(57)【要約】  本明細書では、胎盤組織、皮膚、腎臓、及び脳組織を含む組織の老化及び／又は酸化損傷を検出又は判定する方法が提供される。一実施形態は、体組織の老化を検出又は判定するための方法を提供し、この方法は、生物学的試料中のアルデヒドオキシダーゼ１（ＡＯＸ１）の発現又は活性の１つ又は複数のマーカーを測定することを含み、ＡＯＸ１の発現若しくは活性又は１つ若しくは複数のマーカーのレベルが組織の老化の指標である。本明細書では、１つ又は複数の細胞又は組織の老化又は酸化損傷に関連する疾患又は状態を処置する方法も提供され、この方法は、ＡＯＸ１の阻害剤を、それを必要とする対象に投与することを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
体組織の老化を検出又は判定するための方法であって、対象から得られた生物学的試料中のアルデヒドオキシダーゼ１（ＡＯＸ１）の発現又は活性の１つ又は複数のマーカーを測定することを含み、ＡＯＸ１の発現若しくは活性又は１つ若しくは複数のマーカーのレベルが組織の老化の指標である、方法。
【請求項２】
前記対象が妊娠中である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組織が胎盤組織である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記生物学的試料には、前記妊娠中の対象、胎盤、又は胎児からの試料が含まれる、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記生物学的試料には、血液、羊水、胎盤組織、又はそれらに由来する試料が含まれる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記生物学的試料には、血液又はそれに由来する試料が含まれる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記生物学的試料には、全血、血漿、又は血清が含まれる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記生物学的試料が、母体由来の試料である、請求項２〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記試料が母体血である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＡＯＸ１の発現又は活性の１つ又は複数のマーカーが、前記生物学的試料中に存在する遊離ＲＮＡ若しくは遊離ＤＮＡ、胎盤細胞の断片、エキソソーム、又は微粒子に由来する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＡＯＸ１の発現の１つ又は複数のマーカーには、ＡＯＸ１  ｍＲＮＡ及び／又はＡＯＸ１タンパク質が含まれる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＡＯＸ１活性の１つ又は複数のマーカーには、８−ヒドロキシ−デオキシグアノシン（８ＯＨｄＧ）、８−ヒドロキシ−グアノシン（８ＨＯＧ）、４−ヒドロキシノネナール（４ＨＮＥ）、又はマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）が含まれる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ＡＯＸ１の発現又は活性の２つ以上のマーカーの組み合わせが測定される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記２つ以上のマーカーには、ＡＯＸ１  ｍＲＮＡ及び／又はタンパク質並びに４ＨＮＥが含まれる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
参照値と比較した、前記生物学的試料中のＡＯＸ１の発現若しくは活性又はその１つ若しくは複数のマーカーのレベルの増加が、前記組織の酸化ストレス及び／又は老化を示す、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
酸化ストレスの１つ又は複数の追加のマーカーも又、前記生物学的試料又はさらなる生物学的試料で測定される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記妊娠中の対象において、参照値と比較した前記生物学的試料中のＡＯＸ１の活性若しくは発現又はその１つ若しくは複数のマーカーのレベルの増加が、胎盤の老化、子癇前症、子宮内発育遅延、出産予定日を超過した妊娠のリスク、死産のリスク、出産予定日を超過した妊娠若しくは死産を防止するための介入の必要性、又は出産の適切な時期を示す、請求項２〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
出産予定日を超過した妊娠又は死産を防止するための前記介入には、予防的帝王切開、陣痛の誘発、及び／又は胎盤の老化を予防若しくは遅らせる、又は子宮内胎児の生存を引き延ばすための治療の実施が含まれる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＡＯＸ１の発現又は活性の１つ又は複数のマーカーが、経時的に前記対象から得られた、妊娠中の対象からの１つ又は複数の生物学的試料で測定される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
妊娠中の死産のリスクを監視するために使用される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記１つ又は複数の生物学的試料が、前記妊娠中の対象から隔週、毎週、又は毎日得られ；ＡＯＸ１の発現若しくは活性又はその１つ若しくは複数のマーカーの経時的な増加が死産のリスクの増加を示す、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
胎盤の老化を検出するための方法であって、妊娠中の対象から生物学的試料を得ること、及び前記生物学的試料中の胎盤ＡＯＸ１の発現又は活性の１つ又は複数のマーカーを測定することを含み、ＡＯＸ１の発現若しくは活性又はその１つ若しくは複数のマーカーのレベルが、胎盤の老化の指標である、方法。
【請求項２３】
参照値と比較して増加したＡＯＸ１の発現若しくは活性又はその１つ若しくは複数のマーカーのレベルが胎盤の老化を示す、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
出産予定日を超過した妊娠又は死産のリスクを予測するための方法であって、妊娠中の対象から生物学的試料を得ること、及び前記生物学的試料中の胎盤ＡＯＸ１の発現又は活性の１つ又は複数のマーカーを測定することを含み、前記ＡＯＸ１の発現若しくは活性又はその１つ若しくは複数のマーカーのレベルが、出産予定日を超過した妊娠又は死産のリスクを示す、方法。
【請求項２５】
参照値と比較して増加したＡＯＸ１の発現若しくは活性又はその１つ若しくは複数のマーカーが死産のリスクを示す、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
出産予定日を超過した妊娠又は死産を防止するための介入の必要性を判断するための方法であって、妊娠中の対象から生物学的試料を得ること、及び前記生物学的試料中の胎盤ＡＯＸ１の発現又は活性の１つ又は複数のマーカーを測定することを含み、前記ＡＯＸ１の発現若しくは活性又はその１つ若しくは複数のマーカーのレベルが介入の必要性の指標である、方法。
【請求項２７】
参照値と比較して増加したＡＯＸ１の発現若しくは活性、又はその１つ若しくは複数のマーカーのレベルが、死産を防止するための介入の必要性を示す、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記介入には、予防的帝王切開、陣痛の誘発、又は胎盤の老化を遅らせる若しくは子宮内胎児の生存を引き延ばすための治療の実施の少なくとも１つが含まれる、請求項２６又は２７に記載の方法。
【請求項２９】
胎盤の酸化ストレスを検出するための方法であって、妊娠中の対象から生物学的試料を得ること、及び前記生物学的試料中の胎盤ＡＯＸ１の発現又は活性の１つ又は複数のマーカーを測定することを含み、前記ＡＯＸ１の発現若しくは活性又はその１つ若しくは複数のマーカーのレベルが胎盤の酸化ストレスの指標である、方法。
【請求項３０】
参照値と比較して増加したＡＯＸ１の発現若しくは活性又はその１つ若しくは複数のマーカーのレベルの増加が胎盤の酸化ストレスを示す、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
胎盤の老化、胎盤の酸化ストレス、又は妊娠期間中の出産予定日を超過した妊娠若しくは死産のリスクを監視するための方法であって：
（ｉ）妊娠期間中の最初の時点で妊娠中の対象から生物学的試料を得ること；
（ｉｉ）前記生物学的試料中の胎盤ＡＯＸ１の発現又は活性の１つ又は複数のマーカーを測定すること；
（ｉｉｉ）前記妊娠期間中の１つ又は複数の後の時点で、前記対象から１つ又は複数のさらなる生物学的試料を得ること；及び
（ｉｖ）前記１つ又は複数のさらなる生物学的試料中の胎盤ＡＯＸ１の発現又は活性の１つ又は複数のマーカーを測定することを含み、
前記ＡＯＸ１の発現若しくは活性又はその１つ若しくは複数のマーカーのレベルの経時的な増加が、胎盤の老化、胎盤の酸化ストレス、又は出産予定日を超過した妊娠若しくは死産のリスクを示す、方法。
【請求項３２】
前記１つ又は複数のマーカーの測定を妊娠中期に開始する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記生物学的試料が妊娠約２０週から得ることができる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記時点間の間隔が、毎日、毎週、隔週、又は毎月である、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
１つ又は複数の細胞又は組織の老化又は酸化損傷を遅くする又は防止する方法であって、前記１つ又は複数の細胞又は組織をＡＯＸ１の阻害剤に曝露することを含む、方法。
【請求項３６】
前記組織が、胎盤、皮膚、腎臓、又は脳組織である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＡＯＸ１の阻害剤が妊娠中の対象に投与される、請求項３５又は３６に記載の方法。
【請求項３８】
１つ又は複数の細胞又は組織の老化又は酸化損傷に関連する疾患又は状態を処置する方法であって、ＡＯＸ１の阻害剤をそれを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項３９】
出産予定日を超過した妊娠又は死産のリスクを防止又は低減するための方法であって、妊娠中の対象にＡＯＸ１の阻害剤を投与することを含む、方法。
【請求項４０】
前記ＡＯＸ１の阻害剤が、ラロキシフェン又はＧタンパク質共役エストロゲン受容体１（ＧＰＥＲ１）アゴニストである、請求項３５〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＧＰＥＲ１アゴニストがＧ−１である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
老化若しくは酸化損傷を低減若しくは防止するため、組織の老化若しくは酸化損傷に関連する疾患若しくは状態を処置するため、又は出産予定日を超過した妊娠若しくは死産のリスクを防止若しくは低減するための薬剤の製造におけるＡＯＸ１の阻害剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、一般に、胎盤組織、皮膚、腎臓、及び脳組織などの組織の老化及び／又は酸化損傷を検出又は判定する方法に関する。本開示は又、そのような組織における老化及び／又は酸化損傷を遅延させる、遅くする、又は防止する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
組織の累積したランダムな損傷は、組織の機能に影響を与え、老化の一因となり得る。代謝プロセス及び細胞の増殖は、タンパク質、脂質、及び核酸に損傷を与え得る活性酸素種を生成する。細胞は、カタラーゼ及びスーパーオキシドジスムターゼのような酵素などの、酸化ストレスに対する防御機構を備えているが、修復機構が活性酸素種の生成を補うのに不十分な場合、組織の損傷及び老化が起こり得る。
【０００３】
増殖経路は、一般に、酸化ストレスの増加に関連している。胎児の成長を促進する胎盤の機能により、特に胎児の成長が速い妊娠末期近くで、酸化損傷の指標が胎盤に現れ得ることは驚くべきことではない。本発明者らは、死産は、老化した胎盤の胎児を維持する能力の低下に関連し得ると仮定した（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ  ２０１３，Ｐｌａｃｅｎｔａ，３４：３１０−３１３）。この見解を支持して、満期での原因不明の子宮内死の症例に関連する胎盤の組織病理学的研究により、９１％が母体のらせん動脈壁の肥厚を示し、５４％が胎盤梗塞を含み、１０％が石灰化領域を有し、１３％が血管閉塞；他の臓器の老化に関連する変化を示したことが明らかにされた。本発明者らは、出産が遅れた又は死産した女性からの胎盤には、老化及び酸化ストレスの生化学的証拠があることを実証した。
【０００４】
原因不明の胎児死亡は、先進国では２００の妊娠のうちの約１つの妊娠で発生し、発展途上国ではより頻繁に起きる妊娠の一般的な合併症である。原因不明の胎児死亡は、乳幼児突然死症候群の４０倍も一般的であるが、あまり注目されていない。しかしながら、この出来事は、関係する家族に大打撃を与える。原因は確定していないが、死産は、胎児の発育遅延、先天異常、分娩前出血、周産期感染症、子癇前症、並びに母親の身長及び年齢、肥満、高血圧、糖尿病、喫煙、親の血族関係、民族性、及び出生国などの母体因子に関連し得る。死産の危険因子は存在するが、多くの場合、原因不明のままである。
【０００５】
一部の分娩前の症例では、死産の前に胎児が動かなくなることもあるが、警告サインがない場合もあり得る。死産の原因の理解不足により、妊娠中のリスクを予測することが困難である。死産は、妊娠２０週以上又は出生時体重４００ｇ以上での出産前又は出産中の胎児の死亡として定義することができる（Ｐｅｒｉｎａｔａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ  ａｎｄ  Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ  ｆｏｒ  Ｐｅｒｉｎａｔａｌ  Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ；  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．２，Ａｐｒｉｌ  ２００９）。死産のリスクの指標を特定することにより、胎児のリスクを減らすために予防的帝王切開又は陣痛の誘発を受ける機会を妊婦に提供することができる。したがって、死産のリスクの診断バイオマーカーは、死産の防止に非常に有益であるはずである。
【０００６】
妊娠の最適な期間は個体間で異なる可能性がある。早産の場合、乳児は生存可能であり得るが、子宮内で十分に発達していなければ合併症が起きる可能性が高い。一般に、より長い妊娠期間（最大約４１週間）は、乳児の解剖学及び生理学系のより良い発達に関連する。実際、妊娠４１週で生まれた乳児は、妊娠３７週で生まれた乳児よりも後年に特別な教育を必要とする可能性が低い。しかしながら、妊娠期間が長引くと、胎児が成長し続けて栄養素のさらなる供給を必要とする過熟妊娠症状（ｐｏｓｔ−ｍａｔｕｒｉｔｙ  ｓｙｍｐｔｏｍ）になることがある。過熟妊娠症候群（ｐｏｓｔ−ｍａｔｕｒｉｔｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）は、妊娠後期の栄養不良の証拠を示す出産予定日を超過して生まれた乳児（ｐｏｓｔ−ｄａｔｅｄ  ｉｎｆａｎｔ）に見られる状態である。満期で生まれた正常なヒトの乳児は、体脂肪が１２〜１４％であるが、過熟妊娠症候群は、皮下脂肪不足により皮膚に重度のしわのある乳児の誕生に関連している。過熟妊娠症候群は、陣痛が自然に起きなかった場合は陣痛の誘発又は帝王切開を使用して、通常は妊娠４２週未満で出産が行われる現代の産科診療ではめったに見られない。特に、死産のリスクは、過期妊娠で大幅に増加し、そのレートは、妊娠が３８週を超えると指数関数的に上昇する。したがって、妊娠には最適な妊娠期間があるように思われるが、この期間は個体間で異なる可能性が高い。現在、個々の妊娠についての理想的な妊娠期間を決定する方法が存在しない。胎盤の老化は、出産する適切な時期の指標であり得るが、胎児へのリスクが最小限で妊婦の胎盤の酸化状態を決定する方法は現在存在しない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示は、アルデヒドオキシダーゼ１（ＡＯＸ１）の発現及び活性（及び４−ヒドロキシノネナール、４ＨＮＥなどのそのマーカーのレベル）が胎盤及び腎臓を含む複数の組織における組織の老化及び酸化損傷に相関するという発明者らの驚くべき発見に基づいている。本発明者らは、ラロキシフェンなどのＡＯＸ１の阻害剤、又はＧ１などのＧタンパク質共役エストロゲン受容体１（ＧＰＥＲ１）アゴニストの投与によって胎盤の酸化ストレスを低減できることも実証した。本明細書に例示されるように、ＡＯＸ１の阻害は、胎盤組織における酸化的変化及びリソソーム変化を防止する。
【０００８】
したがって、本発明者らは、それによって妊娠が死産のリスクにさらされ得ることを示す胎盤の酸化ストレスの指標を得るために非侵襲的にサンプリングすることができる効果的なバイオマーカーを特定した。胎盤で観察されるものと同様の酸化的変化及びリソソーム変化は、加齢に関連する疾患（例えば、アルツハイマー病、ハンチントン病）でも見ることができる。したがって、ＡＯＸ１は、複数の組織型における酸化損傷及び老化のマーカー、並びにそれらの処置又は予防の標的も提供する。
【０００９】
本開示の第１の態様は、体組織の老化を検出又は判定するための方法を提供し、この方法は、対象から得られた生物学的試料中のアルデヒドオキシダーゼ１（ＡＯＸ１）の発現又は活性の１つ又は複数のマーカーを測定することを含み、１つ又は複数のマーカーのレベルによって決定されるＡＯＸ１の発現又は活性のレベルは組織の老化の指標である。
【００１０】
一実施形態では、組織は、胎盤組織、皮膚、腎臓、又は脳組織から選択される。
【００１１】
例示的な一実施形態では、対象は妊娠中であり、組織は胎盤組織である。
【００１２】
生物学的試料は、例えば、関連する組織の試料、又は血液（全血、血漿、若しくは血清）、尿、唾液、若しくは羊水などの液体試料であり得る。対象が妊娠中である実施形態では、試料には、例えば、母体血、胎児血、尿、唾液、又は羊水が含まれ得る。対象が妊娠中である実施形態では、生物学的試料は、典型的には母体由来であり、任意選択により母体血である。対象が妊娠中である他の実施形態では、生物学的試料は、母体血に由来する全ＲＮＡなどの、妊娠中の対象、胎盤組織、及び／又は胎児からの試料の誘導体を含み得、この全ＲＮＡは、母体由来、胎盤由来、又は胎児由来であり得る。
【００１３】
ＡＯＸ１の発現又は活性の１つ又は複数のマーカーは、老化組織から血液中に放出された物質から測定することができる。対象が妊娠中である実施形態では、ＡＯＸ１の発現又は活性の１つ又は複数のマーカーは、老化胎盤組織から母体血中に放出された物質から測定することができる。したがって、１つ又は複数のマーカーは母体血で測定することができる。例示的な実施形態では、１つ又は複数のマーカーは、生物学的試料中に存在する遊離ＲＮＡ若しくは遊離ＤＮＡ、胎盤細胞の断片、エキソソーム、又は微粒子に由来する。
【００１４】
ＡＯＸ１の発現は、ｍＲＮＡ若しくは遺伝子レベルで、又はポリペプチド若しくはタンパク質レベルで測定することができる。例示的な実施形態では、ＡＯＸ１の発現又は活性の適切なマーカーには、ＡＯＸ１  ｍＲＮＡが含まれ得る。他の実施形態では、ＡＯＸ１の発現又は活性の適切なマーカーには、脂質過酸化生成物などのＡＯＸ１の下流の分子が含まれ得る。例示的な脂質過酸化生成物は、４−ヒドロキシノネナール（４ＨＮＥ）及びマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）である。測定することができる他の酸化損傷の生成物には、８−ヒドロキシ−デオキシグアノシン（８ＯＨｄＧ）、８−ヒドロキシグアノシン（８ＨＯＧ）が含まれ得る。例示的な実施形態では、ＡＯＸ１の発現又は活性の任意の２つ以上のマーカーを組み合わせて決定又は測定することができる。例えば、ＡＯＸ１  ｍＲＮＡは、４ＨＮＥなどの脂質過酸化生成物と組み合わせて測定することができる。
【００１５】
典型的には、１つ又は複数のマーカーにより決定される、対象におけるＡＯＸ１の発現又は活性のレベルが、酸化損傷が存在しない組織におけるＡＯＸ１の発現若しくは活性の１つ若しくは複数の参照値、又はその１つ若しくは複数のマーカーと比較される。参照値は、１つ又は複数の対照又は参照個体から得る又は導出することができる。あるいは、参照値は、異なる時点で対象から得られた１つ又は複数の生物学的試料から導出することができ、対象からのさらなる生物学的試料を比較することができるベースライン値として使用することができる。当業者であれば、適切な参照試料を決定及び選択する方法に精通しているであろう。
【００１６】
典型的には、参照値と比較した、対象からの生物学的試料中のＡＯＸ１の発現若しくは活性又はその１つ若しくは複数のマーカーのレベルの増加は、組織の酸化ストレス及び／又は老化を示す。例示的な実施形態では、組織は胎盤組織であり、生物学的試料は母体血である。
【００１７】
特定の実施形態では、胎盤又は胎児の酸化ストレスなどの酸化ストレスの追加のマーカーも、生物学的試料又はさらなる生物学的試料で測定することができる。そのような追加の酸化損傷又は酸化ストレスのマーカーの非限定的な例としては、ＡＯＸ１タンパク質、グルタチオン、又はタンパク質カルボニルを挙げることができる。
【００１８】
対象が妊娠中である実施形態では、本方法は、妊娠中の任意の時点、特に、ヒト対象の場合には妊娠約２０週などの妊娠の後半で１回又は複数回行うことができる。特定の実施形態では、この方法は、例えばヒト対象の場合には妊娠４０週以降の出産予定日を超過した妊娠（ｐｏｓｔ−ｄａｔｅｄ  ｐｒｅｇｎａｎｃｙ）で行うことができる。
【００１９】
本開示の方法の特定の用途は、死産のリスクを予測するために妊娠中の対象の胎盤の老化を検出することであり、参照値と比較した、生物学的試料中のＡＯＸ１の発現若しくは活性又はその１つ若しくは複数のマーカーのレベルの増加は、胎盤の老化及び死産のリスクを示す。胎盤の老化は、胎盤及び／又は胎児の酸化損傷、胎児の健康状態の悪化、並びに死産のリスクの増加に関連し得る。胎盤の酸化ストレス及び胎盤の老化は、胎児への栄養分の不十分な移動にも関連し得る。この方法は、妊娠中の対象の子癇前症を診断するため、又は胎児の子宮内発育遅延を診断するためにも使用することができる。この方法は又、出産予定日を超過した妊娠のリスクを予測するために使用することができる、又はこの出産予定日を超過した妊娠に関連し得る。
【００２０】
本開示のさらなる実施形態は、妊娠中の対象から生物学的試料を得ること、及び妊娠中の死産を防止するための介入の必要性を判断するために、この生物学的試料中の胎盤ＡＯＸ１の発現又は活性の１つ又は複数のマーカーを測定することを含み、参照値と比較して増加したＡＯＸ１の発現若しくは活性、又はその１つ若しくは複数のマーカーのレベルは介入が必要であり得ることを示す。そのような介入には、予防的帝王切開、陣痛の誘導、及び／又は胎盤の老化を防止若しくは遅延させる、又は子宮内胎児の生存を引き延ばすための治療の実施が含まれ得る。したがって、一実施形態では、この方法は、胎盤の酸化ストレスが胎児が死産のリスクにさらされているレベルであるか否かを判断することによって、子供を出産するのに適切な時期を決定するために使用することができる。参照値と比較して増加したＡＯＸ１の発現若しくは活性、又はその１つ若しくは複数のマーカーのレベルは、子供を出産するのに適切な時期を示唆又は示し得る。
【００２１】
一実施形態では、本開示の方法は、経時的に対象から得た１つ又は複数の生物学的試料中のＡＯＸ１の発現又は活性の１つ又は複数のマーカーを測定することによって胎盤組織の老化を検出又は判定することにより、妊娠中の死産のリスクを監視するために使用することができる。そのような方法では、妊娠中の複数の時点で、例えば隔週、毎週、又は毎日、妊娠中の対象から生物学的試料を得て、胎盤ＡＯＸ１の発現又は活性の１つ又は複数のマーカーを各時点の各生物学的試料で測定する。ＡＯＸ１の発現若しくは活性又はその１つ若しくは複数のマーカーのレベルの経時的な増加は、死産のリスクの増加を示し得、したがって死産を防止するための介入の必要性を示し得る。
【００２２】
本開示の第２の態様は、胎盤の老化を検出するための方法を提供し、この方法は、妊娠中の対象から生物学的試料を得ること、及びこの生物学的試料中の胎盤ＡＯＸ１の発現又は活性の１つ又は複数のマーカーを測定することを含み、ＡＯＸ１の発現若しくは活性又はその１つ若しくは複数のマーカーのレベルは胎盤の老化の指標である。
【００２３】
典型的には、参照値と比較して増加したＡＯＸ１の発現若しくは活性、又はその１つ若しくは複数のマーカーのレベルは胎盤の老化を示す。適切な参照値は、胎盤組織が酸化損傷の兆候を示さない１つ若しくは複数の個体の組織からの試料から導出若しくは得ることができる、又は妊娠中のより早い時点で対象から導出若しくは得ることができる。
【００２４】
胎盤の老化は、死産のリスクの増加、子癇前症、胎児の子宮内発育遅延、及び／又は出産予定日を超過した妊娠のリスクの増加に関連し得る。
【００２５】
本開示の第３の態様は、妊娠中の死産のリスクを予測するための方法を提供し、この方法は、妊娠中の対象から生物学的試料を得ること、及びこの生物学的試料中の胎盤ＡＯＸ１の発現又は活性の１つ又は複数のマーカーを測定することを含み、ＡＯＸ１の発現若しくは活性又はその１つ若しくは複数のマーカーのレベルは死産のリスクの指標である。
【００２６】
死産のリスクは、直接的又は間接的に判定することができる。例えば、ＡＯＸ１の発現若しくは活性又はその１つ若しくは複数のマーカーのレベルは、子癇前症、胎児の子宮内発育遅延、及び／又は出産予定日を超過した妊娠のリスクの増加の指標であり得、これらはそれぞれ、死産のリスク増加に関連する指標又は因子である。
【００２７】
典型的には、参照値と比較して増加したＡＯＸ１の発現若しくは活性、又はその１つ若しくは複数のマーカーのレベルは死産のリスクを示す。参照値は、１つ又は複数の対照又は参照個体から得る又は導出することができる。適切な参照値は、胎盤組織が酸化損傷の兆候を示さない１つ若しくは複数の個体の組織からの試料から導出する若しくは得ることができる、又は妊娠中のより早い時点で対象から導出する若しくは得ることができる。
【００２８】
したがって、本開示の第４の態様は、出産予定日を超過した妊娠又は妊娠中の死産を防止するための介入の必要性を判断するための方法を提供し、この方法は、妊娠中の対象から生物学的試料を得ること、及びこの生物学的試料中の胎盤アルデヒドオキシダーゼ１（ＡＯＸ１）の発現又は活性の１つ又は複数のマーカーを測定することを含み、ＡＯＸ１の発現若しくは活性又はその１つ若しくは複数のマーカーのレベルが介入の必要性の指標である。
【００２９】
介入には、予防的帝王切開、陣痛の誘発、又は胎盤の老化を遅延させる若しくは子宮内胎児の生存を引き延ばすための治療の実施のうちの少なくとも１つが含まれ得る。安全に出産するには胎児が未熟すぎる、又は生存するには発達が遅れすぎている場合、介入には、本開示のさらなる態様及び実施形態で論じられるように、酸化ストレス又はＡＯＸ１の発現若しくは活性を低下させる対象の処置が含まれ得る。
【００３０】
本開示の第５の態様は、胎盤の酸化ストレスを検出するための方法を提供し、この方法は、妊娠中の対象から生物学的試料を得ること、及びこの生物学的試料中の胎盤ＡＯＸ１の発現又は活性の１つ又は複数のマーカーを測定することを含み、ＡＯＸ１の発現若しくは活性又はその１つ若しくは複数のマーカーのレベルは胎盤の酸化ストレスの指標である。
【００３１】
典型的には、参照値と比較して増加したＡＯＸ１の発現若しくは活性、又はその１つ又は複数のマーカーのレベルは胎盤の酸化ストレスを示す。参照値は、１つ若しくは複数の対照又は参照個体から得る又は導出することができる。適切な参照値は、胎盤組織が酸化損傷の兆候を示さない１つ若しくは複数の個体の組織からの試料から導出する若しくは得ることができる、又は妊娠中のより早い時点で対象から導出する若しくは得ることができる。
【００３２】
本開示の第６の態様は、胎盤の老化、胎盤の酸化ストレス、又は妊娠期間中の出産予定日を超過した妊娠若しくは死産のリスクを監視するための方法を提供し、この方法は：（ｉ）妊娠期間中の最初の時点で妊娠中の対象から生物学的試料を得ること；（ｉｉ）この生物学的試料中の胎盤ＡＯＸ１の発現又は活性の１つ又は複数のマーカーを測定すること；（ｉｉｉ）妊娠中の１つ又は複数の後の時点で、対象から１つ又は複数のさらなる生物学的試料を得ること；及び（ｉｖ）１つ又は複数のさらなる生物学的試料中の胎盤ＡＯＸ１の発現又は活性の１つ又は複数のマーカーを測定することを含み、ＡＯＸ１の発現若しくは活性又はその１つ若しくは複数のマーカーのレベルの経時的な増加は、胎盤の老化、胎盤の酸化ストレス、又は出産予定日を超過した妊娠又は死産のリスクを示す。
【００３３】
１つ又は複数のマーカーの測定は、例えば妊娠中期に開始することができる。例示的な実施形態では、生物学的試料は、妊娠約２０週で得ることができる。時点間の間隔は、当業者が決定してもよく、毎日、毎週、隔週、毎月、又は開業医によって決定される別の適切な期間であってもよい。時点は、妊娠期間を通して、特に出産予定日を超過した妊娠で頻度を増加させてもよい。
【００３４】
本開示の第７の態様では、１つ又は複数の細胞又は組織の老化又は酸化損傷を遅くする又は防止する方法が提供され、この方法は、１つ又は複数の細胞又は組織をＡＯＸ１の阻害剤に曝露することを含む。
【００３５】
阻害剤は、ＡＯＸ１に直接的又は間接的に作用し得る。例示的な一実施形態では、ＡＯＸ１の阻害剤は、ラロキシフェン又はＧタンパク質共役エストロゲン受容体１（ＧＰＥＲ１）アゴニストである。例示的なＧＰＥＲ１アゴニストは、Ｇ−１（（１−［４−（６−ブロモベンゾ［１，３］ジオキソール−５イル）−３ａ，４，５，９ｂ−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｃ］キノリン−８−イル］−エタノン）である。
【００３６】
例示的な一実施形態では、組織は胎盤組織である。したがって、ＡＯＸ１の阻害剤は、妊娠中の対象に投与される。
【００３７】
さらなる例示的な実施形態では、組織は、皮膚、腎臓、又は脳組織である。
【００３８】
本開示の第８の態様では、１つ又は複数の細胞又は組織の老化又は酸化損傷に関連する疾患又は状態を処置する方法が提供され、この方法は、ＡＯＸ１の阻害剤をそれを必要とする対象に投与することを含む。
【００３９】
本開示の第９の態様では、出産予定日を超過した妊娠又は死産のリスクを防止又は低減する方法が提供され、この方法は、妊娠中の対象にＡＯＸ１の阻害剤を投与することを含む。
【００４０】
さらなる態様は、老化若しくは酸化損傷を軽減若しくは防止するため、老化若しくは酸化損傷に関連する疾患若しくは状態を処置するため、又は出産予定日を超過した妊娠若しくは死産のリスクを防止若しくは低減するための薬剤の製造における阻害剤又はＡＯＸ１の使用を提供する。
【００４１】
本開示の態様及び実施形態は、以下の図面を参照して、単に非限定的な例として本明細書に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】アルデヒドオキシダーゼは、死産に関連する胎盤の酸化損傷を調節する。脂肪酸の酸化損傷は、リソソーム及び／又はオートファゴソーム機能の変化に関連する４−ヒドロキシノネアール（４ＨＮＥ）によって実証することができる。酸化損傷は又、細胞内の核酸（ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ）を変化させることがあり、これは、８−ヒドロキシ−グアノシン（８ＯＨｄＧ）又は８−ヒドロキシグアノシン（８ＨＯＧ）の存在によって実証することができる。４ＨＮＥ、８ＯＨｄＧ、及び８ＨＯＧは、胎盤の老化を示し得る。アルデヒドオキシダーゼは、ラロキシフェンによって、及びアゴニストＧ１を使用してＧタンパク質共役エストロゲン受容体１と相互作用することによって阻害することができる。
【図２】死産と継続妊娠数との間の関係。妊娠期間の関数としての継続妊娠数のカプランマイヤープロット、及び１０００の継続妊娠当たりの原因不明の死産のプロット；Ｏｍｉｇｂｏｄｕｎ  ａｎｄ  Ａｄｅｗｕｙｉ（１９９７）（Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｍｅｄ  Ａｓｓｏｃ，８９：６１７）及びＳｕｔａｎ  ｅｔ  ａｌ（２０１０）（Ｊ  Ｐｅｒｉｎａｔｏｌ，３０：３１１−３１８）からのデータ。プロットは、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９９）（Ｃｅｌｌ，９６：２９１−３０２）によって提案された老化の使用可能な定義と一致して時間とともに死産のリスクが増加すること、及び以前の出産により４１週までの死産のリスクのある妊娠数が比較的少ないことを示している。
【図３】出産予定日を超過した胎盤及び死産の胎盤におけるＤＮＡ／ＲＮＡの酸化。このグラフは、出産予定日を超過した胎盤及び死産の胎盤が、満期胎盤と比較して、高い強度の核８ＯＨｄＧ／８ＨＯＧ染色を有することを例示している（出産予定日を超過した胎盤ではｐ＜０．０００１、死産の胎盤ではｐ＝０．０００５、マン・ホイットニー検定）。白丸及び黒丸はそれぞれ、満期帝王切開の非分娩の胎盤（ｎ＝１０）及び満期経膣分娩の胎盤（ｎ＝８）を表す。白い四角及び黒い四角はそれぞれ、出産予定日を超過した帝王切開の胎盤（ｎ＝５）及び出産予定日を超過した経膣分娩の胎盤（ｎ＝１３）を表す。黒い三角は、妊娠後期の経膣分娩での原因不明の死産の胎盤（ｎ＝４）を表す。グラフの各点は、１００倍の倍率及び１．４の光学解像度で撮影された胎盤に付き６枚の画像における６０の核の８ＯＨｄＧ／８ＨＯＧの平均強度を表す。
【図４】脂質過酸化は、出産予定日を超過した胎盤及び死産の胎盤で増加している。４ＨＮＥの強度は、出産予定日を超過した胎盤（ｐ＜０．０００１、マン・ホイットニー検定）及び死産の胎盤（ｐ＝０．００１３、マン・ホイットニー検定）で有意に増加している。白丸及び黒丸はそれぞれ、満期帝王切開の非分娩の胎盤（ｎ＝２１）と満期経膣娩分娩の胎盤（ｎ＝１４）を表す。白い四角及び黒い四角はそれぞれ、出産予定日を超過した帝王切開の胎盤（ｎ＝１０）及び出産予定日を超過した経膣分娩の胎盤（ｎ＝１８）を表す。黒い三角は、妊娠後期の経膣分娩での原因不明の死産の胎盤（ｎ＝４）を表す。グラフの各点は、１００倍の倍率及び１．４の光学解像度で撮影された個々の胎盤についての６枚の画像の単位面積当たりの平均強度を表す。
【図５】早期（ｎ＝１７）、後期（ｎ＝２６）、子癇前症（ＰＥ、ｎ＝２２）、及び子宮内発育遅延（ＩＵＧＲ、ｎ＝２４）の症例からの母体血漿中の４ＨＮＥのレベル。後期群、ＰＥ群、及びＩＵＧＲ群は、早期群よりも有意に高いレベルの４ＨＮＥを有する。早期対後期、ｐ＝０．００１６；早期対ＰＥ、ｐ＝０．００１７；早期対ＩＵＧＲ、ｐ＝０．００１６。
【図６】出産予定日を超過した胎盤及び死産の胎盤におけるリソソーム分布の変化。リソソームマーカーであるＬＡＭＰ２の免疫組織化学により、リソソームが、（例えば、白い線で示されるように）主に満期胎盤（Ａ）の頂端面に局在することを示したが、リソソーム分布は、出産予定日を超過した胎盤（Ｂ）及び死産の胎盤（Ｃ）の合胞体栄養細胞の核周囲及び基底面に及んでいることが示された。合胞体栄養細胞全体の強度計算により、出産予定日を超過した胎盤（ｎ＝５、図５Ｆ）及び原因不明の死産の胎盤（ｎ＝４、図５Ｇ）におけるＬＡＭＰ２の分布は、核周囲及び基底面にシフトするのに対し、満期帝王切開の胎盤（ｎ＝５、図５Ｄ）及び満期経膣分娩の胎盤（ｎ＝５、図５Ｅ）におけるリソソーム分布は、合胞体栄養細胞の頂端領域に残ったことが示された。ＤＡＰＩ染色は核を識別する。図５Ｄ〜図５Ｇでは、それぞれの色付きの線は、個々の胎盤での結果を表し、胎盤に付き６枚の個々の画像ごとに５つのランダムな部位（５Ａ、５Ｂ、及び５Ｃの明るい緑色の線で表された例）における合胞体栄養細胞全体のＬＡＭＰ２の平均強度を示す。画像は、１００倍の倍率及び１．４の光学解像度で撮影した。スケールバー、２０μｍ。
【図７】より大きいオートファゴソームは、出産予定日を超過した胎盤及び死産の胎盤で存在する。ＮＩＳ要素ソフトウェアを使用してオートファゴソームのサイズを定量化し、その直径を、１０００〜３０００の任意の強度範囲、直径範囲０．２〜１μｍ、及び円形範囲０．５〜１で測定した。分析により、出産予定日を超過した胎盤及び死産の胎盤は、満期胎盤よりも有意に大きい（それぞれ、ｐ＝０．０１２及びｐ＝０．００１９、マン・ホイットニー検定）オートファゴソームを有することが示された。白丸及び黒丸はそれぞれ、満期帝王切開の非分娩の胎盤（ｎ＝ｌｌ）及び満期経膣分娩の胎盤（ｎ＝１０）を表す。白い四角及び黒い四角はそれぞれ、出産予定日を超過した帝王切開の胎盤（ｎ＝８）及び出産予定日を超過した経膣分娩の胎盤（ｎ＝１５）を表す。黒い三角は、原因不明の死産の胎盤（ｎ＝４）を表す。グラフの各点は、それぞれの胎盤で撮影された６枚の画像におけるＬＣ３Ｂ粒子の平均直径を表す。
【図８】出産予定日を超過した胎盤のオートファゴソーム内の酸化脂質。代表的な二重標識蛍光免疫染色により、オートファゴソームマーカーであるＬＣ３Ｂが脂質過酸化のマーカーである４ＨＮＥと共局在していることが示された。ドット（Ｃの矢印が指している）は、共局在化を示す。ＤＡＰＩ染色は核を示す。元の倍率は１００倍；スケールバー２０μｍ。
【図９】ＲＮＡ−配列決定データにより、出産予定日を超過した胎盤が満期胎盤よりも有意に高いＡＯＸ１  ｍＲＮＡの発現を有することが示された。
【図１０】４ＨＮＥの産生におけるアルデヒドオキシダーゼ１（ＡＯＸ１）の役割。出産予定日を超過した胎盤（Ａ〜Ｃ）及び死産の胎盤（Ｄ〜Ｆ）における代表的な二重標識蛍光免疫染色により、ＡＯＸ１陽性粒子が４ＨＮＥと共局在していることが示された。ドット（Ｃ及びＦの矢印が指している）は、共局在化の程度を示す。核はＤＡＰＩで染色されている。リアルタイムＰＣＲにより、ＡＯＸ１  ｍＲＮＡの発現が、満期胎盤（Ｇ）と比較して、出産予定日を超過した胎盤（ｐ＝０．００９７）及び死産の胎盤（ｐ＝０．０１２）で増加していることが示された。元の倍率は１００倍；スケールバー２０μｍ。
【図１１】胎盤における４ＨＮＥの産生及びＧＰＥＲ１の発現の薬理学的阻害。（血清飢餓によって誘発される）４ＨＮＥの産生は、胎盤外植片をＡＯＸ１阻害剤であるラロキシフェン（Ａ）及び膜エストロゲン受容体ＧＰＥＲ１アゴニストであるＧ１（Ｂ）で処理した後に有意に減少している。データは平均±ＳＥＭ、*ｐ＜０．０５（Ｎ＝６）である。
【図１２】無血清培地で培養された胎盤外植片におけるオートファゴソームサイズの変化。免疫組織化学分析により、オートファゴソーム（ＬＣ３Ｂ陽性粒子）のサイズが、０時間と比較して血清飢餓の２４時間後に増加したことが示された。データは平均±ＳＥＭ、***ｐ＝０．０００２（Ｎ＝１３）として表示された。
【図１３】リアルタイムＰＣＲ及びウェスタンブロット法による異なる組織におけるＧＰＥＲ１の検出。リアルタイムｑＰＣＲデータにより、ＧＰＥＲ１のｍＲＮＡが、羊膜、絨毛膜、及び脱落膜よりも満期胎盤でより多く発現していることが示された（Ａ）。ＧＰＥＲ１のｍＲＮＡの発現量は、これらの組織では次の順である：脱落膜＜絨毛膜＜羊膜＜胎盤（Ａ）。これらのタンパク質は、乳癌細胞株ＭＣＦ−７、満期胎盤、満期子宮筋層、満期羊膜、満期絨毛膜、満期脱落膜から抽出され、ウェスタンブロット法が行われた（Ｂ）。胎盤、子宮筋層、及びＭＣＦ−７細胞株は、羊膜、絨毛膜、又は脱落膜よりも多量のＧＰＥＲ１を発現した（Ｂ）。ウェスタンブロット法のデータにより、すべての組織がグリコシル化ＧＰＥＲ１（**又は***で示される）及び非グリコシル化新生ＧＰＥＲ１（*で示される）を発現したことが示された。同じＰＶＤＦ膜のｓｙｐｒｏ−ｒｕｂｙ染色は、内部ローディング対照として使用されている（Ｃ）。
【図１４】ＡＯＸ１  ｍＲＮＡは、満期妊娠と比較して、死産の症例の母体全血で増加している。
【図１５】６６歳の対象（Ａ）及び２１歳の対象（Ｂ）からの腎臓組織における４ＨＮＥの免疫染色。特に指示がない限り、すべての画像は２０倍の倍率である。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
特段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての科学技術用語は、本開示が属する一般的な技術者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載の方法及び材料と類似又は同等のあらゆる方法及び材料を、本開示の実施又は試験において使用することができるが、典型的な方法及び材料が説明される。
【００４４】
冠詞「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」は、本明細書では、冠詞の文法的目的語の１つ又は２つ以上（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用される。ほんの一例として、「要素」は、１つの要素又は複数の要素を意味する。
【００４５】
本明細書及び以下の特許請求の範囲を通して、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語、及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」又は「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、述べられた整数若しくは工程又は整数群若しくは工程群の包含を意味するが、その他の整数若しくは工程又は整数群若しくは工程群を除外するものではないことを理解されよう。
【００４６】
本明細書で使用される「対象」という用語には、ヒト、非ヒト霊長類、家畜動物（例えば、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ、ヤギ）、実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット、その他のげっ歯類）、及びコンパニオンアニマル（例えば、イヌ、ネコ）などのあらゆる哺乳動物が含まれる。典型的な実施形態では、対象はヒトである。同様に、「個体」という用語には、ヒト、非ヒト霊長類、家畜動物（例えば、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ、ヤギ）、実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット、その他のげっ歯類）、及びコンパニオンアニマル（例えば、イヌ、ネコ）などのあらゆる哺乳動物が含まれる。典型的な実施形態では、個体はヒトである。
【００４７】
本明細書における「死産」という用語は、妊娠約２０週以上又は出生時体重約４００ｇ以上の出産前又は出産中の胎児の死亡を指す（Ｐｅｒｉｎａｔａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ  ａｎｄ  Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ  ｆｏｒ  Ｐｅｒｉｎａｔａｌ  Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ；Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．２，Ａｐｒｉｌ  ２００９）。
【００４８】
「出産予定日を超過した」という用語は、予定妊娠期間を超えた妊娠を指す。本開示の文脈において、ヒトの妊娠に言及する場合、「出産予定日を超過した」という用語は、妊娠４０週を超える妊娠を示すために使用される。出産予定日を超過した妊娠は過期妊娠とも呼ばれることもある。
【００４９】
本明細書で使用される「酸化ストレス」という用語は、「酸化損傷」という用語と互換的に使用され、活性酸素種と抗酸化機構との間の不均衡、及びそのような不均衡によって引き起こされる損傷を指す。酸化損傷の非限定的な例には、例えば８−ヒドロキシ−デオキシグアノシン又は８−ヒドロキシグアノシン（８ＯＨｄＧ又は８ＨＯＧ）の分析又は測定によって試料で検出され得るＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸の酸化、及び、例えば４−ヒドロキシノネナール（４ＨＮＥ）などのアルケナールの測定によって試料で検出され得る脂質の酸化が含まれる。特に、本明細書では、「胎盤の酸化ストレス」という用語は、胎盤で発生する酸化ストレスを指す。理論に拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、胎盤における酸化ストレスの増加は、胎盤の老化に関連し、胎盤が胎児を適切に維持する能力の欠如をもたらし得ると提示している。したがって、本発明者らは、胎盤の酸化ストレスが死産のリスクの増加と関連し得ると仮定している。
【００５０】
本明細書で使用される「バイオマーカー」という用語は、遺伝子、核酸配列、タンパク質若しくはその断片、又は他の代謝産物などの天然に存在する生物学的に機能的な化合物又は分子を指し、この化合物又は分子は、胎盤、皮膚、腎臓、及び脳などの様々な体組織における組織の老化の診断のための予測値、子癇前症の診断のための予測値、子宮内発育遅延の診断のための予測値、並びに出産予定日を超過した妊娠及び死産のリスクの診断及び評価のための予測値を有する。生物学的試料中のマーカーのレベル又は活性の決定には、マーカー自体又はその前駆体、誘導体、若しくは代謝産物の検出及び定量化が含まれ得る。「バイオマーカー」及び「マーカー」という用語は、本明細書で互換的に使用することがある。
【００５１】
本開示の文脈において、バイオマーカーは、ＲＮＡ又は他の核酸配列であり得る。胎盤組織の老化、並びに関連する状態及び影響が評価される実施形態では、ｍＲＮＡは、胎盤に由来し、母体血で測定することができる。又、本開示の実施形態によると、本明細書で特定されるバイオマーカーの前駆体、誘導体、変異体、類似体、及び機能的断片の発現の決定である。バイオマーカーの変異体には、それ自体が変異体であるこのバイオマーカーの機能活性の少なくとも一部を示す分子が含まれる。
【００５２】
本開示の文脈において、所与の試料中のマーカーの発現の増加への言及は、典型的には１つ若しくは複数の対照若しくは参照試料における発現レベルと比較した場合、又は同じ対象の試料のベースライン測定と比較した場合の試料中の当該マーカーの発現レベルの増加を意味する。酸化ストレス又は組織の老化の兆候のなく、且つ／又は妊娠中の個体の場合は出産予定日を超過した妊娠又は死産のリスクがない１つ又は複数の個体から得られた試料を示すために、本明細書では、対照又は参照試料を使用することができる。
【００５３】
一態様では、本開示は、体組織の老化を検出又は判定する方法を提供し、この方法は、対象から得られた生物学的試料中のアルデヒドオキシダーゼ１（ＡＯＸ１）の発現又は活性の１つ又は複数のマーカーを測定することを含み、１つ又は複数のマーカーのレベルによって決定されるＡＯＸ１の発現又は活性のレベルは組織の老化の指標である。
【００５４】
本開示のさらなる態様は、胎盤の老化を検出するための方法を提供し、この方法は、妊娠中の対象から生物学的試料を得ること、及びこの生物学的試料中の胎盤ＡＯＸ１の発現又は活性の１つ又は複数のマーカーを測定することを含み、ＡＯＸ１の発現若しくは活性又はその１つ若しくは複数のマーカーのレベルは胎盤の老化の指標である。さらなる態様は、妊娠中の死産のリスクを予測するための方法を提供し、この方法は、妊娠中の対象から生物学的試料を得ること、及びこの生物学的試料中の胎盤ＡＯＸ１の発現又は活性の１つ又は複数のマーカーを測定することを含み、ＡＯＸ１の発現若しくは活性又はその１つ若しくは複数のマーカーのレベルは死産のリスクの指標である。
【００５５】
本明細書に開示及び例示される本発明者の新規の発見は、いくつかの実施形態では、出産予定日を超過した妊娠又は死産のリスクを予測するための正確で費用効果の高い迅速な方法を提供する。したがって、例示的な実施形態では、死産のリスクの予測及びリスクのある妊娠のための治療的予防又は予防的な療法の特定を容易にする単純な生化学的検査が本明細書に開示される。
【００５６】
本明細書に開示及び例示される本発明者の新規の発見は、いくつかの実施形態では、例えば胎盤、皮膚、腎臓、及び脳組織を含む様々な体組織において組織の老化の検出又は判定のため、及び組織の酸化損傷の検出又は判定のための正確で費用効果の高い迅速な方法も提供する。
【００５７】
本発明者らは、妊娠３８週〜４１週の間で胎盤の生化学及び生理学に劇的な変化が生じることを本明細書で実証する。特に、ＤＮＡ及び脂質の酸化損傷の増加、合胞体栄養細胞の核周囲及び基底面に蓄積するリソソームの位置の変化、酸化脂質に関連するより大きなオートファゴソームの形成、及び酵素ＡＯＸ１の発現の増加が起こる。死産に関連する胎盤でも同じ変化が観察されている。脂質の酸化、リソソームの局在化、及びオートファゴソームのサイズの同様の変化は、成長因子を奪われた胎盤外植片で起こり、これらの変化はＡＯＸ１の阻害によってブロックすることができる。
【００５８】
本発明者らは又、４１週での胎盤の生理学的機能が、他の組織で老化の多くの特徴を有する低下の証拠を示すことを本明細書で実証する。したがって、妊娠３８週後に発生する原因不明の子宮内死亡の既知の指数関数的な増加は、胎盤の老化、及び成長中の胎児の要求の増加に応えるために適切に機能する能力の低下の結果であり得る。この知識は、胎盤が老化して重大な障害点（ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｆａｉｌｕｒｅ）に達する前に確実に乳児が生まれるようにするべく、産科診療に影響を与え得る。
【００５９】
前述したように、死産のリスクは妊娠期間とともに増加し、特に妊娠が３８週を超えると指数関数的に上昇する。同様に、胎盤が老化するにつれて酸化損傷の兆候が増加する。しかしながら、当業者は、胎盤の老化の兆候及びそのための酸化損傷が、異なる個体で異なる時間に現れ、異なる速度で進行し得ることを理解されよう。したがって、本発明の方法を開始するべき特定の妊娠期間、又は本発明の方法をいつから開始するべきかの特定の妊娠期間、又は方法を利用するべき妊娠中の回数を指示することはできない。例えば、本開示の方法は、ヒト対象の場合は、妊娠約１８週間、１９週間、２０週間、２１週間、２２週間、２３週間、２４週間、２５週間、２６週間、２７週間、２８週間、２９週間、３０週間、３１週間、３２週間、３３週間、３４週間、３５週間、３６週間、３７週間、３８週間、３９週間、４０週間、又は４１週間から行うことができる。この方法は、妊娠中に１回又は複数回、例えば毎週又は隔週で行うことができる。本明細書に開示される方法を用いた試験及び監視の頻度は、妊娠期間が長くなるにつれて増加し得る。本開示による試験及び監視の開始の適切なタイミング並びに適切な頻度は、過度の負担もさらなる発明の必要もなく、熟練した受信者が症例ごとに決定することができる。
【００６０】
本発明者らは又、自分達の知見が胎盤組織以外の組織にも及ぶことを本明細書で実証し、ＡＯＸ１が腎臓の酸化損傷を引き起こすという証拠を提供する。
【００６１】
理論に拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、胎盤、皮膚、腎臓、又は脳などの組織におけるＡＯＸ１の発現又は活性の増加が、その組織の酸化損傷及び酸化ストレスをもたらし、組織の老化に寄与することを示唆している（図１、胎盤の文脈において）。胎盤組織の場合、胎盤の老化は、胎児への適切な栄養素の送達不足をもたらし、子宮内発育遅延及び／又は死産を引き起こし得る。本発明者らは、胎盤アルデヒドオキシダーゼなどの胎盤の酸化ストレスの指標が母体血中で測定可能であり、胎児へのリスクを最小限に抑えて非侵襲的にアッセイできる胎盤の完全性のバイオマーカーを提供できることを示した。したがって、ＡＯＸ１発現などの胎盤の酸化ストレスのバイオマーカーを使用して、妊娠中の死産のリスクをアッセイするための適切な方法が本明細書に開示される。本発明者らは又、そのような酸化ストレスがＡＯＸ１阻害により防止され得ることを実証する。
【００６２】
本発明者らは又、酸化損傷及びリソソーム局在化などの胎盤の老化の指標がアルツハイマー病などの他の病理と共有されていることに注目し、そして、老化及び酸化ストレス全般がＡＯＸ１に関連し得、ＡＯＸ１阻害により遅延も又は防止もできることを示唆している。
【００６３】
本開示の特定の実施形態では、この方法は、母体血中の胎盤ＡＯＸ１  ｍＲＮＡの測定を含む。ＡＯＸ１の発現又は活性についての代用となる追加の胎盤の酸化ストレスバイオマーカーには、限定されるものではないが：脂質の酸化損傷を示す４−ヒドロキシノネナール（４ＨＮＥ）及びその他のヒドロキシアルケナールなどの脂質過酸化生成物；核酸の酸化損傷を示す８−ヒドロキシグアノシン（８ＯＨｄＧ）及び８−ヒドロキシグアノシン（８ＨＯＧ）；並びにマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）、イソプロスタン、オキシステロール、又はタンパク質カルボニル濃度の増加などの酸化ストレスを示す他のマーカーが含まれる。
【００６４】
本開示の実施形態は、出産予定日を超過した妊娠及び死産のリスクを検出及び判定するための方法を含み、この方法では、ＡＯＸ１  ｍＲＮＡ又はＡＯＸ１の発現若しくは活性の他のマーカーのベースライン（典型的には、前述の１つ又は複数の参照値によって決定される）を超える増加は、胎盤の酸化ストレス、及び出産予定日を超過した妊娠又は死産のリスクの増加を示す。死産は妊娠のあらゆる段階で起こり得るため（定義では、妊娠２１週以上又はヒトでは４００ｇ以上）、本明細書で開示される方法は、妊娠中の様々な時点での母体全血中における本明細書で開示される酸化ストレスマーカーの存在とレベルの監視を企図している。そのようなマーカーは、ヒトでは、例えば妊娠２０週から１週間、２週間、３週間、又は４週間の間隔で妊娠期間にわたって検出及び測定することができる。ＡＯＸ１  ｍＲＮＡ又はＡＯＸ１の発現若しくは活性のマーカーのベースラインからの増加は、出産予定日を超過した妊娠又は死産のリスクの増加を示すであろう。
【００６５】
本明細書に開示される実施形態に従ってバイオマーカーのレベルを決定するために使用される生化学的検査は、当技術分野で公知の任意の手段を用いて実施することができ、本開示は、バイオマーカーのレベルが決定される手段への言及によって限定されるものではない。バイオマーカーのレベルの決定は、検出及び／又は定量を含んでもよく、そのような決定に利用可能な方法及び技術は当業者に周知である。典型的には、バイオマーカーがｍＲＮＡである場合、本開示のアッセイは定量的リアルタイムＰＣＲであろう。本明細書のバイオマーカーを検出する他の方法には、限定されるものではないが、ＰＣＲ、ＤＮＡアレイ、マイクロアレイ、リガーゼ連鎖反応、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ、ｃＤＮＡマイクロアレイ、次世代シーケンシング、ノーザンブロッティング、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、及び個体の差次的発現を決定するためのさらなる統計分析が含まれる。
【００６６】
タンパク質バイオマーカーを測定するための適切な方法及び技術には、限定されるものではないが、スペクトル分析、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動法、質量分析及びタンパク質スポットの識別、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、画像の取得と分析（磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）分光法、単一光子放射型コンピューター断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）など）、免疫染色、ＨＰＬＣ、ＬＣ／ＭＡの使用も含まれ得る。本明細書に開示される実施形態に従ってバイオマーカーのレベルを決定するために使用される生化学的検査は、病院、診療所、外科診療若しくは医療行為、又は病理検査室などの任意の適切な環境又は設定で利用することができる。
【００６７】
所望のバイオマーカーを分析する能力を有する１つ又は複数の装置に適切な生化学的検査を組み込み、それによって検査プロセスのある程度の又は完全な自動化を可能にすることができる。適切な装置は、典型的には、生物学的試料を受け取り、前記試料中の１つ又は複数のバイオマーカーのレベルを分析し、リアルタイムで前記バイオマーカーのレベルに関するデータを提供する能力を有し、したがって、基礎から臨床（ｂｅｎｃｈ−ｔｏ−ｂｅｄｓｉｄｅ）及び治療現場の分析、診断、リスク評価、及び／又は処置を容易にする。発現のレベル又はマーカーのレベルを決定することへの言及は、対象の関連組織における所望のマーカーの発現レベル又はレベルに関連する情報を提供することになる任意の適切な技術の使用への言及を意図することを理解されたい。したがって、これらの技術には、リンコイルを用いたＭＲＩイメージングなどのｉｎ  ｖｉｖｏ技術と、対象から抽出された生物学的試料に適用されるｉｎ  ｖｉｔｒｏ技術との両方が含まれる。４ＨＮＥ、８ＯＨｄＧ、又は８ＨＯＧなどの他の酸化ストレスマーカーは、当技術分野で周知の方法によって、例えば、蛍光検出、免疫組織化学法、又はＨＰＬＣなどのクロマトグラフィー法などによって検出することができる。
【００６８】
酸化ストレスマーカーのレベルを決定するために個体から得られた生物学的試料は、任意の適切な体液又は組織に由来し得る。典型的には、本開示の方法では、試料には、血液（赤血球、白血球、全血、血漿、若しくは血清など）、尿、羊水、唾液、又は組織が含まれ得る。対象が妊娠中である場合、生物学的試料は、母体由来、胎盤由来、又は胎児由来であり得る。一実施形態では、生物学的試料は母体全血である。
【００６９】
胎児の細胞又は核酸が母体血中に存在し得ることは当技術分野で公知である。したがって、本開示の方法で測定されるバイオマーカーは、胎盤から母体循環へ放出される遊離ＤＮＡ若しくは遊離ＲＮＡ、胎盤細胞、胎盤細胞の断片、エキソソーム、又は微粒子などの試料で測定することができる。
【００７０】
自然陣痛の前に増加したＡＯＸ１  ｍＲＮＡ又はバイオマーカーのレベルが検出された場合、医師は、死産のリスクを低減するための利用可能な選択肢を検討することができる。そのような選択肢には、例えば、胎児が生まれたときに生存している可能性が高い段階にある場合、陣痛誘発又は帝王切開が含まれる。乳児が早産とみなされる月齢で増加したＡＯＸ１  ｍＲＮＡ又はバイオマーカーのレベルが検出された場合、胎盤の老化を遅らせる又は妊娠期間を長くする選択肢を検討することができる。本明細書に開示及び例示されるように、選択肢には、例えば、抗酸化処置又は１つ若しくは複数のＡＯＸ１阻害剤で妊娠中の母親を処置することが含まれ得る。以下でさらに論じられるように、適切なＡＯＸ１阻害剤の例には、ラロキシフェン、又はＧ−１などのＧタンパク質共役エストロゲン受容体１（ＧＰＥＲ１）のアゴニストが含まれる。
【００７１】
本開示の実施形態は、ＡＯＸ１の発現又は活性のマーカーを、組織の老化のさらなる指標としての１つ又は複数の臨床評価と組み合わせて決定又は測定できることを提供する。例えば、妊娠中の対象では、胎児の動きの変化、胎児の成長の測定、又は胎盤動脈、胎盤静脈、若しくは胎児の大脳動脈の修正ドップラー超音波検査（ａｌｔｅｒｅｄ  Ｄｏｐｐｌｅｒ  ｓｔｕｄｙ）などの臨床評価を、ＡＯＸ１の発現又は活性のマーカーと組み合わせて使用して、胎盤の老化、死産のリスク、死産を防止するための介入の必要性、及び胎盤の酸化ストレスを評価することができる。文脈に適切な臨床評価は、当業者が容易に決定することができる。
【００７２】
本開示は又、本開示の方法に従って使用するのに適したキットを提供する。そのようなキットには、例えば、本明細書に開示される識別バイオマーカー（ＡＯＸ１  ｍＲＮＡ、４ＨＮＥ、８ＨＯＧ、及び８ＯＨｄＧなど）の発現レベルを検出するための試薬を含む生物学的試料をアッセイするための予後キットが含まれる。本開示によるキットには又、緩衝液及び／又は希釈剤などの、本開示の方法を実施するために必要な他の構成要素も含まれ得る。キットには、典型的には、様々な構成要素を収容するための容器、及び本開示の方法でキットの構成要素を使用するための説明書が含まれる。
【００７３】
本開示は又、酸化損傷又は組織の老化を阻止するための治療薬の投与を企図する。いくつかの実施形態では、超未熟児のため出産が不可能である場合を含め、死産のリスクが高いと判明している妊娠中の胎盤の酸化損傷又は胎盤の老化の場合、妊娠中に適切な治療薬を投与することができる。理論に拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、胎盤が、９ヶ月の期間で独自に老化するヒト組織の老化の扱いやすいモデルを提供できることを示唆している。本明細書では、本発明者らは、アルツハイマー病及びハンチントン病などの老化疾患の変化に類似している胎盤の酸化ストレスマーカー及びリソソームの位置の変化を実証する（実施例を参照）。胎盤の老化と神経変性疾患における老化との間の酸化損傷及びリソソーム（ｌｙｓｏｓｙｍａｌ）分布の類似性は、これらの状態には同様の老化機構が存在し得ることを示唆している。したがって、本開示は、酸化ストレスによる老化、並びに酸化損傷が病因である疾患及び状態を、ＧＰＥＲ１アゴニスト又はラロキシフェンなどのＡＯＸ１阻害剤、及びＡＯＸ１の他の阻害剤又は本明細書で企図されるＧＰＥＲ１アゴニストの投与で防止する、遅延させる、又は処置することができることが本開示で企図される。
【００７４】
したがって、他の実施形態では、適切な治療薬を投与して、皮膚、腎臓、又は脳組織における老化及び酸化ストレス又は損傷を予防する、遅延させる、遅くする、遅らせる、又は処置することができる。そのような組織の酸化ストレス及び酸化損傷は、単に老化プロセスの結果であるか、又は他の様々な要因によって引き起こされる、加速される、又は悪化され得る。ほんの一例として、皮膚の酸化損傷及び老化は、日光への長時間の曝露又は日焼けに関連し得、腎臓の酸化損傷及び老化は、急性又は慢性の腎臓損傷又は腎臓疾患、喫煙及び薬物乱用、高血圧、脂質異常症、肥満、及び炎症性疾患に関連し得、且つ脳の酸化損傷及び老化は、脳外傷若しくは脳損傷、又は記憶喪失、アルツハイマー病、及びパーキンソン病などの神経変性状態と関連し得る。
【００７５】
本開示の方法によると、本開示に従って使用される治療薬には、例えば、限定されるものではないが、ラロキシフェン及びＧタンパク質共役受容体１（ＧＰＥＲ１）アゴニストを含む、ＡＯＸ１の阻害剤が含まれる。例えば、本開示の実施形態では、ＧＰＥＲ１のアゴニストを使用して、胎盤の酸化ストレスを低減又は予防することができる。本開示に従って使用されるＧＰＥＲ１の特に適切なアゴニストの１つは、Ｇ−１、（１−［４−（６−ブロモベンゾ［１，３］ジオキソール−５イル）−３ａ，４，５，９ｂ−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｃ］キノリン−８−イル］−エタノン）である。Ｇ−１は、高親和性ＧＰＥＲアゴニストとして作用する細胞透過性の非ステロイド系ジヒドロキノリン化合物である。
【００７６】
しかしながら、当業者であれば、本開示の範囲はそれほど限定されず、ＧＰＥＲ１受容体又はその下流経路を直接的又は間接的に活性化できるその他のＡＯＸ１阻害剤又は薬剤を使用できることを理解されよう。本開示の方法での使用にも適したＡＯＸ１の他の阻害剤には、例えば、タモキシフェン、エストラジオール、エチニルエストラジオール、フェノチアジン、三環系抗うつ薬、三環系非定型抗精神病薬、ジヒドロピリジンカルシウムチャネル遮断薬、ロラチジン、シクロベンザプリン、アモジアキン、マプロチリン、オンダンセトロン、プロパフェノン、ドンペリドン、キナクリン、ケトコナゾール、ベラパミル、タクリン、及びサルメテロールが含まれる。
【００７７】
ＧＰＥＲ１又はＡＯＸ１を標的とする治療化合物と組み合わせて、又はその代わりに使用できる追加の治療法には、抗酸化分子、化合物又は処置、例えばチオール、アスコルビン酸、又はフェノール（ポリフェノールなど）、スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、ペルオキシレドキシン、チオレドキシン、グルタチオン、カロテン、α−トコフェロール、レスベラトロール、及びフラボノイドが含まれる。
【００７８】
本開示の目的のために、投与用の治療薬を含む組成物は、当業者に周知の方法によって調製することができる。したがって、この組成物には、薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、及び／又はアジュバントが含まれ得る。担体、希釈剤、賦形剤、及びアジュバントは、組成物の他の成分と適合性であるという点から「許容可能」でなければならず、且つ組成物を摂取する対象にとって有害であってはならない。使用されるべき薬学的に許容され得る担体、希釈剤、賦形剤、及び／又はアジュバントは、この組成物の意図された投与経路次第であり得、当業者には周知であろう。組成物は、例えば、局所、経口、経鼻、若しくは他の粘膜経路、又は皮下、筋肉内、若しくは動脈内などの非経口を含む任意の便利な経路若しくは適切な経路を介して投与することができる。投与経路は、処置が行われる組織を含むいくつかの因子によって決まるであろう。同様に、組成物が投与される形態又はビヒクルは、処置が行われる組織を含む多くの因子によって決まるであろう。例示的な形態には、局所投与用の注射可能な溶液又は懸濁液、ローション、リニメント剤、ゲル、クリーム、軟膏、泡、油、及び粉末など、並びに経口投与用の錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、カシェ剤、顆粒、粉末、ゲル、ペースト、溶液、懸濁液、可溶性サシェ、カプレット、ロゼンジ、発泡錠、チュアブル錠、及び多層錠などが含まれ得る。
【００７９】
皮膚の老化又は皮膚の酸化損傷を処置する、予防する、遅くする、遅らせる、又は遅延させるための組成物の投与のための例示的な一実施形態では、本明細書に開示される適切なＡＯＸ１阻害剤又はＧＰＥＲアゴニストは、皮膚への局所適用のためにリニメント剤、ゲル、クリーム、軟膏、泡、又はオイルなどに製剤化することができる。そのような製剤は、皮膚に直接適用してもよいし、又は溶液槽に製剤を加えることによって適用してもよい。製剤は又、例えば、紫外線の影響を最小限にし、且つ／又は皮膚の保湿及び／若しくは修復を助けるために、日焼け止め、ビタミンＥ、又は他の適切な成分を含み得る。
【００８０】
薬学的に許容され得る担体、希釈剤、賦形剤、及びアジュバントの例には、限定されるものではないが、脱塩水又は蒸留水；食塩水；落花生油（ｐｅａｎｕｔ  ｏｉｌ）、サフラワー油、オリーブ油、綿実油、トウモロコシ油、ゴマ油、落花生油（ａｒａｃｈｉｓ  ｏｉｌ）、又はココナッツ油などの落花生油（ｐｅａｎｕｔ  ｏｉｌ）、サフラワー油、オリーブ油、綿実油、トウモロコシ油、ゴマ油などの植物由来の油；メチルポリシロキサン、フェニルポリシロキサン、及びメチルフェニルポリソルポキサンなどのポリシロキサンを含むシリコーン油；揮発性シリコーン；流動パラフィン、軟パラフィン、又はスクワランなどの鉱油；メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、又はヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのセルロース誘導体；低級アルカノール、例えばエタノール又はイソプロパノール；低級アラルカノール（ａｒａｌｋａｎｏｌ）；低級ポリアルキレングリコール又は低級アルキレングリコール、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、又はグリセリン；パルミチン酸イソプロピル、ミリスチン酸イソプロピル、又はオレイン酸エチルなどの脂肪酸エステル；ポリビニルピリドン；寒天；カラギーナン；トラガカントゴム又はアカシアゴム、及びワセリンが含まれる。
【００８１】
本明細書におけるあらゆる先行刊行物（若しくはそれに由来する情報）、又は既知のあらゆる事項への言及は、これらの先行刊行物（若しくはそれに由来する情報）又は既知のあらゆる事項が、本明細書に関する努力傾注分野における共通の一般知識の一部を構成するということの承認若しくは許可又は任意の形態の提案ではないし、そのようにみなされるべきものでもない。
【００８２】
ここで、本開示は、以下の特定の実施例を参照して説明するが、これらの実施例は、本開示の範囲を決して限定するとして解釈されるべきものではない。
【実施例】
【００８３】
以下の実施例は、本開示の例示であり、本明細書全体を通した記述の開示の一般的性質を決して限定するとして解釈されるべきものではない。
【００８４】
一般的な方法
組織の倫理、収集、及び処理
この研究は、Ｈｕｎｔｅｒ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ及びＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ，ＮＳＷ，Ａｕｓｔｒａｌｉａのヒト研究倫理委員会によって承認された。書面によるインフォームドコンセントを助産師が患者から得た後にヒト胎盤を採取した。胎盤は、正常経膣分娩の経験のある、以前に帝王切開を受けたために帝王切開により出産した妊娠３８〜３９週（満期）の女性、及び正常経膣分娩の経験のある、帝王切開により出産した妊娠４１週以上の女性、及び死産の経験のある、経膣分娩で出産した女性から採取した。胎盤を出産直後に採取し、遅滞なく処理した。絨毛組織を複数の部位から採取し、これを、組織学及びＲＮＡ抽出のために調製した。各胎盤について、胎盤の少なくとも５つの異なる領域及び絨毛膜板の下４〜５ｍｍから組織を得た。個々の胎盤からの試料を液体窒素下で直ちに凍結し、次の実験まで−８０℃で保存した。組織学実験のために、組織を２４時間２％ホルムアルデヒドで固定し、室温（ＲＴ）で５０％エタノールに保存し、パラフィンに包埋した。胎盤ロールを形成するために、膜に付着した少量の胎盤を維持しながら、胎盤の周辺から絨毛羊膜の２ｃｍのストリップを切り出した。ストリップをピンセットの周りに巻き付けて、円筒ロールの中心に残留胎盤を残した。次いで、円筒ロールを円筒軸に垂直に切断して、厚さ４ｍｍの切片を得た。次いで、組織をホルマリンで固定し、パラフィンブロックにマウントした。感染症、糖尿病、子癇前症、前置胎盤、子宮内発育遅延、又は早期剥離の患者の胎盤は除外した。
【００８５】
胎盤外植片の培養
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験では、選択的（計画的な繰り返しの）帝王切開後に、陣痛の症状を伴わない正常な単胎妊娠の女性からヒト満期胎盤（妊娠３８〜３９週）を得た。分娩直後に胎盤を採取し、外植片培養の準備をした。胎盤の絨毛組織を、胎盤の異なる領域及び絨毛膜板の下４〜５ｍｍからランダムにサンプリングした。滅菌条件下でダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）で組織を数回洗浄して、過剰な血液を除去した。約２ｍｍ3の絨毛外植片を切り出し、これらを、１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清（ＦＢＳ）が添加された、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１％Ｎａ−ピルビン酸、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（１００倍）溶液を添加した２５ｍｌのダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を含む１００×２０ｍｍ培養皿（３０片／皿）に置き、９５％空気（２０％酸素）及び５％ＣＯ2を維持しながら、３７℃の温度で２４時間細胞培養チャンバーで培養した。２日目に、絨毛外植片を新鮮な３０ｍｌの増殖培地に移し、細胞培養チャンバーで９０分間インキュベートした。この後、ＦＢＳを含まないＤＭＥＭ（「無血清培地」又は「成長因子欠損培地」と呼ばれる）で組織を洗浄した。次に、重さ約４００ｍｇの６〜７個の絨毛組織を、その後の最大２４時間のインキュベーションのために薬理作用のある物質、例えばラロキシフェン（１ｎＭ）及びＧＰＥＲ１アゴニストＧ１（１ｎＭ）を含む、又は含まない無血清培地６ｍｌを含む培養皿（６０×１５ｍｍ）に移した。２４時間の終わりに、いくつかの組織を２％ホルムアルデヒドで固定し、通常の組織学的処理を行い、パラフィンワックスに包埋し、一部の組織を直ちに液体窒素で凍結し、次の実験まで−８０℃で保存した。各胎盤外植片の培養について、試料を「０（ゼロ）」時間で、すなわち無血清培地でのインキュベーションの前に収集し、ホルマリン固定し、さらなる実験まで−８０℃で凍結保存した。
【００８６】
ウェスタンブロット法
ウェスタンブロット法は、Ｍａｉｔｉ，Ｋ  ｅｔ  ａｌ（２０１１，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１５２：２４４８−２４５５）に従って実施した。胎盤の試料（１ｇ）を液体窒素下で粉砕した。胎盤組織１００ｍｇのアリコートを１ｍＬの溶解緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００、０．１％Ｂｒｉｊ−３５、１×プロテアーゼ阻害剤、１×ホスファターゼ阻害剤、ｐＨ７．４）でホモジナイズした。各胎盤抽出物のタンパク質濃度を、ＢＣＡタンパク質測定キットを用いて測定し、４０μｇの胎盤抽出物をＮｕＰａｇｅ  ｂｉｓ−ｔｒｉｓプレキャスト１２ウェルゲルで電気泳動によって２００Ｖの定電圧で５０分間分離した。Ｎｏｖｅｘトランスファーシステムを７０分間使用して、分離したタンパク質をニトロセルロース膜に移し、０．１％ｔｗｅｅｎ−２０を含むトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳＴ）中の１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で一晩ブロックした。次いで、膜をＴＢＳＴ中の１％ＢＳＡで一次抗体とともに２時間インキュベートし、次いでＴＢＳＴで３回洗浄し、次いでＴＢＳＴ中の１％ＢＳＡでＨＲＰ結合二次抗体とともに１時間インキュベートした。ＴＢＳＴでさらに３回洗浄した後、Ｌｕｍｉｎａｔａ試薬で免疫反応性バンドを発生させ、Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  Ｄａｒｋ  Ｂｏｘ  ＬＡＳ−３０００  Ｉｍａｇｅｒ（Ｆｕｊｉ  Ｐｈｏｔｏ  Ｆｉｌｍ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて検出した。
【００８７】
母体血漿中の４ＨＮＥの検出
母体血漿中の４ＨＮＥタンパク質付加物の検出及び定量のために、本発明者らはＯｘｉＳｅｌｅｃｔ（商標）ＨＮＥ  Ａｄｄｕｃｔ  Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ，ＳＴＡ−８３８）を使用した。このアッセイは、ＨＮＥコンジュゲートとＨＮＥタンパク質に対する抗ＨＮＥ抗体との競合に基づいている。このアッセイでは、まず、ＨＮＥコンジュゲートをＥＬＩＳＡプレートにコーティングする。次いで、未知のＨＮＥタンパク質試料又はＨＮＥ−ＢＳＡ標準をＨＮＥコンジュゲート再吸収ＥＬＩＳＡプレートに加える。短時間のインキュベーション後、抗ＨＮＥ抗体を加え、続いて二次抗体（ＨＲＰコンジュゲート）を加える。未知の試料中のＨＮＥタンパク質付加物の量を、所定のＨＮＥ−ＢＳＡ標準曲線から推定した。
【００８８】
このアッセイでは、まず、ＨＮＥコンジュゲートを９６ウェルプレートにコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。ＨＮＥコンジュゲートを除去し、ウェルを１×ＰＢＳで２回すすいだ。アッセイ希釈液を各ウェルに添加し、室温で１時間ブロックし、次いで使用するまで４℃に移した。使用直前に、アッセイ希釈液を除去し、５０μｌの母体血漿試料及びＨＮＥ−ＢＳＡ標準を加えた。次いで、プレートをオービタルシェーカー上で室温で１０分間インキュベートした。希釈した抗ＨＮＥ抗体を各ウェルに添加し、オービタルシェーカー上で室温で２時間インキュベートした。次いで、プレートを１×洗浄緩衝液で３回洗浄し、各洗浄の間に完全に吸引した。希釈したＨＲＰコンジュゲート二次抗体をすべてのウェルに添加し、オービタルシェーカー上で室温で１時間インキュベートした。次いで、ストリップウェルを１×洗浄緩衝液でさらに３回洗浄した。基質溶液を各ウェルに添加し、オービタルシェーカー上で室温で２〜５分間インキュベートし、色の変化を監視した。停止溶液を各ウェルに添加して、酵素反応を停止させた。各ウェルの吸光度を、一次波長として４５０ｎｍを使用して、マイクロプレートリーダー（ＳＰＥＣＴＲＯｓｔａｒ  Ｎａｎｏ，ＢＭＧ  ＬＡＢＴＥＣＨ）で読み取った。未知の試料中のＨＮＥタンパク質付加物の含有量は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、所定のＨＮＥ−ＢＳＡ標準曲線との比較によって決定した。結果をグラフ化し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して統計分析を行った。
【００８９】
免疫組織化学
６μｍのパラフィン胎盤切片を脱パラフィンし、水和させ、次いで抗原回復のために電子レンジ内でトリス−ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ９）で加熱した。切片を、ＴＢＳＴ中の１％ＢＳＡで、室温で１時間ブロックした。切片を一次抗体とともに一晩インキュベートし、ＴＢＳＴで３回洗浄した後、Ａｌｅｘａコンジュゲート二次抗体とともに９０分間インキュベートした。切片を、ＤＡＰＩによる退色防止溶液でマウントした。図３〜図７、図９、及び図１１の蛍光写真は、Ｎｉｋｏｎ  ｅｃｌｉｐｓｅ  ９０ｉ共焦点顕微鏡で撮影した。図１０の蛍光写真は、Ｎｉｋｏｎ  ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｔｉ蛍光顕微鏡で撮影した。
【００９０】
ＲＮＡの単離及びリアルタイムＰＣＲ
胎盤組織を液体窒素下で粉砕した。約１００ｍｇの破砕した胎盤組織を、Ｕｌｔｒａ  Ｔｕｒｒａｘホモジナイザーによって２ｍｌのＴｒｉｚｏｌ試薬でホモジナイズした。全ＲＮＡを、Ｄｉｒｅｃｔ−ｚｏｌ（商標）ＲＮＡ  ＭｉｎｉＰｒｅｐによってＴｒｉｚｏｌ抽出物から抽出した。ＲＮＡをＤＮＡｓｅで処理し、ＲＮＡ  Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（商標）−５キットで精製した。ＤＮＡｓｅ処理試料を１×ＴＡＥ緩衝液中の臭化エチジウムを含むアガロースゲルで泳動することによってＲＮＡの品質を監視した。精製したＲＮＡを用いて、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍキットを使用してｃＤＮＡを作製した。このｃＤＮＡを使用して、アルデヒドオキシダーゼ１（ＡＯＸ１）のＴａｑｍａｎプライマー及び内部対照１８ｓリボソームＲＮＡを含むＴａｑｍａｎ遺伝子発現マスターミックスによってリアルタイムＰＣＲを実行し、ＡＯＸ１のｍＲＮＡを定量した。ＳｙＢｒグリーンマスターミックスを用いて、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ  ７５００  ＰＣＲシステムを使用して内部対照としてのβ−アクチンに対してＧタンパク質共役受容体１（ＧＰＥＲ１）のｍＲＮＡを定量した。
【００９１】
ＧＰＥＲ１プライマーは、５’−ＣＧＴＣＣＴＧＴＧＣＡＣＣＴＴＣＡＴＧＴ−３’（フォワード、配列番号１）及び５’−ＡＧＣＴＣＡＴＣＣＡＧＧＴＧＡＧＧＡＡＧＡＡ−３’（リバース、配列番号２）であった。ＡＯＸ１プライマーは、Ｔｈｅｒｍｏ−ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手した（ＣＡＴ：４３３１１８２、アッセイ番号：Ｈｓ００１５４０７９＿ｍ１）。ＡＯＸ１  ＴａｑＭａｎアッセイは、エクソン２７／２８境界で、ＮＭ＿００１１５９．３（本明細書では配列番号３）の３２７０の塩基から８４ｂｐのアンプリコンを検出するように設計した。
【００９２】
統計分析
個々の図面の説明文に試料数が示されている。図３、図４、図６、図９、及び図１２のデータを、マン・ホイットニー検定（二元配置（ｔｗｏ  ｗａｙ））を使用して分析し、結果を中央値又は標準誤差を示す散布図として示している。図１０及び図１１のデータは、ウィルコクソンマッチドペア符号付き順位検定を使用して分析した。すべてのｐ値は、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して計算した。
【００９３】
実施例１−死産のリスクと妊娠期間との関係
死産のリスクと妊娠期間との間の関係を例示するために、発明者らは、Ｏｍｉｇｂｏｄｕｎ  ａｎｄ  Ａｄｅｗｕｙｉ（１９９７，Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｍｅｄ  Ａｓｓｏｃ，８９：６１７）による医学的介入が比較的低いレベルの集団におけるヒトの妊娠期間についてのデータのカプランマイヤープロットを作成し、これを、Ｓｕｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０，Ｊ  Ｐｅｒｉｎａｔｏｌ，３０：３１１−３１８）による１０００の継続妊娠当たりの死産のリスクについてのデータと組み合わせた（図２）。このデータは、死産が、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９，Ｃｅｌｌ，９６：２９１−３０２）によって定義された老化原因と一致していることを示している。
【００９４】
実施例２−胎盤組織におけるＤＮＡ／ＲＮＡ及び脂質の酸化
酸化損傷が多くの老化組織で観察されているため、本発明者らは、ＤＮＡ／ＲＮＡ酸化のマーカーとして、８−ヒドロキシ−デオキシグアノシン／８−ヒドロキシグアノシン（８ＯＨｄＧ／８ＨＯＧ）によって測定される胎盤ＤＮＡ／ＲＮＡ酸化の証拠を探した。８ＯＨｄＧ／８ＨＯＧについて免疫組織化学（ＩＨＣ）を胎盤で行い、核／フレームでの８ＯＨｄＧ／８ＨＯＧ染色の平均強度が、出産予定日を超過した胎盤及び死産に関連する胎盤でのＤＮＡ／ＲＮＡ酸化の有意な増加を実証した（図３）。
【００９５】
ＤＮＡ酸化の増加は、脂質過酸化にもつながる可能性があるフリーラジカル損傷を示唆した。４−ヒドロキシノネナール（４ＨＮＥ）の生成によって測定される脂質過酸化はアルツハイマー病で増加することが観察されている（Ｍａｒｋｅｓｂｅｒｙ  ａｎｄ  Ｌｏｖｅｌｌ，１９９８，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ａｇｉｎｇ，１９：３３−３６）。したがって、本発明者らは、出産予定日を超過した胎盤組織、死産の胎盤組織、及び満期胎盤組織における４ＨＮＥについて免疫組織化学を行った。これにより、図４に示す死産に関連する胎盤でも観察された、出産予定日を超過した合胞体栄養細胞の４ＨＮＥ染色の顕著な増加が明らかになった。出産予定日を超過した胎盤及び死産の胎盤における高レベルの８ＯＨｄＧ／８ＨＯＧ及び４ＨＮＥは、これらの胎盤で胎盤の老化が起きた可能性があることを示唆している。
【００９６】
本発明者らは、早期出生、後期出産（出産予定日を超過した出産）、子癇前症、及び子宮内発育遅延（ＩＵＧＲ）の場合に、市販のＥＬＩＳＡキットを使用して母体血漿中の４ＨＮＥレベルも調べた。早期と比較した場合、出産予定日を超過した出産、子癇前症、及びＩＵＧＲのそれぞれの場合で、４ＨＮＥレベルが有意に高いことが判明した（図５）。出産予定日を超過した出産、子癇前症、及びＩＵＧＲはすべて、死産のリスクの増加と関連していることが知られている。
【００９７】
実施例３−出産予定日を超過した胎盤及び死産の胎盤におけるリソソームの移動とクラスター化
誤って折り畳まれたタンパク質及び損傷したミトコンドリアは、通常は、リソソームを含むタンパク質分解酵素とのオートファゴソーム融合を伴うプロセスにおいてオートファゴソームで再利用される。異常なタンパク質の蓄積、例えば、アルツハイマー病におけるタウ及びアミロイドタンパク質並びにハンチントン病における突然変異ｈｕｎｔｉｎの蓄積は、老化、特に脳の老化において役割を果たすと考えられている。ハンチントン病では、ニューロン内のリソソームの分布が変化し、リソソームの核周囲蓄積が増加する。本発明者らは、リソソームマーカーであるリソソーム関連膜タンパク質−２（ＬＡＭＰ２）を使用して、免疫組織化学によって胎盤のリソソームの分布を分析した。これは、満期胎盤の合胞体栄養細胞の頂端面に位置するリソソームを示したが（図６Ａ、図６Ｄ、及び図６Ｅ）、リソソームは、出産予定日を超過した胎盤及び死産の胎盤では核周囲面及び基底面に移動していた（図６Ｂ、図６Ｃ、図６Ｆ、及び図６Ｇ）。
【００９８】
現在のデータは、出産予定日を超過した胎盤及び死産に関連する胎盤の合胞体栄養細胞の核周囲面及び基底面におけるリソソームマーカーＬＡＭＰ２に陽性の粒子の顕著な蓄積を実証している。
【００９９】
実施例４−４ＨＮＥを含むより大きなオートファゴソームは、出産予定日を超過した胎盤及び死産に関連する胎盤に存在する
リソソームとの融合の失敗によるオートファゴソーム機能の阻害は、オートファゴソームのサイズの増加をもたらす。このプロセスは、アルツハイマー病、ダノン病、及び神経変性で見られるオートファジー機能全体の阻害につながる。現在の研究では、本発明者らは、ＬＣ３Ｂに対する抗体を用いた免疫組織化学を使用してオートファゴソームを検出した。オートファゴソームのサイズの有意な増加が、満期胎盤と比較して、出産予定日を超過した胎盤及び死産関連胎盤の両方で観察された（図７）。二重標識蛍光免疫染色により、出産予定日を超過した及び死産の胎盤のより大きなオートファゴソームが脂質過酸化の産物である４ＨＮＥを含むことが示された（図８）。
【０１００】
オートファジーは、酸性リソソームとオートファゴソームの融合を伴う。現在のデータは、死産の胎盤及び出産予定日を超過した胎盤が、満期胎盤よりも大きなオートファゴソームを含むことを示し、これらの胎盤における自己貪食プロセスの阻害を示唆している。これらのデータは、融合の失敗で、オートファゴソームが４ＨＮＥの形態の酸化脂質でコーティングされていることをさらに示している。オートファゴソームの機能におけるそのような障害は、異常なタンパク質の蓄積及び合胞体栄養細胞の機能の低下をもたらし得る。
【０１０１】
実施例５−胎盤の酸化損傷におけるアルデヒドオキシダーゼ１（ＡＯＸ１）の役割
当業者に周知の方法を使用して、本発明者らは、６つの満期胎盤及び６つの出産予定日を超過した胎盤から単離されたＲＮＡを配列決定した。ＲＮＡ配列決定データの分析により、胎盤で発現された２０１１１の遺伝子のうち、アルデヒドオキシダーゼ１（ＡＯＸ１）が満期胎盤と比較して出産予定日を超過した胎盤で有意に増加したことが示された（図９）。
【０１０２】
ＡＯＸ１は、４ＨＮＥを含む様々なアルデヒドを酸化して対応する酸及び過酸化物にするモリブドフラボ酵素（ｍｏｌｙｂｄｏｆｌａｖｏｅｎｚｙｍｅ）である。次いで、本発明者らは、ＡＯＸ１が、出産予定日を超過した胎盤及び死産関連胎盤で観察される４ＨＮＥの増加の生成に関与しているという仮説を検証した。二重標識蛍光ＩＨＣにより、ＡＯＸ１が、出産予定日を超過した胎盤（図１０Ａ〜図１０Ｃ）及び死産の胎盤（図１０Ｄ〜図１０Ｆ）において４ＨＮＥ陽性粒子に共局在することが示された。さらに、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＴａｑＭａｎアッセイＨｓ００１５４０７９＿ｍ１を使用したリアルタイムｑＰＣＲによって、出産予定日を超過した胎盤及び死産の胎盤が満期胎盤よりも有意に高いＡＯＸ１に対してｍＲＮＡを発現することが確認された（図１０Ｇ）。これらのデータは、ＡＯＸ１が、出産予定日を超過した胎盤及び死産関連胎盤で発生する酸化損傷に役割を果たし得るという概念を支持している。
【０１０３】
実施例６−胎盤外植片培養を用いた４ＨＮＥの産生の薬理学的阻害
現在のデータは、脂質酸化の増加、異常なリソソーム−オートファゴソーム相互作用、及び出産予定日を超過した胎盤及び死産の胎盤の合胞体栄養細胞でのＡＯＸ１発現の増加の明確な証拠を提供する。これらの事象に因果関係があるかどうかを判断するために、発明者らは無血清（成長因子欠乏）培地で培養された満期胎盤組織を用いる胎盤外植片培養系を開発した。ＩＨＣは、血清枯渇がインキュベーションの２４時間後に４ＨＮＥの産生を有意に増加させたことを示した（図１１Ａ及び図１１Ｂ）。オートファゴソームのサイズの有意な増加は、無血清培地での２４時間のインキュベーション後にも見られ（図１２Ａ及び図１２Ｂ）、死産の胎盤及び出産予定日を超過した胎盤で観察されるように、２４時間での酸化損傷によるオートファジーの阻害を示唆している。ＡＯＸ１のｍＲＮＡは２４時間で増加し、ＡＯＸ１の酸化損傷への関与を示唆した。
【０１０４】
本発明者らは、胎盤外植片を血清及びＡＯＸ１の非存在下で培養したときに観察された脂質酸化の発生間の因果関係を決定しようとした。ＧＰＥＲアゴニストＧ−１を使用して、アルデヒドオキシダーゼを阻害した。強力なＡＯＸ１阻害剤であるラロキシフェンも使用した。本発明者らが合胞体栄養細胞の頂端面上でのＧＰＥＲ発現を検出したため、Ｇ−１を選択し（図１１Ｃ及び図１１Ｄ）、ＧＰＥＲ１アゴニストは、腎臓における４ＨＮＥの産生を阻害することが示された（Ｌｉｎｄｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ，５８：６６５−６７１）。ラロキシフェン及びＧ−１は共に、２４時間の処置後に血清飢餓胎盤外植片での４ＨＮＥの産生を阻害し（図１１Ａ及び図１１Ｂ）、これらの組成物が、脂質の酸化損傷並びにオートファゴソームのサイズ及びリソソームの位置の異常も阻止できることを実証した（図１２）。
【０１０５】
実施例７−合胞体栄養細胞の頂端面上の細胞表面エストロゲン受容体ＧＰＥＲ１の存在
Ｇ−１は胎盤外植片培養において明らかな効果を有していたため、本発明者らは、胎盤組織におけるＧＰＥＲ１発現の特徴付けを行った。蛍光免疫組織化学によって検出された胎盤ロールの切片におけるＧＰＥＲ１の発現は、ＧＰＥＲ１が胎盤絨毛で発現することを示し（データは示していない）、より高い倍率（１００倍）では胎盤絨毛の頂端面に局在化していたが、満期の羊膜、絨毛膜、及び脱落膜は、ＧＰＥＲ１発現をほとんど示さなかった（データは示していない）。ＬＣ３Ｂに対する抗体を用いた蛍光免疫染色により、血清飢後の胎盤外植片におけるオートファゴソームのサイズの変化が示された（図１２）。
【０１０６】
ＧＰＥＲ１プライマーは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから供給された：ＧＰＥＲ１フォワードプライマー５’−ＣＧＴＣＣＴＧＴＧＣＡＣＣＴＴＣＡＴＧＴ−３’（配列番号１）及びＧＰＥＲ１リバースプライマー５’−ＡＧＣＴＣＡＴＣＣＡＧＧＴＧＡＧＧＡＡＧＡＡ−３’（配列番号２）。ＧＰＥＲ１のリアルタイムＰＣＲにより、胎盤絨毛が、羊膜、絨毛膜、及び脱落膜よりも有意に高いＧＰＥＲ１の発現を有することが示された（図１３Ａ）。ＧＰＥＲ１のウェスタンブロットにより、胎盤絨毛組織におけるＧＰＥＲ１のタンパク質レベルが羊膜、絨毛膜、及び脱落膜よりも高いことが確認された（図１３Ｂ）。
【０１０７】
合胞体栄養細胞頂端膜上の細胞表面エストロゲン受容体ＧＰＥＲの存在は新規の発見であり、この受容体が胎盤内の酸化損傷の調節において役割を果たし得ることを示唆している。過熟妊娠症候群の胎児を有する妊婦の尿は、正常な胎児を有する女性よりもエストロゲン：クレアチニン比が低いことが示されている（Ｒａｙｂｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ，６０：１４８−１５３）。これらのデータは、低エストロゲン濃度が、ＡＯＸ１のＧＰＥＲ媒介阻害の減少、並びに結果として胎盤の酸化損傷及び機能障害をもたらし得る可能性を支持している。
【０１０８】
実施例８−母体血中のＡＯＸ１  ｍＲＮＡの検出
胎児ＡＯＸ１  ｍＲＮＡが、当業者に周知の方法によって母体血で検出された。簡単に説明すると、母親の血液試料を、ＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ  Ｔｕｂｅで収集した。ＲＮＡの単離に使用するまで、血液試料を−３０℃で保存した。ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ｍｉＲＮＡ  Ｋｉｔ及び完全自動化ＲＮＡ単離システムＱＩＡｃｕｂｅ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、２．５ｍｌの母体全血試料中の全ＲＮＡを単離した。試料からのＲＮＡの品質は、バイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でＲＮＡ試料を泳動させることで確認した。２８Ｓと１８Ｓの１を超える比率の値は、全血から得られた良質のＲＮＡとみなした。ｃＤＮＡの調製に使用する前に、全ＲＮＡをＲＮＡｓｅフリーＤＮＡｓｅで処理した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、全ＲＮＡからｃＤＮＡを調製した。Ｔａｑｍａｎ遺伝子発現系、及び内部対照としてヒト１８ＳリボソームＲＮＡを用いる７５００  ａｐｐｌｉｅｄ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ  ＰＣＲマシンを使用して、ｃＤＮＡを用いてＡＯＸ１のｍＲＮＡを定量した。
【０１０９】
母体血中のＡＯＸ１  ｍＲＮＡの大部分は胎盤に由来するため、母体血のＡＯＸ１  ｍＲＮＡを、胎盤の酸化ストレスの指標として使用することができる。本発明者らは、満期の（３７〜３９週の妊娠期間が完了している）７人の母親の母体血ＡＯＸ１  ｍＲＮＡを測定し、死産となった２人の妊婦の血液試料を妊娠３１週及び３６週で測定した。ＡＯＸ１  ｍＲＮＡの平均量は、満期妊娠と比較して、死産の母体血で有意に増加していた（図１４）。
【０１１０】
実施例９−腎臓のアルデヒドオキシダーゼ媒介老化
２１歳の対象及び６６歳の対象からの腎臓組織を、アルデヒドオキシダーゼによって生成された酸化脂質のマーカーとして４ＨＮＥについて染色した。図１５に示されている結果は、アルデヒドオキシダーゼが、老化のマーカーである酸化損傷を腎臓に引き起こすことを実証している。したがって、アルデヒドオキシダーゼを発現する組織は、酸化損傷によって老化し得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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