(57)【要約】本発明は、とりわけ、極薄コンフォーマルコーティングを施された、生細胞、細胞集塊、組織、臓器、及びハイブリッド合成臓器などの生体表面、ならびに、例えば、クリック反応性水溶性ポリマーを使用した、生体表面を損傷または顕著に修飾しない条件下でのその作製方法を提供する。一部の実施形態では、コーティングされた生体表面は、それを必要とする対象への送達に好適である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハイドロゲルコンフォーマルコーティングを有する生体表面を含む組成物であって、前記コンフォーマルコーティングを有しない好適な対照生体表面と比べて、前記生体表面が、ｉ）機能を保持する、及びｉｉ）損傷または他の形態の表面修飾を実質的に有しないか、またはごく少量しか有しない、前記組成物。
【請求項２】
前記ハイドロゲルが、５〜１０ｋＤａの４アームＰＥＧ、もしくは１００〜２００ｋＤａでありホスホコリン６０〜９０％のメタクリロイルオキシエチルホスホコリンコポリマー、またはそれらの組み合わせなどのマルチアームポリマーの共有結合性架橋ネットワークを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ハイドロゲル中での生体表面のコンフォーマルコーティング方法であって、
２つの水性層を含む系を用意することであって、第１の層が、約０．２５％〜約２％（Ｗ／Ｖ）の懸濁化剤、約１％〜約２５％（Ｗ／Ｖ）の第１の官能化マルチアームポリマー、及び前記生体表面の溶液を含み、
第２の層が、糖類のクッション及び約１％〜約２５％（Ｗ／Ｖ）の第２の官能化マルチアームポリマーを含み、前記第２の官能化マルチアームポリマーの官能基が、生理学的条件下で前記第１の官能化マルチアームポリマーの官能基と反応性である、前記用意することと、
前記生体表面を前記第２の層の中に通過させ、それによって前記第１及び第２の官能基が反応し、前記生体表面にコンフォーマルコーティングを施す架橋したハイドロゲルを形成できるようにすることと、を含む、前記方法。
【請求項４】
前記第１の官能化マルチアームポリマーが、５〜１０ｋＤａの４アームＰＥＧである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記第１の官能化マルチアームポリマーが、１００〜２００ｋＤａでありホスホコリン６０〜９０％のメタクリロイルオキシエチルホスホコリンコポリマーである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記第１の官能化マルチアームポリマーの前記官能基が、リジン−ＤＢＣＯを含むＤＢＣＯ、またはアジドなどのクリック官能基である、請求項３〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記第２の官能化マルチアームポリマーが、５〜１０ｋＤａの４アームＰＥＧである、請求項３〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記第２の官能化マルチアームポリマーが、１００〜２００ｋＤａでありホスホコリン６０〜９０％のメタクリロイルオキシエチルホスホコリンコポリマーである、請求項３〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記第２の官能化マルチアームポリマーの前記官能基が、アジドまたはＤＢＣＯなどのクリック官能基である、請求項３〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記第２の層が第２の懸濁化剤を含み、任意選択的に、前記第２の懸濁化剤が、前記第１の層における前記懸濁化剤と同じである、請求項３〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記系が、前記第１の層と前記第２の層との間に介在層を含み、任意選択的に、前記介在層が気層である、請求項３〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記懸濁化剤が、約１％で存在する約１〜８ＭＤａの分子量を有するＰＥＯである、請求項３〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
ハイドロゲル中での生体表面のコンフォーマルコーティング方法であって、
介在する気層によって分離された２つの水性層を含む系を用意することであって、第１の層が、約０．２５％〜約２％（Ｗ／Ｖ）の懸濁化剤、約１％〜約２５％（Ｗ／Ｖ）の第１の官能化マルチアームポリマー、及び前記生体表面の溶液を含み、
第２の層が、約０．２５％〜約２％（Ｗ／Ｖ）の懸濁化剤、糖類のクッション、及び約１％〜約２５％（Ｗ／Ｖ）の第２の官能化マルチアームポリマーの溶液を含み、前記第２の官能化マルチアームポリマーの官能基が、生理学的条件下で前記第１の官能化マルチアームポリマーの官能基と反応性である、前記用意することと、
前記生体表面を前記第２の層の中に通過させ、それによって前記第１及び第２の官能基が反応し、前記生体表面にコンフォーマルコーティングを施す架橋したハイドロゲルを形成できるようにすることと、を含み、前記第１の官能化マルチアームポリマーが、メタクリロイルオキシエチルホスホコリンコポリマーである、前記方法。
【請求項１４】
前記第１の層が、前記第２の層に連続的に添加され、任意選択的に、前記第２の層が、前記混合物が遠心力下で移動できるように寸法決めされた開口部を有する先細サイドアームを通した前記第１の層の前記添加に好適な容器内にある、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記生体表面が、遠心分離によって前記第２の層の中に通過させられる、請求項３〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記コンフォーマルコーティングの厚さが、約２０μｍ未満である、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物または方法。
【請求項１７】
前記生体表面が、ヒト細胞などの哺乳類細胞などの動物細胞などの、生細胞を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物または方法。
【請求項１８】
前記生細胞がインスリン産生細胞である、請求項１７に記載の組成物または方法。
【請求項１９】
前記細胞が、誘導多能性幹細胞などの多能性幹細胞である、請求項１７または１８に記載の組成物または方法。
【請求項２０】
約２ｍＭ〜約２０ｍＭのグルコースで刺激すると、前記コンフォーマルコーティングに供されていない好適な対照細胞と比べて、前記細胞が、前記好適な対照細胞と実質的に同様である動態で及び／または濃度でインスリンを分泌する、請求項１９に記載の組成物または方法。
【請求項２１】
請求項３〜２０のいずれか１項に記載の方法によって調製された、コンフォーマルコーティングを有する生体表面。
【請求項２２】
薬学的に許容される希釈剤または賦形剤をさらに含み、任意選択的に、前記生体表面が、シリンジ中または生体適合性容器中に含有される、請求項１、２、または１６〜２１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２３】
哺乳類対象の治療方法であって、前記対象に、治療上有効量の請求項１、２、または１６〜２２のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含み、任意選択的に、前記投与が、直接注射によってまたは生体適合性容器の埋め込みによってのいずれかで行われ得る、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
先願
本出願は、２０１６年１２月１３日に出願された米国仮出願第６２／４３３，４４９号の利益を主張するものである。上記出願の教示全体は、参照により本明細書に援用される。
【０００２】
本発明は、薄い半透過性表面を有する生体表面（例えば、細胞、細胞集塊、組織、臓器、及びハイブリッド合成臓器）、すなわちコンフォーマルコーティングを施された生体表面、及びそれらの関連する作製方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
細胞ベースの療法、例えば、インスリン依存性糖尿病の治療のための膵島移植は、部分的には、根底にある宿主の免疫系活性に起因して限定されている。移植細胞を宿主の免疫系から隔離するための既存のバリアベースの方法は、成功が限られてきた。生細胞に適用されるマイクロカプセル化方法は、そのサイズの差異及びマイクロカプセル環境における細胞／集塊の様々な不規則分布のため、栄養及び酸素拡散の制限などのいくつかの深刻な欠点を有する。これらの問題は通常、細胞の機能及び寿命を脅かすものである。ハイドロゲルコンフォーマルコーティングは、慣習的なマイクロカプセル化に一般に伴うこれらの問題を克服できる可能性がある。コンフォーマルコーティングの理論上の利点（既存の様式によっては満たされないが）のうちのいくつかには、細胞へのより優れた栄養及び酸素供給により寿命が延長されること、薬物を分泌する細胞の機能性が改善されること、ならびに少量で高用量の細胞を負荷する機会が挙げられる。コンフォーマルコーティングのいくつかの利点にもかかわらず、生細胞に適用するために利用可能な好適な方法は何ら存在せず、コンフォーマルコーティングを参照する既存の方法は一般に非常に厚く、マイクロカプセル化の欠点の多くを共有している。さらに、二相系、エマルションベースの方法、及びラジカル／光開始法、微少流体法、及び液液界面法などの既存の方法は、１）生細胞を修飾してそれに有害作用をもたらす、２）５０〜７５ミクロンを超える厚いコートを形成することが多い、ならびに３）再現性及び拡張性に悩まされる。しがたって、コンフォーマルコーティングを有する（修飾または損傷が実質的にない）生体表面、及びそれらの関連する作製方法に対する必要性が存在し、この方法は、生理学的条件下で行うことができ、再現可能、拡張可能であり、より優れた結果をもたらすことが好ましい。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、とりわけ、真のコンフォーマルコーティングを有する（修飾または損傷が実質的にない）生体表面、及びそれらの関連する作製方法であって、生理学的条件下で行うことができ、再現可能、拡張可能であり、より優れた結果をもたらす該方法を提供する。
【０００５】
本発明によって提供される組成物は、ハイドロゲルなどのコンフォーマルコーティングを有し、これは生体表面が、損傷または修飾をほとんどまたは全く伴わずに、例えば、細胞表面分子の修飾を伴わずに、例えば、ハイドロゲルを共有結合性で生体表面に複合体化することなく、あるいは別様に、例えば、ジスルフィド結合を破壊する、またはカルボキシレート、アミン、もしくはヒドロキシル官能基を修飾する、またはＤＮＡを修飾することによって（例えば、光活性化を必要とするプロセスにおいて）（これは細胞をマトリックスに包理するために使用される多くのプロセスにつきものである）、表面を修飾することなく、生物学的機能を保持できるようにする。本明細書に例示されるように、例えば、マルチアームＰＥＧ分子及び線状メタクリロイルオキシエチルコポリマー、例えば、ホスホコリンまたは他の双性イオン基とのメタクリロイルオキシエチルコポリマー、例えば、ホスホコリン及び誘導体化アリルアミン（例えば、クリック反応性基などの付加された官能基を有し、任意選択的に、架橋を促進するための介在リンカーを有する）とのメタクリロイルオキシエチルコポリマーから形成されたハイドロゲルを含む、当業者に既知の様々なポリマーがハイドロゲルに好適であろう。
【０００６】
本発明によって提供される組成物を形成するための数多くの手法が本明細書に記載される。本発明によって提供される方法の利点には、容易性、再現性、拡張性、及び生理学的適合性が含まれる。細胞または細胞集塊などの生体表面は、過酷な条件に曝露されないため、他のコーティング方法に関連するある特定の変異原性の可能性がある工程を回避しながら、より優れた生存率及び機能性を維持する。ある特定の本発明によって提供される方法の１つの有利な態様は、水性相と、マルチアームポリマーと会合させたクリック反応性官能基、例えば、クリック官能性マルチアームＰＥＧ分子、ならびにメタクリロイルオキシエチルホスホコリン及びアリルアミンに基づくクリック官能性線状コポリマー（市販のＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）−ＮＨ０１など）との使用である。
【０００７】
また、関連する態様では、本発明によって提供される組成物は、例えば、障害の治療または緩和方法において、ヒトなどの対象に投与することができる。例えば、生物学的機能（例えば、インスリン産生）の欠如あるいは欠乏を特徴とする障害（１型糖尿病などのインスリン欠乏症）が、本発明によって提供される有効量の組成物、例えば、コンフォーマルコーティングを施された生体表面（例えば、インスリン産生細胞）を含む組成物を投与することによって、治療され得る。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】スクロース媒体中でのコーティングされたポリスチレン（ＰＳ）粒子（４アームＰＥＧＮＨ２／４アームＰＥＧＮＨＳ）の共焦点顕微鏡写真である。
【図２】コーティングされたＰＳ粒子（ＰＥＯ（分子量８００万）、４アームＰＥＧ−ＮＨＳ／４アームＰＥＧ−ＮＨ２）の共焦点顕微鏡写真である。
【図３】コーティングされたＰＳ粒子（ＰＥＯ（分子量４００万）、４アームＰＥＧ−ＮＨＳ／４アームＰＥＧ−ＮＨ２）の共焦点顕微鏡写真である。
【図４】コーティングされたＰＳ粒子（ＰＥＯ（分子量１００万）、４アームＰＥＧ−ＮＨＳ／４アームＰＥＧ−ＮＨ２）の共焦点顕微鏡写真である。
【図５】コーティングされたＰＳ粒子（ＰＥＯ（分子量１００万）、４アームＰＥＧ−Ｎ３／４アームＰＥＧ−ＤＢＣＯ）の共焦点顕微鏡写真である。
【図６】コーティングされたＰＳ粒子（ＰＥＯ（分子量８００万）、４アームＰＥＧ−Ｎ３／４アームＰＥＧ−ＤＢＣＯ）の共焦点顕微鏡写真である。
【図７】コーティングされた５００細胞のＨＣＴ１１６スフェロイド（ＰＥＯ（分子量１００万）、４アームＰＥＧ−Ｎ３／４アームＰＥＧ−ＤＢＣＯ）の共焦点顕微鏡写真である。
【図８】コーティングされた５００細胞のＨＣＴ１１６スフェロイド（ＰＥＯ（分子量４００万）、４アームＰＥＧ−Ｎ３／４アームＰＥＧ−ＤＢＣＯ）の共焦点顕微鏡写真である。
【図９】コーティングされた５００細胞のＨＣＴ１１６スフェロイド（ＰＥＯ（分子量８００万）、４アームＰＥＧ−Ｎ３／４アームＰＥＧ−ＤＢＣＯ）の共焦点顕微鏡写真である。
【図１０】コーティングされたＨＣＴ１１６  １０００細胞／スフェロイド（ＰＥＯ（分子量８００万）４アームＰＥＧ−ＤＢＣＯ：４アームＰＥＧアジド）の共焦点顕微鏡写真である。
【図１１】裸のＨＣＴ１１６  １０００細胞／スフェロイド（３日目の細胞生存率染色）の共焦点顕微鏡写真である。
【図１２】コーティングされたＨＣＴ１１６  １０００細胞／スフェロイド（ＰＥＯ８００万、４アームＰＥＧ−ＤＢＣＯ：４アームＰＥＧアジド）（３日目の細胞生存率染色）の共焦点顕微鏡写真である。
【図１３】従来の蛍光顕微鏡下でのコーティングされたラットインスリノーマ細胞スフェロイドの顕微鏡写真である。
【図１４】従来の蛍光顕微鏡下でのコーティングされたラット膵島細胞の顕微鏡写真である。
【図１５】コンフォーマルコーティングを施された、裸の、及びマイクロカプセル化されたラットインスリノーマ細胞スフェロイド製剤についてグルコースに対するインスリン分泌応答の比較を提供する、ラットインスリノーマ細胞スフェロイドを用いたインスリン分泌研究を要約する棒グラフである。
【図１６】コンフォーマルコーティングを施された、裸の、及びマイクロカプセル化されたラットインスリノーマスフェロイド製剤を比較する、インスリン分泌動態を高グルコース緩衝液中で測定した、ラットインスリノーマ細胞スフェロイドを用いたインスリン分泌動態を要約する折れ線グラフである。
【図１７】コンフォーマルコーティングを施された、裸の、またはマイクロカプセル化されたラット膵島細胞におけるグルコースに対するインスリン分泌応答を比較する、ラット膵島細胞を用いたインスリン分泌研究を要約する棒グラフである。
【図１８】コンフォーマルコーティングを施された、裸の、及びマイクロカプセル化されたラット膵島細胞製剤を比較する、高グルコース緩衝液中のラット膵島細胞インスリン分泌動態を要約する折れ線グラフである。
【図１９】第１の層（上層）に懸濁化剤を使用してクリック反応性ＭＰＣポリマーでコーティングした、コーティングされたＡＲＰＥ−１９スフェロイドの安定性の共焦点顕微鏡画像である。
【図２０】第１の層（上層）に懸濁化剤を使用してクリック反応性ＭＰＣポリマーでコーティングした、コーティングされたＡＲＰＥ−１９スフェロイドの安定性の共焦点顕微鏡画像である。
【図２１】第１の層（上層）に懸濁化剤を使用してクリック反応性ＭＰＣポリマーでコーティングした、コーティングされたＡＲＰＥ−１９スフェロイドの安定性の共焦点顕微鏡画像である。
【図２２】両方の層に懸濁化剤を使用してクリック反応性ＭＰＣポリマーでコーティングした、ＡＲＰＥ−１９スフェロイドの安定性の共焦点顕微鏡画像である。
【図２３】両方の層に懸濁化剤を使用してクリック反応性ＭＰＣポリマーでコーティングした、ＡＲＰＥ−１９スフェロイドの安定性の共焦点顕微鏡画像である。
【図２４】両方の層に懸濁化剤を使用してクリック反応性ＭＰＣポリマーでコーティングした、ＡＲＰＥ−１９スフェロイドの安定性の共焦点顕微鏡画像である。
【図２５】両方の層に懸濁化剤を使用してクリック反応性ＭＰＣポリマーでコーティングした、ＡＲＰＥ−１９スフェロイドの安定性の共焦点顕微鏡画像である。
【図２６】両方の層に懸濁化剤を使用してクリック反応性ＭＰＣポリマーでコーティングした、ＡＲＰＥ−１９スフェロイドの安定性の共焦点顕微鏡画像である。
【図２７】両方の層に懸濁化剤を使用してクリック反応性ＭＰＣポリマーでコーティングした、ＡＲＰＥ−１９スフェロイドの安定性の共焦点顕微鏡画像である。
【図２８】両方の層に懸濁化剤を使用してクリック反応性ＭＰＣポリマーでコーティングした、ＡＲＰＥ−１９スフェロイドの安定性の共焦点顕微鏡画像である。
【図２９】連続添加法によってコーティングされたＡＲＰＥ−１９スフェロイド共焦点顕微鏡画像である。
【図３０】ＭＰＣクリック反応性ポリマーを使用して連続添加法によってコーティングされたラット膵島細胞の安定性の共焦点顕微鏡画像である。
【図３１】ＭＰＣクリック反応性ポリマーを使用して連続添加法によってコーティングされたラット膵島細胞の安定性の共焦点顕微鏡画像である。
【図３２】ＭＰＣクリック反応性ポリマーを使用して連続添加法によってコーティングされたラット膵島細胞の安定性の共焦点顕微鏡画像である。
【図３３】ＭＰＣクリック反応性ポリマーを使用して連続添加法によってコーティングされたラット膵島細胞の安定性の共焦点顕微鏡画像である。
【図３４】裸の及びコーティングされたラット膵島細胞の生／死生存率の共焦点顕微鏡画像である（膵島細胞はクリック反応性ＭＰＣポリマーを使用して連続添加法によってコーティングされた）。
【図３５】裸の及びコーティングされたラット膵島細胞の生／死生存率の共焦点顕微鏡画像である（膵島細胞はクリック反応性ＭＰＣポリマーを使用して連続添加法によってコーティングされた）。
【図３６】裸の及びコーティングされたラット膵島細胞の生／死生存率の共焦点顕微鏡画像である（膵島細胞はクリック反応性ＭＰＣポリマーを使用して連続添加法によってコーティングされた）。
【図３７】裸の及びコーティングされたラット膵島細胞の生／死生存率の共焦点顕微鏡画像である（膵島細胞はクリック反応性ＭＰＣポリマーを使用して連続添加法によってコーティングされた）。
【図３８】裸の膵島細胞及びクリック反応性ＭＰＣポリマーを使用して連続添加法によってコーティングされた膵島細胞のラット膵島細胞インスリン分泌を要約する棒グラフである。
【図３９】裸の膵島細胞及びクリック反応性ＭＰＣポリマーを使用して連続添加法によってコーティングされた膵島細胞のラット膵島細胞インスリン分泌を要約する棒グラフである。
【図４０】フルオレセイン標識４アームＰＥＧ−ＮＨ２の合成に関するスキーム１の図解である。
【図４１−１】４アーム−ＰＥＧ−｛ＮＨＣＯ−（ＰＥＧ）４−ＤＢＣＯ｝３−ＦＩＴＣの合成に関するスキーム２の図解である。
【図４１−２】同上。
【図４２】分子量１０Ｋの４アームＰＥＧ−ＮＨ−ＤＢＣＯの合成に関するスキーム３の図解である。
【図４３】４アームＰＥＧ−ＮＨ−（ＰＥＧ）４−ＤＢＣＯの合成に関するスキーム４の図解である。
【図４４】ＰＥＧリンカーを有しクリック反応性ＤＢＣＯ基を含有するメタクリロイルオキシホスホコリン−アリルアミンのクリック反応性コポリマーの合成に関するスキーム５の図解である。
【図４５】ＰＥＧリンカーを有しクリック反応性アジド基を含有するメタクリロイルオキシホスホコリン−アリルアミンのコポリマーの合成に関するスキーム６の図解である。
【図４６】疎水性鎖（Ｃ６）リンカーを有しクリック反応性ＤＢＣＯ基を含有するメタクリロイルオキシホスホコリン−アリルアミンのクリック反応性コポリマーの合成に関するスキーム７の図解である。
【図４７】フルオレセインタグを有しクリック反応性ＤＢＣＯ基を含有するメタクリロイルオキシホスホコリン−アリルアミンのクリック反応性コポリマーの合成に関するスキーム８の図解である。
【図４８】本発明によって提供される２層系及び３層系の２つのコンフォーマルコーティング方法を図解する、スキーム９の図解である。
【図４９】コンフォーマルコーティングの連続添加法に関するスキーム１０の図解である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明は、少なくとも部分的には、出願者らによる、極薄及び半透過性で、高度に再現可能及び拡張可能であり、生体表面（例えば、細胞）のいかなる顕著な損傷（構造変化）または修飾（機能の喪失／障害）も有しない、生体表面のコンフォーマルコーティングの発見、ならびに広範な生理学的条件下でのこれらのコンフォーマルコーティングを施された生体表面の作製方法に基づく。これらは個々に、「本発明によって提供される組成物」（または「本発明によって提供される生体表面」）及び「本発明によって提供される方法」であり、「本発明によって提供される組成物及び方法」等と総称される。本発明によって提供される組成物及び方法は、有利なことに、生体表面への損傷／不十分な生体適合性、再現性、拡張性、及び厚さ、透過性、または均一性などの、既存の方法及び組成物の難点及び制限を克服する。例えば、Ｔｏｍｅｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（２０１４）１１１（２９），１０５１４−１０５１９、Ｌ．Ｈ．Ｇｒａｎｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１），Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ，Ｂｌｏｏｄ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  （２０１１）３９：２７４−２８０、Ｂｌａｓｉ  ｅｔ  ａｌ.，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ（２０１３）４４０，１４１−１４７；Ｈｕｂｂｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｏｍｅｉ，ＵＳ２０１４／０１４７４８３  Ａ１、Ｇａｒｃｉａ  ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ２０１５／００７１９９７  Ａ１、Ｓａｎｇ  Ｖａｎ，ｅｔ  ａｌ.，ＵＳ８，２１６，５５８  Ｂ２、Ｃｈａｉｋｏｆ，ｅｔ  ａｌ.  ＵＳ７，８２４，６７２  Ｂ２、Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｈ．Ｍａｙ，１９９８，Ｐｈ．Ｄ．ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｏｒｏｎｔｏ、Ａｎｇｅｌｏ  Ｓ．Ｍａｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，（２０１７），１６，２３６−２４３、Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｔｏｄａｙ（２０１２），１５：６０−６６、Ｒｉｂｅｉｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ＆  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ，（２０１７），９：１２９６７−１２９７４を参照されたい。
【００１０】
したがって、第１の態様では、本発明は、ハイドロゲルコンフォーマルコーティングを有する生体表面を含む組成物を提供する。コンフォーマルコーティングを有しない好適な対照生体表面と比べて、該生体表面は、ｉ）機能を保持する（すなわち、生物学的機能、例えば、グルコースに応答したインスリン分泌など）、及びｉｉ）損傷または他の形態の表面修飾を実質的に有しないか、またはごく少量しか有しない。例えば、一部の実施形態では、生体表面上のジスルフィド結合、アミン（−ＮＨ２）、カルボキシル（−ＣＯＯＨ）、またはヒドロキシル（−ＯＨ）部分（または１つ、２つ、３つ、もしくは４つすべての組み合わせ）の約２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、０．７５、０．５、０．２５、０．１％未満が修飾される。
【００１１】
「コンフォーマルコーティング」とは、薄い（５０μｍ未満、一部の実施形態では、約５０、４０、３０、２０、もしくは１０μｍ未満、例えば、２０μｍ未満、例えば、約５〜２０μｍ、または１０μｍ未満もしくは約１０μｍ）外来性のコーティングであり、これは、コーティングされている表面を覆って実質的に均一であり、また、分子量によるふるい操作を可能にする、すなわち、栄養、ある特定のタンパク質、及び酸素等を通過させるが、抗体または細胞は通過させない。本明細書で使用されるとき、コンフォーマルコーティングは、生体表面のコンフォーマルコーティングへの顕著な共有結合性の連結、または生体表面の、表面の別様の共有結合性修飾を包含しない。代わりに、コンフォーマルコーティングは、生体表面への顕著な量の架橋を伴わずに（すなわち、約１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、０．７５、０．５、０．２５、０．１％未満、または好ましくは何もない、すなわち検出限界未満）生体表面を包囲する、ハイドロゲルなどの架橋ネットワークを包含する。ある特定の具体的な実施形態では、コンフォーマルコーティングは、光活性化、ラジカル開始剤、界面活性剤、酸もしくは塩基触媒、酸化もしくは還元剤、または有機溶媒の使用を包含せず、好ましくは、広範な温度、例えば、約４℃〜３７℃にわたって、好適なｐＨ条件、例えば生理的ｐＨ条件で行うことができる。ある特定の実施形態では、コンフォーマルコーティングを構成するハイドロゲルは、正味中性電荷を有する。一般に、本発明によって提供されるコンフォーマルコーティング（及びそれらの作製方法）は、生体表面、例えば、細胞の官能性に実質的に（または全く）影響を与えない。つまり、生体表面の生物学的機能（グルコースに応答したインスリン分泌など）への影響は、あったとしても無視できる程度である。同様に、生体表面、特にコンフォーマルコーティングに近接するその外表面の物理的構造は修飾されず、例えば、ジスルフィド結合は、実質的に（または完全に）無傷のままである一方で、アミン、カルボキシル、及びヒドロキシルなどの他の反応性基は、実質的に（または完全に）未修飾である。ある特定の具体的な実施形態では、生体表面上のジスルフィド結合、アミン（−ＮＨ２）、カルボキシル（−ＣＯＯＨ）、またはヒドロキシル（−ＯＨ）部分（または１つ、２つ、３つ、もしくは４つすべての組み合わせ）の約２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、０．７５、０．５、０．２５、０．１％未満が、コンフォーマルコーティングの適用後に修飾される。加えて、本発明によって提供されるコンフォーマルコーティング（及びそれらの作製方法）は、最大約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０ｋＤａ、またはそれを超える、例えば、７５、８０、または８５ｋＤａの分子（例えば、栄養、酸素、及びインスリンなどの分泌タンパク質などのある特定の分泌分子）に対して透過性であるが、抗体または細胞などのより大きい分子に対しては透過性でなく、故に、約９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０ｋＤａ、またはそれを超える分子に対して不透過性である。
【００１２】
「生体表面」には、生細胞（細菌、古細菌、真菌、植物、または動物細胞、例えば、昆虫もしくは哺乳類細胞、例えば、ヒトなどの霊長類、ならびに非ヒト霊長類由来の細胞、ならびにマウス、ラット、ブタ、ヒツジ、ウシ、イヌ、ネコ、ラクダ、ウサギ等といった非霊長類哺乳動物細胞を含む）が含まれ、この生細胞は、個々の細胞、細胞集塊、オルガノイド、細胞スフェロイド、胚様体、組織、または天然組織の外植片（腎臓、膵臓、肝臓、または心臓などの全臓器または臓器断片を含む）もしくはインビトロで増殖させた組織を含む組織断片、ならびにバイオ人工／ハイブリッド臓器または臓器デバイスの形態にあり得る。具体的な実施形態では、細胞は、誘導多能性幹細胞などの多能性幹細胞である。生体表面はまた、リポソーム、ハイドロゲル、固体（ポリスチレン、またはＰＬＡ、ＰＧＡ、もしくはそれらの組み合わせなどのプラスチックなど）等といった非生細胞に連結されたタンパク質（酵素など）などの、人工細胞も包含する。細胞などの生体表面は、典型的には（必ずしもそうではないが）実質的に球形の形状である。細胞（ならびに細胞集塊またはスフェロイド）は、約５μｍ〜約１ｍｍ、例えば、約１０μｍ〜１ｍｍ、例えば、約１００μｍ〜約４００μｍ、例えば、一部の実施形態では、最大約３００μｍ、例えば、約１００〜３００μｍの直径を有し得る。他の実施形態では、生体表面（細胞、細胞集塊、または細胞スフェロイド）は、約１０μｍ〜２ｍｍ、２０μｍ〜１ｍｍ、５０〜８００μｍ、または１００〜５００μｍである。
【００１３】
一部の実施形態では、本発明によって提供される組成物のハイドロゲルは、５〜１０ｋＤａの４アームＰＥＧ、１００〜２００ｋＤａ、ホスホコリン６０〜９０％（または他の双性イオン基；ＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）−ＮＨ０１に基づくポリマーを含む）のメタクリロイルオキシエチルホスホコリンコポリマー、ならびにそれらの組み合わせなどのマルチアームポリマーの共有結合性架橋ネットワークである。
【００１４】
別の態様では、本発明は、ハイドロゲル中での生体表面のコンフォーマルコーティング方法を提供する。これらの方法は、２つの水性層を含む系を用意することであって、第１の層が、約０．２５％〜２％（Ｗ／Ｖ）の懸濁化剤、約１％〜約２５％（Ｗ／Ｖ）の第１の官能化マルチアームポリマー、及び生体表面の溶液を含み、第２の層が、糖類のクッション及び約１％〜約２５％（Ｗ／Ｖ）の第２の官能化マルチアームポリマーを含み、第２の官能化マルチアームポリマーの官能基が、生理学的条件下で第１の官能化マルチアームポリマーの官能基と反応性である、該用意することと、次いで、生体表面を第２の層の中に通過させ、それによって第１及び第２の官能基が反応し、生体表面にコンフォーマルコーティングを施す架橋したハイドロゲルを形成できるようにすることと、を包含する。前述のように、本発明によって提供される方法は、２つよりも多くの層、例えば、３つ以上の層を使用することができ、１つよりも多くの糖類のクッションを含むことができる。典型的には、水性層は、ラジカル及び有機溶媒を実質的に含まない（例えば、１．０、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１、０．０５％（Ｖ／Ｖ）未満、または、一部の実施形態では検出限界未満の、ラジカルまたは有機溶媒）。
【００１５】
「懸濁化剤」とは、水溶液の粘度を増加させる化学物質であり、線状、櫛形多価ポリマー、分岐状、ホモ及びブロックポリマーが含まれる。代表的な懸濁化剤には、高分子量ＰＥＧ（別名ポリエチレンオキシド、ＰＥＯ）を含めたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ならびにＰＶＡ（ポリビニルアルコール）、ＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）、及びＨＰＭＣ（ヒドロキシプロピルメチルセルロース）が含まれる。懸濁化剤は、線状または分岐状のいずれであってもよい。懸濁化剤は、約０．０５％〜２．０％、例えば、約０．１％〜２．０％、または約０．２５％〜２．０％、または約１％、例えば、０．５％〜１．５％で存在する。ある特定の実施形態では、懸濁化剤は、約１ＭＤａ（メガダルトン）〜約１０ＭＤａ、例えば、約１ＭＤａ〜約８ＭＤａの分子量を有する。具体的な実施形態では、懸濁化剤は、約１ＭＤａ〜１０ＭＤａ、例えば、１ＭＤａ〜８ＭＤａの分子量を有する、例えば、上記の濃度でのＰＥＯである。当業者には理解されようが、例えば、約１％、約１ＭＤａ〜約８ＭＤａの高分子量ＰＥＯに関して本明細書に記載される結果と同様の特性を達成するような、他の懸濁化剤が使用され得る。懸濁化剤は、例えば、生理食塩水、例えば、０．９％生理食塩水などの様々な水溶液中に溶解され得る。一部の実施形態では、懸濁化剤は、第１の層のみに存在する一方で、他の実施形態では、懸濁化剤は、第１及び第２の層の両方に存在する。懸濁化剤が両方の層に存在する一部の実施形態では、第１の層における懸濁化剤は、第２の層におけるものと同じ懸濁化剤である一方で、他の実施形態では、これらの懸濁化剤は異なってもよい。
【００１６】
「糖類のクッション」とは、溶液の密度を増加させ、本明細書に記載される水溶液の積層を促進する、単糖類、二糖類、三糖類、オリゴ糖類、または多糖類（例えば、スクロース、グルコース、トレハロース、マンニトール、デキストロース、フルクトース、ラクトース、マルトース、またはそれらの組み合わせ）の１％〜１５％（Ｗ／Ｖ）溶液である。ある特定の実施形態では、糖類は、溶液の約５％〜約１５％、例えば、約７．５％〜約１２．５％、例えば、約１０％である。ある特定の具体的な実施形態では、糖類は、スクロースである。例えば、本明細書に例示される具体的な濃度でスクロースと同様の密度を達成することに基づいて、他の糖類のクッションが使用され得る。一部の実施形態では、本発明によって提供される方法は、２つの層、またはそれよりも多く、例えば、３つの層、またはそれよりもさらに多くを使用する。
【００１７】
「官能化マルチアームポリマー」とは、アームの遠位端に官能基を有する３つ以上（例えば、３〜１２、より具体的には４または８）のアームを有するマルチアームポリマーである。アームは、一部の実施形態では、中心核から放射状に広がるか（マルチアームＰＥＧなど）、または他の実施形態では、中心軸ポリマーの全長に沿って異なる点から伸び（コポリマーなどの櫛形ポリマーの場合のように）、後者の場合、マルチアームポリマーは、４つよりも多くのアーム、例えば、約２０、２５、３０、３５、４５、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００のアーム、もしくはそれよりも多くを有し得、このコポリマーは、その軸に沿って、その全サイズ／質量に対して、例えば、約１０ｋＤａ〜１ＭＤａ、２０ｋＤａ〜８００ｋＤａ、５０〜５００ｋＤａ、例えば、約１００〜４００ｋＤａ、１００〜３００ｋＤａ、２００〜３５０ｋＤａ、２００〜３００ｋＤａ、または約３００ｋＤａ、例えば、約２７５〜３２５ｋＤａの、様々なポリマーの実質的に均一の分布を含有する。官能化マルチアームポリマーは、複数のアームの遠位端、例えば、複数のアーム、例えば、２〜最大ｎのアームのうちの２つ以上の遠位端に官能基を有し、ここでｎは、マルチアームポリマー上のアームの数であり、例えば、ｎ＝４の場合、２、３、または４つすべてのアームがそれらの遠位端に官能基を有し得る。一部の実施形態では、例えば、すべてのアームのうちの約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５％が、それらの遠位端に官能基を有し、例えば、すべてのアームのうちの約５〜１５％が、それらの遠位端に官能基を有し、この場合、マルチアームポリマーは、大きい櫛形ポリマーである。官能化マルチアームポリマーは、溶液中に、約１％〜約２５％（Ｗ／Ｖ）、例えば、約２．５％〜約２０％、より具体的には、約８％〜約１２％、または約１０％で存在する。一部の実施形態では、官能化マルチアームポリマーは、約５％〜約１０％で存在する。他の具体的な実施形態では、マルチアームポリマーは、溶液中に、約２．５％〜７．５％、例えば、約４％〜約６％または約５％で存在する。
【００１８】
ある特定の実施形態では、官能化マルチアームポリマーは、例えば、総分子量が約５〜４０、５〜３０、１０〜２０、８〜１２、または１０ｋＤａのＰＥＧ、例えば、分子量が約５〜４０、５〜３０、１０〜２０、８〜１２、または１０ｋＤａの４または８アームＰＥＧであり、例えば、約５％または１０％Ｗ／Ｖである。
【００１９】
他の実施形態では、官能化マルチアームポリマーは、メタクリロイルオキシエチルまたは他の骨格（ポリビニルまたはポリアミドなど）を有する線状コポリマー、例えば、ホスホコリンまたは他の双性イオン基を含むコポリマーであり、この場合、例えば、コポリマーアームのうちの約４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または９５％、例えば、６０〜９０％、７０〜９０％、７５〜８５％、または約８０％のアームが双性イオン基を含み、これは簡略化のために、ポリマーにおける双性イオン基含有アームの割合、例えば、ホスホコリンの割合、例えば、ホスホコリン６０〜９０％などとして言及される。これらの実施形態では、コポリマーアームのうち残りの６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、または５％は、官能基、例えば、アリルアミン（名称ＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）−ＮＨ０１で販売されるコポリマーなど）、または誘導体、例えば、コポリマーのアリルアミン単位のＮＨ２基にクリック官能基、例えば、ＤＢＣＯまたはアジドが付加されている官能化アームを含有する（任意選択的に、ＰＥＧなどの介在リンカーを有し、このリンカーは、約２〜８０、３〜６０、３〜５０、５〜４０、１０〜４０、１５〜４０、２０〜４０、２５〜４０、３０〜４０、３５〜４０、または３８原子（Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｓ、またはそれらの組み合わせなど）の長さであり得る）。一部の実施形態では、官能基（例えば、アリルアミンなど）のうち官能化誘導体（例えば、付加されたクリック官能基を有し、任意選択的な介在リンカーを有する）に変換される割合は、約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５％、またはそれよりも多く、例えば、約２５〜７５％、４０〜６０％、４５〜５５％、または５０％である。故に、例えば、コポリマーのうちの６０〜９０％が双性アームである実施形態では、コポリマーのアームのうちの４０〜１０％が、クリック官能基を有するように変換に利用可能であり、このうち、一部の実施形態では、約５０％にクリック官能基が付加され、すなわち、アームの総数のうちの２０〜５％が、付加されたクリック官能基を有する。したがって、ある特定の実施形態では、櫛形官能化マルチアームポリマーにおける約５０、６０、８０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００のアーム、またはそれよりも多く、例えば、約７０〜１５０または８０〜９０、または約８５のアームが、付加されたクリック官能基を有する。
【００２０】
他の実施形態では、官能化マルチアームポリマーは、メタクリロイルオキシエチルホスホコリンであり（ＭＰＣ；例えば、一部の実施形態では、リジン−ＤＢＣＯなど、ＤＢＣＯで官能化され、他の実施形態では、アリルアミンコポリマーを有する）、例えば、より具体的な実施形態では、第１の層における官能化マルチアームポリマーは、ＭＰＣ（例えば、ＭＰＣ−リジン−ＤＢＣＯ）であり、第２の層における官能化マルチアームポリマーは、ＰＥＧ、例えば、４または８アームＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−アジド）である。他の実施形態では、第１のポリマーとして、官能化線状コポリマーは、メタクリロイルオキシエチルホスホコリン−アリルアミン（例えば、ＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）−ＮＨ０１）であり、コポリマーのアリルアミン単位のＮＨ２基がクリック官能性ＤＢＣＯで官能化され、第２のポリマーとして、官能化線状コポリマーであるメタクリロイルオキシエチルホスホコリン−アリルアミン（例えばＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）−ＮＨ０１）は、コポリマーのアリルアミン単位のアミン基がクリック官能性アジド基で官能化されている。一部の実施形態では、メタクリロイルオキシエチルホスホコリン−アリルアミンのコポリマーは、約８０：２０モル比、５０：５０モル比、２０：８０モル比である。
【００２１】
本明細書で使用される「マルチアームポリマー」とは、官能化マルチアームポリマー、ならびに、実質的に同一であるが、官能基が欠如したポリマー、例えば、ポリマーアームの遠位端に反応性官能基をもはや有しない（すなわち、約１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、０．７５、０．５、０．２５、０．１％未満の未反応官能基が残っている）架橋した（すなわち、反応した）官能化マルチアームポリマーから構成されるハイドロゲルを包含する。ある特定の実施形態では、第１の官能化マルチアームポリマーは、第２の官能化マルチアームポリマーと同じであるが、ただし例外として、これら２つの官能化マルチアームポリマーは、それぞれＤＢＣＯ及びアジド官能化メタクリロイルオキシエチルコポリマー、またはそれぞれＤＢＣＯ及びアジド官能化マルチアームＰＥＧなど、相補性（反応性）官能基を有する。他の実施形態では、第１の官能化マルチアームポリマーは、第２の官能化マルチアームポリマーとは異なり、例えば、アジドまたはＤＢＣＯ官能化マルチアームＰＥＧを有するＤＢＣＯまたはアジド官能化メタクリロイルオキシエチルコポリマーなどである。
【００２２】
本発明によって提供される方法で有用な官能化マルチアームポリマー上の官能基は、第１の官能化マルチアームポリマーと第２の官能化マルチアームポリマーとの間の効率的な架橋を促進して安定なハイドロゲルを形成する反応性基である。当業者には、様々な好適な化学作用がこの目的に好適であるとして認識されよう。代表的な化学作用には、ＮＨＳ／活性化エステルが含まれ、具体的な実施形態では、クリック官能基が含まれる。
【００２３】
「クリック官能性」（時にクリック反応性と称される）基は、クリックケミストリーに好適な化学部分、すなわち、特異的であり、生物学的条件下で迅速に進行し（高い熱力学的駆動力）、水によって妨害されず、顕著な毒性または攻撃的な副産物を生成しないシングルポット反応である。好適なクリック官能基は、例えば、１，２−双極子環状付加及びヘテロ・ディールス・アルダー環状付加などの環状付加；アジリジン、エポキシド、環状硫酸エステル、エピスルホニウム等のような歪み複素環式求電子剤の求核開環；非アルドールカルボニル化学作用による尿素、チオ尿素、ヒドラゾン、オキシムエーテル、アミド、及び芳香族複素環の形成；ならびにエポキシ化、アジリジン化、ジヒドロキシル化、ハロゲン化スルフェニル付加、ニトロシル付加、及びマイケル付加などの炭素−炭素多重結合への付加、といった化学反応を経る。ある特定の実施形態では、クリックケミストリー反応対（すなわち、第１及び第２の官能化マルチアームポリマー上のクリック官能基）には、アジド−ＤＢＣＯ（ジベンゾシクロオクチン）（トリアゾール連結をもたらす）、チオール−ノルボルネン（マイケル付加）、及びテトラジン−ノルボルネン（ピラゾ連結）が含まれる。ある特定の具体的な実施形態では、本発明で有用なクリック官能基には、アジド及びＤＢＣＯが含まれる。
【００２４】
本発明によって提供される方法のある特定の実施形態では、第１の官能化マルチアームポリマーは、５〜１０ｋＤａの４アームＰＥＧである。より具体的な実施形態では、第１の官能化マルチアームポリマーの官能基は、ＤＢＣＯまたはアジドなどのクリック官能基である。本発明によって提供される方法の他の具体的な実施形態では、第１の官能化マルチアームポリマーは、１００〜２００ｋＤａ、ホスホコリン６０〜９０％のメタクリロイルオキシエチルホスホコリンコポリマーである。より具体的な実施形態では、第１の官能化マルチアームポリマーの官能基は、ＤＢＣＯまたはアジドなどのクリック官能基である。
【００２５】
本発明によって提供される方法の一部の実施形態では、第２の官能化マルチアームポリマーは、５〜１０ｋＤａの４アームＰＥＧである。より具体的な実施形態では、第２の官能化マルチアームポリマーの官能基は、アジドまたはＤＢＣＯなどのクリック官能基である。本発明によって提供される方法の他の具体的な実施形態では、第２の官能化マルチアームポリマーは、１００〜２００ｋＤａでありホスホコリン６０〜９０％のメタクリロイルオキシエチルホスホコリンコポリマーである。より具体的な実施形態では、第２の官能化マルチアームポリマーの官能基は、アジドまたはＤＢＣＯなどのクリック官能基である。
【００２６】
本発明によって提供される方法の一部の実施形態では、懸濁化剤は、約１％で存在する、約１〜８ＭＤａの分子量を有するＰＥＯである。
【００２７】
本発明によって提供される方法のある特定の実施形態では、生体表面は、遠心分離によって第２の層の中に通過させられる。
【００２８】
本発明によって提供される方法のある特定の実施形態では、生体表面は、遠心分離下で下層に一滴ずつ連続的に添加される。
【００２９】
ある特定の実施形態では、遠心分離バイアルは、混合物が遠心力下で一滴ずつ移動できるように十分に小さい開口部を有する先細サイドアームを挿入することによる、生体表面の連続添加に好適であるように設計される。
【００３０】
故に、別の態様では、本発明はまた、介在層（気層など）によって分離された２つの水性層を含む系を用意することであって、第１の層が、約０．２５％〜２％（Ｗ／Ｖ）の懸濁化剤、約１％〜約２５％（Ｗ／Ｖ）の第１の官能化マルチアームポリマー、及び生体表面の溶液を含み、第２の層が、約０．２５％〜２％（Ｗ／Ｖ）の懸濁化剤、糖類のクッション、及び約１％〜約２５％（Ｗ／Ｖ）の第２の官能化マルチアームポリマーを含み、第２の官能化マルチアームポリマーの官能基が、生理学的条件下で第１の官能化マルチアームポリマーの官能基と反応性である、該用意することと、生体表面を第２の層の中に通過させ、それによって第１及び第２の官能基が反応し、生体表面にコンフォーマルコーティングを施す架橋したハイドロゲルを形成できるようにすることと、による、ハイドロゲル中での生体表面のコンフォーマルコーティング方法も提供し、第１の官能化マルチアームポリマーは、線状メタクリロイルオキシエチルホスホコリンコポリマーである。
【００３１】
これらの方法のある特定の実施形態では、第１の層は、第２の層に連続的に添加される。一部の実施形態では、第２の層は、混合物が遠心力下で移動できるように寸法決めされた開口部を有する先細サイドアームを通した第１の層の添加に好適な容器内にある。かかる実施形態の１つの例示説明は、図４９に示されるような、一滴ずつの添加であり、このようにして生体表面は、懸濁化剤を含有する糖類溶液中、第２の官能化ポリマーの層に進入する。このプロセスは、界面での細胞の捕捉を回避し、高収率でのコーティングされた生体表面を実現する。ある特定の実施形態では、第１の層の第２の層への実質的な連続添加は、出発生体表面の量に対して、少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５％またはそれよりも高い収率でのコンフォーマルコーティングを施された生体表面をもたらし、例えば、膵島細胞などの細胞を用いた連続添加法では、少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５％またはそれよりも多くの出発（未コーティング）細胞が最終的に完全にコーティングされた細胞となる。ある特定の実施形態では、上部の開口部直径は、２００マイクロメートル〜５０００マイクロメートルであり、下部の開口部直径は、５マイクロメートル〜１０００マイクロメートル、好ましくは１０マイクロメートル５００マイクロメートルである。
【００３２】
本発明によって提供される組成物及び方法に関する具体的な実施形態では、コンフォーマルコーティングの厚さは、約２０μｍ未満であり、例えば、約１０〜２０μｍ、５〜１０μｍ、７．５〜１２．５μｍ、または１０μｍである。
【００３３】
本発明によって提供される組成物及び方法に関するある特定の実施形態では、生体表面は、生細胞（例えば、動物、植物、細菌、酵母細胞）または細胞集塊である。具体的な実施形態では、生細胞は、動物細胞である。より具体的な実施形態では、動物細胞は、哺乳類細胞である。なおもより具体的な実施形態では、哺乳類細胞は、ヒト細胞である。他の具体的な実施形態では、生体表面が細胞である場合、細胞は、インスリン産生細胞である。一部の具体的な実施形態では、生体表面が細胞である場合、細胞は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、例えば哺乳類ｉＰＳＣ、例えばヒトｉＰＳＣなどの、多能性幹細胞である。
【００３４】
本発明によって提供される組成物及び方法の具体的な実施形態では、細胞がインスリン産生細胞である場合、約２ｍＭ〜約２０ｍＭのグルコースで刺激すると、コンフォーマルコーティングに供されていない好適な対照細胞と比べて、当該細胞は、好適な対照細胞と実質的に同様である動態で及び／または濃度で、例えば、対照細胞からのピークインスリン分泌まで約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、もしくは３０分以内で及び／または対照細胞からのインスリンの濃度の約５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、もしくは５０％以内で（例えば、１０、２０、６０、９０、または１２０分時点で）、インスリンを分泌する。
【００３５】
関連する態様では、本発明は、本発明によって提供される方法のうちのいずれかによって調製された、ハイドロゲルコンフォーマルコーティングを有する生体表面を提供する。
【００３６】
別の態様では、本発明は、例えば、治療上有効量の本発明によって提供される組成物を投与することによって哺乳類対象を治療するのに使用するための、本発明によって提供される生体表面と、１つ以上の薬学的に許容される希釈剤または賦形剤とを含む組成物を提供する。
【００３７】
別の態様では、本発明は、対象の必要性を緩和する、本発明によって提供される組成物を提供することを含む、治療を必要とする（例えば、本発明によって提供される組成物により提供されるある特定の生物学的機能が欠如または欠乏した）対象の治療方法を提供する。ある特定の実施形態では、対象は、例えば、インスリン依存性糖尿病を有する、成人または小児対象などのヒトである。かかる方法で使用される本発明によって提供される組成物は、対象に直接適用することができるか（例えば、本発明によって提供される組成物がヒトなどの哺乳類対象への投与に好適なシリンジ中に提供される、注射または埋め込みによって）、または対象に埋め込まれる生体適合性容器中に提供され得、例えば、本発明によって提供される組成物は、対象内でのその移動を制限するが、半透過性であり、例えば、栄養、酸素、及び治療剤の拡散を許容する、生体適合性容器内に配置される。
【００３８】
例示
概要
水性等張系中、中性ｐＨで、特定の生細胞に好適な所望の温度で、特異的に１つのポリマーを別のポリマーに反応させることが可能であるマルチアームクリック反応性親水性ポリマーを利用して、極薄コンフォーマルコーティングを達成した。まず、ポリスチレン粒子（１００〜１２５ミクロン範囲）を細胞スフェロイドのモデルとして使用し、４アームＰＥＧ−ＮＨＳ及び４アームＰＥＧ−ＮＨ２からなる活性化Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルアプローチを使用して、本方法を開発した。これを達成するために、最初にＦＩＴＣ標識を有する４アームＰＥＧ−ＮＨ２を粒子表面上に積層した。これは当該プロセスにおいて重要な工程であることが見出された。これは、粒子を、４アーム−ＰＥＧ−（ＮＨ２）３−ＦＩＴＣ（１％溶液）でスパイクした５％４アームＰＥＧ−ＮＨ２と混合することによって遂行した。混合物を３０℃で６時間真空乾燥させた。結果として得られた粉末を、４アームＰＥＧ−ＮＨＳ（５％）を含有する６０％スクロース溶液中に縣濁させた。混合物をボルテックスし、ＰＢＳ緩衝液で洗浄して、過剰のスクロース、未反応ＰＥＧ、及び過剰の蛍光ＰＥＧポリマー、及び塩を除去した。粒子を収集し、共焦点顕微鏡下で蛍光場において可視化した。顕微鏡画像により、５〜１０ミクロン範囲の厚さを有する極薄コーティングが粒子表面上に均一に形成されたことが確認された（図１）。故に、水性系において２つの反応性ポリマーを使用したコンフォーマルコーティングの概念が証明されたが、この作業条件及びテトラＰＥＧ−ＮＨ２、テトラ−ＰＥＧ−ＮＨＳエステルなどの試薬、ならびに真空乾燥及び高張性スクロース６０％溶液の使用は、生細胞に望ましくない。
【００３９】
６０％スクロース溶液を置き換えるためのいくつかの懸濁媒を調査し、高分子量ＰＥＯ（１００万〜８００万）の１％溶液が、懸濁媒として高張性スクロース溶液を置き換えるのに有用であることが見出された。また、真空乾燥工程を、第１のポリマーを高分子量ＰＥＯ溶液中で粒子と混合する密度勾配アプローチと置き換えることを評価した。これは１つの層とみなされる。高分子量ＰＥＯの長いポリマー鎖は、４アームＰＥＧ−ＮＨ２の短鎖が粒子表面上に一時的に保持されるよう強いる。これらの粒子がスキーム５（図２３）に示されるように下層（等張スクロース溶液中４アームＰＥＧ−ＮＨＳを有する）に移動するにつれて、ＰＥＧ−ＮＨＳ分子は、ＰＥＯ鎖にわたって透過し、４アームＰＥＧ−ＮＨ２と急速に反応し、こうして共有結合性で連結されたハイドロゲルネットワークを粒子表面上に均一に形成する（図２、３、及び４）。これにより、高張性スクロース（６０％）溶液を１％ＰＥＯ溶液で置き換え可能であり、密度勾配法を使用することによって真空乾燥を排除可能であることが確認される。このアプローチは奏功し、再現可能であったが、活性化エステルが細胞表面タンパク質と反応し得るため、それは依然として生細胞に理想的ではなかった。よって、活性化エステルをより好ましい重合化学作用物質により置き換えることが望ましかった。クリックケミストリーが生細胞に好適な化学アプローチであろうと考えられた。
【００４０】
４アームＰＥＧ−ＤＢＣＯ（ジベンゾシクロオクチン）及び４アームＰＥＧ−アジドなどのクリック反応性マルチアームＰＥＧが、４アームＰＥＧ−ＮＨ２及び４アームＰＥＧ−ＮＨＳエステルを置き換えると考えた。クリック反応は中性条件で起こり、これは生細胞に望ましい。種々の濃度のいくつかの高分子量ＰＥＯ（１００万〜８００万）の溶液を、上述の密度勾配アプローチを使用してスクリーニングした。これには、第１のポリマーを高分子量ＰＥＯ溶液中で粒子表面上に積層することが伴った。高分子量ＰＥＯの長いポリマー鎖は、短鎖４アームＰＥＧ−ＤＢＣＯが粒子表面上に一時的に保持されるよう強いる。これらの粒子が、５％スクロース溶液中４アームＰＥＧ−アジドを有する下層に移動するにつれて、ＰＥＧ−アジド分子は、ＰＥＯ鎖にわたって透過し、４アームＰＥＧ−ＤＢＣＯと急速に反応し、こうして共有結合性で連結されたハイドロゲルネットワークを粒子表面上に形成した（図５及び６）。これらの条件は、生細胞のコンフォーマルコーティングに理想的であることが見出された。これを生細胞に適用する前に、クリックケミストリーアプローチをポリスチレン（ＰＳ）粒子に適用し、何の問題もなく奏功することが見出された（図５及び６）。次いでこれらの方法を、ＨＣＴ１１６細胞スフェロイド（図７〜９）、インスリノーマ細胞スフェロイド（図１３）、及び新たに単離したラット膵島細胞（図１４）に成功裏に適用した。
【００４１】
ＨＣＴ細胞スフェロイド（ｈｃｔ１１６細胞株）、インスリノーマスフェロイド（ヒト由来）、またはラット膵島細胞を、ＰＥＯ（１００万〜８００万）１％溶液中、４アームＰＥＧ−（ＤＢＣＯ）３−ＦＩＴＣの１％溶液でスパイクした４アームＰＥＧ−ＤＢＣＯ５％の溶液と混合した。混合物を１０％スクロース溶液中の４アームＰＥＧ−アジドのベッド上に積層した。高分子量ＰＥＯの長いポリマー鎖は、それらがスクロース層の中へ移動するにつれて短鎖４アームＰＥＧ−ＤＢＣＯを細胞表面の方へ押し得、ここで４アームＰＥＧアジドが透過し、４アームＰＥＧ−ＤＢＣＯと急速に反応して、２つのポリマー間に共有結合性の連結を形成し、こうして薄いコーティングを細胞スフェロイドまたは膵島細胞の周りに均一に形成する。移動速度は、遠心分離力及びＰＥＯ溶液の粘度によって制御される。コーティングの厚さは、粒子の移動速度、２つのクリック反応性ＰＥＧポリマーの濃度、懸濁化剤ポリマーの分子量及び粘度に影響を受け得る。コーティングされたスフェロイドは底部に沈殿し、これを、上清液を除去することによって収集した。コーティングされたスフェロイドを緩衝液／血漿で洗浄して、４℃での遠心分離によってＰＥＯ、スクロース、塩、及び未反応性ＰＥＧなどの添加剤を除去した。コーティングされた細胞スフェロイド及び膵島細胞を、共焦点顕微鏡ならびに従来の蛍光顕微鏡を使用して蛍光場の下で可視化した。極薄コーティングが５〜１０ミクロンの範囲の厚さでスフェロイドの周りに均一に形成された。細胞は、これらの条件下で生存し、コーティング後にもそれらの完全な機能性を呈した。
【００４２】
３日目、カルシアン（ｃａｌｃｉａｎ）／エチジウムホモダイマー−１（Ｅｔｈｄ−１）を使用して、コーティングされたＨＣＴ１１６スフェロイド及び対応する裸のスフェロイドにおいて生／死細胞を調査した。コーティングされたスフェロイドは、顕著に高い数の死細胞（図１１、赤色）を有する裸のスフェロイドと比較して、高い割合の生細胞（図１２、緑色で現れる）を有することが見出された。このデータは、コンフォーマルコーティングが細胞に安定性を提供し、こうしてそれらがインビトロで裸の細胞と比較してより長時間生存したことを示す。
【００４３】
コンフォーマルコーティングを施されたインスリノーマスフェロイド及びラット膵島細胞のインスリン分泌及び放出動態を、アルギン酸バリウムでマイクロカプセル化されたスフェロイド／膵島細胞及び未コーティングのスフェロイド／膵島細胞と対応させて比較した。
【００４４】
コンフォーマルコーティングを施されたスフェロイド及びラット膵島細胞は、低、中、及び高グルコース濃度で、対応する未コーティングバージョンと同等に、しかしマイクロカプセル化された製剤よりも良好に、グルコースに応答してインスリンを非常によく分泌した（図１５及び１７）。
【００４５】
コンフォーマルコーティングを施された製剤のインスリン放出動態は、裸の製剤及びアルギン酸バリウムでマイクロカプセル化された製剤よりも良好であることが見出された（図１６及び１８）。
【００４６】
材料及び方法：
４アーム−ＰＥＧ−ＮＨＳエステル（分子量５ｋ）、４アーム−ＰＥＧ−ＮＨＳエステル（分子量５ｋ及び１０ｋ）、４アームＰＥＧ−アジド（５ｋ及び１０ｋ）をＪｅｎＫｅｍ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＵＳＡから購入した。４アームＰＥＧ−ＮＨ２（５ｋ及び１０ｋ）をＣｒｅａｔｉｖｅ  ＰＥＧ  Ｗｏｒｋｓから購入した。ＤＢＣＯ試薬及び溶媒をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ポリスチレン粒子（１０６〜１２５ミクロンサイズ）をＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ，ＰＡ，ＵＳＡから購入した。スフェロイドとして増殖させたＨＣＴ１１６細胞（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手可能）を、１０％ウシ胎仔血清でスパイクしたＭｃＣｏｙ  ５ａ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中、５％ＣＯ２環境下、３７℃で７２時間増殖させた。
【００４７】
実施例１：４アーム−ＰＥＧ−（ＮＨ２）３−ＦＩＴＣ、［４アーム−（ＰＥＧ−ＮＨ２）３−ＰＥＧ−ＮＨ−Ｃ（＝Ｓ）＝Ｎ−フルオレセイン］、分子量５ｋ、スキーム１。
４アームＰＥＧ  ＮＨ２（分子量５ｋ）０．５ｇ（０．１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（ジメチルホルムアミド１０ｍｌ）中に溶解させ、これにフルオレセインイソチオシアネート（３９ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）を暗下で添加した。混合物を室温で６時間撹拌した。溶液を、１０００分子量カットオフ膜を使用してＤＩ水中で、暗所で一晩、ＤＩ水を交換しながら（４×１Ｌ）透析した。溶液を凍結乾燥させた。明るい黄色の粉末（５１２ｍｇ）を収集し、琥珀色のボトル中に−２０℃で貯蔵した。
【００４８】
実施例２：４アーム−ＰＥＧ−（ＮＨ２）３−ＦＩＴＣ、［４アーム−（ＰＥＧ−ＮＨ２）３−ＰＥＧ−ＮＨ−Ｃ（＝Ｓ）＝ＮＨ−フルオレセイン］、分子量１０ｋ、スキーム１。
４アームＰＥＧ  ＮＨ２（分子量１０ｋ）０．５ｇ（０．０５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１０ｍｌ）中に溶解させ、これにフルオレセインイソチオシアネート（２０ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）を暗下で添加した。混合物を室温で６時間撹拌した。溶液を、１０００分子量カットオフ膜を使用してＤＩ水中で、暗所で一晩、ＤＩ水を交換しながら（４×１Ｌ）透析した。溶液を凍結乾燥させた。明るい黄色の粉末（４９２ｍｇ）を収集し、琥珀色のボトル中に−２０℃で貯蔵した。
【００４９】
実施例３：アーム−ＰＥＧ−（ＮＨＣＯ−ＰＥＧ４−ＤＢＣＯ）３−ＮＨ２、［４アーム−ポリエチレングリコール−｛ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ）３−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯ−ジベンゾシクロオクチン｝３−ＮＨ２］、分子量１０ｋ、スキーム２：
４アームＰＥＧ  ＮＨ２（分子量１０ｋ）１．０ｇ（０．１ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（２０ｍｌ）中に溶解させ、これにＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ＮＨＳエステル（１９５ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で１６時間撹拌した。反応をＴＬＣによって監視した。反応が完了した後、溶媒を真空下で除去して５ｍｌとなった。溶液を低温のジエチルエーテル中に一滴ずつ注いだ。生成物が沈殿し、それを濾過により収集した。生成物をエーテル（４×５０ｍｌ）で十分に洗浄し、真空下で４時間乾燥させた。材料を淡黄色の粉末１．１ｇとして得た。それを琥珀色のボトル中に−２０℃で貯蔵した。
【００５０】
実施例４：４アーム−ＰＥＧ−［ＮＨ−ＰＥＧ４−ＤＢＣＯ）］３−ＦＩＴＣ、［４アーム−ポリエチレングリコール−ＮＨ−［ＣＯ−（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ）３−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯ−ジベンゾシクロオクチン］−フルオレセインイソチオシアネート（ｉｓｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）］、分子量１０ｋ、スキーム２。
４アーム−ＰＥＧ−｛ＮＨＣＯ−ＰＥＧ４−ＤＢＣＯ｝３−ＮＨ２（分子量１０ｋ）５００ｍｇ（０．０５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（５ｍｌ）中に溶解させ、これにフルオレセインイソチオシアネート（２０ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）を暗下で添加した。混合物を室温で６時間撹拌した。溶液を、１０００分子量カットオフ膜を使用してＤＩ水中で、暗所で一晩、ＤＩ水を交換しながら（４×１Ｌ）透析した。溶液を凍結乾燥させた。明るい黄色の粉末（４８５ｍｇ）を収集し、琥珀色のボトル中に−２０℃で貯蔵した。
【００５１】
実施例５：４アーム−ＰＥＧ−ＮＨ−ＤＢＣＯ：４アーム−ポリエチレングリコール−｛ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）４−ＣＯ−ジベンゾシクロオクチン、分子量１０ｋ、スキーム３：
４アームＰＥＧ  ＮＨ２（分子量１０ｋ）１．４ｇ（０．１４ｍｍｏｌ）をリン酸緩衝液中に溶解させ、これにＤＢＣＯ−スルホ−ＮＨＳエステル（０．３０ｇ、０．５６ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で１６時間撹拌した。反応をＴＬＣによって監視した。反応が完了した後、反応混合物を低温イソプロパノール（５００ｍｌ）中に撹拌しながら一滴ずつ注いだ。生成物が沈殿し、それを濾過により収集した。生成物をＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍｌ）中に再び溶解させ、低温ジエチルエーテル（３００ｍｌ）中に注いだ。生成物が粉末として沈殿し、それを濾過により収集し、エーテル（４×５０ｍｌ）で十分に洗浄し、真空下で４時間乾燥させた。材料を淡黄色の粉末１．６５ｇとして得た。それを琥珀色のボトル中に−２０℃で貯蔵した。
【００５２】
実施例６：４アーム−ＰＥＧ−ＮＨ−ＰＥＧ４−ＤＢＣＯ：４アーム−ポリエチレングリコール−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ）３−ＣＨ２ＣＨ２ＮＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯ−ジベンゾシクロオクチン］、分子量１０ｋ、スキーム４：
４アームＰＥＧ  ＮＨ２（分子量１０ｋ）１．４ｇ（０．１４ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（３０ｍｌ）中に溶解させ、これにＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ＮＨＳエステル（０．３７ｇ、０．５６ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で１６時間撹拌した。反応をＴＬＣによって監視し、反応が完了した後、溶媒を真空下で除去して５ｍｌとなった。溶液を低温のジエチルエーテル中に一滴ずつ注いだ。生成物が沈殿し、それを濾過により収集し、それをエーテル（４×５０ｍｌ）で十分に洗浄し、真空下で４時間乾燥させた。材料を淡黄色の粉末１．７１ｇとして得た。それを琥珀色のボトル中に−２０℃で貯蔵した。
【００５３】
実施例７：ＰＥＧリンカーを有しクリック反応性ＤＢＣＯ基を含有するクリック反応性メタクリロイルオキシホスホコリン−アリルアミンのコポリマーの合成（スキーム５）：
メタクリロイルオキシホスホコリン−アリルアミンコポリマー（ＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）ＮＨ−０１、５％ポリマー溶液、２０ｍｌ）の溶液を丸底フラスコに取り込み、これにＤＭＦ（５ｍｌ）中ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ＮＨＳエステル（４００ｍｇ）を添加し、混合物を磁気撹拌子により室温で撹拌した。即座に、ｐＨを８．５前後に維持するためにトリエチルアミン（１００μＬ）を混合物に添加し、撹拌を室温で１６時間継続した。反応の終わりに、反応混合物を透析した（１０Ｋ分子量カットオフ膜）。溶液を凍結乾燥させた。ポリマーを白色の粉末として得た。１ＨＮＭＲ （Ｄ２Ｏ）：０．９６−１．１６ （ｍ， ＣＨ３）；１．５−２．２ ｍ （骨格ＣＨ２）；２．８ −３．２ ｍ；３．８−４．４ ｍ；４．７ｍ， ６．８−７．３広域ピーク （芳香族Ｈ）．
【００５４】
実施例８：クリック反応性アジド基を含有するメタクリロイルオキシホスホコリン−アリルアミンのコポリマーの合成（スキーム６）：
メタクリロイルオキシホスホコリン−アリルアミンコポリマー（ＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）ＮＨ−０１、５％ポリマー溶液、２０ｍｌ）の溶液を丸底フラスコに取り込み、これにＤＭＦ（５ｍｌ）中アジド−ＰＥＧ１２−ＮＨＳエステル（４００ｍｇ）を添加し、この間、混合物を磁気撹拌子により室温で撹拌した。即座に、ｐＨを８．５前後に維持するためにトリエチルアミン（１００マイクロリットル）を混合物に添加し、撹拌を室温で１６時間継続した。反応の終わりに、反応混合物を透析した（１０Ｋ分子量カットオフ膜）。溶液を凍結乾燥させた。ポリマーを白色の粉末として得た。１ＨＮＭＲ （Ｄ２Ｏ）：３．１５ （ｓ， 第四級ＣＨ３基）；３．５８ ｓ， ３．９−４．２８ （ｍ， −ＣＨ２）．
【００５５】
実施例９：疎水性アルキル鎖リンカーを有しクリック反応性ＤＢＣＯ基を含有するクリック反応性メタクリロイルオキシホスホコリン−アリルアミンのコポリマーの合成（スキーム７）：
メタクリロイルオキシホスホコリン−アリルアミンコポリマー（ＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）ＮＨ−０１、５％ポリマー溶液、２０ｍｌ）の溶液を丸底フラスコに取り込み、これにＤＢＣＯ−（Ｃ６−リンカー）−スルホＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（４００ｍｇ）粉末を添加し、混合物を磁気撹拌子により室温で撹拌した。即座に、ｐＨを７．４前後に維持するためにＮａＨＣＯ３（１００ｍｇ粉末）を混合物に添加し、撹拌を室温で１６時間継続した。反応の終わりに、反応混合物を透析した（１０Ｋ分子量カットオフ膜）。溶液を凍結乾燥させた。ポリマーを淡黄色の綿状材料として得た。１ＨＮＭＲ （Ｄ２Ｏ）：０．９８−１．１８ （ｍ， ＣＨ３）；１．６−２．２ ｍ；２．８ −３．４ ｍ；３．９−４．３ ｍ；４．８ ｍ， ６．９−７．３ｍ（芳香族Ｈ）．
【００５６】
実施例１０：フルオレセインタグを有しクリック反応性ＤＢＣＯ基を含有するクリック反応性メタクリロイルオキシホスホコリン−アリルアミンのコポリマーの合成（スキーム８）：
丸底フラスコに、クリック反応性ＤＢＣＯポリマーを含有するメタクリロイルオキシホスホコリン−アリルアミン（１００ｍｇ）及び磁気撹拌子を装入した。フラスコに、１０ｍｌの脱イオン水を添加し、ポリマーが完全に溶解するまで撹拌した。ポリマー溶液のｐＨは７．１であり、これをトリエチルアミンで８．０に調整した。フルオレセインイソチオシアネート３５ｍｇをバイアル中で秤量し、暗所でＤＭＦ（５ｍｌ）中に溶解させた。フルオレセインイソチオシアネート（ｉｓｏｔｈｙｏｃｙａｎｔｅ）溶液をポリマー溶液に添加し、混合物を暗所で一晩撹拌させた。反応の終わりに、反応混合物を、１０Ｋ分子量カットオフ膜を使用して脱イオン水に対して暗所で透析した。透析の完了後、透析バッグの内容物を凍結乾燥させた。生成物を明るい黄色が買った海綿状の材料（１２０ｍｇ）として得た。生成物を他のクリック反応性ポリマーと混合することによって生体表面のコーティング用に直接使用した。
【００５７】
実施例１１：ＨＣＴ１１６スフェロイド：ＨＣＴ１１６細胞スフェロイド調製のための手順
ＨＣＴ１１６細胞株を、１０％ウシ胎仔血清でスパイクした１００マイクロリットルのＭｃＣｏｙ  ５ａ緩衝液を含有する各ウェルに、ウェル当たり５００、１０００、及び１５００細胞の用量で播種した。プレートを５％ＣＯ２下、３７℃でインキュベートした。７２時間後、スフェロイドを収集し、ＰＢＳで洗浄し、コンフォーマルコーティング用に即座に使用した。
【００５８】
実施例１２：ラットインスリノーマ細胞スフェロイド：インスリノーマ細胞スフェロイド調製のための手順
ラットインスリノーマ細胞（ｉｎｓ−１細胞）を、１０％ウシ胎仔血清を含有する１００マイクロリットルのＤＭＥＭ培地を含有する各ウェルに、ウェル当たり１０００の用量で播種した。プレートを５％ＣＯ２下、３７℃でインキュベートした。７２時間後、スフェロイドを収集し、コンフォーマルコーティング用に即座に使用した。
【００５９】
実施例１３：ラット膵島細胞：膵島細胞単離及びコーティング実施までの保存のための手順
コラゲナーゼ消化法を使用してラット膵島細胞をＷｉｓｔａｒラットから単離した。Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＰＲＯＣＥＤＵＲＥＳ  ＯＮＬＩＮＥ，ｖｏｌ  １１，ｎｕｍｂｅｒ  １，２００９。近位総胆管にカテーテルをカニュレーションし、１０ｍｌの低温コラゲナーゼ溶液をゆっくりと注射した。膵被膜の完全性を維持するように膵全摘術を慎重に行った。単離した膵臓組織を追加の５ｍｌのコラゲナーゼ溶液中、３７℃で２０分間インキュベートし、次いで組織を激しい振とう下で消化させた。０．０２％ＤＮａｓｅ  Ｉ及び１％ウシ血清アルブミンを含有する３０ｍｌの低温ＨＢＳＳ緩衝液で２回洗浄した後、それを金網ふるいに通し、続いて１３００ｒｐｍで、４℃で３分間遠心分離した。次いで塊を１０ｍｌのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７溶液中に縣濁させた。組織懸濁液の上に０．０２％ＤＮａｓｅ  Ｉ及び１％ウシ血清アルブミンを含有する１０ｍｌのＨＢＳＳ緩衝液を積層し、続いて１８００ｒｐｍで、４℃で３分間勾配遠心分離を行った。精製された膵島細胞を上層と第２の層との間の界面からピペットで収集し、次いでＲＰＭＩ−１６４０培地で繰り返し洗浄した。洗浄した膵島細胞を氷冷貯蔵下で保存し、コンフォーマルコーティング用に即座に使用した。
【００６０】
実施例１４：コンフォーマルコーティング方法：懸濁媒としてのスクロース中の活性化エステルアプローチ、続いてコーティング前の真空乾燥を用いたポリスチレン（ＰＳ）粒子のコンフォーマルコーティング。
ポリスチレン（ＰＳ）粒子（１０６〜１２５ミクロンサイズ）５０ｍｇ、４アームＰＥＧ−ＮＨ２（５ｋ）５０ｍｇ、及び４アームＰＥＧ（ＮＨ２）３−ＦＩＴＣ（５ｋ）２００マイクロリットル（ｍｉｃｒｉｏｌｉｔｅｒｓ）の１％溶液を、４００マイクロリットル（ｍｉｃｒｏｌｔｅｒｓ）の水と混合した。ペーストを３０℃で真空遠心機において６時間真空乾燥させた。ペレットを２５０マイクロリットルのスクロース溶液（６０％）中に縣濁させた。活性化４アームＰＥＧ−ＮＨＳエステル（５ｋ）の新たに調製した溶液（２０ｍｇを８０マイクロリットルの水中に溶解させた）を、２０００ｒｐｍで３分間ボルテックスしながらスクロース溶液中のＰＳ粒子に添加した。混合物を３０００ｒｐｍで、４℃で５分間遠心分離し、上清を除去した。ペレットをＰＢＳ（２ｍｌ）中に縣濁させ、ボルテックスして、コーティングされた粒子を溶液中に均一に分散させ、再び３０００ｒｐｍで、４℃で５分間遠心分離した。この洗浄手順を５回繰り返して、過剰の未反応ポリマー及びスクロースを除去した。コーティングされた粒子を顕微鏡評価のためにウェルに移した。共焦点顕微鏡画像により、蛍光場の下で可視化したときに粒子が均一にコーティングされたことが明らかとなった（図１）。
【００６１】
実施例１５：上層の懸濁媒としてのＰＥＯ（分子量８００万）１％溶液中の４アームＰＥＧ−ＮＨＳ活性化エステル（１０ｋ）でのポリスチレン粒子のコンフォーマルコーティング
２ｍｌ遠心管に、１００マイクロリットルの１５％スクロース溶液を充填した（層３）。この上部に、４アームＰＥＧ−ＮＨＳ（１０ｋ、２０ｍｇ）を含有する２００マイクロリットルの２．５％スクロース溶液を積層した（第２の層）。その上部に、ポリスチレン粒子１ｍｇ、４アームＰＥＧ−ＮＨ２（１０ｋ、５ｍｇ）、４アームＰＥＧ−（ＮＨ２）３−ＦＩＴＣ（１０ｋ）（５マイクロリットル、ＤＩ水中１％溶液）、及びＰＥＯ（分子量８００万）５０マイクロリットル（ｍｉｃｒｏｌｔｅｒｓ）の１％溶液を含有する溶液の混合物を積層した（層１）。管を密閉し、１０００ｒｐｍで、４℃で６０分間遠心分離した。
【００６２】
コーティングされたＰＳ粒子が底部に沈殿し、上清液を慎重に除去し、新たなＤＩ水（２ｍｌ）で置き換え、ボルテックスしてベッドを液体中に均一に分散させ、再び１０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上清を除去し、新たな水で置き換え、ボルテックスしてベッドを分散させた。この洗浄手順を４回繰り返した。最後に、コーティングされた粒子を共焦点顕微鏡研究のためにウェルに入れた。蛍光場の下での共焦点顕微鏡画像により、ポリスチレン粒子が均一にコーティングされたことが明らかとなった（図２）。
【００６３】
実施例１６：上層の懸濁媒としてのＰＥＯ（分子量４００万）１％溶液中の４アームＰＥＧ−ＮＨＳエステル（１０ｋ）でのポリスチレン粒子のコンフォーマルコーティング
２ｍｌ遠心管に、１００マイクロリットルの１５％スクロース溶液を充填した（層３）。この上部に、４アームＰＥＧ−ＮＨＳ（１０ｋ、及び２０ｍｇ）を含有する２００マイクロリットルの２．５％スクロース溶液を積層した（第２の層）。その上部に、ポリスチレン粒子１ｍｇ、４アームＰＥＧ−ＮＨ２（５ｍｇ、１０ｋ）、４アームＰＥＧ−（ＮＨ２）３−ＦＩＴＣ（１０ｋ、５マイクロリットル、ＤＩ水中１％溶液）、及びＰＥＯ（分子量４００万）５０マイクロリットルの１％溶液を含有する溶液の混合物を積層した（層１）。管を密閉し、１０００ｒｐｍで、４℃で６０分間遠心分離した。
【００６４】
コーティングされたポリスチレン粒子が底部に沈殿し、上清液を慎重に除去し、新たなＤＩ水（２ｍｌ）で置き換えた。それをボルテックスしてベッドを液体中に分散させ、再び１０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上清を除去し、新たな水で置き換え、ボルテックスしてベッドを分散させた。この洗浄手順を４回繰り返した。終わりに、コーティングされた粒子を共焦点顕微鏡研究のためにウェルに入れた。蛍光場の下での共焦点顕微鏡画像により、粒子が均一にコーティングされたことが明らかとなった（図３）。
【００６５】
実施例１７：上層の懸濁媒としてのＰＥＯ（分子量１００万）１％溶液中の４アームＰＥＧ−ＮＨＳ活性化エステル（１０ｋ）でのポリスチレン粒子のコンフォーマルコーティング
２ｍｌ遠心管に、１００マイクロリットルの１５％スクロース溶液を充填した（層３）。その上部に、４アームＰＥＧ−ＮＨＳ（１０ｋ）２０ｍｇを含有する２００マイクロリットルの２．５％スクロース溶液を積層した（第２の層）。その上部に、ポリスチレン粒子１ｍｇ、４アームＰＥＧ−ＮＨ２（１０ｋ、５ｍｇ）、４アームＰＥＧ−（ＮＨ２）３−ＦＩＴＣ（１０ｋ、５マイクロリットル、ＤＩ水中１％溶液）、及びＰＥＯ（分子量１００万）５０マイクロリットル（ｍｉｃｒｏｌｔｅｒｓ）の１％溶液を含有する溶液の混合物を積層した（層１）。管を密閉し、１０００ｒｐｍで、４℃で６０分間遠心分離した。
【００６６】
コーティングされたポリスチレン粒子が底部に沈殿し、上清液を慎重に除去し、新たなＤＩ水（２ｍｌ）で置き換えた。それをボルテックスしてベッドを液体中に分散させ、再び１０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上清を除去し、新たな水で置き換え、ボルテックスしてベッドを分散させた。この洗浄手順を４回繰り返した。最後に、コーティングされた粒子を共焦点顕微鏡研究のためにウェルに入れた。蛍光場の下での共焦点顕微鏡画像により、ポリスチレン粒子が分子量１００万のＰＥＯ懸濁化剤中で、８００万または４００万のＰＥＯ懸濁化剤と比較してより低い均一性でコーティングされたことが明らかとなった（図４、３、及び２）。
【００６７】
実施例１８：上層の懸濁媒としてのＰＥＯ（分子量１００万）１％溶液中のクリック反応性ポリマーでのポリスチレン粒子のコンフォーマルコーティング
２ｍｌ遠心管に、１００マイクロリットルの１０％スクロース溶液を充填した（層３）。その上部に、４アームＰＥＧ−アジド（分子量１０ｋ）１０ｍｇを含有する２００マイクロリットルの５％スクロース溶液を積層した（第２の層）。再び、第２の層の上部に、ＰＳ粒子１ｍｇ、４アームＰＥＧ−ＮＨ−ＤＢＣＯ、（１０ｋ、１．２５ｍｇ）、４アーム−ＰＥＧ−［ＮＨ−（ＰＥＧ）４−ｄｂｃｏ）］３−ＦＩＴＣ（１０ｋ、１．２５マイクロリットル、ＤＩ水中１％溶液）、及びＰＥＯ（分子量１００万）５０マイクロリットル（ｍｉｃｒｏｌｔｅｒｓ）の１％溶液を含有する溶液の混合物を積層した（層１）。管を密閉し、１０００ｒｐｍで、４℃で１０分間遠心分離した。
【００６８】
コーティングされた粒子が底部に沈殿した。上清液を慎重に除去し、新たなＤＩ水（２ｍｌ）で置き換えた。それをボルテックスしてベッドを液体中に分散させ、再び１０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上清を除去し、新たな水で置き換え、ボルテックスしてベッドを分散させた。この洗浄手順を４回繰り返した。最後に、洗浄済みのコーティングされた粒子を共焦点顕微鏡研究のためにウェルに入れた。蛍光場の下での共焦点顕微鏡画像により、ビーズが均一にコーティングされたことが明らかとなった。図５を参照されたい。
【００６９】
実施例１９：上層の懸濁媒としてのＰＥＯ（分子量８００万）１％溶液中のクリック反応性ポリマーでのポリスチレン粒子のコンフォーマルコーティング
２ｍｌ遠心管に、１００マイクロリットルの１０％スクロース溶液を充填した（層３）。この上に、４アームｐｅｇ−アジド（分子量１０ｋ）１０ｍｇを含有する２００マイクロリットルの５％スクロース溶液を積層した（第２の層）。第２の層の上部に、ＰＳ粒子１ｍｇ、４アームＰＥＧ−ＮＨ−ＤＢＣＯ（１０ｋ、１．２５ｍｇ）、４アーム−ＰＥＧ−［ＮＨ−（ＰＥＧ）４−ＤＢＣＯ］３−ＦＩＴＣ（１０ｋ、１．２５マイクロリットル、ＤＩ水中１％溶液）、及びＰＥＯ（分子量８００万）５０マイクロリットル（ｍｉｃｒｏｌｔｅｒｓ）の１％溶液を含有する溶液の混合物を積層した（層１）。管を密閉し、１０００ｒｐｍで、４℃で１０分間遠心分離した。
【００７０】
コーティングされたビーズが底部に沈殿した。上清液を慎重に除去し、新たなＤＩ水（２ｍＬ）で置き換え、ボルテックスしてベッドを液体中に分散させ、再び１０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上清を除去し、新たな水で置き換え、ボルテックスしてベッドを分散させた。この洗浄手順を４回繰り返した。最後に、洗浄済みのコーティングされた粒子を共焦点顕微鏡研究のためにウェルに入れた。蛍光場の下での共焦点顕微鏡画像により、分子量８００万のＰＥＯ懸濁媒中のＰＳ粒子が、分子量１００万のＰＥＯ懸濁媒と比較してより低い均一性でコーティングされたことが明らかとなった。図５及び６を参照されたい。
【００７１】
実施例２０：上層の懸濁媒としての分子量１００万のＰＥＯ１％溶液中のクリック反応性ポリマーでのＨＣＴ１１６細胞スフェロイド（スフェロイド当たり５００細胞の初回用量）のコンフォーマルコーティング方法
２ｍｌ遠心管に、４アームｐｅｇ−アジド（分子量１０ｋ）１０ｍｇを含有する２００マイクロリットルの１０％スクロース溶液を充填した（第２の層）。その上部に、ＨＣＴ−１１６細胞スフェロイド（３０スフェロイド）、４アームＰＥＧ−ＮＨ−ＤＢＣＯ（１０ｋ、１．２５ｍｇ）、４アーム−ＰＥＧ−［ＮＨ−（ＰＥＧ）４−ＤＢＣＯ］３−ＦＩＴＣ（１０ｋ、１．２５マイクロリットル、ＤＩ水中１％溶液）、及びＰＥＯ（分子量１００万、５０マイクロリットル（ｍｉｃｒｏｌｔｅｒｓ）、生理食塩水中１％溶液）を含有する溶液の混合物を第１の層として積層した。管を密閉し、１０００ｒｐｍで、４℃で３分間遠心分離した。
【００７２】
コーティングされた細胞スフェロイドが底部に沈殿した。上清液を慎重に除去し、新たなＭｃＣｏｙ  ５ａ緩衝液（１０％ウシ胎仔血清でスパイク、２ｍｌ）で置き換え、ボルテックスしてベッドを液体中に分散させ、再び１０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上清を除去し、３ｍｌの新たな緩衝液で置き換え、ボルテックスしてベッドを分散させた。この洗浄手順を４回繰り返した。最後に、コーティングされた細胞スフェロイドを緩衝液とともに共焦点顕微鏡研究のためにウェルに入れた。蛍光場の下での共焦点顕微鏡画像により、ＨＣＴ１１６細胞スフェロイドが、分子量４００万及び８００万のＰＥＯ懸濁媒と比較してより低い均一性でコーティングされたことが明らかとなった（図７）。
【００７３】
実施例２１：上層の懸濁媒としてのＰＥＯ（分子量４００万）１％溶液中のクリック反応性ポリマーでのＨＣＴ細胞１１６スフェロイド（スフェロイド当たり５００細胞の初回用量）のコンフォーマルコーティング
２ｍｌ遠心管に、４アームＰＥＧ−アジド（分子量１０ｋ、１０ｍｇ）を含有する２００マイクロリットルの１０％スクロース溶液を充填した（第２の層、下層）。その上部に、ＨＣＴ−１１６スフェロイド（３０スフェロイド）、４アームＰＥＧ−ＮＨ−ＤＢＣＯ（１．２５ｍｇ）、４アーム−ＰＥＧ−［ＮＨ−ＰＥＧ４−ＤＢＣＯ］３−ＦＩＴＣ（１０ｋ、１．２５マイクロリットルのＤＩ水中１％溶液）、及びＰＥＯ（分子量４００万、５０マイクロリットル（ｍｉｃｒｏｌｔｅｒｓ）の生理食塩水中１％溶液）を含有する溶液の混合物を積層した（第１の層、上層）。管を密閉し、１０００ｒｐｍで、４℃で３分間遠心分離した。
【００７４】
コーティングされたスフェロイドが底部に沈殿した。上清液を慎重に除去し、新たなＭｃＣｏｙ  ５ａ緩衝液（１０％ウシ胎仔血清でスパイク、２ｍｌ）で置き換えた。それをボルテックスしてベッドを液体中に分散させ、再び１０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上清を除去し、３ｍｌの新たな緩衝液で置き換え、ボルテックスしてベッドを分散させた。この洗浄手順を４回繰り返した。最後に、コーティングされた細胞スフェロイドを緩衝液とともに共焦点顕微鏡研究のためにウェルに入れた。蛍光場の下での共焦点顕微鏡画像により、ＨＣＴ１１６細胞スフェロイドが均一にコーティングされ、分子量１００万のＰＥＯ懸濁媒と比較してより良好であると見出されたことが明らかとなった（図８）。
【００７５】
実施例２２：上層の懸濁媒としてのＰＥＯ（分子量８００万）１％溶液中のクリック反応性ポリマーでのＨＣＴ１１６細胞スフェロイド（スフェロイド当たり５００細胞の初回用量）のコンフォーマルコーティング
２ｍｌ遠心管に、４アームＰＥＧ−アジド（分子量１０ｋ、１０ｍｇ）を含有する２００マイクロリットルの１０％スクロース溶液を充填した（第２の層、下層）。その上部に、ＨＣＴ−１１６細胞スフェロイド（３０スフェロイド）、４アームＰＥＧ−ＮＨ−ＤＢＣＯ（１．２５ｍｇ）、４アーム−ＰＥＧ−［ＮＨ−（ＰＥＧ）４−ＤＢＣＯ］３−ＦＩＴＣ（１０ｋ、１．２５マイクロリットル、ＤＩ水中１％溶液）、及びＰＥＯ（分子量８００万、５０マイクロリットル（ｍｉｃｒｏｌｔｅｒｓ）、生理食塩水中１％溶液）を含有する溶液の混合物を積層した（第１の層、上層）。管を密閉し、１０００ｒｐｍで、４℃で３分間遠心分離した。
【００７６】
コーティングされたスフェロイドが底部に沈殿した。上清液を慎重に除去し、新たなＭｃＣｏｙ  ５ａ緩衝液（１０％ウシ胎仔血清でスパイク、２ｍｌ）で置き換えた。それをボルテックスしてベッドを液体中に分散させ、再び１０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上清を除去し、３ｍｌの緩衝液で置き換え、ボルテックスしてベッドを分散させた。この洗浄手順を４回繰り返した。最後に、コーティングされた細胞スフェロイドを緩衝液とともに共焦点顕微鏡研究のためにウェルに入れた。蛍光場の下での共焦点顕微鏡画像により、ＨＣＴ１１６細胞スフェロイドが均一にコーティングされ、１００万のＰＥＯ懸濁媒と比較してより良好であると見出されたことが明らかとなった（図９）。
【００７７】
実施例２３：上層における懸濁媒としてのＰＥＯ（分子量８００万）１％溶液中のクリック反応性ポリマーでのＨＣＴ１１６細胞スフェロイド（スフェロイド当たり１０００細胞の初回用量）のコンフォーマルコーティング
２ｍｌ遠心管に、４アームＰＥＧ−アジド（分子量１０ｋ、２０ｍｇ）を含有する２００マイクロリットルの１０％スクロース溶液を充填した（第２の層、下層）。その上部に、ＨＣＴ−１１６細胞スフェロイド（３０スフェロイド）、４アームＰＥＧ−ＮＨ−ＤＢＣＯ（２．５ｍｇ）、４アーム−ＰＥＧ−［ＮＨ−（ＰＥＧ）４−ＤＢＣＯ］３−ＦＩＴＣ（１０ｋ、２．５マイクロリットル、ＤＩ水中１％溶液）、及びＰＥＯ（分子量８００万、５０マイクロリットル、生理食塩水中１％溶液）を含有する溶液の混合物を積層した（第１の層、上層）。管を密閉し、１０００ｒｐｍで、４℃で３分間遠心分離した。
【００７８】
コーティングされたスフェロイドが底部に沈殿し、上清液を慎重に除去し、続いて新たなＭｃＣｏｙ  ５ａ緩衝液２ｍｌ（１０％ウシ胎仔血清でスパイク）を添加した。管をボルテックス（ｖｅｒｔｅｘ）してベッドを液体中に均一に分散させ、再び１０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上清を除去し、３ｍｌの新たなＭｃＣｏｙ  ５ａ緩衝液で置き換え、再びボルテックスしてベッドを分散させた。この洗浄手順を４回繰り返した。最後に、コーティングされたスフェロイドを共焦点顕微鏡研究のためにウェルに入れた。蛍光場の下での共焦点顕微鏡画像により、示されるように均一にコーティングされたことが明らかとなった（図１０）。
【００７９】
実施例２４：生／死細胞アッセイ
生細胞は、細胞内エステラーゼ活性によって識別され、これは、実質的に非蛍光性のカルセインＡＭの蛍光カルセイン部分への酵素変換によって決定される。カルセインＡＭ色素は、生細胞内に保持され、細胞内エステラーゼと反応してｅｘ／ｅｍ約４９５ｎｍ／約５１５ｎｍで強い緑色蛍光を生成する、ポリアニオン色素である。対照的に、エチジウムホモダイマー−１（ＥｔｈＤ−１）は、死細胞の損傷した膜を有する細胞に進入し、核酸に結合すると４０倍の蛍光増強を経て、ｅｘ／ｅｍ約４９５／約６３５ｎｍで明るい赤色蛍光を発する。Ｅｔｈｄ−１は、生細胞の無傷の形質膜によっては除外される。これらの２つの色素を組み合わせることにより、所与の試料の生／死細胞の概観が得られるであろう。
【００８０】
実施例２５：生／死細胞アッセイ手順
２０マイクロリットルの２ｍＭ  Ｅｔｈｄ−１原液を１０ｍｌの滅菌組織培養グレードダルベッコＰＢＳに取り込んだ。５マイクロリットルのＤＭＳＯ中４ｍＭカルセインＡＭ溶液をＥｔｈｄ−１溶液に添加し、混合物をボルテックスした。結果として得られた生／死試験用試薬は、溶液中、ＥｔｈＤ−１  ４マイクロモル当たり２マイクロモルのカルセイン（Ｃａｌｃｉｅｎ）を有する。マルチウェルプレートの各ウェルに１００マイクロリットルの細胞含有試験液を充填し、これに１００マイクロリットルの生／死試験用試薬を添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。細胞を共焦点顕微鏡においてｅｘ／ｅｍ約４９５ｎｍ／約５１５ｎｍ及び約４９５／約６３５ｎｍの２つの異なる波長で評価した。
【００８１】
実施例２６：コーティングされたＨＣＴ１１６細胞スフェロイド及び裸のＨＣＴ１１６細胞スフェロイドの顕微鏡検査及び生／死生存率アッセイ
コーティングされたＨＣＴ細胞１１６スフェロイド（１０００細胞の初回用量／スフェロイド）を新たに調製し、２つの部分に分割した。コンフォーマルコーティングを、実施例１９に記載される４アームＰＥＧ−ＤＢＣＯ及び４アームＰＥＧアジドにより１つの部分に適用した。コーティングされた細胞スフェロイド及び裸の細胞スフェロイドの両方を、カルセインＡＭ／ＥｔｈＤ−１アッセイを使用して細胞生存率について即座に評価した。コーティングされたスフェロイドも裸のスフェロイドも、最初は生存細胞を有し、死細胞はなかった。ＭｃＣｏｙ  ５ａ緩衝液中、５％ＣＯ２下で、３７℃でエージングすると、３日目時点で、細胞死は、コーティングされた細胞スフェロイド（図１２）と比較して裸のスフェロイド（図１１）において顕著に高かった。
【００８２】
実施例２７：上層の懸濁媒としてのＰＥＯ（分子量１００万）１％溶液中のクリック反応性ポリマーでのインスリノーマ細胞スフェロイドのコンフォーマルコーティング
２ｍｌ遠心管に、４アームＰＥＧ−アジド（分子量１０ｋ、１０ｍｇ）を含有する２００マイクロリットルの１０％スクロース溶液を第２の層として充填した（下層）。その上部に、インスリノーマスフェロイド（１０００スフェロイド）、４アームＰＥＧ−ＮＧ−ＤＢＣＯ（２．５ｍｇ）、４アーム−ＰＥＧ−［ＮＨ−（ＰＥＧ）４−ＤＢＣＯ］３−ＦＩＴＣ（１０ｋ、２．５マイクロリットル、ＤＩ水中１％溶液）、及びＰＥＯ（分子量１００万、５０マイクロリットル、生理食塩水中１％溶液）を含有する溶液の混合物を積層した（第１の層）。管を密閉し、１０００ｒｐｍで、４℃で３分間遠心分離した。
【００８３】
コーティングされたスフェロイドが底部に沈殿し、上清液を慎重に除去し、続いて生理食塩水２ｍｌを添加した。管をボルテックスしてベッドを液体中に分散させ、再び１０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上清を除去し、新たな生理食塩水２ｍｌで置き換え、それをボルテックスしてベッドを分散させた。この洗浄手順を４回繰り返した。最後に、洗浄済みのコーティングされたスフェロイドを蛍光顕微鏡研究のためにウェルに入れた。蛍光顕微鏡画像により、インスリノーマ細胞スフェロイドが均一にコーティングされたことが明らかとなった（図１３）。
【００８４】
実施例２８：上層における懸濁媒としてのＰＥＯ（分子量１００万）１％溶液中のクリック反応性ポリマーでのラット膵島細胞のコンフォーマルコーティング
２ｍｌ遠心管に、４アームＰＥＧ−アジド（分子量１０ｋ、１０ｍｇ）を含有する２００マイクロリットルの１０％スクロース溶液を充填した（第２の層、下層）。その上部に、膵島細胞（１００の膵島細胞）、４アームＰＥＧ−ＮＨ−ＤＢＣＯ（２．５ｍｇ）、４アーム−ＰＥＧ−［ＮＨ−（ＰＥＧ）４−ＤＢＣＯ］３−ＦＩＴＣ（１０ｋ、２．５マイクロリットル、ＤＩ水中１％溶液）、及びＰＥＯ（分子量１００万、５０マイクロリットル（ｍｉｃｒｏｌｔｅｒｓ）、生理食塩水中１％溶液）を含有する溶液の混合物を積層した（第１の層、上層）。管を密閉し、１０００ｒｐｍで、４℃で３分間遠心分離した。
【００８５】
コーティングされた膵島細胞が底部に沈殿し、上清液を慎重に除去し、続いて新たな生理食塩水２ｍｌを添加した。管をボルテックスしてベッドを液体中に分散させ、再び１０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上清を除去し、新たな生理食塩水２ｍｌで置き換え、それをボルテックスしてベッドを分散させた。この洗浄手順を４回繰り返した。最後に、洗浄済みのコーティングされた膵島細胞を蛍光顕微鏡研究のためにウェルに入れた。蛍光顕微鏡画像により、膵島細胞が示されるようにコーティングされたことが明らかとなった（図１４）。
【００８６】
実施例２９：上層における懸濁媒としてＰＥＯ溶液を用いたクリック反応性ＭＰＣポリマーでのＡＲＰＥ−１９細胞スフェロイドのコンフォーマルコーティング
２ｍｌ遠心管に、アジド修飾ＭＰＣポリマー（１０ｍｇ）を含有する２００マイクロリットルの１０％スクロース溶液を第２の層として充填した（下層）。その上部に、ＡＲＰＥ−１９スフェロイド（５０スフェロイド）、ＤＢＣＯ修飾ＭＰＣポリマー（２．５ｍｇ）、ＦＩＴＣ標識ＤＢＣＯ修飾ＭＰＣポリマー（０．０２５ｍｇ）、及びＰＥＯ（分子量１００万、５０マイクロリットル、生理食塩水中１％溶液）を含有する溶液の混合物を積層した（第１の層）。管を密閉し、１０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。コーティングされたスフェロイドが底部に沈殿し、上清液を慎重に除去し、続いて生理食塩水２ｍｌを添加した。管をボルテックスしてベッドを液体中に分散させ、再び１０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上清を除去し、新たなＰＢＳ  ２ｍｌで置き換え、それをボルテックスしてベッドを分散させた。洗浄手順を３回繰り返した。最後に、洗浄済みのコーティングされたスフェロイドをウェルに入れ、共焦点顕微鏡研究のためにＤＭＥＭ培地中、３７℃で培養した。共焦点顕微鏡画像により、ＡＲＰＥ−１９細胞スフェロイドが均一にコーティングされ、コーティングポリマーの経時的な除去とともに徐々に融合したことが明らかとなった（図１９〜２１）。
【００８７】
実施例３０：両方の層における懸濁媒としてのＰＥＯ溶液中のクリック反応性ＭＰＣポリマーでのＡＲＰＥ−１９細胞スフェロイドのコンフォーマルコーティング
２ｍｌ遠心管に、アジド修飾ＭＰＣポリマー（１０ｍｇ）及びＰＥＯ（分子量１００万、２ｍｇ）を含有する２００マイクロリットルの１０％スクロース溶液を第２の層として充填した（下層）。その上部に、ＡＲＰＥ−１９スフェロイド（５０スフェロイド）、ＤＢＣＯ修飾ＭＰＣポリマー（２．５ｍｇ）、ＦＩＴＣ標識ＤＢＣＯ修飾ＭＰＣポリマー（０．０２５ｍｇ）、及びＰＥＯ（分子量１００万、５０マイクロリットル、生理食塩水中１％溶液）を含有する溶液の混合物を積層した（第１の層）。管を密閉し、１０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。コーティングされたスフェロイドが底部に沈殿し、上清液を慎重に除去し、続いて生理食塩水２ｍｌを添加した。管をボルテックスしてベッドを液体中に分散させ、再び１０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上清を除去し、新たなＰＢＳ  ２ｍｌで置き換え、それをボルテックスしてベッドを分散させた。洗浄手順を３回繰り返した。最後に、洗浄済みのコーティングされたスフェロイドをウェルに入れ、共焦点顕微鏡研究のためにＤＭＥＭ培地中、３７℃で培養した。共焦点顕微鏡画像により、ＡＲＰＥ−１９細胞スフェロイドが均一にコーティングされ、２カ月を超えても安定しており融合しなかったことが明らかとなった（図２２〜２８）。
【００８８】
実施例３１：両方の層において懸濁媒を使用した、上層の連続添加法によるクリック反応性ポリマーでのＡＲＰＥ−１９細胞スフェロイドのコンフォーマルコーティング
ＤＢＣＯ修飾ＭＰＣポリマー（０．５ｍｇ）、ＦＩＴＣ標識ＤＢＣＯ修飾ＭＰＣポリマー（０．０５ｍｇ）、及びＰＥＯ（分子量１００万、０．１ｍｇ）を含有する、２００のＡＲＰＥ−１９スフェロイドが縣濁した１０マイクロリットルの生理食塩水をピペット先端に導入し、底部にアジド修飾ＭＰＣポリマー（１０ｍｇ）及びＰＥＯ（分子量１００万、２ｍｇ）を含有する、２００マイクロリットルの１０％スクロース溶液を充填したマイクロチューブに組み立てた。卓上遠心機を使用してマイクロチューブを１０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。コーティングされたスフェロイドが底部に沈殿し、上清液を慎重に除去し、続いて生理食塩水２ｍｌを添加した。管をボルテックスしてベッドを液体中に分散させ、再び１０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上清を除去し、新たなＰＢＳ  ２ｍｌで置き換え、それをボルテックスしてベッドを分散させた。洗浄手順を３回繰り返した。最後に、洗浄済みのコーティングされたスフェロイドをウェルに入れ、共焦点顕微鏡研究のためにＤＭＥＭ培地中、３７℃で培養した。共焦点顕微鏡画像により、ＡＲＰＥ−１９細胞スフェロイドが均一にコーティングされ、高収率で得られたことが明らかとなった（図２９）。
【００８９】
実施例３２：両方の層において懸濁媒を使用した、上層の連続添加法によるクリック反応性ＭＰＣポリマーでのラット膵島細胞のコンフォーマルコーティング
ＤＢＣＯ修飾ＭＰＣポリマー（０．２５ｍｇ）、ＦＩＴＣ標識ＤＢＣＯ修飾ＭＰＣポリマー（０．０２５ｍｇ）、及びＰＥＯ（分子量１００万、０．０５ｍｇ）を含有する生理食塩水に、５０の膵島細胞（５マイクロリットル体積）を縣濁させ、それをピペット先端に導入し、底部にアジド修飾ＭＰＣポリマー（５ｍｇ）及びＰＥＯ（分子量１００万、１ｍｇ）を含有する、１００マイクロリットルの１０％スクロース溶液を充填したマイクロチューブに組み立てた。卓上遠心機を使用してマイクロチューブを１０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。コーティングされた膵島細胞が底部に沈殿し、上清液を慎重に除去し、続いて生理食塩水２ｍＬを添加した。管をボルテックスしてベッドを液体中に分散させ、再び１０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上清を除去し、新たなＰＢＳ  ２ｍＬで置き換え、それをボルテックスしてベッドを分散させた。洗浄手順を３回繰り返した。最後に、洗浄済みのコーティングされた膵島細胞をウェルに入れ、共焦点顕微鏡研究のためにＲＰＭＩ培地中、３７℃で培養した。共焦点顕微鏡画像により、膵島細胞が均一にコーティングされ、コーティングポリマーが最大２６日間安定して存在したことが明らかとなった（図３０〜３３）。
【００９０】
実施例３３：裸のインスリノーマ細胞スフェロイドと比較しての実施例２７のコーティングされたインスリノーマ細胞スフェロイドのインスリン分泌研究
コーティングされたインスリノーマスフェロイド及び裸のインスリノーマスフェロイド（各々１００のスフェロイド）を、平衡化及びプレインキュベーションのために１ｍＬの１ミリモル濃度グルコースのクレブス緩衝液（Ｓｉｇｍａ）を含有するウェルに３７℃で１時間入れた。これに続いて、低グルコース（３ミリモル濃度、１ｍＬ）、高グルコース（１０ミリモル濃度、１ｍＬ）、及び低グルコース（３ミリモル濃度、１ｍＬ）のクレブス緩衝液中で、３７℃で２時間、順次にインキュベートした。低グルコース緩衝液中でのインキュベーションの終わりに、１００マイクロリットルの上清をアッセイのために収集した。高グルコース緩衝液の場合、各時点（１０、３０、６０、９０、１２０分）で、３０マイクロリットルの上清をアッセイのために収集し、再び低グルコース緩衝液の場合は１００マイクロリットルの上清をアッセイのために収集した。収集した試料をＥＬＩＳＡによってアッセイした。グルコースに対するインスリン分泌反応性が、コーティングされたスフェロイド及び裸のスフェロイドの両方について確認され、コーティングされたスフェロイドのインスリン分泌は、高グルコース緩衝液中で裸のスフェロイドに匹敵した。図１５を参照されたい。コーティングされたスフェロイドについて、高グルコース緩衝液中でインスリン分泌の遅延は観察されず、それは裸のスフェロイドと比べてであるが、マイクロカプセル化された（アルギン酸バリウム）製剤よりも優れていることが見出された。データを図１６においてプロットした。
【００９１】
実施例３４：裸の膵島細胞と比較しての実施例２８のコーティングされたラット膵島細胞を使用したインスリン分泌研究
コーティングされたラット膵島細胞及び裸の膵島細胞（各々２０の膵島細胞）を、平衡化及びプレインキュベーションのために１ｍｌの１ミリモル濃度グルコースのクレブス緩衝液を含有するウェルに３７℃で１時間入れた。これに続いて、低グルコース（２ｍＭ、１ｍＬ）、高グルコース（２０ｍＭ、１ｍＬ）、及び低グルコース（２ｍＭ、１ｍＬ）のクレブス緩衝液中で、３７℃で２時間、順次にインキュベートした。低グルコース緩衝液中でのインキュベーションの終わりに、１００マイクロリットルの上清をアッセイのために収集した。高グルコース緩衝液の場合、各時点（１０、３０、６０、９０、１２０分）で、３０マイクロリットルの上清をアッセイのために収集し、再び低グルコース緩衝液の場合は１００マイクロリットルの上清をアッセイのために収集した。収集した試料をＥＬＩＳＡによってアッセイした。グルコースに対するインスリン分泌反応性が、コーティングされたスフェロイド及び裸のスフェロイドの両方について確認され、コーティングされた膵島細胞のインスリン分泌は、高グルコース緩衝液中で裸の膵島細胞に匹敵した（図１７）。コーティングされたスフェロイドについて、高グルコース緩衝液中でインスリン分泌の遅延は観察されず、それは裸のスフェロイドと比べてであるが、マイクロカプセル化された（アルギン酸バリウム）製剤よりも優れていることが見出された。データを図１８においてプロットした。
【００９２】
実施例３５：実施例３２の連続添加法によってコーティングされた膵島細胞及び裸のラット膵島細胞の顕微鏡検査及び生／死生存率アッセイ
膵島細胞をダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）で簡便にすすぎ、４μＭカルセインＡＭ及び８μＭエチジウムホモダイマー−１（ＥｔｈＤ−１）から構成されるＤＰＢＳ中で３０分間インキュベートした。膵島細胞の生存率を共焦点顕微鏡で評価した。コーティングされたスフェロイドも裸のスフェロイドも、最初はほぼすべて生存細胞を有する。培地中でエージングすると、裸の膵島細胞では、２９日目時点で互いの凝集に起因して中心細胞の壊死が引き起こされた一方で、コーティングされた膵島細胞は、依然として生存して、コーティングポリマーの作用による凝集を回避した（図３４〜３７）。
【００９３】
実施例３６：裸の膵島細胞と比較しての実施例３２の連続添加法によってコーティングされたラット膵島細胞のインスリン分泌研究
コーティングされたラット膵島細胞及び裸の膵島細胞（各々２０の膵島細胞）を、平衡化及びプレインキュベーションのために１ｍＬの１ｍＭグルコースのクレブス緩衝液を含有するウェルに３７℃で１時間入れた。これに続いて、低グルコース（２ｍＭ、１ｍＬ）、高グルコース（２０ｍＭ、１ｍＬ）、及び低グルコース（２ｍＭ、１ｍＬ）のクレブス緩衝液中で、３７℃で２時間、順次にインキュベートした。各グルコース緩衝液中でのインキュベーションの終わりに、１００μｌの上清をアッセイのために収集した。収集した試料をＥＬＩＳＡによってアッセイした。裸の膵島細胞及びコーティングされた膵島細胞の両方のインスリン分泌機能は、インビトロ培養下で１７日目まで一致していることが見出されたが、裸の膵島細胞では２３日目時点でそれらの機能が顕著に減少した一方で、コーティングされた膵島細胞は、依然としてそれらの機能を維持した（図３８、３９）。
【００９４】
本出願においていくつかのパラメータを説明する、「約」、「少なくとも」、「〜未満」、及び「〜よりも多く」などのすべての数字の境界に関して、この説明はまた、記載される値によって境界を定められた任意の範囲も必然的に包含することが理解されるべきである。したがって、例えば、「少なくとも１、２、３、４、または５」という説明はまた、とりわけ、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、２〜３、２〜４、２〜５、３〜４、３〜５、及び４〜５等の範囲も説明する。
【００９５】
本明細書に引用されるすべての特許、出願、または非特許文献及び参考配列情報などの他の参考文献に関して、それらは参照によりそれらの全体が全目的でならびに記載される提案のために本明細書に援用されることが理解されるべきである。参照により援用される文献と本出願との間に矛盾が存在する場合、本出願が優先する。
【００９６】
本出願で使用される見出しは、便宜上のものにすぎず、本出願の解釈に影響を及ぼすものではない。
【００９７】
本発明によって提供される態様の各々の好ましい特徴は、必要な変更を加えて本発明の他の態様のすべてに適用可能であり、限定されないが、従属請求項によって例示され、また、実施例を含めた本発明の具体的な実施形態及び態様の個々の特徴（例えば、数値範囲及び代表的な実施形態を含めた要素）の組み合わせ及び順列も包含する。例えば、実施例で例示される具体的な実験パラメータは、本発明から逸脱することなく、特許請求される発明における断片的な使用のために適合させることができる。例えば、開示される材料に関して、これらの化合物の個々の及び集合的な種々の組み合わせ及び順列の各々への具体的な言及は、明示的に開示されていない場合があるが、各々が本明細書で具体的に企図され、記載される。故に、要素Ａ、Ｂ、及びＣの部類ならびに要素Ｄ、Ｅ、及びＦの部類が開示され、要素Ａ−Ｄの組み合わせの例が開示される場合、各々が個々に記載されていない場合でも、各々が個々に及び集合的に企図される。故に、この例では、組み合わせＡ−Ｅ、Ａ−Ｆ、Ｂ−Ｄ、Ｂ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、Ｃ−Ｄ、Ｃ−Ｅ、及びＣ−Ｆの各々が具体的に企図され、Ａ、Ｂ、及びＣ；Ｄ、Ｅ、及びＦ；ならびに組み合わせ例Ａ−Ｄの開示により開示されると見なされるべきである。同様に、これらの任意のサブセットまたは組み合わせも具体的に企図され、開示される。故に、例えば、Ａ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、及びＣ−Ｅのサブグループが具体的に企図され、Ａ、Ｂ、及びＣ；Ｄ、Ｅ、及びＦ；ならびに組み合わせ例Ａ−Ｄの開示により開示されると見なされるべきである。この概念は、組成物（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｔｔｅｒ）の要素及びその組成物の作製方法または使用方法の工程を含めて、本出願のすべての態様に適用される。
【００９８】
本明細書の教示に従って当業者によって認識される、本発明の上述の態様は、それらが先行技術に対して新規かつ非自明である範囲で、任意の組み合わせまたは順列で特許請求され得、故に、ある要素が当業者に既知の１つ以上の参考文献に記載される範囲で、それらは、とりわけ、その特徴または特徴の組み合わせの消極的限定またはディスクレーマによって、特許請求される発明から除外されてもよい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１−１】
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【図４１−２】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【国際調査報告】
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