(57)【要約】  抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を含む、タンパク質の効率的な産生を達成するための、培地成分、バッチ持続時間または細胞密度による細胞培養プロセスにおけるシステインおよび／またはシスチンの計画的枯渇を含む細胞増殖条件の操作による、抗体上の選択的にキャップされたシステインおよびキャップされていないシステインの産生を最適化すること；それを、抗体鎖間硫黄結合を顕著に還元することなしにタンパク質からＴＮＢキャッピング部分を脱離させることが可能な還元剤と反応させることにより、ＴＮＢキャップされたシステイン含有タンパク質をコンジュゲートすること、ならびにタンパク質上の還元された硫黄結合を、反応性連結部分を介してペイロードにコンジュゲートすること。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学物質ペイロードにコンジュゲートされることが可能なシステイン含有タンパク質を生成するためのプロセスであって、
（ａ）システイン、シスチンおよびグルタチオンから選択される１種または複数の増殖成分を含む細胞増殖培地に、システイン含有タンパク質を発現することが可能な細胞を播種するステップ；
（ｂ）前記細胞をインキュベートして、前記増殖培地中に存在する増殖成分の大部分を使い尽くすのに十分な細胞密度を達成するステップ；ならびに
（ｃ）前記細胞をさらにインキュベートして、遊離チオールを含む１つまたは複数のキャップされていないシステイン残基を有するシステイン含有タンパク質を発現させるステップ
を含むプロセス。
【請求項２】
（ｄ）前記発現されたシステイン含有タンパク質に、所定のキャッピング部分またはその前駆体を導入するステップ
をさらに含み、それにより、前記タンパク質上の１つまたは複数のシステインが、前記所定のキャッピング部分でキャップされる、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
化学物質ペイロードにコンジュゲートされることが可能なシステイン含有タンパク質を生成するためのプロセスであって、
（ａ）システイン、シスチンおよびグルタチオンから選択される１種または複数の増殖成分を含む細胞増殖培地に、システイン含有タンパク質を発現することが可能な細胞を播種するステップ；
（ｂ）前記細胞をインキュベートして、遊離チオールを含む１つまたは複数のキャップされていないシステイン残基を有するシステイン含有タンパク質を発現させるステップ；ならびに
（ｃ）ステップ（ａ）、ステップ（ｂ）、またはステップ（ａ）および（ｂ）の両方において、前記１種または複数の増殖成分の濃度を、０．４ｍＭ未満、０．３ｍＭ未満、０．２ｍＭ未満、０．１ｍＭ未満または０．０５ｍＭ未満の濃度で維持するステップ
を含むプロセス。
【請求項４】
（ｄ）前記発現されたシステイン含有タンパク質に、所定のキャッピング部分またはその前駆体を導入するステップ
をさらに含み、それにより、前記タンパク質上の１つまたは複数のシステインが、前記所定のキャッピング部分でキャップされる、請求項３に記載のプロセス。
【請求項５】
化学物質ペイロードにコンジュゲートされることが可能なシステイン含有タンパク質を生成するためのプロセスであって、
（ａ）システイン、シスチンおよびグルタチオンから選択される１種または複数の増殖成分を含む細胞増殖培地に、システイン含有タンパク質を発現することが可能な細胞を播種するステップ、ならびに
（ｂ）前記細胞をインキュベートして、遊離チオールを含む１つまたは複数のキャップされていないシステイン残基を有するシステイン含有タンパク質を発現させるステップであって、それにより、前記インキュベーション後の前記増殖成分の濃度が、２．０ｍＭ未満、０．４ｍＭ未満、０．３ｍＭ未満、０．２ｍＭ未満、０．１ｍＭ未満または０．０５ｍＭ未満である、ステップ
を含むプロセス。
【請求項６】
前記インキュベートするステップの後に、
（ｃ）前記発現されたシステイン含有タンパク質に、所定のキャッピング部分またはその前駆体を導入するステップ
をさらに含み、それにより、前記タンパク質上の１つまたは複数のシステインが、前記所定のキャッピング部分でキャップされる、請求項５に記載のプロセス。
【請求項７】
前記細胞増殖培地中の分数システイン制限比を１．０×未満まで制限することによって、前記増殖成分が使い尽くされる、請求項１から２のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項８】
前記比が、約０．９５×、０．９０×、０．８５×、０．８０×、０．７５×、０．７０×、０．６５×、０．６０×、０．５５×、０．５０×、０．４５×、０．４０×、０．３５×、０．３０×、０．２５×、０．２０×、０．１５×、０．１０×または０．０５×である、請求項７に記載のプロセス。
【請求項９】
前記システイン含有タンパク質が、抗体および融合タンパク質からなる群から選択される、請求項１から６のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１０】
前記達成される細胞密度が、少なくとも約１Ｅ６細胞／ｍＬである、請求項１から２のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１１】
前記細胞密度が、少なくとも約５Ｅ６細胞／ｍＬ、１０Ｅ６細胞／ｍＬ、５０Ｅ６細胞／ｍＬ、１００Ｅ６細胞／ｍＬまたは５００Ｅ６細胞／ｍＬである、請求項１０に記載のプロセス。
【請求項１２】
前記所定のキャッピング部分が、５−チオ−２−ニトロ安息香酸（ＴＮＢ）、２−メルカプトピリジン、ジチオジピリジン（ＤＴＤＰ）、４−チオ安息香酸、２−チオ安息香酸、４−チオベンゼンスルホン酸、２−チオベンゼンスルホン酸、メチルスルホネート（Ｍｓ）、ｐ−トルエンスルホネート（Ｔｓ）およびトリフルオロメタンスルホネート（Ｔｆ）からなる群から選択される、請求項２、４および６のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１３】
前記所定のキャッピング部分が、アルデヒドハンドルを有するマレイミドトリオキサ−４−ホルミルベンズアミド（ＭＴＦＢ）様分子、またはアジドハンドルを有するマレイミドアジド−リジン様分子、またはアルキンハンドルを有するジベンゾシクロオクチル−ポリエチレンマレイミド（ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−マレイミド）様分子からなる反応性基から選択される、請求項２、４および６のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１４】
前記所定のキャッピング部分がＴＮＢである、請求項２、４および６のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１５】
前記前駆体がＤＴＮＢである、請求項２、４および６のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１６】
前記キャップされたタンパク質が、単離、精製および濃縮のうち１つまたは複数からなるさらなる処理に供される、請求項２、４および６のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１７】
前記細胞の少なくとも５０％が、前記所定のキャッピング部分またはその前駆体の導入前に、前記発現されたシステイン含有タンパク質から分離される、請求項２、４および６のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１８】
前記分離が、遠心分離または濾過によって達成される、請求項１７に記載のプロセス。
【請求項１９】
ＴＮＢキャップされたシステイン含有タンパク質をコンジュゲートするためのプロセスであって、
（ａ）前記ＴＮＢキャップされたシステイン含有タンパク質を、抗体鎖間硫黄結合を顕著に還元することなしに前記タンパク質から前記ＴＮＢキャッピング部分を脱離させることが可能な還元剤と反応させるステップ；
（ｂ）任意選択により、前記反応混合物を濾過して、過剰な還元剤、脱離されたＴＮＢ、またはその両方を除去するステップ；および
（ｃ）酸化剤を導入することなしに、前記抗体上の１つまたは複数の還元された硫黄結合を、反応性連結部分を介してペイロードにコンジュゲートするステップ
を含むプロセス。
【請求項２０】
ＴＮＢキャップされたシステイン含有タンパク質をコンジュゲートするためのプロセスであって、
（ａ）前記ＴＮＢキャップされたシステイン含有タンパク質を、任意選択により塩化ナトリウムの存在下で、約４：１〜６：１化学量論的過剰の、抗体鎖間硫黄結合を顕著に還元することなしに前記タンパク質から前記ＴＮＢキャッピング部分を脱離させることが可能な還元剤と反応させるステップ；
（ｂ）前記反応混合物を濾過して、過剰な還元剤、脱離されたＴＮＢのうち１種または複数を除去するステップ；
（ｃ）酸化剤を導入するステップ；および
（ｄ）前記タンパク質上の１つまたは複数の還元された硫黄結合を、反応性連結部分を介してペイロードにコンジュゲートするステップ
を含むプロセス。
【請求項２１】
前記化学量論的過剰が約５：１である、請求項２０に記載のプロセス。
【請求項２２】
ステップ（ｃ）が、周囲温度で実施される、請求項２０に記載のプロセス。
【請求項２３】
ステップ（ｃ）が、約２５セルシウス度で実施される、請求項２０に記載のプロセス。
【請求項２４】
ステップ（ｃ）が、約４セルシウス度で実施される、請求項２０に記載のプロセス。
【請求項２５】
（ｅ）ステップ（ｄ）の後に過剰なシステインを添加して、前記連結部分の反応をクエンチするステップ；および
（ｆ）前記クエンチされたリンカー−ペイロードを前記コンジュゲートから分離するステップ
をさらに含む、請求項２０に記載のプロセス。
【請求項２６】
前記分離が、ダイアフィルトレーションまたはカラムクロマトグラフィーによって実施される、請求項２５に記載のプロセス。
【請求項２７】
前記カラムクロマトグラフィーが疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）である、請求項２６に記載のプロセス。
【請求項２８】
１種または複数のイソプロパノール含有緩衝液が、前記ＨＩＣ精製を実施するために使用される、請求項２７に記載のプロセス。
【請求項２９】
前記システイン含有タンパク質が抗体である、請求項１から２８のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項３０】
前記システイン含有タンパク質が、抗ＥＤＢ抗体および抗ＨＥＲ２抗体から選択される抗体である、請求項１から２８のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項３１】
前記抗ＨＥＲ２抗体がトラスツズマブである、請求項３０に記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野は、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）のより効率的な産生を可能にする、細胞増殖条件の操作による抗体上の５−チオ−２−ニトロベンゾエート（ＴＮＢ）キャップされたシステインの産生を最適化することである。
【背景技術】
【０００２】
抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、強力な細胞毒性薬物を備えた抗体から典型的になる標的化治療の１つの型である（Ｃｈｕｄａｓａｍａら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０１６；ＪｕｎｕｔｕｌａおよびＧｅｒｂｅｒ、ＡＣＳ  ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｌｅｔｔｅｒｓ  ２０１６）。したがって、ＡＤＣのおかげで、長期の処置期間での化学療法の使用をしばしば制限または排除してしまうオフターゲット毒性を回避しながら毒性ペイロードを腫瘍へと選択的に送達する見込みが得られている。有望な治療的プラットフォームとして、現在、市場には、少なくとも２つの承認されたＡＤＣ製品（ブレンツキシマブベドチンおよびトラスツズマブエムタンシン）が存在する。急激に増殖しているＡＤＣは、臨床評価を受けている顕著な数の治療的候補を有する。
【０００３】
ＡＤＣがその治療的潜在力を達成するためには、洗練されたコンジュゲーションテクノロジーが、細胞毒性薬物を抗体に接続するために必要である。２つの市販のＡＤＣを含む現行のＡＤＣ候補のほとんどは、ランダムな表面リジン、または還元された４つの鎖間ジスルフィドの遊離システインを介した従来の非特異的コンジュゲーション方法を利用している。これは、製造再現性の課題を生み出すだけでなく、治療指数を顕著に減少させる、高度に不均一なＡＤＣ混合物を生じる。
【０００４】
これらの問題に対処するために、ＡＤＣの分野は、部位特異的コンジュゲーションテクノロジー、例えば、システイン（Ｃｙｓ）ベースの部位特異的ＡＤＣに向かって進んできた（Ｊｕｎｕｔｕｌａら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００８）。操作された対になっていないシステイン残基を含むロバストな求核性チオール側鎖は、均一なＡＤＣ製品を提供するために、迅速かつ単純な化学的コンジュゲーション反応によって多様なリンカー／ペイロードを結合するのを可能にする。これらの得られたＡＤＣ分子についてのより規定され改善された薬物動態（ＰＫ）プロファイルが報告されている。部位特異的プラットフォームは、その独自の技術的課題を有する。哺乳動物細胞において産生される場合、導入されたシステイン残基上のチオール基は、遊離システインまたはグルタチオン（ＧＳＨ）とジスルフィドを形成する。これらのいわゆるＣｙｓキャッピング改変は、部分的還元ステップを介して、薬物コンジュゲーションの前に除去される必要がある。かかる処理は、抗体鎖間ジスルフィドも還元するので、還元された抗体鎖間ジスルフィドは次いで、還元剤、システインまたはグルタチオンを透析して除き、酸化試薬で処理することを含む再酸化プロセスを介して再形成される必要がある（Ｊｕｎｕｔｕｌａら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００８）。この煩雑な還元および再酸化プロセスは、潜在的に、抗体にジスルフィドシャッフリングおよびねじれを導入し、これは、タンパク質フォールディングおよびタンパク質の質に悪影響を与え得、得られたＡＤＣについてのより不良なＰＫなどの問題も引き起こす。
【０００５】
この潜在的な問題を解決するために、抗体の鎖間ジスルフィドに影響を与えない、チオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）を使用したＣｙｓキャッピングの新規選択的還元戦略が開発された（参照によって本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＩＢ２０１６／０５４７８９を参照のこと）。エルマン試薬（５，５’−ジチオビス（２−ニトロベンゾエート）、ＤＴＮＢ）とシステインの遊離チオール基との反応産物であるＴＮＢキャッピングは、その弱い酸化還元潜在力に起因して、不安定なキャッピングである。還元剤トリス（３−スルホナトフェニル）ホスフィン（ＴＳＰＰ）は、内因性ジスルフィドを還元することなしに、ＴＮＢキャッピングを選択的に除去できることが示されている。このＴＮＢ／ＴＳＰＰプロセスとその後の直接的コンジュゲーションは、従来の還元−再酸化ステップの厳しい条件を排除し、元の抗体のフォールディングを完全なままに維持する。しかし、ＴＮＢキャッピングのより効率的な方法が、ＡＤＣの商業的産生を最適化するために必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、抗体上のシステイン残基のキャッピング状態が、細胞増殖、細胞密度および／または細胞培養などのパラメーターを最適化することによって改変され得るという発見に基づく。したがって、本発明は、操作された対になっていないシステイン残基が遊離チオールでキャップされないままであり、種々の濃度のジチオニトロベンゾエート（ＤＴＮＢ）が異なる細胞培養物状態または細胞密度において添加された場合に、効率的な改変、典型的には、チオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）によるキャッピングを可能にする、哺乳動物細胞における抗体産生プロセスに関する。
【０００８】
本発明は、鎖間ジスルフィドの還元を回避し、したがって、コンジュゲーション前の（再）酸化ステップの必要性を排除する、これらのＴＮＢキャップされた抗体を使用して産生される抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）または治療的タンパク質薬物コンジュゲート、特に、ＴＮＢキャップされた抗体のシステイン残基の選択的還元によって形成されるＡＤＣにさらに関する。本発明は、その上、改善されたコンジュゲーション効率を有する直接的コンジュゲーションのためのＴＳＰＰまたは関連の薬剤による選択的還元を可能にする本明細書に記載される方法に従って作製される新規チオニトロベンゾエートキャップされた抗体にさらに関する。
【０００９】
より具体的には、本発明では、抗体上の対になっていない表面システインのキャッピング状態が、細胞増殖、細胞密度または細胞培養条件の注意深い操作によって改善できることが実証された。哺乳動物細胞培養物では、システインは重要なアミノ酸である。培養培地中のシステインおよびその酸化形態であるシスチン（Ｃｔｎ）は、アミノ酸輸送体Ｘｃ−をおそらくは介して、細胞増殖に優先的に利用される（Ｓａｔｏら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９９；以下の図）。細胞の外側のシステイン／シスチン／グルタチオンによるＣｙｓキャッピング反応は、緩徐なプロセスであり、結果として、対になっていない表面システインは、高い細胞密度での培養の間、遊離チオールでキャップされないままである。ＤＴＮＢを特定の段階で細胞培養物に添加した場合、ほぼ均一なＴＮＢキャップされた抗体が生成された。これらの知見は、ＴＮＢキャップされた抗体を大量に産生するための実行可能な戦略を提供している。
【００１０】
【化１】
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【００１１】
さらに、細胞培養プロセスは、典型的には、細胞増殖、生存細胞密度および力価を最大化するため、ならびにアミノ酸置換（即ち、アミノ酸の誤取り込み）を防止するために、アミノ酸、例えば、システインおよびその等価物が制限も枯渇もされないことを確実にするように設計される（米国特許第８，２３２，０７５号を参照のこと）。メチオニンの変換からのシステインの生成は、細胞増殖、細胞代謝および生産性の律速であるので、Ｌ−システインおよびその酸化形態であるＬ−シスチンは、哺乳動物細胞培養における重要なアミノ酸とみなされる。しかし、本発明では、細胞培養に利用可能なシステイン／シスチンの量を計画的に制限または枯渇させるいくつかの方法を、ＴＮＢによる抗体上のシステイン残基の適切なキャッピング状態を促進するために使用した。
【００１２】
したがって、本発明のある実施形態では、化学物質ペイロードにコンジュゲートされることが可能なシステイン含有タンパク質を生成するためのプロセスであって、（ａ）システイン、シスチンおよびグルタチオンから選択される１種または複数の増殖成分を含む細胞増殖培地に、システイン含有タンパク質を発現することが可能な細胞を播種するステップ；（ｂ）細胞をインキュベートして、増殖培地中に存在する増殖成分の大部分を使い尽くすのに十分な細胞密度を達成するステップ；ならびに（ｃ）細胞をさらにインキュベートして、遊離チオールを含む１つまたは複数のキャップされていないシステイン残基を有するシステイン含有タンパク質を発現させるステップを含むプロセスが提供される。このプロセスは、（ｄ）発現されたシステイン含有タンパク質に、所定のキャッピング部分またはその前駆体を導入するステップをさらに含み得、それにより、タンパク質（複数可）上の１つまたは複数のシステインが、所定のキャッピング部分でキャップされる。この実施形態では、達成される細胞密度は、典型的には、少なくとも約１Ｅ６細胞／ｍＬであり、例えば、少なくとも約５Ｅ６細胞／ｍＬ、１０Ｅ６細胞／ｍＬ、５０Ｅ６細胞／ｍＬ、１００Ｅ６細胞／ｍＬまたは５００Ｅ６細胞／ｍＬであり得、好ましくは１０Ｅ６細胞／ｍＬを上回り得、より好ましくは５０Ｅ６細胞／ｍＬを上回り得る。
【００１３】
所定のキャッピング部分は、アルキル化剤であり得、一部の場合には、さらなる型の薬物コンジュゲーション化学反応に有用なＴＮＢまたは類似の不安定な部分以外の化学的「ハンドル」として作用することに留意されたい。これらのハンドルは、新規アルキル化化学スペーサーを培養培地中に添加することによって抗体に付加される。アルキル化化学スペーサーは、アルデヒド、ケトン、アジドおよびアルキンなどの化学的ハンドルを含有する。ケトンおよびアルデヒドの場合、これらの化学的ハンドルは、さらなるコンジュゲーション化学反応のためのアミノオキシ求核試薬またはヒドラジドと反応して、オキシム／ヒドラゾン産物を形成することができる。アジドおよびアルキンの場合、これらの化学的ハンドルは、環化付加コンジュゲーションを可能にできる。さらなるアルキル化化学スペーサーは、ビオチンの機能的ドメインを含み、ストレプトアビジンとビオチンとの間の緊密な特異的非共有結合相互作用を可能にする。化学的ハンドルマレイミドトリオキサ−４−ホルミルベンズアミド（ＭＴＦＢ）、ジベンゾシクロオクチル−ポリエチレンマレイミド（ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−マレイミド）およびマレイミド−ＰＥＧ２−ビオチン（ＭＰＢ）を議論するＷＯ２０１７／０２５８９７の実施例４を参照のこと。
【００１４】
本発明のさらなる実施形態は、化学物質ペイロードにコンジュゲートされることが可能なシステイン含有タンパク質を生成するためのプロセスであって、（ａ）システイン、シスチンおよびグルタチオンから選択される１種または複数の増殖成分を含む細胞増殖培地に、システイン含有タンパク質を発現することが可能な細胞を播種するステップ；（ｂ）細胞をインキュベートして、遊離チオールを含む１つまたは複数のキャップされていないシステイン残基を有するシステイン含有タンパク質を発現させるステップ；ならびに（ｃ）ステップ（ａ）、ステップ（ｂ）、またはステップ（ａ）および（ｂ）の両方において、１種または複数の増殖成分の濃度を、０．４ｍＭ未満、０．３ｍＭ未満、０．２ｍＭ未満、０．１ｍＭ未満または０．０５ｍＭ未満の濃度で維持するステップを含むプロセスを含む。このプロセスは、（ｄ）発現されたシステイン含有タンパク質に、所定のキャッピング部分またはその前駆体を導入するステップをさらに含み得、それにより、タンパク質上の１つまたは複数のシステインが、所定のキャッピング部分でキャップされる。
【００１５】
なおさらなる実施形態は、化学物質ペイロードにコンジュゲートされることが可能なシステイン含有タンパク質を生成するためのプロセスであって、（ａ）システイン、シスチンおよびグルタチオンから選択される１種または複数の増殖成分を含む細胞増殖培地に、システイン含有タンパク質を発現することが可能な細胞を播種するステップであって、増殖成分の初期濃度が、２ｍＭ未満、０．４ｍＭ未満、０．３ｍＭ未満、０．２ｍＭ未満、０．１ｍＭ未満または０．０５ｍＭ未満の場合が含まれるがこれらに限定されない、ステップ、ならびに次いで、（ｂ）細胞をインキュベートして、遊離チオールを含む１つまたは複数のキャップされていないシステイン残基を有するシステイン含有タンパク質を発現させるステップを含むプロセスを含む。このプロセスは、（ｃ）発現されたシステイン含有タンパク質に、所定のキャッピング部分またはその前駆体を導入するステップをさらに含み得、それにより、タンパク質上の１つまたは複数のシステインが、所定のキャッピング部分でキャップされる。
【００１６】
プロセス中のシステインおよび／またはその代替的形態を計画的に制限することによって、細胞培養物中の増殖成分が使い尽くされる実施形態もまた、本発明の範囲内である。米国特許第８，２３２，０７５号に教示される合理的培地設計および化学量論的アプローチを使用して、特定のピーク細胞密度および産生される産物の量のために必要とされるシステイン／シスチンの必要量は、以下の方程式（方程式１）によって計算され得る。この方程式は、ＣＨＯ培養物について包括的であり、より具体的な方程式は、所与のプロセスにおけるその細胞株についてのシステイン消費速度を決定することによって、特定の細胞株について生成され得る。
【００１７】
方程式１．必要なシステイン濃度
必要なシステイン濃度＝［（ｘ＊ｍ）＋（ｘ＊ｍ＊ｋ）＋（ｐ＊ｎ）］＊ｆ
ｘ：Ｅ６細胞／ｍＬに必要なシステイン濃度（０．０９ｍＭ）
ｍ：ピーク細胞密度（Ｅ６細胞／ｍＬ）
ｋ：維持因数（１０〜１５％）
ｐ：１ｇ／Ｌの抗体に必要なシステイン濃度（０．１９ｍＭ）
ｎ：最終抗体濃度（１ｇ／Ｌ）
ｆ：安全性因数（１．１〜１．３）
【００１８】
所与のプロセスにおける特定の細胞株についてのシステインの必要量を決定した後、培養物中のシステイン／シスチンを計画的に制限または枯渇させるために、分数システイン制限比方程式を使用して、具体的な制限比（方程式２）を標的化するためにプロセス中に提供されるシステイン／シスチンの量を決定することができる。細胞増殖培地中の分数システイン制限比を約１．０×未満まで制限することによって増殖成分が使い尽くされる実施形態が、本発明の範囲内である。これらの比は、例えば、約０．９５×、０．９０×、０．８５×、０．８０×、０．７５×、０．７０×、０．６５×、０．６０×、０．５５×、０．５０×、０．４５×、０．４０×、０．３５×、０．３０×、０．２５×、０．２０×、０．１５×、０．１０×または０．０５×であり得る。
【００１９】
方程式２．分数システイン制限比
【００２０】
【数１】
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【００２１】
当然、本発明のシステイン含有タンパク質は、抗体および融合タンパク質が含まれるがこれらに限定されない広範な種々の部分を含む。これらは、抗ＥＤＢ抗体、およびトラスツズマブを含む抗ＨＥＲ２抗体であり得る。
【００２２】
本明細書に記載されるプロセスでは、所定のキャッピング部分は、５−チオ−２−ニトロ安息香酸（ＴＮＢ）、２−メルカプトピリジン、ジチオジピリジン（ＤＴＤＰ）、４−チオ安息香酸、２−チオ安息香酸、４−チオベンゼンスルホン酸、２−チオベンゼンスルホン酸、メチルスルホネート（Ｍｓ）、ｐ−トルエンスルホネート（Ｔｓ）およびトリフルオロメタンスルホネート（Ｔｆ）からなる群から選択され得る；ならびに／または所定のキャッピング部分は、アルデヒドハンドルを有するマレイミドトリオキサ−４−ホルミルベンズアミド（ＭＴＦＢ）様分子、またはアジドハンドルを有するマレイミドアジド−リジン様分子、またはアルキンハンドルを有するジベンゾシクロオクチル−ポリエチレンマレイミド（ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−マレイミド）様分子からなる反応性基から選択される。しばしば、所定のキャッピング部分はＴＮＢであり、しばしば、前駆体はＤＴＮＢである。
【００２３】
また、本明細書に記載されるプロセスでは、キャップされたタンパク質は、プロセス中の１つまたは複数の異なる点において、単離、精製および濃縮のうち１つまたは複数からなるさらなる処理に供される。したがって、本発明のある特定の実施形態では、細胞の少なくとも５０％は、所定のキャッピング部分またはその前駆体の導入前に、発現されたシステイン含有タンパク質から分離される。この分離は、遠心分離または濾過によって達成され得る。
【００２４】
本発明は、ＴＮＢキャップされた（または他の方法でキャップされた）システイン含有タンパク質をコンジュゲートするための実施形態であって、（ａ）ＴＮＢキャップされたシステイン含有タンパク質を、抗体鎖間硫黄結合を顕著に還元することなしにタンパク質からＴＮＢキャッピング部分を脱離させることが可能な還元剤と反応させるステップ；（ｂ）反応混合物を濾過して、過剰な還元剤、脱離されたＴＮＢ、またはその両方を除去するステップ；および（ｃ）酸化剤を導入することなしに、抗体上の１つまたは複数の還元された硫黄結合を、反応性連結部分を介してペイロードにコンジュゲートするステップを含む実施形態をさらに提供する。
【００２５】
本発明は、その上、ＴＮＢキャップされた（または他の方法でキャップされた）システイン含有タンパク質をコンジュゲートするための実施形態であって、（ａ）ＴＮＢキャップされたシステイン含有タンパク質を、任意選択により塩、例えば、塩化ナトリウムまたは他の塩の存在下（実施例８を参照のこと）で、化学量論的過剰の、抗体鎖間硫黄結合を顕著に還元することなしにタンパク質からＴＮＢキャッピング部分を脱離させることが可能な還元剤と反応させるステップ；（ｂ）反応混合物を濾過して、過剰な還元剤、脱離されたＴＮＢのうち１種または複数を除去するステップ；（ｃ）酸化剤を導入して、過剰な還元剤によって引き起こされる還元された鎖間硫黄結合を修復するステップ；および（ｄ）抗体上の１つまたは複数の還元された硫黄結合を、反応性連結部分を介してペイロードにコンジュゲートするステップを含む実施形態をさらに提供する。化学量論的過剰は、典型的には、約４：１〜６：１の還元剤対キャップされたシステイン残基（例えば、４つのキャップされたシステインを有する抗体については、１６：１〜２４：１の還元剤対抗体）、好ましくは約５：１である。このプロセスのステップ（ｃ）は、酸化時間を短縮しプロセス温度変化を回避するために、周囲温度で、例えば、約２５セルシウス度で実施され得る。低い温度、例えば約４セルシウス度での実施は、より長い酸化時間を必要とするが、標的酸化時間を超えた場合の収量の喪失に対してそれほど感受性でない。上記プロセスは、（ｅ）ステップ（ｄ）の後に過剰なシステインを添加して、連結部分の反応をクエンチするステップ；および（ｆ）クエンチされたリンカー−ペイロードをコンジュゲートから分離するステップをさらに含み得る。システインクエンチは、クロマトグラフィーまたはダイアフィルトレーションによるリンカー−ペイロードの改善された分離を可能にする。さらに、上記プロセスでは、分離は、ダイアフィルトレーションまたはカラムクロマトグラフィー、典型的には、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によって実施され得る。ＨＩＣ精製を実施するためのイソプロパノール含有緩衝液の使用は、精製されたコンジュゲートの増加した回収を生じる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】完全にキャップされていないシステイン変異体抗体を、通常のＣＤ  ＣＨＯ培地における高い細胞密度の安定なＣＨＯ発現によって生成した。トラスツズマブシステイン変異体Ｋ２９０Ｃ−Ｋ３３４ＣまたはＫ３９２Ｃ−Ｋ３３４Ｃを安定に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を、３Ｅ６細胞／ｍｌまたは６Ｅ６細胞／ｍｌの密度でＣＤ  ＣＨＯ培地中に播種し、３７セルシウス度で７２時間培養した。順化培地を、ＰｒｏＡカラムおよびサイズ排除カラム（ＳＥＣ）を介して精製した。精製された抗体タンパク質を、実施例１に記載されるように、ＬＣ／ＭＳ解析に供した。
【図２−１】
【図２−２】ＤＴＮＢを含むＣＨＯ培地における安定なＣＨＯ細胞株の高い細胞密度の培養条件。トラスツズマブシステイン変異体Ｋ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃを安定に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を、実施例１に記載されるように、制御された流加バイオリアクター中で、０．６Ｅ６細胞／ｍＬの密度で独占所有権のある基本培地中に播種した。図２Ａは、基本培地、供給培地またはＤＴＮＢの培養条件を示す。図２Ｂは、生存細胞密度（ＶＣＤ）および培養物生存度を示す。
【図３−１】
【図３−２】Ｆｃ  Ｋ２９０Ｃ部位において完全にＴＮＢキャップされたシステイン変異体抗体を、ＤＴＮＢを含むＣＨＯ培地における高い細胞密度の安定なＣＨＯ発現によって生成した。図２に記載される培養条件からの順化培地を、ＰｒｏＡカラム／ＳＥＣを介して精製し、抗体トラスツズマブシステイン変異体Ｋ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃを、実施例１に記載されるように、ＩＤＥＳで消化し（図３Ａ）、ＬＣ／ＭＳ解析に供した。
【図４】Ｆａｂ  Ｋ１８３Ｃ部位において完全にＴＮＢキャップされたシステイン変異体抗体を、ＤＴＮＢを含むＣＨＯ培地における高い細胞密度の安定なＣＨＯ発現によって生成した。図２に記載される培養条件からの順化培地を、ＰｒｏＡカラム／ＳＥＣを介して精製し、抗体トラスツズマブシステイン変異体Ｋ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃを、実施例１に記載されるように、ＩＤＥＳで消化し、ＬＣ／ＭＳ解析に供した。
【図５−１】
【図５−２】ＤＴＮＢを含むＨｉＰＤＯＧおよび流加プロセスにおける安定なＣＨＯ発現の高い細胞密度の培養条件。トラスツズマブシステイン変異体Ｋ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃを安定に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を、制御されたバイオリアクター中で、２Ｅ６細胞／ｍＬまたは０．６Ｅ６細胞／ｍＬの密度で独占所有権のある基本培地中に播種した。図５Ａは、基本培地、供給培地またはＤＴＮＢの培養条件を示す。図５Ｂは、生存細胞密度（ＶＣＤ）を示す。
【図６−１】
【図６−２】完全にキャップされていないシステイン変異体抗体を、ＤＴＮＢを含むＣＨＯ培地における高い細胞密度の安定なＣＨＯ発現によって生成した。図５に記載される培養条件からの順化培地を、ＰｒｏＡカラム／ＳＥＣを介して精製し、抗体トラスツズマブシステイン変異体Ｋ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃを、ＩＤＥＳで消化し、ＬＣ／ＭＳ解析に供した（図６Ａ）。図６Ｂは、キャッピングデータ概略表を示す。
【図７】生成されたトラスツズマブシステイン変異体Ｋ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃ抗体のＴＮＢキャッピング。キャッピングをＬＣ／ＭＳ解析によって決定して、変異したシステイン残基のキャッピング種を示した。システイン変異した抗体を、システイン／シスチンを意図的に枯渇させた独占所有権のある基本および供給培地を使用して、高い細胞密度の培養で生成した。ＤＴＮＢ供給を、産生バッチの間に培養物に添加した。培養物からの順化培地を、ＬＣ／ＭＳ解析前にＰｒｏＡ精製した。産生された主要な種（＞９５％）は、４つのＴＮＢで完全にキャップされた所望のｍＡｂであった；低いレベルの、４つよりも少ないＴＮＢキャップを有する混合種が存在した。
【図８】供給培地中に高いおよび低いシステイン／シスチン濃度を用いた条件のシステインプロファイル。濃度を、ＵＰＬＣが実施したアミノ酸解析によって得た；ＵＰＬＣ解析から得られたシスチン濃度を、化学量論的にシステインに変換した。両方の条件が、システイン変異体抗体トラスツズマブＫ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃを安定に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を使用し、独占所有権のある基本および供給培地を含む１Ｌのベンチスケールバイオリアクター中でそれらを実行した。両方の条件が、供給培地中の異なる濃度のシスチンと共に、基本培地中に類似の出発濃度のシステイン／シスチンを有した。各条件からの順化培地試料を、４日目に開始して解析して、バッチを通じたシステイン／シスチン枯渇の時間経過を得た。
【図９】高いおよび低い補足的シスチン濃度を用いた条件のシステインプロファイル。濃度を、ＵＰＬＣが実施したアミノ酸解析によって得た；ＵＰＬＣ解析から得られたシスチン濃度を、化学量論的にシステインに変換した。全ての条件が、システイン変異体抗体抗ＥＤＢ  Ｋ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃを安定に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を使用し、独占所有権のある基本および供給培地を含む１Ｌのベンチスケールバイオリアクター中でそれらを実行した。全ての条件が、播種密度条件に従って、基本培地中に類似の出発濃度のシステイン／シスチンを有した。各条件からの順化培地試料を、０日目に開始して解析して、バッチを通じたシステイン／シスチン枯渇の時間経過を得た。
【図１０】標的分数システイン制限比を用いた条件のシステインプロファイル。濃度を、ＵＰＬＣが実施したアミノ酸解析によって得た；ＵＰＬＣ解析から得られたシスチン濃度を、システインに変換した。全ての条件が、システイン変異体抗体トラスツズマブＫ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃを安定に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を使用し、独占所有権のある基本および供給培地を含む１Ｌのベンチスケールバイオリアクター中でそれらを実行した。分数システイン制限比を、以前に記載した方程式１および２を使用することによって決定した；条件は全て、所望の分数システイン制限比を標的化するために、そのそれぞれの培地中に異なるレベルのシスチンを有した。各条件からの順化培地試料を、４日目に開始して解析して、バッチを通じたシステイン／シスチン枯渇の時間経過を得た。
【図１１−１】
【図１１−２】高いおよび低いピーク細胞密度条件の生存細胞密度およびシステイン濃度プロファイル。高いおよび低いピーク細胞密度を、システイン変異体抗体トラスツズマブＫ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃを安定に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を用いて達成した。両方の条件を、独占所有権のある基本および供給培地を含む１Ｌのベンチスケールバイオリアクター中で実行した；異なるピーク密度に到達しそれを維持するために、２つの条件について一部のプロセスパラメーターは異なっていたが、システイン／シスチン濃度は、基本培地では類似であり、供給培地では同一であった。図１１Ａは、生存細胞密度を示す。図１１Ｂは、バッチの間のシステイン濃度を示す。各条件からの順化培地試料を、０日目に開始して解析して、バッチを通じたシステイン／シスチン枯渇の時間経過を得た。アミノ酸解析は、ＵＰＬＣが実施した；ＵＰＬＣ解析から得られたシスチン濃度を、化学量論的にシステインに変換した。
【図１２】条件培地へのＤＴＮＢ添加の粗製ＤＡＲ４結果。システイン変異体抗体トラスツズマブＫ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃを安定に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を、独占所有権のある基本および供給培地を使用して１Ｌのバイオリアクター中で培養した。バイオリアクター中の培養がバッチ持続時間中の特定の時点に達した後、細胞を、遠心分離および０．２μｍ濾過によって順化培地から分離した。順化培地を別々の容器に移し、２ｍＭ  ＤＴＮＢを添加し、種々の長さの時間にわたってインキュベートした。異なるインキュベーション時間の試料を、ＰｒｏＡ精製し、ＴＮＢコンジュゲーション基本プロセスを使用してコンジュゲートし（実施例５を参照のこと）、完全にＴＮＢキャップされた抗体の代用マーカーとして使用される粗製ＤＡＲ４百分率を決定した。
【図１３】条件培地へのＤＴＮＢ添加の粗製ＤＡＲ４結果。システイン変異体抗体抗ＥＤＢ  Ｋ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃを安定に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を、独占所有権のある基本および供給培地を使用して１Ｌのバイオリアクター中で培養した。バイオリアクター中の培養がバッチ持続時間中の特定の時点に達した後、細胞を、遠心分離および０．２μｍ濾過によって順化培地から分離した。順化培地を別々の容器に移し、２ｍＭ  ＤＴＮＢを添加し、種々の長さの時間にわたってインキュベートした。異なるインキュベーション時間の試料を、ＰｒｏＡ精製し、ＴＮＢコンジュゲーション基本プロセスを使用してコンジュゲートし（実施例５を参照のこと）、完全にＴＮＢキャップされた抗体の代用マーカーとして使用される粗製ＤＡＲ４百分率を決定した。
【図１４】還元後緩衝液交換の影響。ＴＮＢキャップされたトラスツズマブＫ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃ抗体を、６当量のＴＳＰＰで還元し（３７℃で３時間）、変動する量のｍｃｖｃＰＡＢＣ０１０１とコンジュゲートした；四角：還元後の緩衝液交換、菱形：緩衝液交換なし。％ＤＡＲ４を、解析的疎水性相互作用クロマトグラフィーによって測定した。
【図１５】再酸化ステップの影響。２０当量のＴＳＰＰによる還元、緩衝液交換、および１０当量のｍｃｖｃＰＡＢＣ０１０１とのコンジュゲーション後の、解析的疎水性相互作用クロマトグラフィートレース（２８０ｎｍにおける検出）；黒色トレース：再酸化なし、灰色トレース：コンジュゲーション前のデヒドロアスコルビン酸による再酸化。過剰コンジュゲートした種は、還元された鎖間ジスルフィド結合へのコンジュゲーションから生じる。
【図１６】システイン変異体抗ＥＤＢ抗体Ｋ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃおよびシステイン変異体抗体トラスツズマブＫ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃの粗製コンジュゲートの比較。コンジュゲートを、以下の実施例９に記載されるプロトコールに従って生成し、解析的疎水性相互作用クロマトグラフィー（２８０ｎｍにおける検出）によって解析した。
【図１７】システイン変異体トラスツズマブコンジュゲートの疎水性相互作用クロマトグラフィー精製。粗製コンジュゲートを、実施例９に記載される手順に従って調製し、実施例１４に記載されるカラムおよび条件を使用して精製した。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
一般的手順
細胞培養法
用語「培養物」および「細胞培養物」とは、本明細書で使用する場合、細胞集団の生存および／または増殖に適切な条件下で培地中に懸濁される細胞集団を指す。当業者に明らかなように、一部の実施形態では、これらの用語は、本明細書で使用する場合、細胞集団、および集団が懸濁される培地を含む組み合わせを指す。一部の実施形態では、細胞培養物の細胞は、哺乳動物細胞を含む。
【００２８】
本発明は、所望のプロセス（例えば、組換えタンパク質（例えば、抗体）の産生）に適した任意の細胞培養法と共に使用され得る。非限定的な例として、細胞は、バッチまたは流加培養物中で増殖され得、このとき、培養は、組換えタンパク質（例えば、抗体）の十分な発現後に終結され、その後、発現されたタンパク質（例えば、抗体）が収集される。あるいは、別の非限定的な例として、細胞は、バッチ−再供給（batch-refeed）で増殖され得、このとき培養は終結されず、新たな栄養素および他の成分が周期的または連続的に培養物に添加され、その間、発現された組換えタンパク質（例えば、抗体）が、周期的または連続的に収集される。他の適切な方法（例えば、スピンチューブ培養）が、当該分野で公知であり、本発明を実施するために使用され得る。
【００２９】
一部の実施形態では、本発明に適切な細胞培養は、流加培養である。用語「流加培養」とは、本明細書で使用する場合、さらなる成分が培養プロセスの開始に引き続く時点（単数または複数）で培養物に提供される、細胞を培養する方法を指す。かかる提供された成分は、典型的には、培養プロセスの間に枯渇された、細胞のための栄養成分を含む。流加培養は、典型的には、いくつかの時点で停止され、培地中の細胞および／または成分は収集され、任意選択により精製される。一部の実施形態では、流加培養は、供給培地が補充された基本培地を含む。一部の実施形態では、ラクテートは、Ｇａｇｎｏｎらに開示されたグルコースのハイエンドｐＨ制御送達（high-end pH-controlled delivery of glucose）（ＨｉＰＤＯＧプロセス）を使用することによって、低いレベルで維持される。
【００３０】
一部の実施形態では、本発明に適切な細胞培養は、灌流プロセスである。用語「灌流」とは、本明細書で使用する場合、細胞が接種基本培地を受ける、細胞を培養する方法を指し、細胞が所望の細胞密度に達した時点で、消費された培地が新鮮な培地によって置き換えられるように細胞灌流が開始される。灌流プロセスは、培養物が高い細胞密度に達するのを可能にし、したがって、大量の産物の産生を可能にする。しかし、灌流プロセスの少なくとも一部の形態は、大量の培地を補給することを必要とし、その結果、産物のいくらかの部分が、単一の収集中に濃縮されるのではなく、大きい体積の消費された培地中に含有されることになる。
【００３１】
用語「バイオリアクター」とは、本明細書で使用する場合、原核生物または真核生物細胞培養物（例えば、哺乳動物細胞培養物）の増殖のために使用される任意の容器を指す。バイオリアクターは、細胞（例えば、哺乳動物細胞）の培養に有用である限り、任意のサイズのものであり得る。細胞は、実施者によって選択される任意の簡便な体積で増殖され得る。例えば、細胞は、数ミリリットルから数リットルまでの範囲の体積の小規模反応容器中で増殖され得る。あるいは、細胞は、およそ少なくとも１リットルから、１０、５０、１００、２５０、５００、１０００、２５００、５０００、８０００、１００００、１２０００、１５０００、２００００もしくは２５０００リットルまたはそれよりも多くまでの範囲の体積の、あるいはそれらの間の任意の体積の、市販の大規模バイオリアクター中で増殖され得る。
【００３２】
一部の実施形態では、細胞は、実施者の要求および細胞自体の要件に依存して、より多いまたは少ない量の時間にわたって、初期増殖期（または増殖期）の間増殖され得る。一部の実施形態では、細胞は、予め規定された細胞密度に達するのに十分な期間にわたって増殖される。一部の実施形態では、細胞は、乱されずに増殖される場合に細胞が最終的に到達する最大細胞密度の所与の百分率である細胞密度に達するのに十分な期間にわたって増殖される。例えば、細胞は、最大細胞密度の１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または９９パーセントの所望の生存細胞密度に達するのに十分な期間にわたって増殖され得る。一部の実施形態では、細胞は、細胞密度が、１日の培養当たり、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％よりも大きくは増加しないところまで、増殖される。一部の実施形態では、細胞は、細胞密度が、１日の培養当たり５％よりも大きくは増加しないところまで、増殖される。
【００３３】
一部の実施形態では、細胞は、規定された期間にわたって増殖される。例えば、細胞培養物の出発濃度、細胞が増殖する温度、および細胞の固有の増殖速度に依存して、細胞は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれよりも多い日数、好ましくは４〜１０日間にわたって、増殖され得る。一部の場合には、細胞は、１カ月以上にわたって増殖させてもよい。本発明の実施者は、タンパク質産生の要件、および細胞自体の要求に依存して、初期増殖期の持続時間を選択することができる。
【００３４】
一部の実施形態では、細胞は、所望の細胞密度または産生力価に到達するまで、引き続く産生期で維持され得る。本発明の別の実施形態では、細胞は、引き続く産生期の間、規定された期間にわたって増殖される。例えば、引き続く増殖期の開始時の細胞培養物の濃度、細胞が増殖する温度、および細胞の固有の増殖速度に依存して、細胞は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれよりも多い日数にわたって増殖され得る。一部の場合には、細胞は、１カ月以上にわたって増殖させてもよい。本発明の実施者は、ポリペプチドまたはタンパク質産生の要件、および細胞自体の要求に依存して、引き続く産生期の持続時間を選択することができる。
【００３５】
一部の実施形態では、細胞は、組換えタンパク質を発現し、本発明の細胞培養法は、増殖期および産生期を含む。
【００３６】
細胞
細胞培養を受け入れる任意の細胞が、本発明に従って利用され得る。一部の実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。本発明に従って使用され得る哺乳動物細胞の非限定的な例には、ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫系統（ＮＳＯ／ｌ、ＥＣＡＣＣ番号８５１１０５０３）；ヒト網膜芽細胞（ＰＥＲ．Ｃ６、ＣｒｕＣｅｌｌ、Ｌｅｉｄｅｎ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）；ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系統（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胎児由来腎臓系統（懸濁培養での増殖のためにサブクローニングされた２９３または２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．、３６：５９、１９７７）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞＋／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：４２１６、１９８０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．、２３：２４３〜２５１、１９８０）；サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１  ５８７）；ヒト子宮頚癌細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；ｂｕｆｆａｌｏラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、３８３：４４〜６８、１９８２）；ＭＲＣ  ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒトヘパトーマ系統（Ｈｅｐ  Ｇ２）が含まれる。一部の好ましい実施形態では、細胞は、ＣＨＯ細胞である。一部の好ましい実施形態では、細胞は、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）遺伝子発現系を使用する。
【００３７】
さらに、いくつもの市販および非市販のハイブリドーマ細胞株が、本発明に従って利用され得る。用語「ハイブリドーマ」とは、本明細書で使用する場合、不死化細胞と抗体産生細胞との融合から生じる細胞または細胞の子孫を指す。かかる得られたハイブリドーマは、抗体を産生する不死化細胞である。ハイブリドーマを生み出すために使用される個々の細胞は、ラット、ブタ、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびヒトが含まれるがこれらに限定されない任意の哺乳動物供給源由来であり得る。一部の実施形態では、ハイブリドーマは、ヒト細胞とマウス骨髄腫細胞株との間の融合の産物であるヘテロハイブリッド骨髄腫融合物の子孫を形質細胞と引き続いて融合させたときに生じる、トリオーマ（trioma）細胞株である。一部の実施形態では、ハイブリドーマは、抗体を産生する任意の不死化ハイブリッド細胞株、例えば、クアドローマなどである（例えば、Ｍｉｌｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ、５３７：３０５３、１９８３を参照のこと）。当業者は、ハイブリドーマ細胞株が、異なる栄養要件を有し得、および／または最適な増殖のために異なる培養条件を必要とし得ることを理解し、必要に応じて条件を改変することができる。
【００３８】
細胞増殖および生産性
高い細胞密度とは、本明細書で使用する場合、１Ｅ６細胞／ｍＬ、５Ｅ６細胞／ｍＬ、１０Ｅ６細胞／ｍＬ、５０Ｅ６細胞／ｍＬ、１００Ｅ６細胞／ｍＬまたは５００Ｅ６細胞／ｍＬを上回る、好ましくは１０Ｅ６細胞／ｍＬを上回る、より好ましくは５０Ｅ６細胞／ｍＬを上回る、細胞密度を指す。
【００３９】
一部の実施形態では、細胞増殖は、生存細胞密度（ＶＣＤ）、最大生存細胞密度または積分生存細胞計数（ＩＶＣＣ）によって決定される。一部の実施形態では、細胞増殖は、最大生存細胞密度によって決定される。
【００４０】
用語「生存細胞密度」とは、本明細書で使用する場合、所与の体積の培地中に存在する細胞の数を指す。生存細胞密度は、当業者に公知の任意の方法によって測定され得る。好ましくは、生存細胞密度は、Ｂｉｏｐｒｏｆｉｌｅ  Ｆｌｅｘ（登録商標）（Ｎｏｖａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）などの自動細胞カウンターを使用して測定される。用語最大細胞密度とは、本明細書で使用する場合、細胞培養の間に達成される最大細胞密度を指す。用語「細胞生存度」とは、本明細書で使用する場合、所与のセットの培養条件または実験バリエーションの下で培養物中の細胞が生存する能力を指す。当業者は、細胞生存度を決定するための多くの方法の１つが本発明に包含されることを理解する。例えば、生きた細胞の膜は通過しないが、死細胞または瀕死細胞の破壊された膜を通過できる色素（例えば、トリパンブルー）を、細胞生存度を決定するために使用できる。
【００４１】
用語「積分生存細胞計数（ＩＶＣＣ）」とは、本明細書で使用する場合、生存細胞密度（ＶＣＤ）曲線下の面積を指す。ＩＶＣＣは、以下の式を使用して計算できる：
ＩＶＣＣｔ＋１＝ＩＶＣＣｔ＋（ＶＣＤｔ＋ＶＣＤｔ＋１）＊（Δｔ）／２
式中、Δｔは、ｔ時点とｔ＋１時点との間の時差である。ＩＶＣＣｔ＝０は無視できるものとしてよい。ＶＣＤｔおよびＶＣＤｔ＋１は、ｔ時点およびｔ＋１時点における生存細胞密度である。
【００４２】
上記方法の一部の実施形態では、生産性は、力価および／または体積生産性によって決定される。
【００４３】
用語「力価」とは、本明細書で使用する場合、例えば、所与の量の培地体積中の細胞培養物によって産生された組換え発現されたタンパク質の総量を指す。力価は、典型的には、培地１リットル当たりのタンパク質のグラム数を単位として表現される。
【００４４】
上記方法の一部の実施形態では、生産性は、力価によって決定される。一部の実施形態では、生産性は、対照培養物と比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％または２５％増加される。一部の実施形態では、生産性は、対照培養物と比較して、少なくとも１０％増加される。一部の実施形態では、生産性は、対照培養物と比較して、少なくとも２０％増加される。
【００４５】
細胞培養培地
用語「培地」、「細胞培養培地」および「培養培地」とは、本明細書で使用する場合、増殖中の哺乳動物細胞に栄養を与える成分または栄養素を含有する溶液を指す。典型的には、栄養素には、最小の増殖および／または生存のために細胞によって必要とされる、必須および非必須アミノ酸、ビタミン、エネルギー源、脂質ならびに微量元素が含まれる。かかる溶液は、ホルモンおよび／もしくは他の増殖因子、特定のイオン（例えば、ナトリウム、塩化物イオン、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸イオン）、緩衝液、ビタミン、ヌクレオシドもしくはヌクレオチド、微量元素（通常は非常に低い最終濃度で存在する無機化合物）、高い最終濃度で存在する無機化合物（例えば、鉄）、アミノ酸、脂質ならびに／またはグルコースもしくは他のエネルギー源が含まれるがこれらに限定されない、最小の速度を上回って増殖および／または生存を増強する、さらなる栄養素または補足成分もまた含有し得る。一部の実施形態では、培地は、有利には、細胞の生存および増殖に最適なｐＨおよび塩濃度に処方される。一部の実施形態では、培地は、細胞培養の開始後に添加される供給培地である。
【００４６】
アミノ酸濃度を測定するための方法
アミノ酸の濃度は、当業者に公知の任意の方法によって測定され得る。オンラインまたはオフラインの方法でアミノ酸の濃度を測定するための好ましい方法には、例えば、液体クロマトグラフィー、例えば、ＨＰＬＣ、ＵＰＬＣもしくはＬＣＭＳ、ＮＭＲまたはＧＣＭＳが含まれる。
【００４７】
一部の実施形態では、アミノ酸の濃度は、細胞培養培地の試料を採取し、前記試料中の前記少なくとも１種のアミノ酸の濃度を測定することによって、オフラインで測定される。一部の実施形態では、アミノ酸の濃度は、実施例３．１、３．２および３．３に開示されるように測定される。オフライン方法でアミノ酸の濃度を測定するための好ましい方法は、ＵＰＬＣである。
【００４８】
一部の実施形態では、アミノ酸の濃度は、オンラインで測定される。一部の実施形態では、アミノ酸の濃度は、ラマン分光法を使用して、オンラインで測定される。一部の実施形態では、アミノ酸の濃度は、ラマン分光法を使用して、オンラインで測定される。一部の実施形態では、アミノ酸の濃度は、試料をリアクターから引き出し、プログラムされた様式でそれを装置に移すオートサンプラーを用いて、ＨＰＬＣまたはＵＰＬＣベースのテクノロジーを使用して、オンラインで測定される。
【００４９】
ＷＯ２０１５／１４０７０８に記載されるようなさらなる手順もまた、本発明において使用され得、参照によって本明細書に取り込まれる。
【００５０】
薬物対抗体比を測定するための方法
薬物対抗体比（ＤＡＲ）は、当業者に公知の任意の方法によって測定され得る。ＤＡＲを測定するための好ましい方法には、例えば、液体クロマトグラフィー、例えば、ＨＰＬＣ、ＵＰＬＣまたはＬＣＭＳ、質量分析、およびＮＭＲが含まれる。
【００５１】
一部の実施形態では、ＤＡＲは、コンジュゲーション混合物、クロマトグラフィー画分またはさらに精製された材料の試料を採取し、前記試料中の前記の濃度を測定することによって測定される。ＤＡＲを測定するための好ましい方法は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ  ＨＰＬＣ）および逆相ＨＰＬＣである。
【００５２】
さらなる定義
上で提供される定義に加えて、以下のさらなる定義が提供される：
【００５３】
ＣＨＯは、提供された実施例において開示されるように、治療的タンパク質の産生のために使用される、チャイニーズハムスターの卵巣に由来するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞として、本明細書に記載される。ＣＨＯ−Ｋ１は、Ｌｏｎｚａから市販されているグルタミンシンターゼ（ＧＳ）発現系から構成される親ＣＨＯ細胞株からサブクローニングされた祖先宿主細胞株として、本明細書に記載される。
【００５４】
ＨｉＰＤＯＧとは、本明細書で使用する場合、「グルコースのハイエンドｐＨ制御送達」（ＨｉＰＤＯＧ）を指し、これは、細胞培養物中のラクテート蓄積を抑制するためにｐＨを上昇させることによってもたらされる、濃縮グルコース溶液を送達する栄養素供給法である。
【００５５】
用語ｍＡｂとは、本明細書で使用する場合、モノクローナル抗体を指す。
【００５６】
用語ＤＡＲ４とは、本明細書で使用する場合、４：１の薬物対抗体比を指し、４つの薬物ペイロードが１つのタンパク質に連結されている（例えば、１つのかかる例を示す以下の図を参照のこと。図中、「Ｒ」は、ペイロードを示す）。用語粗製ＤＡＲ４は、コンジュゲーションプロセスの後であるが最終精製ステップの前の薬物対抗体比を記述する。
【００５７】
【化２】
2020505935.tif 000005
【００５８】
用語ＵＦ／ＤＦとは、本明細書で使用する場合、限外濾過／ダイアフィルトレーションを指す。
【実施例】
【００５９】
以下の実施例は、本発明の重要な特色を示す。
【００６０】
（実施例１）
通常のＣＤ  ＣＨＯ培地における高い細胞密度の安定なＣＨＯ発現による、完全にキャップされていないシステイン変異体抗体の生成
システイン変異体抗体トラスツズマブＫ２９０Ｃ−Ｋ３３４ＣまたはＫ３９２Ｃ−Ｋ３３４Ｃを安定に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を、３Ｅ６細胞／ｍＬまたは６Ｅ６細胞／ｍＬの密度で通常のＣＤ  ＣＨＯ培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）中に播種し、増殖させ、５％ＣＯ２を有する加湿インキュベーター中で３７セルシウス度に維持した。１つの条件では、５ｍＭのシスチンを、ＣＤ  ＣＨＯ培地に添加した。細胞を、３７セルシウス度で７２時間培養した。細胞生存度を測定し、順化培地を収集した。細胞は、９８％よりも高くが生存していた。
【００６１】
抗体タンパク質を、以下のように、ＰｒｏＡおよびサイズ排除カラムを介して精製した。順化培地を、０．２μｍフィルターで濾過し、５０ｍＭトリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５（ＴＢＳ）で予め平衡化したプロテインＡ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を通過させた。カラムを、２カラム体積（ＣＶ）のＴＢＳ、５ＣＶのＣａＣｌ２、ｐＨ７．５、３ＣＶの１０ｍＭトリス、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５で洗浄し、その後、タンパク質を、１５０ｍＭグリシン、４０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ３．５の１００％ステップを使用して溶出させた。タンパク質を、２Ｍ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０を使用してｐＨを７．０に調整し、タンパク質を、ＰＢＳ（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、８．１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、２．７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．２で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム上にロードした。ピーク画分をプールし、５０ｋＤａ  ＭＷＣＯ遠心分離デバイスを使用して１０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。
【００６２】
タンパク質試料を、以下のように、Ｃｙｓキャッピング状態測定のために質量分析によって解析した。液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ／ＭＳ）解析を、Ａｇｉｌｅｎｔ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）１２００キャピラリーＨＰＬＣに連結されたＷａｔｅｒｓ  Ｘｅｖｏ  Ｑ−ＴＯＦ  Ｇ２質量分析器（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）を使用して実施した。タンパク質試料を、ＩｄｅＳプロテアーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）で室温で２時間処理した。タンパク質試料を、０．０５％ＴＦＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で１：１希釈することによって酸性化し、その後液体クロマトグラフィー質量分析解析を行った。試料を、６５μｌ／分の流速で、８０℃に維持したＷａｔｅｒｓ  ＢＥＨ３００  Ｃ４、１．７μｍ（１．０×５０ｍｍ）カラムで分離した。移動相Ａは、０．０５％ＴＦＡを含む水であり、移動相Ｂは、０．０５％ＴＦＡを含むアセトニトリルであった。タンパク質を、以下の勾配を使用してカラムから溶出させた：０．５分で２％〜２０％のＢ、６分で２０％〜４０％のＢ、および４分で４０％〜１００％のＢ。質量分析器を、８００〜３５００ｍ／ｚにわたるポジティブＭＳのみのモードで実行し、データを、ＭａｓｓＬｙｎｘ（Ｗａｔｅｒｓ）４．１ソフトウェアを用いて獲得した。抗体に対応するＴＯＦ−ＭＳシグナルを要約し、ＭａｘＥｎｔ１（Ｗａｔｅｒｓ）プログラムを使用してデコンボリューションした。システインおよびグルタチオンキャップされた種を、質量シフトによって決定した（Ｃｙｓ：１１９．００４Ｄａ、ＧＳＨ：３０５．０６８Ｄａ）。
【００６３】
図１に示されるように、ＣＤ  ＣＨＯ培地について、システイン変異体抗体は、５ｍＭのシスチンを培地に添加した場合、完全にシステイン化された（cysteinylated）。通常のＣＤ  ＣＨＯ培地では、ＣＨＯ細胞は、３Ｅ６細胞／ｍＬの細胞密度で、かなりのキャップされていないシステイン変異体タンパク質を産生した。ＣＨＯ細胞を６Ｅ６細胞／ｍＬに増加させた場合、完全にキャップされていないシステイン変異体抗体が生成され、これは、培地中のほとんどのシスチンが細胞増殖に使用されたことを示唆している。細胞密度の増加は、シスチンの培地を枯渇させ得、結果的に、対になっていない表面システインのキャッピング状態に影響を与え得る。
【００６４】
（実施例２）
通常のＣＨＯ培地における高い細胞密度の安定なＣＨＯによる、完全にＴＮＢキャップされたシステイン変異体抗体の生成
実施例１に示されるように、高い密度での細胞増殖は、培地中の顕著な量のシステインまたはシスチンを消費し得る。結果的に、完全にキャップされていないシステイン変異体抗体が生成された。実施例１に基づくと、これは、異なる時点において種々の濃度のＤＴＮＢを細胞培養物に添加することによって、完全にＴＮＢキャップされたシステイン変異体抗体の大量の生成を可能にした。ＤＴＮＢは、キャップされていない変異体抗体上の遊離チオールを効率的にアルキル化し、ＴＮＢキャップされた抗体の生成を生じた。
【００６５】
したがって、システイン変異体抗体トラスツズマブＫ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃを安定に発現するＣＨＯ細胞株を、１Ｌの初期作業体積を有する制御されたバイオリアクター（Ａｐｐｌｉｋｏｎ，Ｉｎｃ．、Ｓｃｈｉｅｄａｍ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）中に播種した。示されるように、８つの条件を実行し、図２Ａに示されるように、基本培地中の異なる濃度のシステインおよび／またはシスチンを評価した。流加培養プロセスを、０．６Ｅ６細胞／ｍＬで播種し、培養体積に基づいて固定された百分率の栄養素供給で制御し、３日目に開始して投与した；ＴＮＢキャップされた抗体を産生する条件は、システインおよびシスチンの両方を含まない供給培地を使用した。７日目に、１ｍＭ  ＤＴＮＢを培養物に添加し、細胞培養を、さらに５日間継続した。
【００６６】
図２Ｂに示されるように、細胞の倍加および生存度は、試験した全ての条件下で正常であった。
【００６７】
抗体タンパク質を精製したとき、それらをＣｙｓキャッピング解析に供した。図３Ａに示されるように、抗体をＩｄｅｓプロテアーゼによって消化して、Ｆｃ断片およびＦａｂ２断片を生成した。混合物を、実施例１に上記されたように、ＬＣ／ＭＳによって解析した。図３Ｂに示されるように、あまり溶媒曝露されなかったＦｃに位置するＫ２９０Ｃ部位について、全てのＴＮＢ添加条件（実行２〜８）は、＞９５％のＴＮＢキャップされた材料を産生した。図４に示されるように、より溶媒曝露された軽鎖に位置するＦａｂ  Ｋ１８３Ｃ部位について、ＴＮＢ添加条件（実行５〜８）はまた、ＴＮＢキャップされた材料を優勢に生成した。
【００６８】
ＴＮＢキャッピング効率をさらに改善するために、より高い細胞密度を用いた培養条件を試験した。より良いラクテート制御のためのグルコース制御されたＨｉＰＤＯＧプロセスを利用した（Ｇａｇｎｏｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ２０１１）。播種密度およびシステイン／シスチン培地濃度を用いた実験条件は、図５Ａに示される。ラクテート制御されたＨｉＰＤＯＧプロセス（実行３）は、対応する流加条件（実行７）よりも、顕著に高いピーク細胞密度を生じた（図５Ｂ）。
【００６９】
抗体を、順化培地から精製し、ＬＣ／ＭＳによるＣｙｓキャッピング解析に供した。図６に示されるように、Ｆａｂ  Ｋ１８３Ｃ部位は、条件実行３〜７について９５％よりも高いＴＮＢキャッピングを達成したが、Ｆｃ  Ｋ２９０Ｃ部位は、条件実行３〜７についておよそ９８％のＴＮＢキャッピングを達成した。
【００７０】
（実施例３）
制限されたシステイン／シスチン曝露を標的化するプロセスにおける、完全にＴＮＢキャップされたシステイン変異体抗体の生成
以下の実施例では、システイン変異体抗体についてのキャッピング効率の読み出しは、最終精製の前の抗体へのリンカー−ペイロードのコンジュゲーション後に得られる粗製ＤＡＲ４（薬物対抗体比）百分率によって示される。粗製ＤＡＲ４値は、これらの実施例において、キャッピング効率の代用マーカーとして使用されている；しかし、抗体上の各変異したシステイン残基のキャッピング状態を決定することは、コンジュゲーションプロセスの前に長期ＬＣ／ＭＳ解析（実施例１に記載される）によって決定され得る。ＬＣ／ＭＳ解析の一例は、図７に見出すことができ、図中、抗体１つ当たりの異なるキャッピング種が特定および定量化されている。この解析に使用した試料は、ＴＮＢキャップされた抗体を産生するためのＤＴＮＢ供給を伴う、低いシステイン／シスチンプロセスであった。所望の標的種は、抗体１つ当たり４つのＴＮＢであり、これは、低レベルの還元不能なキャップおよびいくらかのサブ−４抗体種を伴って、この特定の実施例のＬＣ／ＭＳ結果において＞９５％を占める。
【００７１】
（実施例３．１）
供給培地中に処方された濃度を減少させることによって、培養物中のシステイン／シスチンを計画的に制限する
アプローチ１：この実施例は、補足的供給培地中に処方されたいずれかの成分の量を減少させることによって、培養物中のシステインおよび／またはシスチン濃度を意図的に制限することを示す。この実施例で使用した２つの条件は、基本培地中に類似の出発濃度のシステインおよび／またはシスチンを有した；しかし、１つの条件は、栄養素供給培地中にシステイン成分もシスチン成分も有さず、第２の条件は、シスチンのみを含有する供給培地を使用した（表１）；全ての他のプロセスパラメーターは、これら２つの条件について同一であった。標準的な哺乳動物細胞培養プロセスは、細胞培養培地中でのこれらの成分の溶解度の課題に起因して、さらなる補足的供給中にシステインおよび／またはシスチンを取り込む。
【００７２】
この実施例について、システイン変異体抗体トラスツズマブＫ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃを安定に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を、蠕動ポンプおよびガスマスフローコントローラーモジュールを備えたＢｉｏＮｅｔモジュラーコントローラー（Ｂｒｏａｄｌｅｙ−Ｊａｍｅｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）により動作する１ＬのＡｐｐｌｉｋｏｎバイオリアクター（Ａｐｐｌｉｋｏｎ，Ｉｎｃ．、Ｓｃｈｉｅｄａｍ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）中で、独占所有権のある基本および供給培地と共に使用した。培養物をおよそ２Ｅ６細胞／ｍＬで播種し、温度をおよそ３７セルシウス度で維持しつつ、ｐＨを、炭酸ナトリウム／カリウム溶液またはＣＯ２のいずれかの添加によって、７．０近傍で制御した。溶存酸素レベルを、純粋酸素のスパージングによって、＞２０％の空気飽和度に制御した。抗体のＴＮＢキャッピングのために、ＤＴＮＢ供給を、増殖期後に開始して、バイオリアクター中４ｍＭのＤＴＮＢ濃度の範囲を標的化した。以下に提供される実施例についてのバッチ持続時間は、およそ１２日間であった。
【００７３】
標準化された粗製ＤＡＲ４値により、供給培地からのシスチンの除去が、培養物中の利用可能なシステイン／シスチンを枯渇させる首尾よい方法であることが証明され、これにより、細胞増殖に対しても生産性に対しても有害な影響なしに、ＴＮＢによる抗体のより良いキャッピングおよびより高い百分率のＤＡＲ４抗体−薬物コンジュゲートが可能になった。
【００７４】
【表１】
2020505935.tif 000006
【００７５】
Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）を、追跡実験からの条件のアミノ酸解析に使用し、この実験では、対照条件に、７、９および１１日目に０．５ｍＭのシスチンを添加して、以前に記載された合理的培地設計に従うバッチ中のいずれの点におけるシスチン制限も回避した（表２）；ＴＮＢキャッピングのために使用したＤＴＮＢ標的濃度は、５ｍＭであった。全ての他のプロセスパラメーターは、表１に以前に記載した実験と同一であった。
【００７６】
【表２】
2020505935.tif 000007
【００７７】
これらの結果は、供給培地からシステイン／シスチンを除去することが、この特定の実施例について６〜７日目の間に培養物中のシステイン／シスチン濃度の枯渇を生じるということを、明らかに実証している；ＵＰＬＣ解析から得られたシスチン濃度を、化学量論的にシステインに変換し、図８にグラフで示した。
【００７８】
この特定の実施例のバッチ持続時間は、５日目の終わりまでのみであり、過剰なシステイン／シスチンは、実行４の培養物において利用可能であり、抗体の最適未満のＴＮＢキャッピングをもたらすことが理解される。この例では、バッチ持続時間を８日目またはそれよりも後まで延長させることは、最適なＴＮＢキャッピングに適切な環境をもたらす、過剰なシステイン／シスチンを枯渇させるための有効な方法であった。
【００７９】
さらに、灌流などの培地交換戦略を、プロセスにおいて後に、実行４の培養物からシステイン／シスチンを枯渇させるために、実行することができることが理解される。より高いレベルのシステイン／シスチンを含む供給培地は、バッチの増殖期の間およびピーク生存細胞密度が達成された後に使用され得、培地交換は、図８に匹敵するシステイン／シスチン枯渇の非常に類似のプロファイルを模倣するために、低いレベルのシステイン／シスチンを含有する培地を用いて行うことができる。
【００８０】
アプローチ２：この実施例は、補足的供給培地中に処方されたいずれかの成分の量を減少させることによって、培養物中のシステインおよび／またはシスチン濃度を意図的に制限するが、第２の抗体産生細胞株を用いる、アプローチ１に示された同じ戦略を示す。この実施例で使用した条件は、高いまたは低い播種条件にグループ分けされ、基本培地中に類似の出発濃度のシステインおよび／またはシスチンを有した。高いまたは低い播種密度のいずれかの１つの条件は、基本培地中の出発濃度のほかには、システインまたはシスチンの補充を有さなかったが、残りの条件は、別々の補足的シスチン供給を有した（表３）；全ての条件は、システインまたはシスチンなしの栄養素供給を有した。全ての他のプロセスパラメーターは、その播種条件に従って、２つの条件について同一であった（例えば、より高い播種密度条件は、より高い補足的栄養素供給速度を必要とした）。
【００８１】
この実施例について、抗ＥＤＢについてのシステイン変異体抗体Ｋ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃを安定に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を、蠕動ポンプおよびガスマスフローコントローラーモジュールを備えたＢｉｏＮｅｔモジュラーコントローラー（Ｂｒｏａｄｌｅｙ−Ｊａｍｅｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）により動作する１ＬのＡｐｐｌｉｋｏｎバイオリアクター（Ａｐｐｌｉｋｏｎ，Ｉｎｃ．、Ｓｃｈｉｅｄａｍ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）中で、独占所有権のある基本および供給培地と共に使用した。培養物をおよそ０．６Ｅ６細胞／ｍＬまたは３Ｅ６細胞／ｍＬで播種し、温度をおよそ３７セルシウス度で維持しつつ、ｐＨを、炭酸ナトリウム／カリウム溶液またはＣＯ２のいずれかの添加によって、７．０近傍で制御した。溶存酸素レベルを、純粋酸素のスパージングによって、＞２０％の空気飽和度に制御した。抗体のＴＮＢキャッピングのために、ＤＴＮＢ供給を、増殖期後に開始して、バイオリアクター中４ｍＭのＤＴＮＢ濃度の範囲を標的化した。以下に提供される実施例についてのバッチ持続時間は、およそ１２日間であった。
【００８２】
第２の細胞株の評価は、任意の補足的供給からのシステインおよび／またはシスチンの除去が、培養物中の利用可能なシステイン／シスチンを枯渇させるロバストな戦略であり、それが次いで、ＴＮＢによる抗体のより良いキャッピングを可能にすることを実証している。この戦略は、細胞増殖に対しても生産性に対しても有害な影響なしに、より高い百分率の粗製ＤＡＲ４抗体−薬物コンジュゲートを最終的にもたらす（表３）。
【００８３】
【表３】
2020505935.tif 000008
【００８４】
Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）を、アプローチ２（表４）の条件のアミノ酸解析に使用した。ＵＰＬＣ解析から得た全てのシスチン濃度を、システインに変換し、図９に示した。これらの結果は、システイン／シスチンの補充を除去することが、早くも７日目に培養物中の濃度の枯渇を生じ（図９）、粗製ＤＡＲ４値によって示されるように、最適なＴＮＢキャッピングに適切な環境をもたらすことを明確に示している。
【００８５】
【表４】
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【００８６】
（実施例３．２）
化学量論的アプローチおよび標的化された分数システイン制限比を使用して、培養物中のシステイン／シスチンを制限する：以前に記載された合理的培地設計および化学量論的アプローチを使用して、特定のピーク細胞密度および産生される産物の量のために必要とされるシステイン／シスチンの必要量を計算でき、その特定のプロセスに最適な培地を設計するためにそれを使用できる（方程式１）。この実施例では、システイン／シスチンの必要量を、プロセスの推定ピーク生存細胞密度および収集力価を使用して、合理的培地設計に基づいて計算した。システイン／シスチンの計算された必要量を（例えば、米国特許第８，２３２，０７５号で教示される比と比較して）下回る異なる分数システイン制限比の範囲を評価して、許容可能なピーク生存細胞密度および収集力価になおも達しつつ、抗体のＴＮＢキャッピングを促進するために、システイン／シスチンを制限または枯渇させる理想的な標的比を見出した（方程式２を参照のこと）。
【００８７】
全ての必要とされるシステイン／シスチン濃度を、標的分数システイン制限比に基づいて計算し、基本培地のみに添加した。
【００８８】
システイン変異体抗体トラスツズマブＫ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃを安定に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を、蠕動ポンプおよびガスマスフローコントローラーモジュールを備えたＢｉｏＮｅｔモジュラーコントローラー（Ｂｒｏａｄｌｅｙ−Ｊａｍｅｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）により動作する１ＬのＡｐｐｌｉｋｏｎバイオリアクター（Ａｐｐｌｉｋｏｎ，Ｉｎｃ．、Ｓｃｈｉｅｄａｍ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）中で、独占所有権のある基本および供給培地と共に使用した。培養物をおよそ２Ｅ６細胞／ｍＬで播種し、温度をおよそ３７セルシウス度で維持しつつ、ｐＨを、炭酸ナトリウム／カリウム溶液またはＣＯ２のいずれかの添加によって、７．０近傍で制御した。溶存酸素レベルを、純粋酸素のスパージングによって、＞２０％の空気飽和度に制御した。抗体のＴＮＢキャッピングのために、ＤＴＮＢ供給を、増殖期後に開始して、バイオリアクター中４ｍＭのＤＴＮＢ濃度の範囲を標的化した。以下に提供される実施例についてのバッチ持続時間は、およそ１２日間であった。基本培地中のシステイン／シスチン濃度は別にして、全てのプロセスパラメーターは、評価した条件の全てについて同一であった。
【００８９】
表５は、分数システイン制限比が増加するにつれて、粗製ＤＡＲ４百分率（したがって、抗体のキャッピング）が減少することを明らかに示している；これは、より低い分数システイン制限比が、抗体のキャッピングに最も最適であることを示しており、この実施例では、０．６３×および０．７６×の比が、許容可能なピーク生存細胞密度、収集力価および類似のキャッピング結果を提供した（表５）。収集力価および粗製ＤＡＲ４値は、標準化されている。
【００９０】
【表５】
2020505935.tif 000010
【００９１】
Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）を、表５に記載されるものと類似の条件のアミノ酸解析に使用した。ＵＰＬＣ解析から得た全てのシスチン濃度を、化学量論的にシステインに変換した。これらの結果は、より低い分数システイン制限比が、１．１５×条件と比較して、培養物中のシステイン／シスチンのレベルをより早期に枯渇させることを明らかに示しており、標的分数システイン制限比を使用することが、一貫した予測可能な低いレベルのＣｙｓキャッピングおよび高いＴＮＢキャッピング効率をもたらし得ることを示している（図１０）。
【００９２】
（実施例３．３）
ピーク細胞密度を増加させることによって、培養物中のシステイン／シスチンを制限する：実施例３．１で２つの細胞株によって以前に実証されたように、バッチの間に、システイン／シスチンが低い濃度に制限される場合または完全に枯渇される場合、ＴＮＢキャッピング効率は増加する。培養物中のシステイン／シスチン濃度のレベルを意図的に減少または枯渇させる第２の例は、ピーク生存細胞密度を使用することによって実施され得る。所与の培養物中の生存細胞密度が増加するにつれて、アミノ酸の消費およびアミノ酸に対する需要も、典型的には同様に増加する（米国特許第８，２３２，０７５号）。この実施例では、異なるピーク生存細胞密度が達成された２つの別々の条件を評価した。
【００９３】
システイン変異体抗体トラスツズマブＫ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃを安定に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を、蠕動ポンプおよびガスマスフローコントローラーモジュールを備えたＢｉｏＮｅｔモジュラーコントローラー（Ｂｒｏａｄｌｅｙ−Ｊａｍｅｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）により動作する１ＬのＡｐｐｌｉｋｏｎバイオリアクター（Ａｐｐｌｉｋｏｎ，Ｉｎｃ．、Ｓｃｈｉｅｄａｍ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）中で、独占所有権のある基本および供給培地と共に使用した。条件を、およそ０．６Ｅ６または２Ｅ６細胞／ｍＬで播種し、温度をおよそ３７セルシウス度で維持しつつ、ｐＨを、炭酸ナトリウム／カリウム溶液またはＣＯ２のいずれかの添加によって、７．０近傍で制御した。溶存酸素レベルを、純粋酸素のスパージングによって、＞２０％の空気飽和度に制御した。以下に提供される実施例についてのバッチ持続時間は、およそ１２日間であった；１つの条件は、低い生存度に起因して、早期に収集した。２つの条件について、一部のプロセスパラメーター、例えば、栄養素供給速度は、異なるピーク細胞密度に到達しそれを持続するために異なっていた。しかし、基本培地中のシステインおよびシスチン濃度は類似であり、供給培地のシスチン濃度は同じであった（表６）。
【００９４】
【表６】
2020505935.tif 000011
【００９５】
Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）を、表６に記載される条件のアミノ酸解析に使用した。ＵＰＬＣ解析から得た全てのシスチン濃度を、システインに変換した。これらの条件のアミノ酸解析は、より高いピーク生存細胞密度を用いた条件が、収集まで残存濃度のシステイン／シスチンを維持したより低いピーク生存細胞密度を用いた条件と比較して、バッチ中のシステイン／シスチンのより早期の枯渇に成功したことを示した（図１１Ｂ）。粗製ＤＡＲ４は、これらの試料については解析せず、アミノ酸解析データに基づいた；システイン／シスチンは、高い播種条件についてはより早期に枯渇された。このデータから、効率的なＴＮＢキャッピングに最適な低いシステイン／シスチン環境が、より高いピーク生存細胞密度によって誘導されたことが推測できる。これは、より高い細胞密度に培養物が到達するように促進できる育成条件が、抗体のＴＮＢキャッピングのための所望の環境を促進するために、細胞培養物中のシステイン／シスチンを低いまたは枯渇したレベルで維持する、有効な代替的方法であり得ることを実証している。
【００９６】
（実施例４）
細胞の非存在下でのＴＮＢキャップされたＣｙｓ変異体抗体の生成。所望の抗体薬物コンジュゲートを生成するためのコンジュゲーションステップにおいて引き続いて使用され得るような形態での抗体または融合タンパク質の生成は、慣用的には、製造細胞株の開発の一部として達成される、および／または製造プロセスの上流／細胞培養プロセス部分の一部として達成される。ＴＮＢキャップされた抗体の生成の場合、これまでに記載されたアプローチは、以前に記載された細胞培養プロセスの種々のさらなる改変（例えば、システイン／シスチン供給濃度の調整、バッチ長さの改変であるがこれらに限定されない）と共にまたはそれなしで、細胞培養プロセスの一部としてＤＴＮＢ供給を含めることを介したものであった。これは、所望のキャップされた抗体の産生を可能にするが、これらのアプローチは、製造プロセスの細胞培養物部分に依存し、製造設備の全体的生産性を低減させ得る。したがって、ＴＮＢキャップされた抗体の処理量は、設備、特に、細胞培養に使用される産生バイオリアクターまたは発酵槽の最適未満の利用に起因して制限される。
【００９７】
この実施例では、システイン変異体組換えタンパク質、例えば、システイン変異体抗体、システイン変異体融合タンパク質などが、細胞培養／発酵技術を介して産生される。次いで、タンパク質含有順化培地が、遠心分離、精密濾過または他の適切な細胞分離技術によって、細胞から分離され得る。細胞分離は、完全でも部分的でもよい。次のステップは、ＴＮＢキャップされたタンパク質を生成するための、ＤＴＮＢとの、変異体ｃｙｓ組換えタンパク質の曝露／インキュベーションである。ａ）システイン変異体組換えタンパク質を生成するステップとｂ）システイン変異体組換えタンパク質のキャッピングのステップとを分離することによって、製造プロセスおよび設備は、プロセスのキャッピング部分における細胞培養バイオリアクター／発酵槽の利用を回避し、したがって、バイオリアクター／発酵槽に必要なサイクル時間を最小化することによって、生産性を最大化するために最適化され得る。したがって、バイオリアクター／発酵槽のサイクル時間を最小化することは、（期間当たりに実施されるより多い数のサイクルを介して）より高い処理量を可能にする。
【００９８】
アプローチ１：この実施例について、システイン変異体抗体トラスツズマブＫ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃを安定に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を、蠕動ポンプおよびガスマスフローコントローラーモジュールを備えたＢｉｏＮｅｔモジュラーコントローラー（Ｂｒｏａｄｌｅｙ−Ｊａｍｅｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）により動作する１ＬのＡｐｐｌｉｋｏｎバイオリアクター（Ａｐｐｌｉｋｏｎ，Ｉｎｃ．、Ｓｃｈｉｅｄａｍ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）中で、基本および供給培地と共に使用した。細胞培養物温度をおよそ３７セルシウス度で維持しつつ、ｐＨを、炭酸ナトリウム／カリウム溶液またはＣＯ２のいずれかの添加によって、７．０近傍で制御した。溶存酸素レベルを、純粋酸素のスパージングによって、＞２０％の空気飽和度に制御した。細胞培養物の培養後、タンパク質含有順化培地を、遠心分離および０．２ｕｍ濾過を介して分離した。次いで、順化培地を別々の容器に移した。この容器に、特定の濃度のＤＴＮＢを、タンパク質含有順化培地に直接添加した。所望の材料を生成する手順のロバストさを実証するために、種々の期間にわたって反応を生じさせた。図１２（トラスツズマブＫ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃ）で見られるように、所望の産物が、様々なインキュベーション期間を使用して生成され、より長い時間は、改善された成績をもたらした。
【００９９】
アプローチ２：この実施例について、システイン変異体抗体抗ＥＤＢ  Ｋ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃを安定に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞の第２の細胞株を、ポンプおよびガスマスフローコントローラーモジュールを備えたＢｉｏＮｅｔモジュラーコントローラー（Ｂｒｏａｄｌｅｙ−Ｊａｍｅｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）により動作する１ＬのＡｐｐｌｉｋｏｎバイオリアクター（Ａｐｐｌｉｋｏｎ，Ｉｎｃ．、Ｓｃｈｉｅｄａｍ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）中で、基本および供給培地と共に使用した。細胞培養物温度をおよそ３７セルシウス度で維持しつつ、ｐＨを、炭酸ナトリウム／カリウム溶液またはＣＯ２のいずれかによって、７．０近傍で制御した。溶存酸素レベルを、純粋酸素のスパージングによって、＞２０％の空気飽和度に制御した。細胞培養物の培養後、タンパク質含有順化培地を、遠心分離および０．２ｕｍ濾過を介して分離した。次いで、順化培地を別々の容器に移した。この容器に、特定の濃度のＤＴＮＢを、タンパク質含有順化培地に直接添加した。所望の材料を生成する手順のロバストさを実証するために、種々の期間にわたって反応を生じさせた。図１３（抗ＥＤＢ  Ｋ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃ）で見られるように、所望の産物が、様々なインキュベーション期間を使用して生成され、より長い時間は、改善された成績をもたらし、このことは、２つの異なる抗体発現細胞株において同じ傾向が観察されたことを実証している。
【０１００】
（実施例５）
ＴＮＢコンジュゲーションプロセス。ＴＮＢでキャップされたシステイン変異体抗体を、ＴＳＰＰで選択的に還元する。生成された遊離チオール基は、限外濾過／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）および再酸化ステップなしの直接的薬物コンジュゲーションを可能にし、プロセスを単純化する。抗体１つ当たり４つのキャッピング（ＤＡＲ４）の形態の、ＴＮＢで完全にキャップされたシステイン変異体抗体トラスツズマブＫ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃが生成され、ＴＳＰＰ処理後に、７０％の効率で直接コンジュゲートされた。
【０１０１】
さらなる例として、ＴＮＢキャッピングおよびコンジュゲーション（Ｋ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃにおける）を、本明細書でさらに議論する。システイン変異体コンジュゲーションのためのＴＮＢキャップコンジュゲーションプロトコールは、粗製コンジュゲートをもたらす２つのステップ：選択的還元およびコンジュゲーションからなる。第１のステップでは、変異体システインの選択的還元を、鎖間ジスルフィドの最小限の還元を伴うまたは還元を伴わない、変異体システイン残基からの保護基（複数可）の除去を達成するために行う。典型的には、これは、過剰量（約７当量）の、トリス（３−スルホナトフェニル）ホスフィン（ＴＳＰＰ）などの還元剤を使用して、周囲温度で２時間実施する。第２のステップでは、保護されていない変異体システインを、リンカー−ペイロードにコンジュゲートする。典型的には、過剰量（約１２当量）のリンカー−ペイロードを反応に添加し、反応を、周囲温度で１時間実施して、粗製コンジュゲートを産生する。最終コンジュゲートは、ネイティブの鎖間ジスルフィド結合を維持するが、それは、これらが、還元ステップの間に破損されなかったからである。
【０１０２】
特定の場合には、１．０ｇ（６．９μｍｏｌ；６０ｍＭヒスチジン、ｐＨ７中２５ｍｇ／ｍＬ；３８．９ｍＬ）のトラスツズマブＫ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃ抗体に、２７．５ｍｇのＴＳＰＰ（７当量；４８．３μｍｏｌ；水中１０ｍＭ；４．８３ｍＬ）を添加した。反応混合物を、周囲温度で２時間インキュベートした。この反応混合物に、１１１ｍｇのｍｃｖｃＰＡＢＣ０１０１リンカー−ペイロード（１２当量、８２．７μｍｏｌ；ジメチルスルホキシド中２５ｍＭ；３．３１ｍＬ）を添加した。反応混合物を周囲温度で１時間インキュベートして、粗製コンジュゲートを得た。
【０１０３】
（実施例６）
還元後ダイアフィルトレーションを用いるＴＮＢコンジュゲーションプロセス。実施例５に記載されるプロセスにおいて使用される過剰量のリンカー−ペイロードは、ＴＳＰＰ還元後に、リンカー−ペイロードと反応する種を除去するためのダイアフィルトレーション（緩衝液交換）ステップを追加することによって低減させることができる。図１４に示されるように、７０％のＤＡＲ４が、緩衝液交換後に６当量のリンカーペイロードを用いて達成されるが、緩衝液交換が実施されない場合、有意により高い当量が必要とされる。また、ＴＳＰＰの量は、還元温度および／または時間を増加させることによって、わずかに低減され得る。
【０１０４】
特定の場合には、４．０ｇ（２７．６μｍｏｌ；６０ｍＭヒスチジン、ｐＨ７中２５ｍｇ／ｍＬ；１５６ｍＬ）のトラスツズマブＫ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃ抗体に、９３．８ｍｇのＴＳＰＰ（６当量；１６５μｍｏｌ；水中１０ｍＭ；１６．５ｍＬ）を添加した。反応混合物を３７℃で３時間インキュベートし、次いで、ダイアフィルトレーション（ＴａｎｇｅｎＸ  ＰｒｏＳｔｒｅａｍ  ５０ｋＤメンブレン、１１０〜２１０ｇ／ｍ２、１０ダイアボリューム（diavolume）の６０ｍＭヒスチジン、ｐＨ７）によって緩衝液交換した。ダイアフィルトレーション後、２２２ｍｇのｍｃｖｃＰＡＢＣ０１０１リンカー−ペイロード（６等量、１６５μｍｏｌ；ジメチルスルホキシド中２５ｍＭ；６．６２ｍＬ）を添加した。反応混合物を２５℃で１時間インキュベートして、粗製コンジュゲートを得た。
【０１０５】
（実施例７）
増加したＴＳＰＰ化学量論、還元後ダイアフィルトレーションおよび再酸化を用いる、ＴＮＢコンジュゲーションプロセス。実施例６に記載されるプロセスによって産生される凝集物の量は、ＴＳＰＰ化学量論を増加させることによって低減させることができる。増加したＴＳＰＰ化学量論は、変異したシステインからＴＮＢをより迅速に除去し、抗体間でのジスルフィド結合の形成を防止する。しかし、増加したＴＳＰＰ化学量論は、鎖間ジスルフィド結合のごく一部の還元もまた生じる。塩化ナトリウムおよび他の塩の存在（実施例８を参照のこと）は、より高いＴＳＰＰ化学量論における鎖間ジスルフィド還元の程度を減少させる。ダイアフィルトレーション後の再酸化ステップの追加は、還元された鎖間ジスルフィド結合の一部を修復する。図１５に示されるように、２０当量のＴＳＰＰによる還元および緩衝液交換の後のコンジュゲーションは、再酸化ステップなしの場合、鎖間ジスルフィド結合還元に起因する低いレベルの過剰コンジュゲートした種を生じる。再酸化をプロセスに追加すると、過剰コンジュゲートした種は形成されない。
【０１０６】
特定の場合には、２４．７ｇ（０．１７０ｍｍｏｌ；６０ｍＭヒスチジン中２６ｍｇ／ｍＬ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７；９６１ｍＬ）のトラスツズマブＫ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃ抗体に、１．９４ｇのＴＳＰＰ（２０当量；３．４１ｍｍｏｌ；水中１００ｍＭ；３４．１ｍＬ）を添加した。反応混合物を、３７℃で３時間撹拌し、次いで、ダイアフィルトレーション（ＴａｎｇｅｎＸ  ＰｒｏＳｔｒｅａｍ  ５０ｋＤメンブレン、１１０〜２１０ｇ／ｍ２、１０ダイアボリュームの６０ｍＭヒスチジン、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７）によって緩衝液交換した。ダイアフィルトレーション後、混合物を４℃に冷却し、０．４５ｇのデヒドロアスコルビン酸（１５当量；２．５６ｍｍｏｌ；１：１のＤＭＳＯ／水中５０ｍＭ；５１．２ｍＬ）を添加し、混合物を４℃で１６時間撹拌した、混合物を２５℃に加熱し、１．３７ｇのｍｃｖｃＰＡＢＣ０１０１リンカー−ペイロード（６等量、１．０２ｍｍｏｌ；ジメチルスルホキシド中２５ｍＭ；４０．９ｍＬ）を添加し、混合物を２５℃で１．５時間撹拌して、粗製コンジュゲートを得た。
【０１０７】
（実施例８）
増加したＴＳＰＰ化学量論、還元後ダイアフィルトレーション、再酸化およびリンカー−ペイロードクエンチを用いる、ＴＮＢコンジュゲーションプロセス。還元混合物中の、実施例７中の塩化ナトリウムなどの塩の存在は、より高いＴＳＰＰ化学量論において鎖間ジスルフィド還元の程度を減少させる。
【０１０８】
さらなる例として、再酸化が実施されない場合に形成される過剰コンジュゲートした種の、図１５からの測定を使用すると、鎖間ジスルフィド還元は、塩が存在しなかった場合の約３３％から、１５０〜５００ｍＭの塩の存在下での１０〜２０％まで減少した。塩、例えば、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、硝酸カリウム、リン酸水素カリウム、硝酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化グアニジニウムおよび硫酸アンモニウムは、鎖間ジスルフィド還元を減少させた。
【０１０９】
特定の場合には、鎖間ジスルフィド還元は、塩が添加されなかった場合の３３％から、それぞれ１５０ｍＭ、２５０ｍＭおよび５００ｍＭの塩化ナトリウムの存在下での１５％、１４％および１２％まで減少した。
【０１１０】
（実施例９）
増加したＴＳＰＰ化学量論、還元後ダイアフィルトレーション、再酸化およびリンカー−ペイロードクエンチを用いる、ＴＮＢコンジュゲーションプロセス。この実施例は、実施例７と類似であるが、以下を特徴とする：（１）再酸化時間を顕著に低減させ、ダイアフィルトレーション後の時間のかかる冷却およびコンジュゲーション前の加熱を排除する、２５℃における再酸化実行、および（２）特定の条件下での下流の精製を改善する、システインとの反応によるリンカー−ペイロードのクエンチ（以下の実施例１４を参照のこと）。
【０１１１】
特定の場合には、８０．０ｇ（０．５４１ｍｍｏｌ；６０ｍＭヒスチジン中２６ｍｇ／ｍＬ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７；３０５３ｍＬ）のトラスツズマブＫ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃ抗体に、６．１４ｇのＴＳＰＰ（２０当量；１０．８ｍｍｏｌ；水中１００ｍＭ；１０８ｍＬ）を添加した。反応混合物を、３７℃で３時間撹拌し、次いで、ダイアフィルトレーション（ＴａｎｇｅｎＸ  ＰｒｏＳｔｒｅａｍ  ５０ｋＤメンブレン、１１０〜２１０ｇ／ｍ２、１０ダイアボリュームの６０ｍＭヒスチジン、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７）によって緩衝液交換した。ダイアフィルトレーション後、０．１９ｇのデヒドロアスコルビン酸（２当量；１．０８ｍｍｏｌ；１：１のＤＭＳＯ／水中５０ｍＭ；２１．６ｍＬ）を添加し、混合物を２５℃で０．５時間撹拌した。次いで、４．３５ｇのｍｃｖｃＰＡＢＣ０１０１リンカー−ペイロード（６等量、３．２４ｍｍｏｌ；ジメチルスルホキシド中２５ｍＭ；１３０ｍＬ）を添加し、混合物を２５℃で１時間撹拌した。最後に、０．７９ｇのシステイン（１２等量、６．４８ｍｍｏｌ；水中１００ｍＭ；６４．９ｍＬ）を添加し、混合物を２５℃で１時間撹拌して、粗製コンジュゲートを得た。
【０１１２】
（実施例１０）
ＴＮＢコンジュゲーションプロセス−再酸化による抗体断片修復。実施例７および９のような再酸化ステップの追加は、入ってくる抗体中に存在する断片を修復し、そうして、最終コンジュゲートの質および収量を改善した。断片は、鎖間ジスルフィド結合のうち１つまたは複数が完全なままではない抗体に起源する。したがって、実施例９に記載されるプロセスを使用する、１５〜３５％の断片レベルを含む抗体ロットのコンジュゲーションは、低いおよび同等のレベルの断片とのコンジュゲートを産生した。
【０１１３】
特定の場合には、３５％の断片を有する抗体は、およそ１０％の断片を有する粗製コンジュゲートを産生した；断片の大部分は、再酸化によって修復された。精製された最終コンジュゲートは、３％未満の断片を含有した。
【０１１４】
（実施例１１）
抗ＥＤＢ  Ｋ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃ抗体を用いたＴＮＢコンジュゲーションプロセス。ＴＮＢコンジュゲーションプロセスは、トラスツズマブ以外のＴＮＢキャップされた抗体に適切である。
【０１１５】
特定の場合には、実施例９に記載される手順を使用する、ＴＮＢでキャップされた抗ＥＤＢＫ  １８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃ抗体の処理により、トラスツズマブＫ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃ抗体を用いて得られたものと匹敵する粗製コンジュゲートが得られた。図１６に示されるように、これらの抗体の粗製コンジュゲートは、約７５％のＤＡＲ４で、高度に類似している。
【０１１６】
（実施例１２）
ＴＮＢコンジュゲーションプロセスによって産生されたコンジュゲートの精製。このプロセスによって産生された粗製コンジュゲートは、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によって精製することができる。ＨＩＣ精製は、遊離リンカー−ペイロード、凝集物、断片およびより低いＤＡＲのコンジュゲートを除去するまたは顕著に低減させる。
【０１１７】
さらなる例として、ＨＩＣ精製は、直列に接続したＣａｐｔｏ（商標）Ｂｕｔｙｌ  ＩｍｐＲｅｓ樹脂（ＧＥ）カラムおよびＴｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）ＰＰＧ−６００Ｍ（Ｔｏｓｏｈ）カラムを使用して達成できる。Ｃａｐｔｏ（商標）Ｂｕｔｙｌ  ＩｍｐＲｅｓは、凝集物、断片およびより低いＤＡＲのコンジュゲートの適切な除去を提供し、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）ＰＰＧ−６００Ｍは、遊離ｍｃｖｃＰＡＢＣ０１０１リンカー−ペイロードを保持する。精製されたコンジュゲートは、限外濾過／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）によって濃縮および緩衝液交換することができる。ＵＦ／ＤＦは、ＨＩＣ精製後に存在する場合、残存遊離リンカー−ペイロードを除去することもできる。
【０１１８】
特定の場合には、実施例６に記載されるプロセスによって産生された粗製コンジュゲート（４．０ｇ、２６ｍｇ／ｍＬ）を、１体積の１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７で希釈した。希釈された粗製混合物を、２０ｍＭリン酸ナトリウム、１Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ７でさらに１：１希釈して、ＨＩＣローディング溶液を得た。ＨＩＣ精製を、直列に接続したＣａｐｔｏ（商標）Ｂｕｔｙｌ  ＩｍｐＲｅｓ樹脂（ＧＥ）カラム（２４ｃｍ（ｈ）×２．６ｃｍ（ｄ））およびＴｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）ＰＰＧ−６００Ｍ（Ｔｏｓｏｈ）カラム（４ｃｍ（ｈ）×２．６ｃｍ（ｄ））を使用して達成した。Ｃａｐｔｏ（商標）Ｂｕｔｙｌ  ＩｍｐＲｅｓカラム上へのローディング溶液の導入後、精製されたコンジュゲートが、２５カラム体積にわたって緩衝液Ａ中に５０〜１００％の緩衝液Ｂの勾配で、２カラムシリーズから溶出された；緩衝液Ａ：２０ｍＭリン酸ナトリウム、１Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ７；緩衝液Ｂ：１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７。所望のコンジュゲートを含有する画分をプールし、濃縮および緩衝液交換のためにＵＦ／ＤＦに供した（ＴａｎｇｅｎＸ  ＰｒｏＳｔｒｅａｍ  ５０ｋＤメンブレン、１１０〜２１０ｇ／ｍ２、１０ダイアボリュームの２０ｍＭヒスチジン、ｐＨ５．８）。
【０１１９】
（実施例１３）
増加した回収を有するＴＮＢコンジュゲーションプロセスによって産生されたコンジュゲートの精製。ＨＩＣによって精製する場合、ＤＡＲ４  ＡＤＣの回収は、移動相緩衝液Ｂへのイソプロパノールの添加によって改善され、したがって、プロセス収量を増加させることができる。
【０１２０】
特定の場合には、実施例７に記載されるプロセスによって産生された粗製コンジュゲート（１２．４ｇ、２６ｍｇ／ｍＬ）を、１体積の１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７、５％（ｖ／ｖ）イソプロパノールで希釈した。希釈された粗製混合物を、２０ｍＭリン酸ナトリウム、１Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ７でさらに１：１希釈して、ＨＩＣローディング溶液を得た。ＨＩＣ精製を、直列に接続したＣａｐｔｏ（商標）Ｂｕｔｙｌ  ＩｍｐＲｅｓ樹脂（ＧＥ）カラム（２２ｃｍ（ｈ）×５ｃｍ（ｄ））およびＴｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）ＰＰＧ−６００Ｍ（Ｔｏｓｏｈ）カラム（４ｃｍ（ｈ）×５ｃｍ（ｄ））を使用して達成した。Ｃａｐｔｏ（商標）Ｂｕｔｙｌ  ＩｍｐＲｅｓカラム上へのローディング溶液の導入後、精製されたコンジュゲートが、２５カラム体積にわたって緩衝液Ａ中に５０〜１００％の緩衝液Ｂの勾配で、２カラムシリーズから溶出された；緩衝液Ａ：２０ｍＭリン酸ナトリウム、１Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ７；緩衝液Ｂ：１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７、５％（ｖ／ｖ）イソプロパノール。所望のコンジュゲートを含有する画分をプールし、濃縮および緩衝液交換のためにＵＦ／ＤＦに供した（ＴａｎｇｅｎＸ  ＰｒｏＳｔｒｅａｍ  ５０ｋＤメンブレン、１１０〜２１０ｇ／ｍ２、１０ダイアボリュームの２０ｍＭヒスチジン、ｐＨ５．８）。プロセス全体についてのＡＤＣ収量は、イソプロパノールがＨＩＣ精製において緩衝液Ｂ中に存在した場合、実施例１２の精製プロセスを使用した場合よりもおよそ５０％改善された。
【０１２１】
（実施例１４）
リンカー−ペイロードクエンチを用いたＴＮＢコンジュゲーションプロセスによって産生されたコンジュゲートの精製。ｍｃｖｃＰＡＢＣ０１０１リンカー−ペイロードを、実施例９のように、クエンチステップにおいてシステインでキャップする場合、ＨＩＣ精製は、Ｃａｐｔｏ（商標）Ｂｕｔｙｌ  ＩｍｐＲｅｓ樹脂（ＧＥ）カラム単独を使用して達成することができる。システインキャップされたｍｃｖｃＰＡＢＣ０１０１は、ＤＡＲ４コンジュゲートよりも早く溶出し、Ｃａｐｔｏ（商標）Ｂｕｔｙｌ  ＩｍｐＲｅｓカラムで十分に分離される。図１７に示されるように、ＤＡＲ４コンジュゲートを、この実施例に記載される条件を使用して、システインキャップされたｍｃｖｃＰＡＢＣ０１０１、より低いＤＡＲのコンジュゲート、凝集物および断片から分離する。システインキャップされたｍｃｖｃＰＡＢＣ０１０１は、ダイアフィルトレーションによっても容易に清澄化される。
【０１２２】
特定の場合には、実施例９に記載されるプロセスによって産生された粗製コンジュゲート（４０．０ｇ、２６ｍｇ／ｍＬ）を、１体積の１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７、５％（ｖ／ｖ）イソプロパノールで希釈した。希釈された粗製混合物を、２０ｍＭリン酸ナトリウム、１Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ７でさらに１：１希釈して、ＨＩＣローディング溶液を得た。ＨＩＣ精製を、Ｃａｐｔｏ（商標）Ｂｕｔｙｌ  ＩｍｐＲｅｓ樹脂（ＧＥ）カラム（２４．５ｃｍ（ｈ）×１０ｃｍ（ｄ））を使用して達成した。カラム上へのローディング溶液の導入後、精製されたコンジュゲートが、１０カラム体積にわたって緩衝液Ａ中に５０〜１００％の緩衝液Ｂの勾配で溶出された；緩衝液Ａ：２０ｍＭリン酸ナトリウム、１Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ７；緩衝液Ｂ：１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７、５％（ｖ／ｖ）イソプロパノール。所望のコンジュゲートを含有する画分をプールし、濃縮および緩衝液交換のためにＵＦ／ＤＦに供した（ＴａｎｇｅｎＸ  ＰｒｏＳｔｒｅａｍ  ５０ｋＤメンブレン、１１０〜２１０ｇ／ｍ２、１０ダイアボリュームの２０ｍＭヒスチジン、ｐＨ５．８）。
【０１２３】
別の特定の場合には、実施例９に記載されるプロセスによって産生された粗製コンジュゲート（０．８３ｇ、約２３ｍｇ／ｍＬ）を、１体積の１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７、５％（ｖ／ｖ）イソプロパノールで希釈した。希釈された粗製混合物を、２０ｍＭリン酸ナトリウム、１Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ７でさらに１：１希釈して、ＨＩＣローディング溶液を得た。ＨＩＣ精製を、直列に接続したＢｕｔｙｌ  ＨＰ樹脂（ＧＥ）カラム（２４ｃｍ（ｈ）×１．６ｃｍ（ｄ））およびＴｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）ＰＰＧ−６００Ｍ（Ｔｏｓｏｈ）カラム（５．３ｃｍ（ｈ）×１．６ｃｍ（ｄ））を使用して達成した。カラム上へのローディング溶液の導入後、精製されたコンジュゲートが、１０カラム体積にわたって緩衝液Ａ中に５０〜１００％の緩衝液Ｂの勾配で溶出された；緩衝液Ａ：２０ｍＭリン酸ナトリウム、１Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ７；緩衝液Ｂ：１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７、５％（ｖ／ｖ）イソプロパノール。所望のコンジュゲートを含有する画分をプールした。高い回収が、ＤＡＲ４コンジュゲートからのｍｃｖｃＰＡＢＣ０１０１リンカー−ペイロードの分離と共に達成された。
【０１２４】
（実施例１５）
抗体のヒンジ領域におけるジスルフィドスクランブリングを解析するためのアッセイ。ＴＮＢコンジュゲーションプロセスの利点は、抗体上のヒンジジスルフィド還元の顕著な減少または完全な排除であり、したがって、ネイティブの鎖間ジスルフィド結合を有するコンジュゲートの産生である。抗体およびコンジュゲートの両方においてヒンジスクランブリングのレベルを測定するためのアッセイを開発した。このアッセイでは、抗体またはコンジュゲートを、以下に示されるように、ヒンジの下で切断する酵素、およびヒンジの上で切断する第２の酵素で処理する：
【０１２５】
【化３】
2020505935.tif 000012
【０１２６】
次いで、ヒンジ断片を、ＨＰＬＣまたはＬＣ−ＭＳによって解析して、抗体またはコンジュゲート中に存在したネイティブのおよびスクランブルされたヒンジの量を決定する。
【０１２７】
１ｍｇ／ｍＬのＡＤＣ試料を、ＩｄｅＳ（酵素１、１μｇのＡＤＣ当たり１単位）で３７℃で３０分間処理し、その後、Ｌｙｓ−Ｃ（酵素２、１５０μｇのＡＤＣ当たり１μｇ）で３７℃で５分間処理した。次いで、反応をトリフルオロ酢酸でクエンチした。試料をＨＰＬＣによって解析した：Ｗａｔｅｒｓ  ＸＢｒｉｄｇｅ  ＢＥＨ  Ｃ１８カラム、カラム温度：６０℃、移動相Ａ：水中０．１％のＴＦＡ、移動相Ｂ：アセトニトリル中０．１％のＴＦＡ、勾配：３０分間にわたって２０〜３０％の移動相Ｂ、流速：０．２ｍＬ／分、２１４ｎｍにおけるＵＶ検出。ピークをＭＳによって確認した。
【０１２８】
（実施例１６）
システインキャップされた抗体へのコンジュゲーションとの比較。システインキャップされた抗体から産生されたＡＤＣは、ヒンジ−スクランブルされた産物を含有する。システインキャップされた抗体をコンジュゲートするために、抗体は、過剰量のトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）で完全に還元されなければならず、還元された鎖間ジスルフィド結合は、デヒドロアスコルビン酸で再酸化されて、変異したシステイン残基のみを、コンジュゲーションのための遊離チオールとして利用可能なままにする。次いで、変異したシステイン残基をリンカー−ペイロードにコンジュゲートして、粗製ＡＤＣを得る。再酸化ステップは、抗体のヒンジ領域において、ネイティブの鎖間ジスルフィド結合およびスクランブルされたジスルフィド結合の両方を産生する。この完全還元／再酸化プロセスによって産生されたＡＤＣについて、実施例１５に記載されるアッセイによって測定されたヒンジスクランブリングのレベルは、典型的には５〜２０％である。ヒンジスクランブリングは出発抗体中では検出されていないので、全てのヒンジスクランブリングがＡＤＣコンジュゲーションプロセスに起源することに留意されたい。
【０１２９】
４．０ｇ（２７．６μｍｏｌ；６０ｍＭヒスチジン、ｐＨ７中２７ｍｇ／ｍＬ；１４４ｍＬ）のシステインキャップされたトラスツズマブＫ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃ抗体に、１．６５ｍＬの０．５Ｍ  ＴＣＥＰ（３０当量；０．８２７ｍｍｏｌ；水中０．５Ｍ溶液）を添加した。反応混合物を３７℃で５時間インキュベートし、次いで、ダイアフィルトレーション（ＴａｎｇｅｎＸ  ＰｒｏＳｔｒｅａｍ  ５０ｋＤメンブレン、１１０〜２１０ｇ／ｍ２、１０ダイアボリュームの６０ｍＭヒスチジン、ｐＨ７）によって緩衝液交換した。ダイアフィルトレーション後、混合物を４℃に冷却し、０．１４４ｇのデヒドロアスコルビン酸（３０当量；０．８２７ｍｍｏｌ；１：１のＤＭＳＯ／水中５０ｍＭ；１６．５ｍＬ）を添加し、混合物を４℃でおよそ１６時間インキュベートした。混合物を２５℃に加熱し、０．１８５ｇのｍｃｖｃＰＡＢＣ０１０１リンカー−ペイロード（５等量、０．１３８ｍｍｏｌ；ジメチルスルホキシド中２５ｍＭ；５．５１ｍＬ）を添加し、混合物を２５℃で１時間インキュベートして、粗製コンジュゲートを得た。ＨＩＣ精製後、実施例１５に記載されるアッセイによって測定されたＡＤＣ中のヒンジスクランブリングのレベルは、１８％であった。
【０１３０】
比較のために、ＴＮＢキャップされた抗体から産生されたＡＤＣは上記実施例６、７および９のように、実施例１５に記載されるアッセイによって測定した場合、ＨＩＣ精製後に検出可能なヒンジスクランブリングを含有しない。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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