(57)【要約】  本発明は、ブタを、ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）および／またはブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）を含むコロナウイルス感染と関連する疾患に対して防御するためのワクチンに関する。ワクチンは、一般に、不活化／死滅させたＰＥＤＶ（例えば、化学的に不活化させたＰＥＤウイルス）、ならびに／または組換えＰＥＤＶ抗原、ならびに／またはアジュバントにより不活化／死滅させたＰＤＣｏＶ（例えば、化学的に不活化させたＰＤＣｏＶウイルス）、ならびに／または組換えＰＤＣｏＶ抗原およびアジュバントを含む。ブタを、ＰＥＤＶおよび／またはＰＤＣｏＶと関連する疾患に対して防御するための方法、ならびにブタ流行性下痢ウイルスワクチンおよび／またはブタデルタコロナウイルスワクチンを作製する方法もまた提供される。
2020506915.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）の１または複数の抗原と、アジュバントとを含む免疫原性組成物であって、ブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）が、
ａ）配列番号１、５、もしくは９によりコードされ、かつ／または配列番号１、５、もしくは９の配列を含み、かつ／または配列番号１、５、もしくは９のＲＮＡ同等物を含むＰＤＣｏＶ；
ｂ）その配列が、配列番号配列番号１と、少なくとも９９％同一であり、かつ／または配列番号１、５、もしくは９のＲＮＡ同等物と、少なくとも９９％同一であるＰＤＣｏＶ；
ｃ）そのスパイクタンパク質が、配列番号３、７、１１、１７、または２７の核酸配列によりコードされるＰＤＣｏＶ；
ｄ）そのスパイクタンパク質が、配列番号３、７、１１、１７、または２７と、少なくとも９０％同一な核酸配列によりコードされるＰＤＣｏＶ；
ｅ）配列番号２、６、または１０によりコードされる、任意のＰＤＣｏＶ；あるいは
ｆ）その配列が、配列番号２、６、または１０と、少なくとも９９％同一であるＰＤＣｏＶ
のいずれかのＰＤＣｏＶである免疫原性組成物。
【請求項２】
アジュバントが、水中油エマルジョンである、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
組換え抗原または不活化させた全ブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）抗原である、請求項１または２に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
抗原が、不活化させた全ＰＤＣｏＶ抗原である、請求項１から３のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
ＰＤＣｏＶ抗原が、化学的に不活化されている、請求項４に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
ＰＤＣｏＶ抗原が、エチレンイミン、バイナリーエチレンイミン、アセチルエチレンイミン、およびこれらの混合物からなる群から選択される化合物を含む化学的不活化剤による処置により化学的に不活化されている、請求項５に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
ＰＤＣｏＶが、バイナリーエチレンイミンによる処置により化学的に不活化されている、請求項６に記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
アジュバントが、ＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（登録商標）水中油エマルジョンベースのアジュバントである、請求項１から７のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
不活化させたブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）が、配列番号１、５、もしくは９を含み、かつ／または配列番号１、５、もしくは９のＲＮＡ同等物を含む、請求項４に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
ＰＤＣｏＶ抗原が、組換え抗原である、請求項１から３のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
組換え抗原が、
ａ）ブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）スパイクタンパク質の抗原をコードする単離核酸であって、組換えスパイクポリペプチドが、配列番号４、８、１２、１８、または２８と、少なくとも９０％の相同性を有する単離核酸；
ｂ）ａ）の単離核酸を含む組換えベクター；
ｃ）ａ）の核酸によりコードされる組換えＰＤＣｏＶスパイクタンパク質；および
ｄ）これらの任意の組合せ
からなる群から選択される、１または複数の免疫原性構成要素を含む、請求項１０に記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
薬学的に許容可能な担体および／または賦形剤を含む、請求項１０または１１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
水中油エマルジョンが、ＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（登録商標）水中油エマルジョンベースのアジュバントである、請求項１０から１２のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１４】
免疫原性組成物が、１または複数のさらなる抗原をさらに含む、請求項１から１３のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１５】
さらなる抗原が、ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）の抗原であり、ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）が、
ａ）配列番号２９によりコードされ、かつ／または配列番号２９もしくは３３の配列を含み、かつ／または配列番号２９もしくは３３のＲＮＡ同等物を含むＰＥＤＶ；
ｂ）その配列が、配列番号２９もしくは３３と、少なくとも９９％同一であり、かつ／または配列番号２９もしくは３３のＲＮＡ同等物と、少なくとも９９％同一であるＰＥＤＶ；
ｃ）そのスパイクタンパク質が、配列番号３０、３４、４６、または５２の核酸配列によりコードされるＰＥＤＶ；
ｄ）そのスパイクタンパク質が、配列番号３０、３４、４６、または５２と、少なくとも９０％同一な核酸配列によりコードされるＰＥＤＶ；
ｅ）配列番号３２または３６によりコードされるＰＥＤＶ；あるいは
ｆ）配列番号３２または３６と、少なくとも９９％同一な配列よりコードされるＰＥＤＶ
のいずれかのＰＤＣｏＶである、請求項１４に記載の免疫原性組成物。
【請求項１５】
さらなるＰＥＤＶ抗原が、組換え抗原または不活化させた全ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）である、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項１６】
抗原が、不活化させた全ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）である、請求項１６に記載の免疫原性組成物。
【請求項１７】
抗原が、組換えＰＥＤＶ抗原である、請求項１６に記載の免疫原性組成物。
【請求項１８】
組換え抗原が、
ａ）ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）スパイクタンパク質の抗原をコードする単離核酸であって、抗原が、配列番号３１、３５、４７、または５２と、少なくとも９０％の相同性を有する単離核酸；
ｂ）ａ）の単離核酸を含む組換えベクター；
ｃ）ａ）の核酸によりコードされる組換えＰＥＤＶスパイクタンパク質；および
ｄ）これらの任意の組合せ
からなる群から選択される、１または複数の免疫原性構成要素を含む、請求項１６または１８に記載の免疫原性組成物。
【請求項１９】
組換え抗原が、ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）の構造タンパク質Ｍ、Ｅ、またはＮからなる群から選択される、１または複数の免疫原性構成要素を含む、請求項１４、１５、１６、または１８に記載の免疫原性組成物。
【請求項２０】
免疫原性構成要素が、単離核酸である、請求項１９に記載の免疫原性組成物。
【請求項２１】
免疫原性構成要素が、組換えベクターである、請求項１９に記載の免疫原性組成物。
【請求項２２】
免疫原性構成要素が、組換えブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）スパイクタンパク質である、請求項１９に記載の免疫原性組成物。
【請求項２３】
免疫原性構成要素が、組合せである、請求項１９に記載の免疫原性組成物。
【請求項２４】
ブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）と関連する疾患の臨床症状を軽減するための方法であって、ブタへと、請求項１から２４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物を投与するステップを含む方法。
【請求項２５】
ブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）と関連する疾患の臨床症状を軽減するための方法であって、ブタへと、請求項４に記載の免疫原性組成物を投与するステップを含む方法。
【請求項２６】
ブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）と関連する疾患の臨床症状を軽減するための方法であって、ブタへと、請求項１０に記載の免疫原性組成物を投与するステップを含む方法。
【請求項２７】
このような免疫原性組成物が、
ａ）配列番号１、５、もしくは９によりコードされ、かつ／または配列番号１の配列を含み、かつ／または配列番号１、５、もしくは９のＲＮＡ同等物を含む免疫原性構成要素；
ｂ）その配列が、配列番号１、５、もしくは９と、少なくとも９９％同一であり、かつ／または配列番号１、５、もしくは９のＲＮＡ同等物と、少なくとも９９％同一である免疫原性構成要素；
ｃ）そのスパイクタンパク質が、配列番号３、７、１１、１７、または２７の核酸配列によりコードされる免疫原性構成要素；
ｄ）そのスパイクタンパク質が、配列番号３、７、１１、１７、または２７と、少なくとも９０％同一な核酸配列によりコードされる免疫原性構成要素；
ｅ）配列番号２、６、または１０によりコードされる免疫原性構成要素；および
ｆ）その配列が、配列番号２、６、または１０と、少なくとも９９％同一である免疫原性構成要素
からなる群から選択される、１または複数の免疫原性構成要素を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
このような免疫原性組成物が、
ａ）配列番号１、５、または９の配列によりコードされるか、またはこれを含む免疫原性構成要素；
ｂ）その配列が、配列番号１、５、または９と、少なくとも９９％同一である免疫原性構成要素；
ｃ）そのスパイクタンパク質が、配列番号３、７、１１、１７、または２７の核酸配列によりコードされる免疫原性構成要素；および
ｄ）そのスパイクタンパク質が、配列番号３、７、１１、１７、または２７と、少なくとも９０％同一な核酸配列によりコードされる免疫原性構成要素
からなる群から選択される、１または複数の免疫原性構成要素を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
このような組換え抗原が、
ａ）ブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）スパイクタンパク質の抗原をコードする単離核酸であって、組換えスパイクポリペプチドが、配列番号４、８、１２、１８、または２８と、少なくとも９０％の相同性を有する単離核酸；
ｂ）ａ）の単離核酸を含む組換えベクター；
ｃ）ａ）の核酸によりコードされる、組換えブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）スパイクタンパク質；および
ｄ）これらの任意の組合せ
からなる群から選択される、１または複数の免疫原性構成要素を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
ブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）およびブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）と関連する疾患の臨床症状を軽減するための方法であって、ブタへと、請求項１５から２４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物を投与するステップを含む方法。
【請求項３１】
ブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）およびブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）と関連する疾患の臨床症状を軽減する方法であって、このようなブタへと、請求項１４から１７のいずれか１項に記載の免疫原性組成物を投与するステップを含む方法。
【請求項３２】
ブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）およびブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）と関連する疾患の臨床徴候を軽減するための方法であって、このようなブタへと、請求項１４、１５、１６、または１８から２４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物を投与するステップを含む方法。
【請求項３３】
ブタにおいて、ブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）と関連する疾患に対する免疫原性応答を誘導するためのキットであって、
ａ）免疫原性組成物を、ブタに投与することが可能な分注器；および
ｂ）請求項１から１４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物
を含むキット。
【請求項３４】
ブタにおいて、ブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）と関連する疾患に対する免疫原性応答を誘導するためのキットであって、
ａ）免疫原性組成物を、ブタに投与することが可能な分注器；および
ｂ）請求項４から９のいずれか１項に記載の免疫原性組成物
を含むキット。
【請求項３５】
ブタにおいて、ブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）と関連する疾患に対する免疫原性応答を誘導するためのキットであって、
ａ）免疫原性組成物を、ブタに投与することが可能な分注器；および
ｂ）請求項１０から１４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物
を含むキット。
【請求項３６】
ブタにおいて、ブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）およびブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）と関連する疾患に対する免疫原性応答を誘導するためのキットであって、
ａ）免疫原性組成物を、ブタに投与することが可能な分注器；および
ｂ）請求項１５から２４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物
を含むキット。
【請求項３７】
ブタにおいて、ブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）およびブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）と関連する疾患に対する免疫原性応答を誘導するためのキットであって、
ａ）免疫原性組成物を、ブタに投与することが可能な分注器；および
ｂ）請求項１５から１７のいずれか１項に記載の免疫原性組成物
を含むキット。
【請求項３８】
ブタにおいて、ブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）およびブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）と関連する疾患に対する免疫原性応答を誘導するためのキットであって、
ａ）免疫原性組成物を、ブタに投与することが可能な分注器；および
ｂ）請求項１８から２４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物
を含むキット。
【請求項３９】
請求項４から９のいずれか１項に記載のブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）による免疫原性組成物を作製する方法であって、
ａ）ブタ精巣細胞に、ブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）を接種するステップ；
ｂ）接種されたブタ精巣細胞をインキュベートするステップ；
ｃ）ブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）を、インキュベートされた細胞から採取するステップ；および
ｄ）採取された細胞を、化学的不活化剤、好ましくは、エチレンイミン、バイナリーエチレンイミン、アセチルエチレンイミン、またはこれらの混合物からなる群から選択される化合物により処置して、不活化させたブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）抗原を形成するステップ
を含む方法。
【請求項４０】
ブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）が、
ａ）配列番号１、５、または９の配列によりコードされるか、またはこれらを含む配列；
ｂ）配列番号１、５、または９と、少なくとも９９％同一な配列；
ｃ）配列番号３、７、１１、１７、または２７の核酸配列によりコードされるスパイクタンパク質；
ｄ）配列番号３、７、１１、１７、または２７と、少なくとも９０％同一な核酸配列によりコードされるスパイクタンパク質
を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４１】
ブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）が、配列番号１、５、もしくは９、および／または配列番号１、５、もしくは９のＲＮＡ同等物を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４２】
ブタ精巣細胞が、ＡＩ−ＳＴ細胞である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
化学的不活化剤が、バイナリーエチレンイミンを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４４】
水中油エマルジョンベースのアジュバントであるＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（登録商標）を、ブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）抗原へと添加するステップをさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
請求項１０から２４のいずれか１項に記載の、組換えブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）抗原を含む免疫原性組成物を作製する方法であって、
ａ）ブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）の抗原を、宿主細胞内で発現させるステップ；
ｂ）ブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）細胞の抗原を採取するステップ；および
ｃ）水中油エマルジョンベースのアジュバントを、ステップｂ）のブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）抗原へと添加するステップ
を含む方法。
【請求項４６】
ブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）抗原が、
ａ）ブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）スパイクタンパク質の抗原をコードする単離核酸であって、組換えスパイクポリペプチドが、配列番号４、８、１２、１８、または２８と、少なくとも９０％の相同性を有する単離核酸；
ｂ）ａ）の単離核酸を含む組換えベクター；
ｃ）ａ）の核酸によりコードされる、組換えブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）スパイクタンパク質；および
ｄ）これらの任意の組合せ
を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４７】
ブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）の抗原を、組換えバキュロウイルスベクターにより発現させる、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
ブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）の抗原を、昆虫細胞内で発現させる、請求項４８に記載の方法。
【請求項４９】
水中油ベースのアジュバントが、ＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（登録商標）水中油エマルジョンベースのアジュバントである、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
ブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）と関連する疾患の症状を軽減させるための使用のための、請求項１から１４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項５１】
ブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）および／またはブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）と関連する疾患の症状を軽減させるための使用のための、請求項１５から２４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表
本出願は、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２１〜１．８２５に従う配列表を含有する。本出願に付属の配列表は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる。１０−０１７６−ＷＯ−ＳＥＱと名付けられる配列表であって、４８０ｋｂのサイズであり、２０１７年１月２３日に作成され、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して、本出願と共に電子的に提出される配列表は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明の分野：
本発明は、ブタを、ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）およびブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）により引き起こされる疾患から防御する免疫原性組成物と、ＰＥＤＶ抗原およびＰＤＣｏＶ抗原の両方をもたらす組合せワクチンとに関する。併せて存在することが多い、高頻度の腸疾患は、１０日齢未満の仔ブタにおける死亡率が高い（最大で、１００％）ために、米国養豚業にとって、大きな経済的懸念をもたらす。
【背景技術】
【０００３】
関連技術についての記載：
ブタ流行性下痢ウイルスとは、ブタにおいて、急性下痢、嘔吐、および脱水を引き起こす、エンベロープ型、プラス鎖の、一本鎖ＲＮＡウイルスである。ブタ流行性下痢ウイルスは、当初、欧州において同定されたが、韓国、中国、日本、フィリピン、およびタイを含む、多くのアジア諸国において、ますます問題となった。２０１３年４月、ＰＥＤＶは、米国中西部のブタにおいて新たに勃興し、瞬く間に、全国に拡大した。２０１３年１０月までに、ＰＥＤＶは、１８州のブタの群れにおいて検出された。ＰＥＤＶ感染の経済的影響は、既に、かなりのものとなっている。ＰＥＤＶの北米分離株は、同定されているが（Huang et al. 2013; Stevenson et al. 2013）、米国では、完全に認可されたワクチンは、市販されていない。したがって、ブタを、ＰＥＤＶと関連する疾患に対して防御することが可能なワクチンを開発することが必要とされ続けている。経粘膜経路（経口経路または鼻腔内経路）を介して、および非経口法（例えば、筋内法、皮下法、または静脈内法）を介して投与されうる、新興北米ＰＥＤＶ株に対して有効なワクチンを開発することが有利であろう。
ＰＥＤＶは、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｎａｅ亜科、Ａｌｐｈａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ属のメンバーであり（Bridgen et al. 1993）、１９７１年に、英国で、最初に同定され、ベルギー、中国、ハンガリー、イタリア、日本、韓国、およびタイなど、他の諸国でも同定された（Oldham J. 1972; Pensaert and De Bouck P. 1978; Chen et al. 2008; Nagy et al. 1996; Martelli et al. 2008; Takahashi et al. 1983; Chae et al. 2000；およびPuranaveja et al. 2009）。このファミリーの他のメンバーは、ブタ呼吸器コロナウイルス（ＰＲＣＶ）、ブタ血球凝集性脳脊髄炎コロナウイルス（ＰＨＥ）、およびブタ伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）を含む。ＰＥＤＶウイルスと、ＴＧＥＶウイルスとは、類縁であり、臨床徴候も、極めて類似するが、免疫的な交差防御は存在しない。
【０００４】
ＰＥＤＶは、約２８ｋｂ、プラス鎖、一本鎖のＲＮＡゲノムを保有し、５’キャップおよび３’側ポリアデニル化テールを伴う、エンベロープ型ウイルスである（Pensaert and De Bouck P. 1978）。ゲノムは、５’側非翻訳領域（ＵＴＲ）、３’ＵＴＲ、ならびに４つの構造タンパク質（スパイク（Ｓ）、エンベロープ（Ｅ）、膜（Ｍ）、およびヌクレオカプシド（Ｎ））、および３つの非構造タンパク質（レプリカーゼ１ａおよび１ｂならびにＯＲＦ３）をコードする、少なくとも７つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み；これらは、ゲノム上、５’−レプリカーゼ（１ａ／１ｂ）−Ｓ−ＯＲＦ３−Ｅ−Ｍ−Ｎ−３’の順に配置されている（Oldham J. 1972；およびBridgen et al. 1993）。Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ  ＭＮ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＦ４６８７５２．１）、Ｉｏｗａ  ＩＡ１（ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＦ４６８７５３．１）、およびＩｏｗａ  ＩＡ２（ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＦ４６８７５４．１）と特徴づけられた、最初の３つの新興の北米ＰＥＤＶのゲノム配列は、ポリアデノシンテールを除き、同じ２８，０３８ヌクレオチド（ｎｔ）のサイズを有し、プロトタイプのＰＥＤＶ  ＣＶ７７７株（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦ３５３５１１．１）と、ゲノム構成を共有する。これらの３つの北米ＰＥＤＶ配列は、９９．８〜９９．９％のヌクレオチド同一性を共有した。特に、ＭＮ株と、ＩＡ２株とは、ゲノム全体にわたるヌクレオチドの差異が１１だけであった。
【０００５】
ＰＥＤＶ  Ｓタンパク質は、１，３８３アミノ酸（ａａ）から構成される、Ｉ型糖タンパク質である。Ｓタンパク質は、他のコロナウイルスのＳタンパク質とのその相同性に基づき、Ｓ１（１〜７８９ａａ）ドメインと、Ｓ２（７９０〜１，３８３ａａ）ドメインとに分けることができる（Chang et al; 2002;Cruz et al、1994; Godet、et al 1994; Jackwood et al. 2001; Sturman and Holmes;1984;およびSun et al. 2008）。コロナウイルスにおけるＳタンパク質とは、ウイルスの進入を媒介するように、宿主細胞の受容体糖タンパク質との相互作用を調節し、天然の宿主内の中和抗体の誘導を刺激することにおいて役割を果たす、表面抗原である。したがって、Ｓ糖タンパク質は、ＰＥＤＶに対して有効なワクチンを開発するための、主要な標的である。
ＰＥＤＶ  Ｍタンパク質は、ウイルスのアセンブリー過程において重要な役割を果たす、最も存在量が多いエンベロープ構成要素であり、また、ウイルスを中和する抗体も誘導する。同様に、ヌクレオカプシドの構造基盤をもたらすビリオンＲＮＡに結合するＰＥＤＶ  Ｎタンパク質もまた、細胞媒介性免疫の誘導に重要でありうる（Saif, L. 1993）。
【０００６】
ＰＥＤＶ内の、唯一のアクセサリー遺伝子は、ＯＲＦ３である。一般に、野生株では、アクセサリー遺伝子は維持されるが、ＯＲＦ３の変更は、強毒性に影響すると考えられ、強毒性を軽減するために、ＯＲＦ３遺伝子を変更するように、細胞培養物の適応が使用されている（Song et al. 2003）。実際、ＯＲＦ３遺伝子についての探索を通して、研究者らは、２００６年以来、中国国内の免疫化されたブタ群れにおけるＰＥＤＶの、新たなゲノグループの新興を把握している。これらの株、および中国におけるＰＥＤＶの地域的再興についての系統発生研究は、これらの野生株が、ＯＲＦ３において、欧州株およびワクチン株と遺伝子的に異なる、壊滅的な腸疾患を引き起こすことを裏付けた（Park et al. 2011）。
【０００７】
ＰＥＤＶの異なる株が毒性のレベルを変動させながら存在することは周知上記の文章である。１９８０年代〜１９９０年代において、ＰＥＤＶは、欧州全体、ベルギー、イギリス、ドイツ、フランス、オランダ、およびスイスなどの諸国において蔓延した。その後、欧州内で報告される症例の頻度は、低下し、かつ／またはＰＥＤＶにより引き起こされる疾患は、市販用ワクチンの開発を開始するのに十分な経済的重要性を有さなくなった（Song and Park 2012）。中国では、１９８０年代以来、ＰＥＤＶの流行が記録されているが、２０１０年以来新たに勃興し、下痢の大規模な流行と関連する、ＰＥＤＶの変異体株は、より急性かつ重度である。したがって、ワクチン開発についての試験は、主に、アジア諸国において達せられた（Song and Park 2012）。２０１０年以来新たに勃興する変異体は、乳仔ブタにおいて、８０〜９０％の罹患率および５０〜９０％の死亡率を有すると報告されている（Bi et al. 2012; Pan et al. 2012;およびLi et al. 2012）。近年の証拠は、ＰＥＤＶの、中国において新たに勃興する毒性形態は、生ワクチン株の進化の結果でありうることを示唆する（Chen et al. 2010）。
【０００８】
ブタの腸に影響を及ぼす腸疾患として、ＰＥＤＶは、糞便−口腔曝露を介して拡大する。汚染されたトラックおよび設備は、しばしば、ワクチン接種を受けていない動物に対する感染源である。ＰＥＤＶ感染の臨床徴候は、ブタ伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）感染と同様である（Pijpers et al. 1993）。３週齢およびこれより若齢のブタでは、臨床徴候（急性水様、下痢、嘔吐、および脱水を含む）は、早ければ、ＰＥＤＶ感染の２４時間後に見られる場合があり、１００％の死亡率をもたらす。ＰＥＤＶに感染したフィーダー期およびグローワー期のブタのほか、雌ブタおよび雄ブタも、下痢および嘔吐を発症しうる。動物はまた、食欲不振の徴候も示す場合があり、嗜眠性でありうる。より成熟したブタに対する影響は、いまだ十分に決定されていないが、飼料効率が低下し、市販までの日数が増大し、感染した動物が二次感染にかかりやすくなる可能性が高い。雌ブタでは、全身状態の低下は、生殖能力に対して、負の影響を及ぼしうる。報告は、ＰＥＤＶが、北米の群れにおいて、風土病となる結果として、遷延性下痢および他の難病をもたらしうる徴候が存在することを指し示している。
【０００９】
米国において、ＰＥＤＶに感染した動物の消化管における、肉眼的および組織学的な変化は、中国において観察される変化と同様であり、本質的に、ウイルスはブタの腸の絨毛を破壊し、その結果、栄養物を吸収することができなくなる。Huang et al. 2012は、ミネソタ州およびアイオア州の流行において、疾患に斃れた動物は、小腸に限局された、肉眼的病変を有し、小腸は、黄色の体液で膨満した、薄い半透明の内壁を特徴とすることを報告した。組織学的査定は、絨毛を伴う小腸の領域の平滑化および癒着、ならびに粘膜固有層（ｌａｍｉａ  ｐｒｏｐｒｉａ）の絨毛へのリンパ芽球の浸潤が最小限であることを明らかにした。
【００１０】
Huang et al. 2013は、米国において沈静化する流行に由来する、ＰＥＤＶの３つの異なる株を特徴づけた（ミネソタ州に由来する１つの株、およびアイオア州に由来する２つの株であって、それぞれ、ＭＮ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＫＦ４６８７５２）、およびＩＡ１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＫＦ４６８７５３）、およびＩＡ２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＫＦ４８７５４）と命名された株）。Ｈｕａｎｇによる系統発生サーベイは、ＰＥＤＶ株を、ゲノグループ１（Ｇ１）およびゲノグループ２（Ｇ２）と命名される、２つの別個のゲノグループに収まるものとして群分けした。スパイク遺伝子のＮ末端ドメイン（ＮＴＤ）内の有意な変化が、ゲノグループ１および２を分化させた。Huang et al. 2013は、Ｎ末端のドメイン（ＮＴＤ）内の、第２の欠失領域（ＤＲ２）は、ＤＲ１より、高度な抗原性変化を有することを示唆し、新興北米株が、Ｇ１ａワクチン株とは、それほど「抗原的に」類縁ではないことを示唆する。
【００１１】
ゲノグループ１は、少なくとも３つのクラスターである、１ａ、１ｂ、およびＲを含む。亜群１ａは、早期欧州分離株、中国分離株、および韓国分離株、例えば、プロトタイプである、ＣＶ７７７株（ベルギー、１９７８年、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦ３５３５１１．１）、およびＬＺＣ株（中国、甘粛省、２００６年；ＧｅｎＢａｎｋ：ＥＦ１８５９９２）、およびＳＭ９８株（韓国、１９９８年；ＧｅｎＢａｎｋ：ＧＵ９３７７９７．１）を含む。亜群１ｂは、５つの株（１つの株は、大韓民国由来であり（ＤＲ１３弱毒化ワクチン株、ＧｅｎＢａｎｋ：ＪＱ０２３１６２．１）、他の株は共通の「遺伝子署名」である、ｎｓｐ３における８ａａの欠失、およびＣ末端における、大規模なＯＲＦ３の欠失により連関する、中国由来である）を含有する。群「Ｒ」は、他のゲノグループの組換え体と関連する。しかし、２０１０年以来、中国で勃興するＰＥＤＶ株、および２０１３年以来、北米で勃興するＰＥＤＶ株を含む、新興のＰＥＤＶ株は、ゲノグループＧ２ａに属する。中国株ＡＨ２０１２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＫＣ２１０１４５）と、北米株とは、いくつかの固有のヌクレオチド変化を共有し、併せて、ゲノグループ２ａにクラスター化される。ＭＮ株およびＩＡ２株についての、ＡＨ２０１２とのヌクレオチド同一性は、９９．６％であり、株ＩＡ１については、９９．５％であった。研究者らは、おそらく、ＡＨ２０１２様のウイルスが、中国東部地域へと伝播し、次いで、米国へと移出され、北米株の最も近縁の祖型である可能性が高いと推測した。ゲノグループ２ａのメンバーは、プロトタイプのＰＥＤＶ株である、ゲノグループ１ａのＣＶ７７７に対して、わずかに約９６．９％の類似性を共有する（Bridgen et al. 1993; Huang et al. 2013；ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦ３５３５１１．１）。こうして、歴史的な、ＣＶ７７７由来のＧ１ａ株、またはＤＲ１３由来のＧ１ｂ株に基づく弱毒化ＰＥＤＶワクチンは、新興の中国Ｇ２ａ  ＰＥＤＶ株および北米Ｇ２ａ  ＰＥＤＶ株とは、抗原的な関連性が小さい可能性があり、したがって、優れたワクチン候補物質ではない可能性がある。
【００１２】
近縁の北米分離株であるＵＳ／Ｃｏｌｏｒａｄｏ／２０１３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＫＦ２７２９２０．１）もまた、Marthaler et al, 2013により報告されている。上記の北米分離株と同様に、ＣＯ／１３の完全ＰＥＤＶゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋで入手可能な、他の完全ＰＥＤＶゲノムと、９６．５〜９９．５％のヌクレオチド同一性を有し、最大のヌクレオチド同一性（９９．５％）は、中国株ＡＨ２０１２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＫＣ２１０１４５）との同一性であった。中国株ＡＨ２０１２は、２ａゲノグループのメンバーである。ＣＯ／１３の完全ゲノムの、ＰＥＤＶ基準株であるＣＶ７７７の完全ゲノムとの比較は、ＣＯ／１３が、１ｎｔの挿入（４８位における）、および５’ＵＴＲ内の、５ヌクレオチドの欠失（７３および８３〜８６位）を含有することを裏付ける。この北米ウイルスは、ゲノム位置２０，６９６〜２１，１２５のＳ１内で、相違の増大を呈し、８２％のヌクレオチド同一性を共有するに過ぎず、いくつかの挿入／欠失を伴う。
それらのゲノム配列、送達方式、および有効性が異なる、いくつかのＰＥＤＶワクチンが開発されている。ＰＥＤＶの流行が甚大であったアジア諸国では、欧州ＣＶ７７７株の細胞培養適応物が使用されている。これらは、１９９０年代以来、使用されている。
【００１３】
１９８０年代初頭に、日本の研究者らが、病原性のＰＥＤウイルス株８３Ｐ−５を、感染したブタの下痢から分離した。Kusanagi et al. 1989は、Ｖｅｒｏ細胞内で、株を分離し、適応させた。日本では、１９９７年以来、雌ブタにおいて、細胞培養物適応型ＰＥＤＶ（Ｐ−５Ｖ）（８３Ｐ−５）による弱毒化ウイルスワクチンが使用されている。第１００継代の８３Ｐ−５株が、弱毒化ＰＥＤＶワクチンとしての使用のために、日本の日生研株式会社に対して認可された（Sato et al. 2011）。８３Ｐ−５株の適応および緩和は、弱毒化ＤＲ１３株のＳタンパク質との配列類似性を伴うＳタンパク質の細胞外部分において、突然変異を示したことが報告されている（Sato et al. 2011；第１００継代の株である８３Ｐ−５のスパイク遺伝子配列を参照されたい；ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ５４８６２１．１）。この後発の日本製のワクチンは、効果的であると考えられるが、全ての雌ブタが、免疫を、それらの仔ブタへと受け渡すことが可能なわけではなかった（Usami et al. 1998）。日本株および欧州株は、ゲノグループＧ１ａまたはＧ１ｂのメンバーである。上記で論じた通り、これらの弱毒化ワクチン株の、これらと相違する北米株に対する類縁性は、ゲノグループ２ａの新興中国株に対する類縁性より小さい。
【００１４】
弱毒化させたゲノグループＧ１ｂのメンバーである、韓国ＰＥＤＶ株のＤＲ１３（継代レベル１００）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＪＱ０２３１６２．１）による経口ワクチン接種は、ワクチンとして効果的であることが示されている。ウイルス性株ＤＲ１３は、大韓民国では、２００４年以来、経口ワクチンとして、認可され、使用され、２０１１年、フィリピンにおいて、登録され、市販化された（Song and Park 2012）。しかし、弱毒化ＤＲ１３は、抗原投与された仔ブタにおけるウイルス排出の持続期間を、それほど変更しないことが報告されていることから、免疫防御は、不完全であることが指し示される。さらに、高度に弱毒化させたＰＥＤＶによる経口免疫化だけが、極めて高量のワクチン用量で、防御を付与した（Song and Park 2012）。
【００１５】
他の公知のワクチンは、死滅させたＰＥＤＶワクチンと、ＴＧＥＶワクチンとの組合せである、ＳＵＩＳＨＯＴ（登録商標）ＰＴ−１００（ＣｈｏｏｎｇＡｎｇ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓｏｕｔｈ  Ｋｏｒｅａ）、および死滅させたＰＥＤＶワクチンである、ＳＵＩＳＨＯＴ（登録商標）ＰＥＤを含む。ＣｈｏｏｎＡｎｇ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓにより提供されている株および亜型は、未知である。また、別の大韓民国企業である、Ｋｏｍｉｐｈａｒｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏ．も、ＰＲＯ−ＶＡＣ（登録商標）という商標名の下で市販されている、一連の、死滅させたワクチン、生ワクチン、および組合せワクチンであって、ゲノグループＧ１ａのＰＥＤＶ株であるＳＭ９８Ｐを含むワクチンを提供している。中国のＱｉｌｕ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｆａｃｔｏｒｙもまた、中国において、株および亜型が未知であるＰＥＤＶおよびＴＧＥＶを含有する、死滅させた組合せワクチンを市販している。
【００１６】
ブタデルタコロナウイルスであるＳＤＣｏＶまたはＳＤＣＶとしてもまた公知であり、本明細書では、互換的に使用される、新興のブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）は、ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）と類似し、新生仔動物における罹患に関与することが多く、地球規模の拡大、および疾患の、養豚業に対する影響に寄与している。ＰＤＣｏＶは、ＰＥＤＶから短時日のうちに、同様の罹患パターンで米国を襲った。米国では、ＰＥＤＶと異なり、デルタコロナウイルスは、仔ブタにおいて、死亡を引き起こさないが、仔ブタにおいて、重度の下痢、嘔吐、および体重の減少を含む急性罹患を引き起こす。ＰＥＤＶ感染より軽度であるが、ＰＤＣｏＶ感染は、新生仔において、３０〜４０％の死亡率を結果としてもたらす。ＰＥＤＶ、ロタウイルス、およびＴＧＥＶとの共感染では、より重度の疾患を見ることができる（Marthaler et al., 2014a；およびWang et al. 2014）。加えて、２０１５年５月には、第３の新たな病原体である、ブタオルトレオウイルス（ＰＯＲＶ）が、米国で検出され、共感染において存在する場合、潜在的に、疾患の重症度に寄与している。ＰＤＣｏＶおよび他の共感染作用物質の発症機序および臨床への含意については、より多くの知見が必要とされるが、この近年における、ＰＥＤＶと、ＰＤＣｏＶとの共勃興は、疾患の重症度、および群れに対する影響を、潜在的に強化している。
【００１７】
ブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）とは、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ科、デルタコロナウイルス属のメンバーである。ＰＤＣｏＶウイルスは、２００９年に回収された、Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ  ＳＡＲの、ブタ直腸内スワブ試料の間で、最初に同定された（Woo, P.C., et al., Discovery of seven novel Mammalian and avian coronaviruses in the genus deltacoronavirus supports bat coronaviruses as the gene source of alphacoronavirus and betacoronavirus and avian coronaviruses as the gene source of gammacoronavirus and deltacoronavirus. J Virol, 2012. 86(7): p. 3995-4008）が、疾患と関連することは知られていなかった。本明細書ではＰＤＣｏＶと称する、ＳＤＣＶは、２０１４年２月に、米国オハイオ州およびインディアナ州のブタの群れにおいて、最初に検出され、他の州へと、急速に拡大した（Hu, H., et al., Isolation and Characterization of Porcine Deltacoronavirus from Pigs with Diarrhea in the United States. J Clin Microbiol, 2015. 53(5): p. 1537-1548; Chen, Q., et al., Pathogenicity and pathogenesis of a United States porcine deltacoronavirus cell culture isolate in 5-day-old neonatal piglets. Virology, 2015. 482: p. 51-59; Li, G., et al., Full-Length Genome Sequence of Porcine Deltacoronavirus Strain USA/IA/2014/8734. Genome Announc, 2014. 2(2); Marthaler, D., et al., Rapid detection, complete genome sequencing, and phylogenetic analysis of porcine deltacoronavirus. Emerg Infect Dis, 2014a. 20(8): p. 1347-50; Marthaler, D., et al., Complete Genome Sequence of Strain SDCV/USA/Illinois121/2014, a Porcine Deltacoronavirus from the United States. Genome Announc, 2014b. 2(2); Wang, L., B. Byrum, and Y. Zhang, Detection and genetic characterization of deltacoronavirus in pigs, Ohio, USA, 2014. Emerg Infect Dis, 2014. 20(7): p. 1227-30; Jung, K., et al., Pathogenicity of 2 porcine deltacoronavirus strains in gnotobiotic pigs. Emerg Infect Dis, 2015. 21(4): p. 650-4）。ＰＤＣｏＶはまた、２０１４年４月における韓国（Lee, S. and C. Lee, Complete Genome Characterization of Korean Porcine Deltacoronavirus Strain KOR/KNU14-04/2014. Genome Announc, 2014. 2(6)）、中国本土（Dong, N., et al., Porcine Deltacoronavirus in Mainland China. Emerg Infect Dis, 2015. 21(12): p. 2254-5；およびSong, D., et al., Newly Emerged Porcine Deltacoronavirus Associated With Diarrhoea in Swine in China: Identification, Prevalence and Full-Length Genome Sequence Analysis. Transbound Emerg Dis, 2015. 62(6): p. 575-80）、および日本（ISERPD 2015）でも検出された。
【００１８】
同定の後、３つの研究グループは、細胞培養物由来の材料および／または臨床症例に由来する組織ホモジネートによる感染が、ノトバイオートおよび／または従来の仔ブタにおける、急性の消化管臨床徴候を結果としてもたらすことを確認した（Chen et al., 2015; Ma, Y., et al., Origin, evolution, and virulence of porcine deltacoronaviruses in the United States. MBio, 2015. 6(2)；およびVitosh-Sillman, S., et al. Histopathological and immunohistochemical characterization of pigs experimentally infected with porcine deltacoronavirus. in American Association of Swine Veterinarians. 2015. Orlando, FL）。ＰＤＣｏＶは、臨床徴候の発生８〜９日間後の分娩舎内の雌ブタおよび仔ブタにおいて、嘔吐および脱水と共に（Ma et al. 2015）、急性下痢を引き起こすことが示されている（Li et al. 2014）。ＰＤＣｏＶウイルスは、ブタ腸コロナウイルス（ＰＥＤＶ）、ブタ伝染性胃腸炎コロナウイルス（ＴＧＥＶ）、およびブタオルトレオウイルス（ＰＯＲＶ）と同様の臨床徴候および臨床症状を示す。
【００１９】
Ｍａｒｘら（ＷＯ２０１６００７５７Ａ２）による近年の開示は、ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）およびＰＤＣｏＶにより引き起こされる疾患から、ブタを防御するとされる免疫原性組成物について記載する。しかし、ＭａｒｘらによるＰＥＤＶワクチンは、北米コロラド株ウイルスに基づき、弱毒化欧州ＩＮＤＥＬ株Ｃａｌａｆ１４（対照動物において、わずかに２３．８％の死亡率を引き起こす）により抗原投与された場合に、部分的に防御性（例えば、死亡、体重の減少、または下痢といった臨床症状のわずかな軽減）であるに過ぎないことが明らかである。さらに、Ｍａｒｘらはまた、デルタコロナウイルスワクチンについても記載しているが、防御または疾患の臨床症状の軽減は、ＰＤＣｏＶの一価ワクチンまたはＰＥＤＶおよびＰＤＣｏＶの二価ワクチンのいずれによっても裏付けられなかった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
したがって、必要とされているのは、免疫化された動物におけるウイルス排出の軽減を含め、ＰＥＤＶおよびＰＤＣｏＶにより引き起こされる疾患の臨床徴候の軽減、ならびに免疫化された動物における防御性免疫の誘導が可能なＰＥＤＶワクチンおよびＰＤＣｏＶワクチンである。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明は、当技術分野における欠点を克服する、免疫原性組成物、ワクチン、および関連する方法を提供する。本発明は、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ科のエンベロープ型（＋）一本鎖ＲＮＡウイルス：ブタ流行性下痢ウイルスもしくはＰＥＤＶ、および／またはブタデルタコロナウイルスもしくはＰＤＣｏＶの、不活化／死滅形態および／または組換え形態を含む免疫原性組成物に関する。特に、本出願は、ＰＥＤＶおよびＰＤＣｏＶへの感染と関連する疾患を伴うブタにおける臨床症状を軽減する免疫原性組成物を提供する。本ＰＤＣｏＶ分離株（ＮＳＶＬ）（配列番号１および２）、ならびに分離株であるＰＤＣｏＶ  ２．０３０７およびＰＤＣｏＶ  ５．０３２７（それぞれ、配列番号５、６、９、および１０）は、他の北米株およびアジア株の遺伝子プロファイルと同様の遺伝子プロファイルを有する。本ＰＥＤＶ分離株であるＢＩ１２５１−１２５−１０（本明細書では、「１２５−１０」と称する）（配列番号２９、３２）は、ゲノグループ２ａについて報告された、他の北米ＰＥＤＶの遺伝子プロファイルと同様の遺伝子プロファイルを伴う、毒性北米ＲＮＡウイルス株である。ＰＥＤＶの派生的分離株である「１２５−１０  ｐ３０」（配列番号３４、３６）は、これもまた、北米ゲノグループ２ａと符合する遺伝子プロファイルを伴う、継代弱毒化ウイルスである。
【００２２】
本発明の免疫原性組成物およびワクチンは、不活化／死滅させたＰＤＣｏＶ（例えば、化学的に不活化させたＮＳＶＬ分離株（配列番号１および２）、および／または分離株であるＰＤＣｏＶ  ２．０３０７およびＰＤＣｏＶ  ５．０．３２７（それぞれ、配列番号５および６ならびに配列番号９および１０）、および／または不活化／死滅させたＰＥＤＶ（例えば、化学的に不活化させたＰＥＤＶ分離株である、「１２５−１０」または「１２５−１０  ｐ３０」（それぞれ、配列番号２９または３２および配列番号３３または３６））を含み、また、アジュバントも含むことが典型的である。ワクチンはまた、保存剤、抗微生物剤、安定化剤、例えば、ワクチン、エマルジョンの半減期を延長しうる安定化剤、および他のブタ病原体に由来する抗原などの他の構成要素も含みうる。
【００２３】
本発明の免疫原性組成物およびワクチンは、限定的な一例では、ＰＤＣｏＶスパイクタンパク質および／またはＰＥＤＶスパイクタンパク質を発現させる組換えバキュロウイルスを介して、昆虫細胞内で発現させたスパイク抗原、例えば、ＰＤＣｏＶスパイクタンパク質（例えば、配列番号４、８、１２、１８、または２８のアミノ酸配列をコードする、配列番号３、７、１１、１７、または２７の核酸配列を含む）、および／またはアミノ酸配列（配列番号３１、３５、４７、または５３）をコードするＰＥＤＶスパイクの核酸配列（配列番号３０、３４、４６、または５２を含む）を含み、また、アジュバントも含むことが典型的である。ワクチンはまた、保存剤、安定化剤、および他のブタ病原体に由来する抗原などの他の構成要素も含みうる。
【００２４】
本発明における使用に適する、好ましいＰＤＣｏＶスパイクおよび／またはＰＥＤＶスパイクの核酸配列は、スパイクポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、配列番号３、７、１１、１７、もしくは２７のＰＤＣｏＶスパイクポリペプチド、もしくはこれらの機能的な断片、および／または配列番号３０、３４、４６、もしくは５２のＰＥＤＶスパイク、もしくこれらの機能的な断片に対する、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、または８９％、より好ましくは、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、または９４％の配列同一性を有し、最も好ましくは、少なくとも９５％、９６％、９６．１％、９６．２％、９６．３％、９６．４％、９６．５％、９６．６％、９６．７％、９６．８％、９６．９％、９７％、９７．１％、９７．２％、９７．３％、９７．４％、９７．４１％、９７．４２％、９７．４３％、９７．４４％、９７．４５％、９７．４６％、９７．４７％、９７．４８％、９７．４９％、９７．５％、９７．５１％、９７．５２％、９７．５３％、９７．５４％、９７．５５％、９７．５６％、９７．５７％、９７．５８％、９７．５９％、９７．６％、９７．６１％、９７．６２％、９７．６３％、９７．６４％、９７．６５％、９７．６６％、９７．６７％、９７．６８％、９７．６９％  ９７．７％、９７．７１％、９７．７２％、９７．７３％、９７．７４％、９７．７５％、９７．７６％、９７．７７％、９７．７８％、９７．７９％、９７．８％、９７．８１％、９７．８２％、９７．８３％、９７．８４％、９７．８５％、９７．８６％、９７．８７％、９７．８８％、９７．８９％、９７．９％、９７．９１％、９７．９２％、９７．９３％、９７．９４％、９７．９５％、９７．９６％、９７．９７％、９７．９８％、９７．９９％、９８％、９８．０１％、９８．０２％、９８．０３％、９８．０４％、９８．０５％、９８．０６％、９８．０７％、９８．０８％、９８．０９％、９８．１％、９８．１１％、９８．１２％、９８．１３％、９８．１４％、９８．１５％、９８．１６％、９８．１７％、９８．１８％、９８．１９％、９８．２％、９８．２１％、９８．２２％、９８．２３％、９８．２４％、９８．２５％、９８．２６％、９８．２７％、９８．２８％、９８．２９％、９８．３％、９８．３１％、９８．３２％、９８．３３％、９８．３４％、９８．３５％、９８．３６％、９８．３７％、９８．３８％、９８．３９％、９８．４％、９８．４１％、９８．４２％、９８．４３％、９８．４４％、９８．４５％、９８．４６％、９８．４７％、９８．４８％、９８．４９％、９８．５％、９８．５１％、９８．５２％、９８．５３％、９８．５４％、９８．５５％、９８．５６％、９８．５７％、９８．５８％、９８．５９％、９８．６％、９８．６１％、９８．６２％、９８．６３％、９８．６４％、９８．６５％、９８．６６％、９８．６７％、９８．６８％、９８．６９％、９８．７％、９８．７１％、９８．７２％、９８．７３％、９８．７４％、９８．７５％、９８．７６％、９８．７７％、９８．７８％、９８．７９％、９８．８％、９８．８１％、９８．８２％、９８．８３％、���８．８４％、９８．８５％、９８．８６％、９８．８７％、９８．８８％、９８．８９％、９８．９％、９８．９１％、９８．９２％、９８．９３％、９８．９４％、９８．９５％、９８．９６％、９８．９７％、９８．９８％、９８．９９％、９９％、９９．０１％、９９．０２％、９９．０３％、９９．０４％、９９．０５％、９９．０６％、９９．０７％、９９．０８％、９９．０９％、９９．１％、９９．１１％、９９．１２％、９９．１３％、９９．１４％、９９．１５％、９９．１６％、９９．１７％、９９．１８％、９９．１９％、９９．２％、９９．２１％、９９．２２％、９９．２３％、９９．２４％、９９．２５％、９９．２６％、９９．２７％、９９．２８％、９９．２９％、９９．３％、９９．３１％、９９．３２％、９９．３３％、９９．３４％、９９．３５％、９９．３６％、９９．３７％、９９．３８％、９９．３９％、９９．４％、９９．４１％、９９．４２％、９９．４３％、９９．４４％、９９．４５％、９９．４６％、９９．４７％、９９．４８％、９９．４９％、９９．５％、９９．５１％、９９．５２％、９９．５３％、９９．５４％、９９．５５％、９９．５６％、９９．５７％、９９．５８％、９９．５９％、９９．６％、９９．６１％、９９．６２％、９９．６３％、９９．６４％、９９．６５％、９９．６６％、９９．６７％、９９．６８％、９９．６９％、９９．７％、９９．７１％、９９．７２％、９９．７３％、９９．７４％、９９．７５％、９９．７６％、９９．７７％、９９．７８％、９９．７９％、９９．８％、９９．８１％、９９．８２％、９９．８３％  ９９．８４％、９９．８５％、９９．８６％、９９．８７％、９９．８８％、９９．８９％、９９．９％、９９．９１％、９９．９２％、９９．９３％、９９．９４％、９９．９５％、９９．９６％、９９．９７％、９９．９８％、および９９．９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチドである。本明細書で使用される通り、「配列番号Ｘに対する配列同一性」または「同一な配列番号Ｘ」という用語は、それぞれ、「配列番号Ｘの長さにわたる、配列番号Ｘの配列との配列同一性」という用語または「配列番号Ｘの長さにわたり、配列番号Ｘの配列と同一である」と同義であることが、特に、理解される。
【００２５】
本発明における使用に適する、好ましいスパイクポリペプチドは、配列番号４、８、１２、１８、もしくは２８のＰＤＣｏＶスパイク、および／または配列番号４、８、１２、１８、２８、３１、３５、４７、および／もしくは５３との、少なくとも９０％の相同性、例えば、配列番号４、８、１２、１８、２８、３１、３５、４７、および／もしくは５３との、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の相同性など、配列番号４、８、１２、１８、２８、３１、３５、４７、および／もしくは５３との、少なくとも８０％の相同性、例えば、配列番号４、８、１２、１８、２８、３１、３５、４７、および／もしくは５３との、少なくとも８５％の相同性を有する配列番号３１、３５、４７、もしくは５３のＰＥＤＶスパイクに明示された配列を有するポリペプチドである。
【００２６】
本明細書では、「ワクチン」および「免疫原性組成物」という用語は、ワクチンを接種された動物における免疫応答を刺激することが可能な、投与可能な形態にある、任意の種類の生物学的薬剤を指すように、広義に規定される。ワクチンは一般に、ウイルス自体（例えば、死滅／不活化させるか、または弱毒化させたウイルス）に基づく場合もあり、ウイルスの免疫原性（抗原性）構成要素に基づく場合もある。本発明の一実施形態では、ワクチン（免疫原性組成物）は、好ましくは、死滅／不活化形態にあるウイルス性薬剤、またはサブユニットワクチンとして提示される、ウイルスの抗原性部分を含む。本明細書で、免疫原性組成物に言及して使用される場合の、「臨床症状の軽減」という用語は、問題となる疾患または状態と関連する症状のうちのいずれかを、緩和または改善すること（部分的または完全に）を指す。したがって、本免疫原性組成物による、ＰＤＣｏＶおよび／またはＰＥＤＶに感染したブタの臨床症状の軽減は、一般に、ウイルスの排出、ならびに／またはＰＤＣｏＶおよび／もしくはＰＥＤＶの感染と関連する臨床症状（例えば、１０日齢未満のブタにおける、急性水様便、急性嘔吐、脱水、食欲不振、嗜眠、抑うつ、および高死亡率）のうちの１もしくは複数の減少を結果としてもたらす。同様に、本免疫原性組成物による、ＰＤＣｏＶおよび／またはＰＥＤＶに感染したブタの臨床症状の軽減は、一般に、ウイルスの排出、ならびに／またはＰＤＣｏＶおよび／もしくはＰＥＤＶの感染と関連する臨床症状（例えば、１０日齢未満のブタにおける、急性水様便、急性嘔吐、脱水、食欲不振、嗜眠、抑うつ、および高死亡率）のうちの１もしくは複数の減少を結果としてもたらす。
【００２７】
当業者は、本明細書で使用される組成物を、公知の注射用の、生理学的に許容される滅菌溶液へと組み込みうることを理解するであろう。非経口注射または非経口注入のための、即時使用可能溶液を調製するために、水性等張性溶液、例えば、生理食塩液または血漿タンパク質溶液が、たやすく利用可能である。加えて、本発明の免疫原性組成物およびワクチン組成物は、獣医学的に許容可能な担体、希釈剤、等張性薬剤、安定化剤、またはアジュバントを含みうる。
【００２８】
本発明の方法は、単独で、または互いと組み合わせて、もしくは他の共感染と組み合わせて、対象において、ＰＤＣｏＶ感染および／またはＰＥＤＶ感染に対する免疫応答を惹起する方法であって、対象へと、不活化／死滅させたＰＤＣｏＶおよび／もしくはＰＥＤＶ、弱毒化させたＰＤＣｏＶおよび／もしくはＰＥＤＶ、ならびに／またはＰＤＣｏＶおよび／もしくはＰＥＤＶに由来する組換えスパイク抗原を含む免疫原性組成物を投与するステップを含む方法を含むがこれらに限定されない。好ましくは、免疫応答は、ＰＤＣｏＶまたはＰＥＤＶの、１つを超える血清型または株に対して惹起される。本発明の組成物を使用して、ＰＤＣｏＶ感染、ＰＥＤＶ感染、および／またはＰＥＤＶ／ＰＤＣｏＶ共感染を防止することができる。好ましくは、このような免疫応答は、１または複数のＰＤＣｏＶ遺伝子型および／またはＰＥＤＶ遺伝子型／ゲノグループの感染と関連するか、またはこれらにより引き起こされる、１または複数の臨床徴候の発生率または重症度を低減する。
【００２９】
本明細書では、本発明の組成物を投与しうる適切な対象、およびそれを必要とする対象は、ウイルスと関連する感染、疾患、または状態に対する予防的処置を必要とする動物を含む。本発明の組成物または方法の使用により免疫応答が刺激される動物は、ブタ、ウシなどの家畜、家禽類（例えば、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、またはシチメンチョウ）、ヤギ、およびヒツジ、ならびにマウス、ウサギ、イヌ、ネコ、およびウマなどの家畜を含む。好ましい動物は、ブタ科動物、ネズミ科動物、ウマ科動物、ウサギ目動物、およびウシ科動物を含む。最も好ましくは、免疫応答は、ブタにおいて刺激される。
【００３０】
本発明はまた、ＰＤＣｏＶ感染および／またはＰＥＤＶ感染と関連するか、またはこれらにより引き起こされる、１または複数の臨床徴候の発生率または重症度を軽減する方法であって、ＰＤＣｏＶおよび／またはＰＥＤＶへの感染の臨床徴候の発生率または重症度を、本明細書で提示される免疫原性組成物を施されなかった対象と比べて、少なくとも１０％、好ましくは、少なくとも２０％、なおより好ましくは、少なくとも３０％、なおより好ましくは、少なくとも５０％、なおより好ましくは、少なくとも７０％、最も好ましくは１００％軽減するように、不活化／死滅させたＰＤＣｏＶワクチン、不活化／死滅させたＰＥＤＶワクチンを含み、かつ／または本明細書で提示される、ＰＤＣｏＶおよび／もしくはＰＥＤＶに由来する組換えスパイク抗原と、好ましくは、担体分子と組み合わせた、本発明の免疫原性組成物を投与するステップを含む方法も提供する。このような臨床徴候は、水様便、嘔吐、および脱水を含む。これらの臨床徴候のうちのいずれかは、２ａのゲノグループ、またはＧ１ａ、Ｇ１ｂ、もしくはＧ２ｂを含む、他の任意のＰＥＤＶゲノグループを有するＰＥＤＶの感染から生じうる。同様に、これらの臨床徴候のうちのいずれかは、多様な遺伝子型のＰＤＣｏＶの感染および／または共感染からも生じうる。
【００３１】
一実施形態では、本免疫原性組成物は、ＰＤＣｏＶの化学的不活化形態を含む。化学的に不活化させたＰＤＣｏＶウイルス（配列番号１または２、５または６、９または１０）を含むワクチンが、特に所望される。加えて、本免疫原性組成物は、ＰＥＤＶの化学的不活化形態を含みうる。化学的に不活化させたＰＥＤＶウイルス（配列番号２９または３２または配列番号３３または３６）を含むワクチンが、特に所望される。当業者に公知の、様々な化学的不活化剤を利用して、ウイルスを不活化させることができる。エチレンイミン、ならびにバイナリーエチレンイミン（「ＢＥＩ」）およびアセチルエチレンイミンなど、類縁の誘導体は、ＳＤＣｏウイルスおよび／またはＰＥＤウイルスの不活化における使用に適する化学的不活化剤の例である。他の化学的不活化剤、例えば、ベータ−プロピオラクトンまたはアルデヒド（ホルムアルデヒドおよびグルタルアルデヒドなど）もまた、ウイルスを不活化させるのに使用することができる。
【００３２】
本免疫原性組成物および／または本ワクチンは、一般に、特に、ウイルスを、鼻腔内投与が可能となるようにデザインする場合、生体接着特性を有することが所望されうるアジュバントを含む。適切なアジュバントの例は、架橋アクリル酸ポリマーなど、架橋されたオレフィン性不飽和カルボン酸ポリマーを含む。本明細書で使用される「架橋アクリル酸ポリマー」という用語は、混合物中の主要な単量体として、アクリル酸を含む、単量体混合物から形成されるポリマーおよびコポリマーを指す。適切な架橋アクリル酸ポリマーの例は、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）９３４ＰおよびＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）９７１（Ｂ．Ｆ．Ｇｏｏｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．、Ｃｌｅａｖｅｌａｎｄ、Ｏｈｉｏから市販されている）の商標名下で市販されている架橋アクリル酸ポリマーを含む。本ワクチンにおける使用に特に適する、１つのアジュバントは、約２０，０００ｃＰｓ（ｐＨ７．５における、１．０質量％の水溶液として、２０ｒｐｍで測定される）以下のブルックフィールド粘度を有する架橋アクリル酸ポリマーである。生体接着性アジュバントが所望される場合、切り出されたばかりのウサギ胃組織の２つの小片の間で測定される（米国特許第４，６１５，６９７号において記載された手順により決定される）、少なくとも約５０ダイン／ｃｍ２の生体接着特性を有するアジュバントを用いることが有利でありうる。
【００３３】
本発明はまた、対象を免疫化する方法であって、対象へと、本明細書で記載される免疫原性組成物のうちのいずれかを投与するステップを含む方法にも関する。
「〜を免疫化すること」という用語は、免疫化される対象への、免疫原性組成物の投与による能動的免疫化であって、これにより、このような免疫原性組成物に含まれる抗原に対する免疫応答を引き起こす能動的免疫化に関する。
【００３４】
好ましくは、免疫化は、群れの中の、特定のＰＤＣｏＶ感染単独、もしくはＰＥＤＶ感染と組み合わせた、特定のＰＤＣｏＶの発生率を低下させること、または特定のＰＤＣｏＶおよび／もしくはＰＥＤＶへの感染により引き起こされるか、もしくはこれと関連する、臨床徴候の重症度の軽減を結果としてもたらす。
【００３５】
さらに、本明細書で提示される免疫原性組成物による、それを必要とする対象の免疫化は、ＰＤＣｏＶおよび／またはＰＥＤＶへの感染により、対象の感染の防止を結果としてもたらす。なおより好ましくは、免疫化は、ＰＤＣｏＶおよび／またはＰＥＤＶへの感染に対する、有効で、長期持続的な、免疫学的応答を結果としてもたらす。前記期間は、２カ月間を超えて、好ましくは、３カ月間を超えて、より好ましくは、４カ月間を超えて、より好ましくは、５カ月間を超えて、より好ましくは、６カ月間を超えて持続することが理解されるであろう。免疫化は、免疫化された全ての対象において有効とは限らないことを理解されたい。
【００３６】
好ましくは、この文脈では、通常、すなわち、免疫化を伴わなければ、ＰＤＣｏＶ感染および／またはＰＥＤＶ感染により引き起こされるか、またはこれと関連する、臨床徴候を発症する対象の群れが想定される。群れの対象が、効果的に免疫化されたのかどうかは、当業者によって、さらなる煩雑さを伴わずに決定することができる。好ましくは、所与の群れの対象のうちの、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、さらにより好ましくは、少なくとも９５％における臨床徴候であり、最も好ましくは、１００％における臨床徴候を、発生率または重症度において、本発明の前に利用可能であった免疫原性組成物で免疫化されていないか、または免疫化されたが、その後、特定のＰＤＣｏＶおよび／またはＰＥＤＶに感染した対象と比較して、少なくとも１０％、より好ましくは、少なくとも２０％、さらにより好ましくは、少なくとも３０％、なおより好ましくは、少なくとも４０％、さらにより好ましくは、少なくとも５０％、なおより好ましくは、少なくとも６０％、さらにより好ましくは、少なくとも７０％、なおより好ましくは、少なくとも８０％、さらにより好ましくは、少なくとも９０％、さらにより好ましくは、少なくとも９５％低下させ、最も好ましくは、１００％低下させたら、免疫化は、有効であるものとする。
【００３７】
ＰＤＣｏＶおよび／もしくはＰＥＤＶにより引き起こされる臨床徴候を、それを必要とする対象において防止するための方法、またはブタを、ＰＤＣｏＶおよび／もしくはＰＥＤＶと関連する疾患に対して防御する方法は、不活化／死滅させたＰＤＣｏＶ、および／もしくは不活化／死滅させたＰＥＤＶ、ならびに／またはＰＤＣｏＶおよび／もしくはＰＥＤＶに由来するスパイク抗原を含有する免疫原性組成物および／またはワクチンを、ブタに投与するステップを含む。ワクチンは、鼻腔内投与、経口投与、および／または非経口（例えば、筋内）投与を含む、様々な方法を使用して投与することができる。方法の一実施形態では、例えば、不活化ＰＤＣｏＶおよび／または不活化ＰＥＤＶを含有する免疫原性組成物を、１回または複数回にわたり（例えば、２〜４週間間隔で）、筋内投与する。方法の別の実施形態では、例えば、不活化ＰＤＣｏＶおよび／または不活化ＰＥＤＶを含有するワクチンを、１回または複数回にわたり（例えば、２〜４週間間隔で）、経口投与する。代替的な実施形態では、経口投与は、ワクチンの、少なくとも１回の筋内投与に後続する場合もあり、かつ／またはこれに先行する場合もある（例えば、ワクチンの非経口投与の２〜４週間後に、かつ／またはこの前において）。疾患の症状の拡大に対して防御するために、所与の群れにおける、全てのブタに、所定の間隔でワクチン接種することが理想的である。
【００３８】
不活化／死滅させたＰＤＣｏＶワクチン、不活化／死滅させたＰＥＤＶワクチン、または組合せのＰＤＣｏＶ／ＰＥＤＶ免疫原性組成物を作製する方法もまた提供される。ＰＤＣｏＶを作製するために、方法は、典型的に、ブタ精巣細胞に、ＰＤＣｏウイルス、例えば、配列番号１または２、５または６、および９または１０のＰＤＣｏウイルスを接種するステップを含む。接種されたブタ精巣細胞を、一般に、少なくとも、ＣＰＥが観察されるまでインキュベートし、次いで、ＰＥＤウイルスを、インキュベートされた細胞から採取する。採取されたウイルス含有液を、バイナリーエチレンイミンなどの化学的不活化剤により処理して、不活化／死滅させたＰＤＣｏウイルスを形成することができる。不活化させたウイルスを、例えば、濃縮および他の構成要素とのブレンディングによりさらに加工して、市販用製剤を作製することが典型的である。例えば、不活化させたウイルスを含有する流体を濃縮し、アジュバントおよび／または１または複数の、他のブタ病原体に由来する抗原とブレンドすることができる。ＰＥＤＶを作製するために、方法は、典型的に、サル細胞に、ＰＥＤウイルス、例えば、配列番号２９または配列番号３３のＰＥＤウイルスを接種するステップを含む。接種されたサル細胞を、一般に、少なくとも、ＣＰＥが観察され、次いで、ＰＥＤウイルスが、インキュベートされた細胞から採取されるまでインキュベートする。採取されたウイルス含有液を、バイナリーエチレンイミンなどの化学的不活化剤により処理して、不活化／死滅させたＰＥＤウイルスを形成することができる。不活化させたウイルスを、例えば、濃縮および他の構成要素とのブレンディングによりさらに加工して、市販用製剤を作製することが典型的である。例えば、不活化させたウイルスを含有する流体を濃縮し、アジュバントおよび／または１または複数の、他のブタ病原体に由来する抗原とブレンドすることができる。
【００３９】
ＰＤＣｏＶスパイクタンパク質および／またはＰＥＤＶスパイクタンパク質を発現させる組換えバキュロウイルスを介して、昆虫細胞内で作出される、組換え発現スパイク抗原ワクチンを作製する方法もまた提供される。例示的な一実施形態における方法は、例えば、ＰＤＣｏＶスパイク−Ｆｃ抗原構築物（配列番号１７）、および／またはＰＤＣｏＶスパイクバキュロディスプレイ構築物（配列番号２７）、および／またはＰＥＤＶ  ２ａスパイク構築物（配列番号４６）、および／またはＰＥＤＶ  ２ｂスパイク構築物（配列番号５２）を含む、ＰＤＣｏＶスパイクコード配列（例えば、配列番号３、７、１１、１７、または２７）および／またはＰＥＤＶスパイクコード配列（配列番号３０、３４、４６、または５２）を、バキュロウイルスベクターへとクローニングするステップと、Ｓｆ９昆虫細胞に共トランスフェクトするステップとを含む。
【００４０】
本出願はまた、（１）ワクチンを、ブタに投与することが可能な分注器と；（２）化学的に不活化させたＰＤＣｏＶ、ならびに／または化学的に不活化させたＰＥＤＶ、ならびに／またはＰＤＣｏＶおよび／もしくはＰＥＤＶに由来する組換えスパイク抗原とを、組合せで含むキットであって、ＰＤＣｏＶおよび／またはＰＥＤＶと関連する疾患に対して防御することが可能なワクチンを含有するキットも対象とする。キットは、液滴、例えば、エアゾール、微粉化スプレー、および／または液滴としてのその内容物を分注することが可能な分注器と、例えば、鼻腔内投与および／または筋内投与された場合に、ＰＤＣｏＶおよび／またはＰＥＤＶと関連する疾患に対する防御が可能な形態のワクチンを含みうる。
【００４１】
本出願を通して、本文は、本組成物および／または関連する方法の、多様な実施形態に言及する。記載される多様な実施形態は、様々な例示的例を提示することを意図するものであり、代替的な種についての記載としてみなされるべきではない。そうではなくて、本明細書で提示される、多様な実施形態についての記載は、範囲が重複しうることに注意すべきである。本明細書で論じられる実施形態は、例示的なだけのものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【００４２】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明のある特定の態様をさらに裏付けるために組み入れられる。これらの図面のうちの１または複数を、本明細書に提示される具体的な実施形態についての詳細な記載と組み合わせて参照することにより、本発明をよりよく理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】ＰＤＣｏＶ分離株／株の、完全ゲノムヌクレオチドについての、近隣結合法による系統樹を示す図である。スケールは、ｐ距離を指し示す。ＧｅｎＢａｎｋ受託番号は、２文字の州コードまたは３文字の国コード（ＣＨＮ：中国、ＴＪＫ：タイ、ＬＡＯ：ラオス）と共に列挙される。
【図２】ＰＤＣｏＶ分離株／株の、スパイクアミノ酸についての、近隣結合法による系統樹を示す図である。スケールは、ｐ距離を指し示す。ＧｅｎＢａｎｋ受託番号は、２文字の州コードまたは３文字の国コード（ＣＨＮ：中国、ＴＪＫ：タイ、ＬＡＯ：ラオス）と共に列挙される。
【図３Ａ】ＰＤＣｏＶ  Ｓ１−ＩｇＧ２ａ  ＦｃバキュロウイルスＰＤＣｏＶ  Ｓ１−ＩｇＧ２ａ  Ｆｃのタンパク質マップについての概略図である。
【図３Ｂ】ＰＤＣｏＶＳ  ＢＤ  ＢａｃｕｌｏｄｉｓｐｌａｙバキュロウイルスＰＤＣｏＶＳ  ＢＤのタンパク質マップについての概略図である。
【図４】ＰＤＣｏＶプロトタイプ（群１、２、および４：それぞれ、ＢａｃｕｌｏＳ−ＢＤ−ＰＤＣｏＶ、全細胞ＰＤＣｏＶ、およびＢａｃｕｌｏＳ−ＦＣ−ＰＤＣｏＶ）についての、プラセボ（群３）と比較した、血清学研究を示す図である。
【図５】ＰＤＣｏＶプロトタイプによるワクチン接種後における、Ｓ１−ＩｇＧ２ａ−ＦｃベースのＥＬＩＳＡにより、プラセボ（群３）と比較して検出される血清学的応答（群１、２、および４：それぞれ、ＢａｃｕｌｏＳ−ＢＤ−ＰＤＣｏＶ、全細胞ＰＤＣｏＶ、およびＢａｃｕｌｏＳ−ＦＣ−ＰＤＣｏＶ）を示す図である。
【図６Ａ】ＰＥＤＶ  ２ａ  ＢＤ  Ｂａｃｕｌｏｄｉｓｐｌａｙバキュロウイルスタンパク質マップについての概略図である。
【図６Ｂ】ＰＥＤＶ  ２ｂ  ＢＤ  Ｂａｃｕｌｏｄｉｓｐｌａｙバキュロウイルスタンパク質マップについての概略図である。
【図７】ＰＥＤＶ  ＢＤ抗原投与の後における、群および日数ごとの生存率を示す図である。
【図８】ワクチン接種された動物におけるＩｇＡレベルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
本発明は、ＰＤＣｏＶおよび／もしくはＰＥＤＶの不活化／死滅形態、ならびに／または組換えにより発現させたＰＤＣｏＶスパイク抗原および／もしくはＰＥＤＶスパイク抗原を含む免疫原性組成物を提供する。免疫原性組成物は、ブタを、ＰＤＣｏＶおよび／またはＰＥＤＶと関連する疾患に対して防御するためにデザインされる。免疫原性組成物は典型的に、ＰＤＣｏＶおよび／またはＰＥＤＶの化学的不活化形態を含み、化学的に不活化／死滅させたＰＤＣｏＶウイルスおよび／または化学的に不活化／死滅させたＰＥＤＶウイルスを含む免疫原性組成物が、特に所望される。別の実施形態では、免疫原性組成物は、組換えにより発現させたＰＤＣｏＶスパイク抗原および／またはＰＥＤＶスパイク抗原であって、例えば、ＰＤＣｏＶスパイクタンパク質および／またはＰＥＤＶスパイクタンパク質を発現させる組換えバキュロウイルスを介して、昆虫細胞内で作出されたスパイク抗原を含む。
【００４５】
一般に、本発明は、ブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）の１または複数の抗原と、アジュバントとを含む免疫原性組成物であって、ブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）が、ａ）配列番号１、５、もしくは９によりコードされ、かつ／または配列番号１、５、もしくは９の配列を含み、かつ／または配列番号１、５、もしくは９のＲＮＡ同等物を含む、任意のＰＤＣｏＶ；ｂ）その配列が、配列番号１、５、もしくは９と、少なくとも９９％同一であり、かつ／または配列番号１、５、もしくは９のＲＮＡ同等物と、少なくとも９９％同一である、任意のＰＤＣｏＶ；ｃ）そのスパイクタンパク質が、配列番号３、７、または１１の核酸配列によりコードされる、任意のＰＤＣｏＶ；ｄ）そのスパイクタンパク質が、配列番号３、７、または１１と、少なくとも９０％同一な核酸配列によりコードされる、任意のＰＤＣｏＶ；ｅ）配列番号２、６、または１０によりコードされる、任意のＰＤＣｏＶ；またはｆ）その配列が、配列番号２、６、または１０と、少なくとも９９％同一である、任意のＰＤＣｏＶである免疫原性組成物を提供する。
【００４６】
上記の文章に従う免疫原性組成物の具体的な態様では、アジュバントは、水中油エマルジョンである。
本発明のさらに具体的な態様では、免疫原性組成物は、上記の文のうちのいずれかにおいて記載された通りであり、この場合、免疫原性組成物は、組換え抗原または不活化させた全ブタデルタコロナウイルスＰＤＣｏＶ抗原である。
本発明のさらに具体的な態様では、免疫原性組成物は、上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された通りであり、この場合、抗原は、不活化させた全ＰＤＣｏＶ抗原である。
本発明のさらに具体的な態様では、免疫原性組成物は、上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された通りであり、この場合、ＰＤＣｏＶ抗原は、化学的に不活化されている。
【００４７】
本発明のさらに具体的な態様では、免疫原性組成物は、上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された通りであり、この場合、ＰＤＣｏＶ抗原は、エチレンイミン、バイナリーエチレンイミン、アセチルエチレンイミン、およびこれらの混合物からなる群から選択される化合物を含む化学的不活化剤による処置により化学的に不活化されている。
本発明のさらに具体的な態様では、免疫原性組成物は、上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された通りであり、この場合、ＰＤＣｏＶは、バイナリーエチレンイミンによる処置により化学的に不活化されている。
本発明のさらに具体的な態様では、免疫原性組成物は、上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された通りであり、この場合、アジュバントは、ＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（登録商標）水中油エマルジョンベースのアジュバントである。
【００４８】
本発明のさらに具体的な態様では、免疫原性組成物は、上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された通りであり、この場合、不活化させたブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）は、配列番号１、５、もしくは９を含み、かつ／または配列番号１、５、もしくは９のＲＮＡ同等物を含む。
本発明のさらに具体的な態様では、免疫原性組成物は、上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された通りであり、この場合、ＰＤＣｏＶ抗原は、組換え抗原である。
本発明のさらに具体的な態様では、免疫原性組成物は、上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された通りであり、この場合、組換え抗原は、ａ）ブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）スパイクタンパク質の抗原をコードする単離核酸であって、組換えスパイクポリペプチドが、配列番号４、８、１２、１８、または２８と、少なくとも９０％の相同性を有する単離核酸；ｂ）ａ）の単離核酸を含む組換えベクター；ｃ）ａ）の核酸によりコードされる組換えＰＤＣｏＶスパイクタンパク質；およびｄ）これらの任意の組合せ
からなる群から選択される、１または複数の免疫原性構成要素を含む。
【００４９】
本発明のさらに具体的な態様では、免疫原性組成物は、上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された通りであり、この場合、このような免疫原性組成物は、薬学的に許容可能な担体および／または賦形剤を含む。
本発明のさらに具体的な態様では、免疫原性組成物は、上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された通りであり、この場合、水中油エマルジョンは、ＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（登録商標）水中油エマルジョンベースのアジュバントである。
本発明のさらに具体的な態様では、免疫原性組成物は、上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された通りであり、この場合、免疫原性組成物は、１または複数のさらなる抗原をさらに含む。
【００５０】
本発明のさらに具体的な態様では、免疫原性組成物は、上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された通りであり、この場合、さらなる抗原は、ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）の抗原であり、この場合、ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）は、ａ）配列番号２９もしくは３３によりコードされ、かつ／または配列番号２９もしくは３３の配列を含み、かつ／または配列番号２９もしくは３３のＲＮＡ同等物を含む、任意のＰＥＤＶ；ｂ）その配列が、配列番号２９もしくは３３と、少なくとも９９％同一であり、かつ／または配列番号２９もしくは３３のＲＮＡ同等物と、少なくとも９９％同一である、任意のＰＥＤＶ；ｃ）そのスパイクタンパク質が、配列番号３０、３４、４６、または５２の核酸配列によりコードされる、任意のＰＥＤＶ；ｄ）そのスパイクタンパク質が、配列番号３０、３４、４６、または５２と、少なくとも９０％同一な核酸配列によりコードされる、任意のＰＥＤＶ；ｅ）配列番号３２または３６によりコードされる、任意のＰＥＤＶ；またはｆ）配列番号３２または３６と、少なくとも９９％同一な配列によりコードされる、任意のＰＥＤＶである。
【００５１】
本発明のさらに具体的な態様では、免疫原性組成物は、上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された通りであり、この場合、さらなるＰＥＤＶ抗原は、組換え抗原または不活化させた全ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）である。
本発明のさらに具体的な態様では、免疫原性組成物は、上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された通りであり、この場合、抗原は、不活化させた全ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）である。
本発明のさらに具体的な態様では、免疫原性組成物は、上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された通りであり、この場合、抗原は、組換えＰＥＤＶ抗原である。
【００５２】
本発明のさらに具体的な態様では、免疫原性組成物は、上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された通りであり、この場合、組換え抗原は、ａ）ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）スパイクタンパク質の抗原をコードする単離核酸であって、抗原が、配列番号３１、３５、４７、または５３と、少なくとも９０％の相同性を有する単離核酸；ｂ）ａ）の単離核酸を含む組換えベクター；ｃ）ａ）の核酸によりコードされる組換えＰＥＤＶスパイクタンパク質；およびｄ）これらの任意の組合せからなる群から選択される、１または複数の免疫原性構成要素を含む。
本発明のさらに具体的な態様では、免疫原性組成物は、上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された通りであり、この場合、組換え抗原は、ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）の構造タンパク質Ｍ、Ｅ、またはＮからなる群から選択される、１または複数の免疫原性構成要素を含む。
【００５３】
本発明のさらに具体的な態様では、免疫原性組成物は、上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された通りであり、この場合、免疫原性構成要素は、単離核酸である。
本発明のさらに具体的な態様では、免疫原性組成物は、上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された通りであり、この場合、免疫原性構成要素は、組換えベクターである。
本発明のさらに具体的な態様では、免疫原性組成物は、上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された通りであり、この場合、免疫原性構成要素は、組換えブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）スパイクタンパク質である。
【００５４】
本発明のさらに具体的な態様では、免疫原性組成物は、上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された通りであり、この場合、免疫原性構成要素は、組合せである。
本発明は、ブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）と関連する疾患の臨床症状を軽減するための方法であって、ブタへと、上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された免疫原性組成物を投与するステップを含む方法にさらに関する。
本発明のさらに具体的な態様では、方法は、上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された通りであり、ブタへと、不活化させた全ＰＤＣｏＶ抗原を含む免疫原性組成物を投与するステップを含む。
本発明のさらに具体的な態様では、方法は、上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された通りであり、ブタへと、組換え抗原としてのＰＤＣｏＶ抗原を含む免疫原性組成物を投与するステップを含む。
【００５５】
本発明のさらに具体的な態様では、方法は、上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された通りであり、この場合、このような、投与された免疫原性組成物は、ａ）配列番号１の配列によりコードされ、かつ／または配列番号１、５、もしくは９を含み、かつ／または配列番号１、５、もしくは９のＲＮＡ同等物を含む、任意の免疫原性構成要素；ｂ）その配列が、配列番号１、５、もしくは９と、少なくとも９９％同一であり、かつ／または配列番号１、５、もしくは９のＲＮＡ同等物と、少なくとも９９％同一である、任意の免疫原性構成要素；ｃ）そのスパイクタンパク質が、配列番号３、７、１１、１７、２７の核酸配列によりコードされる、任意の免疫原性構成要素；ｄ）そのスパイクタンパク質が、配列番号３、７、１１、１７、または２７と、少なくとも９０％同一な核酸配列によりコードされる、任意の免疫原性構成要素；ｅ）配列番号２、６、または１０によりコードされる、任意の免疫原性構成要素；およびｆ）その配列が、配列番号２、６、または１０と、少なくとも９９％同一である、任意の免疫原性構成要素
からなる群から選択される、１または複数の免疫原性構成要素を含む。
【００５６】
本発明のさらに具体的な態様では、方法は、上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された通りであり、この場合、このような、投与された免疫原性組成物は、ａ）配列番号１、５、または９の配列によりコードされるか、またはこれを含む、任意の免疫原性構成要素；ｂ）その配列が、配列番号１、５、または９と、少なくとも９９％同一である、任意の免疫原性構成要素；ｄ）そのスパイクタンパク質が、配列番号３、７、１１、１７、または２７の核酸配列によりコードされる、任意の免疫原性構成要素；およびｅ）そのスパイクタンパク質が、配列番号３、７、１１、１７、または２７と、少なくとも９０％同一な核酸配列によりコードされる免疫原性構成要素からなる群から選択される、１または複数の免疫原性構成要素を含む。
本発明のさらに具体的な態様では、方法は、上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された通りであり、この場合、このような、投与された免疫原性組成物は、ａ）ブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）スパイクタンパク質の抗原をコードする単離核酸であって、組換えスパイクポリペプチドが、配列番号４、８、１２、１８、または２８と、少なくとも９０％の相同性を有する単離核酸；ｂ）ａ）の単離核酸を含む組換えベクター；ｃ）ａ）の核酸によりコードされる、組換えブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）スパイクタンパク質；およびｄ）これらの任意の組合せからなる群から選択される、１または複数の免疫原性構成要素を含む組換え抗原を含む。
【００５７】
本発明は、ブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）およびブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）と関連する疾患の臨床症状を軽減するための方法であって、ブタへと、上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された免疫原性組成物のうちのいずれかの免疫原性組成物であって、好ましくは、ＰＤＣｏＶの、１または複数の抗原と、１または複数のさらなる抗原とを含み、さらなる抗原が、ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）の抗原である、免疫原性組成物を投与するステップを含む方法にさらに関する。
【００５８】
本発明のさらに具体的な態様では、方法は、上記の文章において記載された通りであり、このようなブタへと、免疫原性組成物を投与するステップを含み、この場合、さらなるＰＥＤＶ抗原は、組換え抗原または不活化させた全ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）である。
本発明のさらに具体的な態様では、方法は、上記の文章において記載された通りであり、このようなブタへと、上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された免疫原性組成物を投与するステップを含む。
本発明は、ブタにおいて、ブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）と関連する疾患に対する免疫原性応答を誘導するためのキットであって、ａ）免疫原性組成物を、ブタに投与することが可能な分注器；およびｂ）上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された免疫原性組成物を含むキットにさらに関する。
【００５９】
本発明は、ブタにおいて、ブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）と関連する疾患に対する免疫原性応答を誘導するためのキットであって、ａ）免疫原性組成物を、ブタに投与することが可能な分注器；およびｂ）上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された免疫原性組成物であって、より具体的には、抗原が、不活化させた全ＰＤＣｏＶ抗原であり、なおより具体的には、ＰＤＣｏＶ抗原が、化学的に不活化されており；より具体的には、ＰＤＣｏＶ抗原が、エチレンイミン、バイナリーエチレンイミン、アセチルエチレンイミン、およびこれらの混合物からなる群から選択される化合物を含む化学的不活化剤による処置により化学的に不活化されており；好ましくは、ＰＤＣｏＶが、バイナリーエチレンイミンによる処置により化学的に不活化されており；より具体的には、アジュバントが、ＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（登録商標）水中油エマルジョンベースのアジュバントであり；なおより好ましくは、不活化させたブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）が、配列番号１、５、もしくは９を含み、かつ／または配列番号１、５、もしくは９のＲＮＡ同等物を含む免疫原性組成物を含むキットにさらに関する。
【００６０】
本発明は、ブタにおいて、ブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）と関連する疾患に対する免疫原性応答を誘導するためのキットであって、ａ）免疫原性組成物を、ブタに投与することが可能な分注器；およびｂ）上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された免疫原性組成物であって、より具体的には、ＰＤＣｏＶ抗原が、組換え抗原であり、なおより具体的には、組換え抗原が、ａ）ブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）スパイクタンパク質の抗原をコードする単離核酸であって、組換えスパイクポリペプチドが、配列番号４、８、１２、１８、または２８と、少なくとも９０％の相同性を有する単離核酸；ｂ）ａ）の単離核酸を含む組換えベクター；ｃ）ａ）の核酸によりコードされる組換えＰＤＣｏＶスパイクタンパク質；およびｄ）これらの任意の組合せからなる群から選択される、１または複数の免疫原性構成要素を含み、なおより具体的には、薬学的に許容可能な担体および／または賦形剤を含み、なおより具体的には、水中油エマルジョンが、ＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（登録商標）水中油エマルジョンベースのアジュバントである免疫原性組成物を含むキットにさらに関する。
【００６１】
本発明は、ブタにおいて、ブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）およびブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）と関連する疾患に対する免疫原性応答を誘導するためのキットであって、ａ）免疫原性組成物を、ブタに投与することが可能な分注器；およびｂ）上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された免疫原性組成物であって、具体的には、さらなる抗原が、ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）であり、上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された、任意のＰＥＤＶ抗原である免疫原性組成物を含むキットにさらに関する。
【００６２】
本発明は、ブタにおいて、ブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）およびブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）と関連する疾患に対する免疫原性応答を誘導するためのキットであって、ａ）免疫原性組成物を、ブタに投与することが可能な分注器；およびｂ）上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された免疫原性組成物であって、具体的には、さらなる抗原が、ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）であり、上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された、任意の組換えＰＥＤＶ抗原、または任意の不活化全ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）である免疫原性組成物を含むキットにさらに関する。
本発明は、ブタにおいて、ブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）およびブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）と関連する疾患に対する免疫原性応答を誘導するためのキットであって、ａ）免疫原性組成物を、ブタに投与することが可能な分注器；およびｂ）上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された免疫原性組成物であって、具体的には、さらなる抗原が、上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された、任意の組換えＰＥＤＶ抗原である免疫原性組成物を含むキットにさらに関する。
【００６３】
本発明は、上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された、ブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）による免疫原性組成物を作製する方法であって、ａ）ブタ精巣細胞に、ブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）を接種するステップ；ｂ）接種されたブタ精巣細胞をインキュベートするステップ；ｃ）ブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）を、インキュベートされた細胞から採取するステップ；およびｄ）採取された細胞を、化学的不活化剤、好ましくは、エチレンイミン、バイナリーエチレンイミン、アセチルエチレンイミン、またはこれらの混合物からなる群から選択される化合物により処置して、不活化させたブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）抗原を形成するステップをさらに含む方法にさらに関する。
【００６４】
本発明のさらに具体的な態様では、方法は、上記の文章において記載された通りであり、この場合、ブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）は、さらなる特色：ａ）配列番号１、５、または９の配列によりコードされるか、またはこれらを含む配列、ｂ）配列番号１、５、または９と、少なくとも９９％同一な配列、ｃ）配列番号３、７、１１、１７、または２７の核酸配列によりコードされるスパイクタンパク質；ｄ）配列番号３、７、１１、１７、または２７と、少なくとも９０％同一な核酸配列によりコードされるスパイクタンパク質を含む。
本発明のさらに具体的な態様では、方法は、上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された通りであり、この場合、ブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）は、配列番号１、５、もしくは９、および／または配列番号１、５、もしくは９のＲＮＡ同等物という、さらなる特色を含む。
本発明のさらに具体的な態様では、方法は、上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された通りであり、この場合、ブタ精巣細胞は、ＡＩ−ＳＴ細胞である。
【００６５】
本発明のさらに具体的な態様では、方法は、上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された通りであり、この場合、化学的不活化剤は、バイナリーエチレンイミンを含む。
本発明のさらに具体的な態様では、方法は、上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された通りであり、水中油エマルジョンベースのアジュバントであるＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（登録商標）を、ブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）抗原へと添加するステップという、さらなる特色をさらに含む。
本発明は、前出の文のうちのいずれかにおいて記載された、組換えブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）抗原を含む免疫原性組成物を作製する方法であって、ａ）ブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）の抗原を、宿主細胞内で発現させるステップ、ｂ）ブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）細胞の抗原を採取するステップ；およびｃ）水中油エマルジョンベースのアジュバントを、ステップｂ）のブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）抗原へと添加するステップを含む方法にさらに関する。
【００６６】
本発明のさらに具体的な態様では、方法は、上記の文章において記載された通りであり、この場合、ブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）抗原は、ａ）ブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）スパイクタンパク質の抗原をコードする単離核酸であって、組換えスパイクポリペプチドが、配列番号３、７、１１、１７、または２７と、少なくとも９０％の相同性を有する単離核酸；ｂ）ａ）の単離核酸を含む組換えベクター；ｃ）ａ）の核酸によりコードされる、組換えブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）スパイクタンパク質；およびｄ）これらの任意の組合せを含む。
本発明のさらに具体的な態様では、方法は、上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された通りであり、この場合、ブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）の抗原を、組換えバキュロウイルスベクターにより発現させる。
本発明のさらに具体的な態様では、方法は、上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された通りであり、この場合、ブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）の抗原を、昆虫細胞内で発現させる。
【００６７】
本発明のさらに具体的な態様では、方法は、上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された通りであり、この場合、さらなる特色として、水中油ベースのアジュバントは、ＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（登録商標）水中油エマルジョンベースのアジュバントである。
本発明は、ブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）と関連する疾患の症状を軽減させるための使用のための、上記の文章のうちのいずれかにおいて記載されたＰＤＣｏＶを含む免疫原性組成物にさらに関する。
本発明は、ＰＤＣｏＶと、少なくとも１つのさらなる抗原とを含む免疫原性組成物であって、少なくとも１つのさらなる抗原が、ブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）および／またはブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）と関連する疾患の症状を軽減させるための使用のための、ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）の抗原である免疫原性組成物にさらに関する。
【００６８】
本発明のさらに具体的な態様では、免疫原性組成物は、上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された通りであり、ＰＥＤＶ遺伝子型２ａの、１または複数の抗原をさらに含み、具体的には、ＰＥＤＶは、北米由来である。
本発明のさらに具体的な態様では、免疫原性組成物は、上記の文章のうちのいずれかにおいて記載された通りであり、ＰＤＣｏＶの、１または複数の抗原をさらに含み、この場合、ＰＤＣｏＶは、北米由来である。
より一般的には、当業者に公知の、様々な化学的不活化剤を利用して、ウイルスを不活化させることができる。エチレンイミン、ならびにバイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）およびアセチルエチレンイミンなど、類縁の誘導体は、ＰＥＤウイルスの不活化における使用に適する化学的不活化剤の例である。他の化学的不活化剤、例えば、ベータ−プロピオラクトン、アルデヒド（ホルムアルデヒドなど）、および／または界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）界面活性剤、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ、またはアルキルトリメチルアンモニウム塩）もまた、ウイルスを不活化させるのに使用することができる。不活化は、当業者に公知の標準的な方法を使用して実施することができる。試料は、定期的な時間間隔で採取し、残存する生ウイルスについてアッセイすることができる。適切な細胞系における細胞変性効果のモニタリング、および／または適切な特異的モノクローナル抗体もしくは特異的ポリクローナル抗体による蛍光染色を使用して、残存する生ウイルスの存在を検出することができる。
【００６９】
ＢＥＩによる不活化は、ＢＥＩ原液（例えば、０．１〜０．２Ｍの２−ブロモエチルアミンヒドロブロミドを、０．１〜０．２ＮのＮａＯＨ水溶液へと添加することにより形成される溶液）を、ウイルス液と、ＢＥＩの最終濃度約１〜５ｍＭまで組み合わせることにより達することができる。不活化は一般に、ＢＥＩ−ウイルス混合物を、一定の混合を伴い、３５〜４０℃（例えば、３７℃）で、２４〜７２時間にわたり保持することにより実施する。ウイルスの不活化は、チオ硫酸ナトリウム溶液の、ＢＥＩ濃度に対して過剰となる最終濃度までの添加（例えば、過剰量のＢＥＩを中和するように、ＢＥＩ容量の１７％におけるチオ硫酸ナトリウムの添加）に続く混合により停止させることができる。
【００７０】
本免疫原性組成物は、通例、不活化／死滅させたＰＥＤＶと共に組み込まれたアジュバントと、所望の場合、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）界面活性剤など、１または複数の乳化剤とを含む。適切なアジュバントは、例えば、ビタミンＥ酢酸エステルソリュビリゼート、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、または酸化アルミニウム、（鉱物）油エマルジョン、非イオン性界面活性剤、スクアレン、およびサポニンを含む。使用されうる、他のアジュバントは、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）およびフロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）など、油ベースのアジュバントを含みうる。ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）９７１ポリマーなど、架橋されたオレフィン性不飽和カルボン酸ポリマーは、特に、本不活化ＰＥＤＶ免疫原性組成物における使用に適するアジュバントであることが見出されている。
【００７１】
適切な水中油エマルジョンの例は、ＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（登録商標）（水中油エマルジョン）、ＥＭＵＬＳＩＧＥＮ−Ｄ（登録商標）（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡ）を伴う水中油エマルジョン）、ＥＭＵＬＳＩＧＥＮ−Ｐ（登録商標）（特許権のある免疫刺激剤を伴う水中油エマルジョン）、ＥＭＵＬＳＩＧＥＮ−７５（登録商標）（架橋されたポリマーを伴う水中油エマルジョンから構成された二重アジュバント）、およびＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（登録商標）−ＢＣＬ（動物由来の構成要素を含まない水中油エマルジョン）（ＭＶＰ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｏｍａｈａ、Ｎｅｂｒ．、ＵＳＡ）など、ＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（登録商標）ベースのアジュバントである。不活化ＰＥＤＶタンパク質または組換えＰＥＤＶタンパク質を含む医薬／ワクチン組成物は、水中油エマルジョン、好ましくは、このようなＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（登録商標）ベースのアジュバント、より好ましくは、ＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（登録商標）（動物由来の構成要素を含まない水中油エマルジョン）およびＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（登録商標）−ＢＣＬ（動物由来の構成要素を含まない水中油エマルジョン）で、有効にアジュバント処理されている。
【００７２】
投与の容易さおよび投与量の均一性のために、本組成物を、単位剤形で製剤化することが、一般に有利である。本明細書で使用される単位剤形とは、処置される哺乳動物対象のための単位投与量として適する物理的に個別の単位であって、各単位が、要求される医薬担体と会合して、所望の治療効果をもたらすように計算された、所定数量の活性材料を含有する単位を指す。不活化／死滅させたＰＤＣｏＶおよび／もしくはＰＥＤＶ、ならびに／または組換えにより発現させたＰＤＣｏＶ抗原および／もしくはＰＥＤＶ抗原の単位剤形のための規格は、他にも因子はある中で、（ａ）活性材料の固有の特徴、および達成される特定の治療効果；（ｂ）疾患の処置のために、このような活性材料を組み合わせることの、当技術分野において固有の限界；ならびに（ｃ）単位剤形の、意図される投与方式により、かつ、これらに依存して指示される。
【００７３】
主要な有効成分は、簡便かつ有効な投与のために、本明細書で開示される単位剤形内に、適切な、薬学的に許容される担体を伴う有効量で組み合わされることが典型的である。単位剤形は、例えば、１〜約５相対効力単位（「ＲＰＵ」）の範囲の量の、ＰＤＣｏＶ抗原および／またはＰＥＤＶ抗原を含有しうる。この量の抗原は、一般に、担体１ｍｌ当たり約１〜約２５で存在する。補助的有効成分を含有する組成物の場合、投与量は、補助的有効成分の通例の用量および投与方式の参照により決定される。
【００７４】
本ワクチンは、典型的に、薬学的に許容される担体と共に製剤化された、不活化ＰＤＣｏＶおよび／または不活化ＰＥＤＶを含む。注射使用に適する医薬形態は、通常、滅菌水溶液（水溶性の場合）、または滅菌分散液、および滅菌注射用溶液もしくは滅菌注射用分散液を即席で調製するための滅菌粉末を含む。所望では、製剤は、滅菌であり、容易な注射針通過可能性が存在する程度に流体であるものとする。剤形は、製造条件下および保管条件下において安定であるものとし、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から防護されることが典型的である。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体のポリエチレングリコールなど）、これらの適切な混合物、および植物油を含有する、溶媒の場合もあり、分散媒の場合もある。１つの可能な担体は、生理学的塩溶液である。例えば、レシチンなどのコーティングを使用することにより、分散液の場合には要求される粒子サイズを維持することにより、かつ、界面活性剤を使用することにより、適正な流体性を維持することができる。微生物作用の防止は、多様な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール（エチル水銀チオサリチル酸ナトリウム）、デオマイシン、ゲンタマイシンなどによりもたらすことができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましいことがある。注射用組成物の遅延吸収は、所望の場合は、組成物中に吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを使用することによりもたらすことができる。
【００７５】
滅菌注射用溶液は、適切な溶媒中に、所望量の不活化ウイルスを、要求に応じて、上記で列挙した、他の多様な成分と共に組み込んだ後、濾過滅菌を施すことにより調製することができる。一般に、分散液は、多様な有効成分を、基本的な分散媒と、上記で列挙した成分に由来する、要求される他の成分とを含有する滅菌媒体へと組み込むことにより調製することができる。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製法は、有効成分に、任意のさらなる所望の成分を加えた粉末を、既に滅菌濾過されたその溶液から得る、真空乾燥法および凍結乾燥法である。
【００７６】
また、安定化剤を、本組成物へと添加して、不活化ウイルスの安定性を改善することも有利でありうる。適切な安定化剤は、例えば、グリセロール／ＥＤＴＡ、炭水化物（ソルビトール、マンニトール、トレハロース、デンプン、スクロース、デキストラン、またはグルコースなど）、タンパク質（アルブミンまたはカゼインなど）、およびタンパク質分解産物（例えば、部分的に加水分解されたゼラチン）を含む。所望の場合は、アルカリ金属のリン酸塩、例えば、リン酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素カリウム、および／またはリン酸二水素カリウムなどの試薬を使用して、製剤を、当技術分野で公知の方法により緩衝処理することができる。エタノールまたはプロピレングリコールなど、他の溶媒を使用して、ワクチン製剤中の成分の可溶性および／または溶液の安定性を増大させることができる。本製剤中で使用されうる、さらなる添加剤は、従来の抗酸化剤と、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など、従来のキレート剤とを含む。
本発明の組成物および方法は、本発明を例示し、当業者に、どのようにしてこれを作り、使用するのかを教示する一助となるように提示される、以下の例により例示することができる。これらの例は、いかなる形であれ、本発明の範囲を狭めるか、または他の形で限定することを意図するものではない。
【００７７】
本発明の実施は、そうでないことが指し示されない限りにおいて、当技術分野の技術の範囲内にある、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技術、タンパク質化学、および免疫学の従来の技法を利用するであろう。このような技法は、文献において説明されている。例えば、Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vols. I, II and III, Second Edition (1989); DNA Cloning, Vols. I and II (D. N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Animal Cell Culture (R. K. Freshney ed. 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL press, 1986); Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); the series, Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Protein purification methods - a practical approach (E.L.V. Harris and S. Angal, eds., IRL Press at Oxford University Press)；およびHandbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell eds., 1986, Blackwell Scientific Publications)を参照されたい。
【００７８】
本発明は、そのようなＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド配列、または工程パラメータは、当然ながら、変動しうるので、特定のＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド配列、または工程パラメータに限定されないことを理解されたい。また、本明細書で使用される用語法は、本発明の特定の実施形態を記載することだけを目的とするものであり、限定的であることを意図するものではないことも理解されたい。本明細書および付属の特許請求の範囲において使用される通り、そうでないことが文脈により明確に指示されない限りにおいて、単数形の「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」、および「その」とは、複数の指示対象を含むことに注意しなければならない。したがって、例えば、「ある抗原」に対する言及は、２つまたはこれを超える抗原の混合物を含み、「ある賦形剤」に対する言及は、２つまたはこれを超える賦形剤の混合物を含むなどである。
【００７９】
定義：
そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、出願時に本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。用語の意味および範囲は、明確なはずであるが、万一、なんらかの潜在的な曖昧さが生じた場合、本明細書で提示される定義が、任意の辞書または外部の定義に対して優先される。さらに、文脈により、そうでないことが要求されない限りにおいて、単数形の用語は、複数形を含み、複数形の用語は、単数形を含むものとする。本明細書では、そうでないことが言明されない限りにおいて、「または」の使用は、「および／または」を意味する。さらに、「〜を含むこと」という用語のほか、「〜を含む」および「含まれた」など、他の形態の使用は、限定的ではない。本明細書で参照される、全ての特許および刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００８０】
「疾患に対する防御」、「防御性免疫」、「機能的免疫」、および同様の語句は、疾患または感染へと曝露された、非免疫化対象において予測されるよりもわずかな有害作用を結果としてもたらす、１または複数の、本発明の治療用組成物またはこの組合せの投与により作り出される、疾患または状態に対する応答を意味する。すなわち、ワクチン接種された対象では、感染の有害作用の重症度が低下する。ワクチン接種された対象では、感染は、軽減される場合もあり、緩徐化される場合もあり、おそらくは、完全に防止される場合もある。本明細書では、感染の完全な防止が意図される場合、具体的に言明される。完全な防止が言明されない場合は、用語は、部分的防止を含む。
【００８１】
本明細書における「臨床徴候の発生率および／または重症度の軽減」または「臨床症状の軽減」とは、野生型感染と比較して、群内の感染した対象の数を低減すること、感染の臨床徴候を呈する対象の数を低減もしくは無化すること、または１もしくは複数の対象において存在する、任意の臨床徴候の重症度を軽減することを意味するがこれらに限定されない。例えば、本明細書における「臨床徴候の発生率および／または重症度の軽減」または「臨床症状の軽減」とは、病原体の負荷、病原体の排出の任意の低減、病原体の伝染の低減、またはＰＥＤＶに症候的な、任意の臨床徴候の軽減を指すものとする。これらの臨床徴候は、本発明の治療用組成物を施される、１または複数の対象において、組成物を施されず、かつ、感染した対象と比較して、少なくとも１０％軽減されることが好ましい。より好ましくは、臨床徴候は、本発明の組成物を施される対象において、少なくとも２０％、好ましくは、少なくとも３０％、より好ましくは、少なくとも４０％軽減され、なおより好ましくは、少なくとも５０％軽減される。
【００８２】
本明細書における「防御の増大」という用語は、ワクチン接種対象群における、感染作用物質、好ましくは、ＰＤＣｏＶおよび／またはＰＥＤＶによる感染と関連する、１または複数の臨床症状の、ワクチン接種されていない対照の対象群と対比した、統計学的に有意な軽減を意味するがこれらに限定されない。「臨床症状の統計学的に有意な軽減」という用語は、感染作用物質による抗原投与の後の、ワクチン接種対象群における、少なくとも１つの臨床症状の発生頻度が、ワクチン接種されていない対照群より、少なくとも１０％、好ましくは、２０％、より好ましくは、３０％、なおより好ましくは、５０％低下し、なおより好ましくは、７０％低下することを意味するがこれらに限定されない。
「長期持続性防御」とは、少なくとも３週間であるが、より好ましくは、少なくとも３カ月間、さらにより好ましくは、少なくとも６カ月間にわたり存続する「有効性の改善」を指すものとする。家畜の場合、長期持続性防御は、動物が食肉用に市販される、平均年齢まで存続することが最も好ましい。
【００８３】
「免疫原性組成物または免疫学的組成物」とは、少なくとも１つのブタデルタコロナウイルスおよび／もしくはブタ流行性下痢ウイルス、ならびに／またはこれらの免疫原性部分を含み、宿主において、組成物に対する細胞性免疫学的または抗体媒介性免疫学的である免疫応答を誘発する組成物を指す。本発明の好ましい実施形態では、免疫原性組成物は、免疫応答を誘導し、より好ましくは、ＰＤＣｏＶおよび／またはＰＥＤＶへの感染の臨床徴候のうちの１または複数に対する防御性免疫を付与する。
本明細書で使用される免疫原性組成物はまた、本明細書で記載されるＰＤＣｏＶスパイクポリペプチドおよび／またはＰＥＤＶスパイクポリペプチドのいずれかを含む組成物も指す。さらなる実施形態に従い、このような免疫原性組成物は、前記ＰＤＣｏＶスパイクタンパク質および／またはＰＥＤＶスパイクタンパク質を発現させるウイルスベクター、好ましくは、組換えバキュロウイルスの少なくとも一部をさらに含む。さらに、免疫原性組成物は、ｉ）好ましくは、上記で記載した濃度の、上記で記載したＰＤＣｏＶタンパク質またはＰＥＤＶタンパク質のいずれか、ｉｉ）前記ＰＤＣｏＶスパイクタンパク質および／またはＰＥＤＶスパイクタンパク質を発現させるウイルスベクター、好ましくは、組換えバキュロウイルスの少なくとも一部、ならびにｉｉｉ）細胞培養物上清の一部を含みうる。
【００８４】
したがって、一態様に従い、本発明は、ブタの群れにおける、ＰＤＣｏＶおよび／またはＰＥＤＶへの感染の百分率を低減するための方法であって、前記ブタへと、有効量のＰＤＣｏＶスパイク抗原および／もしくはＰＥＤＶスパイク抗原、またはＰＤＣｏＶ抗原および／もしくはＰＥＤＶ抗原を含む免疫原性組成物を投与するステップであって、ＰＤＣｏＶおよび／またはＰＥＤＶ抗原が、組換えＰＤＣｏＶスパイク抗原および／または組換えＰＥＤＶスパイク抗原、好ましくは、バキュロウイルスにより発現させたＰＤＣｏＶスパイクタンパク質および／またはＰＥＤＶスパイクタンパク質であるステップを含む方法に関する。好ましくは、この組換えＰＤＣｏＶスパイクおよび／もしくは組換えＰＥＤＶスパイクまたはバキュロウイルスにより発現させたＰＤＣｏＶスパイクおよび／もしくはＰＥＤＶスパイクは、本明細書で記載される配列を有する。
【００８５】
「免疫応答」または「免疫学的応答」とは、目的の組成物またはワクチンに対する細胞性免疫応答および／または抗体媒介性免疫応答の発生を意味するがこれらに限定されない。通例、免疫応答または免疫学的応答は、以下の効果：目的の組成物またはワクチンに含まれる、１または複数の抗原を特異的に指向する、抗体、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、および／または細胞傷害性Ｔ細胞の産生または活性化のうちの１または複数を含むがこれらに限定されない。宿主は、新たな感染への抵抗性が増強され、かつ／または疾患の臨床重症度が軽減されるように、治療的免疫学的応答または防御的免疫学的（記憶）応答を提示することが好ましいであろう。このような防御は、症状の数の低減、症状の重症度の軽減、または病原体の感染と関連する症状のうちの１もしくは複数の欠如、ウイルス血症の発症の遅延、ウイルス存続の低減、全体的なウイルス負荷の低減、および／またはウイルス排出の低減により裏付けられるであろう。
【００８６】
抗原の「免疫学的防御量」または「免疫学的有効量」または「免疫応答をもたらす有効量」とは、レシピエントにおいて、免疫原性応答を誘導するのに有効な量である。免疫原性応答は、診断的目的または他の検査に十分な場合もあり、疾患作用物質の感染により引き起こされる、健康への有害作用またはこれらの合併症を含む、疾患の徴候または症状を防止するのに適度な場合もある。体液性免疫を誘導することもでき、細胞媒介性免疫を誘導することもでき、これらの両方を誘導することもできる。動物の、免疫原性組成物に対する免疫原性応答は、例えば、抗体力価の測定、リンパ球増殖アッセイにより、間接的に査定することもでき、野生型株による抗原投与の後で、徴候および症状をモニタリングすることにより、直接的に査定することもできるが、ワクチンにより付与された防御性免疫は、例えば、対象の死亡率、罹患率、体温、全身状態、および全体的な健康、ならびに運動能など、臨床徴候の軽減を測定することにより査定することができる。免疫応答は、限定せずに述べると、細胞性免疫および／または体液性免疫の導入を含みうる。「免疫原性」とは、免疫応答または抗原性応答を惹起することを意味する。したがって、免疫原性組成物は、免疫応答を誘導する、任意の組成物であろう。
【００８７】
「治療有効量」とは、ウイルスまたは細菌などの病原体の感染により引き起こされる、健康への有害作用またはこれらの合併症を含む、疾患の臨床徴候または臨床症状を防止または軽減するのに適度な免疫応答を抗原またはワクチンを施される対象において誘導する、抗原またはワクチンの量を指す。体液性免疫を誘導することもでき、細胞媒介性免疫を誘導することもでき、体液性免疫および細胞媒介性免疫の両方を誘導することもできる。動物の、ワクチンに対する免疫原性応答は、例えば、抗体力価の測定、リンパ球増殖アッセイにより、間接的に査定することもでき、野生型株による抗原投与の後で、徴候および症状をモニタリングすることにより、直接的に査定することもできる。ワクチンにより付与された防御性免疫は、例えば、対象の死亡率、罹患率、体温、全身状態、および全体的な健康、ならびに運動能など、臨床徴候の軽減を測定することにより査定することができる。治療有効量のワクチンは、使用される特定のアジュバント、使用される特定の抗原、または対象の状態に応じて変動する場合があり、当業者により決定されうる。
【００８８】
本明細書で使用される「薬学的に許容可能な担体または獣医学的に許容可能な担体」とは、任意の溶媒および全ての溶媒、任意の分散媒および全ての分散媒、任意のコーティングおよび全てのコーティング、任意のアジュバントおよび全てのアジュバント、任意の安定化剤および全ての安定化剤、任意の希釈剤および全ての希釈剤、任意の保存剤および全ての保存剤、任意の抗菌剤および全ての抗菌剤ならびに任意の抗真菌剤および全ての抗真菌剤、任意の等張剤および全ての等張剤、任意の吸着遅延剤および全ての吸着遅延剤などを含む。一部の好ましい実施形態では、かつ、とりわけ、凍結乾燥免疫原性組成物を含む実施形態では、本発明における使用のための安定化剤は、凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎまたはｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇ）のための安定化剤を含む。
【００８９】
一部の実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、アジュバントを含有する。本明細書で使用される「アジュバント」とは、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウム、サポニン、例えば、Ｑｕｉｌ  Ａ、ＱＳ−２１（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＭＡ）、ＧＰＩ−０１００（Ｇａｌｅｎｉｃａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）、油中水エマルジョン、水中油エマルジョン、水中油中水エマルジョンを含みうる。
【００９０】
エマルジョンは、特に、ライト液体パラフィン油（欧州薬局方型）；スクアランまたはスクアレンなどのイソプレノイド油；アルケン、特に、イソブテンまたはデケンのオリゴマー化から得られる油；直鎖状アルキル基を含有する酸またはアルコールのエステル、より特定すると、植物油、オレイン酸エチル、プロピレングリコールジ（カプリル酸／カプリン酸）エステル、グリセリルトリ（カプリル酸／カプリン酸）エステル、またはプロピレングリコールジオレイン酸エステル；分枝状脂肪酸またはアルコールのエステル、特に、イソステアリン酸エステルに基づくことができる。油を、乳化剤と組み合わせて使用して、エマルジョンを形成する。乳化剤は、好ましくは、非イオン性界面活性剤、特に、ソルビタン、マンニド（例えば、無水マンニトールオレイン酸エステル）、グリコール、ポリグリセロール、プロピレングリコール、およびオレイン酸、イソステアリン酸、リノレン酸、またはヒドロキシステアリン酸のエステルであって、エトキシル化されていてもよいエステル、ならびにポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンコポリマーブロック、特に、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ製品、とりわけ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ１２１である。Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed.Stewart-Tull, D.  E.  S.). JohnWiley and Sons, NY, pp51-94 (1995)；およびTodd et al., Vaccine 15:564-570 (1997)を参照されたい。例示的なアジュバントは、“Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach” edited by M.  Powell and M.  Newman, Plenum Press, 1995の１４７頁に記載されているＳＰＴエマルジョン、およびこの同じ書物の１８３頁に記載されているエマルジョンＭＦ５９である。
【００９１】
適切な水中油エマルジョンの例は、ＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（登録商標）（水中油エマルジョン：ｏ／ｗ）、ＥＭＵＬＳＩＧＥＮ−Ｄ（登録商標）（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡ）を伴う水中油（ｏ／ｗ））、ＥＭＵＬＳＩＧＥＮ−Ｐ（登録商標）（特許権のある免疫刺激剤を伴う水中油（ｏ／ｗ））、ＥＭＵＬＳＩＧＥＮ−７５（登録商標）（架橋ポリマーを伴う水中油（ｏ／ｗ）から構成された二重アジュバント）、およびＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（登録商標）−ＢＣＬ（動物由来の構成要素を含まない水中油エマルジョン）（ＭＶＰ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｏｍａｈａ、Ｎｅｂｒ．、ＵＳＡ）など、ＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（登録商標）ベースのアジュバントである。不活化ＰＤＣｏＶタンパク質、不活化ＰＥＤＶタンパク質、ならびに／または組換えＰＤＣｏＶタンパク質および／もしくはＰＥＤＶタンパク質を含む医薬／ワクチン組成物は、水中油エマルジョン、好ましくは、このようなＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（登録商標）ベースのアジュバント、より好ましくは、ＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（登録商標）（水中油エマルジョン：ｏ／ｗ）および／またはＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（登録商標）−ＢＣＬ（動物由来の構成要素を含まない水中油エマルジョン）で、有効にアジュバント処理されている。
【００９２】
獣医学用のワクチンにおける使用に適する吸着剤である、アルミニウム水酸化ゲルの例は、ＲＥＨＹＤＲＡＧＥＬ（登録商標）、ＲＥＨＹＤＲＡＧＥＬ−ＣＧ（登録商標）；ＲＥＨＹＤＲＡＧＥＬ−ＬＶ；ＲＥＨＹＤＲＡＧＥＬ−ＨＰＡ；ＲＥＨＹＤＲＡＰＨＯＳ（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ  Ｈｅｉｇｈｔｓ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳＡ）を含む。
【００９３】
アジュバントのさらなる例は、アクリル酸またはメタクリル酸のポリマー、および無水マレイン酸と、アルケニル誘導体とのコポリマーから選択される化合物である。有利なアジュバント化合物は、とりわけ、糖またはポリアルコールのポリアルケニルエーテルで架橋された、アクリル酸またはメタクリル酸のポリマーである。これらの化合物は、カルボマーという用語で公知である（Phameuropa Vol. 8, No. 2, June 1996）。当業者はまた、ポリヒドロキシル化化合物で架橋された、このようなアクリルポリマーであって、好ましくは、少なくとも３つのヒドロキシルの、８つ以下の水素原子が、少なくとも２つの炭素原子を有する不飽和脂肪族ラジカルで置きかえられた、少なくとも３つのヒドロキシル基を有するアクリルポリマーについて記載する、米国特許第２，９０９，４６２号も参照することができる。好ましいラジカルは、２〜４個の炭素原子、例えば、ビニル、アリル、および他のエチレン系不飽和基を含有するラジカルである。不飽和ラジカルは、それら自体、メチルなど、他の置換基を含有しうる。ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）（ポリアクリル酸としてもまた公知である；ＢＦ  Ｇｏｏｄｒｉｃｈ、Ｏｈｉｏ、ＵＳＡ）の商標名で販売されている製品が、特に、適切である。ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）は、アリルスクロースまたはアリルペンタエリトリトールで架橋されている。これらの中で、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）９７４Ｐ（ポリアクリル酸としてもまた公知である）、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）９３４Ｐ（ポリアクリル酸としてもまた公知である）、およびＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）９７１Ｐ（ポリアクリル酸としてもまた公知である）を挙げることができる。ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）９７１Ｐ（ポリアクリル酸としてもまた公知である）の使用が、最も好ましい。無水マレイン酸と、アルケニル誘導体とのコポリマーの中には、無水マレイン酸と、エチレンとのコポリマーである、コポリマーＥＭＡ（Ｍｏｎｓａｎｔｏ）がある。これらのポリマーの、水中の溶解は、酸溶液をもたらすが、免疫原性組成物、免疫学的組成物、またはワクチン組成物が組み込まれるアジュバント溶液をもたらすために、これを、好ましくは、生理学的ｐＨへと中和する。
【００９４】
さらなる、適切なアジュバントは、とりわけ、ＲＩＢＩアジュバント系（Ｒｉｂｉ  Ｉｎｃ）、ブロックコポリマー（ＣｙｔＲｘ、Ａｔｌａｎｔａ  Ｇａ．）、ＳＡＦ−Ｍ（Ｃｈｉｒｏｎ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ  Ｃａｌｉｆ．）、モノホスホリスリピドＡ、アブリジン脂質−アミンアジュバント、Ｅ．ｃｏｌｉに由来する易熱性エンテロトキシン（組換えまたは他の形の）、コレラ毒素、またはムラミルジペプチドを含むがこれらに限定されない。
アジュバントは、投与１回当たり約１００μｇ〜約１０ｍｇの量、好ましくは、投与１回当たり約１００μｇ〜約１０ｍｇの量、より好ましくは、投与１回当たり約５００μｇ〜約５ｍｇの量、なおより好ましくは、投与１回当たり約７５０μｇ〜約２．５ｍｇの量で添加することができ、最も好ましくは、投与１回当たり約１ｍｇの量で添加しうることが予測される。代替的に、アジュバントは、最終生成物の容量で、約０．０１％〜５０％の濃度、好ましくは、約２％〜３０％の濃度、より好ましくは、約５％〜２５％の濃度、さらにより好ましくは、約７％〜２２％の濃度であることが可能であり、最も好ましくは、１０％〜２０％の濃度でありうる。
【００９５】
「希釈剤」とは、水、生理食塩液、デキストロース、エタノール、グリセロールなどを含みうる。等張剤は、とりわけ、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースを含みうる。安定化剤は、とりわけ、アルブミンおよびエチレンジアミン四酢酸のアルカリ塩を含む。
「単離された」とは、「人為により」、その天然の状態から変更されたことを意味する、すなわち、「単離される」ことが、天然において生じる場合、「単離された」ものは、その元の環境から変化しているか、もしくは取り出されているか、またはこれらの両方である。例えば、この用語が、本明細書で利用される通り、生存する生物において、天然で存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、「単離されて」いないが、その天然状態の共存材料から分離された、同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、「単離されて」いる。
【００９６】
「安全性」とは、ワクチン接種後の、ワクチン接種された動物における、有害な帰結であって、ウイルスベースのワクチンの、毒性への、潜在的な復帰、遷延性で全身性の疾病、またはワクチン投与部位における、許容不可能な炎症など、臨床的に重大な副作用を含むがこれらに限定されない帰結の非存在を指す。
【００９７】
本明細書で使用される「ワクチン接種」または「ワクチン接種すること」という用語、またはこれらの変化形は、動物に投与されると、動物において、ＰＤＣｏＶおよび／またはＰＥＤＶに対する免疫応答を誘発するか、またはこれを誘発する（直接的に、または間接的に）ことが可能な、本発明の免疫原性組成物の投与を含む工程を意味するがこれらに限定されない。
【００９８】
本発明の文脈における「死亡」とは、ＰＤＣｏＶ感染、ＰＥＤＶ感染、ならびに／またはＰＤＣｏＶおよびＰＥＤＶの共感染により引き起こされる死亡を指し、感染が、極めて重度であるため、動物を安楽死させて、苦痛を防止し、その生涯に人道的な終わりをもたらす状況を含む。
本明細書における「有効用量」とは、抗原が投与される動物において、臨床症状の軽減をもたらす免疫応答を誘発するか、またはこれを誘発することが可能な抗原の量を意味するがこれらに限定されない。
【００９９】
当技術分野で公知の「配列同一性」、２つもしくはこれを超えるポリペプチド配列、または２つもしくはこれを超えるポリヌクレオチド配列の間の関係、すなわち、基準配列と、基準配列と比較される所与の配列との関係を指す。配列同一性は、このような配列の連なりの間のマッチにより決定される、最高度の配列類似性をもたらすように、配列を、最適な形でアライメントした後で、所与の配列を、基準配列と比較することにより決定する。このようなアライメントがなされたら、配列同一性が、位置対位置ベースで確認される、例えば、配列は、特定の位置において、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基が同一であれば、その位置において「同一」である。次いで、このような位置同一性の総数を、基準配列内のヌクレオチドまたは残基の総数で除して、配列同一性％をもたらす。配列同一性は、公知の方法であって、それらの教示が参照により本明細書に組み込まれる、Computational Molecular Biology, Lesk, A. N., ed., Oxford University Press, New York (1988), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York (1991)；およびCarillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988)に記載されている方法を含むがこれらに限定されない方法により、たやすく計算することができる。配列同一性を決定するのに好ましい方法は、被験配列の間で、最大のマッチをもたらすようにデザインされる。配列同一性を決定する方法は、所与の配列の間の配列同一性を決定する、公開のコンピュータプログラムにコード化されている。このようなプログラムの例は、ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1):387 (1984)）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990)）を含むがこれらに限定されない。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、ＮＣＢＩおよび他の供給元から公開されている（それらの教示が参照により本明細書に組み込まれる、ＢＬＡＳＴ Manual, Altschul, S. et al., NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894、Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990)）。これらのプログラムは、所与の配列と、基準配列との、最高のレベルの配列同一性をもたらすために、デフォルトのギャップ重みを使用して、配列を、最適な形でアライメントする。例示として述べると、基準ヌクレオチド配列に対する、少なくとも、例えば、８５％、好ましくは、９０％、なおより好ましくは、９５％の「配列同一性」を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにより、所与のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、所与のポリヌクレオチド配列が、基準ヌクレオチド配列の、各１００ヌクレオチド当たり、最大で１５、好ましくは、最大で１０、なおより好ましくは、最大で５カ所の点突然変異を含みうることを除き、基準配列と同一であることを意図する。言い換えれば、基準ヌクレオチド配列と比べて、少なくとも８５％、好ましくは、９０％、なおより好ましくは、９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド内では、基準配列内のヌクレオチドのうち��、最大で１５％、好ましくは、１０％、なおより好ましくは、５％を、欠失させるか、または別のヌクレオチドで置換することもでき、基準配列内の全ヌクレオチドのうちの、最大で１５％、好ましくは、１０％、なおより好ましくは、５％の数のヌクレオチドを、基準配列へと挿入することもできる。基準配列のこれらの突然変異は、基準ヌクレオチド配列の、５’末端位または３’末端位に生じる場合もあり、これらの末端位の間の、ある位置であって、基準配列内のヌクレオチド間で、個別に散在するか、または基準配列内の、１もしくは複数の連続群内に散在する、ある位置に生じる場合もある。同様に、基準アミノ酸配列に対する、少なくとも、例えば、８５％、好ましくは、９０％、なおより好ましくは、９５％の「配列同一性」を有する所与のアミノ酸配列を有するポリペプチドにより、所与のポリペプチドのアミノ酸配列は、所与のポリペプチド配列が、基準アミノ酸配列の、各１００アミノ酸当たり、最大で１５、好ましくは、最大で１０、なおより好ましくは、最大で５カ所のアミノ酸の変更を含みうることを除き、基準配列と同一であることを意図する。言い換えれば、基準アミノ酸配列との、少なくとも８５％、好ましくは、９０％、なおより好ましくは、９５％の配列同一性を有する、所与のポリペプチド配列を得るために、基準配列内のアミノ酸残基のうちの、最大で１５％、好ましくは、１０％、なおより好ましくは、５％を、欠失させるか、または別のアミノ酸で置換することもでき、基準配列内のアミノ酸残基の総数のうちの、最大で１５％、好ましくは、１０％、なおより好ましくは、５％の数のアミノ酸を、基準配列へと挿入することもできる。基準配列のこれらの変更は、基準アミノ酸配列の、アミノ末端位またはカルボキシ末端位に生じる場合もあり、これらの末端位の間の、ある位置であって、基準配列内の残基間で、個別に散在するか、または基準配列内の、１もしくは複数の連続群内に散在する、ある位置に生じる場合もある。好ましくは、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換により異なる。しかし、保存的置換は、配列同一性を決定する場合のマッチとしては組み入れない。
【０１００】
「保存的置換」とは、アミノ酸残基の置換、または全体的な機能性が有意に変化しないように、サイズ、疎水性などを含む、同様の特徴もしくは特性を有する、別のアミノ酸残基による置換を指す。
【０１０１】
本明細書で使用される「配列相同性」とは、保存的置換を割り引いて、２つの配列の類縁性を決定する方法を指す。配列相同性を決定するために、２つまたはこれを超える配列を、最適な形でアライメントし、必要な場合は、ギャップを導入する。言い換えれば、基準配列との、９５％配列相同性を有するポリペプチドを得るために、基準配列内のアミノ酸残基のうちの、８５％、好ましくは、９０％、なおより好ましくは、９５％は、別のアミノ酸とマッチするか、もしくは別のアミノ酸による保存的置換を含まなければならないか、または基準配列内の、全アミノ酸残基のうちの、最大で、１５％、好ましくは、最大で、１０％、なおより好ましくは、最大で、５％の数の、保存的置換を含まないアミノ酸を、基準配列へと挿入することができる。好ましくは、相同体配列は、少なくとも５０アミノ酸、なおより好ましくは１００アミノ酸、なおより好ましくは２５０アミノ酸、なおより好ましくは５００アミノ酸の連なりを含む。
【０１０２】
本明細書では、「配列同一性」および「同一性パーセント」という用語を、互換的に使用する。本明細書では、本発明の目的で、２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の同一性パーセントを決定するには、最適の比較を目的として、配列をアライメントする（例えば、第２のアミノ酸配列または核酸配列との最適のアライメントのために、第１のアミノ酸または核酸の配列内に、ギャップを導入することができる）ことを規定する。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列内の位置が、第２の配列内の対応する位置と、同じアミノ酸残基またはヌクレオチドにより占有される場合、分子は、この位置において同一である。２つの配列の間の同一性パーセントとは、配列により共有される同一な位置の数の関数である（すなわち、同一性％＝同一な位置の数／位置の総数（すなわち、重複する位置）×１００）。好ましくは、２つの配列は、同じ長さである。配列同一性を、タンパク質に言及して使用する場合、同一でない残基位置は、アミノ酸残基を、同様の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を伴う、他のアミノ酸残基で置換し、したがって、分子の機能的な特性を実質的に変化させない、保存的アミノ酸置換により異なることが認識される。配列が、保存的置換により異なる場合は、置換の保存的性格について補正するように、配列同一性パーセントを、上方に調整することができる。このような保存的置換により異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有するという。
【０１０３】
配列の比較は、比較される２つの配列の全長にわたり実行することもでき、２つの配列の断片にわたり実行することもできる。比較は、比較される２つの配列の全長にわたり実行することが典型的である。しかし、配列同一性は、例えば、２０、５０、１００、またはこれを超える連続アミノ酸残基の領域にわたり実行することもできる。
【０１０４】
当業者は、２つの配列の間の相同性を決定するのに、いくつかの、異なるコンピュータプログラムが利用可能である事実を承知しているであろう。例えば、数学的アルゴリズムを使用して、２つの配列の間の、配列の比較および同一性パーセントの決定を達することができる。好ましい実施形態では、２つのアミノ酸配列または核酸配列の間の同一性パーセントは、Ｂｌｏｓｕｍ  ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックス、ならびに１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ重み、および１、２、３、４、５、または６の長さ重みを使用する、Ａｃｃｅｌｒｙｓ  ＧＣＧソフトウェアパッケージ（http://www.accelrys.com/products/gcg/において入手可能である）内のＧＡＰプログラムへと組み込まれた、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（J. Mol. Biol. (48): 444-453 (1970)）によるアルゴリズムを使用して決定する。当業者は、全てのこれらの異なるパラメータは、わずかに異なる結果をもたらすが、異なるアルゴリズムを使用しても、２つの配列の、全体的な同一性百分率は、有意に変わらないことを理解するであろう。
【０１０５】
本発明のタンパク質配列または核酸配列は、公開されているデータベースに対する検索を実施して、例えば、他のファミリーメンバーまたは類縁の配列を同定するための、「クエリー配列」としても、さらに使用することができる。Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10による、ＢＬＡＳＴＮプログラムおよびＢＬＡＳＴＰプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０）を使用して、このような検索を実施することができる。スコア＝５０、ワード長＝３とするＢＬＡＳＴＰプログラムにより、ＢＬＡＳＴによるタンパク質検索を実施して、本発明のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較を目的として、ギャップ処理されたアライメントを得るためには、Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402において記載されている、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを用いることができる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合、それぞれのプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＮ）のデフォルトのパラメータを使用することができる。http://www.ncbi.nlm.nih.gov/における、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのホームページを参照されたい。
【０１０６】
本発明の、特許請求されるＰＥＤＶはまた、ＰＥＤＶ分離株である１２５１−１２５−１０（「１２５−１０」）の変異体、およびこの部分断片の変異体も包含する。このような変異体は、オクラホマ株（配列番号２９および３４）の特徴と、本質的に同じ免疫学的特性を有する。「本質的に同じ免疫学的特性を有すること」という用語は、前記変異体が、下記で記載される、ＰＥＤＶにより引き起こされる臨床徴候の処置もしくは防止、または下記で記載される有効性パラメータの改善において、本質的に有効であることを包含する（がこれに制約されない）。
【０１０７】
本発明の、特許請求されるＰＤＣｏＶはまた、ＰＤＣｏＶ分離株である、ＮＳＶＬ、ＰＤＣｏＶ  ２．０３０７、およびＰＤＣｏＶ  ５．０３２７の変異体、ならびにこれらの部分断片の変異体も包含する。このような変異体は、ＮＳＶＬ株（配列番号１および２）、ならびに分離株であるＰＤＣｏＶ  ２．０３０７（配列番号５および６）およびＰＤＣｏＶ  ５．０３２７（配列番号９および１０）の特徴と、本質的に同じ免疫学的特性を有する。「本質的に同じ免疫学的特性を有すること」という用語は、前記変異体が、本明細書で記載される、ＰＤＣｏＶにより引き起こされる臨床徴候の処置もしくは防止、または本明細書で記載される有効性パラメータの改善において、本質的に有効であることを包含する（がこれに制約されない）。ワクチン中で使用されうる、多様なＰＤＣｏＶ株のほか、これらの部分断片を含む、組換えスパイクタンパク質抗原もまた、ワクチン中で使用することができる。同様に、例示的なスパイクタンパク質配列は、下記で列挙される、ＰＤＣｏＶ分離株または「変異体」と、本質的に同じ免疫学的特性を伴うスパイクタンパク質配列を含むがこれらに限定されない。
【０１０８】
ＰＤＣｏＶの配列（配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１７、１８、２７、および２８）、またはＰＥＤＶの配列（配列番号２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、４６、４７、５２、および５３）（例えば、ポリペプチド配列または核酸配列）に関する、「変異体」という用語は、実質的に同様の配列を意味することを意図する。オープンリーディングフレームを含むヌクレオチド配列について、変異体は、遺伝子コードの縮重のために、天然のタンパク質の、同一なアミノ酸配列をコードする配列を含む。変異体のヌクレオチド配列はまた、例えば、部位指向突然変異誘発を使用することにより作出された、変異体のヌクレオチド配列、および、オープンリーディングフレームについては、天然のタンパク質をコードする、変異体のヌクレオチド配列のほか、コドン最適化を目的とした天然のタンパク質と比べて、アミノ酸置換を有するポリペプチドをコードする、変異体のヌクレオチド配列など、合成由来のヌクレオチド配列も含む。一般に、本発明のヌクレオチド配列変異体は、標準的なパラメータを使用する、記載されたアライメントプログラムのうちの１つを使用して、基準配列と比較して、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、または８９％、より好ましくは、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、または９４％を有し、最も好ましくは、少なくとも９５％、９６％、９６．１％、９６．２％、９６．３％、９６．４％、９６．５％、９６．６％、９６．７％、９６．８％、９６．９％、９７％、９７．１％、９７．２％、９７．３％、９７．４％、９７．４１％、９７．４２％、９７．４３％、９７．４４％、９７．４５％、９７．４６％、９７．４７％、９７．４８％、９７．４９％、９７．５％、９７．５１％、９７．５２％、９７．５３％、９７．５４％、９７．５５％、９７．５６％、９７．５７％、９７．５８％、９７．５９％、９７．６％、９７．６１％、９７．６２％、９７．６３％、９７．６４％、９７．６５％、９７．６６％、９７．６７％、９７．６８％、９７．６９％  ９７．７％、９７．７１％、９７．７２％、９７．７３％、９７．７４％、９７．７５％、９７．７６％、９７．７７％、９７．７８％、９７．７９％、９７．８％、９７．８１％、９７．８２％、９７．８３％、９７．８４％、９７．８５％、９７．８６％、９７．８７％、９７．８８％、９７．８９％、９７．９％、９７．９１％、９７．９２％、９７．９３％、９７．９４％、９７．９５％、９７．９６％、９７．９７％、９７．９８％、９７．９９％、９８％、９８．０１％、９８．０２％、９８．０３％、９８．０４％、９８．０５％、９８．０６％、９８．０７％、９８．０８％、９８．０９％、９８．１％、９８．１１％、９８．１２％、９８．１３％、９８．１４％、９８．１５％、９８．１６％、９８．１７％、９８．１８％、９８．１９％、９８．２％、９８．２１％、９８．２２％、９８．２３％、９８．２４％、９８．２５％、９８．２６％、９８．２７％、９８．２８％、９８．２９％、９８．３％、９８．３１％、９８．３２％、９８．３３％、９８．３４％、９８．３５％、９８．���６％、９８．３７％、９８．３８％、９８．３９％、９８．４％、９８．４１％、９８．４２％、９８．４３％、９８．４４％、９８．４５％、９８．４６％、９８．４７％、９８．４８％、９８．４９％、９８．５％、９８．５１％、９８．５２％、９８．５３％、９８．５４％、９８．５５％、９８．５６％、９８．５７％、９８．５８％、９８．５９％、９８．６％、９８．６１％、９８．６２％、９８．６３％、９８．６４％、９８．６５％、９８．６６％、９８．６７％、９８．６８％、９８．６９％、９８．７％、９８．７１％、９８．７２％、９８．７３％、９８．７４％、９８．７５％、９８．７６％、９８．７７％、９８．７８％、９８．７９％、９８．８％、９８．８１％、９８．８２％、９８．８３％、９８．８４％、９８．８５％、９８．８６％、９８．８７％、９８．８８％、９８．８９％、９８．９％、９８．９１％、９８．９２％、９８．９３％、９８．９４％、９８．９５％、９８．９６％、９８．９７％、９８．９８％、９８．９９％、９９％、９９．０１％、９９．０２％、９９．０３％、９９．０４％、９９．０５％、９９．０６％、９９．０７％、９９．０８％、９９．０９％、９９．１％、９９．１１％、９９．１２％、９９．１３％、９９．１４％、９９．１５％、９９．１６％、９９．１７％、９９．１８％、９９．１９％、９９．２％、９９．２１％、９９．２２％、９９．２３％、９９．２４％、９９．２５％、９９．２６％、９９．２７％、９９．２８％、９９．２９％、９９．３％、９９．３１％、９９．３２％、９９．３３％、９９．３４％、９９．３５％、９９．３６％、９９．３７％、９９．３８％、９９．３９％、９９．４％、９９．４１％、９９．４２％、９９．４３％、９９．４４％、９９．４５％、９９．４６％、９９．４７％、９９．４８％、９９．４９％、９９．５％、９９．５１％、９９．５２％、９９．５３％、９９．５４％、９９．５５％、９９．５６％、９９．５７％、９９．５８％、９９．５９％、９９．６％、９９．６１％、９９．６２％、９９．６３％、９９．６４％、９９．６５％、９９．６６％、９９．６７％、９９．６８％、９９．６９％、９９．７％、９９．７１％、９９．７２％、９９．７３％、９９．７４％、９９．７５％、９９．７６％、９９．７７％、９９．７８％、９９．７９％、９９．８％、９９．８１％、９９．８２％、９９．８３％  ９９．８４％、９９．８５％、９９．８６％、９９．８７％、９９．８８％、９９．８９％、９９．９％、９９．９１％、９９．９２％、９９．９３％、９９．９４％、９９．９５％、９９．９６％、９９．９７％、９９．９８％、および９９．９９％の配列同一性を有するであろう。
【０１０９】
ＰＤＣｏＶの配列（配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１７、１８、２７、および２８）（例えば、ポリペプチド配列または核酸配列）に関する、「変異体」という用語は、実質的に同様の配列を意味することを意図する。したがって、本発明の免疫原性組成物は、好ましくは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＫＰ９８１３９５として寄託された分離株であるＮＳＶＬ−ＳＣＤＶ．１（ブタデルタコロナウイルス株であるＵＳＡ／ＩＬ／２０１４／０２６ＰＤＶ＿Ｐ１１）；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＫＰ７５７８９０として寄託された分離株であるＣＨＮ−ＡＨ−２００４；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＫＰ７５７８９１として寄託された分離株であるＣＨＮ−ＨＢ−２０１４；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＫＰ７５７８９２として寄託された分離株であるＣＨＮ−ＪＳ−２０１４；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＫＲ１３１６２１として寄託された分離株であるＰＤＣｏＶ／ＣＨＪＸＮＩ２／２０１５；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＫＲ１５０４４３として寄託された株であるＵＳＡ／Ａｒｋａｎｓａｓ６１／２０１５；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＫＲ２６５８４７として寄託された株であるＵＳＡ／Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ４４２／２０１４；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＫＲ２６５８４８として寄託された株であるＵＳＡ／Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ２１４／２０１４；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＫＲ２６５８４９として寄託された株であるＵＳＡ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ４４７／２０１４；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＫＲ２６５８５０として寄託された株であるＵＳＡ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ４４８／２０１４；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＫＲ２６５８５１として寄託された株であるＵＳＡ／Ｉｎｄｉａｎａ４５３／２０１４；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＫＲ２６５８５２として寄託された株であるＵＳＡ／Ｉｌｌｉｎｏｉｓ４４９／２０１４；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：KR２６５８５３として寄託された株であるＵＳＡ／Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ／２０１３；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＫＲ２６５８５４として寄託された株であるＵＳＡ／Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ４５４／２０１４；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＫＲ２６５８５５として寄託された株であるＵＳＡ／Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ４５５／２０１４；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＫＲ２６５８５６として寄託された株であるＵＳＡ／Ｉｌｌｉｎｏｉｓ２７２／２０１４；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＫＲ２６５８５７として寄託された株であるＵＳＡ／Ｉｌｌｉｎｏｉｓ２７３／２０１４；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＫＲ２６５８５８として寄託された株であるＵＳＡ／ＮｏｒｔｈＣａｒｏｌｉｎａ４５２／２０１４；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＫＲ２６５８５９として寄託された株であるＵＳＡ／Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ１５９／２０１４；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＫＲ２６５８６０として寄託された株であるＵＳＡ／Ｎｅｂｒａｓｋａ２０９／２０１４；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＫＲ２６５８６１として寄託された株であるＵＳＡ／Ｎｅｂｒａｓｋａ２１０／２０１４；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＫＲ２６５８６２として寄託された株であるＵＳＡ／Ｏｈｉｏ４４４／２０１４；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＫＲ２６５８６３として寄託された株であるＵＳＡ／Ｏｈｉｏ４４５／２０１���；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＫＲ２６５８６４として寄託された株であるＵＳＡ／Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ２９２／２０１４；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＫＲ２６５８６５として寄託された株であるＵＳＡ／Ｉｏｗａ４５９／２０１４；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＫＴ０２１２３４として寄託された株であるＣＨ／ＳＸＤ１／２０１５；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＫＴ２６６８２２として寄託された株であるＣＨ／Ｓｉｃｈｕａｎ／Ｓ２７／２０１２；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＫＴ３３６５６０として寄託された分離株であるＣＨＮ−ＨＮ−２０１４；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＫＵ０５１６４１として寄託された株であるＰＤＣｏＶ／Ｓｗｉｎｅ／Ｔｈａｉｌａｎｄ／Ｓ５０１１／２０１５；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＫＵ０５１６４９として寄託された株であるＰＤＣｏＶ／Ｓｗｉｎｅ／Ｔｈａｉｌａｎｄ／Ｓ５０１５Ｌ／２０１５；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＫＵ９８１０５９として寄託された株であるＮＨ；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＫＵ９８１０６０として寄託された株であるＮＨの、継代０の分離株；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＫＵ９８１０６１として寄託されたＮＨの、継代５の分離株；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＫＵ９８１０６２として寄託された株であるＮＨの、継代１０の分離株；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＫＵ９８４３３４として寄託された分離株であるＴＴ＿１１１５；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＫＸ０２２６０２として寄託された株であるＰＤＣｏＶ／ＵＳＡ／Ｉｏｗａ１３６／２０１５；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＫＸ０２２６０３として寄託された株であるＰＤＣｏＶ／ＵＳＡ／Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ１４０／２０１５；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＫＸ０２２６０４として寄託された株であるＰＤＣｏＶ／ＵＳＡ／Ｎｅｂｒａｓｋａ１３７／２０１５；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＫＸ０２２６０５として寄託された株であるＰＤＣｏＶ／ＵＳＡ／Ｎｅｂｒａｓｋａ１４５／２０１５；およびＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＫＸ１１８６２７として寄託された分離株であるＰ１＿１６＿ＢＴＬ＿０１１５／ＰＤＣｏＶ／２０１６／Ｌａｏに対して、少なくとも約９０％の、全体的なヌクレオチド同一性を有する全ての株を含むがこれらに限定されない、ＰＤＣｏＶの、全ての認識される株または分離株を、有効に組み込みうる。
【０１１０】
当技術分野で公知の「ゲノグループ」という用語は、属内の類縁のウイルスであって、遺伝子クラスターへとさらに細分されうるウイルスを指す。同定されたＰＥＤＶのゲノグループは、亜群であるＧ１ａ、Ｇ１ｂ、Ｒ（弱毒化／適応化）を含む、群Ｇ１；ならびに亜群であるＧ２ａおよびＧ２ｂを含むＧ２を含む。Ｇ２ａゲノグループのメンバーは、いくつかの固有のヌクレオチド変化を共有する、中国株ＡＨ２０１２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＫＣ２１０１４５）および北米株を含む。ＡＨ２０１２と、それぞれ、ＭＮ株およびＩＡ２株は、９９．６％のヌクレオチド同一性を有し、株ＩＡ１は、９９．５％のヌクレオチド同一性を有した。研究者らは、おそらく、ＡＨ２０１２様のウイルスが、中国東部地域へと伝播し、次いで、米国へと移出され、北米株の最も近縁の祖型である可能性が高いと推測した。ゲノグループ２ａのメンバーは、プロトタイプのＰＥＤＶ株である、ゲノグループ１ａのＣＶ７７７に対して、わずかに約９６．９％の類似性を共有する（Bridgen et al. 1993; Huang et al. 2013；ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦ３５３５１１．１）。こうして、歴史的な、ＣＶ７７７由来のＧ１ａ株、またはＤＲ１３由来のＧ１ｂ株に基づく弱毒化ＰＥＤＶワクチンは、新興の中国Ｇ２ａ  ＰＥＤＶ株および北米Ｇ２ａ  ＰＥＤＶ株とは、抗原的な関連性が小さい可能性がある。
【０１１１】
近縁の北米 ＰＥＤＶ分離株であるＵＳ／Ｃｏｌｏｒａｄｏ／２０１３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＫＦ２７２９２０．１）もまた、Marthaler et al. 2013により報告されている。上記の北米分離株と同様に、ＣＯ／１３の完全ＰＥＤＶゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋで入手可能な、他の完全ＰＥＤＶゲノムと、９６．５〜９９．５％のヌクレオチド同一性を有し、最大のヌクレオチド同一性（９９．５％）は、中国株ＡＨ２０１２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＫＣ２１０１４５）との同一性であった。中国株ＡＨ２０１２は、２ａゲノグループのメンバーである。北米分離株であるＣＯ／１３の完全ゲノムと、ＰＥＤＶ基準株であるＣＶ７７７の完全ゲノムとの比較は、ＣＯ／１３が、１ヌクレオチドの挿入（４８位における）、および５’ＵＴＲ内の、５ヌクレオチドの欠失（７３および８３〜８６位）を含有するのに対し、スパイク遺伝子が、１６ヌクレオチドの挿入（２０８０４、２０８１０〜２０８２０、２０８４３、および２１０５３〜２１０５５位）、および７ヌクレオチドの欠失（２０８５３および２１１１８〜２１１２４位）を含有することを示す。
【０１１２】
旧来のプロトタイプ株と比較して、天然で弱毒化することが多い、「ＩＮＤＥＬ」株と称する、ＰＥＤＶの他の変異体も新たに勃興している。これらもまた、ウイルスが、生の弱毒化ウイルスまたは不活化ウイルスであるワクチンとして使用することができる。このような場合、安全なワクチン弱毒化物をもたらすのに、ごく最小限の、さらなる継代が必要とされうる。したがって、本発明の、例示的なワクチンウイルスはまた、測定されるのが、アミノ酸であれ、コードするヌクレオチド配列であれ、スパイクタンパク質についてであれ、完全ウイルス性配列に基づくのであれ、このような株と、少なくとも９５％、９６％、９６．１％、９６．２％、９６．３％、９６．４％、９６．５％、９６．６％、９６．７％、９６．８％、９６．９％、９７％、９７．１％、９７．２％、９７．３％、９７．４％、９７．４１％、９７．４２％、９７．４３％、９７．４４％、９７．４５％、９７．４６％、９７．４７％、９７．４８％、９７．４９％、９７．５％、９７．５１％、９７．５２％、９７．５３％、９７．５４％、９７．５５％、９７．５６％、９７．５７％、９７．５８％、９７．５９％、９７．６％、９７．６１％、９７．６２％、９７．６３％、９７．６４％、９７．６５％、９７．６６％、９７．６７％、９７．６８％、９７．６９％  ９７．７％、９７．７１％、９７．７２％、９７．７３％、９７．７４％、９７．７５％、９７．７６％、９７．７７％、９７．７８％、９７．７９％、９７．８％、９７．８１％、９７．８２％、９７．８３％、９７．８４％、９７．８５％、９７．８６％、９７．８７％、９７．８８％、９７．８９％、９７．９％、９７．９１％、９７．９２％、９７．９３％、９７．９４％、９７．９５％、９７．９６％、９７．９７％、９７．９８％、９７．９９％、９８％、９８．０１％、９８．０２％、９８．０３％、９８．０４％、９８．０５％、９８．０６％、９８．０７％、９８．０８％、９８．０９％、９８．１％、９８．１１％、９８．１２％、９８．１３％、９８．１４％、９８．１５％、９８．１６％、９８．１７％、９８．１８％、９８．１９％、９８．２％、９８．２１％、９８．２２％、９８．２３％、９８．２４％、９８．２５％、９８．２６％、９８．２７％、９８．２８％、９８．２９％、９８．３％、９８．３１％、９８．３２％、９８．３３％、９８．３４％、９８．３５％、９８．３６％、９８．３７％、９８．３８％、９８．３９％、９８．４％、９８．４１％、９８．４２％、９８．４３％、９８．４４％、９８．４５％、９８．４６％、９８．４７％、９８．４８％、９８．４９％、９８．５％、９８．５１％、９８．５２％、９８．５３％、９８．５４％、９８．５５％、９８．５６％、９８．５７％、９８．５８％、９８．５９％、９８．６％、９８．６１％、９８．６２％、９８．６３％、９８．６４％、９８．６５％、９８．６６％、９８．６７％、９８．６８％、９８．６９％、９８．７％、９８．７１％、９８．７２％、９８．７３％、９８．７４％、９８．７５％、９８．７６％、９８．７７％、９８．７８％、９８．７９％、９８．８％、９８．８１％、９８．８２％、９８．８３％、９８．８４％、９８．８５％、９８���８６％、９８．８７％、９８．８８％、９８．８９％、９８．９％、９８．９１％、９８．９２％、９８．９３％、９８．９４％、９８．９５％、９８．９６％、９８．９７％、９８．９８％、９８．９９％、９９％、９９．０１％、９９．０２％、９９．０３％、９９．０４％、９９．０５％、９９．０６％、９９．０７％、９９．０８％、９９．０９％、９９．１％、９９．１１％、９９．１２％、９９．１３％、９９．１４％、９９．１５％、９９．１６％、９９．１７％、９９．１８％、９９．１９％、９９．２％、９９．２１％、９９．２２％、９９．２３％、９９．２４％、９９．２５％、９９．２６％、９９．２７％、９９．２８％、９９．２９％、９９．３％、９９．３１％、９９．３２％、９９．３３％、９９．３４％、９９．３５％、９９．３６％、９９．３７％、９９．３８％、９９．３９％、９９．４％、９９．４１％、９９．４２％、９９．４３％、９９．４４％、９９．４５％、９９．４６％、９９．４７％、９９．４８％、９９．４９％、９９．５％、９９．５１％、９９．５２％、９９．５３％、９９．５４％、９９．５５％、９９．５６％、９９．５７％、９９．５８％、９９．５９％、９９．６％、９９．６１％、９９．６２％、９９．６３％、９９．６４％、９９．６５％、９９．６６％、９９．６７％、９９．６８％、９９．６９％、９９．７％、９９．７１％、９９．７２％、９９．７３％、９９．７４％、９９．７５％、９９．７６％、９９．７７％、９９．７８％、９９．７９％、９９．８％、９９．８１％、９９．８２％、９９．８３％  ９９．８４％、９９．８５％、９９．８６％、９９．８７％、９９．８８％、９９．８９％、９９．９％、９９．９１％、９９．９２％、９９．９３％、９９．９４％、９９．９５％、９９．９６％、９９．９７％、９９．９８％、および９９．９９％の配列同一性、またはこれを超える配列同一性（ｉｄｅｎｔｉｆｙ）を有するワクチンウイルスも含む。
【０１１３】
「北米由来のＰＥＤＶ」という用語は、配列番号２９および／もしくは３３、ならびに／または配列番号３２および／もしくは３６を含むＰＥＤＶ分離株、ならびに／あるいは配列番号２９および／もしくは３３に対する、少なくとも９９％の配列同一性を有する、任意のＰＥＤＶ分離株、を意味し、かつ／あるいは、配列番号２９および／もしくは３３のＲＮＡ同等物、ならびに／またはスパイクタンパク質が、配列番号３０、３４、４６、もしくは５２によりコードされるＰＥＤＶ分離株、ならびに／またはスパイクタンパク質が、配列番号３０、３４、４６、もしくは５２に対する、少なくとも９８％の配列同一性を有する、任意のＰＥＤＶ分離株、ならびに／または発現させるスパイクタンパク質が、配列番号３１、３５、４７、５３との、少なくとも９０％の相同性を有する、任意のＰＥＤＶ分離株と、少なくとも９９％同一である。
【０１１４】
当技術分野で公知の「クレード」という用語は、系統発生樹内の単一の「分枝」である、祖型およびその全ての後代からなる群を指す。例として述べると、祖型は、個体の場合もあり、集団の場合もあり、種の場合もある。ゲノグループは、複数のクレードを含む場合があり、例えば、ＡＨ２０１２は、北米分離株と異なるクレードである。
【０１１５】
さらなる実施形態に従い、本発明はまた、本明細書で記載されるような核酸分子のうちのいずれかを含むベクターにも関する。言い換えれば、本発明は、任意のこのようなスパイクＰＥＤＶタンパク質、Ｍ  ＰＥＤＶタンパク質、Ｅ  ＰＥＤＶタンパク質、Ｎ  ＰＥＤＶタンパク質、またはこれらの部分のコード配列を含むベクターに関する。好ましくは、前記ベクターは、任意のこのようなスパイクＰＥＤＶタンパク質、Ｍ  ＰＥＤＶタンパク質、Ｅ  ＰＥＤＶタンパク質、および／もしくはＮ  ＰＥＤＶタンパク質、またはタンパク質の部分の発現を可能とする発現ベクターである。本発明に従うベクターは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおける、細菌細胞、酵母細胞、または動物細胞のトランスフェクションまたは感染に適するベクターである。
【０１１６】
ベクター、ならびに発現のためにベクター（または組換え体）を作る方法および／またはこれらを使用する方法は、とりわけ、米国特許第４，６０３，１１２号、同第４，７６９，３３０号、同第５，１７４，９９３号、同第５，５０５，９４１号、同第５，３３８，６８３号、同第５，４９４，８０７号、同第４，７２２，８４８号、同第５，９４２，２３５号、同第５，３６４，７７３号、同第５，７６２，９３８号、同第５，７７０，２１２号、同第５，９４２，２３５号、同第３８２，４２５号、ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／１６７１６号、同第ＷＯ９６／３９４９１号、同第ＷＯ９５／３００１８号；Paoletti, “Applications of pox virus vectors to vaccination: An update, “PNAS USA 93: 11349-11353, October 1996; Moss, “Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression, vaccination, and safety,” PNAS USA 93: 11341-11348, October 1996；Ｓｍｉｔｈら、米国特許第４，７４５，０５１号（組換えバキュロウイルス）；Richardson, C. D. (Editor), Methods in Molecular Biology 39, “Baculovirus Expression Protocols” (1995 Humana Press Inc.); Smith et al., “Production of Human Beta Interferon in Insect Cells Infected with a Baculovirus Expression Vector”, Molecular and Cellular Biology, December, 1983, Vol. 3, No. 12, p. 2156-2165; Pennock et al., “Strong and Regulated Expression of Escherichia coli B-Galactosidase in Infect Cells with a Baculovirus vector, “Molecular and Cellular Biology March 1984, Vol. 4, No. 3, p. 406;欧州特許出願第３７０５７３号；１９８６年１０月１６日に出願された、米国出願第９２０，１９７号；欧州特許出願第２６５７８５号；米国特許第４，７６９，３３１号（組換えヘルペスウイルス）；Roizman, “The function of herpes simplex virus genes: A primer for genetic engineering of novel vectors,” PNAS USA 93:11307-11312, October 1996; Andreansky et al., “The application of genetically engineered herpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors,” PNAS USA 93: 11313-11318, October 1996; Robertson et al., “Epstein-Barr virus vectors for gene delivery to B lymphocytes”, PNAS USA 93: 11334-11340, October 1996; Frolov et al., “Alphavirus-based expression vectors: Strategies and applications,” PNAS USA 93: 11371-11377, October 1996; Kitson et al., J. Virol. 65, 3068-3075, 1991;米国特許第５，５９１，４３９号、同第５，５５２，１４３号；ＷＯ９８／００１６６；いずれも、１９９６年７月３日に出願され、許可された、米国出願第０８／６７５，５５６号および同第０８／６７５，５６６号（組換えアデノウイルス）；Grunhaus et al., 1992, “Adenovirus as cloning vectors,” Seminars in Virology (Vol. 3) p. 237-52, 1993; Ballay et al. EMBO Journal, vol. 4, p. 3861-65, Graham, Tibtech 8, 85-87, April, 1990; Prevec et al., J. Gen Virol. 70, 42434；ＰＣＴ  ＷＯ９１／１１５２５；Felgner et al. (1994), J. Biol. Chem. 269, 2550-2561, Science, 259: 1745-49, 1993；およびMcClements et al., “Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein D or glycoprotein B, alone or in combination, induces protective immunity in animal models of herpes simplex virus-2 disease”, PNAS USA 93: 11414-11420, October 1996；ならびに米国特許第５，５９１，６３９号、同第５，５８９，４６６号、および同第５，５８０，８５９号のほか、ＷＯ９０／１１０９２、ＷＯ９３／１９１８３、ＷＯ９４／２１７９７、ＷＯ９５／１１３０７、ＷＯ９５／２０６６０；Tang et al., Nature, and Furth et al., Analytical Biochemistry, relating to DNA expression vectorsに開示されている方法によりなされる場合もあり、これらと類似の方法によりなされる���合もある。また、ＷＯ９８／３３５１０；Ju et al., Diabetologia, 41: 736-739, 1998（レンチウイルス発現系）；Ｓａｎｆｏｒｄら、米国特許第４，９４５，０５０号；Ｆｉｓｃｈｂａｃｈら（Ｉｎｔｒａｃｅｌ）；ＷＯ９０／０１５４３；Robinson et al., Seminars in Immunology vol. 9, pp. 271-283 (1997)（ＤＮＡベクター系）；Ｓｚｏｋａら、米国特許第４，３９４，４４８号（ＤＮＡを生細胞へと導入する方法）；ＭｃＣｏｒｍｉｃｋら、米国特許第５，６７７，１７８号（細胞変性ウイルスの使用）；および米国特許第５，９２８，９１３号（遺伝子送達のためのベクター）のほか、本明細書で引用される他の文献も参照されたい。
【０１１７】
好ましいバキュロウイルスベクターは、特に、作製細胞が、昆虫細胞であるという条件で、ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）などのバキュロウイルスを含む。バキュロウイルス発現系が好ましいが、当業者により、他の発現系も、本発明の目的、すなわち、細胞培養物の上清への、ＨＧの発現のために働くことが理解される。このような他の発現系は、Ｈ５の、培地への発現を引き起こすために、シグナル配列の使用を要求しうる。
有効用量：
本明細書で記載される化合物は、ＰＤＣｏＶおよび／またはＰＥＤＶに関連する疾患を防止するように、対象へと、治療有効用量で投与することができる。投与量は、ワクチンを施される宿主のほか、宿主のサイズ、体重、および年齢などの因子に依存するであろう。
【０１１８】
製剤中で利用される、本発明の免疫原性組成物の正確な量は、投与経路および対象の性格（例えば、年齢、サイズ、疾患の病期／レベル）に依存し、標準的な臨床法に従い、医療従事者の判断および各対象の状況に従い決定されるべきである。有効免疫化量は、対象におけるＰＤＣｏＶおよび／またはＰＥＤＶ感染性疾患を処置または防止するのに十分な量である。
組成物の免疫原性は、組成物による免疫化の後における、被験対象の免疫応答を、当技術分野で公知である、任意のイムノアッセイの使用を介してモニタリングすることにより決定することができる。体液性（抗体）応答および／または細胞媒介性免疫の発生は、免疫応答の指示として理解することができる。被験対象は、ブタ、マウス、ハムスター、イヌ、ネコ、ウサギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、家禽類（例えば、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、およびシチメンチョウ）、およびヒトなどの動物を含みうる。
【０１１９】
被験対象の免疫応答は、結果として生じる免疫血清の、免疫原性コンジュゲートに対する反応性であって、公知の技法、例えば、酵素免疫測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫ブロット、免疫沈降、ウイルス中和などによりアッセイされる反応性；または感染性疾患作用物質のレベル、例えば、ウイルスレベルについてアッセイするための、当技術分野で公知の任意の方法（例えば、対象に由来する試料を培養することによる）により決定される、免疫化された宿主の、病原体による感染からの防御、および／もしくは免疫化された宿主における、病原体による感染に起因する症状の緩和、あるいは当技術分野で公知の他の技法など、多様な手法により解析することができる。感染性疾患作用物質のレベルはまた、免疫グロブリンが指向する抗原のレベルを測定することによっても決定されうる。感染性疾患作用物質のレベルの低下、または感染性疾患の症状の改善は、組成物が、有効であることを指し示す。
【０１２０】
本発明の治療剤を、ｉｎ  ｖｉｖｏの動物における使用の前に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、所望の治療活性または予防活性について調べることができる。例えば、具体的な治療剤の投与が、適応であるのかどうかを決定するのに使用しうるｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは、細胞系に由来する適切な細胞、または特定の疾患もしくは障害を有する対象から培養された細胞を、治療剤へと曝露するか、またはこれらに、他の形で治療剤を投与し、治療剤の、細胞に対する効果を観察する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける細胞培養物アッセイを含む。
【０１２１】
代替的に、治療は、治療剤を、感染性疾患作用物質による感染を受けやすいが、感染性疾患作用物質に感染していない細胞（対象から培養された細胞、または培養された細胞系に由来する細胞）と接触させ、細胞を、感染性疾患作用物質へと曝露し、次いで、治療剤と接触させた細胞の感染率が、治療剤と接触させなかった細胞の感染率より小さいのかどうかを決定することによりアッセイすることもできる。細胞への、感染性疾患作用物質の感染は、当技術分野で公知の任意の方法によりアッセイすることができる。
加えて、治療剤は、動物モデルまたはヒト対象において、抗体が指向する分子のレベルを、治療の前、治療時、または治療後の、適切な時間間隔で測定することにより評価することもできる。分子の量の、任意の変化または変化の非存在を同定し、処置の、対象に対する効果と相関させることができる。分子のレベルは、当技術分野で公知の任意の方法により決定することができる。
本発明の方法および組成物を使用する、動物への、ＰＤＣｏＶおよび／またはＰＥＤＶによるワクチン接種の後で、当技術分野で公知の結合アッセイを使用して、結果として得られる抗体と、特定の分子との間の結合について評価することができる。これらのアッセイはまた、特定の抗原に対して、より高度なアフィニティーまたは特異性を呈する抗体を選択するのにも実施することができる。
【０１２２】
対象への投与：
好ましい投与経路は、鼻腔内経路、経口経路、皮内経路、および筋内経路を含むがこれらに限定されない。当業者は、本発明の組成物がまた、１、２回、またはこれを超える回数の投与によっても投与しうるほか、他の投与経路によっても投与しうることを認識するであろう。例えば、このような他の経路は、皮下経路、皮内経路、静脈内経路、血管内経路、動脈内経路、腹腔内経路、髄腔内経路、気管内経路、皮内経路、心内経路、小葉内経路、髄内経路、肺内経路、および膣内経路を含む。所望の処置の持続期間および有効性に応じて、本発明に従う組成物は、１回または何回かにわたり投与することができ、また、間欠的に投与することもでき、例えば、何日間、何週間、または何カ月間かにわたり毎日投与することもでき、異なる投与量で投与することもできる。
【０１２３】
以下の例は、本発明の好ましい実施形態を裏付けるために組み入れられる。当業者は、後続の例で開示される技法が、本発明者らにより、本発明の実施において、良好に機能することが発見され、したがって、その実施のために好ましい方式を構成すると考えられる技法を表すことを理解されたい。しかし、当業者は、本開示に照らして、開示される具体的な実施形態では、多くの変化を施すことができるが、それでもなお、本発明の精神および範囲から逸脱しない限りにおいて、同様または類似の結果を得うることを理解されたい。
【実施例】
【０１２４】
（例１）
ＰＥＤＶ株の単離および作製
死滅させたウイルスである、ブタ流行性下痢ウイルスワクチンを作製するために、ＰＥＤＶ（分離株）のマスター種培養物を、まず作製した。このマスター種から、ＰＥＤＶの培養物を増殖させ、次いで、不活化させた。次いで、ブタ流行性下痢ウイルスワクチンを作製するために、不活化させたウイルス培養物を、アジュバントと混合した。以下の方法を使用して、ブタ流行性下痢ウイルスワクチンを作製した。
極度の下痢を呈する動物または動物に由来する組織は、２０１３年に得られた。粘膜剥離物に由来するホモジネートを、０．２μｍのシリンジフィルターを通して濾過されたこれらの動物から作出し、濾過物を使用して、アフリカグリーンモンキー腎臓細胞（ＶＥＲＯ）に接種した。改変ＭＥＭ、ブタトリプシン、リン酸トリプトース培養液、酵母抽出物、およびＨＥＰＥＳ緩衝液を含有するＰＥＤＶ維持培地の存在下で、ウイルスを増殖させた。ウイルスの増殖は、特徴的な合胞体の形成および細胞単層の融合について点検することにより、査定し、視覚化した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製のＭＩＳＥＱ（登録商標）シーケンサー技術を使用して、ＣＰＥ陽性材料をシーケンシングにかけた。
ＰＥＤＶマスター種ウイルス培養物（「ＰＥＤＶ  ＭＳＶ」）を作製するために、ブタ流行性下痢ウイルス株（分離株）（ＰＥＤＶ分離株）を、ＢＩ  ＶＥＲＯ細胞内で単離し、ＢＩ  ＶＥＲＯ細胞内で、のべ１９代にわたり継代培養し、次いで、ウイルスを、２０１３  ＥＵ  ＶＥＲＯ細胞内で、第３０継代まで増殖させた。第３０継代のウイルスを希釈し、ＰＥＤＶ  ＫＶ−１２５１−１２５−１０−ＯＫと命名されるマスター種ウイルスとして登録した。
【０１２５】
２０１３  ＥＵ  ＶＥＲＯ細胞に、改変最小必須培地、ブタトリプシン（１０μｇ／ｍｌ）、リン酸トリプトース培養液（０．３％）、酵母抽出物（０．０２％）、および１ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（２．５％）を含有するＰＥＤＶ維持培地中のＰＥＤＶ  ＫＶ−１２５１−１２５−１０−ＯＫ  ＭＳＶを感染させることにより、マスター種ウイルスから、ＰＥＤＶ（本明細書で「１２５−１０」と称する、ＫＶ−１２５１−１２５−１０−ＯＫ）の培養物を作製した。典型的に、２０１３  ＥＵ  ＶＥＲＯ細胞に、８５０ｃｍ2のローラーボトル１本当たり１０4×ＴＣＩＤ50の最小用量のＰＥＤＶ（１２５−１０）ＭＳＶを感染させた。このような培養物は、ディスポーザブルの滅菌ローラーボトル内またはマイクロキャリアビーズ上で増殖させることができる。培養物は、細胞変性効果（「ＣＰＥ」）が観察されるまで、３６℃±２℃で、２４〜４８時間にわたりインキュベートした。特徴的な合胞体は、感染の１２時間以内に見うることが典型的であり、合胞体が拡大し、細胞の単層は、２４〜４８時間で融合するのに続いて、細胞の剥落が生じる。インキュベーション時に、培養物を、ＰＥＤＶにより誘導されたＣＰＥについてモニタリングして、純粋なＰＥＤＶ株を確認した。非定型のＣＰＥが観察されるか、または任意の目視可能なもしくは顕微鏡的な夾雑の証拠が存在する場合は、培養物を廃棄した。純粋なウイルス培養物を、ポリプロピレン製の滅菌カーボイへと、無菌的に採取した。ウイルスを、凍結融解させて、細胞に会合したビリオンを放出させ、遠心分離または０．４５μｍのフィルターに続く、０．２μｍのフィルターを通した濾過により清澄化した。不活化の前に、バルクウイルスの採取液を調べて、マイコプラズマの非存在を確認した。即時に不活化させない採取液は、−７０℃以下で保存した。
【０１２６】
採取液の容量を決定し、採取液の温度を、３６±２℃とする。２−ブロモエチレンアミン（ＢＥＡ）の０．４Ｍ溶液を、０．３Ｎ  ＮａＯＨの原液と混合して、バイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）原液を作出し、次いで、これを、採取液へと添加して、最終濃度５ｍＭのＢＥＩをもたらす。流体を、最小で２４時間にわたり、持続的に攪拌する。５ｍＭの最小最終濃度をもたらす、１．０Ｍのチオ硫酸ナトリウム溶液を添加して、任意の残存するＢＥＩを中和する。不活化させた採取液は、長期の場合は、−７０±３℃で保存することもでき、短期の場合は、４±３℃で保存することもできる。
【０１２７】
ＢＥＩによる処理の後、ウイルスの不活化を確認するように、培養物を、ＰＥＤＶに典型的なＣＰＥを誘導する、その能力について調べた。この作業は、ＢＥＩで処理されたウイルス液を、Ｖｅｒｏ細胞上に流過させ、Ｖｅｒｏ細胞を、任意のウイルス感染について点検することにより達せられた。ＢＥＩで処理された培養液は、典型的に、不活化アッセイが完了するまで、−７０℃以下で保存した。
【０１２８】
不活化ウイルスは、不活化ＰＥＤＶ培養物を、アジュバントである、ＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（登録商標）−ＢＣＬと、バルク系列を形成するように、２０％の組入れ率で、完全にブレンドすることにより、アジュバント処理されたワクチンとして製剤化した。バルク系列は、投与１または１０回分の用量（投与１回当たり２．０ｍｌで）を含有するバイアルへと移すまで、２〜８℃で維持した。
【０１２９】
（例２）
ブタデルタコロナウイルス株の単離および作製
ブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＮＶＳＬ）、Ａｍｅｓ、ＩＡから購入した。このウイルスは、ＮＶＳＬにおいて、２０１４年のイリノイ州由来のブタ腸試料から単離された。ウイルスは、５μｇ／ｍＬのＴＰＣＫトリプシンの存在下にある無血清培地中のブタ精巣（ＳＴ）細胞上で単離された。元のウイルスを、ＮＶＳＬにおいて、２ラウンドにわたるプラーク精製にかけ、第１０継代のウイルスを、出発材料として用いた。
【０１３０】
ＢＩにおいて、ＨＥＰＥＳ、リン酸トリプトース培養液、酵母抽出物、およびブタトリプシンを伴う改変最小必須培地を含有するＰＤＣｏＶ維持培地と共に、第１０継代のウイルスを、ブタ精巣（ＳＴ）細胞へと接種し、適応させた。細胞を、５％ＣＯ２と共に、３７℃で、２４〜４８時間にわたりインキュベートし、ＰＤＣｏＶにより誘導された細胞変性効果の証拠について観察した。ＣＰＥが完了し、細胞が剥落したら、フラスコを、１回凍結融解させ、溶解物を採取した。次いで、採取された材料を、連続継代のために、新鮮な単層へと接種した。継代は、このようにして、第１２継代まで続けた。第１２継代から採取されたウイルスを、「ＡＩ−ＳＴ２０１５」細胞と命名された、代替的な、派生的ブタ精巣（ＳＴ）細胞系統へと接種し、適応させた。さらに４代にわたるウイルスの継代を、ＡＩ−ＳＴ２０１５細胞内、第１１および１２継代と同じ形で実行し、Ｐ１６ウイルスを得た。Ｐ１６ウイルスを、ローラーボトルへと接種して、最終的な「Ｐ１７」マスター種ウイルス分離株を得、これを、採取し、０．２μｍのフィルターを通して濾過し、プールして、バルクのウイルス原液を得、−６０℃を下回る温度で保存した。マスター種ウイルスである「Ｐ１７」の平均力価を、１ｍＬ当たり４．９１  ｌｏｇ１０  ＦＡＩＤ５０と決定した。
【０１３１】
（例３）
ＰＥＤＶ分離株およびＰＤＣｏＶ分離株のゲノム配列解析
試料の調製および解析：
ウイルスを抽出する前に、組織培養物上清を、ＤＮアーゼおよびＲＮアーゼのカクテルで前処理して、残存する宿主細胞のゲノム核酸を除去した。次いで、ＲＮＥＡＳＹ（登録商標）ウイルスＲＮＡ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ；型番５２９０６）を使用して、ウイルスゲノムＲＮＡを、ヌクレアーゼで処理された試料から抽出した。抽出後、試料を、ＤＮアーゼで、再度処理して、ウイルスゲノムＲＮＡについて、さらにエンリッチした。その後、ランダムプライミング式逆転写およびＫｌｅｎｏｗ断片処理により、ウイルスゲノムＲＮＡを、二本鎖ｃＤＮＡ（ｄｓ  ｃＤＮＡ）へと転換した。次いで、ｄｓ  ｃＤＮＡ産物を、ＮＥＸＴＥＲＡ（登録商標）ＸＴライブラリー調製キット（型番ＦＣ−１３１−１０２４）を使用する、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭＩＳＥＱ（登録商標）シーケンサーベースのシーケンシングのためのライブラリーを作出するのに使用した。各試料を、５’末端および３’末端の両方において、固有のタグでバーコード処理して、バイオインフォマティクスによるミスビニングの可能性を最小化した。このライブラリーを、５００サイクルのキット（型番ＭＳ−１０２−２００３）を使用する、ＭＩＳＥＱ（登録商標）シーケンサーにかけ、ＮｅｘｔＧｅｎｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．３．４）およびＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒソフトウェア（ｖｅｒｓｉｏｎ  ５．１）の組合せを使用して、データを解析した。高品質配列を、２５を超えるＱスコア中央値を含有する配列として選択し、３’末端における、３つ以下の非判定塩基、またはＱスコアの測定値が１６未満である、３つ以下の連続塩基をカットオフとしてトリミングした。次いで、３５ｂｐの連なりにわたる、８５％またはこれを超えるマッチの判定基準を使用して、配列を、デノボでアセンブルして、各分離株について、推定全ゲノムを作出した。次いで、各々についての、推定完全ゲノム配列を、一塩基多型（ＳＮＰ）または可変的な小規模の挿入／欠失について検証する、鋳型ベースのアライメントにより検証した。
【０１３２】
ＰＥＤＶ分離株である１２５１−１２５−１０について、低品質データに対するトリミングの後で、平均の長さを１３６ｂｐとして、合計５７０，２５３の配列を生成した。これらの配列のうち、２７，９９５ｂｐ長の、単一のコンティグへとアセンブルされた４８４，２４７（８４．９％）は、ＢＬＡＳＴｎ解析により、一本鎖ＲＮＡ型アルファコロナウイルスであるＰＥＤＶに対する、大きな同一性があることがを明らかになった。合計１１の位置が、単一のヌクレオチドにおける多型、または小規模の挿入／欠失を呈したが、これらの位置を、表１に列挙する。
【０１３３】
表1:「125-10」である、1251-125-10分離株内の多型残基
【表１】
2020506915.tif 000003
【０１３４】
１２５１−１２５−１０の、完全な／完全に近い推定ＰＥＤＶゲノム（配列番号２９）を、ＰＥＤＶのうちで最も近縁の、Ｃｈｉｎｅｓｅ  ＡＨ２０１２分離株（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＫＣ２１０１４５）およびＮｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｏｒａｄｏ  ２０１３分離株（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＧＯ５８９２４）に照らしてアライメントした。いずれの分離株に対する同一性も、９９．２％を超えたことから、両方の株に対する、緊密な類縁性が指し示され、いずれの株も、ゲノグループ２ａであることが指し示される。
次に、免疫原性スパイクタンパク質の配列を、ＰＥＤＶスパイクタンパク質の、大規模なＧｅｎＢａｎｋリポジトリーに対する、タンパク質の同一性／類似性について検討した。ここでもまた、提供された、最も近縁のＧｅｎＢａｎｋ分離株は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＧＯ５８９２４）により寄託された、Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｏｒａｄｏ  ２０１３株に由来し、９９．５％を超える同一性（１３８６中１３８０の同一なアミノ酸）（配列番号Ｘ）を呈した。６カ所のアミノ酸変化のうち、１カ所は、２３，１０１位における多型に起因し、８３８位において、多数で、ＣＧＡ（Ａｒｇ）をコードするか、または少数で、ＣＡＡ（Ｇｌｎ）をコードするであろう。Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｏｒａｄｏ  ２０１３株は、この位置において、Ｇｌｎを含有する。
【０１３５】
ＰＤＣｏＶについて、１２の、個別に単離された試料をシーケンシングした。材料は、ウイルスＲＮＡについてエンリッチするために、ウイルス粒子に保護された核酸消化（ＲＮアーゼ＋ＤＮアーゼ）の後において抽出した。抽出後、核酸を、ＤＮアーゼで処理して、ＲＮＡについてエンリッチした。二本鎖ｃＤＮＡは、逆転写およびランダムヘキサマーによるプライミングを使用するｋｌｅｎｏｗ処理により作出した。次いで、これらの産物を、ライブラリーの作出のために使用した。
【０１３６】
試料を、ＮＥＸＴＥＲＡ（登録商標）ＸＴライブラリー調製キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ；型番ＦＣ−１３１−１０２４）を使用する、ライブラリーの作出を介する、ＭＩＳＥＱ（登録商標）シーケンサーベースのシーケンシングのために加工した。各試料を、５’末端および３’末端の両方において、固有のタグでバーコード処理して、バイオインフォマティクスによるミスビニングの可能性を最小化した。ライブラリーを、５００サイクルのキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ；型番ＭＳ−１０２−２００３）を使用する、ＭＩＳＥＱ（商標）シーケンサーにかけ、ＮＥＸＴＧＥＮＥ（登録商標）シーケンシングソフトウェア（ＳｏｆｔＧｅｎｅｔｉｃｓ，ＬＬＣ、ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．３．４．２）およびＳＥＱＵＥＮＣＥＲ（登録商標）ソフトウェア（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐ．、ｖｅｒｓｉｏｎ  ５．１）の組合せを使用して、データを解析した。高品質配列を、２５を超えるＱスコア中央値を含有する配列として選択し、３’末端における、３つ以下の非判定塩基、またはＱスコアの測定値が１６未満である、３つ以下の連続塩基をカットオフとしてトリミングした。３５ｂｐの連なりにわたる、８５％またはこれを超えるマッチの判定基準を使用して、これらの配列を、デノボでアセンブルし、かつ、基準ファイルに照らしてアライメントした。アライメントのための基準配列は、デノボの配列アセンブリーに由来するか、またはＣａｒｔｈａｇｅ株およびＮＶＳＬ  ＰＤＣｏＶ株（ＮＳＶＬ；ブタデルタコロナウイルス株である、ＵＳＡ／ＩＬ／２０１４／０２６ＰＤＶ＿Ｐ１１；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＫＰ９８１３９５．１）については、ＭＩＳＥＱ（登録商標）シーケンサー由来の基準配列に由来した。
【０１３７】
総じて、ＢＩウイルス分離株および他の株の各々の間の遺伝子類似性（元の分離株である「Ｃａｒｔｈａｇｅ」と、ＮＶＳＬ株との間の遺伝子類似性）は、大きく（＞９９．８％の同一性）、変異体ＮＶＳＬと、ＢＩ−ＳＴ細胞により増殖させたウイルスとの差異は、なおより少数の変化を呈する（＞９９．９５％同一性）（表２）。また、それぞれ、ＰＤＣｏＶ分離株／株の、完全ゲノムヌクレオチドについての、近隣結合法による系統樹、およびＰＤＣｏＶ分離株／株の、スパイクアミノ酸についての、近隣結合法による系統樹を概略的に示す、図１および２も参照されたい。スケールは、ｐ距離を指し示す。
【０１３８】
ＮＶＳＬによる変異体と、ＢＩ−ＳＴ細胞により増殖させたウイルスとの類似性は、試料の一部で由来が共通であることに起因する可能性が極めて高い。１つの注目すべき配列の差異は、培養されたＰＤＣｏＶ＿２２０１−１分離株内のスパイク（アミノ酸位置２２９〜２３１）における、インフレームの、９ｂｐの欠失の存在であるが、これは、ブタに由来する元のホモジネート中または材料中では観察されない。「Ｃａｒｔｈａｇｅ」分離株と公知の関連を有さない、ＢＩ  ＰＤＣｏＶ−５．０３２７分離株もまた、「ＢＩ−ＳＴ」細胞系内では、同一な欠失を呈するが、ＮＶＳＬ−ＳＴ細胞系内では、これを呈さないので、この位置は、ＩＮ／ＤＥＬによる可変性の「ホットスポット」であると考えられる。これらの変化は、ウイルス組織培養物への適応を示しうる。
【０１３９】
表2:BIウイルス分離株の間の遺伝子類似性の各々
【表２−１】
2020506915.tif 000004
【表２−２】
2020506915.tif 000005
【０１４０】
（例４）
全ＰＥＤＶ分離株および全ＰＤＣｏＶ分離株の不活化
ＰＥＤＶウイルスの各ロットまたはプールを、ＶＥＲＯ細胞内の継代による不活化について調べる。２４時間にわたる細胞培養物７５ｃｍ2に、不活化ＰＥＤＶ液２．０ｍＬを接種し、３６±３℃で、４８時間にわたり維持する。ＶＥＲＯ細胞のフラスコ１つは、接種せずにおく。陽性ウイルス対照のために、ＶＥＲＯ細胞の培養物に、陽性対照ＰＥＤＶを接種する。インキュベーション時間の終了時に、細胞単層を、ＰＥＤＶに典型的なＣＰＥについて検討する。材料を、３回にわたり、凍結および融解させ、次いで、各材料２ｍｌずつを、１日齢のＶＥＲＯ細胞へと接種した。培養物は、３７±２℃で、４８時間にわたり維持するものとする。第２継代の後、第３継代を実施する。インキュベーションおよび継代の後、免疫蛍光染色の欠如により決定される、ＢＥＩで処理されたウイルス液中の、ウイルス感染細胞の非存在は、十分な不活化試験を構成する。陽性対照ウイルスを接種された対照細胞は、ＰＥＤＶに典型的なＣＰＥを示すものとし、接種されていないフラスコは、ＰＥＤＶ  ＣＰＥの証拠を示さないものとする。
【０１４１】
ＰＤＣｏＶウイルス採取物を、５ｍＭのＢＥＩにより、３７℃で、２４時間にわたり不活化させる。不活化の後、採取物を、チオ硫酸ナトリウムにより中和する。不活化は、不活化採取物についてのＴＣＩＤ５０の査定により確認した。不活化材料中に、生ウイルスは検出されなかった。１０ｋｄの中空糸ＰＥＳカートリッジ（ＧＣ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；型番ＵＦＰ−１０−Ｃ−３ＭＡ）を使用して不活化され、中和されたウイルス採取物を濃縮する。濃縮された抗原を、改変最小必須培地（最終濃度＝１０倍濃度）で、無菌的に希釈する。希釈された抗原の一部を、ＥＭＵＬＳＩＧＥＮ  Ｄ（登録商標）（ＭＶＰ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；型番１０００５４０８）と組み合わせて、１２．５％の製剤を達成する。
【０１４２】
（例５）
ＰＤＣｏＶスパイク抗原をコードし、発現させる、組換えバキュロウイルスの構築
ＰＤＣｏＶ  Ｓ１−ＩｇＧ２ａ  Ｆｃバキュロウイルスの調製
ブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）スパイクのＳ１領域（アミノ酸１〜６７３）は、プライマーである、Ｐ２９６７１６７Ａ（配列番号１３）およびＰ２９６７１６７Ｂ（配列番号１４）を使用するＰＣＲにより、プラスミドＤＮＡから増幅した。短いＧＧＳリンカーおよびヒンジ領域を含む、ブタＩｇＧ２ａのＦｃ領域は、プライマーである、Ｐ２９６７１６７Ｃ（配列番号１５）およびＰ２９６８０１４Ｅ（配列番号１６）を使用して、プラスミドＤＮＡから増幅した。２つの断片を、プライマーである、Ｐ２９６７１６７Ａ（配列番号１３）およびＰ２９６８０１４Ｅ（配列番号１６）を使用する、オーバーラップエクステンションＰＣＲにより融合させて、開始コドンのすぐ５’側の、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列を含有する、ＰＤＣｏＶ  Ｓ１−ＩｇＧ２ａ  Ｆｃのコード配列（配列番号１７）を作出した。図３Ａにおける概略図を参照されたい。最終的なコード配列は、ＢａｍＨＩ制限部位と、ＮｏｔＩ制限部位とで挟んで、バキュロウイルス導入プラスミドであるｐＶＬ１３９３へのクローニングを容易とした。完了したら、プラスミドであるｐＶＬ１３９３−ＰＤＣｏＶ  Ｓ１−ＩｇＧ２ａ  Ｆｃを、直鎖化されたＢａｃｕｌｏＧｏｌｄバキュロウイルスＤＮＡと共に使用して、組換えバキュロウイルスを作製するように、Ｓｆ９昆虫細胞にトランスフェクトする。
【０１４３】
ＰＤＣｏＶＳ  ＢＤ  Ｂａｃｕｌｏｄｉｓｐｌａｙバキュロウイルスの調製
ブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）に由来するＰＤＣｏＶスパイク遺伝子を、プラスミドＤＮＡに由来する、２つの重複断片（Ｎ末端およびＣ末端）内にクローニングした。Ｎ末端断片は、プライマーである、Ｐ２９６７００２Ｃ（配列番号２３）およびＰ２９６７００２Ｄ（配列番号２４）を使用して増幅する一方、Ｃ末端断片は、プライマーである、Ｐ２９６７００２Ｅ（配列番号２５）およびＰ２９６７００２Ｆ（配列番号２６）を使用して増幅した。Ｎ末端およびＣ末端の断片は、天然のシグナル配列およびＣ末端のテールを除去するように増幅した。Ｎ末端断片を、プライマーである、Ｐ２９０１９４Ａ（配列番号１９）およびＰ２９６７００２Ｄ（配列番号２０）を使用する、オーバーラップエクステンションＰＣＲ（ＯＥ−ＰＣＲ）により、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）ｇｐ６４シグナル配列（Ｏ２９６７００２Ａ）（配列番号２１）と融合させた。Ｃ末端断片を、プライマーである、Ｐ２９０１９４Ｂ（配列番号２０）およびＰ２９６７００２Ｅ（配列番号２５）を使用するＯＥ−ＰＣＲにより、ＡｃＮＰＶ  ｇｐ６４Ｃ末端テールのコード配列（Ｏ２９６７００２Ｂ）（配列番号２２）と融合させた。結果として得られる２つの断片を、プライマーである、Ｐ２９０１９４Ａ（配列番号１９）およびＰ２９０１９４Ｂ（配列番号２０）を使用するＯＥ−ＰＣＲにより融合させて、開始コドンのすぐ５’側の、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列を含有する、ＰＤＣｏＶスパイクＢａｃｕｌｏＤｉｓｐｌａｙ（ＰＤＣｏＶＳ  ＢＤ）のコード配列（配列番号２７）を作出した。図３Ｂにおける概略図を参照されたい。最終的なコード配列は、ＢａｍＨＩ制限部位と、ＮｏｔＩ制限部位とで挟んで、バキュロウイルス導入プラスミドであるｐＶＬ１３９３へのクローニングを容易とした。完了したら、プラスミドである、ｐＶＬ１３９３−ＰＤＣｏＶＳ  ＢＤを、直鎖化されたＢａｃｕｌｏＧｏｌｄバキュロウイルスＤＮＡと共に使用して、組換えバキュロウイルスを作製するように、Ｓｆ９昆虫細胞にトランスフェクトする。
【０１４４】
（例６）
ＰＥＤＶスパイク抗原を含む医薬組成物（ワクチン）の調製：
５ｍＭのＢＥＩを使用して、不活化ＰＥＤＶ材料のために、ＰＥＤＶウイルス採取物を、最小で２４時間にわたり不活化させ、清澄化し、０．４５μｍで濾過した。
中和の後、多様なアジュバントを添加し、以下のワクチン／医薬組成物を作出した。
【０１４５】
（例７）
ＰＤＣｏＶスパイク抗原を含む医薬組成物（ワクチン）の調製：
ＰＤＣｏＶ抗原（ＢａｃｌｕｌｏＳ−ＢＤ−ＰＤＣｏＶおよびＢａｃｕｌｏＳ−ＦＣ−ＰＤＣｏＶ）のバッチを、３Ｌのスピナー内で増殖させた。感染させるために、ＳＦ＋細胞に、ウイルスを、約１．０〜２．１の間のＭＯＩで接種した。フラスコを、１００ｒｐｍに設定して、攪拌しながら、２７℃でインキュベートした。採取は、感染の５日後に開始した。採取時に、細胞の生存率は、２４％〜２６％の間であり、１ｍＬ当たりの生存細胞は、０．３１×１０6〜０．３６×１０6個の間であった。採取液は、１０，０００×ｇで１０分間にわたる遠心分離により清澄化し、０．２μｍで濾過した。清澄化した採取液を、ＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（登録商標）Ｄと組み合わせて、１２．５％の製剤を達成する。
【０１４６】
（例８）
ブタへの、不活化ＰＤＣｏＶワクチンおよびバキュロウイルススパイクワクチンの接種、ならびに血清学的応答の評価
研究の目的は、従来の仔ブタにおける、ＰＤＣｏＶワクチンプロトタイプによる血清学的応答について査定することであった。ＰＤＣｏＶのスパイクタンパク質を、多様なバックボーン内で発現させる、いくつかのプロトタイプワクチンを作出した。加えて、全細胞不活化ウイルス調製物も作出した。
【０１４７】
被験群の説明については、下記の表３を参照されたい。群１〜４を無作為化し、同じ室内に保持した。加えて、本研究には、約４週齢で離乳した、厳密な対照動物（群５）も組み入れた。０日目に、ブタを、４つの群へと無作為化し、プロトタイプのＰＤＣｏＶワクチンまたはプラセボの各々を、用量２ｍＬずつ投与した。２１日目に、ブタに、プロトタイプワクチンの各々の２回目の投与または追加投与を施した。血清および口腔液を、各回のワクチン接種時および３５日目の処置の投与の前に、ブタから回収した。試料を、セロコンバージョンの証拠についてアッセイした。全般的な健康の観察を、部屋ごとに、毎日記録した。注射部位を、ワクチンの投与後最低で３日間にわたり反応について観察した。
【０１４８】
表3:被験群
【表３】
2020506915.tif 000006
ＩＦＡにより検出される、ワクチン接種後における血清学的応答
間接的免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）
１倍濃度のリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ；Ｇｉｂｃｏ；型番１００１０−０２３）中で、各試料の、１：４０〜１：３２０にわたる、２倍の希釈系列を作った。各希釈試料１００μｌずつを、ＰＤＣｏＶ感染プレートへと添加し、３７℃で、１時間にわたりインキュベートした。インキュベーション後、血清を除去し、単層を、１倍濃度のＰＢＳにより、２回にわたり洗浄した。次いで、希釈率を１：１００とするＦＩＴＣコンジュゲートヤギ抗ブタＩｇＧ抗体、ウェル１つ当たり１０μｌずつを使用して、細胞を染色した。力価は、非感染対照ウェルと比較して、ＰＤＣｏＶの染色を示す、最大血清希釈率として報告した。
【０１４９】
−８日目（Ｄ−８）、２１日目、および３５日目における血清学的応答を、下記の表４における群ごとに提示する。日数および群ごとの検出の最小２乗平均および頻度を、表５に提示する。いかなる動物も、ワクチン接種の前に、検出可能な血清学的応答を示さなかった（図４も参照されたい）。
単回の（ｓｉｇｎａｌ）ワクチン接種の後、ＢａｃｕｌｏＳ−ＢＤプロトタイプをワクチン接種された動物のうちの２０〜７３％が応答した。３５日目までに、全細胞プロトタイプまたはＢａｃｕｌｏＳ−ＦＣプロトタイプをワクチン接種された、全ての動物が、検出可能な応答を示した。ＢａｃｕｌｏＳ−ＢＤプロトタイプをワクチン接種された動物のうちの５０％だけが、３５日目までに、検出可能な応答を示した。
【０１５０】
−８日目において、プロトタイプをワクチン接種されたブタにおける血清学的応答と、プラセボをワクチン接種されたブタにおける血清学的応答との間の有意差は観察されなかった。２１および３５日目までに、プロトタイプワクチンを施される動物では、血清学的応答が増大した（全ての日数における、全ての群について、ｐ＜０．００２）。数値的には、ＢａｃｕｌｏＳ−ＦＣプロトタイプワクチンおよび全細胞プロトタイプワクチンは、３５日目までに、ＢａｃｕｌｏＳＢＤ構築物と比較して、高度なＩｇＧ応答を刺激すると考えられた。
【０１５１】
表4:IFAにより測定される、日数および群ごとの血清学的データ
【表４】
2020506915.tif 000007
*値が、プラセボ群と有意に異なることを指し示す(ダネット法(Dunnett's method))
【０１５２】
Ｓ１−ＩｇＧ２ａ−ＦｃベースのＥＬＩＳＡにより検出される、ワクチン接種後における血清学的応答
ＰＤＣｏＶ  ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡ
精製されたＰＤＣｏＶ−Ｓ１−ＩｇＧ２ａＦｃ抗原（ＢＩＶＩ；型番３０９１−１４１；０．２ｍｇ／ｍＬ）を、炭酸緩衝液（ＢＩＶＩ；型番３１４４−１８０）中、１：６６６６．６７に希釈した。ＥＬＩＳＡプレート（高結合９６ウェルプレート；Ｇｒｅｉｎｅｒ；型番６５５０６１）を、ウェル１つ当たり１００μｌの希釈抗原でコーティングし、４℃で、一晩にわたりインキュベートした。プレートを、自動式プレート洗浄機を使用して、ウェル１つ当たり３００μｌのＴＢＳＴ（０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０）で、５回にわたり洗浄した。洗浄ステップの後、１５０μｌのブロッキング溶液（カゼインブロッカー；Ｔｈｅｒｍｏ；型番３７５３２）を、ウェルごとに添加し、プレートを、１５〜３０℃で、１時間にわたりインキュベートした。初期血清希釈液を、カゼインブロッカー中、希釈率を１：２００として調製した（陰性対照および被験試料）。インキュベーションの後、カゼインブロッカーを、プレートから除去し、被験試料の２倍の系列希釈液を、１：２００〜１２８００にわたって作った（カゼインブロッカー中で作った）。陰性対照の２倍の系列希釈液は、１：２００〜１：２０４８００にわたって作った。希釈液は、プレート上において、最終容量を、ウェル１つ当たり１００μｌとして調製した。プレートを、振盪（１００ｒｐｍ）しながら、３７℃で、１時間にわたりインキュベートした。インキュベーションの後、プレートを、既に記載した通りに洗浄した。希釈率を１：２０００（カゼインブロッカー中）とする、ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ブタＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ；型番１１４−０３５−００３）を調製し、１００μｌを、各ウェルへと添加した。プレートを、１００ｒｐｍで振盪しながら、３７℃で、１時間にわたりインキュベートし、次いで、既に記載した通りに洗浄した。検出のために、ウェル１つ当たり１００μｌの、調製されたＴＭＢ基質（ＫＰＬ；型番５０−７６−００）を、ウェルごとに添加した。プレートを、１５〜３０℃で、１０分間にわたりインキュベートした。反応を、１ＮのＨＣｌ、ウェル１つ当たり１００μｌで停止させ、自動式プレートリーダーにより、４５０ｎｍで、速やかに読み取った。
【０１５３】
結果は、以下の計算により作成した。まず、最後の５つの陰性血清希釈ウェルからの光学濃度（ＯＤ）リーディングの平均値および標準偏差を計算した。次いで、カットオフを、平均値＋３標準偏差として確立した。各試料の光学濃度リーディング（それらの初期希釈率における）を、このプレートについてのバックグラウンドカットオフで除した。データは、シグナル：バックグラウンド比として報告した。
−８日目、２１日目、および３５日目における血清学的応答を、群ごとに提示する。日数および群ごとの検出の最小２乗平均および頻度を、表５（図５も参照されたい）に提示する。いかなる動物も、ワクチン接種の前に、検出可能な血清学的応答を示さなかった。
【０１５４】
２回目のワクチン接種の後、群に関わらず、動物のうちの４０〜４５％が応答した。３５日目までに、全細胞プロトタイプまたはＢａｃｕｌｏＳ−ＦＣプロトタイプをワクチン接種された、全ての動物が、検出可能な応答を示した。８日目または２１日目において、プロトタイプをワクチン接種されたブタにおける血清学的応答と、プラセボをワクチン接種されたブタにおける血清学的応答との間の有意差は観察されなかった。３５日目までに、プロトタイプワクチンを施される動物では、血清学的応答が増大した（群１、２、および４について、それぞれ、ｐ＝０．００３９、＜０．０００１または＜０．０００１）。ＩＦＡ結果と同様に、ＢａｃｕｌｏＳ−ＦＣプロトタイプワクチンおよび全細胞プロトタイプワクチンは、３５日目までに、ＢａｃｕｌｏＳ−ＢＤ構築物と比較して、高度なＩｇＧ応答を刺激した。
【０１５５】
表5:IgG ELISAにより測定された、日数および群ごとの血清学的データ
【表５】
2020506915.tif 000008
*値が、プラセボ群と有意に異なることを指し示す(ダネット法(Dunnett's method))
【０１５６】
（例９）
ＰＥＤＶバキュロウイルスワクチンの有効性
以下の研究では、死滅させたブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）ワクチン、またはバキュロウイルス構築物によるワクチン２ｍＬずつ、２回にわたる投与（ｄｏｅｓ）によるワクチン接種に対する血清学的応答であって、３週齢時における、ワクチンの、ブタへの投与の後で測定される応答について査定した。主要転帰は、処置されたブタの、ワクチン接種後において回収された血清試料についての、蛍光フォーカス中和（ＦＦＮ）による血清学的試験結果であった。
【０１５７】
研究群は、Ｔ０１＝ＰＢＳ（ｎ＝１０）；Ｔ０２＝１ｍｌ当たり６．９３  ｌｏｇ  ＴＣＩＤ50のＢＥＩ  ＰＥＤＶ＋２０％のＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（登録商標）−ＢＣＬ（ｎ＝２０）；Ｔ０３＝ＰＥＤＶスパイクＡｇを伴うバキュロウイルス（ｎ＝９）；ＰＥＤＶスパイクＡｇを伴う６倍濃縮バキュロウイルス（ｎ＝１０）；ＰＥＤＶスパイクＡｇを伴う、トリプシンバキュロウイルス（ｎ＝１０）；および条件付きで認可された、死滅させた陽性対照ワクチン（ＰＯＳ  ＣＯＮ）（ｎ＝１０）を含んだ。０日目に、ブタに、右側頸部に、２ｍＬの筋内処置を投与した。２回目の処置を、Ｔ０１〜Ｔ０５については、１４日目に、左側頸部に、Ｔ０６については、２１日目に投与した。
【０１５８】
ＰＥＤＶ２ａ−ＢＤの調製
本研究では、ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）２ａに由来するスパイク遺伝子を、プラスミドＤＮＡに由来する、２つの重複断片（Ｎ末端およびＣ末端）内にクローニングした。Ｎ末端断片は、プライマーである、Ｐ１３６０１１０Ａ（配列番号３７）およびＰＥＤＶ−Ｓ２−Ｒ（配列番号３８）を使用して増幅する一方、Ｃ末端断片は、プライマーである、ＰＥＤＶ−Ｓ１−Ｆ（配列番号３９）およびＰ１３６０１１０Ｂ（配列番号４０）を使用して増幅した。Ｎ末端およびＣ末端の断片は、天然のシグナル配列およびＣ末端のテールを除去するように増幅した。Ｎ末端断片を、プライマーである、Ｐ２９０１９４Ａ（配列番号４５）およびＰＥＤＶ−Ｓ２−Ｒ（配列番号３８）を使用するオーバーラップエクステンションＰＣＲ（ＯＥ−ＰＣＲ）により、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）ｇｐ６４シグナル配列（Ｏ１３６０１１０Ｃ）（配列番号４１）と融合させた。Ｃ末端断片を、プライマーである、Ｐ２９０１９４Ｂ（配列番号４３）およびＰＥＤＶ−Ｓ１−Ｆ（配列番号４４）を使用するＯＥ−ＰＣＲにより、ＡｃＮＰＶ  ｇｐ６４のＣ末端テールのコード配列（Ｏ１３６０１１０Ｄ）（配列番号４２）と融合させた。結果として得られる２つの断片を、プライマーである、Ｐ２９０１９４Ａ（配列番号４５）およびＰ２９０１９４Ｂ（配列番号４３）を使用するＯＥ−ＰＣＲにより融合させて、開始コドンのすぐ５’側の、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列を含有する、ＰＥＤＶスパイクＢａｃｕｌｏＤｉｓｐｌａｙ（ＰＥＤＶＳ  ＢＤ）（配列番号４６）のコード配列を作出した。最終的なコード配列は、ＢａｍＨＩ制限部位と、ＮｏｔＩ制限部位とで挟んで、バキュロウイルス導入プラスミドであるｐＶＬ１３９３へのクローニングを容易とした。完了したら、プラスミドである、ｐＶＬ１３９３−ＰＥＤＶＳ  ＢＤを、直鎖化されたＢａｃｕｌｏＧｏｌｄバキュロウイルスＤＮＡと共に使用して、組換えバキュロウイルスを作製するように、Ｓｆ９昆虫細胞にトランスフェクトする。図６Ａ：ＰＥＤＶ  ２ａ  ＢＤ  ＢａｃｕｌｏＤｉｓｐｌａｙバキュロウイルスについての概略図を参照されたい。
【０１５９】
表6:PEDVによる試作品製剤および対照
【表６】
2020506915.tif 000009
BEI = バイナリーエチレンイミン
*PEDVスパイクシグナル配列およびC末端テールを、バキュロウイルスのgp64同等物で置きかえた。組換えPEDVスパイクディスプレイバキュロウイルスを、昆虫細胞内で作製した。感染させた培養物を採取し、遠心分離および0.2μmにおける濾過により清澄化させた。清澄化させた採取材料を、5mMのBEIにより、37℃で、72時間にわたり不活化させ、次いで、遠心分離および0.2μmにおける濾過により清澄化させた。
【０１６０】
血清学：
ワクチン接種後（２８日目および３５日目）におけるセロコンバージョンは、２０％のＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（登録商標）ＢＣＬでアジュバント処理されたＰＥＤｖワクチンをワクチン接種されたブタのうちの２０％（Ｔ０２；表７）、およびトリプシンで増殖させたＰＥＤＶスパイク−バキュロウイルスをワクチン接種されたブタのうちの６０％（Ｔ０５；表７）において生じた。全ての処置群について、≧１：２０である血清陽性ブタの幾何平均力価を、下記の表７に提示する。全てのブタの、処置群ごとの力価の頻度分布を、表８に提示する。
【０１６１】
表7:血清陽性ブタの比率、および血清学的に応答するブタについての、群ごとの幾何平均力価
【表７】
2020506915.tif 000010
【０１６２】
表8:群ごとの力価の頻度分布
【表８】
2020506915.tif 000011
【０１６３】
結論：
セロコンバージョンは、ＢＥＩで不活化させ、２０％のＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（登録商標）ＢＣＬでアジュバント処理した、１ｍｌ当たり６．９３  ｌｏｇ10  ＴＣＩＤ50のＰＥＤＶにより製剤化された被験ワクチンの、２回にわたる投与の後の、Ｔ０２のブタのうちの２０％において生じた。セロコンバージョンは、ＰＥＤＶスパイク糖タンパク質により製剤化された、被験組換えトリプシン増殖型バキュロウイルスワクチンの、２回にわたる投与の後の、Ｔ０５のブタのうちの６０％において生じた。
【０１６４】
（例１０）
ＰＥＤＶ  ２ａ  ＢＤバキュロウイルスワクチンの有効性
本研究の主要目的は、従来の雌ブタモデルにおいて、プロトタイプのＰＥＤＶバキュロウイルスワクチンの有効性を査定することであった。３６匹の雌ブタを、５つの群へと無作為化した。分娩の５週間前および２週間前の雌ブタの筋内に、被験ＰＥＤＶワクチン、プラセボ、市販の陽性対照によりワクチン接種するか、またはワクチン接種せずにおいた（厳密な対照）。使用された群およびワクチンについての簡単な記載を、下記の表９に列挙する。妊娠期間、分娩期間、および抗原投与期間を通して、血清試料および糞便試料を、雌ブタおよびブタから回収して、抗ＰＥＤＶ抗体およびＰＥＤＶ  ＲＮＡの存在をモニタリングした。臨床徴候を、毎日１回記録した。
【０１６５】
研究の主要転帰パラメータは、ブタの死亡率であった。６９％のブタの死亡率、臨床徴候の存在、およびプラセボ群におけるブタに由来する糞便材料中のＰＥＤＶ  ＲＮＡの同定に基づき、本研究のために使用された抗原投与モデルは、妥当であると考えられた。雌ブタにおける、２回の投与にわたるＢａｃｕｌｏＳ−ＮＴ構築物の使用は、ブタの死亡率を、有意に低減することが可能であった。これと比較して、現在市販されているＰＥＤＶワクチンもまた、ブタの死亡率を低減することが可能であったが、低減は、有意ではなかった。ＢａｃｕｌｏＳ−ＮＴプロトタイプは、トリプシンの存在下で増殖させず、１２．５％のＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（登録商標）Ｄでアジュバント処理したので、このプロトタイプは、作製のための好ましいフォーマットであり、２１日間の休薬期間を有することが期待される。
【０１６６】
研究の副次的転帰パラメータは、ブタにおける臨床徴候を防止する、ワクチンプロトタイプの能力であった。全てのブタのうち、９３％を超えるブタが、少なくとも連続で２日間にわたり、完全な水様便を示したので、ワクチンプロトタイプまたは市販品のいずれも、重度の臨床徴候の発生を防止することが可能ではなかった。同様に、いずれのワクチンも、ブタにおける臨床徴候の持続期間を短縮することができなかった。
【０１６７】
表9:研究デザイン:
【表９】
2020506915.tif 000012
【０１６８】
分娩の５週間前および２週間前の雌ブタの筋内に、被験ＰＥＤＶワクチン、プラセボ、市販の陽性対照によりワクチン接種するか、またはワクチン接種せずにおいた（厳密な対照）。妊娠期間中に、血清試料および糞便試料を、各ワクチン接種の前に回収し、それぞれ、セロコンバージョンおよび排出の証拠についてアッセイした。臨床観察を、各雌ブタについて、毎日記録した。
ブタの死亡率：
毒性ＰＥＤＶ分離株による抗原投与後におけるブタの死亡率が、ワクチンの有効性について評価するのに使用される主要転帰パラメータであった。抗原投与期間中の、群ごとの死亡率の概要を、下記の表１０に提示する。群および日数ごとの生存率を、図７に提示する（「群および日数ごとの、生存するブタの百分率」）。０日目に、適切なサイズの、滅菌注射針およびシリンジを使用して、用量２ｍＬのワクチンを、健常な雌ブタの右側頸部の筋組織に投与した。２１日目に、注射を頸部の左側に施すことを例外として、工程は同一であった。
【０１６９】
抗原投与材料は、ＰＥＤＶウイルス増殖培地（ＨＥＰＥＳ、リン酸トリプトース培養液、および酵母抽出物を伴う、改変最小必須培地）中に、１．０×１０3の力価へと希釈された、毒性のＰＥＤＶ原液材料（ＰＥＤＶ１２５１−１４０−４；ｐ５；型番２８４２−１７４；力価＝１ｍｌ当たり２．０２×１０5  ＴＣＩＤ50）であった。かつての研究と同様に、死亡の大部分は、抗原投与材料への曝露の８日以内に見られた。
総じて、全ての群は、感染から４８時間以内のブタの大部分において臨床徴候が存在する同様の傾向を有した。臨床徴候は、抗原投与後６日目までを通して、全ての群内の、５０％を超えるブタにおいて存在した。抗原投与後７日目〜抗原投与後１１日目において、臨床徴候は、消失した。抗原投与後１３日目までに、ブタのうちのいずれにおいても、臨床徴候は観察されなかった。
【０１７０】
解析：
生物統計学：全てのデータは、解析のために、ＳＡＳ（登録商標）ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．４へとインポートした。処置群ごとに、頻度分布を含む、データの一覧および統計の概要を作成した。同腹仔効果および飼育場効果を、適切な効果として組み込む解析を行った。抗原投与後における、群ごとのブタの死亡率および同腹仔ごとのブタの死亡率を列挙し、記述統計学の平均値、中央値、最小値、および最大値を、群ごとの概要のために使用した。群ごとの死亡率および同腹仔ごとの死亡率は、ピアソンのカイ２乗を伴う一般線形モデルを、過分散（ｏｖｅｒ  ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ）として使用して解析した。次いで、各処置群についての、プラセボ群と比較した、モデルベースの予防分画および９５％信頼区間を推定した。過分散としてのピアソンのカイ２乗を伴う一般線形モデルを、固定効果としての年齢、処置スコア、およびパリティーを加えた死亡率データへと、再度当てはめて、これらの因子が、何らかの効果を、死亡率に対して及ぼしたのかどうかを検討した。研究の無作為化データを一覧した。ブタについての糞便スコアを、頻度分布を使用して、群および日数ごとに一覧し、まとめた。まとめは、抗原投与の前および抗原投与時に、個別に行った。雌ブタについての臨床徴候のスコア（糞便、嘔吐、注射部位における病変、乳汁分泌欠如、および処置スコア）を、頻度分布を使用して、群および日数ごとに、分娩の前および後について、個別に一覧し、まとめた。ブタの体重データを記述統計学の中央値、最小値、および最大値を使用して、同腹仔ごとに、群および日数ごとに一覧し、まとめた。１日当たりの平均体重増加量（ＡＤＷＧ）は、モデルを、固定効果としての群および分娩時の体重；ランダム効果としての同腹仔および飼育室と組み合わせることにより解析した。最小２乗平均および群間におけるそれらの対比を推定し、対応する標準誤差および９５％信頼区間を推定した。ブタについての剖検データであって、盲腸病変、結腸病変、小腸病変、および肺病変の、臓器および内容物についての病理学データ、ならびに胃についての記録を含むデータを、死亡率により分けられた群ごとに、各変数についてのカウントを使用して、一覧し、まとめた。任意の病変が存在するのかどうかもまた、群ごとのカウントおよび百分率を使用してまとめた。雌ブタについてのＰＥＤウイルス血清抗体力価（ＦＦＮ）、ブタおよび雌ブタの個々についての、血清ＩｇＡによる全細胞ＥＬＩＳＡ、雌ブタについての、ＩｇＡおよびＩｇＧによるｂａｃｕｌｏｓ  ＥＬＩＳＡ、雌ブタおよびブタについての、ＩｇＡおよびＩｇＧによるＩＤＥＸＸ  ＥＬＩＳＡならびにＰＣＲを含む検査室データを、まず一覧した。次に、幾何平均値（ＦＦＮ）（ＦＦＮについては、標準偏差は与えられなかったが）、または平均値（ＥＬＩＳＡ、ＰＣＲ）を使用して、記述統計学の平均値、最小値、最大値、および標準誤差を、群および日数ごとに計算した。次に、ランダム効果としての同腹仔および飼育室と組み合わせたモデルを使用して、群および日数ごとの、最小２乗平均、標準誤差、および９５％信頼区間を推定した。対をなす群間の最小２乗平均および対応する９５％信頼区間の対比を推定した。
【０１７１】
表10:群ごとのブタの死亡率
【表１０】
2020506915.tif 000013
【０１７２】
研究の主要転帰パラメータは、ブタの死亡率であった。このパラメータに基づき、雌ブタにおける、２回の投与にわたるＢａｃｕｌｏＳ−ＮＴ構築物の使用は、ブタの死亡率を、有意に低減することが可能であった（ＰＦ＝０．４８）。これと比較して、現在市販されているＰＥＤＶワクチンもまた、ブタの死亡率を低減することが可能であったが、低減は、有意ではなかった（群４）。ＢａｃｕｌｏＳ−ＮＴプロトタイプは、トリプシンの存在下で増殖させず、１２．５％のＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（登録商標）Ｄでアジュバント処理したので、このプロトタイプは、作製のための好ましいフォーマットであり、２１日間の休薬期間を有することが期待される。
【０１７３】
研究の副次的転帰パラメータは、ブタおよび雌ブタにおける臨床徴候を防止する、ワクチンプロトタイプの能力であった。全てのブタのうち、９３％を超えるブタが、少なくとも、連続で２日間にわたり、完全な水様便を示したので、ワクチンプロトタイプまたは市販品のいずれも、重度の臨床徴候の発生を防止することが可能ではなかった。同様に、いずれのワクチンも、ブタにおける臨床徴候の持続期間を短縮することが可能ではなかった。臨床徴候の消失の後、ＰＥＤＶ  ＲＮＡを、抗原投与後１４日目の動物のうちの１２〜３３％において同定した。これは、ワクチン接種が、定着に対して防御しなかったことを示唆する。群１つ当たり１〜３匹の雌ブタでは、少なくとも連続で２日間にわたり、重度の下痢が観察された。これは、ワクチンが、雌ブタを、抗原投与されたブタにより排出された、高量ウイルスへの曝露に対して、完全に防御することが可能ではなかったことを指し示す。加えて、雌ブタの大部分（１６例中１４例）で、検出可能な量のウイルスが、腸間膜リンパ節内に存在していたことは、ワクチン接種が、定着を防止しなかったことを指し示す。
【０１７４】
ワクチン接種された雌ブタの大部分は、２回にわたるワクチンの投与後において、検出可能なＩｇＧ（およびＦＦＮ）応答を示し、力価は、プラセボによるワクチン接種対照と比較して高度（データは示さない）であった。ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡの結果と、ＦＦＮの結果とは、極めて類似するので、ＦＦＮアッセイは、主に、ＩｇＧを検出している可能性が高い。ＩｇＧは、ウイルスを中和しうるが、群間の明らかな差異は見られなかったので、ＩｇＧが、ＰＥＤＶワクチンの有効性の唯一の決定因子である可能性は低い。
【０１７５】
ＩｇＡ  ＥＬＩＳＡ（ＩＤＥＸＸ）として測定されたＩｇＡレベルに基づくと、ワクチン接種を受けていない雌ブタおよびワクチン接種された雌ブタは、抗原投与後１３／１４日目までに、同様の血清中ＩｇＡ力価および乳汁中ＩｇＡ力価を有した。しかし、ワクチン接種された動物では、抗原投与後３日目において回収された血清中、初乳中、および乳汁中のＩｇＡ力価の増大が認められた。ワクチン接種された雌ブタから生き残るブタもまた、最高のＩｇＡ力価を有したので、このデータは、腸感染における、ＩｇＡの重要性を強調する、既に公表された文献を支持する（図８を参照されたい）。
【０１７６】
（例１１）
ＰＥＤＶ２ｂバキュロウイルスワクチンの調製
ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）２ｂに由来するスパイク遺伝子は、２つの重複断片（Ｎ末端およびＣ末端）内で調製した。Ｎ末端断片は、プライマーである、Ｐ２９０１９４Ａ（配列番号４８）およびＰ３１８３１３１Ｂ（配列番号４９）を使用して、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）ｇｐ６４シグナル配列の、ＰＥＤＶ  ２ｂスパイクのアミノ酸２２〜４００との融合体を含有する合成ＤＮＡから増幅した。Ｃ末端断片は、プライマーである、Ｐ３１８３１３１Ａ（配列番号５０）およびＰ２９０１９４Ｂ（配列番号５１）を使用して、ＡｃＮＰＶ  ｇｐ６４のＣ末端テールのコード配列を既に含有する、ｐＶＬ１３９３−ＰＥＤＶＳ  ＢＤプラスミドＤＮＡから増幅した。結果として得られる２つの断片を、プライマーである、Ｐ２９０１９４Ａ（配列番号４８）およびＰ２９０１９４Ｂ（配列番号５１）を使用するＯＥ−ＰＣＲにより融合させて、開始コドンのすぐ５’側の、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列を含有する、ＰＥＤＶ  ２ｂスパイクＢａｃｕｌｏＤｉｓｐｌａｙ（ＰＥＤＶＳ  ２ｂ  ＢＤ）（配列番号５２）のコード配列を作出した。最終的なコード配列は、ＢａｍＨＩ制限部位と、ＮｏｔＩ制限部位とで挟んで、バキュロウイルス導入プラスミドであるｐＶＬ１３９３へのクローニングを容易とした。完了したら、プラスミドである、ｐＶＬ１３９３−ＰＥＤＶＳ  ２ｂ  ＢＤを、直鎖化されたＢａｃｕｌｏＧｏｌｄバキュロウイルスＤＮＡと共に使用して、組換えバキュロウイルスを作製するように、Ｓｆ９昆虫細胞にトランスフェクトする。図６Ｂ：ＰＥＤＶ  ２ｂ  ＢＤ  ＢａｃｕｌｏＤｉｓｐｌａｙバキュロウイルスタンパク質マップについての概略図を参照されたい。
【０１７７】
（例１２）
ＰＥＤＶおよびＰＤＣｏＶの有効性研究
下記の研究をデザインして、死滅させたＰＥＤＶワクチンおよび／または死滅させたＰＤＣｏＶワクチンまたは他のプロトタイプワクチンの、ブタにおける有効性について評価した。主要転帰パラメータは、ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）および／またはＰＤＣｏＶによる抗原投与後における、仔ブタの死亡率である。副次的転帰パラメータは、雌親ブタについての血清学であった。測定される他のパラメータは、ワクチン接種後の雌ブタにおける臨床徴候（ＩＳＬを含む）；ワクチン接種後の雌ブタにおけるウイルスの排出（ｑＲＴ−ＰＣＲを介する）；仔ブタにおける臨床徴候；ならびに仔ブタにおけるＰＥＤＶおよび／またはＰＤＣｏＶについての血清学を含んだ。
【０１７８】
ＰＥＤＶ研究：
分娩の４および２週間前（０日目および１４日目）において、妊娠中の各雌親に、３つの経路（筋内、鼻腔内、および経口）により、２ｍＬの、以下の処置：Ｔ０１（陰性対照、ＮＣ）リン酸緩衝生理食塩液；Ｔ０２（ＢＥＩ−ＶＨ）２０％のＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（登録商標）ＢＣＬによるアジュバント処理；Ｔ０３（厳密な対照；ＳＣ）非ワクチン接種／非抗原投与対照として用いられたのうちの１つを投与した。４匹の動物を有したＴ０６を除き、群１つ当たり８匹ずつの動物を使用した。３５日目または３６日目に、ブタに、１ｍｌ当たり２．０  ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０のＰＥＤＶウイルス採取物１ｍＬを、経口により抗原投与した。雌親およびブタにおける臨床徴候（嘔吐および下痢）を、抗原投与期に、毎日観察した。血清を、雌親から、分娩の４および２週間前（０日目および１４日目）、仔ブタへの抗原投与の前日（３４日目または３５日目）および試験終了日（５７日目）において回収した。
【０１７９】
０日目および１４日目において、ＰＥＤＶによるプロトタイプの免疫原性組成物を、雌ブタに投与した。各ワクチン接種時に、雌ブタに、２ｍＬずつが、筋内経路、鼻腔内経路、および経口経路により投与される、合計６ｍＬの材料を施した。筋内投与経路では、２ｍＬの注射を、耳の下方の頸部の筋組織へと施した。投与されるの頸部の左右は、初期のワクチン接種と、追加のワクチン接種とで交代させた。経口投与経路のためには、シリンジへと接合させた、８Ｆｒのポリプロピレンカテーテル（直径２．７ｍｍ×長さ２５４ｍｍ）を使用して、２ｍｌを、尾側の口腔咽頭経由で送達した。鼻腔内経路のためには、シリンジへと接合させた、４．５インチのカテーテルを使用して１ｍｌずつを、各鼻腔に注入した。
【０１８０】
表11:PEDVによる被験免疫原性組成物および対照生成物
【表１１】
2020506915.tif 000014
【０１８１】
表12:PEDVによる抗原投与の材料
【表１２】
2020506915.tif 000015
【０１８２】
ワクチンの有効性：
ブタの死亡率：毒性ＰＥＤＶ分離株による抗原投与後におけるブタの死亡率が、ワクチンの有効性について評価するのに使用される主要転帰パラメータであった。抗原投与期間中の、群ごとの死亡率の概要を、下記に列挙する。死亡率が５５％であり、Ｔ０１（ＮＣ）において、全ての同腹仔が罹患したので、抗原投与は、十分に毒性であると考えられた。Ｔ０１（ＮＣ）と比較して、Ｔ０２（ＢＥＩ−ＶＨ）は、０．２０（−０．５５０，０．５８６）のＰＦ（９５％ＣＩ）により、ブタ死亡率数値の低減を裏付けた。９５％ＣＩ（−０．５５０，０．５８６）が、ゼロを含んだので、低減は、統計学的に有意ではなかった（表１３を参照されたい）。
【０１８３】
この研究では、超二項変動が明らかである結果として、基礎的な二項分布を用いたところ、Ｔ０２（ＢＥＩ−ＶＨ）ＰＦについて、広い信頼区間がもたらされた。死亡率は、群内の同腹仔間で、Ｔ０２（ＢＥＩ−ＶＨ）について、０％〜１００％の範囲にわたることを含め、大きく変動した。
剖検時に、腸試料または腸内容物を採取し、ＰＥＤＶ抗原を検出するように、ｑＲＴ−ＰＣＲにより調べた。死亡率がピーク時の動物に由来する被験試料のうちの５５．５％から、ＰＥＤＶが検出された。
【０１８４】
表13:
【表１３】
2020506915.tif 000016
* T01(NC)における罹患率に基づく
**NC= NC=計算なし。研究デザインに基づき、T02(BEI-VH)に可能な信頼区間
【０１８５】
雌ブタについての血清学：
蛍光フォーカス中和（ＦＦＮ）アッセイ：ＦＦＮアッセイを使用して、ワクチン接種および抗原投与の後の雌親における、ウイルス中和応答について評価した。群ごとに列挙される幾何平均力価を、血液を雌ブタから回収した日について、下記に提示する。
２回にわたるワクチンの投与後、Ｔ０２（ＢＥＩ−ＶＨ）における雌ブタ８例中２例（２５％）が、検出可能なレベルの中和抗体を有した。検出可能なレベルの中和抗体は、他の群のいずれにおいても観察されなかった。
ＰＥＤＶへの外側曝露の後、曝露された処置群内の全ての雌ブタは、検出可能なレベルの中和抗体を有した。Ｔ０３（ＳＣ）群内の動物は、試験を通して、血清中陰性を維持した。５７日目（曝露の約２１日後）における幾何平均力価は、ワクチン接種が、Ｔ０１（ＮＣ）と比較して、高値の力価を結果としてもたらすことを指し示した。Ｔ０２（ＢＥＩ−ＶＨ）群における雌ブタは、Ｔ０１（ＮＣ）における雌ブタについての、２００のＧＭＴと比較して約３倍の力価である、６１３のＧＭＴを有した（ｐ＝０．００５）。Ｔ０２（ＢＥＩ−ＶＨ）群における複数の試料が、最大の被験希釈率（１：６４０）において、検出可能な中和抗体を有したので、これらの結果は、群間差の保守的な推定値を表す可能性が高い。
【０１８６】
表14:雌ブタについての血清学
【表１４】
2020506915.tif 000017
全ての値が、<20であった場合は、幾何平均力価を、<20として提示する。他の場合は、<20の値を、GMT計算のために、10とした。
**T01(NC)およびT02(BEI-VH)についての、57日目のGMTは、逆変換された最小2乗平均である。
【０１８７】
Ｓ１ベースのＥＬＩＳＡデータ：
Ｓ１ベースのＥＬＩＳＡを使用して、ワクチン接種および抗原投与の後における、ＰＥＤＶスパイクタンパク質に対する、雌親の応答について評価した。初乳、乳汁、および血清についてのアッセイ結果を、試料を回収した日について、群ごとに列挙する。
【０１８８】
ブタへの抗原投与時に、Ｔ０２（ＢＥＩ−ＶＨ）における雌ブタは、Ｔ０１（ＮＣ）における雌ブタと比較して、有意に高度な、血清中の幾何平均力価を有した（ｐ＝０．０００５）。ＰＥＤＶへの曝露の後、２つ群間では、大きな有意差が認められた（ｐ＜０．０００１）。
Ｔ０２（ＢＥＩ−ＶＨ）と、Ｔ０４（ＮＣ）との間では、初乳中および乳汁中の抗ＰＥＤＶ  ＩｇＡの幾何平均力価における有意差が観察されなかった。
【０１８９】
表15:
【表１５】
2020506915.tif 000018
* T01(NC)およびT02(BEI-VH)についてのGMTは、逆変換された最小2乗平均である。
【０１９０】
ブタについての血清学：
剖検時に、血清を、ブタから回収して、中和抗体の存在について査定した。下記の表１６は、陽性ブタの幾何平均値ＦＦＮ力価を、群ごとに提示する。表１６はまた、被験動物数に対する、ＧＭＴが２０以上のブタの数として表される検出頻度も含む。試験は、入手可能な全ての試料に対して実施した。多数のブタに由来する試料は、死亡と剖検との時差のために、得ることが不可能であった。
【０１９１】
死亡状態（死亡：死亡した／死亡していない）ごとのＦＦＮ力価、および群（全体）ごとのＦＦＮ力価についての記述統計学を、下記に列挙する。総じて、ワクチン接種群では、剖検時のいかんに関わらず、同様の比率のブタが、セロコンバージョンした（または母体の抗体を有した）。しかし、Ｔ０１（ＮＣ）では、試験終了の前に死亡したブタのうちの高百分率（８８％）が、研究の持続期間にわたり生存したブタ（４３％）と比較して、力価を有した。
群ごとの全体のブタ力価を検討すると、Ｔ０２（ＢＥＩ−ＶＨ）について、死亡率の推定値は、群全体のＦＦＮ百分率と逆相関した。
【０１９２】
表16:
【表１６】
2020506915.tif 000019
* GMT(力価≧20の動物数/全被験ブタ;百分率);なお、血清は、全てのブタから得られたわけではない
【０１９３】
抗原投与後における臨床観察：
ブタの糞便スコア：群ごとの、ブタにおける異常な糞便の観察期間、および死亡状態（死亡：死亡した／死亡していない）ごとの、ブタにおける異常な糞便の観察期間についての記述統計学を、下記に列挙する。総じて、死亡状態が同じブタにおける、異常な糞便スコアの持続期間中央値は、群間で同様であった。死亡するか、または安楽死させた動物では、異常な糞便スコアの持続期間中央値が、数値上短くなった。この傾向は、Ｔ０１（ＮＣ）のブタにおいて、最も明白であったが、これらの動物の大部分が、抗原投与後の１週目以内に死亡したという事実による副次的なものである可能性が高い。
【０１９４】
表17:
【表１７】
2020506915.tif 000020
ブタにおける糞便スコアの重症度を、下記の、頻度についての表１８にまとめられる。全ての処置群において、ブタの大部分（＞９１％）が、抗原投与後の、少なくとも１回の観察時に、２の糞便スコアを提示した。
【０１９５】
表18:
【表１８】
2020506915.tif 000021
結論：
Ｔ０２（ＢＥＩ−ＶＨ）群では、Ｔ０１（ＮＣ）群と比較して、ブタの死亡率の２０％の低減が観察された。本研究では、３つの投与経路を試みた。３つの経路を使用したが、ＩＭ以外の経路が、アジュバントおよびワクチンによる製剤に基づくＴ０２（ＢＥＩ−ＶＨ）の有効性に寄与したとは予測されない。総じて、不活化前力価を、最小の、１ｍｌ当たり６．０４  ｌｏｇ  ＴＣＩＤ50とする、２０％のＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（登録商標）−ＢＣＬワクチンでアジュバント処理された不活化ＰＥＤＶは、仔ブタおよび雌ブタにおいて、良好な免疫応答を誘導すると考えられる。好ましいワクチン接種スケジュールは、２週間間隔で、２ｍｌずつ、３回にわたる投与である、３週齢またはこれを超える仔ブタのためのＩＭ投与経路である。Ｔ０２（ＢＥＩ−ＶＨ）では、ワクチン接種後の雌ブタにおける臨床徴候が観察されず、他の処置群でも、限定的であった。ワクチン接種の使用は、生産ブタの百分率に影響を及ぼさないと考えられた（データは示さない）。
【０１９６】
雌親ブタについての血清学は、２つの個別のアッセイ（フォーカス蛍光中和、Ｓ１ベースのＥＬＩＳＡ）により、副次的パラメータとして査定された。いずれのアッセイも、ワクチン接種および曝露の後のＴ０２（ＢＥＩ−ＶＨ）において、Ｔ０１（ＮＣ）と比較して、有意な力価の増大を指し示した。ＦＦＮアッセイの公知の限界のために、試料はまた、Ｓ１ベースのＥＬＩＳＡによっても調べた。スパイクタンパク質のＳ１ドメインは、中和エピトープを含有すると予測されるので、このＥＬＩＳＡが選択された。
【０１９７】
ＰＥＤＶへの外側曝露の後、曝露された処置群内の全ての動物は、検出可能なレベルの中和抗体を有した。Ｔ０２（ＢＥＩ−ＶＨ）における雌ブタは、Ｔ０１（ＮＣ）動物と比較して、約３倍の力価を有した。これは、ワクチンの使用が、初期の主要な応答を刺激し、抗原投与用ウイルスへの曝露後における、より大きな副次的応答を結果としてもたらしたことの証拠である。Ｔ０２（ＢＥＩ−ＶＨ）群における複数の試料が、最大の被験希釈率（１：６４０）において、検出可能な中和抗体を有したので、これらの結果は、群間差の保守的な推定値を表す可能性が高い。
【０１９８】
表19:ブタの死亡率および雌ブタについての血清学的データを下記にまとめる
【表１９】
2020506915.tif 000022
【０１９９】
ＰＤＣｏＶについての研究
本研究の目的は、プロトタイプのＰＤＣｏＶワクチンの、宿主動物における有効性を決定することであった。ＰＤＣｏＶの抗原投与材料およびＰＤＣｏＶについての疾患モデルを開発するための、下記の予備研究に基づくと、ワクチン接種されなかった仔ブタは、抗原投与から１週間以内に、体重の減少および下痢を呈したが、回復した。死亡は、観察されなかった。
【０２００】
表20:ブタデルタコロナウイルス(PDCoV)による抗原投与の材料:
【表２０】
2020506915.tif 000023
【０２０１】
ブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）についての抗原投与株を確立するために、２つの内部抗原投与分離株（群３および４）を、ＢＩ−ＳＴ細胞上で増殖させ、ＮＶＳＬ  ＰＤＣｏＶ分離株（イリノイ州、２０１４）と比較した。群３および４における分離株は、それらが保有する突然変異と、ＮＶＳＬ（イリノイ州、２０１４）分離株からの、それらの遺伝的距離とに基づき選択した。群３のウイルス（ＢＩＰＤＣｏＶ−５．０３２７）は、ＮＳＶＬ  ＰＤＣｏＶ分離株と比較して、スパイク糖タンパク質内の、３つのアミノ酸欠失と、ＯＲＦ１ＡＢ遺伝子内の、２つの変化とを有した。群４のウイルス（ＢＩ ＰＤＣｏＶ  ２．０３０７）は、ＮＶＳＬ  ＰＤＣｏＶと比較して、スパイク糖タンパク質内の、４つのアミノ酸欠失と、ＯＲＦ１ＡＢ遺伝子内の、３つの差異とを有した。
【０２０２】
抗原投与された仔ブタを、抗原投与後における下痢について評定した［評定中、０＝正常、１＝異常（全くの液状便ではない）、または２＝重度の下痢（全くの液状便）］。陰性対照群では、下痢が観察されなかった。加えて、ＮＶＳＬ  ＰＤＣｏＶにより抗原投与された群は、抗原投与後において、体重の減少、嘔吐、または下痢の、いかなる臨床徴候も示さなかった。群３および４における仔ブタは、重度の臨床徴候を呈し、仔ブタの１００％が、嘔吐および体重の減少を伴う、重度の下痢（２のスコア）を経た。加えて、群３および４における雌ブタも、下痢を患った（抗原投与後６日目〜８日目）が、処置された。かつての公表された研究は、ＰＤＣｏＶに感染した仔ブタにおける感染（およびウイルスの排出）の遷延について記載した。かつての研究による観察は、本発明者による結果と符合する。
ＮＶＳＬ  ＰＤＣｏＶ群および陰性対照群における動物は、抗原投与後に、体重が増加した。これと比較して、２つの抗原投与用分離株であるＢＩＰＤＣｏＶ−５．０３２７（群３）およびＢＩＰＤＣｏＶ  ２．０３０７（群４）により抗原投与された動物は、同じ期間内に、対照群と比較して、それほど頑健な体重の増加を呈さなかった。
【０２０３】
有効性研究：
表21:PDCoVについての研究デザイン(ワクチン群、用量、および経路)
【表２１】
2020506915.tif 000024
有効性研究のために、４つの群の雌ブタに、分娩の５および２週間前において、適切な経路により、表２１で詳述された各ワクチン製剤により、ワクチン接種した。血清は、セロコンバージョンアッセイのために、各ワクチン接種時に、処置を投与する前に、雌ブタから回収する。糞便試料は、各ワクチン接種時に、雌ブタから回収し、ワクチン排出の証拠についてアッセイする。
免疫化された雌ブタに由来する仔ブタは、分娩時に、試験へと登録する。仔ブタには、経口経路を使用して、約５〜７日齢において、１．０ｍＬの抗原投与材料を接種する。
【０２０４】
仔ブタおよび雌ブタのいずれも、抗原投与後（ＤＰＣ）０日目〜抗原投与後１４日目にわたり、毎日１回、臨床徴候についてモニタリングした。抗原投与後に、糞便試料および血清試料を、全ての仔ブタおよび雌ブタから採取した。糞便試料を、ＰＤＣｏＶ  ＲＮＡの存在について調べ、血清を、抗ＰＤＣｏＶ抗体の存在について調べる。初乳は、全ての雌ブタから、分娩時または分娩時近傍において回収する。乳汁は、全ての雌ブタから、抗原投与後３日目、および抗原投与後１０日目〜抗原投与後１４日目の間の１つの時点において回収する。初乳および乳汁を、抗ＰＤＣｏＶ抗体の存在について調べる。仔ブタの体重は、抗原投与後０、７、および２１日目にモニタリングし、最終回の血清の回収は、抗原投与後２１日目に行う。
【０２０５】
本明細書で開示され、特許請求される組成物および方法の全ては、本開示に照らして、不要な実験を伴わずに作製し、実行することができる。本発明の組成物および方法について、好ましい実施形態との関係で記載してきたが、当業者には、本発明の概念、精神、および範囲から逸脱しない限りにおいて、本明細書において記載される組成物および方法、ならびに方法のステップまたはステップの連鎖に、変動を適用しうることが明らかであろう。より具体的には、同じ結果または同様の結果を達成しながら、化学的かつ生理学的に類縁である、ある特定の薬剤を、本明細書で記載される薬剤で代用しうることが明らかであろう。当業者に明らかな、全てのこのような同様の代用および改変は、付属の特許請求の範囲により規定される、本発明の精神、範囲、および概念の中にあるものとみなされる。
【０２０６】
以下の参考文献は、それらが、本明細書で明示される詳細に対して補助的な、例示的な手順上の詳細または他の詳細を提示する程度において、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。
【０２０７】
参考文献
2020506915.tif 000025
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2020506915.tif 000027
2020506915.tif 000028
2020506915.tif 000029
2020506915.tif 000030
2020506915.tif 000031
【図１】
2020506915.tif 000032
【図２】
2020506915.tif 000033
【図３Ａ】
2020506915.tif 000034
【図３Ｂ】
2020506915.tif 000035
【図４】
2020506915.tif 000036
【図５】
2020506915.tif 000037
【図６Ａ】
2020506915.tif 000038
【図６Ｂ】
2020506915.tif 000039
【図７】
2020506915.tif 000040
【図８】
2020506915.tif 000041
【配列表】
2020506915000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年7月26日(2019.7.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）の抗原とアジュバントとを含む免疫原性組成物であって、ＰＥＤＶが、（i）配列番号３２または３６と少なくとも９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド、（ii）配列番号２９または３３のＲＮＡ相補体と少なくとも９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド、および／または、（iii）配列番号３０、３４、４６または５２と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされるスパイクタンパク質を含む、免疫原性組成物。
【請求項２】
抗原が、化学的に不活化された全ＰＥＤＶである、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
抗原が、エチレンイミン、バイナリーエチレンイミン、アセチルエチレンイミン、またはこれらの混合物で化学的に不活化された全ＰＥＤＶである、請求項２に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
抗原が、組換え抗原である、請求項１から３のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
組換え抗原が、（i）配列番号３１、３５、４７または５３と少なくとも９０％の配列同一性を有するＰＥＤＶスパイクタンパク質、および／または、（ii）配列番号３１、３５、４７または５３と少なくとも９０％の配列同一性を有するＰＥＤＶスパイクタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項４に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
組換え抗原が、ＰＥＤＶのＭ、Ｅ、またはＮタンパク質を含む、請求項４に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
組換え抗原が、組換えベクター、組換えＰＥＤＶスパイクタンパク質、またはこれらの組合せである、請求項４に記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
アジュバントが、水中油エマルジョンである、請求項１から７のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
薬学的に許容可能な担体および／または賦形剤をさらに含む、請求項１から８のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
ブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）の抗原をさらに含む、請求項１から９のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
ＰＤＣｏＶが、（i）配列番号２、６、または１０と少なくとも９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド、（ii）配列番号１、５、もしくは９のＲＮＡ相補体と少なくとも９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド、および／または、（iii）配列番号３、７、１１、１７、または２７と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされるスパイクタンパク質を含む、請求項１０に記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
ＰＤＣｏＶの抗原が、不活化された全ＰＤＣｏＶである、請求項１１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
ＰＤＣｏＶの抗原が、（i）配列番号４、８、１２、１８または２８と少なくとも９０％の配列同一性を有するＰＤＣｏＶスパイクタンパク質、および／または、（ii）配列番号４、８、１２、１８または２８と少なくとも９０％の配列同一性を有するＰＤＣｏＶスパイクタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組換え抗原である、請求項１１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１４】
ＰＥＤＶに関連する疾患の臨床徴候を発症するブタのリスクを軽減するための方法であって、ブタに請求項１から１３のいずれか１項に記載の免疫原性組成物を投与するステップを含む方法。
【請求項１５】
免疫原性組成物が、請求項１０から１３のいずれか１項に記載の免疫原性組成物であり、ＰＥＤＶおよびＰＤＣｏＶに関連する疾患の臨床徴候を発症するブタのリスクを低減する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ＰＥＤＶの組換え抗原とアジュバントとを含む免疫原性組成物を作製する方法であって、
組換え抗原を、宿主細胞内で作製させるステップ；
組換え抗原を宿主細胞から採取するステップ；および
水中油エマルジョンベースのアジュバントを、組換え抗原に添加するステップ
を含み、
組換え抗原が、（i）配列番号３１、３５、４７または５３と少なくとも９０％の配列同一性を有するＰＥＤＶスパイクタンパク質、および／または、（ii）配列番号３１、３５、４７または５３と少なくとも９０％の配列同一性を有するＰＥＤＶスパイクタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、方法。
【請求項１７】
組換え抗原が、宿主細胞内で組換えバキュロウイルスベクターによって発現されたＰＥＤＶスパイクタンパク質を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
宿主細胞が、昆虫細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ＰＤＣｏＶの抗原とアジュバントとを含む免疫原性組成物であって、ＰＤＣｏＶが、（i）配列番号２、６または１０と少なくとも９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド、（ii）配列番号１、５または９のＲＮＡ相補体と少なくとも９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド、および／または、（iii）配列番号３、７、１１、１７または２７と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列によりコードされるスパイクタンパク質を含む、免疫原性組成物。
【請求項２０】
抗原が、
不活化された全ＰＤＣｏＶである、または
（i）配列番号４、８、１２、１８または２８と少なくとも９０％の配列同一性を有するＰＤＣｏＶスパイクタンパク質、および／または、（ii）配列番号４、８、１２、１８または２８と少なくとも９０％の配列同一性を有するＰＤＣｏＶスパイクタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、組換え抗原である、
請求項１９に記載の免疫原性組成物。
【国際調査報告】
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