(57)【要約】  一般的な抗生物質に対して耐性の細菌株を含むグラム陰性病原体によって引き起こされる感染症の処置において使用するための、抗菌ペプチドと抗生物質薬との治療的組み合わせが開示される。抗菌ペプチド及び抗生物質を含有する医薬調製物及び医薬組成物も開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の細菌種：Klebsiella pneumoniae、Pseudomonas aeruginosa及びAcinetobacter baumanniiの１つ以上によって引き起こされるヒト又は動物感染症の処置において使用するための、抗菌ペプチドＫＫＩＲＶＲＬＳＡ（配列番号１）、その類似体又は誘導体と、メロペネム、リファンピン、アズトレオナム及びトブラマイシンからなる群より選択される抗菌剤との組み合わせ。
【請求項２】
抗菌剤がメロペネム及びアズトレオナムから選択され、細菌種がPseudomonas aeruginosaである、請求項１に記載の使用のための組み合わせ。
【請求項３】
抗菌剤が、メロペネム、アズトレオナム、トブラマイシン及びリファンピンから選択され、細菌種がAcinetobacter baumanniiである、請求項１に記載の使用のための組み合わせ。
【請求項４】
抗菌剤が、リファンピンであり、細菌種がKlebsiella pneumoniaeである、請求項１に記載の使用のための組み合わせ。
【請求項５】
ａ）以下の細菌種：Klebsiella pneumoniae、Pseudomonas aeruginosa及びAcinetobacter baumanniiの１つ以上による感染症について陽性と診断された被験体由来の生体液又は生体組織のサンプルを提供すること；
ｂ）上記で定義されるような組み合わせに対する感染性株の反応性をin vitroで試験すること；
並びに
ｃ）該株の成長が該組み合わせによってin vitroで阻害される場合、前記組み合わせを該被験体に投与すること
を含む、感染症を処置する方法において使用するための、抗菌ペプチドＫＫＩＲＶＲＬＳＡ（配列番号１）、その類似体又は誘導体と、メロペネム、リファンピン、アズトレオナム及びトブラマイシンからなる群より選択される抗菌剤との組み合わせ。
【請求項６】
配列番号１の抗菌ペプチドが線状形態又はデンドリマー形態、特に二分枝若しくは四分枝形態である、請求項１〜５に記載の使用のための組み合わせ。
【請求項７】
配列番号１の全てのアミノ酸がＬ型又はＤ型のいずれかである、請求項１〜６に記載の使用のための組み合わせ。
【請求項８】
感染症が、前記細菌種の多剤耐性株又は超多剤耐性株によって引き起こされる、請求項１〜７に記載の使用のための組み合わせ。
【請求項９】
以下の細菌種：Klebsiella pneumoniae、Pseudomonas aeruginosa及びAcinetobacter baumanniiの１つ以上によって引き起こされるヒト又は動物感染症の処置方法において使用するための、配列番号１の抗菌ペプチド、その類似体又は誘導体と、メロペネム、リファンピン、アズトレオナム及びトブラマイシンからなる群より選択される抗菌剤とを別個の容器に含有するキットであって、該ペプチド及び該抗菌剤が、それを必要とする被験体に同時投与又は別個投与される、キット。
【請求項１０】
薬学的に許容し得る賦形剤と一緒に、配列番号１の抗菌ペプチド、その類似体又は誘導体と、メロペネム、リファンピン、アズトレオナム及びトブラマイシンからなる群より選択される抗菌剤とを含む、医薬組成物。
【請求項１１】
経口、非経口、エアロゾル又は局所投与に適切な形態である、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
錠剤、カプセル、注射用液、洗眼液、うがい薬、スプレー、エアロゾル、クリーム又は軟膏の形態である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
抗菌ペプチドが、０，５mg/kg〜５０mg/Kg、好ましくは３mg/Kg〜１５mg/Kgの範囲のその１日量を提供する投与量単位で分配される、請求項９に記載のキット又は請求項１０〜１２に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グラム陰性病原体によって引き起こされる感染症の処置において使用するための抗菌ペプチドと抗生物質薬との治療的組み合わせを提供する。治療的組み合わせは、一般的な抗生物質に耐性の細菌株に対して相乗活性を示した。本発明はさらに、適切な賦形剤と混合して、抗菌ペプチド及び抗生物質を含有する医薬調製物及び医薬組成物を提供する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
今日、全ての社会分野、すなわち科学界だけではなく公衆衛生機関及び政府によっても、新たな「前抗生物質」時代の世界的脅威が認識されている。多剤耐性（ＭＤＲ）及び超多剤耐性（ＸＤＲ）細菌病原体の拡散により、一般的な感染症でさえ、標準的な治療用抗生物質で処置不可能な症状に変わり得る［１−２］。
【０００３】
今日、この緊急の医学的必要性に向き合うために、多大な努力が向けられている。ＭＤＲ及びＸＤＲ病原体によって引き起こされる感染症をコントロールするために、新たな併用処置と共に、新たな抗生物質が必要とされている［３］。
【０００４】
ＳＥＴ−Ｍ３３は、近年広く研究されている抗菌ペプチド（ＡＭＰ）である［４−７］。それは、グラム陰性菌に対してin vitro及びin vivoで活性である一方、免疫原性［８］及び溶血活性を欠き、ヒト細胞及びマウスにおいて許容し得る毒性プロファイルを示す［９−１０］。現在、このＡＭＰは、ＭＤＲ及びＸＤＲグラム陰性感染症に対する新たな処置選択肢として開発されている。事実、ＳＥＴ−Ｍ３３は、嚢胞性線維症患者由来の分離株を含む多くのグラム陰性ＭＤＲ及びＸＤＲ臨床分離株に対して有効性を既に示し、バイオフィルムの根絶においても能力を示した［６］。
【０００５】
抗感染症化合物を組み合わせて、範囲を拡大し、治療転帰を改善し、さらには耐性の出現を減少させることは、抗菌化学療法における十分に確立された戦略である［１１−１３］。
【０００６】
以前の研究では、異なる抗菌剤と組み合わされたＡＭＰ、特にコリスチンの相乗活性がしばしば研究されている。コリスチンは、多くの場合、カルバペネム耐性K. pneumoniae及びグラム陰性非発酵菌を含むグラム陰性菌に対して、リファンピン及びカルバペネムとの相乗作用を示しており［２１−２３］、程度は低いがアズトレオナム、フルオロキノロン及びアミノグリコシドとの相乗作用を示している［２１、２４−２６］。主にリファンピン及びβ−ラクタムとの組み合わせでは、他のＡＭＰも相乗的であると報告されたのに対して［２０、２７−２８］、他の薬剤との相乗作用に関するデータは依然としてより限定的であるか、又は論争の的になっている［２９−３１］。
【０００７】
公知技術
国際公開公報第２００６／００６１９５号には、いくつかの細菌種に対して抗菌活性を示すペプチドＱＫＫＩＲＶＲＬＳＡ（Ｍ６）を含む抗菌ペプチドであって、減少した細胞毒性及び低い溶血速度を有する抗菌ペプチドが開示されている。ペプチドは線状形態であるか、又はポリアクリルアミド、デキストラン若しくはエチレングリコール単位の骨格で多量体化されており、好ましくは、ペプチドは、多抗原ペプチドの形態で提供される。
【０００８】
欧州特許出願公開第２３４４１７８号には、配列ＫＫＩＲＶＲＬＳＡ（これは、第１のアミノ酸Ｇｌｎを欠く国際公開公報第２００６／００６１２５号に開示されているＭ６ペプチドに対応する）を含む抗菌ペプチド配列が開示されている。ペプチドは、改善された安定性及びバッチ間均一性のほかに、良好な抗菌活性をもたらし、単量体又はデンドリマー構造、特に多抗原ペプチド形態で提供される。
【０００９】
国際公開公報第２０１０／０３８２２０号には、単量体又はデンドリマー構造、好ましくは多抗原ペプチド形態のＫＫＩＲＶＲＬＳＡペプチドを含む抗菌ペプチドが開示されている。
【００１０】
欧州特許出願公開第２５９５４９６号には、全てのアミノ酸がＤ型（Ｄ−Ｍ３３）であり、線状形態であるか、又はポリアクリルアミド、デキストラン若しくはグリコール単位の骨格で多量体化されていることを特徴とするペプチドＫＫＩＲＶＲＬＳＡが開示されている。
【発明の概要】
【００１１】
発明の説明
本発明では、標準的な治療用抗生物質と組み合わせて、グラム陰性病原体に対する抗菌活性について、ペプチドＳＥＴ−Ｍ３３（「Ｍ３３」とも称され、一文字アミノ酸コードによれば配列ＫＫＩＲＶＲＬＳＡを有する）をin vitroで評価した。
【００１２】
驚くべきことに、このペプチドは、グラム陰性病原体Klebsiella pneumoniae、Pseudomonas aeruginosa及びAcinetobacter baumanniiの多剤耐性株及び超多剤耐性株に対して、リファンピン、メロペネム、アズトレオナム及びトブラマイシンと組み合わせて相乗効果をもたらすことが見出された。
【００１３】
試験した株は全て、キノロン、アミノグリコシド及びβ−ラクタムを含む主要クラスの抗生物質に対して耐性表現型を示した。全ての株はカルバペネマーゼ産生株であり、K. pneumoniae、P. aeruginosa及びA. baumannii株は、それぞれＫＰＣ型酵素、メタロ−β−ラクタマーゼ（ＶＩＭ−１及びＩＭＰ−１３酵素）及びＯＸＡ−２４酵素をコードする。全ての株は、抗生物質耐性の蔓延において主要な役割を果たすことが公知の成功ハイリスククローンに属していた［１７］。
【００１４】
特に、試験した組み合わせは、コリスチン耐性株に対して有効であることが証明された。コリスチン及びＳＥＴ−Ｍ３３の共通の作用機序が以前に仮説されていたことを考慮すると［１０］、これはさらに驚くべきことである。
【００１５】
したがって、本発明の目的は、以下の細菌種：Klebsiella pneumoniae、Pseudomonas aeruginosa及びAcinetobacter baumanniiの１つ以上によって引き起こされるヒト又は動物感染症の処置において使用するための、抗菌ペプチドＫＫＩＲＶＲＬＳＡと、メロペネム、リファンピン、アズトレオナム及びトブラマイシンからなる群より選択される抗菌剤との治療的組み合わせを提供することである。
【００１６】
ペプチドＫＫＩＲＶＲＬＳＡは、例えばBrunetti J et al. In vitro and in vivo efficacy, toxicity, bio-distribution and resistance selection of a novel antibacterial drug candidate. Sci Rep. 2016; 6:26077. doi: 10.1038/srep26077に記載されているような公知の手順にしたがって調製され得る。それは、線状形態又は多量体形態、例えば欧州特許出願公開第２３４４１７８号及び国際公開公報第２０１０／０３８２２０号に記載されているようなデンドリマー形態、特に二分枝及び四分枝形態又は多抗原ペプチド形態で提供され得る。ＫＫＩＲＶＲＬＳＡペプチドに含まれるアミノ酸残基は、Ｌ型又はＤ型のいずれかであり得る；全てのアミノ酸がＤ型であるペプチドＫＫＩＲＶＲＬＳＡは、欧州特許出願公開第２５９５４９６号に記載されている。
【００１７】
好ましい一実施態様では、ペプチドＭ３３又はその類似体若しくは誘導体は、メロペネム及びアズトレオナムから選択される抗菌剤と組み合わされ、組み合わせは、細菌種Pseudomonas aeruginosaによって引き起こされる感染症の処置において使用される。
【００１８】
別の好ましい実施態様では、ペプチドＭ３３又はその類似体若しくは誘導体は、メロペネム、アズトレオナム、トブラマイシン及びリファンピンから選択される抗菌剤と組み合わされ、組み合わせは、細菌種Acinetobacter baumanniiによって引き起こされる感染症の処置において使用される。
【００１９】
さらに好ましい実施態様では、ペプチドＭ３３又はその類似体若しくは誘導体は、抗菌剤リファンピンと組み合わされ、組み合わせは、細菌種Klebsiella pneumoniaeによって引き起こされる感染症の処置において使用される。
【００２０】
感染個体の処置に最も有効なペプチドＭ３３と抗生物質との組み合わせを同定するために、前記個体由来の生物学的サンプルは、本発明の異なる組み合わせに対する反応性についてアッセイされ得る。したがって、さらなる実施態様では、本発明は、
１）以下の細菌種：Klebsiella pneumoniae、Pseudomonas aeruginosa及びAcinetobacter baumanniiの１つ以上による感染症について陽性と診断された被験体由来の生体液又は生体組織のサンプルを提供すること；
２）上記で定義されるような組み合わせに対する感染性株の反応性をin vitroで試験すること；
並びに、該株の成長が該組み合わせによってin vitroで阻害される場合、
３）前記組み合わせを該被験体に投与すること
を含む感染症を処置する方法において使用するための、上記で定義されるような組み合わせを提供する。
【００２１】
本発明はさらに、Klebsiella pneumoniae、Pseudomonas aeruginosa及びAcinetobacter baumanniiから選択される１つ以上のグラム陰性病原体によって引き起こされる感染症を処置するためのキットであって、薬学的に許容し得る担体及び賦形剤と一緒に、ペプチドＭ３３と、メロペネム、リファンピン、アズトレオナム及びトブラマイシンから選択される１つ以上の抗生物質とが別個の容器に含まれており、それを必要とする被験体への同時投与又は別個投与、例えば逐次投与のための適切な形態で提供されるキットを提供する。
【００２２】
本発明はさらに、薬学的に許容し得る賦形剤と一緒に、ペプチドＳＥＴ−Ｍ３３と、メロペネム、リファンピン、アズトレオナム及びトブラマイシンから選択される１つ以上の抗生物質薬とを含有する医薬組成物を提供する。医薬組成物は、経口、局所又は非経口投与に適切であり、それは、好ましくは、錠剤、カプセル、注射用液、洗眼液、うがい薬、スプレー、エアロゾル、クリーム又は軟膏の形態である。本発明の医薬組成物は、標準的な方法、例えばRemington’s Pharmaceuticals Sciences Handbook”, Mack Pub. Co., NY, USA, XVII edに記載されているものにしたがって製剤化され得る。本発明の組成物を製剤化するために使用され得る薬学的に許容し得る賦形剤は、特に、Handbook of Pharmaceuticals Excipients, American Pharmaceutical Association (Pharmaceutical Press; 6th Revised edition, 2009)に記載されている。
【００２３】
本発明のキット及び医薬組成物は、有効量のペプチド及び抗生物質薬を含有する。ペプチドＭ３３の適切な１日量は、０．５mg/Kg〜５０mg/Kg、好ましくは３mg/Kg〜１５mg/Kgの範囲である。一般に、抗生物質薬の量は標準治療の間隔内であり、使用される特定の分子、疾患の重症度及び処置すべき患者の一般的状態に依存するか、又はそれは、処置に対する患者の反応性に基づいて評価され得る。
【００２４】
以下の実験セクションは、本発明をさらに説明する。
【実施例】
【００２５】
実験セクション
材料及び方法
ペプチド合成
Syro multiple peptide synthesizer (MultiSynTech, Witten, Germany)を使用して、標準Ｆｍｏｃ化学による固相合成によって、ＳＥＴ−Ｍ３３を調製した。側鎖保護基は、Ｒについては２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル、Ｋについてはｔ−ブトキシカルボニル、及びＳについてはｔ−ブチルであった(Iris Biotech GmbH, Marktredwitz, Germany)。固体支持体から最終生成物を切断し、トリイソプロピルシラン及び水を含有するＴＦＡ（２．５／２．５／９５）による処理によって脱保護し、ジエチルエーテルで沈殿させた。Phenomenex Jupiter C18 analytical column (300 A, 250 x 4.6 mm)の逆相クロマトグラフィーによって、及び質量分析によって最終的なペプチドの純度及び同一性を確認した。
【００２６】
細菌株
６つの十分に特徴付けられている臨床株において、ＳＥＴ−Ｍ３３及び抗生物質の活性を評価した。耐性表現型及び遺伝子型にしたがって、株を選択した。各株の詳細な説明は、表に報告されている。
【００２７】
in vitro感受性試験
Clinical and Laboratory Standards Instituteのガイドライン［１４］にしたがって、標準ブロス微量希釈アッセイを使用して、ＭＩＣを決定した。
【００２８】
９６ウェルマイクロタイタープレート(Sarstedt, Inc., Newton, NC)中、カチオン調整ミューラー・ヒントンブロス（ＭＨＢ）を使用してチェッカーボード法［１５］を用いて、６つの各株について、組み合わせの抗菌活性を２回反復で評価した。最終容量 １００μlで５×１０４ＣＦＵ／ウェルの最終細菌接種材料を使用して、アッセイを実施した。３５℃における２０時間のインキュベーション後、結果を記録した。以下のようにEUCAST最終文書E.Def 1.2［１６］にしたがって、各抗生物質組み合わせの総分画阻害濃度（ΣＦＩＣ）を計算した：ΣＦＩＣ＝薬剤ＡのＦＩＣ＋薬剤ＢのＦＩＣ（式中、薬剤Ａ又はＢのＦＩＣは、他方の存在下における薬剤Ａ又はＢのＭＩＣを、薬剤Ａ又はＢのみのＭＩＣで割ったものである）。以下の定義にしたがって、結果を解釈した：≦０．５のΣＦＩＣは相乗作用を示し；＞０．５〜１のΣＦＩＣは相加性を示し；＞１〜＜２のΣＦＩＣは中立を示し；≧２のΣＦＩＣは拮抗作用を示した。
【００２９】
結果
利用可能である場合、EUCAST臨床ブレイクポイント［１９］にしたがって、ＳＥＴ−Ｍ３３のＭＩＣ値は４〜３２μg/mLで変動し、他の抗生物質のＭＩＣは常に耐性範囲内であった。
【００３０】
ＳＥＴ−Ｍ３３及びメロペネムは、６つの株の２つ（１つのP.aeruginosa及び１つのA.baumannii）では相乗的であり、残りの株では相加効果を示した。ＳＥＴ−Ｍ３３とリファンピンとの組み合わせについては、K.pneumoniae及びA.baumannii株を含む６つの株の３つで相乗効果が観察された。ＳＥＴ−Ｍ３３及びアズトレオナムは、P.aeruginosaの１つ及び両A.baumannii株で相乗作用を示した。トブラマイシンと組み合わせてＳＥＴ−Ｍ３３を使用した場合、A.baumannii株の１つで相乗作用が観察された（表）。シプロフロキサシンと組み合わせてＳＥＴ−Ｍ３３を使用した場合にのみ、相加性が観察された（示さず）。特に、拮抗効果は全く検出されなかった。
【００３１】
成長阻害をもたらす抗生物質組み合わせの分析により、ほとんどの場合、ＳＥＴ−Ｍ３３のＭＩＣ値はわずかに影響を受けたか（例えば、リファンピン、アズトレオナム及びトブラマイシンと組み合わせて相乗効果が存在する場合）、又は影響を受けなかった（効果が相加的又は中立的である場合）ことが明らかになった。他方、従来の抗生物質のＭＩＣ値は顕著に影響を受け、相乗効果の場合には１２８倍まで減少した（例えば、メロペネム及びリファンピンの場合）（表）。
【００３２】
興味深いことに、リファンピン又はアズトレオナムと組み合わせて、ＳＥＴ−Ｍ３３は、K.pneumoniaeのコリスチン耐性株に対してさえ相乗活性を示した。
【００３３】
【表１】
2020505463.tif 000002
2020505463.tif 000003
【００３４】
参考文献
【表２】
2020505463.tif 000004
2020505463.tif 000005
2020505463.tif 000006
2020505463.tif 000007
2020505463.tif 000008
【配列表】
2020505463000001.app
【国際調査報告】
2020505463.tif 000009
2020505463.tif 000010
2020505463.tif 000011