(57)【要約】  本発明は、所定のヌクレオチド配列に従ってポリヌクレオチド分子を合成するための新たな方法に関する。本発明はまた、合成後の合成ポリヌクレオチドの構築方法、ならびに合成および／または構築方法を行うためのシステムおよびキットに関する。【選択図】図１
2020506687.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
所定の配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドをインビトロで合成する方法であって、前記方法が、合成サイクルを行うことを含み、各サイクルにおいて、第１の鎖が前記所定の配列のヌクレオチドの組み込みによって伸長され、前記第１の鎖にハイブリダイズされた第２の鎖がヌクレオチドの組み込みによって伸長され、それによって前記第１の鎖の前記組み込まれたヌクレオチドとヌクレオチド対を形成する、方法。
【請求項２】
各サイクルが、前記所定の配列の前記ヌクレオチドを付着した可逆的ブロッキング基と一緒に組み込むことによって前記第１の鎖を伸長させ、続いて前記第２の鎖を伸長させることを含み、前記可逆的ブロッキング基が、前記第２の鎖が伸長される前または後に除去される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
各サイクルにおいて、前記ヌクレオチドが足場ポリヌクレオチドに組み込まれる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
各サイクルが、
（１）足場ポリヌクレオチドを提供することと、
（２）前記所定の配列のヌクレオチドを、ポリメラーゼの作用によって前記足場ポリヌクレオチドに組み込むことであって、前記ヌクレオチドが、ポリメラーゼによるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基を含む、組み込むことと、
（３）前記足場ポリヌクレオチドを切断部位で切断することと、
（４）連結ポリヌクレオチドを前記切断された足場ポリヌクレオチドに連結することであって、前記連結ポリヌクレオチドが前記所定の配列の前記ヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドを含み、連結時に、前記所定の配列の前記ヌクレオチドが前記パートナーヌクレオチドと対合する、連結することと、
（５）前記所定の配列の前記ヌクレオチドから前記可逆的ターミネーター基を除去することと、を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
工程（１）が、合成鎖とそれにハイブリダイズされた支持鎖とを含む足場ポリヌクレオチドを提供することを含み、前記合成鎖がプライマー鎖部分を含み、前記支持鎖がユニバーサルヌクレオチドを含み、工程（３）が、前記足場ヌクレオチドを切断部位で切断することを含み、前記部位が、前記支持鎖中の前記ユニバーサルヌクレオチドを含む配列によって定義され、切断が、前記支持鎖を切断すること、および前記ユニバーサルヌクレオチドを除去することを含み、工程（４）において、前記連結ポリヌクレオチドが、次のサイクルで使用するための切断部位を定義するユニバーサルヌクレオチドを含む支持鎖を含み、前記連結ポリヌクレオチドが、前記切断された足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖に連結される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記方法が、
（１）合成鎖とそれにハイブリダイズされた支持鎖とを含む足場ポリヌクレオチドを提供することであって、前記合成鎖が、一本鎖切断によって分離されたプライマー鎖部分およびヘルパー鎖部分を含み、前記支持鎖がユニバーサルヌクレオチドを含む、提供することと、
（２）前記所定の配列の１番目のヌクレオチドを、ポリメラーゼの作用によって前記合成鎖に組み込むことであって、前記１番目のヌクレオチドが、ポリメラーゼによるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基を含む、組み込むことと、
（３）前記足場ポリヌクレオチドを切断部位で切断することであって、前記部位が、前記支持鎖中の前記ユニバーサルヌクレオチドを含む配列によって定義され、切断が、前記支持鎖を切断すること、および前記ユニバーサルヌクレオチドを除去して、前記合成鎖中に前記１番目のヌクレオチドを含む突出末端を提供することを含む、切断することと、
（４）二本鎖連結ポリヌクレオチドを前記切断された足場ポリヌクレオチドに連結することであって、前記連結ポリヌクレオチドが、支持鎖、ヘルパー鎖、および相補的連結末端を含み、前記連結末端が、ユニバーサルヌクレオチド、および前記ヘルパー鎖に突出した前記１番目のヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドを前記支持鎖中に含み、かつリン酸基を欠く末端ヌクレオチドを前記ヘルパー鎖中に含み、前記支持鎖の連結時に、前記１番目のヌクレオチドが前記パートナーヌクレオチドと対合する、連結することと、
（５）前記１番目のヌクレオチドから前記ターミネーター基を除去することと、
（６）前記所定のヌクレオチド配列の隣のヌクレオチドを、ポリメラーゼの作用によって前記足場ポリヌクレオチドの前記合成鎖に組み込むことであって、前記隣のヌクレオチドが、ポリメラーゼによるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基を含む、組み込むことと、
（７）前記足場ポリヌクレオチドを切断部位で切断することであって、前記部位が、前記支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドを含む配列によって定義され、切断が、前記支持鎖を切断すること、および前記ユニバーサルヌクレオチドを除去して、前記合成鎖中に前記隣のヌクレオチドを含む突出末端を提供することを含む、切断することと、
（８）二本鎖連結ポリヌクレオチドを前記切断された足場ポリヌクレオチドに連結することであって、前記連結ポリヌクレオチドが、支持鎖、ヘルパー鎖、および相補的連結末端を含み、前記連結末端が、ユニバーサルヌクレオチド、および前記ヘルパー鎖に突出した前記隣のヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドを前記支持鎖中に含み、かつリン酸基を欠く末端ヌクレオチドを前記ヘルパー鎖中に含み、前記支持鎖の連結時に、前記隣のヌクレオチドが前記パートナーヌクレオチドと対合する、連結することと、
（９）前記隣のヌクレオチドから前記ターミネーター基を除去することと、
（１０）工程６〜９を複数回繰り返して、所定のヌクレオチド配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドを得ることと、を含む、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
所与の合成サイクルにおいて、前記ユニバーサルヌクレオチドが、（ａ）工程１および６における前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖中の位置ｎを占め、位置ｎが、そのサイクルに組み込まれたときに前記所定の配列の前記ヌクレオチドによって占められることになる前記合成鎖中の位置と反対側の前記支持鎖中の前記ヌクレオチド位置であり、かつ（ｂ）工程４および８における前記連結ポリヌクレオチドの前記支持鎖中の位置ｎを占め、位置ｎが、次の合成サイクルに組み込まれたときに前記所定の配列の前記隣のヌクレオチドによって占められることになる前記合成鎖中の位置と反対側の前記支持鎖中の前記ヌクレオチド位置であり、位置ｎ−１が、前記ヘルパー鎖に対して遠位方向／前記プライマー鎖に対して近位方向において前記ユニバーサルヌクレオチドによって占められる位置に対する前記支持鎖中の前記隣のヌクレオチド位置であり、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖が、工程３および７における位置ｎとｎ−１との間で切断される、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
所与の合成サイクルにおいて、前記ユニバーサルヌクレオチドが、（ａ）工程１および６における前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖中の位置ｎ＋１を占め、位置ｎが、そのサイクルに組み込まれたときに前記所定の配列の前記ヌクレオチドによって占められることになる前記合成鎖中の位置と反対側の前記支持鎖中の前記ヌクレオチド位置であり、かつ（ｂ）工程４および８における前記連結ポリヌクレオチドの前記支持鎖中の位置ｎ＋１を占め、位置ｎが、次の合成サイクルに組み込まれたときに前記所定の配列の前記隣のヌクレオチドによって占められることになる前記合成鎖中の位置と反対側の前記支持鎖中の前記ヌクレオチド位置であり、位置ｎ−１が、前記ヘルパー鎖に対して遠位方向／前記プライマー鎖に対して近位方向において位置ｎに対する前記支持鎖中の前記隣のヌクレオチド位置であり、位置ｎ＋１が、前記ヘルパー鎖に対して近位方向／前記プライマー鎖に対して遠位方向において位置ｎに対する前記支持鎖中の前記隣のヌクレオチド位置であり、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖が、工程３および７における位置ｎとｎ−１との間で切断される、請求項５または６に記載の方法。
【請求項９】
所与の合成サイクルにおいて、前記ユニバーサルヌクレオチドが、（ａ）工程１および６における前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖中の位置ｎを占め、位置ｎが、そのサイクルに組み込まれたときに前記所定の配列の前記ヌクレオチドによって占められることになる前記合成鎖中の位置と反対側の前記支持鎖中の前記ヌクレオチド位置であり、かつ（ｂ）工程４および８における前記連結ポリヌクレオチドの前記支持鎖中の位置ｎを占め、位置ｎが、次の合成サイクルに組み込まれたときに前記所定の配列の前記隣のヌクレオチドによって占められることになる前記合成鎖中の位置と反対側の前記支持鎖中の前記ヌクレオチド位置であり、位置ｎ−１が、前記ヘルパー鎖に対して遠位方向／前記プライマー鎖に対して近位方向において前記ユニバーサルヌクレオチドによって占められる位置に対する前記支持鎖中の前記隣のヌクレオチド位置であり、位置ｎ−２が、前記ヘルパー鎖に対して遠位方向／前記プライマー鎖に対して近位方向において位置ｎ−１に対する前記支持鎖中の前記隣のヌクレオチド位置であり、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖が、工程３および７における位置ｎ−１とｎ−２との間で切断される、請求項５または６に記載の方法。
【請求項１０】
ａ）工程（１）／（６）において、前記支持鎖中の前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記一本鎖切断に隣接する前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドと反対側に位置付けられ、それと対合され（位置ｎ）、
ｂ）工程（２）／（６）において、前記１番目の／隣のヌクレオチドが、前記支持鎖中の前記ユニバーサルヌクレオチドと反対側の位置（位置ｎ）で前記合成鎖に組み込まれ、そのときに前記１番目の／隣のヌクレオチドが前記ユニバーサルヌクレオチドと対合し、
ｃ）工程（３）／（７）において、前記支持鎖が、前記支持鎖中の前記ユニバーサルヌクレオチド位置（位置ｎ）と、前記支持鎖中の前記ユニバーサルヌクレオチド位置の隣の前記ヌクレオチド（位置ｎ−１、前記ヘルパー鎖に対して遠位方向／前記プライマー鎖に対して近位方向において）との間の位置で切断され、切断が、前記支持鎖に突出した前記１番目の／隣のヌクレオチドを含む前記足場ポリヌクレオチド中に一塩基突出を生成し、
ｄ）工程（４）／（８）において、前記連結ポリヌクレオチドの連結末端が、一塩基突出を含み、
ｉ．前記支持鎖中の前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドと反対側に位置付けられ（位置ｎ）、それと対合され、
ｉｉ．前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドの隣に位置付けられ、
ｉｉｉ．前記支持鎖の前記末端ヌクレオチド（位置ｎ−１）が、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドに突出し、工程（２）／（６）の前記１番目の／隣のヌクレオチドに対する前記パートナーヌクレオチドである、請求項６または７に記載の方法。
【請求項１１】
ａ）工程（１）において、前記足場ポリヌクレオチドが、工程（２）の前記１番目のヌクレオチドに対する前記パートナーヌクレオチドであるヌクレオチド（位置ｎ）を有する前記支持鎖中に提供され、前記支持鎖中の前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記パートナーヌクレオチドの隣に位置付けられ（位置ｎ＋１、前記ヘルパー鎖に対して近位方向／前記プライマー鎖に対して遠位方向において）、
ｂ）工程（２）／（６）において、前記１番目の／隣のヌクレオチドが、前記支持鎖中の前記パートナーヌクレオチドと反対側の位置（位置ｎ）で前記合成鎖に組み込まれ、そのときに前記１番目の／隣のヌクレオチドが、前記パートナーヌクレオチドと対合し、
ｃ）工程（３）／（７）において、前記支持鎖が、前記ヘルパー鎖に対して遠位方向／前記プライマー鎖に対して近位方向において、前記支持鎖中の前記ユニバーサルヌクレオチドから前記１番目のヌクレオチド（位置ｎ）と２番目のヌクレオチド（位置ｎ−１）との間の位置で切断され、切断が、前記ユニバーサルヌクレオチドを除去し、前記支持鎖に突出した前記１番目の／隣のヌクレオチドを含む前記足場ポリヌクレオチド中に一塩基突出を作成し、
ｄ）工程（４）／（８）において、前記連結ポリヌクレオチドの前記相補的連結末端が一塩基突出を含み、
ｉ．前記支持鎖中の前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記ヘルパー鎖の前記最後から２番目のヌクレオチドと反対側に位置付けられ（位置ｎ＋１）、それと対合され、
ｉｉ．前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記支持鎖の前記最後から２番目のヌクレオチドの隣に位置付けられ（位置ｎ）、
ｉｉｉ．前記支持鎖の前記最後から２番目のヌクレオチド（位置ｎ）が、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドと対合され、次の合成サイクルの工程（６）において前記隣のヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドであり、
ｉｖ．前記支持鎖の前記末端ヌクレオチド（位置ｎ−１）が、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドに突出し、工程（２）の前記１番目のヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドであるか、または現在の合成サイクルの工程（６）の新たに組み込まれたヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドである、請求項６または８に記載の方法。
【請求項１２】
ａ）工程（１）／（６）において、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖中の前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記一本鎖切断に隣接する前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドと反対側に位置付けられ、それと対合され（位置ｎ）、
ｂ）工程（２）／（６）において、前記１番目の／隣のヌクレオチドが、前記支持鎖中の前記ユニバーサルヌクレオチドと反対側の位置で前記合成鎖に組み込まれ、そのときに前記１番目の／隣のヌクレオチドが前記ユニバーサルヌクレオチドと対合し、
ｃ）工程（３）／（７）において、前記支持鎖が、前記ヘルパー鎖に対して遠位方向／前記プライマー鎖に対して近位方向において、前記支持鎖中の前記ユニバーサルヌクレオチドからの前記１番目のヌクレオチド（位置ｎ−１）と前記２番目のヌクレオチド（位置ｎ−２）との間の位置で切断され、切断が、前記ユニバーサルヌクレオチドを除去し、前記支持鎖に突出した前記１番目の／隣のヌクレオチドを含む前記足場ポリヌクレオチド中に二塩基突出を作成し、
ｄ）工程（４）／（８）において、前記連結ポリヌクレオチドの前記相補的連結末端が、二塩基突出を含み、
ｉ．前記支持鎖中の前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドと反対側に位置付けられ（位置ｎ）、それと対合され、
ｉｉ．前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記支持鎖の前記最後から２番目のヌクレオチドの隣に位置付けられ、
ｉｉｉ．前記支持鎖の前記最後から２番目のヌクレオチド（位置ｎ−１）が、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドに突出し、工程（２）／（６）における前記１番目の／隣のヌクレオチドに対する前記パートナーヌクレオチドである、請求項６または９に記載の方法。
【請求項１３】
前記所定の配列の１番目の／隣のヌクレオチドと対合するヌクレオチドが、前記１番目の／隣のヌクレオチドと相補的な、好ましくは天然に相補的なヌクレオチドである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
工程（１）および／または（６）が、合成鎖とそれにハイブリダイズされた支持鎖とを含む足場ポリヌクレオチドを提供することを含み、前記合成鎖がヘルパー鎖なしで提供される、請求項６〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
任意の１つ以上の合成サイクルにおいて、またはすべての合成サイクルにおいて、前記二本鎖連結ポリヌクレオチドを前記切断された足場ポリヌクレオチドに連結する工程の後で、かつ前記所定のヌクレオチド配列の前記隣のヌクレオチドを前記足場ヌクレオチドの前記合成鎖に組み込む工程の前に、前記合成鎖の前記ヘルパー鎖部分が、前記足場ポリヌクレオチドから除去される、請求項６〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記合成鎖の前記ヘルパー鎖部分が、（ｉ）前記足場ポリヌクレオチドを約８０℃〜約９５℃の温度に加熱し、前記足場ポリヌクレオチドから前記ヘルパー鎖部分を分離すること、（ｉｉ）前記足場ポリヌクレオチドを８Ｍ尿素などの尿素溶液で処理し、前記足場ポリヌクレオチドから前記ヘルパー鎖部分を分離すること、（ｉｉｉ）１００％ホルムアミドなどのホルムアミドまたはホルムアミド溶液で前記足場ポリヌクレオチドを処理し、前記足場ポリヌクレオチドから前記ヘルパー鎖部分を分離すること、または（ｉｖ）前記足場ポリヌクレオチドを、前記ヘルパー鎖部分の配列と相補的であるヌクレオチド配列の領域を含む一本鎖ポリヌクレオチド分子と接触させ、それによって前記ヘルパー鎖部分と前記足場ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを競合的に阻害すること、によって前記足場ポリヌクレオチドから除去される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
各切断工程が、前記ユニバーサルヌクレオチドを除去し、よって脱塩基部位を形成することを含む第１の工程と、前記支持鎖を前記脱塩基部位で切断することを含む第２の工程と、を含む、請求項４〜７、１０および１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１の工程が、ヌクレオチド除去酵素を用いて行われる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ヌクレオチド除去酵素が、３−メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ酵素である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ヌクレオチド除去酵素が、ヒトアルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｈＡＡＧ）である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記第２の工程が、塩基である化学物質を用いて行われる、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記塩基が、ＮａＯＨである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記第２の工程が、脱塩基部位切断活性を有する有機化学物質を用いて行われる、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記有機化学物質が、Ｎ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミンである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記第２の工程が、脱塩基部位リアーゼ活性を有する酵素を用いて行われる、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記酵素が、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記切断工程が、前記支持鎖を酵素で切断することを含む、請求項４および１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記酵素が、前記ユニバーサルヌクレオチドの隣にある前記ヌクレオチドの後の前記支持鎖を切断し、それによって前記１番目の／隣のヌクレオチドを含む前記合成鎖中に前記突出末端を作成する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記酵素がエンドヌクレアーゼＶである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記合成二本鎖ポリヌクレオチドの両方の鎖がＤＮＡ鎖である、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記合成鎖および前記支持鎖がＤＮＡ鎖である、請求項５〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
組み込まれたヌクレオチドがｄＮＴＰである、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３３】
組み込まれたヌクレオチドが、可逆的ターミネーター基を含むｄＮＴＰである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
可逆的ターミネーター基を含む前記組み込まれたヌクレオチドのうちの１つ以上が、３’−Ｏ−アリル−ｄＮＴＰである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
可逆的ターミネーター基を含む前記組み込まれたヌクレオチドのうちの１つ以上が、３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＮＴＰである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記合成二本鎖ポリヌクレオチドの第１の鎖がＤＮＡ鎖であり、前記合成二本鎖ポリヌクレオチドの第２の鎖がＲＮＡ鎖である、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記合成鎖がＲＮＡ鎖であり、前記支持鎖がＤＮＡ鎖である、請求項１〜２９および３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
組み込まれたヌクレオチドがＮＴＰである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
組み込まれたヌクレオチドが、可逆的ターミネーター基を含むＮＴＰである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
可逆的ターミネーター基を含む組み込まれたヌクレオチドが、３’−Ｏ−アリル−ＮＴＰである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
可逆的ターミネーター基を含む組み込まれたヌクレオチドが、３’−Ｏ−アジドメチル−ＮＴＰである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記ポリメラーゼが、ＤＮＡポリメラーゼ、好ましくは未修飾ポリメラーゼと比較して可逆的ターミネーター基を含むｄＮＴＰを組み込む能力が増強された修飾ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記ポリメラーゼが、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種９°Ｎ、好ましくは種９°Ｎ−７由来の天然ＤＮＡポリメラーゼの変異体である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記ポリメラーゼが、Ｔ３またはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼなどのＲＮＡポリメラーゼ、任意選択的に、未修飾ポリメラーゼと比較して可逆的ターミネーター基を含むＮＴＰを組み込む能力が増強された修飾ＲＮＡポリメラーゼである、請求項１〜２９および３６〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記１番目の／隣のヌクレオチドから前記可逆的ターミネーター基を除去する工程が、トリス（カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を用いて行われる、請求項３〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
二本鎖連結ポリヌクレオチドを前記切断された足場ポリヌクレオチドに連結する工程が、リガーゼ酵素を用いて行われる、請求項３〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記リガーゼ酵素が、Ｔ３  ＤＮＡリガーゼまたはＴ４  ＤＮＡリガーゼである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
工程（１）および／または（６）において、前記ヘルパー鎖とそれにハイブリダイズされた前記支持鎖の前記部分とがヘアピンループによって接続されている、請求項３〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
工程（１）において、前記プライマー鎖部分を含む前記合成鎖とそれにハイブリダイズされた前記支持鎖の前記部分とがヘアピンループによって接続されている、請求項３〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
工程（１）および／または（６）において、
ａ）前記ヘルパー鎖とそれにハイブリダイズされた前記支持鎖の前記部分とがヘアピンループによって接続され、
ｂ）前記プライマー鎖部分を含む前記合成鎖とそれにハイブリダイズされた前記支持鎖の前記部分とがヘアピンループによって接続されている、請求項３〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記連結ポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、前記突出末端と反対側の末端で前記支持鎖と前記ヘルパー鎖とを接続するヘアピンループを含む単一分子として提供される、請求項３〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
各合成サイクルの前記連結ポリヌクレオチドが、前記突出末端と反対側の末端で前記支持鎖と前記ヘルパー鎖とを接続するヘアピンループをそれぞれ含む単一分子として提供される、請求項３〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
工程（１）において、前記プライマー鎖部分を含む前記合成鎖とそれにハイブリダイズされた前記支持鎖の前記部分とが共通の表面に繋留されている、請求項３〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記プライマー鎖部分とそれにハイブリダイズされた前記支持鎖の前記部分とがそれぞれ切断可能なリンカーを含み、前記リンカーが、合成後に前記表面から前記二本鎖ポリヌクレオチドを切り離すために切断され得る、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
工程（１）において、前記合成鎖の前記プライマー鎖部分とそれにハイブリダイズされた前記支持鎖の前記部分とがヘアピンループによって接続され、前記ヘアピンループが表面に繋留されている、請求項３〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記ヘアピンループが切断可能なリンカーを介して表面に繋留され、前記リンカーが、合成後に前記表面から前記二本鎖ポリヌクレオチドを切り離すために切断され得る、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記切断可能なリンカーがＵＶ切断可能なリンカーである、請求項５４または５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記表面が微粒子である、請求項５３〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記表面が平坦な表面である、請求項５３〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記表面がゲルを含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記表面が、約２％のポリアクリルアミドなどのポリアクリルアミド表面を含み、好ましくは前記ポリアクリルアミド表面がガラスなどの固体支持体に結合されている、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記プライマー鎖部分を含む前記合成鎖とそれにハイブリダイズされた前記支持鎖の前記部分とが、１つ以上の共有結合を介して前記共通の表面に繋留されている、請求項５３〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記１つ以上の共有結合が、前記共通の表面上の官能基と前記足場分子上の官能基との間に形成され、前記足場分子上の前記官能基が、アミン基、チオール基、チオリン酸基、またはチオアミド基である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記共通の表面上の前記官能基がブロモアセチル基であり、任意選択的に前記ブロモアセチル基が、Ｎ−（５−ブロモアセトアミジルペンチル）アクリルアミド（ＢＲＡＰＡ）を使用して得られるポリアクリルアミド表面上に提供される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記所定の配列のヌクレオチドから前記可逆的ターミネーター基を除去する工程が、前記切断工程の前、または前記連結工程の前に行われる、請求項３〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
合成サイクルが、微小流体システム内の液滴中で行われる、請求項１〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記微小流体システムがエレクトロウェッティングシステムである、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記微小流体システムが、エレクトロウェッティングオン誘電体システム（ＥＷＯＤ）である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
合成後、前記二本鎖ポリヌクレオチドの前記鎖が分離されて、所定の配列を有する一本鎖ポリヌクレオチドを得る、請求項１〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
合成後、前記二本鎖ポリヌクレオチドまたはその領域が、好ましくはＰＣＲによって増幅される、請求項１〜６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
所定の配列を有するポリヌクレオチドを構築する方法であって、所定の配列を有する第１のポリヌクレオチドおよび所定の配列を有する１つ以上の追加のポリヌクレオチドを合成するために請求項１〜７０のいずれか一項に記載の方法を行うことと、前記第１のポリヌクレオチドおよび前記１つ以上の追加のポリヌクレオチドを一緒に接合することと、を含む、方法。
【請求項７２】
前記第１のポリヌクレオチドおよび前記１つ以上の追加のポリヌクレオチドが二本鎖である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記第１のポリヌクレオチドおよび前記１つ以上の追加のポリヌクレオチドが一本鎖である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７４】
前記第１のポリヌクレオチドおよび前記１つ以上の追加のポリヌクレオチドが、適合する末端を作成するために切断され、連結によって一緒に接合される、請求項７１〜７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
前記第１のポリヌクレオチドおよび前記１つ以上の追加のポリヌクレオチドが、切断部位で制限酵素によって切断される、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記合成および／または構築工程が、微小流体システム内の液滴中で行われる、請求項６８〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記構築工程が、所定の配列を有する第１の合成ポリヌクレオチドを含む第１の液滴と、所定の配列を有する追加の１つ以上の合成ポリヌクレオチドを含む第２の液滴とを提供することを含み、前記液滴が互いに接触し、前記合成ポリヌクレオチドが一緒に接合され、それによって前記第１のポリヌクレオチドおよび前記追加の１つ以上のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを構築する、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記合成工程が、複数の液滴を提供することであって、各液滴が前記合成サイクルの工程に対応する反応試薬を含む、提供することと、前記合成サイクルの前記工程に従って前記足場ポリヌクレオチドに前記液滴を順次送達することと、によって行われる、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
液滴の送達後かつ次の液滴の送達の前に、過剰の反応試薬を除去するために洗浄工程が実施される、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記微小流体システムがエレクトロウェッティングシステムである、請求項７８および７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記微小流体システムが、エレクトロウェッティングオン誘電体システム（ＥＷＯＤ）である、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
合成工程および構築工程が、同じシステム内で行われる、請求項７８〜８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
請求項１〜７６および７８〜８２のいずれか一項に記載の方法を実施するためのポリヌクレオチド合成システムであって、（ａ）反応領域のアレイであって、各反応領域が少なくとも１つの足場ポリヌクレオチドを含む、反応領域のアレイと、（ｂ）前記反応試薬を前記反応領域に送達するための手段と、任意選択的に（ｃ）前記足場ポリヌクレオチドからの前記合成二本鎖ポリヌクレオチドを切断するための手段と、を含む、ポリヌクレオチド合成システム。
【請求項８４】
前記反応試薬を液滴で提供するための手段と、前記合成サイクルに従って前記足場ポリヌクレオチドに前記液滴を送達するための手段とをさらに含む、請求項８３に記載のシステム。
【請求項８５】
請求項８３または８４に記載のシステムと共に使用され、請求項１〜７５のいずれか一項に記載の方法を実施するためのキットであって、前記合成サイクルの前記工程に対応する反応試薬の容量を含む、キット。
【請求項８６】
ポリヌクレオチドマイクロアレイを作製する方法であって、前記マイクロアレイが複数の反応領域を含み、各領域が所定の配列を有する１つ以上のポリヌクレオチドを含み、前記方法が、
ａ）複数の反応領域を含む表面を提供することであって、各領域が１つ以上の二本鎖アンカーまたは足場ポリヌクレオチドを含む、提供することと、
ｂ）各反応領域で請求項１〜６８のいずれか一項に記載の方法に従って合成サイクルを行い、それによって各領域で所定の配列を有する１つ以上の二本鎖ポリヌクレオチドを合成することと、を含む、方法。
【請求項８７】
合成後、前記二本鎖ポリヌクレオチドの前記鎖が分離されて、各領域が所定の配列を有する１つ以上の一本鎖ポリヌクレオチドを含むマイクロアレイを提供する、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
配列番号１〜６７のいずれか１つに定義されるような配列を有するポリヌクレオチド分子を含むヌクレオチド分子構築物。
【請求項８９】
配列番号１〜６７のいずれか１つに定義されるような配列を有するポリヌクレオチド分子を含むヌクレオチド分子構築物であって、配列番号１〜６７のいずれか１つに定義されるような各ポリヌクレオチド配列が、存在する場合、図に示されるそれぞれの修飾（複数可）によって修飾される、ヌクレオチド分子構築物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、所定のヌクレオチド配列に従ってポリヌクレオチド分子を合成するための新たな方法に関する。本発明はまた、合成後の合成ポリヌクレオチドの構築方法、ならびに合成および／または構築方法を行うためのシステムおよびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリヌクレオチド分子、特にＤＮＡの合成および構築のための２つの主な方法が現在存在する。
【０００３】
ホスホルアミダイト化学は、化学的に活性化されたＴ、Ｃ、Ａ、またはＧのモノマーを段階的なプロセスによって長さ約１００／１５０塩基のオリゴヌクレオチドに構築する合成手法である。化学反応工程は高度に感受性であり、条件は完全に無水の（水が完全に存在しない）、水性の酸化的条件と酸性条件との間で変わる（Ｒｏｙ  ａｎｄ  Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２０１３，１８，１４２６８−１４２８４）。前の反応工程からの試薬が完全に除去されていない場合、これは将来の合成工程にとって有害となるであろう。したがって、この合成方法は、長さ約１００ヌクレオチドのポリヌクレオチドの生産に限定されている。
【０００４】
ポリメラーゼ合成手法は、Ｔ、Ｃ、Ａ、およびＧ三リン酸を使用してＤＮＡ鋳型に対する相補鎖を合成するためにポリメラーゼを使用する。反応条件は水性かつ温和であり、この手法は、長さが数千塩基のＤＮＡポリヌクレオチドを合成するのに使用することができる。この方法の主な欠点は、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡをこの方法ではデノボ合成することができず、それから複製が作られるＤＮＡ鋳型を必要とすることである。（Ｋｏｓｕｒｉ  ａｎｄ  Ｃｈｕｒｃｈ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１４，１１，４９９−５０７）。
【０００５】
したがって、以前の方法は、複製される既存の鋳型分子の助けなしには二本鎖ＤＮＡをデノボ合成するために使用することができない。
【０００６】
本発明者らは、既存の鋳型分子を複製する必要なく、一本鎖および二本鎖ポリヌクレオチド分子を段階的にデノボ合成することができる新たな方法論を開発した。そのような方法はまた、ホスホルアミダイト化学技術に関連する極端な条件を回避し、対照的に、中性ｐＨ付近の温和な水性条件下で実施される。このような方法はまた、合成生物学の広範囲の適用可能性を提供し、完全なゲノムの＞１００ｍｅｒのヌクレオチド長を有する現在の合成方法に対する電位１０８改善による一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチド分子のデノボ合成を可能にする。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、所定の配列を有する二本鎖ポリヌクレオチド分子をインビトロで合成する方法であって、本方法が、合成サイクルを行うことを含み、各サイクルにおいて、第１のポリヌクレオチド鎖が所定の配列のヌクレオチドの組み込みによって伸長され、次に、第１の鎖にハイブリダイズされた第２のポリヌクレオチド鎖がヌクレオチドの組み込みによって伸長され、それによって第１の鎖の組み込まれたヌクレオチドとヌクレオチド対を形成する、方法を提供する。好ましくは、本方法はＤＮＡを合成するためのものである。
【０００８】
本明細書に記載される本発明の方法のうちのいずれにおいても、本方法は、所定の配列を有する二本鎖ポリヌクレオチド分子の合成に続いて、二本鎖ポリヌクレオチド分子の一方の鎖が除去、または複製および／または増幅される一本鎖ポリヌクレオチド分子の合成を提供し得る。
【０００９】
本明細書に記載される本発明の方法のうちのいずれにおいても、本方法は、二本鎖または一本鎖オリゴヌクレオチドの合成を提供する。したがって、本発明の方法のうちのいずれかを使用した二本鎖ポリヌクレオチドの合成に関する本明細書におけるすべての参照は、必要な変更を加えて二本鎖オリゴヌクレオチドの合成に適用される。
【００１０】
本発明の方法では、各サイクルは、所定の配列のヌクレオチドを、付着した可逆的ブロッキング基と一緒に組み込むことによって第１の鎖を伸長し、続いて第２の鎖を伸長することを含み、可逆的ブロッキング基は、第２の鎖が伸長される前または後に除去される。いかなるそのような方法においても、各サイクルにおいて、ヌクレオチドは、足場ポリヌクレオチドに組み込まれ得る。
【００１１】
本発明は、上記および本明細書に記載される方法であって、各サイクルが、
（１）足場ポリヌクレオチドを提供することと、
（２）所定の配列のヌクレオチドを、ポリメラーゼの作用によって足場ポリヌクレオチドに組み込むことであって、ヌクレオチドが、ポリメラーゼによるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基を含む、組み込むことと、
（３）足場ポリヌクレオチドを切断部位で切断することと、
（４）連結ポリヌクレオチドを切断された足場ポリヌクレオチドに連結することであって、連結ポリヌクレオチドが、（２）の所定の配列のヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドを含み、連結時に、所定の配列のヌクレオチドがパートナーヌクレオチドと対合する、連結することと、
（５）（２）の所定の配列のヌクレオチドから可逆的ターミネーター基を除去することと、を含む、方法を提供する。
【００１２】
足場ポリヌクレオチドを伴う方法では、合成鎖とそれにハイブリダイズされた支持鎖とを含む足場ポリヌクレオチドであって、合成鎖がプライマー鎖部分およびヘルパー鎖部分を含む、足場ポリヌクレオチドが提供され得る。いかなるそのような方法においても、ヘルパー鎖部分は、足場ポリヌクレオチドに所定の配列のヌクレオチドを組み込む任意の１つ以上またはすべての工程の前に、足場ポリヌクレオチドから除去され得る。
【００１３】
足場ポリヌクレオチドを伴ういかなるそのような方法においても、合成鎖は第１の鎖であり得、支持鎖は第２の鎖であり得る。
【００１４】
いかなるそのような方法においても、支持鎖は、連結ポリヌクレオチドを支持鎖に連結することによって伸長され得、各合成サイクルにおいて、連結ポリヌクレオチドは、そのサイクルにおいて第１の鎖に組み込まれた所定のヌクレオチドとヌクレオチド対を形成するヌクレオチドを含む。
【００１５】
連結ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖であり得る。好ましくは、連結ポリヌクレオチドは二本鎖である。
【００１６】
連結ポリヌクレオチドが二本鎖である方法では、連結ポリヌクレオチドは、好ましくは、支持鎖およびヘルパー鎖を含み得る。次の合成サイクルにおいて所定の配列のヌクレオチドを足場ポリヌクレオチドに組み込む工程の前に、ヘルパー鎖は足場ポリヌクレオチドから除去され得、そのような方法では、ヘルパー鎖は連結工程の後に除去される。
【００１７】
本発明は、上記に記載されるような方法であって、工程（１）が、合成鎖とそれにハイブリダイズされた支持鎖とを含む足場ポリヌクレオチドを提供することを含み、合成鎖がプライマー鎖部分を含み、支持鎖がユニバーサルヌクレオチドを含み、工程（３）が、足場ポリヌクレオチドを切断部位で切断することを含み、部位が、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドを含む配列によって定義され、切断が、支持鎖を切断すること、およびユニバーサルヌクレオチドを除去することを含み、工程（４）において、連結ポリヌクレオチドが、次のサイクルで使用するための切断部位に寄与する／定義するユニバーサルヌクレオチドを含む支持鎖を含み、連結ポリヌクレオチドが切断された足場ポリヌクレオチドの支持鎖に連結される、方法を提供する。
【００１８】
本発明は、上記に記載されるような方法であって、
（１）合成鎖とそれにハイブリダイズされた支持鎖とを含む足場ポリヌクレオチドを提供することであって、合成鎖が、一本鎖切断によって分離されたプライマー鎖部分およびヘルパー鎖部分を含み、支持鎖がユニバーサルヌクレオチドを含む、提供することと、
（２）所定の配列の１番目のヌクレオチドを、ポリメラーゼの作用によって合成鎖に組み込むことであって、１番目のヌクレオチドが、ポリメラーゼによるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基を含む、組み込むことと、
（３）足場ポリヌクレオチドを切断部位で切断することであって、部位が、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドを含む配列によって定義され、切断が、支持鎖を切断すること、およびユニバーサルヌクレオチドを除去して、合成鎖中に１番目のヌクレオチドを含む突出末端を提供することを含む、切断することと、
（４）二本鎖連結ポリヌクレオチドを切断された足場ポリヌクレオチドに連結することであって、連結ポリヌクレオチドが、支持鎖、ヘルパー鎖、および相補的連結末端を含み、連結末端が、ユニバーサルヌクレオチド、および１番目のヌクレオチドに対する（ヘルパー鎖に突出した）パートナーヌクレオチドを支持鎖中に含み、かつリン酸基を欠く末端ヌクレオチドをヘルパー鎖中に含み、連結ポリヌクレオチドの支持鎖と切断された足場ポリヌクレオチドの支持鎖との連結時に、１番目のヌクレオチドがパートナーヌクレオチドと対合する、連結することと、
（５）１番目のヌクレオチドから可逆的ターミネーター基を除去することと、
（６）所定のヌクレオチド配列の隣のヌクレオチドを、ポリメラーゼの作用によって足場ポリヌクレオチドの合成鎖に組み込むことであって、隣のヌクレオチドが、ポリメラーゼによるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基を含む、組み込むことと、
（７）足場ポリヌクレオチドを切断部位で切断することであって、部位が、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドを含む配列によって定義され、切断が、支持鎖を切断すること、およびユニバーサルヌクレオチドを除去して、合成鎖中に隣のヌクレオチドを含む突出末端を提供することを含む、切断することと、
（８）二本鎖連結ポリヌクレオチドを切断された足場ポリヌクレオチドに連結することであって、連結ポリヌクレオチドが、支持鎖、ヘルパー鎖、および相補的連結末端を含み、連結末端が、ユニバーサルヌクレオチド、およびヘルパー鎖に突出した隣のヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドを支持鎖中に含み、かつリン酸基を欠く末端ヌクレオチドをヘルパー鎖中に含み、連結ポリヌクレオチドの支持鎖と切断された足場ポリヌクレオチドの支持鎖との連結時に、隣のヌクレオチドがパートナーヌクレオチドと対合する、連結することと、
（９）隣のヌクレオチドから可逆的ターミネーター基を除去することと、
（１０）工程６〜９を複数回繰り返して、所定の塩基配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドを得ることと、を含む、方法を提供する。
【００１９】
所与の合成サイクルにおけるいかなるそのような方法においても、ユニバーサルヌクレオチドは、（ａ）工程１および６における足場ポリヌクレオチドの支持鎖中の位置ｎを占め、位置ｎが、そのサイクルに組み込まれたときに所定の配列のヌクレオチドによって占められることになる合成鎖中の位置と反対側の支持鎖中のヌクレオチド位置であり、かつ（ｂ）工程４および８における連結ポリヌクレオチドの支持鎖中の位置ｎを占め、位置ｎが、次の合成サイクルに組み込まれたときに所定の配列の隣のヌクレオチドによって占められることになる合成鎖中の位置と反対側の支持鎖中のヌクレオチド位置であり、位置ｎ−１が、ヘルパー鎖に対して遠位方向／プライマー鎖に対して近位方向においてユニバーサルヌクレオチドによって占められる位置に対する支持鎖中の隣のヌクレオチド位置であり、足場ポリヌクレオチドの支持鎖が、工程３および７における位置ｎとｎ−１との間で切断される。
【００２０】
代替的に、所与の合成サイクルにおけるそのような方法のうちのいずれにおいても、ユニバーサルヌクレオチドは、（ａ）工程１および６における足場ポリヌクレオチドの支持鎖中の位置ｎ＋１を占め、位置ｎが、そのサイクルに組み込まれたときに所定の配列のヌクレオチドによって占められることになる合成鎖中の位置と反対側の支持鎖中のヌクレオチド位置であり、かつ（ｂ）工程４および８における連結ポリヌクレオチドの支持鎖中の位置ｎ＋１を占め、位置ｎが、次の合成サイクルに組み込まれたときに所定の配列の隣のヌクレオチドによって占められることになる合成鎖中の位置と反対側の支持鎖中のヌクレオチド位置であり、位置ｎ−１が、ヘルパー鎖に対して遠位方向／プライマー鎖に対して近位方向において位置ｎに対する支持鎖中の隣のヌクレオチド位置であり、位置ｎ＋１が、ヘルパー鎖に対して近位方向／プライマー鎖に対して遠位方向において位置ｎに対する支持鎖中の隣のヌクレオチド位置であり、足場ポリヌクレオチドの支持鎖が、工程３および７における位置ｎとｎ−１との間で切断される。
【００２１】
代替的にまた、所与の合成サイクルにおけるそのような方法のうちのいずれにおいても、ユニバーサルヌクレオチドは、（ａ）工程１および６における足場ポリヌクレオチドの支持鎖中の位置ｎを占め、位置ｎが、そのサイクルに組み込まれたときに所定の配列のヌクレオチドによって占められることになる合成鎖中の位置と反対側の支持鎖中のヌクレオチド位置であり、かつ（ｂ）工程４および８における連結ポリヌクレオチドの支持鎖中の位置を占め、位置ｎが、次の合成サイクルに組み込まれたときに所定の配列の隣のヌクレオチドによって占められることになる合成鎖中の位置と反対側の支持鎖中のヌクレオチド位置であり、位置ｎ−１が、ヘルパー鎖に対して遠位方向／プライマー鎖に対して近位方向においてユニバーサルヌクレオチドによって占められる位置に対する支持鎖中の隣のヌクレオチド位置であり、位置ｎ−２が、ヘルパー鎖に対して遠位方向／プライマー鎖に対して近位方向において位置ｎ−１に対する支持鎖中の隣のヌクレオチド位置であり、足場ポリヌクレオチドの支持鎖が、工程３および７における位置ｎ−１とｎ−２との間で切断される。
【００２２】
ユニバーサルヌクレオチドが位置ｎを占め、足場ポリヌクレオチドの支持鎖が位置ｎとｎ−１との間で切断される上記および本明細書に記載されるいかなるそのような方法においても、本方法の実行は、
ａ）工程（１）／（６）において、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドが、一本鎖切断に隣接するヘルパー鎖の末端ヌクレオチドと反対側に位置付けられ、それと対合され（位置ｎ）、
ｂ）工程（２）／（６）において、１番目の／隣のヌクレオチドが、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドと反対側の位置（位置ｎ）で合成鎖に組み込まれ、そのときに１番目の／隣のヌクレオチドが、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドの適所でユニバーサルヌクレオチドと対合し、
ｃ）工程（３）／（７）において、支持鎖が、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチド位置（位置ｎ）と、ユニバーサルヌクレオチド位置の隣のヌクレオチド（位置ｎ−１、ヘルパー鎖に対して遠位方向／プライマー鎖に対して近位方向において）との間の位置で切断され、切断が、支持鎖に突出した１番目の／隣のヌクレオチドを含む足場ポリヌクレオチド中に一塩基突出を生成し、
ｄ）工程（４）／（８）において、連結ポリヌクレオチドの連結末端が、一塩基突出を含み、
ｉ．支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドが、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドと反対側に位置付けられ、それと対合され、
ｉｉ．ユニバーサルヌクレオチドが、支持鎖の末端ヌクレオチドの隣に位置付けられ（位置ｎ）、
ｉｉｉ．支持鎖の末端ヌクレオチド（位置ｎ−１）が、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドに突出し、工程（２）／（６）の１番目の／隣のヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドであることを含み得る。
【００２３】
ユニバーサルヌクレオチドが位置ｎ＋１を占め、足場ポリヌクレオチドの支持鎖が位置ｎとｎ−１との間で切断される上記および本明細書に記載されるいかなるそのような方法においても、本方法の実行は、
ａ）工程（１）において、足場ポリヌクレオチドが、工程（２）の１番目のヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドであり、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドと対合するヌクレオチド（位置ｎ）を有する支持鎖中に提供され、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドが、パートナーヌクレオチドの隣に位置付けられ（位置ｎ＋１、ヘルパー鎖の近位方向／プライマー鎖の遠位方向において）、
ｂ）工程（２）／（６）において、１番目の／隣のヌクレオチドが、支持鎖中のパートナーヌクレオチドと反対側の位置（位置ｎ）で合成鎖に組み込まれ、そのときに１番目の／隣のヌクレオチドが、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドの適所でパートナーヌクレオチドと対合し、
ｃ）工程（３）／（７）において、支持鎖が、ヘルパー鎖に対する遠位方向／プライマー鎖に対して近位方向において、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドから１番目のヌクレオチド（位置ｎ）と２番目のヌクレオチド（位置ｎ−１）との間の位置で切断され、切断が、ユニバーサルヌクレオチドを除去し、支持鎖に突出した１番目の／隣のヌクレオチドを含む足場ポリヌクレオチド中に一塩基突出を作成し、
ｄ）工程（４）／（８）において、連結ポリヌクレオチドの相補的連結末端が、一塩基突出を含み、
ｉ．支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドが、ヘルパー鎖の最後から２番目のヌクレオチドと反対側に位置付けられ（位置ｎ＋１）、それと対合され、
ｉｉ．ユニバーサルヌクレオチドが、支持鎖の最後から２番目のヌクレオチドの隣に位置付けられ（位置ｎ）、
ｉｉｉ．支持鎖の最後から２番目のヌクレオチドが、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドと対合され、次の合成サイクルの工程（６）において隣のヌクレオチドのためのパートナーヌクレオチドであり、
ｉｖ．支持鎖の末端ヌクレオチド（位置ｎ−１）が、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドに突出し、工程（２）の１番目のヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドであるか、または現在の合成サイクルの工程（６）の新たに組み込まれたヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドであることを含み得る。
【００２４】
ユニバーサルヌクレオチドが位置ｎを占め、足場ポリヌクレオチドの支持鎖が位置ｎ−１とｎ−２との間で切断される上記および本明細書に記載されるいかなるそのような方法においても、本方法の実行は、
ａ）工程（１）／（６）において、足場ポリヌクレオチドの支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドが、一本鎖切断に隣接するヘルパー鎖の末端ヌクレオチドと反対側に位置付けられ、それと対合され（位置ｎ）、
ｂ）工程（２）／（６）において、１番目の／隣のヌクレオチドが、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドと反対側の位置で合成鎖に組み込まれ、そのときに１番目の／隣のヌクレオチドが、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドの適所でユニバーサルヌクレオチドと対合し、
ｃ）工程（３）／（７）において、支持鎖が、ヘルパー鎖に対して遠位方向／プライマー鎖に対して近位方向において支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドから１番目のヌクレオチド（位置ｎ−１）と２番目のヌクレオチド（位置ｎ−２）との間の位置で切断され、切断が、ユニバーサルヌクレオチドを除去し、支持鎖に突出した１番目の／隣のヌクレオチド突出を含む足場ポリヌクレオチド中に二塩基突出を作成し、合成鎖の末端ヌクレオチドが１番目の／隣のヌクレオチドであり、
ｄ）工程（４）／（８）において、連結ポリヌクレオチドの相補的連結末端が、二塩基突出を含み、
ｉ．支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドが、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドと反対側に位置付けられ（位置ｎ）、それと対合され、
ｉｉ．ユニバーサルヌクレオチドが、支持鎖の最後から２番目のヌクレオチドの隣に位置付けられ（位置ｎ−１）、
ｉｉｉ．支持鎖の最後から２番目のヌクレオチド（位置ｎ−１）が、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチド（位置ｎ−２）に突出し、工程（２）／（６）において１番目の／隣のヌクレオチドのパートナーヌクレオチドであることを含み得る。
【００２５】
代替的な実施形態では、本発明は、上記および本明細書に記載される方法であって、
ａ）工程（１）において、足場ポリヌクレオチドが、工程（２）の１番目のヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドであるヌクレオチド（位置ｎ）を有する支持鎖中に提供され、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドが、位置ｎ＋２（ヘルパー鎖に対して近位方向／プライマー鎖に対して遠位方向において）に位置付けられ、
ｂ）工程（２）／（６）において、１番目の／隣のヌクレオチドが、支持鎖中のパートナーヌクレオチドと反対側の位置（位置ｎ）で合成鎖に組み込まれ、そのときに１番目の／隣のヌクレオチドが、パートナーヌクレオチドと対合し、
ｃ）工程（３）／（７）において、支持鎖が、ヘルパー鎖に対して遠位方向／プライマー鎖に対して近位方向において支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドから２番目のヌクレオチド（位置ｎ）と３番目のヌクレオチド（位置ｎ−１）との間の位置で切断され、切断がユニバーサルヌクレオチドを除去し、支持鎖に突出した１番目の／隣のヌクレオチドを含む足場ポリヌクレオチド中に一塩基突出を作成し、
ｄ）工程（４）／（８）において、連結ポリヌクレオチドの相補的連結末端が、一塩基突出を含み、
ｉ．ユニバーサルヌクレオチドが、ヘルパー鎖中のヌクレオチドと反対側の支持鎖中の位置ｎ＋２に位置付けられ、それと対合され、
ｉｉ．支持鎖の最後から２番目のヌクレオチドが、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドと対合され、次の合成サイクルの工程（６）における隣のヌクレオチドのパートナーヌクレオチドであり（位置ｎ）、
ｉｉｉ．支持鎖の末端ヌクレオチド（位置ｎ−１）が、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドに突出し、工程（２）の１番目のヌクレオチドのパートナーヌクレオチドであるか、または現在の合成サイクルの工程（６）の新たに組み込まれたヌクレオチドのパートナーヌクレオチドである、方法を提供する。
【００２６】
直前に記載されたこの方法の修正例では、工程（１）において、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドは、位置ｎ＋３（ヘルパー鎖に対して近位方向／プライマー鎖に対して遠位方向において）に位置付けられ、工程（４）／（８）において、連結ポリヌクレオチドの相補的連結末端に、位置ｎ＋３に位置付けられた支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドが提供される。代替的に、工程（１）において、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドは、位置ｎ＋３＋ｘ（ヘルパー鎖に対して近位方向／プライマー鎖に対して遠位方向において）に位置付けられ、工程（４）／（８）において、連結ポリヌクレオチドの相補的連結末端に、位置ｎ＋３＋ｘに位置付けられた支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドが提供され、ここでｘは１〜１０以上の整数である。
【００２７】
さらなる代替的な実施形態では、本発明は、上記および本明細書に記載される方法であって、
ａ）工程（１）において、足場ポリヌクレオチドが、工程（２）の１番目のヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドであるヌクレオチド（位置ｎ）を有する支持鎖中に提供され、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドは、位置ｎ＋１（ヘルパー鎖に対して近位方向／プライマー鎖に対して遠位方向において）に位置付けられ、
ｂ）工程（２）／（６）において、１番目の／隣のヌクレオチドが、支持鎖中のパートナーヌクレオチドと反対側の位置（位置ｎ）で合成鎖に組み込まれ、そのときに１番目の／隣のヌクレオチドが、パートナーヌクレオチドと対合し、
ｃ）工程（３）／（７）において、支持鎖が、ヘルパー鎖に対して遠位方向／プライマー鎖に対して近位方向において、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドから２番目のヌクレオチド（位置ｎ−１）と３番目のヌクレオチド（位置ｎ−２）との間の位置で切断され、切断がユニバーサルヌクレオチドを除去し、支持鎖に突出した１番目の／隣のヌクレオチドを含む足場ポリヌクレオチド中に二塩基突出を作成し、
ｄ）工程（４）／（８）において、連結ポリヌクレオチドの相補的連結末端が、二塩基突出を含み、
ｉ．支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドが、ヘルパー鎖中のヌクレオチドと反対側の位置ｎ＋１に位置付けられ、それと対合され、
ｉｉ．支持鎖の最後から２番目のヌクレオチド（位置ｎ−１）が、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドに突出し、工程（２）の１番目のヌクレオチドのパートナーヌクレオチドであるか、または現在の合成サイクルの工程（６）の新たに組み込まれたヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドであり、
ｉｉｉ．支持鎖の位置ｎのヌクレオチドが、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドと対合され、次の合成サイクルの工程（６）における隣のヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドである、方法を提供する。
【００２８】
直前に記載されたこの方法の修正例では、工程（１）において、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドは、位置ｎ＋２（ヘルパー鎖に対して近位方向／プライマー鎖に対して遠位方向において）に位置付けられ、工程（４）／（８）において、連結ポリヌクレオチドの相補的連結末端に、位置ｎ＋２に位置付けられる支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドが提供される。代替的に、工程（１）において、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドは、位置ｎ＋２＋ｘ（ヘルパー鎖に対して近位方向／プライマー鎖に対して遠位方向において）に位置付けられ、工程（４）／（８）において、連結ポリヌクレオチドの相補的連結末端に、位置ｎ＋２＋ｘに位置付けられる支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドが提供され、ここでｘは１〜１０以上の整数である。
【００２９】
上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、所定の配列の１番目の／隣のヌクレオチドと対合するヌクレオチドは、１番目の／隣のヌクレオチドと相補的なヌクレオチド、好ましくは天然に相補的なヌクレオチドであり得る。
【００３０】
上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、工程（１）／（６）は、合成鎖とそれにハイブリダイズされた支持鎖とを含む足場ポリヌクレオチドを提供することであって、合成鎖がヘルパー鎖部分を含まずに提供される、提供することを含み得る。
【００３１】
上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、任意の１つ以上の合成サイクルにおいて、またはすべての合成サイクルにおいて、二本鎖連結ポリヌクレオチドを切断された足場ポリヌクレオチドに連結する工程の後で、かつ隣のものを所定のヌクレオチド配列の隣のヌクレオチドを足場ポリヌクレオチドの合成鎖に組み込む工程の前に、合成鎖のヘルパー鎖部分は、足場ポリヌクレオチドから除去され得る。いかなるそのような方法においても、合成鎖のヘルパー鎖部分は、（ｉ）足場ポリヌクレオチドを約８０℃〜約９５℃の温度に加熱し、足場ヌクレオチドからヘルパー鎖部分を分離すること、（ｉｉ）足場ポリヌクレオチドを８Ｍ尿素などの尿素溶液で処理し、足場ポリヌクレオチドからヘルパー鎖部分を分離すること、（ｉｉｉ）足場ポリヌクレオチドをホルムアミドまたは１００％ホルムアミドなどのホルムアミド溶液で処理し、足場ポリヌクレオチドからヘルパー鎖部分を分離すること、または（ｉｖ）足場ポリヌクレオチドを、ヘルパー鎖部分の配列と相補的であるヌクレオチド配列の領域を含む一本鎖ポリヌクレオチド分子と接触させ、それによってヘルパー鎖部分の足場ポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションを競合的に阻害することによって、足場ポリヌクレオチドから除去することができる。
【００３２】
ユニバーサルヌクレオチドが位置ｎを占め、足場ポリヌクレオチドの支持鎖が位置ｎとｎ−１との間で切断される上記および本明細書に記載されるいかなるそのような方法においても、各切断工程は、ユニバーサルヌクレオチドを除去し、よって脱塩基部位を形成することを含む第１の工程と、脱塩基部位で支持鎖を切断することを含む第２の工程と、を含み得る。いかなるそのような方法においても、第１の工程は、ヌクレオチド除去酵素を用いて行われ得る。ヌクレオチド除去酵素は、３−メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ酵素であり得る。ヌクレオチド除去酵素は、ヒトアルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｈＡＡＧ）であり得る。いかなるそのような方法においても、第２の工程は、塩基である化学物質を用いて行われ得る。塩基はＮａＯＨであり得る。いかなるそのような方法においても、第２の工程は、脱塩基部位切断活性を有する有機化学物質を用いて行われ得る。有機化学物質は、Ｎ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミンであり得る。いかなるそのような方法においても、第２の工程は、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩのような脱塩基部位リアーゼ活性を有する酵素を用いて行われ得る。
【００３３】
ユニバーサルヌクレオチドが位置ｎ＋１を占め、足場ポリヌクレオチドの支持鎖が位置ｎとｎ−１との間で切断される上記および本明細書に記載されるいかなるそのような方法においても、またはユニバーサルヌクレオチドが位置ｎを占め、足場ポリヌクレオチドの支持鎖が位置ｎ−１とｎ−２との間で切断されるそのような方法のうちのいずれにおいても、切断工程は、酵素で支持鎖を切断することを含み得る。酵素は、プライマー鎖部分に対して近位方向においてユニバーサルヌクレオチドの隣のヌクレオチドの後で支持鎖を切断し、それによって１番目の／隣のヌクレオチドを含む合成鎖中に突出末端を作成し得る。そのような酵素はエンドヌクレアーゼＶであり得る。
【００３４】
上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、合成二本鎖ポリヌクレオチドの両方の鎖は、ＤＮＡ鎖であり得る。合成鎖および支持鎖はＤＮＡ鎖であり得る。そのような場合、組み込まれたヌクレオチドは、好ましくはｄＮＴＰ、好ましくは可逆的ターミネーター基を含むｄＮＴＰである。いかなるそのような方法においても、可逆的ターミネーター基を含む組み込まれたヌクレオチドのうちのいずれか１つ以上またはすべてが、３’−Ｏ−アリル−ｄＮＴＰまたは３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＮＴＰを含み得る。
【００３５】
上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、合成二本鎖ポリヌクレオチドの第１の鎖はＤＮＡ鎖であり得、合成二本鎖ポリヌクレオチドの第２の鎖はＲＮＡ鎖であり得る。合成鎖はＲＮＡ鎖であり得、支持鎖はＤＮＡ鎖であり得る。そのような場合、組み込まれたヌクレオチドは、好ましくはＮＴＰ、好ましくは可逆的ターミネーター基を含むＮＴＰである。いかなるそのような方法においても、可逆的ターミネーター基を含む組み込まれたヌクレオチドのうちのいずれか１つ以上またはすべてが、３’−Ｏ−アリル−ＮＴＰまたは３’−Ｏ−アジドメチル−ＮＴＰであり得る。
【００３６】
ＤＮＡを含む合成鎖へのヌクレオチドの組み込み、例えば１つ以上のｄＮＴＰの組み込みを伴う上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、酵素は、ポリメラーゼ、好ましくはＤＮＡポリメラーゼ、より好ましくは非修飾ポリメラーゼと比較して、可逆的ターミネーター基を含むｄＮＴＰを組み込む能力が増強された修飾ＤＮＡポリメラーゼであり得る。ポリメラーゼは、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種９°Ｎ、好ましくは種９°Ｎ−７由来の天然ＤＮＡポリメラーゼの変異体であり得る。
【００３７】
ＲＮＡを含む合成鎖へのヌクレオチドの組み込み、例えば１つ以上のＮＴＰの組み込みを伴う上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、酵素は、ポリメラーゼ、好ましくはＴ３またはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼなどのＲＮＡポリメラーゼ、より好ましくは非修飾ポリメラーゼと比較して、可逆的ターミネーター基を含むＮＴＰを組み込む能力が増強された修飾ＲＮＡポリメラーゼであり得る。
【００３８】
上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、合成二本鎖ポリヌクレオチドの第１の鎖はＤＮＡ鎖であり得、合成二本鎖ポリヌクレオチドの第２の鎖はＲＮＡ鎖であり得る。代替的に、合成二本鎖ポリヌクレオチドの第１の鎖はＲＮＡ鎖であり得、合成二本鎖ポリヌクレオチドの第２の鎖はＤＮＡ鎖であり得る。
【００３９】
上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、１番目の／隣のヌクレオチドから可逆的ターミネーター基を除去する工程は、トリス（カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を用いて行われ得る。
【００４０】
上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、二本鎖連結ポリヌクレオチドを切断された足場ポリヌクレオチドに連結する工程は、好ましくはリガーゼ酵素を用いて行われる。リガーゼ酵素は、Ｔ３  ＤＮＡリガーゼまたはＴ４  ＤＮＡリガーゼであり得る。
【００４１】
上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、工程（１）および／または（６）において、ヘルパー鎖とそれにハイブリダイズされた支持鎖の部分とが、ヘアピンループによって接続され得る。
【００４２】
上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、工程（１）において、プライマー鎖部分とそれにハイブリダイズされた支持鎖の部分とが、ヘアピンループによって接続され得る。
【００４３】
上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、工程（１）および／または（６）において、
ａ）ヘルパー鎖とそれにハイブリダイズされた支持鎖の部分とが、ヘアピンループによって接続され得、
ｂ）プライマー鎖部分を含む合成鎖とそれにハイブリダイズされた支持鎖の部分とが、ヘアピンループによって接続され得る。
【００４４】
上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、連結ポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つ以上またはすべてが、突出端部と反対側の端部で支持鎖とヘルパー鎖とを接続するヘアピンループを含む単一分子として提供され得る。上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、各合成サイクルの連結ポリヌクレオチドは、突出末端と反対側の末端で支持鎖とヘルパー鎖とを接続するヘアピンループをそれぞれ含む単一分子として提供され得る。
【００４５】
上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、工程（１）において、プライマー鎖部分を含む合成鎖とそれにハイブリダイズされた支持鎖の部分とが、共通の表面に繋留され得る。プライマー鎖部分とそれにハイブリダイズされた支持鎖の部分とが、それぞれ切断可能なリンカーを含み得、リンカーは、合成後に表面から二本鎖ポリヌクレオチドを切り離すために切断され得る。
【００４６】
上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、工程（１）において、合成鎖のプライマー鎖部分とそれにハイブリダイズされた支持鎖の部分とが、ヘアピンループによって接続され得、ヘアピンループは表面に繋留されている。
【００４７】
上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、ヘアピンループは、切断可能なリンカーを介して表面に繋留され得、リンカーは、合成後に表面から二本鎖ポリヌクレオチドを切り離すために切断され得る。切断可能なリンカーは、ＵＶ切断可能なリンカーであり得る。
【００４８】
上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、ポリヌクレオチドが付着している表面は、微粒子の表面または平坦な表面であり得る。
【００４９】
上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、ポリヌクレオチドが付着している表面はゲルを含み得る。表面は、約２％のポリアクリルアミドなどのポリアクリルアミド表面を含み、好ましくはポリアクリルアミド表面は、ガラスなどの固体支持体に結合されている。
【００５０】
上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、プライマー鎖部分を含む合成鎖とそれにハイブリダイズされた支持鎖の部分とが、１つ以上の共有結合を介して共通の表面に繋留され得る。１つ以上の共有結合は、共通の表面上の官能基と足場分子上の官能基との間に形成され得、足場分子上の官能基は、アミン基、チオール基、チオリン酸基、またはチオアミド基であり得る。共通の表面上の官能基は、ブロモアセチル基であり得、任意選択的に、ブロモアセチル基は、Ｎ−（５−ブロモアセトアミジルペンチル）アクリルアミド（ＢＲＡＰＡ）を使用して得られるポリアクリルアミド表面上に提供される。
【００５１】
上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、所定の配列のヌクレオチドから可逆的ターミネーター基を除去する工程は、切断工程の前、または連結工程の前に行われ得る。
【００５２】
上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、上記および本明細書に記載される合成サイクルのうちのいずれかに関する反応は、微小流体システム内の液滴中で行われ得る。微小流体システムは、エレクトロウェッティングシステムであり得る。微小流体システムは、エレクトロウェッティングオン誘電体システム（ＥＷＯＤ）であり得る。
【００５３】
関連する態様では、本発明はさらに、所定の配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドをインビトロで合成する合成方法におけるユニバーサルヌクレオチドの使用であって、ユニバーサルヌクレオチドを使用して、各合成サイクル中にポリヌクレオチド切断部位を作成し、各合成サイクルにおいて、当該使用が、合成鎖とそれにハイブリダイズされた支持鎖とを含む足場ポリヌクレオチドを提供することであって、合成鎖が、プライマー鎖部分および任意選択的にプライマー鎖部分から一本鎖切断によって分離されたヘルパー鎖部分を含み、ユニバーサルヌクレオチドが支持鎖中に提供される、提供することと、可逆的ターミネーター基を含む所定の配列の新たなヌクレオチドをポリメラーゼによって合成鎖に組み込むことであって、新たなヌクレオチドが、ユニバーサルヌクレオチドを含むポリヌクレオチド切断部位を定義するように、ユニバーサルヌクレオチドと近接する足場ポリヌクレオチド中の位置を占める、組み込むことと、足場ポリヌクレオチドを切断部位で切断することであって、そのときにユニバーサルヌクレオチドが足場ポリヌクレオチドから除去され、切断された末端が足場ポリヌクレオチド中に作成され、突出末端が新たなヌクレオチドを含む合成鎖中に作成される、切断することと、を含み、切断された末端が、支持鎖とそれにハイブリダイズされたヘルパー鎖とを有する連結ポリヌクレオチドに対する連結アクセプター部位として作用し、支持鎖が、足場ポリヌクレオチドの合成鎖中の新たなヌクレオチドと対合するためのヌクレオチドを含み、次の合成サイクルで使用するための新たなユニバーサルヌクレオチドをさらに含む、使用をさらに提供する。所定の配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドを合成する方法におけるユニバーサルヌクレオチドのそのような使用は、上記および本明細書に定義および記載されたる特定の方法のうちのいずれかを使用して実施され得る。
【００５４】
関連する態様では、本発明はさらに、ポリヌクレオチド分子の合成鎖を所定のヌクレオチドでインビトロで伸長させる方法を提供し、本方法は、合成鎖とそれにハイブリダイズされた支持鎖とを含む足場ポリヌクレオチドを提供することであって、合成鎖が、プライマー鎖部分、および任意選択的に一本鎖切断によってプライマー鎖部分から分離されたヘルパー鎖部分を含み、ユニバーサルヌクレオチドが支持鎖中に提供される、提供することと、可逆的ターミネーター基を含む所定のヌクレオチドをポリメラーゼによって合成鎖に組み込むことであって、所定のヌクレオチドが、ユニバーサルヌクレオチドを含むポリヌクレオチド切断部位を定義するように、ユニバーサルポリヌクレオチドと近接する足場ポリヌクレオチド中の位置を占める、組み込むことと、足場ポリヌクレオチドを切断部位で切断することであって、そのときにユニバーサルヌクレオチドが足場ポリヌクレオチドから除去され、切断された末端が足場ポリヌクレオチド中に作成され、突出末端が、所定のヌクレオチドを含む合成鎖中に作成される、切断することと、を含み、切断された末端が、支持鎖とそれにハイブリダイズされたヘルパー鎖とを有する連結ポリヌクレオチドに対する連結アクセプター部位として作用し、支持鎖が、足場ポリヌクレオチドの合成鎖中の所定のヌクレオチドと対合するためのヌクレオチドを含み、次の合成サイクルで使用するための新たなユニバーサルヌクレオチドをさらに含む、方法をさらに提供する。ポリヌクレオチド分子の合成鎖を所定のヌクレオチドで伸長させるいかなるそのような方法においても、本方法は、上記および本明細書に定義および記載される任意の特定の方法のうちのいずれかを使用して実施され得る。
【００５５】
関連する態様では、本発明はさらに、所定の配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドをインビトロで合成する方法であって、本方法が合成サイクルを含み、各合成サイクルが、合成鎖とそれにハイブリダイズされた支持鎖とを含む足場ポリヌクレオチドを提供することであって、合成鎖が、プライマー鎖部分、および任意選択的に一本鎖切断によってプライマー鎖部分から分離されたヘルパー鎖部分を含み、ユニバーサルヌクレオチドが支持鎖中に提供される、提供することと、可逆的ターミネーター基を含む所定の配列の新たなヌクレオチドをポリメラーゼによって合成鎖に組み込むことであって、新たなヌクレオチドが、ユニバーサルヌクレオチドを含むポリヌクレオチド切断部位を定義するように、ユニバーサルヌクレオチドに近接する足場ポリヌクレオチド中の位置を占める、組み込むことと、足場ポリヌクレオチドを切断部位で切断することであって、そのときにユニバーサルヌクレオチドが足場ポリヌクレオチドから除去され、切断された末端が足場ポリヌクレオチド中に作成され、突出末端が新たなヌクレオチドを含む合成鎖中に作成される、切断することと、支持鎖とそれにハイブリダイズされたヘルパー鎖とを有する連結ポリヌクレオチドを切断された末端に連結することであって、支持鎖が、足場ポリヌクレオチドの合成鎖中の新たなヌクレオチドと対合するためのヌクレオチドを含み、次の合成サイクルで使用するための新たな足場ポリヌクレオチドをさらに含む、連結することと、切断または連結工程の後に新たなヌクレオチドから可逆的ターミネーター基を除去して、次の合成サイクルで使用するための新たな足場ポリヌクレオチドを作成することと、任意選択的に、連結工程の後に、かつ次のサイクルの組み込み工程の前にヘルパー鎖を除去することと、を含む、方法を提供する。所定の配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドを合成するいかなるそのような方法においても、本方法は、上記および本明細書に定義および記載される特定の方法のうちのいずれかを使用して実施され得る。
【００５６】
関連する態様では、本発明はさらに、所定の配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドを合成するサイクル中に、ユニバーサルヌクレオチドを含む連結ポリンクレオチドを二本鎖ポリンクレオチドにインビトロで連結する方法であって、合成サイクル中に、二本鎖ポリヌクレオチドが、所定のヌクレオチドおよびそのパートナーで伸長され、本方法が、合成鎖とそれにハイブリダイズされた支持鎖とを含む足場ポリヌクレオチドを提供することであって、合成鎖が、プライマー鎖部分、および任意選択的に一本鎖切断によってプライマー鎖部分から分離されたヘルパー鎖部分を含み、ユニバーサルヌクレオチドが支持鎖中に提供される、提供することと、可逆的ターミネーター基を含む所定の配列の新たなヌクレオチドをポリメラーゼによって合成鎖に組み込むことであって、新たなヌクレオチドが、ユニバーサルヌクレオチドを含むポリヌクレオチド切断部位を定義するように、ユニバーサルヌクレオチドに近接する足場ポリヌクレオチド中の位置を占める、組み込むことと、足場ポリヌクレオチドを切断部位で切断することであって、そのときにユニバーサルヌクレオチドが足場ポリヌクレオチドから除去され、切断された末端が足場ポリヌクレオチド中に作成され、突出末端が新たなヌクレオチドを含む合成鎖中に作成される、切断することと、支持鎖とそれにハイブリダイズされたヘルパー鎖とを有する連結ポリヌクレオチドを切断された末端に連結することであって、支持鎖が、足場ポリヌクレオチドの合成鎖中の新たなヌクレオチドと対合するためのヌクレオチドを含み、次の合成サイクルで使用するための新たな足場ポリヌクレオチドをさらに含む、連結することと、切断または連結工程の後に新たなヌクレオチドから可逆的ターミネーター基を除去して、次の合成サイクルで使用するための新たな足場ポリヌクレオチドを作成することと、任意選択的に、連結工程の後に、かつ次のサイクルの組み込み工程の前にヘルパー鎖を除去することと、を含む、方法を提供する。所定の配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドを合成するサイクル中に、ユニバーサルヌクレオチドを含む連結ポリヌクレオチドを二本鎖ポリヌクレオチドに連結するいかなるそのような方法においても、本方法は、上記および本明細書に定義および記載される特定の方法のうちのいずれかを使用して実施され得る。
【００５７】
上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、合成後、二本鎖ポリヌクレオチドの鎖を分離して、所定の配列を有する一本鎖ポリヌクレオチドを得ることができる。
【００５８】
上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、合成後、二本鎖ポリヌクレオチドまたはその領域を、好ましくはＰＣＲによって増幅させる。
【００５９】
本発明はまた、所定の配列を有するポリヌクレオチドを構築する方法であって、所定の配列を有する第１のポリヌクレオチドと所定の配列を有する１つ以上の追加のポリヌクレオチドとを合成するために、上記および本明細書に記載される合成方法のうちのいずれかを行うことと、第１および１つ以上の追加のポリヌクレオチドを一緒に接合することと、を含む、方法を提供する。第１および１つ以上の追加のポリヌクレオチドは、好ましくは異なる所定の配列を含み得る。第１のポリヌクレオチドおよび１つ以上の追加のポリヌクレオチドは、二本鎖であり得るか、または一本鎖であり得る。第１のポリヌクレオチドおよび１つ以上の追加のポリヌクレオチドを最初に切断して、適合する末端を作成し、次に、例えば連結によって一緒に接合することができる。第１のポリヌクレオチドおよび１つ以上の追加のポリヌクレオチドは、切断部位で制限酵素によって切断されて、適合する末端を作成することができる。
【００６０】
上記および本明細書に記載されるような所定の配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドをインビトロで合成するための方法のうちのいずれも、および／または上記および本明細書に記載されるような所定の配列を有するポリヌクレオチドをインビトロで構築する方法のうちのいずれも、微小流体システム内の液滴中で行われ得る。いかなるそのような方法においても、本構築方法は、所定の配列を有する第１の合成ポリヌクレオチドを含む第１の液滴と、所定の配列を有する追加の１つ以上の合成ポリヌクレオチドを含む第２の液滴とを提供することを含み、液滴が互いに接触し、合成ポリヌクレオチドが一緒に接合され、それによって第１のポリヌクレオチドおよび追加の１つ以上のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを構築する、構築工程を含み得る。いかなるそのような方法おいても、合成工程は、複数の液滴を提供することであって、各液滴が合成サイクルの工程に対応する反応試薬を含む、提供することと、合成サイクルの工程に従って足場ポリヌクレオチドに液滴を順次送達することと、によって行われ得る。いかなるそのような方法においても、液滴の送達後かつ次の液滴の送達前に、過剰の反応試薬を除去するために洗浄工程を実施することができる。いかなるそのような方法においても、微小流体システムは、エレクトロウェッティングシステムであり得る。いかなるそのような方法においても、微小流体システムは、エレクトロウェッティングオン誘電体システム（ＥＷＯＤ）であり得る。いかなるそのような方法においても、合成工程および構築工程は、同じシステム内で行われ得る。
【００６１】
本発明は追加的に、上記および本明細書に記載される合成および／または構築方法のうちのいずれかを実施するためのポリヌクレオチド合成システムであって、（ａ）反応領域のアレイであって、各反応領域が少なくとも１つの足場ポリヌクレオチドを含む、反応領域のアレイ、（ｂ）反応試薬を反応領域に送達するための手段、および任意選択的に（ｃ）足場ポリヌクレオチドから合成二本鎖ポリヌクレオチドを切断するための手段を含む、ポリヌクレオチド合成システムを提供する。このようなシステムはさらに、反応試薬を液滴で提供するための手段と、合成サイクルに従って足場ポリヌクレオチドに液滴を送達するための手段とを含み得る。
【００６２】
本発明はさらに、上記および本明細書に記載されるシステムのうちのいずれかと共に使用するための、ならびに上記および本明細書に記載される合成方法のうちのいずれかを実施するためのキットであって、合成サイクルの工程に対応する反応試薬の容量を含む、キットを提供する。
【００６３】
本発明はまた、ポリヌクレオチドマイクロアレイを作製する方法であって、マイクロアレイが複数の反応領域を含み、各領域が所定の配列を有する１つ以上のポリヌクレオチドを含み、本方法が、
ａ）複数の反応領域を含む表面を提供することであって、各領域が１つ以上の二本鎖アンカーまたは足場ポリヌクレオチドを含む、提供することと、
ｂ）上記および本明細書に記載される方法のいずれかに従って各反応領域で合成サイクルを行い、それによって所定の配列を有する１つ以上の二本鎖ポリヌクレオチドを各領域で合成することと、を含む、方法を提供する。
【００６４】
そのような方法では、合成後、二本鎖ポリヌクレオチドの鎖を分離して、各領域が所定の配列を有する１つ以上の一本鎖ポリヌクレオチドを含む、マイクロアレイを提供することができる。
【００６５】
本発明はまた、配列番号１〜６７のいずれか１つに定義されているような配列を有するポリヌクレオチド分子を含むヌクレオチド分子構築物に関する。
【００６６】
本発明はまた、配列番号１〜６７のいずれか１つに定義されるような配列を有するポリヌクレオチド分子を含むヌクレオチド分子構築物であって、配列番号１〜６７のいずれか１つに定義されるような各ポリヌクレオチド配列が、存在する場合、図に示されるそれぞれの修飾（複数可）、ならびに本明細書に記載される末端修飾により修飾される。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
本明細書に提示され、以下に記載される関連図は、本発明の方法を使用する合成サイクルの工程のうちのいくつかまたはすべて、ならびにオリゴヌクレオチド、表面、表面付着化学、リンカーなどの方法の態様を行うための手段を示す。これらの図ならびにそれらのすべての記載およびすべての関連する方法、試薬、およびプロトコルは、例示のためだけに提示されたものであり、限定的に解釈されるべきではない。
【００６８】
例えば、図１、２、３ａ、３ｂ、３ｃ、６ａ、７ａ、８ａ等の関連図は、ヌクレオチド（例えば、可逆的ターミネーター基を含むヌクレオチド）の組み込み、切断（例えば、足場ポリヌクレオチドを第１の部分と第２の部分とに切断し、第１の部分はユニバーサルヌクレオチドを含み、第２の部分は組み込まれたヌクレオチドを含む）、連結（例えば、一本鎖部分を含むポリヌクレオチド構築物を、組み込まれたヌクレオチドを含む切断された足場ポリヌクレオチドの第２の部分に連結し、一本鎖部分は、組み込まれたヌクレオチドに相補的なパートナーヌクレオチドを含む）、および脱保護（例えば、組み込まれたヌクレオチドからの可逆的ターミネーター基の除去）を含む合成サイクルの工程のうちのいくつかまたはすべてを示す。
【００６９】
【図１】例示的な方法のバージョン１のスキーム。  足場ポリヌクレオチドの提供、組み込み、切断、連結、および脱保護のサイクルを含む、例示的な方法のバージョン１による第１の合成サイクルを示すスキーム。このスキームは、第１の合成サイクル（１０１、１０２）におけるチミンヌクレオチドの組み込み、およびパートナーアデニンヌクレオチド（１０４）と反対側のその対合、ならびに次の合成サイクルで使用するための足場ポリヌクレオチド（１０６）の提供を示す。この対は、例示の目的のみのために示されており、限定するものではなく、必要とされる所定の配列に応じた任意の対であり得る。ヌクレオチドＺは、任意のヌクレオチドであり得る。ヌクレオチドＸは、任意の好適なヌクレオチドであり得る。図はまた、第２の合成サイクルに対応する参照符号を示す。
【図２】例示的な方法のバージョン２のスキーム。  足場ポリヌクレオチドの提供、組み込み、切断、連結、および脱保護のサイクルを含む、例示的な方法のバージョン２による第１の合成サイクルを示すスキーム。このスキームは、第１のサイクル（２０１、２０２）におけるチミンヌクレオチドおよびパートナーアデニンヌクレオチド（２０４）と反対側のその対合の組み込み、ならびに次の合成サイクルにおいてシトシンと対合するためのグアニンを含む足場ポリヌクレオチド（２０６）の提供を示す。これらの対は、例示の目的のみのために示されており、限定するものではなく、必要とされる所定の配列に応じた任意の対であり得る。ヌクレオチドＺは、任意のヌクレオチドであり得る。ヌクレオチドＸは、任意の好適なヌクレオチドであり得る。図はまた、第２の合成サイクルに対応する参照符号を示す。
【図３ａ】例示的な方法のバージョン３のスキーム。  足場ポリヌクレオチドの提供、組み込み、切断、連結、および脱保護のサイクルを含む、例示的な方法のバージョン３による第１の合成サイクルを示すスキーム。このスキームは、第１のサイクル（３０１、３０２）におけるチミンヌクレオチドおよびパートナーアデニンヌクレオチド（３０４）と反対側のその対合の組み込み、ならびに次の合成サイクルで使用するための足場ポリヌクレオチド（３０６）の提供を示す。この対は、例示の目的のみのために示されており、限定するものではなく、必要とされる所定の配列に応じた任意の対であり得る。このスキームはまた、足場ポリヌクレオチドの成分としてのシトシン−グアニン対を示し、これは所定の配列の一部ではない。この対はまた、例示の目的のみのために示されており、限定するものではなく、任意の対であり得る。ヌクレオチドＺは、任意のヌクレオチドであり得る。ヌクレオチドＸは、任意の好適なヌクレオチドであり得る。
【図３ｂ】例示的な方法のバージョン４のスキーム。  足場ポリヌクレオチドの提供、組み込み、切断、連結、および脱保護のサイクルを含む、例示的な方法のバージョン４による第１の合成サイクルを示すスキーム。このスキームは、第１のサイクル（４０１、４０２）におけるチミンヌクレオチドおよびパートナーユニバーサルヌクレオチド（４０４）と反対側のその対合の組み込み、ならびに次の合成サイクルにおいてシトシンと対合するためのグアニンを含む足場ポリヌクレオチド（４０６）の提供を示す。これらの対は、例示の目的のみのために示されており、限定するものではなく、必要とされる所定の配列に応じた任意の対であり得る。ヌクレオチドＸ、Ｙ、およびＺは、任意のヌクレオチドであり得る。
【図３ｃ】例示的な方法のバージョン５のスキーム。  足場ポリヌクレオチドの提供、組み込み、切断、連結、および脱保護のサイクルを含む、例示的な方法のバージョン５による第１の合成サイクルを示すスキーム。このスキームは、第１のサイクル（５０１、５０２）におけるチミンヌクレオチドおよびパートナーアデニンヌクレオチド（５０４）と反対側のその対合の組み込み、ならびに次の合成サイクルにおいてシトシンと対合するためのグアニンを含む足場ポリヌクレオチド（５０６）の提供を示す。このスキームはまた、足場ポリヌクレオチドの成分としてのシトシン−グアニン対（位置ｎ−２）を示し、これは所定の配列の一部ではない。これらの対は、例示の目的のみのために示されており、限定するものではなく、必要とされる所定の配列に応じた任意の対であり得る。ヌクレオチドＸ、Ｙ、およびＺは、任意のヌクレオチドであり得る。
【図４】足場ポリヌクレオチドの表面固定化を示すスキーム。  スキームは、足場ポリヌクレオチドの可能な例示的なヘアピンループ構成およびそれらの表面への固定化を示す（ａ〜ｈ）。  スキーム（ｉおよびｊ）は、ポリヌクレオチドを表面に付着させるための表面化学の例を示す。実施例は、両方の鎖がヘアピンを介して接続されている二本鎖の実施形態を示しているが、非接続二本鎖ポリヌクレオチドの一方または両方の鎖を付着させるために同じ化学を使用することができる。
【図５】ヘルパー鎖の不在−組み込み。  ａ）破線枠で強調表示されている組み込み工程を示すスキーム。  ｂ）イノシンと反対側の３’−Ｏ−修飾−ｄＴＴＰの組み込みについてのＤＮＡポリメラーゼの評価。図は、５０℃のＭｎ２＋イオンの存在下での様々なＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｓｔ、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ（エキソ）、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩおよびＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ）による３’−Ｏ−修飾−ｄＴＴＰの組み込みの結果を示すゲルを図示する。レーン１：Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼを使用した３’−Ｏ−アリル−ｄＴＴＰの組み込み。レーン２：Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼを使用した３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＴＴＰの組み込み。レーン３：Ｄｅｅｐ  ｖｅｎｔ（エキソ）ＤＮＡポリメラーゼを使用した３’−Ｏ−アリル−ｄＴＴＰの組み込み。レーン４：Ｄｅｅｐ  ｖｅｎｔ（エキソ）ＤＮＡポリメラーゼを使用した３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＴＴＰの組み込み。レーン５：Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｉ  ＤＮＡポリメラーゼを使用した３’−Ｏ−アリル−ｄＴＴＰの組み込み。レーン６：Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｉ  ＤＮＡポリメラーゼを使用した３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＴＴＰの組み込み。レーン７：Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼを使用した３’−Ｏ−アリル−ｄＴＴＰの組み込み。レーン８：Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼを使用した３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＴＴＰの組み込み。  ｃ）イノシンと反対側の３’−Ｏ−修飾−ｄＴＴＰの組み込みについてのＤＮＡポリメラーゼの評価。様々なＤＮＡポリメラーゼを使用した組み込みの結果。  ｄ）Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼを使用した組み込みについての温度の評価。図は、様々な温度でＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼを使用したＭｎ２＋イオンの存在下でのイノシンと反対側の３’−修飾−ｄＴＴＰの組み込みの結果を示すゲルを図示する。レーン１：３７℃での３’−Ｏ−アリル−ｄＴＴＰの組み込み。レーン２：３７℃での３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＴＴＰの組み込み。レーン３：５０℃での３’−Ｏ−アリル−ｄＴＴＰの組み込み。レーン４：５０℃での３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＴＴＰの組み込み。レーン５：６５℃での３’−Ｏ−アリル−ｄＴＴＰの組み込み。レーン６：６５℃での３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＴＴＰの組み込み。  ｅ）Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼを使用した組み込みについての温度の評価。異なる温度で行われた組み込みの結果。  ｆ）Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼを使用した組み込みについてのＭｎ２＋の存在の評価。図は、６５℃でのイノシンと反対側の３’−Ｏ−修飾−ｄＴＴＰの組み込みの結果を示すゲルを図示する。レーンＳ：標準。レーン１：Ｍｎ２＋イオンを含まない３’−Ｏ−アリル−ｄＴＴＰの組み込み。レーン２：Ｍｎ２＋イオンを含まない３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＴＴＰの組み込み。レーン３：Ｍｎ２＋イオンの存在下での３’−Ｏ−アリル−ｄＴＴＰの組み込み。レーン４：Ｍｎ２＋イオンの存在下での３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＴＴＰの組み込み。  ｇ）Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼを使用した組み込みに��いてのＭｎ２＋の存在の評価。Ｍｎ２＋イオンの存在下および不在下での組み込みの結果。  ｈ）組み込み工程の研究のために使用されるオリゴヌクレオチド。
【図６】ヘルパー鎖の不在−切断。  ａ）ヘルパー鎖の不在下でのハイブリダイズされたポリヌクレオチド鎖の切断を示すスキーム。切断工程は、破線枠で強調表示されている。  ｂ）３７℃および室温２４℃でのそれぞれｈＡＡＧおよび０．２Ｍ  ＮａＯＨ（強塩基）によるオリゴヌクレオチドの切断を示すゲル。レーン１．開始オリゴヌクレオチド。両方の全長鎖を含有する陽性対照であるレーン２は、９０％：１０％の切断対未切断ＤＮＡ比のより高い収率を示した。ヘルパー鎖によらない切断反応を含むレーン３は、１０％：９０％の切断対未切断ＤＮＡ比の低い収率を示した。  ｃ）３７℃でのｈＡＡＧおよびＥｎｄｏ  ＶＩＩＩによるオリゴヌクレオチドの切断を示すゲル。両方の全長鎖を含有する陽性対照であるレーン２は、約９０％：１０％の切断対未切断ＤＮＡ比のより高い収率を示した。ヘルパー鎖によらない切断反応を含むレーン３は、約７％：９３％の切断対未切断ＤＮＡ比の低いパーセンテージ収率を示した。  ｄ）ｈＡＡＧ／Ｅｎｄｏ  ＶＩＩＩおよびｈＡＡＧ／化学塩基によるオリゴヌクレオチドの切断の要約。  ｅ）切断工程の研究のために使用されるオリゴヌクレオチド。
【図７】ヘルパー鎖の不在−連結。  ａ）ヘルパー鎖の不在下でのハイブリダイズされたポリヌクレオチド鎖の連結を示すスキーム。破線枠で強調表示されている連結工程。  ｂ）ヘルパー鎖の不在下で室温（２４℃）でのＱｕｉｃｋ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼによるオリゴヌクレオチドの連結を示すゲル。レーン１は、３６ｍｅｒのＴＡＭＲＡ一本鎖オリゴと１８ｍｅｒのＴＡＭＲＡ一本鎖オリゴとの混合物を含有した。これらのオリゴは参照バンドを提供した。  ｃ）切断工程の研究のために使用されるオリゴヌクレオチド。
【図８】ヘルパー鎖によるバージョン１化学−組み込み。  ａ）破線枠で強調表示されている組み込み工程を示すスキーム。  ｂ）組み込み工程の研究に適用可能なオリゴヌクレオチド。
【図９】ヘルパー鎖によるバージョン１化学−切断。  ａ）ヘルパー鎖の不在下でのハイブリダイズされたポリヌクレオチド鎖の切断を示すスキーム。切断工程は、破線枠で強調表示されている。  ｂ）３７℃および室温２４℃でのそれぞれｈＡＡＧおよび０．２Ｍ  ＮａＯＨ（強塩基）によるオリゴヌクレオチドの切断を示すゲル。レーン１．開始オリゴヌクレオチド。両方の全長鎖を含有する陽性対照であるレーン２は、９０％：１０％の切断対未切断ＤＮＡ比のより高い収率を示した。ヘルパー鎖によらない切断反応を含むレーン３は、１０％：９０％の切断対未切断ＤＮＡ比の低い収率を示した。ヘルパー鎖による切断反応を含むレーン４は、５０％：５０％の切断対未切断ＤＮＡ比の等しいパーセンテージ収率を示した。  ｃ）脱塩基部位の切断についてのエンドヌクレアーゼＶＩＩＩの評価。ゲルは、３７℃でのｈＡＡＧおよびＥｎｄｏ  ＶＩＩＩによるオリゴヌクレオチドの切断を示す。両方の全長鎖を含有する陽性対照であるレーン２は、約９０％：１０％の切断対未切断ＤＮＡ比のより高い収率を示した。ヘルパー鎖によらない切断反応を含むレーン３は、約７％：９３％の切断対未切断ＤＮＡ比の低いパーセンテージ収率を示した。ヘルパー鎖による切断反応を含むレーン４は、約１０％：９０％の切断対未切断ＤＮＡ比の低いパーセンテージ収率を示した。  ｄ）脱塩基部位の切断についてのＮ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミンの評価。ゲルは、３７℃でのｈＡＡＧおよび１００ｍＭのＮ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミンによるオリゴヌクレオチドの切断を示す。レーン１．開始オリゴヌクレオチド。両方の全長鎖を含有する陽性対照であるレーン２は、１００％の切断ＤＮＡを示した。ヘルパー鎖による切断反応を含むレーン３は、９０％：１０％の切断対未切断ＤＮＡ比のより高いパーセンテージ収率を示した。  ｅ）ｈＡＡＧ／Ｅｎｄｏ  ＶＩＩＩ、ｈＡＡＧ／化学塩基およびｈＡＡＧ／代替化学塩基によるオリゴヌクレオチドの切断の要約。  ｆ）切断工程の研究のために使用されるオリゴヌクレオチド。
【図１０】ヘルパー鎖によるバージョン１化学−連結。  ａ）ヘルパー鎖の存在下でハイブリダイズされたポリヌクレオチド鎖の連結を示すスキーム。破線枠で強調表示されている連結工程。  ｂ）ヘルパー鎖の存在下での室温（２４℃）でのＱｕｉｃｋ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼによるオリゴヌクレオチドの連結を示すゲル。レーン１は、３６ｍｅｒのＴＡＭＲＡ一本鎖オリゴと１８ｍｅｒのＴＡＭＲＡ一本鎖オリゴとの混合物を含有した。これらのオリゴは参照バンドを提供した。レーン２では、２０分後に予想されるバンドサイズ３６ｍｅｒの観察可能な連結生産物があった。  ｃ）ヘルパー鎖の存在下で一晩インキュベートした後の、室温（２４℃）でのＱｕｉｃｋ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼによるオリゴヌクレオチドの連結を示すゲル。レーン１は、３６ｍｅｒのＴＡＭＲＡ一本鎖オリゴと１８ｍｅｒのＴＡＭＲＡ一本鎖オリゴとの混合物を含有した。これらのオリゴは参照バンドとして機能した。レーン２では、３６ｍｅｒの予想されるバンドサイズの観察可能な完全連結生産物があった。  ｄ）切断工程の研究のために使用されるオリゴヌクレオチド。
【図１１】ヘルパー鎖によるバージョン２化学−組み込み。  ａ）オレンジ色の破線枠で強調表示されている組み込み工程を示すスキーム  ｂ）２７℃でのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼによる３’−Ｏ−修飾−ｄＴＴＰの組み込みの結果を示すゲル。レーン１：開始材料。レーン２：１分後の組み込み、転化率５％。レーン３：２分後の組み込み、転化率１０％。レーン４：５分後の組み込み、転化率２０％。レーン５：１０分後の組み込み、転化率３０％。レーン６：２０分後の組み込み、転化率３５％。  ｃ）図は、３７℃でのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼによる３’−Ｏ−修飾−ｄＴＴＰの組み込みの結果を示すゲルを図示する。レーン１：開始材料。レーン２：１分後の組み込み、転化率３０％。レーン３：２分後の組み込み、転化率６０％。レーン４：５分後の組み込み、転化率９０％。レーン５：１０分後の組み込み、転化率９０％。レーン６：２０分後の組み込み、転化率９０％。  ｄ）４７℃でのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼによる３’−Ｏ−修飾−ｄＴＴＰの組み込みの結果を示すゲル。レーン１：開始材料。レーン２：１分後の組み込み、転化率３０％。レーン３：２分後の組み込み、転化率６５％。レーン４：５分後の組み込み、転化率９０％。レーン５：１０分後の組み込み、転化率９０％。レーン６：２０分後の組み込み、転化率９０％。  ｅ）２７℃でＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼによる３’−Ｏ−修飾−ｄＴＴＰの組み込みの結果を示すゲル。レーン１：開始材料。レーン２：１分後の組み込み、転換率７０％。レーン３：２分後の組み込み、転化率８５％。レーン４：５分後の組み込み、転化率９２％。レーン５：１０分後の組み込み、転化率９６％。レーン６：２０分後の組み込み、転化率９６％。  ｆ）３７℃でのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼによる３’−Ｏ−修飾−ｄＴＴＰの組み込みの結果を示すゲル。レーン１：開始材料。レーン２：１分後の組み込み、転化率８５％。レーン３：２分後の組み込み、転化率９５％。レーン４：５分後の組み込み、転化率９６％。レーン５：１０分後の組み込み、転化率９６％。レーン６：２０分後の組み込み、転化率９６％。  ｇ）４７℃でのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼによる３’−Ｏ−修飾−ｄＴＴＰの組み込みの結果を示すゲル。レーン１：開始材料。レーン２：１分後の組み込み、転化率８５％。レーン３：２分後の組み込み、転化率９０％。レーン４：５分後の組み込み、転化率９６％。レーン５：１０分後の組み込み、転化率９６％。レーン６：２０分後の組み込み、転化率９６％。  ｈ）様々な温度での３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＴＴＰの組み込みおよびＭｎ２＋イオンの存在の要約。  ｉ）３７℃でのＭｎ２＋の存在下でのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼによる相補的塩基と反対側の３’−Ｏ−修飾−ｄＮＴＰの組み込みの結果を示すゲル。レーン１：開始材料。レーン２：５分間の３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＴＴＰの組み込み。レーン３：５分間の３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＡＴＰの組み込み。レーン４：５分間の３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＣＴＰの組み込み。レーン５��５分間の３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＧＴＰの組み込み。  ｊ）組み込み工程の研究のために使用されるオリゴヌクレオチド。
【図１２】ヘルパー鎖によるバージョン２化学−切断。  ａ）ヘルパー鎖の存在下でのハイブリダイズされたポリヌクレオチド鎖の切断を示すスキーム。切断工程はオレンジ色の破線枠で強調表示されている。  ｂ）ゲルは、３７℃でのＥｎｄｏ  Ｖによるオリゴヌクレオチドの切断を示す。レーン１．開始オリゴヌクレオチド。両方の全長鎖を含有する陽性対照であるレーン２は、８０％：２０％の切断対未切断ＤＮＡ比の収率を示した。ヘルパー鎖によらない切断反応を含むレーン３は、＞９９％の切断ＤＮＡのはるかに高い収率を示した。ヘルパー鎖による切断反応を含むレーン４も、＞９９％のＤＮＡ切断収率を示した。  ｃ）エンドヌクレアーゼＶによる切断研究の要約。  ｄ）切断工程の研究のために使用されるオリゴヌクレオチド。
【図１３】ヘルパー鎖によるバージョン２化学−連結。  ａ）ヘルパー鎖の不在下でのハイブリダイズされたポリヌクレオチド鎖の連結を示すスキーム。オレンジ色の破線枠で強調表示されている連結工程。  ｂ）切断工程の研究のためのオリゴヌクレオチド。
【図１４】ヘルパー鎖によるバージョン２化学−脱保護。  ａ）オレンジ色の破線枠で強調表示されている脱保護工程を示すスキーム。  ｂ）図は、３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＴＴＰの組み込み後の５０ｍＭのＴＣＥＰによる３’−Ｏ−アジドメチル基の脱保護の結果を示すゲルを図示する。レーン１：開始プライマーレーン２：Ｍｎ２＋の存在下での３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＴＴＰの組み込み。レーン３：すべての天然ｄＮＴＰの添加によるレーン２の生産物の伸長。レーン４：５０ｍＭのＴＣＥＰによるレーン２の生産物（０．５μＭ）の脱保護。レーン５：すべての天然ｄＮＴＰの添加によるレーン４の生産物の伸長。  ｃ）図は、３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＴＴＰの組み込み後の３００ｍＭのＴＣＥＰによる３’−Ｏ−アジドメチル基の脱保護の結果を示すゲルを図示する。レーン１：開始プライマー。レーン２：Ｍｎ２＋の存在下での３−Ｏ−アジドメチル−ｄＴＴＰの組み込み。レーン３：すべての天然ｄＮＴＰの添加によるレーン２の生産物の伸長。レーン４：３００ｍＭのＴＣＥＰによるレーン２の生産物（０．５μＭ）の脱保護。レーン５：すべての天然ｄＮＴＰの添加によるレーン４の生産物の伸長。  ｄ）図は、３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＣＴＰの組み込み後の５０ｍＭのＴＣＥＰによる３’−Ｏ−アジドメチル基の脱保護の結果を示すゲルを図示する。レーン１：開始プライマー。レーン２：Ｍｎ２＋の存在下での３−Ｏ−アジドメチル−ｄＣＴＰの組み込み。レーン３：すべての天然ｄＮＴＰの添加によるレーン２の生産物の伸長。レーン４：３００ｍＭのＴＣＥＰによるレーン２の生産物（０．５μＭ）の脱保護。レーン５：すべての天然ｄＮＴＰの添加によるレーン４の生産物の伸長。  ｅ）図は、３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＣＴＰの組み込み後の３００ｍＭのＴＣＥＰによる３’−Ｏ−アジドメチル基の脱保護の結果を示すゲルを図示する。レーン１：開始プライマーレーン２：Ｍｎ２＋の存在下での３−Ｏ−アジドメチル−ｄＣＴＰの組み込み。レーン３：すべての天然ｄＮＴＰの添加によるレーン１の生産物の伸長。レーン４：３００ｍＭのＴＣＥＰによるレーン１の生産物（０．５μＭ）の脱保護。レーン５：すべての天然ｄＮＴＰの添加によるレーン３の生産物の伸長。  ｆ）．図は、３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＡＴＰの組み込み後の３００ｍＭのＴＣＥＰによる３’−Ｏ−アジドメチル基の脱保護の結果を示すゲルを図示する。  レーン１：開始プライマー  レーン２：Ｍｎ２＋の存在下での３−Ｏ−アジドメチル−ｄＡＴＰの組み込み。レーン３：すべての天然ｄＮＴＰの添加によるレーン２の生産物の伸長。レーン４：３００ｍＭのＴＣＥＰによるレーン２の生産物（０．５μＭ）の脱保護。レーン５：すべての天然ｄＮＴＰの添加によるレーン４の生産物の伸長。  ｇ）図は、３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＧＴＰの組み込み後の３００ｍＭのＴＣＥＰによる３’−Ｏ−アジドメチル基の脱保護の結果を示すゲルを図示する。レーン１：開始プライマー。レーン２：Ｍｎ２＋の存在下での３−Ｏ−アジドメチル−ｄＧＴＰの組み込み。レーン３：すべての天然ｄＮＴＰの添加によるレーン２の生産物の伸長。レーン４：３００ｍＭのＴＣＥＰによるレーン２の生産物（０．５μＭ）の脱保護。レーン５：すべての天然ｄＮＴＰの添加によるレーン４の生産物の伸長。  ｈ）０．２μＭのＤＮＡに対するＴＣＥＰによる脱保護の効率。  ｉ）切断工程の研究のために使用されるオリゴヌクレオチド。
【図１５】二重ヘアピンモデルによるバージョン２化学−組み込み。  ａ）破線枠で強調表示されている組み込み工程を示すスキーム。  ｂ）その天然対応物と反対側の３’−Ｏ−修飾−ｄＴＴＰの組み込みについてのＤＮＡポリメラーゼの評価。図は、３７℃でのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼによる３’−Ｏ−修飾−ｄＴＴＰの組み込みの結果を示すゲルを図示する。レーン１：開始材料。レーン２：天然ｄＮＴＰ混合物の組み込み。レーン３：Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼによる３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＴＴＰの組み込み。レーン４：すべての天然ｄＮＴＰの添加によるレーン３の生産物の伸長。  ｃ）その天然対応物と反対側の３’−Ｏ−修飾−ｄＴＴＰの組み込みについてのＤＮＡポリメラーゼの評価。組み込み工程の研究に適用可能なオリゴヌクレオチド。
【図１６】二重ヘアピンモデルによるバージョン２化学−切断。  ａ）ヘアピンオリゴヌクレオチドの切断を示すスキーム。切断工程は破線枠で強調表示されている。  ｂ）３７℃でのＥｎｄｏ  Ｖによるヘアピンオリゴヌクレオチドの切断を示すゲル。レーン１．開始ヘアピンオリゴヌクレオチド。５分後に切断されたヘアピンオリゴヌクレオチドであるレーン２は、約９８％の割合で高収率の消化ＤＮＡを示した。１０分後に切断されたヘアピンオリゴヌクレオチドであるレーン３は、約９９％の割合で高収率の消化ＤＮＡを示した。３０分後に切断されたヘアピンオリゴヌクレオチドであるレーン４は、約９９％の割合で高収率の消化ＤＮＡを示し、１時間後に切断されたヘアピンオリゴヌクレオチドであるレーン５は、約９９％の割合で高収率の消化ＤＮＡを示した。  ｃ）切断工程の研究のために使用されるオリゴヌクレオチド。
【図１７】二重ヘアピンモデルによるバージョン２化学−連結。  ａ）ハイブリダイズされたヘアピンの連結を示すスキーム。破線枠で強調表示されている連結工程。  ｂ）ヘルパー鎖の存在下での室温（２４℃）での平滑／ＴＡ  ＤＮＡリガーゼによるヘアピンオリゴヌクレオチドの連結を示すゲル。レーン１は開始ヘアピンオリゴヌクレオチドを含有した。１分後に連結されたヘアピンオリゴヌクレオチドであるレーン２は、約８５％の割合で高収率の連結ＤＮＡ生産物を示した。２分後に連結されたヘアピンオリゴヌクレオチドであるレーン３は、約８５％の割合で高収率の消化ＤＮＡを示した。３分後に連結されたヘアピンオリゴヌクレオチドであるレーン４は、約８５％の割合で高収率の連結ＤＮＡ生産物を示した。４分後に連結されたヘアピンオリゴヌクレオチドであるレーン５は、＞約８５％の割合で高収率の連結ＤＮＡ生産物を示した。  ｃ）連結工程の研究のために使用されるオリゴヌクレオチド。
【図１８】バージョン２化学−二重ヘアピンモデルについての完全サイクル。  ａ）酵素的組み込み、切断、連結、および脱保護工程を伴う完全サイクルを示すスキーム。  ｂ）その天然対応物と反対側の３’−Ｏ−修飾−ｄＴＴＰの組み込みについてのＤＮＡポリメラーゼの評価。図は、３７℃でのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼによる３’−Ｏ−修飾−ｄＴＴＰの組み込みの結果を示すゲルを図示する。レーン１：開始材料。レーン２：Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼによる３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＴＴＰの組み込み。レーン３：すべての天然ｄＮＴＰの添加によるレーン２の生産物の伸長。レーン４：エンドヌクレアーゼＶによるレーン２の生産物の切断。レーン５：平滑ＴＡリガーゼキットによるレーン４の生産物の連結。  ｃ）組み込み工程の研究に適用可能なオリゴヌクレオチド。
【図１９】バージョン２化学−ヘルパー鎖を使用した単一ヘアピンモデルについての完全サイクル。  ａ）酵素的組み込み、切断、連結、および脱保護工程を伴う完全サイクルを示すスキーム。  ｂ）組み込み工程の研究に適用可能なオリゴヌクレオチド。
【図２０】バージョン３化学−二重ヘアピンモデルについての完全サイクル。  ａ）酵素的組み込み、切断、連結、および脱保護工程を伴う完全サイクルを示すスキーム。  ｂ）組み込み工程の研究に適用可能なオリゴヌクレオチド。
【図２１】バージョン２化学−二重ヘアピンモデルについての完全２サイクル。  ａ）酵素的組み込み、脱保護、切断、および連結工程を伴う第１の完全サイクルを示すスキーム。  ｂ）酵素的組み込み、脱保護、切断、および連結工程を伴う第１の完全サイクルに続く第２の完全サイクルを示すスキーム。  ｃ）図は、組み込み、脱保護、切断、および連結工程を含む完全２サイクル実験を示すゲルを図示する。レーン１．開始材料。レーン２．天然ｄＮＴＰによる開始材料の伸長。レーン３．Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼによる３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＴＴＰの組み込み。レーン４．すべての天然ｄＮＴＰの添加によるレーン３の生産物の伸長。レーン５．ＴＣＥＰによるレーン３の生産物の脱保護。レーン６．すべての天然ｄＮＴＰの添加によるレーン５の生産物の伸長。レーン７．エンドヌクレアーゼＶによるレーン５の生産物の切断。レーン８．平滑ＴＡリガーゼキットによるレーン７の生産物の連結。レーン９．ラムダエキソヌクレアーゼによるレーン８の生産物の切断。レーン１０．第２のサイクルのための開始材料−レーン９と同じ材料。レーン１１．Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼによる３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＴＴＰの組み込み。レーン１２．すべての天然ｄＮＴＰの添加によるレーン１１の生産物の伸長。レーン１３．ＴＣＥＰによるレーン１１の生産物の脱保護。レーン１４．すべての天然ｄＮＴＰの添加によるレーン１３の生産物の伸長。レーン１５．エンドヌクレアーゼＶによるレーン１３の生産物の切断。レーン１６．平滑ＴＡリガーゼキットによるレーン１５の生産物の連結。  ｄ）研究のために使用されるオリゴヌクレオチド。
【図２２】本明細書に記載される方法により合成されるような所定の配列のポリヌクレオチドの足場ヌクレオチドからの放出の機構を示す例。
【図２３】本発明によるＲＮＡの合成のための例示的な方法の概略。例示的な方法は、ヘルパー鎖の不在下での合成を示す。
【図２４】本発明によるＲＮＡの合成のための例示的な方法の概略。例示的な方法は、ヘルパー鎖の存在下での合成を示す。
【図２５】本発明によるＲＮＡの合成のための例示的な方法の概略。例示的な方法は、ヘルパー鎖の存在下での合成を示す。
【図２６】組み込み工程の前にヘルパー鎖を変性する工程を伴う、単一ヘアピンモデルによる合成方法バージョン２によるＤＮＡ合成のための例示的な方法の例示的な方法の第１の完全サイクルの概略。
【図２７】組み込み工程の前にヘルパー鎖を変性する工程を伴う、単一ヘアピンモデルによる合成方法バージョン２によるＤＮＡ合成のための例示的な方法の第２の完全サイクルの概略。
【図２８】組み込み工程の前にヘルパー鎖を変性する工程を伴う、単一ヘアピンモデルによる合成方法バージョン２によるＤＮＡ合成のための例示的な方法の第３の完全サイクルの概略。
【図２９】実施例９に詳述される実験に使用されるオリゴヌクレオチド。
【図３０】実施例９に詳述されるような完全３サイクル実験に対応する反応生産物を示すゲル。  図は、組み込み、脱ブロック、切断、および連結工程を含む完全３サイクル実験の結果を示すゲルを図示する。レーン１：開始材料。レーン２．天然ｄＮＴＰによる開始材料の伸長レーン３：Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｘ  ＤＮＡポリメラーゼによる３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＴＴＰの組み込み。レーン４：すべての天然ｄＮＴＰの添加によるレーン３の生産物の伸長。¬レーン５：ＴＣＥＰによるレーン３の生産物の脱ブロックレーン６：すべての天然ｄＮＴＰの添加によるレーン５の生産物の伸長。¬レーン７：エンドヌクレアーゼＶによるレーン５の生産物の切断。レーン８：Ｔ３  ＤＮＡリガーゼによるレーン７の生産物の連結レーン９：第２のサイクルの開始材料−レーン９と同じ材料レーン１０：すべての天然ｄＮＴＰの添加によるレーン９の生産物の伸長。レーン１１：Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｘ  ＤＮＡポリメラーゼによる３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＴＴＰの組み込み。レーン１２：すべての天然ｄＮＴＰの添加によるレーン１１の生産物の伸長。レーン１３：ＴＣＥＰによるレーン１１の生産物の脱ブロックレーン１４：すべての天然ｄＮＴＰの添加によるレーン１３の生産物の伸長。レーン１５：エンドヌクレアーゼＶによるレーン１３の生産物の切断レーン１６：Ｔ３  ＤＮＡリガーゼによるレーン１５の生産物の連結レーン１７：第３のサイクルのための開始材料−レーン１６と同じ材料レーン１８：すべての天然ｄＮＴＰの添加によるレーン１７の生産物の伸長。レーン１９：Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｘ  ＤＮＡポリメラーゼによる３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＴＴＰの組み込み。レーン２０：すべての天然ｄＮＴＰの添加によるレーン１９の生産物の伸長。レーン２１：ＴＣＥＰによるレーン１９の生産物の脱ブロックレーン２２：すべての天然ｄＮＴＰの添加によるレーン２１の生産物の伸長。レーン２３：エンドヌクレアーゼＶによるレーン２１の生産物の切断レーン２４：Ｔ３  ＤＮＡリガーゼによるレーン２３の生産物の連結
【図３１】ＦＩＴＣ−ＰＥＧ−ＳＨおよびＦＩＴＣ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨに曝露された異なる量のＢＲＡＰＡを添加したポリアクリルアミドゲル表面からの蛍光シグナル。
【図３２】ＦＩＴＣ−ＰＥＧ−ＳＨおよびＦＩＴＣ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨに曝露された異なる量のＢＲＡＰＡを添加したポリアクリルアミドゲル表面上のフルオレセインチャネルから測定された蛍光シグナル。
【図３３】（ａ）異なる試料に固定化されたリンカーを有しないヘアピンＤＮＡの配列を示す。  （ｂ）異なる試料に固定化されたリンカーを有するヘアピンＤＮＡの配列を示す。
【図３４】ブロモアセチル官能化ポリアクリルアミド表面に固定化されたリンカーを有するおよび有しないヘアピンＤＮＡオリゴマーからの蛍光シグナル。
【図３５】ブロモアセチル官能化ポリアクリルアミド表面に固定化されたリンカーを有するおよび有しないヘアピンＤＮＡオリゴマーから測定された蛍光。
【図３６】三リン酸の組み込み後のブロモアセチル官能化ポリアクリルアミド表面に固定化されたリンカーを有するおよび有しないヘアピンＤＮＡオリゴマーからの蛍光シグナル。
【図３７】三リン酸の組み込み後のブロモアセチル官能化ポリアクリルアミド表面に固定化されたリンカーを有するおよび有しないヘアピンＤＮＡオリゴマーから測定された蛍光。
【図３８】（ａ）実施例１２に詳述されるような各反応工程についての実験的概観および結果。  （ｂ）実施例１２に詳述される実験に使用されるオリゴヌクレオチド。
【図３９】切断反応の前および後のヘアピンＤＮＡオリゴマーからの蛍光シグナルを示す（実施例１２）。
【図４０】切断反応の前および後のヘアピンＤＮＡオリゴマーから測定された蛍光シグナルを示す（実施例１２）。
【図４１】連結反応のためのイノシン含有鎖および相補的「ヘルパー」鎖のための配列を示す（実施例１２）。
【図４２】連結反応のモニタリングに対応するヘアピンＤＮＡオリゴマーからの蛍光シグナルに関する結果（実施例１２）。
【図４３】連結反応のモニタリングに対応するヘアピンＤＮＡオリゴマーから測定された蛍光に関する結果（実施例１２）。
【００７０】
図の解釈。
図４、５ａ、６ａ、７ａ、８ａ、９ａ、１０ａ、１１ａ、１２ａ、１３ａ、１４ａ、１５ａ、１６ａ、１７ａ、１８ａ、１９ａ、２０ａ、２１ａ、２１ｂ、２２、２３、２４、２５、２６、２７、および２８に図示される構造は、図１、２、および３ａに図示されるものと一貫して解釈されるべきである。したがって、これらの図では、二本鎖足場ポリヌクレオチド分子の各左手鎖は、支持鎖（図１、２、および３ａの鎖「ａ」に対応する）に関連し、二本鎖足場ポリヌクレオチド分子の各右手鎖は、合成鎖（図１、２、および３ａの鎖「ｂ」に対応する）に関し、すべての足場ポリヌクレオチド分子は、プライマー鎖部分を含む鎖に対応するより低い合成鎖（図１、２、および３ａの鎖「ｂ」の実線および点線に対応する）を含み、ヘルパー鎖部分を含む鎖（図１、２、および３ａの鎖「ｂ」の破線に対応する）に対応する上部合成鎖を有する、新たなヌクレオチドの組み込みの前の特定の足場ポリヌクレオチド分子（例えば、図８ａおよび１６ａ）が示され、ヘルパー鎖部分を含まない（図１、２、および３ａの鎖「ｂ」の破線の欠如に対応する）、特定の足場ヌクレオチド分子（図５ａ、６ａ、および７ａの）が示され、ヘルパー鎖部分を含む鎖（図１、２、および３ａの鎖「ｂ」の破線に対応する）に対応する上部合成鎖を有する、連結工程後の特定の足場ポリヌクレオチド分子（例えば、図２６、２７、および２８の）が示され、ヘルパー鎖部分は、次の合成サイクルにおいて新たなヌクレオチドの組み込みの前に除去される。
【００７１】
加えて、これらの図では、関連する場合、各新たなヌクレオチドは、ｒｔＮＴＰと標識され、小さな円形構造（図１、２、および３ａの小さな三角形構造に対応する）として図示される、可逆的ターミネーター基と一緒に組み込まれるように示され、末端リン酸基は、「ｐ」と標識され、小さな楕円形構造として図示される。
【００７２】
図４ｃ、４ｄ、４ｇ、４ｈ、１５ａ、１６ａ、１７ａ、１８ａ、２０ａ、２１ａ、２１ｂ、および２２は、ヘルパー鎖部分を含む鎖と支持鎖とがヘアピンループによって接続されている足場ポリヌクレオチド分子を示す。図４ｂ、１５ａ、１６ａ、１７ａ、１８ａ、１９ａ、２０ａ、２１ａ、２１ｂ、２２、２６、２７、および２８は、ヘルパー鎖部分を含む鎖と支持鎖とがヘアピンループによって接続されている足場ポリヌクレオチド分子を示す。
【００７３】
図２０ａおよび２１ａなどの図は、ヘルパー鎖部分を含む鎖（右上の鎖）と支持鎖（左上の鎖）とがヘアピンループによって接続されている足場ポリヌクレオチド分子を示し、同じ分子において、プライマー鎖部分を含む鎖（右下の鎖）と支持鎖（左下の鎖）とが、ヘアピンループによって接続されている。
【発明を実施するための形態】
【００７４】
本発明は、所定のヌクレオチド配列によるポリヌクレオチド分子のデノボ合成のための方法を提供する。合成されるポリヌクレオチドは、好ましくはＤＮＡであり、好ましくは二本鎖ポリヌクレオチド分子である。本発明は、既存の合成方法と比較して利点を提供する。例えば、すべての反応工程を穏やかなｐＨの水性条件で行うことができ、広範囲の保護および脱保護手順は必要ではない。さらに、合成は、所定のヌクレオチド配列を含む既存の鋳型鎖の複製に依存しない。
【００７５】
本発明者らは、本明細書に定義されるようなユニバーサルヌクレオチドの使用が、各合成サイクル中に新たに組み込まれたヌクレオチドがその所望のパートナーヌクレオチドと正しく対合されることを可能にすると判定した。ユニバーサルヌクレオチドの使用は、デノボ合成の領域内の切断部位の作成を可能にし、これが切断および繰り返しの合成サイクルを促進する。本発明は、ポリヌクレオチドを合成するための、およびそのような合成されたポリヌクレオチドを含む大きな断片を構築するための多用途の方法を提供する。
【００７６】
本発明の合成方法の特定の実施形態は、５つの方法のバージョンを含む例示的な方法を参照することによって本明細書により一般的に詳細に記載されるであろう。方法のバージョンもまた、実施例に具体的に詳細に記載されている。５つの方法のバージョンを含むすべての例示的な方法が本発明を限定することを意図するものではないことが理解されるべきである。本発明は、所定の配列を有する二本鎖ポリヌクレオチド分子をインビトロで合成する方法であって、本方法が、合成サイクルを行うことを含み、各サイクルにおいて、第１のポリヌクレオチド鎖が所定の配列のヌクレオチドの組み込みによって伸長され、次に、第１の鎖にハイブリダイズされた第２のポリヌクレオチド鎖がヌクレオチドの組み込みによって伸長され、それによって第１の鎖の組み込まれたヌクレオチドとヌクレオチド対を形成する、方法を提供する。好ましくは、本方法はＤＮＡを合成するためのものである。本明細書に記載される特定の方法は、本発明の実施形態として提供される。
【００７７】
反応条件
一態様では、本発明は、所定の配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドを合成するための方法を提供する。
一態様では、本発明は、所定の配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドを合成するための方法を提供する。
【００７８】
いくつかの実施形態では、合成は、二本鎖ポリヌクレオチド内のヌクレオチドのハイブリダイゼーションに好適な条件下で実施される。ポリヌクレオチドは、典型的には、ヌクレオチドの相補的ヌクレオチドへのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で試薬と接触される。ハイブリダイゼーションを可能にする条件は、当該技術分野においてよく知られている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−ｌｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９５））。
【００７９】
ポリヌクレオチドへのヌクレオチドの組み込みは、例えば、好適な緩衝溶液の存在下で、好適な温度（例えば、約６５℃）で修飾ヌクレオチド（例えば、３’−Ｏ−修飾−ｄＮＴＰ）を組み込むために、ポリメラーゼ（例えば、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸポリメラーゼ）を使用して、好適な条件下で実施され得る。一実施形態では、緩衝溶液は、２ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１ｍＭのＫＣｌ、０．２ｍＭのＭｇＳＯ４、および０．０１％のトリトン（登録商標）Ｘ−１００を含み得る。
【００８０】
ポリヌクレオチドの切断は、例えば、好適な緩衝溶液の存在下で、酵素と適合する温度（例えば、３７℃）でポリヌクレオチド切断酵素（例えば、エンドヌクレアーゼ）を使用して、好適な条件下で実施され得る。一実施形態では、緩衝溶液は、５ｍＭの酢酸カリウム、２ｍＭのトリス−酢酸、１ｍＭの酢酸マグネシウム、および０．１ｍＭのＤＴＴを含み得る。
【００８１】
ポリヌクレオチドの連結は、例えば、好適な緩衝溶液の存在下で、酵素と適合する温度（例えば、室温）でリガーゼ（例えば、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ）を使用して、好適な条件下で実施され得る。一実施形態では、緩衝溶液は、４．４ｍＭのトリス−ＨＣｌ、７ｍＭのＭｇＣｌ２、０．７ｍＭのジチオスレイトール、０．７ｍＭのＡＴＰ、５％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ６０００）を含み得る。
【００８２】
脱保護は、例えば還元剤（例えば、ＴＣＥＰ）を使用して、好適な条件下で実施され得る。例えば、脱保護は、トリス緩衝液中のＴＣＥＰを使用して（例えば、最終濃度３００ｍＭで）行われ得る。
【００８３】
アンカーポリヌクレオチドおよび足場ポリヌクレオチド
所定の配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドは、本明細書で足場ポリヌクレオチドと呼ばれる、本明細書に記載されるような表面に付着し得るか、または付着することができる、既存のポリヌクレオチドへの所定のヌクレオチドの組み込みによる本発明の方法によって合成される。本明細書により詳細に記載されるように、足場ポリヌクレオチドは、新たに合成されたポリヌクレオチドを収容するための支持構造を形成し、本明細書の記載から明らかになるように、従来の合成方法におけるように複製される既存の鋳型鎖を含まない。足場ポリヌクレオチドが表面に付着している場合、足場ポリヌクレオチドは、アンカーポリヌクレオチドと呼ばれることがある。足場ポリヌクレオチドを表面に付着させてアンカーポリヌクレオチドを形成するための表面付着化学は、本明細書により詳細に記載されている。
【００８４】
一実施形態では、足場ポリヌクレオチドは、相補的支持鎖にハイブリダイズされた合成鎖を含む。合成鎖は、一本鎖切断または「ニック」（例えば、図１〜３ａ）によって分離されたポリメラーゼプライマー鎖部分および任意選択的にヘルパー鎖部分を含む。合成鎖のプライマー鎖部分とヘルパー鎖部分との両方が、相補的支持鎖にハイブリダイズされて提供され得る。代替的に、合成鎖のヘルパー鎖部分は別々に提供され得る。合成鎖のヘルパー鎖部分が最初に提供され得、続いて支持鎖およびヘルパー鎖が提供され得る。代替的に、足場ポリヌクレオチドの成分は別々に提供され得る。例えば、支持鎖が最初に提供され得、続いて合成鎖のプライマー鎖部分、次に、ヘルパー鎖が提供され得る。支持鎖が最初に提供され得、続いて合成鎖のヘルパー鎖部分、次に、プライマー鎖が提供され得る。合成鎖のヘルパー鎖部分は、切断工程の前に提供され得る。ヘルパー鎖部分は、新たな所定のヌクレオチドの組み込みの前に足場ポリヌクレオチドから削除され得る。ヘルパー鎖部分は、本明細書により詳細に記載されるように、新たな所定のヌクレオチドの組み込みの前に、例えば変性によって足場ポリヌクレオチドから除去され得る。好適な条件下で成分を混合すると、足場ポリヌクレオチドが別々の成分のハイブリダイゼーション時に形成される。
【００８５】
一本鎖切断部位でポリメラーゼによって新たな合成が開始される。したがって、ポリメラーゼは、一本鎖切断部位でプライマー鎖部分の末端ヌクレオチドを伸長させるように作用するであろう。合成鎖のヘルパー鎖部分と合成鎖のプライマー鎖部分との間の一本鎖切断または「ニック」は、典型的には、支持鎖とのハイブリダイゼーション後に整列することになる別々の分子として合成鎖の両方の部分を提供することによって達成される。一本鎖切断部位におけるヘルパー鎖の（５’）末端ヌクレオチドは、典型的には、リン酸基を欠いて提供される。末端リン酸基の欠如は、ヘルパー鎖部分の末端ヌクレオチドが一本鎖切断部位におけるプライマー鎖部分の末端ヌクレオチドと連結するのを防止し、よって一本鎖切断を維持する。一本鎖切断の作成および維持は他の手段によっても達成され得る。例えば、ヘルパー鎖部分の末端ヌクレオチドには、プライマー鎖部分との連結を防止する好適なブロッキング基が提供され得る。好ましくは、ヘルパー鎖は、一本鎖切断部位において末端リン酸基を欠いて提供される。
【００８６】
足場ポリヌクレオチドには、隣接する末端で接続されていない支持鎖および合成鎖のそれぞれが提供され得る。足場ポリヌクレオチドには、足場ヌクレオチドの両方の末端でヘアピンループなどを介して、隣接する末端で接続されている支持鎖および合成鎖の両方が提供され得る。足場ポリヌクレオチドには、足場ヌクレオチドの一方の末端または任意の他の好適なリンカーでヘアピンループなどを介して、隣接する末端で接続されている支持鎖および合成鎖の両方が提供され得る。
【００８７】
ヘアピンを有するまたは有しない足場ポリヌクレオチドは、本明細書により詳細に記載されるような固体支持体または表面に固定化され得る（図４を参照されたい）。
【００８８】
「ヘアピン」または「ヘアピンループ」という用語は、現在の技術分野において一般的に使用されている。「ヘアピンループ」という用語は、「ステムループ」とも呼ばれることが多い。そのような用語は、ポリヌクレオチド分子の一方の鎖が分子内塩基対合のために同じ鎖の別の区分にハイブリダイズしたときに形成される、不対合核酸塩基のループを含むポリヌクレオチド中の二次構造の領域を指す。したがって、ヘアピンはＵ字型の構造に似ている場合がある。そのような構造の例を図４に示す。
【００８９】
ヌクレオチドおよびユニバーサルヌクレオチド
本明細書に記載される方法のうちのいずれかによって合成ポリヌクレオチドに組み込まれ得るヌクレオチドは、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、および修飾ヌクレオチドであり得る。ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、および修飾ヌクレオチドは、本明細書に記載される方法のうちのいずれかによって合成ポリヌクレオチドに組み込まれ得る。
【００９０】
本明細書に定義および記載される本発明の合成方法のうちのいずれにおいても、ヌクレオチドは、好ましくは、本明細書に記載されるような可逆的ターミネーター基を含むヌクレオチドとして組み込まれる。
【００９１】
ヌクレオチドは、天然核酸塩基または非天然核酸塩基を含み得る。ヌクレオチドは、天然核酸塩基、糖、およびリン酸基を含有し得る。天然核酸塩基は、アデノシン（Ａ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）、グアニン（Ｇ）、およびシトシン（Ｃ）を含む。ヌクレオチドの成分のうちの１つは、さらに修飾され得る。
【００９２】
ヌクレオチド類似体は、塩基、糖、もしくはリン酸、またはそれらの組み合わせのいずれかにおいて構造的に修飾され、オリゴヌクレオチド鎖への組み込みのための基質としてのポリメラーゼ酵素になお許容可能なヌクレオチドである。
【００９３】
非天然核酸塩基は、標的ポリヌクレオチド中の核酸塩基のうちのすべてにある程度結合する、例えば水素結合するものであり得る。非天然核酸塩基は、好ましくは、ヌクレオシドアデノシン（Ａ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）、グアニン（Ｇ）、およびシトシン（Ｃ）を含むヌクレオチドにある程度結合する、例えば水素結合するものである。
【００９４】
非天然ヌクレオチドは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、およびアンロックド核酸（ＵＮＡ）、架橋核酸（ＢＮＡ）またはモルホリノ、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートであり得る。
【００９５】
非天然ヌクレオチドは、修飾糖および／または修飾核酸塩基を含み得る。修飾糖としては、２’−Ｏ−メチルリボース糖が挙げられるが、これに限定されない。修飾核酸塩基としては、メチル化核酸塩基が挙げられるが、これに限定されない。核酸塩基のメチル化は、遺伝子およびマイクロＲＮＡなどの他の要素の発現を改変させる能力を有する認識された形態のエピジェネティック修飾である。核酸塩基のメチル化は、主にＣｐＧモチーフからなるジヌクレオチドである別々の遺伝子座で起こるが、ＣＨＨモチーフ（ここで、ＨはＡ、Ｃ、またはＴである）でも起こり得る。典型的には、メチル化中に、メチル基がシトシン塩基の第５の炭素に添加されてメチルシトシンを作成する。したがって、修飾核酸塩基としては、５−メチルシトシンが挙げられるが、これに限定されない。
【００９６】
所定の配列のヌクレオチドは、ヌクレオチド対を形成するために反対側のパートナーヌクレオチドに組み込まれ得る。パートナーヌクレオチドは相補的ヌクレオチドであり得る。相補的ヌクレオチドは、所定の配列のヌクレオチドにある程度結合する、例えば水素結合することができるヌクレオチドである。
【００９７】
典型的には、所定の配列のヌクレオチドは、天然に相補的なパートナー核酸塩基と反対側のポリヌクレオチドに組み込まれる。したがって、アデノシンは、チミンとは反対側に組み込まれ得、逆もまた同様である。グアニンは、シトシンとは反対側に組み込まれ得、逆もまた同様である。代替的に、所定の配列のヌクレオチドは、それがある程度結合する、例えば水素結合する、パートナー核酸塩基とは反対側に組み込まれ得る。
【００９８】
代替的に、パートナーヌクレオチドは、非相補的ヌクレオチドであり得る。非相補的ヌクレオチドは、所定の配列のヌクレオチドに結合する、例えば水素結合することができないヌクレオチドである。したがって、合成されたポリヌクレオチドが全体として二本鎖であり、かつ第１の鎖がハイブリダイゼーションによって第２の鎖に付着しているという条件で、所定の配列のヌクレオチドがパートナーヌクレオチドと反対側に組み込まれて、ミスマッチを形成する場合がある。
【００９９】
「反対側の」という用語は、核酸生化学の分野におけるこの用語の通常の使用、具体的には従来のワトソン−クリック塩基対合に関するものとして理解されるべきである。したがって、配列５’−ＡＣＧＡ−３’の１番目の核酸分子は、配列５’−ＴＣＧＴ−３’の２番目の核酸分子と二本鎖を形成することができ、ここで１番目の分子のＧは、２番目のＣと反対側に位置付けられ、それと水素結合するであろう。配列５’−ＡＴＧＡ−３’の１番目の核酸分子は、配列５’−ＴＣＧＴ−３’の２番目の核酸分子と二本鎖を形成し得、ここで１番目の分子のＴは、２番目の分子のＧとミスマッチであるが、それでもなおそれと反対側に位置付けられ、パートナーヌクレオチドとして作用するであろう。この原理は、ユニバーサルヌクレオチドを含むパートナー対を含む、本明細書に開示される任意のヌクレオチドパートナー対関係に当てはまる。
【０１００】
本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、支持鎖中の位置および合成鎖中と反対側の位置は、位置番号「ｎ」を割り当てられる。この位置は、任意の所与の合成サイクルにおいて、工程（２）での組み込み時に新たに組み込まれた所定の配列のヌクレオチドによって占められることになる合成鎖中の位置と反対側である足場ポリヌクレオチドの支持鎖中のヌクレオチドの位置を指す。それはまた、位置が、工程（６）の次の合成サイクルにおける組み込み時に新たに組み込まれた所定の配列のヌクレオチドによって占められることになる合成鎖中の位置と反対側である工程（４）における連結ポリヌクレオチドの支持鎖中の位置を指す。支持鎖中の位置および合成鎖中と反対側の位置の両方が、ポジトンｎと呼ばれ得る。参照のために、図１、２、３ａ、３ｂ、および３ｃを参照されたい。
【０１０１】
ユニバーサルヌクレオチドの配置に対する、新たに組み込まれた所定の配列のヌクレオチドおよびそのパートナーの足場ポリヌクレオチド内での位置付けに関連する「に近接する」という用語は、本発明の文脈におけるその用語の通常の使用に関連するものとして理解されるべきである。したがって、本明細書に記載される方法のバージョン１などの方法では、新たに組み込まれた所定の配列のヌクレオチド（位置「ｎ」を占める）は、最初に、ユニバーサルヌクレオチドをそのパートナーとして有し（したがって位置ｎも占める）、次に、上記に記載されるようなユニバーサルヌクレオチドの「反対側」に位置付けられる。これは、ユニバーサルヌクレオチドに近接して位置付けられる新たに組み込まれたヌクレオチドの一例である。代替的に、新たに組み込まれた所定の配列のヌクレオチド（位置ｎを占める）は、最初に、そのパートナーと異なるヌクレオチドを有し得、ユニバーサルヌクレオチドは、本明細書に記載される方法のバージョン２におけるような位置ｎ＋１などの異なる位置を占め得る。この場合、新しく組み込まれたヌクレオチドは、ユニバーサルヌクレオチドに近接して位置付けられるが、ユニバーサルヌクレオチドと反対側には位置付けられない。代替的な方法では、ユニバーサルヌクレオチドは、位置ｎから１位置ずつ増分的に除去されて、例えば、位置ｎ＋２、ｎ＋３、ｎ＋３＋ｘを占めることができ、ここでｘは、１〜１０以上などの整数である。そのような代替的な方法では、ユニバーサルヌクレオチドによって定義される切断部位が作成され得るという条件で、かつ本明細書に記載される突出構造が切断時に生成されて、その後の連結ポリヌクレオチドの連結を可能にし得るという条件で、新たに組み込まれたヌクレオチドがなおユニバーサルヌクレオチドと近接して位置付けられる。
【０１０２】
ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体は、好ましくは、ヌクレオシド三リン酸として提供され得る。したがって、ＤＮＡポリヌクレオチドを合成するための本発明の方法のうちのいずれにおいても、ヌクレオチドは、例えばＤＮＡポリメラーゼ酵素の作用によって、２’−デオキシリボヌクレオシド−５’−Ｏ−三リン酸（ｄＮＴＰ）から組み込まれ得る。ＲＮＡポリヌクレオチドを合成するための本発明の方法のうちのいずれにおいても、ヌクレオチドは、例えばＲＮＡポリメラーゼ酵素の作用によって、リボヌクレオシド−５’−Ｏ−三リン酸（ＮＴＰ）から組み込まれ得る。三リン酸は、四リン酸または五リン酸（一般的には、オリゴリン酸）で置換することができる。これらのオリゴリン酸は、他のアルキル基またはアシル基で置換することができる。
【化１】
2020506687.tif 000003
【０１０３】
本発明の方法は、ユニバーサルヌクレオチドを使用することができる。ユニバーサルヌクレオチドを足場分子の支持鎖の成分として使用して、各合成サイクル中に新たに組み込まれたヌクレオチドがその所望のパートナーヌクレオチドと正しく対合されることを促進することができる。必要に応じて、ユニバーサルヌクレオチドも、所定のヌクレオチド配列の成分として合成鎖に組み込まれ得る。
【０１０４】
ユニバーサルヌクレオチドは、核酸塩基が所定の配列の任意のヌクレオチドの核酸塩基にある程度結合する、すなわち水素結合するものである。ユニバーサルヌクレオチドは、好ましくは、ヌクレオシドアデノシン（Ａ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）、グアニン（Ｇ）、およびシトシン（Ｃ）を含むヌクレオチドにある程度結合する、例えば水素結合するものである。ユニバーサルヌクレオチドは、他のヌクレオチドよりもいくつかのヌクレオチドにより強く結合し得る。例えば、ヌクレオシド、２’−デオキシイノシンを含むユニバーサルヌクレオチド（Ｉ）は、Ｉ−Ｃ＞Ｉ−Ａ＞Ｉ−Ｇの優先的な対合順序がおよそ＝Ｉ−Ｔであることを示すであろう。
【０１０５】
可能なユニバーサルヌクレオチドの例は、イノシンまたはニトロインドールである。ユニバーサルヌクレオチドは、好ましくは、以下の核酸塩基、ヒポキサンチン、４−ニトロインドール、５−ニトロインドール、６−ニトロインドール、３−ニトロピロール、ニトロイミダゾール、４−ニトロピラゾール、４−ニトロベンゾイミダゾール、５−ニトロインダゾール、４−アミノベンゾイミダゾール、またはフェニル（Ｃ６芳香族環のうちの１つを含む。ユニバーサルヌクレオチドは、より好ましくは、以下のヌクレオシド：２’−デオキシイノシン、イノシン、７−デアザ−２’−デオキシイノシン、７−デアザ−イノシン、２−アザ−デオキシイノシン、２−アザ−イノシン、４−ニトロインドール２’−デオキシリボヌクレオシド、４−ニトロインドールリボヌクレオシド、５−ニトロインドール２’デオキシリボヌクレオシド、５−ニトロインドールリボヌクレオシド、６−ニトロインドール２’デオキシリボヌクレオシド、６−ニトロインドールリボヌクレオシド、３−ニトロピロール２’デオキシリボヌクレオシド、３−ニトロピロールリボヌクレオシド、ヒポキサンチンの非環状糖類似体、ニトロイミダゾール２’デオキシリボヌクレオシド、ニトロイミダゾールリボヌクレオシド、４−ニトロピラゾール２’デオキシリボヌクレオシド、４−ニトロピラゾールリボヌクレオシド、４−ニトロベンゾイミダゾール２’デオキシリボヌクレオシド、４−ニトロベンゾイミダゾールリボヌクレオシド、５−ニトロインダゾール２’デオキシリボヌクレオシド、５−ニトロインダゾールリボヌクレオシド、４−アミノベンゾイミダゾール２’デオキシリボヌクレオシド、４−アミノベンゾイミダゾールリボヌクレオシド、フェニルＣ−リボヌクレオシド、またはフェニルＣ−２’−デオキシリボシルヌクレオシドのうちの１つを含む。
【０１０６】
ユニバーサル塩基のいくつかの例を以下に示す。
【化２】
2020506687.tif 000004
【０１０７】
光切断可能な塩基および酵素切断可能な塩基を含む切断可能な塩基を組み込むユニバーサルヌクレオチドも使用することができ、それらのいくつかの例を以下に示す。
光切断可能な塩基：
【化３】
2020506687.tif 000005
エンドヌクレアーゼＩＩＩにより切断可能な塩基類似体：
【化４】
2020506687.tif 000006
ホルムアミドピリミジンＤＮＡグリコシラーゼ（Ｆｐｇ）によって切断可能な塩基類似体：
【化５】
2020506687.tif 000007
８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｈＯＧＧ１）によって切断可能な塩基類似体：
【化６】
2020506687.tif 000008
ｈＮｅｉｌ１によって切断可能な塩基類似体：
【化７】
2020506687.tif 000009
チミンＤＮＡグリコシラーゼ（ＴＤＧ）によって切断可能な塩基類似体：
【化８】
2020506687.tif 000010
ヒトアルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｈＡＡＧ）によって切断可能な塩基類似体：
【化９】
2020506687.tif 000011
ウラシルＤＮＡグリコシラーゼによって切断可能な塩基：
【化１０】
2020506687.tif 000012
ヒト一本鎖選択的単官能性ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＳＭＵＧ１）によって切断可能な塩基
【化１１】
2020506687.tif 000013
５−メチルシトシンＤＮＡグリコシラーゼ（ＲＯＳ１）によって切断可能な塩基：
【化１２】
2020506687.tif 000014
（Ｓ．Ｓ．Ｄａｖｉｄ，Ｓ．Ｄ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗｓ  １９９８，９８，１２２１−１２６２およびＭ．Ｉ．Ｐｏｎｆｅｒｒａｄａ−Ｍａｒｉｎ，Ｔ．Ｒｏｌｄａｎ−Ａｒｊｏｎａ，Ｒ．Ｒ．Ａｒｉｚａ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２００９，３７，４２６４−４２７４を参照されたい）。
【０１０８】
足場ポリヌクレオチドを伴う方法のうちのいずれにおいても、ユニバーサルヌクレオチドは、最も好ましくは２’−デオキシイノシンを含む。
【０１０９】
本明細書に記載される合成方法のうちのいずれかを使用して組み込むことができるエピジェネティック塩基の例には、以下のものが含まれる。
【化１３】
2020506687.tif 000015
【０１１０】
本明細書に記載される合成方法のうちのいずれかを使用して組み込むことができる修飾塩基の例には、以下のものが含まれる。
【化１４】
2020506687.tif 000016
【０１１１】
本明細書に記載される合成方法のうちのいずれかを使用して組み込むことができるハロゲン化塩基の例には、以下のものが含まれる。
【化１５】
2020506687.tif 000017
ここで、Ｒ１＝Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、アルキル、アリール、蛍光標識、アミノプロパルギル、アミノアリルである。
【０１１２】
本明細書に記載される合成方法のうちのいずれかを使用して組み込むことができる、例えば付着／リンカー化学において有用であり得るアミノ修飾塩基の例には、以下のものが含まれる。
【化１６】
2020506687.tif 000018
ここで、塩基＝アルキンまたはアルケンリンカーを有するＡ、Ｔ、Ｇ、またはＣである。
【０１１３】
本明細書に記載される合成方法のうちのいずれかを使用して組み込むことができる、例えばクリック化学において有用であり得る修飾塩基の例には、以下のものが含まれる。
【化１７】
2020506687.tif 000019
【０１１４】
本明細書に記載される合成方法のうちのいずれかを使用して組み込むことができるビオチン修飾塩基の例には、以下のものが含まれる。
【化１８】
2020506687.tif 000020
ここで、塩基＝アルキンまたはアルケンリンカーを有するＡ、Ｔ、Ｇ、またはＣである。
【０１１５】
本明細書に記載される合成方法のうちのいずれかを使用して組み込むことができるフルオロフォアおよびクエンチャーを担持する塩基の例には、以下のものが含まれる。
【化１９】
2020506687.tif 000021
【０１１６】
ヌクレオチド組み込み酵素
本明細書に記載される方法を使用して所定のヌクレオチドを組み込むために任意の好適な酵素を用いることができる。したがって、ポリメラーゼの使用に関して本明細書に定義および記載されるすべての方法において、ポリメラーゼは、本発明の方法の文脈においてポリメラーゼと同じ機能を果たすことができる別の酵素と置換され得る。
【０１１７】
好ましくは、ポリメラーゼ酵素を、本明細書に記載される方法に用いることができる。ポリメラーゼ酵素は、本明細書に記載されるように、修飾ヌクレオチド、具体的には、付着した可逆的ターミネーター基を有するヌクレオチドを組み込むそれらの能力に基づいて選択され得る。本明細書に記載される例示的な方法において、ＤＮＡに作用するすべてのポリメラーゼは、３’〜５’のエキソヌクレアーゼ活性を有してはならない。好ましくは、ポリメラーゼは鎖置換活性を有するであろう。
【０１１８】
したがって、好ましくは、ポリメラーゼは、未修飾ポリメラーゼと比較して、可逆的ターミネーター基を含むヌクレオチドを組み込む能力が増強された修飾ポリメラーゼである。ポリメラーゼは、より好ましくは、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種９°Ｎ、好ましくは種９°Ｎ−７由来の天然ＤＮＡポリメラーゼの遺伝子操作された変異体である。そのような修飾ポリメラーゼの一例は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓから入手可能なＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼである。この酵素は、３’−Ｏ修飾ｄＮＴＰを組み込む能力が向上している。
【０１１９】
本発明の方法のうちのいずれにおいても可逆的ターミネーターｄＮＴＰの組み込みに使用することができる他のポリメラーゼの例は、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ（エキソ）、Ｖｅｎｔ（エキソ）、９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗ断片（エキソ）、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、およびＴａｑポリメラーゼである。
【０１２０】
本発明の方法のうちのいずれにおいても可逆的ターミネーターＮＴＰの組み込みに使用することができる他のポリメラーゼの例は、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、およびＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼである。
【０１２１】
可逆的ブロッキング基
本明細書に定義および記載されるすべての方法は、可逆的ブロッキング基または可逆的ターミネーター基を指す。そのような基は、所与の合成サイクルにおいて酵素によるさらなる伸長を防止するように作用し、その結果、所定の配列のヌクレオチドのみが合成鎖を伸長させるために制御可能に使用され得、したがって非特異的ヌクレオチドの組み込みが防止される。この効果を達成する任意の機能性は、本明細書に定義および記載される方法のうちのいずれにおいても使用され得る。ヌクレオチドに付着した可逆的ブロッキング基／可逆的ターミネーター基および脱ブロッキング工程は、この効果を達成するための好ましい手段である。しかしながら、この効果は、必要に応じて代替的な手段によっても達成され得る。
【０１２２】
所与のサイクルにおけるヌクレオチドの組み込み後の酵素によるさらなる伸長を防止し、サイクル当たり１つのヌクレオチドへの組み込みを制限するために、任意の好適な可逆的ブロッキング基がヌクレオチドに付着し得る。本発明のうちのいずれの方法においても、可逆的ブロッキング基は、好ましくは、ポリメラーゼ酵素によるさらなる伸長を防止するように作用する可逆的ターミネーター基である。可逆的ターミネーターの例を以下に提供する。
【０１２３】
プロパルギル可逆的ターミネーター：
【化２０】
2020506687.tif 000022
アリル可逆的ターミネーター：
【化２１】
2020506687.tif 000023
シクロオクテン可逆的ターミネーター：
【化２２】
2020506687.tif 000024
シアノエチル可逆的ターミネーター：
【化２３】
2020506687.tif 000025
ニトロベンジル可逆的ターミネーター：
【化２４】
2020506687.tif 000026
ジスルフィド可逆的ターミネーター：
【化２５】
2020506687.tif 000027
アジドメチル可逆的ターミネーター：
【化２６】
2020506687.tif 000028
アミノアルコキシ可逆的ターミネーター：
【化２７】
2020506687.tif 000029
【０１２４】
塩基に付着したかさ高い基を有するヌクレオシド三リン酸は、３’−ヒドロキシ基上の可逆的ターミネーター基の代替物として機能し得、さらなる組み込みをブロックすることができる。この基は、ＴＣＥＰまたはＤＴＴ生産天然ヌクレオチドによって脱保護することができる。
【化２８】
2020506687.tif 000030
【０１２５】
本発明の方法のうちのいずれかに従ってＤＮＡポリヌクレオチドを合成するために、好ましい修飾ヌクレオシドは、３’−Ｏ−修飾−２’−デオキシリボヌクレオシド−５’−Ｏ−三リン酸である。本発明の方法のうちのいずれかに従ってＲＮＡポリヌクレオチドを合成するために好ましい修飾ヌクレオシドは、３’−Ｏ−修飾リボヌクレオシド−５’−Ｏ−三リン酸である。
【０１２６】
好ましい修飾ｄＮＴＰは、３’−Ｏ−アリル−ｄＮＴＰおよび３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＮＴＰである修飾ｄＮＴＰである。
３’−Ｏ−アリル−ｄＮＴＰを以下に示す。
【化２９】
2020506687.tif 000031
３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＮＴＰを以下に示す。
【化３０】
2020506687.tif 000032
【０１２７】
本明細書に記載および定義される本発明の方法は、脱保護または脱ブロッキング工程を指す場合がある。そのような工程は、任意の好適な手段による可逆的ブロッキング基（例えば、可逆的ターミネーター基）の除去、または別様に、酵素／ポリメラーゼによるさらなる伸長を阻害するためにブロッキング基／ターミネーター基の機能性を逆転させることを伴う。
【０１２８】
脱保護工程において、任意の好適な試薬を使用して可逆的ターミネーター基を除去することができる。
【０１２９】
好ましい脱保護剤は、トリス（カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）である。ＴＣＥＰを使用して、組み込み後に（Ｐｄ０と共に）３’−Ｏ−アリル−ヌクレオチドおよび３’−Ｏ−アジドメチル−ヌクレオチドから可逆的ターミネーター基を除去することができる。
【０１３０】
脱保護試薬の例を以下に提供する。
プロパルギル可逆的ターミネーター：
Ｐｄ触媒による処理−Ｎａ２ＰｄＣｌ４、ＰｄＣｌ２。
リガンド、例えば、トリフェニルホスフィン−３，３’，３’’−トリスルホン酸三ナトリウム塩を使用することができる。
アリル可逆的ターミネーター：
Ｐｄ触媒による処理−Ｎａ２ＰｄＣｌ４、ＰｄＣｌ２。
リガンド、例えば、トリフェニルホスフィン−３，３’，３’’−トリスルホン酸三ナトリウム塩を使用することができる。
アジドメチル可逆的ターミネーター：
チオール（メルカプトエタノールまたはジチオトレイトール）、またはトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン−ＴＣＥＰによる処理。
シアノエチル可逆的ターミネーター：
フッ化物−フッ化アンモニウム、フッ化テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）による処理。
ニトロベンジル可逆的ターミネーター：
ＵＶ光への曝露
ジスルフィド可逆的ターミネーター：
チオール（メルカプトエタノールまたはジチオトレイトール）、またはトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン−ＴＣＥＰによる処理。
アミノアルコキシ可逆的ターミネーター：
亜硝酸塩（ＮＯ２−、ＨＮＯ２）による処理ｐＨ＝５．５
【０１３１】
可逆的ブロッキング基（例えば、可逆的ターミネーター基）は、可逆的ターミネーター基の除去後のさらなる組み込みを防止するために組み込み工程からの不要な試薬が除去されるという条件で、組み込み工程の直後に、かつ切断工程の前に行われる工程によって除去することができる。可逆的ブロッキング基（例えば、可逆的ターミネーター基）は、切断工程の直後に、かつ連結工程の前に行われる工程によって除去することができる。可逆的ブロッキング基（例えば、可逆的ターミネーター基）は、連結工程の直後に行われる工程によって除去することができる。
【０１３２】
合成ポリヌクレオチド
本明細書に記載される方法に従って合成された所定の配列を有するポリヌクレオチドは二本鎖である。合成されたポリヌクレオチドは全体として二本鎖であり、ここで第１の鎖は、ハイブリダイゼーションによって第２の鎖に付着している。第１の鎖が全体としてハイブリダイゼーションによって第２の鎖に付着しているという条件で、非ハイブリダイゼーションのミスマッチおよび領域は許容され得る。
【０１３３】
本明細書に記載される方法に従って合成された所定の配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドは、二本鎖ポリヌクレオチドとして保持され得る。代替的に、二本鎖ポリヌクレオチドの二本鎖を分離して、所定の配列を有する一本鎖ポリヌクレオチドを得ることができる。二本鎖ポリヌクレオチドの２つの鎖の分離（溶解）を可能にする条件は、当該技術分野においてよく知られている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−ｌｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９５））。
【０１３４】
本明細書に記載される方法に従って合成された所定の配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドは、合成後に増幅され得る。二本鎖ポリヌクレオチドのいかなる領域も増幅され得る。二本鎖ポリヌクレオチドの全体またはいかなる領域も、足場ポリヌクレオチドの全体またはいかなる領域と一緒に増幅され得る。二本鎖ポリヌクレオチドの増幅を可能にする条件は、当該技術分野においてよく知られている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−ｌｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９５））。したがって、本明細書に記載される合成方法のうちのいずれも、所定の配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドまたはその任意の領域が上記に記載されるように増幅される増幅工程をさらに含み得る。増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ポリメラーゼらせん反応（ＰＳＲ）、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、自立配列複製（３ＳＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、多重置換増幅（ＭＤＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、分岐増幅法（ＲＡＭ）などの任意の好適な方法によって行われ得る。好ましくは、増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって行われる。
【０１３５】
本明細書に記載される方法に従って合成された所定の配列を有する二本鎖または一本鎖ポリヌクレオチドは、任意の長さであり得る。例えば、ポリヌクレオチドは、少なくとも１０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも１５０個、少なくとも２００個、少なくとも２５０個、少なくとも３００個、少なくとも３５０個、少なくとも４００個、少なくとも４５０個、または少なくとも５００個のヌクレオチドまたはヌクレオチド対の長さであり得る。例えば、ポリヌクレオチドは、約１０〜約１００個のヌクレオチドまたはヌクレオチド対、約１０〜約２００個のヌクレオチドまたはヌクレオチド対、約１０〜約３００個のヌクレオチドまたはヌクレオチド対、約１０〜約４００個のヌクレオチドまたはヌクレオチド対、および約１０〜約５００個のヌクレオチドまたはヌクレオチド対の長さであり得る。ポリヌクレオチドは、最大１０００個以上のヌクレオチドもしくはヌクレオチド対、最大５０００個以上のヌクレオチドもしくはヌクレオチド対の長さ、または約１０００００以上のヌクレオチドもしくはヌクレオチド対の長さであり得る。
【０１３６】
足場ポリヌクレオチドの切断
足場ポリヌクレオチドの存在および連結前の切断工程を必要とする方法において、切断工程を行うための試薬の選択は、用いられる具体的な方法に依存するであろう。切断部位は、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドの特定の位置、および一旦切断された足場ポリヌクレオチド中の一塩基突出または二塩基突出の必要性によって定義される。したがって、本明細書に記載される例示的な方法を参照することによって容易に明らかになるように、所望の切断部位の構成および適切な切断試薬の選択は、その方法で用いられる特定の化学に依存するであろう。
【０１３７】
修飾塩基を認識するＤＮＡ切断酵素のいくつかの例を以下の表に示す。
【表１】
2020506687.tif 000033
【０１３８】
連結ポリヌクレオチド
足場ポリヌクレオチドの存在および切断後の連結工程を必要とする方法において、連結ポリヌクレオチドの構成および構造の選択はまた、用いられる具体的な方法に依存するであろう。連結ポリヌクレオチドは、一般に、本明細書に記載される支持鎖および本明細書に記載されるヘルパー鎖を含む。連結ポリヌクレオチドにおいて使用される支持鎖およびヘルパー鎖は、最初の足場ポリヌクレオチド構築物において使用されるものと同じでもまたは異なっていてもよい。例えば、連結ポリヌクレオチドの連結末端の支持鎖における一重塩基突出または二塩基突出の必要性は、用いられる方法に依存するであろう。適切な構造は、本明細書に記載される例示的な方法を参照することによって容易に達成することができる。
【０１３９】
連結ポリヌクレオチドの連結末端には、典型的に、突出に隣接するヘルパー鎖中に非リン酸化末端ヌクレオチドが提供される。これにより、合成鎖のヘルパー鎖部分と合成鎖のプライマー鎖部分との連結が防止され、よって合成鎖中の一本鎖切断が維持される。合成鎖における連結を防止するための代替的な手段を使用することもできる。例えば、ブロッキング部分は、ヘルパー鎖中の末端ヌクレオチドに付着し得る。さらに、本明細書にさらに記載されるように、ヘルパー鎖は、次の合成サイクルにおける隣の所定のヌクレオチドの組み込みの前に、例えば変性によって足場分子から除去され得る。
【０１４０】
連結
連結工程を伴う本発明の方法において、連結は、任意の好適な手段を使用して達成され得る。好ましくは、連結工程は、リガーゼ酵素によって行われるであろう。リガーゼは、一塩基突出基質に対する活性が増強された修飾リガーゼであり得る。リガーゼは、Ｔ３  ＤＮＡリガーゼまたはＴ４  ＤＮＡリガーゼであり得る。リガーゼは平滑ＴＡリガーゼであり得る。例えば、平滑ＴＡリガーゼは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ（ＮＥＢ）から入手可能である。これは、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼと、連結エンハンサーと、平滑末端および一塩基突出基質の両方の連結および形質転換を改善するために特別に調製された最適化反応緩衝液との、すぐに使用できるマスターミックス溶液である。一本鎖および二本鎖ポリヌクレオチドを連結（接合）するための分子、酵素、化学物質、および方法は、当業者によく知られている。
【０１４１】
固相合成
本発明の合成方法に従って生産された合成ポリヌクレオチドは、好ましくは固相または可逆的固相技術を使用して合成することができる。様々なそのような技術が当該技術分野において知られており、また、使用され得る。所定の配列の新たな二本鎖ポリヌクレオチドの合成を開始する前に、足場ポリヌクレオチドを表面、例えば、ガラスなどの平坦な表面、ゲル系材料、またはビーズもしくは官能化量子ドットなどの微粒子の表面に固定化し得る。表面を構成する材料自体が基質に結合され得る。例えば、足場ポリヌクレオチドは、例えばポリアクリルアミドなどのゲル系材料に固定化され得、ここでゲル系材料は、ガラスなどの支持基質に結合されている。
【０１４２】
ポリヌクレオチドは、直接または間接的に表面に固定化または繋留され得る。例えば、それらは化学結合によって表面に直接取り付けられ得る。それらは、以下に記載されるように、例えば、ＳＰＲＩにおけるような、またはエレクトロウェッティングシステムにおけるような、微粒子もしくはビーズの表面などの中間表面を介して表面に間接的に繋留され得る。次に、新たに合成されたポリヌクレオチドを組み込んでいる足場ポリヌクレオチドが固定化されている間に、合成サイクルを開始し、完了させることができる。
【０１４３】
そのような方法において、二本鎖足場ポリヌクレオチドは、所定の配列の１番目のヌクレオチドの組み込みの前に表面に固定化され得る。したがって、そのような固定化された二本鎖足場ポリヌクレオチドは、合成中および合成後に、所定の配列の二本鎖ポリヌクレオチドを表面に繋留するためのアンカーとして作用し得る。
【０１４４】
そのような二本鎖アンカー／足場ポリヌクレオチドの一方の鎖のみが、分子の同じ末端の表面に固定化され得る。代替的に、二本鎖アンカー／足場ポリヌクレオチドの両方の鎖が、それぞれ分子の同じ末端で表面に固定化され得る。二本鎖アンカー／足場ポリヌクレオチドには、新たな合成の開始部位と反対側の末端のヘアピンループなどを介して、隣接する末端で連結された各鎖が提供され得、接続されている末端は、表面上に固定化され得る（例えば、図４に概略的に図示されるように）。
【０１４５】
足場ポリヌクレオチドを伴う方法において、本明細書に記載されるように、足場ポリヌクレオチドは、所定の配列における１番目のヌクレオチドの組み込みの前に表面に付着し得る。したがって、図４（ａ）および（ｃ）に図示されるように、プライマー鎖部分を含む合成鎖とそれにハイブリダイズされた支持鎖の部分とを、両方とも別々に表面に付着させることができる。図４（ｂ）および（ｄ）に図示されるように、プライマー鎖部分を含む合成鎖とそれにハイブリダイズされた支持鎖の部分とが、ヘアピンループなどを介して、隣接する末端で、例えば新たな合成の開始部位と反対側の末端で接続され得、接続されている末端は表面に繋留され得る。図４（ｅ）〜（ｈ）に図示されるように、プライマー鎖部分を含む合成鎖とそれにハイブリダイズされた支持鎖の部分との一方または他方を、別々に表面に付着させることができる。好ましくは、プライマー鎖部分を含む合成鎖とそれにハイブリダイズされた支持鎖の部分とが表面に付着している。
【０１４６】
平坦な表面上での固相合成
所定の配列の新たな二本鎖ポリヌクレオチドの合成を開始する前に、合成アンカー／足場ポリヌクレオチドを、本明細書に記載されるものを含む当該技術分野で既知の方法によって合成し、表面に繋留させることができる。
【０１４７】
予め形成されたポリヌクレオチドを、平坦な表面に付着した核酸マイクロアレイを作成するために一般的に用いられる方法によって表面に繋留させることができる。例えば、アンカー／足場ポリヌクレオチドを作成し、次に、平坦な表面上にスポットまたは印刷することができる。アンカー／足場ポリヌクレオチドは、接触印刷技術を使用して表面上に堆積させることができる。例えば、中実または中空のチップまたはピンを、予め形成された足場ポリヌクレオチドを含む溶液に浸漬し、平坦な表面と接触させることができる。代替的に、オリゴヌクレオチドをマイクロスタンプ上に吸着させ、次に、物理的接触によって平坦な表面に転写することができる。非接触印刷技術としては、サーマル印刷または圧電印刷が挙げられ、ここでは、予め形成された足場ポリヌクレオチドを含むサブナノリットルサイズの微小液滴を、インクジェットおよびバブルジェット印刷に使用される方法と同様の方法を使用して印刷チップから射出することができる。
【０１４８】
一本鎖オリゴヌクレオチドは、マイクロアレイを作成するために用いられる、いわゆる「オンチップ」方法を使用するなど、平坦な表面上で直接合成することができる。次に、そのような一本鎖オリゴヌクレオチドは、予め形成されたアンカー／足場ポリヌクレオチドを固定化するための付着部位として作用し得る。
【０１４９】
一本鎖オリゴヌクレオチドを生成するためのオンチップ技術は、保護されたヌクレオチドを選択的に活性化して、その後の新たな保護されたヌクレオチドの組み込みを可能にするためのフォトリソグラフィマスクを通して向けられるＵＶ光の使用を伴うフォトリソグラフィを含む。ＵＶ媒介脱保護および予め判定されたヌクレオチドの結合のサイクルは、所望の配列を有するオリゴヌクレオチドのインサイチュ生成を可能にする。フォトリソグラフィマスクの使用に対する代替物として、インクジェット印刷技術を使用した核酸塩基の逐次堆積、ならびに所望の配列を有するオリゴヌクレオチドを生成するための結合、酸化、および脱保護のサイクルの使用によって、オリゴヌクレオチドを平坦な表面上に作成し得る（レビューのために、Ｋｏｓｕｒｉ  ａｎｄ  Ｃｈｕｒｃｈ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１４，１１，４９９−５０７を参照されたい）。
【０１５０】
以下に記載されるような可逆的固定化を伴う方法を含む、本明細書に記載される合成方法のうちのいずれにおいても、表面は任意の好適な材料で作製され得る。典型的には、表面は、シリコン、ガラス、またはポリマー材料を含み得る。表面は、約２％のポリアクリルアミドなどのポリアクリルアミド表面、任意選択的にＮ−（５−ブロモアセトアミジルペンチル）アクリルアミド（ＢＲＡＰＡ）を使用して得られるポリアクリルアミド表面などのゲル表面を含むことができ、好ましくはポリアクリルアミド表面は、ガラスなどの固体支持体に結合されている。
【０１５１】
可逆的固定化
所定の配列を有する合成ポリヌクレオチドは、可逆的固定化を促進する、微粒子およびビーズなどの結合表面および結合構造を使用して本発明に従って合成することができる。固相可逆的固定化（ＳＰＲＩ）方法または改良された方法が、当該技術分野において知られており、また用いることができる（例えば、ＤｅＡｎｇｅｌｉｓ  Ｍ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＣＲ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２３（２２）：４７４２−４７４３を参照されたい）。
【０１５２】
表面は、常磁性ビーズなどの微粒子の形態で提供され得る。常磁性ビーズは磁場の影響下で凝集する場合がある。例えば、常磁性表面には、化学基、例えばカルボキシル基が提供され得、これは、以下により詳細に記載されるように、適切な付着条件下で、核酸に対する結合部分として作用するであろう。核酸は、そのような表面から適切な溶出条件下で溶出され得る。微粒子およびビーズの表面には、ＵＶ感受性ポリカーボネートが提供され得る。核酸は、好適な固定化緩衝液の存在下で活性化表面に結合され得る。
【０１５３】
微粒子およびビーズを反応溶液内で自由に移動させ、次に、例えば、ビーズを表面にエッチングしたマイクロウェルまたはピット内に保持することによって可逆的に固定化することができる。ビーズは、例えば、ビーズに付着した固有の核酸「バーコード」の使用によって、または色分けの使用によって、アレイの一部として局在化され得る。
【０１５４】
したがって、所定の配列の新たな二本鎖ポリヌクレオチドの合成を開始する前に、本発明によるアンカー／足場ポリヌクレオチドを合成し、次に、そのような結合表面に可逆的に固定化することができる。本発明の方法によって合成されたポリヌクレオチドは、そのような結合表面に可逆的に固定化される間に合成することができる。
【０１５５】
微小流体技術およびシステム
表面は、エレクトロウェッティングオン誘電体システム（ＥＷＯＤ）であり得る。ＥＷＯＤシステムは、微小液滴の形態での非常に小さい液体容量の微小流体操作を促進する誘電体被覆表面を提供する（例えば、Ｃｈｏｕ，Ｗ−Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｒｅｃｅｎｔ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｍｉｃｒｏｍａｃｈｉｎｅｓ，６：１２４９−１２７１．）。液滴容量は、エレクトロウェッティング技術によってチップ上でプログラム可能に作成、移動、区分化、および組み合わせることができる。したがって、エレクトロウェッティングシステムは、合成中および合成後にポリヌクレオチドを可逆的に固定化するための代替的な手段を提供する。
【０１５６】
所定の配列を有するポリヌクレオチドは、本明細書に記載される方法によって固相で合成することができ、ここでポリヌクレオチドは、ＥＷＯＤ表面上に固定化され、各サイクルにおける必要な工程はエレクトロウェッティング技術によって促進される。例えば、足場ポリヌクレオチドを伴い、組み込み、切断、連結、および脱保護工程を必要とする方法において、各工程に必要な試薬、ならびに使用済みかつ不要な試薬を除去するために必要な任意の洗浄工程に必要な試薬は、エレクトロウェッティング技術を介した電場の影響下で輸送される微小液滴の形態で提供され得る。
【０１５７】
本発明の合成方法において使用され得る他の微小流体プラットフォームが利用可能である。例えば、核酸操作のために一般的に用いられているエマルジョンベースの微小液滴技術を使用することができる。そのようなシステムでは、微小液滴は、２つの不混和性流体、典型的には水と油との混合によって作成されるエマルジョン中に形成される。エマルジョン微小液滴は、微小流体網内でプログラム可能に作成、移動、区分化、および組み合わせることができる。ヒドロゲル系もまた利用可能である。本明細書に記載される合成方法のうちのいずれにおいても、微小液滴は、上記に記載されるＥＷＯＤシステムおよび他の微小流体システム、例えば、エラストマー材料を含む成分に基づくアーキテクチャを含む微小流体システムなどの任意の好適な適合システムで操作することができる。
【０１５８】
微小液滴は、それらが本明細書の合成方法と適合するという条件で、任意の好適なサイズのものであり得る。微小液滴のサイズは、用いられる具体的なシステムおよびシステムの関連するアーキテクチャに応じて変化するであろう。したがって、サイズは必要に応じて適応され得る。本明細書に記載される合成方法のうちのいずれにおいても、液滴直径は、約１５０ｎｍ〜約５ｍｍの範囲であり得る。１μｍ未満の液滴直径は、例えば、Ｇａｎａｎ−Ｃａｌｖｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｈｙｓｉｃｓ，２００７，３，ｐｐ７３７−７４２）に記載されているような、キャピラリージェット法を伴う技術などによって、当該技術分野において既知の手段によって検証することができる。
【０１５９】
表面付着化学
オリゴヌクレオチドは典型的には化学的に付着するが、それらはまた、親和性相互作用などを介して間接的な手段によって表面に付着し得る。例えば、オリゴヌクレオチドをビオチンで官能化し、アビジンまたはストレプトアビジンで被覆された表面に結合させることができる。
【０１６０】
ポリヌクレオチドを表面（例えば、平坦な表面）、微粒子、およびビーズなどに固定化するために、様々な表面付着方法および化学が利用可能である。付着を促進するために、表面を官能化または誘導体化することができる。そのような官能化は、当該技術分野において知られている。例えば、表面は、ポリヒスチジンタグ（ヘキサヒスチジン−タグ、６×Ｈｉｓ−タグ、Ｈｉｓ６タグ、またはＨｉｓ−タグ（登録商標））、Ｎｉ−ＮＴＡ、ストレプトアビジン、ビオチン、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＧＮＡ、ＴＮＡ、またはＬＮＡなど）、カルボキシル基、第４級アミン基、チオール基、アジド基、アルキン基、ＤＩＢＯ、脂質、ＦＬＡＧタグ（ＦＬＡＧオクタペプチド）、ポリヌクレオチド結合タンパク質、ペプチド、タンパク質、抗体、または抗体断片で官能化され得る。表面は、アンカー／足場ポリヌクレオチドに特異的に結合する分子または基で官能化され得る。
【０１６１】
ポリヌクレオチドを表面に付着させるのに好適な化学のいくつかの例を、図４ｉおよび図４ｊに示す。
【０１６２】
本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、プライマー鎖部分を含む合成鎖とそれにハイブリダイズされた支持鎖の部分とを含む足場ポリヌクレオチドは、１つ以上の共有結合を介して共通の表面に繋留され得る。１つ以上の共有結合は、共通の表面上の官能基と足場分子上の官能基との間に形成され得る。足場分子上の官能基は、例えば、アミン基、チオール基、チオリン酸基、またはチオアミド基であり得る。共通の表面上の官能基は、ブロモアセチル基であり得、任意選択的に、ブロモアセチル基は、Ｎ−（５−ブロモアセトアミジルペンチル）アクリルアミド（ＢＲＡＰＡ）を使用して得られるポリアクリルアミド表面上に提供される。
【０１６３】
本発明の方法のうちのいずれにおいても、足場ポリヌクレオチドは、リンカーを介して直接または間接的のいずれかで表面に付着し得る。生体適合性および親水性の性質を有する任意の好適なリンカーを使用することができる。
【０１６４】
リンカーは、直鎖状リンカーであってもまたは分岐状リンカーであってもよい。
【０１６５】
リンカーは炭化水素鎖を含み得る。炭化水素鎖は、２〜約２０００個以上の炭素原子を含み得る。炭化水素鎖は、アルキレン基、例えば、Ｃ２〜約２０００個以上のアルキレン基を含み得る。炭化水素鎖は、−（ＣＨ２）ｎ−の一般式を有し得、式中、ｎは２〜２０００以上である。炭化水素鎖は、１つ以上のエステル基（すなわち、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−）または１つ以上のアミド基（すなわち、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｈ）−）によって任意選択的に中断され得る。
【０１６６】
ＰＥＧ、ポリアクリルアミド、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ−２−メチル−２−オキサゾリン（ＰＭＯＸＡ）、双性イオンポリマー、例えばポリ（メタクリル酸カルボキシベタイン）（ＰＣＢＭＡ）、ポリ［Ｎ−（３−スルホプロピル）−Ｎ−メタクリロキシエチル−Ｎ、Ｎ−ジメチルアンモニウムベタイン］（ＰＳＢＭＡ）、グリコポリマー、およびポリペプチドを含む群から選択される任意のリンカーを使用することができる。
【０１６７】
リンカーは、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−の一般式を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含み得、式中、ｎは１〜約６００以上である。
【０１６８】
リンカーは、−［（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−ＰＯ２−−Ｏ］ｍ−の一般式を有するオリゴエチレングリコール−リン酸単位を含み得、式中、ｎは１〜約６００以上であり、ｍは１〜２００以上であり得る。
【０１６９】
上記に記載されるリンカーのうちのいずれも、リンカーの一末端で本明細書に記載される足場分子に付着することができ、リンカーの他方の末端で１番目の官能基に付着することができ、ここで１番目の官能基は、表面に共有結合を提供し得る。１番目の官能基は、本明細書にさらに記載されるように、例えば、アミン基、チオール基、チオリン酸基、またはチオアミド基であり得る。表面をさらなる官能基で官能化して、１番目の官能基と共有結合を提供し得る。さらなる官能基は、本明細書にさらに記載されるように、例えば、２−ブロモアセトアミド基であり得る。任意選択的に、ブロモアセチル基は、Ｎ−（５−ブロモアセトアミジルペンチル）アクリルアミド（ＢＲＡＰＡ）を使用して得られるポリアクリルアミド表面上に提供される。表面上のさらなる官能基は、ブロモアセチル基であり得、任意選択的に、ブロモアセチル基は、Ｎ−（５−ブロモアセトアミジルペンチル）アクリルアミド（ＢＲＡＰＡ）を使用して得られるポリアクリルアミド表面上に提供され、１番目の官能基は、必要に応じて、例えば、アミン基、チオール基、チオリン酸基、またはチオアミド基であり得る。ポリヌクレオチドが付着している表面は、ゲルを含み得る。表面は、約２％のポリアクリルアミドなどのポリアクリルアミド表面を含み、好ましくはポリアクリルアミド表面は、ガラスなどの固体支持体に結合されている。
【０１７０】
本発明の方法のうちのいずれにおいても、足場ポリヌクレオチドは、足場ポリヌクレオチドに組み込まれた分岐ヌクレオチドを介してリンカーに任意選択的に付着し得る。任意の好適な分岐ヌクレオチドを、任意の好適な適合するリンカーと共に使用することができる。
【０１７１】
本発明の合成サイクルを開始する前に、足場ポリヌクレオチドは、足場ポリヌクレオチドに組み込まれた１つ以上の分岐ヌクレオチドを用いて合成することができる。１つ以上の分岐ヌクレオチドが足場ポリヌクレオチドに組み込まれる正確な位置、したがってリンカーが付着し得る正確な位置は変化してもよく、所望に応じて選択され得る。位置は、例えば、支持鎖および／または合成鎖の末端にあり得るか、または例えば、ヘアピンループを含む実施形態では、支持鎖を合成鎖に接続するループ領域内にあり得る。
【０１７２】
足場ポリヌクレオチドの合成中に、１つ以上の分岐ヌクレオチドは、分岐部分の反応基をブロックするブロッキング基と共に足場ポリヌクレオチドに組み込まれ得る。次に、ブロッキング基は、リンカーの分岐部分、またはリンカーが複数の単位を含む場合はリンカーの１番目の単位（分子）への結合の前に除去（脱ブロック）され得る。
【０１７３】
足場ポリヌクレオチドの合成中に、１つ以上の分岐ヌクレオチドを、その後の「クリック化学」反応において使用するのに好適な基で足場ポリヌクレオチドに組み込んで、リンカー、またはリンカーが複数の単位を含む場合にはリンカーの１番目の単位を分岐部分に結合することができる。そのような基の例はアセチレン基である。
【０１７４】
いくつかの非限定的で例示的な分岐ヌクレオチドを以下に示す。
【化３１】
2020506687.tif 000034
【０１７５】
リンカーは、任意選択的に、例えば、Ｓｐ９スペーサーのような１つ以上のスペーサー分子（単位）を含み得、ここで第１のスペーサー単位は、分岐ヌクレオチドに付着している。
【０１７６】
リンカーは、第１のスペーサー基に付着した１つ以上のさらなるスペーサー基を含み得る。例えば、リンカーは、複数の、例えばＳｐ９スペーサー基を含み得る。第１のスペーサー基は分岐部分に付着し、次に、１つ以上のさらなるスペーサー基が、順次添加されて、それらの間にリン酸基で接続されている複数のスペーサー単位を含むスペーサー鎖を伸長させる。
【０１７７】
分岐ヌクレオチドに付着した第１のスペーサー単位、または分岐鎖に既に付着した既存のスペーサー単位に付着するさらなるスペーサー単位を含むことができるスペーサー単位（Ｓｐ３、Ｓｐ９、およびＳｐ１３）のいくつかの非限定的な例を以下に示す。
【化３２】
2020506687.tif 000035
【０１７８】
リンカーは、１つ以上のエチレングリコール単位を含み得る。
【０１７９】
リンカーは、複数の単位がヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドを含み得る。
【０１８０】
上記に図示される構造では、５’’という用語は、分岐部分が付着しているヌクレオチドの５’末端と示差するために使用され、ここで５’は当該技術分野におけるその通常の意味を有する。５’’とは、そこからリンカーが伸長され得るヌクレオチド上の位置を意味することが意図される。５’’位置は異なる場合がある。５’’位置は、典型的には、ヌクレオチドの核酸塩基中の位置である。核酸塩基中の５’’位置は、上記の構造に図示されるように、所望の分岐部分の性質に応じて変化し得る。
【０１８１】
マイクロアレイ
本明細書に記載されるポリヌクレオチド合成方法のうちのいずれかを使用して、ポリヌクレオチドマイクロアレイを製造することができる（Ｔｒｅｖｉｎｏ，Ｖ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．２００７  １３，ｐｐ５２７−５４１）。したがって、アンカーまたは足場ポリヌクレオチドは、表面上の複数の個々にアドレス可能な反応部位に繋留され得、所定の配列を有するポリヌクレオチドは、マイクロアレイ上にインサイチュで合成され得る。
【０１８２】
合成後、各反応領域において、所定の配列のポリヌクレオチドに、固有の配列を付与することができる。アンカーまたは足場ポリヌクレオチドに、同定を促進するためのバーコード配列が提供され得る。
【０１８３】
所定の配列のポリヌクレオチドを合成する方法以外に、本明細書に記載される技術を含む、この技術分野で一般的に使用される技術を使用して、マイクロアレイ製造を行うことができる。例えば、アンカーまたは足場ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるものを含む既知の表面付着方法および化学を使用して表面に繋留され得る。
【０１８４】
所定の配列のポリヌクレオチドの合成後に、非繋留末端からあらゆる望ましくないポリヌクレオチド配列を除去するための最終切断工程が提供され得る。
【０１８５】
所定の配列のポリヌクレオチドは、二本鎖形態で反応部位に提供され得る。代替的に、合成後に、二本鎖ポリヌクレオチドを分離し、一本鎖を除去して、反応部位に一本鎖ポリヌクレオチドを残してもよい。このプロセスを促進するために、鎖の選択的繋留が提供され得る。例えば、足場ポリヌクレオチドを伴う方法において、合成鎖は表面に繋留され得、支持鎖は繋留されない場合があるか、またはその逆でもよい。合成鎖に、切断不能なリンカーが提供され得、支持鎖に、切断可能なリンカーが提供され得るか、またはその逆でもよい。鎖の分離は、熱処理などの従来の方法によって行われ得る。
【０１８６】
合成ポリヌクレオチドの構築
本明細書に記載される方法によって合成され、任意選択的に本明細書に記載される方法によって増幅される所定の配列を有するポリヌクレオチドは、より大きな合成ポリヌクレオチドを作成するために１つ以上の他のそのようなポリヌクレオチドに接合され得る。
【０１８７】
複数のポリヌクレオチドの接合は、当該技術分野において一般的に知られている技術によって達成することができる。本明細書に記載される方法によって合成された第１のポリヌクレオチドおよび１つ以上の追加のポリヌクレオチドを切断して適合する末端を作成し、次に、ポリヌクレオチドを連結によって一緒に接合することができる。切断は任意の好適な手段によって達成することができる。典型的には、制限酵素切断部位をポリヌクレオチド中に作成し得、次に、制限酵素を使用して切断工程を行い、それにより合成されたポリヌクレオチドを任意のアンカー／足場ポリヌクレオチドから放出し得る。切断部位は、アンカー／足場ポリヌクレオチドの一部として設計され得る。代替的に、切断部位は、所定のヌクレオチド配列の一部として、新たに合成されたポリヌクレオチド内に作成され得る。
【０１８８】
ポリヌクレオチドの構築は、好ましくは固相法を使用して行われる。例えば、合成後、第１のポリヌクレオチドは、表面固定化部位に対して遠位の好適な位置で単一の切断に供され得る。したがって、第１のポリヌクレオチドは表面に固定化されたままであり、単一の切断は別のポリヌクレオチドへの接合に対して適合する末端を生成するであろう。追加のポリヌクレオチドを２つの好適な位置で切断に供して、他のポリヌクレオチドに結合するための適合する末端を各末端に生成し得、同時に追加のポリヌクレオチドを表面固定化から放出し得る。追加のポリヌクレオチドは、第１のポリヌクレオチドと適合的に接合され得、したがって、所定の配列を有し、さらに別の追加のポリヌクレオチドへの接合に適合する末端を有する、より大きな固定化ポリヌクレオチドを作成し得る。したがって、予め選択された切断合成ポリヌクレオチドの接合の反復サイクルが、はるかに長い合成ポリヌクレオチド分子を作成し得る。追加のポリヌクレオチドの接合の順序は、必要な所定の配列によって決定されるだろう。
【０１８９】
したがって、本発明の構築方法は、１つ以上のＭｂ程度の長さを有する合成ポリヌクレオチド分子の作成を可能にし得る。
【０１９０】
本発明の構築および／または合成方法は、当該技術分野において知られている装置を使用して行うことができる。上記に記載されるように、非常に少量の試薬を、典型的にはエレクトロウェッティングオン誘電体（ＥＷＯＤ）などの液滴エレクトロウェッティング技術の形態で、アレイの異なる場所で他の容量と選択的に移動、区分化、および組み合わせることを可能にする技術および装置を用いることができる。液滴を操作することができる、本発明に用いられ得る好適なエレクトロウェッティング技術およびシステムは、例えば、ＵＳ８６５３８３２、ＵＳ８８２８３３６、ＵＳ２０１４／０１９７０２８、およびＵＳ２０１４／０２０２８６３に開示されている。
【０１９１】
固相からの切断は、プライマー鎖部分とそれにハイブリダイズされた支持鎖の部分との一方または両方で切断可能なリンカーを提供することによって達成され得る。切断可能なリンカーは、例えば、ＵＶ切断可能なリンカーであり得る。
【０１９２】
酵素的切断を伴う切断方法の例を図２２に示す。概略図は、（黒菱形構造を介して）表面に付着し、所定の配列のポリヌクレオチドを含む足場ポリヌクレオチドを示す。足場ポリヌクレオチドは上部ヘアピンおよび下部ヘアピンを含む。いずれの場合も、上部ヘアピンは、ユニバーサルヌクレオチドを利用して切断部位を定義する切断工程を使用して切断することができる。下部ヘアピンは、足場ポリヌクレオチドに操作されるか、または所定の配列の新たに合成されたポリヌクレオチドに操作される部位を介して制限エンドヌクレアーゼによって除去することができる。
【０１９３】
したがって、上記に記載されるように、所定の配列を有するポリヌクレオチドは、エレクトロウェッティング表面に固定化されながら合成され得る。合成されたポリヌクレオチドは、エレクトロウェッティング表面から切断され得、液滴の形態で電場の影響下で移動され得る。液滴は、それらが他の切断合成ポリヌクレオチドとの連結のための切断された合成ポリヌクレオチドを送達することができる表面上の特定の反応部位で組み合わせることができる。次に、ポリヌクレオチドを、例えば連結によって接合することができる。そのような技術を使用して、所望の所定の配列に従って順番に異なるポリヌクレオチドの集団を合成し、付着させることができる。そのようなシステムを使用して、完全自動化ポリヌクレオチド合成および構築システムを設計することができる。このシステムは、所望の所定の配列に従って、所望の配列を受け取り、試薬を供給し、合成サイクルを行い、続いて所望のポリヌクレオチドを構築するようにプログラムすることができる。
【０１９４】
システムおよびキット
本発明はまた、本明細書に記載および定義される合成方法のうちのいずれか、ならびに本明細書に記載および定義されるその後の増幅および構築工程のうちのいずれかを実施するためのポリヌクレオチド合成システムも提供する。
【０１９５】
典型的には、合成サイクル反応は、本明細書に記載および定義される手段によって表面に繋留されている足場ポリヌクレオチド分子に所定の配列のヌクレオチドを組み込むことによって実施されるであろう。表面は、本明細書に記載および定義されるような任意の好適な表面であり得る。
【０１９６】
一実施形態では、所定の配列のヌクレオチドを足場ポリヌクレオチド分子に組み込むための反応は、反応領域内の足場ポリヌクレオチドに対して合成方法のうちのいずれかを行うことを伴う。
【０１９７】
反応領域は、足場ポリヌクレオチド分子が付着しており、合成方法を行うための試薬を送達することができる好適な基質の任意の領域である。
【０１９８】
一実施形態では、反応領域は、単一の足場ポリヌクレオチド分子を含む表面の単一の領域であり得、ここで単一の足場ポリヌクレオチド分子は試薬でアドレス指定され得る。
【０１９９】
別の実施形態では、反応領域は、複数の足場ポリヌクレオチド分子を含む表面の単一の領域であり得、足場ポリヌクレオチド分子は、互いに単離して試薬で個別にアドレス指定することはできない。したがって、そのような実施形態では、反応領域内の複数の足場ポリヌクレオチド分子は同じ試薬および条件に曝露され、したがって、同じまたは実質的に同じヌクレオチド配列を有する合成ポリヌクレオチド分子を生じさせることができる。
【０２００】
一実施形態では、本明細書に記載および定義される合成方法のうちのいずれかを実施するための合成システムは、複数の反応領域を含み得、各反応領域は１つ以上の付着した足場ポリヌクレオチドを含み、各反応領域は、他の反応領域のそれぞれから単離して試薬で個別にアドレス指定することができる。そのようなシステムは、例えば反応領域が基質、典型的には平坦な基質上に形成される場合には、例えばアレイの形態で構成され得る。
【０２０１】
単一の反応領域を含むか、または複数の反応領域を含む基質を有するシステムは、例えば、ＥＷＯＤシステムもしくは微小流体システム内に含まれ得、システムは、試薬を反応部位に送達するように構成され得る。ＥＷＯＤおよび微小流体システムは、本明細書により詳細に記載されている。例えば、ＥＷＯＤシステムは、電気的制御下で試薬を反応部位（複数可）に送達するように構成され得る。例えばエラストマー材料もしくは同様の材料から形成される微細加工アーキテクチャを含むような微小流体システムは、流体圧力および／もしくは吸引制御下で、または機械的手段によって試薬を反応部位（複数可）に送達するように構成され得る。試薬は、例えば試薬送達用の導管として作用するカーボンナノチューブを介して、任意の好適な手段によって送達され得る。任意の好適なシステムが想定され得る。
【０２０２】
ＥＷＯＤ、微小流体システムおよび他のシステムは、合成後に足場ポリヌクレオチドから合成二本鎖ポリヌクレオチドを切断するための酵素、および／または基質から足場ポリヌクレオチド全体を放出するためにリンカーを切断するための試薬、および／または合成後のポリヌクレオチド分子またはその任意の領域もしくは部分を増幅するための試薬、および／または本発明の合成方法に従って合成されたより小さなポリヌクレオチド分子からより大きなポリヌクレオチド分子を構築するための試薬などの任意の他の所望の試薬を反応部位に送達するように構成され得る。
【０２０３】
本発明はまた、本明細書に記載および定義される合成方法のうちのいずれかを実施するためのキットも提供する。キットは、本明細書に記載および定義される本発明の合成および／または構築方法のうちのいずれかを行うための試薬の任意の所望の組み合わせを含み得る。例えば、キットは、足場ポリヌクレオチドを含む任意の１つ以上の容量（複数可）の反応試薬、本明細書に記載および定義される合成サイクルの任意の１つ以上の工程に対応する容量（複数可）の反応試薬、可逆的ブロッキング基もしくは可逆的ターミネーター基を含むヌクレオチドを含む容量（複数可）の反応試薬、合成後の１つ以上のポリヌクレオチド分子またはその任意の領域もしくは部分を増幅するための容量（複数可）の反応試薬、本発明の合成方法に従って合成されたより小さいポリヌクレオチド分子からより大きいポリヌクレオチド分子を構築するための容量（複数可）の反応試薬、合成後に足場ポリヌクレオチドから合成二本鎖ポリヌクレオチドを切断するための容量（複数可）の反応試薬、および１つ以上のリンカーを切断して基質から足場ポリヌクレオチド全体を放出するための容量（複数可）の反応試薬を含み得る。
【０２０４】
例示的な方法
本発明によるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド分子を合成する例示的な方法は、添付の特許請求の範囲を含む本明細書に記載されている。以下の文中の参照符号は、図１、２、３ａ、３ｂ、および３ｃのものと対応している。
【０２０５】
以下に記載される各例示的な方法において、各工程に記載される構造は、必要に応じて参照符号の助けを借りて特定の図を参照することによって参照され得る。しかしながら、そのような参照は、図に示される構造に限定されることを意図しておらず、関連する構造の記載は、例示されているものも含めて、その全体が本明細書に提供されるようなその記載に対応している。
【０２０６】
５つの非限定的で例示的な方法、方法のバージョン１〜５を以下に記載する（例えば、それぞれ図１〜３ｃを参照されたい）。これらの例示的な方法のそれぞれの工程（１）において、相補的支持鎖（図１〜３ｃのそれぞれの工程１に図示される構造において「ａ」と標識された鎖を参照されたい）にハイブリダイズされた合成鎖（図１〜３ｃのそれぞれの工程１に図示される構造において「ｂ」と標識された鎖を参照されたい）を含む足場ポリヌクレオチド（図１〜３ｃのそれぞれの工程１に図示される構造を参照されたい）が提供される（１０１、２０１、３０１、４０１、５０１）。
【０２０７】
足場ポリヌクレオチドは二本鎖であり、デノボ合成されるので合成ポリヌクレオチドの領域を収容するための支持構造を提供する。足場ポリヌクレオチドは、一本鎖切断または「ニック」によって分離された、ポリメラーゼプライマー鎖部分鎖（図１〜３ｃのそれぞれの工程１に図示される構造において「ｂ」と標識された鎖の点線部分を参照されたい）およびヘルパー鎖部分（図１〜３ｃのそれぞれの工程１に図示される構造において「ｂ」と標識された鎖の破線部分を参照されたい）を含む合成鎖を含む。本明細書により詳細に記載されるように、本明細書に記載される例示的な方法のバージョン１〜５およびその変形例のうちのいずれにおいても、ヘルパー鎖は、組み込み工程（２）の前に、例えば変性によって除去され得る。プライマー鎖部分および合成鎖のヘルパー鎖部分の両方が、相補的支持鎖にハイブリダイズされて提供される。合成鎖のプライマー鎖部分は、ポリメラーゼ酵素による合成の開始において使用するためのプライマー配列を提供する。一本鎖切断部位で合成が開始される。したがって、ポリメラーゼは、一本鎖切断部位でプライマー鎖部分の末端ヌクレオチドを伸長させるように作用するであろう。したがって、この末端ヌクレオチドは、典型的には、５’〜３’方向への伸長を触媒するポリメラーゼ酵素による伸長を可能にするために、プライマー鎖部分の３’末端を定義するであろう。プライマー鎖部分を含む合成鎖と反対側の末端は、結果的に典型的には、５’末端を定義し、合成鎖の５’末端に隣接する支持鎖の末端ヌクレオチドは、結果的に典型的には、支持鎖の３’末端を定義するであろう。
【０２０８】
一本鎖切断の部位に位置付けられた合成鎖のヘルパー鎖部分の末端ヌクレオチドは、典型的には、ヘルパー鎖部分の５’末端を定義し、結果的に、合成鎖のヘルパー鎖部分と反対側の末端が、典型的には合成鎖の３’末端を定義するであろう。
【０２０９】
合成鎖のヘルパー鎖部分とプライマー鎖部分との間の一本鎖切断または「ニック」は、典型的には、リン酸基なしでヘルパー鎖の（５’）末端ヌクレオチドを提供することによって達成される。切断は、典型的には、（ｉ）支持鎖、（ｉｉ）非リン酸化（５’）末端ヌクレオチドを有する合成鎖のヘルパー鎖部分、および（ｉｉｉ）プライマー配列を含む別々の成分から足場ヌクレオチドを構築することによって達成される。好適な条件下で成分を混合すると、足場ポリヌクレオチドが別々の成分のハイブリダイゼーション時に形成される。
【０２１０】
方法の工程（２）において、所定のヌクレオチド配列中の１番目のヌクレオチドは、ポリメラーゼの作用によって合成鎖に組み込まれる（１０２、２０２、３０２、４０２、５０２）。１番目のヌクレオチドには、ポリメラーゼによるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基（図１〜３ｃのそれぞれの工程２において組み込まれたヌクレオチドの小さい三角形として図示される）が提供される。したがって、工程（２）において、一塩基のみが組み込まれる。
【０２１１】
任意の好適な可逆的ターミネーター基を含むヌクレオチドを使用することができる。可逆的ターミネーター基を有する好ましいヌクレオチドは、本明細書に記載されるように、３’−Ｏ−アリル−ｄＮＴＰおよび／または３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＮＴＰである。
【０２１２】
５つの方法のそれぞれにおいて、ユニバーサルヌクレオチド（図１〜３ｃのそれぞれに図示される構造において「Ｕｎ」と標識される）が支持鎖中に提供され、これが所定の配列のヌクレオチドの組み込みを助け、かつ／または足場ポリヌクレオチド（１０３、２０３、３０３、４０３、５０３）の切断を促進する。ユニバーサルヌクレオチドの役割は、以下の各方法の詳細な説明から明らかになるであろう。
【０２１３】
合成方法のバージョン１
本発明の合成方法の第１の例示的なバージョンでは、新たなヌクレオチドは、支持鎖中に位置付けられたユニバーサルヌクレオチドと反対側の二本鎖足場ポリヌクレオチドに組み込まれる（図１の工程１および２、１０１、１０２）。各合成サイクルにおいて、足場ポリヌクレオチドは、ユニバーサルヌクレオチドを含む配列によって定義される切断部位で切断される（図１の工程３、１０３）。新たに組み込まれたヌクレオチドを含む一塩基突出が、切断された足場ポリヌクレオチド中に生成される（図１の下部中央に図示される構造を参照されたい）。切断された足場ポリヌクレオチドへの連結ポリヌクレオチド（図１の下部の左端に図示される構造を参照されたい）の連結は、パートナーヌクレオチドを足場ポリヌクレオチドに組み込み、新たに組み込まれたヌクレオチドがパートナーヌクレオチドと対合することを可能にし（図４の工程４、１０４）、これにより合成サイクルが完了する。
【０２１４】
本発明の合成方法の第１の例示的なバージョンでは、足場ポリヌクレオチドは、上記に記載されるように工程（１）で提供される（１０１）。この方法では、足場ポリヌクレオチドの支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドは、一本鎖切断部位でヘルパー鎖の末端ヌクレオチド（図１の構造中に「Ｘ」と標識される）と反対側に位置付けられ、それと対合される（図１の工程１に図示される構造を参照されたい）。
【０２１５】
工程（２）において、ユニバーサルヌクレオチドがその組み込み時に１番目のヌクレオチドと対合するように、所定の配列の１番目のヌクレオチドをユニバーサルヌクレオチドと反対側に組み込む（１０２）。したがって、この構成では、ユニバーサルヌクレオチドは、図１に図示されるように、合成鎖に組み込まれた１番目のヌクレオチドに関して位置「ｎ」で工程（１）および（２）において支持鎖中に位置付けられる（工程３）。
【０２１６】
伸長中、ポリメラーゼはヘルパー鎖（存在する場合）に「侵入」し、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドを置換するように作用するであろう。組み込まれた１番目のヌクレオチドは、ヘルパー鎖の置換された末端ヌクレオチドによって以前に占められていた位置を占めるであろう（図１の工程３）。
【０２１７】
方法の工程（３）において、足場ポリヌクレオチドは切断部位で切断される（１０３）。切断部位は、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドを含む配列によって定義される。切断は、１番目のヌクレオチドを含む突出末端を合成鎖中に提供するための支持鎖を含む。切断は足場ポリヌクレオチド中に二本鎖切断をもたらす。この例示的な方法では、合成鎖にすでに一本鎖切断または「ニック」が提供されており、したがって足場ポリヌクレオチド中に二本鎖切断を提供するためには支持鎖の切断のみが必要である。
【０２１８】
この例示的な方法のバージョンでは、切断は、支持鎖に突出した合成鎖中に突出を生成する。切断部位での合成鎖の突出末端は、組み込まれた１番目のヌクレオチドである単一のハイブリダイズされていないヌクレオチドのみを含む。典型的には、突出した１番目のヌクレオチドは、切断された足場ポリヌクレオチドにおいて支持鎖の５’末端に突出した合成鎖の３’末端を定義するであろう（図１の下部中央に図示される構造を参照されたい）。
【０２１９】
この方法では、ユニバーサルヌクレオチドは、切断工程の前に支持鎖中の位置「ｎ」を占める。ユニバーサルヌクレオチドが支持鎖中の位置「ｎ」を占めるときにそのような一塩基突出を得るために、支持鎖はユニバーサルヌクレオチドに対して特定の位置で切断される。足場ポリヌクレオチドの支持鎖は、ヌクレオチド位置「ｎ」と「ｎ−１」との間で切断される。
【０２２０】
「ｎ」とは、その所与のサイクルに組み込まれた所定の配列のヌクレオチドと対合されたユニバーサルヌクレオチドによって占められるか、または占められている、支持鎖中のヌクレオチド位置を意味する。したがって、切断工程において、支持鎖中の位置「ｎ」は、そのサイクルに組み込まれた所定の配列のヌクレオチドによって占められる位置、すなわち、合成鎖のプライマー鎖部分の末端ヌクレオチドと反対側にある。「ｎ−１」とは、ヘルパー鎖に対して遠位方向／プライマー鎖に対して近位方向において、ユニバーサルヌクレオチドによって占められるか、または占められている位置に対する支持鎖中の隣のヌクレオチド位置を意味する（図１の工程３に概略的に示されるように、位置ｎ−１で「ｚ」と標識されたヌクレオチド）。したがって、切断工程では、支持鎖中の位置「ｎ−１」は、合成鎖のプライマー鎖部分の最後から２番目のヌクレオチドによって占められる位置と反対側である（図１の工程３に図示されるように、１０３）。
【０２２１】
ヌクレオチド位置ｎとｎ−１との間の支持鎖の切断時に、ユニバーサルヌクレオチド、ヘルパー鎖、およびヘルパー鎖にハイブリダイズされた支持鎖の部分は、残りの足場ポリヌクレオチドから除去され（図の下部の右端に図示される構造を参照されたい）、それにより、切断された足場ポリヌクレオチドにおいて支持鎖に突出した合成鎖中の１番目のヌクレオチドを含む一塩基突出を生成する。
【０２２２】
リン酸基は、突出の部位で支持鎖の末端ヌクレオチドに付着し続けるべきである（図１の下部中央に示される構造に図示されるように）。これにより、連結工程において、連結ポリヌクレオチドの支持鎖を切断された足場ポリヌクレオチドの支持鎖に確実に連結することができる。
【０２２３】
したがって、方法のバージョン１では、ユニバーサルヌクレオチドは支持鎖中の位置ｎを占め、支持鎖はヌクレオチド位置ｎとｎ−１との間で切断される。
【０２２４】
好ましくは、支持鎖は、ヌクレオチド位置ｎとｎ−１との間のホスホジエステル結合（ヘルパー鎖に対して遠位方向／プライマー鎖に対して近位方向において、ユニバーサルヌクレオチドの位置に対する支持鎖の第１のホスホジエステル結合）の切断によって切断される。
【０２２５】
支持鎖は、ヌクレオチド位置ｎとｎ−１との間のホスホジエステル結合の一方のエステル結合の切断によって切断され得る。
【０２２６】
好ましくは、支持鎖は、ヌクレオチド位置ｎに対する１番目のエステル結合の切断によって切断される。これは、切断された足場ポリヌクレオチドの支持鎖上の切断位置で末端リン酸基を保持する効果を有するであろう。
【０２２７】
上記に記載されるようなヌクレオチド位置ｎとｎ−１との間の支持鎖の切断は、酵素の作用によって行われ得る。
【０２２８】
上記に記載されるようなヌクレオチド位置ｎとｎ−１との間の支持鎖の切断は、二段階プロセスとして行われ得る。
【０２２９】
第１の切断工程は、支持鎖からユニバーサルヌクレオチドを除去し、それによって位置ｎに脱塩基部位を形成することを含み得、第２の切断工程は、位置ｎとｎ−１との間の脱塩基部位で支持鎖を切断することを含み得る。
【０２３０】
支持鎖中の位置ｎを占めるユニバーサルヌクレオチドを含む配列によって定義される切断部位で支持鎖を切断する１つの機構は、実施例２に記載されている。上記に記載される一塩基突出が達成されるという条件で、記載される機構は例示的であり、他の機構を用いることができる。
【０２３１】
第１の切断工程では、糖−リン酸足場を無傷のままにしながら、ユニバーサルヌクレオチドを支持鎖から除去する。これは、二本鎖ポリヌクレオチドから単一のユニバーサルヌクレオチドを特異的に除去ことができる酵素の作用によって達成することができる。例示された方法では、ユニバーサルヌクレオチドはイノシンであり、イノシンは酵素の作用によって支持鎖から除去され、よって脱塩基部位を形成する。例示された方法では、酵素は、３−メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ酵素、具体的にはヒトアルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｈＡＡＧ）である。無塩基部位が形成されるという条件で、他の酵素、分子、または化学物質を使用することができる。
【０２３２】
第２の切断工程では、支持鎖は、一本鎖切断を作製することによって脱塩基部位で切断される。例示された方法では、支持鎖は、ＮａＯＨなどの塩基である化学物質の作用によって切断される。代替的に、Ｎ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミンなどの有機化学物質を使用してもよい。代替的に、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩなどの脱塩基部位リアーゼ活性を有する酵素を使用してもよい。記載されるような脱塩基部位で支持鎖が切断されるという条件で、他の酵素、分子、または化学物質を使用することができる。
【０２３３】
したがって、ユニバーサルヌクレオチドが支持鎖の位置ｎにあり、支持鎖が位置ｎとｎ−１との間で切断される実施形態では、第１の切断工程は、ヌクレオチド除去酵素を用いて行われ得る。そのような酵素の例は、ヒトアルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｈＡＡＧ）などの３−メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ酵素である。第２の切断工程は、ＮａＯＨなどの塩基である化学物質を用いて行われ得る。第２の工程は、Ｎ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミンなどの脱塩基部位切断活性を有する有機化学物質を用いて行われ得る。第２の工程は、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩなどの脱塩基部位リアーゼ活性を有する酵素を用いて行われ得る。
【０２３４】
方法の工程（４）において、二本鎖連結ポリヌクレオチドは、切断された足場ポリヌクレオチドに連結される（１０４）。連結ポリヌクレオチドは、支持鎖およびヘルパー鎖を含む。連結ポリヌクレオチドはさらに、ユニバーサルヌクレオチドと、所定の配列の１番目のヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドである単一の突出ヌクレオチドとを支持鎖中に含む相補的連結末端を含む。連結ポリヌクレオチドは、突出に隣接するヘルパー鎖中にリン酸基を欠く末端ヌクレオチドをさらに含む（図１の下部の左端に図示される構造において「Ｘ」と標識された位置を参照されたい）。相補的連結末端は、好適な連結条件に供されたときに、それが工程（３）の切断された足場ポリヌクレオチド生産物の突出末端と適合的に接合するように構成される。支持鎖の連結時に、１番目のヌクレオチドはそのパートナーヌクレオチドと対合される。
【０２３５】
したがって、この例示的な方法（１０４）の工程（４）において、連結ポリヌクレオチドの相補的連結末端中で、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドは、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドと反対側に位置付けられ、それと対合される。ユニバーサルヌクレオチドは、支持鎖の末端ヌクレオチドの隣に位置付けられる（位置ｎ）。連結ポリヌクレオチド中の位置ｎとは、連結ポリヌクレオチドの連結末端が切断された足場ポリヌクレオチドに連結されたときに、ユニバーサルヌクレオチドが支持鎖中に位置付けられ、その結果、それが工程（６）で、すなわち、図１（１０６、１０７）に図示されるように、次の合成サイクルにおいて組み込まれる隣のヌクレオチドと対合することを意味する。工程（４）の連結ポリヌクレオチドの相補的連結末端において、支持鎖の末端ヌクレオチドは、工程（２）の１番目のヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドであり、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドに突出する。
【０２３６】
連結ポリヌクレオチドにおいて、突出に隣接する末端ヌクレオチドがリン酸基を欠くように、ヘルパー鎖が提供される。典型的には、上記に記載されるように、ヘルパー鎖のこの非リン酸化末端ヌクレオチドは、ヘルパー鎖の５’末端を定義するであろう。
【０２３７】
工程（４）において、連結ポリヌクレオチドの支持鎖と切断された足場ポリヌクレオチドの支持鎖（１０４）との連結時に、合成鎖の１番目のヌクレオチドは、支持鎖のそのパートナーヌクレオチドと対合する。
【０２３８】
支持鎖の連結は、任意の好適な手段によって行われ得る。連結は、合成鎖中、すなわちプライマー鎖部分中の１番目のヌクレオチドと、１番目のヌクレオチドに隣接するヘルパー鎖の末端ヌクレオチドとの間の一本鎖切断を維持しながら、支持鎖のみの接合をもたらすであろう。
【０２３９】
連結は、典型的には、リガーゼ活性を有する酵素によって行われ得る。例えば、連結は、Ｔ３  ＤＮＡリガーゼまたはＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いて行われ得る。ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドは末端リン酸基がないためにリガーゼに対する基質として作用することができないので、そのような酵素の使用は、合成鎖における一本鎖切断の維持をもたらすであろう。
【０２４０】
切断された足場ポリヌクレオチドへの連結ポリヌクレオチドの連結は、第１の合成サイクルを完了し、そのときに、所定のヌクレオチド配列の１番目のヌクレオチドがそのパートナーヌクレオチドと反対側のポリヌクレオチドに組み込まれることを除いて、工程（１）の足場ポリヌクレオチドが効果的に再構築される。この例示的な方法では、所与の合成サイクルの終わりに、合成サイクル中に、ユニバーサルヌクレオチドは、前のサイクルで支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドによって占められる位置に対して、支持鎖中の位置ｎ＋１を占めるであろう。同時に、所与の合成サイクルの終わりに、ユニバーサルヌクレオチドは、次のサイクルで組み込まれる所定のヌクレオチド配列の隣のヌクレオチドによって占められることになる合成鎖中の位置に対して、支持鎖中の位置ｎを占めるであろう。したがって、所与の合成サイクルの終わりに、次の合成サイクルで使用するための修飾された足場分子が提供され（１０６）、ここでユニバーサルヌクレオチドは、再び支持鎖中に位置付けられ、所定のヌクレオチド配列の隣のヌクレオチドの組み込み、および次の合成サイクルにおける支持鎖の切断を促進する。
【０２４１】
本発明のこの例示的な方法のバージョンでは、バージョン２および３と同様に、隣のヌクレオチドを次の合成サイクルに組み込むことができるようにするために、可逆的ターミネーター基を１番目のヌクレオチドから除去しなければならない（脱保護工程、１０５）。これは、第１のサイクルのさまざまな段階で行われ得る。典型的には、それは、図１の工程５に示されるように、連結工程（４）の後に、方法の工程（５）として行われるであろう（１０５）。しかしながら、脱保護工程は、新たなヌクレオチドの組み込み後の任意の工程で行われ得る。どの段階の脱保護工程が行われるかにかかわらず、１番目のヌクレオチドの多重組み込みを防止するために、ポリメラーゼおよび残りの組み込まれていない１番目のヌクレオチドが最初に除去されるべきである。ポリメラーゼおよび組み込まれていない１番目のヌクレオチドは、好ましくは、切断工程（工程（３））の前に除去される。したがって、１番目のヌクレオチドからの可逆的ターミネーター基の除去は、切断工程（工程（３））の前、連結工程（工程（４））の前、または連結工程の後（工程（５）として）に行われ得る。
【０２４２】
１番目のヌクレオチドからの可逆的ターミネーター基の除去は、任意の好適な手段によって行われ得る。例えば、除去は、トリス（カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）などの化学物質の使用によって行われ得る。
【０２４３】
方法のバージョン１では、第２の合成サイクルおよびその後の合成サイクルは、第１の合成サイクルについて上記に記載されるように行われ得る。
【０２４４】
したがって、工程（６）において、次の合成サイクル（１０６）のために提供される足場ポリヌクレオチドは、第１の合成サイクルの連結工程（４）と脱保護工程（５）との生産物である。工程（６）において、第１のサイクルの工程（２）について上記に記載されるように、所定のヌクレオチド配列中の隣のヌクレオチドは、ポリメラーゼの作用によって足場ポリヌクレオチドの合成鎖に組み込まれる（１０７）。隣のヌクレオチドはまた、ポリメラーゼによるそのサイクルでのさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基を含む。ヘルパー鎖は、本明細書にさらに記載されるように、組み込み工程（６）の前に任意選択的に除去され得る。
【０２４５】
方法のバージョン１の第１の合成サイクルの工程（２）のように、工程（６）において、隣のヌクレオチドは、その組み込み時に隣のヌクレオチドと対合するように、支持鎖中に位置付けられたユニバーサルヌクレオチドと反対側に組み込まれる。この構成では、ユニバーサルヌクレオチドは再び、合成鎖中の組み込まれた隣のヌクレオチドに対して位置「ｎ」に位置付けられる。さらに、第１の合成サイクルについて上記に記載されるように、次の合成サイクルの工程（６）において、ユニバーサルヌクレオチドは、前のサイクルの工程（２）における支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドによって占められる位置に対して、支持鎖中の位置「ｎ＋１」を占めるであろう。これは、前の合成サイクルの連結ポリヌクレオチドにおいて、ユニバーサルヌクレオチドがヘルパー鎖の末端非リン酸化ヌクレオチドと反対側にあるように位置付けられ、これと対合されたために達成される。
【０２４６】
工程（７）において、足場ポリヌクレオチドは、切断部位であって、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドを含む配列によって定義される、切断部位で切断される（１０８）。切断は、支持鎖を切断することと、ユニバーサルヌクレオチドを除去して、突出の末端ヌクレオチドとして所定のヌクレオチド配列中の隣のヌクレオチドを含む一本鎖突出末端を合成鎖中に提供することと、を含む。合成鎖の一塩基突出は、切断された足場ポリヌクレオチド中の支持鎖の末端ヌクレオチドに突出する。切断工程は、第１のサイクルの工程（３）について上記に記載されるように行われ得る。
【０２４７】
次のサイクルの工程（８）において、二本鎖連結ポリヌクレオチドは、切断された足場ポリヌクレオチドに連結される（１０９）。連結ポリヌクレオチドは、支持鎖およびヘルパー鎖を含む。連結ポリヌクレオチドは、ユニバーサルヌクレオチド、および所定のヌクレオチド配列の隣のヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドである単一の突出ヌクレオチドを支持鎖中に含む相補的連結末端をさらに含む。連結ポリヌクレオチドは、突出に隣接するヘルパー鎖中にリン酸基を欠く末端ヌクレオチドをさらに含む。相補的連結末端は、好適な連結条件に供されたときに、それが工程（７）の切断された足場ポリヌクレオチド生産物の突出末端と適合的に接合するように構成される。支持鎖の連結時に、所定のヌクレオチド配列の隣のヌクレオチドは、そのパートナーヌクレオチドと対合される。
【０２４８】
次の合成サイクルおよびその後の合成サイクルの工程（８）の連結ポリヌクレオチドが構成される場合があり、連結工程は、第１の合成サイクルの工程（４）について上記に記載されるように行われ得る。
【０２４９】
したがって、連結（１０９）時の工程（８）において、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドは、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドと反対側に位置付けられ、それと対合される。支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドは、次のサイクルに組み込まれる隣のヌクレオチドに対して位置「ｎ」に位置付けられる。さらに、上記に記載されるように、工程（８）の後、ユニバーサルヌクレオチドは、工程（６）の開始前に支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドによって占められる位置に対して、支持鎖中の位置「ｎ＋１」を占めるであろう。
【０２５０】
次のサイクルおよびその後のサイクル（１１０）における可逆的ターミネーター基の脱保護は、第１の合成サイクルに関して上記に記載されるように行われ得る。
【０２５１】
合成サイクルは、所定のヌクレオチド配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドを合成するのに必要な回数だけ繰り返される。
【０２５２】
合成方法のバージョン２。
本発明の合成方法の第２の例示的なバージョンでは、新たなヌクレオチドは、支持鎖中に位置付けられた相補的ヌクレオチドと反対側の二本鎖足場ポリヌクレオチドに組み込まれる（図２の工程１および２、２０１、２０２）。各合成サイクルにおいて、足場ポリヌクレオチドは、ユニバーサルヌクレオチドを含む配列によって定義される切断部位で切断される（図２の工程３、２０３）。新たに組み込まれたヌクレオチドを含む一塩基突出が、切断された足場ポリヌクレオチド中に生成される（図２の下部中央に図示される構造を参照されたい）。
【０２５３】
切断された足場ポリヌクレオチド（２０４）への連結ポリヌクレオチドの連結は、足場ポリヌクレオチドにパートナーヌクレオチドを組み込み、新しく組み込まれたヌクレオチドがパートナーヌクレオチドと対合することを可能にし、これにより完全合成サイクルが完了する。切断された足場ポリヌクレオチド（２０４）への連結ポリヌクレオチド（図２の下部の左端に図示される構造を参照されたい）の連結もまた、次のサイクルにおいて組み込まれる隣のヌクレオチドと対合することができるヌクレオチドを、足場ポリヌクレオチドに組み込む。
【０２５４】
本発明の合成方法の第２の例示的なバージョンでは、上記に記載されるような工程（１）において、足場ポリヌクレオチドが提供される（２０１）。この方法では、工程（２）の１番目のヌクレオチドと対合することができるヌクレオチドが、足場ポリヌクレオチドの支持鎖中に提供され、一本鎖切断部位でヘルパー鎖の末端ヌクレオチドと反対側に位置付けられ、それと対合される。相補的ヌクレオチドは、図２の工程１に図示されるように、合成鎖に組み込まれた１番目のヌクレオチドに関して位置「ｎ」で支持鎖中に位置付けられる。
【０２５５】
工程（２）において、所定の配列の１番目のヌクレオチドは、その相補的ヌクレオチドがその組み込み時に１番目のヌクレオチドと対合するように、相補的ヌクレオチドと反対側に組み込まれる（２０２）。
【０２５６】
合成方法の第２のバージョンの工程（１）において、足場ポリヌクレオチドにはまた、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドが提供される。この方法では、ユニバーサルヌクレオチドは、一本鎖切断部位で、すなわち、典型的にはヘルパー鎖の５’末端で、ヘルパー鎖中の最後から２番目のヌクレオチドと反対側の支持鎖中に位置付けられ（位置「ｎ＋１」）、これと対合される（図２の工程１に図示される構造を参照されたい）。
【０２５７】
伸長中、ポリメラーゼは、存在する場合、ヘルパー鎖に「侵入」し、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドを置換するように作用し、組み込まれた１番目のヌクレオチドは、ヘルパー鎖の置換された末端ヌクレオチドによって以前に占められていた位置を占めるであろう。１番目のヌクレオチドの組み込みの後、図２の工程３の構造に図示されるように、ユニバーサルヌクレオチドは、一本鎖切断部位における合成鎖中の１番目のヌクレオチドに関して位置「ｎ＋１」で支持鎖中に位置付けられるであろう。
【０２５８】
方法の工程（３）において、足場ポリヌクレオチドは切断部位で切断される（２０３）。切断部位は、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドを含む配列によって定義される。切断は、支持鎖を切断して、所定のヌクレオチド配列の１番目のヌクレオチドを含む突出末端を合成鎖中に提供することを含む。切断は足場ポリヌクレオチド中に二本鎖切断をもたらす。合成鎖にすでに一本鎖切断または「ニック」が提供されており、したがって足場ポリヌクレオチド中に二本鎖切断を提供するためには支持鎖の切断のみが必要である。
【０２５９】
この例示的な方法のバージョンでは、切断は、支持鎖に突出する突出を合成鎖中に生成する。合成鎖の突出末端は、組み込まれた１番目のヌクレオチドである単一のハイブリダイズされていないヌクレオチドのみを含む。典型的には、突出した１番目のヌクレオチドは、図２の下部中央に示される構造に図示されるように、切断された足場ポリヌクレオチド中の支持鎖の５’末端に突出した合成鎖の３’末端を定義するであろう。
【０２６０】
この方法では、ユニバーサルヌクレオチドは支持鎖中の位置「ｎ＋１」を占める。ユニバーサルヌクレオチドが支持鎖中の位置「ｎ＋１」を占めるときにそのような一塩基突出を得るために、支持鎖は、工程３においてヌクレオチド位置「ｎ」と「ｎ−１」との間で切断される。
【０２６１】
例示的な方法のバージョン２における「ｎ」とは、ヘルパー鎖に対して遠位方向／プライマー鎖に対して近位方向において、ユニバーサルヌクレオチドによって占められる位置に対して支持鎖中の隣のヌクレオチド位置である、支持鎖中のヌクレオチド位置を意味する。したがって、切断工程において、支持鎖中の位置「ｎ」は、そのサイクルに組み込まれた所定の配列のヌクレオチド、すなわち、合成鎖のプライマー鎖部分の／プライマー鎖に対して近位の末端ヌクレオチドによって占められる位置と反対側にある。「ｎ−１」とは、ヘルパー鎖に対して遠位方向／プライマー鎖に対して近位方向において、ユニバーサルヌクレオチドによって占められる位置に対する支持鎖中の２番目のヌクレオチド位置を意味する（図２の「ｚ」と標識されたヌクレオチド）。したがって、切断工程では、支持鎖中の位置「ｎ−１」は、合成鎖のプライマー鎖部分の最後から２番目のヌクレオチドによって占められている位置と反対側にある。この構成では、ユニバーサルヌクレオチドは位置「ｎ＋１」を占める。この方法では、位置「ｎ＋１」におけるユニバーサルヌクレオチドは、ニックに対して、合成鎖のヘルパー鎖部分の最後から２番目のヌクレオチドと反対側にある（図２の工程３に図示されるように）。
【０２６２】
支持鎖（２０３）の切断時に、ユニバーサルヌクレオチド、ヘルパー鎖（存在する場合）、およびヘルパー鎖にハイブリダイズされた支持鎖の部分が、残りの足場ポリヌクレオチドから除去され（図２の下部の右端に図示される構造を参照されたい）、このようにして、切断された足場ポリヌクレオチド中の支持鎖に突出した合成鎖中の所定のヌクレオチド配列の１番目のヌクレオチドを含む一塩基突出を生成する（図２の下部中央に図示される構造を参照されたい）。
【０２６３】
リン酸基は、突出の部位で支持鎖の末端ヌクレオチドに付着し続けるべきである（図２の下部中央に示される構造に図示されるように）。これにより、連結工程において、連結ポリヌクレオチドの支持鎖を切断された足場ポリヌクレオチドの支持鎖に確実に連結することができる。
【０２６４】
したがって、方法のバージョン２では、支持鎖はヌクレオチド位置ｎとｎ−１との間で切断される。
【０２６５】
好ましくは、支持鎖は、ヌクレオチド位置ｎとｎ−１との間のホスホジエステル結合（ヘルパー鎖に対して遠位方向／プライマー鎖に対して近位方向において、ユニバーサルヌクレオチドｎ＋１の位置に対する支持鎖の第２のホスホジエステル結合）の切断によって切断される。
【０２６６】
支持鎖は、ヌクレオチド位置ｎとｎ−１との間のホスホジエステル結合の一方のエステル結合の切断によって切断され得る。
【０２６７】
好ましくは、支持鎖は、ヌクレオチド位置ｎに対する１番目のエステル結合の切断によって切断される。これは、切断された足場ポリヌクレオチドの支持鎖上の切断位置で末端リン酸基を保持する効果を有するであろう。
【０２６８】
上記に記載されるようなヌクレオチド位置ｎとｎ−１との間の支持鎖の切断は、エンドヌクレアーゼＶなどの酵素の作用によって行われ得る。
【０２６９】
支持鎖中の位置ｎ＋１を占めるユニバーサルヌクレオチドを含む配列によって規定される切断部位においてヌクレオチド位置ｎとｎ−１との間で支持鎖を切断する１つの機構が実施例３に記載されている。上記に記載される一塩基突出が達成されるという条件で、記載される機構は例示的であり、他の機構を用いることができる。
【０２７０】
この例示的な機構では、エンドヌクレアーゼ酵素が用いられる。例示された方法では、酵素はエンドヌクレアーゼＶである。上記に記載される一塩基突出が形成されるという条件で、他の酵素、分子、または化学物質を使用することができる。
【０２７１】
方法の工程（４）において、連結ポリヌクレオチドは、切断された足場ポリヌクレオチドに連結される（２０４）。連結ポリヌクレオチドは、支持鎖およびヘルパー鎖を含む。連結ポリヌクレオチドは、ユニバーサルヌクレオチド、および１番目のヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドである突出ヌクレオチドを支持鎖中に含む相補的連結末端をさらに含む。連結ポリヌクレオチドは、突出に隣接するヘルパー鎖中にリン酸基を欠く末端ヌクレオチドをさらに含む（図２の下部の左端に図示される構造を参照されたい）。相補的連結末端は、好適な連結条件に供されたときに、それが工程（３）の切断された足場ポリヌクレオチド生産物の突出末端と適合的に接合するように構成される。支持鎖の連結時に、１番目のヌクレオチドはそのパートナーヌクレオチドと対合される。
【０２７２】
この方法では、連結ポリヌクレオチドの支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドは、一本鎖切断部位の部位でヘルパー鎖の最後から２番目のヌクレオチドと反対側の相補的連結末端に位置付けられ、それにハイブリダイズされる。支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドは、工程（６）の合成鎖に組み込まれる所定のヌクレオチド配列の隣のヌクレオチドに関して位置「ｎ＋１」で、すなわち図２に概略的に図示されるような次の合成サイクルにおいて、連結ポリヌクレオチド中に位置付けられる。連結ポリヌクレオチドの相補的連結末端において、支持鎖の最後から２番目のヌクレオチドは、工程（６）の隣のヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドであり、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドと対合される。支持鎖の末端ヌクレオチドは、工程（２）の１番目のヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドである。支持鎖の末端ヌクレオチドは、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドに突出する。
【０２７３】
連結ポリヌクレオチドにおいて、突出に隣接する末端ヌクレオチドがリン酸基を欠くように、ヘルパー鎖が提供される。典型的には、上記に記載されるように、ヘルパー鎖のこの非リン酸化末端ヌクレオチドは、ヘルパー鎖の５’末端を定義するであろう。
【０２７４】
工程（４）において、連結ポリヌクレオチドの支持鎖と切断された足場ポリヌクレオチドの支持鎖（２０４）との連結時に、合成鎖中の１番目のヌクレオチドは支持鎖中のそのパートナーヌクレオチドと対合される。
【０２７５】
支持鎖の連結は、任意の好適な手段によって行われ得る。連結は、合成鎖中、すなわちプライマー鎖部分中の１番目のヌクレオチドと、１番目のヌクレオチドに隣接するヘルパー鎖の末端ヌクレオチドとの間の一本鎖切断を維持しながら、支持鎖のみの接合をもたらすであろう。
【０２７６】
方法のバージョン１と同様に、方法のバージョン２における連結は、典型的には、リガーゼ活性を有する酵素によって行われ得る。例えば、連結は、Ｔ３  ＤＮＡリガーゼまたはＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いて行われ得る。ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドは末端リン酸基がないためにリガーゼに対する基質として作用することができないので、そのような酵素の使用は、合成鎖における一本鎖切断の維持をもたらすであろう。
【０２７７】
図２に図示されるように、切断された足場ポリヌクレオチドへの連結ポリヌクレオチドの連結は、第１の合成サイクルを完了し、そのときに、所定のヌクレオチド配列の１番目のヌクレオチドがそのパートナーヌクレオチドと反対側のポリヌクレオチドに組み込まれることを除いて、工程（１）の足場ポリヌクレオチドは効果的に再構築され、次の合成サイクルに組み込まれる隣のヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドであるヌクレオチドは、支持鎖中に位置付けられ、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドと対合される（工程４）。例示的な方法のバージョン１のように、所与の合成サイクルの終わりの例示的な方法のバージョン２では、合成サイクル中に、ユニバーサルヌクレオチドは、前のサイクルにおける支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドによって占められる位置に対して、支持鎖中の位置ｎ＋１を占める。同時に、所与の合成サイクルの終わりに、ユニバーサルヌクレオチドはまた、次のサイクルに組み込まれる所定のヌクレオチド配列の隣のヌクレオチドによって占められることになる、合成鎖中の位置に対して支持鎖中の位置ｎ＋１を占めるであろう。したがって、所与の合成サイクルの終わりに、次の合成サイクルで使用するための修飾足場分子が提供され（２０６）、ユニバーサルヌクレオチドは、次の合成サイクルにおける支持鎖の切断を促進するために、再び支持鎖に位置付けられる。
【０２７８】
隣のヌクレオチドが次の合成サイクルに組み込まれることを可能にするために、可逆的ターミネーター基は、１番目のヌクレオチドから除去されなければならない（脱保護工程、２０５）。これは、方法のバージョン１について上記に記載されるように行われ得る。
【０２７９】
例示的な方法のバージョン２では、第２の合成サイクルおよびその後の合成サイクルは、第１の合成サイクルについて上記に記載されるように行われ得る。
【０２８０】
したがって、工程（６）において、次の合成サイクル（２０６）のために提供される足場ポリヌクレオチドは、第１の合成サイクル（２０５）の連結工程（４）と脱保護工程、例えば工程（５）との生産物である。工程（６）において、第１のサイクルの工程（２）について上記に記載されるように、所定のヌクレオチド配列中の隣のヌクレオチドが、ポリメラーゼの作用によって足場ポリヌクレオチドの合成鎖に組み込まれる（２０７）。隣のヌクレオチドはまた、ポリメラーゼによるそのサイクルでのさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基を含む。
【０２８１】
例示的な方法のバージョン２の第１の合成サイクルの工程（２）のように、工程（６）において、所定のヌクレオチド配列の隣のヌクレオチドが、それがその組み込み時に隣のヌクレオチドと対合するように支持鎖中に位置付けられたそのパートナーヌクレオチドと反対側に組み込まれる（２０７）。この構成では、ユニバーサルヌクレオチドは、合成鎖中の組み込まれた隣のヌクレオチドに関して位置「ｎ＋１」に位置付けられる。さらに、第１の合成サイクルについて上記に記載されるように、次の合成サイクルの工程（６）において、ユニバーサルヌクレオチドはまた、前のサイクルの工程（２）における支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドによって占められる位置に対して、支持鎖中の位置「ｎ＋１」を占めるであろう。これは、前の合成サイクルの連結ポリヌクレオチドにおいて、ユニバーサルヌクレオチドがヘルパー鎖の最後から２番目のヌクレオチドと反対側に位置付けられ、これと対合されるために達成される。
【０２８２】
工程（７）において、足場ポリヌクレオチドは、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドを含む配列によって定義される切断部位で切断される（２０８）。切断は、支持鎖を切断することと、ユニバーサルヌクレオチドを除去して、残りの足場ポリヌクレオチド中の突出の末端ヌクレオチドとして隣のヌクレオチドを含む一塩基突出末端を合成鎖中に提供することと、を含む。合成鎖の一塩基突出は、残りの切断された足場ポリヌクレオチド中の支持鎖の末端ヌクレオチドに突出する。切断工程は、第１のサイクルの工程（３）について上記に記載されるように行われ得る。
【０２８３】
次のサイクルの工程（８）において、二本鎖連結ポリヌクレオチドは、切断された足場ポリヌクレオチドに連結される（２０９）。連結ポリヌクレオチドは、支持鎖およびヘルパー鎖を含む。連結ポリヌクレオチドは、ユニバーサルヌクレオチド、および所定のヌクレオチド配列の隣のヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドである突出ヌクレオチドを支持鎖中に含む相補的連結末端をさらに含む。連結ポリヌクレオチドは、突出に隣接するヘルパー鎖中にリン酸基を欠く末端ヌクレオチドをさらに含む。相補的連結末端は、好適な連結条件に供されたときに、それが工程（７）の切断された足場ポリヌクレオチド生産物の突出末端と適合的に接合するように構成される。支持鎖の連結時に、所定のヌクレオチド配列の隣のヌクレオチドは、そのパートナーヌクレオチドと対合される。
【０２８４】
次の合成サイクルおよびその後の合成サイクルの工程（８）の連結ポリヌクレオチドが構成される場合があり、連結工程は、第１の合成サイクルの工程（４）について上記に記載されるように行われ得る。
【０２８５】
したがって、連結（２０９）時の工程（８）において、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドは、ヘルパー鎖の最後から２番目のヌクレオチドと反対側に位置付けられ、それと対合される。支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドは、次のサイクルに組み込まれる隣のヌクレオチドに対して位置「ｎ＋１」に位置付けられる。さらに、上記に記載されるように、工程（８）の後、ユニバーサルヌクレオチドは、工程（６）の開始前に支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドによって占められる位置に対して、支持鎖中の位置「ｎ＋１」を占めるであろう。
【０２８６】
次のサイクル（２１０）における可逆的ターミネーター基の脱保護は、第１の合成サイクルに関して上記に記載されるように行われ得る。
【０２８７】
合成サイクルは、所定のヌクレオチド配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドを合成するのに必要な回数だけ繰り返される。
【０２８８】
合成方法のバージョン３。
本発明の合成方法の第３の例示的なバージョンでは、新たなヌクレオチドは、支持鎖中に位置付けられたユニバーサルヌクレオチドと反対側の二本鎖足場ポリヌクレオチドに組み込まれる（図３ａの工程１および２、３０１、３０２）。各合成サイクルにおいて、足場ポリヌクレオチドは、ユニバーサルヌクレオチドを含む配列によって定義される切断部位で切断される（図３ａの工程３、３０３）。新たに組み込まれたヌクレオチドを含む二塩基突出が、切断された足場ポリヌクレオチド中に生成される（図３ａの下部中央に図示される構造を参照されたい）。切断された足場ポリヌクレオチドへの連結ポリヌクレオチド（図３ａの下部の左端に図示される構造を参照されたい）の連結は、パートナーヌクレオチドを足場ポリヌクレオチドに組み込み、これにより新しく組み込まれたヌクレオチドがパートナーヌクレオチドと対合することを可能にし（図３ａの工程４、３０４）、よって完全合成サイクルが完了する。
【０２８９】
本発明の合成方法の第３の例示的なバージョンでは、足場ポリヌクレオチドは、上記に記載されるような工程（１）において提供される（３０１）。この方法では、足場ポリヌクレオチドの支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドは、一本鎖切断部位でヘルパー鎖の末端ヌクレオチドと反対側に位置付けられ、これと対合される（図３ａの工程１に図示される構造を参照されたい）。
【０２９０】
工程（２）において、１番目のヌクレオチドは、それがその組み込み時に１番目のヌクレオチドと対合するように支持鎖中に位置付けられたユニバーサルヌクレオチドと反対側に組み込まれる（３０２）。この構成では、ユニバーサルヌクレオチドは、図３ａに図示されるように、合成鎖に組み込まれた１番目のヌクレオチドに関して位置「ｎ」に位置付けられる（工程３）。
【０２９１】
伸長中、ポリメラーゼは、存在する場合、ヘルパー鎖に「侵入」し、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドを置換するように作用するであろう。組み込まれた１番目のヌクレオチドは、ヘルパー鎖の置換された末端ヌクレオチドによって前に占められていた位置を占めるであろう（図３ａの工程３）。
【０２９２】
方法の工程（３）において、足場ポリヌクレオチドは切断部位で切断される（３０３）。切断部位は、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドを含む配列によって定義される。切断は、１番目のヌクレオチドを含む突出末端を合成鎖中に提供するための支持鎖を含む。切断は足場ポリヌクレオチド中に二本鎖切断をもたらす。合成鎖にすでに一本鎖切断または「ニック」が提供されており、したがって足場ポリヌクレオチド中に二本鎖切断を提供するためには支持鎖の切断のみが必要である。
【０２９３】
この例示的な方法のバージョンでは、切断は、支持鎖に突出する突出を合成鎖中に生成する。合成鎖の突出末端は、２つのハイブリダイズされていないヌクレオチドを含む。第１の突出したハイブリダイズされていないヌクレオチドは、切断された足場ポリヌクレオチドの合成鎖の末端ヌクレオチドであり、所定のヌクレオチド配列の組み込まれた１番目のヌクレオチドである。第２のハイブリダイズされていないヌクレオチドは、合成鎖中の１番目のヌクレオチドの隣のヌクレオチドである。典型的には、突出した１番目のヌクレオチドは、切断された足場ポリヌクレオチドにおいて支持鎖の５’末端に突出した合成鎖の３’末端を定義するであろう（図３ａの下部中央に図示される構造を参照されたい）。
【０２９４】
この方法では、ユニバーサルヌクレオチドは支持鎖中の位置「ｎ」を占める。ユニバーサルヌクレオチドが支持鎖中の位置「ｎ」を占めるときにそのような二塩基突出を得るために、支持鎖は位置「ｎ−１」と「ｎ−２」との間で切断される。
【０２９５】
「ｎ」とは、その所与のサイクルに組み込まれた所定の配列のヌクレオチドと対合されるユニバーサルヌクレオチドによって占められる支持鎖中のヌクレオチド位置を意味する。したがって、切断工程では、支持鎖中の位置「ｎ」は、その所与のサイクルに組み込まれた所定の配列のヌクレオチドによって占められる位置、すなわち、合成鎖のプライマー鎖部分の末端ヌクレオチドと反対側にある。「ｎ−１」とは、ヘルパー鎖に対して遠位方向／プライマー鎖に対して近位方向において、ユニバーサルヌクレオチドによって占められる位置に対する支持鎖中の隣のヌクレオチド位置を意味する。したがって、切断工程において、支持鎖中の位置「ｎ−１」は、合成鎖のプライマー鎖部分の最後から２番目のヌクレオチドによって占められている位置と反対側にある。「ｎ−２」とは、ヘルパー鎖に対して遠位方向／プライマー鎖に対して近位方向において、ユニバーサルヌクレオチドによって占められる位置に対する支持鎖中の２番目のヌクレオチド位置を意味する（図３ａの工程３に図示されるように、３０３）。
【０２９６】
したがって、支持鎖の切断時に、ユニバーサルヌクレオチド、ヘルパー鎖（存在する場合）、およびヘルパー鎖にハイブリダイズされた支持鎖の部分が、残りの足場ポリヌクレオチドから除去され（図３ａの下部の右端に図示される構造を参照されたい）、このようにして、残りの支持鎖に突出した合成鎖中の１番目のヌクレオチドを含む二塩基突出を生成する。
【０２９７】
リン酸基は、突出の部位で支持鎖の末端ヌクレオチドに付着し続けるべきである（図３ａの下部中央に示される構造に図示されるように）。これにより、連結工程において、連結ポリヌクレオチドの支持鎖を切断された足場ポリヌクレオチドの支持鎖に確実に連結することができる。
【０２９８】
したがって、支持鎖はヌクレオチド位置ｎ−１とｎ−２との間で切断される。
【０２９９】
好ましくは、支持鎖は、ヌクレオチド位置ｎ−１とｎ−２との間のホスホジエステル結合（ヘルパー鎖に対して遠位方向／プライマー鎖に対して近位方向において、ユニバーサルヌクレオチドの位置に対する支持鎖の第２のホスホジエステル結合）の切断によって切断される。
【０３００】
支持鎖は、ヌクレオチド位置ｎ−１とｎ−２との間のホスホジエステル結合の一方のエステル結合の切断によって切断され得る。
【０３０１】
好ましくは、支持鎖はヌクレオチド位置ｎ−１に対する１番目のエステル結合の切断により切断される。これは、切断された足場ポリヌクレオチドの支持鎖上の切断位置で末端リン酸基を保持する効果を有するであろう。
【０３０２】
上記に記載されるようｎヌクレオチド位置ｎ−１とｎ−２との間の支持鎖の切断は、エンドヌクレアーゼＶなどの酵素の作用によって行われ得る。
【０３０３】
二塩基突出を生成するために、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチド占有位置ｎを含む配列によって定義される切断部位で支持鎖を切断する１つの機構が、実施例７に記載されている。記載される機構は例示的であり、上記に記載される二塩基突出が達成されるという条件で、他の機構を用いることができる。
【０３０４】
この例示された機構では、エンドヌクレアーゼ酵素が用いられている。例示された方法では、酵素はエンドヌクレアーゼＶである。上記に記載される一塩基突出が形成されるという条件で、他の酵素、分子、または化学物質を使用することができる。
【０３０５】
方法の工程（４）において、二本鎖連結ポリヌクレオチドは、切断された足場ポリヌクレオチドに連結される（３０４）。連結ポリヌクレオチドは、支持鎖およびヘルパー鎖を含む。連結ポリヌクレオチドは、ユニバーサルヌクレオチド、および１番目のヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドである突出ヌクレオチドを支持鎖中に含む相補的連結末端をさらに含む。連結ポリヌクレオチドは、突出に隣接するヘルパー鎖中にリン酸基を欠く末端ヌクレオチドをさらに含む（図３ａの下部の左端に図示される構造を参照されたい）。相補的連結末端は、好適な連結条件に供されたときに、それが工程（３）の切断された足場ポリヌクレオチド生産物の突出末端と適合的に接合するように構成される。支持鎖の連結時に、１番目のヌクレオチドはそのパートナーヌクレオチドと対合される。
【０３０６】
この方法では、連結ポリヌクレオチドの支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドは、一本鎖切断部位でヘルパー鎖の末端ヌクレオチドと反対側の相補的連結末端中に位置付けられ、それと対合される。図３ａに概略的に図示されるように、連結ポリヌクレオチドの支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドは、工程（６）の合成鎖に組み込まれる所定のヌクレオチド配列の隣のヌクレオチドに関して位置「ｎ」に、すなわち、次の合成サイクルにおいて位置付けられる。連結ポリヌクレオチドの相補的連結末端において、支持鎖の最後から２番目のヌクレオチドは、工程（２）の１番目のヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドであり、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドに突出する。
【０３０７】
連結ポリヌクレオチドにおいて、突出に隣接する末端ヌクレオチドがリン酸基を欠くように、ヘルパー鎖が提供される。典型的には、上記に記載されるように、ヘルパー鎖のこの非リン酸化末端ヌクレオチドは、ヘルパー鎖の５’末端を定義するであろう。
【０３０８】
工程（４）において、連結ポリヌクレオチドの支持鎖と切断された足場ポリヌクレオチドの支持鎖（３０４）との連結時に、合成鎖中の所定のヌクレオチド配列の１番目のヌクレオチドは、支持鎖中のそのパートナーヌクレオチドと対合される。
【０３０９】
連結は、典型的には、リガーゼ活性を有する酵素によって行われ得る。例えば、連結は、Ｔ３  ＤＮＡリガーゼまたはＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いて行われ得る。ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドは末端リン酸基がないためにリガーゼに対する基質として作用することができないので、そのような酵素の使用は、合成鎖における一本鎖切断の維持をもたらすであろう。
【０３１０】
切断された足場ポリヌクレオチドへの連結ポリヌクレオチドの連結は、第１の合成サイクルを完了し、そのときに、所定のヌクレオチド配列の１番目のヌクレオチドがそのパートナーヌクレオチドと反対側のポリヌクレオチドに組み込まれることを除いて、工程（１）の足場ポリヌクレオチドが効果的に再構築される。
【０３１１】
方法のバージョン１および２と同様に、方法のバージョン３における連結は、典型的には、リガーゼ活性を有する酵素によって行われ得る。例えば、連結は、Ｔ３  ＤＮＡリガーゼまたはＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いて行われ得る。ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドは末端リン酸基の不在のためにリガーゼの基質として作用することができないので、リガーゼ酵素の使用は、合成鎖中の一本鎖切断の維持をもたらすであろう。
【０３１２】
図３ａに図示されるように、切断された足場ポリヌクレオチドへの連結ポリヌクレオチドの連結は、第１の合成サイクルを完了し、そのときに、所定のヌクレオチド配列の１番目のヌクレオチドがそのパートナーヌクレオチドと反対側のポリヌクレオチドに組み込まれることを除いて、工程（１）の足場ポリヌクレオチドが効果的に再構築される。例示的な方法のバージョン１および２のように、所与の合成サイクルの終わりにおける例示的な方法のバージョン３では、合成サイクル中に、ユニバーサルヌクレオチドは、前のサイクルにおける支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドによって占められる位置に対して支持鎖中の位置ｎ＋１を占めるであろう。同時に、例示的な方法のバージョン１のように、所与の合成サイクルの終わりに、ユニバーサルヌクレオチドはまた、次のサイクルにおいて組み込まれる所定のヌクレオチド配列の隣のヌクレオチドによって占められることになる合成鎖中の位置に対して支持鎖中の位置ｎを占めるであろう。したがって、所与の合成サイクルの終わりに、次の合成サイクルにおいて使用するための修飾された足場分子が提供され（３０６）、ここでユニバーサルヌクレオチドは再び支持鎖に位置付けられ、所定のヌクレオチド配列の隣のヌクレオチドの組み込み、および次の合成サイクルにおける支持鎖の切断を促進する。
【０３１３】
所定のヌクレオチド配列の隣のヌクレオチドを次の合成サイクルに組み込むことを可能にするために、可逆的ターミネーター基を１番目のヌクレオチドから除去しなければならない（脱保護工程、３０５）。これは、方法のバージョン１について上記に記載されるように行われ得る。
【０３１４】
例示的な方法のバージョン３では、第２の合成サイクルおよびその後の合成サイクルは、第１の合成サイクルについて上記に記載されるように行われ得る。
【０３１５】
したがって、工程（６）において、次の合成サイクル（３０６）のために提供される足場ポリヌクレオチドは、第１の合成サイクルの連結工程（４）と、脱保護工程、例えば工程（５）との生産物である。工程（６）において、第１のサイクルの工程（２）について上記に記載されるように、所定のヌクレオチド配列中の隣のヌクレオチドが、ポリメラーゼの作用によって足場ポリヌクレオチドの合成鎖に組み込まれる（３０７）。隣のヌクレオチドはまた、ポリメラーゼによるそのサイクルでのさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基を含む。
【０３１６】
例示的な方法のバージョン３の第１の合成サイクルの工程（２）のように、工程（６）において、隣のヌクレオチドは、その組み込み時に隣のヌクレオチドと対合するように支持鎖中に位置付けられたユニバーサルヌクレオチドと反対側に組み込まれる。この構成では、ユニバーサルヌクレオチドは再び、合成鎖に組み込まれた隣のヌクレオチドに関して位置「ｎ」に位置付けられる。さらに、第１の合成サイクルについて上記に記載されるように、次の合成サイクルの工程（６）において、ユニバーサルヌクレオチドは、前のサイクルの工程（２）における支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドによって占められる位置に対して、支持鎖中の位置「ｎ＋１」を占めるであろう。これは、前の合成サイクルの連結ポリヌクレオチドにおいて、ユニバーサルヌクレオチドがヘルパー鎖の末端非リン酸化ヌクレオチドと反対側にあるように位置付けられ、これと対合されたために達成される。
【０３１７】
工程（７）において、足場ポリヌクレオチドは、切断部位であって、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドを含む配列によって定義される、切断部位で切断される（３０８）。切断は、支持鎖を切断することと、ユニバーサルヌクレオチドを除去して、残りの足場ポリヌクレオチド中の突出の末端ヌクレオチドとして隣のヌクレオチドを含む二塩基突出末端を合成鎖中に提供することと、を含む。合成鎖の二塩基突出は、残りの切断された足場ポリヌクレオチド中の支持鎖の末端ヌクレオチドに突出する。切断工程は、第１のサイクルの工程（３）について上記に記載されるように行われ得る。
【０３１８】
次のサイクルの工程（８）において、二本鎖連結ポリヌクレオチドは、切断された足場ポリヌクレオチドに連結される（３０９）。連結ポリヌクレオチドは、支持鎖およびヘルパー鎖を含む。連結ポリヌクレオチドは、ユニバーサルヌクレオチド、および所定のヌクレオチド配列の隣のヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドである突出ヌクレオチドを支持鎖中に含む相補的連結末端をさらに含む。連結ポリヌクレオチドは、突出に隣接するヘルパー鎖中にリン酸基を欠く末端ヌクレオチドをさらに含む。相補的連結末端は、好適な連結条件に供されたときに、それが工程（７）の切断された足場ポリヌクレオチド生産物の突出末端と適合的に接合するように構成される。支持鎖の連結時に、所定のヌクレオチド配列の隣のヌクレオチドがそのパートナーヌクレオチドと対合され、これによりさらなる合成サイクルが完了する。
【０３１９】
次の合成サイクルおよびその後の合成サイクルの工程（８）の連結ポリヌクレオチドが構成される場合があり、連結工程は、第１の合成サイクルの工程（４）について上記に記載されるように行われ得る。
【０３２０】
したがって、連結（３０９）時の工程（８）において、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドは、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドと反対側に位置付けられ、それと対合される。第１の合成サイクルに関して上記に記載されるように、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドは、隣のヌクレオチドに対して位置「ｎ」に位置付けられる。さらに、上記に記載されるように、工程（８）の後、ユニバーサルヌクレオチドは、工程（６）の開始前に支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドによって占められる位置に対して、支持鎖中の位置「ｎ＋１」を占めるであろう。
【０３２１】
次のサイクル（３１０）における可逆的ターミネーター基の脱保護は、第１の合成サイクルに関して上記に記載されるように行われ得る。
【０３２２】
合成サイクルは、所定のヌクレオチド配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドを合成するのに必要な回数だけ繰り返される。
【０３２３】
合成方法のバージョン４
合成方法のバージョン４は、合成方法のバージョン２の変形例である。したがって、合成方法のバージョン２と同様に、合成方法のバージョン４では、新たに組み込まれた所定のヌクレオチドは、工程（２）／（６）の間に位置ｎで支持鎖中のパートナーヌクレオチドと反対側の合成鎖に組み込まれ、支持鎖は、工程（３）／（７）の間に位置ｎとｎ−１との間で切断される。ユニバーサルヌクレオチドが位置ｎ＋１を占める合成方法のバージョン２とは異なり、合成方法のバージョン４では、ユニバーサルヌクレオチドは、ヘルパー鎖に対して近位方向／プライマー鎖に対して遠位方向において、位置ｎ＋２を占める。したがって、この違いを考慮に入れて、合成方法のバージョン４は、方法のバージョン２に関する上記の記載の文脈において図３ｂおよびその記載を参照して記載され得る。この方法のさらなる変形例は、各変形方法において、支持鎖が、工程（３）／（７）の間に位置ｎとｎ−１との間で切断され、ユニバーサルヌクレオチドが、例えば位置ｎ＋３または位置ｎ＋３＋ｘなど、それぞれ位置ｎ＋２からさらに１位置ずつ除去された支持鎖中の位置を増分的に占めることが想定され、ここで、ｘは１〜１０以上の整数である。
【０３２４】
したがって、本発明はまた、上記および本明細書に記載されるような所定の配列を有する二本鎖ポリヌクレオチド分子をインビトロで合成する方法であって、本方法が、合成サイクルを行うことを含み、
ａ）工程（１）において、足場ポリヌクレオチドが、工程（２）の１番目のヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドであるヌクレオチド（位置ｎ）を有する支持鎖中に提供され、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドが、位置ｎ＋２（ヘルパー鎖に対して近位方向／プライマー鎖に対して遠位方向において）に位置付けられ、
ｂ）工程（２）／（６）において、１番目の／隣のヌクレオチドが、支持鎖中のパートナーヌクレオチドと反対側の位置（位置ｎ）で合成鎖に組み込まれ、そのときに１番目の／隣のヌクレオチドが、パートナーヌクレオチドと対合し、
ｃ）工程（３）／（７）において、支持鎖が、ヘルパー鎖に対して遠位方向／プライマー鎖に対して近位方向において支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドから２番目のヌクレオチド（位置ｎ）と３番目のヌクレオチド（位置ｎ−１）との間の位置で切断され、切断がユニバーサルヌクレオチドを除去し、支持鎖に突出した１番目の／隣のヌクレオチドを含む足場ポリヌクレオチド中に一塩基突出を作成し、
ｄ）工程（４）／（８）において、連結ポリヌクレオチドの相補的連結末端が、一塩基突出を含み、
ｉ．ユニバーサルヌクレオチドが、ヘルパー鎖中のヌクレオチドと反対側の支持鎖中の位置ｎ＋２に位置付けられ、それと対合され、
ｉｉ．支持鎖の最後から２番目のヌクレオチドが、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドと対合され、次の合成サイクルの工程（６）における隣のヌクレオチドのパートナーヌクレオチドであり（位置ｎ）、
ｉｉｉ．支持鎖の末端ヌクレオチド（位置ｎ−１）が、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドに突出し、工程（２）の１番目のヌクレオチドのパートナーヌクレオチドであるか、または現在の合成サイクルの工程（６）の新たに組み込まれたヌクレオチドのパートナーヌクレオチドである、方法を提供する。
【０３２５】
直前に記載されたこの方法の修正例では、工程（１）において、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドは、位置ｎ＋３（ヘルパー鎖に対して近位方向／プライマー鎖に対して遠位方向において）に位置付けられ、工程（４）／（８）において、連結ポリヌクレオチドの相補的連結末端に、位置ｎ＋３に位置付けられた支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドが提供される。代替的に、工程（１）において、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドは、位置ｎ＋３＋ｘ（ヘルパー鎖に対して近位方向／プライマー鎖に対して遠位方向において）に位置付けられ、工程（４）／（８）において、連結ポリヌクレオチドの相補的連結末端に、位置ｎ＋３＋ｘに位置付けられた支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドが提供され、ここでｘは１〜１０以上の整数である。
【０３２６】
方法のバージョン２と同様に、方法のバージョン４およびその変形例では、ヘルパー鎖部分は、新たな所定のヌクレオチドの組み込みの前に足場ポリヌクレオチドから削除され得る。ヘルパー鎖部分は、本明細書により詳細に記載されるように、新たな所定のヌクレオチドの組み込みの前に、例えば変性によって足場ポリヌクレオチドから除去され得る。
【０３２７】
合成方法のバージョン５
合成方法のバージョン５は、合成方法のバージョン３の変形例である。したがって、合成方法のバージョン３と同様に、合成方法のバージョン４では、新たに組み込まれた所定のヌクレオチドは、工程（２）／（６）の間に位置ｎで支持鎖中のパートナーユニバーサルヌクレオチドと反対側の合成鎖に組み込まれ、支持鎖は、工程（３）／（７）の間に位置ｎ−１とｎ−２との間で切断される。ユニバーサルヌクレオチドが位置ｎを占める合成方法のバージョン３とは異なり、合成方法のバージョン５では、ユニバーサルヌクレオチドは、ヘルパー鎖に対して近位方向／プライマー鎖に対して遠位方向において、位置ｎ＋１を占める。したがって、この違いを考慮に入れて、合成方法のバージョン５は、方法のバージョン３に関する上記の記載の文脈で図３ｃおよびその記載を参照して記載され得る。この方法のさらなる変形例は、各変形方法において、支持鎖が、工程（３）／（７）の間に位置ｎとｎ−１との間で切断され、ユニバーサルヌクレオチドが、例えば位置ｎ＋２または位置ｎ＋２＋ｘなど、それぞれ位置ｎ＋１からさらに１位置ずつ除去された支持鎖中の位置を増分的に占めることが想定され、ここで、ｘは１〜１０以上の整数である。
【０３２８】
したがって、本発明はまた、上記および本明細書に記載されるような所定の配列を有する二本鎖ポリヌクレオチド分子をインビトロで合成する方法であって、本方法が、合成サイクルを行うことを含み、
ａ）工程（１）において、足場ポリヌクレオチドが、工程（２）の１番目のヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドであるヌクレオチド（位置ｎ）を有する支持鎖中に提供され、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドは、位置ｎ＋１（ヘルパー鎖に対して近位方向／プライマー鎖に対して遠位方向において）に位置付けられ、
ｂ）工程（２）／（６）において、１番目の／隣のヌクレオチドが、支持鎖中のパートナーヌクレオチドと反対側の位置（位置ｎ）で合成鎖に組み込まれ、そのときに１番目の／隣のヌクレオチドが、パートナーヌクレオチドと対合し、
ｃ）工程（３）／（７）において、支持鎖が、ヘルパー鎖に対して遠位方向／プライマー鎖に対して近位方向において、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドから２番目のヌクレオチド（位置ｎ−１）と３番目のヌクレオチド（位置ｎ−２）との間の位置で切断され、切断がユニバーサルヌクレオチドを除去し、支持鎖に突出した１番目の／隣のヌクレオチドを含む足場ポリヌクレオチド中に二塩基突出を作成し、
ｄ）工程（４）／（８）において、連結ポリヌクレオチドの相補的連結末端が、二塩基突出を含み、
ｉ．支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドが、ヘルパー鎖中のヌクレオチドと反対側の位置ｎ＋１に位置付けられ、それと対合され、
ｉｉ．支持鎖の最後から２番目のヌクレオチド（位置ｎ−１）が、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドに突出し、工程（２）の１番目のヌクレオチドのパートナーヌクレオチドであるか、または現在の合成サイクルの工程（６）の新たに組み込まれたヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドであり、
ｉｉｉ．支持鎖の位置ｎのヌクレオチドが、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドと対合され、次の合成サイクルの工程（６）における隣のヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドである、方法を提供する。
【０３２９】
直前に記載されたこの方法の修正例では、工程（１）において、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドは、位置ｎ＋２（ヘルパー鎖に対して近位方向／プライマー鎖に対して遠位方向において）に位置付けられ、工程（４）／（８）において、連結ポリヌクレオチドの相補的連結末端に、位置ｎ＋２に位置付けられる支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドが提供される。代替的に、工程（１）において、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドは、位置ｎ＋２＋ｘ（ヘルパー鎖に対して近位方向／プライマー鎖に対して遠位方向において）に位置付けられ、工程（４）／（８）において、連結ポリヌクレオチドの相補的連結末端に、位置ｎ＋２＋ｘに位置付けられる支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドが提供され、ここでｘは１〜１０以上の整数である。
【０３３０】
方法のバージョン３と同様に、方法のバージョン５およびその変形例では、ヘルパー鎖部分は、新たな所定のヌクレオチドの組み込みの前に足場ポリヌクレオチドから削除され得る。ヘルパー鎖部分は、本明細書により詳細に記載されるように、新たな所定のヌクレオチドの組み込みの前に、例えば変性によって足場ポリヌクレオチドから除去され得る。
【０３３１】
合成鎖
上記に記載されるような方法のバージョン１、２、および３を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載されるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを合成する方法において、足場ポリヌクレオチドに合成鎖が提供される。合成サイクル中に、所定の配列の各新たなヌクレオチドが合成鎖に組み込まれる。ポリメラーゼ酵素を使用して、各新たなヌクレオチド、ヌクレオチド類似体／誘導体または非ヌクレオチドの組み込みを触媒することができる。合成鎖はプライマー鎖部分を含み、好ましくはヘルパー鎖部分を含む。
【０３３２】
ヘルパー鎖
切断工程で切断酵素（複数可）の結合を促進するために、足場ポリヌクレオチドにヘルパー鎖が提供され得る。必要に応じて、切断工程での切断酵素（複数可）の結合を確実にし、連結工程での連結を確実にするために代替的な手段が提供されるという条件で、ヘルパー鎖が削除され得る。本発明の好ましい方法において、合成鎖にヘルパー鎖が提供される。
【０３３３】
ヘルパー鎖が切断工程における切断酵素（複数可）の結合を促進するのに好適であるという条件で、ヘルパー鎖の長さ、配列、および構造のパラメーターに関する特別な要件はない。
【０３３４】
ヘルパー鎖は、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体／誘導体および／または非ヌクレオチドを含み得る。
【０３３５】
好ましくは、ヘルパー鎖の配列の領域内で、支持鎖とのミスマッチは回避されるべきであり、ＧＣおよびＡＴに富む領域は回避されるべきであり、加えて、ヘアピンまたはバルジなどの二次構造の領域は回避されるべきである。
【０３３６】
ヘルパー鎖の長さは１０塩基以上であり得る。任意選択的に、ヘルパー鎖の長さは１５塩基以上、好ましくは３０塩基以上であり得る。しかしながら、ヘルパー鎖が切断および／または連結を促進することができるという条件で、ヘルパー鎖の長さは変化し得る。
【０３３７】
ヘルパー鎖は支持鎖の対応する領域にハイブリダイズされなければならない。ヘルパー鎖が切断工程における切断酵素（複数可）の結合および／または連結工程におけるリガーゼ酵素の結合を促進することができるという条件で、ヘルパー鎖の全体が支持鎖の対応する領域にハイブリダイズされることは必須ではない。したがって、ヘルパー鎖と支持鎖の対応の対応する領域との間のミスマッチは許容され得る。ヘルパー鎖は支持鎖の対応する領域よりも長い場合がある。支持鎖は、プライマー鎖に対して遠位方向において、ヘルパー鎖に対応する領域を越えて伸長し得る。ヘルパー鎖は、例えばヘアピンを介して、支持鎖の対応する領域に接続され得る。
【０３３８】
ヘルパー鎖は、好ましくは、ニックの部位のヘルパー鎖の末端ヌクレオチドがニックの部位のプライマー鎖の末端ヌクレオチドに対して合成鎖中の隣の連続したヌクレオチド位置を占めるように支持鎖にハイブリダイズされる。したがって、この構成では、ヘルパー鎖とプライマー鎖との間にヌクレオチド位置ずれはない。それにもかかわらず、ヘルパー鎖およびプライマー鎖は、一本鎖の切断またはニックの存在のために物理的に分離されるであろう。好ましくは、ニックの部位におけるヘルパー鎖の末端核酸塩基は、支持鎖中のそのパートナーヌクレオチドにハイブリダイズされる。
【０３３９】
ユニバーサルヌクレオチドと対合するヘルパー鎖中のヌクレオチドは、任意の好適なヌクレオチドであり得る。好ましくは、分子のらせん構造を歪める可能性がある対合は回避されるべきである。好ましくは、シトシンはユニバーサルヌクレオチドに対するパートナーとして作用する。特に好ましい実施形態では、ユニバーサルヌクレオチドは、イノシン、またはその類似体、変異体もしくは誘導体であり、ヘルパー鎖中のユニバーサルヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドはシトシンである。
【０３４０】
ヘルパー鎖の除去
例示的な方法のバージョン１、２、および３を含む、本明細書に記載される合成方法のうちのいずれにおいても、合成鎖とそれにハイブリダイズされた支持鎖とを含む足場ポリヌクレオチドを提供する工程（１）（すなわち、第１のサイクルにおいて）（１０１、１０６、２０１、２０６、３０１、３０６）において、合成鎖は、ヘルパー鎖なしで提供され得る。これにより、足場ポリヌクレオチドへのポリメラーゼの結合が改善され得る。
【０３４１】
さらに、任意の１つ以上の合成サイクルにおいて、またはすべての合成サイクルにおいて、二本鎖連結ポリヌクレオチドを切断された足場ポリヌクレオチドに連結する工程の後で、かつ所定のヌクレオチド配列の隣のヌクレオチドを足場ヌクレオチドの合成鎖に組み込む工程の前に、合成鎖のヘルパー鎖部分が足場ポリヌクレオチドから除去され得る。合成鎖のヘルパー鎖部分は、（ｉ）足場ポリヌクレオチドを約８０℃〜約９５℃の温度に加熱し、足場ポリヌクレオチドからヘルパー鎖部分を分離すること、（ｉｉ）足場ポリヌクレオチドを８Ｍ尿素などの尿素溶液で処理し、足場ポリヌクレオチドからヘルパー鎖部分を分離すること、（ｉｉｉ）足場ポリヌクレオチドをホルムアミドもしくは１００％ホルムアミドなどのホルムアミド溶液で処理し、足場ポリヌクレオチドからヘルパー鎖部分を分離すること、または（ｉｖ）足場ポリヌクレオチドを、ヘルパー鎖部分の配列と相補的なヌクレオチド配列の領域を含む一本鎖ポリヌクレオチド分子と接触させ、それによって足場ポリヌクレオチドへのヘルパー鎖部分のハイブリダイゼーションを競合的に阻害することを含むがこれらに限定されない任意の好適な手段によって、足場ポリヌクレオチドから除去することができる。
【０３４２】
二本鎖連結ポリヌクレオチドを切断された足場ポリヌクレオチドに連結する工程の後で、かつ所定のヌクレオチド配列の隣のヌクレオチドを足場ポリヌクレオチドの合成鎖に組み込む工程の前に、ヘルパー鎖部分を足場ポリヌクレオチドから除去する方法において、切断工程は、ヘルパー鎖によって提供される二本鎖領域の不在下で支持鎖を切断することを含むであろう。本明細書に開示される任意の好適な酵素から選択されるものなど、任意の好適な酵素を、そのような切断工程を行うために選択することができる。
【０３４３】
プライマー鎖
プライマー鎖は十分な長さであるべきであり、ポリメラーゼ酵素が合成を開始することを可能にする、すなわち、ニックの部位でのプライマー鎖の末端における新たなヌクレオチドの組み込みを触媒するのに好適であるような配列および構造を保有するべきである。
【０３４４】
プライマー鎖は、新たなポリヌクレオチド合成を開始するように作用し得る（例えば、図１〜３のそれぞれに図示される構造において点線で示されるような）配列の領域を含み得る。プライマー鎖は、新たなポリヌクレオチド合成を開始するように作用し得る配列の領域からなる場合があり、したがって、プライマー鎖の全体は、新たなポリヌクレオチド合成を開始するように作用し得る配列であり得る。
【０３４５】
プライマー鎖が新たなポリヌクレオチド合成を開始するのに好適であるという条件で、プライマー鎖の長さ、配列、および構造のパラメーターについて特別な要件はない。
【０３４６】
プライマー鎖は、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体／誘導体および／または非ヌクレオチドを含み得る。
【０３４７】
当業者は、新たなポリヌクレオチド合成を開始することができるプライマー鎖を容易に構築することができる。したがって、新たなポリヌクレオチド合成を開始するように作用し得るプライマー鎖の配列領域内では、支持鎖とのミスマッチは回避されるべきであり、ＧＣおよびＡＴに富む領域は回避されるべきであり、加えて、ヘアピンまたはバルジなどの二次構造の領域は回避されるべきである。
【０３４８】
新たなポリヌクレオチド合成を開始するように作用し得るプライマー鎖の配列領域の長さは、好みおよび使用されるポリメラーゼ酵素に応じて当業者が選択することができる。この領域の長さは、７塩基以上、８塩基以上、９塩基以上、または１０塩基以上であり得る。任意選択的に、この領域の長さは、１５塩基以上、好ましくは３０塩基以上であろう。
【０３４９】
プライマー鎖は支持鎖の対応する領域にハイブリダイズされなければならない。プライマー鎖が新たなポリヌクレオチド合成を開始することができるという条件で、プライマー鎖の全体が支持鎖の対応する領域にハイブリダイズされることは必須ではない。したがって、ヘルパー鎖と支持鎖の対応の対応する領域との間のミスマッチは、ある程度許容され得る。好ましくは、新たなポリヌクレオチド合成を開始するように作用し得るプライマー鎖の配列領域は、支持鎖中の対応する核酸塩基に相補的な核酸塩基を含むべきである。
【０３５０】
プライマー鎖は支持鎖の対応する領域よりも長い場合がある。支持鎖は、ヘルパー鎖に対して遠位方向において、プライマー鎖に対応する領域を越えて伸長し得る。ヘルパー鎖は、例えばヘアピンを介して、支持鎖の対応する領域に接続され得る。
【０３５１】
支持鎖
方法のバージョン１、２、および３を含むがこれらに限定されない本発明の方法では、上記に記載されるように、足場ポリヌクレオチドに支持鎖が提供される。支持鎖は合成鎖にハイブリダイズされる。上記に記載されるように、支持鎖がプライマー鎖部分と適合し、含まれる場合、合成鎖のヘルパー鎖部分と適合するという条件で、支持鎖の長さ、配列、および構造のパラメーターについて特別な要件はない。
【０３５２】
ＲＮＡ合成
ＤＮＡ合成について記載される方法はＲＮＡの合成に適応され得る。一適応形態では、方法のバージョン１〜３について記載される合成工程が適応され得る。したがって、方法のバージョン１〜３のそれぞれにおいて、足場ポリヌクレオチドの支持鎖は、上記に記載されるように、ＤＮＡ鎖である。足場ポリヌクレオチドの合成鎖のプライマー鎖部分はＲＮＡ鎖である。ヘルパー鎖は、存在する場合、好ましくはＲＮＡ鎖である。ヘルパー鎖は、存在する場合、ＤＮＡ鎖であり得る。
【０３５３】
ヌクレオチドは、上記に記載されるように、可逆的ターミネーター基を含むように修飾され得るリボヌクレオシド−５’−Ｏ−三リン酸（ＮＴＰ）から組み込まれ得る。好ましくは３’−Ｏ−修飾リボヌクレオシド−５’−Ｏ−三リン酸が使用される。修飾ヌクレオチドはＲＮＡポリメラーゼの作用によって組み込まれる。
【０３５４】
したがって、方法のバージョン１〜３に関する上記の記載は、ＲＮＡ合成のために必要な変更を加えて適用することができるが、記載されるように適応され得る。方法のバージョン１および２に関する例示的な適応される反応スキームを図２３〜２５に示す。方法のバージョン３も同様に適応され得る。ＲＮＡ合成のために適応される方法のうちのいずれにおいても、支持鎖、プライマー鎖、ヘルパー鎖、連結ポリヌクレオチド、およびユニバーサルヌクレオチドの上記の記載は、必要な変更を加えて適用することができるが、記載されるように適応され得る。ユニバーサルヌクレオチドを含む支持鎖はＤＮＡ鎖であるので、先に記載されるような切断工程および切断位置は、必要な変更を加えて適用することができる。好ましい実施形態では、ＳｐｌｉｎｔＲ  ＤＮＡリガーゼが連結工程において使用される。
【実施例】
【０３５５】
以下の実施例は、本発明によるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを合成するための方法、ならびにその方法において使用される例示的な構築物の特定の実施形態を例示する。実施例は本発明を限定しない。
【０３５６】
実施例１．ヘルパー鎖の不在下での合成。
この実施例は、４つの工程：部分二本鎖ＤＮＡ上への３’−Ｏ−修飾ｄＮＴＰの組み込み、切断、連結、および脱保護を使用したポリヌクレオチドの合成を記載しており、第１の工程は、ユニバーサルヌクレオチド、この特定の場合はイノシンと反対側で起こる。
【０３５７】
工程１：組み込み
第１の工程は、ＤＮＡポリメラーゼによる酵素的組み込みによるオリゴヌクレオチドへの３’−Ｏ−保護一塩基の制御された添加を記載する（図５ａ）。
【０３５８】
材料および方法
材料
１．Ｊｉａｎ  Ｗｕ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２００８のＰｈＤ論文に記載されるプロトコルに従って、３’−Ｏ−修飾ｄＮＴＰを社内で合成した。合成のためのプロトコルはまた、米国特許出願公開：Ｊ．Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｅｆｃａｖｉｔｃｈ，Ｊｕｌｉｅｓｔａ  Ｅ．Ｓｙｌｖｅｓｔｅｒ，Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ−Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｏｌｙｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ  ＵＳ２０１６／０１０８３８２Ａ１にも記載されている。
２．オリゴヌクレオチドを社内で設計し、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手した（図５ｈ）。原液を１００μＭの濃度で調製した。
３．３−Ｏ−修飾ｄＮＴＰを組み込む能力が増強された、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓによって操作されたＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼを使用した。しかしながら、修飾ｄＮＴＰを組み込むことができる任意のＤＮＡポリメラーゼを使用することができる。
２種類の可逆的ターミネーターを試験した。
【化３３】
2020506687.tif 000036
【０３５９】
方法
１．２μｌの１０×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ（登録商標）緩衝液（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１％のトリトン（登録商標）Ｘ−１００、ｐＨ８．８、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中の１２．２５μｌの滅菌脱イオン水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）と混合した。
２．０．５μｌの１０μＭプライマー（合成鎖）（５ｐｍｏｌ、１当量）（配列番号１、図５ｈ）および０．７５μｌの１０μＭ鋳型（支持鎖）（６ｐｍｏｌ、１．５当量）（配列番号２、図５ｈ）を反応混合物に加えた。
３．３’−Ｏ−修飾−ｄＴＴＰ（２μｌの１００μＭ）およびＭｎＣｌ２（１μｌの４０ｍＭ）を加えた。
４．次に、１．５μｌのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼ（１５Ｕ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を加えた。しかしながら、修飾ｄＮＴＰを組み込むことができる任意のＤＮＡポリメラーゼを使用することができる。
５．反応物を６５℃で２０分間インキュベートした。
６．ＴＢＥ−尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）を加えて反応を停止させた。
７．反応物を、ＴＢＥ緩衝液を含むポリアクリルアミドゲル（１５％）上で分離し、ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰ撮像システム（ＢｉｏＲａｄ）によって可視化した。
【０３６０】
ゲル電気泳動およびＤＮＡの可視化
１．５μｌの反応混合物を滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中の５μｌのＴＢＥ−尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）に加え、熱サーモミキサー（エッペンドルフ）を使用して５分間９５℃まで加熱した。
２．次に、５μｌの試料を、予熱した１×ＴＢＥ緩衝液Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（８９ｍＭのトリス、８９ｍＭのホウ酸、および２ｍＭのＥＤＴＡ）を含有する１５％のＴＢＥ−尿素ゲル１．０ｍｍ×１０ウェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のウェルに入れた。
３．Ｘ−ｃｅｌｌ  ｓｕｒｅ  ｌｏｃｋモジュール（Ｎｏｖｅｘ）を適所に固定し、以下の条件、室温で４０分間、２６０Ｖ、９０Ａで電気泳動を行った。
４．ゲルを、Ｃｙ３  ＬＥＤを使用してＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰ（ＢｉｏＲａｄ）によって可視化した。可視化および分析は、Ｉｍａｇｅ  ｌａｂ  ２．０プラットフォーム上で実施した。
【０３６１】
結果
Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ製のカスタマイズされて操作されたＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼは、ユニバーサルヌクレオチド、例えばノシンと反対側に３’−Ｏ−修飾−ｄＮＴＰを組み込むことができる効率的なＤＮＡポリメラーゼである（図５ｂ〜ｃ）。
イノシンと反対側の効率的な組み込みは、６５℃の温度で起こった（図５ｄ〜ｅ）。
イノシンと反対側の３’−Ｏ−修飾−ｄＴＴＰの組み込みは、Ｍｎ２＋イオンの存在を必要とする（図５ｆ〜ｇ）。成功した転化は、図５ｃ、ｅ、ｇ、およびｈにおいて太字でマークされている。
【０３６２】
結論
イノシンと反対側の３−Ｏ−修飾−ｄＴＴＰの組み込みは、Ｍｎ２＋イオンの存在下で６５℃の温度で、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ製のカスタマイズされて操作されたＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼを使用して特に高い効率で達成され得る。
【０３６３】
工程２：切断
第２の工程は、ｈＡＡＧ／Ｅｎｄｏ  ＶＩＩＩまたはｈＡＡＧ／化学塩基のいずれかによるポリヌクレオチドの二段階切断を記載する（図６ａ）。
【０３６４】
材料および方法
材料
１．実施例１で利用されたオリゴヌクレオチドを社内で設計し、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈによって合成した（配列については図６（ｅ）の表を参照されたい）。
２．滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）を使用して、オリゴヌクレオチドを１００μＭのストック濃度に希釈した。
【０３６５】
方法
以下の手順を使用して、オリゴヌクレオチド上の切断反応を実施した。
１．ピペット（Ｇｉｌｓｏｎ）を使用して、４１μｌの滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移した。
２．次に、５μｌの１０×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ（登録商標）反応緩衝液ＮＥＢ（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１％のトリトン（登録商標）Ｘ−１００、ｐＨ８．８）を同じエッペンドルフチューブに加えた。
３．各１μｌのオリゴヌクレオチド（図６ｅ）、鋳型（配列番号３）または任意の蛍光タグ付きの長オリゴ鎖、Ｔを有するプライマー（配列番号４）、および対照（配列番号５）をすべて５ｐｍｏｌで同じチューブに加えた。
４．１μｌのヒトアルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｈＡＡＧ）ＮＥＢ（１０単位／μｌ）を同じチューブに加えた。
５．次に、反応混合物をピペットで再懸濁することによって穏やかに混合し、５秒間１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、３７℃で１時間インキュベートした。
６．典型的には、インキュベーション時間が経過した後、酵素的熱不活性化（すなわち、６５℃で２０分間）によって反応を終了させた。
【０３６６】
周囲条件下での精製試料混合物を以下に概説されたプロトコルを使用して精製した。
１．５００μｌの緩衝液ＰＮＩ  ＱＩＡＧＥＮ（５Ｍの塩化グアニジニウム）を試料に加え、ピペットで穏やかに再懸濁することによって混合した。
２．混合物をＱＩＡｑｕｉｃｋスピンカラム（ＱＩＡＧＥＮ）に移し、６０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
３．遠心分離後、フロースルーを廃棄し、７５０μｌの緩衝液ＰＥ  ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５および８０％のエタノール）をスピンカラムに加え、６０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
４．フロースルーを廃棄し、スピンカラムを１３０００ｒｐｍでさらに１分間遠心分離して、残留ＰＥ緩衝液を除去した。
５．次に、スピンカラムを滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに入れた。
６．ＤＮＡ溶出について、５０μｌの緩衝液ＥＢ  ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス．ＣＬ、ｐＨ８．５）をカラム膜の中央に加え、室温で１分間放置した。
７．次に、チューブを１３０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。溶出したＤＮＡ濃度を測定し、その後の使用のために−２０℃で保存した。
【０３６７】
以下のプロトコルを使用して、精製されたＤＮＡ濃度の測定値を判定した。
１．２μｌの滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）を台座に加えることによって、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ｏｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を平衡化した。
２．平衡化の後、糸くずの出ないレンズ洗浄用ティッシュ（Ｗｈａｔｍａｎ）を使用して、水をやさしく拭き取った。
３．２μｌの緩衝液ＥＢ  ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス．ＣＬ、ｐＨ８．５）を加えることによって、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ｏｎｅをブランクにした。ブランキングの後に、工程２を繰り返した。
４．２μｌの試料を台座に加え、タッチスクリーン上の測定アイコンを選択することによって、ＤＮＡ濃度を測定した。
【０３６８】
生成された脱塩基部位の切断を以下の手順を使用して実施した。
１．２μｌ（１０〜１００ｎｇ／μｌ）のＤＮＡを滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに加えた。
２．４０μｌ（０．２Ｍ）のＮａＯＨまたは１．５μｌのＥｎｄｏ  ＶＩＩＩ  ＮＥＢ（１０単位／μｌ）および５μｌの１０×反応緩衝液ＮＥＢ（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、７５ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、２５℃でｐＨ８）も同じチューブに加え、再懸濁して１３０００ｒｐｍで５秒間遠心分離することによって穏やかに混合した。
３．得られた混合物をＮａＯＨ処理試料について室温で５分間インキュベートし、その間にＥｎｄｏ  ＶＩＩＩ反応混合物を３７℃で１時間インキュベートした。
４．インキュベーション時間が経過した後、上記に概説されるような精製プロトコルの工程１〜７を使用して、反応混合物を精製した。
【０３６９】
ゲル電気泳動およびＤＮＡの可視化
１．５μｌのＤＮＡおよびＴＢＥ−尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）を滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに加え、熱サーモブロック（エッペンドルフ）を使用して２分間９５℃まで加熱した。
２．次に、ＤＮＡ混合物を、予熱した１×ＴＢＥ緩衝液Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（８９ｍＭのトリス、８９ｍＭのホウ酸、および２ｍＭのＥＤＴＡ）を含有する１５％のＴＢＥ−尿素ゲル１．０ｍｍ×１０ウェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のウェルに入れた。
３．Ｘ−ｃｅｌｌ  ｓｕｒｅ  ｌｏｃｋモジュール（Ｎｏｖｅｘ）を適所に固定し、以下の条件、室温で４０分間、２６０Ｖ、９０Ａで電気泳動を行った。
４．ゲル中のＤＮＡの検出および可視化は、Ｃｙ３  ＬＥＤを使用してＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰ（ＢｉｏＲａｄ）で実施した。可視化および分析は、Ｉｍａｇｅ  ｌａｂ  ２．０プラットフォーム上で実施した。
【０３７０】
結果および結論
ヘルパー鎖によらない切断反応は、切断対未切断ＤＮＡ比の約７％：９３％という低いパーセンテージ収率を示した（図６ｂ〜ｄ）。
【０３７１】
切断結果は、この特定の実施例において、使用された特定の試薬に基づいて、陽性対照と比較して、ヘルパー鎖の不在下で低い収率の切断ＤＮＡが得られることを示した。加えて、脱塩基部位の切断のための化学塩基の使用は、ＥｎｄｏＶＩＩＩ切断と比較して時間がかからなかった。
【０３７２】
工程３：連結
第３の工程は、ヘルパー鎖の不在下でのＤＮＡリガーゼとのポリヌクレオチドの連結を記載する。概略図を図７に示す。
【０３７３】
材料および方法
材料
１．実施例１で利用されたオリゴヌクレオチドを社内で設計し、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈによって合成した（配列については図７ｃの表を参照されたい）。
２．滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）を使用して、オリゴヌクレオチドを１００μＭのストック濃度に希釈した。
【０３７４】
方法
以下の手順を使用して、オリゴヌクレオチド上の連結反応を実施した。
１．ピペット（Ｇｉｌｓｏｎ）を使用して、１６μｌの滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移した。
２．次に、１０μｌの２×Ｑｕｉｃｋ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ緩衝液ＮＥＢ（１３２ｍＭのトリス−ＨＣｌ、２０ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのジチオトレイトール、２ｍＭのＡＴＰ、１５％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ６０００）および２５℃でｐＨ７．６）を同じエッペンドルフチューブに加えた。
３．各１μｌのオリゴヌクレオチド（図７ｃ）、ＴＡＭＲＡまたは任意の蛍光タグ付きリン酸鎖（配列番号７）、Ｔを有するプライマー（配列番号８）、およびイノシン鎖（配列番号９）をすべて５ｐｍｏｌで同じチューブに加えた。
４．１μｌのＱｕｉｃｋ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼＮＥＢ（４００単位／μｌ）を同じチューブに加えた。
５．次に、反応混合物をピペットで再懸濁することにより穏やかに混合し、５秒間１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、室温で２０分間インキュベートした。
６．典型的には、インキュベーション時間が経過した後、ＴＢＥ−尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）を加えて反応を終了させた。
７．上記に記載されるような精製工程１〜７に概説されるプロトコルを使用して、反応混合物を精製した。
【０３７５】
以下のプロトコルを使用して、精製されたＤＮＡ濃度の測定値を判定した。
１．２μｌの滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）を台座に加えることによって、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ｏｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を平衡化した。
２．平衡化の後、糸くずの出ないレンズ洗浄用ティッシュ（Ｗｈａｔｍａｎ）を使用して、水をやさしく拭き取った。
３．２μｌの緩衝液ＥＢ  ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス．ＣＬ、ｐＨ８．５）を加えることによって、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ｏｎｅをブランクにし、次に、ブランキングの後に工程２を繰り返した。
４．２μｌの試料を台座に加え、タッチスクリーン上の測定アイコンを選択することによって、ＤＮＡ濃度を測定した。
５．精製されたＤＮＡをポリアクリルアミドゲルに流し、上記に記載される工程５〜８の手順に従って可視化した。条件または試薬に変更はなかった。
【０３７６】
結果および結論
この特定の実施例において、使用される特定の試薬に基づいて、ヘルパー鎖の不在下で室温（２４℃）でのＤＮＡリガーゼ、この特定の場合はクイックＴ４  ＤＮＡリガーゼとのオリゴヌクレオチドの連結は、低減された量の連結生産物をもたらす（図７ｂ）。
【０３７７】
実施例２．ヘルパー鎖によるバージョン１の化学。
この実施例は、４つの工程：ニック部位からの３’−Ｏ−修飾ｄＮＴＰの組み込み、切断、連結、および脱保護を使用したポリヌクレオチドの合成を記載しており、第１の工程は、ユニバーサルヌクレオチド、この特定の場合はイノシンと反対側で起こる。この方法は、連結および切断工程の効率を改善するヘルパー鎖を使用する。
【０３７８】
工程１：組み込み
第１の工程は、ＤＮＡポリメラーゼを使用した酵素的組み込みによるオリゴヌクレオチドへの３’−Ｏ−保護一塩基の制御された添加を記載する（図８ａ）。
【０３７９】
材料および方法
材料
１．Ｊｉａｎ  Ｗｕ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２００８のＰｈＤ論文に記載されるプロトコルに従って、３’−Ｏ−修飾ｄＮＴＰを社内で合成した。合成のためのプロトコルはまた、米国特許出願公開：Ｊ．Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｅｆｃａｖｉｔｃｈ，Ｊｕｌｉｅｓｔａ  Ｅ．Ｓｙｌｖｅｓｔｅｒ，Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ−Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｏｌｙｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ  ＵＳ２０１６／０１０８３８２Ａ１にも記載されている。
２．オリゴヌクレオチドを社内で設計し、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。原液を１００μＭの濃度で調製した。オリゴヌクレオチドを図８ｂに示す。
３．３−Ｏ−修飾ｄＮＴＰを組み込む能力が増強された、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓによって操作されたＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼを使用した。
２種類の可逆的ターミネーターを試験した。
【化３４】
2020506687.tif 000037
【０３８０】
方法
１．２μｌの１０×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ（登録商標）緩衝液（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＳＯ４を、０．１％のトリトン（登録商標）Ｘ−１００、ｐＨ８．８、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中の１０．２５μｌの滅菌脱イオン水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）と混合した。
２．０．５μｌの１０μＭプライマー（５ｐｍｏｌ、１当量）（配列番号１０、図８（ｂ）の表）、０．７５μｌの１０μＭ鋳型（６ｐｍｏｌ、１．５当量）（配列番号１１、図８（ｂ）の表）、２μｌの１０μＭのヘルパー鎖（配列番号１２、図８（ｂ）の表）を反応混合物に加えた。
３．３’−Ｏ−修飾−ｄＴＴＰ（２μｌの１００μＭ）およびＭｎＣｌ２（１μｌの４０ｍＭ）を加えた。
４．次に、１．５μｌのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼ（１５Ｕ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を加えた。
５．反応物を６５℃で２０分間インキュベートした。
６．ＴＢＥ−尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）を加えて反応を停止させた。
７．反応物をポリアクリルアミドゲル（１５％）ＴＢＥ緩衝液上で分離し、ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰ撮像システム（ＢｉｏＲａｄ）によって可視化した。
【０３８１】
ゲル電気泳動およびＤＮＡの可視化
１．５μｌの反応混合物を、滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中の５μｌのＴＢＥ−尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）に加え、熱サーモミキサー（エッペンドルフ）を使用して５分間９５℃まで加熱した。
２．次に、５μｌの試料を、予熱した１×ＴＢＥ緩衝液Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（８９ｍＭのトリス、８９ｍＭのホウ酸、および２ｍＭのＥＤＴＡ）を含有する１５％のＴＢＥ−尿素ゲル１．０ｍｍ×１０ウェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のウェルに入れた。
３．Ｘ−ｃｅｌｌ  ｓｕｒｅ  ｌｏｃｋモジュール（Ｎｏｖｅｘ）を適所に固定し、以下の条件、室温で４０分間、２６０Ｖ、９０Ａで電気泳動を行った。
４．ゲルを、Ｃｙ３  ＬＥＤを使用してＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰ（ＢｉｏＲａｄ）によって可視化した。可視化および分析は、Ｉｍａｇｅ  ｌａｂ  ２．０プラットフォーム上で実施した。
【０３８２】
組み込み工程は、上記に記載されるプロトコルに従って研究することができる。
【０３８３】
工程２：切断
第２の工程は、ｈＡＡＧ／Ｅｎｄｏ  ＶＩＩＩまたはｈＡＡＧ／化学塩基（×２）のいずれかによるポリヌクレオチドの二段階切断を記載する（図９ａ）。
【０３８４】
材料および方法
材料
１．実施例２で利用されたオリゴヌクレオチドを社内で設計し、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈによって合成した（配列については図９ｆを参照されたい）。
２．滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）を使用して、オリゴヌクレオチドを１００μＭのストック濃度に希釈した。
【０３８５】
方法
以下の手順を使用して、オリゴヌクレオチド上の切断反応を実施した。
１．ピペット（Ｇｉｌｓｏｎ）を使用して、４１μｌの滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移した。
２．５μｌの１０×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ（登録商標）反応緩衝液ＮＥＢ（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１％のトリトン（登録商標）Ｘ−１００、ｐＨ８．８）を同じエッペンドルフチューブに加えた。
３．各１μｌのオリゴヌクレオチド（図９ｆ）、鋳型（配列番号１３）または任意の蛍光タグ付き長オリゴ鎖、Ｔを有するプライマー（配列番号１４）、対照（配列番号１５）、およびヘルパー鎖（配列番号１６）をすべて５ｐｍｏｌで同じチューブに加えた。
４．１μｌのヒトアルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｈＡＡＧ）ＮＥＢ（１０単位／μｌ）を同じチューブに加えた。
５．代替塩基を使用する反応では、１μｌのヒトアルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｈＡＡＧ）ＮＥＢ（１００単位／μｌ）を加えた。
６．次に、反応混合物をピペットで再懸濁することによって穏やかに混合し、５秒間１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、３７℃で１時間インキュベートした。
７．典型的には、インキュベーション時間が経過した後、酵素的熱不活性化（すなわち、６５℃で２０分間）によって反応を終了させた。
【０３８６】
周囲条件下での精製試料混合物を以下に概説されたプロトコルを使用して精製した。
１．５００μｌの緩衝液ＰＮＩ  ＱＩＡＧＥＮ（５Ｍの塩化グアニジニウム）を試料に加え、ピペットで穏やかに再懸濁することによって混合した。
２．混合物をＱＩＡｑｕｉｃｋスピンカラム（ＱＩＡＧＥＮ）に移し、６０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
３．遠心分離後、フロースルーを廃棄し、７５０μｌの緩衝液ＰＥ  ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５および８０％のエタノール）をスピンカラムに加え、６０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
４．フロースルーを廃棄し、スピンカラムを１３０００ｒｐｍでさらに１分間遠心分離して、残留ＰＥ緩衝液を除去した。
５．次に、スピンカラムを滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに入れた。
６．ＤＮＡ溶出のために、５０μｌの緩衝液ＥＢ  ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス．ＣＬ、ｐＨ８．５）をカラム膜の中央に加え、室温で１分間放置した。
７．次に、チューブを１３０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。溶出したＤＮＡ濃度を測定し、その後の使用のために−２０℃で保存した。
【０３８７】
以下のプロトコルを使用して、精製されたＤＮＡ濃度の測定値を判定した。
１．２μｌの滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）を台座に加えることによって、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ｏｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を平衡化した。
２．平衡化の後、糸くずの出ないレンズ洗浄用ティッシュ（Ｗｈａｔｍａｎ）を使用して、水をやさしく拭き取った。
３．２μｌの緩衝液ＥＢ  ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス．ＣＬ、ｐＨ８．５）を加えることによって、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ｏｎｅをブランクにした。ブランキングの後に、工程２を繰り返した。
４．２μｌの試料を台座に加え、タッチスクリーン上の測定アイコンを選択することによって、ＤＮＡ濃度を測定した。
【０３８８】
以下の手順を使用して、生成された脱塩基部位の切断を実施した。
１．２μｌ（１０〜１００ｎｇ／μｌ）のＤＮＡを滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに加えた。
２．４０μｌ（０．２Ｍ）のＮａＯＨまたは１．５μｌのＥｎｄｏ  ＶＩＩＩ  ＮＥＢ（１０単位／μｌ）および５μｌの１０×反応緩衝液ＮＥＢ（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、７５ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、２５℃でｐＨ８）も同じチューブに加え、再懸濁して１３０００ｒｐｍで５秒間遠心分離することによって穏やかに混合した。
３．得られた混合物を、０．２ＭのＮａＯＨ処理試料について室温で５分間インキュベートし、その間にＥｎｄｏ  ＶＩＩＩ反応混合物を３７℃で１時間インキュベートした。
４．インキュベーション時間が経過した後、反応混合物を上述の精製プロトコルの工程１〜７を使用して精製した。
【０３８９】
以下の手順を使用して、代替の塩基性化学物質を使用して生成された脱塩基部位の切断を実施した。
１．１μｌ（１０〜１００ｎｇ／μｌ）のＤＮＡを滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに加えた。次に、酢酸溶液シグマ（９９．８％）で室温でｐＨ７．４に緩衝化された２μｌのＮ，Ｎ’ジメチルエチレンジアミンシグマ（１００ｍＭ）を同じチューブに加えた。
２．２０μｌの滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）をチューブに加え、再懸濁して１３０００ｒｐｍで５秒間の遠心分離することによって穏やかに混合した。
３．得られた試料を３７℃で２０分間インキュベートした。
４．インキュベーション時間が経過した後、反応混合物を上述の精製プロトコルの工程１〜７を使用して精製した。
【０３９０】
ゲル電気泳動およびＤＮＡの可視化
１．５μｌのＤＮＡおよびＴＢＥ−尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）を滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに加え、熱サーモブロック（エッペンドルフ）を使用して２分間９５℃まで加熱した。
２．次に、ＤＮＡ混合物を、予熱した１×ＴＢＥ緩衝液Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（８９ｍＭのトリス、８９ｍＭのホウ酸、および２ｍＭのＥＤＴＡ）を含有する１５％のＴＢＥ−尿素ゲル１．０ｍｍ×１０ウェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のウェルに入れた。
３．Ｘ−ｃｅｌｌ  ｓｕｒｅ  ｌｏｃｋモジュール（Ｎｏｖｅｘ）を適所に固定し、以下の条件、室温で４０分間、２６０Ｖ、９０Ａで電気泳動を行った。
４．ゲル中のＤＮＡの検出および可視化は、Ｃｙ３  ＬＥＤを使用してＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰ（ＢｉｏＲａｄ）で実施した。可視化および分析は、Ｉｍａｇｅ  ｌａｂ  ２．０プラットフォーム上で実施した。
【０３９１】
結果
ｈＡＡＧ  ＤＮＡグリコシラーゼによるユニバーサルヌクレオチド、この場合はイノシンを含む切断部位での切断効率は、ヘルパー鎖の不在下での１０％からヘルパー鎖の存在下での５０％まで有意に増加した（図９ｂ）。ｈＡＡＧおよびエンドヌクレアーゼＶＩＩＩは、ｈＡＡＧおよびＮａＯＨ（５０％）よりも低い効率（１０％）でイノシンを切断する。ニックの入ったＤＮＡを使用した記載されるシステムでは、０．２ＭのＮａＯＨを使用した化学的切断が、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩよりもＡＰ部位の切断に好ましいことが示された（図９ｃ）。中性ｐＨでの穏やかなＮ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミンは、０．２ＭのＮａＯＨのような脱塩基部位を切断するのに高い効率を有し、それゆえ、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩおよびＮａＯＨと比較して好ましい（図９ｄ〜ｅ）。
【０３９２】
結論
イノシンを含有するＤＮＡの切断について、３つの方法を評価した。１つの完全酵素法−ｈＡＡＧ／エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、ならびに化学的および酵素的切断を組み合わせた２つの方法−ｈＡＡＧ／ＮａＯＨおよびｈＡＡＧ／ジメチルエチルアミンを、実施例２においてＤＮＡ切断について研究した。
【０３９３】
ｈＡＡＧ／ＮａＯＨの結果は、ヘルパー鎖の不在下（１０％）と比較して、ヘルパー鎖の存在下で切断ＤＮＡのはるかに高い収率（５０％）を示した。これらの特定の実施例では、使用される特定の試薬に基づいて、ヘルパー鎖はＤＮＡ切断の収率を増加させる。
【０３９４】
ＮａＯＨに対する代替物としてエンドヌクレアーゼＶＩＩＩを使用した酵素的切断は、ヘルパー鎖の存在下でのＮａＯＨ（５０％）と比較して、効率が悪かった（１０％）。
【０３９５】
代替の穏やかな化学塩基Ｎ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミンを含めると、ＮａＯＨと同じくらい効率的にＡＰ部位の高い切断効率が得られ、１０×ｈＡＡＧ酵素の添加と一緒に、切断ＤＮＡが有意に増加した（図９ｅを参照されたい）。
【０３９６】
工程３：連結
第３の工程は、ヘルパー鎖の存在下でのポリヌクレオチドとＤＮＡリガーゼとの連結を記載する。概略図を図１０ａに示す。
【０３９７】
材料および方法
材料
１．オリゴヌクレオチドを社内で設計し、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈによって合成した（配列については図１０ｄを参照されたい）。
２．滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）を使用して、オリゴヌクレオチドを１００μＭのストック濃度に希釈した。
【０３９８】
方法
以下の手順を使用して、オリゴヌクレオチド上の連結反応を実施した。
１．ピペット（Ｇｉｌｓｏｎ）を使用して、１６μｌの滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移した。
２．次に、１０μｌの２×Ｑｕｉｃｋ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ緩衝液ＮＥＢ（１３２ｍＭのトリス−ＨＣｌ、２０ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのジチオトレイトール、２ｍＭのＡＴＰ、１５％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ６０００）および２５℃でｐＨ７．６）を同じエッペンドルフチューブに加えた。
３．各１μｌのオリゴヌクレオチド（図１０ｄ）、ＴＡＭＲＡまたは任意の蛍光タグ付きリン酸鎖（配列番号１８）、Ｔを有するプライマー（配列番号１９）およびイノシン鎖（配列番号２０）およびヘルパー鎖（配列番号２１）をすべて５ｐｍｏｌで同じチューブに加えた。
４．１μｌのＱｕｉｃｋ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼＮＥＢ（４００単位／μｌ）を同じチューブに加えた。
５．次に、反応混合物をピペットで再懸濁することによって穏やかに混合し、５秒間１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、２０分間室温でインキュベートした。
６．典型的には、インキュベーション時間が経過した後、ＴＢＥ−尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）を加えて反応を終了させた。
７．上記に記載されるような精製工程１〜７に概説されるプロトコルを使用して、反応混合物を精製した。
【０３９９】
以下のプロトコルを使用して、精製されたＤＮＡ濃度の測定値を判定した。
１．２μｌの滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）を台座に加えることによって、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ｏｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を平衡化した。
２．平衡化の後、糸くずの出ないレンズ洗浄用ティッシュ（Ｗｈａｔｍａｎ）を使用して、水をやさしく拭き取った。
３．２μｌの緩衝液ＥＢ  ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス．ＣＬ、ｐＨ８．５）を加えることによって、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ｏｎｅをブランクにした。ブランキングの後に、工程２を繰り返した。
４．２μｌの試料を台座に加え、タッチスクリーン上の測定アイコンを選択することによって、ＤＮＡ濃度を測定した。
５．精製されたＤＮＡをポリアクリルアミドゲルに流し、上記の工程５〜８の手順に従って可視化した。条件または試薬に変更はなかった。
【０４００】
結果および結論
この特定の実施例では、使用される特定の試薬に基づいて、ヘルパー鎖の不在下では連結活性の低下が観察され（図１０ｂ）、ヘルパー鎖の存在下では連結が高い効率で進行し（図１０ｃ）、生産物が高効率で形成された。
【０４０１】
実施例３．ヘルパー鎖によるバージョン２化学
この実施例は、４つの工程：部分二本鎖ＤＮＡ上への３’−Ｏ−修飾ｄＮＴＰの組み込み、切断、連結、および脱保護を使用したポリヌクレオチドの合成を記載しており、組み込みの第１の工程は、ユニバーサルヌクレオチド、この特定の場合はイノシンに隣接して支持鎖中に位置付けられた天然に相補的なヌクレオチドと反対側で起こる。
【０４０２】
工程１：組み込み
材料および方法
材料
第１の工程は、ＤＮＡポリメラーゼによる酵素的組み込みによるオリゴヌクレオチドへの３’−Ｏ−保護一塩基の制御された添加を記載する（図１１ａ）。
１．Ｊｉａｎ  Ｗｕ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２００８のＰｈＤ論文に記載されるプロトコルに従って、３’−Ｏ−修飾ｄＮＴＰを社内で合成した。合成のためのプロトコルはまた、米国特許出願公開：Ｊ．Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｅｆｃａｖｉｔｃｈ，Ｊｕｌｉｅｓｔａ  Ｅ．Ｓｙｌｖｅｓｔｅｒ，Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ−Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｏｌｙｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ  ＵＳ２０１６／０１０８３８２Ａ１にも記載されている。
２．オリゴヌクレオチドを社内で設計し、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手した（図１１ｊ）。原液を１００μＭの濃度で調製する。
３．３−Ｏ−修飾ｄＮＴＰを組み込む能力が増強された、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓによって操作されたＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼを使用した。
すべてのｄＮＴＰの３’−Ｏ−アジドメチル可逆的ターミネーターを、組み込みについて独立して試験した。
【化３５】
2020506687.tif 000038
【０４０３】
方法
１．２μｌの１０×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ（登録商標）緩衝液（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１％のトリトン（登録商標）Ｘ−１００、ｐＨ８．８、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中の１２．２５μｌの滅菌脱イオン水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）と混合した。
２．０．５μｌの１０μＭプライマー（５ｐｍｏｌ、１当量）（配列番号２２、図１１ｊ）および０．７５μｌの１０μＭ鋳型−Ａ／Ｇ／Ｔ／Ｃ（６ｐｍｏｌ、１．５当量）（配列番号２３〜２６、図１１ｊ）および１μＬの１０μＭのヘルパー鎖Ｔ／Ｃ／Ａ／Ｇ（１０ｐｍｏｌ、２当量）（配列番号２７〜３０、図１１ｊ）を反応混合物に加えた。
３．３’−Ｏ修飾−ｄＴＴＰ／ｄＣＴＰ／ｄＡＴＰ／ｄＧＴＰ（２μｌの１００μＭ）およびＭｎＣｌ２（１μｌの４０ｍＭ）を加えた。
４．次に、１．５μｌのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼ（１５Ｕ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を加えた。
５．反応物を６５℃で２０分間インキュベートした。
６．ＴＢＥ−尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）を加えて反応を停止させた。
７．反応物をポリアクリルアミドゲル（１５％）ＴＢＥ緩衝液上で分離し、ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰ撮像システム（ＢｉｏＲａｄ）によって可視化した。
【０４０４】
ゲル電気泳動およびＤＮＡの可視化
１．５μｌの反応混合物を、滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中の５μｌのＴＢＥ−尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）に加え、熱サーモミキサー（エッペンドルフ）を使用して５分間９５℃まで加熱した。
２．次に、５μｌの試料を、予熱した１×ＴＢＥ緩衝液Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（８９ｍＭのトリス、８９ｍＭのホウ酸、および２ｍＭのＥＤＴＡ）を含有する１５％のＴＢＥ−尿素ゲル１．０ｍｍ×１０ウェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のウェルに入れた。
３．Ｘ−ｃｅｌｌ  ｓｕｒｅ  ｌｏｃｋモジュール（Ｎｏｖｅｘ）を適所に固定し、以下の条件、室温で４０分間、２６０Ｖ、９０Ａで電気泳動を行った。
４．ゲルを、Ｃｙ３  ＬＥＤを使用してＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰ（ＢｉｏＲａｄ）によって可視化した。可視化および分析は、Ｉｍａｇｅ  ｌａｂ  ２．０プラットフォーム上で実施した。
【０４０５】
結果および結論
Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼを使用した３−Ｏ−アジドメチル−ｄＴＴＰの組み込み時の温度の評価に関して、結果は、連結のためのヘルパー鎖の存在下での３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＴＴＰの組み込みが５分後に９０％に達することを示す。３７℃および４７℃で２０分後には、１０％のプライマーが未伸長のままである。
【０４０６】
２ｍＭのＭｎ２＋イオンおよび３７℃の温度でのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼは、ヘルパー鎖（前のサイクルによる連結工程からの）の存在下で高い効率でＤＮＡ中の相補的塩基と反対側に３’−Ｏ−修飾−ｄＮＴＰを組み込むための良好な条件を提供する。
【０４０７】
工程２：切断
第２の工程は、エンドヌクレアーゼＶによるポリヌクレオチドの一段階切断を記載する（図１２ａ）。
【０４０８】
材料および方法
材料
１．実施例３で利用されたオリゴヌクレオチドを社内で設計し、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈによって合成した（配列については図１２ｄの表を参照されたい）。
２．滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）を使用して、オリゴヌクレオチドを１００μＭのストック濃度に希釈した。
【０４０９】
方法
以下の手順を使用して、オリゴヌクレオチド上の切断反応を実施した。
１．ピペット（Ｇｉｌｓｏｎ）を使用して、４１μｌの滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移した。
２．次に、５μｌの１０×反応緩衝液（登録商標）ＮＥＢ（５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭのトリス−酢酸、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、１ｍＭのＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．９）を同じエッペンドルフチューブに加えた。
３．各１μｌのオリゴヌクレオチド（図１２ｄ）、鋳型（配列番号３１）または任意の蛍光タグ付き長オリゴ鎖、Ｔを有するプライマー（配列番号３２）および対照（配列番号３３）およびヘルパー鎖（配列番号３４）をすべて５ｐｍｏｌで同じチューブに加えた。
４．１μｌのヒトエンドヌクレアーゼＶ（Ｅｎｄｏ  Ｖ）ＮＥＢ（１０単位／μｌ）を同じチューブに加えた。
５．次に、反応混合物をピペットで再懸濁することによって穏やかに混合し、５秒間１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、３７℃で１時間インキュベートした。
６．典型的には、インキュベーション時間が経過した後、酵素的熱不活性化（すなわち、６５℃で２０分間）によって反応を終了させた。
【０４１０】
試料混合物を以下に概説されたプロトコルを使用して精製した。
１．５００μｌの緩衝液ＰＮＩ  ＱＩＡＧＥＮ（５Ｍの塩化グアニジニウム）を試料に加え、ピペットで穏やかに再懸濁することによって混合した。
２．混合物をＱＩＡｑｕｉｃｋスピンカラム（ＱＩＡＧＥＮ）に移し、６０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
３．遠心分離後、フロースルーを廃棄し、７５０μｌの緩衝液ＰＥ  ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５および８０％のエタノール）をスピンカラムに加え、６０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
４．フロースルーを廃棄し、スピンカラムを１３０００ｒｐｍでさらに１分間遠心分離して、残留ＰＥ緩衝液を除去した。
５．次に、スピンカラムを滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに入れた。
６．ＤＮＡ溶出のために、５０μｌの緩衝液ＥＢ  ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス．ＣＬ、ｐＨ８．５）をカラム膜の中央に加え、室温で１分間放置した。
７．次に、チューブを１３０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。溶出したＤＮＡ濃度を測定し、その後の使用のために−２０℃で保存した。
【０４１１】
以下のプロトコルを使用して、精製されたＤＮＡ濃度の測定値を判定した。
１．２μｌの滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）を台座に加えることによって、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ｏｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を平衡化した。
２．平衡化の後、糸くずの出ないレンズ洗浄用ティッシュ（Ｗｈａｔｍａｎ）を使用して、水をやさしく拭き取った。
３．２μｌの緩衝液ＥＢ  ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス．ＣＬ、ｐＨ８．５）を加えることによって、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ｏｎｅをブランクにした。ブランキングの後に、工程２を繰り返した。
４．２μｌの試料を台座に加え、タッチスクリーン上の測定アイコンを選択することによって、ＤＮＡ濃度を測定した。
【０４１２】
ゲル電気泳動およびＤＮＡの可視化
１．５μｌのＤＮＡおよびＴＢＥ−尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）を滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに加え、熱サーモブロック（エッペンドルフ）を使用して２分間９５℃まで加熱した。
２．次に、ＤＮＡ混合物を、予熱した１×ＴＢＥ緩衝液Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（８９ｍＭのトリス、８９ｍＭのホウ酸、および２ｍＭのＥＤＴＡ）を含有する１５％のＴＢＥ−尿素ゲル１．０ｍｍ×１０ウェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のウェルに入れた。
３．Ｘ−ｃｅｌｌ  ｓｕｒｅ  ｌｏｃｋモジュール（Ｎｏｖｅｘ）を適所に固定し、以下の条件、室温で４０分間、２６０Ｖ、９０Ａで電気泳動を行った。
４．ゲル中のＤＮＡの検出および可視化は、Ｃｙ３  ＬＥＤを使用してＣｈｅｍｉｄｏｃ  ＭＰ（ＢｉｏＲａｄ）で実施した。可視化および分析は、Ｉｍａｇｅ  ｌａｂ  ２．０プラットフォーム上で実施した。
【０４１３】
結果および結論
実施例３からの切断結果は、ヘルパー鎖の存在下または不在下でエンドヌクレアーゼＶを用いて有意に高収率の切断ＤＮＡを得ることができることを示した（図１２ｃ）。
【０４１４】
工程３：連結
第３の工程は、ヘルパー鎖の存在下でのポリヌクレオチドとＤＮＡリガーゼとの連結を記載する。概略図を図１３ａに示す。
【０４１５】
材料および方法
材料
１．実施例３で利用されたオリゴヌクレオチドを社内で設計し、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈによって合成した（配列については図１３ｂの表を参照されたい）。
２．滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）を使用して、オリゴヌクレオチドを１００μＭのストック濃度に希釈した。
【０４１６】
方法
以下の手順を使用して、オリゴヌクレオチド上の連結反応を実施した。
１．ピペット（Ｇｉｌｓｏｎ）を使用して、１６μｌの滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移した。
２．次に、１０μｌの２×Ｑｕｉｃｋ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ緩衝液ＮＥＢ（１３２ｍＭのトリス−ＨＣｌ、２０ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのジチオスレイトール、２ｍＭのＡＴＰ、１５％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ６０００）、２５℃でｐＨ７．６）を同じエッペンドルフチューブに加えた。
３．各１μｌのオリゴヌクレオチド（図１３ｂ）、ＴＡＭＲＡまたは任意の蛍光タグ付きリン酸鎖（配列番号３５）、Ｔを有するプライマー（配列番号３６）およびイノシン鎖（配列番号３７）およびヘルパー鎖（配列番号３８）をすべて５ｐｍｏｌの量を有して同じチューブに加えた。
４．１μｌのＱｕｉｃｋ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼＮＥＢ（４００単位／μｌ）を同じチューブに加えた。
５．次に、反応混合物をピペットで再懸濁することによって穏やかに混合し、５秒間１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、室温で２０分間インキュベートした。
６．典型的には、インキュベーション時間が経過した後、ＴＢＥ−尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）を加えて反応を終了させた。
７．上記に記載されるような精製工程１〜７に概説されるプロトコルを使用して、反応混合物を精製した。
【０４１７】
以下のプロトコルを使用して、精製されたＤＮＡ濃度の測定値を判定した。
１．２μｌの滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）を台座に加えることによって、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ｏｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を平衡化した。
２．平衡化の後、糸くずの出ないレンズ洗浄用ティッシュ（Ｗｈａｔｍａｎ）を使用して、水をやさしく拭き取った。
３．２μｌの緩衝液ＥＢ  ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス．ＣＬ、ｐＨ８．５）を加えることによって、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ｏｎｅをブランクにした。ブランキングの後に、工程２を繰り返した。
４．２μｌの試料を台座に加え、タッチスクリーン上の測定アイコンを選択することによって、ＤＮＡ濃度を測定した。
５．精製されたＤＮＡをポリアクリルアミドゲルに流し、上記に記載される工程５〜８の手順に従って可視化した。条件または試薬に変更はなかった。
【０４１８】
ゲル電気泳動およびＤＮＡの可視化
１．５μｌのＤＮＡおよびＴＢＥ−尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）を滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに加え、熱サーモブロック（エッペンドルフ）を使用して２分間９５℃まで加熱した。
２．次に、ＤＮＡ混合物を、予熱した１×ＴＢＥ緩衝液Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（８９ｍＭのトリス、８９ｍＭのホウ酸、および２ｍＭのＥＤＴＡ）を含有する１５％のＴＢＥ−尿素ゲル１．０ｍｍ×１０ウェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のウェルに入れた。
３．Ｘ−ｃｅｌｌ  ｓｕｒｅ  ｌｏｃｋモジュール（Ｎｏｖｅｘ）を適所に固定し、以下の条件、室温で４０分間、２６０Ｖ、９０Ａで電気泳動を行った。
４．ゲル中のＤＮＡの検出および可視化は、Ｃｙ３  ＬＥＤを使用してＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰ（ＢｉｏＲａｄ）で実施した。可視化および分析は、Ｉｍａｇｅ  ｌａｂ  ２．０プラットフォーム上で実施した。
【０４１９】
工程４：脱保護
Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼによる３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＮＴＰの組み込みによってＤＮＡに導入された３’−Ｏ−アジドメチル基を担持するＤＮＡモデルについて、脱保護工程（図１４ａ）を研究した。脱保護をトリス（カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）によって実施し、すべての天然ｄＮＴＰの混合物を精製された脱保護ＤＮＡの溶液に加えたときの伸長反応によってモニターした。
【０４２０】
材料および方法
材料
１．実施例３で利用されたオリゴヌクレオチドを社内で設計し、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈによって合成した（配列については図１４ｉを参照されたい）。
２．滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）を使用して、オリゴヌクレオチドを１００μＭのストック濃度に希釈した。
３．酵素は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓから購入した。
【０４２１】
方法
１．２μｌの１０×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ（登録商標）緩衝液（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１％のトリトン（登録商標）Ｘ−１００、ｐＨ８．８、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中の１２．２５μｌの滅菌脱イオン水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）で混合した。
２．１μｌの１０μＭプライマー（１０ｐｍｏｌ、１当量）（配列番号３９、図１４ｉ）および１．５μｌのいずれかの１０μＭ鋳型−Ａ／Ｇ／Ｔ／Ｃ（１５ｐｍｏｌ、１．５当量）（配列番号４０〜４３、図１４ｉ）を反応混合物に加えた。
３．３’−Ｏ修飾−ｄＴＴＰ／ｄＣＴＰ／ｄＡＴＰ／ｄＧＴＰ（２μｌの１００μＭ）およびＭｎＣｌ２（１μｌの４０ｍＭ）を加えた。
４．次に、１．５μｌのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼ（１５Ｕ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を加えた。
５．反応物を３７℃で５分間インキュベートした。
６．４μＬの試料を取り出し、０．５μｌの５ｍＭのｄＮＴＰ混合物と混合し、制御反応のために１０分間反応させた。
７．ｐＨ７．４の１Ｍのトリス緩衝液中の４０μＬの５００ｍＭのＴＣＥＰを反応混合物に加え、３７℃で１０分間反応させた。
８．２０μＬの１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ（登録商標）緩衝液によって溶出するＱＩＡＧＥＮヌクレオチド除去キットを使用して、反応混合物を精製した。
９．１μＬの５ｍＭのｄＮＴＰ混合物および１μＬのＤｅｅｐＶｅｎｔ（エキソ）ＤＮＡポリメラーゼを精製された反応混合物に加え、１０分間反応させた。
１０．ＴＢＥ−尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）を加えて反応を停止させた。
１１．反応物をポリアクリルアミドゲル（１５％）ＴＢＥ緩衝液上で分離し、ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰ撮像システム（ＢｉｏＲａｄ）によって可視化した。
【０４２２】
結果および結論
５０ｍＭのＴＣＥＰは、０．２μＭのＤＮＡモデル上で３’−Ｏ−アジドメチル基を高い効率で切断するのに十分ではなかった（図１４ｈ）。対照的に、３００ｍＭのＴＣＥＰは、０．２μＭのＤＮＡモデル上で３’−Ｏ−アジドメチル基を９５％の効率で首尾よく切断した（図１４ｈ）。
【０４２３】
実施例４．二重ヘアピンモデルによるバージョン２化学
この実施例は、２つのヘアピンモデル上での４つの工程：ニック部位からの３’−Ｏ−修飾ｄＮＴＰの組み込み、切断、連結、および脱保護を使用したポリヌクレオチドの合成を記載しており、第１の工程は、ユニバーサルヌクレオチド、この特定の場合はイノシンに隣接する支持鎖中に位置付けられた天然に相補的なヌクレオチドと反対側で起こる。
【０４２４】
工程１：組み込み
第１の工程は、ＤＮＡポリメラーゼによる酵素的組み込みによるオリゴヌクレオチドへの３’−Ｏ−保護一塩基の制御された添加を記載する（図１５ａ）。
【０４２５】
材料および方法
材料
１．Ｊｉａｎ  Ｗｕ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２００８のＰｈＤ論文に記載されるプロトコルに従って、３’−Ｏ−修飾ｄＮＴＰを社内で合成した。合成のためのプロトコルはまた、米国特許出願公開：Ｊ．Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｅｆｃａｖｉｔｃｈ，Ｊｕｌｉｅｓｔａ  Ｅ．Ｓｙｌｖｅｓｔｅｒ，Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ−Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｏｌｙｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ  ＵＳ２０１６／０１０８３８２Ａ１にも記載されている。
２．オリゴヌクレオチドを社内で設計し、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手した（図１５ｃ）。原液を１００μＭの濃度で調製した。
３．３−Ｏ−修飾ｄＮＴＰを組み込む能力が増強された、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓによって操作されたＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼを使用した。
３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＴＴＰを組み込みについて試験した。
３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＴＴＰ：
【化３６】
2020506687.tif 000039
【０４２６】
方法
１．２μｌの１０×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ（登録商標）緩衝液（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＳＯ４を、０．１％のトリトン（登録商標）Ｘ−１００、ｐＨ８．８、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中の１０．２５μｌの滅菌脱イオン水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）と混合した。
２．０．５μｌの１０μＭヘアピンオリゴヌクレオチド（５ｐｍｏｌ、１当量）（配列番号４４、図１５ｃ）を反応混合物に加えた。
３．３’−Ｏ−修飾−ｄＴＴＰ（２μｌの１００μＭ）およびＭｎＣｌ２（１μｌの４０ｍＭ）を加えた。
４．次に、１．５μｌのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼ（１５Ｕ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を加えた。
５．反応物を６５℃で２０分間インキュベートした。
６．ＴＢＥ−尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）を加えて反応を停止させた。
７．反応物をポリアクリルアミドゲル（１５％）ＴＢＥ緩衝液上で分離し、ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰ撮像システム（ＢｉｏＲａｄ）によって可視化した。
【０４２７】
ゲル電気泳動およびＤＮＡの可視化
１．５μｌの反応混合物を滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中の５μｌのＴＢＥ−尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）に加え、熱サーモミキサー（エッペンドルフ）を使用して５分間９５℃まで加熱した。
２．次に、５μｌの試料を、予熱した１×ＴＢＥ緩衝液Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（８９ｍＭのトリス、８９ｍＭのホウ酸、および２ｍＭのＥＤＴＡ）を含有する１５％のＴＢＥ−尿素ゲル１．０ｍｍ×１０ウェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のウェルに入れた。
３．Ｘ−ｃｅｌｌ  ｓｕｒｅ  ｌｏｃｋモジュール（Ｎｏｖｅｘ）を適所に固定し、以下の条件、室温で４０分間、２６０Ｖ、９０Ａで電気泳動を行った。
４．ゲルを、Ｃｙ３  ＬＥＤを使用してＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰ（ＢｉｏＲａｄ）によって可視化した。可視化および分析は、Ｉｍａｇｅ  ｌａｂ  ２．０プラットフォーム上で実施した。
【０４２８】
結果
ＤＮＡポリメラーゼは、ヘアピン構築物中のその天然に相補的な塩基と反対側に３’−Ｏ−修飾−ｄＴＴＰを組み込む。
【０４２９】
工程２：切断
第２の工程は、この特定の場合におけるエンドヌクレアーゼＶによるヘアピンモデルの一段階切断を記載する（図１６ａ）。
【０４３０】
材料および方法
材料
１．実施例４で利用されたオリゴヌクレオチドを社内で設計し、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈによって合成した（配列については図１６ｃを参照されたい）。
２．滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）を使用して、オリゴヌクレオチドを１００μＭのストック濃度に希釈した。
【０４３１】
方法
以下の手順を使用して、ヘアピンオリゴヌクレオチド上の切断反応を実施した。
１．ピペット（Ｇｉｌｓｏｎ）を使用して、４３μｌの滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移した。
２．次に、５μｌの１０×反応緩衝液（登録商標）ＮＥＢ（５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭのトリス−酢酸、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、１ｍＭのＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．９）を同じエッペンドルフチューブに加えた。
３．５ｐｍｏｌの量を有する１μｌのヘアピンオリゴヌクレオチド（配列番号４５、図１６ｃ）を同じチューブに加えた。
４．１μｌのヒトエンドヌクレアーゼＶ（Ｅｎｄｏ  Ｖ）ＮＥＢ（３０単位／μｌ）を同じチューブに加えた。
５．次に、反応混合物をピペットで再懸濁することによって穏やかに混合し、５秒間１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、３７℃で１時間インキュベートした。
６．典型的には、インキュベーション時間が経過した後、酵素的熱不活性化（すなわち、６５℃で２０分間）によって反応を終了させた。
【０４３２】
試料混合物を以下に概説されたプロトコルを使用して精製した。
１．５００μｌの緩衝液ＰＮＩ  ＱＩＡＧＥＮ（５Ｍの塩化グアニジニウム）を試料に加え、ピペットで穏やかに再懸濁することによって混合した。
２．混合物をＱＩＡｑｕｉｃｋスピンカラム（ＱＩＡＧＥＮ）に移し、６０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
３．遠心分離後、フロースルーを廃棄し、７５０μｌの緩衝液ＰＥ  ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５および８０％のエタノール）をスピンカラムに加え、６０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
４．フロースルーを廃棄し、スピンカラムを１３０００ｒｐｍでさらに１分間遠心分離して、残留ＰＥ緩衝液を除去した。
５．次に、スピンカラムを滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに入れた。
６．ＤＮＡ溶出のために、５０μｌの緩衝液ＥＢ  ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス．ＣＬ、ｐＨ８．５）をカラム膜の中央に加え、室温で１分間放置した。
７．次に、チューブを１３０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。溶出したＤＮＡ濃度を測定し、その後の使用のために−２０℃で保存した。
【０４３３】
以下のプロトコルを使用して、精製されたＤＮＡ濃度の測定値を判定した。
１．２μｌの滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）を台座に加えることによって、ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｏｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を平衡化した。
２．平衡化の後、糸くずの出ないレンズ洗浄用ティッシュ（Ｗｈａｔｍａｎ）を使用して、水をやさしく拭き取った。
３．２μｌの緩衝液ＥＢ  ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス．ＣＬ、ｐＨ８．５）を加えることによって、ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｏｎｅをブランクにした。ブランキングの後に、工程２を繰り返した。
４．２μｌの試料を台座に加え、タッチスクリーン上の測定アイコンを選択することによって、ＤＮＡ濃度を測定した。
【０４３４】
ゲル電気泳動およびＤＮＡの可視化
１．５μｌのＤＮＡおよびＴＢＥ−尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）を滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに加え、熱サーモミキサー（エッペンドルフ）を使用して２分間９５℃まで加熱した。
２．次に、ＤＮＡ混合物を、予熱した１×ＴＢＥ緩衝液Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（８９ｍＭのトリス、８９ｍＭのホウ酸、および２ｍＭのＥＤＴＡ）を含有する１５％のＴＢＥ−尿素ゲル１．０ｍｍ×１０ウェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のウェルに入れた。
３．Ｘ−ｃｅｌｌ  ｓｕｒｅ  ｌｏｃｋモジュール（Ｎｏｖｅｘ）を適所に固定し、以下の条件、室温で４０分間、２６０Ｖ、９０Ａで電気泳動を行った。
４．ゲル中のＤＮＡの検出および可視化は、Ｃｙ３  ＬＥＤを使用してＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰ（ＢｉｏＲａｄ）で実施した。可視化および分析は、Ｉｍａｇｅ  ｌａｂ  ２．０プラットフォーム上で実施した。
【０４３５】
結果および結論
実施例４からの切断結果は、エンドヌクレアーゼＶを用いて３７℃で著しく高収率の消化されたヘアピンＤＮＡが得られることを示した（図１６ｂ）。
【０４３６】
工程３：連結
第３の工程は、ヘアピンモデルとＤＮＡリガーゼとの連結を記載する。概略図を図１７ａに示す。
【０４３７】
材料および方法
材料
１．実施例４で利用されたオリゴヌクレオチドを社内で設計し、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈによって合成した（配列については図１７ｃを参照されたい）。
２  滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）を使用して、オリゴヌクレオチドを１００μＭのストック濃度に希釈した。
【０４３８】
方法
以下の手順を使用して、オリゴヌクレオチド上の連結反応を実施した。
１．ピペット（Ｇｉｌｓｏｎ）を使用して、１μｌ（５ｐｍｏｌ）のＴＡＭＲＡまたは任意の蛍光タグ付きリン酸ヘアピンオリゴ（配列番号４６）を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移した。
２．次に、１５μｌ（１００ｐｍｏｌ）のイノシン含有ヘアピン構築物（配列番号４７）を同じチューブに加え、ピペットで３秒間再懸濁することによって穏やかに混合した。
３．４０μｌの平滑／ＴＡ  ＤＮＡリガーゼＮＥＢ（１８０単位／μｌ）を同じチューブに加えた。
４．次に、反応混合物をピペットで再懸濁することによって穏やかに混合し、５秒間１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、室温で２０分間インキュベートした。
５．典型的には、インキュベーション時間が経過した後、ＴＢＥ−尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）を加えて反応を終了させた。
６．上記の精製工程１〜７に概説されたプロトコルを使用して、反応混合物を精製した。
【０４３９】
以下のプロトコルを使用して、精製されたＤＮＡ濃度の測定値を判定した。
１．２μｌの滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）を台座に加えることによって、ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｏｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を平衡化した。
２．平衡化の後、糸くずの出ないレンズ洗浄用ティッシュ（Ｗｈａｔｍａｎ）を使用して、水をやさしく拭き取った。
３．２μｌの緩衝液ＥＢ  ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス．ＣＬ、ｐＨ８．５）を加えることによって、ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｏｎｅをブランクにした。ブランキングの後に、工程２を繰り返した。
４．２μｌの試料を台座に加え、タッチスクリーン上の測定アイコンを選択することによって、ＤＮＡ濃度を測定した。
５．精製されたＤＮＡをポリアクリルアミドゲルに流し、上記に記載されるような工程５〜８の手順に従って可視化した。条件または試薬に変更はなかった。
【０４４０】
ゲル電気泳動およびＤＮＡの可視化
１．５μｌのＤＮＡおよびＴＢＥ−尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）を滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに加え、熱サーモミキサー（エッペンドルフ）を使用して２分間９５℃まで加熱した。
２．次に、ＤＮＡ混合物を、予熱した１×ＴＢＥ緩衝液Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（８９ｍＭのトリス、８９ｍＭのホウ酸、および２ｍＭのＥＤＴＡ）を含有する１５％のＴＢＥ−尿素ゲル１．０ｍｍ×１０ウェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のウェルに入れた。
３．Ｘ−ｃｅｌｌ  ｓｕｒｅ  ｌｏｃｋモジュール（Ｎｏｖｅｘ）を適所に固定し、以下の条件、室温で４０分間、２６０Ｖ、９０Ａで電気泳動を行った。
４．ゲル中のＤＮＡの検出および可視化は、Ｃｙ３  ＬＥＤを使用してＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰ（ＢｉｏＲａｄ）で実施した。可視化および分析は、Ｉｍａｇｅ  ｌａｂ  ２．０プラットフォーム上で実施した。
【０４４１】
結果
ヘルパー鎖の存在下で室温（２４℃）での平滑／ＴＡ  ＤＮＡリガーゼとヘアピンオリゴヌクレオチドとの連結は、高収率の連結生産物をもたらした。１分後の連結ヘアピンオリゴヌクレオチドは、約８５％の比率で、高収率の連結ＤＮＡ生産物を示した。２分後の連結ヘアピンオリゴヌクレオチドは、約８５％の比率で、高収率の連結ＤＮＡ生産物を示した。３分後の連結ヘアピンオリゴヌクレオチドは、約８５％の割合で、高収率の連結ＤＮＡ生産物を示した。４分後の連結ヘアピンオリゴヌクレオチドは、＞約８５％の比率で、高収率の連結ＤＮＡ生産物を示した（図１７ｂ）。
【０４４２】
実施例５．バージョン２化学−二重ヘアピンモデルの完全サイクル。
この実施例は、二重ヘアピンモデル上での４つの工程：ニック部位からの３’−Ｏ−修飾ｄＮＴＰの組み込み、切断、連結、および脱保護を使用したポリヌクレオチドの合成を記載しており、第１の工程は、ユニバーサルヌクレオチド、この特定の場合はイノシンに隣接して支持鎖中に位置付けられた天然に相補的なヌクレオチドと反対側で起こる。ヘアピンの一端は付着アンカーとして機能する。
【０４４３】
本方法は、ＤＮＡポリメラーゼによる酵素的組み込み、その後のイノシン切断、連結、および脱保護によるオリゴヌクレオチドへの３’−Ｏ−保護一塩基の制御された添加によって開始する（図１８ａ）。
【０４４４】
材料および方法
材料
１．Ｊｉａｎ  Ｗｕ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２００８のＰｈＤ論文に記載されるプロトコルに従って、３’−Ｏ−修飾ｄＮＴＰを社内で合成した。合成のためのプロトコルはまた、米国特許出願公開：Ｊ．Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｅｆｃａｖｉｔｃｈ，Ｊｕｌｉｅｓｔａ  Ｅ．Ｓｙｌｖｅｓｔｅｒ，Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ−Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｏｌｙｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ  ＵＳ２０１６／０１０８３８２Ａ１にも記載されている。
２．オリゴヌクレオチドを社内で設計し、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手した（図１８ｃ）。原液を１００μＭの濃度で調製する。
３．３−Ｏ−修飾ｄＮＴＰを組み込む能力が増強された、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓによって操作されたＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼを使用した。
３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＴＴＰを組み込みについて試験した。
３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＴＴＰ：
【化３７】
2020506687.tif 000040
【０４４５】
方法
１．２μｌの１０×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ（登録商標）緩衝液（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１％のトリトン（登録商標）Ｘ−１００、ｐＨ８．８、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中の１２．５μｌの滅菌脱イオン水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）で混合した。
２．２μｌの１０μＭの二重ヘアピンモデルオリゴヌクレオチド（２０ｐｍｏｌ、１当量）（配列番号４８、図１８ｃ）を反応混合物に加えた。
３．３’−Ｏ−修飾−ｄＴＴＰ（２μｌの１００μＭ）およびＭｎＣｌ２（１μｌの４０ｍＭ）を加えた。
４．次に、１．５μｌのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼ（１５Ｕ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を加えた。
５．反応物を３７℃で１０分間インキュベートした。
６．アリコート（５μｌ）を反応混合物から取り出し、０．５μｌの天然ｄＮＴＰ混合物を加え、１０分間反応させた。ゲル電気泳動によって反応物を分析した。
７．精製工程１〜７に概説されたプロトコルを使用して、反応混合物を精製した。
８．２０μｌのＮＥＢ反応緩衝液（登録商標）（５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭのトリス−酢酸、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、１ｍＭのＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．９）によって、ＤＮＡ試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
９．１μｌのヒトエンドヌクレアーゼＶ（Ｅｎｄｏ  Ｖ）ＮＥＢ（３０単位／μｌ）を同じチューブに加えた。
１０．次に、反応混合物をピペットで再懸濁することによって穏やかに混合し、５秒間１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、３７℃で１時間インキュベートした。
１１．インキュベーション時間が経過した後、酵素的熱不活性化（すなわち、６５℃で２０分間）によって反応を終了させた。
１２．アリコート（５μｌ）を反応混合物から取り出し、ＴＢＥ緩衝液を使用してポリアクリルアミドゲル（１５％）上で分析し、ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰ撮像システム（ＢｉｏＲａｄ）によって可視化した。
１３．上記の精製工程１〜７に概説されたプロトコルを使用して、反応混合物を精製した。
１４．２０μｌのＮＥＢ反応緩衝液（登録商標）（５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭのトリス−酢酸、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、１ｍＭのＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．９）によって、ＤＮＡ試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
１５．１０μｌの連結のための１００μＭの鎖（１ｎｍｏｌ）（配列番号４９、図１８ｃ）を反応混合物に加えた。
１６．４０μｌの平滑／ＴＡ  ＤＮＡリガーゼＮＥＢ（１８０単位／μｌ）を精製されたＤＮＡ試料に加えた。
１７．次に、反応混合物をピペットで再懸濁することによって穏やかに混合し、５秒間１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、室温で２０分間インキュベートした。
１８．ｐＨ７．４の１Ｍのトリス緩衝液中の４０μＬの５００ｍＭのＴＣＥＰを反応混合物に加え、３７℃で１０分間反応させた。
１９．２０μＬの１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ（登録商標）緩衝液によって溶出するＱＩＡＧＥＮヌクレオチド除去キットを使用して、反応混合物を精製した。
【０４４６】
ゲル電気泳動およびＤＮＡの可視化
１．５μｌの反応混合物を滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中の５μｌのＴＢＥ−尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）に加え、熱サーモミキサー（エッペンドルフ）を使用して５分間９５℃まで加熱した。
２．次に、５μｌの試料を、予熱した１×ＴＢＥ緩衝液Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（８９ｍＭのトリス、８９ｍＭのホウ酸、および２ｍＭのＥＤＴＡ）を含有する１５％のＴＢＥ−尿素ゲル１．０ｍｍ×１０ウェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のウェルに入れた。
３．Ｘ−ｃｅｌｌ  ｓｕｒｅ  ｌｏｃｋモジュール（Ｎｏｖｅｘ）を適所に固定し、以下の条件、室温で４０分間、２６０Ｖ、９０Ａで電気泳動を行った。
４．ゲルを、Ｃｙ３  ＬＥＤを使用してＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰ（ＢｉｏＲａｄ）によって可視化した。可視化および分析は、Ｉｍａｇｅ  ｌａｂ  ２．０プラットフォーム上で実施した。
【０４４７】
以下のプロトコルを使用して、精製されたＤＮＡ濃度の測定値を判定した。
１．２μｌの滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）を台座に加えることによって、ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｏｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を平衡化した。
２．平衡化の後、糸くずの出ないレンズ洗浄用ティッシュ（Ｗｈａｔｍａｎ）を使用して、水をやさしく拭き取った。
３．２μｌの緩衝液ＥＢ  ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス．ＣＬ、ｐＨ８．５）を加えることによって、ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｏｎｅをブランクにした。ブランキングの後に、工程２を繰り返した。
４．２μｌの試料を台座に加え、タッチスクリーン上の測定アイコンを選択することによって、ＤＮＡ濃度を測定した。
５．精製されたＤＮＡをポリアクリルアミドゲルに流し、第２節の工程５〜８の手順に従って可視化した。条件または試薬に変更はなかった。
【０４４８】
以下に概説されたプロトコルを使用した各工程後に、試料混合物を精製した。
１．５００μｌの緩衝液ＰＮＩ  ＱＩＡＧＥＮ（５Ｍの塩化グアニジニウム）を試料に加え、ピペットで穏やかに再懸濁することによって混合した。
２．混合物をＱＩＡｑｕｉｃｋスピンカラム（ＱＩＡＧＥＮ）に移し、６０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
３．遠心分離後、フロースルーを廃棄し、７５０μｌの緩衝液ＰＥ  ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５および８０％のエタノール）をスピンカラムに加え、６０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
４．フロースルーを廃棄し、スピンカラムを１３０００ｒｐｍでさらに１分間遠心分離して、残留ＰＥ緩衝液を除去した。
５．次に、スピンカラムを滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに入れた。
６．ＤＮＡ溶出のために、反応のための２０μｌの適切な緩衝液をカラム膜の中心に加え、室温で１分間放置した。
７．次に、チューブを１３０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。溶出したＤＮＡ濃度を測定し、その後の使用のために−２０℃で保存した。
【０４４９】
結果
ＤＮＡポリメラーゼは、二重ヘアピン構築物中のその天然に相補的な塩基と反対側に３’−Ｏ−修飾−ｄＴＴＰを組み込む（図１８ｂ）。
【０４５０】
実施例６バージョン２化学−ヘルパー鎖を使用した単一ヘアピンモデルの完全サイクル
この実施例は、単一ヘアピンモデル上での４つの工程：ニック部位からの３’−Ｏ−修飾ｄＮＴＰの組み込み、切断、連結、および脱保護を使用したポリヌクレオチドの合成を記載しており、第１の工程は、天然に相補的な塩基と反対側で起こる。ＤＮＡ合成は、その過程においてヘルパー鎖を使用する。
【０４５１】
本方法は、ＤＮＡポリメラーゼによる酵素的組み込み、その後のイノシン切断、連結、および脱保護によるオリゴヌクレオチドへの３’−Ｏ−保護一塩基の制御された添加によって開始する（図１９ａ）。
【０４５２】
材料および方法
材料
１．Ｊｉａｎ  Ｗｕ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２００８のＰｈＤ論文に記載されるプロトコルに従って、３’−Ｏ−修飾ｄＮＴＰを社内で合成した。合成のためのプロトコルはまた、米国特許出願公開：Ｊ．Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｅｆｃａｖｉｔｃｈ，Ｊｕｌｉｅｓｔａ  Ｅ．Ｓｙｌｖｅｓｔｅｒ，Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ−Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｏｌｙｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ  ＵＳ２０１６／０１０８３８２Ａ１にも記載されている。
２．オリゴヌクレオチドを社内で設計し、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから入手した（図１９ｂ）。原液を１００μＭの濃度で調製する。
３．３−Ｏ−修飾ｄＮＴＰを組み込む能力が増強された、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓによって操作されたＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼを使用した。
３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＴＴＰを組み込みについて試験した。
３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＴＴＰ：
【化３８】
2020506687.tif 000041
【０４５３】
方法
１．２μｌの１０×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ（登録商標）緩衝液（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１％のトリトン（登録商標）Ｘ−１００、ｐＨ８．８、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中の１２．５μｌの滅菌脱イオン水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）で混合した。
２．２μＬの１０μＭの単一ヘアピンモデルオリゴヌクレオチド（２０ｐｍｏｌ、１当量）（配列番号５０、図１９ｂ）およびヘルパー鎖（３０ｐｍｏｌ、１．５当量）（配列番号５１、図１９ｂ）を反応混合物に加えた。
３．３’−Ｏ修飾−ｄＴＴＰ（２μｌの１００μＭ）およびＭｎＣｌ２（１μｌの４０ｍＭ）を加えた。
４．次に、１．５μｌのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼ（１５Ｕ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を加えた。
５．反応物を３７℃で１０分間インキュベートした。
６．アリコート（５μｌ）を反応混合物から取り出し、０．５μｌの天然ｄＮＴＰ混合物を加え、１０分間反応させた。ゲル電気泳動によって反応物を分析した。
７．上記の精製工程１〜７に概説されたプロトコルを使用して、反応混合物を精製した。
８．２０μｌのＮＥＢ反応緩衝液（登録商標）（５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭのトリス−酢酸、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、１ｍＭのＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．９）によって、ＤＮＡ試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
９．１μｌのヒトエンドヌクレアーゼＶ（Ｅｎｄｏ  Ｖ）ＮＥＢ（３０単位／μｌ）を同じチューブに加えた。
１０．次に、反応混合物をピペットで再懸濁することによって穏やかに混合し、５秒間１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、３７℃で１時間インキュベートした。
１１．インキュベーション時間が経過した後、酵素的熱不活性化（すなわち、６５℃で２０分間）によって反応を終了させた。
１２．アリコート（５μｌ）を反応混合物から取り出し、ＴＢＥ緩衝液を使用してポリアクリルアミドゲル（１５％）上で分析し、ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰ撮像システム（ＢｉｏＲａｄ）によって可視化した。
１３．上記の精製工程１〜７に概説されたプロトコルを使用して、反応混合物を精製した。
１４．２０μｌのＮＥＢ反応緩衝液（登録商標）（５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭのトリス−酢酸、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、１ｍＭのＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．９）によって、ＤＮＡ試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
１５．１０μｌの連結のための１００μＭの鎖（１ｎｍｏｌ）（配列番号５２、図１９ｂ）および１０μｌの連結のための１００μＭのヘルパー鎖（１ｎｍｏｌ）（配列番号５３、図１９ｂ）を反応混合物に加えた。
１６．４０μｌの平滑／ＴＡ  ＤＮＡリガーゼＮＥＢ（１８０単位／μｌ）を同じチューブに加えた。
１７．次に、反応混合物をピペットで再懸濁することによって穏やかに混合し、５秒間１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、室温で２０分間インキュベートした。
１８．ｐＨ７．４の１Ｍのトリス緩衝液中の４０μＬの５００ｍＭのＴＣＥＰを反応混合物に加え、３７℃で１０分間反応させた。
１９．２０μＬの１×ＮＥＢ  Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ（登録商標）緩衝液によって溶出するＱＩＡＧＥＮヌクレオチド除去キットを使用して、反応混合物を精製した。
２０．典型的には、インキュベーション時間が経過した後、ＴＢＥ−尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）を加えて反応を終了させた。
【０４５４】
ゲル電気泳動およびＤＮＡの可視化
１．５μｌの反応混合物を、滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中の５μｌのＴＢＥ−尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）に加え、熱サーモミキサー（エッペンドルフ）を使用して５分間９５℃まで加熱した。
２．次に、５μｌの試料を、予熱した１×ＴＢＥ緩衝液Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（８９ｍＭのトリス、８９ｍＭのホウ酸、および２ｍＭのＥＤＴＡ）を含有する１５％のＴＢＥ−尿素ゲル１．０ｍｍ×１０ウェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のウェルに入れた。
３．Ｘ−ｃｅｌｌ  ｓｕｒｅ  ｌｏｃｋモジュール（Ｎｏｖｅｘ）を適所に固定し、以下の条件、室温で４０分間、２６０Ｖ、９０Ａで電気泳動を行った。
４．ゲルを、Ｃｙ３  ＬＥＤを使用してＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰ（ＢｉｏＲａｄ）によって可視化した。可視化および分析は、Ｉｍａｇｅ  ｌａｂ  ２．０プラットフォーム上で実施した。
【０４５５】
以下のプロトコルを使用して、精製されたＤＮＡ濃度の測定値を判定した。
１．２μｌの滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）を台座に加えることによって、ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｏｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を平衡化した。
２．平衡化の後、糸くずの出ないレンズ洗浄用ティッシュ（Ｗｈａｔｍａｎ）を使用して、水をやさしく拭き取った。
３．２μｌの緩衝液ＥＢ  ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス．ＣＬ、ｐＨ８．５）を加えることによって、ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｏｎｅをブランクにした。ブランキングの後に、工程２を繰り返した。
４．２μｌの試料を台座に加え、タッチスクリーン上の測定アイコンを選択することによって、ＤＮＡ濃度を測定した。
５．精製されたＤＮＡをポリアクリルアミドゲルに流し、工程５〜８において上記した手順に従って可視化した。条件または試薬に変更はなかった。
【０４５６】
以下に概説されたプロトコルを使用した各工程後に、試料混合物を精製した。
１．５００μｌの緩衝液ＰＮＩ  ＱＩＡＧＥＮ（５Ｍの塩化グアニジニウム）を試料に加え、ピペットで穏やかに再懸濁することによって混合した。
２．混合物をＱＩＡｑｕｉｃｋスピンカラム（ＱＩＡＧＥＮ）に移し、６０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
３．遠心分離後、フロースルーを廃棄し、７５０μｌの緩衝液ＰＥ  ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５および８０％のエタノール）をスピンカラムに加え、６０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
４．フロースルーを廃棄し、スピンカラムを１３０００ｒｐｍでさらに１分間遠心分離して、残留ＰＥ緩衝液を除去した。
５．次に、スピンカラムを滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに入れた。
６．ＤＮＡ溶出のために、反応のための２０μｌの適切な緩衝液をカラム膜の中央に加え、室温で１分間放置した。
７．次に、チューブを１３０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。溶出したＤＮＡ濃度を測定し、その後の使用のために−２０℃で保存した。
【０４５７】
実施例７．バージョン３化学−二重ヘアピンモデルの完全サイクル。
この実施例は、二重ヘアピン構築物モデルについての４つの工程：ニック部位からの３’−Ｏ−修飾ｄＮＴＰの組み込み、切断、連結、および脱保護を使用したポリヌクレオチドの合成を記載しており、第１の工程は、ユニバーサルヌクレオチド、この特定の場合はイノシン塩基と反対側で起こる。
【０４５８】
この方法は、ＤＮＡポリメラーゼによる酵素的組み込み、その後のイノシン切断、連結、および脱保護によるオリゴヌクレオチドへの３’−Ｏ−保護一塩基の制御された添加によって開始する（図２０ａ）。
【０４５９】
材料および方法
材料
１．Ｊｉａｎ  Ｗｕ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２００８のＰｈＤ論文に記載されるプロトコルに従って、３’−Ｏ−修飾ｄＮＴＰを社内で合成した。合成のためのプロトコルはまた、米国特許出願公開：Ｊ．Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｅｆｃａｖｉｔｃｈ，Ｊｕｌｉｅｓｔａ  Ｅ．Ｓｙｌｖｅｓｔｅｒ，Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ−Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｏｌｙｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ  ＵＳ２０１６／０１０８３８２Ａ１にも記載されている。
２．オリゴヌクレオチドを社内で設計し、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手した（図２０ｂ）。原液を１００μＭの濃度で調製する。
３．Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓによって操作されたＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼは、３−Ｏ−修飾ｄＮＴＰを組み込む能力を高めた。
３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＴＴＰを組み込みについて試験した。
３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＴＴＰ：
【化３９】
2020506687.tif 000042
【０４６０】
方法
１．２μｌの１０×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ（登録商標）緩衝液（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１％のトリトン（登録商標）Ｘ−１００、ｐＨ８．８、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中の１２．５μｌの滅菌脱イオン水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）で混合した。
２．２μｌの１０μＭの二重ヘアピンモデルオリゴヌクレオチド（２０ｐｍｏｌ、１当量）（配列番号５４、図２０ｂ）を反応混合物に加えた。
３．３’−Ｏ−修飾−ｄＴＴＰ（２μｌの１００μＭ）およびＭｎＣｌ２（１μｌの４０ｍＭ）を加えた。
４．次に、１．５μｌのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼ（１５Ｕ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を加えた。
５．反応物を３７℃で１０分間インキュベートした。
６．アリコート（５μｌ）を反応混合物から取り出し、０．５μｌの天然ｄＮＴＰ混合物を加え、１０分間反応させた。ゲル電気泳動によって反応物を分析した。
７．精製工程１〜７に概説されたプロトコルを使用して、反応混合物を精製した。
８．２０μｌのＮＥＢ反応緩衝液（登録商標）（５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭのトリス−酢酸、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、１ｍＭのＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．９）によって、ＤＮＡ試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
９．１μｌのヒトエンドヌクレアーゼＶ（Ｅｎｄｏ  Ｖ）ＮＥＢ（３０単位／μｌ）を同じチューブに加えた。
１０．次に、反応混合物をピペットで再懸濁することによって穏やかに混合し、５秒間１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、３７℃で１時間インキュベートした。
１１．インキュベーション時間が経過した後、酵素的熱不活性化（すなわち、６５℃で２０分間）によって反応を終了させた。
１２．アリコート（５μｌ）を反応混合物から取り出し、ＴＢＥ緩衝液を使用してポリアクリルアミドゲル（１５％）上で分析し、ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰ撮像システム（ＢｉｏＲａｄ）によって可視化した。
１３．上記の精製工程１〜７に概説されたプロトコルを使用して、反応混合物を精製した。
１４．２０μｌのＮＥＢ反応緩衝液（登録商標）（５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭのトリス−酢酸、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、１ｍＭのＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．９）によって、ＤＮＡ試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
１５．１０μｌの連結のための１００μＭの鎖（１ｎｍｏｌ）（配列番号５５、図２０ｂ）を反応混合物に加えた。
１６．４０μｌの平滑／ＴＡ  ＤＮＡリガーゼＮＥＢ（１８０単位／μｌ）を同じチューブに加えた。
１７．次に、反応混合物をピペットで再懸濁することによって穏やかに混合し、５秒間１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、室温で２０分間インキュベートした。
１８．ｐＨ７．４の１Ｍのトリス緩衝液中の４０μＬの５００ｍＭのＴＣＥＰを反応混合物に加え、３７℃で１０分間反応させた。
１９．２０μＬの１×ＮＥＢ  Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ（登録商標）緩衝液によって溶出するＱＩＡＧＥＮヌクレオチド除去キットを使用して、反応混合物を精製した。
２０．典型的には、インキュベーション時間が経過した後、ＴＢＥ−尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）を加えて反応を終了させた。
【０４６１】
ゲル電気泳動およびＤＮＡの可視化
１．５μｌの反応混合物を滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中の５μｌのＴＢＥ−尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）に加え、熱サーモミキサー（エッペンドルフ）を使用して５分間９５℃まで加熱した。
２．次に、５μｌの試料を、予熱した１×ＴＢＥ緩衝液Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（８９ｍＭのトリス、８９ｍＭのホウ酸、および２ｍＭのＥＤＴＡ）を含有する１５％のＴＢＥ−尿素ゲル１．０ｍｍ×１０ウェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のウェルに入れた。
３．Ｘ−ｃｅｌｌ  ｓｕｒｅ  ｌｏｃｋモジュール（Ｎｏｖｅｘ）を適所に固定し、以下の条件、室温で４０分間、２６０Ｖ、９０Ａで電気泳動を行った。
４．ゲルを、Ｃｙ３  ＬＥＤを使用してＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰ（ＢｉｏＲａｄ）によって可視化した。可視化および分析は、Ｉｍａｇｅ  ｌａｂ  ２．０プラットフォーム上で実施した。
【０４６２】
以下のプロトコルを使用して、精製されたＤＮＡ濃度の測定値を判定した。
１．２μｌの滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）を台座に加えることによって、ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｏｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を平衡化した。
２．平衡化の後、糸くずの出ないレンズ洗浄用ティッシュ（Ｗｈａｔｍａｎ）を使用して、水をやさしく拭き取った。
３．２μｌの緩衝液ＥＢ  ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス．ＣＬ、ｐＨ８．５）を加えることによって、ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｏｎｅをブランクにした。次に、ブランキングの後に、工程２を繰り返した。
４．２μｌの試料を台座に加え、タッチスクリーン上の測定アイコンを選択することによって、ＤＮＡ濃度を測定した。
５．精製されたＤＮＡをポリアクリルアミドゲルに流し、第２節の工程５〜８の手順に従って可視化した。条件または試薬に変更はなかった。
【０４６３】
以下に概説されたプロトコルを使用した各工程後に、試料混合物を精製した。
１．５００μｌの緩衝液ＰＮＩ  ＱＩＡＧＥＮ（５Ｍの塩化グアニジニウム）を試料に加え、ピペットで穏やかに再懸濁することによって混合した。
２．混合物をＱＩＡｑｕｉｃｋスピンカラム（ＱＩＡＧＥＮ）に移し、６０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
３．遠心分離後、フロースルーを廃棄し、７５０μｌの緩衝液ＰＥ  ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５および８０％のエタノール）をスピンカラムに加え、６０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
４．フロースルーを廃棄し、スピンカラムを１３０００ｒｐｍでさらに１分間遠心分離して、残留ＰＥ緩衝液を除去した。
５．次に、スピンカラムを滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに入れた。
６．ＤＮＡ溶出のために、反応のための２０μｌの適切な緩衝液をカラム膜の中心に加え、室温で１分間放置した。
７．次に、チューブを１３０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。溶出したＤＮＡ濃度を測定し、その後の使用のために−２０℃で保存した。
【０４６４】
実施例８バージョン２化学−二重ヘアピンモデルについての完全な２サイクル実験
この実施例は、二重ヘアピンモデル上で４つの工程：ニック部位からの３’−Ｏ−修飾ｄＮＴＰの組み込み、脱保護、切断、および連結を使用したポリヌクレオチドの合成のための完全な２サイクル実験を記載しており、第１の工程は、相補的塩基と反対側で起こる。
【０４６５】
本方法は、図２１ａに示される第１のサイクルの反応概略に図示されるように、ＤＮＡポリメラーゼによる酵素的組み込み、その後の脱保護、イノシン切断、および連結によるオリゴヌクレオチドへの３’−Ｏ−保護一塩基の制御された添加によって開始する。図２１ｂは、第２のサイクルのための反応概略を示す。
【０４６６】
材料および方法
材料
１．Ｊｉａｎ  Ｗｕ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２００８のＰｈＤ論文に記載されるプロトコルに従って、３’−Ｏ−修飾ｄＮＴＰを社内で合成した。合成のためのプロトコルはまた、米国特許出願公開：Ｊ．Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｅｆｃａｖｉｔｃｈ，Ｊｕｌｉｅｓｔａ  Ｅ．Ｓｙｌｖｅｓｔｅｒ，Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ−Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｏｌｙｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ  ＵＳ２０１６／０１０８３８２Ａ１にも記載されている。
２．オリゴヌクレオチドを社内で設計し、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手した（図２１ｄ）。原液を１００μＭの濃度で調製する。
３．Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓによって操作されたＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼは、３’−Ｏ−修飾ｄＮＴＰを組み込む能力を高めた。
３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＴＴＰおよび３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＣＴＰを組み込みのために使用した。
【化４０】
2020506687.tif 000043
【０４６７】
方法
第１のサイクル：
１．２μｌの１０×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ（登録商標）緩衝液（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１％のトリトン（登録商標）Ｘ−１００、ｐＨ８．８、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中の１２．５μｌの滅菌脱イオン水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）で混合した。
２．２μｌの１０μＭの二重ヘアピンモデルオリゴヌクレオチド（２０ｐｍｏｌ、１当量）（配列番号５６、図２１ｄ）を反応混合物に加えた。
３．３’−Ｏ−修飾−ｄＴＴＰ（２μｌの１００μＭ）およびＭｎＣｌ２（１μｌの４０ｍＭ）を加えた。
４．次に、１．５μｌのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼ（１５Ｕ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を加えた。
５．反応物を３７℃で１０分間インキュベートした。
６．アリコート（５μｌ）を反応混合物から取り出し、０．５μｌの天然ｄＮＴＰ混合物を加え、１０分間反応させた。ゲル電気泳動によって反応物を分析した。
７．ｐＨ＝７．４の１Ｍのトリス緩衝液中の４０μｌの５００ｍＭのＴＣＥＰを反応混合物に加え、３７℃で１０分間反応させた。
８．精製工程１〜７に概説されたプロトコルを使用して、反応混合物を精製した。
９．２０μｌのＮＥＢ反応緩衝液（登録商標）（５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭのトリス−酢酸、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、１ｍＭのＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．９）によって、ＤＮＡ試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
１０．１μｌのヒトエンドヌクレアーゼＶ（Ｅｎｄｏ  Ｖ）ＮＥＢ（３０単位／μｌ）を同じチューブに加えた。
１１．次に、反応混合物をピペットで再懸濁することによって穏やかに混合し、５秒間１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、３７℃で１時間インキュベートした。
１２．インキュベーション時間が経過した後、酵素的熱不活性化（すなわち、６５℃で２０分間）によって反応を終了させた。
１３．アリコート（５μｌ）を反応混合物から取り出し、ＴＢＥ緩衝液を使用してポリアクリルアミドゲル（１５％）上で分析し、ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰ撮像システム（ＢｉｏＲａｄ）によって可視化した。
１４．精製工程１〜７に概説されたプロトコルを使用して、ＱＩＡＧＥＮヌクレオチド除去キットによって、反応混合物を精製した。
１５．２０μｌのＮＥＢ反応緩衝液（登録商標）（５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭのトリス−酢酸、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、１ｍＭのＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．９）によって、ＤＮＡ試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
１６．１０μｌの連結のための１００μＭの鎖（１ｎｍｏｌ）（配列番号５７、図２１ｄ）を反応混合物に加えた。
１７．４０μｌの平滑／ＴＡ  ＤＮＡリガーゼＮＥＢ（１８０単位／μｌ）を同じチューブに加えた。
１８．次に、反応混合物をピペットで再懸濁することによって穏やかに混合し、５秒間１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、室温で２０分間インキュベートした。
１９．精製工程１〜５に概説されたプロトコルを使用して、ストレプトアビジン磁気ビーズキットによって、反応混合物を精製した。
２０．非連結オリゴヌクレオチドをラムダエキソヌクレアーゼによって消化した。
２１．精製工程１〜７に概説されたプロトコルを使用して、ＱＩＡＧＥＮヌクレオチド除去キットによって、反応混合物を精製した。
２２．２０μｌのＮＥＢ反応緩衝液（登録商標）（５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭのトリス−酢酸、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、１ｍＭのＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．９）によって、ＤＮＡ試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
第２のサイクル：
２３．３’−Ｏ−修飾−ｄＣＴＰ（２μｌの１００μＭ）およびＭｎＣｌ２（１μｌの４０ｍＭ）を加えた。
２４．次に、１．５μｌのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＸ  ＤＮＡポリメラーゼ（１５Ｕ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を加えた。
２５．反応物を３７℃で１０分間インキュベートした。
２６．アリコート（５μｌ）を反応混合物から取り出し、０．５μｌの天然ｄＮＴＰ混合物を加え、１０分間反応させた。ゲル電気泳動によって反応物を分析した。
２７．ｐＨ＝７．４の１Ｍのトリス緩衝液中の４０μｌの５００ｍＭのＴＣＥＰを反応混合物に加え、３７℃で１０分間反応させた。
２８．精製工程１〜７に概説されたプロトコルを使用して、反応混合物を精製した。
２９．２０μｌのＮＥＢ反応緩衝液（登録商標）（５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭのトリス−酢酸、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、１ｍＭのＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．９）によって、ＤＮＡ試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
３０．１μｌのヒトエンドヌクレアーゼＶ（Ｅｎｄｏ  Ｖ）ＮＥＢ（３０単位／μｌ）を同じチューブに加えた。
３１．次に、反応混合物をピペットで再懸濁することによって穏やかに混合し、５秒間１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、３７℃で１時間インキュベートした。
３２．インキュベーション時間が経過した後、酵素的熱不活性化（すなわち、６５℃で２０分間）によって反応を終了させた。
３３．アリコート（５μｌ）を反応混合物から取り出し、ＴＢＥ緩衝液を使用してポリアクリルアミドゲル（１５％）上で分析し、ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰ撮像システム（ＢｉｏＲａｄ）によって可視化した。
３４．精製工程１〜７に概説されたプロトコルを使用して、反応混合物を精製した。
３５．２０μｌのＮＥＢ反応緩衝液（登録商標）（５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭのトリス−酢酸、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、１ｍＭのＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．９）によって、ＤＮＡ試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
３６．１０μｌの連結のための１００μＭの鎖（１ｎｍｏｌ）（配列番号５８、図２１ｄ）を反応混合物に加えた。
３７．４０μｌの平滑／ＴＡ  ＤＮＡリガーゼＮＥＢ（１８０単位／μｌ）を同じチューブに加えた。
３８．次に、反応混合物をピペットで再懸濁することによって穏やかに混合し、５秒間１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、室温で１０分間インキュベートした。
３９．インキュベーション時間が経過した後、ＴＢＥ−尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）を加えて反応を終了させた。
【０４６８】
ゲル電気泳動およびＤＮＡの可視化
１．５μｌの反応混合物を、滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中の５μｌのＴＢＥ−尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）に加え、熱サーモミキサー（エッペンドルフ）を使用して５分間９５℃まで加熱した。
２．次に、５μｌの試料を、予熱した１×ＴＢＥ緩衝液Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（８９ｍＭのトリス、８９ｍＭのホウ酸、および２ｍＭのＥＤＴＡ）を含有する１５％のＴＢＥ−尿素ゲル１．０ｍｍ×１０ウェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のウェルに入れた。
３．Ｘ−ｃｅｌｌ  ｓｕｒｅ  ｌｏｃｋモジュール（Ｎｏｖｅｘ）を適所に固定し、以下の条件、室温で４０分間、２６０Ｖ、９０Ａを適用することによって、電気泳動に供した。
４．ゲルを、Ｃｙ３  ＬＥＤを使用してＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰ（ＢｉｏＲａｄ）によって可視化した。可視化および分析は、Ｉｍａｇｅ  ｌａｂ  ２．０プラットフォーム上で実施した。
【０４６９】
以下のプロトコルを使用して、精製されたＤＮＡ濃度の測定値を判定した。
１．２μｌの滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）を台座に加えることによって、ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｏｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を平衡化した。
２．平衡化の後、糸くずの出ないレンズ洗浄用ティッシュ（Ｗｈａｔｍａｎ）を使用して、水をやさしく拭き取った。
３．２μｌの緩衝液ＥＢ  ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス．ＣＬ、ｐＨ８．５）を加えることによって、ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｏｎｅをブランクにした。ブランキングの後に、工程２を繰り返した。
４．２μｌの試料を台座に加え、タッチスクリーン上の測定アイコンを選択することによって、ＤＮＡ濃度を測定した。
【０４７０】
以下に概説されたプロトコルを使用して、ＱＩＡＧＥＮヌクレオチド除去キットによって、試料混合物を精製した。
１．５００μｌの緩衝液ＰＮＩ  ＱＩＡＧＥＮ（５Ｍの塩化グアニジニウム）を試料に加え、ピペットで穏やかに再懸濁することによって混合した。
２．混合物をＱＩＡｑｕｉｃｋスピンカラム（ＱＩＡＧＥＮ）に移し、６０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
３．遠心分離後、フロースルーを廃棄し、７５０μｌの緩衝液ＰＥ  ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５および８０％のエタノール）をスピンカラムに加え、６０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
４．フロースルーを廃棄し、スピンカラムを１３０００ｒｐｍでさらに１分間遠心分離して、残留ＰＥ緩衝液を除去した。
５．次に、スピンカラムを滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに入れた。
６．ＤＮＡ溶出のために、反応のための２０μｌの適切な緩衝液をカラム膜の中心に加え、室温で１分間放置した。
７．次に、チューブを１３０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
【０４７１】
連結工程の後に、ストレプトアビジン磁気ビーズを使用して、以下に概説されたプロトコルを介して、試料混合物を精製した。
１．２００μｌの結合緩衝液（２０ｍＭのトリス、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ＝７．４）によって、１００μｌのストレプトアビジン磁気ビーズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を３回洗浄した。
２．連結工程後の反応混合物を１０容量の結合緩衝液（２０ｍＭのトリス、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ＝７．４）と混合し、ストレプトアビジン磁気ビーズと共に２０℃で１５分間インキュベートする。
３．２００μｌの結合緩衝液（２０ｍＭのトリス、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ＝７．４）によって、ストレプトアビジン磁気ビーズを３回洗浄した。
４．脱イオン水によって、ストレプトアビジン磁気ビーズを３回洗浄した。
５．９５℃で３分間加熱することによる４０μｌの脱イオン水によって、オリゴヌクレオチドを溶出した。
【０４７２】
図２１ｃに示される結果は、本発明の例示的な方法を使用した２つの完全な合成サイクルの実行を実証している。
【０４７３】
実施例９．バージョン２化学−単一ヘアピンモデル上での完全な３サイクル実験。
この実施例は、二重ヘアピンモデル上での５つの工程：ニック部位からの３’−Ｏ−修飾ｄＮＴＰの組み込み、脱保護、切断、連結、および変性工程を使用したポリヌクレオチドの合成のための完全な３サイクル実験を記載しており、第１の工程は、相補的塩基と反対側で起こる。
【０４７４】
方法の例示的な概略図を図２６、２７、および２８に示す。
【０４７５】
本方法は、ＤＮＡポリメラーゼによる酵素的組み込み、その後の脱保護、切断、連結、およびヘルパー鎖の変性によるオリゴヌクレオチドへの３’−Ｏ−保護一塩基の制御された添加によって開始する。図２６は、酵素的組み込み、脱保護、切断、連結、および変性工程を伴う第１の完全サイクルを示す。この実施例では、オリゴヌクレオチドはＴヌクレオチドだけ伸長されている。図２７は、酵素的組み込み、脱保護、切断、連結工程、および変性工程を伴う第１のサイクルに続く第２の完全サイクルを示す。この実施例では、オリゴヌクレオチドはＴヌクレオチドだけ伸長されている。図２８は、酵素的組み込み、脱保護、切断、連結、および変性工程を伴う第２のサイクルに続く第３の完全サイクルを示す。この実施例では、オリゴヌクレオチドはＴヌクレオチドだけ伸長されている。
【０４７６】
材料および方法
材料
１．Ｊｉａｎ  Ｗｕ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２００８のＰｈＤ論文に記載されるプロトコルに従って、３’−Ｏ−修飾ｄＮＴＰを社内で合成した。合成のためのプロトコルはまた、米国特許出願公開：Ｊ．Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｅｆｃａｖｉｔｃｈ，Ｊｕｌｉｅｓｔａ  Ｅ．Ｓｙｌｖｅｓｔｅｒ，Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ−Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｏｌｙｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ  ＵＳ２０１６／０１０８３８２Ａ１にも記載されている。
２．オリゴヌクレオチドを社内で設計し、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手した（図２９）。原液を１００μＭの濃度で調製する。
３．３−Ｏ−修飾ｄＮＴＰを組み込む能力が増強された、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓによって操作されたＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｘ  ＤＮＡポリメラーゼを使用した。代替的に、任意のＤＮＡポリメラーゼまたは修飾ｄＮＴＰを組み込むことができる他の酵素を使用することができる。
３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＴＴＰを組み込みのために使用した。
【化４１】
2020506687.tif 000044
【０４７７】
方法
第１のサイクル：
１．２０μｌの１０×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ（登録商標）緩衝液（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１％のトリトン（登録商標）Ｘ−１００、ｐＨ８．８、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）およびＭｎＣｌ２溶液（１０μｌの４０ｍＭ）を、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中の１３９μｌの滅菌脱イオン水（ＥＬＧＡ  ＶＥＯＬＩＡ）と混合した。
２．２０μｌの１００μＭの単一ヘアピンモデルオリゴヌクレオチド（２ｎｍｏｌ、１当量）（配列番号５９、図２９）を反応混合物に加えた。
３．アリコート（４μｌ）を反応混合物から取り出し、０．５μｌの天然ｄＮＴＰ混合物（４ｍＭ）および０．５μｌのＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼならびに０．５μｌのＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼＩＶを追加し、１０分間反応させた。ゲル電気泳動によって反応物を分析した。
４．３’−Ｏ−修飾−ｄＴＴＰ（１０μｌの２ｍＭ）を加えた。
５．次に、５μｌのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（５０Ｕ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を加えた。しかしながら、修飾ｄＮＴＰを組み込むことができる任意のＤＮＡポリメラーゼまたは他の酵素を使用することができる。
６．反応物を３７℃で３０分間インキュベートした。
７．精製工程６６〜７２に概説されたＱＩＡＧＥＮヌクレオチド除去キットを使用して、反応混合物を精製した。
８．２００μｌのＴＥ緩衝液によって、ＤＮＡ試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
９．アリコート（４μｌ）を反応混合物から取り出し、０．５μｌの天然ｄＮＴＰ混合物（４ｍＭ）および０．５μｌのＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼならびに０．５μｌのＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼＩＶを追加し、１０分間反応させた。ゲル電気泳動によって反応物を分析した。
１０．４００μＬの５００ｍＭのＴＣＥＰを反応混合物に加え、３７℃で１０分間反応させた。
１１．精製工程６６〜７２に概説されたＱＩＡＧＥＮヌクレオチド除去キットを使用して、反応混合物を精製した。
１２．１５０μｌのＮＥＢ反応緩衝液（登録商標）（５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭのトリス−酢酸、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、１ｍＭのＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．９）によって、ＤＮＡ試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
１３．アリコート（４μｌ）を反応混合物から取り出し、０．５μｌの天然ｄＮＴＰ混合物（４ｍＭ）および０．５μｌのＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼならびに０．５μｌのＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼＩＶを追加し、１０分間反応させた。ゲル電気泳動によって反応物を分析した。
１４．５μｌのヒトエンドヌクレアーゼＶ（Ｅｎｄｏ  Ｖ）ＮＥＢ（３０単位／μｌ）を溶出液に加え、３７℃で３０分間インキュベートした。任意の好適な代替エンドヌクレアーゼを使用することができる。
１５．インキュベーション時間が経過した後、酵素的熱不活性化（すなわち、６５℃で２０分間）によって反応を終了させた。
１６．アリコート（５μｌ）を反応混合物から取り出し、ポリアクリルアミドゲル上で分析した。
１７．精製工程６６〜７２に概説されたプロトコルを使用して、ＱＩＡＧＥＮヌクレオチド除去キットによって、反応混合物を精製した。
１８．１００μｌのＴ３  ＤＮＡリガーゼ緩衝液（２倍濃縮物）によって、ＤＮＡ試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
１９．２０μｌの連結のための１００μＭのイノシン鎖（２ｎｍｏｌ）および２０μｌの連結のための１００μＭのヘルパー鎖（２ｎｍｏｌ）（配列番号６０、５１、図２９）、ならびに４０μｌの水を反応物に加えた。
２０．２０μｌのＴ３  ＤＮＡリガーゼＮＥＢ（３０００単位／μｌ）を同じチューブに加え（これは任意のＤＮＡ連結酵素を含み得る）、室温で３０分間インキュベートした。
精製工程７３〜７８に概説された変性工程を含むストレプトアビジン磁気ビーズキットのためのプロトコルを使用して、反応混合物を精製した。
２１．精製工程６６〜７２に概説されたＱＩＡＧＥＮヌクレオチド除去キットのためのプロトコルを使用して、反応混合物を精製した。
２２．１００μｌのＴＥ緩衝液によって、ＤＮＡ試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
第２のサイクル：
２３．１５μｌの１０×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ（登録商標）緩衝液（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１％のトリトン（登録商標）Ｘ−１００、ｐＨ８．８、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、ＭｎＣｌ２溶液（７．５μｌの４０ｍＭ）、および１９μｌの脱イオン水を加えた。
２４．アリコート（４μｌ）を反応混合物から取り出し、０．５μｌの天然ｄＮＴＰ混合物（４ｍＭ）および０．５μｌのＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼならびに０．５μｌのＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼＩＶを加え、１０分間反応させた。ゲル電気泳動によって反応物を分析した。
２５．３’−Ｏ−修飾−ｄＴＴＰ（７．５μｌの２ｍＭ）を加えた。
２６．次に、５μｌのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（５０Ｕ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を加えた。修飾ｄＮＴＰを組み込むことができる任意のＤＮＡポリメラーゼを使用することができる。
２７．反応物を３７℃で３０分間インキュベートした。
２８．精製工程６６〜７２に概説されたＱＩＡＧＥＮヌクレオチド除去キットを使用して、反応混合物を精製した。
２９．１００μｌのＴＥ緩衝液によって、ＤＮＡ試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
３０．アリコート（４μｌ）を反応混合物から取り出し、０．５μｌの天然ｄＮＴＰ混合物（４ｍＭ）および０．５μｌのＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼならびに０．５μｌのＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼＩＶを加え、１０分間反応させた。ゲル電気泳動によって反応物を分析した。
３１．２００μＬの５００ｍＭのＴＣＥＰを反応混合物に加え、３７℃で１０分間反応させた。
３２．精製工程６６〜７２に概説されたＱＩＡＧＥＮヌクレオチド除去キットを使用して、反応混合物を精製した。
３３．１００μｌのＮＥＢ反応緩衝液（登録商標）（５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭのトリス−酢酸、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、１ｍＭのＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．９）によって、ＤＮＡ試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
３４．アリコート（４μｌ）を反応混合物から取り出し、０．５μｌの天然ｄＮＴＰ混合物（４ｍＭ）および０．５μｌのＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼならびに０．５μｌのＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼＩＶを追加し、１０分間反応させた。ゲル電気泳動によって反応物を分析した。
３５．５μｌのヒトエンドヌクレアーゼＶ（Ｅｎｄｏ  Ｖ）ＮＥＢ（３０単位／μｌ）を溶出液に加え、３７℃で３０分間インキュベートした。任意の好適な代替エンドヌクレアーゼを使用することができる。
３６．インキュベーション時間が経過した後、酵素的熱不活性化（すなわち、６５℃で２０分間）によって反応を終了させた。
３７．アリコート（５μｌ）を反応混合物から取り出し、ポリアクリルアミドゲル上で分析した。
３８．精製工程６６〜７２に概説されたプロトコルを使用して、ＱＩＡＧＥＮヌクレオチド除去キットによって、反応混合物を精製した。
３９．６０μｌのＴ３  ＤＮＡリガーゼ緩衝液（２倍濃縮物）によって、ＤＮＡ試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
４０．２０μｌの連結のための１００μＭのイノシン鎖（２ｎｍｏｌ）および２０μｌの連結のための１００μＭのヘルパー鎖（２ｎｍｏｌ）（配列番号６０、５１、図２９）、ならびに１０μｌの脱イオン水を反応混合物に加えた。
４１．１０μｌのＴ３  ＤＮＡリガーゼＮＥＢ（３０００単位／μｌ）を同じチューブに加え、室温で３０分間インキュベートした。任意の好適なＤＮＡリガーゼを使用することができる。
４２．精製工程７３〜７８に概説された変性工程を含むストレプトアビジン磁気ビーズキットのためのプロトコルを使用して、反応混合物を精製した。
４３．精製工程６６〜７２に概説されたＱＩＡＧＥＮヌクレオチド除去キットのためのプロトコルを使用して、反応混合物を精製した。
４４．４６μｌのＴＥ緩衝液によって、ＤＮＡ試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
第３のサイクル：
４５．６μｌの１０×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ（登録商標）緩衝液（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１％のトリトン（登録商標）Ｘ−１００、ｐＨ８．８、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、ＭｎＣｌ２溶液（３μｌの４０ｍＭ）を加えた。
４６．アリコート（４μｌ）を反応混合物から取り出し、０．５μｌの天然ｄＮＴＰ混合物（４ｍＭ）および０．５μｌのＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼならびに０．５μｌのＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼＩＶを加え、１０分間反応させた。ゲル電気泳動によって反応物を分析した。
４７．３’−Ｏ−修飾−ｄＴＴＰ（６μｌの２００μＭ）を加えた。
４８．次に、３μｌのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（３０Ｕ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を加えた。修飾ｄＮＴＰを組み込むことができる任意のＤＮＡポリメラーゼまたは他の好適な酵素を使用することができる。
４９．反応物を３７℃で３０分間インキュベートした。
５０．精製工程６６〜７２に概説されたＱＩＡＧＥＮヌクレオチド除去キットを使用して、反応混合物を精製した。
５１．５０μｌのＴＥ緩衝液によって、ＤＮＡ試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
５２．アリコート（４μｌ）を反応混合物から取り出し、０．５μｌの天然ｄＮＴＰ混合物（４ｍＭ）および０．５μｌのＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼならびに０．５μｌのＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼＩＶを追加し、１０分間反応させた。ゲル電気泳動によって反応物を分析した。
５３．１００μＬの５００ｍＭのＴＣＥＰを反応混合物に加え、３７℃で１０分間反応させた。
５４．精製工程６６〜７２に概説されたＱＩＡＧＥＮヌクレオチド除去キットを使用して、反応混合物を精製した。
５５．４９μｌのＮＥＢ反応緩衝液（登録商標）（５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭのトリス−酢酸、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、１ｍＭのＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．９）によって、ＤＮＡ試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
５６．アリコート（４μｌ）を反応混合物から取り出し、０．５μｌの天然ｄＮＴＰ混合物（４ｍＭ）および０．５μｌのＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼならびに０．５μｌのＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼＩＶを加え、１０分間反応させた。ゲル電気泳動によって反応物を分析した。
５７．５μｌのヒトエンドヌクレアーゼＶ（Ｅｎｄｏ  Ｖ）ＮＥＢ（３０単位／μｌ）を溶出液に加え、３７℃で３０分間インキュベートした。代替的に、任意の好適なエンドヌクレアーゼを使用することができる。
５８．インキュベーション時間が経過した後、酵素的熱不活性化（すなわち、６５℃で２０分間）によって反応を終了させた。
５９．アリコート（５μｌ）を反応混合物から取り出し、ポリアクリルアミドゲル上で分析した。
６０．精製工程６６〜７２に概説されたプロトコルを使用して、ＱＩＡＧＥＮヌクレオチド除去キットによって、反応混合物を精製した。
６１．３０μｌのＴ３  ＤＮＡリガーゼ緩衝液（２倍濃縮物）によって、ＤＮＡ試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
６２．１０μｌの連結のための１００μＭのイノシン鎖（２ｎｍｏｌ）、１０μｌの連結のための１００μＭのヘルパー鎖（２ｎｍｏｌ）（配列番号６０、５１、図２９）、および５μｌの水を反応混合物に加えた。
６３．５μｌのＴ３  ＤＮＡリガーゼＮＥＢ（３０００単位／μｌ）を同じチューブに加えた。（これは任意のＤＮＡ連結酵素を含み得）、室温で３０分間インキュベートした。
６４．ゲル電気泳動によって反応物を分析した。
【０４７８】
以下に概説されたプロトコルを使用した、組み込み、脱ブロック、および切断工程の後のＱＩＡＧＥＮヌクレオチド除去キットによる反応混合物の精製。
６５．１０容量の緩衝液ＰＮＩ  ＱＩＡＧＥＮ（５Ｍの塩化グアニジニウム）を試料に加え、ピペットで穏やかに再懸濁することによって混合した。
６６．混合物をＱＩＡｑｕｉｃｋスピンカラム（ＱＩＡＧＥＮ）に移し、６０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
６７．遠心分離後、フロースルーを廃棄し、７５０μｌの緩衝液ＰＥ  ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５および８０％のエタノール）をスピンカラムに加え、６０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
６８．フロースルーを廃棄し、スピンカラムを１３０００ｒｐｍでさらに１分間遠心分離して、残留ＰＥ緩衝液を除去した。
６９．次に、スピンカラムを滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに入れた。
７０．ＤＮＡ溶出のために、反応のための２０〜２００μｌの適切な緩衝液をカラム膜の中心に加え、室温で１分間放置した。
７１．次に、チューブを１３０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
【０４７９】
変性工程を伴うストレプトアビジン磁気ビーズを使用した連結工程後の反応物の精製を、以下に概説されたプロトコルを介して行った。
７２．２００μｌの結合緩衝液（２０ｍＭのトリス、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ＝７．４）によって、１００μｌのストレプトアビジン磁気ビーズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を３回洗浄した。
７３．連結工程後の反応混合物を１０容量の結合緩衝液（２０ｍＭのトリス、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ＝７．４）と混合し、ストレプトアビジン磁気ビーズと共に２０℃で１５分間インキュベートさせた。
７４．２００μｌの結合緩衝液（２０ｍＭのトリス、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ＝７．４）によって、ストレプトアビジン磁気ビーズを３回洗浄した。
７５．ヘルパー鎖を除去するために、ストレプトアビジン磁気ビーズを２００μｌの結合緩衝液（２０ｍＭのトリス、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ＝７．４）中で８０℃まで加熱し、磁石にかけ、上清を迅速に廃棄した。
７６．脱イオン水を用いて、ストレプトアビジン磁気ビーズを３回洗浄した。
７７．９５℃で３分間加熱することによる５０〜１００μｌの脱イオン水によって、オリゴヌクレオチドを溶出した。
【０４８０】
結果および結論
図３０は、組み込み、脱ブロック、切断、および連結工程を含む完全３サイクル実験に対応する反応生産物を示すゲルを図示する。示されている結果は、本発明の例示的な方法を使用した３つの完全合成サイクルの実行を実証している。
【０４８１】
実施例１０．ポリアクリルアミド表面の誘導体化およびその後の分子の固定化
この実施例は、Ｎ−（５−ブロモアセトアミジルペンチル）アクリルアミド（ＢＲＡＰＡ）を使用したポリアクリルアミド表面上のブロモアセチル基の提示、およびその後のブロモアセチル基へのそれらの共有結合によるチオール化分子の表面固定化を記載する。
【０４８２】
材料および方法
顕微鏡用スライドガラスおよびカバーガラスを、アセトン、エタノール、および水中でそれぞれ１０分間ずつ順次超音波処理することによって洗浄し、アルゴンで乾燥させた。清浄なガラス製のカバーガラスを、ポリスチレン製ペトリ皿中で気相でトリクロロ（１Ｈ、１Ｈ、２Ｈ、２Ｈ−ペルフルオロオクチル）シランでシラン化し、エタノール中で２回超音波処理し、Ａｒで乾燥させた（以後、「フッ素化カバーガラス」）。顕微鏡用スライドガラス上で、４％アクリルアミド／Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（１９：１）溶液を、１００μｌの１０％（ｗ／ｖ）過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）、１０μｌのテトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）と混合し、０、０．１、０．２、および０．３％（ｗ／ｖ）でＮ−（５−ブロモアセトアミジルペンチル）アクリルアミド（ＢＲＡＰＡ）を添加し、直径４ｍｍのゴム製ガスケットに素早く分配し、続いてアクリルアミド溶液に向かって面するフッ素化側を含むフッ素化カバーガラスで挟み、１０分間重合した。１０分後、表面を脱イオン水に浸し、合計４時間浸したままにし、その間にフッ素化カバーガラスを注意深く取り除いた。重合されたポリアクリルアミド表面をアルゴンで乾燥させた。
【０４８３】
続いてポリアクリルアミド表面を、リン酸ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８）中の陰性対照として、チオール化ポリエチレングリコール（１ｋＤａ）フルオレセイン（ＦＩＴＣ−ＰＥＧ−ＳＨ）、およびカルボキシル化ポリエチレングリコール（１ｋＤａ）フルオレセイン（ＦＩＴＣ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ）に１時間曝露し、続いてリン酸ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７）および０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／０．５ＭのＮａＣｌを含有する同じ緩衝液で順次洗浄して、非特異的に吸着されたチオール化およびカルボキシル化フルオロフォアを除去した。続いて表面を、フルオレセインチャネルのＣｈｅｍｉＤｏｃ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によって撮像した。
【０４８４】
結果および結論
図３１は蛍光シグナルを示し、図３２は、ＦＩＴＣ−ＰＥＧ−ＳＨおよびＦＩＴＣ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨに曝露された異なる量のＢＲＡＰＡを添加したポリアクリルアミドゲル表面から測定された蛍光を示す。フルオレセインの固定化は、カルボキシル化フルオレセインのゼロに近い非特異的吸着を伴って、ＢＲＡＰＡおよびチオール化フルオレセインのみを添加したポリアクリルアミド表面でのみ成功した。
【０４８５】
ＢＲＡＰＡを含有しないこうしたポリアクリルアミド表面（ＢＲＡＰＡ  ０％）ならびにＢＲＡＰＡおよびカルボキシル化分子（ＦＩＴＣ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ）を含有するこうしたポリアクリルアミド表面と比較して、ＢＲＡＰＡを含有するポリアクリルアミド表面（ＢＲＡＰＡ  ０．１、０．２、および０．３％）、およびチオール化分子（ＦＩＴＣ−ＰＥＧ−ＳＨ）のみから、有意に高い陽性蛍光シグナルが得られた。結果は、表面からのブロモアセチル部分とフルオレセインタグ付き分子からのチオール部分との間に、特異的共有結合が起こったことを示す。
【０４８６】
結果は、本発明の方法で使用するための支持鎖および合成鎖を含む分子などの分子が、本明細書に記載されるポリヌクレオチド合成反応に適合する表面基質上に容易に固定化され得ることを実証する。
【０４８７】
実施例１１．ヘアピンＤＮＡオリゴマーの表面固定化、およびその後の蛍光標識されたデオキシヌクレオシド三リン酸の組み込み。
この実施例は以下を記載する。
（１）薄いポリアクリルアミド表面上にブロモアセチル基を提示する方法、
（２）チオリン酸官能化ヘアピンＤＮＡのリンカーを有するか、または有しない共有結合を介したヘアピンＤＮＡのその後の固定化、および
（３）ヘアピンＤＮＡへの２’−デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）の組み込み。
【０４８８】
本方法は、実質的にあらゆる種類の材料表面（例えば、金属、ポリマーなど）と適合する。
【０４８９】
（１）：ブロモアセチル官能化された薄いポリアクリルアミド表面の加工
材料および方法
最初に、顕微鏡用スライドガラスを、純粋なＤｅｃｏｎ  ９０（３０分）、水（３０分）、１ＭのＮａＯＨ（１５分）、水（３０分）、０．１ＭのＨＣｌ（１５分）、水（３０分）中で超音波処理によって洗浄し、最後にアルゴンで乾燥させた。
【０４９０】
最初に、２％（ｗ／ｖ）のアクリルアミドモノマー溶液を、１ｇのアクリルアミドモノマーを５０ｍｌの水に溶解することによって作製した。アクリルアミドモノマー溶液をボルテックスし、アルゴン中で１５分間脱気した。Ｎ−（５−ブロモアセトアミジルペンチル）アクリルアミド（ＢＲＡＰＡ、８２．５ｍｇ）を、８２５μｌのＤＭＦに溶解し、アクリルアミドモノマー溶液に加え、さらにボルテックスした。最後に、１ｍｌの５％（ｗ／ｖ）過硫酸カリウム（ＫＰＳ）および１１５μｌの純粋なテトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）を、アクリルアミド溶液に加え、ボルテックスし、清浄な顕微鏡用スライドガラスを、このアクリルアミド重合混合物に９０分間曝露した。９０分後、表面を脱イオン水で洗浄し、アルゴンで乾燥させた。これらの表面は、この実施例では、以後「ＢＲＡＰＡ修飾表面」と呼ぶことにする。陰性対照として、ＢＲＡＰＡを含まないポリアクリルアミド表面もまた、アクリルアミドモノマー溶液へのＢＲＡＰＡ溶液の添加を除外することによって、上記に記載されるものと同様の方法で作製された。これらの表面は、この実施例では、以後「ＢＲＡＰＡ制御表面」と呼ぶことにする。
【０４９１】
（２）：ポリアクリルアミド表面へのチオリン酸官能化ヘアピンＤＮＡの共有結合
材料および方法
直径４ｍｍの円形開口部を有するゴム製ガスケットを、ＢＲＡＰＡ修飾表面およびＢＲＡＰＡ制御表面上に置いて固定した。最初に、表面をリン酸ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７）で１０分間下塗りした。続いて緩衝液を除去し、表面を、それぞれ１μＭの濃度の６個の単一のチオリン酸で修飾されたリンカーを含み、かつ含まない５’−蛍光標識された（Ａｌｅｘａ  ６４７）ヘアピンＤＮＡオリゴマーに曝露し、暗所で１時間インキュベートした。対照として、リンカーを有するおよび有しないが、チオリン酸を有しないＤＮＡオリゴマーと共に、ＢＲＡＰＡ修飾表面をインキュベートした（この実施例では、以後「オリゴマー制御表面」と呼ばれる）。インキュベーション後、リン酸ナトリウム（１００ｍＭ、ｐＨ７）、続いてトリス−ＥＤＴＡ緩衝液（１０ｍＭのトリス、１０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８）で表面をすすぎ、最後に水ですすいだ。任意の非特異的に吸着されたＤＮＡオリゴマーを除去するために、続いて１Ｍの塩化ナトリウムおよび０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０を含有する水で表面を洗浄し、水で洗浄し、アルゴンで乾燥させた。Ａｌｅｘａ  ６４７チャネルのＣｈｅｍｉＤｏｃ撮像装置上で表面をスキャンした。
【０４９２】
図３３ａは、リンカーが異なる試料に固定化されていないヘアピンＤＮＡの配列を示す。図３３ｂは、リンカーが異なる試料に固定化されたヘアピンＤＮＡの配列を示す。
【０４９３】
結果
結果を図３４および３５に示す。図３４は、ブロモアセチル官能化ポリアクリルアミド表面に固定化されたリンカーを有するおよび有しないヘアピンＤＮＡオリゴマーから生じるが、ＢＲＡＰＡまたはオリゴマー対照からは生じない蛍光シグナルを示す。
【０４９４】
図３５は、ポリアクリルアミド表面へのＤＮＡ固定化の後に測定された蛍光強度を示す。この図は、様々なポリアクリルアミド表面から得られた表面蛍光シグナルを示し、ブロモアセチル官能化ポリアクリルアミド表面へのＤＮＡの共有結合固定化の成功のために、（（２）に記載されるような）ＢＲＡＰＡおよびオリゴマー制御表面と比較して、有意に高いシグナルが、ＢＲＡＰＡ修飾表面に固定化されたヘアピンＤＮＡオリゴマーから得られたことを示す。
【０４９５】
結論
ＤＮＡからの蛍光シグナルは、ＢＲＡＰＡを添加したＢＲＡＰＡ修飾表面からのみ顕著に存在し、チオリン酸官能基を介した表面へのＤＮＡの共有結合の成功を示している。リンカーを有しないＤＮＡと比較して、リンカーを有するＤＮＡから、均一かつより高いシグナルが得られた。
【０４９６】
（３）：リンカーを有するヘアピンＤＮＡオリゴマーへの三リン酸の組み込み
材料および方法
直径９ｍｍの円形開口部を有するゴム製ガスケットを、リンカーを有するＤＮＡオリゴマーで固定化されたＢＲＡＰＡ修飾表面上に置き、組み込み緩衝液（５０ｍＭのトリス、ｐＨ８、１ｍＭのＥＤＴＡ、６ｍＭのＭｇＳＯ４、０．０５％のｔｗｅｅｎ２０、および２ｍＭのＭｎＣｌ２）で１０分間下塗りした。続いて表面を、ＤＮＡポリメラーゼ（０．５Ｕ／μｌのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｘ  ＤＮＡポリメラーゼ）および三リン酸（２０μＭのＡｌｅｘａ  ４８８標識ｄＵＴＰ）を含有する組み込み緩衝液に曝露し、１時間インキュベートした（この実施例では、以後「ポリメラーゼ表面」と呼ばれる）。陰性対照として、追加の表面の組も、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｘ  ＤＮＡポリメラーゼを含まない組み込み緩衝液に１時間曝露した（この実施例では、以後「陰性表面」と呼ばれる）。１時間後、両方の種類の試料を水中で洗浄し、続いて１Ｍの塩化ナトリウムおよび０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０を含有する水にさらし、再び水で洗浄した。表面からの蛍光シグナルを、Ａｌｅｘａ  ６４７およびＡｌｅｘａ  ４８８チャネルのＣｈｅｍｉＤｏｃを使用して測定し、ヘアピンＤＮＡの存在（Ａｌｅｘａ  ６４７）およびｄＵＴＰの組み込み（Ａｌｅｘａ  ４８８）の両方をモニターした。
【０４９７】
結果
図３６は、Ａｌｅｘａ  ４８８標識ｄＵＴＰの組み込み前および後のＡｌｅｘａ  ６４７およびＡｌｅｘａ  ４８８チャネルから検出された蛍光シグナルを示す。組み込み前および後のＡｌｅｘａ  ６４７からの不変の陽性シグナルは、表面固定化ヘアピンＤＮＡが組み込み反応中に安定的であることを示し、Ａｌｅｘａ  ４８８からの陽性シグナルは、ポリメラーゼの存在によってのみ、ｄＵＴＰの組み込みの成功を示す、組み込み反応後のポリメラーゼ表面からのみ観察された。
【０４９８】
図３７は、（３）に記載されるようなＡｌｅｘａ  ４８８標識ｄＵＴＰの組み込み前および後の「ポリメラーゼ表面」および「陰性表面」から得られたＡｌｅｘａ  ６４７（ヘアピンＤＮＡ）およびＡｌｅｘａ  ４８８（ｄＵＴＰ）チャネルにおいて測定された測定蛍光シグナルを示す。組み込みが成功した結果、ポリメラーゼ表面からの組み込み反応後に、Ａｌｅｘａ  ４８８蛍光シグナルの有意な増加が得られたが、陰性表面からのシグナルは、ポリメラーゼの不在のために、組み込み反応後も同じままであった。Ａｌｅｘａ  ６４７チャネルの蛍光シグナルは、組み込み反応後に実質的に変化しないままであり、これは表面上のヘアピンＤＮＡの存在を示している。蛍光シグナルのわずかな減少は、２回目の露光による光退色の効果によるものと思われる。
【０４９９】
結論
結果は、本発明の方法において使用するための支持鎖および合成鎖を含む分子が、本明細書に記載されるポリヌクレオチド合成反応と適合する表面基質上に容易に固定化され得ることを実証する。結果はさらに、そのような分子が、合成鎖を伸長させるために新たなｄＮＴＰの組み込みを許容し得ると同時に、分子が安定的で、基質に付着したままであることを実証する。
【０５００】
実施例１２．リンカーおよびチオリン酸共有結合を介して誘導体化表面に固定化されたヘアピンＤＮＡオリゴマーの切断および連結。
この実施例は、リンカーを有するチオリン酸官能化ヘアピンＤＮＡの誘導体化表面への共有結合、その後の切断および連結反応を記載する。基質調製およびヘアピンＤＮＡの結合を、実施例１１に記載されるように実施した。
【０５０１】
（１）：リンカーを有する固定化ヘアピンＤＮＡオリゴマーの切断
材料および方法
実施例１１に記載されるような表面ＢＲＡＰＡ修飾表面上に、ヘアピンＤＮＡを固定化した。切断および連結反応のためのすべての実験対照を含む４組の三重表面を調製した。実験条件を図３８ａに記載した。図３８ｂは、異なる試料に固定化されたヘアピンＤＮＡの配列を示す。
【０５０２】
ＤＮＡ固定化工程の後に、直径９ｍｍの円形開口部を有するゴム製ガスケットを、５’末端でＡｌｅｘａ  ６４７で標識されたＤＮＡで固定化されたすべての表面上に置き、１×ＮＥ緩衝液４（５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭのトリス−酢酸、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、１ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ７．９）で１０分間下塗りした。試料Ｄについては、固定化ヘアピンＤＮＡはイノシンを含有せず、イノシンはグアニンによって置換されることに留意されたい。続いてすべての試料を、１．５Ｕ／μｌのエンドヌクレアーゼＶを含有するＮＥ緩衝液４（試料Ａ、Ｂ、およびＤ）またはエンドヌクレアーゼＶを含まないＮＥ緩衝液４（試料Ｃ）のいずれかに１時間曝露した。続いてすべての試料を、１×Ｔ３  ＤＮＡリガーゼ緩衝液（６６ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＡＴＰ、７．５％のＰＥＧ６０００、１ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ７．６）、１Ｍの塩化ナトリウムおよび０．０５％の（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含有する１×Ｔ３  ＤＮＡリガーゼ緩衝液で洗浄し、１×Ｔ３  ＤＮＡリガーゼ緩衝液で再び洗浄し、Ａｌｅｘａ  ６４７チャネルのＣｈｅｍｉＤｏｃ撮像装置上でスキャンした。
【０５０３】
結果
図３９は、切断反応前および後のヘアピンＤＮＡオリゴマーからの蛍光シグナルを示す。
【０５０４】
図４０は、上記に記載されるようなＤＮＡ固定化表面から得られた切断反応の前および後に測定された蛍光シグナルを示す。切断反応の成功は、試料ＡおよびＢからのみ観察されたが、エンドヌクレアーゼＶ（試料Ｃ）または配列中のイノシン（試料Ｄ）のいずれも存在しないため、蛍光シグナル強度は、試料ＣおよびＤについて略同じままであった。
【０５０５】
エンドヌクレアーゼＶの存在下でＤＮＡ鎖内のイノシン部位での切断反応が成功した結果、試料ＡおよびＢからの蛍光シグナルの有意な減少が観察された。試料ＣおよびＤについて、ＤＮＡ中のエンドヌクレアーゼＶの不在およびイノシンの欠如は、それぞれ蛍光シグナルをもたらし、ＤＮＡ固定化後に得られた初期シグナルと略同じレベルを維持した。
【０５０６】
（２）：連結反応
材料および方法
（１）に記載されるような切断反応の後、試料ＡおよびＢ（図３８ａに記載されるような）を、試料ＡについてはＴ３  ＤＮＡリガーゼ（２５０Ｕ／μｌ）を用い、試料Ｂについては陰性対照としてＴ３  ＤＮＡリガーゼを用いずに、ＭｎＣｌ２を含有する１×Ｔ３  ＤＮＡリガーゼ緩衝液（２ｍＭ）、５′末端でＡｌｅｘａ  ６４７で標識されたイノシン鎖（１６μＭ）、および相補的「ヘルパー」鎖（１６μＭ）（配列を下記の図４１に示す）に曝露した。試料をそれぞれの溶液中で１時間インキュベートした。１時間後、表面を水中で洗浄し、続いて１Ｍの塩化ナトリウムおよび０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０を含有する水にさらし、再び水で洗浄した。Ａｌｅｘａ  ６４７チャネルのＣｈｅｍｉＤｏｃを使用して、表面からの蛍光シグナルを測定した。図４１は、連結反応のためのイノシン含有鎖および相補的「ヘルパー」鎖についての配列を示す。
【０５０７】
結果
図４２は、連結反応のモニタリングに関する結果を示す。連結反応の前および後に、Ａｌｅｘａ  ６４７チャネルから検出された蛍光シグナル。連結後のＡｌｅｘａ  ６４７チャネルにおける蛍光シグナルの増加は、Ｔ３  ＤＮＡリガーゼを有する試料Ａからのみ得られたが、Ｔ３  ＤＮＡリガーゼの不在のため、試料Ｂについては連結反応後、蛍光シグナルは同じレベルのままであった。
【０５０８】
図４３は、連結の成功の結果として試料Ａからの連結反応後に、Ａｌｅｘａ  ６４７蛍光シグナルの有意な増加が得られたことを示し、ここで、シグナルレベルは、ＤＮＡ固定化の後に、かつ図４０に示されるような切断反応の前に、初期シグナルレベルに回復する。試料Ｂからの蛍光シグナルは、Ｔ３  ＤＮＡリガーゼの不在のため、連結反応後も同じままであった。
【０５０９】
結論
この実施例の結果は、本発明の方法で使用するための支持鎖および合成鎖を含む分子が、本明細書に記載されるポリヌクレオチド合成反応に適合する表面基質上に容易に固定化でき、同時に安定的で基質に付着したままでありながら、切断および連結に曝露され得ることを実証する。
【０５１０】
上記の実施例では、配列番号１〜６７に提示されるすべてのオリゴヌクレオチドは、３’末端にヒドロキシル基を有する。配列番号１〜６７に提示されるすべてのオリゴヌクレオチドは、配列番号７、配列番号１８、および配列番号３５を除いて、５’末端にリン酸基を欠く。
【０５１１】
開示される方法および生産物の異なる適用が、当該技術分野における特定の必要性に合わせられ得ることが理解されるべきである。本明細書で使用される専門用語は、本発明の特定の実施形態のみを説明する目的のためのものであり、限定的であることは意図されないことも理解されたい。
【０５１２】
さらに、この明細書および添付の特許請求の範囲に使用される場合、単数形「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が別途明確に示さない限り、複数の指示物を含む。したがって、例えば、「連結ポリヌクレオチド」への言及は、２つ以上のそのようなポリヌクレオチドを含み、「足場ポリヌクレオチド」への言及は、２つ以上のそのような足場ポリヌクレオチドを含むなどである。
【０５１３】
本明細書に引用されるすべての公報、特許、および特許出願は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
2020506687.tif 000045
【図２】
2020506687.tif 000046
【図３−１】
2020506687.tif 000047
【図３−２】
2020506687.tif 000048
【図３−３】
2020506687.tif 000049
【図４−１】
2020506687.tif 000050
【図４−２】
2020506687.tif 000051
【図４−３】
2020506687.tif 000052
【図５−１】
2020506687.tif 000053
【図５−２】
2020506687.tif 000054
【図５−３】
2020506687.tif 000055
【図６−１】
2020506687.tif 000056
【図６−２】
2020506687.tif 000057
【図７】
2020506687.tif 000058
【図８】
2020506687.tif 000059
【図９−１】
2020506687.tif 000060
【図９−２】
2020506687.tif 000061
【図１０−１】
2020506687.tif 000062
【図１０−２】
2020506687.tif 000063
【図１０−３】
2020506687.tif 000064
【図１１−１】
2020506687.tif 000065
【図１１−２】
2020506687.tif 000066
【図１１−３】
2020506687.tif 000067
【図１１−４】
2020506687.tif 000068
【図１２−１】
2020506687.tif 000069
【図１２−２】
2020506687.tif 000070
【図１３】
2020506687.tif 000071
【図１４−１】
2020506687.tif 000072
【図１４−２】
2020506687.tif 000073
【図１４−３】
2020506687.tif 000074
【図１４−４】
2020506687.tif 000075
【図１５−１】
2020506687.tif 000076
【図１５−２】
2020506687.tif 000077
【図１６−１】
2020506687.tif 000078
【図１６−２】
2020506687.tif 000079
【図１７−１】
2020506687.tif 000080
【図１７−２】
2020506687.tif 000081
【図１８−１】
2020506687.tif 000082
【図１８−２】
2020506687.tif 000083
【図１９】
2020506687.tif 000084
【図２０】
2020506687.tif 000085
【図２１−１】
2020506687.tif 000086
【図２１−２】
2020506687.tif 000087
【図２１−３】
2020506687.tif 000088
【図２２】
2020506687.tif 000089
【図２３】
2020506687.tif 000090
【図２４】
2020506687.tif 000091
【図２５】
2020506687.tif 000092
【図２６】
2020506687.tif 000093
【図２７】
2020506687.tif 000094
【図２８】
2020506687.tif 000095
【図２９】
2020506687.tif 000096
【図３０】
2020506687.tif 000097
【図３１】
2020506687.tif 000098
【図３２】
2020506687.tif 000099
【図３３】
2020506687.tif 000100
【図３４】
2020506687.tif 000101
【図３５】
2020506687.tif 000102
【図３６】
2020506687.tif 000103
【図３７】
2020506687.tif 000104
【図３８】
2020506687.tif 000105
【図３９】
2020506687.tif 000106
【図４０】
2020506687.tif 000107
【図４１】
2020506687.tif 000108
【図４２】
2020506687.tif 000109
【図４３】
2020506687.tif 000110
【配列表】
2020506687000001.app
【国際調査報告】
2020506687.tif 000111
2020506687.tif 000112
2020506687.tif 000113
2020506687.tif 000114