(57)【要約】本発明は、昆虫細胞におけるアデノ随伴ウイルスベクターの産生に関する。それ故、昆虫細胞は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列を含み、ＡＡＶ  ＶＰ１カプシドタンパク質の翻訳のための開始コドンはＡＵＧである。ＶＰ１オープンリーディングフレームの上流には、ＶＰ１タンパク質の翻訳開始を改変して、すなわち低下させて、高い効力を有するＡＡＶをもたらす良好な化学量論のＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３の産生を可能にするように、代替アウトオブフレームスタートコドンが置かれている。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
オープンリーディングフレームを含むヌクレオチド配列の昆虫細胞における発現のための発現制御配列を含む核酸構築物であって、前記オープンリーディングフレーム配列が、
ｉ）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３、並びに
ｉｉ）ＶＰ１に対するＡＴＧ翻訳開始コドン
をコードし、前記ヌクレオチド配列が、前記オープンリーディングフレームの上流に、前記オープンリーディングフレームと読み枠がずれている代替スタートコドンを含む、核酸構築物。
【請求項２】
前記代替スタートコドンが、ＣＴＧ、ＡＴＧ、ＡＣＧ、ＴＴＧ、ＧＴＧ、ＣＴＣ、及びＣＴＴからなる群から選択される、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項３】
前記ヌクレオチド配列が、前記ＶＰ１に対するＡＴＧ翻訳開始コドンを包含する、前記代替スタートコドンで始まる代替オープンリーディングフレームを含む、請求項１又は請求項２に記載の核酸構築物。
【請求項４】
前記代替スタートコドンに続く前記代替オープンリーディングフレームが、最高で２０アミノ酸のペプチドをコードする、請求項３に記載の核酸構築物。
【請求項５】
前記オープンリーディングフレームに隣り合い、前記代替スタートコドンを含む前記ヌクレオチド配列が、配列番号１のヌクレオチド残基１〜８である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸構築物。
【請求項６】
前記ＶＰ１に対するＡＴＧ翻訳開始コドンを含む前記オープンリーディングフレームが、配列番号１のヌクレオチド配列を有し、位置９〜１１における残基が前記ＶＰ１に対するＡＴＧ翻訳開始コドンである、請求項５に記載の核酸構築物。
【請求項７】
前記オープンリーディングフレームの第２のコドンが、アラニン、グリシン、バリン、アスパラギン酸、及びグルタミン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基をコードする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の核酸構築物。
【請求項８】
前記ＡＡＶカプシドタンパク質がＡＡＶ血清型カプシドタンパク質である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸構築物。
【請求項９】
ポリヘドリン（ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｎ）プロモーター、ｐ１０プロモーター、４×Ｈｓｐ２７  ＥｃＲＥ＋最小Ｈｓｐ７０プロモーター、デルタＥ１プロモーター、及びＥ１プロモーターからなる群から選択されるプロモーターを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の核酸構築物。
【請求項１０】
バキュロウイルスベクターである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の核酸構築物。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の核酸構築物を含む昆虫細胞。
【請求項１２】
（ａ）少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）ヌクレオチド配列を含む第２のヌクレオチド配列、
（ｂ）昆虫細胞における発現のための発現制御配列に作動的に連結されたＲｅｐ７８又はＲｅｐ６８コード配列を含む第３のヌクレオチド配列、
（ｃ）任意選択で、昆虫細胞における発現のための発現制御配列に作動的に連結されたＲｅｐ５２又はＲｅｐ４０コード配列を含む第４のヌクレオチド配列
をさらに含む、請求項１１に記載の昆虫細胞。
【請求項１３】
（ａ）請求項１１又は請求項１２に記載の昆虫細胞をＡＡＶが産生されるような条件下で培養するステップ、及び任意選択で（ｂ）前記ＡＡＶを回収するステップを含む、昆虫細胞においてＡＡＶを産生するための方法。
【請求項１４】
パルボウイルスカプシドタンパク質をコードする核酸構築物を提供するための方法であって、前記核酸構築物が１つ又は複数の向上した特性を有し、前記方法は、
ａ）複数の核酸構築物を用意するステップであって、各構築物が、発現制御配列に作動的に連結されたパルボウイルスカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列、及び発現制御配列に作動的に連結されたパルボウイルスカプシドタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列に隣接する少なくとも１つのパルボウイルス逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含む、ステップ、
ｂ）前記複数の核酸構築物を、パルボウイルスＲｅｐタンパク質を発現し得る昆虫細胞に移入するステップ、
ｃ）前記昆虫細胞を、パルボウイルスカプシドタンパク質及び前記パルボウイルスｒｅｐタンパク質の発現を可能にする条件に供し、それにより、前記核酸構築物がパルボウイルスカプシドにパッケージされてパルボウイルスビリオンを提供し得るステップ、
ｄ）前記昆虫細胞及び／又は昆虫細胞上清からパルボウイルスビリオンを回収するステップ、
ｅ）前記パルボウイルスビリオンと標的細胞とを接触させて、前記標的細胞の感染を可能にするステップ、
ｆ）前記標的細胞から前記核酸構築物を回収するステップ
を含む、方法。
【請求項１５】
ステップａ）において規定される核酸構築物がバキュロウイルスベクターに含有される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ステップｆ）において回収される、発現制御配列に作動的に連結されたパルボウイルスカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、遺伝子療法ベクターの産生のための核酸構築物を作出するステップｇ）をさらに含む、請求項１４又は請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、昆虫細胞におけるアデノ随伴ウイルスの産生、及び向上した感染力を提供するアデノ随伴ウイルスに関する。本発明は、アデノ随伴ウイルスベクターライブラリーを伴う手段及び方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、ヒト遺伝子療法のための最も有望なウイルスベクターの１つと考えることができる。ＡＡＶは、分裂並びに非分裂ヒト細胞に効率的に感染する能力を有し、ＡＡＶウイルスゲノムは、宿主細胞のゲノムにおける単一の染色体部位に組み込まれ、最も重要なことには、たとえＡＡＶが多くのヒトに存在しているとしても、ＡＡＶはいかなる疾患とも関連付けられたことがない。これらの利点を考慮して、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）は、血友病Ｂ、悪性黒色腫、嚢胞性線維症、及び他の疾患に対する遺伝子療法臨床試験において評価されているところである。アリポジーンチパルボベック（Ａｌｉｐｏｇｅｎｅ  ｔｉｐａｒｖｏｖｅｃ）（グリベラ（Ｇｌｙｂｅｒａ）（登録商標）、ｕｎｉＱｕｒｅ）など、欧州における遺伝子療法医薬の数々の臨床試験及び認可は、ＡＡＶが臨床実践の主流（ｍａｉｎ  ｓｔａｙ）になる見込みを秘めている。
【０００３】
一般的に、組み換えＡＡＶのための２つの主なタイプの産生システムがある。一方では、哺乳類細胞タイプ（２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＫＢ細胞など）における従来の産生システムがあり、他方では、昆虫細胞を用いた産生システムがある。
【０００４】
哺乳類産生システムはいくつかの欠点に悩まされており、欠点には、細胞あたり作出されるｒＡＡＶ粒子の限定された数（１０４個粒子の桁）（Ｃｌａｒｋ、２００２、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．６１（補足１）：９〜１５において総説されている）及び煩雑な大規模製造が含まれることがある。臨床研究に関しては、１０１５個粒子を上回る数のｒＡＡＶが要されることがある。この数のｒＡＡＶ粒子を産生するためには、５，０００個の１７５ｃｍ２フラスコの細胞と等価であるおよそ１０１１個の培養ヒト２９３細胞を用いたトランスフェクション及び培養が要されると考えられ、それは最高で１０１１個の２９３細胞にトランスフェクトすることを意味する。それ故、臨床試験のための材料を獲得するための、哺乳類細胞培養システムを用いたｒＡＡＶの大規模産生は問題があることがすでに証明されており、大きな商業規模での産生は実現可能でさえないことがある。さらに、哺乳類細胞培養において産生される臨床使用のためのベクターは、哺乳類宿主細胞に存在する、望ましくないおそらく病原性の材料で汚染されるという危険性が常にある。
【０００５】
哺乳類産生システムのこれらの問題を克服するために、昆虫細胞を用いたＡＡＶ産生システムが開発されている（Ｕｒａｂｅら、２００２、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１３：１９３５〜１９４３；米国特許出願公開第２００３０１４８５０６号；及び米国特許出願公開第２００４０１９７８９５号）。野生型ウイルス由来のＡＡＶ野生型カプシドは、約６０個のカプシドタンパク質、すなわち約１：１：１０の化学量論のＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３からなる。理論によって拘束されることなく、化学量論は、組み換えＡＡＶの優れた効力、すなわち優れた形質導入を達成するために重要であると思われる。野生型ウイルスにおいて、すなわち哺乳類細胞において、３種のＡＡＶカプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３）の約１：１：１０の化学量論を達成することは、２つのスプライスアクセプター部位の交互使用の組み合わせ、及びＶＰ２に対するＡＣＧ開始コドンのそれほど最適ではない利用に依存する。しかしながら、昆虫細胞におけるＡＡＶの産生に関して、発現ストラテジーは、それが哺乳類細胞において生じるようには昆虫細胞において再現されないため、改変が必要であった。昆虫細胞におけるカプシドタンパク質の向上した産生を獲得するために、Ｕｒａｂｅら（２００２、前出）は、スプライシングを要することなく３種すべてのＶＰタンパク質を発現し得る単一のポリシストロン性メッセンジャーに転写され、最初の翻訳開始コドンがＡＣＧコドンによって置き換えられている構築物を用いた。国際公開第２００７／０４６７０３号は、昆虫細胞におけるＡＡＶカプシドタンパク質の比率をさらに最適化することによる、バキュロウイルスにより産生されるｒＡＡＶベクターの感染力のさらなる向上を開示している。
【０００６】
Ｕｒａｂｅら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、２００６、８０（４）：１８７４〜１８８５）は、ＶＰ１カプシドタンパク質の開始コドンとしてＡＣＧを用いたバキュロウイルスシステムにおいて産生されたＡＡＶ５粒子が不十分な形質導入効率又は効力を有すること、及びＡＣＧ開始コドンから発現されるＶＰ１を有するＡＡＶ２とは対照的に、ＡＡＶ５  ＶＰ１コード配列における＋４位置をＧ残基に変異させることが感染力を向上させなかったことを報告した。Ｕｒａｂｅらは、ＡＡＶ５  ＶＰ１の少なくとも４９個のアミノ酸のＮ末端部分が、ＡＡＶ２  ＶＰ１の相当する部分と置き換えられたキメラＡＡＶ２／５  ＶＰ１タンパク質を構築し、そのキメラタンパク質はビリオンの形質導入特性を向上させた。
【０００７】
さらなる手法では、ＡＡＶカプシドコード配列において、準最適な（ＡＴＧ以外の）翻訳開始コドンと、野生型カプシドアミノ酸配列の位置２におけるアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基をコードするコドンとの間に１つ又は複数のアミノ酸残基を挿入することによって、ＡＡＶカプシドタンパク質の発現が向上した（Ｌｕｂｅｌｓｋｉら、国際公開第２０１５１３７８０２号）。
【０００８】
医学的治療における使用のためのＡＡＶ遺伝子療法ベクターの製造のための、カプシドの昆虫細胞に基づく産生の向上にもかかわらず、ＡＡＶカプシド産生をさらに向上させる必要性、及び向上したＡＡＶカプシド構築物を昆虫細胞における発現について選択する新たな方法を提供する必要性が依然としてある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者らは、ＡＡＶカプシドが、重複するリーディングフレームからのＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３タンパク質に対する転写産物をコードする発現構築物であって、ＶＰ１がＡＵＧ開始コドンから翻訳される発現構築物から、昆虫細胞において非常に効率的に産生され得ることを驚くべきことに見い出した。ＡＴＧ開始コドンを含有する先行技術の構築物は、約１：１：１０という野生型ＡＡＶにおいて観察されるようなＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３の比率をもたらさず、それ故、理論によって拘束されることなく、強力なＡＡＶを産生しない。本発明において同定された発現構築物は、医学的治療における使用のための、かなりの分量の非常に強力なＡＡＶ遺伝子療法ベクターの昆虫細胞における効率的な産生を可能にする。そのようなベクターは、ＣＴＧ又はＧＴＧなどの代替スタートコドンから産生されるＡＡＶ遺伝子療法ベクターよりも効力及び分量に関して向上したとまではいかないとしても、少なくとも同程度である（図４を参照されたい）。
【００１０】
したがって、本発明の構築物は、ＶＰ１スタートコドンにおける翻訳開始の低下を一見もたらすＶＰ１  ＡＴＧスタートコドンから５’に付加的なアウトオブフレームスタートコドンを含有し、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３の十分な分量の翻訳を可能にする。理論によって拘束されることなく、そのような構築物は、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３アミノ酸配列が野生型ウイルスにおいて見い出されるように、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３アミノ酸配列の発現を可能にし得る。
【００１１】
実施例において示されるように、そのような構築物は、昆虫細胞に対してＡＡＶカプシド発現構築物のライブラリーを用いることによって同定された。昆虫細胞におけるＡＡＶカプシドの非常に効率的な産生を第一に要し、及び選択された標的細胞で高度に感染性であることを第二に要して、構築物を選択した。したがって、本発明者らは、向上した特性、例えば向上した産生及び／又は向上した感染力を有するＡＡＶカプシド発現構築物を提供する非常に効率的な選択法も提供する。
【００１２】
したがって、本発明における第１の態様において、オープンリーディングフレームを含むヌクレオチド配列の昆虫細胞における発現のための発現制御配列を含む核酸構築物であって、前記オープンリーディングフレーム配列は、
ｉ）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３；並びに
ｉｉ）ＶＰ１に対するＡＵＧ翻訳開始コドン
をコードし、前記ヌクレオチド配列は、オープンリーディングフレームの上流に、オープンリーディングフレームと読み枠がずれている代替スタートコドンを含む、核酸構築物が提供される。言い換えれば、代替スタートコドンは、スタートコドンの３Ｎ＋１又は３Ｎ＋２ヌクレオチド上流にあることが好ましい。
【００１３】
別の態様において、本発明は、昆虫細胞における産生のための、パルボウイルスカプシドタンパク質をコードする核酸構築物を提供するための方法であって、前記核酸構築物は１つ又は複数の向上した特性を有し、方法は、
ａ）複数の核酸構築物を提供するステップであって、各構築物は、発現制御配列に作動的に連結されたパルボウイルスカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列、及び発現制御配列に作動的に連結されたパルボウイルスカプシドタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列に隣接する少なくとも１つのパルボウイルス逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含む、ステップ；
ｂ）前記複数の核酸構築物を、パルボウイルスＲｅｐタンパク質を発現し得る昆虫細胞に移入するステップ；
ｃ）前記昆虫細胞を、パルボウイルスカプシドタンパク質及びパルボウイルスｒｅｐタンパク質の発現を可能にする条件に供し、それにより、前記核酸構築物はパルボウイルスカプシドにパッケージされてパルボウイルスビリオンを提供し得るステップ；
ｄ）前記昆虫細胞及び／又は昆虫細胞上清からパルボウイルスビリオンを回収するステップ；
ｅ）前記パルボウイルスビリオンと標的細胞とを接触させて、標的細胞の感染を可能にするステップ；
ｆ）前記標的細胞から前記核酸構築物を回収するステップ
を含む、方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ライブラリー作出及び選択工程の概略的表示である。（ａ）まず、ＤＮＡライブラリーが提供されている。この特定の例において、発現構築物のライブラリーは、ＡＡＶ５  ＶＰ１に対する多様なスタートコドン（ＸＸＸ）を有し、選択された位置（Ｎ）にランダムなヌクレオチドを有し（配列番号７１）、そのような構築物の例が列挙されている（１は配列番号１であり；２は配列番号６３であり；ｎは配列番号６５である）；（ｂ）ＤＮＡライブラリーは、ＡＡＶ５  ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３のカプシドタンパク質（Ｃａｐ（ＶＰ１２３））の発現のためのプロモーター（Ｐ）を有する発現カセットを有するベクター構築物に移入され、前記発現カセットは、ＡＡＶカプシドにおけるカプシド化を可能にする２つのＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）によって隣接されている。また、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ７８に対する発現カセット（複数可）が提供されている；（ｃ）前記Ｃａｐ及びＲｅｐ構築物は、その後昆虫細胞に、この例ではＳｆ９細胞に移入される。移入は、感染多重度（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）を制御することが可能であるバキュロウイルスベクターを介したものであり得る；（ｄ）したがって、昆虫細胞において、発現されるＲｅｐ５２及びＲｅｐ７８タンパク質は、カプシド発現カセットを含有するＡＡＶベクターゲノムを複製し及びカプシド化する。述べられているように、バキュロウイルスベクターが用いられる場合、感染多重度はよく制御され得、この感染多重度は好ましくはＣａｐ構築物に対して１より下に保たれて、Ｓｆ９細胞あたり平均で１つのみのライブラリーメンバーを有して交差パッケージングを回避する。カプシドを有効に産生するＣａｐ発現カセットのみがベクターゲノムをカプシド化すると考えられる；（ｅ）次に、ベクターゲノムを含有するカプシドは、感染力、すなわち標的細胞へのベクターゲノムの効率的な移入について試験される。ベクターゲノムを有するベクター粒子は例えば非感染性であり得るが、一方でベクターゲノム及び約１：１：１０のＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３比を有するベクター粒子は高度に感染性である。この例では、ＡＡＶベクターゲノムを複製もし得るＨｅＬａＲＣ３２細胞株が用いられている。標的細胞から、ベクターゲノムはその後同定され得る。例えば、（ａ）に示される様々な配列を含有するベクターゲノム配列又はその一部が決定され得る。代替的に、識別子配列を決定して、標的細胞の感染に成功している（ａ）のライブラリーメンバーを同定し得る。  したがって、組み合わせると、ステップ（ｃ）及び（ｅ）により、昆虫細胞における効率的な産生を可能にし、標的細胞で感染性ビリオンを産生するカプシド発現構築物を選択することが可能となる。集団を支配する選択された発現構築物は、特に適切な候補であることがある。選択された候補発現構築物（隣接するＩＴＲなし）を、その後、例えばバキュロウイルスベクターにおいて用いて又は細胞株に挿入して、ＡＡＶ遺伝子療法ベクターを産生し得る。
【図２Ａ】これらのプロットでは、特定のスタートコドンを有するライブラリーメンバー（ｘ軸）のパーセンテージ（ｙ軸）が、選択工程の各段階で示されている；Ａ）このプロットは、ＡＡＶ  ＩＴＲによって隣接された発現カセットを有する、作製されたプラスミドＤＮＡライブラリーのスタートコドンの分布を示している。普及率は約４％〜約８％の間で様々である。
【図２Ｂ】Ｂ）このプロットは、ＡＡＶ  ＩＴＲによって隣接された挿入された発現カセットを有する、作製されたバキュロウイルスライブラリーのスタートコドンの分布を示している。普及率は約４％〜約９％の間で様々であり、このライブラリーの分布プロファイルはプラスミドライブラリーに非常に類似していることに留意されたい。
【図２Ｃ】Ｃ）このプロットは、図２Ｂ）のバキュロウイルスライブラリーから作製されたＡＡＶライブラリーに含有されるスタートコドンの分布を示している。スタートコドンの分布は、１つの例外として、すなわち０．５％をはるかに下回る普及率を有するＡＴＧスタートコドンを除いて、約４％〜９％に及び、バキュロウイルスライブラリーに非常に類似していることに留意されたい。
【図２Ｄ】Ｄ）このプロットは、図２Ｃ）のＡＡＶライブラリーを感染させた細胞におけるＡＡＶベクターゲノムに含有されるスタートコドンの分布を示している。スタートコドンの分布は、ここでは非常に異なることに留意されたい。ＣＴＧ及びＧＴＧは、約５０％の普及率を有する最も普及しているスタートコドンである。ＡＡＶライブラリーにおいてあまり表されなかったＡＴＧスタートコドンは、ここでは約８％の普及率を有し、一方で残りのスタートコドンは、約１％〜３％の普及率を有した。
【図２Ｅ】Ｅ）このプロットは、図２Ａ）〜Ｄ）のそれぞれのプロットを統合している。ＡＡＶライブラリーに関するＡＴＧコドンに対する下落、並びに細胞ライブラリーにおけるＣＴＧ、ＧＴＧ、及びＡＴＧに対するピークに留意されたい。
【図３】選択された配列（ＡＴＧ１、ＡＴＧ２等）を、その後ＡＡＶ５カプシドの発現のためのバキュロウイルスベクターにクローニングした。バキュロウイルスベクターのクローンを、その後ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析して、ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３比を査定した。ＣＴＧ１は良好なクローンを産生しなかったが、一方でＣＴＧ２及びＧＴＧ２は産生し、以前に示されている化学量論を呈した（Ｌｕｂｅｌｓｋｉら、国際公開第２０１５１３７８０２号）。ＴＡＧクローンは低い力価をもたらし、ＴＧＡクローンはＶＰ１を産生しないように見えた。ＡＴＧ１及びＡＴＧ２が、ＣＴＧ２に類似した化学量論を有する良好なクローンを産生したことは驚きである。
【図４】ＡＡＶ効力アッセイのグラフである。ＣＭＶプロモーターの制御下における、ＳＥＡＰレポーター遺伝子を保持する種々のＡＡＶベクターの相対的効力を、Ｈｕｈ７細胞（Ａ）及びＨｅＬａ細胞（Ｂ）において試験した。細胞に種々の感染多重度（細胞あたり１０６、１０５、１０４ゲノムコピーのＡＡＶ（ｇｃ））で感染させ、ＳＥＡＰレポーター遺伝子の発現を判定した。ＡＴＧ１構築物は最も強力なベクターをもたらし、一方でＡＴＧ２、ＣＴＧ２、及びＧＴＧ２は類似したプロファイルを有し、一方でＴＧＡは有意に力が弱く、その理由はＴＧＡがＶＰ１タンパク質を全く含有しなかった又はほとんど含有しなかったためである。ＧＴＧ１  ＡＡＶベクターは、低い力価のｇｃ／ｍｌをもたらし、したがって、１０６のＭＯＩでの感染を可能にしなかった。
【図５】効率的なＡＡＶカプシドタンパク質発現のためのＡＴＧ配列文脈の略図である。Ａ）上側のボックスは、左から右に、ＶＰ１に対するオープンリーディングフレームにおけるコドンを示している。ＶＰ１スタートコドンを有するボックスは、「ＡＴＧ」を含有する。下側のボックスは、ＶＰ１に対するオープンリーディングフレームと読み枠がずれている。ＡＴＧコドンの上流には代替スタートコドン（スタート）があり、その下流にはストップコドン（ストップ）もある。Ｂ）ライブラリーから選択された優位な配列の配列が示されている（配列番号１）。アウトオブフレーム重複リーディングフレーム（ＯＯＦ）において、ＡＴＧスタートコドンは、Ｃａｐに対するインフレームリーディングフレームの上流に見い出される。ＯＯＦは、野生型ＡＡＶ５配列に由来する配列においてＴＧＡ下流ストップコドンを有し、そのＯＯＦは、ＯＯＦ開始コドンから翻訳される場合、６アミノ酸の短いペプチドＭＨＨＧＫ（配列番号７２）をもたらすであろう；Ｃ）別の上流スタートコドンからのさらなるアウトオブフレーム重複リーディングフレームからの配列が示されている。上側の状況は、ＡＡＶ５配列に由来する配列のさらに下にあるストップコドンとともに、アウトオブフレームＣＴＧスタートコドン（配列番号２）を有する（とりわけ、配列番号７０を参照されたい）。この状況は、ＴＡＧストップコドンで終結する約１５８アミノ酸のより大きなタンパク質配列の翻訳をもたらすであろう。下側の状況も、スタートコドンのすぐ下流にある、変異した配列におけるストップコドンとともに、ＣＴＧスタートコドンを有し、その状況は、ＯＯＦ（配列番号９）から翻訳される場合、４アミノ酸の短いペプチドＭＥＩＷ（配列番号７３）をもたらすであろう；Ｄ）図５Ａ〜Ｃに描写される構築物からのＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３カプシドタンパク質の発現の略図である。ＤＮＡは、プロモーター（Ｐ）、及びカプシドタンパク質に対するオープンリーディングフレーム（Ｃａｐ（ＶＰ１２３））を有する発現カセットを含有する。転写開始は矢印によって示されている。転写はｍＲＮＡをもたらし、ｍＲＮＡからまずＯＯＦタンパク質が翻訳され得、その後ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３カプシドタンパク質が翻訳され得る。ＯＯＦ配列は、ＶＰ１翻訳スタートと重複している。
【図６Ａ】ＡＡＶライブラリー調製のための様々なベクタービヒクル構成の略図である。図６Ａ：ＡＡＶカプシドタンパク質を発現する発現カセット（灰色のボックス）が、ＡＡＶ  ＩＴＲの間、バキュロウイルスゲノムに含有される、実施例において用いられる構成が示されている。その構成から産生されるＡＡＶは、発現カセットに隣接するＩＴＲを有するベクターゲノムを含有する。
【図６Ｂ】図６Ｂ：ベクタービヒクル（例えば、バキュロウイルス）がパルボウイルスカプシドタンパク質に対する発現カセットを含有し、ベクターゲノムＩＴＲ配列の間に配列識別子（ＩＤ）が置かれている構成が示されている。その構成から産生されるＡＡＶは、配列識別子に隣接するＩＴＲを有するベクターゲノムを含有する。Ｃａｐ配列及びＩＤは連結しているため、例えばシーケンシングにより配列識別子を同定することによって、ＩＤ及びＣａｐ配列は１つのゲノムにおいて結び付いているため、例えば両方を含有するバキュロウイルスベクターのシーケンシングにより、又は識別子配列及びＣａｐ発現配列組み合わせが先験的に（ａ  ｐｒｉｏｒｉ）公知であるような手段でバキュロウイルスベクターが構築されたため、相当するｃａｐ配列が決定され得る。
【図６Ｃ】図６Ｃ：構築物は、パルボウイルスベクターゲノムにレポーター遺伝子も含むことができる。
【００１５】
定義
本明細書において使用するとき、「作動的に連結された」という用語は、機能的関係性にあるポリヌクレオチド（又はポリペプチド）要素の連結を指す。核酸が別の核酸配列と機能的関係性に置かれている場合、核酸は「作動的に連結されて」いる。例えば、転写調節配列がコード配列の転写に影響を及ぼす場合、転写調節配列はコード配列に作動的に連結されている。作動的に連結されたとは、連結されているＤＮＡ配列が典型的には近接していること、及び２つのタンパク質コード領域をつなぎ合わせる必要がある場合には、近接しておりリーディングフレームにあることを意味する。
【００１６】
「発現制御配列」とは、発現制御配列が作動的に連結しているヌクレオチド配列の発現を調節する核酸配列を指す。発現制御配列がヌクレオチド配列の転写及び／又は翻訳を制御する及び調節する場合、発現制御配列はヌクレオチド配列に「作動的に連結されて」いる。故に、発現制御配列には、プロモーター、エンハンサー、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、転写ターミネーター、タンパク質コード遺伝子の前にあるスタートコドン、イントロンに対するスプライシングシグナル、及びストップコドンが含まれ得る。「発現制御配列」という用語は、配列の存在が発現に影響するように設計されている配列を最低でも含むことを意図され、付加的な有利な構成要素も含み得る。例えば、リーダー配列及び融合パートナー配列は発現制御配列である。前記用語には、インフレーム及びアウトオブフレームにある望ましくない潜在的開始コドンが配列から除去されるような、核酸配列の設計も含まれ得る。前記用語には、望ましくない潜在的スプライス部位が除去されるような、核酸配列の設計も含まれ得る。前記用語には、ポリＡ配列と称される配列である、ポリＡテール、すなわちｍＲＮＡの３’末端における一続きのアデニン残基の付加を指揮する配列又はポリアデニル化配列（ｐＡ）が含まれる。発現制御配列は、ｍＲＮＡ安定性を増強するようにも設計され得る。転写及び翻訳安定性に影響を及ぼす発現制御配列、例えばプロモーター、並びに翻訳に影響を与える配列、例えばコザック配列が、昆虫細胞において公知である。発現制御配列は、より低い発現レベル又はより高い発現レベルが達成されるように発現制御配列が作動的に連結されているヌクレオチド配列を変調するような性質のものであり得る。
【００１７】
本明細書において使用するとき、「プロモーター」又は「転写調節配列」という用語は、１つ又は複数のコード配列の転写を制御するように機能し、コード配列の転写開始部位の転写の方向に対して上流に位置し、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに対する結合部位、転写開始部位、並びに転写因子結合部位、リプレッサー及びアクチベータータンパク質結合部位を含むがそれらに限定されない他の任意のＤＮＡ配列、並びにプロモーターからの転写の量を調節するように直接的又は間接的に作用することが当業者に公知のヌクレオチドの他の任意の配列の存在によって構造的に同定されている、核酸フラグメントを指す。「構成的」プロモーターとは、ほとんどの生理学的及び発生学的条件下でほとんどの組織において活性があるプロモーターである。「誘導性」プロモーターとは、例えば化学的誘導因子の適用によって、生理学的に又は発生学的に調節されるプロモーターである。「組織特異的」プロモーターとは、特異的タイプの組織又は細胞においてのみ活性がある。
【００１８】
「実質的に同一の」、「実質的同一性」、又は「本質的に類似の」、又は「本質的類似性」という用語は、２つのペプチド又は２つのヌクレオチド配列が、デフォルトパラメーターを用いたＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴプログラムなどによって最適にアラインされた場合、本明細書における他の箇所で規定される少なくともある特定のパーセンテージの配列同一性を共有することを意味する。ＧＡＰは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈグローバルアライメントアルゴリズムを用いて２つの配列を２つの配列の長さ全体にわたってアラインし、合致の数を最大限に高めギャップの数を最小限に抑える。一般的に、ギャップ創出ペナルティ＝５０（ヌクレオチド）／８（タンパク質）、及びギャップ伸長ペナルティ＝３（ヌクレオチド）／２（タンパク質）を有するＧＡＰデフォルトパラメーターが用いられる。ヌクレオチドに関して、用いられるデフォルトスコア行列はｎｗｓｇａｐｄｎａであり、タンパク質に関して、デフォルトスコア行列はＢｌｏｓｕｍ６２である（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、１９９２、ＰＮＡＳ  ８９、９１５〜９１９）。ＲＮＡ配列がＤＮＡ配列と本質的に類似している又はある特定の程度の配列同一性を有すると言われる場合、ＤＮＡ配列におけるチミン（Ｔ）がＲＮＡ配列におけるウラシル（Ｕ）に等しいと考えられていることは明らかである。Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．、９６８５  Ｓｃｒａｎｔｏｎ  Ｒｏａｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ  ９２１２１−３７５２  ＵＳＡから入手可能なＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン１０．３などのコンピュータープログラム、又はＷｉｎｄｏｗｓ向けのオープンソースソフトウェアＥｍｂｏｓｓ（現バージョン２．７．１−０７）を用いて、配列同一性パーセンテージに対する配列アライメント及びスコアを決定することができる。代替的に、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなどのデータベースに対して検索することによって、類似性又は同一性パーセントを決定することができる。
【００１９】
本発明のパルボウイルスＲｅｐタンパク質又はＣａｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列を、中程度の又は好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ヌクレオチド配列がそれらそれぞれのヌクレオチド配列とハイブリダイズする能力によっても規定することができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、少なくとも約２５個、好ましくは約５０個のヌクレオチド、７５個又は１００個、及び最も好ましくは約２００個又はそれを上回る数のヌクレオチドの核酸配列が、約１Ｍの塩を含む溶液、好ましくは６×ＳＳＣ、又は匹敵するイオン強度を有する他の任意の溶液にて約６５℃の温度でハイブリダイズし、約０．１Ｍの塩若しくはそれ未満を含む溶液、好ましくは０．２×ＳＳＣ、又は匹敵するイオン強度を有する他の任意の溶液にて６５℃で洗浄することを可能にする条件として本明細書において定義される。ハイブリダイゼーションは、一晩、すなわち少なくとも１０時間実施されることが好ましく、洗浄は、洗浄液の少なくとも２回の交換を有して少なくとも１時間実施されることが好ましい。これらの条件は、約９０％又はそれを上回る割合の配列同一性を有する配列の特異的ハイブリダイゼーションを通常では可能にすると考えられる。
【００２０】
中程度の条件とは、少なくとも約５０個のヌクレオチド、好ましくは約２００個又はそれを上回る数のヌクレオチドの核酸配列が、約１Ｍの塩を含む溶液、好ましくは６×ＳＳＣ、又は匹敵するイオン強度を有する他の任意の溶液にて約４５℃の温度でハイブリダイズし、約１Ｍの塩を含む溶液、好ましくは６×ＳＳＣ、又は匹敵するイオン強度を有する他の任意の溶液にて室温で洗浄することを可能にする条件として本明細書において定義される。ハイブリダイゼーションは、一晩、すなわち少なくとも１０時間実施されることが好ましく、洗浄は、洗浄液の少なくとも２回の交換を有して少なくとも１時間実施されることが好ましい。これらの条件は、最高で５０％の配列同一性を有する配列の特異的ハイブリダイゼーションを通常では可能にすると考えられる。当業者であれば、これらのハイブリダイゼーション条件を改変して、５０％〜９０％の間で同一性が様々である配列を特異的に同定し得るであろう。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、哺乳類細胞における核酸の導入及び／又は発現のためのベクターとしての使用のための、動物パルボウイルス、特に感染性ヒト又はサルＡＡＶなどのディペンドウイルス及びその構成要素（例えば、動物パルボウイルスゲノム）の使用に関する。特に、本発明は、昆虫細胞において産生される場合の、そのようなパルボウイルスベクターの感染力の向上に関する。
【００２２】
パルボビリダエ（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）ファミリーのウイルスは、小型のＤＮＡ動物ウイルスである。パルボビリダエを、２つのサブファミリー：脊椎動物に感染するパルボビリナエ（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｎａｅ）、及び昆虫に感染するデンソビリナエ（Ｄｅｎｓｏｖｉｒｉｎａｅ）に分割することができる。パルボビリナエサブファミリーのメンバーは、本明細書においてパルボウイルスと称され、ディペンドウイルス属を含む。ディペンドウイルスの属の名前から推測することができるように、ディペンドウイルスのメンバーは、それらメンバーが、細胞培養における生産的な感染のためにアデノウイルス又はヘルペスウイルスなどのヘルパーウイルスとの共感染を通常では要する点において固有である。ディペンドウイルス属には、通常ではヒト（例えば、血清型１、２、３Ａ、３Ｂ、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３）又は霊長類（例えば、血清型１及び４）に感染するＡＡＶ、及び他の温血動物に感染する近縁ウイルス（例えば、ウシ、イヌ、ウマ、及びヒツジアデノ随伴ウイルス）が含まれる。パルボウイルス及びパルボビリダエの他のメンバーに関するさらなる情報は、Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（第３編、１９９６）におけるＫｅｎｎｅｔｈ  Ｉ．Ｂｅｒｎｓ、「Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ  Ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ」、第６９章に記載されている。便宜上、本発明は、ＡＡＶを参照することによって本明細書においてさらに例示され及び記載される。しかしながら、本発明はＡＡＶに限定されるわけではなく、他のパルボウイルスに同等に適用することができると理解される。
【００２３】
すべての公知のＡＡＶ血清型のゲノム編成は非常に類似している。ＡＡＶのゲノムは、長さが約５，０００ヌクレオチド（ｎｔ）未満である線状の一本鎖ＤＮＡ分子である。逆位末端反復（ＩＴＲ）が、非構造性の複製（Ｒｅｐ）タンパク質及び構造（ＶＰ）タンパク質に対する固有のコードヌクレオチド配列に隣接する。ＶＰタンパク質（ＶＰ１、−２、及び−３）はカプシドを形成する。末端の１４５ｎｔは自己相補的であり、Ｔ字型ヘアピンを形成するエネルギー的に安定な分子内二重鎖を形成することができるように編成される。これらのヘアピン構造は、ウイルスＤＮＡ複製のための起点として機能し、細胞ＤＮＡポリメラーゼ複合体に対するプライマーとして働く。哺乳類細胞におけるｗｔＡＡＶ感染の後、Ｒｅｐ遺伝子（すなわち、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２）がそれぞれＰ５プロモーター及びＰ１９プロモーターから発現され、両Ｒｅｐタンパク質はウイルスゲノムの複製における機能を有する。Ｒｅｐ  ＯＲＦにおけるスプライシング事象は、実際には４種のＲｅｐタンパク質（すなわち、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及びＲｅｐ４０）の発現をもたらす。しかしながら、哺乳類細胞において、ＡＡＶベクター産生には、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質をコードするスプライシングされていないｍＲＮＡで十分であることが示されている。昆虫細胞においても、ＡＡＶベクター産生にはＲｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質で十分である。３種のカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３は、ｐ４０プロモーターから単一のＶＰリーディングフレームから発現される。哺乳類細胞におけるｗｔＡＡＶ感染は、カプシドタンパク質産生について、２つのスプライスアクセプター部位の交互使用の組み合わせ、及びＶＰ２に対するＡＣＧ開始コドンの準最適な利用に依存する。
【００２４】
昆虫細胞において、ＶＰ１（ＡＵＧスタートコドンを有する）、ＶＰ２、及びＶＰ３タンパク質をコードするＡＡＶオープンリーディングフレームを有する転写産物、すなわちｍＲＮＡの発現は、約１：１：１０の比率の強力なＡＡＶをもたらす量のＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３カプシドタンパク質を通常では産生しない。効力とは、ＡＡＶベクターがそのベクターゲノムを標的細胞に移入し導入遺伝子の効率的な発現を可能にする能力として本明細書において定義される。本発明者らは、ＡＡＶカプシドが、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３タンパク質に対する転写産物をコードする発現構築物であって、ＶＰ１がＡＵＧ開始コドンから翻訳される発現構築物から、昆虫細胞において非常に効率的に産生され得ることを今回驚くべきことに見い出した。
【００２５】
本発明において同定された発現構築物は、医学的治療における使用のための、かなりの分量の非常に強力なＡＡＶ遺伝子療法ベクターの昆虫細胞における効率的な産生を可能にする。そのようなベクターは、ＣＴＧ又はＧＴＧなどの代替スタートコドンから産生されるＡＡＶ遺伝子療法ベクターよりも効力に関して向上したとまではいかないとしても、少なくとも同程度である（図４）。核酸配列に関して、核酸配列は、Ａ、Ｔ、Ｃ、及びＧを列挙するＤＮＡ配列として、又はＡ、Ｕ、Ｃ、及びＧを列挙するＲＮＡ配列として列挙され得ると理解される。発現構築物とは、通常、ＤＮＡ配列を指してもよく、一方で、発現されたヌクレオチド配列はＲＮＡ配列、すなわち発現構築物から転写される又は発現されるｍＲＮＡを指すと理解される。
【００２６】
本発明の構築物は、ＶＰ１スタートコドンにおける翻訳開始の低下を一見もたらすＶＰ１スタートコドンから５’に付加的なアウトオブフレームスタートコドンをコードし、ＶＰ２及びＶＰ３の両方の十分な分量のさらなる翻訳を可能にする。理論によって拘束されることなく、そのようなアウトオブフレーム５’スタートコドンは、ＶＰ１  ＡＵＧスタートコドンにおける転写開始への干渉をもたらし、野生型ＡＡＶにおいて生じるのと同様の漏れやすい疑似リボソームスキャニングを可能にする。理論によって拘束されることなく、これら代替スタートコドンからの短いペプチドの合成（例えば、ＶＰ２コード配列の前に、アウトオブフレームリーディングフレームの翻訳終結）は、リボソームにＶＰ１  ＡＵＧ開始コドンの下流をスキャンし続けさせることができ又はリボソームを再開させることができ、同じ転写産物からのＶＰ２及びＶＰ３の翻訳を可能にする。
【００２７】
そのような構築物は、先行技術において産生されるＡＡＶカプシドと比較して優れた効力を有する、昆虫細胞におけるＡＡＶカプシドの向上したとまではいかないとしても少なくとも同程度の産生を提供する。そのような構築物は、昆虫細胞に対する発現構築物の作出に利用される場合、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３ヌクレオチド配列が野生型ウイルスにおいて見い出されるように、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３ヌクレオチド配列が改変されないことを可能にし得ることは有利である。本発明に従った構築物は、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３カプシドタンパク質に対するアミノ酸配列が、野生型ウイルスにおいて見い出されるカプシドタンパク質のものと実質的に同一である又はそれらと同一であることを可能にし得る。それ故、この発現ストラテジーは、任意のパルボウイルスベクター構築物又はＡＡＶベクター構築物に一般的に適用可能であり、５’配列又はＡＡＶカプシドオープンリーディングフレームの配列のさらなる調整を全く要しなくてもよい。
【００２８】
したがって、本発明の第１の態様において、オープンリーディングフレームを含むヌクレオチド配列の昆虫細胞における発現のための発現制御配列を含む核酸構築物であって、前記オープンリーディングフレーム配列は、
ｉ）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３；並びに
ｉｉ）ＶＰ１に対するＡＴＧ翻訳開始コドン
をコードし、前記ヌクレオチド配列は、オープンリーディングフレームの上流に、オープンリーディングフレームと読み枠がずれている代替スタートコドンを含む、核酸構築物が提供される。
【００２９】
本発明に従ったヌクレオチド配列の発現は、発現されるｍＲＮＡに関すると理解される。したがって、代替スタートコドンはｍＲＮＡに含まれる対象となり、すなわち、代替スタートコドンは、カプシドタンパク質をコードするオープンリーディングフレームから５’にある配列に含まれ、代替スタートコドンは核酸構築物の転写開始部位から３’にある。故に、代替リーディングフレームは、発現されたｍＲＮＡに含まれるＶＰ１  ＡＵＧコドンから５’にある。本発明に従ったオープンリーディングフレームは単一のオープンリーディングフレームであると理解され、すなわち、カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３をコードする配列は重複していると理解される。言い換えれば、ＶＰ２及びＶＰ３タンパク質は、ＶＰ１配列と同じ配列によってコードされる。そのようなオープンリーディングフレームは近接したオープンリーディングフレームであり得るが、近接していなくてもよく、例えばイントロン配列を含有する。ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３が翻訳されているオープンリーディングフレームは、近接した単一のオープンリーディングフレームであり、カプシドタンパク質が翻訳され得る転写産物から（例えば、１つの転写産物はＶＰ１をコードし、別の転写産物はＶＰ２をコードし、さらにさらなる転写産物はＶＰ３をコードする場合）、さらなる転写産物は昆虫において転写されないことが好ましい。
【００３０】
アウトオブフレームスタートコドンは、ＣＵＧ、ＡＣＧ、ＡＵＧ、ＵＵＧ、ＣＵＣ、及びＣＵＵからなる群から選択されることが好ましい。代替スタートコドンは、ＡＵＧ又はＣＵＧから選択されることがより好ましい。代替スタートコドンはＡＵＧであることが最も好ましい。実施例の節において示されるように、最も普及しているＡＵＧスタートコドンを有する配列は、大部分がアウトオブフレームスタートコドンを含有した。上流アウトオブフレームスタートコドンは、大部分がＵＵＧ、ＣＵＧ、ＧＵＧ、ＡＵＧ、及びＡＣＧなどの比較的強いコドンである。ＣＵＣ及びＣＵＵなどのより弱いスタートコドンも観察された。最も普及しており最も好ましいのは、アウトオブフレーム代替スタートコドンとしてのＡＵＧである。
【００３１】
代替スタートコドンは、代替オープンリーディングフレームのスタートであり得る。したがって、代替スタートコドンは、リボソームが翻訳を開始し得るコドンを含むと理解される。時には、スタートコドンが、例えばｍＲＮＡの５’キャップされた末端に近い場合、そのような配列は、スタートコドンとして機能することが許されないことがある。トリプレットがアミノ酸をコードする遺伝子コードが理由で、核酸配列は、翻訳が開始する及び終結する場所に応じて、３つの異なるアミノ酸配列に翻訳され得ると理解される。アウトオブフレーム代替スタートコドンはＶＰ１  ＡＵＧ開始コドンの上流にあり、代替スタートコドンに続く遺伝子コードは、好ましくは、リボソームがＶＰ１  ＡＵＧ開始コドンからの翻訳を開始しない又は開始するのを妨げられるような翻訳終結が生じるようなものである。同様に、理論によって拘束されることなく、ＶＰ１  ＡＵＧ開始コドンの上流にあるアウトオブフレーム代替スタートコドンは、ｍＲＮＡからの翻訳の開始を可能にする。代替オープンリーディングフレームは、ＶＰ１  ＡＵＧ開始コドンの下流で終結することが好ましい。例えば、ＶＰ１  ＡＵＧ開始コドンの直後にＡが続く場合、ＡＵＧＡ配列におけるＵＧＡトリプレットは終結コドンをコードする。したがって、上流にある代替スタートコドンで始まる代替オープンリーディングフレームは、ＶＰ１  ＡＵＧスタートコドンを包含することが好ましい。
【００３２】
それ故、本発明に従ったさらなる実施形態において、オープンリーディングフレームを含むヌクレオチド配列の昆虫細胞における発現のための核酸構築物であって、前記オープンリーディングフレーム配列は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３、並びにＶＰ１に対するＡＵＧ翻訳開始コドンをコードし、前記ヌクレオチド配列は、代替スタートコドンで始まる代替オープンリーディングフレームを含み、代替オープンリーディングフレームは前記ＶＰ１に対するＡＵＧ翻訳開始コドンを包含する、核酸構築物が提供される。
【００３３】
代替オープンリーディングフレームは、ＶＰ１  ＡＵＧスタートコドンから５’にある好ましくは多くても１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、又は１０ヌクレオチドから開始し、その後で終結する。代替オープンリーディングフレームは、ＶＰ１  ＡＵＧスタートコドンの５’から開始し、その後多くても５００、４００、３００、２００、１５０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、又は１０ヌクレオチドで終結する。代替オープンリーディングフレームは、ＶＰ１  ＡＵＧスタートコドンから５’にある多くても５０ヌクレオチドから開始し得、その後多くても５００ヌクレオチドで終結する。代替オープンリーディングフレームは、ＶＰ１  ＡＵＧスタートコドンから５’にある多くても４０ヌクレオチドから開始し得、その後多くても２００ヌクレオチドで終結する。代替オープンリーディングフレームは、ＶＰ１  ＡＵＧスタートコドンから５’にある多くても３０ヌクレオチドから開始し得、その後多くても５０ヌクレオチドで終結する。代替オープンリーディングフレームは、ＶＰ１  ＡＵＧスタートコドンから多くても１０ヌクレオチドから開始し得、その後多くても２０ヌクレオチドで終結する。１つの代替的な実施形態において、代替オープンリーディングフレームは、ＶＰ３の開始コドンの前で、好ましくはＶＰ２の開始コドンの前で終結する。例えば、実施例において示されるそのような代替オープンリーディングフレームは、４ヌクレオチド上流で開始し、その後１４ヌクレオチドで終結する、又は８ヌクレオチド上流で開始し、その後４若しくはそれを上回る数のヌクレオチドで終結する。
【００３４】
そのような代替オープンリーディングフレームは、配列番号７０のＤＮＡ配列のヌクレオチド１０５〜１５５によってコードされる配列である、ＶＰ１  ＡＴＧスタートコドン配列の上流を含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３をコードするＤＮＡ配列に含まれてもよいことが好ましい。ＡＴＧスタートコドンの上流にある配列は、ＲＮＡに転写される。そのような代替オープンリーディングフレームも、配列番号７０のＤＮＡ配列のヌクレオチド１〜１５５によってコードされる配列である、ＶＰ１  ＡＴＧスタートコドン配列の上流を含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３をコードするＤＮＡ配列に含まれてもよい。上流配列は、ＡＴＧ  ＶＰ１スタートコドンの上流にあるポリヘドリンプロモーター及び５’リーダー配列をコードする（１０５〜１５５）。
【００３５】
したがって、上で記載される本発明の代替オープンリーディングフレームは、昆虫細胞においてペプチドに翻訳されることが好ましい。１つの実施形態において、ペプチドは、少なくとも４アミノ酸、少なくとも５アミノ酸、少なくとも６アミノ酸の長さを有する。１つの実施形態において、翻訳されたアミノ酸配列は、配列番号７２又は配列番号７３を含む又はそれからなる。別の実施形態において、ペプチドは、多くても２００、１５０、１００、５０、４０、３０、２０、又は１０アミノ酸の長さを有する。さらなる実施形態において、代替オープンリーディングフレームをコードする本発明に従った核酸構築物は、２〜２００アミノ酸、２〜１００、２〜５０、又は好ましくは２〜１０アミノ酸に及ぶ長さを有するペプチドに翻訳される。したがって、代替スタートコドンに続く代替オープンリーディングフレームを含む本明細書において記載される本発明に従った核酸構築物は、ペプチドをコードする。ペプチドの長さは、ＶＰ１スタートコドンの後の配列、すなわち、例えば天然に由来するＡＡＶ配列に由来し得る、又は合成若しくは人工のＡＡＶカプシド配列（例えば、コドン最適化された、又は向上した特性を有する変異バリアント）に由来し得るＶＰ１をコードする配列に依存してもよい。したがって、長さは、ＶＰ１  ＡＴＧスタートコドンの上流にある代替スタートコドンから始まるアウトオブフレームリーディングフレームにおいてストップコドン（ＴＧＡ、ＴＡＡ、ＴＡＧ）が存在する場所に依存する。スタートコドンの下流にある配列を、アウトオブフレーム上流スタートコドンとインフレームにあるストップコドンを導入するように変異させてもよい。このように、ペプチドの長さを意図的に選択することができる。それによって、ＶＰ１コード配列に関してアミノ酸配列に変化を導入しない、言い換えればＶＰ１リーディングフレームにおけるサイレント変異である、アウトオブフレームストップコドンを導入することができる。導入されるアウトオブリーディングフレームストップコドンは、リーディングフレームにおける３つの連続した核酸における１つ、２つ、又は３つの点変異によって導入されてもよい。ＶＰ１コード配列にトリプレット配列（すなわち、ＴＧＡ、ＴＡＡ、又はＴＡＧ）も挿入することができ、トリプレット配列は、コード配列の長さに関して１アミノ酸の挿入をもたらすことができ、及びＶＰ１コード配列の付加的なアミノ酸変化をもたらすことができる（すなわち、ＶＰ１コード配列の１つのトリプレットは、アウトオブフレームストップコドンの挿入によって２つのトリプレットに変化する）。
【００３６】
別の実施形態において、オープンリーディングフレームを含むヌクレオチド配列の昆虫細胞における発現のための発現制御配列を含む核酸構築物であって、前記オープンリーディングフレーム配列は、
ｉ）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３；並びに
ｉｉ）ＶＰ１に対するＡＵＧ翻訳開始コドン
をコードし、前記ヌクレオチド配列は、ＶＰ１  ＡＵＧのすぐ上流に、配列番号３２〜６２からなる群から選択されるヌクレオチド配列のヌクレオチド１〜８を含む、核酸構築物が提供される。配列番号３２〜６２はＲＮＡ配列を指し、したがって核酸構築物は、配列番号１〜３１に列挙されるものなど、ＲＮＡ配列をコードする相当するＤＮＡ配列を有すると理解される。ヌクレオチド配列は、ＶＰ１  ＡＵＧのすぐ下流にＧヌクレオチドを含むことが好ましい。本発明に従った核酸構築物は、ＶＰ１スタートコドンをコードする、配列番号１〜３１からなる群から選択される配列を含み、前記ＶＰ１スタートコドンは配列番号１〜３１の位置９〜１１に相当することがより好ましい。配列番号１及び配列番号３２に由来する配列が最も好ましく、すなわち配列番号１及び配列番号３２のヌクレオチド１〜８が好ましく、ＶＰ１  ＡＴＧに直接隣り合ったＧを有することが好ましく、いずれか配列番号１の配列全体をコードすることが最も好ましい。
【００３７】
さらなる実施形態において、ＶＰ１のオープンリーディングフレームの第２のコドンが、アラニン、グリシン、バリン、アスパラギン酸、及びグルタミン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基をコードする、本発明に従った核酸構築物が提供される。この第２のアミノ酸残基は、スタートコドンと、例えば野生型ＡＡＶ  ＶＰ１配列に由来する第２のコドンとの間に挿入されたコドンに由来してもよい、又はＶＰ１ヌクレオチド配列の第２のコドンは、変異したコドンであってもよい（例えば、ＶＰ１  ＡＴＧコドンの直後の核酸をＧに変異させることによる）。ＶＰ１の第２のコドンはバリンをコードすることが最も好ましい。第２のコドンは、ＧＵＡ、ＧＵＣ、ＧＵＵ、ＧＵＧからなる群から選択されることがより好ましく、第２のコドンはＧＵＡであることが好ましい。オープンリーディングフレームは、第２のコドンの後に、さらなる付加的なアミノ酸残基をコードする１つ又は複数のコドン、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個の付加的なアミノ酸、しかし好ましくは６０、５０、４０、３５、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、又は１４個未満の付加的なアミノ酸残基に対するコドンを任意選択で含む。容易に理解されるであろうように、付加的なアミノ酸残基をコードするコドンは、カプシドタンパク質のオープンリーディングフレームとインフレームであるべきである。
【００３８】
したがって、１つの実施形態において、例えば野生型ＶＰ１カプシドタンパク質配列の位置２の改変により、又は野生型ＶＰ１カプシドタンパク質配列の位置１と位置２の間へのバリンコドンの挿入により、又は天然に見い出される若しくはすでに選択されたＶＰ１カプシドタンパク質は位置２にバリンを含むため、ＶＰ１の位置２にバリンを有するＶＰ１カプシドタンパク質を含むＡＡＶベクターが提供される。昆虫細胞において産生されることが好ましいそのようなカプシドは、本明細書において記載される医学的治療において特に有用であることがある。
【００３９】
一実施形態において、オープンリーディングフレームを野生型カプシドタンパク質と比較した場合、カプシドタンパク質をコードするオープンリーディングフレームは、ＶＰ１のＡＴＧ翻訳開始コドンと、相当する野生型カプシドタンパク質における開始コドンにその３’末端ですぐ隣り合ったアミノ酸残基をコードするコドンとの間に挿入された１つ又は複数のアミノ酸残基をコードするコドンをさらに含む。例えば、オープンリーディングフレームは、相当する野生型カプシドタンパク質と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個の付加的なアミノ酸残基に対するコドンを含む。オープンリーディングフレームは、相当する野生型カプシドタンパク質と比較して、６０、５０、４０、３５、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、又は１４個未満の付加的なアミノ酸残基に対するコドンを含むことが好ましい。容易に理解されるであろうように、付加的なアミノ酸残基をコードするコドンは、カプシドタンパク質のオープンリーディングフレームとインフレームであるべきである。相当する野生型カプシドタンパク質と比較して付加的なアミノ酸残基をコードするこれらのコドンのうち、第１のコドン、すなわち準最適な翻訳開始コドンにその３’末端ですぐ隣り合っているコドンは、アラニン、グリシン、バリン、アスパラギン酸、及びグルタミン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基をコードする。故に、翻訳開始コドンと、野生型配列の残基２に相当するアミノ酸残基をコードするコドンとの間に１つのみの付加的なコドンがある場合、その付加的なコドンは、アラニン、グリシン、バリン、アスパラギン酸、及びグルタミン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基をコードする。翻訳開始コドンと、野生型配列のアミノ酸残基２をコードするコドンとの間に１つを上回る数の付加的なコドンがある場合には、翻訳開始コドンの直後のコドンは、アラニン、グリシン、バリン、アスパラギン酸、及びグルタミン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基をコードする。準最適な翻訳開始コドンの直後の（すなわち、翻訳開始コドンの３’末端における）付加的なアミノ酸残基はバリンであることが好ましい。言い換えれば、本発明の好ましい実施形態において、準最適な翻訳開始コドンの直後のコドンはバリンをコードする。
【００４０】
ステップａ）におけるＡＡＶカプシドタンパク質をコードする配列は、例えば、ヌクレオチド及びアミノ酸配列が、参照により文献全体として本明細書に組み入れられるＬｕｂｅｌｓｋｉらの国際公開第２０１５１３７８０２号に配列番号１３〜３８として列挙されているＡＡＶ１〜ＡＡＶ１３のものなど、天然に見い出されるカプシド配列であり得る。したがって、本発明に従った核酸構築物は、Ｌｕｂｅｌｓｋｉらの国際公開第２０１５１３７８０２号によって開示されるＡＡＶカプシドタンパク質に対するオープンリーディングフレーム全体を含み得る。代替的に、配列は人為的なものであり得、例えば配列はハイブリッド形態であってもよい、又は例えばＡｃｍＮＰｖ若しくはツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）のコドン使用法などによって、コドン最適化されてもよい。例えば、カプシド配列はＡＡＶ１のＶＰ２及びＶＰ３配列から構成されてもよく、一方で残りのＶＰ１配列はＡＡＶ５のものである。好ましいカプシドタンパク質は、Ｌｕｂｅｌｓｋｉらの国際公開第２０１５１３７８０２号に列挙されている、好ましくは配列番号２２に提供されるＡＡＶ５、又は好ましくは配列番号２８に提供されるＡＡＶ８である。故に、好ましい実施形態において、ＡＡＶカプシドタンパク質は、本発明に従って改変されているＡＡＶ血清型５又はＡＡＶ血清型８カプシドタンパク質である。ＡＡＶカプシドタンパク質は、本発明に従って改変されているＡＡＶ血清型５カプシドタンパク質であることがより好ましい。カプシドタンパク質の正確な分子量並びに翻訳開始コドンの正確な位置は、種々のパルボウイルス間で異なることがあると理解される。しかしながら、当業者であれば、ＡＡＶ−５以外のパルボウイルス由来のヌクレオチド配列における相当する位置を同定する方法を知っているであろう。代替的に、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする配列は、例えば指向的進化法実験の結果としての、人為的な配列である。この指向的進化法実験は、ＤＮＡシャッフリング、エラープローンＰＣＲ、バイオインフォマティクス的な合理的設計、部位飽和突然変異誘発による、カプシドライブラリーの作出を含み得る。結果として生じるカプシドは、既存の血清型に基づくが、そのようなカプシドの特質を向上させる様々なアミノ酸又はヌクレオチド変化を含有する。結果として生じるカプシドは、既存の血清型の様々な部分の組み合わせ「シャッフルされたカプシド」であり得る、或いは完全に新規の変化、すなわち、群に編成された又は遺伝子若しくはタンパク質の全長にわたって広がる、１つ又は複数のアミノ酸又はヌクレオチドの付加、欠失、又は置換を含有し得る。例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Ｓｃｈａｆｆｅｒ及びＭａｈｅｓｈｒｉ；Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ２６ｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＩＥＥＥ  ＥＭＢＳ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ、ＵＳＡ；２００４年９月１〜５日、３５２０〜３５２３ページ；Ａｓｕｒｉら（２０１２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２０（２）：３２９〜３３８９；Ｌｉｓｏｗｓｋｉら（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ  ５０６（７４８８���：３８２〜３８６を参照されたい。
【００４１】
本発明の好ましい実施形態において、ＶＰ３カプシドタンパク質をコードするオープンリーディングフレームは、ＡＣＧ、ＡＴＴ、ＡＴＡ、ＡＧＡ、ＡＧＧ、ＡＡＡ、ＣＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡ、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＴＴＧ、ＴＡＧ、及びＧＴＧからなる群から選択される非標準翻訳開始コドンで始まる。非標準翻訳開始コドンは、ＧＴＧ、ＣＴＧ、ＡＣＧ、ＴＴＧからなる群から選択されることが好ましく、非標準翻訳開始コドンはＣＴＧであることがより好ましい。
【００４２】
ＡＡＶカプシドタンパク質の発現のための本発明のヌクレオチド配列は、ＶＰ１オープンリーディングフレームのヌクレオチド位置１２におけるＧ、ヌクレオチド位置２１におけるＡ、及びヌクレオチド位置２４におけるＣの中から選択される、ＡＡＶ  ＶＰ１カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列の少なくとも１つの改変をさらに含むことが好ましく、前記ヌクレオチド位置は野生型ヌクレオチド配列のヌクレオチド位置に相当する。「潜在的な／考え得る偽スタート部位」又は「潜在的な／考え得る偽翻訳開始コドン」とは、カプシドタンパク質（複数可）のコード配列に位置するインフレームのＡＴＧコドンを意味すると本明細書において理解される。他の血清型のＶＰ１コード配列にある翻訳のための考え得る偽スタート部位の排除は、昆虫細胞において認識されることがある推定スプライス部位の排除のように、当業者によって十分に理解されるであろう。例えば、位置１２におけるヌクレオチドの改変は、Ｔヌクレオチドが偽ＡＴＧコドンを生じさせないことから、組み換えＡＡＶ５に要されない。昆虫細胞における適正な発現のための野生型ＡＡＶ配列の様々な改変は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ（２００１）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（第３編）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されるものなど、周知の遺伝子操作技法の適用によって達成される。ＶＰ及びビリオンの産出量を増加させ得る、又は指向性の変更など他の所望の効果を有し得る、又はビリオンの抗原性を低下させ得る、ＶＰコード領域の様々なさらなる改変が当業者に公知である。これらの改変は、本発明の範囲内にある。
【００４３】
ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする本発明のヌクレオチド配列は、昆虫細胞における発現のための発現制御配列に作動的に連結されていることが好ましい。故に、第２の態様において、本発明は、本発明に従った核酸分子を含む核酸構築物であって、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質をコードするオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列が、昆虫細胞における発現のための発現制御配列に作動的に連結されている核酸構築物に関する。これらの発現制御配列は、昆虫細胞において活性があるプロモーターを少なくとも含むと考えられる。昆虫宿主細胞において外来遺伝子を発現させるための当業者に公知の技法を用いて、本発明を実践し得る。昆虫細胞におけるポリペプチドの分子操作及び発現のための方法論は、例えばＳｕｍｍｅｒｓ及びＳｍｉｔｈ．１９８６．Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ、Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌ．第７５５５号、Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ、Ｔｅｘ．；Ｌｕｃｋｏｗ．１９９１．Ｉｎ  Ｐｒｏｋｏｐら、Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｖｅｃｔｏｒｓ’  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、９７〜１５２；Ｋｉｎｇ，Ｌ．Ａ．及びＲ．Ｄ．Ｐｏｓｓｅｅ、１９９２、Ｔｈｅ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ、Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｄ．Ｒ．、Ｌ．Ｋ．Ｍｉｌｌｅｒ、Ｖ．Ａ．Ｌｕｃｋｏｗ、１９９２、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ及びＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｃ．Ｄ．、１９９５、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第３９巻；米国特許第４，７４５，０５１号；米国特許出願公開第２００３１４８５０６号；及び国際公開第０３／０７４７１４号に記載されている。ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする本発明のヌクレオチド配列の転写のための特に適切なプロモーターは、例えばポリヘドリン（ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｎ）プロモーター（ｐｏｌＨ）であり、そのようなｐｏｌＨプロモーターは配列番号７０に提供されている（又は、Ｌｕｂｅｌｓｋｉらの国際公開第２０１５１３７８０２号において、配列番号５３及びその短縮型の配列番号５４として列挙されている）。しかしながら、昆虫細胞において活性があり本発明に従って選択することができる他のプロモーター、例えばポリヘドリン（ｐｏｌＨ）プロモーター、ｐ１０プロモーター、ｐ３５プロモーター、４×Ｈｓｐ２７  ＥｃＲＥ＋最小Ｈｓｐ７０プロモーター、デルタＥ１プロモーター、Ｅ１プロモーター、又はＩＥ−１プロモーター、及び上記の参考文献に記載されるさらなるプロモー��ーは、当技術分野において公知である。
【００４４】
昆虫細胞におけるＡＡＶカプシドタンパク質の発現のための核酸構築物は、昆虫細胞適合性ベクターであることが好ましい。「昆虫細胞適合性ベクター」又は「ベクター」とは、昆虫又は昆虫細胞の生産的な形質転換又はトランスフェクションが可能な核酸分子であると理解される。例示的な生物学的ベクターには、プラスミド、線状核酸分子、及び組み換えウイルスが含まれる。ベクターが昆虫細胞適合性である限りにおいて、任意のベクターを採用し得る。ベクターは昆虫細胞ゲノムに組み込まれることがあるが、昆虫細胞におけるベクターの存在は永続的である必要はなく、一過性のエピソーム性ベクターも含まれる。ベクターは、公知の任意の手段によって、例えば細胞の化学的処理、エレクトロポレーション、又は感染によって導入され得る。好ましい実施形態において、ベクターは、バキュロウイルス、ウイルスベクター、又はプラスミドである。より好ましい実施形態において、ベクターはバキュロウイルスであり、すなわち構築物はバキュロウイルスベクターである。バキュロウイルスベクター及びバキュロウイルスベクターの使用のための方法は、昆虫細胞の分子操作に関する上で引用される参考文献に記載されている。
【００４５】
第３の態様において、本発明は、上で規定される本発明の核酸構築物を含む昆虫細胞に関する。ＡＡＶの複製を可能にし培養下で維持され得る任意の昆虫細胞が、本発明に従って用いられ得る。例えば、用いられる細胞株は、ツマジロクサヨトウ由来のもの、ショウジョウバエ細胞株、又は蚊細胞株、例えばヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）由来細胞株であり得る。好ましい昆虫細胞又は細胞株は、例えばｅｘｐｒｅｓＳＦ＋（登録商標）、ショウジョウバエシュナイダー（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）２（Ｓ２）細胞、Ｓｅ３０１、ＳｅＩＺＤ２１０９、ＳｅＵＣＲ１、Ｓｆ９、Ｓｆ９００＋、Ｓｆ２１、ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４、ＭＧ−１、Ｔｎ３６８、ＨｚＡｍ１、Ｈａ２３０２、Ｈｚ２Ｅ５、及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＨｉｇｈ  Ｆｉｖｅを含めた、バキュロウイルス感染に感受性である昆虫種由来の細胞である。
【００４６】
本発明に従った好ましい昆虫細胞は、（ａ）少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）ヌクレオチド配列を含む第２のヌクレオチド配列；（ｂ）昆虫細胞における発現のための発現制御配列に作動的に連結されたＲｅｐ５２又はＲｅｐ４０コード配列を含む第３のヌクレオチド配列；及び（ｃ）昆虫細胞における発現のための発現制御配列に作動的に連結されたＲｅｐ７８又はＲｅｐ６８コード配列を含む第４のヌクレオチド配列、をさらに含む。
【００４７】
本発明の文脈において、「少なくとも１つのＡＡＶ  ＩＴＲヌクレオチド配列」とは、「Ａ」、「Ｂ」、及び「Ｃ」領域とも称される、大部分が相補的で対照的に並べられた配列を含む回文配列を意味すると理解される。ＩＴＲは、複製において「シス」役割を有する部位、すなわち回文及び回文内部の特異的配列を認識するトランス作用性複製タンパク質（例えば、Ｒｅｐ７８又はＲｅｐ６８）に対する認識部位である、複製の起点として機能する。ＩＴＲ配列の対称性の１つの例外は、ＩＴＲの「Ｄ」領域である。Ｄ領域は固有である（１つのＩＴＲ内に相補体を有しない）。一本鎖ＤＮＡのニッキングは、Ａ及びＤ領域間の接合部で生じる。接合部は、新たなＤＮＡ合成が開始する領域である。Ｄ領域は、回文の片側に通常では存在し、核酸複製ステップに方向性を提供する。哺乳類細胞において複製するＡＡＶは、典型的には２つのＩＴＲ配列を有する。しかしながら、結合部位がＡ領域の両鎖にあり、Ｄ領域が回文の両側に１つずつ対称的に位置するように、ＩＴＲを操作することが可能である。二本鎖の環状ＤＮＡ鋳型（例えば、プラスミド）に関して、Ｒｅｐ７８又はＲｅｐ６８に支援された核酸複製は、次いで両方向に進み、環状ベクターのＡＡＶ複製には単一のＩＴＲで十分である。故に、１つのＩＴＲヌクレオチド配列が、本発明の文脈において用いられ得る。しかしながら、２つ又は別の偶数の規則的ＩＴＲが用いられることが好ましい。２つのＩＴＲ配列が用いられることが最も好ましい。ウイルスベクターの安全性を考慮して、細胞への初回導入後にさらに繁殖することができないウイルスベクターを構築することが望ましいことがある。レシピエントにおける望ましくないベクター繁殖を抑えるためのそのような安全性機構を、米国特許出願公開第２００３１４８５０６号に記載されるキメラＩＴＲを有するｒＡＡＶを用いることによって提供することができる。好ましい実施形態において、パルボウイルスＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、国際公開第２００９／１５４４５２号に記載されるものなど、免疫回避リピートをコードする配列の少なくとも１つのインフレーム挿入を含む。この挿入は、いわゆる自己相補的な又は単量体二重鎖のパルボウイルスビリオンの形成をもたらす。好ましい実施形態において、パルボウイルスＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３カプシドタンパク質をコードする配列は、単量体二重鎖の又は自己相補的なゲノムを含む。単量体二重鎖ＡＡＶベクターの調製に関しては、ＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質及びＡＡＶカプシドタンパク質を、本発明に従った昆虫細胞において少なくとも１つのＡＡＶ  ＩＴＲを含むベクターゲノムの存在下で発現させ、Ｒｅｐ５２及び／又はＲｅｐ４０タンパク質発現をＲｅｐ７８及び／又はＲｅｐ６８タンパク質発現と比べて増加させる。単量体二重鎖ＡＡＶベクターは、例えば国際公開第２０１１／１２２９５０号に記載されるように、少なくとも１つのＡＡＶ  ＩＴＲによって隣接されたベクターゲノム構築物の存在下で、ＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質及びＡＡＶ  Ｃａｐタンパク質を昆虫細胞において発現させ、Ｒｅｐ７８及び／又はＲｅｐ６０のニッキング活性をＲｅｐ５２及び／又はＲｅｐ４０のヘリカーゼ／カプシド化活性と比べて低下させることによっても調製され得る。
【００４８】
採用されるベクター又は核酸構築物の数は、本発明において限定されていない。例えば、１、２、３、４、５、６つ、又はそれを上回る数のベクターを採用して、本発明に従った昆虫細胞においてＡＡＶを産生し得る。６つのベクターが採用される場合、１つのベクターはＡＡＶ  ＶＰ１をコードし、別のベクターはＡＡＶ  ＶＰ２をコードし、さらに別のベクターはＡＡＶ  ＶＰ３をコードし、なおさらに別のベクターはＲｅｐ５２又はＲｅｐ４０をコードし、一方でＲｅｐ７８又はＲｅｐ６８は別のベクターによってコードされ、最後のベクターは少なくとも１つのＡＡＶ  ＩＴＲを含む。付加的なベクターを採用して、例えばＲｅｐ５２とＲｅｐ４０とを、及びＲｅｐ７８とＲｅｐ６８とを発現させることができるであろう。６つよりも少ないベクターが用いられる場合、ベクターは、少なくとも１つのＡＡＶ  ＩＴＲと、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、Ｒｅｐ５２／Ｒｅｐ４０、及びＲｅｐ７８／Ｒｅｐ６８コード配列との様々な組み合わせを含み得る。２つのベクター又は３つのベクターが用いられることが好ましく、上で記載されるように２つのベクターがより好ましい。２つのベクターが用いられる場合、昆虫細胞は、（ａ）上で規定されるＡＡＶカプシドタンパク質の発現のための第１の核酸構築物であって、構築物は、上の（ｂ）及び（ｃ）において規定される第３及び第４のヌクレオチド配列をさらに含み、前記第３のヌクレオチド配列は、昆虫細胞における発現のための少なくとも１つの発現制御配列に作動的に連結されたＲｅｐ５２又はＲｅｐ４０コード配列を含み、前記第４のヌクレオチド配列は、昆虫細胞における発現のための少なくとも１つの発現制御配列に作動的に連結されたＲｅｐ７８又はＲｅｐ６８コード配列を含む、第１の核酸構築物；並びに、（ｂ）少なくとも１つのＡＡＶ  ＩＴＲヌクレオチド配列を含む、上の（ａ）において規定される第２のヌクレオチド配列を含む第２の核酸構築物、を含むことが好ましい。３つのベクターが用いられる場合、カプシドタンパク質の発現に並びにＲｅｐ５２、Ｒｅｐ４０、Ｒｅｐ７８、及びＲｅｐ６８タンパク質の発現に別個のベクターが用いられるという点を除いて、２つのベクターに対して用いられるものと同じ構成が用いられることが好ましい。各ベクターでの配列は、互いに対して任意の順序にあり得る。例えば、１つのベクターが、ＩＴＲと、ＶＰカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＯＲＦとを含む場合、ＩＴＲ配列間のＤＮＡの複製があるとＶＰ  ＯＲＦが複製される又は複製されないように、ＶＰ  ＯＲＦはベクターに位置し得る。別の例として、Ｒｅｐコード配列、及び／又はＶＰカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＯＲＦは、ベクターで任意の順序にあり得る。第２、第３、及びさらなる核酸構築物（複数可）も昆虫細胞適合性ベクターであることが好ましく、上で記載されるバキュロウイルスベクターであることが好ましいと理解される。代替的に、本発明の昆虫細胞において、第１のヌクレオチド配列、第２のヌクレオチド配列、第３のヌクレオチド配列、及び第４のヌクレオチド配列、及び任意選択のさらなるヌクレオチド配列のうちの１つ又は複数は、昆虫細胞のゲノムに安定に組み��まれることがある。当業者であれば、昆虫ゲノムにヌクレオチド配列を安定に導入する方法、及びゲノムにそのようなヌクレオチド配列を有する細胞を同定する方法を知っている。ゲノムへの組み入れを、例えば、昆虫ゲノムの領域に高度に相同なヌクレオチド配列を含むベクターの使用によって支援することができる。トランスポゾンなどの特異的配列の使用は、ゲノムにヌクレオチド配列を導入する別の手段である。
【００４９】
故に、好ましい実施形態において、本発明に従った昆虫細胞は、（ａ）本発明に従った第１の核酸構築物であって、前記第１の核酸構築物は、上で規定される第３及び第４のヌクレオチド配列をさらに含む、第１の核酸構築物；並びに（ｂ）上で規定される第２のヌクレオチド配列を含む第２の核酸構築物であって、前記第２の核酸構築物は昆虫細胞適合性ベクターであることが好ましく、バキュロウイルスベクターであることがより好ましい、第２の核酸構築物、を含む。
【００５０】
本発明の好ましい実施形態において、本発明の昆虫細胞に存在する第２のヌクレオチド配列、すなわち少なくとも１つのＡＡＶ  ＩＴＲを含む配列は、関心対象の遺伝子産物をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列（哺乳類細胞における発現のためのものであることが好ましい）をさらに含み、関心対象の遺伝子産物をコードする前記少なくとも１つのヌクレオチド配列は、昆虫細胞において産生されるＡＡＶのゲノムに組み入れられることになることが好ましい。関心対象の遺伝子産物をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列は、哺乳類細胞における発現のための配列であることが好ましい。第２のヌクレオチド配列は２つのＡＡＶ  ＩＴＲヌクレオチド配列を含み、関心対象の遺伝子産物をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列は前記２つのＡＡＶ  ＩＴＲヌクレオチド配列の間に位置することが好ましい。関心対象の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列（哺乳類細胞における発現のためのもの）は、ヌクレオチド配列が２つの規則的ＩＴＲの間に位置する場合又は２つのＤ領域を有するように操作されたＩＴＲのいずれかの側に位置する場合、昆虫細胞において産生されるＡＡＶゲノムに組み入れられることが好ましい。故に、好ましい実施形態において、本発明は、第２のヌクレオチド配列が２つのＡＡＶ  ＩＴＲヌクレオチド配列を含み、関心対象の遺伝子産物をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列が前記２つのＡＡＶ  ＩＴＲヌクレオチド配列の間に位置する、本発明に従った昆虫細胞を提供する。
【００５１】
ＩＴＲを含めた関心対象の遺伝子産物は、典型的に長さが５，０００ヌクレオチド（ｎｔ）又はそれ未満である。別の実施形態において、特大のＤＮＡ、すなわち長さが５，０００ｎｔを上回るものは、本発明によって記載されるＡＡＶベクターを用いることによってインビトロ又はインビボで発現され得る。特大のＤＮＡとは、５ｋｂｐの最大ＡＡＶパッケージング限度を超えるＤＮＡとして本明細書で理解される。それ故、通常では５．０ｋｂよりも大きなゲノムによってコードされる組み換えタンパク質を産生し得るＡＡＶベクターの作出も実現可能である。例えば、本発明者らは、昆虫細胞においてｈＦＶＩＩＩの部分的な単一方向にパッケージされたフラグメントを含有するｒＡＡＶ５ベクターを作出した。少なくとも５．６ｋｂを包含するベクターゲノムの総サイズを、ＦＶＩＩＩフラグメント含有ＡＡＶ５粒子の２つの集団にパッケージした。これらのバリアントＡＡＶ５−ＦＶＩＩＩベクターは、活性なＦＶＩＩＩの発現及び分泌を推進することが示された。この推進はインビトロで確認され、Ｈｕｈ７細胞の感染後の、第ＶＩＩＩ因子をコードする関心対象の遺伝子産物を含むＡＡＶベクターは、活性なＦＶＩＩＩタンパク質の産生をもたらした。同様に、マウスにおけるｒＡＡＶ．ＦＶＩＩＩの尾静脈送達は、活性なＦＶＩＩＩタンパク質の産生をもたらした。カプシド化産物の分子解析は、５．６ｋｂｐのＦＶＩＩＩ発現カセットがＡＡＶ粒子において完全にカプシド化されるわけではないことをはっきりと示した。いかなる理論によっても拘束されることなく、本発明者らは、カプシド化された分子の＋及び−ＤＮＡ鎖は、欠けた５’末端を示したという仮説を立てている。この仮説は、４．７〜４，９ｋｂｐ限度を有する「ヘッドフル（ｈｅａｄ−ｆｕｌｌ）原理」に従って作動する、以前に報告された単一方向の（３’末端で始まる）パッケージング機構と一致している（例えば、Ｗｕら［２０１０］Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １８（１）：８０〜８６；Ｄｏｎｇら［２０１０］Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １８（１）：８７〜９２；Ｋａｐｒａｎｏｖら［２０１２］Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２３：４６〜５５；及び特にＬａｉら［２０１０］Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １８（１）：７５〜７９を参照されたい）。５．６ｋｂベクターゲノム全体のおよそ５ｋｂのみがカプシド化されたものの、ベクターは強力であり、活性なＦＶＩＩＩの発現につながる。本発明者らは、ＦＶＩＩＩの産生のための正しい鋳型が、＋及び−ＤＮＡ鎖の部分的相補性、それに続く第２鎖の合成に基づいて標的細胞において会合したことを示した。
【００５２】
故に、本明細書において上で規定される第２のヌクレオチド配列は、昆虫細胞において複製されるＡＡＶゲノムにヌクレオチド配列が組み入れられるように位置する、哺乳類細胞における発現のための少なくとも１つの「関心対象の遺伝子産物」をコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。構築物がＡＡＶビリオンのパッケージング容量の範囲内にとどまる限りにおいて、本発明に従って産生されたＡＡＶをトランスフェクトされた哺乳類細胞に、後の発現のために、任意のヌクレオチド配列が組み入れられ得る。ヌクレオチド配列は、例えばタンパク質をコードしてもよく、ヌクレオチド配列はＲＮＡｉ作用物質、すなわち、例えばｓｈＲＮＡ（短いヘアピンＲＮＡ）又はｓｉＲＮＡ（短い干渉ＲＮＡ）など、ＲＮＡ干渉が可能であるＲＮＡ分子を発現させてもよい。「ｓｉＲＮＡ」とは、哺乳類細胞において有毒でない短い長さの二本鎖ＲＮＡである小さな干渉ＲＮＡを意味する（Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１、Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：４９４〜９８；Ｃａｐｌｅｎら、２００１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：９７４２〜４７）。好ましい実施形態において、第２のヌクレオチド配列は２つのヌクレオチド配列を含んでもよく、それぞれは哺乳類細胞における発現のための関心対象の１つの遺伝子産物をコードする。関心対象の産物をコードする２つのヌクレオチド配列のそれぞれは、昆虫細胞において複製されるｒＡＡＶゲノムにそれぞれが組み入れられるように位置する。
【００５３】
哺乳類細胞における発現のための関心対象の産物は、治療用遺伝子産物であってもよい。治療用遺伝子産物は、標的細胞において発現した場合、例えば非所望の活性の除去、例えば感染細胞の除去、又は例えば酵素活性の欠損を引き起こす遺伝子欠陥の相補などの所望の治療効果を提供する、ポリペプチド、又はＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ）、又は他の遺伝子産物であり得る。治療用ポリペプチド遺伝子産物の例には、ＣＦＴＲ、第ＩＸ因子、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ、好ましくはＬＰＬ  Ｓ４４７Ｘ；国際公開第０１／００２２０号を参照されたい）、アポリポタンパク質Ａ１、ウリジン二リン酸グルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）、網膜色素変性症ＧＴＰａｓｅレギュレーター相互作用タンパク質（ＲＰ−ＧＲＩＰ）、例えばＩＬ−１０のようなサイトカイン又はインターロイキン、ジストロフィン、ＰＢＧＤ、ＮａＧＬＵ、Ｔｒｅｇ１６７、Ｔｒｅｇ２８９、ＥＰＯ、ＩＧＦ、ＩＦＮ、ＧＤＮＦ、ＦＯＸＰ３、第ＶＩＩＩ因子、ＶＥＧＦ、ＡＧＸＴ、及びインスリンが含まれる。代替的に、又は第２の遺伝子産物として加えて、本明細書において上で規定される第２のヌクレオチド配列は、細胞形質転換及び発現を査定するマーカータンパク質として働くポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。この目的のための適切なマーカータンパク質は、例えば蛍光タンパク質ＧＦＰ、及び選択可能マーカー遺伝子ＨＳＶチミジンキナーゼ（ＨＡＴ培地での選択用）、細菌ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ハイグロマイシンＢに対する選択用）、Ｔｎ５アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（Ｇ４１８に対する選択用）、及びジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）（メトトレキサートに対する選択用）、ＣＤ２０、低アフィニティーの神経成長因子遺伝子である。これらマーカー遺伝子を獲得するための供給源及びそれらマーカー遺伝子の使用のための方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌ（２００１）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（第３編）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに提供されている。さらに、本明細書において上で規定される第２のヌクレオチド配列は、必要と判断される場合、本発明のｒＡＡＶを形質導入された細胞から対象を治癒させるフェイルセーフ機構として働くことができるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。自殺遺伝子としばしば称されるそのようなヌクレオチド配列は、タンパク質が発現されるトランスジェニック細胞を殺傷し得る毒性物質にプロドラッグを変換し得るタンパク質をコードする。そのような自殺遺伝子の適切な例には、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ遺伝子、又は単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、及び水痘・帯状疱疹ウイルス由来のチミジンキナーゼ遺伝子の１つが含まれ、その場合、ガンシクロビルをプロドラッグとして用いて、対象におけるトランスジェニック細胞を殺傷することができる（例えば、Ｃｌａｉｒら、１９８７、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃ���ｅｍｏｔｈｅｒ．３１：８４４〜８４９を参照されたい）。
【００５４】
別の実施形態において、関心対象の遺伝子産物はＡＡＶタンパク質であり得る。特に、Ｒｅｐ７８若しくはＲｅｐ６８などのＲｅｐタンパク質、又はその機能的フラグメント。Ｒｅｐ７８及び／又はＲｅｐ６８をコードするヌクレオチド配列は、本発明のｒＡＡＶゲノムに存在し本発明のｒＡＡＶを形質導入された哺乳類細胞において発現する場合、形質導入された哺乳類細胞のゲノムへのｒＡＡＶの組み込みを可能にする。ｒＡＡＶを形質導入された又は感染させた哺乳類細胞におけるＲｅｐ７８及び／又はＲｅｐ６８の発現は、ｒＡＡＶによって細胞に導入された関心対象の他の任意の遺伝子産物の長期にわたる又は永続的な発現を可能にすることによって、ｒＡＡＶのある特定の使用に利点を提供し得る。
【００５５】
本発明のｒＡＡＶベクターにおいて、哺乳類細胞における発現のための関心対象の遺伝子産物をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列（複数可）は、少なくとも１つの哺乳類細胞適合性発現制御配列、例えばプロモーターに作動的に連結されていることが好ましい。多くのそのようなプロモーターが当技術分野において公知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌ、２００１、前出を参照されたい）。ＣＭＶプロモーターなど、多くの細胞タイプにおいて広く発現される構成的プロモーターが用いられてもよい。しかしながら、誘導性、組織特異的、細胞タイプ特異的、又は細胞周期特異的であるプロモーターがより好ましいであろう。例えば、肝臓特異的発現のために、プロモーターは、α１−アンチトリプシンプロモーター、甲状腺ホルモン結合グロブリンプロモーター、アルブミンプロモーター、ＬＰＳ（チロキシン結合グロビン）プロモーター、ＨＣＲ−ＡｐｏＣＩＩハイブリッドプロモーター、ＨＣＲ−ｈＡＡＴハイブリッドプロモーター及びアポリポタンパク質Ｅプロモーター、ＬＰ１、ＨＬＰ、最小ＴＴＲプロモーター、ＦＶＩＩＩプロモーター、ハイペロン（ｈｙｐｅｒｏｎ）エンハンサー、ｅａｌｂ−ｈＡＡＴから選択されてもよい。他の例には、腫瘍選択的な、特に神経系細胞腫瘍選択的な発現のためのＥ２Ｆプロモーター（Ｐａｒｒら、１９９７、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．３：１１４５〜９）、又は単核血液細胞における使用のためのＩＬ−２プロモーター（Ｈａｇｅｎｂａｕｇｈら、１９９７、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ；１８５：２１０１〜１０）が含まれる。
【００５６】
ＡＡＶは多くの哺乳類細胞に感染し得る、例えば、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、５（１１）：３２５１〜３２６０（１９８５）、及びＧｒｉｍｍら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、１０（１５）：２４４５〜２４５０（１９９９）を参照されたい。しかしながら、ヒト滑膜線維芽細胞のＡＡＶ形質導入は、類似のマウス細胞においてよりも有意に効率的であり、Ｊｅｎｎｉｎｇｓら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ、３：１（２００１）、ＡＡＶの細胞トロピシティー（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｒｏｐｉｃｉｔｙ）は血清型によって異なる。例えば、Ｄａｖｉｄｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９７（７）：３４２８〜３４３２（２０００）（哺乳類ＣＮＳ細胞の指向性及び形質導入効率に関して、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、及びＡＡＶ５間の違いを考察している）を参照されたい。
【００５７】
述べられているように、昆虫細胞におけるＡＡＶの産生のための本発明において用いることができるＡＡＶ配列は、任意のＡＡＶ血清型のゲノムに由来し得る。一般的に、ＡＡＶ血清型は、アミノ酸及び核酸レベルでかなり相同なゲノム配列を有し、同一の一連の遺伝子機能を提供し、本質的には物理的及び機能的に等価であるビリオンを産生し、事実上同一の機構によって複製し及び会合する。様々なＡＡＶ血清型のゲノム配列及びゲノム類似性の概説に関しては、例えばＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ８９７９０；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｊ０１９０１；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０４３３０３；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０８５７１６；Ｃｈｌｏｒｉｎｉら（１９９７、Ｊ．Ｖｉｒ．７１：６８２３〜３３）；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら（１９８３、Ｊ．Ｖｉｒ．４５：５５５〜６４）；Ｃｈｌｏｒｉｎｉら（１９９９、Ｊ．Ｖｉｒ．７３：１３０９〜１３１９）；Ｒｕｔｌｅｄｇｅら（１９９８、Ｊ．Ｖｉｒ．７２：３０９〜３１９）；及びＷｕら（２０００、Ｊ．Ｖｉｒ．７４：８６３５〜４７）を参照されたい。ヒト又はサルアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型は、本発明の文脈における使用のためのＡＡＶヌクレオチド配列の好ましい供給源であり、通常ではヒト（例えば、血清型１、２、３Ａ、３Ｂ、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３）又は霊長類（例えば、血清型１及び４）に感染するＡＡＶ血清型がより好ましい。
【００５８】
本発明の文脈における使用のためのＡＡＶ  ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、及び／又はＡＡＶ４に由来することが好ましい。同様に、Ｒｅｐ５２、Ｒｅｐ４０、Ｒｅｐ７８、及び／又はＲｅｐ６８コード配列は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、及び／又はＡＡＶ４に由来することが好ましい。本発明の文脈における使用のためのＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３カプシドタンパク質をコードする配列は、公知の４２種の血清型のいずれかから、より好ましくはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、若しくはＡＡＶ９、又は例えばカプシドシャッフリング技法及びＡＡＶカプシドライブラリーによって獲得される新たに開発されたＡＡＶ様粒子から選ばれてもよい。好ましい実施形態において、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３カプシドタンパク質をコードする配列は、ＡＡＶ５又はＡＡＶ８由来のものであり、ＡＡＶ５由来のものであることがより好ましい。
【００５９】
ＡＡＶ  Ｒｅｐ及びＩＴＲ配列は、ほとんどの血清型の間で特に保存されている。様々なＡＡＶ血清型のＲｅｐ７８タンパク質は、例えば８９％を上回って同一であり、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、及びＡＡＶ６間でのゲノムレベルにおける全体的ヌクレオチド配列同一性は８２％前後である（Ｂａｎｔｅｌ−Ｓｃｈａａｌら、１９９９、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７３（２）：９３９〜９４７）。さらには、多くのＡＡＶ血清型のＲｅｐ配列及びＩＴＲは、哺乳類細胞におけるＡＡＶ粒子の産生において、他の血清型由来の相当する配列を効率的に交差補完する（すなわち、機能的に代わりになる）ことが公知である。米国特許出願公開第２００３１４８５０６号は、ＡＡＶ  Ｒｅｐ及びＩＴＲ配列が、昆虫細胞においても他のＡＡＶ  Ｒｅｐ及びＩＴＲ配列を効率的に交差補完することを報告している。
【００６０】
ＡＡＶ  ＶＰタンパク質は、ＡＡＶビリオンの細胞トロピシティーを決定することが公知である。ＶＰタンパク質コード配列は、種々のＡＡＶ血清型の間でＲｅｐタンパク質及び遺伝子よりもかなり保存されていない。Ｒｅｐ及びＩＴＲ配列が他の血清型の相当する配列を交差補完する能力は、一血清型（例えば、ＡＡＶ３）のカプシドタンパク質と、別のＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ２）のＲｅｐ及び／又はＩＴＲ配列とを含む偽型ＡＡＶ粒子の産生を可能にする。そのような偽型ＡＡＶ粒子は、本発明の一部である。
【００６１】
述べられているように、改変された「ＡＡＶ」配列も、本発明の文脈において、例えば昆虫細胞におけるｒＡＡＶベクターの産生に用いられ得る。そのような改変された配列は、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、又はＡＡＶ９  ＩＴＲ、Ｒｅｐ、又はＶＰと少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又はそれを上回る割合のヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列同一性を有する配列（例えば、約７５〜９９％のヌクレオチド配列同一性を有する配列）を含み、野生型ＡＡＶ  ＩＴＲ、Ｒｅｐ、又はＶＰ配列の代わりに用いられ得る。
【００６２】
多くの点において他のＡＡＶ血清型と類似しているものの、ＡＡＶ５は、他の公知のヒト及びサル血清型よりも、他のヒト及びサルＡＡＶ血清型とは異なる。そのことを考慮して、ＡＡＶ５の産生は、昆虫細胞における他の血清型の産生とは異なり得る。本発明の方法を採用してｒＡＡＶ５を産生する場合、１つ又は複数のベクターは、１つを上回る数のベクターの場合には集合的に、ＡＡＶ５  ＩＴＲを含むヌクレオチド配列を含み、一ヌクレオチド配列はＡＡＶ５  Ｒｅｐ５２及び／又はＲｅｐ４０コード配列を含み、一ヌクレオチド配列はＡＡＶ５  Ｒｅｐ７８及び／又はＲｅｐ６８コード配列を含むことが好ましい。そのようなＩＴＲ及びＲｅｐ配列を所望のとおりに改変して、昆虫細胞におけるｒＡＡＶ５又は偽型ｒＡＡＶ５ベクターの効率的な産生を獲得し得る。例えば、Ｒｅｐ配列のスタートコドンを改変し得る。
【００６３】
好ましい実施形態において、第１のヌクレオチド配列、第２のヌクレオチド配列、第３のヌクレオチド配列、及び任意選択で第４のヌクレオチド配列は、昆虫細胞のゲノムに安定に組み込まれる。
【００６４】
本発明に従った好ましいＡＡＶは、関心対象の遺伝子産物をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列をＡＡＶのゲノムに含むビリオンであり、少なくとも１つのヌクレオチド配列は天然のＡＡＶヌクレオチド配列ではないことが好ましく、ＡＡＶビリオンは、アミノ酸位置１にメチオニン及び位置２にバリンを含むＶＰ１カプシドタンパク質を含む。例えば本明細書において下で規定される方法において、上で規定される昆虫細胞から獲得可能であるＡＡＶビリオンがさらにより好ましい。
【００６５】
本発明のＡＡＶビリオンの利点は、それらビリオンの向上した感染力である。いかなる理論によっても拘束されることなく、感染力は、ＶＰ１の位置２におけるバリンと組み合わせて、カプシドにおけるＶＰ２及び／又はＶＰ３の量との関係においてカプシドにおけるＶＰ１タンパク質の量の増加とともに増加するように見える。ＡＡＶビリオンの感染力とは、導入遺伝子の発現率及び導入遺伝子から発現される産物の量又は活性から推測することができるように、ビリオンに含まれる導入遺伝子の形質導入の効率を意味すると本明細書において理解される。
【００６６】
本発明のＡＡＶビリオンは、ＣＦＴＲ、第ＩＸ因子、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ、好ましくはＬＰＬ  Ｓ４４７Ｘ；国際公開第０１／００２２０号を参照されたい）、アポリポタンパク質Ａ１、ウリジン二リン酸グルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）、網膜色素変性症ＧＴＰａｓｅレギュレーター相互作用タンパク質（ＲＰ−ＧＲＩＰ）、例えばＩＬ−１０のようなサイトカイン又はインターロイキン、ジストロフィン、ＰＢＧＤ、ＮａＧＬＵ、Ｔｒｅｇ１６７、Ｔｒｅｇ２８９、ＥＰＯ、ＩＧＦ、ＩＦＮ、ＧＤＮＦ、ＦＯＸＰ３、第ＶＩＩＩ因子、ＶＥＧＦ、ＡＧＸＴ、及びインスリンからなる群から選択されるポリペプチド遺伝子産物をコードする関心対象の遺伝子産物を含むことが好ましい。関心対象の遺伝子産物は、第ＩＸ因子又は第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードすることがより好ましい。
【００６７】
別の態様において、故に、本発明は、昆虫細胞においてＡＡＶを産生するための方法に関する。方法は、（ａ）本明細書において上で規定される昆虫細胞をＡＡＶが産生されるような条件下で培養するステップ；及び任意選択で（ｂ）前記ＡＡＶを回収するステップを含むことが好ましい。培養下にある昆虫細胞に対する成長条件、及び培養下にある昆虫細胞における異種産物の産生は、当技術分野において周知であり、例えば昆虫細胞の分子操作に関する上で引用される参考文献に記載されている。
【００６８】
方法は、抗ＡＡＶ抗体、好ましくは固定した抗体を用いた、ＡＡＶのアフィニティー精製のステップをさらに含むことが好ましい。抗ＡＡＶ抗体はモノクローナル抗体であることが好ましい。特に適切な抗体は、例えばラクダ又はラマから獲得可能である、単鎖ラクダ科抗体又はそのフラグメントである（例えば、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ、２００１、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４：２７７〜３０２を参照されたい）。ＡＡＶのアフィニティー精製のための抗体は、ＡＡＶカプシドタンパク質のエピトープに特異的に結合する抗体であることが好ましく、エピトープは、１種を上回る種類のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質に存在するエピトープであることが好ましい。例えば、抗体は、ＡＡＶ２カプシドへの特異的結合に基づいて作り出されても又は選択されてもよいが、同時にまた抗体は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、及びＡＡＶ５カプシドにも特異的に結合してもよい。
【００６９】
本発明の別の態様において、パルボウイルスカプシドタンパク質をコードする核酸構築物を提供するための方法であって、前記核酸構築物は１つ又は複数の向上した特性を有し、方法は、
ａ）複数の核酸構築物を提供するステップであって、各構築物は、発現制御配列に作動的に連結されたパルボウイルスカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列、及び発現制御配列に作動的に連結されたパルボウイルスカプシドタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列に隣接する少なくとも１つのパルボウイルス逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含む、ステップ；
ｂ）前記複数の核酸構築物を、パルボウイルスＲｅｐタンパク質を発現し得る昆虫細胞に移入するステップ；
ｃ）前記昆虫細胞を、パルボウイルスカプシドタンパク質及びパルボウイルスｒｅｐタンパク質の発現を可能にする条件に供し、それにより、前記核酸構築物はパルボウイルスカプシドにパッケージされてパルボウイルスビリオンを提供し得るステップ；
ｄ）前記昆虫細胞及び／又は昆虫細胞上清からパルボウイルスビリオンを回収するステップ；
ｅ）前記パルボウイルスビリオンと標的細胞とを接触させて、標的細胞の感染を可能にするステップ；
ｆ）前記標的細胞から前記核酸構築物を回収する又は同定するステップ
を含む、方法が提供される。
【００７０】
実施例の節において示されるように及び上で記載されるように、この方法は、構築物が、ベクターゲノムを含有するかなりの量のカプシドを産生し得るという意味で、昆虫細胞において非常に機能的である核酸構築物をまず第１に選択するのに特に有用であり、構築物のＤＮＡを標的細胞に移入することにおいて非常に有効でありその後構築物のＤＮＡを発現させる、カプシドに含有された構築物を作出もし得る。
【００７１】
複数の核酸構築物に関しては、発現制御配列、及び／又はカプシドタンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列、及び／又はカプシドタンパク質のアミノ酸配列、及び／又はＩＴＲ配列（複数可）に関して様々である構築物を意味すると理解される。したがって、核酸構築物における任意の変形が企図され得る。特性の任意の向上に関しては、特性は、参照配列、例えば野生型配列又は昆虫細胞におけるＡＡＶカプシドの産生のための先行技術の核酸構築物との関係にあり得る。複数の核酸構築物において様々であり得る配列に関係する、向上を必要とすることがある任意の特性が企図され得る。そのような特性には、例えば効力の向上、産出量の向上、標的細胞選択性の向上が含まれてもよいが、それらに限定されるわけではない。
【００７２】
分子多様性を創出すること又は突然変異誘発は、本発明の方法における第１のステップである。例えばエラープローン（ＥＰ）ＰＣＲにより、向上が求められる参照配列にランダム点変異を導入することによって、複数の核酸は変異配列（すなわち、変異核酸のライブラリー）をコードする。述べられているように、ランダム変異は、非コード配列及び／又はコード配列に含有されてもよい。導入され得る変異の頻度を、鋳型及びＰＣＲサイクルの量、並びに用いられる変異原性プライマーを様々に変えることによって変化させることができる。参照が複数に対してなされる場合、この参照は、複数の核酸構築物に導入される対象となる変形に応じて、１００個若しくはそれを上回る、好ましくは１，０００個若しくはそれを上回る、１０，０００個若しくはそれを上回る、１００，０００個若しくはそれを上回る、又は１０００，００００個若しくはそれを上回る数の異なる配列を伴うと理解される。「ライブラリー」又は「複数」という用語は、用語が、例えば関連し得る、すなわち実質的な配列同一性を有し得る数多くの異なる配列を指すという意味で、本明細書において同じ意味を有し得ると理解される。ライブラリーの各メンバー、すなわち異なる各配列は、ライブラリーにおいて１回を上回って表されることがある。例えば、ライブラリーが１，０００個の固有の配列を含有する場合、ライブラリーは全体で１０００，０００個の配列を含有することがある。このことは、各ライブラリーメンバーの平均で、１０００コピーがライブラリーに存在することを意味する。
【００７３】
突然変異誘発は、当業者に公知の任意の様式で行われてもよい。例えば、そのような突然変異誘発はランダムであり得るが、そのような突然変異誘発は指向的であり得る（すなわち、例えば核酸構築物内の特異的な配列／構造を標的にする）。ランダム突然変異誘発を行って、低い変異率を達成することができ、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０個、又はそれを上回る数のアミノ酸変化（突然変異誘発が行われる出発配列と比較して）を有するＣａｐタンパク質をコードする配列を提供することができる。
【００７４】
ランダム突然変異誘発を行うために用いることができる技法には、大腸菌ＸＬ１ｒｅｄ、ＵＶ照射、化学的方法（例えば、脱アミノ化、アルキル化、又は塩基類似体変異原）、又はＰＣＲ法（例えば、ＤＮＡシャッフリング、部位指向的ランダム突然変異誘発、又はエラープローンＰＣＲ）が含まれる。
【００７５】
エラープローンＰＣＲは、ポリメラーゼの天然のエラー率を変更する及び増強するように設計された、標準的ＰＣＲプロトコールの改変である。ＡＴからＧＣへの変化に偏ったエラーを有するＴａｑポリメラーゼの天然に高いエラー率が理由で、Ｔａｑポリメラーゼを用いることができる。しかしながら、偏りが変異タイプの変形の増加（すなわち、より多くのＧＣからＡＴへの変化）を可能にする、ポリメラーゼの代替形態を用いることも可能である。
【００７６】
エラープローンＰＣＲ反応は、非相補的ペアを安定させるために、基本的なＰＣＲ反応と比較してより高濃度のＭｇＣｌ２を典型的には含有する。ＭｇＣｌ２を添加して、エラー率も増加させ得る。変異率を改変する他の手段には、反応におけるヌクレオチドの比率（ｒａｔｉｏｎ）を様々に変えること、又は８−オキソ−ＧＴＰ若しくはｄＩＴＰなどのヌクレオチド類似体を含めることが含まれる。サイクルの数を増加させる／減少させることにより有効な倍増の数を変化させることによって、又は初回鋳型濃度を変化させることによっても、変異率を改変することができる。
【００７７】
とにかく、どちらの手段で変異が導入されるとしても、結果として生じる複数の配列をその後核酸構築物内にクローニングして、複数の核酸構築物を獲得する。核酸構築物は、発現制御配列に作動的に連結された、パルボウイルスカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列に隣接する１つ又は複数のパルボウイルス又はＡＡＶ  ＩＴＲを含有する（典型的には２つのＡＡＶ  ＩＴＲによって隣接される）。核酸構築物は、ＣＭＶ及びバキュロウイルスｐ１０プロモーターなどのプロモーターの制御下で、例えばＩＴＲの間に、任意選択で緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現カセットなどのレポーター遺伝子発現カセットも含有することができる。複数の構築物を、目的地ベクター、例えばバキュロウイルスベクターにその後導入して、バキュロウイルスのライブラリーを獲得し得る。この導入は、相同組み換えなどの一般の生体分子技法を用いることによって、及びＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃのような市販のシステムを用いることによっても容易に達成され得る。ライブラリーにおける各バキュロウイルスは単一の核酸構築物を含有し、前記単一の核酸構築物は、意図された配列変形を有する。ライブラリーの複雑性は、バキュロウイルスライブラリーが作出された場合に維持される（すなわち、バキュロウイルスライブラリーにおける固有の配列の量が、核酸ライブラリーと比較した場合にほぼ同じままである）ことが好ましい。したがって、上記の方法のステップａ）において規定される核酸構築物は、バキュロウイルスベクターに含有されることが好ましい。
【００７８】
その後、複数の構築物を昆虫細胞に移入する。複数のバキュロウイルスを用いることが好ましい。この理由は、バキュロウイルスを用いると、感染多重度をよく制御し得るためである。したがって、バキュロウイルスライブラリーを用いる場合、感染多重度は１よりも下に保たれることが好ましく、０．５よりも下に保たれることが好ましく、０．１よりも下に保たれることがより好ましい。例えば、０．５のｍｏｉを用いると、昆虫細胞の大多数は細胞あたり単一のバキュロウイルスを有すると考えられるが、しかしながら、これらの細胞のかなりの部分は細胞あたりライブラリー由来の２匹のバキュロウイルスを有し、ほとんどの細胞は感染されない。細胞あたりのバキュロウイルスの数は、ポアソン分布によって影響を受ける。ｍｏｉを下げることにより、１匹を上回る数のバキュロウイルスを有する細胞の数はさらにもっと低下する。しかしながら、感染多重度を知ることは、本発明に従って必要でなくてもよい。例えば、実施例の節において示されるように、複数のバキュロウイルスの希釈系列（ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｓｅｒｉｏｕｓ）も用いられ得、最適なＡＡＶベクターライブラリー産生（例えば、最も高い力価及び／又は最も少ない交差パッケージング）を提供する希釈を選択することができる。
【００７９】
複数の構築物が提供される昆虫細胞は、パルボウイルスＲｅｐタンパク質も発現し得る。例えば、Ｒｅｐ発現構築物を含有する付加的なバキュロウイルスを用いて、細胞にＲｅｐ発現構築物を移入してもよい。Ｒｅｐが限定因子ではないように、すなわち細胞に複数の構築物のうちの１つが提供された場合に、細胞がＲｅｐ発現構築物も有する可能性が大きいように、比較的高い感染多重度が用いられることが好ましい。代替的に、Ｒｅｐ発現構築物を含有する安定な細胞株も用いることができ、安定な細胞株は、複数の構築物のうちの１つが細胞に移入された場合に、Ｒｅｐタンパク質を構成的に発現し得る又はＲｅｐを誘導的に発現させることができる。いずれの場合でも、パルボウイルスＲｅｐタンパク質を発現し得、本発明に従った複数の構築物のうちの１つ（又は複数）を提供される昆虫細胞は、次に、パルボウイルスカプシドタンパク質及びパルボウイルスｒｅｐタンパク質の発現を可能にする条件に供され、それにより、核酸構築物はパルボウイルスカプシドにパッケージされてパルボウイルスビリオンを提供し得る。例えばバキュロウイルスシステムが用いられる場合、この供することは、大部分が細胞をしばらくの間培養するステップを伴う。バキュロウイルスベクターシステムが用いられる場合、ほとんどではないとしても多くの細胞が構築物ライブラリーのいくつかのメンバーを含有するような程度までバキュロウイルスの広がりを可能にしない条件を選択することが好ましい。ライブラリー由来の構築物を含有する細胞の大多数が、単一の構築物を含有し、前記単一の構築物も含有する、前記構築物によってコードされるパルボウイルスカプシドのみを産生するような条件を選択することが好ましい。１つを上回る種類の構築物が昆虫細胞に含有されるであろう条件が選択された場合、構築物の１つは感染性の又は強力なＡＡＶを産生し、それほど強力でない又は感染性でない構築物は交差パッケージされ、この交差パッケージは、パッケージされたすべての構築物のうちのどの構築物が強力なＡＡＶを産生し得るかを判定することを難しくする。言い換えれば、低い交差パッケージングを有することが、よりストリンジェントでより有効な選択を可能にする。
【００８０】
次に、パルボウイルスビリオンを昆虫細胞及び／又は昆虫細胞上清から回収する。パルボウイルスビリオンの回収のための数々の方法が使用可能であり、実施例の節において記載されるものなどの方法を含む。また、密度（ステップ）勾配遠心分離などの従来の方法（イオジキサノール、ＣｓＣｌ）、及び／又はタンジェンシャルフロー濾過を用いてもよい。そのような従来の方法は、例えばカプシド配列に、アフィニティークロマトグラフィーに対して効果を有し得る変形が導入される場合に有用であることがある。それにもかかわらず、どの構築物を選択することができるかに基づき、特異的アフィニティークロマトグラフィーステップを特質の１つとして含むことも企図することができる。したがって、特異的アフィニティークロマトグラフィー特質の向上は、同様に向上させることを企図することができる特質の１つであってもよい。それにもかかわらず、昆虫細胞における効率的な産生、及び感染力又は効力は、とどまることを必要とする及び／又は向上し得る特質のままである。
【００８１】
別の実施形態において、上で記載される方法によって産生されたパルボウイルスビリオンライブラリーが提供される。さらなる実施形態において、多様なパルボウイルスベクターを含むパルボウイルスライブラリーが提供され、前記パルボウイルスベクターライブラリーはパルボウイルスベクターカプシドを含み、各パルボウイルスカプシドは、パルボウイルスカプシドタンパク質の発現のための発現カセットを含むパルボウイルスベクターゲノムを含有する。多様なパルボウイルスベクターを含むパルボウイルスベクターライブラリーは、パルボウイルスベクターカプシドを含み、各パルボウイルスカプシドは、昆虫細胞におけるパルボウイルスカプシドタンパク質の発現のための発現カセットを含むパルボウイルスベクターゲノムを含有することが好ましい。多様なパルボウイルスベクターを含むパルボウイルスベクターライブラリーは、パルボウイルスベクターカプシドを含み、実質的にそれぞれのパルボウイルスカプシドはライブラリーに含有され、パルボウイルスカプシドは、パルボウイルスカプシドタンパク質の昆虫細胞における発現のための発現カセットを含むパルボウイルスベクターゲノムを含有し、パルボウイルスベクターゲノムはカプシド化されていることがより好ましい。代替的に、述べられているように、ベクターゲノムは必ずしも発現カセットを含有しなくてもよいが、ベクターゲノムがカプシド化されている、パルボウイルスアミノ酸配列（及び／又はパルボウイルスアミノ酸配列をコードする発現カセット）を同定することができる配列識別子も含有してもよい（図６を参照されたい）。言い換えれば、ベクターゲノムに含有される配列から、ベクターゲノムが含有されている相当するパルボウイルスカプシド（すなわち、パルボウイルスカプシドのアミノ酸配列）が同定され得る限りにおいて、ライブラリーは、カプシド化されたベクターゲノム内の任意の配列を含有することができるパルボウイルスカプシドを実質的に含有する。
【００８２】
企図することができる特異的識別子配列（図６Ｂを参照されたい）は、長さが少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０ヌクレオチドであることが好ましい。企図することができる特異的識別子配列は、長さが多くても５０、６０、７０、８０、又は９０ヌクレオチドであってもよい。少なくとも１５ヌクレオチドの識別子配列を用いると、約１０ｅ９個の考え得る固有の組み合わせが可能である。より長い配列識別子を有することは、より多くの冗長性及びより確実な同定を可能にし得る。配列識別子を、特異的カプシド配列に先験的に共役させてもよい。したがって、そのようなシナリオにおいて配列識別子がシーケンスされる又は検出される場合、表を参照することによって、相当するカプシド発現カセットを同定することができる。代替的に、配列識別子と結び付いているカプシド発現カセット配列又はその一部が決定され得るように、バキュロウイルスゲノムなどのベクタービヒクルゲノムを捕捉する及び／又はシーケンスすることによって、配列識別子を用いてもよい。そのような解析及び／又は配列決定は、後に行われてもよい。複雑なライブラリーから配列を同定するための、ハイスループット技術を用いた配列決定のためのそのような手段及び方法は、当技術分野において周知である。
【００８３】
上で記載される本発明に従った又は上で記載されるように産生されたライブラリーは、粗溶解物又は精製産物として提供されてもよい。特に、そのようなライブラリーは、ベクターゲノムを含有しパルボウイルスカプシドタンパク質をコードするウイルスベクターから産生されてもよいことが好ましい。ライブラリーを作出するために用いられる好ましいベクターは、昆虫細胞において活性があるパルボウイルスカプシドタンパク質に対する発現カセットを含有するバキュロウイルスベクターであってもよい。代替的に、任意の代替的な適切なウイルスベクターライブラリーを容易に構想し得、細胞株を企図することができ、例えばアデノウイルス、ＨＳＶ、レンチウイルスベクターに基づくシステムなどをバキュロウイルスの代わりに用いてもよく、カプシドタンパク質に対する発現カセットは、例えばＨｅＬａ細胞、２９３細胞、ＣＨＯ細胞、Ａ５４９、２９３Ｔ、ＣＯＳなどの哺乳類細胞における発現に適している（又は、発現について選択される対象となる）。企図することができるそのような代替的なベクタービヒクル及び適切な細胞株は、当技術分野において周知であり、例えばＧｅｎｅ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓの第４編、Ｎａｎｃｙ  Ｓｍｉｔｈ  Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ編、２０１５、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓに記載されている。したがって、代替的な実施形態において、バキュロウイルスベクター及び昆虫細胞を用いる代わりに、適切な哺乳類ウイルスビヒクルと組み合わせた哺乳類細胞に対して、本明細書において記載される手段及び方法を容易に用いることができる。いずれの場合でも、ＡＡＶベクターライブラリーなど、本発明に従って提供されるパルボウイルスベクターライブラリーは、産生細胞あたりのコピー数の制御を可能にするベクタービヒクルを用いて作出され、ベクターライブラリーの品質は、そのような制御を可能にしない、プラスミドにより産生されたライブラリーと比較して有意に向上する。
【００８４】
次に、パルボウイルスビリオンが回収され、又は違う言い回しをすれば、パルボウイルスベクターライブラリーが提供され、パルボウイルスベクターライブラリーは粗溶解物又は精製産物であってもよく、そのパルボウイルスビリオンと選択された標的細胞とをその後接触させて、パルボウイルスを標的細胞に感染させる。遺伝子療法が開発されているところである肝臓細胞、腎臓細胞、ニューロンなどの適切な標的細胞であってもよい適切な標的細胞を選択することができる。適切な標的細胞は、例えばＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、若しくはＨｕＨ細胞などのいずれかの細胞株であってもよく、又は初代細胞であってもよい。接触には、適切な動物モデル、例えばラット、マウス、サルへの送達が含まれ、様々な送達経路、例えば静脈内又は筋肉内注射も含まれてもよいこと、及び後続の標的細胞は、そのような動物モデルにおける選択された候補臓器であることを想定することさえできる。いずれの場合でも、任意の細胞タイプを選択することができ、パルボウイルスビリオンと任意の細胞タイプとを任意の手段で、すなわちインビボ又はインビトロで接触させて、感染、すなわちカプシドビリオンに含有されている核酸構築物の細胞への移入を可能にし得る。細胞を、形質導入工程を支援する、例えば形質導入を誘導する、アデノウイルスと共感染させることもできると理解される。共感染は、例えばレポーター遺伝子構築物が核酸構築物に含有されており、ＤＮＡの効率的な移入を可能にするだけでなく、核酸構築物を核に送達する細胞内部の効率的なトラフィッキングも可能にする細胞を選択したい場合に有益であることがある（図６を参照されたい）。理論によって拘束されることなく、カプシド配列を変異させる並びに／又はＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３の化学量論を変化させる場合、共感染は内部トラフィッキングの妨げにつながることがある。例えば、ＶＰ１を欠くカプシドは細胞に感染し得るが、核には入らない。核酸構築物を含有するカプシドは、その後（ｔｈａｎ）エンドソームにとどまり、プロテアソームによるタンパク質分解の標的にされる。したがって、選択工程の目的に基づいて選択ステップを含めること、すなわち核への核酸構築物の効率的な送達を達成して、核酸構築物からの発現を可能にすることは興味深いものであることがある。選択ステップは、例えばレポーター遺伝子又は関心対象の他の任意の遺伝子を介したものであってもよい。選択ステップはまた、ベクターゲノムの効率的な送達を達成するビリオンが増幅される、ＨｅＬａ  ＲＣ３２細胞又は同様のものであってもよい。
【００８５】
最後に、細胞を標的細胞に感染させて、好ましくは効率的な形質導入を可能にした場合、核酸構築物が標的細胞から回収される。細胞集団全体から核酸構築物を回収してもよい。細胞集団の部分集合、例えばレポーター導入遺伝子発現を示し、故に標的細胞に形質導入することにおいて有効であった部分集合からも核酸構築物を回収してもよい。細胞集団全体から、しかし特に全細胞由来の核からも核酸構築物を回収してもよい。このように、標的細胞に形質導入することに優れていると予想される核酸構築物（及び、付随して核酸構築物が同様にコードするカプシド）を選択することができる。回収された核酸構築物を次にシーケンシングに供して、核酸構築物を同定することができる。述べられているように、核酸構築物は、構築物を同定する識別子配列を含有してもよい。例えばバキュロウイルスベクターシステム及び昆虫細胞がパルボウイルスベクターライブラリー作出に用いられており、パルボウイルスベクターゲノムがそれが含有されるパルボウイルスカプシドに対する発現カセットを含有する場合、発現カセット又はその一部は識別子配列であると考えることができるとも理解される。発現カセットは、哺乳類細胞に導入される場合、発現カセットが昆虫細胞プロモーターを有し哺乳類細胞において活性があるプロモーターでない場合にはＡＡＶカプシドを産生することができない。特に、変形が導入された核酸構築物の部分（又は、相当する識別子配列）を、例えば小区分が短時間で増幅されたＰＣＲ反応の後に、シーケンシングに供することができる。核酸構築物全体又はカプシドコード配列全体もシーケンスすることができる。シーケンシングには、ハイスループットシーケンシング又は当技術分野において公知の他の任意の適切なシーケンス法が含まれる（ｉｎｃｕｄｅ）と理解される。
【００８６】
特に興味深いのは、向上した配列を同定することであってもよい。向上した配列が非常に制限的であるような条件が選択される場合、回収されたすべての核酸構築物及びその配列は、向上した核酸構築物である。したがって、核酸構築物の回収は、向上した核酸構築物の選択を含む。それにもかかわらず、回収された配列の集団と、例えば初回に構築されたライブラリーに含有される配列の集団とを比較することによって、回収された核酸構築物に由来する向上した配列を確認しても又は同定してもよい。初回集団と比較した場合に、回収された集団において非常に支配的である回収された配列は、所望の向上した核酸構築物であることを指し示す。したがって、核酸構築物の回収に加えて、付加的なステップは、向上した核酸構築物に相当する、ライブラリー由来の核酸構築物の同定を含んでもよい。そのような同定は、例えば初回ライブラリー、核酸構築物を含有するバキュロウイルスライブラリー、パルボウイルスカプシドに含有される核酸構築物集団からの１つ又は複数のものの集団配列との比較を含んでもよい。
【００８７】
特性に対して核酸構築物が選択された向上した特性を有する核酸構築物がいったん提供される又は同定されると、次のステップは、ステップｆ）において回収される、発現制御配列に作動的に連結された、パルボウイルスカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子療法ベクターの産生のための核酸構築物を作出するステップｇ）である。遺伝子療法ベクターの産生のための核酸構築物は、パルボウイルスＩＴＲ配列によって隣接されたパルボウイルスカプシドタンパク質に対する発現構築物を有しない。したがって、遺伝子療法ベクターの産生のための核酸構築物は、パルボウイルスカプシドタンパク質に対する発現構築物を含有することが好ましく、例えば遺伝子療法構築物、すなわちパルボウイルスＩＴＲによって隣接された治療用遺伝子、及び／又はＲｅｐ発現構築物など、さらなるパルボウイルス構成要素を任意選択で含有してもよく、すべての構築物は昆虫細胞産生との適合性のために構築される。したがって、作出された核酸構築物は、バキュロウイルスベクター又は昆虫細胞に含まれることが好ましい。ＡＡＶウイルスベクターは遺伝子療法にふさわしい候補であるため、特に前記パルボウイルスカプシドタンパク質、パルボウイルスＲｅｐタンパク質、及び／又はＩＴＲヌクレオチド配列は、アデノ随伴ウイルスに由来することが好ましい。遺伝子療法ベクターの産生のための核酸構築物を作出するために用いられる回収された核酸構築物は、例えば回収された核酸構築物から関心対象の配列を切り出すことによって獲得される、実際の物理的核酸であってもよいと理解される。代替的に、関心対象の配列、例えばパルボウイルスカプシド発現カセット又はその一部を、ＰＣＲ反応により増幅し、その後用いてもよい。また、配列を決定することができ、関心対象の配列をデノボ、例えばＤＮＡ合成器によって作出してもよい。
【００８８】
選択工程全体は、医学的治療における使用のための遺伝子療法ベクターの昆虫細胞に基づく製造のための向上した構築物を同定するためのものであるため、さらなる実施形態において、上で記載されるステップａ）〜ｇ）を含む、パルボウイルスベクターの産生のための方法であって、昆虫細胞に、
遺伝子療法ベクターの産生のための作出された核酸構築物；
少なくとも１つの逆位末端反復（ＩＴＲ）ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を含有する核酸構築物；及び
昆虫細胞においてパルボウイルスＲｅｐタンパク質を発現し得る、パルボウイルスＲｅｐタンパク質をコードする核酸構築物
を提供し、前記昆虫細胞を、パルボウイルスベクターが産生されるような条件下で培養し；任意選択で（ｂ）産生されたパルボウイルスベクターの回収、を含む方法が提供される。パルボウイルスベクターはＡＡＶベクターであることが好ましい。したがって、ＶＰ１  ＡＴＧコドンの前にアウトオブフレーム開始コドンを有するＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３発現構築物を有するＡＡＶベクターの産生のための上で記載される方法のいずれかは、遺伝子療法ベクターの産生のための任意の同定された向上した構築物及び作出された核酸構築物にも適用される。
【００８９】
この文書において及びこの文書の特許請求の範囲において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という動詞及びその活用は、前記単語に続く項目は含まれるが、具体的に挙げられていない項目が除外されるわけではないことを意味する前記単語の非限定的な意味で用いられる。加えて、「ａ」又は「ａｎ」という不定冠詞による要素への言及は、１つ及び１つのみの要素があることを文脈がはっきりと要していない限り、１つを上回る数の要素が存在する可能性を除外するわけではない。故に、「ａ」又は「ａｎ」という不定冠詞は、「少なくとも１つ」を通常では意味する。
【００９０】
本明細書において引用されるすべての特許及び文献参考文献は、参照により参考文献全体として本明細書によって組み入れられる。
【００９１】
以下の実施例は、単なる例示目的のために提示されるものであり、本発明の範囲を限定することを意図されるものでは決してない。
【実施例】
【００９２】
１．序論
バキュロウイルス発現システム（ＢＥＶＳ）におけるＡＡＶカプシドの発現は、適度な比率で産生されるべき３種のウイルスカプシドタンパク質をもたらす単一のｍＲＮＡ転写産物を促すような発現カセットの改変を要する。Ｕｒａｂｅら（２００２；前出）によってなされた研究は、イントロンスプライシング部位の除去と組み合わせたスタートコドンの適応が、昆虫細胞における３種すべてのＶＰタンパク質の発現をもたらすことを実証した。さらなる研究により、ＣＴＧ及びＧＴＧは、ＢＥＶＳシステムにおけるＡＡＶの産生のための効率的なスタートコドンとして用いられ得ることが示された。それに付随して、第２の位置におけるアラニンは、例えばＡＡＶ５カプシド配列におけるアラニンの導入によって、天然のＶＰ１〜ＶＰ３カプシドタンパク質比を有するＡＡＶ５カプシドをもたらした。
【００９３】
しかしながら、合理的設計工程において、組み換えバキュロウイルスを産生する労働集約的な研究に起因して、構築物及び組み合わせの限定された部分集合が可能である。したがって、ＡＡＶ５カプシド内のランダム化された文脈配列と組み合わせて一連の代替スタートコドン（合計１７種）を設計するように設計するライブラリー手法を用いて、ＢＥＶＳシステム由来のＡＡＶカプシドの品質及び産出量の向上を選択する余地がまだあるかどうかを判定した（方法の概略に関しては図１を参照されたい）。下で描写される結果及び手法はＡＡＶ５に限定されるわけではなく、他の血清型及び他のパルボウイルスに同様に適用され得、パルボウイルス遺伝子療法ベクターの他の特質の向上を選択するためにも同様に用いられ得る。
【００９４】
材料及び方法
構築物設計及びプラスミドライブラリー
種々の真核生物及び原核生物にわたる以下の代替推定スタートコドンを文献において見い出し、ＡＡＶ５  ＶＰ１産生のための考え得るスタートコドンとして利用した：ＡＴＴ、ＡＴＧ、ＡＴＡ、ＡＧＡ、ＡＧＧ、ＡＡＡ、ＣＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡ、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＴＴＧ、ＴＧＡ、ＴＡＡ、ＴＡＧ、及びＧＴＧ。構築物は、以下の文脈的設計を有した：ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＧＮＮ  ＮＮＮ（配列番号７１）。ＮＮＮがＶＰ１に対する上記スタートコドンのいずれかの挿入を示す場合、一方でＮは、均等な分布を有してＡ、Ｔ、Ｃ、又はＧをランダムに表す。スタートコドンに続く最初の三量体における「Ｇ」は固定されている。このライブラリーの理論的複雑性は、７．１×１０７（４１１×１７）、すなわち作出され得る固有の配列の最大数として算出される。スタートコドンライブラリーをＧｅｎｅＡｒｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）において合成し、ＡＡＶ５コードカプシド配列及び遺伝子発現配列を有する完全な配列を、産生されたＡＡＶカプシドがカプシド自身の中に導入遺伝子としてカプシドコード遺伝子をカプシド化するように、ＩＴＲ含有プラスミドにクローニングした。プラスミドライブラリーをＧｅｎｅＡｒｔにおいて作出し、ライブラリー由来の１００個の単一コロニーをサンガーシーケンシングに供して、ライブラリー内の複雑性及び多様性を確認した。
【００９５】
バキュロウイルスライブラリー
ＢＥＶＳシステムの能力を利用し、その能力によって新たな設計をＢＥＶＳシステムとの設計の適合性についてスクリーニングするために、本発明者らは、上記の供給されたプラスミドライブラリーから組み換えバキュロウイルスライブラリーを作出した。ライブラリーの理論的多様性は７．１×１０７である。標準的な組み換えプロトコールにおいて、本発明者らは、１μｇのＢｓｕ３６Ｉ消化ＢａｃＡＭＴ５バキュロウイルス骨格（７．３４×１０９個分子）とともに１μｇのドナープラスミド（８．１２×１０１０個プラスミド分子）を用いた。限定因子は、１００％の組み換え効率の場合に１０３倍もの理論的ライブラリー複雑性を表すバキュロウイルス骨格である。プールされたＰ０ライブラリーをＳＦ９細胞において増幅し、バキュロウイルスはおよそ１０００倍増幅し、十分に複雑なライブラリーを表すＰ１ライブラリーをもたらすと予想される。
【００９６】
ＡＡＶライブラリー作出
ＡＡＶライブラリーの作出に関しては、ＳＦ９細胞をｍｌあたり１００万個細胞で接種した。ＭＯＩ（感染多重度）を、以下のように算出した：ＭＯＩ＝０．７×ウイルスの容積×力価／細胞密度×細胞の容積。本発明者らは、バキュロウイルスライブラリーのＰ１継代が、およそ２×１０１１ｇｃ／ｍｌの力価を有すると判定した。平均でバキュロウイルスのＴＣＩＤ５０値は、ゲノムコピー力価よりも約２ｌｏｇ値下回ると概算される。２×１０９／ｍｌの概算ＴＣＩＤ５０値をもたらす。Ｐ１バキュロウイルスライブラリーに対して２×１０９の算出される感染力価を用いて、最初のＡＡＶライブラリー（０．５のＭＯＩ）を作出した。３Ｌの昆虫細胞をｍｌあたり１００万個細胞で接種することによって、本発明者らは、カプシド／導入遺伝子に関して０．５のＭＯＩを有する。言い換えれば、細胞あたり１個未満の感染粒子。カプシドは導入遺伝子でもあるため、（それ故、カプシド）カセットは、レプリカーゼによって細胞あたりおよそ１０００倍増幅されると考えられる。この二重感染は、三重感染と比較した場合、ポアソン分布に関して統計的により効率的でもある。５、２５、及び５０の概算ＭＯＩを用いて、さらなる３つのＡＡＶライブラリーを作出した。０．５のＭＯＩで作出されたＡＡＶライブラリーは、選択方法において最高の性能を発揮することが見い出された。
【００９７】
ＡＡＶの精製及び定量
ＡＡＶライブラリー材料を、Ａｋｔａ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒでの５ｍｌ  ＡＶＢセファロースカラム（アフィニティークロマトグラフィー）を通して３Ｌ  ＣＬＢから精製した。ＤＮＡを単離し、ＡＡＶベクターゲノム配列を増幅するプライマーを用いて各画分に対してｑＰＣＲを実施した。ここから本発明者らは、ＨｅＬａ  ＲＣ３２細胞での改変ＴＣＩＤ５０アッセイのために画分をプールして、ライブラリーにおける新規の変異体に対して選択圧をかけた。下記を参照されたい。他の３つのＡＡＶ産生物（それぞれ、５、２５、及び５０のＭＯＩ）を同様の形式で単離した。単離されたすべてのＡＡＶライブラリーから、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）のためにＤＮＡを単離した。
【００９８】
ＡＡＶライブラリーに対する選択圧
ＨｅＬａ  ＲＣ３２細胞での改変ＴＣＩＤ５０アッセイ（Ｔｅｓｓｉｅｒ  Ｊら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５（１）：３７５〜３８３、２００１）を用いて、最も高い効力を呈するＡＡＶバリアントを選択した。ＨｅＬａ  ＲＣ３２細胞は、ゲノムに組み入れられたＡＡＶ２レプリカーゼ及びカプシド遺伝子を含有する。ＡＡＶによる形質導入があると、導入遺伝子はレプリカーゼによって増幅され、ＨｅＬａ細胞内でも作出されるＡＡＶカプシドにパッケージされる。この細胞株の利点は、原理上、レプリカーゼが、核に入る任意のＡＡＶ  ＤＮＡの増幅器として作用することである。ＡＡＶの限界希釈系列を実施し及びＨｅＬａ細胞に感染させることによって、本発明者らは、核に何とか上手く到達するそうしたＡＡＶのみを選択的に増幅し得る。言い換えれば、良好な比率でＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３を含有する／コードするＡＡＶカプシド及び構築物を選択する。ＨｅＬａ細胞に形質導入するために用いられた希釈系列は、６４００ｇｃ／細胞、３２００ｇｃ／細胞、１６００ｇｃ／細胞、８００ｇｃ／細胞、４００ｇｃ／細胞、及び２００ｇｃ／細胞であった。
【００９９】
ＡＡＶ  ＤＮＡの単離
形質導入の２日後、ＨｅＬａ細胞を溶解し、ＤＮＡ単離に供して、核に到達したベクターゲノムがＨｅＬａ細胞において増幅されているＡＡＶベクターゲノムを回収した。次世代シーケンシング（ＮＧＳ）への提出前に、単離されたＤＮＡに対して、カプシドライブラリーに対するユニバーサルプライマーセットを用いたエンドポイントＰＣＲを実施した。
【０１００】
様々なライブラリーのＮＧＳシーケンシング
プラスミドライブラリーからの単離されたＤＮＡ、バキュロウイルスライブラリーのＰ１継代、ＡＡＶライブラリーの産生物、並びに各ＡＡＶライブラリー形質導入に対するプールされた希釈物から単離されたＤＮＡに対して、ＮＧＳシーケンシングを実施した。各シーケンシング反応に対する調製されたＤＮＡを、増幅及びバーコード化のためにＢａｓｅＣｌｅａｒに送った。
【０１０１】
結果
０．５ＭＯＩ感染によりＡＡＶライブラリーを作出した。ＡＡＶライブラリーの産生後、ライブラリーをＨｅＬａＲＣ３２細胞の感染に用いた。プラスミドライブラリー、バキュロウイルスライブラリー、ＡＡＶライブラリー、及び感染したＨｅＬａＲＣ３２を処理し、次世代遺伝子シーケンシングのために解析して、それらの複雑性を判定した。固有の配列を各ステップで同定し、各固有の配列のコピー数も決定し、配列の総数を決定し、各スタートコドンに対する相対パーセンテージを決定し及びプロットした（図２Ａ〜Ｅを参照されたい）。作出されたバキュロウイルスライブラリーは、プラスミドライブラリーの複雑性の概算７４％を表した。プラスミドライブラリーとバキュロウイルスライブラリーとの間に、開始コドンの普及率に関して顕著な観察結果はなく（図２Ａ及び２Ｂを参照されたい）、このことは、開始コドンに対して適用された選択圧がないためと予想される。しかしながら、ＡＴＧがスタートコドンとして用いられた場合、この配列はＡＡＶカプシドにおいて最も少なく見い出された（例えば、図２Ｃを参照されたい）。ここで、ＡＴＧは全ライブラリーの０．５％未満を表す。ＶＰ１に対する強いスタートコドンは、ほとんど又は全くＶＰ２及びＶＰ３タンパク質産生なしで、大部分がＶＰ１タンパク質を作出し、そのうちＶＰ３はカプシドを作出するのに一般的に必須であるため、この低いパーセンテージは予想された。残りに関して、プラスミドライブラリー、バキュロウイルスライブラリー、及びＡＡＶカプシドライブラリーの間に、観察結果はすべて変動の通常の値域内にあったように（約４〜５％から約８〜９％に及ぶ）、コドン使用法に関するパーセンテージに関してなされた顕著な観察結果はなかった。最後に、ＡＡＶライブラリーは、一般的に、バキュロウイルスライブラリーの複雑性のおよそ９６％を表し、バキュロウイルスライブラリーからのＡＡＶの作出における複雑性の包括的移行を示唆した。最後に、ＨｅＬａ  ＲＣ３２細胞に限界希釈系列でＡＡＶライブラリーを感染させた場合、本発明者らは、ＣＴＧ及びＧＴＧが、バキュロウイルス発現システムにおける強力なＡＡＶウイルスカプシド粒子の産生のための２つの最も豊富なスタートコドンであることを見い出した。ＣＴＧ及びＧＴＧは、細胞に上手く形質導入し及び感染する（すなわち、ベクターゲノムＤＮＡを核に移入して、ＨｅＬａＲＣ３２細胞による増幅を可能にする）全配列のほぼ５０％を一緒に構成した。スタートコドンの直後のコドンのみはＧに限られるが、スタートコドンの後のコドンは優位にアラニンをコードすることが見い出されたことは顕著であり（示されず）、Ａｌａをコードする三量体が、アミノ酸配列に起因した及び／又はＤＮＡ／ＲＮＡ配列に起因した、昆虫細胞におけるＶＰ１発現のための第２のコドンとしての選好性を有することがあることを裏付けた。細胞から回収された配列は、ＡＡＶライブラリー複雑性のほんの５％の回収を示唆することは顕著である。この低い回収は、選択圧が重大であったことを示す。
【０１０２】
スタートコドンとしてのＡＴＧが、完全なライブラリーの約８％で、Ｈｅｌａ  ＲＣ３２細胞からの単離されたＤＮＡにおいて３番目に高く表されたスタートコドンであることは興味深い。この割合は、ほんの０．５％での、ＡＡＶライブラリーにおける表示とは対照的である。ＶＰ１開始コドンを有する配列の上位３０が下記の表１に列挙されており、最上位に列挙された最も普及しているもの（配列番号１）は、集団の大多数を占めている。各配列それ自体は、ＶＰ１スタートコドン配列文脈の置き換え配列として用いられる場合、ＡＡＶカプシドの効率的な産生を可能にする。各配列それ自体は、ＡＡＶカプシドの効率的な産生を可能にするある特有の特性を有することがあるが、それに加えて基本的な特質が下で列挙される配列から同定され得、列挙される配列はＡＴＧスタートコドンからの強力なＡＡＶの効率的な産生に影響を与える何らかの一般原則を記載していることがある（とりわけ、図５を参照されたい）。基本的な特質は、ＶＰ１カプシドの位置２に好ましくはバリンをもたらす、ＶＰ１開始コドンの前の（アウトオブフレーム）開始コドン、及び／又はＡＴＧコドンの直後のＧＴ配列を含み得るが、必ずしもそれらに限られなくてもよい。３０個のクローンの大多数に関して、翻訳開始部位として作用し得る上流アウトオブフレームスタートコドン（ＡＴＧ、ＣＴＧ、ＡＣＧ、ＴＴＧ、及びＧＴＧ）が観察された。そのようなアウトオブフレームスタートコドンは、翻訳された場合、ＶＰ１開始コドンの後にストップコドンを有する短いペプチドをもたらすと予想される。また、アウトオブフレームＣＴＴ又はＣＴＣ非標準スタートコドンが同定され得る。ＣＴＴ及びＣＴＣは強い非標準スタートコドンとは考えられていないものの、本発明者らは、これら２つのスタートコドンを特異的に含有する様々なカプシドがＨｅＬａ細胞から単離されることを観察した。理論によって拘束されることなく、このことは、ＶＰ１  ＡＴＧに先行するアウトオブフレームスタートコドンが、リボソームに対するおとり翻訳開始文脈として作用することができ、それによってＶＰ１翻訳に干渉し、野生型ＡＡＶに関して観察され得る漏れやすい疑似リボソームスキャニングを可能にすることを示唆する。より具体的には、これら代替スタートコドンからの（短い）ペプチドの合成は、リボソームにｍＲＮＡ転写産物をスキャンし続けさせることができる又はスキャニングを再開させることができる。この遅れた漏れやすい開始は、１つのポリシストロン性ｍＲＮＡ転写産物からのＶＰ２及びＶＰ３の翻訳を可能にすることがある。さらには、この遅れた漏れやすい開始は、ＣＴＧ、ＧＴＧ、ＴＴＧ、及びＡＣＧが非標準スタートコドンとして導入される場合に起こることにほぼ間違いなく似ていることがあり（付与された欧州特許第１，９４５，７７９  Ｂ１号；付与された米国特許第８，１６３，５４３号；Ｕｒａｂｅら、２００２；前出）、それによって、リボソームに非標準ＶＰ１スタートコドンで翻訳を規則的に開始させず、単一のｍＲＮＡ転写産物におけるＶＰ２及びＶＰ３それぞれのスタートコドンからのＶＰ２及びＶＰ３の翻訳の十分な開始を可能にする。
【０１０３】
【表１】
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【０１０４】
ライブラリーの選択工程が有用な新規のクローンを作出したことを確認するために、それぞれＡＴＧ、ＣＴＧ、ＧＴＧに対する２つの代表的スタートコドン構築物、並びにＴＡＧ及びＴＧＡそれぞれに対する１つの代表的構築物を、安定なバキュロウイルスクローンへの組み換えについて選択した（表１）。これらの構築物を用いて、ウイルスカプシドサブユニット比及び効力を判定した。さらには、本発明者らは、ＡＴＧスタートコドンを有する構築物が、高い産出量及び強力なＡＡＶを作出したことを確認することを望んだ。
【０１０５】
【表２】
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【０１０６】
固有のスタートコドン配列文脈（ＶＰ１開始コドンに下線が引かれている）を選択し、ＡＡＶ５発現構築物配列における置き換えとしてクローニングした（配列番号７０及び７４、配列番号７４はｎｔ１４８〜１６７に相当する）。配列番号３１は、ＭＯＩ５ライブラリーから選択され及び同定された優位なクローンであった。いくつかのクローンを各候補に対して作出し、ＶＰカプシド発現を解析した（図３）。スタートコドンの相対的文脈を有するスタートコドンは、良好な化学量論を有するＡＡＶカプシドを作出することにおいて様々な程度の成功を有した。ほとんどの場合、構築物ごとに３つのクローンを試験して、バキュロウイルスクローンが安定であるかどうかを判定したことに留意されたい。この点において、ＡＴＧ１は１つの安定な産生体を有した（図３におけるＡＴＧ１に関する２番目のレーン）。ＡＴＧ２に関しては、有り余る安定な産生体があり、すべてが良好な化学量論を有した。ＣＴＧ１構築物は産生することができず、一方でＣＴＧ２は、国際特許出願の国際公開第２０１５／１３７８０２号に記載されるものに類似したカプシド化学量論を産生した（データ示さず）。同様に、ＧＴＧ２も良好な化学量論を呈したが、一方でＴＡＧ（ストップコドン）は非常に少量を産生し、ＴＧＡ（ストップコドン）はＶＰ１なしのカプシドの産生をもたらした。したがって、本発明者らが、効率的なＡＡＶカプシド構築物、すなわちＡＡＶ５であって、良好な化学量論を呈するスタートコドンとしてＡＴＧが利用される構築物を作出し得ることが確認されたことは驚くべきことである。
【０１０７】
スタートコドン構築物のそれぞれに対する安定なクローンを選択し、安定なクローンを用いて、ＣＭＶプロモーターの制御下でＳＥＡＰレポーター遺伝子を持つＡＡＶを産生した。すべてのＡＡＶ構築物は、同程度の値域にある力価（ｇｃ／ｍｌ）をもたらした。滴定後、本発明者らは、３つの異なるＭＯＩでＨｕｈ７及びＨｅＬａ細胞の両方に形質導入し、４８時間後にＳＥＡＰ活性を判定した（図５Ａ及び５Ｂ）。ＡＴＧスタートコドンを有する２つの構築物は、ＣＴＧ及びＧＴＧと比較して同程度の又は若干向上した効力のカプシドを産生したが、一方でＶＰ１（ＴＧＡ）を欠くカプシドは、予想されるバックグラウンドを上回る識別可能なＳＥＡＰ活性を有しなかったことは顕著である。バリンが効力を向上させることがあることの裏付けとなる証拠は、表１において同定される支配的な固有のクローンが位置２でバリンをコードするという事実によって提供される。これらの結果は図３からの観察結果と一致しており、これらのカプシドは、ＣＴＧ及びＧＴＧ構築物に非常に類似したＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３化学量論を呈した。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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