(57)【要約】本発明は、組織を再生するために治療的に使用されるが、受容する対象による拒絶を回避する、多能性細胞を提供する。特に、本発明は、宿主の免疫拒絶反応を回避する、低免疫原性多能性細胞を提供する。前記細胞は、免疫応答を引き起こす主要な免疫抗原を欠いており、貪食作用性エンドサイトーシスを回避するように設計されている。本発明は更に、特定の組織及び器官を作製又は再生するための、広く受け入れられることができる「既成の（off-the-shelf）」多能性細胞及びその誘導体（derivatives）を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む、低免疫原性多能性幹細胞を作製する方法：
ａ．人工多能性幹細胞（ iPSC ）中にある B2M 遺伝子の両方の対立遺伝子の活性を無くすこと；
ｂ．前記 iPSC 中にある CIITA 遺伝子の両方の対立遺伝子の活性を無くすこと；及び
ｃ．前記 iPSC 中で CD47 の発現を増加させること。
【請求項２】
前記 iPSC がヒトであり、前記 B2M 遺伝子がヒトであり、前記 CIITA 遺伝子がヒトであり、そして前記増加させた CD47 の発現が、プロモーターの制御下にあるヒト CD47 遺伝子の少なくとも 1 コピーを前記 iPSC 細胞に導入することから生じる、請求項１の方法。
【請求項３】
前記 iPSC がマウスであり、前記 B2m 遺伝子がマウスであり、前記 Ciita 遺伝子がマウスであり、そして前記増加させた Cd47 の発現が、プロモーターの制御下にあるマウス Cd47 遺伝子の少なくとも 1 コピーを前記 iPSC 細胞に導入することから生じる、請求項１の方法。
【請求項４】
前記プロモーターが構成的プロモーターである、請求項２又は３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記 B2M 遺伝子の両方の対立遺伝子における前記破壊が、前記 B2M 遺伝子の対立遺伝子の両方を破壊する、クラスターを形成し規則正しい間隔を持つ短いパリンドローム・リピート（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）/Cas9 （CRISPR）反応で生じる、請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記 CIITA 遺伝子の両方の対立遺伝子における前記破壊が、前記 CIITA 遺伝子の対立遺伝子の両方を破壊する CRISPR 反応で生じる、請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
以下を含むヒト低免疫原性多能性（hHIP）幹細胞：
ａ．内因性 B2M 遺伝子の両方の対立遺伝子を不活性化する 1 つ以上の改変；
ｂ．内因性 CIITA 遺伝子の両方の対立遺伝子を不活性化する 1 つ以上の改変；及び
ｃ．前記 hHIP 幹細胞中で CD47 遺伝子の発現を増加させる改変；
ここで、前記 hHIP 幹細胞は、前記 B2M 及び CIITA の改変を含むが前記 CD47 遺伝子の発現の増加を含まない人工多能性幹細胞（iPSC）によって誘発される第 2 のナチュラル・キラー（NK）細胞応答よりも低い第 1 の NK 細胞応答を誘発し、並びに、ここで、前記第 1 及び第 2 の NK 細胞応答は、前記 hHIP 細胞又は前記 B2M 及び CIITA の改変のみを含む前記 iPSC 細胞の何れかと共に in vitro でインキュベートした NK 細胞からの IFN-γレベルを決定することによって測定される。
【請求項８】
以下を含むヒト低免疫原性多能性（hHIP）幹細胞：
ａ．内因性 B2M 遺伝子の両方の対立遺伝子を不活性化する 1 つ以上の改変；
ｂ．内因性 CIITA 遺伝子の両方の対立遺伝子を不活性化する 1 つ以上の改変；及び
ｃ．前記 hHIP 幹細胞中で CD47 遺伝子の発現を増加させる改変；
ここで、前記 hHIP 幹細胞は、iPSC によって誘発される同種異系ヒト化マウス系統における第 2 の T 細胞応答よりも低い、前記ヒト化マウス系統における第 1 の T 細胞応答を誘発し、並びに、ここで、前記第 1 及び第 2 の T 細胞応答は、エリスポット・アッセイで、前記ヒト化マウスの脾細胞からの IFN-γレベルを決定することによって測定される。
【請求項９】
請求項７又は８の何れか一項に記載の hHIP 幹細胞をヒト対象に移植することを含む方法。
【請求項１０】
以下を含む低免疫原性多能性細胞：
ａ．親多能性細胞と比較した場合に、減少した内因性の主要組織適合抗原クラスI（HLA-I）機能；
ｂ．親多能性細胞と比較した場合に、減少した内因性の主要組織適合抗原クラスII（HLA-II）機能；及び
ｃ．NK 細胞による殺傷に対する感受性を減少させる CD47 機能の増大；
ここで、前記低免疫原性多能性細胞は、前記 HLA-I 機能の減少、前記 HLA-II 機能の減少、及び NK 細胞による殺傷に対する感受性の減少の結果として、対象に移植されたときに拒絶反応を受けにくい。
【請求項１１】
前記 HLA-I 機能が、β-2 ミクログロブリン・タンパク質の発現を減少させることによって減少する、請求項１０に記載の低免疫原性多能性細胞。
【請求項１２】
前記β-2 ミクログロブリン・タンパク質をコードする遺伝子がノックアウトされている、請求項１１に記載の低免疫原性多能性細胞。
【請求項１３】
前記β-2 ミクログロブリン・タンパク質が、配列番号１に対して少なくとも 90% の配列同一性を有する、請求項１２に記載の低免疫原性多能性細胞。
【請求項１４】
前記β-2 ミクログロブリン・タンパク質が、配列番号１の配列を有する、請求項１３に記載の低免疫原性多能性細胞。
【請求項１５】
前記 HLA-I 機能が、HLA-A タンパク質の発現を減少させることによって減少する、請求項１０に記載の低免疫原性多能性細胞。
【請求項１６】
前記 HLA-A タンパク質をコードする遺伝子がノックアウトされている、請求項１５に記載の低免疫原性多能性細胞。
【請求項１７】
前記 HLA-I 機能が、HLA-B タンパク質の発現を減少させることによって減少する、請求項１０に記載の低免疫原性多能性細胞。
【請求項１８】
HLA-B タンパク質がノックアウトされている、請求項１７に記載の低免疫原性多能性細胞。
【請求項１９】
前記 HLA-I 機能が、HLA-C タンパク質の発現を減少させることによって減少する、請求項１０に記載の低免疫原性多能性細胞。
【請求項２０】
前記 HLA-C タンパク質をコードする遺伝子がノックアウトされている、請求項１９に記載の低免疫原性多能性細胞。
【請求項２１】
前記低免疫原性多能性細胞が HLA-I 機能を含まない、請求項１０から２０の何れか一項に記載の低免疫原性多能性細胞。
【請求項２２】
前記 HLA-II 機能が、CIITA タンパク質の発現を減少させることによって減少する、請求項１０から２１の何れか一項に記載の低免疫原性多能性細胞。
【請求項２３】
前記 CIITA タンパク質をコードする遺伝子がノックアウトされている、請求項２２に記載の低免疫原性多能性細胞。
【請求項２４】
前記 CIITA タンパク質が、配列番号２に対して少なくとも 90% の配列同一性を有する、請求項２３に記載の低免疫原性多能性細胞。
【請求項２５】
前記 CIITA タンパク質が、配列番号２の配列を有する、請求項２４に記載の低免疫原性多能性細胞。
【請求項２６】
前記 HLA-II 機能が、HLA-DP タンパク質の発現を減少させることによって減少する、請求項１０から２１の何れか一項に記載の低免疫原性多能性細胞。
【請求項２７】
前記 HLA-DP タンパク質をコードする遺伝子がノックアウトされている、請求項２６に記載の低免疫原性多能性細胞。
【請求項２８】
前記 HLA-II 機能が、HLA-DR タンパク質の発現を減少させることによって減少する、請求項１０から２１の何れか一項に記載の低免疫原性多能性細胞。
【請求項２９】
前記 HLA-DR タンパク質をコードする遺伝子がノックアウトされている、請求項２８に記載の低免疫原性多能性細胞。
【請求項３０】
前記 HLA-II 機能が、HLA-DQ タンパク質の発現を減少させることによって減少する、請求項１０から２１の何れか一項に記載の低免疫原性多能性細胞。
【請求項３１】
前記 HLA-DQ タンパク質をコードする遺伝子がノックアウトされている、請求項３０に記載の低免疫原性多能性細胞。
【請求項３２】
前記低免疫原性多能性細胞が HLA-II 機能を含まない、請求項１０から３１の何れか一項に記載の低免疫原性多能性細胞。
【請求項３３】
前記 NK 細胞による殺傷に対する感受性の減少が、CD47 タンパク質の発現の増加によって引き起こされる、請求項１０から３２の何れか一項に記載の低免疫原性多能性細胞。
【請求項３４】
前記 CD47 タンパク質の発現の増加が、内因性 CD47 遺伝子座への改変から生じる、請求項３３に記載の低免疫原性多能性細胞。
【請求項３５】
前記 CD47 タンパク質の発現の増加が、CD47 導入遺伝子から生じる、請求項３３に記載の低免疫原性多能性細胞。
【請求項３６】
前記 CD47 タンパク質が、配列番号３に対して少なくとも 90% の配列同一性を有する、請求項３３から３５の何れか一項に記載の低免疫原性多能性細胞。
【請求項３７】
前記 CD47 タンパク質が、配列番号３の配列を有する、請求項２７に記載の低免疫原性多能性細胞。
【請求項３８】
前記低免疫原性多能性細胞を死滅させる引き金によって活性化される自殺遺伝子を更に含む、請求項１０から３７の何れか一項に記載の低免疫原性多能性細胞。
【請求項３９】
前記自殺遺伝子が単純ヘルペス・ウイルス・チミジン・キナーゼ遺伝子（HSV-tk）であり、前記引き金がガンシクロビルである、請求項３８に記載の低免疫原性多能性細胞。
【請求項４０】
前記 HSV-tk 遺伝子が、配列番号４に対して少なくとも 90% の配列同一性を含むタンパク質をコードする、請求項３９に記載の低免疫原性多能性細胞。
【請求項４１】
前記 HSV-tk 遺伝子が、配列番号４の配列を含むタンパク質をコードする、請求項４０に記載の低免疫原性多能性細胞。
【請求項４２】
前記自殺遺伝子が大腸菌シトシン・デアミナーゼ遺伝子（EC-CD）であり、前記引き金が 5-フルオロシトシン（5-FC）である、請求項３８に記載の低免疫原性多能性細胞。
【請求項４３】
前記 EC-CD 遺伝子が、配列番号５に対して少なくとも 90% の配列同一性を含むタンパク質をコードする、請求項４２に記載の低免疫原性多能性細胞。
【請求項４４】
前記 EC-CD 遺伝子が、配列番号５の配列を含むタンパク質をコードする、請求項４３に記載の低免疫原性多能性細胞。
【請求項４５】
前記自殺遺伝子が誘導性カスパーゼ・タンパク質をコードし、前記引き金が二量体化への化学誘導剤（CID）である、請求項３８に記載の低免疫原性多能性細胞。
【請求項４６】
前記遺伝子が、配列番号６に対して少なくとも 90% の配列同一性を含む誘導性カスパーゼ・タンパク質をコードする、請求項４５に記載の低免疫原性多能性細胞。
【請求項４７】
前記遺伝子が、配列番号６の配列を含む誘導性カスパーゼ・タンパク質をコードする、請求項４６に記載の低免疫原性多能性細胞。
【請求項４８】
前記 CID が AP1903 である、請求項４５から４７の何れか一項に記載の低免疫原性多能性細胞。
【請求項４９】
以下を含む低免疫原性多能性細胞の製造方法：
ａ．多能性細胞中にある内因性の主要組織適合性抗原クラス I（HLA-I）機能を減少させる；
ｂ．多能性細胞中にある内因性の主要組織適合抗原クラス II（HLA-II）機能を減少させる；及び
ｃ．NK 細胞による殺傷に対する前記多能性細胞の感受性を減少させるタンパク質の発現を増加させる。
【請求項５０】
前記 HLA-I 機能が、β-2 ミクログロブリン・タンパク質の発現を減少させることによって減少する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記β-2 ミクログロブリン・タンパク質の発現が、前記β-2 ミクログロブリン・タンパク質をコードする遺伝子をノックアウトすることによって減少する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記β-2 ミクログロブリン・タンパク質が、配列番号１と少なくとも 90% の配列同一性を有する、β-2 ミクログロブリン５０。
【請求項５３】
前記β-2 ミクログロブリン・タンパク質が、配列番号１の配列を有する、β-2 ミクログロブリン５１。
【請求項５４】
前記 HLA-I 機能が、HLA-A タンパク質発現の発現を減少させることによって減少する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５５】
前記 HLA-A タンパク質の発現が、前記 HLA-A タンパク質をコードする遺伝子をノックアウトすることによって減少する、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記 HLA-I 機能が、HLA-B タンパク質発現の発現を減少させることによって減少する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５７】
前記 HLA-B タンパク質発現が、前記 HLA-B タンパク質をコードする遺伝子をノックアウトすることにより減少する、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記 HLA-I 機能が、HLA-C タンパク質発現の発現を減少させることによって減少する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５９】
前記 HLA-C タンパク質発現が、前記 HLA-C タンパク質をコードする遺伝子をノックアウトすることにより減少する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記低免疫原性多能性細胞が HLA-I 機能を含まない、請求項４９から５９の何れか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記 HLA-II 機能が、CIITA タンパク質の発現を減少させることによって減少する、請求項４９から６０の何れか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記 CIITA タンパク質の発現が、前記 CIITA タンパク質をコードする遺伝子をノックアウトすることによって減少する、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
前記 CIITA タンパク質が、配列番号２に対して少なくとも 90% の配列同一性を有する、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
前記 CIITA タンパク質が、配列番号２の配列を有する、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記 HLA-II 機能が、HLA-DP タンパク質の発現を減少させることによって減少する、請求項４９から６０の何れか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記 HLA-DP タンパク質の発現が、前記 HLA-DP タンパク質をコードする遺伝子をノックアウトすることにより減少する、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記 HLA-II 機能が、HLA-DR タンパク質の発現を減少させることによって減少する、請求項４９から６０の何れか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記 HLA-DR タンパク質の発現が、前記 HLA-DR タンパク質をコードする遺伝子をノックアウトすることにより減少する、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記 HLA-II 機能が、HLA-DQ タンパク質の発現を減少させることによって減少する、請求項４９から６０の何れか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記 HLA-DQ タンパク質の発現が、前記 HLA-DQ タンパク質をコードする遺伝子をノックアウトすることにより減少する、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記低免疫原性多能性細胞が HLA-II 機能を含まない、請求項４９から７０の何れか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記多能性細胞のマクロファージによる貪食作用に対する感受性を減少させるタンパク質の前記発現の増加が、内因性遺伝子座への改変により生じる、請求項４９から７１の何れか一項に記載の方法。
【請求項７３】
前記内因性遺伝子座が CD47 タンパク質をコードする、請求項７２の方法。
【請求項７４】
前記タンパク質の発現の増加が導入遺伝子の発現により生じる、請求項４９から７１の何れか一項に記載の方法。
【請求項７５】
前記導入遺伝子が CD47 タンパク質をコードする、請求項７４の方法。
【請求項７６】
前記 CD47 タンパク質が、配列番号３に対して少なくとも 90% の配列同一性を有する、請求項７３又は７４の何れか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記 CD47 タンパク質が、配列番号３の配列を有する、請求項７６の方法。
【請求項７８】
前記低免疫原性多能性細胞を死滅させる引き金によって活性化される自殺遺伝子を発現させることを更に含む、請求項４９から７７の何れか一項に記載の方法。
【請求項７９】
前記自殺遺伝子が単純ヘルペス・ウイルス・チミジン・キナーゼ遺伝子（HSV-tk）であり、前記引き金がガンシクロビルである、請求項７８の方法。
【請求項８０】
前記 HSV-tk 遺伝子が、配列番号４に対して少なくとも 90% の配列同一性を含むタンパク質をコードする、請求項７９の方法。
【請求項８１】
前記 HSV-tk 遺伝子が、配列番号４の配列を含むタンパク質をコードする、請求項８０の方法。
【請求項８２】
前記自殺遺伝子が大腸菌シトシン・デアミナーゼ遺伝子（EC-CD）であり、前記引き金が 5-フルオロシトシン（5-FC）である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８３】
前記 EC-CD 遺伝子が、配列番号５に対して少なくとも 90% の配列同一性を含むタンパク質をコードする、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記 EC-CD 遺伝子が、配列番号５の配列を含むタンパク質をコードする、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記自殺遺伝子が誘導性カスパーゼ・タンパク質をコードし、前記引き金が二量体化への特異的化学誘導剤（CID）である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８６】
前記遺伝子が、配列番号６に対して少なくとも 90% の配列同一性を含む誘導性カスパーゼ・タンパク質をコードする、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記遺伝子が、配列番号６の配列を含む誘導性カスパーゼ・タンパク質をコードする、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記 CID が AP1903 である、請求項８５から８７の何れか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
（Ｉ．関連出願の相互参照）
本出願は、2017 年 1 月 13 日に出願された米国仮特許出願第62/445,969 号の利益を主張する。
【技術分野】
【０００２】
（ＩＩ．本発明の分野）
再生細胞療法は、損傷を受けた臓器や組織を再生するための重要で将来性がある治療法である。移植のために利用可能な臓器が少ないこと、及びそのことによって長期間待たなければならないことがあり、すぐに利用できる細胞株を患者に移植することにより組織を再生することができることは、明らかに魅力的である。再生細胞療法は、動物モデル（例えば、心筋梗塞後）において、移植後、損傷組織を修復することについて、有望な初期の結果を示している。しかしながら、移植レシピエントの免疫系が同種異系の物質を拒絶する性向によって、治療薬に本来備わっている有効性は大幅に低下し、そのような治療を取り巻く好ましい可能性のある効果は減少する。
【背景技術】
【０００３】
（ＩＩＩ．本発明の背景）
再生細胞療法は、損傷を受けた臓器や組織を再生するための重要で将来性がある治療法である。移植のために利用可能な臓器が少ないこと、及びそのことによって長期間待たなければならないことがあり、すぐに利用できる細胞株を患者に移植することにより組織を再生することができることは、明らかに魅力的である。再生細胞療法は、動物モデル（例えば、心筋梗塞後）において、移植後、損傷組織を修復することについて、有望な初期の結果を示している。しかしながら、移植レシピエントの免疫系が同種異系の物質を拒絶する性向によって、治療薬に本来備わっている有効性は大幅に低下し、そのような治療を取り巻く好ましい可能性のある効果は減少する。
【０００４】
自家人工多能性幹細胞（iPSC）は、患者特異的な細胞ベースの臓器修復戦略のための無制限の細胞源を、理論的には構成する。しかしながら、それらを作製することは、技術的及び製造上での困難なことであり、あらゆる急性期の治療法を概念的に妨げる長いプロセスである。同種異系の iPSC ベースの治療法は、製造の観点からはより容易であり、よくスクリーニングされ、標準化された、高品質の細胞製品を作製することを可能にする。しかしながら、それらは同種異系の起源であるために、そのような細胞製品を使えば拒絶反応を起こすであろう。もし、細胞の抗原性を減少させる、又は無くすことができれば、広く受け入れられる細胞製品を作製することができるであろう。多能性幹細胞は、3 種の胚葉のうち任意の細胞型に分化することができるため、幹細胞療法の潜在的な用途は多岐にわたる。分化を、ex vivo で、又は移植部位の臓器環境の中で分化及び成熟し続ける前駆細胞を移植することによる in vivo で、実施することができる。ex vivo 分化によれば、研究者又は臨床医が、手順を綿密にモニターすることが可能になり、そして移植の前に適切な細胞集団が作製されていることを確実にすることができる。
【０００５】
しかしながら、ほとんどの場合、未分化の多能性幹細胞は、それらが奇形腫を形成する性向があるために臨床移植治療において避けられている。寧ろ、そのような療法は、分化した細胞（例えば、心不全を患っている患者の心筋に移植される幹細胞由来の心筋細胞）を使用する傾向にある。もし、そのような多能性細胞又は組織を臨床に適用すれば、それらの移植後、細胞の増殖及び生存が制御される「安全性の特徴」から、利益が得られるであろう。
【０００６】
当該分野では、罹患細胞又は欠損細胞を再生又は置換するために使用される細胞を産生できる幹細胞が求められている。多能性幹細胞（PSCs）は、急速に増殖し、そして多くの細胞型に分化することができるので、利用することができるかもしれない。PSCs のファミリーには、異なる技術によって作製され、そして異なる免疫原性の特徴を有するいくつかのメンバーが含まれる。PSCs 由来の改変された細胞又は組織に対する患者の適合性によって、免疫拒絶のリスク、及び免疫抑制の必要性が決まる。
【０００７】
胚盤胞の内部細胞塊から単離された胚性幹細胞（ESCs）は、レシピエントに対してミスマッチである組織適合性抗原を示す。この免疫学的な障壁は、ヒト白血球抗原（HLA）型の ESCs バンクでは解決できない。なぜならば、マイナー抗原として機能する非 HLA 分子にミスマッチがあるために、HLA が適合した PSC 移植片でさえも拒絶反応を起こすからである。これまでのところ、PSC ベースのアプローチは前臨床で成功しているが、これは、免疫抑制モデルにおいて又は免疫不全モデルにおいて、若しくは細胞をカプセル化して宿主の免疫システムから保護した場合においてのみで、達成されてきた。しかし、同種異系の臓器移植で使用される全身性の免疫抑制は、再生アプローチを目的として正当化できるものではない。免疫抑制薬には重篤な副作用があり、感染症や悪性腫瘍のリスクを著しく高める。
【０００８】
拒絶の問題を回避するために、患者特異的な多能性幹細胞を作製するための様々な技術が開発されてきた。これらには、体細胞核を除核卵母細胞へ移植すること（体細胞核移植（SCNT）幹細胞）、体細胞と ESC との融合（ハイブリッド細胞）、及び特定の転写因子を用いた体細胞のリプログラミング（人工 PSCs 又は iPSCs）が含まれる。しかしながら、SCNT 幹細胞及び iPSCs は、染色体が同一であるにもかかわらず、それぞれ核又は細胞ドナーと免疫不適合であることがある。SCNT 幹細胞は、卵母細胞から受け継がれたミトコンドリア DNA（mtDNA）を持っている。mtDNA-コードのタンパク質が、関連するマイナー抗原として働き、拒絶反応を引き起こす可能性がある。 iPSCs のリプログラミング及び培養拡大に関連した DNA 及び mtDNA の変異及び遺伝的不安定性によってもまた、免疫拒絶反応に関連するマイナー抗原が生み出される可能性がある。この未知の免疫ハードルによって、SCNT 幹細胞又は iPSCs を用いて、適合性のある患者特異的な組織をうまく大規模に改変できる可能性は減る。
【０００９】
（ＩＶ．本発明の要旨）
宿主の同種異系免疫システムによる拒絶反応を回避する、低免疫多能性（Hypoimmune pluripotent（HIP））細胞を作製した。母体の血液と胎児組織との間の界面を形成する、胎盤の合胞体栄養芽層細胞を利用した。MHC I 又は HLA-I 及び MHC II 又は HLA-II の発現を減少させた。CD47 を増加させた。抗原提示能力を損なわせること、及び自然免疫クリアランスから保護すること、に関するこのパターンによって、宿主の免疫拒絶反応を回避した。このことは、HIP 細胞、並びに HIP 細胞が分化した特定の外胚葉、中胚葉、及び内胚葉由来の細胞で示された。
【００１０】
従って、本発明は、以下を含む低免疫原性多能性幹細胞を作製する方法：人工多能性幹細胞（iPSC）中にある B2M 遺伝子の両方の対立遺伝子の活性を無くすこと；前記 iPSC 中にある CIITA 遺伝子の両方の対立遺伝子の活性を無くすこと；及び、前記 iPSC 中で CD47 の発現を増加させること；を提供する。
【００１１】
前記方法の好ましい実施形態では、前記 iPSC がヒトであり、前記 B2M 遺伝子がヒトであり、前記 CIITA 遺伝子がヒトであり、そして前記増加させた CD47 の発現が、プロモーターの制御下にあるヒト CD47 遺伝子の少なくとも 1 コピーを前記 iPSC 細胞に導入することから生じる。前記方法の別の好ましい実施形態では、前記 iPSC がマウスであり、前記 B2m 遺伝子がマウスであり、前記 Ciita 遺伝子がマウスであり、そして前記増加させた Cd47 発現の発現が、プロモーターの制御下にあるマウス Cd47 遺伝子の少なくとも 1 コピーを前記 iPSC 細胞に導入することから生じる。より好ましい実施態様では、前記プロモーターは構成的プロモーターである。
【００１２】
本明細書に開示される方法のいくつかの実施形態では、前記 B2M 遺伝子の両方の対立遺伝子における前記破壊が、前記 B2M 遺伝子の対立遺伝子の両方を破壊する、クラスターを形成し規則正しい間隔を持つ短いパリンドローム・リピート（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）/Cas9 （CRISPR）反応で生じる。本方法の他の実施形態では、前記 CIITA 遺伝子の両方の対立遺伝子における前記破壊が、前記 CIITA 遺伝子の対立遺伝子の両方を破壊する CRISPR 反応で生じる。
【００１３】
本発明は、以下を含むヒト低免疫原性多能性（hHIP）幹細胞：内因性 B2M 遺伝子の両方の対立遺伝子を不活性化する 1 つ以上の改変；内因性 CIITA 遺伝子の両方の対立遺伝子を不活性化する 1 つ以上の改変；及び前記 hHIP 幹細胞中で CD47 遺伝子の発現を増加させる改変；ここで、前記 hHIP 幹細胞は、前記 B2M 及び CIITA の改変を含むが前記 CD47 遺伝子の発現の増加を含まない人工多能性幹細胞（iPSC）によって誘発される第 2 のナチュラル・キラー（NK）細胞応答よりも低い第 1 の NK 細胞応答を誘発し、並びに、ここで、前記第 1 及び第 2 の NK 細胞応答は、前記 hHIP 細胞又は前記 B2M 及び CIITA の改変を含むが前記 CD47 遺伝子の発現の増加を含まない前記 iPSC 細胞の何れかと共に in vitro でインキュベートした NK 細胞からの IFN-γレベルを決定することによって測定される、を提供する
【００１４】
本発明は、以下を含むヒト低免疫原性多能性（ hHIP ）幹細胞：内因性 B2M 遺伝子の両方の対立遺伝子を不活性化する 1 つ以上の改変；内因性 CIITA 遺伝子の両方の対立遺伝子を不活性化する 1 つ以上の改変；及び前記 hHIP 幹細胞中で CD47 遺伝子の発現を増加させる改変；ここで、前記 hHIP 幹細胞は、iPSC によって誘発される同種異系ヒト化マウス系統における第 2 の T 細胞応答よりも低い、前記ヒト化マウス系統における第 1 の T 細胞応答を誘発し、並びに、ここで、前記第 1 及び第 2 の T 細胞応答は、エリスポット（Elispot）アッセイで、前記ヒト化マウスの脾細胞からの IFN-γレベルを決定することによって測定される、を提供する。
【００１５】
本発明は、本明細書に開示の hHIP 幹細胞又はその誘導体（derivatives）をヒト対象に移植することを含む方法、を提供する。本発明は更に、細胞移植を必要とする病気を治療するための医薬品を調製するための、本明細書に開示されている hHIP 幹細胞の使用、を提供する。
【００１６】
本発明は、以下を含む低免疫原性多能性細胞：親多能性細胞と比較した場合に、減少した内因性の主要組織適合抗原クラスI（HLA-I）機能；親多能性細胞と比較した場合に、減少した内因性の主要組織適合抗原クラスII（HLA-II）機能；及び NK 細胞による殺傷に対する感受性を減少させる CD47 機能の増大；ここで、前記低免疫原性多能性細胞は、前記 HLA-I 機能の減少、前記 HLA-II 機能の減少、及び NK 細胞による殺傷に対する感受性の減少の結果として、対象に移植されたときに拒絶反応を受けにくい、を提供する。
【００１７】
いくつかの実施形態では、前記低免疫原性多能性細胞は、β-2 ミクログロブリン・タンパク質の発現を減少させることによって減少する。好ましい実施形態では、前記β-2 ミクログロブリン・タンパク質をコードする遺伝子がノックアウトされている。より好ましい実施形態では、前記β-2 ミクログロブリン・タンパク質が、配列番号１に対して少なくとも 90% の配列同一性を有する。より好ましい実施形態では、前記β-2 ミクログロブリン・タンパク質が、配列番号１の配列を有する。
【００１８】
いくつかの実施形態では、前記 HLA-I 機能が、HLA-A タンパク質の発現を減少させることによって減少する。好ましい実施形態では、前記 HLA-Aタンパク質をコードする遺伝子がノックアウトされている。いくつかの実施形態では、前記 HLA-I 機能が、HLA-B タンパク質の発現を減少させることによって減少する。好ましい実施形態では、HLA-Bタンパク質をコードする遺伝子がノックアウトされている。いくつかの実施形態では、前記 HLA-I 機能が、HLA-C タンパク質の発現を減少させることによって減少する。好ましい実施形態では、HLA-C タンパク質をコードする遺伝子がノックアウトされている。
【００１９】
別の実施形態では、前記低免疫原性多能性細胞が HLA-I 機能を含まない。
【００２０】
本発明は、前記 HLA-II 機能が、CIITA タンパク質の発現を減少させることによって減少する、低免疫原性多能性細胞を提供する。好ましい実施形態では、前記 CIITA タンパク質をコードする遺伝子がノックアウトされている。より好ましい実施形態では、前記 CIITA タンパク質が、配列番号２に対して少なくとも 90% の配列同一性を有する。より好ましい実施形態では、前記 CIITA タンパク質が、配列番号２の配列を有する。
【００２１】
いくつかの実施形態では、前記 HLA-II 機能が、HLA-DP タンパク質の発現を減少させることによって減少する。好ましい実施形態では、前記 HLA-DP タンパク質をコードする遺伝子がノックアウトされている。いくつかの実施形態では、前記 HLA-II 機能が、HLA-DR タンパク質の発現を減少させることによって減少する。好ましい実施形態では、前記 HLA-DR タンパク質をコードする遺伝子がノックアウトされている。いくつかの実施形態では、前記 HLA-II 機能が、HLA-DQ タンパク質の発現を減少させることによって減少する。好ましい実施形態では、前記 HLA-DQ タンパク質をコードする遺伝子がノックアウトされている。
【００２２】
本発明は、HLA-II 機能を含まない低免疫原性多能性細胞を提供する。
【００２３】
本発明は、マクロファージによる貪食作用又は NK 細胞による殺傷に対する感受性の減少した低免疫原性多能性細胞を提供する。前記感受性の減少は、CD47 タンパク質の発現の増加によって引き起こされる。いくつかの実施形態では、前記 CD47 タンパク質の発現の増加が、内因性 CD47 遺伝子座への改変から生じる。他の実施形態では、前記 CD47 タンパク質の発現の増加が、CD47 導入遺伝子から生じる。好ましい実施形態では、前記 CD47 タンパク質が、配列番号３に対して少なくとも 90% の配列同一性を有する。より好ましい実施形態では、前記 CD47 タンパク質が、配列番号３の配列を有する。
【００２４】
本発明は、低免疫原性多能性細胞又は分化した子孫細胞を死滅させる、引き金によって活性化される自殺遺伝子を含む低免疫原性多能性細胞を提供する。好ましい実施形態では、前記自殺遺伝子が単純ヘルペス・ウイルス・チミジン・キナーゼ遺伝子（HSV-tk）であり、前記引き金がガンシクロビルである。より好ましい実施形態では、前記 HSV-tk 遺伝子が、配列番号４に対して少なくとも 90% の配列同一性を含むタンパク質をコードする。より好ましい実施形態では、前記 HSV-tk 遺伝子が、配列番号４の配列を含むタンパク質をコードする。
【００２５】
別の好ましい実施形態では、前記自殺遺伝子が大腸菌シトシン・デアミナーゼ遺伝子（EC-CD）であり、前記引き金が 5-フルオロシトシン（5-FC）である。より好ましい実施形態では、前記 EC-CD 遺伝子が、配列番号５に対して少なくとも 90% の配列同一性を含むタンパク質をコードする。より好ましい実施形態では、前記 EC-CD 遺伝子が、配列番号５の配列を含むタンパク質をコードする。
【００２６】
別の好ましい実施形態では、前記自殺遺伝子が誘導性カスパーゼ・タンパク質をコードし、前記引き金が二量体化への化学誘導剤（CID）である。より好ましい実施形態では、前記誘導遺伝子が、配列番号６に対して少なくとも 90% の配列同一性を含む誘導性カスパーゼ・タンパク質をコードする。より好ましい実施形態では、前記遺伝子が、配列番号６の配列を含む誘導性カスパーゼ・タンパク質をコードする。より好ましい態様において、前記 CID が AP1903 である。
【００２７】
本発明は、多能性細胞中にある内因性の主要組織適合性抗原クラス I（HLA-I）機能を減少させる；多能性細胞中にある内因性の主要組織適合抗原クラス II（HLA-II）機能を減少させる；及びマクロファージによる貪食作用又は NK 細胞による殺傷に対する前記多能性細胞の感受性を減少させるタンパク質の発現を増加させる；を含む、低免疫原性多能性細胞の製造方法を提供する。
【００２８】
本方法の一実施形態では、前記 HLA-I 機能が、β-2 ミクログロブリン・タンパク質の発現を減少させることによって減少する。好ましい実施形態では、前記β-2 ミクログロブリン・タンパク質の発現が、前記β-2 ミクログロブリン・タンパク質をコードする遺伝子をノックアウトすることによって減少する。より好ましい実施形態では、前記β-2 ミクログロブリン・タンパク質が、配列番号１と少なくとも 90% の配列同一性を有する。より好ましい実施形態では、前記β-2 ミクログロブリン・タンパク質が、配列番号１の配列を有する。
【００２９】
本方法の別の実施形態では、前記 HLA-I 機能が、HLA-A タンパク質発現の発現を減少させることによって減少する。好ましい実施形態では、前記 HLA-A タンパク質発現が、前記 HLA-A タンパク質をコードする遺伝子をノックアウトすることによって減少する。本方法の別の実施形態では、前記 HLA-I 機能が、HLA-B タンパク質発現の発現を減少させることによって減少する。好ましい実施形態では、前記 HLA-B タンパク質発現が、前記 HLA-B タンパク質をコードする遺伝子をノックアウトすることにより減少する。本方法の別の実施形態では、前記 HLA-I 機能が、HLA-C タンパク質発現の発現を減少させることによって減少する。好ましい実施形態では、前記 HLA-C タンパク質発現が、前記 HLA-C タンパク質をコードする遺伝子をノックアウトすることにより減少する。
【００３０】
本方法の別の実施形態では、前記低免疫原性多能性細胞が HLA-I 機能を含まない。
【００３１】
本方法の別の実施形態では、前記 HLA-II 機能が、CIITA タンパク質の発現を減少させることによって減少する。好ましい実施形態では、前記 CIITA タンパク質の発現が、前記 CIITA タンパク質をコードする遺伝子をノックアウトすることによって減少する。より好ましい実施形態では、前記 CIITA タンパク質が、配列番号２に対して少なくとも 90% の配列同一性を有する。より好ましい実施形態では、前記 CIITA タンパク質が、配列番号２の配列を有する。
【００３２】
本方法の別の実施形態では、前記 HLA-II 機能が、HLA-DP タンパク質の発現を減少させることによって減少する。好ましい実施形態では、前記 HLA-DP タンパク質の発現が、前記 HLA-DP タンパク質をコードする遺伝子をノックアウトすることにより減少する。本方法の別の実施形態では、前記 HLA-II 機能が、HLA-DR タンパク質の発現を減少させることによって減少する。好ましい態様において、前記 HLA-DR タンパク質の発現が、前記 HLA-DR タンパク質をコードする遺伝子をノックアウトすることにより減少する。本方法のいくつかの実施形態では、前記 HLA-II 機能が、HLA-DQ タンパク質の発現を減少させることによって減少する。好ましい実施形態では、前記 HLA-DQ タンパク質の発現が、前記 HLA-DQ タンパク質をコードする遺伝子をノックアウトすることにより減少する。
【００３３】
本方法の別の実施形態では、前記低免疫原性多能性細胞が HLA-II 機能を含まない。
【００３４】
本方法の別の実施形態では、前記多能性細胞のマクロファージによる貪食作用に対する感受性を減少させるタンパク質の前記発現の増加が、内因性遺伝子座への改変により生じる。好ましい実施形態では、前記内因性遺伝子座が CD47 タンパク質をコードする。別の実施形態では、前記タンパク質発現の増加が導入遺伝子の発現により生じる。好ましい実施形態では、前記導入遺伝子が CD47 タンパク質をコードする。より好ましい実施形態では、前記 CD47 タンパク質が、配列番号３に対して少なくとも 90% の配列同一性を有する。より好ましい実施形態では、前記 CD47 タンパク質が、配列番号３の配列を有する。
【００３５】
本方法の別の実施形態は、前記低免疫原性多能性細胞を死滅させる引き金によって活性化される自殺遺伝子を発現させることを更に含む。好ましい実施形態では、前記自殺遺伝子が単純ヘルペス・ウイルス・チミジン・キナーゼ遺伝子（HSV-tk）であり、前記引き金がガンシクロビルである。より好ましい実施形態では、前記 HSV-tk 遺伝子が、配列番号４に対して少なくとも 90% の配列同一性を含むタンパク質をコードする。より好ましい実施形態では、前記 HSV-tk 遺伝子が、配列番号４の配列を含むタンパク質をコードする。
【００３６】
本方法の別の実施形態では、前記自殺遺伝子が大腸菌シトシン・デアミナーゼ遺伝子（EC-CD）であり、前記引き金が 5-フルオロシトシン（5-FC）である。好ましい実施形態では、前記 EC-CD 遺伝子が、配列番号５に対して少なくとも 90% の配列同一性を含むタンパク質をコードする。より好ましい実施形態では、前記 EC-CD 遺伝子が、配列番号５の配列を含むタンパク質をコードする。
【００３７】
本方法の別の実施形態では、前記自殺遺伝子が誘導性カスパーゼ・タンパク質をコードし、前記引き金が二量体化への特異的化学誘導剤（CID）である。本方法の好ましい実施形態では、前記遺伝子が、配列番号６に対して少なくとも 90% の配列同一性を含む誘導性カスパーゼ・タンパク質をコードする。より好ましい実施形態では、前記遺伝子が、配列番号６の配列を含む誘導性カスパーゼ・タンパク質をコードする。より好ましい実施形態では、前記 CID が AP1903 である。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
（Ｖ．図面の簡単な説明）
【図１】図１Ａは、本明細書に記載の新規な低免疫多能性細胞の理論的根拠を示す。胎児は、妊娠中に、胎児母体のトレランス（tolerance）によって、「拒絶」から保護されている。細胞は、MHC クラス I の発現がダウンレギュレート（downregulated）している。前記細胞はまた、MHC クラス II の発現がダウンレギュレートしている。前記細胞はまた、CD47 がアップレギュレート（upregulated）している。図１Ｂは、胎児母体のトレランスを、合胞体栄養芽細胞（syncytiotrophoblast cells）が媒介していることを示している。図１Ｃは、合胞体栄養芽細胞は、MHC I 及び II の発現が無く、且つ高い CD47 発現レベルであることを示す。
【図２】図２は、C57BL/6 線維芽細胞から作製されたマウス人工多能性幹細胞（miPSC）を示す。多能性は、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（rtPCR）によって証明した。多能性に関連する複数の mRNA が、miPSC 細胞抽出物中に検出されたが、未誘導の細胞（親マウス線維芽細胞）中には検出されなかった。
【図３】図３は、miPSC 細胞の多能性を確認する。前記 C57BL/6 miPSC 細胞は、同系マウス並びに BALB/c ヌードマウス及び scid ベージュ・マウス中で、奇形腫を形成した。免疫応答性の同種異系 BALB/c マウス中では、奇形腫は形成されなかった。
【図４】図４は、β-2-ミクログロブリンの発現を miPSC 細胞においてノックアウトすると、MHC-I の発現を IFN-γ による刺激によって誘導できないことを示す（右パネル）。対照として、親 miPSC 細胞を IFN-γ で刺激すると（左パネル）、その MHC-I の発現は増加した。
【図５】図５は、Ciita の発現のノックアウトを更に含むmiPSC/β-2-ミクログロブリンのノックアウト（ダブルノックアウト（double-knockout））が、ベースラインの MHC-II 発現を示さず、TNF-α によって MHC-II の発現を誘導できないことを示す。
【図６】図６Ａは、β-2-ミクログロブリン／Ciita ダブルノックアウトに加えた導入遺伝子からの Cd47 の発現が増加していることを示す（iPSChypo細胞）。図６Ｂは、C57BL/6 iPSChypo 細胞が、同種異系 BALB/c の環境では生存するが、親 iPSC 細胞は生存しないことを示す。
【図７】図７は、本発明の一実施形態を示す。それは、本発明の低免疫多能性細胞をもたらす、iPSC の改変に関する概略図を示す。低免疫幹細胞を作製するために、まず最初に、CRISPR-Cas 9 による改変を用いて両方の B2m 対立遺伝子をノックアウトした。次に、CRISPR-Cas 9 による改変を使用して、両方の Ciita 遺伝子対立遺伝子をノックアウトした。第三段階として、レンチウイルスを用いて Cd47 遺伝子をノックインした。
【図８】図８Ａは、前記 MHC I 複合体における B2m の役割を概略的に示す。 B2m をノックアウトすることによって、マウスでは MHC I が、又はヒトでは HLA-1 が欠失する。図８Ｂは、Ciita は、マウスにおいて MHC II の発現を、又はヒトにおいて HLA-II の発現を引き起こす転写因子であることを概略的に示す。Ciita をノックアウトすると、MHC II 又は HLA-II の発現が欠失する。
【図９】図９Ａ、９Ｂ及び９Ｃは、B2m-/- iPSCs が MHC-1 の発現を欠き、B2m-/- Ciita-/- iPSCs が MHC-1 及び MHC-II の発現を欠き、並びに B2m-/- Ciita-/- Cd47 tg iPSCs がMHC-I 及び MHC-II の発現を欠き、並びに Cd47 を過剰発現している、ことを示す。
【図１０】図１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｄ及び１０Ｅは、同種異系又は同系の宿主マウスに移植された、「野生型 iPSCs」対低免疫性 PSCs のマウスモデルを示す。ここで、前記 iPSCs は C57BL/6 マウスから形成され、同種異系マウスは BALB/c である。図１０Ａ、「野生型 iPSCs」は、同系の C57BL/6 マウス大腿にのみ奇形腫を形成した。対照的に、同種異系宿主マウス（BALB/c）中では免疫応答があり、奇形腫は成長しなかった。図１０Ｂ、「野生型 iPSCs」は、同系 C57BL/6 マウスにおいて奇形腫を形成した。図１０Ｃ、免疫応答によって、同種異系 BALB/c 中での奇形腫形成が阻害された。図１０Ｄは、スポット頻度アッセイ（IFN-γ 及び IL-4 を放出する細胞の頻度）を用いて、同系及び同種異系宿主中での iPSC に対する T 細胞応答（IFN-γ 及び IL-4）を比較する。IFN-γ 及び IL-4 の放出は、C57BL/6 宿主において非常に低かったが、BALB/c 宿主においては劇的に増加した。図１０Ｅは、同系及び同種異系宿主における B 細胞応答を示す。前記  iPSCs を、以前に iPSCs の移植を受けたことがある宿主動物の血清と共にインキュベートした。フロー・サイトメトリーを用いて結合した免疫グロブリンを測定した。平均蛍光強度（MFI）は、同種異系 BALB/c レシピエント宿主から採取した血清で、有意により高かった。
【図１１】図１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、１１Ｄ及び１１Ｅは、上記の iPSCs において B2m 遺伝子をノックアウトすることにより、効果が部分的に表れることを示す。図１１Ａ、B2m-/- iPSCs は同系 C57BL/6 マウス大腿部で成長し、免疫応答の欠如のために奇形腫を形成したが、同種異系宿主マウス（BALB/c）では部分的な免疫応答があった；例えば、移植細胞のいくつかは生き残る。図１１Ｂ、同系マウスにおいてB2m-/- iPSCs は奇形腫を形成した。図１１Ｃ、同種異系宿主において部分的な生存（60%）が見られた。図１１Ｄ、2 つの宿主間で T 細胞応答（IFN-γ 及び IL-4）に差があることによって、B2m-/- iPSCs に対して、僅かではあるが検出可能な T 細胞による応答があることが示された。図１１Ｅは、異なる宿主マウスにおける B 細胞による応答を示し、野生型 iPSCs に対してよりも、より弱い免疫応答を示す。C57BL/6 への同系移植と比較した場合、B2m-/- iPSCs の BALB/c への同種異系移植後の免疫グロブリン応答は依然として有意により強力であった。従って、同種異系レシピエントにおいては、B2m-/- iPSCs が生存することは限られていた。
【図１２】図１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、１２Ｄ及び１２Ｅは、同系及び同種異系宿主マウス中での細胞生存に関して、iPSCs において B2m 遺伝子及び Ciita 遺伝子をノックアウトすることにより、効果が部分的に増加することを示す。図１２Ａ、B2m-/- Ciita-/- iPSCs は、同系の C57BL/6 マウスの大腿部に、免疫応答が無いため、奇形腫を形成したが、一方で、同種異系宿主マウス（BALB/c）中では、部分的な免疫応答があった（しかし、B2m-/- iPSCs に対してよりも減少した）。図１２Ｂ、同系マウスにおいて、B2m-/- Ciita-/- iPSCs は奇形腫を形成した。図１２Ｃは、いくつかの細胞移植片（91.7%）が同種異系宿主において生存することを示す。図１２Ｄ、2 つの宿主間の T 細胞応答（IFN-γ 及び IL-4）の差を見ると、同種異系レシピエント中では、同系レシピエントと比較して、ややより高い IFN-γ 応答を示した。図１２Ｅは、異なる宿主マウスにおける B 細胞応答を示す。wt iPSCs 及び B2m-/- iPSCs と比較して、より弱い免疫応答であった。同種異系及び同系のレシピエントの間に有意差は観察されなかった。全体的には、同種異系レシピエント中で、B2m-/- Ciita-/- iPSCs の生存は限られており、これは測定可能な免疫応答に起因すると考えられる。
【図１３】図１３Ａ、１３Ｂ、１３Ｃ、１３Ｄ及び１３Ｅは、同系及び同種異系宿主マウス中での細胞生存に関して、iPSCs 中において B2m 遺伝子及び Ciita 遺伝子をノックアウトすること、及び Cd47 導入遺伝子をノックインすることで、その効果が完全になることを示す。図１３Ａ、B2m-/- Ciita-/- Cd47tg iPSCs 奇形腫は、同系の C57BL/6 の及び同種異系宿主の大腿部の両方で増殖した。移植細胞移植片はすべて生存した。図１３Ｂ、B2m-/- Ciita-/- Cd47tg iPSCs は、C57BL/6 中で、奇形腫を形成した。図１３Ｃ、細胞移植片の 100% が同種異系宿主において生存した。図１３Ｄは、同種異系レシピエント中で、T 細胞応答（IFN-γ 及び IL-4）が欠けていることを示す。2 つの宿主間に違いは見られなかった。図１３Ｅは同種異系レシピエントにおいて B 細胞応答が欠如していることを示す。2 つの宿主間に違いは見られなかった。従って、同種異系レシピエント中では、B2m-/- Ciita-/- Cd47tg iPSCs の生存は完全なものであった。T 細胞又は B 細胞応答を誘発しなかったので、それらは免疫原性ではなかった。
【図１４】図１４Ａ、１４Ｂ及び１４Ｃは、B2m-/- Ciita-/- Cd47tg iPSCs（低免疫原性多能性細胞（HIP）細胞と呼ぶ）が宿主免疫系を回避したことを示す。図１４Ａ、刺激性 NK 細胞リガンドの発現は、HIP 細胞において増加しなかった。NK 細胞膜貫通タンパク質 NKG2D の様々なリガンドを認識する融合タンパク質を使用して、細胞溶解性 NK 細胞活性を活性化し得る活性化リガンドのレベルを評価した。従って、iPSCs への融合タンパク質の結合は、NKG2D を活性化するリガンドの発現に関する全体的なパラメータである。図１４Ｂ、HIP 細胞によって、NK 細胞が CD107a（機能的 NK 細胞活性のマーカー）の発現を増加させることはなかった。対照的に、B2m-/- Ciita-/- iPSCs は、NK 細胞上で CD107a の発現を誘導し、それにより、NK 細胞の細胞溶解機能を誘発した。図１４Ｃ、C57BL/6 マウス脾臓由来で、精製した同系の NK 細胞を用いて IFN-γ エリスポット・アッセイを行うと、HIP 細胞によって誘発される NK 細胞応答は見られなかった。従って、NK 細胞は、活性化し、IFN-γ を放出することはなかった。HIP細胞のスポット頻度は、刺激されていない NK 細胞（陰性対照）のスポット頻度と、差はなかった。B2m-/- Ciita-/- iPSCs のみで、IFN-γ スポット頻度が有意に増加した。
【図１５】図１５Ａ及び１５Ｂは、前記 HIP 細胞が、Cd47 導入遺伝子により、自然免疫系による拒絶又は殺傷を回避したことを示す、更なるデータを示す。 in vivo  NK 細胞アッセイでは、50% の iPSCs と 50 % の HIPs の混合物を、同系の C57BL/6 マウスの NK に富む腹膜に注射した。ここで、細胞毒性は NK 細胞によって引き起こされる。24 及び 48 時間後、腹膜細胞を回収して選別した。図１５Ａは、前記 iPSCs を B2m-/- Ciita-/- iPSCs（Cd47 導入遺伝子なし）と比較する。前記 B2m-/- Ciita-/- iPSCs は、NK 細胞によって選択的に殺傷された。図１５Ｂは、iPSCs と B2m-/- Ciita-/- Cd47 tg iPSCs（HIP 細胞）とを比較する。前記 HIP 細胞は、NK 細胞によって選択的には殺傷されなかった。腹膜 iPSCs 細胞中に HIP 細胞が存在する比率は 50％ のままであったが、これは NK 細胞刺激が無いことを示している。従って、MHC-I 及び MHC-II をノックアウトすると、前記細胞は、NK 細胞による殺傷に対して非常に感受性になったが、前記 Cd47 の 過剰発現によって、刺激性 NK 細胞との相互作用は除かれた。
【図１６】図１６は、本発明のマウス HIP 細胞が正常なマウス核型を示したことを示す。
【図１７】図１７Ａ、図１７Ｂ及び図１７Ｃは、本発明のマウス HIP 細胞が、改変する過程の間に、多能性を保持したことを示す。多能性を示すために一般に認められているマーカーの RT-PCR 解析を示す（Nanog、Oct4、Sox2、Esrrb、Tbx3、Tcl1、及びローディング対照としてのアクチン）。前記多能性マーカーは、3 段階の改変プロセスを通して、発現していた。図１７Ａは、iPSCs、B2m-/- iPSCs、及びマウス線維芽細胞（ネガティブ対照）を比較する。 B2m-/- iPSCs は、多能性遺伝子を保持していた。図１７Ｂは同じ解析を示すが、B2m-/- Ciita-/- iPSCs を用いた。それらは同じ多能性遺伝子を保持していた。図１７Ｃは、同じ解析を示すが、B2m-/- Ciita-/- Cd47 tg iPSCs（HIP 細胞）を用いた。これらの細胞は同じ多能性遺伝子を保持していた。更に、SCID ベージュ・マウスに HIP 細胞を移植した後に発生した奇形腫の組織像は、外胚葉、中胚葉、及び内胚葉に関連する細胞型が同定されたことを示す。3 種全ての胚葉に対する免疫蛍光マーカーを検出した（データ示さず）。細胞形態は、神経外胚葉、中胚葉及び内胚葉に関して、正しいものであった。DAPI、GFAP、サイトケラチン 8 及びブラキュリの免疫蛍光染色により、HIP 細胞の多能性が確認された。
【図１８】図１８Ａ、１８Ｂ及び１８Ｃは、HIP 細胞が中胚葉系列細胞に分化し、そして HIP 細胞の多能性マーカーを失ったことを示す。図１８Ａは、HIP 細胞（「mHIP」と表示）中の多能性マーカーが、分化したマウス内皮細胞（「miEC」と表示）中で失われていることを示す。図１８Ｂは、前記多能性マーカーが HIP 細胞で保持されているが、分化したマウス平滑筋細胞（「miSMC」と表示）中では保持されていないことを示す。図１８Ｃは、前記多能性マーカーが HIP 細胞中で保持されているが、分化したマウス心筋細胞細胞（「miCM」と表示）中では保持されていないことを示す。これらの結果は免疫組織化学により確認した（データ示さず）。内皮細胞は、抗‐CD31 抗体及び抗‐VE-カドヘリン抗体を用いて検出し、平滑筋細胞は、抗‐SMA 抗体及び抗‐SM22 抗体を用いて検出し、そして心筋細胞は、抗‐トロポニン I 及び抗‐肉腫アルファ・アクチニン抗体を用いて検出した。
【図１９】図１９Ａ及び１９Ｂは、前記 HIP 細胞が、C-ペプチド及びインスリンを産生する内胚葉系列の膵島細胞（iIC）に分化したことを示す。図１９Ａ、分化マーカーは、HIP 細胞では検出されなかったが、誘導した膵島細胞では検出された。図１９Ｂ、誘導した膵島細胞はインスリンを産生した。C-ペプチドについての免疫組織化学染色により、これらの結果を確認した（データは示さず）。
【図２０】図２０Ａ及び２０Ｂは、前記 HIP 細胞が外胚葉系列に分化したことを示す。図２０Ａは in vitro での HIP 細胞を示し、そして図２０Ｂは分化した神経細胞を示す。神経外胚葉性幹細胞マーカー Nestin 及び Tuj-1 を用いた免疫組織化学染色により、これらの結果を確認した（データは示さず）。
【図２１】図２１Ａ、２１Ｂ及び２１Ｃは、前記 HIP 細胞から分化した細胞が、MHC I 及び II の発現を欠損した表現型並びに Cd47 の過剰発現を保持していたことを示す。図２１Ａは、マウス誘導内皮細胞（「miEC」）と B2m-/- Ciita-/- Cd47 tg miEC 細胞との間で、MHC-I、MHC-II、及びCd47 の発現を比較する。図２１Ｂは、マウス誘導平滑筋細胞（「miSMC」）と B2m-/- Ciita-/- Cd47 tg miSMC 細胞との間で、MHC-I、MHC-II、及び Cd47 の発現を比較する。図２１Ｃは、マウス誘導心筋細胞（「miCM」）と B2m-/- Ciita-/- Cd47 tg miCM 細胞との間で、MHC-I、MHC-II、及び Cd47 の発現を比較する。
【図２２】図２２Ａ、２２Ｂ及び２２Ｃは、前記 HIP 細胞から分化した内皮細胞が低免疫原性であることを示す。図２２Ａ、同系及び同種異系マウスへの、C57BL/6 miECs 又は mHIP から分化させた miECs の移植。図２２Ｂ、同種異系 BALB/c レシピエント・マウスにおける miECs は、顕著な免疫応答を生じさせたが、同系マウスでは生じさせなかった。これは、BALB/c レシピエントにおける強力な IFN-γ エリスポット及び免疫グロブリン応答（FACS解析）によって証明された。図２２Ｃ、HIP から分化した miEC 細胞は、同系又は同種異系レシピエントにおいて、免疫応答を生じさせなかった。
【図２３】図２３Ａ、２３Ｂ及び２３Ｃは、前記 HIP 細胞から分化したマウス誘導平滑筋細胞が低免疫原性であることを示す。図２３Ａ、同系及び同種異系マウスへの、C57BL/6 miSMCs 又は HIP から分化させた miSMCs の移植。図２３Ｂ、同種異系 BALB/c レシピエント・マウスにおける miSMCs は、顕著な免疫応答を生じさせたが、同系マウスでは生じさせなかった。これは、BALB/c レシピエントにおける強力な IFN-γ エリスポット及び免疫グロブリン応答（FACS解析）によって証明された。図２３Ｃ、HIP から分化した miSMC 細胞は、同系又は同種異系レシピエントにおいて、免疫応答を生じさせなかった。
【図２４】図２４Ａ、Ｂ及びＣは、前記 HIP 細胞から分化したマウス誘導心筋細胞が低免疫原性であることを示す。図２４Ａ、同系及び同種異系マウスへの、C57BL/6 miCMs 又は HIP から分化させた miCMs の移植。図２４Ｂ、同種異系 BALB/c レシピエント・マウスにおける miCMs は、顕著な免疫応答を生じさせたが、同系マウスでは生じさせなかった。これは、BALB/c レシピエントにおける強力な IFN-γ エリスポット及び免疫グロブリン応答（FACS解析）によって証明された。図２４Ｃ、HIP から分化した miCMs は、同系又は同種異系レシピエントにおいて、免疫応答を生じさせなかった。
【図２５】図２５は、HIP 細胞由来の分化細胞（ miECS、miSMCs、miCMs）が、自然免疫系を介した拒絶反応を回避したことを示す。NK 融合タンパク質アッセイによって、miPSCs 由来の分化細胞と比較した場合、前記 3 種の分化細胞の何れも刺激性 NK 細胞リガンドの発現を増加させないことが示された。
【図２６】図２６Ａ及び２６Ｂは、本発明の HIP 細胞由来の miECs が、同種異系宿主において、免疫反応を回避し、及び長期に生存したことを示す。図２６Ａ、miPSCs 由来の miEC 移植片は、同系レシピエント（C57BL/6）において長期に生存したが、同種異系レシピエント（BALB/c）では拒絶された。図２６Ｂ、HIP 由来の miECs は、同系及び同種異系レシピエントの両方において、移植後、長期に生存する。
【図２７】図２７：同種異系宿主中で血管構造を形成するように組織化された HIP 細胞由来の miECS。マトリゲル・マトリックス内への移植後、6 週間にわたり、前記 miECs は三次元的に組織化して血管構造を形成する。これらの結果は、ルシフェラーゼと VE-カドヘリンの免疫蛍光染色によって確認された；移植前に、ルシフェラーゼを発現するように、miECs に形質導入した。生存を生物発光イメージングによりモニターし、そして移植した細胞をルシフェラーゼに対する免疫蛍光染色により同定した（データは示さず）。
【図２８】図２８は、前記ヒト HIP 細胞が正常なヒト核型を示したことを示す。
【図２９】図２９は、ヒト HIP 細胞が、前記改変をした過程の間に、多能性を維持したことを示す。前記 hiPSCs（例えば、本発明の改変前の出発細胞）及び前記 HIP 細胞は、PCR アッセイを使用したところ、両方とも多能性遺伝子（NANOG、OCT4、SOX2、DPPA4、hTERT、ZFP42、及び DEMT3B； ローディング対照として G3PDH）の発現を有する。前記細胞が TRA-1-60、TRA-1-81、Sox2、Oct4、SSEA-4 マーカー、及びアルカリホスファターゼ（データは示さず）を発現するので、免疫蛍光染色によりこの所見が確認された。
【図３０】図３０Ａ及び３０Ｂは、ヒト化同種異系マウスに移植したヒト HIP 細胞が免疫応答を引き起こさなかったことを示す。図３０Ａは、エリスポット・アッセイにおける IFN-γ 産生又は IL-5 によって測定されるように、T 細胞が、移植した HIP 細胞に応答しなかったことを示す。対照的に、移植した iPSCs には応答した。図３０Ｂは、フロー・サイトメトリーにおいて、iPSCs のみが強い抗体応答を引き起こしたことを示す。前記 HIP 細胞は引き起こさなかった。
【図３１】図３１Ａ、３１Ｂ、３１Ｃ、及び３１Ｄは、ヒト HIP 細胞が中胚葉系列に分化したことを示す。図３１Ａは、ヒト HIP 細胞の形態を示す。図３１Ｂは、CD31、VE-カドヘリン、及び対照としての DAPI で染色した HIP 由来内皮細胞を示す。図３１Ｃは、α-肉腫アクチニン、トロポニン I、及び対照としての DAPI で染色した HIP 由来心筋細胞を示す。図３１Ｄは、前記 HIP 由来内皮細胞による未成熟段階の血管形成を示す。HIP 由来の心筋細胞が拍動していることが観察された（データは示さず）。
【図３２】図３２Ａ及び３２Ｂは、移植したヒト HIP 細胞由来のヒト内皮細胞が、同種異系ヒト化マウスにおいて免疫応答を引き起こさなかったことを示す。図３２Ａ、hiECs は、IFN-γ 及び IL-5 エリスポット・アッセイにおいて、有意な T 細胞応答を示したが、一方で、ヒト HIP 細胞由来の hiECs は示さなかった。図３２Ｂは、フロー・サイトメトリーにおける、B 細胞応答を示す。平均蛍光強度（MFI）によって測定したところ、hiECs のみが有意な免疫グロブリン結合を生じた。
【図３３】図３３Ａ及び３３Ｂは、ヒト HIP 細胞由来のヒト心筋細胞を移植すると、同種異系ヒト化マウスにおいて、免疫応答が生じなかったことを示す。図３３Ａは、IFN-γ 及び IL-5 エリスポット・アッセイにおける、「野生型」hiCMs と B2M-/- CIITA-/- CD47 tg HIP 細胞由来の hiCMs についての T 細胞応答の差を示す。図３３Ｂはフロー・サイトメトリーにおける、B 細胞応答を示す。平均蛍光強度（MFI）によって測定したところ、「野生型 hiCMs」のみが、hiECs の有意な免疫グロブリン負荷（significant immunoglobulin loading of hiECs）をもたらした。
【図３４】図３４Ａ、３４Ｂ及び３４Ｃは、本発明のマウス HIP 細胞に由来する細胞（derivatives）が自然免疫系の拒絶を回避したことを示す。磁気活性化細胞選別（MACS）を用いて NK 細胞を BALB/c マウスから単離した。5×106 個の刺激細胞（C57BL/6 iPSC B2m-/- Ciita-/- に由来する細胞（derivatives）又は iPSC B2m-/- Ciita-/- Cd47 tg に由来する細胞（derivatives））の iEC、iSMC 又は iCM の何れかを、5×106個の MACS で選別した NK 細胞と共に、IFN-γ エリスポット・プレートでインキュベートした。24 時間後、そのスポット頻度をエリスポット・リーダーで測定した。B2m-/- Ciita-/- 由来の 3 種の細胞全てが、強い NK 応答を誘導した。しかしながら、B2m-/- Ciita-/- Cd47 tg 由来の 3 種の細胞全てが、NK細胞応答を誘導せず、それらのスポット頻度は、ネガティブ対照（刺激細胞とインキュベートしていない単離した NK 細胞）と統計的に異なるものではなかった。図３４Ａは内皮細胞を示し、図３４Ｂは平滑筋細胞を示す。図３４Ｃは心筋細胞を示す。図３４Ｄは、YAC-1 マウス・リンパ腫のポジティブ対照を示す。
【図３５】図３５Ａ、３５Ｂ及び３５Ｃは、自然免疫応答（又はその欠如）を示す。50 % の野生型に由来する細胞（derivatives）（5×106 個の細胞）と 50% の C57BL/6 B2m-/- Ciita-/- 又は B2m-/- Ciita-/- Cd47 tg に由来する細胞（derivatives）（5×106個の細胞）の混合物を調製した。前記細胞を 10 μM の CFSE 染色で 10 分間染色し、そして 500μl の食塩水中に再懸濁した。次いで、前記細胞混合物を C57BL/6（同系）マウスの NK に富む腹膜に注射した。この同系モデルでは、すべての細胞毒性は NK 細胞によって引き起こされる。48 時間後、腹膜細胞を回収して細胞を選別し、それらの比率を計算した。野生型及び改変した細胞を、MHCI 染色により FACS において同定した。図３５Ａは内皮細胞を示す。図３５Ｂは平滑筋細胞を示す。図３５Ｃは心筋細胞を示す。B2m-/- Ciita-/- に由来する細胞（derivatives）のみが NK 細胞による殺傷を受け、それらの比率は著しく減少した。B2m-/- Ciita-/- Cd47 tg に由来する細胞（derivatives）のどれも、NK 細胞による殺傷を受けず、それらの比率が約 50% で安定したままであった。
【図３６】図３６Ａ、３６Ｂ及び３６Ｃは、FACS によって検証されたヒト iPSCs の遺伝子改変を示す。HLA I 及び HLA II を欠如していることは、B2M-/- CIITA-/- hiPSCs において確認された。更に、B2M-/- CIITA-/- CD47 tg は高い CD47 発現を示した。図３６Ａは HLA I の結果を示す。図３６Ｂは HLA II の結果を示す。図３６Ｃは CD47 の結果を示す。
【図３７】図３７Ａ及びＢは、前記免疫表現型が、B2M-/- CIITA-/- CD47 tg iPSCs の分化後も維持されたことを示す。未修飾の wt 誘導体（derivatives）と比較した場合、FACS 解析によって、B2M-/- CIITA-/- CD47 tg に由来する細胞（derivatives）が、HLA I 及び HLA II の発現を欠き、並びに CD47 を過剰発現していることが示された。図３７Ａは内皮細胞を示し、そして図３７Ｂは心筋細胞を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
（ＶＩ．発明の詳細な説明）
Ａ．前書き
本発明は、本明細書に概説されているように、いくつかの遺伝子操作による宿主免疫応答を回避する低免疫原性多能性（HypoImmunogenic Pluripotent「HIP」）細胞を提供する。前記細胞は、免疫応答を引き起こす主要な免疫抗原を欠いており、貪食作用を回避するように改変されている。これにより、特定の組織及び器官を作製するための「既成の（off-the-shelf）」細胞製品を誘導することが可能になる。ヒト患者においてヒト同種異系 HIP 細胞からの誘導体（derivatives）を使用することができるという利点によって、同種異系移植において一般的に見られる長期の免疫抑制療法及び薬物使用を、回避することができること等を含む有意な利点がもたらされる。それはまた、各患者に対して個別の治療を必要とせずに細胞療法を使用することができるので、かなりのコスト節約にもなる。最近、自家の細胞供給源から産生された細胞製品が、僅かの或いは 1 つの単一の抗原性変異があると、免疫拒絶反応を受けやすくなる可能性があることが示された。従って、自家の細胞製品は本質的に非免疫原性ではない。又、細胞を改変する事及び品質管理には非常に手間と費用がかかり、自家細胞は急性期治療の選択肢としては利用できない。免疫的な障害を克服することができるのであれば、同種異系細胞製品だけが、より大きな患者集団に使用することができるだろう。HIP 細胞は、普遍的に受け入れられる誘導体（derivatives）を作製するための普遍的な細胞供給源として役立つだろう。
【００４０】
本発明は、妊娠中の女性に存在する胎児母体のトレランスを利用することに関する。胎児のヒト白血球抗原（HLA）の半分は父性遺伝であり、そして前記胎児は主要な HLA ミスマッチ抗原を発現するが、母親の免疫系は胎児を同種異系の実体として認識せず、そして免疫応答（例えば、「宿主対移植片」タイプの免疫反応に見られるようなもの）を開始しない。胎児母体のトレランスは、胎児‐母体の界面にある合胞体栄養芽細胞によって主に仲介される。図７に示されるように、合胞体栄養芽層細胞は、主要組織適合遺伝子複合体 I 及び II（MHC-I 及び MHC-II）のタンパク質をほとんど又は全く示さず、CD47（これは貪食作用性の自然免疫による監視及び HLA 欠損細胞の除去を抑制する、「食べるな（don’t eat me）」タンパク質として知られている。）の発現も増加している。驚くべきことに、妊娠中の胎児の拒絶反応を防ぐのと同じトレランスが生じるメカニズムによって、本発明の HIP 細胞は拒絶反応を回避し、並びに、同種異系移植の後に、これらの細胞が長期生存し、及び生着することも可能になる。
【００４１】
これらの結果は、この胎児母体のトレランスを、（開始 iPSCs、例えば hiPSCs と比較して）僅か 3 種の遺伝子改変、即ち 2 種の活性減少（本明細書中に更に記載の「ノックアウト」）及び 1 種の活性増加（本明細書に記載の「ノックイン」）で導入できるという点で更に驚くべきことである。概して、当業者は、iPSCs の免疫原性を抑制することを試みてきたが、成功したのは一部だけである；Rong et al., Cell Stem Cell 14:121-130 (2014) 及びGornalusse et al., Nature Biotech doi:10.1038/nbt.3860 を参照されたい。
【００４２】
従って、本発明は、多能性幹細胞から HIP 細胞を作製すること、そしてそれらを維持し、分化させ、及びそれを必要とする患者にそれらの誘導体（derivatives）を最終的に移植することを提供する。
【００４３】
Ｂ．定義
用語「多能性細胞」は、未分化状態のまま自己再生及び増殖することができ、及び、適切な条件下で、特殊化した細胞型に分化するように誘導することができる細胞を指す。本明細書で使用される用語「多能性細胞」は、胚性幹細胞及び胎児性、羊膜性、又は体性幹細胞等を含む他の種類の幹細胞を包含する。例示的なヒト幹細胞株には、H9 ヒト胚性幹細胞株が含まれる。更なる例示的な幹細胞株には、米国国立衛生研究所のヒト胚性幹細胞レジストリー（the National Institutes of Health Human Embryonic Stem Cell Registry）及びハワード・ヒューズ医学研究所 HUES コレクション（the Howard Hughes Medical Institute HUES collection）（Cowan, C. A. et. al, New England J. Med. 350:13. (2004) に記載されている通りであり、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。）を通じて利用可能になるものが含まれる。
【００４４】
本明細書で使用される「多能性幹細胞」は、3 種の胚葉：内胚葉（例えば、胃リンキング（stomach linking）、胃腸管、肺など）、中胚葉（例えば、筋肉、骨、血液、泌尿生殖器組織等）、又は外胚葉（例：表皮組織及び神経系組織）、の何れにも分化する可能性を有する。本明細書で使用される用語「多能性幹細胞」はまた、「人工多能性幹細胞」、又は「iPSCs」、非多能性細胞に由来するある種の多能性幹細胞も包含する。親細胞の例には、様々な手段によって、多能性の未分化な表現型を誘導するようにリプログラムされた体細胞が含まれる。そのような「iPS」又は「iPSC」細胞は、特定の調節遺伝子の発現を誘導することによって、又は特定のタンパク質を外因的に加えることによって、作製することができる。iPS 細胞の誘導方法は当技術分野において公知であり、更に以下に記載される。（例えば、Zhou et al., Stem Cells 27 (11): 2667-74 (2009); Huangfu et al., Nature Biotechnol. 26 (7): 795 (2008); Woltjen et al., Nature458 (7239): 766-770 (2009); 及び Zhou et al., Cell Stem Cell 8:381-384 (2009)、これらはそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に取り込まれる。）。人工多能性幹細胞（iPSCs）を作製することは、以下で概説する。本明細書中で使用される場合、「hiPSCs」はヒト人工多能性幹細胞であり、そして「miPSCs」はマウス人工多能性幹細胞である。
【００４５】
「多能性幹細胞の特徴」とは、多能性幹細胞を他の細胞から区別する細胞の特徴をいう。適切な条件下で、3 種の胚葉全て（内胚葉、中胚葉、及び外胚葉）の細胞系列に関連する特徴を集団で示す細胞型へと分化し得る子孫を生じさせる能力は、多能性幹細胞の特徴である。特定の組み合わせの分子マーカーを発現すること、又は発現しないことも多能性幹細胞の特徴である。例えば、ヒト多能性幹細胞は、以下の非限定的なリスト：SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、TRA-2-49/6E、ALP、Sox2、E-カドヘリン、UTF-1、Oct4、Rex1、及び Nanog、からの少なくともいくつかのマーカーを、そしていくつかの実施形態では、全てのマーカーを発現する。多能性幹細胞に関連する細胞形態もまた多能性幹細胞の特徴でもある。本明細書中に記載されるように、細胞は、内胚葉前駆細胞及び／又は肝細胞にリプログラミングされるために、多能性を通過する必要はない。
【００４６】
本明細書中で使用される場合、「多能性（multipotent）」又は「多能性細胞（multipotent cell）」は、限られた数の他の特定の細胞型を生じ得る細胞型をいう。例えば、人工多能性細胞（induced multipotent cells）は内胚葉細胞を形成することができる。更に、多能性血液幹細胞（multipotent blood stem cells）は、リンパ球、単球、好中球等を含む数種類の血液細胞に分化することができる。
【００４７】
本明細書中で使用される場合、用語「少能性（oligopotent）」は、成体幹細胞がほんの数種類の異なる細胞型に分化する能力をいう。例えば、リンパ系幹細胞又は骨髄系幹細胞は、それぞれリンパ系列又は骨髄系列の何れかの細胞を形成することができる。
【００４８】
本明細書中で使用される場合、用語「単能性（unipotent）」は、細胞が単一細胞型を形成する能力を意味する。例えば、精原幹細胞は精子細胞を形成することしかできない。
【００４９】
本明細書中で使用される場合、用語「全能性（totipotent）」は、細胞が生物全体を形成する能力を意味する。例えば、哺乳動物では、接合子及び最初の卵割期の割球のみが全能性である。
【００５０】
本明細書中で使用される場合、「非多能性細胞（non-pluripotent cells）」とは、多能性細胞ではない哺乳動物細胞をいう。そのような細胞の例には、分化細胞及び前駆細胞が含まれる。分化細胞の例としては、限定されるものではないが、骨髄、皮膚、骨格筋、脂肪組織及び末梢血から選択される組織由来の細胞が挙げられる。例示的な細胞型としては、限定されるものではないが、線維芽細胞、肝細胞、筋芽細胞、ニューロン、骨芽細胞、破骨細胞、及び T 細胞が挙げられる。人工多能性細胞（induced multipotent cells）、内胚葉前駆細胞、及び肝細胞を作製するために使用する出発細胞は、非多能性細胞であることがある。
【００５１】
分化細胞には、限定されるものではないが、多能性細胞（multipotent cells）、少能性細胞、単能性細胞、前駆細胞、及び最終分化細胞が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、分化能がより小さい細胞は、分化能がより大きい細胞と照らして、「分化している」と考えられる。
【００５２】
「体細胞」は生物の体を形成する細胞である。体細胞には、生物の器官、皮膚、血液、骨、結合組織を構成する細胞が含まれるが、生殖細胞は含まれない。
【００５３】
細胞は、例えば、ヒト又は非ヒトの哺乳動物に由来することがある。例示的な非ヒトの哺乳動物としては、限定されるものではないが、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ウサギ、モルモット、ハムスター、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシ、及び非ヒト霊長類が挙げられる。いくつかの実施形態では、細胞は成体のヒト又は非ヒト哺乳動物に由来する。いくつかの実施形態では、細胞は、新生児のヒト、成体のヒト又は非ヒト哺乳動物に由来する。
【００５４】
本明細書中で使用される場合、用語「対象」又は「患者」は、家畜動物、動物園動物、又はヒト等の任意の動物をいう。前記「対象」又は「患者」は、イヌ、ネコ、トリ、家畜、又はヒトのような哺乳動物であることがある。「対象」及び「患者」の具体例としては、限定されるものではないが、肝臓、心臓、肺、腎臓、膵臓、脳、神経組織、血液、骨、骨髄等に関連する疾患又は障害を有する個体（特にヒト）が含まれる。
【００５５】
哺乳動物細胞は、ヒト又は非ヒトの哺乳動物に由来することがある。例示的な非ヒトの哺乳動物としては、限定されるものではないが、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ウサギ、モルモット、ハムスター、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシ、及び非ヒト霊長類（例えば、チンパンジー、マカク、及び類人猿）が挙げられる。
【００５６】
本明細書における「低免疫原性多能性細胞」又は「HIP 細胞」とは、その多能性の特徴を保持し、更に同種異系宿主に移植した場合に免疫拒絶反応の低下を引き起こす多能性細胞を意味する。好ましい実施形態では、HIP 細胞は免疫応答を引き起こさない。従って、「低免疫原性」とは、本明細書で概説するように、免疫的な改変をする前の親（即ち、「wt」）細胞の免疫応答と比較した場合、免疫応答が有意に減少していること、又は無くなっていることを指す。多くの場合、前記 HIP 細胞は免疫学的にサイレント（silent）であり、なおかつ多能性能力を保持している。HIP の特徴についてのアッセイを、以下に概説する。
【００５７】
「HLA」又は「ヒト白血球抗原」複合体とは、ヒトにおいて、主要組織適合遺伝子複合体（MHC）タンパク質をコードする遺伝子複合体である。HLA 複合体を構成するこれらの細胞表面タンパク質は、抗原に対する免疫応答の調節に関与している。ヒトでは、クラス I とクラス II の 2 つの MHCs、即ち「HLA-I」と「HLA-II」がある。HLA-I には、細胞の内側からペプチドを提示し、及び HLA-I 複合体によって提示される抗原がキラー T 細胞（CD8+ T 細胞又は細胞傷害性 T 細胞としても知られる）を引き寄せる 3 種のタンパク質（HLA-A、HLA-B 及び HLA-C）が含まれる。前記 HLA-1 タンパク質は β-2 ミクログロブリン（B2M）と結合している。HLA-II には、抗原を細胞外から T リンパ球に提示する 5 つのタンパク質（HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOB、HLA-DQ 及び HLA-DR）が含まれる。これは CD4+ 細胞（T ヘルパー細胞としても知られている）を刺激する。「MHC」又は「HLA」のどちらを使用しても、それは遺伝子がヒト（HLA）由来であるかマウス（MHC）由来であるかに依存するので、限定的であることを意味しないことを理解すべきである。従って、哺乳動物細胞に関連するので、これらの用語は本明細書において互換的に使用され得る。
【００５８】
本明細書において「遺伝子ノックアウト」とは、特定の遺伝子を、それが存在する宿主細胞において不活性にし、目的のタンパク質が産生されないようにするか、又は不活性型にするプロセスを意味する。当業者によって理解され、及び以下に更に記載されるように、これは、遺伝子から核酸配列を除去すること、配列に他の配列を割り込ませること、読み枠を変えること、又は調節的な構成要素の核酸を変えること等を含む、多数の異なる方法で達成できる。例えば、目的の遺伝子のコーディング領域の全部又は一部を取り除く、又は「ナンセンス」配列で置換することができ、プロモーター等の調節配列の全部又は一部を取り除く、又は置換することができ、翻訳開始配列を取り除く、又は置換することができる。
【００５９】
本明細書において「遺伝子ノックイン」とは、宿主細胞に遺伝的機能を付加するプロセスを意味する。これによって、コードされたタンパク質のレベルが増加する。当業者には理解されるように、これは、遺伝子の 1 つ以上の更なるコピーを宿主細胞に加えること、又は内因性遺伝子の調節的な構成要素を改変してタンパク質の発現を増加させることを含む、いくつかの方法で達成できる。これは、プロモーターを改変すること、異なるプロモーターを付加すること、エンハンサーを付加すること、又は他の遺伝子発現配列を改変することによって達成され得る。
【００６０】
「β-2 ミクログロブリン」又は「β2M」又は「B2M」タンパク質は、以下に示すアミノ酸配列及び核酸配列を有するヒトβ2M タンパク質を指す；ヒト遺伝子は、アクセッション番号NC_000015.10:44711487-44718159 を有する。
【００６１】
「CD47 タンパク質」タンパク質は、以下に示されるアミノ酸配列及び核酸配列を有するヒト CD47 タンパク質を指す；ヒト遺伝子は、アクセッション番号NC_000016.10:10866208-10941562 を有する。
【００６２】
「CIITA タンパク質」タンパク質とは、以下に示すアミノ酸配列及び核酸配列を有するヒト CIITA タンパク質を指す；ヒト遺伝子は、アクセッション番号NC_000003.12:108043094-108094200 を有する。
【００６３】
細胞の文脈における「野生型」とは、天然に見出される細胞を意味する。しかしながら、多能性幹細胞の文脈において、本明細書中で使用される場合、それは多能性をもたらす核酸変化を含み得るが、低免疫原性を達成するために本発明の遺伝子編集手順を受けなかった iPSC も意味する。
【００６４】
本明細書において「同系」とは、免疫学的適合性（例えば、免疫反応を生じない）がある、宿主生物と細胞移植片との遺伝的類似性又は同一性を指す。
【００６５】
本明細書において「同種異系」とは、免疫応答が生じる、宿主生物と細胞移植片との遺伝的相違性を指す。
【００６６】
本明細書において「B2M-/-」とは、二倍体細胞の両方の染色体において、B2M 遺伝子が不活性化されていることを意味する。本明細書に記載のように、これは様々な方法で行うことができる。
【００６７】
本明細書において「CIITA-/-」とは、二倍体細胞の両方の染色体において、CIITA 遺伝子が不活性化されていることを意味する。本明細書に記載のように、これは様々な方法で行うことができる。
【００６８】
本明細書において「CD47 tg」（「導入遺伝子」を意味する）又は「CD47＋」とは、場合によっては CD47 遺伝子の少なくとも 1 つの追加的なコピーを有することによって、宿主細胞が CD47 を発現することを意味する。
【００６９】
「Oct ポリペプチド」とは、Octamer ファミリーの転写因子の天然に存在するメンバー、又は転写因子活性を保持するそれらの変異体の何れかを指し、転写因子活性は、最も近く関連する天然に存在するファミリー・メンバー、又は天然に存在するファミリー・メンバーの少なくとも DNA 結合ドメインを含むポリペプチドと比較して同様であり（少なくとも 50％、80％、又は 90％ 以内の活性）、及び更に転写活性化ドメインを含むことがある。例示的な Oct ポリペプチドには、Oct-1、Oct-2、Oct-3/4、Oct-6、Oct-7、Oct-8、Oct-9、及び Oct-11 が含まれる。Oct3/4（本明細書では「Oct4」と呼ぶ）は、POU ドメイン、Pit-1、Oct-1、Oct-2、及び uric-86 の間で保存されている 150 アミノ酸配列を含む（Ryan, A. K. & Rosenfeld, M. G., Genes Dev. 11:1207-1225 (1997) を参照のこと。その全体が参照により本明細書に取り込まれる）。いくつかの実施形態では、変異体は、上記に記載されたもの、又は Genbank アクセッション番号NP-002692.2（ヒト Oct4）又はNP-038661.1（マウス Oct4）に記載されているもの等の天然に存在する Oct ポリペプチド・ファミリーのメンバーと比較して、それらの全配列にわたり、少なくとも 85％、90％、又は 95％ のアミノ酸配列の同一性を有する。Oct ポリペプチド（例えば、Oct3/4 又は Oct4）は、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、又は他の動物由来であることがある。一般に、操作する細胞の種（species）と同じ種（species）のタンパク質を一緒に使用する。前記 Oct ポリペプチドは、非多能性細胞において、多能性の誘導を促進することができる多能性因子であることがある。
【００７０】
「Klf ポリペプチド」とは、Kruppel 様因子（Klfs）のファミリーの天然に存在するメンバーのうちの何れかであり、ショウジョウバエ胚パターン調節因子 Kruppel のアミノ酸配列と類似のアミノ酸配列を含むジンク・フィンガー・タンパク質、又は転写因子活性を保持する天然に存在するメンバーの変異体の何れかを指し、転写因子活性は、最も近く関連する天然に存在するファミリー・メンバー、又は天然に存在するファミリー・メンバーの少なくとも DNA 結合ドメインを含むポリペプチドと比較して同様であり（少なくとも 50％、80％、又は 90％ 以内の活性）、及び更に転写活性化ドメインを含むことがある（Dang, D. T., Pevsner, J. & Yang, V. W., Cell Biol. 32:1103-1121 (2000) を参照のこと。その全体が参照により本明細書に取り込まれる）。例示的な Klf ファミリー・メンバーには、Klf1、Klf2、Klf3、Klf-4、Klf5、Klf6、Klf7、Klf8、Klf9、Klf10、Klf11、Klf12、Klf13、Klf14、Klf15、Klf16、及び Klf17 が含まれる。Klf2 及び Klf-4 は、マウスにおいて iPS 細胞を作製することができる因子であることが見出されていて、そして関連遺伝子 Klf1 及び Klf5 も同様に、効率は低下するが、マウスにおいて iPS 細胞を作製することができた（Nakagawa, et al., Nature Biotechnology 26:101-106 (2007) を参照のこと。その全体が参照により本明細書に取り込まれる）。いくつかの実施形態では、変異体は、上記に記載されたもの、又は Genbank アクセッション番号 CAX16088（マウス Klf4）又は CAX14962（ヒト Klf4）に記載されているもの等の天然に存在する Klf ポリペプチド・ファミリーのメンバーと比較して、それらの全配列にわたり、少なくとも 85％、90％、又は 95％ のアミノ酸配列の同一性を有する。Klf ポリペプチド（例えば、Klf1、Klf4、及び Klf5）は、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、又は他の動物由来であることがある。一般に、操作する細胞の種（species）と同じ種（species）のタンパク質を一緒に使用する。Klf ポリペプチドは多能性因子であることがある。Klf4 遺伝子又はポリペプチドの発現は、出発細胞又は出発細胞の集団において多能性の誘導を促進することができる。
【００７１】
「Myc ポリペプチド」とは、Myc ファミリーの天然に存在するメンバーのうちの何れかをいう（例えば、Adhikary, S. & Eilers, M., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6:635-645 (2005) を参照のこと。その全体が参照により本明細書に取り込まれる）。最も近く関連する天然に存在するファミリー・メンバー、又は天然に存在するファミリー・メンバーの少なくとも DNA 結合ドメインを含むポリペプチドと比較して同様の転写因子活性（少なくとも 50％、80％、又は 90％ 以内の活性）を持つ変異体も含まれる。それは更に、天然に存在するファミリー・メンバーの少なくとも DNA 結合ドメインを含むポリペプチドを含み、更に転写活性化ドメインを含むことができる。例示的な Myc ポリペプチドには、例えば、c-Myc、N-Myc 及び L-Myc が含まれる。いくつかの実施形態では、変異体は、上記に記載されたもの、又は Genbank アクセッション番号 CAA25015（ヒト Myc）に記載されているもの等の天然に存在する Myc ポリペプチド・ファミリーのメンバーと比較して、それらの全配列にわたり、少なくとも 85％、90％、又は 95％ のアミノ酸配列の同一性を有する。Myc ポリペプチド（例えば、c-Myc）は、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、又は他の動物由来であることがある。一般に、操作する細胞の種（species）と同じ種（species）のタンパク質を一緒に使用する。Myc ポリペプチドは多能性因子であることがある。
【００７２】
「Sox ポリペプチド」とは、高移動度基（high-mobility group（HMG））ドメインの存在によって特徴付けられる SRY 関連 HMG ボックス（Sox）転写因子の天然に存在するメンバー、又は、最も近く関連する天然に存在するファミリーと比較して同様の転写因子活性（少なくとも 50％、80％、又は 90％ 以内の活性）を持つ変異体、のうちの何れかをいう。それはまた、天然に存在するファミリー・メンバーの少なくとも DNA 結合ドメインを含むポリペプチドを含み、更に転写活性化ドメインを含むことがある（例えば、Dang, D. T. et al., Int. J. Biochem. Cell Biol.32:1103-1121 (2000) を参照のこと。その全体が参照により本明細書に取り込まれる）。例示的な Sox ポリペプチドには、例えば、Sox1、Sox-2、Sox3、Sox4、Sox5、Sox6、Sox7、Sox8、Sox9、Sox10、Sox11、Sox12、Sox13、Sox14、Sox15、Sox17、Sox18、Sox-21、及び Sox30 が含まれる。Sox1 は Sox2 と同様の効率でiPS細胞を生成することが示されており、遺伝子Sox3、Sox15、及び Sox18 も iPS 細胞を生成することが示されているが、Sox2 よりも効率はやや低い（Nakagawa, et al., Nature Biotechnology 26:101-106 (2007) を参照のこと。その全体が参照により本明細書に取り込まれる）。いくつかの実施形態では、変異体は、上記に記載されたもの、又は Genbank アクセッション番号 CAA83435（ヒト Sox2）に記載されているもの等の天然に存在する Sox ポリペプチド・ファミリーのメンバーと比較して、それらの全配列にわたり、少なくとも 85％、90％、又は 95％ のアミノ酸配列の同一性を有する。Sox ポリペプチド（例えば、Sox1、Sox2、Sox3、Sox15、又は Sox18）は、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、又は他の動物由来であることがある。一般に、操作する細胞の種（species）と同じ種（species）のタンパク質を一緒に使用する。Sox ポリペプチドは多能性因子であることがある。本明細書中で考察されるように、SOX2 タンパク質には、iPSCs を作製する際に、特定の用途が見出される。
【００７３】
本明細書において「分化した低免疫原性多能性細胞」又は「分化した HIP 細胞」又は「dHIP 細胞」とは、低免疫原性になるように操作し（例えば、B2M 及び CIITA のノックアウト及び CD47 のノックインによる）、その後、被験者に最終的には移植される細胞型に分化した iPS 細胞を意味する。従って、例えば、HIP 細胞は、肝細胞（「dHIP 肝細胞」）、β様膵臓細胞又は膵島オルガノイド（「dHIP β細胞」）、内皮細胞（「dHIP 内皮細胞」）等に分化することができる。
【００７４】
用語パーセント「同一性」は、2 つ以上の核酸配列又はポリペプチド配列の文脈において、下記に記載される配列比較アルゴリズム（例えば、BLASTP 及び BLASTN 又は当業者に利用可能な他のアルゴリズム）の 1 つを使用して、又は目視検査によって測定して、最大の一致になるように比較し整列させた場合に、特定のパーセンテージのヌクレオチド又はアミノ酸残基が同一である 2 つ以上の配列又は部分配列を指す。用途に応じて、前記パーセント「同一性」は、比較する配列のある領域にわたって（例えば、機能ドメインにわたって）存在するか、あるいは、比較する 2 つの配列の全長にわたって存在することがある。配列を比較するためには、典型的には、ある配列が、テスト配列の比較となる対照配列として振る舞う。配列比較アルゴリズムを使用する場合、テスト配列及び対照配列をコンピューターに入力し、必要ならば部分配列座標を指定し、及び配列アルゴリズム・プログラム・パラメーターを指定する。そして、前記配列比較アルゴリズムは、指定したプログラム・パラメーターに基づいて、対照配列に対するテスト配列のパーセント配列同一性を計算する。
【００７５】
比較をするために、配列を最適にアラインメントすることは、例えば、Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981) の局所ホモロジー・アルゴリズムによって、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970) のホモロジー・アライメント・アルゴリズムによって、Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988) の類似性探索方法によって、これらアルゴリズムをコンピュータで実行すること（ウィスコンシン・ジェネティクス・ソフトウェア・パッケージ（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.）に入っている GAP、BESTFIT、FASTA、及び TFASTA）によって、又は目視検査によって（下記の Ausubel et al を一般的に参照のこと）、実施することができる。
【００７６】
パーセント配列同一性及び配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの一例は BLAST アルゴリズムであり、これは Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990) に記載されている。BLAST 解析を実施するためのソフトウェアは、国立生物工学情報センター（the National Center for Biotechnology Information（www.ncbi.nlm.nih.gov/））を通して公開されていて入手可能である。
【００７７】
「阻害剤」、「活性化剤」、及び「調節剤」は、生物学的に関連のある分子の機能又は発現に対して影響を及ぼす。用語「調節剤」は、阻害剤と活性化剤の両方を含む。それらを、標的分子の発現又は活性についての in vitro 及び in vivo アッセイを用いて同定することができる。
【００７８】
「阻害剤」は、例えば、発現を阻害するか、又は標的分子若しくは標的タンパク質に結合する薬剤である。それらは部分的又は全体的に刺激を遮断するか、又はプロテアーゼ阻害剤活性を有することがある。それらは、記載の標的タンパク質の活性を、不活性化、脱感作、又はダウン・レギュレートすること等を含む、活性化を低下・減少（reduce）、減少（decrease）、阻害、又は遅延させることがある。調節剤は、標的分子又はタンパク質のアンタゴニストであることがある。
【００７９】
「活性化剤」は、例えば、標的分子又はタンパク質の機能又は発現を誘導又は活性化する薬剤である。それらは、標的分子に結合し、標的分子の活性を、刺激し、増大させ、開き、活性化し、又は促進することがある。活性化剤は、標的分子又はタンパク質のアゴニストであることがある。
【００８０】
「ホモログ」は、ヌクレオチド配列、ペプチド配列、機能的、又は構造的レベルで、対照分子と類似している生物活性分子である。ホモログは、対照配列と一定のパーセント同一性を共有する配列誘導体を含むことがある。従って、ある実施形態では、相同配列又は誘導体配列は、少なくとも 70 パーセントの配列同一性を共有する。特定の実施形態では、相同配列又は誘導体配列は少なくとも 80 又は 85 パーセントの配列同一性を共有する。特定の実施形態では、相同配列又は誘導体配列は少なくとも 90 パーセントの配列同一性を共有する。特定の実施形態では、相同配列又は誘導体配列は少なくとも 95 パーセントの配列同一性を共有する。より特定の実施形態では、相同配列又は派生配列は少なくとも 50、55、60、65、70、75、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、又は 99 パーセントの配列同一性を共有する。相同配列又は誘導体核酸配列はまた、それらの配列が、高ストリンジェンシー（high stringency）なハイブリダイゼーション条件下で対照核酸配列に結合したままであることができること、によって定義することもある。対照分子と構造的又は機能的に類似するホモログは、対照分子の化学的誘導体であることがある。構造的及び機能的ホモログ並びに誘導体を検出、作製及びスクリーニングする方法は当技術分野において公知である。
【００８１】
「ハイブリダイゼーション」は、一般に、相補鎖がそれらの融解温度未満の環境にあるときに、変性した DNA が再アニーリングする能力に依存する。プローブとハイブリダイズ可能な配列との間の所望の相同性の程度が高ければ高いほど、使用することができる相対温度が高い。結果として、より高い相対温度によって、前記反応条件はよりストリンジェント（stringent）になる傾向があるが、より低い温度によっては、より低いストリンジェントになるという結果になる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーの更なる詳細及び説明については、Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers (1995) を参照されたく、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。
【００８２】
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー（Stringency）」は、当業者によって容易に決めることができ、そして一般に、プローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存しながら、経験的に計算される。一般に、適切にアニーリングするには、より長いプローブはより高い温度を必要とし、一方より短いプローブはより低い温度を必要とする。
【００８３】
本明細書で定義される「ストリンジェントな条件」又は「高ストリンジェンシーな条件」は、以下の条件によって特定することができる：（１）洗浄に低イオン強度及び高温（例えば、0.015 M 塩化ナトリウム／0.0015 M クエン酸ナトリウム／0.1% ドデシル硫酸ナトリウム、50℃）を用いる；（２）ハイブリダイゼーション中にホルムアミドのような変性剤、例えば、0.1% ウシ血清アルブミンを含む 50%（v/v）ホルムアミド／0.1% フィコール／0.1% ポリビニルピロリドン／50 mM リン酸ナトリウム緩衝液（Ph 6.5）、を、750Mm 塩化ナトリウム、75 Mm クエン酸ナトリウムを添加して、42℃で使用する；又は（３）50% ホルムアミド、5×SSC（0.75M NaCl、0.075M クエン酸ナトリウム）、50 mM リン酸ナトリウム（Ph 6.8）、0.1% ピロリン酸ナトリウム、5×デンハルト溶液、超音波処理したサケ精子 DNA（50 μl/ml）、0.1% SDS、及び 10% 硫酸デキストランを用いた溶液中、42℃で、一晩、ハイブリダイゼーションし、0.2×SSC（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中、42℃ で 10 分間洗浄した後、55℃で EDTA を含有する 0.1×SSC からなる高ストリンジェントな洗浄を 10 分間行う。
【００８４】
本明細書を通して示すあらゆる最大の数値限定は、あたかもそれよりもより低い数値限定が本明細書に明示的に記載されているかのように、あらゆるより低い数値限定を含むことが意図される。本明細書を通して示すあらゆる最小の数値限定は、あたかもそれよりもより高い数値限定が本明細書に明示的に記載されているかのように、あらゆるより高い数値限定を含むであろう。本明細書を通して示すあらゆる数値範囲は、あたかもそれよりもより狭い数値範囲が全て本明細書に明示的に記載されているかのように、そのようなより広い数値範囲内にあるあらゆるより狭い数値範囲を含む。
【００８５】
本明細書中で使用される場合、用語「修飾」とは、修飾分子を親分子から物理的に区別する改変をいう。ある実施形態では、本明細書に記載の方法に従って調製した CD47、HSVtk、EC-CD、又は iCasp9 変異型ポリペプチドのアミノ酸変化によって、この修飾分子を、野生型タンパク質等の本明細書に記載の方法に従って修飾されていない対応する親分子、天然に存在する突然変異タンパク質、又はそのような変異体ポリペプチドの修飾を含まない別の人工タンパク質、と区別する。別の実施形態では、改変体ポリペプチドは、改変体ポリペプチドの機能と未改変ポリペプチドの機能とを区別する 1 つ以上の改変を含む。例えば、変異体ポリペプチドにおけるアミノ酸変化はその受容体結合プロファイルに影響を与える。他の実施形態では、変異型ポリペプチドは、置換、欠失、若しくは挿入修飾、又はそれらの組み合わせを含む。別の実施形態では、変異型ポリペプチドは、受容体に対するその親和性を、未修飾ポリペプチドの親和性と比較して増加させる 1 つ以上の修飾を含む。
【００８６】
ある実施形態では、変異型ポリペプチドは、対応する天然型又は親配列に対して、1 つ以上の置換、挿入、又は欠失を含む。特定の実施形態では、変異体ポリペプチドは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31-40、41 から 50 まで、又は 51 以上の修飾を含む。
【００８７】
本明細書中の「エピソーマル・ベクター」とは、細胞の細胞質中に存在し自律的に複製することができる遺伝的ベクターを意味する；例えば、それは、宿主細胞のゲノム DNA に組み込まれていない。沢山のエピソーマル・ベクターが当該分野で公知であり、そして以下に記載する。
【００８８】
遺伝子の文脈において「ノックアウト」とは、前記ノックアウトを保有する宿主細胞が、その遺伝子の機能的タンパク質産物を産生しないことを意味する。本明細書に概説するように、ノックアウトは、コーディング配列の全部又は一部を除去すること、機能的タンパク質が産生されないようにフレームシフト変異を導入すること（短く切れた配列又はナンセンス配列の何れか）、調節成分（例えば、プロモータ）を除去又は変更すること、といった前記遺伝子が転写されず、mRNA 等への結合によって翻訳が妨げられたりする等、様々な方法によって生じることがある。一般的に、前記ノックアウトはゲノム DNA レベルで行われ、その結果、前記細胞の子孫も恒久的に前記ノックアウトになる。
【００８９】
遺伝子の文脈において「ノックイン」とは、前記ノックインを保有する宿主細胞が、前記細胞内で活性がある、より機能するタンパク質を有することを意味する。本明細書で概説するように、ノックインを、様々な方法で行うことができ、調節成分を置換することによって（例えば、内因性遺伝子に構成的プロモーターを付加することによって）も行われうるが、通常は、タンパク質をコードする導入遺伝子（tg）の少なくとも 1 つのコピーを前記細胞に導入することによって行う等、様々な方法で行うことができる。一般に、ノックイン技術は余分なコピーの導入遺伝子が宿主細胞に組込まれることをもたらす。
【００９０】
（ＶＩＩ．本発明の細胞）
本発明は、野生型細胞から始めて、それらを多能性にし（例えば、人工多能性幹細胞、又は iPSCs を作製し）、次いで iPSC 集団から HIP 細胞を作製する、という、HIP 細胞を作製するための組成物及び方法論を提供する。
【００９１】
Ａ．遺伝子改変のための方法論
本発明は、多能性細胞及び HIP 細胞の両方を作製するために細胞内又は無細胞条件下で核酸配列を修飾する方法を含む。例示的な技術には、相同組換え、ノックイン、ZFNs（ジンク・フィンガー・ヌクレアーゼ）、TALENs（転写アクチベーター様エフェクター・ヌクレアーゼ）、CRISPR（クラスターを形成し規則正しい間隔を持つ短いパリンドローム・リピート）/Cas9、及び他の部位特異的ヌクレアーゼ技術が含まれる。これらの技術によって、所望の遺伝子座部位での二本鎖 DNA 切断が可能になる。これらの制御された二本鎖切断によって、特定の遺伝子座部位での相同組換えが促進される。このプロセスは、染色体等の核酸分子の特定の配列を標的化することに焦点が合わさっており、その配列を認識して結合し、前記核酸分子中で二本鎖の切断を誘導するエンドヌクレアーゼを使って標的化する。前記二本鎖の切断は、変異性の非相同末端結合（non-homologous end-joining（NHEJ））又は相同組換え（HR）の何れかによって修復される。
【００９２】
当業者には理解されるように、本明細書に概説するような低免疫原性にする為に iPSCs を改変することと同様に、本発明の多能性細胞を改変するために多数の異なる技術を使用することがある。
【００９３】
一般に、これらの技術は個別に又は組み合わせて使用することができる。例えば、HIP 細胞を作製するのに際して、CD47 の機能をノックインするためのウイルス技術（例えば、レンチウイルス）を用いて改変した細胞中で、CRISPR を用いて活性のある B2M 及び／又は CIITA タンパク質の発現を減少させることができる。また、当業者には理解されるように、ある実施形態は、B2M をノックアウトするための CRISPR ステップ、続いて CITIA をノックアウトするための CRISPR ステップ、CD47 の機能をノックインするためのレンチウイルスの最終ステップ、の順序で利用するが、異なる技術を使用して、異なる順序でこれらの遺伝子を操作することができる。
【００９４】
以下により十分に議論するように、初期化遺伝子を一過性に発現させることを、一般に多能性幹細胞を作製／誘導するために行う。
【００９５】
ａ．CRISPR 技術
ある実施形態では、前記細胞は、当技術分野で知られているように、クラスターを形成し規則正しい間隔を持つ短いパリンドローム・リピート/Cas（「CRISPR」）技術を使用して操作される。CRISPR を、開始 iPSCs を作製するため、又は iPSCs から HIP 細胞を作製するために使用することがある。CRISPR に基づく多数の技術があり、例えば、参照により本明細書に取り込まれる、Doudna and Charpentier, Science doi:10.1126/science.1258096 を参照されたい。CRISPR 技術及びキットは市販されている。
【００９６】
ｂ．TALEN 技術
いくつかの実施形態では、本発明の HIP 細胞は、転写活性化因子様エフェクター・ヌクレアーゼ（Transcription Activator-Like Effector Nucleases（TALEN））の方法論を用いて作製される。TALEN は、実質的に任意の所望の DNA 配列に結合しそれを切断するように改変されたヌクレアーゼと組み合わせた制限酵素である。TALEN キットは市販されている。
【００９７】
ｃ．ジンク・フィンガー技術
ある実施形態では、前記細胞は、Zn フィンガー・ヌクレアーゼ技術を用いて操作される。Zn フィンガー・ヌクレアーゼは、ジンク・フィンガー DNA 結合ドメインを DNA 切断ドメインと融合することによって作製した人工的な制限酵素である。Zn フィンガー・ドメインを、特定の所望の DNA 配列を標的とするように、改変することができ、これによって、ジンク・フィンガー・ヌクレアーゼが複雑なゲノム内にただ一つだけある配列を標的とすること、が可能になる。内因性の DNA 修復機構を利用することにより、これらの試薬は、CRISPR や TALENs と同様に、高等生物のゲノムを正確に改変するために使用することができる。
【００９８】
ｄ．ウイルス・ベースの技術
本発明の HIP 細胞を作製するために（並びに iPCSs を最初に作製するために）使用することができる多種多様なウイルス技術があり、これには、限定されるものではないが、レトロウイルス・ベクター、レンチウイルス・ベクター、アデノウイルス・ベクター及びセンダイウイルス・ベクターの使用が含まれる。iPSCs を作製する際に使用するエピソーマル・ベクターを以下に記載する。
【００９９】
ｅ．干渉 RNA を用いた遺伝子のダウン・レギュレーション
他の実施形態では、HLA 分子において使用されるタンパク質をコードする遺伝子は、RNAi 技術によってダウン・レギュレートされる。RNA 干渉（RNAi）とは、RNA 分子がしばしば特定の mRNA 分子を分解することによって、遺伝子発現を阻害するプロセスである。2 種類の RNA 分子‐マイクロ RNA（miRNA）と低分子干渉 RNA（siRNA）‐が RNA 干渉の中心である。それらは標的 mRNA 分子に結合し、そしてそれらの活性を増加又は減少させる。RNAi は、ウイルスやトランスポゾンのように寄生する核酸に対して細胞が防御するのを助ける。RNAi は、発生に影響も与える。
【０１００】
sdRNA 分子は、19-21 塩基のガイド（アンチセンス）鎖を含む非対称 siRNAs の一つのクラスである。それらは 5' リン酸、2' Ome 又は2'F 修飾ピリミジン、及び 3'位に 6 個のホスホチオエートを含む。それらはまた、3' 結合ステロール部分、3' 位に 2 個のホスホチオエート、及び 2' Ome 修飾ピリミジンを含むセンス鎖も含む。両方の鎖は、長さ 3 を超えない、未修飾プリンの連続ストレッチを有する 2' Ome プリンを含有する。sdRNA は米国特許番号 8,796,443 号で開示されていて、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。
【０１０１】
これらの技術の全てについて、本明細書に概説されるように、組換え核酸を作製するために周知の組換え技術が使用される。特定の実施形態では、前記組換え核酸（所望のポリペプチド、例えば CD47、をコードするもの、又は破壊配列をコードするもの何れでも）を、発現用コンストラクト中の 1 つ以上の調節ヌクレオチド配列に、動作可能であるように連結しても良い。調節ヌクレオチド配列は、一般に宿主細胞及び治療を受ける対象に適しているであろう。様々な宿主細胞について、多数の種類の適切な発現ベクター及び適切な調節配列が当技術分野において公知である。典型的には、１ つ以上の調節ヌクレオチド配列には、限定されるものではないが、プロモーター配列、リーダー又はシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始及び終結配列、翻訳開始及び終結配列、並びにエンハンサー又はアクチベーター配列が含まれることがある。当技術分野において公知の構成的プロモーター又は誘導性プロモーターもまた企図される。前記プロモーターは、天然に存在するプロモーター、又は 2 つ以上のプロモーターの要素を組み合わせたハイブリッド・プロモーターの何れかであることがある。発現用コンストラクトは、細胞の中で、プラスミドのようなエピソーム上に存在していてもよく、又は前記発現用コンストラクトは染色体に挿入されてもよい。特定の実施形態では、前記発現ベクターは、形質転換された宿主細胞を選択できるようにするマーカー遺伝子を含む。特定の実施形態は、少なくとも 1 つの調節配列に、動作可能であるように連結された変異型ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む。本明細書で使用される調節配列は、プロモーター、エンハンサー、及び他の発現制御要素を含む。特定の実施形態では、前記発現ベクターは、形質転換する宿主細胞、発現を望む変異型ポリペプチド、ベクターのコピー数、そのコピー数を制御する能力、又は抗生物質マーカー等のベクターによってコードされる他のタンパク質の発現、の選択に合わせて、設計される。
【０１０２】
適切な哺乳動物プロモーターの例としては、例えば、以下の遺伝子からのプロモーターが挙げられる：ハムスターのユビキチン/S27a プロモーター（WO 97/15664）、サル空胞形成ウイルス 40（Simian vacuolating virus 40（SV40））初期プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、マウス・メタロチオネイン-I プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（RSV）の長い末端反復領域、マウス乳腺腫瘍ウイルス・プロモーター（mouse mammary tumor virus（MMTV）promoter）、モロニー・マウス白血病ウイルスの長い末端反復領域、及びヒト・サイトメガロウイルス（CMV）の初期プロモーター。他の異種哺乳動物プロモーターの例は、アクチン、免疫グロブリン又は熱ショック・プロモーターである。
【０１０３】
さらなる実施形態では、哺乳動物宿主細胞において使用するためのプロモーターは、ポリオーマ・ウイルス、鶏痘ウイルス（1989 年 7 月 5 日に公開された英国特許第 2,211,504 号）、ウシ・パピローマ・ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、B 型肝炎ウイルス、サル・ウイルス（Simian Virus 40（SV40））から得ることができる。更なる実施形態では、異種哺乳動物プロモーターが使用される。例としては、アクチン・プロモーター、免疫グロブリン・プロモーター、及び熱ショック・プロモーターが挙げられる。SV40 の初期及び後期プロモーターは、SV40 ウイルス複製起点も含む SV40 制限酵素断片として簡便に得られる。Fiers et al., Nature 273: 113-120 (1978)。ヒト・サイトメガロウイルスの即時初期型プロモーター（immediate early promoter）は、HindIII E 制限酵素断片として簡便に得られる。Greenaway, P. J. et al., Gene 18: 355-360 (1982)。前述の参考文献は、その全体が参照により取り込まれる。
【０１０４】
Ｂ．多能性細胞の作製
本発明は、多能性細胞から非免疫原性多能性細胞を産生する方法を提供する。従って、第一ステップは前記多能性幹細胞を提供することである。
【０１０５】
マウス及びヒトの多能性幹細胞（一般に iPSCs と呼ぶ；マウス細胞の場合は miPSCs 、又はヒト細胞の場合は hiPSCs と呼ぶ）の作製は、当技術分野において一般的に知られている。当業者には理解されるように、iPCSs を作製するための様々な異なる方法がある。最初の誘導は、マウス胚又は成体線維芽細胞に、4 種の転写因子、Oct3/4、Sox2、c-Myc 及び Klf4 をウイルス導入して行った；Takahashi and Yamanaka Cell 126:663-676 (2006) を参照のこと（その全体及び具体的にはその中に概説されている技法について、参照により本明細書に取り込まれる）。それ以来、多くの方法が開発されてきた；総説については、Seki et al., World J. Stem Cells 7(1):116-125 (2015)、及びLakshmipathy and Vermuri, 編, Methods in Molecular Biology: Pluripotent Stem Cells, Methods and Protocols, Springer 2013 を参照のこと、これら両方が、その全体が、及び特に hiPSCs を作製するための方法に関して（例えば、後者の参考文献の中の第３章を参照）、参照により明確に取り込まれる。
【０１０６】
一般に、iPSCs は、宿主細胞中での、1 種以上の「リプログラミング因子」の一過性発現によって作製されるが、通常エピソーマル・ベクターを使用して導入される。これらの条件下で、少量の細胞が iPSCs 細胞になるように誘導される（一般に、選択マーカーを使用しないので、このステップの効率は低い）。細胞が「リプログラミング」されて多能性になると、それらはエピソーマル・ベクターを失い、内因性遺伝子を用いて前記因子を産生する。このエピソーマル・ベクターが失われることによって、「ゼロ・フットプリント（zero footprint）」細胞と呼ばれる細胞が生じる。この細胞は、（特に宿主細胞のゲノム中で）遺伝子改変が少なければ少ないほど好ましいので、望ましい。従って、結果として生じる hiPSCs は永久的な遺伝子改変を有していないことが好ましい。
【０１０７】
また当業者には理解されるように、使用することができる、又は使用するリプログラミング因子の数は変わり得る。一般に、使用するリプログラミング因子がより少ないと、細胞の多能性状態への形質転換の効率、並びに「多能性」は低下する。例えば、リプログラミング因子が少なければ、完全に多能性ではなく、より少数の細胞型にだけ分化することができる細胞が生じる可能性がある。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、単一のリプログラミング因子、OCT4 が使用される。他の実施形態では、2 種のリプログラミング因子、OCT4 及び KLF4 が使用される。他の実施形態では、3 種のリプログラミング因子、OCT4、KLF4 及び SOX2 が使用される。他の実施形態では、4 種のリプログラミング因子、OCT4、KLF4、SOX2 及び c-Myc が使用される。他の実施形態では、SOKMNLT；SOX2、OCT4（POU5F1）、KLF4、MYC、NANOG、LIN28、及び SV40L T 抗原、から選択される 5、6 又は 7 種のリプログラミング因子を使用することができる。
【０１０９】
一般に、これらのリプログラミング因子の遺伝子は、当技術分野において公知であり市販されているようなエピソーマル・ベクターに乗せて提供される。例えば、サーモフィッシャー／インビトロゲン（ThermoFisher/Invitrogen）は、hiPSCs のゼロ・フットプリントを作製するためのセンダイ・ウイルス・リプログラミング・キットを販売している。サーモフィッシャーは EBNA ベースのシステムも販売しているが、カタログ番号 A14703 を参照のこと。
【０１１０】
更に、市販されている多くの hiPSC 株がある。例えば、ゼロ・フットプリントであり、ウイルスが組み込まれていないヒト iPSC 細胞株であるギブコ（登録商標）エピソーマル hiPSC 株、K18945 を参照されたい（Burridge et al、2011、前出も参照）。
【０１１１】
一般に、当技術分野で知られているように、iPSCs は、本明細書に記載のようにリプログラミング因子を一過性に発現させること等によって、CD34+ 臍帯血細胞、線維芽細胞等の非多能性細胞から作製される。
【０１１２】
例えば、C-Myc を省略し、Oct3/4、Sox2、及び Klf4 のみを使用しても、iPSCs を作製するのに成功したが、リプログラミングの効率は低下した。
【０１１３】
一般に、iPSCs は、KLF4、Nanog、OCT4、SOX2、ESRRB、TBX3、c-Myc 及び TCL1 を含む特定の因子の発現によって特徴付けられる。本発明の目的のためのこれらの因子が新規に、又は増加して発現することは、内因性遺伝子座の誘導又は調節を介するか、又は導入遺伝子からの発現、に由来することがある。
【０１１４】
例えば、マウス iPSCs 細胞は、Diecke et al, Sci Rep. 2015, Jan. 28;5:8081 (doi:10.1038/srep08081) の方法を用いて作製することができ、その全体及び特に miPSCs を作製するための方法や試薬に関してが、参照により本明細書に取り込まれる。例えば、Burridge et al., PLoS One, 2011 6(4):18293 を参照のこと。その全体及び特にその中に概説されている方法に関してが、参照により本明細書に取り込まれる。
【０１１５】
ある場合には、本明細書に概説されるように、例えば、図１７に一般的に示すようにリプログラミング因子をアッセイすることによって、又は本明細書及び実施例に概説するように分化反応を行うことによって、前記細胞の多能性を測定又は確認する。
【０１１６】
Ｃ．低免疫原性多能性細胞の作製
本発明は、本明細書で定義するように、低免疫原性細胞の作製、操作、増殖及び患者への移植に関する。多能性細胞からの HIP 細胞の作製は、わずか 3 種の遺伝的変化で行い、細胞活性の破壊を最小限に抑えながらも、前記細胞を免疫サイレンシングにする。
【０１１７】
本明細書中で考察するように、ある実施形態は、MHC I 及び II（前記細胞がヒトの場合は HLA I 及び II）のタンパク質活性を減少させること又は無くすことを利用する。これは、それらの構成要素をコードする遺伝子を改変することによって行うことができる。ある実施形態では、前記遺伝子のコーディング領域又は調節配列を、CRISPR を用いて破壊する。別の実施形態では、干渉 RNA 技術を使用して遺伝子の翻訳を減少させる。第三の変化は、CD47 のようなマクロファージによる貪食作用に対する感受性を調節する遺伝子の変化であり、これは一般にウイルス技術を用いた遺伝子の「ノックイン」である。
【０１１８】
CRISPR を遺伝子改変に使用する、ある場合では、細胞株の高効率編集を可能にする Cas9 構築物を含有する hiPSC 細胞を使用することができる。例えば、Life Technologies 社のヒト・エピソーマル Cas9 iPSC 細胞株（the Human Episomal Cas9 iPSC cell line）、A33124 を参照のこと。
【０１１９】
１．HLA-I の減少
本発明の HIP 細胞は、MHC I 機能（前記細胞がヒト細胞に由来する場合は HLA I）を減少させることを含む。
【０１２０】
当業者には理解されるように、機能を減少させることは、遺伝子から核酸配列を除去すること、前記配列に他の配列を割り込ませること、又は核酸の調節成分を改変すること等を含む多くの方法で行うことができる。例えば、目的の遺伝子のコーディング領域の全部又は一部を除去、又は「ナンセンス」配列で置換することができる、フレームシフト変異を作製することができる、プロモーター等の調節配列の全部又は一部を除去又は置換することができる、翻訳開始配列を除去又は置換することができる、等が挙げられる。
【０１２１】
当業者には理解されるように、多能性細胞中で、MHC I 機能（前記細胞がヒト細胞に由来する場合は HLA I）がうまく減少していることを、当技術分野において公知であり以下に記載するような技術；例えば、前記 HLA 複合体に結合する標識抗体を用いる FACS 技術；例えば、ヒト主要組織適合性 HLA クラス I 抗原のアルファ鎖に結合する市販の HLA-A、B、C 抗体を使用する、を使用して測定することができる
【０１２２】
ａ．B2M の改変
ある実施形態では、HLA-I 活性を減少させることを、多能性幹細胞における β-2 ミクログロブリン遺伝子の発現を破壊することによって行い、そのヒト配列を本明細書に開示する。この変化は、本明細書では一般に遺伝子「ノックアウト」と呼び、本発明の HIP 細胞では、宿主細胞の両方の対立遺伝子に対して行う。一般に、両方とも、破壊するための手法は同じである。
【０１２３】
特に有用な実施形態は、前記遺伝子を破壊するために CRISPR 技術を使用する。ある場合では、CRISPR 技術を用いて前記遺伝子のコーディング領域に小さな欠失／挿入を導入し、機能的なタンパク質が産生されないようにする（しばしば、フレームシフト変異の結果、ストップ・コドンができ、短く切れて、機能を持たないタンパク質が作られるようになる）
【０１２４】
従って、有用な技術は、マウスの B2M 遺伝子又はヒトの B2M 遺伝子のコーディング配列を標的とするように設計した CRISPR 配列を使用することである。遺伝子編集を行った後、トランスフェクトした iPSC 細胞培養物をバラバラにして単一の細胞にする。単一細胞をフルサイズのコロニーになるまで増殖させ、そして CRISPR 切断部位に異常な配列が存在することをスクリーニングして、CRISPR 編集について試験する。両方の対立遺伝子が欠失しているクローンを選択する。そのようなクローンは、B2M を発現していないことが、PCR によって実際に示され、そして HLA-I を発現していないことが、FACS 解析によって実際に示される（例えば、実施例１及び６を参照のこと）。
【０１２５】
B2M 遺伝子が不活性化されているかどうかを試験するためのアッセイは公知であり、及び本明細書に記載されている。ある実施形態では、前記アッセイは、B2M タンパク質に対する抗体でプローブする細胞溶解物のウエスタン・ブロットである。別の実施形態では、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（rt-PCR）によって、不活性化の改変が存在することを確認する。
【０１２６】
更に、前記細胞を試験して、前記 HLA I 複合体が前記細胞表面に発現していないことを確認することができる。これは、上記のように、1 つ以上の HLA 細胞表面成分に対する抗体を用いた FACS 解析によってアッセイすることができる。
【０１２７】
両方の対立遺伝子の B2M 遺伝子をサイレンシングしようとしたときに、他の人は悪い結果を出したことは、注目すべきである。例えば、Gornalusse et al., Nature Biotech. Doi/10.1038/nbt.3860) を参照のこと。
【０１２８】
２．HLA-II の減少
HLA I の減少に加えて、本発明の HIP 細胞はまた、MHC II 機能（細胞がヒト細胞に由来する場合は HLA II）も欠く。
【０１２９】
当業者には理解されるように、前記機能の減少は、遺伝子から核酸配列を除去すること、遺伝子に核酸配列を付加すること、読み枠を破壊すること、前記配列に他の配列を割り込ませること、又は核酸の調節成分を変化させること等を含む、多くの方法で達成することができる。ある実施形態では、目的の遺伝子のコーディング領域の全部又は一部を除去するか、又は「ナンセンス」配列と置き換えることができる。別の実施形態では、プロモーターなどの調節配列を除去又は置換することができ、翻訳開始配列を除去又は置換することができる、等である。
【０１３０】
多能性細胞又はそれらの誘導体（derivatives）中で、MHC II 機能（細胞がヒト細胞に由来する場合は HLA II）がうまく減少していることを、そのタンパク質に対する抗体を使用するウエスタン・ブロッティング、FACS 技術、rt-PCR技術等の当技術分野において公知の技術を使用して測定することができる。
【０１３１】
ａ．CIITA の改変
ある実施形態では、HLA-II 活性の減少を、多能性幹細胞における CIITA 遺伝子の発現を破壊することによって行い、そのヒト配列は本明細書に示されている。この改変は、本明細書では一般に遺伝子「ノックアウト」と呼ばれ、本発明の HIP 細胞では、宿主細胞の両方の対立遺伝子に対して行う。
【０１３２】
CIITA 遺伝子が不活性化されているかどうかを試験するためのアッセイは公知であり、及び本明細書に記載されている。ある実施形態では、前記アッセイは、CIITA タンパク質に対する抗体でプローブする細胞溶解物のウエスタン・ブロットである。別の実施形態では、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（rt-PCR）によって、不活性化の改変が存在することを確認する。
【０１３３】
更に、前記細胞を試験して、前記 HLA II 複合体が細胞表面に発現していないことを確認することができる。やはり、このアッセイを、当技術分野において公知であるように行い（例えば、図２１を参照）、一般に、以下に概説するように、ヒト HLA クラス II HLA-DR、DP 及び大部分の DQ 抗原に結合する市販の抗体に基づくウエスタン・ブロット又は FACS 解析の何れかを用いて行う。
【０１３４】
特に有用な実施形態は、CIITA 遺伝子を破壊するために CRISPR 技術を使用する。全ての MHC II 分子にとって必須の転写因子である、マウスの Ciita 遺伝子又はヒトの CIITA 遺伝子のコーディング配列を標的とするように、CRISPRs を設計した。遺伝子編集を行った後、トランスフェクトした iPSC 細胞培養物をバラバラにして単一の細胞にする。単一細胞をフルサイズのコロニーになるまで増殖させ、そして CRISPR 切断部位に異常な配列が存在することをスクリーニングして、CRISPR 編集がうまくいっていることを試験する。欠失を有するクローンは、PCR によって決定されるように CIITA を発現せず、及び FACS 解析によって決定されるように MHC II/HLA-II を発現しなかった。
【０１３５】
３．貪食作用の減少
B2M 及び CIITA のノックアウトを一般的に用いた HLA I 及び II（又は MHC I 及び II）の減少に加えて、本発明の HIP 細胞はマクロファージによる貪食作用及び NK 細胞により殺傷されることに対する感受性が減少している。得られた HIP 細胞は、1 つ以上の CD47 導入遺伝子により、免疫マクロファージ及び自然免疫の経路から「逃げる」。
【０１３６】
ａ．CD47 の増加
いくつかの実施形態では、マクロファージ貪食作用及び NK 細胞により殺傷されることに対する感受性の減少は、HIP 細胞表面上に CD47 が増加することから生じる。これは、「ノックイン」又はトランスジェニック技術を用いて当業者によって理解されるようにいくつかの方法で行われる。いくつかの場合において、CD47 の発現が増加することは、1 つ以上の CD47 導入遺伝子に起因する。
【０１３７】
従って、いくつかの実施形態では、CD47 遺伝子の 1 つ以上のコピーが、誘導性又は構成的プロモーターの制御下で HIP 細胞に加えられるが、後者が好ましい。いくつかの実施形態では、レンチウイルス構築物を、本明細書中に記載されるように、又は当該分野で公知のように使用する。CD47 遺伝子を、当技術分野において公知であるように、適切なプロモーターの制御下で宿主細胞のゲノムの中に組み込むことができる。
【０１３８】
前記 HIP 細胞株を、B2M-/- CIITA-/- iPSCs から作製した。CD47 を発現するレンチウイルス・ベクターを含む細胞を、ブラストサイジン・マーカーを用いて選択した。前記 CD47 遺伝子配列を合成し、そしてその DNA をブラストサイジン耐性を含むプラスミドLentivirus pLenti6/V5（サーモフィッシャーサイエンス社、ウォルサム、MA）にクローニングした。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、前記 CD47 遺伝子の発現を、例えば、内因性プロモーターを構成的プロモーター又は異なる誘導性プロモーターと交換することで、内因性 CD47 遺伝子の調節配列を改変することによって、増加させることができる。これは一般に CRISPR のような既知の技術を用いて行うことができる。
【０１４０】
一旦改変すると、十分な CD47 が発現していることを、抗 CD47 抗体を用いるウエスタン・ブロット、ELISA アッセイ又は FACS アッセイ等の、実施例に記載するような既知の技術を用いてアッセイすることができる。一般に、この文脈における「十分性」とは、HIP 細胞表面上に、CD47 の発現が増加し、これによって NK 細胞により殺傷されることがサイレンシングされることを意味する。細胞上の天然の発現レベルは、それらの MHC I が除去されると、前記細胞を NK 細胞による溶解から保護するには低すぎる。
【０１４１】
４．自殺遺伝子
いくつかの実施形態では、本発明は、「自殺遺伝子」又は「自殺スイッチ」を含む低免疫原性多能性細胞を提供する。これらは、もし低免疫原性多能性細胞が望ましくない様式で増殖及び分裂した場合に、その細胞を死に至らしめることができる「安全スイッチ」として機能するように組み込まれている。「自殺遺伝子」による除去のアプローチは、特定の化合物によって活性化された場合にのみ、細胞の死滅をもたらすタンパク質をコードする自殺遺伝子を遺伝子導入ベクター中に含む。自殺遺伝子は、無毒性の化合物を高毒性の代謝物に選択的に変換する酵素をコードしてもよい。その結果、酵素を発現している細胞が特異的に除去される。いくつかの実施形態では、前記自殺遺伝子はヘルペス・ウイルス・チミジン・キナーゼ（HSV-tk）遺伝子であり、その引き金はガンシクロビルである。他の実施形態では、前記自殺遺伝子は大腸菌シトシン・デアミナーゼ（EC-CD）遺伝子であり、その引き金は 5-フルオロシトシン（5-FC）である（Barese et al., Mol. Therap. 20(10):1932-1943 (2012)、Xu et al., Cell Res. 8:73-8 (1998)、両方ともその全体が参照により本明細書に取り込まれる）。
【０１４２】
他の実施形態では、前記自殺遺伝子は誘導性カスパーゼ・タンパク質である。誘導性カスパーゼ・タンパク質は、アポトーシスを誘導することができるカスパーゼ・タンパク質の少なくとも一部を含む。ある実施形態では、前記カスパーゼ・タンパク質の一部は、配列番号６に例示される。好ましい実施形態では、前記誘導性カスパーゼ・タンパク質は iCasp9 である。これは、一連のアミノ酸を介してヒト・カスパーゼ 9 をコードする遺伝子と連結した、F36V 突然変異を有するヒト FK506 結合タンパク質（FKBP12）の配列を含む。FKBP12-F36V は、低分子二量体化剤である AP1903 に高い親和性で結合する。従って、本発明における iCasp9 の自殺機能は、二量体化の化学誘導剤（chemical inducer of dimerization（CID））を投与することによって引き起こされる。いくつかの実施形態では、前記 CID は低分子薬 AP1903 である。二量体化によって、アポトーシスが急速に誘導される（WO2011146862；Stasi et al, N. Engl. J. Med 365;18 (2011)；Tey et al., Biol. Blood Marrow Transplant. 13:913-924 (2007) を参照のこと、それぞれは、その全体が参照により本明細書に取り込まれる）。
【０１４３】
５．HIP の表現型のアッセイ及び多能性の保持
一度前記 HIP 細胞が作製されると、それらは、本明細書及び実施例に概要として記載するように、それらが低免疫原性であり、及び／又は多能性を保持していることについて、アッセイすることができる。
【０１４４】
例えば、低免疫原性は、図１３及び図１５に例示されるような多数の技術を使用してアッセイされる。これらの技術には、同種異系の宿主へ移植すること、及び宿主免疫系を回避して HIP 細胞が増殖すること（例えば奇形腫）をモニタリングすること、が含まれる。HIP 誘導体（derivatives）はルシフェラーゼを発現するように形質導入したものであり、生物発光イメージングを用いて追跡することができる。同様に、HIP 細胞に対する前記宿主動物の T 細胞及び／又は B 細胞の応答を試験して、HIP 細胞が宿主動物において免疫反応を引き起こさないことを確認する。T 細胞機能を、エリスポット（Elispot）、Elisa、FACS、PCR、又はマス・サイトメトリー（CYTOF）によって評価する。B 細胞応答又は抗体応答は、FACS 又はルミネックスを用いて評価する。追加的に又は代替的に、前記細胞は、自然免疫応答（例えば、図１４に概要として示すような NK 細胞による殺傷）を回避するそれら細胞の能力についてアッセイすることがある。NK 細胞による溶解活性は、（図１５に示されるように）in vitro 又は in vivo で評価する。
【０１４５】
同様に、多能性を保持していることを、多くの方法で試験する。ある実施形態では、多能性は、本明細書に概要として記載され、図２９に示すように、特定の多能性特異的因子の発現により、アッセイする。追加的に又は代替的に、前記 HIP 細胞は、多能性の指標として １ 種以上の細胞型に分化する。
【０１４６】
Ｄ．発明の好ましい実施形態
前記 HIP 細胞として又は前記 HIP 細胞の分化産物として、ヒト患者などの同種異系宿主に移植した場合に、多能性を示すが、宿主免疫応答が生じない、低免疫原性多能性幹細胞（「HIP 細胞」）が本明細書に提供される。
【０１４７】
ある実施形態では、ヒト多能性幹細胞（hiPSCs）は、ａ）各対立遺伝子における B2M 遺伝子の破壊（例えば、B2M-/-）、ｂ）各対立遺伝子における CIITA 遺伝子の破壊（例えば、CIITA-/-）、及び ｃ）CD47 遺伝子の過剰発現（CD47+、例えば、CD47 遺伝子の 1 つ以上のコピーを追加的に導入すること、又はそのゲノム遺伝子を活性化することによる）、によって低免疫原性になる。これによって、hiPSC 集団は B2M-/- CIITA-/- CD47tg になる。好ましい実施形態では、前記細胞は非免疫原性である。別の実施形態では、前記 HIP 細胞は、上記のように非免疫原性の B2M-/- CIITA-/- CD47tg になるが、必要に応じて、in vivo で細胞を殺すように誘導される誘導性の自殺遺伝子が含まれることによって、更に修飾される。
【０１４８】
Ｅ．HIP 細胞のメンテナンス
前記 HIP 細胞は、一度作製されると、iPSCs を維持するために知られているように、未分化状態を維持することができる。例えば、HIP 細胞を、分化を防ぎ、及び多能性を維持する培地を用いて、マトリゲル上で培養する。
【０１４９】
Ｆ．HIP 細胞の分化
本発明は、異なる細胞型に分化させて、その後、対象へ移植する HIP 細胞を提供する。当業者には理解されるように、分化させる方法は、既知の技術を用いながら、所望の細胞型に依存する。前記細胞を、懸濁状態で分化させた後、細胞の生存を促進するために、マトリゲル、ゼラチン、又はフィブリン／トロンビン形態等のゲル・マトリックス形態に置く。分化したことは、一般に細胞特異的マーカーが存在することを評価することによって、当技術分野において知られているようにアッセイされる。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、前記 HIP 細胞を、肝細胞に分化させて、肝細胞機能の喪失又は肝臓の肝硬変に対処する。HIP 細胞を肝細胞に分化させるのに使用できる多くの技術がある。例えば、Pettinato et al., doi:10.1038/spre32888、Snykers et al., Methods Mol Biol 698:305-314 (2011)、Si-Tayeb et al, Hepatology 51:297-305 (2010) 及び Asgari et al., Stem Cell Rev (:493-504 (2013) を参照のこと、これら全ては、その全体並びに特に分化の方法及び試薬に関して、参照により、本明細書に明確に取り込まれる。分化したことは、当技術分野で知られているように、限定されるものではないが、アルブミン、アルファ・フェトプロテイン、及びフィブリノーゲン等を含む、肝細胞関連及び／又は特定のマーカーが存在することを評価することにより、アッセイする。分化したことは、アンモニアの代謝、LDL の貯蔵及び取り込み、ICG の取り込み及び放出、グリコーゲンの貯蔵等、機能的に測定することもできる。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、前記 HIP 細胞を、移植するために、β 様細胞又は膵島オルガノイドに分化させて、I 型糖尿病（T1DM）に対処する。細胞システムは、T1DM に対処するのに有望な方法である（例えば、Ellis et al., doi/10.1038/nrgastro.2017.93 を参照されたい、参照により本明細書に取り込まれる）。更に、Pagliuca らは、hiPSCs から β 細胞に分化させるのに成功したことを報告している（doi/10.106/j.cell.2014.09.040 を参照のこと、その全体及び特にヒト多能性幹細胞由来から機能するヒト β 細胞を大規模に産生するために概説される方法及び試薬に関してが、参照により本明細書に取り込まれる）。更に、Vegas らは、ヒト多能性幹細胞からヒト β 細胞を産生し、その後、宿主による免疫拒絶反応を回避するためにカプセル化することを示している；（doi:10.1038/nm.4030、その全体及び特にヒト多能性幹細胞からの機能するヒト β 細胞を大規模に産生するために概説される方法及び試薬に関して、参照により本明細書に取り込まれる）。
【０１５２】
分化したことは、一般に、限定されるものではないが、インスリン等を含む、β 細胞関連マーカー又は特異的マーカーが存在することを評価することによって、当技術分野で知られているようにアッセイする。分化したことは、グルコース代謝を測定する等、機能的に測定することもできる（Muraro et al, doi:10.1016/j.cels.2016.09.002 を参照のこと、その全体及び特に概説されているバイオマーカーに関してが、参照により本明細書に取り込まれる）。
【０１５３】
一度 dHIP ベータ細胞を作製したら、それらを（本明細書で論じるように、細胞懸濁液として、又はゲル・マトリックス内に入れて）門脈／肝臓、大網、胃腸粘膜、骨髄、筋肉、又は皮下叢（subcutaneous pouches）に移植することができる。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、前記 HIP 細胞を網膜色素上皮（RPE）に分化させ、眼の視力を脅かす疾患に対処する。ヒト多能性幹細胞は、Kamao et al., Stem Cell Reports 2014:2:205-18（その全体並びに特に分化技術及び試薬に関して概説されている方法及び試薬に関してが、参照により本明細書に取り込まれる）に概説されている技法を使用して、RPE 細胞への分化が行われてきている；Mandai et al., doi:10.1056/NEJMoa1608368 も参照のこと、RPE 細胞のシートを作製するための技術及び患者へ移植するための技術に関してもまた、その全体が取り込まれている。
【０１５５】
分化したことは、一般に、RPE 関連及び／又は特異的マーカーが存在することを評価することによって、又は機能的に測定することによって、当技術分野で知られているようにアッセイすることができる。例えば、Kamao et al., doi:10.1016/j.stemcr.2013.12.007 を参照のこと（その全体及び特にその結果のセクションの最初の段落に概説されているマーカーに関してが、参照により本明細書に取り込まれる）。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、前記 HIP 細胞を心筋細胞に分化させ、心血管疾患に対処する。hiPSCs を心筋細胞に分化させるための技術は当技術分野において公知であり、実施例において論じられている。分化したことは、一般に、心筋細胞関連マーカー又は特異的マーカーが存在することを評価することによって、又は機能的に測定することによって、当分野で知られているようにアッセイすることができる；例えば、Loh et al., doi:10.1016/j.cell.2016.06.001 を参照のこと（その全体及び特に心筋細胞等を含む幹細胞を分化させる方法に関してが、参照により本明細書に取り込まれる）。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、前記 HIP 細胞を内皮コロニー形成細胞（ECFCs）に分化させ、新しい血管を形成させて、末梢動脈疾患に対処する。内皮細胞に分化させるための技術は公知である。例えば、Prasain et al., doi:10.1038/nbt.3048 を参照のこと（その全体並びに特にヒト多能性幹細胞から内皮細胞を作製するための方法及び試薬に関してが、並びに移植する技術に関しても、参照により本明細書に取り込まれる）。分化したことは、一般的に、内皮細胞関連マーカー又は特異的マーカーが存在することを評価することによって、又は機能的に測定することによって、当技術分野で知られているようにアッセイすることができる。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、前記 HIP 細胞を甲状腺ホルモンを分泌することができる甲状腺前駆細胞及び甲状腺濾胞オルガノイドに分化させ、自己免疫性甲状腺炎に対処する。甲状腺細胞に分化させる技術は当技術分野において公知である。例えば、Kurmann et al., doi:10.106/j.stem.2015.09.004 を参照のこと（その全体並びに特にヒト多能性幹細胞から甲状腺細胞を作製するための方法及び試薬に関してが、並びに移植する技術に関しても、参照によって本明細書に明確に取り込まれる）。分化は、一般に、甲状腺細胞関連マーカー又は特異的マーカーが存在することを評価することによって、又は機能的に測定することによって、当技術分野で知られているようにアッセイすることができる。
【０１５９】
Ｇ．分化した HIP 細胞の移植
当業者には理解されるように、前記分化した HIP 誘導体（derivatives）は、細胞型及びこれらの細胞の最終用途の両方に応じて、当該分野で公知の技術を用いて、移植される。一般に、本発明の dHIP 細胞は、静脈内に又は注射によって患者の中の特定の場所に移植される。特定の場所に移植する場合、前記細胞は、それら細胞が保持されている間に分散してしまうことを防ぐために、ゲル・マトリックス中に懸濁されることがある。
【０１６０】
本明細書に記載の発明をより完全に理解することができるように、以下の実施例を記載する。これらの実施例は説明をする目的のためだけのものであり、決して本発明を限定するものとして解釈されるべきではないことを理解されたい。
【実施例】
【０１６１】
（ＶＩＩＩ．実施例）
Ａ．一般的な技術
１．マウス iPSCs の作製
これらの細胞は、Diecke et al, Sci Rep. 2015, Jan. 28;5:8081 (doi:10.1038/srep08081) の方法を用いて作製され、その全体及び特に前記 miPSCs を作製するための方法及び試薬に関してが、本明細書に取り込まれる。
【０１６２】
マウスのマウス尻尾先端の線維芽細胞を、コラゲナーゼ・タイプ IV（ライフテクノロジー社、グランド・アイランド、ニューヨーク、米国（Life Technologies、Grand Island、NY、USA））を使ってバラバラに解離させて単離し、10 % ウシ胎児血清（FBS）、L-グルタミン、4.5 g/L グルコース、100 U/mL ペニシリン、及び 100 μg/mL ストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を使って、加湿インキュベーター中、37℃、20% O2、及び 5% CO2で維持した。ネオン・トランスフェクション・システム（Neon Transfection system）を用いて、4 種のリプログラミング因子 Oct4、KLF4、Sox2 及び c-Myc を発現するコドンを最適化した新規なミニ‐イントロン・プラスミド（co-MIP）（10-12 μmの DNA）を用いて、1×106個のマウス線維芽細胞をリプログラミングさせた。トランスフェクションをした後、線維芽細胞を MEF フィーダー層上に播種し、酪酸ナトリウム（0.2 mM）及び 50 μg/mL アスコルビン酸を添加した線維芽細胞培地中に置いた。ESC 様コロニーが出現したとき、培地を DMEM、20％ FBS、L-グルタミン、非必須アミノ酸（NEAA）、β-メルカプトエタノール、及び 10 ng/mL 白血病抑制因子（LIF）を含むマウス iPSC 培地に変更した。2 代継代後、前記マウス iPSCs 細胞を 0.2% ゼラチン・コートしたプレートに移し、更に増殖させた。継代毎に、磁気活性化細胞選別（magnetic activated cell sorting（MACS））を使用して、前記 iPSCs をマウス多能性マーカー SSEA-1 に関して選別した。
【０１６３】
２．ヒト iPSCs の作製
hiPSCs の作製は、Burridge et al., PLoS One, 2011 6(4):18293 （その全体及び特にその中で概説されている方法に関してが、参照により本明細書に取り込まれている）に概説されているように、行った。
【０１６４】
ギブコ（登録商標）ヒト・エピソーマル iPSC 株（カタログ番号 A33124、サーモフィッシャーサイエンティフィック（Thermo Fisher Scientific））は、3 種のプラスミド、7 種の因子（SOKMNLT；SOX2、OCT4（POU5F1）、KLF4、MYC、NANOG、LIN28、及び SV40L T 抗原）の EBNA に基づくエピソーマル系を用いて CD34+ 臍帯血から得た。この iPSC 株は、リプログラミング・イベントからゲノムに組み込まれるものは何もないため、ゼロ・フットプリントであると見なされる。それは全てのどのリプログラミング遺伝子も含まないことが示されている。
【０１６５】
ギブコ（登録商標）ヒト・エピソーマル iPSC 株は、正常な核型であり、並びに Oct4、Sox2、及び Nanog（RT-PCR で示される）並びに Oct4、SSEA4、TRA-1-60、及び TRA-1-81（ICC で示される）のような多能性マーカーを内因性に発現している。全ゲノム発現及びエピジェネティック・プロファイリング解析により、このエピソーマル hiPSC 株はヒト胚性幹細胞株と分子的に区別がつかないことが実証された（Burridge et al., 2011）。方向性を持った分化及び奇形腫の解析において、これらの hiPSCs は、外胚葉、内胚葉、及び中胚葉系列へのそれらの分化能を保持していた（Burridge et al., 2011）。加えて、血管系、造血系、神経系、及び心臓系の系列を、確実な効率で、誘導した（Burridge et al., 2011）。
【０１６６】
３．表面分子の FACS 解析
ａ．ヒト HLA I表面分子の検出
ヒト iPSCs、iCMs 及び iECs を 6 ウェル・プレートに播種し、100 ng/ml のヒト IFNg（ぺプロテック、ロケット・ヒル、ニュー・ジャージ（Peprotech, Rocket Hill, NJ）で刺激した。細胞を採取し、APC 結合 HLA-A、B、C 抗体（クローン G46_2.6、カタログ番号 562006、BD バイオサイエンス、サンノゼ、カリフォルニア州（clone G46_2.6, cat. No.562006, BD BioSciences, San Jose, CA））、又は APC 結合 IgG1 アイソタイプ対照抗体（クローン MOPC-21、カタログ番号 555751、BD バイオサイエンス）で標識した。HLA-A、B、C 抗体は、ヒトの主要組織適合性 HLA クラス I 抗原のアルファ鎖に特異的に結合する。データ解析をフロー・サイトメトリー（BD バイオサイエンス）によって行い、結果をアイソタイプ対照に対する変化割合として表した。
【０１６７】
４．ヒト HLA II表面分子の検出
ヒト iPSCs、iCMs 及び iECs を 6 ウェル・プレートに播種し、100 ng/ml のヒト TNFa（ぺプロテック、ロケット・ヒル、ニュー・ジャージ（Peprotech, Rocket Hill, NJ）で刺激した。細胞を採取し、Alexa-flour647標識 HLA-DR、DP、DQ 抗体（クローン Tu3a、カタログ番号 563591、BD バイオサイエンス、サンノゼ、カリフォルニア州（clone Tu3a, cat. No. 563591, BD BioSciences, San Jose, CA））、又はAlexa-flour647標識 IgG2a アイソタイプ対照抗体（クローン G155-178、カタログ番号 557715、BD バイオサイエンス）で標識した。HLA- DR、DP、DQ 抗体は、ヒトの主要組織適合性 HLA クラス II HLA- DR、DP 及びほとんどの DQ 抗原に特異的に結合する。データ解析をフロー・サイトメトリー（BD バイオサイエンス）によって行い、結果をアイソタイプ対照に対する変化割合として表した。
【０１６８】
５．ヒト CD47 表面分子の検出
ヒト iPSCs、iCMs 及び iECs を 6 ウェル・プレートに播種し、100 ng/ml のヒト IFNg（ぺプロテック、ロケット・ヒル、ニュー・ジャージ（Peprotech, Rocket Hill, NJ）で刺激した。細胞を採取し、PerCP-Cy5 結合 CD47（クローン B6H12、カタログ番号 561261、BD バイオサイエンス、サンノゼ、カリフォルニア州（clone B6H12, cat. No. 561261, BD BioSciences, San Jose, CA））、又は PerCP-Cy5 結合 IgG1 アイソタイプ対照抗体（クローン MOPC-21、カタログ番号 550795、BD バイオサイエンス）で標識した。B6H12 CD47 モノクローナル抗体は、42-52 kDa の N 結合型グリカン・タンパク質である CD47 に特異的に結合する。データ解析をフロー・サイトメトリー（BD バイオサイエンス）によって行い、結果をアイソタイプ対照に対する変化割合として表した。
【０１６９】
６．マウスMHC I表面分子の検出
miPSC、miEC、miSMC 及び miCM 上の MHC I 表面分子を検出することに関し、細胞をゼラチン・コートした 6 ウェル・プレートに播種し、100 ng/ml のマウス IFNg（ぺプロテック、ロケット・ヒル、ニュー・ジャージ（Peprotech, Rocket Hill, NJ）で刺激した。細胞を採取し、PerCP-eFlour710 標識 MHCI 抗体（クローンAF6-88.5.5.3、カタログ番号 46-5958-82、eバイオサイエンス、サンタ・クララ、カリフォルニア州（clone AF6-88.5.5.3, cat.No. 46-5958-82, eBioscience, Santa Clara, CA））、又はPerCP-eFlour710 標識 IgG2b アイソタイプ対照抗体（クローンeB149/10H5、カタログ番号 46-4031-80、eバイオサイエンス）で標識した。前記 MHCI 抗体は H-2Kb MHC クラス I 同種抗原と反応する。データ解析をフロー・サイトメトリー（BD バイオサイエンス）によって行い、結果をアイソタイプ対照に対する変化割合として表した。
【０１７０】
７．マウス MHC II 表面分子の検出
miPSC、miEC、miSMC 及び miCM 上の MHC II 表面分子を検出することに関し、細胞をゼラチン・コートした 6 ウェル・プレートに播種し、100 ng/ml のマウス TNFa（ぺプロテック、ロケット・ヒル、ニュー・ジャージ（Peprotech, Rocket Hill, NJ）で刺激した。細胞を採取し、PerCP-eFlour710 標識 MHC II 抗体（クローンM5/114.15.2、カタログ番号 46-5321-82、eバイオサイエンス、サンタ・クララ、カリフォルニア州（clone M5/114.15.2, cat.No. 46-5321-82, eBioscience, Santa Clara, CA））、又はPerCP-eFlour710 標識 IgG2a/K アイソタイプ対照抗体（クローン eBM2a、カタログ番号46-4724-80、eバイオサイエンス）で標識した。前記 MHC II 抗体は、マウス主要組織適合抗原クラス II で、I-A 及び I-E サブ領域の両方にコードされた糖タンパク質と反応する。データ解析をフロー・サイトメトリー（BD バイオサイエンス）によって行い、結果をアイソタイプ対照に対する変化割合として表した。
【０１７１】
８．マウス Cd47 表面分子の検出
miPSC、miEC、miSMC 及び miCM 上の Cd47 表面分子を検出することに関し、細胞をゼラチン・コートした 6 ウェル・プレートに播種し、100 ng/ml のマウス IFNg（ぺプロテック、ロケット・ヒル、ニュー・ジャージ（Peprotech, Rocket Hill, NJ）で刺激した。細胞を採取し、Alexa Fluor 647 標識 Cd47 抗体（クローン miap301、カタログ番号 563584、BD バイオサイエンス、サン・ノゼ、カリフォルニア州（clone miap301, cat.No. 563584, BD BioSciences, San Jose, CA））、又は Alexa Fluor 647 標識 IgG2a/K アイソタイプ対照抗体（クローン R35-95、カタログ番号 557690、BD バイオサイエンス）で標識した。前記 Cd47 抗体は、インテグリン結合タンパク質（IAP）としても知られている CD47 の細胞外ドメインに特異的に結合する。データ解析をフロー・サイトメトリー（BD バイオサイエンス）によって行い、結果をアイソタイプ対照に対する変化割合として表した。
【０１７２】
９．同種異系移植後の in vivo でのマウス細胞形態の決定
同種異系マウスを誘導チャンバーに入れ、2 % イソフルラン（Isothesia、Butler Schein）で麻酔を誘導した。250 μl の 0.9% 食塩水中の 100 万個（1 mio）の細胞（miPSC 由来の心筋細胞（miCM）、miPSC 由来の平滑筋細胞（miSMC）又は miPSC 由来の内皮細胞（miEC）のどれか）を、250 μl の BD マトリゲル高濃度（BD Matrigel High Concentration）と混合し（1:1；BD バイオサイエンス）、23-G シリンジを使用してマウスの下背部に皮下注射した。移植した 1、2、3、4、5、6、8、10 及び 12 週間後に、マトリゲル・プラグを摘出し、4% パラホルムアルデヒド及び 1% グルテンアルデヒドで 24 時間固定し、続いて脱水し、パラフィン中に包埋した。5 μm 厚の切片を切り出し、そしてヘマトキシリン及びエオシン（HE）で染色した。
【０１７３】
１０．同種異系移植後の in vivo でのヒト細胞形態の決定
ヒト化 NSG-SGM3 マウスを誘導チャンバーに入れ、2 % イソフルラン（Isothesia、Butler Schein）で麻酔を誘導した。ZVAD（100 mM、ベンジルオキシカルボニル-Val-Ala-Asp（O-メチル）-フルオロメチル・ケトン、カルビオケム（Calbiochem））、Bcl-XL BH4（細胞浸透性 TAT ペプチド、50nM、カルビオケム）、シクロスポリンＡ（200 nM、シグマ）、IGF-1（100 ng/ml、ぺプロテック）及びピナシジル（50 mM、シグマ）を含む 250 μl の 0.9% 食塩水中の 100 万個（1 mio）の細胞（hiPSC 由来の心筋細胞（hiCM）、又は hiPSC 由来の内皮細胞（hiEC）のどれか）を、250 μl の BD マトリゲル高濃度（BD Matrigel High Concentration）と混合し（1:1；BD バイオサイエンス）、23-G シリンジを使用してマウスの下背部に皮下注射した。移植した 2、4、6、8、10 及び 12 週間後に、マトリゲル・プラグを摘出し、4% パラホルムアルデヒド及び 1% グルテンアルデヒドで 24 時間固定し、続いて脱水し、パラフィン中に包埋した。5 μm 厚の切片を切り出し、そしてヘマトキシリン及びエオシン（HE）で染色した。
【０１７４】
Ｂ．実施例１：マウス・モデルにおけるβ-2 ミクログロブリン・ノックアウト多能性細胞の作製
＜人工多能性細胞の作製＞：低免疫多能性細胞をマウスの実施形態で作製した。ヒト低免疫多能性細胞は、本明細書に記載の戦略を用いて作製される別の実施形態である。
【０１７５】
マウス人工多能性幹細胞（miPSCs）は、C57BL/6 線維芽細胞から作製した。マイトマイシン阻害 CF1 マウス胚性線維芽細胞（MEF、アプライド・ステムセル社、カリフォルニア州）を融解し、10% 熱非働化したウシ胎児血清（FCS hi）、1% MEM-NEAA 及び 1% ペン・ストレップ（Pen Strep（サーモフィッシャーサイエンティフィック‐ギブコ、ウォルサム、マサチューセッツ州））を添加した DMEM ＋ GlutaMax 31966（ギブコ、グランド・アイランド、ニューヨーク）中で維持した。MEF フィーダー細胞が 100% コンフルエントの単層を形成した後、15% KO 血清代替物、1% MEM-NEAA、1% ペン・ストレップ（サーモフィッシャーサイエンティフィック‐ギブコ）、1×β-メルカプトエタノール及び 100 ユニットの LIF（ミリポア、ビルリカ（Billerica）、マサチューセッツ州）を添加した KO DMEM 10829 中の MEF 上で miPSCs を増殖させた。細胞を 10cm ディッシュで維持し、培地を毎日交換し、0.05% トリプシン‐EDTA（サーモ・フィッシャー‐ギブコ）を用いて 2-3 日毎に細胞を継代した。標準培地を用いてフィーダー無しで miPSC をゼラチン（ミリポア）上で培養した。MycoAlert キット（ロンザ、ケルン、ドイツ）を用いて、細胞培養物をマイコプラズマ感染について定期的にスクリーニングした。
【０１７６】
＜マウス＞：BALB/c（BALB/c AnNCr1、H2d）、C57BL/6（C57BL/6J、B6、H2b）、BALB/c ヌード（BALB/c NU/NU、CAnN.CgFoxn1<nu>/Crl, H2d）及び Scid ベージュ（CBySmn.CB17-Prkdcscid/J）（全て 6-12 週齢）を、異なるアッセイのレシピエントとして使用した（全て 6-12 週齢）。マウスはチャールス・リバー・ラボラトリ（ズルツフェルト、ドイツ）（Charles River Laboratories（Sulzfeld、Germany））から購入し、実験動物原則の指針（the Guide for the Principles of Laboratory Animals）に従って人道的なケアを受けた。動物実験は、ハンブルクの「健康および消費者保護局（Amt fur Gesundheit und Verbraucherschutz）」が承認し、地域及び EU のガイドラインに従って行った。
【０１７７】
＜多能性の確認＞：多能性を rtPCR によって明らかにした。PureLink RNA Miniキット（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック）を用いて RNA を抽出した。混入しているゲノム DNA を除去するために DNase I のステップを入れた。Applied Biosystems（登録商標）High-Capacity cDNA 逆転写キットを用いて cDNA を作製した。逆転写酵素無し（RT 無し）の対照も、全ての RNA サンプルから作製した。AmpliTaq Gold 360 Master Mix（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック‐アプライド・バイオシステム、ウォルサム、マサチューセッツ州）を使用し、遺伝子特異的プライマーを用いて標的配列を増幅した。PCR 反応を、2% アガロース・ゲルで可視化した。細胞性の細胞骨格タンパク質をコードする構成的に発現しているハウスキーピング遺伝子（Actb）を増幅する陽性対照プライマー・セットを入れた。結果を図２に示す。多能性マーカー Nanog、Oct4、Sox2、Esrrb、Tbx3、Tcl1 は、miPSC 細胞を rtPCR することによっては検出されたが、親線維芽細胞では検出されなかった。
【０１７８】
多能性も免疫蛍光によって試験した。miPSC を 24 ウェル・ディッシュに播種し、播種の 48 時間後に RT-PCR 及び免疫細胞化学（ICC）解析のための処理をした。ICC については、Image-iT 固定／透過処理キット（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ州）を用いて細胞を固定、透過処理、そしてブロッキングをした。細胞を Sox2 及び Oct4 に対する一次抗体で 4℃ で一晩染色した。数回洗浄した後、前記細胞をAlexaFluor 488 二次抗体及び NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック）と共にインキュベートした。染色した細胞は、蛍光顕微鏡を用いて画像化し、そして Sox2 及び Oct4 について陽性であった。データは示さない。
【０１７９】
図３は、機能アッセイにより、多能性を更に確認したことを示す。2×106個の miPSC 細胞を、レシピエント C57BL/6（同系）、BALB/c（同種異系）、BALB/c ヌード（同種異系だが T 細胞欠損）、及び Scid ベージュ（免疫不全）マウスの大腿筋に注射した。免疫応答性の同種異系 BALB/c マウスを除く全てのマウスで奇形腫が形成された。
【０１８０】
＜β-2 ミクログロブリン・ノックアウト＞：CRISPR 技術を B2m 遺伝子のノックアウトに使用した。マウスβ-2‐ミクログロブリン（B2m）遺伝子のコーディング配列を標的とするために、キットの説明書に従って（GeneArt CRISPR ヌクレアーゼ・ベクター・キット、サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ州）、CRISPR 配列5’-TTCGGCTTCCCATTCTCCGG(TGG)-3’ をアニーリングさせ、そして Cas9 発現カセットを含むオールインワン（AIO）ベクターに連結させた。（機能はしたが、それほど効果的ではなかった別の CRISPRs は、5’-GTATACTCACGCCACCCAC(CGG)-3’ 及び 5’-GGCGTATGTATCAGTCTCAG(TGG)-3’ であった）。20ms の持続時間の 2 つの 1200V パルスでの Neon エレクトロポレーションを使用して、miPSC に前記 AIO ベクターをトランスフェクトした。トランスフェクトした iPSC 培養物を、0.05% トリプシン（ギブコ）を用いて単一細胞になるようにバラバラに解離させ、次いで、前方散乱及び側方散乱放出を選択的にゲーティングすることによって 2 個の塊及び残骸を除去するために、FACSAria（商標）セル・ソーター（BD バイオサイエンス、フランクリン・レイクス、ニュージャージー州）で選別した。単一細胞をフルサイズのコロニーになるまで増殖させ、そして CRISPR 切断部位に異常な配列が存在することをスクリーニングして、CRISPR 編集を試験した。簡単に説明すると、AmpliTaq Gold Mastermix（サーモ・フィッシャー‐アプライド・バイオシステム、ウォルサム、マサチューセッツ州）及びプライマー B2m gDNA：
F:  5’-CTGGATCAGACATATGTGTTGGGA-3’,
R:  5’-GCAAAGCAGTTTTAAGTCCACACAG-3’
を使用して、PCRによって前記標的配列を増幅した。
【０１８１】
得られた PCR 産物をクリーンアップした後（PureLink（登録商標）Pro 96 Pro Purification Kit、サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ州）、Ion Personal Genome Machine（PGM（商標）、サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック）を使用してサンガー・シークエンシングを行った。同質性（homogeneity）、即ち B2m 遺伝子の 250 bp 領域、を同定するためのシークエンシングを、プライマー B2m gDNA PGM： 
F: 5’-TTTTCAAAATGTGGGTAGACTTTGG-3’ 及び
R: 5’- GGATTTCAATGTGAGGCGGGT-3’  
を用いて PCR 増幅した。
【０１８２】
前記 PCR 産物を前述のように精製し、Ion PGM Hi-Q テンプレート・キット（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック）を用いて調製した。実験は、Ion 318（商標）Chip Kit v2（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック）を用いて Ion PGM（商標）システムで行った。多能性についての解析を再度行った。
【０１８３】
図４に見られるように、β-2‐ミクログロブリンの発現は、miPSC 細胞においてノックアウトされていた。MHC-1 の発現は IFN-γ 刺激によって誘導されなかった（右パネル）。対照として、親の miPSC 細胞を IFN-γ で刺激した（左パネル）。
【０１８４】
Ｃ．実施例2：β-2 ミクログロブリン/Ciita ダブル‐ノックアウト多能性細胞の作製
Ciita 遺伝子を更にノックアウトするために、CRIPSR 技術を使用した。マウス Ciita 遺伝子のコーディング配列を標的とするために、キットの説明書に従って（GeneArt CRISPR ヌクレアーゼ・ベクター・キット、サーモ・フィッシャー、ウォルサム、マサチューセッツ州）、CRISPR 配列 5’- GGTCCATCTGGTCATAGAGG (CGG)-3’ をアニーリングさせ、そして、Cas9 発現カセットを含むオールインワン（AIO）ベクターに連結させた。B2m-KO についてと同じ条件を用いて、miPSC に前記 AIO ベクターをトランスフェクトした。トランスフェクトした iPSC 培養物を、0.05% トリプシン（サーモ・フィッシャー‐ギブコ）を用いて単一細胞になるようにバラバラに解離させ、次いで、前方散乱及び側方散乱放出を選択的にゲーティングすることによって 2 個の塊及び残骸を除去するために、FACSAria（商標）セル・ソーター（BD バイオサイエンス、フランクリン・レイクス、ニュージャージー州）で選別した。単一細胞をフルサイズのコロニーになるまで増殖させ、そして CRISPR 切断部位に異常な配列が存在することをスクリーニングして、CRISPR 編集を試験した。簡単に説明すると、AmpliTaq Gold Mastermix（サーモ・フィッシャー‐アプライド・バイオシステム、ダルムシュタット、ドイツ）及びプライマー Ciita gDNA：F: 5’-CCCCCAGAACGATGAGCTT-3’, R: 5’-TGCAGAAGTCCTGAGAAGGCC-3’ を使用して、PCRによって前記標的配列を増幅した。得られた PCR 産物をクリーンアップした後（PureLink（登録商標）Pro 96 Pro Purification Kit、サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ州）、サンガー・シークエンシングを行った。次いで、DNA 配列クロマトグラムを用いて、CRISPR 切断部位に異常な配列が存在することを通して、編集されたクローンを同定した。インデル・サイズは TIDE ツールを使用して計算した。細胞の多能性状態を確認するために、PCR 及び ICC を再度行った。
【０１８５】
図５によって、miPSC/β-2-ミクログロブリン/Ciita ダブル・ノックアウトであることが確認される。MHC-II は、TNF-α によって、MHC-II を発現するように誘導され得なかった。
【０１８６】
Ｄ．実施例３：β-2ミクログロブリン/Ciitaダブルノックアウト-Cd47+ 多能性細胞の作製
Cd47 発現ベクターを上記で作製した B2m/Ciita ダブルノックアウト miPSC に導入した。抗生物質耐性カセット・ブラストサイジンを含むレンチウイルスを用いて、前記ベクターを送達した。前記 Cd47 遺伝子配列を合成し、そしてその DNA をブラストサイジン耐性マーカーを含むプラスミド Lentivirus pLenti6/V5（サーモ・フィッシャー、ウォルサム、マサチューセッツ州）にクローニングした。サンガー・シークエンシングを行い、変異が生じていないことを確認した。1×107 TU/ml のストック力価でレンチウイルスを作製した。その組換えベクターを 2×105 個の B2m-KO/Ciita ダブルノックアウト miPSCs に 1:10 の MOI 比で形質導入し、72 時間ブラストサイジン耐性 MEF 細胞上で増殖させ、続いて 7 日間 12.5 μg/ml ブラストサイジンを使って抗生物質による選択をした。Cd47 mRNA を RT-qPCR 増幅することによって、及び Cd47 をフロー・サイトメトリーで検出することによって、抗生物質による選択をしたプールを試験した。Cd47 の発現が確認された後、前記細胞を増殖させて多能性アッセイに供した。
【０１８７】
図６Ａは、β-2‐ミクログロブリン／Ciita ダブル‐ノックアウト（iPShypo細胞）に加えた導入遺伝子から、Cd47 の発現が増加していることを示す。図６Ｂは、同種異系 BALB/c の環境で、C57BL/6 iPShypo 細胞は生存するが、その親 iPS 細胞は生存しないことを示す。この画期的な結果によって、低免疫多能性細胞が、低免疫多能性細胞でない細胞にとって不適合宿主である宿主に移植したときに、生き残ることが確認された。
【０１８８】
Ｅ．mHIP 細胞からのマウス細胞の分化
＜膵島細胞＞：前記 mHIP 細胞を、Liu et al., Exp. Diabetes Res 2012:201295 (doi:10.1155/2012/201295)（参照により本明細書に取り込まれ、特にその中に概説されている分化技術について本明細書に取り込まれる）を基に適合させた技術を使用して、膵島細胞に分化させた。iPS 細胞をゼラチン・コートしたフラスコに 30 分間移してフィーダー層を除去し、2 mM グルタミン、100 μM 非必須アミノ酸、10 ng/mL アクチビン A、10 mM ニコチンアミド、及び 1 μg/mL ラミニンを補充した、10 ％ FBS の DMEM/F-12 培地中、1 ウェル当たり 1×106 細胞で、コラーゲンIコートしたプレートに播種した。次に、ES-D3 細胞を、2 mM L-グルタミン、100 μM 非必須アミノ酸、10 ng/mL アクチビンA、10 mM ニコチンアミド、25 μg/mL インスリン、及び 1 μg/mL ラミニンを補充した、2％ FBS の DMEM/F-12 培地中に、6 日間置いた。
【０１８９】
＜神経幹細胞＞：前記 mHIP 細胞を、Abraches et al., doi:10.1371/journal.pone.0006286（参照により本明細書に取り込まれ、特にその中に概説されている分化技術について本明細書に取り込まれる）を基に適合させた技術を使用して、神経細胞に分化させた。単層プロトコールを開始するために、ES 細胞を無血清培地 ESGRO Complete Clone Grade 培地（ミリポア）に高密度（1.5 x 105 細胞//cm2 ）で播種した。24 時間後、ES 細胞を穏やかにバラバラに解離させ、RHB-A 又は N2B27 培地（ステムセル・サイエンス社（StemCell Science Inc.））中、1×104 細胞//cm2で、0.1 %（v/v）ゼラチンコートした組織培養プラスチック上に播種し、1 日おきに培地を交換した。4 日目の再播種に関して、細胞をバラバラに解離させ、5 ng/ml のマウス bFGF（ぺプロテック（Peprotech））を補充した RHB-A 培地中、ラミニン・コートした組織培養プラスチック上に、2×104細胞/cm2 で播種した。この時点から、細胞を 4 日毎に同じ条件で再播種し、培地を 2 日毎に交換し、全部で 20 日間培養した。各時点で分化しているニューロンの数を定量するために、24 ウェルの Nunc プレート中に置いたラミニン・コートしたガラス・カバーガラス上に、細胞を播種し、播種の２日後、培地を RHB-A ：Neurobasal：B27 混合物（1:1:0.02）に変えて、分化したニューロンがより良く生き残るようにした。
【０１９０】
＜平滑筋細胞＞：前記 mHIP 細胞を、Huang et al., Biochem Biophys Res Commun 2006:351(2)321-7（参照により本明細書に取り込まれ、特にその中に概説されている分化技術について本明細書に取り込まれる）を基に適合させた技術を使用して、SM 細胞に分化させた。再懸濁した iPSCs 細胞を、6 ウェルのゼラチン・コートしたプラスチック・ペトリ皿（ファルコン、ベクトン‐ディッキンソン）上、1 ウェルあたり 200 万個（2 mio）の細胞、10 μM atRA の 2 mlの分化培地中、37℃、5 % CO2で、それぞれ培養した。前記分化培地を、DMEM、15% ウシ胎児血清、2 mM L-グルタミン、1 mM MTG（シグマ）、1 % 非必須アミノ酸、ペニシリン、及びストレプトマイシンを組成として作製した。新しい培地に毎日交換しながら培養を 10 日間続けた。
【０１９１】
11 日目から、前記分化培地を、ノックアウト DMEM、15 % ノックアウト血清代替物、2 mM L-グルタミン、1 mM MTG、1 % 非必須アミノ酸、ペニシリン、及びストレプトマイシンからなる無血清培地で置き換えた。無血清培地を毎日交換しながら培養を更に 10 日間続けた。
【０１９２】
＜心筋細胞＞：前記 mHIP 細胞を、Kattman et al., Cell Stem Cell 8:228-240 (2011)（参照により本明細書に取り込まれ、特にその中に概説されている分化技術について本明細書に取り込まれる）を基に適合させた技術を使用して、CM 細胞に分化させた。
【０１９３】
＜内皮細胞＞：前記 mHIP 細胞を、既知のように内皮細胞に分化させた。
【０１９４】
Ｆ．実施例４：HIP 細胞誘導体（derivatives）の同種異系移植は、完全免疫応答性のレシピエントにおいて長期生存を示す。
ａ．マウス：
BALB/c（BALB/c AnNCr1、H2d）、C57BL/6（C57BL/6J、B6、H2b）、BALB/c ヌード（BALB/c NU/NU、CAnN.CgFoxn1<nu>/Crl, H2d）及び Scid ベージュ（CBySmn.CB17-Prkdcscid/J）（全て 6-12 週齢）を、異なるアッセイのレシピエントとして使用した（全て 6-12 週齢）。実験群当たりの動物数を各図に示す。マウスはチャールス・リバー・ラボラトリ（ズルツフェルト、ドイツ）（Charles River Laboratories（Sulzfeld、Germany））から購入し、実験動物原則の指針（the Guide for the Principles of Laboratory Animals）に従って人道的なケアを受けた。動物実験は、ハンブルクの「健康および消費者保護局（Amt fur Gesundheit und Verbraucherschutz）」が承認し、地域及び EU のガイドラインに従って行った。
【０１９５】
ｂ．RT-PCR 及び IF による多能性解析：
miPSC を 24 ウェル・プレートに播種し、播種 48 時間後に RT-PCR 及び免疫蛍光（IF）解析のための処理をした。ICC については、Image-iT（商標）固定／透過処理キット（サーモ・フィッシャー・カタログ番号、R37602）を用いて細胞を固定、透過処理、そしてブロッキングをした。細胞を Sox2、SSEA-1、Oct4、及びアルカリホスファターゼに対する一次抗体で 4℃ で一晩染色した。数回洗浄した後、前記細胞をAlexaFluor 488 二次抗体及び NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent（すべてサーモ・フィッシャー・サイエンティフィック）と共にインキュベートした。染色細胞を蛍光顕微鏡を用いて画像化した。
【０１９６】
RT-PCRのために、PureLink（商標）RNA Miniキット（サーモ・フィッシャー・カタログ番号 12183018A）を用いて RNA を抽出した。混入しているゲノム DNA を除去するために DNase I のステップを入れた。Applied Biosystems（登録商標）High-Capacity cDNA 逆転写キットを用いて cDNA を作製した。逆転写酵素無し（RT 無し）の対照も、全ての RNA サンプルから作製した。AmpliTaq Gol（登録商標）360 Master Mix（サーモ・フィッシャー・カタログ番号 4398876）を使用し、遺伝子特異的プライマーを用いて標的配列を増幅した。PCR 反応を、2% アガロース・ゲルで可視化した。細胞性の細胞骨格タンパク質をコードする構成的に発現しているハウスキーピング遺伝子（Actb）を増幅する陽性対照プライマー・セットを入れた。
【０１９７】
ｃ．マウス iPSCs の遺伝子編集：
miPSCs は、3 つの遺伝子編集ステップを受けた。まず最初のステップでは、マウス B2m 遺伝子のコーディング配列を標的とする CRISPRs をアニーリングさせ、そして Cas9 発現カセットを含有するベクターに連結した。トランスフェクトした miPSCs は、単一細胞になるようにバラバラに解離させ、コロニーになるように増殖させ、シークエンシングをし、そして同質性（homogenicity）について試験をした。2 番目のステップでは、これらの B2m-/- miPSCs に、MHC II 分子のマスター・レギュレーターである Ciita を標的とする CRISPRs を含むベクターをトランスフェクトした。増殖させた単一細胞コロニーのシークエンシングをし、CRISPR 切断部位に異常な配列が存在することを通して、B2m-/- Ciita-/- クローンを同定した。3 番目のステップでは、Cd47 遺伝子配列を合成し、そしてその DNA をブラストサイジン耐性を有するプラスミド・レンチウイルスにクローニングした。B2m-/- Ciita-/- miPSCs にブラストサイジンの存在下でトランスフェクトし、増殖させた。抗生物質で選択したプールを Cd47 の過剰発現について試験し、B2m-/- Ciita-/- Cd47 tg miPSCs を増殖させた。FACS 解析によって、wt miPSCs において、高い MHC I の発現、僅かではあるが検出可能な MHC II の発現、及び極僅かな Cd47 発現が示された。wt miPSCs から作製した miPSC 株においては、MHC I の発現、MHC II の発現、の欠如、及び Cd47 の過剰発現が確認された。全ての改変した miPSC 株を多能性について試験した。多能性は、3 つの改変ステップ後の B2m-/- Ciita-/- Cd47 tg miPSCs において確認され、及びそれらの細胞が全ての 3 胚葉に由来する細胞を形成する可能性を持つことが確認された。
【０１９８】
ｄ．B2m-/- miPSC の作製：
CRIPSR 技術を、B2m 遺伝子をノックアウトするために使用した。マウス・ベータ-2-ミクログロブリン（B2m）遺伝子のコーディング配列を標的とするために、キットの説明書に従って（GeneArt CRISPR ヌクレアーゼ・ベクター・キット、サーモ・フィッシャー、ウォルサム、マサチューセッツ州）、CRISPR 配列 5’- TTCGGCTTCCCATTCTCCGG(TGG)-3’ をアニーリングさせ、そして Cas9 発現カセットを含むオールインワン（AIO）ベクターに連結させた。20ms の持続時間の 2 つの 1200V パルスでの Neon エレクトロポレーションを使用して、miPSC に前記 AIO ベクターをトランスフェクトした。トランスフェクトした iPSC 培養物を、0.05% トリプシン（ギブコ）を用いて単一細胞になるようにバラバラに解離させ、次いで、前方散乱及び側方散乱放出を選択的にゲーティングすることによって 2 個の塊及び残骸を除去するために、FACSAria セル・ソーター（BD バイオサイエンス、フランクリン・レイクス、ニュージャージー州）で選別した。単一細胞をフルサイズのコロニーになるまで増殖させ、そして CRISPR 切断部位に異常な配列が存在することをスクリーニングして、CRISPR 編集を試験した。簡単に説明すると、AmpliTaq Gold Mastermix（アプライド・バイオシステム、ダルムシュタット、ドイツ）及びプライマー B2m gDNA F:  5’-CTGGATCAGACATATGTGTTGGGA-3’, R:  5’-GCAAAGCAGTTTTAAGTCCACACAG-3’ を使用して、PCRによって前記標的配列を増幅した。得られた PCR 産物をクリーンアップした後（PureLink（登録商標）Pro 96 Pro Purification Kit、サーモ・フィッシャー）、サンガー・シークエンシングを行った。同質性（homogeneity）を同定するための Ion Personal Genome Machine（PGM）シークエンシングを使用して、B2m 遺伝子の 250 bp 領域を、プライマー B2m gDNA PGM F: 5’-TTTTCAAAATGTGGGTAGACTTTGG-3’ 及び R: 5’- GGATTTCAATGTGAGGCGGGT-3’ を用いて PCR 増幅した。前記 PCR 産物を前の記載のように精製し、そして Ion PGM Hi-Q テンプレート・キット（サーモ・フィッシャー）を用いて調製した。実験は、Ion 318（商標）Chip Kit v2（サーモ・フィッシャー）を用いて Ion PGM（商標）システムで行った。多能性についての解析を再度行った。
【０１９９】
当該分野で以前に報告されたように、B2m-/- iPSCs の増殖速度又は分化能力の低下は観察されなかった。
【０２００】
ｅ．B2m-/- 及びCiita-/- miPSCs の作製：
Ciita 遺伝子を更にノックアウトするために、CRIPSR 技術を使用した。マウス Ciita 遺伝子のコーディング配列を標的とするために、キットの説明書に従って（GeneArt CRISPR ヌクレアーゼ・ベクター・キット、サーモ・フィッシャー、ウォルサム、マサチューセッツ州）、CRISPR 配列 5’- GGTCCATCTGGTCATAGAGG (CGG)-3’ をアニーリングさせ、そして、Cas9 発現カセットを含むオールインワン（AIO）ベクターに連結させた。B2m-KO についてと同じ条件を用いて、miPSC に前記 AIO ベクターをトランスフェクトした。トランスフェクトした miPSC 培養物を、0.05% トリプシン（ギブコ）を用いて単一細胞になるようにバラバラに解離させ、次いで、前方散乱及び側方散乱放出を選択的にゲーティングすることによって 2 個の塊及び残骸を除去するために、FACSAria セル・ソーター（BD バイオサイエンス、フランクリン・レイクス、ニュージャージー州）で選別した。単一細胞をフルサイズのコロニーになるまで増殖させ、そして CRISPR 切断部位に異常な配列が存在することをスクリーニングして、CRISPR 編集を試験した。簡単に説明すると、AmpliTaq Gold Mastermix（アプライド・バイオシステム、ダルムシュタット、ドイツ）及びプライマー Ciita gDNA：F: 5’-CCCCCAGAACGATGAGCTT-3’, R: 5’-TGCAGAAGTCCTGAGAAGGCC-3’ を使用して、PCRによって前記標的配列を増幅した。得られた PCR 産物をクリーンアップした後（PureLink（登録商標）Pro 96 Pro Purification Kit、サーモ・フィッシャー）、サンガー・シークエンシングを行った。次いで、DNA 配列クロマトグラムを用いて、CRISPR 切断部位に異常な配列が存在することを通して、編集されたクローンを同定した。インデル・サイズは TIDE ツールを使用して計算した。細胞の多能性状態を確認するために、PCR 及び ICC を再度行った。
【０２０１】
ｆ．B2m-/- Ciita-/- Cd47 tg miPSCs の作製：
抗生物質耐性カセット・ブラストサイジンを含む Cd47 発現ベクターをレンチウイルスによって送達した後に、抗生物質耐性による選択を行うことで、細胞株 B2m-KO, Ciita-KO 及び Cd47-tg iPSC を作製した。前記 Cd47 遺伝子配列を合成し、そしてその DNA をブラストサイジン耐性を含むプラスミド Lentivirus pLenti6/V5（サーモ・フィッシャー）にクローニングした。サンガー・シークエンシングを行い、変異が生じていないことを確認した。1×107 TU/ml のストック力価でレンチウイルスを作製した。2×105 個の B2m-/- Ciita-/- miPSCs に 1:10 の MOI 比で形質導入を行い、72 時間ブラストサイジン耐性 MEF 細胞上で増殖させ、続いて 7 日間 12.5 μg/ml ブラストサイジンを使って抗生物質による選択をした。Cd47 mRNA を RT-qPCR 増幅することによって、及び Cd47 をフロー・サイトメトリーで検出することによって、抗生物質による選択をしたプールを試験した。Cd47 の発現が確認された後、前記細胞を増殖させて、続けて多能性アッセイによる確認を行った。
【０２０２】
ｇ．iPSC 由来内皮細胞（iECs）の誘導及び同定
iECs を、三次元アプローチを用いて誘導した。簡単に説明すると、分化を開始するために、白血病阻害因子（LIF）が非存在の EBM2 培地（ロンザ）中、iPSCs を超低、非接着性ディッシュ中で培養して、胚様体（EB）凝集体を形成させた。4 日間の懸濁培養の後、前記 EB を 0.2% ゼラチン・コートしたディッシュに再付着させ、そして VEGF-A165（50 ng/mL；ぺプロテック（Peprotech））を補充した EBM2 培地中で培養した。分化 3 週間の後、細胞解離緩衝液（ライフ・テクノロジー（Life Technologies））を使用して単細胞懸濁液を得て、APC 結合 CD31 （eBiosciences）及び PE 結合 CD144（BD バイオサイエンス）抗マウス抗体で標識した。iECs を CD31+ CD144+ 集団の蛍光活性化細胞選別（fluorescence activated cell sorting（FACS））によって精製した。iECs を、組換えマウス血管内皮増殖因子（50 ng/ml）を補充した EBM2 培地中で維持した。
【０２０３】
それらの表現型は、CD31 及び VE カドヘリンについての免疫蛍光、並びに PCR 及び管形成アッセイ（成熟前の血管構造を形成するという内皮機能を実証するためのアッセイ）によって確認した。注：0.1% ゼラチン又はマトリゲル上のコンフルエントな iPSC 単層を用いた分化プロトコルも成功した。注：他の内皮細胞培地を使用しても成功した。
【０２０４】
ｈ．iPSC 由来平滑筋細胞（iSMCs）の誘導及び同定：
再懸濁した iPSCs を、6 ウェル、0.1 % ゼラチン・コートしたプラスチックペトリ皿（ファルコン、ベクトン‐ディッキンソン）上、10 μM の存在の 2 ml の分化培地中、37℃、5% CO2で、1 ウェルあたり 200 万個（2 mio）の細胞で、培養した。前記分化培地を、DMEM、15 % ウシ胎児血清、2 mM L-グルタミン、1 mM MTG （シグマ）、1 % 非必須アミノ酸、ペニシリン、及びストレプトマイシンを組成として作製した。前記培養を、毎日培地を交換しながら 10 日間続けた。
【０２０５】
11 日目から、前記分化培地をノックアウト DMEM の無血清培地：15 % ノックアウト血清代替物、2 mM L-グルタミン、1 mM MTG 、1 % 非必須アミノ酸、ペニシリン、及びストレプトマイシン、と交換した。前記培養を、無血清培地を毎日交換しながら、更に 10 日間続けた。その表現型を、SMA 及び SM22 の両方について、免疫蛍光法及び PCR によって確認した。
【０２０６】
ｉ．iPSC 由来心筋細胞（iCMs）の誘導及び同定
分化の前に、iPSCs をゼラチン・コートしたディッシュに 2 回継代してフィーダー細胞を除去した。簡単に説明すると、iPSCs を TrypLE（インビトロゲン）でバラバラに解離させ、追加の増殖因子を加えずに75,000-100,000 細胞/ml で 48 時間培養した。3 日齢の EBs を解離させ、細胞を「心臓条件」において分化させた。簡単に説明すると、6×104- 10×104 個の細胞を、2 mM L-グルタミン、1 mM アスコルビン酸（シグマ）、ヒト-VEGF（5 ng/ml）、ヒト-DKK1（150 ng/ml）、ヒト bFGF（10 ng/ml）、及びヒト FGF10（12.5 ng/ml）（R&D システム）を補充したStemPro-34 SF 培地（インビトロゲン）中、ゼラチンでコートした 96 穴平底プレート（ベクトン・ディッキンソン、フランクリン・レイクス、ニュージャージー州）の個々のウェルに播種した。培養物を 4 又は 5 日後に回収した（合計 7 又は 8 日）。
【０２０７】
それらの表現型は、トロポニン I 及び肉腫アルファ・アクチニン（sarcomeric alpha actinin）についての IF、並びに Gata4 及び Mhy6 についての PCR によって確認した。前記細胞は 8-10 日の間に拍動し始めた。これにより、それらの機能的な分化が証明された。
【０２０８】
ｊ．iPSC 由来膵島細胞（iICs）の誘導及び同定
iPS 細胞をゼラチン・コートしたフラスコに 30 分間移してそのフィーダー層を除去し、そして、2 mM グルタミン、100 μM 非必須アミノ酸、10 ng/ml アクチビン A、10 mM ニコチンアミド、及び 1 μg/mL ラミニンを補充した 10 % FBS の DMEM/F-12 培地中、1 ウェル当たり 1×106 細胞でコラーゲン I コート・プレートに播種して一晩置いた。次に、ES-D3 細胞を、2mM L-グルタミン、100 μM 非必須アミノ酸、10 ng/ml アクチビン A、10 mM ニコチンアミド、25 μg/mL インスリン、及び 1μg/mL ラミニンを補充した 2 ％ FBS の DMEM/F-12 培地中に 6 日間置いた。それらの表現型は、c-ペプチドについては免疫蛍光法、グルカゴン、Ngn3、アミラーゼ、インスリン 2、ソマトスタチン及びインスリンの産生については PCR によって確認した。
【０２０９】
ｋ．iPSC 由来神経細胞（iNCs）の誘導と同定
単層プロトコルを開始するために、iPSCs を穏やかにバラバラに解離させ、RHB-A 又は N2B27 培地（StemCell Science Inc.）中、1×104 細胞/cm2で 0.1 % ゼラチン・コートした組織培養プラスチック上に播種し、1 日おきに培地を交換した。4 日目に再播種するのに、細胞を解離させ、5 ng/ml のマウス bFGF（ぺプロテック（Peprotech））を補充した RHB-A 培地中、ラミニン・コートした組織培養プラスチック上に、2×104細胞/cm2 で播種した。この時点から、細胞を 4 日毎に同じ条件で再播種し、培地を 2 日毎に交換し、全部で 20 日間培養した。各時点で分化しているニューロンの数を定量するために、細胞を 24 ウェル Nunc プレート中のラミニン・コートしたガラス・カバーガラス上に播種し、播種の 2 日後、培地を RHB-A：Neurobasal：B27 混合物（1:1:0.02）に変え、分化したニューロンがより良く生存できるようにした。それらの表現型は、Tuj-1 及びネスチンについて、IF により確認した。
【０２１０】
ｌ．エリスポット（Elispot）・アッセイ
一方向性の酵素結合免疫スポット（エリスポット）（Enzyme-Linked ImmunoSpot（Elispot））・アッセイのために、細胞（miPSC、miPSC B2m-/- 又は miPSC B2m-/- Ciita-/- 又は miPSC B2m-/- Ciita-/- Cd47 tg）を注射した 5 日後に、新鮮な脾臓からレシピエント脾細胞を単離し、これを応答細胞として用いた。ドナー細胞（miPSC、miPSC B2m-/- 又は miPSC B2m-/- Ciita-/- 又は miPSC B2m-/- Ciita-/- Cd47 tg）は、マイトマイシンで阻害され、刺激細胞として機能した。106 個の刺激細胞を 5×105個のレシピエント応答脾細胞と共に 24 時間インキュベートし、IFNγ 及び IL-4 のスポット頻度をエリスポット・プレート・リーダーを用いて自動的に数えた。全てのアッセイは、四連で実施した。
【０２１１】
ｍ．in vivo での iPSC 生存を研究するための奇形腫アッセイ
6 週齢の同系又は同種異系マウスを wtiPSCs 又は非免疫原性 iPSCs 細胞の移植に使用した。1×106個の細胞を 100 μl、マウスの右大腿筋に注射した。移植を受けた動物を一日おきに定期的に観察し、腫瘍の成長をキャリパーで測定した。1.5 cm3を超えるまで腫瘍が成長した後、又は 100 日間の観察期間の後に、それらを屠殺した。
【０２１２】
ｎ．in vitro での NK 細胞アッセイ
wt iPSCs 又は HIP 細胞との共培養後の NK 細胞上の CD107 発現を、NK 細胞活性化マーカーとしてフロー・サイトメトリーによって測定した。エリスポット原理を用いて、NK 細胞を wt iPSCs 又は HIP 細胞と共培養し、NK 細胞から IFN-γ が放出されることを測定した。
【０２１３】
「自己性喪失理論（missing self theory）」によると、MHC I 欠損幹細胞は、マウス及びヒト PSCs の両方の細胞とも NK 受容体を活性化するリガンドを発現しているので、NK による殺傷を受けやすいことが実証されている。この活性化受容体の発現は分化と共に減少することが報告されているが、B2K-/- 誘導体（derivatives）を NK が殺傷することが観察されている。ヒト多能性幹細胞において、HLA-E 又は HLA-G が別々に発現していることは、HLA I -/- 細胞において自然免疫応答が軽減することを期待して使用されてきたが、それらの中には、非常に有効な更なる阻害的な非 MHC リガンドがある。本発明により、Cd47 が自然免疫クリアランスの驚くほど強力な阻害因子であることが判明した。
【０２１４】
ｏ．マウス・データのまとめ
改変した全ての miPSC 株を、免疫抑制をすること無しで、同系の C57BL/6 及び同種異系 BALB/c レシピエントに移植した。全ての改変した細胞は、同系のレシピエント中では、同じように奇形腫へと大きくなったが、同種異系レシピエント中では、改変した細胞の生存は、それらの低免疫原性のレベルに依存した。B2m-/- miPSCs による奇形腫形成はBALB/c 中での 60% であり、僅かなエリスポット応答、及びそれでも測定可能な IgM 抗体応答が観察された。B2m-/- Ciita-/- miPSCs では、同種 BALB/c 中の 91.7% の奇形腫形成、僅かなエリスポット反応、が見られたが抗体反応は見られなかった。最後の B2m-/- Ciita-/- Cd47 tg miPSC 株は 100% の奇形腫形成を示し、そしてエリスポット又は抗体応答を示さなかった。Cd47 過剰発現の寄与を、自然免疫のアッセイを行い、B2m-/- Ciita-/- miPSCs と B2m-/- Ciita-/- Cd47 tg miPSCs との間で比較することによって、更に評価した。Cd47 の過剰発現によって、NK 細胞の CD107 発現及び NK 細胞の IFN-γ 放出が有意に減少し、その結果自然免疫クリアランスは軽減した。要約すると、改変のステップを経るごとに、前記 miPSCs はより低免疫原性になった。
【０２１５】
B2m-/- Ciita-/- HIP 細胞は、低免疫原性内皮様細胞（miECs）、平滑筋様細胞（miSMCs）、及び心筋細胞様細胞（miCMs）に分化した。「野生型」の miPSC 誘導体（derivatives）（即ち、改変していない miPSCs 由来のもの）を対照として用いた。全ての誘導体（derivatives）は、それらの意図された成熟組織細胞株が持つ典型的な形態学的外観、細胞マーカーの免疫蛍光及び遺伝子発現を示した。wt 誘導体（derivatives）における MHC I 及び II 分子の発現は、一般にそれらの親 miPSC 株と比較して大きくアップレギュレートしていたが、細胞型によって著しく変動した。予想通り、miECs は MHC I 及び MHC II の発現が圧倒的に最も高く、miSMCs は中程度の MHC I 及び MHC II の発現であり、一方、miCMs は中程度の MHC I の発現であるが MHC II 発現は非常に低かった。全ての wt 誘導体（derivatives）は、Cd47 の発現はかなり低かったが、miPSCs と比較するとやや高くもあった。全ての B2m-/- Ciita-/- Cd47 tg 誘導体（derivatives）は、MHC I 及び MHC II の完全な欠損、並びにそれらの wt 対応細胞よりも有意に高い Cd47 を、相応に示した。
【０２１６】
5×105個の wt の miECs、miSMCs、及び miCMs を含有するマトリゲル・プラグを、同系の C57BL/6 又は同種異系 BALB/c マウスの皮下叢に移植した。5 日後、全ての同種異系レシピエントは、これらの分化した野生型細胞移植片に対して、強い細胞性免疫応答並びに強い IgM 抗体応答を開始した。これとは著しく対照的に、対応する B2m-/- Ciita-/- Cd47 tg（HIP）誘導体（derivatives）の何れにおいても、IFN-γ エリスポット頻度又は IgM 抗体産生が増加することは検出されなかった。
【０２１７】
移植細胞の形態も確認した。同種異系マウスを誘導チャンバーに入れ、2 % イソフルラン（Isothesia、Butler Schein）で麻酔を誘導した。250 μl の 0.9% 生理食塩水中の 100 万個（1 mio）の細胞（HIP miPSC 由来心筋細胞（miCM）、HIP miPSC 由来平滑筋細胞（miSMC）又は HIP miPSC 由来内皮細胞（miEC））を、250 μl の BD マトリゲル高濃度溶液と混合し（1:1；BD バイオサイエンス）、23-G シリンジを使用してマウスの下背部に皮下注射した。マトリゲル・プラグを移植の 1、2、3、4、5、6、8、10 及び 12 週間後に摘出し、4 % パラホルムアルデヒド及び 1 % グルテンアルデヒドで 24 時間固定し、続いて脱水し、パラフィン中に包埋した。5 μm 厚の切片を切り出し、そしてヘマトキシリン及びエオシン（HE）で染色した。組織学的検査により、形態学的に相応な miCMs、miSMCs、及び miECs を確認した。
【０２１８】
Ｇ．実施例５：ヒト iPSCs の作製
ヒト・エピソーマル iPSC 株は、3 種のプラスミド、7 種の因子（SOKMNLT; SOX2、OCT4（POU5F1）、KLF4、MYC、NANOG、LIN28、及び SV40L T 抗原）、サーモ・フィッシャーの EBNA ベースのエピソーマル系を用いて、CD34+ 臍帯血（カタログ番号 A33124、サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック）から誘導した。この iPSC 株は、リプログラミング・イベントでゲノムの中に統合されるものは何も無いため、ゼロ・フットプリント（zero footprint）であると見なされる。それはどのリプログラミング遺伝子も含んでいないことが示されている。前記 iPSCs は、正常な XX 核型を示し、及び OCT4、SOX2、NANOG（RT-PCR によって示されるように）、OCT4、SSEA4、TRA-1-60 及び TRA-1-81（ICC によって示されるように）のような多能性マーカーを内因性に発現する。方向づけされた分化及び奇形腫の解析において、これらの hiPSC は、外胚葉、内胚葉、及び中胚葉系列への分化能を保持していた。更に、血管系、内皮系、及び心臓系列が、極めて安定な効率で誘導された。
【０２１９】
注：iPSC 作製には、いくつかの遺伝子送達の担体（vehicles）を使用しても成功し、これには、レトロウイルス・ベクター、アデノウイルス・ベクター、センダイ・ウイルス、及びウイルスフリーのリプログラミング方法（エピソーマル・ベクター、piggyBac トランスポゾン、合成 mRNAs、マイクロ RNAs、組換えタンパク質、及び低分子薬剤等を使用する）等が含まれる。、
【０２２０】
注：山中因子として知られている、OCT3/4、SOX2、KLF4、及び C-MYC の最初に報告された組み合わせ等、様々な因子をリプログラミングにうまく使用することができた。ある実施形態では、これらの因子のうち 3 種だけを組み合わせて、且つ C-MYC を除外して成功したが、リプログラミング効率は低下した。
【０２２１】
ある実施形態では、C-MYC の代わりに L-MYC 又は GLIS1によって、リプログラミング効率が改善した。別の実施形態では、リプログラミング因子は多能性に関連する遺伝子に限定されない。
【０２２２】
ａ．統計
全てのデータは、平均値±SD として、又は中央値及び最小値から最大値の範囲を示すボックスブロットグラフで表す。グループ間の差異は、対応のないスチューデントの t 検定又は一元配置分散分析（ANOVA）とボンフェローニの事後検定の何れかによって適切に評価した。* p <0.05、** p <0.01。
【０２２３】
Ｈ．実施例６：ヒト HIP 細胞の作製
ヒト Cas9 iPSC は、2 つの遺伝子編集ステップを受けた。第 1 ステップでは、CRISPR技術を実施したが、CRISPR 配列5'-CGTGAGTAAACCTGAATCTT-3' でヒトβ-2-ミクログロブリン（B2M）遺伝子のコーディング配列を、及び CRISPR 配列5'-GATATTGGCATAAGCCTCCC-3’ でヒト CIITA 遺伝子のコーディング配列を、組み合わせて標的化した。キットの説明書（MEGAshortscript T7 Transcription Kit、サーモ・フィッシャー）に従って、T7 プロモーターを有する線状化 CRISPR 配列を用いて gRNA を合成した。回収した in vitro 転写（IVT）gRNA は、MEGAclear Transcription Clean-Up Kit を使って精製した。IVT gRNA の送達に関しては、単一化した細胞に、300 ng IVT gRNA を、Neon エレクトロポレーション・システムを使用して、エレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの後、編集した Cas9 iPSCs を単一細胞で播種して増殖させた：iPSC 培養物を TrypLE（ギブコ）を用いて単一細胞になるようにバラバラに解離させ、Tra1-60 Alexa Fluor（登録商標）488 及びヨウ化プロピジウム（PI）で染色した。細胞選別には FACS Aria セルソーター（BD バイオサイエンス）を使用し、前方散乱及び側方散乱放出を選択的にゲーティングすることによって 2 個の塊及び残骸を播種細胞から除外した。生存している多能性細胞を、PI により染色されず、且つ Tra1-60 Alexa Fluor 488 で染色されたものとして選択した。次いで、単一細胞をフルサイズ・コロニーになるまで増殖させ、その後、そのコロニーを CRISPR 編集について試験をした。CRISPR を介した切断を、GeneArt Genomic Cleavage Detection Kit（サーモ・フィッシャー）を用いて評価した。ゲノム DNA を 1×106個の hiPSCs から単離し、AmpliTaq Gold 360 Master Mix 並びに B2M については F: 5’-TGGGGCCAAATCATGTAGACTC -3’ 及び R: 5’-TCAGTGGGGGTGAATTCAGTGT-3’、並びに CIITA については F: 5’-CTTAACAGCGATGCTGACCCC-3’ 及び R: 5’-TGGCCTCCATCTCCCCTCTCTT-3’ のプライマー・セットを使用して、B2M 及び CIITA のゲノム DNA 領域を PCR 増幅した。TIDE 解析のために、得られた PCR 産物をクリーン・アップし（PureLink PCR Purification Kit、サーモ・フィッシャー）、インデル頻度の予測のためにサンガー・シークエンシングを行った。B2M/CIITA がノックアウトされていることを確認した後、核型分析及び TaqMan hPSC Scorecard Panel（サーモ・フィッシャー）を行って、細胞を更に同定した。前記 PSC は多能性であることがわかり、そしてゲノム編集のプロセスの間、正常な（46、XX）核型を維持した。
【０２２４】
第 2 ステップでは、CD47 遺伝子を合成し、その DNA を EF1a プロモーター及びピューロマイシン耐性を有するプラスミド・レンチウイルスにクローニングした。1×107TU/mL のレンチウイルス・ストック及び 6 μg/mL のポリブレン（サーモ・フィッシャー）を使って、細胞に形質導入した。形質導入後、培地を毎日交換した。形質導入の 3 日後、細胞を増殖させ、そして 0.5 μg/mL のピューロマイシンで選択した。5 日間の抗生物質による選択の後、抗生物質耐性コロニーが出現したが、安定なプールを作製するために更に増殖させた。CD47 のレベルは qPCR によって確認した。細胞の多能性状態を確認するために、多能性アッセイ（TaqMan hPSC Scorecard Panel、サーモ・フィッシャー）及び核型分析を再度行った。
【０２２５】
Ｉ．実施例７：ヒト HIP 細胞の分化
１．ヒト心筋細胞への hHIP 細胞の分化
これは、Sharma et al., J. Vis Exp. 2015 doi: 10.3791/52628（その全体及び特に細胞を分化させるための技術に関してが、参照により本明細書に取り込まれる）を基に適合させたプロトコールを使用して行った。hiPSCs を 6 ウェル・プレート中の希釈したマトリゲル（356231、コーニング）上に播種し、Essential 8 Flex 培地（サーモ・フィッシャー）中で維持した。前記細胞が 90% のコンフルエンシー（confluency）に達したら、分化させることを開始し、培地を、インスリン不含 2% B-27（ギブコ）及び 6 μM CHIR-99021（セレック・ケム（Selleck Chem））を含む 5mL の RPMI1640（ギブコ）に交換した。2 日後、培地を、CHIR 無しで、インスリン不含 2% B-27を含む RPMI1640 に交換した。3 日目に、5 μLの IWR1 を前記培地に加え、更に 2 日間培養した。5 日目に、前記培地をインスリン不含 2% B-27を含む RPMI1640 培地に戻し、48 時間インキュベートした。7 日目に、培地を、インスリン含有 B27（ギブコ）を含む RPMI1640 に交換し、そしてその後 3 日毎に同じ培地と交換した。心筋細胞の自発的拍動が、およそ 10 日目から 12 日目に最初に見ることができるようになった。分化後 10 日目に、心筋細胞の精製を行った。簡単に説明すると、培地を低グルコース培地に交換し、3 日間維持した。13 日目に、培地を、インスリン含有 B27 を含む RPMI1640 に戻した。この手順を 14 日目に繰り返した。残った細胞が高度に精製された心筋細胞である。
【０２２６】
２．ヒト内皮細胞への hHIP 細胞の分化
hiPSC を 6 ウェル・プレート中の希釈したマトリゲル（356231、コーニング）上に播種し、Essential 8 Flex 培地（サーモ・フィッシャー）中で維持した。前記細胞が 60% のコンフルエンシー（confluency）に達したら、分化させることを開始し、培地を、インスリン不含 2% B-27（ギブコ）及び 5 μM CHIR-99021（セレック・ケム（Selleck Chem））を含む RPMI1640（ギブコ）に交換した。2 日目に、前記培地を減らした培地：インスリン不含 2% B-27（ギブコ）及び 2 μM CHIR-99021（セレック・ケム（Selleck Chem））を含有する RPMI1640（ギブコ）、に変えた。4 日目から 7 日目に、細胞を、RPMI EC 培地、即ち、インスリン不含 2% B-27、50 ng/ml 血管内皮増殖因子（VEGF；R&D システム、ミネアポリス、ミネソタ州、米国）、10 ng/ml 線維芽細胞増殖因子塩基性（FGFb；R&D システム）、10 μM Y-27632（シグマ‐アルドリッチ、セント・ルイス、ミズーリ州、米国）及び 1 μM SB 431542（シグマ‐アルドリッチ）を含む RPMI1640、に置いた。内皮細胞クラスターは 7 日目から目に見えるようになり、細胞を、10% FCS hi（ギブコ）、25 ng/ml 血管内皮増殖因子（VEGF; R&D システム、ミネアポリス、ミネソタ州、米国）、2 ng/ml 線維芽細胞増殖因子塩基性（FGFb； R&D システム）、10 μM Y-27632（シグマ‐アルドリッチ、セント・ルイス、ミズーリ州、米国）及び 1 μM SB 431542（シグマ‐アルドリッチ）を含有する、EGM-2 SingleQuots 培地（ロンザ、バーゼル、スイス）中に置いた。分化プロセスは 14 日後に完了し、その分化プロセスの間に未分化細胞は剥離した。精製に関しては、細胞は、CD31 マイクロビーズ（ミルテニー、オーバーン、カルフォルニア州（Miltenyi、Auburn、CA））を使用して、製造業者のプロトコルに従って MACS を行うことの処理をした。高度に精製した EC 細胞を、サプリメント及び10% FCS hi（ギブコ）を添加した EGM-2 SingleQuots 培地（ロンザ、バーゼル、スイス）中で培養した。TrypLE を使用して、3 から 4 日毎に、細胞を 1:3 で継代した。
【０２２７】
Ｊ．ヒト化マウスへの移植
ヒト化 NSG-SGM3 マウスを誘導チャンバーに入れ、2% イソフルラン（Isothesia、Butler Schein）で麻酔を誘導した。250 μl の ZVAD（100 mM、ベンジルオキシカルボニル-Val-Ala-Asp（O-メチル）-フルオロメチル・ケトン、カルビオケム）、Bcl-XL BH 4（細胞浸透性 TAT ペプチド、50 nM、カルビオケム）、シクロスポリン A（200 nM、シグマ）、IGF-1（100 ng/ml、ぺプロテック）及びピナシジル（50 mM、シグマ）を含有する 0.9% 食塩水中の 100 万個（1 mio）の細胞（hiPSC 由来心筋細胞（hiCM）又は hiPSC 由来内皮細胞（hiEC）のどちらか）を、250 μl の BD マトリゲル高濃度（1:1；BD バイオサイエンス）と混合した。そしてこれを、23-G シリンジを使用してマウスの下背部に皮下注射した。移植 2、4、6、8、10 及び 12 週間後にマトリゲル・プラグを摘出して、4% パラホルムアルデヒド及び 1% グルテンアルデヒドで、24 時間、固定した。その後、脱水し、パラフィンに包埋した。5 μm 厚の切片を切り出し、ヘマトキシリン及びエオシン（HE）で染色し、その形態を確認した。
【０２２８】
（ＩＸ．例示的な配列）：
配列番号１ - ヒト β-2-ミクログロブリン
MSRSVALAVLALLSLSGLEAIQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDI
【０２２９】
配列番号２ - ヒト CIITA タンパク質、160 アミノ酸 N-末 
MRCLAPRPAGSYLSEPQGSSQCATMELGPLEGGYLELLNSDADPLCLYHFYDQMDLAGEEEIELYSEPDTDTINCDQFSRLLCDMEGDEETREAYANIAELDQYVFQDSQLEGLSKDIFKHIGPDEVIGESMEMPAEVGQKSQKRPFPEELPADLKHWKP
【０２３０】
配列番号３ - ヒト CD47
MWPLVAALLLGSACCGSAQLLFNKTKSVEFTFCNDTVVIPCFVTNMEAQNTTEVYVKWKFKGRDIYTFDGALNKSTVPTDFSSAKIEVSQLLKGDASLKMDKSDAVSHTGNYTCEVTELTREGETIIELKYRVVSWFSPNENILIVIFPIFAILLFWGQFGIKTLKYRSGGMDEKTIALLVAGLVITVIVIVGAILFVPGEYSLKNATGLGLIVTSTGILILLHYYVFSTAIGLTSFVIAILVIQVIAYILAVVGLSLCIAACIPMHGPLLISGLSILALAQLLGLVYMKFVE
【０２３１】
配列番号４ - 単純ヘルペス・ウイルス・チミジン・キナーゼ(HSV-tk)
MASYPCHQHASAFDQAARSRGHSNRRTALRPRRQQEATEVRLEQKMPTLLRVYIDGPHGMGKTTTTQLLVALGSRDDIVYVPEPMTYWQVLGASETIANIYTTQHRLDQGEISAGDAAVVMTSAQITMGMPYAVTDAVLAPHVGGEAGSSHAPPPALTLIFDRHPIAALLCYPAARYLMGSMTPQAVLAFVALIPPTLPGTNIVLGALPEDRHIDRLAKRQRPGERLDLAMLAAIRRVYGLLANTVRYLQGGGSWWEDWGQLSGTAVPPQGAEPQSNAGPRPHIGDTLFTLFRAPELLAPNGDLYNVFAWALDVLAKRLRPMHVFILDYDQSPAGCRDALLQLTSGMVQTHVTTPGSIPTICDLARTFAREMGEAN
【０２３２】
配列番号５ - 大腸菌（Escherichia coli）シトシン・デアミナーゼ (EC-CD)
MSNNALQTIINARLPGEEGLWQIHLQDGKISAIDAQSGVMPITENSLDAEQGLVIPPFVEPHIHLDTTQTAGQPNWNQSGTLFEGIERWAERKALLTHDDVKQRAWQTLKWQIANGIQHVRTHVDVSDATLTALKAMLEVKQEVAPWIDLQIVAFPQEGILSYPNGEALLEEALRLGADVVGAIPHFEFTREYGVESLHKTFALAQKYDRLIDVHCDEIDDEQSRFVETVAALAHHEGMGARVTASHTTAMHSYNGAYTSRLFRLLKMSGINFVANPLVNIHLQGRFDTYPKRRGITRVKEMLESGINVCFGHDDVFDPWYPLGTANMLQVLHMGLHVCQLMGYGQINDGLNLITHHSARTLNLQDYGIAAGNSANLIILPAENGFDALRRQVPVRYSVRGGKVIASTQPAQTTVYLEQPEAIDYKR
【０２３３】
配列番号６ - 短く切れたヒト・カスパーゼ 9
GFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTS
【０２３４】
本明細書に開示又は参照されているすべての刊行物及び特許文献は、その全体が参照により取り込まれている。前述の記載は、例示及び説明の目的に限定して提示されている。この記載は、本発明を開示した正確な形態に限定することを意図するものではない。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって規定されることを意図している。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３１Ｃ】
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【図３１Ｄ】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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