(57)【要約】  配列番号１〜１８４のうちのいずれか１つで表される癌特異的ネオエピトープ（ｎｅｏ−ｅｐｉｔｏｐｅ）、前記ネオエピトープが負荷された抗原提示細胞、及び前記抗原提示細胞によって癌治療のためのＴ細胞を活性化する方法に関する。本発明で提供する癌特異的エピトープが負荷された抗原提示細胞、すなわち、樹状細胞を介して癌抗原特異的なＴ細胞、好ましくは、メモリーＴ細胞の分化及び増殖を迅速で効果的に誘導することができ、このように活性化されたメモリーＴ細胞は、癌細胞の防御機序を避けて癌又は腫瘍性状態を治療するか、癌の再発、進行又は転移を予防することができる。【選択図】図１３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜１８４のうちのいずれか１つで表される癌特異的ネオエピトープ（ｎｅｏ−ｅｐｉｔｏｐｅ）。
【請求項２】
前記癌特異的ネオエピトープは、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、ＨＬＡ−Ｇ、β２−ミクログロブリン、ＨＬＡ−ＤＰＡ１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＡ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４、ＨＬＡ−ＤＲＢ５、ＨＬＡ−ＤＭ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、及びＨＬＡ−ＤＯＢ遺伝子座のうちの少なくとも１つと結合親和性を示すものである、請求項１に記載の癌特異的ネオエピトープ。
【請求項３】
前記癌特異的ネオエピトープは、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２、ＨＬＡ−Ａ＊Ａ０２０１、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３、ＨＬＡ−Ａ＊１１０１、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６、ＨＬＡ−Ａ＊３１０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５１０１、ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３、ＨＬＡ−Ｂ＊５４０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５８０１、及びＨＬＡ−Ｂ＊３５０１のうちの少なくとも１つと結合親和性を示すものである、請求項１に記載の癌特異的ネオエピトープ。
【請求項４】
前記癌は、エプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）陽性癌である、請求項１に記載の癌特異的ネオエピトープ。
【請求項５】
前記癌は、ＥＢＶ陽性胃癌、ＥＢＶ陽性子宮頸癌、ＥＢＶ陽性バーキットリンパ腫、ＥＢＶ陽性Ｔ細胞リンパ腫、ＥＢＶ陽性乳癌、ＥＢＶ陽性平滑筋肉腫（ｌｅｉｏｍｙｏｓａｒｃｏｍａｓ）、ＥＢＶ陽性平滑筋腫、ＥＢＶ陽性ホジキンリンパ腫、ＥＢＶ陽性非咽頭癌、又はＥＢＶ陽性移植後リンパ細胞増殖疾患（ＰＴＬＤ）である、請求項４に記載の癌特異的ネオエピトープ。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の癌特異的ネオエピトープをコードする、核酸分子。
【請求項７】
請求項６に記載の核酸分子が挿入された、発現ベクター。
【請求項８】
請求項７に記載の発現ベクターがトランスフェクトされた、宿主細胞。
【請求項９】
配列番号１〜１８４のうちのいずれか１つで表される癌特異的ネオエピトープを含む、Ｔ細胞の活性化用組成物。
【請求項１０】
前記Ｔ細胞は、癌の予防又は治療のためのものである、請求項９に記載のＴ細胞の活性化用組成物。
【請求項１１】
前記Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、γδＴ細胞、制御性Ｔ細胞、及びメモリーＴ細胞からなる群より選択される１種以上を含む、請求項９に記載のＴ細胞の活性化用組成物。
【請求項１２】
配列番号１〜１８４のうちのいずれか１つで表される癌特異的ネオエピトープが負荷（ｌｏａｄｉｎｇ）された、抗原提示細胞。
【請求項１３】
前記抗原提示細胞は、樹状細胞、Ｂ細胞、及びマクロファージのうちの１種以上を含む、請求項１２に記載の抗原提示細胞。
【請求項１４】
前記抗原提示細胞は、Ｔ細胞の増殖又は分化を促進する、請求項１３に記載の抗原提示細胞。
【請求項１５】
配列番号１〜１８４のうちのいずれか１つで表される癌特異的ネオエピトープ；及び樹状細胞特異的抗体又はその断片を含む、融合タンパク質。
【請求項１６】
前記樹状細胞特異的抗体は、樹状細胞のＤＣＩＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ４０、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＭＲＦ−４４、ＣＭＲＦ−５６、ＤＣＩＲ、ＤＣ−ＡＳＰＧＲ、ＣＬＥＣ−６、ＣＤ４０、ＢＤＣＡ−２、ＭＡＲＣＯ、ＤＥＣ−２０５、Ｃｌｅｃ９Ａ、３３Ｄ１、マンノース受容体、ランゲリン（Ｌａｎｇｅｒｉｎ）、ＤＥＣＴＩＮ−１、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＦＮ−γ受容体、ＩＬ−２受容体、ＩＣＡＭ−１、Ｆｃγ受容体、ＬＯＸ−１、又はＡＳＰＧＲに特異的な抗体である、請求項１５に記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
配列番号１〜１８４のうちのいずれか１つで表される癌特異的ネオエピトープが負荷された抗原提示細胞を製造する方法。
【請求項１８】
前記抗原提示細胞は、樹状細胞、Ｂ細胞、及びマクロファージのうちの１種以上を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗原提示細胞は、目的の個体の末梢血液由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から得られたものである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記負荷は、前記抗原提示細胞を前記癌特異的ネオエピトープと接触させて行われる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記負荷は、前記抗原提示細胞に前記癌特異的ネオエピトープをパルシング（ｐｕｌｓｉｎｇ）して行われる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記負荷は、前記癌特異的ネオエピトープをコードする核酸分子が挿入された発現ベクターを前記抗原提示細胞にヌクレオフェクション（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ）させて行われる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記負荷は、前記癌特異的ネオエピトープ；及び樹状細胞特異的抗体又はその断片を含む融合タンパク質を用いて行われる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の抗原提示細胞によって活性化されたＴ細胞。
【請求項２５】
請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の抗原提示細胞によってＴ細胞を活性化する方法。
【請求項２６】
前記方法は、前記Ｔ細胞を前記抗原提示細胞と共培養して行われる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記Ｔ細胞は、目的の個体の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から得られたものである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、γδＴ細胞、制御性Ｔ細胞、及びメモリーＴ細胞からなる群より選択される１種以上を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記共培養時、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）、又はこれらの組み合わせを添加して行われる、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記共培養時、サイトカイン及び兔疫グロブリン重鎖不変部を含む融合タンパク質を添加して行われる、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記サイトカインは、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、ＩＬ−１８、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、又は顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記共培養時、ＣＤ２７、ＣＸＣＲ３、又はＣＤ６２Ｌのリガンド；及び兔疫グロブリン重鎖不変部を含む融合タンパク質を添加して行われる、請求項２６に記載の方法。
【請求項３３】
請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の抗原提示細胞を有効成分として含む、癌の予防又は治療用薬学組成物。
【請求項３４】
前記癌は、エプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）陽性癌である、請求項３３に記載の薬学組成物。
【請求項３５】
請求項２４に記載の活性化されたＴ細胞を有効成分として含む、癌の予防又は治療用薬学組成物。
【請求項３６】
前記癌は、エプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）陽性癌である、請求項３５に記載の薬学組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌特異的ネオエピトープ（ｎｅｏ−ｅｐｉｔｏｐｅ）、前記ネオエピトープが負荷された抗原提示細胞、及び前記抗原提示細胞によって癌治療のためのＴ細胞を活性化する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
胃癌の発病は全世界的に、特にアジアで高い発病率を示す悪性腫瘍として知られている。胃癌の発病原因としては種々知られてきているが、代表的に、エプスタイン−バールウイルス（ｅｐｓｔｅｉｎ  ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ；ＥＢＶ）の感染によって現れるＥＢＶ−関連性胃癌と、胃腸細胞の遺伝子変異の蓄積によって発生する胃癌細胞抗原−関連性胃癌とに分類することができる。現在、胃癌に対する治療策は、長い時間の間癌組織の切開手術が最も効果的であると知られており、化学的療法及び放射線治療も行われているが、胃癌を初期に発見できなかった場合は完治が難しい疾病とされている。また、様々な生物学的製剤（抗体、ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）により臨床試験が進行しているが、まだ良い臨床的効果を示す治療剤は現れていない。
【０００３】
最近、患者由来の自己Ｔ細胞を用いた癌細胞特異的ターゲット治療方法が様々な機関で研究されてきており、キメラ抗原受容体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＣＡＲ）Ｔ細胞を用いたリンパ腫に対して様々な機関で臨床試験を行った結果、良好な臨床的効果と低い副作用により、抗癌治療への新たな分野として注目されてきている。
【０００４】
患者由来Ｔ細胞を用いると、細胞治療剤の最も大きな副作用である免疫反応の誘導が少なく、供与者のＨＬＡタイプに対する制限が無くなるので、効果的で副作用のない治療剤とされてきた。今のところ、抗癌治療分野で最も多く使用されている細胞治療剤の種類には、ＣＤ８＋  Ｔ細胞、ＣＤ４＋  Ｔ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、ＣＡＲ  Ｔ細胞が知られている。ＮＫ細胞の場合、細胞死滅効能を有しているが、抗原特異性がないため、様々な副作用があり、樹状細胞の場合には、直接的に細胞を死滅する機能がないのに対し、患者体内のＴ細胞に抗原特異性を伝達して高い効率でＴ細胞の癌細胞特異性を付与できるワクチン概念の治療剤である。また、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、抗原特異性により他の細胞に対して補助する役割を有しており、ＣＤ８＋Ｔ細胞の場合、抗原特異性及び細胞死滅効果が最も良い細胞として知られている。
【０００５】
しかし、今のところ使用又は開発されている細胞治療剤はほとんど限界があり、臨床的な効果が現れていないのが現状である。その限界をみると、癌細胞は、人体内の免疫反応を抑制する物質を自ら分泌するか、癌細胞に対する抗体の生成に必須な抗原を提示できないため、適切な免疫反応を起こせないようにする。
【０００６】
一方、樹状細胞は、人体の外部から入ってくるか、内部で発生する抗原を検知する監視者の役割を果たすだけでなく、このように認知し吸収した抗原をもって免疫器官（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｏｒｇａｎ）に迅速に移動し、抗原と反応するＴ細胞を含む免疫細胞に抗原を提示する、専門的な抗原提示細胞の役割を果たす。樹状細胞を用いた抗癌免疫治療ワクチンの場合、様々な方法により開発されてきており、生体外で生成された（ｅｘ  ｖｉｖｏ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ）樹状細胞ワクチンと、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）樹状細胞ワクチンとに大きく分けられる。生体内樹状細胞ワクチンの場合、体内に存在する樹状細胞に抗原を直接的に伝達する方式である。また、生体外で発生した樹状細胞ワクチン方法の場合、患者のＰＢＭＣから樹状細胞を分離し、分離された樹状細胞に提示する抗原を伝達し、これによって樹状細胞が活性化された後、さらに患者に注入し、注入された樹状細胞からＴ細胞へ抗原を伝達する方法である。この方式の場合には、生体外で樹状細胞の培養方法及び抗原伝達方式が重要であり、現在使用される抗原提示方法としては、提示する抗原のＤＮＡをウイルスやヌクレオフェクション（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ）を用いてトランスフェクションさせるか、樹状細胞を標的とする抗体に抗原を結合させて樹状細胞を標的とする抗原の伝達が使用されている。
【０００７】
現在、樹状細胞ワクチンの最も大きな問題点としては、体内の激しい慢性炎症現象、ワールブルク効果（Ｗａｒｂｕｒｇ  ｅｆｆｅｃｔ）、免疫抑制サイトカイン、免疫抑制Ｔ細胞及び樹状細胞などが存在する癌の微細環境中で効果的な抗癌兔疫細胞の活性化が極めて困難とされているという点である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の一つの目的は、エプスタイン−バールウイルス（ｅｐｓｔｅｉｎ  ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ；ＥＢＶ）陽性癌特異的ネオエピトープ（ｎｅｏｅｐｉｔｏｐｅ）とこれを含むＴ細胞活性化用組成物を提供しようとする。
【０００９】
本発明の他の目的は、本発明のネオエピトープが負荷されたもので、癌治療のためのＴ細胞を活性化させることができる抗原提示細胞を提供しようとする。
【００１０】
本発明のさらに他の目的は、本発明のネオエピトープが負荷された抗原提示細胞によって活性化されたＴ細胞を提供しようとする。
【００１１】
本発明のさらに他の目的は、癌治療のためにＴ細胞を活性化する方法を提供しようとする。
【００１２】
しかし、本発明がなそうとする技術的課題は以上に述べた課題に制限されず、述べていないさらに他の課題は、以下の記載から当業界における通常の知識を有する者に明確に理解されるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の一実施形態によれば、癌特異的エピトープ（ｔｕｍｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｅｐｉｔｏｐｅ）に関する。
【００１４】
本発明において、前記「癌特異的エピトープ」は、癌細胞にのみ存在し、正常細胞には存在しないタンパク質抗原に由来するものである。本発明において、前記癌特異的エピトープは、Ｔ細胞受容体によって認識される少なくとも１つのエピトープを含むもので、好ましくは、エプスタイン−バールウイルス（ｅｐｓｔｅｉｎ  ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ；ＥＢＶ）陽性癌細胞に存在するエピトープとして、前記ＥＢＶウイルスエピトープ又は癌細胞のエピトープを含むことができ、より好ましくは、エプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）陽性癌細胞の抗原であるエプスタイン−バールウイルス潜伏性膜タンパク質２（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ  ｌａｔｅｎｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ２、ＬＭＰ２ａ）、エプスタイン−バール核抗原１（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｎｕｃｌｅａｒ  ａｎｔｉｇｅｎ１、ＥＢＮＡ−１）、又はこれらのネオエピトープ（ｎｅｏｅｐｉｔｏｐｅ）であってもよい。
【００１５】
本発明において、前記「エプスタイン−バールウイルス潜伏性膜タンパク質２（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ  ｌａｔｅｎｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ２、ＬＭＰ２ａ）」は、すべてのＩＩ型及びＩＩＩ型疾患／悪性腫瘍で発現するいくつかのＥＢＶ遺伝子のうちの１つで、ＬＭＰ２ａは、Ｂ細胞−受容体信号伝達のネガティブ調節者として作用し、チロシンキナーゼの隔離（ｓｅｑｕｅｓｔｅｒｉｎｇ）による細胞生存を促進させる膜貫通タンパク質に相当する。ＨＬＡ−Ａ２制限ペプチドは、生体外の、個人の６０〜７５％から検出可能なエピトープ特異的細胞毒性Ｔリンパ球で、潜伏性疾患において最も免疫優性であるＬＭＰエピトープである。ＣＬＧＧＬＬＴＭＶペプチドは、エピトープがＮＰＣ及びＨＬ患者から検査した生検で保存され、その他ＥＢＶ潜在エピトープとともに、免疫学的に脆弱であるので、ＮＰＣ及びＨＬ治療に対する潜在的標的であると、長い間示されてきた。
【００１６】
本発明において、前記「エプスタイン−バール核抗原１（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｎｕｃｌｅａｒ  ａｎｔｉｇｅｎ１、ＥＢＮＡ−１）」は、エプスタイン−バールウイルスに関連する多機能性の二量体ウイルスタンパク質に相当する。これは、すべてのＥＢＶ−関連悪性腫瘍でのみ発見されるＥＢＶタンパク質に相当する。これは、細胞がＥＢＶに感染した時に伴う状態変形を維持するのに重要な役割をする。一方、ＥＢＮＡ−１は、タンパク質をアミノ及びカルボキシ末端ドメインに分けるグリシン−アラニン反復配列に相当する。このような配列は、タンパク質を安定化し、プロテアソーム関連分解を防止し、抗原プロセッシングとＭＨＣクラスＩ−制限的抗原発現を損なう役割をする。したがって、前記ＥＢＮＡ−１は、ウイルス感染した細胞に対するＣＤ８−制限的細胞傷害性Ｔ細胞の反応を抑制する。前記ＥＢＮＡ−１は、すべての潜伏性プログラム（ｌａｔｅｎｃｙ  ｐｒｏｇｒａｍｓ）でＱｐプロモーターによって発現し、潜伏性プログラムＩで唯一発現するウイルスタンパク質に相当する。
【００１７】
本発明において、前記「ネオエピトープ（ｎｅｏ−ｅｐｉｔｏｐｅ）」は、正常な非癌細胞又は生殖細胞のようなレファレンスでは存在しないが、癌細胞では発見されるエピトープを指す。
【００１８】
本発明において、前記ネオエピトープとしては、ヒトの血液から抽出されたＴ細胞、好ましくは、メモリーＴ細胞（ｍｅｍｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ）が効能を有し得るように、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、ＨＬＡ−Ｇ、β２−ミクログロブリン、ＨＬＡ−ＤＰＡ１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＡ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４、ＨＬＡ−ＤＲＢ５、ＨＬＡ−ＤＭ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、及びＨＬＡ−ＤＯＢ遺伝子座のうちの少なくとも１つと結合親和性を示すことができ、なかでも、韓国人にとって最も多く発現しているＨＬＡタイプとして、例えば、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２、ＨＬＡ−Ａ＊Ａ０２０１、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３、ＨＬＡ−Ａ＊１１０１、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６、ＨＬＡ−Ａ＊３１０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５１０１、ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３、ＨＬＡ−Ｂ＊５４０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５８０１、及びＨＬＡ−Ｂ＊３５０１のうちの少なくとも１つと高い結合親和性を示すものであってもよい。
【００１９】
好ましくは、本発明において、前記ネオエピトープとしては、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２に対して高い結合親和性を有するもので、配列番号１〜１５１のうちのいずれか１つで表されるペプチドであるＬＭＰ２ａ抗原のネオエピトープであってもよく；又はＨＬＡ−Ａ＊３１０１に対して高い結合親和性を有するもので、配列番号１５２〜１８４のうちのいずれか１つで表されるペプチドであるＥＢＮＡ−１抗原のネオエピトープであってもよい。
【００２０】
ただし、本発明において、前記ネオエピトープ−ＨＬＡ親和性を測定する方法としては、ネオエピトープが特定のＨＬＡ対立形質に結合するかを予測するためにＮｅｔＭＨＣ３．４（ＵＲＬ：ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＭＨＣ−３．４／）を用いることができるが、これに制限されるわけではない。
【００２１】
本発明において、前記「ＨＬＡ」又は「ヒト白血球抗原」は、免疫系の調節の原因になる細胞の表面上でＭＨＣ（主組織適合性複合体）タンパク質をコードするヒト遺伝子を表す。「ＨＬＡ−Ｉ」又は「ＨＬＡクラスＩ」は、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、ＨＬＡ−Ｇ、及びβ２−ミクログロブリン遺伝子座を含むヒトＭＨＣクラスＩ遺伝子を表す。「ＨＬＡ−ＩＩ」又は「ＨＬＡクラスＩＩ」は、ＨＬＡ−ＤＰＡ１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＡ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４、ＨＬＡ−ＤＲＢ５、ＨＬＡ−ＤＭ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、及びＨＬＡ−ＤＯＢ遺伝子座を含むヒトＭＨＣクラスＩＩ遺伝子を表す。
【００２２】
本発明において、前記癌としては、エプスタイン−バールウイルス（ｅｐｓｔｅｉｎ  ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ；ＥＢＶ）陽性癌、ＥＢＶ陽性胃癌、ＥＢＶ陽性子宮頸癌、ＥＢＶ陽性バーキットリンパ腫（Ｂｕｒｋｉｔｔ’ｓ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）、ＥＢＶ陽性Ｔ細胞リンパ腫（Ｔ  ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａｓ）、ＥＢＶ陽性乳癌、ＥＢＶ陽性平滑筋肉腫（ｌｅｉｏｍｙｏｓａｒｃｏｍａｓ）、ＥＢＶ陽性平滑筋肉腫、ＥＢＶ陽性ホジキンリンパ腫（Ｈｏｄｇｋｉｎ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）、ＥＢＶ陽性非咽頭癌、又はＥＢＶ陽性移植後リンパ細胞増殖疾患（ＰＴＬＤ）であってもよいが、好ましくは、ＥＢＶ陽性胃癌である。
【００２３】
本発明の他の実施形態によれば、本発明で提供する癌特異的エピトープ（ｔｕｍｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｅｐｉｔｏｐｅ）で、好ましくは、エプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）陽性癌細胞の抗原であるＬＭＰ２ａ又はＥＢＮＡ−１のネオエピトープ（ｎｅｏｅｐｉｔｏｐｅ）をコードする核酸分子に関する。
【００２４】
本発明の核酸分子は、当業者に知られているように、本発明で提供するポリペプチドのアミノ酸配列を、ポリヌクレオチド配列に翻訳された核酸分子のすべてを含む。そのため、ＯＲＦ（ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ）による多様なポリヌクレオチド配列が製造可能であり、これもすべて本発明の核酸分子に含まれる。
【００２５】
本発明のさらに他の実施形態によれば、本発明で提供する前記単離された核酸分子が挿入された発現ベクターを提供する。
【００２６】
本発明において、前記「ベクター」は、ある核酸分子が連結された他の核酸を輸送できる前記核酸分子である。ベクターの一つの類型は、追加的なＤＮＡセグメントがライゲーションされ得る円形の二重鎖ＤＮＡを指す「プラスミド」である。他の類型のベクターは、ファージベクターである。さらに他の類型のベクターは、ウイルス性ベクターで、追加的なＤＮＡセグメントがウイルスゲノムにライゲーションされ得る。あるベクターは、それらが導入された宿主細胞で自律的な複製を行うことができる（例えば、バクテリア性ベクターはバクテリア性複製起点を有するエピソーム哺乳類ベクター）。その他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞に導入されて宿主細胞のゲノムに統合され、それによって、宿主ゲノムとともに複製される。それだけでなく、あるベクターは、これらが作動レベルで連結された遺伝子の発現を指示することができる。このようなベクターは、本願において「組換え発現ベクター」又は単に「発現ベクター」と名付けられる。一般的に、組換えＤＮＡ手法で有用な発現ベクターは、たびたびプラスミドの形態で存在する。本明細書において、「プラスミド」と「ベクター」は、プラスミドがベクターのうち最も通常使用される形態であるため、相互交換して使用可能である。
【００２７】
本発明において、前記発現ベクターの具体的な例としては、商業的に広く使用されるｐＣＤＮＡベクター、Ｆ、Ｒ１、ＲＰ１、Ｃｏｌ、ｐＢＲ３２２、ＴｏＬ、Ｔｉベクター；コスミド；ラムダ、ラムドイド（ｌａｍｂｄｏｉｄ）、Ｍ１３、Ｍｕ、ｐ１  Ｐ２２、Ｑμ、Ｔ−ｅｖｅｎ、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ７などのファージ；植物ウイルスからなる群より選択されるが、これに制限されるわけではなく、当業者に発現ベクターとして知られたすべての発現ベクターは本発明に使用可能であり、発現ベクターを選択する際には、目的の宿主細胞の性質による。宿主細胞へのベクターの導入時、リン酸カルシウムトランスフェクション、ウイルス感染、ＤＥＡＥ−デキストラン調節トランスフェクション、リポフェクタミントランスフェクション、又は電気穿孔法によって行われるが、これに限定されるものではなく、当業者は使用する発現ベクター及び宿主細胞に適した導入方法を選択して用いることができる。好ましくは、ベクターは、１つ以上の選別マーカーを含有するが、これに限定されず、選別マーカーを含まないベクターを用いて生産物の生産有無によって選別が可能である。選別マーカーの選択は、目的の宿主細胞によって選別され、これは、すでに当業者に知られた方法を利用するので、本発明はこれに制限を置かない。
【００２８】
本発明の核酸分子を、精製を容易にするためにタグ配列を発現ベクター上に挿入して融合させることができる。前記タグとしては、ヘキサヒスチジンタグ、ヘマグルチニンタグ、ｍｙｃタグ、又はｆｌａｇタグを含むが、これに限定されるものではなく、当業者に知られた精製を容易にするタグはすべて本発明で利用可能である。
【００２９】
本発明のさらに他の実施形態によれば、本発明で提供する前記発現ベクターがトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。
【００３０】
本発明において、前記「宿主細胞」には、ポリペプチド挿入物の組込みのためのベクターの受取者（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）であるか、受取者であった個別的な細胞又は細胞培養物が含まれる。宿主細胞には単一宿主細胞の子孫が含まれ、前記子孫は、自然的な、偶発的な又は故意の突然変異のため、必ずしも元の母細胞と完全に同一（形態学上又はゲノムＤＮＡ補完体において）でないことがある。宿主細胞には本願のポリペプチドで体内に形質注入された細胞が含まれる。
【００３１】
本発明において、前記宿主細胞としては、哺乳動物、植物、昆虫、菌類、又は細胞性起源の細胞を含むことができ、例えば、大腸菌、ストレプトマイセス、サルモネラ・ティフィムリウムなどのバクテリア細胞；酵母細胞、ピキア・パストリスなどの菌類細胞；ショウジョウバエ、スポドプテラＳｆ９細胞などの昆虫細胞；ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞、Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ  ｃｅｌｌｓ）、ＳＰ２／０（マウス骨髄腫）、ヒトリンパ芽球（Ｈｕｍａｎ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ）、ＣＯＳ、ＮＳＯ（マウス骨髄腫）、２９３Ｔ、ＢＯＷメラノーマ細胞、ＨＴ−１０８０、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓細胞、Ｂａｂｙ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｋｉｄｎｅｙ  ｃｅｌｌｓ）、ＨＥＫ（ヒト胚腎臓細胞、Ｈｕｍａｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｋｉｄｎｅｙ  ｃｅｌｌｓ）、又はＰＥＲＣ．６（ヒト網膜細胞）の動物細胞；又は植物細胞であってもよいが、これに制限されるわけではなく、当業者に知られた宿主細胞として使用可能な細胞はすべて利用可能である。
【００３２】
本発明のさらに他の実施形態によれば、本発明で提供する癌特異的エピトープ（ｔｕｍｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｅｐｉｔｏｐｅ）、これをコードする核酸分子、前記核酸分子が挿入された発現ベクター又は前記発現ベクターが形質転換された宿主細胞を含むＴ細胞の活性化用組成物に関する。
【００３３】
本明細書で使用されるように、「Ｔ細胞の活性化」は、少なくとも１つの腫瘍抗原ペプチドを認識するＴ細胞受容体を有する、単クローン（例えば、同一のＴＣＲをコードする）又は多クローン（例えば、相異なるＴＣＲをコードするクローンを有する）Ｔ細胞集団を称する。活性化されたＴ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、γδＴ細胞、制御性Ｔ細胞、及びメモリーＴ細胞からなる群より選択される１種以上を含むが、これに限定されないＴ細胞の１つ以上の亜型を含有することができるが、好ましくは、メモリーＴ細胞（ｍｅｍｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ）である。
【００３４】
本発明において、前記活性化されたＴ細胞は、癌細胞の防御機序を避けて癌又は腫瘍性状態を治療するか、癌の再発、進行又は転移を予防することができる。
【００３５】
本発明のさらに他の実施形態によれば、本発明で提供する癌特異的エピトープ（ｔｕｍｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｅｐｉｔｏｐｅ）が負荷（ｌｏａｄｉｎｇ）された抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ、ＡＰＣ）であってもよい。
【００３６】
本発明において、前記抗原提示細胞は、樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ、ＤＣ）、Ｂ細胞、及びマクロファージのうちの１種以上を含むことができるが、好ましくは、樹状細胞である。
【００３７】
本発明において、前記「樹状細胞」は、リンパ性又は非リンパ性組織で発見される形態学的に類似する細胞類型の多様な集団の構成員である。このような細胞は、これら独特の形態、及び抗原ペプチドをＴ細胞に提示するタンパク質である表面クラスＩ及びクラスＩＩ  ＭＨＣ分子の高い発現水準を特徴とする。ＤＣ、他のＡＰＣ及びＴ細胞は、末梢血液に由来する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のように、都合的には末梢血液から、そして多数の組織供給源から単離されるか、それらに由来すること（例えば、分化）ができる。
【００３８】
本発明において、前記抗原提示細胞は、癌抗原特異的なＴ細胞、好ましくは、メモリーＴ細胞の分化及び増殖を誘導することで癌細胞の防御機序を避けて癌又は腫瘍性状態を治療するか、癌の再発、進行又は転移を予防することができる。
【００３９】
本発明のさらに他の実施形態によれば、本発明で提供する癌特異的エピトープ（ｔｕｍｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｅｐｉｔｏｐｅ）；及び樹状細胞特異的抗体又はその断片を含む融合タンパク質に関する。
【００４０】
本発明で提供する融合タンパク質は、樹状細胞に本発明で提供する癌特異的エピトープが負荷できるようにする。
【００４１】
本発明において、前記樹状細胞特異的抗体としては、樹状細胞のＤＣＩＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ４０、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＭＲＦ−４４、ＣＭＲＦ−５６、ＤＣＩＲ、ＤＣ−ＡＳＰＧＲ、ＣＬＥＣ−６、ＣＤ４０、ＢＤＣＡ−２、ＭＡＲＣＯ、ＤＥＣ−２０５、Ｃｌｅｃ９Ａ、３３Ｄ１、マンノース受容体、ランゲリン（Ｌａｎｇｅｒｉｎ）、ＤＥＣＴＩＮ−１、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＦＮ−γ受容体、ＩＬ−２受容体、ＩＣＡＭ−１、Ｆｃγ受容体、ＬＯＸ−１、又はＡＳＰＧＲに特異的な抗体であってもよいが、これに制限されるわけではない。
【００４２】
本発明の融合タンパク質において、前記癌特異的エピトープは、前記樹状細胞特異的抗体又はその断片にコンジュゲートされたものであってもよい。ここで、前記「コンジュゲート（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）」は、２つの部分を一緒に結合させて形成された任意の物質をいう。本発明に係る代表的な接合体は、抗原と抗体及びＴＬＲ効能剤を一緒に結合させて形成されたものを含む。用語「コンジュゲーション（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）」は、接合体を形成する工程をいい、一般的に、物理的カップリング、例えば、共有結合、同時−配位共有結合、又は第２結合力、例えば、ファンデルワールス結合力（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａａｌｓ  ｂｏｎｄｉｎｇ  ｆｏｒｃｅ）をいう。抗原を抗体に連結させる工程はさらに、ドックリン−コヘシン連合（ｄｏｃｋｅｒｉｎ−ｃｏｈｅｓｉｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）のような非共有結合性連合［（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ）らの米国特許公報第２０１００１３５９９４号、本願に参照として引用された部分に関連する］により、又はペプチド又は化学的結合を形成することで直接的な化学的連結によって行われる。
【００４３】
本発明のさらに他の実施形態によれば、本発明で提供する癌特異的エピトープ（ｔｕｍｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｅｐｉｔｏｐｅ）が負荷された抗原提示細胞（Ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ）を製造する方法に関する。
【００４４】
本発明において、前記抗原提示細胞は、樹状細胞、Ｂ細胞、及びマクロファージのうちの１種以上を含むことができるが、好ましくは、樹状細胞であってもよい。
【００４５】
本発明において、前記樹状細胞（例えば、未成熟樹状細胞）は、自己供給源、すなわち、目的の個体由来を含む多様な供給源から得ることができ、好ましくは、末梢血液由来の末梢血単核細胞（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ、ＰＢＭＣ）から得られ、より好ましくは、個体由来ＰＢＭＣから単核球を分離して複数のサイトカインと接触させることで得られる。ここで、前記単核球の樹状細胞への分化を誘導するサイトカインの種類は特に制限されないが、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４のうちの１種以上を含むことができる。
【００４６】
本発明において、前記「目的の個体」とは、癌が発病したか、発病の可能性が高い個体を意味する。
【００４７】
本発明において、前記のように抗原提示細胞が用意されると、前記抗原提示細胞に本発明の癌特異的エピトープを負荷することができる。一般的に、未成熟樹状細胞は、食作用や受容体を介した細胞内取込み（エンドサイトーシス）により抗原を捕獲して、細胞内の一連の過程により抗原を加工後、ＭＨＣに抗原ペプチドを積載してＴリンパ球に提示する。抗原を加工する過程とともに、樹状細胞は次第に成熟して食作用とエンドサイトーシスに使用される受容体を失い、ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  Ｉ、ＩＩ、補助刺激分子、細胞癒着分子の発現が増加し、新たなケモカイン受容体を発現して周辺リンパ節のＴリンパ球がリッチな地域に移動してＴリンパ球に抗原を提示することにより、Ｔリンパ球免疫反応を起こす。
【００４８】
本発明の一例として、前記癌特異的エピトープを前記抗原提示細胞に負荷するためには、前記抗原提示細胞を本発明の癌特異的エピトープと接触させることができ、好ましくは、前記抗原提示細胞として、例えば、未成熟樹状細胞、又はＰＢＭＣに含まれるか、これに由来する（例えば、分化した）抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）に本発明の前記癌特異的エピトープをパルシング（ｐｕｌｓｉｎｇ）するステップを行うことができる。本技術分野で知られているように、パルシングは、細胞、例えば、樹状細胞を、本発明の癌特異的エピトープペプチドを含有する溶液と混合し、次いで、任意に混合物から前記癌特異的エピトープを除去する工程を表す。本発明では、前記未成熟樹状細胞を癌特異的エピトープと接触させる際に、Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ受容体作用剤を処理して未成熟樹状細胞の集団の成熟を追加的に誘導することができる。この時、例示的なＴＬＲ作用剤には、Ｐｏｌｙ  ＩＣ、ＭＡＬＰ、及びＲ８４８が含まれるが、これに限定されない。
【００４９】
本発明の他の例として、前記癌特異的エピトープを前記抗原提示細胞に負荷するためには、前記癌特異的エピトープをコードする核酸分子が挿入された発現ベクター、好ましくは、プラスミドで前記抗原提示細胞をヌクレオフェクション（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ）させることができる。ここで、前記ヌクレオフェクションの際、例えば、Ａｍａｘａ（登録商標）ヌクレオフェクションシステム又はＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）ヌクレオフェクションシステムを含む、本分野における何らかの有用な手段によって発生することができる。
【００５０】
本発明のさらに他の例として、前記癌特異的エピトープを前記抗原提示細胞に負荷するためには、本発明で提供する前記癌特異的エピトープ；及び樹状細胞特異的抗体又はその断片を含む融合タンパク質を用いて行われる。
本発明のさらに他の実施形態によれば、本発明で提供する抗原提示細胞によって活性化されたＴ細胞に関する。
【００５１】
本発明において、前記Ｔ細胞は、腫瘍抗原ペプチドを認識するＴ細胞受容体を有する、単クローン（例えば、同一のＴＣＲをコードする）又は多クローン（例えば、相異なるＴＣＲをコードするクローンを有する）Ｔ細胞集団を称するもので、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、γδＴ細胞、制御性Ｔ細胞、及びメモリーＴ細胞からなる群より選択される１種以上を含むことができ、これに限定されないＴ細胞の１つ以上の亜型を含有することができるが、好ましくは、メモリーＴ細胞であってもよい。
【００５２】
本発明において、前記「メモリーＴ細胞（ｍｅｍｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ）」は、これらの特異的抗原と前に遭遇して反応したＴ細胞又は活性化されたＴ細胞から分化したＴ細胞である。腫瘍特異的メモリーＴ細胞は、Ｔ細胞総量の小さい部分を構成するが、これらは、個人の全体寿命の間に腫瘍細胞の監視に重要な機能を行う。腫瘍特異的メモリーＴ細胞がこれらの特定腫瘍抗原を発現する腫瘍細胞に遭遇すれば、メモリーＴ細胞は直ちに活性化されてクローン増殖（ｃｌｏｎａｌｌｙ  ｅｘｐａｎｄｅｄ）する。活性化され増殖されたＴ細胞は、エフェクターＴ細胞に分化して、高効率で腫瘍細胞を殺す。メモリーＴ細胞は、Ｔ細胞の臓器腫瘍抗原特異的反応を確立し維持するのに重要である。本発明において、活性化されたＴ細胞、好ましくは、活性化されたメモリーＴ細胞は、癌細胞の抗原を特異的に認識して、癌細胞の防御機序を避けて癌又は腫瘍性状態を治療するか、癌の再発、進行又は転移を予防することができる。
【００５３】
本発明のさらに他の実施形態によれば、本発明で提供する抗原提示細胞（Ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ、ＡＰＣ）によってＴ細胞を活性化する方法に関する。
【００５４】
本発明では、前記Ｔ細胞の活性化のためには、前記Ｔ細胞を本発明の癌特異的エピトープが負荷された抗原提示細胞と共培養することができる。
【００５５】
本発明において、前記Ｔ細胞は、自己供給源、すなわち、目的の個体由来を含む多様な供給源から得ることができ、好ましくは、末梢血液由来の末梢血単核細胞（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ、ＰＢＭＣ）から得られ、より好ましくは、前記末梢血単核細胞の非付着性部分から得ることができる。本発明の一例として、前記ＰＢＭＣの非付着性部分を末梢血液サンプルの密度勾配遠心分離によって得ることができ、これを抗ＣＤ３抗体（例えば、ＯＫＴ３）がある又はない状態で、少なくとも１つのサイトカイン（例えば、ＩＬ−２）と一緒に培養して得ることができる。
【００５６】
本発明において、前記Ｔ細胞は、腫瘍抗原ペプチドを認識するＴ細胞受容体を有する、単クローン（例えば、同一のＴＣＲをコードする）又は多クローン（例えば、相異なるＴＣＲをコードするクローンを有する）Ｔ細胞集団を称するもので、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、γδＴ細胞、制御性Ｔ細胞、及びメモリーＴ細胞からなる群より選択される１種以上を含むことができ、これに限定されないＴ細胞の１つ以上の亜型を含有することができるが、好ましくは、メモリーＴ細胞であってもよい。
【００５７】
また、本発明において、前記Ｔ細胞及び前記抗原提示細胞は、同一の個体、例えば、癌、好ましくは、ＥＢＶ陽性癌に罹患している個体（例えば、低等級から中間等級の癌）に由来できるが、これに制限されるわけではない。
【００５８】
本発明において、前記Ｔ細胞の活性化のために、前記Ｔ細胞は、本発明の抗原提示細胞と１、２、３、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、又は３０日間のうちのいずれか１つ以上の間に共培養され、好ましくは、１日〜２１日、１日〜１４日、２日〜１０日、２日〜５日、２日〜５日、３日、５日、７日、１０日、１４日、１６日、１８日、又は２１日間共培養されるが、これに制限されるわけではない。
【００５９】
本発明において、前記Ｔ細胞と本発明の抗原提示細胞の共培養時、１種以上のサイトカインを添加してＴ細胞の活性化、成熟及び／又は増殖を促進し、後のメモリーＴ細胞への分化のためにＴ細胞をプライミングすることができる。このようなステップで使用できる例示的なサイトカインには、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）、又はこれらの組み合わせなどが含まれるが、これに限定されない。
【００６０】
また、本発明では、前記Ｔ細胞と本発明の抗原提示細胞の共培養時、サイトカイン及び兔疫グロブリン重鎖不変部を含む融合タンパク質を添加してＴ細胞の活性化、成熟及び／又は増殖を促進し、後のメモリーＴ細胞への分化のためにＴ細胞をプライミングすることができる。ここで、前記サイトカインとしては、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、ＩＬ−１８、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）又は顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）であってもよいが、これに制限されるわけではない。また、前記兔疫グロブリン重鎖不変部は、兔疫グロブリンヒンジ部、及び任意にＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、及びＣＨ４ドメイン又はその配合物から構成された群より選択される兔疫グロブリン重鎖不変部領域であってもよいが、これに制限されるわけではない。さらに、前記兔疫グロブリン重鎖不変部は、ＩｇＡ（Ｉｇα）、ＩｇＤ（Ｉｇδ）、ＩｇＥ（Ｉｇε）、ＩｇＧ（Ｉｇγ）、及びＩｇＭ（Ｉｇμ）で、当業界で呼ばれる任意の５つの兔疫グロブリンクラスに属する兔疫グロブリンに由来できるが、好ましくは、ＩｇＧクラスに由来する兔疫グロブリン重鎖不変部であってもよい。
【００６１】
また、本発明では、前記Ｔ細胞と本発明の抗原提示細胞の共培養時、メモリーＴ細胞で高く発現する細胞表面タンパク質と結合するリガンド；及び兔疫グロブリン重鎖不変部を含む融合タンパク質を添加してＴ細胞の活性化、成熟及び／又は増殖を促進し、後のメモリーＴ細胞への分化のためにＴ細胞をプライミングすることができる。ここで、前記メモリーＴ細胞で高く発現する細胞表面タンパク質としては、ＣＤ２７、ＣＸＣＲ３、又はＣＤ６２Ｌであってもよい。前記ＣＤ２７に結合可能なリガンドとしては、ＣＤ７０であってもよく、ＣＸＣＲ３に結合可能なリガンドは、ＣＸＣＲ９又はＣＸＣＲ１０であってもよいし、前記ＣＤ６２Ｌに結合可能なリガンドは、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＣＤ３４、ＭａｄＣＡＭ−１、又はＰＳＧＬ−１であってもよいが、これに制限されるわけではない。さらに、前記兔疫グロブリン重鎖不変部は、ＩｇＡ（Ｉｇα）、ＩｇＤ（Ｉｇδ）、ＩｇＥ（Ｉｇε）、ＩｇＧ（Ｉｇγ）、及びＩｇＭ（Ｉｇμ）で、当業界で呼ばれる任意の５つの兔疫グロブリンクラスに属する兔疫グロブリンに由来できるが、好ましくは、ＩｇＧクラスに由来する兔疫グロブリン重鎖不変部であってもよい。
【００６２】
本発明のさらに他の実施形態によれば、本発明で提供する癌特異的エピトープが負荷された抗原提示細胞を有効成分として含む免疫治療剤に関する。本発明に係る免疫治療剤は、免疫反応を増加させるか、特定疾病で、例えば、癌の治療又は予防に好ましい免疫反応の一部を選択的に上昇させることができる。
【００６３】
本発明のさらに他の実施形態によれば、本発明で提供する癌特異的エピトープが負荷された抗原提示細胞；及び／又は活性化されたＴ細胞を有効成分として含む抗癌ワクチン、又は癌の予防又は治療用薬学組成物に関する。
【００６４】
本発明において、前記「癌」は、哺乳類で典型的に調節されない細胞成長で特徴づけられた生理的状態を示すか、指す。本発明において、予防、改善又は治療の対象になる癌は、エプスタイン−バールウイルス（ｅｐｓｔｅｉｎ  ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ；ＥＢＶ）陽性癌で、ＥＢＶ陽性胃癌、ＥＢＶ陽性子宮頸癌、ＥＢＶ陽性バーキットリンパ腫（Ｂｕｒｋｉｔｔ’ｓ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）、ＥＢＶ陽性Ｔ細胞リンパ腫（Ｔ  ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａｓ）、ＥＢＶ陽性乳癌、ＥＢＶ陽性平滑筋肉腫（ｌｅｉｏｍｙｏｓａｒｃｏｍａｓ）、ＥＢＶ陽性平滑筋腫（ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｔｕｍｏｒｓ）、ＥＢＶ陽性ホジキンリンパ腫（Ｈｏｄｇｋｉｎ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）、ＥＢＶ陽性非咽頭癌、又はＥＢＶ陽性移植後リンパ細胞増殖疾患（ＰＴＬＤ）であってもよく、好ましくは、ＥＢＶ陽性胃癌であってもよいが、これに制限されるわけではない。
【００６５】
本発明で提供する前記抗原提示細胞は、ＥＢＶ陽性癌抗原特異的なＴ細胞、好ましくは、メモリーＴ細胞の分化及び増殖を誘導することができ、このように活性化されたメモリーＴ細胞は、癌細胞の防御機序を避けて癌又は腫瘍性状態を治療するか、癌の再発、進行又は転移を予防することができる。
【００６６】
本発明に係る抗癌ワクチンは、１回投与することで行われる免疫化方法と、連続投与することで行われる免疫化方法をすべて含むことができる。本発明において、「予防」は、本発明の薬学組成物を用いて癌の症状を遮断するか、その症状を抑制又は遅延させるあらゆる行為であれば制限なく含むことができる。
【００６７】
また、本発明において、「治療」は、本発明の薬学組成物を用いて癌の症状が好転するか、有利になるあらゆる行為であれば制限なく含むことができる。
【００６８】
本発明において、前記薬学組成物は、カプセル、錠剤、顆粒、注射剤、軟膏剤、粉末、又は飲料形態であることを特徴とし、前記薬学組成物は、ヒトを対象にすることを特徴とすることができる。
【００６９】
本発明において、前記薬学組成物は、これらに限定されるものではないが、それぞれ通常の方法によって、散剤、顆粒剤、カプセル、錠剤、水性懸濁液などの経口型剤形、外用剤、坐剤、及び滅菌注射溶液の形態に剤形化して使用できる。本発明の薬学組成物は、薬学的に許容可能な担体を含むことができる。薬学的に許容される担体は、経口投与時には、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、色素、香料などを使用することができ、注射剤の場合には、緩衝剤、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張剤、安定化剤などを混合して使用することができ、局所投与用の場合には、基剤、賦形剤、潤滑剤、保存剤などを使用することができる。本発明の薬学組成物の剤形は、上述のような薬剤学的に許容される担体と混合して多様に製造可能である。例えば、経口投与時には、錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル（ｅｌｉｘｉｒ）、サスペンション、シロップ、ウエハーなどの形態で製造することができ、注射剤の場合には、単位投薬アンプル又は多数回投薬の形態で製造することができる。その他、溶液、懸濁液、錠剤、カプセル、徐放型製剤などに剤形化することができる。
【００７０】
一方、製剤化に適した担体、賦形剤、及び希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアガム、アルギネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、未晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレート、又は鉱物油などが使用できる。また、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤、防腐剤などを追加的に含むことができる。
【００７１】
本発明において、前記薬学組成物の投与経路はこれらに限定されるものではないが、口腔、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、硬膜内、心臓内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸管、局所、舌下、又は直腸が含まれる。経口又は非経口投下が好ましい。
【００７２】
本発明において、前記「非経口」とは、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、硬膜内、病巣内、及び頭蓋骨内注射又は注入技術を含む。本発明の薬学組成物はさらに、直腸投与のための坐剤の形態で投与される。
【００７３】
本発明の前記薬学組成物は、使用された特定化合物の活性、年齢、体重、一般的な健康、性別、定式、投与時間、投与経路、排出率、薬物配合、及び予防又は治療される特定疾患の重症度を含む様々な要因によって多様に変化することができ、前記薬学組成物の投与量は、患者の状態、体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路、及び期間によって異なるが、当業者によって適切に選択可能であり、１日０．０００１〜５０ｍｇ／ｋｇ又は０．００１〜５０ｍｇ／ｋｇ投与することができる。投与は、１日に１回投与してもよく、数回分けて投与してもよい。前記投与量は、いかなる面でも本発明の範囲を限定するものではない。本発明に係る医薬組成物は、丸剤、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁剤に剤形化される。
【００７４】
本発明の他の実施形態によれば、癌を予防又は治療するために、目的の個体に本発明で提供する癌特異的エピトープが負荷された抗原提示細胞；及び／又は活性化されたＴ細胞を投与するステップを含む、癌の予防又は治療方法に関する。
【００７５】
本発明において、前記癌は、エプスタイン−バールウイルス（ｅｐｓｔｅｉｎ  ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ；ＥＢＶ）陽性癌で、ＥＢＶ陽性胃癌、ＥＢＶ陽性子宮頸癌、ＥＢＶ陽性バーキットリンパ腫（Ｂｕｒｋｉｔｔ’ｓ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）、ＥＢＶ陽性Ｔ細胞リンパ腫（Ｔ  ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａｓ）、ＥＢＶ陽性乳癌、ＥＢＶ陽性平滑筋肉腫（ｌｅｉｏｍｙｏｓａｒｃｏｍａｓ）、ＥＢＶ陽性平滑筋腫瘍（ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｔｕｍｏｒｓ）、ＥＢＶ陽性ホジキンリンパ腫（Ｈｏｄｇｋｉｎ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）、ＥＢＶ陽性非咽頭癌、又はＥＢＶ陽性移植後リンパ細胞増殖疾患（ＰＴＬＤ）であってもよく、好ましくは、ＥＢＶ陽性胃癌であってもよいが、これに制限されるわけではない。
【００７６】
本発明で提供する癌特異的エピトープが負荷された抗原提示細胞又は活性化されたＴ細胞の投与量、スケジュール、及び投与経路は、個体の大きさ及び条件によって、そして標準薬剤学的慣行によって決定可能である。例示的な投与経路は、静脈内、動脈内、腹腔内、肺内、血管内、筋肉内、器官内、皮下、眼内、脊髄腔内、又は経皮を含む。
【００７７】
個体に投与される細胞の用量は、例えば、投与される細胞の特定類型、投与経路、及び治療される癌の特定類型と病期によって異なる。前記量は、激しい毒性又は有害な事例なしに、癌に対する治療反応のような所望の反応をもたらすのに十分でなければならない。一部の実施形態において、投与される活性化されたＴ細胞又は抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）の量は、治療的有効量である。一部の実施形態において、細胞（例えば、癌特異的エピトープが負荷された樹状細胞又は活性化されたＴ細胞）の量は、治療前の同一の個体での相応する腫瘍の大きさ、癌細胞の数又は腫瘍の成長速度と比較して、又は治療を受けていない他の個体での相応する活性と比較して、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％のうちのいずれか１つの分だけ腫瘍の大きさを減少させるか、癌細胞の数を減少させるか、腫瘍の成長速度を減少させるのに十分な量である。精製された酵素を用いた試験管内検定、細胞ベース検定、動物モデル、又は人体実験のような標準方法を用いて効果の規模を測定することができる。
【００７８】
本発明の一実施形態において、本発明の癌特異的エピトープが負荷された抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）は、１×１０５〜５×１０５、５×１０５〜１×１０６、１×１０６〜２×１０６、２×１０６〜３×１０６、３×１０６〜４×１０６、４×１０６〜５×１０６、５×１０６〜６×１０６、６×１０６〜７×１０６、７×１０６〜８×１０６、８×１０６〜１×１０８、１×１０６〜３×１０６、３×１０６〜５×１０６、５×１０６〜７×１０６、２×１０６〜４×１０６、１×１０６〜５×１０６、又は５×１０６〜１×１０７個のうちのいずれか１つの細胞／個体の投与量で投与されるが、これに制限されるわけではない。
【００７９】
本発明の他の実施形態において、本発明の癌特異的エピトープが負荷された抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）は、１×１０４〜５×１０４、５×１０４〜１×１０５、１×１０５〜２×１０５、２×１０５〜４×１０５、４×１０５〜６×１０５、６×１０５〜８×１０５、８×１０５〜１×１０６、１×１０６〜２×１０６、２×１０６〜１×１０７、１×１０４〜１×１０５、１×１０５〜１×１０６、１×１０６〜１×１０７、１×１０４〜１×１０６、又は１×１０５〜１×１０７個のうちのいずれか１つの細胞／ｋｇの投与量で投与されるが、これに制限されるわけではない。
【００８０】
また、本発明の一実施形態において、本発明の活性化されたＴ細胞は、１×１０８〜５×１０８、５×１０８〜９×１０８、９×１０８〜１×１０９、１×１０９〜２×１０９、２×１０９〜３×１０９、３×１０９〜４×１０９、４×１０９〜５×１０９、５×１０９〜６×１０９、６×１０９〜１×１０１０、１×１０９〜３×１０９、３×１０９〜５×１０９、５×１０９〜７×１０９、７×１０９〜１×１０１０、１×１０９〜５×１０９、５×１０９〜１×１０１０、３×１０９〜７×１０９、１×１０１０〜１．５×１０１０、１×１０１０〜２×１０１０、又は１×１０９〜１×１０１０個のうちのいずれか１つの細胞／個体の投与量で投与されるが、これに制限されるわけではない。
【００８１】
本発明の他の実施形態において、本発明の活性化されたＴ細胞は、１×１０７〜１×１０８、１×１０８〜２×１０８、２×１０８〜４×１０８、４×１０８〜６×１０８、６×１０８〜８×１０８、８×１０８〜１×１０９、１×１０９〜２×１０９、２×１０９〜４×１０９、４×１０９〜１×１０１０、２×１０８〜６×１０８、６×１０８〜１×１０９、１×１０８〜２×１０８、２×１０８〜２×１０９、１×１０７〜１×１０８、１×１０８〜１×１０９、１×１０９〜１×１０１０、又は１×１０７〜１×１０９個のうちのいずれか１つの細胞／ｋｇの投与量で投与されるが、これに制限されるわけではない。
【００８２】
本発明において、前記癌特異的エピトープが負荷された抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）及び／又は活性化されたＴ細胞の投与時、ヒトアルブミンのような安定化剤又は賦形剤がともに使用できる。
【００８３】
本発明において、前記癌特異的エピトープが負荷された抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）及び／又は活性化されたＴ細胞の投与量及び投与スケジュールは、投与する医師の判断に基づいて治療過程にわたって調整可能である。一部の実施形態において、活性化されたＴ細胞は、前記癌特異的エピトープが負荷された抗原提示細胞が投与され、約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、又は１ヶ月後に投与されるか、前記抗原提示細胞と同時に投与されるが、これに制限されるわけではない。
【００８４】
本発明において、前記癌特異的エピトープが負荷された抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）及び／又は活性化されたＴ細胞の投与時、単独で又は他の療法、例えば、手術、放射線治療、遺伝子治療、免疫治療、骨髄移植、幹細胞移植、ホルモン療法、標的治療、冷凍療法、超音波治療、光線力学療法、化学療法などとともに行われる。追加的に、増殖性疾患が発病する危険がより大きい人は疾患の発病を抑制及び／又は遅延するための治療を受けることができる。
【発明の効果】
【００８５】
本発明で提供するエプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）陽性癌特異的エピトープが負荷された抗原提示細胞、すなわち、樹状細胞を介して前記癌抗原特異的なＴ細胞、好ましくは、メモリーＴ細胞の分化及び増殖を迅速で効果的に誘導することができ、このように活性化されたメモリーＴ細胞は、癌細胞の防御機序を避けてエプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）陽性癌又は腫瘍性状態を治療するか、癌の再発、進行又は転移を予防することができる。
【００８６】
かつて養子（ａｄｏｐｔｉｖｅ）Ｔ細胞治療において、癌患者治療のために多数のＴ細胞を生産するために３〜６ヶ月の長時間がかかり、免疫細胞治療における細胞生産工程で大きな問題点があった。しかし、本発明による場合、患者の治療に使用しなければならない１０９の自己メモリーＴ細胞を３週以内に生産することができ、費用節減及び外部汚染源に対する感染危険要素を最小化することができる。したがって、本発明による場合、より多くの固形癌患者に迅速な治療的接近が可能で、末期癌患者にも適用可能な技術である。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】本発明の一実施例によりＳＮＵ７１９細胞株において、ＥＢＮＡ−１由来ネオエピトープのＴ細胞の活性化程度を確認するために、それぞれのネオエピトープに対するＥＬＩＳＰＯＴを実施した結果を示すものである。
【図２】本発明の一実施例によりＥＢＶ感染したＭＫＮ７４細胞株において、ＥＢＮＡ−１由来ネオエピトープのＴ細胞の活性化程度を確認するために、それぞれのネオエピトープに対するＥＬＩＳＰＯＴを実施した結果を示すものである。
【図３】本発明の一実施例によりＳＮＵ７１９細胞株において、ＬＭＰ−２Ａ由来ネオエピトープのＴ細胞の活性化程度を確認するために、それぞれのネオエピトープに対するＥＬＩＳＰＯＴを実施した結果を示すものである。
【図４】本発明の一実施例によりＥＢＶ感染したＭＫＮ７４細胞株において、ＬＭＰ−２Ａ由来ネオエピトープのＴ細胞の活性化程度を確認するために、それぞれのネオエピトープに対するＥＬＩＳＰＯＴを実施した結果を示すものである。
【図５】本発明の一実施例により作製されたヒト由来メモリーＴ細胞のＥＢＶ陽性胃癌細胞抗原の標的癌細胞の死滅活性を確認するために、ＨＬＡタイプによるＳＮＵ−７１９細胞株においてＥＢＮＡ−１由来のネオエピトープの中から選定された３つのネオエピトープに対してそれぞれＣｒ５１放出分析法（Ｃｒ５１  ｒｅｌｅａｓｅ  ａｓｓａｙ）を行った結果を示すものである。
【図６】本発明の一実施例により作製されたヒト由来メモリーＴ細胞のＥＢＶ陽性胃癌細胞抗原の標的癌細胞の死滅活性を確認するために、ＨＬＡタイプによるＥＢＶ感染したＭＫＮ７４細胞株においてＥＢＮＡ−１由来のネオエピトープの中から選定された３つのネオエピトープに対してそれぞれＣｒ５１放出分析法（Ｃｒ５１  ｒｅｌｅａｓｅ  ａｓｓａｙ）を行った結果を示すものである。
【図７】本発明の一実施例により作製されたヒト由来メモリーＴ細胞のＥＢＶ陽性胃癌細胞抗原の標的癌細胞の死滅活性を確認するために、ＨＬＡタイプによるＳＮＵ−７１９細胞株においてＬＭＰ−２Ａ由来のネオエピトープの中から選定された３つのネオエピトープに対してそれぞれＣｒ５１放出分析法（Ｃｒ５１  ｒｅｌｅａｓｅ  ａｓｓａｙ）を行った結果を示すものである。
【図８】本発明の一実施例により作製されたヒト由来メモリーＴ細胞のＥＢＶ陽性胃癌細胞抗原の標的癌細胞の死滅活性を確認するために、ＨＬＡタイプによるＥＢＶ感染したＭＫＮ７４細胞株においてＬＭＰ−２Ａ由来のネオエピトープの中から選定された３つのネオエピトープに対してそれぞれＣｒ５１放出分析法（Ｃｒ５１  ｒｅｌｅａｓｅ  ａｓｓａｙ）を行った結果を示すものである。
【図９】本発明の一実施例により作製されたヒト由来メモリーＴ細胞のＥＢＶ陽性胃癌細胞抗原のうち、ＥＢＮＡ−１由来ネオエピトープの癌細胞特異性を確認するために、ＥＢＶ陰性ＭＫＮ７４細胞株から選定された３つのネオエピトープに対してそれぞれＣｒ５１放出分析法（Ｃｒ５１  ｒｅｌｅａｓｅ  ａｓｓａｙ）を行った結果を示すものである。
【図１０】本発明の一実施例により作製されたヒト由来メモリーＴ細胞のＥＢＶ陽性胃癌細胞抗原のうち、ＥＢＮＡ−１由来ネオエピトープの癌細胞特異性を確認するために、ＥＢＶ陰性ＭＫＮ７４細胞株から選定された３つのネオエピトープに対してそれぞれＣｒ５１放出分析法（Ｃｒ５１  ｒｅｌｅａｓｅ  ａｓｓａｙ）を行った結果を示すものである。
【図１１】本発明の一実施例により作製されたヒト由来メモリーＴ細胞のＥＢＶ陽性胃癌細胞抗原のうち、ＬＭＰ−２Ａ由来ネオエピトープの癌細胞特異性を確認するために、ＥＢＶ陰性ＭＫＮ７４細胞株から選定された３つのネオエピトープに対してそれぞれＣｒ５１放出分析法（Ｃｒ５１  ｒｅｌｅａｓｅ  ａｓｓａｙ）を行った結果を示すものである。
【図１２】本発明の一実施例により作製されたヒト由来メモリーＴ細胞のＥＢＶ陽性胃癌細胞抗原のうち、ＬＭＰ−２Ａ由来ネオエピトープの癌細胞特異性を確認するために、ＥＢＶ陰性ＭＫＮ７４細胞株から選定された３つのネオエピトープに対してそれぞれＣｒ５１放出分析法（Ｃｒ５１  ｒｅｌｅａｓｅ  ａｓｓａｙ）を行った結果を示すものである。
【図１３】本発明の一実施例によりＥＢＮＡ−１由来ネオエピトープの生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）抗癌効果を検証するために、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス異種移植動物モデル（ＳＮＵ−７１９）におけるネオエピトープ特異的細胞毒性Ｔ細胞の効果に対する実験結果を示すものである。
【図１４】本発明の一実施例によりＥＢＮＡ−１由来ネオエピトープの生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）抗癌効果を検証するために、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス異種移植動物モデル（ＥＢＶ感染ＭＫＮ７４）におけるネオエピトープ特異的細胞毒性Ｔ細胞の効果に対する実験結果を示すものである。
【図１５】本発明の一実施例によりＬＭＰ−２Ａ由来ネオエピトープの生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）抗癌効果を検証するために、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス異種移植動物モデル（ＳＮＵ−７１９）におけるネオエピトープ特異的細胞毒性Ｔ細胞の効果に対する実験結果を示すものである。
【図１６】本発明の一実施例によりＬＭＰ−２Ａ由来ネオエピトープの生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）抗癌効果を検証するために、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス異種移植動物モデル（ＥＢＶ感染ＭＫＮ７４）におけるネオエピトープ特異的細胞毒性Ｔ細胞の効果に対する実験結果を示すものである。
【発明を実施するための形態】
【００８８】
本発明の一実施形態によれば、配列番号１〜１８４のうちのいずれか１つで表されるエプスタイン−バールウイルス（ｅｐｓｔｅｉｎ  ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ；ＥＢＶ）陽性癌特異的ネオエピトープ（ｎｅｏ−ｅｐｉｔｏｐｅ）に関する。
【００８９】
本発明の他の実施形態によれば、本発明で提供する前記癌特異的ネオエピトープ（ｎｅｏ−ｅｐｉｔｏｐｅ）が負荷（ｌｏａｄｉｎｇ）された抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ、ＡＰＣ）に関する。
【００９０】
本発明のさらに他の実施形態によれば、本発明で提供する抗原提示細胞（Ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ）によって活性化されたＴ細胞に関する。
【００９１】
本発明のさらに他の実施形態によれば、本発明で提供する癌特異的エピトープが負荷された抗原提示細胞；及び／又は活性化されたＴ細胞を有効成分として含む抗癌ワクチン、又は癌の予防又は治療用薬学組成物に関する。
【実施例】
【００９２】
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないことは当業界における通常の知識を有する者にとって自明であろう。
【００９３】
［実施例１］ＥＢＶ陽性胃癌細胞に特異的な自己メモリーＴ細胞の作製方法及び臨床的適用
１．ＥＢＶ陽性胃癌細胞抗原ネオエピトープの選別
胃癌細胞で遺伝子変異が蓄積された最も主なシーケンスを予測し、このシーケンスがＴ細胞のＨＬＡに結合するエピトープを予測するアルゴリズムは、バイオインフォマティクス及びプロテオミクスを利用して開発した。ネオエピトープ予測アルゴリズムとしては、ＮｅｔＭＨＣ及びＮｅｔＣＴＬｐａｎを用いた。この時、韓国人にとって最も多く発現しているＨＬＡタイプであるＨＬＡ−Ａ＊２４０２、ＨＬＡ−Ａ＊Ａ０２０１、及びＨＬＡ−Ａ＊３３０３を含む様々なＨＬＡタイプで、ＨＬＡ−Ａ＊１１０１、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６、ＨＬＡ−Ａ＊３１０１と、ＨＬＡ−Ｂ＊５１０１、ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３、ＨＬＡ−Ｂ＊５４０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５８０１、ＨＬＡ−Ｂ＊３５０１と結合親和性が高いと予想されるペプチドシーケンスを発掘した。このために、現在存在するＥＢＶ＋胃癌細胞株のＨＬＡタイピング（ｔｙｐｉｎｇ）により各細胞株のＨＬＡタイプを調べ、ＥＢＶウイルスによってＥＢＶ＋胃癌細胞にのみ存在し、悪性腫瘍を誘発する代表的タンパク質であるＬＭＰ−２ＡとＥＢＮＡ−１タンパク質に対して、ＮｅｔＭＨＣプログラムにより各ＨＬＡタイプと結合親和性が高いネオエピトープを予測して発掘した。その結果はそれぞれ表１及び２に示した。
【００９４】
【表１】
2020532956.tif 000003
2020532956.tif 000004
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【００９５】
【表２】
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【００９６】
前記表１及び２から明らかなように、インシリコ（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ）予測により、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２、ＨＬＡ−Ａ＊Ａ０２０１、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３、ＨＬＡ−Ａ＊１１０１、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６、ＨＬＡ−Ａ＊３１０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５１０１、ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３、ＨＬＡ−Ｂ＊５４０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５８０１、又はＨＬＡ−Ｂ＊３５０１に対して高い結合親和性を有するネオエピトープを発掘し、各ＨＬＡと結合親和性をＩＣ５０（ｎＭ）値により予測した。実際にヒトの胃癌細胞に存在し、体内にあるＴ細胞によって認知できるシーケンスを前記ＨＬＡとの結合親和性に基づいて選別した。表１から明らかなように、ＬＭＰ−２Ａに対するネオエピトープは、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２に対する結合親和性が高い順にＴＹＧＰＶＦＭＣＬ（ＩＣ５０＝４３．１ｎＭ）、ＬＬＷＴＬＶＶＬＬ（ＩＣ５０＝２２３６８．６ｎＭ）、ＬＴＥＷＧＳＧＮＲ（ＩＣ５０＝４５２０５．３ｎＭ）を選定し、ＨＬＡ−Ａ＊３１０１に対するネオエピトープは、ＬＡＹＲＲＲＷＲＲ（ＩＣ５０＝５．２ｎＭ）、ＬＴＶＭＴＮＴＬＬ（ＩＣ５０＝１４００４．８ｎＭ）、ＹＰＳＡＳＧＳＹＧ（ＩＣ５０＝４２０３２ｎＭ）を選定した。また、表２から明らかなように、ＥＢＮＡ−１に対するネオエピトープは、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２に対する結合親和性が高い順にＭＶＦＬＱＴＨＩＦ（ＩＣ５０＝７７３．１ｎＭ）、ＡＩＫＤＬＶＭＴＫ（ＩＣ５０＝３９６７６．１ｎＭ）、ＧＳＲＥＲＡＲＧＲ（ＩＣ５０＝４７１８４．８ｎＭ）を選定し、ＨＬＡ−Ａ＊３１０１に対するネオエピトープは、ＫＴＳＬＹＮＬＲＲ（ＩＣ５０＝１８．８ｎＭ）、ＲＧＲＧＧＳＧＧＲ（ＩＣ５０＝２８９．３ｎＭ）、ＦＰＰＭＶＥＧＡＡ（ＩＣ５０＝４３１２６．１ｎＭ）を選定した。以下の実験のために、前記のように選別したネオエピトープをペプチド（ｅｐｔｉｄｅ）で合成した。
【００９７】
２．選別されたネオエピトープが負荷された樹状細胞で活性化されたＴ細胞のＥＬＩＳＰＯＴ結果
健康なヒトの血液から抽出したＰＢＭＣをフローサイトメトリーにより単核球（ｍｏｎｏｃｙｔｅ）と白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ）に分離して、単核球は樹状細胞に分化させるために、ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４サイトカインを培養液に入れて、２日間培養した。また、白血球の場合、抗−ＣＤ３／ＣＤ２８抗体とともに３日間培養し、この後、ＩＬ−２サイトカインをともに入れた培養液で培養した。樹状細胞に分化した単核球に、前記のように選別したネオエピトープペプチドを電気衝撃遺伝子伝達法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒａｔｉｏｎ）を利用して樹状細胞に伝達する。この後、２日間培養して、樹状細胞の表面で前記ネオエピトープが発現することを確認した後、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体が含まれた培養液で培養している白血球とともに１：２０（樹状細胞：白血球）の比率で共培養する。共培養時、培養液には樹状細胞の抗原提示機能の効能を増加させるサイトカインであるＩＬ−４と、Ｔ細胞のメモリ細胞への転換を補助する機能をするサイトカインであるＩＬ−２とＩＬ−７をともに入れたサイトカインカクテルを混ぜて培養した。１６時間後、このように活性化されたＴ細胞のＩＦＮ−γの発現程度をＥＬＩＳＰＯＴで測定して、図１〜４に示した。ただし、前記実験に使用された陰性対照群のペプチドは、ＥＢＮＡ−１とＬＭＰ−２ＡでＮｅｔＭＨＣを通して抽出されない任意のＥＢＮＡ−１、ＬＭＰ−２Ａタンパク質のアミノ酸配列９ｍｅｒ（配列：ＧＧＳＲＥＲＡＲＧ）を採用した。
【００９８】
その結果、本発明のネオエピトープペプチドが負荷された樹状細胞とともに培養されたＴ細胞において、前記ペプチドのＨＬＡに対する結合親和性と関係なく、対照群に比べてＩＦＮｒの分泌がはるかに多いことを確認することができた。
これによって、本発明において、前記表１及び２で、各細胞株のＨＬＡ−Ａ類型によって選定されたネオエピトープが負荷された樹状細胞によって細胞毒性Ｔリンパ球（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ、ＣＴＬｓ）を活性化させることができ、このように活性化されたＴ細胞は、新抗原であるネオエピトープを認知できる抗原特異性を有することが分かった。
【００９９】
３．選別されたネオエピトープが負荷された樹状細胞で活性化されたＴ細胞の癌細胞の溶血効果
前記２．のように、７２時間共培養した後、樹状細胞を介して抗原が提示されたメモリーＴ細胞を選び出すために、ＩＦＮｒサイトカインを分泌するＴ細胞を抽出できる磁石を用いた細胞抽出機（ＭＡＣＳ）を用いてＥＢＶ抗原特異的メモリーＴ細胞を抽出した。抽出されたメモリーＴ細胞は、メモリ機能を維持し、細胞の数を増加させるために、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５サイトカインが混合された培養液で培養して、マウスに注入可能な細胞数に到達するまで培養した。
【０１００】
このように活性化されたＴ細胞をＥＢＶ陽性胃癌細胞であるＳＮＵ−７１９細胞株と、ＥＢＶ感染ＭＫＮ７４細胞株と共培養（ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ）させて、癌細胞の溶血（ｌｙｓｉｓ）の有無をＣｒ５１放出分析法（ｒｅｌｅａｓｅ  ａｓｓａｙ）で確認して、その結果を図５〜８に示し、ＥＢＶ陰性胃癌細胞であるＭＫＮ−７４細胞株と共培養（ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ）させて、癌細胞の溶血（ｌｙｓｉｓ）の有無をＣｒ５１放出分析法（ｒｅｌｅａｓｅ  ａｓｓａｙ）で確認して、その結果を図９〜１２に示した。ただし、前記実験に使用された陰性対照群のペプチドは、ＥＢＮＡ−１とＬＭＰ−２ＡでＮｅｔＭＨＣを介して抽出されない任意のＥＢＮＡ−１、ＬＭＰ−２Ａタンパク質のアミノ酸配列９ｍｅｒ（配列：ＧＧＳＲＥＲＡＲＧ）を採用した。
【０１０１】
その結果、本発明に係るネオエピトープで活性化されたＴ細胞は、ＥＢＶ陽性胃癌細胞の溶血能に優れているのに対し、ＥＢＶ陰性胃癌細胞に対する溶血能はわずかであることを確認することができた。すなわち、本発明に係るＥＢＶ癌特異的抗原ネオエピトープが負荷された樹状細胞で活性化されたＴ細胞は、ＥＢＶ陽性癌細胞を特異的に溶血させることが分かる。
【０１０２】
また、本発明のネオエピトープで活性化されたＴ細胞は、特に、ＥＢＶ陽性胃癌細胞との共培養時、混合濃度依存的に前記溶血能が増加する傾向を示し、各ＨＬＡタイプによるネオエピトープの中でも特にＨＬＡとの結合親和性が高いほど、ＥＢＶ陽性胃癌細胞株に対する溶血能が増加することを確認することができた。
【０１０３】
４．選別されたネオエピトープが負荷された樹状細胞で活性化されたＴ細胞の生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での抗癌効果の確認
ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの脇腹に、ＥＢＶ陽性胃癌細胞株であるＳＮＵ−７１９（ＨＬＡ  ｔｙｐｅ：ＨＬＡ−Ａ＊２４０２）又はＥＢＶ感染ＭＫＮ７４（ＨＬＡ  ｔｙｐｅ：ＨＬＡ−Ａ＊３１０１）を１×１０７細胞の量でマトリゲルと混合して移植して異種移植動物モデルを作製し、４週経過して癌組織が観察されると、前記２．で活性化されたＴ細胞を１×１０７細胞の量で１週に１回ずつ腫瘍内（ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ）注入した後、癌組織の大きさを測定して、図１３〜１６に示した。ただし、前記実験に使用された陰性対照群のペプチドは、ＥＢＮＡ−１とＬＭＰ−２ＡでＮｅｔＭＨＣを介して抽出されない任意のＥＢＮＡ−１、ＬＭＰ−２Ａタンパク質のアミノ酸配列９ｍｅｒ（配列：ＧＧＳＲＥＲＡＲＧ）を採用した。
【０１０４】
その結果、本発明に係るネオエピトープで活性化されたＴ細胞を処理した場合、対照群対比、ＥＢＶ陽性胃癌の大きさが著しく減少したことを確認することができ、各ＨＬＡタイプによるネオエピトープの中でも特にＨＬＡとの結合親和性が高いほど、胃癌の大きさ減少率が高いことを確認することができた。
【０１０５】
上記のように、各細胞株のＨＬＡ−Ａ類型によって選定されたネオエピトープは、すべてＴ細胞の活性向上効果に優れ、バイオインフォマティクス（ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）による結合親和性が増加するほど（すなわち、ＩＣ５０値が低くなるほど）、前記Ｔ細胞の活性向上及び標的癌細胞の死滅に対する活性度が増加することを確認することができた。これによって、表１及び２に示したネオエピトープを樹状細胞を用いてＴ細胞の活性を向上させることができ、これによって標的癌の治療効果にも優れることを容易に予測することができる。
【０１０６】
以上、本発明の特定の部分を詳細に述べたが、当業界における通常の知識を有する者にとってこのような具体的な記述は単に好ましい実施形態に過ぎず、そのため、本発明の範囲が制限されるわけではない点は明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付した請求項とその等価物によって定義されるというべきである。
【産業上の利用可能性】
【０１０７】
本発明は、癌特異的ネオエピトープ（ｎｅｏ−ｅｐｉｔｏｐｅ）、前記ネオエピトープが負荷された抗原提示細胞、及び前記抗原提示細胞によって癌治療のためのＴ細胞を活性化する方法に関する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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