(57)【要約】  本発明は、タンパク質の蛍光標識の分野に関する。特に本発明は、目的の生体分子、好ましくは目的のタンパク質を蛍光標識するための、光反応性黄色タンパク質（ＰＹＰ）の機能的誘導体またはその機能的フラグメントに可逆的に結合できる膜不透過性蛍光発生発色団に関する。特に本発明は、膜不透過性蛍光発生発色団としての式（ＩＩ）：  【化１】2020520676.tif 000018の４−ヒドロキシベンジリデン−ロダニン（ＨＢＲ）アナログに関する。【選択図】なし
2020520676.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光反応性黄色タンパク質（ＰＹＰ）機能的誘導体またはその機能的フラグメントと、式（ＩＩ）：
【化１】
2020520676.tif 000012
の化合物またはその塩と、によって形成された複合体であって、式中、
Ｒ１は、水素、少なくとも２個の炭素原子を有するアルキル基、または少なくとも２個の炭素原子を有するアルコキシ基を表し、
Ｒ２は、水素、アルキル基、またはアルコキシ基を表し、
Ｒ３は、カルボキシアルキル基を表し、ここで、前記基のアルキル部分は、１〜３個の炭素原子、好ましくは１または２個の炭素原子、より好ましくは１個の炭素原子、を含み、
Ｒ１およびＲ２から選択される正確に１つの基が水素である、
複合体。
【請求項２】
Ｒ１が、
２〜６個の炭素原子、好ましくは２〜４個の炭素原子、より好ましくは２もしくは３個の炭素原子、を含むアルキル基；または
２〜６個の炭素原子、好ましくは２〜４個の炭素原子、より好ましくは２もしくは３個の炭素原子、を含むアルコキシ基；
を表し、
Ｒ２が水素を表し；Ｒ３がカルボキシメチル基を表す、
請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
Ｒ１がエチル基を表し；Ｒ２が水素を表し；Ｒ３がカルボキシメチル基を表す、請求項１または２に記載の複合体。
【請求項４】
Ｒ１が水素を表し；Ｒ２が、１〜６個の炭素原子、好ましくは１〜４個の炭素原子、より好ましくは１または２個の炭素原子、を含むアルコキシ基を表し；Ｒ３がカルボキシメチル基を表す、請求項１に記載の複合体。
【請求項５】
光反応性黄色タンパク質（ＰＹＰ）機能的誘導体またはその機能的フラグメントが、約２５℃の温度で測定した場合、約１５μＭ未満、好ましくは約１０μＭ未満のＫＤで式（ＩＩ）の化合物と結合する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項６】
膜不透過性蛍光発生発色団としての式（ＩＩ）：
【化２】
2020520676.tif 000013
の化合物またはその塩の使用であって、式中、
Ｒ１が、水素、少なくとも２個の炭素原子を有するアルキル基、または少なくとも２個の炭素原子を有するアルコキシ基を表し、
Ｒ２が、水素、アルキル基、またはアルコキシ基を表し、
Ｒ３が、カルボキシアルキル基を表し、ここで、前記基のアルキル部分は、１〜３個の炭素原子、好ましくは１または２個の炭素原子、より好ましくは１個の炭素原子を含み、
Ｒ１およびＲ２から選択される正確に１つの基が水素である、
使用。
【請求項７】
式（ＩＩ）の化合物またはその塩が、少なくとも１つの他の蛍光発生発色団と組み合わせて；好ましくは異なる波長で光放出する蛍光発生発色団および／または膜透過性蛍光発生発色団と組み合わせて；より好ましくは４−ヒドロキシベンジリデン  ロダニンまたは４−ヒドロキシ−３−メチルベンジリデンロダニンと組み合わせて；使用される、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
少なくとも１つの膜により封入されている区画を含むサンプルにおいて、目的の生体分子、好ましくは目的のタンパク質を検出するための方法であって、
前記目的の生体分子に光反応性黄色タンパク質（ＰＹＰ）機能的誘導体またはその機能的フラグメントを融合させることにより、ＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントで前記目的の生体分子をタグ付けするステップと、
前記サンプルを、式（ＩＩ）：
【化３】
2020520676.tif 000014
の膜不透過性蛍光発生発色団またはその塩と接触させるステップであって、式中、
Ｒ１が、水素、少なくとも２個の炭素原子を有するアルキル基、または少なくとも２個の炭素原子を有するアルコキシ基を表し、
Ｒ２が、水素、アルキル基、またはアルコキシ基を表し、
Ｒ３が、カルボキシアルキル基を表し、ここで、前記基のアルキル部分は、１〜３個の炭素原子、好ましくは１または２個の炭素原子、より好ましくは１個の炭素原子を含み、
Ｒ１およびＲ２から選択される正確に１つの基が水素である、ステップと、
光反応性黄色タンパク質（ＰＹＰ）機能的誘導体またはその機能的フラグメントに対する式（ＩＩ）の膜不透過性蛍光発生発色団の結合に起因する蛍光を検出するステップと、
を含み、それにより、光反応性黄色タンパク質（ＰＹＰ）機能的誘導体またはその機能的フラグメントに対する式（ＩＩ）の膜不透過性蛍光発生発色団の結合を介して、前記区画の膜外表面に少なくとも一部が存在するかまたは前記区画から分泌される目的の生体分子を検出する、方法。
【請求項９】
前記目的の生体分子が、前記膜の外側にタンパク質の少なくとも一部が突き出た膜タンパク質、または分泌型タンパク質である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
光反応性黄色タンパク質（ＰＹＰ）機能的誘導体またはその機能的フラグメントに対する前記膜不透過性蛍光発生発色団の結合が、可逆的である、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記目的の生体分子にタグ付けされたＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントに対する式（ＩＩ）の膜不透過性蛍光発生発色団の結合時に発せられる蛍光を測定することによって前記目的の生体分子を定量化するステップをさらに含む、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも１つの膜により封入されている区画を含むサンプルにおいて目的のタンパク質を順次標識するための方法であって、
前記目的のタンパク質に光反応性黄色タンパク質（ＰＹＰ）機能的誘導体またはその機能的フラグメントを融合させることにより、ＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントで前記目的のタンパク質をタグ付けするステップと、
前記サンプルを、式（ＩＩ）：
【化４】
2020520676.tif 000015
の膜不透過性蛍光発生発色団またはその塩と接触させるステップであって、式中、
Ｒ１が、水素、少なくとも２個の炭素原子を有するアルキル基、または少なくとも２個の炭素原子を有するアルコキシ基を表し、
Ｒ２が、水素、アルキル基、またはアルコキシ基を表し、
Ｒ３が、カルボキシアルキル基を表し、ここで、前記基のアルキル部分は、１〜３個の炭素原子、好ましくは１または２個の炭素原子、より好ましくは１個の炭素原子を含み、
Ｒ１およびＲ２から選択される正確に１つの基が水素である、
ステップと、
ＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントに対する式（ＩＩ）の膜不透過性蛍光発生発色団の結合に起因する蛍光を検出することにより、前記区画の膜外表面に少なくとも一部が存在するかまたは前記区画から分泌される目的のタンパク質のフラクションを検出するステップと、
前記サンプルを、前記目的のタンパク質に特異的に結合できる膜透過性蛍光発生発色団と接触させるステップと、
前記目的のタンパク質に対する膜透過性蛍光発生発色団の結合に起因する蛍光を検出することにより、前記目的のタンパク質の集合全体を検出するステップと、
を含む方法。
【請求項１３】
少なくとも１つの膜により封入されている区画を含むサンプルにおけるレポータータンパク質の検出に依存するアッセイであって、
光反応性黄色タンパク質（ＰＹＰ）機能的誘導体またはその機能的フラグメントでタグ付けされた、タグ付きレポータータンパク質を得るステップと、
前記サンプルを、式（ＩＩ）：
【化５】
2020520676.tif 000016
の膜不透過性蛍光発生発色団またはその塩と接触させるステップであって、式中、
Ｒ１が、水素、少なくとも２個の炭素原子を有するアルキル基、または少なくとも２個の炭素原子を有するアルコキシ基を表し、
Ｒ２が、水素、アルキル基、またはアルコキシ基を表し、
Ｒ３が、カルボキシアルキル基を表し、ここで、前記基のアルキル部分は、１〜３個の炭素原子、好ましくは１または２個の炭素原子、より好ましくは１個の炭素原子を含み、
Ｒ１およびＲ２から選択される正確に１つの基が水素である、
ステップと、
ＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントに対する式（ＩＩ）の膜不透過性蛍光発生発色団の結合に起因する蛍光を検出するステップと、
を含み、それにより、ＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントに対する式（ＩＩ）の膜不透過性蛍光発生発色団の結合を介して、前記区画の膜外表面に少なくとも一部が存在するかまたは前記区画から分泌されるレポータータンパク質を検出する、アッセイ。
【請求項１４】
前記アッセイが、前記膜でのレポータータンパク質の発現もしくはアンカリングまたはレポータータンパク質の分泌に関与する目的のタンパク質の活性を評価するためのものである、請求項１３に記載のアッセイ。
【請求項１５】
式（ＩＩＩ）：
【化６】
2020520676.tif 000017
の化合物またはその塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質の蛍光標識の分野に関する。特に本発明は、目的の生体分子（好ましくは目的のタンパク質）を蛍光標識するための光反応性黄色タンパク質（ＰＹＰ：Photoactive Yellow Protein）の機能的誘導体またはその機能的フラグメントに可逆的に結合できる膜不透過性蛍光発生発色団に関する。
【０００２】
特に本発明は、膜不透過性蛍光発生発色団としての４−ヒドロキシベンジリデン−ロダニン（ＨＢＲ）アナログに関する。
【背景技術】
【０００３】
オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）由来の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＲ）の発見は、ＧＦＰとの遺伝的な融合によって生物系のタンパク質の動態を研究することを最初に可能にしたことから、生体分子のイメージングに不可欠なものとなっている。新規の蛍光タンパク質の発見および発展が、多色イメージングおよびバイオセンサの設計を促進させ、超解像顕微鏡技術の出現に寄与している。生細胞のタンパク質を定量的に局所化できるＧＦＰ様蛍光タンパク質ではあるが、これらは、タンパク質の輸送、再分布、および再利用を含む細胞事象を調査することに関しては最適ではない。このことは特に、膜タンパク質を含むプロセスに当てはまる。特に、ＧＦＰタグ付与を介して細胞表面タンパク質（たとえば膜貫通型受容体、細胞接着タンパク質）の機能および組織を研究することは、これらタンパク質の生合成、分泌、および分解に関与する細胞構造の同時標識から生じる蛍光のバックグラウンドによって限定されている。
【０００４】
膜の細胞外側にアンカリングされたタンパク質に蛍光を限定するための方法として、膜不透過性フルオロフォアで標識できるペプチドでのタンパク質のタグ付与が挙げられる。一般的な、表面タンパク質の標識を認識するためのペプチドタグとして、ＳＮＡＰ−ｔａｇ／ＣＬＩＰ−ｔａｇまたはＨａｌｏｔａｇなどの自己標識タグ、ならびにビオチンリガーゼおよびホスホパンテテイントランスフェラーゼなどの結合酵素で修飾され得る小さなペプチドがある。しかしながら、共有結合のタンパク質標識方法に関連する標識プロトコルは、最適ではない。複数の試薬を添加する必要があり、かつ／または、過剰なフルオロフォアを排除するために数回の洗浄ステップが必要である。標識化の動態は、多くの場合ゆっくりであり、動的なプロセスの研究を妨げている。過剰なフルオロフォアは、標識時間を低減し得るが、選択性およびコントラストを犠牲にしている。最後に、この標識は、不可逆的である。
【０００５】
迅速な蛍光発生標識戦略は、それ自体では非蛍光性である、膜不透過性蛍光発生発色団、いわゆる「フルオロゲン（fluorogen）」の蛍光を活性化するために非共有結合での分子の認識を使用することにより、これらの問題を解決することを目的とする。非共有結合での分子の認識は、化学反応が関与しないため、より迅速な標識を保証している。さらに、結合していないフルオロゲンは蛍光性ではないため、洗浄ステップは必要ではなく、さらに一時的に標識の分解能を増大させる。たとえば、一本鎖抗体由来のフルオロゲン活性化タンパク質（ＦＡＰ：Fluorogen-Activating Protein）により認識される膜不透過性マラカイトグリーン誘導体は、表面に露出したタンパク質のほぼ瞬間的な標識を可能にした。しかしながら、これら色素の一部に長期間曝露することは、非特異的な標識および部分的な細胞への透過をもたらすことが報告されている。
【０００６】
国際公開第２０１６／００１４３７号は、ＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントを含む新規のペプチドタグを開示している。特に国際公開第２０１６／００１４３７号は、出願人により開発されたフルオロゲンベースのレポーターである、黄色蛍光活性化・吸収シフトタグ（Ｙ−ＦＡＳＴ：yellow fluorescence-activating and absorption-shifting tag、本明細書中以下では「ＦＡＳＴ」）を開示している。ＦＡＳＴは、様々な蛍光発生発色団と複合体を形成できるＰＹＰ由来の１４ｋＤａのタンパク質のタグである。ＦＡＳＴは、フルオロゲンの活性化に関する２つの分光学的な変化：蛍光の量子収率の増加および吸収光の赤方偏移（absorption red shift）に依存している。非結合であるかまたは非特異的に結合したフルオロゲンが励起波長の選択を介して区別され得るため、結合時のさらなる吸収光の赤方偏移は、より著しいイメージングの選択性およびコントラストを確保する。ＦＡＳＴは、４−ヒドロキシベンジリデン  ロダニン（ＨＢＲ）および４−ヒドロキシ−３−メチルベンジリデンロダニン（ＨＭＢＲ）：
【化１】
2020520676.tif 000003
の結合および蛍光の活性化に特に効率的である。
【０００７】
しかしながら、従来技術由来のＦＡＳＴベースの標識化方法で述べられている蛍光発生発色団（ＨＢＲおよびＨＭＢＲなど）は、膜透過性蛍光発生発色団である。よってこれらを、細胞外タンパク質、特に膜タンパク質の細胞外ドメインを選択的に検出するために使用することはできない。さらに、上述のマラカイトグリーン誘導体などの膜不透過性蛍光発生発色団は、ＦＡＳＴタンパク質に適合可能ではない。
【０００８】
タグ付与した細胞表面タンパク質を選択的に検出する可能性を研究者に提供するために、細胞膜を通ることができず、同時にタンパク質タグ（特にＦＡＳＴ）と十分安定した蛍光複合体を形成できる、新規のフルオロゲンが必要とされている。
【０００９】
よって、本出願人は、蛍光発生発色団についての詳細な研究を行い、驚くべきことに、特定の４−ヒドロキシベンジリデン−ロダニン（ＨＢＲ）アナログが、有力な膜不透過性蛍光発生発色団として使用され得ることを見出した。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、光反応性黄色タンパク質（ＰＹＰ）機能的誘導体またはその機能的フラグメントと、式（ＩＩ）：
【化２】
2020520676.tif 000004
の化合物であって、式中、
Ｒ１が、水素、少なくとも２個の炭素原子を有するアルキル基、または少なくとも２個の炭素原子を有するアルコキシ基を表し、
Ｒ２が、水素、アルキル基、またはアルコキシ基を表し、
Ｒ３が、カルボキシアルキル基を表し、ここで、前記基のアルキル部分は、１〜３個の炭素原子（好ましくは１または２個の炭素原子、より好ましくは１個の炭素原子）を含み、
Ｒ１およびＲ２から選択される正確に１つの基が水素である、
化合物またはその塩と、によって形成された複合体に関する。
【００１１】
一実施形態では、Ｒ１は、２〜６個の炭素原子、好ましくは２〜４個の炭素原子、より好ましくは２もしくは３個の炭素原子を含むアルキル基；または２〜６個の炭素原子、好ましくは２〜４個の炭素原子、より好ましくは２もしくは３個の炭素原子を含むアルコキシ基を表し；Ｒ２は、水素を表し；Ｒ３はカルボキシメチル基を表す。
【００１２】
一実施形態では、Ｒ１は、エチル基を表し；Ｒ２は水素を表し；Ｒ３はカルボキシメチル基を表す。
【００１３】
一実施形態では、Ｒ１は水素を表し；Ｒ２は、１〜６個の炭素原子、好ましくは１〜４個の炭素原子、より好ましくは１または２個の炭素原子を含むアルコキシ基を表し；Ｒ３はカルボキシメチル基を表す。
【００１４】
一実施形態では、ＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントは、約２５℃の温度で測定した際に、約１５μＭ未満（好ましくは約１０μＭ未満）のＫＤで式（ＩＩ）の化合物と結合する。
【００１５】
さらに本発明は、膜不透過性蛍光発生発色団としての、上述の式（ＩＩ）の化合物またはその塩の使用に関する。
【００１６】
一実施形態では、式（ＩＩ）の化合物またはその塩は、少なくとも１つの他の蛍光発生発色団と組み合わせて、好ましくは異なる波長で光放出する蛍光発生発色団および／または膜透過性蛍光発生発色団と組み合わせて、より好ましくは４−ヒドロキシベンジリデン  ロダニンまたは４−ヒドロキシ−３−メチルベンジリデンロダニンと組み合わせて、使用される。
【００１７】
さらに本発明は、少なくとも１つの膜により封入されている区画を含むサンプルにおいて、目的の生体分子（好ましくは目的のタンパク質）を検出するための方法であって、
前記目的の生体分子にＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントを融合させることにより、ＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントで前記目的の生体分子をタグ付けするステップと、
前記サンプルを、上述の式（ＩＩ）の膜不透過性蛍光発生発色団またはその塩と接触させるステップと、
ＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントに対する式（ＩＩ）の膜不透過性蛍光発生発色団の結合に起因する蛍光を検出するステップと、を含み、それにより、ＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントに対する式（ＩＩ）の膜不透過性蛍光発生発色団の結合を介して、前記区画の膜外表面（extra membranous surface）に少なくとも一部が存在するかまたは前記区画から分泌される目的の生体分子を検出する、方法に関する。
【００１８】
一実施形態では、目的の生体分子は、上記膜の外側にタンパク質の少なくとも一部が突き出た膜タンパク質、または分泌型タンパク質である。
【００１９】
一実施形態では、ＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントに対する膜不透過性蛍光発生発色団の結合は、可逆的である。
【００２０】
一実施形態では、本方法はさらに、目的の生体分子にタグ付けされたＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントに対する式（ＩＩ）の膜不透過性蛍光発生発色団の結合時に発せられる蛍光を測定することにより、目的の生体分子を定量化するステップを含む。
【００２１】
さらに本発明は、少なくとも１つの膜により封入されている区画を含むサンプルにおいて目的のタンパク質を順次標識するための方法であって、
ＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントを目的のタンパク質に融合させることにより、ＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントで目的のタンパク質をタグ付けするステップと、
前記サンプルを、上述の式（ＩＩ）の膜不透過性蛍光発生発色団またはその塩と接触させるステップと、
ＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントに対する式（ＩＩ）の膜不透過性蛍光発生発色団の結合に起因する蛍光を検出することにより、前記区画の膜外表面に少なくとも一部が存在するかまたは前記区画から分泌される目的のタンパク質のフラクションを検出するステップと、
前記サンプルを、前記目的のタンパク質に特異的に結合できる膜透過性蛍光発生発色団と接触させるステップと、
前記目的のタンパク質に対する膜透過性蛍光発生発色団の結合に起因する蛍光を検出することにより、前記目的のタンパク質の集合全体を検出するステップと、
を含む方法に関する。
【００２２】
さらに本発明は、少なくとも１つの膜により封入されている区画を含むサンプル中のレポータータンパク質の検出に依存するアッセイであって、
ＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントでタグ付けされている、タグ付きレポータータンパク質を得るステップと、
前記サンプルを、上述の式（ＩＩ）の膜不透過性蛍光発生発色団またはその塩と接触させるステップと、
ＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントに対する式（ＩＩ）の膜不透過性蛍光発生発色団の結合に起因する蛍光を検出するステップと、
を含み、それにより、ＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントに対する式（ＩＩ）の膜不透過性蛍光発生発色団の結合を介して、前記区画の膜外表面に少なくとも一部が存在するかまたは前記区画から分泌されるレポータータンパク質を検出する、
アッセイに関する。
【００２３】
一実施形態では、このアッセイは、膜でのレポータータンパク質の発現もしくはアンカリングまたはレポータータンパク質の分泌に関与する目的のタンパク質の活性を評価するためのものである。
【００２４】
さらに本発明は、式（ＩＩＩ）：
【化３】
2020520676.tif 000005
の化合物またはその塩に関する。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
定義
本発明では、以下の用語は以下の意味を有する。
【００２６】
数字の前にある「約」は、上記数字の値の±１０％を意味する。
【００２７】
「酸性官能基（acid function）」は、ブレンステッドの酸、すなわちプロトンまたは水素イオン（Ｈ＋）を供与できる原子の基、を表す。
【００２８】
「塩基性官能基（basic function）」は、ブレンステッドの塩基、すなわち、プロトンまたは水素イオン（Ｈ＋）を受容できる原子の基を表す。
【００２９】
「輝度」は、エミッタあたりの蛍光出力を表す。これは、（励起波長での）モル吸光係数および蛍光の量子収率の積に相当する。
【００３０】
「細胞表面タンパク質」は、本発明において、細胞外表面に少なくとも一部が存在するタンパク質を表す。言い換えると、本発明では、細胞表面タンパク質は、細胞膜（形質膜とも呼ばれている）から少なくとも一部が突き出ている。一実施形態では、細胞表面タンパク質は、膜タンパク質、たとえば、膜貫通型タンパク質または細胞膜でアンカリングされ、少なくとも１つの細胞外ドメインを有するタンパク質である。一実施形態では、細胞表面タンパク質は、細胞膜の細胞外表面に存在するタンパク質である。
【００３１】
「発色団」は、特定の波長で光を吸収し、これにより色を呈する分子を表す。
【００３２】
「少なくとも１つの膜により封入されている区画」は、本発明において、極性の脂質層、好ましくは極性の脂質二重層からなる生体膜により区切られているいずれかの閉鎖的な実体を表す。少なくとも１つの膜により封入されている区画の例として、限定するものではないが、細胞、ベジクル、人工的な形質膜を模倣したベジクルが、挙げられる。
【００３３】
「複合体」は、本発明の文脈の中では、ポリペプチド、好ましくはＰＹＰポリペプチドの、有機分子または有機分子由来の塩、好ましくは蛍光発生発色団との非共有結合または共有結合、好ましくは非共有結合を表す。
【００３４】
タンパク質の「誘導体」は、当該タンパク質のフラグメントまたはバリアントを表す。
【００３５】
「膜外表面」は、本発明の文脈の中では、たとえば細胞、ベジクル、または人工的な形質膜を模倣したベジクルなどの区画を封入する膜の外または外側の表面を表す。よって本発明では、少なくとも１つの膜により封入されている区画の膜外表面は、上記区画の外側の膜の表面を表す。よって、（少なくとも１つの膜により封入されている区画の）膜外表面に存在する生体分子は、上記膜の外面に少なくとも一部が存在している生体分子、すなわち、少なくとも１つの膜により封入されている区画の外側に少なくとも一部が存在する生体分子である。
【００３６】
「蛍光発生発色団」は、本発明の文脈の中では、その輝度が環境の変化によって有意に亢進し得る、発色団を表す。本発明の蛍光発生発色団は、遊離形態下では溶液中で実質的に非蛍光性であるが、その立体構造を限定し、励起状態の非蛍光性脱励起を除外した環境に置かれた際に輝く。本発明の特定の実施形態では、遊離する色素（すなわち蛍光発生発色団）は、溶液中ではほぼ視認することができず、タンパク質のキャビティに上記蛍光発生発色団を入れるタンパク質のスキャフォールドの結合が起こると、蛍光性となる。
【００３７】
「φ」により表される「蛍光の量子収率」は、「蛍光発生発色団」により吸収された光子の数に対する、発せられた光子の数の比を表す。
【００３８】
「フルオロフォア」は、光励起時に、光を再度発することができる蛍光性の化学化合物を表す。
【００３９】
「ペプチド」は、ペプチド結合によりまとめて結合された５０個未満のアミノ酸である直鎖状のアミノ酸のポリマーを表す。さらに、用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は、特段言及されない限り、互換可能に使用され得る。一実施形態では、「ポリペプチド」は、ペプチド結合によりまとめて結合された少なくとも５０個のアミノ酸である、直鎖状のポリマーを表し；「タンパク質」は、具体的には、１つ以上のペプチドまたはポリペプチド、および任意選択で非ポリペプチドの補因子から形成された機能的な実体を表す。
【００４０】
「生理的なｐＨ」は、水性媒体で測定された、約７〜約７．６、好ましくは約７．４のｐＨを表す。
【００４１】
「膜」は、極性の脂質層、好ましくは極性の脂質二重層からなる生体膜を表す。本発明では、生体膜は、原核生物または真核生物の細胞膜、ベジクルの膜、人工的なベジクルの膜を含む。よって細胞膜として、限定するものではないが、動物細胞、植物細胞、真菌、酵母、および細菌の膜が挙げられる。
【００４２】
「膜不透過性」は、ある化合物の、膜を通ることができない特性を表す。
【００４３】
「膜透過性」は、ある化合物の、膜を通ることができる特性を表す。
【００４４】
「モル吸光係数」は、「ε」により表される、ある化学種が所定の波長でどの程度強く光を吸収するかの測定値を表す。
【００４５】
「レポータータンパク質」は、たとえば別のタンパク質の活性、タンパク質間の相互作用、タンパク質のインターナリゼーション、またはタンパク質の分泌などの、標的または目的の機構を間接的に評価するための方法として、検出、局在化、または定量化され得るタンパク質を表す。
【００４６】
「サンプル」は、少なくとも１つの目的の生体分子と、少なくとも１つの膜とを含む検体、または少量の物質、全般的には固体または液体を表す。また「サンプル」は、目的の細胞または組織または生命体を表し得る。
【００４７】
「分泌型タンパク質」は、当初は細胞または少なくとも１つの膜により封入されている区画の中に存在し、排泄、すなわち上記細胞または上記区画を出るタンパク質を表す。
【００４８】
「アルコキシ」は、Ｏ−アルキル基を表す。アルコキシ基の例として、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、またはドデコキシがある。
【００４９】
「アミド」は、−ＮＲ−ＣＯＲ’官能基（式中、Ｒは、−Ｈまたはアルキル基を表し、Ｒ’はアルキル基を表す）を表す。
【００５０】
「アミノ」は、−ＮＨ２基、またはその、有機の脂肪族もしくは芳香族の基での１つまたは水素原子の置換により派生したいずれかの基を表す。好ましくは−ＮＨ２由来の基は、アルキルアミノ基であり、すなわち、モノアルキルアミノおよびジアルキルアミノを含むＮ−アルキル基である。特定の実施形態では、用語「アミノ」は、−ＮＨ２、−ＮＨＭｅ、または−ＮＭｅ２を表す。
【００５１】
「アリール」は、通常５〜１２個の原子、好ましくは６〜１０個の原子を含む、単環（すなわちフェニル）またはまとめて縮合（ナフチル）もしくは共有結合した複数の芳香環（少なくとも１つの環が芳香環である）を有する、多価不飽和型の芳香族のヒドロカルビル基を表す。この芳香環は、任意選択で、これに縮合した１〜２個のさらなる環（シクロアルキル、ヘテロシクリル、またはヘテロアリール）を含み得る。またアリールは、本明細書中列挙される炭素環系の部分的に水素付加された誘導体を含むように意図されている。アリールの例として、フェニル、ビフェニリル、ビフェニレニル、５−または６−テトラリニル、ナフタレン−１−または２−イル、４−、５−、６−または７−インデニル、１−、２−、３−、４−または５−アセナフチレニル（acenaphtylenyl）、３−、４−または５−アセナフテニル（acenaphtenyl）、１−または２−ペンタレニル、４−または５−インダニル、５−、６−、７−または８−テトラヒドロナフチル、１，２，３，４−テトラヒドロナフチル、１，４−ジヒドロナフチル、１−、２−、３−、４−または５−ピレニルが挙げられる。
【００５２】
「アルキル」は、式ＣｎＨ２ｎ＋１（式中ｎは、１以上の数である）のヒドロカルビルラジカルを表す。通常、本発明のアルキル基は、１〜１２個の炭素原子、好ましくは１〜６個の炭素原子を含む。アルキル基は、直鎖状または分枝状であってもよく、本明細書中表されるように置換されていてもよい。適切なアルキル基として、メチル、エチル、プロピル（ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル）、ブチル（ｉ−ブチル、ｓ−ブチル、およびｔ−ブチル）、ペンチルおよびそのアイソマー（たとえばｎ−ペンチル、イソ−ペンチル）、ならびにヘキシルおよびそのアイソマー（たとえばｎ−ヘキシル、イソ−ヘキシル）が挙げられる。
【００５３】
「カルボキサミド」は、−ＣＯ−ＮＲ官能基（式中Ｒは−Ｈまたはアルキル基であり得る）を表す。
【００５４】
「カルボキシ」は、−ＣＯＯ−およびその塩を含む、−ＣＯＯＨ官能基を表す。
【００５５】
「カルボキシアルキル」は、１つ以上のカルボキシ基で置換されたいずれかのアルキル基を表す。カルボキシアルキル基の例として、カルボキシメチル（−ＣＨ２ＣＯＯＨ）基およびカルボキシエチル（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ）基がある。
【００５６】
「シアノ」は、−Ｃ≡Ｎ官能基を表す。
【００５７】
「シクロアルキル」は、環状のアルキル基、すなわち、１または２個の環構造を有する一価の飽和型または不飽和型のヒドロカルビル基を表す。シクロアルキルは、単環または二環のヒドロカルビル基を含む。シクロアルキル基は、環に３つ以上の炭素原子を含み得、全般的に、本発明では、３〜１０個、より好ましくは３〜８個の炭素原子、さらにより好ましくは３〜６個の炭素原子を含む。シクロアルキル基の例として、限定するものではないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルが挙げられる。
【００５８】
「ハロ」は、フルオロ、クロロ、ブロモ、またはヨードを表す。好ましいハロ基は、フルオロおよびクロロである。
【００５９】
「ハロアルキル」は、１つ以上のハロ基で置換されたいずれかのアルキル基を表す。好ましいハロアルキル基の例として、ＣＦ３、ＣＨＦ２、およびＣＨ２Ｆがある。
【００６０】
「ハロアルコキシ」は、１つ以上のハロ基で置換されたいずれかのアルコキシ基を表す。
【００６１】
「ヒドロキシル」は、−ＯＨ官能基を表す。
【００６２】
「ヘテロアルキル」は、炭素または水素ではない少なくとも１つの原子を有するアルキル基を表し；好ましくは、上記原子は、Ｎ、Ｓ、Ｐ、およびＯから選択される。たとえばヘテロアルキルは、アルコキシ基であり得る。
【００６３】
「ヘテロシクロアルキル」は、炭素または水素ではない少なくとも１つの原子を有するシクロアルキル基を表し；好ましくは、上記原子は、Ｎ、Ｓ、Ｐ、およびＯから選択される。
【００６４】
「水素」は、基を表す場合、水素原子（Ｈ）を表す。
【００６５】
「ニトロ」は、−ＮＯ２官能基を表す。
【００６６】
「オキソ」は、−Ｃ＝Ｏ官能基を表す。
【００６７】
「ＨＢＲ」は、「４−ヒドロキシベンジリデン−ロダニン」を意味する。
【００６８】
「ＨＭＢＲ」は、「４−ヒドロキシ−３−メチルベンジリデン−ロダニン」を意味する。
【００６９】
「ｎ．ｄ．」は、「決定せず」を意味する。
【００７０】
「ＰＹＰ」は、「光反応性黄色タンパク質（Photoactive Yellow Protein）」を意味する。
【００７１】
詳細な説明
本発明は、膜不透過性蛍光発生発色団として有用な、４−ヒドロキシベンジリデン−ロダニン（ＨＢＲ）アナログに関する。
【００７２】
一実施形態では、ＨＢＲアナログは、式（Ｉ）：
【化４】
2020520676.tif 000006
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、およびＲ５は、同一であってもよいか異なっていてもよく、それぞれが、水素、ハロ、ヒドロキシル、アリール、アルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキルまたはヘテロシクロアルキル基を表し；上記基は、飽和型または不飽和型であり；任意選択で、ハロ、ヒドロキシル、オキソ、ニトロ、アミド、カルボキシ、アミノ、シアノ、カルボキサミド  ハロアルコキシ、およびハロアルキルから選択される少なくとも１つの基で置換されてもよく；
Ｒ３は、水素、ヒドロキシル、アミノ、アリール、アルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、またはヘテロシクロアルキル基を表し；飽和型または不飽和型であり；任意選択で、ハロ、ヒドロキシル、オキソ、ニトロ、アミド、カルボキシ、カルボキサミド、アミノ、シアノ、ハロアルコキシ、およびハロアルキルから選択される少なくとも１つの基で置換されてもよく；
ＸおよびＹは、同一であってもよいか異なっていてもよく、それぞれが、Ｏ、Ｓ、またはＮ−ＲＮ（式中ＲＮは、水素、アリール、アルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、またはヘテロシクロアルキル基である）を表す）
の化合物、またはその塩である。
【００７３】
一実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、およびＲ５は、同時に水素原子を表すことはない（すなわち、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、およびＲ５のうちの少なくとも１つが水素を表すが、全てが同一であることはない）。
【００７４】
一実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、およびＲ５は、同一であってもよいか異なっていてもよく、それぞれが、水素、ハロ、ヒドロキシル、アルキル、またはアルコキシ基を表し；飽和型または不飽和型であり；任意選択で、ハロ、ヒドロキシル、オキソ、ニトロ、アミド、カルボキシ、アミノ、およびシアノから選択される少なくとも１つの基で置換されてもよい。特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、およびＲ５は、同一であってもよいか異なっていてもよく、それぞれが、水素、アルキル、またはアルコキシ基を表す。特定の実施形態では、アルキル基またはアルコキシ基のアルキル部分は、２〜６個の炭素原子、好ましくは２〜４個の炭素原子、より好ましくは２または３個の炭素原子を含む。
【００７５】
一実施形態では、Ｒ３は、荷電した基、すなわち、水性媒体において６〜８の範囲のｐＨ、たとえば生理的ｐＨ（水性媒体において約７．４）において少なくとも１つの電荷を有する基である。一実施形態では、Ｒ３は、正に荷電した基、たとえば四級アンモニウム基を含む。一実施形態では、Ｒ３は、塩基性官能基、たとえば１級アミン、二級アミン、または三級アミンを含む。特定の実施形態では、塩基性官能基は、８超、好ましくは９超のｐＫＡを有する。一実施形態では、Ｒ３は、酸性官能基を含む。特定の実施形態では、酸性官能基は、６未満、好ましくは５未満のｐＫＡを有する。特定の実施形態では、Ｒ３は、少なくとも１つのカルボキシ官能基を含む。より特定の実施形態では、Ｒ３は、５未満、好ましくは約４のｐＫＡを有するカルボキシ官能基を含む。
【００７６】
一実施形態では、Ｒ３は、カルボキシアルキル基を表す。特定の実施形態では、Ｒ３は、正確に１つのカルボキシ置換基を含む。特定の実施形態では、Ｒ３は、カルボキシメチル基（−ＣＨ２ＣＯＯＨ）である。
【００７７】
本発明の化合物は、塩の形態であってもよい。本発明の化合物の塩は、その酸付加塩および塩基付加塩を含む。
【００７８】
適切な酸付加塩は、本発明の化合物および少なくとも１つの酸から形成される。例として、酢酸塩、アジピン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベシル酸塩、炭酸水素塩／炭酸塩、重硫酸塩／硫酸塩、ホウ酸塩、カムシラート、クエン酸塩、シクラミン酸塩、エジシル酸塩、エシル酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルセプト酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、ヘキサフルオロリン酸塩、ヒベンズ酸塩、塩酸塩／塩化物、臭化水素酸塩／臭化物、ヨウ化水素酸塩／ヨウ化物、イセチオン酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メシル酸塩、メチル硫酸塩、ナフチル酸塩（naphthylate）、２−ナプシル酸塩（2-napsylate）、ニコチン酸塩、硝酸塩、オロト酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、リン酸塩／水素、リン酸塩／二水素、リン酸塩、ピログルタミン酸塩、糖酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、トシル化物、トリフルオロ酢酸塩、およびシナホ酸塩が挙げられる。
【００７９】
適切な塩基の塩は、本発明の化合物および少なくとも１つの塩基から形成される。例として、アルミニウム、アルギニン、ベンザチン、カルシウム、コリン、ジエチルアミン、ジオラミン、グリシン、リジン、マグネシウム、メグルミン、オラミン、カリウム、ナトリウム、トロメタミン、２−（ジエチルアミノ）エタノール、エタノールアミン、モルフォリン、４−（２−ヒドロキシエチル）モルフォリン、および亜鉛塩が挙げられる。
【００８０】
たとえばヘミ硫酸塩およびヘミカルシウム塩といった、酸および塩基のヘミ塩（hemisalt）もまた形成され得る。本発明の化合物が酸性の基および塩基性の基を含む場合、本発明の化合物はまた、分子内塩を形成してもよく、このような化合物は、本発明の範囲内にある。本発明の化合物が、水素を供与するヘテロ原子（たとえばＮＨ）を含む場合、本発明はまた、分子内の塩基性の基または原子への上記水素の移行により形成される塩および／またはアイソマーをも包有する。
【００８１】
本発明の化合物の塩は、これら方法：（ｉ）本発明の化合物を所望の酸と反応させることによる方法；（ｉｉ）本発明の化合物を所望の塩基と反応させることによる方法；（ｉｉｉ）本発明の化合物の適切な前駆体から酸もしくは塩基に不安定な保護基を除去するか、もしくは、所望の酸を使用して、適切な環状の前駆体、たとえばラクトンまたはラクタムを開環することによる方法；または（ｉｖ）適切な酸との反応もしくは適切なイオン交換カラムによって本発明の化合物の１つの塩を別の塩に変換することによる方法のうちの１つ以上により、調製され得る。
【００８２】
一実施形態では、ＨＢＲアナログは、式（ＩＩ）：
【化５】
2020520676.tif 000007
（式中、
Ｒ１が、水素、少なくとも２個の炭素原子を有するアルキル基、または少なくとも２個の炭素原子を有するアルコキシ基を表し、
Ｒ２が、水素、アルキル基、またはアルコキシ基を表し
Ｒ３が、カルボキシアルキル基を表す）
の化合物またはその塩である。
【００８３】
特定の実施形態では、Ｒ１は、アルキル基またはアルコキシ基を表し、上記基のアルキル部分は、２〜６個の炭素原子、好ましくは２〜４個の炭素原子、より好ましくは２または３個の炭素原子を含む。より特定の実施形態では、Ｒ１は、エチル（−ＣＨ２ＣＨ３）またはエトキシ（−ＯＣＨ２ＣＨ３）基を表す。
【００８４】
特定の実施形態では、Ｒ２は、アルキル基またはアルコキシ基を表し、上記基のアルキル部分は、１〜６個の炭素原子、好ましくは１〜４個の炭素原子、より好ましくは１または２個の炭素原子を含む。より特定の実施形態では、Ｒ２は、メトキシ（−ＯＣＨ３）基を表す。別の特定の実施形態では、Ｒ２は、アルキル基またはアルコキシ基を表し、上記基のアルキル部分は、２〜６個の炭素原子、好ましくは２〜４個の炭素原子、より好ましくは２または３個の炭素原子を含む。
【００８５】
特定の実施形態では、Ｒ１およびＲ２のうちの少なくとも１つは、水素を表す。特定の実施形態では、Ｒ１およびＲ２は、異なっている。より特定の実施形態では、Ｒ１およびＲ２のいずれかは、水素を表す。より特定の実施形態では、Ｒ１およびＲ２のうちの１つは、水素を表し、もう１つが、アルキル基またはアルコキシ基を表す。
【００８６】
特定の実施形態では、Ｒ３は、カルボキシアルキル基を表し、この基のアルキル部分は、１〜６個の炭素原子、好ましくは１〜３個の炭素原子、より好ましくは１または２個の炭素原子、さらにより好ましくは１個の炭素原子を含む。より特定の実施形態では、Ｒ３は、カルボキシアルキル基を表し、この基のアルキル部分は、正確に１つの炭素原子を含む。特定の実施形態では、Ｒ３は、正確に１つのカルボキシ基を含む。より特定の実施形態では、Ｒ３は、カルボキシメチル基（−ＣＨ２ＣＯＯＨ）である。
【００８７】
特定の実施形態では、式（ＩＩ）の化合物は、
（Ｚ）−２−（５−（４−ヒドロキシ−２−メトキシベンジリデン）−４−オキソ−２−チオキソチアゾリジン−３−イル）酢酸［ＨＢＲＡＡ−２ＯＭ］；
（Ｚ）−２−（５−（４−ヒドロキシ−３−エチルベンジリデン）−４−オキソ−２−チオキソチアゾリジン−３−イル）酢酸［ＨＢＲＡＡ−３Ｅ］；および
（Ｚ）−２−（５−（４−ヒドロキシ−３−エトキシベンジリデン）−４−オキソ−２−チオキソチアゾリジン−３−イル）酢酸［ＨＢＲＡＡ−３ＯＥ］
から選択される。
【００８８】
より特定の実施形態では、ＨＢＲアナログは、（Ｚ）−２−（５−（４−ヒドロキシ−３−エチルベンジリデン）−４−オキソ−２−チオキソチアゾリジン−３−イル）酢酸［ＨＢＲＡＡ−３Ｅ］、すなわち式（ＩＩＩ）：
【化６】
2020520676.tif 000008
の化合物またはその塩である。
【００８９】
ＨＢＲアナログは、当業者の既知の適切な方法により、製造され得る。一実施形態では、本発明に係るＨＢＲアナログは、置換型４−ヒドロキシ−ベンズアルデヒドとローダミン−３−酢酸の反応により、合成される。置換型４−ヒドロキシ−ベンズアルデヒドは、当業者によく知られている適切な方法、たとえば置換型フェノールの芳香族のホルミル化により、調製することができる。
【００９０】
一実施形態では、式（Ｉ）およびその下位の式の化合物は、膜不透過性蛍光発生発色団として使用するためのものである。
【００９１】
特定の実施形態では、式（Ｉ）およびその下位の式の化合物は、ＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントの可逆的な結合に使用するためのものである。
【００９２】
さらに本発明は、ＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントを伴い本発明に係る４−ヒドロキシベンジリデン−ロダニン（ＨＢＲ）アナログにより形成された複合体に関する。
【００９３】
「光反応性黄色タンパク質（Photoactive yellow protein）」または「ＰＹＰ」は、たとえば紫色の光合成細菌のエクトチオロドスピラ・ハロフィラ（Ｅｃｔｏｔｈｉｏｒｈｏｄｏｓｐｉｒａ  ｈａｌｏｐｈｉｌｅ）（ハロロドスピラ・ハロフィラ（Ｈａｌｏｒｈｏｄｏｓｐｉｒａ  ｈａｌｏｐｈｉｌｅ））から単離された、光受容体タンパク質である。野生型のＰＹＰは、比較的小さなタンパク質であり（１４ｋＤａ）、６９番目のシステイン残基でのチオエステル結合を介して発色団であるｐ−クマル酸に結合できる。
【００９４】
本発明では、ＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントは、本発明の膜不透過性４−ヒドロキシベンジリデン−ロダニン（ＨＢＲ）アナログに結合できる。
【００９５】
一実施形態では、ＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントは、可逆的に、すなわち非共有結合性の相互作用を介して、本発明のＨＢＲアナログに結合する。よって、一実施形態では、ＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントに対する本発明の膜不透過性蛍光発生発色団の結合は、可逆的である。
【００９６】
蛍光発生発色団のポリペプチドに対する結合を評価するための方法は、当該分野でよく知られている。このような方法は、特に、ポリペプチドへの結合時に発色団が発する蛍光の評価に依存しており、蛍光分光分析を含む。一実施形態では、実施例に記載されるように、分光蛍光光度計を用いて蛍光スペクトルを記録する。一実施形態では、ＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントは、約２５℃の温度で測定する際に、約２０μＭ未満、好ましくは１５μＭ未満、より好ましくは１０μＭ未満のＫＤで本発明のＨＢＲアナログに結合する。一実施形態では、ＫＤは、約２５℃で、約７μＭ未満、約６μＭ未満、または約５μＭ未満である。特定の実施形態では、ＫＤは、約２５℃で、約３μＭ未満、約２．５μＭ未満、または約２μＭ未満である。
【００９７】
熱力学的な解離定数ＫＤを測定するための方法は、当該分野でよく知られており、たとえばＰｌａｍｏｎｔ，Ｍ．−Ａら（Ｐｌａｍｏｎｔ，Ｍ．−Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕｓａ  ２０１６，  １１３（３），  ４９７）により記載されるものを含む。一実施形態では、熱力学的な解離定数ＫＤは、実施例に記載されるように、蛍光分光計測によるタイトレーション（spectrofluorometric titration）により、決定される。
【００９８】
一実施形態では、ＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントは、その運動の制限を介して、本発明のＨＢＲアナログの輝度を高める。一実施形態では、本発明のＨＢＲアナログの輝度は、その運動制限を介して高められる。
【００９９】
一実施形態では、本発明の複合体のモル吸光係数（ε）は、最大吸収波長（λａｂｓ）で測定する際に、約１０〜約１００ｍＭ−１ｃｍ−１の範囲にある。一実施形態では、モル吸光係数（ε）は、λａｂｓで約４０〜約８０ｍＭ−１ｃｍ−１の範囲にある。特定の実施形態では、モル吸光係数（ε）は、λａｂｓで約５５〜約６５ｍＭ−１ｃｍ−１の範囲にある。
【０１００】
モル吸光係数（ε）を測定するための方法は、当該分野で知られており、たとえばＰｌａｍｏｎｔ，Ｍ．−Ａら（Ｐｌａｍｏｎｔ，Ｍ．−Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕｓａ  ２０１６，  １１３（３），  ４９７）により記載されたものを含む。
【０１０１】
一実施形態では、本発明の複合体の蛍光の量子収率（φ）は、最大吸収波長（λａｂｓ）で測定する際に、約０．２％超である。一実施形態では、φは、λａｂｓで、約１％超、約２％超、または約３％超である。特定の実施形態では、φは、λａｂｓで、約５％超である。
【０１０２】
蛍光の量子収率（φ）を測定するための方法は、当該分野でよく知られており、たとえばＰｌａｍｏｎｔ，Ｍ．−Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１６により記載されたものを含む。一実施形態では、１つの光子の励起後の蛍光の量子収率φは、関係：
【数１】
2020520676.tif 000009
から計算され、ここで、下付きのｒｅｆは、標準物質のサンプルを意味する。Ａ（λｅｘｃ）は、励起波長λｅｘｃでの吸光度であり、Ｄは、積分した発光スペクトルであり、ｎは、溶媒に関する屈折率である。
【０１０３】
一実施形態では、本発明の複合体の輝度は、約６０超である。一実施形態では、輝度は、約４００超である。特定の実施形態では、輝度は、約２，５００超である。
【０１０４】
輝度を測定するための方法は、当該分野でよく知られている。輝度は、エミッタあたりの蛍光出力に対応しており、モル吸光係数（励起波長時）および蛍光の量子収率の積である。
【０１０５】
一実施形態では、ＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントは、本発明のＨＢＲアナログのスペクトルシフトを誘導する。一実施形態では、本発明のＨＢＲアナログのスペクトルシフトは、その助色団基（auxochromic group）のイオン化を介して誘導される。
【０１０６】
一実施形態では、ＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントは、ハロロドスピラ・ハロフィラ（Ｈａｌｏｒｈｏｄｏｓｐｉｒａ  ｈａｌｏｐｈｉｌａ）（配列番号４９のＰＹＰ）、ハロモナス・ボリビエンシス（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ  ｂｏｌｉｖｉｅｎｓｉｓ）ＬＣ１（配列番号５０のＰＹＰ）、ハロモナス属のＧＦＡＪ−１（配列番号５１のＰＹＰ）、レインヘイメラ属のＡ１３Ｌ（配列番号５２のＰＹＰ）、Ｉｏｄｏｍａｒｉｎａ  ｌｏｉｈｉｅｎｓｉｓ（配列番号５３のＰＹＰ）、チオロドスピラ・シビリカ（Ｔｈｉｏｒｈｏｄｏｓｐｉｒａ  ｓｉｂｉｒｉｃａ）ＡＴＣＣ  ７００５８８（配列番号５４のＰＹＰ）、ロドタラシウム・サレキシゲンス（Ｒｈｏｄｏｔｈａｌａｓｓｉｕｍ  ｓａｌｅｘｉｇｅｎｓ）（配列番号５５のＰＹＰ）、ロゼオモナス・サービカリス（Ｒｏｓｅｏｍｏｎａｓ  ｃｅｒｖｉｃａｌｉｓ）ＡＴＣＣ  ４９９５７（配列番号５６のＰＹＰ）、ロドバクター・スファエロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）（配列番号５７のＰＹＰ）、レプトスピラ・ウォルバキイ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｗｏｌｂａｃｈｉｉ）（配列番号５８のＰＹＰ）、ロドバクター・カプスラータス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）（配列番号５９のＰＹＰ）、ロドスピリラム・センテナム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｃｅｎｔｅｎｕｍ）（配列番号６０のＰＹＰ）、レプトスピラ・バンチエリイ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｖａｎｔｈｉｅｌｉｉ）（配列番号６１のＰＹＰ）、レプトスピラ・テルプストラエ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｔｅｒｐｓｔｒａｅ）（配列番号６２のＰＹＰ）、レプトスピラ・バイフレクサ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｂｉｆｌｅｘａ）血清型  Ｐａｔｏｃの菌株「Ｐａｔｏｃ  １（Ｐａｒｉｓ）」（配列番号６３のＰＹＰ）、レプトスピラ・メイエリー（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｍｅｙｅｒｉ）（配列番号６４のＰＹＰ）、レプトスピラ・ヤナガワエ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｙａｎａｇａｗａｅ）（配列番号６５のＰＹＰ）、サリニバクター・ルバー（Ｓａｌｉｎｉｂａｃｔｅｒ  ｒｕｂｅｒ）ＤＳＭ  １３８５５（配列番号６６のＰＹＰ）、バークホルデリア・フィトフィルマンス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ）ＰｓＪＮ（配列番号６７のＰＹＰ）、ファエオスピリルム・フルブム（Ｐｈａｅｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｆｕｌｖｕｍ）（配列番号６８のＰＹＰ）、アシディチオバチルス・チオオキシダンス（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｉｏｏｘｉｄａｎｓ）（配列番号６９のＰＹＰ）、アシディチオバチルス・カルダス（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｕｓ）ＳＭ−１（配列番号７０のＰＹＰ）、ガンマプロテオバクテリア（Ｇａｍｍａ  ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＮＯＲ５−３（配列番号７１のＰＹＰ）、Ｍｅｔｈｙｌｏｔｅｎｅｒａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ  ３０１（配列番号７２のＰＹＰ）、レプトトリックス・チョロドニイ（Ｌｅｐｔｏｔｈｒｉｘ  ｃｈｏｌｏｄｎｉｉ）ＳＰ−６（配列番号７３のＰＹＰ）、Ｃａｅｎｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｓａｌｉｎａｒｕｍ（配列番号７４のＰＹＰ）、スチグマテラ・アウランティアカ（Ｓｔｉｇｍａｔｅｌｌａ  ａｕｒａｎｔｉａｃａ���ＤＷ４／３−１（配列番号７５のＰＹＰ）、マシリア・チモナエ（Ｍａｓｓｉｌｉａ  ｔｉｍｏｎａｅ）（配列番号７６のＰＹＰ）、メチロバーサチリス・ユニバーサリス（Ｍｅｔｈｙｌｏｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌｉｓ）ＦＡＭ  ５（配列番号７７のＰＹＰ）、スピロソーマ・リングアレ（Ｓｐｉｒｏｓｏｍａ  ｌｉｎｇｕａｌｅ）ＤＳＭ  ７４（配列番号７８のＰＹＰ）、ロドシュードモナス・パルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐａｌｓｔｒｉｓ）ＢｉｓＢ５（配列番号７９のＰＹＰ）、ソランギウム・セルロスム（Ｓｏｒａｎｇｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍ）「Ｓｏ  ｃｅ  ５６」（配列番号８０のＰＹＰ）およびロドミクロビウム・ヴァンニーリイ（Ｒｈｏｄｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｖａｎｎｉｅｌｉｉ）ＡＴＣＣ  １７１００（配列番号８１のＰＹＰ）からなる群から選択される種のＰＹＰ由来である。
【０１０７】
特定の実施形態では、ＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントは、変異Ｃ６９Ｇを伴うハロロドスピラ・ハロフィラ（Ｈａｌｏｒｈｏｄｏｓｐｉｒａ  ｈａｌｏｐｈｉｌａ）のＰＹＰに対応する、配列番号４８の配列を有するＰＹＰ由来である。
【０１０８】
本発明の範囲内において、「機能的ＰＹＰ誘導体」は、本発明に係るＨＢＲアナログに結合できるＰＹＰポリペプチドを意味する。よって、一実施形態では、機能的ＰＹＰ誘導体は、本発明に係るＨＢＲアナログに特異的かつ可逆的に結合できる能力を有する。
【０１０９】
一実施形態では、本発明に係るＨＢＲアナログに結合する、ＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントは、ＰＹＰのバリアントである。
【０１１０】
一実施形態では、ＰＹＰのバリアントは、ＰＹＰ、たとえば配列番号４８の配列を有するＰＹＰのうち少なくとも８個、好ましくは少なくとも１０個、２０個、５０個、１００個、または１２５個の連続したアミノ酸を含む、アミノ酸配列である。
【０１１１】
一実施形態では、ＰＹＰのバリアントは、ＰＹＰ、たとえば配列番号４８の配列を有するＰＹＰのうち少なくとも８個、好ましくは少なくとも１０個、２０個、５０個、１００個、または１２５個の連続したアミノ酸を含む、ペプチドまたはポリペプチドである。
【０１１２】
一実施形態では、ＰＹＰのバリアントは、ＰＹＰまたはそのフラグメント、たとえば配列番号４８の配列を有するＰＹＰまたはそのフラグメントのアミノ酸配列と少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、９０％、もしくは９５％，または少なくとも９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する、ペプチドまたはポリペプチドである。
【０１１３】
一実施形態では、上述のＰＹＰバリアントは、上記に開示したＨＢＲアナログへ特異的に結合する能力を保持している。
【０１１４】
用語「同一性」または「同一な」は、２つ以上のペプチドまたはポリペプチドの配列間の関係に使用される場合、２つ以上のアミノ酸残基の鎖間の一致数により決定される、ペプチドまたはポリペプチドの間の配列の関連性の度合いを表す。「同一性」は、特定の数学モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち「アルゴリズム」）により提示される、ギャップアライメントを有する（存在する場合）２つ以上の配列のうち小さな方に合わせた配列間の同一である一致のパーセントを測定する。関連するペプチドまたはポリペプチドの同一性は、既知の方法により容易に計算することができる。このような方法として、限定するものではないが、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｌｅｓｋ，  Ａ．  Ｍ．，  ｅｄ．，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８８；  Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，  Ｓｍｉｔｈ，  Ｄ．  Ｗ．，  ｅｄ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９３；  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，  Ｐａｒｔ  １，  Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ａ．  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ｈ．  Ｇ．，  ｅｄｓ．，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，  １９９４；  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８７；  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，  Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，  Ｍ．  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，  Ｊ．，  ｅｄｓ．，  Ｍ．  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９１；およびＣａｒｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ＳＩＡＭ  Ｊ．  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．  ４８，  １０７３  （１９８８）に記載されるものが挙げられる。同一性を決定するための好ましい方法は、試験する配列間に最大の一致を提供するように設計されている。同一性を決定する方法は、公的に利用可能なコンピュータプログラムで記載されている。２つの配列間の同一性を決定するための好ましいコンピュータプログラム方法として、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄ．  Ｒｅｓ．  ＼２，  ３８７  （１９８４）；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｓ．）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  ＭｏＩ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５，  ４０３−４１０  （１９９０））を含む、ＧＣＧプログラムパッケージが挙げられる。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）および他のソース（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  Ｍｄ．  ２０８９４；  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ｓｕｐｒａ）から公的に利用可能である。よく知られているＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎもまた、同一性を決定するために使用され得る。
【０１１５】
本発明において、「機能的フラグメント」は、上記に開示したＨＢＲアナログに特異的に結合する能力を保持している、不完全なＰＹＰまたは不完全なＰＹＰ機能的誘導体を意味する。よって、一実施形態では、ＰＹＰの機能的フラグメントは、本発明に係るＨＢＲアナログに特異的かつ可逆的に結合する能力を有する。
【０１１６】
一実施形態では、機能的フラグメントは、少なくとも８個のアミノ酸（好ましくは連続したアミノ酸）、好ましくは少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１１０個、または１２０個のアミノ酸（好ましくは連続したアミノ酸）のアミノ酸配列である。
【０１１７】
一実施形態では、ＰＹＰの機能的フラグメントは、ＰＹＰ、たとえば配列番号４８の配列を有するＰＹＰのうち少なくとも８個、好ましくは少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１１０個、または１２０個のアミノ酸（好ましくは連続したアミノ酸）のアミノ酸配列である。
【０１１８】
一実施形態では、ＰＹＰまたはそのバリアントの機能的フラグメントは、ＰＹＰ、たとえば配列番号４８の配列を有するＰＹＰのうちアミノ酸７０〜１２５、８０〜１２０、９０〜１１０、または９４〜１０１を含む（ここでアミノ酸配列のナンバリングは、配列番号４８の配列を参照してなされている）。
【０１１９】
一実施形態では、ＰＹＰまたはそのバリアントのフラグメントは、ＰＹＰ、たとえば配列番号４８の配列を有するＰＹＰのうちアミノ酸１〜１０１、１０〜１０１、２０〜１０１、３０〜１０１、４０〜１０１、５０〜１０１、６０〜１０１、７０〜１０１、８０〜１０１、９０〜１０１、９０〜１１０、９０〜１２０、または９０〜１２５を含む（ここでアミノ酸配列のナンバリングは、配列番号４８の配列を参照してなされている）。
【０１２０】
一実施形態では、本発明に係るＨＢＲアナログに結合するＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントは、配列番号４８〜８１からなる群で選択されるポリペプチドまたはその機能的フラグメントを含むかまたはからなり、さらに、
９７位でのプロリンでのアミノ酸の置換；
９４位でのトリプトファンでのアミノ酸の置換；
９６位での、分枝状脂肪族側鎖、好ましくはイソロイシン、バリン、またはロイシンを含むアミノ酸残基でのアミノ酸の置換；および／または
９８位でのスレオニンでのアミノ酸の置換
からなる群で選択される修飾のうちの少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、好ましくは少なくとも４つ、好ましくは全てを含み、
ここで、アミノ酸のナンバリングは、配列番号４８の配列を参照してなされている。
【０１２１】
一実施形態では、本発明に係るＨＢＲアナログに結合するＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントは、配列番号４８〜８１からなる群で選択される配列、好ましくは配列番号４８、またはその機能的フラグメントと少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、９０％、または９５％の同一性を有するポリペプチドを含むかまたはからなり、さらに、
９７位でのプロリンでのアミノ酸の置換；
９４位でのトリプトファンでのアミノ酸の置換；
９６位での、分枝状脂肪族側鎖、好ましくはイソロイシン、バリン、またはロイシンを含むアミノ酸残基でのアミノ酸の置換；および／または
９８位でのスレオニンでのアミノ酸の置換
からなる群で選択される修飾のうちの少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、好ましくは少なくとも４つ、好ましくは全てを含み、
ここで、アミノ酸のナンバリングは、配列番号４８の配列を参照してなされている。
【０１２２】
一実施形態では、本発明に係るＨＢＲアナログに結合するＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントは、配列番号４８〜８１からなる群で選択される配列もしくはその機能的フラグメント、または配列番号４８〜８１からなる群で選択される配列、好ましくは配列番号４８、もしくはその機能的フラグメントと少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、９０％、または９５％の同一性を有する配列を有するポリペプチドを含むかまたはからなり、さらに、
９７位でのプロリンでのアミノ酸の置換；
９４位でのトリプトファンでのアミノ酸の置換；
９６位での、分枝状脂肪族側鎖、好ましくはイソロイシン、バリン、またはロイシンを含むアミノ酸残基でのアミノ酸の置換；および／または
９８位でのスレオニンでのアミノ酸の置換
からなる群で選択される修飾のうちの少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、好ましくは少なくとも４つ、好ましくは全てを含み、
ここで、アミノ酸のナンバリングは、配列番号４８の配列を参照してなされている。
【０１２３】
配列番号４８のアミノ酸９４は、配列番号４９、５０〜５５、６８、７０、７７、および７９のアミノ酸９４；配列番号５６、５７、および５９のアミノ酸９３；配列番号７３および７６のアミノ酸９２；配列番号６２〜６５および６９のアミノ酸８９；配列番号７２および７５のアミノ酸９５；配列番号７４のアミノ酸９０；配列番号６６および８１のアミノ酸９１；配列番号５８および６１のアミノ酸８３；アミノ酸配列６０および７８のアミノ酸８７；配列番号６７および８０のアミノ酸７７；ならびに配列番号７１のアミノ酸７８に対応する。
【０１２４】
配列番号４８のアミノ酸９６は、配列番号４９、５０〜５５、６８、７０、７７、および７９のアミノ酸９６；配列番号５６、５７、および５９のアミノ酸９５；配列番号７３および７６のアミノ酸９４；配列番号６２〜６５および６９のアミノ酸９１；配列番号７２および７５のアミノ酸９７；配列番号７４のアミノ酸９２；配列番号６６および８１のアミノ酸９３；配列番号５８および６１のアミノ酸８５；配列番号６０および７８のアミノ酸８９；配列番号６７および８０のアミノ酸７９；ならびに配列番号７１のアミノ酸８０に対応する。
【０１２５】
配列番号４８のアミノ酸９７は、配列番号４９、５０〜５５、６８、７０、７７、および７９のアミノ酸９７；配列番号５６、５７、および５９のアミノ酸９６；配列番号７３および７６のアミノ酸９５；配列番号６２〜６５および６９のアミノ酸９２；配列番号７２および７５のアミノ酸９８；配列番号７４のアミノ酸９３；配列番号６６および８１のアミノ酸９４；配列番号５８および６１のアミノ酸８６；配列番号６０および７８のアミノ酸９０；配列番号６７および８０のアミノ酸８０；ならびに配列番号７１のアミノ酸９１に対応する。
【０１２６】
配列番号４８のアミノ酸９８は、配列番号４９、５０〜５５、６８、７０、７７、および７９のアミノ酸９８；配列番号５６、５７、および５９のアミノ酸９７；配列番号７３および７６のアミノ酸９６；配列番号６２〜６５および６９のアミノ酸９３；配列番号７２および７５のアミノ酸９９；配列番号７４のアミノ酸９４；配列番号６６および８１のアミノ酸９５；配列番号５８および６１のアミノ酸８７；配列番号６０および７８のアミノ酸９１；配列番号６７よび８０のアミノ酸８１；ならびに配列番号７１のアミノ酸８２に対応する。
【０１２７】
一実施形態では、本発明に係るＨＢＲアナログに結合するＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントは、配列番号４８の配列に準拠した９４〜１０１位のアミノ酸配列を含み、以下の配列：ＷＸ１ＩＰＴＸ２Ｘ３Ｘ４（配列番号１２９）（式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４は、それぞれ独立して、いずれかのアミノ酸である）を有する。一実施形態では、本発明に係るＨＢＲアナログに結合するＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントは、以下の配列：ＷＸ１ＩＰＴＸ２Ｘ３Ｘ４（配列番号１２９）（式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４は、それぞれ独立して、いずれかのアミノ酸である）を有するアミノ酸配列を含む。
【０１２８】
特定の実施形態では、本発明に係るＨＢＲアナログに結合するＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントは、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、および配列番号１２８からなる群で選択される、配列番号４８に準拠した９４〜１０１位のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、本発明に係るＨＢＲアナログに結合するＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントは、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、および配列番号１２８からなる群で選択されたアミノ酸を含む。
【０１２９】
好ましくは、本発明に係るＨＢＲアナログに結合するＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントは、配列番号４８に準拠した、配列番号８３の９４〜１０１位のアミノ酸領域を含む。一実施形態では、本発明に係るＨＢＲアナログに結合するＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントは、配列番号８３のアミノ酸配列を含む。
【０１３０】
特定の実施形態では、本発明に係るＨＢＲアナログに結合するＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、および配列番号４７、またはそれらの機能的フラグメントからなる群で選択される配列を含む、またはこの配列を特徴とする。
【０１３１】
好ましくは、本発明に係るＨＢＲアナログに結合するＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントは、配列番号３を含むかまたはこの配列を特徴とする。
【０１３２】
一実施形態では、本発明に係るＨＢＲアナログに結合するＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントは、結果得られる融合タンパク質をコードする核酸配列を（たとえば形質転換またはトランスフェクションを介して）挿入することにより、宿主細胞の中で目的のいずれかのタンパク質と融合させて、発現することができる。
【０１３３】
一実施形態では、目的のタンパク質は、上述のＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントに融合する。一実施形態では、目的のタンパク質は、配列番号３を含むかまたは配列番号３を特徴とするＰＹＰ機能的誘導体に融合する。一実施形態では、目的のタンパク質は、配列番号８３を含むかまたは配列番号８３を特徴とするＰＹＰ機能的誘導体に融合する。
【０１３４】
一実施形態では、目的のタンパク質は、上述のＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントでタグ付与される。一実施形態では、目的のタンパク質は、配列番号３を含むかまたは配列番号３を特徴とするＰＹＰ機能的誘導体でタグ付与される。一実施形態では、目的のタンパク質は、配列番号８３を含むかまたは配列番号８３を特徴とするＰＹＰ機能的誘導体でタグ付与される。
【０１３５】
また本発明は、本発明に係る４−ヒドロキシベンジリデン−ロダニン（ＨＢＲ）アナログと、目的のタンパク質をコードする核酸を挿入させる、上述のＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントをコードする核酸配列を含むベクターとを含む、キットに関する。
【０１３６】
さらに本発明は、膜不透過性蛍光発生発色団としての本発明に係る４−ヒドロキシベンジリデン−ロダニン（ＨＢＲ）アナログの使用に関する。
【０１３７】
一実施形態では、４−ヒドロキシベンジリデン−ロダニン（ＨＢＲ）アナログは、式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および／または式（ＩＩＩ）のものである。
【０１３８】
一実施形態では、膜不透過性蛍光発生発色団は、たとえば分子生物学、細胞生物学、発生生物学、神経生物学、免疫学、または生理学における研究などの生体研究のために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏで使用され得る。
【０１３９】
一実施形態では、本発明の膜不透過性蛍光発生発色団は、少なくとも１つの他の蛍光発生発色団と組み合わせて使用される。一実施形態では、少なくとも１つの他の蛍光発生発色団は、異なる波長で光放出する。一実施形態では、少なくとも１つの他の蛍光発生発色団は、膜不透過性蛍光発生発色団である。一実施形態では、少なくとも１つの他の蛍光発生発色団は、膜透過性蛍光発生発色団、たとえばＨＢＲまたはＨＭＢＲである。
【０１４０】
さらに本発明は、少なくとも１つの膜により封入されている区画を含むサンプルにおいて目的の生体分子を検出するための方法であって、
目的の生体分子に上述のＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントを融合させることにより、ＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントで目的の生体分子にタグ付与するステップと、
前記サンプルを、本発明に係る４−ヒドロキシベンジリデン−ロダニン（ＨＢＲ）と接触させるステップと、
ＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントに対するＨＢＲアナログの結合からもたらされる蛍光を検出するステップと、
を含み、それにより、ＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントに対するＨＢＲアナログの結合を介して、前記区画の膜外表面に少なくとも一部が存在するかまたは前記区画から分泌される目的の生体分子を検出する、方法に関する。
【０１４１】
また本発明は、少なくとも１つの膜により封入されている区画を含むサンプルにおいて、目的の生体分子を検出する方法であって、
上述のＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントでタグ付与されている、タグ付与した目的の生体分子を得るステップと、
前記サンプルを、本発明に係る４−ヒドロキシベンジリデン−ロダニン（ＨＢＲ）と接触させるステップと、
ＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントに対するＨＢＲアナログの結合からもたらされる蛍光を検出するステップと、
を含み、それにより、ＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントに対するＨＢＲアナログの結合を介して、前記区画の膜外表面に少なくとも一部が存在するかまたは前記区画から分泌される目的の生体分子を検出する、方法に関する。
【０１４２】
本発明では、少なくとも１つの膜により封入されている区画として、限定するものではないが、細胞、ベジクル、および人工的な形質膜を模倣したベジクルが、挙げられる。細胞の例として、限定するものではないが、細菌、酵母、真菌、植物の細胞、動物、または後生動物の細胞、たとえば昆虫細胞、哺乳類細胞、またはヒトの細胞が挙げられる。ベジクルの例として、限定するものではないが、ミトコンドリア、小胞体、ゴルジ体、リソソーム、ペルオキシソームなどの細胞のオルガネラ；細胞の核；およびミクロソームが、挙げられる。
【０１４３】
一実施形態では、少なくとも１つの膜により封入されている区画は、細胞である。よって一実施形態では、少なくとも１つの膜により封入されている区画を含むサンプルは、細胞のサンプル、細胞の培養物、またはベジクルの懸濁物である。一実施形態では、少なくとも１つの膜により封入されている区画を含むサンプルは、細胞培養物である。
【０１４４】
細胞のサンプルの例として、限定するものではないが、組織のサンプルおよび生検が挙げられる。細胞培養物の例として、限定するものではないが、細菌の培養物、酵母の培養物、真菌の培養物、植物細胞の培養物、動物細胞の培養物、たとえば昆虫細胞の培養物、哺乳類細胞の培養物、またはヒトの細胞の培養物が挙げられる。ベジクルの懸濁物の例として、限定するものではないが、細胞の遠心分離の後に得られるミクロソームのフラクションが挙げられる。
【０１４５】
一実施形態では、上記の本発明の方法は、細胞を含むサンプルにおいて目的の生体分子を検出するためのものであり、細胞外表面に少なくとも一部が存在するかまたは細胞から分泌される目的の生体分子の検出を可能にする。
【０１４６】
本発明では、蛍光の検出は、落射蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡、超解像顕微鏡、蛍光分光分析、蛍光相関分光法、およびフローサイトメトリーを含む、当該分野で知られているいずれかの方法により行われ得る。
【０１４７】
一実施形態では、目的の生体分子は、細胞外にあり、すなわち細胞の内側にない。一実施形態では、目的の生体分子は、細胞、ベジクル、または人工的なベジクルの外側または外面に位置している。一実施形態では、目的の生体分子は、細胞またはミクロソームなどのベジクルから分泌される。特定の実施形態では、目的の生体分子は、膜のタンパク質である。特定の実施形態では、目的の生体分子は、膜外表面に少なくとも一部が存在する、細胞表面のタンパク質である。
【０１４８】
一実施形態では、目的の生体分子は、目的のタンパク質である。目的のタンパク質は、天然のタンパク質、様々なタンパク質ドメインの融合からもたらされるキメラタンパク質、または合成タンパク質であり得る。一実施形態では、目的のタンパク質は、膜のタンパク質、膜外表面に少なくとも一部が存在する細胞表面のタンパク質、または分泌型タンパク質である。一実施形態では、目的のタンパク質は、タンパク質の少なくとも一部が上記膜の外側に突き出ている膜のタンパク質、または分泌型タンパク質である。
【０１４９】
目的のタンパク質にペプチドのタグを融合するための方法は、よく知られており、研究所で日常的に使用されている。簡潔に述べると、このような方法は、目的のタンパク質をコードする核酸配列を、タグをコードする核酸配列を含むベクターに挿入するステップを含む。目的のタンパク質のＮ末端または目的のタンパク質のＣ末端または内部にタグが希望通りに位置付けられるように、目的のタンパク質をコードする核酸配列を挿入することができる。さらに、リンカーまたはスペーサーをコードする短い核酸配列が、タグをコードする核酸配列と目的のタンパク質をコードする核酸配列との間に、存在し得る。
【０１５０】
次に、タグ付与した目的のタンパク質をコードする核酸配列を含むベクター、すなわち発現ベクターが、たとえば、形質転換またはトランスフェクションなどにより、宿主細胞に挿入されことにより、タグ付与した目的のタンパク質が上記宿主細胞によって発現する。
【０１５１】
一実施形態では、本発明は、少なくとも１つの膜により封入されている区画を含むサンプルにおいて、上記サンプルを本発明に係る４−ヒドロキシベンジリデン−ロダニン（ＨＢＲ）と接触させることにより、上述のＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントに融合するかまたはＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントでタグ付与した目的のタンパク質を検出するための方法に関する。
【０１５２】
本発明では、目的のタンパク質は、上述のＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントでタグ付与され、ここで、目的のタンパク質にタグ付与したＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントは、たとえば目的のタンパク質を含む細胞またはベジクルなどの、区画の膜の外側に存在する。
【０１５３】
一実施形態では、目的のタンパク質は、そのＮ末端でタグ付与される。別の実施形態では、目的のタンパク質は、そのＣ末端でタグ付与される。別の実施形態では、目的のタンパク質は、内部にタグ付与される。
【０１５４】
一実施形態では、目的のタンパク質は、少なくとも１つの膜により封入されている区画の表面に存在し、目的のタンパク質は、タグが上記区画の外側に曝露されるように、Ｎ末端、Ｃ末端、または内部のドメインで、タグ付与される。
【０１５５】
一実施形態では、目的のタンパク質は、分泌型であり、タンパク質を転位させるシグナルペプチドを含み、通常このシグナルペプチドは、タンパク質のＮ末端に存在する。よって一実施形態では、分泌型でありシグナルペプチドを含む目的のタンパク質は、上記シグナルペプチドを含まない末端で、タグ付与される。
【０１５６】
一実施形態では、本発明の方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法である。
【０１５７】
一実施形態では、本発明の目的の生体分子を検出する方法はさらに、目的の生体分子にタグ付与されたＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントに対する本発明のＨＢＲアナログの結合時に発せられる蛍光を測定することにより、目的の生体分子を定量化するステップを含む。
【０１５８】
本発明では、蛍光の測定は、蛍光分光分析、蛍光相関分光法、フローサイトメトリー、および落射蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡、または超解像顕微鏡により得られる画像の解析を含む、当該分野で知られているいずれかの方法により、行われ得る。
【０１５９】
一実施形態では、本発明のＨＢＲアナログは、少なくとも１つの他の蛍光発生発色団と組み合わせて使用される。一実施形態では、少なくとも１つの他の蛍光発生発色団は、異なる波長で光放出する。一実施形態では、少なくとも１つの他の蛍光発生発色団は、膜不透過性蛍光発生発色団である。一実施形態では、少なくとも１つの他の蛍光発生発色団は、膜透過性蛍光発生発色団、たとえばＨＢＲまたはＨＭＢＲである。
【０１６０】
また本発明は、少なくとも１つの膜により封入されている区画を含むサンプルにおいて、目的の生体分子、特に目的のタンパク質を順次標識するための方法であって、
上述のＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントを、目的の生体分子、特に目的のタンパク質に融合させることにより、ＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントで目的の生体分子、特に目的のタンパク質をタグ付与するステップと、
前記サンプルを、本発明に係る膜不透過性４−ヒドロキシベンジリデン−ロダニン（ＨＢＲ）アナログと接触させるステップと、
ＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントに対するＨＢＲアナログの結合からもたらされる蛍光を検出することにより、前記区画の膜外表面に少なくとも一部が存在するかまたは前記区画から分泌される、目的の生体分子、特に目的のタンパク質のフラクションを検出するステップと、
前記サンプルを、目的の生体分子、特に目的のタンパク質に特異的に結合できる膜透過性蛍光発生発色団と接触させるステップと、
目的の生体分子、特に目的のタンパク質に対する膜透過性蛍光発生発色団の結合からもたらされる蛍光を検出することにより、目的の生体分子、特に目的のタンパク質の集合全体を検出するステップと、
を含む方法に関する。
【０１６１】
一実施形態では、本発明に係る４−ヒドロキシベンジリデン−ロダニン（ＨＢＲ）アナログおよび膜透過性蛍光発生発色団は、異なる波長で光放出する。一実施形態では、膜透過性蛍光発生発色団は、上述のＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントに結合する。このような膜透過性蛍光発生発色団の例として、たとえば、４−ヒドロキシベンジリデン−ロダニン（ＨＢＲ）および４−ヒドロキシ−３−メチルベンジリデンロダニン（ＨＭＢＲ）が挙げられる。
【０１６２】
一実施形態では、上記の本発明の方法は、細胞を含むサンプルにおいて目的の生体分子、特に目的のタンパク質を順次標識するための方法であり、細胞外表面に少なくとも一部が存在するかまたは細胞から分泌される目的の生体分子、特に目的のタンパク質のフラクションの検出、および目的の生体分子、特に目的のタンパク質の集合全体の検出を可能にする。
【０１６３】
また本発明は、少なくとも１つの膜により封入されている区画を含むサンプルにおいて、
前記区画の膜外表面に少なくとも一部が存在するかまたは前記区画から分泌される目的の生体分子、特に目的のタンパク質のフラクションを、目的の生体分子、特に目的のタンパク質の集合全体を参照して定量化するための方法であって、
上述のＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントでタグ付与されている、タグ付与した目的の生体分子、特にタグ付与した目的のタンパク質を得るステップと、
前記サンプルを、本発明に係る４−ヒドロキシベンジリデン−ロダニン（ＨＢＲ）アナログおよび目的の生体分子、特に目的のタンパク質に特異的に結合できる膜透過性蛍光発生発色団と、同時にまたは順次接触させるステップと、
ＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントに対するＨＢＲアナログの結合からもたらされる蛍光と、目的の生体分子、特に目的のタンパク質に対する膜透過性蛍光発生発色団の結合からもたらされる蛍光とを検出するステップと、
目的の生体分子、特に目的のタンパク質への膜透過性蛍光発生発色団の結合からもたらされる蛍光に対する、ＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントへのＨＢＲアナログの結合からもたらされる蛍光の比率を測定するステップと、
を含み、それにより、前記区画の膜外表面に少なくとも一部が存在するかまたは前記区画から分泌される目的の生体分子、特に目的のタンパク質のフラクションを、目的の生体分子、特に目的のタンパク質の集合全体を参照して定量化する、方法に関する。
【０１６４】
一実施形態では、本発明に係る４−ヒドロキシベンジリデン−ロダニン（ＨＢＲ）アナログおよび膜透過性蛍光発生発色団は、異なる波長で光放出する。一実施形態では、膜透過性蛍光発生発色団は、上述のＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントに結合する。このような膜透過性蛍光発生発色団の例として、たとえば、４−ヒドロキシベンジリデン−ロダニン（ＨＢＲ）および４−ヒドロキシ−３−メチルベンジリデンロダニン（ＨＭＢＲ）が挙げられる。
【０１６５】
一実施形態では、上記の本発明の方法は、細胞を含むサンプルにおいて、細胞外表面に少なくとも一部が存在するかまたは細胞から分泌される目的の生体分子、特に目的のタンパク質のフラクションを、目的の生体分子、特に目的のタンパク質の集合全体を参照して定量化するための方法である。
【０１６６】
また本発明は、少なくとも１つの膜により封入されている区画を含むサンプルにおけるレポータータンパク質の検出に依存したアッセイであって、
上述のＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントでタグ付与されている、タグ付与したレポータータンパク質を得るステップと、
前記サンプルを、本発明に係る４−ヒドロキシベンジリデン−ロダニン（ＨＢＲ）アナログと接触させるステップと、
ＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントに対するＨＢＲアナログの結合からもたらされる蛍光を検出するステップと、
を含み、それにより、ＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントに対するＨＢＲアナログの結合を介して、前記区画の膜外表面に少なくとも一部が存在するかまたは前記区画から分泌されるレポータータンパク質を検出する、アッセイに関する。
【０１６７】
一実施形態では、上記アッセイは、細胞を含むサンプルにおけるレポータータンパク質の検出に依存しており、細胞外表面に少なくとも一部が存在するかまたは細胞から分泌されるレポータータンパク質の検出を可能にする。
【０１６８】
一実施形態では、本発明のアッセイは、膜でのレポータータンパク質の発現もしくはアンカリングに関与するかまたはレポータータンパク質の分泌に関与する目的のタンパク質の活性を評価するためのものであり、上記方法は、
少なくとも１つの膜により封入されている区画を含むサンプルにおいてタグ付与したレポータータンパク質を発現させるステップであって、前記タンパク質を、上述のＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントでタグ付与し、前記レポータータンパク質が、前記区画の膜でアンカリングするか、または目的のタンパク質の活性の結果として分泌される、ステップと、
前記サンプルを、本発明に係る４−ヒドロキシベンジリデン−ロダニン（ＨＢＲ）アナログと接触させるステップと、
ＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントに対するＨＢＲアナログの結合からもたらされる蛍光を検出するステップと、
を含み、それにより、ＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントに対するＨＢＲアナログの結合を介して、目的のタンパク質の活性を間接的に評価する。
【０１６９】
一実施形態では、本発明のアッセイは、読み取りとして蛍光を使用して、少なくとも１つの膜により封入されている区画から分泌されるタンパク質、または前記区画の膜で局在しているタンパク質を同定するためのスクリーニング方法である。
【０１７０】
一実施形態では、本発明のアッセイは、読み取りとして蛍光を使用して、膜タンパク質間、または膜タンパク質と細胞外タンパク質もしくは分泌型タンパク質との間の相互作用を検出するための方法である。
【０１７１】
一実施形態では、本発明のアッセイは、読み取りとして蛍光を使用して、少なくとも１つの膜により封入されている区画におけるタンパク質のインターナリゼーションを検出するための方法、または少なくとも１つの膜により封入されている区画からのタンパク質の分泌を検出するための方法である。
【０１７２】
一実施形態では、本発明のアッセイは、ＦＲＥＴアッセイである。一実施形態では、上述のＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントは、たとえばＣＦＰなどのドナーと対にあるアクセプターとして作用する。別の実施形態では、上述のＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントは、たとえばｍＣｈｅｒｒｙなどのアクセプターと対にあるドナーとして作用する。
【０１７３】
また本発明は、少なくとも１つの膜により封入されている区画を含むサンプルにおいて膜でのタンパク質輸送またはタンパク質発現を検出するための方法にも関し、ここで、前記膜でのタンパク質輸送またはタンパク質発現は、前記区画の膜でのタンパク質の局在化（たとえばアンカリング）または前記区画からのタンパク質の分泌を特徴とし、前記方法は、
細胞においてタグ付与したレポータータンパク質を発現させるステップであって、前記レポータータンパク質を、上述のＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントでタグ付与し、前記レポータータンパク質は、前記膜でアンカリングされているかまたは分泌されている、ステップと、
前記細胞を、本発明に係る４−ヒドロキシベンジリデン−ロダニン（ＨＢＲ）アナログと接触させるステップと、
ＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントに対するＨＢＲアナログの結合からもたらされる蛍光を検出するステップと、
を含み、それにより、ＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントに対するＨＢＲアナログの結合を介して、前記膜でのタンパク質輸送またはタンパク質発現を検出する。
【０１７４】
また本発明は、少なくとも１つの膜により封入されている区画を含むサンプルにおける膜でのタンパク質輸送またはタンパク質発現の修復を報告するためのスクリーニング方法にも関し、ここで、前記膜でのタンパク質輸送またはタンパク質発現は、前記区画の膜でのタンパク質の局在化（たとえばアンカリング）または前記区画からのタンパク質の分泌を特徴とし、前記方法は、
細胞においてタグ付与したレポータータンパク質を発現させるステップであって、前記タンパク質を、上述のＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントでタグ付与し、前記レポータータンパク質は、前記膜でアンカリングされているかまたは分泌されている、ステップと、
前記サンプルを、膜でのタンパク質輸送またはタンパク質発現を修復する特性に関して試験される分子と共にインキュベートするステップと、
前記サンプルを、本発明に係る４−ヒドロキシベンジリデン−ロダニン（ＨＢＲ）アナログと接触させるステップと、
ＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントに対するＨＢＲアナログの結合からもたらされる蛍光を検出するステップと、
を含み、それにより、ＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントに対するＨＢＲアナログの結合を介して、膜でのタンパク質輸送またはタンパク質発現の修復を検出する。
【０１７５】
一実施形態では、前記方法は、細胞のイメージングを必要としない。一実施形態では、蛍光は、蛍光分光分析、蛍光相関分光法、またはフローサイトメトリーにより検出される。
【０１７６】
また本発明は、少なくとも１つの膜により封入されている区画を含むサンプルにおいて、膜でのタンパク質輸送またはタンパク質発現の阻害を報告するためのスクリーニング方法にも関し、ここで、前記膜でのタンパク質輸送またはタンパク質発現は、前記区画の膜でのタンパク質の局在化（たとえばアンカリング）または前記区画からのタンパク質の分泌を特徴とし、前記方法は、
細胞においてタグ付与したレポータータンパク質を発現させるステップであって、前記タンパク質を、上述のＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントでタグ付与し、前記レポータータンパク質は、前記膜でアンカリングされているかまたは分泌されている、ステップと、
前記サンプルを、本発明に係る４−ヒドロキシベンジリデン−ロダニン（ＨＢＲ）アナログと接触させるステップと、
前記サンプルを、前記膜でのタンパク質輸送またはタンパク質発現を阻害する特性に関して試験される分子と共にインキュベートするステップと、
ＨＢＲアナログがＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントに結合できない特性からもたらされる蛍光の欠如または減少を評価するステップと、
を含み、それにより、ＰＹＰ機能的誘導体またはその機能的フラグメントに対するＨＢＲアナログの結合の欠如を介して、前記膜でのタンパク質輸送またはタンパク質発現の阻害を検出する。
【０１７７】
一実施形態では、前記方法は、細胞のイメージングを必要としない。一実施形態では、蛍光は、蛍光分光分析、蛍光相関分光法、またはフローサイトメトリーにより検出される。
【図面の簡単な説明】
【０１７８】
【図１】図１は、どのように膜不透過性フルオロゲンが、生細胞における細胞表面のＦＡＳＴ−タグ付与されたタンパク質の選択的なイメージングを可能にするかを示した図である。この細胞（左側）は、当該分野の既存の手段としての膜透過性フルオロゲン（ＭＰＦ）により（図１ａ）または本発明に係る膜不透過性フルオロゲン（ＭＩＦ）により（図１ｂ）、標識することができる。
【図２】図２は、どのように本発明に係る膜不透過性フルオロゲンが生細胞の細胞表面に曝露したタンパク質を選択的に標識できるかを示した、一連の写真である（スケールバー  １０μｍ）。並んだ画像は、蛍光強度の直接的な比較のため、同じ状況を使用して記録した。  図２ａは、当該分野の膜透過性フルオロゲン（ＨＭＢＲ）５μＭで１５秒間処理するか、または本発明に係る膜不透過性フルオロゲン（ＨＢＲＡＡ−３Ｅ）５μＭで２時間処理した、赤色蛍光タンパク質ｍＣｈｅｒｒｙに融合したＦＡＳＴを発現するＨｅＬａ細胞の共焦点顕微鏡写真を示す一連の写真である。  図２ｂ〜ｃは、マウスのＩｇκ鎖のリーダー配列のＮ末端、および細胞外側にＦＡＳＴを提示する血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）膜貫通型ドメインのＣ末端で、同時に融合したＦＡＳＴを発現するＨｅＬａ細胞の共焦点顕微鏡写真を示す一連の写真である。  図２ｂは、５μＭの膜透過性ＨＭＢＲまたは膜不透過性ＨＢＲＡＡ−３Ｅでの５分間の処理の後にイメージングした細胞を示す一連の写真である。ＨＭＢＲは、膜および細胞内タンパク質を示し、ＨＢＲＡＡ−３Ｅは、表面に曝露したタンパク質のみを示した。  図２ｃは、５μＭの膜不透過性ＨＢＲＡＡ−３Ｅで１時間処理した後にイメージングした細胞を示す一連の写真である。その後の、膜透過性ＨＭＢＲの添加および即座のイメージング（＜１０秒）により、分泌経路の中のタンパク質が示された。
【実施例】
【０１７９】
実施例
本発明をさらに以下の実施例により示す。
【０１８０】
実施例１：ＨＢＲアナログおよびその製造
以下の表１に、本発明に係る膜不透過性ＨＢＲアナログを提示する。
【表１】
2020520676.tif 000010
【０１８１】
これら化合物の合成を、以下に提示する。
【０１８２】
材料および方法
市販の試薬は、さらに精製することなく開始材料として使用した。
【０１８３】
ＮＭＲスペクトルは、ＡＣ  Ｂｒｕｋｅｒ分光器にて、１Ｈでは３００ＭＨｚおよび１３Ｃでは７５ＭＨｚで記録した；化学シフトは、内部標準物質として、プロトン化溶媒と共にｐｐｍで記録される  １Ｈ，ＣＤＣｌ３中のＣＨＣｌ３  ７．２６ｐｐｍ，  ＣＤ３ＳＯＣＤ３中のＣＨＤ２ＳＯＣＤ３  ２．５０ｐｐｍ；１３Ｃ，ＣＤＣｌ３中の１３ＣＤＣｌ３  ７７．０ｐｐｍ，ＣＤ３ＳＯＣＤ３中の１３ＣＤ３ＳＯＣＤ３  ３９．５２ｐｐｍ；カップリング定数Ｊは、Ｈｚで提供する。質量スペクトルは、化学的イオン化または高分解能により、行った。カラムクロマトグラフィーは、シリカゲル６０（０．０４０〜０．０６３ｎｍ）Ｍｅｒｃｋで行った。解析用の薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、Ｍｅｒｃｋのシリカゲル６０Ｆ２５４であらかじめコーティングしたプレートで行った。
【０１８４】
結果
４−ヒドロキシ−３−エチルベンズアルデヒドの合成：１０％の水酸化ナトリウム水溶液（８０ｍＬ、２００ｍｍｏｌ）における２−エチルフェノール（６．１ｇ、５０ｍｍｏｌ）の溶液に、トリクロロメタン（１５．０ｇ、１２５ｍｍｏｌ）を、１時間にわたり６０℃で滴下し、その後反応混合物を６０℃で２時間攪拌した。冷却後に、この混合物を、塩酸の水溶液により中和し、ジクロロメタンで抽出した。組み合わせた有機層をブラインで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧下で濃縮した。この残渣を、シクロヘキサン／酢酸エチル（７．５／２．５，ｖ／ｖ）を用いたシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、所望の４−ヒドロキシ−３−エチルベンズアルデヒド（１．１ｇ、収率１５％）を、灰桃色の固体として回収した。
１Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３，  δ  ｉｎ  ｐｐｍ）：  ９．８４  （ｓ，  １Ｈ），  ７．７２  （ｓ，  １Ｈ），  ７．６５  （ｄ，  Ｊ＝  ８．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ６．９２  （ｄ，  Ｊ＝  ８．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ６．５１  （ｓ，  １Ｈ），  ２．７０  （ｑ，  Ｊ＝  ７．５  Ｈｚ，  ２Ｈ），  １．２７  （ｔ，  Ｊ＝  ７．５  Ｈｚ，  ３Ｈ）；  １３Ｃ  ＮＭＲ  （７５  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３，  δ  ｉｎ  ｐｐｍ）：  １９２．３，  １６０．５，  １３１．５，  １３１．４，  １３０．６，  １２９．４，  １１５．６，  ２２．８，  １３．５；  ＭＳ  （ＥＳＩ）：  ｍ／ｚ  １４９．２［Ｍ−Ｈ］−，  ｃａｌｃｄ  ｍａｓｓ  ｆｏｒ  ［Ｃ９Ｈ９Ｏ２］−：  １４９．１；  ＨＲＭＳ  （ＥＳＩ）：  ｍ／ｚ  １４９．０６０８  ［Ｍ−Ｈ］−，  ［Ｃ９Ｈ９Ｏ２］−の計算上の質量：  １４９．０６０３
【０１８５】
ＨＢＲアナログの合成に関する全般的なプロトコル：ローダミン−３−酢酸（１９１ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）および適切な置換型４−ヒドロキシベンズアルデヒド（１．０ｍｍｏｌ）を含む水溶液４０ｍＬを、９０℃で７日間攪拌した。４℃に冷却し一晩静置した後に、沈殿物を、ガラスのフィルターを介してろ過し、粗製の固体を水、エタノールで洗浄し、Ｐ２Ｏ５で乾燥させて、所望の生成物を提供した。
【０１８６】
（Ｚ）−２−（５−（４−ヒドロキシベンジリデン）−４−オキソ−２−チオキソチアゾリジン−３−イル）酢酸（ＨＢＲＡＡ）  黄色の粉末（４１％）。
１Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６，  δ  ｉｎ  ｐｐｍ）．  １０．５７  （ｓ，  １  Ｈ），  ７．８３  （ｓ，  １  Ｈ），  ７．５８  （ｄ，  Ｊ＝  ８．７  Ｈｚ，  ２  Ｈ），  ６．９７  （ｄ，  Ｊ＝  ８．７  Ｈｚ，  ２  Ｈ），  ４．７５  （ｓ，  ２Ｈ）．
【０１８７】
（Ｚ）−２−（５−（４−ヒドロキシ−３−メチルベンジリデン）−４−オキソ−２−チオキソチアゾリジン−３−イル）酢酸（ＨＢＲＡＡ−３Ｍ）  黄色の粉末（８０％）。
１Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＣＤ３ＳＯＣＤ３，  δ  ｉｎ  ｐｐｍ）：  １０．５０  （ｓ，  １Ｈ），  ７．７４  （ｓ，  １Ｈ），  ７．４０  （ｓ，  １Ｈ），  ７．３８  （ｄ，  Ｊ＝  ８．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ６．９６  （ｄ，  Ｊ＝  ８．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．７２  （ｓ，  ２Ｈ），  ２．１８  （ｓ，  ３Ｈ）；  １３Ｃ  ＮＭＲ  （７５  ＭＨｚ，  ＣＤ３ＳＯＣＤ３，  δ  ｉｎ  ｐｐｍ）：  １９３．２，  １６７．４，  １６６．５，  １５９．３，  １３４．９，  １３４．１，  １３１．１，  １２５．７，  １２３．８，  １１６．８，  １１５．８，  ４５．０，  １５．９；  ＭＳ  （ＥＳＩ）：  ｍ／ｚ  ３０８．２［Ｍ−Ｈ］−，  ｃａｌｃｄ  ｍａｓｓ  ｆｏｒ  ［Ｃ１３Ｈ１０ＮＯ４Ｓ２］−：  ３０８．０；  ＨＲＭＳ  （ＥＳＩ）：  ｍ／ｚ  ３１０．０２０２  ［Ｍ＋Ｈ］＋，  ［Ｃ１３Ｈ１２ＮＯ４Ｓ２］＋の計算上の質量：３１０．０２０８．
【０１８８】
（Ｚ）−２−（５−（４−ヒドロキシ−２−メトキシベンジリデン）−４−オキソ−２−チオキソチアゾリジン−３−イル）酢酸（ＨＢＲＡＡ−２ＯＭ）  橙色の粉末（７４％）。
１Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＣＤ３ＳＯＣＤ３，  δ  ｉｎ  ｐｐｍ）：  １３．４０  （ｓ，  １Ｈ），  １０．７２  （ｓ，  １Ｈ），  ７．９２  （ｓ，  １Ｈ），  ７．３３  （ｄ，  Ｊ＝  ８．７  Ｈｚ，  １Ｈ），  ６．５７  （ｄｄ，  Ｊ＝  ８．４，  ２．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ６．５３  （ｄ，  Ｊ＝  ２．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．７１  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．８７  （ｓ，  ３Ｈ）；  １３Ｃ  ＮＭＲ  （７５  ＭＨｚ，  ＣＤ３ＳＯＣＤ３，  δ  ｉｎ  ｐｐｍ）：  １９３．６，  １６７．４，  １６６．７，  １６３．４，  １６０．６，  １３２．６，  １２９．９，  １１６．６，  １１２．８，  １０９．２，  ９９．４，  ５５．７，  ４５．０；  ＭＳ  （ＥＳＩ）：  ｍ／ｚ  ３２４．２［Ｍ−Ｈ］−，  ｃａｌｃｄ  ｍａｓｓ  ｆｏｒ  ［Ｃ１３Ｈ１０ＮＯ５Ｓ２］−：  ３２４．０；  ＨＲＭＳ  （ＥＳＩ）：  ｍ／ｚ  ３２４．０００７  ［Ｍ−Ｈ］−，  ［Ｃ１３Ｈ１０ＮＯ５Ｓ２］−の計算上の質量：３２４．００００。
【０１８９】
（Ｚ）−２−（５−（４−ヒドロキシ−２，  ５−ジメチルベンジリデン）−４−オキソ−２−チオキソチアゾリジン−３−イル）酢酸（ＨＢＲＡＡ−２，５ＤＭ）  橙色の粉末（５９％）。
１Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＣＤ３ＳＯＣＤ３，  δ  ｉｎ  ｐｐｍ）：  １３．４３（ｓ，  １Ｈ），  １０．３６  （ｓ，  １Ｈ），  ７．８６  （ｓ，  １Ｈ），  ７．１７  （ｓ，  １Ｈ），  ６．７７  （ｓ，  １Ｈ），  ４．７２  （ｓ，  ２Ｈ），  ２．３６  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．１５  （ｓ，  ３Ｈ）；  １３Ｃ  ＮＭＲ  （７５  ＭＨｚ，  ＣＤ３ＳＯＣＤ３，  δ  ｉｎ  ｐｐｍ）：  １９３．５，  １６７．４，  １６６．４，  １５９．０，  １４０．２，  １３１．８，  １３０．９，  １２３．３，  １２２．４，  １１７．８，  １１７．４，  ４４．９，  １９．２，  １５．６；  ＭＳ  （ＥＳＩ）：  ｍ／ｚ  ３２２．２  ［Ｍ−Ｈ］−，  ｃａｌｃｄ  ｍａｓｓ  ｆｏｒ  ［Ｃ１４Ｈ１２ＮＯ４Ｓ２］−：  ３２２．０；  ＨＲＭＳ  （ＥＳＩ）：  ｍ／ｚ  ３２２．０２１４  ［Ｍ−Ｈ］−，  ［Ｃ１４Ｈ１２ＮＯ４Ｓ２］−の計算上の質量：３２２．０２０８。
【０１９０】
（Ｚ）−２−（５−（４−ヒドロキシ−３−エチルベンジリデン）−４−オキソ−２−チオキソチアゾリジン−３−イル）酢酸（ＨＢＲＡＡ−３Ｅ）  黄色の粉末（６２％）。
１Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＣＤ３ＳＯＣＤ３，  δ  ｉｎ  ｐｐｍ）：  １３．４４  （ｓ，  １Ｈ），  １０．４９  （ｓ，  １Ｈ），  ７．７７  （ｓ，  １Ｈ），  ７．４１  （ｓ，  １Ｈ），  ７．３９  （ｄ，  Ｊ＝  ７．８  Ｈｚ，  １Ｈ），  ６．９７  （ｄ，  Ｊ＝  ７．８  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．７２  （ｓ，  ２Ｈ），  ２．５９  （ｑ，  Ｊ＝  ７．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  １．１７  （ｔ，  Ｊ＝  ７．２  Ｈｚ，  ３Ｈ）；  １３Ｃ  ＮＭＲ  （７５  ＭＨｚ，  ＣＤ３ＳＯＣＤ３，  δ  ｉｎ  ｐｐｍ）：  １９３．１，  １６７．４，  １６６．５，  １５８．９，  １３５．０，  １３２．５，  １３１．５，  １３１．０，  １２３．９，  １１６．８，  １１６．０，  ４５．０，  ２２．５，  １３．７；  ＭＳ  （ＥＳＩ）：  ｍ／ｚ  ３２２．２  ［Ｍ−Ｈ］−，  ｃａｌｃｄ  ｍａｓｓ  ｆｏｒ  ［Ｃ１４Ｈ１２ＮＯ４Ｓ２］−：  ３２２．０；  ＨＲＭＳ  （ＥＳＩ）：  ｍ／ｚ  ３２２．０２１２  ［Ｍ−Ｈ］−，  ［Ｃ１４Ｈ１２ＮＯ４Ｓ２］−の計算上の質量：３２２．０２０８
【０１９１】
（Ｚ）−２−（５−（４−ヒドロキシ−３−エトキシベンジリデン）−４−オキソ−２−チオキソチアゾリジン−３−イル）酢酸（ＨＢＲＡＡ−３ＯＥ）  黄色の粉末（５９％）。
１Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＣＤ３ＳＯＣＤ３，  δ  ｉｎ  ｐｐｍ）：  １３．４３  （ｓ，  １Ｈ），  １０．１３  （ｓ，  １Ｈ），  ７．７９  （ｓ，  １Ｈ），  ７．２０  （ｓ，  １Ｈ），  ７．１６  （ｄ，  Ｊ＝  ８．４  Ｈｚ，  １Ｈ），  ６．９７  （ｄ，  Ｊ＝  ８．４  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．７３  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．１０  （ｑ，  Ｊ＝  ６．９  Ｈｚ，  ２Ｈ），  １．３７  （ｔ，  Ｊ＝  ６．９Ｈｚ，  ３Ｈ）；  １３Ｃ  ＮＭＲ  （７５  ＭＨｚ，  ＣＤ３ＳＯＣＤ３，  δ  ｉｎ  ｐｐｍ）：  １９３．０，  １６７．３，  １６６．４，  １５０．７，  １４７．３，  １３５．０，  １２５．５，  １２４．３，  １１７．２，  １１６．５，  １１５．７，  ６４．０，  ４５．０，  １４．６；  ＭＳ  （ＥＳＩ）：  ｍ／ｚ  ３３８．３  ［Ｍ−Ｈ］−，  ｃａｌｃｄ  ｍａｓｓ  ｆｏｒ  ［Ｃ１４Ｈ１２ＮＯ５Ｓ２］−：  ３３８．０；  ＨＲＭＳ  （ＥＳＩ）：  ｍ／ｚ  ３３８．０１６２  ［Ｍ−Ｈ］−，  ［Ｃ１４Ｈ１２ＮＯ５Ｓ２］−の計算上の質量：３３８．０１５７。
【０１９２】
（Ｚ）−２−（５−（４−ヒドロキシ−３−メトキシベンジリデン）−４−オキソ−２−チオキソチアゾリジン−３−イル）酢酸（ＨＢＲＡＡ−３ＯＭ）  黄色の粉末（５５％）。
１Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＣＤ３ＳＯＣＤ３，  δ  ｉｎ  ｐｐｍ）：  １３．４６  （ｓ，  １Ｈ），  １０．２３  （ｓ，  １Ｈ），  ７．８２  （ｓ，  １Ｈ），  ７．２４  （ｓ，  １Ｈ），  ７．１７  （ｄ，  Ｊ＝  ８．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ６．９７  （ｄ，  Ｊ＝  ８．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．７３  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．８５  （ｓ，  ３Ｈ）；  １３Ｃ  ＮＭＲ  （７５  ＭＨｚ，  ＣＤ３ＳＯＣＤ３，  δ  ｉｎ  ｐｐｍ）  ：  １９３．１，  １６７．４，  １６６．４，  １５０．５，  １４８．２，  １３５．０，  １２５．５，  １２４．３，  １１７．４，  １１６．５，  １１４．７，  ５５．７，  ４５．０；  ＭＳ  （ＥＳＩ）：  ｍ／ｚ  ３２４．２［Ｍ−Ｈ］−，  ［Ｃ１３Ｈ１０ＮＯ５Ｓ２］−の計算上の質量：３２４．０。
【０１９３】
（Ｚ）−２−（５−（４−ヒドロキシ−３，５−ジメチルベンジリデン）−４−オキソ−２−チオキソチアゾリジン−３−イル）酢酸（ＨＢＲＡＡ−３，５ＤＭ）  橙色の粉末（５０％）。
１Ｈ  ＮＭＲ（３００  ＭＨｚ，  ＣＤ３ＳＯＣＤ３，  δ  ｉｎ  ｐｐｍ）：  ９．４０  （ｓ，  １Ｈ），  ７．７０  （ｓ，  １Ｈ），  ７．２７  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．７２  （ｓ，  ２Ｈ），  ２．２３  （ｓ，  ６Ｈ）；  １３Ｃ  ＮＭＲ  （７５  ＭＨｚ，  ＣＤ３ＳＯＣＤ３，  δ  ｉｎ  ｐｐｍ）：  １９３．６，  １６７．８，  １６６．９，  １５７．７，  １３５．３，  １３２．４（２Ｃ），  １２６．０（２Ｃ），  １２４．３，  １１７．４，  ４５．４，  １７．１（２Ｃ）；  ＭＳ  （ＥＳＩ）：  ｍ／ｚ  ３２２．２［Ｍ−Ｈ］−，  ［Ｃ１４Ｈ１２ＮＯ４Ｓ２］−の計算上の質量：３２２．０。
【０１９４】
（Ｚ）−２−（５−（４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシベンジリデン）−４−オキソ−２−チオキソチアゾリジン−３−イル）酢酸（ＨＢＲＡＡ−３，５ＤＯＭ）  橙色の粉末（５９％）。
１Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＣＤ３ＳＯＣＤ３，  δ  ｉｎ  ｐｐｍ）：  ９．６３  （ｓ，  １Ｈ），  ７．８２  （ｓ，  １Ｈ），  ６．９７  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．７３  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．８５  （ｓ，  ６Ｈ）；  １３Ｃ  ＮＭＲ  （７５  ＭＨｚ，  ＣＤ３ＳＯＣＤ３，  ｖ  ｉｎ  ｐｐｍ）：  １９３．４，  １６７．８，  １６６．８，  １４８．８（２Ｃ），  １４０．２，  １３５．７，  １２３．６，  １１８．１，  １０９．３（２Ｃ），  ５６．６（２Ｃ），  ４５．４；  ＭＳ  （ＥＳＩ）：  ｍ／ｚ  ３５４．５［Ｍ−Ｈ］−，  ［Ｃ１４Ｈ１２ＮＯ６Ｓ２］−の計算上の質量：３５４．０。
【０１９５】
実施例２：ＦＡＳＴ−ＨＢＲアナログの複合体
材料および方法
細菌の発現およびタンパク質の精製：ＦＡＳＴは、変異Ｃ６９Ｇ、Ｙ９４Ｗ、Ｔ９５Ｍ、Ｆ９６Ｉ、Ｄ９７Ｐ、Ｙ９８Ｔ、Ｑ９９Ｓ、Ｍ１００Ｒ、Ｔ１０１Ｇを含む、ＰＹＰのバリアントである（配列番号３）。Ｈｉｓタグ付与したＦＡＳＴは、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ  Ｅ．  ｃｏｌｉ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で発現させた。細胞を、３７℃のＬＢ（溶原）培地において、ＯＤ６００ｎｍ０．６まで増殖させた。発現を、イソプロピル  β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度１ｍＭとなるまで添加することにより、４時間誘導した。細胞を、遠心処理（６，０００×ｇ、４℃で１５分間）により回収し、凍結した。細胞のペレットを、溶解バッファー（リン酸塩バッファー５０ｍＭ、ＮａＣｌ１５０ｍＭ、ＭｇＣｌ２２．５ｍＭ、プロテアーゼインヒビター、ＤＮａｓｅ、ｐＨ７．４）に再懸濁し、超音波処理した（２０％の振幅で５分間）。ライセートを、４℃で２時間インキュベートして、ＤＮａｓｅによりＤＮＡを消化させた。細胞フラグメントを、遠心処理により除去した（１５，０００×ｇ、４℃で１時間）。上清を、１０ｍＭのイミダゾールを補充したリン酸緩衝食塩水ＰＢＳ（リン酸ナトリウム５０ｍＭ、ＮａＣｌ  １５０ｍＭ、ｐＨ７．４）中のＮｉ−ＮＴＡアガロースビーズと共にゆっくりと攪拌しながら、４℃で一晩インキュベートした。ビーズを、２０ｍＭのイミダゾールを含む２０容量のＰＢＳ、および４０ｍＭのイミダゾールを補充した５容量のＰＢＳで洗浄した。Ｈｉｓタグを付与したタンパク質を、０．５Ｍのイミダゾールを補充した５容量のＰＢＳで溶出し、次にＰＢＳで透析を行った。
【０１９６】
物理化学の実験：ｐＨの測定を、Ｃｒｉｓｏｎ  ５２０８  Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ（Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，  Ｓｐａｉｎ）を有する標準的なｐＨメーターのＰＨＭ２１０  Ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ（ｐＨ４および７または１０の水性バッファーで較正）で行った。ＵＶ／Ｖｉｓ吸収スペクトルを、ダイオードアレイのＵＶ／Ｖｉｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ａｒｒａｙ，  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上の１ｃｍ×１ｃｍのクォーツのキュベット（Ｈｅｌｌｍａ）で記録した。１つの光子の励起で補正した蛍光スペクトルは、Ｐｅｌｔｉｅｒ  ｃｅｌｌ  ｈｏｌｄｅｒ（ＴＬＣ５０，  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ，  Ｓｈｏｒｅｌｉｎｅ，  ＷＡ）を搭載したＰｈｏｔｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＱｕａｎｔａＭａｓｔｅｒ  ＱＭ−１蛍光分光計（ＰＴＩ，  Ｍｏｎｍｏｕｔｈ  Ｊｕｎｃｔｉｏｎ，  ＮＪ）で記録した。１光子励起後の全量子収率φを前述のように決定した（Ｐｌａｍｏｎｔ，  Ｍ．−Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１６）。親和性の定数は、前述のプロトコルに従い（Ｐｌａｍｏｎｔ，  Ｍ．−Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１６）、Ｓｐａｒｋ  １０Ｍプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ）を使用した蛍光分光計測によるタイトレーションにより決定した。
【０１９７】
結果
ＦＡＳＴの物理化学的な特性：ｐＨ７．４のＰＢＳ中のフルオロゲン複合体を、以下の表２に記載する：λａｂｓ、最大吸収波長；λｅｍ，最大蛍光波長；ε、λａｂｓでのモル吸光係数；φ、蛍光の量子収率；ＫＤ  親和性定数。輝度は、ε×φに相当する。
【表２】
2020520676.tif 000011
【０１９８】
表１に示すように、ＨＢＲまたはＨＭＢＲなどの強力なＦＡＳＴ蛍光発生発色団が、カルボキシメチルなどの陰性の基によりロダニンの頭部（Ｒ３位）で置換される場合、その後ＦＡＳＴとの親和性は急激に減少する：ＦＡＳＴ：ＨＢＲＡＡ−３Ｍは、対応する複合体ＦＡＳＴ：ＨＭＢＲよりも４０倍高いＫＤを有し；ＨＢＲＡＡは、ＦＡＳＴに対してほとんど親和性を有さない（ＫＤ＞２０μＭ）。さらに、ＦＡＳＴ：ＨＢＲＡＡ−３Ｍ複合体は、ＦＡＳＴ：ＨＭＢＲよりも３倍低い輝度を呈した。さらには、ＦＡＳＴ：ＨＲＢＡＡのモル吸光係数は、低い親和性によりに決定することができなかった。
【０１９９】
親和性の欠如は、化合物を、ＦＡＳＴ用の蛍光発生発色団として不適切にし、抑えられた輝度は、全般的に、蛍光透視実験を行う際には好ましくないとみなされる。理論により拘束されるものではないが、本出願人は、親和性および輝度の欠如の結果は、付加されたカルボキシメチル基とＦＡＳＴとの間の立体的な衝突（steric clash）からもたらされている可能性があると考えている。
【０２００】
本出願人は、フルオロゲンの構造を操作することによりこの問題を解決するための徹底的な研究を行った。これを行うことにより、芳香環上の置換基が、ＦＡＳＴ：フルオロゲン複合体の親和性および輝度にとって重要な決定因子であることが明らかとなった。また驚くべきことに、芳香環上の特定の置換が、ＦＡＳＴとその蛍光発生発色団との間の親和性を修復することができ、他の置換はこの複合体の安定性を悪化させることが見いだされた。
【０２０１】
様々な芳香族の位置において様々な基で置換された化合物によるＦＡＳＴと共に形成された複合体の特性を、表２に示す。
【０２０２】
３位のメチル基の３位のメトキシ基への変換は、ＦＡＳＴとほとんど親和性を有さない化合物ＨＢＲＡＡ−３ＯＭをもたらした（表２）。３位のメトキシ基を２位のメトキシ基へと移動させることにより、０．５μＭの高い親和性で非常に強力にＦＡＳＴに結合した化合物ＨＢＲＡＡ−２ＯＭがもたらされた。しかしながら、この複合体の輝度は、約２，８００に限定されている（表２）。
【０２０３】
別の修飾は、３位のメトキシ基の同じ３位でのエトキシ基への交換であり、これは、ＨＢＲＡＡ−３ＯＥ化合物をもたらした。この化合物は、１．７μＭの、わずかに低い親和性を呈するが、より高い約３，７００の輝度の複合体を形成する（表２）。
【０２０４】
結果的に、最も輝度の高いＦＡＳＴ：フルオロゲン複合体は、３位のメチル基がエチル基と交換された、ＨＢＲＡＡ−３Ｅで得られた。ＨＢＲＡＡ−３Ｅと結合したＦＡＳＴは、約１．３μＭの親和性および約４，９００の輝度を有する（表１）ことにより、膜不透過性蛍光発生発色団として使用するための非常に興味深い候補となっている。
【０２０５】
対照的に、二置換した化合物ＨＢＲＡＡ−２，５ＤＭ、ＨＢＲＡＡ−３，５ＤＭ、およびＨＢＲＡＡ−３，５ＤＭＯにより形成された複合体はどれも、ＨＢＲＡＡ−３Ｍのものよりも高い親和性を有さなかった（表２）。よってこれらは、ＦＡＳＴタグ化を介した細胞のイメージングに適切ではない。
【０２０６】
ＦＡＳＴと本発明に係る膜不透過性蛍光発生発色団との間に形成された複合体は、ＦＡＳＴ：ＨＭＢＲ複合体の輝度（１０，３００）と同程度ではないが、その輝度は、ＦＡＳＴ：ＨＢＲ複合体の輝度に匹敵しており（４，０００）、よって、細胞のイメージングに適している。
【０２０７】
興味深いことに、ＦＡＳＴ：ＨＢＲＡＡ−３Ｅはまた、ＦＡＳＴ：ＨＭＢＲと比較して、吸収において２５ｎｍの赤方偏移および蛍光において２０ｎｍの赤方偏移を呈し、さらに、エチル基（ＨＢＲＡＡ−３Ｅ）をエトキシ基（ＨＢＲＡＡ−３ＯＥ）で交換することは、ＦＡＳＴ複合体の吸収および蛍光をさらに赤方偏移させた（表２）。
【０２０８】
結論として、驚くべきことに、芳香環の２位または３位における適切なアルキル基またはアルコキシ基での置換は、ＦＡＳＴとＨＢＲアナログとの間の親和性を修復させることにより、蛍光発生発色団として使用できることが見いだされた。
【０２０９】
本発明に係る膜不透過性蛍光発生発色団は、以下で証明されているように、選択的なイメージング法に有用である。
【０２１０】
実施例３：膜不透過性蛍光発生発色団としてのＨＢＲアナログの使用
材料および方法
分子生物学：外側の形質膜で（さらなるトランスフェクションマーカーとしてのｍＣｈｅｒｒｙに融合した）ＦＡＳＴの哺乳類の発現用のプラスミドｐＡＧ２１１を、Ｓａｌ  ＩおよびＢｇｌ  ＩＩの制限部位を使用してｐＤｉｓｐｌａｙプラスミド（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）の中に目的のタンパク質をコードした配列を挿入することにより得た。ｍＣｈｅｒｒｙに融合したＦＡＳＴの細胞質での発現用のプラスミドｐＡＧ９６は、以前に報告されたものであった（Ｐｌａｍｏｎｔ，  Ｍ．−Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１６）。
【０２１１】
哺乳類細胞の培養：ＨｅＬａ細胞を、フェノールレッド、Ｇｌｕｔａｍａｘ  Ｉ、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、および１％のペニシリン−ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭにて、５％のＣＯ２雰囲気下、３７℃で培養した、顕微鏡によるイメージングのために、細胞を、ポリ−Ｌ−リジンでコーティングしたμＤｉｓｈまたはμＳｌｉｄｅ  ＩＢＩＤＩ（Ｂｉｏｖａｌｌｅｙ）に播種した。細胞に、Ｇｅｎｅｊｕｉｃｅ（Ｍｅｒｃｋ）を製造社のプロトコルに従い使用して、一時的にトランスフェクションを行った。イメージングの前に、細胞を、ＰＢＳで洗浄し、指定の濃度でフルオロゲンを含むＤＭＥＭ培地（血清およびフェノールレッドを含まない）で処理した。洗浄を行わずに、細胞を直接イメージングした。
【０２１２】
蛍光解析：共焦点顕微鏡写真は、Ｐｌａｎ  Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ  ６３×／１．４  ＮＡ油浸対物レンズを搭載したＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ７１０のレーザー走査型顕微鏡で得た。データを回収するためにＺＥＮソフトウェアを使用した。画像は、Ｉｍａｇｅ  Ｊで解析した。フローサイトメトリー解析は、Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６血球計算器（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で行った。
【０２１３】
生細胞において細胞表面に曝露したＦＡＳＴ−タグ付与したタンパク質を標識するための蛍光発生発色団として使用される本発明に係るＨＢＲアナログの特性を、評価した。一般的な原則は、図１に示しており、ここでは、膜透過性フルオロゲン（ＭＰＦ、図１ａ）と膜不透過性フルオロゲン（ＭＩＦ、図１ｂ）との間の細胞標識の差異を示しており；膜不透過性であり、よって細胞のうちマークされた部分はその膜のみであるため、細胞外側に少なくとも一部が突き出ている細胞表面タンパク質または分泌型タンパク質のみがＭＩＦにより標識されている。対照的に、ＭＰＦは、内部および外部のタンパク質の両方を標識しており、よって、細胞表面タンパク質の選択的な標識を許容していない。
【０２１４】
次に、長期間の曝露の後の細胞による排除（ｃｅｌｌ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）を評価した。赤色蛍光タンパク質ｍＣｈｅｒｒｙと融合したＦＡＳＴを、ＨｅＬａ細胞の細胞質で発現させた。細胞を、５μＭのＨＢＲＡＡ−３Ｅを含む培地で２時間処理した。共焦点顕微鏡によるイメージングは、細胞内部の標識を明らかにしなかった（図２ａ）。よってＨＢＲＡＡ−３Ｅは、膜不透過性であり、また、長期間の研究に適した蛍光発生発色団でもある。
【０２１５】
次に、細胞表面のＦＡＳＴ−タグ付与したタンパク質の選択的な標識に関するＨＢＲＡＡ−３Ｅの使用を、試験した。ポリペプチドは、マウスのＩｇκ鎖のリーダー配列と血小板増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）膜貫通型ドメインとの間にＦＡＳＴを含むように操作された。ＦＡＳＴは、タンパク質を分泌経路に誘導するマウスのＩｇκ鎖のリーダー配列のＮ末端、および、タンパク質を形質膜にアンカリングするＰＤＦＧＦＲ膜貫通型ドメインのＣ末端で、融合させた。結果得られるＦＡＳＴ−タグ付与したタンパク質を、ＨｅＬａ細胞で一時的に発現させた。よってトランスフェクトした細胞は、その膜の細胞外側でＦＡＳＴを提示した。トランスフェクトした細胞を、５μＭのＨＭＢＲまたはＨＢＲＡＡ−３Ｅを含む培地で５分間処理した。膜透過性ＨＭＢＲで処理した細胞は、膜および分泌経路の中の両方で、ＦＡＳＴ−タグ付与したタンパク質の標識を示し、膜不透過性ＨＢＲＡＡ−３Ｅで処理した細胞は、形質膜でのみ蛍光標識を示した（図２ｂ）。
【０２１６】
さらに、より長いインキュベーション時間（１時間）を使用した場合に、ＨＢＲＡＡ−３Ｅによる細胞内標識は観察されず（図２ｃ）、長期間曝露した場合であっても細胞による排除が確認された。
【０２１７】
遺伝子変異により誘導される輸送の欠陥を修復できる小分子の発見は、医薬設計に非常に重要なものとなっている。正常な輸送を修復させるための小分子の特性をバリデートすることは、顕微鏡および画像の解析により一般に提供される空間的な情報を必要とし、よって、スクリーニングのスループットを限定している。ＨＢＲＡＡ−３Ｅなどの膜不透過性フルオロゲンは、分泌経路の中を移動するタンパク質を標識しないため、これらは、イメージングを必要とすることなく輸送の修復に関して報告するために、使用され得る。
【０２１８】
逆に、同じ状況は、正常な細胞表面への輸送または選択したタンパク質の分泌を妨げることができる分子に関してスクリーニングするために、使用され得る。これは、疾患の発症に関与するタンパク質（たとえばウイルスの受容体、シグナリング分子、受容体、マトリックスプロテアーゼなど）の活性の遮断を可能にし得る。
【０２１９】
結論として、ＦＡＳＴを結合し、輝度のある蛍光性複合体を提供する膜不透過性フルオロゲンが、開発された。これらの形質膜を通ることができない特性は、細胞内タンパク質を標識することなく、細胞表面タンパク質などの表面に曝露したＦＡＳＴ−タグ付与したタンパク質を選択的にイメージングすることを可能にする。このような染色は、洗浄を行わずに、単一の標識ステップで、リアルタイムで達成することができる。
【図１ａ】
2020520676.tif 000019
【図１ｂ】
2020520676.tif 000020
【図２ａ】
2020520676.tif 000021
【図２ｂ】
2020520676.tif 000022
【図２ｃ】
2020520676.tif 000023
【手続補正書】
【提出日】令和2年1月23日(2020.1.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2020520676000001.app
【国際調査報告】
2020520676.tif 000024
2020520676.tif 000025