(57)【要約】  本発明は生化学及び分子生物学の分野に属する。本発明は、α−コノトキシンペプチドＴｘＩＤの変異体、その医薬組成物及びその使用を提供する。ＴｘＩＤ変異体は、アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）、特にα３β４又はα６／α３β４サブタイプを特異的に遮断することができ、禁煙及び解毒及び鎮痛のための医薬、精神病及び癌の治療のための、食欲を調節するための医薬、及び神経科学のための道具医薬(tool medicine)、の製造において応用が期待される。
2020501584.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
９位のセリンが異なるＬ型又はＤ型アミノ酸で置換されている配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチドであって、好ましくは、配列番号１に示される配列の９位のセリンが、アラニン、２−アミノ酪酸、ヒスチジン、アルギニン、チロシン、スレオニン、リジン、ロイシン、フェニルアラニン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、グルタミン酸、又はアスパラギン酸で置換された、上記ポリペプチド。
【請求項２】
それぞれ配列番号２〜３、７、９、１１〜３３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチド。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のポリペプチドであって、ポリペプチドのＮ末端から数えて、
第１システインが第３システインとジスルフィド結合を形成し、かつ第２システインが第４システインとジスルフィド結合を形成するか；又は、第１システインが第４システインとジスルフィド結合を形成し、かつ第２システインが第３システインとジスルフィド結合を形成するか；又は、第１システインが第２システインとジスルフィド結合を形成し、かつ第３システインが第４システインとジスルフィド結合を形成し、
好ましくは、前記ポリペプチドのカルボキシ末端がアミド化されている、上記ポリペプチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の少なくとも１つのポリペプチドを含む単離された融合タンパク質。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項５に記載のポリヌクレオチドを含む核酸構築物であって、好ましくは前記核酸構築物は組換えベクターであり、好ましくは前記核酸構築物は組換え発現ベクターである、上記核酸構築物。
【請求項７】
請求項５に記載のポリヌクレオチド又は請求項６に記載の核酸構築物を含む形質転換細胞。
【請求項８】
場合により医薬的に許容し得る賦形剤をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の少なくとも１つのポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項９】
アセチルコリン受容体を遮断するための医薬の製造における請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドの使用であって、好ましくは前記アセチルコリン受容体は、α３β４アセチルコリン受容体、又はα６β４* アセチルコリン受容体、例えばα６／α３β４アセチルコリン受容体である、上記使用。
【請求項１０】
神経系疾患又は癌の治療及び／又は予防のための医薬の製造における、又は有害生物の駆除、鎮痛、禁煙、解毒、又は食欲増進のための医薬の製造における、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドの使用であって、
好ましくは、前記神経系疾患は、依存症、神経痛、パーキンソン病、認知症、統合失調症、及び鬱病のうちの少なくとも１つであり；
好ましくは、前記依存症は、以下の要因：ニコチン、アヘン、ヘロイン、メタンフェタミン（アイス）、モルヒネ、マリファナ、コカイン、又はアルコールなどの様々な精神活性物質のうちの少なくとも１つによって引き起こされ；
好ましくは、前記神経痛は、以下：坐骨神経痛、三叉神経痛、リンパ神経痛、多点運動神経痛、急性の激しい自発性神経痛、挫滅性神経痛、及び複合神経痛の少なくとも１つから選択され；
好ましくは、前記神経痛は、以下の要因：癌、癌化学療法、アルコール依存症、糖尿病、硬化症、帯状疱疹、機械的損傷、外科的損傷、ＡＩＤＳ、頭部神経痛、薬物中毒、産業公害中毒、骨髄腫、慢性先天性感覚神経障害、血管炎、脈管炎、虚血、尿毒症、小児胆汁性肝疾患、慢性呼吸器障害、多臓器不全、敗血症／膿血症、肝炎、ポルフィリン症、ビタミン欠乏症、慢性肝疾患、先天性胆汁性硬化症、高脂血症、らい病、ライム関節炎、感覚神経周囲炎、又はアレルギーのうちの少なくとも１つによって引き起こされ；
好ましくは、前記癌は、小細胞肺癌などの肺癌、卵巣癌、白血病、神経芽細胞腫、又は乳癌である、上記使用。
【請求項１１】
有効量の請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドを被験体に投与するか又は細胞にを投与する工程を含む、インビボ又はインビトロでアセチルコリン受容体を遮断するか又はアセチルコリンのレベルを調節する方法であって、好ましくはアセチルコリン受容体は、α３β４アセチルコリン受容体、又はα６／α３β４アセチルコリン受容体などのα６β４* アセチルコリン受容体である、上記方法。
【請求項１２】
アセチルコリン受容体を遮断するのに使用される、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドであって、好ましくは前記アセチルコリン受容体は、α３β４アセチルコリン受容体、又はα６／α３β４アセチルコリン受容体などのα６β４* アセチルコリン受容体である、上記ポリペプチド。
【請求項１３】
神経系疾患又は癌の治療及び／又は予防に使用されるか、又は有害生物の駆除、鎮痛、禁煙、解毒、又は食欲増進に使用される、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドであって、
好ましくは、前記神経系疾患は、依存症、神経痛、パーキンソン病、認知症、統合失調症、及び鬱病のうちの少なくとも１つであり；
好ましくは、前記依存症は、以下の要因：ニコチン、アヘン、ヘロイン、メタンフェタミン（アイス）、モルヒネ、マリファナ、コカイン、又はアルコールなどの様々な精神活性物質のうちの少なくとも１つによって引き起こされ；
好ましくは、前記神経痛は、以下：坐骨神経痛、三叉神経痛、リンパ神経痛、多点運動神経痛、急性の激しい自発性神経痛、挫滅性神経痛、及び複合神経痛の少なくとも１つから選択され；
好ましくは、前記神経痛は、以下の要因：癌、癌化学療法、アルコール依存症、糖尿病、硬化症、帯状疱疹、機械的損傷、外科的損傷、ＡＩＤＳ、頭部神経痛、薬物中毒、産業公害中毒、骨髄腫、慢性先天性感覚神経障害、血管炎、脈管炎、虚血、尿毒症、小児胆汁性肝疾患、慢性呼吸器障害、多臓器不全、敗血症／膿血症、肝炎、ポルフィリン症、ビタミン欠乏症、慢性肝疾患、先天性胆汁性硬化症、高脂血症、らい病、ライム関節炎、感覚神経周囲炎、又はアレルギーのうちの少なくとも１つによって引き起こされ；
好ましくは、前記癌は、小細胞肺癌などの肺癌、卵巣癌、白血球、神経芽細胞腫、又は乳癌である、上記ポリペプチド。
【請求項１４】
神経系疾患又は癌を治療及び／又は予防する方法、又は有害生物を駆除、鎮痛、禁煙、解毒、又は食欲増進をする方法であって、それを必要とする被験体に有効量の請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドを投与する工程を含み、
好ましくは、前記神経系疾患は、依存症、神経痛、パーキンソン病、認知症、統合失調症、及び鬱病のうちの少なくとも１つであり；
好ましくは、前記依存症は、以下の要因：ニコチン、アヘン、ヘロイン、メタンフェタミン（アイス）、モルヒネ、マリファナ、コカイン、又はアルコールなどの様々な精神活性物質）のうちの少なくとも１つによって引き起こされ；
好ましくは、前記神経痛は、以下：坐骨神経痛、三叉神経痛、リンパ神経痛、多点運動神経痛、急性の激しい自発性神経痛、挫滅性神経痛、及び複合神経痛）の少なくとも１つから選択され；
好ましくは、前記神経痛は、以下の要因：癌、癌化学療法、アルコール依存症、糖尿病、硬化症、帯状疱疹、機械的損傷、外科的損傷、ＡＩＤＳ、頭部神経痛、薬物中毒、産業公害中毒、骨髄腫、慢性先天性感覚神経障害、血管炎、脈管炎、虚血、尿毒症、小児胆汁性肝疾患、慢性呼吸器障害、多臓器不全、敗血症／膿血症、肝炎、ポルフィリン症、ビタミン欠乏症、慢性肝疾患、先天性胆汁性硬化症、高脂血症、らい病、ライム関節炎、感覚神経周囲炎、又はアレルギー）のうちの少なくとも１つによって引き起こされ；
好ましくは、前記癌は、小細胞肺癌などの肺癌、卵巣癌、白血病、神経芽細胞腫、又は乳癌である、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生化学及び分子生物学の分野に関し、そしてα−コノトキシンペプチドＴｘＩＤの新規変異体、医薬組成物、およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
コノトキシン（コノペプチド、ＣＴｘ）は、熱帯の薬用海洋生物であるイモ貝（cone shell）から分泌される神経ペプチドであり、これは捕食及び防御に使用され、動物の様々なイオンチャネル及び受容体に特異的に結合するという特異的な機能を有する（Terlau, H., and Olivera, B. M. (2004) Conus venoms: a rich source of novel ion channel-targeted peptides. Physiological reviews 84, 41-68. Schroeder, C. I.、及び Craik, D. J. (2012) Therapeutic potential of conopeptides. Future medicinal chemistry 4, 1243-1255）。
【０００３】
アルファコノトキシンは、最適な選択性を有する現在よく見られるニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）サブタイプに特異的な遮断剤である。アルファ−コノトキシンとその標的ｎＡＣｈＲは、さまざまな疾患機序と薬物開発の研究において極めて有用である。アルファ−コノトキシンは最も初期に発見されたコノトキシンの１つであり、通常は分子量が小さく、そして一般にジスルフィド結合に富む１２〜１９個のアミノ酸残基からなる。多様な活性と構造を有する多種類のα−コノトキシンがある。
【０００４】
ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）は、動物界において重要な生理学的及び臨床的意義を有する細胞膜タンパク質であり、ヒトによって最初に発見された受容体であり、筋肉アセチルコリン受容体と神経アセチルコリン受容体の２種類に分けることができる。ｎＡＣｈＲは細胞膜上のアロステリック膜タンパク質であり、これは中枢及び末梢神経系の多くの生理学的機能（学習、記憶、応答、鎮痛、及び運動制御を含む）を仲介する。ｎＡＣｈＲは、ドーパミン、ノルエピネフリン、セロトニン、γ−アミノ酪酸などの様々な神経伝達物質の放出を活性化する（Gotti, C., and Clementi, F. (2004), Neuronal nicotinic receptors: from structure to pathology. Progress in neurobiology 74, 363-396）。ｎＡＣｈＲは、疼痛、アルコール依存症及び薬物依存症、精神遅滞、認知症、統合失調症、中枢神経障害、てんかん、パーキンソン病、精神疾患、神経筋ブロック、重症筋無力症、鬱病、高血圧、不整脈、喘息、筋弛緩、脳卒中、乳癌、肺癌を含む広範囲の重要な疾患を治療するための薬物のスクリーニングの重要な標的であることが示されている（Gotti, C., Moretti, M., Bohr, I., Ziabreva , I., Vailati, S., Longhi, R., Riganti, L., Gaimarri, A., McKeith, I.G., Perry, R.H., Aarsland, D., Larsen, J.P., Sher, E., Beattie, R., Clementi, F., and Court, JA (2006) Selective nicotinic acetylcholine receptor subunit deficits identified in Alzheimer's disease, Parkinson's disease and dementia with Lewy bodies by immunoprecipitation. Neurobiology of disease 23, 481-489. Lee, C.H., Huang, C.S., Chen, C.S., Tu, S.H., Wang, Y.J., Chang, Y.J., Tam, K.W., Wei, P.L., Cheng, T.C., Chu, J.S., Chen, L.C., Wu, C.H., and Ho, Y.S. (2010) Overexpression and Activation of t He alpha9-nicotinic receptor during tumorigenesis in human breast epithelial cells. Journal of the National Cancer Institute 102, 1322-1335. Lee, C.H., Chang, Y.C., Chen, C.S., Tu, S.H., Wang, Y.J., Chen, L.C., Chang , Y.J., Wei, P.L., Chang, H.W., Chang, C.H., Huang, C.S., Wu, C.H., and Ho, Y.S. (2011) Crosstalk between nicotine and estrogen-induced estrogen receptor activation induces alpha 9-nicotinic acetylcholine receptor expression in human breast cancer cells. Breast Cancer Res Tr 129, 331-345. Rahman, S. (2013) Nicotinic Receptors as Therapeutic Targets for Drug Addictive Disorders. Cns Neurol Disord-Dr 12, 633-640）。ｎＡＣｈＲは、それぞれ異なる薬理学的特徴を有する異なるアルファ及びベータサブユニットから、多種多様なサブタイプに組み立てられる。様々なサブタイプのｎＡＣｈＲに対して高い選択性を有するリガンドとしての薬物の開発は、これらの疾患を治療するための鍵となる（Livett BG, Sandall DW, Keays D, Down J, Gayler KR, Satkunanathan N, Khalil Z. Therapeutic applications of conotoxins that target the neuronal nicotinic acetylcholine receptor. Toxicon, 2006, 48(7): 810-829; Taly A, Corringer PJ, Guedin D, Lestage P, Changeux JP. Nicotinic receptors: allosteric transitions and therapeutic targets in the nervous system. Nat Rev Drug Discov. 2009, 8(9): 733-50; Layla A, McIntosh JM. Alpha-conotoxins as pharmacological probes of nicotinic acetylcholine receptors [J]. Acta Pharmacol Sin 2009 Jun; 30 (6): 771-783）。しかしながら、そのような薬物を開発するための前提は、ｎＡＣｈＲの様々なサブタイプに特異的に結合することができ、様々なサブタイプの微細組成及び生理学的機能を研究及び特定するためのツールとして使用でき、又は関連疾患の治療用の医薬として直接使用できる選択的化合物を得ることである。
【０００５】
薬物依存症は、医学的問題でありかつ深刻な社会問題でもある。タバコ依存症はタバコ中のニコチンによって引き起こされ、その体内の受容体はニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）である（Azam L, McIntosh JM. Alpha-conotoxins as pharmacological probes of nicotinic acetylcholine receptors. Acta Pharmacol Sin. 2009; 30(6): 771-783）。α３β４を含有するｎＡＣｈＲを遮断することは、タバコ、モルヒネ、及びコカイン依存症に対する渇望の開始を防止するのに有効であり、喫煙及び薬物摂取に対する欲望を著しく阻害することが、研究により示されている（Brunzell DH, Boschen KE, Hendrick ES, Beardsley PM, McIntosh JM. Alpha-conotoxin MII-sensitive nicotinic acetylcholine receptors in the nucleus accumbens shell regulate progressive ratio responding maintained by nicotine, Neuropsychopharmacology, 2010, 35(3):665-73)）。
【０００６】
α３β４ ｎＡＣｈＲは、感覚神経中枢及び自律神経中枢における主要なアセチルコリン受容体サブタイプである。α３β４ ｎＡＣｈＲはまた、中枢に広がる手綱（habenula）や背部骨髄などの中枢神経系（ＣＮＳ）ニューロンの分枝でもあり、これは、ニコチンやその他の乱用薬物の依存症に関与している（Millar, N. S.; Gotti, C., Diversity of vertebrate nicotinic acetylcholine receptors. Neuropharmacology 2009,56 (1), 237-46; Tapper, A. R.; McKinney, S. L.; Nashmi, R.; Schwarz, J.; Deshpande, P.; Labarca, C.; Whiteaker, P.; Marks, M. J.; Collins, A. C.; Lester, H. A., Nicotine activation of alpha4* receptors: sufficient for reward, tolerance, and sensitization. Science 2004,306 (5698), 1029-32）。α３β４ ｎＡＣｈＲは中心枝ドーパミン経路に関与しており、特定の物質（ニコチン、薬物など）の乱用の報酬効果に非常に重要な役割を果たしている。（Jackson KJ, Sanjakdar SS, Muldoon PP, McIntosh JM, Damaj MI. The α3β4* nicotinic acetylcholine receptor subtype mediates nicotine reward and physical nicotine withdrawal signs independently of the α5 subunit in the mouse. Neuropharmacology. 2013 Jul; 70:228-35）。α３β４ ｎＡＣｈＲ遮断剤は、コカイン依存症、又はコカインとニコチンの共産薬物依存症を効果的に抑制することができる（Khroyan TV, Yasuda D, Toll L, Polgar WE, Zaveri NT. High affinity α3β4 nicotinic acetylcholine receptor ligands AT-1001 and AT-1012 attenuate cocaineinduced conditioned place preference and behavioral sensitization in mice. Biochem Pharmacol. 2015 Oct 15; 97(4): 531-41）。さらに、ニコチン誘発運動及び報酬効果は、β−４サブユニットノックアウトマウスにおいて顕著に低下し、これは、α３β４ ｎＡＣｈＲがＣＮＳにおけるニコチン中毒において重要な役割を果たすことを意味する。この実験結果は、α３β４ ｎＡＣｈＲ遮断剤も、渇望及びアルコール依存症の発症を効果的に予防できることを示している。(Toll L, Zaveri NT, Polgar WE, Jiang F, Khroyan TV, Zhou W, Xie XS, Stauber GB, Costello MR, Leslie FM. AT-1001: a high affinity and selective α3β4 nicotinic acetylcholine receptor antagonist blocks nicotine self-administration in rats. Neuropsychopharmacology. 2012 May; 37(6):1367-76. Cippitelli A, Wu J, Gaiolini KA, Mercatelli D, Schoch J, Gorman M, Ramirez A, Ciccocioppo R, Khroyan TV, Yasuda D, Zaveri NT, Pascual C, Xie XS, Toll L. AT-1001: a high-affinity α3β4 ｎＡＣｈＲ ligand with novel nicotine-suppressive pharmacology. Br J Pharmacol. 2015 Apr;172(7):1834-45. Slimak MA, Ables JL, Frahm S, Antolin-Fontes B, Santos-Torres J, Moretti M, Gotti C, Ibanez-Tallon I. Habenular expression of rare missense variants of the β4 nicotinic receptor subunit alters nicotine consumption. Front Hum Neurosci. 2014 Jan 27; 8:12. Cippitelli A, Brunori G, Gaiolini KA, Zaveri NT, Toll L. Pharmacological stress is required for the anti-alcohol effect of the α3β4* ｎＡＣｈＲ partial agonist AT-1001. Neuropharmacology. 2015 Jun; 93:229-36. Rahman S, Prendergast MA. Cholinergic receptor system as a target for treating alcohol abuse and dependence. Recent Pat CNS Drug Discov. 2012 Aug;7(2):145-50)
【０００７】
α３β４ ｎＡＣｈＲはまた恐怖反応に重要な役割を果たしており、これはグルタミン酸塩とノルエピネフリンの放出を調節するのに不可欠である (Zhu, P. J.; Stewart, R. R.; McIntosh, J. M.; Weight, F. F., Activation of nicotinic acetylcholine receptors increases the frequency of spontaneous GABAergic IPSCs in rat basolateral amygdala neurons. Journal of neurophysiology 2005, 94 (5), 3081-91. Alkondon, M.; Albuquerque, E. X., A non-alpha7 nicotinic acetylcholine receptor modulates excitatory input to hippocampal CA1 interneurons. Journal of neurophysiology 2002,87 (3), 1651-4. Luo, S.; Kulak, J. M.; Cartier, G. E.; Jacobsen, R. B.; Yoshikami, D.; Olivera, B. M.; McIntosh, J. M., alpha-conotoxin AuIB selectively blocks alpha3 beta4 nicotinic acetylcholine receptors and nicotine-evoked norepinephrine release. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience 1998,18 (21), 8571-9. Kulak, J. M.; McIntosh, J. M.; Yoshikami, D.; Olivera, B. M., Nicotine-evoked transmitter release from synaptosomes: functional association of specific presynaptic acetylcholine receptors and voltage-gated calcium channels. Journal of neurochemistry 2001,77 (6), 1581-9)。α−コノトキシンを使用することによって、ヒト副腎褐色細胞腫において、α３β４ ｎＡＣｈＲが濃縮され、発現されていることが同定される。（Hone AJ, McIntosh JM, Azam L, Lindstrom J, Lucero L, Whiteaker P, Passas J, Blazquez J, Albillos A. α-Conotoxins Identify the α３β４* Subtype as the Predominant Nicotinic Acetylcholine Receptor Expressed in Human Adrenal Chromaffin Cells. Mol Pharmacol. 2015 Nov; 88(5):881-93）。α３β４ ｎＡＣｈＲは嗅覚神経において重要な役割を果たしており、これは、僧帽細胞応答のスクリーニング及びフィルタリングを仲介し、僧帽細胞上のα３β４ ｎＡＣｈＲを活性化することによって、神経細胞の興奮を刺激する（D'Souza RD, Vijayaraghavan S. Nicotinic receptor-mediated filtering of mitral cell responses to olfactory nerve inputs involves the α3β4 subtype. J Neurosci. 2012 Feb 29; 32(9): 3261-6）。
【０００８】
α３β２及びα３β４サブタイプを含むα３−サブユニット含有ｎＡＣｈＲは、主に末梢神経系で発現され、神経痛薬の標的である。α３β２ ｎＡＣｈＲ又はα３β４ ｎＡＣｈＲを遮断するアルファ−コノトキシンは、さまざまな前臨床慢性疼痛モデルにおいて優れた鎮痛作用を示し、中毒性はない。難治性疼痛は世界的な健康問題であり、新しい治療薬が緊急に必要とされている（Napier, I. A.; Klimis, H.; Rycroft, B. K.; Jin, A. H.; Alewood, P. F.; Motin, L.; Adams, D. J.; Christie, M. J., Intrathecal α-conotoxins Vc1.1, AuIB and MII acting on distinct nicotinic receptor subtypes reverse signs of neuropathic pain. Neuropharmacology 2012, 62 (7), 2202-2207. Blyth, F. M.; March, L. M.; Brnabic, A. J.; Jorm, L. R.; Williamson, M.; Cousins, M. J., Chronic pain in Australia: a prevalence study. PAIN 2001, 89 (2-3), 127-34. Cousins, M. J.; Brennan, F.; Carr, D. B., Pain relief: a universal human right. PAIN 2004,112 (1-2), 1-4. Eisenberg, E.; McNicol, E. D.; Carr, D. B., Efficacy and safety of opioid agonists in the treatment of neuropathic pain of nonmalignant origin: systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials. JAMA: the journal of the American Medical Association 2005,293 (24), 3043-52）。ある調査によると、痛みは関節炎、神経痛、腫れ、痛みを含めて6人に1人が罹患している。神経因性疼痛は４〜８％の人が罹患し、そして神経痛はアルコール依存症、坐骨神経痛、癌と癌の化学療法、糖尿病、三叉神経痛、硬化症、帯状疱疹、機械的損傷と外科的損傷などによって誘発され得る。
【０００９】
α６／α３β４（α６β４*、*は他の可能なサブユニットを示す）ｎＡＣｈＲサブタイプの機能もまた非常に重要である。このサブタイプは、ヒト副腎クロム親和性細胞、ラット後根神経節（ＤＲＧ）ニューロン、青年期ラット海馬、ノルアドレナリン作動性神経終末などの重要な部分に広く分布している。α６β４* ｎＡＣｈＲはヒト副腎クロム親和性細胞において優勢であり、一方α３β４ ｎＡＣｈＲはげっ歯類副腎クロム親和性細胞において優勢である（Hernandez-Vivanco A, Hone AJ, Scadden ML, Carmona-Hidalgo B, McIntosh JM, Albillos A. Monkey adrenal chromaffin cells express α6β4* nicotinic acetylcholine receptors. PLoS One. 2014 Apr 11; 9(4):e94142）。後根神経節（ＤＲＧ）に存在するアセチルコリン受容体は、鎮痛薬の潜在的な標的である。研究により、主にα6β4* ｎＡＣｈＲ及びα３β４ ｎＡＣｈＲを発現するＤＲＧ中にニューロンが実際に存在することが示されている（Hone AJ, Meyer EL, McIntyre M., McIntosh JM. Nicotinic acetylcholine receptors in dorsal root ganglion neurons include the α6β4* subtype. FASEB J. 2012 Feb; 26(2): 917-26. Smith NJ, Hone AJ, Memon T, Bossi S, Smith TE, McIntosh JM , Olivera BM, Teichert RW. Comparative functional expression of nAChR subtypes in rodent DRG neurons. Front Cell Neurosci. 2013 Nov 28; 7:225）。従って、末梢神経系ＤＲＧにおけるα６β４* ｎＡＣｈＲ及びα３β４ ｎＡＣｈＲは、神経痛薬の潜在的な標的であり、そしてこれら２つのサブタイプに対する遮断剤は新規鎮痛薬として開発されると予想される。
【００１０】
興味深いことに、α３β４ ｎＡＣｈＲは小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）細胞の増殖を仲介し、この受容体を介したシグナル伝達は肺癌の発症を促進する。α３β４ ｎＡＣｈＲ遮断剤α−コノトキシンＡｕＩＢはＳＣＬＣ細胞の変動性及び増殖の阻害に有効であり、これは、α３β４ ｎＡＣｈＲを特異的に遮断するアンタゴニストが、小細胞肺癌の治療のための新規治療薬として開発されることが期待されることを意味する（Improgo MR, Soll LG, Tapper AR, Gardner PD. Nicotinic acetylcholine receptors mediate lung Cancer growth. Front Physiol. 2013 Sep 17; 4:251）。さらに研究により、白血病、肺癌、及び神経芽細胞腫の腫瘍細胞上のα３β４ ｎＡＣｈＲ又はα６／α３β４ ｎＡＣｈＲを特異的に遮断することで抗癌効果を達成することが期待されることが示された（Improgo MR, Soll LG, Tapper AR, Gardner PD. Nicotinic acetylcholine receptors mediate lung Cancer growth. Front Physiol. 2013 Sep 17; 4:251）。
【００１１】
さらに、いくつかの研究は、マウス実験モデルにおいて視床下部α３β４ ｎＡＣｈＲの活性化が、プロ−オピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）ニューロンを活性化すること；ＰＯＭＣニューロン及びその後のメラノコルチン４受容体の活性化が、ニコチン誘発食欲減退、すなわちα３β４ ｎＡＣｈＲの特異的アゴニスト又は特異的遮断剤による食欲減退（食欲不振）又は食欲増進の調節において重要な役割を果たすこと；α３β４ ｎＡＣｈＲ又はα６／α３β４ ｎＡＣｈＲなどのβ４サブユニットを含むｎＡＣｈＲ受容体が、哺乳動物における食欲の調節において重要な役割を果たすこと；α３β４ ｎＡＣｈＲ又はα６／α３β４ ｎＡＣｈＲの特異的アゴニストがダイエット薬を開発する可能性を有すること；α３β４ ｎＡＣｈＲ又はα６／α３β４ ｎＡＣｈＲの特異的アンタゴニストが、食欲不振の治療用の薬物を開発する可能性、又はダイエット薬をスクリーニングする可能性を有すること、を示した（Yann S. Mineur, Alfonso Abizaid, Yan Rao, Ramiro Salas, Ralph J. DiLeone, Daniela Gundisch, Sabrina Diano, Mariella De Biasi, Tamas L Horvath, Xiao-Bing Gao, Marina R. Picciotto. Nicotine Decreases Food Intake through Activation of POMC Neurons. Science, 2011, 332, 1330-1332）。従って、α３β４ ｎＡＣｈＲ又はα６／α３β４ ｎＡＣｈＲの特異的遮断剤は、減量薬のスクリーニング、ならびに食欲不振及び体重関連代謝疾患の治療のための新薬の開発に使用されることが期待される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
現在、ｎＡＣｈＲの異なるサブタイプを標的とする新しい特異性の高い遮断剤、特にα３β４ ｎＡＣｈＲ又はα６／α３β４ ｎＡＣｈＲに対する特異的遮断剤を開発することが緊急に必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、アセチルコリン受容体を特異的に遮断することができるα−コノトキシンペプチドＴｘＩＤの一連の新規変異体、特に依存症、疼痛、及び小細胞肺癌の薬物標的であるα３β４ ｎＡＣｈＲに対する選択性及び強力な遮断活性を有するもの、及び疼痛薬物標的α６β４*（*は他の可能なサブユニットを示す）ｎＡＣｈＲに対して強力な遮断活性を有するもの、及び禁煙、解毒、及び鎮痛用の薬物の調製において、小細胞肺癌、鬱病、認知症、統合失調症、パーキンソン病の治療薬の開発において、及び神経科学のためのツール薬の開発において、優れた応用見通しを有するものを発見するため、鋭意かつ創造的に研究した。従って、以下の発明が提供される。
【００１４】
本発明の１つの態様は、９位のセリンが異なるＬ型又はＤ型アミノ酸で置換されている配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチドに関し、好ましくは、配列番号１に示される配列の９位のセリンは、アラニン、２−アミノ酪酸、ヒスチジン、アルギニン、チロシン、スレオニン、リジン、ロイシン、フェニルアラニン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、グルタミン酸、又はアスパラギン酸で置換される。異なるＬ型又はＤ型アミノ酸は、そのアミノ酸が９位のセリンとは異なること、すなわち置換後の９位のアミノ酸がＬ−セリンではないことを意味する。
【００１５】
本発明はまた、配列番号１に示すアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチドに関し、ここで、９位と１０位のセリンの間にＬ型又はＤ型のアミノ酸が挿入されており、前記Ｌ型及びＤ型アミノ酸ともＬ−セリンではなく、好ましくは、配列番号１に示される配列の９番目と１０番目の間に、アラニン、２−アミノ酪酸、ヒスチジン、アルギニン、チロシン、スレオニン、リジン、ロイシン、フェニルアラニン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、グルタミン酸、又はアスパラギン酸が挿入される。
【００１６】
本発明の１つの態様は、それぞれ配列番号２〜３、７、９、１１〜３３のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチドに関する。
【００１７】
本発明の１つの実施態様において、前記ポリペプチドのＮ末端から数えて、
第１システインが第３システインとジスルフィド結合を形成し、かつ第２システインが第４システインとジスルフィド結合を形成するか；又は、第１システインが第４システインとジスルフィド結合を形成し、かつ第２システインが第３システインとジスルフィド結合を形成するか；又は、第１システインが第２システインとジスルフィド結合を形成し、かつ第３システインが第４システインとジスルフィド結合を形成する。
【００１８】
本発明の１つの実施態様において、前記ポリペプチドのカルボキシ末端がアミド化されている。
【００１９】
野生型α−コノトキシンＴｘＩＤは本発明者らの以前の特許及び論文に開示されているが、多くの研究は、コノトキシンペプチドについて、配列中の１つの異なるアミノ酸でさえ新しい受容体特異性をもたらし得ることを示しており、これは、受容体の研究において新しい手段が提供されること、及び新薬の開発において新薬候補及び主薬が提供されることを意味する（Conotoxin peptide, Lu Bosong、Huang Peitang、1999年、特許出願第99106070.9号。Halai, R ., Clark, R.J., Nevin, S.T., Jensen, J.E., Adams, D.J., and Craik, D.J. (2009). Scanning mutagenesis of alpha-conotoxin Vc1.1 reveals residues crucial for activity at the alpha9alpha10 nicotinic acetylcholine receptor. The Journal of Biological Chemistry 284, 20275-20284. Kompella SN, Hung A, Clark RJ, Mari F, Adams D.J., 2015. Alanine scan of alpha-conotoxin RegIIA reveals a selective alpha3beta4 nicotinic acetylcholine receptor antagonist. J Biol Chem 290: 1039-1048）。本発明の知見（表２、表３）はこの事実をさらに裏付けるものである。
【００２０】
本発明は、ジスルフィド結合システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）の維持を除いて、ＴｘＩＤ変異体と２つのサブタイプα３β４ ｎＡＣｈＲ及びα６／α３β４ ｎＡＣｈＲ（表２参照）との間で相互作用する重要なアミノ酸｛５位のヒスチジン（ＴｘＩＤ［Ｈ５Ａ］）、６位のプロリン（ＴｘＩＤ［Ｐ６Ａ］）、７位のバリン（ＴｘＩＤ［Ｖ７Ａ］）、１１位のメチオニン（ＴｘＩＤ［Ｍ１１Ａ］）、１３位のプロリン（ＴｘＩＤ［Ｐ１３Ａ］）を含む｝を同定し、ＴｘＩＤ上のこれら５個のアミノ酸は、α３β４ ｎＡＣｈＲ及びα６／α３β４ ｎＡＣｈＲ受容体との相互作用において非常に重要な役割を果たし、どのアミノ酸がアラニン（Ａｌａ、Ａ）に置き換えられても、２つのサブタイプに対するこれらの遮断活性は完全に失われ、これらの遮断用量（ＩＣ50）はすべて１０，０００ｎＭを超え、すなわち１０μＭの高濃度でこれらの変異体は２つのサブタイプα３β４ ｎＡＣｈＲ及びα６／α３β４ ｎＡＣｈＲに対して５０％以下の電流遮断を有するか、又は全く遮断を示さない。詳細は表２を参照されたい。
【００２１】
さらに、ＴｘＩＤ上の９位のセリン（Ｓｅｒ、Ｓ）もまた、サブタイプα６／α３β４ ｎＡＣｈＲの結合に重要である。この位置のセリンをアラニン、アルギニン、又はリジンで置き換える（ＴｘＩＤ［Ｓ９Ａ］、ＴｘＩＤ［Ｓ９Ｒ］、ＴｘＩＤ［Ｓ９Ｋ］）と、α６／α３β４ ｎＡＣｈＲによる遮断活性が顕著に低下し、例えば、ＴｘＩＤ［Ｓ９Ａ］及びＴｘＩＤ［Ｓ９Ｒ］のα６／α３β４ ｎＡＣｈＲに対する遮断活性は、野生型ＴｘＩＤと比較するとそれぞれ５．２及び７．８倍低下するが、ＴｘＩＤ［Ｓ９Ｋ］のそれは５３４．８倍低下する。これは、サブタイプα６／α３β４ ｎＡＣｈＲの結合のためのＴｘＩＤ上の９位のセリンの重要性を示す。ただし、ＴｘＩＤ上の９位のセリンが、それぞれ２−アミノ酪酸（ＴｘＩＤ［Ｓ９Ａｂｕ］）、ヒスチジン（ＴｘＩＤ［Ｓ９Ｈ］）、チロシン（ＴｘＩＤ［Ｓ９Ｙ］）、スレオニン（ＴｘＩＤ［Ｓ９Ｔ］）、ロイシン（ＴｘＩＤ［Ｓ９Ｌ］）、フェニルアラニン（ＴｘＩＤ［Ｓ９Ｆ］）に変異されても、得られた変異体はα３β４ ｎＡＣｈＲ及びα６／α３β４ ｎＡＣｈＲ受容体への結合活性を実質的に維持し、これは、野生型ＴｘＩＤの活性と有意に異ならない。ＴｘＩＤ上の９位のセリンが、それぞれＤ−アルギニン（ＴｘＩＤ［Ｓ９（Ｄ−Ａｒｇ）］）、Ｄ−セリン（ＴｘＩＤ［Ｓ９（Ｄ−Ｓｅｒ）］）、グルタミン酸（ＴｘＩＤ［Ｓ９Ｅ］）、アスパラギン酸ＴｘＩＤ［Ｓ９Ｄ］に変換されると、α３β４ ｎＡＣｈＲ及びα６／α３β４ ｎＡＣｈＲ受容体に対するこれらの得られた変異体の結合活性は少なくとも１０倍顕著に低下し、１０〜３０３倍の振幅の低下を伴う（表２）。α３β４ ｎＡＣｈＲ受容体へのＴｘＩＤ［Ｓ９Ｅ］の結合活性は１００倍以上急激に減弱し、α６／α３β４ ｎＡＣｈＲ受容体への結合（遮断）活性は完全に失われる（表２）。従って、ＴｘＩＤ上の９位のセリンも受容体の結合活性に重要であり、変異体の活性は、その位置を置換するアミノ酸の種類によって変化する。
【００２２】
ＴｘＩＤの１位のグリシンもまた、受容体の結合活性にとって重要である。グリシンをアラニンで置換した変異体（ＴｘＩＤ［Ｇ１Ａ］）の活性は顕著に低下し、そしてα３β４ ｎＡＣｈＲ及びα６／α３β４ ｎＡＣｈＲ受容体へのその結合活性はそれぞれ１７倍及び８．２倍低下する。本発明の結果は、コノトキシンのアミノ酸配列及びその生物学的に活性な機能の多様性が高く、コノトキシン配列中の１つの異なるアミノ酸でさえ機能的変化をもたらし得ることを確認する。
【００２３】
さらに本発明者らは、５つの新しいＴｘＩＤ変異体を見出し、これらは、ＴｘＩＤ［Ｓ９Ａ］である配列番号７、ＴｘＩＤ［Ｓ９Ｒ］である配列番号１９、ＴｘＩＤ［Ｓ９Ｋ］である配列番号２４、ＴｘＩＤ［１４Ｄ］である配列番号２９、及びＴｘＩＤ［Ｓ９Ｅ］である配列番号３１であり、これらは、４５倍を超える識別範囲で２つのサブタイプα３β４ ｎＡＣｈＲ及びα６β４* ｎＡＣｈＲに対して良好な識別を有し、さらにこれらを完全に識別することさえでき、すなわち、これらはα３β４ ｎＡＣｈＲに対して遮断活性を有するが、α６β４* ｎＡＣｈＲに対してはほとんど遮断活性を有さない（表３）。その中でも、ＴｘＩＤ［Ｓ９Ｅ］はα３β４ ｎＡＣｈＲ受容体に対して良好な選択性を示し、一方α３β４ ｎＡＣｈＲ受容体に対するその遮断活性は弱いが、α６／α３β４ ｎＡＣｈＲ受容体に対する結合活性を完全に喪失している。この独特の利点は、上記ポリペプチドを、α３β４ ｎＡＣｈＲ及びα６／α３β４ ｎＡＣｈＲのような類似のサブタイプの区別において重要な科学的意義及び高い応用価値を有するツールとしている。これらすべての結果は、これらが、α３β４ ｎＡＣｈＲ及びα６／α３β４ ｎＡＣｈＲサブタイプの構造的及び機能的研究における分子プローブの設計及び開発ならびに新薬開発に、極めて高い応用価値を有することを示している。
【００２４】
本発明において、新規なα−コノトキシン（新規変異体としてα−ＣＴｘ  ＴｘＩＤと命名される）が得られ、これはα３β４ ｎＡＣｈＲの強力な遮断剤であり、またこれまでに発見された中で最も活性の高いα３β４ ｎＡＣｈＲ遮断剤であり、またα６／α３β４ ｎＡＣｈＲに対する強力な又は特定の遮断効果を有するが、他のｎＡＣｈＲサブタイプに対する遮断活性は全くないか又は極めて弱い。２つの類似のサブタイプ、α３β４ ｎＡＣｈＲα６β４* ｎＡＣｈＲとを効果的に区別することができるリガンド材料は非常に少ない。従って、α−コノトキシンＴｘＩＤシリーズの新規変異体は、α３β４又はα６β４* ｎＡＣｈＲの構造及び機能を研究するための新規ツールであり、依存症、疼痛、癌、恐怖などのための治療薬の開発に貢献する。
【００２５】
本発明の１つの実施態様において、ポリペプチドは、神経系疾患又は癌の治療及び／又は予防に使用するための、あるいは有害生物の駆除、鎮痛、禁煙、解毒、又は食欲増進に使用するためのものであり；
【００２６】
好ましくは、神経系疾患は、依存症、神経痛、パーキンソン病、認知症、統合失調症、及び鬱病のうちの少なくとも１つであり；
好ましくは、依存症は、以下の要因：例えばニコチン、アヘン、ヘロイン、メタンフェタミン（アイス）、モルヒネ、マリファナ、コカイン、又はアルコールなどの様々な精神活性物質のうちの少なくとも１つによって引き起こされ；
好ましくは、前記神経痛は、以下：坐骨神経痛、三叉神経痛、リンパ神経痛、多点運動神経痛（multi-point motor neuralgia）、急性の激しい自発性神経痛（acute strenuous spontaneous neuralgia）、挫滅性神経痛、及び複合神経痛の少なくとも１つから選択され；
好ましくは、前記神経痛は、以下の要因：癌、癌化学療法、アルコール依存症、糖尿病、硬化症、帯状疱疹、機械的損傷、外科的損傷、ＡＩＤＳ、頭部神経痛、薬物中毒、産業公害中毒、骨髄腫、慢性先天性感覚神経障害、血管炎、脈管炎、虚血、尿毒症、小児胆汁性肝疾患、慢性呼吸器障害、多臓器不全、敗血症／膿血症、肝炎、ポルフィリン症、ビタミン欠乏症、慢性肝疾患、先天性胆汁性硬化症、高脂血症、らい病、ライム関節炎、感覚神経周囲炎、又はアレルギーのうちの少なくとも１つによって引き起こされ；
好ましくは、癌は、小細胞肺癌などの肺癌、卵巣癌、又は乳癌である。
【００２７】
上記ポリペプチドは、化学的に合成されたアミノ酸配列（例えば、実施例１の方法を参照することにより合成）であるか、又は遺伝子組換えによってヌクレオチドを発現させることによって得られるポリペプチド（ヌクレオチド配列の調製は、分子生物学の従来の方法を参照することができる）でもよく、次の方法を参照しても得ることもできる。
【００２８】
本発明のポリペプチドの調製方法は以下の工程を含む：
１）ペプチド合成機又はマニュアルの方法により線状ポリペプチドが合成される工程であって、Ｆｍｏｃアミノ酸の側鎖保護基は、Ｐｍｃ（Ａｒｇ）、Ｂｕｔ（Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ）、ＯＢｕｔ（Ａｓｐ）、Ｂｏｃ（Ｌｙｓ）であり、システインの保護基はＴｒｔ又はＡｃｍである工程；
２）工程１）で得られた線状ポリペプチドを樹脂から切断し、そして粗製線状ポリペプチドを沈殿させて回収し、氷ジエチルエーテルで洗浄し、そして分取逆相ＨＰＬＣ  Ｃ１８カラム（Ｖｙｄａｃ）を使用して精製する工程；
３）工程２）で得られた生成物を２工程酸化的折り畳みにかける工程。
【００２９】
本発明のさらなる態様は、少なくとも１つの本発明のポリペプチドを含む単離された融合タンパク質に関する。
【００３０】
本発明はまた、融合ポリペプチド又は切断可能な融合ポリペプチドを包含し、ここで追加のペプチド／ポリペプチドは、本発明のα−コノトキシンペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端で融合している。融合ポリペプチドを製造するための技術は、当技術分野において公知であり、本発明のペプチドをコードするコード配列を追加のペプチド／ポリペプチドをコードするコード配列と連結して、これらが同じ読みとり枠内にあり、かつ融合ポリペプチドの発現が同じプロモーター及びターミネーターによって制御されるようにすることを含む。
【００３１】
本発明のさらなる態様は、本発明のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。
【００３２】
本発明のさらなる態様は、本発明のポリヌクレオチドを含む核酸構築物に関し、好ましくは、核酸構築物は組換えベクターであり；好ましくは、核酸構築物は組換え発現ベクターである。
【００３３】
本発明のさらなる態様は、本発明のポリヌクレオチド又は本発明の核酸構築物を含む形質転換細胞に関する。
【００３４】
本発明のさらなる態様は、本発明の少なくとも１つのポリペプチドを含む、場合により医薬的に許容し得る賦形剤をさらに含む、医薬組成物に関する。
【００３５】
本医薬組成物は、依存症、神経痛、癌、精神遅滞、疼痛、パーキンソン病、精神病、鬱病、重症筋無力症などに関連する疾患又は状態を、研究、診断、改善、又は治療するために使用することができる。１つの実施態様において、治療有効量の本発明のペプチドを含む医薬組成物は、個々の患者の臨床状態、送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び医師に公知の他の要因を考慮して、医薬的に許容し得る方法で処方及び投与される。従って本明細書で使用される用語「有効量」は、これらの考慮事項によって決定される。
【００３６】
治療有効量の本発明のポリペプチドを含む医薬組成物は、非経口的に、経口的に、大槽内に、髄腔内などに投与される。用語「医薬的に許容し得る担体」は、非毒性の固体、半固体、又は液体の充填剤、希釈剤、カプセル材料、又は任意の種類の配合賦形剤を意味する。本明細書で使用される用語「非経口」は、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下、髄腔内、及び関節内注射及び注入を含む投与様式を指す。本発明のポリペプチドはまた、徐放系によっても適切に投与することができる。
【００３７】
本発明のさらなる態様は、アセチルコリン受容体を遮断するための医薬の製造における本発明のポリペプチドの使用に関し、好ましくはアセチルコリン受容体は、α３β４アセチルコリン受容体、又はα６／α３β４アセチルコリン受容体などのα６β４*アセチルコリン受容体である。
【００３８】
本発明のさらなる態様は、神経系疾患又は癌の治療及び／又は予防のための医薬の製造における、又は有害生物の駆除、鎮痛、禁煙、解毒、又は食欲増進のための医薬の製造における、本発明のポリペプチド又は医薬組成物の使用に関し、
好ましくは、神経系疾患は、依存症、神経痛、パーキンソン病、認知症、統合失調症、及び鬱病のうちの少なくとも１つであり、
好ましくは、依存症は、以下の要因：例えばニコチン、アヘン、ヘロイン、メタンフェタミン（アイス）、モルヒネ、マリファナ、コカイン、又はアルコールなどの様々な精神活性物質のうちの少なくとも１つによって引き起こされ；
好ましくは、神経痛は、以下：坐骨神経痛、三叉神経痛、リンパ神経痛、多点運動神経痛、急性の激しい自発性神経痛、挫滅性神経痛、及び複合神経痛の少なくとも１つから選択され；
【００３９】
好ましくは、神経痛は、以下の要因：癌、癌化学療法、アルコール依存症、糖尿病、硬化症、帯状疱疹、機械的損傷、外科的損傷、ＡＩＤＳ、頭部神経痛、薬物中毒、産業公害中毒、骨髄腫、慢性先天性感覚神経障害、血管炎、脈管炎、虚血、尿毒症、小児胆汁性肝疾患、慢性呼吸器障害、多臓器不全、敗血症／膿血症、肝炎、ポルフィリン症、ビタミン欠乏症、慢性肝疾患、先天性胆汁性硬化症、高脂血症、らい病、ライム関節炎、感覚神経周囲炎、又はアレルギーのうちの少なくとも１つによって引き起こされ；
好ましくは、癌は、小細胞肺癌などの肺癌、卵巣癌、白血球、神経芽細胞腫、又は乳癌である。
【００４０】
先行技術の研究は、α３β４ ｎＡＣｈＲが、ニコチン、モルヒネ、及びコカインによって引き起こされる依存症、神経痛、小細胞肺癌、パーキンソン病、認知症、統合失調症、鬱病、恐怖などの精神神経疾患の治療のための薬物標的であることを示している。さらに、α６β４* ｎＡＣｈＲはまた、多くの疾患に対する潜在的な標的であり、また鎮痛薬に対する作用標的でもある（背景技術中の関連する参考文献を参照）。従って、本発明の新規α−コノトキシンＴｘＩＤ変異体は、上記疾患のメカニズムの研究、診断、及び治療において極めて高い応用価値を有する。
【００４１】
本発明のさらなる態様は、インビボ又はインビトロでアセチルコリン受容体を遮断するか又はアセチルコリンのレベルを調節する方法であって、有効量の本発明のポリペプチド又は医薬組成物を被験体に投与するか又は細胞にを投与する工程を含む方法に関し、好ましくは、アセチルコリン受容体は、α３β４アセチルコリン受容体、又はα６／α３β４アセチルコリン受容体などのα６β４* アセチルコリン受容体である。
【００４２】
本発明のさらなる態様は、有効量の本発明のポリペプチド又は医薬組成物を被験体に投与する工程を含む、神経系疾患又は癌を治療及び／又は予防する方法、あるいは有害生物の駆除、鎮痛、禁煙、解毒、又は食欲増進をする方法に関する。
【００４３】
好ましくは、神経系疾患は、依存症、神経痛、パーキンソン病、認知症、統合失調症、及び鬱病のうちの少なくとも１つであり、
好ましくは、依存症は、以下の要因：例えばニコチン、アヘン、ヘロイン、メタンフェタミン（アイス）、モルヒネ、マリファナ、コカイン、又はアルコールなどの様々な精神活性物質のうちの少なくとも１つによって引き起こされ；
好ましくは、神経痛は、以下：坐骨神経痛、三叉神経痛、リンパ神経痛、多点運動神経痛、急性の激しい自発性神経痛、挫滅性神経痛、及び複合神経痛のうちの少なくとも１つによって引き起こされ；
【００４４】
好ましくは、神経痛は、以下：癌、癌化学療法、アルコール依存症、糖尿病、硬化症、帯状疱疹、機械的損傷、外科的損傷、ＡＩＤＳ、頭部神経痛、薬物中毒、産業公害中毒、骨髄腫、慢性先天性感覚神経障害、血管炎、脈管炎、虚血、尿毒症、小児胆汁性肝疾患、慢性呼吸器障害、多臓器不全、敗血症／膿血症、肝炎、ポルフィリン症、ビタミン欠乏症、慢性肝疾患、先天性胆汁性硬化症、高脂血症、らい病、ライム関節炎、感覚神経周囲炎、又はアレルギーのうちの少なくとも１つによって引き起こされ；
好ましくは、癌は、小細胞肺癌などの肺癌、卵巣癌、白血病、神経細胞腫、又は乳癌である。
【００４５】
投与量は、治療される状態の重症度、患者又は動物の性別、年齢、体重、及び個々の反応、ならびに治療されるべき患者の状態及び以前の病歴などのいくつかの要因に依存する。所望の治療効果を達成するのに必要な量より低い用量から始めて、所望の効果が達成されるまで用量を徐々に増加させることは、当技術分野で一般的な方法である。
【００４６】
本発明において用語「依存症」とは、精神活性物質を繰り返し使用している被験体が周期的又は慢性の中毒状態にあることを意味する。精神活性物質とは、ニコチン、アヘン、ヘロイン、メタンフェタミン（アイス）、モルヒネ、マリファナ、コカイン、その他の麻薬、及び正式に規制されていて中毒を引き起こす可能性がある向精神薬を指す。依存症は、脳内で生成される大量のドーパミンと関連する。これは、好ましい物質の制御できない使用、及び自己管理の困難さ、又は使用行動の修正の困難さとして現れる。良好な感情を達成するための又は禁断症状の痛みを回避するための精神活性物質を得るためには、被験体は思慮がなくなる。典型的には、許容度が増加し、物質の使用を中止するとしばしば禁断症状が起きる。依存者の生活は、物質的な使用（material use）によって支配される可能性があり、すなわち他の重要な活動及びすべての責任に対して深刻な影響を及ぼし、さらにはこれらを放棄さえする。従って、物質の使用は個人と社会の両方に害を及ぼす。アルコールで使用すると、それは慢性アルコール依存症の概念と同等である。依存症という用語はまた、肉体的側面と心理的側面の両方を含む。心理的依存症は飲酒や薬物摂取の損なわれた自己管理の経験を強調しているのに対し、身体的依存症は耐性（tolerance）や禁断症状を意味する。
【００４７】
本明細書で定義される「核酸構築物」という用語は、１本鎖又は２本鎖核酸分子、好ましくは人工的に構築された核酸分子である。任意選択的に核酸構築物はさらに、１つ又はそれ以上の作動可能に連結された調節配列を含む。
【００４８】
本発明において、用語「作動可能に連結された」とは、２つまたはそれ以上のヌクレオチド領域又は核酸配列の機能性の空間的配置をいう。「作動可能に連結された」は、遺伝子組換えによって達成され得る。
【００４９】
本発明において「ベクター」という用語は、特定のタンパク質を阻害するポリヌクレオチドを挿入することができる核酸送達ビヒクルを指す。例えば、ベクターには以下が含まれる：ファスミド；ファージミド；コスミド；人工染色体、例えば酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、又はＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）；ファージ、例えばλファージ又はＭ１３ファージ；及び動物ウイルスなど。ベクターとして使用される動物ウイルスには、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルスなど）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス（ＳＶ４０など）が含まれる。ベクターは発現を制御する様々な要素を含み得る。
【００５０】
本発明において用語「宿主細胞」とは、ベクターが導入される細胞を指し、大腸菌又は枯草菌などの原核細胞、例えば酵母細胞又はアスペルギルスなどの真菌細胞、例えばＳ２ショウジョウバエ細胞又はＳｆ９などの昆虫細胞、又は線維芽細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞などの動物細胞、又はヒト細胞などの多くの細胞型を含む。
【００５１】
「有効量」という用語は、被験体において、本明細書に記載の疾患又は状態の治療、予防、軽減、及び／又は改善を達成することができる用量を指す。
【００５２】
「疾患及び／又は状態」という用語は、本明細書に記載の疾患及び／又は状態に関連する被験体の身体的状態を指す。
【００５３】
「被験体」という用語は、本発明の疾患又は状態を治療、予防、改善、及び／又は緩和するために、本発明の医薬組成物を投与される患者又は他の動物、特に哺乳動物、例えばヒト、イヌ、サル、ウシ、ウマなどを指すことができる。
【００５４】
本発明において、特に別の指定がなければ、濃度の単位μＭはμｍｏｌ／Ｌを表し、ｍＭはｍｍｏｌ／Ｌを表し、ｎＭはｎｍｏｌ／Ｌを表す。
【００５５】
本発明において、細胞への投与量が言及される場合は、特に別の指定がなければ、通常、投与後の薬物の最終濃度を意味する。
【００５６】
本発明において用語「アミノ酸」又は特定のアミノ酸名が言及される場合、特に別の指定がなければ、それはＬ型アミノ酸を意味する。
【発明の効果】
【００５７】
本発明は、α３β４ ｎＡＣｈＲの強力な遮断剤であり、かつこれまでに発見された中で最も活性の高いα３β４ ｎＡＣｈＲ遮断剤でもある、新規なα−コノトキシン（新規変異体としてα−ＣＴｘ  ＴｘＩＤと命名される）を得た。さらにこれはまた、α６／α３β４ ｎＡＣｈＲに対して強力な又は特定の遮断効果を有するが、他のｎＡＣｈＲサブタイプに対する遮断活性は全く無いか又は極めて弱い。２つの類似のサブタイプ、α３β４ ｎＡＣｈＲとα６β４* ｎＡＣｈＲを効果的に区別するリガンド材料は非常に少ない。本発明の新規ＴｘＩＤ変異体のいくつかは、２つのサブタイプα３β４ ｎＡＣｈＲとα６β４* ｎＡＣｈＲ、例えば表１〜３の配列番号７、１９、２４、２９に示されるもの、すなわち、７．ＴｘＩＤ［Ｓ９Ａ］、１９．ＴｘＩＤ［Ｓ９Ｒ］、２４．ＴｘＩＤ［Ｓ９Ｋ］、及び２９．ＴｘＩＤ［１４Ｄ］を良好に識別する（４５倍を超え、さらには完全に識別可能である）。このように、α−コノトキシンＴｘＩＤシリーズの新規変異体は、α３β４ ｎＡＣｈＲ又はα６β４* ｎＡＣｈＲの構造と機能を研究するための新しいツールであり、依存症、疼痛、癌、鬱病、恐怖などに対する治療薬の開発に貢献する。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】ＴｘＩＤとＴｘＩＤ［Ｓ９Ａ］のＨＰＬＣクロマトグラムと質量スペクトル。図１Ａ、ピーク時間２３．３１分のＴｘＩＤのＨＰＬＣクロマトグラム。図１Ｂ、ＴｘＩＤのＥＳＩ−ＭＳ質量スペクトルであり、実際に測定された分子量が１４８８．５６Ｄａであり理論値と一致する。図１Ｃ、ピーク時間２５．０８分のＴｘＩＤ［Ｓ９Ａ］のＨＰＬＣクロマトグラム。図１Ｄ、ＴｘＩＤ［Ｓ９Ａ］のＥＳＩ−ＭＳスペクトルであり、実際に測定された分子量が１４７２．５６Ｄａであり理論値と一致する。
【図２】図２Ａ〜２Ｄは、ラットのα３β４ ｎＡＣｈＲの電流に対する、それぞれ１μＭのＴｘＩＤ、ＴｘＩＤ［Ｓ９Ｈ］、ＴｘＩＤ［Ｓ９Ｌ］、又はＴｘＩＤ［Ｓ９Ｙ］の強い遮断活性を示す。  ラットα３β４ ｎＡＣｈＲをアフリカツメガエル卵母細胞で発現させ、細胞膜を−７０ｍＶでクランプ固定し、毎分１秒のＡｃｈパルスを得た。各図において、１つの卵母細胞上の１つのポリペプチドの代表的な電流トレースが示されている。対照電流を得た後、１μＭの毒素ペプチドを添加し、そして５分間インキュベーション後の最初のＡｃｈパルス電流は、図中の矢印によって示される受容体に影響を及ぼすペプチドの電流トレースであった。その後ポリペプチドを溶出し、溶出中にＡｃｈパルスによって発生した電流の大きさとそのトレースも同時に測定される。図中の「Ｃ」は、ＡＣｈ励起によって発生する対照電流を示している。次の電流トレース図の識別は、この説明と同じである。
【図３】図３Ａ〜図３Ｄは、ラットα３β４ ｎＡＣｈＲの電流に対する、それぞれ１μＭのＴｘＩＤ［１４Ｄ］、ＴｘＩＤ［１４Ｈ］、ＴｘＩＤ［１１４Ｌ］、又はＴｘＩＤ［Ｓ９（Ｄ−Ａｒｇ）］の遮断効果を示す。
【図４】図４Ａ〜４Ｄは、ラットα３β４ ｎＡＣｈＲの電流に対する、それぞれ１μＭのＴｘＩＤ［Ｓ９（Ｄ−Ｓｅｒ）］、ＴｘＩＤ［Ｓ９Ａ］、ＴｘＩＤ［Ｓ９Ａｂｕ］、又はＴｘＩＤ［Ｓ９Ｆ］の遮断効果を示す。
【図５】図５Ａ〜５Ｄは、ラットα３β４ ｎＡＣｈＲの電流に対する、それぞれ１μＭのＴｘＩＤ［Ｓ９Ｋ］、ＴｘＩＤ［Ｓ９Ｔ］、ＴｘＩＤ［Ｓ１２Ｙ］、又はＴｘＩＤ［Ｓ９Ｒ］の遮断効果を示す。
【図６】図６Ａ〜６Ｅは、１０μＭのＴｘＩＤ［１０Ｒ］、ＴｘＩＤ［Ｈ５Ｗ、Ｓ９Ａ］、ＴｘＩＤ［Ｈ５Ｗ］、ＴｘＩＤ［Ｍ１１Ｈ］、又はＴｘＩＤ［１０Ｒ］が、ラットα３β４ ｎＡＣｈＲの電流に対して遮断効果を有さないことを示す。
【図７】図７Ａ〜７Ｄは、ラットα６／α３β４ ｎＡＣｈＲの電流に対する、それぞれ１μＭのＴｘＩＤ［Ｓ９Ａｂｕ］、ＴｘＩＤ［Ｓ９Ｆ］、ＴｘＩＤ、又はＴｘＩＤ［１１４Ｌ］の遮断効果を示す。
【図８】図８Ａ〜８Ｄは、ラットα６／α３β４ ｎＡＣｈＲの電流に対する、それぞれ１μＭのＴｘＩＤ［Ｓ９（Ｄ−Ａｒｇ）］、ＴｘＩＤ［Ｓ９Ａ］、ＴｘＩＤ［Ｓ７Ｈ］、又はＴｘＩＤ［Ｓ９Ｌ］の遮断効果を示す。
【図９】図９Ａ〜９Ｄは、ラットα６／α３β４ ｎＡＣｈＲの電流に対する、それぞれ１μＭのＴｘＩＤ［Ｓ９Ｒ］、ＴｘＩＤ［Ｓ９Ｔ］、ＴｘＩＤ［Ｓ９Ｙ］、又はＴｘＩＤ［Ｓ１２Ｙ］の遮断効果を示す。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｄは、１０μＭのＴｘＩＤ［９Ｒ］、ＴｘＩＤ［１０Ｒ］、ＴｘＩＤ［Ｈ５Ｗ、Ｓ９Ａ］、又はＴｘＩＤ［Ｈ５Ｗ］が、ラットα６／α３β４ ｎＡＣｈＲの電流に対して遮断効果を有さないことを示す。
【図１１】図１１Ａ〜図１１Ｃは、１０μＭのＴｘＩＤ［Ｓ９Ｄ］、ＴｘＩＤ［Ｓ９Ｅ］、又はＴｘＩＤ［Ｓ９Ｋ］が、ラットα６／α３β４ ｎＡＣｈＲの電流に対して遮断効果を有さないことを示す。
【図１２】ラットα３β４ ｎＡＣｈＲ及びα６／α３β４ ｎＡＣｈＲの電流に対する１００ｎＭ又は１０ｎＭのＴｘＩＤ又はＴｘＩＤ［Ｓ９Ａ］の効果は、どちらも異なる程度の識別を示す。ラットα３β４ ｎＡＣｈＲ及びα６／α３β４ ｎＡＣｈＲをアフリカツメガエル卵母細胞で発現させ、細胞膜を−７０ｍＶでクランプ固定し、毎分１秒のＡｃｈパルスを得た。１つの卵母細胞上の１つのポリペプチドの代表的な電流トレースを図に示す。対照電流を得た後、１００ｎＭ又は１０ｎＭの毒素ペプチドを添加し、そして５分間インキュベーション後の最初のＡｃｈパルス電流は、図中の矢印によって示される受容体に影響を及ぼすポリペプチドの電流トレースであった。その後ポリペプチドを溶出し、溶出中にＡｃｈパルスによって発生した電流の大きさとそのトレースも同時に測定した。図中の「Ｃ」は、ＡＣｈ励起によって発生する対照電流を示している。  図１２Ａは、ラットα３β４ ｎＡＣｈＲの電流に対する１００ｎＭ ＴｘＩＤの効果を示す。  図１２Ｂは、ラットα６／α３β４ ｎＡＣｈＲの電流に対する１００ｎＭ ＴｘＩＤの効果を示す。  図１２Ｃは、ラットα３β４ ｎＡＣｈＲの電流に対する１００ｎＭ ＴｘＩＤ［Ｓ９Ａ］の効果を示す。  図１２Ｄは、ラットα６／α３β４ ｎＡＣｈＲの電流に対する１００ｎＭ ＴｘＩＤ［Ｓ９Ａ］の効果を示す。  図１２Ｅは、ラットα３β４ ｎＡＣｈＲの電流に対する１０ｎＭ ＴｘＩＤの効果を示す。  図１２Ｆは、ラットα６／α３β４ ｎＡＣｈＲの電流に対する１０ｎＭ ＴｘＩＤの効果を示す。  図１２Ｇは、ラットα３β４ ｎＡＣｈＲの電流に対する１０ｎＭ ＴｘＩＤ［Ｓ９Ａ］の効果を示す。  図１２Ｈは、ラットα６／α３β４ ｎＡＣｈＲの電流に対する１０ｎＭ ＴｘＩＤ［Ｓ９Ａ］の効果を示す。
【図１３】ラットα３β４ ｎＡＣｈＲ及びα６／α３β４ ｎＡＣｈＲに対するＴｘＩＤ又はＴｘＩＤ［Ｓ９Ａ］の濃度応答曲線を示す。図中、横軸は使用したポリペプチドのモル濃度（Ｍ）の対数であり、縦軸は用量応答の百分率（％応答）であり、これは毒素の対応する濃度における、アセチルコリン受容体電流と対照電流の比率の百分率である。対応する半遮断用量（ＩＣ50）を表２に示す。図中の個々の値は、５〜２１個のアフリカツメガエル卵母細胞から得た電流の平均値である。図１３Ａは、α３β４ ｎＡＣｈＲ又はα６／α３β４ ｎＡＣｈＲの２つのサブタイプに対するＴｘＩＤの濃度用量応答曲線である。図１３Ｂは、α３β４ ｎＡＣｈＲ及びα６／α３β４ ｎＡＣｈＲの２つのサブタイプに対するＴｘＩＤ［Ｓ９Ａ］の濃度用量応答曲線である。
【図１４】図１４Ａは、ラットα３β４ ｎＡＣｈＲの電流に対する１μＭのＴｘＩＤ［Ｓ９Ｋ］の効果を示す。図１４Ｂは、ラットα６／α３β４ ｎＡＣｈＲの電流に対する１０μＭのＴｘＩＤ［Ｓ９Ｋ］の効果を示す。図１４Ａ及び１４Ｂは、ＴｘＩＤ［Ｓ９Ｋ］が、極めて類似している２つのサブタイプのα３β４ ｎＡＣｈＲ及びα６／α３β４ ｎＡＣｈＲの間で非常に高度な識別を有することを示す。
【図１５】ＴｘＩＤ［Ｓ９Ａ］（異性体１）とＴｘＩＤ（異性体１）の２次化学シフト（縦軸）分析の比較を示す。  ＴｘＩＤ［Ｓ９Ａ］とＴｘＩＤのアミノ酸配列を図に示す。括弧内のアミノ酸Ｓは、ＴｘＩＤ上の９位のセリン（Ｓｅｒ）がアラニン（Ａｌａ、Ａ）で置換され、次いで変異体ＴｘＩＤ［Ｓ９Ａ］に変異していることを示す。図中の黒い棒はＴｘＩＤ［Ｓ９Ａ］を表し、灰色の棒はＴｘＩＤを表す。
【図１６】図１６Ａは、α３β４アセチルコリン受容体に対するＴｘＩＤの分子結合モデルである。  図１６Ｂは、α６β４９アセチルコリン受容体に対するＴｘＩＤの分子結合モデルである。  図１６Ａ及び１６Ｂでは、α３サブユニットはピンク色で示され、α６サブユニットは青色で示され、そしてβ４サブユニットは緑色で示されている。破線で示すように、水素結合がＳｅｒ−９とＬｙｓ−８１との間に形成される。β４サブユニット上のアミノ酸番号は、ラットβ４サブユニット前駆体配列の全長に従って番号付けされている（ＵｎｉＰｒｏｔ識別子Ｐ１２３９２）。  図１６Ｃは、５０ｎｓにおけるＴｘＩＤの分子動力学（ＭＤ）シミュレーションの結果を示す。ＴｘＩＤのＳｅｒ−９側鎖ヒドロキシル基とβ４ Ｌｙｓ−８１側鎖窒素原子との間の距離は、時間の関数として示されている。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
本発明の実施態様を実施例により以下に詳細に説明する。以下の実施例は単に本発明を例示するものであり、本発明の範囲を限定するものと見なされるべきではないことを当業者は認識するであろう。実施例において、具体的な技術又は条件が示されていない場合、それらは当該分野の文献（例えば、J. Sambrookら, Huang Peitangら, Molecular Cloning Experimental Guide, Third Edition, Science Press参照）に記載されている技術又は条件、又は製品マニュアルに従って実施される。使用される試薬又は機器が製造業者によって示されていない場合、それらは商業的に入手することができる通常の製品である。
【００６０】
実施例１：α−コノトキシンＴｘＩＤの新規変異体の配列設計及び人工合成
α−コノトキシンＴｘＩＤ成熟ペプチド（そのアミノ酸配列は以下の表１の配列番号１に示され、そのＣ末端はアミド化されている）に基づいて、本発明者らは一連の新規ポリペプチド変異体を創造的に設計した。そのアミノ酸配列を下記表１の配列番号２〜３７に示す。
【表１】
2020501584.tif 000003
【００６１】
表１に列記したポリペプチドの線状ペプチドは、Ｆｍｏｃ法により人工的に合成した。具体的な方法は以下の通りである。
【００６２】
樹脂ペプチドをＦｍｏｃ化学的方法によって人工的に合成し、樹脂ペプチドはペプチド合成機又はマニュアルの合成法によって合成することができた。システインに加えて、残りのアミノ酸を標準的な側鎖保護基で保護した。各ポリペプチドの第１システイン及び第３システイン（Ｃｙｓ）の−ＳＨ基はＴｒｔ（Ｓ−トリチル）により保護し、そして第２システイン及び第４システインの−ＳＨ基はＡｃｍ（Ｓ−アセトアミドメチル）により保護し、そして酸化的折り畳み後のジスルフィド結合は、Ｃｙｓ１−Ｃｙｓ３及びＣｙｓ２−Ｃｙｓ４、すなわちＣｙｓ（１−３、２−４）であった。合成手順は以下の通りであった：固相合成においてＦｍｏｃ法及びＦａｓｔＭｏｃ法によって、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ４３３ａポリペプチド合成装置で線状ペプチドを合成した。Ｆｍｏｃアミノ酸の側鎖保護基は、Ｐｍｃ（Ａｒｇ）、Ｔｒｔ（Ｃｙｓ）、Ｂｕｔ（Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ）、ＯＢｕｔ（Ａｓｐ）、Ｂｏｃ（Ｌｙｓ）であった。Ｆｍｏｃ  ＨＯＢＴ  ＤＣＣ法を用いて、樹脂及びＦｍｏｃアミノ酸をＲｉｎｋによってアミド化し、そして機器合成マニュアルを参照して合成工程を実施した。反応を完了させるために、ピペリジン脱保護時間及びカップリング時間を適切に延長し、そして不応性アミノ酸を二重カップリングして樹脂ペプチドを得た。線状ペプチドを試薬Ｋ（トリフルオロ酢酸／水／エタンジチオール／フェノール／チオアニソール；９０：５：２．５：７．５：５、ｖ／ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）を用いて樹脂から切断し、沈殿させ、そして氷ジエチルエーテルで洗浄して、粗製線状ペプチドをリサイクルした。
【００６３】
分取用逆相ＨＰＬＣ Ｃ１８カラム（Ｖｙｄａｃ）を精製に使用し、溶出勾配は０〜２０分で１０〜４０％Ｂ９０であった。溶媒Ｂ９０は、９０％ＡＣＮ（アセトニトリル）、０．５％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）、及び残りの純水からなり、溶媒Ａは０．６５％ＴＦＡの水溶液であった。ＵＶ吸収分析は２１４ｎｍの波長で行った。精製した線状ペプチドを、分析用ＨＰＬＣ Ｃ１８カラム（Ｖｙｄａｃ）を用いて純度検出にかけ、溶出勾配は上記と同じであった。これは９５％以上の純度を有し、酸化的折り畳みのために使用した。
【００６４】
文献（Dowell, C.; Olivera, B.M.; Garrett, J.E.; Staheli, S.T.; Watkins, M.; Kuryatov, A.; Yoshikami, D.; Lindstrom, J.M.; McIntosh, J.M., Alpha-conotoxin PIA is selective for alpha6 subunit-containing nicotinic acetylcholine receptors. The Journal of neuroscience. 2003, 23 (24), 8445-52）に従って、上記の線状ペプチドの２段階酸化的折り畳み反応が以下のように記載された。
【００６５】
まずジスルフィド結合の最初の対を、フェリシアン化カリウム酸化（２０ｍＭのフェリシアン化カリウム、０．１Ｍのトリス、ｐＨ７．５、３０分）によって、Ｔｒｔ保護基の２つのシステイン間に形成した。単環式ペプチドを逆相ＨＰＬＣ Ｃ１８カラム（Ｖｙｄａｃ）により精製し、次いでヨウ素（Ｈ2Ｏ中１０ｍＭのヨウ素：トリフルオロ酢酸：アセトニトリル、７８：２：２０容量、１０分）で酸化し、他の２つのシステイン上のＡｃｍを除去し、これらの２つのサイクルの間に、ジスルフィド結合の第２の対を形成した。２環式ペプチドを逆相ＨＰＬＣ Ｃ１８カラム（Ｖｙｄａｃ）により精製し、そして溶出の直線勾配は０〜２０分以内でなお１０〜４０％Ｂ９０であった。２１４ｎｍの波長で紫外線吸収分析を行った。こうして、対応するシステイン間にＮ末端からＣ末端に向かってジスルフィド結合が配向して形成されたα−コノトキシンが得られた。
【００６６】
２対のジスルフィド結合を有する精製ペプチドを、ＨＰＬＣと質量分析法によって純度及び分子量について試験したところ、結果はすべて正しかった。ＨＰＬＣクロマトグラフィー条件は以下の通りであった：Ｖｙｄａｃ Ｃ１８ ＨＰＬＣ逆相分析カラム、１０％〜４０％の溶液Ｂ及び９０％〜６０％の溶液Ａを用いて２０分間の勾配溶出を行い。ここで、溶液Ａは０．６５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、溶液Ｂは０．５％ＴＦＡ及び９０％アセトニトリルの水溶液であった。ＵＶ分析波長は２１４ｎｍであり、ＴｘＩＣのピーク時間、すなわち保持時間は２３．３６６分であった。
【００６７】
例えば図１Ａ〜１Ｄは、ＴｘＩＤ及びＴｘＩＤ［Ｓ９Ａ］のＨＰＬＣクロマトグラム及び質量スペクトルを示す。ＴｘＩＤのピーク時間は２３．３１分（図１Ａ）であり、質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）（図１Ｂ）により正しいことが同定された。酸化的折り畳み後のＴｘＩＤのモノアイソトピック質量は、測定された分子量と一致した：ＴｘＩＤの理論的分子量は１４８８．５５９Ｄａであり、測定されたＴｘＩＤの分子量は１４８８．５６Ｄａであった。ＴｘＩＤ［Ｓ９Ａ］のピーク時間は２５．０８分（図１Ｃ）であり、ＥＳＩ−ＭＳ質量分析（図１Ｄ）によっても確認された。酸化的に折り畳まれたＴｘＩＤ［Ｓ９Ａ］のモノアイソトピック質量もまた、測定された分子量と一致した：ＴｘＩＤ［Ｓ９Ａ］の理論的分子量は１４７２．５６４Ｄａであり、そしてＴｘＩＤ［Ｓ９Ａ］の測定された分子量は１４７２．５６Ｄａであった。
【００６８】
上記工程を経て、表１に列記した３７個のポリペプチド全てが正しく合成され、そしてＣｙｓ（１−３、２−４）のジスルフィド結合を有する酸化的に折り畳まれたペプチドが形成され、これらはその後の活性研究及び構造分析に使用できた。
【００６９】
ポリペプチドの濃度は、２８０ｎｍの波長で比色法によって決定され、そしてポリペプチドの濃度及び質量は、Ｂｅｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔの式に従って計算され、そして以下の実施例における実験で使用された。
【００７０】
実施例２：α３β４ ｎＡＣｈＲサブタイプを特異的に遮断するα−コノトキシンＴｘＩＤ新規変異体の実験
文献（Luo S, Zhangsun D, Zhu X, Wu Y, Hu Y, Christensen S, Harvey PJ, Akcan M, Craik DJ, McIntosh JM. Characterization of a novel α-conotoxin TxID from Conus textile that potently blocks rate α3β4 nicotinic acetylcholine receptors. Journal of Medicinal Chemistry. 2013, 56: 9655-9663. Azam L, Yoshikami D, McIntosh JM. Amino acid residues that confer high selectivity of the alpha6 nicotinic acetylcholine receptor subunit to alpha-conotoxin MII[S4A,E11A,L15A]. J Biol Chem. 2008;283(17):11625-32）中の方法、並びにインビトロ転写キット（mMessage mMachine in vitro transcription kit (Ambion, Austin, TX)）の仕様中の方法を参照して、種々のラット神経ｎＡＣｈＲサブタイプ（α３β４、α６／α３β４、α９α１０、α４β２、α４β４、α３β４、α２β２、α２β４、α７）、ヒトα３β４及びα６／α３β４、ならびにマウス筋肉ｎＡＣｈＲ（α１β１δε）ｃＲＮＡを調製し、それらの濃度を測定し、ＵＶ  ２６０ｎｍでのＯＤ値により計算した。アフリカツメガエルを解剖し、卵母細胞（カエルの卵）を採取し、サブユニット当たり５〜１０ｎｇのｃＲＮＡをカエルの卵に注入した。カエルの卵をＮＤ−９６で培養した。カエルの卵を採取後１〜２日以内にｃＲＮＡを注入し、注入後１〜４日以内にｎＡＣｈＲの電圧クランプを記録した。
【００７１】
ｃＲＮＡを注入した１つのカエルの卵を３０μＬのＳｙｌｇａｒｄ記録溝（深さ４ｍｍ×直径２ｍｍ）に入れ、０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含有するＮＤ９６灌流液（９６．０ｍＭ ＮａＣｌ、２．０ｍＭ ＫＣｌ、１．８ｍＭ ＣａＣｌ2、１．０ｍＭ ＭｇＣｌ2、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．１〜７．５）、又は１ｍＭアトロピンを含有するＮＤ９６（ＮＤ９６Ａ）を１ｍｌ／分の流速で流して、重力注入を行った。全てのコノトキシン溶液はまた、毒素の非特異的吸着を減らすために０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含み、切り替え弁（SmartValve, Cavro Scientific Instruments, Sunnyvale, CA）を用いて、毒素の注入とアセチルコリン（ＡＣｈ）の注入を切り替え、一連の三方電磁弁（モデル１６１ＴＯ３１、Neptune Research, Northboro, MA）を用いて灌流ＮＤ９６とＡＣｈを自由に切り替えた。Ａｃｈゲート電流を２電極電圧クランプ増幅器（モデルＯＣ−７２５Ｂ、Warner Instrument Corp., Hamden, CT）によって「低速」クランプに設定し、クランプゲインを最大（×２０００）位置に設定したときに、オンライン記録を行った。ガラス電極を、１ｍｍの外径×０．７５ｍｍの内径を有するガラスキャピラリー（ファイバー充填ホウケイ酸キャピラリー、WPI Inc., Sarasota, FL）から引き出し、そして電圧及び電流電極として３ＭのＫＣｌを充填した。膜電圧を−７０ｍＶにクランプ固定した。システム全体はコンピューターによって制御され記録された。ＡＣｈパルスは、５分毎に１秒間のＡＣｈの自動灌流であった。ＡＣｈの濃度は、筋肉のｎＡＣｈＲ及びニューロンのα９α１０ ｎＡＣｈＲについては１０μＭ、発現ニューロン ｎＡＣｈＲのα７については２００μＭ、及び他のサブタイプについては１００μＭであった。異なる毒素濃度に対して特定のサブタイプを発現する少なくとも５個の卵の電流応答及び電流トレースを記録した。
【００７２】
試験の電流データをＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（San Diego, CA）によって統計解析し、そして用量応答曲線を描いて、ｎＡＣｈＲを遮断する毒素について、半遮断濃度ＩＣ50などのコノトキシンの様々なパラメーターを計算した。
【００７３】
実験結果を下記表２に示す。これらの変異体のα３β４ ｎＡＣｈＲに対する遮断活性とＴｘＩＤのそれとの比も表２に要約されている。
【表２】
2020501584.tif 000004
【００７４】
結果は次のとおりである：
配列番号２〜３、７、９、１１〜３２に示す２６個の変異体（実施例１で調製）はすべてラットα３β４ ｎＡＣｈＲに対するナノモル遮断活性を有し（表２、図２Ａ〜２Ｄ、図３Ａ〜３Ｄ参照、図４Ａ〜４Ｄ、及び図５Ａ〜５Ｄを参照）、ならびにそれらの半遮断用量（ＩＣ50）は１．８７ｎＭ〜３７９．５ｎＭの範囲で変動した（表２）。これらの中で、ほとんどの変異体（合計２３個のポリペプチド）はα３β４ ｎＡＣｈＲに対する強力な遮断活性を維持し、そしてそれらのＩＣ50値はすべて１００ｎＭ未満であった。そして１９個のポリペプチドはα３β４ ｎＡＣｈＲに対してより強い遮断活性を有し、そしてそれらのＩＣ50は全て３６ｎＭ未満であった。
【００７５】
ほとんどの変異体は、α３β４ ｎＡＣｈＲに対して強い遮断活性を有し、それらのＩＣ50値はＴｘＩＤのそれに近く、そして全て１０ｎＭ未満であり、そしてそれらのうちのいくつかはＴｘＩＤの遮断活性よりもさらに強力であった（ＩＣ50、３．６ｎＭ）。例えば、配列番号１７のＴｘＩＤ［Ｓ９Ａｂｕ］及び配列番号１８のＴｘＩＤ［Ｓ９Ｈ］のＩＣ50値は、それぞれわずか１．８７ｎＭ及び２．６１ｎＭであり（表２）、これらは、これまでに発見された最強の遮断活性を有する、α３β４ ｎＡＣｈＲに対する特異的遮断剤であった。
【００７６】
α３β４ ｎＡＣｈＲの電流を遮断した後のＴｘＩＤ及びその新規変異体の溶出速度は異なっていた（図２Ａ〜２Ｄ、図３Ａ〜３Ｄ、図４Ａ〜４Ｄ、図５Ａ〜５Ｄ）。図２Ａ〜２Ｄに示されるように、１μＭの新規変異体ＴｘＩＤ［Ｓ９Ｈ］、ＴｘＩＤ［Ｓ９Ｌ］、及びＴｘＩＤ［Ｓ９Ｙ］がα３β４ ｎＡＣｈＲの電流を遮断した後、溶出は非常に遅く、２分の溶出後の電流はほぼ０ｎＡであった。しかしながら１μＭの野生型ＴｘＩＤで遮断した後、その電流は溶出の２分以内に対照電流「Ｃ」のレベルに戻った。また、ＴｘＩＤ［Ｓ９Ａｂｕ］及びＴｘＩＤ［Ｓ９Ｆ］（４Ａ−４Ｄ）がα３β４ ｎＡＣｈＲの電流を遮断した後も、溶出は非常に遅かった。残りのポリペプチドの溶出速度は比較的速かったが、それぞれの溶出速度は異なっていた（図３Ａ〜３Ｄ、図４Ａ〜４Ｄ、図５Ａ〜５Ｄ）。溶出速度は、ポリペプチドと受容体との間の結合の重要な特徴、すなわち反応結合が解離する速度を反映していた。
【００７７】
３つの変異体ポリペプチド、配列番号３０のＴｘＩＤ［Ｓ９（Ｄ−Ｓｅｒ）］、配列番号３１のＴｘＩＤ［Ｓ９Ｅ］、配列番号３２のＴｘＩＤ［Ｓ９Ｄ］のみが、１１５〜３８０ｎＭのＩＣ50を有した。α３β４ ｎＡＣｈＲに対する遮断活性を喪失した１０個のポリペプチド、配列番号４、５、６、８、１０、及び３３〜３７があり（表２、図６Ａ〜６Ｅ）、１０μＭの高濃度で、α３β４ ｎＡＣｈＲの電流に対するそれらの遮断活性は５０％未満であり、それらのＩＣ50は１００００ｎＭ超であった（表２、及び図６Ａ〜６Ｅ参照）。
【００７８】
さらに、本発明者らはまた、ヒトα３β４ ｎＡＣｈＲに対するＴｘＩＤ及びその新規変異体（表１など）の遮断活性も測定し、それらの活性はラットα３β４ ｎＡＣｈＲに対するものと同様であり、２つの種の間に有意差はなかった。
【００７９】
実施例３：α６／α３β４ ｎＡＣｈＲサブタイプを特異的に遮断するα−コノトキシンＴｘＩＤ新規変異体の実験
実施例２の電気生理学的方法を参照して、α６／α３β４（α６β４*に相当、*は残りの可能なサブユニットを表す）ｎＡＣｈＲに対する表１のＴｘＩＤ及びその新規突然変異体の全ポリペプチドの遮断活性を測定し、結果を表２ならびに図７Ａ〜図７Ｄ、図８Ａ〜図８Ｄ、図９Ａ〜図９Ｄ、図１０Ａ〜図１０Ｄ、及び図１１Ａ〜図１１Ｃ示した。α６／α３β４ ｎＡＣｈＲに対するこれらの変異体の遮断活性とＴｘＩＤとの比も表２にまとめた。
【００８０】
結果は次のとおりである。
合計２４個の新規ペプチド、配列番号２〜３、７、９、１１〜２３、２５〜３０、及び３３（実施例１で調製）は、ラットα６／α３β４ ｎＡＣｈＲに対して異なる程度の遮断効果（表２、ならびに図７Ａ〜７Ｄ、図８Ａ〜８Ｄ及び図９Ａ〜９Ｄを参照）と、４．９１ｎＭ〜３４９２．８２ｎＭの範囲の半遮断用量（ＩＣ50）（表２）を有した。
【００８１】
これらの中で、全部で２２個のポリペプチド中のほとんどの変異体がα６／α３β４ ｎＡＣｈＲに対する遮断活性を維持し、それらのＩＣ50はすべて１０００ｎＭ未満であり、このうち７個のポリペプチド、すなわち配列番号２、７、１３、１９、２７、２８、及び３０は、１００〜１０００ｎＭの範囲のα６／α３β４ ｎＡＣｈＲに対するＩＣ50を示した。α６／α３β４ ｎＡＣｈＲに対してより強い遮断活性を有する１５個の変異体があり、これらのＩＣ50値はＴｘＩＤのそれに近く、全て１００ｎＭ未満であり、これらのいくつかは、α６／α３β４ ｎＡＣｈＲに対するＴｘＩＤの遮断活性（ＩＣ50、３３．９ｎＭ）よりも強かった：例えば、配列番号２０、２３、２５、及び２６のＩＣ50値は、それぞれ１７．７６ｎＭ、２８．９８ｎＭ、１６．１８ｎＭ、及び７．１１ｎＭであった（表２）。１μＭ〜１０μＭの範囲のＩＣ50を示した２つの変異体ポリペプチド、配列番号２９及び配列番号３３が存在した。
【００８２】
さらに、α６／α３β４ ｎＡＣｈＲに対する遮断活性をほとんど失っており（表２、図１０Ａ〜１０Ｄ、及び図１１Ａ〜１１Ｃ）、及びそれらのＩＣ50値が１００００ｎＭ（すなわち１０μＭ）より大きかった１２個のポリペプチド、配列番号４〜６、８、１０、２４、３１〜３２、３４〜３７があった。
【００８３】
α６／α３β４ ｎＡＣｈＲの電流を遮断した後のＴｘＩＤ及びその新規変異体の溶出速度は異なっていた（図７Ａ〜７Ｄ、図８Ａ〜８Ｄ、図９Ａ〜９Ｄ）。図７Ａ〜７Ｄに示されるように、ＴｘＩＤ［Ｓ９Ｆ］の溶出速度は他のポリペプチドのそれよりも著しく遅かった。一般にこれらは、α６／α３β４ ｎＡＣｈＲの電流を遮断した後の野生型ＴｘＩＤの溶出速度及びピーク形状に類似し（図７Ａ〜７Ｄ、図８Ａ〜８Ｄ、図９Ａ〜９Ｄ）、そして一般に２分間の溶出後の対照電流「Ｃ」のレベルに戻ることができた。
【００８４】
さらに、本発明者らはまた、ヒトα６／α３β４ ｎＡＣｈＲに対するＴｘＩＤ及びその新規変異体（表１に示す）の遮断活性も測定し、これらの活性が、ラットα６／α３β４ ｎＡＣｈＲに対するものと同様であり、２つの種の間に有意差がないことを示した。
【００８５】
実施例４：α３β４ ｎＡＣｈＲ及びα６／α３β４ ｎＡＣｈＲの２つのサブタイプに対するα−コノトキシンＴｘＩＤ新規変異体の活性の比較
本発明者らは、上記表２の実験データに従って、α３β４ ｎＡＣｈＲ及びα６／α３β４ ｎＡＣｈＲの２つのサブタイプに対するα−コノトキシンＴｘＩＤ新規変異体の活性を比較し、比較結果を識別の程度［識別の程度＝（ラットα６／α３β４上の変異体のＩＣ50／ラットα３β４上の変異体のＩＣ50）］によって表し、単位はｎＭであった。結果を下記表３に示す。さらに本発明者らはまた、文献調査により、α３β４ ｎＡＣｈＲに作用する現在知られているコノトキシン、ならびに２つの非常に類似したサブタイプα３β４ ｎＡＣｈＲ及びα６／α３β４ ｎＡＣｈＲ間のそれらの識別を、表３に列記する。
【表３】
2020501584.tif 000005
【００８６】
表２と表３から以下が明らかである：
α−コノトキシンＴｘＩＤの新規変異体のほとんどは、２つの類似のサブタイプのα３β４ ｎＡＣｈＲとα６β４* ｎＡＣｈＲに対する遮断活性を保持し（表２）、２つのサブタイプ間の識別度はほとんど１０倍以内であった。２つの類似のサブタイプのα３β４ ｎＡＣｈＲとα６β４* ｎＡＣｈＲ間の野生型ＴｘＩＤの識別はわずか９．３倍であった（表３）。
【００８７】
しかし、表２〜３に示すとおり、２つのサブタイプα３β４ ｎＡＣｈＲとα６β４* ｎＡＣｈＲとの間の良好な識別が、５つの新規ＴｘＩＤ変異体（ＴｘＩＤ［Ｓ９Ａ］である配列番号７、ＴｘＩＤ［Ｓ９Ｒ］である配列番号１９、ＴｘＩＤ［Ｓ９Ｋ］である配列番号２４、ＴｘＩＤ［１４Ｄ］である配列番号２９、及びＴｘＩＤ［Ｓ９Ｅ］である配列番号３１を含む）において観察された。これらのうち、配列番号７、１９、及び２９のポリペプチドは、２つの類似のサブタイプのα３β４ ｎＡＣｈＲ及びα６β４* ｎＡＣｈＲ間で高度の識別性を有し、３つのポリペプチドの識別度は比較的似ており、そして識別度は４５〜５０倍の範囲であった。
【００８８】
新規変異体の配列番号２４であるＴｘＩＤ［Ｓ９Ｋ］が、２つのサブタイプ間の最良の識別を有することが見出され、そしてこれまでで２つの同様のサブタイプα３β４ ｎＡＣｈＲ及びα６β４* ｎＡＣｈＲ間の最も高い識別度を有することが見出されたリガンド物質であったことが、特に注目される。ＴｘＩＤ［Ｓ９Ｋ］はわずか１０．１３ｎＭの半遮断用量でα３β４ ｎＡＣｈＲに対して高活性であり、一方α６β４* ｎＡＣｈＲに対する遮断活性は失われ、その遮断電流は、１０μＭの高濃度で５０％未満であり、そしてその半遮断用量は＞１００００ｎＭであった（表２、表３、図１１Ｃ）。配列番号３１、すなわちＴｘＩＤ［Ｓ９Ｅ］は、α３β４ ｎＡＣｈＲに対して比較的弱い活性を有し、その半遮断用量は３０７．６１ｎＭであったが、α６β４* ｎＡＣｈＲに対する遮断活性は消失し、１０μＭの高濃度でα６β４* ｎＡＣｈＲに対する遮断活性は有しておらず（図１１Ｂ、表２、表３）、この変異体ペプチドは、２つの類似のサブタイプのα３β４ ｎＡＣｈＲ及びα６β４* ｎＡＣｈＲ間で十分な識別を示した。
【００８９】
しかしながら、先行技術において見いだされたコノトキシンの全ては、２つのサブタイプに関して２０倍未満の識別度を有し（表３）、例えば、ＲｅｇＩＩＡ、ＲｅｇＩＩＡ［Ｎ１１、１２Ａ］、ＰｅＩＡ、ＰＩＡ、ＢｕＩＡは、２つのサブタイプについて３．１〜１７．３倍の識別度を示す。
【００９０】
さらに本発明者らはまた、α３β４ ｎＡＣｈＲ及びα６β４* ｎＡＣｈＲの２つのサブタイプに対する、それぞれ異なる濃度の野生型ＴｘＩＤ、変異体ＴｘＩＤ［Ｓ９Ａ］、及び変異体ＴｘＩＤ［Ｓ９Ｋ］の電流遮断効果も詳細に分析した。結果を図１２〜１４に示す。具体的な実験工程は、上記の実施例２〜３を参照されたい。
【００９１】
図１２及び図１３は、それぞれα３β４ ｎＡＣｈＲ及びα６β４* ｎＡＣｈＲの２つのサブタイプに対する野生型ＴｘＩＤと変異体ＴｘＩＤ［Ｓ９Ａ］との電流遮断効果の比較（図１２Ａ〜１２Ｈ）、及び濃度−用量応答曲線（図１３Ａ〜１３Ｂ）を示す。
【００９２】
１００ｎＭ又は１０ｎＭのＴｘＩＤは、２つのサブタイプに対して同様の電流遮断強度を示した（図１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｅ、１２Ｆ）。１００ｎＭのＴｘＩＤは、２つのサブタイプのα３β４ ｎＡＣｈＲ及びα６β４* ｎＡＣｈＲの電流をそれぞれ９７％及び８５％遮断した（図１２Ａ〜１２Ｂ）。１０ｎＭのＴｘＩＤは、２つのサブタイプのα３β４ ｎＡＣｈＲ及びα６β４* ｎＡＣｈＲの電流をそれぞれ６７％及び４６％遮断した（図１２Ｅ〜１２Ｆ）。
【００９３】
１００ｎＭ又は１０ｎＭのＴｘＩＤ［Ｓ９Ａ］は、２つの受容体サブタイプの電流遮断について大きく異なる効果を示し、これらを区別することができた（図１２Ｃ、１２Ｄ、１２Ｇ、１２Ｈ）。１００ｎＭのＴｘＩＤ［Ｓ９Ａ］は、２つのサブタイプα３β４ ｎＡＣｈＲ及びα６β４* ｎＡＣｈＲの電流をそれぞれ９８％及び２６％遮断し（図１２Ｃ〜１２Ｄ）、有意差を示した。１０ｎＭのＴｘＩＤ［Ｓ９Ａ］はα３β４ ｎＡＣｈＲサブタイプの電流を７５％遮断し（図１２Ｇ）、そして１０ｎＭのＴｘＩＤ［Ｓ９Ａ］はα６β４* ｎＡＣｈＲサブタイプに対する遮断活性を完全に喪失し（図１２Ｈ）、その電流は対照電流と同じであった。
【００９４】
図１３Ａ〜１３Ｂの濃度用量応答曲線はまた、ＴｘＩＤ［Ｓ９Ａ］が２つのサブタイプのα３β４ ｎＡＣｈＲ及びα６β４* ｎＡＣｈＲについて良好な識別をしたことを反映している。
【００９５】
１μＭのＴｘＩＤ［Ｓ９Ｋ］は、α３β４ ｎＡＣｈＲの電流を完全に遮断し（図１４Ａ〜１４Ｂ）、一方１０μＭの高濃度のＴｘＩＤ［Ｓ９Ｋ］は、α６／α３β４ ｎＡＣｈＲに対して極めて弱い遮断活性、すなわち対照電流の１／４未満の活性を示した（図１４Ａ〜１４Ｂ）。
【００９６】
実施例５：核磁気共鳴（ＮＭＲ）によるＴｘＩＤ及びＴｘＩＤ［Ｓ９Ａ］の空間構造分析
本発明者らはさらに、核磁気共鳴（ＮＭＲ）及びLuo S, Zhangsun D, Zhu X, Wu Y, Hu Y, Christensen S, Harvey PJ, Akcan M, Craik DJ, McIntosh JM. 2013a. Characterization of a novel α-conotoxin TxID from Conus textile that potently blocks rat α3β4 nicotinic acetylcholine receptors. Journal of Medicinal Chemistry 56: 9655-9663 に記載された具体的方法により、ＴｘＩＤ及びＴｘＩＤ［Ｓ９Ａ］の空間構造を分析した。図１５は、ＴｘＩＤ［Ｓ９Ａ］（異性体１）及びＴｘＩＤ（異性体１）の２次化学シフト（縦軸）の分析結果を示す。
【００９７】
ＮＭＲ構造分析は、ＴｘＩＤ［Ｓ９Ａ］が、水溶液中に異性体１（トランス−トランス異性体、トランス異性体）及び異性体２（シス−トランス異性体）と呼ばれる２つの配座異性体を有することを示した。３０８Ｋで、２つの空間異性体の比率は７０：３０であった。これらの空間異性体は、６位及び１３位のプロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）に先行するペプチド結合のシス−トランス異性化によって形成された。２次αＨ化学シフトがランダムカール値より０．１ｐｐｍ大きい場合、それはポリペプチドが典型的な構造的特徴を有することを示し、すなわち、正のシフトはβ型折り畳み構造を表し、負のシフトはαらせん構造を表す（Wishart DS, Bigam CG. , Holm A, Hodges RS, Sykes BD. 1995. 1H, 13C and 15N random coil NMR chemical shifts of the common amino acids. 1. Investigations of nearest-neighbor effects. Journal of Biomolecular NMR 5: 67-81）。図１５は、ＴｘＩＤ［Ｓ９Ａ］のトランス異性体（異性体１）が、ＴｘＩＤのトランス異性体と比較して、２次構造特性において大きな差がないことを示す。ＴｘＩＤの９位のセリン（Ｓｅｒ−９）をアラニン（Ａｌａ−９）に変異させると、ポリペプチドの中央部分のα−らせん構造が増強された。シス及びトランス異性体については、ＴｘＩＤ及びＴｘＩＤ［Ｓ９Ａ］の両方が、ランダムコイル構造を採用する傾向があった（データは示されていない）。
【００９８】
Yu ら. 2012 (Yu, R., Kaas, Q., and Craik, DJ (2012). Delineation of the unbinding pathway of alpha-conotoxin ImI from the alpha7 nicotinic acetylcholine receptor. The Journal of Physical Chemistry B 116 , 6097-6105) の方法を参照して、α−コノトキシンＴｘＩＤとラットα３β４ ｎＡＣｈＲ又はα６β４ ｎＡＣｈＲのリガンド結合ドメインとの相互作用の分子ドッキング分析を行った。元の相同性モデルは、Ｍｏｄｅｌｌｅｒ９ｖ１３（Sali and Blundell 1993）ソフトウェア及び２つの分子鋳型を使用して構築された。これら２つの分子鋳型は、それぞれアセチルコリン結合タンパク質（ＡＣｈＢＰ）及びα−コノトキシンＴｘＩＡ変異体（ＰＤＢ識別子２ｕｚ６）の結晶構造（Dutertre, S., Ulens, C., Buttner, R., Fish, A., van Elk, R., Kendel, Y., Hopping, G., Alewood, PF, Schroeder, C., Nicke, A. ら. (2007). AChBP-targeted alpha-conotoxin correlates distinct binding orientations With nAChR subtype selectivity. The EMBO Journal 26, 3858-3867）と、単離されたヒトα９サブユニットの結晶構造（ＰＤＢ識別子４ｄ０１）であった（Zouridakis ら. 2014）。α３β４ ｎＡＣｈＲ及びα６β４ ｎＡＣｈＲは、２つのαサブユニット及び３つのβサブユニットからなる五量体であり、受容体へのコノトキシンの結合部位は、α（右側）サブユニットとβ（相補側）サブユニットとの間に形成される界面であると考えられた。分子動力学（ＭＤ）シミュレーションソフトウェア及びアンバーｆｆ９９ＳＢ−ＩＬＤＮ（Lindorff-Larsen, K., Piana, S., Palmo, K., Maragakis, P., Klepeis, J.L., Dror, R.O., and Shaw, D.E. (2010). Improved side-chain torsion potentials for the Amber ff99SB protein force field. Proteins 78, 1950-1958）分子力場及びＧｒｏｍａｃｓ  ５．１  ＭＤエンジン（Pronk, S., Pall, S., Sc Hulz, R., Larsson, P., Bjelkmar, P., Apostolov, R., Shirts, M.R., Smith, J.C., Kasson, P.M., van der Spoel, D.ら. (2013). GROMACS 4.5: a high-throughput and highly parallel open source molecular simulation toolkit. Bioinformatics 29, 845-854）を用いる方法を使用して、ＴｘＩＤとラットα３β４ ｎＡＣｈＲ又はα６β４ ｎＡＣｈＲとの相互作用の分子ドッキング結合モデルをそれぞれ改良し、３つの分子動力学（ＭＤ）シミュレーション結果を得た（図１６）。
【００９９】
α３β４ ｎＡＣｈＲ及びα６β４* ｎＡＣｈＲに対するＴｘＩＤの分子ドッキング結合モデル（図１６Ａ〜１６Ｂ）は、２つの間の全体的な差は非常に小さいが、主に結合部位の形状が異なるために、そしてα３サブユニット及びα６サブユニットの結合部位付近のアミノ酸種の違いのために、依然として差があることを示す。５０ｎｓ以内に行った分子動力学（ＭＤ）シミュレーションは、α６β４* ｎＡＣｈＲへの結合部位において、弱い水素結合がＴｘＩＤのＳｅｒ−９とβ４ Ｌｙｓ−８１との間に形成されたが（図１６Ｂ）、α３β４ ｎＡＣｈＲへの結合部位には水素結合が存在しなかった（図１６Ａ）。
【０１００】
ＴｘＩＤのＳｅｒ−９側鎖ヒドロキシル基とβ４ Ｌｙｓ−８１側鎖窒素原子との間の時間依存性距離を図１６Ｃに示した。Ｓｅｒ−９をアラニンで置換すると、この水素結合相互作用が破壊された。結果は、α６β４* ｎＡＣｈＲに対するＴｘＩＤ［Ｓ９Ａ］の遮断活性がＴｘＩＤのそれと比較して５倍低下したことを示し、これは、３００Ｋでこの点突然変異が約１ｋｃａｌ／ｍｏｌのエネルギー減少（これは水素結合を失うエネルギーと一致する）を引き起こしたという事実に帰せられるかもしれない（Bowie JU. 2011. Membrane protein folding: how important are hydrogen bonds? Curr Opin Struct Biol 21: 42-49）。対照的に、α３β４ ｎＡＣｈＲへの結合部位では、ＴｘＩＤのＳｅｒ−９と受容体との間に相互作用はなく、従ってＳ９Ａの置換はα３β４ ｎＡＣｈＲの遮断活性に影響を及ぼさず、これは実験結果と一致した（表２〜３、図１６Ａ）。
【０１０１】
ＴｘＩＤの１位のグリシン（Ｇｌｙ−１）がアラニン（Ｇ１Ａ）で置換された場合、α３β４ ｎＡＣｈＲ及びα６／α３β４ ｎＡＣｈＲに対する遮断活性は、それぞれ１７倍及び８倍低下した。図１６の分子ドッキング結合モデルによれば、β４サブユニット上の負に荷電したＡｓｐ−１９２とＴｘＩＤの１位のグリシンとの間に電荷相互作用があるかもしれない。この相互作用は、野生型α−コノトキシンＴｘＩＤと比較して、ＴｘＩＤ［Ｇ１Ａ］の骨格のコンフォメーション（bone conformation）の変化によって弱められる可能性がある。ＴｘＩＤの１１位のメチオニン（Ｍｅｔ−１１）をイソロイシン（Ｉｌｅ）（Ｍ１１ｌ）で置き換えると、α３β４ ｎＡＣｈＲに対する遮断活性は２０倍低下したが、α６／α３β４ ｎＡＣｈＲに対する遮断活性は低下しなかった。分子ドッキングモデルによれば、Ｍｅｔ−１１は、α３サブユニットのＣ−ループ上のＣｙｓ−２１８と接触しており、より大きい側鎖が立体障害を引き起こすため、Ｍ１１Ａの置換は結合様式の変化を引き起こし得る。Ｍ１１Ａ変異は、α３β４ ｎＡＣｈＲ及びα６／α３β４ ｎＡＣｈＲの両方に対する遮断活性の完全な喪失をもたらし、そしてそれらの半遮断用量は１００００ｎＭを超えた（表２）。対照的に、α６β４への結合モデルでは、α６サブユニット上の結合部位への立体障害を引き起こさずに、Ｍｅｔ−１１をＩｌｅで置換することができ、従ってα６／α３β４ ｎＡＣｈＲに対する野生型ＴｘＩＤ及び点突然変異ＴｘＩＤ［Ｍ１１Ｉ］の遮断活性に影響を及ぼさなかった（図１６Ａ〜図１６Ｂ、表２）。
【０１０２】
実施例６：α３β４ ｎＡＣｈＲ及びα６／α３β４ ｎＡＣｈＲの２つのサブタイプに対するα−コノトキシンＴｘＩＤのいくつかの新規変異体の遮断活性の再アッセイ
ラットα３β４ ｎＡＣｈＲ及びα６／α３β４ ｎＡＣｈＲに対するＴｘＩＤのいくつかの新規変異体の遮断活性を、新たに購入したアフリカツメガエル卵母細胞を使用して実施例２の電気生理学的方法によって再度測定した。結果を表４に示す。結果は、これらの変異体の遮断活性が、それらの半遮断用量（ＩＣ50）がわずかに変化（これらは、通常の誤差の変動内であった）したことを除いて、基本的に実施例２及び３の活性と同じであった。これらの結果は、α３β４ ｎＡＣｈＲ及びα６／α３β４ ｎＡＣｈＲに対する上記変異体の遮断活性をさらに確認した。
【表４】
2020501584.tif 000006
【０１０３】
本発明の特定の実施態様を詳細に説明してきたが、当業者であれば、本発明の教示に照らして詳細の様々な修正及び変更が可能であることを理解するであろう。本発明の全範囲は、添付の特許請求の範囲及びその任意の均等物によって与えられる。
【図１】
2020501584.tif 000007
【図２】
2020501584.tif 000008
【図３】
2020501584.tif 000009
【図４】
2020501584.tif 000010
【図５】
2020501584.tif 000011
【図６】
2020501584.tif 000012
【図７】
2020501584.tif 000013
【図８】
2020501584.tif 000014
【図９】
2020501584.tif 000015
【図１０】
2020501584.tif 000016
【図１１】
2020501584.tif 000017
【図１２】
2020501584.tif 000018
【図１３】
2020501584.tif 000019
【図１４】
2020501584.tif 000020
【図１５】
2020501584.tif 000021
【図１６】
2020501584.tif 000022
【配列表】
2020501584000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年8月20日(2019.8.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
９位のセリンが異なるＬ型又はＤ型アミノ酸で置換されている配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチド。
【請求項２】
配列番号１に示される配列の９位のセリンが、アラニン、２−アミノ酪酸、ヒスチジン、アルギニン、チロシン、スレオニン、リジン、ロイシン、フェニルアラニン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−セリン、グルタミン酸、又はアスパラギン酸で置換されている、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
それぞれ配列番号２〜３、７、９、１１〜３３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドであって、ポリペプチドのＮ末端から数えて、
第１システインが第３システインとジスルフィド結合を形成し、かつ第２システインが第４システインとジスルフィド結合を形成するか；又は、第１システインが第４システインとジスルフィド結合を形成し、かつ第２システインが第３システインとジスルフィド結合を形成するか；又は、第１システインが第２システインとジスルフィド結合を形成し、かつ第３システインが第４システインとジスルフィド結合を形成する、上記ポリペプチド。
【請求項５】
前記ポリペプチドのカルボキシ末端がアミド化されている、請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の少なくとも１つのポリペプチドを含む単離された融合タンパク質。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項５に記載のポリヌクレオチドを含む核酸構築物。
【請求項９】
請求項７に記載のポリヌクレオチド又は請求項８に記載の核酸構築物を含む形質転換細胞。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の少なくとも１つのポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項１１】
医薬的に許容し得る賦形剤をさらに含む、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
アセチルコリン受容体を遮断するのに使用される、請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチドであって、前記アセチルコリン受容体は、α３β４アセチルコリン受容体、又はα６β４* アセチルコリン受容体である、上記ポリペプチド。
【請求項１３】
α６β４*アセチルコリン受容体がα６／α３β４アセチルコリン受容体である、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
神経系疾患又は癌の治療及び／又は予防に使用されるか、又は有害生物の駆除、鎮痛、禁煙、解毒、又は食欲増進に使用される、請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
前記神経系疾患が、依存症、神経痛、パーキンソン病、認知症、統合失調症、及び鬱病のうちの少なくとも１つである、請求項１４に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
前記依存症が、少なくとも１つの精神活性物質によって引き起こされる、請求項１５に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
前記精神活性物質が、ニコチン、アヘン、ヘロイン、メタンフェタミン（アイス）、モルヒネ、マリファナ、コカイン、又はアルコールである、請求項１６に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
前記神経痛が、以下：坐骨神経痛、三叉神経痛、リンパ神経痛、多点運動神経痛、急性の激しい自発性神経痛、挫滅性神経痛、及び複合神経痛の少なくとも１つから選択される、請求項１５に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
前記神経痛が、以下の要因：癌、癌化学療法、アルコール依存症、糖尿病、硬化症、帯状疱疹、機械的損傷、外科的損傷、ＡＩＤＳ、頭部神経痛、薬物中毒、産業公害中毒、骨髄腫、慢性先天性感覚神経障害、血管炎、脈管炎、虚血、尿毒症、小児胆汁性肝疾患、慢性呼吸器障害、多臓器不全、敗血症／膿血症、肝炎、ポルフィリン症、ビタミン欠乏症、慢性肝疾患、先天性胆汁性硬化症、高脂血症、らい病、ライム関節炎、感覚神経周囲炎、又はアレルギーのうちの少なくとも１つによって引き起こされる、請求項１５に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
前記癌が、肺癌、卵巣癌、白血病、神経芽細胞腫、又は乳癌である、請求項１４に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
前記肺癌が、小細胞肺癌である、請求項２０に記載のポリペプチド。
【国際調査報告】
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