(57)【要約】  連続流動システムにおける狭い滞留時間分布を維持する方法であって、特にタンパク質精製プロセス中などのウイルス不活性化に適用可能である。流体サンプルは、軸方向流動チャンネルに導入され、滞留時間分布と軸方向分散を最小限に抑えるために、別個のパケットまたはゾーンの状態でその中に流される。本明細書に記載の実施形態は、タンパク質精製プロセス中にウイルス不活化を実行するための大きなタンクまたはリザーバーを使用する必要性を除去または最小限に抑える。ウイルス不活性化に必要な全体の時間を短縮し、および／またはタンパク質精製プロセス中にウイルス不活性化操作を実行するために必要な全体の物理スペースを削減し、これにより、精製プロセスの全体的なフットプリントを削減する。
2020520350.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
軸方向長さを有する流体チャンネル内を流れる流体サンプルの狭い滞留時間分布を維持する方法であって、前記流体サンプルを、前記流体チャンネル内で前記軸方向長さに沿って別個のパケットの状態で流すことを含む、方法。
【請求項２】
前記流体チャンネルに圧縮力を加えることにより、前記流体サンプルを別個のパケットの状態で流す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記流体サンプルが、前記流体チャンネル内で１〜２分の名目上の滞留時間を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記流体サンプルが、前記流体チャンネル内で２〜４分の名目上の滞留時間を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記流体サンプルが、前記流体チャンネル内で４〜６分の名目上の滞留時間を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記流体サンプルが、前記流体チャンネル内で６〜８分の名目上の滞留時間を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記流体サンプルが、前記流体チャンネル内で８〜１０分の名目上の滞留時間を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記流体サンプルが、前記流体チャンネル内で１０〜１５分の名目上の滞留時間を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記流体サンプルが、前記流体チャンネル内で１５〜３０分の名目上の滞留時間を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
標的分子を含むサンプル中の１つ以上のウイルスを不活性化する方法であって、前記方法は、前記標的分子を精製するプロセス中に、前記サンプルを不活性条件に連続的に曝しながら、前記サンプルを別個のパケットの状態で流動チャンネル内に流すことを含む、方法。
【請求項１１】
標的分子を含む流体サンプル中の１つ以上のウイルスを不活性化する方法であって、前記流体サンプルをプロテインＡアフィニティクロマトグラフィープロセスに供し、それにより溶出液を得；前記溶出液を軸方向流動チャンネルに連続的に移送して、１つ以上のウイルス不活性化剤を前記溶出液と混合し；前記溶出液を、前記ウイルスを不活性化するのに十分な時間、別個のパケットの状態で前記軸方向チャンネル内に流すことを含む、方法。
【請求項１２】
標的分子を含む流体サンプル中の１つ以上のウイルスを不活性化する方法であって、前記流体サンプルをイオン交換クロマトグラフィープロセスに供し、それにより溶出液を得；前記溶出液を軸方向流動チャンネルに連続的に移送して、１つ以上のウイルス不活性化剤を前記溶出液と混合し；前記溶出液を、前記ウイルスを不活性化するのに十分な時間、別個のパケットの状態で前記軸方向チャンネルに流すことを含む、方法。
【請求項１３】
前記流体サンプルが、前記流体チャンネル内で１〜２分の名目上の滞留時間を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記流体サンプルが、前記流体チャンネル内で２〜４分の名目上の滞留時間を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記流体サンプルが、前記流体チャンネル内で４〜６分の名目上の滞留時間を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記流体サンプルが、前記流体チャンネル内で６〜８分の名目上の滞留時間を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記流体サンプルが、前記流体チャンネル内で８〜１０分の名目上の滞留時間を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記流体サンプルが、前記流体チャンネル内で１０〜１５分の名目上の滞留時間を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記流体サンプルが、前記流体チャンネル内で１５〜３０分の名目上の滞留時間を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
前記流体チャンネルに圧縮力を加えることにより、前記溶出液を別個のパケットの状態で流す、請求項１１に記載の方法。
【請求項２１】
前記標的が抗体またはタンパク質を含むＦｃ領域である、請求項１１に記載の方法。
【請求項２２】
軸方向の長さを有する流体チャンネルであって、前記流体チャンネルが、標的分子および１つ以上のウイルス不活性剤を含む流体サンプルの複数の別個のパケットを含む流体チャンネル。
【請求項２３】
前記流体サンプルがウイルスを含む、請求項２２に記載の流体チャンネル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２０１７年５月１１日に出願された米国仮出願第６２／５０４，６３３号の優先権を主張し、その開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
治療用タンパク質、特にモノクローナル抗体の精製に関する大規模な生産と経済性は、バイオ医薬品産業においてますます重要な問題である。治療用タンパク質は一般に、関心のタンパク質を産生するように設計された哺乳類細胞または細菌細胞のいずれかで産生される。しかしながら、関心のタンパク質は、いったん産生されると、宿主細胞タンパク質（ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＨＣＰｓ））、エンドトキシン、ウイルス、ＤＮＡなどのさまざまな不純物から分離する必要がある。
【０００３】
典型的な精製プロセスでは、細胞培養収穫物は、細胞破片を除去するための浄化工程にかけられる。次に、関心のタンパク質を含む浄化された細胞培養収穫物は、１つ以上のクロマトグラフィー工程にかけられる。クロマトグラフィー工程としては、アフィニティークロマトグラフィー工程または陽イオン交換クロマトグラフィー工程を含み得る。治療候補者のウイルスの安全性を確保し、規制の命令に従うために、ウイルスの除去ユニットの操作が精製プロセスに実施される。このような工程には、プロテインＡおよびイオン交換クロマトグラフィー、ろ過、低ｐＨ／化学的不活性化が含まれる。ウイルス不活性化は、典型的にクロマトグラフィーの工程の後に（例えば、アフィニティークロマトグラフィーの後、または陽イオン交換クロマトグラフィーの後に）行われる。典型的な大規模精製プロセスでは、関心のタンパク質を含むクロマトグラフィー溶出プールを、大きなタンクまたはリザーバーに収集し、溶出プールに存在する可能性のあるウイルスの完全な不活性化を達成するために、混合を伴う長時間に亘るウイルス不活性工程／プロセスにかける。当該ウイルス不活性工程／プロセスは数時間から１日以上かかることがある。
【０００４】
例えば、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）処理では、一連の独立したユニットの操作がバッチモードで行われる。このモードでは、保持タンクを使用してユニットの各操作間で材料を保管して、各工程間で必要な溶液調整を容易にする。典型的には、材料は１つのタンクに集められ、そこにおいて、目標の不活性条件を達成するために、材料が調整される。これは、低ｐＨ目標レベルを達成するための酸の添加による場合もあれば、界面活性剤を基にした不活性プロセスにおける界面活性剤の添加による場合もある。次に、材料は２番目のタンクに移され、そこで、指定のインキュベーション時間の間、不活性条件に保持される。移送の目的は、目標の不活性条件に到達していない可能性があり、ウイルス粒子が含まれている可能性のある第１タンクの壁に小滴がつくリスクを排除することである。材料を別のタンクに移すことにより、このリスクが軽減される。
【０００５】
タンパク質溶液を特定の温度、ｐＨまたは放射線にさらすこと、および界面活性剤および／または塩などの特定の化学物質にさらすことなど、いくつかのウイルス不活性技術が当技術分野で知られている。１つのウイルス不活性プロセスには、大きな保持タンクが含まれ、そこでは、低ｐＨおよび／または界面活性剤への暴露などの不活性条件で６０分間、材料を保持する。この静的な保持工程は、連続処理に移行する際のボトルネックである。
【０００６】
しかしながら、ウイルス死滅動態は、不活性時間が６０分よりも大幅に短くなり得ることを示しており、これは、処理時間が大幅に短縮され、ウイルス不活性化用の静的保持タンクが排除され、この方法が連続的な処理および／または流動の不活性化により適していることを示唆している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
近年、ユニットの各操作が結びつけられ、手動の溶液調整が最小限に抑えられる、連続的なプロセスが望まれている。これを促進するために、インラインのウイルス不活性化や他のインラインの溶液調整を可能にするインラインの処理方法を開発する努力がなされている。連続的な処理への挑戦は、ポイントＡからポイントＢへの流体の効率的な移動である。一例は、一本の配管を通る流体の押し出し流れ（ｐｌｕｇ  ｆｌｏｗ）移動である。ｍＡｂ処理に関係する流動は、典型的に、層流レジーム（レイノルズ数２１００未満）に分類される。このレジームでは、放射状の拡散により分子が分散し、その結果、溶質パルスが流動の方向に沿って軸方向に広がる。これはテイラー分散として知られており、図１に模式的に示されている。層流のためのポアズイユ流は放物線状の速度プロファイルをもたらす。パルスの先端と後端は、鋭い界面として始まるが、流体の層流により放物線状になる。軸方向の広がりは時間とともに続き、分子は管の長さにわたってより分散する。軸方向の分散の影響は、図２に見られるように、マーカー種のパルス注入で得られた、管出口での結果の濃度のプロファイルで観察される。濃度プロファイルは、マーカー種の滞留時間の幅広い分布を反映している。このような様々な滞留時間は、すべての流体がウイルス不活性環境で十分な滞留時間を持っているか、または、すべての流体のシステムが大きすぎるという結果になり、予想以上に分子がすぐに出ないことを引き起こすか、という不確実性をもたらす。ウイルス不活性化のために十分に長い滞留時間を確保した結果、タンパク質（製品）は、潜在的な分解や凝集などの望ましくない結果をもたらす、過度に長い滞留時間の不活性条件にさらされる。
【０００８】
連続または半連続流動システムでは、狭い滞留時間分布を維持する方法を提供することが望ましい。
【０００９】
特にタンパク質精製の場合、生体分子精製用の連続または半連続流動システムの提供が望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本明細書で開示される実施形態は、タンパク質精製プロセス中などのウイルス不活性化に特に適用可能な、連続流動システムにおいて、狭い滞留時間分布を維持する方法を提供する。
【００１１】
本明細書に記載の実施形態は、タンパク質精製プロセス中にウイルス不活性化を実行するための大きなタンクまたはリザーバーを使用する必要性を除去または最小化し、ウイルス不活性化に必要な全体の時間を短縮し、および／またはタンパク質精製プロセスの間にウイルス不活性化の操作を実行するために必要な全体的な物理スペースを低減し、これにより、精製プロセス用の全体のフットプリントを低減する。さらに、これは、すべての分子が最小滞留時間にかけられるという確実性を高め、不活性保証のための安全係数を提供する一方で、延長された保持を最小限にする。
【００１２】
いくつかの実施形態では、精製プロセスでサンプル中に存在する可能性のある１つまたは複数のウイルスを不活性化する方法が提供される。その方法は、管などの流動チャンネルの軸方向で流動する際に別個のゾーンまたはパケットに流体を分離することにより、連続流動システムにおいて狭い滞留分布を維持することを含む。流動チャンネルは、インキュベーションチャンバーとして機能してもよい。これにより、流体のすべての種のための流動チャンネル内での十分な滞留時間が可能になり、次に、流体が流動チャンネル内を流れ、１つまたは複数のウイルス不活性剤と混合する際の、ウイルス不活性化が可能になる。流動チャンネルは、さまざまな材料と形状で作製でき、円形のプラスチック配管と、マクロ流体流路アセンブリ「Ｓｍａｒｔ  ＦＬＥＸＷＡＲＥ（登録商標）」（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａより市販（米国特許第９，１８１，９４１号と米国特許第９，０５１，９２９号））と、を含む。当該アセンブリは、２枚のプラスチックシートを一定のパターンで一緒に溶着しチャンネルを作ることにより形成される。
【００１３】
特定の実施形態では、インキュベーションチャンバー、流動チャンネルまたは管は、効率的な半径方向の混合および最小の軸方向の混合を提供するように構成され、その結果、滞留時間分布が狭くなり、または減少する。また、ここで、チャンバーまたは管のボリュームは、圧力と温度に起因する変動に左右されない。いくつかの実施形態では、インキュベーションチャンバー、流動チャンネルまたは管は使い捨てのチャンバーまたは管であり、滅菌可能である。
【００１４】
特定の実施形態において、標的分子（例えば、抗体、またはタンパク質を含むＦｃ領域）を含む流体サンプルに存在し得る１つ以上のウイルスを不活性化する方法を提供し、当該方法は、流体サンプルをプロテインＡアフィニティクロマトグラフィープロセス、または、イオン交換クロマトグラフィープロセスに供し、それにより溶出液を得；溶出液を軸方向流動チャンネルに連続的に導入して、流動チャンネル内で１つ以上のウイルス不活性化剤を溶出液と混合し；溶出液を、ウイルスを不活性化するのに十分な時間、別個のパケットの状態で軸方向チャンネル内に流すことを含む。特定の実施形態では、クロマトグラフィープロセスは連続モードで実施される。アフィニティークロマトグラフィープロセスからの溶出液は、ｐＨ、導電率、濃度などのすべての勾配を有するシステムに入るカラムからのリアルタイム溶出であるか、均質化後に次に不活性化される溶出のプールであり得る。
【００１５】
いくつかの実施形態では、インラインインキュベーションチャンバ、流動チャンネルまたは管は、保持プールまたはタンクがチャンバー、チャンネルまたは管のすぐ上流、下流、または両方に位置するプロセスで実施されてもよい。いくつかの実施形態では、インラインインキュベーションチャンバー、流動チャンネルまたは管は、チャンバー、チャンネルまたは管が２つのユニットの操作、例えば上流のプロテインＡクロマトグラフィー操作および下流のカチオン交換操作を直接接続するプロセスで実施されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、チャンネル内の流体の流れの概略図である。
【図２】図２は、従来技術によるチャンネル内のマーカー種のパルス入力（マーカー種の有限量が、主流内に高速で注入されて、段階的変化に近づくプラグの各端に濃度プロファイルを有するマーカー種の均一なプラグを作製する）から得られる濃度プロファイルのプロットである。
【図３】図３は、ＵＶ曝露と様々な流動チャンネルの時間のグラフである。
【図４】図４は、ＵＶ曝露と様々な流動チャンネルのボリュームのグラフである。
【図５】図５は、特定の実施形態による、流動チャンネルへの圧縮力を作り流体のパケットを形成するのに適した装置の斜視図である。
【図６】図６は、図５に示す主軸の周りに巻かれた流動チャンネルの斜視図である。
【図７】図７は、図５の装置に配置された主軸の周りに巻かれた流動チャンネルの斜視図である。
【図８】図８は、様々なＰｈｉ６力価のウイルス不活性時間を示すグラフである。
【図９】図９は、様々なＸＭｕＬＶレトロウイルス力価のウイルス不活性時間を示すグラフである。
【図１０】図１０は、Ｐｈｉ６力価の、界面活性剤に基づいたウイルス不活性動態を示すグラフである。
【図１１】図１１は、コイル状配管および従来の流動チャンネルにおけるＰｈｉ６ウイルスの滞留時間分布のグラフである。
【図１２】図１２は、特定の実施形態によるインライン連続不活性プロセスの概略図である。
【図１３Ａ】図１３Ａは、特定の実施形態による流動チャンネルを圧縮してパケットを形成するための風車設計の概略図である。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、特定の実施形態による流動チャンネルを圧縮してパケットを形成するためのコンベヤー設計の上面図および斜視図を示す。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、特定の実施形態による流動チャンネルを圧縮してパケットを形成するためのローラー設計の概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
用語「インライン（ｉｎ−ｌｉｎｅ）」または「インラインの操作（ｉｎ−ｌｉｎｅ  ｏｐｅｒａｔｉｏｎ）」は、容器に保管せずに、管またはその他の導管または流動チャンネルを通じて液体サンプルを移動させるプロセスを指す。
【００１８】
用語「ウイルス不活性化（ｖｉｒｕｓ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）」または「ウイルスの不活性化（ｖｉｒａｌ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）」は、１つまたは複数のウイルスが複製できなくなったり、または不活性になったりするように、１つまたは複数のウイルスを含むサンプルを処理することを指す。本明細書に記載の方法において、用語「ウイルス（ｖｉｒｕｓ）」および「ウイルスの（ｖｉｒａｌ）」は互換的に使用され得る。ウイルス不活性化は、物理的手段、例えば熱、紫外線、超音波振動、または、化学的手段、例えばｐＨの変化もしくは化学物質（例えば界面活性剤）の添加、により達成され得る。ウイルス不活性化は、ほとんどの哺乳動物のタンパク質精製プロセスで、特に、哺乳動物由来の発現システムから治療用タンパク質を精製する場合に、典型的に、使用されるプロセス工程である。本明細書に記載の方法では、ウイルス不活性化は、サンプルが別個のゾーンまたはパケットの状態で移動する流体流動チャンネル内で実行される。本技術分野で知られおよび本明細書に記載される標準アッセイを使用して、サンプル中に１つまたは複数のウイルスを検出できないことは、１つまたは複数のウイルス不活性化剤でサンプルを処理した後の１つまたは複数のウイルスが完全に不活性化したことを示すことが理解される。
【００１９】
用語「別個のゾーン（ｄｉｓｃｒｅｔｅ  ｚｏｎｅ）」または用語「パケット（ｐａｃｋｅｔ）」は、隣接する各ボリュームから介在する障壁によって分離された、個々に画定されたボリュームを指す。
【００２０】
用語「ウイルス不活性化剤（ｖｉｒｕｓ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）」または用語「ウイルス不活性剤（ｖｉｒｕｓ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｇｅｎｔ）」または用語「ウイルス除去剤（ｖｉｒｕｓ  ｃｌｅａｒａｎｃｅ  ａｇｅｎｔ）」は、１つまたは複数のウイルスを不活性に、または複製不能にすることができる物理的または化学的手段を指す。本明細書に記載の方法で使用されるウイルス不活性化剤は、溶液条件の変化（例えば、ｐＨ、伝導率、温度など）、或いは、サンプル中の１つまたは複数のウイルスと相互作用する、界面活性剤、塩、酸（例えば、酢酸、３．６または３．７のｐＨを達成するためのモル濃度）、ポリマー、溶媒、小分子、薬物分子もしくは他の適切な実在物など、またはそれらの任意の組み合わせ、の添加、或いは、ウイルス不活性化剤への曝露が１つ以上のウイルスを不活性または複製不能にするような物理的手段（例えば、ＵＶ光への曝露、振動など）を含んでいてもよい。特定の実施形態では、ウイルス不活性剤はｐＨ変化であり、ここで、ウイルス不活性剤は、サンプルが分割したゾーンまたはパケットの状態で流れる流動チャンネルにおいて、標的分子を含むサンプル（例えば、プロテインＡ結合および溶出クロマトグラフィー工程からの溶出液）と混合される。
【００２１】
本明細書で使用される用語「連続プロセス（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｐｒｏｃｅｓｓ）」は、標的分子を精製するためのプロセスを含み、当該プロセスは、１つのプロセス工程からのアウトプットが、中断することなく、プロセスの次のプロセス工程に直接流れるように、２つ以上のプロセス工程（またはユニットの操作）を含む。ここでの２つ以上のプロセス工程は、それらの継続期間の少なくとも一部にわたって同時に実行することができる。言い換えれば、連続プロセスの場合、サンプルの一部が常にプロセス工程を移動している限り、次のプロセス工程が開始される前にプロセス工程を完了する必要はない。
【００２２】
同様に、「半連続プロセス（ｓｅｍｉ−ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｐｒｏｃｅｓｓ）」は、１つまたは複数のユニットの操作の定期的な中断を有する、設定された期間にわたって連続モードで実行される操作を含んでいてもよい。例えば、連続的なキャプチャー操作中に、フィードの投入を停止して、他のレート制限工程を完了できるようにする。
【００２３】
タンパク質精製の従来のプロセスには、典型的に、細胞培養法が含まれ、例えば、関心のタンパク質（例えば、モノクローナル抗体）を産生するように組み換え操作された哺乳類または細菌の細胞株を使用し、その後、細胞培養ブロスから細胞および細胞破片を除去する細胞回収工程がある。細胞回収工程の後には通常、キャプチャー工程が続き、典型的に、その後に研磨工程とも呼ばれる、１つ以上のクロマトグラフィー工程が続く。クロマトグラフィー工程は、通常、１つ以上の陽イオン交換クロマトグラフィーおよび／または陰イオン交換クロマトグラフィーおよび／または疎水性相互作用クロマトグラフィーおよび／または混合モードクロマトグラフィーおよび／またはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、深層濾過或いは活性炭の使用を含む。キャプチャー工程の後に、ウイルス不活性工程が含まれ得る。通常、研磨工程の後にウイルスろ過と限外ろ過／ダイアフィルトレーションが行われ、精製プロセスが完了する。
【００２４】
バイオ医薬品の製造では、医薬品の安全性と食品医薬品局（ＦＤＡ）などの規制機関が定める基準を満たすために、ウイルス（哺乳動物細胞を含む動物由来成分によってもたらされる）の不活性化または除去が必要である。典型的なプロセスには、必要な保護を累積的に与える多くのウイルスの除去工程が含まれる。
【００２５】
いくつかのプロセスでは、エンベロープウイルスおよびウイルスの成分を破壊するために、標的タンパク質を含む溶液を低ｐＨに滴定する必要がある。従来、標的タンパク質を含むサンプルは、ウイルス不活性化に時間が必要なため、さらに重要なことには、効果的なウイルス不活性化のための均一な混合を確保するために、これらの条件で長期間保持される。したがって、大規模なプロセスの場合、しばしば混合を伴う効率的なウイルス不活性化を促進するため、標的タンパク質を含むサンプルを低ｐＨで長時間インキュベートする。多くの場合、２つの別々のタンクが使用され、１つ目のタンクはｐＨの調整に使用され、２つ目のタンクは実際のインキュベーション保持に使用される。
【００２６】
ｐＨ条件は、不活性化を引き起こすのに十分な低ｐＨ値と、標的タンパク質の変性を回避したり、製品の分解の広がりを制限したりするのに十分な高さの値と、のバランスとして確立される。さらに、ウイルス活動値が通常２〜６ＬＲＶ（対数減少値（ｌｏｇ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｖａｌｕｅ））で大幅に減少するように、サンプルを一定時間暴露する必要がある。
【００２７】
ウイルス不活性プロセスに重要と見なされるパラメーターは、均一な混合が存在する場合において、ｐＨ値、曝露時間、バックグラウンド溶液条件の同一性（例えば、バッファータイプ、バッファー濃度）、ｍＡｂ濃度、および温度である。大規模プロセスの場合、大容量と、混合速度や物質移動などの追加パラメーターとにより、混合が課題となる。
【００２８】
タンパク質を含むＦｃ領域（例えばモノクローナル抗体）の場合、溶出プールのｐＨがウイルス不活性のための望ましいｐＨに近いため、ウイルス不活性化は、通常、結合および溶出クロマトグラフィープロセス工程（例えばプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーまたは陽イオン交換クロマトグラフィー）からの溶出後に行われる。例えば、今日の業界で使用されるプロセスでは、プロテインＡクロマトグラフィーの溶出プールのｐＨは通常３．５から４．０の範囲であり、陽イオン交換結合および溶出クロマトグラフィーの溶出プールのｐＨは通常約５．０である。
【００２９】
今日の業界で使用されているほとんどのプロセスでは、標的タンパク質を含む溶出プールは、ウイルスの不活性化に必要なｐＨに調整され、一定時間保持される。ｐＨと時間の組み合わせは、ウイルス不活性化をもたらすことが示されている。特に大規模なプロセスの場合、ウイルス不活性化には時間が長いほど効果的であるが、長い時間は、タンパク質凝集物（免疫原性）の形成につながり得る、タンパク質の損傷とタンパク質の変性を引き起こすことが知られている。低ｐＨに長時間さらされると、沈殿物と凝集物の形成との可能性があり、これは望ましくなく、デプスフィルターおよび／または滅菌フィルターを使用してこのような沈殿物や凝集物をしばしば除去する必要がある。
【００３０】
本明細書に記載の方法は、連続的または半連続的な方法でウイルス不活性化を達成することができ、これにより、ほとんどの従来のプロセスに比べてウイルス不活性化に関連する時間を大幅に短縮でき、ひいては精製プロセス全体の時間を短縮できる。
【００３１】
いくつかの実施形態では、異なるプロセス工程は、連続的または半連続的な方法で操作されるように接続されている。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のウイルス不活性方法は、連続または半連続精製プロセスにおけるプロセス工程を構成し、そこでは、例えばプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー工程またはイオン交換クロマトグラフィー工程から、ウイルス不活性工程へ、典型的にフロースルー精製プロセス工程であるプロセス中の次の工程へ、サンプルが連続的に流れる。インラインｐＨ不活性化は従来技術で提案されているが（例：Ｋｌｕｔｚ  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｖｉｒａｌ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｔ  ｌｏｗ  ｐＨ  ｖａｌｕｅ  ｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  １０２（２０１６）  ８８−１０１）、滞留時間分布が狭い適切なインキュベーションチャンバーの開発は、これらのチャンバーが大きすぎであり、検証がより困難になる可能性があることを意味する。
【００３２】
いくつかの実施形態では、ウイルス不活性プロセス工程は、連続的または半連続的に実行され、すなわち、前の結合および溶出クロマトグラフィー工程（例えば、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー、図１２）などの前のプロセス工程からの溶出液が連続的にウイルス不活性工程内に流れる。当該工程は、溶出液を別個のゾーンまたはパケットの状態で流す１つまたは複数の流体チャンネルを採用する。その後、いくつかの実施形態では、次の処理工程が実行されるまでウイルス不活性化溶出液を保管容器に収集することができるか、または、いくつかの実施形態では、次の下流プロセス工程に直接かつ連続的に与えることができる。例えば、図１２を参照されるように、特定の実施形態において、プロテインＡ  ｍＡｂ溶出液は、正確なシリンジポンプおよびスタティックミキサーを有するインライン酸添加を使用して、均一で低ｐＨの状態に迅速になる。１Ｍ酢酸濃縮液を使用して、さまざまなタンパク質フィード濃度にわたって堅牢な低ｐＨが維持される。ｐＨは、サンプリングとオフラインセンサーを使用して確認され得る。複雑な連続フィードバック制御ループと信頼性の低いｐＨセンサーを使用せずに、長日にわたる堅牢なｐＨ制御を達成できる。不活性チャンバーまたはインキュベーションチャンバーは、堅牢なＬＲＶための信頼できる保持時間と、後続の工程のために必要なｐＨ（例えば５−７．５）への迅速で一貫したクエンチを提供する。
【００３３】
特定の実施形態によれば、連続または半連続流動システムにおいて、狭い滞留時間分布が維持される。滞留時間分布は、システム内を移動する流体サンプルの効果的なウイルス不活性化を達成するために十分に狭い（および従来の設計と比較して減少する）。適切な狭い滞留時間分布は、従来の設計から得られた結果との比較に基づいて定量化できる。異なる設計のパルスデータ（例えばＵＶ吸収ピーク）は、統計的定量化メトリックを使用して比較できる。例えば、流体の中央の８０％が流動チャンネルを出るのに必要な時間の総計を比較することができる。つまり、１０％と９０％の面積値の間の広がりを作ることができる（ｔ10%は流体の１０％がチャンネルを出た時間を表し、ｔ90%は流体の９０％がチャンネルを出た時間を表す。）。この比較は、５０ｍＬのシステムボリューム（ホールドアップボリューム）に相当するような、内径が１／８インチ、長さが２５０インチの配管を使用して、図３に示されたピークに対して実行され、以下の表１に明らかにされている。例えばモーメント分析など、当業者によって適用されるようなピーク特性を分析する他の方法も活用できる。
【００３４】
【表１】
2020520350.tif 000003
【００３５】
異なるシステムボリュームを有するさまざまな設計を比較するために、これらのデータを正規化ボリューム（システムボリュームに正規化）として提示することもできる。これは図４に示され、以下の表２に明らかにされている。
【００３６】
【表２】
2020520350.tif 000004
【００３７】
これらの分析例では、本明細書で開示される実施形態の１０〜９０％の広がりは、従来の設計の値よりも著しく小さく、本明細書で開示される実施形態による狭い滞留時間分布を構成する。これは従来の設計の分布から減少する。プラグ流動の理想的な場合においては、この１０〜９０％の広がりはゼロになる。
【００３８】
いくつかの実施形態において、狭い滞留時間分布は、機械的方法を使用して作成および維持され、サンプルが移動する流体流動チャンネルの軸方向に沿って流体を異なるまたは別個のゾーンまたはパケットに分離する。別個のパケットは、介在する障壁によって別のパケットまたはゾーンから分離されたパケットまたはゾーンである。プロセス流体の１つのボリュームとプロセス流体の１つの隣接するボリュームもしくは各ボリュームとの間の境界を形成する分離の程度は、別個のゾーンまたはパケットである。障壁は、流体チャンネルの壁を一緒に機械的につまむことで作製することができる（以下で詳しく説明する）。パケット分離の長さ（つまり、圧縮領域の長さ）は重要ではない。各パケット間の分離を維持するのに十分なサイズである限り、パケットは非常に短い長さまたははるかに長い長さで分離できる。
【００３９】
いくつかの実施形態では、流体流動チャンネルの外側に圧縮力を加えることによって、流体の異なるもしくは別個のゾーンまたはパケットを達成し、当該ゾーンまたはパケットがチャンネルの軸方向の長さに沿って間隔を空け、流体がチャンネル内を流れている間、蠕動ポンプを本質的に擬態する。流体をゾーンまたはパケットに分離すると、チャンネル内の流体の軸方向の分散と混合が最小限に抑えられる。滞留時間の軸方向の分散は、粒子が経験する滞留時間の範囲に影響を与える。低ｐＨである間にウイルス粒子を不活性化するために滞留時間が長いほど望ましい場合がある。しかし、低ｐＨで過度に長い滞留時間にかけられた同じ溶液中のタンパク質粒子は劣化する可能性があり、これは望ましくない。滞留時間の最小化の程度は、処理される製品（例えばタンパク質）の感度に依存するが、いずれにせよそれが低いほど有益である。したがって、許容できる分散の量は、特定の用途によって異なる。ウイルス除去の用途では、軸方向の分散を最小限に抑えることで、短い間の時間でウイルス不活性化に対する信頼性が高まるため、処理時間を短縮するという点で大きな利点が得られる。
【００４０】
特定の実施形態では、流体の別個のパケットまたはゾーンの形成により、流体種を、流動チャンネルの長さに沿って軸方向に移動させ、チャンネル入口でのプロファイルがチャンネル出口でのプロファイルと一致または実質的に一致するようにし、一貫性と確実性をチャンネル内の流体種の滞留時間に追加する。
【００４１】
流動チャンネルの一端にパルスとして導入されたサンプルは、既知の時間にシャープで明確なピークで流動チャンネルから出る。これは、システムを流れる種の目標最小滞留時間を達成する必要がある、インライン連続ウイルス不活性化の用途において利点がある。また、それは、移動相（例えばバッファー）の状態が変化するシステムやバッファーの希釈が発生するシステムにおいても実施できる。これは、典型的なｍＡｂ精製プロセス内の複数の場所で行われる可能性がある。１つの例は、結合および溶出陽イオン交換（ｂｉｎｄ−ａｎｄ−ｅｌｕｔｅ  ｃａｔｉｏｎ  ｅｘｃｈａｎｇｅ）工程とフロースルー陰イオン交換（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ  ａｎｉｏｎ  ｅｘｃｈａｎｇｅ）工程との間でしばしば必要となる調整である。多くの場合、陽イオン交換工程からの溶出プールは、しばしば、陰イオン交換工程の目標値よりも低いｐＨと高い導電率である。連続流動システムで陽イオン交換溶出プールを適切な条件に効率的に調整するために、新しい条件への効率的な移行を可能にする別個のパケットを形成できる。異なるバッファータイプ間でシャープな移行ゾーンを提供でき、それ故に、必要な時間とバッファーの量を最小限に抑え、インラインバッファー希釈またはインラインコンディショニング用途が可能になる。
【００４２】
ここで、図５〜７を参照すると、流体チャンネルに圧縮力を加えるための適切な装置が示され、本明細書に開示される実施形態に従う流体ゾーンまたはパケットを作成する。図１３Ａ〜１３Ｃに示されているものなど、同じ効果を生み出す他の多くの形状および構成を設計することができる。図６および７は、配管などの流体チャンネル１０をその周りに巻き付けて流体チャンネル１０を所定の位置に固定することができる主軸５を示している。１つ以上のローラー１５が主軸５の周りを回転し、回転するにつれて流体チャンネル１０の外側に一定の圧縮力を加える。チャンネル１０の内部の流体は、ローラー１５が回転するにつれてチャンネルを通って軸方向に移動する。ローラー１５からの圧力が、流体を、流体チャンネル１０の全長に沿って多くの異なるゾーンまたはパケットに分離している。ゾーンまたはパケットへの分離は、流体の軸方向の分散を最小限に抑え、したがって、インラインのウイルス不活性化、またはバッファーの移行またはバッファーの希釈などのある液体から別の液体への移行など、種の効率的な移動を伴う用途に望ましい流動特性を与える。「蠕動らせん（ｐｅｒｉｓｔａｌｔｉｃ  ｈｅｌｉｘ）」設計の１つの象限を横切る全ての流動チャンネルを完全に閉じるために必要な力は、流動チャンネルとして使用される配管のタイプとサイズの関数である。例えば、強化シリコーン配管（外径３／８インチ、内径１／８インチ）を使用する場合、らせんの１つの象限（２．２３インチの円周で区切られた各象限であり、つまり、圧縮力は、ローラー間の配管の円弧長さ２．２３インチごとに適用される。）にわたる１７回転の配管を圧縮するのに必要な力は、１８７  ｌｂｓｆ（配管１回転当たり１１  ｌｂｓｆ）であった。各ローラー間の間隔により、各パケットの軸方向の長さが決まる。当業者は、前述が単なる例示であることを理解するであろう。他の設計では、他のパケットサイズを提供することができる。
【００４３】
いくつかの実施形態では、断面が変化する放射状パターンで動作する「風車」設計を使用することができ、一定の角速度でローラーが駆動して一定の流体速度が維持される。１つまたは複数のローラーを回転ハブに取り付けることができる。ハブが回転すると、ローラーが流動チャンネルを圧縮し、流動チャンネルに沿って流体パケットを形成する。流動チャンネルは、円形のプラスチック配管で作成するか、一緒に溶接してチャンネルを作るプラスチックシートで形成することができる（例えば、Ｓｍａｒｔ  ＦＬＥＸＷＡＲＥ（登録商標））。図１３Ａは、断面が変化する放射状パターンで配管が配置される機械設計の例である。ハブが回転すると、配管を圧縮するために１つ以上のローラーが使用される。図１３Ａに示す例では、４つのローラーが風車上に示されているが、所望の流体パケットサイズに応じて異なる数のローラーを使用することができる。
【００４４】
いくつかの実施形態では、配管の配列にわたって移動する一対のピンチローラーを有する２つのロールを含む「コンベヤー」設計を使用することができる。ピンチローラーは、２つのロール間のギャップに沿って横切り、次いで、分離してもう一方の端に戻った後、再び回ってくる。ピンチローラー間の間隔は、希望するパケットサイズに基づいて決定される。図１３Ｂは、配管が２本のロールの周りに巻き付けられ、２本のロール間のギャップに沿って横断するローラーにより挟まれた機械的設計の例を示している。
【００４５】
いくつかの実施形態では、ローラーは、固定された外壁に対して配管を圧縮するように、配管コイルの内側に配置され得る。各ローラーの間隔と配管のサイズは、所望のパケットサイズに基づいて決定される。図１３Ｃは、各ローラーが配管コイルの内側に配置され、各ローラーが固定外壁に対して配管を圧縮する機械的圧縮方法の例を示している。
【００４６】
特定の滞留時間を標的とするために、流量と配管の長さを選択することができる。ウイルス不活性化の用途の場合、滞留時間は、流動チャンネル内でウイルス不活性化を達成するのに十分な時間として、好ましくはいくらかの安全係数を伴って選択される。たとえば、３０分間の不活性時間が必要な場合、２の安全係数を使用して、流動チャンネルでの標的滞留時間を６０分間にすることができる。ウイルス不活性化が１〜２分未満で起こる、他の実施形態では、安全係数を採用することができ、流動チャンネル内の４または５分の標的滞留時間が使用される。最小滞留時間は、ウイルス不活性化の許容可能な安全係数の観点から規制ガイダンスに依存していてもよい。
【００４７】
適切な名目上の滞留時間は、限定されないが、１〜２分、２〜４分、４〜６分、６〜８分、８〜１０分、１０〜１５分、および１５〜３０分を含む。
【００４８】
狭い滞留時間分布を維持する能力は、ウイルスに不可欠なｍＡｂ処理などのウイルス不活性プロセスにおいて利点があり、低ｐＨ、界面活性剤への曝露などの指定の不活性条件で最小限の時間を費やす。狭い滞留時間分布を維持することにより、ウイルス不活性化の最小時間要件を満たすと同時に、製品（例えば、タンパク質／ｍＡｂ）の、過酷な不活性条件への暴露を最小限に抑えることができる。
【００４９】
低ｐＨ不活性化の場合、例えば、酸などのウイルス不活性化剤を副流として、メインフィード流動チャンネル内に添加してもよい。特定の実施形態では、所望の量のウイルス不活性化剤を添加するためのソフトウェアプログラムによって制御されるシリンジポンプが使用され得る。いくつかの実施形態では、ポンプ用のコントローラを備えてもよく、当該コントローラは処理ユニットおよび貯蔵要素を有する。処理ユニットは、マイクロプロセッサなどの汎用コンピューティングデバイスであり得る。あるいは、プログラマブルロジックコントローラー（ＰＬＣ）などの特殊な処理デバイスでもよい。記憶素子は、ＲＡＭ、ＤＲＡＭ、ＲＯＭ、フラッシュＲＯＭ、ＥＥＲＯＭ、ＮＶＲＡＭ、磁気媒体、またはコンピュータ可読データおよび命令を保持するのに適した他の媒体など、任意のメモリ技術を利用してもよい。当該命令は、ポンプの操作に必要なものであってよい。コントローラは、タッチスクリーン、キーボード、または、コントローラが使用するパラメーターのセットをオペレータが入力できるようにする他の適切なデバイスなど、入力デバイスも含むことができる。この入力デバイスは、ヒューマンマシンインターフェースまたはＨＭＩと呼ばれ得る。コントローラは、ポンプを制御するように適合された出力を備えていてもよい。これらの出力は、本質的にアナログまたはデジタルであり、バイナリ出力（つまり、オンまたはオフ）を与えるか、アナログ信号やマルチビットデジタル出力など、可能な範囲の出力を与える。前記剤が追加され、混合された後（たとえば、インラインスタティックミキサーを介して）、インキュベーションチャンバーの流動チャンネルに入り、そこで、標的の不活性時間だけ流れる。前記剤の添加量は、酸の種類、酸の強さ、および供給溶液のバッファー能力に依存する。供給溶液のバッファー能力は、バッファー種、バッファー濃度、ｍＡｂ濃度など、多くの要因に依存する。低ｐＨ不活性化の代わりに、類似のプロセスを界面活性剤不活性化に使用できる。
【００５０】
本明細書に開示される実施形態によれば、流体チャンネルに導入された流体サンプルは、最小限のピーク広がりで流体チャンネルから出る。本明細書に開示される方法が適用される場合に観察されるピークの広がりの量は、ウイルス不活性化の従来の方法が使用される場合よりも著しく少ない。図４は、本明細書に開示された方法から生じるピーク広がりを、従来の方法との比較で示す。図４は、本明細書に開示される実施形態に従って、別個の流体パケットが誘導される、直線管、コイル状管（直径３インチのロッドに巻き付けられた管）および管に、注入されたサンプルによるピークの広がりを示す。すべての管は、５０ｍＬの理論上のホールドアップボリュームに相当する同じ内径と長さを有した。最初に水が入った管に０．５ｍＬのサンプルを注入し、サンプルの注入後、各管に１０ｍＬ／ｍｉｎで水を流した（公称滞留時間５分に対応）。結果のＵＶトレースは、管の出口で収集された。ボリュームはシステムボリュームに正規化された。
【００５１】
文献では、コイル状管は、二次流れ特性によって直線管よりも有利であることが示されている（例えば、ディーン渦（Ｄｅａｎ  ｖｏｒｔｉｃｅｓ）、米国特許第５，２０３，００２号「曲がったチャンネル膜ろ過」）。ディーン渦は、連続的なウイルス不活性化のために特別に実施される（国際公開第２０１５／１３５８４４  Ａ１「継続的なウイルス不活性化のためのデバイスと方法」）。本明細書に開示された方法を使用して得られたピークは、直線管とコイル状管の両方のピークよりもはるかに狭く、別個のパケットまたはゾーンの状態で流動チャンネル内を移動する流体種がシステム内の狭い滞留時間分布を有していたことを示している。
【００５２】
また、本明細書で説明する方法は、例えば、ウイルス不活性化のためにプールタンクを使用する必要性をなくしたり、または、適切な安全率でウイルスを不活性化するために必要なインキュベーションチャンバーのサイズを最小化したりすることにより、プロセスの物理的フットプリントも小さくする。一般に、プロセスの全体的な物理的フットプリント（つまり、床面積）を低減することにより効率を改善する、より柔軟な製造プロセスに対する需要が高まっている。本明細書に記載の方法は、ウイルス不活性化に典型的に使用される大きなプールタンクを排除することにより、精製プロセスの全体的なフットプリントを削減することができる。
【実施例】
【００５３】
実施例１．バクテリオファージウイルスによる静的低ｐＨウイルス不活性化
この代表的な実験において、目的は、低ｐＨ条件で、エンベロープを有するバクテリオファージウイルス（Ｐｈｉ６）の不活性動態を評価することであった。目標は、完全な不活性化に必要な暴露時間を決定することであった。
【００５４】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は標準プロテインＡクロマトグラフィーで精製し、５ｍｇ／ｍＬの濃度で調製した。８．７Ｍの酢酸を使用して、ｐＨをｐＨ６．３からｐＨ３．６に調整した。Ｐｈｉ６の安定性のために、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（０．２５％ｖ／ｖ）を追加した。ｐＨの確認後、ｍＡｂを含むサンプルリザーバーにウイルススパイクを加え、ボルテックスして、十分に混合されたシステムを確保した。Ｐｈｉ６の目標スパイクレベルは１×１０7ｐｆｕ（プラーク形成単位）／ｍＬであった。ウイルス添加の０．３分以内に、１ｍＬのサンプルを取り出し、事前に決定した２Ｍ  Ｔｒｉｓ  Ｂａｓｅ、ｐＨ１０の容量の入った管に移して、サンプルを中和（ｐＨ６〜８）して不活性工程を停止した。塩基を加えた後、管をボルテックスした。サンプルを除去し中和するこのプロセスを、各時点で繰り返した。これらの実験は、２２〜２５℃の室温で実施された。初期および最終時点でのコントロールサンプルも分析した。コントロールサンプルの場合、ｐＨはフィードｐＨレベル（ｐＨ６．３）に維持されたが、サンプルは、ｐＨ６．３のバックグラウンドバッファーを使用して実際のサンプルと同様に希釈した。
【００５５】
プラークアッセイを使用して、中和されたサンプルの感染性をアッセイし、結果を表３に示す。対応するＰｈｉ６力価を「静的」値として図８に示す。
【００５６】
【表３】
2020520350.tif 000005
【００５７】
これらの結果は、ｐＨ３．６条件がＰｈｉ６を急速に不活性化し、１分以内に完全に不活性化することを示している。０および１５分のコントロールサンプルは、元の力価レベルを維持した。
【００５８】
実施例２．ＸＭｕＬＶレトロウイルスによる静的低ｐＨウイルスの不活性化
この研究の目的は、低ｐＨ条件下でのモノクローナル抗体製品の除去の研究に一般的に使用され、エンベロープを有するウイルスである、外因性マウス白血病ウイルス（ＸＭｕＬＶ）のウイルス不活性動態を評価することであった。目標は、完全な不活性化に必要な暴露時間を決定することであった。
【００５９】
モノクローナル抗体を、標準プロテインＡクロマトグラフィーにより精製し、１８ｇ／Ｌの濃度で調製した。８．７Ｍ酢酸を使用して、ｐＨをｐＨ３．５、ｐＨ３．７、ｐＨ４．０、またはｐＨ４．２の目標レベルに調整した。ｐＨの確認後、ｍＡｂを含むサンプルリザーバーにウイルススパイクを加え、ボルテックスして、十分に混合されたシステムを確保した。ＸＭｕＬＶの標的スパイクレベルは１×１０7  ＴＣＩＤ50／ｍＬ（ＴＣＩＤ50＝組織培養感染量）（４％スパイクｖ／ｖ）であった。ウイルスの添加から０．３分以内に、１ｍＬのサンプルを取り出し、さらに、当該サンプルを中和（ｐＨ６〜８）して不活性工程を停止するために、当該サンプルを事前に決定した２Ｍ  Ｔｒｉｓ  Ｂａｓｅの容量の入った管に移した。塩基を加えた後、管をボルテックスした。この、サンプルの除去および中和のプロセスを各時点で繰り返した。これらの実験は２２〜２５℃の室温で実施した。初期および最終時点でのコントロールサンプルも分析した。コントロールサンプルの場合、ｐＨはフィードｐＨレベルに維持したが、当該サンプルはバックグラウンドバッファーを使用して実際のサンプルと同様に希釈した。
【００６０】
中和されたサンプルは、ＰＧ４インジケーター細胞を用いた、細胞に基づくＴＣＩＤ50感染性解析（ボルトンＧ、カバチンガンＭ、ルビノＭら、通常の流動ウイルスろ過：バイオプロセシングのエンドポイントの検出と評価、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２００５；  ４２：１３３−４２）を用いた感染性についての解析がなされた。細胞毒性を緩和し、ウイルス不活性化を抑えるために、サンプルを細胞培養培地の１０倍段階希釈で１：５０に希釈し、各希釈液の１００μＬの一定分量を９６ウェルプレートに加えた。５％ＣＯ2、３７℃で７日間インキュベートした後、感染したウェルを細胞変性効果（ＣＰＥ）について視覚的に評価した。力価とＬＲＶは、標準的な方法を使用して計算した（ＩＣＨ。ヒトまたは動物起源の細胞株に由来するバイオテクノロジー製品のウイルスの安全性評価に関するガイダンス。Ｕｓｅ  ＩＣｏＨｏＴＲｆＲｏＰｆＨ、Ｇｅｎｅｖａ編、スイス：ＩＣＨ、１９９８）。各時点でのＬＲＶを決定するために、その時点の力価を最も近いコントロール時点の力価から差し引いた。対数減少値を表４に示す。対応する力価を図９に示す。
【００６１】
【表４】
2020520350.tif 000006
【００６２】
これらの結果は、ｐＨ３．５およびｐＨ３．７条件がＸＭｕＬＶを急速に不活性化し、１分以内に完全に不活性化することを示している。０および６０分のコントロールサンプルは、元の力価レベルを維持した。
【００６３】
実施例３．Ｐｈｉ６バクテリオファージウイルスによる静的界面活性剤に基づくウイルス不活性化
この研究の目的は、界面活性剤に基づくウイルス不活性動態を調べることであった。この代表的な実験では、２つの異なる濃度（０．１％ｖ／ｖおよび１．０％ｖ／ｖ）の界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を使用して、バクテリオファージウイルスＰｈｉ６を不活性化した。目標は、完全な不活性化に必要な暴露時間を決定することであった。
【００６４】
モノクローナル抗体を、標準プロテインＡクロマトグラフィーにより精製し、１５ｍｇ／ｍＬの濃度で調製した。ウイルススパイクを加え、ボルテックスして、十分に混合されたシステムを確保した。Ｐｈｉ６ターゲットスパイクレベルは１×１０8ｐｆｕ／ｍＬであった。０．１％ｖ／ｖおよび１．０％ｖ／ｖの所望の濃度に達するように、界面活性剤を追加した。さまざまな時点でサンプルを取り出し、当該サンプルを１：１０００の希釈率でバッファーに加えることで停止した。界面活性剤の添加後、管をボルテックスした。これらの実験は、２２〜２５℃の室温で行った。初期および最終時点でのコントロールサンプルも分析した。バックグラウンドバッファーを使用して、コントロールサンプルを実際のサンプルと同様に希釈した。
【００６５】
プラーク解析を使用して、中和されたサンプルの感染性を解析し、また、対数減少値を表５に示す。対応するＰｈｉ６力価を図１０に示す。
【００６６】
【表５】
2020520350.tif 000007
【００６７】
これらの結果は、０．１％および１．０％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００条件がＰｈｉ６を急速に不活性化し、１分以内に完全に不活性化することを示している。０および３０分のコントロールサンプルは、元の力価レベルを維持した。
【００６８】
実施例４．パケットを作製するための機械的な方法の実施
この代表的な実験は、流体チャンネルに沿ってパケットを作製するための機械的方法の使用を説明する。
【００６９】
装置（図５〜７に示す）は、配管の長さに沿って画定された間隔で圧縮力を与えるように設計した。配管の寸法は、指定された流量（つまり、１０ｍＬ／ｍｉｎ）で指定の滞留時間を達成するために必要なボリュームに基づいて選択した。内径１／８インチ、外径３／８インチのシリコーン強化配管を使用した。この配管は、外径３インチの主軸に巻き付けられていた。主軸の螺旋経路の長さは１４７インチであった。追加の長さの配管がこの装置を主供給ポンプに接続し、別の長さの配管がインキュベーションチャンバーの出口側で使用された。
【００７０】
主軸に巻き付けられた配管を、４つのローラーのセットを同時に使用して圧縮した。これらのローラーは、ローラーを配管に対して固定する装置によって支持され、装置は、配管を主軸とローラーの間で圧縮した。これにより、流体経路が機械的にパケットに分離した。ローラーは、流体がメインフィードポンプによって設定された目標流量を達成するような回転速度で主軸の周りを回転した。
【００７１】
実施例５．滞留時間の決定
この代表的な実施例は、滞留時間分布を決定するために使用される方法を与える。
【００７２】
蠕動ポンプを使用して、マーカー種（リボフラビン、０．２ｍｇ／ｍＬ）を含むフィード溶液を管、インキュベーションチャンバーからＵＶ検出器に送り込んだ。供給流量は１０ｍＬ／ｍｉｎであった。インキュベーションチャンバーは、実施例４で説明した機械的方法を利用して、システム内に流体のパケットを作製した。インキュベーションチャンバーは、機械装置内部の１４７インチのシリコーン強化配管（内径１／８インチ）で構成されていた。さらに３０インチの配管を入口および出口のインキュベーションチャンバー配管に取り付けた。これらの追加管は、内径が１／８インチであり、分散を最小限に抑えるためにヘリカルスタティックミキサーで満たされていた。インキュベーションチャンバーの出口の配管は、チャンバーをＵＶ検出器に接続した。
【００７３】
入口管はバッファーリザーバーに接続されていた。最初は、システム全体が水で満たされていた。流動を止めて、一定量（０．５ｍＬ）のマーカー種（リボフラビン）をインキュベーションチャンバーの上流の管に加えた。流量を１０ｍＬ／ｍｉｎに設定し、水を使用してマーカー種をシステムに押し込んだ。時間の関数としてのＵＶ検出器からの信号を使用して、システム内のマーカー種の滞留時間を決定した。
【００７４】
実施例６．ウイルスの滞留時間分布
この代表的な例は、インキュベーションチャンバーを介したウイルスの滞留時間分布を示す。システムは、実施例５に記載されているようにセットアップされており、インキュベーションチャンバー内で流体パケットを作るための機械的方法が実装された。
【００７５】
Ｐｈｉ６ウイルスをマーカー種として使用した。Ｐｈｉ６の目標スパイクレベルは、バッファー中１×１０7ｐｆｕ／ｍＬであった。このシステムは、配管の入口にあるバッファーリザーバー、機械的圧縮下にあるインキュベーションチャンバー内の１本の配管、インキュベーションチャンバーをＵＶ検出器に接続する出口管、で構成されていた。当初、システムはバッファーで満たされていた。次に、Ｐｈｉ６ウイルスのサンプル５ｍＬをシステムに注入した。流量を１０ｍＬ／ｍｉｎに設定し、バッファーを使用してマーカー種をシステムに押し込んだ。サンプルを配管出口で収集し、プラーク解析を使用して感染性を解析した。結果を図１１に示す。図１１では、Ｐｈｉ６力価を、正規化されたボリュームの関数としてプロットした。ボリュームをシステムボリュームに正規化した。これらの実験は、２２〜２５℃の室温で行った。
【００７６】
機械的圧縮法を実施した現在の流動チャンネルでは、狭いピークが観察された。これらの結果は、機械的圧縮法がコイル状配管よりも狭いウイルス滞留時間分布を与えることを示す。
【００７７】
実施例７．連続流動システムを使用したウイルス不活性化
この代表的な例では、低ｐＨウイルス不活性化を実行するための連続流動システムの使用について説明する。
【００７８】
メインフィードポンプ、酸添加ポンプ、および塩基添加ポンプで構成されるシステムを使用して、連続流動条件下でウイルスを不活性化した。ｍＡｂ溶液にＰｈｉ６を混ぜ、メインフィードポンプ入口に接続した。Ｐｈｉ６の目標スパイクレベルは１×１０8ｐｆｕ／ｍＬであった。酸は１Ｍ酢酸で、塩基は２Ｍトリス塩基溶液であった。供給流量を１ｍＬ／ｍｉｎに設定した。０．７５ｍＬ／ｍｉｎの流量で主流に酸を加えた。次に、流体は、スタティックミキサーと、特定のボリューム（所望の滞留時間を目標）を含むように設計された１本の配管を通過した。バルブからのデッドボリューム、および、酸添加点とインキュベーションチャンバーの始まりとの間のｐＨプローブを考慮した後、各標的平均滞留時間（１、２、３、４、５、１５分）に必要なボリュームを含めるために、異なる長さの配管を使用した。すべての場合において、配管の内径は１／８インチであった。インキュベーションチャンバーの出口で、０．４ｍＬ／ｍｉｎの流速でメインラインに塩基を加えることにより、材料を中和した。流体は別のスタティックミキサーを通過し、その後、中和されたサンプルが出口で収集され、プラーク解析を使用して感染性について解析した。対数減少値を表６に示す。これらの実験は、室温、２２〜２５℃で行った。コントロールサンプルも分析した。コントロールサンプルの場合、ｐＨはフィードｐＨレベルに維持されたが、サンプルはバックグラウンドバッファーを使用して実際のサンプルと同様に希釈した。対応するＰｈｉ６力価を「インライン」値として図８に示す。
【００７９】
【表６】
2020520350.tif 000008
【００８０】
これらの結果は、ウイルス不活性化が、インライン連続不活性システムを使用して１分以内に発生したことを示す。０および１５分のコントロールサンプルは、元の力価レベルを維持した。
【００８１】
インラインシステムからのこれらのデータは、Ｐｈｉ６ウイルスの静的低ｐＨ不活性条件を使用して実施例１で得られたデータと同一であり、２つの各アプローチ間の同等性を説明している。
【図１】
2020520350.tif 000009
【図２】
2020520350.tif 000010
【図３】
2020520350.tif 000011
【図４】
2020520350.tif 000012
【図５】
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【図６】
2020520350.tif 000014
【図７】
2020520350.tif 000015
【図８】
2020520350.tif 000016
【図９】
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【図１０】
2020520350.tif 000018
【図１１】
2020520350.tif 000019
【図１２】
2020520350.tif 000020
【図１３Ａ】
2020520350.tif 000021
【図１３Ｂ】
2020520350.tif 000022
【図１３Ｃ】
2020520350.tif 000023
【手続補正書】
【提出日】令和2年1月8日(2020.1.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
軸方向長さを有する流体チャンネル内を流れる流体サンプルの狭い滞留時間分布を維持する方法であって、前記流体サンプルを、前記流体チャンネル内で前記軸方向長さに沿って別個のパケットの状態で流すことを含む、方法。
【請求項２】
前記流体チャンネルに圧縮力を加えることにより、前記流体サンプルを別個のパケットの状態で流す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記流体サンプルが、前記流体チャンネル内で１〜２分の名目上の滞留時間を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記流体サンプルが、前記流体チャンネル内で２〜４分の名目上の滞留時間を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記流体サンプルが、前記流体チャンネル内で４〜６分の名目上の滞留時間を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記流体サンプルが、前記流体チャンネル内で６〜８分の名目上の滞留時間を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記流体サンプルが、前記流体チャンネル内で８〜１０分の名目上の滞留時間を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記流体サンプルが、前記流体チャンネル内で１０〜１５分の名目上の滞留時間を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記流体サンプルが、前記流体チャンネル内で１５〜３０分の名目上の滞留時間を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
標的分子を含むサンプル中の１つ以上のウイルスを不活性化する方法であって、前記方法は、前記標的分子を精製するプロセス中に、前記サンプルを不活性条件に連続的に曝しながら、前記サンプルを別個のパケットの状態で流動チャンネル内に流すことを含む、方法。
【請求項１１】
標的分子を含む流体サンプル中の１つ以上のウイルスを不活性化する方法であって、前記流体サンプルをプロテインＡアフィニティクロマトグラフィープロセスに供し、それにより溶出液を得；前記溶出液を軸方向流動チャンネルに連続的に移送して、１つ以上のウイルス不活性化剤を前記溶出液と混合し；前記溶出液を、前記ウイルスを不活性化するのに十分な時間、別個のパケットの状態で前記軸方向チャンネル内に流すことを含む、方法。
【請求項１２】
標的分子を含む流体サンプル中の１つ以上のウイルスを不活性化する方法であって、前記流体サンプルをイオン交換クロマトグラフィープロセスに供し、それにより溶出液を得；前記溶出液を軸方向流動チャンネルに連続的に移送して、１つ以上のウイルス不活性化剤を前記溶出液と混合し；前記溶出液を、前記ウイルスを不活性化するのに十分な時間、別個のパケットの状態で前記軸方向チャンネルに流すことを含む、方法。
【請求項１３】
前記流体サンプルが、前記流体チャンネル内で１〜２分の名目上の滞留時間を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記流体サンプルが、前記流体チャンネル内で２〜４分の名目上の滞留時間を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記流体サンプルが、前記流体チャンネル内で４〜６分の名目上の滞留時間を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記流体サンプルが、前記流体チャンネル内で６〜８分の名目上の滞留時間を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記流体サンプルが、前記流体チャンネル内で８〜１０分の名目上の滞留時間を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記流体サンプルが、前記流体チャンネル内で１０〜１５分の名目上の滞留時間を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
前記流体サンプルが、前記流体チャンネル内で１５〜３０分の名目上の滞留時間を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
前記流体チャンネルに圧縮力を加えることにより、前記溶出液を別個のパケットの状態で流す、請求項１１に記載の方法。
【請求項２１】
前記標的が抗体またはタンパク質を含むＦｃ領域である、請求項１１に記載の方法。
【請求項２２】
軸方向の長さを有する流体チャンネルであって、前記流体チャンネルが、標的分子および１つ以上のウイルス不活性剤を含む流体サンプルの複数の別個のパケットを含む流体チャンネル。
【請求項２３】
前記流体サンプルがウイルスを含む、請求項２２に記載の流体チャンネル。
【国際調査報告】
2020520350.tif 000024