態では、ＢＯ−１１２組成物は、ポリイノシン−ポリシチジン酸（ポリ（Ｉ：Ｃ））において、二本鎖ポリリボヌクレオチドの５％〜６０％が４００塩基対未満を有し、二本鎖ポリリボヌクレオチドの１５％〜３０％が４００塩基〜８５０塩基を有し、二本鎖ポリリボヌクレオチドの１０％〜７０％が８５０塩基対〜５０００塩基対を有し、二本鎖ポリリボヌクレオチドの０％〜１０％が５０００塩基対超を有する、上記による組成物である。
【００４１】
更により好ましい実施形態では、ＢＯ−１１２組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体、有機溶媒、賦形剤及び／又はアジュバントを更に含む、上記による組成物である。
【００４２】
更により一層好ましい実施形態では、ＢＯ−１１２組成物は、有機化合物、無機化合物、核酸、アプタマー、ペプチド又はタンパク質から選択される少なくとも１つの化合物を更に含む、上記による組成物である。
【００４３】
また更に一層好ましい実施形態では、ＢＯ−１１２組成物は、１％〜１０％（重量／容積）の濃度のグルコース又はマンニトールを更に含む、上記による組成物である。
【００４４】
また更により一層好ましい実施形態では、ＢＯ−１１２組成物は、２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜６００ｍＯｓｍ／ｋｇのモル浸透圧濃度を有する水性組成物である、上記による組成物である。
【００４５】
更により一層好ましい実施形態では、ＢＯ−１１２組成物は、
（ｉ）上記粒子の各々が、少なくとも１つの二本鎖ポリリボヌクレオチド、又はその塩若しくはその溶媒和物と、少なくとも１つの直鎖ポリアルキレンイミン、又はその塩及び／又はその溶媒和物との複合体を作製することによって形成され、ここで上記二本鎖ポリリボヌクレオチドがポリイノシン−ポリシチジン酸（ポリ（Ｉ：Ｃ））であり、上記直鎖ポリアルキレンイミンの平均分子量が１７ｋＤａ〜２３ｋＤａであり、
（ｉｉ）上記粒子の少なくとも９０％が３００ｎｍ未満の単峰性の径分布を有し、
（ｉｉｉ）上記粒子がＩＳＯ２２４１２：２０１７によって測定される２００ｎｍ以下のｚ平均径を有し、
（ｉｖ）上記組成物が少なくとも０．５ｍｇ／ｍＬの濃度のポリイノシン−ポリシチジン酸（ポリ（Ｉ：Ｃ））を含み、
（ｖ）上記組成物が２〜４のｐＨを有し、
（ｖｉ）上記組成物がＩＳＯ１３０９９による３０ｍＶ以上のゼータ電位を有し、
２．５以上の上記組成物中の上記二本鎖ポリリボヌクレオチドのリンのモル数に対する上記ポリアルキレンイミンの窒素のモル数の比率で上記粒子が形成される、
上記による組成物である。
【００４６】
更により一層好ましい実施形態の好ましい実施形態では、ＢＯ−１１２組成物は、上記ポリイノシン−ポリシチジン酸（ポリ（Ｉ：Ｃ））が、
（ｉ）分子の８０％〜９９％が４００塩基未満を有し、分子の０％〜２０％が４００塩基〜８５０塩基を有し、分子の０％〜５％が８５０塩基〜５０００塩基を有し、分子の０％〜５％が５０００塩基超を有するポリイノシン酸（ポリ（Ｉ））調剤と、
（ｉｉ）分子の２０％〜８５％が４００塩基未満を有し、分子の１０％〜４０％が４００塩基〜８５０塩基を有し、分子の０％〜５０％が８５０塩基〜５０００塩基を有し、分子の０％〜５％が５０００塩基超を有するポリシチジン酸（ポリ（Ｃ））調剤と、
のアニーリングによって形成される、上記による組成物である。
【００４７】
更により一層好ましい実施形態及びその好ましい実施形態のより好ましい実施形態では、ＢＯ−１１２組成物は、１％〜１０％（重量／上記組成物の総容積）の濃度のグルコース又はマンニトールを更に添加することによって形成される、上記による組成物である。
【００４８】
上記のより好ましい実施形態では、上記ポリイノシン−ポリシチジン酸（ポリ（Ｉ：Ｃ））は、
（ｉ）分子の２０％〜８２％が４００塩基未満を有し、１５％〜４０％が４００塩基〜８５０塩基を有し、３％〜５０％が８５０塩基〜５０００塩基を有し、分子の１％未満が５０００塩基超を有するポリシチジン酸（ポリ（Ｃ））調剤と、
（ｉｉ）分子の８０％〜９９％が４００塩基未満を有し、分子の１％〜２０％が４００塩基〜８５０塩基を有し、分子の０％〜５％が８５０塩基〜５０００塩基を有し、分子の１％未満が５０００塩基超を有するポリイノシン酸（ポリ（Ｉ））調剤と、
のアニーリングによって形成される。
【００４９】
より好ましくは、ポリイノシン−ポリシチジン酸（ポリ（Ｉ：Ｃ））は、
（ｉ）分子の３３％〜７３％が４００塩基未満を有し、分子の２０％〜３７％が４００塩基〜８５０塩基を有し、分子の５％〜４８％が８５０塩基〜５０００塩基を有し、分子の１％未満が５０００塩基超を有するポリシチジン酸（ポリ（Ｃ））調剤と、
（ｉｉ）分子の８１％〜９８％が４００塩基未満を有し、分子の６％〜１７％が４００塩基〜８５０塩基を有し、分子の０％〜３％が８５０塩基〜５０００塩基を有し、分子の１％未満が５０００塩基超を有するポリイノシン酸（ポリ（Ｉ））調剤と、
のアニーリングによって形成される。
【００５０】
上記の更に一層好ましい実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ組成物及びＢＯ−１１２組成物は、上記ポリ（Ｉ：Ｃ）に含まれる分子の７％〜５７％が４００塩基未満を有し、分子の２０％〜４５％が４００塩基〜８５０塩基を有し、分子の２０％〜７０％が８５０塩基〜５０００塩基を有し、分子の０％〜９％が５０００塩基超を有する粒度分布を有するポリ（Ｉ：Ｃ）分子を含む。ＢＯ−１１Ｘ組成物及びＢＯ−１１２組成物が、上記ポリ（Ｉ：Ｃ）に含まれる分子の１０％〜３０％が４００塩基未満を有し、分子の２０％〜３０％が４００塩基〜８５０塩基を有し、分子の４０％〜６０％が８５０塩基〜５０００塩基を有し、分子の０％〜５％が５０００塩基超を有する粒度分布を有するポリ（Ｉ：Ｃ）分子を含むことがより好ましい。ＢＯ−１１Ｘ組成物及びＢＯ−１１２組成物が、上記ポリ（Ｉ：Ｃ）に含まれる分子の１１％〜２８％が４００塩基未満を有し、分子の２３％〜２７％が４００塩基〜８５０塩基を有し、分子の４２％〜５５％が８５０塩基〜５０００塩基を有し、分子の０％〜３％が５０００塩基超を有する粒度分布を有するポリ（Ｉ：Ｃ）分子を含むことが更に一層好ましい。
【００５１】
ＢＯ−１１２組成物は、上記の実施形態のいずれかによる水性組成物の凍結乾燥によって得られ得る組成物でもある。これらの凍結乾燥ＢＯ−１１２組成物は、その後適切な溶液を用いて再構成し、上に規定される特徴の１つ以上を示す製剤、特に、粒子を含む組成物であって、
（ｉ）上記粒子の各々は、少なくとも１つの二本鎖ポリリボヌクレオチド、又はその塩若しくはその溶媒和物と、少なくとも１つのポリアルキレンイミン、又はその塩及び／又はその溶媒和物との複合体を含み、
（ｉｉ）上記粒子の少なくとも９５％又は少なくとも９０％は、９００ｎｍ以下、好ましくは５００ｎｍ以下（例えば、１４０ｎｍ〜４００ｎｍ又は１４０ｎｍ〜２５０ｎｍ）の直径を有し、
（ｉｉｉ）上記粒子は、特にＩＳＯ２２４１２：２０１７によって測定される３００ｎｍ以下、好ましくは２００ｎｍ以下、より好ましくは１５０ｎｍ以下のｚ平均径を有する、
組成物を得ることができる。
【００５２】
さらに、本発明は、被験体に由来する細胞又は組織を本明細書で規定されるＢＯ−１１ｘ組成物、好ましくはＢＯ−１１２組成物によりｅｘ  ｖｉｖｏで処理することによって得られ得る製剤にも関する。上記製剤は、本明細書に開示される組成物によりｅｘ  ｖｉｖｏで処理された、被験体に由来する細胞又は組織を含むことが好ましい。上記細胞又は組織が、血液試料、リンパ液試料又は組織生検材料等の被験体に由来する試料中の細胞又は組織であることがより好ましい。
【００５３】
本発明は、ポリ（Ｉ：Ｃ）分子の水溶液（グルコース又はマンニトール等の賦形剤を既に含有するか、それを含有しない）を生成するための手段も提供し、ＢＯ−１１Ｘ製剤を生産するため、ポリアルキレンイミン（ポリエチレンイミン等）の水溶液との混合に適切な特徴を有する。これら２つの水溶液を混合することによりもたらされるポリ（Ｉ：Ｃ）含有製剤を、その後バッチ調剤として維持し（好ましくは、なおも水溶液として、又は凍結乾燥形態で）、又は各々が単回使用バイアル、シリンジ、若しくは保存用、かかるアリコートの単回使用用、及び／又は凍結乾燥用の他の適切な容器に含まれるアリコートに直接調製してもよい。ＢＯ−１１Ｘ製剤（液体又は凍結乾燥の形態）を室温、８℃〜２℃に含まれる温度、又は０℃未満若しくは−２０℃未満の温度で保存してもよい。
【００５４】
かかる好ましい実施形態では、更なる化合物（１以上の抗体、ホルモン、ペプチド、賦形剤、担体、酵素活性の阻害剤、化学療法剤、抗生物質、安定剤、標識剤、有機溶媒、防腐剤、担体、又は他の薬物等）を（粒子の正確な形成又はＢＯ−１１Ｘ製剤について上に列挙される任意の他の特徴を変更しない場合）それらの混合の前、又はＢＯ−１１Ｘ製剤が２つの水溶液（二本鎖ポリリボヌクレオチドとポリアルキレンイミンと）の混合によって産生された後のいずれかに、２つの各水溶液に添加してもよい。結果的にＢＯ−１１Ｘ成分と同時に投与されるかかる追加の成分は、バイオアベイラビリティー、効能、薬物動態学的／薬力学的なプロファイル、安定性、代謝、又は当初のＢＯ−１１Ｘ製剤若しくは追加の成分（例えば薬学的関心のある別の化合物）の各々を単独で投与する、又は当初のＢＯ−１１Ｘ製剤若しくは追加の成分の各々を別々に投与する場合には観察されない、薬学的関心のある他の特性の改善を組成物にもたらすことができる。
【００５５】
更なる好ましい実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤は、（例えば、任意に薬学的に許容可能な担体、賦形剤及び／又はアジュバントを含む注射用水性組成物として）製剤化され、外因性の病原体（細菌又はウイルス等）と関係する疾患を提示する、又はヒト若しくは動物の細胞の生育異常を特徴とする細胞増殖障害、例えば癌（すなわち、腫瘍原性の形質転換、転移、毒性化合物を伴う）、若しくは雌性哺乳動物の生殖器の細胞の生育異常を特徴とする婦人科障害によりに起因する変更を提示する健康状態にある臓器又は組織への二本鎖ポリリボヌクレオチドの送達のため投与される医薬組成物等の医薬として使用される。したがって、好ましい実施形態では、本発明は、ヒト又は動物に本発明の組成物を投与することを含む疾患の治療法に関する。更なる好ましい実施形態では、本発明は、本発明の組成物をヒト又は動物に投与することを含む、本明細書に定義される、ヒト又は動物の細胞の生育異常を特徴とする細胞増殖障害の治療方法に関する。
【００５６】
ＢＯ−１１Ｘ製剤は、（直接的又は間接的に）腫瘍細胞の死を誘導する、又は腫瘍細胞の生育を抑制する、治療の領域において、癌の生育、生存、転移、上皮間葉転換、免疫学的回避又は再発を軽減、改善、又は阻止する方法に使用されることが好ましい。ＢＯ−１１Ｘ製剤は、癌腫、神経膠腫、黒色腫又は肉腫等の固形腫瘍を治療する方法で使用されることがより好ましい。特に、ＢＯ−１１Ｘ製剤は、全身、又は腫瘤の縁、周辺の上皮細胞、リンパ管若しくは血管（例えば、腫瘍内又は腫瘍周囲への注射）、又は雌性哺乳動物の生殖器の異常に生育している細胞等において腫瘍内に直接に又は腫瘍に近い場所のいずれかに投与される。本発明の更なる好ましい実施形態は、医薬として使用される、上記に規定されるＢＯ−１１２組成物に関する。本発明の更なる好ましい実施形態は、上記に規定される使用のためのＢＯ−１１２組成物であって、上記医薬が薬学的に許容可能な担体、賦形剤及び／又はアジュバントを任意に含む注射用水性組成物である、ＢＯ−１１２組成物に関する。
【００５７】
本発明の別の実施形態は、ヒト又は動物の細胞の生育異常を特徴とする細胞増殖障害の治療に使用される、上記に規定されるＢＯ−１１２組成物に関する。好ましい実施形態は、上記細胞増殖障害が癌又は雌性哺乳動物の生殖器の細胞の生育異常を特徴とする婦人科障害である、上記による使用のためのＢＯ−１１２組成物に関する。上述の実施形態のより好ましい実施形態は、組成物が腫瘍内又は腫瘍周囲への注射に使用されるものである、上記による使用のためのＢＯ−１１２組成物に関する。代替的には、上述の実施形態及びその好ましい実施形態のより好ましい実施形態は、組成物が皮膚又は内臓若しくは内部組織のレベルでの注射に使用されるものである、上記による使用のためのＢＯ−１１２組成物に関する。
【００５８】
本発明の別の実施形態は、ワクチンとして使用される、上記に規定されるＢＯ−１１Ｘ組成物、好ましくはＢＯ−１１２組成物に関する。同様に、本発明は、上記ワクチンを用いた被験体（患者）における疾患の治療方法にも関する。上記ＢＯ−１１Ｘ又はＢＯ−１１２組成物がヒト又は動物の細胞の生育異常を特徴とする細胞増殖障害の治療、より好ましくは癌の治療におけるワクチンとして使用されるものであることが好ましい。代替的には、上記ＢＯ−１１Ｘ又はＢＯ−１１２組成物は、感染症関連ワクチンとして使用されるものである。
【００５９】
いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤は、製造方法に従って産生され、その後、ＢＯ−１１２製剤として実施例に記載されるように構造的及び機能的に規定される。ＢＯ−１１Ｘ製剤は、特許文献１６に記載される、ＢＯ−１１０について特性評価された、生物学的活性、すなわち、改善された程度にかかわらず、癌細胞における又は好ましくはヒト起源の癌細胞に由来する細胞株におけるオートファジーの誘導と併せて、ファミリーヘリカーゼＭＤＡ−５の活性化又はＮＯＸＡ発現レベルを更に示す場合がある。特許文献１６に記載されるＢＯ−１１０の特性及び作用機構を特性評価するプロセスとは無関係に、ＢＯ−１１Ｘ製剤を検証するための細胞株の例は、ヒトのＳＫ−Ｍｅｌ−１９細胞、ＳＫ−Ｍｅｌ−２８細胞、ＳＫ−Ｍｅｌ−１０３細胞及びＳＫ−Ｍｅｌ−１４７細胞、並びにマウスＢ１６細胞であり、上記黒色腫細胞株は、ＢＯ−１１Ｘ製剤に曝されるとインターフェロンベータ等の分子の発現増加を提示する。さらに、ＢＯ−１１Ｘ製剤は、免疫系の細胞と同様に、通常癌治療において二次的な毒性部位を提示する、メラノサイト又は他の皮膚細胞等の対照として使用される正常な細胞に対して、癌細胞株において腫瘍細胞死を促進する用量では毒性を提示しない。また、ＢＯ−１１Ｘ製剤は、癌細胞のオートファジー及びアポトーシス（又はこの製剤がかかる細胞において誘導し得る治療的関心のある任意の他の効果）に続いて、特に、ＢＯ−１１Ｘ製剤が、同じ適応症に対する別の薬物又は他の治療の同時又は連続する投与を伴って又はそれを伴わずに、（例えば、腫瘤の縁、周辺の上皮細胞、リンパ管若しくは血管に、又は直接腫瘤内にＢＯ−１１Ｘを投与する腫瘍周囲又は腫瘍内への注射によって）癌細胞又は腫瘍に局所的に投与される場合に、腫瘍特異的な免疫学的応答の誘導因子として作用し得る癌細胞抗原の放出を誘導する。
【００６０】
ＢＯ−１１Ｘ製剤は、腫瘤から離れた又は独立した位置での投与（例えば、筋肉内若しくは皮下注射による、又は患者から得られ、その後再注入される細胞へのｅｘ  ｖｉｖｏ投与による）の後に、癌細胞以外の細胞（血液循環中の又は癌の近くに位置する免疫細胞又は他の細胞を含む）の標的化に対しても治療的関心のある効果をもたらすことができる。かかる効果は、腫瘍周囲又は腫瘍内への注射が可能でない場合（白血病又は他の血液癌等の非固形腫瘍における場合等）でも、腫瘍特異的エフェクターの放出の誘導、又は癌細胞若しくは腫瘍内への細胞の移動による可能性がある。
【００６１】
また、本発明は、本明細書に開示される組成物を製造するプロセスであって、
（ｉ）少なくとも１つの二本鎖ポリリボヌクレオチド又はその塩若しくはその溶媒和物の水溶液、及び少なくとも１つのポリアルキレンイミン又はその塩又はその溶媒和物の水溶液を作製することと、
ここで、いずれか又は両方の溶液が任意に薬学的に許容可能な担体、有機溶媒、賦形剤及び／又はアジュバントを更に含み、
（ｉｉ）各溶液を５００ｎｍ以下の細孔径を有するフィルタを通して別々に濾過し、滅菌溶液を作製することと、
（ｉｉｉ）混合チャンバーにおいて上記溶液の一方をもう一方の溶液に１ｍＬ／分以上の速度で、任意に注入によって添加することによって、又は１ｍＬ／分以上の速度で任意に注入によって混合チャンバーへ上記溶液の各々を同時に添加することによって、得られた滅菌溶液を混合チャンバーで混合し、水性組成物を形成することと、また、任意に、
（ｉｖ）６００ｎｍ以下の細孔径を有するフィルタを通して得られた水性組成物を濾過し、濾液を形成する、又は得られた水性組成物を２２４８０ｍ／ｓ２以上で遠心分離して上清を形成することと、また、任意に、
（ｖ）得られた水性組成物、濾液又は上清を凍結乾燥することと、
を含む、プロセスに関する。
【００６２】
したがって、好ましい一実施形態では、本発明は、本明細書に開示される組成物を製造するプロセスであって、
（ｉ）少なくとも１つの二本鎖ポリリボヌクレオチド又はその塩若しくはその溶媒和物の水溶液、及び少なくとも１つのポリアルキレンイミン又はその塩又はその溶媒和物の水溶液を作製することと、
ここで、いずれか又は両方の溶液が任意に薬学的に許容可能な担体、有機溶媒、賦形剤及び／又はアジュバントを更に含み、
（ｉｉ）各溶液を５００ｎｍ以下の細孔径を有するフィルタを通して別々に濾過し、滅菌溶液を作製することと、
（ｉｉｉ）混合チャンバーにおいて上記溶液の一方をもう一方の溶液に１ｍＬ／分以上の速度で、任意に注入によって添加することによって、又は１ｍＬ／分以上の速度で任意に注入によって混合チャンバーへ上記溶液の各々を同時に添加することによって、得られた滅菌溶液を混合チャンバーで混合し、水性組成物を形成することと、
（ｉｖ）任意に得られた水性組成物を凍結乾燥することと、
を含む、プロセスに関し得る。
【００６３】
また、別の好ましい一実施形態では、本発明は、本明細書に開示される組成物を製造するプロセスであって、
（ｉ）少なくとも１つの二本鎖ポリリボヌクレオチド又はその塩若しくはその溶媒和物の水溶液、及び少なくとも１つのポリアルキレンイミン又はその塩又はその溶媒和物の水溶液を作製することと、
ここで、いずれか又は両方の溶液が任意に薬学的に許容可能な担体、有機溶媒、賦形剤及び／又はアジュバントを更に含み、
（ｉｉ）各溶液を５００ｎｍ以下の細孔径を有するフィルタを通して別々に濾過し、滅菌溶液を作製することと、
（ｉｉｉ）混合チャンバーにおいて上記溶液の一方をもう一方の溶液に１ｍＬ／分以上の速度で、任意に注入によって添加することによって、又は１ｍＬ／分以上の速度で任意に注入によって混合チャンバーへ上記溶液の各々を同時に添加することによって、得られた滅菌溶液を混合チャンバーで混合し、水性組成物を形成することと、
（ｉｖ）６００ｎｍ以下の細孔径を有するフィルタを通して得られた水性組成物を濾過し、濾液を形成する、又は得られた水性組成物を２２４８０ｍ／ｓ２以上で遠心分離して上清を形成することと、
（ｖ）任意に得られた濾液又は上清を凍結乾燥することと、
を含む、プロセスに関し得る。
【００６４】
本発明のプロセスは、凍結乾燥の最終工程を含まないことがより好ましい。本発明のプロセス（又は方法）において、上記二本鎖ポリリボヌクレオチド、上記ポリアルキレンイミン、及び上記薬学的に許容可能な担体、有機溶媒、賦形剤及び／又はアジュバントは、本明細に開示される通りである。５００ｎｍ以下の細孔径を有するフィルタに上記溶液を別々に通して濾過することにより、好ましくは３００ｎｍ以下の細孔径を有するフィルタに上記溶液を別々に通して濾過することにより、より好ましくは２００ｎｍ以下の細孔径を有するフィルタに上記溶液を通して濾過することにより、各溶液の滅菌を行って滅菌溶液を形成する。得られた濾液の混合を、大規模な渦の対流輸送、その後の純粋な拡散輸送による濃度差の排除により行う。混合チャンバーは、上記溶液の混合を開始する、フラスコ、リアクタ又はミキサー等の任意のチャンバー又は容器であってもよく、混合が限られた空間内で制御して行われる任意の適切な形状（円柱状、球状、又はチャンバー内での正確な混合を可能とする他の形状等）を有する。上記混合チャンバーが０．１ｍＬ〜２０ｍＬ（又は特にＧＭＰ条件下で連続的なより高収率の生成物を可能とする、２５ｍＬ、５０ｍＬ、１００ｍＬ又はそれ以上等の更に大きな容積）、更に好ましくは０．２ｍＬ〜１０ｍＬ、より一層好ましくは０．５ｍＬ〜８ｍＬの固定容積を有することがより好ましい。混合は、添加により、任意には１ｍＬ／分〜２０００ｍＬ／分、より一層好ましくは１０ｍＬ／分〜１０００ｍＬ／分、更に好ましくは２０ｍＬ／分〜５００ｍＬ／分の速度の注入によって行われることがより好ましい。濾液を形成する又は収集するための得られた水溶液の最適な濾過は、その後、６００ｎｍ以下、好ましくは５００ｎｍを超えない、より好ましくは４００ｎｍを超えない、更により好ましくは３００ｎｍを超えない細孔径を有するフィルタを通して行われてもよい。代替的には、その後、上清を形成する又は収集するために得られた水性組成物の任意の遠心分離が、２２４８０ｍ／ｓ２超（半径０．０８２ｍを有するローターで５０００ｒｐｍ）、好ましくは２７２０２ｍ／ｓ２超（半径０．０８２ｍを有するローターで５５００ｒｐｍ）、より好ましくは３２３７２ｍ／ｓ２超（半径０．０８２ｍを有するローターで６０００ｒｐｍ）、更により好ましくは４４０６２ｍ／ｓ２（半径０．０８２ｍを有するローターで７０００ｒｐｍ）で行われてもよい。特に好ましい一実施形態は、本発明の組成物が本発明のプロセスの（ｉ）〜（ｉｉｉ）の工程によって達成されない場合、すなわち、上記水性組成物に含まれる粒子の９５％未満が６００ｎｍ以下の直径を有するような速度で添加が行われる場合、及び／又は上記粒子が２００ｎｍ超のｚ平均粒径を有する場合、より好ましくは上記粒子が単峰性の径分布を有しない場合、工程（ｉｖ）は必須である。これは、添加が１ｍＬ／分〜２０ｍＬ／分の速度で、特に０．５ｍＬ〜２０ｍＬの混合（反応）チャンバーにおいて行われる場合にあたり得る。最後に、得られた水性組成物、濾液、又は上清を凍結乾燥に供して、微粒子固体として本発明の組成物を得てもよい。
【００６５】
したがって、本発明のプロセスのより一層特に好ましい一実施形態では、上記プロセスは、
（ｉ）少なくとも１つの二本鎖ポリリボヌクレオチド又はその塩若しくはその溶媒和物の水溶液、及び少なくとも１つのポリアルキレンイミン又はその塩又はその溶媒和物の水溶液を作製することと、
ここで、いずれか又は両方の溶液が任意に薬学的に許容可能な担体、有機溶媒、賦形剤及び／又はアジュバントを更に含み、
（ｉｉ）各溶液を２００ｎｍ以下の細孔径を有するフィルタを通して別々に濾過し、滅菌溶液を作製することと、
（ｉｉｉ）混合チャンバーにおいて上記溶液の一方をもう一方の溶液に２０ｍＬ／分〜１００ｍＬ／分の速度で、任意に注入によって添加することによって、又は２０ｍＬ／分〜１００ｍＬ／分の速度で任意に注入によって混合チャンバーへ上記溶液の各々を同時に添加することによって、得られた滅菌溶液を混合チャンバーで混合し、水性組成物を形成することと、
ここで、上記混合チャンバーが０．２ｍＬ〜１０ｍＬの容積を有し、
（ｉｖ）得られた水性組成物を５００ｎｍ以下の細孔径を有するフィルタを通して濾過して濾液を形成する、又は得られた水性組成物を３２３７２ｍ／ｓ２以上（半径０．０８２ｍを有するローター上６０００ｒｐｍ）で遠心分離して上清を形成することと、
（ｖ）任意に得られた濾液又は上清を凍結乾燥することと、
を含む。
【００６６】
本発明のプロセスの別の更により一層特に好ましい実施形態では、上記プロセスは、
（ｉ）少なくとも１つの二本鎖ポリリボヌクレオチド又はその塩若しくはその溶媒和物の水溶液、及び少なくとも１つのポリアルキレンイミン又はその塩又はその溶媒和物の水溶液を作製することと、
ここで、いずれか又は両方の溶液が任意に薬学的に許容可能な担体、有機溶媒、賦形剤及び／又はアジュバントを更み、
（ｉｉ）各溶液を２００ｎｍ以下の細孔径を有するフィルタを通して別々に濾過し、滅菌溶液を作製することと、
（ｉｉｉ）混合チャンバーにおいて上記溶液の一方をもう一方の溶液に３０ｍＬ／分〜１００ｍＬ／分の速度で、任意に注入によって添加することによって、又は３０ｍＬ／分〜１００ｍＬ／分の速度で任意に注入によって混合チャンバーへ上記溶液の各々を同時に添加することによって、得られた滅菌溶液を混合チャンバーで混合し、水性組成物を形成することと、
ここで、上記混合チャンバーが０．５ｍＬ〜８ｍＬの容積を有し、
（ｉｖ）任意に得られた水性組成物を凍結乾燥することと、
を含む。
【００６７】
更なる実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤は、得られた粒子が、本質的に透明なコロイド溶液としての外観と共に、特に直径及び単峰性の径分布に関して、上に規定される特徴を提示するように、二本鎖ポリリボヌクレオチド（又はその塩若しくはその溶媒和物）を含む第１の水溶液と、ポリアルキレンイミン（又はその塩若しくはその溶媒和物）を含む第２の水溶液との２つの水溶液を混合することを含む製造プロセスに従ってもたらされる。
【００６８】
更なる任意の工程では、付加的な化合物（免疫関連アジュバント若しくは治療用化合物、例えばＣＤ４０Ｌ、ＩＬ１２、ウイルス抗原若しくは腫瘍抗原、又は抗癌薬である）を、上に規定される組成物を製造するプロセスにおいて工程（ｉ）中に、又は工程（ｉ）〜（ｖ）若しくは工程（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれかの後に添加することができる。得られた組成物（上記のような特徴の組み合わせを提示する場合にＢＯ−１１Ｘｍ、より具体的にはＢＯ−１１２ｍと名付けることができる）は、ＢＯ−１１Ｘ組成物、具体的にはＢＯ−１１２組成物の使用について本明細書に開示される実施形態のいずれかに従って使用することができる。
【００６９】
実施例に更に詳細に記載されるように、ＢＯ−１１Ｘ製剤を、二本鎖ポリリボヌクレオチドと水溶性ポリカチオン性ホモ若しくはヘテロポリマーによって形成される粒子を含む医薬組成物を濾過及び／又は遠心分離により、目視可能な凝集塊のないバルク用途又は単回使用の液体組成物としてＢＯ−１１Ｘ製剤を提供することができる。上記組成物を製造するかかるプロセスは、
（ｉ）少なくとも１つの二本鎖ポリリボヌクレオチド又はその塩若しくはその溶媒和物の水溶液、及び少なくとも１つのポリアルキレンイミン又はその塩若しくは溶媒和物の水溶液を、任意にいずれかの溶液に存在する、薬学的に許容可能な担体、有機溶媒、賦形剤及び／又はアジュバントと共に、作製することと、
（ｉｉ）上記溶液を混合することと、
（ｉｉｉ）得られた混合物を、６００ｎｍ以下の細孔径を有するフィルタに通して濾過する、又は２２４８０ｍ／ｓ２超で遠心分離することと、
を含む。
【００７０】
特に上記組成物が使用の直前に製造されることを必要とする場合、又は医薬組成物においてより一般的な、長期保存用及び／又は各々が単回使用用の複数の容器（例えば滅菌バイアル又はシリンジ）の形態で製造され、最も均一なサイズ、ポリ（Ｉ：Ｃ）含有量、安定性、溶解度及び最後に、投与された場合に生物学的作用を有する粒子を含んでいる場合、組成物の使用、保存、輸送、包装、及び／又は投与の所望の方法と同様に、組成物の実際の成分（二本鎖ポリリボヌクレオチド、ポリアルキレンイミン、及び任意の更なる成分）に対して、このプロセスを更に適合させてもよい。
【００７１】
上記混合工程（ｉｉ）及び濾過工程（ｉｉｉ）は、濾過及び／又は混合の順番、混合の方法、混合速度、及び／又は混合される溶液の量のレベルで適合され得る。更に好ましい実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤の製造方法は、
（ｉ）少なくとも１つの二本鎖ポリリボヌクレオチド又はその塩若しくはその溶媒和物の水溶液、及び少なくとも１つのポリアルキレンイミン又はその塩若しくはその溶媒和物の水溶液を、任意にいずれかの溶液に存在する、薬学的に許容可能な担体、有機溶媒、賦形剤及び／又はアジュバントと共に、作製することと、
（ｉｉ）各溶液を別々に濾過することによって滅菌することと、
（ｉｉｉ）該組成物の保存、凍結乾燥、及び／又は使用のため、容器内の上記溶液を、流速１ｍＬ／分〜５０ｍＬ／分で５０ｒｐｍ超の注入速度にて、最初にいずれかの溶液を添加し、その後他の溶液を添加することによって混合することと、
（ｉｖ）容器を密閉することと、
を含む。
【００７２】
更なる任意の工程では、別の化合物（免疫関連アジュバント若しくは治療用化合物、例えばＣＤ４０Ｌ、ＩＬ１２、ウイルス抗原若しくは腫瘍抗原であるか、又はアジュバント若しくは治療用化合物、例えば抗癌薬である）を、上に規定される組成物を製造するプロセスにおいて工程（ｉ）中に、又は工程（ｉ）〜（ｖ）若しくは工程（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれかの後に添加することができる。得られた組成物（上記の特徴（ｉ）〜（ｖｉ）の組み合わせを提示する場合にＢＯ−１１Ｘｍ、より具体的にはＢＯ−１１２ｍと名付けることができる）は、ＢＯ−１１Ｘ組成物、具体的にはＢＯ−１１２組成物の使用について本明細書に開示される実施形態のいずれかに従って使用することができる。
【００７３】
本発明の水性組成物をどのように投与すべきか（例えば、皮下又は腫瘍内注射による）に応じて、上記に規定されるＢＯ−１１Ｘ組成物又はＢＯ−１１２は、単回使用又は複数回投与に最も適切な容器及び／又は量で提供することができる。
【００７４】
組み合わせ
本発明による組成物は、相加的又は更には相乗的効果を提供しない場合、適合性であることが知られている他の化合物又は治療を含む組み合わせで使用することができる。さらに、ＢＯ−１１Ｘｍ（具体的にはＢＯ−１１２ｍ）と名付けられる組成物を上記のように作製し、ＢＯ−１１２組成物等のＢＯ−１１Ｘ組成物と別の化合物との組み合わせが、ＢＯ−１１Ｘ組成物と他の化合物とを単に使用前に混合する組み合わせと比較して、治療効果又は他の薬学的に適切な効果の改善（全般的に、又は特定の適応症若しくは投与経路に関して、より低用量での安定性又は効力を含む）をもたらす、新たな生成物を得ることができる。
【００７５】
例えば、ポリ（Ｉ：Ｃ）分子は、種々の抗癌薬、抗体、放射線療法若しくは化学療法と組み合わせて（Le U et al., 2008；Le U et al., 2009；Taura M et al., 2010；Matijevic T et al., 2011；Levitzki A, 2012;Yoshino H and Kashiwakura I, 2013；非特許文献１）、又は種々の長さのポリ（Ｉ：Ｃ）分子（Zhou Y et al., 2013）と組み合わせて使用することができる。また、癌抗原又は細胞溶解物によるワクチン接種（Ammi R et al., 2015）、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路を遮断する薬剤（Nagato T and Celis E, 2014）、ＴＬＲ９アゴニストＣｐＧ  ＯＤＮ等の他のＴＬＲアゴニスト（Zhang Y et al., 2014）、ジクロロ酢酸（Ohashi T et al., 2013）、ＩＬ２７（Chiba Y et al., 2013）、ソラフェニブ等のキナーゼ阻害剤（Ho V et al.,2015）、ＮＳ１等のアポトーシス促進性タンパク質（Gupta S et al. 2016）、ゾレドロン酸（非特許文献７）、又は全トランス型レチノイン酸（Szabo A et al., 2012）等の他の薬剤と合わせた場合において、ポリ（Ｉ：Ｃ）分子は、アジュバント又は相乗的に作用する薬剤として使用されてきた。ＢＯ−１１Ｘ製剤の他の使用は、前脂肪細胞に対して、分化及び脂肪細胞における分化を阻害する（Yu L et al., 2016）、間葉系幹細胞に対して免疫抑制性の効果を増強する（Cho K. et al., 2016；Vega-Letter A et al., 2016）、又はＮＫ細胞の活性化（Perrot I et al., 2010）等の、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを少なくとも使用して、最近実証された特定細胞型に対するポリ（Ｉ：Ｃ）分子の活性を考慮して明らかになる場合がある。
【００７６】
いくつかの態様では、本発明は有効量のＢＯ−１１Ｘ製剤と、有効量の１以上の免疫調節剤、特に免疫チェックポイント分子（ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ１３４、ＣＤ１３４Ｌ、ＣＤ１３７、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７ＲＰ１、ＬＡＧ３、ＩＣＯＳ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＣＤ２８、ＡＰ２Ｍ１、ＳＨＰ−２、ＰＰＰ２Ｒ５Ａ、又はＯＸ−４０等）を標的とする薬剤とを含む医薬組成物に関し、上記化合物はチェックポイント阻害剤（ＣＰＩ）として一般に命名される。代替的には、ＩＤＯ、ＴＧＦ−β、ＳＴＡＴ３又はＣＳＦＲ１のような薬物標的の阻害剤等の免疫調節剤は、制御性Ｔ細胞の免疫抑制効果を遮断する。
【００７７】
したがって、本発明は、ＢＯ−１１Ｘ製剤（又はＢＯ−１１Ｘｍ製剤）及び別の治療剤又は治療（放射線療法、化学療法、凍結療法、腫瘍アブレーション又は光線力学療法を含む）の適用を含む併用療法及び投薬計画に有用な組成物及び方法を提供する。特に、本発明は、ＢＯ−１１Ｘ製剤と１以上の抗癌薬、好ましくは免疫調節剤とを投与することを含む、被験体における癌の生育、転移、潰瘍形成、免疫回避又は再発を治療する、改善する、又は予防する方法に関し、ここで、上記投与は同時（別々の製剤として、又は合剤の状況で）又は順次（任意の順、又は連続する投与サイクルで）ある。いくつかの態様では、本発明は癌を治療する方法であって、有効量のＢＯ−１１Ｘ製剤と、有効量の１以上の免疫調節剤とを、それを必要とする被検体に投与することを含み、特に、上記被験体が１以上の免疫調節剤による癌療法を受けている、方法に関する。
【００７８】
いくつかの実施形態では、免疫調節剤は、モノクローナル抗体及び他の抗体フォーマットを含む抗体、又は免疫応答を制御する細胞表面タンパク質に結合してＣＰＩとして作用する任意の他の薬学的に利用可能な薬剤であることが好ましく、このＣＰＩは、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１若しくはＰＤ−Ｌ２、及び／又はＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１若しくはＰＤ−Ｌ２との結合を遮断する、減少する、及び／又は阻害することができる。代替的には、このＣＰＩは、ＣＴＬＡ−４、ＡＰ２Ｍ１、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＳＨＰ−２及び／又はＰＰＰ２Ｒ５Ａ等の他の免疫チェックポイント分子の活性を遮断する、減少する及び／又は減少を阻害する、及び／又は阻害することができる。更なる選択肢として、ＣＰＩは、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）及び／又は１以上の４−１ＢＢリガンド及びＴＲＡＦ２とＣＤ１３７（４−１ＢＢ）との結合を増加及び／又は賦活する。
【００７９】
いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤（又はＢＯ−１１Ｘｍ製剤）の投与を含む癌の治療に対する併用療法及び投薬計画を含む方法は、ＢＯ−１１Ｘ製剤を免疫調節薬剤、好ましくはＣＰＩ等の他の治療用化合物の１つとは異なる経路によって投与する具体的な投与方法に関して更に定義され得る。この方法は、腫瘍内又は腫瘍周囲への注射（腫瘍内、腫瘤の縁、周辺の上皮細胞中、リンパ管又は血管）により、又は癌細胞若しくは癌細胞を含む臓器内への直接の若しくはそれに隣接した（例えば、間接的ではなく、例えば血流による）ＢＯ−１１Ｘ製剤の投与、及びＣＰＩ若しくは他の免疫賦活剤の全身投与を可能とする他の手段によってＢＯ−１１Ｘ製剤を投与することを含んでもよい。ＢＯ−１１Ｘ製剤の腫瘍内又は腫瘍周囲への注射は、皮膚のレベルで、すなわち、皮膚に対して（例えば、黒色腫の治療のため、又はワクチンとの組み合わせと関連して）、又は内臓若しくは組織のレベルで、すなわち該内臓若しくは組織内に対して（例えば、肝臓癌を治療するための肝臓内への注射、又は膀胱癌に対する小胞内への投与によって）行われてもよい。ＢＯ−１１Ｘ製剤のかかる局所投与は、好ましくは免疫賦活剤の投与の後に行われるか、又は（好ましくは）その後に免疫賦活剤の投与が続く。
【００８０】
ＢＯ−１１Ｘ製剤（又はＢＯ−１１Ｘｍ製剤）は、細胞療法と組み合わせて投与することもでき、ここでＢＯ−１１Ｘは、細胞療法と共に患者に直接同時投与されるか、又は患者から（血液から、又は腫瘤内の、腫瘤の縁の、周辺の上皮細胞、リンパ管若しくは血管内の細胞を含む生検材料から）得られる細胞の処理に使用される。これらの細胞は、特定の細胞型についての正又は負の選択を行って又は行わずに、適切な実験室状況でＢＯ−１１Ｘ製剤に曝し、この処理の後にマーカーを提示し、タンパク質を分泌し、及び／又は抗原を露出させる、更なる癌治療に有用な細胞を生成することができる。かかる自己細胞は、この場合も更なる負又は正の選択を行って又は行わずに、患者に投与することができる。治療の後期に、ＢＯ−１１Ｘ製剤を任意の適切な手段によって（腫瘍内注射、又は好ましくは筋肉内若しくは皮下注射によって）患者に更に投与することができる。患者に由来する細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ処理は、１時間超、好ましくは３時間超、より好ましくは８時間超、更に一層好ましくは２４時間超、又はそれ以上の期間に亘って、１回の筋肉内又は皮下注射よりも低い濃度（好ましくはかかる用量の５０％、より好ましくは２５％、更に一層好ましくは１０％、更に好ましくは５％、又はより一層好ましくは１％）で行うことができる。
【００８１】
相加効果及び使用
更なる実施形態では、本発明は、病原体又は望ましくない生物学的因子に対する免疫応答を増加させるため、特に、免疫調節剤としてそれ自体が作用する可能性がある抗腫瘍免疫応答を増強するためのＢＯ−１１Ｘ製剤（又はＢＯ−１１Ｘｍ製剤）の投与を含む薬学的使用及び方法を提供する。かかる効果を、関連する細胞型及び亜集団（例えば樹状細胞、制御性Ｔ細胞、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞）、及び／又は免疫学的バイオマーカー（例えば、ケモカイン、成長因子、サイトカイン、及びそれらの受容体）のレベルで腫瘍部位及び腫瘍微小環境への（又は、血流、他の体液、及び組織において）腫瘍関連免疫応答を測定することによりモニタリングすることができる。
【００８２】
特に、ＢＯ−１１Ｘ製剤（又はＢＯ−１１Ｘｍ製剤）を腫瘍内注射によって臨床的に投与する場合、アポトーシス及び／又はネクローシスが腫瘍内で観察され、これにより常在樹状細胞への腫瘍抗原の提示が促進される可能性がある。また、シグナル伝達カスケードが腫瘤への免疫細胞、特にＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の動員をもたらし、腫瘍に対する免疫効果を促進し、ＢＯ−１１Ｘの細胞毒性効果に寄与し得る。
【００８３】
別の実施形態は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞又は組織におけるインターフェロン産生を誘導する方法であって、細胞又は組織と組成物とを接触させる工程を含み、該細胞又は組織がヒト又は動物の細胞の生育異常を特徴とする細胞増殖障害を示し、上記組成物がＢＯ−１１Ｘ、より好ましくはＢＯ−１１２である、方法に関する。したがって、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで被験体に由来する細胞におけるインターフェロン産生を誘導する方法であって、
（ｉ）被験体から細胞を得ることと、
（ｉｉ）上記細胞とＢＯ−１１Ｘ、好ましくはＢＯ−１１２の組成物とを接触させることと、
を含む、方法に関する。
【００８４】
医薬組成物
ＢＯ−１１Ｘ製剤と１つ以上のその薬学的に許容可能なアジュバント、希釈剤、担体又は賦形剤とを混合することによってＢＯ−１１２の医薬組成物（及び／又はＢＯ−１１Ｘｍ又はＢＯ−１１２ｍ製剤等の他のＢＯ−１１Ｘ製剤）を作製する方法も提供する。かかる成分は、特定の医学的適応症（例えば、固形癌又は血液癌）、及び／又は例えば注射（腫瘍周囲、腫瘍内、肝臓内、膵臓内、筋肉内又は皮下注射）による、吸入による、局所的な若しくは経口的な投与手段に対して適合させることができる。
【００８５】
ＢＯ−１１Ｘ製剤に基づく併用治療は、ＢＯ−１１Ｘ製剤及び他の化合物に対して同一又は異なった投与経路を含んでもよい。特に、ＢＯ−１１Ｘ製剤を、他の免疫賦活性ＲＮＡ剤に対するように、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路阻害剤のようなＣＰＩとして作用する治療的抗体（Bald T et al., 2014）、又は活性化Ｔ細胞（Amos SM et al., 2011）の全身投与に先立って免疫系を活性化し得る腫瘍内又は腫瘍周囲への注射によって投与することができる。代替的にはＢＯ−１１Ｘ製剤を、抗癌ワクチン接種の効果を増強するためのＣｐＧ分子若しくはレシキモド（Sajadian A et al., 2014）又は樹状細胞（Fujimura T et al., 2006）等のＴＬＲアゴニスト又はリガンドである他の治療用化合物と共に投与することができる（together with）。
【００８６】
免疫調節剤
ＢＯ−１１Ｘ製剤（ＢＯ−１１Ｘｍ製剤を含む）を１以上の免疫調節剤と組み合わせてもよい。いくつかの実施形態では、免疫調節剤は、共刺激分子又は共阻害分子（例えば、非限定的に、Ｔ細胞及びＮＫ細胞等の１以上の免疫細胞）である。いくつかの実施形態では、免疫調節剤は、例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ１３７、ＣＤ９６、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ４７、ＣＤ６９、ＣＤ２６、ＴＩＭ３及びＬＡＧ３に関してアゴニスト又はアンタゴニストとして作用することによってＣＤ４及び／又はＣＤ８のＴ細胞を調節する薬剤である。他の実施形態では、免疫調節剤は、例えば、ＣＤ３、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４４及びＮＫｐ３０に関してアゴニスト又はアンタゴニストとして作用することによってＮＫ細胞を調節する薬剤である。他の実施形態では、免疫調節剤は、例えば、ＣＤ４５、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＰＴＥＮ及びＣＤ３１、又はそれらの組み合わせに関してアゴニスト又はアンタゴニストとして作用することによって腫瘍間質バイオマーカー及び腫瘍内皮バイオマーカーを調節する薬剤である。組み合わせた薬剤が種々の免疫細胞集団を発現する細胞を標的とするよう、免疫調節剤の組み合わせを種々の免疫集団の標的化に使用することができる。
【００８７】
免疫調節剤は、有機化合物又は無機化合物、核酸、アプタマー、ペプチド、タンパク質の形態の更なる化合物、より詳しくは体液中又は細胞表面上の関連する標的と結合する抗体として提供される。抗体は、ポリクローナル又はモノクローナル；インタクト又はトランケート（例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ）；二重特異性又は多重特異性；それらの異種形態、同種形態、同系形態、又は改変形態（例えば、キメラ抗体又はヒト化抗体）であってもよい。免疫調節剤がモノクローナル抗体である場合、非ヒト哺乳動物由来モノクローナル抗体、組換えキメラモノクローナル抗体、組換えヒト化モノクローナル抗体、又はヒトモノクローナル抗体であってもよい。
【００８８】
免疫調節剤として作用する抗体は、Ｆｃ受容体と相互作用して免疫応答を活性化し、免疫細胞又は他の細胞の枯渇及び／又は細胞死をもたらす、１以上の抗原を結合可能であって（例えば、二重特異性又は多重特異性の抗体）、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、又はＩｇＭ）のＦｃ領域を提示可能な、ジスルフィド結合によって相互接続した４本のポリペプチド鎖、すなわち２本の重鎖（Ｈ）及び２本の軽鎖（Ｌ）等の必要な生物学的活性を発揮するのに通常必要とされる構造上の要素を更に含んでもよい。重鎖は各々、重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域で構成される。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３の３つのドメインで構成される。軽鎖は各々、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬで構成される。ＶＨ領域及びＶＬ領域を、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存されている領域が間に入る相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域に更に細分することができる。各可変領域（ＶＨ又はＶＬ）は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３で示される３つのＣＤＲを含む。また、各可変領域は、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４で示される４つのフレームワークサブ領域を含む。抗体の用語は、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭ、及びそれらの各サブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、及びＩｇＧ−４；ＩｇＡ−１及びＩｇＡ−２を含む全種類の抗体を含む。またいくつかの実施形態では、抗体は、抗体フラグメント及び抗原結合フラグメントを指す。
【００８９】
本明細書に記載される方法を実施するのに適した抗体は、様々な抗体フォーマット、例えば、モノクローナル、ポリクローナル、二重特異性、多重特異性であってもよく、限定されないが、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリ及び／又は上のいずれかの結合フラグメントによって産生されたフラグメントを含むヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体を挙げることができる。また、抗体は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、本明細書に記載される少なくとも２つの標的に対する、少なくとも２つの抗原又は標的結合部位を含む分子を指す。本明細書に記載される免疫グロブリン分子は、任意の種類（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又は免疫グロブリン分子のサブクラスであってもよい。さらに、本明細書に記載される本発明を実施するのに適した抗体（例えば、単一特異性、二重特異性、及び／又は多重特異性）は、文献に開示される代替的なフォーマットのいずれか、例えば、Ｄｉａｂｏｄｙ；Ｆｌｅｘｉｂｏｄｙ；ラクダ抗体、Ｉｍｍｕｎｏｂｏｄｙ；Ｔｒｉｏｍａｂ、Ｐｅｐｂｏｄｙ、Ｖａｃｃｉｂｏｄｙ、ｍｉｎｉｂｏｄｙ、Ｆｃａｂ、ＵｎｉＢｏｄｙ、又はＤｕｏＢｏｄｙ（Storz U, 2011）で提供されてもよい。
【００９０】
ＰＤ−１（ＣＤ２７９又はプログラム細胞死タンパク質１としても知られる）は、受容体Ｂ７ファミリーのメンバーである。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１はヒトＰＤ−１配列（例えば、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００５００９を参照されたい）及び任意の天然起源の対立遺伝子、スプライス変異体、及びそれらのプロセシング形態（Keir M et al., 2008；ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｑ１５１１６）を指す。ＰＤ−１は、Ｂ７ファミリーのメンバーでもある、ＰＤ−Ｌ１（ＣＤ２７４又はＢ７−Ｈ１としても知られる）及びＰＤ−Ｌ２（ＣＤ２７３又はＢ７−ＤＣとしても知られる）を結合する。実施形態では、ＰＤ−Ｌ１は、任意の天然起源の対立遺伝子、スプライス変異体、及びそれらのプロセシング形態と共に、ヒトＰＤ−Ｌ１（例えばＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦ２３３５１６を参照されたい）を指し、ＰＤ−Ｌ２はヒトＰＤ−Ｌ２（例えばＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿０２５２３９）を指す。
【００９１】
いくつかの実施形態では、免疫調節剤はＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、及びＰＤ−Ｌ２の１以上を標的とする。特に、免疫調節剤はＰＤ−１阻害剤である。いくつかの実施形態では、免疫調節剤はＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、及びＰＤ−Ｌ２の１以上に対して特異的な抗体である。かかる免疫調節剤は、非限定的には、ニボルマブ、（ＯＮＯ−４５３８／ＢＭＳ−９３６５５８、ＭＤＸ１１０６、ＯＰＤＩＶＯ）、ペンブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ）、ピディリズマブ（ＣＴ−０１１）、ＭＫ−３４７５、ＢＭＳ  ９３６５５９、ＭＰＤＬ３２８０Ａ及び近年再検討されている他のもの（Tan S et al. 2016）等の抗体である。
【００９２】
いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤（又はＢＯ−１１Ｘｍ製剤）は、例えば進行した固形腫瘍の治療に対して、ＢＭＳ−９３６５５９及びＭＥＤＩ４７３６の１つ以上と併用される。いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤は、黒色腫の治療に対して、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（任意にベムラフェニブと）及びＭＥＤＩ４７３６（任意にダブラフェニブ及びトラメチニブの１つ以上と）の１以上と併用される。いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤は、ＮＳＣＬＣの治療に対して、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（任意にエルロチニブと）及びＭＥＤＩ４７３６（任意にトレメリムマブと）の１以上と併用される。いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤は、ＲＣＣの治療に対して、ＭＰＤＬ３２８０Ａと（任意にベバシズマブ及びスニチニブの１以上と）併用される。いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤は、固形又は血液の悪性疾患の治療に対してＭＰＤＬ３２８０Ａと併用される。いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤は、固形腫瘍の治療に対してＭＰＤＬ３２８０Ａ（任意にベバシズマブ、化学療法及びコビメチニブの１以上と）；ＭＥＤＩ４７３６（任意にトレメリムマブと）及びＭＳＢ００１０７１８Ｃの１以上と併用される。いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤は、進行した癌の治療に対して、ＡＭＰ−２２４と併用される。いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤は、進行した固形腫瘍の治療に対して、ニボルマブと（任意に腸腰（iliolumbar）（抗ＫＩＲ）と）併用される。いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤は、去勢抵抗性前立腺癌、黒色腫、ＮＳＣＬＣ及びＲＣＣの治療に対して、ニボルマブと併用される。いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤は、結腸癌の治療に対して、ペンブロリズマブと併用される。いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤は、胃癌、頭頸部癌、ＴＮＢＣ及び尿路上皮癌の治療に対して、ペンブロリズマブと併用される。いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤は、胃癌、膵癌、小細胞肺癌及びＴＮＢＣの治療に対して、ニボルマブと（任意にイピリムマブと）併用される。いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤は、膠芽腫の治療に対して、ニボルマブと（任意にイピリムマブと）併用される。いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤は、肝細胞癌（hepatocellular cancer）の治療に対して、ニボルマブと併用される。いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤は、ホジキンリンパ腫、骨髄腫、骨髄異形成症候群及び非ホジキンリンパ腫の治療に対して、ペンブロリズマブと併用される。いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤は、悪性神経膠腫の治療に対して、ピディリズマブと併用される。いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤は、黒色腫の治療に対して、ニボルマブ（任意に、イピリムマブ、並びに複数のクラス１ペプチド及びモンタニド（montanide）ＩＳＡ  ５１  ＶＧの１以上；並びに任意にイピリムマブと連続して）及びペンブロリズマブの１以上と併用される。いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤は、黒色腫及びＮＳＣＬＣの治療に対して、ペンブロリズマブと併用される。いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤は、ＮＳＣＬＣの治療に対して、ニボルマブ（任意にゲムシタビン／シ���プラチン、ペメトレキセド／シスプラチン、カルボプラチン／パクリタキセル、ベバシズマブ、エルロチニブ及びイピリムマブの１以上と）及びペンブロリズマブの１以上と併用される。いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤は膵癌の治療に対してピディリズマブと（任意にゲムシタビンと）併用される。いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤は、前立腺癌の治療に対して、ピディリズマブと（任意にシプリューセル−Ｔ（sipleucel-T）及びシクロホスファミドの１以上と）併用される。いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤は、ＲＣＣの治療に対して、ニボルマブ（任意にスニチニブ、パゾパニブ及びイピリムマブの１以上と）、ペンブロリズマブ（任意にパゾパニブと）及びピディリズマブ（任意に樹状細胞／ＲＣＣ融合細胞ワクチンと）の１以上と併用される。いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤は、固形腫瘍の治療に対して、抗ＬＡＧ３（ＢＭＳ−９８６０１６、任意にニボルマブと）、ニボルマブ（任意にインターロイキン−２１と）及びＡＭＰ−５５４の１以上と併用される。いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤は、固形腫瘍の治療に対してペンブロリズマブと併用される。
【００９３】
いくつかの実施形態では、免疫調節剤は、ＣＤ１３７又はＣＤ１３７Ｌの１以上を標的とする。いくつかの実施形態では、免疫調節剤は、ＣＤ１３７又はＣＤ１３７Ｌの１以上に特異的な抗体である。例えば、いくつかの実施形態では、免疫調節剤は、非限定的には、ウレルマブ（urelumab）（ＢＭＳ−６６３５１３及び抗４−１ＢＢ抗体としても知られる）等の抗体である。いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤を、固形腫瘍、及び／又はＢ細胞非ホジキンリンパ腫、及び／又は頭頸部癌、及び／又は多発性骨髄腫の治療に対して、ウレルマブと（任意にニボルマブ、リリルマブ（lirilumab）及びウレルマブの１以上と）併用する。いくつかの実施形態では、免疫調節剤は、非限定的には、イピリムマブ（ＭＤＸ−０１０、ＭＤＸ−１０１、ヤーボイ（Yervoy）、ＢＭＳ）及び／又はトレメリムマブ（Pfizer）等の抗体である。いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤を、黒色腫、前立腺癌及び肺癌の１以上の治療に対してイピリムマブと（任意にバビツキシマブと）併用する。
【００９４】
いくつかの実施形態では、免疫調節剤はＣＤ２０を標的とする。いくつかの実施形態では、免疫調節剤はＣＤ２０特異的抗体である。例えば、いくつかの実施形態では、免疫調節剤は、非限定的な例として、オファツムマブ、オビヌツズマブ（GAZYVA）、ＡＭＥ−１３３ｖ、オクレリズマブ、ＴＲＵ−０１５、及びベルツズマブ等の抗体である。
【００９５】
ＢＯ−１１Ｘ製剤の検証
ＢＯ−１１Ｘ製剤（本発明による、ＢＯ−１１Ｘｍ製剤を含み、また実施例においてＢＯ−１１２により例示される）の治療的効力の前臨床での検証を細胞系アッセイにおいて、また最も興味深いことには、ＢＯ−１１Ｘ製剤を単独で又は候補の若しくは承認された抗癌薬と組み合わせて使用し、治療効果を効果的に達成する最も適切な条件を確立するために種々の実験基準を試験し、比較することができる、動物モデルにおいて行うことができる。これらの基準は、効力、安全性及び／又は臨床用途の観点から、ＢＯ−１１Ｘ製剤の（ＢＯ−１１Ｘｍ製剤として単独の、又は候補若しくは承認された抗癌薬と相乗的な）治療的使用に対してどれがより良好な条件かを識別する範囲でいずれかの化合物の用量、投与経路、投与の順番及び／又は頻度を含む。動物モデル及び／又はｅｘ  ｖｉｖｏモデルを使用する場合、ＢＯ−１１Ｘ製剤は、以下の基準：癌細胞の細胞毒性、ＰＡＲＰ活性化、免疫原性細胞死、治療的効力（特に、直接の又はアブスコパル効果により間接的な癌細胞のアポトーシス及び／又はネクローシスによる）、免疫細胞集団上のマーカーの発現の増加、免疫細胞集団の増加、及び実施例に示す他のアッセイの１つ以上を用いて検証することができる。
【００９６】
種々の投薬量のＢＯ−１１Ｘ製剤（又はＢＯ−１１Ｘｍ製剤）の効果、投与の数及び／又は部位（特に、１以上の部位に注射することによる）、各化合物、投与経路、頻度、及び／又は投与の時間点を、関連するエンドポイント及び単独で又は他の薬物と組み合わせた試験化合物に曝される細胞又は（好ましくは）動物から得られた生体試料において測定される、生理学的パラメーターに関連づけることができる。かかるパラメーターの非限定的な一覧は、腫瘍サイズの退縮、腫瘍成長及び／又は腫瘍細胞の増殖の阻止、アポトーシス、腫瘍血管新生又は転移の減少、一般的な抗癌薬に対する耐性の克服（或いは、治療集団におけるかかる薬物に対する応答の改善）、正常な組織及び機能に対する腫瘍に関連する有害事象の減少、免疫応答及び／又は特定の活性及び特徴を有する免疫細胞の調節、その増加（又は減少）が一般的に癌治療効果、特に動物モデル、場合によっては癌患者の生存と関連していると文献において知られている、生体材料中のバイオマーカー若しくは特定の細胞集団の同定（例えば、癌細胞の調製物、腫瘍生検材料、又は体液に存在する）を含む。可能な場合は常に、かかるエンドポイントは、特定の投与経路及び／又は医薬製剤を使用して、各試験化合物の投与、又は所与の用量及び／又は投薬計画における化合物の組み合わせ試験の後に、中間及び最終の時点で測定される。
【００９７】
ＢＯ−１１Ｘ製剤（又はＢＯ−１１Ｘｍ製剤）の治療的な抗癌効力を、単独で、又は標準治療である従来の治療（放射線療法、化学療法、細胞キナーゼ阻害剤、エピジェネティック効果を有する薬物等）若しくは新規の機構及び／又は新規の候補抗癌薬を含む治療と組み合わせて試験することができる。実際に、ＢＯ−１１Ｘ製剤と組み合わせて試験され得る新規な抗癌化合物のカテゴリーは、除かれる散在性腫瘍細胞を標的とする全身の抗腫瘍免疫の提供によって、腫瘍微小環境内で抗腫瘍免疫応答を改善するものである。このアプローチは、動物モデル及び患者において成功することが証明されており、放射線療法又は化学療法等の従来の治療法の成果を改善することができる（例えば、Galluzzi L et al., 2014；Vacchelli E et al., 2013；Van der Jeught K et al., 2015を参照されたい）。
【００９８】
この成長している新たな制癌薬のパネルは、癌細胞が免疫による検出及び人体による破壊から逃れる機構を標的とする。他の癌療法（例えば腫瘍細胞特異性）と比較した場合、癌特異的免疫療法は、一連の利点を提供する場合がある。実際に、癌免疫療法の一連の分子標的の同定は、腫瘍の可塑性、不均質性、耐性又は微小環境に関して、腫瘍に対する免疫応答に適切な共同刺激（又は共抑制）効果を提供することができる機構及び化合物を明らかにすることにおいて大きな進歩をもたらしている。
【００９９】
各々が異なる分子標的及び／又は機構に作用する癌の受動的な又は積極的な免疫療法の非限定的な一覧は、腫瘍を標的とする又は他の免疫調節性のモノクローナル抗体、腫瘍崩壊ウイルス、免疫賦活サイトカイン、養子細胞移入及び他の細胞療法、ＤＮＡ又はペプチドに基づくワクチン、免疫抑制性代謝の阻害剤、又はパターン認識受容体のアゴニストを含む。これらの機構のうち、抗体又は他の化合物がアゴニスト活性又はアンタゴニスト活性（免疫応答又は免疫応答からの癌の回避におけるそれらの役割に応じて）のいずれかを有する分子標的として、腫瘍発生に対するチェックポイントである、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ１３７、ＣＤ３８、ＯＸ−４０、ＣＤ２６、ＴＩＭ３及びＬＡＧ３等の一連の細胞膜タンパク質が挙げられ、それらに対する種々のアゴニスト抗体又はアンタゴニスト抗体は、商業的に入手可能であるか、又は、それらの特異性及び／又はヒト抗原若しくは（動物モデルを扱う場合は）対応する齧歯類抗原に対する抗癌効果のレベルを特性評価するための科学的リポジトリ（repository）において入手可能である。
【０１００】
これらの共刺激分子又は共阻害分子を標的とする薬剤（例えば抗ＰＤ−１又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体に基づく治療法）に対する印象的な患者の反応にもかかわらず、免疫チェックポイント阻害剤に対する臨床的な反応は、多くの（too many）癌患者において所望の治療効果を達成するには、まだ不完全であるか、又は非効率的である。抗ＰＤ−１抗体、抗ＣＴＬＡ４、又は抗ＣＤ１３７抗体等の化合物との適切な組み合わせにおけるＢＯ−１１Ｘ製剤は、それら２つの抗癌剤の１つの単独投与の効果と比較した場合、おそらくは予測され得る付加的効果を超えて、腫瘍の生育及び転移の減少を増強する（又はかかる減少を提示する被験体の数を増加する）可能性がある。
【０１０１】
好ましくはヒト起源の初代癌細胞又は樹立された癌細胞株を含む単離された又は混合された細胞培養物に基づくいくつかの細胞系モデルの１つにおいて、ＢＯ−１１Ｘ製剤（又はＢＯ−１１Ｘｍ製剤）の治療効果を評価することができる。ＢＯ−１１Ｘ製剤を検証するための癌細胞株の例は、黒色腫（ヒトのＳＫ−Ｍｅｌ−１９細胞、ＳＫ−Ｍｅｌ−１０３細胞及びＵＡＣＣ６２細胞；マウスＢ１６細胞）、癌腫（マウスＨｅｐａ１−６細胞；ラットＦＡＯ細胞）、乳癌（ヒトのＢＴ４８３細胞、ＨＣＣ１１４３細胞、ＨＣＣ１９３７細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４１５細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞及びＢＴ５４９細胞）、膵癌（ヒトのＭｉａＰａＣａ２細胞、ＩＭＩＭ−ＰＣ２細胞、Ｐａｎｃ１細胞、Ｐａｎｃ０２０３細胞、Ｐａｎｃ３．２７細胞又はＢｘＰｃ３細胞）、又はＡＴＣＣ、他の公的若しくは学術的なリポジトリ、又は商業的な提供者を通して入手可能な他の関連する細胞株のように癌の種類に従って定義することができる。ＢＯ−１１Ｘ製剤の抗癌効果は、増殖、死、バイオマーカーの発現のレベルで、及び／又は様々な生理学的な条件下において確認されるＢＯ−１１Ｘ製剤の関連する可能性のある効果を示すシグナル伝達分子（ケモカイン又はインターフェロンベータ等）の放出の阻止を有するのに必要な期間、頻度、及び／又は用量を含む複数の測定基準で評価され得る。
【０１０２】
したがって、ＢＯ−１１Ｘ製剤（又はＢＯ−１１Ｘｍ製剤）の効果を、ＢＯ−１１２等の例示的な製剤の投与による抗腫瘍反応が単独療法及び併用治療（例えば、抗ＰＤ−１抗体等のＣＰＩと共に）の両方について、投与後、より短期間又はより長期間の間、異なるプロトコルで判断される腫瘍動物モデルにおいて評価することができる。その研究は、注入された細胞の増殖に起因する腫瘍の発生の所与の時間において、すなわち癌細胞の注入後の特定の日数の後、若しくは（好ましくは）所望の腫瘍サイズ（例えば、８０ｍｍ３〜１００ｍｍ３の平均サイズ）を提示する動物において、又は腫瘍の消滅の後に（腫瘍再発に対する各薬物又は薬物の組み合わせの任意の効果の評価のため）、ＢＯ−１１２及び／又は抗ＰＤ−１抗体を投与することによって追及されてもよい。また、その研究は、文献において、特定の腫瘍に対して及び／又は所与の動物モデルにおいて薬物の有効性に対する基準として指定される、化学療法薬又は他の抗癌薬等の陰性対照（例えばビヒクル単独）、又は陽性対照のいずれかである対照化合物を含む場合がある。また、動物モデル及び動物細胞におけるこれらの活性の確認は、獣医学に使用されるＢＯ−１１Ｘ製剤の開発をもたらし得る。
【０１０３】
動物モデルは、典型的には、癌が、（不死化細胞株又は患者によって得られる癌生検材料に由来する）ヒト癌細胞移植及び生着、又は動物におけるマウス腫瘍細胞の誘導（又は移入）のいずれかの結果として生じるマウスモデルである。細胞は、異なる種類の腫瘍（例えば、肺癌、黒色腫、又はリンパ腫）を起源としてもよく、研究の間、腫瘍の検出、並びに腫瘍サイズ及び／又は組成の分析のため、それぞれのマウスの脇腹に皮下注射されてもよい。その後、マウスを、結果の統計学的分析を可能とする各サイズの群（例えば、各対照群又は治療群に対して３匹、５匹、１０匹、１２匹、１５匹、２０匹以上の動物）へと無作為化することによって処理する。
【０１０４】
ＢＯ−１１２等のＢＯ−１１Ｘ製剤、及び抗ＰＤ−１抗体等のチェックポイント阻害剤によってもたらされる可能性のある改善が、癌の動物モデルにおいて改善を誘導し（特に、量、順番又は他の投与基準に関して適切に組み合わされる場合）、ＢＯ−１１２及び／又は抗ＰＤ−１抗体による治療の終了後の治療後の動物の生存及び／又は腫瘍消失、腫瘍再発の減少、毒性及び／又は抵抗の効果の限定若しくは遅延、並びに腫瘍接種の再チャレンジに対する反応の改善を増大し得る。
【０１０５】
ＢＯ−１１２製剤及び抗ＰＤ−１抗体として上に構造的及び機能的に識別される例示的なＢＯ−１１Ｘ製剤を（単独で又は組み合わせて、単回又は複数回の用量で）、腫瘍細胞に関して異なる場所に、及び／又は異なる量で投与することができる。典型的には、ＢＯ−１１２及びマウスＰＤ−１に対して特異的なモノクローナル抗体（例えば、BioLegend製のクローンＲＭＰ１−１４、又は他の提供元から入手可能な同様のもの）を皮下、血管内、腹腔内、腫瘍周囲、又は腫瘍内に（モデル及び腫瘍分子及び病理学的特徴に応じて）、動物の重量に関して決定された濃度（例えば、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜２．５ｍｇ／ｋｇ）、注射容量中の濃度（例えば、０．０１ｍＬ〜０．５ｍＬ）、及び／又は各投薬中の含有量（例えば、１用量当たり０．０１μｇ〜２５０μｇ）で注射する。特に、固定された抗ＰＤ−１抗体用量と併用される種々の濃度のＢＯ−１１２の用量反応（又はその逆）は、他の化合物との併用による、投与されるいずれかの化合物の量の著しい減少の後の任意の有利な効果（例えば、影響されない、又は更に改善された効能及び／又は安全性のプロファイル；異なる、治療していない場所の腫瘍におけるアブスコパル効果）の判定を可能とし得る。
【０１０６】
ＢＯ−１１２組成物（又はＢＯ−１１２ｍ組成物）を１サイクルで注射してもよく、又は固定の所望の日数（１日、２日、３日、５日、７日以上）によって分けられる複数のサイクル（例えば、２回、３回又は４回以上）で注射してもよい。代替的にはＢＯ−１１２が抗ＰＤ−１の抗体と同時投与される場合、ＢＯ−１１２を、ここでも、１又は複数の（所与の日数によって分けられた）サイクルで、抗体（又は単一の注射用調剤において）の直前（又は直後）に投与してもよい。更に代替的には、２つの薬剤は、任意の連続する順番であるが、変更可能な期間（例えば、１時間、３時間、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、３６時間、２日以上）によって分かれて、製剤化又は投与されてもよい。特に、ＢＯ−１１２が抗ＰＤ−１抗体の後に投与される場合、後の投与（単独、又は抗ＰＤ−１抗体と更に組み合わせた）は、抗ＰＤ−１抗体が腫瘍細胞に対して有効ではない動物において抗腫瘍レスキュー効果を提供して、任意の特異的な腫瘍耐性又は回避機構を克服する可能性がある。治療期間の終わりに、腫瘍の完全な退縮があった全て動物に癌細胞の更なる皮下注射よる再チャレンジをして又はそれなしで腫瘍が再出現するか、及びどのように再出現するかをモニタリングするため、全ての生存する動物を、連続して１週間、２週間、３週間以上に亘って治療せずに放置してもよい。
【０１０７】
腫瘍及び／又は正常細胞の分子的特徴（ＮＫ細胞の総数及び／又は特定の亜集団、腫瘍浸潤リンパ球、脾細胞、放射性標識化前駆体の組み込み、及び骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）；腫瘍関連好中球（ＴＡＮ）、Ｍ２マクロファージ、及び腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）等の抗腫瘍局所性又は全身性免疫応答に関与し得る他の細胞を含む）を特定するため、ＢＯ−１１２組成物（又はＢＯ−１１２ｍ組成物）の単独、又は上に記載の抗ＰＤ−１抗体との併用の効果を、動物を屠殺せずに（例えば、腫瘍サイズの測定、まだ生存しているマウスの割合、体重又は行動基準によって）研究の間に報告される中間的な結果として、又は動物を屠殺した後（又はすでに死亡したマウスにおいて）に判断することができる。並行して、関連するバイオマーカーの存在／不在を、関連するＲＮＡのＰＣＲ増幅によって、又はサイトカイン若しくはケモカイン等の組織中若しくは血中に循環している細胞表面上のタンパク質レベルで標準的な免疫学的アッセイ及びキットを使用して特定することができる。
【０１０８】
この全体的な表現型分析を、フローサイトメトリーによって検出され、文献に記載される、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＦｏｘＰ３、ＣＤ８、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＰＴＥＮ、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ１３７、ＣＤ９６、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ４７、ＣＤ６９、ＣＤ２６、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、Ｇｒ１、ＣＤ１１ｂ、Ｌｙ６Ｃ、Ｌｙ６Ｇ、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＣＤ４５、及びＣＤ３１等の細胞表面マーカーを発現する細胞数の任意の統計学的及び／又は治療的に関連する変化を検出するため、腫瘍、血液、脾臓、リンパ節又は他の関連する組織及び場所から単離された細胞を使用して行うことができる。また、かかる細胞を腫瘍抗原特異的免疫応答、関連する転写因子、サイトカイン又はケモカイン（例えば、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＦＮ−ベータ、ＴＮＦアルファ、ＨＩＦ１ａ、ＨＩＦ２ａ、ｐ５３）の発現のレベルで、又は他の細胞系アッセイを使用して評価することができる。
【０１０９】
さらに、いずれかの免疫不全で完全に免疫応答性の動物モデルにおける臓器及び皮膚の肉眼検査及び顕微鏡による病理学的分析は、研究化合物の効能（単独で又は組み合わせて）、又は臓器の炎症及び壊死等のそれらの毒性に関して更に示すことができる。同様の研究で作成される定量的データを、どの治療（特に、抗腫瘍）効果がＢＯ−１１Ｘ製剤の単独又は別の抗癌剤との併用による投与によって提供されるかを評価する領域において、適切な統計学的検定の使用により、複合の試験に対する補正を伴って及び補正を伴わずに、種々の実験群間で比較することができる。
【０１１０】
治療法及び患者の選択
いくつかの実施形態では、本発明は、ＢＯ−１１Ｘ製剤（又はＢＯ−１１Ｘｍ製剤）と１以上の免疫調節剤とを投与することによる投与を含む、癌の生育、生存、転移、上皮間葉転換、免疫回避又は再発を治療、減少、改善、又は予防する方法に関する。癌は腫瘍学的疾患であってもよい。癌は、癌の転移によって生じ得る潜伏腫瘍であってもよい。また、潜伏腫瘍は、腫瘍の外科的摘出から取り残される場合もある。癌の再発は、例えば、腫瘍再成長、肺転移、又は肝転移であってもよい。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、癌は、基底細胞癌、胆道癌；膀胱癌；骨癌；脳及び中枢神経系の癌；乳癌；腹膜の癌；絨毛癌；結合組織癌；消化器系癌（食道、胃、結腸、直腸、又は他の消化器の癌を含む）；眼癌；頭頸部癌；膠芽腫；肝癌；肝細胞腫；上皮内腫瘍；腎臓癌、副腎癌又は腎癌；白血病；肝臓癌；肺癌（例えば小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌及び肺扁平上皮癌）；黒色腫；骨髄腫；神経芽細胞腫；口腔癌（唇、喉頭、舌、口及び咽頭）；膵癌；前立腺癌；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；呼吸器系の癌；唾液腺癌；皮膚癌；扁平上皮癌；精巣癌；甲状腺癌；子宮、子宮内膜、子宮頸部、外陰部、卵巣、又は他の婦人科の癌；尿路系の癌；Ｂ細胞リンパ腫、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ；低悪性度／濾胞状、小リンパ球性、中悪性度／濾胞状、中悪性度びまん性、高悪性度免疫芽球性、高悪性度リンパ芽球性、高悪性度小型非切れ込み核細胞性、又は巨大腫瘤病変ＮＨＬ等の特定の種類を含む）を含むリンパ腫、マントル細胞リンパ腫及びエイズ関連リンパ腫；慢性リンパ球性白血病；急性リンパ芽球性白血病；毛様細胞性白血病；慢性の骨髄芽球白血病；同様に他の癌腫及び肉腫；移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）、また同様に、母斑症又は浮腫と関連する（脳腫瘍と関連するもの等）血管増殖異常の１以上である。いくつかの実施形態では、癌は胆道癌である。いくつかの実施形態では、胆道癌は、膵癌、胆嚢癌、胆管癌及びファーター乳頭部の癌から選択される。いくつかの実施形態では、癌は肝臓癌である。いくつかの実施形態では、癌は結腸癌である。いくつかの実施形態では、胆道癌は胆管細胞癌及び／又は腺癌である。代替的には、癌は、欧州又は米国において規定される発生基準に従って規定され、International Rare Cancers Initiative（http://www.irci.info）又はRaraCare（http://www.rarecare.eu）等の組織のウェブサイトで利用可能な定期的に更新される一覧に示される希少疾患の一覧に挙げられるものであり得る。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤（又はＢＯ−１１Ｘｍ製剤）及び／又は免疫調節剤は、様々なステージ（例えば、ステージＩ、ステージＩＩ、ステージＩＩＩ、又はステージＩＶ）の癌を治療するために使用される。非限定的な例として、全体的なステージ分類を使用すれば、ステージＩの癌は身体の一部に局在され、ステージＩＩの癌は局所的に進行しており、ステージＩＩＩの癌も同様である。癌がステージＩＩ又はステージＩＩＩとして指定されるかどうかは、癌の具体的な種類に依存し得る。非限定的な一例では、ホジキン病のステージＩＩは、横隔膜の片方のみに冒されたリンパ節を示すのに対し、ステージＩＩＩは横隔膜の上及び下に冒されたリンパ節を示す。したがって、ステージＩＩ及びステージＩＩＩの具体的な基準は、診断により異なる。ステージＩＶの癌は、他の臓器又は全身に転移又は広がっていることが多い。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤（又はＢＯ−１１Ｘｍ製剤）及び／又は免疫調節剤は、患者が経験する可能性のある治療の副作用を軽減する。例えば、ＢＯ−１１Ｘ製剤と１以上の免疫調節剤の併用療法は、（例えば単剤療法と比較して）より低用量のＢＯ−１１Ｘ製剤及び／又は１以上の免疫抑制剤を可能とする場合があり、それによりいずれかの薬剤の治療濃度域を増加する。いくつかの実施形態では、用量の低下は、効能を失うことなく（又は最小限の喪失で）１以上の副作用を軽減する。いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤及び／又は免疫調節剤を使用して、難治性癌（treatment-refractory cancer）を有する被験体を治療する。いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤を使用して、１以上の免疫調節剤、特にＢＯ−１１Ｘ製剤と実際に併用されるものに対して不応性である被験体を治療する。
【０１１４】
いくつかの実施形態（実施例３も参照されたい）では、被験体は、例えば、ニボルマブ（ＯＮＯ−４５３８／ＢＭＳ−９３６５５８、ＭＤＸ１１０６、又はＯＰＤＩＶＯ）、ペンブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ）、ピディリズマブ（ＣＴ−０１１）、ＭＫ−３４７５、ＢＭＳ−９３６５５９、イブルチニブを含む、ＰＤ−１剤及び／又はＰＤ−Ｌ１剤及び／又はＰＤ−Ｌ２剤に対して不応性である、及び／又はＭＰＤＬ３２８０Ａ不応性患者である。例えば、いくつかの実施形態では、被験体は抗ＣＴＬＡ−４剤に不応性、例えば、イピリムマブ（ヤーボイ）不応性患者（例えば、黒色腫患者）である。いくつかの実施形態では、被験体はＢＯ−１１Ｘ製剤に対して不応性である。したがって、いくつかの実施形態では、本発明はＢＯ−１１Ｘ製剤又は１以上の免疫調節剤の単剤療法を含む様々な治療法に対して非反応性の患者を救済する癌治療の方法を提供する。
【０１１５】
特に、或る特定のタイプの癌を、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体又は抗ＣＴＬＡ４抗体等による免疫療法に対するそれらの感度に応じてＢＯ−１１Ｘ製剤（又はＢＯ−１１Ｘｍ製剤）による治療に選択することができる。これらの癌として、黒色腫、非小細胞肺癌、頭頸部癌、腎細胞癌、膀胱癌、肝細胞癌及びホジキンリンパ腫が挙げられる。代替的には、ＢＯ−１１Ｘ製剤（又はＢＯ−１１Ｘｍ製剤）は、免疫療法に対するいかなる感度も以前に実証されていない癌タイプ、例えば前立腺癌、乳癌、大腸癌、又は例えば高い変異負荷（又はマイクロサテライト不安定性）を有するこれらの癌のサブタイプ、例えば文献（Ayers M et al. 2017、Budczies J et al., 2016、Gong J et al. 2017、Shin DS et al., 2017、Zaretsky JM et al. 2016）中に報告されるように、インターフェロン、特にインターフェロンガンマに対する応答に影響を及ぼす、遺伝子配列及び／又は発現プロファイリングによって検出されるＪＡＫ、ＰＯＬＥ又は他の突然変異を提示するものの治療のために投与することができる。
【０１１６】
一般に、ＢＯ−１１Ｘ製剤は、ｍｉＲＮＡ（又はＲＮＡｉ  ｓｈＲＮＡ若しくはｓｉＲＮＡ等の特定の遺伝子の発現の阻害剤若しくは調節因子として作用する他のノンコーディングＲＮＡ分子；Ling H, 2016、Larsson M et al., 2017）、ｍＲＮＡ（すなわち、細胞内への場合にタンパク質をコードするＲＮＡ）、又は任意の他のＲＮＡ系薬物と組み合わせることもでき、この場合、ＢＯ−１１２製剤等のＢＯ−１１Ｘ製剤は、この併用又は同時投与方法によってＲＮＡの送達、活性及び／又は安定性（例えばＩＤＯ、ＴＧＦベータ又はＮＫＧ２ＤリガンドをサイレンシングするためのｍｉＲＮＡ）を改善することができる。ＢＯ−１１２製剤と相補的な作用機構との相乗的組み合わせは、免疫抑制及びＴ細胞枯渇（exhaustion）を低減するか、Ｔ細胞活性化を増強するか、又は腫瘍特異的Ｔ細胞の数を増加させるように設計される薬物を含む。これらの薬物は腫瘍細胞、Ｔ細胞、又は腫瘍微小環境中の他の細胞を標的とすることができ、免疫調節性ｍＡｂ（ＣＴＬＡ４、ＰＤ１又はＰＤＬ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＣＤ２５）、活性化サイトカイン（ＩＬ２、ＩＬ１２）、他の中和ｍＡｂ（ＴＧＦベータ、ＩＤＯ１、ＩＬ１０、ＮＫＧ２ｄリガンド）、ＣＡＲ−Ｔ細胞又は癌抗原ワクチン等の分子を含む。現在のデータによってもＴｒｅｇを標的とする薬剤、並びにＤＮＡの修復及び／又は複製に関与する（また、標的化する）薬物との組み合わせが支持される。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、「患者」及び「被験体」の用語は同じ意味で使用される。いくつかの実施形態では、被験体及び／又は動物は、哺乳動物、例えばヒト、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ネコ、ウマ、雌ウシ、ブタ、ウサギ、ヒツジ、又は非ヒト霊長動物（サル（例えばヒヒ）、又はチンパンジー等）である。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、本発明の方法はヒト被験体の治療に有用である。いくつかの実施形態では、ヒトは小児である。他の実施形態では、ヒトは成人である。他の実施形態では、ヒトは高齢者である。他の実施形態では、ヒトは患者又は被験者と呼ばれる場合がある。いくつかの実施形態では、ヒトは女性である。いくつかの実施形態では、ヒトは男性である。
【０１１９】
治療レジメン及び併用療法
一実施形態では、本発明は、以下の工程：
（ｉ）上記組成物又は上記製剤による少なくとも１回の治療に従う上記被験体（患者）への投与、続いて、
（ｉｉ）上記被験体（患者）の医学的状態の追跡（分析）、及び／又はその腫瘍、癌及び／又は免疫細胞内の遺伝子発現の追跡、それと共に又は続いて、
（ｉｉｉ）（ａ）腫瘍生検材料内の細胞浸潤物（例えば、ＣＤ８及び／又はＣＤ４陽性Ｔ細胞）、（ｂ）腫瘍生検材料における癌細胞のネクローシス及び／又はアポトーシス、又は（ｃ）血液中の循環免疫細胞の増加／減少の評価、
を含む、ヒト又は動物の細胞の生育異常を特徴とする細胞増殖障害の治療に使用される、本明細書で規定されるＢＯ−１１Ｘ組成物（又はＢＯ−１１Ｘｍ組成物）、好ましくはＢＯ−１１２組成物（又はＢＯ−１１２ｍ組成物）に関する。
【０１２０】
このアプローチは、ＢＯ−１１２等のＢＯ−１１Ｘ製剤の投与を評価するのに有用であり、例えば腫瘍量及び／又は応答を評価するための画像化に関して利用可能な技術に従って更に開発することができる（実施例３も参照されたい）。
【０１２１】
図１４及び図１５に要約されるもの等の他の実施形態では、本発明は、ヒト又は動物の細胞の生育異常を特徴とする細胞増殖障害の治療に使用される、
（ｉ）本明細書で規定されるＢＯ−１１Ｘ組成物（又はＢＯ−１１Ｘｍ組成物）、好ましくはＢＯ−１１２組成物（又はＢＯ−１１２ｍ組成物）、又は、
（ｉｉ）本明細書で規定される、被験体（患者）に由来する細胞若しくは組織をｅｘ  ｖｉｖｏでＢＯ−１１ｘ組成物（又はＢＯ−１１Ｘｍ組成物）、好ましくはＢＯ−１１２組成物（又はＢＯ−１１Ｘｍ組成物）により処理することによって得られ得る製剤、
であって、
、該組成物が上記被験体（患者）に、以下の工程：
（ｉ）該組成物又は該製剤による少なくとも１回の治療、続いて、
（ｉｉ）上記被験体（患者）の医学的状態の追跡（分析）、及び／又はその腫瘍、癌及び／又は免疫細胞内の遺伝子発現の追跡、及び／又は（ｉｉ，ａ）腫瘍生検材料内の細胞浸潤物（例えば、ＣＤ８及び／又はＣＤ４陽性Ｔ細胞）、（ｉｉ，ｂ）腫瘍生検材料における癌細胞のネクローシス及び／又はアポトーシス、若しくは（ｉｉ，ｃ）血液中の循環免疫細胞の増加／減少の評価、それと共に又は続いて、
（ｉｉｉ）該組成物及び／又は該製剤、及び／又は標準治療プロトコル、及び／又は被験体（患者）が抵抗性を示す、応答しない若しくは殆ど応答しない抗癌薬若しくは治療（既に承認された又は臨床研究プロトコル中の）による少なくとも１回の治療、
を含むプロセスに従って投与され、
工程（ｉ）及び工程（ｉｉｉ）における該組成物及び／又は該製剤による治療を、同じ又は異なる用量、投与手段（腫瘍内又は皮下／筋肉内）又はレジメンを用いて行うことができる、組成物又は製剤に関する。標準治療、臨床開発中の薬物、又は被験体（患者）が抵抗性を示す、応答しない若しくは殆ど応答しない他の治療は、放射線療法、化学療法、抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１療法（又は他の免疫チェックポイント阻害剤）、癌抗原系ワクチン接種、又は細胞療法（ＣＡＲ−Ｔ療法を含む）であることがより好ましい。遺伝子発現が特定の一連のタンパク質のｍＲＮＡ及び／又はタンパク質発現を含むことが好ましい。
【０１２２】
別の実施形態では、本発明は、ヒト又は動物細胞の生育異常を特徴とする細胞増殖障害の治療に使用されるＢＯ−１１Ｘ組成物（又はＢＯ−１１Ｘｍ組成物）、好ましくはＢＯ−１１２組成物であって、
（Ｉ）該組成物の少なくとも１回の（又は第１の）腫瘍内注射と、
（ＩＩ）該組成物の少なくとも１回の（又は第２の）皮下又は筋肉内注射と、
を含む投与レジームに従って被験体（患者）に投与され、上記少なくとも１回の腫瘍内注射が上記少なくとも１回の皮下又は筋肉内注射の前に行われる、組成物に関する。
【０１２３】
同様に、本発明は、ヒト又は動物の細胞の生育異常を特徴とする細胞増殖障害の被験体（患者）における治療方法であって、ＢＯ−１１Ｘ組成物（又はＢＯ−１１Ｘｍ組成物）、好ましくは、ＢＯ−１１２組成物（又はＢＯ−１１２ｍ組成物）は、
（Ｉ）上記組成物の少なくとも１回の（又は第１の）腫瘍内注射と、
（ＩＩ）上記組成物の少なくとも１回の（又は第２の）皮下又は筋肉内注射と、
を含む投与レジームに従って上記被験体に投与され、上記少なくとも１回の腫瘍内注射が上記少なくとも１回の皮下又は筋肉内注射の前に行われる、治療方法にも関する。
【０１２４】
代替的には、ヒト又は動物の細胞の生育異常を特徴とする細胞増殖障害の被験体（患者）におけるＢＯ−１１Ｘ組成物（又はＢＯ−１１Ｘｍ組成物）の投与レジメン又は対応する治療方法は、
（ｉ）第１の病変における少なくとも第１の腫瘍内注射と、
（ｉｉ）同じ病変における、又はもはや存在しない場合に１つ以上の付加的な病変における少なくとも第２の腫瘍内注射と、
を含み得る。
【０１２５】
上記用途のための組成物及び上記治療方法において、上記後続の腫瘍内注射は、上記少なくとも１回の腫瘍内注射の少なくとも２４時間後、更に一層好ましくは２回〜４回の腫瘍内注射を行ってから少なくとも４８時間後、より一層好ましくは４回の腫瘍内注射を行ってから少なくとも１週間後に行うことが好ましい。上記用途のための組成物及び上記治療方法において、上記少なくとも１回の腫瘍内注射の適用を等しい又は異なる時間間隔で繰り返すことが更に一層好ましい。
【０１２６】
これらの投与レジメン（又は対応する治療方法）は、
（ａ）ＢＯ−１１Ｘ組成物（又はＢＯ−１１Ｘｍ組成物）を、第２の治療剤の投与の前又は後に投与し、該第２の治療剤を同じ及び／又は他の病変（複数の場合もある）における腫瘍内若しくは腫瘍周囲への注射、皮下注射、又は筋肉内注射によって投与すること、
（ｂ）ＢＯ−１１Ｘ組成物（又はＢＯ−１１Ｘｍ組成物）を、被験体が上記第２の治療剤に抵抗性を示す、非感受性の、又は殆ど（又は全く）応答しないかを判定した後に投与すること、
（ｃ）また、ＢＯ−１１Ｘ組成物（又はＢＯ−１１Ｘｍ組成物）の投与を受けて、統計的に有意な循環免疫細胞の数の増加及び／又は表Ｉの遺伝子のいずれかの発現の変化が見られるかを判定した後に上記第２の治療剤を被験体に投与すること（実施例４を参照されたい）、
も含み得る。
【０１２７】
上の実施形態（ｂ）及び（ｃ）に関して、第２の治療剤が抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ１、抗ＰＤＬ１、ＣＡＲ−Ｔ細胞、癌抗原ワクチン、又は制御性Ｔ細胞を標的とする薬剤、代謝酵素、ＤＮＡの修復及び／又は複製、又は表Ｉの遺伝子のいずれかによって発現されるタンパク質から選択されることが好ましい。
【０１２８】
代替的には、ＢＯ−１１Ｘ組成物（又はＢＯ−１１Ｘｍ組成物）の投与レジメンは、かかる組成物による細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ処理を含み得る。この場合、ＢＯ−１１Ｘ組成物（又はＢＯ−１１Ｘｍ組成物）は、
（ｉ）被験体から細胞を得ることと、
（ｉｉ）上記細胞と上記組成物とをｅｘ  ｖｉｖｏで接触させることと、
（ｉｉｉ）かかる細胞を被験体に投与することと、
を含む投与レジメンに従って被験体に投与することにより医薬として使用されるものである。
【０１２９】
先の実施形態の全てに示されるヒト又は動物の細胞の生育異常を特徴とする細胞増殖障害の治療が癌の治療であることが好ましい。上記用途のための組成物及び上記治療方法において、上記少なくとも１回の（又は任意の第２の若しくは他の付加的な）腫瘍内、腫瘍周囲、皮下又は筋肉内注射が上記少なくとも１回の（又は第１の）腫瘍内注射の少なくとも２４時間後、更に一層好ましくは２回〜４回の腫瘍内注射を行ってから少なくとも４８時間後、より一層好ましくは４回の腫瘍内注射を行ってから少なくとも１週間後に行われるのがより好ましい。上記用途のための組成物及び上記治療方法において、上記少なくとも１回の腫瘍内注射の適用を等しい又は異なる時間間隔で繰り返すことがが更に一層好ましい。少なくとも１回の皮下注射の適用を等しい若しくは異なる時間間隔で繰り返し、及び／又は筋肉内注射を等しい若しくは異なる時間間隔で繰り返すことが好ましい。上記用途のための組成物及び上記治療方法において、少なくとも１回の皮下注射又は筋肉内注射において投与される組成物が少なくとも１回の腫瘍内注射と同じ量又はより少ない量のポリイノシン−ポリシチジン酸（ポリ（Ｉ：Ｃ））を含むことがより一層好ましい。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、本発明は、ＢＯ−１１Ｘ製剤（又はＢＯ−１１Ｘｍ製剤）及び第２の免疫調節剤（また任意に１以上の追加の治療剤）による特定の癌の治療レジメンに備える。例えば、いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤、例えばＢＯ−１１２を、第１に任意に低酸素症の軽減又は除去によって腫瘍血管新生を正常化するため患者に投与することができる。代替的にはｍＢＯ−１１Ｘ製剤、例えばＢＯ−１１２のかかる第１の投与は、Ｔリンパ球（例えば、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋のＴ細胞）及び／又はＮＫ細胞腫瘍を賦活及び／又は増加し、及び／又は免疫抑制細胞（例えば骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）；腫瘍関連好中球（ＴＡＮ）、Ｍ２マクロファージ及び腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ））の腫瘍への補充を阻害及び／又は減少し得る。いくつかの実施形態では、本発明の治療法は、Ｍ１マクロファージを支援するように、腫瘍部位におけるＭ２マクロファージに対するＭ１マクロファージの比率を変更し得る。ＢＯ−１１Ｘ製剤は、いくつかの実施形態では、長期間継続する（すなわち、一時的よりも大きな）血管の正常化を誘導し得る。例えば、ＢＯ−１１Ｘ製剤の血管正常化は、１日、又は２日、又は３日、又は４日、又は５日、又は６日、又は７日、又は１４日、又は２１日を超えて継続し得る。したがって、いくつかの実施形態では、この長期間継続するＢＯ−１１Ｘ製剤の血管正常化（又は概して、腫瘍に浸潤する又は血流を循環する免疫細胞の変化）は、１以上の免疫調節剤に対して反応性となる可能性がより高い持続性で寛容な腫瘍微小環境を可能とし得る。すなわち、いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤は、免疫調節剤療法を増強する、救済する、又は免疫調節剤療法に対する感受性を上げることができる。
【０１３１】
代替的には、ＢＯ−１１Ｘ製剤（又はＢＯ−１１Ｘｍ組成物、例えばＢＯ−１１２又はＢＯ−１１２ｍ）は１以上の免疫調節剤による治療の開始の前後に患者に投与される。例えば、いくつかの実施形態では、免疫調節剤は、１以上の共阻害分子を標的とし、免疫抑制を減少させるか、又は排除する。この好都合な状況では、すなわち抑制の除去により、ＢＯ−１１Ｘ製剤（又はＢＯ−１１Ｘｍ組成物、例えばＢＯ−１１２又はＢＯ−１１２ｍ）を、免疫系を賦活するために投与する。代替的には、免疫調節剤は、１以上の共刺激分子を最初に標的とし、次に、例えば相乗的にこの効果を支持するためにＢＯ−１１Ｘ製剤（又はＢＯ−１１Ｘｍ組成物、例えばＢＯ−１１２又はＢＯ−１１２ｍ）を投与する。
【０１３２】
さらに、本明細書に記載されるように、ＢＯ−１１Ｘ製剤及び／又は免疫調節剤を、例えば同時投与、治療レジメン又は合剤の状況で追加の治療剤と組み合わせてもよい。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤（又はＢＯ−１１Ｘｍ組成物）及び／又は免疫調節剤を、任意に追加的な治療剤と共に、連続して投与してもよい。本明細書で使用される「連続して（連続）」の用語は、追加の治療剤と、ＢＯ−１１Ｘ製剤及び／又は免疫調節剤とを、約６０分超の時間をあけて投与することを意味する。例えば、追加の治療剤と、ＢＯ−１１Ｘ製剤及び／又は免疫調節剤の連続投与との間の時間は、約６０分超、約２時間超、約５時間超、約１０時間超、約１日超、約２日超、約３日超、又は約１週超あけてもよい。最適な投与回数は、投与される追加の治療剤、並びにＢＯ−１１Ｘ製剤及び／又は免疫調節剤の代謝、排泄の速度及び／又は薬力学的活性に依存する場合がある。追加の治療剤又は本発明の薬剤のいずれかを最初に投与してもよい。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤（又はＢＯ−１１Ｘｍ組成物）及び／又は免疫調節剤を、任意に追加の治療剤と共に、同時に投与してもよい。本明細書で使用される「同時に（同時）」の用語は、追加の治療剤、並びにＢＯ−１１Ｘ製剤及び／又は免疫調節剤を約３０分以下、約２０分以下、約１０分以下、約５分以下、又は約１分以下等の約６０分以下の時間をあけて投与することを意味する。追加の治療剤、並びにＢＯ−１１Ｘ製剤及び／又は免疫調節剤の投与は、単一の製剤（例えば、追加の治療剤と、ＢＯ−１１Ｘ製剤及び／又は免疫調節剤とを含む製剤）又は別々の製剤（例えば、追加の治療剤を含む第１の製剤、並びにＢＯ−１１Ｘ製剤及び／又は免疫調節剤を含む第２の製剤）の同時投与によってもよい。
【０１３５】
また、同時投与は、投与される追加の治療剤を同じ投与経路によって被験体に投与されることを必要としない。むしろ、各治療剤を任意の適切な経路によって、例えば、非経口的に又は経口的（non-parenterally）に投与してもよい。
【０１３６】
かかる組み合わせは、より低用量のＢＯ−１１Ｘ製剤（又はＢＯ−１１Ｘｍ組成物）及び／又は免疫調節剤で相乗効果及び／又は相加効果及び／又は強力な効果をもたらす可能性がある。例えば、ＢＯ−１１Ｘ製剤が１以上の免疫調節剤と併用される場合、ＢＯ−１１Ｘ製剤の有効量は単剤療法のときよりも低くなることがある。いくつかの実施形態では、例えば、ＢＯ−１１Ｘ製剤を免疫調節剤と併用すると、ＢＯ−１１Ｘ製剤の有効量は治療量以下の用量であり、免疫調節剤をＢＯ−１１Ｘ製剤と併用すると、免疫調節剤の有効量は単剤療法のときよりも低くなることがある。いくつかの実施形態では、免疫調節剤をＢＯ−１１Ｘ製剤と併用すると、免疫調節剤の有効量は治療量以下の用量である。いくつかの実施形態では、免疫調節剤をＢＯ−１１Ｘ製剤及び追加の治療剤と併用すると、該追加の治療剤の有効量は治療量以下の用量である。「治療量以下の用量又は量」の用語は、薬理学的に活性な物質の用量又は量が、治療効果を達成するために単独の物質として投与されるその物質の用量又は量を下回ることを意味する。かかる物質の治療量以下の用量は、治療される被験体及び疾患の状態、被験体の体重及び年齢、疾患状態の重症度、投与の方法等に応じて変化し得るが、当業者によって容易に決定することができる。一実施形態では、化学療法剤の治療量以下の用量又は量は、化学療法剤に関する米国食品医薬品局承認のラベル情報に提供されるもの等の化学療法剤の承認された全用量の９０％未満である。他の実施形態では、化学療法剤の治療量以下の用量又は量は、承認された全用量の８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、又は更には１０％未満であり、例えば、２０％〜９０％、３０％〜８０％、４０％〜７０％、又は本明細書において提供される値に含まれる別の範囲である。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、免疫調節剤の有効量は、同じ癌に対する単剤療法及び／又は同じ癌に対するＢＯ−１１Ｘ製剤以外の薬剤との併用療法で使用される有効量よりも少ない。いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤の有効量は、同じ癌若しくは臨床状態に対する単剤療法、及び／又は同じ癌若しくは臨床状態に対する薬剤（免疫調節剤等）との併用療法で使用される有効量よりも少ない。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤（又はＢＯ−１１Ｘｍ組成物）を１以上の免疫調節剤（例えば、１個、又は２個、又は３個、又は４個、又は５個の免疫調節剤）及び任意に１以上の追加の治療剤（例えば１個、又は２個、又は３個、又は４個、又は５個の追加の治療剤）と併用する。かかる組み合わせは、より低用量のＢＯ−１１Ｘ製剤及び／又は免疫調節剤及び／又は１以上の追加の治療剤で相乗効果及び／又は相加効果及び／又は強力な効果をもたらす可能性がある。同時投与は同時であってもよく、又は連続してもよい。さらに、ＢＯ−１１Ｘ製剤及び／又は免疫調節剤を含む医薬組成物は、追加の治療剤を含んでもよい（例えば、合剤による）。すなわち、いくつかの実施形態では、本明細書に開示される２以上の任意の薬剤を合剤化してもよい。さらに、いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤及び／又は免疫調節剤を、１以上の追加の治療剤により治療を受けている患者に投与してもよい。さらに、いくつかの実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤及び／又は免疫調節剤は、１以上の追加の治療剤による患者の現在の治療に取って代わる場合がある。
【０１３９】
アジュバントケア（adjuvant care）とも呼ばれるアジュバント療法は、一次、主要、又は初回の治療に加えて与えられる治療である。非限定的な例として、アジュバント療法は、通常、全ての検出可能な疾患が除去されたが、潜在性疾患による再発の統計学的リスクが残る場合の手術の後に与えられる追加的な治療であってもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される薬剤を癌の治療におけるアジュバント療法として使用する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される治療剤を切除に先立ってネオアジュバント療法として適用する。或る特定の実施形態では、ネオアジュバント療法は、任意の手術に先立って腫瘍を縮小及び／又はダウングレード（downgrade）する治療法を指す。いくつかの実施形態では、ネオアジュバント療法は、本明細書に記載される治療剤を手術又は腫瘍の切除を可能とする他の手技に先立って癌患者に投与することを意味する。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される治療剤は、本開示の追加の治療剤のいずれかを含むが、これらに限定されない、第一選択療法による最初の治療後の維持療法として有用である。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、本発明は、治療的有効量のＢＯ−１１Ｘ製剤及び／又は免疫調節剤と、本明細書に記載される１以上の追加の治療剤とを同時に又は連続して投与することを含む、被験体において癌又は腫瘍を治療する治療レジメン又は方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、治療的有効量のＢＯ−１１Ｘ製剤及び／又は免疫調節剤と、限定されないが化学療法剤を含む、本明細書に記載される１以上の抗癌剤とを同時に又は連続して投与することを含む、被験体において癌又は腫瘍を治療する治療レジメン又は方法を提供する。本発明の方法において使用される好適な化学療法剤として、本明細書に記載されるものが挙げられ得る。或る特定の実施形態では、化学療法剤は５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ドキソルビシン、ゲムシタビン、パクリタキセル、及びシスプラチンの１以上である。一例として、いくつかの実施形態では、本発明は、ＢＯ−１１Ｘ製剤及び／又は免疫調節剤と、１以上の一般的な癌治療レジメン（非限定的な実例として、ＦＯＬＦＯＸ、ＦＯＬＦＩＲＩ、ＩＦＬ、ＦＬ（Ｍａｙｏ）、ＱＵＡＳＡＲ、Ｍａｃｈｏｖｅｒスケジュール、ＣＡＦ、ＣＭＦ、ＥＣＦ、及びＦＥＣ）と組み合わせることを提供する。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、追加の治療剤は抗過剰増殖剤である。抗過剰増殖剤として、限定されないが、ドキソルビシン、ダウノルビシン、マイトマイシン、アクチノマイシンＤ、ブレオマイシン、シスプラチン、ＶＰ１６、エンジイン、タキソール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、カルムスチン、メルファラン、シクロホスファミド、クロラムブチル、ブスルファン、ロムスチン、５−フルオロウラシル、ゲムシタビン、ＢＣＮＵ、又はカンプトテシンが挙げられる。
【０１４３】
さらに、追加の治療剤は放射線の使用を更に含んでもよい。さらに、上記治療法は光線力学療法の使用を更に含んでもよい。
【０１４４】
塩、医薬組成物及び用量
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載される製剤、組成物（本発明では製剤と組成物とは区別なく使用される）と、薬学的に許容可能なエステル、プロドラッグ、塩、溶媒和物、鏡像異性体、立体異性体、活性代謝産物、共結晶、及びそれらの他の生理学的に機能性の誘導体とを提供する。
【０１４５】
一態様では、本発明は、本明細書に記載される薬剤と、薬学的に許容可能な担体又は賦形剤とを提供する。上記医薬組成物は、所望の使用及び投与経路に適切な任意の好適な形態であってもよい。薬学的賦形剤は、石油、動物、野菜、又は合成に由来するもの等、例えばラッカセイ油、ダイズ油、鉱物油、ゴマ油等を含む、水及び油等の液体であってもよい。薬学的賦形剤は、例えば、生理食塩水、アラビアゴム、ゼラチン、デンプンペースト、タルク、ケラチン、コロイドシリカ、尿素等であってもよい。一実施形態では、薬学的に許容可能な賦形剤は、被験体に投与される際に無菌である。本明細書に記載される任意の薬剤を静脈内投与する場合、水は有用な賦形剤である。また、生理食塩水溶液、並びにデキストロース及びグリセロールの水溶液も、液体賦形剤、具体的には注射用溶液として採用され得る。また、好適な薬学的賦形剤として、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等が挙げられる。好適な薬学的賦形剤の他の例は、Remington's Pharmaceutical Sciences（Allen, Loyd V., Jr編；２２版、２０１２）に記載される。
【０１４６】
さらに、本発明の医薬組成物又は製剤は、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤、及び分散剤等のアジュバントを含んでもよい。さらに、助剤、安定化剤、増粘剤、滑剤、及び着色剤を含んでもよい。微生物の活動の阻止は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール酸等を含むことによって保証され得る。また、上記医薬組成物は、糖、塩化ナトリウム等の等張剤を含んでもよい。また必要な場合、上記医薬組成物は可溶化剤を含んでもよい。また、上記薬剤を好適なビヒクル又は当該技術分野で既知の送達デバイスにより送達してもよい。投与用の組成物は、注射部位における痛みを軽減するため、例えば、リドカイン等の局所麻酔を含んでもよい。
【０１４７】
本発明の医薬組成物又は製剤は、溶液、懸濁液、エマルジョン、液滴、錠剤、丸剤、ペレット剤、カプセル剤、液体を含むカプセル剤、粉末、徐放剤、坐剤、エマルジョン、エアゾール、スプレー、懸濁液の形態、又は使用に適した任意の他の形態をとることができる。したがって、本明細書に記載される組成物は、カプセル剤、錠剤、丸剤、カプレット、ボトル、アンプル、サッシェ、シリンジ、カートリッジ、ネブライザー、又は他の容器に含まれてもよい。一実施形態では、医薬組成物はカプセル剤の形態である。別の実施形態では、医薬組成物は錠剤の形態である。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、記載される薬剤及び組成物のいずれかの投与は、経口、静脈内、及び非経口のいずれか一つである。いくつかの実施形態では、投与経路として、例えば経口、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、舌下、鼻腔内、脳内、肝臓内、膵臓内、小胞内、膣内、経皮的、直腸に、吸入により、又は局所的に、例えば耳、鼻、眼若しくは皮膚が挙げられる。いくつかの実施形態では、投与は経口で又は非経口注射によってなされる。投与の様式は、医療者の判断にゆだねてもよく、その部位の医学的状態及び／又は（例えば、化学療法、放射線療法、又は抗体、ワクチン、及び他の癌を標的とする薬物との併用である）併用治療（concurrent treatment）に一部依存する。いくつかの実施形態では、投与は、血流への本明細書に記載される任意の薬剤の放出をもたらす。
【０１４９】
本明細書に記載される任意の薬剤、医薬組成物及び／又は製剤を経口投与してもよい。また、かかる薬剤及び／又は医薬組成物を、任意の他の簡便な経路により、例えば、静脈内の点滴又はボーラス注入、上皮又は粘膜−皮膚の内側（例えば、口腔粘膜、直腸及び腸の粘膜等）を通る吸収により投与してもよく、追加の治療剤と共に投与してもよい。投与は全身であってもよく、又は局所であってもよい。様々な送達システム、例えば、リポソーム、マイクロ粒子、マイクロカプセル、カプセル等への封入が知られ、それらを使用することができる。具体的な実施形態では、治療を必要とする領域に局所的に投与することが望ましい場合がある。
【０１５０】
一実施形態では、本明細書に記載される薬剤及び／又は本明細書に記載される医薬組成物及び／又は製剤を、ヒトに対する経口投与に適合された組成物として慣例の手順に従って製剤化する。経口投与用の固体剤形として、例えば、カプセル剤、錠剤、丸剤、粉末、及び顆粒が挙げられる。かかる剤形では、不活性な薬学的に許容可能な、クエン酸ナトリウム、リン酸二カルシウム等の賦形剤又は担体、及び／又はａ）デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、ケイ酸、微結晶性セルロース、及びＢａｋｅｒｓ  Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｓｕｇａｒ等のフィラー又は増量剤、ｂ）例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン等の結合剤、ｃ）グリセロール等の湿潤剤、ｄ）寒天、炭酸カルシウム、バレイショ又はタピオカデンプン、アルギン酸、或る特定のケイ酸塩、炭酸ナトリウム、クロスポビドン（架橋ポリビニルピロリドン）、クロスカルメロースナトリウム（架橋ナトリウムカルボキシメチルセルロース）等の架橋ポリマー、デンプングリコール酸ナトリウム等の崩壊剤、ｅ）パラフィン等の溶液遅延剤（solution retarding agent）、ｆ）第四級アンモニウム剤等の吸収促進剤、ｇ）例えば、セチルアルコール及びグリセロールモノステアレート等の湿潤剤、ｈ）カオリン、ベントナイト粘土等の吸収性剤、並びにｉ）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固形ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、ベヘン酸グリセリル等の滑沢剤等、並びにかかる賦形剤の混合物の少なくとも１つと活性薬剤とを混合する。当業者は、経口剤形において特定の賦形剤が２以上の機能を有し得ることを認識する。また、経口剤形、例えばカプセル剤又は錠剤の場合には、該剤形は緩衝剤を含んでもよい。
【０１５１】
経口投与用の液体剤形は、薬学的に許容可能なエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ剤、及びエリキシル剤を含む。活性薬剤に加えて、液体剤形は、例えば、水又は他の溶媒等の当該技術分野で一般的に使用される不活性な希釈剤、可溶化剤及び乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、及びゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、及びソルビタンの脂肪酸エステル、並びにそれらの混合物を含んでもよい。非経口投与（例えば静脈内、筋肉内、肝臓内、膵臓内、腹腔内、皮下、及び関節内の注射及び点滴）に適した剤形として、例えば、溶液、懸濁液、分散液、エマルジョン等が挙げられる。また上記の剤形は、使用の直前に無菌の注射用媒質に溶解又は懸濁され得る無菌の固体組成物（例えば凍結乾燥組成物）の形態で製造されてもよい。上記剤形は、例えば、当該技術分野で知られている懸濁剤、又は分散剤を含んでもよい。非経口注射用の本発明の医薬組成物は、使用の直前に無菌注射用の溶液又は分散液への再構成用の無菌粉末と同様に、薬学的に許容可能な無菌の水性又は非水性溶液、分散液、懸濁液、又はエマルジョンを含む。好適な水性又は非水性の担体、希釈剤、溶媒、又はビヒクルの例として、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、及びそれらの好適な混合物、植物油（オリーブ油等）、並びにオレイン酸エチル等の注射用有機エステルが挙げられる。適切な流動性を、例えば、レシチン等のコーティング材料の使用によって、分散液の場合に必要な粒度の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。
【０１５２】
本明細書に記載される任意の薬剤及び／又は本明細書に記載される任意の医薬組成物を、制御放出手段若しくは徐放性手段によって、又は当業者に知られている送達デバイスによって投与することができる。かかる剤形は、変動する割合の所望の放出プロファイルを提供するため、例えばヒドロプロピルセルロース、ヒドロプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、Ｅｕｄｒａｇｉｔ、他のポリマーマトリクス、ゲル、透過膜、浸透システム、多層コーティング剤、マイクロ粒子、リポソーム、ミクロスフェア、又はそれらの組み合わせを使用して、１以上の有効成分の制御放出又は徐放を提供するのに有用な場合がある。好適な制御放出又は徐放性の製剤は、本明細書に記載される薬剤の有効成分による使用に対して容易に選択され得る。したがって、本発明は、限定されないが、制御放出又は徐放に対して適合される、錠剤、カプセル剤、ジェルキャップ（gelcap）、及びカプレット等の経口投与に適した単回の単位剤形を提供する。
【０１５３】
本明細書に記載される薬剤及び／又は本発明の医薬組成物を含む製剤は、簡便には、単位剤形で提示され、薬学の分野で既知の任意の方法によって調製され得る。かかる方法は、一般に、治療剤を、１以上の副成分を構成する担体と会合させる工程を含む。典型的には、製剤は、治療剤を液体担体、微粒子固体担体、又はそれらの両方と均一かつ密接に会合させた後、必要に応じて、生成物を所望の製剤の剤形へと成形することによって作製される（例えば、湿式又は乾式の造粒、パウダーブレンド等の後、当該技術分野で知られている従来の方法を使用して打錠する）。
【０１５４】
本発明に従って投与される本明細書に記載される薬剤及び／又は本発明の医薬組成物の実際の用量は、特定の薬剤、特定の剤形、及び投与様式により変化し得ることが理解される。ＢＯ−１１Ｘ製剤の作用を変え得る多くの因子（例えば、体重、性別、食餌、投与の時間、投与経路、排泄の速度、被験体の状態、薬物の組み合わせ、遺伝学的傾向、及び反応感受性）が当業者によって考慮され得る。投与は、継続的に、又は最大耐用量内で１以上の個別の投薬で実行され得る。所与の一連の状態に対して最適な投与速度は、従来の投与量試験（dosage administration test）を使用して、当業者によって確認され得る。
【０１５５】
本明細書に記載される薬剤及び／又は本発明の医薬組成物の個々の用量を、例えば、ＢＯ−１１Ｘ製剤又はＢＯ−１１Ｘｍ製剤中約０．０１ｍｇ〜約１０００ｍｇのポリ（Ｉ：Ｃ）分子を含む単位剤形（例えば錠剤又はカプセル剤）で投与することができ、例えば、上記個々のＢＯ−１１Ｘ製剤は約０．０１ｍｇ〜約１０００ｍｇのポリ（Ｉ：Ｃ）］、好ましくは約０．５ｍｇ〜約２．５ｍｇのポリ（Ｉ：Ｃ）、より好ましくは約１ｍｇ〜約２ｍｇのポリ（Ｉ：Ｃ）（それらの間の全ての値及び範囲を包含する）から複合体を作製することにより形成される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される薬剤及び／又は本発明の医薬組成物を、ＢＯ−１１Ｘ製剤中約０．０１ｍｇ〜約１０００ｍｇのポリ（Ｉ：Ｃ）分子の量で毎日、又は約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇで毎日（例えば、ここで、上記個々の毎日のＢＯ−１１Ｘ製剤は約０．０１ｍｇ〜約１０００ｍｇ、好ましくは約０．０１ｍｇ〜１０ｍｇのポリ（Ｉ：Ｃ）から複合体を作製することにより形成される）（それらの間の全ての値及び範囲を包含する）投与する。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、本発明の薬剤及び／又は医薬組成物の好適な投薬量は、被験体の体重１ｋｇ当たり、ＢＯ−１１Ｘ製剤中約０．００１ｍｇ〜約１０ｍｇの範囲のポリ（Ｉ：Ｃ）分子であり、好ましくは、ＢＯ−１１Ｘ製剤又はＢＯ−１１Ｘｍ製剤中０．００３ｍｇ〜約１０ｍｇのポリ（Ｉ：Ｃ）分子（被験体に対して算出されるか、又は必要に応じて被験体の体重に対して算出される）であり、より好ましくは、被験体の体重１ｋｇ当たりＢＯ−１１Ｘ製剤中０．００５ｍｇ〜約１０ｍｇのポリ（Ｉ：Ｃ）分子であり、より一層好ましくは、被験体の体重１ｋｇ当たりＢＯ−１１Ｘ製剤中０．０１ｍｇ〜約１０ｍｇのポリ（Ｉ：Ｃ）分子であり（例えば、ここで、投与される上記個々のＢＯ−１１Ｘ製剤は、約０．００５ｍｇ〜約１０ｍｇのポリ（Ｉ：Ｃ）から複合体を作製することによって形成される）、被験体の体重１ｋｇ当たり、好ましくは、被験体の体重１ｋｇ当たり約０．００３ｍｇ〜約１０ｍｇのポリ（Ｉ：Ｃ）であり、より好ましくは、被験体の体重１ｋｇ当たり約０．００１ｍｇ〜約１０ｍｇのポリ（Ｉ：Ｃ）であり、それらの間の全ての値及び範囲を包含する。被験体の体重１ｋｇ当たり０１ｍｇ〜約１０ｍｇ、並びにそれらの間の全ての値及び範囲を包含する。他の実施形態では、ＢＯ−１１Ｘ製剤及び／又は免疫調節剤及び／又は追加の治療剤の好適な投薬量は、体重１ｋｇ当たり約０．０１ｍｇ〜約１０ｍｇの範囲、又は体重１ｋｇ当たり約０．０５ｍｇ〜約１ｍｇの範囲にある。
【０１５７】
本発明の或る特定の実施形態によれば、本明細書に記載される薬剤及び／又は医薬組成物を、例えば、１日２回以上、約１日に１回、約２日に１回、約３日に１回、約１週間に１回、約２週間に１回、約１ヶ月に１回、約２ヶ月に１回、約３ヶ月に１回、約６ヶ月に１回、又は約１年に１回、投与してもよい。一実施形態では、本発明の薬剤及び／又は医薬組成物の好適な投与量は、治療サイクルに亘って被験体（患者）１人当たりＢＯ−１１Ｘ製剤中０．１ｍｇ〜１０ｍｇのポリ（Ｉ：Ｃ）分子、好ましくは被験体１人当たりＢＯ−１１Ｘ製剤中０．５ｍｇ〜２ｍｇのポリ（Ｉ：Ｃ）分子、より好ましくは被験体１人当たり０．６ｍｇ〜１ｍｇの範囲である。特に、皮内又は腫瘍内注射によって本発明の組成物を投与する場合、組成物の総量を結果的に適合することができる。
【０１５８】
キット
また本発明は、本明細書に記載される薬剤及び／又は医薬組成物の投与を単純化することができるキットを提供する。キットは、本明細書に記載される薬剤を少なくとも１つ含む材料又は構成要素の集合である。キットにおいて構成される構成要素の正確な性質はその意図される目的に依存する。一実施形態では、キットはヒト被験体を治療する目的で構成される。
【０１５９】
使用に関する指示書がキットに備えられてもよい。使用に関する指示書は、典型的には、例えば癌、婦人科障害又は感染症を治療又は予防するといった所望の成果に影響を及ぼすキットの構成要素の使用に採用される技術を説明する明瞭な表現を含む。また任意に、上記キットは、希釈剤、バッファー、薬学的に許容可能な担体、シリンジ、カテーテル、アプリケータ、フィルタ、針（マイクロニードル）、ピペッティング若しくは計量の器具、テーピング材料等の他の有用な構成要素、又は当業者に容易に認識され得る有用な他の装備を備える。特に、キットは、より正確な（例えば画像誘導）腫瘍内又は腫瘍周囲薬物送達のためのデバイス、マトリックス（多孔性、生分解性及び／又は高分子構造及びスキャフォールドを含む）の形式の埋め込み型（又は埋め込み型でない）薬物溶出デバイス、封入システム、又は臨床用途のための他の適切なパッケージングを含み得る。
【０１６０】
ＢＯ−１１Ｘ組成物又はＢＯ−１１Ｘｍ組成物は直接、他の化合物（例えばワクチン、薬物、アジュバント等）と組み合わせて、種々の投与経路を用いて、及び／又は患者に由来する細胞若しくは試料の回収及び分析を伴って使用することができることから、キットは腫瘍内、筋肉内及び／又は皮下注射用のシリンジ（プレフィルド又はプレフィルドでない）、希釈用のビヒクル、患者に由来する生体物質を保存するためのバイアル、及び／又は特定の細胞マーカーを検出するための抗体等の特定の物質を含み得る。
【実施例】
【０１６１】
実施例１：ｊｅｔＰＥＩ系ポリ（Ｉ：Ｃ）調剤（ＢＯ−１１Ｘ製剤）の構造特性評価、及び初期ｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能検証
材料及び方法
ポリ（Ｉ：Ｃ）調剤
二本鎖ポリイノシン−ポリシチジン酸（ポリ（Ｉ：Ｃ）］分子）を生成するため使用した一本鎖ポリイノシン酸（ポリ（Ｉ））分子及びポリシチジン酸（ポリＩ）分子をTide Group、Carbogen、Hangzhou Fst Pharmaceutical Co、又はInvivogen等の商業上の提供者から得た。供給元及びバッチに応じて、ポリＩ（Ｃ）分子に対する粒度分布は次のように定義される：４００塩基未満、２０％〜８２％（例えば、３３％、４３％、５０％、７０％又は７３％ｓを提示する調剤を使用して行った詳細な試験による）；４００塩基〜８５０塩基、１５％〜４０％（例えば、２０％、２７％、３０％、３４％、又は３７％を提示する調剤を使用して行った詳細な試験による）；８５０塩基〜５０００塩基、３％〜５０％（例えば、５％、６％、１３％、３０％、３４％、４２％、又は４８％を提示する調剤を使用して行った詳細な試験による）；５０００塩基超、１％以下（通常は存在しない）。供給元及びバッチに応じて、ポリ（Ｉ）分子に対する粒度分布は次のように定義される：４００塩基未満、８０％〜９９％（例えば、８１％、８６％、９１％、９５％、又は９８％を提示する調剤を使用して行った詳細な試験による）；４００塩基〜８５０塩基、１％〜２０％（例えば、６％、８％、１２％、又は１７％を提示する調剤を使用して行った詳細な試験による）；８５０塩基〜５０００塩基、０％〜５％（例えば、３％、１％以下を提示する調剤を使用して行った詳細な試験による）；５０００塩基超、１％以下（通常は存在しない）。また、ポリ（Ｉ）及びポリ（Ｃ）の粉体又は溶液に適用するＢＯ−１１Ｘ製剤を製造するための判定基準は、最大吸光度（ポリ（Ｉ）Ｉｄポリ（Ｃ）に対してそれぞれ２４８±１ｎｍ及び２６８±１ｎｍの波長において）、エンドトキシン含有量（１０ＥＵ／ｍ−以下）、ｐＨ（６．０〜８．０）及び沈降係数（４Ｓ以上）を含む。
【０１６２】
バッチポリ（Ｉ）調剤及びポリ（Ｃ）調剤を、国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０７８０７８号に記載のように得て、アニーリングし、精製した。要するに、ポリ（Ｉ）調剤及びポリ（Ｃ）調剤は、同じ方法、及び同じ濃度で別々に粉体のポリ（Ｃ）を使用して得られた。開始溶液の品質を更に改善するため、３００ｋＤａカットオフ又は５００ｋＤａカットオフを有するメンブレンを（Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ２カセット、Millipore）使用して、濾過の追加工程を実行してもよい。これらの濾過工程の浸透物（permeates）は濃縮され、３０ｋＤａのメンブレン（Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ２カセット、Millipore）上でモノマー等の小型の不純物を含まない。各溶液に対して得られた被保持物（retentate）を濃縮バッファー溶液（１０倍ＰＢＳ等）と混合する。両方の溶液について、後のアニーリング工程のため１：１の化学量論をもとに濃度を計算するため、光学密度を特定し、結果的にアニーリング工程前に総容積を調整する。５５℃〜６２℃で３０分間に亘りポリ（Ｉ）溶液をポリ（Ｃ）溶液分子と混合し、撹拌する。得られた溶液を、一本鎖分子をアニーリングし、ポリ（Ｉ：Ｃ）分子を生成するためおよそ３時間かけてゆっくりと室温まで冷却し、最終的にＧ３ガラスポアフィルタ（細孔径およそ１５μｍ〜４０μｍ）により濾過した。
【０１６３】
このアニーリングプロセスによって、異なる二本鎖ポリ（Ｉ：Ｃ）分子のプールを含む溶液を生成し、その後、これをクロマトグラフィーのＧＰＣカラム上に適用する。４０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー中の７００ｍｌのＴｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ−６５Ｆのスラリーを充填した直径５ｃｍのＯｍｎｉｆｉｔガラスカラムを用いて、クロマトグラフィーを行った。スラリーをゆっくりと沈殿させた後、流速を１０ｍＬ／分から６０ｍＬ／分に増加させて４０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ＝６．９）で洗浄した。カラムを、２つのフィードポンプ、ＵＶ検出器、サンプリングバルブ及びコンピューターからなる分取ＨＰＬＣ装置に設置した。アニーリングによる反応混合物をカラムに装填し、４０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（フロー＝５０ｍＬ／分、ｐＨ＝６．９）で溶出した。ＵＶシグナルが１００ｍＶ〜１２５０ｍＶである場合に標的画分を得て、４回の希釈の脱塩サイクルを使用する更なる処理、及び接線流装置（ＴＦＦ、MilliporeのＰｅｌｌｉｃｏｎ  ２、再生セルロース、各々０．１ｍ２の３本のメンブレンカセットを備える、３００ｋＤａカットオフ）を使用する濃縮のために貯蔵した。貯蔵したクロマトグラフィー画分を含む第１のガラスビンにインレット及びアウトレットを接続した。最終被保持物及び洗浄溶液をメンブレンにより濾過し、透明で無色の溶液を得て、イソプロパノールを使用してこれを脱塩し、凍結乾燥し（freeze-dried）、室温で凍結乾燥（およそ５日間に亘り１ｍｂａｒにて）した（lyophilized）。ポリ（Ｉ：Ｃ）調剤は、以下の例示的プロセスによって得ることができる：ポリ（Ｃ）溶液を、これをポリ（Ｉ）溶液と混合する前に６１℃〜６６℃で１．５時間に亘って加熱し、５５℃〜５８℃で７０分間撹拌し、その後、該混合物を冷却して０．２μｍのメンブレンにより濾過した。
【０１６４】
種々の市販のｉｎ  ｖｉｖｏ−ＪｅｔＰＥＩ（８．３ｋＤａ〜２２．５ｋＤａに含まれる平均分子量を有し、ゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ：ＳＯＰ  ＧＰＣ−００４４）によってＰＥＯＸ（ポリエチレンオキシド、ＰＥＩの前駆体）の多分散性指数から決定される多分散性指数１．５未満、及び０．２μｍフィルタによる滅菌濾過）をＰｏｌｙＰｌｕｓ（カタログ番号２０１−５０Ｇ）から得た。
【０１６５】
クロマトグラフィー及び／又は濾過工程に適用可能ないくつかの条件、凍結工程の不在又は存在を、バッファー及びアニーリング時間と共に、更なる溶液粘度の減少又は複合体の沈澱に対して適合させた。マンニトール又はグルコースのいずれかを最終製剤における賦形剤として使用する。ＪｅｔＰＥＩを含有する溶液１は、濃縮した液体調剤中のＪｅｔＰＥＩを使用すること、又はＪｅｔＰＥＩ（１７ｋＤａ〜２３ｋＤａに含まれる分子量を有する）の固体バルク調剤を１５０ｍＭに達するように或る量の注射用滅菌水に可溶化し、均質な溶液を得るために混合することのいずれかによって得られる。最終のバイアル内の５．６２ｍＭ〜５．８５ｍＭまでの最終希釈の前に１１．２５ｍＭ〜１１．７ｍＭの濃度に達するように、更なる希釈工程を行う。溶液２はポリ（Ｉ：Ｃ）分子と、ＪｅｔＰＥＩと混合した後に５％グルコース（重量／上記組成物の総容積）及び上記組成物の総容積１ｍＬ当たり０．５ｍｇ〜０．７ｍｇのポリ（Ｉ：Ｃ）を含有する溶液を提供する量のグルコース一水和物とを含有し、それによって、上記ポリ（Ｉ：Ｃ）と上記ＪｅｔＰＥＩとが複合体化する。
【０１６６】
溶液１及び溶液２を、Watson-Marlowのポンプ（速度３０ｒｐｍ）を使用して、０．２μｍのフィルタ（滅菌グレードフィルタ（ＡＳＴＭ  Ｆ−８３８−０５ガイドラインによる）として十分確認されているＳａｒｔｏｐｏｒｅ（商標）２  １５０  ０．２μｍ）による二重濾過を使用して個別に滅菌する。２つの溶液の自動化混合は、次の連続するプロセスを使用して、各バイアルにおいて行われる：（ｉ）５．９５ｇ〜６．０５ｇ（６ｍＬ；密度：１ｇ／ｍＬ）を投薬するためWatson-Marlowのポンプを使用して、溶液１をバイアルに添加し、（ｉｉ）６．０８ｇ〜６．４０ｇ（６ｍＬ）を投薬するため、５５０ｒｐｍの速度でFlexiconのポンプを使用してＧ２０−０．９μｍ針に接続された内径１．８ｍｍのチューブを使用して、溶液２を溶液１上に添加する。結果は、Ｔピースミキサーの使用により改善される場合がある。静電相互作用により製造プロセスの終わりに（又はその保存中に）目視検査によってなおも存在し得る粒子（例えば、１μｍ〜１００μｍ以上の範囲のサイズ）が凝集した場合には、それによって生物学的特性も組成物内の粒子の単峰性の径分布も変更することなく、製品を使用に先立って（例えばその注入の前に）０．８μｍフィルタで濾過することができる。例えば、０．８μｍの排除サイズを有するＭｉｎｉｓａｒｔシリンジフィルタ（Sartorious）にＢＯ−１１２製剤を通して濾過してもよい。バイアル（ＢＯ−１１２製剤の様々な容積、例えば１ｍＬ、２ｍＬ、５ｍＬ、１０ｍＬ又はそれ以上を有する）を無菌の発熱物質を含まないゴム栓で密閉してアルミニウムカプセルで圧着し、個別にラベルを付す。これらのバイアルを直接注射に使用しても、又はそれらの内容物を使用に先立って適切なビヒクルで希釈してもよい。
【０１６７】
クロマトグラフィーによって、又はアガロースゲル、及び非標識化又は［３２Ｐ］標識化されたポリ（Ｉ）及びポリ（Ｉ：Ｃ）の調剤を使用して、ＢＯ−１１Ｘ調剤に含まれるポリ（Ｉ：Ｃ）分子のサイズを特定し、比較した。簡潔には、１μｇのポリ（Ｉ）及びポリ（Ｉ：Ｃ）（ＰＢＳ）をアガロースゲルにロードし、ＴＢＥバッファー中８０ボルトで１時間、電気泳動を行った。当初のポリ（Ｃ）及びポリ（Ｉ）の分子の粒度分布に応じて、ＢＯ−１１Ｘ調剤に存在するポリ（Ｉ：Ｃ）分子の粒度分布は、クロマトグラフィーによっても次の通りであると特定された：４００塩基未満、７％〜５７％（調剤を用いて行った更なる試験では１０％〜３０％に含まれる値、例えば１１％、１５％、１７％、２１％、２６％又は２８％が示される）；４００塩基〜８５０塩基、２０％〜４５％（調剤を用いて行った更なる試験では２０％〜３０％に含まれる値、例えば２３％、２５％又は２７％が示される）；８５０塩基〜５０００塩基、２０％〜７０％（調剤を用いて行った更なる試験では４０％〜６０％に含まれる値、例えば４２％、４５％、５２％、５３％又は５５％が示される）；５０００塩基超、０％〜９％（調剤を用いて行った更なる試験では０％〜５％に含まれる値、例えば３％、１％又は０％が示される）。種々のバッチポリ（Ｉ）調剤及びポリ（Ｃ）調剤のサイズをクロマトグラフィーによって評価し、比較した。
【０１６８】
ＢＯ−１１２組成物を国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０７８０７８号にＢＯ−１１Ｘ製剤について記載される濃度及び粒径分布で作製し、検証する。ＢＯ−１１２組成物は、０．５ｍｇ／ｍＬ〜０．８ｍｇ／ｍＬ濃度のポリ（Ｉ：Ｃ）を含むバイアルとして提供する。これらのバイアルにおけるＢＯ−１１２組成物の安定性を２℃〜８℃での１年間の保存後に確認した。
【０１６９】
商業的に入手可能なポリ（Ｉ：Ｃ）含有製剤
ポリ−ＩＣＬＣは、ポリリジン及びカルボキシメチルセルロースで安定化されるポリ（Ｉ：Ｃ）調剤である（Ewel C et al., 1992、特許文献１２）。ＬｙｏＶｅｃ−ＨＭＷ（カタログ番号ｔｌｒｌ−ｐｉｃｌｖ）及びＬｙｏＶｅｃ−ＬＭＷ（カタログ番号ｔｌｒｌ−ｐｉｃｗｌｖ）、並びに対応する高分子量（ＨＭＷ；カタログ名ｔｌｒｌ−ｐｉｃ）及び低分子量（ＬＭＷ；カタログ名ｔｌｒｌ−ｐｉｃｗ）を有するポリ（Ｉ：Ｃ）調剤はInvivogenから入手可能である。
【０１７０】
分析技術
別々のＢＯ−１１Ｘ調剤（０．５ｍｇ／ｍＬ〜０．８ｍｇ／ｍＬ、ポリ（Ｉ：Ｃ）濃度１．０μｇ／ｍＬで細胞系及び他のアッセイのため希釈される）におけるＪｅｔＰＥＩ／ポリ（Ｉ：Ｃ）粒子のゼータ平均（ｚ平均）径及び多分散性指数に対する値を、上記粒子が球形であるという仮定に基づき、製造業者の指示に従ってＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳを使用し、ＩＳＯ２２４１２に従って決定した。一般に、動的光散乱（ナノサイザー技術）はｖ７．１１ソフトウェアを使用して適用される。
【０１７１】
ＢＯ−１１Ｘ調剤のｉｎ  ｖｉｔｒｏ特性評価
ヒト黒色腫細胞株ＳＫ−ＭＥＬ−１０３及びヒト膵臓癌細胞株ｃ上のＢＯ−１１０複合体の特性を記載する文献に従って（非特許文献１６；非特許文献１７；特許文献１６）、種々のポリ（Ｉ：Ｃ）系調剤をヒト黒色腫細胞、ヒト膵細胞又はヒトメラノサイトを使用して試験した。簡潔には、細胞の生存率アッセイを処理の少なくとも１２時間前に付着細胞に対して行った。指定の時間及び処理濃度での細胞死のパーセンテージを、貯蔵され、０．４％トリパンブルー溶液（米国ニューヨーク州グランドアイランドのGibco Laboratories）で染色され、光学顕微鏡下で採点された（１つの処理当たり最低１００個〜５００個の細胞を計数した）浮遊細胞及び付着細胞に対する標準的なトリパンブルー排除アッセイによって推定した。各調剤を１２時間〜４８時間に含まれる期間について、０．３μｇ／ｍｌ〜２．５μｇ／ｍｌの範囲に含まれた種々の調剤におけるポリ（Ｉ：Ｃ）分子の濃度で試験した。
【０１７２】
ＢＯ−１１２の細胞死誘導活性（death-inducing activity）を、正常なメラノサイト、並びに黒色腫及び膠芽腫に由来する細胞株で試験し、単離した成分、すなわちポリ（Ｉ：Ｃ）分子及び直鎖ＰＥＩ（ＪｅｔＰＥＩ；Ｐｏｌｙｐｌｕｓ）と比較した。正常なメラノサイトを無症候性ドナーの包皮から単離した。黒色腫細胞ＳＫ−Ｍｅｌ−２８、ＳＫ−Ｍｅｌ−１０３及びＵＡＣＣ６２（それぞれ、ｐ５３、ＮＲＡＳ及びＢＲＡＦに突然変異を有する）をＡＴＣＣ又はメモリアルスローンケタリング癌センター（Memorial Sloan Kettering Cancer Centre）（米国）の樹立されたコレクションから得て、細胞株認証のためショートタンデムリピート（ＳＴＲ）プロファイリング（ＧｅｎｅＰｒｉｎｔ（商標）１０  Ｓｙｓｔｅｍ）に供した。黒色腫患者に由来する初代細胞を、標準的なプロトコルを用いて得て、維持した。細胞を９６ウェルプレートに播種した（６０００細胞／ウェル）。０．５μｇ／ｍｌ又は１μｇ／ｍｌのポリ（Ｉ：Ｃ）のみ、ＢＯ−１１０又はＢＯ−１１２の製剤による２４時間又は４０時間の処理で１つの実験当たり３回。
【０１７３】
腫瘍細胞死の特性評価
皮膚黒色腫のマウス癌細胞株Ｂ１６−Ｆ１０（ＡＴＣＣコードＣＲＬ−６４７５）をＡＴＣＣの樹立されたコレクションから得た。Ｂ１６−ＯＶＡ細胞（Ｂ１６−Ｆ１０細胞に由来する）を応用医学研究センター（Centro de Investigacion Medica Aplicada）（スペイン、ナバラ）から得た。ＩＦＮに非感受性のＢ１６細胞株をInvivogenから得て（Ｂ１６−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＦＮ−γ細胞、カタログ番号ｂｂ−ｉｆｎｇ；Ｂ１６−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＦＮα／β細胞、カタログ番号ｂｂ−ｉｆｎｔ１）、製造業者に指示されるように維持した。ＢＯ−１１２製剤によって誘導される腫瘍細胞死（アポトーシス、ネクローシス、免疫原性細胞死）の特性評価を調べ、単離ポリ（Ｉ：Ｃ）及び他のＴＬＲリガンド（ＴＬＲ４に特異的なＬＰＳ）と比較した。Ｂ１６−ＯＶＡ細胞（１０５細胞／ウェル）を単独で、超高純度ＬＰＳ（０．２５μｇ／ｍＬ及び１μｇ／ｍＬ、InvivoGen、カリフォルニア州サンディエゴ）と共に、ＢＯ−１１２製剤（０．２５μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ及び１μｇ／ｍｌ）と共に、又はポリＩ：Ｃのみ（０．２５μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ及び１μｇ／ｍｌ）と共に４８時間培養した。細胞のアポトーシス及びネクローシスの速度を、アネキシンＶ及び７ＡＤＤの併用染色を用いたフローサイトメトリーによって分析した（生細胞：７ＡＤＤ陰性、アネキシンＶ陰性；細胞ネクローシス：７ＡＤＤ陽性、アネキシンＶ陰性；初期アポトーシス：７ＡＤＤ陰性、アネキシンＶ陽性；後期アポトーシス：７ＡＤＤ陽性、アネキシンＶ陽性）。免疫原性細胞死の誘導に対するＢＯ−１１２の影響を、ＭＨＣ−１、ＣＤ９５及びカルレティキュリンの細胞表面発現を検出することによるフローサイトメトリーによって分析した。フローサイトメトリーについては、試料をＧａｌｌｉｏｓサイトメーター（Beckman Coulter）において得て、データをＫａｌｕｚａフロー分析ソフトウェア（Beckman Coulter）で分析した。
【０１７４】
ＰＡＲＰ活性化
加えて、ＤＮＡ修復、ゲノム安定性及びプログラム細胞死に関与する酵素であるポリＡＤＰリボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の活性化に対するＢＯ−１１２製剤の影響を調べた。ＭＣ３８結腸腺癌（ＣｅｌｌｏｓａｕｒｕｓコードＣＶＣＬ＿Ｂ２８８、Kerafastカタログ番号ＥＮＨ２０４）及び４Ｔ１乳癌細胞（ＡＴＣＣコードＣＲＬ−２５３９）をＡＴＣＣ等の樹立された細胞コレクションから得た。各癌細胞株（３×１０６個）をＢＯ−１１２（０．５μｇ／ｍＬ）で刺激し、ＰＡＲＰ活性化を細胞溶解物においてウエスタンイムノブロッティングによって０時間、１６時間及び２４時間の時点で分析した。ＰＡＲＰモノクローナル抗体（クローンＣ−２−１０、ThermoFisher Scientific）を使用して、ＰＡＲＰに相当する１１６ｋＤａのタンパク質及び８５ｋＤａのアポトーシス誘導切断産物を同定した。
【０１７５】
結果
国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０７８０７８号は、ＢＯ−１１Ｘ製剤の当初の開発及び特性評価に関するプロトコル及び実験データを開示し、文献中に記載され、実験室規模で得られるＢＯ−１１０複合体と比較して、癌細胞に対するＢＯ−１１Ｘ製剤の細胞毒性の増加を導く（非特許文献１６、非特許文献１７、特許文献１６）。プロセス及び調剤に関するＧＭＰ条件におけるＢＯ−１１Ｘ製造プロセス及び得られたポリ（Ｉ：Ｃ）含有調剤に関するデータを、文献中に開示されるデータと比較した。
【０１７６】
図１Ａは、ＢＯ−１１２製剤と名付けられる第１型のＢＯ−１１Ｘ調剤を生成するかかるプロセスの概要を提供し、該プロセスにおいては、原体（すなわち、ポリ（Ｉ）及びポリ（Ｃ）の一本鎖分子のアニーリングによって生成される二本鎖ポリ（Ｉ：Ｃ）分子）を担体（すなわちＪｅｔＰＥＩ）の機能を有するポリマーを含有する溶液とは別々に濾過によって滅菌される溶液中で、グルコースのような賦形剤と最初に混合する。その後、これらの２つのバルク調剤を各バイアルに適切に混合し、薬物毒物学の研究及び臨床応用に必要な多数の構造的及び機能的に匹敵する医薬製剤を生成する。このプロセスは、更なる化合物（免疫関連アジュバント又は他の治療用化合物等）が段階１において形成される粒子中（ひいては最終製剤中）に存在するポリ（Ｉ：Ｃ）製剤を、特にかかる治療的に関連する化合物をグルコースのような賦形剤と共に（又はその代替として）添加することによって提供することもでき、ＢＯ−１１２ｍと名付けることができるＢＯ−１１Ｘｍ製剤の例が得られる。
【０１７７】
かかる再現性及び判定基準のうちの少なくともいくつかは、抗癌活性が知られている他のポリ（Ｉ：Ｃ）含有製剤のものと比較することができる。ポリ（Ｉ：Ｃ）分子サイズのレベルでは、市販のＬｙｏｖｅｃ−ＨＭＷ及びＬｙｏｖｅｃ−ＬＭＷに含まれるポリ（Ｉ：Ｃ）分子は、ＢＯ−１１Ｘの製造プロセスによって提供されるものとは明らかに異なるサイズ範囲を包含する（ＨＭＷはほぼ完全に０．８５ｋｂを上回り、ＬＭＷはほぼ完全に０．８５ｋｂを下回る）。ポリ（Ｉ：Ｃ）分子のこのサイズ差は、異なる製造プロセス及び／又は複合体においてポリ（Ｉ：Ｃ）分子と会合される担体に依存し得る。ポリ−ＩＣＬＣ（ポリリジン及びカルボキシメチルセルロースを含む）及びＬｙｏＶｅｃ−ＨＭＷ／ＬｙｏＶｅｃ−ＬＭＷ（製造業者によれば、カチオン性脂質系トランスフェクション試薬のジ−テトラデシルホスホリル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルメタンアミニウムクロリド、すなわちＤＴＣＰＴＡ、及び中性脂質の１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、すなわちＤｉＰＰＥを含む）に含まれるポリ（Ｉ：Ｃ）系複合体内の複合体のＺ平均値を、ＢＯ−１１２製剤のものと比較して、これらの市販の製剤が、少なくとも二峰性分布を伴うＬｙｏｖｅｃ−ＬＭＷについて、はるかに大きい（大多数が２００ｎｍより大きい）複合体を含むことを示す（図１Ｂ）。この分析が凍結／融解サイクルの後に行なわれる場合、これらの市販の調剤もまた、ＢＯ−１１２については観察されない可変性を伴い、より安定していないものに見える。実際、ＢＯ−１１２製剤は、１００±５０ｎｍ（例えば８２．５ｎｍ）の４００ｎｍを超えないＺ平均径（ｄ．ｎｍ）を有する場合、ＬｙｏＶｅｃ系及びポリ−ＩＣＬＣの製剤は、３００ｎｍよりかなり高いＺ平均値を有することから、商業的に入手可能なポリ（Ｉ：Ｃ）は、組成物において不均質であるか、又は機能的な特性評価に乏しく、そのサイズが凍結／融解サイクル中に変化する、大きな粒子を含むかのいずれかの調剤として提供されることが確認される。
【０１７８】
このアプローチは、更に一層均一な特徴を有するＢＯ−１１Ｘ製剤（ＢＯ−１１２調剤等）を提供するために自動化することができる。この製造手順は、ＢＯ−１１２調剤内で複合体化していない溶液中の遊離ＪｅｔＰＥＩ又はポリ（Ｉ：Ｃ）分子を有することを防ぐだけでなく、Ｚ平均を３０ｎｍ〜１５０ｎｍに調節することができるように、ＢＯ−１１２調剤中の複合体の制御された平均径及び単峰性の径分布を得ることも可能にする。さらに、このアプローチは、異なる粒度分布のポリ（Ｉ：Ｃ）分子、並びに異なるサイズ、サイズの分布を有し、及び／又は一本鎖及び二本鎖領域を提示する他のポリリボヌクレオチド（ポリ（Ａ）、ポリ（Ｇ）及び／又はポリ（Ｕ））が含まれるように適合することができる。
【０１７９】
国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０７８０７８号は、市販のポリ（Ｉ：Ｃ）が組成物において不均質であるか、又は機能的な特性評価に乏しく、そのサイズが凍結／融解サイクル中に変化する、大きな粒子を含むかのいずれかの調剤として提供されることも開示する。実際、ポリ（Ｉ）鎖とポリ（Ｃ）鎖との間の分離を決定する温度（又は他の条件の）変化の結果として、ＢＯ−１１２製剤、特に粒子内の二本鎖ポリ（Ｉ：Ｃ）分子の安定性を評価するため、ハイパークロミシティーを使用することもできる。ＢＯ−１１２製剤は、０．２未満又は０．１未満の２６０ｎｍでの透過率の差を有する、非常に低いハイパークロマティック効果を示した。また、種々の時間に対する−２０℃での凍結ＢＯ−１１Ｘバイアルの安定性を少なくとも１ヶ月まで評価し、確認した。
【０１８０】
投与前のＢＯ−１１２製剤の濾過及び凍結は、本来のＢＯ−１１２製剤に関して、組成物内の粒子に対する細胞毒性の特性又は安定性に対する本質的な変化を促進しない。例えば、組成物は、２５０ｎｍ未満のＤ９０％、３０ｍＶ超（例えば４０ｍＶ〜５０ｍＶ）のゼータ電位、３０ｎｍ〜１５０ｎｍのＺ平均を有する流体力学的径、賦形剤としてのグルコースの使用との適合性、０．１〜０．６に含まれる多分散値、及びヨーロッパ薬局方による他の該当する基準を維持する）。
【０１８１】
したがって、ＢＯ−１１２調剤等のＢＯ−１１Ｘ調剤は、他の担体及び製造方法に基づく市販のポリ（Ｉ：Ｃ）製剤については観察されない、２００ｎｍ未満（１００ｎｍ未満でない場合）のＺ平均直径（ｄ．ｎｍ）を有するポリ（Ｉ：Ｃ）−ＪｅｔＰＥＩ複合体によって形成される粒子に対する高レベルの安定性及び再現性を提示する製剤である。得られたＢＯ−１１２調剤は、単峰性の径分布を有し、最終溶液がバルク溶液の１と２とを混合した後に５μｍを通して濾過されなくても目視可能な粒子を含まない（すなわち、欧州薬局方２．９．２０によって要求される限界を超える多数の粒子を含まない）ＢＯ−１１２複合体を提示する。ＢＯ−１１２調剤は、それによって生物学的特性も組成物内の粒子の単峰性の径分布も変更することなく、使用に先立って（例えばその注入の前に）０．８μｍフィルタで濾過することができる。例えば、０．８μｍの排除サイズを有するＭｉｎｉｓａｒｔシリンジフィルタ（Sartorious）にＢＯ−１１２製剤を通して濾過してもよい。混合条件を、特に、５０ｒｐｍ〜６００ｒｐｍの混合速度及び／又はポリ（Ｉ：Ｃ）又はＪｅｔＰＥＩ溶液のいずれかに対する１ｍＬ／分〜５０ｍＬ／分のフロー速度の調整によって、適合させてもよい。
【０１８２】
一般に、ＢＯ−１１Ｘ調剤（特に、ＢＯ−１１２調剤）は次の主な特徴：無色で、目視可能な粒子はなく、モル浸透圧濃度は２２０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜３４０ｍＯｓｍ／ｋｇに含まれ、ｐＨはｐＨ２〜ｐＨ４に含まれ（例えば２．７〜３．４）、＋１５００〜＋３７５０の旋光度、３０ｍＶ以上のゼータ電位、３０ｎｍ〜２５０ｎｍ（例えば３０ｎｍ〜１５０ｎｍ）、しかしながら好ましくは６０ｎｍ〜１３０ｎｍのＺ平均径（ｎｍ）を有する粒子の単峰性の径分布を提示し、かかる二本鎖ポリリボヌクレオチドの少なくとも４０％、５０％又は６０％が０．８５Ｋｂを超えるサイズを有し、かかる二本鎖ポリリボヌクレオチドの少なくとも７０％が０．４Ｋｂ〜５Ｋｂに含まれるサイズを有する、ポリ（Ｉ：Ｃ）分子を含む。溶液１及び溶液２の両方に対する種々のフロー速度と組み合わせてＴピースミキサーを使用することにより、粒子の径分布等の特徴を調整してもよい。かかる速度が２０ｍＬ／分を上回る（例えば３０ｍＬ／分）場合、得られたＢＯ−１１２調剤の濁度は、この値周辺のＺ平均粒径及び径分布の減少と並行して減少されるのに対し、おそらくはフローレジーム（flow regime）の変化により、単峰性を維持する。
【０１８３】
例示的なＢＯ−１１２調剤は、Ｚ平均径４５±５ｎｍ〜８１±５ｎｍ（例えば７３±５ｎｍ）を有し、少なくとも５０％の粒子が８５±２０ｎｍより小さく、０．２５の多分散性、３８ｍＶのゼータ電位及びｐＨ３．１の粒子を含むバイアルとして提供される。−２０℃の凍結／融解サイクル、又は室温での広範囲な曝露の後に維持されるこれらの構造特性を別のバッチにおいて調整することができ、値の特定範囲内の判定基準を維持する。特に、ＧＭＰバッチ及び非ＧＭＰバッチを物理化学的及び機能的特性、並びにＢＯ−１１２製剤（概してＢＯ−１１Ｘ製剤）を評価するためのより再現性のある効果的な基準について比較する場合、より好ましい範囲が規定される。例えば、治療的に及び生物学的に効果的なＢＯ−１１２製剤は、１００±５０ｎｍ又は８０±２０ｎｍ（例えば７６ｎｍ、８９ｎｍ又は９６ｎｍ）のＺ平均径を有し、電位ｚが約３５（又は４０）ｍＶ〜５０ｍＶ（例えば３９ｍＶ、４６ｍＶ又は５０ｍＶ）又は約４０ｍＶ〜４５ｍＶ（例えば４３ｍＶ）に含まれ、粒子の少なくとも９０％が２５０ｎｍ未満又は２００±５０ｎｍ（例えば１７０ｎｍ、１７２ｎｍ、１７４ｎｍ、２１６ｎｍ、２１８ｎｍ、２２０ｎｍ）の直径、及び０．２〜０．３（例えば０．２１、０．２３又は０．２５）の多分散性を有する粒子を提示し得る。付加的な基準は、検出未満又は無関連の単量体イノシン酸の存在（例えば１μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ又は０．１μｇ／ｍＬ未満）、３００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇに含まれるモル浸透圧濃度、５ｍＭ未満、又は好ましくは１ｍＭ未満（例えば０．７ｍＭ、０．７６ｍＭ、０．７８ｍＭ又は０．８０ｍＭ）のイオン強度等の水性組成物中で測定される特徴と関連付けることができる。これらの値は、低温（例えば５℃±３℃）での貯蔵後に変化してもよいが、依然としてこれらの範囲内にとどまるものとする。
【０１８４】
バイアル内のポリ（Ｉ：Ｃ）及び粒子の濃度は、最終用途に従って適合することができる。しかしながら、組成物におけるポリ（Ｉ：Ｃ）系及びＰＥＩ系複合体の安定性を維持するためには、バイアルは０．１ｍｇ／ｍＬ超のポリ（Ｉ：Ｃ）、場合によっては０．５ｍｇ／ｍＬ超のポリ（Ｉ：Ｃ）分子の濃度でＢＯ−１１Ｘを含むものとし、それによりゼータ電位及び凝集特徴が安定し、ＢＯ−１１Ｘ調剤の均一かつ効果的な使用が可能となる。バイアルは、治療期間（３日間、５日間、７日間、１０日間、１５日間、３０日間又はそれ以上）に亘って投与される単回使用用の２つ、３つ、５つ又はそれ以上のアリコートに分割することができる、より大きなバッチの調剤（５ｍＬ、１０ｍＬ、１５ｍＬ又はそれ以上のＢＯ−１１Ｘ組成物を含む）と同様、単回使用用（４ｍＬ、２ｍＬ、１ｍＬ又はそれ以下の容積のＢＯ−１１Ｘ組成物を含む）に準備することができる。
【０１８５】
ＢＯ−１１２製剤の細胞毒性活性を市販の製剤と比較する場合、後者は、少なくとも２つのｉｎ  ｖｉｔｒｏモデル（図２Ａ及び図２Ｂ）において癌細胞の殺傷にそれほど有効でないように見える。ＢＯ−１１Ｘ調剤の細胞毒性活性を、種々の癌の適応症を代表する種々のタイプの癌細胞株における更なる使用のために測定及び検証することができる。また、これらの効果は、癌細胞に対する細胞応答を変化させるとともに改善する可能性があることが知られているタンパク質の発現及び／又は分泌を測定することによって検討され得る。例えば、ＢＯ−１１２製剤は、ポリ−ＩＣＬＣより一層効率的に、少なくとも２４時間の期間に亘って黒色腫細胞株においてインターフェロン−ベータ発現を誘導する（図２Ｃ）。このｉｎ  ｖｉｔｒｏでの証拠を、ＢＯ−１１Ｘ製剤を投与することによってどのタイプの癌がより効率的に治療され得るかを評価するためのみならず、ＢＯ−１１Ｘ製剤と組み合わせて投与される場合に（例えば、投薬量、頻度及び／又はこの他のアプローチによる治療期間を減少することによって）、どの他の癌の治療（細胞系若しくは抗原系ワクチン、アジュバント、抗体、化学療法薬、放射線療法、細胞療法、免疫療法、エピジェネティック療法、又はキナーゼ若しくは代謝酵素等の酵素活性の阻害剤等）がより効果的に作用し得るかを評価するためにも使用することができる。
【０１８６】
実際、ＢＯ−１１Ｘ製剤による正常な初代細胞に対してではなく、癌細胞株に対するかかる細胞毒性効果の特異性（実験室スケールのＢＯ−１１０製剤について先に記載される；非特許文献１７）を、適切な化合物及び細胞対照と活性を比較することによってｉｎ  ｖｉｔｒｏで確認した（図３）。直鎖ＰＥＩＬもポリ（Ｉ：Ｃ）分子単独も、腫瘍細胞（黒色腫又は神経膠腫）の生存可能性に有意に影響しない。ＢＯ−１１２製剤中で提供されるように直鎖ＰＥＩとポリ（Ｉ：Ｃ）分子とが複合体化される場合に限り、正常なメラノサイトの生存可能性に影響することなく、腫瘍細胞の顕著な殺傷が観察される。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性についての細胞系アッセイが、更なる（前）臨床用途の前のＢＯ−１１２製剤のバッチの検証及び格付けの一環であり得る。かかるアッセイは、陰性対照としての比較可能な基準（モル浸透圧濃度、ｐＨ又はイオン強度等）を有するビヒクル、又は他の粒子を含まない溶液、及びＳＤＳ又は他の生物学的若しくは化学的細胞毒性剤を使用して、培養培地中で１つ、２つ又はそれ以上の標準濃度（例えば０．３５μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、０．８５μｇ／ｍＬ、１．０μｇ／ｍＬ又は１．５μｇ／ｍＬ；先に０．８μｍフィルタを用いた濾過を行う又は行わない）のＢＯ−１１２製剤のバッチへの２４時間、３６時間又は４８時間の曝露後のヒト黒色腫細胞株（ＳＫ−Ｍｅｌ−１９、ＳＫ−Ｍｅｌ−２８、ＳＫ−Ｍｅｌ−１０３及びＳＫ−Ｍｅｌ−１４７細胞等）に対する影響に基づくことができる。
【０１８７】
全体として、ＢＯ−１１Ｘ製剤（特にＢＯ−１１２製剤）の作製及び検証に適用されるポリ（Ｉ：Ｃ）、粒子、組成物及び細胞毒性に基づく基準は、このポリ（Ｉ：Ｃ）製剤を、市販の（図面を参照されたい）及び／又は文献（非特許文献２、特許文献１６、特許文献９）中に記載される以前のポリ（Ｉ：Ｃ）系製剤と比べて構造的に異なり、機能的に改善された製剤とする。これらの後者の公報に関して、これらの非ＧＭＰポリ（Ｉ：Ｃ）系製剤は、実質的により大きなサイズを有し、より高いＮ／Ｐ比率で、製造時に付加的な化学的複雑性を有し、癌細胞に対する特異性がＥＧＦＲ等の細胞表面抗原を発現するものに限られた粒子含有溶液を使用して所望のレベルの細胞毒性を達成するために、ＰＥＧ等の基（保護活性を有する）及び／又はＥＧＦペプチド（細胞標的化のため）の付加を必要とする。
【０１８８】
上記の観察結果から、ＢＯ−１１２組成物に曝した黒色腫患者に由来する細胞株が、（他のポリ（Ｉ：Ｃ）系製剤と比較した場合に）癌細胞の生存率を特異的に、より強く低減するだけでなく、かかる細胞によるインターフェロンアルファ／ベータ産生も誘導することが確認された（図４）。さらに、ＢＯ−１１２組成物は、同等の濃度のＬＰＳ（ＴＬＲ４アゴニスト）又は対応するポリ（Ｉ：Ｃ）分子（一般的にＴＬＲ３アゴニストと定義される）よりもはるかに大きな程度で腫瘍細胞死（アポトーシス及びネクローシス）を促進し、免疫原性細胞死（ＩＣＤ）を増進する（図５Ａ及び図５Ｂ）。ＢＯ−１１２製剤のこのより強いアポトーシス促進効力は、これらのＴＬＲ特異的アゴニストと比較した場合に、癌細胞の除去だけでなく、効果的な抗腫瘍免疫応答の活性化にも重大な影響がある。実際、ＭＨＣ−Ｉ、ＣＤ９５又はカルレティキュリン等のＩＣＤマーカーの発現レベルの顕著な増大がＢＯ−１１２刺激後に観察され（非処理細胞、ＬＰＳ又はポリＩ：Ｃで処理した細胞と比較して）、抗腫瘍免疫を誘導するＢＯ−１１２製剤の強い効力が確認される。ｉｎ  ｖｉｖｏ研究及び臨床開発を導くための腫瘍マウスモデルを使用して同様のｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究を行うことができる。
【０１８９】
同様の細胞系アプローチを、濾過及び／又は凍結に曝されたＢＯ−１１Ｘ、特にＢＯ−１１２製剤を検証し、細胞毒性効果が、かかる処理の後にＢＯ−１１２調剤において定性的に及び定量的に維持されることを確認するだけでなく、細胞死マーカー、及び／又は免疫細胞若しくは制癌薬によって特異的に認識される癌抗原若しくは標的の発現の増強を評価するためにも使用した。例えば、このアプローチを、細胞表面マーカー及び受容体、キナーゼ、酵素等の制癌薬の生物学的標的の発現の低減又は減少（又は分解）を測定するためにも使用することができる。
【０１９０】
例えば、転移性進行におけるＴＬＲ３シグナル伝達の役割が評価された自己原発性及び転移性頭頸部扁平上皮癌に由来する細胞株及び新たな腫瘍標本においてＰＡＲＰ１について観察されているように、免疫チェックポイントを別として、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ等のＤＮＡ修復を制御する酵素の活性は、ＢＯ−１１Ｘ組成物への細胞の曝露に影響を受ける可能性があり、原発性及び転移性腫瘍試料、並びに関連する細胞株においてポリ（Ｉ：Ｃ）分子への曝露後に切断型ＰＡＲＰによって測定されるように顕著なアポトーシスが観察される（Umemura N. et al., 2012）。図６は、ＰＡＲＰ切断がＢＯ−１１２製剤を４Ｔ１乳癌及びＭＣ３８結腸癌細胞株に投与した場合にも観察されることを示し、ＢＯ−１１２製剤を、抗ＰＤ１又は抗ＰＤ−Ｌ１について前の図面に示されているように、ＰＡＲＰ阻害剤の治療的有用性を広げるための併用療法における、臨床用途が患者における耐性機構によって限られている（Lim J and Tan D, 2017）ＰＡＲＰ阻害剤の使用を改善するために使用することができることが示される。
【０１９１】
種々のＢＯ−１１Ｘ製剤の生産及び比較、種々の投与レジメン、及び／又は癌等の疾患に関連する状態を含む種々の前臨床モデルを使用して、臨床開発を導くためのこれらのｉｎ  ｖｉｔｒｏデータのより深く掘り下げた分析を行うことができる。特に、付加的な研究は、生体物質（血液又は生検材料等）及び患者から得られた細胞（癌細胞、免疫細胞又は他の細胞型である）におけるｍＲＮＡ及び／又は対応するタンパク質の活性、発現、及び／又は濃度に対するＢＯ−１１Ｘ製剤の影響についての判定を含み得る。ＢＯ−１１Ｘ製剤の特性を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養し、ｅｘ  ｖｉｖｏで試験した場合、及び／又はより複雑な免疫学的機構を検討することができる、マウスに注射した場合のヒト細胞（初代腫瘍細胞、細胞株又は遺伝子組み換え細胞である）において評価することができる。かかる活性、並びに遺伝子発現及び潜在的作用機構における付随した変化の特性評価は、実施例３に要約されるように、最適化された投与経路及びレジメン、他の薬物との組み合わせ、追跡治療及び／又はＢＯ−１１Ｘ製剤に適用可能な患者集団を定義することを可能にし得る。
【０１９２】
実施例２：動物モデルにおけるＢＯ−１１Ｘ調剤の機能的特性評価
材料及び方法
ＢＯ−１１Ｘ製剤及び他の化合物
実施例１に記載される通りＢＯ−１１２製剤を得て、５％グルコースＰＢＳ溶液（ビヒクル；参照：ＢＥ１４−５１６Ｆ、フランス国Lonza）で、それぞれ０．０５ｍｇ／Ｋｇ、０．５ｍｇ／Ｋｇ及び２．５ｍｇ／Ｋｇの動物の体重１キログラム当たりの投薬量に従って、３つの異なる濃度に希釈した。
【０１９３】
マウス抗ＰＤ−Ｌ１抗体（ＩｎＶｉｖｏＰｌｕｓ、クローン１０Ｆ．９Ｇ２）を免疫療法化合物との組み合わせとして選択した。ラット−ＩｇＧ２ｂ抗体（クローンＬＴＦ−２、BioXCell）をアイソタイプ対照として使用した。マウスに対する毎日の注射では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体及びラット−ＩｇＧ２ｂ（ＲＩｇＧ）抗体を１．５ｍｇ／ｍｌの最終濃度にビヒクルで希釈した。
【０１９４】
マウス抗ＣＤ４（クローンＧＫ１．５）及び抗ＣＤ８α（クローン２．４３）、並びにラット−ＩｇＧ２ｂ（クローンＬＴＦ−２）抗体（全てBioXCellによる）をＴ細胞枯渇に使用した。マウスに抗ＣＤ４若しくは抗ＣＤ８α（３００μｇ／マウス）、又はラット−ＩｇＧ２ｂ（１００μｇ／用量）抗体の３つの初期用量、続いて１００μｇ／マウスの維持用量を与えた。
【０１９５】
マウス細胞株
Ｂ１６−Ｆ１０（皮膚黒色腫、ＡＴＣＣコードＣＲＬ−６４７５）及びそれに由来するＢ１６−ＯＶＡ；ＭＣ３８（結腸腺癌、ＣｅｌｌｏｓａｕｒｕｓコードＣＶＣＬ＿Ｂ２８８、Kerafastカタログ番号ＥＮＨ２０４）；４Ｔ１（乳癌、ＡＴＣＣコードＣＲＬ−２５３９）を、ＡＴＣＣの樹立されたコレクション又は応用医学研究センター（スペイン、ナバラ）から得て、可能であれば細胞株認証のためショートタンデムリピート（ＳＴＲ）プロファイリング（ＧｅｎｅＰｒｉｎｔ（商標）１０  Ｓｙｓｔｅｍ）に供した。ＩＦＮに非感受性のＢ１６細胞株をInvivogenから得て（Ｂ１６−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＦＮ−γ細胞、カタログ番号ｂｂ-ｉｆｎｇ；Ｂ１６−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＦＮα／β細胞、カタログ番号ｂｂ-ｉｆｎｔ１）、製造業者に指示されるように維持した。
【０１９６】
ヒト癌に対する動物モデル
上に示した細胞株を８週齢〜１０週齢の雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右脇腹に皮下（ｓ．ｃ．）注射した（５×１０５〜１×１０６５細胞）。アブスコパル研究については、第２のｓ．ｃ．注射（３×１０５細胞）を左脇腹に行った（右脇腹への腫瘍細胞の第１の注射の直後、同時注射モデル）。再チャレンジ研究については、第２のｓ．ｃ．注射（２．５〜５×１０５細胞）を、ＢＯ−１１２治療に応答し、腫瘍を有しないマウスの左脇腹に行った。屠殺するまで腫瘍をノギスによって毎週測定し、体積を計算した（長さ×幅２／２）。生存をカプラン−マイヤー分析によって評価した。
【０１９７】
ＢＯ−１１２投与及び他の化合物
腫瘍体積が８０ｍｍ３〜１００ｍｍ３となった時点でＢＯ−１１２治療を開始した。ＢＯ−１１２及びビヒクルの投与を、右脇腹の腫瘤への単回直接注射により腫瘍内に行った（ＢＯ−１１２投与スケジュール（２回の投与／週、３週間））。抗ＰＤ−Ｌ１及びラット−ＩｇＧ２ｂ抗体投与を、ＢＯ−１１Ｘの第２の投与で開始して腹腔内に行い、ＢＯ−１１２と同じスケジュールを継続した。抗ＣＤ４、抗ＣＤ８α及びラット−ＩｇＧ２ｂ  ｍＡｂを腹腔内に投与した。初期用量をＢＯ−１１２投与の開始の前日に注射し、実験を通して継続した。全実験の投与（ＢＯ−１１２及び他の化合物）の正確なスケジュールを図面に示す。
【０１９８】
免疫応答研究
ＢＯ−１１２抗腫瘍効果における種々のＴ細胞サブセットの影響をＭＣ３８マウス腫瘍モデルにおけるＴ細胞枯渇実験によって調べた。抗ＣＤ４又は抗ＣＤ８α抗体をＭＣ３８腫瘍担持マウスに全身投与した（ＢＯ−１１２治療前に開始する）。ＢＯ−１１２、抗ＣＤ４又は抗ＣＤ８α抗体の投与量、投与及びスケジュールは先に記載している。屠殺するまで腫瘍をノギスによって毎週測定し、体積を計算した（長さ×幅２／２）。ＢＯ−１１２療法によってｉｎ  ｖｉｖｏで誘導されるＴ細胞活性化及びプライミングを、ＢＯ−１１２の第２の投与の２４時間後に評価した。腫瘍及び流入領域リンパ節を摘出し、腫瘍を消化し（コラゲナーゼ／ディスパーゼ消化培地）、濾過し、全ての試料を処理して単一細胞懸濁液を得た。フローサイトメトリー表面及び細胞内染色の標準的なプロトコルを行い、次の蛍光色素標識抗体を使用した：抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＣＤ４５、抗ＰＤ−１、抗ＩＦＮγ、抗ＣＤ１３７（Biolegend）。ＯＶＡ又はＴｒｐ２に対する抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を分析した（ｉＴＡｇ  Ｔｅｔｒａｍｅｒ／ＰＥ  −  Ｈ−２Ｋｂ、BML international Corporation）。Ｇａｌｌｉｏｓサイトメーター（Beckman Coulter）を用いて試料を得て、データをＫａｌｕｚａフロー分析ソフトウェア（Beckman Coulter）で分析した。
【０１９９】
ＢＯ−１１２の細胞死誘導活性をＩＦＮに応答しないマウス癌細胞においてＭＴＳアッセイによって試験した（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（商標）  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ、Promega）。Ｂ１６、Ｂ１６−ＩＦＮ−α／β（ＩＦＮ−γに応答しない）及びＢ１６−ＩＦＮ−γ（ＩＦＮ−α／βに応答しない）細胞（５０００細胞／ウェル；９６フラットウェルプレート、１条件当たり８反復）を、図面に記載されるようにポリ（Ｉ：Ｃ）のみ（０．５μｇ／ｍＬ）、ＢＯ−１１２製剤（０．５μｇ／ｍＬ）又は２’，３’−サイクリックＧＭＰ  Ｓｔｉｎｇアゴニスト（７μｇ／ｍＬ；InvivoGen、カリフォルニア州サンディエゴ）と共に実験に応じて２４時間、４８時間、７２時間培養した。吸光度（ＯＤ４９２ｎｍ）をＥＬＩＳＡリーダーにおいて測定した。死細胞％は非処理細胞（０％）を参照する。
【０２００】
結果
ＢＯ−１１２製剤のｉｎ  ｖｉｖｏでの抗癌の効力を、マウス黒色腫細胞を移植した免疫応答性マウス系統においてｉｎ  ｖｉｖｏで調べた。マウスをＰＢＳ溶液、又はマウス抗ＰＤ−Ｌ１抗体（好ましくは全身投与される）と組み合わせて、３つの異なる濃度（好ましくは腫瘍内に投与される０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ又は２．５ｍｇ／ｋｇ）のＢＯ−１１２製剤のいずれかで治療し、３週間に亘り、ビヒクル単独と比較した（図７Ａ）。ビヒクルと組み合わせた抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ビヒクル単独と比較した場合、顕著には生存を増加しなかった。抗ＰＤ−Ｌ１（また、おそらくはかかる抗体から独立して）で試験した３つ全てのＢＯ−１１２製剤の組み合わせは、ビヒクル又は抗ＰＤ−Ｌ１単独と比較してマウスの生存を著しく増加した。さらに、生存は、より低用量のＢＯ−１１２製剤と比較して、２．５ｍｇ／ｋｇのＢＯ−１１２製剤＋抗ＰＤ−Ｌ１の組み合わせで著しく増加した（図７Ｂ）。実際、単独で投与したＢＯ−１１２製剤は、このモデルにおける腫瘍成長を明らかに低減し（図７Ｃ及び図７Ｄ）。この組み合わせの影響を同様の黒色腫マウスモデルへの腫瘍内注射のアブスコパル効果に対するモデルにおいても試験したが、ＢＯ−１１２製剤は、注射した腫瘤だけでなく注射しなかった腫瘤のサイズも低減し、ＢＯ−１１２製剤の局所的かつ全身的な抗腫瘍効果が確認された（図８）。
【０２０１】
抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、重要で検証された抗癌薬であり、癌細胞に対する有効な免疫応答の媒介物質である。本発明者らの実験は、ＢＯ−１１Ｘ複合体を他の抗癌剤と組み合わせて使用できること、及びＢＯ−１１Ｘ化合物と、抗ＰＤ１等の他の抗癌剤との組み合わせが抗癌剤単独に対してより優れた効力を有し、生存及び抗腫瘍の効能の著しい増加をもたらすことを実証する。さらに、生存（又は免疫記憶細胞、及びより一般的な全身治療応答）における改善は、上記組み合わせに対するＢＯ−１１Ｘ製剤の用量の増加と相関し、生存における追加の利益がＢＯ−１１Ｘ製剤によって媒介されることを支持する。ＢＯ−１１２製剤のこのｉｎ  ｖｉｖｏでの抗癌効力を、それぞれ乳癌及び大腸癌に対する４Ｔ１系（図９）及びＭＣ３８系（図１０）モデルの両方において、抗ＰＤ−Ｌ１又は任意の他の治療の不在下でも確認した。ＢＯ−１１２は、４Ｔ１乳癌モデルにおける腫瘍成長を低減するだけでなく、ＭＣ３８結腸癌モデルにおいて、２つの異なるアプローチ（癌細胞による再チャレンジを行う又は行わない；図１０及び図１１）を用いることによっても、マウス生存を改善した。
【０２０２】
したがって、ＢＯ−１１Ｘ製剤（単独で、又は同じ若しくは異なる経路を使用して投与され得る他の抗癌剤、例えば抗体、免疫療法若しくは化学療法と組み合わせて）を黒色腫及び他の癌適応症、特に、膵癌、子宮内膜癌、卵巣癌、腎癌、肝細胞癌又は大腸癌等の腫瘍周囲又は腫瘍内への注射を可能とするものの治療に使用することができる。さらに、ＢＯ１１２は、免疫細胞記憶を促進することによって全身性免疫を誘導し、単一治療剤としてのその使用が可能となる。
【０２０３】
この領域では、樹状細胞の活性を増強する、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−Ｌ１又はＣＤ１３７を標的とする免疫調節性モノクローナル抗体、及びポリ（Ｉ：Ｃ）調剤の併用効果について示されたように（Sanchez-Paulete AR et al., 2015）、特定の生物学的経路及び作用機構の同定は、最も適切な投薬量、投薬計画、他の薬物又は治療法との組み合わせ、及びＢＯ−１１Ｘ製剤に対する適応症を導く可能性がある。この目的のため、Duewell P et al., 2015は、膵癌の免疫療法について本発明の組成物を試験するため使用され得る疾患の代替的な動物モデルを開示する。
【０２０４】
いかにしてかかる治療が、更なる薬物又はワクチンの同時投与により又はそれによらずに、関連するモデル（マウス黒色腫、乳癌、卵巣癌、平滑筋肉腫、子宮内膜癌又は膵癌モデル等）におけるマウス生存を改善するのかを評価するため、ポリ（Ｉ：Ｃ）分子に関する濃度範囲（０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ又は５ｍｇ／ｋｇ等）に亘る腫瘍内（ｉ．ｔ．）投与についてｉｎ  ｖｉｖｏ研究を行うことにより、腫瘍成長（局所及び／又は遠位の場所での）及び抗腫瘍免疫応答に対するＢＯ１１Ｘ製剤の治療効果を測定することができる。同時に、ＢＯ−１１Ｘ治療によって誘導された特定の生物学的活性に関する用量反応研究を、アポトーシス誘導（カスパーゼに関連する発光（Caspase-related Glow）による）、免疫原性細胞死誘導（例えばＭＨＣ−Ｉ、カルレティキュリン、ＣＤ９５又はＨＭＧＢ１の発現）、体液中のケモカイン／サイトカインの分泌（例えばＩＬ−６及びＩＰ−１０の分泌）、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞の活性化及び／又は増殖（例えば、適切な細胞型に対するＣＤ４０、ＣＤ８６、ＣＤ６９の上方制御と関連する）のレベルでのヒト又は動物の試料を使用して、ｅｘ  ｖｉｖｏで並行して評価することができる。これらの研究は、疾患に直接関与する細胞（例えば腫瘍細胞、上皮細胞、内皮又は上皮細胞）、又は腫瘍内、リンパ器官内若しくは血液中でいくつかの免疫活性若しくは免疫調節性活性を行ってから間接的に関与する細胞（例えばヒト末梢血単核細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞、樹状細胞）を使用して行われ得る。これらの研究は、ＢＯ−１１Ｘ臨床用途のための種々のスケジュールを確立するために、皮下又は筋肉内投与等の種々の投与経路を用いたＢＯ−１１Ｘ治療の効果、更には癌関連及び／又は感染症関連ワクチン接種におけるアジュバントとしてのＢＯ−１１Ｘ適性も対象とし得る。
【０２０５】
ＢＯ−１１Ｘ治療に対する疾患段階及び／又は患者集団を階級化するため、これらの研究を、ＢＯ−１１Ｘに対する応答（又は応答の欠如）を予測するためのバイオマーカーとして使用され得る分子の同定に対して更に関連付けることができる。特に、ＢＯ−１１Ｘ活性の分析を、ＢＯ−１１Ｘ投与と組み合わせて（例えばＴ細胞枯渇若しくは活性化抗体、ウイルス抗原、細菌抗原若しくは癌抗原、養子Ｔ細胞療法等の細胞系治療、又はアジュバント特性を有する化合物を同時投与することによって）特定の細胞型が枯渇又は活性化される場合にも特定の細胞マーカー及び（亜）集団の変化を測定することができる動物モデルにおいて、免疫細胞（ＮＫ細胞、Ｂ細胞、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞等）の定性的及び／又は定量的な特徴並びに腫瘍成長動態を比較することによって行うことができる。
【０２０６】
特定の免疫細胞の関与を、ＢＯ−１１２製剤による治療がＢＯ−１１２製剤の投与後に腫瘍における免疫細胞の枯渇又は特定の免疫細胞集団の存在に関して評価される、以前に記載されているものと同様の癌動物モデルにおいて調査することができる。ＣＤ４陽性Ｔ細胞の枯渇は、ＢＯ−１１２製剤の効果を改善し、ＢＯ−１１２とＣＤ４  Ｔｒｅｇを標的とする薬物との併用療法の臨床的可能性が示唆される（図１２Ａ及び図１２Ｂ）。ＣＤ８陽性Ｔ細胞の枯渇は、マウス腫瘍モデルに対するＢＯ−１１２製剤の抗腫瘍効果を減少させるようであり、ＢＯ−１１２抗腫瘍媒介効果における適応免疫応答の関与が確認される。さらに、腫瘍浸潤リンパ球中の特定の細胞集団の提示は、ＣＤ４５／ＣＤ８陽性Ｔ細胞だけでなく、ＣＤ１３７、ＯＶＡ及びＴｒｐ２四量体に対する陽性、ＰＤ−１、並びにＣＤ８陽性細胞におけるインターフェロンガンマ発現の顕著な増大も伴って、ＢＯ−１１２製剤の腫瘍内注射によって変更され、これらの影響はＣＤ４陽性細胞において一部確認される。同じモデルにおいて、内在性腫瘍抗原Ｔｒｐ２に対する特定のＣＤ８＋Ｔ細胞が腫瘍流入領域リンパ節においても増加する（図１２Ｃ及び図１２Ｄ）。
【０２０７】
これらのデータから、ＢＯ−１１２製剤が腫瘍に対する適応免疫応答を促進し、全身性免疫を誘導することが可能であることが確認される。腫瘍細胞死を誘導し、Ｔ細胞の浸潤及び活性化を促進するＢＯ−１１２の強力な効果は、免疫抑制等の腫瘍進行の補完機構を標的とする薬物との臨床的組み合わせの証拠を提供する（Chen DS and Mellman I, 2013）。ＢＯ−１１２療法後の腫瘍におけるＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化によりＩＦＮシグナル伝達経路の活性化が実証される。ＩＦＮγは、抗腫瘍全身及び局所免疫において極めて重要な役割を果たすだけでなく、癌細胞においてＰＤ−Ｌ１発現を誘導し、これは局所腫瘍免疫を損ない、免疫抑制を推進すると記載される機構である（Abiko K et al., 2015）。種々のマウス腫瘍モデルにおけるＢＯ−１１２腫瘍内投与は、腫瘍細胞においてＰＤ−Ｌ１発現を誘導し、ＢＯ−１１２とＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１を標的とする薬物との併用療法の根拠を支持する。有望な組み合わせとして、ＣＴＬＡ４、Ｔｉｍ−３、ＬＡＧ３又はＩＤＯ等の腫瘍細胞及び／又は腫瘍微小環境によって誘導される免疫抑制を解除する（unblock）ための他の免疫チェックポイント阻害剤を標的とする薬物が挙げられる。
【０２０８】
腫瘍細胞に対するＢＯ−１１２製剤の強力な直接の細胞毒性効果は、ＩＦＮに応答しない細胞においても検出される（患者選択及びＢＯ−１１２治療に対して関連する臨床的意義を有する）。ＢＯ−１１２製剤は、同様にインターフェロンに応答する癌細胞の能力とは独立して腫瘍細胞死を誘発するようである（図１３）。ＩＦＮ−ガンマ受容体シグナル伝達又は抗原提示機構における機能喪失型突然変異は、ＰＤ−１遮断療法に対する一次耐性及び獲得耐性のいくつかの場合を媒介する（Zaretsky J et al., 2016）。腫瘍細胞におけるＢＯ−１１２によるＲＩＧ１／ＭＤＡ５経路の活性化は、ＩＦＮ−γ耐性を克服する戦略となり、自己ＣＤ８＋Ｔ細胞療法に対して腫瘍を再感作し得る。初期染色体異常は、或る特定の腫瘍タイプにおいてＩＦＮγ耐性及びＴ細胞耐性の獲得を起こしやすくし、したがって、耐性発現のリスクを規定するための免疫療法前の染色体異常及び遺伝子突然変異についての患者転移のスクリーニングがＢＯ−１１２療法によって利益を得る患者の選択に有用であり得る。
【０２０９】
文献により、腫瘍（黒色腫、浸潤性乳癌、前立腺腺癌、肺腺癌及び大腸腺癌を含む）中の細胞に対するヒト組織標本が、ＪＡＫ１又はＪＡＫ２のシグナル伝達を減少させることが推定されるＪＡＫ１又はＪＡＫ２のいずれかの機能喪失型変化（ホモ欠失（homodeletions）、短縮型突然変異、又は遺伝子若しくはタンパク質の下方制御）を含むＪＡＫ１及びＪＡＫ２の変化を有するといういくつかの証拠が提供される。これらの証拠は、腫瘍による変異負荷を考慮して、ＢＯ−１１２療法によって特に利益を得る患者の選択に有用であり得る。
【０２１０】
実施例３  ＢＯ−１１２製剤を用いた臨床研究
動物モデルにおけるＢＯ−１１２の投与に関する前臨床研究は、局所的及び全身的な抗腫瘍効果のより安全かつより集中的な増強を求める、ＢＯ−１１２を（例えば、腫瘍内送達により）投与する臨床研究の確立の基礎として用いることができる。免疫調節治療としてのＢＯ−１１２腫瘍内投与の可能性及びその毒性／安全性プロファイルが、このファーストインヒューマン（first in human）概念実証臨床試験において分析されている（ＮＣＴ０２８２８０９８）。悪性固形腫瘍及び触知可能な皮膚／皮下又はリンパ節の転移（１ｃｍ超）等の腫瘍内注射を利用可能な癌病変を有し、生検材料を得ることができる患者を、少なくとも０．５ｍｇ／ｍＬ超の濃度のポリ（Ｉ：Ｃ）分子を含有するＢＯ−１１２調剤から開始して種々の用量レベル（各用量中において０．６ｍｇ〜１ｍｇのポリ（Ｉ：Ｃ）含有量、週１回の投与で１回〜３回の投与）の腫瘍内注射を用いてＢＯ−１１２で治療する。注射した病変を、治療の開始前及び最終投与の７日〜１４日後、又は代替的には例えば６週間後に生検する。患者を、臨床的関連性及び自然又は適応免疫系応答及びシグナル伝達経路の兆候に関して並行して評価する。ＢＯ−１１２薬物動態、並びにＩ型インターフェロン、ＴＮＦ−アルファ及びＩＬ−６等の循環サイトカインも血漿中で評価する。
【０２１１】
予備的結果から、患者が、治療せずに回復した２例の血小板減少症のエピソードを除いて関連の毒性を経験しなかったことが示される。ＢＯ−１１２は、腫瘍内送達後に血流中において検出可能でなかった。ＢＯ−１１２について、以下の腫瘍関連基準の少なくとも１つに関して全ての患者において統計的及び治療的の両方で関連する変化を特定した：注射した腫瘍のサイズ、転移の出現又は無転移、癌細胞のアポトーシス及びネクローシス（ＢＯ−１１２製剤によって腫瘍において誘発される免疫原性細胞死を示す）、ＣＤ４陽性腫瘍浸潤Ｔ細胞の増加、ＣＤ８陽性腫瘍浸潤Ｔ細胞の増加、循環免疫細胞（ＮＫ細胞、樹状細胞、単球、及び／又は制御性Ｔ細胞、ＣＤ１６又はＰＤ−１等の特異的マーカーを提示する全集団又は特定の亜集団を含む）の増加。
【０２１２】
ＢＯ−１１Ｘ製剤（又はＢＯ−１１Ｘｍ製剤）を腫瘍内注射によって臨床的に投与した場合、おそらくは腫瘍に内在する他の細胞による抗腫瘍応答の活性化と組み合わせた直接の抗腫瘍効果（例えば、樹状細胞への腫瘍抗原の提示を促進することによる）の結果として、アポトーシス及び／又はネクローシスが腫瘍において観察され、カスケードが免疫細胞、特にＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の腫瘤への動員及び／又は活性化ももたらし、腫瘍に対する免疫効果を促進し、ＢＯ−１１Ｘの細胞毒性効果に寄与し得る。ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ４  Ｔｒｅｇ、ＮＫ  Ｔ、ＮＫ、ＣＤ１６＋単球又はＤＣ等の免疫細胞集団における組織的な変化も誘発され、これは一次及び記憶抗腫瘍応答の両方を高めることが可能であり得る。
【０２１３】
ＢＯ−１１Ｘ製剤（又はＢＯ−１１Ｘｍ製剤）は、１回以上の治療サイクルにおいて、単剤として、又は後続の腫瘍内注射を含むだけでなく、皮下若しくは筋肉内投与等の代替的な投与経路を含むレジメンにて他の投与経路によって、異なる頻度で与えられるチェックポイント阻害剤若しくは他の癌免疫療法剤等の他の抗癌療法と組み合わせて（化学療法及び放射線療法に加えて又は加えずに）投与することもできる（図１４Ａ及び図１４Ｂ、抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ−１又は抗ＰＤ−Ｌ１同時療法も含む）。ＢＯ−１１Ｘ治療のサイクルは、同じ又は異なる腫瘍病変への規定の回数の腫瘍内注射（１週間、２週間、３週間、４週間又はそれ以上に亘る１回〜最大４回又はそれ以上の連続した注射）として確立することができる。
【０２１４】
上で言及したファーストインヒューマン臨床試験の第二部では、抗ＰＤ１抗体による治療に応答しない患者に、抗ＰＤ１抗体による継続治療に加えてＢＯ−１１２の複数回投与を行う（図１４Ｂを参照されたい）。画像化法に基づいて全腫瘍量によって測定される治療に対する臨床応答、並びに腫瘍組織及び循環免疫細胞において判断される生物活性を試験中に評価する（図１５を参照されたい）。
【０２１５】
これに続いて、複数回の筋肉内又は皮下注射（１週間、４週間、７週間、１５週間又はそれ以上に亘る１回〜最大７回又はそれ以上の連続した注射）を行い、患者応答に応じて同じレジメンにより（又は注射の間隔を広げて）かかるサイクルを繰り返すことができる。これらの筋肉内又は皮下注射におけるＢＯ−１１Ｘ製剤は、場合により、腫瘍内注射と比較してより低用量（例えば、腫瘍内に注射される用量の５０％、２５％、１０％、５％、１％）のポリ（Ｉ：Ｃ）分子を得るために投与前に希釈されるが、依然として腫瘍内注射の最初の治療効果及び／又は免疫調節効果を維持することができる。上述のパラメーターに加えて、臨床応答を身体検査、ＣＴスキャン、ＭＲＩスキャン、又は腫瘍量を評価するための他の画像化法によっても評価することができる。
【０２１６】
代替的には、ＢＯ−１１Ｘ製剤（又はＢＯ−１１Ｘｍ製剤）を、特に樹状細胞等の特定の免疫細胞の成熟、効力、及び／又は活性化を改善するために、患者から単離された細胞を使用してｅｘ  ｖｉｖｏで投与することができる（図１４Ｃ）。このアプローチは、新生抗原、養子Ｔ細胞、細胞溶解物、癌、婦人科疾患及び／又は感染に関連する用途について文献中に記載されているように、樹状細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ成熟に適用することができる（Vanderlocht J et al., 2010、 Gallois A and Bhardwaj N, 2013、Da Silva DM et al., 2015、Fritsch EF et al., 2014、Gonzalez FE et al., 2014、Tai LH et al. 2013、Hammerich L et al., 2015、Hervas-Stubbs S et al., 2012、Ochoa MC et al., 2017、Osada T et al., 2015、Perica K et al, 2015）。また、この場合、これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏ／ｅｘ  ｖｉｖｏ方法におけるＢＯ−１１Ｘ製剤は、場合により、腫瘍内注射と比較してより低用量（例えば、腫瘍内に注射される用量の５０％、２５％、１０％、５％、１％であるが、場合によっては、実施例１に開示される細胞系モデルにおいてＢＯ−１１Ｘ製剤を検証するために用いられる用量及び濃度の範囲内）のポリ（Ｉ：Ｃ）分子を得るために投与前に希釈される。これらの投与量は、その後に同じ患者においてＢＯ−１１Ｘ治療のサイクルを適用して又は適用せずに、依然としてかかる治療アプローチに適切な治療効果及び／又は免疫調節効果をもたらすことができる。
【０２１７】
上に挙げた投与経路及びレジメンのいずれかを用いることで、ＢＯ−１１Ｘ製剤（又はＢＯ−１１２製剤等のＢＯ−１１Ｘｍ製剤）を、患者において生検材料、血液試料、及び／又は他の臨床基準を用いて測定される１つ以上の組み合わせ基準を考慮して検証することができる（上記及び図１５Ａを参照されたい）。したがって、腫瘍サイズ及び転移の直接評価とは別に、ＢＯ−１１Ｘ製剤の治療的効力は、以下の３つの一般的基準：癌細胞に対する直接的な細胞毒性（癌細胞のアポトーシス及びネクローシス）、腫瘍浸潤免疫細胞（ＣＤ４陽性及び／又はＣＤ８陽性腫瘍浸潤Ｔ細胞等）の増加、血中を循環する免疫細胞（リンパ球、ＮＫ細胞、単球、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞の全集団又は特定の亜集団等）の増加の少なくとも１つを評価し、及び／又は応答する若しくは応答しない患者のいずれかにおいてのみ治療前対治療後でいくらかの差次的発現（ＲＮＡシークエンシング又は他の大量シークエンシングアプローチによって決定される）を示す方法において決定することができる。
【０２１８】
この検証プロセスは、治療の効力だけでなく、ＢＯ−１１Ｘ（又はＢＯ−１１Ｘｍ）投与が患者の応答性を増強したことから他の治療（以前に効果がないことが見出された）を適用することができるかについて確認することができるような、例えば特定の一連のタンパク質のｍＲＮＡ及び／又はタンパク質発現をスクリーニングすることによる分子レベルでの追跡を含んでいてもよい。ＢＯ−１１Ｘ又はＢＯ−１１Ｘｍで治療された患者において特定することができる、かかるシグネチャー及び代替的なレジームの例は、例えばインターフェロン発現及び／又は同定すべき他のマーカー、並びに患者の潜在的な救済のためのＰＤ−１系療法に対する獲得耐性に関して文献中に見ることができる（Zaretsky J et al., 2016、Masucci G et al., 2016）。したがって、安全性、効力及び免疫生物学的データは、単独の及び／又は他の薬物、標準治療プロトコル、又は更なる治療的利益をもたらし得る免疫療法と組み合わせたＢＯ−１１２等のＢＯ−１１Ｘ製剤を用いて今後の臨床試験のためにＢＯ−１１Ｘ（又はＢＯ−１１Ｘｍ）の投与量を選択する根拠を提供する（図１５Ｂ）。
【０２１９】
ＢＯ−１１２製剤の治療的効力は、関連する臨床効果を更に示す２つの最初の例を用いた臨床評価段階にある（図１６及び図１７）。これらの予備的結果から、癌病変の低減におけるＢＯ−１１２の効力が確認され、チェックポイント療法に対する癌患者の不応性に対処し、免疫原性細胞死及び抗腫瘍免疫を誘導する潜在的効果と共に、抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ１及び／又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体の同時投与を行った又は行わない場合の安全性及び意図される生物学的効果が実証される。さらに、これらの予備的結果から、患者が、どちらも回復した（一方は血小板の輸血により、他方は治療を行わずに）２例の血小板減少症を除いて臨床的に関連する毒性を経験しなかったことが示される。ＢＯ−１１２は、腫瘍内送達後に血流中において検出可能でなかった。ＢＯ−１１２は、以下の腫瘍関連基準の少なくとも１つに関して全ての患者において治療的に関連する変化を示した：注射した腫瘍のサイズ、癌細胞のアポトーシス及びネクローシス、ＣＤ４陽性腫瘍浸潤Ｔ細胞の増加、ＣＤ８陽性腫瘍浸潤Ｔ細胞の増加、循環免疫細胞（ＮＫ細胞、樹状細胞、単球、及び／又は制御性Ｔ細胞、ＣＤ１６又はＰＤ−１等の特異的マーカーを提示する全集団又は特定の亜集団を含む）の増加。
【０２２０】
実施例４  患者におけるＢＯ−１１２製剤の投与による生物学的効果の評価
材料及び方法
アポトーシス、ネクローシス、免疫浸潤物及び炎症遺伝子ＲＮＡ発現シグネチャーを分析するために（例えば、Nanostringのプラットホーム、及びＰａｎＣａｎｃｅｒ  Ｐａｔｈｗａｙｓ、ＰａｎＣａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ又はＰａｎＣａｎｃｅｒ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐａｎｅｌのような製造業者によって挙げられるパネル等のヒト遺伝子の特定のパネルを用いる）、注射した転移性病変からの治療前及び治療後の生検材料を得る。薬物動態、血清サイトカイン及び循環免疫細胞を、治療前及び治療後の血液試料において順次検討する。
【０２２１】
ｎＳｏｌｖｅｒ分析ソフトウェア（NanoString, Inc.）を用いて、カウントを初めに、実験変動性を補正するためにアッセイに加えられた陰性対照の幾何平均に対して正規化した。次いで、幾何平均を、陽性対照の正規化因子を計算するために用い、最後にＨｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙパネルに組み込まれたハウスキーピング遺伝子に対して正規化した。詳細な正規化分析の指針は、NanoString Technologiesのウェブサイトに見ることができる（http://www.NanoString.com）。正規化データをカウントとして測定した。ｎＳｏｌｖｅｒ手順の正規化データを、７５０個の内在性遺伝子について対数変換した（２を底とする）。
【０２２２】
１２人の患者についてのｎＣｏｕｎｔｅｒチップデータを治療前及び治療後に得た。差次的発現を、各遺伝子について対応のあるｔ検定を用いて評価した。使用した計画行列は、
【数１】
2020520368.tif 000003
であった。ここで、β０、及びβ１〜β１３は、治療前と治療後との差次的発現である。治療後により高発現に変更された遺伝子は、倍率変化の正の値を示した。ｎＣｏｕｎｔｅｒデータの線形モデルを、ｌｉｍｍａパッケージを用いて構築した。Benjamini及びHochbergの方法を用いてｐ値を多重比較について補正した。ｐ＜０．０５の有意値を有する遺伝子をクラスター化した。全ての遺伝子発現分析をＲで行った。
【０２２３】
結果
初めに、ＢＯ−１１２で治療した患者から得られた細胞を用いた遺伝子発現研究により、表Ｉに要約されるように、限られた数の遺伝子の下方制御又は上方制御の特定が可能となった。
【０２２４】
【表１】
2020520368.tif 000004
【０２２５】
遺伝子を選択し、（ｌｏｇ２）倍率変化、ｐ値及び調整されたｐ値を提示する。この分析から、２３個の遺伝子が腫瘍（したがって、癌細胞及び浸潤免疫細胞の両方を含む可能性がある）において治療前と治療後とで差次的に発現されることが見出された（ｐ値＜０．０５）。上記の表Ｉに挙げた遺伝子は、免疫応答又は免疫防御（現在の又は潜在的な内部の及び／又は侵襲的な脅威に対する）、一般的な免疫学的過程及び／又は炎症過程、又は有機、無機若しくは生物学的作用物質に対する他の応答の頻度、速度又は程度の調節（しかし好ましくは、活性化又は増大）に関連するＧＯ（遺伝子オントロジー）クラスの１つ以上に関連付けることができる。かかるＧＯクラスには、系統名：Ｍ１４３２９、Ｍ１１９７６、Ｍ１０５７４、Ｍ１３４９６、Ｍ１２９０４、Ｍ１３６５７、Ｍ１２８６６、Ｍ１０７００、Ｍ１６７２８及びＭ１６３０６を有するものが含まれる。特に、３つの遺伝子（ＣＣＬ７、ＭＡＲＣＯ、ＭＳＲ１）がマクロファージに特異的に関連し、１つ（ＯＡＳ３）が活性化ＤＣに関連し、１つ（ＬＡＩＲ２）がＴｈ２  Ｔ細胞に関連する。２つの更なる遺伝子（ＣＤ１６３、ＣＤ３６）が食作用に関与する受容体に相当する。
【０２２６】
代替的には、これらの遺伝子は、それらのタンパク質局在化及び／又は酵素活性に基づいて分析することができる。上方制御される遺伝子の第１の群では、対応するタンパク質は、作用が小分子によって阻害され得る酵素であり、これらの化学物質は多くの場合、ＴＬＲ３に関連する又は関連しない、免疫応答及び／又は癌に対する応答を変化させることによる治療特性を有する。例えば、ＩＲＡＫ２は、ＴＬＲ３シグナル伝達のメディエーターであり（Jain A et al., 2014）、ＯＡＳ３は、細胞性自然応答において重要な役割を果たすインターフェロン誘導ｄｓＲＮＡ活性化酵素であるが、カテプシンＬ１及びＢＴＫは、どちらも抗癌化合物及び／又は免疫調節化合物の標的である（Feng M et al., 2015、Molina-Cerrillo J et al., 2017、Ping L et al., 2017、Li YY et al., 2017、Sudhan D and Siemann D, 2015）。上方制御される遺伝子の第２の群（ＭＳＲ１、ＭＡＲＣＯ、ＬＡＩＲ２、ＴＬＲ２、ＣＤ１６３、ＣＤ３６、ＳＬＣ１１Ａ１、ＬＲＲＮ３）では、対応するタンパク質は、作用が様々な作用物質（抗体又は小分子）によって活性化（又は阻害）され得る細胞表面受容体であり、これらの化合物は多くの場合、治療特性を有する。上方制御される遺伝子の第３の群（ＩＬ１０、ＩＬ８、ＣＣＬ３、ＣＣＬ７、ＣＸＣＬ１、ＬＹ９６）では、対応するタンパク質は、作用又は細胞表面受容体との相互作用が様々な作用物質（抗体又は小分子）によって阻害され得る分泌タンパク質であり、これらの化合物も多くの場合、治療特性を有する。
【０２２７】
これらのカテゴリー化スキームを用い、次いで細胞株、組織試料又は他の生体物質に対して適切な抗体、阻害剤又は他の市販の製品を試験することで、ＢＯ−１１Ｘ投与が、ＴＬＲ３関連活性に関連する又は関連しない一連（複数の場合もある）の遺伝子、免疫細胞、及び／又は癌に対する応答に影響を及ぼすことによって、免疫応答及び／又は癌に対する応答にどのように影響を及ぼし得るかを規定することが可能である。上記のアプローチは、かかる製剤による治療後又は治療前の患者の細胞又は組織（腫瘍、血液試料又は血液画分等）における１つ以上の遺伝子についてのＲＮＡ及び／又はタンパク質レベルでの発現の存在（及び／又は不在）の組み合わせを決定した後に、疾患（癌等）を患う患者を治療する及び／又は疾患（癌又は感染症等）を予防する方法にＢＯ−１１Ｘ製剤（ＢＯ−１１Ｘｍ製剤を含む）を使用する、本発明の一連の更なる実施形態をもたらすことができる。したがって、これらの方法は、
（ｉ）治療有効量のＢＯ−１１Ｘ製剤（又はＢＯ−１１Ｘｍ製剤）、
（ｉｉ）ＢＯ−１１Ｘ製剤（又はＢＯ−１１Ｘｍ製剤）による治療後に被験体が抗腫瘍若しくは抗感染応答を有し得ることを予測する、治療的に関連するバイオマーカー（複数の場合もある）、
（ｉｉｉ）ＢＯ−１１Ｘ製剤（又はＢＯ−１１Ｘｍ製剤）による治療後に、被験体を化合物による治療に応答するようにすることができる治療有効量のＢＯ−１１Ｘ製剤（又はＢＯ−１１Ｘｍ製剤）、及び／又は、
（ｉｖ）ＢＯ−１１Ｘ製剤（又はＢＯ−１１Ｘｍ製剤）による治療後に被験体が化合物による治療に応答し得ることを予測する、治療的に関連するバイオマーカー（複数の場合もある）、
に関連する遺伝子発現シグネチャーを規定することを可能にし得る。
【０２２８】
したがって、表Ｉの遺伝子のいずれかを、市販されており、ＲＴ−ＰＣＲ又は抗体ベースの方法等の一般的な技術に適用可能である、これらの遺伝子のいずれかのＲＮＡ及び／又はタンパク質発現を検出／測定する手段を用いて、上の（ｉ）〜（ｉｖ）に要約される使用及び方法に使用することができる）。特に、表Ｉの選択される（一連の）遺伝子の協調的な上方制御及び下方制御を、治療的に投与した場合のＢＯ−１１Ｘ（特にＢＯ−１１２）に対する生物学的応答を規定するために用いることができ、特定の疾患、特に特定の癌関連適応症を呈する患者におけるＴＬＲ３媒介活性、インターフェロン誘導及び／又は免疫応答の調節、臨床病期、及び／又は他の薬物との組み合わせと関連付けることができる。上に挙げた技術に適用可能な製品（核酸プローブ又は抗体等）に加えて、かかる遺伝子の生物活性は、ＢＯ−１１２等のＢＯ−１１Ｘ製剤の投与との潜在的相互作用を適切に試験するために利用可能な様々な商業的及び技術的な薬剤を用いて明確に規定されていることが多い。
【０２２９】
さらに、発現がＢＯ−１１Ｘ製剤（又はＢＯ−１１Ｘｍ製剤）による治療の影響を受けるタンパク質の標的化に更なる治療剤が利用可能である。上述の遺伝子のいずれかを標的とする薬物は、同じ組成物又は別の組成物のいずれかにおいて投与することによってＢＯ−１１Ｘ製剤と組み合わせて有利に使用され得る。
【０２３０】
参照文献
Abiko K et al., 2015. Br J Cancer;112:1501-9.
Ammi R et al., 2015. Pharmacol. Ther.;146:1 20-31.
Amos SM et al.,2011. Cancer Immunol. Immunother.; 60: 671-83. 
Ayers M et al.  2017. J Clin Invest.;127(8):2930-2940. 
Bald T et al., 2014. Cancer Discov.; 4: 674-87.
Bhoopathi P et al., 2014. Cancer Res.; 74: 6224-35.
Bilensoy E, 2010. Expert Opin. Drug Deliv.; 7: 795-809.
Budczies J et al., 2017. Genes Chromosomes Cancer;56(8):651-659.
Chen DS and Mellman I, 2013. Immunity; 25;39:1-10
Chen L et al., 2013. Int. J. Nanomed.; 8:137-145.
Chiba Y et al., 2013. PLoSOne.; 8: e76159.
Cho K. et al., 2016, Immunobiology. 222(2):394-398 ( Epub 2016 Aug 31).
Cobaleda-Siles M et al., 2014. Small.; 10: 5054-67.
Da Silva DM et al., 2015. Papillomavirus Res. 1;1:12-21
Duewell P et al., 2015., OncoImmunol.; 4(10): e1029698.
Ewel C et al., 1992. Cancer Res.; 52: 3005-10.
Feng M et al., 2015. Proc Natl Acad Sci U S A.; 112(7):2145-50
Fritsch EF et al., 2014. Oncoimmunology. 25;3:e29311
Fujimura T et al., 2006. Eur. J. Immunol.; 36: 3371-80.
Gallois A and Bhardwaj N, 2013. Front Immunol. 10;4:436.
Galluzzi L et al., 2014. Oncotarget; 5: 12472-508.
Garcia-Pascual C and Gomez R, 2013. J. Endometr.; 5(suppl.1):S13 (SP-04).
Germershaus O and Nultsch K, 2015. Asi J Pharm Sci. 10: 159-175.
Gong J et al. 2017. J Natl Compr Canc Netw.;15(2):142-147.
Gonzalez FE et al., 2014. Hum Vaccin Immunother. 10(11):3261-9.
Gupta S et al. 2016. Tumor Biol. 37: 12089 - 12102.
Hafner A et al., 2013. Advanced Drug Delivery Rev.; 65 (10): 1386-1399.
Hammerich L et al., 2015. Mol Oncol. 9(10):1966-81.
Hervas-Stubbs S et al., 2012. J Immunol. 189(7):3299-310
Ho V et al.,2015. Oncotarget. 6: 27252 - 27266).
Islam M et al., 2014. Journal of Controlled Release; 193: 74-89.
Jain A et al., 2014. Front Immunol.; 17;5:553.
Kabilova T et al., 2014. BMC Cancer.; 14: 338.
Keir M et al., 2008. Annu. Rev. Immunol.; 26: 677-704.
Kubler K et al., 2011. Eur. J. Immunol.; 41: 3028-39.
Kurosaki T et al., 2009. Biomaterials,30: 2846-2853.
Le U et al., 2008. Canc. Biol. Ther.; 7: 440-447.
Le U et al., 2009. Radiother. Oncol.; 90: 273-279.
Levitzki A, 2012. Front. Oncol.; 2: 4. 
Li YY et al., 2017. Expert Opin Ther Pat.; 27: 643-656.  
Lim J and Tan D, 2017. Cancers (Basel;9(8). pii:E109.
Ling H, 2016. Adv Exp Med Biol.; 937:229-37.
Masucci G et al., 2016. J Immunother Cancer.  4: 76.
Matijevie T et al., 2011. Chemotherapy; 57: 460-7.
McBain S et al., 2007. J. Mater. Chem.; 17: 2561-2565.
Molina-Cerrillo J et al., 2017. Cancer Treat Rev.; 58:41-50. 
Nagato T and Celis E, 2014. Oncoimmunology; 3: e28440.
Ochoa MC et al., 2017. Immunol Cell Biol. 95(4):347-355.
Ohashi T et al., 2013. Int. J. Cancer; 133: 1107-18.
Osada T et al., 2015. J Immunother. 38(4):155-64
Palchetti S et al., 2013. RSC Adv.; 3: 24597-24604.
Perica K et al, 2015. Rambam Maimonides Med J.  6(1): e0004.
Perrot I et al., 2010. J. Immunol.  185:2080-2088.
Ping L et al., 2017. Oncotarget; 8(24):39218-39229. 
Pozuelo-Rubio M et al., 2014. Nano-Oncologicals in Adv. Del. Sci. Tech., Springer, pp. 453-470.
Saheki A et al., 2011. Int. J. Pharm.; 406: 117-21.
Sajadian A et al., 2014. Arch. Virol.; 159: 1951-1960.
Sanchez-Paulete AR et al., 2015. Cancer Discov.; pii: CD-15-0510.
Schaffert D et al., 2011. Pharm. Res., 28: 731-741. 
Shabani M et al., 2010. Avicenna J. Med. Biotech.; 2: 123-130.
Shin DS et al., 2017. Cancer Discov.;7(2):188-201.
Storz U, 2011. MAbs. 3: 310-7.
Sudhan D and Siemann D, 2015. Pharmacol Ther.;155:105-16.
Szabo A et al., 2012. Melanoma Res.; 22: 351-361.
Tai LH et al. 2013, Clin Cancer Res. 19:5104-15.
Tan S et al. 2016. Protein Cell;7(12):866-877.
Taura M et al., 2010. Cancer Sci.; 101: 1610-7.
Tormo D et al., 2009.Cancer Cell; 16: 103-114.
Tutin-Moeavin I et al., 2015.Org & Biomol Chem. 13: 9005-9011.
Umemura N. et al., 2012. Cancer Res. 72: 45-55.
Vacchelli E et al., 2013. Oncoimmunology; 2: e25396, e23510, e25595. 
Van der Jeught K et al., 2015. Oncotarget; 6: 1359-81.
Vanderlocht J et al., 2010. Int J Immunopathol Pharmacol.;23(1):35-50.
Vega-Letter A et al., 2016. Stem Cell Res. & Ther. 7:150
Yoshino H and Kashiwakura I, 2013.Blood; 122: 4721.
Yu L et al., 2016. Immunol Cell Biol. 94:875-885.
Zaretsky J et al., 2016. N Engl J Med. 375:819-829
Zhang Y et al., 2014.Cancer Lett. 355: 76-84. 
Zhou Y et al., 2013. Innate Immun.; 19: 184-192.
【図１】
2020520368.tif 000005
【図２】
2020520368.tif 000006
【図３】
2020520368.tif 000007
【図４】
2020520368.tif 000008
【図５】
2020520368.tif 000009
【図６】
2020520368.tif 000010
【図７】
2020520368.tif 000011
【図８】
2020520368.tif 000012
【図９】
2020520368.tif 000013
【図１０】
2020520368.tif 000014
【図１１】
2020520368.tif 000015
【図１２】
2020520368.tif 000016
【図１３】
2020520368.tif 000017
【図１４】
2020520368.tif 000018
【図１５】
2020520368.tif 000019
【図１６】
2020520368.tif 000020
【図１７】
2020520368.tif 000021
【国際調査報告】
2020520368.tif 000022
2020520368.tif 000023
2020520368.tif 000024
2020520368.tif 000025