(57)【要約】本発明は、AIPペプチドおよびポリヌクレオチド組成物、CPVTの治療のためのそのような組成物の使用方法、ならびに心筋の伝導および収縮を調節する薬剤を特徴付けるのに有用なヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞モデルを特徴とする。2020532492.tif 000019
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
CaMKIIペプチド阻害剤をコードするベクターの有効量を含む、薬学的組成物。
【請求項２】
CaMKIIペプチド阻害剤がAIP、CN19、CN19o、CN27、CN21、またはそれらの類似体もしくは断片である、請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
CaMKIIペプチド阻害剤をコードするポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項４】
CaMKIIペプチド阻害剤が、哺乳動物の心臓細胞で該ペプチドの発現を推進するのに適したプロモーターに機能的に連結されている、請求項3に記載の発現ベクター。
【請求項５】
CaMKIIペプチド阻害剤、その類似体または断片の有効量を含む薬学的組成物である、請求項3または4に記載の発現ベクター。
【請求項６】
レトロウイルス、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルスベクターである、請求項3〜5のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項７】
請求項3〜6のいずれか一項に記載の発現ベクターを含む、細胞。
【請求項８】
心臓リアノジンチャネル（RYR2）を含む細胞と、CaMKII阻害剤、CaMKIIペプチド阻害剤、またはCaMKIIペプチド阻害剤をコードするポリヌクレオチドとを接触させることを含む、対象における心不整脈を調節するための方法。
【請求項９】
心臓リアノジンチャネル（RYR2）を含む細胞と、CaMKII阻害剤、CaMKIIペプチド阻害剤、またはCaMKIIペプチド阻害剤をコードするポリヌクレオチドとを接触させることを含む、対象におけるリアノジンチャネル（RYR2）ポリペプチドのリン酸化を阻害するための方法。
【請求項１０】
心不整脈に関連する突然変異を含む対象を治療する方法であって、該対象に、CaMKII阻害剤、CaMKIIペプチド阻害剤、その類似体もしくは断片、またはCaMKIIペプチド阻害剤をコードするポリヌクレオチドを投与することを含む、方法。
【請求項１１】
前記突然変異が心臓リアノジンチャネル（RYR2）にある、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
前記突然変異がRYR2R4651Iである、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
心不整脈を抑制する、請求項8〜12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
対象におけるカテコラミン誘発性多形性心室頻拍を抑制する、請求項8〜13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
CPVTに関連する突然変異を含む心臓リアノジンチャネル（RYR2）を発現する人工多能性幹細胞由来心筋細胞を使用して、心伝導または心収縮をモニタリングすることを含む、心筋細胞を特徴付ける方法。
【請求項１６】
CPVTに関連する突然変異を含む心臓リアノジンチャネル（RYR2）を発現する人工多能性幹細胞由来心筋細胞と候補薬剤とを接触させること、および該細胞における心伝導または心収縮を測定することを含む、化合物のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国を指定した国際出願であり、かつ、その内容全体が参照により本明細書に組み入れられる2017年7月6日に出願された米国仮特許出願第62/529,256号の35 U.S.C.第119条(e)に基づく恩典を主張するものである。
【０００２】
連邦政府の資金提供を受けた研究の下でなされた発明に対する権利の陳述
本発明は、米国国立衛生研究所により授与された助成金番号：NIH U01 HL100401およびUG3 TR002145の下で政府の支援によりなされたものである。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
カテコラミン誘発性多形性心室頻拍（catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia：CPVT）は、異常な心拍リズムを特徴とする病態であり、1万人に1人の割合で罹患する。CPVTの症状には、運動または感情的ストレスに関連しためまいまたは失神が含まれる。心室頻拍のエピソードは、心臓の鼓動を事実上停止させ（心停止）、小児および若年成人では心臓の異常を認めることなく突然死を引き起こすことがある。CPVTの治療としては、運動制限、β遮断薬の使用、および自動式植え込み型除細動器が挙げられる。他の治療法は、外科的交感神経切除術とフレカイニド（flecainide）による治療である。残念ながら、これらの治療は全ての患者に効果があるわけではなく、患者のコンプライアンス、薬物の副作用、または植え込み型除細動器による致命的な電気ストーム（electrical storm）などの有害事象のリスクによって制限されている。
【発明の概要】
【０００４】
本開示の態様は、一部には、CaMKII活性化とその後の下流シグナル伝達を阻害することが、カルシウムリアノジンチャネルRYR2の突然変異に関連するカテコラミン刺激性潜在性不整脈を大幅に低減する、という発見に基づいている。インビボ実験において、本発明者らは、ペプチド阻害剤であるAIPが、CPVTモデルマウスの心臓組織でインビボ発現されると、マウスの不整脈を抑制することを明らかにした。実施例2、図17および18を参照されたい。本発明者らはまた、RYR2のS2814でのセリン残基のCaMKII媒介リン酸化がCPVT突然変異におけるカテコラミン刺激性潜在性不整脈に不可欠であることを見出した。セリンからアラニンへの変異は、RYR2タンパク質にCPVT関連の突然変異を有する心臓細胞について記録された異常なCa2+スパークの頻度を逆転させる。
【０００５】
したがって、以下に記載するように、本発明は、オートカムチド2関連阻害ペプチド（autocamtide-2-related inhibitory peptide：AIP）と関連ペプチド、およびCaM-Kntideと関連ポリペプチド（例えばCN19o）を含めて、Ca2+カルモジュリン依存性キナーゼII（CaMKII）阻害ペプチド、関連するポリヌクレオチド組成物、ならびにCPVTの治療のためにそのような組成物の使用方法を特徴とする。本発明はさらに、CPVT人工多能性幹細胞心筋細胞（iPSC-CM）、およびCPVT治療用の薬剤を特徴付けるためのそれらの使用方法を提供する。
【０００６】
一局面において、本開示は、CaMKIIペプチド阻害剤をコードするベクターの有効量を含む薬学的組成物を提供する。
【０００７】
一局面において、本明細書では、例えばカテコラミン誘発性多形性心室頻拍（CPVT）などの、心不整脈の治療に使用するための、CaMKIIペプチド阻害剤をコードするベクターの有効量を含む薬学的組成物が提供される。
【０００８】
一局面において、本明細書では、例えばCPVTなどの、心不整脈の治療のための医薬の製造に使用するための、CaMKIIペプチド阻害剤をコードするベクターの有効量を含む薬学的組成物が提供される。
【０００９】
別の局面において、本明細書では、CaMKIIペプチド阻害剤をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターが提供される。
【００１０】
一局面において、本明細書では、例えばCPVTなどの、心不整脈の治療に使用するための、CaMKIIペプチド阻害剤をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターが提供される。
【００１１】
一局面において、本明細書では、例えばCPVTなどの、心不整脈の治療のための医薬の製造に使用するための、CaMKIIペプチド阻害剤をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターが提供される。
【００１２】
別の局面において、本明細書では、CaMKIIペプチド阻害剤をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む細胞が提供される。
【００１３】
一局面において、本明細書では、例えばCPVTなどの、心不整脈の治療に使用するための、CaMKIIペプチド阻害剤をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む細胞が提供される。
【００１４】
一局面において、本明細書では、例えばCPVTなどの、心不整脈の治療のための医薬の製造に使用するための、CaMKIIペプチド阻害剤をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む細胞が提供される。
【００１５】
別の局面において、本明細書では、対象における心不整脈を調節するための方法が提供され、この方法は、心臓リアノジンチャネル（RYR2）を含む細胞と、CaMKII阻害剤、CaMKIIペプチド阻害剤、またはCaMKIIペプチド阻害剤をコードするポリヌクレオチドとを接触させることを含む。
【００１６】
別の局面において、本明細書では、対象におけるリアノジンチャネル（RYR2）ポリペプチドのリン酸化を阻害するための方法が提供され、この方法は、心臓リアノジンチャネル（RYR2）を含む細胞と、CaMKII阻害剤、CaMKIIペプチド阻害剤、またはCaMKIIペプチド阻害剤をコードするポリヌクレオチドとを接触させることを含む。
【００１７】
別の局面において、本明細書では、心不整脈に関連する突然変異を含む対象を治療する方法が提供され、この方法は、該対象に、CaMKII阻害剤、CaMKIIペプチド阻害剤、その類似体もしくは断片、またはCaMKIIペプチド阻害剤をコードするポリヌクレオチドを投与することを含む。
【００１８】
別の局面において、本明細書では、心筋細胞を特徴付ける方法が提供され、この方法は、CPVTに関連する突然変異を含む心臓リアノジンチャネル（RYR2）を発現する人工多能性幹細胞由来心筋細胞を使用して、心伝導もしくは心収縮をモニタリングするか、または心不整脈をモニタリングすることを含む。
【００１９】
別の局面において、本明細書では、化合物のスクリーニング方法が提供され、この方法は、CPVTに関連する突然変異を含む心臓リアノジンチャネル（RYR2）を発現する人工多能性幹細胞由来心筋細胞と候補薬剤とを接触させること、および該細胞における心伝導または心収縮を測定することを含む。
【００２０】
上記のいずれか1つの局面の一態様において、CaMKIIペプチド阻害剤はAIP、CN19、CN19o、CN27、CN21、またはそれらの類似体もしくは断片である。
【００２１】
上記のいずれか1つの局面の一態様、または先行態様のいずれか1つにおいて、CaMKIIペプチド阻害剤は、哺乳動物の心臓細胞において該ペプチドの発現を推進するのに適したプロモーターに機能的に連結されている。
【００２２】
上記のいずれか1つの局面の一態様、または先行態様のいずれか1つにおいて、前記ベクターは、CaMKIIペプチド阻害剤、その類似体または断片の有効量を含む薬学的組成物である。
【００２３】
上記のいずれか1つの局面の一態様、または先行態様のいずれか1つにおいて、前記ベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルスベクターである。
【００２４】
上記のいずれか1つの局面の一態様、または先行態様のいずれか1つにおいて、前記突然変異は心臓リアノジンチャネル（RYR2）にある。
【００２５】
上記のいずれか1つの局面の一態様、または先行態様のいずれか1つにおいて、前記突然変異は、RYR2R4651I、RYR2R176Q、RYR2D385N、RYR2S404R、およびRYR2G3946Sからなる群より選択される。
【００２６】
上記のいずれか1つの局面の一態様、または先行態様のいずれか1つにおいて、前記方法は心不整脈を抑制する。
【００２７】
上記のいずれか1つの局面の一態様、または先行態様のいずれか1つにおいて、前記方法は対象におけるカテコラミン誘発性多形性心室頻拍を抑制する。
【００２８】
本発明によって定義される組成物および物品は、以下に提供される実施例との関連で、分離されたものであるか、そうでなければ製造されたものである。本発明の他の特徴および利点は、詳細な説明から、および特許請求の範囲から明らかであろう。
【００２９】
定義
別に定義されない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されている意味を有する。以下の文献は、本発明で使用する用語の多くの一般的な定義を当業者に提供するものである：Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (第2版 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker編, 1988); The Glossary of Genetics, 第5版, R. Rieger et al. (編), Springer Verlag (1991); およびHale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。本明細書で使用する以下の用語は、特に指定のない限り、以下でそれらに割り当てられた意味を有する。
【００３０】
「オートカムチド2関連阻害ペプチド（AIP）」とは、
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の少なくとも約9〜13アミノ酸を含むペプチドまたはその断片を意味し、心臓調節活性および/またはCAMKII阻害活性を有する。一態様では、AIPペプチドは該ペプチド配列中に1つまたは複数の改変を含む。一態様では、AIPペプチドは本質的にSEQ. ID. NO: 1からなる。別の態様では、AIPペプチドはSEQ. ID. NO: 1からなるか、またはSEQ. ID. NO: 1の約9〜13個連続したアミノ酸からなる。一態様では、AIPペプチドは本質的にSEQ. ID. NO: 1からなるか、または本質的にSEQ. ID. NO: 1の約9〜13個連続したアミノ酸からなる。他の態様では、AIPペプチドは1つまたは複数の修飾アミノ酸を含む。
【００３１】
「CAMKII阻害剤」とは、CAMKIIの活性を阻害するペプチドまたは小分子を意味する。例示的な阻害剤は当技術分野で知られており（例：AIP、CN19、CN27、CN19o、CN21）、例えば、Coultrap et al., PLOS One e25245, Vol 6, Issue 10, 2011およびPellicena et al., Frontiers in Pharmacology 21:1-20, 2014に記載されている。その他の阻害剤には次のものが含まれる。
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【００３２】
「AIPポリヌクレオチド」とは、AIPペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。
【００３３】
「薬剤」とは、ペプチド、ポリペプチド、核酸分子、または小分子化合物を意味する。
【００３４】
「改善する」とは、疾患の発症または進行を低減、抑制、減弱、減少、停止、または安定化することを意味する。
【００３５】
AIPペプチドの「改変」とは、AIPペプチドのアミノ酸配列の変化を意味する。
【００３６】
例えば、ポリヌクレオチド類似体は、対応する天然に存在するポリペプチドの生物学的活性を保持しながら、天然に存在するポリヌクレオチドと比較してその類似体の機能を高める特定の生化学的修飾を有する。そのような生化学的修飾は、例えばそのタンパク質コード化機能などの機能的活性を変えることなく、類似体のヌクレアーゼ耐性、膜透過性、または半減期を増大させる可能性がある。類似体は修飾核酸分子を含み得る。
【００３７】
本明細書で使用する用語「心筋細胞」は、広く心臓の筋肉細胞を指す。一態様では、哺乳動物の心臓細胞は心筋細胞である。別の態様では、人工多能性幹細胞から分化した心筋細胞が心筋細胞である。
【００３８】
本明細書で使用する語句「心血管病態、疾患または障害」は、不十分な、望ましくないまたは異常な心機能によって特徴付けられる全ての障害を含むことを意図しており、例えば、虚血性心疾患、心不整脈、高血圧性心疾患および肺高血圧性心疾患、弁膜症、先天性心疾患、および対象、特にヒト対象においてうっ血性心不全を引き起こす病態が含まれる。不十分または異常な心機能は、疾患、損傷、遺伝的変異、および/または加齢の結果であり得る。背景として、心筋損傷への応答は、はっきりとした経路をたどり、一部の細胞は死んでしまい、他の細胞はまだ死んでいないが機能していない冬眠状態に入る。これに続いて、炎症細胞の浸潤、瘢痕化の一部としてのコラーゲンの沈着が起こり、これらの全ては、新しい血管の内部成長およびある程度の継続的な細胞死と並行して起こる。
【００３９】
本明細書で使用する用語「有効量」は、例えば、疾患または障害の少なくとも1つまたは複数の症状を軽減するのに十分なタンパク質の量を表すために、薬学的組成物の治療薬の量を指し、かつ望ましい効果をもたらすのに十分な薬理学的組成物の量を指す。例えば本明細書に記載のAIPペプチドの、本明細書で使用する「治療有効量」という語句は、あらゆる医療に適用できる合理的なベネフィット/リスク比で、障害を治療するのに十分な組成物の量を意味する。したがって、用語「治療有効量」は、例えば、心血管病態、疾患または障害のある典型的な対象に投与したとき、心機能不全もしくは障害に関連する症状または臨床マーカーの治療的または予防的に有意な減少をもたらすのに十分な、本明細書に記載の組成物の量を指す。
【００４０】
例えば、対象の心血管病態または疾患の治療に関して、用語「治療有効量」は、心血管疾患または障害（例えば、心不整脈）の発症を予防するまたは遅らせるのに安全かつ十分な量を指す。したがって、その量は、不整脈を治癒または抑制したり、心血管疾患もしくは障害を緩和したり、心血管疾患の進行の経過を遅らせたり、心血管疾患もしくは障害の症状を遅延または抑制したり、心血管疾患もしくは障害の二次的症状の確立を遅延または抑制したり、心血管疾患もしくは障害の二次的症状の発症を抑制したりすることができる。心血管疾患または障害を治療するための有効量は、治療される心血管疾患のタイプ、症状の重症度、治療される対象、対象の年齢および全身状態、投与方法などに依存する。したがって、正確な「有効量」を指定することはできない。しかしながら、どのような所与のケースでも、適切な「有効量」は、日常的な実験のみを使用して、当業者によって決定され得る。治療の有効性は通常のスキルをもつ医師によって判定され、例えば、有効性は、本明細書に記載の心血管疾患または障害の動物モデル、例えば急性心筋梗塞または虚血再灌流傷害を伴うげっ歯類の治療、および本明細書に記載の心血管疾患または障害の少なくとも1つの症状の減少につながる治療または組成物もしくは製剤の投与により評価することができ、例えば、心臓駆出率の増加、心不全率の低下、梗塞サイズの減少、関連する疾病率（肺水腫、腎不全、不整脈）の減少、運動負荷試験またはその他のQOL（クオリティ・オブ・ライフ）尺度の改善、および死亡率の低下は、有効な治療を示している。心血管疾患または障害の治療に組成物を使用する態様では、その組成物の有効性は、心血管疾患の実験動物モデル、例えば、虚血再灌流傷害の動物モデル（Headrick J P, Am J Physiol Heart circ Physiol 285;H1797; 2003）および急性心筋梗塞の動物モデル（Yang Z, Am J Physiol Heart Circ. Physiol 282:H949: 2002; Guo Y, J Mol Cell Cardiol 33;825-830, 2001）を使用して判定することができる。実験動物モデルを使用する場合、治療の有効性は、心血管疾患または障害の症状の軽減、例えば、呼吸困難、胸痛、動悸、めまい、失神、浮腫、チアノーゼ、蒼白、倦怠感および高血圧の1つまたは複数の症状の軽減が、未治療の動物と比較して、治療された動物でより早く起こる場合に証明される。
【００４１】
本明細書に記載の方法による治療に適した対象は、心不整脈を診断する任意の方法によって識別することができる。これらの病態を診断する方法は当業者に周知である。非限定的な例として、心不整脈は、紙またはコンピュータモニターへの心臓活動のグラフィック記録である心電図（ECGまたはEKG）によって診断され得る。
【００４２】
本明細書で交換可能に使用される用語「冠動脈疾患」および「急性冠症候群」は、心筋梗塞を指し、心血管病態、疾患または障害を指し、不十分な、望ましくないまたは異常な心機能によって特徴付けられる全ての障害、例えば、虚血性心疾患、高血圧性心疾患および肺高血圧性心疾患、弁膜症、先天性心疾患、および対象、特にヒト対象においてうっ血性心不全を引き起こす病態を含む。不十分または異常な心機能は、疾患、損傷および/または加齢の結果であり得る。背景として、心筋損傷への応答は、はっきりとした経路をたどり、一部の細胞は死んでしまい、他の細胞はまだ死んでいないが機能していない冬眠状態に入る。これに続いて、炎症細胞の浸潤、瘢痕化の一部としてのコラーゲンの沈着が起こり、これらの全ては、新しい血管の内部成長およびある程度の継続的な細胞死と並行して起こる。
【００４３】
本開示において、「含む（comprise）」、「含む（comprising）」、「含有する」、および「有する」などは、米国特許法でそれらに定められた意味を有し、「含む（include）」、「含む（including）」などを意味することができる；同様に、「本質的に〜からなる（consisting essentially of）」または「本質的に〜からなる（consist essentially）」は、米国特許法に定められた意味を有し、この用語は非限定的（open-ended）であって、列挙されたものの基本的または新規な特徴が列挙されたもの以外の存在によって変化しない限り、列挙されたもの以外の存在を可能にするが、先行技術の実施態様は除外される。
【００４４】
「断片」とは、ポリペプチドまたは核酸分子の一部分を意味する。この部分は、好ましくは、参照核酸分子またはポリペプチドの全長の少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、または90％を含む。断片は、10、20、30、40、50、60、70、80、90、もしくは100、200、300、400、500、600、700、800、900、もしくは1000個のヌクレオチドまたはアミノ酸を含み得る。
【００４５】
「ハイブリダイゼーション」は、相補的な核酸塩基間の水素結合を意味し、それはワトソン-クリック、フーグスティーンまたは逆フーグスティーンの水素結合であり得る。例えば、アデニンとチミンは、水素結合の形成を介して対合する相補的な核酸塩基である。
【００４６】
「単離された」、「精製された」、または「生物学的に純粋な」という用語は、天然の状態で見られるような、通常それに付随する成分をさまざまな程度に含まない材料を指す。「単離する」は、元の供給源または周囲からの分離の程度を表す。「精製する」は、単離よりも高い分離の程度を表す。「精製された」または「生物学的に純粋な」タンパク質は、不純物がそのタンパク質の生物学的特性に実質的な影響を与えたり、他の有害な影響を引き起こしたりしないように、他の物質が十分に除かれている。すなわち、本発明の核酸またはペプチドは、それが組換えDNA技術により製造される場合には細胞材料、ウイルス材料または培地を、化学合成される場合には化学的前駆物質または他の化学物質を実質的に含まないならば、精製されている。純度および均一性は、一般に、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学技術を用いて測定される。「精製された」という用語は、核酸またはタンパク質が電気泳動ゲルに本質的に1本のバンドを生じさせることを意味しうる。リン酸化またはグリコシル化などの修飾を受けやすいタンパク質の場合、異なる修飾によって異なる単離タンパク質が生じる可能性があり、それらは別々に精製され得る。
【００４７】
「単離されたポリヌクレオチド」とは、本発明の核酸分子が由来する生物の天然に存在するゲノムにおいて、その遺伝子に隣接している遺伝子を含まない、核酸（例えば、DNA）を意味する。したがって、この用語には、例えば、ベクターに；自律的に複製するプラスミドもしくはウイルスに；または原核生物もしくは真核生物のゲノムDNAに組み込まれた組換えDNA；あるいは他の配列とは独立した別個の分子（例えば、PCRまたは制限エンドヌクレアーゼ消化によって生成されたcDNAまたはゲノムもしくはcDNA断片）として存在する組換えDNAが含まれる。さらに、この用語には、DNA分子から転写されたRNA分子、および追加のポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えDNAが含まれる。
【００４８】
「単離されたポリペプチド」とは、天然でそれに付随する成分から分離されている本発明のポリペプチドを意味する。典型的には、該ポリペプチドは、それが天然で結合しているタンパク質および天然に存在する有機分子を、重量で少なくとも60％含まない場合に、単離されている。好ましくは、その調製物は、重量で少なくとも75％、より好ましくは少なくとも90％、最も好ましくは少なくとも99％の本発明のポリペプチドである。本発明の単離されたポリペプチドは、例えば、天然源からの抽出により；そのようなポリペプチドをコードする組換え核酸の発現により；または該タンパク質を化学合成することにより得ることができる。純度は、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはHPLC分析などの、適切な方法により測定され得る。
【００４９】
本明細書で使用する「薬剤を得る」におけるような「得る」は、薬剤を合成すること、購入すること、または他の方法で取得することを含む。
【００５０】
本明細書に記載の心不整脈との関連で、または症状との関連で「軽減（低減）する」とは、不整脈もしくは症状の発生率、または症状の重症度の、少なくとも1％、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも25％、少なくとも50％、少なくとも75％、または少なくとも100％（1％から100％までの全整数パーセントを含む）の軽減・低減を意味する。
【００５１】
「参照配列」は、配列比較の基礎として使用される定義された配列である。参照配列は、指定された配列の一部もしくは全体；例えば、完全長のcDNAもしくは遺伝子配列のセグメント、または完全なcDNAもしくは遺伝子配列であり得る。ポリペプチドの場合、参照ポリペプチド配列の長さは、一般に、少なくとも約16アミノ酸、好ましくは少なくとも約20アミノ酸、より好ましくは少なくとも約25アミノ酸、さらにより好ましくは約35アミノ酸、約50アミノ酸、または約100アミノ酸である。核酸については、参照核酸配列の長さは、一般に、少なくとも約50ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約60ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約75ヌクレオチド、さらにより好ましくは約100ヌクレオチドまたは約300ヌクレオチド、またはその辺りもしくはその間の任意の整数である。一態様において、参照AIPペプチドは、
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である。
【００５２】
本発明の方法において有用な核酸分子には、本発明のポリペプチドまたはその断片をコードする核酸分子が含まれる。そのような核酸分子は、内因性核酸配列と100％同一である必要はないが、一般的には実質的な同一性を示すであろう。内因性配列に対して「実質的な同一性」を有するポリヌクレオチドは、典型的には、二本鎖核酸分子の少なくとも1つの鎖とハイブリダイズすることができる。本発明の方法において有用な核酸分子には、本発明のポリペプチドまたはその断片をコードする核酸分子が含まれる。そのような核酸分子は、内因性核酸配列と100％同一である必要はないが、一般的には実質的な同一性を示すであろう。内因性配列に対して「実質的な同一性」を有するポリヌクレオチドは、典型的には、二本鎖核酸分子の少なくとも1つの鎖とハイブリダイズすることができる。「ハイブリダイズする」とは、様々なストリンジェンシー条件下で、相補的ポリヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載の遺伝子）またはその部分の間で二本鎖分子を形成するために対合することを意味する（例えば、Wahl, G. M. and S. L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399; Kimmel, A. R. (1987) Methods Enzymol. 152:507を参照されたい）。
【００５３】
例えば、ストリンジェントな塩濃度は通常、約750mM未満のNaClおよび75mM未満のクエン酸三ナトリウム、好ましくは約500mM未満のNaClおよび50mM未満のクエン酸三ナトリウム、より好ましくは約250mM未満のNaClおよび25mM未満のクエン酸三ナトリウムである。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは有機溶媒、例えばホルムアミドの非存在下で得られ、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは少なくとも約35％ホルムアミド、より好ましくは少なくとも約50％ホルムアミドの存在下で得られる。ストリンジェントな温度条件は通常、少なくとも約30℃、より好ましくは少なくとも約37℃、最も好ましくは少なくとも約42℃の温度を含む。様々な追加のパラメータ、例えば、ハイブリダイゼーション時間、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）などの界面活性剤の濃度、キャリアDNAの包含または除外などは、当業者に周知である。様々なレベルのストリンジェンシーは、必要に応じてこれらの様々な条件を組み合わせることによって達成される。好ましい実施態様では、ハイブリダイゼーションは、750mM NaCl、75mMクエン酸三ナトリウム、および1％SDS中30℃で起こる。より好ましい実施態様では、ハイブリダイゼーションは、500mM NaCl、50mMクエン酸三ナトリウム、1％SDS、35％ホルムアミド、および100μg/ml変性サケ精子DNA（ssDNA）中37℃で起こる。最も好ましい実施態様では、ハイブリダイゼーションは、250mM NaCl、25mMクエン酸三ナトリウム、1％SDS、50％ホルムアミド、および200μg/ml ssDNA中42℃で起こる。これらの条件に対する有用なバリエーションは、当業者には容易に明らかであろう。
【００５４】
ほとんどの適用例では、ハイブリダイゼーションに続く洗浄ステップでもストリンジェンシーが異なるであろう。洗浄のストリンジェンシー条件は、塩濃度と温度によって定義され得る。上記のように、洗浄のストリンジェンシーは、塩濃度を下げるか温度を上げることにより高めることができる。例えば、洗浄ステップのためのストリンジェントな塩濃度は、好ましくは約30mM未満のNaClおよび3mM未満のクエン酸三ナトリウム、最も好ましくは約15mM未満のNaClおよび1.5mM未満のクエン酸三ナトリウムである。洗浄ステップのためのストリンジェントな温度条件は通常、少なくとも約25℃、より好ましくは少なくとも約42℃、さらにより好ましくは少なくとも約68℃の温度を含む。好ましい実施態様では、洗浄ステップは、30mM NaCl、3mMクエン酸三ナトリウム、および0.1％SDS中25℃で起こる。より好ましい実施態様では、洗浄ステップは、15mM NaCl、1.5mMクエン酸三ナトリウム、および0.1％SDS中42℃で起こる。より好ましい実施態様では、洗浄ステップは、15mM NaCl、1.5mMクエン酸三ナトリウム、および0.1％SDS中68℃で起こる。これらの条件の追加のバリエーションは、当業者には容易に明らかであろう。ハイブリダイゼーション技術は当業者に周知であり、例えば、以下の文献に記載されている：Benton and Davis (Science 196:180, 1977); Grunstein and Hogness (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 72:3961, 1975); Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, 2001); Berger and Kimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, New York); およびSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York。
【００５５】
「実質的に同一」とは、参照アミノ酸配列（例えば、本明細書に記載のアミノ酸配列のいずれか1つ）または核酸配列（例えば、本明細書に記載の核酸配列のいずれか1つ）に対して少なくとも50％の同一性を示すポリペプチドまたは核酸分子を意味する。好ましくは、そのような配列は、比較のために使用される配列と、アミノ酸または核酸レベルで、少なくとも60％同一、より好ましくは80％または85％、より好ましくは90％、95％または99％さえも同一である。
【００５６】
配列同一性は、一般的には、配列解析ソフトウェアを使用して測定される（例えば、Genetics Computer Group（University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705）の配列解析ソフトウェアパッケージ；BLAST、BESTFIT、GAP、またはPILEUP/PRETTYBOXプログラム）。そのようなソフトウェアは、様々な置換、欠失および/または他の修飾に対する相同性の程度を割り当てることにより、同一または類似の配列を照合する。保存的置換は通常、次のグループ内の置換を含む：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リシン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。同一性の程度を決定するための例示的なアプローチでは、BLASTプログラムを使用することができ、この場合には、e-3とe-100の間の確率スコアが密接に関連する配列を示している。
【００５７】
本明細書で使用する用語「調節する」は、ある程度に調節または調整することを指す。
【００５８】
本明細書で使用する用語「薬学的に許容される」、「生理学的に許容される」およびそれらの文法上の変形は、それらが組成物、担体、希釈剤および試薬を指すとき、交換可能に使用され、悪心、めまい、胃の不調などの望ましくない生理作用をもたらすことなく、材料を哺乳動物に投与できることを表す。薬学的に許容される担体は、それと混合される薬剤に対する免疫反応の高まりを、そのような要望がない限り、促進しない。活性成分が溶解または分散されている薬理学的組成物の調製は、当技術分野でよく理解されており、配合・処方に基づいて限定される必要はない。典型的には、そのような組成物は、溶液または懸濁液のいずれかとして注射可能に調製されるが、使用に先立って液体中に溶解または懸濁するのに適した固体剤形としても調製され得る。調製物はまた、乳化してもよく、またはリポソーム組成物として提示してもよい。活性成分は、本明細書に記載の治療方法で使用するのに適した量で、薬学的に許容されかつ活性成分と適合しうる賦形剤と混合され得る。適切な賦形剤には、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組み合わせが含まれる。さらに、必要に応じて、組成物は、活性成分の有効性を高める、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝剤などの少量の補助物質を含むことができる。本発明の治療用組成物は、その中の成分の薬学的に許容される塩を含むことができる。薬学的に許容される塩には、例えば塩酸、リン酸などの無機酸、または酢酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸により形成される酸付加塩（ポリペプチドの遊離アミノ基により形成される）が含まれる。また、遊離カルボキシル基により形成される塩は、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、水酸化第二鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導され得る。生理学的に許容される担体は、当技術分野で周知である。例示的な液状担体は無菌の水溶液であり、これは活性成分と水のほかに材料を含まないか、または緩衝液、例えば生理的pH値のリン酸ナトリウム、生理食塩水、またはその両方、例えばリン酸緩衝生理食塩水を含む。さらに、水性担体は、塩化ナトリウム、塩化カリウムなどの塩だけでなく、複数の緩衝塩、デキストロース、ポリエチレングリコール、他の溶質を含むことができる。液体組成物はまた、水に加えて、または水を除外して、液相を含んでもよい。そのような追加の液相の例は、グリセリン、綿実油などの植物油、および水-油エマルジョンである。特定の障害または病態の治療に有効な、本明細書に記載の方法で使用される活性薬剤の量は、その障害または病態の性質に依存し、標準的な臨床技術により決定することができる。適切な薬学的担体は、この技術分野の標準的な参考書であるRemington's Pharmaceutical Sciences, A. Osolに記載されている。例えば、注射による投与に適した非経口組成物は、1.5重量％の活性成分を0.9％塩化ナトリウム溶液に溶解することにより調製される。
【００５９】
一態様では、「薬学的に許容される」担体には、インビトロ細胞培養培地は含まれない。
【００６０】
一態様では、用語「薬学的に許容される」は、連邦政府もしくは州政府の規制当局によって承認されていること、または動物、より具体的にはヒトへの使用について米国薬局方もしくは他の一般的に承認された薬局方に掲載されていることを意味する。具体的には、それは、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、その他の問題または合併症を伴わずに、合理的なベネフィット/リスク比に見合って、人間および動物の組織と接触させて使用するのに適した化合物、材料、組成物、および/または剤形を指す。
【００６１】
「担体」という用語は、治療薬と共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。そのような薬学的担体は、無菌の液体、例えば水および油であり、油には、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などの石油、動物、植物または合成起源のものが含まれる。薬学的組成物を静脈内投与する場合には、水が好ましい担体である。生理食塩水、デキストロースおよびグリセロールの水溶液も、特に注射剤の、液状担体として使用することができる。適切な薬学的賦形剤としては、以下が挙げられる：デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなど。組成物は、必要に応じて、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはpH緩衝剤をも含むことができる。これらの組成物は、溶液剤、懸濁液剤、乳濁液剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉剤、徐放性製剤などの形態をとることができる。組成物は、従来の結合剤および担体、例えばトリグリセリドを用いて、坐剤として製剤化することができる。経口製剤には、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的な担体を含めることができる。適切な薬学的担体の例は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 第18版, Gennaro編 (Mack Publishing Co., 1990)に記載されている。製剤は投与方法に適合させるべきである。
【００６２】
本明細書で使用する「対象」には、遺伝子治療ベクター、細胞ベースの治療薬、および本明細書に記載の方法を用いて治療できる、単一遺伝子疾患、障害または病態の症状を示す任意の動物が含まれる。好ましい態様では、対象は、遺伝子治療ベクター、細胞ベースの治療薬、および本明細書で企図される方法を用いて治療できる疾患、障害または病態の症状を示す任意の動物を含む。適切な対象（例えば、患者）には、実験動物（マウス、ラット、ウサギ、モルモットなど）、農場飼育動物、家畜またはペット（ネコ、イヌなど）が含まれる。非ヒト霊長類と、好ましくはヒト患者が含まれる。典型的な対象には、治療によって調節され得る1つまたは複数の生理学的活動の異常な量（「正常」または「健康」な対象よりも低いまたは高い量）を示す動物が含まれる。対象は哺乳動物を意味し、ヒトまたはウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ、ネコなどの非ヒト哺乳動物を含むがこれらに限定されない。
【００６３】
本明細書で提供される範囲は、その範囲内の全ての値の省略表現であることが理解される。例えば、1〜50の範囲は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50からなる群からの任意の数、数の組み合わせ、または部分範囲を含むと理解される。 
【００６４】
用語「組織」は、ある種の特殊な機能を一緒に果たす、同じように特殊化された細胞の群または層を指す。用語「組織特異的」は、特殊な組織からの細胞の供給源または決定的特徴を指す。
【００６５】
本明細書で使用する用語「治療する」または「治療」は、障害および/またはそれに関連する症状を軽減または改善することを指す。排除するものではないが、障害または病態を治療することは、障害、病態またはそれに関連する症状が完全に消失することを必要としないことが理解されよう。
【００６６】
特に明記されないか、文脈から明らかでない限り、本明細書で使用する用語「または」は包括的であると理解される。特に明記されないか、文脈から明らかでない限り、本明細書で使用する用語「1つの（a）」、「1つの（an）」および「その（the）」は単数形または複数形であると理解される。
【００６７】
特に明記されないか、文脈から明らかでない限り、本明細書で使用する用語「約」は、当技術分野の通常の許容範囲内、例えば平均の2標準偏差内、であると理解される。約は、記載された値の10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、または0.01％以内と理解される。文脈から特に明らかでない限り、本明細書に記載される全ての数値は、約という用語によって修飾される。
【００６８】
本明細書での変動要因の定義における化学基のリストの列挙は、リストされた化学基の任意の単一の化学基または組み合わせとしての、その変動要因の定義を含む。本明細書における変動要因または局面の実施態様の列挙は、任意の単一の実施態様としての、または任意の他の実施態様もしくはその一部と組み合わせた、その実施態様を含む。
【００６９】
本明細書に記載される組成物または方法はどれも、本明細書に記載される他の組成物および方法のいずれか1つまたは複数と組み合わせることができる。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】図1A〜1Cは、孤立したiPSC-CM島のCa2+振動の評価を示す。図1Aは、サルコメアマーカーACTN2を染色されたWT、CPVTp、およびCPVTe iPSC-CMの免疫蛍光画像を示す。これらの細胞株は見分けがつかなかった。バー、50μm。図1Bは、共焦点ラインスキャンイメージングにより、Fluo-4を添加したiPSC-CMから記録されたCa2+スパークを示す。バイオリンプロットは、Ca2+スパーク頻度の分布を示す。各形状の近くの数字は細胞クラスターの数を示す。図1Cは、孤立したiPSC-CM島の共焦点ラインスキャンイメージングにより記録されたCa2+振動を示す。矢印と矢じりは、それぞれ、異常な早期および遅延Ca2+放出イベントを示す。各形状の近くの数字は細胞クラスターの数を示す。多重検定補正によるSteel Dwassノンパラメトリック検定；#, WTに対して；†, WT+ISOに対して；§, CPVTpに対して；\, CPVTに対して。*, P＜0.05; **, P＜0.01; ***, P＜0.001。
【図２Ａ】図2A〜2Fは、不整脈モデリングのための人工的に作り出されたオプトMTF（opto-MTF）心臓組織を示す。図2Aは、組織レベルのCa2+波の伝播と収縮を光学的にペーシングして光学的に測定するためのオプトMTFシステムの概略図を示す。ChR2を発現するようにプログラムされた心筋細胞を、一端に柔軟なカンチレバーを備えたマイクロ成形ゼラチン上に播種する。光ファイバを使用した焦点照明が細胞を励起し、結果的に、MTFに沿ってカンチレバーへとCa2+波の伝播をもたらす。Ca2+波の伝播は、Ca2+感受性色素X-Rhod-1の蛍光イメージング、およびカンチレバーの暗視野イメージングによる機械的収縮によって測定される。
【図２Ｂ】図2A〜2Fは、不整脈モデリングのための人工的に作り出されたオプトMTF心臓組織を示す。図2Bは、ACTN2染色されたオプトMTFの共焦点画像を示す。マイクロ成形ゼラチンは、iPSC-CMの長軸がMTFの長軸と整合するように、iPSC-CMを成長させる。
【図２Ｃ】図2A〜2Fは、不整脈モデリングのための人工的に作り出されたオプトMTF心臓組織を示す。図2Cは、CPVTpオプトMTFにおける興奮-収縮カップリング（excitation-contraction coupling）を示す。代表的なタイムラプス（time lapse）画像は、光遺伝学的な点刺激によって誘発されたCa2+波の伝播と記録された機械的収縮を示す。
【図２Ｄ】図2A〜2Fは、不整脈モデリングのための人工的に作り出されたオプトMTF心臓組織を示す。図2Dは、図2Cの右端の画像のａ〜ｄと表示された点で記録されたCa2+トレースを示す。各トレースを横切る垂直の平行線は、刺激点での光学的ペーシングを示す。活性化時間は、Ca2+シグナルの最大アップストローク（upstroke：立ち上がり）速度までの時間である。CaTD80は、80％減衰でのCa2+トランジェント（transient）の持続時間である。
【図２Ｅ】図2A〜2Fは、不整脈モデリングのための人工的に作り出されたオプトMTF心臓組織を示す。図2Eは、1.5HzのペーシングでのWTおよびCPVTpオプトMTFについての活性化時間、Ca2+波の速度と方向、およびCaTD80の空間マップを示し、両方の組織の秩序だった挙動を示している。バー、1mm。
【図２Ｆ】図2A〜2Fは、不整脈モデリングのための人工的に作り出されたオプトMTF心臓組織を示す。図2Fは、自発的に拍動する細胞島またはオプトMTF組織における後脱分極の頻度の比較を示す。Fisherの正確検定：***, P＜0.001。
【図３Ａ】図3A〜3Iは、CPVTオプトMTFの特性評価を示す。図3Aは、CPVTpオプトMTF Ca2+波面伝播およびカンチレバー収縮のタイムラプス画像を示す。Ca2+シグナルの時間微分から計算されたCa2+波面は、スパイラルリエントリー（spiral wave re-rntry）を示す。バー、1mm。
【図３Ｂ】図3A〜3Iは、CPVTオプトMTFの特性評価を示す。図3Bは、リエントリー時のCa2+シグナルおよび収縮応力のトレースを示す。3HzでペーシングされたCPVTpオプトMTFの代表例。各トレースを横切る垂直の平行線は、刺激部位での光学的ペーシングを示す。
【図３Ｃ】図3A〜3Iは、CPVTオプトMTFの特性評価を示す。図3Cは、CPVTおよびWTオプトMTFでのリエントリーの発生を示す。高≧2Hzペーシング；低＜2Hzペーシング。高いペーシングレートおよびISOはリエントリーの発生を増加させた。同じ条件でのWTに対するPearsonのカイ二乗検定：†, P＜0.05；††, P＜0.01；†††, P＜0.001。バーにはサンプル数が示される。
【図３Ｄ】図3A〜3Iは、CPVTオプトMTFの特性評価を示す。図3D〜3Fは、WTまたはCPVTpオプトMTFにおけるCa2+波の活性化時間、速度、およびCaTD80の空間マップを示す。同じ組織が1.5Hzまたは3Hzのペーシングで示される。3Hzのペーシングにより、時空間的不均一性（spatiotemporal heterogeneity）が増加した。
【図３Ｅ】図3A〜3Iは、CPVTオプトMTFの特性評価を示す。図3D〜3Fは、WTまたはCPVTpオプトMTFにおけるCa2+波の活性化時間、速度、およびCaTD80の空間マップを示す。同じ組織が1.5Hzまたは3Hzのペーシングで示される。3Hzのペーシングにより、時空間的不均一性が増加した。
【図３Ｆ】図3A〜3Iは、CPVTオプトMTFの特性評価を示す。図3D〜3Fは、WTまたはCPVTpオプトMTFにおけるCa2+波の活性化時間、速度、およびCaTD80の空間マップを示す。同じ組織が1.5Hzまたは3Hzのペーシングで示される。3Hzのペーシングにより、時空間的不均一性が増加した。
【図３Ｇ】図3A〜3Iは、CPVTオプトMTFの特性評価を示す。図3G〜3Hは、ISO刺激下で、ペーシング周波数の関数として、正規化したグローバル速度およびCaTD80（図3G）と、それらの空間的および時間的分散（図3H）を示す。1：1カップリングを有する組織からのデータを含めた（＞3回の採取からn＝12 WT、12 CPVTp、13 CPVTe）。滑らかな線は、データにフィットする二次関数である。網掛け部分は、フィットの95％信頼区間を表す。図3Gでは、データを、ISOなしに1.5Hzでペーシングした同じオプトMTFからの値に対して正規化した。
【図３Ｈ】図3A〜3Iは、CPVTオプトMTFの特性評価を示す。図3G〜3Hは、ISO刺激下で、ペーシング周波数の関数として、正規化したグローバル速度およびCaTD80（図3G）と、それらの空間的および時間的分散（図3H）を示す。1：1カップリングを有する組織からのデータを含めた（＞3回の採取からn＝12 WT、12 CPVTp、13 CPVTe）。滑らかな線は、データにフィットする二次関数である。網掛け部分は、フィットの95％信頼区間を表す。
【図３Ｉ】図3A〜3Iは、CPVTオプトMTFの特性評価を示す。図3Iは、WTオプトMTFとCPVTオプトMTFにおけるCa2+伝播の54の組織レベルパラメータを示すボルケーノプロット（volcano plot）を示す。9つのマーカーのそれぞれは、ISOありおよびISOなしに3つの異なるペーシングレート（1、2、および3Hz）で測定された表示特性を表す。網掛け部分は、P＜0.05および2倍超の変化（fold change）を伴うパラメータを示す。A、D〜Fのバー＝1mm
【図４Ａ】図4A〜4Dは、CPVTオプトMTFにおけるリエントリーの開始を示す。図4Aは、ISOを用いた2HzペーシングでのCPVTpオプトMTFを示す。活性化マップと速度場は整然と秩序だっていた。速度ヒストグラムは狭い範囲の値を反映している。
【図４Ｂ】図4A〜4Dは、CPVTオプトMTFにおけるリエントリーの開始を示す。図4Bは、パネル図4Aの点aおよびbからのCa2+トレーシングを示す。
【図４Ｃ】図4A〜4Dは、CPVTオプトMTFにおけるリエントリーの開始を示す。図4Cは、ISOを用いて3Hzでペーシングした、図4Aと同じオプトMTFを示す。速度場でのより大きな不均一性と、活性化マップの秩序の破壊が認められる。局所的な伝導ブロックと逆行伝導はパルス＃18および＃19で明らかになる。ヒストグラムは、速度のより大きな空間的分散を示す。
【図４Ｄ】図4A〜4Dは、CPVTオプトMTFにおけるリエントリーの開始を示す。図4Dは、パネル図4Cの点aおよびbでのCa2+トレーシングを示す。伝導ブロックとリエントリーの開始は、Ca2+トランジェントの異常と関連していた。
【図５Ａ】図5A〜5Fは、RYR2-S2814のCaMKIIリン酸化が、孤立した細胞クラスターでCPVT不整脈表現型を発現するのに必要であることを示す。図5Aは、孤立した細胞クラスターのiPSC-CMがISOと選択的CaMKII阻害剤（C）またはPKA阻害剤（P）で処理されたことを示す。Ca2+スパークを共焦点ラインスキャニングにより画像化した。
【図５Ｂ】図5A〜5Fは、RYR2-S2814のCaMKIIリン酸化が、孤立した細胞クラスターでCPVT不整脈表現型を発現するのに必要であることを示す。図5Bは、RYR2（四量体の2つのサブユニットが示される）の概略図を示す。3つの重要な残基が強調表示されている：S2808、PKAリン酸化の標的；S2814、CaMKIIリン酸化の標的；およびR4651、CPVTpで突然変異する。
【図５Ｃ】図5A〜5Fは、RYR2-S2814のCaMKIIリン酸化が、孤立した細胞クラスターでCPVT不整脈表現型を発現するのに必要であることを示す。図5C〜5Dは、CPVTeでのCa2+スパーク頻度がS2814A変異によって減少したが、S2808A変異によっては減少しなかったことを示す。図5Cは、代表的なトレースを示す。
【図５Ｄ】図5A〜5Fは、RYR2-S2814のCaMKIIリン酸化が、孤立した細胞クラスターでCPVT不整脈表現型を発現するのに必要であることを示す。図5C〜5Dは、CPVTeでのCa2+スパーク頻度がS2814A変異によって減少したが、S2808A変異によっては減少しなかったことを示す。図5Dは、Ca2+スパーク頻度の分布を示す。
【図５Ｅ】図5A〜5Fは、RYR2-S2814のCaMKIIリン酸化が、孤立した細胞クラスターでCPVT不整脈表現型を発現するのに必要であることを示す。図5E〜5Fは、異常なCa2+トランジェント頻度を示す。矢印と矢じりは、代表的なトレーシングでの早期および後期の異常なCa2+放出イベントを示す（図5E）。
【図５Ｆ】図5A〜5Fは、RYR2-S2814のCaMKIIリン酸化が、孤立した細胞クラスターでCPVT不整脈表現型を発現するのに必要であることを示す。図5E〜5Fは、異常なCa2+トランジェント頻度を示す。細胞あたりの異常なCa2+トランジェントの割合の分布（図5F）。多重検定補正によるSteel-Dwassノンパラメトリック検定；†, 一致するISO処理を行ったWTに対して；§, 一致するISO処理を行ったCPVTeに対して。†または§, P＜0.05；††または§§, P＜0.01；†††または§§§, P＜0.001。
【図６Ａ】図6A〜6Hは、RYR2-S2814A突然変異がCPVT人工組織においてリエントリーを妨げることを示す。図6Aは、CPVTe-S2814A iPSC-CMを使用して構築されたオプトMTFの共焦点画像である。筋細胞がマイクロ成形ゼラチン基板によって整列されている。
【図６Ｂ】図6A〜6Hは、RYR2-S2814A突然変異がCPVT人工組織においてリエントリーを妨げることを示す。図6Bは、代表的なCPVTe-S2814AオプトMTFを示す。Ca2+トランジェントと収縮期収縮は、3Hzの光刺激（青い線）により1：1でカップリングした。
【図６Ｃ】図6A〜6Hは、RYR2-S2814A突然変異がCPVT人工組織においてリエントリーを妨げることを示す。図6Cは、一致する条件下での、WT（†）およびCPVTe（§）オプトMTFと比較したCPVTe-S2814Aにおけるリエントリーの発生を示す。Pearsonのカイ二乗検定：†または§, P＜0.05；††または§§, P＜0.01；†††または§§§, P＜0.001。バーにはサンプルサイズが示される。
【図６Ｄ】図6A〜6Hは、RYR2-S2814A突然変異がCPVT人工組織においてリエントリーを妨げることを示す。図6Dは、ISOの存在下に1.5Hzまたは3.0Hzでペーシングした同じCPVTe-S2814AオプトMTFの空間マップを示す。活性化時間、Ca2+波の伝播速度、およびCaTD80はよく組織化されており、CPVTeと比較して比較的均一であった（図3を参照）。
【図６Ｅ】図6A〜6Hは、RYR2-S2814A突然変異がCPVT人工組織においてリエントリーを妨げることを示す。図6E〜6Fは、CPVTおよびWTと比較したCPVTe-S2814Aにおけるペーシング周波数の関数としての、グローバル速度およびCaTD80（図6E）またはそれらの空間的もしくは時間的分散（図6F）を示す。サンプルをISOで処理した。サンプルをISOで処理した。あらゆる刺激に対して1：1で応答する組織のみを含めた（＞3回の採取からn＝12 WT、12 CPVTp、13 CPVTe、および18 CPVTe-S2814A）。滑らかな線は、データにフィットする二次関数である；網掛け部分は、フィットの95％信頼区間を表す。グローバル速度およびCaTD80は、ISOなしに1.5Hzで得られた同じ組織からのデータに対して正規化した。
【図６Ｆ】図6A〜6Hは、RYR2-S2814A突然変異がCPVT人工組織においてリエントリーを妨げることを示す。図6E〜6Fは、CPVTおよびWTと比較したCPVTe-S2814Aにおけるペーシング周波数の関数としての、グローバル速度およびCaTD80（図6E）またはそれらの空間的もしくは時間的分散（図6F）を示す。サンプルをISOで処理した。サンプルをISOで処理した。あらゆる刺激に対して1：1で応答する組織のみを含めた（＞3回の採取からn＝12 WT、12 CPVTp、13 CPVTe、および18 CPVTe-S2814A）。滑らかな線は、データにフィットする二次関数である；網掛け部分は、フィットの95％信頼区間を表す。グローバル速度およびCaTD80は、ISOなしに1.5Hzで得られた同じ組織からのデータに対して正規化した。
【図６Ｇ】図6A〜6Hは、RYR2-S2814A突然変異がCPVT人工組織においてリエントリーを妨げることを示す。図6Gは、Ca2+波伝播の54の組織レベルパラメータのボルケーノプロットを示す（図3を参照）。CPVT組織パラメータとは異なり、CPVTe-S2814A組織パラメータはWTの組織パラメータと統計的に差がなかった。
【図６Ｈ】図6A〜6Hは、RYR2-S2814A突然変異がCPVT人工組織においてリエントリーを妨げることを示す。図6Hは、CaMKII阻害ペプチドオートカムチド（AIP）をコードするアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターを作成するための実験戦略を示す概略図を提供する。AAV9をマウスに腹腔内注射して電気生理学（EP）研究を行った。
【図７】図7は、心臓（上列）における、および心臓組織の顕微鏡写真におけるAAV9-GFP-AIPの発現を示す一連のパネルを提供する。
【図８】図8は、AAV9ウイルスに感染した心筋細胞の割合を示す2つのグラフを提供する。左のグラフは、GFPシグナルが低い細胞とGFPシグナルが中等度の細胞を示す。各対の列の左側の列はGFP低度であり、右側の列はGFP中等度である。右のグラフは、異なるAIPを含む細胞を示し、各3列セット中の列は、左から右へ、AIP中等度、高度、および十分である。各パネルの最初のセットの列には、これらの識別子が含まれる。
【図９】図9は、AIP発現ベクターAAV9-GFP-AIP、または対照ベクターを注射したp10マウスからの全心臓溶解物中のリン酸化（P）CaMKII対CaMKII（全体）のレベルを示すウエスタンブロットの画像を提供する。
【図１０】図10は、AAV9-GFP-AIPまたは対照ベクターを発現する細胞におけるCaMKIIリン酸化の定量化を示すボックスプロットを提供する。
【図１１】図11は、CPVTのモデルとして心臓リアノジンチャネル（RYR2）におけるR176Qのノックインを示す概略図を提供する。
【図１２】図12は、マウスにおけるペーシングおよび記録用のカテーテルの配置を示す概略図である。この方法は、Mathur, N. et al. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology (2009)に詳しく記載されている。
【図１３】図13は、マウスCPVT不整脈を誘発して記録するために使用されるプロトコルを示す概略図である。
【図１４−１】図14は、野生型マウスおよび心臓リアノジンチャネル（RYR2）にR176Q突然変異を有するマウスのベースライン心電図を示す。
【図１４−２】図14は、野生型マウスおよび心臓リアノジンチャネル（RYR2）にR176Q突然変異を有するマウスのベースライン心電図を示す。
【図１５】図15は、野生型（WT）マウスおよび心臓リアノジンチャネル（RYR2）にR176Qのノックインを有するマウスにおける心拍数の変化を示すグラフであり、この場合、マウスはCaMKII阻害ペプチドオートカムチド（AIP）またはGFP対照をコードするアデノウイルスを発現している。各3列セット中の列は、左から右へ、ベースライン、イソプロテレノール、およびエピネフリンである。最初のセットの列には、これらの識別子が含まれる。
【図１６】図16は、QT間隔の変化を定量化するグラフである。各3列セット中の列は、左から右へ、ベースライン、イソプロテレノール、およびエピネフリンである。最初のセットの列には、これらの識別子が含まれる。
【図１７】図17A〜17Dは、GFP発現対照ベクターまたはAIP発現ベクターを注射した、心臓リアノジンチャネル（RYR2）にR176Q変異を有するマウス（R176Q変異型マウス）におけるベースラインおよび自発性不整脈を示す心電図である。
【図１８Ａ】図18A〜18Fは、AIPのインビボ発現がペーシング（図18A〜18B）およびカテコラミン（図18C〜18D）により誘発される不整脈の確率を低下させることを示す。
【図１８Ｂ】図18A〜18Fは、AIPのインビボ発現がペーシング（図18A〜18B）およびカテコラミン（図18C〜18D）により誘発される不整脈の確率を低下させることを示す。
【図１８Ｃ】図18A〜18Fは、AIPのインビボ発現がペーシング（図18A〜18B）およびカテコラミン（図18C〜18D）により誘発される不整脈の確率を低下させることを示す。
【図１８Ｄ】図18A〜18Fは、AIPのインビボ発現がペーシング（図18A〜18B）およびカテコラミン（図18C〜18D）により誘発される不整脈の確率を低下させることを示す。
【図１８Ｅ】図18A〜18Fは、AIPのインビボ発現がペーシング（図18A〜18B）およびカテコラミン（図18C〜18D）により誘発される不整脈の確率を低下させることを示す。図18Eは、AAV9ウイルスの用量を増加した場合の相対的形質導入レベルを示す。
【図１８Ｆ】図18A〜18Fは、AIPのインビボ発現がペーシング（図18A〜18B）およびカテコラミン（図18C〜18D）により誘発される不整脈の確率を低下させることを示す。図18Fは、様々な用量のAIPによる誘発された心室性不整脈の抑制を示す。**P＜0.001；§P＝0.7；*P＜0.01；†P＝0.4。Nは示した通り。カイ2乗によるP値。
【図１９Ａ−１】図19A〜19Cは、RYR2-R4651I変異を有するCPVT患者を示す。図19Aは、この患者について得られた植込み型心臓モニタリングシステムからの心電図データを示す。該患者は二方向性心室頻拍を発症し（左上）、これは多形性心室頻拍に変化した（右上および左下）。患者は洞調律（sinus rhythm）に自然に回復した（右下）。
【図１９Ａ−２】図19A〜19Cは、RYR2-R4651I変異を有するCPVT患者を示す。図19Aは、この患者について得られた植込み型心臓モニタリングシステムからの心電図データを示す。該患者は二方向性心室頻拍を発症し（左上）、これは多形性心室頻拍に変化した（右上および左下）。患者は洞調律（sinus rhythm）に自然に回復した（右下）。
【図１９Ｂ】図19A〜19Cは、RYR2-R4651I変異を有するCPVT患者を示す。図19Bは、正常な個々のiPSCおよび患者由来のiPSCについてのRYR2-R4651座位でのサンガー配列決定データを示す。矢印は、R4651I置換を引き起こす点突然変異を指す。
【図１９Ｃ】図19A〜19Cは、RYR2-R4651I変異を有するCPVT患者を示す。図19Cは、突然変異ホットスポット領域（領域1〜4）および領域4内のR4651I突然変異の位置を示すRYR2タンパク質の概略図である。
【図２０Ａ】図20A〜20Gは、CPVT iPSC系統の特性評価およびゲノム編集を示す。図20A〜20Dは、CPVT iPSC系統の品質管理分析を示す。CPVTp細胞は、正常な核型（図20A）、多能性マーカーの発現（図20B）、典型的なコロニー形態（図20C）を有し、組織切片のH＆E染色により評価されるように、3つの胚葉から派生した奇形腫を形成した（図20D）。
【図２０Ｂ】図20A〜20Gは、CPVT iPSC系統の特性評価およびゲノム編集を示す。図20A〜20Dは、CPVT iPSC系統の品質管理分析を示す。CPVTp細胞は、正常な核型（図20A）、多能性マーカーの発現（図20B）、典型的なコロニー形態（図20C）を有し、組織切片のH＆E染色により評価されるように、3つの胚葉から派生した奇形腫を形成した（図20D）。
【図２０Ｃ】図20A〜20Gは、CPVT iPSC系統の特性評価およびゲノム編集を示す。図20A〜20Dは、CPVT iPSC系統の品質管理分析を示す。CPVTp細胞は、正常な核型（図20A）、多能性マーカーの発現（図20B）、典型的なコロニー形態（図20C）を有し、組織切片のH＆E染色により評価されるように、3つの胚葉から派生した奇形腫を形成した（図20D）。
【図２０Ｄ】図20A〜20Gは、CPVT iPSC系統の特性評価およびゲノム編集を示す。図20A〜20Dは、CPVT iPSC系統の品質管理分析を示す。CPVTp細胞は、正常な核型（図20A）、多能性マーカーの発現（図20B）、典型的なコロニー形態（図20C）を有し、組織切片のH＆E染色により評価されるように、3つの胚葉から派生した奇形腫を形成した（図20D）。
【図２０Ｅ】図20A〜20Gは、CPVT iPSC系統の特性評価およびゲノム編集を示す。図20Eは、iPSC-CMをiPSCから分化させるために使用したプロトコルの概略図である。
【図２０Ｆ】図20A〜20Gは、CPVT iPSC系統の特性評価およびゲノム編集を示す。図20Fは、乳酸選択されたiPSC-CMの純度を示すFACSプロットである。
【図２０Ｇ】図20A〜20Gは、CPVT iPSC系統の特性評価およびゲノム編集を示す。図20Gは、R4651Iヘテロ接合変異をPGP1野生型iPSCに導入して、CPVTeと命名された細胞系統を作成するための効果的なゲノム編集を示す、サンガー配列決定の結果である。
【図２１】図21は、人工的に作り出されたオプトMTFの記録用プラットフォームである。光ファイバがオプトMTF上の焦点領域を刺激する。オプトMTFを顕微鏡下で照らして、高空間分解能カメラを使用した機械的カンチレバーの暗視野イメージング、および高感度高速度カメラを使用したCa2+波伝播の蛍光イメージングを同時に行う。
【図２２−１】図22A〜22Lは、hiPSC-CMを播種したオプトMTFの作製を示す。
【図２２−２】図22A〜22Lは、hiPSC-CMを播種したオプトMTFの作製を示す。
【図２３】図23は、CPVTeオプトMTFの共焦点画像を示す。CPVTeオプトMTFをサルコメアのZディスクマーカーACTN2および核マーカーDAPIについて免疫染色した。iPSC-CMは平行に整列していた。バー＝20μm。
【図２４】図24A〜24Bは、オプトMTFにおけるCa2+波伝播の光学マッピングを示す。図24Aは、X-Rhod-1シグナル（「Ca2+イメージング」）およびMTFの末端にある変形可能なカンチレバーの暗視野イメージングを示す、オプトMTFのタイムラプス画像である。図24Bは、MTFにおけるCa2+トランジェントと機械的応力のトレースである。Ca2+ X-Rhod-1シグナルは、（図24A）の右端の画像に表示された点a〜dで記録された。トレースを横切る垂直の平行線は、488nmの光学的ペーシング信号を示す。
【図２５】図25A〜25Bは、オプトMTF構築物における隣接MTFの独立性を示す。図25Aは、異なるペーシング周波数（1.5、2、3および4Hz）によるMTFへの独立した光刺激の際のMTFのピーク収縮期および拡張期収縮を示す。図25Bは、各MTFの応力トレースを示す。各MTFは異なる周波数の個別の光ファイバによって刺激される。各MTFの機械的収縮期は、応力トレースの異なる周波数でここに示されるように、他のMTFから独立していた。青い線は光学的ペーシングを示す。
【図２６】図26A〜26Dは、オプトMTFにおける速度およびカルシウムトランジェント時間の空間的および時間的分散を示す。伝播速度または80％回復時のカルシウムトランジェント時間（CaTD80）の不均一性を、示した細胞を用いて構築されたオプトMTFについて計算した：NRVMs，新生児ラット心室心筋細胞；Cor.4U，Axiogenesis社からのiPSC-CM；WT、CPVTeおよびCPVTe-S2814A，この研究からのiPSC-CM。名前付き統計的検定：*, P＜0.05；**, P＜0.01；***, P＜0.001。
【図２７Ａ】図27A〜27Dは、オプトMTFにおける自発的Ca2+波を示す。CPVTp（図27A）、CPVTe（図27B）、またはWT iPSC-CM（図27C）から構築されたオプトMTFは、自発的に拍動することができた。Ca2+波をX-Rhod-1蛍光強度により光学的に記録した。図27A〜27Cでは、左のパネルは活性化マップであり、右のトレースはMTF上の表示された点でのCa2+シグナルである。異常なCa2+トランジェントがないことに留意されたい。自発的Ca2+波はMTFの端から発生した。
【図２７Ｂ】図27A〜27Dは、オプトMTFにおける自発的Ca2+波を示す。CPVTp（図27A）、CPVTe（図27B）、またはWT iPSC-CM（図27C）から構築されたオプトMTFは、自発的に拍動することができた。Ca2+波をX-Rhod-1蛍光強度により光学的に記録した。図27A〜27Cでは、左のパネルは活性化マップであり、右のトレースはMTF上の表示された点でのCa2+シグナルである。異常なCa2+トランジェントがないことに留意されたい。自発的Ca2+波はMTFの端から発生した。
【図２７Ｃ】図27A〜27Dは、オプトMTFにおける自発的Ca2+波を示す。CPVTp（図27A）、CPVTe（図27B）、またはWT iPSC-CM（図27C）から構築されたオプトMTFは、自発的に拍動することができた。Ca2+波をX-Rhod-1蛍光強度により光学的に記録した。図27A〜27Cでは、左のパネルは活性化マップであり、右のトレースはMTF上の表示された点でのCa2+シグナルである。異常なCa2+トランジェントがないことに留意されたい。自発的Ca2+波はMTFの端から発生した。
【図２７Ｄ】図27A〜27Dは、オプトMTFにおける自発的Ca2+波を示す。図27Dは、示した組織の個々のピクセルでのCa2+シグナルが、EADまたはDADと一致するCa2+トランジェントの異常について分析されたことを示す。自発的に拍動するオプトMTFのいずれにおいても異常は観察されなかった。オプトMTFの自発的拍動周波数はiPSC-CMタイプ間で同等であった。Allは、記録された全てのCPVTpおよびCPVTe組織の合体を表す。
【図２８】図28は、WT、CPVTp、CPVTeオプトMTFでのリエントリーの発生を示す。ISOまたは低（＜2Hz）もしくは高（≧2Hz）ペーシングで刺激された、WT、CPVTp、およびCPVTeオプトMTFから組み立てられたオプトMTFでのリエントリーの発生。†, WTの同等の処理群との比較；§ CPVTpの同等の処理群との比較。Fisher検定：†または§, P＜0.05; ††または§§, P＜0.01; †††または§§§, P＜0.001。
【図２９Ａ】図29A〜29Dは、CPVTeオプトMTFでのリエントリーを示す。図29A〜29B：2Hzでのペーシング。Ca2+波は整然と秩序だっていた。Aの左パネルに表示された点からのCa2+トレースをBに示す。
【図２９Ｂ】図29A〜29Dは、CPVTeオプトMTFでのリエントリーを示す。図29A〜29B：2Hzでのペーシング。Ca2+波は整然と秩序だっていた。Aの左パネルに表示された点からのCa2+トレースをBに示す。
【図２９Ｃ】図29A〜29Dは、CPVTeオプトMTFでのリエントリーを示す。図29C〜29D：3Hzでの同じ組織のペーシング。Ca2+波は雑然としており、複数のリエントリー領域が形成される。図29Cの左パネルに表示された点からのCa2+トレースを図29Dに示す。最遠位点dはペーシング刺激により3：2または2：1カップリングを有することに留意されたい。活性化マップとCa2+トレースは、得られた映像のCa2+イメージングデータを処理することにより計算された。
【図２９Ｄ】図29A〜29Dは、CPVTeオプトMTFでのリエントリーを示す。図29C〜29D：3Hzでの同じ組織のペーシング。Ca2+波は雑然としており、複数のリエントリー領域が形成される。図29Cの左パネルに表示された点からのCa2+トレースを図29Dに示す。最遠位点dはペーシング刺激により3：2または2：1カップリングを有することに留意されたい。活性化マップとCa2+トレースは、得られた映像のCa2+イメージングデータを処理することにより計算された。
【図３０】図30A〜30Bは、WT、CPVTp、およびCPVTeオプトMTFのリエントリーに対する脆弱性を示す。図30Aは、示されたペーシングレートでのISO処理組織のCa2+波伝播速度およびCaTD80を示す。図30Bは、示されたペーシングレートでのISO処理組織におけるCa2+波伝播速度とCaTD80の空間的および時間的分散を示す。
【図３１】図31は、オプトMTF特性の統計分析を示す。9つのパラメータをISO処理ありとなしで1、2、および3Hzのペーシング周波数で分析した。これらの54の比較を、WTとCPVT（CPVTpとCPVTeの合体）の間およびWTとCPVTe-S2814Aの間で行った。
【図３２Ａ】図32A〜32Dは、CPVTeオプトMTFでのリエントリーの開始を示す。図32A〜32Bは、2Hzのペーシングでの組織化されたCa2+波を示す。図32Bのトレースは、図32Aに表示された点から記録された。
【図３２Ｂ】図32A〜32Dは、CPVTeオプトMTFでのリエントリーの開始を示す。図32A〜32Bは、2Hzのペーシングでの組織化されたCa2+波を示す。図32Bのトレースは、図32Aに表示された点から記録された。
【図３２Ｃ】図32A〜32Dは、CPVTeオプトMTFでのリエントリーの開始を示す。図32C〜32D：2.5Hzのペーシングでのリエントリーの発生。図32Dのトレースは、図32Cに表示された点から記録された。パルス2に続くCa2+トランジェント異常の発生と、付随して起こるパルス3でのリエントリーの開始に留意されたい。
【図３２Ｄ】図32A〜32Dは、CPVTeオプトMTFでのリエントリーの開始を示す。図32C〜32D：2.5Hzのペーシングでのリエントリーの発生。図32Dのトレースは、図32Cに表示された点から記録された。パルス2に続くCa2+トランジェント異常の発生と、付随して起こるパルス3でのリエントリーの開始に留意されたい。
【図３３】図33は、細胞透過性阻害ペプチドによるCaMKII活性の阻害を示す。iPSC-CMを細胞透過性CaMKIIペプチド阻害剤AIP（250nM）で処理した。免疫ブロット法で細胞抽出物を分析する前に、細胞を1μMのISOで60分間刺激した。野生型（PGP1）細胞では、CaMKII T286のリン酸化がAIPによってブロックされたが、全CaMKIIに変化はなかった。CPVTp細胞では、CaMKIIの基礎活性化が認められた。これはAIPでブロックされた。
【図３４Ａ】図34A〜34Dは、RYR2のS2808およびS2814部位のゲノム編集を示す。図34Aは、PGP1（WT）またはPGP1-RYR2R4651I/+（CPVTe）iPSCのいずれかでホモ接合性S2808AまたはS2814A突然変異を得るために使用したゲノム編集戦略の概略図である。
【図３４Ｂ】図34A〜34Dは、RYR2のS2808およびS2814部位のゲノム編集を示す。図34Bは、ゲノム編集を確認するための代表的なサンガー配列決定を示す。
【図３４Ｃ】図34A〜34Dは、RYR2のS2808およびS2814部位のゲノム編集を示す。図34Cは、ゲノム編集した細胞株のiPSC-CM分化を示す。
【図３４Ｄ】図34A〜34Dは、RYR2のS2808およびS2814部位のゲノム編集を示す。図34Dは、S2814A変異型細胞株がISO刺激でS2814リン酸化を示さなかったことを示す。
【図３５Ａ】図35Aは、CPVT患者が正常な安静時心電図を有するが、運動時には重篤で生命を脅かす恐れがある不整脈を有することを示す。VT，心室頻拍；VF，心室細動。トレースは、説明のために示された理想的なスケッチである。
【図３５Ｂ】図35Bは、CPVTの病態生理を示す。左，心筋細胞のCa2+誘発性Ca2+放出の図解画。1. 活動電位がL型Ca2+チャネル（LTCC）を開く；2. Ca2+がRYR2の開口と筋小胞体（SR）からのCa2+の放出を誘導する；3. 上昇した細胞内Ca2+が筋フィラメントの収縮を誘発する；4. Ca2+がSERCAおよびNCXによりサイトゾルから排出される。右，RYR2のCPV突然変異は拡張期Ca2+リークを増加させる。
【図３６】図36は、AAV9による若い動物の治療についての概略図と、単一細胞の試験のためのワークフローを、心室ペーシングと共に示す。
【図３７】図37A〜37Bは、治療した動物から単離された単一の心筋細胞に対するAAV9-GFP-AIPの効果を示す。図37Aは、1分間の外部ペーシング後のCa2+指示薬（Rhod-2）の共焦点ライントレースを示す。自発的Ca2+が記録され、定量化される（図37B）。N＝33 (GFP), N＝25 (AIP)，**P＜0.01。
【図３８】図38A〜38Cは、後眼窩注射によってAAV9でGFPまたはAIPのいずれかにより治療されたR176Q変異型マウスにおける誘発された心室性不整脈の抑制を示す。図38Aは、GFPまたはAIP治療動物のそれぞれで誘発された心室性不整脈（上パネル）または不整脈なし（下パネル）の代表的なトレーシングを示す。図38B〜38Cは、心室性不整脈を有する動物の割合（図38B）、またはペーシングにより誘発された心室性不整脈の持続時間（図38C）を示す。N＝6 (GFP), N＝6 (AIP), *P＜0.01。
【図３９】図39A〜39Bは、ペプチド阻害剤に対する修飾RNAによる異常なCa2+シグナル伝達の抑制を示す。RYR2-R176Qマウスからの成体心筋細胞に、ペプチド阻害剤AIPおよびCN19oの修飾RNA（modRNA）をトランスフェクトするか、またはRYR2結合タンパク質FKBP12.6に融合させて、トランスフェクトし、mCherryを共発現させた。12時間培養した後、個々の心筋細胞にCa2+指示薬（Fluo-4）を添加し、1分間ペーシングした後にポストペーシングCa2+イベントを記録した。図39Aは、成体心筋細胞の代表的な共焦点ライントレーシングおよびmCherryの発現（左）を示す。図39Bは、mCherryのみと比較した、試験した全ての阻害剤の定量化を示す。mCherryのみと比較して、CN19oを発現する心筋細胞では異常なポストペーシングCa2+イベントの統計的に有意な減少、およびAIPを発現する細胞では有意に近い。N＝15 (mCherry), N＝5 (AIP), N＝5 (FKBP12.6-AIP), N＝5 (CN19o), N＝7 (FKBP12.6-CN19o)。AIPのP値＝0.07, *P＜0.05, §P＞0.5。
【図４０】図40は、多数の組織にわたる新規AAVキャプシドの相対的発現を示す。出生後3日目に皮下注射により各AAVウイルス2×1010vg/gを注射した後、出生後28日目に組織を採取して、全RNAを処理した。図40は、tata結合タンパク質（TBP）の発現に対して正規化された相対的GFP mRNAレベルを示す。自己相補的（SC）Anc82は、AAV9と比較して、筋肉および心臓での発現の増加を示す。
【図４１−１】図41は、ホットスポット領域1および3（R1およびR3）にRYR2変異を含む2つの追加の患者由来iPSC-CMにおける異常なカルシウムトランジェントのAIP阻害を示す。CPVT-R1およびCPVT-R3遺伝型はそれぞれS404RおよびG3946Sであった。AIPは、これらの追加の2つのCPVT遺伝型において異常なカルシウムトランジェントを低減させるのに効果的であった。個々の細胞の数は示される通り；カイ二乗法によりP＜0.01。
【図４１−２】図41は、ホットスポット領域1および3（R1およびR3）にRYR2変異を含む2つの追加の患者由来iPSC-CMにおける異常なカルシウムトランジェントのAIP阻害を示す。CPVT-R1およびCPVT-R3遺伝型はそれぞれS404RおよびG3946Sであった。AIPは、これらの追加の2つのCPVT遺伝型において異常なカルシウムトランジェントを低減させるのに効果的であった。個々の細胞の数は示される通り；カイ二乗法によりP＜0.01。
【図４２−１】図42は、他の点ではWT系統と同質遺伝子であるCas9操作iPSC-CM（CPVTe2）における異常なカルシウムスパークのAIP阻害を示す。操作された突然変異はRYR2-D385Nであり、これはCPVT患者に見られる。AIPは、カルシウムスパーク頻度を、WTで見られるものに匹敵するレートに戻して低減させた。
【図４２−２】図42は、他の点ではWT系統と同質遺伝子であるCas9操作iPSC-CM（CPVTe2）における異常なカルシウムスパークのAIP阻害を示す。操作された突然変異はRYR2-D385Nであり、これはCPVT患者に見られる。AIPは、カルシウムスパーク頻度を、WTで見られるものに匹敵するレートに戻して低減させた。
【発明を実施するための形態】
【００７１】
発明の詳細な説明
カテコラミン誘発性多形性心室頻拍（CPVT）は、心筋細胞の主要な細胞内カルシウム放出チャネルである心臓リアノジン受容体（RYR2）をコードする遺伝子の常染色体優性突然変異によって主に引き起こされる遺伝性不整脈である。典型的には、CPVT患者は安静時には無症候性であるが、運動または精神的苦痛の際には致死的となり得る心室頻拍を発症する（図35A）。野生型の心筋細胞では、心臓の活動電位が原形質膜にある電位感受性のL型Ca2+チャネルを開くと、結果として生じるCa2+の局所的流入により、RYR2を介した筋小胞体からのCa2+の放出が引き起こされる（図35B）。その結果として細胞質Ca2+が増加し、これはサルコメアの収縮につながる。その細胞が心臓拡張期に入ると、RYR2が閉じて、細胞質Ca2+が筋小胞体に送り返される。CPVTに関連する突然変異を有する細胞では、RYR2は細胞質により多く放出し、その結果、拡張期Ca2+が上昇し、ナトリウム・カルシウム交換系（NCX1）を介して原形質膜からのナトリウムとカルシウムの交換を推進し、これは追加の活動電位を発生し得る後脱分極（after-depolarization）につながる。カテコラミン刺激がCPVT突然変異の不整脈の性質をアンマスク（unmask）する分子メカニズムは知られていない。RYR2突然変異が心室頻拍の臨床表現型をもたらすメカニズムも不確かである。
【００７２】
本発明者らは、CaMKII活性化とその後の下流シグナル伝達の阻害が、カルシウムリアノジンチャネルRYR2の突然変異に関連するカテコラミン刺激性潜在性不整脈を大幅に低減することを発見した。インビボ実験において、本発明者らは、ペプチド阻害剤であるAIPが、CPVTモデルマウスの心臓組織でインビボ発現されると、CPVTモデルマウスで不整脈を抑制することを明らかにした。実施例2、図17および18を参照されたい。本発明者らはまた、RYR2のS2814でのセリン残基のCaMKII媒介リン酸化がCPVT突然変異におけるカテコラミン刺激性潜在性不整脈に不可欠であることを見出した。セリンからアラニンへの変異は、RYR2タンパク質にCPVT関連の突然変異を有する心臓細胞について記録された異常なCa2+スパーク頻度を逆転させる。
【００７３】
したがって、本発明は、CAMKII阻害剤、例えばAIPペプチド、その類似体または断片を特徴とする組成物、そのようなペプチドをコードするポリヌクレオチド、AIPペプチドおよびポリヌクレオチドを含む治療用組成物、ならびに対象をCPVTになりやすくする素因である、心臓リアノジンチャネル（RYR2）の突然変異を有する対象の治療のために、このような組成物を使用する方法を特徴とする。これらのペプチド阻害剤は、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター、または他のベクター、例えばアデノウイルスおよびレンチウイルス、を用いて送達され得る。該組成物および方法は、他のタイプの心臓病の治療にも使用することができる。
【００７４】
単離されたCPVT iPSC由来心筋細胞（iPSC-CM）は異常なカルシウムトランジェントを起こしやすかった一方で、これらは非刺激CPVT組織ではめったに見られなかった。しかし、カテコラアミンおよび高頻度ペーシング（rapid pacing）によって刺激されたCPVT組織は、活動電位のリエントリーに対して脆弱であり、臨床疾患の顕著な運動依存を再現していた。Cas9ゲノム編集を使用して、単一のカテコラミン推進型リン酸化事象であるCa2+カルモジュリン依存性プロテインキナーゼII（CaMKII）によるRYR2-S2814リン酸化は、操作されたCPVT心筋シートにおける不整脈誘発（pro-arrhythmia）をアンマスクするために必要であるとして同定された。これらの研究は、CPVTの分子的および細胞的発症機序を解明し、この疾患の組織スケールのメカニズムにおけるCaMKII依存性リエントリーの重要な役割を明らかにする。重要なこととして、本発明は、操作された光遺伝学的心筋組織モデルにiPSC-CMを含むインビトロ不整脈モデルを提供する。
【００７５】
一局面において、本明細書では、CaMKIIペプチド阻害剤をコードするベクターの有効量と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物が提供される。
【００７６】
一局面において、本明細書では、CPVTなどの心不整脈の治療に使用するための、CaMKIIペプチド阻害剤をコードするベクターの有効量と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物が提供される。
【００７７】
一局面において、本明細書では、CPVTなどの心不整脈の治療のための医薬の製造に使用するための、CaMKIIペプチド阻害剤をコードするベクターの有効量と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物が提供される。
【００７８】
別の局面において、本明細書では、CaMKIIペプチド阻害剤をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターが提供される。
【００７９】
一局面において、本明細書では、CPVTなどの心不整脈の治療に使用するための、CaMKIIペプチド阻害剤をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターが提供される。
【００８０】
一局面において、本明細書では、CPVTなどの心不整脈の治療のための医薬の製造に使用するための、CaMKIIペプチド阻害剤をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターが提供される。
【００８１】
別の局面において、本明細書では、CaMKIIペプチド阻害剤をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む細胞が提供される。
【００８２】
一局面において、本明細書では、CPVTなどの心不整脈の治療に使用するための、CaMKIIペプチド阻害剤をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む細胞が提供される。
【００８３】
一局面において、本明細書では、CPVTなどの心不整脈の治療のための医薬の製造に使用するための、CaMKIIペプチド阻害剤をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む細胞が提供される。
【００８４】
上記の薬学的組成物、発現ベクター、および発現ベクターを含む細胞は全て、対象における心不整脈の治療に有用である。
【００８５】
別の局面において、本明細書では、対象における心不整脈を調節するための方法が提供され、この方法は、心臓リアノジンチャネル（RYR2）を含む細胞と、CaMKII阻害剤、CaMKIIペプチド阻害剤、またはCaMKIIペプチド阻害剤をコードするポリヌクレオチドとを接触させることを含む。
【００８６】
別の局面において、本明細書では、対象におけるリアノジンチャネル（RYR2）ポリペプチドのリン酸化を阻害するための方法が提供され、この方法は、心臓リアノジンチャネル（RYR2）を含む細胞と、CaMKII阻害剤、CaMKIIペプチド阻害剤、またはCaMKIIペプチド阻害剤をコードするポリヌクレオチドとを接触させることを含む。
【００８７】
別の局面において、本明細書では、心不整脈に関連する突然変異を含む対象を治療する方法が提供され、この方法は、該対象に、CaMKII阻害剤、CaMKIIペプチド阻害剤、その類似体もしくは断片、またはCaMKIIペプチド阻害剤をコードするポリヌクレオチドを投与することを含む。
【００８８】
別の局面において、本明細書では、心不整脈を有する対象を治療する方法が提供され、この方法は、該対象に、CaMKIIペプチド阻害剤をコードするベクターの有効量と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を投与することを含む。一態様では、心不整脈はCPVTである。一態様では、薬学的組成物は静脈内に、または心臓内注射により投与される。
【００８９】
別の局面において、本明細書では、心筋細胞を特徴付ける方法が提供され、この方法は、CPVTに関連する突然変異を含む心臓リアノジンチャネル（RYR2）を発現する人工多能性幹細胞由来心筋細胞（iPSC-CM）を使用して、心伝導または心収縮をモニタリングすることを含む。
【００９０】
別の局面において、本明細書では、化合物のスクリーニング方法が提供され、この方法は、CPVTに関連する突然変異を含む心臓リアノジンチャネル（RYR2）を発現する人工多能性幹細胞由来心筋細胞と候補薬剤とを接触させること、および該細胞における心伝導または心収縮を測定することを含む。他の態様では、この方法は、Ca2+スパーク頻度、Ca2+リエントリー、および実施例セクションに記載される他のパラメータを測定することを含む。
【００９１】
上記のいずれか1つの局面の一態様において、CaMKIIペプチド阻害剤はAIP、CN19、CN19o、CN27、CN21、またはそれらの類似体もしくは断片である。
【００９２】
上記のいずれか1つの局面の一態様、または上記のいずれか1つの先行態様において、CaMKIIペプチド阻害剤は、哺乳動物の心臓細胞において該ペプチドの発現を推進するのに適したプロモーターに機能的に連結される。心筋細胞特異的発現のためのプロモーターは当技術分野で公知であり、例えば、心筋トロポニンTプロモーター、αミオシン重鎖（α-MHC）プロモーター、ミオシン軽鎖-2v（MLC-2v）プロモーター、または心筋NCX1プロモーターである。
【００９３】
上記方法のいずれか1つの局面の一態様において、接触させる細胞は心筋細胞である。
【００９４】
上記方法のいずれか1つの局面の一態様、または上記のいずれか1つの先行態様において、接触させる心筋細胞は、その中の心臓リアノジンチャネル（RYR2）に突然変異を有する。
【００９５】
上記方法のいずれか1つの局面の一態様、または上記のいずれか1つの先行態様において、接触させる心筋細胞は、その中のRYR2チャネルに複数の突然変異を有する。
【００９６】
上記のいずれか1つの局面の一態様、または上記のいずれか1つの先行態様において、前記ベクターは、CaMKIIペプチド阻害剤、その類似体または断片の有効量を含む薬学的組成物として使用される。
【００９７】
上記のいずれか1つの局面の一態様、または上記のいずれか1つの先行態様において、前記ベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルスベクターである。
【００９８】
上記のいずれか1つの局面の一態様、または上記のいずれか1つの先行態様において、心不整脈は心室頻拍である。
【００９９】
上記のいずれか1つの局面の一態様、または上記のいずれか1つの先行態様において、心室頻拍は運動誘発性またはストレス誘発性である。
【０１００】
上記のいずれか1つの局面の一態様、または上記のいずれか1つの先行態様において、心室頻拍はCPVTである。
【０１０１】
上記のいずれか1つの局面の一態様、または上記のいずれか1つの先行態様において、心不整脈は遺伝的変異を伴うか、それに関連している。
【０１０２】
上記のいずれか1つの局面の一態様、または上記のいずれか1つの先行態様において、心不整脈に関連する遺伝的変異は、心筋細胞のRYR2チャネルに見られる。
【０１０３】
上記のいずれか1つの局面の一態様、または上記のいずれか1つの先行態様において、RYR2の遺伝的変異は、RYR2ポリペプチドの領域1（アミノ酸残基77〜466）、領域2（アミノ酸残基2246〜2534）、領域3（アミノ酸残基3778〜4201）または領域4（アミノ酸残基4497〜4959）で発生する。
【０１０４】
上記のいずれか1つの局面の一態様、または上記のいずれか1つの先行態様において、RYR2の遺伝的変異は、RYR2ポリペプチドの領域4のアミノ酸位置4651のアミノ酸アルギニンからイソロイシンへの置換（R4651I）である（RYR2R4651I）。
【０１０５】
上記のいずれか1つの局面の一態様、または上記のいずれか1つの先行態様において、RYR2の遺伝的変異は、RYR2ポリペプチドの領域1のアミノ酸位置176のアミノ酸アルギニンからグルタミンへの置換（R176Q）である（RYR2R176Q）。
【０１０６】
上記のいずれか1つの局面の一態様、または上記のいずれか1つの先行態様において、RYR2の遺伝的変異は、RYR2ポリペプチドのアミノ酸位置385のアミノ酸アスパラギン酸からアスパラギンへの置換（D385N）である（RYR2D385N）。
【０１０７】
上記のいずれか1つの局面の一態様、または上記のいずれか1つの先行態様において、RYR2の遺伝的変異は、RYR2ポリペプチドのアミノ酸位置404のアミノ酸セリンからアルギニンへの置換（S404R）である（RYR2S404R）。
【０１０８】
上記のいずれか1つの局面の一態様において、RYR2の遺伝的変異は、RYR2ポリペプチドのアミノ酸位置3946のアミノ酸グリシンからセリンへの置換（G3946S）である（RYR2G3946S）。
【０１０９】
上記方法のいずれか1つの局面の一態様、または上記のいずれか1つの先行態様において、前記方法は対象における心不整脈を抑制する。
【０１１０】
上記方法のいずれか1つの局面の一態様、または上記のいずれか1つの先行態様において、前記方法は対象における心不整脈の発生率を減らす。例えば、対象において一定期間内に起こる心不整脈の回数。
【０１１１】
上記方法のいずれか1つの局面の一態様、または上記のいずれか1つの先行態様において、前記方法は、運動刺激または感情的ストレスの際の対象における心不整脈の発生率を減らす。
【０１１２】
上記方法のいずれか1つの局面の一態様、または上記のいずれか1つの先行態様において、前記方法は、対象におけるカテコラミン誘発性多形性心室頻拍（CPVT）を抑制する。
【０１１３】
上記方法のいずれか1つの局面の一態様、または上記のいずれか1つの先行態様において、前記方法は、対象におけるCPVTを軽減する。
【０１１４】
上記の治療または調節する方法のいずれか1つの局面の一態様、または上記のいずれか1つの先行態様において、前記方法は、心不整脈またはCPVTを有する対象を選択することをさらに含む。
【０１１５】
上記の治療または調節する方法のいずれか1つの局面の一態様、または上記のいずれか1つの先行態様において、前記方法は、心不整脈またはCPVTに関連する突然変異を有する対象を選択することをさらに含む。
【０１１６】
上記の治療または調節する方法のいずれか1つの局面の一態様、または上記のいずれか1つの先行態様において、前記方法は、心不整脈に関連する突然変異を有する対象を選択することをさらに含み、その突然変異は心筋細胞のカルシウムリアノジンチャネル（RYR2）に見られる。一態様では、RYR2の遺伝的変異は、RYR2ポリペプチドの領域1（アミノ酸残基77〜466）、領域2（アミノ酸残基2246〜2534）、領域3（アミノ酸残基3778〜4201）または領域4（アミノ酸残基4497〜4959）で発生する。別の態様では、その遺伝的変異は、RYR2R4651I、RYR2R176Q、RYR2D385N、RYR2S404R、およびRYR2G3946Sからなる群より選択される。
【０１１７】
上記のスクリーニング方法のいずれか1つの局面の一態様、または上記のいずれか1つの先行態様において、iPSC-CMは、心不整脈に関連する突然変異を有する対象に由来する。別の態様では、対象は、心不整脈に関連する複数の突然変異を有し、例えば、RYR2チャネルタンパク質におけるRYR2R4651I、RYR2R176Q、RYR2D385N、RYR2S404R、およびRYR2G3946Sを有する。
【０１１８】
上記のスクリーニング方法のいずれか1つの局面の一態様、または上記のいずれか1つの先行態様において、iPSC-CMは、その心臓リアノジンチャネル（RYR2）に1つまたは複数の突然変異を有する。例えば、RYR2R4651IとRYR2R176Qの両突然変異、RYR2D385NとRYR2S404Rの両突然変異、またはRYR2S404RとRYR2G3946Sの両突然変異を有する。いくつかの態様では、RYR2チャネルタンパク質のRYR2R4651I、RYR2R176Q、RYR2D385N、RYR2S404R、およびRYR2G3946Sで生じる複数の突然変異の全ての可能な組み合わせが含まれる。
【０１１９】
上記のスクリーニング方法のいずれか1つの局面の一態様、または上記のいずれか1つの先行態様において、iPSC-CMは、RYR2ポリペプチドの領域1（アミノ酸残基77〜466）、領域2（アミノ酸残基2246〜2534）、領域3（アミノ酸残基3778〜4201）または領域4（アミノ酸残基4497〜4959）で生じるRYR2の1つまたは複数の突然変異を有する。
【０１２０】
上記のスクリーニング方法のいずれか1つの局面の一態様、または上記のいずれか1つの先行態様において、iPSC-CMは、RYR2ポリペプチドの領域4のアミノ酸位置4651のアミノ酸アルギニンからイソロイシンへの置換（R4651I）をもたらす突然変異（RYR2R4651I）を有する。
【０１２１】
上記のスクリーニング方法のいずれか1つの局面の一態様、または上記のいずれか1つの先行態様において、iPSC-CMは、RYR2ポリペプチドの領域1のアミノ酸位置176のアミノ酸アルギニンからグルタミンへの置換（R176Q）をもたらす突然変異（RYR2R176Q）を有する。
【０１２２】
上記のスクリーニング方法のいずれか1つの局面の一態様、または上記のいずれか1つの先行態様において、iPSC-CMは、RYR2ポリペプチドのアミノ酸位置385のアミノ酸アスパラギン酸からアスパラギンへの置換（D385N）をもたらす突然変異（RYR2D385N）を有する。
【０１２３】
上記のスクリーニング方法のいずれか1つの局面の一態様、または上記のいずれか1つの先行態様において、iPSC-CMは、RYR2ポリペプチドのアミノ酸位置404のアミノ酸セリンからアルギニンへの置換（S404R）をもたらす突然変異（RYR2S404R）を有する。
【０１２４】
上記のスクリーニング方法のいずれか1つの局面の一態様、または上記のいずれか1つの先行態様において、iPSC-CMは、RYR2ポリペプチドのアミノ酸位置3946のアミノ酸グリシンからセリンへの置換（G3946S）をもたらす突然変異（RYR2G3946S）を有する。
【０１２５】
一局面において、本明細書では、CPVTに関連する突然変異を有する心臓リアノジンチャネル（RYR2）を発現する人工多能性幹細胞由来心筋細胞（iPSC-CM）が提供される。例えば、RYR2R4651I、RYR2R176Q、RYR2D385N、RYR2S404R、RYR2G3946Sなど。
【０１２６】
一局面において、本明細書では、突然変異を有する心臓リアノジンチャネル（RYR2）を発現する人工多能性幹細胞由来心筋細胞（iPSC-CM）が提供される。
【０１２７】
別の局面において、本明細書では、突然変異を有する心臓リアノジンチャネル（RYR2）を発現するiPSC-CMを含む組成物が提供される。
【０１２８】
別の局面において、本明細書では、CPVTに関連する突然変異を有する心臓リアノジンチャネル（RYR2）を発現するiPSC-CMを含む組成物が提供される。例えば、RYR2R4651I、RYR2R176Q、RYR2D385N、RYR2S404R、RYR2G3946Sなど。
【０１２９】
上記のiPSC-CMまたは上記のiPSC-CMを含む組成物のいずれか1つの局面の一態様、または上記のいずれか1つの先行態様において、iPSC-CMは、RYR2ポリペプチドの領域1（アミノ酸残基77〜466）、領域2（アミノ酸残基2246〜2534）、領域3（アミノ酸残基3778〜4201）または領域4（アミノ酸残基4497〜4959）で生じるRYR2の突然変異を有する。
【０１３０】
上記のiPSC-CMまたは上記のiPSC-CMを含む組成物のいずれか1つの局面の一態様、または上記のいずれか1つの先行態様において、iPSC-CMは、RYR2チャネルに複数の突然変異を有する。
【０１３１】
上記のiPSC-CMまたは上記のiPSC-CMを含む組成物のいずれか1つの局面の一態様、または上記のいずれか1つの先行態様において、iPSC-CMは、RYR2ポリペプチドの領域4のアミノ酸位置4651のアミノ酸アルギニンからイソロイシンへの置換（R4651I）をもたらす突然変異（RYR2R4651I）を有する。
【０１３２】
上記のiPSC-CMまたは上記のiPSC-CMを含む組成物のいずれか1つの局面の一態様、または上記のいずれか1つの先行態様において、iPSC-CMは、RYR2ポリペプチドの領域1のアミノ酸位置176のアミノ酸アルギニンからグルタミンへの置換（R176Q）をもたらす突然変異（RYR2R176Q）を有する。
【０１３３】
上記のiPSC-CMまたは上記のiPSC-CMを含む組成物のいずれか1つの局面の一態様、または上記のいずれか1つの先行態様において、iPSC-CMは、RYR2ポリペプチドのアミノ酸位置385のアミノ酸アスパラギン酸からアスパラギンへの置換（D385N）をもたらす突然変異（RYR2D385N）を有する。
【０１３４】
上記のiPSC-CMまたは上記のiPSC-CMを含む組成物のいずれか1つの局面の一態様、または上記のいずれか1つの先行態様において、iPSC-CMは、RYR2ポリペプチドのアミノ酸位置404のアミノ酸セリンからアルギニンへの置換（S404R）をもたらす突然変異（RYR2S404R）を有する。
【０１３５】
上記のiPSC-CMまたは上記のiPSC-CMを含む組成物のいずれか1つの局面の一態様、または上記のいずれか1つの先行態様において、iPSC-CMは、RYR2ポリペプチドのアミノ酸位置3946のアミノ酸グリシンからセリンへの置換（G3946S）をもたらす突然変異（RYR2G3946S）を有する。
【０１３６】
上記のiPSC-CMまたは上記のiPSC-CMを含む組成物のいずれか1つの局面の一態様、または上記のいずれか1つの先行態様において、iPSC-CMは、RYR2の突然変異をS2814に有する。例えば、S2814A突然変異。
【０１３７】
上記のiPSC-CMまたは上記のiPSC-CMを含む組成物のいずれか1つの局面の一態様、または上記のいずれか1つの先行態様において、iPSC-CMは、RYR2の突然変異をS2808に有する。例えば、S2808A突然変異。
【０１３８】
上記のiPSC-CMまたは上記のiPSC-CMを含む組成物のいずれか1つの局面の一態様、または上記のいずれか1つの先行態様において、iPSC-CMは、RYR2の第1の突然変異をS2808またはS2814に有し、かつRYR2ポリペプチドの領域1（アミノ酸残基77〜466）、領域2（アミノ酸残基2246〜2534）、領域3（アミノ酸残基3778〜4201）または領域4（アミノ酸残基4497〜4959）で生じるRYR2の第2の突然変異を有する。例えば、S2808またはS2814でのRYR2の第1の突然変異と、R4651またはR176での第2の突然変異。
【０１３９】
上記のiPSC-CMまたは上記のiPSC-CMを含む組成物のいずれか1つの局面の一態様、または上記のいずれか1つの先行態様において、前記突然変異はアミノ酸置換である。例えば、セリンからアラニンへの置換、またはアルギニンからグルタミンへの置換、またはアルギニンからイソロイシンへの置換。
【０１４０】
上記のiPSC-CMを含む組成物のいずれか1つの局面の一態様、または上記のいずれか1つの先行態様において、前記組成物は薬学的に許容される担体をさらに含む。
【０１４１】
カテコラミン誘発性多形性心室頻拍（CPVT）
カテコラミン誘発性多形性心室頻拍（CPVT）は、心筋細胞の主要な細胞内カルシウム放出チャネルである心臓リアノジン受容体2（RYR2）をコードする遺伝子の常染色体優性突然変異によって主に引き起こされる遺伝性不整脈である。典型的には、CPVT患者は安静時には無症候性であるが、運動または精神的苦痛の際には致死的となり得る心室頻拍を発症する。心臓の活動電位により、原形質膜にある電位感受性のL型Ca2+チャネルが開かれる。結果として生じるCa2+の局所的流入は、筋小胞体に位置するRYR2を開いて、Ca2+を細胞質ゾルに放出し、そこでサルコメアの収縮を引き起こす。心臓の活動電位が終了し、細胞が拡張期に入ると、RYR2が閉じて、細胞質Ca2+が筋小胞体Ca2+-ATPアーゼによって筋小胞体に送り返される。
【０１４２】
CPVT突然変異は、筋小胞体から細胞質へのRYR2による拡張期Ca2+放出を増加させる。個々の心筋細胞では、上昇した拡張期Ca2+が、原形質膜でNCX1を介した逆ナトリウム-カルシウム交換を誘発し、追加の活動電位を発生させる可能性のある後脱分極をもたらす。カテコール刺激がCPVT突然変異の不整脈の性質をアンマスクする分子メカニズムは不明であるが、Ca2+カルモジュリン依存性プロテインキナーゼII（CaMKII）のカテコール誘発性活性化が関与していた。RYR2突然変異が心室頻拍の臨床表現型をもたらすメカニズムも不確かであるが、1つの理論は、心筋細胞により誘発された活動が心室頻拍を引き起こすというものである。
【０１４３】
人工多能性幹細胞（iPSC）技術およびiPSCを心筋細胞（iPSC-CM）に分化させる効率的な方法の出現により、遺伝性不整脈を研究する絶好の機会が生まれた。iPSC-CMは、CPVT患者だけでなく他の遺伝性不整脈の患者からも作成されており、異常な活動電位持続時間および薬物応答を含めて、これらの疾患の主要な特徴を獲得していることが示された。しかし、現在の研究は単離された細胞または細胞クラスターに限定されており、心臓組織へと組み立てられた細胞の創発特性（emergent properties）である臨床不整脈のモデル化には大きなギャップが依然として存在する。
【０１４４】
AIPおよび類似体
また、本発明には、心臓のリズムを調節する能力を増強するまたは抑制しない方法で改変されたAIPポリペプチドまたはその断片をコードするアデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスベクターも含まれる。一態様では、本発明は、AIPアミノ酸配列または核酸配列を、変化を生じさせることにより最適化する方法を提供する。そのような変化には、特定の突然変異、欠失、挿入、翻訳後修飾、タンデム重複（tandem replication）などが含まれる。1つの好ましい態様では、AIPアミノ酸配列は、プロテアーゼ耐性、特にメタロプロテアーゼ耐性を増強するように修飾・改変される。したがって、本発明は、本発明の天然に存在するポリペプチドの類似体をさらに含む。類似体は、アミノ酸配列の相違、翻訳後修飾、またはその両方によって、本発明の天然に存在するポリペプチドと異なっていてよい。本発明の類似体は、一般に、本発明の天然に存在するアミノ酸配列の全部または一部と少なくとも85％、より好ましくは90％、最も好ましくは95％の同一性、さらには99％もの同一性を示す。配列比較の長さは、少なくとも10、13、15アミノ酸残基である。この場合も、同一性の程度を決定するための例示的なアプローチでは、BLASTプログラムを使用することができ、e-3とe-100の間の確率スコアが密接に関連する配列を示している。修飾には、ポリペプチドのインビボおよびインビトロ化学的誘導体化、例えば、アセチル化、カルボキシル化、リン酸化、またはグリコシル化が含まれる；そのような修飾は、ポリペプチドの合成または処理の間に、または単離した修飾酵素による処理の後に起こる。類似体はまた、一次配列の変化により、本発明の天然に存在するポリペプチドと異なっていてもよい。これらには、天然および人工の両方の遺伝的変異体が含まれる（例えば、放射線照射もしくはエタンメチル硫酸塩への曝露によるランダム変異誘発、またはSambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第2版), CSH Press, 1989またはAusubel et al., 前出に記載される部位特異的変異誘発により生じる）。また、L-アミノ酸以外の残基、例えばD-アミノ酸、または非天然もしくは合成アミノ酸、例えばβまたはγアミノ酸を含む、環化されたペプチド、分子、および類似体も含まれる。
【０１４５】
全長ポリペプチドに加えて、本発明は、本発明のいずれか1つのポリペプチドの断片も含む。本明細書で使用する用語「断片」は、少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、または13アミノ酸の長さを意味する。本発明の断片は、当業者に公知の方法により生成することができるか、または通常のタンパク質プロセシング（例えば、新生ポリペプチドからの生物学的活性に必要とされないアミノ酸の除去、または選択的mRNAスプライシングもしくは選択的タンパク質スプライシング事象によるアミノ酸の除去）から得ることができる。
【０１４６】
AIP機能活性（例えば、心臓調節活性）を模倣するように設計された化学構造を有する非タンパク質AIP類似体は、本発明の方法に従って投与され得る。AIP類似体は天然AIPの生理活性を超えてもよい。類似体の設計方法は当技術分野で周知であり、類似体の合成は、そのような方法に従って、得られた類似体が天然AIPの免疫調節活性を示すように化学構造を改変することにより行うことができる。こうした化学修飾には、代替R基の置換、および天然AIPの特定の炭素原子での飽和度の変更が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、AIP類似体は、インビボ分解に対して比較的耐性があり、投与時により長い治療効果をもたらす。機能的活性を測定するアッセイには、以下の実施例に記載されるものが含まれるが、これらに限定されない。
【０１４７】
本発明はまた、RYR2へのCaMKIIの作用に対するCaMKII阻害の特異性および効力を増大させる方法も企図している。例えば、RYR2結合モジュールとCaMKII阻害剤配列を含む融合タンパク質の発現により、該阻害性ペプチドをRYR2に局在化することができる。RYR2結合モジュールは、FKBP12.6またはFKBP12.6の誘導体からなり得る。
【０１４８】
ポリヌクレオチド療法
AIPペプチド、その類似体、変異体、または断片をコードするポリヌクレオチドを特徴とするポリヌクレオチド療法は、心不整脈（例えば、CPVT）を治療するための別の治療アプローチである。心臓細胞でのそのようなタンパク質の発現は、例えば、RYR2のリン酸化を阻害することにより、CAMKII活性を阻害することにより、または別の方法で心臓のリズムを規則正しくすることにより、心臓の細胞、組織または器官の機能を調節すると予想される。そのような核酸分子は、心不整脈を有する対象の細胞に送達され得る。核酸分子は、治療上有効なレベルのAIPペプチドまたはその断片が産生されるように、それらを取り込むことができる形で対象の細胞に送達されねばならない。
【０１４９】
形質導入ウイルス（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス）ベクターは、特に高い感染効率と、安定した組込みおよび発現のため、体細胞遺伝子治療に使用することができる（例えば、Cayouette et al., Human Gene Therapy 8:423-430, 1997; Kido et al., Current Eye Research 15:833-844, 1996; Bloomer et al., Journal of Virology 71:6641-6649, 1997; Naldini et al., Science 272:263-267, 1996; およびMiyoshi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:10319, 1997を参照されたい）。例えば、AIPペプチド、その変異体または断片をコードするポリヌクレオチドをレトロウイルスベクターにクローニングし、その内在性プロモーターから、レトロウイルスの長い末端反復配列から、または関心のある標的細胞型に特異的なプロモーターから発現を推進することができる。使用可能な他のウイルスベクターには、例えば、ワクシニアウイルス、ウシパピローマウイルス、またはヘルペスウイルス、例えばエプスタイン・バーウイルスが含まれる（例えば、Miller, Human Gene Therapy 15-14, 1990; Friedman, Science 244:1275-1281, 1989; Eglitis et al., BioTechniques 6:608-614, 1988; Tolstoshev et al., Current Opinion in Biotechnology 1:55-61, 1990; Sharp, The Lancet 337:1277-1278, 1991; Cornetta et al., Nucleic Acid Research and Molecular Biology 36:311-322, 1987; Anderson, Science 226:401-409, 1984; Moen, Blood Cells 17:407-416, 1991; Miller et al., Biotechnology 7:980-990, 1989; Le Gal La Salle et al., Science 259:988-990, 1993; およびJohnson, Chest 107:77S-83S, 1995に記載のベクターも参照されたい）。レトロウイルスベクターは特によく開発されており、臨床現場で使用されている（Rosenberg et al., N. Engl. J. Med 323:370, 1990; Anderson et al., 米国特許第5,399,346号）。一態様では、AIPペプチドをコードするポリヌクレオチドを心臓組織に投与するために、ウイルスベクターが使用される。
【０１５０】
形質導入ウイルスベクターは、他の細胞種と比較して、ある細胞種の選択的形質導入を可能にする組織指向性（tissue tropism）を持っている。例えば、心筋細胞でのCAMKII阻害は、CPVTまたは他のタイプの心臓病にとっては治療になるが、脳などの他の組織でのCAMKII阻害は望ましくないことがある。いくつかの態様では、他の細胞種と比較して高い特異性で心筋細胞を標的とするベクターが使用される。これは、CAMKII阻害ペプチド分子の発現の特異的な心臓ターゲティングを可能にする。それは、他の非心臓細胞でのCAMKII阻害が有害であり得るためである。可能性のあるアデノ随伴ウイルスの候補には、AAV9、AAV6、AAV2i8、Anc80、およびAnc82がある。アデノ随伴ウイルスの形質導入効率は、そのゲノムが「自己相補的」である場合に向上する。いくつかの態様では、遺伝子治療ベクターによる心臓形質導入を増加させるために、自己相補的なアデノ随伴ウイルスが使用される。
【０１５１】
CPVTの抑制を必要とする患者の心臓細胞に治療薬を導入するために、非ウイルス性のアプローチを採用することもできる。例えば、核酸分子は、リポフェクション（Feigner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:7413, 1987; Ono et al., Neuroscience Letters 17:259, 1990; Brigham et al., Am. J. Med. Sci. 298:278, 1989; Staubinger et al., Methods in Enzymology 101:512, 1983）、アシアロオロソムコイド-ポリリシン結合（Wu et al., Journal of Biological Chemistry 263:14621, 1988; Wu et al., Journal of Biological Chemistry 264:16985, 1989）の存在下で該核酸を投与することによって、または手術条件下でのマイクロインジェクション（Wolff et al., Science 247:1465, 1990）によって、細胞に導入され得る。好ましくは、核酸はリポソームおよびプロタミンと組み合わせて投与される。
【０１５２】
遺伝子導入は、インビトロでのトランスフェクションを含む非ウイルス手段を用いて達成することもできる。そのような方法は、リン酸カルシウム、DEAEデキストラン、エレクトロポレーション、およびプロトプラスト融合の使用を含む。リポソームもまた、細胞へのDNAの送達に潜在的に有益であり得る。患者の罹患組織への正常遺伝子の移植はまた、エクスビボで正常な核酸を培養可能な細胞種（例えば、自己もしくは異種の初代細胞またはその子孫）に導入し、その後、該細胞（またはその子孫）を標的組織に注入することによっても達成され得る。
【０１５３】
ポリヌクレオチド治療法で用いるcDNAの発現は、任意の適切なプロモーター（例えば、ヒトサイトメガロウイルス（CMV）、シミアンウイルス40（SV40）、CMV-ニワトリβアクチンハイブリッドプロモーター（「CAG」）、またはメタロチオネインプロモーター）から誘導され、かつ任意の適切な哺乳動物調節要素により調節され得る。CPVTの治療では、心筋細胞でCAMKII阻害剤を選択的に発現させて、他の細胞種での発現を最小限に抑えることが望ましい。いくつかの態様では、CAMKII阻害剤ペプチドの発現のために心筋細胞選択的プロモーターが使用される。使用されるプロモーターまたはエンハンサーには、限定するものではないが、組織特異的または細胞特異的なエンハンサーとして特徴付けられるものが含まれる。例えば、心筋トロポニンTプロモーター、αミオシン重鎖（α-MHC）プロモーター、ミオシン軽鎖-2v（MLC-2v）プロモーター、または心筋NCX1プロモーターを用いて、心筋細胞での発現を指令することができる。あるいは、ゲノムクローンが治療用構築物として使用される場合、調節は、コグネイト調節配列によって媒介されるか、または必要に応じて、上記のプロモーターもしくは調節要素のいずれかを含む異種の供給源に由来する調節配列によって媒介され得る。
【０１５４】
本発明に含まれる別の治療アプローチは、潜在的なもしくは実際の罹患組織の部位に直接または全身的に（例えば、従来の組換えタンパク質投与技術により）、組換えAIPペプチド、その変異体または断片などの治療用組換えCaMKII阻害剤を投与することを含む。投与されるペプチドの用量は、個々の患者の体格および健康状態を含めて、多くの要因に依存する。特定の対象について、具体的な投薬計画は、個々のニーズおよび該組成物の投与を管理または監督する者の専門的判断に従って、経時的に調整される必要がある。
【０１５５】
スクリーニングアッセイ
本発明は、CAMKII阻害剤、AIPもしくはその類似体、またはAIPをコードするポリヌクレオチドを投与することにより、心臓のリズムを修正する方法を提供する。本明細書に記載の実施例は、AIPペプチドをコードするAAVベクターの使用を具体的に説明しているが、当業者であれば、本発明の方法はそのようなものに限定されないことが理解されよう。CAMKIIによる心臓リアノジンチャネル（RYR2）のリン酸化を阻害する事実上いかなる薬剤でも、本発明の方法で使用することができる。例示的なCAMKII阻害剤は当技術分野で公知であり、本明細書に記載されている。
【０１５６】
本発明の方法は、CPVTを抑制するかまたは心臓のリズムを有利に調節する候補薬剤のハイスループットで低コストのスクリーニングに有用である。そのような薬剤は、例えば、光遺伝学的アクチュエーターまたはセンサーを発現するヒトiPSC由来心筋細胞を用いて、同定することができる。その後、CPVTを特異的に抑制し、RYR2のCaMKIIリン酸化を阻害する候補薬剤が単離されて、CPVTを抑制するその能力、望ましくは心臓リズムまたは他の心機能を調節するその能力についてインビトロアッセイまたはインビボアッセイで活性を試験される。当業者には理解されるように、細胞、組織または臓器に対する候補薬剤の効果は、典型的には、候補薬剤と接触していない対応する対照の細胞、組織または臓器と比較される。したがって、スクリーニング方法は、接触させた細胞の特性を未処理の対照細胞の特性と比較することを含む。
【０１５７】
AIPの効果を模倣する薬剤、すなわち、CPVTを抑制する薬剤、CaMKIIによるRYR2のリン酸化を阻害する薬剤、または別の方法で心臓のリズムを調節する薬剤は、例えば、心臓のリズムを調節する治療薬として使用され得る。本明細書で提供されるポリヌクレオチド配列のそれぞれは、そのような治療用化合物の探索および開発に使用することもできる。コードされたAIPペプチドとその類似体は、発現時に、対象におけるCPVTを予防するために使用され得る。
【０１５８】
試験化合物および抽出物
一般的に、CaMKII阻害剤、AIPペプチド類似体および模倣物は、当技術分野で公知の方法に従って、天然産物もしくは合成（または半合成）抽出物の大きなライブラリーから、または化学ライブラリーから、またはポリペプチドもしくは核酸ライブラリーから同定される。医薬品探索・開発の分野の当業者は、試験抽出物または化合物の正確な供給源が本発明のスクリーニング法にとって重要ではないことを理解するであろう。スクリーニングで使用される薬剤には、心不整脈を治療するための治療薬として知られているものが含まれる。あるいは、事実上あらゆる未知の化学抽出物または化合物が本明細書に記載の方法を用いてスクリーニングされ得る。そのような抽出物または化合物の例には、限定するものではないが、植物、真菌、原核生物または動物ベースの抽出物、発酵ブロス、および合成化合物、ならびに既存のポリペプチドの修飾が含まれる。
【０１５９】
細菌、真菌、植物および動物の抽出物の形態の天然ポリペプチドのライブラリーは、Biotics（Sussex, 英国）、Xenova（Slough, 英国）、Harbor Branch Oceangraphics Institute（Ft. Pierce, フロリダ州）、およびPharmaMar, U.S.A.（Cambridge, マサチューセッツ州）を含めて、多くの供給源から市販されている。そのようなポリペプチドは、当技術分野で公知でありかつ本明細書に記載される方法を用いて、タンパク質形質導入ドメインを含むように修飾され得る。さらに、天然のおよび合成的に作成されたライブラリーは、必要に応じて、当技術分野で公知の方法に従って、例えば標準的な抽出および分画法により、作成される。分子ライブラリーの合成方法の例は、当技術分野で、例えば以下の文献に見い出すことができる：DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6909, 1993; Erb et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422, 1994; Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37:2678, 1994; Cho et al., Science 261:1303, 1993; Carrell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059, 1994; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061, 1994; およびGallop et al., J. Med. Chem. 37:1233, 1994。さらに、必要に応じて、ライブラリーまたは化合物はどれも、標準的な化学的、物理的または生化学的方法を用いて容易に修飾される。
【０１６０】
また、糖、脂質、ペプチド、および核酸ベースの化合物を含むがこれらに限定されない、様々なポリペプチドまたは化合物のランダムまたは指向性合成（例えば、半合成または全合成）を生み出すために、多数の方法が利用可能である。合成化合物ライブラリーは、Brandon Associates社（Merrimack, ニューハンプシャー州）およびAldrich Chemical社（Milwaukee, ウィスコンシン州）から市販されている。あるいは、候補化合物として使用される化合物は、標準的な合成技術および当業者に公知の方法論を使用して、容易に入手可能な出発物質から合成することができる。本明細書に記載の方法により同定された化合物を合成するのに有用な合成化学変換および保護基（保護および脱保護）の方法論は、当技術分野で知られており、例えば、以下の文献に記載されるものを含む：R. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers (1989); T. W. Greene and P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 第2版, John Wiley and Sons (1991); L. Fieser and M. Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1994); L. Paquette編, Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995)；およびそれらの後続の改訂版。
【０１６１】
化合物のライブラリーは、溶液中に（例えば、Houghten, Biotechniques 13:412-421, 1992）、またはビーズ（Lam, Nature 354:82-84, 1991）、チップ（Fodor, Nature 364:555-556, 1993）、細菌（Ladner, 米国特許第5,223,409号）、胞子（Ladner, 米国特許第5,223,409号）、プラスミド（Cull et al., Proc Natl Acad Sci USA 89:1865-1869, 1992）もしくはファージ（Scott and Smith, Science 249:386-390, 1990; Devlin, Science 249:404-406, 1990; Cwirla et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6378-6382, 1990; Felici, J. Mol. Biol. 222:301-310, 1991; Ladner 前出）の上に提示され得る。
【０１６２】
さらに、医薬品探索・開発の分野の当業者には容易に理解されるように、脱複製（例えば、分類学的脱複製、生物学的脱複製、化学的脱複製、またはそれらの任意の組み合わせ）の方法、または活性について既に知られている物質の反復または繰り返しの排除は、いつでも可能な限り、採用されるべきである。
【０１６３】
粗抽出物に心臓リズム調節活性またはCAMKII阻害活性があることが判明した場合、観察された効果に関与している分子成分を単離するために、陽性のリード抽出物のさらなる分画が必要である。したがって、抽出、分画、および精製プロセスの目標は、所望の活性を有する粗抽出物中の化学物質の慎重な特性評価と同定である。そのような不均質抽出物の分画および精製の方法は、当技術分野で知られている。必要に応じて、治療薬として有用であることが示された化合物は、当技術分野で公知の方法に従って化学的に修飾される。
【０１６４】
治療方法
AIP模倣活性（例えば、CaMKII阻害活性、心臓リズム調節活性）を有するCaMKII阻害剤および/またはAIPもしくはAIP類似体をコードするポリヌクレオチドとして同定された薬剤は、CPVTまたは別の心不整脈を予防または改善するのに有用である。不整脈を特徴とする疾患および障害は、本発明の方法および組成物を用いて治療することができる。
【０１６５】
1つの治療アプローチでは、本明細書に記載のように同定された薬剤は、潜在的なまたは実際の罹患組織の部位に投与されるか、または全身投与される。投与される薬剤の用量は、個々の患者の体格および健康状態を含めて、多くの要因に依存する。特定の対象について、具体的な投薬計画は、個々のニーズおよび該組成物の投与を管理または監督する者の専門的判断に従って、経時的に調整される必要がある。
【０１６６】
薬学的治療
本発明は、CaMKII阻害活性および/または心臓リズム調節活性を有する組成物（ポリヌクレオチド、ペプチド、小分子阻害剤、およびAIP模倣物を含む）を同定するための単純な手段を提供する。したがって、本明細書に記載の方法を用いて医学的価値を有することが見出された化学物質は、薬物として、または例えば合理的な薬物設計による、既存の化合物の構造改修のための情報として有用である。そのような方法は、心不整脈を特徴とする様々な病態に効果がある薬剤をスクリーニングするのに有用である。
【０１６７】
治療的使用の場合、本明細書に記載の方法を用いて同定された組成物または薬剤は、例えば生理食塩水のような薬学的に許容される緩衝液で製剤化して、全身に投与することができる。好ましい投与経路には、例えば、患者に薬物の連続した持続的なレベルを提供する皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、または皮内注射が含まれる。AAV遺伝子治療では、投与は静脈内または冠動脈内投与であり得る。ヒト患者または他の動物の治療は、生理学的に許容される担体中の本明細書で同定された治療薬の治療有効量を使用して実施される。適切な担体およびそれらの製剤は、例えば、E. W. MartinによるRemington's Pharmaceutical Sciencesに記載されている。投与される治療薬の量は、投与方法、患者の年齢と体重、および心不整脈の臨床症状に応じて変化する。一般的に、その量は、心機能の調節を必要とする他の疾患の治療に使用される他の薬剤の使用量の範囲内にあるが、特定の場合には、化合物の特異性の増加のために、より少ない量が必要とされる。化合物はCAMKII阻害活性または心臓リズム調節活性を有する投与量で投与され、こうした活性は当業者に公知の方法により測定されるか、またはCAMKIIポリペプチドの発現もしくは生物学的活性を測定する任意のアッセイを使用して決定される。
【０１６８】
薬学的組成物の製剤化
心不整脈の治療用の化合物の投与は、他の成分と組み合わせて、不整脈を改善、軽減、または安定化するのに有効な治療薬の濃度をもたらす任意の適切な手段によるものであり得る。該化合物は、適切な担体物質中に適切な量で含まれ、一般には、組成物の総重量の1〜95重量％の量で存在する。組成物は、非経口（例えば、皮下、静脈内、筋肉内、または腹腔内）投与経路に適した剤形で提供され得る。薬学的組成物は、従来の製薬プラクティスに従って製剤化することができる（例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (第20版), A. R. Gennaro編, Lippincott Williams & Wilkins, 2000およびEncyclopedia of Pharmaceutical Technology, J. Swarbrick and J. C. Boylan編, 1988-1999, Marcel Dekker, New Yorkを参照されたい）。
【０１６９】
本発明による薬学的組成物は、投与後ほぼすぐに、または投与後の所定の時間または期間に活性化合物を放出するように製剤化され得る。後者のタイプの組成物は、一般に制御放出製剤として知られており、これには以下の製剤が含まれる：（i）長期間にわたって体内で薬物のほぼ一定した濃度をもたらす製剤；（ii）所定のラグタイムの後に、長期間にわたって体内で薬物のほぼ一定した濃度をもたらす製剤；（iii）活性物質の血漿レベルの高下（鋸歯状動力学パターン）に関連する望ましくない副作用を最小限に抑えると同時に、体内で比較的一定した有効レベルを維持することによって、作用を所定の期間中持続する製剤；（iv）例えば、胸腺に隣接する、または胸腺と接触する制御放出組成物の空間的配置により、作用を局在化する製剤；（v）例えば、用量を週1回または2週に1回投与するといった、便利な投薬を可能にする製剤；および（vi）治療薬を特定の細胞種（例：心臓細胞）に送達する担体または化学的誘導体を使用することによって、心不整脈を標的とする製剤。いくつかの適用例では、制御放出製剤は、血漿レベルを治療レベルに維持するために日中に頻繁に投与する必要性を排除する。
【０１７０】
放出速度が問題の化合物の代謝速度を上回る制御放出を得るために、多くの戦略のいずれかを実行することができる。一例では、制御放出は、例えば、様々なタイプの制御放出組成物およびコーティング剤を含めて、様々な製剤化パラメータおよび成分を適切に選択することによって得られる。したがって、治療薬は、適切な賦形剤を用いて、投与時に制御された方法で治療薬を放出する薬学的組成物へと製剤化される。例としては、シングルユニット型またはマルチプルユニット型の錠剤またはカプセル剤組成物、油性溶液、懸濁液、エマルジョン、マイクロカプセル、ミクロスフェア、分子複合体、ナノ粒子、パッチ、およびリポソームが挙げられる。
【０１７１】
非経口組成物
薬学的組成物は、従来の非毒性の薬学的に許容される担体および補助剤を含む剤形、製剤での注射、注入または移植（皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、冠動脈内など）によって、または適切な送達デバイスもしくはインプラントを介して、非経口的に投与することができる。そのような組成物の製剤化および調製は、製剤の分野の当業者に周知である。製剤は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 前出に記載されている。
【０１７２】
非経口用の組成物は、単位剤形（例えば、1回量アンプル）で、または数回の用量を含むバイアル（適切な防腐剤が添加されてもよい）で提供され得る（以下を参照）。該組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、注入器、または移植用の送達デバイスの形態であってもよし、使用前に水または別の適切なビヒクルで再調製される乾燥粉末として提示されてもよい。心不整脈を軽減または改善する活性薬剤とは別に、該組成物は、適切な非経口的に許容される担体および/または賦形剤を含むことができる。制御放出のために、活性治療薬（複数可）をミクロスフェア、マイクロカプセル、ナノ粒子、リポソームなどに組み込んでもよい。さらに、該組成物は、懸濁化剤、可溶化剤、安定剤、pH調整剤、等張化剤、および/または分散剤を含むことができる。
【０１７３】
上記のように、本発明による薬学的組成物は、無菌の注射に適した形態であり得る。そのような組成物を調製するために、適切な治療薬は、非経口的に許容される液体ビヒクルに溶解または懸濁される。使用可能な許容されるビヒクルおよび溶媒には、水、適量の塩酸、水酸化ナトリウムまたは適切な緩衝液の添加により適切なpHに調整された水、1,3-ブタンジオール、リンゲル液、および等張性塩化ナトリウム溶液およびデキストロース溶液が含まれる。水性製剤はまた、1種または複数種の防腐剤（例えば、p-ヒドロキシ安息香酸メチル、エチルまたはn-プロピル）を含んでもよい。化合物の1つが水に難溶性であるかまたはわずかにしか溶けない場合には、溶解促進剤または可溶化剤を加えることができ、または溶媒が10〜60％w/wのプロピレングリコールなどを含んでもよい。
【０１７４】
制御放出非経口組成物
制御放出非経口組成物は、水性懸濁液、ミクロスフェア、マイクロカプセル、磁性ミクロスフェア、油性溶液、油性懸濁液、またはエマルジョンの形態であり得る。あるいは、活性薬物は、生体適合性キャリア、リポソーム、ナノ粒子、インプラント、または注入器に組み込むこともできる。
【０１７５】
ミクロスフェアおよび/またはマイクロカプセルの調製に使用される材料は、例えば、ポリガラクチン、ポリ-(イソブチルシアノアクリレート)、ポリ(2-ヒドロキシエチル-L-グルタミン)、ポリ(乳酸)などの生分解性/生体内浸食性ポリマーである。制御放出非経口製剤を製剤化するときに使用できる生体適合性キャリアは、炭水化物（例：デキストラン）、タンパク質（例：アルブミン）、リポタンパク質、または抗体である。インプラントに使用できる材料は、非生分解性（例：ポリジメチルシロキサン）または生分解性（例：ポリ(カプロラクトン)、ポリ(乳酸)、ポリ(グリコール酸)、ポリ(オルトエステル)、またはそれらの組み合わせ）であり得る。
【０１７６】
経口用の固体剤形
経口投与用の製剤には、非毒性の薬学的に許容される賦形剤との混合物として有効成分を含む錠剤が含まれる。そのような製剤は当業者に公知である。賦形剤は、例えば、不活性希釈剤または充填剤（例：スクロース、ソルビトール、糖、マンニトール、微結晶セルロース、ジャガイモデンプンなどのデンプン、炭酸カルシウム、塩化ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、またはリン酸ナトリウム）；造粒剤および崩壊剤（例：微結晶セルロースなどのセルロース誘導体、ジャガイモデンプンなどのデンプン、クロスカルメロースナトリウム、アルギン酸塩、またはアルギン酸）；結合剤（例：スクロース、グルコース、ソルビトール、アカシア、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、デンプン、アルファ化デンプン、微結晶セルロース、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン、またはポリエチレングリコール）；および滑沢剤、流動促進剤、および付着防止剤（例：ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、シリカ、硬化植物油、またはタルク）であり得る。その他の薬学的に許容される賦形剤には、着色剤、香味剤、可塑剤、保湿剤、緩衝剤などがある。
【０１７７】
錠剤はコーティングされていなくても、コーティングされていてもよい；コーティングは、任意で胃腸管での崩壊および吸収を遅らせることによって長期間にわたり持続した作用を提供するために、公知の技術で施される。コーティングは、（例えば、制御放出製剤を達成するために）活性薬物を所定のパターンで放出するように適合させてもよいし、胃を通り抜けるまで活性薬物を放出しないように適合させてもよい（腸溶性コーティング）。コーティングは、糖衣コーティング、フィルムコーティング（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アクリレートコポリマー、ポリエチレングリコールおよび/またはポリビニルピロリドンを基剤とする）、または腸溶性コーティング（例えば、メタクリル酸コポリマー、酢酸フタル酸セルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、酢酸コハク酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリ酢酸ビニルフタレート、シェラック、および/またはエチルセルロースを基剤とする）であり得る。さらに、例えばモノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどの時間遅延（time delay）材料を使用してもよい。
【０１７８】
固体錠剤組成物は、該組成物を望ましくない化学変化（例えば、心臓活性治療物質の放出前のその活性物質の化学的分解）から保護するのに適したコーティングを含み得る。コーティングは、前出のEncyclopedia of Pharmaceutical Technologyに記載される方法と同様の方法で、固体剤形に施すことができる。
【０１７９】
一態様において、2つ以上の心臓治療薬は錠剤中に一緒に混合されてもよいし、区分化されてもよい。一例では、第1の活性心臓治療薬が錠剤の内側に含まれ、第2の活性治療薬が外側にあり、その結果、第2の治療薬の大部分は第1の活性治療薬の放出前に放出される。
【０１８０】
経口投与用の製剤は、チュアブル錠として、または活性成分が不活性固体希釈剤（例：ジャガイモデンプン、ラクトース、微結晶セルロース、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはカオリン）と混合されている硬ゼラチンカプセル剤として、または活性成分が水もしくは油性媒体（例：ピーナッツ油、流動パラフィン、またはオリーブ油）と混合されている軟ゼラチンカプセル剤としても提示され得る。粉剤および顆粒剤は、例えば、ミキサー、流動床装置または噴霧乾燥装置を使用する従来の方法で、錠剤およびカプセル剤について上述した成分を用いて調製することができる。
【０１８１】
制御放出経口剤形
経口投与用の制御放出組成物は、例えば、活性物質の溶解および/または拡散を制御することにより、活性心臓治療薬を放出するように構築され得る。溶解または拡散制御放出は、化合物の錠剤、カプセル剤、ペレット剤、もしくは顆粒剤の適切なコーティングによって、または化合物を適切なマトリックスに組み込むことによって、達成することができる。制御放出コーティングは、上記のコーティング材料および/または例えば以下の材料の1つまたは複数を含み得る：シェラック、蜜ろう、グリコワックス、硬化ヒマシ油（castor wax）、カルナウバワックス、ステアリルアルコール、モノステアリン酸グリセリル、ジステアリン酸グリセリル、パルミトステアリン酸グリセロール、エチルセルロース、アクリル樹脂、dl-ポリ乳酸、酢酸酪酸セルロース、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニル、ビニルピロリドン、ポリエチレン、ポリメタクリレート、メチルメタクリレート、2-ヒドロキシメタクリレート、メタクリレートヒドロゲル、1,3ブチレングリコール、エチレングリコールメタクリレート、および/またはポリエチレングリコール。制御放出マトリックス製剤では、マトリックス材料として、例えば、水和メチルセルロース、カルナウバワックスおよびステアリルアルコール、カルボポール934、シリコーン、トリステアリン酸グリセリル、アクリル酸メチル-メタクリル酸メチル、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、および/またはハロゲン化フルオロカーボンも含まれる。
【０１８２】
1つまたは複数の治療用化合物を含む制御放出組成物はまた、浮遊性の錠剤またはカプセル剤（すなわち、経口投与時に一定期間にわたり胃内容物の上に浮遊している錠剤またはカプセル剤）の形態であってもよい。化合物の浮遊性錠剤を調製するには、化合物と賦形剤および20〜75％w/wの親水コロイド、例えばヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなど、との混合物を造粒する。次に、得られた顆粒を錠剤に圧縮する。胃液と接触すると、この錠剤はその表面の周りに実質的に水不浸透性のゲルバリアを形成する。このゲルバリアは、1未満の密度を維持することに関わり、それにより、錠剤が胃液中で浮遊し続けることを可能にする。
【０１８３】
併用療法
任意で、本明細書に記載の心臓治療薬（例えば、CAMKII阻害剤、AIPペプチドまたはポリヌクレオチド）は、心機能を調節するのに有用な他の標準的治療と組み合わせて投与することができる；そのような方法は当業者に公知であり、E. W. MartinによるRemington's Pharmaceutical Sciencesに記載されている。
【０１８４】
変異型RYR2のゲノム編集
RYR2突然変異を有する対象はCPVTを起こしやすいため、RYR2ポリペプチドをコードする欠陥遺伝子を特異的に修復することが望ましいだろう。治療遺伝子編集は、基礎科学と臨床科学との境界を含む、生物医学的研究の主要な関心事である。多数の異なる劣性遺伝ヒト疾患症候群は、疾患遺伝子の両アレル（biallelic）不活性化点突然変異の遺伝によって引き起こされる。新規な「遺伝子編集」ツールの開発により、ゲノムの他の部位に変異を導入することなく、特定の染色体座位で細胞のDNA配列を操作することができる。この技術は、研究者がインビトロまたはインビボで対象の細胞のゲノムを操作して、有害な遺伝子型（例えば、RYR2R4651Iをコードする遺伝子）を元に戻すことを効率よく可能にする。これとは別に、本発明者らは、CAMKIIによるRYR2-S2814のリン酸化がCPVT変異をアンマスクすること、およびRYR2-S2814A変異が保護的であることを見出したため、治療遺伝子編集は、S2814A変異を患者の心筋細胞に導入して、それらが不整脈を起こしにくくすることを含み得る。
【０１８５】
一態様において、遺伝子編集は、エンドヌクレアーゼ（DNA分子内でDNA切断を内部的に引き起こす酵素）をゲノムの特定部位にターゲティングし、それによって選択された部位での染色体二本鎖切断（double strand break：DSB）の形成を引き起こすことを含む。染色体切断の導入と同時に、ドナーDNA分子が（例えば、プラスミドまたはオリゴヌクレオチドの導入により）導入されると、切断された染色体と導入されたDNAとの間で相互作用が、特に2つの配列が相同性を共有する場合に、起こり得る。この場合、「遺伝子ターゲティング」と呼ばれるプロセスが起こり、そこでは染色体のDNA末端が相同組換え（HR）によってドナーDNAの相同配列に入り込む。ドナープラスミド配列をHRのテンプレートとして使用することにより、染色体DSBのシームレス修復が達成され得る。重要なことには、ドナーDNA分子が配列の点で染色体配列とわずかに異なる場合、HRを介したDSB修復はドナー配列を染色体に導入し、その結果、染色体座位の遺伝子変換/遺伝子修正をもたらす。治療遺伝子ターゲティングとの関連では、選択される改変配列は、対象となる疾患遺伝子の活性または機能性断片（例えば、野生型、正常）であろう。疾患の原因となる点突然変異を含むゲノム部位にヌクレアーゼをターゲティングすることに関して、その概念は、DSB形成を使用してHRを促進すること、それによって変異型疾患配列を野生型配列と置き換えること（遺伝子修正）である。HR経路の利点は、それが、以前の変異型アレルの代わりに、その遺伝子の野生型コピーをシームレスに生成する可能性があることである。
【０１８６】
現在のゲノム編集ツールは、細胞の遺伝子操作を高めるために、二本鎖切断（DSB）の誘導を使用している。そのような方法としては、以下が挙げられる：ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN；例えば、次の米国特許：6,534,261、6,607,882、6,746,838、6,794,136、6,824,978、6,866,997、6,933,113、6,979,539、7,013,219、7,030,215、7,220,719、7,241,573、7,241,574、7,585,849、7,595,376、6,903,185および6,479,626、ならびに次の米国特許出願公開：20030232410およびUS2009020314に記載されており、これらは参照により本明細書に組み入れられる）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN；例えば、次の米国特許：8,440,431、8,440,432、8,450,471、8,586,363および8,697,853、ならびに次の米国特許出願公開：20110145940、20120178131、20120178169、20120214228、20130122581、20140335592および20140335618に記載されており、これらは参照により本明細書に組み入れられる）、およびCRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）/Cas9システム（例えば、次の米国特許：8,697,359、8,771,945、8,795,965、8,871,445、8,889,356、8,906,616、8,932,814、8,945,839、8,993,233および8,999,641、ならびに次の米国特許出願公開：20140170753、20140227787、20140179006、20140189896、20140273231、20140242664、20140273232、20150184139、20150203872、20150031134、20150079681、20150232882および20150247150に記載されており、これらは参照により本明細書に組み入れられる）。例えば、ZFN DNA配列の認識能力と特異性は予測不能である。同様に、TALENとCRISPR/Cas9は、目的の部位だけでなく、他の「オフターゲット」部位でも切断する。これらの方法は、オフターゲット二本鎖切断の誘導と、これらのオフターゲット効果に関連するインデル、ゲノム再編成、染色体再編成などの有害な突然変異の可能性と結び付いた重大な問題を抱えている。ZFNとTALENは、ゲノム中の〜18bp配列に対する特異性を生み出すためにモジュール配列特異的なDNA結合タンパク質の使用を必然的に伴う。
【０１８７】
タイプ2 CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat）/Cas（CRISPR関連）システムに基づくRNA誘導型（RNA-guided）ヌクレアーゼ媒介ゲノム編集は、ゲノムを改変するための価値あるアプローチを提供する。簡単に説明すると、シングルガイドRNA（sgRNA）によって誘導されるヌクレアーゼであるCas9は、プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）の隣の標的ゲノム座位に結合して、二本鎖切断（DSB）を生成する。その後、DSBは、挿入/欠失（インデル）突然変異をもたらす非相同末端結合（NHEJ）により、または外因性テンプレートを必要としかつ標的座位で正確な修飾を生成できる相同組換え修復（HDR）により修復される（Mali et al., Science. 2013 Feb 15;339(6121):823-6）。機能的または部分的に機能的な遺伝子のコピーを患者の細胞に追加するが、その遺伝子の元の機能不全のコピーを保持する他の遺伝子治療法とは異なって、このシステムは欠陥を取り除くことができる。人工ヌクレアーゼを使用した遺伝子修正は、組織培養細胞および希少疾患のげっ歯類モデルで実証されている。
【０１８８】
CRISPRは、パン酵母（Saccharomyces cerevisiae）、ゼブラフィッシュ、線虫（Caenorhabditis elegans）、植物、マウス、その他の数種の生物を含めて、広範囲の生物において使用されている。さらに、CRISPRは、科学者が特定の遺伝子を標的にして該遺伝子を活性化またはサイレンシングすることを可能にするプログラム可能な転写因子を作成するように改変された。今では、何万ものガイドRNAのライブラリーが利用可能である。
【０１８９】
2012年以来、CRISPR/Casシステムは、マウスおよび霊長類のような真核生物においても機能する遺伝子編集（特定の遺伝子をサイレンシング、増強、または変更すること）に使用されてきた。cas遺伝子と特別に設計されたCRISPRを含むプラスミドを挿入することにより、生物のゲノムを所望の位置で切断することができる。
【０１９０】
CRISPRリピート配列は、サイズが24〜48塩基対の範囲である。それらは通常、若干のダイアド（dyad）対称性を示し、ヘアピンなどの二次構造の形成を暗示するが、真の回文構造ではない。リピート配列は同じような長さのスペーサー配列によって分離されている。一部のCRISPRスペーサー配列は、プラスミドおよびファージ由来の配列に正確に一致するが、一部のスペーサーは原核生物のゲノムに一致する（自己ターゲティングスペーサー）。新しいスペーサーがファージ感染に応答して迅速に追加され得る。
【０１９１】
CRISPR関連（cas）遺伝子群は、多くの場合、CRISPRリピート-スペーサーアレイに関連している。2013年の時点で、40を超える異なるCasタンパク質ファミリーが報告されていた。これらのタンパク質ファミリーのうち、Cas1は異なるCRISPR/Casシステム間で遍在しているようである。cas遺伝子とリピート構造の特定の組み合わせを使用して、8つのCRISPRサブタイプ（Ecoli、Ypest、Nmeni、Dvulg、Tneap、Hmari、Apern、およびMtube）が定義されており、そのうちの一部は、リピート関連ミステリアスタンパク質（repeat-associated mysterious protein）（RAMP）をコードする追加の遺伝子モジュールに関連している。1つのゲノムに複数のCRISPRサブタイプが存在し得る。CRISPR/Casサブタイプの散発的分布は、微生物の進化の間にこのシステムが遺伝子の水平伝播を受けやすいことを示唆している。
【０１９２】
外因性DNAは、Cas遺伝子によりコードされたタンパク質によって小さなエレメント（長さ約30塩基対）にプロセシングされるようであり、それらはその後、リーダー配列の近くのCRISPR座位に何らかの形で挿入される。CRISPR座位からのRNAは構成的に発現されて、Casタンパク質によって、隣接リピート配列を有する個々の外因的に誘導された配列エレメントからなる小さなRNAにプロセシングされる。該RNAは他のCasタンパク質をガイドして、外因性の遺伝的エレメントをRNAまたはDNAレベルでサイレンシングする。証拠からは、CRISPRサブタイプ間の機能的多様性が示唆される。Cse（CasサブタイプEcoli）タンパク質（大腸菌ではCasA-Eと呼ばれる）は、機能的複合体であるCascadeを形成し、CRISPR RNA転写産物をスペーサー-リピート単位にプロセシングしてCascadeに取り込む。他の原核生物では、Cas6がCRISPR転写産物をプロセシングする。興味深いことに、大腸菌でのCRISPRベースのファージ不活性化には、CascadeとCas3が必要であるが、Cas1とCas2は必要でない。パイロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）および他の原核生物に見られるCmr（Cas RAMPモジュール）タンパク質は、小さなCRISPR RNAと機能的複合体を形成し、該複合体が相補的な標的RNAを認識して切断する。RNA誘導型CRISPR酵素は、タイプV制限酵素として分類される。
【０１９３】
また、米国特許出願公開第2014/0068797号を参照されたい；その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１９４】
Cas9
Cas9はヌクレアーゼであり、DNA切断に特化した酵素であって、二重らせんの各鎖に1つずつ、2つの活性切断部位がある。Cas9がその標的DNAを位置づけてホーミングする能力を保持しながら、一方または両方の部位を無効にできることが実証された。Jinek et al. (2012)は、tracrRNAとスペーサーRNAを組み合わせて「シングルガイドRNA」分子とした；これは、Cas9と混合されると、正しいDNA標的を見つけて切断することができる。このような合成ガイドRNAは遺伝子編集に使用できるかもしれない、と提唱された（Jinek et al., Science. 2012 Aug 17;337(6096):816-21）。
【０１９５】
Cas9タンパク質は病原菌および共生細菌に非常に豊富である。CRISPR/Casを介した遺伝子調節は、特に細菌と真核生物宿主との相互作用中に、内因性細菌遺伝子の調節に寄与している可能性がある。例えば、フランシセラ・ノビシダ菌（Francisella novicida）のCasタンパク質Cas9は、ユニークで小さなCRISPR/Cas関連RNA（scaRNA）を使用して、細菌リポタンパク質をコードする内因性転写産物を抑制している；該リポタンパク質は、宿主応答を弱めかつ病原性を増進させるためにF.ノビシダにとって極めて重要である。Cas9 mRNAとsgRNAの生殖細胞系列（接合体）への同時注入は、変異のあるマウスをもたらした。Cas9 DNA配列の送達も企図される。
【０１９６】
gRNA
RNA誘導型タンパク質として、Cas9はDNA標的の認識を指示する短いRNAを必要とする。Cas9はPAM配列NGGを含むDNA配列を優先的に調べるが、それはプロトスペーサー標的なしでここに結合することができる。しかし、Cas9-gRNA複合体は、二本鎖切断を生成するためにgRNAへの厳密な一致を必要とする。細菌のCRISPR配列は複数のRNAに発現されており、その後プロセシングされてRNAのガイド鎖を生成する。真核生物システムはCRISPR RNAのプロセシングに必要なタンパク質の一部を欠いているため、Cas9ターゲティングに不可欠なRNA片を、RNAポリメラーゼタイプ2IプロモーターU6により発現される単一のRNAに結合させて、合成構築物gRNAが作成された。合成gRNAは最小長で100bpをわずかに上回り、PAM配列NGGの直前の20個のプロトスペーサーヌクレオチドを標的とする部分を含む；gRNAはPAM配列を含まない。
【０１９７】
1つのアプローチでは、対象の1つまたは複数の細胞が、CRISPR-Casシステムを使用して、RYR2R4651Iの野生型形態を発現するように改変される。突然変異を含むRYR2R4651Iを標的とするためにCas9が使用され得る。標的が認識されると、Cas9はRYR2R4651I標的遺伝子に二本鎖切断を誘導する。二本鎖切断部位での相同組換え修復（HDR）により、所望の野生型RYR2R4651I配列の挿入が可能になる。
【０１９８】
以下の米国特許および米国特許出願公開は、参照により本明細書に組み入れられる：特許第8,697,359号、20140170753、20140179006、20140179770、20140186843、20140186958、20140189896、20140227787、20140242664、20140248702、20140256046、20140273230、20140273233、20140273234、20140295556、20140295557、20140310830、20140356956、20140356959、20140357530、20150020223、20150031132、20150031133、20150031134、20150044191、20150044192、20150045546、20150050699、20150056705、20150071898、20150071899、20150071903、20150079681、20150159172、20150165054、20150166980、および20150184139。
【０１９９】
本発明の実施には、特に明記しない限り、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来の技術が採用され、これらは当業者の技量の範囲内である。そのような技術は、例えば、以下の文献に十分に説明されている：“Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 第2版 (Sambrook, 1989); “Oligonucleotide Synthesis” (Gait, 1984); “Animal Cell Culture” (Freshney, 1987); “Methods in Enzymology” “Handbook of Experimental Immunology” (Weir, 1996); “Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells” (Miller and Calos, 1987); “Current Protocols in Molecular Biology” (Ausubel, 1987); “PCR: The Polymerase Chain Reaction”, (Mullis, 1994); “Current Protocols in Immunology” (Coligan, 1991)。これらの技術は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの生産に適用可能であり、したがって、本発明を構成して実施する際に考慮され得る。特定の実施態様に特に有用な技術については、以下のセクションで説明することにする。
【０２００】
以下の実施例は、本発明のアッセイ、スクリーニング、および治療法をいかにして構成し使用するかについての完全な開示および説明を当業者に提供するために提示され、本発明者らが発明とみなすものの範囲を限定することを意図したものではない。
【実施例】
【０２０１】
実施例1：  同質遺伝子CPVT（PGP1-RYR2R4651I）
皮膚線維芽細胞をCPVT患者から入手した。この患者は、安静時心電図が正常であったものの、運動誘発性の多形性心室頻拍があった。ジェノタイピング（遺伝子型決定）により、該患者はRYR2に点突然変異があり、4651位のアルギニンがイソロイシンに置換されていることが明らかになった（R4651I；図19A〜19C）。臨床的ジェノタイピングは、候補となる他の遺伝性不整脈遺伝子を暗示しなかった。該線維芽細胞をiPSCにリプログラミングした（CPVTp系統、ここでpは患者由来を示す；図20A〜20D）；該iPSCは、野生型iPSC系統PGP1に匹敵する効率でiPSC-CMへとロバストに分化した（図1A、20E〜20F）。Cas9ゲノム編集を使用して、PGP1に患者の突然変異を導入し、同質遺伝子CPVT系統（PGP1-RYR2R4651I、略語CPVTe、ここでeは遺伝子操作したことを表す）と対照系統（PGP1、略語WT）を得た（図20G）。
【０２０２】
野生型（WT）、CPVTp、およびCPVTe iPSC-CMのCa2+ハンドリングは、自発的に拍動する孤立した細胞島（cell island）にCa2+感受性色素Fluo-4を添加して、共焦点ラインスキャンイメージングによって分析した。WTと比較して、患者由来のiPSC-CM（CPVTp）とゲノム編集した同質遺伝子iPSC-CM（CPVTe）の両方には、Ca2+スパークとして知られる、個々のCa2+放出単位でより頻繁な自発的Ca2+放出イベントがあり、これは、β交感神経様作動薬であるイソプロテレノール（ISO）によってさらに悪化した（図1B）。RYR2機能はカルシウムトランジェントを記録することにより調べた。ベースラインで、CPVTpとCPVTeは後脱分極の頻度を劇的に増加させた（図1C）。イソプロテレノール刺激により、後脱分極の頻度は、WTと比較してCPVTpとCPVTeで著しく上昇したままであった。
【０２０３】
臨床的不整脈は、組織へと組み立てられた心筋細胞の集団的挙動から発生するので、遺伝性不整脈をよりよくモデル化するために、筋肉薄膜（MTF）を統合し、光遺伝学、および光学マッピングにより、心筋の伝導と収縮の同時評価を可能にするプラットフォームである「オプトMTF」を作成した（図2A）。
【０２０４】
レンチウイルスを使用して、記載されるように、光ゲート式（light-gated）チャネルであるチャネルロドプシン（ChR2）を発現するように心筋細胞をプログラミングした。パイロット実験において、心筋細胞でのChR2発現は、それらの電気的活動に測定可能な影響を与えることなく、青色光を使用した光学的ペーシングを可能にした（図21）。光応答性のChR2発現心筋細胞を、マイクロ成形ゼラチンチップに播種した（図22H）；結果的に、それらは天然の心筋に特徴な平行配列に組み立てられた（図2A〜2B）。光ファイバを通して方向づけられた青色LED光照明（470nm、10ミリ秒パルス）が、3×10mm MTFの一端で、約500個の細胞を含む約0.79mm2の領域を照らした。これは、筋線維の長軸に沿ってMTFを横切って伝導する活動電位波を引き出すのに十分であった（図2A）。MTFの他端に位置する2つのフィルムカンチレバーに到達すると、活動電位波はiPSC-CM収縮を誘発して、カンチレバーを変位させた（図2Aおよび2C）。暗視野顕微鏡と組み合わせたCa2+感受性色素X-Rhod-1を用いる蛍光光学マッピングを使用して、カルシウムトランジェントと収縮を同時に記録した。対照iPSC-CMを用いて組み立てられたMTFでは、カルシウム波の伝播とその後のカンチレバーのたわみが明確に観察され、効果的な興奮-収縮カップリングが実証された（図2Cおよび24）。活性化マッピング、カルシウムトランジェントの持続時間、伝導速度などの、MTFの時空間的特性は、光学マッピングデータから測定した（図2D）。隣接するMTFは互いに独立しており、光刺激システムは各MTFを異なる周波数で個別にコントロールすることを可能にした。
【０２０５】
オプトMTFプラットフォームが確立されたら、それを使用して、CPVT遺伝子操作された心臓組織の組織スケールの特性を評価した。CPVTオプトMTFのCa2+トランジェント持続時間と伝導速度は、対照と有意な差がなかった（図2E〜2Gおよび24A）。CPVT iPSC-CMはベースラインでさえ頻繁な後脱分極を示したが（図1C）、オプトMTF組織への組み立てにより、この異常な活動はほぼ消失した（図2F）。したがって、CPVT組織シートは、運動または感情的ストレスの非存在下では不整脈がほとんどない患者のベースライン表現型をより良く再現していた。
【０２０６】
CPVT患者は、運動または感情的ストレスの間に心室頻拍を発症する。こうした誘発的な条件の主要な特徴をインビトロでシミュレートするために、オプトMTFを、次第に増加する光学的ペーシング周波数（1〜3Hz）またはβアドレナリン刺激（0〜10μMのISO）により刺激した。注目すべきことに、ペーシングまたはISOのいずれかによる、対照のオプトMTFの処理ではなく、CPVTの処理は、組織レベルの心室頻拍に相当するスパイラルリエントリーを維持するサブセットを誘導した（図3A〜3C）。高いペーシングレートとISOの両方の組み合わせは、リエントリーを最も強く誘発した。リエントリーの間、対になったオプトMTFカンチレバーは非同期的に動き（図3D）、臨床的心室頻拍の心拍出量を損なう非協調的な心収縮を模倣していた。これらのデータは、CPVT iPSC-CMのオプトMTFへの組み立て（アセンブリ）が組織レベルでの該疾患の重要な特徴をモデル化していることを示す。さらに、これらのデータは、CPVTでの不整脈メカニズムとしてリエントリーを暗示する。
【０２０７】
組織興奮性の不均一性は、リエントリーに対する組織の脆弱性を高める。CPVT組織をリエントリーに対して脆弱にする細胞メカニズムを調べるために、光学マッピングデータを分析して、空間と時間にわたる伝導速度（CV）とCa2+トランジェント持続時間（CaTD）の分散に対するペーシングレートとイソプロテレノールの影響を評価した。これらの分析では、1：1キャプチャで、リエントリーなしの記録のみを使用した。ペーシングとISOの増加に伴い、CPVT組織は、対照組織よりも大きなCVとCaTDの空間的時間的分散を示した（図4A、4B、および24）。これらのデータは、RYR2突然変異が組織興奮性の不均一性を高め、リエントリーが発生する脆弱な基板を作り出すことを示唆している。
【０２０８】
脆弱なCPVT基板においてリエントリーを開始するイベントが分析された。リエントリーの開始を捉えた3つの記録が特定された（図4C）。どの場合も、後脱分極（図4C、矢印）は旋回波（rotor）の開始時に発生した。DADは、局部的な脱分極を引き起こすのに十分ではなかったが、局部的な伝導ブロックと一方向性のインパルス伝導を引き起こし、旋回波の形成をもたらした。リエントリーを開始するための閾値以下のDADのこの役割は、事前の計算モデリング（computational modeling）研究によって予測された。
【０２０９】
カテコラミン刺激がCPVTで不整脈を起こさせることはよく知られているが、βアドレナリン刺激がRYR2突然変異の潜在的な不整脈の可能性をアンマスクする分子標的は知られていなかった。βアドレナリン刺激は、Ca2+カルモジュリン依存性キナーゼII（CaMKII）およびプロテインキナーゼA（PKA）を含めて、多数のシグナル伝達経路を活性化する。強力な細胞透過性ペプチドを使用したPKAの阻害は、患者由来（CPVTp）iPSC-CMと遺伝子操作された同質遺伝子（CPVTe）iPSC-CMの両方でCa2+スパーク頻度を有意に減らさなかった（図5A）。対照的に、高度に選択的かつ強力なCaMKII阻害剤である細胞透過性のオートカムチド阻害ペプチド（AIP）によるCaMKII阻害は、CPVT iPSC-CMにおいてCa2+スパーク頻度を強力に減少させた（図5Aおよび25）。
【０２１０】
CaMKIIは、Ca2+ハンドリングに直接または間接的に影響を与える複数のタンパク質を標的とする。1つの重要なCaMKII標的はRYR2自体のセリン2814（S2814）である(図5B)。CaMKIIによるRYR2-S2814のリン酸化は、拡張期のRYR2 Ca2+リークを促進し、一般的に催不整脈性がある。RYR2-S2814のCaMKII媒介リン酸化がCPVT突然変異の発現に不可欠であるという仮説を検証するために、Cas9ゲノム編集を使用して、RYR2野生型およびRYR2R4651I/+バックグラウンドの両方で、両RYR2アレルのS2814をアラニンで置き換えた（S2814A；図26）。これらの変異型アレルを、それぞれWT-S2814AおよびCPVTe-S2814Aと命名する。RYR2はPKAによってS2808でもリン酸化される；並行して、ゲノム編集を使用して、類似したRYR2-S2808Aホモ接合変異株を作成し、WT-S2808AおよびCPVTe-S2808Aと命名した（図26）。CaMKII阻害ペプチドの効果を踏まえて、CPVTe-S2814A iPSC-CMは、ベースラインでまたはイソプロテレノール刺激により、CPVTeよりも低く、WTに匹敵するCa2+スパーク頻度を示した（図5C、5D、および26）。対照的に、CPVTe-S2808A iPSC-CMは、CPVTeと比較して同様のCa2+スパーク頻度を有し（図5Cおよび5D）、薬理学的PKA阻害の効果の欠如と一致した（図5A）。同様の結果が、後脱分極により破壊されたCa2+トランジェントの頻度を測定することにより得られた（図5Eおよび5F）。これらのデータは、RYR2-S2814のCaMKIIリン酸化がCPVT R4651I突然変異の催不整脈の可能性をアンマスクするのに必要であることを示している。
【０２１１】
CPVT組織に対するCaMKII阻害の効果をモデル化するために、CPVTeまたは同質遺伝子対照のオプトMTFを選択的阻害剤AIPで処理した。CPVTpオプトMTFとCPVTeオプトMTFの両方で、AIPはスパイラルリエントリーの頻度を減衰させた（データは示してない）。次に、CPVTe-S2814A iPSC-CMからオプトMTFを作成したところ、これは細胞島でのアッセイで異常なCa2+放出を示さなかった。高頻度ペーシングおよびISOは、これらの組織においてリエントリーを誘発しなかった（図6B〜6D）。これらの組織におけるCVおよびCaTDの分散の測定により、S2814リン酸化の廃止は、ペーシングおよびISOによって誘発されるCPVT組織不均一性の増加を防止することが示された（図6D〜6G）。これらのデータは、RYR2-S2814リン酸化の防止がCPVTにおける組織レベルのリエントリーをブロックするのに十分であることを示している。
【０２１２】
CPVTのヒト組織モデルが作成され、この疾患の分子病態および細胞病態を解明するために使用された。分子レベルで、R4651I CPVT突然変異の不整脈の可能性の完全な発現には、RYR2-S2814のCaMKIIリン酸化が必要である。このリン酸化事象は、CPVTの治療のための心臓選択的治療標的であり得る。組織レベルでは、これらの研究は、リエントリーがCPVTにおける重要な不整脈メカニズムであることを示している。高頻度ペーシングとISO刺激により、CPVTオプトMTFは、より大きな組織不均一性を示し、リエントリーに対して脆弱な基板をもたらした。この脆弱な基板上で、CPVT突然変異によって引き起こされる閾値以下の後脱分極は、スパイラルリエントリーを開始させる。
【０２１３】
実施例2：  AIPはCPVTのマウスモデルで不整脈を抑制する
上記で報告したように、AIPはR4561I突然変異を発現するオプトMTFモデルにおいてCPVTを選択的に抑制した。インビボでの有効性を調べるために、GFPに連結されたCaMKII阻害ペプチドオートカムチド（AIP）をコードするアデノウイルスベクターを作成した。このアデノウイルスベクターをマウスに腹腔内注射した（図6H）。図7に示すように、AIP GFPの発現はマウス心臓組織で観察された。心臓組織の顕微鏡写真は、AIP-GFP発現の局在を示している。トロポニン陽性細胞の約16パーセントは低レベルのGFPを発現したが、トロポニン陽性細胞の大多数はより高いレベルでGFPを発現した（図8、左パネル）。トロポニン陽性細胞でのAIP発現も定量化された（図8、右パネル）。細胞の大部分は、GFPに連結されたAIPを中レベルまたは高レベルで発現する。
【０２１４】
AIPの発現は、イソプロテレノール刺激に応答したCaMKIIによるリン酸化を阻害するのに十分であった（図9および10）。イソプロテレノール刺激は、運動誘発CPVTの重要な特徴をシミュレートする。全心臓溶解物中のリン酸化CaMKIIのレベルは、対照ベクターを注射したマウスに由来する対照溶解物に存在するリン酸化CaMKIIのレベルと比較して、AIP発現アデノウイルスベクターAAV9-GFP-AIPを注射したイソプロテレノール刺激マウスでは減少した（図9および10）。
【０２１５】
心臓リアノジンチャネルの活性化におけるリン酸化の役割をさらに検討するために、心臓リアノジンチャネル（RYR2）にR176Qをノックインし（図11）、その後R176Q変異を有するマウスの電気生理学を評価した（図12および13）。野生型マウスおよび心臓リアノジンチャネル（RYR2）にR176Q変異を有するマウスのベースライン心電図（ECG）を図14に示す。運動誘発CPVTの影響を模倣するために、ペーシングプロトコルとイソプロテレノールまたはエピネフリンを使用した。興味深いことに、イソプロテレノールまたはエピネフリンで処理された、R176Q変異を持つマウスは、野生型対照マウスと比較して、心拍数およびベースラインQT間隔の変化を示した（図15および16）。R176Qマウスのベースラインおよび自発的不整脈の変化を図17A〜17Eに示す。R176Qマウスには、誘発された不整脈が観察された（図18）。こうした不整脈は、AIPをコードするウイルスベクターを受け取ったR176Qマウスには観察されなかった。
【０２１６】
上記の結果は、以下の方法と材料を使用して得られた。
【０２１７】
ヒト線維芽細胞の単離とリプログラミング
患者由来の新鮮な皮膚生検材料を小片（1mm3未満）に切り、コラゲナーゼ1（DMEM中に1mg/ml）と共に37℃で8時間インキュベートした。各患者からの消化した組織を組織培養ディッシュに置き、ガラス製のカバースリップで覆い、10％FBSを含むDMEM中で培養した。毎日培地を交換して7日後、組織培養ディッシュおよびカバースリップ上の線維芽細胞の増殖を継代した。線維芽細胞は、ヒト皮膚線維芽細胞用のNucleofector（商標）キット（Lonza社）を使用して、OCT4、SOX2、KLF4、およびOCT4発現構築物によるエピソームトランスフェクションにより5回目の継代前にリプログラミングした。iPSCは、多能性遺伝子のqRTPCRと免疫染色、核型分析、およびインビボでのテラトーマ形成により、多能性について試験した。
【０２１８】
ヒトiPSCの維持
研究中の全てのiPSC系統は、mTeSR（商標）1培地（STEMCELL Technologies社）中に維持して、5日ごとにバーゼン（versene）液（15040066，Thermo Fisher Scientific社）で継代した。培養ディッシュは、継代前に1：100希釈のマトリゲル（Corning（登録商標）Matrigel（登録商標）hESC-Qualified Matrix，LDEVフリー）でコーティングした。
【０２１９】
ヒトiPSCからの心筋細胞（iPSC-CM）への分化
マトリゲルをコーティングしたディッシュにヒトiPSCを通常の継代密度で播種した。iPSC-CMへのiPSC分化は、図20Eに示されるタイムラインに従った。iPSC培養の3日目に、mTeSR（商標）1培地を除去し、細胞をPBS（Ca2+またはMg2+を含まない）で1回すすぎ、5μMのCHIR99021（72054，STEMCELL Technologies社）を含む分化培地（インスリン不含のB27（A1895601，Thermo Fisher Scientific社）を含むRPMI培地（11875093，Thermo Fisher Scientific社））で培養した。24時間後、培地を、CHIR99021を含まない分化培地に交換した。分化3日目に、細胞を5μMのIWR-1（3532，Tocris社）を含む分化培地で培養した。48時間後、細胞をIWRなしの分化培地で15日目まで培養し、その間培地を2〜3日ごとに交換した。15日目に、細胞を選択培地（0.4mM乳酸（＃L7022，Sigma Aldrich社）を含む非グルコースDMEM（11966025，Thermo Fisher Scientific社））で5日間培養し、iPSC-CMを富化させた。
【０２２０】
分化した心筋細胞の単離およびエンジニアリングチップ上への播種
ヒトiPSC由来の心筋細胞は、コラゲナーゼ1（Sigma C-0130，50mlのPBS/20％FBS中の100mgコラゲナーゼ1）中で1時間インキュベートし、続いて0.25％トリプシンと37℃で5〜10分間インキュベートすることにより単離した。50μg/mlのDNase I（＃260913，EMD Millipore社）を含む50％FBS含有DMEMを使用して、トリプシン処理を停止させた。iPSC-CMを、10％FBSと10μM Y27632を含む培養培地（RPMI：非グルコースDMEM 1：1、インスリン不含の1×B27と0.2mM乳酸を添加）に懸濁した。心筋細胞を、エンジニアリングチップ用に600μl量あたり100万個の細胞の最終濃度で、10％FBSと10μM Y27632を含む培養培地で懸濁させた。48時間後、該培地をチップ培養培地（培養培地と選択培地で1：1に混合）に変更した。同時に、再播種した心筋細胞に、今後の実験のためにCHR2レンチウイルスを24時間感染させた。
【０２２１】
免疫蛍光染色
分化した心筋細胞を、マトリゲルをコーティングしたガラスボトムディッシュに5日間播種した。該細胞を4％パラホルムアルデヒドにより室温で10分間固定し、その後0.02％トリトンX-100を添加した5％ロバ血清により4℃で一晩透過処理した。一次抗体は1：200として4℃＞8時間で使用した。Oct4 (SANTA CRUZ社, SC8628)、SSEA4 (Millipore社, MAB4304)、Cardiac Troponin I (Abcam社, ab56357)、ACTN2 (Abcam社, ab56357)、RYR2 (Abcam社, ab2827)。オリンパスFV1000共焦点顕微鏡でイメージングを行った。
【０２２２】
Ca2+イメージング
分化した心筋細胞を、マトリゲルをコーティングしたガラスボトムディッシュに5日間播種した。50μgずつのFluo 4（F14201，Thermo Fisher Scientific社）を8μlのDMSOで溶解した後、Pluronic（登録商標）F-127（DMSO中の20％溶液）（P3000MP，Thermo Fisher Scientific社）で1：1に希釈した。心筋細胞を3μg/mlのFluo 4により37℃で30分間処理した。次に、培養培地で洗浄してからCa2+を記録した。全ての記録を培地中で行った。記録はFV1000-オリンパス共焦点顕微鏡により、10ミリ秒/ラインおよび記録あたり1000ラインでスキャンした。10μMのKN93（K1385，SIGMA社）および10μMのH89二塩酸塩をCAMKIIおよびPKA阻害化合物として使用し、0.025μMのオートカムチド2関連阻害ペプチド（SCP0001，SIGMA社）および1μMのPKA阻害剤14-22（476485，EMD Millipore社）をCAMKIIおよびPKA阻害ペプチドとして使用した。イソプロテレノールは1μMで使用した。
【０２２３】
CRISPR/Cas9を介したゲノム編集
CRISPR/Cas9ゲノム編集の手順は当技術分野で公知である。一般的に、野生型PGP1ヒトiPSCはドキシサイクリン誘導性Cas9を含んでいた。ガイドRNAと90ヌクレオチドのドナーオリゴヌクレオチドを発現するプラスミドを、プログラムB-016でヒト幹細胞用のNucleofector（商標）キット（Lonza社＃VPH-5012）により、PGP1-Cas9細胞にトランスフェクトした。ゲノム編集からの候補クローンをPCRで増幅し、配列決定して、置換変異が起こっていることを確認した。配列決定用プライマーは次の通りである：
R4651部位に関して：
R4651フォワードプライマー：
2020532492.tif 000007
R4651リバースプライマー：
2020532492.tif 000008
S2814部位に関して：
S2814フォワードプライマー：
2020532492.tif 000009
S2814リバースプライマー：
2020532492.tif 000010
S2808部位に関して：
S2808フォワードプライマー：
2020532492.tif 000011
S2808リバースプライマー：
2020532492.tif 000012
。R4651部位ではヘテロ接合変異を選択し、S2814およびS2808部位ではホモ接合変異を選択した。
【０２２４】
使用したガイドRNA配列（gRNA）は次の通りであった：
2808部位に関して：
2020532492.tif 000013
2814部位に関して：
2020532492.tif 000014
4651部位に関して：
2020532492.tif 000015
。
【０２２５】
90ヌクレオチドの相同組換え修復（HDR）テンプレートは次の通りであった：
2808部位に関して：
2020532492.tif 000016
2814部位に関して：
2020532492.tif 000017
4651部位に関して：
2020532492.tif 000018
。
【０２２６】
市販のiPSC-CMの培養
市販のhiPSC由来の心筋細胞（hiPSC-CM, Cor4U；Axiogenesis社，Cologne，ドイツ）は製造元の指示に従って培養した。簡単に説明すると、細胞播種の1日前に、T-25細胞培養フラスコ（クライオバイアル100万本あたり）に0.01μg/mLのフィブロネクチン（FN）（BD Biosciences社，Bedford，MA）をコーティングした。クライオバイアルを37℃の水浴で素早く解凍し、4.5μLの10mg/mLピューロマイシン（Axiogenesis社，Cologne，ドイツ）を添加した9mLの完全培養培地（Axiogenesis社，Cologne，ドイツ）に再懸濁した。24時間後、その細胞培養培地をピューロマイシン不含培地（総量10ml）と交換した。48時間後、細胞を0.25％トリプシン-EDTA（Life Technologies社）で10分間解離させ、洗浄し、ピューロマイシン不含培地に懸濁した。再懸濁した細胞は、カバースリップまたはオプトMTFチップに播種するために使用した。
【０２２７】
新生児ラット心室筋細胞の採取
新生児ラットの心室筋細胞の単離は当技術分野で以前に記載されたように行った。簡単に説明すると、2日齢のSprague Dawley子ラット（Charles River Laboratories）から心室を摘出した。その組織を手作業で刻んだ。最初の酵素消化のために、組織を0.1％トリプシン（Sigma Aldrich社）溶液中に4℃で約12時間入れた。酵素消化の第2段階では、トリプシンを0.1％II型コラゲナーゼ（Sigma Aldrich社）溶液に置き換えた。第2段階の消化を37℃で4回繰り返した後、得られた解離細胞の溶液から心室筋細胞をさらに単離するため、遠心分離して、再懸濁した溶液を40μmセルストレーナーに通した。その溶液を37℃で45分間ずつ2回プレプレーティングして、線維芽細胞と内皮細胞を取り除いた。その後、得られた心室筋細胞を、10％熱不活性化FBS（Life Technologies社）を添加したM199細胞培地（Life Technologies社）に再懸濁することによって、播種溶液を作った。
【０２２８】
ゼラチン筋肉薄膜（MTF）基板の作製
ガラス製カバースリップ（22×22mm2）を70％エタノール（Sigma社）で洗浄して、低粘着テープ（3M）で覆った。レーザー彫刻システム（Epilog Laser社）を使用して、テープの中央に2つの長方形を有し、その長方形を外縁で4つの台形が取り囲むようにテープを切断した。3mm×10mmと7mm×10mmの内側の長方形は、それぞれ、カンチレバー用およびMTFのベース領域用である。
【０２２９】
ガラス製カバースリップを選択的に活性化して、MTFのベース領域のゼラチンはガラス製カバースリップにしっかりと付着するが、カンチレバー領域のゼラチンは簡単に剥がれるようにした。最初に、ベース領域のテープのみを取り除き、カンチレバーと外側の領域のテープは、次の活性化からガラスを保護するために残しておいた。カバースリップを0.1M NaOH（Sigma社）溶液で5分間、95％エタノール（Sigma社）中の0.5％APTES（Sigma社）溶液で5分間、続いて0.5％グルタルアルデヒド溶液で30分間活性化した。
【０２３０】
活性化プロセス後にカンチレバー領域のテープを取り除いたが、外側の領域のテープはガラス製カバースリップ上に残しておいた。20％w/vゼラチン（Sigma社）および8％w/v MTG（Ajinomoto社）を、それぞれ65℃と37℃に30分間加温した。次に、これらの溶液を混合して、10％w/vゼラチンと4％w/v MTGの最終溶液を調製した。300μlのゼラチン混合物を、ガラス製カバースリップの露出した内側長方形領域に素早くピペットで移した。次に、ライン溝構造（隆起幅25μm、溝幅4μm、溝の深さ5μm）を備えたPDMSスタンプをゼラチン液滴の上に逆さに置き、200gのウエイトを使用して加重した。その後、スタンプとウエイトを所定の位置に置いた状態で、ゼラチンを室温で一晩硬化させた。
【０２３１】
ゼラチンが硬化した後、スタンプの外側の余分なゼラチンとともにウエイトを慎重に取り除いた。マイクロ成形ゼラチンへの損傷を最小限に抑えるために、カバースリップとスタンプを蒸留水に浸して、ゼラチンを1時間再水和処理した。その後、スタンプをゼラチンから注意深く剥がした。
【０２３２】
マイクロ成形ゼラチンを備えたカバースリップをペーパーワイプ（Kimwipes, Kimberly-Clark Professional社）で素早く乾かした。出力3％、速度7％、周波数1900HzのEpilogレーザー彫刻システムを使用して、脱水したマイクロ成形ゼラチンにカンチレバー（幅1mm×長さ2mm）をレーザー彫刻した。ゼラチンチップを90秒間UVO処理し、1mg/mlコラーゲンと0.1mg/mgフィブロネクチンを含むpH4.5の2mM MES溶液中で再水和処理した。そのゼラチンチップを溶液中に室温で2時間保存した。コラーゲンとフィブロネクチンの溶液をPBSに取り換えた。ゼラチンチップは細胞を播種するまで4℃で保存した。
【０２３３】
ソフトリソグラフィおよびPDMSマイクロ成形スタンプの作製
マイクロ成形スタンプは、当技術分野で知られている、以前に発表されたソフトリソグラフィプロトコルを使用して、ポリジメチルシロキサン（PDMS，Sylgard 184，Dow Corning社）から作製した。簡単に説明すると、MicroChemプロトコルマニュアルで提案されているように、厚さ5μmのSU-8 2005フォトレジスト（MicroChem社）をシリコンウエハー上にスピンコーティングして、90℃でプリベーク（prebake）した。そのSU-8層を、ライン構造（幅25μmのダークラインと幅4μmのクリアライン）を備えたカスタマイズされたフォトマスクの下でUV光に露光した。露光後、ウエハーを90℃でポストベーク（post-bake）し、プロピレングリコールモノメチルエーテルアセタートを用いて現像して、フルオロシラン（United Chemical Technologies社）によりシラン処理した。PDMSをベースと硬化剤の比10：1で混合し、ウエハーに注入し、65℃で4時間硬化させ、ウエハーから慎重に剥離して、マイクロ成形スタンプに切断した。
【０２３４】
オプトMTFの構築
心筋トロポニンTプロモーターがChR2-eYFPPを推進するChR2レンチウイルスベクターは、心筋トロポニンT（cTnT）プロモーター、ChR2、および高感度黄色蛍光タグを含むFCK(1.3)GWプラスミドに基づいて構築した。
【０２３５】
播種に先立って、ゼラチンチップをPBSで洗浄し、hiPSC-CMまたはNRVM播種培地とインキュベートした。解離したWT、CPVTp、およびCPVTe iPSC-CMを、10％FBSおよび10μMのY27632を含む培養培地中に、600μlあたり100万個の細胞の最終濃度で懸濁した。48時間後、培養培地をチップ培養培地（培養培地と選択培地の1：1混合物）に交換した。同時に、iPSC-CMにChR2レンチウイルスを14〜23の感染多重度で24時間形質導入した。市販のhiPSC-CM（Cor4U；Axiogenesis社，Cologne，ドイツ）およびNRVM細胞を、それぞれ220k/cm2および110k/cm2の密度でデバイスに播種した。24時間後、NRVMをChR2レンチウイルスにより14〜23の感染多重度で24時間処理した。
【０２３６】
マイクロ成形ゼラチンヒドロゲル上の人工心臓組織の免疫蛍光染色
iPSC-CMオプトMTFを37℃のPBSで洗浄し、4％パラホルムアルデヒドと0.05％Triton X-100を含むPBSを用いて37℃で12分間固定して、PBSですすいだ。組織をマウス抗サルコメアα-アクチニンモノクローナル一次抗体（Sigma社）で室温にて1時間染色し、次いでAlexa-Fluor 546（Life Technologies社）に結合したマウスIgGに対する二次抗体およびDAPI（Life Technologies社）で染色した。サンプルを、ProLong Gold褪色防止用封入剤（Life Technologies社）を使用してガラススライドにマウントした。Zスタック（Z-stack）画像は、alpha Plan-Apochromat 100x/1.46 Oil DIC M27対物レンズを備えた共焦点顕微鏡（Zeiss LSM）を用いて取得した。
【０２３７】
ウエスタンブロット法
全てのサンプルの泳動に10％Invitrogen Boltゲルを使用した。RYR2およびRYR2-P2814ウエスタンブロットでは、転写（transfer）を75Vで900分間行った。その他のウエスタンでは、80Vで120分間転写した。ウエスタンブロットに使用した抗体は以下の通りであった：CaMKII-phospho-T286（Abcam社, ab171095）、CaMKII（Abcam社, ab134041）、RYR2-phospho-S2814（Badrilla社, A010-31AP）、および心筋トロポニンT（Abcam社, ab45932）。HiMark Pre-Stained Protein Standards（Life Technologies社＃LC5699）を分子量マーカーとして使用した。
【０２３８】
細胞クラスターのCa2+イメージング
マトリゲルをコーティングしたガラスボトムディッシュにiPSC-CMを5日間播種した。50μgのFluo-4（F14201, Thermo Fisher Scientific社）を8μlのDMSOに溶解し、Pluronic（登録商標）F-127（DMSO中の20％溶液）（P3000MP, Thermo Fisher Scientific社）で1：1に希釈した。iPSC-CMを3μg/mlのFluo-4により37℃で30分間処理した。次に、サンプルを培養培地で洗浄してから、ラインスキャンモード（10ミリ秒/ライン、記録あたり1000ライン）を使用してオリンパスFV1000でCa2+イメージングを行った。スキャンラインは、3〜10個の細胞のクラスターに属する個々のiPSC-CM内に位置付けた。細胞が自発的Ca2+トランジェントを示さない時に、または自発的拍動時に、自発的Ca2+放出イベントの記録を行った。0.025μMのミリストイル化オートカムチド2関連阻害ペプチド（SCP0001, Sigma社）と1μMのPKA阻害剤14-22アミド（476485, EMD Millipore社）をCaMKIIおよびPKA阻害ペプチドとして使用した。イソプロテレノールは1μMで使用した。
【０２３９】
オプトMTFの光学セットアップ
タンデムレンズマクロスコープ（Scimedia社）を、光遺伝学的刺激によるCa2+イメージングおよび収縮性の同時測定のために改良した（図20）。Ca2+イメージングでは、このシステムに高速度カメラ（MiCAM Ultima，Scimedia社）、plan APO 1x対物レンズ、コリメータ（Lumencor社）、および落射蛍光（epifluorescence）照明用の200mW水銀ランプ（X-Cite exacte，Lumen Dynamics社）を備え付けた。収縮性測定の場合は、このシステムに高空間分解能sCMOSカメラ（pco.edge，PCO AG社）と880nm暗視野LEDライト（Advanced Illumination社）を組み込んだ。このシステムのCa2+および暗視野イメージングのための視野は、それぞれ10mm×10mmおよび16mm×13mmであった。光遺伝学的刺激のために、8チャネルLEDアレイ（465/25nm，Doric Lenses社）を使用して光パルスを発生させた。個々のMTFをペーシングするための光パルスは、3軸マニピュレータ（Zaber社，カナダ）を用いてゼラチンチップの500μm上に取り付けられた、8本の光ファイバ（直径400μm，NA 0.48，Doric Lenses社）と8本の単心光ファイバカニューラ（フラットエンド，直径400μm，NA 0.48，Doric Lenses社）を通って伝達された。収縮性測定のためのCa2+トランジェントおよび暗視野照明の励起光波長とChR2励起波長とのオーバーラップを防ぐために、ChR2励起波長よりも長い波長を有するフィルターセットを使用した。Ca2+イメージングには、580/14nmの励起フィルター、593nmカットオフのダイクロイックミラー、および641/75nmの吸収フィルター（Semrock社, Rochester, NY）を使用した。暗視野イメージングでは、685nmカットオフのダイクロイックミラーと664nmカットオフのロングパス吸収フィルター（Semrock社, Rochester, NY）をCa2+イメージングの光路に追加した。LEDアレイの光源は、LabVIEW（National Instruments社）で書かれたカスタムソフトウェアによるアナログ出力モジュール（NI 9264，National Instruments社）で合成されたアナログ信号により、独立して制御された。ポストイメージング処理では、これらのアナログ信号を高速度カメラと高空間分解能sCMOSカメラを使用して同時に記録し、両方のシステムからのフレームをアライメントするための基準としてアナログ信号を使用した。
【０２４０】
組織レベルのデータの収集
形質導入後3日目に、人工オプトMTF組織を、2μMのX-Rhod-1（Invitrogen社, Carlsbad, CA）と37℃で30分間インキュベートし、2％FBSを含む培養培地ですすいで、非特異的に結合した色素を除去し、再度30分間インキュベートして色素のエステル分解を完了させた。実験の記録に先立って、培養培地をタイロード溶液（脱イオン水中の1.8mM CaCl2, 5mMグルコース, 5mM Hepes, 1mM MgCl2, 5.4mM KCl, 135mM NaCl, および0.33mM NaH2PO4, pH7.4, 37℃; Sigma社）に交換した。タイロード溶液中の遺伝子操作組織サンプルは、培養ディッシュインキュベータ（Warner Instruments社）を使用して実験の間37℃に維持した。
【０２４１】
遺伝子操作された人工オプトMTF組織を、カスタムLabVIEWプログラム（National Instruments社）を使用して、0.7〜3Hzの周波数範囲で10msの光パルスにより刺激した。LED光源（465/25nm, Doric Lenses社）を使用して、MTF組織の一端に光点刺激を与えた。各記録につき、Ca2+および暗視野の画像を、それぞれ、10秒および4秒にわたる200Hzおよび100Hzのフレームレートで2000フレームおよび400フレームにより同時に収集した。
【０２４２】
カルシウム画像データの分析
生のカルシウムデータの後処理は、MATLAB（MathWorks社）で書かれたカスタムソフトウェアを用いて行った。シグナル対ノイズ比を改善するために、3×3ピクセルの空間フィルターを適用した。最初に、各ピクセル（px）および各パルス（p）の局所的Ca2+活性化時間Tact p, pxおよび80％再分極時間CaTD80p, pxを、それぞれ、最大アップストロークスロープを有する時間と、アップストロークから80％回復までの時間を特定することにより計算した。次に、各ピクセルおよび各パルスのカルシウム伝播速度CaS p, pxを、21ピクセル（波の横方向xに3ピクセル、縦方向yに7ピクセル）におけるTact p, pxのxおよびy方向の変化率を計算することによって決定した。Ca2+伝播速度CaSspatおよび80％再分極時間CaTD80spatの空間的分散を計算するために、各ピクセルの多重連続パルス（3〜20パルス）にわたるCaS p, pxおよびCaTD80p, pxを平均化して、対象エリア（500〜1000ピクセル）にわたるこれらの時間的平均の変動係数を算出した。カルシウム伝播速度CaStempおよび80％再分極時間CaTD80tempの時間的分散を計算するには、各パルスの全ての対象領域にわたるCaS p, pxおよびCaTD80p, pxを平均化して、多重連続パルスにわたるこれらの空間的平均の変動係数を算出した。グローバルなCa2+伝播速度CaSglobalおよび80％再分極時間CaTD80globalは、多重連続パルスおよび対象ピクセル領域にわたるCaS p, pxおよびCaTD80p, pxを平均化することによって計算した。局所的Ca2+伝播速度が0.2cm/s未満であった領域は、機能的伝導ブロックがあると定義した。さらに、グローバルなCa2+波長、Ca2+シグナル振幅、および相対的な拡張期Ca2+レベルを測定した。グローバルなカルシウム波長は、カルシウム不応期の時間中に波が移動する距離として定義され、カルシウム伝播速度CaSglobalと80％再分極時間CaTD80globalを乗算することによって計算した。カルシウム振幅は、収縮期と拡張期のピークCa2+レベルの差として求めた。相対的拡張期Ca2+レベルは、組織全体に分布する500超のサンプリングポイントでの拡張期平均値から、オプトMTFの外側の10ポイントで測定されたバックグラウンド強度を差し引くことによって、計算した。ベースレート（0.7Hz、ISOなし）でのバックグラウンド減算値をF0として設定した。より高いペーシング周波数での相対的拡張期Ca2+レベルの変化は、(F-F0)/F0として計算した。グローバル変数のISOおよびペーシング周波数依存性を調べるために、グローバル変数のデータを、ISOなしの1.5Hzペーシングでの同じオプトMTFからの値に対して正規化した。
【０２４３】
収縮性暗視野イメージングデータの分析
暗視野イメージングデータの後処理は、MATLAB（MathWorks社）で書かれたカスタムソフトウェアを用いて行った。収縮応力定量ImageJソフトウェアプログラムを、当技術分野で知られているように改変した。最初に、各フレームからの各MTFの投影長さを、画像を閾値処理する（image thresholding）MATLAB関数を使用して測定した。次に、膜応力を、投影長さ、ゼラチン膜の厚さ、およびゼラチン特性を使用して、該膜の曲率半径、弧の角度、および投影長さの幾何学的関係を考慮することにより、修正ストーニー（Stoney）の式を用いて、計算した。ここで、当技術分野で以前に決定されたように、ヤング率＝56kPa、ゼラチンMTF厚さ＝188μm。単収縮応力（twitch stress）は、ピーク応力とベースライン応力の差として計算した。
【０２４４】
統計分析
組織レベルの機能差はスチューデントのt検定（p＜0.05）により計算し、ベンジャミニ-ホッホベルグ（Benjamini-Hochberg）の多重検定補正を偽発見率（false discovery rate：FDR）20％で適用した。
【０２４５】
その他の実施態様
前述の説明から、本明細書に記載の本発明を様々な使用法および条件に取り入れるために、本発明に変更および修正を加えることができることは明らかであろう。そのような実施態様もまた、添付の特許請求の範囲内にある。
【０２４６】
本明細書での変動要因の定義における要素のリストの列挙は、リストされた要素の任意の単一の要素または組み合わせ（もしくは部分的組み合わせ）としての、その変動要因の定義を含む。本明細書における実施態様の列挙は、任意の単一の実施態様としての、または任意の他の実施態様もしくはその部分と組み合わせた、その実施態様を含む。
【０２４７】
本明細書で言及される全ての特許および刊行物は、それぞれの独立した特許および刊行物が参照により組み入れられることを具体的かつ個別に示されるのと同程度に、参照により本明細書に組み入れられる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図３Ｉ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１８Ｅ】
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【図１８Ｆ】
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【図１９Ａ−１】
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【図１９Ａ−２】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２０Ｅ】
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【図２０Ｆ】
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【図２０Ｇ】
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【図２１】
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【図２２−１】
2020532492.tif 000084
【図２２−２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
2020532492.tif 000091
【図２７Ｃ】
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【図２７Ｄ】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図２９Ｃ】
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【図２９Ｄ】
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【図３０】
2020532492.tif 000099
【図３１】
2020532492.tif 000100
【図３２Ａ】
2020532492.tif 000101
【図３２Ｂ】
2020532492.tif 000102
【図３２Ｃ】
2020532492.tif 000103
【図３２Ｄ】
2020532492.tif 000104
【図３３】
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【図３４Ａ】
2020532492.tif 000106
【図３４Ｂ】
2020532492.tif 000107
【図３４Ｃ】
2020532492.tif 000108
【図３４Ｄ】
2020532492.tif 000109
【図３５Ａ】
2020532492.tif 000110
【図３５Ｂ】
2020532492.tif 000111
【図３６】
2020532492.tif 000112
【図３７】
2020532492.tif 000113
【図３８】
2020532492.tif 000114
【図３９】
2020532492.tif 000115
【図４０】
2020532492.tif 000116
【図４１−１】
2020532492.tif 000117
【図４１−２】
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【図４２−１】
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【図４２−２】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年3月9日(2020.3.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2020532492000001.app
【国際調査報告】
2020532492.tif 000121
2020532492.tif 000122
2020532492.tif 000123