(57)【要約】  腫瘍の良性・悪性度を検出するために使用されるモデル及びその応用である。前記モデルは、インプリント遺伝子の欠失発現量及びインプリント遺伝子のコピー数異常発現量を計算することにより腫瘍におけるインプリント遺伝子の変化を分級する。本開示に係る検出モデル及び装置は、初めて、腫瘍患者のサンプルにおけるインプリンティング消失の発現を直観的方法で示し、インプリント遺伝子のインサイチュ標識法により、インプリント（刷り込み）遺伝子の変化を客観的、直観的、早期、正確に検出し、且つ定量的モデルを提供でき、分子病理学診断に大きく貢献する。
2020520675.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍におけるインプリント遺伝子の総発現量、インプリント遺伝子の欠失発現量、及びインプリント遺伝子のコピー数異常発現量の変化を計算することによりインプリント遺伝子の発現状態を分級する、モデル。
【請求項２】
前記インプリント遺伝子はＺ１〜Ｚ１６であり、前記インプリント遺伝子Ｚ１はＧｎａｓであり、前記インプリント遺伝子Ｚ２はＩｇｆ２であり、前記インプリント遺伝子Ｚ３はＰｅｇ１０であり、前記インプリント遺伝子Ｚ４はＩｇｆ２ｒであり、前記インプリント遺伝子Ｚ５はＭｅｓｔであり、前記インプリント遺伝子Ｚ６はＰｌａｇｌ１であり、前記インプリント遺伝子Ｚ７はＣｄｋｎ１ｃであり、前記インプリント遺伝子Ｚ８はＤｃｎであり、前記インプリント遺伝子Ｚ９はＤｌｋ１であり、前記インプリント遺伝子Ｚ１０はＧａｔｍであり、前記インプリント遺伝子Ｚ１１はＧｒｂ１０であり、前記インプリント遺伝子Ｚ１２はＰｅｇ３であり、前記インプリント遺伝子Ｚ１３はＳｇｃｅであり、前記インプリント遺伝子Ｚ１４はＳｌｃ３８ａ４であり、前記インプリント遺伝子Ｚ１５はＤｉｒａｓ３であり、前記インプリント遺伝子Ｚ１６はＳｎｒｐｎ／Ｓｎｕｒｆである、請求項１に記載のモデル。
【請求項３】
インプリント遺伝子の計算方法は、インプリント遺伝子の組み合わせを計算することであり、前記インプリント遺伝子はＺ１〜Ｚ１６の１６個のインプリント遺伝子の組み合わせである、請求項１又は２に記載のモデル。
【請求項４】
前記インプリント遺伝子の発現量、インプリント遺伝子の欠失発現量、及びインプリント遺伝子のコピー数異常発現量の計算式は、
総発現量＝（ｂ＋ｃ＋ｄ）／（ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ）×１００％
正常なインプリント遺伝子の発現量＝ｂ／（ｂ＋ｃ＋ｄ）×１００％、
インプリント遺伝子の欠失発現量＝ｃ／（ｂ＋ｃ＋ｄ）×１００％、
インプリント遺伝子のコピー数異常発現量＝ｄ／（ｂ＋ｃ＋ｄ）×１００％であり、  ここで、前記ａは、細胞をヘマトキシリンで染色した後、細胞核内で標識が存在しなく、インプリント遺伝子が発現していないことであり、前記ｂは、細胞をヘマトキシリンで染色した後、細胞核内で１つの赤色/茶色の標識が存在し、インプリント遺伝子が存在することであり、前記ｃは、細胞をヘマトキシリンで染色した後、細胞核内で２つの赤色/茶色の標識が存在し、インプリント遺伝子の欠失であることであり、前記ｄは、細胞をヘマトキシリンで染色した後、細胞核内で２つ以上の赤色/茶色の標識が存在し、インプリント遺伝子のコピー数異常であることである、
請求項１〜３のいずれか１項に記載のモデル。
【請求項５】
前記インプリント遺伝子の発現量、インプリント遺伝子の欠失発現量、及びインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は５つの異なるレベルに分けられる、請求項１〜４のいずれか１項に記載のモデル。
【請求項６】
前記５つの異なるレベルは、Ｚ１〜Ｚ１６の１６個のインプリント遺伝子のインプリント遺伝子の発現量、インプリント遺伝子の欠失発現量、及びインプリント遺伝子のコピー数異常発現量をそれぞれ分けるものである、請求項５に記載のモデル。
【請求項７】
Ｚ１におけるインプリント遺伝子の欠失発現量、及びインプリント遺伝子のコピー数異常発現量を分ける５つの異なるレベルは、以下の通りであり、
０級：前記インプリント遺伝子Ｚ１におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は、１５％未満であり、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ１におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、１．５％未満であり、
Ｉ級：前記インプリント遺伝子Ｚ１におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は１５〜２５％であり、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ１におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、１．５〜２．５％であり、
ＩＩ級：前記インプリント遺伝子Ｚ１におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は、２５〜３０％であり、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ１におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、２．５〜４％であり、
ＩＩＩ級：前記インプリント遺伝子Ｚ１におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は、３０〜３５％であり、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ１におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、４〜６％であり、
ＩＶ級：前記インプリント遺伝子Ｚ１におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は、３５％を超え、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ１におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、６％を超える、請求項５又は６に記載のモデル。
【請求項８】
Ｚ２及びＺ１２におけるインプリント遺伝子の欠失発現量、及びインプリント遺伝子のコピー数異常発現量を分ける５つの異なるレベルは、以下の通りであり、
０級：前記インプリント遺伝子Ｚ２及びＺ１２におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は、１５％未満であり、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ２及びＺ１２におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、１％未満であり、
Ｉ級：前記インプリント遺伝子Ｚ２及びＺ１２におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は、１５〜２０％であり、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ２及びＺ１２におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、１〜２％であり
ＩＩ級：前記インプリント遺伝子Ｚ２及びＺ１２におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は、２０〜２５％であり、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ２及びＺ１２におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、２〜３％であり、
ＩＩＩ級：前記インプリント遺伝子Ｚ２及びＺ１２におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は、２５〜３５％であり、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ２及びＺ１２におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、３〜５％であり
ＩＶ級：前記インプリント遺伝子Ｚ２及びＺ１２におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は、３５％を超え、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ２及びＺ１２におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、５％を超える、請求項５〜７のいずれか１項に記載のモデル。
【請求項９】
Ｚ３、Ｚ４、Ｚ９、Ｚ１０及びＺ１１におけるインプリント遺伝子の欠失発現量、及びインプリント遺伝子のコピー数異常発現量を分ける５つの異なるレベルは、以下の通りであり、
０級：前記インプリント遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ９、Ｚ１０及びＺ１１におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は、１５％未満であり、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ９、Ｚ１０及びＺ１１におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、１％未満であり、
Ｉ級：前記インプリント遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ９、Ｚ１０及びＺ１１におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は、１５〜２０％であり、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ９、Ｚ１０及びＺ１１におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、１〜２．５％であり、
ＩＩ級：前記インプリント遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ９、Ｚ１０及びＺ１１におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は、２０〜３０％であり、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ９、Ｚ１０及びＺ１１におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、２．５〜４％であり、
ＩＩＩ級：前記インプリント遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ９、Ｚ１０及びＺ１１におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は、３０〜３５％であり、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ９、Ｚ１０及びＺ１１におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、４〜６％であり、
ＩＶ級：前記インプリント遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ９、Ｚ１０及びＺ１１におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は、３５％を超え、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ９、Ｚ１０及びＺ１１におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、６％を超える、請求項５〜８のいずれか１項に記載のモデル。
【請求項１０】
Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１３及びＺ１６におけるインプリント遺伝子の欠失発現量、及びインプリント遺伝子のコピー数異常発現量を分ける５つの異なるレベルは、以下の通りであり、
０級：前記インプリント遺伝子Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１３及びＺ１６におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は、１５％未満であり、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１３及びＺ１６におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、１％未満であり、
Ｉ級：前記インプリント遺伝子Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１３及びＺ１６におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は、１５〜２０％であり、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１３及びＺ１６におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、１〜２．５％であり、
ＩＩ級：前記インプリント遺伝子Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１３及びＺ１６におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は、２０〜２５％であり、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１３及びＺ１６におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、２．５〜４％であり、
ＩＩＩ級：前記インプリント遺伝子Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１３及びＺ１６におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は、２５〜３５％であり、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１３及びＺ１６におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、４〜６％であり、
ＩＶ級：前記インプリント遺伝子Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１３及びＺ１６におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は、３５％を超え、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１３及びＺ１６におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、６％を超える、請求項５〜９のいずれか１項に記載のモデル。
【請求項１１】
Ｚ７、Ｚ１４及びＺ１５におけるインプリント遺伝子の欠失発現量、及びインプリント遺伝子のコピー数異常発現量を分ける５つの異なるレベルは、以下の通りであり、
０級：前記インプリント遺伝子Ｚ７、Ｚ１４及びＺ１５におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は、１０％未満であり、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ７、Ｚ１４及びＺ１５におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、０．５％未満であり、
Ｉ級：前記インプリント遺伝子Ｚ７、Ｚ１４及びＺ１５におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は、１０〜１５％であり、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ７、Ｚ１４及びＺ１５におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、０．５〜１％であり、
ＩＩ級：前記インプリント遺伝子Ｚ７、Ｚ１４及びＺ１５におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は、１５〜２０％であり、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ７、Ｚ１４及びＺ１５におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、１〜２％であり、
ＩＩＩ級：前記インプリント遺伝子Ｚ７、Ｚ１４及びＺ１５におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は、２０〜２５％であり、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ７、Ｚ１４及びＺ１５におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、２〜３％であり、
ＩＶ級：前記インプリント遺伝子Ｚ７、Ｚ１４及びＺ１５におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は、２５％を超え、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ７、Ｚ１４及びＺ１５におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、３％を超える、請求項５〜１０のいずれか１項に記載のモデル。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のモデルを使用した腫瘍の良性・悪性度を検出する装置であって、
（１）被験サンプルを取得するサンプリングユニット、
（２）インプリント遺伝子配列に基づいて特異的プライマーを設計するプローブ設計ユニット、
（３）ステップ（２）でのプローブと被験サンプルとのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行う検出ユニット、
（４）顕微鏡イメージングによりインプリント遺伝子の発現状態を解析する解析ユニット、
を含み、
ここで、前記解析ユニットは、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のモデルにより、インプリント遺伝子の発現量、インプリント遺伝子の欠失発現量、及びインプリント遺伝子のコピー数異常発現量を計算することにより、インプリント遺伝子の欠失発現量、及びインプリント遺伝子のコピー数異常発現量のレベルにより腫瘍の良性・悪性度を判断する、
腫瘍の良性・悪性度を検出するための装置。
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のモデルを使用した腫瘍の良性・悪性度を検出する方法であって、
（１）被験サンプルを取得するステップと、
（２）インプリント遺伝子配列に基づいて特異的プライマーを設計するステップと、
（３）ステップ（２）でのプローブと被験サンプルとのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行うステップと、
（４）顕微鏡イメージングによりインプリント遺伝子の発現状態を解析するステップ、
を含み、
ここで、前記解析ユニットは、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のモデルにより、インプリント遺伝子の発現量、インプリント遺伝子の欠失発現量、及びインプリント遺伝子のコピー数異常発現量を計算することにより、インプリント遺伝子の欠失発現量、及びインプリント遺伝子のコピー数異常発現量のレベルにより腫瘍の良性・悪性度を判断する、
方法。
【請求項１４】
ステップ（１）に係る被験サンプルはヒトの組織及び／又は細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ステップ（１）に係る被験サンプルは針生検のサンプルである、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーションは、ＲＮＡｓｃｏｐｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション法を使用する、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＲＮＡｓｃｏｐｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション法は、シングル又はマルチチャンネル比色キット、或いはシングル又はマルチチャンネル蛍光キット、好ましくは、シングルチャンネル赤色/茶色の比色キット又はマルチチャンネル蛍光キットを使用する、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
被験腫瘍の良性・悪性度は、良性、悪性潜在性、早期悪性腫瘍、中期悪性腫瘍及び進行性悪性腫瘍に分類される、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
腫瘍の良性・悪性度を判断した結果は、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６におけるインプリント遺伝子の欠失発現量、及びインプリント遺伝子のコピー数異常発現量はいずれも０級であり、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の１つ以下のインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子の欠失発現量はＩ級であり、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の１つ以下のインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量はＩ級である場合のいずれか１つであると、良性腫瘍である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記腫瘍の良性・悪性度を判定した結果は、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の少なくとも２つのインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子の欠失発現量はＩ級であり、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の少なくとも２つのインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量はＩ級であり、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の１つ以下のインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子の欠失発現量はＩ級であり、又はインプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の１つ以下のインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量はＩＩ級である場合のいずれか１つであると、悪性潜在性であると判断する、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記腫瘍の良性・悪性度を判断した結果は、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の少なくとも２つのインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子の欠失発現量はＩＩ級であり、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の少なくとも２つのインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量はＩＩ級であり、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の１つ以下のインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子の欠失発現量はＩＩＩ級であり、又はインプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の１つ以下のインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量はＩＩＩ級であると、早期悪性腫瘍である、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記腫瘍の良性・悪性度を判定した結果は、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の少なくとも２つのインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子の欠失発現量はＩＩＩ級であり、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の少なくとも２つのインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量はＩＩＩ級であり、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の１つ以下のインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子の欠失発現量はＩＶ級であり、又はインプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の１つ以下のインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量はＩＶ級であると、中期悪性腫瘍である、請求項１８〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記腫瘍の良性・悪性度を判定した結果は、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の少なくとも２つのインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子の欠失発現量はＩＶ級であり、又はインプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の少なくとも２つのインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量はＩＶ級であると、進行性悪性腫瘍である、請求項１８〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のモデル又は請求項１２に記載の装置の、腫瘍を検出及び／又は治療するための医薬品の調製における用途。
【請求項２５】
被験腫瘍の良性・悪性度は、良性、悪性潜在性、早期悪性腫瘍、中期悪性腫瘍及び進行性悪性腫瘍に分類される、請求項２４に記載の用途。
【請求項２６】
腫瘍の良性・悪性度を判断した結果は、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６におけるインプリント遺伝子の欠失発現量及びインプリント遺伝子のコピー数異常発現量はいずれも０級であり、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の１つ以下のインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子の欠失発現量はＩ級であり、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の１つ以下のインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量はＩ級である場合のいずれか１つであると、良性腫瘍である、請求項２４又は２５に記載の用途。
【請求項２７】
前記腫瘍の良性・悪性度を判定した結果は、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の少なくとも２つのインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子の欠失発現量はＩ級であり、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の少なくとも２つのインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量はＩ級であり、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の１つ以下のインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子の欠失発現量はＩ級であり、又はインプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の１つ以下のインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量はＩＩ級である場合のいずれか１つであると、悪性潜在性であると判断する、請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の用途。
【請求項２８】
前記腫瘍の良性・悪性度を判定した結果は、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の少なくとも２つのインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子の欠失発現量はＩＩ級であり、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の少なくとも２つのインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量はＩＩ級であり、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の１つ以下のインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子の欠失発現量はＩＩＩ級であり、又はインプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の１つ以下のインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量はＩＩＩ級であると、早期悪性腫瘍である、請求項２４〜２７のいずれか１項に記載の用途。
【請求項２９】
前記腫瘍の良性・悪性度を判断した結果は、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の少なくとも２つのインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子の欠失発現量はＩＩＩ級であり、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の少なくとも２つのインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量はＩＩＩ級であり、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の１つ以下のインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子の欠失発現量はＩＶ級であり、又はインプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の１つ以下のインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量はＩＶ級であると、中期悪性腫瘍である、請求項２４〜２８のいずれか１項に記載の用途。
【請求項３０】
前記腫瘍の良性・悪性度を判断した結果は、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の少なくとも２つのインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子の欠失発現量はＩＶ級であり、又はインプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の少なくとも２つのインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量はＩＶ級であると、進行性悪性腫瘍である、請求項２４〜２９のいずれか１項に記載の用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書は、生物技術分野、例えば、遺伝子診断分野に関し、特に、モデル、診断方法及びその応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
国際的ながん統計によると、世界中で毎年800万人以上ががんで亡くなっている。そのために、早期発見、診断、治療が特に重要である。がんは、細胞レベルで時間の経過とともに蓄積する複雑な遺伝子変異及びエピジェネティックな変化によって引き起こされ、最終的には制御されない細胞分裂につながる。
【０００３】
伝統的な病理学による良性及び悪性細胞の診断は、細胞の大きさ、形態、侵襲性及び末梢細胞組織の関係に基づいているものである。細胞（がん）の早期変化の発見には大きな制限があるため、細胞分子レベルでのがん診断法は、研究のホットスポットになっている。
【０００４】
現在、病変組織の良性・悪性、及びがんのタイピング分類又はがんのステージ分類の判断は、主にヘマトキシリン・エオシン染液で染色された病理組織切片で観察される細胞の形態によって決定される。ただし、この方法には固有の制限がある。まず、この方法は腫瘍形成時に分子レベルの変化（分子変化は事前診断及び診断のより正確な基礎を提供できる）を観察することができず、次に、細胞形態診断は主観的判断であり、それ自体が不正確な診断を引き起こす可能性がある。この主観的判断によるバラツキは、早期がんの診断に大きな影響を及ぼし、特に、がんの早期診断の感度及び精度は、患者にとって非常に重要である。最後に、一部の悪性腫瘍細胞は、形態学的に良性腫瘍細胞との違いが極めて小さい。
【０００５】
遺伝学の観点から、腫瘍の進行は複数の遺伝子変化のプロセスであり、エピジェネティック修飾は腫瘍の発生、診断、治療にとって非常に重要であり、臨床的にも応用されている。大量の科学的研究により、インプリンティング状態遺伝子の再発現と細胞発がんとの関連性が確認されている。
【０００６】
ゲノムインプリンティングは、エピジェネティックな遺伝子制御の方法であり、特定の遺伝子について特定の親由来の対立遺伝子のみが発現され、別の一方の対立遺伝子は遺伝子サイレンシングとして現されるように示される。
【発明の概要】
【０００７】
本明細書は、モデル、診断方法及びその応用を提供する。
【０００８】
本明細書の一実施例は、インプリント遺伝子分級モデルであって、腫瘍における刷り込み遺伝子の発現量、インプリント遺伝子の欠失発現量、及びインプリント遺伝子のコピー数異常発現量の変化を計算することによりインプリント遺伝子を分級するモデルを提供する。
【０００９】
前記インプリンティング（刷り込み）消失とは、インプリント（刷り込み）遺伝子のうち、以前に沈黙状態にあった対立遺伝子が活性化される（脱メチル化する）ことを意味し、これはがんの最も一般的で初期に発生されたエピジェネティックな変化であり、この特徴は病理学的標識として使用できる。比較的には、健康な細胞アッセイでは、刷り込み消失の割合は非常に低く、前記インプリント遺伝子と刷り込み遺伝子とは同じ概念であり、同一の意味を指し、置き換えることができる。
【００１０】
前記インプリント遺伝子の欠失は、細胞をヘマトキシリンで染色した後、細胞核内で２つの赤色/茶色の標識が存在することであり、前記インプリント遺伝子のコピー数異常は、細胞をヘマトキシリンで染色した後、細胞核内で２つ以上の赤色/茶色の標識が存在することであり、前記コピー数異常は、がん細胞の異常な遺伝子複製によるものであり、その結果、この遺伝子は三倍体またはより高い多倍体として発現することである。
【００１１】
前記ヘマトキシリンで染色された標識は、赤色又は茶色から選択されるが、これらに限定されなく、他の色による染色標識は、刷り込み遺伝子の発現量、インプリント遺伝子の欠失発現量、及びインプリント遺伝子のコピー数異常発現量の計算に使用することもできる。
【００１２】
本明細書の一実施例において、前記インプリント遺伝子はＺ１−Ｚ１６であり、前記インプリント遺伝子Ｚ１はＧｎａｓであり、前記インプリント遺伝子Ｚ２はＩｇｆ２であり、前記インプリント遺伝子Ｚ３はＰｅｇ１０であり、前記インプリント遺伝子Ｚ４はＩｇｆ２ｒであり、前記インプリント遺伝子Ｚ５はＭｅｓｔであり、前記インプリント遺伝子Ｚ６はＰｌａｇｌ１であり、前記インプリント遺伝子Ｚ７はＣｄｋｎ１ｃであり、前記インプリント遺伝子Ｚ８はＤｃｎであり、前記インプリント遺伝子Ｚ９はＤｌｋ１であり、前記インプリント遺伝子Ｚ１０はＧａｔｍであり、前記インプリント遺伝子Ｚ１１はＧｒｂ１０であり、前記インプリント遺伝子Ｚ１２はＰｅｇ３であり、前記インプリント遺伝子Ｚ１３はＳｇｃｅであり、前記インプリント遺伝子Ｚ１４はＳｌｃ３８ａ４であり、前記インプリント遺伝子Ｚ１５はＤｉｒａｓ３であり、前記インプリント遺伝子Ｚ１６はＳｎｒｐｎ／Ｓｎｕｒｆである。
【００１３】
本明細書の一実施例において、前記モデルにおいて、インプリント遺伝子を計算する方法は、インプリント遺伝子の組み合わせを計算することであり、前記インプリント遺伝子はＺ１〜Ｚ１６の１６個のインプリント遺伝子の組み合わせである。
【００１４】
幾つかの実施例では、発明者は、インプリント遺伝子Ｚ２のＬＯＩ、ＣＮＶ及びＴＥを計算することにより、甲状腺がんに対する検出感度が７１．４％に達することができ、インプリント遺伝子Ｚ３のＬＯＩ、ＣＮＶ及びＴＥを計算することにより、甲状腺がんに対する検出感度が７８．６％に達することができ、インプリント遺伝子Ｚ４のＬＯＩ、ＣＮＶ及びＴＥを計算することにより、甲状腺がんに対する検出感度が７８．６％に達することができ、インプリント遺伝子Ｚ５のＬＯＩ、ＣＮＶ及びＴＥを計算することにより、甲状腺がんに対する検出感度が６４．３％に達することができ、インプリント遺伝子Ｚ６のＬＯＩ、ＣＮＶ及びＴＥを計算することにより、甲状腺がんに対する検出感度が５７．１％に達することができ、インプリント遺伝子Ｚ８のＬＯＩ、ＣＮＶ及びＴＥを計算することにより、甲状腺がんに対する検出感度が５８．３％に達することができ、インプリント遺伝子Ｚ９のＬＯＩ、ＣＮＶ及びＴＥを計算することにより、甲状腺がんに対する検出感度が６４．３％に達することができ、インプリント遺伝子Ｚ１０のＬＯＩ、ＣＮＶ及びＴＥを計算することにより、甲状腺がんに対する検出感度が７１．４％に達することができ、インプリント遺伝子Ｚ１１のＬＯＩ、ＣＮＶ及びＴＥを計算することにより、甲状腺がんに対する検出感度が７１．４％に達することができ、インプリント遺伝子Ｚ１２のＬＯＩ、ＣＮＶ及びＴＥを計算することにより、甲状腺がんに対する検出感度が６９．２％に達することができることを発見している。
【００１５】
幾つかの実施例では、発明者は、２つ又は２つ以上のインプリント遺伝子のＬＯＩ、ＣＮＶ及びＴＥを計算することにより感度をさらに向上させることができ、特定の実施例では、インプリント遺伝子のうち、２つのインプリント遺伝子の組み合わせを検出する場合には、甲状腺がんに対する診断感度が９２．９％以上に達することができ、Ｚ３とＺ４との組み合わせを検出する場合には、甲状腺がんに対する診断感度が９２．９％以上に達することができ、Ｚ３とＺ１０との組み合わせを検出する場合には、甲状腺がんに対する診断感度が９２．９％以上に達することができ、Ｚ４とＺ９との組み合わせを検出する場合には、甲状腺がんに対する診断感度が９２．９％以上に達することができることを発見している。
【００１６】
本明細書の一実施例では、前記インプリント遺伝子発現量、インプリント遺伝子の欠失発現量、及びインプリント遺伝子のコピー数異常発現量を計算するための下式を提供する。
【００１７】
総発現量＝（ｂ＋ｃ＋ｄ）／（ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ）×１００％；
【００１８】
正常なインプリント遺伝子の発現量＝ｂ／（ｂ＋ｃ＋ｄ）×１００％；
【００１９】
インプリント遺伝子欠失の遺伝子発現量＝ｃ／（ｂ＋ｃ＋ｄ）×１００％；
【００２０】
インプリント遺伝子コピー数異常の遺伝子発現量＝ｄ／（ｂ＋ｃ＋ｄ）×１００％；
【００２１】
ここで、前記ａは、細胞をヘマトキシリンで染色した後、細胞核内で標識が存在しなく、インプリント遺伝子が発現していないことであり、前記ｂは、細胞をヘマトキシリンで染色した後、細胞核内で１つの赤色/茶色の標識が存在し、インプリント遺伝子が存在することであり、前記ｃは、細胞をヘマトキシリンで染色した後、細胞核内で２つの赤色/茶色の標識が存在し、インプリント遺伝子の欠失であることであり、前記ｄは、細胞をヘマトキシリンで染色した後、細胞核内で２つ以上の赤色/茶色の標識が存在し、インプリント遺伝子のコピー数変異であることである。
【００２２】
本明細書の一実施例において、前記インプリント遺伝子の発現量、インプリント遺伝子の欠失発現量、及びインプリント遺伝子のコピー数異常発現量が、５つの異なるレベルに分けられるのは、サンプル中の各プローブの最も強い陽性発現を示す領域で少なくとも１２００個の細胞をカウントし、Ｚ１〜Ｚ１６の１６個のインプリント遺伝子のうち、インプリント遺伝子の欠失発現量及びインプリント遺伝子のコピー数異常発現量を、５つの異なるレベルそれぞれ分けることである。
【００２３】
本明細書の一実施例において、Ｚ１におけるインプリント遺伝子の欠失発現量、及びインプリント遺伝子のコピー数異常発現量を分ける５つの異なるレベルは、以下の通りである。
【００２４】
０級：前記インプリント遺伝子Ｚ１におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は、１５％未満であり、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ１におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、１．５％未満である。
【００２５】
Ｉ級：前記インプリント遺伝子Ｚ１におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は、１５〜２５％であり、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ１におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、１．５〜２．５％である。
【００２６】
ＩＩ級：前記インプリント遺伝子Ｚ１におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は、２５〜３０％であり、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ１におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、２．５〜４％である。
【００２７】
ＩＩＩ級：前記インプリント遺伝子Ｚ１におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は、３０〜３５％であり、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ１におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、４〜６％である。
【００２８】
ＩＶ級：前記インプリント遺伝子Ｚ１におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は、３５％を超え、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ１におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、６％を超える。
【００２９】
本明細書の一実施例において、Ｚ２及びＺ１２におけるインプリント遺伝子の欠失発現量、及びインプリント遺伝子のコピー数異常発現量を分ける５つの異なるレベルは、以下の通りである。
【００３０】
０級：前記インプリント遺伝子Ｚ２及びＺ１２におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は、１５％未満であり、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ２及びＺ１２におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、１％未満である。
【００３１】
Ｉ級：前記インプリント遺伝子Ｚ２及びＺ１２におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は、１５〜２０％であり、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ２及びＺ１２におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、１〜２％である。
【００３２】
ＩＩ級：前記インプリント遺伝子Ｚ２及びＺ１２におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は、２０〜２５％であり、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ２及びＺ１２におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、２〜３％である。
【００３３】
ＩＩＩ級：前記インプリント遺伝子Ｚ２及びＺ１２におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は、２５〜３５％であり、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ２及びＺ１２におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、３−５％である。
【００３４】
ＩＶ級：前記インプリント遺伝子Ｚ２及びＺ１２におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は、３５％を超え、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ２及びＺ１２におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、５％を超える。
【００３５】
本開示において、前記インプリント遺伝子Ｚ２及びＺ１２におけるインプリント遺伝子の欠失発現量、及びインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は互いに独立する。
【００３６】
本明細書の一実施例において、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ９、Ｚ１０及びＺ１１におけるインプリント遺伝子の欠失発現量、及びインプリント遺伝子のコピー数異常発現量を分ける５つの異なるレベルは、以下の通りである。
【００３７】
０級：前記インプリント遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ９、Ｚ１０及びＺ１１におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は、１５％未満であり、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ９、Ｚ１０及びＺ１１におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、１％未満である。
【００３８】
Ｉ級：前記インプリント遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ９、Ｚ１０及びＺ１１におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は、１５〜２０％であり、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ９、Ｚ１０及びＺ１１におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、１〜２．５％である。
【００３９】
ＩＩ級：前記インプリント遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ９、Ｚ１０及びＺ１１におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は、２０〜３０％であり、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ９、Ｚ１０及びＺ１１におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、２．５〜４％である。
【００４０】
ＩＩＩ級：前記インプリント遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ９、Ｚ１０及びＺ１１におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は、３０〜３５％であり、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ９、Ｚ１０及びＺ１１におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、４〜６％である。
【００４１】
ＩＶ級：前記インプリント遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ９、Ｚ１０及びＺ１１におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は、３５％を超え、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ９、Ｚ１０及びＺ１１におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、６％を超える。
【００４２】
前記インプリント遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ９、Ｚ１０及びＺ１１におけるインプリント遺伝子の欠失発現量、及びインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は互いに独立する。
【００４３】
本明細書の一実施例において、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１３及びＺ１６におけるインプリント遺伝子の欠失発現量、及びインプリント遺伝子のコピー数異常発現量を分ける５つの異なるレベルは、以下の通りである。
【００４４】
０級：前記インプリント遺伝子Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１３及びＺ１６におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は、１５％未満であり、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１３及びＺ１６におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、１％未満である。
【００４５】
Ｉ級：前記インプリント遺伝子Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１３及びＺ１６におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は、１５〜２０％であり、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１３及びＺ１６におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、１〜２．５％である。
【００４６】
ＩＩ級：前記インプリント遺伝子Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１３及びＺ１６におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は、２０〜２５％であり、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１３及びＺ１６におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、２．５〜４％である。
【００４７】
ＩＩＩ級：前記インプリント遺伝子Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１３及びＺ１６におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は、２５〜３５％であり、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１３及びＺ１６におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、４〜６％である。
【００４８】
ＩＶ級：前記インプリント遺伝子Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１３及びＺ１６におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は、３５％を超え、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１３及びＺ１６におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、６％を超える。
【００４９】
前記インプリント遺伝子Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１３及びＺ１６におけるインプリント遺伝子の欠失発現量、及びインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は互いに独立する。
【００５０】
本明細書の一実施例において、Ｚ７、Ｚ１４及びＺ１５におけるインプリント遺伝子の欠失発現量、及びインプリント遺伝子のコピー数異常発現量を分ける５つの異なるレベルは、以下の通りである。
【００５１】
０級：前記インプリント遺伝子Ｚ７、Ｚ１４及びＺ１５におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は、１０％未満であり、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ７、Ｚ１４及びＺ１５におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、０．５％未満である。
【００５２】
Ｉ級：前記インプリント遺伝子Ｚ７、Ｚ１４及びＺ１５におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は、１０〜１５％であり、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ７、Ｚ１４及びＺ１５におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、０．５〜１％である。
【００５３】
ＩＩ級：前記インプリント遺伝子Ｚ７、Ｚ１４及びＺ１５におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は、１５〜２０％であり、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ７、Ｚ１４及びＺ１５におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、１〜２％である。
【００５４】
ＩＩＩ級：前記インプリント遺伝子Ｚ７、Ｚ１４及びＺ１５におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は、２０〜２５％であり、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ７、Ｚ１４及びＺ１５におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、２〜３％である。
【００５５】
ＩＶ級：前記インプリント遺伝子Ｚ７、Ｚ１４及びＺ１５におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は、２５％を超え、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ７、Ｚ１４及びＺ１５におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、３％を超える。
【００５６】
前記インプリント遺伝子Ｚ７、Ｚ１４及びＺ１５におけるインプリント遺伝子の欠失発現量、及びインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は互いに独立する。
【００５７】
本明細書の一実施例において、以下のユニットを含む装置を提供する。
【００５８】
（１）サンプリングユニット：被験サンプルを取得する。
【００５９】
（２）プローブ設計ユニット：インプリント遺伝子配列に基づいて特異的プライマーを設計する。
【００６０】
（３）検出ユニット：ステップ（２）でのプローブと被験サンプルとのｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション（ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）を行う。
【００６１】
（４）解析ユニット：顕微鏡イメージングによりインプリント遺伝子の発現を解析する。
【００６２】
ここで、前記解析ユニットは、前記モデルにより、インプリント遺伝子の発現量、インプリント遺伝子の欠失発現量、及びインプリント遺伝子のコピー数異常発現量を計算することにより、インプリント遺伝子の欠失発現量、及びインプリント遺伝子のコピー数異常発現量のレベルにより腫瘍の良性・悪性度を判断する。
【００６３】
前記インプリント遺伝子欠失は、細胞をヘマトキシリンで染色した後、細胞核内で２つの赤色/茶色の標識が存在することであり、前記インプリント遺伝子のコピー数異常は、細胞をヘマトキシリンで染色した後、細胞核内で２つ以上の赤色/茶色の標識が存在することであり、前記コピー数異常は、がん細胞の異常な遺伝子複製によるものであり、その結果、この遺伝子は三倍体又はより高い多倍体として発現することである。
【００６４】
前記ヘマトキシリンで染色された標識は、赤色又は茶色から選択されるが、これらに限定されなく、他の色による染色標識は、刷り込み遺伝子の発現量、インプリント遺伝子の欠失発現量、及びインプリント遺伝子のコピー数異常発現量の計算に使用することもできる。
【００６５】
前記検出装置は、単一細胞及び組織レベルで各タイプの腫瘍のインプリンティング（刷り込み）遺伝子の変化を早期かつ直観的に観察するために使用されて腫瘍の良性・悪性及び悪性度を判断し、早期の腫瘍患者に最も有利な治療機会を提供する。
【００６６】
本明細書の一実施例において、ステップ（１）に係る被験サンプルは、ヒトの組織及び／又は細胞に由来する。
【００６７】
前記被験サンプルは、ＲＮＡが適時かつ固定な処理を受ける限り実行可能であり、当業者は必要に応じて選択することができ、本明細書において特別に制限されなく、本開示に係る被験サンプルは、組織のパラフィン切片及び／又は針生検細胞打錠及び／又は自然脱落及び機械的方法により得られた脱落細胞を含む。
【００６８】
本明細書の一実施例において、前記組織のパラフィン切片の具体的な手順は、ヒト腫瘍組織サンプルを採取し、タイムリーに１０％  中性ホルマリン又は他の固定方法で固定し、パラフィン包埋し、１０μｍの厚さに切り出し、正に帯電したスライドガラスで組織スライドを作製した。厚さはわずか１０μｍであるため、顕微鏡下で見られる細胞の一部は不完全な核であるので、一部の偽陰性の遺伝子欠失が発生する。
【００６９】
本明細書の一実施例において、前記の他の固定方法は、アルコール固定を含む。前記アルコール固定は、具体的には、以下のステップを含む。
【００７０】
被験サンプルを中国特許ＺＬ２００７１００２４０４８．６に記載の標本防腐固定液に入れ、室温で２４ｈ以上固定する。
【００７１】
発明者は、固定方法により異なる分級基準があり、各指標には上下２０％の変動があることを発見する。
【００７２】
本明細書の一実施例において、前記針生検細胞打錠は、具体的な手順が、ヒト細胞を取得し、タイムリーに１０％  中性ホルマリン又は他の固定方法で固定すればよい。
【００７３】
前記自然脱落及び機械的方法により得られた脱落細胞は、具体的な手順が、ヒト細胞を取得し、タイムリーに１０％  中性ホルマリン又は他の固定方法で固定すればよい。
【００７４】
穿刺で細胞を採取するのは、患者への損傷が少なく、サンプリングプロセスが簡単であり、血液の循環特性を考慮し、穿刺で細胞を採取するのは位置を確認することもできるため、穿刺による細胞は実験サンプルとして特別な優位を持つ。
【００７５】
本明細書の一実施例において、前記被験サンプルは、針生検細胞である。
【００７６】
本明細書の一実施例において、前記インプリント遺伝子はＺ１−Ｚ１６であり、前記インプリント遺伝子Ｚ１はＧｎａｓであり、前記インプリント遺伝子Ｚ２はＩｇｆ２であり、前記インプリント遺伝子Ｚ３はＰｅｇ１０であり、前記インプリント遺伝子Ｚ４はＩｇｆ２ｒであり、前記インプリント遺伝子Ｚ５はＭｅｓｔであり、前記インプリント遺伝子Ｚ６はＰｌａｇｌ１であり、前記インプリント遺伝子Ｚ７はＣｄｋｎ１ｃであり、前記インプリント遺伝子Ｚ８はＤｃｎであり、前記インプリント遺伝子Ｚ９はＤｌｋ１であり、前記インプリント遺伝子Ｚ１０はＧａｔｍであり、前記インプリント遺伝子Ｚ１１はＧｒｂ１０であり、前記インプリント遺伝子Ｚ１２はＰｅｇ３であり、前記インプリント遺伝子Ｚ１３はＳｇｃｅであり、前記インプリント遺伝子Ｚ１４はＳｌｃ３８ａ４であり、前記インプリント遺伝子Ｚ１５はＤｉｒａｓ３であり、前記インプリント遺伝子Ｚ１６はＳｎｒｐｎ／Ｓｎｕｒｆである。
【００７７】
前記インプリント遺伝子Ｚ１（Ｇｎａｓ）、Ｚ２（Ｉｇｆ２）、Ｚ３（Ｐｅｇ１０）、Ｚ４（Ｉｇｆ２ｒ）、Ｚ５（Ｍｅｓｔ）、  Ｚ６（Ｐｌａｇｌ１）、Ｚ７（Ｃｄｋｎ１ｃ）、Ｚ８（Ｄｃｎ）、Ｚ９（Ｄｌｋ１）、Ｚ１０（Ｇａｔｍ）、Ｚ１１（Ｇｒｂ１０）、Ｚ１２（Ｐｅｇ３）、Ｚ１３（Ｓｇｃｅ）、Ｚ１４（Ｓｌｃ３８ａ４）、Ｚ１５（Ｄｉｒａｓ３）、Ｚ１６（Ｓｎｒｐｎ／Ｓｎｕｒｆ）は、正常な腫瘍細胞組織では発現の程度が異なり、悪性病変が発生すると、発現量及びインプリンティング状態はいずれも有意に変化する。
【００７８】
本明細書の一実施例において、前記設計プローブは、インプリント遺伝子Ｚ１〜Ｚ１６であるＧｎａｓ、Ｉｇｆ２、Ｐｅｇ１０、Ｉｇｆ２ｒ、Ｍｅｓｔ、Ｐｌａｇｌ１、Ｃｄｋｎ１ｃ、Ｄｃｎ、Ｄｌｋ１、Ｇａｔｍ、Ｇｒｂ１０、Ｐｅｇ３、Ｓｇｃｅ、Ｓｌｃ３８ａ４、Ｄｉｒａｓ３及びＳｎｒｐｎ／Ｓｎｕｒｆに従って設計されたものであり、具体的には、各遺伝子のループ構造の内部にある配列をプローブとして選択し、具体的なプローブはＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社によって設計したものである。
【００７９】
本明細書の一実施例において、前記ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーションは、ＲＮＡ  ｓｃｏｐｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法を採用する。
【００８０】
本明細書の一実施例において、前記ＲＮＡ  ｓｃｏｐｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション法は、シングル又はマルチチャンネル比色キット或いはシングル又はマルチチャンネル蛍光キットを使用し、好ましくは、シングルチャンネルの赤色/茶色の比色キット或いはマルチチャンネル蛍光キットである。
【００８１】
前記マルチチャンネル比色キット或いはマルチチャンネル蛍光キットは、２つのチャンネル又は２つ以上のチャンネルの比色キット或いは蛍光キットを含み、前記２つのチャンネルの比色キット或いはマルチチャンネル蛍光キットは、２つのインプリント遺伝子プローブ又はインプリント遺伝子と他の遺伝子との組み合わせ発現、又は複数のインプリント遺伝子と非インプリント遺伝子との総合的発現を使用することができる。
【００８２】
プローブはｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行い、細胞核をＨｅｍｏｔｏｘｙ（ヘマトキシリン）で染色してシグナル増幅を行い、４０×又は６０×顕微鏡下で、各細胞核内でインプリント遺伝子の存在、インプリント遺伝子の欠失又はコピー数異常を判断し、インプリント遺伝子の発現量、インプリント遺伝子欠失の遺伝子発現量及びインプリント遺伝子コピー数異常の遺伝子発現量を計算することによりそのサンプルの腫瘍の良性・悪性度を判定する。切片はわずか１０μｍであるため、顕微鏡で見られた核の約２０％は不完全な核であり、つまり、一部の偽陰性である可能性がある。
【００８３】
本明細書の一実施例において、前記判断した腫瘍の良性・悪性度は、良性、悪性潜在性、早期悪性腫瘍、中期悪性腫瘍及び進行性悪性腫瘍に分類される。
【００８４】
本明細書の一実施例において、前記腫瘍の良性・悪性度を判断した結果は、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６におけるインプリント遺伝子の欠失発現量、及びインプリント遺伝子のコピー数異常発現量はいずれも０級であり、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の１つ以下のインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子の欠失発現量はＩ級であり、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の１つ以下のインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量はＩ級のいずれか１つである場合のいずれか１つであると、良性腫瘍である。
【００８５】
本明細書の一実施例において、前記腫瘍の良性・悪性度を判断した結果は、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の少なくとも２つのインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子の欠失発現量はＩ級であり、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の少なくとも２つのインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量はＩ級であり、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の１つ以下のインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子の欠失発現量はＩ級であり、又はインプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の１つ以下のインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量はＩＩ級である場合のいずれか１つであると、悪性潜在性であると判定する。
【００８６】
本明細書の一実施例において、前記腫瘍の良性・悪性度を判断した結果は、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の少なくとも２つのインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子の欠失発現量はＩＩ級であり、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の少なくとも２つのインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量はＩＩ級であり、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の１つ以下のインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子の欠失発現量はＩＩＩ級であり、又はインプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の１つ以下のインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量はＩＩＩ級であると、早期悪性腫瘍である。
【００８７】
本明細書の一実施例において、前記腫瘍の良性・悪性度を判断した結果は、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の少なくとも２つのインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子の欠失発現量はＩＩＩ級であり、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の少なくとも２つのインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量はＩＩＩ級であり、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の１つ以下のインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子の欠失発現量はＩＶ級であり、又はインプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の１つ以下のインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量はＩＶ級であると、中期悪性腫瘍である。
【００８８】
本明細書の一実施例において、前記腫瘍の良性・悪性度を判断した結果は、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の少なくとも２つのインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子の欠失発現量はＩＶ級であり、又はインプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の少なくとも２つのインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量はＩＶ級であると、進行性悪性腫瘍である。
【００８９】
本明細書の一実施例において、前記腫瘍は、当分野の通常の腫瘍であればよく、本開示は、甲状腺腫瘍、肺腫瘍又は脳腫瘍のいずれか１つまたは少なくとも２つの組み合わせから選択されるが、これらに限定されない。
【００９０】
本明細書の一実施例は、以下のステップを含む検出方法を提供する。
【００９１】
（１）被験サンプルを取得する。
【００９２】
（２）インプリント遺伝子配列に基づいて特異的プライマーを設計する。
【００９３】
（３）ステップ（２）でのプローブと被験サンプルとのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行う。
【００９４】
（４）顕微鏡イメージングによりインプリント遺伝子の発現を解析する。
【００９５】
ここで、モデルにより、インプリント遺伝子の発現量、インプリント遺伝子の欠失発現量、及びインプリント遺伝子のコピー数異常発現量を計算することにより、インプリント遺伝子の欠失発現量、及びインプリント遺伝子のコピー数異常発現量のレベルを算出して腫瘍の良性・悪性度を判断する。
【００９６】
前記インプリント遺伝子欠失は、細胞をヘマトキシリンで染色した後、細胞核内で２つの赤色/茶色の標識が存在することであり、前記インプリント遺伝子のコピー数異常は、細胞をヘマトキシリンで染色した後、細胞核内で２つ以上の赤色/茶色の標識が存在することであり、前記コピー数異常は、がん細胞の異常な遺伝子複製によるものであり、その結果、この遺伝子は三倍体又はより高い多倍体として発現することである。
【００９７】
前記ヘマトキシリンで染色された標識は、赤色又は茶色から選択されるが、これらに限定されなく、他の色による染色標識は、刷り込み遺伝子の発現量、インプリント遺伝子の欠失発現量、及びインプリント遺伝子のコピー数異常発現量の計算に使用することもできる。
【００９８】
前記検出装置は、単一細胞及び組織レベルで各タイプの腫瘍のインプリンティング（刷り込み）遺伝子の変化を早期かつ直観的に観察するために使用されて腫瘍の良性・悪性及び悪性度を判断し、早期腫瘍患者に最も有利な治療機会を提供する。
【００９９】
本明細書の一実施例において、ステップ（１）に係る被験サンプルは、ヒトの組織及び／又は細胞に由来する。
【０１００】
前記被験サンプルは、ＲＮＡが適時かつ固定な処理を受ける限り実行可能であり、当業者は必要に応じて選択することができ、本明細書において特別に制限されなく、本開示に係る被験サンプルは、組織のパラフィン切片、針生検細胞打錠又は自然脱落及び機械的方法により得られた脱落細胞を含む。
【０１０１】
本明細書の一実施例において、前記組織のパラフィン切片の具体的な手順は、ヒト腫瘍組織サンプルを採取し、タイムリーに１０％  中性ホルマリン又は他の固定方法で固定し、パラフィン包埋し、１０μｍの厚さに切り出し、正に帯電したスライドガラスで組織スライドを作製し、厚さはわずか１０μｍであるため、顕微鏡下で見られる細胞の一部は不完全な核であるので、一部の偽陰性の遺伝子欠失が発生する。
【０１０２】
本明細書の一実施例において、前記他の固定方法は、アルコール固定を含み、具体的には、前記アルコール固定は以下のステップを含む。
【０１０３】
被験サンプルを中国特許ＺＬ２００７１００２４０４８．６に記載の標本防腐固定液に入れ、室温で２４ｈ以上固定する。
【０１０４】
発明者は、固定方法により異なる分級基準があり、各指標には上下２０％の変動があることを発見する。
【０１０５】
本明細書の一実施例において、前記針生検細胞打錠は、具体的な手順が、ヒト細胞を取得し、タイムリーに１０％  中性ホルマリン又は他の固定方法で固定すればよい。
【０１０６】
前記自然脱落及び機械的方法により得られた脱落細胞は、具体的な手順が、ヒト細胞を取得し、タイムリーに１０％  中性ホルマリン又は他の固定方法で固定すればよい。
【０１０７】
穿刺で細胞を採取するのは、患者への損傷が少ない、サンプリングプロセスが簡単で、血液の循環特性を考慮し、穿刺で細胞を採取するのは位置を確認することもできるため、穿刺による細胞は実験サンプルとして特別な優位を持つ。
【０１０８】
本明細書の一実施例において、前記被験サンプルは、針生検細胞である。
【０１０９】
本明細書の一実施例において、前記インプリント遺伝子はＺ１〜Ｚ１６であり、前記インプリント遺伝子Ｚ１はＧｎａｓであり、前記インプリント遺伝子Ｚ２はＩｇｆ２であり、前記インプリント遺伝子Ｚ３はＰｅｇ１０であり、前記インプリント遺伝子Ｚ４はＩｇｆ２ｒであり、前記インプリント遺伝子Ｚ５はＭｅｓｔであり、前記インプリント遺伝子Ｚ６はＰｌａｇｌ１であり、前記インプリント遺伝子Ｚ７はＣｄｋｎ１ｃであり、前記インプリント遺伝子Ｚ８はＤｃｎであり、前記インプリント遺伝子Ｚ９はＤｌｋ１であり、前記インプリント遺伝子Ｚ１０はＧａｔｍであり、前記インプリント遺伝子Ｚ１１はＧｒｂ１０であり、前記インプリント遺伝子Ｚ１２はＰｅｇ３であり、前記インプリント遺伝子Ｚ１３はＳｇｃｅであり、前記インプリント遺伝子Ｚ１４はＳｌｃ３８ａ４であり、前記インプリント遺伝子Ｚ１５はＤｉｒａｓ３であり、前記インプリント遺伝子Ｚ１６はＳｎｒｐｎ／Ｓｎｕｒｆである。
【０１１０】
前記インプリント遺伝子Ｚ１（Ｇｎａｓ）、Ｚ２（Ｉｇｆ２）、Ｚ３（Ｐｅｇ１０）、Ｚ４（Ｉｇｆ２ｒ）、Ｚ５（Ｍｅｓｔ）、Ｚ６（Ｐｌａｇｌ１）、Ｚ７（Ｃｄｋｎ１ｃ）、Ｚ８（Ｄｃｎ）、Ｚ９（Ｄｌｋ１）、Ｚ１０（Ｇａｔｍ）、Ｚ１１（Ｇｒｂ１０）、Ｚ１２（Ｐｅｇ３）、Ｚ１３（Ｓｇｃｅ）、Ｚ１４（Ｓｌｃ３８ａ４）、Ｚ１５（Ｄｉｒａｓ３）、Ｚ１６（Ｓｎｒｐｎ／Ｓｎｕｒｆ）は、正常な腫瘍細胞組織では発現の程度が異なり、悪性病変が発生すると、発現量及びインプリンティング状態はいずれも有意に変化する。
【０１１１】
本明細書の一実施例において、前記設計プローブは、インプリント遺伝子Ｚ１〜Ｚ１６である、Ｇｎａｓ、Ｉｇｆ２、Ｐｅｇ１０、Ｉｇｆ２ｒ、Ｍｅｓｔ、Ｐｌａｇｌ１、Ｃｄｋｎ１ｃ、Ｄｃｎ、Ｄｌｋ１、Ｇａｔｍ、Ｇｒｂ１０、Ｐｅｇ３、Ｓｇｃｅ、Ｓｌｃ３８ａ４、Ｄｉｒａｓ３和Ｓｎｒｐｎ／Ｓｎｕｒｆに従って設計されたものであり、具体的には、各遺伝子のループ構造の内部にある配列をプローブとして選択し、具体的なプローブはＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社によって設計したものである。
【０１１２】
本明細書の一実施例において、前記ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーションは、ＲＮＡ  ｓｃｏｐｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法を採用する。
【０１１３】
本明細書の一実施例において、前記ＲＮＡ  ｓｃｏｐｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション法は、シングル又はマルチチャンネル比色キット或いはシングル又はマルチチャンネル蛍光キットを使用し、好ましくは、シングルチャンネルの赤色/茶色の比色キット或いはマルチチャンネル蛍光キットである。
【０１１４】
前記マルチチャンネル比色キット或いはマルチチャンネル蛍光キットは、２つのチャンネル又は２つ以上のチャンネルの比色キット或いは蛍光キットを含み、前記２つのチャンネルの比色キット或いはマルチチャンネル蛍光キットは、２つのインプリント遺伝子プローブ又はインプリント遺伝子と他の遺伝子との組み合わせ発現、ひいては複数のインプリント遺伝子と非インプリント遺伝子との総合的発現を使用することができる。
【０１１５】
プローブはｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行い、及び細胞核をＨｅｍｏｔｏｘｙ（ヘマトキシリン）で染色してシグナル増幅を行い、４０×又は６０×顕微鏡下で、各細胞核内でインプリント遺伝子の存在、インプリント遺伝子の欠失又はコピー数異常を判断し、インプリント遺伝子の発現量、インプリント遺伝子欠失の遺伝子発現量及びインプリント遺伝子コピー数異常の遺伝子発現量を計算することによりそのサンプルの腫瘍の良性・悪性度を判定する。切片はわずか１０μｍであるため、顕微鏡で見られた核の約２０％は不完全な核であり、つまり、一部の偽陰性である可能性がある。
【０１１６】
本明細書の一実施例において、前記インプリント遺伝子の欠失発現量、及びインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、５つの異なるレベルに分けられる。
【０１１７】
本明細書の一実施例において、前記５つの異なるレベルは、サンプル中の各プローブの最も強い陽性発現を示す領域で少なくとも１２００個の細胞をカウントし、Ｚ１〜Ｚ１６の１６個のインプリント遺伝子のうち、インプリント遺伝子の欠失発現量及びインプリント遺伝子のコピー数異常発現量をそれぞれ分けるものである。
【０１１８】
本明細書の一実施例において、Ｚ１におけるインプリント遺伝子の欠失発現量、及びインプリント遺伝子のコピー数異常発現量を分ける５つの異なるレベルは、以下の通りである。
【０１１９】
０級：前記インプリント遺伝子Ｚ１におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は、１５％未満であり、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ１におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、１．５％未満である。
【０１２０】
Ｉ級：前記インプリント遺伝子Ｚ１におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は１５〜２５％であり、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ１におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、１．５〜２．５％である。
【０１２１】
ＩＩ級：前記インプリント遺伝子Ｚ１におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は、２５〜３０％であり、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ１におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、２．５〜４％である。
【０１２２】
ＩＩＩ級：前記インプリント遺伝子Ｚ１におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は、３０〜３５％であり、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ１におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、４〜６％である。
【０１２３】
ＩＶ級：前記インプリント遺伝子Ｚ１におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は、３５％を超え、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ１におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、６％を超える。
【０１２４】
本明細書の一実施例において、Ｚ２及びＺ１２におけるインプリント遺伝子の欠失発現量、及びインプリント遺伝子のコピー数異常発現量を分ける５つの異なるレベルは、以下の通りである。
【０１２５】
０級：前記インプリント遺伝子Ｚ２及びＺ１２におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は、１５％未満であり、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ２及びＺ１２におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、１％未満である。
【０１２６】
Ｉ級：前記インプリント遺伝子Ｚ２及びＺ１２におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は、１５〜２０％であり、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ２及びＺ１２におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、１〜２％である。
【０１２７】
ＩＩ級：前記インプリント遺伝子Ｚ２及びＺ１２におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は、２０〜２５％であり、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ２及びＺ１２におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、２〜３％である。
【０１２８】
ＩＩＩ級：前記インプリント遺伝子Ｚ２及びＺ１２におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は、２５〜３５％であり、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ２及びＺ１２におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、３〜５％である。
【０１２９】
ＩＶ級：前記インプリント遺伝子Ｚ２及びＺ１２におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は、３５％を超え、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ２及びＺ１２におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、５％を超える。
【０１３０】
前記インプリント遺伝子Ｚ２及びＺ１２におけるインプリント遺伝子の欠失発現量、及びインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は互いに独立する。
【０１３１】
本明細書の一実施例において、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ９、Ｚ１０及びＺ１１におけるインプリント遺伝子の欠失発現量、及びインプリント遺伝子のコピー数異常発現量を分ける５つの異なるレベルは、以下の通りである。
【０１３２】
０級：前記インプリント遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ９、Ｚ１０及びＺ１１におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は、１５％未満であり、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ９、Ｚ１０及びＺ１１におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、１％未満である。
【０１３３】
Ｉ級：前記インプリント遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ９、Ｚ１０及びＺ１１におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は、１５〜２０％であり、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ９、Ｚ１０及びＺ１１におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、１〜２．５％である。
【０１３４】
ＩＩ級：前記インプリント遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ９、Ｚ１０及びＺ１１におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は、２０〜３０％であり、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ９、Ｚ１０及びＺ１１におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、２．５〜４％である。
【０１３５】
ＩＩＩ級：前記インプリント遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ９、Ｚ１０及びＺ１１におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は、３０〜３５％であり、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ９、Ｚ１０及びＺ１１におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、４〜６％である。
【０１３６】
ＩＶ級：前記インプリント遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ９、Ｚ１０及びＺ１１におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は、３５％を超え、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ９、Ｚ１０及びＺ１１におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、６％を超える。
【０１３７】
前記インプリント遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ９、Ｚ１０及びＺ１１におけるインプリント遺伝子の欠失発現量、及びインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は互いに独立する。
【０１３８】
本明細書の一実施例において、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１３及びＺ１６におけるインプリント遺伝子の欠失発現量、及びインプリント遺伝子のコピー数異常発現量を分ける５つの異なるレベルは、以下の通りである。
【０１３９】
０級：前記インプリント遺伝子Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１３及びＺ１６におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は、１５％未満であり、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１３及びＺ１６におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、１％未満である。
【０１４０】
Ｉ級：前記インプリント遺伝子Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１３及びＺ１６におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は、１５〜２０％であり、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１３及びＺ１６におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、１〜２．５％である。
【０１４１】
ＩＩ級：前記インプリント遺伝子Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１３及びＺ１６におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は、２０〜２５％であり、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１３及びＺ１６におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、２．５〜４％である。
【０１４２】
ＩＩＩ級：前記インプリント遺伝子Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１３及びＺ１６におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は、２５〜３５％であり、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１３及びＺ１６におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、４〜６％である。
【０１４３】
ＩＶ級：前記インプリント遺伝子Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１３及びＺ１６におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は、３５％を超え、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１３及びＺ１６におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、６％を超える。
【０１４４】
前記インプリント遺伝子Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１３及びＺ１６におけるインプリント遺伝子の欠失発現量、及びインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は互いに独立する。
【０１４５】
本明細書の一実施例において、Ｚ７、Ｚ１４及びＺ１５におけるインプリント遺伝子の欠失発現量、及びインプリント遺伝子のコピー数異常発現量を分ける５つの異なるレベルは、以下の通りである。
【０１４６】
０級：前記インプリント遺伝子Ｚ７、Ｚ１４及びＺ１５におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は、１０％未満であり、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ７、Ｚ１４及びＺ１５におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、０．５％未満である。
【０１４７】
Ｉ級：前記インプリント遺伝子Ｚ７、Ｚ１４及びＺ１５におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は、１０〜１５％であり、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ７、Ｚ１４及びＺ１５におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、０．５〜１％である。
【０１４８】
ＩＩ級：前記インプリント遺伝子Ｚ７、Ｚ１４及びＺ１５におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は、１５〜２０％であり、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ７、Ｚ１４及びＺ１５におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、１〜２％である。
【０１４９】
ＩＩＩ級：前記インプリント遺伝子Ｚ７、Ｚ１４及びＺ１５におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は、２０〜２５％であり、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ７、Ｚ１４及びＺ１５におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、２〜３％である。
【０１５０】
ＩＶ級：前記インプリント遺伝子Ｚ７、Ｚ１４及びＺ１５におけるインプリント遺伝子の欠失発現量は、２５％を超え、及び／又は前記インプリント遺伝子Ｚ７、Ｚ１４及びＺ１５におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は、３％を超える。
【０１５１】
前記インプリント遺伝子Ｚ７、Ｚ１４及びＺ１５におけるインプリント遺伝子の欠失発現量、及びインプリント遺伝子のコピー数異常発現量は互いに独立する。
【０１５２】
本明細書の一実施例において、前記判断腫瘍の良性・悪性度は、良性、悪性潜在性、早期悪性腫瘍、中期悪性腫瘍及び進行性悪性腫瘍に分類される。
【０１５３】
本明細書の一実施例において、前記腫瘍の良性・悪性度を判断した結果は、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６におけるインプリント遺伝子の欠失発現量、及びインプリント遺伝子のコピー数異常発現量はいずれも０級であり、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の１つ以下のインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子の欠失発現量はＩ級であり、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の１つ以下のインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量はＩ級である場合のいずれか１つであると、良性腫瘍である。
【０１５４】
本明細書の一実施例において、前記腫瘍の良性・悪性度を判断した結果は、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の少なくとも２つのインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子の欠失発現量はＩ級であり、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の少なくとも２つのインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量はＩ級であり、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の１つ以下のインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子の欠失発現量はＩ級であり、又はインプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の１つ以下のインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量はＩＩ級である場合のいずれか１つであると、悪性潜在性であると判定する。
【０１５５】
本明細書の一実施例において、前記腫瘍の良性・悪性度を判断した結果は、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の少なくとも２つのインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子の欠失発現量はＩＩ級であり、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の少なくとも２つのインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量はＩＩ級であり、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、  Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の１つ以下のインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子の欠失発現量はＩＩＩ級であり、又はインプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の１つ以下のインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量はＩＩＩ級であると、早期悪性腫瘍である。
【０１５６】
本明細書の一実施例において、前記腫瘍の良性・悪性度を判断した結果は、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の少なくとも２つのインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子の欠失発現量はＩＩＩ級であり、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の少なくとも２つのインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量はＩＩＩ級であり、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の１つ以下のインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子の欠失発現量はＩＶ級であり、又はインプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の１つ以下のインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量はＩＶ級であると、中期悪性腫瘍である。
【０１５７】
本明細書の一実施例において、前記腫瘍の良性・悪性度を判断した結果は、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の少なくとも２つのインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子の欠失発現量はＩＶ級であり、又はインプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の少なくとも２つのインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量はＩＶ級であると、進行性悪性腫瘍である。
【０１５８】
本明細書の実施例において、各インプリント遺伝子に対する異なる腫瘍の感度が異なるため、異なる腫瘍の各指標には上下２０％の変動がある。
【０１５９】
本明細書の一実施例において、前記モデル又は前記装置の、腫瘍を検出及び／又は治療するための医薬品の調製における用途を提供する。
【０１６０】
本明細書の一実施例において、被験腫瘍の良性・悪性度は良性、悪性潜在性、早期悪性腫瘍、中期悪性腫瘍及び進行性悪性腫瘍に分類される。
【０１６１】
本明細書の一実施例において、腫瘍の良性・悪性度を判断した結果は、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６におけるインプリント遺伝子の欠失発現量、及びインプリント遺伝子のコピー数異常発現量はいずれも０級であり、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の１つ以下のインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子の欠失発現量はＩ級であり、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の１つ以下のインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量はＩ級である場合のいずれか１つであると、良性腫瘍である。
【０１６２】
本明細書の一実施例において、前記腫瘍の良性・悪性度を判断した結果は、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の少なくとも２つのインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子の欠失発現量はＩ級であり、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の少なくとも２つのインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量はＩ級であり、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の１つ以下のインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子の欠失発現量はＩ級であり、又はインプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の１つ以下のインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量はＩＩ級である場合のいずれか１つであると、悪性潜在性であると判定する。
【０１６３】
本明細書の一実施例において、前記腫瘍の良性・悪性度を判断した結果は、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の少なくとも２つのインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子の欠失発現量はＩＩ級であり、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の少なくとも２つのインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量はＩＩ級であり、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の１つ以下のインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子の欠失発現量はＩＩＩ級であり、又はインプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の１つ以下のインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量はＩＩＩ級であると、早期悪性腫瘍である。
【０１６４】
本明細書の一実施例において、前記腫瘍の良性・悪性度を判断した結果は、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の少なくとも２つのインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子の欠失発現量はＩＩＩ級であり、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の少なくとも２つのインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量はＩＩＩ級であり、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の１つ以下のインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子の欠失発現量はＩＶ級であり、又はインプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の１つ以下のインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量はＩＶ級であると、中期悪性腫瘍である。
【０１６５】
本明細書の一実施例において、前記腫瘍の良性・悪性度を判断した結果は、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の少なくとも２つのインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子の欠失発現量はＩＶ級であり、又はインプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の少なくとも２つのインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量はＩＶ級であると、進行性悪性腫瘍である。
【０１６６】
関連技術と比較しては、本明細書の実施例において、前記検出モデル及び装置を利用し、腫瘍患者サンプルにおけるインプリント遺伝子の発現を直観的方法で示し、インプリント遺伝子のインサイチュ標識法により、インプリンティング（刷り込み）遺伝子的変化を客観的、直観的、早期、正確に検出し、且つ定量的モデルを提供することができ、分子病理診断に大きく貢献する。
【０１６７】
他の態様は、図面及び詳細な説明を読んで理解すると明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【０１６８】
図面は、本明細書に係る技術案のさらなる理解を提供するために使用され、且つ明細書の一部を構成し、本出願の実施形態と併せて本明細書に係る技術案を説明するために使用されるものであり、本明細書の技術案を制限しない。
【０１６９】
【図１】図１は、本開示の実施例一においてインプリント遺伝子欠失とがんとの関係を示す図である。
【０１７０】
【図２】図２は、本開示の実施例一においてヘマトキシリンで染色された核の甲状腺がんの病理切片を示し、ここで、前記ａは、細胞をヘマトキシリンで染色した後、細胞核内で標識が存在しなく、インプリント遺伝子が発現していないことであり、前記ｂは、細胞をヘマトキシリンで染色した後、細胞核内で１つの赤色/茶色の標識が存在し、インプリント遺伝子が存在することであり、前記ｃは、細胞をヘマトキシリンで染色した後、細胞核内で２つの赤色/茶色の標識が存在し、インプリント遺伝子の欠失であることであり、前記ｄは、細胞をヘマトキシリンで染色した後、細胞核内で２つ以上の赤色/茶色の標識が存在し、インプリント遺伝子のコピー数変異であることである。
【０１７１】
【図３】図３は、本開示の実施例一において甲状腺腫瘍の異なる悪性度の病理切片における１６個の遺伝子の発現状態を示し、ここで、図３（ａ）は、０級にある甲状腺腫瘍の病理切片における１６個の遺伝子の発現状態を示し、図３（ｂ）は、Ｉ級にある甲状腺がんの病理切片における１６個の遺伝子の発現状態を示し、図３（ｃ）は、ＩＩ級にある甲状腺がんの病理切片における１６個の遺伝子の発現状態を示し、図３（ｄ）は、ＩＩＩ級にある甲状腺がんの病理切片における１６個の遺伝子の発現状態を示し、図３（ｅ）は、ＩＶ級にある甲状腺がんの病理切片における１６個の遺伝子の発現状態を示す。
【０１７２】
【図４】図４は、本開示の実施例二において１７例の甲状腺腫瘍の病理切片における１６個の遺伝子のインプリンティング消失・コピー数異常の分布範囲及び分級基準を示し、ここで、図４（ａ）は、１７例の甲状腺腫瘍の病理切片におけるインプリント遺伝子Ｚ１のインプリンティング消失・コピー数異常の分布範囲及び分級基準を示し、図４（ｂ）は、１７例の甲状腺腫瘍の病理切片におけるインプリント遺伝子Ｚ２のインプリンティング消失・コピー数異常の分布範囲及び分級基準を示し、図４（ｃ）は、１７例の甲状腺腫瘍の病理切片におけるインプリント遺伝子Ｚ３のインプリンティング消失・コピー数異常の分布範囲及び分級基準を示し、図４（ｄ）は、１７例の甲状腺腫瘍の病理切片におけるインプリント遺伝子Ｚ４のインプリンティング消失・コピー数異常の分布範囲及び分級基準を示し、図４（ｅ）は、１７例の甲状腺腫瘍の病理切片におけるインプリント遺伝子Ｚ５のインプリンティング消失・コピー数異常の分布範囲及び分級基準を示し、図４（ｆ）は、１７例の甲状腺腫瘍の病理切片におけるインプリント遺伝子Ｚ６のインプリンティング消失・コピー数異常の分布範囲及び分級基準を示し、図４（ｇ）は、１７例の甲状腺腫瘍の病理切片におけるインプリント遺伝子Ｚ８のインプリンティング消失・コピー数異常の分布範囲及び分級基準を示し、図４（ｈ）は、１７例の甲状腺腫瘍の病理切片におけるインプリント遺伝子Ｚ９のインプリンティング消失・コピー数異常の分布範囲及び分級基準を示し、図４（ｉ）は、１７例の甲状腺腫瘍の病理切片におけるインプリント遺伝子Ｚ１０のインプリンティング消失・コピー数異常の分布範囲及び分級基準を示し、図４（ｊ）は、１７例の甲状腺腫瘍の病理切片におけるインプリント遺伝子Ｚ１１のインプリンティング消失・コピー数異常の分布範囲及び分級基準を示し、図４（ｋ）は、１７例の甲状腺腫瘍の病理切片におけるインプリント遺伝子Ｚ１２のインプリンティング消失・コピー数異常の分布範囲及び分級基準を示し、図４（ｌ）は、１７例の甲状腺腫瘍の病理切片におけるインプリント遺伝子Ｚ１３のインプリンティング消失・コピー数異常の分布範囲及び分級基準を示し、図４（ｍ）は、１７例の甲状腺腫瘍の病理切片におけるインプリント遺伝子Ｚ１６のインプリンティング消失・コピー数異常の分布範囲及び分級基準を示す。
【０１７３】
【図５】図５は、本開示の実施例三において異なる悪性度の皮膚病理切片における１６個の遺伝子の発現状態を示し、ここで、図５（ａ）は、黒斑の組織切片における１６個の遺伝子の発現状態を示し、図５（ｂ）は、皮膚悪性黒色腫の病理切片における１６個の遺伝子的発現状態を示す。
【０１７４】
【図６】図６は、本開示の実施例四において異なる悪性度の肺腫瘍の病理切片における１６個の遺伝子の発現状態を示し、ここで、図６（ａ）は、良性肺腫瘍の組織切片における１６個の遺伝子の発現状態を示し、図６（ｂ）は、肺がんの病理切片における１６個の遺伝子の発現状態を示す。
【０１７５】
【図７】図７は、本開示の実施例五において異なる悪性度の膀胱腫瘍の病理切片における１６個の遺伝子の発現状態を示し、ここで、図７（ａ）は、良性膀胱腫瘍の組織切片における１６個の遺伝子の発現状態を示し、図７（ｂ）は、膀胱がんの病理切片における１６個の遺伝子の発現状態を示す。
【０１７６】
【図８】図８は、本開示の実施例六において異なる悪性度の膵腫瘍の病理切片における１６個の遺伝子の発現状態を示し、ここで、図８（ａ）は、良性膵腫瘍の組織切片における１６個の遺伝子の発現状態を示し、図８（ｂ）は、膵臓がんの病理切片における１６個の遺伝子の発現状態を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１７７】
以下、本明細書の実施例を図面を参照しながら詳しく説明する。
【０１７８】
ゲノムインプリンティングは、エピジェネティックな遺伝子制御の方法であり、特定の遺伝子について特定の親由来の対立遺伝子のみが発現され、別の一方の対立遺伝子は遺伝子沈黙として現されるように示される。
【０１７９】
腫瘍の進展は複数の遺伝子変化のプロセスであり、エピジェネティック修飾は腫瘍の発生、診断、治療にとって非常に重要であり、臨床的にも応用されている。大量の科学的研究により、インプリンティング状態遺伝子の再発現と細胞発がんとの関連性が確認されている。
【０１８０】
本開示は、直接的に患者の針生検細胞からインプリンティング消失を診断する検出方法及び装置を創立し、腫瘍患者の手術前に腫瘍の良性・悪性度に対する判断を取得できることで、手術及び精密な治療のための根拠を提供することは、細胞分子の分野で腫瘍診断の革命的なブレークスルーである。
【０１８１】
本開示は、腫瘍のタイプを正確に判断し、現在の組織形態学的診断の制限を補い、早期の正確な診断を可能にし、後の標的療法に支援を提供することができる。
【０１８２】
本開示は、単一細胞及び組織レベルでインプリント遺伝子の発現状態を検出する最初のものであり、且つ細胞レベルでのインプリント遺伝子の発現に対して定性・定量的研究及び空間的定位を行い、臓器組織におけるインプリンティング消失と腫瘍発生の段階との関係を示す。
【０１８３】
本開示の検出方法は、免疫組織化学的方法とは異なり、偽陽性及び他の不良影響を低減したのみならず、発見された腫瘍関連インプリント遺伝子欠失部位によりその遺伝子のサイレンシング、ノックアウト、再配列をもたらす標的医薬品又は技術手段は、後の治療及び医薬品投与のガイドに使用できる。
【実施例】
【０１８４】
実施例一  甲状腺がんのインプリント遺伝子解析
【０１８５】
本実施例は、インプリント遺伝子により甲状腺がんを検出する方法を提供し、それらの関係は図１に示し、前記検出方法は、以下の手順を含む。
【０１８６】
（１）甲状腺がんの組織細胞切片（１０μｍ）を取得し、ＲＮＡの分解を防ぐために中国特許ＺＬ２００７１００２４０４８．６に記載の固定液に入れて固定し、固定時間が２４時間であり、パラフィン包埋し（ＦＦＰＥ）、前記スライドガラスはスーパーフロストプラスを使用する必要であり、前記切片は４０℃のオーブンで３ｈ以上加熱した。
【０１８７】
（２）ＲＮＡＳＣｏｐｅのサンプル処理方法に従って脱蝋し、サンプルの内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックし、透過性を向上させてＲＮＡ分子を露出させた。
【０１８８】
（３）設計プローブ：インプリント遺伝子配列に基づいて特異的プライマーを設計した。
【０１８９】
前記設計プローブは、インプリント遺伝子Ｚ１（Ｇｎａｓ）、Ｚ２（Ｉｇｆ２）、Ｚ３（Ｐｅｇ１０）、Ｚ４（Ｉｇｆ２ｒ）、Ｚ５（Ｍｅｓｔ）、Ｚ６（Ｐｌａｇｌ１）、Ｚ７（Ｃｄｋｎ１ｃ）、Ｚ８（Ｄｃｎ）、Ｚ９（Ｄｌｋ１）、Ｚ１０（Ｇａｔｍ）、Ｚ１１（Ｇｒｂ１０）、  Ｚ１２（Ｐｅｇ３）、Ｚ１３（Ｓｇｃｅ）、Ｚ１４（Ｓｌｃ３８ａ４）、Ｚ１５（Ｄｉｒａｓ３）及びＺ１６（Ｓｎｒｐｎ／Ｓｎｕｒｆ）に従って設計されたものであり、具体的には、各遺伝子のループ構造の内部にある配列をプローブとして選択し、具体的なプローブは、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社により設計された。
【０１９０】
（４）ステップ（３）でのプローブと被験サンプルとのキットによるＲＮＡＳＣｏｐｅｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行った。
【０１９１】
（５）シグナル増幅及びヘマトキシリンによる染色を行い、顕微鏡イメージングによりインプリント遺伝子の発現状態を解析した。
【０１９２】
前記モデルは、インプリント遺伝子の発現量、インプリント遺伝子の欠失発現量、及びインプリント遺伝子のコピー数異常発現量を計算する式が、以下の通りである。
【０１９３】
総発現量＝（ｂ＋ｃ＋ｄ）／（ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ）×１００％；
【０１９４】
正常なインプリント遺伝子の発現量＝ｂ／（ｂ＋ｃ＋ｄ）×１００％；
【０１９５】
インプリント遺伝子欠失の遺伝子発現量（ＬＯＩ）＝ｃ／（ｂ＋ｃ＋ｄ）×１００％；
【０１９６】
インプリント遺伝子コピー数異常の遺伝子発現量（ＣＮＶ）＝ｄ／（ｂ＋ｃ＋ｄ）×１００％；
【０１９７】
ここで、ａ、ｂ、ｃ、ｄは、図２に示し、前記ａは細胞をヘマトキシリンで染色した後、細胞核内で標識が存在しなく、インプリント遺伝子が発現していないことであり、前記ｂは、細胞をヘマトキシリンで染色した後、細胞核内で１つの赤色/茶色の標識が存在し、インプリント遺伝子が存在することを示し、前記ｃは、細胞をヘマトキシリンで染色した後、細胞核内で２つの赤色/茶色の標識が存在し、インプリント遺伝子の欠失であることであり、前記ｄは、細胞をヘマトキシリンで染色した後、細胞核内で２つ以上の赤色/茶色の標識が存在し、インプリント遺伝子のコピー数異常であることであり、それらの結果は図３（ａ）〜図３（ｅ）に示した。
【０１９８】
図３（ａ）〜図３（ｅ）より分かるように、０級〜ＩＶ級のサンプルでは、悪性度が増加するにつれてインプリンティング消失（細胞核内で２つの信号点がある）及びコピー数異常（細胞核内で３つ以上の信号点がある）細胞の割合は徐々に増加した。
【０１９９】
実施例二  Ｚ１〜Ｚ１６インプリント遺伝子の甲状腺がんに対する感受性
【０２００】
１７例の甲状腺腫瘍患者の組織（１０μｍ）を取得し、固定及び検出方法は実施例１と同じであり、検出結果は図４（ａ）〜図４（ｍ）に示した。
【０２０１】
図４（ａ）〜図４（ｍ）より、１７例の甲状腺腫瘍の組織サンプルにおける各プローブのインプリンティング消失及びコピー数異常の割合は低から高への分布を示し、異なるプローブの分布傾向に基づいて、図の点線で示される分級基準を計算し、各プローブのインプリンティング消失及びコピー数異常をそれぞれ低から高まで５つのレベルに分けられ、具体的なレベル分類は、以下の通りである。
【０２０２】
図４（ａ）より分かるように、前記インプリント遺伝子Ｚ１は、インプリント遺伝子の欠失発現量が１５％未満であり、及び／又はインプリント遺伝子のコピー数異常発現量が１．５％未満であり、０級となり、インプリント遺伝子の欠失発現量が１５〜２５％であり、及び／又はインプリント遺伝子のコピー数異常発現量が１．５〜２．５％であり、Ｉ級であり、インプリント遺伝子の欠失発現量が２５〜３０％であり、及び／又はインプリント遺伝子のコピー数異常発現量が２．５〜４％であり、ＩＩ級となり、インプリント遺伝子の欠失発現量が３０〜３５％であり、及び／又はインプリント遺伝子のコピー数異常発現量が４〜６％であり、ＩＩＩ級となり、インプリント遺伝子の欠失発現量が３５％を超え、及び／又はインプリント遺伝子のコピー数異常発現量が６％を超え、ＩＶ級となる。
【０２０３】
図４（ｂ）より分かるように、前記インプリント遺伝子Ｚ２は、インプリント遺伝子の欠失発現量が１５％未満であり、及び／又はインプリント遺伝子のコピー数異常発現量が１％未満であり、０級となり、インプリント遺伝子の欠失発現量が１５〜２０％であり、及び／又はインプリント遺伝子のコピー数異常発現量が１〜２％であり、Ｉ級となり、インプリント遺伝子の欠失発現量が２０〜２５％であり、及び／又はインプリント遺伝子のコピー数異常発現量が２〜３％であり、ＩＩ級となり、インプリント遺伝子の欠失発現量が２５〜３５％であり、及び／又はインプリント遺伝子のコピー数異常発現量が３〜５％であり、ＩＩＩ級となり、インプリント遺伝子の欠失発現量が３５％を超え、及び／又はインプリント遺伝子のコピー数異常発現量が５％を超え、ＩＶ級となる。
【０２０４】
図４（ｃ）より分かるように、前記インプリント遺伝子Ｚ３は、インプリント遺伝子の欠失発現量が１５％未満であり、及び／又はインプリント遺伝子のコピー数異常発現量が１％未満であり、０級となり、インプリント遺伝子の欠失発現量が１５〜２０％であり、及び／又はインプリント遺伝子のコピー数異常発現量が１〜２．５％であり、Ｉ級となり、インプリント遺伝子の欠失発現量が２０〜３０％であり、及び／又はインプリント遺伝子のコピー数異常発現量が２．５〜４％であり、ＩＩ級となり、インプリント遺伝子の欠失発現量が３０〜３５％であり、及び／又はインプリント遺伝子のコピー数異常発現量が４〜６％であり、ＩＩＩ級となり、インプリント遺伝子の欠失発現量が３５％を超え、及び／又はインプリント遺伝子のコピー数異常発現量が６％を超え、ＩＶ級となる。
【０２０５】
図４（ｄ）より分かるように、前記インプリント遺伝子Ｚ４は、インプリント遺伝子の欠失発現量が１５％未満であり、及び／又はインプリント遺伝子のコピー数異常発現量が１％未満であり、０級となり、インプリント遺伝子の欠失発現量が１５〜２０％であり、及び／又はインプリント遺伝子のコピー数異常発現量が１〜２．５％であり、Ｉ級となり、インプリント遺伝子の欠失発現量が２０〜３０％であり、及び／又はインプリント遺伝子のコピー数異常発現量が２．５〜４％であり、ＩＩ級となり、インプリント遺伝子の欠失発現量が３０〜３５％であり、及び／又はインプリント遺伝子のコピー数異常発現量が４〜６％であり、ＩＩＩ級となり、インプリント遺伝子の欠失発現量が３５％を超え、及び／又はインプリント遺伝子のコピー数異常発現量が６％を超え、ＩＶ級となる。
【０２０６】
図４（ｅ）より分かるように、前記インプリント遺伝子Ｚ５は、インプリント遺伝子の欠失発現量が１５％未満であり、及び／又はインプリント遺伝子のコピー数異常発現量が１％未満であり、０級となり、インプリント遺伝子の欠失発現量が１５〜２０％であり、及び／又はインプリント遺伝子のコピー数異常発現量が１〜２．５％であり、Ｉ級となり、インプリント遺伝子の欠失発現量が２０〜２５％であり、及び／又はインプリント遺伝子のコピー数異常発現量が２．５〜４％であり、ＩＩ級となり、インプリント遺伝子の欠失発現量が２５〜３５％であり、及び／又はインプリント遺伝子のコピー数異常発現量が４〜６％であり、ＩＩＩ級となり、インプリント遺伝子の欠失発現量が３５％を超え、及び／又はインプリント遺伝子のコピー数異常発現量が６％を超え、ＩＶ級となる。
【０２０７】
図４（ｆ）より分かるように、前記インプリント遺伝子Ｚ６は、インプリント遺伝子の欠失発現量が１５％未満であり、及び／又はインプリント遺伝子のコピー数異常発現量が１％未満であり、０級となり、インプリント遺伝子の欠失発現量が１５〜２０％であり、及び／又はインプリント遺伝子のコピー数異常発現量が１〜２．５％であり、Ｉ級となり、インプリント遺伝子の欠失発現量が２０〜２５％及び／又はインプリント遺伝子のコピー数異常発現量が２．５〜４％であり、ＩＩ級となり、インプリント遺伝子の欠失発現量が２５〜３５％であり、及び／又はインプリント遺伝子のコピー数異常発現量が４〜６％であり、ＩＩＩ級となり、インプリント遺伝子の欠失発現量が３５％を超え、及び／又はインプリント遺伝子のコピー数異常発現量が６％を超え、ＩＶ級となる。
【０２０８】
図４（ｇ）より分かるように、前記インプリント遺伝子Ｚ８がインプリント遺伝子の欠失発現量が１５％未満であり、及び／又はインプリント遺伝子のコピー数異常発現量が１％未満であり、０級となり、インプリント遺伝子の欠失発現量が１５〜２０％であり、及び／又はインプリント遺伝子のコピー数異常発現量が１〜２．５％であり、Ｉ級となり、インプリント遺伝子の欠失発現量が２０〜２５％であり、及び／又はインプリント遺伝子のコピー数異常発現量が２．５〜４％であり、ＩＩ級となり、インプリント遺伝子の欠失発現量が２５〜３５％であり、及び／又はインプリント遺伝子のコピー数異常発現量が４〜６％であり、ＩＩＩ級となり、インプリント遺伝子の欠失発現量が３５％を超え、及び／又はインプリント遺伝子のコピー数異常発現量が６％を超え、ＩＶ級となる。
【０２０９】
図４（ｈ）より分かるように、前記インプリント遺伝子Ｚ９は、インプリント遺伝子の欠失発現量が１５％未満であり、及び／又はインプリント遺伝子のコピー数異常発現量が１％未満であり、０級となり、インプリント遺伝子の欠失発現量が１５〜２０％であり、及び／又はインプリント遺伝子のコピー数異常発現量が１〜２．５％であり、Ｉ級となり、インプリント遺伝子の欠失発現量が２０〜３０％であり、及び／又はインプリント遺伝子のコピー数異常発現量が２．５〜４％であり、ＩＩ級となり、インプリント遺伝子の欠失発現量が３０〜３５％であり、及び／又はインプリント遺伝子のコピー数異常発現量が４〜６％であり、ＩＩＩ級となり、インプリント遺伝子の欠失発現量が３５％を超え、及び／又はインプリント遺伝子のコピー数異常発現量が６％を超え、ＩＶ級となる。
【０２１０】
図４（ｉ）より分かるように、前記インプリント遺伝子Ｚ１０は、インプリント遺伝子の欠失発現量が１５％未満であり、及び／又はインプリント遺伝子のコピー数異常発現量が１％未満であり、０級となり、インプリント遺伝子の欠失発現量が１５〜２０％であり、及び／又はインプリント遺伝子のコピー数異常発現量が１〜２．５％であり、Ｉ級となり、インプリント遺伝子の欠失発現量が２０〜３０％であり、及び／又はインプリント遺伝子のコピー数異常発現量が２．５〜４％であり、ＩＩ級となり、インプリント遺伝子の欠失発現量が３０〜３５％であり、及び／又はインプリント遺伝子のコピー数異常発現量が４〜６％であり、ＩＩＩ級となり、インプリント遺伝子の欠失発現量が３５％を超え、及び／又はインプリント遺伝子のコピー数異常発現量が６％を超え、ＩＶ級となる。
【０２１１】
図４（ｊ）より分かるように、前記インプリント遺伝子Ｚ１１は、インプリント遺伝子の欠失発現量が１５％未満であり、及び／又はインプリント遺伝子のコピー数異常発現量が１％未満であり、０級となり、インプリント遺伝子の欠失発現量が１５〜２０％であり、及び／又はインプリント遺伝子のコピー数異常発現量が１〜２．５％であり、Ｉ級となり、インプリント遺伝子の欠失発現量が２０〜３０％であり、及び／又はインプリント遺伝子のコピー数異常発現量が２．５〜４％であり、ＩＩ級となり、インプリント遺伝子の欠失発現量が３０〜３５％であり、及び／又はインプリント遺伝子のコピー数異常発現量が４〜６％であり、ＩＩＩ級となり、インプリント遺伝子の欠失発現量が３５％を超え、及び／又はインプリント遺伝子のコピー数異常発現量が６％を超え、ＩＶ級となる。
【０２１２】
図４（ｋ）より分かるように、前記インプリント遺伝子Ｚ１２は、インプリント遺伝子の欠失発現量が１５％未満であり、及び／又はインプリント遺伝子のコピー数異常発現量が１％未満であり、０級となり、インプリント遺伝子の欠失発現量が１５〜２０％であり、及び／又はインプリント遺伝子のコピー数異常発現量が１〜２％であり、Ｉ級となり、インプリント遺伝子の欠失発現量が２０〜２５％であり、及び／又はインプリント遺伝子のコピー数異常発現量が２〜３％であり、ＩＩ級となり、インプリント遺伝子の欠失発現量が２５〜３５％であり、及び／又はインプリント遺伝子のコピー数異常発現量が３〜５％であり、ＩＩＩ級となり、インプリント遺伝子の欠失発現量が３５％を超え、及び／又はインプリント遺伝子のコピー数異常発現量が５％を超え、ＩＶ級となる。
【０２１３】
図４（ｌ）より分かるように、前記インプリント遺伝子Ｚ１３は、インプリント遺伝子の欠失発現量が１５％未満であり、及び／又はインプリント遺伝子のコピー数異常発現量が１％未満であり、０級となり、インプリント遺伝子の欠失発現量が１５〜２０％であり、及び／又はインプリント遺伝子のコピー数異常発現量が１〜２．５％であり、Ｉ級となり、インプリント遺伝子の欠失発現量が２０〜２５％であり、及び／又はインプリント遺伝子のコピー数異常発現量が２．５〜４％であり、ＩＩ級となり、インプリント遺伝子の欠失発現量が２５〜３５％であり、及び／又はインプリント遺伝子のコピー数異常発現量が４〜６％であり、ＩＩＩ級となり、インプリント遺伝子の欠失発現量が３５％を超え、及び／又はインプリント遺伝子のコピー数異常発現量が６％を超え、ＩＶ級となる。
【０２１４】
図４（ｍ）より分かるように、前記インプリント遺伝子Ｚ１６は、インプリント遺伝子の欠失発現量が１５％未満であり、及び／又はインプリント遺伝子のコピー数異常発現量が１％未満であり、０級となり、インプリント遺伝子の欠失発現量が１５〜２０％であり、及び／又はインプリント遺伝子のコピー数異常発現量が１〜２．５％であり、Ｉ級となり、インプリント遺伝子の欠失発現量が２０〜２５％であり、及び／又はインプリント遺伝子のコピー数異常発現量が２．５〜４％であり、ＩＩ級となり、インプリント遺伝子の欠失発現量が２５〜３５％であり、及び／又はインプリント遺伝子のコピー数異常発現量が４〜６％であり、ＩＩＩ級となり、インプリント遺伝子の欠失発現量が３５％を超え、及び／又はインプリント遺伝子のコピー数異常発現量が６％を超え、ＩＶ級となる。
【０２１５】
これらの１７個の甲状腺腫瘍のサンプルの総合的な分析により、以下の結論を出すことができる。
【０２１６】
前記甲状腺腫瘍の良性・悪性度を判断した結果は、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６におけるインプリント遺伝子の欠失発現量、及びインプリント遺伝子のコピー数異常発現量がいずれも０級であり、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の１つ以下のインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子の欠失発現量がＩ級であり、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の１つ以下のインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量がＩ級である場合のいずれか１つであると、良性甲状腺腫瘍と判断した。
【０２１７】
前記甲状腺腫瘍の良性・悪性度を判断した結果は、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の少なくとも２つのインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子の欠失発現量がＩ級であり、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の少なくとも２つのインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量がＩ級であり、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の１つ以下のインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子の欠失発現量がＩ級であり、又はインプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の１つ以下のインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量がＩＩ級である場合のいずれか１つであると、甲状腺腫瘍の悪性潜在性であると判断した。
【０２１８】
前記甲状腺腫瘍の良性・悪性度を判断した結果は、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の少なくとも２つのインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子の欠失発現量がＩＩ級であり、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の少なくとも２つのインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量がＩＩ級であり、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の１つ以下のインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子の欠失発現量がＩＩＩ級であり、又はインプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の１つ以下のインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量がＩＩＩ級であると、早期甲状腺がんと判断した。
【０２１９】
前記甲状腺腫瘍の良性・悪性度を判断した結果は、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の少なくとも２つのインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子の欠失発現量がＩＩＩ級であり、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の少なくとも２つのインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量がＩＩＩ級であり、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の１つ以下のインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子の欠失発現量がＩＶ級であり、又はインプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の１つ以下のインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量がＩＶ級であると、中期甲状腺がんと判断した。
【０２２０】
前記甲状腺腫瘍の良性・悪性度を判断した結果は、インプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の少なくとも２つのインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子の欠失発現量がＩＶ級であり、又はインプリント遺伝子Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｚ１３、Ｚ１４、Ｚ１５及びＺ１６の少なくとも２つのインプリント遺伝子におけるインプリント遺伝子のコピー数異常発現量がＩＶ級であると、進行性甲状腺がんと判断した。
【０２２１】
実施例三  皮膚がんのインプリント遺伝子解析
【０２２２】
正常な黒斑及び皮膚悪性黒色腫の組織サンプルを採取し、１０％  中性ホルマリンで２４時間以上固定し、他の検出方法は実施例１と同じであり、検出結果は図５（ａ）〜図５（ｂ）に示した。
【０２２３】
図５（ａ）〜図５（ｂ）より分かるように、図５（ａ）は良性黒斑であり、図５（ｂ）は皮膚悪性黒色腫であり、黒斑には個別のインプリンティング消失の細胞だけがあり、コピー数異常の細胞が見つけられないが、皮膚悪性黒色腫には大量のインプリンティング消失及びコピー数異常の細胞が存在することが認められた。
【０２２４】
実施例四  肺がんのインプリント遺伝子解析
【０２２５】
良性肺腫瘍及び肺がんの組織サンプルを採取し、１０％  中性ホルマリンで２４時間以上固定し、他の検出方法は実施例１と同じであり、検出結果は図６（ａ）〜図６（ｂ）に示した。
【０２２６】
図６（ａ）〜図６（ｂ）より分かるように、図６（ａ）は良性肺腫瘍であり、図６（ｂ）は肺がんであり、良性肺腫瘍には個別のインプリンティング消失の細胞だけがあり、コピー数異常の細胞が見つけられないが、肺がんには大量のインプリンティング消失及びコピー数異常の細胞が存在することが認められた。
【０２２７】
実施例五  膀胱がんのインプリント遺伝子解析
【０２２８】
良性膀胱腫瘍及び膀胱がんの組織サンプルを採取し、１０％  中性ホルマリンで２４時間以上固定し、他の検出方法は実施例１と同じであり、検出結果は図７（ａ）〜図７（ｂ）に示した。
【０２２９】
図７（ａ）〜図７（ｂ）より分かるように、図７（ａ）は良性膀胱腫瘍であり、図７（ｂ）は膀胱がんであり、良性膀胱腫瘍には個別のインプリンティング消失の細胞だけがあり、コピー数異常的細胞が見つけられないが、膀胱がんには大量のインプリンティング消失及びコピー数異常の細胞が存在することが認められた。
【０２３０】
実施例六  膵臓がんのインプリント遺伝子解析
【０２３１】
良性膵腫瘍及び膵臓がんの組織サンプルを採取し、１０％  中性ホルマリンで２４時間以上固定し、他の検出方法は実施例１と同じであり、検出結果は図８（ａ）〜図８（ｂ）に示した。
【０２３２】
図８（ａ）〜図８（ｂ）より分かるように、図８（ａ）は良性膵腫瘍であり、図８（ｂ）は膵臓がんであり、良性膵腫瘍には個別のインプリンティング消失の細胞だけがあり、コピー数異常的細胞が見つけられないが、膵臓がんには大量のインプリンティング消失及びコピー数異常の細胞が存在することが認められた。
【０２３３】
以上により、本願に係る検出モデル及び装置を利用し、腫瘍患者サンプルにおけるインプリント遺伝子の発現を直観的方法で示し、インプリント遺伝子のインサイチュ標識法により、インプリンティング（刷り込み）遺伝子的変化を客観的、直観的、早期、正確に検出し、且つ定量的モデルを提供することができ、腫瘍の診断に大きく貢献する。
【０２３４】
出願人は、本願が本願の詳しい方法を上記の実施例によって説明するが、これらに限定されなく、即ち、本願の実施が上記の詳しい方法に依存する必要があるという意味ではない。本願に対する任意の改良、本願製品の各原料への同等置換及び補助成分の追加、具体的な方式の選択などが、いずれも本願の保護範囲及び開示の範囲に含まれることは、当業者にとっては明らかになる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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