(57)【要約】  本開示は、比較的高い事象率でフローサイトメトリーを通して粒子分析を実行するため、かつ粒子の高解像度画像を収集するための、装置、システム、および方法を提供する。【選択図】図２
2020513103.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
入口を有し、かつ流体が通って連通するための流路を画定する、フローチャネルと、
第１の照明源および第１の検出モジュールを備える第１の光学系であって、前記第１の検出モジュールは、前記第１の照明源による前記フローチャネルの第１の領域の照明に関係する信号を受信するように配置され、前記第１の領域は、前記フローチャネルの前記入口から第１の距離に位置する、第１の光学系と、
第２の照明源および第２の検出モジュールを備える第２の光学系であって、前記第２の検出モジュールは、前記第２の照明源による前記フローチャネルの第２の領域の照明に関係する信号を受信するように配置され、前記第２の領域は、前記フローチャネルの前記入口から第２の距離に位置し、前記第２の距離は前記第１の距離よりも大きい、第２の光学系と
を備えるシステムであって、
（ａ）前記フローチャネルの前記第１の領域は第１の断面積を画定し、前記フローチャネルの前記第２の領域は第２の断面積を画定し、前記第１および第２の断面積は、面積、形状、もしくは面積および形状の両方の点で互いに異なるか、または
（ｂ）（ｉ）前記システムは、前記フローチャネルの前記入口と前記フローチャネルの前記第１の領域との間で前記フローチャネルに進入する導管を備えるか、（ｉｉ）前記システムは、前記フローチャネルの前記第１の領域と前記第２の領域との間で前記フローチャネルに進入する導管を備えるか、もしくは（ｉ）および（ｉｉ）の両方であり、
（ｃ）前記システムは、前記流路内の粒子の速度を変調するように構成された流量変調器を備えるか、または
（ｄ）前記システムは、場モジュールをさらに備え、前記場モジュールは、前記フローチャネル内の流れ中にあり前記場に対する感度の高い少なくとも一部の粒子を前記フローチャネル内の前記流れ中の粒子速度の速度流線Ｓ０から前記フローチャネル内の前記流れ中の粒子速度の速度流線Ｓ１まで移動させるように前記フローチャネルのある領域において場を増減するように構成され、前記フローチャネルの前記第１の領域と前記第２の領域との間で、システム動作中の前記Ｓ０における粒子速度は前記Ｓ１における粒子速度と異なるか、あるいは
（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）の任意の組み合わせである、
システム。
【請求項２】
前記第１および第２の断面積は、互いに面積が異なり、前記第１の断面積と前記第２の断面積との比は、１：１を除く、約１００：１〜約１：１００である、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記フローチャネルは主軸を画定する、請求項１〜２のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項４】
前記第１および第２の照明源のうちの少なくとも一方は、前記フローチャネルの前記主軸に対して本質的に平行な照明を提供するように構成されている、請求項３に記載のシステム。
【請求項５】
前記流路は、少なくとも部分的に非線形である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項６】
前記フローチャネルと流体連通する粒子セパレータをさらに備える、請求項１〜５のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項７】
前記セパレータは、粒子サイズ、粒子形状、粒子質量、１つ以上の粒子に関連付けられた信号、またはこれらの任意の組み合わせに基づいて粒子を迂回させるように構成されている、請求項６に記載のシステム。
【請求項８】
前記セパレータは、前記１つ以上の粒子に関連付けられた信号に基づいて前記フローチャネル内の粒子を迂回させるように構成されている、請求項７に記載のシステム。
【請求項９】
分離された粒子の１つ以上の画像を収集するように構成されている、請求項６〜８のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１０】
前記第１または第２の検出モジュールのうちの少なくとも一方は、複数の検出器を備える、請求項１〜９のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１１】
少なくとも１つの検出モジュールと光通信状態である、光反射器、光スプリッタ、または両方をさらに備える、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１２】
前記第１または第２の光学系のうちの一方または両方は、前記フローチャネル内の２つ以上の平面で撮像を行うように構成されている、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１３】
前記第１または第２の光学系のうちの一方または両方は、２つ以上の焦点面で画像を収集するように構成されている、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１４】
前記第１または第２の光学系のうちの少なくとも一方は、２つ以上の平面に照明を合焦させるように構成されている、請求項１２〜１３のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１５】
前記第１の光学系は、前記第１の照明源からの照明軸が前記第１の検出モジュールから、ある角度でオフセットされるように構成されるか、前記第２の光学系は、前記第２の照明源からの照明軸が前記第２の検出モジュールから、ある角度でオフセットされるか、または両方である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１６】
前記第１の照明源、前記第２の照明源、または両方は、レーザー、ランプ、発光ダイオード、またはこれらの任意の組み合わせを備える、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１７】
前記第１の検出モジュール、前記第２の検出モジュール、または両方は、光電子増倍管、アバランシェフォトダイオード、カメラ、シリコン光電子増倍管、またはこれらの任意の組み合わせを備える、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１８】
前記第１の光学系によって収集される信号に、（ａ）前記第２の光学系の動作、（ｂ）存在する場合は前記セパレータの動作、または（ａ）および（ｂ）の両方が関係するように構成されている、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１９】
前記場モジュールは、磁場、電場、音響場、またはこれらの任意の組み合わせの供給源を備える、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項２０】
粒子集団をフローチャネルに流すことと、
第１の光学系を用いて、前記フローチャネルの第１の領域で前記粒子集団の少なくとも一部を照明し、前記照明に関係する第１の信号またはその欠如を収集することと、
第２の光学系を用いて、前記フローチャネルの第２の領域で前記粒子集団の少なくとも一部を照明し、前記照明に関係する第２の信号またはその欠如を収集することと
を含む方法であって、
前記フローチャネルの前記第１の領域における粒子速度は、前記フローチャネルの前記第２の領域における粒子速度とは異なり、
前記第１の信号は、前記第２の信号とは異なる、
方法。
【請求項２１】
前記フローチャネルの前記第１の領域の断面積は、前記フローチャネルの前記第２の領域の断面積とは、面積、形状、または両方の点で異なる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記フローチャネルの前記第１の領域と前記第２の領域との間の位置において、流体を導入することまたは前記フローチャネルから除去することをさらに含む、請求項２０〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記フローチャネルは主軸を画定する、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記フローチャネルの前記第１の領域で前記粒子集団の少なくとも一部を照明すること、前記フローチャネルの前記第２の領域で前記粒子集団の少なくとも一部を照明すること、または両方は、前記主軸に対して本質的に平行な照明によって行われる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記フローチャネルは、少なくとも部分的に非線形の流路を画定する、請求項２０〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記第１の信号、前記第２の信号、または両方に基づいて、前記粒子集団の少なくとも一部を分離することをさらに含む、請求項２０〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
１つ以上の分離された粒子の画像を収集することをさらに含む、請求項２０〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
照明反射器、照明スプリッタ、または両方を用いて、前記第１の光学系からの照明を方向付けることをさらに含む、請求項２０〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
照明反射器、照明スプリッタ、または両方を用いて、前記第２の光学系からの照明を方向付けることをさらに含む、請求項２０〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記フローチャネル内の２つ以上の平面で信号を収集するように前記第１の光学系、前記第２の光学系、または両方を動作させることをさらに含む、請求項２０〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記フローチャネル内の２つ以上の平面に照明を合焦させるように前記第１の光学系、前記第２の光学系、または両方を動作させることをさらに含む、請求項２０〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記第１の光学系の照明源からの照明軸は、前記第１の光学系の検出モジュールから、ある角度でオフセットされるか、前記第２の光学系の照明源からの照明は、前記第２の光学系の検出モジュールから、ある角度でオフセットされるか、あるいは両方である、請求項２０〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記第１の信号、前記第２の信号、または両方は、蛍光信号、明視野画像、暗視野画像、またはこれらの任意の組み合わせである、請求項２０〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記第２の光学系の動作は、前記第１の光学系によって収集された前記第１の信号に関係する、請求項２０〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記第１の信号、前記第２の信号、または両方を、前記粒子集団のうちの少なくとも１つの１つ以上の特性に相関させることをさらに含む、請求項２０〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記粒子集団は、前記第１の領域では第１の流体流量で、かつ前記第２の領域では第２の流体流量で流れ、前記第１の流体流量と前記第２の流体流量との比は、１：１を除く、約４０：１〜約１：４０である、請求項２０〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
フローチャネルを通じて、前記フローチャネルの第１の領域から前記フローチャネルの第２の領域に向かう方向で、粒子集団を連通させることと、
第１の光学系を用いて、前記フローチャネルの前記第１の領域で前記粒子集団の少なくとも一部を照明し、前記照明に関係する第１の信号を収集することと、
第２の光学系を用いて、前記フローチャネルの前記第２の領域で前記粒子集団の少なくとも一部を照明し、前記照明に関係する第２の信号を収集することと、
前記粒子のサブセットにおいて、前記フローチャネルの前記第１の領域と第２の領域との間で場を増減させることと
を含む方法であって、
前記場は、前記フローチャネル内の粒子速度の速度流線Ｓ０から前記フローチャネル内の粒子速度の速度流線Ｓ１へと前記粒子のサブセットを移動させるように増減され、前記Ｓ０における粒子速度は前記Ｓ１における粒子速度とは異なる、
方法。
【請求項３８】
前記場は、磁場、電場、音響場、またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記粒子のサブセットを、前記場に対する感度の高いエンティティに結合することをさらに含む、請求項３７〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記エンティティは、磁性粒子を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記エンティティは、誘電体粒子を含む、請求項３９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、流体流中の細胞および他の粒子のための撮像装置、システム、および方法の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
フローサイトメトリーは、細胞または粒子に、高度に合焦されたレーザービームを通過させ、そこで、統合された蛍光と散乱光とが検出器のバンクによって収集される、高速の粒子分析である。これは、粒子が、システムを通過中、複数のレーザー／検出バンクを通過する、高度に並行した方式で行われるのが一般的である。結果として得られるデータは、表面タンパク質、内部マーカー、粒子形状の大まかな推定などの特性の有無を判定するために使用される。典型的なサイトメーターでは、この分析は毎秒数１００〜数１００，０００個の細胞の割合で行われる。
【０００３】
できるだけ多くの細胞に関連付けられた光を収集することが望まれるが、動作中は、コインシデンスと呼ばれる状態を回避する必要がある。１つを超える細胞／粒子がレーザービーム中に同時に含まれている場合、コインシデンスが発生する。コインシデンスの割合は、粒子がレーザー中で費やす時間（調査時間）に直接比例する。原則として、調査時間が短いほど、コインシデンスの可能性は低くなる。このため、コインシデンス事象を最小限に抑えるために、通常、非常に低いデューティサイクル（＜１０％）と数マイクロ秒ほどの短い調査時間とが採用される。
【０００４】
しかしながら、マイクロ秒ほどの調査時間は、検出に十分な光子を収集することにおいて困難をもたらす。この問題を克服するために、高出力レーザー、光電子増倍検出器（光電子増倍管（ＰＭＴ）やアバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）など）、および高速電子機器の組み合わせが採用される。これは、何十年もの間、フローサイトメトリー設計の標準である。これらの非常に短い調査時間は、伝統的フローサイトメトリーのアプローチで行われているように、信号が細胞全体によって生成された統合応答である場合、一般に許容される。しかしながら、このような短い時間は、細胞膜、核、細胞質、および／または細胞小器官の可視化を可能にする様式で細胞を撮像するなど、より高い空間解像度データが必要な場合、問題となる。
【０００５】
高分析速度に要求される短い調査時間のため、フローサイトメトリーにおける高解像度撮像は制限されている。細胞全体から統合信号を収集するのとは対照的に、カメラなどの撮像検出器は、ピクセルごとに、ピクセル上の細胞上のはるかに小さな位置からの光を検出する必要がある。単一細胞の高解像度画像を高速で収集することは、各ピクセルで生成される光子数が、統合された光子数よりもはるかに少ないため、困難である。このため、フローサイトメーターで行われる撮像は、一般に、光子数を増やすためにはるかに長い調査時間で行われる。しかしながら、調査時間が長くなると事象率が大幅に低下するため、フローサイトメトリーの撮像は、主に特定分野の用途で利用される。したがって、比較的遅い調査時間と比較的速い調査時間との両方で情報を収集するように動作することができる、フローサイトメトリーを撮像するための装置、システム、および方法が、当技術分野で長年切望されている。
【発明の概要】
【０００６】
一態様では、本開示は、
入口を有し、かつ流体が通って連通するための流路を画定する、フローチャネルと、
第１の照明源および第１の検出モジュールを備える第１の光学系であって、第１の検出モジュールは、第１の照明源によるフローチャネルの第１の領域の照明に関係する信号を受信するように配置され、第１の領域は、フローチャネルの入口から第１の距離に位置する、第１の光学系と、
第２の照明源および第２の検出モジュールを備える第２の光学系であって、第２の検出モジュールは、第２の照明源によるフローチャネルの第２の領域の照明に関係する信号を受信するように配置され、第２の領域は、フローチャネルの入口から第２の距離に位置し、第２の距離は第１の距離よりも大きい、第２の光学系と
を備えるシステムであって、
（ａ）フローチャネルの第１の領域は第１の断面積を画定し、フローチャネルの第２の領域は第２の断面積を画定し、第１および第２の断面積は、面積、形状、もしくは面積および形状の両方の点で互いに異なるか、または
（ｂ）（ｉ）システムは、フローチャネルの入口とフローチャネルの第１の領域との間でフローチャネルに進入する導管を備えるか、（ｉｉ）システムは、フローチャネルの第１の領域と第２の領域との間でフローチャネルに進入する導管を備えるか、もしくは（ｉ）および（ｉｉ）の両方であり、
（ｃ）システムは、流路内の粒子の速度を変調するように構成された流量変調器を備えるか、または
（ｄ）システムは、場モジュールをさらに備え、場モジュールは、フローチャネル内の流れ中にあり場に対する感度の高い少なくとも一部の粒子をフローチャネル内の流れ中の粒子速度の速度流線Ｓ０からフローチャネル内の流れ中の粒子速度の速度流線Ｓ１まで移動させるようにフローチャネルのある領域において場を増減するように構成され、フローチャネルの第１の領域と第２の領域との間で、システム動作中のＳ０における粒子速度はＳ１における粒子速度と異なるか、あるいは
（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）の任意の組み合わせである、
システム
を提供する。
【０００７】
別の態様では、本開示は、粒子集団をフローチャネルに流すことと、第１の光学系を用いて、フローチャネルの第１の領域で粒子集団の少なくとも一部を照明し、照明に関係する第１の信号を収集することと、第２の光学系を用いて、フローチャネルの第２の領域で粒子集団の少なくとも一部を照明し、照明に関係する第２の信号を収集することと、を含む方法であって、フローチャネルの第１の領域における粒子速度は、フローチャネルの第２の領域における粒子速度とは異なり、第１の信号は、第２の信号とは異なる、方法を提供する。
【０００８】
さらに、フローチャネルを通じて、フローチャネルの第１の領域からフローチャネルの第２の領域に向かう方向で、粒子集団を連通させることと、第１の光学系を用いて、フローチャネルの第１の領域で粒子集団の少なくとも一部を照明し、照明に関係する第１の信号を収集することと、第２の光学系を用いて、フローチャネルの第２の領域で粒子集団の少なくとも一部を照明し、照明に関係する第２の信号を収集することと、粒子のサブセットにおいて、フローチャネルの第１の領域と第２の領域との間で場を増減させることと、を含む方法であって、場は、フローチャネル内の粒子速度の速度流線Ｓ０からフローチャネル内の粒子速度の速度流線Ｓ１へと粒子のサブセットを移動させるように増減され、Ｓ０における粒子速度はＳ１における粒子速度とは異なる、方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
要約および以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むとさらに理解される。技術を説明する目的で、図面には本発明の例示的実施形態および好ましい実施形態が示されている。しかしながら、本開示は、開示された特定の方法、構成、およびデバイスに限定されない。さらに、図面は必ずしも縮尺通りに描かれているわけではなく、図面の様々な部分の文字ラベルは単なる例示であり、開示された技術を限定するものではない。図面において：
【図１】異なる速度で異なる調査ゾーンを通過する粒子の図を提供する。
【図２】異なる断面を有するフローセルが、異なる調査位置の間で粒子の速度をどのように変化させるかを示す。
【図３Ａ】調査ゾーン間にシース液を注入または除去することで、調査ゾーン間で粒子に速度差を生み出すように動作するフローセルを提供する。
【図３Ｂ】調査ゾーン間に流量変調器を使用することで、調査ゾーン間で粒子に速度差を生み出すように動作するフローセルを提供する。
【図３Ｃ】調査ゾーン間に場モジュールを使用することで、調査ゾーン間で粒子に速度差を生み出すように動作するフローセルを提供する。
【図４】粒子の流れの方向に沿って画像を収集するように構成されたフローセルを提供する。
【図５】粒子の流路に沿って画像を収集するように構成されたフローセルを提供し、ここでは、粒子の速度は、フローチャネルの寸法を大きくすることで低下され、出力ポートを適切にサイジングして粒子の軌跡を調整することによりさらに低下される。
【図６】従来型フローサイトメトリーデータ（高さ、面積、および幅）ならびにまた、いくつかの粒子それぞれの画像データの収集を示す。
【図７】選別前に、粒子の従来型フローサイトメトリーデータを収集し、かつ画像を獲得するフローサイトメーターを示す。
【図８】選別後に、粒子／細胞の画像または他のデータを獲得するフローサイトメーターを示し、ここでは、選別後領域は、選別された粒子／細胞の下流操作のためのトラップおよびまたは他の手段をさらに組み込み得る。
【図９】同じ画像内で明視野および蛍光データの両方を収集するなど、合成画像を獲得するように構成されたシステムを示す。
【図１０】結像光学系によって作り出された収束波形を示し、また、ここでは、ダイクロイックが、複数のカメラを使用しながら収差のない画像を作り出す様式で、光の通過または反射を選択的に可能にする。
【図１１】水晶板を挿入することにより、画像検出器の１つまでの焦点距離を延長する実施形態の図を提供する。
【図１２】撮像システムを通過する軌道がわずかに異なる粒子に対して、複数の対物平面が結像光学系によって使用される実施形態を提供し、被写界深度が浅い撮像システムについては、このような配置により、高度に正確な粒子位置決めの要件を低減することができ、かつ従来型フロー光学系の被写界深度を増大することができ、有用な高開口数（ＮＡ）光学設計の範囲を拡大できる。
【図１３】照明光学系で使用される複数の焦点面がより大きな焦点深度にわたってより均一な照明を産生し、それによって画質を向上させ、レーザー斑点を低減し、対物位置決めに対する感度を低下させる実施形態を提供する。
【図１４】光学系内の照明および撮像の光軸が角度αだけオフセットされ、強化されたコントラストを提供する結果として得られる画像内に、影領域を作り出す実施形態を提供する。
【図１５】４ｍ／ｓで移動する赤血球を撮影した画像を提供する（露光時間は１マイクロ秒である）−示されているように、画像はぼやけており、細胞境界を識別することは困難である。
【図１６】図１５と同じ設定で、４倍遅い速度の１ｍ／ｓで撮影された赤血球の画像を提供する−示されているように、動きのぼやけが減少し、細胞の外側境界が容易に区別可能である。
【図１７】約１ｍ／ｓで移動するビーズの画像を提供する（ビーズは合焦にある）。
【図１８】約８ｍ／ｓで移動するビーズの画像を提供する（ビーズはぼやけている）。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
例示的実施形態の詳細な説明
別途規定されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。矛盾が生じる場合には、定義を含む、本文書が優先されるものとする。好ましい方法および材料は以下に記載されるが、本明細書に記載されるものと類似または同等の方法および材料は、実践または試験で使用することができる。本明細書中で言及されたすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。本明細書で開示される材料、方法、および例は、例示のみであり、限定することを意図していない。
【００１１】
単数形「ある」、「１つの」、および「その」は、文脈上明確に別様に指示されない限り、複数形照応を含む。明細書および特許請求の範囲で使用される場合、用語「含む」は、「からなる」および「本質的にからなる」実施形態を含み得る。本明細書で使用される用語「備える」、「含む」、「有する」、「有する」、「できる」、「包含する」、およびこれらの変形は、指定された成分／ステップの存在を必要とし、他の成分／ステップの存在を許容する、制約のない暫定的な語句、用語、または語を意図する。しかしながら、そのような説明は、列挙された成分／ステップ「からなる」および「本質的にからなる」として、組成物またはプロセスを説明するものと解釈されるべきであり、これは、結果として生じる可能性のある混入物を伴う、指定された成分／ステップのみの存在を可能にし、かつ他の成分／ステップを排除するものである。本明細書で使用される専門用語は、特定の態様のみを説明するためのものであり、限定するようには意図されていないことが理解される。本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、用語「含む」は、「からなる」および「本質的にからなる」実施形態を含むことができる。別途規定されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書および以下の特許請求の範囲では、本明細書で規定される多数の用語を参照する。
【００１２】
本出願の明細書および特許請求の範囲における数値は、平均値を反映している。さらに、反対の指示がない限り、数値は、同じ有効数字桁数に減らしたときに同じである数値と、値を決定するための、本出願に記載されているタイプの従来型測定技術の実験誤差よりも少ない値だけ、記述された値とは異なる数値とを含むと理解されるべきである。
【００１３】
本明細書に開示されるすべての範囲は、列挙された端点を含み、かつ独立して組み合わせることができる（例えば、「２グラム（ｇ）〜１０グラム」の範囲は、端点、２グラムおよび１０グラムとすべての中間値とを含む）。本明細書に開示されている範囲の端点および任意の値は、正確な範囲または値に限定されず、それらの範囲および／または値を近似する値を含めるのに十分に曖昧である。
【００１４】
本明細書で使用される場合、近似用語は、関係する基本機能に変化をもたらすことなく変わり得る任意の定量的表現を修飾するために適用され得る。したがって、「約」や「実質的に」などの用語によって修飾された値は、特定された明確な値に限定されない場合がある。少なくともいくつかの例では、近似用語は、値を測定するための機器の精度に対応し得る。修飾語「約」も、２つの端点の絶対値によって規定される範囲を開示していると見なされるべきである。例えば、表現「約２〜約４」もまた「２〜４」の範囲を開示する。用語「約」は、示された数の＋または−１０％を指し得る。例えば、「約１０％」は９％〜１１％の範囲を示し得、「約１」は０．９〜１．１を意味し得る。「約」の他の意味は、四捨五入など、文脈から明らかであり得、例えば「約１」は０．５〜１．４も意味し得る。
【００１５】
用語
本明細書で使用される場合、「照明」とは、粒子、細胞、または他の対象分析物に適用し得る放射線（可視または非可視）を指す。用語「照明」は、蛍光染料または他の部分の励起を含み、明視野、暗視野、位相コントラスト照明などの文脈における放射線の適用も含むことを理解されたい。同様に、「照明源」は、照明を実行するデバイス、または照明の実行を可能にするデバイスまたはシステムの１つ以上のコンポーネントである。レーザー、ランプ、発光ダイオードなどは、照明源の非限定的な例と見なされる。
【００１６】
本明細書で使用される場合、「検出」は、反射されているかどうか、波長シフトされているかどうか、または反射されていないかどうかに関わらず、発射光（蛍光を含む）またはサンプルと相互作用した光を含む、光の集まりを指す。一例として、可視画像を収集するカメラは「検出」を実行する。同様に、「検出器」は、検出を実行するデバイス、または検出の実行を可能にするデバイスまたはシステムの１つ以上のコンポーネントである。光電子増倍管（ＰＭＴ）、シリコン光電子増倍管（ＳｉＰＭ）、光子カウンタ、アバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）などは、検出器の非限定的な例と見なされる。
【００１７】
本明細書で使用される場合、用語「画像検出器」は、粒子の画像の作成を可能にする任意のタイプの検出器または検出方法を指す。ピクセル構成検出器、スリット走査光学系、周波数多重化撮像、タイムストレッチ法などは、粒子の画像を生成できる「画像検出器」と見なされる。
【００１８】
本明細書で使用される場合、用語「従来型フローサイトメトリーデータ」と交換可能に使用される用語「伝統的フローサイトメトリーデータ」は、光とフローストリーム中の粒子との相互作用から生じる光から収集されたデータ、例えばパルス高、面積、および幅を指す。このような伝統的フローサイトメトリーデータは、伝統的フローサイトメーターが歴史的に撮像機能を有さなかったので、歴史的に撮像データを含まなかった。本明細書で使用される場合、用語「伝統的フローサイトメーター」および「従来型フローサイトメーター」は交換可能に使用される。
【００１９】
本明細書で説明するように、粒子の高解像度画像を作成しながら、高事象率および低コインシデンス率で伝統的フローサイトメトリーデータを収集できる機器を有することが望ましい。フローサイトメトリーを撮像する複数の例がある。これらの過去のアプローチのほとんどは、従来型フローサイトメーター設計において画像検出器を使用していた。しかしながら、従来型フローサイトメーターの設計および利用可能な撮像技術の不足により、フロー中の粒子を撮像する試みは、低い画像獲得率および分析率という結果となった。現在、フローサイトメトリーを撮像するためのより高いデータ率に対処するいくつかの技法がある。１つの技法は、時間遅延統合（ＴＤＩ）アレイを使用する。ＴＤＩアレイは、動いている対象物の複数の露光を蓄積し、それによって調査時間を長くする。この技法では、検出器が粒子の通過を追跡できるように、粒子の速度を正確に把握する必要がある。この技法を使用する現在のシステムは、１秒あたりわずか数千個の粒子という最高事象率を有する。さらに、従来型フローサイトメトリーデータ（統合信号）は、画像内の細胞を見つけて、計算された細胞境界内で統合することにより処理される。この処理は、メモリを集中的に使用し、時間がかかるため、データの表示および分析は、データ収集後に実行されることが強要される。
【００２０】
第２の技法は、周波数多重化を使用する方法である。この方法では、照明光は周波数多重化されて、小さなピクセルの大きなアレイになる。粒子とこのビームアレイとの相互作用によって産生される時間ドメインシグネチャは、ＰＭＴによって収集される。次いで、周波数ドメインで信号を処理し、ピクセル位置を特定のスペクトル値に割り当てることにより、画像が構築される。このシステムは、周波数多重顕微鏡と非常によく似た様式で動作する。
【００２１】
周波数多重化撮像は、従来型フローサイトメトリーデータ（統合信号）が取得するのがより簡単であるため、フローサイトメーターにおけるカメラベースのシステムに比べて利点がある。画像を分析するのとは対照的に、統合データは、時間ドメイン信号を統合することによって取得される。ただし、画像内の動いている細胞からぼやけを低減するには、粒子速度を制限して高解像度の画像を取得する必要がある。この方法を使用した従来型フローサイトメトリーデータの処理は迅速に行うことができるが、速度を下げる必要性は、従来型フローサイトメーターよりもデータ率が下がる結果となる。
【００２２】
周波数多重化撮像と同様に、光のパルスを空間的に引き伸ばすための同様の方法が開発されている。照明は、ビーム全体に広がる周波数スペクトルを有する光パルスを含む。細胞と相互作用した後、収集された光は、周波数の関数として光のパルスを時間的に拡張する分散要素を通過する。一旦時間ドメインシグナチャが獲得されると、特定の時間に収集された光量にピクセルを割り当てることにより、画像が再構築される。
【００２３】
理論的には、これらの撮像技法に伴うより低いデータ率は、サンプルをより高濃度およびより低速度で動かすことにより、高めることができる。これは、高められた空間分解能を使用して画像内の個々の細胞を相互により適切に区別し、それによって、処理負荷およびデータ待ち時間の増大を犠牲にして、画像処理によってコインシデンス事象の数を減らすことができるため、可能である。
【００２４】
しかしながら、実際には、サンプル濃度の増加は常に実用的または望ましいとは限らない。従来型フローサイトメーターのデータ率を達成するためにより高いサンプル濃度を必要とすることは、典型的な作業条件を超えて濃縮されたサンプルを作り出すために、サンプル調製方法を変更することを要求する。また、高濃度は、特に付着性サンプルの場合、より多くの細胞が互いに付着することももたらす。
【００２５】
低速で分析された、より高濃度のサンプルの問題を悪化させているのは、撮像システムに関連する浅い被写界深度である。高倍率の光学系には限られた被写界深度が要求されるため、高品質の高解像度画像を得るには、画像平面内の粒子を厳密に配置する必要がある。通常、この正確な位置決めは、シース液のサンプル液に対する高い比を利用することで達成される。したがって、浅い被写界深度に対応するように粒子を正確に配置するには、事象率をさらに制限する比較的低い体積サンプル入力レートが必要である。
【００２６】
高速で安価な電子機器と組み合わされた、電子増倍型電荷結合素子（ＥＭＣＣＤ）、強化電荷結合素子（ＩＣＣＤ）、相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）デバイスなどの高速で高感度の撮像検出器の出現により、照明された調査ゾーンを通過する細胞の画像は、従来型フローサイトメーターのそれに近い比較的高速で処理することができる。本発明は、また粒子の高解像度画像を取得しながら、従来型フローサイトメーターの高事象率で統合粒子データを収集できるハイブリッドフローサイトメーターを作成および使用するための装置、システム、および方法を説明する。様々な異なる実施形態を以下に説明する。
【００２７】
複数の速度ゾーン
異なる粒子速度を各ゾーンに関連付けることにより、システム内に別個の粒子調査ゾーンを作り出すことにより、ハイブリッド撮像フローサイトメーターのスループットとデータ品質とを向上させることが可能である。図１は、別個の粒子調査ゾーンを作り出す１つの方法を提供する。図１に示すように、システム１００は、第１の照明源１０２（この場合、照明源）を、第１の照明源１０２と検出器１０４との間の位置にある第１の位置１８０ａで粒子を照明するように配置させて含むことができる。第１の位置１８０ａでは、粒子は速度Ｖ１を経験する。
【００２８】
次いで、粒子は第２の位置１８０ｂに移行するが、この第２の位置は、第２の照明源１０６と、ここではカメラとして描かれている画像検出器１１０との間に配置される。第２の位置１８０ｂでは、粒子は速度Ｖ２を経験するが、速度Ｖ２は速度Ｖ１よりも小さい。より高速のゾーン（Ｖ１）により、従来型フローサイトメーターの短い調査時間と低コインシデンス率とが可能になる。より低速のゾーン（Ｖ２）により、統合光子数を増加させ、かつ撮像デバイスのぼやけを減少させる、より長い調査時間が可能になる。撮像方法の利点に加えて、結果として得られる画像を処理して、第１の位置１８０ａに関連付けられるコインシデンス事象を決定することができる。
【００２９】
粒子経路に沿って異なる速度ゾーンを作り出す１つの方法は、フローチャネルの断面を変化させることである。図２は、フローチャネル２２０の断面積が２つの領域間で変化するシステム２００を示す。第１の領域２９０ａは、第１の照明源２０２と検出器２０４との間に位置する。第２の領域２９０ｂは、第２の照明源２０６と画像検出器２１０との間に位置する。粒子が、第１の領域２９０ａ内の第１の位置２８０ａから第２の領域２９０ｂ内の第２の位置２８０ｂに移行すると、粒子は、第１の領域２９０ａと比較して増加された、第２の領域２９０ｂ内のフローチャネル２２０の断面積のために、速度の減少（第１の位置２８０ａにおけるＶ１、およびそれより低速の、第２の位置２８０ｂにおけるＶ２）を経験する。
【００３０】
粒子の速度は流れの断面積に比例してスケーリングできるため、正方形断面の流れの寸法が２倍変化すると（例えば、１００μｍ×１００μｍ断面が２００μｍ×２００μｍ断面に変化する）、粒子速度は４倍変化し得る。この例では、総光子数が４倍に増加し、画像検出器の信号対ノイズレベルを大幅に増大する。さらに、速度の低下により、画像内のぼやけが減り、粒子の動きに対して平行な次元でのより高い解像度が可能になる。
【００３１】
調査時間が長くなる一方で、フローセルの寸法を大きくすると、粒子の位置のばらつきも大きくなる。これにより、焦点深度を拡張する必要性が高まり、画質を低下させる可能性がある。これは、他の方向のフローセルの寸法の拡大と比較して、対物平面に垂直な方向に比較的少ない量でフローセルの寸法を拡大することにより軽減できる。あるいは、粒子を画像平面内により良く集束させるために音響集束などの場集束技術を使用するなど、他の軽減アプローチを採用することができる。
【００３２】
調査ゾーン間で粒子速度を変化させる別の方法では、調査ゾーン間の流れ特性を変更する。２つの調査ゾーン間の体積流量を増減すると、速度差を生じさせることができる。そのようなシステムの例を図３Ａに示す。
【００３３】
図３Ａに示すように、システム３００はフローチャネル３２０を含み、その中で粒子は、（第１の照明源３０２と画像検出器３０６との間に配置された）第１の領域３９０ａ内の第１の位置３８０ａから（第２の照明源３０４と検出器３０８との間に配置された）第２の領域３９０ｂ内の第２の位置３８０ｂに移行する。第１の領域３９０ａと第２の領域３９０ｂとの間に、フローチャネル３２０はサイドチャネル３４０およびサイドチャネル３４２を含み得、これらのサイドチャネルは、第１の位置３８０ａと第２の位置３８０ｂとの間で流速を増減させるように、追加の流体（例えば、シース液）の導入および／または引き出しを可能にする導管として機能する。図３Ａに示すように、サイドチャネル３４０およびサイドチャネル３４２を介した追加流体のシース液の導入は、先の第１の位置３８０ａにおけるより低速度Ｖ１と比較して、第２の位置３８０ｂにおいてより高速度Ｖ２を有する粒子を提供する。
【００３４】
別の実施形態では、サイドチャネル３４０およびサイドチャネル３４２は、流体を導入するのではなく、フローチャネル３２０から流体を引き出す。そのような実施形態では、第１の位置３８０ａと第２の位置３８０ｂとの間のフローチャネル３２０からの流体の除去は、Ｖ１がＶ２よりも大きくなるように粒子の速度を低下させる効果を有する。これらの代替実施形態では、少なくとも画像検出器３０６および検出器３０８の位置を交換する（すなわち、画像検出器３０６が第２の位置３８０ｂで粒子の画像を取得するようにする）ことが望ましい場合がある。これは、そのような実施形態において、所与のより低速度Ｖ２が収集され得る光子の増加した数から、画像検出器３０６に利益を提供するであろう。そのような実施形態では、それぞれの能力および所望の出力に応じて、第１の照明源３０２および第２の照明源３０４の位置を交換することも望ましい場合がある。
【００３５】
さらに、流体をフローチャネル３２０に導入および／またはフローチャネル３２０から引き出すためにサイドチャネルが使用される実施形態のために、特定の実施形態は、１対の調査ゾーン間にただ１つのサイドチャネルまたは導管を利用してもよい（例えば、サイドチャネル３４０のみを有し、サイドチャネル３４２はないシステム３００）。そのような実施形態では、１つのサイドチャネルを採用する効果は、粒子をフローチャネル３２０の１つの側壁のより近くに動かすことである。当技術分野で知られているように、フローチャネル内の流体および粒子の速度は、チャネルの中心で最高であり、流体および粒子がチャネルの壁に近づくにつれて減少する。そのような単一のサイドチャネルの実施形態の使用は、例えば、画像検出器の対象となるフローチャネルの領域に近づくにつれて粒子の速度を遅くするのを支援することができ、したがって、チャネルの壁の近くで粒子速度が低下する結果としてより多くの光子を収集することが可能となる。
【００３６】
調査ゾーン間で粒子の速度を変化させる別の方法では、調査ゾーン間に流量変調器を使用する。そのようなシステムの例を図３Ｂに示す。
【００３７】
図３Ｂに示すように、システム３００はフローチャネル３２０を含み、その中で粒子は、（第１の照明源３０２と画像検出器３０６との間に配置された）第１の領域３９０ａ内の第１の位置３８０ａから（第２の照明源３０４と検出器３０８との間に配置された）第２の領域３９０ｂ内の第２の位置３８０ｂへ移行する。第１の領域３９０ａと第２の領域３９０ｂとの間に、システム３００は、流量変調器３５０および流量変調器３５２を含むことができ、これらの流量変調器は、第１の位置３８０ａと第２の位置３８０ｂとの間の流速の増減を可能にする。流量変調器は、例えば、ポンプ、バルブなどを備えてもよい。図３Ｂに示すように、フローチャネル３２０内に追加の流体を送り込むための流量変調器３５０および流量変調器３５２の使用は、先の第１の位置３８０ａにおけるより低速度Ｖ１と比較して、第２の位置３８０ｂにおいてより高速度Ｖ２を有する粒子を提供する。
【００３８】
図３Ｂの代替実施形態では、流量変調器３５０および／または流量変調器３５２は、開いたときにフローチャネル３２０から流体を除去する働きをするバルブを備えてもよい。そのような実施形態は、先の第１の位置３８０ａにおけるより高速度Ｖ１よりも第２の位置３８０ｂにおいて粒子により低速度Ｖ２を提供する。そのような実施形態は、粒子がより低速度を有するフローチャネル３２０の領域に画像検出器３０６を配置することが望まれる場合、画像検出器３０６および検出器３０８の位置を交換してもよい。図３Ａの特定の代替実施形態と同様に、単一の流量変調器のみが使用される図３Ｂの代替実施形態がある。例えば、流量変調器３５０は、開かれたときにフローチャネル３２０から流体を除去するためのバルブとして使用することができ、対応する流量変調器３５２はない。この例では、粒子はやはりフローチャネル３２０の側壁に近づき、その速度をさらに低下させる。
【００３９】
調査ゾーン間で粒子の速度を変化させる別の方法では、調査ゾーン間で場モジュールを使用する。そのようなシステムの例を図３Ｃに示す。
【００４０】
図３Ｃに示すように、システム３００はフローチャネル３２０を含み、その中で粒子は、（第１の照明源３０２と画像検出器３０６との間に配置された）第１の領域３９０ａ内の第１の位置３８０ａから（第２の照明源３０４と検出器３０８との間に配置された）第２の領域３９０ｂ内の第２の位置３８０ｂへ移行する。第１の領域３９０ａと第２の領域３９０ｂとの間に、システム３００は場モジュール３６０を含み得、この場モジュールは、場によって影響を受ける粒子をフローチャネル３２０内の流れの異なる速度流線中に再配置するために、フローチャネル３２０のある領域における場を増減するように構成されている。（図３Ｃにはただ１つの場モジュールが示されているが、開示された技術は、両方の単一場モジュールの使用と複数の場モジュールの使用とを想定していることを理解されたい。一例として、本開示に従うシステムは、磁場モジュールおよびさらに音響場モジュールを含むことができる。）図３Ｃに示すように、粒子は、第１の位置３８０ａにおいては速度流線３７０内にあり、場モジュール３６０によって速度流線３７５内に移動された後、第２の位置３８０ｂにあるときには、速度流線３７５内に移動する。この粒子の再配置は、第２の位置３８０ｂにおける粒子の速度Ｖ２が第１の位置３８０ａにおける粒子の速度Ｖ１よりも小さいという効果を有する。場モジュール３６０は、磁場、電場、音響場、またはこれらの任意の組み合わせを生成し得る。異なる場の組み合わせが採用される場合、システム３００は、場モジュール３６０に加えて１つ以上のさらなる場モジュールを採用してもよい。したがって、１つ以上の場モジュールを使用して、所与の粒子がフローチャンバ内の異なる領域で異なる速度を経験するようにすることができる。
【００４１】
様々な実施形態の上記説明から分かるように、寸法変化から生じるより遅い流れと同様に、より遅い体積速度からのより遅い流れは、サンプル粒子のより広い位置分布をもたらす。このより遅い流れは、１次元において別の次元よりも多くの流れを加減することにより、２次元で同様に制御でき、また、場ベースの集束から同様に恩恵を受けることができる。加減された流れを別様に制御する手段が提供されている場合、より良い画像の焦点を達成するために、この方法を使用して粒子の位置を調整することもできる。体積速度を変化させる方法の利点は、特定の用途に望ましいように、各速度ゾーンを個々に調整または目盛り合わせできることである。例えば、単一のオリフィスから流体を注入または除去し、それによって粒子をより低速のフローストリームに再配置すると、粒子の速度を低下させる結果となり得る。流体の注入／除去は、手動または自動で行うことができる。流体の注入／除去は、一定でもよいし、または時間とともに変化させてもよい。
【００４２】
本開示に従うシステムは、フローセルの寸法変化を体積流量の増減と組み合わせることを含み得ることを理解されたい。両方法を組み合わせることにより、フロー領域を、所望の粒子速度、粒子分布、フローチャネルの物理的寸法、および（照明源および検出器を含む）システム全体の構成に対して、最大限の柔軟性で設計できる。
【００４３】
粒子が速度ゾーンを経験する順序を選択することにより、特定の利点を達成できる。例えば、より高速をより低速に先行させることの利点は、より高速のゾーンで生成されたメモリ集約度の低いデータ（例えば、細胞全体からの統合信号）をより容易に使用して、統合された信号データに基づく画像獲得を選択的にトリガできることである。画像獲得デバイスを選択的にトリガするだけで、特にまれな事象の場合、収集および取り扱われるデータの量が削減される。この特性を活用して、例えば、より少ない細胞数でより高解像度の、より満足した画像が可能となる。この特性は、非常に高い反復率で使用すると電子が枯渇する可能性のあるマルチチャネルプレートまたはストリークチューブを使用する画像強調装置や、データをダウンロードまたは処理するための待ち時間を必要とする画像検出器など、低デューティサイクルから恩恵を受ける画像技術とともに使用できる。開示された技術は、まれな事象、例えば０．０１％以下の頻度で発生する事象を含む用途に適していることを理解されたい。開示された技術は、０．０１％以下、例えば０．０１％〜０．００１％、またはさらに０．０１％〜０．００００１％の頻度の事象の検出に使用され得る。
【００４４】
いくつかの実施形態では、本開示に従うシステムは、粒子をより低速のセクションに、続いて高速のセクションにさらし得る。そのような実施形態は、（例えば、画像解像度を向上させるように）より低速のセクションで粒子を撮像し、次いで、それに続く選別および／または従来型フロー分析のために粒子速度を上げることが所望される状況で有用であり得る。図１を参照すると、そのような実施形態は、Ｖ２がＶ１より大きく、画像検出器（例えば、カメラまたは他の撮像装置）がＶ１上流位置に存在し、検出器が下流のＶ２位置に存在するものである。
【００４５】
開示された技術の実施形態は、２つを超える速度ゾーンを含み得ることを理解されたい。例えば、多くの様々な検出器システムによって細胞を調査する場合、いくつかの連続的な速度変化が有利となり得る。一例として、システムは、従来型フローデータ、低解像度画像データ、および高解像度画像データの順次生成を含み得る。別の例として、システムは、撮像用の低速ゾーン、従来型フロー用の比較的高速のゾーン、および選別時のより良い分離のためになおも比較的高速のゾーンを含み得る。本開示に従うシステムは、例えば、３つ、４つ、またはさらにそれ以上の速度ゾーンを有し得る。
【００４６】
他の様々な実施形態は、検出器およびもしくは照明源の向きの変化、ならびにまたは流れ方向の変化を含み得る。例えば、図４は、チャネル４２０内の流れの軸に沿って画像を獲得するように構成された対物レンズを備えた画像検出器４０８を含むシステム４００を示す。
【００４７】
示されるように、粒子は、（照明源４０２と検出器４０４との間に配置された）第１の領域４９０ａ内の第１の位置４８０ａから第２の領域４９０ｂ内の第２の位置４８０ｂに移行し、そこで、粒子は、照明源４０６からおよび／または照明源４６０からの照明にさらされ得る。図４に示すように、照明源４６０は、落射照明を提供するように構成されている。図に示すように、粒子は、第１の領域４９０ａにおいて速度Ｖ１を経験し、速度Ｖ１は、粒子が第２の領域４９０ｂにおいて経験する速度Ｖ２よりも大きくてもよい。第２の領域４９０内の粒子の照明は、任意選択で、画像検出器４０８の対物レンズから分離することができ、かつ／または画像検出器４０８の対物レンズ自体を使用することができる。
【００４８】
図５は、システム５００を提供し、システムは、第２の領域５９０ｂ内の流れが第１の領域５９０ａ内よりも遅い、図４の代替構成を有する。図５に示すように、粒子は、フローチャネル５２０内を第１の位置５８０ａから第２の位置５８０ｂへ移行し得、ここで、粒子は、第２の位置５８０ｂにおいて、第１の位置５８０ａにおける速度Ｖ１よりも小さい速度Ｖ２を有する。示されるように、第１の位置５８０ａにおいて、粒子は照明源５０２と検出器５０４との間に配置される。第２の位置５８０ｂにおいて、粒子は、照明源５５０および／または照明源５５５から照明を受けることができ、対応する画像データが画像検出器５６０によって収集される。図５に示すように、照明源５５５はエピ構成にある。照明は、任意選択で、画像検出器５６０の対物レンズから分離することができ、かつ／または画像検出器５６０の対物レンズ自体を使用することができる。前述のような形状の変更は、検出器または照明要素の物理的収容、および照明構成によって産生される迷光を制御するために望ましい場合がある。
【００４９】
さらに、照明軸が粒子の動きに垂直またはほぼ垂直であり、かつ画像収集軸が粒子の動きに対してほぼ平行である構成では、粒子が被写界深度によって画定される領域全体を流れるため、被写界深度は、流れの方向に垂直な平面内の粒子位置にもはや関連付けられなくなるので、厳しい被写界深度要件を大幅に削減できる。そのような実施形態では、（横方向位置の制御とは対照的に）適切な時間の選択が、所望の平面内で画像を獲得するために必要なすべてである。
【００５０】
上記実施形態は、フロー撮像への適用を有するが、この技術は、標準の高速フローデータを従来の方法では検出することが困難な低光レベル現象と組み合わせる有用性を有することを理解されたい。例えば、単一細胞の化学発光および生物発光は、従来の流速では検出が困難である。そのような代替実施形態では、図４の画像検出器４０８または図５の画像検出器５６０などの撮像要素は存在しなくてもよく、それは、撮像機能のない検出器はまた、より遅い流速における低パワー信号から収集される光子数の増加の恩恵を受けるので、代替実施形態はまた撮像機能のない検出器を採用してもよいからである。
【００５１】
コインシデンスゲーティング
伝統的フローサイトメーターでは、データは、検出領域内の細胞全体からの散乱光／蛍光を統合することにより形成される。事象がコインシデンスかどうかを判定するために、通常、パルス高、パルス幅、またはパルス面積を含み得るいくつかの異なるパラメータに対してデータがプロットされる。次いで、このデータを使用して、起こり得るコインシデンスを判定する。この方法は、コインシデンス事象を判定するための近似として機能し得る。
【００５２】
しかしながら、コインシデンスが重要な実験では、コインシデンスを判定するための改善された方法が必要である。従来型フローサイトメーターに画像生成デバイスまたはシステムを追加すると、コインシデンス検出を大幅に改善することが可能である。画像は、検出領域内の１つを超える細胞の存在を判定するための空間情報を含む。
【００５３】
図６は、従来型フローデータおよび画像データが粒子から収集される例示的な構成を有するシステム６００を提供する。示されるように、粒子は、第１の位置６２０ａから第２の位置６２０ｂに、そして第３の位置６２０ｃへ移行することができ、第１の位置は第１の照明源６３０および第１の検出器６６０の対象であり、第２の位置は第２の照明源６３２および第２の検出器６６２の対象であり、そして第３の位置は照明源６２０および画像検出器６５０の対象である。説明したように、従来型フローデータは、検出器によって収集される光のパルスから収集されるいくつかのパラメータからなる。これらのパラメータには、パルス高（Ｈ）、パルス面積（Ａ）、およびパルス幅（Ｗ）が含まれ得る。この構成は、調査ゾーン間で速度の変化があるかどうかに関係なく、有益である。
【００５４】
粒子の画像を追加すると、ユーザはこれらのデータをいくつかの異なる方法で利用して、特定の細胞または粒子からのデータが、別の細胞が存在したときに収集されたかどうかを判定できる。例えば、画像を見ることにより、データ品質のゼロ次判定を提供する所与の事象のコインシデンスを評価することが可能である。より複雑な様式では、画像を処理して、データセット全体における任意のデータポイントについて、コインシデンス事象が存在するかどうかを判定することができる。この場合、ユーザは特定のルールセットに従って画像データを処理し、データセット内でどの事象がコインシデンス条件で収集されたかを判定することができる。次いで、ユーザは、コインシデンス事象に関連付けられたデータを破棄して、データ記憶スペースを節約し、または追加の分析を行うことができる。
【００５５】
コインシデンスは常に不利なわけではないことに留意されたい。接触している２つの細胞が、対象の細胞間相互作用を呈し得る場合がある。従来型フローサイトメーターでは空間データが限られているため、このような相互作用の検出は困難である。従来型フローサイトメーターに撮像機能を追加すると、ユーザは、画像を見、または処理することでこの状態を判定することができる。この情報は、次いで、収集された従来型フローサイトメトリーデータ内の特定の事象に関連付けることができる。
【００５６】
画像に基づく選別
フローサイトメトリーの選別では、伝統的フローサイトメトリーデータ（統合信号）を個々の細胞から収集して、細胞選別の意思決定を行う。ユーザが、選別されたものの対応画像を有することは有利である。図７に示すように、従来型フローサイトメトリー検出器を踏まえて撮像機能を追加することにより、画像を、選別された粒子に関連付けることができる。画像には、細胞の形態、核のサイズ／形状、コインシデンス相互作用など、従来型フローサイトメトリーデータには存在しない情報が含まれる。
【００５７】
例示的な図７のシステム７００によって示されるように、粒子は、第１の位置７２０ａから第２の位置７２０ｂへ、そして第３の位置７２０ｃへ移行することができ、第１の位置は第１の照明源７１４および第１の検出器７７０の対象であり、第２の位置は第２の照明源７１２および第２の検出器モジュール７７２の対象であり、第３の位置は第３の照明源７１０および画像検出器７７４の対象である。説明したように、フローデータには、検出器によって収集される光パルスから収集されるいくつかのパラメータが含まれ得る。これらのパラメータには、パルス高（Ｈ）、パルス面積（Ａ）、およびパルス幅（Ｗ）が含まれ得る。この構成は、調査ゾーン間で速度変化があるかどうかに関係なく、有益である。
【００５８】
図７のシステムは、選別モジュール７９０をさらに含むことができ、この選別モジュールは、１つ以上の特定のマーカー、細胞機能、物理的特徴などの存在、不在、またはレベルを表すデータの存在、不在、またはレベルに基づいて、粒子を選別するように作用し得る。いくつかの例示的な選別モジュールには、機械的選別器、例えばキャッチチューブ選別器、バルブ選別器などが含まれる。液滴選別器およびバブル選別器も適しており、電気、音響、および磁気に基づく場選別器などの場に基づく選別器も同様である。場の強さは一定でよいが、ユーザのニーズに従って時間とともに調整または変更されてもよい。
【００５９】
従来型フローサイトメトリーデータを使用して選別意思決定を実行し、画像を獲得するシステムは、フローサイトメトリーのユーザにとって有利である。いくつかの実施形態では、そのようなシステム内で、選別された粒子の画像のみが保存されるようにカメラをトリガするための選別トリガを使用し得る。このような方法では、ユーザは、ゲートを描いて、それらのゲートの範囲内に入る特性を有する任意の粒子を選択することができる。選択したゲートの範囲外のデータをユーザが希望する場合、ネガティブも可能である。データをリアルタイムで分析して、選別および撮像の意思決定を判定する。選別および撮像用に選択的にゲーティングすることにより、データ記憶スペースの要件を大幅に削減できる。さらに、データを分析するための処理負荷も大幅に削減される。
【００６０】
画像または他の分析があとに続く選別
選別処理自体は、選別動作により粒子または細胞が、例えば（ｉ）異なるフローチャネル、（ｉｉ）異なるチャンバ、または（ｉｉｉ）異なる速度を有する流れの異なる部分に移動するならば、分析領域を切り替えるためのツールとして使用できる。この技法は、その細胞のために速度が大幅に低下するか、またはさらに停止し得る希少な細胞に特に有利である。物理的なまたは場に基づく細胞トラップを利用して、撮像／分析領域内でまたはそのような領域の後のいずれかで、細胞を収集することもできる。
【００６１】
図８のシステム８００によって示されるように、粒子は、第１の位置８２０ａ（そこでは、粒子は第１の照明源８３４からの照明および第１の検出器８４０の対象である）から第２の位置８２０ｂに移行し、そこで、粒子は第２の照明源８３２および第２の検出器８４２の対象となる。次いで、選別モジュール８３０が、特定の原則に基づいて粒子を選別するように作用し得、選別された粒子（例えば、位置８２０ｅに示される粒子）は（例えば、同じフローチャネルに継続する）１つの方向にルーティングされ、選別されなかった粒子または適用可能な選別基準を満たさなかった粒子（例えば、位置８２０ｄの粒子）は、別の方向にルーティングされる（例えば、別のフローチャネルにルーティングされる）。画像検出器８５０（例えば、カメラ）は、選別された粒子の画像を収集し得る。
【００６２】
もちろん、システムは複数の選別器を含むように構成され得、複数の選別器は、異なる粒子特性に基づいて粒子を選別するように作用し得る。例えば、システムは、サイズに基づいて粒子を選別するように作用する第１の選別器と、粒子の電荷に基づいて粒子を選別する第２の選別器を含み得る。システムはまた、ある選別段階の前または後に粒子画像の収集を可能にするために、１つ以上の撮像装置を含んでもよい。
【００６３】
いくつかの実施形態では、チャネルは、「胴」領域から複数の「分岐」領域に分割され得る。流速は、分岐領域よりも胴領域で遅くなり得るが、これは必須ではない。そのような実施形態は、粒子選別がある（例えば、細胞がフローデータによって選別され、次いで、潜在的な対象の細胞が撮像され、対象でない細胞が別の分岐に向けられる）用途に適し得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の分岐領域は、サンプルの多重分析を可能にするために、それ自体の照明源および／または検出器を含み得る。
【００６４】
別様に制限される可能性のある撮像技術を使用して、より満足な情報を収集できる。本明細書に開示される実施形態を使用することから非常に利益を得ることができるそのような撮像技術の例には、時間分解イメージング、３Ｄ共焦点イメージング、および３Ｄホログラフィックイメージングが含まれる。そのようなデバイスでは、緩衝液を交換すること／他の試薬を加えることにより、収集された細胞を下流でさらに操作して、他の分析のためにそれらを準備することができる。
【００６５】
オーバーラップ、合成画像、およびカラー画像
従来型フローサイトメーターを動作させるフローサイトメトリー技師は、細胞に対していくつかの異なるアッセイを同時に実行することがある。例えば、研究者は、細胞におけるＣＤ４、ＣＤ８、およびＣＤ４５の発現に興味があるかもしれない。これには、関連付けられた各ラベルからの寄与を識別するために、いくつかの検出チャネルが必要とされる。同様に、細胞を撮像する場合、細胞上のどこで相互作用が発生するかを示すいくつかの異なるラベルを実行する機能を有することは興味深い。
【００６６】
伝統的に、空間識別は、異なる波長でいくつかの画像を作成することで達成されてきた。例えば、撮像アレイ上に、またはさらに単一のピクセル構成検出器上に、複数の別個の画像を作成する方法がある。同様に、波長多重化法を利用したフローサイトメトリー撮像法が提案されており、フィルタをかけた光は別々のＰＭＴに収集され、後で画像を作成するために処理される。
【００６７】
同じ画像からいくつかの情報（例えば、散乱や蛍光）を収集し、それによって、システムの複雑さ、コスト、および必要な記憶スペースを低減することは有利となり得る。１つの方法では、異なる情報を含むいくつかの信号を同じ画像内で同時に収集して、合成画像を作成することができる。例えば、画像コントラストを作り出すために使用できる、細胞の空間的に特定の領域を染色する多くの染料（例えば、核染色）がある。適切なフィルタを使用することにより、異なる細胞構造間でコントラストを作り出すことができる。
【００６８】
図９は、例示的なシステム９００を提供する。示されるように、粒子は、（第１の照明源９４０および第１の検出器９７０の対象である）第１の位置９２０ａから（第２の照明源９４２および第２の検出器９７２の対象である）第２の位置９２０ｂへ、第３の位置９２０ｃ（ここで、粒子は、第３の照明源９４４および画像検出器９６０（例えば、図９に示されたようなカメラ）の対象となり得る）へ移行し得る。１つ以上のフィルタ９５０（例えば、レーザ減衰、バンドパス）が、画像検出器９６０によって受け取られる光を調整するように配置され得る。
【００６９】
一例として、ユーザは、核を適切な染料で染色し、明視野または暗視野の画像を収集し得る。適切なフィルタを用いて、核に追加のコントラストを与えることができる。この状況におけるフィルタには、散乱信号を減らすレーザー減衰フィルタと、核染色を他の蛍光信号から単離するバンドパスフィルタとが含まれる。コントラストをさらに高めるために、結像軸に対して平行ではない照明ビームで目標物を照明し、それによってまた、画像センサに到達する照明源からの光量を減少させてもよい。
【００７０】
細胞のサイズ、形態、および粒度などの測定値も、細胞内の核のサイズおよび位置と同様に、合成画像から決定することができる。非常に明るい染料、例えば特定の抗体に結合できるポリマー染料の出現により、抗体ベースの染料結合体を使用して画像内にコントラストを作り出し得る。
【００７１】
上記の例および開示された技術の様々な実施形態では、合成画像内に特定のコントラストを作り出すことができる様々な染料および染色剤がある。染色剤は、区画、構造、および細胞境界を明るくするために含むことができる。これらの場合、適切なフィルタを使用して、単一の画像内にいくつかの染色剤を含めてもよい。さらに、吸収性染料を使用して特定の空間的エンティティを単離しかつそのコントラストを高めることにより、より高いコントラストを作り出すことができる。
【００７２】
同様の方法で、カラー染料を使用して複合情報を収集できる。例えば、トリパンブルーは生体／死滅体用染料として使用できる。上記のようにカラーカメラまたは適切なフィルタセットを使用すると、明領域または暗領域の画像上に青色染色を重ねることができる。
【００７３】
レーザーなどの単色光源を使用すると、励起に使用される波長における特定の染料の吸収に基づいて、染料の吸収コントラストが作り出される。１つを超える励起源の吸光度情報は、フィルタを用いるか、または励起源を空間的または時間的に分離して交互に、決定できる。また、多くの蛍光染料は、吸光を通して空間コントラストを追加できる強い吸光係数を有することに留意されたい。さらに、標的化学的部分、例えばクリック化学を使用する技術が開発され、これらの化学反応部位を組み込むようにされた所望の構造の、特別に設計されたカラー染色を可能としている。
【００７４】
細胞内の構造および体積を標識するための無数の染料および染色剤は大きく、合成画像またはカラー画像から有用な情報を取得するために使用できる多くの組み合わせがある。画像には、明視野、暗視野、蛍光、もしくはカラー画像、またはこれらの任意の組み合わせを含めることができる。
【００７５】
非点収差矯正
フローサイトメトリーにおける一般的な撮像方法では、レンズを使用して対象物から受け取った光をコリメートする。次いで、このコリメートされた光は、一連のダイクロイックフィルタおよびバンドパスフィルタを通過してから検出器上に結像される。光分散／調整フィルタ要素を通過するために光をコリメートする必要なしに、対象物を直接撮像することは有利である。傾斜したダイクロイックミラーに集束光または収束光を通過させると、傾斜した配置の結果として伝播経路に非対称性が生じるため、これは問題である。これにより、非点収差などの収差が生じる。
【００７６】
図１０は、傾斜したダイクロイックミラーを使用するのとは対照的に、ダイクロイックコーティングを有する固体素子を使用して光を２方向に分割するように構成されたシステム１０００を提供する。システム１０００について図に示すように、位置１０２０の粒子は照明源１０３０の対象である。結像光学系１０７０と、伝播経路に非対称性を導入しないダイクロイックミラー１０４０（例えば、図１０に示された立方体などの固体素子内のダイクロイックコーティング）とは、次いで画像検出器１０５０および画像検出器１０６０によって収集された光を処理するように構成される。収差をほとんどまたはまったく導入しない直方体構成など、ダイクロイックミラー１０４０について他の固体要素構成も可能である。さらに、図１０に示すように、結像光学系１０７０は、収束素子（例えば、収束レンズ）を含む。このような構成では、収束する波形は、伝播経路おいて空間的な非対称性を被らない。このようにして、ほぼ収差のない画像が、両方の伝播方向において産生される。さらに、このような配置を用いると、２つを超える画像検出器を別々の位置で使用できる配列を作り出すことができ、異なる波長で収差のない高品質の画像を作成することがさらに容易になる。
【００７７】
同様の様式では、固体ダイクロイック素子および／または透明素子を使用して、収束ビームの焦点距離を変更できる。異なる光伝播速度の材料を光路に挿入することにより、焦点距離をその経路に沿って変更できる。
【００７８】
図１１は、単一の集束レンズを採用して収束波形を作り出しながら、システム内の１つの画像検出器に関連付けられた焦点距離を変更するように構成されたシステム１１００を提供する。図１１に示すように、システム１１００は、結像光学系１１２０および画像検出器１１５０に光学的に接続されたダイクロイックミラー１１４０（例えば、図示のようなダイクロイックキューブ）を含み得る。図１０に関して前述したように、ダイクロイックミラー１１４０は立方体として描かれているが、直方体構成などの他の構成を有することができる。さらなる画像検出器１１７０は、ダイクロイックミラー１１４０に光学的に接続され、焦点距離を増大させるために、挿入物１１６０（例えば、水晶板挿入物）がダイクロイックミラー１１４０と画像検出器１１７０との間に存在する。特定の理論に縛られるものではないが、水晶などの固体材料挿入物を伝播経路に挿入することにより、ビームの焦点距離が柔軟性を向上させ、画像検出器までの光路長を等しくできない構成を可能にする。
【００７９】
被写界深度の拡大
被写界深度は、フローサイトメトリーの撮像において対処するのが最も難しい効果の１つである。大きな倍率が必要なため、被写界深度は通常非常に小さい。被写界深度の値が小さいため、粒子を対物平面内に高度に正確に配置する必要がある。流動システムでは、粒子は次いでミクロン範囲の許容誤差で調整され、センサによって、流れるすべての粒子の画像が合焦にあることを保証する必要があるため、これは課題である。
【００８０】
この問題に対処する１つの方法は、複数の対物平面を有するシステムを作り出すことである。これは、画像獲得中に対物平面を移動させることによりなされ得る。対物平面を移動させることにより、掃引中のある時点で画像が合焦となる。対物平面の移動は、撮像システムの特性を迅速に変更することによって達成できる。これは、光学系内のある要素を移動させるか、または光学素子の１つを迅速に操作して、対物平面の位置を効果的に変更することによってなされ得る。図１２は、複数の画像平面を用いた撮像の例を示す。
【００８１】
図１２に示すように、動作中、システム１２００は、フローチャネル１２１０に進入する粒子１２０２、１２０４、および１２０６を含み得る。異なる対物平面（例えば、第１の対物平面１２１２および第２の対物平面１２１４）も示されている。結像光学系１２２０は、複数の対物平面で掃引して画像を収集するように動作し得、その画像は、次いで、画像検出器１２４０によって収集される。画像平面は、結像光学系を迅速に動かすことなどの機械的手段によって、またはシステムの焦点距離を迅速に変更できる光学コンポーネント（例えば、可変焦点レンズ）を使用することにより動かすことができる。あるいは、レンズアレイを使用して、複数の平面を同時に収集できる。さらに、図１２は第１の対物平面１２１２および第２の対物平面１２１４を示しているが、代替実施形態は、特定のシステムの構成、所望の性能能力、およびシステム１２００の他の態様との互換性（例えば、結像光学系１２２０の能力）に基づいて、２つを超える対物平面（例えば、３つ、４つ、５つなど）を有してもよい。システム１２００は、本明細書に開示された他の実施形態に従う、１つ以上の照明源など、明示的に示されていない他の態様をさらに含み得る。
【００８２】
この同じ方法を、従来型フローサイトメトリー光学系においても使用して被写界深度を拡大し、それによって、粒子配置許容範囲を広げ、かつ通常は浅い被写界深度を有する高倍率、高開口数（ＮＡ）の対物レンズの使用を可能にすることができる。
【００８３】
照明のための拡大被写界深度
同様に、光源の合焦胴線を迅速に掃引することにより、照明光の焦点を拡大することができる。この技法は、より均一な照明を作り出し、ビームのコヒーレンスを変更する可能性があり、斑点などの望ましくない効果を低減する。この技法は撮像に有用であり、かつ、定量的な蛍光および散乱データの精度を高めるために均一な照明が望ましい場合、従来型フローサイトメトリーにも適用できる。そのような技法の例を図１３に示す。
【００８４】
図１３に示すように、動作中、システム１３００は、異なる対物平面（例えば、第１の焦点面１３１２および第２の焦点面１３１４）でフローチャネル１３１０に進入する粒子１３０２、１３０４、および１３０６を含み得る。照明光学系１３２０は、照明源１３４０によって供給される照明で、複数の焦点面で掃引しデータを収集するように動作し得る。焦点面は、結像光学系を迅速に動かすことなどの機械的手段によって、またはシステムの焦点距離を迅速に変更できる光学コンポーネント（例えば、可変焦点レンズ）を使用することにより、動かし得る。さらに、図１３は第１の焦点面１３１２および第２の焦点面１３１４を示しているが、代替実施形態は、特定のシステムの構成、所望の性能能力、およびシステム１３００の他の態様との互換性（例えば、照明光学系１３２０の能力）に基づいて、２つを超える焦点面（例えば、３つ、４つ、５つなど）を有してもよい。システム１３００は、本明細書に開示される他の実施形態に従って、１つ以上の検出器（１つ以上の画像検出器を含む）など、明示的に示されていない他の態様をさらに含み得る。
【００８５】
この同じ方法を、従来型フローサイトメトリー光学系において使用して被写界深度を拡大し、それによって、粒子配置許容範囲を広げ、かつ通常は浅い被写界深度を有する高倍率で高ＮＡの対物レンズの使用を可能にすることができる。
【００８６】
非通常の照明
ほとんどの画像システムでは、照明光はシステムの光軸に対して平行である。特に、画像が周囲の媒体に対して多分のコントラストを提供しない場合、より高いコントラストが必要な用途がある。そのような場合、顕微鏡は、結像軸に対して平行な光を排除するために、サンプルを円錐形の光で照明するなどの構造化照明を使用し得る。これは、照明に軸対称の円錐光を使用することでなされ得る。
【００８７】
図１４に示すように、動作中、システム１４００は粒子１４３０を含み得る。システム１４００は、粒子１４３０を照明するように構成された照明源１４１０と、粒子１４３０の照明から生じる信号を収集するように構成された画像検出器１４２０とを備える。粒子１４３０を、撮像システムの光軸と平行ではなく（斜め入射）かつその軸の周りで軸対称ではない光で照明することにより、画像内に影領域を作り出し、それに応じて、画像において細胞／粒子の特徴部に対してコントラストを高めることが可能である。
【００８８】
影領域は、細胞構造などの画像内の特徴部に隣接する領域における照明の量を制限することにより、より高いコントラストを生み出すことができる。さらに、軸外照明は、画像検出器に到達する照明光の量も減らし、画像コントラストをさらに高める。影の深さは、２つの軸間のオフセット角度によって制御できる。
【００８９】
図１４は、照明軸１４４０が結像軸１４５０から角度αだけオフセットされている構成を示す。さらに、フローセル中に存在する反響照明が、従来型フローサイトメトリーデータを収集するように設計された調査ゾーンなど、存在する可能性のある他の調査ゾーンから離れるよう案内されるように、照明を誘導することができる。
【００９０】
上述のように、図１０〜１４は、本開示に従う様々な光学コンポーネント構成を示す。図１０〜１４に示されているコンポーネント構成のいずれも、図１〜９に示されたフローシステム構成のいずれかと共に使用され得ることを理解されたい。
【００９１】
例示的な画像
以下の結果は単なる例示であり、本明細書の範囲を限定するものとして理解されるべきではない。
【００９２】
本明細書の他所で説明されているように、通常、従来型流量データを収集するためには、比較的高い粒子速度が使用される。そのようなアプローチの１つの特徴は、粒子が調査ゾーンで費やす時間が短いほど、２つの粒子が同時に調査される可能性が低くなり、したがって、誤った結果をもたらすことである。しかしながら、粒子を撮像するためには、粒子の動きを最小限に抑えるために、より低速が有利である。これを、図１５および図１６によって示す。
【００９３】
図１５は、１マイクロ秒の露出時間で、４ｍ／ｓで移動する赤血球の撮影された画像を提供する。示されているように、画像は比較的ぼやけており、細胞境界を識別することは困難である。
【００９４】
比較すると、図１６は、図１５と同じ設定で撮影された赤血球の画像を提供するが、細胞は、図１５に示した細胞の速度よりも４倍遅い（すなわち、１ｍ／ｓ）速度で移動している。図１６に示すように、図１５の細胞と比較して、動きのぼやけが低減され、細胞の外部境界はより容易に区別可能である。
【００９５】
図１７および図１８は、（それぞれ）１ｍ／ｓおよび８ｍ／ｓの速度で移動するビーズの画像を提供する。示されているように、１ｍ／ｓで移動するビーズの画像は合焦にあり、容易に識別可能である。対照的に、８ｍ／ｓで移動するビーズはぼやけている。この試験の基本パラメータは、（ｉ）ビーズ直径：１５ミクロン、（ｉｉ）速度１または８ｍ／ｓ、（ｉｉｉ）シャッタ時間：１マイクロ秒、（ｉｖ）レンズ倍率：５０×、（ｖ）構成：明視野；（ｖｉ）照明：ＬＥＤ、（ｖｉｉｉ）画像内の流れは左から右である。
【００９６】
図１７および図１８では、約１ｍ／ｓの速度で、ビーズは、シャッタサイクル中に約１ミクロン移動した。８ｍ／ｓでは、ビーズはシャッタ中に約８ミクロン移動する。ビーズは直径が約１５ミクロンであったため、ビーズは、シャッタサイクル中にその直径の半分よりわずかに大きく移動する。本開示に従うシステムは、粒子が、シャッタサイクル中にその直径の４倍未満、またはシャッタサイクル中にその直径の２倍未満、シャッタサイクル中にその直径の約１倍未満、またはさらにシャッタサイクル中の直径の約０．７５未満、移動するように構成され得る。
【００９７】
例示的な態様
以下の態様は例示にすぎず、本明細書または添付の特許請求の範囲の範囲を限定するものとして理解されるべきではない。
【００９８】
態様１．
入口を有し、かつ流体が通って連通するための流路を画定する、フローチャネルと、
第１の照明源および第１の検出モジュールを備える第１の光学系であって、第１の検出モジュールは、第１の照明源によるフローチャネルの第１の領域の照明に関係する信号を受信するように配置され、第１の領域は、フローチャネルの入口から第１の距離に位置する、第１の光学系と、
第２の照明源および第２の検出モジュールを備える第２の光学系であって、第２の検出モジュールは、第２の照明源によるフローチャネルの第２の領域の照明に関係する信号を受信するように配置され、第２の領域は、フローチャネルの入口から第２の距離に位置し、第２の距離は第１の距離よりも大きい、第２の光学系と
を備えるシステムであって、
（ａ）フローチャネルの第１の領域は第１の断面積を画定し、フローチャネルの第２の領域は第２の断面積を画定し、第１および第２の断面積は、面積、形状、もしくは面積および形状の両方の点で互いに異なるか、または
（ｂ）（ｉ）システムは、フローチャネルの入口とフローチャネルの第１の領域との間でフローチャネルに進入する導管を備えるか、（ｉｉ）システムは、フローチャネルの第１の領域と第２の領域との間でフローチャネルに進入する導管を備えるか、もしくは（ｉ）および（ｉｉ）の両方であり、
（ｃ）システムは、流路内の粒子の速度を変調するように構成された流量変調器を備えるか、または
（ｄ）システムは、場モジュールをさらに備え、場モジュールは、フローチャネル内の流れ中にあり場に対する感度の高い少なくとも一部の粒子をフローチャネル内の流れ中の粒子速度の速度流線Ｓ０からフローチャネル内の流れ中の粒子速度の速度流線Ｓ１まで移動させるようにフローチャネルのある領域において場を増減するように構成され、フローチャネルの第１の領域と第２の領域との間で、システム動作中のＳ０における粒子速度はＳ１における粒子速度と異なるか、あるいは
（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）の任意の組み合わせである、
システム。
【００９９】
フローチャネルは円形断面を有し得るが、楕円形、多角形、または不規則な断面でもよい。長方形または正方形の断面が特に適していると見なされるが、要求はされない。チャネルは、約５０マイクロメートル〜約１０，０００マイクロメートルの範囲の断面寸法（例えば、直径）を有し得る。
【０１００】
適切な第１の照明および検出モジュールは、本明細書の他所に記載されている。
【０１０１】
システムの第１の領域は、第１の照明源と第１の検出モジュールとの間に配置されたフローチャネルの領域、例えば、粒子が第１の照明源により照明され得、かつその照明（または蛍光などのそれに関係する信号）が第１の検出モジュールによって検出され得る、フローチャネルのセクションであり得る。
【０１０２】
同様に、システムの第２の領域は、第２の照明源と第２の検出モジュールとの間に配置されるフローチャネルの領域、例えば、粒子が第２の照明源によって照明され得、かつその照明（または蛍光などのそれに関係する信号）が第２の検出モジュールによって検出され得る、フローチャネルのセクションであり得る。
【０１０３】
第１の領域および第２の領域は、フローチャネルの入口から、フローチャネルに沿って測定して、異なる距離に適切に配置される。第１の領域と第２の領域との間の分離は、例えば、約１００マイクロメートル〜約１０ｍｍであってもよいが、これは要件ではない。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、第２の領域は、第１の領域に対して下流として説明され得る。いくつかの実施形態では、第１の領域は、第２の領域に対して下流として説明され得る。本明細書の他所で説明されるように、フローチャネルは、胴部から２つ以上のフロー分岐に分岐し得る。あるいは、フローチャネルは、２つ以上の分岐から胴部に収束し得る。胴部における流量は、分岐部における流量とは異なり得る。
【０１０５】
態様２．第１および第２の断面積は、互いに面積が異なり、第１の断面積と第２の断面積との比は、１：１を除く、約１００：１〜約１：１００である、態様１に記載のシステム。いくつかの非限定的な例として、第１の断面積と第２の断面積との比は、約１００：１〜約１：１００、または約９８：１〜約１：９８、または約９０：１〜約１：９０、または約８０：１〜約１：８０、または約７０：１〜約１：７０、または約６０：１〜約１：６０、または約５０：１〜約１：５０、または約４０：１〜約１：４０、または約３０：１〜約１：３０、または約２０：１〜約１：２０、または約１０：１〜約１：１０、または約８：１〜約１：８、または約６：１〜約１：６、または約５：１〜約１：５、または約４：１〜約１：４、または約３：１〜約１：３、または約２：１〜約１：２、または約１．８：１〜約１：１．８、または約１．５：１〜約１：１．５、または約１．３：１〜約１：１．３、または約１．１：１〜約１：１．１であり得る。
【０１０６】
このようにして、システムは、動作中に、第１の領域と第２の領域とで異なる粒子速度を生じさせる。一実施形態では、粒子は、速度ｖ１で第１の領域を通過し、次いで、速度ｖ２で第２の領域を通過し得、ここで、第１の領域のフローチャネルの断面積は、第２の領域のフローチャネルの断面積よりも大きいので、ｖ２＜ｖ１である。より高速度とは、例えば、より低速度の１．０００１倍〜約１０００倍、またはより低速度の１．００１倍〜約１００倍、またはより低速度の１．０１倍〜約１０倍、またはより低速度の約１．０１倍〜約５であり得る。
【０１０７】
態様３．フローチャネルは主軸を画定する、態様１〜２のいずれか１つに記載のシステム。これは、例えば、円筒形フローチャネルにおいて、主軸が円筒形チャネルの中心軸である場合であり得る。
【０１０８】
態様４．第１および第２の照明源のうちの少なくとも一方は、フローチャネルの主軸に対して本質的に平行な照明を提供するように構成されている、態様３に記載のシステム。いくつかの実施形態では、第１および第２の照明源のうちの少なくとも一方は、フローチャネルの主軸に本質的に垂直な照明を提供するように構成される。もちろん、照明は、フローチャネルの主軸に対して平行と垂直との間の角度であってもよい。ほんの数例として、照明は、フローチャネルの主軸に対して、約１度〜約８９度、またはフローチャネルの主軸に対して約３度〜約８６度、またはフローチャネルの主軸に対して約７度〜約８１度、またはフローチャネルの主軸に対して約１１度〜約７７度、またはフローチャネルの主軸に対して約１７度〜約７０度、またはフローチャネルの主軸に対して約２３度〜約６５度、またはフローチャネルの主軸に対して約３０度〜約５８度、またはフローチャネルの主軸に対して約３７度〜約５０度、またはフローチャネルの主軸に対して約４０度〜約４４度であり得る。
【０１０９】
態様５．流路は、少なくとも部分的に非線形である、態様１〜４のいずれか１つに記載のシステム。そのような流路は、例えば、湾曲していても、屈曲していても、またはさらに角を含んでいてもよい。（１つのそのような実施形態を図５に示し、この図は、フローチャネル５２０に非線形の屈曲流路を提供する。）流路は、９０度未満、８０度未満、７０度未満、６０度未満、５０度未満、４０度未満、３０度未満、２０度未満、または１０度未満の屈曲またはよじれを含み得る。
【０１１０】
流路は、単一のチャネルから複数のチャネルに分岐してもよく、また、複数のチャネルからより少ないチャネル、またはさらに単一のチャネルに収束してもよい。
【０１１１】
態様６．フローチャネルと流体連通する粒子セパレータをさらに備える、態様１〜５のいずれか１つに記載のシステム。
【０１１２】
態様７．セパレータは、粒子サイズ、粒子形状、粒子質量、１つ以上の粒子に関連付けられた信号、またはこれらの任意の組み合わせに基づいて粒子を迂回させるように構成されている、態様６に記載のシステム。適切なこのようなセパレータは、当業者に知られている。いくつかの例示的なセパレータには、例えば、単一細胞選別、蛍光活性化細胞選別、磁気細胞選別、浮力活性化細胞選別などが含まれる。
【０１１３】
態様８．セパレータは、１つ以上の粒子に関連付けられた信号に基づいてフローチャネル内の粒子を迂回させるように構成されている、態様７に記載のシステム。一例として、セパレータは、特定の波長または波長範囲で少なくとも特定の強度の蛍光を示す粒子を迂回させるように構成され得る。
【０１１４】
態様９．システムは、分離された粒子の１つ以上の画像を収集するように構成されている、態様６〜８のいずれか１つに記載のシステム。例えば、システムは、代替のフローチャネルまたはフローストリームに迂回される粒子を撮像するように構成されたデバイス（例えば、カメラ、ＣＣＤ）を有し得る。
【０１１５】
態様１０．第１または第２の検出モジュールのうちの少なくとも一方は、複数の検出器を備える、態様１〜９のいずれか１つに記載のシステム。
【０１１６】
態様１１．少なくとも１つの検出モジュールと光通信状態である光反射器、光スプリッタ、または両方をさらに備える、態様１〜１０のいずれか１つに記載のシステム。
【０１１７】
図１１は、例示的なそのようなシステムを提供する。図１１に示すように、例示的なシステムは、画像検出器１１５０および画像検出器１１７０と光通信状態である（反射および分割特性を有する）ダイクロイックミラー１１４０を含み得る。
【０１１８】
態様１２．第１または第２の光学系のうちの一方または両方は、フローチャネル内の２つ以上の平面で撮像を行うように構成されている、態様１〜１１のいずれか１つに記載のシステム。
【０１１９】
態様１３．第１または第２の光学系のうちの一方または両方は、２つ以上の焦点面で画像を収集するように構成されている、態様１２に記載のシステム。
【０１２０】
態様１４．第１または第２の光学系のうちの一方または両方は、２つ以上の平面に照明を合焦させるように構成されている、態様１２〜１３のいずれか１つに記載のシステム。
【０１２１】
態様１５．第１の光学系は、第１の照明源からの照明軸が第１の検出モジュールから、ある角度でオフセットされるように構成されるか、第２の光学系は、第２の照明源からの照明軸が第２の検出モジュールから、ある角度でオフセットされるように構成されるか、または両方である、態様１〜１２のいずれか１つに記載のシステム。オフセット角は、例えば、約１〜約９０度、例えば、約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、またはさらに約９０度であってもよい。
【０１２２】
態様１６．第１の照明源、第２の照明源、または両方は、レーザー、ランプ、発光ダイオード（ＬＥＤ）などを備える、態様１〜１５のいずれか１つに記載のシステム。
【０１２３】
態様１７．第１の検出モジュール、第２の検出モジュール、または両方は、光電子増倍管（ＰＭＴ）、アバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）、カメラ、シリコン光電子増倍管（ＳｉＰＭ）などを備える、態様１〜１６のいずれか１つに記載のシステム。
【０１２４】
態様１８．システムは、第１の光学系によって収集される信号に、（ａ）第２の光学系の動作、（ｂ）存在する場合はセパレータの動作、または（ａ）および（ｂ）の両方が関係するように構成されている、態様１〜１７のいずれか１つに記載のシステム。
【０１２５】
態様１９．場モジュールは、磁場、電場、音響場、またはこれらの任意の組み合わせの供給源を備える、態様１〜１８のいずれか１つに記載のシステム。
【０１２６】
態様２０．
粒子集団をフローチャネルに流すことと、
第１の光学系を用いて、フローチャネルの第１の領域で、粒子集団の少なくとも一部を照明し、照明に関係する第１の信号またはその欠如を収集することと、
第２の光学系を用いて、フローチャネルの第２の領域で、粒子集団の少なくとも一部を照明し、照明に関係する第２の信号またはその欠如を収集することと
を含む方法であって、
フローチャネルの第１の領域における粒子速度は、フローチャネルの第２の領域における粒子速度とは異なり、
第１の信号は、第２の信号とは異なる、
方法。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、第１および第２の信号は、強度、波長、または両方において異なる。一例として、１つの信号は染料の励起に関係する蛍光信号であり、別の信号は可視光下で集められた通話の視覚画像であり得る。別の例として、１つの信号は第１の染料の励起に関係する蛍光信号であり得、別の信号は第２の異なる染料の励起に関係する蛍光信号であり得る。
【０１２８】
さらに別の例では、第１の検出器は、第１の照明器からの照明を受ける領域に位置する第１の染料の蛍光に関係する信号を収集し得る。第２の検出器は、第２の照明器からの照明を受ける領域に位置する第２の染料の蛍光に関係する光子の不在を検出し得、この光子の不在は信号と見なされ得る。
【０１２９】
態様２１．フローチャネルの第１の領域の断面積は、フローチャネルの第２の領域の断面積とは、面積、形状、または両方の点で異なる、態様２０に記載の方法。
【０１３０】
態様２２．フローチャネルの第１の領域と第２の領域との間の位置で、流体を導入することまたはフローチャネルから除去することをさらに含む、態様２０〜２１のいずれか１つに記載の方法。
【０１３１】
流体は、第２の領域の流体の体積流量と第１の領域の体積流量との比が、例えば、１．０００１：１〜約５：１、１０：１、２０：１、またはさらに約４０：１であり得る。流体は、第２の領域の流体の体積流量と第１の領域の体積流量との比が、例えば１：１．０００１〜約１：５、１：１０、１：２０、またはさらに約１：４０であり得る。
【０１３２】
第１および第２の領域での粒子の調査時間は変化し得、約０．１マイクロ秒から、例えば１ミリ秒またはさらに数十ミリ秒であり得る。一例として、粒子から蛍光信号を収集するためのレーザー調査は、１マイクロ秒〜数十マイクロ秒の範囲の調査時間を有し得る。粒子の標準画像を収集するための可視光調査は、１ミリ秒〜数十ミリ秒の範囲の調査時間を有し得る。第１の領域における粒子調査時間と第２の領域における粒子調査時間との比は、例えば、約１：１００，０００〜約１００，０００：１（例えば、１０，０００：１〜１：１０，０００）の範囲で、かつすべての中間値であり得る。
【０１３３】
態様２３．フローチャネルは主軸を画定する、態様２０〜２２のいずれか１つに記載の方法。
【０１３４】
態様２４．フローチャネルの第１の領域で粒子集団の少なくとも一部を照明すること、フローチャネルの第２の領域で粒子集団の少なくとも一部を照明すること、または両方は、主軸に対して本質的に平行な照明によって行われる、態様２３に記載の方法。
【０１３５】
態様２５．フローチャネルは、少なくとも部分的に非線形の流路を画定する、態様２０〜２４のいずれか１つに記載の方法。
【０１３６】
側面２６．第１の信号、第２の信号、または両方に基づいて粒子集団の少なくとも一部を分離することをさらに含む、態様２０〜２５のいずれか１つに記載の方法。
【０１３７】
態様２７．１つ以上の分離された粒子の画像を収集することをさらに含む、態様２０〜２６のいずれか１つに記載の方法。これは、分離基準を満たした、または分離基準を満たさなかった粒子の１つ以上の画像を収集することを含み得ることを理解されたい。
【０１３８】
態様２８．照明反射器、照明スプリッタ、または両方を用いて、第１の光学系からの照明を方向付けることをさらに含む、態様２０〜２７のいずれか１つに記載の方法。
【０１３９】
態様２９．照明反射器、照明スプリッタ、または両方を用いて、第２の光学系からの照明を方向付けることをさらに含む、態様２０〜２８のいずれか１つに記載の方法。
【０１４０】
態様３０．フローチャネル内の２つ以上の平面で信号を収集するように第１の光学系、第２の光学系、または両方を動作させることをさらに含む、態様２０〜２９のいずれか１つに記載の方法。
【０１４１】
態様３１．フローチャネル内の２つ以上の平面に照明を合焦させるように第１の光学系、第２の光学系、または両方を動作させることをさらに含む、態様２０〜３０のいずれか１つに記載の方法。
【０１４２】
態様３２．第１の光学系の照明源からの照明軸は、第１の光学系の検出モジュールから、ある角度でオフセットされるか、第２の光学系の照明源からの照明は、第２の光学系の検出モジュールから、ある角度でオフセットされるか、または両方である、態様２０〜３１のいずれか１つに記載の方法。
【０１４３】
態様３３．第１の信号、第２の信号、または両方は、蛍光信号、蛍光画像、発光画像、位相コントラスト画像、ホログラフィック画像、明視野画像、暗視野画像、散乱信号、またはこれらの任意の組み合わせである、態様２０〜３２のいずれか１つに記載の方法。
【０１４４】
態様３４．第２の光学系の動作は、第１の光学系によって収集された第１の信号に関係する、態様２０〜３３のいずれか１つに記載の方法。一例として、第２の光学系は、特定の閾値信号（例えば、所定レベルの蛍光）が第１の光学系によって収集されない限り、照明または検出するように動作しなくてもよい。このようにして、第２の光学系は、第１の光学系によって収集される１つ以上の基準を満たした細胞または他の粒子に関する情報のみを収集するように動作し得る。
【０１４５】
態様３５．第１の信号、第２の信号、または両方を、粒子集団のうちの少なくとも１つの１つ以上の特性に相関させることをさらに含む、態様２０〜３４のいずれか１つに記載の方法。一例として、本明細書の他所で説明するように、特定の染料の存在を細胞の生／死の状態に相関させてもよい。また、例えば、信号（例えば、蛍光）の強度を細胞内のマーカーまたは他の染料のレベルに相関させてもよい。
【０１４６】
態様３６．粒子集団は、第１の領域では第１の流体流量で、かつ第２の領域では第２の流体流量で流れ、第１の流体流量と第２の流体流量との比は、１：１を除く、約４０：１〜約１：４０である、態様２０〜３５のいずれか１つに記載の方法。
【０１４７】
（第１または第２の領域における）例示的な粒子速度は、例えば、センチメートル／秒〜数十メートル／秒の範囲、例えば、約０．１ｍ／ｓ〜約１０ｍ／ｓ、約０．５〜約５ｍ／ｓ、約１〜約２．．５ｍ／ｓ、またはさらに約１．５ｍ／ｓであり得る。
【０１４８】
また、特定の理論に縛られるものではないが、開示されたシステムは、例えば、約１０μｌ／分（マイクロリットル／分）〜毎分約１０００μｌの体積流量で動作し得る。約１０〜約１０００μｌ／分、または約５０〜約７００μｌ／分、または約１００〜約５００μｌ／分、または約２００〜約４００μｌ／分の流量はすべて適切と考えられる。
【０１４９】
本開示に従うシステムは、例えば、約１０〜約１００，０００細胞／秒の速度で動作し得る。約１０〜約１００，０００細胞／秒、または約５０〜約５０，０００細胞／秒、または約１００〜約１０，０００細胞／秒、またはさらに約５００〜約５，０００細胞／秒の速度はすべて適切と考えられる。
【０１５０】
また、本開示に従うシステムは、約１０〜約１００，０００事象／秒の速度で動作し得ることも理解されるべきである。約１０〜約１００，０００事象／秒、または約５０〜約５０，０００事象／秒、または約１００〜約１０，０００事象／秒、またはさらに約５００〜約５，０００事象／秒の速度はすべて適切と考えられる。選別および／またはゲーティングの適用により、システムは、サンプル中の特定の細胞／粒子を除外し、非除外細胞／粒子のみを分析して、サンプルのサブ集団のみにシステム資源を利用するように構成できる。ほんの一例として、システムが１秒あたり５０，０００事象で動作できる場合、システムは５００，０００細胞の母集団を分析するのに１０秒を要する。しかしながら、システムがサンプル中の細胞の５０％を除外するように構成されている場合、システムはわずか５秒で２５０．０００個の対象の細胞を分析できる。
【０１５１】
態様３７．
フローチャネルを通じて、フローチャネルの第１の領域からフローチャネルの第２の領域に向かう方向で、粒子集団を連通させることと、
第１の光学系を用いて、フローチャネルの第１の領域で粒子集団の少なくとも一部を照明し、照明に関係する第１の信号を収集することと、
第２の光学系を用いて、フローチャネルの第２の領域で粒子集団の少なくとも一部を照明し、照明に関係する第２の信号を収集することと、
粒子のサブセットにおいて、フローチャネルの第１の領域と第２の領域との間で場を増減させることと
を含む方法であって、
場は、フローチャネル内の粒子速度の速度流線Ｓ０からフローチャネル内の粒子速度の速度流線Ｓ１へと粒子のサブセットを移動させるように増減され、Ｓ０における粒子速度はＳ１における粒子速度とは異なる、
方法。
【０１５２】
特定の理論に縛られるものではないが、これは、フローチャネルの中心にある第１の速度流線からフローチャネルの壁にある第２の速度流線へ（電界の影響を受ける）粒子を移動させるように実行され得るが、ここで、標準ポアズイユの法則によれば、フローチャネルの中心の流れに比べて、壁での流れは比較的遅い。このようにして、粒子は、フローチャネルの壁の近くに移動すると、第１の領域を通過するときの速度よりも遅い速度で第２の領域を通過し得る。
【０１５３】
態様３８．場は、磁場、電場、音響場、重力場、誘電場、またはこれらの任意の組み合わせの場を含む、態様３７に記載の方法。
【０１５４】
態様３９．粒子のサブセットを場に対する感度の高いエンティティに結合することをさらに含む、態様３７〜３８のいずれか１つに記載の方法。例示的なエンティティには、例えば、磁性粒子、異なる誘電特性を有する粒子、異なる密度を有する粒子、および異なる圧縮率を有する粒子が含まれる。
【０１５５】
態様４０．エンティティは、磁性粒子を含む、態様３９に記載の方法。
【０１５６】
態様４１．エンティティは誘電体粒子を含む、態様３９に記載の方法。
【０１５７】
態様４２．粒子の集団を態様１〜１９のいずれか１つに従うシステムを通して流すことを含む方法。
【０１５８】
態様４３．態様１〜１９のいずれか１つに従ってシステムを動作させることを含む方法。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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