(57)【要約】  ＮＫＧ２Ｄ受容体、ＣＤ１６、及び腫瘍関連抗原ＦＬＴ３と結合する多重特異性結合タンパク質が記載され、それに加えてがんの処置に有用な医薬組成物及び治療方法が記載される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質であって、
（ａ）ＮＫＧ２Ｄと結合する第１抗原結合部位と、
（ｂ）ＦＬＴ３と結合する第２抗原結合部位と、
（ｃ）抗体ＦｃドメインもしくはＣＤ１６と結合するのに十分なその一部分、またはＣＤ１６と結合する第３抗原結合部位とを含む、前記タンパク質。
【請求項２】
前記第１抗原結合部位が、ヒトのＮＫＧ２Ｄに結合する、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
前記第１抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む、請求項１または２に記載のタンパク質。
【請求項４】
前記重鎖可変ドメイン及び前記軽鎖可変ドメインが、同じポリペプチド上に存在する、請求項３に記載のタンパク質。
【請求項５】
前記第２抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む、請求項３または４に記載のタンパク質。
【請求項６】
前記第２抗原結合部位の前記重鎖可変ドメイン及び前記軽鎖可変ドメインが、同じポリペプチド上に存在する、請求項５に記載のタンパク質。
【請求項７】
前記第１抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、前記第２抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有する、請求項５または６に記載のタンパク質。
【請求項８】
前記第１抗原結合部位が、配列番号：１、配列番号：４１、配列番号：４９、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：６１、配列番号：６９、配列番号：７７、配列番号：８５、及び配列番号：９３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインを含む、先行請求項のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項９】
前記第１抗原結合部位が、配列番号：４１と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメイン及び配列番号：４２と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項１０】
前記第１抗原結合部位が、配列番号：４９と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメイン及び配列番号：５０と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項１１】
前記第１抗原結合部位が、配列番号：５７と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメイン及び配列番号：５８と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項１２】
前記第１抗原結合部位が、配列番号：５９と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメイン及び配列番号：６０と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項１３】
前記第１抗原結合部位が、配列番号：６１と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメイン及び配列番号：６２と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項１４】
前記第１抗原結合部位が、配列番号：６９と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメイン及び配列番号：７０と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項１５】
前記第１抗原結合部位が、配列番号：７７と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメイン及び配列番号：７８と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項１６】
前記第１抗原結合部位が、配列番号：８５と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメイン及び配列番号：８６と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項１７】
前記第１抗原結合部位が、配列番号：９３と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメイン及び配列番号：９４と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項１８】
前記第１抗原結合部位が、配列番号：１０１と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメイン及び配列番号：１０２と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項１９】
前記第１抗原結合部位が、配列番号：１０３と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメイン及び配列番号：１０４と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項２０】
前記第１抗原結合部位が、単一ドメイン抗体である、請求項１または２に記載のタンパク質。
【請求項２１】
前記単一ドメイン抗体が、ＶＨＨ断片またはＶＮＡＲ断片である、請求項２０に記載のタンパク質。
【請求項２２】
前記第２抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む、請求項１〜２または２０〜２１のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項２３】
前記第２抗原結合部位の前記重鎖可変ドメイン及び前記軽鎖可変ドメインが、同じポリペプチド上に存在する、請求項２２に記載のタンパク質。
【請求項２４】
前記第２抗原結合部位がＦＬＴ３と結合し、前記第２抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、配列番号：１０９と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、配列番号：１１３と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項２５】
前記第２抗原結合部位がＦＬＴ３と結合し、前記第２抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、配列番号：１１７と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、配列番号：１２１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項２６】
前記第２抗原結合部位がＦＬＴ３と結合し、前記第２抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、配列番号：１２５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、配列番号：１２９と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項２７】
前記第２抗原結合部位が、単一ドメイン抗体である、請求項１〜４または８〜２１のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項２８】
前記第２抗原結合部位が、ＶＨＨ断片またはＶＮＡＲ断片である、請求項２７に記載のタンパク質。
【請求項２９】
前記タンパク質が、ＣＤ１６と結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインの一部分を含み、前記抗体Ｆｃドメインがヒンジ及びＣＨ２ドメインを含む、先行請求項のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項３０】
前記抗体Ｆｃドメインが、ヒトＩｇＧ１抗体のヒンジ及びＣＨ２ドメインを含む、請求項２９に記載のタンパク質。
【請求項３１】
前記Ｆｃドメインが、ヒトＩｇＧ１抗体のアミノ酸２３４〜３３２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項２９または３０に記載のタンパク質。
【請求項３２】
前記Ｆｃドメインが、ヒトＩｇＧ１の前記Ｆｃドメインと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１、Ｋ４３９からなる群から選択される１つ以上の位置で異なる、請求項３１に記載のタンパク質。
【請求項３３】
先行請求項のいずれか１項に記載のタンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む、製剤。
【請求項３４】
請求項１〜３２のいずれか１項に記載のタンパク質を発現する１つ以上の核酸を含む、細胞。
【請求項３５】
腫瘍細胞死の増強方法であって、腫瘍細胞及びナチュラルキラー細胞を、有効量の請求項１〜３２のいずれか１項に記載の前記タンパク質に曝露することを含み、前記腫瘍細胞がＦＬＴ３を発現する、前記方法。
【請求項３６】
がんの処置方法であって、前記方法が、有効量の請求項１〜３２のいずれか１項に記載の前記タンパク質または請求項３３に記載の前記製剤を患者に投与することを含む、前記方法。
【請求項３７】
前記がんが白血病である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記白血病が、急性骨髄性白血病、Ｔ細胞白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、及び有毛細胞白血病からなる群から選択される、請求項３７に記載のがんの処置方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年７月３１日出願の米国特許仮出願第６２／５３９，４２１号明細書の利益及びその優先権を主張し、その内容全体が、あらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含有し、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。２０１８年７月３０日に作成されたＡＳＣＩＩコピーは、ＤＦＹ−０２７ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、１０３，７３１バイトのサイズである。
【０００３】
本発明は、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１６、及び腫瘍関連抗原ＦＬＴ３に結合する多重特異性結合タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００４】
がんは、かなりの研究努力及び化学的進歩が、この疾患の処置について文献で報告されているにもかかわらず、重大な健康問題であり続けている。血液がん及び骨髄がんは、高い頻度で診断されるがん型であり、多発性骨髄腫、白血病、及びリンパ腫を含む。これらのがんに対する現在の処置選択肢は、全ての患者にとって効果的なものではなく、及び／またはかなり有害な副作用を有し得る。他の種類のがんも、既存の治療選択肢を使用して処置することが依然として困難である。
【０００５】
がん免疫療法は、それらが高度に特異的であることから望ましく、患者自身の免疫系を使用してがん細胞の破壊を促進し得る。二重特異性Ｔ細胞誘導体などの融合タンパク質は、腫瘍細胞及びＴ細胞に結合し、腫瘍細胞の破壊を促進する、文献に記載されているがん免疫療法である。ある特定の腫瘍関連抗原に、かつある特定の免疫細胞に結合する抗体が、文献に記載されてきた。例えば、ＷＯ２０１６／１３４３７１及びＷＯ２０１５／０９５４１２を参照のこと。
【０００６】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、自然免疫系の構成要素であり、循環リンパ球のおよそ１５％を構成する。ＮＫ細胞は実質的に全ての組織に浸潤し、元より、以前の感作を必要とすることなく、効果的に腫瘍細胞を死滅させるそれらの能力を特徴とした。活性化ＮＫ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞に類似した手段によって、すなわち、パーフォリン及びグランザイムを含有する細胞溶解性顆粒によって、それに加えて細胞死受容体経路によって標的細胞を死滅させる。活性化ＮＫ細胞はまた、標的組織に対して他の白血球の動員を促進するＩＦＮ−γ及びケモカインなどの炎症性サイトカインを分泌する。
【０００７】
ＮＫ細胞は、それらの表面上の様々な活性化受容体及び阻害性受容体を介してシグナルに応答する。例えば、ＮＫ細胞が健康な自己細胞に遭遇する場合、それらの活性は、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）の活性化によって阻害される。あるいは、ＮＫ細胞が外来細胞またはがん細胞に遭遇する場合、それらは、それらの活性化受容体（例えば、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＣＲ、ＤＮＡＭ１）によって活性化される。ＮＫ細胞はまた、それらの表面上のＣＤ１６受容体を介する一部の免疫グロブリンの定常領域によって活性化される。活性化に対するＮＫ細胞の全体的な感度は、刺激シグナル及び阻害シグナルの合計に依存する。
【０００８】
ＦＭＳ様チロシンキナーゼ−３（ＦＬＴ３）、すなわち多能性前駆細胞及びリンパ球系共通前駆細胞で発現される受容体チロシンキナーゼは、造血系及び免疫系の発生に重要である。ＦＬＴ３を介するシグナル伝達は、細胞の生存、増殖、及び分化において重要な役割を果たす。ＦＬＴ３受容体の変異は、白血病、例えば、急性骨髄性白血病、Ｔ細胞白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、及び有毛細胞白血病の発症を招き得る。ＦＬＴ３の遺伝子内縦列重複（ＦＬＴ３−ＩＴＤ）は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）と関連する最も一般的な変異である。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体及びＣＤ１６受容体、ならびに腫瘍関連抗原ＦＬＴ３に結合する多重特異性結合タンパク質を提供する。そのようなタンパク質は、ＮＫ活性化受容体のうち２種以上と結合し得、天然リガンドとＮＫＧ２Ｄとの結合をブロックする可能性がある。ある特定の実施形態では、タンパク質は、ヒトのＮＫ細胞を作動させ得る。いくつかの実施形態では、タンパク質は、ヒトのＮＫ細胞ならびにげっ歯類及びカニクイザルなどの、他の種のＮＫ細胞を作動させ得る。本発明の様々な態様及び実施形態が、以下でさらに詳しく記載される。
【００１０】
したがって、本発明の一態様は、ＮＫＧ２Ｄと結合する第１抗原結合部位、腫瘍関連抗原ＦＬＴ３と結合する第２抗原結合部位、及び抗体Ｆｃドメイン、ＣＤ１６と結合するのに十分なその一部分、またはＣＤ１６と結合する第３抗原結合部位を組み込むタンパク質を提供する。
【００１１】
抗原結合部位は各々、抗体重鎖可変ドメイン及び抗体軽鎖可変ドメインを組み込む可能性がある（例えば、抗体におけるように配置される、もしくはｓｃＦｖを形成するように互いに融合される）か、または抗原結合部位のうち１つ以上が、ラクダ抗体のようなＶＨＨ抗体もしくは軟骨魚類に見られるもののようなＶＮＡＲ抗体などの単一ドメイン抗体である可能性がある。
【００１２】
一態様では、本発明は、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体及びＣＤ１６受容体、ならびに腫瘍関連抗原ＦＬＴ３に結合する多重特異性結合タンパク質を提供する。ＮＫＧ２Ｄ結合部位は、配列番号：１、配列番号：４１、配列番号：４９、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：６１、配列番号：６９、配列番号：７７、配列番号：８５、及び配列番号：９３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインを含む。
【００１３】
ＮＫＧ２Ｄに結合する第１抗原結合部位は、いくつかの実施形態では、配列番号：１と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一のアミノ酸配列を有すること、及び／または配列番号：１のＣＤＲ１（配列番号：１０５）、ＣＤＲ２（配列番号：１０６）、及びＣＤＲ３（配列番号：１０７）配列と同一のアミノ酸配列を組み込むことなどによって、配列番号：１に関連する重鎖可変ドメインを組み込み得る。配列番号：１に関連する重鎖可変ドメインは、様々な軽鎖可変ドメインと対になってＮＫＧ２Ｄ結合部位を形成し得る。例えば、配列番号：１に関連する重鎖可変ドメインを組み込む第１抗原結合部位は、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、及び４０に関連する配列のうちいずれか１つから選択される軽鎖可変ドメインをさらに組み込み得る。例えば、第１抗原結合部位は、配列番号：１と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインならびに配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、及び４０から選択される配列のうちいずれか１つと少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを組み込む。
【００１４】
あるいは、第１抗原結合部位は、配列番号：４１に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号：４２に関連する軽鎖可変ドメインを組み込み得る。例えば、第１抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号：４１と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であり得る、及び／または配列番号：４１のＣＤＲ１（配列番号：４３）、ＣＤＲ２（配列番号：４４）、及びＣＤＲ３（配列番号：４５）配列と同一のアミノ酸配列を組み込み得る。同様に、第２抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号：４２と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であり得る、及び／または配列番号：４２のＣＤＲ１（配列番号：４６）、ＣＤＲ２（配列番号：４７）、及びＣＤＲ３（配列番号：４８）配列と同一のアミノ酸配列を組み込み得る。
【００１５】
他の実施形態では、第１抗原結合部位は、配列番号：４９に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号：５０に関連する軽鎖可変ドメインを組み込み得る。例えば、第１抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号：４９と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であり得る、及び／または配列番号：４９のＣＤＲ１（配列番号：５１）、ＣＤＲ２（配列番号：５２）、及びＣＤＲ３（配列番号：５３）配列と同一のアミノ酸配列を組み込み得る。同様に、第２抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号：５０と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であり得る、及び／または配列番号：５０のＣＤＲ１（配列番号：５４）、ＣＤＲ２（配列番号：５５）、及びＣＤＲ３（配列番号：５６）配列と同一のアミノ酸配列を組み込み得る。
【００１６】
あるいは、第１抗原結合部位は、配列番号：５７に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号：５８に関連する軽鎖可変ドメインを、それぞれ配列番号：５７と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列及び配列番号：５８と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を有することなどによって組み込み得る。
【００１７】
別の実施形態では、第１抗原結合部位は、配列番号：５９に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号：６０に関連する軽鎖可変ドメインを組み込み得、例えば、第１抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号：５９と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であり得る、及び／または配列番号：５９のＣＤＲ１（配列番号：１３４）、ＣＤＲ２（配列番号：１３５）、及びＣＤＲ３（配列番号：１３６）配列と同一のアミノ酸配列を組み込み得る。同様に、第２抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号：６０と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であり得る、及び／または配列番号：６０のＣＤＲ１（配列番号：１３７）、ＣＤＲ２（配列番号：１３８）、及びＣＤＲ３（配列番号：１３９）配列と同一のアミノ酸配列を組み込み得る。
【００１８】
ＮＫＧ２Ｄに結合する第１抗原結合部位は、いくつかの実施形態では、配列番号：６１に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号：６２に関連する軽鎖可変ドメインを組み込み得る。例えば、第１抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号：６１と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であり得る、及び／または配列番号：６１のＣＤＲ１（配列番号：６３）、ＣＤＲ２（配列番号：６４）、及びＣＤＲ３（配列番号：６５）配列と同一のアミノ酸配列を組み込み得る。同様に、第２抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号：６２と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であり得る、及び／または配列番号：６２のＣＤＲ１（配列番号：６６）、ＣＤＲ２（配列番号：６７）、及びＣＤＲ３（配列番号：６８）配列と同一のアミノ酸配列を組み込み得る。いくつかの実施形態では、第１抗原結合部位は、配列番号：６９に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号：７０に関連する軽鎖可変ドメインを組み込み得る。例えば、第１抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号：６９と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であり得る、及び／または配列番号：６９のＣＤＲ１（配列番号：７１）、ＣＤＲ２（配列番号：７２）、及びＣＤＲ３（配列番号：７３）配列と同一のアミノ酸配列を組み込み得る。同様に、第２抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号：７０と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であり得る、及び／または配列番号：７０のＣＤＲ１（配列番号：７４）、ＣＤＲ２（配列番号：７５）、及びＣＤＲ３（配列番号：７６）配列と同一のアミノ酸配列を組み込み得る。
【００１９】
いくつかの実施形態では、第１抗原結合部位は、配列番号：７７に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号：７８に関連する軽鎖可変ドメインを組み込み得る。例えば、第１抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号：７７と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であり得る、及び／または配列番号：７７のＣＤＲ１（配列番号：７９）、ＣＤＲ２（配列番号：８０）、及びＣＤＲ３（配列番号：８１）配列と同一のアミノ酸配列を組み込み得る。同様に、第２抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号：７８と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であり得る、及び／または配列番号：７８のＣＤＲ１（配列番号：８２）、ＣＤＲ２（配列番号：８３）、及びＣＤＲ３（配列番号：８４）配列と同一のアミノ酸配列を組み込み得る。
【００２０】
いくつかの実施形態では、第１抗原結合部位は、配列番号：８５に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号：８６に関連する軽鎖可変ドメインを組み込み得る。例えば、第１抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号：８５と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であり得る、及び／または配列番号：８５のＣＤＲ１（配列番号：８７）、ＣＤＲ２（配列番号：８８）、及びＣＤＲ３（配列番号：８９）配列と同一のアミノ酸配列を組み込み得る。同様に、第２抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号：８６と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であり得る、及び／または配列番号：８６のＣＤＲ１（配列番号：９０）、ＣＤＲ２（配列番号：９１）、及びＣＤＲ３（配列番号：９２）配列と同一のアミノ酸配列を組み込み得る。
【００２１】
いくつかの実施形態では、第１抗原結合部位は、配列番号：９３に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号：９４に関連する軽鎖可変ドメインを組み込み得る。例えば、第１抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号：９３と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であり得る、及び／または配列番号：９３のＣＤＲ１（配列番号：９５）、ＣＤＲ２（配列番号：９６）、及びＣＤＲ３（配列番号：９７）配列と同一のアミノ酸配列を組み込み得る。同様に、第２抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号：９４と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であり得る、及び／または配列番号：９４のＣＤＲ１（配列番号：９８）、ＣＤＲ２（配列番号：９９）、及びＣＤＲ３（配列番号：１００）配列と同一のアミノ酸配列を組み込み得る。
【００２２】
いくつかの実施形態では、第１抗原結合部位は、配列番号：１０１に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号：１０２に関連する軽鎖可変ドメインを、それぞれ配列番号：１０１と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列及び配列番号：１０２と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を有することなどによって組み込み得る。いくつかの実施形態では、第１抗原結合部位は、配列番号：１０３に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号：１０４に関連する軽鎖可変ドメインを、それぞれ配列番号：１０３と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列及び配列番号：１０４と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を有することなどによって組み込み得る。
【００２３】
いくつかの実施形態では、ＦＬＴ３に結合する第２抗原結合部位は、配列番号：１０９に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号：１１３に関連する軽鎖可変ドメインを組み込み得る。例えば、第２抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号：１０９と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であり得る、及び／または配列番号：１０９のＣＤＲ１（配列番号：１１０）、ＣＤＲ２（配列番号：１１１）、及びＣＤＲ３（配列番号：１１２）配列と同一のアミノ酸配列を組み込み得る。同様に、第２抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号：１１３と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であり得る、及び／または配列番号：１１３のＣＤＲ１（配列番号：１１４）、ＣＤＲ２（配列番号：１１５）、及びＣＤＲ３（配列番号：１１６）配列と同一のアミノ酸配列を組み込み得る。
【００２４】
あるいは、ＦＬＴ３に結合する第２抗原結合部位は、配列番号：１１７に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号：１２１に関連する軽鎖可変ドメインを組み込み得る。例えば、第２抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号：１１７と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であり得る、及び／または配列番号：１１７のＣＤＲ１（配列番号：１１８）、ＣＤＲ２（配列番号：１１９）、及びＣＤＲ３（配列番号：１２０）配列と同一のアミノ酸配列を組み込み得る。同様に、第２抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号：１２１と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であり得る、及び／または配列番号：１２１のＣＤＲ１（配列番号：１２２）、ＣＤＲ２（配列番号：１２３）、及びＣＤＲ３（配列番号：１２４）配列と同一のアミノ酸配列を組み込み得る。
【００２５】
あるいは、ＦＬＴ３に結合する第２抗原結合部位は、配列番号：１２５に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号：１２９に関連する軽鎖可変ドメインを組み込み得る。例えば、第２抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号：１２５と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であり得る、及び／または配列番号：１２５のＣＤＲ１（配列番号：１２６）、ＣＤＲ２（配列番号：１２７）、及びＣＤＲ３（配列番号：１２８）配列と同一のアミノ酸配列を組み込み得る。同様に、第２抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号：１２９と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であり得る、及び／または配列番号：１２９のＣＤＲ１（配列番号：１３０）、ＣＤＲ２（配列番号：１３１）、及びＣＤＲ３（配列番号：１３２）配列と同一のアミノ酸配列を組み込み得る。
【００２６】
いくつかの実施形態では、第２抗原結合部位は、第１抗原結合部位中に存在する軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを組み込む。
【００２７】
いくつかの実施形態では、タンパク質は、ＣＤ１６と結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインの一部分を組み込み、抗体Ｆｃドメインは、ヒンジ及びＣＨ２ドメイン、及び／またはヒトＩｇＧ抗体のアミノ酸配列２３４〜３３２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。
【００２８】
本明細書に記載されるタンパク質のうちいずれか１つを含有する製剤、タンパク質を発現する１つ以上の核酸を含有する細胞、及びタンパク質を使用して腫瘍細胞死を増強する方法も提供される。
【００２９】
本発明の別の態様は、患者のがんを処置する方法を提供する。本方法は、治療有効量の本明細書に記載される多重特異性結合タンパク質を、それを必要とする患者に投与することを含む。多重特異性結合タンパク質を使用して処置される例示的ながんとしては、白血病、例えば、急性骨髄性白血病、Ｔ細胞白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、及び有毛細胞白血病が挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】ヘテロ二量体多重特異性抗体の図である。各アームは、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン、またはＦＬＴ３結合ドメインのいずれかを表し得る。いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ及びＦＬＴ３結合ドメインは、共通の軽鎖を共有し得る。
【００３１】
【図２】ヘテロ二量体多重特異性抗体の図である。ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインまたはＦＬＴ３結合ドメインのいずれかが、ｓｃＦｖ型を取り得る（右アーム）。
【００３２】
【図３】ＥＬＩＳＡアッセイにおける、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列挙される）とヒト組換えＮＫＧ２Ｄとの結合親和性を示す線グラフである。
【００３３】
【図４】ＥＬＩＳＡアッセイにおける、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列挙される）とカニクイザル組換えＮＫＧ２Ｄとの結合親和性を示す線グラフである。
【００３４】
【図５】ＥＬＩＳＡアッセイにおける、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列挙される）とマウス組換えＮＫＧ２Ｄとの結合親和性を示す線グラフである。
【００３５】
【図６】平均蛍光強度（ＭＦＩ）のバックグラウンドに対する倍率（ＦＯＢ）を示すフローサイトメトリーによる、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列挙される）とヒトＮＫＧ２Ｄを発現するＥＬ４細胞との結合を示す棒グラフである。
【００３６】
【図７】平均蛍光強度（ＭＦＩ）のバックグラウンドに対する倍率（ＦＯＢ）を示すフローサイトメトリーによる、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列挙される）とマウスＮＫＧ２Ｄを発現するＥＬ４細胞との結合を示す棒グラフである。
【００３７】
【図８】天然リガンドＵＬＢＰ−６と競合することによって、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列挙される）と組換えヒトＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃとの特異的結合親和性を示す線グラフである。
【００３８】
【図９】天然リガンドＭＩＣＡと競合することによって、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列挙される）と組換えヒトＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃとの特異的結合親和性を示す線グラフである。
【００３９】
【図１０】天然リガンドＲａｅ−１デルタと競合することによって、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列挙される）と組換えマウスＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃとの特異的結合親和性を示す線グラフである。
【００４０】
【図１１】ＴＮＦ−α陽性細胞のパーセンテージを定量化することによって、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列挙される）によるヒトＮＫＧ２Ｄの活性化を示す棒グラフであり、この細胞はヒトＮＫＧ２Ｄ−ＣＤ３ゼータ融合タンパク質を発現する。
【００４１】
【図１２】ＴＮＦ−α陽性細胞のパーセンテージを定量化することによって、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列挙される）によるマウスＮＫＧ２Ｄの活性化を示す棒グラフであり、この細胞はマウスＮＫＧ２Ｄ−ＣＤ３ゼータ融合タンパク質を発現する。
【００４２】
【図１３】ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列挙される）によるヒトＮＫ細胞の活性化を示す棒グラフである。
【００４３】
【図１４】ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列挙される）によるヒトＮＫ細胞の活性化を示す棒グラフである。
【００４４】
【図１５】ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列挙される）によるマウスＮＫ細胞の活性化を示す棒グラフである。
【００４５】
【図１６】ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列挙される）によるマウスＮＫ細胞の活性化を示す棒グラフである。
【００４６】
【図１７】腫瘍細胞上のＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列挙される）の細胞傷害効果を示す棒グラフである。
【００４７】
【図１８】示差走査蛍光定量法によって測定されるＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列挙される）の融解温度を示す棒グラフである。
【００４８】
【図１９】ＣＤ１６及びＮＫＧ２Ｄ結合を使用したＮＫ細胞の相乗的活性化の棒グラフである。図１９ＡはＣＤ１０７ａのレベルを示し、図１９ＢはＩＦＮ−γのレベルを示し、図１９ＣはＣＤ１０７ａ及びＩＦＮ−γのレベルを示す。グラフは、平均（ｎ＝２）±ＳＤを示す。データは、５人の異なる健康なドナーを使用した５つの独立した実験の典型である。
【００４９】
【図２０】Ｔｒｉｏｍａｂ型のＴｒｉＮＫＥＴの図であり、これはＩｇＧ様形状を維持する三機能性の二重特異性抗体である。このキメラは２つの半抗体からなり、各々が１本の軽鎖及び１本の重鎖を有し、２つの親抗体に由来する。Ｔｒｉｏｍａｂ型は、１／２のラット抗体及び１／２のマウス抗体を含有するヘテロ二量体構築物の場合もある。
【００５０】
【図２１】ＫｉＨ共通軽鎖型のＴｒｉＮＫＥＴの図であり、これはノブ・イントゥ・ホール（ＫＩＨ）技術を含む。ＫｉＨは、標的１及び２に結合する２つのＦａｂ、ならびにヘテロ二量体化変異によって安定化させたＦｃを含有するヘテロ二量体である。ＫｉＨ型のＴｒｉＮＫＥＴは、２本の異なる重鎖及び両方の重鎖と対になる共通の軽鎖を含有する、標的１及び標的２に結合する２つのＦａｂを有するヘテロ二量体構築物の場合もある。
【００５１】
【図２２】二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ−Ｉｇ（商標））型のＴｒｉＮＫＥＴの図であり、これは天然に存在するフレキシブルリンカーを介して２つのモノクローナル抗体の標的結合ドメインを組み合わせ、四価のＩｇＧ様分子をもたらす。ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）は、抗原２を標的とする可変ドメインが、抗原１を標的とするＦａｂの可変ドメインのＮ末端に融合されているホモ二量体構築物である。ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）型は、通常のＦｃを含有する。
【００５２】
【図２３】直交Ｆａｂ界面（オルソ−Ｆａｂ）型のＴｒｉＮＫＥＴの図であり、これはＦｃに融合されている標的１及び標的２に結合する２つのＦａｂを含有するヘテロ二量体構築物である。軽鎖（ＬＣ）−重鎖（ＨＣ）対合は、直交界面によって確実に行われる。ヘテロ二量体化は、Ｆｃの変異によって確実に行われる。
【００５３】
【図２４】２・イン・１Ｉｇ型のＴｒｉＮＫＥＴの図である。
【００５４】
【図２５】ＥＳ型のＴｒｉＮＫＥＴの図であり、これはＦｃに融合されている標的１及び標的２に結合する２つの異なるＦａｂを含有するヘテロ二量体構築物である。ヘテロ二量体化は、Ｆｃの静電ステアリング変異によって確実に行われる。
【００５５】
【図２６】Ｆａｂアーム交換型のＴｒｉＮＫＥＴの図であり、この抗体は、重鎖及び付随する軽鎖（半分子）と別の分子からの重−軽鎖対とを交換することによってＦａｂアームを交換し、これにより二重特異性抗体をもたらす。Ｆａｂアーム交換型（ｃＦａｅ）は、標的１及び２に結合する２つのＦａｂ、ならびにヘテロ二量体化変異によって安定化させたＦｃを含有するヘテロ二量体である。
【００５６】
【図２７】ＳＥＥＤボディ型のＴｒｉＮＫＥＴの図であり、これは標的１及び２に結合する２つのＦａｂ、ならびにヘテロ二量体化変異によって安定化させたＦｃを含有するヘテロ二量体である。
【００５７】
【図２８】ＬｕＺ−Ｙ型のＴｒｉＮＫＥＴの図であり、その場合、ロイシンジッパーが２つの異なるＨＣのヘテロ二量体化を誘導するために使用される。ＬｕＺ−Ｙ型は、Ｆｃに融合されている標的１及び２に結合する２つの異なるｓｃＦａｂを含有するヘテロ二量体である。ヘテロ二量体化は、ＦｃのＣ末端に融合されているロイシンジッパーモチーフによって確実に行われる。
【００５８】
【図２９】Ｃｏｖ−Ｘ−ボディ型のＴｒｉＮＫＥＴの図である。
【００５９】
【図３０】ｋλ−ボディ型のＴｒｉＮＫＥＴの図であり、これはヘテロ二量体化変異によって安定化させたＦｃに融合されている２つの異なるＦａｂを有するヘテロ二量体構築物であり、抗原１を標的とする一方のＦａｂがカッパＬＣを含有し、抗原２を標的とする第２ＦａｂがラムダＬＣを含有する。図３０Ａは、ｋλ−ボディの１つの型の例示的な図であり、図３０Ｂは、別のｋλ−ボディの例示的な図である。
【００６０】
【図３１】標的１に結合するＦａｂ及び標的２に結合するｓｃＦａｂを含み、その両方がＦｃドメインに融合されているＯａｓｃ−Ｆａｂヘテロ二量体構築物である。ヘテロ二量体化は、Ｆｃドメインの変異によって確実に行われる。
【００６１】
【図３２】ＤｕｅｔＭａｂであり、これは抗原１及び２に結合する２つの異なるＦａｂ、ならびにヘテロ二量体化変異によって安定化させているＦｃを含有するヘテロ二量体構築物である。Ｆａｂ１及び２は、正確な軽鎖及び重鎖対合を確実に行う示差的Ｓ−Ｓ架橋を含有する。
【００６２】
【図３３】ＣｒｏｓｓｍＡｂであり、これは標的１及び２に結合する２つの異なるＦａｂ、ならびにヘテロ二量体化変異によって安定化させたＦｃを有するヘテロ二量体構築物である。ＣＬ及びＣＨ１ドメイン、ならびにＶＨ及びＶＬドメインが交換されていて、例えば、ＣＨ１がＶＬとインラインで融合される一方で、ＣＬがＶＨとインラインで融合される。
【００６３】
【図３４】Ｆｉｔ−Ｉｇであり、これは抗原２に結合するＦａｂが、抗原１に結合するＦａｂのＨＣのＮ末端に融合されるホモ二量体構築物である。構築物は、野生型Ｆｃを含有する。
【００６４】
【図３５】ＦＬＴ３標的化ＴｒｉＮＫＥＴと、ＥＬ４細胞上で発現されるＮＫＧ２Ｄとの結合を示す線グラフである。ＦＬＴ３モノクローナル抗体ＩＭＣＥＢ１０を対照として使用した。
【００６５】
【図３６】ＦＬＴ３標的化ＴｒｉＮＫＥＴと、ヒトＡＭＬ細胞株Ｍｏｌｍ−１３（図３６Ａ）及びＥＯＬ−１（図３６Ｂ）上で発現されるＦＬＴ３との結合を示す線グラフである。ＦＬＴ３モノクローナル抗体ＩＭＣＥＢ１０を対照として使用した。
【００６６】
【図３７】３７℃での２時間及び２０時間のインキュベーション後における、ＥＯＬ−１細胞（図３７Ａ）及びＭｏｌｍ−１３細胞（図３７Ｂ）上でのＦＬＴ３標的化ＴｒｉＮＫＥＴの内在化を示す線グラフである。リンツズマブを対照として使用した。
【００６７】
【図３８】ＦＬＴ３発現ＥＯＬ−１細胞に対するヒトＮＫ細胞のＴｒｉＮＫＥＴ媒介性細胞傷害を示す線グラフである。ＦＬＴ３モノクローナル抗体ＩＭＣＥＢ１０及びＩＭＣＥＢ１０に由来するＦＬＴ３結合ドメインを含有するＴｒｉＮＫＥＴが、図３８Ａに示される。ＦＬＴ３モノクローナル抗体４Ｇ８及び４Ｇ８に由来するＦＬＴ３結合ドメインを含有するＴｒｉＮＫＥＴが、図３８Ｂに示される。
【発明を実施するための形態】
【００６８】
本発明は、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体及びＣＤ１６受容体、ならびに腫瘍関連抗原ＦＬＴ３と結合する多重特異性結合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、多重特異性タンパク質は、ＦＬＴ３または別の腫瘍関連抗原と結合する追加の抗原結合部位をさらに含む。本発明は、そのような多重特異性結合タンパク質を含む医薬組成物、ならびにがんを処置するなどの目的のために、そのような多重特異性タンパク質及び医薬組成物を使用する治療方法も提供する。本発明の様々な態様が以下の節に記載されているが、しかしながら、ある特定の節に記載されている本発明の態様が、いずれの特定の節にも限定されるべきではない。
【００６９】
本発明の理解を促進するために、多数の用語及び語句が以下に定義される。
【００７０】
「ａ」及び「ａｎ」という用語は、本明細書で使用される場合に「１つ以上」を意味し、文脈が不適切でない限り複数形を含む。
【００７１】
本明細書で使用される場合、「抗原結合部位」という用語は、抗原結合に関与する免疫グロブリン分子の一部を指す。ヒト抗体では、抗原結合部位は、重（「Ｈ」）鎖及び軽（「Ｌ」）鎖のＮ末端可変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基によって形成される。重鎖及び軽鎖のＶ領域内における３つの大きく異なるストレッチは「超可変領域」と称され、これらは「フレームワーク領域」、または「ＦＲ」として知られるより保存された隣接ストレッチ間に挿入される。したがって、「ＦＲ」という用語は、免疫グロブリンの超可変領域間で天然に見られ、かつそれらに隣接しているアミノ酸配列を指す。ヒト抗体分子では、軽鎖の３つの超可変領域及び重鎖の３つの超可変領域は、三次元空間中で互いに関連して配置され、抗原結合表面を形成する。抗原結合表面は、結合抗原の三次元表面に相補的であり、重鎖及び軽鎖の各々の３つの超可変領域は、「相補性決定領域」、または「ＣＤＲ」と称される。ラクダ及び軟骨魚類などのある特定の動物では、抗原結合部位は、「単一ドメイン抗体」をもたらす一本の抗体鎖によって形成される。抗原結合部位は、インタクトな抗体中において、抗原結合表面を保持する抗体の抗原結合断片中において、またはｓｃＦｖなどの、ペプチドリンカーを使用して単一ポリペプチド中で重鎖可変ドメインを軽鎖可変ドメインに結合させる組換えポリペプチド中において存在し得る。
【００７２】
「腫瘍関連抗原」という用語は、本明細書で使用される場合、がんと関連するタンパク質、糖タンパク質、ガングリオシド、炭水化物、脂質を含むが、これらに限定されないいずれかの抗原を意味する。そのような抗原は、悪性細胞上で、または腫瘍微小環境中において、例えば、腫瘍関連の血管、細胞外マトリックス、間葉系間質、もしくは免疫浸潤物上などで発現され得る。
【００７３】
本明細書で使用される場合、「対象」及び「患者」という用語は、本明細書に記載される方法及び組成物によって処置される生物を指す。そのような生物としては、好ましくは、哺乳動物（例えば、ネズミ、サル、ウマ科、ウシ科、ブタ、イヌ科、ネコ科など）が挙げられるが、これらに限定されず、より好ましくはヒトが挙げられる。
【００７４】
本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、有益なまたは所望の結果をもたらすのに十分な化合物（例えば、本発明の化合物）の量を指す。有効量は、１つ以上の投与、適用または投与量で投与され得、特定の製剤または投与経路に限定されることを意図するものではない。本明細書で使用される場合、「処置すること」という用語は、状態、疾患、障害などの改善をもたらす、例えば、低下、減少、調節、向上もしくは排除、またはそれらの症状を向上させるいずれかの効果を含む。
【００７５】
本明細書で使用される場合、「医薬組成物」という用語は、活性剤と、その組成物をインビボまたはエクスビボでの診断的または治療的使用に特に好適にさせる、不活性または活性な担体との組合せを指す。
【００７６】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、標準的な医薬担体、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、水、エマルジョン（例えば、油／水または水／油エマルジョンなど）、及び様々な種類の湿潤剤などのいずれかを指す。組成物は、安定剤及び防腐剤も含み得る。担体、安定剤及びアジュバントの例については、例えば、Ｍａｒｔｉｎ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ［１９７５］を参照のこと。
【００７７】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される塩」という用語は、本発明の化合物の任意の薬学的に許容される塩（例えば、酸または塩基）を指し、これは対象への投与時に本発明の化合物またはその活性代謝産物もしくは残基を提供することができる。当業者には既知の通り、本発明の化合物の「塩」は、無機または有機酸及び塩基に由来する場合がある。例示的な酸としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、リン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、コハク酸、トルエン−ｐ−スルホン酸、酒石酸、酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ベンゼンスルホン酸などが挙げられるが、これらに限定されない。シュウ酸などの他の酸は、それ自体では薬学的に許容されないが、本発明の化合物及びそれらの薬学的に許容される酸付加塩を得る時に中間体として有用な塩の調製に用いられる場合がある。
【００７８】
例示的な塩基としては、アルカリ金属（例えば、ナトリウム）水酸化物、アルカリ土類金属（例えば、マグネシウム）水酸化物、アンモニア、及び式ＮＷ４＋（式中、Ｗは、Ｃ１〜４アルキルである）の化合物などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７９】
例示的な塩としては、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、ショウノウ酸塩、ショウノウスルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、フルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パルモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩、ウンデカン酸塩などが挙げられるが、これらに限定されない。塩の他の例としては、好適なカチオン、例えば、Ｎａ＋、ＮＨ４＋、及びＮＷ４＋（式中、Ｗは、Ｃ１〜４アルキル基である）などと化合される本発明の化合物のアニオンが挙げられる。
【００８０】
治療的使用に関して、本発明の化合物の塩は、薬学的に許容されるものとして考慮される。しかしながら、薬学的に許容されない酸及び塩基の塩もまた、例えば、薬学的に許容される化合物の調製または精製において用途を見出す場合もある。
【００８１】
記載全体を通して、組成物が特定の構成要素を有する、含む、もしくは備えると記載されている場合か、またはプロセス及び方法が特定のステップを有する、含む、もしくは備えると記載されている場合、さらに、列挙される構成要素から本質的になる、またはそれらからなる本発明の組成物が存在すること、ならびに列挙されるプロセスステップから本質的になる、またはそれらからなる本発明によるプロセス及び方法が存在することが考慮される。
【００８２】
一般的な事項として、パーセンテージを明示している組成物は、別段の指定がない限り重量によるものである。さらに、変数が定義を伴わない場合には、変数の前の定義を考慮に入れる。
【００８３】
Ｉ．タンパク質
本発明は、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体及びＣＤ１６受容体、ならびに腫瘍関連抗原ＦＬＴ３に結合する多重特異性結合タンパク質を提供する。多重特異性結合タンパク質は、本明細書に記載される医薬組成物及び治療方法に有用である。多重特異性結合タンパク質と、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体及びＣＤ１６受容体との結合は、ＦＬＴ３を発現する腫瘍細胞の破壊に対するナチュラルキラー細胞の活性を増強する。多重特異性結合タンパク質とＦＬＴ３発現細胞との結合は、がん細胞をナチュラルキラー細胞に近接させ、これにより、ナチュラルキラー細胞による直接的かつ間接的ながん細胞の破壊が促進される。いくつかの例示的な多重特異性結合タンパク質のさらなる記載が以下に提供される。
【００８４】
多重特異性結合タンパク質の第１構成要素は、ＮＫＧ２Ｄ受容体発現細胞に結合し、これらの細胞としては、ＮＫ細胞、γδＴ細胞及びＣＤ８＋αβＴ細胞が挙げられ得るが、これらに限定されない。ＮＫＧ２Ｄ結合時、多重特異性結合タンパク質は、ＮＫＧ２Ｄとの結合及びＮＫＧ２Ｄ受容体の活性化から、ＵＬＢＰ６及びＭＩＣＡなどの天然リガンドをブロックする可能性がある。
【００８５】
多重特異性結合タンパク質の第２構成要素は、ＦＬＴ３と結合する。ＦＬＴ３発現細胞は、白血病、例えば、急性骨髄性白血病及びＴ細胞白血病で見られる場合がある。
【００８６】
多重特異性結合タンパク質の第３構成要素は、ＣＤ１６を発現する細胞、白血球、例えば、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、肥満細胞、及び濾胞樹状細胞を含むものの表面上におけるＦｃ受容体に結合する。
【００８７】
本明細書に記載される多重特異性結合タンパク質は、様々な型を取り得る。例えば、１つの型は、第１免疫グロブリン重鎖、第１免疫グロブリン軽鎖、第２免疫グロブリン重鎖及び第２免疫グロブリン軽鎖を含むヘテロ二量体多重特異性抗体である（図１）。第１免疫グロブリン重鎖は、第１Ｆｃ（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）ドメイン、第１重鎖可変ドメイン及び場合により、第１ＣＨ１重鎖ドメインを含む。第１免疫グロブリン軽鎖は、第１軽鎖可変ドメイン及び第１軽鎖定常ドメインを含む。第１免疫グロブリン軽鎖は、第１免疫グロブリン重鎖と一緒になって、ＮＫＧ２Ｄと結合する抗原結合部位を形成する。第２免疫グロブリン重鎖は、第２Ｆｃ（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）ドメイン、第２重鎖可変ドメイン及び場合により、第２ＣＨ１重鎖ドメインを含む。第２免疫グロブリン軽鎖は、第２軽鎖可変ドメイン及び第２軽鎖定常ドメインを含む。第２免疫グロブリン軽鎖は、第２免疫グロブリン重鎖と一緒になって、ＦＬＴ３と結合する抗原結合部位を形成する。第１Ｆｃドメイン及び第２Ｆｃドメインは共に、ＣＤ１６に結合することができる（図１）。いくつかの実施形態では、第１免疫グロブリン軽鎖は、第２免疫グロブリン軽鎖と同一である。
【００８８】
別の例示的な型は、第１免疫グロブリン重鎖、第２免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖を含むヘテロ二量体多重特異性抗体を含む（図２）。第１免疫グロブリン重鎖は、リンカーまたは抗体ヒンジのいずれかを介して、対合してＮＫＧ２Ｄと結合するか、またはＦＬＴ３抗原と結合する重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインで構成される一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）に融合される第１Ｆｃ（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）ドメインを含む。第２免疫グロブリン重鎖は、第２Ｆｃ（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）ドメイン、第２重鎖可変ドメイン及び場合により、ＣＨ１重鎖ドメインを含む。免疫グロブリン軽鎖は、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含む。第２免疫グロブリン重鎖は、免疫グロブリン軽鎖と対合してＮＫＧ２Ｄに結合するか、または腫瘍関連抗原ＦＬＴ３と結合する。第１Ｆｃドメイン及び第２Ｆｃドメインは共に、ＣＤ１６に結合することができる（図２）。
【００８９】
１つ以上の追加の結合モチーフが、場合によりリンカー配列を介して、定常領域ＣＨ３ドメインのＣ末端に融合される場合がある。ある特定の実施形態では、抗原結合モチーフは、四価または三価の分子を形成する一本鎖またはジスルフィド安定化可変領域（ｓｃＦｖ）である。
【００９０】
いくつかの実施形態では、多重特異性結合タンパク質はＴｒｉｏｍａｂ型であり、これはＩｇＧ様形状を維持する三機能性の二重特異性抗体である。このキメラは２つの半抗体からなり、各々が１本の軽鎖及び１本の重鎖を有し、２つの親抗体に由来する。
【００９１】
いくつかの実施形態では、多重特異性結合タンパク質はＫｉＨ共通軽鎖（ＬＣ）型であり、これはノブ・イントゥ・ホール（ＫＩＨ）技術を含む。ＫＩＨは、ＣＨ３ドメインを操作して各重鎖に「ノブ」または「ホール」のいずれかを作製し、ヘテロ二量体化を促進することを含む。「ノブ・イントゥ・ホール（ＫｉＨ）」Ｆｃ技術の背後にある構想とは、小さい残基から嵩高い残基への置換によって１つのＣＨ３ドメイン（ＣＨ３Ａ）に「ノブ」を導入すること（例えば、ＥＵ番号付けのＴ３６６ＷＣＨ３Ａ）であった。「ノブ」を収容するために、相補的な「ホール」表面が、最も近接した隣接残基を、より小さな残基を有するノブに置き換えることによって他方のＣＨ３ドメイン（ＣＨ３Ｂ）上に作製された（例えば、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７ＶＣＨ３Ｂ）。「ホール」変異は、構造に基づくファージライブラリースクリーニングによって最適化された（Ａｔｗｅｌｌ  Ｓ，Ｒｉｄｇｗａｙ  ＪＢ，Ｗｅｌｌｓ  ＪＡ，Ｃａｒｔｅｒ  Ｐ．，Ｓｔａｂｌｅ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｓ  ｆｒｏｍ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｔｈｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  ｏｆ  ａ  ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂｒａｒｙ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９７）２７０（１）：２６−３５）。ＫｉＨ  ＦｃバリアントのＸ線結晶構造（Ｅｌｌｉｏｔｔ  ＪＭ，Ｕｌｔｓｃｈ  Ｍ，Ｌｅｅ  Ｊ，Ｔｏｎｇ  Ｒ，Ｔａｋｅｄａ  Ｋ，Ｓｐｉｅｓｓ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｐａｒａｌｌｅｌ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｋｎｏｂ  ａｎｄ  ｈｏｌｅ  ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ  ｈａｌｆ−ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｈｏｍｏｄｉｍｅｒｓ  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ａ  ＣＨ２−ＣＨ３  ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０１４）４２６（９）：１９４７−５７、Ｍｉｍｏｔｏ  Ｆ，Ｋａｄｏｎｏ  Ｓ，Ｋａｔａｄａ  Ｈ，Ｉｇａｗａ  Ｔ，Ｋａｍｉｋａｗａ  Ｔ，Ｈａｔｔｏｒｉ  Ｋ．Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｆｃ  ｖａｒｉａｎｔ  ｗｉｔｈ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｆｏｒ  ＦｃγＲｓ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１４）５８（１）：１３２−８）は、ヘテロ二量体化が、ＣＨ３ドメイン間のコア界面における立体相補性によって促進される疎水性相互作用により熱力学的に有利となるのに対して、ノブ−ノブ及びホール−ホール界面は、それぞれ立体障害及び有利な相互作用の破壊ゆえに、ホモ二量体化に有利ではないことを実証した。
【００９２】
いくつかの実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ−Ｉｇ（商標））型であり、これは天然に存在するフレキシブルリンカーを介して２つのモノクローナル抗体の標的結合ドメインを組み合わせ、四価のＩｇＧ様分子をもたらす。
【００９３】
いくつかの実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、直交Ｆａｂ界面（オルソ−Ｆａｂ）型である。オルソ−Ｆａｂ  ＩｇＧアプローチ（Ｌｅｗｉｓ  ＳＭ，Ｗｕ  Ｘ，Ｐｕｓｔｉｌｎｉｋ  Ａ，Ｓｅｒｅｎｏ  Ａ，Ｈｕａｎｇ  Ｆ，Ｒｉｃｋ  ＨＬ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＩｇＧ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ａｎ  ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  Ｆａｂ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１４）３２（２）：１９１−８）では、構造に基づく領域設計によって、他方のＦａｂを一切変化させることなく、一方のＦａｂのみにおいてＬＣ及びＨＣＶＨ−ＣＨ１界面に相補的変異が導入される。
【００９４】
いくつかの実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、２・イン・１Ｉｇ型である。いくつかの実施形態では、多重特異性結合タンパク質はＥＳ型であり、これはＦｃに融合されている標的１及び標的２に結合する２つの異なるＦａｂを含有するヘテロ二量体構築物である。ヘテロ二量体化は、Ｆｃの静電ステアリング変異によって確実に行われる。
【００９５】
いくつかの実施形態では、多重特異性結合タンパク質はｋλ−ボディ型であり、これはヘテロ二量体化変異：抗原１を標的とするＦａｂ１がカッパＬＣを含有する一方で、抗原２を標的とする第２ＦａｂがラムダＬＣを含有する変異によって安定化させたＦｃに融合されている２つの異なるＦａｂを有するヘテロ二量体構築物である。図３０Ａは、ｋλ−ボディの１つの型の例示的な図であり、図３０Ｂは、別のｋλ−ボディの例示的な図である。
【００９６】
いくつかの実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、Ｆａｂアーム交換型（重鎖及び付随する軽鎖（半分子）と別の分子からの重−軽鎖対とを交換することによってＦａｂアームを交換する抗体であって、これにより二重特異性抗体をもたらす）である。
【００９７】
いくつかの実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、ＳＥＥＤボディ型である。鎖交換操作ドメイン（ＳＥＥＤ）プラットフォームは、天然抗体の治療用途を拡大させる能力を持つ、非対称かつ二重特異性抗体様分子を生成するように設計された。このタンパク質操作プラットフォームは、保存されたＣＨ３ドメイン内で免疫グロブリンの構造的に関連した配列を交換することに基づく。ＳＥＥＤ設計は、ＡＧ／ＧＡヘテロ二量体の効率的な生成を可能にする一方で、ＡＧ及びＧＡ  ＳＥＥＤ  ＣＨ３ドメインのホモ二量体化を不利にする。（Ｍｕｄａ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．（２０１１，２４（５）：４４７−５４））。
【００９８】
いくつかの実施形態では、多重特異性結合タンパク質はＬｕＺ−Ｙ型であり、その場合、ロイシンジッパーが２つの異なるＨＣのヘテロ二量体化を誘導するために使用される。（Ｗｒａｎｉｋ，ＢＪ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２０１２），２８７：４３３３１−９）。
【００９９】
いくつかの実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、Ｃｏｖ−Ｘ−ボディ型である。二重特異性Ｃｏｖ−Ｘ−ボディでは、２つの異なるペプチドが、分岐アゼチジノンリンカーを使用して互いに結合され、緩やかな条件下において部位特異的手法で足場抗体に融合される。ファーマコフォアが機能活性に関与するのに対して、抗体足場は長期の半減期及びＩｇ様分布を付与する。ファーマコフォアは、最適化された、または特有の二重特異性抗体を生成するために、化学的に最適化され得るか、または他のファーマコフォアで置き換えられ得る。（Ｄｏｐｐａｌａｐｕｄｉ  ＶＲ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ（２０１０），１０７（５２）、２２６１１−２２６１６）。
【０１００】
いくつかの実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、Ｆｃに融合されている、標的１に結合するＦａｂ、及び標的２に結合するｓｃＦａｂを含むＯａｓｃ−Ｆａｂヘテロ二量体型である。ヘテロ二量体化は、Ｆｃの変異によって確実に行われる。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、多重特異性結合タンパク質はＤｕｅｔＭａｂ型であり、これは抗原１及び２に結合する２つの異なるＦａｂ、ならびにヘテロ二量体化変異によって安定化させたＦｃを含有するヘテロ二量体構築物である。Ｆａｂ１及び２は、正確なＬＣ及びＨＣ対合を確実に行う示差的Ｓ−Ｓ架橋を含有する。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、多重特異性結合タンパク質はＣｒｏｓｓｍＡｂ型であり、これはヘテロ二量体化によって安定化させたＦｃに融合されている、標的１及び２に結合する２つの異なるＦａｂを有するヘテロ二量体構築物である。ＣＬ及びＣＨ１ドメインならびにＶＨ及びＶＬドメインが交換されていて、例えば、ＣＨ１がＶＬとインラインで融合される一方で、ＣＬがＶＨとインラインで融合される。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、多重特異性結合タンパク質はＦｉｔ−Ｉｇ型であり、これは抗原２に結合するＦａｂが、抗原１に結合するＦａｂのＨＣのＮ末端に融合されるホモ二量体構築物である。構築物は、野生型Ｆｃを含有する。
【０１０４】
表１は、組み合わせるとＮＫＧ２Ｄに結合し得る重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインのペプチド配列を一覧にしている。ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインは、ＮＫＧ２Ｄに対するそれらの結合親和性が異なる可能性があるが、それにもかかわらず、それらは全てヒトＮＫＧ２Ｄ及びＮＫ細胞を活性化させる。
【表１】
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【０１０５】
あるいは、配列番号：１０１で表される重鎖可変ドメインは、配列番号：１０２で表される軽鎖可変ドメインと対合し、ＵＳ９，２７３，１３６で例証されるように、ＮＫＧ２Ｄに結合し得る抗原結合部位を形成し得る。
【化１】
2020529410.tif 000010
【０１０６】
あるいは、配列番号：１０３で表される重鎖可変ドメインは、配列番号：１０４で表される軽鎖可変ドメインと対合し、ＵＳ７，８７９，９８５で例証されるように、ＮＫＧ２Ｄに結合し得る抗原結合部位を形成し得る。
【化２】
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【０１０７】
一態様では、本開示は、ナチュラルキラー細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体及びＣＤ１６受容体、ならびに抗原ＦＬＴ３に結合する多重特異性結合タンパク質を提供する。表２は、組み合わせるとＦＬＴ３に結合し得る重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインのいくつかの例示的な配列を一覧にしている。
【表２】
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【０１０８】
あるいは、ＦＬＴ３に結合し得る新規の抗原結合部位は、配列番号：１３３で定義されるアミノ酸配列への結合についてのスクリーニングによって同定され得る。
【化３】
2020529410.tif 000015
【０１０９】
Ｆｃドメイン内では、ＣＤ１６結合は、ヒンジ領域及びＣＨ２ドメインによって媒介される。例えば、ヒトＩｇＧ１内では、ＣＤ１６との相互作用は、ＣＨ２ドメインにおけるアミノ酸残基Ａｓｐ２６５−Ｇｌｕ２６９、Ａｓｎ２９７−Ｔｈｒ２９９、Ａｌａ３２７−Ｉｌｅ３３２、Ｌｅｕ２３４−Ｓｅｒ２３９、及び炭水化物残基Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンに主に集中している（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４０６（６７９３）：２６７−２７３を参照のこと）。既知のドメインに基づいて、変異は、ファージディプレイライブラリーもしくは酵母表面ディスプレイｃＤＮＡライブラリーなどを使用することによって、ＣＤ１６に対する結合親和性を増強もしくは減少させるために選択され得るか、または相互作用の既知の三次元構造に基づいて設計され得る。
【０１１０】
ヘテロ二量体抗体重鎖の集合は、同じ細胞中で２つの異なる抗体重鎖配列を発現することによって達成され得、これにより各抗体重鎖のホモ二量体の集合に加えて、ヘテロ二量体の集合がもたらされる可能性がある。ヘテロ二量体の優先的集合を促進することは、ＵＳ１３／４９４８７０、ＵＳ１６／０２８８５０、ＵＳ１１／５３３７０９、ＵＳ１２／８７５０１５、ＵＳ１３／２８９９３４、ＵＳ１４／７７３４１８、ＵＳ１２／８１１２０７、ＵＳ１３／８６６７５６、ＵＳ１４／６４７４８０、及びＵＳ１４／８３０３３６に示されるように、各抗体重鎖定常領域のＣＨ３ドメインに異なる変異を組み込むことによって達成され得る。例えば、変異は、ヒトＩｇＧ１に基づき、第１ポリペプチド及び第２ポリペプチドが互いに選択的にヘテロ二量体化するのを可能にする、これら２本の鎖内におけるアミノ酸置換の異なる対を組み込むことでＣＨ３ドメイン中に作製され得る。以下に例証されるアミノ酸置換の位置は全て、ＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックスに従って番号付けされる。
【０１１１】
１つの設定では、第１ポリペプチドのアミノ酸置換は、元のアミノ酸を、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）またはトリプトファン（Ｗ）から選択されるより大きなアミノ酸と置き換え、第２ポリペプチドの少なくとも１つのアミノ酸置換は、元のアミノ酸（複数可）を、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、またはバリン（Ｖ）から選択されるより小さなアミノ酸（複数可）と置き換えて、その結果、より大きなアミノ酸置換（突起）がより小さなアミノ酸置換（空洞）の表面に収まる。例えば、一方のポリペプチドがＴ３６６Ｗ置換を組み込み得、他方がＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖを含む３つの置換を組み込み得る。
【０１１２】
本発明の抗体重鎖可変ドメインは、抗体定常領域、例えば、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含み、ＣＨ１ドメインを含む、または含まないＩｇＧ定常領域などと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列に場合により結合され得る。いくつかの実施形態では、定常領域のアミノ酸配列は、ヒト抗体定常領域、例えば、ヒトＩｇＧ１定常領域、ＩｇＧ２定常領域、ＩｇＧ３定常領域、またはＩｇＧ４定常領域などと少なくとも９０％同一である。いくつかの他の実施形態では、定常領域のアミノ酸配列は、別の哺乳動物、例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、マウス、またはウマなどの抗体定常領域と少なくとも９０％同一である。１つ以上の変異が、ヒトＩｇＧ１定常領域と比較した場合、定常領域中に、例えば、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１及び／またはＫ４３９に組み込まれ得る。例示的な置換としては、例えば、Ｑ３４７Ｅ、Ｑ３４７Ｒ、Ｙ３４９Ｓ、Ｙ３４９Ｋ、Ｙ３４９Ｔ、Ｙ３４９Ｄ、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｋ、Ｌ３５１Ｄ、Ｌ３５１Ｙ、Ｓ３５４Ｃ、Ｅ３５６Ｋ、Ｅ３５７Ｑ、Ｅ３５７Ｌ、Ｅ３５７Ｗ、Ｋ３６０Ｅ、Ｋ３６０Ｗ、Ｑ３６２Ｅ、Ｓ３６４Ｋ、Ｓ３６４Ｅ、Ｓ３６４Ｈ、Ｓ３６４Ｄ、Ｔ３６６Ｖ、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｍ、Ｔ３６６Ｋ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ｅ、Ｌ３６８Ａ、Ｌ３６８Ｄ、Ｋ３７０Ｓ、Ｎ３９０Ｄ、Ｎ３９０Ｅ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｆ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｔ３９４Ｆ、Ｔ３９４Ｗ、Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｖ、Ｓ４００Ｋ、Ｓ４００Ｒ、Ｄ４０１Ｋ、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｙ４０７Ｉ、Ｙ４０７Ｖ、Ｋ４０９Ｆ、Ｋ４０９Ｗ、Ｋ４０９Ｄ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ、Ｋ４３９Ｄ、及びＫ４３９Ｅが挙げられる。
【０１１３】
ある特定の実施形態では、ヒトＩｇＧ１定常領域のＣＨ１中に組み込まれ得る変異は、アミノ酸Ｖ１２５、Ｆ１２６、Ｐ１２７、Ｔ１３５、Ｔ１３９、Ａ１４０、Ｆ１７０、Ｐ１７１、及び／またはＶ１７３における場合がある。ある特定の実施形態では、ヒトＩｇＧ１定常領域のＣｋ中に組み込まれ得る変異は、アミノ酸Ｅ１２３、Ｆ１１６、Ｓ１７６、Ｖ１６３、Ｓ１７４、及び／またはＴ１６４における場合がある。
【０１１４】
あるいは、アミノ酸置換は、表３に示される置換の以下のセットから選択され得る。
【表３】
2020529410.tif 000016
【０１１５】
あるいは、アミノ酸置換は、表４に示される置換の以下のセットから選択され得る。
【表４】
2020529410.tif 000017
【０１１６】
あるいは、アミノ酸置換は、表５に示される置換の以下のセットから選択され得る。
【表５】
2020529410.tif 000018
【０１１７】
あるいは、各ポリペプチド鎖の少なくとも１つのアミノ酸置換は、表６から選択され得る。
【表６】
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【０１１８】
あるいは、少なくとも１つのアミノ酸置換は、表７における置換の以下のセットから選択され得て、第１ポリペプチド列に示される位置（複数可）は、任意の既知の負荷電アミノ酸によって置き換えられ、第２ポリペプチド列に示される位置（複数可）は、任意の既知の正荷電アミノ酸によって置き換えられる。
【表７】
2020529410.tif 000020
【０１１９】
あるいは、少なくとも１つのアミノ酸置換は、表８の以下のセットから選択され得て、第１ポリペプチド列に示される位置（複数可）は、任意の既知の正荷電アミノ酸によって置き換えられ、第２ポリペプチド列に示される位置（複数可）は、任意の既知の負荷電アミノ酸によって置き換えられる。
【表８】
2020529410.tif 000021
【０１２０】
あるいは、アミノ酸置換は、表９の以下のセットから選択され得る。
【表９】
2020529410.tif 000022
【０１２１】
あるいは、またはさらに、ヘテロ多量体タンパク質の構造安定性は、第１または第２ポリペプチド鎖のいずれか上のＳ３５４Ｃ、及び相対するポリペプチド鎖上のＹ３４９Ｃを導入することによって増加する場合があり、これは２つのポリペプチドの界面内で人工ジスルフィド架橋を形成する。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、抗体定常領域における一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列が、Ｔ３６６位でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域における他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６、Ｌ３６８及びＹ４０７からなる群から選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、抗体定常領域における一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列が、Ｔ３６６、Ｌ３６８及びＹ４０７からなる群から選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域における他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６位でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、抗体定常領域における一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列が、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｔ３９４、Ｄ４０１、Ｆ４０５、及びＴ４１１からなる群から選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域における他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９、Ｅ３５７、Ｓ３６４、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｔ３９４、Ｄ４０１、Ｆ４０５及びＴ４１１からなる群から選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、抗体定常領域における一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列が、Ｙ３４９、Ｅ３５７、Ｓ３６４、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｔ３９４、Ｄ４０１、Ｆ４０５及びＴ４１１からなる群から選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域における他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｔ３９４、Ｄ４０１、Ｆ４０５、及びＴ４１１からなる群から選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、抗体定常領域における一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列が、Ｌ３５１、Ｄ３９９、Ｓ４００及びＹ４０７からなる群から選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域における他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｋ４０９及びＴ４１１からなる群から選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、抗体定常領域における一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列が、Ｔ３６６、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｋ４０９及びＴ４１１からなる群から選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域における他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｌ３５１、Ｄ３９９、Ｓ４００及びＹ４０７からなる群から選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、抗体定常領域における一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列が、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｋ３６０、及びＫ４０９からなる群から選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域における他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｑ３４７、Ｅ３５７、Ｄ３９９及びＦ４０５からなる群から選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、抗体定常領域における一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列が、Ｑ３４７、Ｅ３５７、Ｄ３９９及びＦ４０５からなる群から選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域における他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９、Ｋ３６０、Ｑ３４７及びＫ４０９からなる群から選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、抗体定常領域における一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列が、Ｋ３７０、Ｋ３９２、Ｋ４０９及びＫ４３９からなる群から選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域における他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｄ３５６、Ｅ３５７及びＤ３９９からなる群から選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、抗体定常領域における一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列が、Ｄ３５６、Ｅ３５７及びＤ３９９からなる群から選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域における他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｋ３７０、Ｋ３９２、Ｋ４０９及びＫ４３９からなる群から選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、抗体定常領域における一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列が、Ｌ３５１、Ｅ３５６、Ｔ３６６及びＤ３９９からなる群から選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域における他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｌ３６８、Ｋ３９２及びＫ４０９からなる群から選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、抗体定常領域における一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列が、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｌ３６８、Ｋ３９２及びＫ４０９からなる群から選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域における他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｌ３５１、Ｅ３５６、Ｔ３６６及びＤ３９９からなる群から選択される１つ以上の位置でＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、抗体定常領域における一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列が、Ｓ３５４Ｃ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域における他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｙ３４９Ｃ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、抗体定常領域における一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列が、Ｙ３４９Ｃ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域における他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｓ３５４Ｃ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、抗体定常領域における一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列が、Ｋ３６０Ｅ及びＫ４０９Ｗ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域における他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｏ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ及びＦ４０５Ｔ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、抗体定常領域における一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列が、Ｏ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ及びＦ４０５Ｔ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域における他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｋ３６０Ｅ及びＫ４０９Ｗ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、抗体定常領域における一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列が、Ｔ３６６Ｗ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域における他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６Ｓ、Ｔ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、抗体定常領域における一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列が、Ｔ３６６Ｓ、Ｔ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域における他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３６６Ｗ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、抗体定常領域における一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列が、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、及びＹ４０７Ｖ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域における他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｌ、及びＴ３９４Ｗ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、抗体定常領域における一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列が、Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｌ、及びＴ３９４Ｗ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なり、抗体定常領域における他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、及びＹ４０７Ｖ置換によってＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列とは異なる。
【０１４２】
上に記載される多重特異性タンパク質は、当業者に周知の組換えＤＮＡ技術を使用して作製され得る。例えば、第１免疫グロブリン重鎖をコードする第１核酸配列は、第１発現ベクターにクローニングされ得、第２免疫グロブリン重鎖をコードする第２核酸配列は、第２発現ベクターにクローニングされ得、免疫グロブリン軽鎖をコードする第３核酸配列は、第３発現ベクターにクローニングされ得、第１、第２、及び第３発現ベクターは一緒に宿主細胞へと安定にトランスフェクトされ、多量体タンパク質を産生し得る。
【０１４３】
多重特異性タンパク質の最高収量を達成するために、異なる比の第１、第２、及び第３発現ベクターが、宿主細胞へのトランスフェクションについて最適な比を決定するために調査され得る。トランスフェクション後、単一クローンは、当該技術分野において既知の方法、例えば、限界希釈法、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、顕微鏡法、またはＣｌｏｎｅｐｉｘなどを使用して、細胞バンク生成のために単離され得る。
【０１４４】
クローンは、バイオリアクターのスケールアップに好適な条件下で培養され、多重特異性タンパク質の発現を維持し得る。多重特異性タンパク質は、当該技術分野において既知の方法、例えば、遠心分離、深層濾過、細胞溶解、均質化、凍結融解、アフィニティー精製、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用交換クロマトグラフィー、及びミックスモードクロマトグラフィーを含む方法を使用して、単離かつ精製され得る。
【０１４５】
ＩＩ．多重特異性タンパク質の特性
本明細書に記載される多重特異性タンパク質は、ＮＫＧ２Ｄ結合部位、ＣＤ１６結合部位、及びＦＬＴ３結合部位を含む。いくつかの実施形態では、多重特異性タンパク質は、ＮＫ細胞などの、ＮＫＧ２Ｄ及び／またはＣＤ１６を発現する細胞、ならびにＦＬＴ３を発現する腫瘍細胞に同時に結合する。多重特異性結合タンパク質とＮＫ細胞との結合は、腫瘍細胞の破壊に対するＮＫ細胞の活性を増強し得る。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、多重特異性タンパク質は、対応するＦＬＴ３モノクローナル抗体（すなわち、多重特異性タンパク質に組み込まれているものと同じＦＬＴ３結合部位を含有するモノクローナル抗体）と同様の親和性でＦＬＴ３に結合する。いくつかの実施形態では、多重特異性タンパク質は、対応するＦＬＴ３モノクローナル抗体よりも、ＦＬＴ３を発現する腫瘍細胞を死滅させるのにより効果的である。
【０１４７】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される多重特異性タンパク質は、ＮＫＧ２Ｄ結合部位及びＦＬＴ３に対する結合部位を含み、ＦＬＴ３を発現する細胞と共培養する場合に初代ヒトＮＫ細胞を活性化させる。ＮＫ細胞活性化は、ＣＤ１０７ａ脱顆粒及びＩＦＮ−γサイトカイン産生の増加を特徴とする。さらに、対応するＦＬＴ３モノクローナル抗体と比較して、多重特異性タンパク質は、ＦＬＴ３を発現する細胞の存在下でヒトＮＫ細胞の優れた活性化を示す場合がある。
【０１４８】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される多重特異性タンパク質は、ＮＫＧ２Ｄ結合部位及びＦＬＴ３に対する結合部位を含み、ＦＬＴ３を発現する細胞と共培養すると、静止及びＩＬ−２活性化ヒトＮＫ細胞の活性を増強する。
【０１４９】
ある特定の実施形態では、ＦＬＴ３に結合する対応するモノクローナル抗体と比較して、多重特異性タンパク質は、中レベル及び低レベルのＦＬＴ３を発現する腫瘍細胞を標的とすることに利点がある。
【０１５０】
ＩＩＩ．治療用途
本発明は、本明細書に記載される多重特異性結合タンパク質及び／または本明細書に記載される医薬組成物を使用して、がんを処置する方法を提供する。本方法は、ＦＬＴ３を発現する様々ながんを処置するために使用されてよい。いくつかの実施形態では、がんは白血病、例えば、急性骨髄性白血病、Ｔ細胞白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、または有毛細胞白血病である。
【０１５１】
いくつかの他の実施形態では、がんは、乳癌、卵巣癌、食道癌、膀胱癌もしくは胃癌、唾液腺導管癌、唾液腺導管癌（複数可）、肺の腺癌または子宮漿液性子宮内膜癌などの子宮癌の侵攻型である。いくつかの他の実施形態では、がんは、脳癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、白血病、肺癌、肝臓癌、黒色腫、卵巣癌、膵臓癌、直腸癌、腎臓癌、胃癌、精巣癌、または子宮癌である。さらに他の実施形態では、がんは、扁平上皮癌、腺癌、小細胞癌、黒色腫、神経芽細胞腫、肉腫（例えば、血管肉腫もしくは軟骨肉腫）、喉頭癌、耳下腺癌、胆道癌、甲状腺癌、末端黒子型黒色腫、日光角化症、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、腺様嚢胞癌、腺腫、腺肉腫、腺扁平上皮癌、肛門管癌、肛門癌、肛門直腸癌、星状細胞腫瘍、バルトリン腺癌、基底細胞癌、胆道癌、骨癌、骨髄癌、気管支癌、気管支腺癌、カルチノイド、胆管癌、軟骨肉腫、脈絡叢乳頭腫／癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、明細胞癌、結合組織癌、嚢胞腺腫、消化器系癌、十二指腸癌、内分泌系癌、内胚葉洞腫瘍、子宮内膜増殖症、子宮内膜間質肉腫、類内膜腺癌、内皮細胞癌、上衣癌、上皮細胞癌、ユーイング肉腫、眼及び眼窩の癌、女性生殖器癌、限局性結節性過形成、胆嚢癌、胃洞癌、胃底部癌、ガストリノーマ、膠芽腫、グルカゴノーマ、心臓癌、血管芽細胞腫、血管内皮腫、血管腫、肝細胞腺腫、肝細胞腺腫症、肝胆道癌、肝細胞癌、ホジキン病、回腸癌、インスリノーマ、上皮内腫瘍、上皮内扁平上皮腫瘍、肝内胆管癌、浸潤性扁平上皮癌、空腸癌、関節癌、カポジ肉腫、骨盤癌、大細胞癌、大腸癌、平滑筋肉腫、悪性黒子型黒色腫、リンパ腫、男性生殖器癌、悪性黒色腫、悪性中皮腫瘍、髄芽腫、髄様上皮腫、髄膜癌、中皮癌、転移性癌、口腔癌、粘表皮癌、多発性骨髄腫、筋肉癌、鼻道癌、神経系癌、神経上皮腺癌、結節性黒色腫、非上皮性皮膚癌、非ホジキンリンパ腫、燕麦細胞癌、乏突起膠細胞癌、口腔癌、骨肉腫、乳頭状漿液性腺癌、陰茎癌、咽頭癌、下垂体腫瘍、形質細胞腫、偽肉腫、肺芽腫、直腸癌、腎細胞癌、呼吸器系癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、漿液性癌、洞癌、皮膚癌、小細胞癌、小腸癌、平滑筋癌、軟組織癌、ソマトスタチン分泌腫瘍、脊椎癌、扁平上皮癌、横紋筋癌、中皮下癌、表在拡大型黒色腫、Ｔ細胞白血病、舌癌、未分化癌、尿管癌、尿道癌、膀胱癌、泌尿器系癌、子宮頸癌、子宮体癌、ブドウ膜黒色腫、膣癌、疣状癌、ＶＩＰｏｍａ、外陰癌、高分化癌、またはウィルムス腫瘍である。
【０１５２】
いくつかの他の実施形態では、処置されるがんは、Ｂ細胞リンパ腫またはＴ細胞リンパ腫などの非ホジキンリンパ腫である。ある特定の実施形態では、非ホジキンリンパ腫は、Ｂ細胞リンパ腫、例えば、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾臓辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、有毛細胞白血病、または中枢神経系原発（ＣＮＳ）リンパ腫などである。ある特定の他の実施形態では、非ホジキンリンパ腫は、Ｔ細胞リンパ腫、例えば、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫、末梢性Ｔ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、節外性ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫、腸管症型Ｔ細胞リンパ腫、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、または末梢性Ｔ細胞リンパ腫などである。
【０１５３】
ＩＶ．併用療法
本発明の別の態様は、併用療法をもたらす。本明細書に記載される多重特異性結合タンパク質は、がんを処置するために追加の治療剤と組み合わせて使用され得る。
【０１５４】
がんの処置において併用療法の一部として使用される場合のある例示的な治療剤としては、例えば、放射線、マイトマイシン、トレチノイン、リボムスチン、ゲムシタビン、ビンクリスチン、エトポシド、クラドリビン、ミトブロニトール、メトトレキサート、ドキソルビシン、カルボコン、ペントスタチン、ニトラクリン、ジノスタチン、セトロレリクス、レトロゾール、ラルチトレキセド、ダウノルビシン、ファドロゾール、フォテムスチン、チマルファシン、ソブゾキサン、ネダプラチン、シタラビン、ビカルタミド、ビノレルビン、ベスナリノン、アミノグルテチミド、アムサクリン、プログルミド、酢酸エリプチニウム、ケタンセリン、ドキシフルリジン、エトレチナート、イソトレチノイン、ストレプトゾシン、ニムスチン、ビンデシン、フルタミド、ドロゲニル、ブトシン、カルモフール、ラゾキサン、シゾフィラン、カルボプラチン、ミトラクトール、テガフール、イホスファミド、プレドニムスチン、ピシバニール、レバミソール、テニポシド、インプロスルファン、エノシタビン、リスリド、オキシメトロン、タモキシフェン、プロゲステロン、メピチオスタン、エピチオスタノール、フォルメスタン、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−２アルファ、インターフェロン−ベータ、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）、コロニー刺激因子−１、コロニー刺激因子−２、デニロイキンジフチトクス、インターロイキン−２、黄体形成ホルモン放出因子ならびに剤の同種受容体に対する示差的結合、及び血清半減期の増加または低減を示す可能性がある上述した剤の変化形態が挙げられる。
【０１５５】
がんの処置において併用療法の一部として使用される場合のある追加の剤の種類は、免疫チェックポイント阻害剤である。例示的な免疫チェックポイント阻害剤としては、（ｉ）細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）、（ｉｉ）プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）、（ｉｉｉ）ＰＤＬ１、（ｉｖ）ＬＡＧ３、（ｖ）Ｂ７−Ｈ３、（ｖｉ）Ｂ７−Ｈ４、及び（ｖｉｉ）ＴＩＭ３のうち１つ以上を阻害する剤が挙げられる。ＣＴＬＡ４阻害剤のイピリムマブは、黒色腫を処置するために米国食品医薬品局によって承認されている。
【０１５６】
さらに、がんの処置において併用療法の一部として使用される場合のある他の剤は、非チェックポイント標的を標的とするモノクローナル抗体剤（例えば、ハーセプチン）及び非細胞傷害剤（例えば、チロシンキナーゼ阻害剤）である。
【０１５７】
さらに、抗がん剤の他のカテゴリーとしては、例えば、以下のものが挙げられる：（ｉ）ＡＬＫ阻害剤、ＡＴＲ阻害剤、Ａ２Ａアンタゴニスト、塩基除去修復阻害剤、Ｂｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼ阻害剤、ブルトン型チロシンキナーゼ阻害剤、ＣＤＣ７阻害剤、ＣＨＫ１阻害剤、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤、ＤＮＡ−ＰＫ及びｍＴＯＲの両方の阻害剤、ＤＮＭＴ１阻害剤、２−クロロ−デオキシアデノシンを加えたＤＮＭＴ１阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、ヘッジホッグシグナル伝達経路阻害剤、ＩＤＯ阻害剤、ＪＡＫ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＭＥＬＫ阻害剤、ＭＴＨ１阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、ホスホイノシチド３−キナーゼ阻害剤、ＰＡＲＰ１及びＤＨＯＤＨの両方の阻害剤、プロテアソーム阻害剤、トポイソメラーゼ−ＩＩ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、ＶＥＧＦＲ阻害剤、ならびにＷＥＥ１阻害剤から選択される阻害剤、（ｉｉ）ＯＸ４０、ＣＤ１３７、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＴＮＦＲＳＦ２５、またはＩＣＯＳのアゴニスト、ならびに（ｉｉｉ）ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＧ−ＣＳＦから選択されるサイトカイン。
【０１５８】
本発明のタンパク質は、原発巣の外科的除去のために補助剤としても使用され得る。
【０１５９】
多重特異性結合タンパク質及び追加の治療剤の量ならびに投与の相対的タイミングは、所望の組み合わされた治療効果を達成するために選択される場合がある。例えば、併用療法を、そのような投与を必要とする患者に投与する場合、組み合わせた治療剤、または治療剤を含む医薬組成物（複数可）は、例えば、順次、並行して、共に、同時になどの任意の順序で投与されてよい。さらに、例えば、多重特異性結合タンパク質は、追加の治療剤（複数可）が、その予防効果もしくは治療効果を発揮しているか、または逆の場合の間中、投与されてよい。
【０１６０】
Ｖ．医薬組成物
本開示はまた、治療有効量の本明細書に記載されるタンパク質を含有する医薬組成物を特徴とする。組成物は、様々な薬物送達システムで使用するために製剤化され得る。１つ以上の生理学的に許容される賦形剤または担体も、適切な製剤化のために組成物に含まれ得る。本開示での使用に好適な製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，１７ｔｈ  ｅｄ．，１９８５に見出される。薬剤送達の方法の簡単な概説については、例えば、Ｌａｎｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３，１９９０）を参照のこと。
【０１６１】
本開示の静脈内薬物送達製剤は、バッグ、ペン、またはシリンジ中に含有されてよい。ある特定の実施形態では、バッグは、管及び／または針を含む導管に連結されてよい。ある特定の実施形態では、製剤は、凍結乾燥製剤または液体製剤であってよい。ある特定の実施形態では、製剤は、凍結して乾燥（凍結乾燥）されて、約１２〜６０本のバイアル中に含有されてよい。ある特定の実施形態では、製剤は凍結乾燥されてよく、４５ｍｇの凍結乾燥製剤が、１本のバイアル中に含有されてよい。ある特定の実施形態では、約４０ｍｇ〜約１００ｍｇの凍結乾燥製剤が、１本のバイアル中に含有されてよい。ある特定の実施形態では、１２、２７、または４５本のバイアルからの凍結乾燥製剤が、静脈内薬物製剤中に治療用量のタンパク質を得るために組み合わされる。ある特定の実施形態では、製剤は液体製剤であって、約２５０ｍｇ／バイアル〜約１０００ｍｇ／バイアルとして保存されてよい。ある特定の実施形態では、製剤は液体製剤であって、約６００ｍｇ／バイアルとして保存されてよい。ある特定の実施形態では、製剤は液体製剤であって、約２５０ｍｇ／バイアルとして保存されてよい。
【０１６２】
タンパク質は、製剤を形成する緩衝溶液中に治療有効量のタンパク質を含む、液状の水性医薬製剤中に存在し得る。
【０１６３】
これらの組成物は、従来の滅菌技術によって滅菌されてよいか、または滅菌濾過されてよい。得られた水溶液は、そのまま使用するために梱包されてよいか、または凍結乾燥されてよく、凍結乾燥調製物は投与前に滅菌水性担体と組み合わされる。調製物のｐＨは通常、３〜１１、より好ましくは５〜９または６〜８、最も好ましくは７〜７．５などの７〜８であることになる。固体形態の得られた組成物は、固定量の上述した剤（複数可）を各々含有する、複数の単回用量単位で梱包されてよい。固体形態の組成物はまた、変動する量のために容器中に梱包され得る。
【０１６４】
ある特定の実施形態では、本開示は、本開示のタンパク質を、マンニトール、クエン酸一水和物、クエン酸ナトリウム、リン酸二ナトリウム二水和物、リン酸二水素ナトリウム二水和物、塩化ナトリウム、ポリソルベート８０、水、及び水酸化ナトリウムと組み合わせて含む、有効期限が延長された製剤を提供する。
【０１６５】
ある特定の実施形態では、水性製剤は、ｐＨ緩衝溶液中に本開示のタンパク質を含んで調製される。本発明の緩衝液は、約４〜約８、例えば、約４．５〜約６．０、もしくは約４．８〜約５．５の範囲のｐＨを有してよいか、または約５．０〜約５．２のｐＨを有してよい。上に列挙したｐＨの中間の範囲も、本開示の一部であることを意図する。例えば、上限及び／または下限として上に列挙した値のいずれかの組合せを使用する値の範囲が、含まれることを意図する。この範囲内でｐＨを制御することになる緩衝液の例としては、酢酸塩（例えば、酢酸ナトリウム）、コハク酸塩（コハク酸ナトリウムなど）、グルコン酸塩、ヒスチジン、クエン酸塩及び他の有機酸緩衝液が挙げられる。
【０１６６】
ある特定の実施形態では、製剤は、約４〜約８の範囲でｐＨを維持するためにクエン酸塩及びリン酸塩を含有する緩衝系を含む。ある特定の実施形態では、ｐＨ範囲は、約４．５〜約６．０、または約ｐＨ４．８〜約５．５、または約５．０〜約５．２のｐＨ範囲内であってよい。ある特定の実施形態では、緩衝系としては、クエン酸一水和物、クエン酸ナトリウム、リン酸二ナトリウム二水和物、及び／またはリン酸二水素ナトリウム二水和物が挙げられる。ある特定の実施形態では、緩衝系としては、約１．３ｍｇ／ｍＬのクエン酸（例えば、１．３０５ｍｇ／ｍＬ）、約０．３ｍｇ／ｍＬのクエン酸ナトリウム（例えば、０．３０５ｍｇ／ｍＬ）、約１．５ｍｇ／ｍＬのリン酸二ナトリウム二水和物（例えば、１．５３ｍｇ／ｍＬ）、約０．９ｍｇ／ｍＬのリン酸二水素ナトリウム二水和物（例えば、０．８６）、及び約６．２ｍｇ／ｍＬの塩化ナトリウム（例えば、６．１６５ｍｇ／ｍＬ）が挙げられる。ある特定の実施形態では、緩衝系としては、１〜１．５ｍｇ／ｍＬのクエン酸、０．２５〜０．５ｍｇ／ｍＬのクエン酸ナトリウム、１．２５〜１．７５ｍｇ／ｍＬのリン酸二ナトリウム二水和物、０．７〜１．１ｍｇ／ｍＬのリン酸二水素ナトリウム二水和物、及び６．０〜６．４ｍｇ／ｍＬの塩化ナトリウムが挙げられる。ある特定の実施形態では、製剤のｐＨは、水酸化ナトリウムで調整される。
【０１６７】
ポリオールは等張化剤として作用し、抗体を安定化させる場合があり、これも製剤中に含まれてよい。ポリオールは、製剤の所望の等張性に関して変動する場合がある量で製剤に添加される。ある特定の実施形態では、水性製剤は等張であってよい。添加されるポリオールの量はまた、ポリオールの分子量に対して変化する場合もある。例えば、より少量の単糖（例えば、マンニトール）が、二糖（トレハロースなど）と比較して添加されてよい。ある特定の実施形態では、等張化剤として製剤に使用される場合もあるポリオールは、マンニトールである。ある特定の実施形態では、マンニトール濃度は、約５〜約２０ｍｇ／ｍＬであってよい。ある特定の実施形態では、マンニトールの濃度は、約７．５〜１５ｍｇ／ｍＬであってよい。ある特定の実施形態では、マンニトールの濃度は、約１０〜１４ｍｇ／ｍＬであってよい。ある特定の実施形態では、マンニトールの濃度は、約１２ｍｇ／ｍＬであってよい。ある特定の実施形態では、ポリオールのソルビトールが、製剤に含まれてよい。
【０１６８】
洗剤または界面活性剤もまた、製剤に添加されてよい。例示的な洗剤としては、非イオン性洗剤、例えば、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０、８０など）またはポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）などが挙げられる。添加される洗剤の量は、それが製剤化抗体の凝集を減少させる、及び／または製剤中の微粒子の形成を最小限に抑える、及び／または吸着を減少させるような量である。ある特定の実施形態では、製剤は、ポリソルベートである界面活性剤を含んでよい。ある特定の実施形態では、製剤は、洗剤のポリソルベート８０またはＴｗｅｅｎ８０を含有してよい。Ｔｗｅｅｎ８０は、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエートを記載するために使用される用語である（Ｆｉｅｄｌｅｒ，Ｌｅｘｉｋｏｎ  ｄｅｒ  Ｈｉｆｓｓｔｏｆｆｅ，Ｅｄｉｔｉｏ  Ｃａｎｔｏｒ  Ｖｅｒｌａｇ  Ａｕｌｅｎｄｏｒｆ，４ｔｈ  ｅｄ．，１９９６を参照のこと）。ある特定の実施形態では、製剤は、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、または約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約５ｍｇ／ｍＬを含有してよい。ある特定の実施形態では、約０．１％のポリソルベート８０が、製剤に添加されてよい。
【０１６９】
実施形態では、本開示のタンパク質産物は、液体製剤として製剤化される。液体製剤は１０ｍｇ／ｍＬ濃度で、ゴム栓で閉められ、アルミニウムクリンプシールクロージャーで密閉されたＵＳＰ／Ｐｈ  ＥｕｒタイプＩ  ５０Ｒバイアルのいずれか中に提示されてよい。栓は、ＵＳＰ及びＰｈ  Ｅｕｒに適合するエラストマーで作製されてよい。ある特定の実施形態では、バイアルは、６０ｍＬの抽出可能な体積を可能にするために、６１．２ｍＬのタンパク質産物溶液で満たされてよい。ある特定の実施形態では、液体製剤は、０．９％の生理食塩水で希釈されてよい。
【０１７０】
ある特定の実施形態では、本開示の液体製剤は、安定したレベルの糖と組み合わせて１０ｍｇ／ｍＬ濃度の溶液として調製されてよい。ある特定の実施形態では、液体製剤は、水性担体中で調製されてよい。ある特定の実施形態では、安定剤は、静脈内投与に望ましくない、または不適当な粘度をもたらす可能性のある量以下の量で添加されてよい。ある特定の実施形態では、糖は二糖、例えば、スクロースであってよい。ある特定の実施形態では、液体製剤はまた、緩衝剤、界面活性剤、及び防腐剤のうち１つ以上を含んでよい。
【０１７１】
ある特定の実施形態では、液体製剤のｐＨは、薬学的に許容される酸及び／または塩基の添加によって設定されてよい。ある特定の実施形態では、薬学的に許容される酸は、塩酸であってよい。ある特定の実施形態では、塩基は水酸化ナトリウムであってよい。
【０１７２】
凝集に加えて、脱アミドは、発酵、採取／細胞清澄化、精製、原薬／医薬品の保存中及び試料分析中に生じる可能性のあるペプチド及びタンパク質の一般的な産物バリアントである。脱アミドは、加水分解され得るスクシンイミド中間体を形成するタンパク質からのＮＨ３の消失である。スクシンイミド中間体は、親ペプチドの１７ダルトンの質量低減をもたらす。後続の加水分解によって、１８ダルトンの質量増加がもたらされる。スクシンイミド中間体の単離は、水性条件下では不安定性ゆえに困難である。そのため、脱アミドは通常、１ダルトンの質量増加として検出可能である。アスパラギンの脱アミドは、アスパラギン酸またはイソアスパラギン酸のいずれかをもたらす。脱アミドの割合に影響を及ぼすパラメータとしては、ｐＨ、温度、溶媒誘電率、イオン強度、一次配列、局所的なポリペプチド立体構造及び三次構造が挙げられる。ペプチド鎖中でＡｓｎに隣接するアミノ酸残基は、脱アミドの割合に影響を及ぼす。タンパク質配列中においてＡｓｎの後のＧｌｙ及びＳｅｒは、脱アミドに対してより高い感受性をもたらす。
【０１７３】
ある特定の実施形態では、本開示の液体製剤は、タンパク質産物の脱アミノ反応を防止するためのｐＨ及び湿度の条件下で保存されてよい。
【０１７４】
本明細書における目的の水性担体は、薬学的に許容され（ヒトへの投与について安全かつ非毒性）、液体製剤の調製に有用なものである。例示的な担体としては、注射用滅菌水（ＳＷＦＩ）、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩水、リンゲル液またはデキストロース溶液が挙げられる。
【０１７５】
防腐剤は、細菌作用を減少させるために、本明細書における製剤に場合により添加されてよい。防腐剤の添加は、例えば、複数回使用（複数回用量）製剤の作製を容易にする場合がある。
【０１７６】
静脈内（ＩＶ）製剤は、特定の場合で、例えば、患者が移植後に入院してＩＶ経路によって全ての薬物を受け入れる場合などでは、好ましい投与経路である場合がある。ある特定の実施形態では、液体製剤は、投与前に０．９％の塩化ナトリウム溶液で希釈される。ある特定の実施形態では、注射のために希釈した医薬品は等張であり、静脈内注入による投与に好適である。
【０１７７】
ある特定の実施形態では、塩または緩衝液成分は、１０ｍＭ〜２００ｍＭの量で添加されてよい。塩及び／または緩衝液は薬学的に許容され、「塩基形成」金属またはアミンを有する様々な既知の酸（無機及び有機）から得られる。ある特定の実施形態では、緩衝液はリン酸緩衝液であってよい。ある特定の実施形態では、緩衝液は、グリシン酸、炭酸、クエン酸緩衝液であってよく、その場合、ナトリウム、カリウムまたはアンモニウムイオンが対イオンとして機能し得る。
【０１７８】
防腐剤は、細菌作用を減少させるために、本明細書における製剤に場合により添加されてよい。防腐剤の添加は、例えば、複数回使用（複数回用量）製剤の作製を容易にする場合がある。
【０１７９】
本明細書における目的の水性担体は、薬学的に許容され（ヒトへの投与について安全かつ非毒性）、液体製剤の調製に有用なものである。例示的な担体としては、注射用滅菌水（ＳＷＦＩ）、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩水、リンゲル液またはデキストロース溶液が挙げられる。
【０１８０】
本開示のタンパク質は、タンパク質及びリオプロテクタントを含む凍結乾燥製剤中に存在し得る。リオプロテクタントは糖、例えば、二糖であってよい。ある特定の実施形態では、リオプロテクタントは、スクロースまたはマルトースであってよい。凍結乾燥製剤はまた、緩衝剤、界面活性剤、増量剤、及び／または防腐剤のうち１つ以上を含んでよい。
【０１８１】
凍結乾燥医薬品の安定化に有用なスクロースまたはマルトースの量は、少なくとも１：２のタンパク質対スクロースまたはマルトースの重量比であってよい。ある特定の実施形態では、タンパク質対スクロースまたはマルトースの重量比は、１：２〜１：５であってよい。
【０１８２】
ある特定の実施形態では、凍結乾燥前の製剤のｐＨは、薬学的に許容される酸及び／または塩基の添加によって設定されてよい。ある特定の実施形態では、薬学的に許容される酸は、塩酸であってよい。ある特定の実施形態では、薬学的に許容される塩基は、水酸化ナトリウムであってよい。
【０１８３】
凍結乾燥前、本開示のタンパク質を含有する溶液のｐＨは、６〜８に調整されてよい。ある特定の実施形態では、凍結乾燥医薬品のｐＨ範囲は、７〜８であってよい。
【０１８４】
ある特定の実施形態では、塩または緩衝液成分は、１０ｍＭ〜２００ｍＭの量で添加されてよい。塩及び／または緩衝液は薬学的に許容され、「塩基形成」金属またはアミンを有する様々な既知の酸（無機及び有機）から得られる。ある特定の実施形態では、緩衝液はリン酸緩衝液であってよい。ある特定の実施形態では、緩衝液は、グリシン酸、炭酸、クエン酸緩衝液であってよく、その場合、ナトリウム、カリウムまたはアンモニウムイオンが対イオンとして機能し得る。
【０１８５】
ある特定の実施形態では、「増量剤」が添加されてよい。「増量剤」は、凍結乾燥混合物に質量を添加し、凍結乾燥ケーキの物理的構造に寄与する（例えば、開孔構造を維持する本質的に均一の凍結乾燥ケーキの作製を容易にする）化合物である。例示的な増量剤としては、マンニトール、グリシン、ポリエチレングリコール及びソルビトールが挙げられる。本発明の凍結乾燥製剤は、そのような増量剤を含有してよい。
【０１８６】
防腐剤は、細菌作用を減少させるために、本明細書における製剤に場合により添加されてよい。防腐剤の添加は、例えば、複数回使用（複数回用量）製剤の作製を容易にする場合がある。
【０１８７】
ある特定の実施形態では、凍結乾燥医薬品は、水性担体で構成されてよい。本明細書における目的の水性担体は、薬学的に許容され（例えば、ヒトへの投与について安全かつ非毒性）、凍結乾燥後の液体製剤の調製に有用なものである。例示的な希釈剤としては、注射用滅菌水（ＳＷＦＩ）、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩水、リンゲル液またはデキストロース溶液が挙げられる。
【０１８８】
ある特定の実施形態では、本開示の凍結乾燥医薬品は、注射用滅菌水、ＵＳＰ（ＳＷＦＩ）または０．９％の塩化ナトリウム注射液、ＵＳＰのいずれかで再構成される。再構成中、凍結乾燥粉末が溶液中に溶解する。
【０１８９】
ある特定の実施形態では、本開示の凍結乾燥タンパク質産物は、約４．５ｍＬの注射用水中に構成され、０．９％の生理食塩水（塩化ナトリウム溶液）で希釈される。
【０１９０】
本発明の医薬組成物中における活性成分の実際の投与量レベルは、患者にとって毒性がなく、特定の患者、組成物、及び投与方法に関して所望の治療応答を達成するのに効果的な活性成分の量を得るように変化させてよい。
【０１９１】
特定の用量は、各患者に対して均一な用量、例えば、５０〜５０００ｍｇのタンパク質であり得る。あるいは、患者の用量は、患者の概算の体重または表面積に合わせることができる。適切な投与量を決定する時の他の要因としては、処置または予防される疾患または状態、疾患の重症度、投与経路、ならびに患者の年齢、性別及び健康状態が挙げられ得る。処置に適切な投与量を決定するのに必要な計算のさらなる精度向上は、当業者によって、特に本明細書に開示される投与量情報及びアッセイに鑑みて日常的に行われる。投与量はまた、適切な用量反応データと組み合わせて使用される投与量を決定することを目的とした既知のアッセイの使用によって決定され得る。個々の患者の投与量は、疾患の進行をモニターしながら調整され得る。患者における標的化可能な構築物または複合体の血中レベルは、投与量が効果濃度に達する、またはそれを維持するために調整が必要であるかを確認するために測定され得る。ファーマコゲノミクスは、どの標的化可能な構築物及び／または複合体、ならびにその投与量が、所与の個体にとって効果的な可能性が最も高いのかを決定するために使用されてよい（Ｓｃｈｍｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ３０８：４３−５３，２００１、Ｓｔｅｉｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ３０８：３３−４１，２００１）。
【０１９２】
概して、体重に基づく投与量は、約０．０１μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、例えば、約０．０１μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約１００μｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約５０μｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約１０μｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約１μｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約０．１μｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ〜約１００μｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ〜約１０μｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ〜約１μｇ／ｋｇ体重、約１μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇ〜約１００μｇ／ｋｇ体重、約１μｇ〜約５０μｇ／ｋｇ体重、約１μｇ〜約１０μｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ〜約１００μｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ〜約５０μｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ〜約１００μｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１０ｍｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１０ｍｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約５０ｍｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重などである。
【０１９３】
用量は、毎日、毎週、毎月または毎年１回以上、あるいは２〜２０年ごとに１回の投与であってよい。当業者は、体液または組織中において標的化可能な構築物または複合体の測定された滞留時間及び濃度に基づいて、投薬の反復率を容易に推定し得る。本発明の投与は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、胸膜内、髄腔内、腔内、カテ−テルによる灌流によって、または直接の病巣内注射によって行われ得る。これは、毎日１回以上、毎週１回以上、毎月１回以上、及び毎年１回以上投与されてよい。
【０１９４】
上の記載は、本発明の複数の態様及び実施形態について記載している。本特許出願は、態様及び実施形態の全ての組合せ及び順列を具体的に考慮する。
【実施例】
【０１９５】
ここに概して記載される本発明は、以下の実施例を参照することによってより容易に理解されることとなり、それらは、単に本発明のある特定の態様及び実施形態の例示を目的として含まれ、本発明を限定することを意図するものではない。
【０１９６】
実施例１−ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインはＮＫＧ２Ｄに結合する
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインは、精製した組換えＮＫＧ２Ｄに結合する
ヒト、マウスまたはカニクイザルＮＫＧ２Ｄエクトドメインの核酸配列を、ヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインをコードする核酸配列と融合し、発現される哺乳動物細胞内に導入した。精製後、ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ融合タンパク質をマイクロプレートのウェルに吸着させた。非特異的結合を防止するためにウシ血清アルブミンでウェルをブロックした後、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを滴定し、ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ融合タンパク質を予め吸着させたウェルに添加した。一次抗体の結合を、西洋ワサビペルオキシダーゼと複合化させた、Ｆｃ交差反応を回避するためにヒトカッパ軽鎖を特異的に認識する二次抗体を使用して検出した。３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、すなわち、西洋ワサビペルオキシダーゼの基質をウェルに添加して結合シグナルを可視化し、その吸光度を４５０ｎＭで測定して５４０ｎＭで補正した。ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインクローン、アイソタイプ対照または陽性対照（配列番号：１０１〜１０４から選択される重鎖及び軽鎖可変ドメインを含む、もしくはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅで入手可能な抗マウスＮＫＧ２ＤクローンのＭＩ−６及びＣＸ−５）を各ウェルに添加した。
【０１９７】
アイソタイプ対照が、組換えＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃタンパク質に対して最小限の結合を示した一方で、陽性対照は、組換え抗原に最も強く結合した。全てのクローンによって産生されたＮＫＧ２Ｄ結合ドメインが、ヒト、マウス、及びカニクイザル組換えＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃタンパク質に対して結合を実証したが、クローンごとに親和性が異なっていた。概して、各抗ＮＫＧ２Ｄクローンは、ヒト（図３）及びカニクイザル（図４）組換えＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃに同様の親和性で結合したが、マウス（図５）組換えＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃに対する親和性は低かった。
【０１９８】
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインは、ＮＫＧ２Ｄを発現する細胞に結合する
ＥＬ４マウスリンパ腫細胞株を操作して、ヒトまたはマウスＮＫＧ２Ｄ−ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインキメラ抗原受容体を発現させた。ＮＫＧ２Ｄ結合クローン、アイソタイプ対照または陽性対照を１００ｎＭの濃度で使用して、ＥＬ４細胞上に発現した細胞外ＮＫＧ２Ｄを染色した。抗体結合を、フルオロフォア複合化抗ヒトＩｇＧ二次抗体を使用して検出した。細胞をフローサイトメトリーによって分析し、バックグラウンドに対する倍率（ＦＯＢ）を、親ＥＬ４細胞と比較したＮＫＧ２Ｄ発現細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を使用して算出した。
【０１９９】
全てのクローンによって産生されたＮＫＧ２Ｄ結合ドメインが、ヒト及びマウスＮＫＧ２Ｄを発現するＥＬ４細胞に結合した。陽性対照抗体（配列番号：１０１〜１０４から選択される重鎖及び軽鎖可変ドメインを含む、またはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅで入手可能な抗マウスＮＫＧ２ＤクローンのＭＩ−６及びＣＸ−５）が、最も良好なＦＯＢ結合シグナルをもたらした。各クローンに対するＮＫＧ２Ｄ結合親和性は、ヒトＮＫＧ２Ｄ（図６）及びマウス（図７）ＮＫＧ２Ｄを発現する細胞間で類似していた。
【０２００】
実施例２−ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインは、ＮＫＧ２Ｄに結合する天然リガンドをブロックする
ＵＬＢＰ−６との競合
組換えヒトＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃタンパク質をマイクロプレートのウェルに吸着させ、非特異的結合を減少させるためにウシ血清アルブミンでウェルをブロックした。飽和濃度のＵＬＢＰ−６−Ｈｉｓ−ビオチンをウェルに添加し、続いてＮＫＧ２Ｄ結合ドメインクローンを添加した。２時間のインキュベーション後、ウェルを洗浄し、ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃでコーティングしたウェルに結合したままであったＵＬＢＰ−６−Ｈｉｓ−ビオチンを、西洋ワサビペルオキシダーゼと複合化したストレプトアビジン及びＴＭＢ基質によって検出した。吸光度を４５０ｎＭで測定し、５４０ｎＭで補正した。バックグラウンドを差し引いた後、ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃタンパク質に対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメインの特異的結合を、ウェル中でＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃタンパク質に対する結合からブロックされたＵＬＢＰ−６−Ｈｉｓ−ビオチンのパーセンテージから算出した。陽性対照抗体（配列番号：１０１〜１０４から選択される重鎖及び軽鎖可変ドメインを含む）ならびに様々なＮＫＧ２Ｄ結合ドメインが、ＮＫＧ２Ｄに結合するＵＬＢＰ−６をブロックした一方で、アイソタイプ対照は、ＵＬＢＰ−６との競合をほとんど示さなかった（図８）。
【０２０１】
ＵＬＢＰ−６配列は、配列番号：１０８で表される。
【化４】
2020529410.tif 000023
【０２０２】
ＭＩＣＡとの競合
組換えヒトＭＩＣＡ−Ｆｃタンパク質をマイクロプレートのウェルに吸着させ、非特異的結合を減少させるためにウシ血清アルブミンでウェルをブロックした。ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ−ビオチンをウェルに添加し、続いてＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを添加した。インキュベーション及び洗浄後、ＭＩＣＡ−Ｆｃでコーティングしたウェルに結合したままであったＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ−ビオチンを、ストレプトアビジン−ＨＲＰ及びＴＭＢ基質を使用して検出した。吸光度を４５０ｎＭで測定し、５４０ｎＭで補正した。バックグラウンドを差し引いた後、ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃタンパク質に対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメインの特異的結合を、ＭＩＣＡ−Ｆｃでコーティングしたウェルに対する結合からブロックされたＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ−ビオチンのパーセンテージから算出した。陽性対照抗体（配列番号：１０１〜１０４から選択される重鎖及び軽鎖可変ドメインを含む）ならびに様々なＮＫＧ２Ｄ結合ドメインが、ＮＫＧ２Ｄに結合するＭＩＣＡをブロックした一方で、アイソタイプ対照は、ＭＩＣＡとの競合をほとんど示さなかった（図９）。
【０２０３】
Ｒａｅ−１デルタとの競合
組換えマウスＲａｅ−１デルタ−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した）をマイクロプレートのウェルに吸着させ、非特異的結合を減少させるためにウシ血清アルブミンでウェルをブロックした。マウスＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ−ビオチンをウェルに添加し、続いてＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを添加した。インキュベーション及び洗浄後、Ｒａｅ−１デルタ−Ｆｃでコーティングしたウェルに結合したままであったＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ−ビオチンを、ストレプトアビジン−ＨＲＰ及びＴＭＢ基質を使用して検出した。吸光度を４５０ｎＭで測定し、５４０ｎＭで補正した。バックグラウンドを差し引いた後、ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃタンパク質に対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメインの特異的結合を、Ｒａｅ−１デルタ−Ｆｃでコーティングしたウェルに対する結合からブロックされたＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ−ビオチンのパーセンテージから算出した。陽性対照（配列番号：１０１〜１０４から選択される重鎖及び軽鎖可変ドメインを含む、またはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅで入手可能な抗マウスＮＫＧ２ＤクローンのＭＩ−６及びＣＸ−５）ならびに様々なＮＫＧ２Ｄ結合ドメインクローンが、マウスＮＫＧ２Ｄに結合するＲａｅ−１デルタをブロックした一方で、アイソタイプ対照抗体は、Ｒａｅ−１デルタとの競合をほとんど示さなかった（図１０）。
【０２０４】
実施例３−ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインクローンは、ＮＫＧ２Ｄを活性化させる
ヒト及びマウスＮＫＧ２Ｄの核酸配列を、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインをコードする核酸配列に融合し、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）構築物を得た。次いで、ＮＫＧ２Ｄ−ＣＡＲ構築物を、ギブソンアセンブリを使用してレトロウイルスベクターにクローニングし、レトロウイルス産生のためにｅｘｐｉ２９３細胞にトランスフェクトした。ＥＬ４細胞を、８μｇ／ｍＬのポリブレンと共にＮＫＧ２Ｄ−ＣＡＲを含有するウイルスに感染させた。感染から２４時間後、ＥＬ４細胞中のＮＫＧ２Ｄ−ＣＡＲの発現レベルをフローサイトメトリーによって分析し、細胞表面上で高レベルのＮＫＧ２Ｄ−ＣＡＲを発現するクローンを選択した。
【０２０５】
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインがＮＫＧ２Ｄを活性化させるかを決定するために、それらをマイクロプレートのウェルに吸着させ、ＮＫＧ２Ｄ−ＣＡＲ  ＥＬ４細胞を、抗体断片でコーティングしたウェル上で４時間、ブレフェルジン−Ａ及びモネンシンの存在下において培養した。細胞内ＴＮＦ−α産生、すなわち、ＮＫＧ２Ｄ活性化の指標をフローサイトメトリーによってアッセイした。ＴＮＦ−α陽性細胞のパーセンテージを、陽性対照で処理した細胞を基準として正規化した。全てのＮＫＧ２Ｄ結合ドメインが、ヒトＮＫＧ２Ｄ（図１１）及びマウスＮＫＧ２Ｄ（図１２）の両方を活性化させた。
【０２０６】
実施例４−ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインはＮＫ細胞を活性化させる
初代ヒトＮＫ細胞
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、密度勾配遠心分離法を使用して、ヒト末梢血バフィーコートから単離した。ＮＫ細胞（ＣＤ３−ＣＤ５６＋）を、磁気ビーズを用いたネガティブセレクションを使用してＰＢＭＣから単離し、単離したＮＫ細胞の純度は通常、＞９５％であった。次いで、単離したＮＫ細胞を、１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２を含有する培地中で２４〜４８時間培養してから、それらを、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを吸着させたマイクロプレートのウェルに移し、フルオロフォア複合化抗ＣＤ１０７ａ抗体、ブレフェルジン−Ａ、及びモネンシンを含有する培地中で培養した。培養後、ＮＫ細胞を、フローサイトメトリーによってＣＤ３、ＣＤ５６及びＩＦＮ−γに対するフルオロフォア複合化抗体を使用してアッセイした。ＣＤ１０７ａ及びＩＦＮ−γ染色を、ＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞中で分析し、ＮＫ細胞活性化を評価した。ＣＤ１０７ａ／ＩＦＮ−γ二重陽性細胞の増加は、１つの受容体ではなく、２つの活性化受容体の結合による良好なＮＫ細胞活性化を示している。ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインならびに陽性対照（例えば、配列番号：１０１または配列番号：１０３で表される重鎖可変ドメイン、及び配列番号：１０２または配列番号：１０４で表される軽鎖可変ドメイン）は、アイソタイプ対照よりも高いパーセンテージの、ＣＤ１０７ａ＋及びＩＦＮ−γ＋となるＮＫ細胞を示した（図１３及び図１４は、２つの独立した実験からのデータを表し、各々でＮＫ細胞調製のために異なるドナーのＰＢＭＣを使用した）。
【０２０７】
初代マウスＮＫ細胞
脾臓をＣ５７Ｂｌ／６マウスから入手し、７０μｍのセルストレーナーによって破砕して単一の細胞懸濁液を得た。細胞をペレットにし、ＡＣＫ溶解緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した＃Ａ１０４９２０１、１５５ｍＭの塩化アンモニウム、１０ｍＭの重炭酸カリウム、０．０１ｍＭのＥＤＴＡ）中に再懸濁して赤血球を除去した。残存する細胞を１００ｎｇ／ｍＬのｈＩＬ−２と共に７２時間培養してから、採取してＮＫ細胞単離のために調製した。次いで、ＮＫ細胞（ＣＤ３−ＮＫ１．１＋）を、磁気ビーズを用いたネガティブ除去技術を使用して脾臓細胞から単離し、通常は＞９０％の純度であった。精製したＮＫ細胞を、１００ｎｇ／ｍＬのｍＩＬ−１５を含有する培地中で４８時間培養してから、それらを、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを吸着させたマイクロプレートのウェルに移し、フルオロフォア複合化抗ＣＤ１０７ａ抗体、ブレフェルジン−Ａ、及びモネンシンを含有する培地中で培養した。ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインでコーティングしたウェル中での培養後、ＮＫ細胞を、フローサイトメトリーによってＣＤ３、ＮＫ１．１及びＩＦＮ−γに対するフルオロフォア複合化抗体を使用してアッセイした。ＣＤ１０７ａ及びＩＦＮ−γ染色を、ＣＤ３−ＮＫ１．１＋細胞中で分析し、ＮＫ細胞活性化を評価した。ＣＤ１０７ａ／ＩＦＮ−γ二重陽性細胞の増加は、１つの受容体ではなく、２つの活性化受容体の結合による良好なＮＫ細胞活性化を示している。ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインならびに陽性対照（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅで入手可能な抗マウスＮＫＧ２ＤクローンのＭＩ−６及びＣＸ−５から選択される）は、アイソタイプ対照よりも高いパーセンテージの、ＣＤ１０７ａ＋及びＩＦＮ−γ＋となるＮＫ細胞を示した（図１５及び図１６は、２つの独立した実験からのデータを表し、各々でＮＫ細胞調製のために異なるマウスを使用した）。
【０２０８】
実施例５−ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインは、標的腫瘍細胞の細胞傷害を可能にする
ヒト及びマウス初代ＮＫ細胞活性化アッセイは、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインとのインキュベーション後における、ＮＫ細胞上での細胞傷害性マーカーの増加を実証した。このことが腫瘍細胞溶解の増加につながるかを確認するために、細胞に基づくアッセイを利用し、各ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを単一特異性抗体とした。Ｆｃ領域を１つの標的化アームとして使用した一方で、Ｆａｂ領域（ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン）は、ＮＫ細胞を活性化させるための別の標的化アームとして機能した。ＴＨＰ−１細胞はヒト起源であり、高レベルのＦｃ受容体を発現し、これらを腫瘍標的として使用して、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＤＥＬＦＩＡ細胞傷害性キットを使用した。ＴＨＰ−１細胞をＢＡＴＤＡ試薬で標識し、１０５／ｍＬで培養培地中に再懸濁させた。次いで、標識したＴＨＰ−１細胞をＮＫＧ２Ｄ抗体と組み合わせ、マウスＮＫ細胞をマイクロタイタープレートのウェル中において３７℃で３時間単離した。インキュベーション後、２０μＬの培養上清を除去し、２００μＬのユウロピウム溶液と混合して１５分間暗所で振盪しながらインキュベートした。蛍光を、時間分解蛍光モジュールを備えたＰｈｅｒａＳｔａｒプレートリーダーによって経時的に測定し（励起３３７ｎｍ、発光６２０ｎｍ）、特異的溶解をキットの説明書に従って算出した。
【０２０９】
ＮＫＧ２Ｄに対する天然リガンドである陽性対照のＵＬＢＰ−６は、マウスＮＫ細胞によるＴＨＰ−１標的細胞の特異的溶解の増加を示した。ＮＫＧ２Ｄ抗体はまた、ＴＨＰ−１標的細胞の特異的溶解も増加させた一方で、アイソタイプ対照抗体は特異的溶解の減少を示した。点線は、抗体を添加しなかった場合の、マウスＮＫ細胞によるＴＨＰ−１細胞の特異的溶解を示す（図１７）。
【０２１０】
実施例６−ＮＫＧ２Ｄ抗体は高い熱安定性を示す
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインの融解温度を、示差走査蛍光定量法を使用してアッセイした。外挿した見かけの融解温度は、典型的なＩｇＧ１抗体と比較して高い（図１８）。
【０２１１】
実施例７−ＮＫＧ２Ｄ及びＣＤ１６を架橋することによるヒトＮＫ細胞の相乗的活性化
初代ヒトＮＫ細胞活性化アッセイ
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、密度勾配遠心分離法を使用して、ヒト末梢血バフィーコートから単離した。ＮＫ細胞を、ネガティブ磁気ビーズ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ＃１７９５５）を使用してＰＢＭＣから精製した。ＮＫ細胞は、フローサイトメトリーによって決定した場合、＞９０％のＣＤ３−ＣＤ５６＋であった。次いで、細胞を、活性化アッセイでの使用前に１００ｎｇ／ｍＬのｈＩＬ−２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ＃２００−０２）を含有する培地中で４８時間増殖させた。抗体を９６ウェル平底プレート上に、２μｇ／ｍＬ（抗ＣＤ１６、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ＃３０２０１３）及び５μｇ／ｍＬ（抗ＮＫＧ２Ｄ、Ｒ＆Ｄ＃ＭＡＢ１３９）の濃度で、１００μＬの滅菌ＰＢＳ中において一晩４℃でコーティングし、続いてウェルを完全に洗浄して過剰な抗体を除去した。脱顆粒の評価のために、ＩＬ−２活性化ＮＫ細胞を５×１０５細胞／ｍＬで、１００ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ−２（ｈＩＬ２）及び１μｇ／ｍＬのＡＰＣ複合化抗ＣＤ１０７ａ  ｍＡｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ＃３２８６１９）を補充した培養培地中に再懸濁させた。次いで、１×１０５細胞／ウェルを抗体でコーティングしたプレート上に添加した。タンパク質輸送阻害剤のブレフェルジンＡ（ＢＦＡ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ＃４２０６０１）及びモネンシン（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ＃４２０７０１）を、それぞれ１：１０００及び１：２７０の最終希釈で添加した。播種した細胞を、４時間３７℃で５％ＣＯ２中においてインキュベートした。ＩＦＮ−γの細胞内染色のために、ＮＫ細胞を抗ＣＤ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ＃３００４５２）及び抗ＣＤ５６ｍＡｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ＃３１８３２８）で標識し、その後、固定して透過処理し、抗ＩＦＮ−γ  ｍＡｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ＃５０６５０７）で標識した。生ＣＤ５６＋ＣＤ３−細胞上でゲーティングした後、ＮＫ細胞を、ＣＤ１０７ａ及びＩＦＮ−γの発現についてフローサイトメトリーによって分析した。
【０２１２】
受容体の組合せの相対的効力を調査するために、プレート結合刺激によるＮＫＧ２ＤまたはＣＤ１６の架橋、及び両方の受容体の共架橋を実施した。図１９（図１９Ａ〜１９Ｃ）に示す通り、ＣＤ１６及びＮＫＧ２Ｄの複合刺激は、ＣＤ１０７ａ（脱顆粒）（図１９Ａ）及び／またはＩＦＮ−γ産生（図１９Ｂ）の大幅なレベル上昇をもたらした。点線は、各受容体の個々の刺激に関する相加効果を表す。
【０２１３】
ＩＬ−２活性化ＮＫ細胞のＣＤ１０７ａレベル及び細胞内ＩＦＮ−γ産生を、抗ＣＤ１６、抗ＮＫＧ２Ｄまたは両方のモノクローナル抗体の組合せによるプレート結合刺激の４時間後に分析した。グラフは、平均（ｎ＝２）±ＳＤを示す。図１９ＡはＣＤ１０７ａのレベルを示し、図１９ＢはＩＦＮ−γのレベルを示し、図１９ＣはＣＤ１０７ａ及びＩＦＮ−γのレベルを示す。図１９Ａ〜１９Ｃに示したデータは、５人の異なる健康なドナーを使用した５つの独立した実験の典型である。
【０２１４】
実施例８−細胞に発現したヒトＮＫＧ２Ｄに結合するＴｒｉＮＫＥＴの評価
ＥＬ４マウスリンパ腫細胞株を操作して、ヒトＮＫＧ２Ｄを発現させた。多重特異性結合タンパク質、例えば、三重特異性結合タンパク質（ＴｒｉＮＫＥＴ）は、その各々がＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン、ＦＬＴ３結合ドメイン、及びＣＤ１６に結合するＦｃドメインを含有し、ＥＬ４細胞上に発現した細胞外ＮＫＧ２Ｄに結合するそれらの親和性について試験した。ＴｒｉＮＫＥＴを２０μｇ／ｍＬに希釈し、次いで段階的に希釈した。ＴｒｉＮＫＥＴとＮＫＧ２Ｄとの結合を、フルオロフォア複合化抗ヒトＩｇＧ二次抗体を使用して検出した。次いで、細胞をフローサイトメトリーによって分析し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、二次抗体対照を基準として正規化してバックグラウンドに対する倍率（ＦＯＢ）値を得た。
【０２１５】
試験したＴｒｉＮＫＥＴは、Ａ４４−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＦＬＴ３−ＩＭＣＥＢ１０（クローンＡＤＩ−２７７４４からのＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン、ならびにＦＬＴ３モノクローナル抗体ＩＭＣＥＢ１０から、例えば、配列番号：１０９の重鎖可変領域及び配列番号：１１３の軽鎖可変領域を組み込むことによって得られるＦＬＴ３結合ドメイン）、Ａ４４−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＦＬＴ３−４Ｇ８（クローンＡＤＩ−２７７４４からのＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン、ならびにモノクローナル抗体４Ｇ８から、例えば、配列番号：１１７の重鎖可変領域及び配列番号：１２１の軽鎖可変領域を組み込むことによって得られるＦＬＴ３結合ドメイン）、Ａ４９−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＦＬＴ３−ＩＭＣＥＢ１０（クローンＡＤＩ−２７７４９からのＮＫＧ２Ｄ結合ドメインならびにＦＬＴ３モノクローナル抗体ＩＭＣＥＢ１０から、例えば、配列番号：１０９の重鎖可変領域及び配列番号：１１３の軽鎖可変領域を組み込むことによって得られるＦＬＴ３結合ドメイン）、Ａ４９−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＦＬＴ３−４Ｇ８（クローンＡＤＩ−２７７４９からのＮＫＧ２Ｄ結合ドメインならびにモノクローナル抗体４Ｇ８から、例えば、配列番号：１１７の重鎖可変領域及び配列番号：１２１の軽鎖可変領域を組み込むことによって得られるＦＬＴ３結合ドメイン）、Ｃ２６−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＦＬＴ３−４Ｇ８（クローンＡＤＩ−２８２２６からのＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン、ならびにモノクローナル抗体４Ｇ８から、例えば、配列番号：１１７の重鎖可変領域及び配列番号：１２１の軽鎖可変領域を組み込むことによって得られるＦＬＴ３結合ドメイン）であった。ＦＬＴ３モノクローナル抗体ＩＭＣＥＢ１０を対照として使用した。ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを含有するＴｒｉＮＫＥＴ（Ａ４４、Ａ４９、またはＣ２６）は、細胞表面上に発現したＮＫＧ２Ｄに結合することを示した。同じＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを含有するが、異なるＦＬＴ３結合ドメインを含有するＴｒｉＮＫＥＴは、細胞表面上のＮＫＧ２Ｄに対して同様の結合親和性を示した（図３５）。
【０２１６】
実施例９−がん細胞上に発現したＦＬＴ３に結合するＴｒｉＮＫＥＴの評価
ＦＬＴ３を発現するヒトＡＭＬ細胞株（Ｍｏｌｍ−１３及びＥＯＬ−１）を使用して、ＦＬＴ３標的化ＴｒｉＮＫＥＴと腫瘍関連抗原との結合をアッセイした。ＴｒｉＮＫＥＴを細胞と共にインキュベートし、結合を、フルオロフォア複合化抗ヒトＩｇＧ二次抗体を使用して検出した。細胞をフローサイトメトリーによって分析し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、二次抗体対照を基準として正規化してバックグラウンドに対する倍率（ＦＯＢ）値を得た。
【０２１７】
ＩＭＣＥＢ１０または４Ｇ８のＦＬＴ３結合ドメインを含有するＦＬＴ３標的化ＴｒｉＮＫＥＴは、Ｍｏｌｍ−１３及びＥＯＬ−１細胞（図３６Ａ及び図３６Ｂ）に対する結合が陽性を示した。ＩＭＣＥＢ１０または４Ｇ８のいずれかのＦＬＴ−３結合ドメインを含有するＴｒｉＮＫＥＴとヒトＡＭＬ細胞株との結合は、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインに依存しなかった。４Ｇ８のＦＬＴ３結合ドメインを含有するＴｒｉＮＫＥＴは、より高い最大結合及びＥＣ５０値を示した。
【０２１８】
実施例１０−ＦＬＴ３発現細胞上でのＦＬＴ３標的化ＴｒｉＮＫＥＴの内在化
ヒトＡＭＬ細胞株のＭｏｌｍ−１３及びＥＯＬ−１を使用して、細胞表面上に発現したＦＬＴ３に結合した後のＦＬＴ３標的化ＴｒｉＮＫＥＴの内在化を評価した。ＴｒｉＮＫＥＴまたはモノクローナル抗体のリンツズマブを２０μｇ／ｍＬに希釈し、これを使用して細胞を染色した。染色後、試料の３分の２を３７℃で一晩置いて内在化を促進させ、試料の残り３分の１を、フルオロフォア複合化抗ヒトＩｇＧ二次抗体を使用して検出し、ベースラインＭＦＩを得た。３７℃での２時間及び２０時間のインキュベーション後、試料をインキュベーターから取り出し、細胞の表面上にある結合した抗体を、フルオロフォア複合化抗ヒトＩｇＧ二次抗体を使用して検出し、試料ＭＦＩを得た。内在化を算出した：％内在化＝（１−（試料ＭＦＩ／ベースラインＭＦＩ））＊１００％。
【０２１９】
図３７Ａ及び３７Ｂは、それぞれＥＯＬ−１及びＭｏｌｍ−１３細胞とのインキュベーション後におけるＦＬＴ３標的化ＴｒｉＮＫＥＴの内在化を示した。ＣＤ３３はＭｏｌｍ−１３及びＥＯＬ−１細胞株の両方に発現されるため、抗ＣＤ３３モノクローナル抗体のリンツズマブを内在化の陽性対照として使用した。リンツズマブは、両方の細胞株上で高レベルの内在化を示し、内在化は経時的に増加した。ＩＭＣＥＢ１０のＦＬＴ３結合ドメインを含有するＴｒｉＮＫＥＴは、４Ｇ８のＦＬＴ３結合ドメインを含有するＴｒｉＮＫＥＴと比較して、２時間のインキュベーション後により高いレベルの内在化を示した。２０時間のインキュベーション後、４Ｇ８のＦＬＴ３結合ドメインを含有するＴｒｉＮＫＥＴ及びＩＭＣＥＢ１０のＦＬＴ３結合ドメインを含有するＴｒｉＮＫＥＴは、細胞上で同様のレベルの内在化を示した。
【０２２０】
実施例１１−ＴｒｉＮＫＥＴは、がん細胞に対するヒトＮＫ細胞の細胞傷害を増強する
ＦＬＴ３標的化ＴｒｉＮＫＥＴの存在下においてＦＬＴ３発現がん細胞を溶解させるヒトＮＫ細胞の能力を試験するために、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離し、ＮＫ細胞単離のために調製した。ＰＢＭＣを、密度勾配遠心分離法を使用して、ヒト末梢血バフィーコートから単離した。単離したＰＢＭＣを洗浄し、ＮＫ細胞単離のために調製した。ＮＫ細胞を、磁気ビーズを用いたネガティブセレクション技術を使用して単離し、単離したＮＫ細胞の純度は通常、＞９０％のＣＤ３−ＣＤ５６＋であった。単離したＮＫ細胞を、１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２を含有する培地中で培養したか、またはサイトカインを入れずに一晩置いた。ＩＬ−２活性化または置いたＮＫ細胞を、細胞傷害性アッセイで翌日使用した。
【０２２１】
全ての細胞傷害性アッセイを、以下の通りに調製した：ＦＬＴ３陽性腫瘍細胞ＥＯＬ−１を培養物から採取し、ＰＢＳで洗浄して、ＢＡＴＤＡ試薬（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃ１３６−１００）での標識のために、増殖培地中において１０６／ｍＬで再懸濁させた。標的細胞の標識については、製造業者の指示に従った。標識後、細胞をＨＢＳで３回洗浄し、０．５〜１．０×１０５／ｍＬで培養培地中において再懸濁させた。バックグラウンドウェルを調製するために、標識した細胞のアリコートを別に取り、細胞を培地から分離した。１００μＬの培地を３連でウェルに慎重に添加し、細胞ペレット化の妨害を回避した。１００μＬのＢＡＴＤＡ標識細胞を、９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。ウェルを標的細胞からの自然放出のために保存し、ウェルを、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘの添加によって標的細胞の最大溶解のために調製した。ＦＬＴ３モノクローナル抗体またはＦＬＴ３標的化ＴｒｉＮＫＥＴを培養培地中で希釈し、５０μＬの希釈したモノクローナル抗体またはＴｒｉＮＫＥＴを各ウェルに添加した。置いた、及び／または活性化させたＮＫ細胞を培養物から採取して洗浄し、１０５〜２．０×１０６／ｍＬで培養培地中において、所望のエフェクター細胞対標的細胞比に応じて再懸濁させた。５０μＬのＮＫ細胞をプレートの各ウェルに添加し、合計で２００μＬの培養体積とした。プレートを３７℃で５％ＣＯ２を用いて２〜３時間インキュベートしてから、アッセイを進めた。
【０２２２】
２〜３時間の培養後、プレートをインキュベーターから取り出し、細胞を遠心分離によって２００ｇで５分間ペレットにした。２０μＬの培養上清を、製造業者から提供された清浄なマイクロプレートに移し、２００μＬの室温ユウロピウム溶液を各ウェルに添加した。プレートを光から保護し、プレートシェーカー上において２５０ｒｐｍで１５分間インキュベートした。プレートを、Ｖｉｃｔｏｒ３またはＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ｉ３Ｘ機器のいずれかを使用して読み取った。％特異的溶解を、以下の通りに算出した：％特異的溶解＝（（実験的放出−自然放出）／（最大放出−自然放出））＊１００％。
【０２２３】
ＦＬＴ３標的化ＴｒｉＮＫＥＴは、ＦＬＴ３陽性ＥＯＬ−１がん細胞に対するヒトＮＫ細胞の細胞傷害を媒介した。図３８Ａに示す通り、両方のＴｒｉＮＫＥＴ（Ａ４９−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＩＭＣＥＢ１０及びＡ４４−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＩＭＣＥＢ１０）は、がん細胞に対するＮＫ細胞の細胞傷害活性を用量反応的に増強することができた。両方のＴｒｉＮＫＥＴは、対応するＦＬＴ３モノクローナル抗体ＩＭＣＥＢ１０よりも著しく強力であった。図３８Ｂに示す通り、ＴｒｉＮＫＥＴ（Ａ４９−ＴｒｉＮＫＥＴ−４Ｇ８、Ａ４４−ＴｒｉＮＫＥＴ−４Ｇ８、及びＣ２６−ＴｒｉＮＫＥＴ−４Ｇ８）は、がん細胞に対するＮＫ細胞の細胞傷害活性を用量反応的に増強することができた。ＴｒｉＮＫＥＴは、対応するＦＬＴ３モノクローナル抗体４Ｇ８よりも著しく強力であった。さらに、４Ｇ８のＦＬＴ３結合ドメインを含有するＴｒｉＮＫＥＴは、ＩＭＣＥＢ１０のＦＬＴ３結合ドメインを含有するＴｒｉＮＫＥＴよりも、ヒトＮＫ細胞の細胞傷害を媒介する時により強力であった。
【０２２４】
参照による援用
本明細書で言及される特許文献及び科学論文の各々の開示全体は、あらゆる目的のために参照によって組み込まれる。
【０２２５】
均等論
本発明は、その趣旨または本質的特徴から逸脱することなく、他の特定の形態で具現化されてよい。したがって、前述の実施形態は、本明細書に記載される本発明を限定するのではなく、あらゆる点において例示的であると見なされるべきである。したがって、本発明の範囲は、前述の記載によってではなく、添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と等価の意味及び範囲内に入る全ての変更が、本明細書に包含されること意図する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年7月1日(2020.7.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2020529410000001.app
【国際調査報告】
2020529410.tif 000065
2020529410.tif 000066