(57)【要約】  本発明は、複合的な体液において、標的生体分子の二次構造分布に対する潜在的な薬物介入についての直接的な情報を与える、すなわち、神経変性疾患などのミスフォールドタンパク質を伴う疾患のための、方法を提供する。二次構造変化は振動分光法によりモニタリングされる。本方法は、特定の生体分子を標的とするための薬物候補のプレスクリーニングに適用することができる。二次構造分布に対する薬物の効果はリアルタイムで無標識でモニタリングされ、それによって潜在的な薬物の効力についての直接的な情報を提供する。
2020513544.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複合的な体液において、ミスフォールド標的タンパク質を伴う疾患に関連する、二次構造変化を起こしている標的タンパク質に対する潜在的な薬物の効力を決定するための薬物スクリーニングアッセイであって、
（ａ）
赤外線透過材料のコアを備える内部反射素子と、
前記コアの少なくとも１つの表面に直接グラフトされている、前記標的タンパク質用の少なくとも１つの受容体であって、
前記標的タンパク質への特異的かつ立体配座的に独立した結合が可能な抗体であり、ならびに
前記少なくとも１つの受容体の自由にアクセス可能なアミン基を短いシラン／チオールリンカー上のアミン反応基と反応させ、かつ前記短いシラン／チオールリンカー上の残留するアミン反応基を前記標的タンパク質と交差反応しないブロッキング物質でブロッキングする、前記短いシランリンカーを用いたシラン化によってまたは前記短いチオールリンカーを用いたチオール化によって、前記内部反射素子の少なくとも１つの表面に直接グラフトされている、前記標的タンパク質用の前記少なくとも１つの受容体と
を有する赤外線センサー素子を含むＩＲセル内で、可溶性の標的タンパク質を有する前記複合的な体液の試料のフラックスを行って、前記ＩＲセルを通してＩＲビームを送って、かつそれから赤外線スペクトルを得る、ステップと；
（ｂ）前記コアの前記表面にグラフトされている、前記標的タンパク質用の前記受容体に前記標的タンパク質をロードしている、ステップ（ａ）の同じＩＲセル内で、潜在的な薬物を有する溶液のフラックスを行って、前記ＩＲセルを通してＩＲビームを送って、かつそれから赤外線スペクトルを得る、ステップと；
（ｃ）得られた前記赤外線スペクトルを解析して、前記試料中の前記可溶性の標的タンパク質の二次構造分布を決定することにより前記潜在的な薬物の効果を評価する、ステップであって、前記潜在的な薬物の適用後、（ａ）における相応するアミドＩバンドに比較して、（ｂ）の前記スペクトルにおいてβシートに特徴的なアミドＩバンドのアップシフトまたは消失によって、前記潜在的な薬物の前記効力が示される、ステップと
を含む、薬物スクリーニングアッセイ。
【請求項２】
（ｉ）前記ＩＲセルの前記赤外線透過材料は、ヒ化ガリウム、シリコン、ゲルマニウム、セレン化亜鉛およびダイヤモンドから独立して選択され、好ましくはゲルマニウムであり；および／または
（ｉｉ）前記疾患に関連する立体配座転移を起こしている前記標的タンパク質は、健康状態依存性の、特徴的な二次構造組成のアミロイド形成性ペプチドまたは（ポリ）ペプチドであり、それには、アルツハイマー病に関連するアミロイド−ベータ（Ａβ）ペプチドおよびタウタンパク質、パーキンソン病に関連するアルファ−シヌクレイン、クロイツフェルト−ヤコブ病に関連するプリオンタンパク質、またはハンチントン病に関連するハンチンチンタンパク質が挙げられ、前記標的タンパク質は、好ましくはＡβペプチドまたはタウタンパク質であり；および／または
（ｉｉｉ）標的タンパク質を含む前記複合的な体液の前記試料は、ヒトＣＳＦ、血清または血漿である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記赤外線センサー素子は、
台形または平行四辺形の形状であり、前記アミドＩバンドを検出するのに十分な信号対雑音比を持って赤外線透過であるゲルマニウム内部反射素子と、
前記標的タンパク質用の少なくとも１つの受容体であって
前記バイオマーカータンパク質への特異的かつ立体配座的に独立した結合が可能な抗体であり、ならびに
前記少なくとも１つの受容体の自由にアクセス可能なアミン基を短いシラン／チオールリンカー上のアミン反応基と反応させ、かつ短いシラン／チオールリンカー上の残留するアミン反応基を前記バイオマーカータンパク質と交差反応しないブロッキング物質でブロッキングする、前記短いシランリンカーを用いたシラン化によってまたは前記短いチオールリンカーを用いたチオール化によって、前記内部ゲルマニウム反射素子の少なくとも１つの表面に直接グラフトされている、前記標的タンパク質用の前記少なくとも１つの受容体と
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記内部反射素子は、
（ｉ）ゲルマニウム単結晶、好ましくは台形に切断されたゲルマニウム単結晶であり；および／もしくは
（ｉｉ）前記反射素子を通して、赤外光の１回を超える通過を可能としまたは提供し；および／もしくは
（ｉｉｉ）異なる波長での蛍光の検出を含めて別の光学的方法による並行解析にさらに適しており；ならびに／または
（ｉｖ）前記標的タンパク質と交差反応しない前記ブロッキング物質は、カゼイン、エタノールアミン、Ｌ−リジン、ポリエチレングリコール、アルブミン、およびそれらの誘導体から選択される、請求項１または３に記載の方法。
【請求項５】
前記シランリンカーおよびチオールリンカーは、均一なシランリンカーおよびチオールリンカー、シランリンカーの混合物およびチオールリンカーの混合物を含み、原子が２０個以下または原子が１５個以下の有効リンカー鎖長（合算数の炭素およびヘテロ原子）を有し、好ましくは、前記シランリンカーは、以下の式のうちの１つを有する：
（ｉ）  Ｘ３Ｓｉ−（ＣＨ２）ｎ−Ｙ−（ＣＨ２）ｎ’−Ｚ、
（ｉｉ）  Ｘ２Ｒ１Ｓｉ−（ＣＨ２）ｎ−Ｙ−（ＣＨ２）ｎ’−Ｚまたは
（ｉｉｉ）  Ｘ（Ｒ１）２Ｓｉ−（ＣＨ２）ｎ−Ｙ−（ＣＨ２）ｎ’−Ｚ、
および前記チオールリンカーは以下の式を有する：
（ｉｖ）  ＷＳ−（ＣＨ２）ｎ−Ｙ−（ＣＨ２）ｎ’−Ｚ、
［式中、Ｗは、ＨまたはＲ１Ｓ−であり、Ｘは、出現する毎にハロゲンおよびＣ１〜６アルコキシから独立して選択され、ｎは、１〜１０の整数であり、ｎ’は、１〜５の整数である；Ｒ１は、出現する毎にＣ１〜６アルキルから独立して選択され、Ｙは、化学結合、−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＳＯ２−、−ＮＲ２−、−Ｓ−、−ＳＳ−、−ＮＲ２ＣＯ−、−ＣＯＮＲ２−、−ＮＲ２ＳＯ２−および−ＳＯ２ＮＲ２−（式中、Ｒ２はＨまたはＣ１〜６アルキルである）から選択され、およびＺは、−ＣＯ２Ｈ、−ＳＯ３Ｈおよびそれらのエステル誘導体を含めてアミン反応基である］、
請求項１、３または４に記載の方法。
【請求項６】
前記赤外線センサー素子は、
（ｉ）シラン化により取得可能であり、かつ式（ｉ）〜（ｉｉｉ）の前記リンカーにおいて、ＸはＣ１〜６アルコキシ基から、好ましくはメトキシ基およびエトキシ基から独立して選択され、Ｙは−ＮＨＣＯ−であり、Ｚは−ＣＯ２Ｈまたはそのエステル誘導体であり、ならびにｎは１〜５の整数でありおよびｎ’は１〜３の整数であり、好ましくは、ｎは３でありおよびｎ’は２であり；または
（ｉｉ）チオール化により取得可能であり、かつ式（ｉｖ）の前記リンカーにおいて、ＷはＨであり、Ｙは化学結合であり、Ｚは−ＣＯ２Ｈまたはそのエステル誘導体であり、ならびにｎは１〜８の整数でありおよびｎ’は１〜５の整数であり、好ましくは、ｎは８でありおよびｎ’は４である、
請求項５に記載の方法。
【請求項７】
（ｉ）前記標的タンパク質はＡβペプチドであり、前記Ａβペプチドに結合する前記受容体は抗体であり、好ましくは、抗体Ａ８９７８を含めて前記Ａβペプチドのセントラルエピトープに特異的に結合する抗体であり；または
（ｉｉ）前記標的タンパク質はタウタンパク質であり、前記タウタンパク質に結合する前記受容体は抗体であり、好ましくは、抗体タウ−５を含めて全てのタウ変異体（リン酸化、切断型、３〜４反復領域、およびアイソフォーム）がアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗体である、
請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記標的タンパク質の前記アミドＩバンドのシフトは、前記潜在的な薬物の前記効力を示す分類指標である、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記潜在的な薬物は抗体などのアミドバンドを有する場合、前記方法は、前記標的タンパク質の前記アミドＩバンドのシフトを検出するために、前記潜在的な薬物の参照スペクトルを差し引くステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記標的タンパク質はＡβペプチドであり、
Ａβペプチド二次構造を示す任意の値への前記アミドＩバンドのシフト、好ましくはアミドＩバンド最大値のシフト、最も好ましくは、前記Ａβペプチドの原線維画分については１６２６ｃｍ−１から１６５５ｃｍ−１へのシフト、および前記Ａβペプチドの全画分については１６３６ｃｍ−１から１６５５ｃｍ−１へのシフトによって、前記潜在的な薬物の前記効力が示される、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記標的タンパク質はタウタンパク質であり、
タウタンパク質二次構造を示す任意の値への前記アミドＩバンドのシフト、好ましくは前記アミドＩバンド最大値のシフト、最も好ましくは、前記タウタンパク質の原線維画分については１６２６ｃｍ−１から１６５５ｃｍ−１へのシフト、および前記タウタンパク質の全画分については１６３６ｃｍ−１から１６５５ｃｍ−１へのシフトによって、前記潜在的な薬物の前記効力が示される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
潜在的な薬物とミスフォールドタンパク質を伴う疾患に関連する立体配座転移を起こしている標的タンパク質との間の相互作用を直接解析するための、請求項１から７のいずれか一項に記載の赤外線センサー素子の使用。
【請求項１３】
前記潜在的な薬物による治療の際、前記標的タンパク質の二次構造または構造変化の解析が、所望の標的タンパク質に対する前記薬物の前記効力についての直接的な情報を与える、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
神経変性疾患の治療のための薬物候補のプレセレクション用である、請求項１３に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、振動分光法によって二次構造変化をモニタリングすることによって、標的生体分子の二次構造分布に対する潜在的な薬物の介入についての直接的な情報を与える、すなわち、多くの神経変性疾患などのミスフォールドタンパク質を伴う疾患のための、方法を提供する。本方法は、特異的生体分子を標的とする薬物候補のプレスクリーニングに適用することができる。薬物の介入をリアルタイムで無標識でモニタリングし、この介入によって、病的なフォールディング種を防止する潜在的な薬物の効力についての直接的な情報が提供される。
【背景技術】
【０００２】
例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）の治療は、世界中で数百万人ものヒトに影響を及ぼす新しい分野である。疾患の進行は、脳内の斑ともつれの形成を特徴とし、これらはＡβペプチドおよびタウタンパク質の凝集プロセスに基づいている。タンパク質凝集は、βシート濃縮のペプチド種またはタンパク質種への構造変換によって推進される。アルツハイマー病に対する薬物の開発は難しい問題である。多くの有力な薬物候補が治験で失敗し(Emre, Int. J. Clinical Practice Supplement 127(June):64-72 (2002); Imbimbo, J. Alzheimer’s Disease: JAD 17(4):757-60 doi:10.3233/JAD-2009-1092 (2009); Cummings, Alzheimer’s & Dementia 7(3):e13-44 doi:10.1016/j.jalz.2010.06.004 (2011); Greenberg et al., Alzheimer’s & Dementia 9(1):39-49 doi:10.1016/j.jalz.2012.02.002 (2013); Cedernaes et al., Exp. Geront. 57(Sept.):104-6 doi:10.1016/j.exger.2014.05.002 (2014))、現在まで、アルツハイマー病の初期／中期段階も後期段階も治癒する薬物は市販されていない。臨床症状が出現しているこれらの段階では、脳は既に不可逆的な損傷を受けている。したがって、臨床症状が出現する前の早期診断が前提条件である。かかる診断ツールが特許化されている（先の特許出願国際公開第２０１５１２１３３９号パンフレット）。本特許出願では、かかるツールを使用して、二次構造分布に対する薬物の介入および病的な種を無害な形態にリフォールディングするその能力をモニタリングすることができ、それによってその効力をモニタリングすることができることが示されている。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、表面弾性波（ＳＡＷ）または水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）などの技法を使用して、タンパク質−リガンドまたはタンパク質薬物相互作用を解析する。こういった技法は動力学的情報のみを提供するが、スペクトル解像度または構造解像度は提供しないので、タンパク質の二次構造分布をモニタリングすることができない。関連する１つのアプローチは、ハイスループット化学マイクロアレイ表面プラズモン共鳴（ＨＴ−ＣＭ−ＳＰＲ）の使用であり、これは、原理上は逆転したＳＰＲシステムであるが、なぜなら、潜在的な薬物が固定化され、標的タンパク質を表面上にフラッシュするからである（Pickhardt et al., Current Alzheimer Res. 12(9):814-28 (2015)）。このアプローチは、単量体タウに結合している小分子を同定するのに首尾よく採用されたが（Pickhardt et al., Current Alzheimer Res. 12(9):814-28 (2015)）、二次構造に対する効果を、スペクトル解像度および構造解像度が不足しているために、検出することができない。表面増強赤外吸収（ＳＥＩＲＡ）分光法などのさらなる技法はスペクトル解像度を提供するが、測定の再現性は、粗い金表面の調製に起因して極めて困難な問題であり、したがってタンパク質−薬物解析用のロバストプラットフォームを提供しない。臨床診断における従来技術は、ヒトの脳内の斑などの凝集物（βシート濃縮タンパク質から蓄積された）を検出するための陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）および磁気共鳴断層撮影法（ＭＲＴ）である。後期段階に出現するかかる凝集物の薬物誘導性の解離をモニタリングすることができる。それにもかかわらず、ＰＥＴおよびＭＲＴは非常に高価で時間のかかる技法であり、こういった技法は集団スクリーニング法としてもまた薬物候補のプレセレクション用にも採用することは���きない。さらなる欠点は、ＰＥＴの場合における造影剤の使用であり、これもまた患者にストレスを与える。しかし、これらの技法によって、疾患のより後期の段階でのインビボでの薬効の解析が可能である。提示された発明によれば、脳脊髄液（ＣＳＦ）について本明細書に示されているように体液を解析することによって薬効を明らかにすることができる。既に述べた技法の他に、蛍光に基づく免疫アッセイ、特に酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および表面蛍光強度分布解析法（ｓＦＩＤＡ）もまた新しい分野である。しかし、対照的に、標的タンパク質の二次構造分布に影響を及ぼす可能性のある蛍光標識抗体の必要性があることから、これらのアッセイは本発明のように無標識ではない（Hulsemann et al., J. Alzheimer’s Disease: JAD, July doi:10.3233/JAD-160253 (2016); Kuhbach et al., Frontiers in Neuroscience 10:8 doi:10.3389/fnins.2016.00008 (2016)）。最も重要なことに、ＥＬＩＳＡおよびｓＦＩＤＡは、二次構造分布または薬物による二次構造分布の変化についての直接的な情報を提供しない。しかし、こういった情報は、例えば神経変性疾患におけるように薬効の解析にとって極めて重要である。ウエスタンブロットなどの普通のアッセイはまた、標識二次抗体を必要とし、分子量のみに基づいてタンパク質の凝集状態に関する間接的な情報を提供する。ウエスタンブロットの調製プロセスに起因して、タンパク質の天然の二次構造は失われる。したがって、ＥＬＩＳＡ、ｓＦＩＤＡ、またはウエスタンブロットでは、標的タンパク質の二次構造分布に対する潜在的な薬物の介入を直接測定することができない。提示された発明によれば、言及された制限全てが解決し、インビトロでの薬効が証明される。表面化学および一般的な設定に関する詳細な情報については、本発明者ら自身の文献（Guldenhaupt et al., FEBS Journal 275 (23):5910-18 doi:10.1111/j.1742-4658.2008.06720.x (2008); Pinkerneil et al., ChemPhysChem 13 (11): 2649-53 doi:10.1002/cphc.201200358 (2012); Schartner et al., JACS 135 (10):4079-87 doi:10.1021/ja400253p (2013); Schartner et al., Chembiochem 15(17):2529-34 doi:10.1002/cbic.201402478 (2014); Nabers et al., J. Biophotonics 9(3):224-34 doi:10.1002/jbio.201400145 (2016); Nabers et al., Anal. Chem. 88(5):2755-62 doi:10.1021/acs.analchem.5b04286 (2016)）および特許出願国際公開第２０１５１２１３３９号パンフレットに記載されている。
【０００３】
薬物候補の一例として、メチレンブルーが使用される。これは多くの様々な科学分野で応用されている化合物である（Ramsay et al., British J. Pharmacol. 152(6):946-51 doi:10.1038/sj.bjp.0707430 (2007); Evora, Texas Heart Institute Journal / from the Texas Heart Institute of St. Luke’s Episcopal Hospital, Texas Children’s Hospital 43(1):103 doi:10.14503/THIJ-15-5629 (2016); Rey-Funes et al., Am. J. Physiol., Regulatory, Integrative and Comparative Physiology, March, doi:10.1152/ajpregu.00266.2015 (2016)）。タウタンパク質の凝集は、アルツハイマー病（ＡＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、またはピック病（ＰｉＤ）などのいくつかの疾患に関連している（Wang and Mandelkow, Nature Rev. Neuroscience 17(1):5-21 doi:10.1038/nrn.2015.1 (2016); Lee et al., Annual Rev. of Neuroscience 24:1121-59 doi:10.1146/annurev.neuro.24.1.1121 (2001); Alzheimer, Allg. Z. Psychiatrie Psychisch-gerichtl. Med. 64:146-148 (1907)）。Ｃｌａｕｄｅ  Ｗｉｓｃｈｉｋは、１９９６年に、メチレンブルーによるタウタンパク質凝集の選択的阻害について示した（Wischik et al., PNAS 93(20):11213-18 (1996)）。この数十年間、次いで、メチレンブルーについていくつかの研究で調査がなされたが、現在、臨床第ＩＩＩ相試験において解析がなされている（Baddeley et al., J. Pharm. Exp. Therap. 352(1):110-18 doi:10.1124/jpet.114.219352 (2015); Harrington et al., J. Biol. Chem. 290(17):10862-75 doi:10.1074/ jbc.M114.616029 (2015); M et al., J. Alzheimer&apos;s Disease 2:705-720. doi:10.3233/JAD-142874 (2015); Simic et al., Biomolecules 6(1):6 doi:10.3390/biom6010006 (2016)）。２０１３年に、Ｃｙｓ残基が酸化することがタウ凝集の阻害の機序的な理由であることが見出された（Akoury et al., Angew. Chem. (Int. Ed. Engl.) 52(12):3511-15 doi:10.1002/anie.201208290 (2013)）。本発明者らは本明細書において、図１に概略的に示すように、疾患関連標的タンパク質の二次構造分布に対する潜在的な薬物の効果を直接かつ無標識で測定するＡＴＲ−ＦＴＩＲセンサーを利用しているスクリーニング方法について記載する。アッセイの要件は、疾患の進行中のタンパク質内の二次構造変化である。多くの神経変性疾患はこの要求を理想的に満たすが、なぜなら、疾患の進行はしばしば特定のタンパク質またはペプチドの凝集を特徴とするからである。認知症の最も普通の原因はアルツハイマー病であるので、本発明者らは主要な２つのバイオマーカー、タウとＡβ１−４２との薬物相互作用を調べた。タウタンパク質の場合、これはＡＤ患者の脳内の神経原線維変化の形成に関与するが、メチレンブルーは、臨床第ＩＩＩ相試験で現在評価されている有力な薬物である（Wischik et al., PNAS 93(20):11213-18 (1996); Wischik et al., J. Alzheimer&apos;s Disease 2:705-720 doi:10.3233/JAD-142874 (2015); Simic et al., Biomolecules 6(1):6 doi:10.3390/biom6010006. (2016)）。本発明者らは、異なる２つの薬物候補メチレンブルーとベルベリンとを使用して本発明者らのスクリーニング方法の可能性を実証した。ＡＤ患者由来のＣＳＦから抽出したヒトタウタンパク質の二次構造分布に対するメチレンブルーの介入を測定した（図３）。潜在的な薬物ベルベリンは、伝統的な漢方薬にもともと由来する多重標的の薬物である（Yao et al., Science China Life Sciences 58(9):854-59 doi:10.1007/s11427-013-4568-z (2015)）。医療用途においてベルベリンが幅広く用いられていることは、Ａｈｍｅｄらによる総説にうまくまとめられている（Ahmed et al., Pharmacol. Reports 67(5):970-79 doi:10.1016/j.pharep.2015.03.002 (2015)）。とりわけ、ＡＤの治療においてベルベリンは有力な効果を示す（Ahmed et al., Pharmacol. Reports 67(5):970-79 doi:10.1016/j.pharep.2015.03.002 (2015); Campisi et al., Phytotherapy Res. 25(6):816-20 doi:10.1002/ptr.3340 (2011); Zhu and Qian, BMC Neuroscience 7:78 doi:10.1186/1471-2202-7-78 (2006); Lee et al., Korean J. Physiol. & Pharmacol. 16(2):79-89 doi:10.4196/kjpp.2012.16.2.79 (2012)）。ベルベリンはラットモデルにおいて記憶機能にプラスの効果を示す（Lee et al., Korean J. Physiol. & Pharmacol. 16(2):79-89 doi:10.4196/kjpp.2012.16.2.79 (2012); Zhu and Qian, BMC Neuroscience 7:78 doi:10.1186/1471-2202-7-78 (2006); Ahmed et al., Pharmacol. Reports 67(5):970-79 doi:10.1016/j.pharep.2015.03.002 (2015)）。ベルベリンによる処理が広範囲であることから、重大な役割を果たすかもしれない多くの経路および受容体が存在する（Ahmed et al., Pharmacol. Reports 67(5):970-79 doi:10.1016/j.pharep.2015.03.002. (2015)）。ＡＤ治療において重要である可能性がある記憶効果に関する分子機構については、今のところ完全には理解されていない。
【０００４】
一方、体液中の特定のタンパク質の二次構造分布を解析する方法が当技術分野において公知である。前記方法では、対象のタンパク質を表面層内に選択的に結合させるが、これは、抗体機能化内部反射素子（ＩＲＥ）を用いて達成する（Schartner et al., JACS 135(10):4079-87 doi:10.1021/ja400253p (2013)）。本方法は、中度のＡＤと疾患対照との鑑別用に、ＣＳＦおよび血漿由来の可溶性のＡβ画分の二次構造分布の抽出および決定に適用された（Nabers et al., J. Biophotonics 9(3):224-34 doi:10.1002/jbio.201400145 (2016); Nabers et al., Anal. Chem. Doi: 10.1021/acs.analchem.5b04286 (2016)）。
【０００５】
国際公開第２０１５／１２１３３９号パンフレットでは、振動分光法による、立体配座および二次構造解析用の、例えば体液のような、複合的な混合物内の、特に単一の選択されたタンパク質の直接非侵襲的定性の二次構造解析用のバイオセンサーが提供されている。解析のために、選択した物質を単離し、濃縮し、または特別な調製手順によって前処理することを必要としない。バイオセンサーは、候補バイオマーカータンパク質の立体配座転移が疾患病理に関連している疾患の決定に適しており、バイオマーカータンパク質のアミドＩバンド最大値のシフトによって疾患が示される。かかるバイオセンサーはまた、神経毒性が少ないα−ヘリックス型へのＡβのリフォールディングを支援する薬物候補の治療効力をモニタリングするために潜在的に使用できる可能性があることがさらに強調されている（Nabers et al., Anal. Chem. Doi: 10.1021/acs.analchem.5b04286 (2016)）。
【０００６】
かかるセンサーを用いてかつ適切なアッセイ設定を用いて、複合的な体液中のＡβ１−４２二次構造分布に対するベルベリンの介入を、これはインビボでのＡβの状況によく似ているが、実際に観察することができる、ことがここで見出された。具体的には、本発明者らは、ベルベリンが高濃度でＡβ１−４２の自己誘導性線維形成を鈍化させ、したがってさらなる調査のための興味深い薬物候補とし得ることを見出した。２つの例が示すところは、ＡＴＲ−ＦＴＩＲセンサーを複合的な体液中の普遍的なインビトロスクリーニングアッセイとして使用して、神経変性疾患、特にアルツハイマー病の治療のための潜在的な薬物をプレセレクションすることができることである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、標的タンパク質（以下、「バイオマーカー」、「候補バイオマーカー」および「候補バイオマーカータンパク質」とも称する）中の、薬物の効力と相関している二次構造変化を誘導する潜在的な薬物を直接解析するための赤外線センサー素子を利用するスクリーニングアッセイを提供する。赤外線センサー素子は化学的修飾（例えば、シランまたはチオール）ゲルマニウム表面をベースとするが、これは共有結合した抗体で終端している。原理は普遍的であり、したがって所望の標的タンパク質に対する任意の捕捉抗体を適用することができ、さらにまた任意の潜在的な薬物（小分子、治療用抗体）を開発されたアッセイで原則としてスクリーニングすることができる。標的タンパク質については、精製試料から固定化しても、ヒトＣＳＦなどの複合的な液体から抽出してもよい。潜在的な薬物の解析をリアルタイムで無標識で行い、インビトロでの効力が証明される。したがって、本発明は、
（１）タンパク質ミスフォールディング病（以下、「ミスフォールドタンパク質を伴う疾患」とも称する）において病的な種への二次構造変化を起こしている標的タンパク質に対する潜在的な薬物の効力を決定するための薬物スクリーニングアッセイ、好ましくは複合的な体液に由来する試料に関して行われる前記アッセイであって、
（ａ）赤外線透過材料のコアを備える内部反射素子と、
前記コアの少なくとも１つの表面に直接グラフトされている、候補バイオマーカー用の少なくとも１つの受容体とを有する赤外線センサー素子を含むＩＲセル内で、可溶性の候補バイオマーカータンパク質を有する試料のフラックスを行って、前記第１のＩＲセルを通してＩＲビームを送って、かつそれから赤外線スペクトルを得る、ステップと；
（ｂ）コアの表面にグラフトされている、候補バイオマーカー用の受容体に候補バイオマーカータンパク質をロードしている、ステップ（ａ）の同じＩＲセル内で、潜在的な薬物を有する溶液のフラックスを行って、前記ＩＲセルを通してＩＲビームを送って、かつそれから赤外線スペクトルを得る、ステップと；
（ｃ）得られた赤外線スペクトルを解析して、試料中の可溶性の候補バイオマーカータンパク質の二次構造分布を決定することにより潜在的な薬物の効果を評価する、ステップであって、潜在的な薬物の適用後、好ましくは（ａ）に対する（ｂ）のスペクトルにおけるアミドＩバンドのアップシフトまたは消失によって、潜在的な薬物の効力が示される、ステップと
を含む、薬物スクリーニングアッセイ、ならびに
（２）潜在的な薬物と疾患に関連する立体配座転移を起こしている候補バイオマーカータンパク質との間の相互作用を直接解析するための、上（１）に記載の赤外線センサー素子の使用
を、提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本発明の方法の一般的原理を示すグラフィカルアブストラクトの図である。
【図２】（Ａ）シラン化学によるタウ−５の抗体の結合およびＰＢＳバッファーでの最終洗浄を示す図である。（Ｂ）抗体がヒトＣＳＦ由来のタウタンパク質を特異的に捕捉し、これは表面をＰＢＳバッファーで洗浄した後も十分に安定した状態を保っていることを示す図である。
【図３】タウタンパク質が抗体終端ゲルマニウム上に固定化されたことを示す図である。タウタンパク質のアミドＩは、１６４０ｃｍ−１で吸光度最大値をもたらす大量のβシートを表す（黒色）。潜在的な薬物メチレンブルーの添加によって、アミドＩバンドは１６５３ｃｍ−１にシフトし、これは、α−ヘリックスが優位を占めている二次構造分布への大きな構造変化を示している（灰色）。
【図４】図３に示した２つのスペクトル間の差スペクトルが、メチレンブルー（５０μＭ）の添加により誘導された主にβシートの減少およびα−ヘリックスの増加を示している図である。これが示すところは、本発明によって、二次構造分布に対する薬物介入を極めて正確にモニタリングすることができることである。
【図５】時間に依存した、メチレンブルーの存在下（黒色）および非存在下（灰色）での、ＣＳＦ由来のタウタンパク質のアミドＩバンドの構造シフトを示す図である。
【図６】Ａβ１−４２タンパク質が抗体（Ａ８９７８）終端ゲルマニウム表面に固定化されたことを示す図である。明灰色（右）のスペクトルは、線維形成Ａβ１−４２に特徴的な１６３４ｃｍ−１での吸光度最大値を有する異なる二次構造の広域分布を示す。さらに、フォールディングプロセスの中間体のアミドＩ（破線の明灰色）が１６０分後で示されている。潜在的な薬物ベルベリン（１００μＭ）を添加すると、Ａβ１−４２のα−ヘリックスのまたは主に単量体のアイソフォームが今や優位を占めている著しく異なる二次構造分布が、１６５９ｃｍ−１に（黒色スペクトル、左）、しかし１６３４ｃｍ−１での著しいショルダーを有する状態で、もたらされている。暗灰色の破線スペクトルは、１６０分後のフォールディングプロセスの中間体としてアミドＩバンドを示す。
【図７】メチレンブルー（明灰色）、ベルベリン（灰色）との、およびいずれもの薬物介入なし（黒色）でのインキュベーション後のＡβ１−４２二次構造分布（黒色）の比較を示す図である。図６で既に見たように、ベルベリンは主にα−ヘリックスに分布をシフトするが、一方、メチレンブルーはβシートおよび原線維の形成を誘導する。この発見は文献（Necula et al., Biochem. 46(30):8850-60 doi:10.1021/bi700411k (2007)）と一致している。これが示すところは、異なる薬物による二次構造分布に対する異なる介入を識別できるということである。
【図８】潜在的な薬物ベルベリン（１００μＭ）によって、図３に示すようにメチレンブルーとは対照的に、タウタンパク質（ＣＳＦから抽出）の二次構造分布は変化しなかった。この発見が示すところは、同じ標的タンパク質に対する異なる薬物の異なる介入を識別できるということである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明は、多くの神経変性疾患におけるなどの、病的なミスフォールドタンパク質標的に対する潜在的な薬物のプレセレクションのための方法を記載する。
【００１０】
本方法は：
（ａ）赤外線透過材料のコアを備える内部反射素子と、
前記コアの少なくとも１つの表面に直接グラフトされている、候補バイオマーカー用の少なくとも１つの受容体と
を有する赤外線センサー素子を含むＩＲセル内で、可溶性の候補バイオマーカータンパク質を有する試料のフラックスを行って、前記第１のＩＲセルを通してＩＲビームを送って、かつそれから赤外線スペクトルを得る、ステップと；
（ｂ）コアの表面にグラフトされている、候補バイオマーカー用の受容体に候補バイオマーカータンパク質をロードしている、ステップ（ａ）の同じＩＲセル内で、潜在的な薬物を有する溶液のフラックスを行って、前記ＩＲセルを通してＩＲビームを送って、かつそれから赤外線スペクトルを得る、ステップと；
（ｃ）得られた赤外線スペクトルを解析して、試料中の可溶性の候補バイオマーカータンパク質の二次構造分布を決定することにより潜在的な薬物の効果を評価する、ステップであって、
潜在的な薬物の適用後、（ａ）に比較して、（ｂ）のスペクトルにおけるアミドＩバンドのアップシフトまたは消失によって、潜在的な薬物の効力が示される、ステップと
を含む。
【００１１】
本発明によれば、ＩＲセルの赤外線透過材料は、ヒ化ガリウム、シリコン、ゲルマニウム、セレン化亜鉛およびダイヤモンドから選択され、好ましくはゲルマニウムである。さらに、候補バイオマーカータンパク質は、疾患に関連する立体配座転移を起こし、かつ健康状態依存性の、特徴的な二次構造組成のアミロイド形成性ペプチドまたは（ポリ）ペプチドであり、それには、アルツハイマー病に関連するアミロイド−ベータ（Ａβ）ペプチドおよびタウタンパク質、パーキンソン病に関連するアルファ−シヌクレイン、クロイツフェルト−ヤコブ病に関連するプリオンタンパク質、またはハンチントン病に関連するハンチンチンタンパク質が挙げられ、候補バイオマーカータンパク質は、好ましくはＡβペプチドまたはタウタンパク質である。さらに、候補バイオマーカータンパク質を含む試料は、バイオマーカーの精製試料であってもよく、ヒトＣＳＦを含めてバイオマーカーを含む複合的な体液であってもよい。その他の適切な複合的な体液は、ヒト血清、血漿、涙液および乳頭吸引液である。
【００１２】
前記赤外線センサー素子は、
台形または平行四辺形の形状であり、大きなバックグラウンド吸光度を超えてアミドＩバンドを検出するのに十分な信号対雑音比を持って赤外線透過であるゲルマニウム内部反射素子と、
バイオマーカータンパク質用の少なくとも１つの受容体であって、
バイオマーカータンパク質への特異的かつ立体配座的に独立した結合が可能な抗体であり、ならびに
前記少なくとも１つの受容体の自由にアクセス可能なアミン基を短いシラン／チオールリンカー上のアミン反応基と反応させ、かつ短いシラン／チオールリンカー上の残留するアミン反応基をバイオマーカータンパク質と交差反応しないブロッキング物質でブロッキングする、短いシランリンカーを用いたシラン化によってまたは短いチオールリンカーを用いたチオール化によって、前記内部ゲルマニウム反射素子の少なくとも１つの表面に、好ましくは少なくとも２つまたは３つの表面に直接グラフトされている、バイオマーカータンパク質用の少なくとも１つの受容体と
を含むことが好ましい。
【００１３】
本発明によれば、内部反射素子はゲルマニウム単結晶であること、好ましくは台形に切断されたゲルマニウム単結晶であることが特に好ましい。ゲルマニウム結晶は、反射素子を通して赤外光の１回、１回を超える、または３回を超える反射を可能とするまたは提供するのがさらに好ましく、５回を超える反射またはさらに２０回を超える反射が特に好ましい（アクティブに検知された１３回の反射を伴う２５回の反射が好ましい）。さらに、内部反射素子は、異なる波長での蛍光の検出を含めて別の光学的方法による並行解析に適していることが特に好ましい。最終的には、ブロッキング物質はバイオマーカータンパク質と交差反応しないことが極めて重要であり、カゼイン、エタノールアミン、Ｌ−リジン、ポリエチレングリコール、アルブミン、およびそれらの誘導体から選択される。
【００１４】
グラフト化用のシランリンカーおよびチオールリンカーは、均一なシランリンカーおよびチオールリンカー、シランリンカーの混合物およびチオールリンカーの混合物を含み、原子が２０個以下または原子が１５個以下の有効リンカー鎖長（合算数の炭素およびヘテロ原子）を有し、好ましくは、シランリンカーは、以下の式のうちの１つを有する：
（ｉ）  Ｘ３Ｓｉ−（ＣＨ２）ｎ−Ｙ−（ＣＨ２）ｎ’−Ｚ、
（ｉｉ）  Ｘ２Ｒ１Ｓｉ−（ＣＨ２）ｎ−Ｙ−（ＣＨ２）ｎ’−Ｚまたは
（ｉｉｉ）  Ｘ（Ｒ１）２Ｓｉ−（ＣＨ２）ｎ−Ｙ−（ＣＨ２）ｎ’−Ｚ、
およびチオールリンカーは以下の式を有する：
（ｉｖ）  ＷＳ−（ＣＨ２）ｎ−Ｙ−（ＣＨ２）ｎ’−Ｚ
［式中、Ｗは、ＨまたはＲ１Ｓ−であり、Ｘは、出現する毎にハロゲンおよびＣ１〜６アルコキシから独立して選択され、ｎは、１〜１０の整数であり、ｎ’は、１〜５の整数である；Ｒ１は、出現する毎にＣ１〜６アルキルから独立して選択され、Ｙは、化学結合、−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＳＯ２−、−ＮＲ２−、−Ｓ−、−ＳＳ−、−ＮＲ２ＣＯ−、−ＣＯＮＲ２−、−ＮＲ２ＳＯ２−および−ＳＯ２ＮＲ２−（式中、Ｒ２はＨまたはＣ１〜６アルキルである）から選択され、およびＺは、−ＣＯ２Ｈ、−ＳＯ３Ｈおよびそれらのエステル誘導体を含めてアミン反応基である］。本発明内のハロゲンには、フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素の原子が含まれる。Ｃ１〜６アルキルおよびＣ１〜６アルコキシには、飽和であっても不飽和であってもよい、１〜６個の炭素原子を有する直鎖状の、分枝状の、もしくは環状のアルキル基またはアルコキシ基が含まれる。環状のアルキル基およびアルコキシ基の場合、これは３〜６個の炭素原子を有するものを指す。適切なＣ１〜６アルキル基およびＣ１〜６アルコキシ基としては、とりわけ、メチルおよびメトキシ、エチルおよびエトキシ、ｎ−プロピルおよびｎ−プロポキシ、イソ−プロピルおよびイソ−プロポキシ、シクロプロピルおよびシクロプロポキシ、ｎ−ブチルおよびｎ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブチルおよびｔｅｒｔ−ブトキシ、シクロブチルおよびシクロブトキシ、ｎ−ペンチルおよびｎ−ペントキシ、シクロペンチルおよびシクロペントキシ、ｎ−ヘキシルおよびｎ−ヘキソキシ、シクロヘキシルおよびシクロヘキソキシ等が挙げられる。アミン反応基Ｚには、遊離アミノ基と反応性であるあらゆる種類の官能基が含まれる。これらの中で、−ＣＯ２Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、およびそれらのエステル誘導体（活性なエステルを含めて）が特に好ましい。
【００１５】
上記式中の−（ＣＨ２）ｎ−および−（ＣＨ２）ｎ’−の構造的要素は、１つもしくは複数の二重結合および／または三重結合も含有することができ、かつ１つまたは複数のフッ素などのハロゲン原子または重水素で置換されていてもよい。
【００１６】
赤外線センサー素子がシラン化により取得可能である場合、上の式（ｉ）〜（ｉｉｉ）のリンカーにおいて、ＸはＣ１〜６アルコキシ基から、好ましくはメトキシ基およびエトキシ基から独立して選択され、Ｙは−ＮＨＣＯ−であり、Ｚは−ＣＯ２Ｈまたはそのエステル誘導体であり、ならびにｎは１〜５の整数でありおよびｎ’は１〜３の整数であり、好ましくは、ｎは３でありおよびｎ’は２であることが好ましい。
【００１７】
赤外線センサー素子がチオール化により取得可能である場合、上の式（ｉｖ）のリンカーにおいて、ＷはＨであり、Ｙは化学結合であり、Ｚは−ＣＯ２Ｈまたはそのエステル誘導体であり、ならびにｎは１〜８の整数でありおよびｎ’は１〜５の整数であり、好ましくは、ｎは８でありおよびｎ’は４であることが好ましい。
【００１８】
特定の好ましい一実施形態では、バイオマーカータンパク質はＡβペプチドであり、Ａβペプチドに結合する受容体は抗体であり、好ましくは、抗体Ａ８９７８を含めてＡβペプチドのセントラルエピトープに特異的に結合する抗体である。
【００１９】
さらに特定の好ましい一実施形態では、バイオマーカータンパク質はタウタンパク質であり、タウタンパク質に結合する受容体は抗体であり、好ましくは、抗体タウ−５を含めて全てのタウ変異体（リン酸化、切断型、３〜４反復領域等、アイソフォーム）がアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗体である。
【００２０】
本発明の方法では、溶液中の潜在的な薬物の濃度は、ＩＲ測定の検出限界未満であるか、または潜在的な薬物の参照スペクトルによって容易に差し引くことができるかのいずれかである。
【００２１】
本発明の方法では、潜在的な薬物が抗体などのアミドバンドを有する場合、方法は、標的タンパク質のアミドＩバンドのシフトを検出するために、潜在的な薬物の参照スペクトルを差し引くステップをさらに含む。
【００２２】
具体的には、標的タンパク質がＡβペプチドである場合、Ａβペプチド二次構造を示す任意の値へのアミドＩバンドのシフト、好ましくはアミドＩバンド最大値のシフトによって、潜在的な薬物の効力が示される。特に、Ａβペプチドの原線維画分については、１６２６ｃｍ−１から１６５５ｃｍ−１へのシフト、およびＡβペプチドの全画分については、１６３６ｃｍ−１から１６５５ｃｍ−１へのシフトによって、潜在的な薬物の効力が示される。
【００２３】
さらに、標的タンパク質がタウタンパク質である場合、タウタンパク質二次構造を示す任意の値へのアミドＩバンドのシフト、好ましくはアミドＩバンドの最大値のシフトによって、潜在的な薬物の効力が示される。特に、タウタンパク質の原線維画分については１６２６ｃｍ−１から１６５５ｃｍ−１へのシフト、およびタウタンパク質の全画分については１６３６ｃｍ−１から１６５５ｃｍ−１へのシフトによって、潜在的な薬物の効力が示される。
【００２４】
本発明は、振動分光法による、潜在的な薬物によって誘導された二次構造変化の検出に基づいている。本発明では、原則として、本発明者らの以前の特許出願国際公開第２０１５１２１３３９号パンフレットと同じ実験設定を使用する。７０Ｖ（Ｂｒｕｋｅｒ）の代わりに、本発明者らは８０Ｖ  ＦＴＩＲ分光光度計（Ｂｒｕｋｅｒ）を用いて、測定値の信号対雑音比を改善した。内部反射素子として、ゲルマニウム結晶を、所望の抗体の共有結合用のアンカーとして機能するＮＨＳ−シランで化学的に修飾した。カゼインで表面をブロッキングすると、表面は標的タンパク質（タウまたはＡβ１−４２）を捕捉するのに準備完了である。タウタンパク質については、ヒトＣＳＦから直接抽出した。精製タンパク質試料が不要でありかつＣＳＦの前処理が必要ではないので、これは大きな利点であり、この利点によって、アッセイが診療所または臨床検査室での適用に、より容易に利用しやすいものとなっている。標的タンパク質を潜在的な薬物の存在下で解析し、その効果をアミドＩバンドの変化によってモニタリングした。タウタンパク質について示されるように、潜在的な薬物メチレンブルーの効果を直接モニタリングした（図３）。二次構造分布の変化は、１６４０ｃｍ−１（未処理）から１６５３ｃｍ−１（処理済み）へのアミドＩバンドの薬物誘導シフトによって特徴付けられる。効果は二重差スペクトル（図４）においてさらに明白になり、二重差スペクトルはβシートの消失を示す１６２５ｃｍ−１での負のバンドおよびα−ヘリックスに典型的な１６５５ｃｍ−１での正のバンドを明確に示す。薬物なしの対照では、タウタンパク質のアミドＩバンド吸光度最大値は安定した状態を保っている（図５）。したがって、神経変性疾患の治療における薬物候補のプレセレクションのために、本発明は理想的なプラットフォームを提供する。別の例は、第２の重要なバイオマーカーＡβ１−４２の研究である。開発されたセンサーは普遍的であるので、Ａβ１−４２のエピトープ１３−２８に対する抗体Ａ８９７８を潜在的な薬物ベルベリンの解析に適用する可能性がある。ベルベリンの潜在的な効果をモニタリングするために、表面に合成Ａβ１−４２をロードした。インキュベーションなしでは、高濃度での自己誘導性線維形成プロセスによって、βシートが優位を占めているＡβ１−４２の広い二次構造分布がもたらされる（図６、明灰色）。ベルベリンを添加すると、広い二次構造分布のアミドＩの最大値が１６３４から、主にα−ヘリックス種または単量体種を示している１６５９ｃｍ−１にシフトする（図６、黒色）。したがって、ベルベリンは自己誘導性線維形成プロセスを鈍化させるようである。これはさらなる調査のための興味深い標的とすることができる。結論として、本方法によって、タウおよびＡβ１−４２について実証されたように、薬物候補による標的タンパク質の二次構造分布の介入についての無標識の直接的な情報が提供される。この方法は、同じ標的タンパク質に対する薬物の異なる介入を識別する。この普遍的なアプローチを、あらゆるタンパク質および小分子（潜在的な薬物）に原理上移転することができ、したがって、これは、製薬用途に極めて高い可能性を持っている。
【００２５】
本発明を以下の実施例においてさらに開示するが、それらは用途を限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【００２６】
材料および方法：本出願者らの以前の特許出願国際公開第２０１５１２１３３９号パンフレットと同じ実験設定を使用する。
【００２７】
サンプリングおよび前処理：ＣＳＦは腰椎穿刺により取り出し、Ｅｓｓｅｎ大学病院で一定量分取し、液体窒素内で急速凍結し、−８０℃で輸送および保管した。試料は、測定前に前処理せず、３７℃で３０秒間解凍のみを行い、使用するまで氷上で保持した。
【００２８】
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳバッファー）：１３７ｍＭ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、２．７ｍＭ塩化カリウム（ＫＣｌ）、１２ｍＭ総ホスフェート（Ｎａ２ＨＰＯ４およびＮａＨ２ＰＯ４の形態で）、ｐＨ７．４。
【００２９】
カゼインブロッキング溶液：２００ｍＭ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、牛乳（粉末）由来の１％（ｗ／ｖ）カゼイン、ｐＨをＨ３ＰＯ４で７．４に調整。
【００３０】
シラン化溶液：使用するＮＨＳ−シラン（Ｎ−（４，４，４−トリエトキシシランブチル）スクシンアミド酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イルエステル）を合成し、記載のとおり確認した（Schartner et al., JACS 135(10):4079-4087 (2013)）。
【００３１】
抗体：Ａβ１−４２の解析のために、抗体Ａ８９７８（ロット番号：０６１Ｍ４７７３、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いた。タウタンパク質の場合、抗体タウ−５（ＡＨＢ００４２、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用した。
【００３２】
Ａβ１−４２：ヒトＡβペプチド（Ａ９８１０、アミロイド−ベータ−タンパク質フラグメント１−４２）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。
【００３３】
潜在的な薬物：メチレンブルー（塩酸メチルチオニン、ロット番号：６６７２０）および塩化ベルベリン（ロット番号：Ｂ３２５１）はＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。
【００３４】
測定の実施：一般的な手順は、特許出願国際公開第２０１５１２１３３９号パンフレットと同じである。ＩＲ測定を、液体窒素で冷却したテルル化カドミウム水銀（ＭＣＴ）検出器を備えたＶｅｒｔｅｘ  ８０Ｖ分光光度計（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｏｐｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ、Ｅｔｔｌｉｎｇｅｎ、ドイツ）で実施した。両面インターフェログラムを、インターフェロメーターの前後方向の動きの中で、データレート８０ｋＨｚにて、スペクトル解像度２ｃｍ−１、ブラックマン−ハリス−３項−アポディゼーション、メルツ相補正、および４回ゼロ充填で記録した。参照スペクトルを、１０００回のインターフェログラムの平均値として、試料スペクトルを、２００回のインターフェログラムの平均値として記録した。ブランクセンサーの参照単一チャンネルスペクトル、２−プロパノールを含むセンサー、シラン化表面、バッファー、平衡状態の抗体コーティング表面またはカゼインコーティング表面を記録することにより、ランベルト−ベールの法則（Ｅ＝−ｌｏｇ（Ｉ／Ｉ０）に基づく、高感度差分光法が可能となった。状態変化の吸光度は、変化前後における強度関係の１０を底とする負の対数である。
【００３５】
メチレンブルーで処理したタウタンパク質：Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製のＴａｕ抗体（タウ−５）を、Ｎａｂｅｒｓらによって他の抗体について記載されているようにゲルマニウム表面に共有結合させた（Nabers et al., J. Biophotonics 9(3):224-34 doi:10.1002/jbio.201400145 (2016)）。ブロッキングした後、タウタンパク質が首尾よく固定化されるまで（約６０分）、タウ抗体終端表面をヒトＣＳＦ１００μｌとともにインキュベートした。次のステップにおいて、系が平衡化されるまで（１ｍｌ）、５０μＭメチレンブルー溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）２ｍｌを表面上にフラッシュし、次いで、６０分間循環させた。タウの二次構造に対する効果を、アミドＩのバンド位置および形状によって直接モニタリングした。
【００３６】
ベルベリンで処理したＡβペプチド：抗体Ａ８９７９（Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ）をＡβペプチドを捕捉するのに用いた（Nabers et al., Anal. Chem. 88(5):2755-62 doi:10.1021/acs.analchem.5b04286 (2016)）。Ａβペプチド（Ａβ１−４２、合成、Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ、Ｔａｕｆｋｒｉｃｈｅｎ、ドイツ）を、他（Nabers et al., J. Biophotonics 9(3):224-34 doi:10.1002/jbio.201400145 (2016)）に記載のように、ヘキサフルオロ−２−プロパノールとのインキュベーションによって単量化した。解析のために、Ａβ１−４２１００μｇを抗体終端センサー上で１時間循環させて、薬物が固定化プロセスを妨害しないことを確実にした。対照実験では、潜在的な薬物の存在下でＡβ１−４２の固定化をさらに１７時間（合計１８時間）モニタリングして、自己誘導性線維形成プロセスを追跡した（図６、明灰色のスペクトル）。潜在的な薬物ベルベリンの効果を解析するために、対照実験と同じプロトコルを使用した。唯一の違いは、Ａβ１−４２（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）の１時間の固定化後に、１００μＭベルベリン溶液１．５ｍＬで平衡化し、続いて１００μＭベルベリンの存在下で系を循環させることによって、１００μＭベルベリンを添加したことである（図６、黒色のスペクトル）。Ａβ１−４２の二次構造に対する効果を、アミドＩのバンド位置および形状によって直接モニタリングした。対応する破線のスペクトルによって、１６０分の合計時間後の各実験についてフォールディングプロセスの中間体が示されている。
【００３７】
スペクトルの前処理：水蒸気を、参照スペクトルのスケールドサブトラクションにより除去した。スペクトルをベースライン補正し、記載されているように（Schartner et al., Chembiochem 15(17):2529-34 doi:10.1002/cbic.201402478 (2014)）スライディング平均を実施し、観察された二次構造に応じて領域１７３０〜１５９０ｃｍ−１内の同じアミドＩシグナル強度に正規化した。
【００３８】
[実施例１]：メチレンブルーはインビトロでアルツハイマー病を「治癒」する
メチレンブルーの薬効をモニタリングするために、本発明の方法を用いた。本発明者らは先に免疫−ＡＴＲセンサーを発明したが、このセンサーは、ＣＳＦ解析をベースにして９０％および血漿解析をベースにして８４％の精度でＡＤを鑑別する（Nabers et al., Anal. Chem. 88(5):2755-62 doi:10.1021/acs.analchem.5b04286 (2016)）。第１に、本発明者らはシラン化学を用いてゲルマニウム表面を修飾した（Schartner et al., JACS 135(10):4079-87 doi:10.1021/ja400253p (2013)）。第２に、モノクローナルＩｇＧ１抗体タウ−５をゲルマニウム表面に共有結合で固定化した。固定化は、５ｍＯＤの吸光度に達することによって、図２Ａに提示のように２時間後に完了する。表面を結合バッファー１で洗浄した後、抗体は安定した状態を保っている（図２Ａ）。高度に特異的な表面を得るためには、カゼインによる飽和が極めて重要である（Nabers et al., J. Biophotonics 9(3):224-34 doi:10.1002/ jbio.201400145 (2016)）。最終的に、脳脊髄液（ＣＳＦ）などの複合的な試料をセンサー上にフラッシュする。タウタンパク質の結果として得られる単純指数関数的結合動態を図２Ｂに提示する。固定化タウ画分を使用すれば、潜在的な薬物メチレンブルーの効果を解析することがここで可能である。メチレンブルー５０μＭ溶液を表面上にフラッシュし、平衡化後に系を循環させた。アルツハイマー病の診断用の上記の免疫−ＡＴＲ−ＦＴＩＲセンサー（国際公開第２０１５１２１３３９号パンフレット）は、ＡＤと疾患対照との鑑別用に１６４３ｃｍ−１で或る値を有する単純な閾値分類指標を診断用に使用しているが、これはまた、タウタンパク質に移転することもできる（未発表データ、特許出願準備中）。図３の黒色のスペクトルによって、疾患関連βシート濃縮アイソフォームの量がより高いことを示すアミドＩの最大値１６４０ｃｍ−１が示され、このことは、本発明者らの免疫−ＩＲ−センサーによって罹患していると診断されることになるであろう（Nabers et al., Anal. Chem. 88(5):2755-62 doi:10.1021/acs.analchem.5b04286 (2016)）。メチレンブルーのインキュベーションを行うと、１時間以内により高い波数への著しいシフトが観察され（図３、灰色のスペクトル）、したがって、不規則なまたはα−ヘリックス立体配座への二次構造の変化が、潜在的な薬物メチレンブルーによって誘導された。これはヒト脳内のタウ関連もつれの減少を実証したＣｌａｕｄｅ  Ｗｉｓｃｈｉｋのグループのインビボ研究と一致している（Simic et al., Biomolecules 6(1):6 doi:10.3390/biom6010006 (2016); Wischik et al., PNAS 93(20):11213-18 (1996)）。患者は本発明者らの開発した免疫−ＡＴＲ−ＦＴＩＲセンサーによって健康であるとここで診断されることになる（図３、灰色のスペクトル）（Nabers et al., Anal. Chem. 88(5):2755-62 doi:10.1021/acs.analchem.5b04286 (2016)）。したがって、提示されたアプローチは、ＡＤに対するまた他の神経変性疾患に対する候補薬物を選択するためのプレスクリーニングツールとして非常に高い可能性を有する。薬物処理状態から未処理状態を差し引くことによって、二次構造変化は、１６２５ｃｍ−１での負のバンドおよび１６５５ｃｍ−１での正のバンドによって示されるようにさらにいっそう明白になる（図４）。変化がメチレンブルーによって真に引き起こされていることを証明するために、メチレンを含まない対照を実施した（図５）。薬物のインキュベーションなしでは、アミドＩの最大値は安定であり、約±１波数だけ異なる（図５、灰色の線）が、一方、薬物の存在下では、より高い波数への明らかなシフトが観察される（図５、黒色の線）。
【００３９】
[実施例２]：ベルベリンはＡβ１−４２の凝集を鈍化させる
アルツハイマー病の第２の重要なマーカータンパク質はＡβ１−４２である。本発明者らは記載の方法を用いて線維形成プロセスを解析した。合成Ａβ１−４２をヘキサフルオロ−２−プロパノールで単量化した。単量化Ａβ１−４２の溶液をセンサー上にフラッシュし、抗体Ａ８９７９で特異的に固定化した（Nabers et al., J. Biophotonics 9(3):234-34 doi:10.1002/jbio.201400145 (2016)）。自発的な線維形成を１８時間にわたってモニタリングし、アミドＩの最大値１６３４ｃｍ−１がその結果得られた（図６、明灰色のスペクトル）。同じ実験を１００μＭベルベリンの存在下で行うと、１６５９ｃｍ−１へとアミドＩの最大値に関して２５ｃｍ−１のシフトが示された（図６、黒色のスペクトル）。これが示すところは、ベルベリンによってＡβ１−４２の凝集プロセスが直接的に鈍化することである。少量のβシート濃縮アイソフォームが１６３４ｃｍ−１でのショルダーとして観察されるが、優位を占めている立体配座は単量体Ａβ１−４２である。このことは、薬物として適用してＡＤの初期プロセスを予防する可能性があり、したがって疾患の進行を遅らせるのに有用であるかもしれない、ベルベリンとＡβ１−４２との直接的な相互作用を、示唆している。
【００４０】
[実施例３]：メチレンブルーはＡβ１−４２にも影響を及ぼす
加えて、Ａβ１−４２に対するメチレンブルーの効果をベルベリンと同じ条件下で調べた。得られたスペクトルは明らかに原線維を示し（図７、明灰色のスペクトル）、これは文献と一致している（Necula et al., Biochem. 46(30):8850-60 doi:10.1021/bi700411k (2007)）。この効果は、有毒なオリゴマーの形成を防止すると議論されており、したがって、アルツハイマー病を治療する可能性を有するかもしれない（Necula et al., Biochem. 46(30):8850-60 doi:10.1021/bi700411k (2007)）。このことは、本方法が極めて効果的に働き、薬物の分子機構に関する直接的な情報を与えることを示している。
【００４１】
[実施例４]：ベルベリンはタウに影響を及ぼさない
さらに、本発明者らは、メチレンブルーと同じ条件下で（ＣＳＦ由来の）タウタンパク質に対するベルベリンの効果について調べた（図８）。アミドバンドおよびその最大値はベルベリン処理によって影響を及ぼされず、これはベルベリンがメチレンブルーと比較してタウタンパク質に対して有意な効果を有さないことを示している（図３および図８）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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