(57)【要約】  本明細書では、ヒトIL-5に免疫特異的に結合する完全ヒト抗体分子が開示される。抗体分子は、表面プラズモン共鳴によって決定される、少なくとも約40pMの平衡親和性定数(KD)でヒトIL-5に結合することができる。
2020513761.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面プラズモン共鳴によって決定される、少なくとも約40pMの平衡親和性定数(KD)でヒトIL-5に免疫特異的に結合するヒト抗体分子。
【請求項２】
ヒトIL-5に免疫特異的に結合するヒト抗体分子であって、
配列番号4のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号6のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、配列番号8のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、配列番号5、21、24、27、30、33、36、39、又は66のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号7、42、又は45のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号15、48、51、54、57、60、又は63のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む、ヒト抗体分子。
【請求項３】
配列番号4のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号6のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、配列番号8のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、並びに
a. 配列番号5のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号15のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3;
b. 配列番号21のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号15のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3;
c. 配列番号24のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号15のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3;
d. 配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号15のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3;
e. 配列番号30のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号15のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3;
f. 配列番号33のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号15のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3;
g. 配列番号36のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号15のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3;
h. 配列番号39のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号15のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3;
i. 配列番号66のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号15のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3;
j. 配列番号5のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号42のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号15のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3;
k. 配列番号5のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号45のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号15のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3;
l. 配列番号5のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号48のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3;
m. 配列番号5のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号51のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3;
n. 配列番号5のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3;
o. 配列番号5のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号57のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3;
p. 配列番号5のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号60のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3;又は
q. 配列番号5のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号63のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含み、CDRのアミノ酸残基の位置がAbMに従って決定される、請求項1又は2に記載の抗体分子。
【請求項４】
配列番号4のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号6のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、配列番号8のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、配列番号5のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号15のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む、請求項3に記載の抗体分子。
【請求項５】
配列番号16のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び
a. 配列番号17のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
b. 配列番号22のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
c. 配列番号25のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
d. 配列番号28のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
e. 配列番号31のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
f. 配列番号34のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
g. 配列番号37のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
h. 配列番号40のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
i. 配列番号43のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
j. 配列番号46のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
k. 配列番号49のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
l. 配列番号52のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
m. 配列番号55のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
n. 配列番号58のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
o. 配列番号61のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
p. 配列番号64のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;又は
q. 配列番号67のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項６】
配列番号16のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号17のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項７】
a. S228P変異;
b. M252Y変異、S254T変異、及びT256E変異;
c. 重鎖C末端リジン残基の欠失;又は
d. aからcのいずれかの組合せ
を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項８】
S228P変異及び重鎖C末端リジン残基の欠失を含む、請求項7に記載の抗体分子。
【請求項９】
S228P変異、M252Y変異、S254T変異、T256E変異、及び重鎖C末端リジン残基の欠失を含む、請求項7に記載の抗体分子。
【請求項１０】
IgG4重鎖定常領域及びラムダ軽鎖定常領域を含む、請求項1から9のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項１１】
配列番号18のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖、及び
a. 配列番号19のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖;
b. 配列番号23のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖;
c. 配列番号26のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖;
d. 配列番号29のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖;
e. 配列番号32のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖;
f. 配列番号35のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖;
g. 配列番号38のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖;
h. 配列番号41のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖;
i. 配列番号44のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖;
j. 配列番号47のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖;
k. 配列番号50のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖;
l. 配列番号53のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖;
m. 配列番号56のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖;
o. 配列番号59のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖;
o. 配列番号62のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖;
p. 配列番号65のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖;又は
q. 配列番号68のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、請求項1から10のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項１２】
配列番号20のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号19のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項1から10のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項１３】
Fab断片、Fab2断片、又は単鎖抗体である、請求項2又は請求項3に記載の抗体分子。
【請求項１４】
以下の特性:
a. IL-5のIL-5受容体への結合を低減すること;
b. 少なくとも約20日の血清半減期を有すること;又は
c. ヒト及びカニクイザルIL-5に結合するが、マウス、ラット、若しくはモルモットIL-5には結合しないこと
のうちの1つ又は複数を有する、請求項1から13のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項１５】
表面プラズモン共鳴によって決定される、少なくとも約40pMの平衡親和性定数(KD)でヒトIL-5に結合する、請求項2に記載の抗体分子。
【請求項１６】
請求項1から15のいずれか一項に記載の抗体分子を含む医薬組成物。
【請求項１７】
請求項1から15のいずれか一項に記載の抗体分子をコードする核酸分子。
【請求項１８】
請求項17に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１９】
請求項1から15のいずれか一項に記載の抗体分子を発現するように形質転換された細胞。
【請求項２０】
好酸球性喘息、好酸球増多症候群、好酸球の関与する鼻ポリープ症、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症、アトピー性皮膚炎又は好酸球性食道炎を有する対象を処置する方法であって、
治療有効量の請求項1から15のいずれか一項に記載の抗体分子又は請求項16に記載の医薬組成物を対象に投与して、好酸球性喘息、好酸球増多症候群、好酸球の関与する鼻ポリープ症、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症、アトピー性皮膚炎又は好酸球性食道炎を処置する工程
を含む方法。
【請求項２１】
好酸球性喘息、好酸球増多症候群、好酸球の関与する鼻ポリープ症、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症、アトピー性皮膚炎、又は好酸球性食道炎の処置における、有効量の請求項1から15のいずれか一項に記載の抗体分子又は請求項16に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２２】
好酸球性喘息、好酸球増多症候群、好酸球の関与する鼻ポリープ症、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症、アトピー性皮膚炎又は好酸球性食道炎の処置のための医薬の製造における、請求項1から15のいずれか一項に記載の抗体分子又は請求項16に記載の医薬組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
この出願は、その開示が参照によりその全体として本明細書に組み込まれる、2016年12月23日に出願された米国仮出願第62/438,502号の優先権を主張する。
【０００２】
配列表
本出願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出され、参照によりその全体として本明細書に組み込まれる配列表を含有する。2017年11月30日に作成された前記ASCIIのコピーは102085.000906_sl.txtという名称であり、93,529バイトのサイズである。
【０００３】
技術分野
本明細書では、IL-5に免疫特異的に結合する新規抗体分子、及び本開示の抗体の使用が開示される。
【背景技術】
【０００４】
インターロイキン5(IL-5)は、B細胞と好酸球の両方の増殖及び分化を引き起こす2型ヘルパーT細胞(Th2)サイトカインである。B細胞中でIL-5はまた、免疫グロブリン分泌を増加させる。IL-5は好酸球の重要なモジュレーターであり、好酸球においてIL-5はまた、成熟、組織への移動、生存、及びアポトーシスの防止を調節する。
【０００５】
2つの別々のモチーフによって、IL-5は、その特異的受容体(IL5-Rα)と、インターロイキン3(IL-3)と顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GMCSF)の間で共有される共通β鎖(βc)であるシグナル伝達受容体とに結合する。IL-5のIL5-Rαに対する親和性は、中程度から低いnM範囲(0.2〜100nM)であることが報告されており、これは、βcの存在下で中程度のpM範囲(約100pM)へとシフトする。IL5-RαはIL-5に特異的に結合し、次いでβcがIL-5Rに動員される。
【０００６】
インターロイキン5(IL-5)を標的とする治療可能性は、文献における広範囲にわたる検証及びレスリズマブとメポリズマブの両方に対する最近のポジティブな第III相臨床データによって実証されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際特許公開番号WO1998/44001
【特許文献２】国際特許公開番号WO1988/01649
【特許文献３】国際特許公開番号WO1994/13804
【特許文献４】国際特許公開番号WO1992/01047
【特許文献５】国際特許公開番号WO2009/085462
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Wardら、Nature 341:544〜546頁、1989
【非特許文献２】Wu及びKabat J Exp Med 132:211〜50頁
【非特許文献３】Kabatら  Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版  Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda, Md.、1991
【非特許文献４】Chothia及びLesk Mol Biol 196:901〜17頁、1987
【非特許文献５】Rees, A.R.、Searle, S.M.J.、Henry, A.H.及びPedersen, J.T. (1996) In Sternberg M.J.E.(編)、Protein Structure Prediction. Oxford University Press、Oxford、141〜172頁
【非特許文献６】Lefrancら、Dev Comparat Immunol 27:55〜77頁、2003
【非特許文献７】Almagro Mol Recognit 17:132〜43頁、2004
【非特許文献８】http://www_imgt_org
【非特許文献９】Knappikら、J Mol Biol 296:57〜86頁、2000
【非特許文献１０】Shiら、J Mol Biol 397:385〜96頁、2010
【非特許文献１１】Hart, T.K.ら、Preclinical efficacy and safety of mepolizumab(SB-240563)、humanized monoclonal antibody to IL-5, in cynomolgus monkeys. J Allergy Clin Immunol、2001. 108(2):250〜7頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本明細書では、表面プラズモン共鳴によって決定される、少なくとも約40pMの平衡親和性定数(KD)でヒトIL-5に免疫特異的に結合するヒト抗体分子が開示される。
【００１０】
配列番号4のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号6のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、配列番号8のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、配列番号5、21、24、27、30、33、36、39、又は66のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号7、42、又は45のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号15、48、51、54、57、60、又は63のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む抗体分子も提供される。
【００１１】
本開示の抗体分子は、配列番号16のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号17、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、又は67のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む可能性があり、可変性(すなわち、少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%の同一性)は、CDR配列の外側で生じる。
【００１２】
本開示の抗体分子は、配列番号18又は20のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号19、23、26、29、32、35、38、41、44、47、50、53、56、59、62、65、又は68のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む可能性があり、可変性(すなわち、少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%の同一性)はCDR配列の外側で生じる。
【００１３】
本開示の抗体分子をコードする核酸分子、核酸分子を含むベクター、及び本開示の抗体分子を発現するよう形質転換された細胞も提供される。
【００１４】
本明細書に開示の抗体分子のいずれかを含む医薬組成物も開示される。
【００１５】
治療有効量の本明細書に開示の抗体分子のいずれか、又はそれを含む医薬組成物を対象に投与して、好酸球性喘息、好酸球増多症候群、好酸球の関与する鼻ポリープ症、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症、アトピー性皮膚炎又は好酸球性食道炎を有する対象を処置する方法であって、好酸球性喘息、好酸球増多症候群、好酸球の関与する鼻ポリープ症、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症、アトピー性皮膚炎又は好酸球性食道炎を処置する工程を含む、方法も提供される。
【００１６】
好酸球性喘息、好酸球増多症候群、好酸球の関与する鼻ポリープ症、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症、アトピー性皮膚炎、又は好酸球性食道炎の処置における、有効量の本明細書に開示の抗体分子のいずれか、又はそれを含む医薬組成物の使用も提供される。
【００１７】
好酸球性喘息、好酸球増多症候群、好酸球の関与する鼻ポリープ症、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症、アトピー性皮膚炎又は好酸球性食道炎の処置のための医薬の製造における、本明細書に開示の抗体分子のいずれか、又はそれを含む医薬組成物の使用が更に提供される。
【００１８】
概要は、以下の詳細な説明と同様に、添付の図面と併せて読んだ場合に更に理解される。本開示の抗体分子、方法、及び使用を例示するために、図面において、抗体分子、方法、及び使用の例示的実施形態が示されるが、抗体分子、方法、及び使用は、開示される特定の実施形態に限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】抗体バリアント3A5.001(IgG4形式で)が、元の抗体3A5(IgG1形式で)と等しい効力を保持したことを示すTF-1.6G4アッセイを例証するグラフである。
【図２】抗体バリアント3A5.040が、親抗体3A5.001と等しい効力を保持したことを示すTF-1.6G4アッセイを例証するグラフである。
【図３】元の3A5.040VH配列(一番上の配列)にアラインメントした、3A5.040VH CDRに生じた異なる単一アミノ酸置換の位置及び同一性を示すグラフマトリックスである。ボックスは、AbM命名法に従って示されたCDR残基である残基を含有する。CDR残基に加えて、実施例の「抗体の機能的試験及び特徴付け」に記載のように、Kabat残基番号93及び94(HC CDR3に隣接する)にバリアントを作製した。この図に記載した種々の配列は配列番号73に提供する。
【図４】元の3A5.040VL配列(一番上の配列)にアラインメントした、3A5.040VL CDRに生じた異なる単一アミノ酸置換の位置及び同一性を示すグラフマトリックスである。ボックスは、AbM命名法に従って示されたCDR残基である残基を含有する。この図に記載した種々の配列は配列番号74に提供する。
【図５】3A5.040VL配列(一番上の配列)にアラインメントした例示的軽鎖CDRコンセンサス配列を例示する。実施例の(バリアントのkdの3A5.040のkdに対する比率≧1.5)及び(バリアントの発現レベルの3A5.040の発現レベルに対する比率≧0.5)に記載の組み入れ基準に従って潜在的改善を示した3A5.040VL CDRの単一アミノ酸置換バリアントは、コンセンサス配列に含まれた。CDRの定義及び番号付けは、それぞれ、AbM及びKabat命名法に従う。ボックスはCDR残基の位置を特定する。この図に記載した種々の配列は配列番号75に提供する。
【図６】2.5、1.25、0.625、0.313及び0.156μg/mLの組換えヒトIL-5に結合する3A5.046抗体の多濃度Biacore速度論分析を例証するグラフである。センサーグラムは、一番上のトレースの2.5μg/mLのIL-5から一番下のトレースの0.156μg/mLのIL-5まで順に、IL-5の濃度の低下を示す。
【図７Ａ】IL-5に応答したTF-1.6G4細胞の増殖、及びIL-5に駆動された増殖の3A5.046による阻害効力を例示するグラフである。3A5.046は、メポリズマブよりも、ヒトIL-5のより強力な阻害剤であった。
【図７Ｂ】IL-5に応答したTF-1.6G4細胞の増殖、及びIL-5に駆動された増殖の3A5.046による阻害効力を例示するグラフである。3A5.046は、メポリズマブよりも、カニクイザルIL-5のより強力な阻害剤であった。
【図８Ａ】3A5抗体及び対照捕捉抗体(R&D Systems社)を使用して開発した例示的ELISAを例示するグラフである。ELISAによって組換えIL-5を検出することができた。
【図８Ｂ】3A5抗体及び対照捕捉抗体(R&D Systems社)を使用して開発した例示的ELISAを例示するグラフである。ELISAによって3名のドナーに由来するCD3/CD28/IL-33活性化初代ヒトT細胞から生じたIL-5を検出することができた。図8Bの一番上のパネル:ドナー1、図8Bの真ん中のパネル:ドナー3、図8Bの一番下のパネル:ドナー4。
【図９】CD34+臍帯血細胞が、実施例に記載されたIL-5及び他のサイトカインを使用して、表典型的に成熟した好酸球へと分化した実験結果を例示するグラフである。抗体3A5.046は、IL-5に誘導された好酸球への分化を阻害することにおいて、メポリズマブより強力であった。
【図１０Ａ】ヒトIL-5に結合する抗体3A5.046のBiacore交差反応性分析の結果を例示するグラフである。二重参照したセンサーグラムは、1μg/ml又は10μg/mlのサイトカインへの結合について示される。
【図１０Ｂ】カニクイザルIL-5に結合する抗体3A5.046のBiacore交差反応性分析の結果を例示するグラフである。二重参照したセンサーグラムは、1μg/ml又は10μg/mlのサイトカインへの結合について示される。
【図１０Ｃ】マウスIL-5に結合する抗体3A5.046のBiacore交差反応性分析の結果を例示するグラフである。二重参照したセンサーグラムは、1μg/ml又は10μg/mlのサイトカインへの結合について示される。
【図１０Ｄ】ラットIL-5に結合する抗体3A5.046のBiacore交差反応性分析の結果を例示するグラフである。二重参照したセンサーグラムは、1μg/ml又は10μg/mlのサイトカインへの結合について示される。
【図１０Ｅ】モルモットIL-5に結合する抗体3A5.046のBiacore交差反応性分析の結果を例示するグラフである。二重参照したセンサーグラムは、1μg/ml又は10μg/mlのサイトカインへの結合について示される。
【図１１Ａ】抗体3A5.046のBiacore特異性分析の結果を例示するグラフである。二重参照したセンサーグラムは、10μg/mlのサイトカインへの結合について示される。
【図１１Ｂ】抗体3A5.046のBiacore特異性分析の結果を例示するグラフである。二重参照したセンサーグラムは、10μg/mlのサイトカインへの結合について示される。
【図１１Ｃ】抗体3A5.046のBiacore特異性分析の結果を例示するグラフである。二重参照したセンサーグラムは、1μg/mlのサイトカインへの結合について示される。
【図１１Ｄ】抗体3A5.046のBiacore特異性分析の結果を例示するグラフである。二重参照したセンサーグラムは、1μg/mlのサイトカインへの結合について示される。
【図１２】気道好酸球増加症のカニクイザルモデルにおけるブタ回虫(Ascaris suum(A. suum))負荷の結果を例示するグラフである。3A5.046で処置した動物及びビヒクル(プラセボ)で処置した動物を比較すると、2日目に、肺(BALF)の好酸球数に実質的な差があった(p<0.01;マン・ホイットニー検定)。
【図１３Ａ】A. suum負荷の1週間前に3A5.046又はアイソタイプ適合対照抗体(「プラセボ」)で前処置したカニクイザルにおけるA. suum負荷後10日にわたる血中好酸球応答を例示するグラフである。
【図１３Ｂ】負荷後45日(投与後52日)までの、3A5.046抗体で処置した動物に関する血中好酸球数の更なる詳細を例示するグラフである。好酸球数は、負荷の1週間前の3A5.046単回投与後に、負荷後少なくとも45日間ベースライン未満のままであった。
【図１４】アルテルナリア・アルテルナータ(Alternaria alternata)による負荷に応答したヒトIL-5ノックイン(KI)ラットモデルにおけるBALF好酸球レベルを例示するグラフである。このモデルは、アルテルナリア負荷後のBALF好酸球数をモジュレートする抗IL-5抗体の効力を試験するために使用してもよい。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本開示の抗体分子、方法、及び使用は、本開示の一部を形成する添付の図面に関連して以下の詳細な説明を参照してより容易に理解することができる。本開示の抗体分子、方法、及び使用は、本明細書に記載された及び/又は示された特定の抗体分子、方法、及び使用に限定されず、本明細書で使用される用語は、単に例として特定の実施形態を説明するためのものであり、特許請求された抗体分子、方法、及び使用の限定を意図するものではないことが理解されるべきである。
【００２１】
別段具体的に述べられていなければ、改善のための可能な機序又は作用方式又は理由についての任意の記載は単に例示的であることを意味し、本開示の抗体分子、方法、及び使用は、任意のそのような示唆された改善のための機序又は作用方式又は理由が正しいか否かによって拘束されるべきではない。
【００２２】
この本文全体を通して、本記載は抗体分子及び前記抗体分子を使用する方法に言及する。本開示が、抗体分子に関連する特徴又は実施形態について記載又は特許請求する場合、このような特徴又は実施形態は前記抗体分子を使用する方法に等しく適用可能である。同様に、本開示が、抗体分子を使用する方法に関連する特徴又は実施形態について記載又は特許請求する場合、このような特徴又は実施形態は抗体分子に等しく適用可能である。
【００２３】
数値範囲が本明細書で記載され又は確立される場合、その範囲は、その端点、並びにその範囲内のすべての個別の整数及び分数を含み、また、これらの端点並びに内部の整数及び分数のすべての種々の可能な組合せから、記載の範囲内の値のより大きな群の亜群を形成することによって形成されるより狭い範囲のそれぞれも、それらのより狭い範囲のそれぞれが明記されるのと同程度に含む。ある数値範囲が、記載の値を超えると本明細書に記載される場合、それにもかかわらず、その範囲は有限であり、本明細書に記載の本発明の状況内で使用可能な値によるその上限が境界となる。ある数値範囲が、記載の値未満であると本明細書に記載される場合、それにもかかわらず、その範囲は0ではない値によるその下限が境界となる。範囲を定義する場合、本発明の範囲が記載された具体的な値に限定されることを意図するものではない。すべての範囲は包括的であり組合せ可能である。
【００２４】
特定の数値への言及は、文脈が特段明確に指定していなければ、少なくともその特定の値を含む。
【００２５】
値が近似値として表現される場合、先行する「約」の使用によって、特定の値が別の実施形態を形成することが理解される。「約」という用語は、数値範囲、カットオフ、又は具体的な値に言及して使用される場合、記載された値が列挙された値から10%程度まで変化する可能性があることを示すために使用される。したがって、「約」という用語は、特定値から±10%若しくはそれ未満の変動、±5%若しくはそれ未満の変動、±1%若しくはそれ未満の変動、±0.5%若しくはそれ未満の変動、又は±0.1%若しくはそれ未満の変動を包含するために使用される。
【００２６】
明確化のために、別々の実施形態の文脈において本明細書で記載される、本開示の抗体分子、方法、及び使用のある特定の特徴はまた、単一の実施形態において組み合わせて提供され得ることが認識されるべきである。逆に、簡潔性のために、単一の実施形態の文脈で記載された、本開示の抗体分子、方法、及び使用の種々の特徴はまた、別々に又は任意の部分的組合せで提供され得る。
【００２７】
本明細書で使用される場合、単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」、及び「その(the)」は複数を含む。
【００２８】
本記載の態様に関連する種々の用語は、本明細書及び特許請求の範囲全体を通して使用される。このような用語は、別段指定されていなければ、当技術分野における通常の意味が与えられるべきである。他の具体的に定義された用語は、本明細書で与えられた定義と矛盾しないように解釈されるべきである。
【００２９】
「含む(comprising)」という用語は、必ずしもこれらに限定されないが、「から本質的になる(consisting essentially of)」及び「からなる(consisting of)」という用語によって包含される例を含むことを意図し、同様に、「から本質的になる(consisting essentially of)」という用語は、必ずしもこれらに限定されないが、「からなる(consisting of)」という用語によって包含される例を含むことを意図する。
【００３０】
「抗体分子」という用語は、広義の意味であり、全長免疫グロブリン分子及びその抗原結合断片を含む。
【００３１】
免疫グロブリンは、重鎖定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、5つの主要なクラス、すなわち、IgA、IgD、IgE、IgG、及びIgMに割り当てることができる。IgA及びIgGは、アイソタイプIgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3、及びIgG4として更に下位分類される。任意の脊椎動物種の抗体軽鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、2つの明確に区別されるタイプ、すなわち、カッパ(κ)及びラムダ(λ)のうちの1つに割り当てることができる。
【００３２】
「抗原結合断片」は、親全長抗体の抗原結合特性を保持する免疫グロブリン分子の一部(すなわち、「その抗原結合断片」)を指す。例示的抗原結合断片は、重鎖相補性決定領域(HCDR)1、2、及び/又は3;軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、2、及び/又は3;重鎖可変領域(VH);軽鎖可変領域(VL);並びにそれらの組合せを有することができる。抗原結合断片は、Fab断片、すなわち、VL、VH、定常軽(CL)、及び定常重1(CH1)ドメインからなる一価の断片;F(ab)2断片、すなわち、ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋によって連結した2つのFab断片を含む2価の断片;VH及びCH1ドメインからなるFd断片;抗体の単一アームのVL及びVHドメインからなるFv断片;並びにVHドメイン又はVLドメインからなるドメイン抗体(dAb)断片(Wardら、Nature 341:544〜546頁、1989)を含む。VH及びVLドメインを操作して、合成リンカーを介して一緒に連結し、VH/VLドメインが分子内で対合するか、又はVH及びVLドメインが別々の単鎖抗体構築物によって発現される場合に分子間で対合する種々のタイプの単鎖抗体デザインを形成し、例えば、国際特許公開番号  WO1998/44001、WO1988/01649、WO1994/13804、及びWO1992/01047に記載の単鎖Fv(scFv)又はダイアボディ等の一価の抗原結合部位を形成することができる。これらの抗体断片は当業者に周知の技法を使用して得られ、断片は全長抗体と同じ方式で有用性についてスクリーニングされる。
【００３３】
「免疫特異的に結合する」という句は、本開示の抗体分子が、分子の混合集団を含有する試料において他の分子に優先的に結合することなくその標的(抗IL-5抗体分子の場合にはIL-5)に優先的に結合する能力を指す。IL-5に免疫特異的に結合する抗体分子は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない(例えば、抗IL-5抗体は、IL-5以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない)。しかし、IL-5に免疫特異的に結合する抗体分子は、カニクイザル(Macaca fascicularis)(カニクイザル(cynomolgus monkey))IL-5を含む、ヒトIL-5のオルソログ等の他の抗原に対する交差反応性を有する場合がある。本明細書に開示の抗体分子は、天然に生じるヒトIL-5と哺乳動物又は原核細胞において組換えによって生じるIL-5の両方に免疫特異的に結合することができる。
【００３４】
抗体可変領域は、3つの「抗原結合部位」で遮られた4つの「フレームワーク」領域からなる。抗原結合部位は、種々の用語を使用して定義され、(i)VH内に3つ(HCDR1、HCDR2、HCDR3)、及びVL内に3つ(LCDR1、LCDR2、LCDR3)ある、相補性決定領域(CDR)は、配列の多様性に基づくものであり(Wu及びKabat J Exp Med 132:211〜50頁、1970;Kabatら  Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版  Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda, Md.、1991);(ii)VH内に3つ(H1、H2、H3)及びVL内に3つ(L1、L2、L3)ある「超可変領域」は、Chothia及びLeskによって定義された、構造の変化が大きい抗体可変ドメインの領域を指す(Chothia及びLesk Mol Biol 196:901〜17頁、1987)。CDRのAbM定義も幅広く使用され、Kabat番号付けスキームとChothia番号付けスキームの間の折衷案であり、Oxford Molecular's AbM抗体モデリングソフトウェアによって使用されたためそのように称される(Rees, A.R.、Searle, S.M.J.、Henry, A.H.及びPedersen, J.T. (1996) In Sternberg M.J.E.(編)、Protein Structure Prediction. Oxford University Press、Oxford、141〜172頁)。他の用語には、「IMGT-CDR」(Lefrancら、Dev Comparat Immunol 27:55〜77頁、2003)及び「特異性決定残基使用」(SDRU)(Almagro Mol Recognit 17:132〜43頁、2004)が挙げられる。International ImMunoGeneTics(IMGT)データベース(http://www_imgt_org)は、抗原結合部位の標準的な番号付け及び定義を提供する。CDR、HV及びIMGTの記述間の対応については、Lefrancら、Dev Comparat Immunol 27:55〜77頁、2003に記載されている。
【００３５】
「フレームワーク」又は「フレームワーク配列」は、抗原結合部位であることを定義された配列以外の、可変領域の残りの配列である。抗原結合部位は、上記に記載した種々の用語によって定義することができるため、フレームワークの正確なアミノ酸配列は、抗原結合部位がどのように定義されるかによって決まる。「ヒト抗体」、「完全ヒト抗体」等の用語は、フレームワークと抗原結合部位の両方がヒト起源の配列に由来する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を有する抗体を指す。抗体が定常領域を含有する場合、定常領域はまた、ヒト起源の配列に由来する。ヒト抗体は、抗体の可変領域が、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン又は再構成された免疫グロブリン遺伝子を使用する系から得られる場合、ヒト起源の配列「に由来する」重鎖可変領域及び/又は軽鎖可変領域を含む。このような系として、ファージに提示されたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリー、及び本明細書に記載されたヒト免疫グロブリン遺伝子座を有するマウス等のトランスジェニック非ヒト動物が挙げられる。「ヒト抗体」は、ヒト生殖細胞系又は再構成された免疫グロブリン配列と比較した場合、例えば、天然に存在する体細胞変異又は可変ドメイン(フレームワーク及び抗原結合部位)、若しくは定常ドメインにおける意図的な置換の導入により、アミノ酸差異を含有し得る。典型的には、「ヒト抗体」は、アミノ酸配列が、ヒト生殖細胞系又は再構成された免疫グロブリン遺伝子によってコードされたアミノ酸配列と少なくとも約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一である。一部の場合には、「ヒト抗体」は、例えば、Knappikら、J Mol Biol 296:57〜86頁、2000に記載のヒトフレームワーク配列分析に由来するコンセンサスフレームワーク配列、又は、例えば、Shiら、J Mol Biol 397:385〜96頁、2010及び国際特許公開番号WO2009/085462に記載のファージ上に提示されたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーに組み込まれた合成HCDR3を含有することができる。抗原結合部位が非ヒト種に由来する抗体は、「ヒト抗体」の定義に含まれない。
【００３６】
ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来するが、合成CDR及び/又は合成フレームワークを組み込んだファージディスプレイ等の系を使用して生成されてもよく、又は可変領域、若しくは定常領域、若しくは両方において抗体特性を改善するためにインビトロ変異誘発に供することができ、これにより、インビボのヒト抗体生殖細胞系レパートリー内で天然には存在しない抗体が得られる。
【００３７】
「組換え抗体」には、組換え手段によって調製、発現、作出、若しくは単離される全ての抗体が含まれ、例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子が遺伝子導入若しくは染色体導入された動物(例えば、マウス)又はこれらから調製されたハイブリドーマから単離される抗体(以下で更に説明される);抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から単離される抗体;組換えコンビナトリアル抗体ライブラリーから単離される抗体;及び、ヒト免疫グロブリン遺伝子配列を他のDNA配列にスプライスすることを含む任意の他の手段によって調製、発現、作出、若しくは単離される抗体、又はFabアーム交換を使用してインビトロで生成される抗体が含まれる。
【００３８】
「モノクローナル抗体」は、単一分子組成物の抗体分子の集団を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性及び親和性を示すか、又は二重特異性モノクローナル抗体の場合、2つの異なるエピトープに対して二重結合特異性を示す。したがって、モノクローナル抗体は、抗体重鎖からC末端のリジンを除去する等の可能な周知の変更を除き、各重鎖及び各軽鎖における単一のアミノ酸組成を有する抗体集団を指す。モノクローナル抗体は、抗体集団内で異種の糖化を有し得る。モノクローナル抗体は、単一特異性若しくは多特異性、又は一価、二価若しくは多価であってもよい。二重特異性抗体は、モノクローナル抗体という用語に含まれる。
【００３９】
「エピトープ」は、抗体が特異的に結合する抗原の一部を指す。エピトープは、通常、アミノ酸又は多糖類側鎖等の部分の化学的に活性な(極性、非極性、又は疎水性等)表面基からなり、特定の3次元構造特性、及び特定の電荷特性を有し得る。エピトープは、立体配座空間単位を形成する連続する及び/又は連続していないアミノ酸からなり得る。連続していないエピトープについて、タンパク質分子が折り畳まれることにより、抗原の直鎖状配列の異なる部分のアミノ酸が、3次元空間において近接するようになる。
【００４０】
「バリアント」は、1つ又は複数の改変、例えば、置換、挿入、又は欠失によって、基準ポリペプチド又は基準ポリヌクレオチドとは異なっているポリペプチド又はポリヌクレオチドを指す。本明細書で使用される「変異」という用語は、ポリペプチド又はポリヌクレオチドになされる1つ又は複数の意図的な置換を意味することを意図する。
【００４１】
本明細書で使用する場合、「90%同一」は、基準項目(例えば、生物学的配列)に少なくとも90%同一、91%同一、92%同一、93%同一、94%同一、95%同一、96%同一、97%同一、98%同一、99%同一、又は100%同一を包含する。本明細書では、いくつかの配列を説明するために「%同一」という用語が使用される。理解されるように、「%同一」という用語は、特定領域の2つの配列を比較して、2つの配列が同じ位置に特定数の同一残基を有することを意味する。同一性のレベルは、デフォルトパラメーターを有するCLUSTAL Wを使用して決定することができる。
【００４２】
「処置する」、「処置」等の用語は、治療処置及び予防又は防止手段の両方を指し、直接的又は間接的に、好酸球性喘息、好酸球増多症候群、好酸球の関与する鼻ポリープ症、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症、アトピー性皮膚炎又は好酸球性食道炎によって引き起こされた、症状の重症度及び/又は頻度を低減すること、症状及び/又は症状の根底にある原因を除去すること、症状及び/又はその根底にある原因の頻度又は可能性を低減すること、損傷を改善又は矯正することを含む。処置は、処置を受けていない対象の期待される生存と比較して、生存を延長することも含む。処置される対象は、状態若しくは障害を有する対象、及び状態若しくは障害を有する傾向のある対象又は状態若しくは障害が防止されるべき対象を含む。
【００４３】
本明細書で使用する場合、「対象に投与する工程」及び類似の用語は、対象の身体の標的細胞、組織、又はセグメントが本開示の抗体分子と接触するように、本開示の抗体分子又はそれを含む組成物が患者に注射される手順を示す。
【００４４】
「治療有効量」という句は、本明細書に記載される場合、これらに限定されないが、本明細書に開示され、記載され、又は例示された生物学的又は治療的結果等の特定の生物学的又は治療的結果を達成するのに有効な抗体分子の量を指す。治療有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別、及び体重等の要因、並びに対象において所望の応答を引き起こす組成物の能力によって変わる場合がある。治療有効量の例示的指標は、例えば、患者の健康状態の改善、疾患症状の低減、疾患症状の進行の停止若しくは遅延、及び/又は疾患症状の非存在を含む。
【００４５】
以下の略語が本明細書で使用される:アルテルナリア・アルテルナータ(アルテルナリア)、ブタ回虫(A. suum);相補性決定領域(CDR);重鎖(HC);軽鎖(LC);重鎖可変領域(VH);軽鎖可変領域(VL);表面プラズモン共鳴(SPR)。
抗体分子
【００４６】
本明細書では、ヒトIL-5に免疫特異的に結合するヒト抗体分子が開示される。ヒト抗体分子は、表面プラズモン共鳴(SPR)によって決定される、少なくとも約40pMの平衡親和性定数(KD)でヒトIL-5に免疫特異的に結合することができる。本明細書で使用する場合、「少なくとも約40pMの」は、本開示の抗体が、約40pM未満か又はそれに等しいKDで、ヒトIL-5に免疫特異的に結合することを意味する。例えば、本開示の抗体は、約40pM、約30pM、約20pM、約10pM、又は約10pM未満のKDでヒトIL-5に免疫特異的に結合することができる。
【００４７】
本開示のヒト抗体分子は、配列番号4のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号6のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、配列番号8のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、配列番号1のアミノ酸配列を含む軽鎖コンセンサスCDR1、配列番号2のアミノ酸配列を含む軽鎖コンセンサスCDR2、及び配列番号3のアミノ酸配列を含む軽鎖コンセンサスCDR3を含むことができる。
【００４８】
軽鎖コンセンサスCDR1は、GX1X2X3X4X5X6KX7X8Y(配列番号1)のアミノ酸配列を含み、ここで、
X1は、G又はKであり;
X2は、N又はDであり;
X3は、N又はHであり;
X4は、I又はAであり;
X5は、G又はDであり;
X6は、S又はKであり;
X7は、N又はHであり;
X8は、V又はAである。
【００４９】
一部の実施形態では、軽鎖CDR1アミノ酸配列は、GGNNIGSKNVY(配列番号5)を含むことができる。一部の実施形態では、軽鎖CDR1アミノ酸配列は、GKNNIGSKNVY(配列番号21)を含むことができる。一部の実施形態では、軽鎖CDR1アミノ酸配列は、GGDNIGSKNVY(配列番号24)を含むことができる。一部の実施形態では、軽鎖CDR1アミノ酸配列は、GGNHIGSKNVY(配列番号27)を含むことができる。一部の実施形態では、軽鎖CDR1アミノ酸配列は、GGNNAGSKNVY(配列番号30)を含むことができる。一部の実施形態では、軽鎖CDR1アミノ酸配列は、GGNNIDSKNVY(配列番号66)を含むことができる。一部の実施形態では、軽鎖CDR1アミノ酸配列は、GGNNIGKKNVY(配列番号33)を含むことができる。一部の実施形態では、軽鎖CDR1アミノ酸配列は、GGNNIGSKHVY(配列番号36)を含むことができる。一部の実施形態では、軽鎖CDR1アミノ酸配列は、GGNNIGSKNAY(配列番号39)を含むことができる。
【００５０】
軽鎖CDR2アミノ酸配列は、DDX8X9RPS(配列番号2)を含み、ここで、
X8は、S又はLであり;
X9は、D又はSである。
【００５１】
一部の実施形態では、軽鎖CDR2アミノ酸配列は、DDSDRPS(配列番号7)を含むことができる。一部の実施形態では、軽鎖CDR2アミノ酸配列は、DDLDRPS(配列番号42)を含むことができる。一部の実施形態では、軽鎖CDR2アミノ酸配列は、DDSSRPS(配列番号45)を含むことができる。
【００５２】
軽鎖CDR3アミノ酸配列は、QVWX10SSSDX11VX12(配列番号3)を含み、ここで、
X10は、D又はLであり;
X11は、H、S、Y、又はDであり;
X12は、V、A、又はWである。
【００５３】
一部の実施形態では、軽鎖CDR3アミノ酸配列は、QVWDSSSDHVV(配列番号15)を含むことができる。一部の実施形態では、軽鎖CDR3アミノ酸配列は、QVWLSSSDHVV(配列番号48)を含むことができる。一部の実施形態では、軽鎖CDR3アミノ酸配列は、QVWDSSSDSVV(配列番号51)を含むことができる。一部の実施形態では、軽鎖CDR3アミノ酸配列は、QVWDSSSDYVV(配列番号54)を含むことができる。一部の実施形態では、軽鎖CDR3アミノ酸配列は、QVWDSSSDDVV(配列番号57)を含むことができる。一部の実施形態では、軽鎖CDR3アミノ酸配列は、QVWDSSSDHVA(配列番号60)を含むことができる。一部の実施形態では、軽鎖CDR3アミノ酸配列は、QVWDSSSDHVW(配列番号63)を含むことができる。
【００５４】
本開示のヒト抗体分子は、配列番号4のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号6のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、配列番号8のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、配列番号5、21、24、27、30、33、36、39、又は66のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号7、42、又は45のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号15、48、51、54、57、60、又は63のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含むことができる。例示的抗体分子は、配列番号4のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号6のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、配列番号8のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、並びに
a. 配列番号5のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号15のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3;
b. 配列番号21のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号15のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3;
c. 配列番号24のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号15のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3;
d. 配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号15のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3;
e. 配列番号30のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号15のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3;
f. 配列番号33のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号15のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3;
g. 配列番号36のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号15のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3;
h. 配列番号39のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号15のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3;
i. 配列番号66のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号15のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3;
j. 配列番号5のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号42のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号15のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3;
k. 配列番号5のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号45のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号15のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3;
l. 配列番号5のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号48のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3;
m. 配列番号5のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号51のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3;
n. 配列番号5のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3;
o. 配列番号5のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号57のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3;
p. 配列番号5のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号60のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3又は
q. 配列番号5のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号63のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含み、CDRのアミノ酸残基の位置がAbMに従って決定される。
【００５５】
本開示の抗体分子は、配列番号16のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号17、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、又は67のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む可能性があり、可変性(すなわち、少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%の同一性)はCDR配列の外側で生じる。例示的抗体分子をTable 1(表1)及びTable 15(表15)に提供する。
【００５６】
【表１Ａ】
2020513761.tif 000003
【００５７】
【表１Ｂ】
2020513761.tif 000004
【００５８】
一部の実施形態では、本開示の抗体分子は、配列番号16のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び
a. 配列番号17のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
b. 配列番号22のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
c. 配列番号25のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
d. 配列番号28のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
e. 配列番号31のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
f. 配列番号34のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
g. 配列番号37のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
h. 配列番号40のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
i. 配列番号43のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
j. 配列番号46のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
k. 配列番号49のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
l. 配列番号52のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
m. 配列番号55のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
n. 配列番号58のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
o. 配列番号61のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
p. 配列番号64のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域又は
q. 配列番号67のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む可能性があり、
可変性(すなわち、少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%の同一性)はCDR配列の外側で生じる。
【００５９】
本開示の抗体分子は、フレームワーク及び/又は定常領域に、1つ又は複数の変異、欠失、又は挿入を含むことができる。一部の実施形態では、IgG4抗体分子はS228P変異を含み得る。S228は、IgG4抗体分子のヒンジ領域に位置する。セリン(「S」)のプロリン(「P」)への変異は、IgG4のヒンジを安定化させ、インビトロ及びインビボでのFabアーム交換を防止する役割を果たす。一部の実施形態では、抗体分子は、抗体分子のインビボ半減期を増加させる1つ又は複数の改変を含み得る。例えば、ある特定の実施形態では、抗体は、M252Y変異、S254T変異、及びT256E変異(「YTE」変異と総称する)を含み得る。M252、S254、及びT256は、重鎖のCH2ドメインに位置する。これらの残基のチロシン(「Y」)、トレオニン(「T」)、及びグルタミン酸(「E」)への変異は、それぞれ、抗体分子をリソソーム分解から保護し、それによって、抗体分子の血清半減期を増強する。他の抗体の例に基づいて、抗IL-5抗体におけるYTE変異の導入により血清半減期の十分な延長がもたらされ、3カ月又はそれより長い投与間隔を有する投与レジームが可能となる場合がある。一部の実施形態では、抗体分子は、重鎖C末端リジン残基の欠失を含み得る。重鎖C末端リジン残基の欠失により、哺乳動物細胞によって産生される場合の抗体分子の不均質性が低減される。一部の実施形態では、抗体分子は、変異、欠失、又は挿入の組合せを含み得る。例えば、一部の態様では、本開示の抗体分子は、S228P変異及び重鎖C末端リジン残基の欠失を含み得る。配列番号18の重鎖配列を含む本開示の抗体は、例えば、S228P変異及び重鎖C末端リジン残基の欠失を含む。一部の態様では、本開示の抗体分子は、S228P変異、M252Y変異、S254T変異、T256E変異、及び重鎖C末端リジン残基の欠失を含み得る。例えば、配列番号20の重鎖を含む3A5.046抗体は、S228P変異、M252Y変異、S254T変異、T256E変異、及び重鎖C末端リジン残基の欠失を含む。
【００６０】
抗体分子は、IgG1又はIgG4重鎖定常領域及びラムダ軽鎖定常領域を含み得る。一部の実施形態では、抗体分子は、IgG1重鎖定常領域及びラムダ軽鎖定常領域(例えば、抗体3A5)を含む。一部の実施形態では、抗体分子は、IgG4重鎖定常領域及びラムダ軽鎖定常領域を含む。
【００６１】
本開示の抗体分子は、配列番号18又は20のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号19、23、26、29、32、35、38、41、44、47、50、53、56、59、62、65、又は68のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む可能性があり、可変性(すなわち、少なくとも90%の同一性)は、CDR配列の外側で生じる。例示的抗体分子は、Table 1(表1)及びTable 15(表15)に提供する。一部の実施形態では、抗体分子は、配列番号18のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖、及び
a. 配列番号19のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖;
b. 配列番号23のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖;
c. 配列番号26のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖;
d. 配列番号29のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖;
e. 配列番号32のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖;
f. 配列番号35のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖;
g. 配列番号38のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖;
h. 配列番号41のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖;
i. 配列番号44のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖;
j. 配列番号47のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖;
k. 配列番号50のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖;
l. 配列番号53のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖;
m. 配列番号56のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖;
n. 配列番号59のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖;
o. 配列番号62のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖;
p. 配列番号65のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖又は
q. 配列番号68のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む可能性があり、
可変性(すなわち、少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%の同一性)は、CDRの外側で生じる。
【００６２】
本開示の抗体分子は、配列番号20のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号19のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む可能性があり、可変性(すなわち、少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%の同一性)は、CDR配列の外側で生じる。
【００６３】
一部の実施形態では、抗体分子は全長抗体分子(重鎖C末端リジン残基の欠失を含むか又は含まない)である。他の実施形態では、抗体分子は抗原結合断片である。適切な抗体結合断片として、これらに限定されないが、Fab断片、Fab2断片、又は単鎖抗体が挙げられる。
【００６４】
抗体分子は、以下の特性のうちの1つ又は複数を有し得る:
a. 表面プラズモン共鳴によって決定される、少なくとも約40pMの平衡親和性定数でヒトIL-5に結合する;
b. IL-5のIL-5受容体への結合を低減する;
c. 少なくとも約20日の血清半減期を有する;又は
d. ヒト及びカニクイザルIL-5に結合するが、マウス、ラット、若しくはモルモットIL-5には結合しない。
【００６５】
本開示の抗体分子のいずれかを含む医薬組成物も提供される。
【００６６】
本開示の抗体分子のいずれかをコードする核酸分子及び本開示の核酸分子を含むベクターも提供される。
【００６７】
本開示の抗体分子のいずれかを発現するよう形質転換された細胞が更に提供される。
【００６８】
方法及び使用
本開示の抗体分子、又はそれを含む医薬組成物を使用して、好酸球性喘息、好酸球増多症候群、好酸球の関与する鼻ポリープ症、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症、アトピー性皮膚炎及び好酸球性食道炎を処置することができる。本明細書に開示の抗体分子の特徴はいずれも、本開示の方法及び使用において使用される抗体に等しく当てはまる。
【００６９】
本明細書では、好酸球性喘息、好酸球増多症候群、好酸球の関与する鼻ポリープ症、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症、アトピー性皮膚炎又は好酸球性食道炎を有する対象を処置する方法であって、治療有効量の本明細書に開示の抗体分子のいずれか、又はそれを含む医薬組成物を対象に投与するして、好酸球性喘息、好酸球増多症候群、好酸球の関与する鼻ポリープ症、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症、アトピー性皮膚炎又は好酸球性食道炎を処置する工程を含む方法が開示される。
【００７０】
好酸球性喘息、好酸球増多症候群、好酸球の関与する鼻ポリープ症、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症、アトピー性皮膚炎又は好酸球性食道炎の処置における、有効量の本開示の抗体分子のいずれか、又はそれを含む医薬組成物の使用も提供される。
【００７１】
好酸球性喘息、好酸球増多症候群、好酸球の関与する鼻ポリープ症、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症、アトピー性皮膚炎又は好酸球性食道炎の処置のための医薬の製造における、本開示の抗体分子のいずれか、又はそれを含む医薬組成物の使用も提供される。
【実施例】
【００７２】
以下の実施例は、本明細書に開示の実施形態の一部を更に説明するために提供される。実施例は、本開示の実施形態を限定するのではなく、例示することを意図する。
【００７３】
抗ヒトIL-5抗体の生成
抗ヒトIL-5抗体は、ゲノムにヒトV遺伝子をクローニングし、ヒトVドメイン及びラットFcドメインを有する抗体を産生する遺伝子導入ラット(OMT)から得た。簡潔には、遺伝子導入ラットは、21日にわたって4回(0日目、7日目、14日目、21日目)、IL-5をコードするDNAで遺伝子免疫化され、免疫化プロトコールの28日目に組換えヒトIL-5で追加免疫した。組換えヒトIL-5を使用するELISAアッセイによって、免疫化プロトコールの0日目及び38日目に血清抗体力価を決定した。簡潔には、各動物由来の血清を、PBS 1% BSA中に希釈し、1μg/mlのヒトIL-5、又は対照としてのBSAでコーティングしたELISAプレートを使用して試験した。ヤギ抗ラットIgG R-フィコエリトリンコンジュゲート(SouthernBiotech社、番号3030-09)を二次抗体として10μg/mlで使用した。特定の動物を、これらの血清力価に基づいてハイブリドーマ融合のために選択した。
【００７４】
ヒトIL-5に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを生成するために、免疫化動物から脾臓細胞及び/又はリンパ節細胞を単離し、P3X63Ag8.653非分泌マウス骨髄腫細胞(ATCC、CRL-1580)に融合させた。平底マイクロタイタープレートに、1mL当たりおよそ1×105個の細胞をプレーティングし、10%の胎仔クローン血清及び1×HAT(Sigma社)を含んだ選択培地で2週間インキュベートした。96ウェルプレートで4回培地を交換し(96ウェルの段階1から4)、次いでT25フラスコに入れ、最後にT75フラスコに入れる連続継代によってハイブリドーマを増殖させた。
【００７５】
ハイブリドーマクローン由来の上清を、最初に、GPIアンカーヒトIL-5でトランスフェクトした細胞を使用する全細胞ELISA、次いで、組換えヒトIL-5ELISAアッセイを使用するELISA(上述の後者)において、ハイブリドーマ増殖プロセスの間、アッセイした。T75段階までのスケールアッププロセスを生存し、これらのアッセイの両方において、結合に関する所与の閾値を超えるシグナルを与えたハイブリドーマを、Ig vドメインのクローニング及び配列決定のために、細胞ペレットとして凍結させた。キメラIgGを産生するおよそ20個のハイブリドーマを、これらのスクリーニング工程後のクローニングのために選択した。
【００７６】
候補キメラIgG由来のヒトvドメインを、ハイブリドーマ細胞のペレット由来のcDNAの生成、vドメインのPCR増幅、サブクローニング、及びDNA配列決定によって単離した。全部でおよそ35個の重鎖及び軽鎖の組合せを、これらのハイブリドーマの配列決定から得た。すべての抗体を哺乳動物の発現ベクターにクローニングし、HEK293細胞に一過的にトランスフェクトした。標準的プロテインA精製プロトコールを使用して、抗体を精製した。
【００７７】
抗体の機能試験及び特徴付け
ヒトIgG1フォーマットで選択した抗体を、ヒトIL-5のELISAにおいて特異性について最初にアッセイした。簡潔には、抗体をPBS 0.1% BSAに希釈し、1μg/mlのヒトIL-5、又は無関係の対照タンパク質でコーティングしたELISAプレートを使用して試験した。セイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗IgG抗体を二次抗体として使用した。
【００７８】
ヒトIL-5への免疫特異的結合を示した抗体を、ヒトTF-1.6G4(ヒト赤白血病細胞株TF-1の誘導体)細胞を使用するヒトIL-5に依存する細胞増殖アッセイにおける効力についてランク付けした。TF-1.6G4細胞株をサブクローニングし、IL-5Rαの表面発現の増強及びヒトIL-5への矛盾しない増殖応答について選択した。TF-1.6G4細胞株を、TF-1ヒト赤白血病細胞株(ATCC:CRL-2003)に対して使用した標準条件に従う培養において維持した。簡潔には、各抗体の希釈物を、45pMのヒトIL-5及び48時間インキュベートした1ウェル当たり5×104個のTF-1.6G4細胞の存在下でインキュベートし、CellTiter-Glo(登録商標)発光細胞生存能アッセイ(Promega社、WI)を使用して細胞増殖を決定した。すべての増殖曲線及び阻害曲線は、GraphPad Prism 6(バージョン6.04)ソフトウェアにおける3又は4パラメーター用量応答モデルを使用してフィッティングされた。Table 2(表2)にこれらの結果をまとめる。
【００７９】
【表２】
2020513761.tif 000005
【００８０】
Table 2(表2)では、試験の結果をTF1.6G4アッセイの効力の順にランク付けした。初期試験パネルを、効力、親和性、IL-5Rα阻害及び配列ライアビリティ(liability)(免疫原性及び発展性)に基づいて選択した。
【００８１】
Biacoreアッセイを使用して、組換えヒトIL-5に対する試験抗体の親和性及びヒトIL-5に対するIL-5Rα結合を阻害する効力を決定した。Table 2(表2)にこれらの結果をまとめる。ヒトIL-5に対する試験抗体の結合親和性(KD;図6)を、Biacore Series S Sensor Chip Protein A(GE Healthcare社)を75RUの捕捉レベルまで選択された精製IgG抗体でコーティングすることによってBiacore T200システム(GE Healthcare社)で決定し、次いで、組換えヒトIL-5を、1μg/mLから出発する7工程の2倍連続希釈範囲にわたって、1分当たり60μLで注射した。すべての実験は、HBS-EP+緩衝液(GE Healthcare社)を使用して実行した。得られたセンサーグラムは、二重参照された(対照(コーティングされた抗体を有さないプロテインA表面)フローセル値、また、緩衝液ブランクから減算した試験フローセル値)。結合定数は、二重参照センサーグラムに1:1Langmuir結合モデルをフィッティングさせることによって決定した。
【００８２】
各試験抗体がIL-5のIL-5Rαへの結合を阻害したかどうかを決定するために、Biacore T200又はBiacore 3000システム(GE Healthcare社)のいずれかを使用した。Biacore CM5 Sensor Chipを、2つの隣接する(試験及び対照)フローセルにおいて、製造業者の使用説明書に従って、Fab捕捉キット(GE Healthcare社)を用いて最初に誘導体化した。この表面を使用して、単一の試験フローセルにおいてそれぞれ精製したIgG試験抗体を捕捉した。次いで、5μg/mLの組換えヒトIL-5又は緩衝液ブランクを、試験フローセルと対照フローセルの両方にわたって注入し、それぞれ、試験フローセル表面を満たし、IL-5の非特異的会合を制御した。10μg/mLの精製IgG試験抗体又は緩衝液ブランクの第2の注入を試験フローセルに実行し、それぞれ、遊離のIL-5結合部位をブロックし、IgG試験抗体のFab捕捉抗体からの解離を制御した。
【００８３】
両フローセルにわたる5若しくは20μg/mLのいずれかのIL-5Rα-Fc(R&D Systems社)又は緩衝液ブランクの次の注入を使用して、この工程の間に、IgG試験抗体がIL-5とIL-5Rαの間の相互作用をブロックしたかどうかを決定するか又はIgG抗体のFab捕捉抗体からの解離を制御した。IL-5のIL-5Rαへの結合を阻害した抗体は、IL-5Rαの注入の際に著しいシグナルの低減を示した(Table 2(表2))。三重参照の減算方法を使用して、上記で詳述した方式でデータを分析した。すべてのデータをBiacore評価ソフトウェアからエクスポートし、Excel(Microsoft社)ソフトウェアで減算した。すべての実験をHBS-EP+緩衝液(GE Healthcare社)を使用して実行した。
【００８４】
試験抗体のより小さなパネル(Table 2(表2)の3A5、5H11及び2B4)をこれらの結果に基づいて選択した。抗体をヒトIgG4として再フォーマットし、同じアッセイで試験した。抗体3A5(元のIgG1)のIgG4バージョンを3A5.001と指定した。この完全ヒト抗体が、IgG1フォーマットの元の試験3A5と同等の効力を有することが実証された(図1)。
【００８５】
予測T細胞エピトープを除去するためにvドメイン領域に導入された特異的アミノ酸置換(VH:S[68]T、N[82A]S;VL:S[2]Y、I[3]V、Y[92]D、ここで、角括弧内の残基はKabatの位置を表す)を有する抗体3A5.001のバリアント(3A5.040と指定)を調製した。抗体3A5.040が、TF-1.6G4アッセイにおいて、その親抗体3A5.001(図2)と同等の効力を有することが実証された。
【００８６】
抗体3A5.040のCDRスキャン
抗体3A5.040のバリアントの生成-抗体3A5.040の単一変異バリアントを、軽鎖CDR1(CDR-L1)、軽鎖CDR2(CDR-L2)、重鎖CDR1(CDR-H1)及び重鎖CDR2(CDR-H2)(AbM命名法によって定義した)における各アミノ酸位置の9つの代表的アミノ酸-A、S、L、Y、D、Q、K、H、Wの群のうちの1つを置換することによって作製した。抗体バリアントをまた、軽鎖CDR3(CDR-L3)、重鎖CDR3(CDR-H3)における各CDRアミノ酸位置、並びに可変重鎖におけるKabatの位置93及び94における10個の代表的アミノ酸-A、S、L、Y、D、Q、K、H、W、Pの群のうちの1つを置換することによって作製した。生成したすべての単一変異抗体バリアントの完全なリストを、それぞれ、図3(可変重鎖)及び図4(可変軽鎖)に示す。
【００８７】
抗体を発現するベクターの構築-可変領域バリアントを、アミノ酸配列をDNA配列に逆翻訳し、次に、合成オリゴヌクレオチドのアセンブリーによってデノボで合成することによって生成した。可変重(VH)バリアントを、ヒト定常領域を含有する哺乳動物発現ベクターにクローニングし、全長抗体重鎖(ヒトIgG4重鎖CH1、ヒンジ、CH2、及びCH3ドメイン)を産生した。同様に、可変軽(VL)バリアントを、ヒトラムダ軽鎖定常領域を含有する哺乳動物発現ベクターにサブクローニングし、全長抗体ラムダ鎖を産生した。
【００８８】
抗体バリアントの発現-抗体重鎖及び軽鎖をコードする別々の発現ベクターをEXPI293(登録商標)細胞(Life Technologies社、Carlsbad、CA)にコトランスフェクトすることによって抗体を産生した。各単一変異鎖は、EXPI293(登録商標)システムにおいて、タンパク質発現のために親鎖と対合した。それぞれ20mLのトランスフェクションに対して、EXPI293(登録商標)発現培地20mLに3.6×107個の細胞が必要とされた。トランスフェクションの前日に、1mL当たり0.9×106個の生存細胞の密度で細胞を播種し、200rpmで回転するオービタルシェーカーにおいて、空気中8%のCO2の加湿雰囲気中で、37℃で終夜インキュベートした。トランスフェクションの日に、自動細胞カウンターを使用して、細胞数及び生存率を決定した。98%を超える生存細胞を有する培養物のみを使用した。それぞれ20mLのトランスフェクションに対して、OPTI-MEM(登録商標)(Life Technologies社、Carlsbad、CA)I還元血清培地(カタログ番号31985-062)中10μgの重鎖DNA及び10μgの軽鎖DNAを総体積1.0mLまで希釈することによって、脂質-DNA複合体を調製した。54μLのEXPIFECTAMINE(登録商標)293試薬(Life Technologies社、Carlsbad、CA)をOPTI-MEM(登録商標)I培地中で総体積1.0mLまで希釈した。両方のバイアルを穏やかに混合し、室温で5分間インキュベートした。インキュベーション後、希釈DNAを、希釈EXPIFECTAMINE(登録商標)293試薬及びDNA-EXPIFECTAMINE(登録商標)293試薬混合物と混合し、室温で更に20分間インキュベートして、DNA-EXPIFECTAMINE(登録商標)293試薬複合体の形成を可能とした。インキュベーション後、2mLのDNA-EXPIFECTAMINE(登録商標)293試薬複合体をそれぞれ50mLのバイオリアクターチューブ(TPP Techno Plastic Products AG社)に加えた。2mLのOPTI-MEM(登録商標)(Life Technologies社、Carlsbad、CA)I培地をDNA-EXPIFECTAMINE(登録商標)293試薬複合体の代わりに陰性対照チューブに加えた。200rpmで回転するオービタルシェーカーにおいて、空気中8%のCO2の加湿雰囲気を有する37℃のインキュベーター中で、細胞をインキュベートした。トランスフェクションのおよそ16〜18時間後に、100μLのEXPIFECTAMINE(登録商標)293トランスフェクションエンハンサー1及び1.0mLのEXPIFECTAMINE(登録商標)293トランスフェクションエンハンサー2を各バイオリアクターに加えた。トランスフェクションのおよそ48時間後に、上清を回収した。
【００８９】
抗体バリアントの精製-各抗体バリアントは、20又は100mLの細胞培養のいずれかで、EXPI293(登録商標)細胞において発現した。培養物を、50mLのファルコンチューブ中、3000×gで20分間遠心沈殿させ、0.22μmのフィルターを使用して、上清を濾過した。Gilson ASPEC GX274ロボットを使用して、上清を精製した。簡潔には、1.2mLのMABSELECT SURE(登録商標)プロテインA樹脂(GE Healthcare社)を充填したSPEカートリッジ(Agilent、12131014)を、3カラム体積の1×PBSを用いて予め平衡化した。上清をカラムにランし、続いて、4mLの1×PBSで洗浄した。各カラムを、1Mのクエン酸(pH2.9)9mLで洗浄した。抗体を0.1Mのクエン酸(pH2.9)2mLで溶出した。PD-10カラム(GE Healthcare社)を使用して、抗体をSorensens PBS(5mMのKH2PO4、3mMのNa2HPO4.2H2O、145.4mMのNaCl(pH約5.8))へ脱塩した。
【００９０】
Biacoreによる上清中の3A5.040バリアント抗体力価の決定-EXPI293(登録商標)細胞における発現に由来する抗体を含有する上清を、Biacore T200のプロテインAシリーズSチップを使用して分析し、それらの力価を決定し、親抗体3A5.040に関してそれらをランク付けした。各上清試料をランニング緩衝液(1×HBS-EP+、350mMのNaCl)で希釈し、フローセル(FC)2に60μL/分で注入することによって捕捉した。応答単位(RU)で得られた捕捉レベルを、注入の5秒後のレポートポイントからサイクル開始の5秒後のレポートポイントを減算することによって、FC2-1で測定した。60μL/分の流速で12秒間、50mMのNaOHをFC1に、4サイクル毎に2回注入することによって、表面を再生した。各再生後、ランニング緩衝液の注入によって、表面及びセンサーグラムを120秒間安定化させた。この方式でスクリーニングした多数の抗体によって複数のバッチを実行した。
【００９１】
各上清試料に対して得た捕捉レベル(Biacore応答単位「RU」で)を、それぞれ30秒の注入に対して得られた値を上清希釈因子で乗算することによって調整し、異なる実験ランにわたってさまざまな程度まで希釈した上清間の捕捉レベルの比較を可能とした。各変異体の相対的抗体発現レベル(力価)を、以下の式を使用して、バッチ特異的3A5.040上清(Table 3(表3))と比較した:
(30秒の注入に対して調整した3A5.040基準RU/30秒の注入に対して調整したバリアント抗体のRU)×100=親抗体の力価の比率(% 3A5.040力価)
式1
【００９２】
3A5.040親抗体より高い力価を有するバリアント抗体は、100%を超える「% 3A5.040力価」値を有し、より低い力価を有するバリアント抗体は、100%未満の値を有した。このことは、親抗体である3A5.040に対して改善された発現を有し得るバリアント抗体の特定を可能とした。一部のバリアントの力価は、上清試料のBiacore分析によって決定されなかったが、上述のように発現及び精製され、それらの精製された収量を分光光度分析(A280)によって決定し、次いで、3A5.040親抗体と比較した(Table 5(表5))。
【００９３】
Biacoreによる3A5.040バリアント抗体のIL-5結合速度論の決定-EXPI293(登録商標)細胞における発現に由来する抗体又は精製抗体を含有する上清を、Biacore T200システム(GE Healthcare社)のプロテインAシリーズSチップを使用して分析し、組換えヒトIL-5に対するそれらの結合親和性を決定し、親抗体3A5.040に関してそれらをランク付けした。
【００９４】
各抗体をランニング緩衝液(1×HBS-EP+、350mMのNaCl)中で希釈し、FC2でおよそ50RUまで60μL/分で捕捉した。次いで、ランニング緩衝液の注入によって、表面及びセンサーグラムを120秒間安定化させた。5μg/mLの組換えヒトIL-5又はランニング緩衝液を、60μL/分の流速で70秒間、FC1及び2に注入した。IL-5をランニング緩衝液中に300秒間解離させた。60μL/分の流速で12秒間、50mMのNaOHをFC1及び2に注入することによって、表面を再生した。60μL/分の流速で60秒間、FC1及び2への流れを更に浄化するために、緩衝液を注入した。表面を、FC1及び2に対して、ランニング緩衝液を用いて300秒間安定化させた。3A5.040親抗体を含有し、各バッチに関してトランスフェクトされた上清を、各ランの間中、およそ25サイクル毎にランした。3A5.040及びIgG4ラムダアイソタイプ対照の精製試料を、アッセイ間の変動性の尺度としてバッチ毎にランした。この方式でスクリーニングした多数の抗体によって複数のバッチを実行した。
【００９５】
データを二重参照し(フローセル2をフローセル1及び緩衝液ブランクから減算した)、Biacore評価ソフトウェアを用いる1:1 Langmuir結合モデルに、センサーグラムをフィッティングした。kd(オフレート)値を実行の間中、各3A5.040上清試料に対して計算し、1つの3A5.040上清試料のみを有した実行2.1を除いて、これらを平均して基準kdを与えた(Table 3(表3)及びTables 6〜11(表6〜11))。各上清抗体に対して計算したkd値を、以下の式を使用して、3A5.040の平均基準kdに対して比較した:
(3A5.040の基準kd/バリアント抗体のkd)×100=親抗体のkdの比率(% 3A5.040のkd)
式2
【００９６】
3A5.040親抗体より低いkd(より遅いオフレート)を有するバリアント抗体は、100%を超える「% 3A5.040のkd」値を有し、より高いkdを有するバリアント抗体は、100%未満の値を有した。このことは、親抗体であるに3A5.040対して、IL-5に対して改善された結合速度論、したがって、改善された機能を有し得るバリアント抗体の特定を可能とした。精製タンパク質だけが作製されたバリアントについて(Table 6(表6))、Biacore速度論分析を、これらの精製抗体を使用して上記のように三連で実施し、各三連の分析に由来する平均値を使用して、上記のように、kdの比率計算を実施した(Table 4(表4)及びTables 8〜11(表8〜11))。
【００９７】
【表３Ａ】
2020513761.tif 000006
【００９８】
【表３Ｂ】
2020513761.tif 000007
【００９９】
【表３Ｃ】
2020513761.tif 000008
【０１００】
【表３Ｄ】
2020513761.tif 000009
【０１０１】
【表３Ｅ】
2020513761.tif 000010
【０１０２】
【表３Ｆ】
2020513761.tif 000011
【０１０３】
【表３Ｇ】
2020513761.tif 000012
【０１０４】
【表３Ｈ】
2020513761.tif 000013
【０１０５】
【表３Ｉ】
2020513761.tif 000014
【０１０６】
【表３Ｊ】
2020513761.tif 000015
【０１０７】
【表３Ｋ】
2020513761.tif 000016
【０１０８】
【表３Ｌ】
2020513761.tif 000017
【０１０９】
【表３Ｍ】
2020513761.tif 000018
【０１１０】
【表３Ｎ】
2020513761.tif 000019
【０１１１】
【表３Ｏ】
2020513761.tif 000020
【０１１２】
【表３Ｐ】
2020513761.tif 000021
【０１１３】
【表３Ｑ】
2020513761.tif 000022
【０１１４】
【表３Ｒ】
2020513761.tif 000023
【０１１５】
【表３Ｓ】
2020513761.tif 000024
【０１１６】
【表３Ｔ】
2020513761.tif 000025
【０１１７】
【表３Ｕ】
2020513761.tif 000026
【０１１８】
【表３Ｖ】
2020513761.tif 000027
【０１１９】
【表３Ｗ】
2020513761.tif 000028
【０１２０】
【表３Ｘ】
2020513761.tif 000029
【０１２１】
【表３Ｙ】
2020513761.tif 000030
【０１２２】
【表３Ｚ】
2020513761.tif 000031
【０１２３】
【表３ａ】
2020513761.tif 000032
【０１２４】
【表３ｂ】
2020513761.tif 000033
【０１２５】
【表４Ａ】
2020513761.tif 000034
【０１２６】
【表４Ｂ】
2020513761.tif 000035
【０１２７】
【表４Ｃ】
2020513761.tif 000036
【０１２８】
【表４Ｄ】
2020513761.tif 000037
【０１２９】
【表４Ｅ】
2020513761.tif 000038
【０１３０】
【表４Ｆ】
2020513761.tif 000039
【０１３１】
【表５】
2020513761.tif 000040
【０１３２】
【表６】
2020513761.tif 000041
【０１３３】
【表７】
2020513761.tif 000042
【０１３４】
【表８】
2020513761.tif 000043
【０１３５】
【表９】
2020513761.tif 000044
【０１３６】
【表１０】
2020513761.tif 000045
【０１３７】
【表１１】
2020513761.tif 000046
【０１３８】
発現ベクターの構築
ヌクレオチド配列は、遺伝子発現、次にタンパク質発現レベルに影響を及ぼすことができる。3A5.046の最適な発現のために、いくつかの異なるヌクレオチド配列を試験した。これらの配列を以下の表にまとめる:
【０１３９】
【表１２】
2020513761.tif 000047
【０１４０】
SPRによるヒト組換えIL-5に対する抗体3A5.046の親和性の測定
抗体3A5.046の組換えヒトIL-5に対する親和性を、Biacore T200システム(GE Healthcare社)を使用して決定した。簡潔には、市販のマウス抗ヒトIgG抗体(Thermo Scientific社)を、製造業者の推奨に従って、Biacore CM5チップ(GE Healthcare社)の2つの隣接する(対照及び試験)フローセルに連結させた。3A5.046抗体を、試験フローセル表面に、低密度(およそ125RU)で捕捉し、組換えヒトIL-5の希釈液又は緩衝液ブランクを、30μL/分で、試験フローセルと対照フローセルの両方に対して注入した(図6、Table 13(表13))。
【０１４１】
得られたセンサーグラムを二重参照した(対照(コーティングされた抗体を有さない抗ヒトIgG連結表面)フローセル値、及びまた、緩衝液ブランクから減算した試験フローセル値)。2.5、1.25、0.625、0.313、及び0.156μg/mLのヒトIL-5の注入から減算したセンサーグラムを、二連のアッセイに由来する結合定数を決定するために、Biacore評価ソフトウェアを使用して1:1Langmuir結合モデルにフィッティングさせた(Table 13(表13))。
【０１４２】
【表１３】
2020513761.tif 000048
【０１４３】
これらの結果は、抗体3A5.046が組換えヒトIL-5に対して高い親和性を有することを実証する。
【０１４４】
TF-1.6G4細胞株増殖アッセイにおいて、メポリズマブと比較した3A5.046の効力
3A5.046及びメポリズマブを、TF-1.6G4細胞株増殖アッセイにおいてランした。3A5.046及びメポリズマブは、それぞれ、13.8pM及び534pMの平均IC50を有するヒトIL-5の増殖を阻害した(Table 14(表14)及び図7Aを参照のこと)。両抗体は、3A5.046に対して43.8pM及びメポリズマブに対して584pMの平均IC50を有する、TF1.6G4細胞株(図7B)におけるカニクイザルIL-5の阻害を実証した。
【０１４５】
【表１４】
2020513761.tif 000049
【０１４６】
本発明の抗IL-5抗体を使用するELISAによる、初代細胞由来のナイーブIL-5の検出
抗体3A5をサンドイッチELISAにおける捕捉試薬として使用した。スパイク緩衝液試料中の市販の検出抗体(TRFk5R;R&D systems社、番号MAB405)と対合した組換えIL-5レベルの定量化を決定することができた(図8)。次いで、この方法を、初代細胞によって分泌されたナイーブIL-5の検出に適用した。4名のドナーに由来するCD4+ T細胞を刺激して、IL-5を分泌させた。次いで、IL-5レベルを、捕捉試薬として抗体3A5を用いるサンドイッチELISAを使用して決定した。4名のドナーのT細胞のうちの3つがT細胞刺激に応答し、細胞培養物上清において検出可能なIL-5レベルを有した(図8)。捕捉剤として抗体3A5.046を使用して、初代ヒトドナーのCD4+ T細胞から分泌されたヒトIL-5に関して、同様の研究を実施し、得られた結果は、抗体3A5を用いて得た結果と一致した(データは示さず)。
【０１４７】
好酸球分化の抗IL-5抗体による阻害
CD34+臍帯血細胞を使用する生存アッセイを使用して、骨髄前駆細胞の好酸球へのIL-5に依存する分化を阻害する抗IL-5抗体の能力を評価し、表現型的に成熟した好酸球の生存を阻害する抗IL-5抗体の能力を評価した。IL-5で処理した対照細胞では、表現型的に成熟した好酸球は、28日目に優勢集団であった(図9、グラフの陰付き領域)。抗体3A5.046は、IL-5と共に28日間インキュベートした、CD34+臍帯血細胞の好酸球への分化を阻害することができた。抗体3A5.046は、メポリズマブよりも強力なIL-5媒介好酸球分化の阻害剤であった(図9)。
【０１４８】
X線結晶学分析
抗体3A5.046Fabと組換えヒトIL-5の間の複合体の分子構造をX線結晶学によって調査する。X線結晶学実験を準備するために、3A5.046をパパインで消化し、ヒンジ領域のインタクト抗体を切断し、FcドメインとFabドメインを分離する。3A5.046Fabを標準のプロテインA親和性クロマトグラフィーによって精製し、組換え非グリコシル化ヒトIL-5と複合体を形成させる。3A5.046Fab:ヒトIL-5複合体を、標準のサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、結晶化実験のために精製する。複合体を、様々な濃度で、結晶化条件の広範囲のサンプリングのための市販のスパースマトリックス結晶化スクリーニングに設定する。スパースマトリックススクリーニングから複合体の結晶をもたらす任意の「ヒット」条件の最適化を、所望の結晶形態及び結晶回折に関する改善のために実施する。
【０１４９】
3A5.046Fab:ヒトIL-5複合体の結晶を回収し、液体窒素中で瞬間凍結し、回折試験及びデータ採取のためにシンクロトロン設備に輸送する。結晶回折試験を、高分解能回折を生じるための高エネルギーX線マイクロビームラインを収容するシンクロトロンで実施する。このようにして、3A5.046Fab:ヒトIL-5複合体の結晶に関するX線回折データを採取する。複合体の初期構造モデルは、鋳型としてIL-5及びFabの公開された分子構造を用いる標準の分子置き換え技法を使用して得ることができる。3A5.046FabとヒトIL-5複合体の最終構造は、フィッティングのエラーが30%より良好であり(最終Rfreeが0.3)、化学結合パラメーター(例えば、結合の長さ及び角、化学量論並びに水素結合の分布)が許容限界内であるまでは、構造モデルの反復改良によって得ることができる。
【０１５０】
非ヒトモデル種由来のIL-5に結合する抗体3A5.046の特徴付け
組換えサイトカインヒトIL-5、ラットIL-5、マウスIL-5、及びモルモットIL-5に対する結合について、T200システム(GE Healthcare社)を使用するBiacoreアッセイによって、抗体3A5.046を試験した。非ヒトIL-5のこのパネルは、前臨床開発において使用される主要な動物モデル種を代表するよう選択した。アイソタイプ対照抗体(IgG4)及び抗体3A5.046を、標準のアミンカップリング法を使用して、それぞれ、シリーズS CM5チップ(GE Healthcare社)のフローセル1及び2に固定した。サイトカインを、HBS-EP+ランニング緩衝液(GE Healthcare社)中1及び10μg/mlまで希釈し、フローセル1及び2にわたって注入した。フローセル1及び2にわたる緩衝液のみの注入は、二重参照のために含まれた。Biacore T200評価ソフトウェアを使用してデータ分析を実施した。得られたセンサーグラムを二重参照した(対照フローセル値、また緩衝液ブランクから減算した試験フローセル値)。
【０１５１】
抗体3A5.046は、ヒトIL-5及びカニクイザルIL-5に結合するが、マウスIL-5、ラットIL-5、又はモルモットIL-5には結合しないことが分かった(図10A〜図10E)。このことは、3A5.046がカニクイザル・マカク(cynomolgus macaque)の前臨床モデルで使用され得ることを示した。
【０１５２】
抗体3A5.046はIL-5に密接に関連する他のヒトサイトカインに結合しない
組換えヒトサイトカインIL-2、IL-3、IL-4、IL-5、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)、及び成長ホルモン(GH)に対する結合について、T200システム(GE Healthcare社)を使用するBiacoreアッセイによって、抗体3A5.046を試験した。この密接に関連するヒトサイトカインの代表的なパネルを、ヒトIL-5に対するそれらの構造及び機能の類似性に基づいて選択した。アイソタイプ対照抗体(IgG4)及び抗体3A5.046を、標準のアミンカップリング法を使用して、それぞれ、シリーズS CM5チップ(GE Healthcare社)のフローセル1及び2に固定した。サイトカインを、HBS-EP+ランニング緩衝液(GE Healthcare社)中1及び10μg/mlまで希釈し、フローセル1及び2にわたって注入した。フローセル1及び2にわたる緩衝液のみの注入は、二重参照のために含まれた。Biacore T200評価ソフトウェアを使用してデータ分析を実施した。得られたセンサーグラムを二重参照した(対照フローセル値、また緩衝液ブランクから減算した試験フローセル値)。
【０１５３】
抗体3A5.046は、ヒトIL-5にのみ結合し、ヒトサイトカインIL-2、IL-3、IL-4、GM-CSF、M-CSF、又はGHには結合しないことが分かり(図11A〜図11D)、したがって、3A5.046のヒトIL-5に対する高い特異性が実証された。
ブタ回虫に誘導されるカニクイザルの気道好酸球増加症モデルにおける抗体3A5.046の評価
【０１５４】
Hart, T.K.ら、Preclinical efficacy and safety of mepolizumab(SB-240563)、humanized monoclonal antibody to IL-5, in cynomolgus monkeys. J Allergy Clin Immunol、2001. 108(2):250〜7頁に記載された急性気道好酸球増加症のブタ回虫カニクイザルモデルを使用して、抗体3A5.046を試験した。
【０１５５】
ブタ回虫に以前に感作された16頭の雌のカニクイザル・マカクを、A. suumによる皮内負荷によって保持された感受性レベルについて評価した。これらの動物のうちの14頭を、負荷に対する皮膚丘疹応答に基づいて、この研究における参加に対して選択し、1群当たりn=7の2つの群に無作為化した。皮内皮膚丘疹試験の2週間後に、ベースラインの血液及び気管支肺胞洗浄液(BALF)試料を採取した(8日目)。ベースライン試料採取の約24時間後に、盲検方式で、プラセボ(200mMのアルギニン及び25mMのヒスチジンを含む水性緩衝液(pH6.3)を含む)又は抗体3A5.046(200mMのアルギニン及び25mMのヒスチジンを含む水性緩衝液(pH6.3)中、静脈内に10mg/kg)のいずれかで、動物を処置した(7日目)。プラセボ又は抗体による処置の1週間後に、第2の皮内A. suum負荷を実施し、A. suum吸入負荷を、PARI LCネブライザーにより投与した等量のA. suum抽出物(Greer Laboratories Inc.社;滅菌水中5mg/ml)の送達によってすべての動物に与えた(0日目)。皮膚丘疹の直径を負荷の15分後に測定した。A. suum吸入負荷の2日後に、血液及びBALF試料を採取した。血液学エンドポイント及びPK分析のための更なる血液試料を、10日目に開始して45日目まで、毎週採取した。
【０１５６】
第1の皮内A. suum負荷と第2の皮内A. suum負荷の間に、皮膚丘疹応答における有意な差はなかった。すべての動物は、A. suum負荷の結果としてBALFにおける好酸球の増加を示したが、抗体3A5.046で処置した動物では、この増加は無視できるものであった。A. suum負荷の48時間後にプラセボ処置した動物と比較して、抗体3A5.046で処置した動物のBALFには有意に少ない好酸球が存在した(p<0.01;マン・ホイットニー検定;図12)。
【０１５７】
A. suum負荷はまた、負荷の10日後にプラセボ処置した動物においてベースラインに対して血中好酸球の有意な増加を導いた(図13A)。抗体3A5.046による処置は、ベースライン未満のレベルまで、血中好酸球の有意な減少を導き(図13A)、この血中好酸球数の下降は、初期投与後少なくとも52日の期間にわたって維持された(図13B)。
【０１５８】
まとめると、3A5.046による処置は、負荷の48時間後に、A. suumに誘導された気道好中球増加症を有意に低減させ、10mg/kgの静脈内(IV)単回投与後に少なくとも52日間、ベースラインレベル未満まで、血中好酸球を有意に減少させた。
【０１５９】
気道好酸球増加症のヒト化IL-5ラットモデルにおける抗体機能の調査
アルテルナリア・アルテルナータ(Alternaria)は、ヒトにおいて喘息を誘発することが知られている真菌アレルゲンであり、齧歯類において好酸球増加症及び喘息様症状を引き起こす可能性がある。Alternariaを負荷した場合、ヒト化IL-5ノックインラット(ラットIL-5をヒトIL-5によって置き換えた動物)は、肺由来の気管支肺胞洗浄液(BALF)における好酸球レベルの上昇を示す(図14)。
【０１６０】
Alternaria懸濁液の単回気管内注入がヒト化IL-5ラットに投与され、Alternaria投与の2、3又は4日後に血液及びBALF試料が採取される。典型的には、このモデルにおいて、好酸球はBALF試料で有意に増加し、血液試料では増加するか又は変化しない場合がある。Alternariaによる好酸球増加症の誘導前に、試験抗体を投与し、BALF及び血液中の好酸球数を低減させるそれらの能力を評価する。
【０１６１】
当業者は、多数の変更及び修正が本発明の好ましい実施形態に対してなされ得ること、並びにこのような変更及び修正は本発明の精神を逸脱することなくなされ得ることを認識する。したがって、添付の特許請求の範囲は、本発明の真の精神及び範囲内にあるすべてのこのような均等なバリエーションを網羅することが意図される。
【０１６２】
この文書で引用され又は記載されるそれぞれの特許、特許出願、及び刊行物の開示は、参照によりその全体として本明細書に組み込まれる。
【０１６３】
【表１５Ａ】
2020513761.tif 000050
【０１６４】
【表１５Ｂ】
2020513761.tif 000051
【０１６５】
【表１５Ｃ】
2020513761.tif 000052
【０１６６】
【表１５Ｄ】
2020513761.tif 000053
【０１６７】
【表１５Ｅ】
2020513761.tif 000054
【０１６８】
【表１５Ｆ】
2020513761.tif 000055
【０１６９】
【表１５Ｇ】
2020513761.tif 000056
【０１７０】
【表１５Ｈ】
2020513761.tif 000057
【０１７１】
【表１５Ｉ】
2020513761.tif 000058
【０１７２】
【表１５Ｊ】
2020513761.tif 000059
【０１７３】
【表１５Ｋ】
2020513761.tif 000060
【０１７４】
【表１５Ｌ】
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【０１７５】
【表１５Ｍ】
2020513761.tif 000062
【０１７６】
【表１５Ｎ】
2020513761.tif 000063
【０１７７】
【表１５Ｏ】
2020513761.tif 000064
【０１７８】
【表１５Ｐ】
2020513761.tif 000065
【０１７９】
【表１５Ｑ】
2020513761.tif 000066
【０１８０】
【表１５Ｒ】
2020513761.tif 000067
【０１８１】
【表１５Ｓ】
2020513761.tif 000068
【０１８２】
【表１５Ｔ】
2020513761.tif 000069
【０１８３】
【表１５Ｕ】
2020513761.tif 000070
【０１８４】
【表１５Ｖ】
2020513761.tif 000071
【０１８５】
実施形態
以下の実施形態のリストは、以前の記載に取って代わる又は以前の記載と取り替えるというよりは、補足することを意図するものである。
【０１８６】
実施形態1.  表面プラズモン共鳴によって決定される、少なくとも約40pMの平衡親和性定数(KD)でヒトIL-5に免疫特異的に結合するヒト抗体分子。
【０１８７】
実施形態2.  ヒトIL-5に免疫特異的に結合するヒト抗体分子であって、
配列番号4のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号6のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、配列番号8のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、配列番号5、21、24、27、30、33、36、39、又は66のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号7、42、又は45のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号15、48、51、54、57、60、又は63のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む、ヒト抗体分子。
【０１８８】
実施形態3.  配列番号4のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号6のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、配列番号8のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、並びに
a. 配列番号5のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号15のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3;
b. 配列番号21のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号15のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3;
c. 配列番号24のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号15のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3;
d. 配列番号27のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号15のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3;
e. 配列番号30のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号15のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3;
f. 配列番号33のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号15のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3;
g. 配列番号36のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号15のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3;
h. 配列番号39のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号15のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3;
i. 配列番号66のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号15のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3;
j. 配列番号5のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号42のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号15のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3;
k. 配列番号5のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号45のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号15のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3;
l. 配列番号5のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号48のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3;
m. 配列番号5のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号51のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3;
n. 配列番号5のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号54のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3;
o. 配列番号5のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号57のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3;
p. 配列番号5のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号60のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3;又は
q. 配列番号5のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号63のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含み、CDRのアミノ酸残基の位置がAbMによって決定される、実施形態1又は2に記載の抗体分子。
【０１８９】
実施形態4.  配列番号4のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号6のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、配列番号8のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、配列番号5のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号7のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号15のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む、実施形態3に記載の抗体分子。
【０１９０】
実施形態5.  配列番号16のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び
a. 配列番号17のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
b. 配列番号22のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
c. 配列番号25のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
d. 配列番号28のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
e. 配列番号31のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
f. 配列番号34のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
g. 配列番号37のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
h. 配列番号40のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
i. 配列番号43のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
j. 配列番号46のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
k. 配列番号49のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
l. 配列番号52のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
m. 配列番号55のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
n. 配列番号58のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
o. 配列番号61のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
p. 配列番号64のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;又は
q. 配列番号67のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、実施形態1から4のいずれか1つに記載の抗体分子。
【０１９１】
実施形態6.  配列番号16のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号17のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、実施形態1から5のいずれか1つに記載の抗体分子。
【０１９２】
実施形態7. a. S228P変異;
b. M252Y変異、S254T変異、及びT256E変異;
c. 重鎖C末端リジン残基の欠失;又は
d. aからcのいずれかの組合せ
を含む、実施形態1から6のいずれか1つに記載の抗体分子。
【０１９３】
実施形態8. S228P変異及び重鎖C末端リジン残基の欠失を含む、実施形態7に記載の抗体分子。
【０１９４】
実施形態9. S228P変異、M252Y変異、S254T変異、T256E変異、及び重鎖C末端リジン残基の欠失を含む、実施形態7に記載の抗体分子。
【０１９５】
実施形態10. IgG4重鎖定常領域及びラムダ軽鎖定常領域を含む、実施形態1から9のいずれか1つに記載の抗体分子。
【０１９６】
実施形態11.  配列番号18のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖、及び
a. 配列番号19のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖;
b. 配列番号23のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖;
c. 配列番号26のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖;
d. 配列番号29のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖;
e. 配列番号32のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖;
f. 配列番号35のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖;
g. 配列番号38のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖;
h. 配列番号41のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖;
i. 配列番号44のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖;
j. 配列番号47のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖;
k. 配列番号50のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖;
l. 配列番号53のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖;
m. 配列番号56のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖;
n. 配列番号59のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖;
o. 配列番号62のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖;
p. 配列番号65のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖;又は
q. 配列番号68のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、実施形態1から10のいずれか1つに記載の抗体分子。
【０１９７】
実施形態12.  配列番号20のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号19のアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、実施形態1から10のいずれか1つに記載の抗体分子。
【０１９８】
実施形態13. Fab断片、Fab2断片、又は単鎖抗体である、実施形態2又は実施形態3に記載の抗体分子。
【０１９９】
実施形態14.  以下の特性:
a. IL-5のIL-5受容体への結合を低減すること;
b. 少なくとも約20日の血清半減期を有すること;又は
c. ヒト及びカニクイザルIL-5に結合するが、マウス、ラット、若しくはモルモットIL-5には結合しないこと
のうちの1つ又は複数を有する、実施形態1から13のいずれか1つに記載の抗体分子。
【０２００】
実施形態15.  表面プラズモン共鳴によって決定される、少なくとも約40pMの平衡親和性定数(KD)でヒトIL-5に結合する、実施形態2に記載の抗体分子。
【０２０１】
実施形態16.  実施形態1から15のいずれか1つに記載の抗体分子を含む医薬組成物。
【０２０２】
実施形態17.  実施形態1から15のいずれか1つに記載の抗体分子をコードする核酸分子。
【０２０３】
実施形態18.  実施形態17に記載の核酸分子を含むベクター。
【０２０４】
実施形態19.  実施形態1から15のいずれか1つに記載の抗体分子を発現するように形質転換された細胞。
【０２０５】
実施形態20.  好酸球性喘息、好酸球増多症候群、好酸球の関与する鼻ポリープ症、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症、アトピー性皮膚炎又は好酸球性食道炎を有する対象を処置する方法であって、
治療有効量の実施形態1から15のいずれか1つに記載の抗体分子又は実施形態16に記載の医薬組成物を対象に投与して、好酸球性喘息、好酸球増多症候群、好酸球の関与する鼻ポリープ症、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症、アトピー性皮膚炎又は好酸球性食道炎を処置する工程を含む方法。
【０２０６】
実施形態21.  好酸球性喘息、好酸球増多症候群、好酸球の関与する鼻ポリープ症、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症、アトピー性皮膚炎、又は好酸球性食道炎の処置における、有効量の実施形態1から15のいずれか1つに記載の抗体分子又は実施形態16に記載の医薬組成物の使用。
【０２０７】
実施形態22.  好酸球性喘息、好酸球増多症候群、好酸球の関与する鼻ポリープ症、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症、アトピー性皮膚炎又は好酸球性食道炎の処置のための医薬の製造における、実施形態1から15のいずれか1つに記載の抗体分子又は実施形態16に記載の医薬組成物の使用。
【図１】
2020513761.tif 000072
【図２】
2020513761.tif 000073
【図３】
2020513761.tif 000074
【図４】
2020513761.tif 000075
【図５】
2020513761.tif 000076
【図６】
2020513761.tif 000077
【図７Ａ】
2020513761.tif 000078
【図７Ｂ】
2020513761.tif 000079
【図８Ａ】
2020513761.tif 000080
【図８Ｂ】
2020513761.tif 000081
【図９】
2020513761.tif 000082
【図１０Ａ】
2020513761.tif 000083
【図１０Ｂ】
2020513761.tif 000084
【図１０Ｃ】
2020513761.tif 000085
【図１０Ｄ】
2020513761.tif 000086
【図１０Ｅ】
2020513761.tif 000087
【図１１Ａ】
2020513761.tif 000088
【図１１Ｂ】
2020513761.tif 000089
【図１１Ｃ】
2020513761.tif 000090
【図１１Ｄ】
2020513761.tif 000091
【図１２】
2020513761.tif 000092
【図１３Ａ】
2020513761.tif 000093
【図１３Ｂ】
2020513761.tif 000094
【図１４】
2020513761.tif 000095
【配列表】
2020513761000001.app
【国際調査報告】
2020513761.tif 000096
2020513761.tif 000097
2020513761.tif 000098
2020513761.tif 000099