(57)【要約】  本発明は、肝疾患の処置または予防に適したＲＮＡに関する。特に、本発明は、細胞外マトリクスプロテアーゼ、ＣＣＡＡＴ／エンハンサ−結合タンパク質α（CEBPA）、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（TRAIL）、肝細胞増殖因子（HGF）、肝細胞核因子４α（HNF4A）、線維芽細胞増殖因子、オピオイド成長因子受容体様１（opioid growth factor receptor-like 1）（OGFRL1）、リラキシン１（RLN1）、リラキシン２（RLN2）およびリラキシン３（RLN3）からなる群から選択される少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡを提供する。本発明は、上記ＲＮＡ、ならびに当該ＲＮＡを含んでいる組成物およびキットに関する。さらに、本発明は、医薬としての使用のため（特に特に肝疾患の処置または予防のため）の、本明細書に開示されようなＲＮＡ、組成物またはキットに関する。本発明はまた、コードされているタンパク質の発現を増強させるための、特に遺伝子治療における、本明細書に開示されているようなＲＮＡ、組成物またはキットの使用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのコード配列を含んでおり、
上記コード配列は、ヒトコラゲナーゼMMP1、肝細胞増殖因子（HGF）、ＣＣＡＡＴ／エンハンサ−結合タンパク質α（CEBPA）、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（TRAIL）、細胞外マトリクスプロテアーゼ、肝細胞核因子４α（HNF4A）、線維芽細胞増殖因子２１（FGF21）、オピオイド増殖因子受容体様１（OGFRL1）、リラキシン１（RLN1）、リラキシン２（RLN2）およびリラキシン３（RLN3）、またはこれらのペプチドもしくはタンパク質のうちいずれかの断片もしくはバリアントからなる群から選択される少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質をコードする、肝疾患の処置または予防における使用のための、ＲＮＡ。
【請求項２】
上記ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ウイルスＲＮＡまたはレプリコンＲＮＡである、請求項１に記載の使用のためのＲＮＡ。
【請求項３】
上記ＲＮＡ、好ましくは上記コード配列は、化学修飾された糖、化学修飾された骨格または化学修飾された核酸塩基を含んでいない、請求項１または２に記載の使用のためのＲＮＡ。
【請求項４】
上記ＲＮＡは、化学修飾されたヌクレオシドまたはヌクレオチドを含んでいない、請求項３に記載の使用のためのＲＮＡ。
【請求項５】
上記ＲＮＡは化学修飾されていない、請求項３または4に記載の使用のためのＲＮＡ。
【請求項６】
上記肝疾患は、肝線維症、肝硬変および肝がんからなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用のためのＲＮＡ。
【請求項７】
上記ペプチドまたはタンパク質は、細胞外マトリクスプロテアーゼまたはその断片もしくはバリアントを含んでいる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用のためのＲＮＡ。
【請求項８】
上記細胞外マトリクスプロテアーゼが、細菌コラゲナーゼおよび哺乳類基質メタロプロテイナーゼからなる群から選択される、請求項７に記載の使用のためのＲＮＡ。
【請求項９】
上記細胞外マトリクスプロテアーゼは、基質メタロプロテイナーゼ−１、好ましくはヒト基質メタロプロテイナーゼ−１、クロストリジウムコラゲナーゼColGおよびクロストリジウムコラゲナーゼColHから選択される、請求項７または８に記載の使用のためのＲＮＡ。
【請求項１０】
上記ペプチドまたはタンパク質は、配列番号２０〜２８からなる群から選択されるアミノ酸配列、または当該アミノ酸配列のいずれか１つの断片もしくはバリアントを含んでいる、請求項７〜９のいずれか１項に記載の使用のためのＲＮＡ。
【請求項１１】
上記ペプチドまたはタンパク質は、ＣＣＡＡＴ／エンハンサ−結合タンパク質α（CEBPA）、好ましくはヒトCEBPA、またはその断片もしくはバリアントを含んでいる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用のためのＲＮＡ。
【請求項１２】
上記ペプチドまたはタンパク質は、配列番号８〜１３からなる群から選択されるアミノ酸配列、または当該アミノ酸配列のいずれか１つの断片もしくはバリアントを含んでいる、請求項１１に記載の使用のためのＲＮＡ。
【請求項１３】
上記ペプチドまたはタンパク質は、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（TRAIL）、またはその断片もしくはバリアントを含んでいる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用のためのＲＮＡ。
【請求項１４】
上記ペプチドまたはタンパク質は、配列番号４〜７からなる群から選択されるアミノ酸配列、または当該アミノ酸配列のいずれか１つの断片もしくはバリアントを含んでいる、請求項１３に記載の使用のためのＲＮＡ。
【請求項１５】
上記ペプチドまたはタンパク質は、肝細胞核因子４α（HNF4A）、肝細胞増殖因子（HGF）、線維芽細胞増殖因子２１（FGF21）、オピオイド増殖因子受容体様１（OGFRL1）、リラキシン１（RLN1）、リラキシン２（RLN2）およびリラキシン３（RLN3）からなる群から選択され、上記ペプチドまたはタンパク質は、好ましくは配列番号１４〜１９からなる群から選択されるアミノ酸配列、または当該アミノ酸配列のいずれか１つの断片またはバリアントを含んでいる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用のためのＲＮＡ。
【請求項１６】
上記ＲＮＡの上記少なくとも１つのコード配列は、配列番号３２〜７１からなる群から選択される核酸配列、または当該核酸配列のいずれか１つの断片もしくはバリアントを含んでいる、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の使用のためのＲＮＡ。
【請求項１７】
上記ＲＮＡは、モノシストロン性、ビシストロン性、またはマルチシストロン性である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の使用のためのＲＮＡ。
【請求項１８】
上記ＲＮＡはｍＲＮＡである、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の使用のためのＲＮＡ。
【請求項１９】
ＲＮＡは、修飾ＲＮＡ、好ましくは安定化ＲＮＡである、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の使用のためのＲＮＡ。
【請求項２０】
上記ＲＮＡの上記少なくとも１つのコード配列のＣ／Ｇ含量は、対応する野生型ＲＮＡの対応するコード配列のＣ／Ｇ含量と比べて多く、
上記ＲＮＡの上記少なくとも１つのコード配列のＣ含量は、対応する野生型ＲＮＡの対応するコード配列のＣ含量と比べて多く、および／または
上記ＲＮＡの上記少なくとも１つのコード配列の少なくとも１つのコドンは、ヒトのコドン使用頻度に適合されており、コドン適合指数（CAI）は、好ましくは上記ＲＮＡの上記少なくとも１つのコード配列において増大されているか、または最大化されており、
上記ＲＮＡによってコードされる上記アミノ酸配列は、好ましくは対応する野生型ＲＮＡによってコードされているアミノ酸配列と比べて改変されていない、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の使用のためのＲＮＡ。
【請求項２１】
上記少なくとも１つのコード配列は、配列番号７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６および４０７からなる群から選択される核酸配列を含んでいる、請求項２０に記載の使用のためのＲＮＡ。
【請求項２２】
５’−キャップ構造を含んでいる、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の使用のためのＲＮＡ。
【請求項２３】
１０〜２００、１０〜１００、４０〜８０または５０〜７０のアデノシンヌクレオチドを好ましく含んでいるポリ（Ａ）配列および／または１０〜２００、１０〜１００、２０〜７０、２０〜６０または１０〜４０のシチジンヌクレオチドを好ましく含んでいるポリ（Ｃ）配列を、含んでいる、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の使用のためのＲＮＡ。
【請求項２４】
少なくとも１つのヒストンステムループを含んでいる、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の使用のためのＲＮＡ。
【請求項２５】
上記少なくとも１つのヒストンステムループが、以下の式（Ｉ）または（ＩＩ）：
【化１】
2020501545.tif 000019
にしたがう核酸配列を含んでおり、
ステム１またはステム２の境界エレメントＮ１−６は、１〜６、好ましくは２〜６、より好ましくは２〜５、より一層好ましくは３〜５、最も好ましくは４〜５または５のＮの連続する配列であり、Ｎのそれぞれは、他のＮから独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、ＧおよびＣから選択されるヌクレオチド、またはそのヌクレオチド類似物から選択され；
ステム１［Ｎ０−２ＧＮ３−５］は、ステム２のエレメントと逆相補的または部分的に逆相補的であり、かつ５〜７のヌクレオチドの間の連続する配列であり；
Ｎ０−２は、０〜２、好ましくは０〜１、より好ましくは１のＮの連続する配列であり、Ｎのそれぞれは、他のＮから独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、ＧおよびＣから選択されるヌクレオチド、またはそのヌクレオチド類似物から選択され；
Ｎ３−５は、３〜５、好ましくは４〜５、より好ましくは４のＮの連続する配列であり、Ｎのそれぞれは、他のＮから独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、ＧおよびＣから選択されるヌクレオチド、またはそのヌクレオチド類似物から選択され、
Ｇは、グアノシンまたはその類似物であり、ステム２におけるその相補的なシチジンヌクレオチドがグアノシンによって置き換えられている条件のもとに、シチジンまたはその類似物に任意に置き換えられ得；
ループ配列［Ｎ０−４（Ｕ／Ｔ）Ｎ０−４）］は、ステム１およびステム２のエレメントの間に配置されており、３〜５のヌクレオチド、より好ましくは４のヌクレオチドの連続する配列であり；
Ｎ０−４のそれぞれは、他のＮから独立して、０〜４、好ましくは１〜３、より好ましくは１〜２のＮの連続する配列であり、Ｎのそれぞれは、他のＮから独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、ＧおよびＣから選択されるヌクレオチド、またはそのヌクレオチド類似物から選択され；
Ｕ／Ｔは、ウリジン、または任意にチミジンを表しており；
ステム２［Ｎ３−５ＣＮ０−２］は、ステム１のエレメントと逆相補的または部分的に逆相補的であり、５〜７のヌクレオチドの間の連続する配列であり；
Ｎ３−５は、３〜５、好ましくは４〜５、より好ましくは４のＮの連続する配列であり、Ｎのそれぞれは、他のＮから独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、ＧおよびＣから選択されるヌクレオチド、またはそのヌクレオチド類似物から選択され；
Ｎ０−２は、０〜２、好ましくは０〜１、より好ましくは１のＮの連続する配列であり、Ｎのそれぞれは、他のＮから独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、ＧおよびＣから選択されるヌクレオチド、またはそのヌクレオチド類似物から選択され；
Ｃは、シチジンまたはその類似物であり、ステム１におけるその相補的なグアノシンヌクレオチドがシチジンに置き換えられている条件のもとに、グアノシンまたはその類似物に任意に置き換えられ得；
ステム１およびステム２は、互いに塩基対形成可能であり、塩基対形成がステム１およびステム２の間に生じ得る逆相補性配列を形成しているか、または不完全な塩基対形成がステム１およびステム２の間に生じ得る部分的な逆相補性配列を形成している、請求項２４に記載の使用のためのＲＮＡ。
【請求項２６】
上記少なくとも１つのヒストンステムループは、以下の式（Ｉａ）または（ＩＩａ）：
【化２】
2020501545.tif 000020
にしたがう核酸配列を含んでいる、請求項２４または２５に記載の使用のためのＲＮＡ。
【請求項２７】
上記少なくとも１つのヒストンステムループは、配列番号１４５１にしたがう核酸配列、最も好ましくは配列番号１４５２にしたがうＲＮＡ配列を含んでいる、請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の使用のためのＲＮＡ。
【請求項２８】
上記ＲＮＡは、少なくとも１つの３’−非翻訳領域エレメント（３’−ＵＴＲエレメント）を含んでいる、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の使用のためのＲＮＡ。
【請求項２９】
３’−ＵＴＲエレメントは、好ましくは安定なｍＲＮＡをコードする、遺伝子の３’−ＵＴＲ、または当該遺伝子の相同物、断片もしくはバリアントに由来する核酸配列を含んでいる、請求項２８に記載の使用のためのＲＮＡ。
【請求項３０】
上記３’−ＵＴＲエレメントは、アルブミン遺伝子、α−グロビン遺伝子、β−グロビン遺伝子、チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子、リポキシゲナーゼ遺伝子およびコラーゲンアルファ遺伝子からなる群から選択される遺伝子の３’−ＵＴＲ、またはその相同物、断片もしくはバリアントから選択される核酸配列を含んでいる、請求項２９に記載の使用のためのＲＮＡ。
【請求項３１】
上記３’−ＵＴＲエレメントは、好ましくは配列番号１４４４したがう核酸配列を含んでいる、α−グロビン遺伝子、その相同物、断片またはバリアントの３’−ＵＴＲに由来する核酸配列を含んでいる、請求項２９または３０に記載の使用のためのＲＮＡ。
【請求項３２】
上記ＲＮＡは、以下の要素：
a)５’−キャップ構造、好ましくはm7GpppN、
b)請求項２１に規定されている通りの、少なくとも１つのコード配列、
c)好ましくは配列番号１４４４にしたがう核酸配列を含んでいる、α−グロビン遺伝子、その相同物、断片もしくはバリアントを含んでいる、３’−ＵＴＲエレメント、
d)好ましくは１０〜２００、１０〜１００、４０〜８０または５０〜７０のアデノシンヌクレオチドからなる、ポリ（Ａ）テイル、
e)好ましくは１０〜２００、１０〜１００、２０〜７０、２０〜６０または１０〜４０のシチジンヌクレオチドからなる、ポリ（Ｃ）テイル、ならびに
f)好ましくは配列番号１４５２にしたがう核酸配列を含んでいる、ヒストンステムループ
を、好ましくは５’から３’方向に、含んでいる、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の使用のためのＲＮＡ。
【請求項３３】
上記ＲＮＡは、配列番号４０８〜７５０からなる群から選択される核酸配列、または当該核酸配列のいずれか１つの断片もしくはバリアントを含んでいる、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の使用のためのＲＮＡ。
【請求項３４】
上記少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメントは、脊椎動物アルブミン遺伝子の３’−ＵＴＲまたはそのバリアント、好ましくは哺乳動物アルブミン遺伝子の３’−ＵＴＲまたはそのバリアント、より好ましくはヒトアルブミン遺伝子の３’−ＵＴＲまたはそのバリアント、より一層好ましくはGenBank Acceession番号NM_000477．5にしたがうヒトアルブミン遺伝子の３’−ＵＴＲまたはその断片もしくはバリアントに由来する核酸配列を含んでいる、請求項２９または３０に記載の使用のためのＲＮＡ。
【請求項３５】
上記３’−ＵＴＲエレメントは、配列番号１４４８または１４５０にしたがう核酸配列、またはその相同物、断片またはバリアントを含んでいる、請求項３４に記載の使用のためのＲＮＡ。
【請求項３６】
上記ＲＮＡは、５’−ＵＴＲエレメントを含んでいる、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の使用のためのＲＮＡ。
【請求項３７】
上記５’−ＵＴＲエレメントは、TOP遺伝子の５’−ＵＴＲ、好ましくは対応するＲＮＡ配列、または好ましくは５’−TOPモチーフを欠いている、その相同物、断片もしくはバリアントに由来する核酸配列を含んでいる、請求項３６に記載の使用のためのＲＮＡ。
【請求項３８】
上記５’−ＵＴＲエレメントは、リボソームタンパク質をコードするTOP遺伝子の５’−ＵＴＲ、好ましくは対応するＲＮＡ配列、または好ましくは５’−TOPモチーフを欠いている、その相同物、断片またはバリアントに由来する核酸配列を含んでいる、請求項３７に記載の使用のためのＲＮＡ。
【請求項３９】
上記５’−ＵＴＲエレメントは、リボソーム巨大タンパク質（RPL）をコードするTOP遺伝子の５’−ＵＴＲ、または好ましくは５’−TOPモチーフを欠いている、その相同物、断片またはバリアントに由来する核酸配列を含んでいる、請求項３７または３８に記載の使用のためのＲＮＡ。
【請求項４０】
上記５’−ＵＴＲエレメントは、配列番号１４３２にしたがう核酸配列、またはその相同物、断片またはバリアントを含んでいる、請求項３７〜３９のいずれか１項に記載の使用のためのＲＮＡ。
【請求項４１】
上記ＲＮＡは、以下の要素：
a)５’−キャップ構造、好ましくはm7GpppN、
b)好ましくは配列番号１４３２に記載の核酸配列を含んでいる、TOP遺伝子の５’−ＵＴＲ、またはその相同体、断片もしくはバリアントを含んでいる核酸配列を含んでいる、または当該核酸配列からなる５’−ＵＴＲエレメント、
c)請求項２１に規定されている通りの少なくとも１つのコード配列、
d)α−グロビン遺伝子、またはその相同物、断片もしくはバリアントに由来する核酸配列、好ましくは配列番号１４４４にしたがう核酸配列を含んでいる３’−ＵＴＲエレメント；および／または
アルブミン遺伝子、またはその相同物、断片またはバリアントに由来する核酸配列、好ましくは配列番号１４４８または１４５０にしたがう核酸配列を含んでいる３’−ＵＴＲエレメント、
e)好ましくは１０〜２００、１０〜１００、４０〜８０または５０〜７０のアデノシンヌクレオチドからなる、ポリ（Ａ）テイル、
f)好ましくは１０〜２００、１０〜１００、２０〜７０、２０〜６０または１０〜４０のシトシンヌクレオチドからなる、ポリ（Ｃ）テイル、ならびに
g)好ましくは配列番号１４５２にしたがう核酸配列を含んでいる、ヒストンステムループ
を、好ましくは５’から３’の方向に、含んでいる、請求項１〜４０のいずれか１項に記載の使用のためのＲＮＡ。
【請求項４２】
上記ＲＮＡは、配列番号７５１〜１０９０または配列番号２１３４からなる群から選択される核酸配列、または当該核酸配列のいずれか１つの断片もしくはバリアントを含んでいる、請求項１〜４０のいずれか１項に記載の使用のためのＲＮＡ。
【請求項４３】
５’−ＵＴＲエレメントは、HSD17B4遺伝子、好ましくは対応するＲＮＡ配列、またはその相同物、断片もしくはバリアントに由来する核酸配列を含んでいる、請求項３６に記載の使用のためのＲＮＡ。
【請求項４４】
５’−ＵＴＲエレメントは、配列番号１４３６に記載の核酸配列、またはその相同物、断片もしくはバリアントを含んでいる、請求項４３に記載の使用のためのＲＮＡ。
【請求項４５】
以下の要素：
a)５’−キャップ構造、好ましくはm7GpppN、
b)好ましくは配列番号１４３６にしたがう核酸配列を含んでいる、HSD17B4遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する核酸配列またはその相同物、断片もしくはバリアントを含んでいる、または当該核酸配列またはその相同物、断片もしくはバリアントからなる、５’−ＵＴＲエレメント、
c)請求項２１に規定されている通りの少なくとも１つのコード配列、
d)好ましくは配列番号１４４４にしたがう核酸配列を含んでいる、α−グロビン遺伝子またはその相同物、断片もしくはバリアントに由来する、３’−ＵＴＲエレメント
好ましくは配列番号１４４８または１４５０にしたがう核酸配列を含んでいる、アルブミン遺伝子またはその相同物、断片またはバリアントに由来する核酸配列を含んでいる、３’−ＵＴＲエレメント
e) 好ましくは１０〜２００、１０〜１００、４０〜８０または５０〜７０のアデノシンヌクレオチドからなる、ポリ（Ａ）テイル
を、好ましくは５’〜３’方向に、含んでいる、請求項１〜４４のいずれか１項に記載の使用のためのＲＮＡ。
【請求項４６】
上記ＲＮＡは、配列番号１０９１〜１４３０からなる群から選択される核酸配列、または当該核酸配列のいずれか１つの断片もしくはバリアントを含んでいる、請求項１〜４５のいずれか１項に記載の使用のためのＲＮＡ。
【請求項４７】
上記ＲＮＡは、配列番号４０８〜１４３０からなる群から選択される核酸配列、または当該核酸配列のいずれか１つの断片もしくはバリアントを含んでいる、請求項１〜４６のいずれか１項に記載の使用のためのＲＮＡ。
【請求項４８】
上記ＲＮＡは、少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体と一緒に製剤化されている、請求項１〜４７のいずれか１項に記載の使用のためのＲＮＡ。
【請求項４９】
上記ＲＮＡは、１つ以上の、カチオン性化合物またはポリカチオン性化合物、好ましくはカチオン性ポリマーまたはポリカチオン性ポリマー、カチオン性ペプチドもしくはポリカチオン性タンパク質またはポリカチオン性ペプチドもしくはポリカチオン性タンパク質（例えばプロタミン）、カチオン性多糖またはポリカチオン性多糖、および／またはカチオン性脂質またはポリカチオン性脂質と複合化されている、請求項４８に記載の使用のためのＲＮＡ。
【請求項５０】
上記１つ以上のカチオン性ペプチドもしくはポリカチオン性タンパク質またはポリカチオン性ペプチドもしくはポリカチオン性タンパク質に対する、上記ＲＮＡのＮ／Ｐ比率は、約０．３〜４、約０．５〜２、約０．７〜２、および約０．７〜１．５の範囲を包含している約０．１〜１０の範囲である、請求項４９に記載の使用のためのＲＮＡ。
【請求項５１】
少なくとも１つのＲＮＡは、１つ以上のカチオン性化合物またはポリカチオン性化合物と複合化されており、少なくとも１つのＲＮＡが遊離状態にある、請求項４９または５０のいずれか１項に記載の使用のためのＲＮＡ。
【請求項５２】
上記少なくとも１つの複合化されているＲＮＡは、上記少なくとも１つの遊離ＲＮＡと同一である、請求項５１に記載の使用のためのＲＮＡ。
【請求項５３】
上記遊離ＲＮＡに対する、上記複合化されているＲＮＡのモル比は、約１：１の比を含んでいる約０．００１：１〜約１：０．００１のモル比から選択される、請求項５１または５２に記載の使用のためのＲＮＡ。
【請求項５４】
上記ＲＮＡは、１つ以上の脂質と複合化されており、それによってリポソーム、脂質ナノ粒子および／またはリポプレックスを形成している、請求項４８〜５３のいずれか１項に記載の使用のためのＲＮＡ。
【請求項５５】
上記ＲＮＡ、または当該ＲＮＡと一緒に製剤化されている薬学的担体は、標的化基によってコンジュゲートを形成している、請求項１〜５４のいずれか１項に記載の使用のためのＲＮＡ。
【請求項５６】
上記標的化基は、肝臓、好ましくは肝臓マクロファージ、肝星状細胞、肝細胞および／または肝臓類洞内皮細胞（LSEC）への複合体の送達をもたらす、請求項５５に記載の使用のためのＲＮＡ。
【請求項５７】
上記標的化基は、葉酸、GalNAc、ガラクトース、マンノース、マンノース−6P、アプタマー、インテグリン受容体リガンド、ケモカイン受容体リガンド、トランスフェリン、ビオチン、セロトニン受容体リガンド、PSMA、エンドセリン、GCPII、ソマトスタチン、LDLリガンドおよびHDLリガンドからなる群から選択される、請求項５５または５６に記載の使用のためのＲＮＡ。
【請求項５８】
上記ＲＮＡは、非経口投与、好ましくは注入によって、それを必要とする対象に投与される、請求項１〜５７のいずれか１項に記載の使用のためのＲＮＡ。
【請求項５９】
上記処置または予防は、薬剤的に活性な、さらなる成分の投与を含んでいる、請求項１〜５８のいずれか１項に記載の使用のためのＲＮＡ。
【請求項６０】
請求項１〜５９のいずれか１項にしたがって規定されている通りの少なくとも１つのＲＮＡ、および任意に追加の薬学的に許容可能な担体を含んでいる、組成物。
【請求項６１】
請求項１〜５９のいずれか１項にしたがって規定されている通りの少なくとも１つのＲＮＡまたは請求項６０に記載の組成物、任意に可溶化するための液体ビヒクルならびに任意に上記ＲＮＡまたは組成物の投与および用量に関する情報を有している技術的説明書を含んでいる、キット、好ましくはキットの一部。
【請求項６２】
上記キットは、リンゲル−乳酸塩溶液を、一部として含んでいる、請求項６１に記載のキット。
【請求項６３】
遺伝子治療における使用のための、請求項１〜５９のいずれか１項にしたがって規定されている通りのＲＮＡ、請求項６０に記載の組成物、または請求項６１もしくは６２に記載のキット。
【請求項６４】
肝疾患の遺伝子治療における使用のための、請求項１〜５９のいずれか１項にしたがって規定されている通りのＲＮＡ、請求項６０に記載の組成物、または請求項６１もしくは６２に記載のキット。
【請求項６５】
請求項１〜５９のいずれか１項にしたがって規定されている通りのＲＮＡ、請求項６０に記載の組成物、または請求項６１もしくは６２に記載のキットの有効量を、それを必要とする対象に投与することを含んでいる、障害を処置または予防する方法。
【請求項６６】
上記障害は、好ましくは肝線維症、肝硬変および肝がんからなる群から選択される、肝疾患である、請求項６５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔序論〕
本発明は、肝疾患の処置または予防に適したＲＮＡに関する。特に、本発明は、細胞外マトリクスプロテアーゼ、ＣＣＡＡＴ／エンハンサ−結合タンパク質α（CEBPA）、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（TRAIL）、肝細胞核因子４α（HNF4A）、線維芽細胞増殖因子２１（FGF21）、オピオイド成長因子受容体様1（OGFRL1）、肝細胞成長因子（HGF）、リラキシン１（RLN1）、リラキシン２（RLN2）およびリラキシン３（RLN3）、またはこれらのペプチドもしくはタンパク質のうちいずれかの断片もしくはバリアントからなる群から選択される少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡを提供する。本発明は、上記ＲＮＡならびに当該ＲＮＡを含んでいる、組成物およびキットに関する。さらに、本発明は、医薬としての使用のため、特に肝疾患の処置または予防のための、本明細書に開示されている通りのＲＮＡ、組成物またはキットに関する。本発明はまた、特に遺伝子治療において、コードされる上記タンパク質の発現を向上させるための、本明細書に開示されている通りのＲＮＡ、組成物またはキットの使用を提供する。
【０００２】
肝疾患は、世界的に、主要な健康上の懸念を代表している。肝臓の損傷の主な原因は、ウイルス性疾患、および代謝異常に関わる自己免疫疾患から、栄養不良およびアルコール薬物乱用まで多岐に及び、種々の集団において大きく異なる。しかし、その原因にかかわらず、持続する肝臓の損傷は、肝臓内にある間葉細胞集団の活性化および増殖によって細胞外マトリクス（ECM）が再構築される特徴的な傷治癒応答を導く。長期にわたる肝組織の損傷は、傷害組織を取り囲む堆積した細胞外マトリクスタンパク質の進行性の蓄積を引き起こし、深刻な構造的かつ機能的な変性を生じる。線維症とも呼ばれるこの過程は、肝硬変、肝不全および肝がんを、最終的にもたらし得るか、または助長し得る。
【０００３】
いくつかの治療アプローチが、線維性応答を停止または低減させるために計画された（概要について、Wallace K. et al: Liver fibrosis. Biochem. J. (2008), 411:1-18を参照）。しかし、現在、肝線維症の第一処置に指定され、認可されている治療薬はなく、標的化されている抗線維症療法は依然として存在しない。他の肝疾患（例えば肝硬変）にも、有効な治療法が早急に求められている。
【０００４】
従来技術に基づいて、例えばTRAILまたはコラゲナーゼの、全身投与は、副作用（例えば全身毒性）をもたらし得ることが知られている。組換えTRAILには、短い半減期および低い有効性という難があり、TRAILの非常に短い半減期は、頻繁な大量の投与を必要とする（Forero-Torres et al.: Phase I Trial of Weekly Tigatuzumab, an Agonistic Humanized Monoclonal Antibody Targeting Death Receptor 5 (DR5). Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals 25.1 (2010): 13-19. PMCを参照）。したがって、TRAILは、がんの臨床試験において有効性を示せなかった。
【０００５】
同様に、WO2014158795A1は、化学修飾された血管内皮成長因子（VEGF）のｍＲＮＡを用いた線維症の診断および処置を扱っている。
【０００６】
したがって、本発明の目的は、肝線維症、肝硬変または肝がんなどの肝疾患の処置または予防に使用するのに適した系を提供することである。特に、本明細書に記載の肝疾患を軽減、寛解または治癒できるペプチドまたはタンパク質を発現させるための系を提供することが目的である。本発明のさらなる目的は、肝臓疾患、特に本明細書で定義される肝臓疾患の処置および／または予防を、安全かつ有効な方式において可能にする、そのような系を提供することである。
【０００７】
本発明の根底にある課題は、特許請求される主題によって解決される。
【０００８】
本出願は、電子フォーマットの配列表と共に提出される。本出願と共に提出された配列表の電子フォーマットに含まれる情報は本出願の説明の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で「配列番号」を参照する場合、別段の指定がない限り、それぞれの識別子を有する配列表中の対応する核酸配列またはアミノ酸配列を参照する。
【０００９】
〔定義〕
明確にし、読みやすくするために、以下の定義を提供する。これらの定義のために言及された任意の技術的特徴は、本発明の各実施形態およびすべての実施形態で読むことができる。これらの実施形態の文脈において、追加の定義および説明を具体的に提供することができる。
【００１０】
人工核酸分子：人工核酸分子は典型的には核酸分子、例えば、天然に存在しないＤＮＡまたはＲＮＡであると理解され得る。換言すれば、人工核酸分子は、非天然核酸分子として理解され得る。このような核酸分子は、その個々の配列（天然に存在しない）および／または天然に存在しない他の修飾（例えばヌクレオチドの構造修飾）のために、非天然であってもよい。人工核酸分子は、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、またはＤＮＡおよびＲＮＡ部分を含んでいるハイブリッド分子であり得る。典型的には、人工核酸分子がヌクレオチドの所望の人工配列（異種配列）に対応するように、遺伝子工学的方法によって設計および／または生成され得る。この文脈において、人工配列は、通常、天然に存在し得ない配列であり、すなわちそれは、少なくとも１つのヌクレオチドだけ野生型配列と異なる。用語「野生型」は、天然に存在する配列として理解され得る。さらに、用語「人工核酸分子」は「１つの単一分子」を意味することに限定されず、典型的には同一分子の集合を包含していると理解される。したがって、本発明は、分取物に含まれる複数の同一分子に関するものであってもよい。
【００１１】
ビシストロン性ＲＮＡ、マルチシストロン性ＲＮＡ：ビシストロン性またはマルチシストロン性ＲＮＡは、典型的にはＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡであり、典型的には2つ（ビシストロン性）以上（マルチシストロン性）オープンリーディングフレーム（ORF）を有し得る。この文脈におけるオープンリーディングフレームは、ペプチドまたはタンパク質に翻訳可能なコドンの配列である。
【００１２】
担体／ポリマー担体：本発明の文脈における担体は、典型的には別の化合物（貨物）の輸送および／または複合物形成を容易にする化合物であり得る。ポリマー担体は、典型的にはポリマーから形成される担体である。担体は、共有結合または非共有結合相互作用によって、そのカーゴと会合され得る。担体は核酸（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）を標的細胞に輸送し得る。担体は、いくつかの実施形態ではカチオン性成分であってもよい。
【００１３】
カチオン性成分：「カチオン性成分」という用語は、典型的にはpH値、典型的には1〜9、好ましくは9以下（例えば5〜9）、8以下（例えば5〜8）、7以下（例えば5〜7）、最も好ましくは生理学的pH、例えば7．3〜7．4で正に荷電した（カチオン）荷電分子を指す。従って、カチオン性成分は任意の正に荷電した化合物またはポリマー、好ましくはカチオン性ペプチドまたはタンパク質であり得、これは生理学的状態、特にインビボの生理学的状態で正に荷電している。「カチオン性ペプチドまたはタンパク質」は少なくとも１つの正に荷電したアミノ酸、または１つより多い正に荷電したアミノ酸（例えば、Arg、His、LysまたはOrnから選択される）を含み得る。従って、「ポリカチオン性」成分もまた、所定の条件下で複数の正電荷を示す範囲内にある。
【００１４】
５’−キャップ：５’−キャップは、一般に成熟ｍＲＮＡの５’−末端を「キャップ」する構成要素、典型的には修飾ヌクレオチド構成要素である。５’−キャップは、典型的には修飾ヌクレオチド、特にグアニンヌクレオチドの誘導体によって形成され得る。好ましくは、５’−キャップが５’−５’−三リン酸結合を介して５’−末端に連結される。５’−キャップはメチル化されていてもよく、例えばm7GppNであり、ここでNは５’−キャップを担持する核酸の端末５’ヌクレオチドであり、典型的にはＲＮＡの５’端末である。５’−キャップ構造のさらなる例には、グリセリル、逆方向デオキシ脱塩基残基（部分）、4’，５’−メチレンヌクレオチド、1−（β−D−エリスロフラノシル）ヌクレオチド、4’−チオヌクレオチド、炭素環ヌクレオチド、1，5−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド、α−ヌクレオチド、修飾塩基ヌクレオチド、スレオ−ペントフラノシルヌクレオチド、非環式3，4’−ジヒドロキシブチルヌクレオチド、非環式3，5ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、３’−３’−逆方向ヌクレオチド部分、３’−2’−逆方向脱塩基部分、1，4−ブタンジオールホスフェート、ヘキシルホスフェート、３’−ホスフェート、３’−ホスホロジチオエート または架橋または非架橋メチルホスホネート部分。
【００１５】
ＤＮＡ: ＤＮＡは、デオキシリボ核酸の通常の略語である。それは核酸分子、すなわちヌクレオチドからなるポリマーである。これらのヌクレオチドは通常、デオキシ−アデノシン−モノホスフェート、デオキシ−チミジン−モノホスフェート、デオキシ−グアノシン−モノホスフェート、およびデオキシ−シチジン−モノホスフェートモノマーであり、これらは、それら自体、糖部分（デオキシリボース）、塩基部分およびリン酸部分から構成され、そして特徴的な骨格構造によって単量体である。骨格構造は、典型的にはヌクレオチドの糖部分、すなわちデオキシリボースと、第1の隣接単量体のリン酸部分との間のホスホジエステル結合によって形成される。モノマーの特定の並び、すなわち、糖／リン酸骨格に連結された塩基の並びは、ＤＮＡ配列と呼ばれる。ＤＮＡは一本鎖であっても二本鎖であってもよい。二本鎖形態では、第1鎖のヌクレオチドが典型的には例えば、A／T塩基対形成およびg／C塩基対形成によって、第2鎖のヌクレオチドとハイブリダイズする。
【００１６】
配列の断片：配列の断片は、典型的には例えば核酸分子またはアミノ酸配列の全長配列のより短い部分であり得る。従って、断片は、代表的には全長配列内の対応するストレッチと同一である配列からなる。本発明の文脈における配列の好ましい断片は断片が由来する完全（つまり全長）分子の少なくとも20％、好ましくは少なくとも30％、より好ましくは少なくとも40％、より好ましくは少なくとも50％、より一層好ましくは少なくとも60％、より一層好ましくは少なくとも70％、最も好ましくは少なくとも80％に相当する、断片が由来する分子中のエンティティの連続ストレッチに対応するヌクレオチドまたはアミノ酸などの構成要素の連続するストレッチからなる。
【００１７】
G／C修飾核酸：G／C修飾核酸は、典型的には野生型配列と比べて、好ましくは増加した数のグアノシンおよび／またはシトシンヌクレオチドを含んでいる修飾野生型配列に基づく、核酸、好ましくは本明細書で定義される人工核酸分子であり得る。このような増加した数は、グアノシンまたはシトシンヌクレオチドを含んでいるコドンによるアデノシンまたはチミジンヌクレオチドを含んでいるコドンの置換によって生成され得る。濃縮されたG／C含有量がＤＮＡまたはＲＮＡのコード領域に存在する場合、それは遺伝暗号の縮重を利用する。従って、コドン置換は、好ましくはコードされるアミノ酸残基を変化させないが、核酸分子のG／C含有量を全体的に増加させる。本明細書中で使用される場合、ターム「G／C修飾」は特に、本発明によるＲＮＡ中のグアノシンおよび／またはシトシンヌクレオチドの数の修飾（例えば、配列のGC最適化、ヒトコドン使用頻度への配列の適合、コドン最適化、または配列のC最適化）を含んでいる。
【００１８】
遺伝子治療：遺伝子治療は典型的にはペプチドまたはタンパク質をコードする核酸による、患者の身体または患者の身体の単離された要素（例えば、単離された組織／細胞）の処置を意味すると理解され得る。それは典型的にはa）患者への核酸、好ましくは本明細書で定義されるＲＮＡの、いずれかの投与経路による直接的な投与、または患者の単離された細胞／組織へのインビボ／エクスビボまたはインビトロのいずれかでの患者の細胞のトランスフェクションをもたらすインビトロでの患者への投与; b)導入された核酸分子の転写および／または翻訳；および任意にc）核酸が患者に直接投与されていない場合には単離されトランスフェクトされた細胞の患者への再投与の工程の少なくとも１つである。本明細書で使用される用語「遺伝子治療」は、典型的には疾患の処置ならびに阻止または予防を含んでいる。
【００１９】
異種配列：2つの配列は、それらが同じ遺伝子から由来しないとき、典型的には「異種」であると理解される。すなわち、異種配列は同じ生物から由良し得るが、それらは天然に（自然界に）、同じ核酸分子（例えば、同じｍＲＮＡ中）には存在しない。
【００２０】
クローニングサイト：クローニングサイトは典型的には核酸配列、例えば、オープンリーディングフレームを含んでいる核酸配列の挿入に適した核酸分子のセグメントであると理解される。挿入は当業者に公知の任意の分子生物学的方法（例えば、制限および連結）によって行われ得る。クローニングサイトは、典型的には１つ以上の制限酵素認識部位（制限部位）を含んでいる。これらの１つ以上の制限部位は、これらの部位でＤＮＡを切断する制限酵素によって認識され得る。複数の制限部位を含んでいるクローニングサイトは、マルチクローニングサイト（MCS）またはポリリンカーとも称され得る。
【００２１】
核酸分子：核酸分子は、好ましくは核酸成分を含んでいる分子である。用語「核酸分子」は、好ましくはＤＮＡまたはＲＮＡ分子を指す。それは、好ましくは用語「ポリヌクレオチド」と同義に使用される。好ましくは、核酸分子が糖／リン酸骨格のホスホジエステル結合によって互いに共有結合したヌクレオチドモノマーを含んでいるか、またはヌクレオチドモノマーからなるポリマーである。用語「核酸分子」はまた、塩基修飾、糖修飾または骨格修飾などの修飾核酸分子を包含する。ＤＮＡまたはＲＮＡ分子。
【００２２】
オープンリーディングフレーム：本発明の文脈におけるオープンリーディングフレーム（ORF）は代表的にはいくつかのヌクレオチドトリプレットの配列であり得、これはペプチドまたはタンパク質に翻訳され得る。オープンリーディングフレームは、好ましくは開始コドン（通常はアミノ酸のメチオニン）（ATG）をコードする3つの後続のヌクレオチドの組合せを、その５’末端および後続の領域に含み、これは通常、3ヌクレオチドの倍数である長さを示す。ORFは好ましくは終止コドン（例えば、TAA、TAG、TGA）によって終止される。典型的には、これはオープンリーディングフレームの唯一の終止コドンである。従って、本発明の文脈におけるオープンリーディングフレームは好ましくは開始コドン（例えばATG）に始じまり、好ましくは停止コドン（例えば、TAA、TGA、またはTAG）に終わる、3で割れる数のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列である。オープンリーディングフレームは単離され得るか、またはより長い核酸配列（例えば、ベクターまたはｍＲＮＡ）に組み込まれ得る。オープンリーディングフレームはまた、「（タンパク質）コード領域」または好ましくは「コード配列」と呼ばれ得る。
【００２３】
ペプチド：ペプチドまたはポリペプチドは、典型的にはペプチド結合によって連結されたアミノ酸モノマーのポリマーである。それは、典型的には50未満のモノマー単位を含有する。それにもかかわらず、用語「ペプチド」は、50を超えるモノマー単位を有する分子を排除しない。長いペプチドはまた、典型的には50〜600モノマー単位を有するポリペプチドとも呼ばれる。
【００２４】
薬学的有効量：本発明の文脈における薬学的有効量は、典型的には免疫応答、発現されたペプチドまたはタンパク質の病理学的レベルの変化、または例えば病理学的状況の場合の欠損遺伝子産物の置換などの薬理作用を誘導するのに十分な量であると理解される。
【００２５】
タンパク質：タンパク質は、典型的には１つ以上のペプチドまたはポリペプチドを含んでいる。タンパク質は、典型的にはタンパク質がその生物学的機能を発揮するために必要とされ得る3次元形態に折り畳まれる。
【００２６】
ポリ（Ａ）配列：ポリ（Ａ）テイルまたは３’−ポリ（Ａ）テイルとも呼ばれるポリ（Ａ）配列は、典型的にはアデノシンヌクレオチドの配列、例えば約400個までのアデノシンヌクレオチド、例えば約20個から約400個、好ましくは約50個から約400個、より好ましくは約50個から約300個、さらに好ましくは約50個から約250個、最も好ましくは約60個から約250個のアデノシンヌクレオチドの配列であると理解される。本明細書中で使用される場合、ポリ（Ａ）配列はまた、約10〜200のアデノシンヌクレオチド、好ましくは約10〜100のアデノシンヌクレオチド、より好ましくは約40〜80のアデノシンヌクレオチド、またはより一層好ましくは約50〜70のアデノシンヌクレオチドを含み得る。ポリ（Ａ）配列は、典型的にはｍＲＮＡの３’末端に位置する。本発明の文脈において、ポリ（Ａ）配列はｍＲＮＡまたは任意の他の核酸分子（例えば、ベクター中、例えば、ベクターの転写によるＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡの生成のための鋳型として働くベクター中）に位置し得る。
【００２７】
ポリアデニル化：ポリアデニル化は典型的にはＲＮＡ分子のような核酸分子、例えば、未成熟ｍＲＮＡへのポリ（Ａ）配列の付加であると理解される。ポリアデニル化は、いわゆるポリアデニル化シグナルによって誘導され得る。このシグナルは好ましくはポリアデニル化されるべき核酸分子（例えば、ＲＮＡ分子）の３’末端のヌクレオチドのストレッチ内に位置する。ポリアデニル化シグナルは、典型的にはアデニンおよびウラシル／チミンヌクレオチドからなるヘキサマー、好ましくはヘキサマー配列AAUAAを含んでいる。他の配列、好ましくはヘキサマー配列も考えられる。ポリアデニル化は、典型的にはｍＲＮＡ前駆体（premature−ｍＲＮＡとも呼ばれる）の処理の間に起こる。典型的には、ＲＮＡ成熟（ｍＲＮＡ前駆体からｍＲＮＡ成熟体まで）がポリアデニル化の工程を含んでいる。
【００２８】
制限部位：制限酵素認識部位とも呼ばれる制限部位は、制限酵素によって認識されるヌクレオチド配列である。制限部位は典型的には短い、好ましくはパリンドロームヌクレオチド配列、例えば4〜8ヌクレオチドを含んでいる配列である。制限部位は、好ましくは制限酵素によって特異的に認識される。制限酵素は、典型的にはこの部位に制限部位を含んでいるヌクレオチド配列を切断する。二本鎖ＤＮＡ配列のような二本鎖ヌクレオチド配列において、制限酵素は、典型的にはヌクレオチド配列の両方の鎖を切断する。
【００２９】
ＲＮＡ、ｍＲＮＡ: ＲＮＡは、リボ核酸の通常の略語である。それは核酸分子、すなわちヌクレオチドからなるポリマーである。これらのヌクレオチドは、通常、いわゆる骨格に沿って互いに連結されたアデノシン−一リン酸、ウリジン−一リン酸、グアノシン−一リン酸およびシチジン−一リン酸モノマーである。骨格は、第1のモノマーの糖、すなわちリボースと、第2の隣接モノマーのリン酸部分との間のホスホジエステル結合によって形成される。モノマーの特定の連続はＲＮＡ配列と呼ばれる。通常、ＲＮＡは、例えば細胞内でのＤＮＡ配列の転写によって得ることができる。真核細胞において、転写は、典型的には核またはミトコンドリアの内部で行われる。インビボでは、ＤＮＡの転写が通常、いわゆるメッセンジャーＲＮＡ（通常、ｍＲＮＡと略される）にプロセシングされなければならない、いわゆる未成熟ＲＮＡを生じる。例えば真核生物における早期ＲＮＡのプロセシングは、スプライシング、５’−キャッピング、ポリアデニル化、核またはミトコンドリアからの輸出などの様々な異なる転写後修飾を含んでいる。これらの過程をまとめて、ＲＮＡの成熟とも呼ばれる。成熟メッセンジャーＲＮＡは、通常、特定のペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列に翻訳され得るヌクレオチド配列を提供する。典型的には、成熟ｍＲＮＡが５’−キャップ、５’−ＵＴＲ、オープンリーディングフレーム、３’−ＵＴＲおよびポリ（Ａ）配列を含んでいる。メッセンジャーＲＮＡとは別に、転写および／または翻訳の調節に関与し得るいくつかの非コード種類のＲＮＡが存在する。
【００３０】
核酸分子の配列：核酸分子の配列は典型的には特定の個々の順序、すなわち、そのヌクレオチドの連続であると理解される。タンパク質またはペプチドの配列は、典型的にはそのアミノ酸の順序、すなわち連続であると理解される。
【００３１】
配列同一性：ヌクレオチドまたはアミノ酸の同じ長さおよび順序を示す場合、2つ以上の配列が同一である。同一性のパーセンテージは典型的には2つの配列が同一である程度を記述し、すなわち、典型的には、基準配列の同一ヌクレオチドと配列位置において対応するヌクレオチドのパーセンテージを記述する。同一性の程度の決定のために、比較されるべき配列は同じ長さ、すなわち、比較されるべき配列の最も長い配列の長さを示すと考えられる。これは、8ヌクレオチドからなる第1の配列が第1の配列を含んでいる10ヌクレオチドからなる第2の配列と80％同一であることを意味する。換言すれば、本発明の文脈において、配列の同一性は、好ましくは同じ長さを有する2つ以上の配列において同じ位置を有する配列のヌクレオチドの割合に関する。ギャップは、通常、アラインメントにおけるそれらの実際の位置にかかわらず、同一でない位置とみなされる。
【００３２】
安定化された核酸分子：安定化された核酸分子は修飾されていない核酸分子よりも、例えば、環境要因または酵素消化（例えば、エキソヌクレアーゼ分解またはエンドヌクレアーゼ分解による）による崩壊または分解に対して、より安定であるように修飾された核酸分子、好ましくはＤＮＡまたはＲＮＡ分子である。好ましくは、本発明の文脈における安定化された核酸分子が細胞（例えば、原核細胞または真核細胞）において、好ましくは哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞）において安定化される。安定化効果はまた、細胞の外部、例えば緩衝溶液などにおいて、例えば安定化核酸分子を含んでいる医薬組成物の製造プロセスにおいて発揮され得る。
【００３３】
トランスフェクション：「トランスフェクション」という用語はＤＮＡまたはＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ）分子などの核酸分子を細胞、好ましくは真核細胞に導入することを指す。本発明の文脈において、用語「トランスフェクション」は核酸分子を細胞、好ましくは真核細胞（例えば、哺乳類細胞）に導入するための、当業者に公知の任意の方法を包含する。このような方法は例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション（例えば、カチオン性脂質および／またはリポソームに基づく）、リン酸カルシウム沈殿、ナノ粒子に基づくトランスフェクション、ウイルスに基づくトランスフェクション、またはカチオン性ポリマー（例えば、DEAE−デキストランまたはポリエチレンイミンなど）に基づくトランスフェクションを包含する。好ましくは、導入は非ウイルス性である。
【００３４】
ベクター：「ベクター」という用語は、核酸分子、好ましくは人工核酸分子を指す。本発明の文脈におけるベクターは所望の核酸配列（例えば、オープンリーディングフレームを含んでいる核酸配列）を組み込むか、または保有するために適切である。このようなベクターは、保存ベクター（storage vector）、発現ベクター、クローニングベクター、転写ベクターなどであり得る。保存ベクターは、核酸分子、例えばｍＲＮＡ分子の簡便な保存を可能にするベクターである。従って、ベクターは例えば、所望のｍＲＮＡ配列またはその一部に対応する配列（例えば、ｍＲＮＡのコード配列および３’−ＵＴＲに対応する配列）を含み得る。発現ベクターはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）、またはペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質などの発現産物の産生のために使用され得る。例えば、発現ベクターはベクターの配列ストレッチの転写に必要な配列、例えば、プロモーター配列、例えば、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含み得る。クローニングベクターは代表的にはクローニングサイトを含んでいるベクターであり、これは、ベクターに核酸配列を組み込むために使用され得る。クローニングベクターは例えば、プラスミドベクターまたはバクテリオファージベクターであり得る。移行ベクターは核酸分子を細胞または生物に移すために適したベクター、例えば、ウイルスベクターであってもよい。本発明の文脈におけるベクターは例えば、ＲＮＡベクターまたはＤＮＡベクターであり得る。好ましくは、ベクターはＤＮＡ分子である。好ましくは、本出願の意味におけるベクターがクローニングサイト、選択マーカ（例えば、抗生物質耐性因子）、およびベクターの増殖に適切な配列（例えば、複製開始点）を含んでいる。好ましくは、本出願の文脈におけるベクターがプラスミドベクターである。
【００３５】
ビヒクル：ビヒクルは、典型的には薬学的に活性な化合物などの化合物を貯蔵、輸送、および／または投与するのに適した材料であると理解される。例えば、それは、薬学的に活性な化合物を貯蔵、輸送、および／または投与するのに適した、生理学的に許容される液体であってもよい。
【００３６】
３’−非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）：一般に、用語「３’−ＵＴＲ」はオープンリーディングフレームの３’（すなわち、「下流」）に位置し、タンパク質に翻訳されない人工核酸分子の一部を指す。典型的には、３’−ＵＴＲがタンパク質コード領域（オープンリーディングフレーム（ORF）またはコード配列（CDS））とｍＲＮＡのポリ（Ａ）配列との間に位置するｍＲＮＡの部分である。本発明の文脈において、用語「３’−ＵＴＲ」はまた、鋳型にコードされず、そこからＲＮＡが転写されるが、成熟の間に転写後に付加されるエレメント（例えば、ポリ（Ａ）配列）を含み得る。ｍＲＮＡの３’−ＵＴＲはアミノ酸配列に翻訳されない。３’−ＵＴＲ配列は一般に、遺伝子発現プロセスの間に各ｍＲＮＡ転写される遺伝子によってコードされる。ゲノム配列は最初に、任意のイントロンを含んでいる成熟前ｍＲＮＡに転写される。次いで、成熟前ｍＲＮＡは、成熟過程において、成熟ｍＲＮＡにさらにプロセシングされる。この成熟過程は５’−キャッピング、成熟前ｍＲＮＡのスプライシング、任意のイントロンの切り出し、および成熟前ｍＲＮＡの３’−末端のポリアデニル化、ならびに任意のエンド／またはエキソヌクレアーゼ切断などの３’−末端の修飾の工程を含んでいる。本発明の文脈において、３’−ＵＴＲは、タンパク質コード領域の終止コドン、好ましくはタンパク質コード領域の終止コドンのすぐ３’とｍＲＮＡのポリ（Ａ）配列との間に位置する成熟ｍＲＮＡの配列に対応する。用語「に対応する」は、３’−ＵＴＲ配列が３’−ＵＴＲ配列を規定するために使用されるｍＲＮＡ配列におけるようなＲＮＡ配列、またはそのようなＲＮＡ配列に対応するＤＮＡ配列であり得ることを意味する。本発明の文脈において、用語「遺伝子の３’−ＵＴＲ」、例えば「リボソームタンパク質遺伝子の３’−ＵＴＲ」はこの遺伝子に由来する成熟ｍＲＮＡの３’−ＵＴＲ、すなわち、遺伝子の転写および成熟前ｍＲＮＡの成熟によって得られるｍＲＮＡに対応する配列である。用語「遺伝子の３’−ＵＴＲ」は、３’−ＵＴＲのＤＮＡ配列およびＲＮＡ配列（センス鎖およびアンチセンス鎖の両方、ならびに成熟および未成熟の両方）を包含する。
【００３７】
５’−非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）：５’−ＵＴＲは、典型的にはメッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)の特定の部分と理解される。それは、ｍＲＮＡのオープンリーディングフレームの５’に位置する。典型的には、５’−ＵＴＲは転写開始部位から始まり、オープンリーディングフレームの開始コドンの1ヌクレオチド前で終わる。５’−ＵＴＲは、遺伝子発現を制御するためのエレメント（制御エレメントとも呼ばれる）を含み得る。このような制御エレメントは例えば、リボソーム結合部位であり得る。５’−ＵＴＲは例えば、５’−キャップの付加によって、転写後修飾されてもよい。本発明の文脈において、５’−ＵＴＲは、５’−キャップと開始コドンとの間に位置する成熟ｍＲＮＡの配列に対応する。好ましくは、５’−ＵＴＲが３’から５’−キャップに位置するヌクレオチド、好ましくは３’から５’−キャップに位置するヌクレオチドから、タンパク質コード領域の開始コドンの５’から５’に位置するヌクレオチド、好ましくはタンパク質コード領域の開始コドンの５’から５’に位置するヌクレオチドまで延びる配列に対応する。成熟ｍＲＮＡの５’−キャップのすぐ３’に位置するヌクレオチドは、典型的には転写開始部位に対応する。用語「に対応する」は、５’−ＵＴＲ配列が５’−ＵＴＲ配列を規定するために使用されるｍＲＮＡ配列におけるようなＲＮＡ配列、またはそのようなＲＮＡ配列に対応するＤＮＡ配列であり得ることを意味する。本発明の文脈において、用語「遺伝子の５’−ＵＴＲ」はこの遺伝子に由来する成熟ｍＲＮＡの５’−ＵＴＲ、すなわち、遺伝子の転写および成熟前ｍＲＮＡの成熟によって得られるｍＲＮＡに対応する配列である。用語「遺伝子の５’−ＵＴＲ」は、５’−ＵＴＲのＤＮＡ配列およびＲＮＡ配列を包含する。本発明の実施形態により、このような５’−ＵＴＲは、コード配列の５’−末端に提供され得る。その長さは、典型的には500、400、300、250または200ヌクレオチド未満である。他の実施形態において、その長さは、少なくとも10、20、30または40、好ましくは100または150ヌクレオチドまでの範囲であり得る。
【００３８】
５’−末端オリゴピリミジントラクト（TOP）：５’−末端オリゴピリミジントラクト（TOP）は典型的には核酸分子の５’−末端領域、例えば、あるｍＲＮＡ分子の５’−末端領域、またはある遺伝子の機能的実体、例えば、転写領域の５’−末端領域に位置するピリミジンヌクレオチドのストレッチである。この配列は通常、転写開始部位に対応するシチジンから始まり、通常約3〜30個のピリミジンヌクレオチドのストレッチが続く。例えば、TOPは、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29である。ピリミジンは伸長し、したがって、５’TOPは、TOPの下流に位置する第1のプリンヌクレオチドの５’側のヌクレオチドで終わる。５’端末オリゴピリミジン消化を含んでいるメッセンジャーＲＮＡは、しばしばTOP ｍＲＮＡと呼ばれる。従って、このようなメッセンジャーＲＮＡを提供する遺伝子はTOP遺伝子である。TOP配列は例えば、ペプチド伸長因子およびリボソームタンパク質をコードする遺伝子およびｍＲＮＡにおいて見出されている。
【００３９】
TOPモチーフ：本発明の文脈において、TOPモチーフ定義した５’TOPに対応する核酸配列である。従って、本発明の文脈におけるTOPモチーフ、好ましくは、3〜30ヌクレオチドの長さを有するピリミジンヌクレオチドのストレッチである。好ましくはTOPモチーフが少なくとも3個のピリミジンヌクレオチド、好ましくは少なくとも4個のピリミジンヌクレオチド、好ましくは少なくとも5個のピリミジンヌクレオチド、より好ましくは少なくとも6個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも7個のヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも8個のピリミジンヌクレオチドからなり、ピリミジンヌクレオチドのストレッチは好ましくはシトシンヌクレオチドでその５’末端で開始する。TOP遺伝子およびTOP ｍＲＮＡにおいて、TOPモチーフは好ましくは転写開始部位でその５’末端で開始し、該遺伝子またはｍＲＮＡ中の最初のプリン残基に対して1ヌクレオチド５’で終わる。本発明の意味におけるTOPモチーフは、好ましくは、５’−ＵＴＲを表す配列の５’−末端、または５’−ＵＴＲをコードする配列の５’−末端に位置する。従って、好ましくは、3以上のピリミジンヌクレオチドのストレッチは、このストレッチがそれぞれの配列（例えば、人工核酸分子、人工核酸分子の５’−ＵＴＲエレメント、または本明細書に記載されるようなTOP遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する核酸配列）の５’−末端に位置する場合、本発明の意味においてTOPモチーフである。換言すれば、５’−ＵＴＲまたは５’−ＵＴＲエレメントの５’−末端ではなく、５’−ＵＴＲまたは５’−ＵＴＲエレメント内のどこかに位置する、3個以上のピリミジンヌクレオチドのストレッチは、好ましくはTOPモチーフである。
【００４０】
TOP遺伝子: TOP遺伝子は、典型的には５’端末オリゴピリミジン消化の存在によって特徴付けられる。さらに、ほとんどのTOP遺伝子は、増殖関連の翻訳調節によって特徴付けられる。しかし、組織特異的な翻訳制御を有しているTOP遺伝子が知られている。上記で定義したように、TOP遺伝子の５’−ＵＴＲは、由来する成熟ｍＲＮＡの５’−ＵＴＲの配列に対応し、好ましくは、３’から５’−キャップに位置するヌクレオチドから５’から開始コドンに位置するヌクレオチドまで伸びている。TOP遺伝子の５’−ＵＴＲは典型的にはいかなる開始コドンも含まず、好ましくは上流AUG（uAUG）または上流オープンリーディングフレーム（uORF）も含んでいない。その中で、上流のAUGおよび上流のオープンリーディングフレームは、典型的には翻訳されるべきオープンリーディングフレームの開始コドン（AUG）の５’に存在するAUGおよびオープンリーディングフレームであると理解される。TOP遺伝子は、一般にかなり短い。TOP遺伝子のＵＴＲの長さは20ヌクレオチドから500ヌクレオチドまでの間で変化し得、代表的には約200ヌクレオチド未満、好ましくは約150ヌクレオチド未満、より好ましくは約100ヌクレオチド未満である。本発明の意味におけるTOP遺伝子の例示的な５’−ＵＴＲは、特許出願WO2013／143700の配列番号1〜1363にしたがう配列中の5位のヌクレオチドから開始コドン（例えば、ATG）のすぐ５’側に位置するヌクレオチドに伸びる核酸配列である。この文脈において、TOP遺伝子ＵＴＲの特に好ましい断片は、５’TOPモチーフを欠くTOP遺伝子ＵＴＲである。用語「TOP遺伝子の５’−ＵＴＲ」または「５’TOP−ＵＴＲ」は、好ましくは天然に存在するTOP遺伝子の５’−ＵＴＲをいう。
【００４１】
〔発明の詳細な説明〕
本発明は、新規のＲＮＡ、ＲＮＡを含んでいる組成物およびキットに関する。さらに、本発明に係るＲＮＡ、組成物およびキットの様々な使用、特に医療用途が提供される。
【００４２】
第１の態様において、本発明は、細胞外マトリクスプロテアーゼまたはヒトコラゲナーゼMMP1、肝細胞増殖因子（HGF）、ＣＣＡＡＴ／エンハンサ−結合タンパク質α（CEBPA）、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（TRAIL）、肝細胞核因子４α（HNF4A）、線維芽細胞増殖因子２１（FGF21）、オピオイド増殖因子受容体様１（OGFRL1）、クロストリジウムＩＩ型コラゲナーゼ、リラキシン１（RLN1）、リラキシン２（RLN2）およびリラキシン３（RLN3）、またはこれらのペプチドもしくはタンパク質のいずれかの断片もしくはバリアントからなる群から選択されるペプチドもしくはタンパク質を含んでいるかまたは当該ペプチドもしくはタンパク質からなる少なくとも１つのペプチドもしくはタンパク質をコードしている少なくとも１つのコード配列を含んでいるＲＮＡに関する。
【００４３】
本発明に記載のＲＮＡは、本明細書に記載されているような肝疾患または肝障害（好ましくは肝線維症および肝硬変から選択される）の処置または予防における使用に、好ましく適している。より好ましくは、本発明に記載のＲＮＡは、本明細書に記載されているような哺乳類（好ましくはヒト）における肝疾患の安全かつ有効な処置または予防における使用に、好ましく適している。
【００４４】
従って、第２の態様において、本発明は、肝疾患の処置または予防における使用のための、本明細書に記載されているようなＲＮＡを提供する。その上、本明細書に記載されているようなＲＮＡは、好ましくは遺伝子療法のために提供される。
【００４５】
以下、本発明に記載のＲＮＡを説明する。また、本発明のＲＮＡに関する開示は、そのままで、本明細書に記載されているような（医療）用途のためのＲＮＡ、ならびに（薬学的）組成物と関連するＲＮＡ、または本発明に係るＲＮＡを含んでいるキット（の一部）と関連するＲＮＡに当てはまる。特に、「本発明に係るＲＮＡ」に言及する時、本開示はまた、「本発明に係る使用のためのＲＮＡ」にも関し、その逆も同様である。
【００４６】
本発明者らは驚くべきことに、本発明に係るＲＮＡは、少なくとも１つのコード領域にコードされているペプチドまたはタンパク質の十分な発現を、例えば哺乳類対象への（特に肝臓における）当該ＲＮＡの投与によって、提供する能力があることを見出した。それぞれの上記ペプチドまたはタンパク質をコードしている、この技術において公知基準コンストラクトを用いて達成される発現レベルと比べて向上した、ペプチドまたはタンパク質の発現レベルが、意外にも、本発明のＲＮＡを用いることによって達成され得る。有利に、ＲＮＡによってコードされているペプチドまたはタンパク質がこのようにしてその効果を発揮することができ、当該効果は、好ましくは許容可能な副作用を伴わずに、または伴って、特に哺乳類対象の肝臓における、肝疾患の処置または予防に利用されることが好ましい。好ましい実施形態において、コードされているペプチドまたはタンパク質の発現レベルは、肝臓においてその効果を発揮するためには肝臓において十分に高く、副作用を減らすために他の臓器において下がる。
【００４７】
本発明と関連して、本発明に係るＲＮＡの少なくとも１つのコード配列は、本明細書で開示されるペプチドもしくはタンパク質を含んでいるかまたは当該ペプチドもしくはタンパク質をコードする核酸配列を含んでいることが好ましい。いくつかの実施形態では、ペプチドまたはタンパク質が、天然に存在するペプチドまたはタンパク質（例えば、基質メタロプロテイナーゼ−１またはＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（TRAIL））などの基準ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列全体を実質的に含む。本明細書に用いられている「全長ペプチドまたは全長タンパク質」という用語は、例えばデータベース受託番号ＮＰ_００３８０１．１、Ｐ５０５９１、ＮＰ_０３６６５６．１、Ｐ０５５５４、ＮＰ_０３１７０４．２、Ｐ５３５６６、ＮＰ_００４３５５．２、Ｐ４９７１５、ＮＰ_０００４４８．３、Ｐ４１２３５、ＮＰ_０６１９８６．１、Ｑ９ＮＳＡ１、ＮＰ_０７８８５２．３、Ｑ５ＴＣ８４、ＮＰ_００８８４２．１、Ｐ０４８０８、ＮＰ_６０４３９０．１、Ｐ０４０９０、ＮＰ_５４３１４０．１、Ｑ８ＷＸＦ３、ＮＰ_００２４１２．１、Ｐ０３９５６、ＢＡＡ７７４５３．１、ＢＡＡ３４５４２．１およびＢＡＡ３４５４２．１によって定義されているアミノ酸配列、または配列番号４、８、１０、１２、１４〜１９、２０、２２、２５および２６によって定義されているアミノ酸配列のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含んでいるかまたは当該アミノ酸配列からなるペプチドまたはタンパク質といった天然に存在するペプチドまたはタンパク質に言及する。さらに、上記用語はまた、配列番号５〜７、９、１１、１３、２１、２３、２４、２７および２８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでいるかまたはそれからなるペプチドまたはタンパク質を指す。その上、上記用語はまた、データベース受託番号ＮＭ_００３８１０．３、ＣＣＤＳ３２１９．１、ＥＮＳＧ０００００１２１８５８、ＮＭ_０１２５２４．３、ＮＭ_００７６７８．３、ＣＣＤＳ２１１４５．１、ＮＭ_００４３６４．４、ＣＣＤＳ５４２４３、Ｍ３７１９７、ＥＮＳＧ０００００２４５８４８、ＮＭ_０００４５７．４、ＣＣＤＳ１３３３０．１、Ｘ７６９３０、ＥＮＳＧ０００００１０１０７６、ＮＭ_０１９１１３．３、ＣＣＤＳ１２７３４．１、ＡＢ０２１９７５、ＥＮＳＧ０００００１０５５５０、ＮＭ_０２４５７６．４、ＣＣＤＳ３４４８２．１、ＥＮＳＧ０００００１１９９００、ＮＭ_００６９１１．３、ＣＣＤＳ６４６２.、ＥＮＳＧ０００００１０７０１８、ＮＭ_１３４４４１．２、ＣＣＤＳ６４６０．１、ＥＮＳＧ０００００１０７０１４、ＮＭ_０８０８６４．３、ＮＭ_００１３１１１９７、ＣＣＤＳ１２３０２．１、ＡＦ４４７４５１、ＥＮＳＧ０００００１７１１３６、ＮＭ_００２４２１．３、ＣＣＤＳ８３２２．１、Ｘ５４９２５、ＥＮＳＧ０００００１９６６１１、Ｄ８７２１５．１、ＡＢ０１４０７５．１、およびＡＢ０１４０７５によって定義されている核酸配列のいずれか１つによってコードされているアミノ酸配列に言及する。
【００４８】
係る好ましい実施形態では、本発明に係るＲＮＡの少なくとも１つのコード配列は、データベース受託番号ＮＰ_００３８０１．１００３８０１．１、Ｐ５０５９１、ＮＰ_０３６６５６．１、Ｐ０５５５４、ＮＰ_０３１７０４．２、Ｐ５３５６６、ＮＰ_００４３５５．２、Ｐ４９７１５、ＮＰ_０００４４８．３、Ｐ４１２３５、ＮＰ_０６１９８６．１、Ｑ９ＮＳＡ１、ＮＰ_０７８８５２．３、Ｑ５ＴＣ８４、ＮＰ_００８８４２．１、Ｐ０４８０８、ＮＰ_６０４３９０．１、Ｐ０４０９０、ＮＰ_５４３１４０．１、Ｑ８ＷＸＦ３、ＮＰ_００２４１２．１、Ｐ０３９５６、ＢＡＡ７７４５３．１、ＢＡＡ３４５４２．１およびＢＡＡ３４５４２．１によって定義されているアミノ酸配列のいずれか１つ、またはこれらのアミノ酸配列の断片もしくはバリアントのいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含んでいるかまたは当該アミノ酸配列またはアミノ酸配列の断片もしくはバリアントからなるペプチドまたはタンパク質でコードする。コードされているペプチドまたはタンパク質が、データベース受託番号ＮＭ_００３８１０．３、ＣＣＤＳ３２１９．１、ＥＮＳＧ０００００１２１８５８、ＮＭ_０１２５２４．３、ＮＭ_００７６７８．３、ＣＣＤＳ２１１４５．１、ＮＭ_００４３６４．４、ＣＣＤＳ５４２４３、Ｍ３７１９７、ＥＮＳＧ０００００２４５８４８、ＮＭ_０００４５７．４、ＣＣＤＳ１３３３０．１、Ｘ７６９３０、ＥＮＳＧ０００００１０１０７６、ＮＭ_０１９１１３．３、ＣＣＤＳ１２７３４．１、ＡＢ０２１９７５、ＥＮＳＧ０００００１０５５５０、ＮＭ_０２４５７６．４、ＣＣＤＳ３４４８２．１、ＥＮＳＧ０００００１１９９００、ＮＭ_００６９１１．３、ＣＣＤＳ６４６２．、ＥＮＳＧ０００００１０７０１８、ＮＭ_１３４４４１．２、ＣＣＤＳ６４６０．１、ＥＮＳＧ０００００１０７０１４、ＮＭ_０８０８６４．３、ＮＭ_００１３１１１９７、ＣＣＤＳ１２３０２．１、ＡＦ４４７４５１、ＥＮＳＧ０００００１７１１３６、ＮＭ_００２４２１．３、ＣＣＤＳ８３２２．１、Ｘ５４９２５、ＥＮＳＧ０００００１９６６１１、Ｄ８７２１５．１、ＡＢ０１４０７５．１、およびＡＢ０１４０７５によって定義されている核酸配列のいずれか１つ、またはこれらの核酸配列の断片もしくはバリアントのいずれか１つによってコードされているアミノ酸配列を含んでいるかまたは当該アミノ酸配列からなることがより好ましい。コードされているペプチドまたはタンパク質が、配列番号４〜配列番号２８からなる群から選択されるアミノ酸配列、またはこれらのアミノ酸配列のいずれか１つの断片またはバリアントを含んでいるかまたは当該アミノ酸配列からなることがさらにより好ましい。
【００４９】
あるいは、本発明に係るＲＮＡの少なくとも１つのコード配列はまた、本明細書に記載されているようなペプチドもしくはタンパク質の断片、または本明細書で記載されているようなペプチドまたはタンパク質のバリアントの断片を含んでいるかまたは当該ペプチドまたはタンパク質からなるペプチドまたはタンパク質をコードしている核酸配列を含んでいる。
【００５０】
本発明と関連して、ペプチドもしくはタンパク質またはそのバリアントの「断片」は、上記に定義されているペプチドまたはタンパク質またはそのバリアントの配列を含み、そのアミノ酸配列（またはそのコードされた核酸配列）に関して、天然に存在するタンパク質またはそのバリアントのアミノ酸配列のような、基準アミノ酸配列と比べて、、Ｎ末端、Ｃ末端および／または配列内（intrasequentially）でトランケートされている。そのようなトランケーションは、それぞれアミノ酸レベルまたは核酸レベルのいずれかで起こり得る。本明細書で定義されているような当該断片に関係する同一性配列は、好ましくは本明細書で定義されているようなペプチド、タンパク質またはそのバリアント全体、または当該ペプチドまたはタンパク質またはそのバリアントの核酸配列全体（コードする）を指す。
【００５１】
本発明に係る様々な実施形態によれば、ＲＮＡは、本明細書で定義されているようなペプチドまたはタンパク質のバリアントを含んでいるかまたは当該バリアントまたはバリアントからなるペプチドまたはタンパク質をコードする少なくとも１つのコード配列、またはペプチドまたはタンパク質のバリアントの断片を含んでいる。
【００５２】
本発明の特定の実施形態では、本明細書で定義されているようなペプチドもしくはタンパク質またはその断片の「バリアント」が本明細書で定義されているような少なくとも１つのコード配列を含んでいるＲＮＡによってコードされているものであって、アミノ酸配列は基準アミノ酸配列（天然に存在するアミノ酸配列など）から少なくとも１つのアミノ酸残基が異なる、少なくとも１つのコード配列によってコードされているものである。これと関連して、少なくとも１つのアミノ酸残基における「変化」は、例えば、アミノ酸残基の別のアミノ酸への変異、欠失または挿入においてなり得る。より好ましくは、アミノ酸配列に関連して使用される用語「バリアント」は本明細書で定義されているような任意の相同体、アイソフォームもしくはペプチドもしくはタンパク質またはその断片の転写バリアントを含む本発明に係るＲＮＡの少なくとも１つのコード配列によってコードされているものであって、相同体、アイソフォームまたは転写バリアントは好ましくは本明細書で定義されているような同一性または相同性の程度によってそれぞれ特徴付けられる。
【００５３】
本発明と関連して、タンパク質またはペプチドの「フラグメント」または「バリアント」は、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも５０、少なくとも７５もしくは、少なくとも１００の当該タンパク質もしくはペプチドのアミノ酸のストレッチの少なくとも５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８０％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上のアミノ酸同一性を有し得る。本明細書で使用されるようなタンパク質またはペプチドの「断片」または「バリアント」は、少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％のタンパク質もしくはペプチド（当該バリアントに由来する）と同一であることがより好ましい。
【００５４】
好ましくは、ペプチドもしくはタンパク質のバリアントまたはその断片が本明細書で定義されているような少なくとも１つのコード配列を含んでいるＲＮＡによってコードされ得るものであって、アミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸残基は、置換された少なくとも１つのコード配列よってコードされている。同じクラスに由来するアミノ酸が、互いに置換する置換は保存的置換と呼ばれる。特に、当該置換は、脂肪族側鎖、正または負に荷電した側鎖、側鎖中の芳香族基またはアミノ酸を有するアミノ酸であり、当該側鎖は水素結合を形成することができる（例えば、水酸基を有する側鎖）。保存的置換によって、例えば、極性側鎖を有するアミノ酸は対応する極性側鎖を有する別のアミノ酸、または、例えば、対応する疎水性側鎖（例えば、トレオニン（セリン）によるセリン（トレオニン）、またはイソロイシン（ロイシン）によるロイシン（イソロイシン））を有する別のアミノ酸によって置換され得る疎水性側鎖によって特徴付けられるアミノ酸である。好ましい実施形態において、ペプチドもしくはタンパク質のバリアントまたはその断片は、本発明に係るＲＮＡによってコードされ得るものであって、少なくとも１つの保存的置換を比較した基準配列（例えば、それぞれ天然に存在する配列）を含む少なくとも１つのコード配列によってコードされているアミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸残基である。当該アミノ酸配列ならびに当該アミノ酸配列をコードする核酸配列は特に、本明細書中で定義されているような用語「バリアント」に含まれる。
【００５５】
挿入、欠失および／または非保存的置換もまた、特に、好ましくは三次元構造の実質的な修飾を引き起こさない当該アミノ酸配列の配列位置において可能である。挿入または欠失による三次元構造への修飾は例えば、ＣＤスペクトル（円偏光二色性スペクトル）を用いて容易に測定することができる（Urry、1985、Absorption、Circular Dichroism and ORD of Polypeptides、in: Modern Physical Methods in Biochemistry、Neuberger et al.(ed),Elsevier,Amsterdam)。
【００５６】
当該アミノ酸の２つの配列（核酸配列、例えば、本明細書で定義されているようなＲＮＡまたはｍＲＮＡ配列、またはアミノ酸配列、好ましくは本発明に係るＲＮＡによってコードされているアミノ酸配列）が同一であるかの割合を測定するために、配列は、後で互いに比較するために一列に並べられた。この目的のために、例えば、ギャップを第１の配列の配列に挿入することができ、第２の配列の対応する位置における構成要素を比較することができる。もし、第１の配列における位置が第２の配列における対応する位置における場合のように、同じ構成要素によって存在するならば、２つの配列は、上記位置において同一である。当該２つの配列が同一である割合は、同一位置の数の基を位置の総数によって割ったものである。２つの配列が同一である割合は、数学的アルゴリズムを用いて測定することができる。好ましくは、例に挙げた数学的アルゴリズムには、限定されず、Karlin et al. (1993), PNAS USA, 90:5873-5877 or Altschul et al. (1997), Nucleic Acids Res., 25:3389-3402のアルゴリズムを使用することができる。このようなアルゴリズムは例えば、ＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれる。本発明の配列で同一である配列における特定の範囲は、上記プログラムによって特定することができる。
【００５７】
本発明と関連して、本発明に係るＲＮＡの少なくとも１つのコード配列によってコードされているペプチドまたはタンパク質の断片、またはそのバリアントは一般的には、基準アミノ酸配列であり、好ましくはそれぞれの天然に存在する全長のペプチドまたは全長タンパク質またはそのバリアントのアミノ酸配列と、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは９５％または９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【００５８】
本発明に係るＲＮＡの少なくとも１つのコード配列によってコードされているペプチドまたはタンパク質の断片またはそのバリアントが、一般的にはデータベース受託番号ＮＰ_００３８０１．１、Ｐ５０５９１、ＮＰ_０３６６５６．１、Ｐ０５５５４、ＮＰ_０３１７０４．２、Ｐ５３５６６、ＮＰ_００４３５５．２、Ｐ４９７１５、ＮＰ_０００４４８．３、Ｐ４１２３５、ＮＰ_０６１９８６．１、Ｑ９ＮＳＡ１、ＮＰ_０７８８５２．３、Ｑ５ＴＣ８４、ＮＰ_００８８４２．１、Ｐ０４８０８、ＮＰ_６０４３９０．１、Ｐ０４０９０、ＮＰ_５４３１４０．１、Ｑ８ＷＸＦ３、ＮＰ_００２４１２．１、Ｐ０３９５６、ＢＡＡ７７４５３．１、ＢＡＡ３４５４２．１およびＢＡＡ３４５４２．１によって定義されている基準アミノ酸配列のいずれか１つ、または上記ペプチドもしくはタンパク質のいずれか１つの断片もしくはバリアントが、少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでいるかまたは当該アミノ酸配列からなることがより好ましい。コードされているペプチドまたはタンパク質が、配列番号４〜配列番号２８からなる群から選択される基準アミノ酸配列のいずれか１つ、またはこれらの配列のいずれか１つの断片もしくはバリアントが、少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでいるかまたは当該アミノ酸配列からなることが最も好ましい。
【００５９】
好ましくは、本明細書で定義される少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質をコードしているＲＮＡの少なくとも１つのコード配列が配列番号３２〜７１、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６および４０７からなる群または、これらの核酸配列のいずれか１つの断片またはバリアントから選択される核酸配列を含んでいるかまたは当該核酸配列からなる。本明細書に用いられている、配列番号３２〜７１、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６５、３６６、３６７、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６および４０７からなる群から選択される核酸配列を含んでいるかまたは当該核酸配列からなる核酸配列もまた、「全長核酸（配列）」に言及される。
【００６０】
特定の実施形態において、本発明に係るＲＮＡ、好ましくは本発明に係るＲＮＡの少なくとも１つのコード配列は本明細書で定義されるペプチドもしくはタンパク質、または断片またはそのバリアントをコードしている核酸配列の断片を含んでいるか、または当該ペプチドもしくはタンパク質、または断片またはそのバリアントをコードしている核酸配列からなり得る。本発明に係るＲＮＡの少なくとも１つのコード配列が、好ましくは、本明細書で定義されているような、配列番号３２〜７１、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６および４０７に係る核酸配列のいずれか１つ、またはこれらの配列のいずれか１つのバリアント、断片を含んでいるまたは当該断片からなることが好ましい。
【００６１】
これと関連して、「核酸（配列）の断片」は、好ましくは本明細書に記載されるようなペプチドまたはタンパク質の断片またはそのバリアントの断片をコードしている核酸配列である。より好ましくは、上記発現「核酸（配列）の断片」は、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する核酸配列、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、またはさらに９７％の配列同一性を有する核酸配列、それぞれの全長核酸配列、好ましくは配列番号３２〜７１、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６および４０７からなる群から選択される核酸配列、またはこれらの核酸配列のいずれかのバリアントに言及する。
【００６２】
別の好ましい実施形態では、本発明に係るＲＮＡ、好ましくは本発明によるＲＮＡの少なくとも１つのコード配列が、本明細書で定義される核酸配列のバリアント、好ましくは本明細書で定義されるペプチドもしくはタンパク質またはその断片をコードする核酸配列のバリアントを含んでもよく、あるいは、その核酸配列のバリアントからなってもよい。
【００６３】
本明細書に記載されるようなペプチドもしくはタンパク質またはその断片をコードする核酸配列に関連して、本明細書中にて使用される場合の「核酸配列のバリアント」という表現は、典型的には、それぞれの基準核酸配列、例えば、それぞれの天然に存在する核酸配列もしくは本明細書に定義されるような全長核酸配列またはその断片から、少なくとも１つの核酸残基が異なっている核酸配列を指す。より好ましくは、本発明に関連して使用される場合の「核酸配列の変形例」という表現は、由来元の核酸配列と、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、またはさらに９７％の配列同一性を有する核酸配列を指す。
【００６４】
好ましくは、本発明に係るＲＮＡ、より好ましくは本発明に係るＲＮＡの少なくとも１つのコード配列は、好ましくは本明細書で定義されるように、ペプチドもしくはタンパク質のバリアントまたはその断片をコードする。
【００６５】
好ましい実施形態では、本発明に係るＲＮＡ、より好ましくは本発明に係るＲＮＡの少なくとも１つのコード配列は、本明細書で定義されるペプチドもしくはタンパク質またはその断片をコードする核酸配列のバリアントを含んでいるか、またはその核酸配列のバリアントからなる。上記核酸配列のバリアントは、アミノ酸残基からなる少なくとも１つの保存的置換を含んでいるアミノ酸配列をコードする。
【００６６】
別の実施形態では、本発明に係るＲＮＡ、より好ましくは本発明に係るＲＮＡの少なくとも１つのコード配列が、本明細書で定義されるような、ペプチドもしくはタンパク質またはその断片をコードする核酸配列のバリアントを含んでいるか、またはその核酸配列のバリアントからなる。上記バリアントにおける核酸配列は、基準核酸配列と、好ましくは少なくとも１つの核酸残基中において天然に存在する、それぞれの核酸配列と異なっており、より好ましくは、変性した遺伝コードによって、コードされたアミノ酸配列の改変を生じることがなく、すなわち、バリアントによってコードされるアミノ酸配列またはその少なくとも一部は、好ましくは、上記の目的内にて、１つまたは複数の変異体において天然に存在するアミノ酸配列と異なっていなくともよい。
【００６７】
さらに、本明細書で定義される、ペプチドもしくはタンパク質またはその断片もしくはバリアントをコードする核酸配列の「バリアント」はまた、本明細書で定義されるＲＮＡ配列に対応するＤＮＡ配列を含んでもよく、本明細書で定義されるＤＮＡ配列に対応するさらなるＲＮＡ配列を含んでもよい。当業者はＲＮＡ配列のＤＮＡ配列への翻訳（またはその逆）、または相補鎖配列の作製（すなわち、Ｕ残基をＴ残基にて置換することによる、および／または所定の配列に関して相補鎖を構築することによる）に精通している。
【００６８】
好ましい態様によれば、本発明に係るＲＮＡの少なくとも１つのコード配列は、基準核酸配列と、好ましくは、天然に存在する全長のペプチドもしくはタンパク質またはそのバリアントをコードする核酸配列と、あるいは、本明細書に定義される全長のペプチドもしくはタンパク質またはそのバリアントと、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、またはさらに９７％の配列同一性を有する核酸配列を含んでいるか、あるいは、その核酸配列からなる。
【００６９】
さらに好ましい実施形態では、本発明に係るＲＮＡの少なくとも１つのコード配列は、配列番号３２〜７１、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６および４０７からなる群から選択される核酸配列と、同一配列であるか、あるいは、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％またはさらに９７％の配列同一性を有する核酸配列、またはこれらの核酸配列のいずれかの断片もしくはバリアントを含んでいるか、あるいは、それらからなる。
【００７０】
さらに好ましい実施形態によれば、本発明に係るＲＮＡの少なくとも１つのコード配列は、配列番号３６、３７、７５、７７、７８、９１〜９５および９７〜９９からなる群から選択される核酸配列と、同一もしくは少なくとも８０％が同一の核酸配列、または、これらの核酸配列のいずれかの断片もしくはバリアントを含んでいるか、あるいは、それらからなる。
【００７１】
別の実施形態では、本発明に係るＲＮＡの少なくとも１つのコード配列は、配列番号７５、７７、７８、９１〜９５および９７〜９９からなる群から選択される核酸配列と、同一もしくは少なくとも８０％が同一の核酸配列、または、これらの核酸配列のいずれかの断片もしくはバリアントを含んでいるか、あるいは、それらからなる。
【００７２】
好ましい実施形態によれば、本発明は、少なくとも１つのコード配列を含んでいるＲＮＡを提供し、上記ＲＮＡにおける上記少なくとも１つのコード配列は、細胞外マトリクス（ECM）プロテアーゼ、またはその断片もしくはバリアントを含んでいるか、あるいは、それらからなる少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質をコードする。本発明はさらに、少なくとも１つのコード配列を含んでいるＲＮＡを提供し、ここで、コード配列は、本明細書に記載されるような肝疾患の処置又は予防において使用するための、細胞外マトリクス（ECM）プロテアーゼ、またはそのフラグメントもしくは改変体を含んでいるかまたはそれらからなる少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質をコードする。ここで、上記肝疾患は、好ましくは、肝線維症および肝硬変から選択される。
【００７３】
本発明に関連して、「細胞外マトリクスプロテアーゼ」という用語は、好ましくは肝臓組織における、細胞外マトリクス蛋白質の分解を触媒することができる酵素を指す。本明細書中で使用される場合、「細胞外マトリクス蛋白質」は、好ましくは肝臓組織中の任意の型の細胞外マトリクス蛋白質、より好ましくはコラーゲンであり、さらにより好ましくは間質コラーゲンおよび基底膜コラーゲンから選択され、最も好ましくはＩ型、ＩＩＩ型およびＩＶ型コラーゲンから選択される。本明細書で使用される「細胞外マトリクスプロテアーゼ」という用語は、好ましくはコラゲナーゼを指し、より好ましくは本明細書に記載される細菌コラゲナーゼまたは哺乳類基質メタロプロテイナーゼ（本明細書では「哺乳動物コラゲナーゼ」とも呼ばれる）を指す。細菌コラゲナーゼの例としては、クロストリジウムコラゲナーゼ、より好ましくはクロストリジウムＩＩ型コラゲナーゼ、最も好ましくはクロストリジウムヒストリチカム由来のＩＩ型コラゲナーゼ（例えば、ColGまたはColHなど）が挙げられる。例示的な哺乳類基質メタロプロテイナーゼは、例えば、ヒト基質メタロプロテイナーゼ−１である。
【００７４】
細菌コラゲナーゼまたは哺乳動物コラゲナーゼ等の細胞外マトリクスプロテアーゼは典型的には前駆体タンパク質として発現され、上記細胞外マトリクスプロテアーゼは通常、不活性である。上記前駆体タンパク質は調節ドメインを除去する細胞酵素により、例えば、決定された切断部位でのタンパク質分解切断によって活性化され得る。本発明の好ましい実施形態によれば、ＲＮＡの少なくとも１つのコード配列は、上記調節ドメインを欠くコラゲナーゼ、好ましくは、上記調節ドメインを欠く細菌コラゲナーゼもしくは上記調節ドメインを欠く哺乳類基質メタロプロテイナーゼ、またはその断片もしくはバリアントを含んでいるか、あるいは、それらからなる、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質をコードする。上記調節ドメインを欠くコラゲナーゼは、好ましくは、事前に活性化しないものでさえ、発現時に活性である。
【００７５】
一実施形態では、本発明に係るＲＮＡの少なくとも１つのコード配列が、配列番号２０〜２８からなる群から選択されるアミノ酸配列と、同一もしくは少なくとも８０％が同一のアミノ酸配列、または、当該アミノ酸配列のいずれか１つの断片もしくはバリアントを含んでいるか、あるいは、それらからなる、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質をコードする。
【００７６】
好ましい実施形態では、本発明に係るＲＮＡの少なくとも１つのコード配列が、哺乳類基質メタロプロテイナーゼ、好ましくは基質メタロプロテイナーゼ−１、より好ましくはヒト基質メタロプロテイナーゼ−１、またはその断片もしくはバリアントを含んでいるか、あるいは、それらからなる、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質をコードする。
【００７７】
本明細書中で使用される場合、「ヒト基質メタロプロテイナーゼ−１」との用語は、例えば、「MMP1」と略され得、典型的には、データベース受託番号ＮＰ_００２４１２．１もしくはＰ０３９５６によって規定されるアミノ酸配列のいずれか１つと、同一もしくは少なくとも８０％が同一のアミノ酸配列、またはこれらの配列のいずれか１つのホモログ、断片もしくはバリアントを含んでいるか、あるいは、それらからなる、ペプチドまたはタンパク質を指し得る。好ましくは、上記用語はまた、データベースアクセッション番号ＮＭ_００２４２１．３、ＣＣＤＳ８３２２．１、Ｘ５４９２５もしくはＥＮＳＧ０００００１９６６１１によって定義される通りの核酸配列のいずれか１つと、同一もしくは少なくとも８０％が同一の核酸配列、またはこれらの配列のいずれか１つのホモログ、断片もしくはバリアントによってコードされるようなアミノ酸配列を指し得る。さらに、本明細書で使用される上記用語はまた、配列番号２０または２１から選択されるアミノ酸配列と、同一または少なくとも８０％が同一のアミノ酸配列、または当該アミノ酸配列のいずれか１つのホモログ、断片もしくはバリアントを含んでいるか、あるいは、それらからなる、ペプチドまたはタンパク質を指し得る。
【００７８】
特定の実施形態では、本発明に係るＲＮＡの少なくとも１つのコード配列が、哺乳類基質メタロプロテイナーゼを含んでいるか、あるいは、その哺乳類基質メタロプロテイナーゼからなる、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質をコードする。ここで、上記ペプチドまたは上記タンパク質は、配列番号２０または２１と、同一もしくは少なくとも８０％が同一のアミノ酸配列、またはこれらのアミノ酸配列のいずれか１つの断片もしくはバリアントを含んでいるか、あるいは、それらからなる。好ましい実施形態によれば、上述のコードされるペプチドまたはタンパク質は、配列番号２１と同一または少なくとも８０％が同一のアミノ酸配列、またはそのアミノ酸配列の断片またはバリアントを含んでいるか、あるいは、それらからなる。そこで、上記ＲＮＡの少なくとも１つのコード配列は、好ましくは配列番号５５、５６、５７、９１、９２、１１９、１２０、１４７、１４８、１７５、１７６、２０３、２０４、２３１、２３２、２５９、２６０、２６０、２６０、３１５、３１５、３４３、３４４、３７１、３７２、３９９および４００からなる群より選択される核酸配列と、同一もしくは少なくとも８０％が同一の核酸配列、または、これらの核酸配列のいずれかの断片もしくはバリアントを含んでいる、あるいは、それらからなる。
【００７９】
別の実施形態では、本発明に係るＲＮＡの少なくとも１つのコード配列が、細菌コラゲナーゼ、好ましくはクロストリジウムコラゲナーゼ、より好ましくはクロストリジウムＩＩ型コラゲナーゼ、最も好ましくはクロストリジウムヒストリチカム由来のＩＩ型コラゲナーゼ、またはその断片もしくはバリアントを含んでいるか、あるいは、その細菌コラゲナーゼからなる、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質をコードする。上述のコードされるペプチドまたはタンパク質は、クロストリジウムヒストリチカム由来のColGまたはColHを含んでいるか、あるいは、それらからなることが、特に好ましい。
【００８０】
本明細書中で使用される場合、「ColG」との用語は、典型的には、データベース受託番号ＢＡＡ７７４５３．１によって定義されるアミノ酸配列と同一もしくは少なくとも８０％が同一のアミノ酸配列、またはそのアミノ酸配列のホモログ、断片またはバリアントを含んでいるか、あるいは、それらからなるペプチドまたはタンパク質を指す。好ましくは、上記用語はまた、データベース受託番号Ｄ８７２１５．１によって定義される核酸配列と、同一もしくは少なくとも８０％が同一の核酸配列、またはそのホモログ、断片もしくはバリアントによってコードされる通りのアミノ酸配列を指し得る。さらに、本明細書で使用される上記用語はまた、配列番号２２〜２４からなる群から選択されるアミノ酸配列と、同一もしくは少なくとも８０％が同一であるアミノ酸配列、または当該アミノ酸配列のいずれか１つのホモログ、断片もしくはバリアントを含んでいるか、あるいは、それらからなる、ペプチドまたはタンパク質を指し得る。
【００８１】
本発明に関連して、「ColH」との用語は、典型的には、データベース受託番号ＢＡＡ３４５４２．１によって定義される通りのアミノ酸配列と、同一もしくは少なくとも８０％が同一のアミノ酸配列、またはそのアミノ酸配列のホモログ、断片もしくはバリアントを含んでいるか、あるいは、それらからなる、ペプチドまたはタンパク質を指す。好ましくは、上記用語はまた、データベース受託番号ＡＢ０１４０７５．１によって定義される通りの核酸配列と、同一あるいは少なくとも８０％が同一の核酸配列、またはその核酸配列のホモログ、断片もしくはバリアントによってコードされる通りのアミノ酸配列を指し得る。さらに、本明細書で使用される上記用語はまた、配列番号２５〜２８からなる群から選択されるアミノ酸配列と、同一または少なくとも８０％が同一のアミノ酸配列、または当該アミノ酸配列のいずれか１つのホモログ、断片もしくはバリアントを含んでいるか、あるいは、それらからなる、ペプチドまたはタンパク質を指し得る。
【００８２】
〔修飾〕
［化学修飾］
本明細書で使用される用語「ＲＮＡ修飾」は、骨格修飾ならびに糖修飾または塩基修飾を含む化学修飾を表し得る。
【００８３】
本文脈において、本明細書中で定義される修飾ＲＮＡは、ヌクレオチド類似物／修飾（例えば、骨格修飾、糖修飾または塩基修飾）を含み得る。本発明に関連する骨格修飾は、本明細書で定義されるＲＮＡ中に含まれるヌクレオチドの骨格のリン酸が化学的に修飾される修飾である。本発明に関連する糖修飾は、本明細書で定義されるＲＮＡのヌクレオチドの糖の化学修飾である。さらに、本発明に関連する塩基修飾は、ＲＮＡのヌクレオチドの塩基部分の化学修飾である。本文脈において、ヌクレオチド類似物またはヌクレオチド修飾は、好ましくは転写および／または翻訳に適用可能なヌクレオチド類似物から選択される。
【００８４】
［糖修飾］
修飾されたヌクレオシドおよびヌクレオチドは、糖部分において修飾されていてもよく、該修飾されたヌクレオシドおよびヌクレオチドは、本明細書に記載されるように修飾ＲＮＡに組み込まれ得る。例えば、２’ヒドロキシル基（ＯＨ）は、多数の異なる「酸素を含む（oxy）」または「脱酸素（deoxy）」置換基で修飾または置換されていてもよい。「酸素を含む」−２’ヒドロキシル基修飾の例としては、アルコキシまたはアリールオキシ（−ＯＲ、例えば、Ｒ＝Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲ；２’ヒドロキシルが、例えばメチレン架橋によって、同じリボース糖の４’炭素に連結される「固定された」核酸（ＬＮＡ）；およびアミノ基（−Ｏ−アミノ、ここで、アミノ基、例えばＮＲＲは、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノであってもよい）またはアミノアルコキシ基等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８５】
「脱酸素」修飾には水素、アミノ（例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸）が含まれ：また、上記アミノ基は、Ｃ原子、Ｎ原子およびＯ原子を１つ以上含むリンカーを介して、糖に結合されていてもよい。
【００８６】
糖基はまた、リボース中の対応する炭素の立体化学的配置とは反対の立体化学的配置を有する１つ以上の炭素を含んでいてもよい。従って、修飾ＲＮＡは、例えばアラビノースを糖として含むヌクレオチドを含んでいてもよい。
【００８７】
［骨格修飾］
リン酸骨格は、修飾されたヌクレオシドおよびヌクレオチドにおいて、さらに修飾され得、該修飾されたヌクレオシドおよびヌクレオチドは、本明細書に記載されるように修飾ＲＮＡに組み込まれ得る。１つ以上の酸素原子が異なる置換基で置換されることによって、骨格のリン酸基が、修飾されていてもよい。さらに、修飾されたヌクレオシドおよびヌクレオチドにおいて、修飾されていないリン酸部分が、本明細書に記載されるように修飾されたリン酸で完全に置換されていてもよい。修飾されたリン酸基の例としては、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェート、ボラノホスフェートエステル、ホスホネート水素、ホスホロアミデート、アルキルまたはアリールホスホネートおよびホスホトリエステルが挙げられるが、これらに限定されない。ホスホロジチオエートにおいて、両方の非結合酸素が、硫黄で置き換えられている。リン酸リンカーもまた、結合酸素が、窒素（架橋ホスホロアミデート）、硫黄（架橋ホスホロチオエート）および炭素（架橋メチレンホスホネート）で置換されることによって、修飾されていてもよい。
【００８８】
［塩基修飾］
修飾されたヌクレオシドおよびヌクレオチドは、本明細書に記載されるように修飾ＲＮＡに組み込まれ得、核酸塩基部分においてさらに修飾されてもいてもよい。ＲＮＡ中に見出される核酸塩基の例としては、アデニン、グアニン、シトシンおよびウラシルが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、本明細書に記載のヌクレオシドおよびヌクレオチドは、主溝面上で化学的に修飾されていてもよい。いくつかの実施形態において、主溝化学修飾は、アミノ基、チオール基、アルキル基、またはハロ基を含んでいてもよい。
【００８９】
本発明の特に好ましい態様において、ヌクレオチド類似物／修飾は、塩基修飾から選択され、好ましくは２−アミノ−６−クロロプリンリボシド−５’−トリホスフェート、２−アミノプリン−リボシド−５’−トリホスフェート；２’−アミノアデノシン−５’−トリホスフェート、２’−アミノ−２’−デオキシシチジン−トリホスフェート、２−チオシチジン−５’−トリホスフェート、２−チオウリジン−５’−トリホスフェート、２’−フルオロチミジン−５’−トリホスフェート、２’−Ｏ−メチル−イノシン−５’−トリホスフェート、４−チオウリジン−５’−トリホスフェート、５−アミノアリルシチジン−５’−トリホスフェート、５−アミノアリルウリジン−５’−トリホスフェート、５−ブロモシチジン−５’−トリホスフェート、５−ブロモウリジン−５’−トリホスフェート、５−ブロモ−２’−デオキシシチジン−５’−トリホスフェート、５−ブロモ−２’−デオキシウリジン−５’−トリホスフェート、５−ヨードシチジン−５’−トリホスフェート、５−ヨード−２’−デオキシシチジン−５’−トリホスフェート、５−ヨードウリジン−５’−トリホスフェート、５−ヨード−２’−デオキシウリジン−５’−トリホスフェート、５−メチルシチジン−５’−トリホスフェート、５−メチルウリジン−５’−トリホスフェート、５−プロピニル−２’−デオキシシチジン−５’−トリホスフェート、５−プロピニル−２’−デオキシウリジン−５’−トリホスフェート、６−アザシチジン−５’−トリホスフェート、６−アザウリジン−５’−トリホスフェート、６−クロロプリンリボシド−５’−トリホスフェート、７−デアザアデノシン−５’−トリホスフェート、７−デアザグアノシン−５’−トリホスフェート、８−アザアデノシン−５’−トリホスフェート、８−アジドアデノシン−５’−トリホスフェート、ベンズイミダゾール−リボシド−５’−トリホスフェート、Ｎ１−メチルアデノシン−５’−トリホスフェート、Ｎ１−メチルグアノシン−５’−トリホスフェート、Ｎ６−メチルアデノシン−５’−トリホスフェート、Ｏ６−メチルグアノシン−５’−トリホスフェート、プソイドウリジン−５’−トリホスフェート、またはプロマイシン−５’−トリホスフェート、キサントシン−５’−トリホスフェートから選択される。特に好ましくは、５−メチルシチジン−５’−トリホスフェート、７−デアザグアノシン−５’−トリホスフェート、５−ブロモシチジン−５’−トリホスフェート、およびプソイドウリジン−５’−トリホスフェートからなる塩基修飾されたヌクレオチドの群から選択される塩基修飾のためのヌクレオチドが挙げられる。
【００９０】
いくつかの実施形態において、修飾されたヌクレオシドには、ピリジン−４−オンリボヌクレオシド、５−アザ−ウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオウリジン、４−チオ−プソイドウリジン、２−チオプソイドウリジン、５−ヒドロキシウリジン、３−メチルウリジン、５−カルボキシメチルウリジン、１−カルボキシメチル−プソイドウリジン、５−プロピニル−ウリジン、１−プロピニル−プソイドウリジン、５−タウリノメチルウリジン、１−タウリノメチル−プソイドウリジン、５−タウリノメチル−２−チオ−ウリジン、１−タウリノメチル−４−チオ−ウリジン、５−メチル−ウリジン、１−メチル−プソイドウリジン、４−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、２−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−ジヒドロプソイドウリジン、２−メトキシウリジン、２−メトキシ−４−チオ−ウリジン、４−メトキシプソイドウリジン、および４−メトキシ−２−チオ−プソイドウリジンが含まれる。
【００９１】
いくつかの実施形態において、修飾されたヌクレオシドには、５−アザ−シチジン、プソイドイソシチジン、３−メチルシチジン、Ｎ４−アセチルシチジン、５−ホルミルシチジン、Ｎ４−メチルシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、１−メチルプソイドイソシチジン、ピロロ−シチジン、ピロロ−プソイドイソシチジン、２−チオ−シチジン、２−チオ−５−メチル−シチジン、４−チオ−プソイドイソシチジン、４−チオ−１−メチル−プソイドイソシチジン、４−チオ−１−メチル−１−デアザ−プソイドイソシチジン、１−メチル−１−デアザ−プソイドイソシチジン、ゼブラリン、５−アザ−ゼブラリン、５−メチル−ゼブラリン、５−アザ−２−チオ−ゼブラリン、２−チオ−ゼブラリン、２−メトキシ−シチジン、２−メトキシ−５−メチル−シチジン、４−メトキシ−プソイドイソシチジン、および４−メトキシ−１−メチル−プソイドイソシチジンが含まれる。
【００９２】
他の実施形態において、修飾されたヌクレオシドには、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−アデニン、７−デアザ−８−アザ−アデニン、７−デアザ−２−アミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２−アミノプリン７−デアザ−２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノプリン、１−メチルアデノシン、Ｎ６−メチルアデノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、Ｎ６−（ｃｉｓ−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２−メチルチオ−Ｎ６−（ｃｉｓ−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６−グリシニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン、２−メチルチオ−Ｎ６−スレオニルカルバモイルデノシン、Ｎ６−Ｎ６−ジメチルアデノシン、７−メチルアデニン、２−メチルチオ−アデニン、および２−メトキシ−アデニンが含まれる。
【００９３】
他の実施形態において、修飾されたヌクレオシドには、イノシン、１−メチル−イノシン、ワイオシン、ワイブトシン、７−デアザ−グアノシン、７−デアザ−８−アザ−グアノシン、６−チオ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−８−アザ−グアノシン、７−メチル−グアノシン、６−チオ−７−メチル−グアノシン、７−メチルイノシン、６−メトキシ−グアノシン、１−メチルグアノシン、Ｎ２−メチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２−ジメチルグアノシン、８−オキソ−グアノシン、７−メチル−８−オキソ−グアノシン、１−メチル−６−チオ−グアノシン、Ｎ２−メチル−６−チオ−グアノシン、およびＮ２，Ｎ２−ジメチル−６−チオ−グアノシンが含まれる。
【００９４】
いくつかの実施形態において、ヌクレオチドは、主溝面上で修飾されていてもよく、ウラシルのＣ−５上の水素がメチル基またはハロ基で置換されていてもよい。特定の実施形態において、修飾されたヌクレオシドは、５’−Ｏ−（１−チオホスフェート）−アデノシン、５’−Ｏ−（１−チオホスフェート）−シチジン、５’−Ｏ−（１−チオホスフェート）−グアノシン、５’−Ｏ−（１−チオホスフェート）−ウリジンまたは５’−Ｏ−（１−チオホスフェート）−プソイドウリジンである。
【００９５】
さらなる特定の実施形態において、修飾ＲＮＡは、６−アザ−シチジン、２−チオ−シチジン、α−チオ−シチジン、プソイド−イソ−シチジン、５−アミノアリル−ウリジン、５−ヨード−ウリジン、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン、５，６−ジヒドロウリジン、α−チオ−ウリジン、４−チオ−ウリジン、６−アザ−ウリジン、５−ヒドロキシ−ウリジン、デオキシ−チミジン、５−メチル−ウリジン、ピロロ−シチジン、イノシン、α−チオ−グアノシン、６−メチル−グアノシン、５−メチル−シチジン、８−オキソ−グアノシン、７−デアザ−グアノシン、Ｎ１−メチル−アデノシン、２−アミノ−６−クロロ−プリン、Ｎ６−メチル−２−アミノプリン、プソイド−イソ−シチジン、６−クロロ−プリン、Ｎ６−メチル−アデノシン、α−チオ−アデノシン、８−アジド−アデノシン、７−デアザ−アデノシンから選択されるヌクレオシド修飾を含み得る。
【００９６】
［脂質修飾］
さらなる実施形態によれば、本明細書で定義される修飾ＲＮＡは、脂質修飾を含んでいてもよい。このような脂質修飾ＲＮＡは、典型的には、本明細書で定義されるＲＮＡを含む。本明細書で定義されるそのような脂質修飾ＲＮＡは、典型的には、そのＲＮＡと共有結合した少なくとも１つのリンカー、およびそれぞれのリンカーと共有結合した少なくとも１つの脂質をさらに含む。あるいは、脂質修飾ＲＮＡは、本明細書で定義される少なくとも１つのＲＮＡ、およびそのＲＮＡと（リンカーなしで）共有結合した少なくとも１つの（二官能性）脂質を含む。第３の異なる態様によれば、脂質修飾ＲＮＡは、本明細書で定義されるＲＮＡ分子、そのＲＮＡと共有結合した少なくとも１つのリンカー、それぞれのリンカーと共有結合した少なくとも１つの脂質、およびそのＲＮＡと（リンカーなしで）共有結合した少なくとも１つの（二官能性）脂質もまた含んでいる。本文脈において、脂質修飾は直線ＲＮＡ配列の末端に存在することが特に好ましい。
【００９７】
［Ｇ／Ｃ含有量の修飾］
別の実施形態によれば、本発明のＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）は、本発明のＲＮＡ（好ましくはＲＮＡの少なくとも１つのコード配列）のグアノシン／シトシン（Ｇ／Ｃ）含有量が修飾されることによって修飾され得、従って安定化され得る。
【００９８】
本発明の特に好ましい実施形態において、本発明のＲＮＡのコード配列（コード領域）のＧ／Ｃ含有量は、それぞれの野生型ＲＮＡ、すなわち未修飾ＲＮＡのコード領域のＧ／Ｃ含有量と比べて、修飾され、特に増加する。ＲＮＡによってコードされるアミノ酸配列は、好ましくはそれぞれの野生型ＲＮＡによってコードされるアミノ酸配列と比べて修飾されない。本発明のＲＮＡのＧ／Ｃ含有量の修飾は、翻訳されるべき任意のＲＮＡ領域の配列は、そのＲＮＡの効率的な翻訳のために重要であるという事実に基づく。従って、ＲＮＡの組成物および種々のヌクレオチドの配列が重要である。特に、増加したＧ（グアノシン）／Ｃ（シトシン）含有量を有する配列は、増加したＡ（アデノシン）／Ｕ（ウラシル）含有量を有する配列よりも安定である。従って、本発明によれば、ＲＮＡのコドンは、翻訳されたアミノ酸配列を保持しながら、それぞれの野生型ＲＮＡと比べて変更され、その結果、ＲＮＡのコドンは、増加した量のＧ／Ｃヌクレオチドを含む。いくつかのコドンが同一のアミノ酸をコードするという事実（いわゆる遺伝子コードの変性）から、安定性のための最も好ましいコドンを決定することができる（いわゆる代替コドン使用）。ＲＮＡによってコードされるアミノ酸に応じて、ＲＮＡ配列の修飾には、その野生型配列と比べて、様々な可能性がある。ＧまたはＣヌクレオチドのみを含んでいるコドンによってコードされるアミノ酸の場合、コドンの修飾は必要ではない。従って、Ｐｒｏ（CCCまたはCCG）、Ａｒｇ（CGCまたはCGG）、Ａｌａ（GCCまたはGCG）およびＧｌｙ（GGCまたはGGG）のコドンは、ＡまたはＵが存在しないので、修飾を必要としない。対照的に、Ａおよび／またはＵヌクレオチドを含むコドンは、同じアミノ酸をコードするが、Ａおよび／またはＵを含んでいない他のコドンの置換によって修飾することができる。これらの例としては、ＰｒｏのコドンをCCUまたはCCAからCCCまたはCCGに修飾してもよく；ＡｒｇのコドンをCGUまたはCGAまたはAGAまたはAGGからCGCまたはCGGに修飾してもよく；ＡｌａのコドンをGCUまたはGCAからGCCまたはGCGに修飾してもよく；ＧｌｙのコドンをGGUまたはGGAからGGCまたはGGGに修飾してもよい。他の場合には、ＡまたはＵヌクレオチドをコドンから排除することはできないが、Ａおよび／またはＵヌクレオチドの含有量がより少ないコドンを使用することによって、ＡおよびＵ含有量を低下させることが可能である。これらの例としては、ＰｈｅのコドンをUUUからUUCに修飾してもよく；ＬｅｕのコドンをUUA、UUG、CUUまたはCUAからCUCまたはCUGに修飾してもよく；ＳｅｒのコドンをUCUまたはUCAまたはAGUからUCC、UCGまたはAGCに修飾してもよく；ＴｙｒのコドンをUAUからUACに修飾してもよく；ＣｙｓのコドンをUGUからUGCに修飾してもよく；ＨｉｓのコドンをCAUからCACに修飾してもよく；ＧｌｎのコドンをCAAからCAGに修飾してもよく；ＩｌｅのコドンをAUUまたはAUAからAUCに修飾してもよく；ＴｈｒのコドンをACUまたはACAからACCまたはACGに修飾してもよく；ＡｓｎのコドンをAAUからAACに修飾してもよく；ＬｙｓのコドンをAAAからAAGに修飾してもよく；ＶａｌのコドンをGUUまたはGUAからGUCまたはGUGに修飾してもよく；ＡｓｐのコドンをGAUからGAGに修飾してもよく；ＧｌｕのコドンをGAAからGAGに修飾してもよく；終止コドンUAAをUAGまたはUGAに修飾してもよい。一方、Ｍｅｔ（AUG）およびＴｒｐ（UGG）のコドンの場合、配列修飾の可能性はない。上記に列挙された置換は、本発明の組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡのＧ／Ｃ含有量を、その特定の野生型ｍＲＮＡ（すなわち、元の配列）と比べて増加させるために、個々に使用されてもよく、またはすべての可能な組み合わせで使用されてもよい。従って、例えば、野生型配列に存在するＴｈｒのすべてのコドンは、ACC（またはACG）に修飾されてもよい。しかし、好ましくは、例えば、上記の可能性のある置換の組み合わせが使用される：
元の配列（野生型ｍＲＮＡ）中のＴｈｒをコードするすべてのコドンをACC（またはACG）に置換、および
元のＳｅｒをコードするすべてのコドンのUCC（またはUCGまたはAGC）への置換；元の配列中のＩｌｅをコードするすべてのコドンのAUCへの置換、および
元のＬｙｓをコードするすべてのコドンのAAGへの置換、および
元のＴｙｒをコードするすべてのコドンのUACへの置換；元の配列中のＶａｌをコードするすべてのコドンのGUC（またはGUG）への置換、および
元のＧｌｕをコードするすべてのコドンのGAGへの置換、および
元のＡｌａをコードするすべてのコドンのGCC（またはGCG）への置換、および
元のＡｒｇをコードするすべてのコドンのCGC（またはCGG）への置換；元の配列中のＶａｌをコードするすべてのコドンのGUC（またはGUG）への置換、および
元のＧｌｕをコードするすべてのコドンのGAGへの置換、および
元のＡｌａをコードするすべてのコドンのGCC（またはGCG）への置換、および
元のＧｌｙをコードするすべてのコドンのGGC（またはGGG）への置換、および
元のＡｓｎをコードするすべてのコドンのAACへの置換；元の配列中のＶａｌをコードするするすべてのコドンのGUC（またはGUG）への置換、および
元のＰｈｅをコードするすべてのコドンのUUCへの置換、および
元のＣｙｓをコードするすべてのコドンのUGCへの置換、および
元のＬｅｕをコードするすべてのコドンのCUG（またはCUC）をへの置換、および
元のＧｌｎをコードするすべてのコドンのCAGへの置換、
元のＰｒｏをコードするすべてのコドンのCCC（またはCCG）への置換；等。
【００９９】
好ましくは、本発明のＲＮＡのコード領域のＧ／Ｃ含有量は、本明細書に定義されるペプチドもしくはタンパク質またはその断片もしくはバリアントをコードする野生型ＲＮＡのコード領域のＧ／Ｃ含有量と比べて、少なくとも７％、より好ましくは少なくとも１５％、特に好ましくは少なくとも２０％増加する。特定の実施形態によれば、本明細書に定義されるようなペプチドもしくはタンパク質、またはその断片もしくはバリアントをコードする領域、または野生型ＲＮＡ配列の全配列中の置換可能なコドンの少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％、９５％、または１００％が置換され、これにより上記配列中のＧ／Ｃ含有量が増加する。本文脈において、本発明のＲＮＡ、好ましくは本発明に係るＲＮＡの少なくとも１つのコード領域のＧ／Ｃ含有量を、野生型配列と比べて、最大（すなわち、置換可能なコドンの１００％）まで増加させることが特に好ましい。本発明によれば、本発明のＲＮＡのさらに好ましい修飾は、翻訳効率がまた、細胞中のｔＲＮＡが発生する頻度の違いによって決定されるという発見に基づく。従って、いわゆる「稀なコドン」が本発明のＲＮＡ中に増加した状態で存在する場合、比較的「頻繁な」ｔＲＮＡをコードするコドンが存在する場合よりも、「稀なコドン」に対応する修飾ＲＮＡ配列が翻訳される程度は、有意に低い。本発明によれば、本発明の修飾ＲＮＡにおいて、本明細書で定義されるペプチドもしくはタンパク質またはその断片もしくはバリアントをコードする領域は、野生型ＲＮＡの対応する領域と比べて修飾され、細胞において比較的稀なｔＲＮＡをコードする野生型配列の少なくとも１つのコドンが、細胞中で比較的頻繁に存在し、比較的稀なｔＲＮＡと同じアミノ酸を有するｔＲＮＡをコードするコドンと交換される。この修飾により、本発明のＲＮＡの配列は、頻繁に発生するｔＲＮＡが利用可能なコドンが挿入されるように修飾される。換言すれば、本発明によれば、この修飾により、細胞中で比較的稀であるｔＲＮＡをコードする野生型配列のすべてのコドンは、それぞれの場合において、細胞中で比較的頻繁であり、それぞれの場合において、比較的稀なｔＲＮＡと同じアミノ酸を運搬するｔＲＮＡをコードするコドンと交換することができる。どのｔＲＮＡが細胞中に比較的頻繁に発生し、それとは対照的に、比較的稀に発生するかは、当業者に公知である。例えば、Akashi, Curr. Opin. Genet. Dev. 2001, 11(6): 660-666を参照のこと。最も頻繁に発生する特定のアミノ酸ｔＲＮＡを使用するコドン、例えば（ヒト）細胞中で最も頻繁に発生するｔＲＮＡを使用するＧｌｙコドンが、特に好ましい。本発明によれば、ＲＮＡのコード領域によってコードされるペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列を修飾することなく、本発明の修飾ＲＮＡにおいて増加されたる、特に最大化される配列中のＧ／Ｃ含有量を、「頻繁な」コドンと連結することが特に好ましい。この好ましい実施形態は、特に効率的に翻訳され、安定化された（修飾された）本発明のＲＮＡの提供を可能にする。上記の本発明の修飾ＲＮＡの決定（Ｇ／Ｃ含有量��増加；ｔＲＮＡの交換）は、ＷＯ０２／０９８４４３（その開示内容は本発明の全範囲に含まれる）に説明されているコンピュータプログラムを用いて行うことができる。このコンピュータプログラムを使用して、最大Ｇ／Ｃ含有量において、改変されたＲＮＡによってコードされるアミノ酸配列が、好ましくは修飾されていない配列と比べて修飾されないように、細胞中で可能な限り頻繁に発生するtＲＮＡをコードするコドン使用と組み合わせて、任意の所望のＲＮＡのヌクレオチド配列を、遺伝子コードまたはその変性の性質を用いて修飾することができる。あるいは、元の配列と比べて、Ｇ／Ｃ含有量のみ、またはコドン使用のみを修飾することも可能である。Visual Basic 6．0（使用される開発環境: Microsoft Visual Studio Enterprise 6．0 with Servicepack 3）のソースコードもまた、ＷＯ０２／０９８４４３に記載されている。本発明のさらに好ましい実施形態において、本発明のＲＮＡのリボソーム結合部位の環境におけるＡ／Ｕ含有量は、そのそれぞれの野生型ｍＲＮＡのリボソーム結合部位の環境におけるＡ／Ｕ含有量と比べて増加する。この修飾（リボソーム結合部位の周りのＡ／Ｕ含有量の増加）は、リボソームがＲＮＡに結合する効率を増加させる。リボソーム結合部位へのリボソームの効率的な結合（Ｋｏｚａｋ配列：配列番号１４５４；ＡＵＧは開始コドンを形成する）は次に、ＲＮＡの効率的な翻訳に影響する。本発明のさらなる実施形態によれば、本発明のＲＮＡは、潜在的に不安定化する配列要素に関して修飾され得る。特に、このＲＮＡのコード領域および／または５’および／または３’非翻訳領域は、不安定化配列エレメントを含んまないように、それぞれの野生型ＲＮＡと比べて修飾され得、修飾ＲＮＡのコードされるアミノ酸配列は、好ましくはそのそれぞれの野生型ＲＮＡと比べて改変されない。例えば、真核生物ＲＮＡの配列において、不安定化配列エレメント（ＤＳＥ）が生じ、これにシグナルタンパク質が結合し、そしてインビボでＲＮＡの酵素分解を調節することが知られている。修飾ＲＮＡのさらなる安定化のために、任意に、本明細書に定義されるペプチドもしくはタンパク質またはその断片もしくはバリアントをコードする領域において、不安定化配列エレメントは、修飾ＲＮＡに含まれないか、または実質的に含まれないように、野生型ＲＮＡの対応する領域と比べて１つ以上のこのような修飾を行ってもよい。本発明によれば、非翻訳領域（３’−および／または５’−ＵＴＲ）に存在するＤＳＥもまた、このような修飾によって本発明のＲＮＡから排除されてもよい。このような不安定化配列は、例えば、多数の不安定ＲＮＡの３’−ＵＴＲ部に存在するＡＵリッチ配列（ＡＵＲＥＳ）である(Caput et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986, 83: 1670 to 1674）。従って、本発明のＲＮＡは、本発明のＲＮＡがそのような不安定化配列を含んでいないように、好ましくはそれぞれの野生型ＲＮＡと比べて修飾される。これは、トランスフェリン受容体をコードする遺伝子の３’−ＵＴＲセグメントに含まれる可能性のあるエンドヌクレアーゼ、例えば配列ＧＡＡＣＡＡＧによって認識される配列モチーフにも適用される（Binder et al., EMBO J. 1994, 13: 1969-1980）。これらの配列モチーフもまた、好ましくは��本発明のＲＮＡにおいて除去される。
【０１００】
好ましい実施形態によれば、本発明は、少なくとも１つのコード配列を含んでいる本明細書に定義されるＲＮＡを提供し、ここで、少なくとも１つのコード配列は、好ましくは、配列番号７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６および４０７からなる群から選択される核酸配列、またはこれらの核酸配列のいずれか１つの断片もしくはバリアントと同一であるか、または少なくとも８０％同一である核酸配列を含んでいるか、または該各酸配列からなる。
【０１０１】
さらに好ましい実施形態において、本発明に係るＲＮＡの少なくとも１つのコード配列は、配列番号７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６および４０７からなる群から選択される核酸配列、またはこれらの核酸配列のいずれか１つの断片もしくはバリアントと同一であるか、または少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、および最も好ましくは少なくとも９５％またはさらには９７％同一である核酸配列を含んでいるか、または該核酸配列からなる。
【０１０２】
ヒトコドン使用に適合した配列：
本発明によれば、本発明のＲＮＡのさらなる好ましい修飾は、同じアミノ酸をコードするコドンが典型的には異なる頻度で生じるという発見に基づく。本発明によれば、本発明の修飾ＲＮＡにおいて、本明細書で定義されるコード配列（コード領域）は、好ましくは、同じアミノ酸をコードするコドンの発生頻度を、例えば表１に示されるようなヒトコドン使用に応じてそのコドンの自然発生頻度に対応するように、それぞれの野生型ＲＮＡの対応する領域と比べて修飾される。
【０１０３】
例えば、本発明に係るＲＮＡの少なくとも１つのコード配列によってコードされるアミノ酸配列中に存在するアミノ酸アラニン（Ａｌａ）の場合、野生型コード配列は、好ましくは、コドン「GCC」が０．４０の頻度で使用され、コドン「GCT」が０．２８の頻度で使用され、コドン「GCA」が０．２２の頻度で使用され、コドン「GCG」が０．１０等の頻度で使用されるように適合される（表１を参照）。
【０１０４】
【表１】
2020501545.tif 000002
【０１０５】
好ましい実施形態において、本発明は少なくとも１つのコード配列を含むＲＮＡを提供し、ここで、コード配列は、配列番号１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４および１５５からなる群から選択される核酸配列またはこれらの核酸配列のいずれか１つの断片もしくはバリアントと同一であるか、または少なくとも８０％同一である核酸配列、を含んでいる。
【０１０６】
さらなる実施形態によれば、本発明に係るＲＮＡの少なくとも１つのコード配列は、配列番号１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４および１５５からなる群から選択される核酸配列、またはこれらの核酸配列のいずれか１つの断片もしくはバリアントと、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、さらには９７％同一の配列を有する核酸配列を含んでいるか、または該核酸配列からなる。
【０１０７】
コドン最適化配列：
上述のように、本発明によれば、細胞中で比較的稀であるｔＲＮＡをコードする野生型配列のすべてのコドンが、細胞中で比較的頻繁であり、いずれの場合にも、比較的稀なｔＲＮＡと同じアミノ酸を運搬するｔＲＮＡをコードするコドンと交換されることが好ましい。従って、コードされる各アミノ酸の最も頻繁なコドンが使用されることが特に好ましい（表１を参照のこと、最も頻繁なコドンは、アスタリスクでマークされる）。このような最適化処置は、コドン適応指数（codon adaptation index）（ＣＡＩ）を増加させ、最終的にＣＡＩを最大化する。本発明の文脈において、増加したまたは最大化されたＣＡＩを有する配列は、典型的には、「コドン最適化」配列および／またはＣＡＩ増加配列および／またはＣＡＩ最大化配列と称される。好ましい実施形態によれば、本発明のＲＮＡは、少なくとも１つのコード配列を含み、ここで、コード配列は、本明細書に記載されるようにコドン最適化される。より好ましくは、少なくとも１つのコード配列のコドン適応指数（ＣＡＩ）が、少なくとも０．５、少なくとも０．８、少なくとも０．９または少なくとも０．９５である。最も好ましくは、少なくとも１つのコード配列のコドン適応指数（ＣＡＩ）は１である。
【０１０８】
例えば、本発明に係るＲＮＡの少なくとも１つのコード配列によってコードされるアミノ酸配列に存在するアミノ酸アラニン（Ａｌａ）の場合、最も頻繁なヒトコドン「GCC」が常に上記アミノ酸に使用されるように、またはアミノ酸システイン（Ｃｙｓ）には、最も頻繁なヒトコドン「TGC」が常に上記アミノ酸に使用されるように、野生型配列が適応される。
【０１０９】
好ましい実施形態ににおいて、本発明は少なくとも１つのコード配列を含んでいるＲＮＡを提供し、ここで、コード配列は、配列番号１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、および１８３からなる群から選択される核酸配列またはこれらの核酸配列のいずれか１つの断片もしくはバリアントと同一または少なくとも８０％同一の核酸配列である。
【０１１０】
さらなる実施形態によれば、本発明に係るＲＮＡの少なくとも１つのコード配列は、配列番号１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２および１８３からなる群から選択される核酸配列またはこれらの核酸配列のいずれか１つの断片もしくはバリアントと、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％さらには９７％同一の配列を有する核酸配列を含み、または該核酸配列からなる。
【０１１１】
［Ｃ最適化配列］
別の実施形態によれば、本発明のＲＮＡは、ＲＮＡ（好ましくはＲＮＡのコード領域）のシトシン（Ｃ）含有量を修飾、好ましくは増加させることによって修飾され得る。
【０１１２】
本発明の特に好ましい実施形態において、本発明のＲＮＡのコード領域のＣ含有量は、それぞれの野生型ＲＮＡ、すなわち未修飾ＲＮＡのコード領域のＣ含有量と比べて、修飾され、好ましくは増加する。本発明のＲＮＡの少なくとも１つのコード配列によってコードされるアミノ酸配列は、好ましくはそれぞれの野生型ｍＲＮＡによってコードされるアミノ酸配列と比べて修飾されない。
【０１１３】
本発明の好ましい実施形態において、修飾ＲＮＡは、理論的に可能な最大シトシン含有量の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、または８０％、または少なくとも９０％、または最大シトシン含有量さえ達成されるように修飾される。
【０１１４】
さらに好ましい実施形態では、「シトシン含有量最適化可能」である標的ＲＮＡ野生型配列のコドンの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またさらには１００％が、野生型配列に存在するコドンよりも高いシトシン含有量を有するコドンによって置換される。
【０１１５】
さらに好ましい実施形態において、野生型コード配列のコドンのいくつかは、細胞中で比較的稀なｔＲＮＡのコドンが、細胞中で比較的頻繁なｔＲＮＡのコドンによって交換されるように、さらに改変され得る（ただし、比較的頻繁なｔＲＮＡの置換コドンが、元の野生型コドンの比較的稀なｔＲＮＡと同じアミノ酸を運搬することを条件とする）。好ましくは、比較的稀なｔＲＮＡのコドンが、シトシンを全く含んでいないコドンによってのみコードされるアミノ酸をコードするコドンを除いて、または各々が同数のシトシンを含んでいる２つのコドンによってコードされるグルタミン（Ｇｌｎ）を除く、細胞中で比較的頻繁なｔＲＮＡのコドンによって置換される。
【０１１６】
本発明のさらに好ましい実施形態において、修飾された標的ＲＮＡは、細胞中で比較的頻繁なｔＲＮＡをコードするコドンによって、理論的に可能な最大シトシン含有量の少なくとも８０％、または少なくとも９０％、さらには最大シトシン含有量が達成されるように、修飾される。ここで、アミノ酸配列は変化しないままである。
【０１１７】
遺伝子コードの自然発生的な縮重により、複数のコドンが特定のアミノ酸をコードし得る。従って、２０個の自然発生するアミノ酸のうちの１８個は、２個以上のコドン、例えば２個のコドン（例えばＣｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）、３個のコドン（例えばＩｌｅ）、４個のコドン（例えばＡｌ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ）、または６個のコドン（例えばＬｅｕ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ）によってコードされる（ＴｒｙｐおよびＭｅｔは例外である）。しかし、同じアミノ酸をコードするすべてのコドンが、インビボ条件下で同じ頻度で利用されるわけではない。各単一生物に依存して、典型的なコドン使用プロファイルが確立される。
【０１１８】
本発明の文脈において使用される用語「シトシン含有量最適化可能コドン」は、同じアミノ酸をコードする他のコドンよりも低いシトシン含有量を示すコドンを表す。従って、同じアミノ酸をコードし、そのコドン内でより多くのシトシン数を示す別のコドンによって置換され得る任意の野生型コドンは、シトシン最適化可能（Ｃ最適化可能）であると考えられる。野生型コード領域内の特定のＣ最適化コドンによる、Ｃ最適化可能な野生型コドンのこのような置換は、その全体的なＣ含有量を増加させ、修飾されたＣ富化ｍＲＮＡ配列を反映する。好ましい実施形態によれば、本発明のＲＮＡ（好ましくは本発明のＲＮＡの少なくとも１つのコード配列）は、すべての潜在的にＣ最適化可能なコドンのＣ最適化コドンを含んでいるＣ最大化ＲＮＡ配列を含んでいるか、または該Ｃ最大化ＲＮＡ配列からなる。従って、好ましくは、理論的に置換可能なＣ最適化コドンの１００％またはすべてが、コード領域の全長にわたって、Ｃ最適化コドンによって置換される。
【０１１９】
本文脈において、シトシン含有量最適化可能なコドンは、同じアミノ酸をコードする他のコドンよりも少ない数のシトシンを含むコドンである。
【０１２０】
GCG、GCA、GCUのいずれも、アミノ酸Ａｌａをコードし、同じアミノ酸をコードするコドンGCCによって交換され得、および／または
ＣｙｓをコードするコドンUGUは、同じアミノ酸をコードするコドンUGCによって交換され得、および／または
ＡｓｐをコードするコドンGAUは、同じアミノ酸をコードするコドンGACによって交換され得、および／または
ＰｈｅをコードするコドンUUUは、同じアミノ酸をコードするコドンUUCによって交換され得、および／または
ＧｌｙをコードするコドンGGG、GGA、GGUは、同じアミノ酸をコードするGGCによって交換され得、および／または
ＨｉｓをコードするCAUは、同じアミノ酸をコードするCACによって交換され得、および／または
ＩｌｅをコードするコドンAUA、AUUは、AUCによって交換され得、および／または
ＬｅｕをコードするコドンUUG、UUA、CUG、CUA、CUUは、同じアミノ酸をコードするコドンCUCによって交換され得、および/または
ＡｓｎをコードするコドンAAUは、同じアミノ酸をコードするコドンAACによって交換され得、および／または
ＰｒｏをコードするコドンCCG、CCA、CCUは、同じアミノ酸をコードするコドンCCCによって交換され得、および／または
ＡｒｇをコードするコドンAGG、AGA、CGG、CGAは、同じアミノ酸をコードするコドンCGCによって交換され得、および／または
ＳｅｒをコードするコドンAGU、AGC、UCG、UCA、UCUは、同じアミノ酸をコードするコドンUCCによって交換され得、および／または
ＴｈｒをコードするコドンACG、ACA、ACUは、同じアミノ酸をコードするコドンACCによって交換され得、および／または
ＶａｌをコードするコドンGUG、GUA、GUUは、同じアミノ酸をコードするコドンGUCによって交換され得、および／または
ＴｙｒをコードするコドンUAUは、同じアミノ酸をコードするコドンUACによって交換され得る。
【０１２１】
上記の場合のいずれにおいても、シトシンの数は、交換されるコドン当たり１ずつ増加する。コード領域のすべてのＣ最適化されていないコドン（Ｃ最適化可能なコドンに対応する）の交換は、Ｃ最大化コード配列を生じる。本発明の文脈において、本発明によるＲＮＡの少なくとも１つのコード領域内のＣ最適化されていないコドンの少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％は、Ｃ最適化コドンによって置換される。
【０１２２】
いくつかのアミノ酸について、Ｃ最適化コドンによって置換されたＣ最適化可能コドンの割合は７０％未満であり、一方、他のアミノ酸については、コード領域のすべてのＣ最適化可能野生型コドンのＣ最適化の全体の割合が少なくとも７０％を満たすために、置換されたコドンの割合が、７０％より高いことが好ましい場合がある。
【０１２３】
好ましくは、本発明のＣ最適化ＲＮＡにおいて、任意のアミノ酸のＣ最適化可能野生型コドンの少なくとも５０％が、Ｃ最適化コドンで置き換えられ、例えば、任意の修飾されたＣ富化ＲＮＡは、好ましくは上記のアミノ酸Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＶａｌおよびＴｙｒのいずれか１つをコードするＣ最適化可能野生型コドンにおけるＣ最適化コドンの５０％、好ましくは少なくとも６０％を含む。
【０１２４】
本文脈において、シトシン含有量最適化可能ではないが、少なくとも２つのコドンによってコードされるアミノ酸をコードするコドンは、さらなる選択プロセスなしに使用され得る。しかし、細胞（例えば、ヒト細胞）中で比較的稀なｔＲＮＡをコードする野生型配列のコドンは、細胞中で比較的頻繁なｔＲＮＡをコードするコドンと交換され得る。ここで、両方のコドンは、同じアミノ酸をコードする。
【０１２５】
従って、Ｇｌｕをコードする比較的稀なコドンGAAは、同じアミノ酸をコードする比較的頻繁なコドンGAGによって交換され得、および／または
Ｌｙｓをコードする比較的稀なコドンAAAは、同じアミノ酸をコードする比較的頻繁なコドンAAGによって交換され得、および／または
Ｇｌｎをコードする比較的稀なコドンCAAは、同じアミノ酸をコードする比較的頻繁なコドンCAGと交換され得る。
【０１２６】
本文脈において、それぞれ１つのコドンのみによってコードされるアミノ酸Ｍｅｔ（AUG）およびＴｒｐ（ＵＧＧ）は、変化しないままである。停止コドンは、シトシン含有量が最適化されていないが、比較的稀な停止コドンであるアンバー、オクロール（UAA、UAG）は、比較的頻繁な停止コドンオパール（UGA）によって交換され得る。
【０１２７】
野生型ｍＲＮＡ配列と比べて、修飾ＲＮＡのシトシン含有量を最適化するために、上記に列挙した単一の置換を、個々に使用され得、ならびにすべての可能な組合せで使用され得る。
【０１２８】
従って、本明細書で定義される少なくとも１つのコード配列は、少なくとも２つ以上のコドン（そのうちの１つは１つの追加のシトシンを含んでいる）によってコードされるアミノ酸が、１つの追加のシトシンを含んでいるＣ最適化コドンによって交換され得るように、それぞれの野生型ＲＮＡのコード領域に対して変更され得、その場合、アミノ酸は、好ましくは、野生型配列と比べて変化しない。
【０１２９】
好ましい態様において、本発明は少なくとも１つのコード配列を含んでいるＲＮＡを提供し、ここで、コード配列は、配列番号１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６および１２７からなる群から選択される核酸配列、または当該核酸配列のいずれかの１つの断片もしくはバリアントと同一、または少なくとも８０％同一の核酸配列を含んでいる。
【０１３０】
さらなる実施形態によれば、本発明に係るＲＮＡの少なくとも１つのコード配列は、配列番号１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６および１２７からなる群から選択される核酸配列またはこれらの核酸配列の断片もしくはバリアントと、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、および最も好ましくは少なくとも９５％、またさらには９７％の配列同一性を有する核酸配列を含み、または該核酸配列からなる。
【０１３１】
特に好ましい実施形態によれば、本発明は、本明細書で定義される少なくとも１つのコード配列を含むＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）を提供し、
ここで、ＲＮＡの少なくとも１つのコード配列のＧ／Ｃ含有量は、対応する野生型ＲＮＡの対応するコード配列のＧ／Ｃ含有量と比べて増加され、および／または
ＲＮＡの少なくとも１つのコード配列のＣ含有量が対応する野生型ＲＮＡの対応するコード配列のＣ含有量と比べて増加され、および／または
ＲＮＡの少なくとも１つのコード配列中のコドンが、ヒトコドン使用に適応され、
コドン適応指数（ＣＡＩ）は、好ましくはＲＮＡの少なくとも１つのコード配列において増加または最大化され、
ＲＮＡによってコードされるアミノ酸配列は、好ましくは対応する野生型ＲＮＡによってコードされるアミノ酸配列と比べて修飾されていない。
【０１３２】
好ましい実施形態において、本発明が配列番号７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６  および４０７からなる群から選択される核酸配列、またはこれらの核酸配列の断片もしくはバリアントと同一であるか、または少なくとも８０％同一である核酸配列を含んでいる。
【０１３３】
さらなる実施形態によれば、本発明に係るＲＮＡの少なくとも１つのコード配列は、配列番号７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６および４０７からなる群から選択される核酸配列、またはこれらの核酸配列の断片もしくはバリアントと、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、またさらには９７％の配列同一性を有する核酸配列を含んでいるか、または該核酸配列からなる。
【０１３４】
［５’−キャップ］
本発明の他の好適な実施形態によれば、本明細書に定義されている修飾ＲＮＡは、いわゆる「５’−キャップ」構造の付加によって修飾され得る。この構造は、好ましくは、本明細書に記載のＲＮＡを安定化させる。５’−キャップは、エンティティ（通常は、修飾ヌクレオチドエンティティ）であり、一般的に、成熟ｍＲＮＡの５’末端を「キャップ」する。５’−キャップは、通常、修飾ヌクレオチド（特に、グアニンヌクレオチドの誘導体）によって形成され得る。好ましくは、５’−キャップは、５’−５’三リン酸結合を介して５’末端に連結されている。５’−キャップはメチル化されていてもよい。このような例としては、ｍ７ＧｐｐＮがある（ここで、Ｎは、５’−キャップを有している核酸の５’末端のヌクレオチドであり、通常はｍＲＮＡの５’末端である）。ｍ７ＧｐｐｐＮは、５’−キャップ構造であり、ポリメラーゼＩＩによって転写されたｍＲＮＡ中に天然に存在する。したがって好ましくは、この文脈において、修飾ｍＲＮＡに含まれている修飾とはみなされない。したがって、本発明の修飾ＲＮＡは、５’−キャップとしてｍ７ＧｐｐｐＮを含み得るが、それに加えて当該修飾ＲＮＡは、通常は、本明細書に定義されている少なくとも１つのさらなる修飾を含んでいる。
【０１３５】
５’−キャップ構造のさらなる例としては、グリセリル、逆方向デオキシ脱塩基残基（部分）、４’，５’−メチレンヌクレオチド、１−（β−Ｄ−エリトロフラノシル）ヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、炭素環ヌクレオチド、１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド、Ｌ−ヌクレオチド、α−ヌクレオチド、修飾塩基ヌクレオチド、ｔｈｒｅｏ−ペントフラノシルヌクレオチド、非環式３’，４’−ｓｅｃｏヌクレオチド、非環式３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド、非環式３，５ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、３’−３’−逆方向ヌクレオチド部分、３’−３’−逆方向脱塩基部分、３’−２’−逆方向ヌクレオチド部分、３’−２’−逆方向脱塩基部分、１，４−ブタンジオールホスファート、３’−ホスホロアミダート、ヘキシルホスファート、アミノヘキシルホスファート、３’−ホスファート、３’ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、または、架橋性もしくは非架橋性メチルホスホナート部分が挙げられる。これらの修飾された５’−キャップ構造は、この文脈において、少なくとも１つの修飾とみなされる。
【０１３６】
特に好ましい修飾された５’−キャップ構造は、ｃａｐ１（ｍ７Ｇに隣接するヌクレオチドのリボースのメチル化）、ｃａｐ２（ｍ７Ｇの下流にある２番目のヌクレオチドのリボースをさらにメチル化）、ｃａｐ３（ｍ７Ｇの下流にある３番目のヌクレオチドのリボースをさらにメチル化）、ｃａｐ４（ｍ７Ｇの下流にある４番目のヌクレオチドのリボースをメチル化）、ＡＲＣＡ（anti-reverse cap analogue、修飾ＡＲＣＡ（例えば、ホスホチオアート修飾ＡＲＣＡ）、イノシン、Ｎ１−メチル−グアノシン、２’−フルオロ−グアノシン、７−デアザ−グアノシン、８−オキソ−グアノシン、２−アミノ−グアノシン、ＬＮＡ−グアノシン、および２−アジド−グアノシンである。したがって、本発明に係るＲＮＡは、好ましくは、５’−キャップ構造を含んでいる。
【０１３７】
好適な実施形態において、本発明に係るＲＮＡは、少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメントまたは３’−ＵＴＲエレメントを含んでいる。この文脈において、ＵＴＲエレメントは、（i）天然に存在する任意の遺伝子の５’−ＵＴＲまたは３’−ＵＴＲに由来する核酸配列、または、（ii）遺伝子の５’−ＵＴＲまたは３’−ＵＴＲの断片、ホモログまたはバリアントに由来する核酸配列、を含んでいるか、または当該核酸配列からなる。好ましくは、本発明にしたがって使用される５’−ＵＴＲエレメントまたは３’−ＵＴＲエレメントは、本発明のＲＮＡの少なくとも１つのコード配列に対して異種由来である。仮に、天然に存在する遺伝子に由来する５’−ＵＴＲエレメントまたは３’−ＵＴＲエレメントが好ましかったとしても、合成的に操作されたＵＴＲエレメントもまた、本発明の文脈において使用され得る。
【０１３８】
用語「３’−ＵＴＲエレメント」は、通常、３’−ＵＴＲまたは３’−ＵＴＲのバリアントに由来する核酸配列を含んでいる核酸配列、または、３’−ＵＴＲまたは３’−ＵＴＲのバリアントに由来する核酸配列からなる核酸配列を表す。本発明の意味における３’−ＵＴＲエレメントは、ＲＮＡの３’−ＵＴＲ（好ましくは、ｍＲＮＡの３’−ＵＴＲ）を表し得る。したがって、本発明の意味において、好ましくは、３’−ＵＴＲエレメントは、ＲＮＡの３’−ＵＴＲ（好ましくは、ｍＲＮＡの３’−ＵＴＲ）であってもよいし、ＲＮＡの３’−ＵＴＲのための転写テンプレートであってもよい。したがって、３’−ＵＴＲエレメントは、好ましくはＲＮＡの３’−ＵＴＲに対応する核酸配列であり、好ましくはｍＲＮＡ（遺伝子操作されたベクターコンストラクトの転写によって得られるｍＲＮＡなど）の３’−ＵＴＲに対応する核酸配列である。好ましくは、３’−ＵＴＲエレメントは、３’−ＵＴＲの機能を果たしているか、または３’−ＵＴＲの機能を果たす配列をコードしている。
【０１３９】
好適な実施形態によれば、本発明に係るＲＮＡ（好ましくは、ｍＲＮＡ）は、５’−キャップ構造および／または少なくとも１つの３’非翻訳領域エレメント（３’−ＵＴＲエレメント）を含んでいる（好ましくは、本明細書に定義されているように含んでいる）。より好ましくは、ＲＮＡは、本明細書に定義されている５’−ＵＴＲエレメントをさらに含んでいる。
【０１４０】
［ポリ（Ａ）テール］
さらに好適な実施形態によれば、本発明のＲＮＡは、３’末端においてポリ（Ａ）テールを含み得る。ポリ（Ａ）テールは、通常は約１０〜２００アデノシンヌクレオチドであり、好ましくは約１０〜１００アデノシンヌクレオチドであり、より好ましくは約４０〜８０アデノシンヌクレオチドであり、または、より一層好ましくは約５０〜７０アデノシンヌクレオチドである。
【０１４１】
好ましくは、本発明のＲＮＡ中のポリ（Ａ）配列は、ＤＮＡテンプレートに由来し、in vitroにおけるＲＮＡへの転写によって生じる。あるいは、一般的な化学合成の方法によって、in vitroにてポリ（Ａ）配列を得てもよく、必ずしもＤＮＡ前駆体から転写される必要はない。さらに、ポリ（Ａ）配列またはポリ（Ａ）テールは、本発明に係るＲＮＡの酵素的ポリアデニル化によって作製され得る。この際には、市販のポリアデニル化キットと、これに対応する当該分野で公知のプロトコルを使用する。
【０１４２】
あるいは、本明細書に記載のＲＮＡは、任意で、ポリアデニル化シグナルを含んでいる。本明細書において、ポリアデニル化シグナルは、（転写された）ＲＮＡに特定のタンパク質因子によるポリアデニル化をもたらすシグナルとして定義される。このようなタンパク質因子の例としては、切断およびポリアデニル化特異因子（CPSF）、切断刺激因子（CstF）、切断因子Ｉおよび切断因子ＩＩ（CF IおよびCF II）、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ（PAP）が挙げられる。この文脈において、コンセンサスポリアデニル化シグナルは、NN(U/T)ANAコンセンサス配列を含んでいることが好ましい。特に好ましい態様において、ポリアデニル化シグナルは、以下の配列の１つを含んでいる：AA(U/T)AAAまたはA(U/T)(U/T)AAA（ここで、ウリジンは通常ＲＮＡ中に存在し、チミジンは通常ＤＮＡ中に存在する）。
【０１４３】
［ポリ（Ｃ）テール］
さらに好適な実施形態によれば、本発明のＲＮＡは、３’末端においてポリ（Ｃ）テールを含み得る。ポリ（Ｃ）テールは、通常は約１０〜２００シチジンヌクレオチドであり、好ましくは約１０〜１００シチジンヌクレオチドであり、より好ましくは約２０〜７０シチジンヌクレオチドであり、または、より一層好ましくは約２０〜６０シチジンヌクレオチド（もしくは１０〜４０シチジンヌクレオチド）である。
【０１４４】
［３’−ＵＴＲ］
さらに好適な実施形態において、本発明に係るＲＮＡは、少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメントをさらに含んでいる。好ましくは、少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメントは、脊索動物の遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する核酸配列を含んでいるか、または当該核酸配列からなる。このとき、脊索動物の遺伝子は、好ましくは脊椎動物の遺伝子であり、より好ましくは哺乳類の遺伝子であり、最も好ましくはヒト遺伝子である。あるいは、少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメントは、脊索動物の遺伝子の３’−ＵＴＲのバリアントに由来する核酸配列を含んでいるか、または当該核酸配列からなる。このとき、脊索動物の遺伝子は、好ましくは脊椎動物の遺伝子であり、より好ましくは哺乳類の遺伝子であり、最も好ましくはヒト遺伝子である。
【０１４５】
好ましくは、本発明のＲＮＡは、半減期が延長された（安定なｍＲＮＡを提供する）ｍＲＮＡに関連する遺伝子から誘導され得る３’−ＵＴＲエレメントを含んでいる。このような遺伝子の例としては、以下に定義されており記載されているような３’−ＵＴＲエレメントが挙げられる。好ましくは、３’−ＵＴＲエレメントは、遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する核酸配列である。この遺伝子は、好ましくは、安定なｍＲＮＡをコードしている。あるいは、３’−ＵＴＲエレメントは、上記遺伝子のホモログ、断片もしくはバリアントに由来する核酸配列である。
【０１４６】
特に好適な実施形態において、３’−ＵＴＲエレメントは、アルブミン遺伝子、α−グロビン遺伝子、β−グロビン遺伝子、チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子、リポキシゲナーゼ遺伝子、およびコラーゲンα遺伝子（コラーゲンα１（Ｉ）遺伝子など）からなる群から選択される遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する核酸配列を含んでいるか、または当該核酸配列からなる。あるいは、３’−ＵＴＲエレメントは、アルブミン遺伝子、α−グロビン遺伝子、β−グロビン遺伝子、チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子、リポキシゲナーゼ遺伝子、およびコラーゲンα遺伝子（コラーゲンα１（Ｉ）遺伝子など。国際公開第２０１３／１４３７００号の配列番号１３６９〜１３９０に記載。この開示は、参照により本明細書に組み込まれる）からなる群から選択される遺伝子の３’−ＵＴＲのバリアントに由来する核酸配列を含んでいるか、または当該核酸配列からなる。あるいは、３’−ＵＴＲエレメントは、上記遺伝子のホモログ、断片またはバリアントに由来する核酸配列を含んでいるか、または当該核酸配列からなる。特に好適な実施形態において、３’−ＵＴＲエレメントは、アルブミン遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する核酸配列を含んでいるか、または当該核酸配列からなる。このとき、アルブミン遺伝子は、好ましくは脊椎動物のアルブミン遺伝子であり、より好ましくは哺乳類のアルブミン遺伝子であり、最も好ましくはヒトアルブミン遺伝子である（配列番号１４４５、または対応するＲＮＡ配列である配列番号１４４６に記載）あるいは、３’−ＵＴＲエレメントは、上記アルブミン遺伝子の断片またはバリアントの３’−ＵＴＲに由来する核酸配列を含んでいるか、または当該核酸配列からなる。
【０１４７】
この文脈において、特に好ましくは、本発明に係るＲＮＡは、国際公開第２０１３／１４３７００号の配列番号１３６９〜１３９０に記載の核酸に由来する、対応するＲＮＡ配列を含む３’−ＵＴＲエレメントを含んでいる。あるいは、本発明に係るＲＮＡは、上記核酸の断片、ホモログまたはバリアントを含む３’−ＵＴＲエレメントを含んでいる。
【０１４８】
最も好ましくは、３’−ＵＴＲエレメントは、配列番号１４４７（国際公開第２０１３／１４３７００号の配列番号１３７６に対応）または１４４９に記載の、ヒトアルブミン遺伝子断片に由来する核酸配列を含んでいる。
【０１４９】
この文脈において、特に好ましくは、本発明に係るＲＮＡの３’−ＵＴＲエレメントは、配列番号１４４７または１４４９に記載の核酸配列の対応するＲＮＡ配列を含んでいるか、または当該ＲＮＡ配列からなる（配列番号１４４８または１４５０を参照）。
【０１５０】
他の特に好適な実施形態において、３’−ＵＴＲエレメントは、α−グロビン遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する核酸配列を含んでいるか、または当該核酸配列からなる、３’−ＵＴＲエレメントを含んでいる。このα−グロビン遺伝子は、好ましくは脊椎動物のα−またはβ−グロビン遺伝子であり、より好ましくは哺乳類のα−またはβ−グロビン遺伝子であり、最も好ましくはヒトα−もしくはβ−グロビン遺伝子（配列番号１４３７、１４３９または１４４１に記載）または対応するＲＮＡ配列（配列番号１４３８、１４４０または１４４２）である。
【０１５１】
Homo sapiensヘモグロビンα１（HBA1）の３’−ＵＴＲ：
GCTGGAGCCTCGGTGGCCATGCTTCTTGCCCCTTGGGCCTCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTTCCTGCACCCGTACCCCCGTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCGGC（配列番号１４３７；国際公開第２０１３／１４３７００号の配列番号１３７０に対応）。
【０１５２】
Homo sapiensヘモグロビンα２（HBA2）の３’−ＵＴＲ：
GCTGGAGCCTCGGTAGCCGTTCCTCCTGCCCGCTGGGCCTCCCAACGGGCCCTCCTCCCCTCCTTGCACCGGCCCTTCCTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCAG（配列番号１４３９；国際公開第２０１３／１４３７００号の配列番号１３７１に対応）。
【０１５３】
Homo sapiensヘモグロビンβ（HBB）の３’−ＵＴＲ：
GCTCGCTTTCTTGCTGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTTCCCTAAGTCCAACTACTAAACTGGGGGATATTATGAAGGGCCTTGAGCATCTGGATTCTGCCTAATAAAAAACATTTATTTTCATTGC（配列番号１４４１；国際公開第２０１３／１４３７００号の配列番号１３７２に対応）。
【０１５４】
例えば、３’−ＵＴＲエレメントは、中心（ヒトα−グロビン遺伝子などのα−グロビン遺伝子の３’−ＵＴＲのα−複合体結合部位）を含んでいるか、または当該中心からなり得る。あるいは、３’−ＵＴＲエレメントは、上記αグロビン遺伝子のホモログ、断片またはバリアントを含んでいるか、またはそれらからなり得る。好ましくは、配列番号１４４３に記載の配列を含んでいる。
【０１５５】
中心（α−グロビン遺伝子の３’−ＵＴＲのα−複合体結合部位。本明細書では"muag"とも呼ばれる）：
GCCCGATGGGCCTCCCAACGGGCCCTCCTCCCCTCCTTGCACCG（配列番号１４４３；国際公開第２０１３／１４３７００号の配列番号１３９３に対応）。
【０１５６】
この文脈において、特に好ましくは、本発明に係るＲＮＡの３’−ＵＴＲエレメントは、配列番号１４４３に記載の核酸配列の対応するＲＮＡ配列（配列番号１４４４に示すような）、またはそのホモログ、断片もしくはバリアントを含んでいるか、またはそれらからなること。
【０１５７】
用語「（…）遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する核酸配列」は、好ましくは、（…）遺伝子の３’−ＵＴＲ配列またはその一部に基づく核酸配列を表す。このような３’−ＵＴＲ配列の例としては、アルブミン遺伝子、α−グロビン遺伝子、β−グロビン遺伝子、チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子、リポキシゲナーゼ遺伝子、またはコラーゲンα遺伝子（コラーゲンα１（Ｉ）遺伝子など）の３’−ＵＴＲまたはその一部が挙げられ、好ましくはアルブミン遺伝子の３’−ＵＴＲまたはその一部が挙げられる。この用語には、３’−ＵＴＲの全配列（すなわち、遺伝子の３’−ＵＴＲ配列の全長）に対応する配列が含まれている。また、この用語には、遺伝子の３’−ＵＴＲ配列の断片に対応する配列も含まれている。このような遺伝子の例としては、アルブミン遺伝子、α−グロビン遺伝子、β−グロビン遺伝子、チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子、リポキシゲナーゼ遺伝子、またはコラーゲンα遺伝子（コラーゲンα１（Ｉ）遺伝子など）が挙げられ、好ましくはアルブミン遺伝子が挙げられる。
【０１５８】
用語「（…）遺伝子の３’−ＵＴＲのバリアントに由来する核酸配列」は、好ましくは、遺伝子の３’−ＵＴＲ配列のバリアントに基づく核酸配列またはその一部を表す（上述した通り）。このような３’−ＵＴＲのバリアントの例としては、アルブミン遺伝子、α−グロビン遺伝子、β−グロビン遺伝子、チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子、リポキシゲナーゼ遺伝子、またはコラーゲンα遺伝子（コラーゲンα１（Ｉ）遺伝子など）の３’−ＵＴＲのバリアントが挙げられる。この用語には、遺伝子の３’−ＵＴＲのバリアントの全配列（すなわち、遺伝子の３’−ＵＴＲ配列のバリアントの全長）に対応する配列が含まれている。また、この用語には、遺伝子の３’−ＵＴＲ配列のバリアントの断片に対応する配列も含まれている。この文脈における断片は、好ましくは、連続するヌクレオチドの並びからなっており、この並びは、３’−ＵＴＲのバリアントの全長における連続したヌクレオチドの並びに対応している。上記の連続する並びは、３’−ＵＴＲのバリアントの全長のうち少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、より一層好ましくは少なくとも６０％、より一層好ましくは少なくとも７０％、より一層好ましくは少なくとも８０％、および、最も好ましくは少なくとも９０％を表している。本発明の意味において、このようなバリアントの断片は、好ましくは、本明細書に記載のバリアントの機能性の断片である。
【０１５９】
［５’−ＵＴＲ］
特に好適な実施形態において、本発明の組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡは、少なくとも１つの５’−非翻訳領域エレメント（５’−ＵＴＲエレメント）を含んでいる。好ましくは、少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメントは、ＴＯＰ遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する核酸配列を含んでいるか、または当該核酸配列からなる。あるいは、少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメントは、ＴＯＰ遺伝子の５’−ＵＴＲの断片、ホモログもしくはバリアントに由来する核酸配列を含んでいるか、または当該核酸配列からなる。
【０１６０】
特に好ましくは、５’−ＵＴＲエレメントは、ＴＯＰモチーフまたは５’ＴＯＰを含んでいない（上記で定義したように）。
【０１６１】
いくつかの実施形態において、５’−ＵＴＲエレメントの核酸配列は、ＴＯＰ遺伝子の５’−ＵＴＲに由来しており、当該遺伝子またはそれに由来するｍＲＮＡの開始コドン（例えば、A(U/T)G）よりも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個上流に位置しているヌクレオチドで３’末端が終了している。したがって、５’−ＵＴＲエレメントは、タンパク質コード領域のいかなる部分をも含んでいない。したがって、好ましくは、本発明の組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡの唯一のタンパク質コード部分が、コード領域によって与えられている。
【０１６２】
ＴＯＰ遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する核酸配列は、好ましくは真核生物のＴＯＰ遺伝子に由来し、好ましくは植物または動物のＴＯＰ遺伝子に由来し、より好ましくは脊索動物のＴＯＰ遺伝子に由来し、より一層好ましくは脊椎動物のＴＯＰ遺伝子に由来し、最も好ましくは哺乳類のＴＯＰ遺伝子（ヒトＴＯＰ遺伝子など）に由来する。例えば、５’−ＵＴＲエレメントは、好ましくは、以下の核酸配列を含んでいる５’−ＵＴＲエレメント、または当該核酸配列からなる５’−ＵＴＲエレメントから選択される：（i）国際公開第２０１３／１４３７００号（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）の、配列番号１〜１３６３、配列番号１３９５、配列番号１４２１、および配列番号１４２２からなる群から選択される核酸配列に由来する核酸配列；（ii）国際公開第２０１３／１４３７００号の、配列番号１〜１３６３、配列番号１３９５、配列番号１４２１、および配列番号１４２２からなる群から選択される核酸配列のホモログに由来する核酸配列；（iii）これらのバリアント；または、（iv）好ましくは、対応するＲＮＡ配列。用語「国際公開第２０１３／１４３７００号の、配列番号１〜１３６３、配列番号１３９５、配列番号１４２１、および配列番号１４２２のホモログ」は、Homo sapiens以外の種の配列であって、国際公開第２０１３／１４３７００号の配列番号１〜１３６３、配列番号１３９５、配列番号１４２１および配列番号１４２２に記載の配列と相同である配列を表す。
【０１６３】
好適な実施形態において、本発明に係るＲＮＡの５’−ＵＴＲエレメントは、以下に挙げる核酸配列の、位置５のヌクレオチド（すなわち、配列中の位置５に位置しているヌクレオチド）から、開始コドンのすぐ５’側に位置しているヌクレオチド（配列の３’末端に位置しているヌクレオチド。例えば、ATG配列のすぐ５’側に位置しているヌクレオチド）までの核酸配列に由来する核酸配列を含んでいるか、または当該核酸配列からなる。上記核酸配列とは、（i）国際公開第２０１３／１４３７００号の、配列番号１〜１３６３、配列番号１３９５、配列番号１４２１、および配列番号１４２２；（ii）国際公開第２０１３／１４３７００号の、配列番号１〜１３６３、配列番号１３９５、配列番号１４２１、および配列番号１４２２のホモログ；（iii）それらのバリアント；（iv）対応するＲＮＡ配列；から選択される核酸配列である。特に好ましくは、５’−ＵＴＲエレメントは、以下の核酸配列の、５’ＴＯＰのすぐ３’側に位置しているヌクレオチドから、開始コドンのすぐ５’側に位置しているヌクレオチド（配列の３’末端に位置しているヌクレオチド。例えば、ATG配列のすぐ５’側に位置しているヌクレオチド）までの核酸配列に由来している。上記の核酸配列とは、（i）国際公開第２０１３／１４３７００号の、配列番号１〜１３６３、配列番号１３９５、配列番号１４２１、および配列番号１４２２；（ii）国際公開第２０１３／１４３７００号の、配列番号１〜１３６３、配列番号１３９５、配列番号１４２１、および配列番号１４２２のホモログ；（iii）それらのバリアント；（iv）対応するＲＮＡ配列；から選択される核酸配列である。
【０１６４】
特に好適な実施形態において、５’−ＵＴＲエレメントは、リボソームタンパク質をコードしているＴＯＰ遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する核酸配列を含んでいるか、または当該核酸配列からなる。あるいは、５’−ＵＴＲエレメントは、リボソームタンパク質をコードしているＴＯＰ遺伝子のバリアントの５’−ＵＴＲに由来する核酸配列を含んでいるか、または当該核酸配列からなる。例えば、５’−ＵＴＲエレメントは、国際公開第２０１３／１４３７００号の、配列番号６７、１７０、１９３、２４４、２５９、５５４、６５０、６７５、７００、７２１、９１３、１０１６、１０６３、１１２０、１１３８、および１２８４〜１３６０のいずれかに記載の核酸配列である５’−ＵＴＲ、対応するＲＮＡ配列、そのホモログ、またはそのバリアントに由来する、核酸配列を含んでいるか、または当該核酸配列からなる（本明細書に記載の通り）。好ましくは、５’−ＵＴＲエレメントは、５’ＴＯＰモチーフを欠いている。上述したように、位置５から、ＡＴＧのすぐ５’側のヌクレオチド（配列の３’末端に位置しているヌクレオチド）までの配列は、当該配列の５’−ＵＴＲに対応する。
【０１６５】
好ましくは、５’−ＵＴＲエレメントは、リボソームラージタンパク質（RPL）をコードしているＴＯＰ遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する核酸配列を含んでいるか、または当該核酸配列からなる。あるいは、５’−ＵＴＲエレメントは、リボソームラージタンパク質（RPL）をコードしているＴＯＰ遺伝子のホモログまたはバリアントの５’−ＵＴＲに由来する核酸配列を含んでいるか、または当該核酸配列からなる。例えば、５’−ＵＴＲエレメントは、国際公開第２０１３／１４３７００号の、配列番号６７、２５９、１２８４−１３１８、１３４４、１３４６、１３４８−１３５４、１３５７、１３５８、１４２１および１４２２のいずれかに記載の核酸配列である５’−ＵＴＲ、対応するＲＮＡ配列、そのホモログ、またはそのバリアントに由来する、核酸配列を含んでいるか、または当該核酸配列からなる（本明細書に記載の通り）。好ましくは、５’−ＵＴＲエレメントは、５’ＴＯＰモチーフを欠いている。
【０１６６】
特に好適な実施形態において、５’−ＵＴＲエレメントは、リボソームタンパク質ラージ３２遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する核酸配列を含んでいるか、または当該核酸配列からなる。好ましくは、上記のリボソームタンパク質ラージ３２遺伝子（Ｌ３２遺伝子）は、脊椎動物のものであり、より好ましくは哺乳類のものであり、最も好ましくはヒトのものである。あるいは、５’−ＵＴＲエレメントは、リボソームタンパク質ラージ３２遺伝子の５’−ＵＴＲのバリアントに由来する核酸配列を含んでいるか、または当該核酸配列からなる。好ましくは、上記のリボソームタンパク質ラージ３２遺伝子（Ｌ３２遺伝子）は、脊椎動物のものであり、より好ましくは哺乳類のものであり、最も好ましくはヒトのものである。好ましくは、５’−ＵＴＲエレメントは、上記遺伝子の５’ＴＯＰを含んでいない。
【０１６７】
したがって、特に好適な実施形態において、５’−ＵＴＲエレメントは、配列番号１４３１に記載の核酸配列（５’末端のオリゴピリミジン領域を欠失させたヒトリボソームタンパク質ラージ３２の５’−ＵＴＲ（GGCGCTGCCTACGGAGGTGGCAGCCATCTCCTTCTCGGCATC）。国際公開第２０１３／１４３７００号の配列番号１３６８に対応）または好ましくは対応するＲＮＡ配列（配列番号１４３２）に対して、少なくとも約４０％の同一性を有している核酸配列を含んでいるか、または当該核酸配列からなる。この同一性は、好ましくは少なくとも約５０％であり、好ましくは少なくとも約６０％であり、好ましくは少なくとも約７０％であり、より好ましくは少なくとも約８０％であり、より好ましくは少なくとも約９０％であり、より一層好ましくは少なくとも約９５％であり、より一層好ましくは少なくとも約９９％である。あるいは、少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメントは、配列番号１４３１に記載の核酸配列または好ましくは対応するＲＮＡ配列（配列番号１４３２）に対して、少なくとも約４０％の同一性を有している核酸配列の断片を含んでいるか、または当該断片からなる。この同一性は、好ましくは少なくとも約５０％であり、好ましくは少なくとも約６０％であり、好ましくは少なくとも約７０％であり、より好ましくは少なくとも約８０％であり、より好ましくは少なくとも約９０％であり、より一層好ましくは少なくとも約９５％であり、より一層好ましくは少なくとも約９９％である。好ましくは、上記断片は、上述したものである。すなわち、５’−ＵＴＲの全長の、少なくとも２０％（など）のヌクレオチドの連続する並びである。好ましくは、上記断片の長さは、少なくとも約２０ヌクレオチド以上であり、好ましくは少なくとも約３０ヌクレオチド以上であり、より好ましくは少なくとも約４０ヌクレオチド以上である。好ましくは、上記断片は、本明細書に記載されているような機能的の断片である。
【０１６８】
いくつかの実施形態において本発明に係るＲＮＡは５’−ＵＴＲエレメントを含んでおり、当該５’−ＵＴＲエレメントは、脊椎動物（哺乳類など）のＴＯＰ遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する核酸配列を含んでいるか、または当該核酸配列からなる。哺乳類のＴＯＰ遺伝子の例としては、RPSA、RPS2、RPS3、RPS3A、RPS4、RPS5、RPS6、RPS7、RPS8、RPS9、RPS10、RPS11、RPS12、RPS13、RPS14、RPS15、RPS15A、RPS16、RPS17、RPS18、RPS19、RPS20、RPS21、RPS23、RPS24、RPS25、RPS26、RPS27、RPS27A、RPS28、RPS29、RPS30、RPL3、RPL4、RPL5、RPL6、RPL7、RPL7A、RPL8、RPL9、RPL10、RPL10A、RPL11、RPL12、RPL13、RPL13A、RPL14、RPL15、RPL17、RPL18、RPL18A、RPL19、RPL21、RPL22、RPL23、RPL23A、RPL24、RPL26、RPL27、RPL27A、RPL28、RPL29、RPL30、RPL31、RPL32、RPL34、RPL35、RPL35A、RPL36、RPL36A、RPL37、RPL37A、RPL38、RPL39、RPL40、RPL41、RPLP0、RPLP1、RPLP2、RPLP3、RPLP0、RPLP1、RPLP2、EEF1A1、EEF1B2、EEF1D、EEF1G、EEF2、EIF3E、EIF3F、EIF3H、EIF2S3、EIF3C、EIF3K、EIF3EIP、EIF4A2、PABPC1、HNRNPA1、TPT1、TUBB1、UBA52、NPM1、ATP5G2、GNB2L1、NME2、UQCRB、から選択されるヒトＴＯＰ遺伝子、またはこれらのホモログもしくはバリアントが挙げられる。好ましくは、５’−ＵＴＲエレメントは、上記遺伝子のＴＯＰモチーフまたは５’ＴＯＰを含んでいない。任意で、５’−ＵＴＲエレメントの５’末端は、５’末端オリゴピリミジン領域（ＴＯＰ）の下流の位置１、位置２、位置３、位置４、位置５、位置６、位置７、位置８、位置９または位置１０に位置しているヌクレオチドから始まっている。さらに任意で、ＴＯＰ遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する５’−ＵＴＲエレメントの３’末端は、当該エレメントが由来する遺伝子の開始コドン（A(U/T)G）の上流の位置１、位置２、位置３、位置４、位置５、位置６、位置７、位置８、位置９または位置１０に位置しているヌクレオチドで終わっている。
【０１６９】
さらに特に好適な実施形態において、５’−ＵＴＲエレメントは、下記の遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する核酸配列を含んでいるか、または当該核酸配列からなる：リボソームタンパク質ラージ３２遺伝子（RPL32）、リボソームタンパク質ラージ３５遺伝子（RPL35）、リボソームタンパク質ラージ２１遺伝子（RPL21）、ＡＴＰシンターゼ，Ｈ＋輸送，ミトコンドリアＦ１複合体，αサブユニット１，心筋遺伝子（ATP5A1）、ヒドロキシステロイド（１７−β）デヒドロゲナーゼ４遺伝子（HSD17B4）、アンドロゲン誘導１遺伝子（AIG1）、シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＶＩｃ遺伝子（COX6C）、もしくはＮ−アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ（酸性セラミダーゼ）１遺伝子（ASAH1）、それらのバリアント。好ましくは、５’−ＵＴＲエレメントは、下記の遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する核酸配列を含んでいるか、または当該核酸配列からなる：脊椎動物のリボソームタンパク質ラージ３２遺伝子（RPL32）、脊椎動物のリボソームタンパク質ラージ３５遺伝子（RPL35）、脊椎動物のリボソームタンパク質ラージ２１遺伝子（RPL21）、脊椎動物のＡＴＰシンターゼ，Ｈ＋輸送，ミトコンドリアＦ１複合体，αサブユニット１，心筋遺伝子（ATP5A1）、脊椎動物のヒドロキシステロイド（１７−β）デヒドロゲナーゼ４遺伝子（HSD17B4）、脊椎動物のアンドロゲン誘導１遺伝子（AIG1）、脊椎動物のシトクロムｃオキシダーゼサブユニットＶＩｃ遺伝子（COX6C）、脊椎動物のもしくはＮ−アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ（酸性セラミダーゼ）１遺伝子（ASAH1）、それらのバリアント。より好ましくは、５’−ＵＴＲエレメントは、下記の遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する核酸配列を含んでいるか、または当該核酸配列からなる：哺乳類のリボソームタンパク質ラージ３２遺伝子（RPL32）、哺乳類のリボソームタンパク質ラージ３５遺伝子（RPL35）、哺乳類のリボソームタンパク質ラージ２１遺伝子（RPL21）、哺乳類のＡＴＰシンターゼ，Ｈ＋輸送，ミトコンドリアＦ１複合体，αサブユニット１，心筋遺伝子（ATP5A1）、哺乳類のヒドロキシステロイド（１７−β）デヒドロゲナーゼ４遺伝子（HSD17B4）、哺乳類のアンドロゲン誘導１遺伝子（AIG1）、哺乳類のシトクロムｃオキシダーゼサブユニットＶＩｃ遺伝子（COX6C）、哺乳類のもしくはＮ−アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ（酸性セラミダーゼ）１遺伝子（ASAH1）、それらのバリアント。最も好ましくは、５’−ＵＴＲエレメントは、下記の遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する核酸配列を含んでいるか、または当該核酸配列からなる：ヒトのリボソームタンパク質ラージ３２遺伝子（RPL32）、ヒトのリボソームタンパク質ラージ３５遺伝子（RPL35）、ヒトのリボソームタンパク質ラージ２１遺伝子（RPL21）、ヒトのＡＴＰシンターゼ，Ｈ＋輸送，ミトコンドリアＦ１複合体，αサブユニット１，心筋遺伝子（ATP5A1）、ヒトのヒドロキシステロイド（１７−β）デヒドロゲナーゼ４遺伝子（HSD17B4）、ヒトのアンドロゲン誘導１遺伝子（AIG1）、ヒトのシトクロムｃオキシダーゼサブユニットＶＩｃ遺伝子（COX6C）、ヒトのもしくはＮ−アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ（酸性セラミダーゼ）１遺伝子（ASAH1）、それらのバリアント。好ましくは、５’−ＵＴＲエレメントは、上��遺伝子の５’ＴＯＰを含んでいない。
【０１７０】
さらに特に好適な実施形態において、５’−ＵＴＲエレメントは、脊椎動物のヒドロキシステロイド（１７−β）デヒドロゲナーゼ４遺伝子（HSD17B4）（好ましくは、哺乳類のヒドロキシステロイド（１７−β）デヒドロゲナーゼ４遺伝子（HSD17B4））に由来する核酸配列を含んでいるか、または当該核酸配列からなる。より好ましくは、５’−ＵＴＲエレメントは、配列番号１４３５に記載の核酸配列（または、好ましくは配列番号１４３６に記載の対応するＲＮＡ配列）に対して、少なくとも約４０％の同一性を有している。この同一性は、この同一性は、好ましくは少なくとも約５０％であり、好ましくは少なくとも約６０％であり、好ましくは少なくとも約７０％であり、より好ましくは少なくとも約８０％であり、より好ましくは少なくとも約９０％であり、より一層好ましくは少なくとも約９５％であり、より一層好ましくは少なくとも約９９％である。あるいは、少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメントは、配列番号１４３５に記載の核酸配列または好ましくは対応するＲＮＡ配列（配列番号１４３６）に対して、少なくとも約４０％の同一性を有している核酸配列の断片を含んでいるか、または当該断片からなる。この同一性は、好ましくは少なくとも約５０％であり、好ましくは少なくとも約６０％であり、好ましくは少なくとも約７０％であり、より好ましくは少なくとも約８０％であり、より好ましくは少なくとも約９０％であり、より一層好ましくは少なくとも約９５％であり、より一層好ましくは少なくとも約９９％である。好ましくは、上記断片は、上述したものである。すなわち、５’−ＵＴＲの全長の、少なくとも２０％（など）のヌクレオチドの連続する並びである。好ましくは、上記断片の長さは、少なくとも約２０ヌクレオチド以上であり、好ましくは少なくとも約３０ヌクレオチド以上であり、より好ましくは少なくとも約４０ヌクレオチド以上である。好ましくは、上記断片は、本明細書に記載されているような機能的の断片である。
【０１７１】
したがって、特に好適な実施形態において、５’−ＵＴＲエレメントは、国際公開第２０１３／１４３７００号の、配列番号１３６８もしくは配列番号１４１２〜１４２０に記載の核酸配列または対応するＲＮＡ配列に対して、少なくとも約４０％の同一性を有している核酸配列を含んでいるか、または当該核酸配列からなる。この同一性は、好ましくは少なくとも約５０％であり、好ましくは少なくとも約６０％であり、好ましくは少なくとも約７０％であり、より好ましくは少なくとも約８０％であり、より好ましくは少なくとも約９０％であり、より一層好ましくは少なくとも約９５％であり、より一層好ましくは少なくとも約９９％である。あるいは、少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメントは、国際公開第２０１３／１４３７００号の、配列番号１３６８もしくは配列番号１４１２〜１４２０に記載の核酸配列に対して、少なくとも約４０％の同一性を有している核酸配列の断片を含んでいるか、または当該断片からなる。この同一性は、好ましくは少なくとも約５０％であり、好ましくは少なくとも約６０％であり、好ましくは少なくとも約７０％であり、より好ましくは少なくとも約８０％であり、より好ましくは少なくとも約９０％であり、より一層好ましくは少なくとも約９５％であり、より一層好ましくは少なくとも約９９％である。好ましくは、上記断片は、上述したものである。すなわち、５’−ＵＴＲの全長の、少なくとも２０％（など）のヌクレオチドの連続する並びである。好ましくは、上記断片の長さは、少なくとも約２０ヌクレオチド以上であり、好ましくは少なくとも約３０ヌクレオチド以上であり、より好ましくは少なくとも約４０ヌクレオチド以上である。好ましくは、上記断片は、本明細書に記載されているような機能的の断片である。
【０１７２】
したがって、特に好適な実施形態において、５’−ＵＴＲエレメントは、配列番号１４３３（５’末端オリゴピリミジン領域を欠いているATP5A1の５’−ＵＴＲ（GCGGCTCGGCCATTTTGTCCCAGTCAGTCCGGAGGCTGCGGCTGCAGAAGTACCGCCTGCG-GAGTAACTGCAAAG）国際公開第２０１３／１４３７００号の配列番号１４１４に対応）に記載の核酸配列、または好ましくは対応するＲＮＡ配列（配列番号１４３４）に対して、少なくとも約４０％の同一性を有している核酸配列を含んでいるか、または当該核酸配列からなる。この同一性は、好ましくは少なくとも約５０％であり、好ましくは少なくとも約６０％であり、好ましくは少なくとも約７０％であり、より好ましくは少なくとも約８０％であり、より好ましくは少なくとも約９０％であり、より一層好ましくは少なくとも約９５％であり、より一層好ましくは少なくとも約９９％である。あるいは、少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメントは、配列番号１４３３に記載の核酸配列またはより好ましくは対応するＲＮＡ配列（配列番号１４３４）に対して、少なくとも約４０％の同一性を有している核酸配列の断片を含んでいるか、または当該断片からなる。この同一性は、好ましくは少なくとも約５０％であり、好ましくは少なくとも約６０％であり、好ましくは少なくとも約７０％であり、より好ましくは少なくとも約８０％であり、より好ましくは少なくとも約９０％であり、より一層好ましくは少なくとも約９５％であり、より一層好ましくは少なくとも約９９％である。好ましくは、上記断片は、上述したものである。すなわち、５’−ＵＴＲの全長の、少なくとも２０％（など）のヌクレオチドの連続する並びである。好ましくは、上記断片の長さは、少なくとも約２０ヌクレオチド以上であり、好ましくは少なくとも約３０ヌクレオチド以上であり、より好ましくは少なくとも約４０ヌクレオチド以上である。好ましくは、上記断片は、本明細書に記載されているような機能的の断片である。
【０１７３】
好ましくは、少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメントおよび少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメントが相乗的に作用して、上記のような本発明の組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡに由来するタンパク質の産生を増加させる。
【０１７４】
［ヒストンステムループ］
特に好適な実施形態において、本発明に係るＲＮＡは、ヒストンステムループ配列／構造を含んでいる。このようなヒストンステムループ配列は、好ましくは、国際公開第第２０１２／０１９７８０号に開示されているヒストンステムループ配列から選択される（その開示は、参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１７５】
本発明における使用に適したヒストンステムループ配列は、好ましくは以下の式（Ｉ）または（ＩＩ）の少なくとも１つから選択される。
【０１７６】
【化１】
2020501545.tif 000003
【０１７７】
ステム１またはステム２の境界エレメントＮ１−６は、１〜６、好ましくは２〜６、より好ましくは２〜５、より一層好ましくは３〜５、最も好ましくは４〜５または５のＮの連続する配列であり、Ｎのそれぞれは、他のＮから独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、ＧおよびＣから選択されるヌクレオチド、またはそのヌクレオチド類似物から選択され；
ステム１［Ｎ０−２ＧＮ３−５］は、ステム２のエレメントと逆相補的または部分的に逆相補的であり、かつ５〜７のヌクレオチドの間の連続する配列であり；
Ｎ０−２は、０〜２、好ましくは０〜１、より好ましくは１のＮの連続する配列であり、Ｎのそれぞれは、他のＮから独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、ＧおよびＣから選択されるヌクレオチド、またはそのヌクレオチド類似物から選択され；
Ｎ３−５は、３〜５、好ましくは４〜５、より好ましくは４のＮの連続する配列であり、Ｎのそれぞれは、他のＮから独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、ＧおよびＣから選択されるヌクレオチド、またはそのヌクレオチド類似物から選択され、
Ｇは、グアノシンまたはその類似物であり、ステム２におけるその相補的なシチジンヌクレオチドがグアノシンによって置き換えられている条件のもとに、シチジンまたはその類似物に任意に置き換えられ得；
ループ配列［Ｎ０−４（Ｕ／Ｔ）Ｎ０−４）］は、ステム１およびステム２のエレメントの間に配置されており、３〜５のヌクレオチド、より好ましくは４のヌクレオチドの連続する配列であり；
Ｎ０−４のそれぞれは、他のＮから独立して、０〜４、好ましくは１〜３、より好ましくは１〜２のＮの連続する配列であり、Ｎのそれぞれは、他のＮから独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、ＧおよびＣから選択されるヌクレオチド、またはそのヌクレオチド類似物から選択され；
Ｕ／Ｔは、ウリジン、または任意にチミジンを表しており；
ステム２［Ｎ３−５ＣＮ０−２］は、ステム１のエレメントと逆相補的または部分的に逆相補的であり、５〜７のヌクレオチドの間の連続する配列であり；
Ｎ３−５は、３〜５、好ましくは４〜５、より好ましくは４のＮの連続する配列であり、Ｎのそれぞれは、他のＮから独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、ＧおよびＣから選択されるヌクレオチド、またはそのヌクレオチド類似物から選択され；
Ｎ０−２は、０〜２、好ましくは０〜１、より好ましくは１のＮの連続する配列であり、Ｎのそれぞれは、他のＮから独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、ＧもしくはＣから選択されるヌクレオチド、またはそのヌクレオチド類似物から選択され；
Ｃは、シチジンまたはその類似物であり、ステム１におけるその相補的なグアノシンヌクレオシドがシチジンに置き換えられている条件のもとに、グアノシンまたはその類似物に任意に置き換えられ得；
ステム１およびステム２は、互いに塩基対形成可能であり、塩基対形成がステム１およびステム２の間に生じ得る逆相補性配列を形成している。この塩基対形成は、例えば、ヌクレオチドＡとＵ／Ｔとの、またはヌクレオチドＧとＣとのWatson-Crick塩基対形成による。あるいは、この塩基対形成は、非Watson-Crick塩基対形成による。非Watson-Crick塩基対形成の例としては、wobble塩基対形成、逆Watson-Crick塩基対形成、Hoogsteen塩基対形成、逆Hoogsteen塩基対形成が挙げられる。このとき、不完全な塩基対形成がステム１およびステム２の間に生じ得る部分的な逆相補性配列を形成している。
【０１７８】
さらに好適な実施形態によれば、本発明に係るＲＮＡは、以下の特定の式（Ｉａ）または（ＩＩａ）の少なくとも１つにしたがう、少なくとも１つのヒストンステムループ配列を含み得る。
【０１７９】
【化２】
2020501545.tif 000004
【０１８０】
Ｎ、Ｃ、Ｇ、ＴおよびＵは、上記で定義したとおりである。
【０１８１】
より一層好適な実施形態によれば、本発明に係るＲＮＡは、以下の特定の式（Ｉｂ）または（ＩＩｂ）の少なくとも１つにしたがう、少なくとも１つのヒストンステムループ配列を含み得る。
【０１８２】
【化３】
2020501545.tif 000005
【０１８３】
Ｎ、Ｃ、Ｇ、ＴおよびＵは、上記で定義したとおりである。
【０１８４】
特に好ましいヒストンステムループ配列は、配列CAAAGGCTCTTTTCAGAGCCACCA（配列番号１４５１に記載）、または、より好ましくは対応するＲＮＡ配列CAAAGGCUCUUUUCAGAGCCACCA（配列番号１４５２に記載）である。
【０１８５】
［シグナルペプチド］
他の特に好適な実施形態によれば、本発明に係るＲＮＡは、付加的または代替的に、分泌性のシグナルペプチドをコードし得る。このようなシグナルペプチドは、通常は長さが約１５〜３０アミノ酸であり、好ましくはコードされているペプチドのＮ末端に位置する配列であるが、これに限定されるものではない。本明細書に定義されているシグナルペプチドは、好ましくは、組成物の少なくとも１つのｍＲＮＡによってコードされているペプチドまたはタンパク質を、規定の細胞区画へと輸送することを可能にするものである。この細胞区画は、好ましくは、細胞表面、小胞体（ＥＲ）またはエンドソーム−リソソーム区画である。本明細書に定義されている分泌性シグナルペプチド配列の例としては、古典的ＭＨＣ分子または非古典的ＭＨＣ分子のシグナル配列（例えば、ＭＨＣクラスＩ分子ＨＬＡ−Ａ＊０２０１などの、ＭＨＣ  Ｉ分子およびＭＨＣ  ＩＩ分子のシグナル配列）、本明細書に定義されているサイトカインまたは免疫グロブリンのシグナル配列、本明細書に定義されている免疫グロブリンまたは抗体のインバリアント鎖のシグナル配列、Ｌａｍｐ１、タパシン、Ｅｒｐ５７、カルレチクリン、カルネキシン、およびさらなる膜関連タンパク質のシグナル配列、または、小胞体（ＥＲ）もしくはエンドソーム−リソソーム区画と関連するタンパク質のシグナル配列が挙げられるが、これに限定されるものではない。最も好ましくは、ＭＨＣクラスＩ分子ＨＬＡ−Ａ＊０２０１のシグナル配列が、本発明によって使用され得る。例えば、ＨＬＡ−Ａに由来するシグナルペプチドは、好ましくは、本明細書に定義されているように、コードされているペプチドもしくはタンパク質、またはその断片もしくはバリアントの分泌を、促進するために使用される。より好ましくは、ＨＬＡ−Ａシグナルペプチドは、本明細書に定義されているように、コードされているペプチドもしくはタンパク質、またはその断片もしくはバリアントに融合されている。
【０１８６】
上記の修飾はいずれも、本発明のＲＮＡに適用され得る。さらに、上記の修飾はいずれも、本発明の文脈で使用される任意のＲＮＡに適用され得る。また、適切または必要であれば、上記の修飾はいずれも、任意の組合せで互いに組合せることができる。ただし、これらの修飾の組合せは、少なくとも１つのｍＲＮＡにおいて、互いに干渉し合うことがない。当業者は、適宜、選択し得る。
【０１８７】
〔ＲＮＡコンストラクト〕
本明細書に定義されている少なくとも１つのコード配列を含んでいる、本発明に係るＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）は、好ましくは、５’−ＵＴＲおよび／または３’−ＵＴＲを含み得る。この５’−ＵＴＲおよび／または３’−ＵＴＲは、好ましくは、少なくとも１つのヒストンステムループを含んでいる。本明細書に定義されているペプチドもしくはタンパク質、またはその断片もしくはバリアントに加えて、さらなるペプチドまたはタンパク質が、本発明に係るＲＮＡの少なくとも１つのコード配列によってコードされている場合に、当該コードされているペプチドまたはタンパク質は、好ましくは、ヒストンタンパク質、レポータータンパク質、および／またはマーカーもしくは選択タンパク質を含んでいない（本明細書に定義されている通り）。本発明に係るＲＮＡの３’−ＵＴＲは、好ましくは、本明細書に定義されているポリ（Ａ）および／またはポリ（Ｃ）配列をさらに含んでいる。単一の３’−ＵＴＲエレメントは、本発明のＲＮＡの配列中において、任意の順序で５’から３’の方向に存在し得る。さらに、本明細書に記載のさらなるエレメントもまた、含まれ得る。さらなるエレメントの例としては、本明細書に定義されている安定化配列（例えば、グロビン遺伝子のＵＴＲに由来するもの）、ＩＲＥＳ配列などが挙げられる。また、本発明に係るＲＮＡにおいて、各エレメントは、少なくとも１回繰り返され得（特に、ジシストロン性コンストラクトまたはマルチシストロン性コンストラクトにおいて）、好ましくは２回以上繰り返され得る。例えば、本発明に係るＲＮＡにおいて、単一のエレメントは、以下の順序にて存在し得る。このとき、ＲＮＡは、コード領域の５’において、本明細書に記載の５’−ＵＴＲエレメントを任意に含み得る。
５’−コード領域−ヒストンステムループ−ポリ（Ａ）／（Ｃ）配列−３’；または、
５’−コード領域−ポリ（Ａ）／（Ｃ）配列−ヒストンステムループ−３’；または、
５’−コード領域−ヒストンステムループ−ポリアデニル化シグナル−３’；または、
５’−コード領域−ポリアデニル化シグナル−ヒストンステムループ−３’；または、
５’−コード領域−ヒストンステムループ−ヒストンステムループ−ポリ（Ａ）／（Ｃ）配列−３’；または、
５’−コード領域−ヒストンステムループ−ヒストンステムループ−ポリアデニル化シグナル−３’；または、
５’−コード領域−安定化配列−ポリ（Ａ）／（Ｃ）配列−ヒストンステムループ−３’；または、
５’−コード領域−安定化配列−ポリ（Ａ）／（Ｃ）配列−ポリ（Ａ）／（Ｃ）配列−ヒストンステムループ−３’；または、
５’−コード領域−安定化配列−ポリ（Ａ）／（Ｃ）配列−ヒストンステムループ−３’
など。
【０１８８】
さらなる実施形態によれば、本発明のＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）は、好ましくは、以下の構造エレメントの少なくとも１つを含んでいる。（i）５’−非翻訳領域および／または３’非翻訳領域エレメント（ＵＴＲエレメント）、特に、５’−ＵＴＲエレメント（好ましくは、ＴＯＰ遺伝子の５’−ＵＴＲまたはその断片、ホモログもしくはバリアントに由来する核酸配列を含んでいるか、または当該核酸配列からなる）、あるいは、（ii）５’−ＵＴＲエレメントおよび／または３’−ＵＴＲエレメント（好ましくは、ｍＲＮＡを安定化させる遺伝子、またはそのホモログ、断片もしくはバリアントに由来し得る）、（iii）ヒストンステムループ構造（好ましくは、３’非翻訳領域中のヒストンステムループ）、（iv）５’−キャップ構造、（v）ポリＡテール、あるいは、（vi）ポリ（Ｃ）配列。
【０１８９】
いくつかの実施形態によれば、特に好ましくは、本明細書に定義されているペプチドもしくはタンパク質またはその断片もしくはバリアントに加えて、本明細書に定義されている少なくとも１つのコード配列によってさらなるペプチドまたはタンパク質がコードされているならば、当該コードされているペプチドまたはタンパク質は、好ましくは、ヒストンタンパク質を含んでおらず、レポータータンパク質を含んでおらず（例えば、ルシフェラーゼ、GFP、EGFP、β−ガラクトシダーゼ、特にEGFP）、および／または、マーカーもしくは選択タンパク質を含んでいない（例えば、α−グロビン、ガラクトキナーゼ、およびキサンチン：グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（GPT）。好適な実施形態において、本発明に係るＲＮＡは、レポーター遺伝子またはマーカー遺伝子を含んでいない。好ましくは、本発明に係るＲＮＡは、例えば、以下のものをコードしていない：ルシフェラーゼ；緑色蛍光タンパク質（GFP）およびそのバリアント（例えば、eGFP、RFPまたはBFP）；α−グロビン；ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HGPRT）；β−ガラクトシダーゼ；ガラクトキナーゼ；アルカリ性ホスファターゼ；分泌型胎盤アルカリ性ホスファターゼ（SEAP）；または、耐性遺伝子（ネオマイシン、プロマイシン、ハイグロマイシンおよびゼオシンなどに対する抵抗性遺伝子）。好適な実施形態において、本発明に係るＲＮＡは、ルシフェラーゼをコードしていない。他の実施形態において、本発明に係るＲＮＡは、GFPまたはそのバリアントをコードしていない。
【０１９０】
好適な実施形態によれば、本発明に係るＲＮＡは、好ましくは、５’から３’方向に以下のエレメントを含んでいる：
ａ）５’−キャップ構造（好ましくは、ｍ７ＧｐｐｐＮ）
ｂ）本明細書に定義されている少なくとも１つのコード配列
ｃ）α−グロビン遺伝子に由来する核酸配列（好ましくは、配列番号１４４４に記載の核酸配列）、またはそのホモログ、断片もしくはバリアントを含んでいる３’−ＵＴＲエレメント
ｄ）ポリ（Ａ）テール（好ましくは、１０〜２００個、１０〜１００個、４０〜８０個または５０〜７０個のアデノシンヌクレオチドからなる）
ｅ）ポリ（Ｃ）テール（好ましくは、１０〜２００個、１０〜１００個、２０〜７０個、２０〜６０個または１０〜４０個のシチジンヌクレオチドからなる）
ｆ）ヒストンステムループ（好ましくは、配列番号１４５２に記載の核酸配列を含んでいる）。
【０１９１】
好適な実施形態において、本発明は、配列番号４０８〜７５０からなる群から選択される核酸配列に対して、同一または少なくとも８０％同一である核酸配列、または当該核酸配列のいずれか１つの断片もしくはバリアントを含んでいるか、またはそれからなるＲＮＡを提供する。
【０１９２】
さらなる態様によれば、本発明に係るＲＮＡは、配列番号４０８〜７５０からなる群から選択される核酸配列に対して、少なくとも５％の配列同一性を有している核酸配列、または当該核酸配列のいずれかの１つの断片もしくはバリアントを含んでいるか、またはそれからなる。上記配列同一性は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％；好ましくは、少なくとも７０％；より好ましくは、少なくとも８０％；より一層好ましくは、少なくとも８５％；より一層好ましくは、少なくとも９０％；最も好ましくは、少なくとも９５％；最も好ましくは、少なくとも９７％であり得る。
【０１９３】
他の実施形態において、本発明に係るＲＮＡは、好ましくは、５’から３’方向に以下のエレメントを含んでいる：
ａ）５’−キャップ構造（好ましくは、ｍ７ＧｐｐｐＮ）
ｂ）ＴＯＰ遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する核酸配列、またはそのホモログ、断片もしくはバリアントを含んでいるか、またはそれらからなる５’−ＵＴＲエレメント（好ましくは、配列番号１４３２に記載の核酸配列を含んでいる）
ｃ）本明細書に定義されている少なくとも１つのコード配列
ｄ）α−グロビン遺伝子に由来する核酸配列、またはそのホモログ、断片もしくはバリアントを含んでいる３’−ＵＴＲエレメント（好ましくは、配列番号１４４４に記載の核酸配列を含んでいる）；および／または、
アルブミン遺伝子に由来する核酸配列、またはそのホモログ、断片もしくはバリアントを含んでいる３’−ＵＴＲエレメント（好ましくは、配列番号１４４８または１４５０に記載の核酸配列を含んでいる）
ｅ）ポリ（Ａ）テール（好ましくは、１０〜２００個、１０〜１００個、４０〜８０個または５０〜７０個のアデノシンヌクレオチドからなる）
ｆ）ポリ（Ｃ）テール（好ましくは、１０〜２００個、１０〜１００個、２０〜７０個、２０〜６０個または１０〜４０個のシチジンヌクレオチドからなる）
ｇ）ヒストンステムループ（好ましくは、配列番号１４５２に記載の核酸配列を含んでいる）。
【０１９４】
好ましくは、本発明は、配列番号７５１〜１０９０からなる群から選択される核酸配列に対して、同一または少なくとも８０％同一である核酸配列、または当該核酸配列のいずれか１つの断片もしくはバリアントを含んでいるか、またはそれからなるＲＮＡを提供する。
【０１９５】
さらなる実施形態において、本発明に係るＲＮＡは、配列番号７５１〜１０９０からなる群から選択される核酸配列に対して、少なくとも５％の配列同一性を有している核酸配列、または当該核酸配列のいずれかの１つの断片もしくはバリアントを含んでいるか、またはそれからなる。上記配列同一性は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％；好ましくは、少なくとも７０％；より好ましくは、少なくとも８０％；より一層好ましくは、少なくとも８５％；より一層好ましくは、少なくとも９０％；最も好ましくは、少なくとも９５％；最も好ましくは、少なくとも９７％であり得る。
【０１９６】
さらなる実施形態において、本発明に係るＲＮＡは、好ましくは、５’から３’方向に以下のエレメントを含んでいる：
ａ）５’−キャップ構造（好ましくは、ｍ７ＧｐｐｐＮ）
ｂ）HSD17B4遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する核酸配列、またはそのホモログ、断片もしくはバリアントを含んでいるか、またはそれらからなる５’−ＵＴＲエレメント（好ましくは、配列番号１４３６に記載の核酸配列を含んでいる）
ｃ）本明細書に定義されている少なくとも１つのコード配列
ｄ）α−グロビン遺伝子に由来する核酸配列、またはそのホモログ、断片もしくはバリアントを含んでいる３’−ＵＴＲエレメント（好ましくは、配列番号１４４４に記載の核酸配列を含んでいる）；および／または、
アルブミン遺伝子に由来する核酸配列、またはそのホモログ、断片もしくはバリアントを含んでいる３’−ＵＴＲエレメント（好ましくは、配列番号１４４８または１４５０に記載の核酸配列を含んでいる）
ｅ）ポリ（Ａ）テール（好ましくは、１０〜２００個、１０〜１００個、４０〜８０個または５０〜７０個のアデノシンヌクレオチドからなる）。
【０１９７】
好ましくは、本発明は、配列番号１０９１〜１４３０からなる群から選択される核酸配列に対して、同一または少なくとも８０％同一である核酸配列、または当該核酸配列のいずれか１つの断片もしくはバリアントを含んでいるか、またはそれからなるＲＮＡを提供する。
【０１９８】
さらなる実施形態において、本発明に係るＲＮＡは、配列番号１０９１〜１４３０からなる群から選択される核酸配列に対して、少なくとも５％の配列同一性を有している核酸配列、または当該核酸配列のいずれかの１つの断片もしくはバリアントを含んでいるか、またはそれからなる。上記配列同一性は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％；好ましくは、少なくとも７０％；より好ましくは、少なくとも８０％；より一層好ましくは、少なくとも８５％；より一層好ましくは、少なくとも９０％；最も好ましくは、少なくとも９５％；最も好ましくは、少なくとも９７％であり得る。
【０１９９】
他の実施形態において、本発明は、配列番号４０８〜１４３０からなる群から選択される核酸配列に対して、同一または少なくとも８０％同一である核酸配列、または当該核酸配列のいずれか１つの断片もしくはバリアントを含んでいるか、またはそれからなるＲＮＡを提供する。
【０２００】
好適な実施形態において、本発明に係るＲＮＡは、配列番号４０８〜１４３０からなる群から選択される核酸配列に対して、少なくとも５％の配列同一性を有している核酸配列、または当該核酸配列のいずれかの１つの断片もしくはバリアントを含んでいるか、またはそれからなる。上記配列同一性は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％；好ましくは、少なくとも７０％；より好ましくは、少なくとも８０％；より一層好ましくは、少なくとも８５％；より一層好ましくは、少なくとも９０％；最も好ましくは、少なくとも９５％；最も好ましくは、少なくとも９７％であり得る。
【０２０１】
特に好適な実施形態によれば、本発明は、配列番号３６、３７、７５、７７、７８、９１、９２、９３、９４、９５、９７、９８、９９、８０７、８０８、８０９、８１０、８１１、８１３、８１４、８１５、１０９５、１０９６、１１３１、１１３３、１１３４、１１８７および１１８８からなる群から選択される核酸配列に対して、同一または少なくとも８０％同一である核酸配列、または当該核酸配列のいずれか１つの断片もしくはバリアントを含んでいるか、またはそれからなるＲＮＡを提供する。
【０２０２】
好ましくは、本発明に係るＲＮＡは、配列番号３６、３７、７５、７７、７８、９１、９２、９３、９４、９５、９７、９８、９９、８０７、８０８、８０９、８１０、８１１、８１３、８１４、８１５、１０９５、１０９６、１１３１、１１３３、１１３４、１１８７および１１８８からなる群から選択される核酸配列に対して、少なくとも５％の配列同一性を有している核酸配列、または当該核酸配列のいずれかの１つの断片もしくはバリアントを含んでいるか、またはそれからなる。上記配列同一性は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％；好ましくは、少なくとも７０％；より好ましくは、少なくとも８０％；より一層好ましくは、少なくとも８５％；より一層好ましくは、少なくとも９０％；最も好ましくは、少なくとも９５％；最も好ましくは、少なくとも９７％であり得る。
【０２０３】
他の実施形態において、本発明は、配列番号７５、７７、７８、９１、９２、９３、９４、９５、９７、９８、９９、８０７、８０８、８０９、８１０、８１１、８１３、８１４、８１５、１１３１、１１３３および１１３４からなる群から選択される核酸配列に対して、同一または少なくとも８０％同一である核酸配列、または当該核酸配列のいずれか１つの断片もしくはバリアントを含んでいるか、またはそれからなるＲＮＡを提供する。
【０２０４】
好ましくは、本発明に係るＲＮＡは、配列番号７５、７７、７８、９１、９２、９３、９４、９５、９７、９８、９９、８０７、８０８、８０９、８１０、８１１、８１３、８１４、８１５、１１３１、１１３３および１１３４からなる群から選択される核酸配列に対して、少なくとも５％の配列同一性を有している核酸配列、または当該核酸配列のいずれかの１つの断片もしくはバリアントを含んでいるか、またはそれからなる。上記配列同一性は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％；好ましくは、少なくとも７０％；より好ましくは、少なくとも８０％；より一層好ましくは、少なくとも８５％；より一層好ましくは、少なくとも９０％；最も好ましくは、少なくとも９５％；最も好ましくは、少なくとも９７％であり得る。
【０２０５】
本発明に係るＲＮＡは、例えば、当該分野で公知の任意の方法を用いて作製しうる。このような方法には、合成方法（固相合成などＲＮＡ）と、in vitroの方法（in vitroにおけるＲＮＡ転写反応など）とが含まれている。
【０２０６】
好ましいコンストラクトを、以下の表Ａに示す。
【０２０７】
【表２】
2020501545.tif 000006
【０２０８】
【表３】
2020501545.tif 000007
【０２０９】
配列表の数字見出し<223>から明らかなように、種々のコンストラクト設計を適用した。本明細書および配列表に示されている本発明のコンストラクトの設計を、表Ｂに記載する。配列表に示すコンストラクトのそれぞれは、本発明の好ましいコンストラクトに類似している。
【０２１０】
【表４】
2020501545.tif 000008
【０２１１】
好適な実施形態において、HsFGF21(L126R,P199G,A208E)、HsHGF、MmHGF、HsGFER、HsTNFSF10、HsTNFSF10(95-281)、HsALB(1-18)_HsTNFSF10(95-281)、HsALB(1-18)_ILZ_HsTNFSF10(95-281)、RnCebpa、RnCebpa(15-344)、MmCebpa、MmCebpa(15-359)、HsCEBPA、HsCEBPA(15-358)、HsHNF4A、HsFGF21、HsOGFRL1、HsRLN1、HsRLN2、HsRLN3、HsMMP1、HsMMP1(1-19,100-469)、ColG、HsALB(1-18),_ColG(111-1118)、HsALB(1-18),_ColG(1-110),_CS-F,_ColG(111-1118)、ColH、ColH、HsALB(1-18),_ColH(41-1021)、HsALB(1-18),_ColH(1-40),_およびCS-F_ColH(41-1021)には、Design1、Design2、Design3、Design4、Design5、Design6、Design7、Design8、Design9およびDesign10からなる群から選択されるコンストラクト設計が含まれている（表Ｂにて言及されており、また 配列表の数字見出し<223>から明らかであるように）。
【０２１２】
他の実施形態において、HsMMP1のための好ましいコンストラクトは、配列番号２０７３、２１００、２１０１、２１３３、２１５８、２１８３、２２０８、２２３３、２２５８、２２８３、２３０８、２３３３、２３５８、２３８３および２４０８に示されている（数字見出し<223>から明らかなように）。
【０２１３】
他の実施形態において、HsMMP1(1-19,100-469)のための好ましいコンストラクトは、配列番号２１０２、２１３４、２１５９、２１８４、２２０９、２２３４、２２５９、２２８４、２３０９、２３３４、２３５９、２３８４および２４０９に示されている（数字見出し<223>から明らかなように）。
【０２１４】
他の実施形態において、HsHGFのための好ましいコンストラクトは、配列番号１９４７、１９４８、１９５４、１９５８、１９６２、１９６６、１９７０、１９７４、１９７８、１９８２、１９８６、１９９０、１９９４、１９９８および２０７５に示されている（数字見出し<223>から明らかなように）。
【０２１５】
他の実施形態において、HsCEBPA、HsCEBPA(15-358)、RnCebpa、RnCebpa(15-344)、MmCebpa、またはMmCebpa(15-359)のための好ましいコンストラクトは、配列番号２０６５、２０６６、２０８１、２０８２、２０８３、２０８４、２０８５、２０８６、２０８７、２０８８、２１２１、２１２２、２１２３、２１２４、２１２５、２１２６、２１４６、２１４７、２１４８、２１４９、２１５０、２１５１、２１７１、２１７２、２１７５、２１７６、２１９６、２１９７、２１９８、２１９９、２２００、２２０１、２２２１、２２２２、２２２３、２２２４、２２２５、２２２６、２２４６、２２４７、２２４８、２２４９、２２５０、２２５１、２２７１、２２７２、２２７３、２２７４、２２７５、２２７６、２２９６、２２９７、２２９８、２２９９、２３００、２３０１、２３２１、２３２２、２３２３、２３２４、２３２５、２３２６、２３４６、２３４７、２３４８、２３４９、２３５０、２３５１、２３７１、２３７２、２３７３、２３７４、２３７５、２３７６、２３９６、２３９７、２３９８、２３９９、２４００および２４０１に示されている（数字見出し<223>から明らかなように）。
【０２１６】
他の実施形態において、HsTNFSF10、HsTNFSF10(95-281)、HsALB(1-18)_HsTNFSF10(95-281)、またはHsALB(1-18)_ILZ_HsTNFSF10(95-281)のための好ましいコンストラクトは、配列番号２０６３、２０６４、２０７７、２０７８、２０７９、２０８０、２１１７、２１１８、２１１９、２１２０、２１４２、２１４３、２１４４、２１４５、２１６７、２１６８、２１６９、２１７０、２１９２、２１９３、２１９４、２１９５、２２１７、２２１８、２２１９、２２２０、２２４２、２２４３、２２４４、２２４５、２２６７、２２６８、２２６９、２２７０、２２９２、２２９３、２２９４、２２９５、２３１７、２３１８、２３１９、２３２０、２３４２、２３４３、２３４４、２３４５、２３６７、２３６８、２３６９、２３７０、２３９２、２３９３、２３９４および２３９５に示されている（数字見出し<223>から明らかなように）。
【０２１７】
他の実施形態において、ColG、ColH、HsALB(1-18)_ColG(111-1118)、HsALB(1-18)_ColG(1-110)_CS-F_ColG(111-1118)、HsALB(1-18)_ColH(41-1021)、HsALB(1-18)_ColH(1-40)_CS-F_ColH(41-1021)のための好ましいコンストラクトは、配列番号２０７４、２１０３、２１０４、２１０５、２１０６、２１０７、２１０８、２１０９、２１１０、２１１１、２１１２、２１１３、２１１４、２１１５、２１１６、２１３５、２１３６、２１３７、２１３８、２１３９、２１４０、２１４１、２１６０、２１６１、２１６２、２１６３、２１６４、２１６５、２１６６、２１８５、２１８６、２１８７、２１８８、２１８９、２１９０、２１９１、２２１０、２２１１、２２１２、２２１３、２２１４、２２１５、２２１６、２２３５、２２３６、２２３７、２２３８、２２３９、２２４０、２２４１、２２６０、２２６１、２２６２、２２６３、２２６４、２２６５、２２６６、２２８５、２２８６、２２８７、２２８８、２２８９、２２９０、２２９１、２３１０、２３１１、２３１２、２３１３、２３１４、２３１５、２３１６、２３３５、２３３６、２３３７、２３３８、２３３９、２３４０、２３４１、２３６０、２３６１、２３６２、２３６３、２３６４、２３６５、２３６６、２３８５、２３８６、２３８７、２３８８、２３８９、２３９０、２３９１、２４１０、２４１１、２４１２、２４１３、２４１４、２４１５および２４１６に示されている（数字見出し<223>から明らかなように）。
【０２１８】
他の実施形態において、HsFGF21(L126R,P199G,A208E)のための好ましいコンストラクトは、配列番号１９４５、１９４６、１９５３、１９５７、１９６１、１９６５、１９６９、１９７３、１９７７、１９８１、１９８５、１９８９、１９９３および１９９７に示されている（数字見出し<223>から明らかなように）。
【０２１９】
他の実施形態において、HsFGF21のための好ましいコンストラクトは、配列番号２０６８、２０９１、２０９２、２１２８、２１５３、２１７８、２２０３、２２２８、２２５３、２２７８、２３０３、２３２８、２３５３、２３７８および２４０３に示されている（数字見出し<223>から明らかなように）。
【０２２０】
〔医薬組成物〕
さらなる態様において、本発明は、本発明に係るＲＮＡを含んでいる（医薬）組成物に関する（本明細書に記載のように）。したがって、本発明に係る（医薬）組成物は、少なくとも１つのコード配列を含んでいるＲＮＡと、薬学的に許容可能な担体と、を含んでいる。ここで、上記コード配列は、本明細書に記載の少なくとも１つのペプチドもしくはタンパク質、または当該ペプチドもしくはタンパク質の断片もしくはバリアントをコードしている（本明細書に記載のように）。好ましくは、上記ペプチドもしくはタンパク質は、細胞外マトリクスプロテアーゼ、ＣＣＡＡＴ／エンハンサ−結合タンパク質α（CEBPA）、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（TRAIL）、肝細胞核因子４α（HNF4A）、線維芽細胞増殖因子２１（FGF21）、オピオイド増殖因子受容体様１（OGFRL1）、肝細胞増殖因子（HGF）、リラキシン１（RLN1）、リラキシン２（RLN2）およびリラキシン３（RLN3）からなる群から選択される。本発明に係る組成物は、好ましくは、医薬組成物として提供される。
【０２２１】
（医薬）組成物に含まれているＲＮＡに関しては、本発明に係るＲＮＡの説明を参照されたい。この説明が、（医薬）組成物にも適用される。
【０２２２】
本発明に係る（医薬）組成物は、好ましくは、本発明に係る少なくとも１つのＲＮＡを含んでいる（本明細書に記載のように）。他の実施形態において、（医薬）組成物は、本発明に係るＲＮＡ種の少なくとも２つを含んでいる。
【０２２３】
本発明の文脈において、（医薬）組成物は、本明細書に定義されているペプチドもしくはタンパク質の１つ以上、またはその断片もしくはバリアントをコードし得る。好適な実施形態によれば、（医薬）組成物は、本明細書に定義されているペプチドもしくはタンパク質、またはその断片もしくはバリアントの組合せをコードしている。好ましくは、（医薬）組成物は、本明細書に記載のペプチドもしくはタンパク質、またはその断片もしくはバリアントの、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、またはそれ以上をコードしている。このとき、コードされているものは、好ましくは、細胞外マトリクスプロテアーゼ（好ましくは、本明細書に記載のような）、ＣＣＡＡＴ／エンハンサ−結合タンパク質α（CEBPA）、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（TRAIL）、肝細胞核因子４α（HNF4A）、線維芽細胞増殖因子２１（FGF21）、オピオイド増殖因子受容体様１（OGFRL1）、肝細胞増殖因子（HGF）、リラキシン１（RLN1）、リラキシン２（RLN2）、およびリラキシン３（RLN3）からなる群、またはその断片もしくはバリアントから選択される。
【０２２４】
好適な実施形態において、本発明の（医薬）組成物は、本発明に係る少なくとも１つのＲＮＡを含み得る。このとき、上記少なくとも１つのＲＮＡは、本明細書に定義されているペプチドもしくはタンパク質、またはその断片もしくはバリアントの、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９またはそれ以上をコードしている。好ましくは、（医薬）組成物は、本発明に係るＲＮＡ種のいくつかを含んでいる（より好ましくは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、またはそれ以上）。このとき、各ＲＮＡ種は、本明細書に定義されているペプチドもしくはタンパク質の１種、またはその断片もしくはバリアントをコードしている。他の実施形態において、（医薬）組成物に含まれているＲＮＡは、本明細書に定義されているビシストロン性ＲＮＡまたはマルチシストロン性ＲＮＡである。このとき、上記ＲＮＡは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、またはそれ以上の異なるペプチドまたはタンパク質をコードしている。これらの実施形態の間の混合物もまた、想定される。このような混合物の例としては、２つ以上のＲＮＡ種（少なくとも１つのＲＮＡ種がモノシストロン性であり得、一方、少なくとも１つの他のＲＮＡ種がビシストロン性またはマルチシストロン性であり得る）を含んでいる組成物が挙げられる。
【０２２５】
したがって、本発明に係る（医薬）組成物（好ましくは、当該（医薬）組成物に含まれているＲＮＡの少なくとも１つのコード配列）は、本明細書に定義されている核酸配列の任意の組合せを含み得る。
【０２２６】
本発明に係る組成物の好適な実施形態において、本明細書に記載のＲＮＡは、１つ以上のカチオン性またはポリカチオン性化合物と複合体化されている。カチオン性またはポリカチオン性化合物は、好ましくは、カチオン性もしくはポリカチオン性ポリマー、カチオン性もしくはポリカチオン性ペプチドもしくはタンパク質（例えば、プロタミン）、カチオン性もしくはポリカチオン性多糖、および／または、カチオン性もしくはポリカチオン性脂質である。
【０２２７】
いくつかの実施形態において、ＲＮＡは、生理食塩水製剤または脂質製剤として製剤化され得る。好適な実施形態によれば、本発明に係るＲＮＡは、脂質と複合体化されて、リポソーム、リポプレックスまたは脂質ナノ粒子の、少なくとも１つを形成し得る。したがって、一実施形態において、本発明の組成物は、本発明に係るＲＮＡを含んでいるリポソーム、リポプレックス、および／または脂質ナノ粒子を含んでいる。一実施形態において、本発明に係るＲＮＡは、カチオン性脂質および／または中性脂質と複合体化されている。これによって、本発明に係るＲＮＡは、リポソーム、脂質ナノ粒子、リポプレックスまたは中性脂質系ナノリポソームを形成している。
【０２２８】
したがって、好適な実施形態において、脂質製剤は、リポソーム、リポプレックス、コポリマー（ＰＬＧＡなど）、および脂質ナノ粒子からなる群から選択される。
【０２２９】
好適な一実施形態において、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は以下を含んでいる:
ａ）本明細書に定義されている少なくとも１つのコード配列を含んでいるＲＮＡ
ｂ）カチオン性脂質
ｃ）凝集低減剤（ポリエチレングリコール脂質（ＰＥＧ脂質）またはＰＥＧ修飾脂質など）
ｄ）任意で、非カチオン性脂質（中性脂質など）
ｅ）任意で、ステロール。
【０２３０】
一実施形態において、脂質ナノ粒子製剤は、（i）少なくとも１つのカチオン性脂質；（ii）中性脂質；（iii）ステロール（例えば、コレステロール）；および、（iv）ＰＥＧ−脂質からなる。このとき、これらの成分のモル比は、およそ、カチオン性脂質（２０〜６０％）：中性脂質５〜２５％：ステロール（２５〜５５％）：ＰＥＧ脂質（０．５〜１５％）である。
【０２３１】
一実施形態において、核酸は、アミノアルコールリピドイド中にて製剤化され得る。本発明において使用され得るアミノアルコールリピドイドは、米国特許第８，４５０，２９８号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載の方法によって調製され得る。
【０２３２】
［カチオン性脂質］
脂質ナノ粒子は、脂質ナノ粒子の形成に適した、任意のカチオン性脂質を含み得る。好ましくは、カチオン性脂質は、およそ生理学的なｐＨにおいて、正味の正電荷を有している。
【０２３３】
カチオン性脂質は、好ましくはアミノ脂質である。本明細書において用いられるとき、用語「アミノ脂質」は、（i）１つまたは２つの脂肪酸または脂肪アルキル鎖と、（ii）先端のアミノ基（アルキルアミノ基またはジアルキルアミノ基を含む）と、を有している脂質を包含することを意味する。この先端のアミノ基は、生理学的ｐＨにおいて、プロトン化されてカチオン性脂質を形成し得る。
【０２３４】
カチオン性脂質は例えば、以下の物質であり得る。Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（DODAC）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（DDAB）、１，２−ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパンクロリド（DOTAP）（Ｎ−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド、および、１，２−ジオレイルオキシ−３−トリメチルアミノプロパンクロリドとしても知られる）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（DOTMA）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（DODMA）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（DLinDMA）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（DLenDMA）、１，２−ジ−γ−リノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（γ-DLenDMA）、１，２−ジリノレイルカルバモイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（DLin-C-DAP）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（DLin-DAC）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−モルホリノプロパン（DLin-MA）、１，２−ジリノレオイル−３−ジメチルアミノプロパン（DLinDAP）、１，２−ジリノレイルチオ−３−ジメチルアミノプロパン（DLin-S-DMA）、１−リノレオイル−２−リノレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（DLin-2-DMAP)、１，２−ジリノレイルオキシ−３−トリメチルアミノプロパンクロリド（DLin-TMA.Cl）、１，２−ジリノレオイル−３−トリメチルアミノプロパンクロリド（DLin-TAP.Cl）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−（Ｎ−メチルピペラジノ）プロパン（DLin-MPZ）、３−（Ｎ，Ｎ−ジリノレイルアミノ）−１，２−プロパンジオール（DLinAP）、３−（Ｎ，Ｎ−ジオレイルアミノ）−１，２−プロパンジオール（DOAP）、１，２−ジリノレイルオキソ−３−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エトキシプロパン（DLin-EG-DMA）、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（DLin-K-DMA）またはその類似体、（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニル）テトラヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−アミン、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）酪酸塩（ＭＣ３）、１，１’−（２−（４−（２−（（２−（ビス（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン−１−イル）エチルアザンジイル）−ジドデカン−２−オール（C12-200）、２，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（DLin-K-C2-DMA)、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（DLin-K-DMA）、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）酪酸塩（DLin-M-C3-DMA)、３−（（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−１−アミン（MC3エーテル）、４−（（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルブタン−１−アミン（MC4エーテル）、またはこれらの任意の組合せ。
【０２３５】
他のカチオン性脂質としては以下が挙げられるが、これらに限定されない。Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（DDAB）、３Ｐ−（Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル）コレステロール（DC-Choi）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ−２−（スペルミンカルボキサミド）エチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムトリフルオロアセタート（DOSPA）、ジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン（DOGS）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−３−ホスホエタノールアミン（DOPE）、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（DODAP）、Ｎ−（１，２−ジミリスチルオキシプロップ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（DMRIE）、および、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（XTC）。さらに、市販のカチオン性脂質の調製物を使用し得る。このような市販品の例としては、LIPOFECTIN（DOTMAおよびDOPEが含まれている。GIBCO/BRLより販売）、およびLIPOFECTAMINE（DOSPAおよびDOPEが含まれている。GIBCO/BRLより販売）が挙げられる。
【０２３６】
他の適切なカチオン性脂質は、以下の文献に開示されている：国際出願第０９／０８６５５８号、第０９／１２７０６０号、第１０／０４８５３６号、第１０／０５４４０６号、第１０／０８８５３７号、第１０／１２９７０９号および第２０１１／１５３４９３号；米国特許出願公開第２０１１／０２５６１７５号、第２０１２／０１２８７６０号および第２０１２／００２７８０３；米国特許第８，１５８，６０１号；Love et al, PNAS, 107(5), 1864-69, 2010。[51]他の適切なアミノ脂質としては、含まれているアルキル置換基が異なっている（例えば、Ｎ−エチル−Ｎ−メチルアミノ−およびＮ−プロピル−Ｎ−エチルアミノ−）、他の脂肪酸基および他のジアルキルアミノ基を有しているアミノ脂質が挙げられる。一般的に、飽和度の低いアシル鎖を有しているアミノ脂質は、大きさを揃えやすい。とりわけ、濾過滅菌のために複合体を約０．３ミクロン未満の大きさとしなければならない場合には、特に大きさを揃えやすい。炭素鎖長がＣ１４〜Ｃ２２である不飽和脂肪酸を含有しているアミノ脂質を使用し得る。他の足場を使用して、アミノ脂質のアミノ基と、脂肪酸または脂肪アルキルの部分とを分離し得る。
【０２３７】
特定の実施形態において、本発明のアミノ脂質またはカチオン性脂質は、プロトン化可能または脱プロトン化可能な基の少なくとも１つを有している。その結果、生理学的ｐＨ（例えば、ｐＨ７．４）以下のｐＨにおいて脂質は正の電荷を有しており、第２のｐＨ（好ましくは、生理学的ｐＨ以上）において中性である。もちろん、（i）ｐＨの機能としてのプロトンの添加または除去は、平衡プロセスであり、（ii）荷電脂質または中性脂質と言うときは、主要な種の性質を指しており、（iii）全ての脂質が、荷電形態または中性形態で存在することを必要としない、ことが理解される。プロトン化可能または脱プロトン化可能な基の２つ以上を有している脂質、または、両性イオンである脂質は、本発明における使用から除外されない。
【０２３８】
特定の実施形態において、プロトン化可能な脂質のプロトン化可能な基のｐＫａは、約４〜約１１である（例えば、約５〜約７）。
【０２３９】
脂質粒子は、好ましくは、２つ以上のカチオン性脂質を含んでいる。カチオン性脂質は、好ましくは、異なる有利な特性に寄与するように選択される。例えば、特性（アミンのｐＫａ、化学的安定性、循環系における半減期、組織における半減期、組織における正味の蓄積、または毒性など）が異なるカチオン性脂質を、脂質ナノ粒子に使用し得る。特に、カチオン性脂質を選択して、混合された脂質粒子の特性が、個々の脂質のみからなる脂質粒子の特性よりも望ましいようにすることができる。
【０２４０】
カチオン性脂質は、好ましくは、粒子中に存在する全脂質に対して、（i）約２０モル％〜約７０モル％もしくは約２０モル％〜７５モル％、または、（ii）約４５モル％〜約６５モル％、または、（iii）約２０モル％、約２５モル％、約３０モル％、約３５モル％、約４０モル％、約４５モル％、約５０モル％、約５５モル％、約６０モル％、約６５モル％もしくは約７０モル％含まれている。他の実施形態において、脂質ナノ粒子は、モル基準で約２５％〜約７５％のカチオン性脂質を含んでいる（脂質ナノ粒子中の脂質の全モルを１００％モルとする）。カチオン性脂質の含有量は、例えば、モル基準で約２０％〜約７０％、約３５％〜約６５％、約４５％〜約６５％、約６０％、約５７．５％、約５７．１％、約５０％、または約４０％である。一実施形態において、カチオン性脂質の核酸に対する比率は、約３〜約１５である（約５〜約１３または約７〜約１１など）。
【０２４１】
［非カチオン性脂質］
非カチオン性脂質は、好ましくは、中性脂質、アニオン性脂質、または両親媒性脂質である。中性脂質は（存在する場合）、生理学的ｐＨにおいて、電荷を帯びていない形態または中性の両性イオン形態のいずれかで存在する多数の脂質種の、いずれかであり得る。このような脂質としては、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、セファリンおよびセレブロシドが挙げられる。本明細書に記載の粒子に使用するための中性脂質の選択は、一般的に、血流中の脂質粒子の大きさおよび安定性などを考慮して方針を決める。好ましくは、中性脂質は、２つのアシル基を有している脂質である（例えば、ジアシルホスファチジルコリンおよびジアシルホスファチジルエタノールアミン）。一実施形態において、中性脂質は、炭素鎖長がＣ１０〜Ｃ２０である飽和脂肪酸を含有している。他の実施形態においては、炭素鎖長がＣ１０〜Ｃ２０であるモノ不飽和脂肪酸またはジ不飽和脂肪酸を有している中性脂質が使用される。さらに、飽和脂肪酸鎖および不飽和脂肪酸鎖の混合物を有している中性脂質を使用し得る。
【０２４２】
適切な中性脂質としては以下が挙げられるが、これらに限定されない。ジステアロイルホスファチジルコリン（DSPC）、ジオレオイルホスファチジルコリン（DOPC）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（DOPG）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（DPPG）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（DOPE）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（POPC）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（POPE）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシラート（DOPE-mal）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（DPPE）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（DMPE）、ジミリストイルホスファチジルコリン（DMPC）、ジステアロイル−ホスファチジル−エタノールアミン（DSPE）、ＳＭ、１６−０−モノメチルＰＥ、１６−Ｏ−ジメチルＰＥ、１８−１−ｔｒａｎｓＰＥ、１−ステアロイル−２−オレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（SOPE）、コレステロール、またはこれらの混合物本発明の脂質粒子における使用に適したアニオン性脂質としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない。ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ−ドデカノイルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−スクシニルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−グルタリルホスファチジルエタノールアミン、リソホスファチジルグリセロール、および中性脂質に結合している他のアニオン性修飾基。
【０２４３】
用語「両親媒性脂質」は、脂質物質の疎水性部分が疎水性相に配向しており、親水性部分が水性相に配向している、任意の適切な材料を表す。このような化合物としてはリン脂質、アミノ脂質およびスフィンゴ脂質が挙げられるが、これらに限定されない。代表的なリン脂質の例としては、スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、リソホスファチジルコリン、リソホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、またはジリノレオイルホスファチジルコリンが挙げられる。また、リンを含んでいない他の化合物も使用し得る（スフィンゴ脂質、スフィンゴ糖脂質ファミリー、ジアシルグリセロール、およびβ-アシルオキシ酸など）。
【０２４４】
非カチオン性脂質は、好ましくは、粒子中に存在する全脂質の、約５モル％〜約９０モル％、約５モル％〜約１０モル％、約５モル％、約１０モル％、約１５モル％、約２０モル％、約２５モル％、約３０モル％、約３５モル％、約４０モル％、約４５モル％、約５０モル％、約５５モル％、約６０モル％、約６５モル％、約７０モル％、約７５モル％、約８０モル％、約８５モル％、または約９０モル％である。一実施形態において、脂質ナノ粒子は、モル基準で、約０％〜約１５％または約０％〜４５％の中性脂質を含んでいる（例えば、約３％〜約１２％または約５％〜約１０％）。例えば、脂質ナノ粒子は、モル基準で約１５％、約１０％、約７．５％または約７．１％の中性脂質を含み得る（脂質ナノ粒子中の全脂質の総モル数を１００％とする）。
【０２４５】
［ステロール］
好ましいステロールは、コレステロールである。当該分野で公知のさらなるステロールは、本発明の文脈における使用のために、さらに想定される。
【０２４６】
ステロールは、好ましくは、脂質粒子の、約１０モル％〜約６０モル％または約２５モル％〜約４０モル％を構成している。一実施形態において、ステロールは、脂質粒子中に存在する全脂質の、約１０モル％、約１５モル％、約２０モル％、約２５モル％、約３０モル％、約３５モル％、約４０モル％、約４５モル％、約５０モル％、約５５モル％、または約６０モル％を占めている。他の実施形態において、脂質ナノ粒子は、モル基準で、約５％〜約５０％（例えば、約１５％〜約４５％、約２０％〜約４０％、約４８％、約４０％、約３８．５％、約３５％、約３４．４％、約３１．５％、または約３１％）のステロールを含んでいる（脂質ナノ粒子中の脂質の総モル数を１００％とする）。
【０２４７】
［凝集低減剤］
凝集低減剤は、好ましくは、凝集を低減し得る脂質である。このような脂質の例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾脂質、モノシアロガングリオシド（Ｇｍｌ）、およびポリアミドオリゴマー（ＰＡＯ；米国特許第６，３２０，０１７号に記載（参照によりその全体が組み込まれる））が挙げられるが、これらに限定されない。また、電荷を有さず親水性の立体障壁部分を有している他の化合物も、脂質とカップリングし得る（ＰＥＧ、ＧｍｌまたはＡＴＴＡなど）。これにより、製剤時の凝集が防止される。ＡＴＴＡ−脂質は、例えば、米国特許第６，３２０，０１７号に記載されている。ＰＥＧ−脂質複合体は、例えば、米国特許第５，８２０，８７３号、第５，５３４，４９９号、および第５，８８５，６１３号に記載されている（各文献は、その全体が参照により組み込まれる）。
【０２４８】
凝集低減剤は、例えば、ポリエチレングリコール脂質（ＰＥＧ脂質）であり得る。ＰＥＧ脂質の例としては、ＰＥＧ−ジアシルグリセロール（DAG）、ＰＥＧ−ジアルキルグリセロール、ＰＥＧ−ジアルキロキシプロピル（DAA）、ＰＥＧ−リン脂質、ＰＥＧ−セラミド（Cer）、またはこれらの混合物（PEG-Cerl4またはPEG-Cer20など）が挙げられるが、これらに限定されない。ＰＥＧ−ＤＡＡ複合体は、例えば、ＰＥＧ−ジラウリルオキシプロピル（C12）、ＰＥＧ−ジミリスチルオキシプロピル（C14）、ＰＥＧ−ジパルミチルキシプロピル（C16）、またはＰＥＧ−ジステアリルオキシプロピル（C18）であり得る。他のＰＥＧ化脂質の例としては、ポリエチレングリコール−ジミリストイルグリセロール（Ｃ１４−ＰＥＧまたはＰＥＧ−Ｃ１４、ＰＥＧの平均分子量は２０００Ｄａ）（PEG-DMG）；（Ｒ）−２，３−ビス（オクタデシルオキシ）プロピル−１−（メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）プロピルカルバマート）（PEG-DSG）；ＰＥＧ−カルバモイル−１，２−ジミリスチルオキシプロピルアミン（ＰＥＧの平均分子量は２０００Ｄａ）（PEG-cDMA）；Ｎ−アセチルガラクトサミン−（（Ｒ）−２，３−ビス（オクタデシルオキシ）プロピル−１−（メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）プロピルカルバマート））（GalNAc-PEG-DSG）；ｍＰＥＧ（分子量：２０００）−ジアステアロイルホスファチジル−エタノールアミン（PEG-DSPE）；および、ポリエチレングリコール−ジパルミトイルグリセロール（PEG-DPG）が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、凝集低減剤は、PEG-DMGである。他の実施形態において、凝集低減剤は、PEG-c-DMAである。
【０２４９】
リポソーム製剤は、カチオン性脂質成分の選択、カチオン性脂質の飽和度、ＰＥＧ化の種類、全ての成分の比率、および生物物理学的パラメータ（大きさなど）によって影響され得る（ただし、これらに限定されない）。Semple et al.による一例において、リポソーム製剤は、５７．１％のカチオン性脂質、７．１％のジパルミトイルホスファチジルコリン、３４．３％のコレステロール、および１．４％のPEG-c-DMAから構成されていた。（Semple et al. Nature Biotech. 2010 28: 172- 176；参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。他の例として、カチオン性脂質の組成を変化させることによって、ｓｉＲＮＡを種々の抗原提示細胞へと効果的に送達し得る（Basha et al. Mol Ther. 2011 19:2186-2200；参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態において、リポソーム製剤は、約３５％〜約４５％のカチオン性脂質、約４０％〜約５０％のカチオン性脂質、約５０％〜約６０％のカチオン性脂質、および／または、約５５％〜約６５％のカチオン性脂質を含み得る。いくつかの実施形態において、リポソーム中における脂質のｍＲＮＡに対する比率は、約５：１〜約２０：１、約１０：１〜約２５：１、約１５：１〜約３０：１、および／または、少なくとも３０：１であり得る。
【０２５０】
ＰＥＧ修飾脂質中のＰＥＧ部分の平均分子量は、好ましくは、約５００〜約８，０００Ｄａである（例えば、約１，０００〜約４，０００Ｄａ）。好適な一実施形態において、ＰＥＧ部分の平均分子量は、約２，０００Ｄａである。
【０２５１】
凝集低減剤の濃度は、好ましくは、脂質粒子中の脂質の総モル数を１００％とすると、約０．１モル％〜約１５モル％である。一実施形態において、製剤は、脂質粒子中の脂質の総モル数を基準として、約３モル％未満、約２モル％未満、または約１モル％未満のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を含んでいる。
【０２５２】
他の実施形態において、脂質ナノ粒子は、モル比で、約０．１％〜約２０％のＰＥＧ修飾脂質を含んでいる。例えば、脂質ナノ粒子は、モル比で、約０．５〜約１０％、約０．５〜約５％、約１０％、約５％、約３．５％、約１．５％、約０．５％、または約０．３％のＰＥＧ修飾脂質を含んでいる（脂質ナノ粒子中の脂質の総モル数を１００％とする）。
【０２５３】
［脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）］
本明細書において用いられるとき、脂質ナノ粒子は、好ましくは、リポソームの構造を有している。リポソームの構造は、水性の内部を取り囲んでいる脂質含有膜を有している。リポソームは、好ましくは、１つ以上の脂質膜を有している。リポソームは、好ましくは、単一の層であるか（単層(unilamellar)と呼ばれる）、または、多数の層である（多層(multilamellar)と呼ばれる）。核酸と複合体を形成する際に、脂質粒子は、ＤＮＡ層の間に挟まれているカチオン性脂質二重層から構成されるリポプレックスであってもよい。リポソームは、様々なサイズであり得る。例えば、（i）直径が数百ｎｍであり得、狭い水性区画によって分離された一連の同心二重層を含み得る、多層ベシクル（MLV）、（ii）直径が５０ｎｍ未満であり得る、小型のユニセルベシクル（SUV）、および、（iii）直径が５０ｎｍ〜５００ｎｍであり得る大型の単層ベシクル（LUV）であるが、これらに限定されない。リポソーム設計は、好ましくは、オプソニンまたはリガンドを含んでいる。これによって非健康な組織へのリポソームの付着を向上させたり、エンドサイトーシスなどのイベント（ただし、これに限定されない）を活性化させたりする。医薬製剤の送達を改善するために、リポソームは、低ｐＨまたは高ｐＨであり得る。
【０２５４】
非限定的な例として、リポソーム（合成膜ベシクルなど）は、下記に記載されている方法、装置、およびデバイスによって調製され得る：米国特許出願公開第２０１３０１７７６３８号、第２０１３０１７７６３７号、第２０１３０１７７６３６号、第２０１３０１７７６３５号、第２０１３０１７７６３４号、第２０１３０１７７６３３号、第２０１３０１８３３７５号、第２０１３０１８３３７３号、および第２０１３０１８３３７２号（それぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。核酸は、（i）リポソーム内に封入されてもよく、および／または、（ii）水性のコア中に含まれており、当該コアがリポソーム内に封入されてもよい（国際公開第２０１２／０３１０４６号、第２０１２／０３１０４３号、第２０１２／０３０９０１号および第２０１２／００６３７８号、ならびに、米国特許出願公開第２０１３０１８９３５１号、第２０１３０１９５９６９号および第２０１３０２０２６８４号を参照。それぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０２５５】
他の実施形態において、ＲＮＡは、好ましくは、カチオン性の水中油型エマルジョン中に製剤化されている。ここで、エマルジョン粒子は、油のコアおよびカチオン性脂質を含んでおり、当該カチオン性脂質は、ポリヌクレオチドとの相互作用により、分子をエマルジョン粒子に固定し得る（国際公開第２０１２／００６３８０を参照。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。一実施形態において、ＲＮＡは、油中水型エマルジョン中に製剤化され得る。このエマルジョンは、連続した疎水相を含んでおり、当該疎水相により親水相が分散されている。
【０２５６】
一実施形態において、ＲＮＡ(医薬）組成物は、リポソーム中で製剤化されている。リポソームの例としては、DiLa2リポソーム（Marina Biotech, Bothell, WA）、SMARTICLES（登録商標）（Marina Biotech, Bothell, WA）、neutral DOPC（ｌ，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）系リポソーム（例えば、卵巣がん用のｓｉＲＮＡ送達（Landen et al. Cancer Biology & Therapy 2006 5(12)1708-1713）。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、およびヒアルロナン−被覆リポソーム（Quiet Therapeutics, Israel）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２５７】
他の実施形態において、脂質ナノ粒子の直径の中央値は、約５０ｎｍ〜約３００ｎｍであり、例えば約５０ｎｍ〜約２５０ｎｍであり、例えば約５０ｎｍ〜約２００ｎｍである。
【０２５８】
いくつかの実施形態において、ＲＮＡは、小型のＬＮＰを使用して送達される。そのような粒子の直径は、０．１μｍ未満〜１００ｎｍ未満であり得る。この直径は、例えば、０．１μｍ未満、１．０μｍ未満、５μｍ未満、１０μｍ未満、１５μｍ未満、２０μｍ未満、２５μｍ未満、３０μｍ未満、３５μｍ未満、４０μｍ未満、５０μｍ未満、５５μｍ未満、６０μｍ未満、６５μｍ未満、７０μｍ未満、７５μｍ未満、８０μｍ未満、８５μｍ未満、９０μｍ未満、９５μｍ未満、１００μｍ未満、１２５μｍ未満、１５０μｍ未満、１７５μｍ未満、２００μｍ未満、２２５μｍ未満、２５０μｍ未満、２７５μｍ未満、３００μｍ未満、３２５μｍ未満、３５０μｍ未満、３７５μｍ未満、４００μｍ未満、４２５μｍ未満、４５０μｍ未満、４７５μｍ未満、５００μｍ未満、５２５μｍ未満、５５０μｍ未満、５７５μｍ未満、６００μｍ未満、６２５μｍ未満、６５０μｍ未満、６７５μｍ未満、７００μｍ未満、７２５μｍ未満、７５０μｍ未満、７７５μｍ未満、８００μｍ未満、８２５μｍ未満、８５０μｍ未満、８７５μｍ未満、９００μｍ未満、９２５μｍ未満、９５０μｍ未満、９７５μｍ未満であるが、これらに限定されない。他の実施形態において、ＲＮＡは、小型のＬＮＰを使用して送達され、このＬＮＰの直径は、約１ｎｍ〜約１００ｎｍ、約１ｎｍ〜約１０ｎｍ、約１ｎｍ〜約２０ｎｍ、約１ｎｍ〜約３０ｎｍ、約１ｎｍ〜約４０ｎｍ、約１ｎｍ〜約５０ｎｍ、約１ｎｍ〜約６０ｎｍ、約１ｎｍ〜約７０ｎｍ、約１ｎｍ〜約８０ｎｍ、約１ｎｍ〜約９０ｎｍ、約５ｎｍ〜約１００ｎｍ、約５ｎｍ〜約１０ｎｍ、約５ｎｍ〜約２０ｎｍ、約５ｎｍ〜約３０ｎｍ、約５ｎｍ〜約４０ｎｍ、約５ｎｍ〜約５０ｎｍ、約５ｎｍ〜約６０ｎｍ、約５ｎｍ〜約７０ｎｍ、約５ｎｍ〜約８０ｎｍ、約５ｎｍ〜約９０ｎｍ、約１０ｎｍ〜約５０ｎｍ、約２０ｎｍ〜約５０ｎｍ、約３０ｎｍ〜約５０ｎｍ、約４０ｎｍ〜約５０ｎｍ、約２０ｎｍ〜約６０ｎｍ、約３０ｎｍ〜約６０ｎｍ、約４０ｎｍ〜約６０ｎｍ、約２０ｎｍ〜約７０ｎｍ、約３０ｎｍ〜約７０ｎｍ、約４０ｎｍ〜約７０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約７０ｎｍ、約６０ｎｍ〜約７０ｎｍ、約２０ｎｍ〜約８０ｎｍ、約３０ｎｍ〜約８０ｎｍ、約４０ｎｍ〜約８０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約８０ｎｍ、約６０ｎｍ〜約８０ｎｍ、約２０ｎｍ〜約９０ｎｍ、約３０ｎｍ〜約９０ｎｍ、約４０ｎｍ〜約９０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約９０ｎｍ、約６０ｎｍ〜約９０ｎｍおよび／または約７０ｎｍ〜約９０ｎｍであり得る。
【０２５９】
一実施形態において、脂質ナノ粒子の直径は、１００ｎｍ超、１５０ｎｍ超、２００ｎｍ超、２５０ｎｍ超、３００ｎｍ超、３５０ｎｍ超、４００ｎｍ超、４５０ｎｍ超、５００ｎｍ超、５５０ｎｍ超、６００ｎｍ超、６５０ｎｍ超、７００ｎｍ超、７５０ｎｍ超、８００ｎｍ超、８５０ｎｍ超、９００ｎｍ超、９５０ｎｍ超、または１０００ｎｍ超である。
【０２６０】
さらに他の実施形態において、本発明の製剤中の脂質ナノ粒子の粒度分布は、単峰性である（すなわち、二峰性または多峰性ではない）。
【０２６１】
好ましくは、脂質ナノ粒子は、上述のものに加えて、１つ以上の脂質および／または他の成分をさらに含んでいる。他の脂質は、種々の目的のために、リポソーム組成物に含まれ得る（脂質酸化を防止するため、または、リガンドをリポソームの表面に付着させるためなど）。脂質粒子中には、多数ある脂質のうちのいずれがが存在していてもよい（当該脂質には、両親媒性脂質、中性脂質、カチオン性脂質およびアニオン性脂質が含まれている）。このような脂質は、単独で使用し得るし、組合せても使用し得る。
【０２６２】
脂質粒子中に存在し得るさらなる成分の例としては、二重層安定化成分が挙げられる。二重層安定化成分の例としては、ポリアミドオリゴマー（例えば、米国特許第６，３２０，０１７号を参照。参照によりその全体が組み込まれる）、ペプチド、タンパク質、および界面活性剤が挙げられる。
【０２６３】
カチオン性脂質、非カチオン性脂質（または中性脂質）、ステロール（例えば、コレステロール）、および凝集低減剤（例えば、ＰＥＧ修飾脂質）を種々のモル比で含んでいる様々な脂質ナノ粒子を、下記表２に示す（脂質ナノ粒子中の脂質の総モル数を基準とする）。
【０２６４】
【表５】
2020501545.tif 000009
【０２６５】
一実施形態において、脂質のＲＮＡに対する重量比は、少なくとも約０．５：１、少なくとも約１：１、少なくとも約２：１、少なくとも約３：１、少なくとも約４：１、少なくとも約５：１、少なくとも約６：１、少なくとも約７：１、少なくとも約１１：１、少なくとも約２０：１、少なくとも約２５：１、少なくとも約２７：１、少なくとも約３０：１、または少なくとも約３３：１である。一実施形態において、脂質のＲＮＡに対する重量比は、 約１：１〜約３５：１、約３：１〜約１５：１、約４：１〜約１５：１、約５：１〜約１３：１、または約２５：１〜約３３：１である。一実施形態において、脂質のＲＮＡに対する重量比は、約０．５：１〜約１２：１である。
【０２６６】
一実施形態において、本発明のＲＮＡは、処置用ナノ粒子内に封入されている（本明細書では、「処置用ナノ粒子核酸」と呼ぶ）。処置用ナノ粒子は、本明細書に記載の方法によって製剤化し得、当該分野で公知の方法によっても製剤化し得る。公知の方法の例としては、国際公開第２０１０／００５７４０号、第２０１０／０３０７６３号、第２０１０／００５７２１号、第２０１０／００５７２３号、第２０１２／０５４９２３号；
米国特許出願公開第２０１１０２６２４９１号、第２０１００１０４６４５号、第２０１０００８７３３７号、第２０１０００６８２８５号、第２０１１０２７４７５９号、第２０１０００６８２８６号、第２０１２０２８８５４１号、第２０１３０１２３３５１号、第２０１３０２３０５６７号；米国特許第８，２０６，７４７号、第８，２９３，２７６号、第８，３１８，２０８、第８，３１８，２１１号が挙げられるが、これらに限定されない（各文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。他の実施形態において、処置用ポリマーナノ粒子は、米国特許出願公開第２０１２０１４０７９０号に記載の方法によって同定することができる（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０２６７】
一実施形態において、本発明に係るＲＮＡは、（i）合成ナノ担体に封入され得、（ii）合成ナノ担体と結合され得、および／または、（iii）合成ナノ担体と関連付けられ得る。合成ナノ担体の例としては、以下に開示されているものが挙げられるが、これらに限定されない。国際公開第２０１０／００５７４０号、第２０１０／０３０７６３号、第２０１２／１３５０１０号、第２０１２／１４９２５２号、第２０１２／１４９２５５号、第２０１２／１４９２５９号、第２０１２／１４９２６５号、第２０１２／１４９２６８号、第２０１２／１４９２８２号、第２０１２／１４９３０１号、第２０１２／１４９３９３号、第２０１２／１４９４０５号、第２０１２／１４９４１１号、第２０１２／１４９４５号、および第２０１３／０１９６６９号；米国出願公開第２０１１０２６２４９１号、第２０１００１０４６４５号、第２０１０００８７３３７号、第２０１２２４４２２２号（各文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。合成ナノ担体は、当該分野で公知の方法および／または本明細書に記載の方法を使用して、製剤化され得る。非限定的な例として、合成ナノ担体は、以下の文献に開示されている方法によって製剤され得る。国際公開第２０１０／００５７４０号、第２０１０／０３０７６３号、第２０１２／１３５０１０号；米国特許出願公開第２０１１０２６２４９１号、第２０１００１０４６４５号、第２０１０００８７３３７号、第２０１２２４４２２２号（各文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。他の実施形態において、合成ナノ担体製剤は、以下の文献に開示されている方法によって、凍結乾燥され得る。国際公開第２０１１／０７２２１８号；米国特許第８，２１１，４７３号（各文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。さらに他の実施形態において、本発明の製剤は、合成ナノ担体を含んでおり（ただし、これには限定されない）、米国特許出願公開第２０１３０２３０５６８号に開示されている方法によって凍結乾燥または再構成され得る（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０２６８】
一実施形態において、本発明のＲＮＡは、マイクロスフィアを封入している薬物を使用して、送達のために製剤化される。この薬物は、国際公開第２０１３／０６３４６８号または米国特許８，４４０，６１４号に開示されている（各文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０２６９】
好適な実施形態によれば、本発明に係るＲＮＡは、特定の組織または臓器を標的化するために製剤化し得る。特に、本発明に係るＲＮＡ（または、当該ＲＮＡと共に製剤化されている薬学的担体は、好ましくは、標的基(targeting group)と複合体を形成する。上記標的基は、好ましくは、複合体（好ましくは、ＲＮＡを含んでいる複合体）を特定の組織または臓器に対して標的化する。言い換えれば、本発明に係るＲＮＡを標的基と複合体化させることによって（ＲＮＡ−標的基複合体を形成させることによって直接的に、または、標的基と薬学的担体（本発明に係るＲＮＡとの複合体中に存在している）との複合体を形成させることによって間接的に）、特定の組織または臓器へと上記標的基標的化することにより、上記ＲＮＡを上記特定の組織または臓器に送達する。最も好ましくは、標的基は、肝臓組織への送達を提供する。肝臓組織は、好ましくは、肝臓マクロファージ、肝細胞および／または肝臓類洞内皮細胞（LSEC）である。この文脈において、標的基は、好ましくは、葉酸、ＧａｌＮＡｃ、ガラクトース、マンノース、マンノース−６Ｐ、アプタマー、インテグリン受容体リガンド、ケモカイン受容体リガンド、トランスフェリン、ビオチン、セロトニン受容体リガンド、ＰＳＭＡ、エンドセリン、ＧＣＰＩＩ、ソマトスタチン、ＬＤＬリガンド、およびＨＤＬリガンドからなる群から選択される。また、本発明のＲＮＡに適用され得る肝臓への標的化送達のための適切なアプローチは、Bartneck et al.にも開示されている（Bartneck et al.: Therapeutic targeting of liver inflammation and fibrosis by nanomedicine. Hepatobiliary Surgery and Nutrition 2014;3(6):364-376；この開示は、参照によりその全体が組み込まれる）。
【０２７０】
他の実施形態において、リポソームまたはＬＮＰは、標的化送達のために製剤化され得る。好ましくは、リポソームまたはＬＮＰは、本発明に係るＲＮＡを、肝臓（好ましくは、肝臓マクロファージ、肝細胞および／または肝臓類洞内皮細胞（LSEC））へと標的化して送達するために製剤化されている。標的化送達のために使用されるリポソームまたはＬＮＰは、本明細書に記載のリポソームまたはＬＮＰを含み得るが、これらに限定されない。
【０２７１】
標的化された送達を提供するために、本発明のＲＮＡは、好ましくは、複合体を形成している。複合体の例としては、担体または標的基（好ましくは、本明細書に記載のもの）と共有結合しているＲＮＡが挙げられる。あるいは、本発明に係るＲＮＡは、融合タンパク質（例えば、本明細書に記載のペプチドまたはタンパク質に融合している標的基を有している）をコードしており、当該融合タンパク質が特定の組織または臓器（好ましくは肝臓）を標的化している。
【０２７２】
複合体は、好ましくは、標的基を有している。標的基の例としては、細胞または組織を標的化する薬剤が挙げられる。このような薬剤の例としては、レクチン、糖タンパク質、脂質またはタンパク質（例えば、特定の細胞型（肝臓の細胞など）に対して結合する抗体）が挙げられる。標的基は、チロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、サーファクタントタンパク質Ａ、ムチン型糖鎖、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホナート、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸、ビタミンＢ１２、ビオチン、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤペプチド模倣体、またはアプタマーであり得る。
【０２７３】
標的基はさらに、タンパク質（例えば、糖タンパク質）、もしくはペプチド（例えば、例えば、コリガンドに対して特異的な親和性を有している分子）、または抗体（例えば、肝細胞などの特定の細胞型に結合する抗体）であり得る。標的基はまた、ホルモンおよびホルモン受容体を含み得る。標的基はまた、非ペプチド種を含み得る。非ペプチド種の例としては、脂質、レクチン、炭化水素、ビタミン、補助因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン多価マンノース、多価フコース、またはアプタマーが挙げられる。リガンドは、例えば、リポ多糖、またはｐ３８ＭＡＰキナーゼの活性化因子であり得る。
【０２７４】
標的基は、好ましくは、特定の受容体を標的化し得るリガンドである。その例としては、葉酸、ＧａｌＮＡｃ、ガラクトース、マンノース、マンノース−６Ｐ、アプタマー、インテグリン受容体リガンド、ケモカイン受容体リガンド、トランスフェリン、ビオチン、セロトニン受容体リガンド、ＰＳＭＡ、エンドセリン、ＧＣＰＩＩ、ソマトスタチン、ＬＤＬおよびＨＤＬリガンドが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、標的基はアプタマーである。好ましくは、アプタマーは修飾されていないか、または本明細書に記載の修飾の任意の組合せを有している。
【０２７５】
好適な実施形態において、本発明に係る組成物は、本発明に係るＲＮＡを含んでいる。このＲＮＡは、カチオン性もしくはポリカチオン性化合物、および／または、重合性担体と共に製剤化されている。したがって、本発明のさらなる実施形態において、好ましくは、本明細書に定義されているＲＮＡまたは本発明の（医薬）組成物に含まれている他の任意の核酸は、カチオン性もしくはポリカチオン性化合物または重合性担体と関連付けられているか、または複合体化している。カチオン性もしくはポリカチオン性化合物または重合性担体の重量比は、任意で、以下から選択される（ｍＲＮＡまたは核酸の、カチオン性もしくはポリカチオン性化合物および／または重合性担体に対する比）。約６：１（w/w）〜約０．２５：１（w/w）、より好ましくは約５：１（w/w）〜約０．５：１（w/w）、より一層好ましくは約４：１（w/w）〜約１：１（w/w）または約３：１（w/w）〜約１：１（w/w）、最も好ましくは約３：１（w/w）〜約２：１（w/w）。あるいは、任意に、ｍＲＮＡまたは核酸のカチオン性もしくはポリカチオン性化合物および／または重合性担体に対する比率は、窒素／リン酸比（Ｎ／Ｐ比）で、約０．１〜約１０、好ましくは約０．３〜約４または約０．３〜約１、最も好ましくは約０．５〜約１または約０．７〜約１、さらに最も好ましくは約０．３〜約０．９または約０．５〜約０．９の範囲である。より好ましくは、ＲＮＡの少なくとも１つのポリカチオンに対するＮ／Ｐ比は、約０．１〜約１０の範囲である（約０．３〜約４、約０．５〜約２、約０．７〜約２、約０．７〜約１．５など）。
【０２７６】
その点において、本明細書に定義されているＲＮＡまたは本発明に係る（医薬）組成物に含まれている任意の他の核酸はまた、ビヒクル、形質転換剤または複合体化剤と関連付けられ得る。これによって、本発明に係るＲＮＡ（または、任意でさらに含まれている核酸）の形質転換効率および／または発現を増大させる。
【０２７７】
カチオン性またはポリカチオン性化合物は、特にこの文脈において好ましい物質としては、プロタミン、ヌクレオリン、スペルミンもしくはスペルミジン、または他のカチオン性ペプチドもしくはタンパク質（ポリ−Ｌ−リシン（PLL）、ポリアルギニン、塩基性ポリペプチドなど）、細胞貫通性ペプチド（CPP；ＨＩＶ結合ペプチドなど）、ＨＩＶ−１  Ｔａｔ（HIV）、Ｔａｔ由来ペプチド、ペネトラチン、ＶＰ２２由来もしくは類似体ペプチド、ＨＳＶＶＰ２２（Herpes simplex）、ＭＡＰ、ＫＡＬＡもしくはタンパク質導入ドメイン（PTD）、ＰｐＴ６２０、プロリン高含有ペプチド、アルギニン高含有ペプチド、リシン高含有ペプチド、ＭＰＧ−ペプチド、Ｐｅｐ−１、Ｌ−オリゴマー、カルシトニンペプチド、アンテナペディア由来ペプチド（特に、Drosophila antennapedia由来）、ｐＡｎｔｐ、ｐＩｓｌ、ＦＧＦ、ラクトフェリン、トランスポータン、ブホリン−２、Ｂａｃ７１５−２４、ＳｙｎＢ、ＳｙｎＢ（１）、ｐＶＥＣ、ｈＣＴ由来ペプチド、ＳＡＰ、またはヒストンである。より好ましくは、本発明に係るＲＮＡは、少なくとも１つのポリカチオンと複合体化しており、好ましくはプロタミンまたはオリゴフェクタミンと複合体化しており、最も好ましくはプロタミンと複合体化している。この文脈においては、プロタミンが特に好ましい。
【０２７８】
さらに、好ましいカチオン性またはポリカチオン性のタンパク質またはペプチドは、以下の全体式（ＩＩＩ）を有しているタンパク質またはペプチドから選択され得る：
（Ａｒｇ）ｌ；（Ｌｙｓ）ｍ；（Ｈｉｓ）ｎ；（Ｏｒｎ）ｏ；（Ｘａａ）ｘ  （式（ＩＩＩ））。
【０２７９】
式中、ｌ＋ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｘ＝８〜１５である。また、ｌ、ｍ、ｎまたはｏは、互いに独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５から選択される任意の数であり得る。ただし、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、ＨｉｓおよびＯｒｎの全含有量は、オリゴペプチドの全アミノ酸の少なくとも５０％を占めている。Ｘａａは、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、ＨｉｓまたはＯｒｎを除く天然アミノ酸（すなわち、天然に存在するアミノ酸）または非天然アミノ酸から選択される、任意のアミノ酸であり得る。ｘは、０、１、２、３または４から選択される任意の数であり得る。ただし、Ｘａａの全含有量は、オリゴペプチドの全アミノ酸の５０％超にはならない。この文脈において、特に好ましいカチオン性ペプチドは、例えば、Ａｒｇ７、Ａｒｇ８、Ａｒｇ９、Ｈ３Ｒ９、Ｒ９Ｈ３、Ｈ３Ｒ９Ｈ３、ＹＳＳＲ９ＳＳＹ、（ＲＫＨ）４、Ｙ（ＲＫＨ）２Ｒなどである。この文脈において、ＷＯ２００９／０３０４８１の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２８０】
形質転換剤または複合体化剤として使用され得るさらに好ましいカチオン性またはポリカチオン性化合物の例としては、以下が挙げられる。カチオン性多糖類（例えば、キトサン、ポリバレン）；カチオン性ポリマー（例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ））；カチオン性脂質（例えば、ＤＯＴＭＡ：［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル塩化アンモニウム、ＤＭＲＩＥ、ジ−Ｃ１４−アミジン、ＤＯＴＩＭ、ＳＡＩＮＴ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＢＧＴＣ、ＣＴＡＰ、ＤＯＰＣ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＰＥ：ジオレイルホスファチジルエタノールアミン、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＤＡＢ、ＤＯＩＣ、ＤＭＥＰＣ、ＤＯＧＳ：ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン、ＤＩＭＲＩ：ジミリスト−オキシプロピルジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド、ＤＯＴＡＰ：ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン、ＤＣ−６−１４：Ｏ，Ｏ−ジテトラデカノイル−Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）ジエタノールアミンクロリド、ＣＬＩＰ１：ｒａｃ−［（２，３−ジオクタデシルオキシプロピル）（２−ヒドロキシエチル）］−ジメチルアンモニウムクロリド、ＣＬＩＰ６：ｒａｃ−［２（２，３−ジヘキサデシルオキシプロピル−オキシメチルオキシ）エチル］トリメチルアンモニウム、ＣＬＩＰ９：ｒａｃ−［２（２，３−ジヘキサデシルオキシプロピル−オキシスクシニルオキシ）エチル］−トリメチルアンモニウム、オリゴフェクタミン）；あるいは、カチオン性もしくはポリカチオン性ポリマー（例えば、修飾ポリアミノ酸（β−アミノ酸ポリマーまたは逆方向ポリアミドなど）、修飾ポリエチレン（ＰＶＰ（ポリ（Ｎ−エチル−４−ビニルピリジニウムブロミド））など）、修飾アクリレート（ｐＤＭＡＥＭＡ（ポリ（ジメチルアミノエチルメチルアクリレート））など）、修飾アミドアミン（ｐＡＭＡＭ（ポリ（アミドアミン））など、修飾ポリβアミノエステル（ＰＢＡＥ）（ジアミン末端修飾１，４ブタンジオールジアクリレート−ｃｏ−５−アミノ−１−ペンタノールポリマーなど）、デンドリマー（ポリプロピルアミンデンドリマーまたはｐＡＭＡＭ系デンドリマーなど）、ポリイミン（ＰＥＩ：ポリ（エチレンイミン）、ポリ（プロピレンイミン）など）、ポリアリルアミン、糖骨格系ポリマー（シクロデキストリン系ポリマー、デキストラン系ポリマー、キトサンなど）、シラン骨格系ポリマー（ＰＭＯＸＡ−ＰＤＭＳコポリマーなど）、少なくとも１つのカチオン性ブロックの組合せからなるブロックポリマー（例えば、上述のカチオン性ポリマーから選択される）と、少なくとも１つの親水性または疎水性ブロック（例えば、ポリエチレングリコール）との）；など。
【０２８１】
好適な実施形態によれば、本発明の組成物は、本明細書に定義されているＲＮＡと、重合性担体とを含んでいる。本発明に係り使用される重合性担体は、ジスルフィド架橋されたカチオン性成分によって形成される、重合性担体であり得る。ジスルフィド架橋されたカチオン性成分は、互いに同じであっても異なっていてもよい。重合性担体は、さらなる成分を含有し得る。また特に好ましくは、本発明に係り使用される重合性担体は、カチオン性ペプチド、タンパク質またはポリマーと、任意構成であるさらなる成分（本明細書に定義されている）との混合物を含んでいる。これらの成分は、本明細書に記載のように、ジスルフィド結合によって架橋されている。この文脈において、国際公開第２０１２／０１３３２６号開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２８２】
この文脈において、ジスルフィド架橋によって重合性担体の主要成分を形成するカチオン性成分は、通常は、上記の目的に適している、任意のカチオン性またはポリカチオン性のペプチド、タンパク質またはポリマーから選択される。具体的には、本明細書に定義されているＲＮＡまたは組成物に含まれているさらなる核酸と複合体化することができ、それによって、好ましくは、ＲＮＡまたは核酸を濃縮し得るカチオン性またはポリカチオン性のペプチド、タンパク質またはポリマーから選択される。カチオン性またはポリカチオン性のペプチド、タンパク質またはポリマーは、好ましくは、直鎖状分子である。しかし、分岐状のカチオン性またはポリカチオン性のペプチド、タンパク質またはポリマーもまた、使用され得る。
【０２８３】
本発明に係るＲＮＡまたは本発明の（医薬）組成物に含まれている任意のさらなる核酸と複合体化するために使用され得る重合性担体の、ジスルフィド架橋しているカチオン性またはポリカチオン性のタンパク質、ペプチドまたはポリマーは全て、少なくとも１つの−ＳＨ部分を有している。最も好ましくは、少なくとも１つの−ＳＨ部分は、少なくとも１つのシステイン残基、もまたは−ＳＨ部分を有している任意のさらなる化学基である。少なくとも１つの−ＳＨ部分は、縮合したときに、さらなるカチオン性またはポリカチオン性のタンパク質、ペプチドまたはポリマーの少なくとも１つ（上述した重合性担体のカチオン性成分）と、ジスルフィド結合を形成することができる。
【０２８４】
上記で定義したように、本発明のＲＮＡまたは本発明に係る（医薬）組成物に含まれている任意のさらなる核酸を複合体化するために使用され得る重合性担体は、ジスルフィド架橋されたカチオン性（またはポリカチオン性）成分によって形成され得る。好ましくは、重合性担体のカチオン性またはポリカチオン性のペプチド、タンパク質またはポリマーは、少なくとも１つの−ＳＨ部分を含んでいるか、または少なくとも１つの−ＳＨ部分を含むように付加修飾されており、複合体化剤として本明細書に定義されているタンパク質、ペプチドおよびポリマーから選択される。
【０２８５】
さらなる特定の実施形態において、本明細書に定義されているＲＮＡまたは本発明に係る（医薬）組成物に含まれている任意のさらなる核酸を複合体化するために使用し得る重合性担体は、一般式式（ＩＶ）にしたがう重合性担体分子から選択され得る：
Ｌ−Ｐ１−Ｓ−［Ｓ−Ｐ２−Ｓ］ｎ−Ｓ−Ｐ３−Ｌ    式（ＩＶ）。
【０２８６】
式中、Ｐ１およびＰ３は、互いに異なるまたは同一であり、直鎖状または分枝状の親水性ポリマー鎖を表している。Ｐ１およびＰ３はそれぞれ、少なくとも１つの−ＳＨ部分を有している。少なくとも１つの−ＳＨ部分は、縮合に際して、成分Ｐ２とジスルフィド結合を形成し得る。あるいは、少なくとも１つの−ＳＨ部分は、縮合に際して、（ＡＡ）、（ＡＡ）ｘまたは［（ＡＡ）ｘ］ｚとジスルフィド結合を形成し得る（仮に、このような成分が、Ｐ１−Ｐ２間またはＰ２−Ｐ３間のリンカーとして用いられるならば）、および／または、さらなる成分（例えば、（ＡＡ）、（ＡＡ）ｘ、［（ＡＡ）ｘ］ｚまたはＬ）とジスルフィド結合を形成し得る。直鎖状または分枝状の親水性ポリマー鎖は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ−Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド、ポリ−２−（メタクリロイルオキシ）エチルホスホリルコリン、ポリ（ヒドロキシアルキルＬ−アスパラギン）、ポリ（２−（メタクリロイルオキシ）エチルホスホリルコリン）、ヒドロキシエチルデンプン、またはポリ（ヒドロキシアルキルＬ−グルタミン）から互いに独立して選択される。親水性ポリマー鎖の分子量は、約１ｋＤａ〜約１００ｋＤａであり、好ましくは約２ｋＤａ〜約２５ｋＤａである。あるいは、より好ましくは、親水性ポリマー鎖の分子量は、約２ｋＤａ〜約１０ｋＤａである（例えば、約５ｋＤａ〜約２５ｋＤａまたは約５ｋＤａ〜約１０ｋＤａ）。
【０２８７】
Ｐ２は、カチオン性またはポリカチオン性のペプチドまたはタンパク質である（例えば、上述のジスルフィド架橋されたカチオン性成分によって形成さている重合性担体）。Ｐ２の長さは、好ましくは約３〜約１００アミノ酸であり、より好ましくは約３〜約５０アミノ酸であり、より一層好ましくは約３〜約２５アミノ酸である。このとき、Ｐ２の長さは、例えば、約３〜約１０アミノ酸、約５〜約１５アミノ酸、約１０〜約２０アミノ酸、または約１５〜約２５アミノ酸であり；より好ましくは約５〜約２０アミノ酸であり；より一層好ましくは約１０〜約２０アミノ酸である。
【０２８８】
あるいは、Ｐ２は、カチオン性またはポリカチオン性のポリマーである（例えば、上述のジスルフィド架橋されたカチオン性成分によって形成される重合性担体）。Ｐ２の分子量は、通常は約０．５ｋＤａ〜約３０ｋＤａであり（約１ｋＤａ〜約２０ｋＤａなど）、より一層好ましくは約１．５ｋＤａ〜約１０ｋＤａである。あるいは、Ｐ２の分子量は、約０．５ｋＤａ〜約１００ｋＤａであり（約１０ｋＤａ〜約５０ｋＤａなど）、より一層好ましくは約１０ｋＤａ〜約３０ｋＤａである。
【０２８９】
それぞれのＰ２は、少なくとも２つの−ＳＨ部分を有している。少なくとも２つの−ＳＨ部分は、縮合に際して、（i）さらなる成分Ｐ２、（ii）成分Ｐ１および／またはＰ３、あるいは、（iii）さらなる成分（例えば、（ＡＡ）、（ＡＡ）ｘ、または［（ＡＡ）ｘ］ｚ）と、ジスルフィド結合を形成し得る。
【０２９０】
−Ｓ−Ｓ−は、（可逆的な）ジスルフィド結合である（可読性を上げるために、括弧は省略している）。Ｓは、好ましくは、（可逆的な）ジスルフィド結合が形成されている、硫黄または−ＳＨを有している部分を表す。（可逆的な）ジスルフィド結合は、好ましくは、成分Ｐ１および成分Ｐ２、成分Ｐ２および成分Ｐ２、または成分Ｐ２および成分Ｐ３のいずれかの−ＳＨ部分の縮合によって形成される。あるいは、ジスルフィド結合は、任意で、本明細書に定義されているさらなる成分（例えば、Ｌ、（ＡＡ）、（ＡＡ）ｘ、［（ＡＡ）ｘ］ｚなど）の縮合によって形成される。−ＳＨ部分は、上記の成分の構造の一部であり得るか、または以下に定義するように修飾を付加され得る。
【０２９１】
Ｌは、任意に含まれているリガンドであり、存在していても存在していなくてもよい。Ｌは、下記から互いに独立に選択され得る。ＲＧＤ、トランスフェリン、葉酸、シグナルペプチドもしくはシグナル配列、局在化シグナルもしくは配列、核局在化シグナルもしくは配列（ＮＬＳ）、抗体、細胞貫通性ペプチド（例えば、ＴＡＴまたはＫＡＬＡ）、受容体のリガンド（例えば、サイトカイン、ホルモン、成長因子など）、小分子（例えば、マンノースもしくはガラクトースなどの炭化水素、または合成リガンド）、小分子アゴニスト、受容体の阻害剤もしくはアンタゴニスト（例えば、ＲＧＤ擬似ペプチド類似物）、または、本明細書に定義されている他の任意のさらなるタンパク質、など。
【０２９２】
ｎは、整数である。ｎは、通常は、約１〜５０から選択される。好ましくは、約１、２または３〜３０から選択される。より好ましくは、約１、２、３、４もしくは５〜２５、または、約１、２、３、４もしくは５〜２０、または、約１、２、３、４もしくは５〜１５、または、約１、２、３、４もしくは５〜１０から選択される。これらの範囲は、例えば、約４〜９、４〜１０、３〜２０、４〜２０、５〜２０、もしくは１０〜２０であり、または、約３〜１５、４〜１５、５〜１５、もしくは１０〜１５であり、または、約６〜１１もしくは７〜１０である。最も好ましくは、ｎは、約１、２、３、４もしくは５〜１０であり、より好ましくは約１、２、３もしくは４〜９、約１、２、３もしくは４〜８、または、約１、２もしくは３〜７である。
【０２９３】
この文脈において、国際公開第２０１１／０２６６４１号の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。親水性ポリマーＰ１およびＰ３のそれぞれは、通常は、少なくとも１つの−ＳＨ部分を有している。少なくとも１つの−ＳＨ部分がＰ１−Ｐ２間またはＰ３−Ｐ２間のリンカーとして使用される場合は（以下に定義されている）、当該−ＳＨ部分は、成分Ｐ２または成分（ＡＡ）もしくは（ＡＡ）ｘとの反応に際して、ジスルフィド結合を形成し得る。また、例えば２つ以上のジスルフィド結合が含まれている場合には、−ＳＨ部分は、追加の成分（例えば、Ｌ、および／または、（ＡＡ）もしくは（ＡＡ）ｘ）と反応して、ジスルフィド結合を形成し得る。上記の一般式（ＩＶ）に含まれる、下位式「Ｐ１−Ｓ−Ｓ−Ｐ２」および「Ｐ２−Ｓ−Ｐ３」は、通常、以下のような状態を表している（可読性を上げるために、括弧を省略している。また、Ｓ、Ｐ１およびＰ３は、本明細書に定義されているとおりである）。すなわち、水性ポリマーＰ１およびＰ３の−ＳＨ部分のうち１つが、一般式（ＩＶ）の成分Ｐ２の１つの−ＳＨ部分と縮合しており、これらの−ＳＨ部分の両方の硫黄が、式（ＩＶ）において本明細書に定義されているジスルフィド結合−Ｓ−Ｓ−を形成している状態である。これらの−ＳＨ部分は、通常は、親水性ポリマーＰ１およびＰ３のそれぞれによって提供される（例えば、内部に含まれている、システインまたは−ＳＨ部分を有している任意のさらなる（修飾）アミノ酸もしくは化合物を介して）。したがって、−ＳＨ部分がシステインによって提供される場合には、下位式「Ｐ１−Ｓ−Ｓ−Ｐ２」および「Ｐ２−Ｓ−Ｓ−Ｐ３」はまた、「Ｐ１−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐ２」および「Ｐ２−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐ３」とも書くことができる。ここで、用語「Ｃｙｓ−Ｃｙｓ」は、ペプチド結合を介してではなく、ジスルフィド結合を介して結合している２つのシステインを表す。この場合、上記式中の用語「−Ｓ−Ｓ−」は、「−Ｓ−Ｃｙｓ」「−Ｃｙｓ−Ｓ」または「−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−」と書くこともできる。この文脈において、用語「−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−」は、ペプチド結合を表していない。そうではなく、−ＳＨ部分を介してジスルフィド結合を形成している、２つのシステインの結合を表す。したがって、用語「−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−」はまた、一般的に、「−（Ｃｙｓ−Ｓ）−（Ｓ−Ｃｙｓ）−」として理解され得る。この特定の場合において、Ｓは、システインの−ＳＨ部分の硫黄を表す。同様に、用語「−Ｓ−Ｃｙｓ」および「−Ｃｙｓ−Ｓ」は、−ＳＨ含有部分とシステインとの間のジスルフィド結合を表し、「−Ｓ−（Ｓ−Ｃｙｓ）」および「−（Ｃｙｓ−Ｓ）−Ｓ」とも書くことができる。あるいは、親水性ポリマーＰ１およびＰ３は、好ましくは、−ＳＨ部分を有している化合物との化学反応を介して、−ＳＨ部分で修飾され得る。その結果、親水性ポリマーＰ１およびＰ３のそれぞれは、少なくとも１つの−ＳＨ部分を有している。−ＳＨ部分を有している化合物は、例えば、（さらなる）システインまたは−ＳＨ部分を有している任意のさらなる（修飾された）アミノ酸であり得る。このような化合物はまた、任意の非アミノ化合物または部分でもあり得る。この非アミノ化合物または部分は、−ＳＨ部分を含有しているか、または、本明細書に定義されている親水性ポリマーＰ１およびＰ３に−ＳＨ部分を導入し得る。このような非アミノ化合物は、本発明に係る重合性担体の式（４）における親水性ポリマーＰ１およびＰ３に、化学反応または化合物の結合を介して結合し得る。化学反応または化合物の結合の例としては、３−チオプロピオン酸もしくはチオイモランの結合によるもの；アミド形成によるもの（カルボン酸、スルホン酸、アミンなど）；Michael付加によるもの（マレイミド部分、α，β−不飽和カルボニルなど）；クリック・ケミストリーによるもの（アジドもしくはアルキンなど）；アルケン／アルキンのメタセシスによるもの（アルケンもしくはアルキンなど）；イミンもしくはヒドロゾン形成（アルデヒドもしくはケトン、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、アミン）；複合体形成反応（アビジン、ビオチン、Ｇタンパク質）；または、Ｓｎ型置換反応が可能である成分（ハロゲンアルカン、チオール、アルコール、アミン、ヒドラジン、ヒドラジド、スルホン酸エステル、オキシホスホニウム塩など）；または、さらなる成分の結合に利用され得る他の化学部分、が挙げられる。この文脈において特に好ましいＰＥＧ誘導体は、α−メトキシ−ω−メルカプトポリ（エチレングリコール）である。それぞれの場合において、−ＳＨ部分（例えば、システインまたは任意のさらなる（修飾された）アミノ酸もしくは化合物の−ＳＨ部分）は、親水性ポリマーＰ１およびＰ３の末端、または内部にある任意の位置にに存在し得る。本明細書に定義されているように、親水性ポリマーＰ１およびＰ３のそれぞれは、通常は少なくとも１つの−ＳＨ部分を有しており、好ましくは１つの末端に少なくとも１つの−ＳＨ部分を有しているが、２つまたはそれ以上の−ＳＨ部分を含み得る。２つまたはそれ以上の−ＳＨ部分は、本明細書に定義されているさらなる成分との、さらなる結合に使用され得る。さらなる成分は、好ましくは、さらなる機能性ペプチドまたはタンパク質である（例えば、リガンド、アミノ酸成分ＡＡ）または（ＡＡ）ｘ、抗体、細胞貫通性ペプチド、またはエンハンサーペプチド（例えば、ＴＡＴ、ＫＡＬＡ）など）。
【０２９４】
好ましくは、本発明の組成物は、１つ以上のポリカチオンと複合化している本明細書に定義されている少なくとも１つのＲＮＡと、少なくとも１つの遊離ＲＮＡと、を含んでいる。このとき、少なくとも１つの複合体化しているＲＮＡは、好ましくは、少なくとも１つの遊離ＲＮＡと同一である。この文脈において、特に好ましくは、本発明の組成物は、カチオン性もしくはポリカチオン性化合物および／または重合性担体と、好ましくはカチオン性タンパク質またはペプチドと、少なくとも部分的に複合体化している本発明に係るＲＮＡを含んでいる。この文脈において、国際公開第２０１０／０３７５３９号および国際公開第２０１２／１１３５１３号の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。「部分的に」とは、本発明に係る組成物中において、本明細書に定義されているＲＮＡの一部のみが、カチオン性化合物と複合体化しており、本明細書に定義されているＲＮＡ（本発明の（医薬）組成物中に含まれている）の残りの部分は、非複合形態（遊離）であることを意味する。好ましくは、複合体化しているＲＮＡの遊離ＲＮＡに対するモル比は、約０．００１：１〜約１：０．００１から選択される（約１：１など）。より好ましくは、複合体化しているＲＮＡの遊離ＲＮＡに対する比は、本発明の（医薬）組成物中において、約５：１（w/w）〜約１：１０（w/w）から選択され、より好ましくは約４：１（w/w）〜約１：８（w/w）から選択され、より一層好ましくは約３：１（w/w）〜約１：５（w/w）または約１：３（w/w）から選択される。最も好ましくは、本発明の医薬組成物中における、複合体化しているｍＲＮＡの遊離ｍＲＮＡに対する比は、約１：１（w/w）から選択される。
【０２９５】
本発明に係る（医薬）組成物中における複合体化しているＲＮＡは、好ましくは、１ステップにて調製される。このステップでは、本発明に係るＲＮＡを、カチオン性もしくはポリカチオン性化合物および／または重合性担体（好ましくは本明細書に定義されているもの）と、特定の比率で複合体化させて、安定な複合体を形成させる。この文脈において、非常に好ましくは、遊離状態にあるカチオン性もしくはポリカチオン性化合物または重合性担体は、ＲＮＡを複合体化させた後において、複合体化しているＲＮＡの成分中に残存していないか、またはごく微量しか残存していない。したがって、複合体化しているＲＮＡの成分中において、ＲＮＡとカチオン性もしくはポリカチオン性化合物および／または重合性担体との比率は、通常は、ＲＮＡが完全に複合体化され、遊離状態のカチオン性もしくはポリカチオン性化合物または重合性担体が組成物中に残存していないか、またはごく微量しか残存していないような範囲で選択される。
【０２９６】
好ましくは、本明細書に定義されているＲＮＡの、カチオン性もしくはポリカチオン性化合物および／または重合性担体（好ましくは、本明細書に定義されているもの）に対する比率は、約６：１（w/w）〜約０．２５：１（w/w）から選択され、より好ましくは約５：１（w/w）〜約０．５：１（w/w）から選択され、より一層好ましくは約４：１（w/w）〜約１：１（w/w）または約３：１（w/w）〜約１：１（w/w）から選択され、最も好ましくは約３：１（w/w）〜約２：１（w/w）から選択される。あるいは、複合体化しているｍＲＮＡの成分中における、本明細書に定義されているＲＮＡのカチオン性もしくはポリカチオン性化合物および／または重合性担体（好ましくは、本明細書に定義されているもの）に対する比率は、複合体全体の窒素／リン酸比率（Ｎ／Ｐ比率）に基づいて計算することもできる。本発明の文脈において、複合体中にけるＲＮＡ：カチオン性もしくはポリカチオン性化合物および／または重合性担体（好ましくは、本明細書に定義されているもの）の比率に関して、Ｎ／Ｐ比率は、好ましくは約０．１〜１０であり、好ましくは約０．３〜４であり、最も好ましくは約０．５〜２または約０．７〜２である。また、Ｎ／Ｐ比率は、最も好ましくは約０．７〜１．５、約０．５〜１または約０．７〜１であり、さらに最も好ましくは約０．３〜０．９または約０．５〜０．９である。ただし、好ましくは、複合体中のカチオン性またはポリカチオン性化合物は、上述したカチオン性またはポリカチオン性のタンパク質もしくはペプチドおよび／または重合性担体である。
【０２９７】
他の実施形態において、本明細書に定義されているＲＮＡを含んでいる本発明に係る組成物は、さらなるビヒクル、形質転換剤または複合体化剤を伴わずに、それのみで投与し得る。
【０２９８】
理解し認識されるべきことには、本発明によれば、本発明の組成物は、本明細書に定義されている裸のＲＮＡの少なくとも１つ（好ましくは、ｍＲＮＡ）、および／または、本明細書に定義されている製剤化／複合体化されているＲＮＡ（好ましくは、ｍＲＮＡ）の少なくとも１つ、を含み得る。このとき、上記に記載されている全ての製剤化および／または複合体化を使用し得る。
【０２９９】
（医薬）組成物が２つ以上のＲＮＡ種を含んでいる実施形態において、これらのＲＮＡ種は、例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、またはそれ以上の別々の組成物として提供され得る。このとき、これらの組成物は、それぞれ、少なくとも１つのＲＮＡ種を含み得（例えば、３つの別個のｍＲＮＡ種）、それぞれのＲＮＡ種は、本明細書に定義されている別個のペプチドもしくはタンパク質、またはその断片あるいはバリアントをコードしている。これらの組成物は、組合されていてもよいし、組合されていなくてもよい。また、（医薬）組成物は、少なくとも２つの異なる組成物の組合せであってもよい。このとき、各組成物は、本明細書に定義されているペプチドまたはタンパク質の少なくとも１つをコードしている、少なくとも１つのｍＲＮＡを含んでいる。あるいは、（医薬）組成物は、各々が本明細書に定義されているペプチドまたはタンパク質の１つをコードしている、少なくとも１つのｍＲＮＡの組合せとして提供され得る（好ましくは、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、またはそれ以上のｍＲＮＡの組合せ）。（医薬）組成物を、その使用に先立って組み合わせて、１つの単一の組成物を提供してもよい。あるいは、（医薬）組成物を、１回以上の投与が必要なるように使用して、本明細書に定義されているタンパク質の特定の組合せをコードしている異なるｍＲＮＡ種を投与してもよい。（医薬）組成物が、本明細書に定義されているペプチドまたはタンパク質の組合せをコードしている少なくとも１つのｍＲＮＡ分子（通常は、少なくとも２つのｍＲＮＡ分子）を含有している場合には、当該（医薬）組成物を、例えば、１回の単回投与（全てのｍＲＮＡ種が組合せられている）にて投与してもよいし、少なくとも２回の別々の投与によって投与してもよい。したがって、ペプチドまたはタンパク質（または、本明細書に定義されているペプチドもしくはタンパク質（および、任意で、さらなるタンパク質）の任意の組合せ）をコードしているモノシストロン性ｍＲＮＡ、ビシストロン性ｍＲＮＡ、またはマルチシストロン性ｍＲＮＡの任意の組合せを、別々の実体（１つのｍＲＮＡ種を含有している）として提供してもよいし、組合せた実体（２つ以上のｍＲＮＡ種を含有している）として提供してもよいことが、本発明の（医薬）組成物として理解される。（医薬）組成物の特に好適な実施形態によれば、当該（医薬）組成物に全体としてコードされている、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質（好ましくは、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つまたはそれ以上のペプチドまたはタンパク質の組合せ）は、個別に投与される個々のｍＲＮＡ（モノシストロン性ｍＲＮＡ）として提供される。
【０３００】
本発明に係る（医薬）組成物は、液体形態および／または乾燥形態（例えば、凍結乾燥形態）で提供され得る。
【０３０１】
（医薬）組成物は、通常、本明細書に定義されている本発明に係るＲＮＡの、安全かつ有効な量を含んでいる。このＲＮＡは、本明細書に定義されているペプチドもしくはタンパク質、またはその断片もしくはバリアント、またはペプチドもしくはタンパク質の組合せをコードしている（好ましくは、本明細書に定義されているもの）。明細書において用いられるとき、「安全かつ有効な量」は、本明細書中で定義されているような疾病または障害の、良い方向への変更を著しく誘導するのに充分なＲＮＡの量を意味する。しかし、同時に、「安全かつ有効な量」は、重大な副作用を回避するためには、充分に少ない。すなわち、利点とリスクとの間に、実際的な関係が成り立ち得る。これらの限界の決定は、通常は、常識的な医学的判断の範疇にある。本発明の（医薬）組成物に関して、「安全かつ有効な」との表現は、好ましくは、コードされているタンパク質の適切な発現レベルを得るのに適したＲＮＡの量（すなわち、コードされているペプチドまたはタンパク質の量）を意味する。本明細書に定義されている（医薬）組成物のＲＮＡの、上記のような「安全かつ有効な量」は、ＲＮＡの種類に応じてさらに選択され得る（例えば、モノシストロン性ＲＮＡ、ビシストロン性ＲＮＡ，マルチシストロン性ＲＮＡ）。なぜならば、ビシストロン性ＲＮＡまたはマルチシストロン性ＲＮＡは、同量のモノシストロン性ＲＮＡの使用と比較して、コードされているタンパク質の顕著に高い発現をもたらし得るためである。さらに、上記で定義された（医薬）組成物のＲＮＡの「安全かつ有効な量」は、（i）処置されるべき特定の状態、（ii）処置されるべき患者の年齢および身体状態、（iii）状態の重症度、（iv）処置の期間、（v）付随する処置の性質、（vi）使用される具体的な薬学的に許容可能な担体、ならびに、（vii）それらと類似の因子に関連して、医師の有している知識および経験の範囲内で変わり得る。本発明に係る（医薬）組成物は、ヒトおよび獣医学的目的のために、本発明にしたがって使用し得る。
【０３０２】
好適な実施形態において、本発明に係る（医薬）組成物またはパーツのキットのＲＮＡは、凍結乾燥形態で提供される。好ましくは、凍結乾燥されたＲＮＡは、投与前に、適切な緩衝液中にて（有利には、水性担体に基づいて）再構成される。適切な緩衝液の例としては乳酸リンゲル溶液が挙げられ、好ましくはリンゲル溶液、リン酸緩衝液である。好適な実施形態において、本発明に係る（医薬）組成物またはパーツのキットは、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つまたはそれ以上のＲＮＡ（好ましくは、ｍＲＮＡ）を含んでいる。これらのＲＮＡは、凍結乾燥形態にて別々に提供され（任意で、少なくとも１つのさらなる添加剤と共に）、好ましくは、使用前に適切な緩衝液（乳酸リンゲル溶液など）中にて別々に再構成される。これによって、（モノシストロン性）ＲＮＡのそれぞれを、個別に投与することができる。
【０３０３】
本発明に係る（医薬）組成物は、通常は、薬学的に許容可能な担体を含み得る。本明細書において用いられるとき、「薬学的に許容可能な担体」という表現は、好ましくは、組成物の基剤（液体または非液体）を含んでいる。組成物が液体の状態で提供される場合、担体は、水（通常は、発熱物質を含んでいない水）；等張な生理食塩水または（水性）緩衝液（例えば、リン酸塩、クエン酸塩などの緩衝液）である。特に、（医薬）組成物の注射のためには、水、または好ましくは緩衝液、より好ましくは水性緩衝液を用い得る。これらの液体は、ナトリウム塩（好ましくは、少なくとも５０ｍＭのナトリウム塩）、カルシウム塩（好ましくは少なくとも０．０１ｍＭのカルシウム塩）、および、任意構成でカリウム塩（好ましくは、少なくとも３ｍＭのカリウム塩）を含有している。好適な実施形態によれば、ナトリウム塩、カルシウム塩、および任意構成のカリウム塩は、ハロゲン化物の形態（例えば、塩化物、ヨウ化物または臭化物）、水酸化物の形態、炭酸塩の形態、炭酸水素塩の形態、または硫酸塩の形態などで存在し得る。これらに限定されるものではないが、ナトリウム塩の例としては、ＮａＣｌ、ＮａＩ、ＮａＢｒ、Ｎａ２ＣＯ３、ＮａＨＣＯ３、Ｎａ２ＳＯ４が挙げられる。任意構成であるカリウム塩の例としては、ＫＣｌ、ＫＩ、ＫＢｒ、Ｋ２ＣＯ３、ＫＨＣＯ３、Ｋ２ＳＯ４が挙げられる。カルシウムの例としては、ＣａＣｌ２、ＣａＩ２、ＣａＢｒ２、ＣａＣＯ３、ＣａＳＯ４、Ｃａ（ＯＨ）２が挙げられる。また、上記カチオンの有機アニオンを、緩衝液に含有させてもよい。より好適な実施形態によれば、上記に定義されている注射目的に適した緩衝液は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、および任意構成の塩化カリウム（ＫＣｌ）から選択される塩を含有してもよい。このとき、塩化物に加えて、さらなるアニオンが存在してもよい。ＣａＣｌ２は、他の塩（ＫＣｌなど）で置き換え得る。通常、注射用緩衝液中の塩の濃度は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が少なくとも５０ｍＭ、塩化カリウム（ＫＣｌ）が少なくとも３ｍＭ、および、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）が少なくとも０．０１ｍＭである。注射用緩衝液は、特定の参照媒体に対して、高張、等張または低張であり得る。すなわち、緩衝液は、特定の参照媒体に対して、塩の含有量がより高くてもよく、同一であってもよく、またはより低くてもよい。好ましくは、そのような濃度の前述の塩が使用されてもよく、この塩の濃度によって、浸透圧または他の濃度効果による細胞にダメージを及ぼさない。参照媒体は、例えば、in vivoの方法により生じる液体である（血液、リンパ液、細胞質基質液、または他の体液など）。あるいは、参照媒体は、例えば、in vitroの方法において参照媒体として使用され得る液体である（一般的な緩衝液または液体など）。このような一般的な緩衝液または液体は、当業者に公知である。乳酸リンゲル溶液は、液体基剤として特に好ましい。
【０３０４】
しかし、ヒトへの投与に適切な、少なくとも１つの適合性のある固体、液体充填材、稀釈剤あるいはカプセル化合物も、使用され得る。本明細書において用いられるとき、用語「適合性」が意味するのは、通常の使用条件において、本発明に係る（医薬）組成物の薬学的有効性を実質的に低下させる相互作用を起こさないように、本発明に係る組成物の成分と、本明細書に定義されている本発明に係るＲＮＡとを混合し得ることである。薬学的に許容可能な担体、充填剤および稀釈剤は、もちろん、処置されるべきヒトへの投与に適したものとするために、純度が充分に高く、かつ毒性が充分に低くなければならない。薬学的に許容可能な担体、充填剤またはその構成成分として使用し得る化合物のいくつかの例としては、以下が挙げられる。糖（ラクトース、グルコース、トレハロースおよびスクロースなど）；デンプン（コーンスターチまたはジャガイモデンプン）；デキストロース；セルロースおよびその誘導体（カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、酢酸セルロースなど）；トラガカント粉末；麦芽；ゼラチン；獣脂；固体滑剤（ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウムなど）；硫酸カルシウム；植物油（落花生油、綿実油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、およびカカオ属由来の油など）；ポリオール（ポリプロピレングリコール、グリセロール、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコールなど）；アルギン酸。
【０３０５】
薬学的に許容可能な担体の選択は、原則として、本発明に係る医薬組成物が投与される方法によって決定される。（医薬）組成物は、例えば、全身的または局部的に投与され得る。全身的な投与のための経路の例としては、一般的に、経皮経路、経口経路、非経口経路が挙げられる。非経口経路の例としては、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射、動脈内注射、皮内注射および腹腔内注射および／または鼻腔内投与経路が挙げられる。局部的な投与のための経路の例としては、一般的に、局所投与経路に加えて、皮内注射、経皮注射、皮下注射もしくは筋肉内注射、または病巣内注射、頭蓋内注射、肺内注射、心内注射および舌下注射が挙げられる。より好ましくは、本発明に係る（医薬）組成物は、皮内経路、皮下経路または筋肉内経路によって投与され得る。好ましくは、この投与は注射による（無針および／または針注射であり得る）。したがって、（医薬）組成物は、好ましくは、液体または固体の形態で製剤化されている。本発明に係る（医薬）組成物の投与すべき適切な量は、通常の実験（例えば、動物モデルを用いること）によって決定し得る。このようなモデルとしては、ウサギモデル、ヒツジモデル、マウスモデル、ラットモデル、イヌモデルおよび非ヒト霊長類モデルが挙げられるが、これらに限定されない。注射のための好ましい単位用量形態の例としては、水、生理食塩水、またはそれらの混合物の滅菌溶液が挙げられる。このような水溶液のｐＨは、約７．４に調整されるべきである。注射に適した担体の例としては、ヒドロゲル、制御放出または遅延放出のためのデバイス、ポリ乳酸、およびコラーゲンマトリクスが挙げられる。局所適用用の適切な薬学的に許容可能な担体の例としては、ローション、クリーム、ゲルなどでの使用に適したものが挙げられる。（医薬）組成物を経口投与する場合には、錠剤、カプセルなどが好ましい単位用量形態である。経口投与用に使用され得る単位用量形態を調製するための薬学的に許容可能な担体は、先行技術において周知である。このような担体の選択は、二次的な事項によりけりである（味、コストおよび貯蔵性など）。これらの事項は、本発明の目的にとって重要ではなく、当業者によって困難なく調製され得る。
【０３０６】
（医薬）組成物に含まれ得るさらなる添加剤は、乳化剤（例えば、Tween）；湿潤剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム；着色料；矯味剤、薬学的担体；錠剤形成剤；安定剤；抗酸化剤；防腐剤である。
【０３０７】
好適な実施形態において、本発明に係る（医薬）組成物は、本発明に係るＲＮＡに加えて、さらなる薬学的有効成分を含んでいる。好ましくは、さらなる薬学的有効成分は、本明細書に定義されている肝疾患の処置または予防における使用のための適切な化合物から選択される。
【０３０８】
本明細書に定義されている（医薬）組成物はまた、任意の経口的に許容される剤型で経口投与され得る。このような剤型の例としては、カプセル、錠剤、水性懸濁液または溶液が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３０９】
（医薬）組成物はまた、局所的に投与され得る。適切な局所製剤は、各領域または各臓器に対して容易に調製される。局所適用のために、（医薬）組成物は、適切な軟膏に製剤化され得る。この軟膏は、少なくとも１つの担体中に懸濁または溶解している、本発明に係るＲＮＡを含んでいる。
【０３１０】
本発明の上記の態様の好適な実施形態によれば、本発明に係る（医薬）組成物は、非経口経路を介して（好ましくは、注射によって）投与される。好ましくは、本発明の組成物は、皮内注射、皮下注射または筋肉内注射によって投与される。当該分野で公知の任意の適切な注射技術が使用され得る（例えば、従来の針注射、またはジェット注射など無針注射技術）。
【０３１１】
一実施形態において、（医薬）組成物は、本明細書に定義されているＲＮＡの、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つまたはそれ以上を含んでおり、各ＲＮＡは別々に注射される（好ましくは、無針注射によって）。あるいは、（医薬）組成物は、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つまたはそれ以上のＲＮＡを含んでおり、その中の少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つまたはそれ以上のＲＮＡは、混合物として投与される（好ましくは、本明細書に定義されている注射によって）。
【０３１２】
本明細書に定義されているＲＮＡまたは本発明に係る（医薬）組成物の投与は、時間差を置いた処置として実施し得る。時間差を置いた処置は、例えば、疾患または障害（好ましくは、本明細書に記載のもの）に対する従来の処置の前、従来の処置と同時、および／または従来の処置の後における、ＲＮＡまたは組成物の投与であり得る。この投与は、例えば、本明細書に記載の疾患または障害の処置または予防に適した処置または処置剤の投与の前、同時および／または後における、ＲＮＡまたは組成物の投与によるものである。このような時間差を置いた処置は、例えば、キット（好ましくは、本明細書に定義されているパーツのキット）を用いて実施し得る。
【０３１３】
時間差を置いた処置は、付加的または代替的に、本明細書に定義されているＲＮＡまたは本発明に係る（医薬）組成物を、以下のような投与の形態を含む。すなわち、本明細書に定義されているペプチドもしくはタンパク質をコードしているＲＮＡまたはその断片もしくはバリアント（好ましくは、組成物の一部を形成している）が、上記に定義されているペプチドまたはタンパク質をコードしている他のＲＮＡ（好ましくは、同じ本発明の組成物の一部を形成する）と、同時に、前にまたは後に投与されるような形態である。好ましくは、（全てのＲＮＡの）投与は１時間以内に行われ、より好ましくは３０分以内に行われ、より一層好ましくは１５分以内、１０分以内、５分以内、４分以内、３分以内または２分以内、さらには１分以内に行われる。このような時間差を置いた処置は、例えばキット（好ましくは、本明細書に定義されているパーツのキット）を用いて実施し得る。
【０３１４】
さらなる態様によれば、本発明はまた、キット（特に、パーツのキット）を提供する。このようなキット（特に、パーツのキット）は、通常は、１つの構成要素として（またはさらなる構成要素との組合せとして）、本明細書に定義されている少なくとも１つの本発明のＲＮＡ種、または本発明に係るＲＮＡを含んでいる本発明の（医薬）組成物を含んでいる。本明細書に定義されている少なくとも１つのＲＮＡは、本明細書に定義されているさらなる構成要素と任意的に組合せられる。それによって、少なくとも１つのＲＮＡ（キットの第１部分）は、当該キットの少なくとも１つの他の部分とは別々に提供される（他の部分は、少なくとも１つの他の構成要素を含んでいる）。（医薬）組成物は、キットの１つの部分または異なる部分に存在し得る。一例として、キットの少なくとも一部は、本明細書に定義されている少なくとも１つのＲＮＡを含み得、当該キットの少なくとも１つのさらなる部分は、本明細書に定義されている他の構成要素を含み得る。例えば、キットの少なくとも１つの他の部分は、少なくとも１つの（医薬）組成物またはその一部を含み得る。例えば、キットの少なくとも１つの部分は、（i）本明細書に定義されているＲＮＡ、（ii）本明細書に定義されているキットの少なくとも１つのさらなる部分、（iii）（医薬）組成物の全体または部分を構成している、本明細書に定義されているキットの少なくとも１つのさらなる部分、および、（iv）キットの少なくとも１つのさらなる部分（例えば、少なくとも１つの薬学的担体またはビヒクルなど）、を含み得る。キットまたはパーツのキットが本明細書に記載の複数のＲＮＡを含んでいるとき、キットの１つの構成要素は、キットに含まれているＲＮＡを、１つだけ、複数、または全て含み得る
他の実施形態において、全ての／それぞれのＲＮＡ種は、キットの異なる／別々の構成要素に含まれ得る（このとき、各構成要素はキットの一部を形成している）。また、本明細書に定義されている２つ以上のＲＮＡは、キットの一部として、第１構成要素に含まれ得る。一方、キットの他の部分の少なくとも１つを提供する、少なくとも１つの他の構成要素（第２構成要素、第３構成要素など）は、本明細書に定義されているＲＮＡの１つ以上を含み得る。他の構成要素に含まれているＲＮＡは、第１構成要素と同一であっても、部分的に同一であっても、異なっていてもよい。キットまたはパーツのキットは、技術説明書をさらに含み得る。この技術説明書には、本発明に係るＲＮＡ、本発明の（医薬）組成物、または上記キットの任意の構成要素もしくは部品の、投与および用量に関する情報が含まれている（例えば、当該キットがパーツのキットとして準備される場合には）。
【０３１５】
さらなる態様において、本発明はさらに、本発明に係るＲＮＡ、（医薬）組成物またはパーツのキットの、いくつかの適用および使用を提供する。特に、本発明は、本発明に係るＲＮＡの医学的使用を提供する。さらに、本発明に係るＲＮＡ、（医薬）組成物、または本発明に係るパーツのキットの利用は、遺伝子療法において想定されている。
【０３１６】
特定の一態様によれば、本発明は、医薬として本明細書に定義されている、（i）本発明に係るＲＮＡ、（ii）本発明に係る（医薬）組成物、または、（iii）本発明に係るＲＮＡもしくは複数の本発明のＲＮＡを含んでいるキットもしくはパーツのキットの、第一医薬用途に関する。上記の第一医薬用途は、特に遺伝子療法における用途であり、好ましくは本明細書に定義されている肝疾患または障害の処置または予防のための用途である。
【０３１７】
他の態様によれば、本発明は、（i）本発明に係るＲＮＡ、（ii）（医薬）組成物、または、（iii）本明細書に定義されている本発明に係るＲＮＡもしくは複数の本発明のＲＮＡを含んでいるキットもしくはパーツのキットの、本明細書に定義されている肝疾患または障害の処置または予防のための、第二医薬用途に関する。好ましくは、本発明は、本明細書に定義されている肝疾患または障害を予防、処置および／または回復する医薬の調製のための、（i）本明細書に定義されているＲＮＡ、（ii）（医薬）組成物、または、（iii）本明細書に定義されている本発明に係るＲＮＡを含んでいるキットもしくはパーツのキットの使用に関する。好ましくは、上記の目的のために、それを必要とする患者において医薬組成物を投与するか、または当該患者に対して医薬組成物を投与する。
【０３１８】
さらなる態様によれば、本発明に係るＲＮＡまたは本発明に係るＲＮＡを含んでいる（医薬）組成物は、医薬の製造に使用される。この医薬は、好ましくは、本明細書に定義されている肝疾患または障害の処置または予防のためのものである。
【０３１９】
本発明の好適な実施形態において、本明細書に記載のＲＮＡ、（医薬）組成物、またはキットもしくはパーツのキットは、肝疾患の処置または予防における使用のために提供される。したがって、本発明は、少なくとも１つのコード配列を含んでいるＲＮＡであって、当該コード配列が本明細書に記載の少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質をコードしている、肝疾患の処置または予防における使用のためのＲＮＡに関連する。好ましくは、少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質は、細胞外マトリクスプロテアーゼ、ＣＣＡＡＴ／エンハンサ−結合タンパク質α（CEBPA）、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（TRAIL）、肝細胞核因子４α（HNF4A）、線維芽細胞増殖因子２１（FGF21）、オピオイド増殖因子受容体様１（OGFRL1）、肝細胞増殖因子（HGF）、リラキシン１（RLN1）、リラキシン２（RLN2）およびリラキシン３（RLN3）からなる群から選択されるペプチドもしくはタンパク質、または当該ペプチドもしくはタンパク質のいずれかの断片もしくはバリアントを含んでいるか、またはそれらからなる。あるいは、本発明は、本発明に係るＲＮＡを含んでいる、肝疾患の処置または予防における使用のための（医薬）組成物またはキットもしくはパーツのキットに関連する。
【０３２０】
本明細書において用いられるとき、用語「肝疾患」または「肝障害」は、通常は、肝臓組織の構造的変化または損傷に関連する任意の状態か、またはそれを導く任意の状態（特に、肝臓の線維症を導く任意の状態）に関する。特に、本明細書において用いられるとき、「肝疾患（肝線維症または肝硬変など）」とは、肝結合組織の過剰産生を特徴とする（特に、細胞外マトリクス（ECM）タンパク質の蓄積による）、慢性疾患である。好ましくは、肝疾患は、活性化肝星細胞（HSC）によって引き起こされる。肝結合組織の過剰産生および／または細胞外マトリクス（ECM）タンパク質の蓄積のプロセスはまた、「線維症」とも呼ばれ得る。本明細書中で扱われている肝疾患はまた、「線維性肝疾患」とも呼ばれ得る。
【０３２１】
本発明の文脈において、用語「肝疾患」はまた、好ましくは、肝臓組織の線維症を引き起こし得る疾患または障害、および潜在的に肝線維症をもたらす疾患または障害を表す。このような疾患または障害の例としては、感染症（例えば、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎またはＤ型肝炎）、自己免疫疾患（例えば、原発性胆汁性肝硬変または自己免疫性肝炎）、遺伝子性／遺伝性疾患（遺伝性ヘモクロマトーシス、ウィルソン病、嚢胞性線維症、糖尿病）、代謝性疾患および／または食事に関連する疾患（肥満、糖尿病、アルコール乱用、アルコール性肝疾患、非アルコール性脂肪肝（NAFLD）、もしくは非アルコール性脂肪性肝炎（NASH））、癌性または腫瘍性疾患（例えば、肝細胞がん（HCC））、または他の疾患（胆石、バッド＝キアリ症候群、または原発性硬化性胆管胆炎など）が挙げられる。
【０３２２】
好適な実施形態において、本発明に係るＲＮＡは、肝疾患の処置または予防における使用のために提供される。この肝疾患は、好ましくは、肝線維症、肝硬変および肝がんからなる群から選択される。好適な実施形態において、本発明に係るＲＮＡは、肝細胞がん（HCC）の処置または予防における使用のために提供される。最も好ましくは、本発明に係るＲＮＡは、肝線維症または肝硬変の処置または予防における使用のために提供される。
【０３２３】
好適な実施形態において、本明細書に記載のＲＮＡまたは（薬学的）組成物は、肝疾患の処置または予防のために提供される。この提供は、ＲＮＡの標的化送達を含む。好ましくは、哺乳類の被験体に投与する際に、ＲＮＡは肝臓に標的化されている。本発明に係るＲＮＡの標的化送達は、好ましくは、当該ＲＮＡを適切な方法で製剤化することによって達成される（例えば、本明細書に記載のリポソームまたは脂質ナノ粒子として）、および／または、本発明に係るＲＮＡまたは（薬学的）組成物を適切な経路を介して投与することによって達成される。
【０３２４】
好ましくは、本明細書に記載の肝疾患の処置または予防は、任意の適切な方法における、本発明に係るＲＮＡまたは（医薬）組成物の投与を含む。好ましくは、上記任意の適切な方法は、（医薬）組成物に関して本明細書に記載されている方法である。（医薬）組成物の説明は、それが適切である場合には、本発明に係るＲＮＡの医学的使用にも適用される。
【０３２５】
好ましい態様において、処置または予防は、本発明に係るＲＮＡまたは本発明に係る（医薬）組成物と組合された、さらなる薬学的有効成分の投与を含む。好ましくは、さらなる薬学的有効成分は、本明細書に定義されている肝疾患または障害の処置または予防における使用に適した化合物から選択される。
【０３２６】
本発明はまた、本発明に係るＲＮＡまたは医薬組成物の薬学的に有効な量を、それを必要とする被験体に投与することによって、疾患または障害を処置または予防する方法を包含している。上記疾患または障害は、好ましくは、本明細書に定義されている肝疾患または障害である。このような方法は、通常、（i）本発明のＲＮＡまたは組成物を調製する第１工程（任意構成）と、（ii）当該組成物（の薬学的に有効な量）を、それを必要とする患者／被験体に投与することを含む第２工程と、を含む。それを必要とする被験体は、通常、哺乳類である。本発明の文脈において、好ましくは、哺乳類は以下を含む群から選択されるが、これに限定されるものではない：例えば、ヤギ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、ロバ、サル、類人猿、齧歯類（マウス、ハムスター、ウサギなど）、および、特にヒト。これらの哺乳類は、通常、疾患または障害に苛まれている（好ましくは、本明細書に定義されている肝疾患または障害に苛まれている）。
【０３２７】
さらなる態様によれば、本発明はまた、本明細書に記載のペプチドまたはタンパク質の発現を増強させるための方法を提供する。この方法は、例えば、以下の工程を含む。ａ）本明細書に定義されているＲＮＡまたは本明細書に定義されている（医薬）組成物を提供すること；ｂ）ＲＮＡまたは組成物を、発現系（例えば、無細胞発現系）、細胞（例えば、発現宿主細胞もしくは体細胞）、組織または生物に適用または投与すること。この方法は、実験室用、研究用、診断用、ペプチドまたはタンパク質の商業生産用、および／または処置用に適用し得る。この文脈において、通常はＲＮＡまたは組成物を調製した後に、当該ＲＮＡまたは組成物は、通常は、無細胞発現系、細胞（例えば、発現宿主細胞または体細胞）、組織または生物に対して、適用または投与される。この適用または投与は、例えば、裸の形態もしくは複合体化された形態、または本明細書に記載の（医薬）組成物として行われる。この適用または投与は、好ましくは、形質転換を介して行われるか、または本明細書に記載の投与方法のいずれかを使用することによって行われる。この方法は、in vitro、in vivoまたはex vivoで実施し得る。この方法はさらに、特定の疾患（好ましくは本明細書に定義されている疾患）の処置の文脈において実施され得る。
【０３２８】
この文脈において、in vitroは、本明細書において、生体外で培養されている細胞内への、本発明に係るＲＮＡまたは組成物の形質転換または形質導入と定義される。in vivoは、本明細書において、生体または個体全体に対するＲＮＡまたは組成物の適用による、細胞内への本発明に係るＲＮＡまたは組成物の形質転換または形質導入と定義される。ex vivoは、本明細書において、生体または個体の外部にある細胞内への本発明に係るＲＮＡまたは組成物の形質転換または形質導入、および、それに引き続く形質転換された細胞の生体または個体への適用と定義される。
【０３２９】
同様に、他の態様によれば、本発明はまた、本明細書に記載のペプチドまたはタンパク質の発現を増強させるための、本発明に係るＲＮＡまたは組成物の使用を提供する。この使用は、好ましくは、診断または処置を目的とする。この使用は、特に、遺伝子療法におけるものである。この使用は、例えば、ＲＮＡまたは組成物を、例えば、無細胞発現系、細胞（例えば、発現宿主細胞または体細胞）、組織または生物に対して、適用または投与することによるものである。この使用は、実験室用、研究用、診断用、ペプチドまたはタンパク質の商業生産用、および／または処置用（好ましくは、遺伝子療法用）に適用し得る。この文脈において、通常は本発明に係るＲＮＡまたは組成物を調製した後に、当該ＲＮＡまたは組成物は、通常は、無細胞発現系、細胞（例えば、発現宿主細胞または体細胞）、組織または生物に対して、適用または投与される。この適用または投与は、好ましくは、裸の形態もしくは複合体化された形態、または本明細書に記載の（医薬）組成物として行われる。この適用または投与は、好ましくは、形質転換を介して行われるか、または本明細書に記載の投与方法のいずれかを使用することによって行われる。この使用は、in vitro、in vivoまたはex vivoで実施し得る。この使用はさらに、特定の疾患（好ましくは本明細書に定義されている肝疾患または障害）の処置の文脈において実施され得る。
【０３３０】
さらに他の態様において、本発明はまた、本発明に係るＲＮＡを含んでいる本発明の発現系に関する。あるいは、本発明は、本発明の第１の態様に係る対応する核酸配列を含んでいる発現ベクターもしくはプラスミドに関する。この文脈において、発現系は、無細胞発現系（例えば、in vitroの転写／翻訳系）、細胞発現系（例えば、哺乳類細胞（CHO細胞など）、昆虫細胞、酵母細胞、細菌細胞（E. coliなど））、または、ペプチドもしくはタンパク質の発現のために使用される生物（例えば、植物または動物（ウシなど））であり得る。
【０３３１】
〔項目〕
１．少なくとも１つのコード配列を含んでおり、
上記コード配列は、細胞外マトリクスプロテアーゼ、ＣＣＡＡＴ／エンハンサ−結合タンパク質α（CEBPA）、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（TRAIL）、肝細胞核因子４α（HNF4A）、線維芽細胞増殖因子２１（FGF21）、オピオイド増殖因子受容体様１（OGFRL1）、リラキシン１（RLN1）、リラキシン２（RLN2）およびリラキシン３（RLN3）、またはそれらのペプチドもしくはタンパク質のうちいずれかの断片もしくはバリアントからなる群から選択される少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質をコードする、肝疾患の処置または予防における使用のための、ＲＮＡ。
【０３３２】
２．上記ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ウイルスＲＮＡまたはレプリコンＲＮＡである、項目１に記載の使用のためのＲＮＡ。
【０３３３】
３．上記ＲＮＡ、好ましくは上記コード配列は、化学修飾された糖、化学修飾された骨格または化学修飾された核酸塩基を含んでいない、項目１または２に記載の使用のためのＲＮＡ。
【０３３４】
４．上記ＲＮＡは、化学修飾されたヌクレオシドまたはヌクレオチドを含んでいない、項目３に記載の使用のためのＲＮＡ。
【０３３５】
５．上記ＲＮＡは化学修飾されていない、項目３または4に記載の使用のためのＲＮＡ。
【０３３６】
６．上記肝疾患は、肝線維症、肝硬変および肝がんからなる群から選択される、項目１〜５のいずれか１項に記載の使用のためのＲＮＡ。
【０３３７】
７．上記ペプチドまたはタンパク質は、細胞外マトリクスプロテアーゼまたはその断片もしくはバリアントを含んでいる、項目１〜６のいずれか１項に記載の使用のためのＲＮＡ。
【０３３８】
８．上記細胞外マトリクスプロテアーゼが、細菌コラゲナーゼおよび哺乳類基質メタロプロテイナーゼからなる群から選択される、項目７に記載の使用のためのＲＮＡ。
【０３３９】
９．上記細胞外マトリクスプロテアーゼは、基質メタロプロテイナーゼ−１、好ましくはヒト基質メタロプロテイナーゼ−１、クロストリジウムコラゲナーゼColGおよびクロストリジウムコラゲナーゼColHから選択される、項目７または８に記載の使用のためのＲＮＡ。
【０３４０】
１０．上記ペプチドまたはタンパク質は、配列番号２０〜２８からなる群から選択されるアミノ酸配列、または当該アミノ酸配列のいずれか１つの断片もしくはバリアントを含んでいる、項目７〜９のいずれか１項に記載の使用のためのＲＮＡ。
【０３４１】
１１．上記ペプチドまたはタンパク質は、ＣＣＡＡＴ／エンハンサ−結合タンパク質α（CEBPA）、好ましくはヒトCEBPA、またはその断片もしくはバリアントを含んでいる、項目１〜６のいずれか１項に記載の使用のためのＲＮＡ。
【０３４２】
１２．上記ペプチドまたはタンパク質は、配列番号８〜１３からなる群から選択されるアミノ酸配列、または当該アミノ酸配列のいずれか１つの断片もしくはバリアントを含んでいる、項目１１に記載の使用のためのＲＮＡ。
【０３４３】
１３．上記ペプチドまたはタンパク質は、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（TRAIL）、またはその断片もしくはバリアントを含んでいる、項目１〜６のいずれか１項に記載の使用のためのＲＮＡ。
【０３４４】
１４．上記ペプチドまたはタンパク質は、配列番号４〜７からなる群から選択されるアミノ酸配列、または当該アミノ酸配列のいずれか１つの断片もしくはバリアントを含んでいる、項目１３に記載の使用のためのＲＮＡ。
【０３４５】
１５．上記ペプチドまたはタンパク質は、肝細胞核因子４α（HNF4A）、線維芽細胞増殖因子２１（FGF21）、オピオイド増殖因子受容体様１（OGFRL1）、リラキシン１（RLN1）、リラキシン２（RLN2）およびリラキシン３（RLN3）からなる群から選択され、上記ペプチドまたはタンパク質は、好ましくは配列番号１４〜１９からなる群から選択されるアミノ酸配列、または当該アミノ酸配列のいずれか１つの断片またはバリアントを含んでいる、項目１〜６のいずれか１項に記載の使用のためのＲＮＡ。
【０３４６】
１６．上記ＲＮＡの上記少なくとも１つのコード配列は、配列番号３２〜７１からなる群から選択される核酸配列、または当該核酸配列のいずれか１つの断片もしくはバリアントを含んでいる、項目１〜１５のいずれか１項に記載の使用のためのＲＮＡ。
【０３４７】
１７．上記ＲＮＡは、モノシストロン性、ビシストロン性、またはマルチシストロン性である、項目１〜１６のいずれか１項に記載の使用のためのＲＮＡ。
【０３４８】
１８．上記ＲＮＡはｍＲＮＡである、項目１〜１７のいずれか１項に記載の使用のためのＲＮＡ。
【０３４９】
１９．ＲＮＡは、修飾ＲＮＡ、好ましくは安定化ＲＮＡである、項目１〜１８のいずれか１項に記載の使用のためのＲＮＡ。
【０３５０】
２０．上記ＲＮＡの上記少なくとも１つのコード配列のＣ／Ｇ含量は、対応する野生型ＲＮＡの対応するコード配列のＣ／Ｇ含量と比べて多く、
上記ＲＮＡの上記少なくとも１つのコード配列のＣ含量は、対応する野生型ＲＮＡの対応するコード配列のＣ含量と比べて多く、および／または
上記ＲＮＡの上記少なくとも１つのコード配列の少なくとも１つのコドンは、ヒトのコドン使用頻度に適合されており、コドン適合指数（CAI）は、好ましくは上記ＲＮＡの上記少なくとも１つのコード配列において増大されているか、または最大化されており、
上記ＲＮＡによってコードされる上記アミノ酸配列は、好ましくは対応する野生型ＲＮＡによってコードされているアミノ酸配列と比べて改変されていない、項目１〜１９のいずれか１項に記載の使用のためのＲＮＡ。
【０３５１】
２１．上記少なくとも１つのコード配列は、配列番号７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６および４０７からなる群から選択される核酸配列を含んでいる、項目２０に記載の使用のためのＲＮＡ。
【０３５２】
２２．５’−キャップ構造を含んでいる、項目１〜２１のいずれか１項に記載の使用のためのＲＮＡ。
【０３５３】
２３．１０〜２００、１０〜１００、４０〜８０または５０〜７０のアデノシンヌクレオチドを好ましく含んでいるポリ（Ａ）配列および／または１０〜２００、１０〜１００、２０〜７０、２０〜６０または１０〜４０のシチジンヌクレオチドを好ましく含んでいるポリ（Ｃ）配列を、含んでいる、項目１〜２２のいずれか１項に記載の使用のためのＲＮＡ。
【０３５４】
２４．少なくとも１つのヒストンステムループを含んでいる、項目１〜２３のいずれか１項に記載の使用のためのＲＮＡ。
【０３５５】
２５．上記少なくとも１つのヒストンステムループが、以下の式（Ｉ）または（ＩＩ）：
【０３５６】
【化４】
2020501545.tif 000010
【０３５７】
にしたがう核酸配列を含んでおり、
ステム１またはステム２の境界エレメントＮ１−６は、１〜６、好ましくは２〜６、より好ましくは２〜５、より一層好ましくは３〜５、最も好ましくは４〜５または５のＮの連続する配列であり、Ｎのそれぞれは、他のＮから独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、ＧおよびＣから選択されるヌクレオチド、またはそのヌクレオチド類似物から選択され；
ステム１［Ｎ０−２ＧＮ３−５］は、ステム２のエレメントと逆相補的または部分的に逆相補的であり、かつ５〜７のヌクレオチドの間の連続する配列であり；
Ｎ０−２は、０〜２、好ましくは０〜１、より好ましくは１のＮの連続する配列であり、Ｎのそれぞれは、他のＮから独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、ＧおよびＣから選択されるヌクレオチド、またはそのヌクレオチド類似物から選択され；
Ｎ３−５は、３〜５、好ましくは４〜５、より好ましくは４のＮの連続する配列であり、Ｎのそれぞれは、他のＮから独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、ＧおよびＣから選択されるヌクレオチド、またはそのヌクレオチド類似物から選択され、
Ｇは、グアノシンまたはその類似物であり、ステム２におけるその相補的なシチジンヌクレオチドがグアノシンによって置き換えられている条件のもとに、シチジンまたはその類似物に任意に置き換えられ得；
ループ配列［Ｎ０−４（Ｕ／Ｔ）Ｎ０−４）］は、ステム１およびステム２のエレメントの間に配置されており、３〜５のヌクレオチド、より好ましくは４のヌクレオチドの連続する配列であり；
Ｎ０−４のそれぞれは、他のＮから独立して、０〜４、好ましくは１〜３、より好ましくは１〜２のＮの連続する配列であり、Ｎのそれぞれは、他のＮから独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、ＧおよびＣから選択されるヌクレオチド、またはそのヌクレオチド類似物から選択され；
Ｕ／Ｔは、ウリジン、または任意にチミジンを表しており；
ステム２［Ｎ３−５ＣＮ０−２］は、ステム１のエレメントと逆相補的または部分的に逆相補的であり、５〜７のヌクレオチドの間の連続する配列であり；
Ｎ３−５は、３〜５、好ましくは４〜５、より好ましくは４のＮの連続する配列であり、Ｎのそれぞれは、他のＮから独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、ＧおよびＣから選択されるヌクレオチド、またはそのヌクレオチド類似物から選択され；
Ｎ０−２は、０〜２、好ましくは０〜１、より好ましくは１のＮの連続する配列であり、Ｎのそれぞれは、他のＮから独立して、Ａ、Ｕ、Ｔ、ＧおよびＣから選択されるヌクレオチド、またはそのヌクレオチド類似物から選択され；
Ｃは、シチジンまたはその類似物であり、ステム１におけるその相補的なグアノシンヌクレオチドがシチジンに置き換えられている条件のもとに、グアノシンまたはその類似物に任意に置き換えられ得；
ステム１およびステム２は、互いに塩基対形成可能であり、塩基対形成がステム１およびステム２の間に生じ得る逆相補性配列を形成しているか、または不完全な塩基対形成がステム１およびステム２の間に生じ得る部分的な逆相補性配列を形成している、項目２４に記載の使用のためのＲＮＡ。
【０３５８】
２６．上記少なくとも１つのヒストンステムループは、以下の式（Ｉａ）または（ＩＩａ）：
【０３５９】
【化５】
2020501545.tif 000011
【０３６０】
にしたがう核酸配列を含んでいる、項目２４または２５に記載の使用のためのＲＮＡ。
【０３６１】
２７．上記少なくとも１つのヒストンステムループは、配列番号１４５１にしたがう核酸配列、最も好ましくは配列番号１４５２にしたがうＲＮＡ配列を含んでいる、項目２４〜２６のいずれか１項に記載の使用のためのＲＮＡ。
【０３６２】
２８．上記ＲＮＡは、少なくとも１つの３’−非翻訳領域エレメント（３’−ＵＴＲエレメント）を含んでいる、項目１〜２７のいずれか１項に記載の使用のためのＲＮＡ。
【０３６３】
２９．３’−ＵＴＲエレメントは、好ましくは安定なｍＲＮＡをコードする、遺伝子の３’−ＵＴＲ、または当該遺伝子の相同物、断片もしくはバリアントに由来する核酸配列を含んでいる、項目２８に記載の使用のためのＲＮＡ。
【０３６４】
３０．上記３’−ＵＴＲエレメントは、アルブミン遺伝子、α−グロビン遺伝子、β−グロビン遺伝子、チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子、リポキシゲナーゼ遺伝子およびコラーゲンアルファ遺伝子からなる群から選択される遺伝子の３’−ＵＴＲ、またはその相同物、断片もしくはバリアントから選択される核酸配列を含んでいる、項目２９に記載の使用のためのＲＮＡ。
【０３６５】
３１．上記３’−ＵＴＲエレメントは、好ましくは配列番号１４４４したがう核酸配列を含んでいる、α−グロビン遺伝子、その相同物、断片またはバリアントの３’−ＵＴＲに由来する核酸配列を含んでいる、項目２９または３０に記載の使用のためのＲＮＡ。
【０３６６】
３２．上記ＲＮＡは、以下の要素：
a)５’−キャップ構造、好ましくはm7GpppN、
b)項目２１に規定されている通りの、少なくとも１つのコード配列、
c)好ましくは配列番号１４４４にしたがう核酸配列を含んでいる、α−グロビン遺伝子、その相同物、断片もしくはバリアントを含んでいる、３’−ＵＴＲエレメント、
d)好ましくは１０〜２００、１０〜１００、４０〜８０または５０〜７０のアデノシンヌクレオチドからなる、ポリ（Ａ）テイル、
e)好ましくは１０〜２００、１０〜１００、２０〜７０、２０〜６０または１０〜４０のシチジンヌクレオチドからなる、ポリ（Ｃ）テイル、ならびに
f)好ましくは配列番号１４５２にしたがう核酸配列を含んでいる、ヒストンステムループ
を、好ましくは５’から３’方向に、含んでいる、項目１〜３１のいずれか１項に記載の使用のためのＲＮＡ。
【０３６７】
３３．上記ＲＮＡは、配列番号４０８〜７５０からなる群から選択される核酸配列、または当該核酸配列のいずれか１つの断片もしくはバリアントを含んでいる、項目１〜３２のいずれか１項に記載の使用のためのＲＮＡ。
【０３６８】
３４．上記少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメントは、脊椎動物アルブミン遺伝子の３’−ＵＴＲまたはそのバリアント、好ましくは哺乳動物アルブミン遺伝子の３’−ＵＴＲまたはそのバリアント、より好ましくはヒトアルブミン遺伝子の３’−ＵＴＲまたはそのバリアント、より一層好ましくはGenBank Acceession番号NM_000477．5にしたがうヒトアルブミン遺伝子の３’−ＵＴＲまたはその断片もしくはバリアントに由来する核酸配列を含んでいる、項目２９または３０に記載の使用のためのＲＮＡ。
【０３６９】
３５．上記３’−ＵＴＲエレメントは、配列番号１４４８または１４５０にしたがう核酸配列、またはその相同物、断片またはバリアントを含んでいる、項目３４に記載の使用のためのＲＮＡ。
【０３７０】
３６．上記ＲＮＡは、５’−ＵＴＲエレメントを含んでいる、項目１〜３５のいずれか１項に記載の使用のためのＲＮＡ。
【０３７１】
３７．上記５’−ＵＴＲエレメントは、TOP遺伝子の５’−ＵＴＲ、好ましくは対応するＲＮＡ配列、または好ましくは５’−TOPモチーフを欠いている、その相同物、断片もしくはバリアントに由来する核酸配列を含んでいる、項目３６に記載の使用のためのＲＮＡ。
【０３７２】
３８．上記５’−ＵＴＲエレメントは、リボソームタンパク質をコードするTOP遺伝子の５’−ＵＴＲ、好ましくは対応するＲＮＡ配列、または好ましくは５’−TOPモチーフを欠いている、その相同物、断片またはバリアントに由来する核酸配列を含んでいる、項目３７に記載の使用のためのＲＮＡ。
【０３７３】
３９．上記５’−ＵＴＲエレメントは、リボソーム巨大タンパク質（RPL）をコードするTOP遺伝子の５’−ＵＴＲ、または好ましくは５’−TOPモチーフを欠いている、その相同物、断片またはバリアントに由来する核酸配列を含んでいる、項目３７または３８に記載の使用のためのＲＮＡ。
【０３７４】
４０．上記５’−ＵＴＲエレメントは、配列番号１４３２にしたがう核酸配列、またはその相同物、断片またはバリアントを含んでいる、項目３７〜３９のいずれか１項に記載の使用のためのＲＮＡ。
【０３７５】
４１．上記ＲＮＡは、以下の要素：
a)５’−キャップ構造、好ましくはm7GpppN、
b)好ましくは配列番号１４３２に記載の核酸配列を含んでいる、TOP遺伝子の５’−ＵＴＲ、またはその相同体、断片もしくはバリアントを含んでいる核酸配列を含んでいる、または当該核酸配列からなる５’−ＵＴＲエレメント、
c)項目２１に規定されている通りの少なくとも１つのコード配列、
d)α−グロビン遺伝子、またはその相同物、断片もしくはバリアントに由来する核酸配列、好ましくは配列番号１４４４にしたがう核酸配列を含んでいる３’−ＵＴＲエレメント；および／または
アルブミン遺伝子、またはその相同物、断片またはバリアントに由来する核酸配列、好ましくは配列番号１４４８または１４５０にしたがう核酸配列を含んでいる３’−ＵＴＲエレメント、
e)好ましくは１０〜２００、１０〜１００、４０〜８０または５０〜７０のアデノシンヌクレオチドからなる、ポリ（Ａ）テイル、
f)好ましくは１０〜２００、１０〜１００、２０〜７０、２０〜６０または１０〜４０のシトシンヌクレオチドからなる、ポリ（Ｃ）テイル、ならびに
g)好ましくは配列番号１４５２にしたがう核酸配列を含んでいる、ヒストンステムループ
を、好ましくは５’から３’の方向に、含んでいる、項目１〜４０のいずれか１項に記載の使用のためのＲＮＡ。
【０３７６】
４２．上記ＲＮＡは、配列番号７５１〜１０９０からなる群から選択される核酸配列、または当該核酸配列のいずれか１つの断片もしくはバリアントを含んでいる、項目１〜４０のいずれか１項に記載の使用のためのＲＮＡ。
【０３７７】
４３．５’−ＵＴＲエレメントは、HSD17B4遺伝子、好ましくは対応するＲＮＡ配列、またはその相同物、断片もしくはバリアントに由来する核酸配列を含んでいる、項目３６に記載の使用のためのＲＮＡ。
【０３７８】
４４．５’−ＵＴＲエレメントは、配列番号１４３６に記載の核酸配列、またはその相同物、断片もしくはバリアントを含んでいる、項目４３に記載の使用のためのＲＮＡ。
【０３７９】
４５．以下の要素：
a)５’−キャップ構造、好ましくはm7GpppN、
b)好ましくは配列番号１４３６にしたがう核酸配列を含んでいる、HSD17B4遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する核酸配列またはその相同物、断片もしくはバリアントを含んでいる、または当該核酸配列またはその相同物、断片もしくはバリアントからなる、５’−ＵＴＲエレメント、
c)項目２１に規定されている通りの少なくとも１つのコード配列、
d)好ましくは配列番号１４４４にしたがう核酸配列を含んでいる、α−グロビン遺伝子またはその相同物、断片もしくはバリアントに由来する、３’−ＵＴＲエレメント
好ましくは配列番号１４４８または１４５０にしたがう核酸配列を含んでいる、アルブミン遺伝子またはその相同物、断片またはバリアントに由来する核酸配列を含んでいる、３’−ＵＴＲエレメント
e) 好ましくは１０〜２００、１０〜１００、４０〜８０または５０〜７０のアデノシンヌクレオチドからなる、ポリ（Ａ）テイル
を、好ましくは５’〜３’方向に、含んでいる、項目１〜４４のいずれか１項に記載の使用のためのＲＮＡ。
【０３８０】
４６．上記ＲＮＡは、配列番号１０９１〜１４３０からなる群から選択される核酸配列、または当該核酸配列のいずれか１つの断片もしくはバリアントを含んでいる、項目１〜４５のいずれか１項に記載の使用のためのＲＮＡ。
【０３８１】
４７．上記ＲＮＡは、配列番号４０８〜１４３０からなる群から選択される核酸配列、または当該核酸配列のいずれか１つの断片もしくはバリアントを含んでいる、項目１〜４６のいずれか１項に記載の使用のためのＲＮＡ。
【０３８２】
４８．上記ＲＮＡは、少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体と一緒に製剤化されている、項目１〜４７のいずれか１項に記載の使用のためのＲＮＡ。
【０３８３】
４９．上記ＲＮＡは、１つ以上の、カチオン性化合物またはポリカチオン性化合物、好ましくはカチオン性ポリマーまたはポリカチオン性ポリマー、カチオン性ペプチドもしくはポリカチオン性タンパク質またはポリカチオン性ペプチドもしくはポリカチオン性タンパク質（例えばプロタミン）、カチオン性多糖またはポリカチオン性多糖、および／またはカチオン性脂質またはポリカチオン性脂質と複合化されている、項目４８に記載の使用のためのＲＮＡ。
【０３８４】
５０．上記１つ以上のカチオン性ペプチドもしくはポリカチオン性タンパク質またはポリカチオン性ペプチドもしくはポリカチオン性タンパク質に対する、上記ＲＮＡのＮ／Ｐ比率は、約０．３〜４、約０．５〜２、約０．７〜２、および約０．７〜１．５の範囲を包含している約０．１〜１０の範囲である、項目４９に記載の使用のためのＲＮＡ。
【０３８５】
５１．少なくとも１つのＲＮＡは、１つ以上のカチオン性化合物またはポリカチオン性化合物と複合化されており、少なくとも１つのＲＮＡが遊離状態にある、項目４９または５０のいずれか１項に記載の使用のためのＲＮＡ。
【０３８６】
５２．上記少なくとも１つの複合化されているＲＮＡは、上記少なくとも１つの遊離ＲＮＡと同一である、項目５１に記載の使用のためのＲＮＡ。
【０３８７】
５３．上記遊離ＲＮＡに対する、上記複合化されているＲＮＡのモル比は、約１：１の比を含んでいる約０．００１：１〜約１：０．００１のモル比から選択される、項目５１または５２に記載の使用のためのＲＮＡ。
【０３８８】
５４．上記ＲＮＡは、１つ以上の脂質と複合化されており、それによってリポソーム、脂質ナノ粒子および／またはリポプレックスを形成している、項目４８〜５３のいずれか１項に記載の使用のためのＲＮＡ。
【０３８９】
５５．上記ＲＮＡ、または当該ＲＮＡと一緒に製剤化されている薬学的担体は、標的化基によってコンジュゲートを形成している、項目１〜５４のいずれか１項に記載の使用のためのＲＮＡ。
【０３９０】
５６．上記標的化基は、肝臓、好ましくは肝臓マクロファージ、肝星状細胞、肝細胞および／または肝臓類洞内皮細胞（LSEC）への複合体の送達をもたらす、項目５５に記載の使用のためのＲＮＡ。
【０３９１】
５７．上記標的化基は、葉酸、GalNAc、ガラクトース、マンノース、マンノース−6P、アプタマー、インテグリン受容体リガンド、ケモカイン受容体リガンド、トランスフェリン、ビオチン、セロトニン受容体リガンド、PSMA、エンドセリン、GCPII、ソマトスタチン、LDLリガンドおよびHDLリガンドからなる群から選択される、項目５５または５６に記載の使用のためのＲＮＡ。
【０３９２】
５８．上記ＲＮＡは、非経口投与、好ましくは注入によって、それを必要とする対象に投与される、項目１〜５７のいずれか１項に記載の使用のためのＲＮＡ。
【０３９３】
５９．上記処置または予防は、薬剤的に活性な、さらなる成分の投与を含んでいる、項目１〜５８のいずれか１項に記載の使用のためのＲＮＡ。
【０３９４】
６０．項目１〜５９のいずれか１項にしたがって規定されている通りの少なくとも１つのＲＮＡ、および任意に追加の薬学的に許容可能な担体を含んでいる、組成物。
【０３９５】
６１．項目１〜５９のいずれか１項にしたがって規定されている通りの少なくとも１つのＲＮＡまたは項目６０に記載の組成物、任意に可溶化するための液体ビヒクルならびに任意に上記ＲＮＡまたは組成物の投与および用量に関する情報を有している技術的説明書を含んでいる、キット、好ましくはキットの一部。
【０３９６】
６２．上記キットは、リンゲル−乳酸塩溶液を、一部として含んでいる、項目６１に記載のキット。
【０３９７】
６３．遺伝子治療における使用のための、項目１〜５９のいずれか１項にしたがって規定されている通りのＲＮＡ、項目６０に記載の組成物、または項目６１もしくは６２に記載のキット。
【０３９８】
６４．肝疾患の遺伝子治療における使用のための、項目１〜５９のいずれか１項にしたがって規定されている通りのＲＮＡ、項目６０に記載の組成物、または項目６１もしくは６２に記載のキット。
【０３９９】
６５．項目１〜５９のいずれか１項にしたがって規定されている通りのＲＮＡ、項目６０に記載の組成物、または項目６１もしくは６２に記載のキットの有効量を、それを必要とする対象に投与することを含んでいる、障害を処置または予防する方法。
【０４００】
６６．上記障害は、好ましくは肝線維症、肝硬変および肝がんからなる群から選択される、肝疾患である、項目６５に記載の方法。
【０４０１】
〔図面〕
図１：CCl4マウスモデルにおける肝線維症の肉眼分類：制御およびCCl4 処理マウス由来の肝臓の代表的な肉眼的画像。肝臓の線維症のグレードをグレード0（線維症なし）からグレード3（進行性線維症）に分類した。グレード0：肝臓の外表面は滑らかで光沢があった。グレード1：肝臓の外表面の一部（＜50％）は細胞形成異常および肝臓のコラーゲド（collaged）堆積（瘢痕化）の増加などの構造変化を示し、グレード2：肝臓の外表面の大部分（＞50％）は、細胞形成異常および肝臓のコラーゲド堆積（瘢痕化）の増加などの構造変化を示した。グレード3：異形成結節および肝臓の強い細胞外マトリクス（ECM）およびコラーゲン堆積（瘢痕化）によって示される、外部肝臓表面の強い肉眼的変化。
【０４０２】
図２：線維症段階の評価：全ての動物の肝臓を、肝臓状態の肉眼的評価により、図1の肉眼的分類基準に従って異なるグレードの線維症に分類した。線維症の分類：線維症なし（グレード0）；進行した線維症に始まる（グレード1からグレード3）。ｍＲＮＡ投与群（群3〜6）は、ｍＲＮＡ未処置対照群2と比べて、グレード3線維症の減少した外観およびグレード2および1線維症の増加した外観を示した。点線は、対照群1〜2を処理動物群3〜6から分離する。
【０４０３】
図３（Ａ）および３（Ｂ）：ｍＲＮＡ処理動物における肝臓重量および肝臓体重比の減少:
図３（Ａ）  CCl4投与開始29日後（ｍＲＮＡ処理開始14日後）に肝臓の体重を測定した。ｍＲＮＡ投与群（群3〜6）は、ｍＲＮＡ未処置対照群2と比べて、より低い肝臓重量を示した。データ（平均± SEM）。
図３（Ｂ）  CCl4投与開始29日後（ｍＲＮＡ処置開始14日後）の肝重量／体重比を測定した。肝臓重量を体重で割り、100を掛けて、示された比率を決定した。ｍＲＮＡ投与群（群3〜6）は、ｍＲＮＡ未処置対照群2と比べて、より低い肝臓重量を示した。データ（平均± SEM）。
【０４０４】
図４：ｍＲＮＡ処理動物における慢性肝臓損傷マーカであるアラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）の減少：血清ALTを、CCl4投与開始後29日（ｍＲＮＡ処置開始後14日）の血清中で評価した。ALTレベルは、酵素分析によって自動的に決定した。ｍＲＮＡ処理群（群3〜6）は、ｍＲＮＡ未処理対照群2と比べて下部ALTレベルを示した。データ（平均値±ＳＥＭ）。
【０４０５】
〔実施例〕
以下に示す実施例は単に例示であり、本発明をさらに説明している。実施例は、本発明をそれに限定すると解釈されるべきではない。
【０４０６】
実施例１：オスのBALB／cマウスにおける四塩化炭素誘導性の肝線維症モデルに対するｍＲＮＡ処置の処置効果の評価
BALB／cマウスを、表３に示す研究計画から明らかなように、６群に分けた。肝不全の誘導はCCl4投与によって達成され、試験化合物を用いた続く処理は治療有効性を示している。CCl4：鉱油の投与は、１ヶ月間、週２回、腹腔内（i．p．）経路を介してであった。対照として、５匹の動物に、生理食塩水：鉱油を投与した（腹腔内）。
【０４０７】
顎下経路または尾部の傷を介した採血は、−１、１５日、２２日に、および回収日２９に最終の採血を予定した。約１００μｌの全血を血清分離管に回収し、血清を調製し、−20℃で保存した。
【０４０８】
肝機能の評価のために、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）を測定した。
【０４０９】
【表６】
2020501545.tif 000012
【０４１０】
ｍＲＮＡ処理の有効性を、疾患または肝不全の進行を制限する能力によって評価した。処理の有効性評価のために、１００μｌ(４０μｇ）のLNP製剤化ＲＮＡ(ＲＮＡ−LNP）を、CCl4投与開始後14、17、19、21、24および26日目に、静脈内経路（i．v．）を介して動物（n＝12）に注射した:
群1（n＝5）の動物は、shamコントロール（すなわち、（a）生理食塩水（i．p．）および（b）生理食塩水：鉱油（i．p．）の1：1比率の1ml／kgの投与）の役割を果たした;
群2（n＝12）の動物：（a）生理食塩水(i.p.)(b)1ml／kg 1：1の比率のCCl4：鉱油（i．p．）の投与;
群3〜6の動物（各回: n=12）：（a）それぞれのｍＲＮＡおよび調合物（IV）の投与（b）1ml／kg 1：1の比率のCCl4：鉱油（i．p．）。
【０４１１】
最終的な回収を29日目、すなわち最後のCCl4投与の96時間後に実施し、すなわち、全ての生存動物の体重を測定し、活性値を観察し、血清調製のために心臓出血によって血液を抽出し、動物を安楽死させた後、肉眼的剖検を行った。続いて、各動物の肝臓を採取し、秤量した。肝臓の中葉を、組織学のために中性に緩衝化されている10％ホルマリン中で固定し、残りの葉を2つのチューブに分け、速やかに凍結した。
【０４１２】
対照マウスおよびCCl4 処理マウスからの肝臓の代表的な肉眼写真を撮影し、図1の肉眼的分類基準（肝臓状態の肉眼的評価）に従って種々のグレードの線維症に分類した。肝臓の線維症のグレードをグレード0（線維症なし）からグレード3（進行性線維症）に分類した。グレード0：肝臓の外表面は滑らかで光沢があった。グレード1：肝臓の外表面の一部（＜50％）は細胞形成異常および肝臓のコラーゲド堆積（瘢痕化）の増加などの構造変化を示し、グレード2：肝臓の外表面の大部分（＞50％）は、細胞形成異常および肝臓のコラーゲド堆積（瘢痕化）の増加などの構造変化を示した。グレード3：異形成結節および肝臓の強い細胞外マトリクス（ECM）およびコラーゲン堆積（瘢痕化）によって示される、外部肝臓表面の強い肉眼的変化。
【０４１３】
また、CCl4投与開始29日後（ｍＲＮＡ処置開始14日後；図3（A））に肝線維症進行の指標となる肝重量を測定し、肝重量対体重比を求めた（図3（B））。さらに、図4に従い、血清ALTを評価した。
【０４１４】
結果：
全てのｍＲＮＡ処理動物（Gr3〜Gr6）は対照群（Gr2）、図3Aおよび3Bと比べて、より低い肝臓重量およびより低い肝臓／体重比を示した（すなわち、線維症の改善または進行の減少を示した）。また、図1及び図2から明らかなように、ｍＲＮＡ投与群（Gr3〜Gr6）では、線維化度の高い肝臓量が低く、また、図4から明らかなように、線維症マーカであるアラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）は対照群と比べて、全てのｍＲＮＡ投与群で低下しており、肝線維化の改善又は進行の減少を示していた。
【０４１５】
肝機能のさらなる評価のために、さらなる酵素パネル、すなわちアスパラギン酸トランスアミナーゼ（AST）、アルカリホスファターゼ（ALP）および総ビリルビン（TBIL）が測定される。総ビリルビンの測定は非抱合および抱合ビリルビンの両方を含み、非抱合ビリルビンはヘムの分解産物であり、肝臓に関する問題はビリルビン代謝の欠損（例えば、肝細胞取り込みの低下、ビリルビンの抱合の障害、およびビリルビンの肝細胞分泌の低下；例は、肝硬変およびウイルス性肝炎である）として反映される。
【０４１６】
実施例2：組織病理学分析［予言的］
実施例１の動物の組織病理学分析を行う。切片化およびピクロシリウス（PSR）染色（すなわち、コラーゲンIおよびIII線維の組織学的可視化）。さらに、各動物の肝臓のデジタル画像を撮影し、さらに、標準的なヘマトキシリン−エオシン(H & E)およびPSR染色スライドからのスコアリングを行う。組織病理学分析は、肝線維症の進行の減少を示す。
【０４１７】
実施例3：オスのBALB／cマウス［予防的]BALB/cマウスにおける四塩化炭素誘導性の肝線維症モデルに対するｍＲＮＡを用いた処理の治療有効性の評価を、表4に示される試験計画から明らかなように、17群に分ける。肝不全の誘導はCCl4投与によって達成され、その後の試験化合物による処理は治療有効性を示す。CCl4：鉱油の投与は、腹腔内（i．p．）経路を介して、週2回、1ヶ月間である。対照として、生理食塩水：鉱油を5匹の動物に投与する（i．p．）。
【０４１８】
顎下経路または尾部の傷を介した採血は、1日目、14日目、25日目、および採取32日目の最終採血を差し引いた日に予定した。約100μlの全血を血清分離管に回収し、血清を調製し、−20℃で保存する。
【０４１９】
肝機能の評価のために、酵素パネル、すなわちアラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（AST）、アルカリホスファターゼ（ALP）および総ビリルビン（TBIL）を測定する。さらに、アルカリホスファターゼ（ALP）、ガンマ−グルタミルトランスフェラーゼ（GGT）、総ビリルビン（TBIL）、アンモニア、グロブリンおよびアルブミン／グロブリン比を測定する。総ビリルビンの測定は非抱合および抱合ビリルビンの両方を含み、非抱合ビリルビンはヘムの分解産物であり、肝臓に関する問題はビリルビン代謝の欠損（例えば、肝細胞取り込みの低下、ビリルビンの抱合の障害、およびビリルビンの肝細胞分泌の低下；例は、肝硬変およびウイルス性肝炎である）として反映される。また、アルブミンレベルは、肝硬変のような慢性肝疾患において減少するので、アルブミンレベルが測定される。さらに、総タンパク質（グロブリンからの残り）を測定する。
【０４２０】
【表７】
2020501545.tif 000013
【０４２１】
【表８】
2020501545.tif 000014
【０４２２】
ｍＲＮＡ処理の有効性は、疾患または肝不全の進行を制限するその能力によって評価される。処理の有効性を評価するために、100μlのLNP製剤化ＲＮＡ(ＲＮＡ−LNP）を、CCl4投与開始後17、20、24、27および30日目に、静脈内経路（i．v．）を介して動物（n＝12）に注射する:
群1（n＝5）の動物はsham対照（すなわち、（a）生理食塩水（i．p．）および（b）生理食塩水：鉱油（i．p．）の1：1比率の1ml／kgの投与）として役割を果たした;
群2（n＝12）の動物：（a）生理食塩水(i.p.)(b)1ml／kg 1：1の比率のCCl4：鉱油（i．p．）の投与;
群3〜31の動物（各回: n=12）：（a）それぞれのｍＲＮＡおよび調合物（IV）の投与（b）1ml／kg 1：1の比率のCCl4：鉱油（i．p．）;
群32（n＝12）の動物：（a）制御LNP(IV)(b)1ml／kg 1：1の比率のCCl4：鉱油（i．p．）の投与。
【０４２３】
別の実験において、表4の試験計画を、LNP製剤化ｍＲＮＡの代わりにCVCM製剤化ｍＲＮＡを用いて評価する。
【０４２４】
最終的な回収は32日目、すなわち最後のCCl4投与の96時間後であり、すなわち、全ての生存動物の体重を測定し、活動レベルを観察し、血清調製のために心臓出血によって血液を抽出し、動物を安楽死させ、続いて肉眼的剖検を行う。続いて、肝臓を採取し、秤量する。肝臓の中葉を、組織学のために中性に緩衝化された10％ホルマリン中で固定し、残りの葉を2つのチューブに分配し、そして急速凍結する。
【０４２５】
コラーゲン堆積をヒドロキシプロリン測定によって評価する。また、組織病理学分析が行われる。αSMA染色（活性化肝星状細胞のマーカ）を含んでいる切片化およびピクロシリウス（PSR）染色（すなわち、コラーゲンIおよびIII線維の組織学的可視化）。さらに、各動物の肝臓のデジタル画像を撮影し、さらに、標準的なヘマトキシリン−エオシン(H & E)およびPSR染色スライドからのスコアリングを行う。
【０４２６】
結果：
肝臓におけるコラーゲンの減少は、いくつかの群において観察される。また、ヒドロキシプロリンの低下がいくつかの基で観察される。さらに、コラーゲンおよびヒドロキシプロリン含量を含んでいる、減少した細胞外マトリクス沈着が、いくつかの基について観察される。いくつかのグループは、肝細胞に影響を及ぼすことなく、HSCにおいてアポトーシスの特定増加を示す。いくつかの群は、動物モデルが肝硬変の状態に達した場合、生存率の増加を示す。
【０４２７】
実施例4：四塩化炭素誘導性の肝線維症ラットモデルにおけるｍＲＮＡ処理の効果の評価［予言的］
CCl4：オリーブ油（1：1の比率）をオスのラット（ラットノルベジカス種、株: Sprague Dawley)に2ml／kgの投与量で2週間（5回の注射）3日に1回、続いて1ml/kg(i.p.)1回、3日に1回、6週間投与する。ラットを、表5に示す研究計画から明らかなように、17群に分ける。研究は10週目（すなわち、8週間のCCL4処理＋2週間のｍＲＮＡ処理）に終了する。
【０４２８】
処理後（8週間後）d2、d7、d10、d14に血液を収集する。試験終了時に、血液サンプルを回収し、血漿サンプルを肝機能試験およびプロトロンビン時間の測定に供する。
【０４２９】
ｍＲＮＡ処理の有効性は、疾患または肝不全の進行を制限するその能力によって評価される。
【０４３０】
【表９】
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【０４３１】
【表１０】
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【０４３２】
【表１１】
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【０４３３】
【表１２】
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【０４３４】
別の実験において、表5の研究計画を、LNP製剤化ｍＲＮＡの代わりにCVCM製剤化ｍＲＮＡを用いて評価する。
【０４３５】
すなわち、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）、アルカリホスファターゼ（ALP）、ガンマ−グルタミルトランスフェラーゼ（GGT）、総ビリルビン（TBIL）、総タンパク質（TP）、アンモニア、アルブミン、グロブリンおよびアルブミン／グロブリン比を測定する。
【０４３６】
約100mgの生組織の一部を液体窒素中で瞬間凍結し、コラーゲン堆積の評価のためにヒドロキシプロリン推定のために−80℃で保存する。肝組織におけるヒドロキシプロリンアッセイについては、標準的な市販のキットが適用され、結果は肝臓全体当たりまたは肝臓1g当たりのμgとして表される。
【０４３７】
残りの肝臓組織を、中性に緩衝化された10％ホルマリン中で固定し、そして切片を、日常的な組織病理学処理の後に調製する。パラフィン切片を、Masson's Trichrome染色で染色し、そして肝線維症の重症度について病理学者によって評価する。また、実施例１に記載した肝機能試験を行う。
【０４３８】
結果：
実施例１と同様に、肝臓におけるコラーゲン減少がいくつかの群で観察される。また、ヒドロキシプロリンの還元がいくつかの基で観察される。さらに、コラーゲンおよびヒドロキシプロリン含量を含んでいる、減少した細胞外マトリクス堆積が、いくつかの群に観察される。
【０４３９】
いくつかの群は、肝細胞に影響を及ぼすことなく、aHSCにおいてアポトーシスの特定増加を示す。いくつかの群は、動物モデルが肝硬変の状態に達した場合、生存率の増加を示す。
【図面の簡単な説明】
【０４４０】
【図１】CCl4マウスモデルにおける肝線維症の肉眼分類の結果を示す図である。
【図２】線維症段階の評価を示す図である。
【図３】ｍＲＮＡ処理動物における肝臓重量および肝臓体重比の減少を示す図である。
【図４】ｍＲＮＡ処理動物における慢性肝臓損傷マーカであるアラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）の減少を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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