(57)【要約】本発明は、対象の組織内の血管密度及び／又は血流を増加させる方法、並びに対象の運動能力を増加させることに関し、本方法は、有効量の対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性を増加させる薬剤を対象に投与するステップを含み、本発明はさらに、ＮＡＤ＋アゴニスト又はＮＡＤ＋前駆体を対象に投与して血管密度及び／又は血流を増加させることを含む。本発明は前記薬剤を含む組成物を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の組織内の血管密度及び／又は血流を増加させる方法であって、有効量の対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤を対象に投与するステップを含む上記方法。
【請求項２】
対象の組織内の血管密度及び／又は血流を増加させる方法であって、有効量のＮＡＤ＋アゴニストを対象に投与するステップを含む上記方法。
【請求項３】
対象の組織内の血管密度及び／又は血流を増加させる方法であって、有効量のＮＡＤ＋前駆体を対象に投与するステップを含む上記方法。
【請求項４】
対象の運動能力を増加させる方法であって、有効量の、対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤を対象に投与するステップを含む上記方法。
【請求項５】
対象の運動能力を増加させる方法であって、有効量のＮＡＤ＋アゴニストを対象に投与するステップを含む上記方法。
【請求項６】
対象の運動能力を増加させる方法であって、有効量のＮＡＤ＋前駆体を対象に投与するステップを含む上記方法。
【請求項７】
対象の組織内の血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）及び／又は血管新生（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｓａｔｉｏｎ）を増加させる方法であって、有効量の、対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤を対象に投与するステップを含む上記方法。
【請求項８】
対象の組織内の血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）及び／又は血管新生（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｓａｔｉｏｎ）を増加させる方法であって、有効量のＮＡＤアゴニストを対象に投与するステップを含む上記方法。
【請求項９】
対象の組織内の血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）及び／又は血管新生（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｓａｔｉｏｎ）を増加させる方法であって、有効量のＮＡＤ＋前駆体を対象に投与するステップを含む上記方法。
【請求項１０】
対象の組織内の血管密度及び／又は血流を増加させる方法であって、（ａ）運動訓練期間にわたって対象を運動訓練に供するステップと；（ｂ）運動訓練期間の前及び／又は間に、有効量の、対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤を対象に投与するステップとを含む上記方法。
【請求項１１】
対象の組織内の血管密度及び／又は血流を増加させる方法であって、（ａ）運動訓練期間にわたって対象を運動訓練に供するステップと；（ｂ）運動訓練期間の前及び／又は間に、有効量のＮＡＤ＋前駆体を対象に投与するステップとを含む上記方法。
【請求項１２】
対象の運動能力を増加させる方法であって、（ａ）運動訓練期間にわたって対象を運動訓練に供するステップと；（ｂ）運動訓練期間の前及び／又は間に、有効量の、対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤を対象に投与するステップとを含む上記方法。
【請求項１３】
対象の運動能力を増加させる方法であって、（ａ）運動訓練期間にわたって対象を運動訓練に供するステップと；（ｂ）運動訓練期間の前及び／又は間に、有効量のＮＡＤ＋前駆体を対象に投与するステップとを含む上記方法。
【請求項１４】
ＮＡＤ＋アゴニストが、対象の内皮細胞内のＮＡＤ＋レベルを上昇させる薬剤である、請求項２、５又は８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
対象の内皮細胞内のＮＡＤ＋レベルを上昇させる薬剤がＮＡＤ＋前駆体を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ＮＡＤ＋前駆体がＮＭＮ若しくはその薬学的に許容される塩、ＮＲ若しくはその薬学的に許容される塩、ＮａＲ若しくはその薬学的に許容される塩、ＮＡＡＤ若しくはその薬学的に許容される塩、又はＮａＭＮ若しくはその薬学的に許容される塩である、請求項３、６、９、１１、１３及び１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
薬剤をＨ２Ｓ前駆体と組み合わせて投与する、請求項１、４、７、１０又は１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
ＮＡＤ＋アゴニストをＨ２Ｓ前駆体と組み合わせて投与する、請求項２、５又は８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ＮＡＤ＋前駆体をＨ２Ｓ前駆体と組み合わせて投与する、請求項３、６、９、１１、１３、１５又は１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
Ｈ２Ｓ前駆体が水硫化ソーダ若しくはその薬学的に許容される塩、又はＧＹＹ４１３７若しくはその薬学的に許容される塩である、請求項１７から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
血管密度の増加が微小血管密度の増加である、請求項１、２、３、１０又は１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
微小血管密度の増加が毛細管密度の増加である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
組織が筋肉である、請求項１から３、７から１１及び１４から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
筋肉が骨格筋である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
対象が老齢対象である、請求項１から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
薬剤、ＮＡＤ＋アゴニスト又はＮＡＤ＋前駆体を経口投与する、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
対象の冠動脈及び／又は末梢動脈疾患；虚血；潰瘍；肺疾患；肺高血圧；虚弱；サルコペニア；血管性認知症などの神経変性疾患；脳卒中；出血；骨粗鬆症；心臓病；及び血管疾患からなる群から選択される疾患又は状態を治療又は予防する方法であって、有効量の、対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤を対象に投与するステップを含む上記方法。
【請求項２８】
対象の冠動脈及び／又は末梢動脈疾患；虚血；潰瘍；肺疾患；肺高血圧；虚弱；サルコペニア；血管性認知症などの神経変性疾患；脳卒中；出血；骨粗鬆症；心臓病；及び血管疾患からなる群から選択される疾患又は状態を治療又は予防する方法であって、有効量のＮＡＤ＋アゴニストを対象に投与するステップを含む上記方法。
【請求項２９】
対象の冠動脈及び／又は末梢動脈疾患；虚血；潰瘍；肺疾患；肺高血圧；虚弱；サルコペニア；血管性認知症などの神経変性疾患；脳卒中；出血；骨粗鬆症；心臓病；及び血管疾患からなる群から選択される疾患又は状態を治療又は予防する方法であって、有効量のＮＡＤ＋前駆体を対象に投与するステップを含む上記方法。
【請求項３０】
運動性が低下した対象の血管密度又は運動能力を増加させる方法であって、有効量の、対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤を対象に投与するステップを含む上記方法。
【請求項３１】
対象の肝臓類洞内皮細胞機能を強化する方法であって、有効量の、対象の肝臓の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤を対象に投与するステップを含む上記方法。
【請求項３２】
レース用動物の能力を増加させる方法であって、有効量の、動物の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤をレース用動物に投与するステップを含む上記方法。
【請求項３３】
対象の持久力を増加させる方法であって、有効量の、対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤を対象に投与するステップを含む上記方法。
【請求項３４】
対象の身体能力を増加させる方法であって、有効量の、対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤を対象に投与するステップを含む上記方法。
【請求項３５】
対象の運動の効果を増加させる方法であって、有効量の、対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤を対象に投与するステップを含む上記方法。
【請求項３６】
傷害又は不動化後の対象の血管回復を改善する方法であって、有効量の、対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤を対象に投与するステップを含む上記方法。
【請求項３７】
対象の理学療法の利益を増加させる方法であって、有効量の、対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤を対象に投与するステップを含む上記方法。
【請求項３８】
対象の眼への血流を増加させる方法であって、有効量の、対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤を対象に投与するステップを含む上記方法。
【請求項３９】
対象の皮膚外観を増強させる方法であって、有効量の、対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤を対象に投与するステップを含む上記方法。
【請求項４０】
動物の肉生産を増加させる方法であって、有効量の、動物の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤を動物に投与するステップを含む上記方法。
【請求項４１】
−運動性が低下した対象の組織内の血管密度を増加させる；
−運動性が低下した対象の運動能力を増加させる；
−対象の肝臓類洞内皮細胞機能を強化する；
−対象の身体能力を増加させる；
−対象の運動の効果を増加させる；
−傷害又は不動化後の対象の血管回復を改善する；
−対象の理学療法の利益を増加させる；
−対象の持久力を増加させる；
−対象の眼への血流を増加させる；
−対象の皮膚外観を増強させる；又は
−動物の肉生産を増加させる
方法であって、
有効量のＮＡＤ＋アゴニストを対象に投与するステップを含む上記方法。
【請求項４２】
ＮＡＤ＋アゴニストがＮＡＤ＋前駆体である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
ＮＡＤ＋アゴニストと、場合によりＨ２Ｓ前駆体とを含む、対象の血管密度及び／又は血流及び／又は運動能力を増加させるための組成物。
【請求項４４】
ＮＡＤ＋前駆体と、場合によりＨ２Ｓ前駆体とを含む、対象の血管密度及び／又は血流及び／又は運動能力を増加させるための組成物。
【請求項４５】
対象の組織内の血管密度及び／又は血流、並びに／或いは対象の運動能力を増加させるための核酸であって、
（ａ）ＳＩＲＴ１タンパク質；
（ｂ）１つ若しくは複数のＮＡＤ＋生合成酵素、又は
（ｃ）ＮＡＭＰＴ、ＮＭＮＡＴ１、ＮＭＮＡＴ２及び／又はＮＭＮＡＴ３  ｍｉＲＮＡアンタゴニスト
をコードするコード配列を含む上記核酸
を含むウイルスベクターを含むウイルス。
【請求項４６】
コード配列が、内皮細胞内でコード配列を発現するプロモーターに作動可能に連結されている、請求項４５に記載のウイルス。
【請求項４７】
プロモーターが誘導性である、請求項４６に記載のウイルス。
【請求項４８】
プロモーターが、Ｔｉｅ−１、Ｔｉｅ−２、ＣＤ３４、ｅＮＯＳ、Ｆｌｔ−１、ＶＥ−カドヘリン、ｖＷＦ、ＰＤＧＦＢ、ＰＥＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１からなる群から選択される、請求項４６又は４７に記載のウイルス。
【請求項４９】
プロモーターがＴｉｅ−２である、請求項４８に記載のウイルス。
【請求項５０】
老齢対象の活力を増加させる方法であって、有効量の、対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤を対象に投与するステップを含む上記方法。
【請求項５１】
老齢対象の活力を増加させる方法であって、有効量のＮＡＤ＋アゴニストを対象に投与するステップを含む上記方法。
【請求項５２】
老齢対象の活力を増加させる方法であって、有効量のＮＡＤ＋前駆体を対象に投与するステップを含む上記方法。
【請求項５３】
対象がコンパニオンアニマル（ペット）である、請求項５０から５２のいずれか一項に記載の上記方法。
【請求項５４】
老齢対象の活力を増加させる方法であって、有効量の、対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤を対象に投与するステップを含む上記方法。
【請求項５５】
老齢対象の活力を増加させる方法であって、有効量のＮＡＤ＋アゴニストを対象に投与するステップを含む上記方法。
【請求項５６】
老齢対象の活力を増加させる方法であって、有効量のＮＡＤ＋前駆体を対象に投与するステップを含む上記方法。
【請求項５７】
老齢対象における
（ｇ）協調の欠如；
（ｈ）極端な疲労及び嗜眠；
（ｉ）食欲不振；
（ｊ）既存の状態の減退若しくは悪化；
（ｋ）創傷治癒の遅滞；又は
（ｌ）加齢性疾患の発症
を減少させる方法であって、有効量の、対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤を対象に投与するステップを含む上記方法。
【請求項５８】
薬剤がＮＡＤ＋アゴニストである、請求項５７記載の方法。
【請求項５９】
薬剤がＮＡＤ＋前駆体である、請求項５７記載の方法。
【請求項６０】
老齢対象がイヌである、請求項５４から５９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、対象の組織内の血管密度及び／又は血流を増加させる方法、対象の運動能力を増加させること、並びに対象の組織内の血管密度及び血流を増加させ、対象の運動能力を増加させるための組成物に関する。
【０００２】
本出願は、全体が参照により本明細書に組み込まれるオーストラリア仮特許出願第２０１６９０５３１０号からの優先権を主張する。
【背景技術】
【０００３】
加齢に伴う身体への最も重大な変化の１つは、血管系を裏打ちする内皮細胞（ＥＣ）の数及び機能の低下である。Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  Ａｇｉｎｇ（Ｌｅ  Ｃｏｕｔｅｕｒ及びＬａｋａｔｔａ、２０１０）によると、血管密度の進行性喪失は、心筋梗塞、脳卒中、運動不耐性、勃起不全、肝不全、骨粗鬆症、創傷治癒障害、サルコペニア、認知症及び虚弱を含む、様々な形で現れる老化及び加齢性疾患の主因の１つである（Ａｓｋｅｗら、２００５；Ｃｏｓｔａ及びＶｉｒａｇ、２００９；Ｄｕｓｃｈａら、１９９９；Ｋｏｌｌｕｒｕら、２０１２；Ｌａｎｚａ及びＣｒｅａ、２０１０；ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ、１９６６；Ｐｒｉｏｒら、２０１６）。ほとんどの器官及び組織の性能は、酸素の供給を維持し、熱及び種々の栄養素を交換し、代謝の老廃物を除去する、豊富で完全に機能的な微小毛細血管ネットワークに決定的に依存している。
【０００４】
ヒトの健康及び長寿にとって血管密度喪失が重要であるにもかかわらず、その根本的な原因についてほとんど理解されていないのは驚くべきことである。現在のところ、運動が組織内の血管新生を促進することによって微小血管系に対する老化の効果を遅らせるための最良の方法であるが、組織が加齢とともに運動に脱感作する理由はほとんど知られていない（Ｂａｓｓｅｌ−Ｄｕｂｙ及びＯｌｓｏｎ、２００６；Ｂｏｏｔｈ及びＴｈｏｍａｓｏｎ、１９９１；Ｈｏｏｄ、２００１）。
【０００５】
骨格筋は、運動に応じた毛細血管の維持及び血管新生に対する老化の悪影響を研究するための理想的な組織である。若年個体では、筋肉の性能が、酸素の供給を維持し、熱及び種々の栄養素を交換し、代謝の老廃物を除去する、豊富で完全に機能的な微小毛細血管ネットワークに決定的に依存している。はっきりしない理由のために、加齢とともに筋肉内皮細胞の老化及びアポトーシスが全体的に増加し、運動に応じた血管喪失及び筋肉の血管新生の減少をもたらす。その結果、運動をしても筋肉量が減少し（サルコペニア）、人生の後半の数十年間で強度及び持久力が着実に低下する。したがって、老齢対象の血管密度及び／又は血流を増加させることは有利となるだろう。
【０００６】
血管新生の増加はまた、筋肉組織内の血管密度及び／又は血流を増加させて身体能力を増加させようとするあらゆる年齢の対象、或いは血管密度及び／又は血流の増加が有益となり得る状態を患っているあらゆる年齢の対象で有益となるだろう。
【０００７】
それらの潜在的な有用性にもかかわらず、ほんの少数の運動模倣剤（例えばレスベラトロール及びＰＰＡＲγアゴニスト）しか報告されておらず、それらのいずれも血管新生又は筋毛細血管密度を促進することによって作用することは知られていない。
【０００８】
必要とされているのは、対象の組織内の血管密度及び／又は血流を増加させる方法である。
【発明の概要】
【０００９】
本発明者らは、組織の、例えば骨格筋の内皮細胞のサーチュイン１（ＳＩＲＴ１）活性又は発現の増加が、その組織内の血管密度の増加をもたらすことを見出した。本発明者らは、内皮細胞ＳＩＲＴ１活性又は発現が増加している対象は運動能力が増加していることをさらに見出した。
【００１０】
したがって、本発明の第１の態様は、対象の組織内の血管密度及び／又は血流を増加させる方法であって、有効量の対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤を対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【００１１】
代替の第１の態様は、対象の組織内の血管密度及び／又は血流を増加させるのに使用するための内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤、或いは対象の組織内の血管密度及び／又は血流を増加させるための医薬品の製造における内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤の使用を提供する。
【００１２】
第２の態様は、対象の運動能力を増加させる方法であって、有効量の対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤を対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【００１３】
代替の第２の態様は、対象の運動能力を増加させるのに使用するための内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤、或いは対象の運動能力を増加させるための医薬品の製造における内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤の使用を提供する。
【００１４】
本発明の第３の態様は、対象の組織内の血管密度及び／又は血流を増加させる方法であって、有効量のＮＡＤ＋アゴニストを対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【００１５】
代替の第３の態様は、対象の組織内の血管密度及び／又は血流を増加させるのに使用するためのＮＡＤ＋アゴニスト、或いは対象の組織内の血管密度及び／又は血流を増加させるための医薬品の製造におけるＮＡＤ＋アゴニストの使用を提供する。
【００１６】
本発明の第４の態様は、対象の運動能力を増加させる方法であって、有効量のＮＡＤ＋アゴニストを対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【００１７】
代替の第４の態様は、対象の運動能力を増加させるのに使用するためのＮＡＤ＋アゴニスト、又は対象の運動能力を増加させるための医薬品の製造におけるＮＡＤ＋アゴニストの使用を提供する。
【００１８】
本発明の第５の態様は、対象の組織内の血管密度及び／又は血流を増加させる方法であって、有効量のＮＡＤ＋前駆体を対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【００１９】
代替の第５の態様は、対象の組織内の血管密度及び／又は血流を増加させるのに使用するためのＮＡＤ＋前駆体、或いは対象の組織内の血管密度及び／又は血流を増加させるための医薬品の製造におけるＮＡＤ＋前駆体の使用を提供する。
【００２０】
本発明の第６の態様は、対象の運動能力を増加させる方法であって、有効量のＮＡＤ＋前駆体を対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【００２１】
代替の第６の態様は、対象の運動能力を増加させるのに使用するためのＮＡＤ＋前駆体、又は対象の運動能力を増加させるための医薬品の製造におけるＮＡＤ＋前駆体の使用を提供する。
【００２２】
第７の態様は、対象の組織内の血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）及び／又は血管新生（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｓａｔｉｏｎ）を増加させる方法であって、有効量の対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤を対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【００２３】
代替の第７の態様は、対象の組織内の血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）及び／又は血管新生（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｓａｔｉｏｎ）を増加させるのに使用するための内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤、或いは対象の組織内の血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）及び／又は血管新生（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｓａｔｉｏｎ）を増加させるための医薬品の製造における内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤の使用を提供する。
【００２４】
本発明の第８の態様は、対象の組織内の血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）及び／又は血管新生（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｓａｔｉｏｎ）を増加させる方法であって、有効量のＮＡＤ＋アゴニストを対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【００２５】
代替の第８の態様は、対象の組織内の血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）及び／又は血管新生（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｓａｔｉｏｎ）を増加させるのに使用するためのＮＡＤ＋アゴニスト、或いは対象の組織内の血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）及び／又は血管新生（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｓａｔｉｏｎ）を増加させるための医薬品の製造におけるＮＡＤ＋アゴニストの使用を提供する。
【００２６】
本発明の第９の態様は、対象の組織内の血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）及び／又は血管新生（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｓａｔｉｏｎ）を増加させる方法であって、有効量のＮＡＤ＋前駆体を対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【００２７】
代替の第９の態様は、対象の組織内の血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）及び／又は血管新生（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｓａｔｉｏｎ）を増加させるのに使用するためのＮＡＤ＋前駆体、或いは対象の組織内の血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）及び／又は血管新生（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｓａｔｉｏｎ）を増加させるための医薬品の製造におけるＮＡＤ＋前駆体の使用を提供する。
【００２８】
第１０の態様は、対象の組織内の血管密度及び／又は血流を増加させる方法であって、
（ａ）運動訓練期間にわたって対象を運動訓練に供するステップと；
（ｂ）運動訓練期間の前及び／又は間に、有効量の対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤を対象に投与するステップと
を含む方法を提供する。
【００２９】
代替の第１０の態様は、対象の組織内の血管密度及び／又は血流を増加させるのに使用するための対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤であって、（ａ）運動訓練期間にわたって対象を運動訓練に供し；（ｂ）運動訓練期間の前及び／又は間に投与する薬剤；或いは対象の組織内の血管密度及び／又は血流を増加させるための医薬品の製造における対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤の使用であって、（ａ）運動訓練期間にわたって対象を運動訓練に供し；（ｂ）運動訓練期間の前及び／又は間に投与する薬剤の使用を提供する。
【００３０】
第１１の態様は、対象の組織内の血管密度及び／又は血流を増加させる方法であって、（ａ）運動訓練期間にわたって対象を運動訓練に供するステップと；（ｂ）運動訓練期間の前及び／又は間に、有効量のＮＡＤ＋アゴニストを対象に投与するステップとを含む方法を提供する。
【００３１】
代替の第１１の態様は、対象の組織内の血管密度及び／又は血流を増加させるのに使用するためのＮＡＤ＋アゴニストであって、（ａ）運動訓練期間にわたって対象を運動訓練に供し；（ｂ）運動訓練期間の前及び／又は間に投与するＮＡＤ＋アゴニスト；或いは対象の組織内の血管密度及び／又は血流を増加させるための医薬品の製造におけるＮＡＤ＋アゴニストの使用であって、（ａ）運動訓練期間にわたって対象を運動訓練に供し；（ｂ）運動訓練期間の前及び／又は間に投与するＮＡＤ＋アゴニストの使用を提供する。
【００３２】
第１２の態様は、対象の運動能力を増加させる方法であって、（ａ）運動訓練期間にわたって対象を運動訓練に供するステップと；（ｂ）運動訓練期間の前及び／又は間に、有効量の対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤を対象に投与するステップとを含む方法を提供する。
【００３３】
代替の第１２の態様は、対象の運動能力を増加させるのに使用するための対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤であって、（ａ）運動訓練期間にわたって対象を運動訓練に供し；（ｂ）運動訓練期間の前及び／又は間に投与する薬剤；或いは対象の運動能力を増加させるための医薬品の製造における対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤の使用であって、（ａ）運動訓練期間にわたって対象を運動訓練に供し；（ｂ）運動訓練期間の前及び／又は間に投与する薬剤の使用を提供する。
【００３４】
第１３の態様は、対象の運動能力を増加させる方法であって、（ａ）運動訓練期間にわたって対象を運動訓練に供するステップと；（ｂ）運動訓練期間の前及び／又は間に、有効量のＮＡＤ＋薬剤を対象に投与するステップとを含む方法を提供する。
【００３５】
代替の第１３の態様は、対象の運動能力を増加させるのに使用するためのＮＡＤ＋薬剤であって、（ａ）運動訓練期間にわたって対象を運動訓練に供し；（ｂ）運動訓練期間の前及び／又は間に投与するＮＡＤ＋薬剤；或いは対象の運動能力を増加させるための医薬品の製造におけるＮＡＤ＋薬剤の使用であって、（ａ）運動訓練期間にわたって対象を運動訓練に供し；（ｂ）運動訓練期間の前及び／又は間に投与するＮＡＤ＋薬剤の使用を提供する。
【００３６】
第１４の態様は、対象の組織内の血管密度及び／又は血流を増加させる方法であって、（ａ）運動訓練期間にわたって対象を運動訓練に供するステップと；（ｂ）運動訓練期間の前及び／又は間に、有効量のＮＡＤ＋前駆体を対象に投与するステップとを含む方法を提供する。
【００３７】
代替の第１４の態様は、対象の組織内の血管密度及び／又は血流を増加させるのに使用するためのＮＡＤ＋前駆体であって、（ａ）運動訓練期間にわたって対象を運動訓練に供し；（ｂ）運動訓練期間の前及び／又は間に投与するＮＡＤ＋前駆体；或いは対象の組織内の血管密度及び／又は血流を増加させるための医薬品の製造におけるＮＡＤ＋前駆体の使用であって、（ａ）運動訓練期間にわたって対象を運動訓練に供し；（ｂ）運動訓練期間の前及び／又は間に投与するＮＡＤ＋前駆体の使用を提供する。
【００３８】
第１５の態様は、対象の運動能力を増加させる方法であって、（ａ）運動訓練期間にわたって対象を運動訓練に供するステップと；（ｂ）運動訓練期間の前及び／又は間に、有効量のＮＡＤ＋前駆体を対象に投与するステップとを含む方法を提供する。
【００３９】
代替の第１５の態様は、対象の運動能力を増加させるのに使用するためのＮＡＤ＋前駆体であって、（ａ）運動訓練期間にわたって対象を運動訓練に供し；（ｂ）運動訓練期間の前及び／又は間に投与するＮＡＤ＋前駆体；或いは対象の運動能力を増加させるための医薬品の製造におけるＮＡＤ＋前駆体の使用であって、（ａ）運動訓練期間にわたって対象を運動訓練に供し；（ｂ）運動訓練期間の前及び／又は間に投与するＮＡＤ＋前駆体の使用を提供する。
【００４０】
第１６の態様は、対象の血管疾患を治療又は予防する方法であって、（ａ）運動訓練期間にわたって対象を運動訓練に供するステップと；（ｂ）運動訓練期間の前及び／又は間に、有効量の対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤を対象に投与するステップとを含む方法を提供する。
【００４１】
代替の第１６の態様は、対象の血管疾患を治療又は予防するのに使用するための対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤であって、（ａ）運動訓練期間にわたって対象を運動訓練に供し；（ｂ）運動訓練期間の前及び／又は間に投与する薬剤；或いは対象の血管疾患を治療又は予防するための医薬品の製造における対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤の使用であって、（ａ）運動訓練期間にわたって対象を運動訓練に供し；（ｂ）運動訓練期間の前及び／又は間に投与する薬剤の使用を提供する。
【００４２】
第１７の態様は、対象の血管疾患を治療又は予防する方法であって、（ａ）運動訓練期間にわたって対象を運動訓練に供するステップと；（ｂ）運動訓練期間の前及び／又は間に、有効量のＮＡＤ＋アゴニストを対象に投与するステップとを含む方法を提供する。
【００４３】
代替の第１７の態様は、対象の血管疾患を治療又は予防するのに使用するためのＮＡＤ＋アゴニストであって、（ａ）運動訓練期間にわたって対象を運動訓練に供し；（ｂ）運動訓練期間の前及び／又は間に投与するＮＡＤ＋アゴニスト；或いは対象の血管疾患を治療又は予防するための医薬品の製造におけるＮＡＤ＋アゴニストの使用であって、（ａ）運動訓練期間にわたって対象を運動訓練に供し；（ｂ）運動訓練期間の前及び／又は間に投与するＮＡＤ＋アゴニストの使用を提供する。
【００４４】
第１８の態様は、対象の血管疾患を治療又は予防する方法であって、（ａ）運動訓練期間にわたって対象を運動訓練に供するステップと；（ｂ）運動訓練期間の前及び／又は間に、有効量のＮＡＤ＋前駆体を対象に投与するステップとを含む方法を提供する。
【００４５】
代替の第１８の態様は、対象の血管疾患を治療又は予防するのに使用するためのＮＡＤ＋前駆体であって、（ａ）運動訓練期間にわたって対象を運動訓練に供し；（ｂ）運動訓練期間の前及び／又は間にＮＡＤ＋アゴニストを投与するＮＡＤ＋前駆体；或いは対象の血管疾患を治療又は予防するための医薬品の製造におけるＮＡＤ＋前駆体の使用であって、（ａ）運動訓練期間にわたって対象を運動訓練に供し；（ｂ）運動訓練期間の前及び／又は間にＮＡＤ＋アゴニストを投与するＮＡＤ＋前駆体の使用を提供する。
【００４６】
第１９の態様は、ＮＡＤ＋アゴニストと、場合によりＨ２Ｓ前駆体とを含む、対象の組織内の血管密度及び／又は血流を増加させるため、並びに／或いは対象の運動能力を増加させるための組成物を提供する。
【００４７】
第２０の態様は、ＮＡＤ＋前駆体と、場合によりＨ２Ｓ前駆体とを含む、対象の組織内の血管密度及び／又は血流を増加させるため、並びに／或いは対象の運動能力を増加させるための組成物を提供する。
【００４８】
第２１の態様は、対象の冠動脈及び／又は末梢動脈疾患；虚血；潰瘍；肺疾患；肺高血圧；虚弱；サルコペニア；神経変性疾患、例えば血管性認知症；脳卒中；出血；骨粗鬆症；心臓病；及び血管疾患からなる群から選択される疾患又は状態を治療又は予防する方法であって、有効量の対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤を対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【００４９】
代替の第２１の態様は、冠動脈及び／又は末梢動脈疾患；虚血；潰瘍；肺疾患；肺高血圧；虚弱；サルコペニア；神経変性疾患、例えば血管性認知症；脳卒中；出血；骨粗鬆症；心臓病；及び血管疾患からなる群から選択される疾患又は状態を治療又は予防するのに使用するための対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤、或いは冠動脈及び／又は末梢動脈疾患；虚血；潰瘍；肺疾患；肺高血圧；虚弱；サルコペニア；神経変性疾患、例えば血管性認知症；脳卒中；出血；骨粗鬆症；心臓病；及び血管疾患からなる群から選択される疾患又は状態を治療又は予防するための医薬品の製造における対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤の使用を含む。
【００５０】
第２２の態様は、対象の冠動脈及び／又は末梢動脈疾患；虚血；潰瘍；肺疾患；肺高血圧；虚弱；サルコペニア；神経変性疾患、例えば血管性認知症；脳卒中；出血；骨粗鬆症；心臓病；及び血管疾患からなる群から選択される疾患又は状態を治療又は予防する方法であって、有効量のＮＡＤ＋アゴニストを対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【００５１】
代替の第２２の態様は、冠動脈及び／又は末梢動脈疾患；虚血；潰瘍；肺疾患；肺高血圧；虚弱；サルコペニア；神経変性疾患、例えば血管性認知症；脳卒中；出血；骨粗鬆症；心臓病；及び血管疾患からなる群から選択される疾患又は状態を治療又は予防するのに使用するためのＮＡＤ＋アゴニスト、或いは冠動脈及び／又は末梢動脈疾患；虚血；潰瘍；肺疾患；肺高血圧；虚弱；サルコペニア；神経変性疾患、例えば血管性認知症；脳卒中；出血；骨粗鬆症；心臓病；及び血管疾患からなる群から選択される疾患又は状態を治療又は予防するための医薬品の製造におけるＮＡＤ＋アゴニストの使用を提供する。
【００５２】
第２３の態様は、対象の冠動脈及び／又は末梢動脈疾患；虚血；潰瘍；肺疾患；肺高血圧；虚弱；サルコペニア；神経変性疾患、例えば血管性認知症；脳卒中；出血；骨粗鬆症；心臓病；及び血管疾患からなる群から選択される疾患又は状態を治療又は予防する方法であって、有効量のＮＡＤ＋前駆体を対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【００５３】
代替の第２３の態様は、冠動脈及び／又は末梢動脈疾患；虚血；潰瘍；肺疾患；肺高血圧；虚弱；サルコペニア；神経変性疾患、例えば血管性認知症；脳卒中；出血；骨粗鬆症；心臓病；及び血管疾患からなる群から選択される疾患又は状態を治療又は予防するのに使用するためのＮＡＤ＋前駆体、或いは冠動脈及び／又は末梢動脈疾患；虚血；潰瘍；肺疾患；肺高血圧；虚弱；サルコペニア；神経変性疾患、例えば血管性認知症；脳卒中；出血；骨粗鬆症；心臓病；及び血管疾患からなる群から選択される疾患又は状態を治療又は予防するための医薬品の製造におけるＮＡＤ＋前駆体の使用を提供する。
【００５４】
第２４の態様は、運動性が低下した対象の組織内の血管密度及び／又は血流を増加させる方法であって、有効量の対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤を対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【００５５】
代替の第２４の態様は、運動性が低下した対象の組織内の血管密度及び／又は血流を増加させるのに使用するための内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤、或いは運動性が低下した対象の組織内の血管密度及び／又は血流を増加させるための医薬品の製造における内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤の使用を提供する。
【００５６】
第２５の態様は、運動性が低下した対象の運動能力を増加させる方法であって、有効量の対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤を対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【００５７】
代替の第２５の態様は、運動性が低下した対象の運動能力を増加させるのに使用するための内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤、或いは運動性が低下した対象の運動能力を増加させるための医薬品の製造における内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤の使用を提供する。
【００５８】
第２６の態様は、対象の肝臓類洞内皮細胞機能を強化する方法であって、有効量の対象の肝臓の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤を対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【００５９】
代替の第２６の態様は、対象の肝臓類洞内皮細胞機能を強化するのに使用するための内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤、或いは対象の肝臓類洞内皮細胞機能を強化するための医薬品の製造における内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤の使用を提供する。
【００６０】
第２７の態様は、対象（例えば、レース用動物）の身体能力を増加させる方法であって、有効量の動物の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤を対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【００６１】
代替の第２７の態様は、対象の身体能力を増加させるのに使用するための内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤、或いは対象の身体能力を増加させるための医薬品の製造における内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤の使用を提供する。
【００６２】
第２８の態様は、対象の持久力を増加させる方法であって、有効量の対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤を対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【００６３】
代替の第２８の態様は、対象の持久力を増加させるのに使用するための内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤、或いは対象の持久力を増加させるための医薬品の製造における内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤の使用を提供する。
【００６４】
第２９の態様は、対象の運動の効果を増加させる方法であって、有効量の対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤を対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【００６５】
代替の第２９の態様は、対象の運動の効果を増加させるのに使用するための内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤、或いは対象の運動の効果を増加させるための医薬品の製造における内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤の使用を提供する。
【００６６】
第３０の態様は、傷害又は不動化後の対象の血管回復を改善する方法であって、有効量の対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤を対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【００６７】
代替の第３０の態様は、傷害又は不動化後の対象の血管回復を改善するのに使用するための内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤、或いは傷害又は不動化後の対象の血管回復を改善するための医薬品の製造における内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤の使用を提供する。
【００６８】
第３２の態様は、対象の理学療法の利益を増加させる方法であって、有効量の対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤を対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【００６９】
代替の第３２の態様は、対象の理学療法の利益を増加させるのに使用するための内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤、或いは対象の理学療法の利益を増加させるための医薬品の製造における内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤の使用を提供する。
【００７０】
第３３の態様は、（例えば、視力を改善するために）対象の眼への血流を増加させる方法であって、有効量の対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤を対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【００７１】
代替の第３３の態様は、対象の眼への血流を増加させるのに使用するための内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤、或いは対象の眼への血流を増加させるための医薬品の製造における内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤の使用を提供する。
【００７２】
第３４の態様は、対象の皮膚外観を増強させる方法であって、有効量の対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤を対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【００７３】
代替の第３４の態様は、対象の皮膚外観を増強させるのに使用するための内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤、或いは対象の皮膚外観を増強させるための医薬品の製造における内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤の使用を提供する。
【００７４】
第３５の態様は、動物（例えば、動けない動物又は運動が制限された動物）の肉生産を増加させる方法であって、有効量の対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤を動物に投与するステップを含む方法を提供する。
【００７５】
代替の第３５の態様は、動物の肉生産を増加させるのに使用するための内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤、或いは動物の肉生産を増加させるための医薬品の製造における内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤の使用を提供する。
【００７６】
第３６の態様は、
運動性が低下した対象の組織内の血管密度を増加させる；
運動性が低下した対象の運動能力を増加させる；
対象の肝臓類洞内皮細胞機能を強化する；
対象の身体能力を増加させる；
対象の運動の効果を増加させる；
傷害又は不動化後の対象の血管回復を改善する；
対象の理学療法の利益を増加させる；
対象の持久力を増加させる；
対象の眼への血流を増加させる；
対象の皮膚外観を増強させる；又は
動物の肉生産を増加させる
方法であって、
有効量のＮＡＤ＋アゴニストを対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【００７７】
代替の第３６の態様は、
運動性が低下した対象の組織内の血管密度を増加させる；
運動性が低下した対象の運動能力を増加させる；
対象の肝臓類洞内皮細胞機能を強化する；
対象の身体能力を増加させる；
対象の運動の効果を増加させる；
傷害又は不動化後の対象の血管回復を改善する；
対象の理学療法の利益を増加させる；
対象の持久力を増加させる；
対象の眼への血流を増加させる；
対象の皮膚外観を増強させる；若しくは
動物の肉生産を増加させる
のに使用するためのＮＡＤ＋アゴニスト
又は
運動性が低下した対象の組織内の血管密度を増加させる；
運動性が低下した対象の運動能力を増加させる；
対象の肝臓類洞内皮細胞機能を強化する；
対象の身体能力を増加させる；
対象の運動の効果を増加させる；
傷害又は不動化後の対象の血管回復を改善する；
対象の理学療法の利益を増加させる；
対象の持久力を増加させる；
対象の眼への血流を増加させる；
対象の皮膚外観を増強させる；若しくは
動物の肉生産を増加させる
ための医薬品の製造におけるＮＡＤ＋アゴニストの使用
を提供する。
【００７８】
第３７の態様は、ＮＡＤ＋アゴニストと、場合によりＨ２Ｓ前駆体とを含む運動模倣剤を提供する。
【００７９】
第３８の態様は、対象の組織内の血管密度及び／又は血流を増加させるため、並びに／或いは対象の運動能力を増加させるためのキットであって、内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤を含むキットを提供する。
【００８０】
第３９の態様は、対象の組織内の血管密度及び／又は血流を増加させるため、並びに／或いは対象の運動能力を増加させるためのキットであって、ＮＡＤ＋アゴニストを含むキットを提供する。
【００８１】
第４０の態様は、対象の組織内の血管密度及び／又は血流を増加させるため、並びに／或いは対象の運動能力を増加させるためのキットであって、ＮＡＤ＋前駆体を含むキットを提供する。
【００８２】
第４１の態様は、対象の組織内の血管密度及び／又は血流を増加させるため、並びに／或いは対象の運動能力を増加させるための組成物であって、対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤と、場合によりＨ２Ｓ前駆体とを含む組成物を提供する。
【００８３】
第４２の態様は、対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤と、場合によりＨ２Ｓ前駆体とを含む運動模倣剤を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１Ａ】６月齢及び２０月齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウスの骨格筋のコラゲナーゼ／ディスパーゼ消化後の骨格筋内のＣＤ３１＋内皮細胞の代表的な散布図及びＡＰＣコンジュゲートＣＤ３１抗体を使用したフローサイトメトリーによる内皮細胞（ＥＣ）の検出を示す図である。
【図１Ｂ】骨格筋におけるＣＤ３１陽性ＥＣの百分率を示すグラフである（ｎ＝７）。データを平均±ＳＥＭとして表す。スチューデントのｔ検定により＊ｐ＜０．０５。
【図２Ａ】低強度トレッドミル試験における、６月齢及び２０月齢のマウスによる、消耗までの走行時間及び消耗までの走行距離を示すグラフである（ｎ＝１１）。
【図２Ｂ】高強度トレッドミル試験における、６月齢及び２０月齢のマウスによる、消耗までの走行時間及び消耗までの走行距離を示すグラフである（ｎ＝１１）。マウスをトレッドミルで訓練し、その運動能力を２つの異なるトレッドミル試験で測定した。データを平均±ＳＥＭとして表す。スチューデントのｔ検定により＊＊＊ｐ＜０．０００５、δｐ＜０．００００５。
【図３Ａ】毛細血管及び間質をそれぞれ可視化するためにＣＤ３１及びラミニン（挿入図）抗体で免疫染色した６月齢及び２０月齢のマウスの腓腹筋の横断面の代表的な画像である（倍率２０倍）（白色バー＝２００μｍ）。
【図３Ｂ】腓腹筋における高倍率視野（ＨＰＦ）当たりの毛細血管数及び毛細血管数／筋線維数の比（毛細血管密度）（ｎ＝７）のグラフである。
【図３Ｃ】毛細血管及び間質をそれぞれ可視化するためにＣＤ３１及びラミニン（挿入図）抗体で免疫染色した６月齢及び２０月齢のマウスの四頭筋切片の代表的な画像である（倍率２０倍）。
【図３Ｄ】四頭筋における高倍率視野（ＨＰＦ）当たりの毛細血管数及び毛細血管数／筋線維数の比（毛細管密度）（ｎ＝５）のグラフである。データを平均±ＳＥＭとして表す。スチューデントのｔ検定により＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５。
【図４Ａ】６月齢及び２０月齢のマウスから単離した初代マウス肺内皮細胞（ＭＬＥＣ）を一晩飢餓状態にし、次いで、孔径８μｍのＢＤ  ＦｌｕｏｒｏＢｌｏｋトランスウェルに播種し（２．５×１０４個細胞）、ＰＧＣ−１α導入遺伝子を発現するアデノウイルスを形質導入したＣ２Ｃ１２筋管から収集した馴化培地（ＣＭ）を底部チャンバーに添加したトランスウェル遊走アッセイ後の、ＨＰＦ当たりの＋／−Ｃ２Ｃ１２ＣＭで処置した遊走ＥＣの数の定量化を示すグラフである（ｎ＝１０）。２４時間後、遊走した細胞を固定し、ＤＡＰＩで染色し、次いで、写真撮影し（倍率１０倍）、計数した。
【図４Ｂ】６月齢及び２０月齢マウスのＭＬＥＣを成長因子枯渇マトリゲルマトリックス上に播種し（５×１０４個細胞）、Ｃ２Ｃ１２ＣＭで１８時間覆った管形成アッセイから得られた、管ネットワークの位相差顕微鏡写真からの代表的な画像（倍率１０倍）である（白色バー＝４００μｍ）。
【図４Ｃ】（Ｂ）の管形成アッセイからの視野当たりの管分岐点数＋／−Ｃ２Ｃ１２ＣＭの定量化を示すグラフである（ｎ＝８）。
【図４Ｄ】（Ｂ）で言及される管形成アッセイにおいて＋／−Ｃ２Ｃ１２ＣＭで処置した６月齢及び２０月齢のマウスのＭＬＥＣによって形成された毛細血管ネットワークの総管長の定量化を示すグラフである（ｎ＝８）。データを平均±ＳＥＭとして表す。ボンフェローニの多重比較検定による二元配置分散分析により、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５、δｐ＜０．００００５。
【図５Ａ】ＥＣスフェロイドの代表的な位相差顕微鏡写真（倍率１０倍）である。
【図５Ｂ】６月齢及び２０月齢マウスのＭＬＥＣのＥＣスフェロイド（１０００個細胞／スフェロイド）をＩ型コラーゲンマトリックスに包埋し、Ｃ２Ｃ１２ＣＭで２４時間処置したスフェロイドアッセイにおけるスフェロイド＋／−Ｃ２Ｃ１２ＣＭの芽長の定量化を示す図である（ｎ＝１０）。データを平均±ＳＥＭとして表す。ボンフェローニの多重比較検定による二元配置分散分析により、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５、δｐ＜０．００００５。
【図６Ａ】内皮細胞特異的ＧＦＰレポーターマウス（Ｔｉｅ２Ｃｒｅ；Ｇｆｐ）を作製するための戦略の概略図である。ｍＴＳＴＯＰｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ、Ｇｆｐマウスは膜標的タンデムダイマーＴｏｍａｔｏ（ｍＴ）を発現し、Ｔｉｅ２Ｃｒｅマウス（Ｔｉｅ２Ｃｒｅ；Ｇｆｐ）と交雑させると、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現する。
【図６Ｂ】ｍＴ及びＧＦＰの発現を示すｍＴ−ＳＴＯＰｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ、Ｇｆｐ及びＴｉｅ２Ｃｒｅ；ＧＦＰマウスの腓腹筋横断面の代表的な画像である（倍率２０倍）。Ｔｉｅ２プロモーター媒介Ｃｒｅタンパク質は筋毛細血管でＧＦＰ発現をもたらす。細胞外マトリックスに囲まれた筋線維の境界を白色四角で強調している。白色矢印は、ＧＦＰを発現している筋毛細血管を示す。白色バー＝１００μｍ。
【図７Ａ】Ｔｉｅ２プロモーター媒介Ｃｒｅタンパク質が筋毛細血管で特異的にＧＦＰ発現をもたらし（ＣＤ３１陽性）、ＴＯＭＡＴＯタンパク質が筋線維及び周囲間質で発現されることを示す、ＧＦＰ及びＣＤ３１抗体で免疫染色したｍＴ−ＳＴＯＰｆ／ｆ−ＧＦＰマウス及びＴｉｅ２−Ｃｒｅ−ＧＦＰマウスの腓腹筋断面の代表的な画像である（倍率４０倍）（白色バー＝１００μｍ）。
【図７Ｂ】ＧＦＰ及びＣＤ３１抗体を使用して免疫染色した、ｍＴ−ＳＴＯＰｆ／ｆ−ＧＦＰ（白色バー＝１００μｍ）マウス及びＴｉｅ２−Ｃｒｅ−ＧＦＰマウス（白色バー＝１５０μｍ）の四頭筋断面の代表的な画像である（倍率４０倍）。
【図８Ａ】ＧＦＰ及びＣＤ３１抗体を使用して免疫染色した、ｍＴ−ＳＴＯＰｆ／ｆ−ＧＦＰマウス及びＴｉｅ２−Ｃｒｅ−ＧＦＰマウスの心臓切片の代表的な画像である（倍率４０倍）。
【図８Ｂ】ＧＦＰ及びＣＤ３１抗体を使用して免疫染色した、ｍＴ−ＳＴＯＰｆ／ｆ−ＧＦＰマウス及びＴｉｅ２−Ｃｒｅ−ＧＦＰマウスの肺切片の代表的な画像である（倍率４０倍）（白色バー＝２００μｍ）。
【図９Ａ】ＥＣ特異的Ｔｉｅ２プロモーターの指示下でＣｒｅタンパク質を発現するトランスジェニックマウス（Ｔｉｅ２−Ｃｒｅ）とＳＩＲＴ１のｌｏｘＰ部位隣接エクソン４（触媒ドメイン）を含むマウス（ＳＩＲＴ１ｆ／ｆ又はＷＴ）を交雑させることによって、ＥＣ特異的ＳＩＲＴ１ノックアウトマウス（ＥＳＫＯ）を作製する戦略を示す概略図である。
【図９Ｂ】野生型（ＷＴ）マウス及び内皮特異的ＳＩＲＴ１ノックアウト（ＥＳＫＯ）マウスの骨格筋から単離したＥＣにおけるＳＩＲＴ１及びｅＮＯＳについてのウエスタンブロットの画像である。ＥＳＫＯにおけるＥＣ特異的ＳＩＲＴ１エクソン４切除は、野生型（ｗｔ）ＳＩＲＴ１バンドよりわずかに下を泳動するＳＩＲＴ１バンド（Δエクソン４）をもたらす（白色バー＝２０μｍ）。
【図９Ｃ】ＳＩＲＴ１タンパク質レベルの全体的な減少を示す、ＷＴマウス及びＥＳＫＯマウスの肺及び四頭筋組織タンパク質ホモジネートにおけるＳＩＲＴ１についてのウエスタンブロットの画像である。
【図９Ｄ】（Ｃ）に示されるウエスタンブロットについての、ＷＴマウス及びＥＳＫＯマウスの四頭筋におけるＳＩＲＴ１レベルの相対的定量化を示すグラフである（ｎ＝３）＊スチューデントのｔ検定によりｐ＜０．０５。
【図９Ｅ】エクソン４切除ＳＩＲＴ１バンド（Δエクソン４）が野生型（ｗｔ）ＳＩＲＴ１バンドよりわずかに下を泳動する、ＷＴマウス及びＥＳＫＯマウスの胸腺組織タンパク質ホモジネートにおけるＳＩＲＴ１についてのウエスタンブロットの画像である。チューブリンをローディングコントロールとして使用した。
【図１０Ａ】毛細血管及び間質をそれぞれ可視化するためにＣＤ３１及びラミニン（挿入図）抗体で免疫染色した６月齢のＷＴマウス及びＥＳＫＯマウスの四頭筋断面（倍率２０倍）における毛細血管（ＣＤ３１）及び筋間質（ラミニン、挿入図）の代表的な画像である（倍率２０倍）（白色バー＝２００μｍ）。
【図１０Ｂ】四頭筋断面におけるＨＰＦ当たりの毛細血管数、及びＨＰＦ当たりの毛細血管数／筋線維数を示すグラフである（ｎ＝８）。
【図１０Ｃ】ＣＤ３１及びラミニン（挿入図）抗体で免疫染色した６月齢のＷＴマウス及びＥＳＫＯマウスの腓腹筋断面における毛細血管（ＣＤ３１）及び筋間質（ラミニン、挿入図）の代表的な画像である（倍率２０倍）（白色バー＝２００μｍ）。
【図１０Ｄ】６月齢のＷＴマウス及びＥＳＫＯマウスの腓腹筋断面におけるＨＰＦ当たりの毛細血管数、及びＨＰＦ当たりの毛細血管数／筋線維数を示すグラフである（ｎ＝８）。データを平均±標準偏差として表す。スチューデントのｔ検定により＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５。
【図１１Ａ】６月齢のＷＴマウス及びＥＳＫＯマウスの体重、空腹時血糖値、尿クレアチニンレベル及び落下までの潜伏時間を示すロータロッド成績を示すグラフである（ｎ＝７）。
【図１１Ｂ】６月齢のＷＴマウス及びＥＳＫＯマウスにおける腓腹筋（Ｇａｓｔｒｏｃ）、四頭筋（Ｑｕａｄ）及び心臓の組織重量／体重比を示すグラフである（ｎ＝７）。
【図１１Ｃ】６月齢のＷＴマウス及びＥＳＫＯマウスの四頭筋の代表的なＨ＆Ｅ染色（倍率１０倍）画像である。
【図１２Ａ】マウスを１５ｍ／分（５°仰角）のトレッドミルで２０分間走らせた高強度トレッドミル運動試験における、６月齢のＷＴマウス及びＥＳＫＯマウスによる、消耗までの走行時間、及び消耗までの走行距離を示すグラフである（ｎ＝８）。
【図１２Ｂ】高強度トレッドミル運動試験後の６月齢のＷＴマウス及びＥＳＫＯマウスにおける運動後血清乳酸レベルを示すグラフである。血中乳酸レベルは尾部採血によって測定した（ｎ＝５）。データを平均±標準偏差として表す。スチューデントのｔ検定により、＊＊ｐ＜０．００５。
【図１３Ａ】６月齢のＷＴマウス及びＥＳＫＯマウスの腓腹筋におけるミオシン重鎖Ｉ、ＩＩＡ、ＩＩＢ及びＩＩＸの相対ｍＲＮＡレベルを示すグラフである（ｎ＝１０）。
【図１３Ｂ】６月齢のＷＴマウス及びＥＳＫＯマウスの四頭筋組織ホモジネート中のミトコンドリアタンパク質複合体についてのウエスタンブロットの画像である。１４−３−３をローディングコントロールとして使用した。
【図１４Ａ】Ｓｃｒ又はＳＩＲＴ１  ｓｉＲＮＡを形質導入したＨＵＶＥＣにおける相対ＳＩＲＴ１  ｍＲＮＡレベルを示すグラフである（ｎ＝３）。
【図１４Ｂ】スクランブル（Ｓｃｒ）又はＳＩＲＴ１  ｓｉＲＮＡを形質導入し、ＶＥＧＦ（３０ｎｇ／ｍＬ）を用いて又は用いないで管形成アッセイに供したヒト静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の代表的な画像である。得られた管ネットワークの代表的な明視野画像（倍率２０倍）を示す。
【図１４Ｃ】視野当たりの管分岐点及び総管長の定量化を示すグラフである（ｎ＝１２）。データを平均±標準偏差として表す。スチューデントのｔ検定により＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５。
【図１５Ａ】ＳＩＲＴ１−ｉＫＯマウス及び野生型対照マウスの尾及び大動脈におけるＳＩＲＴ１の切除を示すＰＣＲ分析の結果を示す図である。このマウスは、ＳＩＲＴ１のエクソン４（触媒ドメイン）のｆｌｏｘｅｄ対立遺伝子及び普遍的なＣＡＧプロモーター駆動Ｃｒｅ−ｅｓｒ１融合タンパク質を発現する。Ｃｒｅタンパク質は、４−ヒドロキシタモキシフェンで処置すると活性化され、エクソン４が欠失した。完全長野生型ＳＩＲＴ１（上のバンド）は野生型マウスにおいて明らかである一方、より小さいバンドはエクソン４の喪失に相当する。
【図１５Ｂ】コラーゲンマトリックスに埋め込まれた大動脈リングの微小血管芽の代表的な画像である（倍率４倍）。大動脈リングを全身ＳＩＲＴ１誘導性ノックアウト（ＳＩＲＴ１−ｉＫＯ）マウス及び同腹仔対照（野生型）マウスから調製し、次いで、ＶＥＧＦ（３０  ｎｇ／ｍＬ）又はビヒクルで７日間処置した。得られた芽をＢＳ１レクチン−ＦＩＴＣで染色した（黒色バー＝５００μｍ）。
【図１５Ｃ】（Ｂ）で言及される大動脈リングに由来する芽の数及び総面積の定量化を示すグラフである（１処置当たりｎ＝１５）。データを平均±標準偏差として表す。両側スチューデントのｔ検定により＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＃ｐ＜０．００００５。
【図１６Ａ】トランスウェル遊走アッセイにおける遊走ＭＳ１細胞数のグラフである。ＭＳ１細胞をＳｃｒ又はＳＩＲＴ１  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、次いで、１０ｎｇ／ｍＬ  ＶＥＧＦ又はＡｄｅｎｏ−ＰＧＣ−１αを形質導入したＣ２Ｃ１２細胞からの馴化培地を使用してトランスウェル遊走アッセイに供した。次いで、ＨＰＦ当たりの遊走細胞数を定量化した（ｎ＝１６）。
【図１６Ｂ】Ｓｃｒ又はＳＩＲＴ１  ｓｉＲＮＡを形質導入したＨＵＶＥＣにおける相対ＶＥＧＦ  ｍＲＮＡレベルを示すグラフである（ｎ＝３）。
【図１６Ｃ】６月齢のＥＳＫＯ及びＷＴ対照マウスから収集した血清中のＶＥＧＦタンパク質レベルを示すグラフである（ｎ＝５）。
【図１６Ｄ】Ｓｃｒ又はＳＩＲＴ１  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＭＳ１細胞中のＳＩＲＴ１タンパク質レベルを示すウエスタンブロットである。アクチンをローディングコントロールとして使用した。データを平均±標準偏差として表す。両側スチューデントのｔ検定により＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５。
【図１７Ａ】運動によって誘導される骨格筋血管リモデリングにＳＩＲＴ１が必要であることを示す、座ったままの（ＳＩＲＴ１−ｉＫＯ＋ＷＴ）（Ｓｅｄ．）マウス、並びに運動したＷＴ（ＷＴ−ｅｘ．）マウス及びＳＩＲＴ１−ｉＫＯ（ＳＩＲＴ１−ｉＫＯ−ｅｘ）マウスの四頭筋断面の毛細血管（ＣＤ３１）及び間質（ラミニン、挿入図）の代表的な画像である（倍率２０倍）。全身ＳＩＲＴ１誘導性ノックアウト（ＳＩＲＴ１−ｉＫＯ）マウス及びＷＴ（対照）マウス（５月齢）に５週間タモキシフェン食餌（３６０ｍｇ／ｋｇ）を与え、その後、動物を４週間のトレッドミル運動訓練（５°傾斜で１５ｍ／分、３０分間）で訓練した（白色バー＝２００μｍ）。
【図１７Ｂ】（Ａ）で言及されるマウスの四頭筋におけるＨＰＦ当たりの毛細血管数、及びＨＰＦ当たりの毛細血管数／筋線維数の比の定量化を示すグラフである（ｎ＝６）。データを平均±ＳＥＭとして表す。ボンフェローニの多重比較検定による一元配置分散分析により、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５、δｐ＜０．００００５。
【図１８Ａ】４月齢のＷＴマウス、ＥＳＫＯマウス、ＭＣＫ−ＰＧＣ−１α；ＷＴマウス及びＭＣＫ−ＰＧＣ−１α；ＥＳＫＯマウスの四頭筋におけるＶＥＧＦの相対ｍＲＮＡレベルを示すグラフである（ｎ＝５）。ＷＴマウス及びＥＳＫＯマウスを筋特異的ＰＧＣ１−α過剰発現（ＭＣＫ−ＰＧＣ−１α）と交雑させた。
【図１８Ｂ】４月齢のＷＴマウス、ＥＳＫＯマウス、ＭＣＫ−ＰＧＣ−１α；ＷＴマウス及びＭＣＫ−ＰＧＣ−１α；ＥＳＫＯマウスの四頭筋におけるＰＧＣ−１α、ＮＤＵＦＢ５（複合体Ｉ）、ＳＤＨ８（複合体ＩＩ）及びＡＴＰ５ａ（複合体Ｖ）のタンパク質レベルを示すウエスタンブロットの画像である。ＧＡＰＤＨをローディングコントロールとして使用した。
【図１８Ｃ】ＭＣＫ−ＰＧＣ−１α；ＷＴマウス及びＭＣＫ−ＰＧＣ−１α；ＥＳＫＯマウス（４月齢）の四頭筋断面における核（ＤＡＰＩ）及び毛細血管（ＣＤ３１）の代表的な画像である（倍率４０倍）（白色バー＝１００μｍ）。
【図１８Ｄ】（Ｃ）で言及されるマウスの四頭筋におけるＨＰＦ当たりの毛細血管数、及びＨＰＦ当たりの毛細血管数／筋線維数の比を示すグラフである（ｎ＝６）。データを平均±ＳＥＭとして表す。スチューデントのｔ検定（Ｄ）又はボンフェローニの多重比較検定による二元配置分散分析（Ａ）により、＊ｐ＜０．０５、δｐ＜０．００００５。
【図１９Ａ】ＭＣＫ−ＰＧＣ−１α；ＷＴマウス及びＭＣＫ−ＰＧＣ−１α；ＭＳＫＯマウス（４月齢）の四頭筋断面における、ＨＰＦ当たりの毛細血管数、及びＨＰＦ当たりの毛細血管数／筋線維数の比を示すグラフである（ｎ＝６）。ＭＣＫ−ＰＧＣ−１αマウスを筋特異的ＳＩＲＴ１  ＫＯ（ＭＳＫＯ）マウスと交雑させ、同腹仔の筋毛細血管をＣＤ３１及びラミニン抗体で免疫染色した後に評価した（倍率４０倍）。
【図１９Ｂ】高強度トレッドミル運動試験におけるＭＣＫ−ＰＧＣ−１α；ＷＴマウス及びＭＣＫ−ＰＧＣ−１α；ＥＳＫＯマウス（４月齢）による消耗までの走行時間及び消耗までの走行距離を示すグラフである（ｎ＝７）。
【図１９Ｃ】高強度トレッドミル運動試験におけるＭＣＫ−ＰＧＣ−１α；ＷＴマウス及びＭＣＫ−ＰＧＣ−１α；ＭＳＫＯマウス（４月齢）による消耗までの走行時間及び消耗までの走行距離を示すグラフである（ｎ＝７）。データを平均±ＳＥＭとして表す。スチューデントのｔ検定により＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５、δｐ＜０．００００５。
【図２０Ａ】トランスウェル遊走アッセイにおける、視野当たりのＷＴマウス及びＥＳＫＯマウス＋／−Ｃ２Ｃ１２ＣＭから単離した遊走ＭＬＥＣの数の定量化を示すグラフである（ｎ＝１２）。
【図２０Ｂ】マトリゲルマトリックス上にＷＴ及びＥＳＫＯ  ＭＬＥＣによって形成された管ネットワークの代表的な位相差顕微鏡写真である（倍率１０倍）（白色バー＝２００μｍ）。
【図２０Ｃ】（Ｂ）で言及される管形成アッセイからの視野当たりの＋／−Ｃ２Ｃ１２ＣＭでの管分岐点及び管長の定量化を示すグラフである（ｎ＝５）。
【図２０Ｄ】スフェロイドアッセイにおいてＣ２Ｃ１２ＣＭで処置したＷＴ及びＥＳＫＯ  ＭＬＥＣからのスフェロイドの代表的な位相差顕微鏡写真である（倍率１０倍）（ｎ＝８）。
【図２０Ｅ】（Ｄ）で言及されるスフェロイドアッセイにおいてＣ２Ｃ１２ＣＭで処置したＷＴ及びＥＳＫＯ  ＭＬＥＣからのスフェロイドの芽長の定量化を示すグラフである（ｎ＝８）。データを平均±ＳＥＭとして表す。スチューデントのｔ検定（Ｅ）又はボンフェローニの多重比較検定による二元配置分散分析（Ａ及びＣ）により、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５、δｐ＜０．００００５。
【図２１Ａ】大動脈リングをタモキシフェン処置ＳＩＲＴ１−ｉＫＯマウス及びＷＴ対照マウスから調製し、一晩飢餓状態にし、次いで、Ｉ型コラーゲンマトリックスに包埋し、ＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）又はＦＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）で７日間刺激した、ＷＴマウス及びＳＩＲＴ１−ｉＫＯマウスの大動脈リング中の微小血管芽の代表的な画像である（倍率４倍）（ｎ＝１０）。固定芽をＦＩＴＣコンジュゲートＢＳ１レクチンで染色した（黒色バー＝５００μｍ）。
【図２１Ｂ】（Ａ）で調製した大動脈リングにおける、１大動脈リング当たりの芽数、及び大動脈リングに由来する芽の総面積の定量化を示すグラフである（ｎ＝１０）。
【図２１Ｃ】大動脈リングをＳＩＲＴ１−ｉＫＯマウス及びＷＴマウスから調製し、ＢＳＡ又はＶＥＧＦ（３０ｎｇ／ｍＬ）で７日間刺激した、コラーゲンマトリックスに包埋した大動脈リングにおける微小血管芽の代表的な画像である（倍率４倍）（黒色バー＝５００μｍ）。
【図２１Ｄ】（Ｃ）で調製した大動脈リングにおける、１大動脈リング当たりの芽数、及び大動脈リングに由来する芽の総面積の定量化を示すグラフである（ｎ＝１５）。データを平均±ＳＥＭとして表す。ボンフェローニの多重比較検定による一元配置分散分析により、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５、δｐ＜０．００００５。
【図２２Ａ】スクランブル（Ｓｃｒ）又はＳＩＲＴ１（Ｔ１）ｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスに感染させ、ＢＳＡ（担体）、ＶＥＧＦ（２５ｎｇ／ｍＬ）又はＦＧＦ（２５ｎｇ／ｍＬ）の存在下でマトリゲルマトリックス上での管形成について評価した、ヒト大動脈ＥＣ（ＨＡＥＣ）を使用した管形成アッセイから得られた管ネットワークの代表的な位相差顕微鏡写真（倍率１０倍）である（白色バー＝５０μｍ）。
【図２２Ｂ】（Ａ）で言及される管形成アッセイで形成された管における視野当たりの管分岐点数及び総管長を示すグラフである（ｎ＝８）。
【図２２Ｃ】トランスウェルインサート上に播種し、ＢＳＡ、ＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）又はＦＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）を用いて２４時間シミュレートした、レンチウイルス媒介Ｓｃｒ又はＴ１  ｓｈＲＮＡを発現するＨＡＥＣを使用したトランスウェル遊走アッセイにおける視野あたりの遊走ＥＣ数を示すグラフである（ｎ＝８）。
【図２２Ｄ】ノンターゲティング（ＮＴ）又はＳＩＲＴ１（Ｔ１）ｓｉＲＮＡを形質導入したＨＵＶＥＣＳにおける相対ＳＩＲＴ１及びＶＥＧＦ  ｍＲＮＡレベルを示すグラフである（ｎ＝３）。
【図２２Ｆ】６月齢のＷＴマウス及びＥＳＫＯマウスから収集した血清中のＶＥＧＦタンパク質レベルの定量化を示すグラフである（ｎ＝５）。データを平均±ＳＥＭとして表す。ボンフェローニの多重比較検定による一元配置分散分析（Ｂ）及び（Ｃ）、又はスチューデントのｔ検定（Ｅ）により、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５、δｐ＜０．００００５。
【図２３Ａ】ＥＣ特異的Ｔｉｅ２プロモーターの指示下でＣｒｅタンパク質を発現するトランスジェニックマウスとＷＴ（ＳＩＲＴ１ＳＴＯＰ）マウスを交雑させることによって、ＥＣ特異的ＳＩＲＴ１過剰発現マウス（ＥＳＴＯ）を作製する戦略を示す模式図である。ＳＩＲＴ１ＳＴＯＰマウスは、ＳＩＲＴ１が、構成的ＣＡＧＧＳプロモーター、引き続いて転写ｌｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ｌｏｘＰカセットの下流でクローニングされている導入遺伝子を発現する。
【図２３Ｂ】ＳＩＲＴ１の過剰発現を示す、内皮特異的ＳＩＲＴ１過剰発現体（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｏｒ）（ＥＳＴＯ）及びＷＴ対照マウスの四頭筋、肺組織及び胸腺組織タンパク質ホモジネート中のＳＩＲＴ１タンパク質についてのウエスタンブロットの画像である。チューブリンがローディングコントロールとして役立った。
【図２３Ｃ】筋毛細血管におけるＳＩＲＴ１とＣＤ３１の同時発現を示す、四頭筋横断面の代表的な画像である（倍率６０倍）。ＥＳＴＯマウス及びＷＴマウスの四頭筋断面をＳＩＲＴ１及びＣＤ３１抗体について免疫染色して、ＳＩＲＴ１のＥＣ特異的過剰発現を示した（白色バー＝３０μｍ）。
【図２３Ｄ】６月齢のＷＴマウス及びＥＳＴＯマウスの体重、尿クレアチニンレベル及び落下までの潜伏時間の時間を示すロータロッド成績の定量化を示すグラフである（ｎ＝７）。
【図２４Ａ】６月齢のＷＴマウス及びＥＳＴＯマウスにおける体重に正規化した腓腹筋（ＧＡ）、四頭筋（ＱＡ）及び心臓（Ｈ）の組織重量の定量化を示すグラフである（ｎ＝７）。
【図２４Ｂ】６月齢のＷＴマウス及びＥＳＴＯマウスの四頭筋の代表的なＨ＆Ｅ染色画像である。
【図２４Ｃ】６月齢のＷＴマウス及びＥＳＴＯマウスの腓腹筋におけるミオシン重鎖Ｉ、ＩＩＡ、ＩＩＢ及びＩＩＸの相対ｍＲＮＡレベルを示すグラフである（ｎ＝１０）。
【図２４Ｄ】６月齢のＷＴマウス及びＥＳＴＯマウスの四頭筋組織ホモジネート中のミトコンドリアタンパク質複合体ＩＩ、ＩＶ及びＶについてのウエスタンブロットの画像（１４−３−３をローディングコントロールとして使用した）である。複合体ＩＩ、ＩＶ及びＶの相対定量化を示すグラフを右側に示す（ｎ＝４）。
【図２４Ｅ】６月齢のＷＴマウス及びＥＳＴＯマウスの空腹時血糖値の定量化を示すグラフである（ｎ＝７）。
【図２５Ａ】６月齢のＷＴマウス及びＥＳＴＯマウスの四頭筋断面における毛細血管（ＣＤ３１）及び間質（ラミニン、挿入図）の代表的な画像である（倍率２０倍）（白色バー＝２００μｍ）。
【図２５Ｂ】ＷＴマウス及びＥＳＴＯマウスの四頭筋組織におけるＨＰＦ当たりの毛細血管数及びＨＰＦ当たりの毛細血管数／筋線維数の比の定量化を示すグラフである（ｎ＝８）。
【図２５Ｃ】６月齢のＷＴマウス及びＥＳＴＯマウスの腓腹筋横断面における毛細血管（ＣＤ３１）及び筋肉間質（ラミニン、挿入図）の代表的な画像である（倍率２０倍）（白色バー＝１００μｍ）。
【図２５Ｄ】ＷＴマウス及びＥＳＴＯマウスの腓腹筋組織におけるＨＰＦ当たりの毛細血管数、及びＨＰＦ当たりの毛細血管数／筋線維数の比の定量化を示すグラフである（ｎ＝８）。データを平均±ＳＥＭとして表す。スチューデントのｔ検定により＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５。
【図２６Ａ】高強度トレッドミル運動試験における、６月齢のＷＴマウス及びＥＳＴＯマウスによる、消耗までの走行時間、及び消耗までの走行距離を示すグラフである（ｎ＝８）。
【図２６Ｂ】６月齢のＷＴマウス及びＥＳＴＯマウスにおける運動後血中乳酸レベルを示すグラフである（ｎ＝５）。データを平均±ＳＥＭとして表す。スチューデントのｔ検定により＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５。
【図２７Ａ】トランスウェル遊走アッセイにおける、視野当たりの、ＷＴマウス及びＥＳＴＯマウス＋／−Ｃ２Ｃ１２ＣＭから単離した遊走ＭＬＥＣの数を示すグラフである（ｎ＝１０）。
【図２７Ｂ】マトリゲルマトリックス＋／−Ｃ２Ｃ１２ＣＭ上にＷＴ及びＥＳＴＯ  ＭＬＥＣによって形成された管ネットワークの代表的な位相差顕微鏡写真である（倍率１０倍）（白色バー＝５０μｍ）。
【図２７Ｃ】視野当たりの、（Ｂ）で言及される、マトリゲルマトリックス＋／−Ｃ２Ｃ１２ＣＭ上にＷＴ及びＥＳＴＯ  ＭＬＥＣによって形成された管ネットワークにおける管分岐点数及び総管長の定量化を示すグラフである（ｎ＝８）。データを平均±ＳＥＭとして表す。ボンフェローニの多重比較検定による二元配置分散分析により、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５、δｐ＜０．００００５。
【図２８Ａ】Ｃ２Ｃ１２ＣＭで処置したＷＴ及びＥＳＴＯ  ＭＬＥＣからのスフェロイドの代表的な位相差顕微鏡写真である（倍率１０倍）。
【図２８Ｂ】Ｃ２Ｃ１２ＣＭで処置したＷＴ及びＥＳＴＯ  ＭＬＥＣからの芽長を示すグラフである（ｎ＝８〜９）。データを平均±ＳＥＭとして表す。スチューデントのｔ検定により＊＊＊ｐ＜０．０００５。
【図２９Ａ】ＧＦＰ又はＳＩＲＴ１を発現するアデノウイルス（ａ．ａ．１９４〜７４７）に感染したＨＵＶＥＣにおけるＳＩＲＴ１のタンパク質レベルを示すウエスタンブロットの画像である。過剰発現ＳＩＲＴ１は、アデノ−ＳＩＲＴ１感染細胞において内因性ＳＩＲＴ１よりわずかに下を泳動する。１４−３−３をローディングコントロールとして使用した。
【図２９Ｂ】ＡｄＧＦＰ又はＡｄＳＩＲＴ１に感染し、ＢＳＡ又はＶＥＧＦ（３０ｎｇ／ｍＬ）で処置したＨＵＶＥＣによって形成された管ネットワークの位相差顕微鏡写真の代表的な画像である（倍率１０倍）。
【図２９Ｃ】ＧＦＰを発現するアデノウイルス（ＡｄＧＦＰ）又はＳＩＲＴ１を発現するアデノウイルス（ＡｄＳＩＲＴ１）を感染させ、管ネットワーク＋／−ＶＥＧＦ（３０ｎｇ／ｍＬ）について評価した、ヒト臍静脈ＥＣ（ＨＵＶＥＣ）における、視野当たりの分岐点数及び総管長を示すグラフである（ｎ＝８〜９）。データを平均±ＳＥＭとして表す。ボンフェローニの多重比較検定による二元配置分散分析により、＊ｐ＜０．０５。
【図３０Ａ】ＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）で刺激したＡｄ−ＧＦＰ又はＡｄ−ＳＩＲＴ１形質導入ＨＵＶＥＣから形成されたスフェロイドの代表的な位相差顕微鏡写真である（倍率１０倍）。
【図３０Ｂ】（Ａ）で言及されるＡｄ−ＧＦＰ又はＡｄ−ＳＩＲＴ１＋／−ＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）に感染したＨＡＥＣからのスフェロイドの芽長を示すグラフである（ｎ＝８）。データを平均±ＳＥＭとして表す。ボンフェローニの多重比較検定による二元配置分散分析により、＊ｐ＜０．０５、δｐ＜０．００００５。
【図３１Ａ】ＷＴマウス及び全身過剰発現ＳＩＲＴ１トランスジェニック（ＳＩＲＴ１−Ｔｇ）マウスの肺組織ホモジネート中のＳＩＲＴ１タンパク質レベルを示すウエスタンブロットの画像である。１４−３−３をローディングコントロールとして使用した。
【図３１Ｂ】全身ＳＩＲＴ１トランスジェニック（ＳＩＲＴ１−Ｔｇ）マウス及びＷＴマウスから調製され、大動脈リングアッセイでＢＳＡ又はＶＥＧＦ（３０ｎｇ／ｍＬ）で処置した大動脈輪における微小血管芽の代表的な画像（倍率４倍）である。対照条件は最小成長因子（２．５％ＦＢＳ）であり、低因子刺激のためにほとんど発芽しなかった（黒色バー＝５００μｍ）。
【図３１Ｃ】（Ｂ）で言及される大動脈リングアッセイにおける、１リング当たりの芽数及び大動脈リングに由来する芽の総面積を示すグラフである（ｎ＝１５）。データを平均±ＳＥＭとして表す。ボンフェローニの多重比較検定による二元配置分散分析により、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５、δｐ＜０．００００５。
【図３１Ｄ】６月齢のＷＴマウス及びＥＳＴＯマウスから収集した血清中のＶＥＧＦタンパク質レベルの定量化を示すグラフである（ｎ＝５）。データを平均±ＳＥＭとして表す。スチューデントのｔ検定（Ｄ）及びボンフェローニの多重比較検定による二元配置分散分析（Ｃ）により、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５。
【図３２Ａ】ＶＥＧＦ（３０ｎｇ／ｍＬ）及びＮＭＮの存在下又は非存在下でヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）によって形成された管ネットワークの代表的な明視野画像である（倍率１０倍）。
【図３２Ｂ】（Ａ）で形成された管ネットワークからの視野当たりの管分岐点及び総管長の定量化を示すグラフである（ｎ＝１２）。
【図３２Ｃ】ＰＢＳ又は様々な用量のＮＭＮ（１０μＭ、１００μＭ若しくは５００μＭ）で処置したＨＡＥＣによって形成された管ネットワークにおける視野当たりの管分岐点及び総管長の定量化を示すグラフである（ｎ＝３、ＰＢＳに対して＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．０００５及び＃ｐ＜０．００００５）。
【図３２Ｄ】図４ＢのＨＵＶＥＣを完全増殖培地中で４８時間ＰＢＳ又はＮＭＮ（５００μＭ）と共にインキュベートした後の細胞数を示すグラフである。フローサイトメトリーを使用して細胞数を決定した。
【図３２Ｅ】ビヒクル（ＰＢＳ）又はＮＭＮ（５００μＭ）の存在下でＨＵＶＥＣをＶＥＧＦ媒介トランスウェル遊走アッセイに供した後の結果を示すグラフである。高倍率視野当たりの移動した細胞数を定量した（ｎ＝１２）。
【図３３Ａ】トランスウェル遊走アッセイにおける、視野当たりの、ＷＴマウス及びＥＳＫＯマウス＋／−Ｃ２Ｃ１２ＣＭ及び＋／−ＮＭＮ（０．５ｍＭ）から単離した遊走ＭＬＥＣの数を示すグラフである（ｎ＝１２）。
【図３３Ｂ】Ｃ２Ｃ１２ＣＭ及び＋／−ＮＭＮ（０．５ｍＭ）で刺激したＷＴ及びＥＳＫＯからのスフェロイドの芽長を示すグラフである（ｎ＝８）。
【図３３Ｃ】ノンターゲティング（ＮＴ）又はＳＩＲＴ１（Ｔ１）ｓｉＲＮＡを形質導入し、ＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）及び＋／−ＮＭＮ（０．５ｍＭ）で刺激したＨＡＥＣからのスフェロイドの芽長を示すグラフである（ｎ＝８）。
【図３３Ｄ】ＮＴ又はＴ１  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、ＶＧＥＦ（３０ｎｇ／ｍＬ）媒介管形成＋／−ＮＭＮ（０．５ｍＭ）に供したＨＡＥＣを使用した管形成アッセイにおける、視野当たりの分岐点数及び総管長を示すグラフである（ｎ＝１３）。データを平均±ＳＥＭとして表す。ボンフェローニの多重比較検定による二元配置分散分析により、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５、δｐ＜０．００００５。
【図３４Ａ】ＶＥＧＦ（３０ｎｇ／ｍＬ）＋／−ＮＭＮ（０．５ｍＭ）で７日間刺激したＷＴマウス及びＳＩＲＴ１−ｉＫＯマウスから調製した大動脈リングの微小血管芽の代表的な画像である（倍率４倍）（黒色バー＝５００μｍ）。
【図３４Ｂ】（Ａ）で言及されるように＋／−ＮＭＮ（０．５ｍＭ）で７日間ＶＥＧＦ（３０ｎｇ／ｍＬ）媒介発芽に供したＷＴマウス及びＳＩＲＴ１−ｉＫＯマウス（１８月齢）から調製した大動脈リングに由来する、１リング当たりの芽数及び芽の総面積を示すグラフである（ｎ＝１５）。
【図３４Ｃ】１８月齢の野生型マウスから調製し、７日間ＶＥＧＦ（３０ｎｇ／ｍＬ）で処置した又は処置しなかった大動脈リングに由来する芽の数及び総面積の定量化を示すグラフである（ｎ＝１５）。
【図３４Ｄ】Ｓｃｒ又はＳＩＲＴ１  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、次いで、ＰＢＳ又はＮＭＮ（５００μＭ）によるＶＧＥＦ媒介管形成に供したＨＡＥＣを示すグラフである。得られた管ネットワークの視野当たりの管分岐点及び総管長の定量化を示す（ｎ＝１２）。データを平均±ＳＥＭとして表す。ボンフェローニの多重比較検定による二元配置分散分析により、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５、δｐ＜０．００００５。
【図３５Ａ】ＮＴ、ＳＩＲＴ３（Ｔ３）又はＳＩＲＴ６（Ｔ６）ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＨＡＥＣにおけるＳＩＲＴ３及びＳＩＲＴ６タンパク質レベルを示すウエスタンブロットの画像である。チューブリンをローディングコントロールとして使用した。
【図３５Ｂ】ＶＥＧＦ（３０ｎｇ／ｍＬ）＋／−ＮＭＮ下で、ＮＴ、Ｔ３又はＴ６  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＨＡＥＣによって形成された、得られた管ネットワークの視野当たりの管分岐点数及び総管長の定量化のグラフである（倍率１０倍）（ｎ＝１０〜１２）。
【図３５Ｃ】ＮＴ、Ｔ３又はＴ６  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、ＶＥＧＦ＋／−ＮＭＮ（０．５ｍＭ）で刺激したＨＡＥＣからのスフェロイドの芽長の定量化を示すグラフである（ｎ＝８）。データを平均±ＳＥＭとして表す。ボンフェローニの多重比較検定による一元配置分散分析により、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５、δｐ＜０．００００５。
【図３６Ａ】ｑＰＣＲによって定量化される、ＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）＋／−ＮＭＮ（０．５ｍＭ）で刺激したＨＡＥＣからのＮｏｔｃｈ標的遺伝子ＨＥＹ１、ＨＥＳ１及びＮＲＡＲＰ並びにＮＯＴＣＨ１の相対ｍＲＮＡレベルを示すグラフである（ｎ＝４）。
【図３６Ｂ】Ｄｌｌ４刺激ＨＡＥＣにおけるＮｏｔｃｈ標的遺伝子（ＨＥＹ２及びＮＲＡＲＰ）の相対ｍＲＮＡレベルを示すグラフである（ｎ＝３）。データを平均±ＳＥＭとして表す。ボンフェローニの多重比較検定による二元配置分散分析により、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５、δｐ＜０．００００５。
【図３７Ａ】ＶＥＧＦ刺激ＨＡＥＣ＋／−ＮＭＮ（０．５ｍＭ）におけるｎｏｔｃｈ細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）タンパク質レベルを示すウエスタンブロットの画像、及び右側の相対ＮＩＣＤレベルを示すグラフである（ｎ＝３）。
【図３７Ｂ】Ｄｌｌ４刺激ＨＡＥＣ＋／−ＮＭＮ（０．５ｍＭ）におけるＮＩＣＤタンパク質レベルを示すウエスタンブロットの画像、及び右側の相対ＮＩＣＤレベルを示すグラフである（ｎ＝３）。
【図３７Ｃ】ＮＴ又はＴ１  ｓｉＲＮＡを形質導入し、ＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）＋／−ＮＭＮ（０．５ｍＭ）、＋／−ＤＡＰＴ（２０μＭ）及び＋／−ＳＵ５４１６（１０μＭ）で刺激したＨＡＥＣからのスフェロイドの芽長を示すグラフである（ｎ＝８）。ＤＡＰＴ（Ｎ−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェンアセチル）−Ｌ−アラニル］−Ｓ−フェニルグリシンｔ−ブチルエステル）：γ−セクレターゼ阻害剤、ＳＵ５４１６：ＶＥＧＦＲ２阻害剤。
【図３７Ｄ】＋／−ＮＭＮ（０．５ｍＭ）及び＋／−ＤＡＰＴ（２０μＭ）で７日間ＶＥＧＦ（３０ｎｇ／ｍＬ）媒介発芽に供したＷＴマウス及びＳＩＲＴ１−ｉＫＯマウス（１８月齢）から調製した大動脈リングに由来する、芽数を示すグラフである（ｎ＝１３〜１５）。データを平均±ＳＥＭとして表す。スチューデントのｔ検定（Ａ）、ボンフェローニの多重比較検定による一元配置（Ｃ及びＤ）分散分析により、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５、δｐ＜０．００００５。
【図３８Ａ】ＰＢＳ又はＮＭＮ（０．５ｍＭ）と共に４８時間完全増殖培地中でインキュベートしたＨＵＶＥＣの相対細胞数の定量化を示すグラフである（ｎ＝１２）。細胞数はフローサイトメトリーを使用して決定した。
【図３８Ｂ】ＷＴマウス及びＥＳＫＯマウスからのＭＬＥＣを一晩血清飢餓状態にし、次いで、アネキシンＶ／ＰＩ染色によってアポトーシスについて評価し、フローサイトメトリーを使用して分析した場合の、アポトーシス細胞数（アネキシンＶ＋／ＰＩ−）を示すグラフである（ｎ＝１２）。データを平均±ＳＥＭとして表す。スチューデントのｔ検定（Ａ）又はボンフェローニの多重比較検定による二元配置分散分析（Ｂ）により、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５、δｐ＜０．００００５。
【図３８Ｃ】ＳＩＲＴ１がどのようにして発芽血管新生を促進するかのモデルの概略図である。発芽血管新生中のＶＥＧＦ刺激は、端細胞におけるＤｌｌ４リガンドの発現を上方制御し、今度はこれが柄細胞におけるＮｏｔｃｈシグナル伝達を活性化する。この相互作用が、γ−セクレターゼ複合体によるＮｏｔｃｈ受容体のタンパク質分解的切断を誘因して、細胞膜からＮＩＣＤを放出させる。ＮＩＣＤは核に移行し、転写遺伝子活性化を誘導する。ＮＭＮによるＳＩＲＴ１の活性化は、ＶＥＧＦ刺激ＥＣにおける遊走、増殖及び生存を促進する。柄細胞では、ＮＭＮがＶＥＧＦ／Ｄｌｌ４刺激中にＮＩＣＤレベルを低下させ、Ｎｏｔｃｈ標的遺伝子活性化を抑制し、それによって発芽を促進する。
【図３９Ａ】ＰＢＳ又はＮＭＮ（５００μＭ）で６時間前処置し、引き続いてさらに４時間Ｈ２Ｏ２（６００μＭ）に曝露したＨＵＶＥＣにおけるアネキシンＶ染色％を示すグラフである。アネキシンＶ染色をフローサイトメトリーによって検出した（ｎ＝１２）。
【図３９Ｂ】Ｈ２Ｏ２（１５０μＭ）に１時間曝露し、次いで、ＰＢＳ又はＮＭＮ（５００μＭ）を用いたＶＥＧＦ誘導管形成に１０時間供した、Ｓｃｒ又はＳＩＲＴ１  ｓｉＲＮＡトランスフェクトＨＵＶＥＣから形成された管ネットワークの代表的な明視野画像である（倍率４倍）（白色バー＝５００μｍ）。
【図３９Ｃ】Ｈ２Ｏ２（１５０μＭ）に１時間曝露し、次いで、ＰＢＳ又はＮＭＮ（５００μＭ）を用いたＶＥＧＦ誘導管形成に１０時間供した、Ｓｃｒ又はＳＩＲＴ１  ｓｉＲＮＡトランスフェクトＨＵＶＥＣからの視野当たりの管分岐点及び総管長の定量化を示すグラフである（ｎ＝１２）。データを平均値±標準偏差として表す。一元配置分散分析検定により、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．００５及び＃ｐ＜０．００００５。
【図４０Ａ】総タンパク質含量に正規化した、６、１５（腓腹筋の場合）及び２０月齢のマウスから単離したＭＬＥＣ（ｎ＝６）及び腓腹筋（ｎ＝１０）におけるＮＡＤ＋レベルを示すグラフである。
【図４０Ｂ】総タンパク質含量に正規化した、ビヒクル処置マウス及びＮＭＮ処置マウス（１８月齢）の肝臓及び腓腹筋組織におけるＮＡＤ＋レベルを示すグラフである（ｎ＝１２〜１４）。データを平均±標準偏差として表す。スチューデントのｔ検定により＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．００５及び＃ｐ＜０．００００５。
【図４１Ａ】２０月齢のビヒクル処置マウス及びＮＭＮ処置マウスの食物摂取量、水消費量、体重、除脂肪量、体脂肪量、空腹時血糖値、ロータロッド成績及び握力の定量化を示すグラフである（ｎ＝１０）。
【図４１Ｂ】心エコー法（Ｖｅｖｏ  ２１００）を使用して測定した２０月齢のビヒクル処置マウス及びＮＭＮ処置マウスの心機能を示すグラフである。収縮期血圧及び拡張期血圧、並びに駆出率の定量化を示す（ｎ＝１０）。
【図４２Ａ】２０月齢のビヒクル処置マウス及びＮＭＮ（４００ｍｇ／ｋｇ／日）処置マウスの四頭筋断面における毛細血管（ＣＤ３１）及び間質（ラミニン、挿入図）の代表的な画像である（倍率２０倍）（白色バー＝２００μｍ）。
【図４２Ｂ】２０月齢のビヒクル処置マウス及びＮＭＮ（４００ｍｇ／ｋｇ／日）処置マウスの四頭筋断面における、ＨＰＦ当たりの毛細血管数、及びＨＰＦ当たりの毛細血管数／筋線維数の比を示すグラフである（ｎ＝８）。
【図４２Ｃ】２０月齢のビヒクル処置マウス及びＮＭＮ（４００ｍｇ／ｋｇ／日）処置マウスの腓腹筋断面における、毛細血管（ＣＤ３１）及び筋肉間質（ラミニン、挿入図）の代表的な画像である（倍率２０倍）（白色バー＝２００μｍ）。
【図４２Ｄ】２０月齢のビヒクル処置マウス及びＮＭＮ（４００ｍｇ／ｋｇ／日）処置マウスの腓腹筋断面における、ＨＰＦ当たりの毛細血管数、及びＨＰＦ当たりの毛細血管数／筋線維数の比を示すグラフである（ｎ＝８）。データを平均±標準偏差として表す。スチューデントのｔ検定により＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５。
【図４３Ａ】造影超音波を使用して測定したピーク増強（ＰＥ）を示すグラフである。
【図４３Ｂ】ビヒクル処置マウス及びＮＭＮ処置マウス（２０月齢）の後肢における後肢可溶性酸素（ｓＯ２）レベルを示すグラフである（ｎ＝１３）。
【図４３Ｃ】造影超音波（ＣＥＵ）イメージングを使用して測定した、ＮＭＮで処置した又は処置していない２０月齢マウスの後肢骨格筋灌流の代表的な造影モード及びピーク増強モード超音波像の画像である。
【図４３Ｄ】平均ピーク増強（ＰＥ）、最大−最小ビデオ強度、後肢における相対血液量の指標を示すグラフを示すグラフである（ｎ＝５）。データを平均±標準偏差として表す。スチューデントのｔ検定により、＊ｐ＜０．０５。
【図４４Ａ】２０月齢のビヒクル処置マウス及びＮＭＮ処置マウスの四頭筋組織ホモジネートにおけるＳＩＲＴ１並びにミトコンドリアタンパク質複合体ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ及びＶについてのウエスタンブロットの画像である（１４−３−３をローディングコントロールとして使用した）。右側に、複合体ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ及びＶの相対的定量化のグラフを示す（ｎ＝４）。
【図４４Ｂ】２０月齢のビヒクル処置マウス及びＮＭＮ処置マウスの四頭筋の代表的なＣＯＸ染色像、及び右側に、設定閾値を超えるＣＯＸ陽性線維の数の定量化を示すグラフである（ｎ＝４）。
【図４４Ｃ】２０月齢のビヒクル処置マウス及びＮＭＮ処置マウスの四頭筋組織ホモジネートにおけるクエン酸シンターゼ及びコハク酸デヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ）活性を決定することによって評価されるミトコンドリア能力を示すグラフである（ｎ＝１０）。
【図４５Ａ】２０月齢のビヒクル処置マウス及びＮＭＮ処置マウスのヒラメ筋及びＥＤＬ透過性筋線維におけるミトコンドリア複合体Ｉ、ＩＩ及びＩＶによって媒介される酸素消費速度の相対的定量化をＣｌａｒｋ電極系を使用して測定したことを示すグラフである（ｎ＝１０）。
【図４５Ｂ】２０月齢のビヒクル処置マウス及びＮＭＮ処置マウスにおける腓腹筋（ＧＡ）、四頭筋（ＱＡ）及び心臓（Ｈ）組織重量の定量化を示すグラフである（ｎ＝１３）。
【図４５Ｃ】２０月齢のビヒクル処置マウス及びＮＭＮ処置マウスの四頭筋の代表的なＨ＆Ｅ染色画像である。
【図４５Ｄ】２０月齢のビヒクル処置マウス及びＮＭＮ処置マウスの腓腹筋におけるミオシン重鎖Ｉ、ＩＩＡ、ＩＩＢ及びＩＩＸの相対ｍＲＮＡレベルを示すグラフである（ｎ＝１３）。
【図４５Ｅ】Ｏｘｙｍａｘ−ＣＬＡＭＳシステムを使用して測定した２０月齢のビヒクル処置マウス及びＮＭＮ処置マウスの自発運動活性（Ｘ軸にＸａｍｂ−連続ビーム中断）及び酸素消費速度（ＶＯ２）を示すグラフである。Ｘａｍｂ及びＶＯ２の定量化を提示する（ｎ＝６）。データを平均±標準偏差として表す。スチューデントのｔ検定によるｐ。
【図４６Ａ】低強度トレッドミル運動試験における、２０月齢のビヒクル処置マウス及びＮＭＮ処置マウスによる、消耗までの走行時間、及び消耗までの走行距離を示すグラフである（ｎ＝１３）。
【図４６Ｂ】高強度トレッドミル運動試験における、２０月齢のビヒクル処置マウス及びＮＭＮ処置マウスによる、消耗までの走行時間、及び消耗までの走行距離を示すグラフである（ｎ＝１３）。
【図４６Ｃ】２０月齢のビヒクル処置マウス及びＮＭＮ処置マウスにおける運動後血中乳酸レベルを示すグラフである（ｎ＝１３）。データを平均±標準偏差として表す。スチューデントのｔ検定により＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５。
【図４７Ａ】免疫染色によって決定される、２ヶ月間の標準固形飼料＋／−ＮＭＮ（４００ｍｇ／ｋｇ）でのタモキシフェン投与ＳＩＲＴ１−ｉＫＯマウス及びＷＴマウス（２０月齢）の腓腹筋断面におけるＨＰＦ当たりの毛細血管数／筋線維数の比の定量化を示すグラフである（倍率２０倍）（ｎ＝５）。ＮＭＮ処置はＷＴマウスで毛細血管を増加させたが、ＳＩＲＴ１−ｉＫＯマウスでは増加させなかった。
【図４７Ｂ】２０日後に、腓腹筋断面におけるＣＥＵイメージング及び免疫染色によって決定される、後肢虚血＋／−ＮＭＮ（５００ｍｇ／ｋｇ／日）に供したタモキシフェン投与ＳＩＲＴ１−ｉＫＯマウス及びＷＴマウス（８月齢）の虚血腓腹筋断面（ｎ＝５）における虚血肢についてのＰＥ値及びＨＰＦ当たりの毛細血管数／筋線維数の比の定量化を示すグラフである（倍率２０倍）（ｎ＝５）。
【図４７Ｃ】後肢虚血を誘発した２０日後に測定した、ビヒクル処置マウス及びＮＭＮ処置マウスの虚血後肢の代表的なピーク増強モード超音波画像である。データを平均±ＳＥＭとして表す。ボンフェローニの多重比較検定による二元配置分散分析により、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５。
【図４８】１０月齢のビヒクル処置及びＮＭＮ処置した座ったままの又は運動したマウスの四頭筋断面における毛細血管密度を示すグラフである（ｎ＝５）。ＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（１０月齢）マウスを、座ったままに保った又は＋／−ＮＭＮ（４００ｍｇ／ｋｇ／日）で４週間のトレッドミル運動訓練（５°傾斜で、１５ｍ／分で３０分間）で訓練した。四頭筋の毛細血管及び間質をＣＤ３１及びラミニン抗体で免疫染色し、ＨＰＦ当たりの毛細血管／筋線維の比を決定した（ｎ＝５）。データを平均±ＳＥＭとして表す。ボンフェローニの多重比較検定による二元配置分散分析により、δｐ＜０．００００５、＊＊ｐ＜０．００５。
【図４９Ａ】座ったままに保った又は＋／−ＮＭＮ（４００ｍｇ／ｋｇ／日）及び＋／−アキシチニブ（３０ｍｇ／ｋｇ／日）で４週間のトレッドミル運動訓練で訓練したＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（５月齢）の四頭筋組織ホモジネートにおけるＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１、リン酸化ＶＥＧＦＲ１及びＳＩＲＴ１についてのウエスタンブロットの画像である。１４−３−３をローディングコントロールとして使用した。
【図４９Ｂ】（Ａ）で言及される上記マウスから収集した血清中のＶＥＧＦタンパク質レベルの定量化を示すグラフである（ｎ＝５）。
【図４９Ｃ】座ったままに保った又は＋／−ＮＭＮ（４００ｍｇ／ｋｇ／日）及び＋／−アキシチニブ（３０ｍｇ／ｋｇ／日）で４週間のトレッドミル運動訓練で訓練した図６（Ｊ）ＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（５月齢）の四頭筋におけるＨＰＦ当たりの毛細血管数／筋線維数の比を示すグラフである（ｎ＝５）。訓練の最後に、運動したマウスを、高強度トレッドミル試験で消耗持久力について評価した。消耗までの平均走行距離を右側に示す（ｎ＝５）。データを平均±ＳＥＭとして表す。ボンフェローニの多重比較検定による一元配置分散分析により、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５、δｐ＜０．００００５。
【図５０】座ったままに保った又は＋／−ＮＭＮ及び＋／−アキシチニブで運動訓練したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（５月齢）の四頭筋断面（倍率２０倍）における毛細血管（ＣＤ３１）及び筋肉間質（ラミニン、挿入図）の代表的な画像である（白色バー＝２００μｍ）。
【図５１Ａ】ＮａＨＳ（０．１ｍＭ）及び／又はＮＭＮ（０．５ｍＭ）で処置したＨＵＶＥＣにおけるＳＩＲＴ１タンパク質レベルを示す（左）、並びにＮａＨＳ（０．１ｍＭ）及び／又はＮＭＮ（０．５ｍＭ）で処置したＨＵＶＥＣにおける相対ＳＩＲＴ１タンパク質レベルを示す（右）ウエスタンブロットを示す図である（ｎ＝４）。
【図５１Ｂ】漸増用量のＮａＨＳで２４時間処置したＨＵＶＥＣにおける相対ＮＡＤ＋レベルを示すグラフである（ｎ＝６）。データを平均±ＳＥＭとして表す。ボンフェローニの多重比較検定による一元配置分散分析により、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５、δｐ＜０．００００５。
【図５２Ａ】Ｈ２Ｏ２（１５０μＭ）で１時間処置し、次いで、ビヒクル、ＮａＨＳ（１００μＭ）、ＮＭＮ（５００μＭ）又はＮａＨＳ＋ＮＭＮの組み合わせによるＶＥＧＦ媒介管形成に１０時間供したＳｃｒ又はＳＩＲＴ１  ｓｉＲＮＡ形質導入ＨＵＶＥＣを示すグラフである。視野当たりの管分岐点及び総管長の定量化を示す（ｎ＝１２）。
【図５２Ｂ】６時間、ビヒクル、ＮａＨＳ（１００μＭ）及び／又はＮＭＮ（５００μＭ）を用いて、Ｓｃｒ又はＳＩＲＴ１  ｓｉＲＮＡ形質導入ＨＵＶＥＣのコンフルエントな単層をＨ２Ｏ２（１５０μＭ）に１時間曝露し、引っ掻き傷を作り、細胞を遊走させた場合の細胞遊走を示すグラフである。バーは閉鎖間隙の割合を表す（ｎ＝６）。
【図５２Ｃ】ＸＦ９６  ｓｅａｈｏｒｓｅ分析器（ｎ＝６）を使用して測定される、ビヒクル、ＮａＨＳ（１００μＭ）、ＮＭＮ（５００μＭ）又はＮＭＮ＋ＮａＨＳの組み合わせで処置したＨＵＶＥＣの基底酸素消費量（ＯＣＲ）を示すグラフである。複合体Ｖを阻害し、ＡＴＰ合成を遮断しながら、オリゴマイシン（１μＭ）を添加してＯＣＲを測定した。
【図５３Ａ】ＷＴマウス及びＥＳＫＯマウスから単離したＭＬＥＣをＣ２Ｃ１２ＣＭ、＋／−ＮａＨＳ（０．１ｍＭ）及び＋／−ＮＭＮ（０．５ｍＭ）で１２時間刺激したトランスウェル遊走アッセイにおける視野当たりの遊走細胞数を示すグラフである（ｎ＝１５）。
【図５３Ｂ】ＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）、＋／ＮａＨＳ（０．１ｍＭ）及び＋／−ＮＭＮ（０．５ｍＭ）で刺激したＨＵＶＥＣからのスフェロイドの芽長の定量化を示すグラフである（ｎ＝７）。
【図５３Ｃ】ＨＵＶＥＣにＮＴ又はＴ１  ｓｉＲＮＡを形質導入し、コンフルエントな単層に増殖させ、２００μＬピペットチップを使用して引っ掻き傷を作ったスクラッチアッセイにおける面積閉鎖率を示すグラフである。ＥＣを＋／−ＮａＨＳ（０．１ｍＭ）及び＋／−ＮＭＮ（０．５ｍＭ）で６時間遊走させた。バーは閉鎖間隙の割合を表す（ｎ＝６）。データを平均±ＳＥＭとして表す。ボンフェローニの多重比較検定による一元（Ｂ及びＣ）又は二元（Ａ）配置分散分析により、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５、δｐ＜０．００００５。
【図５４】３２月齢のビヒクル、ＮａＨＳ、ＮＭＮ及びＮＭＮ＋ＮａＨＳ処置マウスの食物摂取量、水消費量、体重、除脂肪量及び体脂肪量の定量化を示すグラフである（ｎ＝７）。
【図５５Ａ】＋／−ＮａＨＳ（２０ｍｇ／ｋｇ／日）及び＋／−ＮＭＮ（４００ｍｇ／ｋｇ／日）で４週間処置した３２月齢マウスの四頭筋断面における毛細血管（ＣＤ３１）及び筋肉（ラミニン、挿入図）の代表的な画像である（倍率２０倍）（白色バー＝１００μｍ）。
【図５５Ｂ】（Ａ）で言及される四頭筋における、ＨＰＦ当たりの毛細血管数、及びＨＰＦ当たりの毛細血管数／筋線維数の比を示すグラフである（ｎ＝７）。データを平均±ＳＥＭとして表す。ボンフェローニの多重比較検定による一元配置分散分析により、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５、δｐ＜０．００００５。
【図５６Ａ】ＴＵＮＥＬ及びＣＤ３１免疫染色によって分析した＋／−ＮａＨＳ及び＋／−ＮＭＮで処置した３２ヶ月齢のマウスの四頭筋断面における毛細血管のアポトーシス割合を示すグラフである（ｎ＝５）。
【図５６Ｂ】ビヒクル、ＮａＨＳ（０．１ｍＭ）及び／又はＮＭＮ（０．５ｍＭ）で６時間前前処置し、引き続いてさらに４時間Ｈ２Ｏ２（６００μＭ）に曝露したＨＵＶＥＣ中のアポトーシス細胞（アネキシンＶ＋／ＰＩ−）％を示すグラフである。アポトーシス細胞をアネキシンＶ及びＰＩ染色によって検出し、フローサイトメトリーを使用して分析した（ｎ＝１２）。データを平均±ＳＥＭとして表す。ボンフェローニの多重比較検定による一元配置分散分析により、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５、δｐ＜０．００００５。
【図５７Ａ】低強度トレッドミル運動試験における、３１月齢のビヒクル、ＮａＨＳ、ＮＭＮ及びＮＭＮ＋ＮａＨＳ処置マウスによる、消耗までの消費された時間を示すグラフである（ｎ＝７、ビヒクルに対して＊ｐ＜０．０５及び＃ｐ＜０．００００５）。
【図５７Ｂ】低強度トレッドミル運動試験における、３１月齢のビヒクル、ＮａＨＳ、ＮＭＮ及びＮＭＮ＋ＮａＨＳ処置マウスによる、消耗までの走行距離を示すグラフである（ｎ＝７、ビヒクルに対して＊ｐ＜０．０５及び＃ｐ＜０．００００５）。データを平均±ＳＥＭとして表す。ボンフェローニの多重比較検定による一元配置分散分析により、＊ｐ＜０．０５。
【図５８Ａ】ＥＧＦＰ導入遺伝子及びＳＩＲＴ１  ｍｉＲＮＡが、ＥＣのみを標的とするＶＥ−カドヘリンプロモーターから発現される、ＦＵＷ骨格に基づくレンチウイルス構築物の概略図である。
【図５８Ｂ】ＶＥ−カドヘリンプロモーターの制御下で、ノンターゲティング（ＮＴ）又はＳＩＲＴ１  ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ番号１〜５）を発現するレンチウイルスを形質導入したＷＴ  ＭＬＥＣにおけるＳＩＲＴ１及びＮＩＣＤタンパク質レベルのウエスタンブロット（左）である。形質導入したＭＬＥＣの相対ＳＩＲＴ１タンパク質レベルのグラフを右側に示す（ｎ＝３）。ＳＩＲＴ１  ｍｉＲＮＡ番号５を発現するレンチウイルスの形質導入は、ＳＩＲＴ１の８０％のノックダウンをもたらし、それに伴いＭＬＥＣにおけるＮＩＣＤタンパク質レベルが上昇した。データを平均±ＳＥＭとして表す。スチューデントのｔ検定により＊＊ｐ＜０．００５。
【図５９Ａ】レンチウイルス送達の分布及びＥＣ特異性を示す代表的な画像である（倍率４０倍）。ＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（２０月齢）に、後眼窩注射を介してＶＥカドヘリンプロモーターの制御下でＥＧＦＰ及びＮＴ  ｍｉＲＮＡを形質導入したレンチウイルス粒子を投与した。１０日後、腓腹筋断面をＥＧＦＰ及びＣＤ３１について免疫染色した（白色バー＝３０μｍ）。
【図５９Ｂ】ＮＴ又はＳＩＲＴ１番号５  ｍｉＲＮＡ  ＮＴ又はｍｉＲＮＡ  ５を形質導入したレンチウイルス粒子を投与し、＋／−ＮａＨＳ（２０ｍｇ／ｋｇ／日）、＋／ＧＹＹ４１３７（２０ｍｇ／ｋｇ／日）及び＋／−ＮＭＮ（４００ｍｇ）で４週間処置し、引き続いてＣＤ３１（毛細血管）及びラミニン（筋肉間質）について免疫染色することによって筋毛細血管を分析したＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（２０月齢）における、ＨＰＦ当たりの腓腹筋断面における毛細血管数／筋線維数の比を示すグラフである（倍率４０倍）（ｎ＝６）。データを平均±ＳＥＭとして表す。ボンフェローニの多重比較検定による二元配置分散分析により、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５、δｐ＜０．００００５。
【発明を実施するための形態】
【００８５】
本開示は、対象の組織内の血管密度及び／又は血流を増加させる方法に関する。本方法は、有効量の対象の組織の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤を対象に投与するステップを含む。
【００８６】
サーチュイン１（ＳＩＲＴ１）は、食事制限の健康上の利益を媒介するＮＡＤ＋依存性デアシラーゼのサーチュインファミリーのメンバーである。
【００８７】
例に記載されるように、本発明者らは、ＳＩＲＴ１の欠失を有する老齢マウスが、野生型ＳＩＲＴ１を有する老齢マウスと比較して、骨格筋内の血管密度が減少しており、運動能力が低下していることを見出した。本発明者らは、外因的に供給された導入遺伝子からの老齢マウスの内皮細胞でのＳＩＲＴ１の過剰発現が、導入遺伝子を発現していない老齢マウスと比較して、マウスの骨格筋組織内の血管密度の増加及びマウスの運動能力の増加をもたらすことを見出した。本発明者らは、内皮細胞のＳＩＲＴ１活性及び／又は発現を増加させる薬剤を投与することによって、血管密度及び運動能力を増加させることができることを見出した。
【００８８】
本発明者らはさらに、ＮＡＤ＋レベルが老年期で低下すること、及び老年期中のＮＡＤ＋アゴニストによる処置を通したＮＡＤ＋レベルの回復又は上昇が血管密度の増加、筋肉灌流の増加、及び運動能力の改善をもたらすことを見出した。
【００８９】
本明細書で使用する場合、「血管密度」は、組織の一部分当たりの血管、典型的には毛細血管の数である。組織の一部は、例えば、組織の体積又は組織の面積、例えば組織の断面積であり得る。組織が筋肉であるいくつかの実施形態では、血管密度が筋線維当たり、又は断面積当たりの血管、典型的には毛細血管の数として表され得る。筋組織の血管密度は、例えば、筋組織の断面における高倍率視野当たりの毛細血管の数を決定することによって計算することができる。面積は見た面積に基づいて計算することができ、密度は１平方マイクロメートル当たりの毛細血管の数として表すことができる。一形態では、筋肉内の毛細血管密度が、筋線維当たりの毛細血管の比として表され得る。筋線維当たりの毛細血管の割当は、例えば、筋組織の断面において、視野当たり、典型的には高倍率視野当たりの、毛細血管の数÷筋線維の数として計算することができる。
【００９０】
一態様では、本発明は、対象の組織内の血管密度を増加させる方法であって、有効量の対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤を対象に投与するステップを含む方法を提供する。本方法は、対象の組織内の血管密度を増加させる、すなわち、対象の組織内の血管密度を、薬剤の投与前の組織の血管密度に対して増加させる。
【００９１】
一実施形態では、血管密度の増加が微小血管密度の増加である。典型的には、微小血管密度の増加は毛細管密度の増加である。
【００９２】
別の態様は、対象の組織内の血流を増加させる方法であって、有効量の対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤を対象に投与するステップを含む方法を提供する。本方法は、対象の組織内の血流を増加させる、すなわち、対象の組織内の血流を、薬剤の投与前の組織内の血流に対して増加させる。
【００９３】
別の態様は、対象の組織内の血管密度及び血流を増加させる方法であって、有効量の対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤を対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【００９４】
組織は、血管密度及び／又は血流の増加から利益を得ることができる任意の組織であり得る。一実施形態では、組織が筋肉、肝臓、脳、骨、眼、皮膚及び心臓からなる群から選択される。一実施形態では、組織が筋肉である。一実施形態では、筋肉が骨格筋である。一実施形態では、組織が心臓である。一実施形態では、組織が脳である。一実施形態では、組織が肝臓である。一実施形態では、組織が皮膚である。一実施形態では、組織が眼である。一実施形態では、組織が骨である。
【００９５】
いくつかの実施形態では、組織が健康な組織である。いくつかの実施形態では、組織が虚血組織である。
【００９６】
典型的には、薬剤が対象の全ての組織の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性化又は発現を増加させる。しかし、いくつかの実施形態では、薬剤が対象の１つ又は複数の特定の組織（例えば、特定の器官）に特異的であり得る。
【００９７】
別の態様では、本発明は、対象の運動能力を増加させる方法であって、有効量の対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤を対象に投与するステップを含む方法を提供する。本方法は、対象の運動能力を増加させる、すなわち、対象の運動能力を、薬剤の投与前の対象の運動能力に対して増加させる。
【００９８】
本明細書で使用する場合、「運動能力」は、対象が運動中、典型的には連続的な運動中、より典型的には連続的な激しい運動中の疲労に耐える能力である。運動は有酸素運動であっても無酸素運動であってもよい。典型的には、対象が運動中の疲労に耐える能力の増加は、対象の持久力の増加である。対象の運動能力の増加は、以下のうちの１つ又は複数に起因し得る：
（ａ）運動中の対象の筋組織からの乳酸の除去の増加；
（ｂ）運動中の筋組織への酸素供給の増加；
（ｃ）運動中の筋肉組織からの酸化生成物の除去の増加；
（ｄ）運動中の組織機能のための酵素及び補因子の供給の増加；
（ｅ）運動中の筋組織の再灌流の増加；及び／又は
（ｆ）運動中の乳酸レベルの低下。
【００９９】
ＳＩＲＴ１はＮＡＤ＋依存性シクラーゼであるので、細胞内のＮＡＤ＋レベルを上昇させる、ＮＡＤ＋とＮＡＤＨの比を増加させる、及び／又はＮＡＤ＋の産生を増加させることによってＳＩＲＴ１活性を細胞内で増加させることができる。
【０１００】
一実施形態では、内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤が、ＮＡＤ＋アゴニストを含む。
【０１０１】
一態様では、本発明は、対象の組織内の血管密度及び／又は血流を増加させる方法であって、有効量のＮＡＤ＋アゴニストを対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【０１０２】
別の態様では、本発明は、対象の運動能力を増加させる方法であって、有効量のＮＡＤ＋アゴニストを対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【０１０３】
本明細書で使用する場合、「ＮＡＤ＋アゴニスト」は、内皮細胞内のＮＡＤ＋レベルを上昇させる、及び／又は内皮細胞内のＮＡＤ＋とＮＡＤＨの比を増加させる、及び／又は内皮細胞内のＮＡＤ＋の産生を増加させる薬剤である。
【０１０４】
一実施形態では、ＮＡＤ＋アゴニストが、内皮細胞内のＮＡＤ＋レベルを上昇させる薬剤である。内皮細胞内のＮＡＤ＋レベルを上昇させる薬剤は、薬剤と接触する前の内皮細胞内のＮＡＤ＋の量に対して内皮細胞内のＮＡＤ＋の量を増加させる。
【０１０５】
一実施形態では、ＮＡＤ＋アゴニストが、内皮細胞内のＮＡＤ＋とＮＡＤＨの比を増加させる薬剤である。内皮細胞内のＮＡＤ＋とＮＡＤＨの比を増加させる薬剤は、薬剤と接触する前の内皮細胞内のＮＡＤ＋とＮＡＤＨの比に対して内皮細胞内のＮＡＤ＋とＮＡＤＨの比を増加させる。
【０１０６】
一実施形態では、ＮＡＤ＋アゴニストが、内皮細胞内のＮＡＤ＋の産生を増加させる薬剤である。内皮細胞内のＮＡＤ＋の産生を増加させる薬剤は、薬剤と接触する前の内皮細胞内のＮＡＤ＋の産生に対して内皮細胞内のＮＡＤ＋の産生を増加させる。
【０１０７】
一実施形態では、ＮＡＤ＋アゴニストが、内皮細胞内のＮＡＤ＋レベルを上昇させ、内皮細胞内のＮＡＤ＋とＮＡＤＨの比を増加させる。一実施形態では、ＮＡＤ＋アゴニストが、内皮細胞内のＮＡＤ＋レベルを上昇させ、内皮細胞内のＮＡＤ＋とＮＡＤＨの比を増加させ、内皮細胞内のＮＡＤ＋の産生速度を増加させる。一実施形態では、ＮＡＤ＋アゴニストが、内皮細胞内のＮＡＤ＋レベルを上昇させ、内皮細胞内のＮＡＤ＋の産生を増加させる。
【０１０８】
細胞内のＮＡＤ＋の量、細胞内のＮＡＤ＋とＮＡＤＨの比、及び細胞内のＮＡＤ＋の産生を決定する方法は当技術分野で公知であり、例えば、Ｓｃｈｗａｒｔｚら（１９７４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４９：４１３８〜４１４３；Ｓａｕｖｅ及びＳｃｈｒａｍｍ（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２（３１）：９２４９〜９２５６；Ｙａｍａｄａら（２００６）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５２：２８２〜２８５に記載されている、又は例えばＮＡＤ／ＮＡＤＨ−Ｇｌｏ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｉｎｃ．）若しくはＮＡＤ／ＮＡＤＨ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  Ｋｉｔ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ  Ｉｎｃ．）などの市販のキットを使用して決定することができる。
【０１０９】
一形態では、ＮＡＤ＋アゴニストが、内皮細胞内のＮＡＤ＋の分解を減少させ、それによって細胞内のＮＡＤ＋レベルを上昇させる。内皮細胞を含む細胞内のＮＡＤ＋の分解を減少させる薬剤の例はＣＤ３８阻害剤である。ＣＤ３８は、ＮＡＤ＋及びＡＤＰ−リボースからの環状ＡＤＰ−リボースの合成及び加水分解を触媒する酵素である。  ＣＤ３８は、ＮＡＤ＋を環状ＡＤＰリボースに変換することによって細胞内のＮＡＤ＋レベルを低下させる。したがって、一実施形態では、ＮＡＤ＋アゴニストがＣＤ３８阻害剤である。
【０１１０】
本明細書で使用する場合、「ＣＤ３８阻害剤」は、ＣＤ３８の生物学的活性を低下させる又は排除する薬剤である。ＣＤ３８の生物学的活性は、酵素機能を阻害することによって、又は遺伝子発現及び酵素産生のレベルでＣＤ３８の発現を阻害することによって低下又は排除され得る。「阻害する」は、低下又は排除することを指すことを意図し、部分的と完全の両方の低下又は排除を企図する。
【０１１１】
一実施形態では、ＣＤ３８阻害剤がＣＤ３８酵素機能の阻害剤である。ＣＤ３８酵素機能の阻害剤は、ＣＤ３８の酵素活性を遮断する又は低下させる薬剤である。
【０１１２】
一実施形態では、ＣＤ３８酵素機能の阻害剤が式Ｉの化合物：
【化１】
2020504722.tif 000002
（式中、
ＸはＨ又はＯＨであり；
ＹはＨ又はＯＨである）
又はその薬学的に許容される塩、誘導体若しくはプロドラッグである。
【０１１３】
一実施形態では、Ｘ及びＹが共にＨである。
【０１１４】
ＣＤ３８酵素機能の阻害剤の例はアピゲニン、又はその薬学的に許容される塩、誘導体若しくはプロドラッグである。アピゲニン（５，７−ジヒドロキシ−２−（４−ヒドロキシフェニル）−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン）は、４’，５，７−トリヒドロキシフラボンとしても知られており、パセリ、セロリ、カモミールなどの果実及び野菜を含む植物に見られるイソフラボンである。アピゲニンは以下の構造を有する：
【化２】
2020504722.tif 000003
【０１１５】
ＣＤ３８酵素機能の阻害剤の別の例はケルセチン、又はその薬学的に許容される塩、誘導体若しくはプロドラッグである。ケルセチン［２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−３，５，７−トリヒドロキシ−４Ｈ−クロメン−４−オン］）は、果実、野菜、葉及び穀物を含む植物に見られるイソフラボンである。ケルセチンは以下の構造を有する：
【化３】
2020504722.tif 000004
【０１１６】
アピゲニンとケルセチンの両方がインビトロでＣＤ３８活性の阻害剤であることが示されている（Ｅｓａｎｄｅら（２０１３）Ｄｉａｂｅｔｅｓ、１０８４〜１０９３）。
【０１１７】
イソフラボン（アピゲニン又はケルセチンなど）は、典型的には、単離された形態で投与される。  「単離された」とは、イソフラボンが少なくとも１つの精製ステップを受けたことを意味する。ＣＤ３８酵素機能の阻害剤がイソフラボンである場合、阻害剤は、少なくとも１０％ｗ／ｖの阻害剤、少なくとも２０％ｗ／ｖの阻害剤、少なくとも３０％ｗ／ｖの阻害剤、少なくとも４０％ｗ／ｖの阻害剤、少なくとも５０％ｗ／ｖの阻害剤、少なくとも６０％ｗ／ｖの阻害剤、少なくとも７０％ｗ／ｖの阻害剤、少なくとも８０％ｗ／ｖの阻害剤、少なくとも９０％ｗ／ｖの阻害剤、少なくとも９５％ｗ／ｖの阻害剤、少なくとも９８％ｗ／ｖの阻害剤を含む組成物で好都合に投与される。  一実施形態では、阻害剤が生物学的に純粋な形態（すなわち、他の生物学的に活性な化合物を実質的に含まない）である。  生物学的に純粋な形態のアピゲニン及びケルセチンなどのイソフラボンを単離する方法は当技術分野で公知である。生物学的に純粋なアピゲニン及びケルセチンはまた、例えばＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（セントルイス）（カタログ番号Ａ３１４５及びカタログ番号Ｑ４９５１）又はＩｎｄｏｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（カタログ番号Ａ−００２）から市販されている。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、ＣＤ３８阻害剤が、ＣＤ３８酵素機能の阻害剤の薬学的に許容される塩又はプロドラッグ形態、例えばアピゲニン又はケルセチンの薬学的に許容される塩又はプロドラッグである。「プロドラッグ」という用語は、インビボで薬物の活性形態に変換される化合物を含むよう本明細書でその最も広い意味で使用される。プロドラッグ戦略の使用により、その作用部位へのＮＡＤ＋アゴニストの送達が最適化され得る。
【０１１９】
一実施形態では、ＣＤ３８酵素機能の阻害剤のプロドラッグが、阻害剤のエステル又はイミンである。
【０１２０】
一実施形態では、ＮＡＤ＋アゴニストがアピゲニン、又はその薬学的に許容される塩、誘導体若しくはプロドラッグである。
【０１２１】
別の実施形態では、ＣＤ３８阻害剤がＣＤ３８遺伝子発現又は酵素産生の阻害剤である。ＣＤ３８遺伝子発現又は酵素産生の阻害剤は、ＣＤ３８遺伝子の転写又は翻訳を遮断する又は減少させる薬剤である。ＣＤ３８遺伝子発現又は酵素産生の阻害は、例えば、ＣＤ３８  ｍＲＮＡ転写産物を標的とするＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）（例えばｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ）、アンチセンス核酸、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ＤＮＡザイム又はリボザイムによるもの、ＣＤ３８遺伝子を標的とするジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮＳ）、クラスター化反復短回文配列リピート（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ）（ＣＲＩＳＰＲ）又は設計メガヌクレアーゼ再設計ホーミングヌクレアーゼなどのゲノム編集技術によるものであり得る。「ＲＮＡｉ」は、ｓｉＲＮＡが遺伝子又は標的遺伝子と同じ細胞内に存在する場合に、標的遺伝子の発現を減少させる又は阻害する能力を有する、二本鎖ＲＮＡを形成する核酸を指す。「ｓｈＲＮＡ」又は「短鎖ヘアピンＲＮＡ」は、遺伝子又は標的遺伝子の発現を減少させる又は阻害する能力を有する、タイトなヘアピンループを有する二本鎖ＲＮＡを形成する核酸を指す。「アンチセンス」ポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドと実質的に相補的であり、標的ポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズして標的遺伝子の発現を減少させる能力を有するポリヌクレオチドである。  リボザイム及びＤＮＡザイムはそれぞれ触媒ＲＮＡ及びＤＮＡ分子であり、これらは標的配列とハイブリダイズしてこれを切断し、それによって標的遺伝子の発現を減少又は阻害する。遺伝子発現を制御するためにアンチセンス、リボザイム、ＤＮＡザイム及びＲＮＡｉ技術を使用する一般的な方法は当技術分野で公知である。ゲノム編集は、人工的に設計されたヌクレアーゼを使用してゲノム内の所望の位置に特定の二本鎖切断を作り出し、細胞の内因性機序を利用してその切断を修復する。ゲノム編集技術を使用して遺伝子をサイレンシングする方法は、例えば、Ｔａｎら（２０１２）Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｏｆ  ｌａｒｇｅ  ａｎｉｍａｌ  ｇｅｎｏｍｅｓ、Ａｄｖ．Ｇｅｎｅｔ．８０：３７〜９７；ｄｅ  Ｓｏｕｚａ（２０１１）Ｐｒｉｍｅｒ：Ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ、Ｎａｔ．Ｍｅｔｈ．９（１）２７〜２７；Ｓｍｉｔｈら（２００６）Ａ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｃｒｅａｔｅ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｈｏｍｉｎｇ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｃｌｅａｖｉｎｇ  ｃｈｏｓｅｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３４：２２、ｅ１４９；Ｕｍｏｖら（２０１０）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１１（９）：６３６〜６４６に記載されている。ｉＲＮＡを使用したＣＤ３８発現の阻害は、例えば、Ｅｓｃａｎｄｅら（２０１３）Ｄｉａｂｅｔｅｓ、６２：１０８４〜１０９３に記載されている。
【０１２２】
別の実施形態では、ＮＡＤ＋アゴニストが、内皮細胞内のＮＡＤ＋の合成を促進し、それによって内皮細胞内のＮＡＤ＋レベルを上昇させる薬剤である。ＮＡＤ＋の合成を促進する薬剤の例は、ＮＡＤ＋前駆体である。
【０１２３】
一態様では、対象の組織内の血管密度及び／又は血流を増加させる方法であって、有効量のＮＡＤ＋前駆体を対象に投与するステップを含む方法が提供される。
【０１２４】
一態様では、対象の運動能力を増加させる方法であって、有効量のＮＡＤ＋前駆体を対象に投与するステップを含む方法が提供される。
【０１２５】
一態様では、対象の組織内の血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）及び／又は血管新生（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）を増加させる方法であって、有効量のＮＡＤ＋前駆体を対象に投与するステップを含む方法が提供される。
【０１２６】
本明細書で使用する場合、「ＮＡＤ＋前駆体」は、サーチュイン活性を阻害しないＮＡＤ＋合成の中間体である。ＮＡＤ＋前駆体の例としては、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）、ニコチンアミドリボシド（ＮＲ）、ニコチン酸リボシド（ＮａＲ）、ニコチン酸リボシドのエステル誘導体、ニコチン酸（ナイアシン）、ニコチン酸のエステル誘導体、ニコチン酸モノヌクレオチド（ＮａＭＮ）、ニコチン酸アデニンジヌクレオチド（ＮＡＡＤ）、５−ホスホ−α−Ｄ−リボシル−１−ピロリン酸（ＰＰＲＰ）、又はこれらの薬学的に許容される塩、誘導体若しくはプロドラッグが挙げられる。
【０１２７】
一実施形態では、ＮＡＤ＋アゴニストが、ＮＭＮ又はその薬学的に許容される塩、誘導体若しくはプロドラッグ、ＮＲ又はその薬学的に許容される塩、誘導体若しくはプロドラッグ、又はＮＡＡＤ又はその薬学的に許容される塩、誘導体若しくはプロドラッグである。
【０１２８】
一実施形態では、ＮＡＤ＋アゴニストがＮＭＮ又はその薬学的に許容される塩、誘導体若しくはプロドラッグである。
【０１２９】
一実施形態では、ＮＡＤ＋アゴニストがＮＲ又はその薬学的に許容される塩、誘導体若しくはプロドラッグである。ＮＲの誘導体及びそれらの製造方法の例は、例えば、米国特許第８１０６１８４号明細書に記載されている。
【０１３０】
一実施形態では、ＮＡＤ＋アゴニストがＮＡＡＤ又はその薬学的に許容される塩、誘導体若しくはプロドラッグである。
【０１３１】
一実施形態では、ＮＡＤ＋アゴニストがＮａＲ又はその薬学的に許容される塩、誘導体若しくはプロドラッグである。
【０１３２】
別の実施形態では、ＮＡＤ＋アゴニストが細胞透過性形態のＮＡＤ＋、その誘導体又はプロドラッグである。
【０１３３】
別の実施形態では、ＮＡＤ＋生合成酵素ＮＡＭＰＴ、ＮＭＮＡＴ１、ＮＭＮＡＴ２及びＮＭＮＡＴ３の翻訳の阻害を減少させることによって、ＮＡＤ＋レベルを上昇させることができる。ＮＡＤ＋生合成酵素ＮＡＭＰＴ、ＮＭＮＡＴ１、ＮＭＮＡＴ２及びＮＭＮＡＴ３の翻訳の阻害は、ＮＡＭＰＴ、ＮＭＮＡＴ１、ＮＭＮＡＴ２及びＮＭＮＡＴ３を標的とする内因性マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）によって媒介される。よって、ＮＡＭＰＴ、ＮＭＮＡＴ１、ＮＭＮＡＴ２及びＮＭＮＡＴ３を標的とする内因性ｍｉＲＮＡの活性を阻害することによって、内皮細胞内のＮＡＤ＋レベルを上昇させることができる。したがって、一実施形態では、ＮＡＤ＋アゴニストが、ＮＡＭＰＴ、ＮＭＮＡＴ１、ＮＭＮＡＴ２及び／又はＮＭＮＡＴ３  ｍｉＲＮＡアンタゴニストである。  本明細書で使用する場合、「ＮＡＭＰＴ、ＮＭＮＡＴ１、ＮＭＮＡＴ２及び／又はＮＭＮＡＴ３  ｍｉＲＮＡアンタゴニスト」は、ＮＡＭＰＴ、ＮＭＮＡＴ１、ＮＭＮＡＴ２及びＮＭＮＡＴ３のうちの任意の１つ又は複数の翻訳を阻害するｍｉＲＮＡの活性を阻害する薬剤である。  ＮＡＭＰＴ、ＮＭＮＡＴ１、ＮＭＮＡＴ２及び／又はＮＭＮＡＴ３  ｍｉＲＮＡアンタゴニストは、例えば、ＮＡＭＰＴ、ＮＭＮＡＴ１、ＮＭＮＡＴ２及び／又はＮＭＮＡＴ３を標的とするｍｉＲＮＡを標的とするＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）（例えばｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ）、アンチセンス核酸、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ＤＮＡザイム又はリボザイムを通して、或いはＮＡＭＰＴ、ＮＭＮＡＴ１、ＮＭＮＡＴ２及び／又はＮＭＮＡＴ３を標的とするｍｉＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を標的とするジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮＳ）、クラスター化反復短回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）又は設計メガヌクレアーゼ再設計ホーミングヌクレアーゼなどのゲノム編集技術によってＮＡＭＰＴ、ＮＭＮＡＴ１、ＮＭＮＡＴ２及び／又はＮＭＮＡＴ３を阻害することによって作用し得る。ＣＲＩＳＰＲ指向の異種制御ドメイン（例えば、ＶＰ１６又はＶＰ６４）を使用して、活性化ドメインをＮＡＤ生合成遺伝子の遺伝子（例えば、ＮＡＭＰＴ、ＮＭＮＡＴ１、ＮＭＮＡＴ２及び／又はＮＭＮＡＴ３）に標的化して遺伝子発現を増加させることができる。
【０１３４】
別の実施形態では、細胞を、酵母、ハエ又は植物などの他の種由来のＮＡＤ＋生合成酵素ＮＡＭＰＴ、ＮＭＮＡＴ１、ＮＭＮＡＴ２及び／又はＮＭＮＡＴ３又はＰＮＣ１などのＮＡＤ＋生合成酵素の酵素活性を増加させるＮＡＤ＋アゴニストと接触させることによって、ＮＡＤ＋レベルを上昇させることができる。例えば、Ｐ７Ｃ３はインビトロでＮＡＭＰＴの活性を増加させ、それによって細胞内ＮＡＤ＋のレベルを増加させる（Ｗａｎｇら（２０１４）Ｃｅｌｌ、１５８（６）：１３２４〜１３３４）。Ｐ７Ｃ３は以下の構造を有する：
【化４】
2020504722.tif 000005
【０１３５】
対象の内皮細胞内で１つ又は複数のＮＡＤ＋生合成酵素を発現する核酸を対象の細胞に導入することによって、ＮＡＭＰＴ、ＮＭＮＡＴ１、ＮＭＮＡＴ２及び／又はＮＭＮＡＴ３などのＮＡＤ＋生合成酵素の酵素活性を増加させることができる。
【０１３６】
一実施形態では、ＮＡＤ＋アゴニストが、ＮＡＤ＋アゴニストと接触する前の細胞内のＮＡＤ＋とＮＡＤＨの比に対して細胞内のＮＡＤ＋とＮＡＤＨの比を増加させる薬剤である。例えば、細胞をＮＡＤＨをＮＡＤ＋に変換する酵素を活性化するＮＡＤ＋アゴニストと接触させることによって、ＮＡＤ＋とＮＡＤＨの量の比を増加させることができる。例えば、β−ラパコン（３，４−ジヒドロ−２，２−ジメチル−２Ｈ−ナフトール［１，２−ｂ］ピラン−５，６−ジオン）は、ＮＡＤＨを電子供与体として利用することによって、キノンのヒドロキノンへの還元を触媒する酵素ＮＡＤＨ：キノンオキシドレダクターゼ（ＮＱ０１）を活性化し、結果としてＮＡＤ＋とＮＡＤＨの比が増加する。
【０１３７】
したがって、一実施形態では、ＮＡＤ＋アゴニストが、ラパコンなどのＮＱ０１の活性化剤、又はその薬学的に許容される塩、誘導体若しくはプロドラッグである。
【０１３８】
例に記載されるように、本発明者らは、ＮＡＤ＋前駆体ＮＭＮの投与が、
−内皮細胞を含む細胞内のＮＡＤ＋レベルを増加させる；
−老齢マウスに投与すると、骨格筋内の血管密度を増加させ、血流を増加させる；
−運動訓練を受けているマウスに投与すると、若齢及び高齢の骨格筋内の血管密度を増加させる；
−激しい運動の後に血中乳酸レベルを低下させる；
−運動能力を増加させる；
−内皮細胞の増殖を促進し、血管新生を刺激する；
−虚血組織内の血管密度及び血流を増加させる。
【０１３９】
一実施形態では、対象の組織内の血管密度及び／又は血流を増加させる、並びに／或いは対象の運動能力を増加させる方法であって、有効量のＮＭＮ又はその薬学的に許容される塩、誘導体若しくはプロドラッグを対象に投与するステップを含む方法が提供される。
【０１４０】
一実施形態では、対象の組織内の血管密度及び／又は血流を増加させる方法であって、有効量のＮＭＮ又はその薬学的に許容される塩、誘導体若しくはプロドラッグを対象に投与するステップを含む方法が提供される。
【０１４１】
一実施形態では、対象の運動能力を増加させる方法であって、有効量のＮＭＮ又はその薬学的に許容される塩、誘導体若しくはプロドラッグを投与するステップを含む方法が提供される。
【０１４２】
一実施形態では、対象の組織内の血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）及び／又は血管新生（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）を増加させる方法であって、有効量のＮＭＮ又はその薬学的に許容される塩、誘導体若しくはプロドラッグを対象に投与するステップを含む方法が提供される。
【０１４３】
例に記載されるように、本発明者らはさらに、ＮＡＤ＋アゴニストであるＮＭＮ及びＨ２Ｓ前駆体である水硫化ソーダを投与された老齢マウスが、ＮＭＮ又は水硫化ソーダ単独で処置されたマウスよりも大きな骨格筋血管密度及び運動能力を有することを見出した。
【０１４４】
よって、一実施形態では、本発明の方法は、対象の内皮細胞内のＨ２Ｓレベルを上昇させる化合物と組み合わせてＮＡＤ＋アゴニストを投与するステップを含む。
【０１４５】
一実施形態では、対象の内皮細胞内のＨ２Ｓレベルを上昇させる化合物がＨ２Ｓ前駆体である。よって、一実施形態では、対象の組織内の血管密度及び／又は血流を増加させる方法であって、Ｈ２Ｓ前駆体と組み合わせて有効量のＮＡＤ＋アゴニストを対象に投与するステップを含む方法が提供される。
【０１４６】
一実施形態では、対象の運動能力を増加させる方法であって、Ｈ２Ｓ前駆体と組み合わせて有効量のＮＡＤ＋アゴニストを対象に投与するステップを含む方法が提供される。
【０１４７】
一実施形態では、Ｈ２Ｓ前駆体が、水硫化ソーダ又はモルホリン−４−イウム４−メトキシフェニル（モルホリノ）ホスフィノジチオアート（ＧＹＹ４１３７）である。
【０１４８】
一実施形態では、Ｈ２Ｓ前駆体が水硫化ソーダである。
【０１４９】
一実施形態では、Ｈ２Ｓ前駆体がＧＹＹ４１３７である。
【０１５０】
例に記載されるように、本発明者らはまた、対象の内皮細胞内のＳＩＲＴ１導入遺伝子の発現が血管密度の増加及び運動能力の増加をもたらすことを見出した。
【０１５１】
したがって、一実施形態では、対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１の活性及び／又は発現を増加させる薬剤が、対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１の発現を増加させる。一実施形態では、対象の組織の内皮細胞のＳＩＲＴ１の発現を増加させる薬剤が、対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１を発現することができる核酸を含む。対象の組織の内皮細胞内でＳＩＲＴ１を発現することができる核酸は、内皮細胞内でコード配列によってコードされるタンパク質を発現するように共に作動する制御配列に作動可能に連結されたＳＩＲＴ１のコード配列を含み得る。「コード配列」は、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ配列を指す。これは「中断されていないコード配列」、すなわちｃＤＮＡ中のようなイントロンを欠いているものを構成してもよいし、又は適当なスプライスジャンクションによって結合した１つ若しくは複数のイントロンを含んでもよい。ヒトＳＩＲＴ１コード配列の一例は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＢＣ０１２４９９（配列番号１）のヌクレオチド２１０〜１８７７のヌクレオチド配列である。「制御配列」は、コード配列の上流（５’非コード配列）、内部又は下流（３’非コード配列）に位置し、関連コード配列の転写、ＲＮＡプロセシング若しくは安定性、又は翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列である。制御配列は当技術分野で公知であり、例えば、プロモーター、エンハンサー翻訳リーダー配列、イントロン及びポリアデニル化シグナル配列などの転写制御配列を含み得る。コード配列は、典型的にはプロモーターに作動可能に連結されている。プロモーターは、一定の条件下でＲＮＡポリメラーゼに結合し、通常はプロモーターの下流（３’方向）に位置するコード配列の転写を開始することができるＤＮＡ領域である。コード配列はまた、終止シグナルに作動可能に連結されてもよい。発現カセットはまた、コード配列の適切な翻訳に必要な配列を含み得る。コード配列は、構成的プロモーター又は組織の内皮細胞内で転写を開始する制御可能なプロモーターの制御下にあり得る。  例えば、ＳＩＲＴ１コード配列は、ＳＩＲＴ１遺伝子に天然ではないプロモーター、例えば内皮細胞内でコード配列を発現する、又は内皮細胞内で誘導可能なプロモーターに作動可能に連結されていてもよい。適切なプロモーターの例としては、Ｔｉｅ−１、Ｔｉｅ−２、ＣＤ３４、ｅＮＯＳ、Ｆｌｔ−１、ＶＥ−カドヘリン、ｖＷＦ、ＰＤＧＦＢ、ＰＥＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１が挙げられる。
【０１５２】
タンパク質をコードする核酸（コード配列）は、それが細胞内でのタンパク質の発現を可能にするように制御配列に対して配置されている場合に、制御配列に作動可能に連結している。例えば、プロモーターがコード配列の転写の開始を助ける場合、そのプロモーターはコード領域に作動可能に連結している。
【０１５３】
本明細書で使用する場合、核酸配列の「発現」は、コード配列によってコードされるポリペプチドを産生するためのコード配列を含む核酸配列の転写及び翻訳を指す。
【０１５４】
ＳＩＲＴ１をコードする核酸配列は適切なベクター配列に挿入することができる。「ベクター」という用語は、遺伝子を宿主細胞に移入するのに適した核酸配列を指す。「ベクター」という用語は、プラスミド、コスミド、裸のＤＮＡ、ウイルスベクター等を含む。一実施形態では、ベクターがプラスミドベクターである。プラスミドベクターは二本鎖環状ＤＮＡ分子であり、その中に追加の配列を挿入することができる。プラスミドは発現ベクターであり得る。プラスミド及び発現ベクターは当技術分野で公知であり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第４版、第１〜３巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク（２０１２）に記載されている。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、ベクターがウイルスベクターである。ウイルスベクターは、ウイルスベクターに応じて、ウイルス粒子産生及び／又は宿主細胞ゲノムへの組込み及び／又はウイルス複製を可能にするウイルス配列を含む。本明細書に記載される方法及び組成物で利用することができるウイルスベクターには、骨格筋の内皮細胞などの内皮細胞に核酸を導入することができる任意のウイルスベクターが含まれる。ウイルスベクターの例としては、アデノウイルスベクター；レンチウイルスベクター；アデノ随伴ウイルスベクター；狂犬病ウイルスベクター；単純ヘルペスウイルスベクター；ＳＶ４０；ポリオーマウイルスベクター；ポックスウイルスベクターが挙げられる。
【０１５６】
一態様では、対象の組織内の血管密度及び／又は血流、並びに／或いは対象の運動能力を増加させるための核酸であって、対象の内皮細胞でＳＩＲＴ１の活性又はＳＩＲＴ１の発現を増加させるタンパク質又はＲＮＡをコードするコード配列を含む核酸が提供される。種々の実施形態では、コード配列が、
（ａ）ＳＩＲＴ１タンパク質；
（ｂ）１つ又は複数のＮＡＤ＋生合成酵素、又は
（ｃ）ＮＡＭＰＴ、ＮＭＮＡＴ１、ＮＭＮＡＴ２及び／又はＮＭＮＡＴ３  ｍｉＲＮＡアンタゴニスト
をコードする。
【０１５７】
一実施形態では、コード配列がＳＩＲＴ１をコードする。ＳＩＲＴ１アミノ酸配列の例としては、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＡＩ５２３１５．１（マウス）（配列番号３）、ＡＡＨ１２４９９．１（ヒト）（配列番号２）、ＮＰ＿００１２７７１７５．１（ネコ）（配列番号４）、ＸＰ＿００５６１８９９０．１（イヌ）（配列番号５）が挙げられる。
【０１５８】
一実施形態では、コード配列が、対象の内皮細胞でＮＡＤ＋レベルを上昇させるタンパク質又はＲＮＡをコードする。一実施形態では、コード配列が、１つ又は複数のＮＡＭＰＴ、ＮＭＮＡＴ１、ＮＭＮＡＴ２及びＮＭＮＡＴ３からなる群から選択されるＮＡＤ＋生合成酵素をコードする。ＮＡＭＰＴのアミノ酸配列の例は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ＿００５７３７．１（ヒト）（配列番号６）、ＮＰ＿０６７４９９．２（マウス）（配列番号７）、ＸＰ＿０２２２６１５６６．１（イヌ）（配列番号８）であり；ＮＭＮＡＴ１のアミノ酸配列の例は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＨ１４９４３．１（ヒト）（配列番号９）、ＮＰ＿５９７６７９．１（マウス）（配列番号１０）、ＸＰ＿００５６２０５７９．１（イヌ）（配列番号１１）であり；ＮＭＮＡＴ２のアミノ酸配列の例は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ＿０５５８５４．１（ヒト）（配列番号１２）、ＮＰ＿７８０６６９．１（マウス）（配列番号１３）、ＸＰ＿０２２２７６６７０．１（イヌ）（配列番号１４）であり；ＮＭＮＡＴ３のアミノ酸配列の例は、ＡＡＨ３６２１８．１（ヒト）（配列番号１５）、ＮＰ＿００１３４４３７４．１（マウス）（配列番号１６）、（ＸＰ＿０２２２６４４０１．１）（イヌ）（配列番号１７）である。
【０１５９】
一実施形態では、コード配列が、ＮＡＭＰＴ、ＮＭＮＡＴ１、ＮＭＮＡＴ２及び／又はＮＭＮＡＴ３  ｍｉＲＮＡアンタゴニストをコードする。
【０１６０】
一実施形態では、ＳＩＲＴ１タンパク質；１つ若しくは複数のＮＡＤ＋生合成酵素、又はＮＡＭＰＴ、ＮＭＮＡＴ１、ＮＭＮＡＴ２及び／又はＮＭＮＡＴ３  ｍｉＲＮＡアンタゴニストをコードするコード配列が、内皮細胞内でコード配列を発現する、又は内皮細胞内で誘導可能なプロモーターに作動可能に連結されている。一実施形態では、プロモーターが、Ｔｉｅ−１、Ｔｉｅ−２、ＣＤ３４、ｅＮＯＳ、Ｆｌｔ−１、ＶＥ−カドヘリン、ｖＷＦ、ＰＤＧＦＢ、ＰＥＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１からなる群から選択される。一実施形態では、プロモーターがＴｉｅ−２である。
【０１６１】
対象の組織内の血管密度及び／又は血流、並びに／或いは対象の運動能力を増加させるための核酸を、対象に投与するためのウイルスベクターに組み込むことができる。したがって、一態様では、対象の組織内の血管密度及び／又は血流、並びに／或いは対象の運動能力を増加させるための核酸であって、対象の内皮細胞でＳＩＲＴ１の活性又はＳＩＲＴ１の発現を増加させるタンパク質又はＲＮＡをコードするコード配列を含む核酸を含むウイルスベクターが提供される。種々の実施形態では、コード配列が、
（ａ）ＳＩＲＴ１タンパク質；
（ｂ）１つ又は複数のＮＡＤ＋生合成酵素、又は
（ｃ）ＮＡＭＰＴ、ＮＭＮＡＴ１、ＮＭＮＡＴ２及び／又はＮＭＮＡＴ３  ｍｉＲＮＡアンタゴニスト
をコードする。
【０１６２】
典型的には、コード配列は、内皮細胞内でコード配列を発現する、又は内皮細胞内で誘導可能なプロモーターに作動可能に連結されている。一実施形態では、プロモーターが、Ｔｉｅ−１、Ｔｉｅ−２、ＣＤ３４、ｅＮＯＳ、Ｆｌｔ−１、ＶＥ−カドヘリン、ｖＷＦ、ＰＤＧＦＢ、ＰＥＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１からなる群から選択される。一実施形態では、プロモーターがＴｉｅ−２である。典型的なウイルスベクターは上述の通りであり、アデノウイルスベクター；レンチウイルスベクター；アデノ随伴ウイルスベクター；狂犬病ウイルスベクター；単純ヘルペスウイルスベクター；ＳＶ４０；ポリオーマウイルスベクター；ポックスウイルスベクターが挙げられる。
【０１６３】
一実施形態では、ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。一実施形態では、ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９のベクター又はこれらの変異体からなる群から選択される血清型である。核酸を細胞内に導入するための組換えＡＡＶベクターの使用は当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第２０１６００３８６１３号明細書；Ｇｒｉｅｇｅｒ及びＳａｍｕｌｓｋｉ（２００５）Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ａｓ  ａ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｖｅｃｔｏｒ：ｖｅｃｔｏｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９９：１１９〜１４５に記載されている。組換えＡＡＶを作製する方法は当技術分野で公知であり、例えば、Ｈａｒａｓｔａら（２０１５）Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ４０：１９６９〜１９７８に記載されている。
【０１６４】
ウイルスベクターは、典型的には当技術分野で公知の方法を使用してウイルス粒子にパッケージングされる。次いで、ウイルス粒子を使用して、対象の組織内の血管密度及び／又は血流、並びに／或いは対象の運動能力を増加させるために核酸を対象に移入することができる。よって、別の態様は、対象の組織内の血管密度及び／又は血流、並びに／或いは対象の運動能力を増加させるための核酸であって、対象の内皮細胞でＳＩＲＴ１の活性又はＳＩＲＴ１の発現を増加させるタンパク質又はＲＮＡをコードするコード配列を含む核酸を含むウイルスベクターを含むウイルスを提供する。種々の実施形態では、コード配列が、
（ａ）ＳＩＲＴ１；
（ｂ）１つ又は複数のＮＡＤ＋生合成酵素、又は
（ｃ）ＮＡＭＰＴ、ＮＭＮＡＴ１、ＮＭＮＡＴ２及び／又はＮＭＮＡＴ３  ｍｉＲＮＡアンタゴニスト
をコードする。
【０１６５】
一態様では、老齢対象の組織内の血管密度及び／又は血流を増加させる、並びに／或いは老齢対象の運動能力を増加させる方法であって、有効量の本明細書に記載されるウイルスを投与するステップを含む方法が存在する。
【０１６６】
本明細書で使用する場合、「対象」という用語は哺乳動物を指す。哺乳動物は、例えば、ヒト、霊長類、又は他の動物（例えば、ヒツジ、ウシ、ウマ、ロバ、ブタ、イヌ、ネコ、マウス、ウサギ、ラット、モルモット、ハムスター、キツネ、シカ、サル）であり得る。
【０１６７】
一実施形態では、哺乳動物がヒトである。
【０１６８】
一実施形態では、哺乳動物が非ヒトである。
【０１６９】
一実施形態では、哺乳動物がレース用動物（例えば、競走馬、グレイハウンド）である。
【０１７０】
一実施形態では、哺乳動物がコンパニオンアニマル（例えばイヌ、ネコ）である。
【０１７１】
本発明はマウスモデルを使用して例示しているが、本発明の方法は他の種にも適用され得る。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、対象が中年又は老齢対象である。いくつかの実施形態では、中年又は老齢対象がヒトである。いくつかの実施形態では、対象が中年のヒトである。中年のヒトは年齢が３５歳〜６５歳の範囲である。いくつかの実施形態では、対象が老齢である。いくつかの実施形態では、対象が老齢のヒトである。老齢のヒトは年齢が６６歳〜１１０歳の範囲である。中年及び老齢と見なされるものは、対象の種に依存し、当業者によって容易に決定され得ることが理解されるだろう。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、対象が任意の年齢であり得る。
【０１７４】
一実施形態では、中年又は老齢対象、典型的には老齢対象の組織内の血管密度及び／又は血流を増加させる方法であって、場合によりＨ２Ｓ前駆体と組み合わせて、有効量の対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤を対象に投与するステップを含む方法が提供される。
【０１７５】
一実施形態では、中年又は老齢対象、典型的には老齢対象の組織内の血管密度及び／又は血流を増加させる方法であって、場合によりＨ２Ｓ前駆体と組み合わせて、有効量のＮＡＤ＋アゴニストを対象に投与するステップを含む方法が提供される。
【０１７６】
一実施形態では、中年又は老齢対象、典型的には老齢対象の組織内の血管密度及び／又は血流を増加させる方法であって、場合によりＨ２Ｓ前駆体と組み合わせて、有効量のＮＡＤ＋前駆体を対象に投与するステップを含む方法が提供される。
【０１７７】
一実施形態では、中年又は老齢対象、典型的には老齢対象の運動能力を増加させる方法であって、場合によりＨ２Ｓ前駆体と組み合わせて、有効量の対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤を対象に投与するステップを含む方法が提供される。
【０１７８】
一実施形態では、中年又は老齢対象、典型的には老齢対象の運動能力を増加させる方法であって、場合によりＨ２Ｓ前駆体と組み合わせて、有効量のＮＡＤ＋アゴニストを対象に投与するステップを含む方法が提供される。
【０１７９】
一実施形態では、中年又は老齢対象、典型的には老齢対象の運動能力を増加させる方法であって、場合によりＨ２Ｓ前駆体と組み合わせて、有効量のＮＡＤ＋前駆体を対象に投与するステップを含む方法が提供される。
【０１８０】
本発明者らは、血管密度及び／又は血流の増加並びに／或いは運動能力の増加によって治療、予防又は改善される任意の疾患又は状態を治療、予防又は改善するためにこの方法を使用することができると予想している。例えば、本発明者らは、心臓組織内の血管密度を促進する能力は、虚血性心臓病及び心不全などの心臓病の治療又は予防にとって有用である；末梢組織内の血管密度を促進する能力は、糖尿病性血管疾患、末梢動脈疾患及び潰瘍の治療に有用である；心臓組織内の血管密度を促進する能力は、冠動脈疾患及び心臓病の治療に有用である；脳組織内の血管密度を促進する能力は、血管性認知症の治療に有用である；肺組織内の血管密度を促進する能力は、ＣＯＰＤ及び肺高血圧などの肺状態の治療に有用である；骨格筋内の血管密度を促進する能力は、サルコペニア及び虚弱の治療に有用である；脳内の血管密度及び／又は血流を促進する能力は、血管性認知症などの神経変性疾患、並びに脳卒中及び出血などの他の脳状態の治療に有用である；骨内の血管密度及び／又は血流を促進する能力は、骨粗鬆症の治療に有用であると予想している。
【０１８１】
一態様では、冠動脈及び／又は末梢動脈疾患を治療又は予防する方法であって、有効量の対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤を対象に投与するステップを含む方法が提供される。
【０１８２】
一態様では、冠動脈及び／又は末梢動脈疾患を治療又は予防する方法であって、有効量のＮＡＤ＋前駆体を対象に投与するステップを含む方法が提供される。
【０１８３】
一態様では、虚血を治療又は予防する方法であって、有効量の対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤を対象に投与するステップを含む方法が提供される。
【０１８４】
一態様では、対象の虚血を治療又は予防する方法であって、有効量のＮＡＤ＋前駆体を対象に投与するステップを含む方法が提供される。
【０１８５】
一態様では、潰瘍を治療又は予防する方法であって、有効量の対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤を対象に投与するステップを含む方法が提供される。
【０１８６】
一態様では、対象の潰瘍を治療又は予防する方法であって、有効量のＮＡＤ＋前駆体を対象に投与するステップを含む方法が提供される。
【０１８７】
一態様では、対象の肺状態を治療又は予防する方法であって、有効量の対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤を対象に投与するステップを含む方法が提供される。
【０１８８】
一態様では、対象の肺状態を治療又は予防する方法であって、有効量のＮＡＤ＋前駆体を対象に投与するステップを含む方法が提供される。
【０１８９】
一実施形態では、肺状態がＣＯＰＤなどの肺疾患である。
【０１９０】
一実施形態では、肺状態が肺高血圧である。
【０１９１】
一態様では、虚弱を治療又は予防する方法であって、有効量の対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤を対象に投与するステップを含む方法が提供される。
【０１９２】
一態様では、虚弱を治療又は予防する方法であって、有効量のＮＡＤ＋前駆体を対象に投与するステップを含む方法が提供される。
【０１９３】
虚弱は、典型的には老化に関連し、健康上の問題悪化のリスク増加に関連する状態である。虚弱の要素には、サルコペニア及び筋力低下が含まれる。
【０１９４】
一態様では、サルコペニアを治療又は予防する方法であって、有効量の対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤を対象に投与するステップを含む方法が提供される。
【０１９５】
一態様では、対象において治療又は予防する方法であって、有効量のＮＡＤ＋前駆体を対象に投与するステップを含む方法が提供される。
【０１９６】
一実施形態では、サルコペニアが、典型的には宇宙旅行に起因する無重力サルコペニアである。
【０１９７】
一実施形態では、サルコペニアが加齢性サルコペニアである。
【０１９８】
一態様では、運動性が低下した対象の血管密度又は運動能力を増加させる方法であって、有効量の対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤を対象に投与するステップを含む方法が提供される。
【０１９９】
一態様では、運動性が低下した対象の血管密度又は運動能力を増加させる方法であって、有効量のＮＡＤ＋前駆体を対象に投与するステップを含む方法が提供される。
【０２００】
運動性が低下した対象は、１つ又は複数の身体部分の運動性が低下している可能性がある。運動性が低下した対象は、１つ又は複数の身体部分の運動性が低下しているため、サルコペニア、虚弱及び／又は運動能力の低下を受けやすい。運動性が低下した対象の例としては、四肢麻痺、対麻痺、筋萎縮性側索硬化症患者、長期の床上安静を要する対象、骨折などの傷害後の固定化四肢を有する対象、老齢対象及び座ったままの生活習慣を有する対象が挙げられる。
【０２０１】
一態様では、神経変性疾患を治療又は予防する方法であって、有効量の対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤を対象に投与するステップを含む方法が提供される。
【０２０２】
一態様では、神経変性疾患を治療又は予防する方法であって、有効量のＮＡＤ＋前駆体を対象に投与するステップを含む方法が提供される。
【０２０３】
一実施形態では、神経変性疾患が血管性認知症である。
【０２０４】
一態様では、脳卒中を治療又は予防する方法であって、有効量の対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤を対象に投与するステップを含む方法が提供される。
【０２０５】
一態様では、脳卒中を治療又は予防する方法であって、有効量のＮＡＤ＋前駆体を対象に投与するステップを含む方法が提供される。
【０２０６】
一態様では、出血を治療又は予防する方法であって、有効量の対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤を対象に投与するステップを含む方法が提供される。
【０２０７】
一態様では、出血を治療又は予防する方法であって、有効量のＮＡＤ＋前駆体を対象に投与するステップを含む方法が提供される。
【０２０８】
一態様では、心疾患を治療又は予防する方法であって、有効量の対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤を対象に投与するステップを含む方法が提供される。
【０２０９】
一態様では、心疾患を治療又は予防する方法であって、有効量のＮＡＤ＋前駆体を対象に投与するステップを含む方法が提供される。
【０２１０】
一態様では、血管疾患を治療又は予防する方法であって、有効量の対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤を対象に投与するステップを含む方法が提供される。
【０２１１】
一態様では、血管疾患を治療又は予防する方法であって、有効量のＮＡＤ＋前駆体を対象に投与するステップを含む方法が提供される。
【０２１２】
一実施形態では、血管疾患が糖尿病性血管疾患である。
【０２１３】
一態様では、運動選手、レクリエーションスポーツの人々、軍人、又は法執行官などの対象の身体能力を増加させる方法であって、有効量の対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤を対象に投与するステップを含む方法が提供される。
【０２１４】
一態様では、運動選手、レクリエーションスポーツの人々、軍人、又は法執行官などの対象の身体能力を増加させる方法であって、有効量のＮＡＤ＋前駆体を対象に投与するステップを含む方法が提供される。
【０２１５】
一態様では、理学療法の利益を増加させる方法であって、有効量の対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤を対象に投与するステップを含む方法が提供される。
【０２１６】
一態様では、理学療法の利益を増加させる方法であって、有効量のＮＡＤ＋前駆体を対象に投与するステップを含む方法が提供される。
【０２１７】
一態様では、動けない条件下に保たれている動物の肉生産などの、肉生産を改善する方法であって、有効量の動物の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤を動物に投与するステップを含む方法が提供される。
【０２１８】
一態様では、動けない条件下に保たれている動物の肉生産などの、肉生産を改善する方法であって、有効量のＮＡＤ＋前駆体を動物に投与するステップを含む方法が提供される。
【０２１９】
一態様では、例えば、化粧品用途のために皮膚外観を増強させるために、対照の皮膚への血流を増加させる方法であって、有効量の対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤を対象に投与するステップを含む方法が提供される。
【０２２０】
一態様では、例えば、化粧品用途のために皮膚外観を増強させるために、対照の皮膚への血流を増加させる方法であって、有効量のＮＡＤ＋前駆体を対象に投与するステップを含む方法が提供される。
【０２２１】
典型的には、皮膚への血流増加は皮膚及び皮下血流の増加である。
【０２２２】
一態様では、対象の運動の効果を増加させる方法であって、有効量の対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤を対象に投与するステップを含む方法が提供される。
【０２２３】
一態様では、対象の運動の効果を増加させる方法であって、有効量のＮＡＤ＋前駆体を対象に投与するステップを含む方法が提供される。
【０２２４】
例に記載されるように、ＮＡＤ＋前駆体ＮＭＮの投与は、虚血組織における血管の増殖及び血流を促進する。
【０２２５】
したがって、一態様では、対象の虚血組織内の血管密度及び／又は血流を増加させる方法であって、有効量の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤を投与するステップを含む方法が提供される。典型的には、薬剤がＮＡＤ＋アゴニストである。典型的には、薬剤がＮＡＤ＋前駆体である。
【０２２６】
一態様では、対象の虚血組織内の血管密度及び／又は血流を増加させる方法であって、有効量のＮＡＤ＋前駆体を投与するステップを含む方法が提供される。
【０２２７】
一態様では、傷害又は不動化後の対象の血管回復を改善する方法であって、有効量の対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤を対象に投与するステップを含む方法が提供される。
【０２２８】
一態様では、傷害又は不動化後の対象の血管回復を改善する方法であって、有効量のＮＡＤ＋前駆体を対象に投与するステップを含む方法が提供される。
【０２２９】
一態様では、長期間の無重力後、例えば宇宙旅行後の対象の身体能力を改善する方法であって、有効量の対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤を対象に投与するステップを含む方法が提供される。
【０２３０】
一態様では、長期間の無重力後、例えば宇宙旅行後の対象の身体能力を改善する方法であって、有効量のＮＡＤ＋前駆体を対象に投与するステップを含む方法が提供される。
【０２３１】
本明細書に記載される薬剤が血管密度及び血流を促進するので、本発明者らは、本明細書に記載される薬剤の投与が、肝臓における代謝副産物及び毒素の交換を促進するのに役立つと予想している。よって、一態様では、肝臓類洞内皮細胞機能を強化する方法であって、有効量の対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤を対象に投与するステップを含む方法が提供される。
【０２３２】
一態様では、肝臓類洞内皮細胞機能を強化する方法であって、有効量のＮＡＤ＋前駆体を対象に投与するステップを含む方法が提供される。
【０２３３】
本発明者らは、より多くの血液が組織に供給されるにつれて、対象の活力又は活動レベルが増加すると予想している。したがって、本発明者らは、対象の血管密度、血流及び／又は運動能力を増加させることが、対象の活力を増加させると予想している。このような活力の増加は、老齢のヒトだけでなく、イヌ、ネコ、ウマ等などの老齢のペットにとっても重要であるだろう。
【０２３４】
したがって、一態様では、老齢対象の活力を増加させる方法であって、有効量の対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤を対象に投与するステップを含む方法が提供される。
【０２３５】
一態様では、老齢対象の活力を増加させる方法であって、有効量のＮＡＤ＋アゴニストを対象に投与するステップを含む方法が提供される。
【０２３６】
一態様では、老齢対象の活力を増加させる方法であって、有効量のＮＡＤ＋前駆体を対象に投与するステップを含む方法が提供される。
【０２３７】
一実施形態では、対象が動物である。一実施形態では、動物がペットなどのコンパニオンアニマルである。
【０２３８】
本明細書で使用する場合、活力は、身体活動、精神活動及び食事を含む活動に従事する意欲及び能力を指す。
【０２３９】
活力の増加は、動物の以下の症状を減少させるのに役立ち得る：老齢動物における協調の欠如、極端な疲労及び嗜眠、食欲不振、末期症状などの既存の状態の減退又は悪化、創傷治癒の遅滞、及び加齢性疾患の発症。
【０２４０】
したがって、種々の態様では、老齢対象における
（ａ）協調の欠如；
（ｂ）極端な疲労及び嗜眠；
（ｃ）食欲不振；
（ｄ）既存の状態の減退若しくは悪化；
（ｅ）創傷治癒の遅滞；又は
（ｆ）加齢性疾患の発症
を減少させる方法であって、有効量の対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤を対象に投与するステップを含む方法が提供される。一実施形態では、老齢対象がコンパニオンアニマルである。一実施形態では、コンパニオンアニマルがイヌである。
【０２４１】
種々の実施形態では、老齢対象における
（ａ）協調の欠如；
（ｂ）極端な疲労及び嗜眠；
（ｃ）食欲不振；
（ｄ）既存の状態の減退若しくは悪化；
（ｅ）創傷治癒の遅滞；又は
（ｆ）加齢性疾患の発症
を減少させる方法であって、有効量のＮＡＤ＋アゴニストを対象に投与するステップを含む方法が提供される。一実施形態では、老齢対象がコンパニオンアニマルである。一実施形態では、コンパニオンアニマルがイヌである。
【０２４２】
種々の実施形態では、老齢対象における
（ａ）協調の欠如；
（ｂ）極端な疲労及び嗜眠；
（ｃ）食欲不振；
（ｄ）既存の状態の減退若しくは悪化；
（ｅ）創傷治癒の遅滞；又は
（ｆ）加齢性疾患の発症
を減少させる方法であって、有効量のＮＡＤ＋前駆体を対象に投与するステップを含む方法が提供される。一実施形態では、老齢対象がコンパニオンアニマルである。一実施形態では、コンパニオンアニマルがイヌである。
【０２４３】
例に記載されるように、ＮＭＮ単独、又はＮＭＮと水硫化ソーダ、又はＮＭＮとＧＹＹ４１３７を運動と合わせてマウスに投与すると、マウスは、運動なしで、ＮＭＮ単独、又はＮＭＮと水硫化ソーダを投与したマウスの血管密度及び運動能力の増加よりも大きな血管密度及び運動能力の増加を示した。したがって、本発明者らは、ＳＩＲＴ１活性又は発現を増加させる薬剤の投与が、訓練中である、並びに／或いは身体能力増加を必要とする対象、例えば運動選手、軍人又は法執行官、宇宙飛行士及びレース用動物の身体能力を増加させ得ると予想している。
【０２４４】
したがって、一態様では、対象（例えば、レース用動物、運動選手、軍人若しくは法執行官、又は宇宙飛行士）の身体能力を増加させる方法であって、有効量の対象の組織の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤を対象に投与するステップを含む方法が提供される。
【０２４５】
一態様では、対象（例えば、レース用動物、運動選手、軍人若しくは法執行官、又は宇宙飛行士）の身体能力を増加させる方法であって、有効量のＮＡＤ＋前駆体を対象に投与するステップを含む方法が提供される。対象は、運動能力増加が求められている任意の動物であり得る。一実施形態では、対象が、運動能力増加が求められているヒトである。一実施形態では、対象が運動選手、又はレクリエーションスポーツの人である。別の実施形態では、対象が、身体能力が改善されるであろう軍又は法執行機関の一員である。別の実施形態では、対象が宇宙飛行士であり、長期間の無重力空間旅行後で身体能力低下を受けやすいだろう。
【０２４６】
一実施形態では、対象がレース用動物である。レース用動物は、運動能力増加が求められている任意の動物であり得る。一実施形態では、レース用動物がウマ及びイヌからなる群から選択される。レース用動物の例としては、競走馬、グレイハウンドが挙げられる。
【０２４７】
一態様では、対象の組織内の血管密度及び／又は血流を増加させる方法であって、
（ａ）運動訓練期間にわたって対象を運動訓練に供するステップと；
（ｂ）運動訓練期間の前及び／又は間に、有効量の対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤を対象に投与するステップと
を含む方法が提供される。
【０２４８】
一態様では、対象の組織内の血管密度及び／又は血流を増加させる方法であって、（ａ）運動訓練期間にわたって対象を運動訓練に供するステップと；（ｂ）運動訓練期間の前及び／又は間に、有効量のＮＡＤ＋前駆体を対象に投与するステップとを含む方法が提供される。
【０２４９】
本方法は、ＮＡＤ＋前駆体を投与していない運動訓練後の組織の血管密度及び血流に対して対象の組織内の血管密度及び／又は血流を増加させる。
【０２５０】
運動訓練は運動訓練期間にわたって行われる。運動訓練期間は、運動訓練期間にわたって一定の間隔で運動訓練と共に血管密度及び／又は血流の増加を可能にするのに十分な時間の長さである。運動訓練期間は、対象の種、食餌、性別、及び対象の状態を含む種々の因子に応じて変わることが理解されるだろう。例えば、健康なヒトの運動訓練期間は、１週間〜１年、１週間〜６ヶ月間、又は１ヶ月間〜６ヶ月間、又は２週間〜５ヶ月間、又は１週間〜４ヶ月間、又は１週間〜３ヶ月間、又は１週間〜２ヶ月間、又は１週間〜１ヶ月間の範囲であり得る。運動訓練期間中の運動訓練は、運動訓練期間にわたって一定の間隔で行われる任意の運動であり得る。典型的には、運動訓練の種類は、健康な若年対象で血管密度及び組織への血流を増加させるであろう訓練（例えば、持久力訓練）である。
【０２５１】
薬剤を運動訓練期間の前及び／又は間に投与する。これに関して、薬剤を、運動訓練期間が始まる直前に投与してもよい、及び／又は運動訓練期間の経過にわたって１回若しくは複数回投与で投与してもよい。
【０２５２】
いくつかの実施形態では、薬剤を運動訓練と合わせて投与して、運動訓練中に働いた筋肉の血管新生を必要とする状態を治療する。例えば、薬剤を運動訓練と合わせて対象に投与して、血管疾患を治療することができる。
【０２５３】
したがって、一態様は、対象の血管疾患を治療する方法であって、（ａ）運動期間にわたって対象を運動訓練に供するステップと；（ｂ）運動訓練期間の前及び／又は間に、有効量の対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤を対象に投与するステップとを含む方法を提供する。
【０２５４】
一態様では、対象の血管疾患を治療する方法であって、（ａ）運動期間にわたって対象を運動訓練に供するステップと；（ｂ）運動訓練期間の前及び／又は間に、有効量のＮＡＤ＋前駆体を対象に投与するステップとを含む方法が提供される。
【０２５５】
例に記載されるように、ＮＭＮ単独、又はＮＭＮと水硫化ソーダ、又はＮＭＮとＧＹＹ４１３７によるマウスの処置は、持久力増加を含む運動能力増加をもたらした。したがって、一態様では、対象の持久力を増加させる方法であって、有効量の対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤を対象に投与するステップを含む方法が提供される。
【０２５６】
一態様では、対象の持久力を増加させる方法であって、有効量のＮＡＤ＋前駆体を対象に投与するステップを含む方法が提供される。
【０２５７】
種々の実施形態では、対象において、
（ａ）対象の筋肉組織内の血管密度を増加させる；
（ｂ）対象の運動能力を増加させる；
（ｃ）対象の組織内の血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）及び／又は血管新生（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｓａｔｉｏｎ）を促進する；
（ｄ）対象の冠動脈及び／又は末梢動脈疾患を治療又は予防する；
（ｅ）対象の虚血を治療又は予防する；
（ｆ）対象の潰瘍を治療又は予防する；
（ｇ）対象の肺疾患を治療又は予防する；
（ｈ）対象の肺高血圧を治療又は予防する；
（ｉ）対象の虚弱を治療又は予防する；
（ｊ）対象のサルコペニアを治療又は予防する；
（ｋ）対象の運動性が低下した対象の血管密度又は運動能力を増加させる；
（ｌ）対象の心臓病を治療又は予防する；
（ｍ）対象の糖尿病性血管疾患を治療又は予防する；
（ｎ）対象の肝臓類洞内皮細胞機能を強化する；
（ｏ）対象の対象の身体能力を増加させる；
（ｐ）対象の対象の持久力を増加させる；
（ｑ）レース用動物の能力を増加させる；
（ｒ）対象の対象の運動の効果を増加させる；
（ｓ）対象の傷害又は不動化後の対象の血管回復を改善する；
（ｔ）対象の対象の理学療法の利益を増加させる；
（ｕ）対象の眼への血流を増加させる；
（ｖ）対象の皮膚外観を増強させる；
（ｗ）動物の肉生産を増加させる；
（ｘ）神経変性疾患（血管性認知症など）を治療又は予防する；
（ｙ）脳卒中を治療又は予防する；
（ｚ）出血を治療又は予防する；
（ａａ）骨粗鬆症を治療又は予防する；
（ｂｂ）活力を増加させる
方法であって、有効量のＮＡＤ＋アゴニスト及びＨ２Ｓ前駆体を対象に投与するステップを含む方法が提供される。
【０２５８】
種々の実施形態では、対象において、
（ａ）対象の筋肉組織内の血管密度を増加させる；
（ｂ）対象の運動能力を増加させる；
（ｃ）対象の組織内の血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）及び／又は血管新生（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｓａｔｉｏｎ）を促進する；
（ｄ）対象の冠動脈及び／又は末梢動脈疾患を治療又は予防する；
（ｅ）対象の虚血を治療又は予防する；
（ｆ）対象の潰瘍を治療又は予防する；
（ｇ）対象の肺疾患を治療又は予防する；
（ｈ）対象の肺高血圧を治療又は予防する；
（ｉ）対象の虚弱を治療又は予防する；
（ｊ）対象のサルコペニアを治療又は予防する；
（ｋ）対象の運動性が低下した対象の血管密度又は運動能力を増加させる；
（ｌ）対象の心臓病を治療又は予防する；
（ｍ）対象の糖尿病性血管疾患を治療又は予防する；
（ｎ）対象の肝臓類洞内皮細胞機能を強化する；
（ｏ）対象の対象の身体能力を増加させる；
（ｐ）対象の対象の持久力を増加させる；
（ｑ）レース用動物の能力を増加させる；
（ｒ）対象の対象の運動の効果を増加させる；
（ｓ）対象の傷害又は不動化後の対象の血管回復を改善する；
（ｔ）対象の対象の理学療法の利益を増加させる；
（ｕ）対象の眼への血流を増加させる；
（ｖ）対象の皮膚外観を増強させる；
（ｗ）動物の肉生産を増加させる；
（ｘ）神経変性疾患（血管性認知症など）を治療又は予防する；
（ｙ）脳卒中を治療又は予防する；
（ｚ）出血を治療又は予防する；
（ａａ）骨粗鬆症を治療又は予防する；
（ｂｂ）活力を増加させる
方法であって、有効量のＮＡＤ＋前駆体及びＨ２Ｓ前駆体を対象に投与するステップを含む方法が提供される。
【０２５９】
種々の実施形態では、ＮＡＤ＋前駆体が、
（ａ）ＮＭＮ又はその薬学的に許容される塩、誘導体若しくはプロドラッグ；
（ｂ）ＮＲ又はその薬学的に許容される塩、誘導体若しくはプロドラッグ；
（ｃ）ＮＡＡＤ又はその薬学的に許容される塩、誘導体若しくはプロドラッグ；
（ｄ）ＮａＲ又はその薬学的に許容される塩、誘導体若しくはプロドラッグ；
（ｅ）ニコチン酸（ナイアシン）、ニコチン酸のエステル誘導体又はそれらの薬学的に許容される塩、誘導体若しくはプロドラッグ；
（ｆ）ＮａＭＮ又はその薬学的に許容される塩、誘導体若しくはプロドラッグ；或いは
（ｇ）ＰＰＲＰ又はその薬学的に許容される塩、誘導体若しくはプロドラッグ
である。
【０２６０】
本明細書で使用する場合、「治療する」とは、所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を得るために対象、組織又は細胞に影響を及ぼすことを意味し、状態を阻害すること、すなわちその発達を停止すること；又は状態の効果を軽減若しくは改善すること、すなわち、状態の効果の逆転若しくは後退を引き起こすことを含む。本明細書で使用する場合、「予防する」とは、状態を有するリスクがあり得る細胞又は対象でその状態が起こるのを防ぐことを意味するが、その状態が最終的に発症しないことも、対象が最終的に状態を発症しないことも必ずしも意味しない。予防は、細胞又は対象での状態の発症を遅らせることを含む。
【０２６１】
「有効量」という用語は、研究者、獣医師、医学博士又は他の臨床医によって求められている組織、系、動物又はヒトの生物学的又は医学的反応を誘発する化合物の量を指す。したがって、有効量の対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させる薬剤の投与への言及は、対象の内皮細胞のＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１発現を増加させるのに有効な薬剤の量を指す。
【０２６２】
ＮＡＤ＋アゴニストなどの、ＳＩＲＴ１活性又は発現を増加させる薬剤は、薬剤と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物として投与することができる。「薬学的に許容される担体」は、それが組成物の他の成分と適合性であり、対象にとって有害ではない担体である。組成物は以下に記載される他の治療薬を含有してもよく、例えば、医薬製剤の分野で周知の技術などの技術に従って、慣用的な固体又は液体のビヒクル又は希釈剤、並びに所望の投与様式に適したタイプの医薬添加剤（例えば、賦形剤、結合剤、保存剤、安定剤、香味剤等）を使用することによって製剤化することができる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２１版、２００５、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ参照）。
【０２６３】
いくつかの実施形態では、担体が合成（天然には存在しない）担体である。
【０２６４】
ＳＩＲＴ１活性又は発現を増加させる薬剤は、薬剤が対象の組織の内皮細胞でＳＩＲＴ１活性又は発現を増加させることを可能にする任意の手段によって投与され得る。薬剤がＮＡＤ＋アゴニストである実施形態では、薬剤を、経口的に、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤又は散剤の形態で；舌下に；頬に；非経口的に、例えば皮下、静脈内、筋肉内、（経）皮内、腹腔内若しくは槽内注射又は注入技術などによって（例えば、無菌注射用水溶液又は非水性溶液又は懸濁液として）；経鼻的に、例えば吸入スプレー又は吹送などにより；非毒性の薬学的に許容されるビヒクル又は希釈剤を含有する投与単位製剤で投与することができる。薬剤を、例えば、即時放出又は持続放出に適した形態で投与することができる。即時放出又は持続放出は、薬剤を含む適切な医薬組成物の使用によって達成され得る。典型的には、ＳＩＲＴ１活性又は発現を増加させる薬剤を経口投与する。
【０２６５】
投与するための医薬組成物は、都合よく投与単位形態で提供してもよく、薬学の分野で周知の方法のいずれかによって調製してもよい。これらの方法は一般に、薬剤を１種又は複数の副成分を構成する担体と会合させるステップを含む。一般に、医薬組成物は、化合物を液体担体若しくは微細固体担体又はその両方と均一かつ密接に会合させ、次いで、必要であれば、生成物を所望の製剤に成形することによって調製される。医薬組成物中、活性化合物は所望の効果を生じるのに十分な量で含まれる。本明細書で使用する場合、「組成物」という用語は、指定される量の指定される成分を含む製品、並びに指定される量の指定される成分の組み合わせから直接又は間接的に生じる任意の製品を包含することを意図している。
【０２６６】
医薬組成物は、経口使用に適した形態、例えば、錠剤、トローチ、ロゼンジ、水性若しくは油性懸濁剤、分散性散剤若しくは顆粒剤、乳剤、硬若しくは軟カプセル剤、又はシロップ若しくはエリキシルとしての形態であり得る。経口使用を意図した組成物は、医薬組成物の製造のための当技術分野で公知の任意の方法に従って調製することができ、このような組成物は、例えば、薬学的に安定で口当たりのよい製剤を提供するために、甘味剤、香味剤、着色剤及び保存剤などの１種又は複数の薬剤を含有してもよい。１種又は複数のＮＡＤ＋アゴニストを含有する錠剤は、錠剤の製造に適している非毒性の薬学的に許容される賦形剤と混和して調製することができる。これらの賦形剤は、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム又はリン酸ナトリウムなどの不活性希釈剤；造粒剤及び崩壊剤、例えばコーンスターチ又はアルギン酸；結合剤、例えばデンプン、ゼラチン又はアラビアゴム、及び潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸又はタルクであり得る。錠剤はコーティングされていなくてもよいし、又は胃腸管における崩壊及び吸収を遅延させ、それによって長期間にわたる持続作用を提供するために公知の技術によってコーティングされていてもよい。例えば、モノステアリン酸グリセリル又はジステアリン酸グリセリルなどの時間遅延材料を使用することができる。これらを、制御放出のための浸透圧治療錠剤を形成するようにコーティングしてもよい。
【０２６７】
経口使用のための製剤はまた、ＳＩＲＴ１活性又は発現を増加させる薬剤が不活性固体希釈剤、例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウム若しくはカオリンと混合されている硬ゼラチンカプセルとして、又は薬剤が水若しくは油性媒体、例えば落花生油、流動パラフィン若しくはオリーブ油と混合されている軟ゼラチンカプセルとして提供することもできる。
【０２６８】
水性懸濁液は、水性懸濁液の製造に適した賦形剤と混和して活性物質を含有する。このような賦形剤は懸濁化剤、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシ−プロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニル−ピロリドン、トラガカントゴム及びアラビアゴムであり；分散剤又は湿潤剤は、天然ホスファチド、例えばレシチン、又はアルキレンオキシドと脂肪酸の縮合生成物、例えばポリオキシエチレンステアラート、又はエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールの縮合生成物、例えばヘプタデカエチレンオキシセタノール、又はエチレンオキシドと脂肪酸及びヘキシトールから誘導された部分エステルの縮合生成物、例えばポリオキシエチレンソルビトールモノオレアート、又はエチレンオキシドと脂肪酸及びヘキシトール無水物から誘導された部分エステルの縮合生成物、例えばポリエチレンソルビタンモノオレアートであり得る。水性懸濁液はまた、１種又は複数の保存剤、例えば、エチル又はｎ−プロピル、ｐ−ヒドロキシベンゾアート、１種若しくは複数の着色剤、１種又は複数の香味剤、及び１種又は複数の甘味剤、例えばスクロース又はサッカリンも含有し得る。
【０２６９】
油性懸濁液は、ＳＩＲＴ１活性又は発現を増加させる薬剤を植物油、例えば落花生油、オリーブ油、ゴマ油若しくはヤシ油、又は鉱油、例えば流動パラフィンに懸濁することによって製剤化することができる。油性懸濁液は、増粘剤、例えば蜜ろう、固形パラフィン又はセチルアルコールを含有し得る。上に示されるような甘味剤、及び香味剤を添加して、口当たりのよい経口製剤を提供することができる。これらの組成物は、アスコルビン酸などの抗酸化剤を添加することによって保存することができる。
【０２７０】
水の添加による水性懸濁液の調製に適した分散性粉末及び顆粒は、分散剤又は湿潤剤、懸濁化剤及び１種又は複数の保存剤と混和した化合物を提供する。適切な分散剤又は湿潤剤及び懸濁化剤は、既に上で述べたものによって例示されている。追加の賦形剤、例えば甘味剤、香味剤及び着色剤も存在してよい。
【０２７１】
医薬組成物は水中油型乳剤の形態であってもよい。油相は、植物油、例えばオリーブ油若しくは落花生油、又は鉱油、例えば流動パラフィン、又はこれらの混合物であり得る。適切な乳化剤は、天然ゴム、例えばアラビアゴム又はトラガカントゴム、天然ホスファチド、例えばダイズ、レシチン、及び脂肪酸とヘキシトール無水物から誘導されるエステル又は部分エステル、例えばソルビタンモノオレアート、及び前記部分エステルとエチレンオキシドの縮合生成物、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレアートであり得る。乳剤はまた、甘味剤及び香味剤を含有してもよい。
【０２７２】
シロップ及びエリキシルは、甘味剤、例えばグリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール又はスクロースを用いて製剤化することができる。このような製剤はまた、粘滑剤、保存剤及び香味剤及び着色剤を含有してもよい。
【０２７３】
医薬組成物は、滅菌注射用水性又は油性懸濁液の形態であり得る。この懸濁液は、上に言及されている適切な分散剤又は湿潤剤及び懸濁化剤を使用して、公知の技術に従って製剤化することができる。滅菌注射用製剤は、非毒性の非経口的に許容される希釈剤又は溶媒中の滅菌注射用溶液又は懸濁液、例えば、１，３−ブタンジオール中溶液としてであり得る。使用され得る許容されるビヒクル及び溶媒の中には、水、リンガー液及び等張塩化ナトリウム溶液がある。さらに、滅菌不揮発性油が、溶媒又は懸濁化媒体として慣用的に使用されている。この目的のために、合成モノグリセリド又はジグリセリドを含む、任意の無刺激性不揮発性油を使用することができる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸が注射用製剤の調製に使用される。
【０２７４】
ＳＩＲＴ１活性又は発現を増加させる薬剤はまた、リポソームの形態で投与することもできる。当技術分野で公知であるように、リポソームは一般にリン脂質又は他の脂質物質から誘導される。リポソームは、水性媒体中に分散している単層又は多層の水和液晶によって形成される。リポソームを形成することができる任意の非毒性の生理学的に許容され代謝可能な脂質を使用することができる。リポソーム形態の本組成物は、本発明の化合物に加えて、安定剤、保存剤、賦形剤などを含有することができる。好ましい脂質は、天然と合成の両方の、リン脂質及びホスファチジルコリンである。リポソームを形成する方法は当技術分野で公知である。
【０２７５】
ＳＩＲＴ１活性又は発現を増加させる薬剤はまた、優れた安定化及び純度のために結晶性ＮＡＤ＋前駆体の形態で投与することもできる。
【０２７６】
種々の実施形態では、
（ａ）ＮＭＮ若しくはその薬学的に許容される塩；
（ｂ）ＮＲ若しくはその薬学的に許容される塩；
（ｃ）ＮＡＡＤ若しくはその薬学的に許容される塩；
（ｄ）ＮａＭＮ若しくはその薬学的に許容される塩；
（ｅ）ＮａＲ若しくはその薬学的に許容される塩；
（ｆ）ＮＭＮ若しくはその薬学的に許容される塩と水硫化ソーダ若しくはその薬学的に許容される塩；
（ｇ）ＮＭＮ若しくはその薬学的に許容される塩とＧＹＹ４１３７若しくはその薬学的に許容される塩；
（ｈ）ＮＲ若しくはその薬学的に許容される塩と水硫化ソーダ若しくはその薬学的に許容される塩；
（ｉ）ＮＲ若しくはその薬学的に許容される塩とＧＹＹ４１３７若しくはその薬学的に許容される塩；
（ｊ）ＮＡＡＤ若しくはその薬学的に許容される塩と水硫化ソーダ若しくはその薬学的に許容される塩；
（ｋ）ＮＡＡＤ若しくはその薬学的に許容される塩とＧＹＹ４１３７若しくはその薬学的に許容される塩；
（ｌ）ＮａＭＮ若しくはその薬学的に許容される塩と水硫化ソーダ若しくはその薬学的に許容される塩；
（ｍ）ＮａＭＮ若しくはその薬学的に許容される塩とＧＹＹ４１３７若しくはその薬学的に許容される塩；
（ｎ）ＮａＲ若しくはその薬学的に許容される塩と水硫化ソーダ若しくはその薬学的に許容される塩；又は
（ｏ）ＮａＲ若しくはその薬学的に許容される塩とＧＹＹ４１３７若しくはその薬学的に許容される塩
を含む医薬組成物が提供される。
【０２７７】
さらなる態様は、ＮＡＤ＋アゴニストと、場合によりＨ２Ｓ前駆体とを含む運動模倣剤を提供する。
【０２７８】
別の態様は、ＮＡＤ＋前駆体と、場合によりＨ２Ｓ前駆体とを含む運動模倣剤を提供する。
【０２７９】
本明細書で使用する場合、「運動模倣剤」は、運動に関連する１つ又は複数の生理学的効果を模倣する薬剤である。
【０２８０】
任意の特定の対象についての特定の用量レベル及び投薬頻度は変動し得、使用される特定の化合物の活性、その化合物の代謝安定性及び作用の長さ、年齢、体重、全身の健康状態、性別、食事、投与様式及び投与時間、排泄率、薬物組み合わせ、並びに特定の状態の重症度を含む種々の因子に依存することが理解されるだろう。
【０２８１】
ＮＡＤ＋アゴニストを含む容器を含む製品及びキットも提供される。容器は、単純に経口剤形のＮＡＤ＋アゴニストを含むボトルであり得、各剤形は単位用量のＮＡＤ＋アゴニストを含む。例えば、アピゲニンは、例えば約１００ｍｇ〜７５０ｍｇの量、又はＮＭＮは約１００ｍｇ〜７５０ｍｇの量、ＮａＨＳは約１００ｍｇ〜７５０ｍｇの量である。キットは印刷された説明書をさらに含む。製品は、本方法による対象の処置を示すラベルなどを含むであろう。一形態では、製品は、局所投与用の形態のＮＡＤ＋アゴニストを含む容器であり得る。例えば、ＮＡＤ＋アゴニストは、チューブ又はボトルなどの使い捨て容器中のクリームの形態であり得る。
【０２８２】
本発明者らはまた、状況によっては、子牛肉などの白さが望ましい肉の場合のように、血管密度を減少させることが有利となり得ると予想している。
【０２８３】
したがって、一態様では、子牛肉の白さを増加させる方法であって、有効量のＮＡＤ＋若しくはＳＩＲＴ１活性又はＳＩＲＴ１タンパク質レベルを低下させる薬剤を動物に投与するステップを含む方法が提供される。
【０２８４】
本明細書で使用する場合、文脈が明白な言語又は必要な含意のために要求する場合を除いて、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」若しくは「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は包括的意味で使用される、すなわち述べられた特徴の存在を特定するが、本発明の種々の実施形態におけるさらなる特徴の存在又は追加を排除するものではない。
【０２８５】
本明細書で言及される全ての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。広く記載されている本発明の精神又は範囲から逸脱することなく、特定の実施形態に示されているように、本発明に対して多数の変形及び／又は修正がなされ得ることが当業者には理解されよう。したがって、本実施形態は、あらゆる点で例示的であり、限定的ではないと見なされるべきである。
【０２８６】
より明確に理解され得るように本発明の性質を例示するために、以下の非限定的な例を提供する。
【０２８７】
例
本研究では、内皮細胞におけるＳＩＲＴ１の減少が、筋肉内の血流及び持久力が年齢とともに減少する主な理由であるかどうか、並びにこのような老化の効果を逆転できるかどうかを試験した。
【０２８８】
実験手順
マウス及び飲料水の補充
ＳＩＲＴ１−ｉＫＯ、ＳＩＲＴ１−Ｔｇ及びＳＩＲＴ１ＳＴＯＰマウスは以前に記載されている（Ｆｉｒｅｓｔｅｉｎら、２００８、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ３、ｅ２０２０；Ｐｒｉｃｅら、２０１２、Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ  １５、６７５〜６９０）。Ｔｉｅ２Ｃｒｅ及びＳｉｒｔ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスはＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（メイン州バーハーバー）から購入した。ＭＣＫ−ＰＧＣ−１αマウス及びＭｙｏｇＣｒｅマウスは、それぞれＢｒｕｃｅ  Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ博士（Ｄａｎａ  Ｆａｒｂｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ、マサチューセッツ州）及びＥｒｉｃ  Ｎ．  Ｏｌｓｏｎ博士（ＵＴ  Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ、テキサス州ダラス）から贈与されたものであった。ｍＴ−ＳＴＯＰｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ、Ｇｆｐマウスは、膜標的タンデムダイマーＴｏｍａｔｏ（ｍＴ）に隣接するｌｏｘＰ部位及び転写ＳＴＯＰカセットを有するユビキタスアクチンＢプロモーター、引き続いてＧＦＰコード配列によって駆動される対立遺伝子からなるＥ．Ｏ．Ｗ．によって自家作製した。ＮＭＮ及びＮａＨＳ実験用の野生型Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウスは、Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅｓ（Ｍｏｓｓ  Ｖａｌｅ、ＮＳＷ）から購入した。ＳＩＲＴ１−ｉＫＯマウスに５週間タモキシフェン（３６０  ｍｇ／ｋｇ）食餌を与えて、以前記載されたように（Ｐｒｉｃｅら、２０１２）、全身ＳＩＲＴ１エクソン４切除を誘発した。ＮＭＮ（４００  ｍｇ／ｋｇ、Ｂｏｎｔａｃ  Ｂｉｏ−Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、中国）及びＮａＨＳ（２０ｍｇ／ｋｇ、Ｓｉｇｍａ）及び／又はＧＹＹ４１３７（２０ｍｇ／ｋｇ／日、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を飲料水で投与した。ＮＭＮストックを週に２回交換し、ＮａＨＳ／ＧＹＹ４１３７を毎日補充した。アキシチニブ（３０ｍｇ／ｋｇ／日）を食物を通して与え、毎日変えた。
【０２８９】
マウスに標準げっ歯類固形飼料を与え、午前７時に点灯し、午後７時に消灯する１２時間明／１２時間暗周期の下で飼育した。全ての実験は、ＵＮＳＷ動物管理倫理委員会（ニューサウスウェールズ大学、シドニー、オーストラリア）、ＭＩＴの動物管理委員会（マサチューセッツ工科大学、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）及び施設内動物管理・使用委員会（ベス・イスラエル・ディーコネス・メディカル・センター及びハーバート比較医学センター、ボストン、マサチューセッツ州）によって承認された手順に従って行った。
【０２９０】
レンチウイルスの後眼窩投与
レンチウイルス粒子を超遠心分離（ｃｉｔｅ）によって濃縮し、ウイルス力価を（ｃｉｔｅキット）によって決定し、ＳＩＲＴ１又はＮＴ  ｍｉＲＮＡを有する１×１０１０  ＴＵ／マウスで、２０月齢のＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ＮＩＡ）に後眼窩注射を介して注射した。マウスは２日間隔で交互の眼の後ろに２回連続して注射を受けた。最後の注射の１０日後に、マウスを異なる処置群に割り当てた。
【０２９１】
グルコース、乳酸、ＶＥＧＦ及びクレアチニンの測定
マウスを６時間絶食させ、血糖値を尾部採血（Ａｃｃｕ  Ｃｈｅｃｋ  Ｐｅｒｆｏｒｍａ、Ｒｏｃｈｅ）によって測定した。血中乳酸を、尾部採血（Ａｃｃｕｔｒｅｎｄ  Ｐｌｕｓ、Ｒｏｃｈｅ）によって、１５ｍ／分で２０分間のトレッドミル運動訓練の直前及び直後に測定した。ＶＥＧＦ分析のために、短時間のイソフルラン麻酔下で後眼窩洞から全血を採取した。血清を収集し、ＥＬＩＳＡ（Ｅｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カナダ）によってＶＥＧＦ発現についてアッセイした。２時間の断食後に尿を採取し、比色アッセイキット（Ｃａｙｍａｎ  ｃｈｅｍｉｃａｌ、米国）を製造業者のプロトコルに従って使用してクレアチニンレベルについて分析した。
【０２９２】
トレッドミル及びロータロッド試験
持久力試験トレッドミル試験を、１０５０−ＲＭ  Ｅｘｅｒ  ３／６  Ｏｐｅｎ  Ｔｒｅａｄｍｉｌｌ（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＯＨ）で行った。１０〜１５ｍ／分で２０分間走らせることによって、持久力試験の前にマウスを３日間トレッドミルシステムに順応させた。低強度持久力試験では、速度を５ｍ／分で５分間（ウォームアップ）で開始し、次いで、速度を２１ｍ／分まで毎分１ずつ増加させて一定に保った。高強度持久力試験では、５°傾斜で、速度を１３ｍ／分で５分間（ウォームアップ）で開始し、次いで、速度を２０ｍ／分まで毎分１ずつ増加させて２０分間一定に保った。２０分毎に、速度を５ｍ／分増加させ、２０分間一定に保った。走りを再開しようとせずに１０秒間超ショックプレート上に座ったら、マウスを消耗と見なした。
【０２９３】
運動訓練
１０ｍ／分で２０分間走らせることによって、運動訓練の開始前にマウスを３日間トレッドミルシステムに順応させた。次いで、順応に成功した動物を、１ヶ月間、１日１回、３０分間、５°傾斜で１５〜２０ｍ／分で走らせた。
【０２９４】
ロータロッド試験
以前記載されたロータロッド試験を使用して、運動協調性を評価した（Ｍｅｒｓｍａｎｎら、２０１１、Ｐｌｏｓ  Ｏｎｅ  ６、ｅ２０３３６）。手短に言えば、マウスを、５ｒｐｍの一定速度でそれぞれ２分間続く３回の試験で３日間装置（Ｕｇｏ  Ｂａｓｉｌｅ、イタリアのコメリオ）に順応させた。４日目に、動物を加速ローラー上で３回試験し（４分間で４〜４０ｒｐｍ）、マウスが留まった時間を記録した。
【０２９５】
後肢虚血
虚血誘発性血管形成におけるＮＭＮの効果を、公開されているプロトコル（Ｌｉｍｂｏｕｒｇら、２００９、Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ  ４、１７３７〜１７４６）に従って、ＳＩＲＴ１−ｉＫＯマウス及びＷＴマウスを使用して後肢虚血のマウスモデルで評価した。飲料水を介したＮＭＮ（５００ｍｇ／ｋｇ／日）による動物の処置を、大腿結紮術の１週間前に開始し、実験終了まで続けた。手術２０日後に、造影増強超音波イメージングを使用して、虚血肢の血流を測定した。
【０２９６】
生体内イメージング
光音響イメージング．ＭＳＯＴ  ｉｎＶｉｓｉｏｎ  ２５６−ＴＦ小動物イメージングシステム（ｉＴｈｅｒａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＧｍｂＨ、ミュンヘン、ドイツ）を使用した（Ｍｏｒｓｃｈｅｒら、２０１４、Ｐｈｏｔｏａｃｏｕｓｔｉｃｓ  ２、１０３〜１１０）。マウスをイソフルラン（１．５〜２％、５００ｍｌ  Ｏ２／分）で麻酔し、脱毛クリームを使用して、胸部領域より下の身体部分を剃毛した。次いで、動物をイメージングチャンバー内に水平に入れ、製造業者のプロトコルに従って下部の三次元スキャンを行った。手短に言えば、Ｎｄ：ＹＡＧレーザーでポンピングされた可変光パラメトリック発振器（ＯＰＯ）が、７３０ｎｍで、１０ｍｓの波長調整速度及び１００ｍＪのピークパルスエネルギーで、１０Ｈｚの繰り返し速度で６８０ｎｍ〜９８０ｎｍの波長で９ｎｓの持続時間の励起パルスを提供した。線維束の１０本のアームは、約８ｍｍ幅のリング状光ストリップの均一な照明を提供した。超音波検出のために、２７０°の角度範囲及び４ｃｍの曲率半径の凹面アレイに構成された５ＭＨｚの中心周波数（６０％の帯域幅）を有する２５６個のトロイド集束超音波トランスデューサを使用された。
【０２９７】
造影増強超音波
マウスをイソフルラン（１．５〜２％、５００ｍｌ  Ｏ２／分）で麻酔し、脱毛クリームを使用して後肢を剃毛し、２７ゲージのカテーテルを各マウスの尾に入れ、サージカルテープで固定した。各マウスを３８℃に加熱したプラットホーム上に仰臥位に置き、各足を表面電極にテープで固定してＥＣＧ、心拍数及び呼吸数を監視した。造影増強超音波（ＣＥＵ）（Ｖｅｖｏ  ２１００、Ｖｉｓｕａｌｓｏｎｉｃｓ、カナダ）を１８ＭＨｚのイメージング周波数で行った。矢状面において下後肢を撮像するために、プローブを脚の内側に配置した。製造業者の指示に従って、マイクロバブルのボーラス注射（Ｖｅｖｏ  ＭｉｃｒｏＭａｒｋｅｒ、カナダ）を尾静脈カテーテルを通して注射した。シネループを２０フレーム／秒のフレーム速度で合計１０００フレーム記録した。曲線当てはめ分析を使用してエコー電力を経時的に測定した。最大ビデオ強度と最小ビデオ強度の差をピーク増強として決定し、これが筋肉灌流を決定するために使用した変数であった。
【０２９８】
心臓エコー．以前記載されたように（Ｒｅｓｐｒｅｓｓ  ａｎｄ  Ｗｅｈｒｅｎｓ、２０１０）、Ｖｅｖｏ  ２１００システム（Ｖｉｓｕａｌｓｏｎｉｃｓ）を使用して、傍胸骨短軸Ｍモード画像を取得した。マウスを１〜２％イソフルランで麻酔し、全ての測定で心拍数を４５０〜５００拍／分に維持した。
【０２９９】
代謝測定及び体組成
代謝チャンバー（ＣＬＡＭＳ（商標）、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、ＯＨ）を使用して代謝機能の全身測定を行った。代謝チャンバーへの馴化後、個々に飼育されたマウスを４８時間にわたって連続的に監視して、酸素消費量、二酸化炭素産生量、呼吸商、エネルギー消費量、食物摂取量、水分摂取量及び活動を決定した。体組成（体脂肪量、除脂肪量及び体内総水分量）をＥｃｈｏＭＲＩ（Ｅｃｈｏ  ＭＲＩ（商標）９００）によって測定した。
【０３００】
筋肉中のＣＤ３１＋細胞の分析：骨格筋を切り開き、次いで、コラゲナーゼ／ディスパーゼで消化し、４０ミクロンフィルターを通して濾過した。細胞懸濁液をＡＰＣコンジュゲート抗マウスＣＤ３１抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）と共にインキュベートし、フローサイトメトリー（ＢＤ  ＬＳＲ  ＩＩ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって分析した。
【０３０１】
透過性線維呼吸
透過性線維を、いくつかの修正を加えて公開されたプロトコルに従って調製した（Ｋｕｚｎｅｔｓｏｖら、２００８、Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ  ３、９６５〜９７６）。手短に言えば、ヒラメ筋及び長指伸筋（ＥＤＬ）を腱間で切り開いて氷冷単離緩衝液Ａ（Ｋｕｚｎｅｔｓｏｖら、２００８、Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ  ３、９６５〜９７６）に入れ、高解像度呼吸測定用に線維を直ちに調製した。線維束（約３ｍｇ湿重量）を４℃で２０分間サポニン５０μｇ／ｍｌで処置し、その後、冷呼吸培地Ｂ（０．５ｍＭ  ＥＧＴＡ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ、２０ｍＭタウリン、１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．１％ＢＳＡ、１５ｍＭラクトビオン酸カリウム、１１０ｍＭマンニトール、０．３ｍＭジチオトレイトール、ｐＨ７．１）で洗浄した。ミトコンドリア呼吸鎖機能を、１０ｍＭグルタマート及び５ｍＭマラート、２ｍＭ  ＡＤＰ、０．５μＭロテノン、１０ｍＭスクシナート、５μＭアンチマイシンＡ、０．５ｍＭ  Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−フェニレンジアミン二塩酸塩（ＴＭＰＤ）及び２ｍＭアスコルバート、１０μＭシトクロムｃを連続添加して、公開されているプロトコル（Ｋｕｚｎｅｔｓｏｖら、２００８、Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ  ３、９６５〜９７６）に従って、３７℃で呼吸媒体Ｂ中インサイツでクラーク型電極（Ｒａｎｋ  Ｂｒｏｔｈｅｒｓ  Ｌｔｄ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、英国）で分析した。線維をポーラログラフィー後に採取し、結果を湿重量１ｍｇ当たり１分当たりの酸素のナノモルとして表した。ミトコンドリア膜の完全性を、シトクロムｃ放出試験によって確認した。
【０３０２】
酵素活性アッセイ
四頭筋を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｐＨ７．４中で１：１９（ｗ／ｖ）でホモジナイズした。ホモジネートを３回の凍結−融解サイクルに供し、４℃で７０００ｇで１０分間遠心分離した。以前記載されたように（Ｔｕｒｎｅｒら、２００９、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５８、２５４７〜２５５４）、上清を使用して、クエン酸シンターゼ（ＣＳ）及びコハク酸デヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ）についての活性を決定した。筋肉切片のシトクロムｃオキシダーゼ染色を、公開されているプロトコル（Ｒｏｓｓ、２０１１、Ｊ  Ｖｉｓ  Ｅｘｐ、ｅ３２６６）に従って行った。手短に言えば、四頭筋の２０μｍクライオスタット切片を、３７℃で４０分間、ＰＢＳ中シトクロムｃ（０．１ｍＭ、Ｓｉｇｍａ）、カタラーゼ（２μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）及び３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ、０．０５％、Ｓｉｇｍａ）と共にインキュベートした。スライドをアルコールで脱水し、キシレンで清澄化し、次いで、ＤＰＸ（Ｇｒａｌｅ  ＨＤＳ）でマウントした。
【０３０３】
ＮＡＤ＋測定
製造業者の指示に従って、市販のキット（ＮＡＤ−ＮＡＤＨ  Ｇｌｏ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ＥＣ及び筋肉ホモジネート中のＮＡＤ＋レベル及びＮＡＤＨレベルを測定した。或いは、筋肉及び肝臓中のＮＡＤ＋レベルを、アッセイ自家開発法（Ｕｄｄｉｎら、２０１６、Ｆｒｏｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ７、２５８）によって測定した。手短に言えば、肝臓及び腓腹筋試料を抽出緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１０ｍＭニコチンアミド、ｐＨ７．４）中でホモジナイズし、次いで、遠心分離し（４℃で５分間、１２０００×ｇ）、その後、上清のアリコートをタンパク質定量化のために採取した。フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）及びクロロホルム抽出後、上清を２つのアリコートに分けた。一方は総ＮＡＤを測定するために使用した。他方はＨＣｌで酸性化し、次いで、氷上でＮａＯＨで中和してＮＡＤ＋を定量化した。試料を９６ウェルプレート中で混合した。試料をアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）と室温で混合した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｉｍａｒｋマイクロプレートリーダーを使用して総ＮＡＤＨ及びＮＡＤ＋を定量化した。
細胞培養、ＲＮＡｉノックダウン及びアデノウイルス感染
【０３０４】
プールしたヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）及びヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）をオーストラリアのＬｏｎｚａから購入し、５％ＣＯ２の加湿雰囲気下、３７℃で血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ヒドロコルチゾン、ヘパリン、硫酸ゲンタマイシンアムホテリシン、１％アスコルビン酸及び２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するＥＧＭ−２（Ｌｏｎｚａ、オーストラリア）中で増殖させた。ＭＳ１細胞（ＡＴＣＣ）を、５％ＣＯ２の加湿インキュベーター中、３７℃で１０％ＦＢＳ、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン及び１００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシンを補充した高グルコースＤＭＥＭ中で増殖させた。肺（ＭＬＥＣ）及び筋肉由来の一次マウスＥＣを、修正した公開されているプロトコル（ｖａｎ  Ｂｅｉｊｎｕｍら、２００８、Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ  ３、１０８５〜１０９１）に従って、ＥａｓｙＳｅｐ選択キット（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、単離及び精製した。ＥＣを、３％Ｏ２及び５％ＣＯ２で、３７℃でＥＧＭ−２培地（Ｌｏｎｚａ）中で培養した。Ｃ２Ｃ１２及びＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、５％ＣＯ２、３７℃で、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で増殖させた。ＰＧＣ−１αを発現するアデノウイルスでトランスフェクトしたＣ２Ｃ１２筋芽細胞を筋管に分化させ、次いで、馴化培地（ＣＭ）を４８時間収集した。
【０３０５】
ＨＵＶＥＣ及びＨＡＥＣを、製造業者のプロトコルに従って、Ｄｈａｒｍａｆｅｃｔ  ４（ＧＥ  Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）を使用して、ＳＩＲＴ１  ｓｉＲＮＡ（Ｌ−００３５４０−００−０００５、ＧＥ  Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）及びノンターゲティングスクランブル（Ｓｃｒ）ｓｉＲＮＡ（Ｄ−００１８１０−０１−０５、ＧＥ  Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）でトランスフェクトした。ＭＳ１細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、マウスＳＩＲＴ１（０００４１１、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を標的とするｅｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。製造業者のプロトコルに従って、ＨＵＶＥＣをＳＩＲＴ１又はＧＦＰアデノウイルス（ＡＢＭ  Ｉｎｃ．、カナダ）に感染させた。トランスフェクションの４８時間後に細胞をアッセイに使用した。
【０３０６】
ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ３及びＳＩＲＴ６の発現をサイレンシングするために、製造業者のプロトコルに従って、Ｄｈａｒｍａｆｅｃｔ  ４トランスフェクション試薬を使用して、ＥＣを検証済みのｓｉＲＮＡ二本鎖プール（ＯＮ−Ｔａｒｇｅｔｐｌｕｓ  ＳＭＡＲＴプール、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）でトランスフェクトした。ＯＮ−ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓノンターゲティング対照（ＮＴ）ｓｉＲＮＡを陰性対照として使用した。以前記載されたように（Ｇｏｍｅｓら、２０１３、Ｃｅｌｌ  １５５、１６２４〜１６３８）、ｐＬＫＯ．１  ｓｈＲＮＡを使用してＳＩＲＴ１サイレンシングを達成した。スクランブルｓｈＲＮＡをコードするｐＬＫＯ．１を陰性対照として使用した。ヒトＳＩＲＴ１又はＧＦＰを発現するアデノウイルスはＡｂｍｇｏｏｄ  Ｉｎｃ．から購入し、製造業者のプロトコルに従ってＥＣを形質導入した。
【０３０７】
ＥＣのＤｌｌ４及びＶＥＧＦ刺激．刺激するＥＣを一晩血清飢餓状態にし、ＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）を含有する培地又はＤｌｌ４被覆プレートに移し、次いで、指示された時間インキュベートした。Ｄｌｌ４コーティングは、以前記載されたように（Ｇｕａｒａｎｉら、２０１１、Ｎａｔｕｒｅ  ４７３、２３４〜２３８）行った。凍結乾燥した組換えＤｌｌ４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を０．１％ウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳ中で再構成した。培養皿を３７℃で１時間、０．１％ゼラチン溶液中Ｄｌｌ４（０．５μｇ／ｍＬ）でコーティングした。
【０３０８】
レンチウイルスｍｉＲＮＡベクターの構築
ＮＴ又はＳＩＲＴ１  ｍｉＲＮＡを発現するレンチウイルスを、記載されているように（Ｚｈａｎｇら、２０１３年、ＦＡＳＥＢ  Ｊ  ２７、４０４１〜４０５８）構築した。Ｌｅｎｔｉ−ＶＥ−Ｃａｄ  ｍｉＲＮＡプラスミドはＰａｔｔｙ  Ｊ．  Ｌｅｅ博士（エール大学）からの寛大な贈り物であった。ＢＬＯＣＫ−ｉＴ  ＲＮＡｉデザイナーツール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、マウスＳＩＲＴ１オープンリーディングフレーム（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０１９８１２．３）を標的とするプレｍｉＲＮＡ配列を設計した。ｍｉＲＮＡに対応するオリゴをアニーリングし、製造業者の指示に従ってｐｃＤＮＡ６．２−ＧＷ／ＥｍＧＦＰ−ｍｉＲベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に連結した。ｐｃＤＮＡ６．２−ＧＷ／ＥｍＧＦＰ−ｍｉＲ−ｎｅｇ対照プラスミドを対照として使用した。ＥｍＧＦＰ及びｍｉＲＮＡ配列を有する断片を、プライマー：センス、５’−ＡＧＧＣＧＣＧＣＣＴＧＧＣＴＡＡＣＴＡＧＡＧＡＡＣ−３’、及びアンチセンス、５’−ＧＡＡＴＴＣＴＡＴＣＴＣＧＡＧＴＧＣＧＧＣ−３’を使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。増幅断片をＡｓｃＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、次いで、Ｌｅｎｔｉ−ＶＥ−Ｃａｄ  ｍｉＲＮＡプラスミドのＡｓｃＩ及びＥｃｏＲＩ部位に挿入して、ＮＴ又はＳＩＲＴ１  ｍｉＲＮＡを発現するレンチウイルスプラスミドを作製した。全ての制限エンドヌクレアーゼは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから購入した。
【０３０９】
レンチウイルス作製
Ａｄｄｇｅｎｅによって記載されたプロトコルに従ってレンチウイルス粒子を作製した。手短に言えば、ＦｕＧＥＮＥ  ＨＤトランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ｐｓＰＡＸ２（Ｄｉｄｉｅｒ  Ｔｒｏｎｏからの贈り物、Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド番号１２２６０）、ｐＭＤ２．Ｇ（Ｄｉｄｉｅｒ  Ｔｒｏｎｏからの贈り物、Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド番号１２２５９）及びベクタープラスミドを２９３Ｔ細胞にコトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、ウイルスを収集し、超遠心分離によってＰＢＳ中約１×１０１２形質導入単位（ＴＵ）／ｍＬまで濃縮した。レンチウイルス滴定キットはタカラバイオ社から購入し、製造業者の指示に従って使用した。
【０３１０】
細胞増殖アッセイ
ＥＣ（０．１×１０５細胞）を４８ウェルプレートに播種し、完全増殖培地中でＰＢＳ（ビヒクル）又はＮＭＮ（５００μＭ）と共に４８時間インキュベートした。インキュベーション時間の最後に、細胞を収集し、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地に再懸濁した。フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国）を使用して細胞数を決定した。
【０３１１】
管形成アッセイ
管ネットワークの形成を、以前記載されたように（Ｂｏｒｒａｄａｉｌｅ及びＰｉｃｋｅｒｉｎｇ、２００９、Ａｇｉｎｇ  Ｃｅｌｌ  ８、１００〜１１２）評価した。ＥＣを、１５０μＬのＣｕｌｔｒｅｘ低増殖因子基底膜抽出物（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）でコーティングした２４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に、１ウェル当たり１００００個細胞で播種した。細胞に、ＶＥＧＦ（３０ｎｇ／ｍＬ）又はＦＧＦ（３０ｎｇ／ｍＬ）を含有するＣ２Ｃ１２ＣＭ又はＥＢＭ−２培地を補充した。言及する場合はいつでも、ＮＭＮ（０．５ｍＭ）及びＮａＨＳ（０．１ｍＭ）を培地に添加した。１８時間インキュベートした後、得られた管ネットワークを光学顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴｉＥ）によって分析した。Ｈ２Ｏ２処置による管形成アッセイのために、細胞を播種前に１時間１５０μＭ  Ｈ２Ｏ２と共にインキュベートし、１０時間インキュベートした後に画像化した。分岐点数及び細管ネットワークの全長をＩｍａｇｅＪソフトウェアによって定量化した。
【０３１２】
スフェロイドアッセイ
ＥＣスフェロイドは、以前記載されたように（Ｋｏｒｆｆ及びＡｕｇｕｓｔｉｎ、１９９８、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １４３、１３４１〜１３５２）作製した。ＥＣ（１スフェロイド当たり１０００個細胞）を、２０％メトセル（粘度：４０００ｃｐｓ、Ｓｉｇｍａ）を含有するＥＧＭ−２培地に懸濁し、非接着性丸底９６ウェルプレート（Ｓｉｇｍａ）に播種した。これらの条件下では、全ての懸濁細胞が単一スフェロイドの形成に寄与した。２４時間後にスフェロイドを収集し、コラーゲンゲルに包埋した。ＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）を含有するＣ２Ｃ１２ＣＭ又はＥＢＭ−２培地を添加することによって発芽を開始した。言及する場合はいつでも、ＮＭＮ（０．５ｍＭ）、ＮａＨＳ（０．１ｍＭ）、ＤＡＰＴ（２０μＭ、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）又はＳＵ５４１６（１０μＭ、Ｓｉｇｍａ）を培地に添加した。１群当たり８〜１０個のスフェロイドを分析して、各スフェロイドから成長した芽長を測定することによって、血管新生活性を定量化した。
【０３１３】
大動脈リングアッセイ
大動脈リングアッセイは、公開されているプロトコル（Ｂａｋｅｒら、２０１２、Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ  ７、８９〜１０４）に従って行った。手短に言えば、マウスの胸部大動脈を切除し、そしてＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地に移した。解剖顕微鏡下で鉗子及びメスを用いて全ての余分な脂肪、組織及び分岐血管を除去した。大動脈を約０．５ｍｍ幅のリングに切断し、３７℃／５％ＣＯ２でＯｐｔｉ−ＭＥＭ中でインキュベートすることによって一晩血清飢餓状態にした。翌日、各大動脈リングを９６ウェルプレートの５０μＬコラーゲンマトリックスに包埋し、３７℃／５％ＣＯ２で１時間インキュベートした。包埋後、ＶＥＧＦ（３０ｎｇ／ｍＬ）又はＦＧＦ（３０ｎｇ／ｍＬ）を含む又は含まないＦＢＳ（２．５％）を含有する１５０μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培養物をリングに補充し、３７℃／５％ＣＯ２で７日間インキュベートすることによって、血管発芽を刺激した。言及する場合はいつでも、ＮＭＮ（５００μＭ）を培地に添加し、３日毎に交換した。得られた芽をＢＳ１レクチン−ＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ）で染色し、蛍光顕微鏡を使用して画像化した。ＩｍａｇｅＪソフトウェアによって大動脈リングに由来する芽の数及び総面積を定量化した。
【０３１４】
細胞アポトーシスアッセイ
ＨＵＶＥＣをＰＢＳ（ビヒクル）、ＮａＨＳ（１００μＭ）、ＮＭＮ（５００μＭ）又はＮＭＮ＋ＮａＨＳで６時間処置し、引き続いてさらに４時間Ｈ２Ｏ２（６００μＭ）に曝露した。処置後、アネキシンＶ−ＦＩＴＣアポトーシス検出キット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を製造業者の指示に従って使用して、アポトーシス細胞数を決定した。手短に言えば、細胞をトリプシン処置及び１５００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって収集し、引き続いて細胞ペレットを冷ＰＢＳで２回洗浄し、細胞ペレットを１×アネキシン結合緩衝液に再懸濁した。次いで、５μＬのアネキシン−Ｖ  ＦＩＴＣを１９５μＬの細胞懸濁液に添加し、暗所で１５分間室温でインキュベートした。インキュベーション後、細胞を遠心分離し、１９５μＬの１×アネキシン結合緩衝液に再懸濁し、次いで、５μＬのヨウ化プロピジウム使用液を添加した。穏やかに混合した後、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、５３０ｎｍ及び５７５ｎｍの発光並びに４８８ｎｍの励起で蛍光強度を検出した。フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、５３０ｎｍ及び５７５ｎｍの発光並びに４８８ｎｍの励起でアネキシン−Ｖ及びＰＩ染色を検出した。
【０３１５】
創傷スクラッチアッセイ
コンフルエントな単層が形成されるまでＥＣを培養し、２００μＬのピペットチップを使用して引っ掻き傷を作った。次いで、細胞をＥＧＭ−２培地中＋／−ＮａＨＳ（０．１  ｍＭ）及び＋／−ＮＭＮ（０．５  ｍＭ）に６時間遊走させた。明視野倒立顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ２４６７）を使用して、２時間毎に同じ場所で画像を撮影した。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、間隙閉鎖面積を計算した。
【０３１６】
いくつかの実験では、ＨＵＶＥＣにＳｃｒ又はＳＩＲＴ１  ｓｉＲＮＡを形質導入し、コンフルエントな単層を形成するまで培養した。細胞をＨ２Ｏ２（１５０μＭ）に１時間曝露し、２００μＬのピペットチップを使用して引っ掻き傷を作った。次いで、細胞を、ＥＧＭ−２培地中ＰＢＳ（ビヒクル）、ＮａＨＳ（１００μＭ）及び／又はＮＭＮ（５００μＭ）を用いて６時間遊走させた。明視野倒立顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ２４６７）を使用して、２時間毎に同じ場所で画像を撮影した。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、間隙閉鎖面積を計算した。
【０３１７】
トランスウェル遊走アッセイ
走化性アッセイは、以前記載されたように（Ｏｏｍｍｅｎら、２０１１）行った。ＥＣを、０．２％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で一晩血清飢餓状態にし、次いで、３７℃で２時間、０．２％ＦＢＳを含むＤＭＥＭと予熱したＴｒａｎｓｗｅｌｌインサート（孔径８．０μｍ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）の上部区画に１インサート当たり２５０００〜５００００細胞の密度で蒔いた。細胞を蒔いた３０分後、下部区画の培地を走化性因子培地（１０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ及び０．２％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ、又は１％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ、又はＰＧＣ−１αのためのアデノウイルス発現構築物でトランスフェクトした分化Ｃ２Ｃ１２筋管から収集した馴化培地のいずれか）と交換した。ＨＵＥＶＣ及びＨＡＥＣを、ＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）又はＦＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する０．２％ＦＢＳを含むＥＢＭ−２培地（Ｌｏｎｚａ）で刺激した。言及する場合はいつでも、ＮＭＮ（０．５ｍＭ、Ｂｏｎｔａｃ  Ｂｉｏ−Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、中国）及びＮａＨＳ（０．１ｍＭ、Ｓｉｇｍａ）を走化性因子培地に添加した。トランスウェルインサートの下部区画へのＥＣの遊走を１８時間〜２４時間後に測定した。遊走ＥＣを、室温で２０分間、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドで固定し、綿棒を使用して上部区画に残っている細胞を除去した。トランスウェル膜をＴＢＳＴ中５％ＢＳＡでブロックし、次いで、ＴＢＳＴ中ファリオイジン−ＦＩＴＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で４時間染色してフィラメント状アクチンを可視化した。トランスウェルインサートをＰＢＳＴ中で３回洗浄し、ＤＡＰＩ封入剤（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）を用いてスライド上に載せた。蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して画像を取得した。遊走細胞数の定量化は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、各トランスウェル膜の４つのランダムフィールド上で行った。
【０３１８】
ＨＵＶＥＣを、３７℃で１時間、０．２％ＦＢＳを含むＥＢＭ−２と予熱したＴｒａｎｓｗｅｌｌインサート（孔径８．０μｍ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）の上部区画に１インサート当たり５００００細胞の密度で蒔いた。３０分後、下部区画の培地をＮＭＮ（５００μＭ）及び／又はＶＥＧＦ（３０ｎｇ／ｍＬ）を含有するＥＢＭ−２培地と交換した。６時間後に細胞の遊走を測定した。遊走した細胞を上記のように処置及び分析した。
【０３１９】
Ｓｅａｈｏｒｓｅ分析
Ｓｅａｈｏｒｓｅ  ＸＦ９６分析器（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、製造業者の指示に従って酸素消費速度を測定した。手短に言えば、４００００個のＨＵＶＥＣをＸＦ９６プレート上に蒔き、３７℃／５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。翌日、培地をグルコース（１ｇ／Ｌ）、グルタマート（２ｍＭ）及びピルバート（１ｍＭ）を補充したＸＦアッセイ培地（ＤＭＥＭ）と交換し、ｐＨを７．４に調整した。実験開始時に、ＮａＨＳ（１００μＭ）及び／又はＮＭＮ（５００μＭ）を添加した。基本条件下で約８分毎、及びオリゴマイシン（１μＭ）の添加後に、酸素消費量測定を行った。実験を６つのウェルで繰り返し、各実験条件について平均した。
【０３２０】
免疫蛍光
新たに単離した全四頭筋及び腓腹筋試料を、ＯＣＴコンパウンド（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ）にマウントし、イソペンタン浴に入れ、液体窒素中でゆっくり冷却した。クライオスタット（Ｌｅｉｃａ）上で２０μｍ厚の横断面切片を切断した。切片を予冷アセトン（−２０℃）中で１０分間固定し、ＰＢＳで洗浄した。次いで、スライドをＰＢＳＴ（０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含むＰＢＳ）中の正常ヤギ血清及び５％ブロッキング試薬（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）中、室温で１時間ブロッキングし、次いで、ブロッキング緩衝液に希釈した抗ＣＤ３１（ａｂ５６２９９、Ａｂｃａｍ）及び抗ラミニン（Ｌ９３９３、Ｓｉｇｍａ）、ＧＦＰ（ａｂ６５５６、Ａｂｃａｍ）又はＳＩＲＴ１（ＨＰＡ００６２９５、Ｓｉｇｍａ）抗体と４℃で一晩インキュベートした。スライドをＰＢＳＴで洗浄し、次いで、ブロッキング緩衝液に１：５００に希釈した抗ラットＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８コンジュゲート（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び抗ウサギＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４コンジュゲート（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）抗体と室温で２時間インキュベートした。スライドをＰＢＳＴで再度洗浄し、ＤＡＰＩ封入剤（Ｓｉｇｍａ）を含むＦｌｕｏｒｏｓｈｉｅｌｄを用いてマウントした。共焦点蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ａ１）を使用して画像を取得した。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、毛細血管及び毛細管密度の定量化を行った。製造業者のプロトコルに従って、インサイツＢｒｄＵ−Ｒｅｄ  ＤＮＡ断片化（ＴＵＮＥＬ）アッセイキット（Ａｂｃａｍ）を使用して、筋肉切片でＴＵＮＥＬ染色を行った。
【０３２１】
Ｈ＆Ｅ（ヘマトキシリン及びエオシン）染色
凍結切片を固定した後、試料を０．１％ヘマトキシリン（Ｓｉｇｍａ）で１０分間染色し、ｄＨ２Ｏですすぎ、Ｓｃｏｔｔの青色溶液で１分間染色し、次いで、ｄＨ２Ｏで洗浄した。次いで、切片をエオシンに３分間浸漬し、アルコールで脱水し、キシレンで清澄化した。スライドをＤＰＸ（Ｇｒａｌｅ  ＨＤＳ）を用いてマウントした。
【０３２２】
ＰＣＲ分析
ＳＩＲＴ１−ｉＫＯマウス及び対照マウスから尾又は組織の小片を得て、５０μＬのアルカリ溶解試薬（２５ｍＭ  ＮａＯＨ、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ１２）をそれぞれに添加した。試料を１００℃で１時間インキュベートした。冷却後、５０μＬの中和試薬（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ５）をそれぞれに添加し、混合した。約２μＬの上清をＰＣＲに使用して、プライマーＳｉｒ２Ａ６８６０（ＣＡＴＧＴＡＡＴＣＴＣＡＡＣＣＴＴＧＡＧ）及びＳｉｒ２Ａ６１７１（ＧＣＣＣＡＴＴＡＡＡＧＣＡＧＴＡＴＧＴＧ）を使用してＳＩＲＴ１遺伝子の切除を検出した。
【０３２３】
ＲＮＡ分析
ＴＲＩｚｏｌ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して細胞及び組織から全ｍＲＮＡを単離した。Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｂｉｏｒａｄ）を使用して１μｇの全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。製造業者の指示に従ってＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０システム（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ  Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（Ｒｏｃｈｅ）でｑＰＣＲを行った。ΔΔＣｔ法を使用して相対ｍＲＮＡ発現レベルを計算した。ｑＰＣＲ増幅反応に使用した順方向及び逆方向プライマー配列を表１に示す。
【０３２４】
【表１】
2020504722.tif 000006
【０３２５】
ウエスタンブロット法
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット解析を標準的な手順に従って行い、ＥＣＬ検出キット（Ｂｉｏ−ｒａｄ、オーストラリア）で検出した。ウエスタンブロット解析のために、ＳＩＲＴ１（Ｓｉｇｍａ）、ＳＩＲＴ３（ＣＳＴ）、ＳＩＲＴ６（ＳａｎｔａＣｒｕｚ）、ｅＮＯＳ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ又はＣＳＴ）、切断型Ｎｏｔｃｈ１（ＣＳＴ）、全ＯＸＰＨＯＳカクテル（Ａｂｃａｍ）、ＰＧＣ−１α（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＶＥＧＦ（Ａｂｃａｍ）、ＶＥＧＦＲ２（Ａｂｃａｍ）、ホスホ−ＶＥＧＦＲ２（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、アクチン（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、チューブリン（Ｓｉｇｍａ）、１４−３−３（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＧＡＰＤＨ（ＳａｎｔａＣｒｕｚ）に対する抗体を使用した。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用してデンシトメトリーによるバンド強度の定量化を行った。
【０３２６】
統計解析
データを平均±標準偏差として提示する。統計学的有意性を、両側スチューデントのｔ検定、ボンフェローニの多重比較検定による一元又は二元配置分散分析を使用して行った。統計学的検定を、Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して行った。０．０５未満のｐ値を統計学的に有意であると見なした。
【０３２７】
結果
哺乳動物の老化の最も確かであるが有害な側面の１つは骨格筋への血流の減少である。これと一致して、２０月齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの骨格筋内の内皮細胞（ＥＣ）及び毛細血管の存在量は、６月齢と比較して有意に低く（図１Ａ及び図１Ｂ）。トレッドミル試験で消費される時間と消耗までの距離によって決定されるその運動能力もまた低かった（図２Ａ及び図２Ｂ）。さらに、２０月齢マウスの腓腹筋組織及び四頭筋組織内の毛細血管数及び毛細血管密度は、６月齢マウスの毛細血管数及び毛細血管密度と比較して有意に減少していた（図３Ａ〜図３Ｄ）。
【０３２８】
毛細血管密度の減少についての可能性のある説明は、血管新生能の低下であった。これを試験するために、若齢マウス及び老齢マウスのマウス肺内皮細胞（ＭＬＥＣ）に対して一連のインビトロ血管新生アッセイを行った。ＭＬＥＣを、ＰＧＣ−１α過剰発現Ｃ２Ｃ１２筋管によって提供される血管新生因子を含む馴化培地（ＣＭ）の存在下で培養した（Ａｒａｎｙら、２００８、Ｎａｔｕｒｅ  ４５１、１００８〜１０１２）。若齢マウスのものと比較して、２０月齢マウスのＭＬＥＣは、分岐点数及び管長によって測定されるように、遊走能力が低下し（図４Ａ）、毛細血管様構造を形成する能力が低下していた（図４Ｂ〜図４Ｄ）。同様に、コラーゲンゲルに包埋し、血管新生因子で刺激すると、老齢ＭＬＥＣからのＥＣスフェロイドは、若齢マウスからのものよりもゲルマトリックスに侵入する芽様成長が短かった（図５Ａ及び図５Ｂ）。
【０３２９】
マウスの内皮ＳＩＲＴ１の特異的欠失は毛細血管密度及び持久力に対する老化の効果を模倣する
ＳＩＲＴ１は生後成長中の血管新生の重要な調節因子であるが、それが晩年の血管維持及び血管新生に必要であるかどうかは知られていない。これを試験するために、マウスの内皮細胞でＳＩＲＴ１をノックアウト及び過剰発現させ、老化させた。具体的には、マウスを老化させる前に、マウスのＥＣにおいてＳＩＲＴ１をノックアウト又は過剰発現させるために、Ｔｉｅ２プロモーター駆動Ｃｒｅ系統（Ｔｉｅ２−Ｃｒｅ）を使用した。
【０３３０】
Ｔｉｅ２プロモーターが内皮細胞特異的であるかどうかを試験するために、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス系統をｆｌｏｘｅｄ  Ｔｏｍａｔｏ蛍光タンパク質（ｍＴ）ＥＧＦＰマウス系統と交雑させた（ｍＴ−ＳＴＯＰｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ、Ｇｆｐ）（Ｋｏｎｉら、２００１）（図６Ａ）。このマウスは、膜標的Ｔｏｍａｔｏ蛍光タンパク質（ｍＴ）を偏在的に発現し、Ｃｒｅが存在する場合はいつでも緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）を発現するように特異的に設計されている（Ｍｕｚｕｍｄａｒら、２００７）。ｍＴ−ＳＴＯＰｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ、Ｇｆｐ対照マウスでは、ｍＴが、隣接筋線維の周辺並びに腓腹筋及び四頭筋の横断面の周囲間質細胞で発現され、ＥＧＦＰの証拠はなかった（図６Ｂ、図７Ａ及び図７Ｂ）。Ｔｉｅ２Ｃｒｅ；Ｇｆｐマウスでは、ＣＤ３１染色と一致して、ＥＧＦＰが、毛細血管がある隣接筋線維の細胞外マトリックスにおいてのみ明らかであった（図７Ａ及び図７Ｂ）。同様の発現が脛骨筋及びヒラメ筋断面においても観察され、骨格筋での毛細血管特異的発現が確認された。心臓及び肺の断面におけるＧＦＰとＣＤ３１との間の重複（図８Ａ及び図８Ｂ）により、Ｔｉｅ２駆動Ｃｒｅが骨格筋、心臓及び肺組織の毛細血管で特異的に発現されることが確認された。
【０３３１】
Ｔｉｅ２−Ｃｒｅマウスを、ｌｏｘＰ部位がＳＩＲＴ１のエクソン４に隣接しているｆｌｏｘｅｄ  ＳＩＲＴ１系統と交雑させることによって、内皮ＳＩＲＴ１ノックアウトマウス（遺伝子型Ｔｉｅ２−Ｃｒｅ；ＳＩＲＴ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ）又は「ＥＳＫＯマウス」を作製した（図９Ａ）（Ｐｏｔｅｎｔｅら、２００７、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ２１、２６４４〜２６５８；Ｖａｓｋｏら、２０１４、Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  ２５、２７６〜２９１；Ｗｅｎら、２０１３、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １１０、Ｅ２４２０〜２４２７；Ｐｅａｒｓｏｎら、２００８、Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ  ８、１５７〜１６８）。
【０３３２】
ＥＳＫＯマウスは、明白な発達上又は身体上の異常なしに、予想されるメンデル比で生まれた。骨格筋から単離されたＥＣ（図９Ｂ）並びに四頭筋、肺及び胸腺組織（図９Ｃ、図９Ｄ及び図９Ｅ）で、ＳＩＲＴ１エクソン４のＥＣ特異的欠失が確認された。次いで、それぞれ抗ＣＤ３１抗体及び抗ラミニン抗体を使用して、四頭筋の横断面を免疫染色して、毛細血管及び線維周囲の基底層を可視化した（Ｃｅｂａｓｅｋら、２００４、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  ４８、１５１〜１５８）。その高い毛細管密度及び運動への周知の適応のために、調査を筋肉の中央部に限定した（Ｃｈｉｎｓｏｍｂｏｏｎら、２００９  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０６、２１４０１〜２１４０６）。興味深いことに、６月齢のＥＳＫＯマウスの毛細血管の密度及び数は、同齢対照野生型（ＷＴ）対照マウスと比較して有意に低かった（図１０Ａ及び図１０Ｂ）。腓腹筋の同様の分析によっても、対照同腹仔と比較して、ＥＳＫＯマウスの腓腹筋の中央部における毛細血管密度及び数の減少が明らかになった（図１０Ｃ及び図１０Ｄ）。
【０３３３】
ＷＴマウスと比較したＥＳＫＯマウスの肉眼的分析によって、遺伝子型間で全体重、空腹時血糖値、尿クレアチニン、筋肉重量、心臓重量、筋肉形態、及び運動協調性に差がないことが明らかになった（図１１Ａ〜図１１Ｃ）。ＥＳＫＯマウスで毛細血管数が少なかったことを考えると、運動能力が低い可能性があると仮定した。初期馴化段階の後、ＷＴマウス及びＥＳＫＯマウスを１３〜３０ｍ／分の範囲で速度を徐々に増加させる高強度持久力試験に供した。ＥＳＫＯマウスはＷＴマウスと比較して運動能力がかなり低く、トレッドミルでＷＴ同腹仔の半分しか走らず、走った距離が半分であった（図１２Ａ）。運動後血清乳酸レベルがより高くなる傾向も見られた（図１２Ｂ）（ｐ＝０．０５５）。
【０３３４】
運動能力の差は、一般に、筋線維の種類の変化（Ｐｅｔｔｅ及びＳｔａｒｏｎ、２０００、Ｍｉｃｒｏｓｃ  Ｒｅｓ  Ｔｅｃｈ  ５０、５００〜５０９）又はミトコンドリア含量の変化（Ｌｉｎら、２００２、Ｎａｔｕｒｅ  ４１８、７９７〜８０１）に起因する。ＥＳＫＯマウスとＷＴマウスの腓腹筋及び四頭筋の比較は、線維型（図１３Ａ）ミトコンドリア活性（図１３Ｂ）に有意な差を示さず、ＥＳＫＯマウスの運動能力の低下は毛細血管密度の低下によるものであることを示した。
【０３３５】
内皮ＳＩＲＴ１は運動誘導血管新生に必要である
若齢個体では、運動が血管新生の強力な刺激因子であるが、この効果は知られていない理由で年齢の増加とともにかなり弱まる。血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、骨格筋血管新生を刺激する血管新生の重要な調節因子である（Ａｒａｎｙら、２００８、Ｎａｔｕｒｅ  ４５１、１００８〜１０１２）。ＳＩＲＴ１が、ＶＥＧＦが血管新生を刺激するのに必要であるかどうかを決定するために、一連のインビトロ及びエキソビボアッセイを行った。最初に、ＲＮＡｉを使用してＳＩＲＴ１をヒト臍静脈ＥＣ（ＨＵＶＥＣ）でノックダウンし（図１４Ａ）、次いで、ビヒクル又はＶＥＧＦ（３０ｎｇ／ｍＬ）で処置し、成長因子減少マトリゲル上に管様ネットワークを形成する能力について試験した（図１４Ｂ及び図１４Ｃ）。図１４Ｂ及び図１４Ｃに示されるように、分岐点数及び細管の全長の減少によって示されるように、ＳＩＲＴ１のノックダウンは、ＶＥＧＦがＨＵＶＥＣにおける管形成を刺激する能力を有意に減少させた。１８月齢のＷＴマウス及びＳＩＲＴ１ノックアウトマウス（ＳＩＲＴ１−ｉＫＯ）の胸部大動脈から採取した大動脈リングの外植片培養物を増殖させることによって、ＶＥＧＦの非存在下又は存在下で、三次元（３Ｄ）コラーゲンマトリックスにおけるエキソビボ血管新生アッセイも行った（図１５Ａ）（Ｇｏｍｅｓら、２０１３、Ｃｅｌｌ  １５５、１６２４〜１６３８；Ｐｒｉｃｅら、２０１２、Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ  １５、６７５〜６９０）。ＶＥＧＦ処置は、ビヒクル処置単独と比較して大動脈リングの発芽を増加させ（図１５Ｂ及び図１５Ｃ）、これはＳＩＲＴ１欠失によって２倍減少した（図１５Ｃ）。ＳＩＲＴ１は、ＨＵＶＥＣ中のＶＥＧＦ  ｍＲＮＡ（図１６Ｂ）のレベルにも血清中のＶＥＧＦタンパク質（図１６Ｃ）のレベルにも明らかな効果を及ぼさなかった。まとめると、これらの結果は、ＳＩＲＴ１が、ＶＥＧＦが血管新生を効率的に促進するために必要であることを示した。
【０３３６】
運動後、筋線維はＶＥＧＦを分泌することによって血管新生促進シグナルをＥＣに送る（Ｂｏｏｔｈ及びＴｈｏｍａｓｏｎ、１９９１、Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ  ７１、５４１〜５８５；Ｒｏｗｅら、２０１４、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １２９、７９８〜８１０）。内皮ＳＩＲＴ１が筋芽細胞−ＥＣコミュニケーションに必要であるかどうかを試験するために、ＶＥＧＦ又はマウスＣ２Ｃ１２筋管からの馴化培地をマウス由来不死化ＭＳ１ＥＣに添加するインビトロトランスウェル遊走アッセイを行った（Ａｒｂｉｓｅｒら、２０００、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １５６、１４６９〜１４７６）。驚くべきことに、ＳＩＲＴ１のノックダウン（図１６Ｄ）は、ＶＥＧＦ及びＣ２Ｃ１２馴化培地に対するＭＳ１細胞の走化性応答をほぼ完全に無効にした（図１６Ａ）。これらのデータは、内皮ＳＩＲＴ１が、運動後の筋肉微小血管系のリモデリングを促進する筋線維−ＥＣコミュニケーションの重要なメディエータであり得ることを示唆した。
【０３３７】
本発明者らは、若齢誘導性ＳＩＲＴ１ノックアウトマウス（ＳＩＲＴ１−ｉＫＯ）（Ｐｒｉｃｅら、２０１２）を４週間のトレッドミル訓練パラダイムに供した。ＳＩＲＴ１欠失直後は、毛細管数にも密度にも差はなかった。しかしながら、４週間の運動訓練後、ＳＩＲＴ１−ｉＫＯマウスの四頭筋内の毛細血管数及び毛細血管密度は、ＷＴマウスと比較した座ったままのマウスのものよりも１．４倍高く、座ったままのマウスより２倍高く（図１７Ａ及び図１７Ｂ）、ＳＩＲＴ１が運動誘導性筋肉血管新生に必要であることを示した。
【０３３８】
ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマコアクチベーター１（ＰＧＣ−１α）は、筋細胞におけるミトコンドリア機能の増強におけるその役割について知られているが、それは、ＥＣリモデリング及び血管新生を誘導するためのＶＥＧＦの分泌を誘導することによって血管新生において同様に重要な役割を有するようである（Ｂｏｏｔｈ及びＴｈｏｍａｓｅｎ  １９９１、Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ  ７１、５４１〜５８５；Ｒｏｗｅら２０１４、Ａｒａｎｙら、２００８）。実際、骨格筋においてＰＧＣ−１αを欠くマウスは運動誘導血管新生の能力を欠いている（Ｃｈｉｎｓｏｍｂｏｏｎら、２００９）一方、筋肉においてＰＧＣ−１ａを過剰発現しているマウス（ＭＣＫ−ＰＧＣ−１ａ）は筋肉におけるミトコンドリア及び毛細血管含量が増加しており、全体的な動物の持久力が増加している（Ｚｉｎら  ２００２）。
【０３３９】
ＳＩＲＴ１がこの経路において役割を果たすかどうかを試験するために、筋肉内のミトコンドリア、毛細血管含量の増加及びより大きな持久力のために運動模倣剤と考えられているＰＧＣ−１α過剰発現マウス系統（ＭＣＫ−ＰＧＣ−１α）のＥＣ又は筋細胞のいずれかでＳＩＲＴ１を欠失させた（図１８Ａ）（Ｌｉｎら、２００２）。ミトコンドリアタンパク質レベルに効果がないにもかかわらず（図１８Ｂ）、ＭＣＫ−ＰＧＣ−１α；ＥＳＫＯマウスは、ＭＣＫ−ＰＧＣ−１α；ＷＴマウスと比較して毛細血管数及び毛細血管密度が有意に減少し（図１８Ｃ及び図１８Ｄ）、内皮ＳＩＲＴ１がＰＧＣ−１α誘導血管新生の重要なメディエータであることを示した。
【０３４０】
これが内皮特異的効果であるかどうかを試験するために、ＳＩＲＴ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスをＭｙｏｇ−Ｃｒｅマウス（Ｃｈａｌｋｉａｄａｋｉら、２０１４、ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ  １０、ｅ１００４４９０）と交雑させることによって、骨格筋筋細胞においてＳＩＲＴ１が欠失した筋細胞特異的ＳＩＲＴ１ノックアウトマウス（ＭＳＫＯ）系統を作製した。興味深いことに、筋肉特異的ＳＩＲＴ１ノックアウトマウスと対照マウスとの間で毛細血管数に差はなかった。次いで、本発明者らは、ＭＳＫＯ系統とＭＣＫ−ＰＧＣ−１αマウスを交雑させた。図１９Ａに示されるように、筋細胞におけるＳＩＲＴ１の存在又は非存在は、ＰＧＣ−１αで誘導される毛細血管数に差を生じさせなかった。まとめると、これらのデータは、骨格筋の筋細胞ではなく、内皮細胞のＳＩＲＴ１が、筋線維に由来するＰＧＣ−１α誘導血管新生促進シグナルの重要な下流メディエータであることを示している。
【０３４１】
生理学的レベルで、内皮ＳＩＲＴ１を欠失させるが筋細胞ＳＩＲＴ１を欠失させないことの効果は明らかに自明であった。持久力試験では、ＭＣＫ−ＰＧＣ−１α；ＥＳＫＯマウスが、ＭＣＫ−ＰＧＣ−１αマウスと比較して半分だけしか走らなかった（図１９Ｂ）が、ＭＣＫ−ＰＧＣ−１α−ＳＩＲＴ１筋細胞特異的ノックアウトマウスでは運動能力の統計学的に有意でない低下が観察された（図１９Ｃ）。よって、ミトコンドリア機能が既により高い場合でさえ、内皮細胞のＳＩＲＴ１は、ＰＧＣ−１αがマウスにおける運動耐性を改善するために必要とされ、持久力における血管系ＳＩＲＴ１の重要な役割を強調している。まとめると、これらのデータは、ＳＩＲＴ１が、ＥＣが筋線維から血管リモデリングシグナルを受信して筋肉の毛細血管密度及び持久力を増加させるのに必要であるというモデルを支持する。
【０３４２】
よって、筋毛細血管の増加は、ミトコンドリア機能が増加したマウスの運動耐性をさらに改善することができ、持久力における血管系の重要な役割を強調している。結論として、インビトロとインビボ両方のデータが、ＳＩＲＴ１が、内皮細胞が筋線維から血管リモデリングシグナルを受信して筋肉の毛細血管密度及び持久力を増加させるのに必要であるというモデルを支持する。
【０３４３】
ＳＩＲＴ１は筋細胞からＥＣへの血管新生促進成長因子シグナル伝達に必要である
ＥＣ  ＳＩＲＴ１が応答する特定のシグナルを調査するために、ＷＴマウス及びＥＳＫＯマウス由来のＭＬＥＣを使用して、インビトロトランスウェル遊走及びスフェロイドアッセイを行った。ＳＩＲＴ１を有さないＭＬＥＣは、走化性応答が鈍くなり（図２０Ａ）、管形成が減少し（図２０Ｂ及び図２０Ｃ）、ＥＣスフェロイド芽長がより短くなった（図２０Ｄ及び図２０Ｅ）。運動後のＥＣ複製及び遊走の刺激は、ＶＥＧＦ及び塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を含むいくつかの血管新生促進因子を含む（Ａｒａｎｙら、２００８）。成長因子がＥＣ  ＳＩＲＴ１活性を必要とするかどうかを決定するために、三次元（３Ｄ）コラーゲンマトリックス中でのエキソビボ血管新生アッセイを利用した。野生型マウス及びＳＩＲＴ１−ｉＫＯマウスの外植片胸部大動脈リング培養物をＶＥＧＦ又はＦＧＦのいずれかに曝露した（図２１Ａ〜図２１Ｄ）。これらの用量では、ＶＥＧＦによる発芽の程度がＦＧＦによる発芽の程度よりも大きい（図２１Ａ及び図２１Ｂ）。ＶＥＧＦ処置とＦＧＦ処置の両方が発芽を増加させたが、この効果はＳＩＲＴ１を欠く大動脈リングで減少した（図２１Ａ〜図２１Ｄ）。下流シグナル伝達におけるＳＩＲＴ１の役割についてのさらなる試験として、レンチウイルス媒介ＲＮＡｉを使用してＳＩＲＴ１をノックダウンしたヒト大動脈ＥＣ（ＨＡＥＣ）を、成長因子減少マトリゲル上で管様ネットワークを形成する能力について試験した。ＳＩＲＴ１のノックダウンは、分岐点数及び細管長の減少によって示されるように、ＶＥＧＦ及びＦＧＦが管形成を刺激する能力を低下させた（図２２Ａ及び図２２Ｂ）。ＳＩＲＴ１ノックダウンはまた、成長因子誘導性のＨＡＥＣの遊走も廃止した（図２２Ｃ）。両方の場合において、ＶＥＧＦの効果はＦＧＦの効果よりも有意に大きかった。ＳＩＲＴ１は、ＥＣ中のＶＥＧＦ  ｍＲＮＡ（図２２Ｄ）のレベルにも血清中のＶＥＧＦタンパク質（図２２Ｅ）のレベルにも明らかな効果を及ぼさなかった。これらのデータは、内皮ＳＩＲＴ１が筋線維とＥＣとの間の運動誘導性ＰＣＧ−１α−ＶＥＧＦシグナル伝達の重要な下流メディエータであるというモデルを支持する。
【０３４４】
内皮のＳＩＲＴ１過剰発現は骨格筋毛細血管密度及び運動能力を増加させる
内皮ＳＩＲＴ１がマウスにおける血管リモデリング及び持久力の増加に必要であることを示したので、本発明者らはその存在量又は活性の増加がこれらの変化を誘発するのに十分であるかどうか疑問に思った。Ｔｉｅ２Ｃｒｅマウスを、以前作製した（Ｆｉｒｅｓｔｅｉｎら、２００８、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ３、ｅ２０２０）ｆｌｏｘｅｄ  ＳＩＲＴ１トランスジェニックマウス系統（ＳＩＲＴ１ＳＴＯＰ）と交雑させることによって、内皮細胞特異的ＳＩＲＴ１過剰発現又は「ＥＳＴＯ」マウスの系統を確立した（図２３Ａ）。四頭筋並びに肺及び胸腺などの毛細血管が豊富な組織のウエスタンブロット解析によって、ＳＩＲＴ１が、同腹仔対照と比較してＥＳＴＯマウスで過剰発現していることが確認された（図２３Ｂ）。骨格筋の免疫組織化学により、ＳＩＲＴ１の過剰発現が毛細血管に特異的であることが確認された（図２３Ｃ）。ＥＳＫＯマウスと同様に、ＥＳＴＯマウスは予想されるメンデル比で生まれ、明らかな異常はなかった。体重、尿クレアチニンレベルに関して、及びロータロッド試験において、ＥＳＴＯマウスとＳＩＲＴ１ＳＴＯＰマウスとの間に有意な差は観察されなかった（図２３Ｄ）。筋肉重量（図２４Ａ）、筋肉形態（図２４Ｂ）、線維組成（図２４Ｃ）及び酸化的代謝（図２４Ｄ）も系統間で同様であった。興味深いことに、ＥＳＴＯマウスの血糖値はＳＩＲＴ１ＳＴＯＰマウスと比較して著しく低く（図２４Ｅ）、内皮ＳＩＲＴ１もグルコース取り込みを促進する又は糖新生を抑制し得ることを示している。
【０３４５】
ＥＳＴＯマウスの四頭筋の調査によって、同腹仔対照と比較して１．５倍高い毛細血管密度及び毛細血管数の２倍の増加が明らかになり（図２５Ａ及び図２５Ｂ）、腓腹筋の同様の増加も明らかになった（図２５Ｃ及び図２５Ｄ）。これらの変化の生理学的効果があるかどうかを試験するために、６月齢のマウスを高強度トレッドミルプロトコルに供した。６月齢のＥＳＴＯマウス及び同腹仔対照がＷＴ対照と比較してかなり高い運動能力を有し、トレッドミルで１．８倍長く走り、１．９倍の消耗前距離をカバーすることが確立された（図２６Ａ）。ＥＳＴＯマウスはさらに長く走ったのに、ＥＳＴＯマウスの運動後血清乳酸レベルも対照マウスより有意に低かった（図２６Ｂ）。よって、ＥＣのＳＩＲＴ１を増加させることが骨格筋の毛細血管密度だけでなく、動物の運動耐性も増加させるのに十分である。
【０３４６】
上記の機能喪失及び機能獲得研究によって、内皮ＳＩＲＴ１が筋細胞からの血管新生シグナルの下流メディエータであることが示された。これが正しければ、内皮ＳＩＲＴ１の発現又は活性を増加させるとこれらのシグナルが増強されるはずである。ＭＬＥＣにおけるＳＩＲＴ１の過剰発現は、走化性因子勾配に対する細胞運動性（図２７Ａ）、並びに馴化培地での管形成及びＥＣスフェロイドの芽長（図２７Ｂ、図２７Ｃ、図２８Ａ及び図２８Ｂ）の両方を増加させた。
【０３４７】
上記の本発明者らの研究によって、内皮ＳＩＲＴ１が筋細胞からのＶＥＧＦシグナル伝達の下流メディエータであることが示された。これが正しければ、内皮ＳＩＲＴ１の発現又は活性を増加させるとＶＥＧＦの効果が増強されるはずである。これを試験するために、ＶＥＧＦの存在下又は非存在下（３０ｎｇ／ｍＬ）で、ＳＩＲＴ１  ｃＤＮＡ（ａ．ａ．１９４〜７４７）を発現するアデノウイルス又はＧＦＰ対照に感染したＨＵＶＥＣで管形成アッセイを行った（図２９Ａ）。ＨＵＶＥＣにおけるＳＩＲＴ１の過剰発現は、対照細胞と比較して分岐点数を３３％及び総細管長を１５％増加させた（図２９Ｂ及び図２９Ｃ）。スフェロイド発芽アッセイでは、アデノ−ＳＩＲＴ１感染ＥＣが、ＶＥＧＦ刺激時に対照細胞と比較して１９％長い芽長をもたらした（図３０Ａ及び図３０Ｂ）。
【０３４８】
次いで、ＳＩＲＴ１過剰発現マウス（ＳＩＲＴ１−Ｔｇ）（Ｐｒｉｃｅら、２０１２）及びそれらのＷＴ同腹仔対照の大動脈から調製した大動脈リングを使用して、エキソビボ血管新生アッセイを行った（図３１Ａ）。ＷＴ同腹仔対照（図Ｓ４Ｎ）と比較して、ＶＥＧＦの存在下でインキュベートした場合、ＳＩＲＴ１過剰発現は、芽数を２倍にし、総芽面積を３倍にした（図３１Ｂ及び図３１Ｃ）。この結果は、ＥＳＴＯマウスがより高いＶＥＧＦ血清タンパク質レベルを有するという事実と合わせて（図３１Ｄ）、ＳＩＲＴ１活性化が筋細胞ＶＥＧＦに対して正のフィードバックを提供し得ることを意味する。どちらにしても、これらの結果は、内皮細胞のＳＩＲＴ１が、筋細胞からのＶＥＧＦ媒介シグナルに応答した骨格筋における毛細血管形成に必要かつ十分であるという強力な証拠を提供した。
【０３４９】
ＮＡＤ＋前駆体、ＮＭＮはＳＩＲＴ１仲介Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を阻害することによって血管新生を促進する
老化におけるＳＩＲＴ１の役割を考えると、本発明者らは老齢マウス及びヒトにおける運動反応性の喪失がＳＩＲＴ１又はその共基質ＮＡＤ＋のレベルの低下に起因し得ると仮定した（Ｇｏｍｅｓら、２０１３；Ｍａｓｓｕｄｉら、２０１２）。ＮＡＤ＋前駆体によるマウスの処置が、細胞内ＮＡＤ＋レベルを上昇させ、ＳＩＲＴ１活性を刺激することが知られている（Ｂｏｇａｎ及びＢｒｅｎｎｅｒ、２００８、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｎｕｔｒ  ２８、１１５〜１３０；Ｇｏｍｅｓら、２０１３；Ｙｏｓｈｉｎｏら、２０１１、Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ  １４、５２８〜５３６）。最初に、ＮＡＤ＋前駆体ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）がＳＩＲＴ１の存在下と非存在下の両方において、種々の細胞ベースのアッセイで血管新生を促進することができるかどうかを試験した。ＨＡＥＣのＮＭＮとＶＥＧＦの同時処置は、ＶＥＧＦ単独と比較して分岐点数の３２％の増加及び細管長の１５％の増加をもたらした（図３２Ａ及び図３２Ｂ）。ＮＭＮ自体が分岐点数を２５％増加させ、これはＮＭＮがＶＥＧＦなしでさえも血管新生を促進することができることを示している（図３２Ａ及び図３２Ｂ）。さらに、ＨＡＥＣのＮＭＮ処置は用量依存的に分岐点数及び管全長を着実に増加させた（図３２Ｃ）。ＨＡＥＣ管形成のタイムラプスビデオは、ＮＭＮが構造化管形成を改善するだけでなく、１８時間にわたる管の崩壊も防止することを示した。ＨＵＶＥＣのＮＭＮへの曝露はまた、細胞増殖（図３２Ｄ）及びトランスウェル遊走アッセイにおいてＮＭＮで処置した場合のＶＥＧＦに応答した運動性（図３２Ｅ）を促進した。ＥＳＫＯ由来ＭＬＥＣ（図３３Ａ及び図３３Ｂ）若しくはＶＥＧＦ処置ＨＡＥＣ（図３３Ｃ）を用いた細胞遊走及び発芽血管新生アッセイ、又は管形成アッセイ（図３３Ｄ）において、ＮＭＮが血管新生の尺度を刺激する能力はＳＩＲＴ１依存性であった。興味深いことに、ＨＡＥＣのＮＭＮ処置が構造化管形成を改善するだけでなく、１８時間にわたる管の崩壊も防止した。
【０３５０】
老齢組織の文脈における血管新生に対するＮＭＮの効果を試験するために、１８月齢マウス（７０歳のヒトとほぼ同等）の大動脈リングを使用したエキソビボＶＥＧＦ媒介血管新生アッセイを行った。各大動脈リングからのＶＥＧＦ媒介増殖又は芽の測定は、ＮＭＮがＰＢＳ処置リング（図３４Ｃ）と比較して（図３４Ｃ）内皮芽の数を２倍にすることを示した。ＨＡＥＣ細胞におけるＮＭＮの効果は、ＳＩＲＴ１のノックダウンによって完全に遮断された（図３４Ｄ）。ＮＭＮは、老齢ＷＴマウスの大動脈リングからの増殖又は芽数を２倍にしたが、老齢ＳＩＲＴ１−ｉＫＯマウスからはしなかった（図３４Ａ及び図３４Ｂ）。
【０３５１】
ＳＩＲＴ１に加えて、ＳＩＲＴ３及びＳＩＲＴ６が、培養中のＥＣの血管新生能に影響を及ぼす（Ｃａｒｄｕｓら、２０１３、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ  ９７、５７１〜５７９；Ｗｅｉら、２０１７、Ｊ  Ａｍ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃ  ６）。ｓｉＲＮＡを使用したＨＡＥＣにおけるＳＩＲＴ３及びＳＩＲＴ６のノックダウン（図３５Ａ）は、ＶＥＧＦ媒介管形成及びスフェロイド発芽を減少させ、これは、ＮＭＮ処置によって部分的に救済され（図３５Ｂ及び図３５Ｃ）、ＮＭＮの血管新生効果がＳＩＲＴ３及びＳＩＲＴ６によって部分的に媒介されるが、主にＳＩＲＴ１によって媒介されることを示した。
【０３５２】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路は、脊椎動物の血管形成に必要不可欠である。発芽血管新生中、内皮Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路が、ＶＥＧＦシグナル伝達の下流で端細胞及び柄細胞の挙動を支配する（Ｂｌａｎｃｏ及びＧｅｒｈａｒｄｔ、２０１３、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ  Ｍｅｄ  ３、ａ００６５６９）。ＥＣにおけるＮｏｔｃｈシグナル伝達は、Ｎｏｔｃｈ１細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）タンパク質のレベルによって決定され、これは次にＳＩＲＴ１によって負に調節される（Ｇｕａｒａｎｉら、２０１１、Ｎａｔｕｒｅ  ４７３、２３４〜２３８）。これと一致して、ＶＥＧＦ又はＮｏｔｃｈリガンドＤｌｌ４で刺激した後（図３６Ａ及び図３６Ｂ）、ＮＭＮ処置は、Ｎｏｔｃｈ標的遺伝子発現を有意に減少させ、ＮＩＣＤ減少を促進した（図３７Ａ及び図３７Ｂ）。γ−セクレターゼ阻害剤ＤＡＰＴによるＮＩＣＤ放出の遮断は、ＳＩＲＴ１レベルに関係なく芽長を増加させた（図３７Ｃ）一方、ＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤ＳＵ５４１６による処置は、発芽を完全に遮断し、これはＮＭＮ処置によって救済されなかった（図３７Ｃ）。ＮＭＮによるＮｏｔｃｈ活性化と一致して、処置はＥＣにおける増殖を誘導し（図３８Ａ）、アポトーシスを減少させ（Ｃｈａｎｇら、２０１３、Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ  ８９、８０〜８５；Ｎｏｓｅｄａら、２００４、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２４、８８１３〜８８２２）、これらの効果はＳＩＲＴ１依存性であった（図３８Ｂ）。内皮細胞アポトーシスは、成体生物における血管新生に対抗する（Ｄｉｍｍｅｌｅｒ及びＺｅｉｈｅｒ、２０００）。ＮＭＮは、早期にアポトーシスを受ける細胞の割合を減少させ、Ｈ２Ｏ２での処置後にＶＥＧＦ媒介血管新生を促進した（図３９Ａ及び図３９Ｂ）。まとめると、これらの結果は、ＶＥＧＦ誘導血管新生がＳＩＲＴ１依存的にＮＡＤ＋前駆体ＮＭＮによって刺激されることを示した。
【０３５３】
これらの知見は、筋細胞からＥＣへのＶＥＧＦ及びＮｏｔｃｈシグナル伝達が、ＥＣのＮＡＤ＋レベル及びＳＩＲＴ１の付随する活性に依存するというモデルを支持する（図３８Ｃ）。
【０３５４】
ＮＡＤ＋は老齢マウスの微小血管系及び運動能力の喪失を逆転させる
老化の間、潜在的にＣＤ３８、ＮＡＤグリコヒドロラーゼ及びＰＡＲＰ１の活性の増加のために、ＮＡＤ＋のレベルは多くの組織で低下する（Ｂｒａｉｄｙら、２０１１；Ｃａｎｔｏら、２０１２、Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ  １５、８３８〜８４７；Ｇｏｍｅｓら、２０１３；Ｍａｓｓｕｄｉら、２０１２；Ｍｏｕｃｈｉｒｏｕｄら、２０１３ｂ、Ｃｅｌｌ  １５４、４３０〜４４１；Ｙｏｓｈｉｎｏら、２０１１）。本発明者らは、ＥＣにおけるＮＡＤ＋レベルの低下が、なぜ老齢個体が、老化の間、毛細血管が少なく、血流が減少するのかを説明する可能性があると仮定した。本発明者らの仮説と一致して、２０月齢マウスから単離した腓腹筋及びＥＣは、６月齢マウスから単離したものと比較して有意に低いＮＡＤ＋レベルを有していた（図４０Ａ及び図４０Ｂ）。  そのため、本発明者らは、老齢マウスのＥＣにおけるＮＡＤ＋レベルを若々しいレベルに回復させることはまた、毛細血管密度、血流及び持久力を回復させるかもしれないと推論した。これを試験するために、１８月齢のマウスに飲料水を介してＮＭＮを４００ｍｇ／ｋｇ／日で２ヶ月間投与した。ＮＭＮは、筋肉を含むいくつかの組織でＮＡＤ＋レベルを上昇させ（図４０Ｂ）、食物摂取量、水消費量、体重、体組成、運動学習スキル及び心機能には効果を及ぼさなかった（図４１Ａ及び図４１Ｂ）。
【０３５５】
驚くべきことに、ＮＭＮ投与は、老齢マウスの毛細血管数及び毛細血管密度を、若齢マウスの毛細血管数及び毛細血管密度に（図４２Ａ〜図４２Ｄ）、又は同齢未処置マウスと比較して（図４２Ａ〜図４２Ｄ）回復させた。定常状態での相対血液量の尺度であるピーク増強を評価するための下肢のコントラスト増強超音波イメージング（Ｂａｌｔｇａｌｖｉｓら、２０１４、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ３０６、Ｈ１１２８〜１１４５）（図４３Ａ）もまた、ＮＭＮが静止時筋肉灌流を増加させることを示した（図４３Ｃ及び図４３Ｄ）。光音響トモグラフィーによって測定される静止筋肉中の可溶性酸素（ｓＯ２）レベルは、ビヒクル処置同齢対照と比較して、ＮＭＮ処置マウスで１５％高かった（図４３Ｂ）。
【０３５６】
ＮＭＮは、ミトコンドリアタンパク質レベル（図４４Ａ）も、ミトコンドリア活性（図４４Ｂ及び図４４Ｃ）も、個々の線維の呼吸容量（図４５Ａ）も、組織重量（図４５Ｂ）も、筋肉形態（図４５Ｃ）も、線維型（図４５Ｄ）も、ホームケージ活動も有意には変化させなかった。非処置対照マウスと比較して、ＮＭＮ処置マウスの酸素消費量は、明サイクルで３０％高く、暗サイクルで２３％高かった（図４５Ｅ）。ＮＭＮ補充によって、未処置マウスよりも５６％の改善で低強度持久力が劇的に改善された（４４１ｍ対６８６ｍ）（図４６Ａ及び図４６Ｂ）。高持久力運動レジメン下で試験した場合、ＮＭＮ処置マウスはさらに８０％走行し、未処置マウスと比較して血中乳酸蓄積が低かった（４．９ｍｍｏｌ／Ｌ対３．９ｍｍｏｌ／Ｌ）（図４６Ｂ及び図４６Ｃ）。
【０３５７】
次に、ＳＩＲＴ１がインビボでの血管新生に必要かどうかを調べようとした。２０月齢のＳＩＲＴ１−ｉＫＯマウスをタモキシフェンで処置した後、これらをＮＭＮ（４００ｍｇ／ｋｇ／日）に２ヶ月間置くことによって、ＳＩＲＴ１をＥＣ細胞から欠失させた。ＮＭＮはＷＴマウスの腓腹筋毛細血管を増加させたが、ＳＩＲＴ１−ｉＫＯマウスでは変化が観察されなかった（図４７Ａ）。
【０３５８】
血管可塑性は、老化とともに低下する通常の生理機能の重要な要素であるだけでなく、虚血に応じて不可欠でもある。８月齢のＳＩＲＴ１−ｉＫＯマウス及びＷＴマウスに大腿結紮術をし、マウスを２０日間ＮＭＮ（４００ｍｇ／ｋｇ／日）で処置した。本発明者らの以前の観察と一致して、ＮＭＮは相対血液量（ピーク増強）及び毛細血管密度を回復し、この効果はＳＩＲＴ１依存性であった（図４７Ｂ及び図４７Ｃ）。
【０３５９】
本発明者らは、ＮＭＮが若齢マウスでさえ運動訓練への反応をさらに増加させるかもしれないという仮説を立てた。これを試験するために、若齢マウスをＮＭＮを用いて又は用いないで（４００ｍｇ／ｋｇ／日）、１ヶ月間の持久力訓練に供した。予想通り、運動したマウスは、座ったままのマウスと比較して２倍の数の毛細血管を有していた（図４８Ａ）。興味深いことに、ＮＭＮを同じ訓練レジメンに追加した場合、毛細血管密度の３．２倍の増加が観察されたが、座ったままを保った場合、ＮＭＮ補充は毛細管密度も運動能力も増加させなかった。運動のみを受けたマウスの腓腹筋は、座ったままのマウスの腓腹筋よりも３３％多い毛細血管を有したが、運動し、ＮＭＮ処置したマウスの腓腹筋は７０％多い毛細血管を有した。よって、ＮＭＮ補充は、老齢個体だけでなく若年個体においても骨格筋毛細血管形成において有効となり得るが、運動と組み合わせた場合にのみ有効となり得る。これらの興味深い結果は、運動が血管新生を制限する阻害剤を軽減すること、又は運動中にＮＡＤ＋に対する需要が高まることを示している。
【０３６０】
ＮＭＮの効果がＶＥＧＦを必要とするかどうかを試験するために、アキシチニブ（３０  ｍｇ／ｋｇ／日）で処置したマウスで上記の運動訓練レジメンを繰り返した。アキシチニブは、ＶＥＧＦＲのリン酸化を阻害し、血清ＶＥＧＦレベルを上昇させることによって、ＶＥＧＦシグナル伝達を遮断する（図４９Ａ）（Ｅｓｃｕｄｉｅｒ及びＧｏｒｅ、２０１１）。アキシチニブ処置は、ＮＭＮが媒介する毛細血管密度の増加だけでなく、運動能力の改善も遮断し（図４９Ｂ、図４９Ｃ及び図５０）、ＮＭＮがＶＥＧＦの下流で作用し、筋肉毛細管現象が持久力を高めるかどうかの重要な決定因子であることを確認した。
【０３６１】
まとめると、これらのデータは、短期間のＮＭＮ処置が、老齢マウスの骨格筋内の毛細血管数及び持久力を若々しいレベルに回復させ、ミトコンドリア機能の改善よりも血流の増加が、ＳＴＡＣで処置したマウスの持久力の増加の説明となり得ることを示している。
【０３６２】
外因性硫化水素はＳＩＲＴ１を活性化し、ＮＭＮの効果を増強する
Ｈ２Ｓは、シグナル伝達分子としてＮＡＤ＋と多くの類似点を共有している。Ｈ２ＳはＳＩＲＴ１活性を増加させ、酸化ストレスから保護する。よって、本発明者らはＮＡＤ＋とＨ２Ｓのシグナル伝達間の潜在的な重複を試験することに興味を持っていた。本発明者らは最初に、ＨＵＶＥＣ細胞のアポトーシスに対するＮＭＮ及びＮａＨＳの潜在的な相加効果を試験した。ＮａＨＳ又はＮＭＮ単独でのＨＵＶＥＣの処置は、ＳＩＲＴ１タンパク質レベルを増加させ、２つの組み合わせは、ＳＩＲＴ１レベルを２倍増加させた（図５１Ａ）。ＮａＨＳはまた、用量依存的にＥＣ中の細胞内ＮＡＤ＋レベルを上昇させた（図５１Ｂ）。
【０３６３】
次に、本発明者らは、この組み合わせが酸化ストレス下でＨＵＶＥＣ細胞の血管新生能を改善できるかどうか、及びこれがＳＩＲＴ１によって媒介されるかどうかを決定しようとした。両方の処置が未処置対照と比較して管形成を増加させたが、最大の効果は処置の組み合わせであり、これは分岐点数及び総管長を有意に上昇させた（図５２Ａ）。Ｈ２ＳはＳＩＲＴ１依存的に細胞遊走を増加させ（図５２Ｂ）、ＨＵＶＥＣの基底ＯＣＲを低下させた（図５２Ｃ）一方、ＮＭＮはこれらのパラメータに影響を及ぼさなかった。
【０３６４】
ＭＬＥＣの運動性（図５３Ａ）及びＥＣスフェロイド発芽アッセイ（図５３Ｂ）に対する処置の相加的効果があり、これはＳＩＲＴ１依存的な効果であった（図５３Ａ）。Ａｌｂａｎらと一致して、Ｈ２Ｓは、ＶＥＧＦと無関係であるが、ＳＩＲＴ１に依存してスクラッチアッセイにおいて細胞遊走を増加させた（図５３Ｃ）。Ｈ２ＳはＨＵＶＥＣの基底ＯＣＲも低下させたが、ＮＭＮは低下させなかった。これらの知見は、ＮＡＤ＋及びＨ２ＳがＥＣにおいて重複した機能及び異なる機能を有することを示している。
【０３６５】
ＮＭＮとＮａＨＳの組み合わせの効果を試験するために、本発明者らは、マウスをＮＭＮとＮａＨＳで同時処置して、これらがどちらかの処置単独よりも毛細血管形成及び持久力に対してさらに大きい効果を有するかどうかを調べた。ＮＭＮ（４００ｍｇ／ｋｇ／日）とＮａＨＳ（２０ｍｇ／ｋｇ／日）の組み合わせを３０月齢マウスの飲料水中に４週間供給した。処置は、水消費量、食物消費量、体重、除脂肪量又は体脂肪量に効果を及ぼさなかった（図５５Ａ及び図５５Ｂ）。図５５Ａ及び図５５Ｂに示されるように、ＮａＨＳとＮＭＮの組み合わせで処置したマウスは、他の全ての群と比較して高い毛細血管密度及び毛細血管数を有していた。
【０３６６】
老齢個体における血管新生は、一部は、酸化ストレス及び内皮細胞アポトーシスの増加、細胞培養中のＨ２Ｏ２によって模倣され得る効果のために減少する（Ｄｉｍｍｅｌｅｒ及びＺｅｉｈｅｒ、２０００；Ｐｅａｒｓｏｎら、２００８）。ＴＵＮＥＬアッセイを使用したＣＤ３１及びＤＮＡ断片化のための老齢四頭筋組織の共染色は、ＮＭＮが、アポトーシス細胞を有する毛細血管の数を４２％から１７％に減少させ、ＮＭＮとＮａＨＳの組み合わせがこれを１１％に減少させることを示した（図５６Ａ）。Ｈ２Ｏ２に応答して、ＮＭＮはＨＵＶＥＣＳにおけるアポトーシスを１３％減少させ、組み合わせはこれを３６％減少させた（図５６Ｂ）。
【０３６７】
骨格筋におけるこれらの構造変化が機能的であるかどうかを試験するために、処置マウスをトレッドミル試験に供した。ＮＭＮで処置したマウスは消耗までの時間及び距離の増加に対する有意な傾向を示した（図５７Ａ及び図５７Ｂ）が、最も印象的だったのはＮａＨＳとの組み合わせであり、持久力が倍増し、任意の処置又は運動体制についてこれまでに報告された最大の増加であった。
【０３６８】
ＮＭＮとＨ２Ｓの組み合わせの効果がＳＩＲＴ１によって媒介されたかどうかを試験するために、本発明者らは、血管内皮カドヘリン（ＶＥ−ｃａｄ）プロモーターの下流でＥＧＦＰ導入遺伝子及びＳＩＲＴ１マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を発現するレンチウイルスベクターを使用して、老成体マウスでＥＣ特異的ＳＩＲＴ１  ＫＯを作製した（図５８Ａ）（Ｚｈａｎｇら、２０１３）。種々のｍｉＲＮＡ構築物を試験した後、５番が最も効率的であり、ＳＩＲＴ１タンパク質レベルを８０％ノックダウンした（図５８Ｂ）。次いで、ＳＩＲＴ１を２０月齢のマウスにおいて後眼窩注射によってノックダウンした。免疫染色は、ＥＧＦＰが、ＣＤ３１で陽性に染色された細胞においても発現されることを示し、ノックダウンの効率及び特異性が確認された（図５９Ａ）。ＥＣへのレンチウイルスの組込みを確認した後、マウスを４週間、ＮＭＮ及びＨ２Ｓ前駆体、ＮａＨＳ及びＧＹＹ４１３７（Ｒｏｓｅら、２０１５）で処置した。図５９Ｂに示されるように、単独又はＨ２Ｓ前駆体と組み合わせたＮＭＮが血管新生を増加させる能力は、ＳＩＲＴ１ノックダウンマウスで遮断された。まとめると、これらのデータは、内皮ＳＩＲＴ１が血管新生反応の重要なメディエータであり、ＮＭＮによるＳＩＲＴ１活性の刺激が骨格筋の毛細血管形成及び血流を増加させて運動持久力を改善するための有効な方法、Ｈ２Ｓとの同時処置によってさらに増強され得る経路であることを示している。
【０３６９】
まとめると、これらのデータは、内皮ＳＩＲＴ１が運動に対する血管新生反応の重要なメディエータであり、ＳＩＲＴ１活性の刺激が骨格筋の毛細血管形成及び血流を増加させるための有効な方法、ＮａＨＳとの同時処置によってさらに増強され得る経路であることを示している（図６Ｇ）。
【０３７０】
考察
ヒトでは３５歳以降から、組織の灌流が着実に、一見容赦なく減少する。この減少は、中年を超えて生きるほとんど全ての人々の健康及び寿命の主要な決定因子であり、虚弱、サルコペニア及びほとんどの加齢性疾患に寄与している。運動は推奨されるが、最初は運動に対する血管新生反応が中年では弱まり、最終的には虚弱で運動が禁止されるため、運動は減少を遅らせるだけである。
【０３７１】
本研究では、内皮ＳＩＲＴ１が筋血管系の調節に関与しているかどうか、及びこれを老齢マウスの毛細血管密度及び持久力を回復するために標的とすることができるかどうかを試験することにした。本発明者らの実験は、内皮細胞のＳＩＲＴ１が、ＰＧＣ−１α−ＶＥＧＦ刺激血管新生への応答に必要である血管リモデリングの重要な調節因子であることを示している。
【０３７２】
本発明者らはまた、ＮＡＤ＋前駆体ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）が、毛細血管形成に対する老化の効果、別のＳＩＲＴ１依存性経路であるＨ２Ｓシグナル伝達と相乗作用を示す効果を迅速に逆転させることができる運動模倣薬として作用することを示す。驚くべきことに、寿命の％で９０歳のヒトに匹敵するマウスの３２月齢でさえ、微小血管系に対する老化の効果を迅速に逆転させることができる。これらの知見は、運動能力及び身体が運動に反応する能力の加齢性の低下を逆転させ、それによって運動性の有益なサイクルを再確立する方法としてのＮＡＤ＋及びＨ２Ｓ前駆体の潜在的な健康上の利益を指し示している。
【０３７３】
さらに、本発明者らは、ＮＡＤ＋前駆体ＮＭＮが、運動訓練と組み合わせると、若齢対象と老齢対象の両方で血管密度及び血流を増加させ、運動能力を増加させることができることを示している。
【０３７４】
本発明者らはまた、ＮＡＤ＋前駆体ＮＭＮが虚血組織内の血管密度及び血流の増加を促進することができることを示している。
【０３７５】
結論
本発明者らは、内皮ＳＩＲＴ１活性の喪失が骨格筋血管密度及び運動能力の早期低下の表現型をもたらす一方で、内皮ＳＩＲＴ１の過剰発現が反対の防御効果を有することを示している。ＳＩＲＴ１活性を刺激するためにＮＡＤ＋レベルを薬理学的に上昇させると、老齢マウスの毛細血管密度及びトレッドミル持久力が若々しいレベルまで回復し、これはＨ２Ｓによってさらに増強される効果である。運動と組み合わせた場合、ＳＩＲＴ１活性を刺激するためにＮＡＤ＋レベルを薬理学的に上昇させると、若齢マウスと老齢マウスの両方の毛細血管密度及びトレッドミル持久力が増加する。
【０３７６】
ＮＡＤ＋レベルを薬理学的に上昇させると、虚血組織内の毛細血管密度が増加する。
【０３７７】
参考文献
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2020504722.tif 000008
2020504722.tif 000009
2020504722.tif 000010
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【配列表フリーテキスト】
【０３７８】
配列表１８〜２１、２３〜３４、３６〜５１  ＜２２３＞プライマー配列
【図１】
2020504722.tif 000012
【図２】
2020504722.tif 000013
【図３−１】
2020504722.tif 000014
【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２−１】
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【図４２−２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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