(57)【要約】  重鎖においてＮ末端からＣ末端に向かって順にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、６および８で示され、軽鎖においてＮ末端からＣ末端に向かって順にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、１４および１６で示される、相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列を含む抗原認識領域を含む親和性結合部分が、開示される。有効成分として親和性結合部分を含む医薬組成物もまた、開示される。ＮＫｐ４６の発現に関連する自己免疫疾患または癌を診断、予防または処置する方法もまた、開示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
重鎖においてＮ末端からＣ末端に向かって順にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、６および８で示され、軽鎖においてＮ末端からＣ末端に向かって順にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、１４および１６で示される、相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列を含む抗原認識領域を含む親和性結合部分。
【請求項２】
抗体または抗体断片である、請求項１に記載の親和性結合部分。
【請求項３】
前記抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖおよび単一ドメイン分子からなる群から選択される、請求項２に記載の親和性結合部分。
【請求項４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２および１０で示されるアミノ酸配列を含む単離された抗体。
【請求項５】
前記抗体が、治療性部分にコンジュゲートされている、請求項２もしくは３に記載の親和性結合部分、または請求項４に記載の抗体。
【請求項６】
前記治療性部分が、細胞傷害性部分、毒性部分、サイトカイン部分および薬物からなる群から選択される、請求項５に記載の親和性結合部分または抗体。
【請求項７】
有効成分としての、請求項１〜３、５〜６のいずれか１項に記載の親和性結合部分または請求項４〜６のいずれか１項に記載の抗体と、医薬的に許容できる担体と、を含む医薬組成物。
【請求項８】
必要とする対象におけるＮＫｐ４６の発現に関連する癌を予防または処置する方法であって、請求項５または６に記載の親和性結合部分または抗体の治療有効量を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項９】
必要とする対象におけるＮＫｐ４６の発現に関連する癌を予防または処置する際の使用のための、請求項５または６に記載の親和性結合部分または抗体の治療有効量
【請求項１０】
前記癌が、造血系の癌である、請求項８に記載の方法、または請求項９に記載の使用のための親和性結合部分もしくは抗体。
【請求項１１】
前記癌が、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、ＮＫ細胞白血病、菌状息肉症、ＡＬＫ＋未分化大細胞型リンパ腫およびＴ細胞大顆粒リンパ球性（ＬＧＬ）白血病からなる群から選択される、請求項８もしくは１０に記載の方法、または請求項９もしくは１０に記載の使用のための親和性結合部分もしくは抗体。
【請求項１２】
前記対象を追加の抗癌剤または抗癌治療で処置することをさらに含む、請求項８または１０〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
追加の抗癌剤または抗癌治療の使用をさらに含む、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の使用のための親和性結合部分または抗体。
【請求項１４】
前記抗癌剤または抗癌治療が、化学療法剤、抗体免疫療法、放射線療法、手術、癌ワクチン、抗炎症剤および補助食品からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法、または請求項１３に記載の使用のための親和性結合部分もしくは抗体。
【請求項１５】
必要とする対象における自己免疫疾患を予防または処置する方法であって、請求項１〜３、５〜６のいずれか１項に記載の親和性結合部分、または請求項４〜６のいずれか１項に記載の抗体の治療有効量を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項１６】
必要とする対象における自己免疫疾患を予防または処置する際に使用するための、請求項１〜３、５〜６のいずれか１項に記載の親和性結合部分、または請求項４〜６のいずれか１項に記載の抗体の治療有効量。
【請求項１７】
前記自己免疫疾患が、糖尿病である、請求項１５に記載の方法、または請求項１６に記載の使用のための親和性結合部分もしくは抗体。
【請求項１８】
前記糖尿病が、Ｉ型糖尿病である、請求項１７に記載の方法、または請求項１７に記載の使用のための親和性結合部分もしくは抗体。
【請求項１９】
前記糖尿病が、ＩＩ型糖尿病である、請求項１７に記載の方法、または請求項１７に記載の使用のための親和性結合部分もしくは抗体。
【請求項２０】
前記治療有効量が、前記投与の後に前記対象の血中インスリンレベルの上昇をもたらす、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記治療有効量が、前記投与の後に前記対象の膵臓ベータ細胞破壊の減少をもたらす、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
前記治療有効量が、前記投与の後に前記対象の癌細胞量の減少をもたらす、請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
糖尿病の処置における使用のための、包装材料の中に包装されていて前記包装材料の中または表面の印刷物で識別される、請求項１〜３、５〜６のいずれかに記載の親和性結合部分、または請求項４〜６のいずれか１項に記載の抗体を含む製造品。
【請求項２４】
インスリンをさらに含む、請求項２３に記載の製造品。
【請求項２５】
ＮＫｐ４６の発現に関連する癌の処置における使用のための、包装材料の中に包装されていて前記包装材料の中または表面の印刷物で識別される、請求項５または６に記載の親和性結合部分を含む製造品。
【請求項２６】
請求項１〜３または５〜６のいずれか１項に記載の親和性結合部分をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２７】
前記単離されたポリヌクレオチドの核酸配列が、重鎖においてＮ末端からＣ末端に向かって順にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、５および７で示され、軽鎖においてＮ末端からＣ末端に向かって順にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、１３および１５で示される通りである、請求項２６に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２８】
請求項４に記載の抗体をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２９】
前記単離されたポリヌクレオチドの核酸配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および９で示される通りである、請求項２８に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３０】
請求項２６、２７、２８または２９のいずれかに記載の単離されたポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項３１】
請求項２６、２７、２８もしくは２９のいずれかに記載のポリヌクレオチド、または請求項３０に記載の発現ベクターを含む細胞。
【請求項３２】
対象におけるＮＫｐ４６の発現を検出する方法であって、前記対象の生体試料を請求項１〜３、５〜６のいずれかに記載の親和性結合部分または請求項４〜６のいずれか１項に記載の抗体と接触させること、および前記親和性結合部分または抗体と前記ＮＫｐ４６の間の結合を検出すること、により前記対象の前記生体試料中の前記ＮＫｐ４６の発現を検出し、それにより前記対象における前記ＮＫｐ４６の発現を検出すること、を含む、方法。
【請求項３３】
対象におけるＮＫｐ４６の発現に関連する自己免疫疾患または癌を診断する方法であって、
（ａ）ＮＫｐ４６と請求項１〜３、５〜６のいずれかに記載の親和性結合部分または請求項４〜６のいずれか１項に記載の抗体の間で免疫複合体の形成を可能にする条件下で、前記対象からの生体試料を前記親和性結合部分または前記抗体と接触させること；および
（ｂ）前記生体試料中の前記免疫複合体のレベルを計測すること、
を含み、健常個体からの生体試料中の前記免疫複合体のレベルに関する所定の閾値を超える前記免疫複合体のレベルの上昇が、前記ＮＫｐ４６発現に関連する前記自己免疫疾患または前記癌の指標となる、方法。
【請求項３４】
対象におけるＮＫｐ４６の発現に関連する自己免疫疾患または癌を診断および処置する方法であって、
（ａ）ＮＫｐ４６と請求項１〜３、５〜６のいずれかに記載の親和性結合部分または請求項４〜６のいずれか１項に記載の抗体の間で免疫複合体の形成を可能にする条件下で、前記対象の生体試料を前記親和性結合部分または前記抗体と接触させること；
（ｂ）前記生体試料中のＮＫｐ４６免疫複合体の発現を検出すること；
（ｃ）健常個体からの生体試料中の前記免疫複合体のレベルに関する所定の閾値を超える前記免疫複合体のレベルが上昇している場合、前記対象をＮＫｐ４６発現に関連する自己免疫疾患または癌と診断すること；ならびに
（ｄ）ＮＫｐ４６の発現に関連する自己免疫疾患または前記癌の処置のための治療薬を前記診断された対象に投与し、それにより前記対象におけるＮＫｐ４６発現に関連する自己免疫疾患または前記癌を診断および処置すること、
を含む、方法。
【請求項３５】
血液検査、ＭＲＩまたはＣＴスキャンから選択される診断アッセイを用いて前記診断を裏づけることをさらに含む、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３６】
ＮＫｐ４６の発現に関連する自己免疫疾患または癌の処置のための薬剤の処置をモニタリングする方法であって、
（ａ）ＮＫｐ４６発現に関連する自己免疫疾患または癌の処置のための薬剤で、必要とする対象を処置すること；および
（ｂ）前記処置の前および後に、前記対象の生体試料中のＮＫｐ４６の発現を検出すること、
を含み、前記ＮＫｐ４６の前記発現を前記検出することが、前記生体試料を請求項１〜３、５〜６のいずれかに記載の親和性結合部分または請求項４〜６のいずれか１項に記載の抗体と接触させること、および前記親和性結合部分または抗体と前記ＮＫｐ４６の間の結合を検出すること、により実行され、前記処置前の前記ＮＫｐ４６の前記発現レベルに比較した、前記処置後の前記ＮＫｐ４６のより低い発現レベルが、効率的処置の指標となる、方法。
【請求項３７】
前記対象が、ヒト対象である、請求項８、１０〜１２、１４〜１５、１７〜２２もしくは３２〜３６のいずれか１項に記載の方法、または請求項９〜１１、１３〜１４もしくは１６〜１９のいずれか１項に記載の親和性結合部分もしくは抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幾つかの実施形態において、新規なＮＫｐ４６抗体に関し、より詳細かつ非排他的には悪性疾患および自己免疫疾患を予防および／または処置するためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、１９７５年に初めて、予め刺激することなく腫瘍細胞を死滅させる能力について同定された自然エフェクターリンパ球である。今日までにＮＫ細胞は、腫瘍形質転換、およびウイルス、バクテリアまたは真菌感染に対する最も決定的な最初の応答物質の１つとして出現した。それらは、Ｉ型およびＩＩ型糖尿病などの自己免疫疾患にも関与する。ＮＫ細胞は、細胞傷害活性を有し、サイトカインを分泌することができ、つまりそれらは、自然リンパ球（ＩＬＣ）の新規に特徴づけられたファミリーの一部である。それらは、主に１型サイトカイン（ＩＦＮγおよびＴＮＦα）の産生により、ＩＬＣのグループ１として分類される。ＮＫ細胞は、数多くの生殖系列をコードした活性化および阻害性受容体により、多くの多様な標的を認識する、他と全く異なる能力を有する。これらの受容体により受け取られたシグナルのバランスが、ＮＫ細胞が所与の標的細胞に対抗して作用するか、または中性のままであるかを最終的に決定する。
【０００３】
ＮＫ細胞、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、およびＮＫｐ４６上で見出された３種の活性化受容体は、集合的に自然細胞傷害性受容体（ＮＣＲ）として知られる。これらの受容体は、ＮＫ細胞の抗腫瘍性および抗ウイルス性防御において不可欠である。ＮＫｐ４６は、ほとんど排他的にＮＫ細胞により発現され、マウス相同分子種を有する唯一のＮＣＲであるため、決定的な活性化受容体として確定された。そのリガンドレパートリーは、インフルエンザウイルス、センダイウイルス、ニューキャッスル病ウイルスおよびポックスウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）およびヘマグルチニンノイラミニダーゼ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ−ｎｅｒｕａｍｉｎｄａｓｅ）（ＨＮ）などのウイルスリガンドから、フソバクテリウム・ヌクレアタムなどのバクテリア、腫瘍、脂肪細胞、およびヒト膵臓ベータ細胞上で見出された未知のリガンドにまでに及ぶ。ＮＫｐ４６の未知のリガンド、詳細には腫瘍リガンドの同定は１０年を超える期間、集中的に研究されてきた。
【０００４】
ＮＫｐ４６は、ＩｇＧスーパーファミリーの一部であり、２つのＣ２型Ｉｇ様ドメイン、つまり膜遠位ドメインであるＤ１および膜近位ドメインであるＤ２からなる。興味深いこととして、Ｄ１ドメインは、ＮＫｐ４６リガンド認識に関与しないことが知られており、結合は唯一、Ｄ２ドメイン（ストークおよびヒンジ領域も含む）によって媒介される。Ｄ２ドメイン内の異なる特色が、様々なリガンドへの結合を決定する。例えば、異なるリガンドへの結合に共通して関与する３つのグリコシル化部位：Ａｓｎ２１６、Ｔｈｒ１２５およびＴｈｒ２２５が存在する。ＮＫｐ４６によるＨＡ認識は、シアル酸依存性であり、主として残基Ｔｈｒ２２５により媒介され、全てではないが一部の腫瘍の認識にも関与することが知られている。Ａｓｎ２１６およびＴｈｒ１２５は両者とも、ヒトベータ細胞の認識に関わり、Ｆ．ヌクレアタム上の未知のリガンドは、シアリル化（ｓｉａｌｙａｔｉｏｎ）を必要としない。多様な特色および結合部位を利用して異なるリガンドに結合するＮＫｐ４６のこの特有の特色が、ＮＫｐ４６の機能を含む研究を妨害してきた。さらに、ＮＫｐ４６のＤ１ドメインの生物学的関連性は、依然としてとらえ難い。
関連の技術分野：
ＰＣＴ公報第ＷＯ２０１５／０１５４８９号。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の幾つかの実施形態の態様によれば、重鎖においてＮ末端からＣ末端に向かって順にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、６および８で示され、軽鎖においてＮ末端からＣ末端に向かって順にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、１４および１６で示される、相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列を含む抗原認識領域を含む親和性結合部分が提供される。
【０００６】
本発明の幾つかの実施形態の態様によれば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２および１０で示されるアミノ酸配列を含む単離された抗体が提供される。
【０００７】
本発明の幾つかの実施形態の態様によれば、有効成分としての、本発明の幾つかの実施形態の親和性結合部分または本発明の幾つかの実施形態の抗体と、医薬的に許容できる担体と、を含む医薬組成物が提供される。
【０００８】
本発明の幾つかの実施形態の態様によれば、必要とする対象におけるＮＫｐ４６の発現に関連する癌を予防または処置する方法であって、本発明の幾つかの実施形態の親和性結合部分または抗体の治療有効量を該対象に投与することを含む、方法が提供される。
【０００９】
本発明の幾つかの実施形態の態様によれば、必要とする対象におけるＮＫｐ４６の発現に関連する癌を予防または処置する際の使用のための、本発明の幾つかの実施形態の親和性結合部分または抗体の治療有効量が提供される。
【００１０】
本発明の幾つかの実施形態の態様によれば、必要とする対象における自己免疫疾患を予防または処置する方法であって、本発明の幾つかの実施形態の親和性結合部分または本発明の幾つかの実施形態の抗体の治療有効量を該対象に投与することを含む、方法が提供される。
【００１１】
本発明の幾つかの実施形態の態様によれば、必要とする対象における自己免疫疾患を予防または処置する際の使用のための、本発明の幾つかの実施形態の親和性結合部分または本発明の幾つかの実施形態の抗体の治療有効量が提供される。
【００１２】
本発明の幾つかの実施形態の態様によれば、糖尿病の処置における使用のための、包装材料の中に包装されていて該包装材料の中または表面の印刷物で識別される、本発明の幾つかの実施形態の親和性結合部分または本発明の幾つかの実施形態の抗体を含む製造品が提供される。
【００１３】
本発明の幾つかの実施形態の態様によれば、ＮＫｐ４６の発現に関連する癌の処置における使用のための、包装材料の中に包装されていて該包装材料の中または表面の印刷物で識別される、本発明の幾つかの実施形態の親和性結合部分を含む製造品が提供される。
【００１４】
本発明の幾つかの実施形態の態様によれば、本発明の幾つかの実施形態の親和性結合部分をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。
【００１５】
本発明の幾つかの実施形態の態様によれば、本発明の幾つかの実施形態の抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。
【００１６】
本発明の幾つかの実施形態の態様によれば、本発明の幾つかの実施形態の単離されたポリヌクレオチドを含む発現ベクターが提供される。
【００１７】
本発明の幾つかの実施形態の態様によれば、本発明の幾つかの実施形態のポリヌクレオチド、または本発明の幾つかの実施形態の発現ベクターを含む細胞が提供される。
【００１８】
本発明の幾つかの実施形態の態様によれば、対象におけるＮＫｐ４６の発現を検出する方法であって、該対象の生体試料を本発明の幾つかの実施形態の親和性結合部分または本発明の幾つかの実施形態の抗体と接触させること、および該親和性結合部分または抗体と該ＮＫｐ４６の間の結合を検出すること、により該対象の該生体試料中の該ＮＫｐ４６の発現を検出し、それにより該対象における該ＮＫｐ４６の発現を検出することを含む、方法が提供される。
【００１９】
本発明の幾つかの実施形態の態様によれば、対象におけるＮＫｐ４６の発現に関連する自己免疫疾患または癌を診断する方法であって、（ａ）ＮＫｐ４６と本発明の幾つかの実施形態の親和性結合部分または本発明の幾つかの実施形態の抗体の間で免疫複合体の形成を可能にする条件下で、該対象からの生体試料を該親和性結合部分または該抗体と接触させること；および（ｂ）該生体試料中の該免疫複合体のレベルを計測すること、を含み、健常個体からの生体試料中の該免疫複合体のレベルに関する所定の閾値を超える該免疫複合体のレベルの上昇が、ＮＫｐ４６発現に関連する該自己免疫疾患または該癌の指標となる、方法が提供される。
【００２０】
本発明の幾つかの実施形態の態様によれば、対象におけるＮＫｐ４６の発現に関連する自己免疫疾患または癌を診断および処置する方法であって、（ａ）ＮＫｐ４６と本発明の幾つかの実施形態の親和性結合部分または本発明の幾つかの実施形態の抗体の間で免疫複合体の形成を可能にする条件下で、該対象の生体試料を該親和性結合部分または該抗体と接触させること；（ｂ）該生体試料中のＮＫｐ４６免疫複合体の発現を検出すること；（ｃ）健常個体からの生体試料中の該免疫複合体のレベルに関する所定の閾値を超える該免疫複合体のレベルが上昇している場合、該対象をＮＫｐ４６発現に関連する自己免疫疾患または癌と診断すること；ならびに（ｄ）ＮＫｐ４６発現に関連する自己免疫疾患または癌の処置のための治療薬を該診断された対象に投与し、それにより対象におけるＮＫｐ４６発現に関連する自己免疫疾患または癌を診断および処置すること、を含む、方法が提供される。
【００２１】
本発明の幾つかの実施形態の態様によれば、ＮＫｐ４６発現に関連する自己免疫疾患または癌の処置のための薬剤の処置をモニタリングする方法であって、（ａ）ＮＫｐ４６発現に関連する自己免疫疾患または癌の処置のための薬剤で、必要とする対象を処置すること；および（ｂ）該処置の前および後に、該対象の生体試料中のＮＫｐ４６の発現を検出すること、を含み、該ＮＫｐ４６の発現を検出することが、該生体試料を該本発明の幾つかの実施形態の親和性結合部分または該本発明の幾つかの実施形態の抗体と接触させること、および該親和性結合部分または抗体と該ＮＫｐ４６の間の結合を検出すること、により実行され、該処置前の該ＮＫｐ４６の発現レベルに比較した、該処置後の該ＮＫｐ４６のより低い発現レベルが、効率的処置の指標となる、方法が提供される。
【００２２】
本発明の幾つかの実施形態によれば、該親和性結合部分は、抗体または抗体断片である。
【００２３】
本発明の幾つかの実施形態によれば、該抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖおよび単一ドメイン分子からなる群から選択される。
【００２４】
本発明の幾つかの実施形態によれば、該抗体は、治療性部分にコンジュゲートされている。
【００２５】
本発明の幾つかの実施形態によれば、該治療性部分は、細胞傷害性部分、毒性部分、サイトカイン部分および薬物からなる群から選択される。
【００２６】
本発明の幾つかの実施形態によれば、該癌は、造血系の癌である。
【００２７】
本発明の幾つかの実施形態によれば、該癌は、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、ＮＫ細胞白血病、菌状息肉症、ＡＬＫ＋未分化大細胞型リンパ腫、およびＴ細胞大顆粒リンパ球性（ＬＧＬ）白血病からなる群から選択される。
【００２８】
本発明の幾つかの実施形態によれば、該方法は、該対象を追加の抗癌剤または抗癌治療で処置することをさらに含む。
【００２９】
本発明の幾つかの実施形態によれば、使用のための該親和性結合部分または抗体は、追加の抗癌剤または抗癌治療の使用をさらに含む。
【００３０】
本発明の幾つかの実施形態によれば、該抗癌剤または抗癌治療は、化学療法剤、抗体免疫療法、放射線療法、手術、癌ワクチン、抗炎症剤および補助食品からなる群から選択される。
【００３１】
本発明の幾つかの実施形態によれば、該自己免疫疾患は、糖尿病である。
【００３２】
本発明の幾つかの実施形態によれば、該糖尿病は、Ｉ型糖尿病である。
【００３３】
本発明の幾つかの実施形態によれば、該糖尿病は、ＩＩ型糖尿病である。
【００３４】
本発明の幾つかの実施形態によれば、該治療有効量は、投与後に該対象の血中インスリンレベルの上昇をもたらす。
【００３５】
本発明の幾つかの実施形態によれば、該治療有効量は、投与後に該対象の膵臓ベータ細胞破壊の減少をもたらす。
【００３６】
本発明の幾つかの実施形態によれば、該治療有効量は、投与後に該対象の癌細胞量の減少をもたらす。
【００３７】
本発明の幾つかの実施形態によれば、該製造品は、インスリンをさらに含む。
【００３８】
本発明の幾つかの実施形態によれば、該単離されたポリヌクレオチドの核酸配列は、重鎖においてＮ末端からＣ末端に向かって順にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、５および７で示され、軽鎖においてＮ末端からＣ末端に向かって順にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、１３および１５で示される通りである。
【００３９】
本発明の幾つかの実施形態によれば、該単離されたポリヌクレオチドの核酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および９で示される通りである。
【００４０】
本発明の幾つかの実施形態によれば、該方法は、血液検査、ＭＲＩまたはＣＴスキャンから選択される診断アッセイを用いて該診断を裏づけることをさらに含む。
【００４１】
本発明の幾つかの実施形態によれば、該対象は、ヒト対象である。
【００４２】
他に定義されなければ、本明細書で用いられる全ての技術的および／または科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって共通して理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと類似または同等の方法および材料が、本発明の実施形態の実践またはテストで用いられ得るが、例示的方法および／または材料を以下に記載する。矛盾する場合、定義を含む本特許明細書が、管理することになる。加えて、該材料、方法および実施例は例示に過ぎず、必ずしも限定を意図するものではない。
【００４３】
本発明の幾つかの実施形態を、添付の図面を参照しながら本明細書に記載するが、それは例に過ぎない。ここに、詳細な図面の具体的な参照と共に、示された個々のものが例であり、本発明の実施形態の例示的議論を目的とすることを強調しておく。これに関係して、図面を伴った説明により、本発明の実施形態を実践し得る方法が当業者に明白となる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１Ａ−図１Ｃ。複数の新規な抗ＮＫｐ４６ ｍＡｂがＮＫｐ４６に結合することを示したグラフである。図１Ａ：ＮＫｐ４６を発現するＢＷトランスフェクト細胞に対比させたＢＷ親細胞（それぞれ黒色および赤色ヒストグラム）の抗ＮＫｐ４６ ｍＡｂ（市販の抗ＮＫｐ４６、４Ｇ１Ｇ１、ｈＮＫｐ４６．０２、ｈＮＫｐ４６．０９、ｈＮＫｐ４６．１２）および対照ｍＡｂ（１２Ｅ７）を用いたＦＡＣＳ染色。灰色に塗りつぶされたヒストグラムは、ＢＷ親細胞の二次抗体のみでの染色を表す。ＢＷ  ＮＫｐ４６トランスフェクタントのバックグランドは類似しており、図に示していない。図は、実施された６回のうち１回の代表的実験を示す；図１Ｂ：ＩＬ−２活性化初代ヒトバルクＮＫ細胞（黒色ヒストグラム）の抗ＮＫｐ４６ ｍＡｂ（市販の抗ＮＫｐ４６、４Ｇ１Ｇ１、ｈＮＫｐ４６．０２、ｈＮＫｐ４６．０９、ｈＮＫｐ４６．１２）および対照ｍＡｂ（１２Ｅ７）を用いたＦＡＣＳ染色。灰色に塗りつぶされたヒストグラムは、二次抗体のみでのＮＫ細胞の染色を表す。図は、実施された６回のうち１回の代表的実験を示す。
【図２】図２Ａ−図２Ｃ。複数の新規な抗ＮＫｐ４６ ｍＡｂの特徴づけを示したグラフである。図２Ａ：ＮＫｐ４６−Ｉｇを単独で（黒色ヒストグラム）、対照ｍＡｂと共に、または抗ＮＫｐ４６ ｍＡｂ（市販の抗ＮＫｐ４６、４Ｇ１Ｇ１、ｈＮＫｐ４６．０２、ｈＮＫｐ４６．０９、ｈＮＫｐ４６．１２；赤色ヒストグラム）と共に氷上でプレインキュベートし、その後、ＢＪＡＢ細胞を前処置されたＮＫｐ４６−ＩｇでＦＡＣＳ染色した。灰色で塗りつぶされたヒストグラムは、二次抗体のみでのＢｊａｂの染色を表す；図２Ｂ：活性化バルクＮＫ細胞培養物を、示された抗ＮＫｐ４６ ｍＡｂ（市販の抗ＮＫｐ４６、４Ｇ１Ｇ１、ｈＮＫｐ４６．０２、ｈＮＫｐ４６．０９、ｈＮＫｐ４６．１２）と共に４℃（黒色ヒストグラム）または３７℃（赤色ヒストグラム）で８時間インキュベートし、その後、二次抗体でＦＡＣＳ染色した。灰色で塗りつぶされたヒストグラムは、４℃で処置された細胞の二次抗体のみでの染色を表す。３７℃で処置された細胞のバックグランドは類似しており、図に示していない。図は、実施された５回のうち１回の代表的実験を示す；図２Ｃ：活性化バルクＮＫ細胞培養物を、対照（黒色ヒストグラム）およびｈＮＫｐ４６．０２（赤色ヒストグラム）ｍＡｂと共に３７℃で１６時間インキュベートし、その後、示された異なるコンジュゲート抗体でＮＫ細胞をＦＡＣＳ染色した。灰色で塗りつぶされたヒストグラムは、アイソタイプ対照抗体でのＮＫ細胞の染色を表す。
【図３】図３Ａ−図３Ｃ。時間および濃度依存性ｈＮＫｐ４６．０２介在性ＮＫｐ４６下方制御を示したグラフである。図３Ａ〜Ｂ：活性化バルクＮＫ細胞と４Ｇ１Ｇ１またはｈＮＫｐ４６．０２ ｍＡｂとの、示された濃度での８時間のインキュベーションを、４℃（図３Ａ）または３７℃（図３Ｂ）のいずれかで実施し、その後、抗ＮＫｐ４６−ＡＰＣでＦＡＣＳ染色した。アイソタイプＩｇＧ−ＦＩＴＣ対照染色のバックグランドＭＦＩ値を平均して、全ての試料から差し引いた。染色の調整されたＭＦＩ値を、チェックされた最小濃度（０．１μｇ／ｍｌ）に正規化し、１００％に設定した。図３Ｃ：活性化バルクＮＫ細胞と５μｇ／ｍｌの４Ｇ１Ｇ１またはｈＮＫｐ４６．０２ ｍＡｂとの３７℃でのインキュベーションを、示された時点（１、３、５、８、１６、および２４時間）で実施し、その後、抗ＮＫｐ４６−ＦＩＴＣでＦＡＣＳ染色した。アイソタイプＩｇＧ−ＦＩＴＣ対照染色のバックグランドＭＦＩ値を平均して、全ての試料から差し引いた。次に、調整されたＭＦＩ値を平均して、４Ｇ１Ｇ１に正規化した（１００％に設定）。示されたものは、三重測定で得られた平均値とＳＤである。＊ｐ＜０．０００５。
【図４】図４Ａ−図４Ｅ。ＮＫ細胞機能に及ぼす、ｈＮＫｐ４６．０２ ｍＡｂによるＮＫｐ４６下方制御の影響を示したグラフである。図４Ａ〜Ｂ：ＢＷ  ＮＫｐ４６トランスファクタントを単独で、または示された癌細胞株と共に（図Ａ）、またはＪｅｇ３およびインフルエンザと共にインキュベートされたＪｅｇ３（Ｊｅｇ３  ＰＲ８）と共に（図４Ｂ）、３７℃で４８時間インキュベートし、その後、ＢＷ  ＮＫｐ４６トランスフェクタントから分泌されたＩＬ−２についてＥＬＩＳＡを行った。ＩＬ−２分泌をＯＤ６５０ｎｍで測定し、結果をＢＷ  ＮＫｐ４６トランスフェクタントからの基礎ＩＬ−２分泌に正規化した（１に設定）。図４Ａおよび４Ｂは、実施された少なくとも３回のうちの１回の代表的実験を示す。示されたものは、三重測定で得られた平均値とＳＤである。＊ｐ＜０．０５；図４Ｃ〜Ｅ：活性化バルクＮＫ細胞を最初、５μｇ／ｍｌの対照またはｈＮＫｐ４６．０２ ｍＡｂのいずれかと共に３７℃で１６時間インキュベートした。癌細胞株（図４Ｃ）、インフルエンザの存在下でのＪｅｇ３（図４Ｄ）、およびヒト膵臓ベータ細胞(図４Ｅ）をその後、ＮＫ細胞および抗ＣＤ１０７ａ  ＡＰＣおよび抗ＣＤ５６  ＰＥ抗体と共に３７℃で２時間、コインキュベートした。四重測定の試料を播種し、ＦＡＣＳにより分析した。ＮＫ細胞単独でのバックグランドＭＦＩ値を平均して、全ての試料から差し引いた。次に、調整されたＭＦＩ値を平均して、対照ｍＡｂに正規化した（１００％に設定）。図４Ｃ、４Ｄおよび４Ｅでは、全ての実験を少なくとも２回実施し、１回の代表的リプリケートを表した。示されたものは、四重測定で得られた平均値とＳＤである。＊ｐ＜０．０５。
【図５】図５Ａ−図５Ｂ。抗ＮＫｐ４６ ｍＡｂの結合後の初代ＮＫ細胞でのＮＫｐ４６の転帰の計測を示したグラフである。図５Ａは、活性化バルクＮＫ細胞を最初、単独で（ｍＡｂ含まず）または５μｇ／ｍｌ  対照もしくはｈＮＫｐ４６．０２ ｍＡｂと共に３７℃で１６時間インキュベートした。ＮＫｐ４６が抗ＮＫｐ４６ ｍＡｂによりシェディングされたか否かを決定するために、各処置の上清を採取して、ＥＬＩＳＡプレートに播種した。直接ＥＬＩＳＡの陽性対照として、ＥＬＩＳＡプレートの追加のウェルを指示された濃度のＮＫｐ４６−Ｉｇでコーティングした。その後、ビオチン化抗ＮＫｐ４６ ｍＡｂをＮＫｐ４６の検出に用いて、ＥＬＩＳＡアッセイを実施した。図は、実施された２回のうちの１回の代表的実験を示す。示されたものは、三重測定で得られた平均値およびＳＤである；図５Ｂ：活性化バルクＮＫ細胞を最初、単独で、またはプロテアソーム（ｐｒｏｔｅｏｓｏｍａｌ）阻害剤（ＥＰＸ  ０．５ｎｇ／ｍｌ）もしくはリソソーム阻害剤（ＣＣＭ  Ａ  ２０ｎＭ）と共に２０分間インキュベートし、その後、５μｇ／ｍｌのｍＡｂ（１２Ｅ７、対照およびｈＮＫｐ４６．０２、抗ＮＫｐ４６）を４℃（黒色ヒストグラム）または３７℃（赤色ヒストグラム）で８時間添加した。この後、抗ＮＫｐ４６  ＡＰＣで細胞をＦＡＣＳ染色した。灰色で塗りつぶされたヒストグラムは、４℃で処置された細胞のアイソタイプ対照抗体のみでの染色を表す。３７℃で処置された細胞のバックグランドは類似しており、図に示していない。
【図６】図６Ａ−図６Ｃ。抗ＮＫｐ４６抗体の結合部位を同定および特徴づけしたグラフである。図６Ａ：融合タンパク質Ｄ１−Ｉｇ、Ｄ２−Ｉｇ、およびＮＫｐ４６−Ｉｇを、ＥＬＩＳＡプレートに４℃で一晩コーティングした。次に、抗ＮＫｐ４６抗体（市販の抗ＮＫｐ４６、４Ｇ１Ｇ１、ｈＮＫｐ４６．０２、ｈＮＫｐ４６．０９、ｈＮＫｐ４６．１２）を添加し、その後、ビオチン抗マウス抗体によりＯＤ６５０ｎｍで検出した。図は、実施された２回のうちの１回の代表的実験を示す。示されたものは、四重測定で得られた平均値およびＳＤである；図６Ｂ：ＮＫｐ４６への４Ｇ１Ｇ１およびｈＮＫｐ４６．０２の結合。Ａ１−ａ５は、ｈＮＫｐ４６．０２ ｍＡｂの逐次添加であった。「ｂ」ＮＫｐ４６誘導体化チップでのｈＮＫｐ４６．０２ ｍＡｂの飽和についてのテスト。「ｃ」ｈＮＫｐ４６．０２飽和活性表面への１００ｎＭ  ４Ｇ１Ｇ１添加は、急速な応答を生じた（約２７ＲＵ）。「ｄ」１００ｎＭ  ｈＮＫｐ４６．０２溶液の添加は、新しいベースラインに影響を及ぼさなかった；図６Ｃ：融合タンパク質ＮＫｐ４６−Ｉｇ、Ｄ１−ＩｇおよびＷ３２Ｒ−Ｉｇを、ＥＬＩＳＡプレートに４℃で一晩コーティングした。次に、抗ＮＫｐ４６抗体（４Ｇ１Ｇ１、ｈＮＫｐ４６．０２）を添加し、その後、ビオチン抗マウス抗体によりＯＤ６５０ｎｍで検出した。示されたものは、四重測定で得られた平均値およびＳＤである。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
本発明は、幾つかの実施形態において、新規なＮＫｐ４６抗体に関し、より詳細かつ非排他的には悪性疾患および自己免疫疾患を予防および／または処置するためのその使用に関する。
【００４６】
本発明の原理および操作は、図面および随伴する説明を参照すればよりよく理解され得る。
【００４７】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明が以下の記載に示され、実施例に例示された詳述への適用に必ずしも限定されないことが、理解されなければならない。本発明は、他の実施形態、または様々な方法で実践もしくは実行することが可能である。同じく、本明細書で用いられる表現法および用語法が説明を目的とし、限定と見なされるべきでないことが、理解されなければならない。
【００４８】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、癌および感染細胞を効率的に排除する自然リンパ球である。その機能は、数多くの阻害性および活性化受容体により伝達されたシグナルのバランスにより支配される。ＮＫｐ４６は、全てのＮＫ細胞上で見出された最も重要な活性化受容体の１つである。ウイルス、バクテリア、ヒトベータ細胞、脂肪細胞および腫瘍細胞の範囲の様々なＮＫ細胞ターゲットの同定および排除におけるそれの役割は、確立されている。これらの様々なターゲットの認識が、２つの細胞外ドメイン、つまり膜遠位ドメインＤ１および膜近位ドメインＤ２、のうちの一方により媒介される。ＮＫｐ４６は、Ｄ２ドメイン内の異なる特色および結合部位を利用して、リガンドの大きな力学的レパートリーを同定する。対照的に、ＮＫｐ４６の膜遠位ドメインＤ１の生物学的意義は、未だ決定されていない。ＮＫｐ４６は、リガンドを認識するために異なる特色および結合部位を適用するため、単一のブロッキングモノクローナル抗体は、リガンドの全てへのＮＫｐ４６の結合阻害が成功しない場合がある。
【００４９】
本発明者らは、本発明を縮小して実践し、ｈＮＫｐ４６．０２で表される新規な抗ヒトＮＫｐ４６モノクローナル抗体を開発した。ｈＮＫｐ４６．０２ ｍＡｂは、ＮＫｐ４６の内在化および分解を誘導することができ（図５Ａ〜Ｂ参照）、このためＮＫｐ４６への全てのリガンド結合および次の活性化の可能性が排除される。この抗体介在性受容体内在化は、ＮＫｐ４６のＤ１ドメインへのｈＮＫｐ４６．０２結合により実現された（図６Ａ参照）。興味深いこととして、別の抗ＮＫｐ４６ ｍＡｂである４Ｇ１Ｇ１もＤ１ドメインに結合したが、この相互作用は、ＮＫｐ４６の取り込み（例えば、内在化）に影響を及ぼさなかった。したがって、４Ｇ１Ｇ１およびｈＮＫｐ４６．０２がＤ１上の異なる結合部位を有することが確認された（図６Ｂ参照）。こうして、Ｄ１ドメインが受容体局在化および安定化を調節することが、提案される。
【００５０】
その上、ＮＫ細胞表面でのｈＮＫｐ４６．０２ ｍＡｂによるＮＫｐ４６の下方制御が、ＮＫｐ４６依存性のターゲットに対する活性に有意な影響を及ぼし、腫瘍細胞、ウイルス感染細胞およびベータ細胞の殺傷減少が示された（それぞれ図４Ｃ〜Ｅ）。総括すると、これらの結果から、Ｉ型糖尿病などのＮＫｐ４６依存性自己免疫疾患およびＮＫ細胞関連悪性腫瘍の処置のための治療薬としてのｈＮＫｐ４６．０２ ｍＡｂの潜在能力が示される。
【００５１】
したがって本発明の一態様によれば、重鎖においてＮ末端からＣ末端に向かって順にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、６および８で示され、軽鎖においてＮ末端からＣ末端に向かって順にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、１４および１６で示される、相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列を含む抗原認識領域を含む親和性結合部分が提供される。
【００５２】
本明細書で用いられる「親和性結合部分」は、非特異的抗原よりも高い親和性で特異的抗原に結合する任意の天然由来または人工的に合成された分子または組成物を指す。
【００５３】
親和性が、例えばアビディティーへの寄与を最小限に抑える捕捉または固定されたモノクローナル抗体（ＭＡｂ）形式を利用し、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）（Ｓｃａｒａｎｏ Ｓ, Ｍａｓｃｉｎｉ Ｍ, Ｔｕｒｎｅｒ ＡＰ, Ｍｉｎｕｎｎｉ Ｍ． Ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ ｆｏｒ ａｆｆｉｎｉｔｙ−ｂａｓｅｄ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ. Ｂｉｏｓｅｎｓ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ. ２０１０, ２５： ９５７−６６に記載）などの既知の方法を利用して定量することができ、例えばより低い解離定数Ｋｄがより高い親和性を反映するためＫｄを用いて、計算し得ることが、留意されなければならない。
【００５４】
本明細書で用いられる用語「ＫＤ」は、抗原結合ドメインと各抗原の間の平衡解離定数を指す。
【００５５】
具体的実施形態によれば、該親和性結合部分は、抗体または抗体断片である。
【００５６】
本発明で用いられる用語「抗体」は、インタクト分子およびその機能的断片（抗原のエピトープに結合することが可能）を包含する。
【００５７】
具体的実施形態によれば、該抗体断片としては、一本鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、ミニボディ、ナノモディ、Ｆａｂ発現ライブラリー、またはＨＬＡが制限された手法で抗原のエピトープに結合し得るＶＨおよびＶＬなどの単一ドメイン分子が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５８】
用語「単離された」は、天然環境から、例えば細胞から少なくとも部分的に分離されたことを指す。
【００５９】
本明細書で用いられる「可変領域」および「ＣＤＲ」は、アプローチの組み合わせなど、当該技術分野で公知の任意のアプローチにより画定された可変領域およびＣＤＲを指し得る。具体的実施形態によれば、該ＣＤＲは、カバット法により決定される。
【００６０】
一実施形態によれば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８は、抗体の重鎖の配列順序（それぞれＣＤＲ１〜３としてＮ＞Ｃ）で配置され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６は、抗体の軽鎖の配列順序（それぞれＣＤＲ１〜３としてＮ＞Ｃ）で配置される。
【００６１】
本発明の一実施形態によれば、該アミノ酸配列は、ＮＫｐ４６（例えば、ヒトＮＫｐ４６のＤ１領域）に結合することが可能なＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、６、８、１２、１４または１６に示されたペプチドに対し、少なくとも８０％、少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、例えば１００％の配列相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００６２】
相同性（例えば、相同性の割合％、同一性＋類似性）は、例えばポリペプチド配列から出発してデフォルトパートナーを用いることなどによるＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ(ＮＣＢＩ)のＢｌａｓｔＰもしくはＴＢＬＡＳＴＮソフトウエア、またはタンパク質配列データベースに対してヌクレオチドクエリー配列の６フレーム概念の翻訳産物（両方のストランド）を比較するデフォルトパラメータを用いることなどによるｔＢＬＡＳＴＸアルゴリズム（ＮＣＢＩを介して入手）などの、任意の相同性比較ソフトウエアを用いて計測することができる。
【００６３】
例えばｔＢＬＡＳＴＸのためのデフォルトパラメータとしては、最大標的配列：１００；予測閾値：１０；言語サイズ：３；クエリー範囲内の最大マッチ：０；スコアリングパラメータ：マトリックス−ＢＬＯＳＵＭ６２；フィルターおよびマスキング：フィルター−低複雑度領域、がある。
【００６４】
具体的実施形態によれば、該抗体は、ヒト化抗体である。
【００６５】
具体的実施形態によれば、該抗体は、キメラ抗体である。
【００６６】
本明細書で用いられる「キメラ抗体」は、少なくとも１つの鎖が非ヒト（例えば、ネズミ）動物のものであり、定常領域［例えば、定常領域、例えばＣＬ（カッパまたはラムダ）]がヒトである、抗体を指す。したがって例えば、該抗体は、両方の鎖が非ヒト可変領域およびヒト定常領域を含む完全な抗体またはその断片であり得る。別の例によれば、一方の鎖がヒト化されていて、もう一方の鎖が、非ヒト可変領域およびヒト定常領域を含む。キメラ抗体の二重特異性構成を、本明細書の以下に記載する。
【００６７】
非ヒト（例えば、ネズミ）抗体のヒト化形態が、免疫グロブリンのキメラ分子、つまり非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含む免疫グロブリン鎖である。ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、所望の特異性、親和性および能力（細胞殺傷）を有する、この場合のマウスなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基によって置換されている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）を包含する。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。ヒト化抗体は、レシピエント抗体内、またはインポートされたＣＤＲもしくはフレームワーク配列内のいずれにも見出されない残基を含んでいてもよい。該ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応するＣＤＲ領域の全てと、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のＦＲ領域の全てまたは実質的に全てと、を含む。該ヒト化抗体は、免疫グロブリン、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部も最適に含むであろう［Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ., Ｎａｔｕｒｅ, ３２１：５２２−５２５(１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ., Ｎａｔｕｒｅ, ３３２：３２３−３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ, Ｃｕｒｒ. Ｏｐ. Ｓｔｒｕｃｔ. Ｂｉｏｌ., ２：５９３−５９６（１９９２）］。 
【００６８】
非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当該技術分野で公知である。一般にヒト化抗体は、非ヒトである供給源から該抗体に導入された１つまたは複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は多くの場合、インポート残基（ｉｍｐｏｒｔ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ）と称され、典型的にはインポート可変ドメインから採取される。ヒト化は、本質的にはＷｉｎｔｅｒと共同研究者らの方法［Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ., Ｎａｔｕｒｅ, ３２１：５２２−５２５  （１９８６）；  Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ., Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７  （１９８８）；  Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ., Ｓｃｉｅｎｃｅ, ２３９：１５３４−１５３６  （１９８８）］に従い、ヒト抗体の対応する配列の代わりにげっ歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列を用いることにより実施され得る。したがって、そのようなヒト化抗体は、キメラ抗体であり（米国特許第４，８１６，５６７号）、インタクトのヒト可変ドメインよりも実質的に小さい部分が非ヒト種からの対応する配列により置換されている。実際にヒト化抗体は、典型的には幾つかのＣＤＲ残基、そしてことによると一部のＦＲ残基がげっ歯類抗体の類似部位からの残基により置換されている、ヒト抗体である。
【００６９】
ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーをはじめとする当該技術分野で公知の様々な技術を利用して生成することもできる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ, Ｊ. Ｍｏｌ. Ｂｉｏｌ., ２２７：３８１（１９９１）；  Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ., Ｊ. Ｍｏｌ. Ｂｉｏｌ., ２２２：５８１（１９９１）］。ＣｏｌｅらおよびＢｏｅｒｎｅｒらの技術もまた、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用可能である（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ., Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ, Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ,  ｐ．  ７７  （１９８５）、およびＢｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ., Ｊ. Ｉｍｍｕｎｏｌ., １４７（１）：８６−９５  （１９９１）］。同様にヒト抗体は、トランスジェニック動物、例えば内在性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されたマウスへのヒト免疫グロブリン対立遺伝子の導入により作製され得る。チャレンジ後に、遺伝子再編成、組立て、および抗体レパートリーなど、全ての点でヒトに見出される密接に類似したヒト抗体産生が観察される。このアプローチは、例えば米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，６６１，０１６号、および以下の科学刊行物： Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ., Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０,： ７７９−７８３  （１９９２）； Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ., Ｎａｔｕｒｅ ３６８： ８５６−８５９  （１９９４）；  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ, Ｎａｔｕｒｅ ３６８ ８１２−１３  （１９９４）；  Ｆｉｓｈｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ., Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４, ８４５−５１  （１９９６）；  Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ, Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４： ８２６  （１９９６）；およびＬｏｎｂｅｒｇ ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ, Ｉｎｔｅｒｎ. Ｒｅｖ. Ｉｍｍｕｎｏｌ. １３, ６５−９３  （１９９５）に記載されている。
【００７０】
本発明の一実施形態によれば、該抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２および１０（即ち、それぞれ重鎖および軽鎖）で示されるアミノ酸配列を含む。
【００７１】
一実施形態によれば、該抗体は、二重特異性抗体である。
【００７２】
一実施形態によれば、該抗体は、治療性部分を含む。
【００７３】
一実施形態によれば、該抗体は、検出可能な部分を含む。
【００７４】
これらの構成を、本明細書の以下に詳細に議論する。
【００７５】
上述の通り、本発明の親和性結合部分（例えば、抗体または抗体断片）は、ＮＫｐ４６に結合することが可能である。
【００７６】
本明細書で用いられる用語「ＮＫｐ４６」は、例えばＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＰ＿００１１３８９２９．１、ＮＰ＿００１１３８９３０．１、ＮＰ＿００１２２９２８５．１、ＮＰ＿００１２２９２８６．１またはＮＰ＿００４８２０．１を有するものなど、ＮＫｐ４６として知られるヒト自然細胞傷害性受容体のヒトまたは非ヒト相同体、相同分子種またはアイソフォームを指す。 
【００７７】
具体的実施形態によれば、該ＮＫｐ４６は、ヒトである。
【００７８】
一実施形態によれば、本発明の親和性結合部分は、ヒトＮＫｐ４６のＤ１領域に結合する。
【００７９】
一実施形態によれば、本発明の親和性結合部分は、ＮＫｐ４６受容体内在化を媒介する。受容体内在化は、ＦＡＣＳ分析（例えば、本発明の幾つかの実施形態の抗体での処置と、その後の、フローサイトメトリーを用いた細胞表面での検出による）による、リソソーム／プロテアソーム阻害剤（例えば、内在化に続いて受容体分解を阻害する）での処置による、そして／またはリソソームへの受容体内在化を確認する共焦点顕微鏡測定によるなど、公知の方法を利用して定量することができる。
【００８０】
例えば、該親和性結合部分（例えば、抗体または抗体断片）をコードする核酸配列は、組換えで発現することができる。
【００８１】
本発明の別の実施形態によれば、該核酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および９を含む。
【００８２】
本発明の一実施形態によれば、該核酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、５、７、１１、１３および１５を含む。
【００８３】
同じく提供されるのは、本発明の幾つかの実施形態の単離されたポリヌクレオチドを含む発現ベクターである。一実施形態によれば、該ポリヌクレオチド配列は、シスに作用する調節エレメントに動作可能に連結されている。
【００８４】
本発明の幾つかの実施形態の核酸構築物（本明細書では「発現ベクター」とも称される）は、原核生物、真核生物、または好ましくはその両方においてこのベクターを複製および組み込みに適するようにする（例えば、シャトルベクター）追加の配列を含む。加えて、典型的なクローニングベクターはまた、転写および翻訳開始配列、転写および翻訳ターミネーター、ならびにポリアデニル化シグナルを含有してもよい。例としてそのような構築物は、典型的には５’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、第二鎖ＤＮＡ合成の起点、および３’ＬＴＲまたはその一部を含むであろう。
【００８５】
本発明の幾つかの実施形態の核酸構築物は、典型的には配置された宿主細胞からの抗体の分泌または提示のためのシグナル配列を含む。好ましくはこの目的のためのシグナル配列は、哺乳動物シグナル配列である。
【００８６】
真核生物プロモーターは、典型的には２つのタイプの認識配列、つまりＴＡＴＡボックスおよび上流プロモーターエレメントを含有する。転写開始部位の２５〜３０塩基対上流に位置するＴＡＴＡボックスは、ＲＮＡ合成を開始するようにＲＮＡポリメラーゼを指揮することに関与すると思われる。他の上流プロモーターエレメントは、転写が開始される速度を決定する。
【００８７】
好ましくは本発明の幾つかの実施形態の核酸構築物により用いられるプロモーターは、形質転換された特異的細胞集団において活性である。細胞型特異性および／または組織特異性プロモーターの例としては、肝臓特異性であるアルブミンなどのプロモーター［Ｐｉｎｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ., （１９８７）  Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ. １：２６８−２７７］；リンパ球特異性プロモーター［Ｃａｌａｍｅ ｅｔ ａｌ., （１９８８）  Ａｄｖ. Ｉｍｍｕｎｏｌ. ４３：２３５−２７５］；特にＴ細胞受容体［Ｗｉｎｏｔｏ ｅｔ ａｌ., （１９８９）  ＥＭＢＯ Ｊ. ８：７２９−７３３］および免疫グロブリン［Ｂａｎｅｒｊｉ ｅｔ ａｌ.  （１９８３）  Ｃｅｌｌ ３３７２９−７４０］のプロモーター、ニューロフィラメントプロモーターなどのニューロン特異性プロモーター［Ｂｙｒｎｅ ｅｔ ａｌ.  （１９８９］  Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. ＵＳＡ ８６：５４７３−５４７７］；膵臓特異性プロモーター［Ｅｄｌｕｎｃｈ ｅｔ ａｌ.  （１９８５）  Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：９１２−９１６］または乳清プロモーターなどの乳腺特異性プロモーター（米国特許第４，８７３，３１６号、および欧州特許出願第２６４，１６６号)が挙げられる。
【００８８】
エンハンサーエレメントは、転写を、連結された相同性または非相同性プロモーターの最大１０００倍刺激することができる。エンハンサーは、転写開始部位の下流または上流に配置されると活性になる。ウイルスに由来する多くのエンハンサーエレメントは、広い宿主範囲を有し、種々の組織で活性である。例えばＳＶ４０初期遺伝子エンハンサーは、多くの細胞型に適する。本発明の幾つかの実施形態に適する他のエンハンサー／プロモーターの組み合わせとしては、ポリオーマウイルス、ヒトまたはネズミサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ネズミ白血病ウイルス、ネズミまたはラウス肉腫ウイルスおよびＨＩＶなどの様々なレトロウイルスのロングタームリピートに由来するものが挙げられる。参照により本明細書に組み入れられるＥｎｈａｎｃｅｒｓ ａｎｄ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ, Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ, Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ,  Ｎ.Ｙ. １９８３を参照されたい。
【００８９】
発現ベクターの構築において、該プロモーターは、自然環境における転写開始部位からとほぼ同じ、異種転写開始部位からの距離に配置されていることが好ましい。しかし、当該技術分野で公知の通り、この距離の若干の変動が、プロモーター機能を損失せずに適応され得る。
【００９０】
ポリアデニル化配列もまた、ＴＣＲＬ  ｍＲＮＡ翻訳の効率を上昇させるために、発現ベクターに付加することができる。２つの異なる配列エレメント、つまりポリアデニル化部位から下流に位置するＧＵまたはＵリッチ配列、および１１〜３０ヌクレオチド上流に位置する６ヌクレオチドＡＡＵＡＡＡの高度保存配列が、正確かつ効率的ポリアデニル化に必要となる。本発明の幾つかの実施形態に適した終結およびポリアデニル化シグナルとしては、ＳＶ４０由来のものが挙げられる。
【００９１】
既に記載されたエレメントに加えて、本発明の幾つかの実施形態の発現ベクターは、典型的にはクローニングされた核酸の発現レベルを上昇させること、または組換えＤＮＡを担う細胞の同定を容易にすることを意図した他の専門のエレメントを含有してもよい。例えば、複数の動物ウイルスは、許容細胞型におけるウイルスゲノムの染色体外複製を促進するＤＮＡ配列を含む。適当な因子がプラスミドまたは宿主細胞のゲノムのいずれかで運搬される遺伝子により提供される限りは、これらのウイルスレプリコンを担うプラスミドは、エピソームで複製される。
【００９２】
該ベクターは、真核生物レプリコンを含んでいても、または含んでいなくてもよい。真核生物レプリコンが存在する場合、該ベクターは、適当な選択マーカーを用いて真核生物中で増幅可能である。該ベクターが、真核生物レプリコンを含まない場合、いずれのエピソーム増複も可能でない。代わりに、組換えＤＮＡが、遺伝子操作された細胞のゲノムに組み込まれ、そこでプロモーターが、所望の核酸の発現を指揮する。
【００９３】
哺乳動物細胞中の組換えポリペプチド発現の改善は、トランスフェクトされた宿主細胞における遺伝子投与量を効果的に増加させることにより実現され得る。遺伝子コピー数の増加は、最も一般的には、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）またはグルタミン合成酵素（ＧＳ）などの酵素が欠損する細胞株を、これらの酵素をコードする遺伝子を含有する発現ベクター、ならびにＤＨＦＲを阻害するメトトレキサート（ＭＴＸ）およびＧＳを阻害するメチオニンスルホキサミン（ＭＳＸ）などの薬剤と合わせて使用して遺伝子増幅することにより実現される。したがって、例示的実施形態において、強力なプロモーターの制御下での組換え遺伝子と、ＤＨＦＲまたはＧＳ、ＤＨＦＲ＋またはＧＳ＋トランスフェクタントをそれぞれコードする遺伝子と、を含有する発現ベクターを得ることができ、その後、遺伝子増幅が、漸増する濃度のＭＴＲＸまたはＭＳＸ０中でトランスフェクタントを成長させることにより実現される。
【００９４】
発現のための例示的システムが、ＥＰ２８６１７４１、ＵＳ２０１２０１７８１２６、およびＵＳ２００８０１４５８９５に記載されており、それらはそれぞれ全体として参照により本明細書に組み入れられる。
【００９５】
同じく提供されるのは、本明細書に記載されたポリヌクレオチド／発現ベクターを含む細胞である。
【００９６】
抗体をコードするベクターのクローニングまたは発現に適した宿主細胞としては、本明細書に記載された原核または真核細胞が挙げられる。例えば抗体は、特にグリコシル化およびＦｃエフェクター機能が必要とされない場合には、バクテリア内で産生されてもよい。大腸菌内の抗体断片の発現を記載したＣｈａｒｌｔｏｎ, Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ, Ｖｏｌ. ２４８  （Ｂ. Ｋ. Ｃ. Ｌｏ, ｅｄ., Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ, Ｔｏｔｏｗａ,  Ｎ. Ｊ., ２００３）, ｐｐ. ２４５−２５４も参照されたい。発現の後、該抗体が、可溶性画分中のバクテリア細胞ペーストから単離されてもよく、さらに精製することができる。
【００９７】
原核生物に加えて、糸状菌または酵母などの真核微生物は、グリコシル化経路が「ヒト化されて」一部または完全なヒトグリコシル化パターンを有する抗体を産生する、真菌および酵母をはじめとする抗体コードベクターの適切なクローニングまたは発現宿主である。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ, Ｎａｔ. Ｂｉｏｔｅｃｈ. ２２：１４０９−１４１４  （２００４）、およびＬｉ ｅｔ ａｌ., Ｎａｔ. Ｂｉｏｔｅｃｈ. ２４：２１０−２１５  （２００６）を参照されたい。
【００９８】
グリコシル化抗体の発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物体（無脊椎動物および脊椎動物）に由来する。無脊椎動物細胞の例としては、植物および昆虫細胞が挙げられる。詳細にはスポドプテラ・フルギペルダ細胞のトランスフェクションのための、昆虫細胞と併せて用いられ得る数多くのバキュロウイルス株が、同定された。
【００９９】
植物細胞培養物もまた、宿主として使用することができる。例えば米国特許第５，９５９，１７７, ６号、同第６，０４０，４９８号、同第６，４２０，５４８号、同第７，１２５，９７８号、および同第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物において抗体を産生するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術を記載）を参照されたい 。
【０１００】
脊椎動物細胞を、宿主として用いてもよい。例えば、懸濁物中で生育するように適合された哺乳動物細胞株が、有用な場合がある。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト真核生物腎臓株（例えばＧｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ., Ｊ. Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ. ３６：５９（１９７７）に記載された２９３または２９３細胞）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ, Ｂｉｏｌ. Ｒｅｐｒｏｄ. ２３：２４３−２５１（１９８０）に記載されたＴＭ４細胞）；サル腎臓細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２）；例えばＭａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ., Ａｎｎａｌｓ  Ｎ.Ｙ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. ３８３：４４−６８（１９８２）に記載されたＴＲＩ細胞；ＭＲＣ５細胞；およびＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株としては、ＤＨＦＲ．ｓｕｐ．−ＣＨＯ細胞をはじめとするチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ.,  Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. ＵＳＡ ７７：４２１６（１９８０））；ならびにＹ０、ＮＳ０およびＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株が挙げられる。抗体産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞株の論評については、例えばＹａｚａｋｉ ａｎｄ  Ｗｕ, Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ, Ｖｏｌ. ２４８（Ｂ. Ｋ. Ｃ. Ｌｏ, ｅｄ., Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ, Ｔｏｔｏｗａ,  Ｎ.Ｊ.）, ｐｐ. ２５５−２６８（２００３）を参照されたい。
【０１０１】
組換えポリペプチドの回収は、適当な培養時間に続いて実行される。成句「組換えポリペプチドを回収すること」は、ポリペプチドを含有する発酵培地全体を回収することを指すが、分離または精製の追加のステップを伴う必要はない。上述にもかかわらず、本発明の幾つかの実施形態のポリペプチドは、非限定的にアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、濾過、電気泳動、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、コンカナバリンＡクロマトグラフィー、クロマトフォーカシングおよび示差可溶化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）などの種々の標準的タンパク質精製技術を用いて精製することができる。
【０１０２】
抗体が得られたら、抗体をＮＫｐ４６結合親和性および受容体内在化の誘導についてテストしてもよい。ＮＫｐ４６への特異的抗体を検出するための適当な免疫アッセイは、当該技術分野で公知であり、本発明により抗体を検出するのに即座に用いることができる。適切な免疫アッセイとしては、例えば放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、「サンドイッチ」免疫測定法、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散測定法、沈降反応、アグルチネーションアッセイおよび免疫電気泳動測定法が挙げられる［例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ  Ｌａｎｅ, Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ, Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ, Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ, Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９９）参照]。受容体内在化の誘導を検出するための適当な免疫アッセイは、本明細書の先に記載されている。
【０１０３】
抗体の高い特異性が、抗体を治療適用および診断に特に適するものにしている。
【０１０４】
一実施形態によれば、該抗体は、異種治療性部分に付着されていてもよい（コンジュゲーションの方法は、本明細書の以下に記載する）。治療性部分は、例えば細胞傷害性部分、毒性部分、サイトカイン部分、薬物であり得る。例としては、毒素、例えばシュードモナス・エキソトキシン、ジフテリア毒素、リシンＡ毒素、サポリン毒素、インターロイキン２、インターロイキン４、インターロイキン１０、ＣＤ３、ＣＤ１６が挙げられるが、これらに限定されない。免疫毒素は、参照により本明細書に組み入れられるＡｎｔｉｇｎａｎｉ ａｎｄ  ＦｉｔｚＧｅｒａｌｄ, Ｔｏｘｉｎｓ（Ｂａｓｅｌ）（２０１３）５（８）： １４８６−１５０２にさらに記載されている。
【０１０５】
一実施形態によれば、該抗体は、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）、即ち、生物活性のある細胞傷害剤（例えば、抗癌剤）に連結された抗体または抗体断片を含む分子である。
【０１０６】
一実施形態によれば、該抗体は、二重特異性抗体である。
【０１０７】
二重特異性抗体は、例えば少なくとも２つの異なる抗原への結合特異性を有するモノクローナル抗体であり得る。例えば結合特異性の一方は、ＮＫｐ４６（例えば、Ｄ１ドメイン）に対するものであり得、他方は、任意の他の抗原、例えば非限定的にＰＤＬ１、ＰＶＲ、ＣＥＡなどの腫瘍リガンドに対するものである。二重特異性抗体を作製する方法は、例えばＳｕｒｅｓｈらの（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １２１：２１０  （１９８６））に開示されている。
【０１０８】
該抗体は、可溶性または不溶性形態であってもよい。
【０１０９】
診断適用のために本発明で用いられ得る検出可能な部分の例としては、放射性同位体、リン光剤、化学発光剤、蛍光剤、酵素、蛍光ポリペプチドおよびエピトープタグが挙げられるが、これらに限定されない。検出可能な部分は、結合対のメンバーであり得、該結合対のさらなるメンバーおよび直接視覚化される標識との相互作用を介して同定可能になる。一例では、該結合対のメンバーは、対応する標識抗体により同定される抗原である。一例では、該標識は、発色反応を生じる蛍光タンパク質または酵素である。
【０１１０】
検出可能な部分のさらなる例としては、陽子放出断層撮影法（ＰＥＴ）および磁気共鳴造影法（ＭＲＩ）により検出可能なものが挙げられ、それらは全て、当業者に周知である。
【０１１１】
例示的な検出可能部分としては、ストレプトアビジン、蛍光イソチオシアナート、ベータガラクトシダーゼ、橙色蛍光タンパク質、ビオチンリガーゼタグ、Ｍｙｃタグ、ヒスチジンタグ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、および緑色蛍光タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１２】
検出可能な部分が、ポリペプチドである場合、免疫標識（即ち、検出可能な部分にコンジュゲートされた抗体）は、組換え手段により生成されてもよく、または例えば固相ペプチド合成技術を利用した１つもしくは複数のアミノ酸残基の定義された順序での段階的付加により、化学合成されてもよい。組換えＤＮＡ技術（ＴＣＲＬをコードするポリペプチドを翻訳で検出可能な部分に融合する）を利用して本発明の抗体に連結され得るポリペプチド検出可能部分の例としては、蛍光ポリペプチド、リン光ポリペプチド、酵素およびエピトープタグが挙げられる。
【０１１３】
あるいは本発明の抗体への検出可能な部分の化学的付着は、ペプチド結合を介する（検出可能な部分がポリペプチドである場合）、またはリンカーペプチドなどの介入するリンカーエレメントもしくは有機ポリマーなどの他の化学的部分への共有結合を介するなど、直接的または間接的に、任意の適切な化学結合を利用して実行され得る。そのようなキメラペプチドは、ペプチドのカルボキシ（Ｃ）もしくはアミノ（Ｎ）末端での結合を介して、または直鎖状、分枝状もしくは環状側鎖、内部炭素もしくは窒素原子などの内部化学基への結合を介して連結されてもよい。そのような修飾されたペプチドは、ペプチド合成および／またはペプチドの共有結合の周知方法を利用して、当業者により容易に同定および調製され得る。抗体の蛍光標識の説明は、米国特許第３，９４０，４７５号、同第４，２８９，７４７号、および同第４，３７６，１１０号に詳細に提供されている。
【０１１４】
したがって本明細書に記載されたコンジュゲートは、抗体を脂質、炭水化物、タンパク質、毒素、薬物または他の原子および分子と連結する公知方法により調製することができる。幾つかの実施形態において、該コンジュゲートは、適切な連結または結合を利用して部位特異的コンジュゲーションにより形成される。部位特異的コンジュゲーションは、抗体の結合活性を保存する可能性がより高い。該物質は、チオエーテル結合形成を介して縮小された（ｒｅｄｕｃｅｄ）抗原結合構築物のヒンジ領域でコンジュゲートまたは付着され得る。幾つかの実施形態において、チロシンコンジュゲーションが、用いられ得る。該コンジュゲートを形成するために用いられる他の連結または結合としては、共有結合、非共有結合、ジスルフィド結合、ヒドラゾン結合、エステル結合、アミド結合、およびアミノ結合、イミノ結合、チオセミカルバゾン結合、セミカルバゾン結合、オキシム結合および炭素−炭素結合を挙げることができるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、システインまたは他の結合の態様はいずれも、抗体に含まれる必要はない（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）  Ａｕｔｈｏｒ（ｓ）： Ｇｒｅｇ  Ｔ. Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ ＩＳＢＮ： ９７８−０−１２−３８２２３９−０）。
【０１１５】
部分をコンジュゲートするための例示的方法は、ＷＯ２０１７／０２７３２５または米国特許第９，０７８，９３１号に記載され、それらはそれぞれ全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１１６】
理論に拘束されるのを望むものではないが、本発明者らは、本発明の新規抗体を用いたＮＫｐ４６の結合が、受容体内在化を誘導し、それによりＮＫｐ４６を発現する病原性細胞（例えば、癌細胞）への治療薬の送達に有利になり得ることを示した。
【０１１７】
一実施形態によれば、必要とする対象におけるＮＫｐ４６の発現に関連する癌を予防または処置する方法であって、本発明の幾つかの実施形態の親和性結合部分（例えば、抗体または抗体断片）の治療有効量を該対象に投与することを含む、方法が提供される。
【０１１８】
一実施形態によれば、必要とする対象におけるＮＫｐ４６の発現に関連する癌を予防または処置する際に使用するための、本発明の幾つかの実施形態の親和性結合部分（例えば、抗体または抗体断片）の治療有効量が提供される。
【０１１９】
用語「処置すること」は、疾患、障害もしくは状態の発症を阻害もしくは停止すること、および／または疾患、障害もしくは状態の減少、軽減もしくは復帰を起こすこと、または疾患、障害もしくは状態のリスクを有し得るがまだ該疾患、障害もしくは状態を有すると診断されていない対象において該疾患、障害もしくは状態が生じるのを回避することを指す。様々な方法論およびアッセイを用いて疾患、障害または状態の発症を評定することができ、同様に様々な方法論およびアッセイを用いて疾患、障害または状態の減少、軽減、または復帰を評定し得ることは、当業者に理解されよう。
【０１２０】
本明細書で用いられる用語「予防すること」は、疾患のリスクを有し得るがまだ該疾患を有すると診断されていない対象において該疾患、障害または状態が生じるのを回避することを指す。
【０１２１】
本明細書で用いられる用語「対象」は、病気に罹患し得る任意の年齢または性別の動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを指す。
【０１２２】
本明細書で用いられる用語「癌」は、異常細胞の急速かつ未制御な生育を特徴とする疾患と定義される。癌細胞は、局所に、または血流およびリンパ系を通して身体の他の部分に拡散され得る。
【０１２３】
本発明によれば、該癌は、ＮＫｐ４６の発現に関連する。したがって本発明は、細胞の少なくとも一部がＮＫｐ４６発現細胞である、任意の型の癌を処置するために用いることができる。
【０１２４】
一実施形態によれば、該癌は、造血系の癌である。
【０１２５】
一実施形態によれば、該癌は、白血病またはリンパ腫である。
【０１２６】
一実施形態によれば、該癌は、ＮＫ細胞癌、Ｔ細胞癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、または大顆粒リンパ球（ＬＧＬ）の癌である。
【０１２７】
具体的実施形態によれば、該癌は、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、ＮＫ細胞白血病、Ｔ細胞大顆粒リンパ球性（ＬＧＬ）白血病、菌状息肉症およびＡＬＫ＋未分化大細胞型リンパ腫からなる群から選択される。
【０１２８】
ＮＫｐ４６の発現に関連する癌の診断は、当業者に公知である。したがって例えば、血液検査（例えば、ＮＫｐ４６発現細胞のレベルを計測するためのＦＡＣＳ分析を利用する）、超音波、ＣＴスキャン、ＭＲＩなどを、当業者に公知の通り用いてもよい。
【０１２９】
上述の通り、ＮＫ細胞は、自己免疫疾患の病因に関与し得る。具体的にはＮＫ細胞は、自己免疫性の加速につながり得る組織細胞の直接の殺傷に関与し得る。ＮＫ細胞は、典型的にはＮＫｐ４６受容体をはじめとするＮＫキラー受容体を用いることにより、それらの標的を殺傷する。理論に拘束されるのを望むものではないが、本発明の新規抗体を用いたＮＫｐ４６の結合が、受容体内在化および分解を誘導する可能性があり、それにより様々な自己免疫疾患の予防または処置に有利になる可能性がある。
【０１３０】
一実施形態によれば、必要とする対象における自己免疫疾患を予防または処置する方法であって、本発明の幾つかの実施形態の親和性結合部分（例えば、抗体または抗体断片）の治療有効量を該対象に投与することを含む、方法が提供される。
【０１３１】
一実施形態によれば、必要とする対象における自己免疫疾患を予防または処置する際に使用するための、本発明の幾つかの実施形態の親和性結合部分（例えば、抗体または抗体断片）の治療有効量が提供される。
【０１３２】
本明細書で用いられる用語「自己免疫疾患」は、身体の免疫系が自身の細胞または組織を攻撃する疾患を指す。自己免疫疾患としては、心臓血管疾患、リウマチ疾患、腺疾患、胃腸疾患、皮膚疾患、肝臓疾患、神経疾患、筋肉疾患、腎臓疾患、生殖関連の疾患、結合組織疾患および全身疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３３】
自己免疫心臓血管疾患の例としては、アテローム性硬化症（Ｍａｔｓｕｕｒａ Ｅ. ｅｔ ａｌ., Ｌｕｐｕｓ. １９９８；７ Ｓｕｐｐｌ ２：Ｓ１３５）、心筋梗塞（Ｖａａｒａｌａ Ｏ. Ｌｕｐｕｓ. １９９８；７ Ｓｕｐｐｌ ２：Ｓ１３２）、血栓症（Ｔｉｎｃａｎｉ Ａ. ｅｔ ａｌ., Ｌｕｐｕｓ １９９８；７ Ｓｕｐｐｌ ２：Ｓ１０７−９）、ウェゲナー肉芽腫症、高安動脈炎、川崎症候群（Ｐｒａｐｒｏｔｎｉｋ Ｓ. ｅｔ ａｌ., Ｗｉｅｎ Ｋｌｉｎ Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ ２０００ Ａｕｇ ２５；１１２（１５−１６）：６６０）、抗第ＶＩＩＩ因子自己免疫疾患（Ｌａｃｒｏｉｘ−Ｄｅｓｍａｚｅｓ Ｓ. ｅｔ ａｌ., Ｓｅｍｉｎ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈｅｍｏｓｔ.２０００；２６（２）：１５７）、壊死性小血管炎、顕微鏡的多発血管炎、チャーグ・ストラウス症候群、微量免疫型巣状壊死性半月体形成性糸球体腎炎（Ｎｏｅｌ ＬＨ. Ａｎｎ Ｍｅｄ  Ｉｎｔｅｒｎｅ（Ｐａｒｉｓ）. ２０００ Ｍａｙ；１５１（３）：１７８）、抗リン脂質症候群（Ｆｌａｍｈｏｌｚ Ｒ. ｅｔ ａｌ., Ｊ Ｃｌｉｎ Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ １９９９；１４（４）：１７１）、抗体誘導性心不全（Ｗａｌｌｕｋａｔ  Ｇ. ｅｔ ａｌ., Ａｍ Ｊ Ｃａｒｄｉｏｌ. １９９９ Ｊｕｎ １７；８３ （１２Ａ）：７５Ｈ）、血小板減少性紫斑病（Ｍｏｃｃｉａ Ｆ. Ａｎｎ Ｉｔａｌ Ｍｅｄ  Ｉｎｔ. １９９９ Ａｐｒ−Ｊｕｎ；１４（２）：１１４；Ｓｅｍｐｌｅ ＪＷ. ｅｔ ａｌ., Ｂｌｏｏｄ １９９６ Ｍａｙ １５；８７（１０）：４２４５）、自己免疫溶血性貧血（Ｅｆｒｅｍｏｖ ＤＧ. ｅｔ ａｌ., Ｌｅｕｋ Ｌｙｍｐｈｏｍａ １９９８ Ｊａｎ；２８（３−４）：２８５；Ｓａｌｌａｈ Ｓ. ｅｔ ａｌ., Ａｎｎ Ｈｅｍａｔｏｌ １９９７ Ｍａｒ；７４ （３）：１３９）、シャーガス病における心臓自己免疫性（Ｃｕｎｈａ−Ｎｅｔｏ Ｅ. ｅｔ ａｌ., Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １９９６ Ｏｃｔ １５；９８（８）：１７０９） および抗ヘルパーＴリンパ球自己免疫性（Ｃａｐｏｒｏｓｓｉ ＡＰ. ｅｔ ａｌ., Ｖｉｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９８；１１（１）：９) が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３４】
自己免疫性リウマチ疾患の例としては、関節リウマチ（Ｋｒｅｎｎ Ｖ. ｅｔ ａｌ., Ｈｉｓｔｏｌ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ ２０００ Ｊｕｌ；１５（３）：７９１；Ｔｉｓｃｈ Ｒ, ＭｃＤｅｖｉｔｔ ＨＯ.  Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ｕｎｉｔｓ Ｓ Ａ １９９４ Ｊａｎ １８；９１（２）：４３７）および強直性脊椎炎（Ｊａｎ Ｖｏｓｗｉｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ., Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓ ２００１；３（３）：１８９）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３５】
自己免疫性腺疾患の例としては、膵臓疾患、Ｉ型糖尿病、甲状腺疾患、グレーブス病、甲状腺炎、自然発症自己免疫性甲状腺炎、橋本甲状腺炎、特発性粘液水腫、卵巣自己免疫性、自己免疫性抗精子抗体不妊、自己免疫性前立腺炎およびＩ型多腺性自己免疫症候群が挙げられるが、これらに限定されない。疾患としては、膵臓の自己免疫疾患、Ｉ型糖尿病（Ｃａｓｔａｎｏ Ｌ. ａｎｄ  Ｅｉｓｅｎｂａｒｔｈ  ＧＳ. Ａｎｎ. Ｒｅｖ. Ｉｍｍｕｎｏｌ. ８：６４７；  Ｚｉｍｍｅｔ  Ｐ. Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｒｅｓ Ｃｌｉｎ Ｐｒａｃｔ １９９６ Ｏｃｔ；３４ Ｓｕｐｐｌ：Ｓ１２５）、自己免疫性甲状腺疾患、グレーブス病（Ｏｒｇｉａｚｚｉ Ｊ. Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ Ｃｌｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ａｍ ２０００ Ｊｕｎ；２９（２）：３３９；Ｓａｋａｔａ Ｓ. ｅｔ ａｌ., Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ １９９３ Ｍａｒ；９２（１）：７７)、自然発症自己免疫性甲状腺炎（Ｂｒａｌｅｙ−Ｍｕｌｌｅｎ Ｈ. ａｎｄ  Ｙｕ Ｓ, Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０００ Ｄｅｃ １５；１６５（１２）：７２６２）、橋本甲状腺炎(Ｔｏｙｏｄａ  Ｎ. ｅｔ ａｌ., Ｎｉｐｐｏｎ Ｒｉｎｓｈｏ １９９９ Ａｕｇ；５７（８）：１８１０）、特発性粘液水腫（Ｍｉｔｓｕｍａ  Ｔ. Ｎｉｐｐｏｎ Ｒｉｎｓｈｏ. １９９９ Ａｕｇ；５７（８）：１７５９）、卵巣自己免疫性（Ｇａｒｚａ ＫＭ. ｅｔ ａｌ., Ｊ Ｒｅｐｒｏｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９８ Ｆｅｂ；３７（２）：８７）、自己免疫性抗精子抗体不妊（Ｄｉｅｋｍａｎ ＡＢ. ｅｔ ａｌ., Ａｍ Ｊ Ｒｅｐｒｏｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ. ２０００ Ｍａｒ；４３（３）：１３４）、自己免疫性前立腺炎（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ＲＢ. ｅｔ ａｌ., Ｕｒｏｌｏｇｙ １９９７ Ｄｅｃ；５０（６）：８９３)およびＩ型多腺性自己免疫症候群（Ｈａｒａ  Ｔ. ｅｔ ａｌ., Ｂｌｏｏｄ. １９９１ Ｍａｒ １；７７（５）：１１２７）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３６】
自己免疫性胃腸疾患の例としては、慢性炎症性腸疾患（Ｇａｒｃｉａ Ｈｅｒｏｌａ Ａ. ｅｔ ａｌ., Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ. ２０００ Ｊａｎ；２３  （１）：１６）、セリアック病（Ｌａｎｄａｕ ＹＥ. ａｎｄ  Ｓｈｏｅｎｆｅｌｄ Ｙ. Ｈａｒｅｆｕａｈ ２０００ Ｊａｎ １６；１３８（２）：１２２）、クローン病、回腸炎および潰瘍性大腸炎をはじめとする炎症性腸疾患（ＩＢＤ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３７】
自己免疫性皮膚疾患の例としては、非限定的に尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡および落葉性天疱瘡などの自己免疫性水疱性皮膚疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３８】
自己免疫性肝臓疾患の例としては、非限定的に、肝炎、自己免疫性慢性活動性肝炎（Ｆｒａｎｃｏ Ａ. ｅｔ ａｌ., Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ １９９０ Ｍａｒ；５４  （３）：３８２）、原発性胆汁性肝硬変（Ｊｏｎｅｓ ＤＥ. Ｃｌｉｎ Ｓｃｉ（Ｃｏｌｃｈ）  １９９６ Ｎｏｖ；９１（５）：５５１；Ｓｔｒａｓｓｂｕｒｇ ＣＰ. ｅｔ ａｌ., Ｅｕｒ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ. １９９９ Ｊｕｎ；１１（６）：５９５）および自己免疫性肝炎（Ｍａｎｎｓ ＭＰ. Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ ２０００ Ａｕｇ；３３（２）：３２６）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３９】
自己免疫性神経疾患の例としては、多発性硬化症（ＭＳ, Ｃｒｏｓｓ ＡＨ. ｅｔ ａｌ., Ｊ Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ ２００１ Ｊａｎ １；１１２（１−２）：１）、アルツハイマー病（Ｏｒｏｎ Ｌ. ｅｔ ａｌ., Ｊ Ｎｅｕｒａｌ Ｔｒａｎｓｍ Ｓｕｐｐｌ. １９９７；４９：７７)、重症筋無力症（Ｉｎｆａｎｔｅ ＡＪ. Ａｎｄ Ｋｒａｉｇ Ｅ, Ｉｎｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９９；１８ （１−２）：８３；Ｏｓｈｉｍａ Ｍ. ｅｔ ａｌ., Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９０ Ｄｅｃ；２０（１２）：２５６３）、神経障害、運動神経障害（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ ＡＪ. Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ. ２０００ Ｍａｙ；７  （３）：１９１）；ギラン・バレー症候群および自己免疫性神経障害（Ｋｕｓｕｎｏｋｉ Ｓ. Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ  Ｓｃｉ. ２０００ Ａｐｒ；３１９（４）：２３４）、筋無力症、ランバート・イートン筋無力症候群（Ｔａｋａｍｏｒｉ Ｍ. Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ  Ｓｃｉ. ２０００ Ａｐｒ；３１９ （４）：２０４）；傍腫瘍性神経症、小脳萎縮、傍腫瘍性小脳萎縮およびスティッフ・マン症候群（Ｈｉｅｍｓｔｒａ ＨＳ. ｅｔ ａｌ.,  Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ  Ｓｃｉ ｕｎｉｔｓ Ｓ Ａ ２００１ Ｍａｒ ２７；９８（７）：３９８８）；非傍腫瘍性スティッフ・マン症候群、進行性小脳萎縮、脳炎、ラスムッセン脳炎、筋萎縮性側索硬化症、シデナム舞踏病、ジル・ド・ラ・トゥレット症候群および自己免疫性多腺性内分泌障害（Ａｎｔｏｉｎｅ ＪＣ. ａｎｄ  Ｈｏｎｎｏｒａｔ Ｊ. Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｌ（Ｐａｒｉｓ）  ２０００ Ｊａｎ；１５６（１）：２３）；ディスイミューンニューロパチー（ｄｙｓｉｍｍｕｎｅ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）（Ｎｏｂｉｌｅ−Ｏｒａｚｉｏ Ｅ. ｅｔ ａｌ., Ｅｌｅｃｔｒｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｇｒ Ｃｌｉｎ Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ Ｓｕｐｐｌ １９９９；５０：４１９）；後天性神経性筋強直症、先天性多発性関節拘縮症（Ｖｉｎｃｅｎｔ Ａ. ｅｔ ａｌ., Ａｎｎ  Ｎ Ｙ Ａｃａｄ  Ｓｃｉ. １９９８ Ｍａｙ １３；８４１：４８２）、神経炎、視神経炎（Ｓｏｄｅｒｓｔｒｏｍ Ｍ. ｅｔ ａｌ., Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ １９９４ Ｍａｙ；５７（５）：５４４）および神経変性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４０】
自己免疫性筋肉疾患の例としては、筋炎、自己免疫性筋炎および原発性シェーグレン症候群（Ｆｅｉｓｔ Ｅ. ｅｔ ａｌ., Ｉｎｔ Ａｒｃｈ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０００ Ｓｅｐ；１２３（１）：９２）ならびに平滑筋自己免疫疾患（Ｚａｕｌｉ Ｄ. ｅｔ ａｌ., Ｂｉｏｍｅｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ １９９９ Ｊｕｎ；５３（５−６）：２３４）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４１】
自己免疫性腎臓疾患の例としては、腎炎および自己免疫性間質性腎炎（Ｋｅｌｌｙ ＣＪ. Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ １９９０ Ａｕｇ；１（２）：１４０）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４２】
生殖に関連する自己免疫疾患の例としては、反復性流産（ｒｅｐｅａｔｅｄ ｆｅｔａｌ ｌｏｓｓ）（Ｔｉｎｃａｎｉ Ａ. ｅｔ ａｌ., Ｌｕｐｕｓ １９９８；７ Ｓｕｐｐｌ ２：Ｓ１０７−９）が挙げられるが、これに限定されない。
【０１４３】
自己免疫性結合組織疾患の例としては、耳疾患、自己免疫性耳疾患（Ｙｏｏ  ＴＪ. ｅｔ ａｌ., Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９４ Ａｕｇ;１５７（１）:２４９)および内耳の自己免疫疾患（Ｇｌｏｄｄｅｋ Ｂ． ｅｔ ａｌ., Ａｎｎ  Ｎ Ｙ Ａｃａｄ  Ｓｃｉ １９９７ Ｄｅｃ ２９;８３０:２６６）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４４】
自己免疫性全身疾患の例としては、全身エリテマトーデス（Ｅｒｉｋｓｏｎ Ｊ. ｅｔ ａｌ., Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ １９９８；１７（１−２）：４９）および全身性硬化症（Ｒｅｎａｕｄｉｎｅａｕ Ｙ. ｅｔ ａｌ., Ｃｌｉｎ Ｄｉａｇｎ Ｌａｂ Ｉｍｍｕｎｏｌ. １９９９ Ｍａｒ；６（２）：１５６）；  Ｃｈａｎ ＯＴ. ｅｔ ａｌ., Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ １９９９ Ｊｕｎ；１６９：１０７）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４５】
一実施形態によれば、本発明の抗体は、疾患発病時、疾患軽減時、疾患の急性期、または疾患の慢性期に自己免疫疾患を有する対象に投与される。
【０１４６】
本発明の親和性結合部分（例えば、抗体または抗体断片）のための一特異的使用は、必要とする対象における糖尿病を予防または処置するためのものである。
【０１４７】
本明細書で用いられる「糖尿病」は、生物体の、インスリンの生合成もしくは産生の欠如によるインスリンの絶対的欠乏（Ｉ型糖尿病）、またはインスリン抵抗性の存在下でのインスリンの相対的欠乏（ＩＩ型糖尿病）、即ちインスリン作用の損傷、のいずれかにより生じる疾患を指す。したがって糖尿病患者は、絶対的または相対的インスリン欠乏を有し、他の症状および兆候のうち、血糖濃度の上昇、糖尿の存在、過剰の尿排泄（多尿症）、口渇の増加（多飲症）および空腹感の増加（過食症）を呈する場合がある。症状は、特に小児では、Ｉ型糖尿病で極めて急速に（例えば、数週間または数ヶ月以内に）発症する場合がある。しかしＩＩ型糖尿病では、症状が、かなり緩やかに発症する場合があり、とらえがたい、または完全に存在しない場合がある。糖尿病（両方の型）は、急速かつ有意な体重減少（摂食が正常または増加しているにもかかわらず）および整復不能の精神疲労を引き起こす場合もある。本明細書で用いられる糖尿病は、非限定的にＩ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、代謝症候群、インスリン欠乏症候群、顕性糖尿病、糖尿病前症、成人潜在性自己免疫性糖尿病（ＬＡＤＡ）、若年発症成人型糖尿病（ＭＯＤＹ１〜１１）および永続型新生児糖尿病をはじめとする任意の段階または型の糖尿病を包含する。
【０１４８】
一実施形態によれば、該糖尿病は、Ｉ型糖尿病である。
【０１４９】
一実施形態によれば、該糖尿病は、ＩＩ型糖尿病である。
【０１５０】
一実施形態によれば、本発明の抗体は、前インスリン炎（ｐｒｅ−ｉｎｓｕｒｉｔｉｓ）、早期インスリン炎、糖尿病前症および／または顕性糖尿病を含むＩ型糖尿病のある段階で該対象に投与される。
【０１５１】
別の実施形態によれば、本発明の抗体は、高インスリン血症、糖尿病前症および／または顕性糖尿病を含むＩＩ型糖尿病のある段階で該対象に投与される。
【０１５２】
糖尿病または自己免疫疾患の診断は、当業者に公知である。したがって例えばテストを用いて、例えば空腹時血漿グルコース（ＦＰＧ）テスト、経口糖負荷テスト（ＯＧＴＴ）、随時血漿グルコース（ＲＰＧ）テスト、Ａ１Ｃテストおよび血清インスリンレベルテストをはじめとするグルコースおよびインスリンレベル（例えば、血液またな尿のレベル）を測定することにより、糖尿病または糖尿病前症を診断してもよい。同様に、任意の数のテストを用いて、自己免疫疾患を診断してもよい（テストされる疾患のタイプおよび対象に応じて）。したがって例えば、血液検査、超音波、ＣＴスキャン、ＭＲＩなどを、当業者に公知の通り用いてもよい。
【０１５３】
本発明の幾つかの実施形態の親和性結合部分（例えば、抗体または抗体断片）をそれ自体で、または適当な担体もしくは賦形剤と混合された医薬組成物中で、生物体に投与することができる。
【０１５４】
特記事項として、本明細書に記載された核酸構築物は、本明細書の以下にさらに記載される通り、必要とする対象（例えば、自己免疫疾患を有する対象）に投与される場合にインビボ使用で使用されてもよい。
【０１５５】
本明細書で用いられる「医薬組成物」は、本明細書に記載された有効成分の１種または複数と、生理学的に適切な担体および賦形剤などの他の化学成分との調製物を指す。医薬組成物の目的は、生物体への化合物の投与を容易にすることである。
【０１５６】
本明細書の用語「有効成分」は、生物学的効果を担う親和性結合部分（例えば、抗体または抗体断片）を指す。
【０１５７】
本明細書で以後、互換的に用いられ得る成句「生理学的に許容できる担体」および「医薬的に許容できる担体」は、生物体に著しい刺激を引き起こさず、投与された化合物の生物活性および特性を排除しない担体または希釈剤を指す。アジュバントは、これらの成句に含まれる。
【０１５８】
本明細書における用語「賦形剤」は、有効成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性物質を指す。賦形剤の非限定的な例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖類およびデンプンのタイプ、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、ならびにポリエチレングリコールが挙げられる。
【０１５９】
薬物の配合および投与のための技術は、参照により本明細書に組み入れられる“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ's  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ,” Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ., Ｅａｓｔｏｎ,  ＰＡの最新版に見出すことができる。
【０１６０】
適切な投与経路は、例えば経口、直腸、経粘膜、特に経鼻、腸内、または筋肉内、皮下および髄内注射をはじめとする非経口送達に加え、髄腔内、直接心室内、心内、例えば右心室もしくは左心室内腔へ、総冠動脈へ、静脈内、腹腔内、鼻内、または眼内注射を挙げることができる。
【０１６１】
あるいは、全身的手法よりむしろ局所へ、例えば患者の組織領域への直接の該医薬組成物の注射を介して、該医薬組成物を投与してもよい。
【０１６２】
本発明の幾つかの実施形態の医薬組成物は、当業者に周知の工程により、例えば従来の混合、溶解、造粒、糖剤作製、研和、乳化、カプセル化、封入または凍結乾燥工程によって、製造することができる。
【０１６３】
こうして本発明の幾つかの実施形態による使用のための医薬組成物は、医薬的に用いられ得る調製物への有効成分のプロセシングを容易にする賦形剤および助剤を含む１種または複数の生理学的に許容できる担体を用いて従来の方法で配合されてもよい。適当な配合物は、選択された投与経路に依存する。
【０１６４】
注入の場合、該医薬組成物の有効成分は、水溶液に、好ましくはハンクス液、リンゲル液、または生理学的塩緩衝剤などの生理学的に適合する緩衝剤に、配合させることができる。経粘膜投与の場合、透過されるバリアに適した浸透剤を、配合物中で使用する。そのような浸透剤は、当該技術分野で概ね公知である。
【０１６５】
経口投与の場合、該医薬組成物は、有効成分を当該技術分野で周知の医薬的に許容できる担体と混和することにより、即座に配合させることができる。そのような担体は、該医薬組成物を、患者による経口摂取のための錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液体、ゲル剤、シロップ、スラリー、懸濁剤などとして配合させる。経口使用される医薬調製物が、固形賦形剤を用いて作製され、得られた混合物を場合により粉砕し、その顆粒混合物を、所望なら適切な助剤を添加した後に、加工して錠剤または糖剤コアを得ることができる。適切な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖類などの充填剤；セルロース調製物、例えばトウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの生理学的に許容できるポリマーである。所望なら、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩、例えばアルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤を添加してもよい。
【０１６６】
糖剤コアには、好適なコーティングが施される。この目的のために、高濃度の糖溶液を使用してもよく、この場合、糖溶液は、場合によりアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液および適切な有機溶媒または溶媒混合物を含有してもよい。色素または顔料が、活性化合物用量の同定のため、または活性化合物用量の異なる組み合せを特徴づけるために、錠剤または糖剤コーティングに添加されてもよい。
【０１６７】
経口使用され得る医薬組成物としては、ゼラチンから作製されたプッシュ・フィット型カプセルに加え、ゼラチンとグリセロールまたはソルビトールなどの可塑剤とから作製された軟質の密封カプセルが挙げられる。プッシュ・フィット型カプセルは、ラクトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなど滑沢剤、そして場合により安定化剤と混合された有効成分を含有し得る。軟カプセルでは、有効成分を、脂肪油、流動パラフィンまたは液状のポリエチレングリコールなどの適切な液体に溶解または懸濁させることができる。加えて、安定化剤が、添加され得る。経口投与される配合物は全て、選ばれた投与経路に適した投薬量でなければならない。
【０１６８】
口腔投与の場合、該組成物は、従来の手法で配合された錠剤またはトローチの形態を取ってもよい。
【０１６９】
鼻吸入による投与の場合、本発明の幾つかの実施形態による使用のための有効成分は、適切な噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンまたは二酸化炭素の使用により加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー提供の形態で簡便に送達される。加圧されたエアロゾルの場合、投与単位は、計量された量を送達するためのバルブを備えることによって計測されてもよい。例えばディスペンサーで使用されるゼラチン製の、カプセルおよびカートリッジが、該化合物と、ラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末基剤との粉末混合物を含有するように配合されてもよい。
【０１７０】
本明細書に記載された医薬組成物は、例えば、ボーラス注射または持続注入により、非経口投与のために配合されてもよい。注射用配合物は、例えばアンプルにおいて単位投与剤形で、または反復投与容器において、場合により添加された防腐剤と共に提供され得る。該組成物は、油性または水性ビヒクルにおける懸濁液または溶液またはエマルションであり得、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤などの配合剤を含有してもよい。
【０１７１】
非経口投与のための医薬組成物は、水溶性形態の活性調製物の水溶液を含む。加えて、有効成分の懸濁物を、適切な油性または水系注射懸濁液として調製してもよい。適切な親油性の溶媒またはビヒクルとしては、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチルなどの合成脂肪酸エステル、トリグリセリドまたはリポソームが挙げられる。水性注射用懸濁液は、懸濁液の粘度を増大させる物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランを含有してもよい。場合により該懸濁液はまた、高濃度の溶液の調製を可能にするために、適切な安定化剤または有効成分の溶解度を上昇させる薬剤を含有してもよい。
【０１７２】
あるいは該有効成分は、使用前に適切なビヒクル、例えば滅菌パイロジェンフリー水に基づく溶液により構成される粉末形態であってもよい。
【０１７３】
本発明の幾つかの実施形態の医薬組成物はまた、例えばカカオバターまたは他のグリセリドなどの従来の坐薬ベースを使用して、坐薬または停留浣腸剤などの直腸用組成物に配合されてもよい。
【０１７４】
本発明の幾つかの実施形態に照らした使用に適した医薬組成物としては、有効成分を意図する目的を実現するのに効果的な量で含有する組成物を包含する。より具体的には、治療有効量は、障害（例えば、癌、または糖尿病などの自己免疫疾患）の症状を予防、緩和もしくは好転する、または処置される対象の生存を延長するのに効果的な有効成分（即ち、親和性結合部分、例えば抗体または抗体断片）の量を意味する。
【０１７５】
一実施形態によれば、該治療有効量は、該親和性結合部分（例えば、抗体または抗体断片）の投与後に、対象の血中インスリンレベルの上昇および／または血糖レベルの低下(例えば、正常なレベルに)をもたらす。
【０１７６】
血中インスリンレベルおよび／または血糖レベルの測定は、当業者に公知であり、本明細書の先に詳細に記載されている。
【０１７７】
一実施形態によれば、該治療有効量は、該親和性結合部分（例えば、抗体または抗体断片）の投与後に、対象の膵臓ベータ細胞破壊の減少をもたらす。
【０１７８】
膵臓細胞量の測定は、例えば、生検による、磁気共鳴造影（ＭＲＩ）を用いる、または核造影を用いるなどの当該技術分野で公知の任意の方法に従って使用してもよい。したがって例えば膵臓細胞量の測定は、β細胞量の変動の視覚化を可能にする薬剤を用いた、例えばＲｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ.,  Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ  （２０１１）  １０８（３１）：１２８１５−２０に教示された近赤外蛍光β細胞造影剤を用いた、もしくは放射性同位体標識蛍光β細胞造影剤を用いた、またはＭｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ. Ｄｉａｂｅｔｅｓ  （２００１）, Ｖｏｌ. ５０（１０）： ２２３１−２２３６に教示された、核造影のための放射性同位体キレート化剤で修飾されたβ細胞特異性モノクローナル抗体ＩＣ２を用いた、非侵襲的造影を利用して実施してもよい。
【０１７９】
一実施形態によれば、該治療有効量は、該親和性結合部分（例えば、抗体または抗体断片）の投与後に、対象における癌細胞の量の減少をもたらす。
【０１８０】
癌細胞レベルの測定は、当該技術分野で公知の任意方法を用いて、例えば生検により、磁気共鳴造影（ＭＲＩ）を用いて、核造影技術を用いて、ＣＴスキャンにより、超音波により、または血液検査により（例えば、ＮＫｐ４６発現細胞のレベルを計測するためにＦＡＣＳ分析を利用して）実施されてもよい。
【０１８１】
治療有効量の計測は、特に本明細書に提供された詳細な開示に照らして、当業者の能力の範囲内で充分に行われる。
【０１８２】
本発明の方法で用いられる任意の調製物の場合、該治療有効量または用量は、最初はインビトロおよび細胞培養アッセイから推定され得る。例えば用量が、所望の濃度または力価を実現するように動物モデルで配合され得る。そのような情報を用いて、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。
【０１８３】
本発明の方法に用いられる任意の調製物の場合、該治療有効量または用量は、動物モデル（例えば、ＳＴＺ糖尿病マウス、ＮＫ癌細胞のためのマウス異種移植片モデル）から推定して、所望の濃度または力価を実現することができる。そのような情報を用いて、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。
【０１８４】
本明細書に記載された有効成分の毒性および治療有効性は、インビトロで標準の医薬手順により、細胞培養において、または実験動物で決定され得る。インビトロおよび細胞培養アッセイ、ならびに動物試験におけるこれらから得られたデータは、ヒトにおける使用のための一定範囲の投与量を配合する際に用いることができる。該投与量は、用いられる投与剤形および利用される投与経路に応じて変動してもよい。厳密な配合、投与経路および投与量は、患者の状態を考慮して個々の医師により選択され得る（例えば、Ｆｉｎｇｌ, ｅｔ ａｌ., １９７５, ｉｎ ”Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”, Ｃｈ. １  ｐ.１参照)。
【０１８５】
処置される状態の重症度および応答性に応じて、投与は、単回または複数回になり得、処置期間は、数日から数週間継続されるか、または治癒されるまで、もしくは疾患状態の消失が実現するまでである。
【０１８６】
投与される組成物の量はもちろん、処置される対象、苦痛の度合い、投与の手法、処方する医師の判断などに依存するであろう。
【０１８７】
適合性のある医薬担体中で配合される本発明の調製物を含む組成物は、調製されて適当な容器に入れられ、適応症（例えば、癌または糖尿病などの自己免疫疾患）の処置についてラベル表記されてもよい。
【０１８８】
本発明の幾つかの実施形態の組成物は、所望なら、有効成分を含有する１つまたは複数の単位投与剤形を含有し得るＦＤＡ認可のキットなどのパックまたはディスペンサー装置の中で提供されてもよい。該パックは、例えばブリスターパックなどの金属またはプラスチックホイルを含んでいてもよい。該パックまたはディスペンサー装置は、投与のための使用説明書を随伴していてもよい。該パックまたはディスペンサーは、医薬品の製造、使用または販売を管理する政府機関によって定められた形態で容器に添付された注意書きが収納されていてもよく、該注意書きは、組成物の形態またはヒトもしくは獣医学的投与の関係機関による認可を反映するものである。例えばそのような注意書きは、処方薬のための米国食品医薬品局により認可されたラベル、または認可された製品の挿入物であってもよい。適合性のある医薬担体中に配合された本発明の調製物を含む組成物は、さらに上述の通り、調製され、適当な容器に入れられて、適応症の処置についてラベル表記されてもよい。
【０１８９】
該製造品が、糖尿病のための別の治療組成物、例えばインスリンをさらに含み得ることは、認識されよう。したがって例えば、両方の治療的処置のために、該抗体またはその断片を１つの容器に包装することができ、インスリンを第二の容器に包装してもよい。
【０１９０】
一実施形態によれば、該インスリン組成物は、治療薬について知られる任意の型のインスリンを含んでいてもよい。したがって例えば本発明のインスリンとしては、即時作用型インスリン（例えば、典型的には数分以内に作用を開始し、２、３時間持続する）、規則的または短期作用型インスリン（例えば、典型的には完全に作用するのに約３０分かかり、３〜６時間持続する）、中期作用型インスリン（例えば典型的には完全に作用するのに２〜４時間かかり、その効果が最大１８時間持続し得る）、または長期作用型インスリン（例えば、典型的には血中のピークレベルがなく、終日作用を継続し得る）を挙げることができる。
【０１９１】
該製造品が、癌のための別の治療組成物、例えば抗癌剤をさらに含み得ることは、認識されよう。したがって例えば、両方の治療的処置のために、該親和性結合部分（例えば、抗体または抗体断片）を１つの容器に包装することができ、抗癌剤を第二の容器に包装してもよい。
【０１９２】
本発明の特定の実施形態において、そして疾患処置を改善するために、本発明の幾つかの実施形態の親和性結合部分（例えば、抗体または抗体断片）は、非限定的に化学療法、放射線療法、ホルモン療法、標的治療、免疫療法、手術による治療、癌ワクチン、抗炎症剤および／または補助食品をはじめとする、自己免疫疾患の処置または抗癌治療用の任意の数の関連治療薬と共に実行される。そのような治療およびそれを使用する方法は、当業者に周知である。
【０１９３】
上述の通り、本発明の幾つかの実施形態の親和性結合部分（例えば、抗体または抗体断片）は、診断適用に適する。
【０１９４】
本発明の一態様によれば、対象におけるＮＫｐ４６の発現を検出する方法であって、該対象の生体試料を本発明の幾つかの実施形態の親和性結合部分（例えば、抗体または抗体断片）と接触させること、および該親和性結合部分（例えば、抗体または抗体断片）と該ＮＫｐ４６の間の結合を検出こと、により該対象の生体試料中のＮＫｐ４６の発現を検出し、それにより該対象のＮＫｐ４６の発現を検出すること、を含む、方法が提供される。
【０１９５】
本明細書で用いられる用語「検出すること」は、細胞を検出、知覚、露出、暴露、視覚化または同定する活動を指す。検出の精密な方法は、該親和性結合部分（例えば、抗体または抗体断片）が本明細書の以下にさらに記載される通り付着される検出可能な部分（本明細書では同定可能な部分とも称される）に依存する。
【０１９６】
本明細書で用いられる「生体試料」は、非限定的に、例えば血漿、血清、髄液、リンパ液、皮膚の外側の部分、呼吸管、腸管および泌尿生殖路、涙液、唾液、痰、乳、血液細胞、腫瘍、神経組織、臓器、およびインビボ細胞培養構成物の試料をはじめとする、対象から単離された組織または流体の試料を指す。「対象から得られた生体試料」が、以下により詳細に記載される通り、場合により対象から生理学的に除去されていない試料も含み得ることが、留意されなければならない。
【０１９７】
一実施形態によれば、該生体試料は、細胞または細胞内容物を含有する。
【０１９８】
本発明により用いられる細胞は、対象に由来する任意の細胞であり得る。例としては、血液細胞、骨髄細胞、肝臓細胞、脾臓細胞、腎臓細胞、心臓細胞、皮膚細胞（例えば、上皮細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト）、リンパ節細胞、ならびに羊水細胞、胎盤細胞（例えば、胎児栄養芽細胞）および／または臍帯血細胞などの胎児細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９９】
対象の該当する変異体のＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはポリペプチドのレベル（例えば、ＮＫｐ４６発現）を決定するために、数多くの周知組織または流体回収方法が、対象からの生体試料または細胞を回収するために用いられ得る。
【０２００】
例としては、細針生検、針生検、コア針生検および外科生検（例えば、脳生検）、口腔粘膜塗抹および洗浄が挙げられるが、これらに限定されない。用いられる手順に関わらず、生検／試料が得られたら、該変異体のレベルを計測することができ、それにより診断を行うことができる。
【０２０１】
上述の検出方法は、ＮＫｐ４６の発現に関連する自己免疫疾患または癌の診断につなぐことができる。
【０２０２】
本発明の一態様によれば、対象におけるＮＫｐ４６の発現に関連する自己免疫疾患または癌を診断する方法であって、（ａ）ＮＫｐ４６と本発明の幾つかの実施形態の親和性結合部分（例えば、抗体または抗体断片）の間で免疫複合体の形成を可能にする条件下で、該対象から得られた生体試料を該親和性結合部分（例えば、抗体または抗体断片）と接触させること；および（ｂ）該生体試料中の該免疫複合体のレベルを計測すること、を含み、健常個体からの生体試料中の該免疫複合体のレベルに関する所定の閾値を超える該免疫複合体のレベルの上昇が、ＮＫｐ４６発現に関連する自己免疫疾患または癌の指標となる、方法が提供される。
【０２０３】
本発明の一態様によれば、対象におけるＮＫｐ４６の発現に関連する自己免疫疾患または癌を診断および処置する方法であって、（ａ）ＮＫｐ４６と本発明の幾つかの実施形態の親和性結合部分または抗体の間で免疫複合体の形成を可能にする条件下で、該対象の生体試料を該親和性結合部分（例えば、抗体または抗体断片）と接触させること；（ｂ）該生体試料中のＮＫｐ４６免疫複合体の発現を検出すること；（ｃ）健常個体からの生体試料中の該免疫複合体のレベルに関する所定の閾値を超える該免疫複合体のレベルが上昇している場合、該対象をＮＫｐ４６発現に関連する自己免疫疾患または癌と診断すること；ならびに（ｄ）ＮＫｐ４６発現に関連する自己免疫疾患または癌の処置のための治療薬を該診断された対象に投与し、それにより該対象におけるＮＫｐ４６発現に関連する自己免疫疾患または癌を診断および処置すること、を含む、方法が提供される。
【０２０４】
一実施形態によれば、生体試料は、親和性結合部分との接触前に該対象から得られる。
【０２０５】
本発明の一態様によれば、ＮＫｐ４６発現に関連する自己免疫疾患または癌の処置のための薬剤の処置をモニタリングする方法であって、（ａ）ＮＫｐ４６発現に関連する自己免疫疾患または癌の処置のための薬剤で、必要とする対象を処置すること；および（ｂ）該処置の前および後に、該対象の生体試料中のＮＫｐ４６の発現を検出すること、を含み、該ＮＫｐ４６の発現を検出することが、該生体試料を該本発明の幾つかの実施形態の親和性結合部分（例えば、抗体または抗体断片）と接触させること、および該親和性結合部分または抗体と該ＮＫｐ４６の間の結合を検出すること、により実行され、該処置前の該ＮＫｐ４６の発現レベルに比較した、該処置後の該ＮＫｐ４６のより低い発現レベルが、効率的処置の指標となる、方法が提供される。
【０２０６】
一実施形態によれば、該方法は、処置前に対象からの生体試料を得ることをさらに含む。
【０２０７】
本明細書で用いられる用語「診断すること」は、疾患を分類すること、疾患の重症度（等級または段階）を計測すること、進行をモニタリングすること、疾患の転帰および／または回復の見込みを予測することを指す。
【０２０８】
該対象は、日常的な健康診断を受けている健常対象（例えば、ヒト）であり得る。あるいは該対象は、疾患のリスクがあり得る。あるいは該方法は、処置の有効性をモニタリングするために用いられ得る。
【０２０９】
該親和性結合部分（例えば、抗体または抗体断片）は、例えば同定可能な部分を含んでも、例えばそれに付着されていてもよい。代わりまたは追加として、該親和性結合部分（例えば、抗体または抗体断片）は、二次抗体を用いるなどにより間接的に同定されてもよい。
【０２１０】
上述の通り、本発明の方法は、本発明の免疫複合体（例えば、本発明の親和性結合部分（例えば、抗体または抗体断片）と、典型的には細胞上で発現された場合の該ＮＫｐ４６ペプチドとの複合体）を形成するのに十分な条件下で実行され、そのような条件（例えば、適当な濃度、緩衝剤、温度、反応時間）およびそのような条件を最適化する方法は、当業者に公知であり、例を本明細書の以下に開示する。
【０２１１】
一実施形態によれば、診断は、当該技術分野で公知の任意診断方法、例えば血液検査、ＭＲＩ、超音波またはＣＴスキャンを利用して裏づけられる。
【０２１２】
本明細書で用いられる用語「約」は、±１０％を指す。
【０２１３】
用語「含む」、「含むこと」、「包含する」、「包含すること」、「有すること」およびそれらの活用形は、「非限定的に含むこと」を意味する。
【０２１４】
用語「からなる」は、「含み、かつ限定される」を意味する。
【０２１５】
用語「本質的になる」は、追加の成分、ステップおよび／または部分が請求された組成物、方法または構造の基本的および新規な特徴を実質的に改変しない場合のみ、該組成物、方法または構造が該追加の成分、ステップおよび／または部分を含み得ることを意味する。
【０２１６】
本明細書で用いられる単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈で他に明白に規定されない限り、複数の対象を包含する。例えば用語「化合物」または「少なくとも１種の化合物」は、混合物をはじめとする複数の化合物を包含し得る。
【０２１７】
本出願全体を通して、本発明の様々な実施形態は、範囲の形式で表される場合がある。範囲の形式での記載が単に簡便さおよび明瞭さのためで、本発明の範囲への確固たる限定と解釈されてはならないことが、理解されるべきである。したがって範囲の記載は、具体的に開示された全ての可能な部分的範囲およびその範囲内の個々の数値を有すると見なされるべきである。例えば１から６などの範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などの具体的に開示された部分的範囲、ならびにその範囲内の個々の数字、例えば１、２、３、４、５および６を有すると見なされるべきである。これは、範囲の幅に関わらず適用される。
【０２１８】
数値範囲が、本明細書で示されている場合、それは、示された範囲内の任意の引用された数字（少数または整数）を含むことを意味する。第一の標示数と第二の標示数の「の間の範囲の／範囲である」、および第一の表示数「から」第二の標示数「までの範囲の／範囲である」という成句は、本明細書では互換的に用いられ、第一の標示数および第二の標示数、ならびにそれらの間の全ての小数および整数を含むことを意味する。
【０２１９】
本明細書で用いられる用語「方法」は、所与の職務を遂行するための手法、手段、技術および手順、例えば非限定的に化学、薬理学、生物学、生化学および医薬の技術分野の実践者に知られた、または該実践者に知られた手法、手段、技術および手順から即座に開発された、それらの手法、手段、技術および手順を指す。
【０２２０】
本発明の特定の特色は、明瞭にするために別個の実施形態という状況で記載されるが、単一の実施形態の組み合わせで提供されてもよい。反対に、本発明の様々な特色は、簡潔にするために単一の実施形態の状態で記載されるが、別個に提供されても、または任意の適切な部分的組み合わせで、もしくは適宜、本発明の任意の他の記載された実施形態で、提供されてもよい。様々な実施形態という状況で記載された特定の特色は、その実施形態がそれらの要素を含まなければ作動しない場合を除き、それらの実施形態の本質的特色と見なしてはならない。
【０２２１】
先に叙述され、以下の特許請求の範囲の節で請求された本発明の様々な実施形態および態様は、以下の実施例に実験的裏づけを見出す
【０２２２】
本出願に開示された任意の配列識別番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）がＤＮＡ配列の形式またはＲＮＡ配列の形式のみで表現されていたとしても、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯが言及された状況に応じて、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列のいずれかを指し得ることを理解されたい。例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１は、ＤＮＡ配列形式で表現されるが（例えば、チミジンの場合Ｔで列挙）、それは、抗体の核酸配列に対応するＤＮＡ配列、またはＲＮＡ分子の核酸配列のＲＮＡ配列のいずれかを指し得る。同様に、幾つかの配列は、記載された分子の実際のタイプに応じて、ＲＮＡ配列形式（例えば、ウラシルの場合Ｕと列挙）で表現されるが、それは、ｄｓＲＮＡを含むＲＮＡ分子の配列、または示されたＲＮＡ配列に対応するＤＮＡ分子の配列のいずれかを指し得る。いずれの場合でも、任意の置換基と共に開示された配列を有するＤＮＡおよびＲＮＡの両方の分子が、想定される。
【０２２３】
実施例
ここに、先の記載と併せて以下の実施例を参照するが、これは本発明を非限定的様式で例示するものである。
【０２２４】
一般に、本明細書で用いられる専門語および本発明で利用される検査手順は、分子、生化学、微生物および組換えＤＮＡの技術を包含する。そのような技術は、文献に完全に説明されている。例えば"Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ:  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ"  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ ａｌ., （１９８９）；  ”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ” Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＩＩ Ａｕｓｕｂｅｌ, Ｒ． Ｍ．, ｅｄ.  （１９９４）；  Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ., ”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”, Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ  Ｓｏｎｓ, Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ, Ｍａｒｙｌａｎｄ  （１９８９）；  Ｐｅｒｂａｌ, ”Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”, Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ, Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ  （１９８８）；  Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ., ”Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ”, Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ, Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ;  Ｂｉｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ.  （ｅｄｓ）  ”Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ: Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ”, Ｖｏｌｓ. １−４, Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ, Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ  （１９９８）；米国特許第４，６６６，８２８号、同第４，６８３，２０２号、同第４，８０１，５３１号、同第５，１９２，６５９号および同第５，２７２，０５７号に示された方法論;”Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ: Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ”, Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＩＩ Ｃｅｌｌｉｓ, Ｊ. Ｅ．, ｅｄ.  （１９９４）；”Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ” Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＩＩ Ｃｏｌｉｇａｎ Ｊ. Ｅ．, ｅｄ.  （１９９４）；  Ｓｔｉｔｅｓ ｅｔ ａｌ.  （ｅｄｓ）, ”Ｂａｓｉｃ ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ）, Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ,  Ｎｏｒｗａｌｋ, ＣＴ  （１９９４）；  Ｍｉｓｈｅｌｌ ａｎｄ  Ｓｈｉｉｇｉ  （ｅｄｓ）, ”Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”, Ｗ. Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ  Ｃｏ., Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ  （１９８０）を参照されたい；利用可能な免疫アッセイは、特許および科学文献に詳細に記載されており、例えば米国特許第３，７９１，９３２号、同第３，８３９，１５３号、同第３，８５０，７５２号、同第３，８５０，５７８号、同第３，８５３，９８７号、同第３，８６７，５１７号、同第３，８７９，２６２号、同第３，９０１，６５４号、同第３，９３５，０７４号、同第３，９８４，５３３号、同第３，９９６，３４５号、同第４，０３４，０７４号、同第４，０９８，８７６号、同第４，８７９,２１９号、同第５，０１１，７７１号および同第５，２８１，５２１号、”Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ” Ｇａｉｔ, Ｍ． Ｊ., ｅｄ.  （１９８４）；“Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ” Ｈａｍｅｓ, Ｂ． Ｄ．, ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｓ. Ｊ., ｅｄｓ.  （１９８５）；  ”Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ�� Ｈａｍｅｓ, Ｂ． Ｄ．, ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｓ. Ｊ., ｅｄｓ.  （１９８４）；  ”Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ” Ｆｒｅｓｈｎｅｙ, Ｒ． Ｉ., ｅｄ.  （１９８６）；  ”Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ” ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ, （１９８６）；  ”Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ” Ｐｅｒｂａｌ, Ｂ．, （１９８４）  ａｎｄ  ”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ” Ｖｏｌ. １−３１７, Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ;  ”ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ: Ａ Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”, Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ, Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ, ＣＡ  （１９９０）；  Ｍａｒｓｈａｋ ｅｔ ａｌ., ”Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  −  Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ” ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）を参照されたい（それらの全てが、本明細書に完全に示されるのと同様に、参照により組み入れられる）。他の一般的参照文献が、本文書全体で提供されている。それらの中の手順は、当該技術分野で周知と考えられ、読み手の簡便さのために提供されている。それらに含まれる情報は全て、参照により本明細書に組み入れられる。
【０２２５】
一般的材料および実験手順
細胞およびウイルス
この試験で用いられた細胞株は、７２１．２２１、ＢＣＢＬ１、ＢＪＡＢ、Ｃ１Ｒ、Ｊｅｇ３およびネズミ胸腺腫ＢＷ細胞株であった。ＮＫ細胞を、ＥａｓｙＳｅｐヒトＮＫ濃縮キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて末梢血リンパ球から単離し、ＩＬ−２活性化バルクＮＫ細胞を、先に記載された通り培養した［Ｙａｍｉｎ ｅｔ ａｌ., Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ  （２０１６）  １５： １５４２−１５５３］。初代ヒトベータ細胞も用いた。この試験に用いられたヒトインフルエンザウイルスは、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４ Ｈ１Ｎ１（ＰＲ８）株であり、過去に記載された通り作製された［Ａｃｈｄｏｕｔ ｅｔ ａｌ., Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００３）  １７１（２）  ９１５−９２３］。
【０２２６】
抗体および融合タンパク質
抗ＮＫｐ４６ ｍＡｂ［４Ｇ１Ｇ１（過去にＡｒｎｏｎ ｅｔ ａｌ. Ｂｌｏｏｄ  （２００４）１０３：６６４−６７２に開示)、ｈＮＫｐ４６．０２、ｈＮＫｐ４６．０９、およびｈＮＫｐ４６．１２］は、本発明者らにより作製され、ＮＫｐ４６−Ｉｇ融合タンパク質でのＮｃｒ１ｇｆｐ／ｇｆｐマウスの免疫化を必要とした。内在化実験に用いられた対照ｍＡｂは、抗ＣＤ９９および抗ＨＬＡ．Ｂ７（ハイブリドーマから精製）であった。ＦＡＣＳ染色を、以下の抗体（Ａｂ）で実施した：精製抗ＮＫｐ４６、抗ＮＫｐ４６ ＡＰＣ、抗ＮＫｐ４６ ＦＩＴＣ、抗ＮＫｐ４４ ＡＰＣ、抗ＮＫｐ３０ ＡＰＣ、抗２Ｂ４ ＡＰＣ、抗ＣＤ１６ ＦＩＴＣ、抗ＤＮＡＭ１ ＦＩＴＣ、抗ＮＫＧ２Ｄ  ＰＥ、抗ＣＥＡＣＡＭ１  ＰＥ、抗ＫＩＲ２ＤＬ２ ＦＩＴＣ、抗ＫＩＲ２ＤＬ１ ＦＩＴＣ、抗ＣＤ１０７ａ ＡＰＣ、および抗ＣＤ５６  ＰＥは、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄから購入した。抗ＴＩＧＩＴ ＡＰＣは、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した。ＦＡＣＳ染色に用いた二次アイソタイプ対照Ａｂは、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄから購入されたＩｇＧ ＦＩＴＣ（ＩｇＧ１）、ＩｇＧ  ＰＥ（ＩｇＧ２）、およびＩｇＧ  ＡＰＣ（ＩｇＧ１）であった。ＦＡＣＳ染色で用いられた追加の二次Ａｂは、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７コンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧおよびＰＥコンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅロバ抗ヒトＩｇＧであり、両者ともＪａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈから購入した。精製抗マウスＩＬ−２およびビオチン化抗マウスＩＬ−２ｍＡｂは、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄから購入した。融合タンパク質ＮＫｐ４６−Ｉｇ、Ｄ１−Ｉｇ、およびＤ２−Ｉｇは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞から作製し、先に記載された通り精製した［Ｍａｎｄｅｌｂｏｉｍ ｅｔ ａｌ., ＰＮＡＳ  （１９９９）  ｖｏｌ. ９６（１０）：５６４０−５６４４；  Ｍａｎｄｅｌｂｏｉｍ ｅｔ ａｌ. Ｎａｔｕｒｅ（２００１）  ４０９： １０５５−１０６０；  Ａｒｎｏｎ（２００４）上掲］。
【０２２７】
ブロッキング実験
ＮＫｐ４６−Ｉｇ融合タンパク質（３μｇ／試料）を単独で、または対照（ｃｔｒｌ）と共に、またはＰＢＳ×１で希釈された抗ＮＫｐ４６ ｍＡｂ（１μｇ／試料）と共に、４℃で１時間インキュベートした。その後、処置された融合タンパク質でのＦＡＣＳ染色を、ＢＪＡＢ細胞で実施した。
【０２２８】
ＮＫｐ４６受容体下方制御アッセイ
活性化ＮＫ細胞（５０，０００細胞／１００μｌ）を、ｃｔｒｌまたは抗ＮＫｐ４６ ｍＡｂと共に４℃または３７℃で異なる期間、インキュベートした（用いられたインキュベーション時間および濃度については図の凡例を参照）。割り当てられた期間の後、細胞を洗浄して、図の凡例に示された通りコンジュゲート抗ＮＫｐ４６ ｍＡｂまたはコンジュゲート二次Ａｂのいずれかで染色し、続いてＦＡＣＳ分析した。
【０２２９】
ＢＷレポーターアッセイ
ネズミ胸腺腫ＢＷ細胞を用いて、ＢＷ  ＮＫｐ４６トランスフェクタントを作製し、次にそれを過去に記載された通りＢＷアッセイに用いた（Ｍａｎｄｅｌｂｏｉｍ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ（２００１）、上掲）。手短に述べると、ＢＷ  ＮＫｐ４６細胞を異なるＥ：Ｔ比の放射線照射された（６０００ラド）標的細胞と共に３７℃でインキュベートした。４８時間後に、上清を回収し、ＩＬ−２分泌レベルを、抗ＩＬ−２ ｍＡｂを用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにより定量した。
【０２３０】
ＣＤ１０７ａ脱顆粒アッセイ
ＮＫ細胞表面のＣＤ１０７ａの分析は、過去に記載されている［Ａｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ. Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００４）  ２９４：１５−２２］。本発明者らは最初、ｃｔｒｌまたはｈＮＫｐ４６．０２ ｍＡｂのいずれかの５μｇ／ｍｌと共に３７℃で１６時間インキュベートされた活性化バルクＮＫ細胞で内在化アッセイを実施した。その後、異なるＥ：Ｔ比の標的細胞、抗ＣＤ１０７ａおよび抗ＣＤ５６ ｍＡＢを、試料に３７℃で２時間添加した。ＮＫ細胞上の％ＣＤ１０７ａを、ＦＡＣＳ分析により計測した。
【０２３１】
プロテアゾームおよびリソソーム阻害
活性化バルクＮＫ細胞を単独で、またはプロテアソーム阻害剤のＥＰＸもしくはリソソーム阻害剤のＣＣＭ  Ａ（両者ともＭｅｒｋ  Ｍｉｌｉｐｏｒｅ製）と共に３７℃で２０分間インキュベートした。その後、ｃｔｒｌおよびｈＮＫｐ４６．０２ ｍＡｂを、３７℃でさらに８時間添加し、その後、抗ＮＫｐ４６  ＡＰＣでＦＡＣＳ染色した。
【０２３２】
ＥＬＩＳＡ
ＮＫｐ４６表面シェディング：ｃｔｒｌまたはｈＮＫｐ４６．０２ ｍＡｂと共にインキュベートされた活性化バルクＮＫ細胞での１６時間の内在化アッセイからの上清を回収して、ＥＬＩＳＡプレートに４℃で一晩入れた。陽性対照として、ＮＫｐ４６−Ｉｇを示された濃度で播種した。ブロッキングを(ＰＢＳ×１／Ｔｗｅｅｎ ０．０５％／ＢＳＡ １％)で実施し、その後、ブロッキング緩衝液で希釈された１μｇ／ｍｌのビオチン化抗ＮＫｐ４６ ｍＡｂを添加した。その後、ストレプトアビジン−ＨＲＰを添加し、ＴＭＢでの検出をＯＤ６５０ｎｍで測定した。
【０２３３】
抗ＮＫｐ４６ ｍＡｂの結合部位の決定：融合タンパク質（ＮＫｐ４６−Ｉｇ、Ｄ１−Ｉｇ、Ｄ２−Ｉｇ、およびＷ３２Ｒ−Ｉｇ）を最初、ＰＢＳ×１で希釈して１μｇ／ｍｌで播種した。ブロッキングを(ＰＢＳ×１／Ｔｗｅｅｎ ０．０５％／ＢＳＡ １％)で実施し、その後、ブロッキング緩衝液で希釈された１μｇ／ｍｌの抗ＮＫｐ４６ ｍＡｂを添加した。ビオチン抗マウスに、次にストレプトアビジン−ＨＲＰを添加し、ＴＭＢでの検出をＯＤ６５０ｎｍで測定した。
【０２３４】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いた異なる結合部位の決定
Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００を用いた表面プラズモン共鳴を利用して、ＮＫｐ４６での結合について、ｈＮＫｐ４６．０２と４Ｇ１Ｇ１とを識別した。ＮＫｐ４６−Ｉｇ融合タンパク質を、ｐＨ５の１０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液に１０μｇ／ｍｌで溶解した。この溶液を、標準のアミンカップリングプロトコルを利用してＮＫｐ４６−Ｉｇを約５００ＲＵのレベルまでＣＭ５  Ｓｅｒｉｅｓ Ｓチップに固定するのに使用した。ＮＫｐ４６活性表面のｈＮＫｐ４６．０２ ｍＡｂ飽和を、ランニング緩衝液（１０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ １５０ ｍＭ ＮａＣｌ ３ ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０  ｐＨ ７．３）中の１μＭ  ｈＮＫｐ４６．０２ ｍＡｂ溶液の流速２０μＬ／分での５連続の１分間注射により遂行した。その後、４Ｇ１Ｇ１を１００ｎＭで流速２０μＬ／分で１分間注射した。最後に、１００ｎＭのｈＮＫｐ４６．０２ ｍＡｂの注射を実施して、活性表面が依然としてｈＮＫｐ４６．０２ ｍＡｂに関して飽和されていることを確認した。
【０２３５】
実施例１
抗ＮＫｐ４６ ｍＡｂ：ｈＮＫｐ４６．０２の作製
ＮＫｐ４６に対する抗体を開発するために、ＮＫｐ４６欠損マウス（Ｎｃｒ１ｇｆｐ／ｇｆｐ）に、ヒトＩｇＧに融合されたＮＫｐ４６の細胞外部分からなる融合タンパク質を注射した。新しい抗ＮＫｐ４６ ｍＡｂを、ＮＫｐ４６に結合する能力について評価した。結合は最初、ＮＫｐ４６を発現するマウス胸腺腫ＢＷトランスフェクタント細胞（ＢＷ  ＮＫｐ４６）で検査した。対照として、市販の抗ＮＫｐ４６ ｍＡｂ、および過去に本発明者らの検査室で開発された抗ＮＫｐ４６ ｍＡｂである４Ｇ１Ｇ１を用いた。市販の抗ＮＫｐ４６ ｍＡｂおよび４Ｇ１Ｇ１と同様に、ＢＷ  ＮＫｐ４６とは特異的に相互作用するが親ＢＷ細胞とは特異的に相互作用しない３種の新しい抗ＮＫｐ４６ ｍＡｂ、即ちｈＮＫｐ４６．０２、ｈＮＫｐ４６．０９およびｈＮＫｐ４６．１２を作製し、図１Ａに示している。新しい抗ＮＫｐ４６ ｍＡｂがヒトＮＫ細胞により自然に発現されたＮＫｐ４６を認識することを実証するために、ＩＬ−２活性化初代バルクヒトＮＫ細胞（活性化ＮＫ細胞）を染色して、全ての抗ＮＫｐ４６ ｍＡｂによる認識について観察した（図１Ｂ）。
【０２３６】
実施例２
ｈＮＫｐ４６．０２ ｍＡｂによるＮＫｐ４６の結合はＮＫ細胞の表面からＮＫ４６下方制御を導く
本発明者らは最初、新しい抗ＮＫｐ４６ ｍＡｂがＮＫｐ４６とリガンドとの相互作用を遮断し得るか否かを確認したかった。本発明者らは、未知の腫瘍リガンド（複数可）へのＮＫｐ４６の結合を阻害し得る抗ＮＫｐ４６ ｍＡｂを開発することに特別に関心を持っていたため、ＮＫｐ４６への未知のリガンドを発現するＢＪＡＢ腫瘍細胞を用いた（図２Ａ）。ＮＫｐ４６−Ｉｇを単独で、または様々な抗ＮＫｐ４６ ｍＡｂと共に氷上でインキュベートし、その後、処置されたＮＫｐ４６−Ｉｇ融合タンパク質でＢＪＡＢ細胞をＦＡＣＳ染色した。いずれの抗ＮＫｐ４６ ｍＡｂも、細胞へのＮＫｐ４６−Ｉｇの結合を遮断することができず（図２Ａ）、抗ＮＫｐ４６ ｍＡｂがｍＡｂを遮断しないことが示唆された。本発明者らは、次に、抗ＮＫｐ４６ ｍＡｂの１つがＮＫ細胞の表面からのＮＫｐ４６の下方制御を導き得るか否かをテストした。抗ＮＫｐ４６ ｍＡｂは、活性化ＮＫ細胞と共に４℃または３７℃のいずれかで８時間インキュベートした。その後、細胞をコンジュゲート二次抗マウス抗体でＦＡＣＳ染色した。興味深いこととして、ｍＡｂのｈＮＫｐ４６．０２の１種のみが細胞の表面からのＮＫｐ４６の下方制御を導くことが観察された（図２Ｂ）。下方制御が特異的であることを確認するために、該アッセイをｈＮＫｐ４６．０２ ｍＡｂおよび対照ｍＡｂと共に活性化ＮＫ細胞上で再度行い、その後、活性化および阻害性の両方のＮＫ細胞受容体の大型レパートリーに対してＦＡＣＳ染色した。結果から、ｈＮＫｐ４６．０２ ｍＡｂ介在性下方制御がＮＫｐ４６に対して特異的であることが実証された（図２Ｃ）。同様の結果が、様々なドナーからの活性化ＮＫ細胞を用いて得られた。
【０２３７】
次のステップは、ｈＮＫｐ４６．０２ ｍＡｂに媒介されたＮＫｐ４６下方制御を最適化することであった。したがって、活性化ＮＫ細胞を様々な濃度の４Ｇ１Ｇ１（対照として使用）およびｈＮＫｐ４６．０２ ｍＡｂと共に４℃または３７℃（それぞれ図３Ａおよび３Ｂ）のいずれかで８時間インキュベートする用量依存性アッセイを実施した。４℃では、ＮＫ４６の下方制御が行われなかった。最大ＮＫｐ４６下方制御（８時間の表面発現がおよそ４０％の減少。図３Ｂ）を誘導したｈＮＫｐ４６．０２ ｍＡｂの最小量は、５０，０００ＮＫ細胞あたり０．５μｇであった（図３Ｂ）。より多量のｈＮＫｐ４６．０２ ｍＡｂは、表面からの受容体のさらなる下方制御を生じなかった。これらの結果を考慮し、時間経過的アッセイを、ＮＫ細胞５０，０００個あたり０．５μｇで４Ｇ１Ｇ１およびｈＮＫｐ４６．０２ ｍＡｂと共にインキュベートされた活性化ＮＫ細胞で実施した。１６時間後に、ｈＮＫｐ４６．０２ ｍＡｂは、ＮＫｐ４６表面発現のおよそ６０％の減少を導き、それが２４時間後も維持された（図３Ｃ）。
【０２３８】
実施例３
ｈＮＫｐ４６．０２により媒介されたＮＫｐ４６受容体下方制御はＮＫ細胞活性化を妨害する
ｈＮＫｐ４６．０２ ｍＡｂによるＮＫｐ４６下方制御がＮＫ細胞の機能に及ぼす影響を有するか否かを決定するために、本発明者らは、最初に、ＮＫｐ４６依存性ＮＫ細胞活性化を導く標的細胞を見出す必要があった。そのため、マウス胸腺腫ＢＷ細胞（ＢＷ細胞）を含む細胞に基づくレポータシステムを用いた。これらの細胞に、マウスζ鎖に融合されたＮＫｐ４６の細胞外部分で構成されたキメラタンパク質をトランスフェクトした（ＢＷ  ＮＫｐ４６。図１Ａに示す）。受容体とリガンドとのエンゲージメントで、ＩＬ−２の分泌を導き、それをその後、ＥＬＩＳＡアッセイにより定量する。様々な癌細胞株をこの系でアッセイし、選択された幾つかの７２１．２２１、ＢＣＢＬ１、ＢＪＡＢおよびＣ１Ｒを、ＢＷ  ＮＫｐ４６の一定した著しい活性化に基づく提示のために選択した（図４Ａ）。ＮＫｐ４６リガンドを発現しないことが知られるＪｅｇ３細胞をインフルエンザと共にインキュベートし、アッセイの陽性対照として用いた。インフルエンザ−Ｊｅｇ３細胞は、ＮＫｐ４６の確定されたウイルスリガンドであるインフルエンザのヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質を発現する。図４Ｂに認められ得る通り、ＢＷ  ＮＫｐ４６と共にインキュベートされたＪｅｇ３細胞は、ＩＬ−２分泌の有意な増加を導いたインフルエンザ−Ｊｅｇ３細胞とは異なり、有意なＩＬ−２分泌を誘導しなかった。
【０２３９】
その後、上記の標的細胞を用いて、ｈＮＫｐ４６．０２ ｍＡｂの機能を検査した。活性化ＮＫ細胞を対照またはｈＮＫｐ４６．０２ ｍＡｂのいずれかと共に１６時間インキュベートした直後に、ＣＤ１０７ａ脱顆粒アッセイを活性化ＮＫ細胞で実施した。図４Ｃに認められる通り、脱顆粒アッセイの前にｈＮＫｐ４６．０２ ｍＡｂと共にインキュベートされた活性化ＮＫ細胞は、％ＣＤ１０７ａの有意な低下を呈しており、それらの活性化能がｈＮＫｐ４６．０２ ｍＡｂにより阻害されることが示された。同様に、ｈＮＫｐ４６．０２ ｍＡｂと共に予めインキュベートされた活性化ＮＫ細胞は、インフルエンザの存在下でＪｅｇ３細胞と共にインキュベートされると、より低い％ＣＤ１０７ａを有した（図４Ｄ）。過去の研究で、Ｉ型糖尿病のヒトおよびマウスモデルの両方で、ＮＫ細胞がＮＫｐ４６依存的にベータ細胞と相互作用してそれを破壊することが実証されている［Ｇｕｒ ｅｔ ａｌ., Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ.  （２０１１）  １８７（６）：３０９６−１０３］。その結果、本発明者らは、活性化ＮＫ細胞でのｈＮＫｐ４６．０２ ｍＡｂによるＮＫｐ４６下方制御が、ヒトベータ細胞の殺傷を予防するか否かをテストした。ＦＡＣＳ分析から、およそ６５％の急激な％ＣＤ１０７ａ減少が明らかとなり、ｈＮＫｐ４６．０２ ｍＡｂがＮＫ細胞のヒトベータ細胞殺傷を強力に阻害することが示された（図４Ｅ）。
【０２４０】
実施例４
ｈＮＫｐ４６．０２介在性ＮＫｐ４６下方制御のメカニズム
ＮＫｐ４６のｈＮＫｐ４６．０２介在性下方制御は、受容体シェディングまたは内在化と、その後の分解による可能性がある。ＮＫ細胞とのｈＮＫｐ４６．０２ ｍＡｂインキュベーションの後にＮＫｐ４６がシェディングされるか否かをテストするために、上清中のＮＫｐ４６の量をモニタリングした。活性化ＮＫ細胞を単独で、または対照もしくはｈＮＫｐ４６．０２ ｍＡｂと共に３７℃で１６時間インキュベートした。上清を回収して、ＥＬＩＳＡプレートに入れた。アッセイの陽性対照として、ＮＫｐ４６−ＩｇもまたＥＬＩＳＡプレートに入れた。図５Ａは、単独で、または対照もしくはｈＮＫｐ４６．０２ ｍＡｂと共にインキュベートされたＮＫ細胞の上清において、ＮＫｐ４６−Ｉｇが検出されたが、ＮＫｐ４６が検出されなかったことが示される。それゆえこれらの結果から、ｈＮＫｐ４６．０２ ｍＡｂがおそらくＮＫ細胞表面からのＮＫｐ４６のシェディングを誘発せず、代わりにＮＫｐ４６内在化を導く得ると結論づけた。
【０２４１】
ＮＫｐ４６が内在化され、分解されるか否かをテストするために、対照またはｈＮＫｐ４６．０２ ｍＡｂとのインキュベートを実施する前に、活性化ＮＫ細胞をプロテアソーム（ＥＰＸ）またはリソソーム（ＣＣＭ  Ａ）阻害剤のいずれかで処置した。図５Ｂで認められる通り、ＮＫｐ４６発現は、阻害剤で処置されていない活性化ＮＫ細胞およびプロテアソーム阻害剤で処置された該細胞ではｈＮＫｐ４６．０２ ｍＡｂにより減少された。興味深いこととして、ＮＫｐ４６発現は、ＮＫ細胞を最初にリソソーム阻害剤で処置した場合には減少せず、したがってＮＫｐ４６がｈＮＫｐ４６．０２ ｍＡｂによる内在化の際にリソソーム分解を受けることが示された。
【０２４２】
実施例５
ｈＮＫｐ４６．０２ ｍＡｂはＮＫｐ４６のＤ１ドメイン上の特定の部位に結合する
本発明者らは、ＮＫｐ４６上のｈＮＫｐ４６．０２ ｍＡｂの結合部位を特徴づけたかった。ＮＫｐ４６は、２つのドメイン、つまりＤ１およびＤ２で構成される。ヒトＩｇＧに融合されたＤ１またはＤ２ドメインで構成された融合タンパク質を調製し（それぞれＤ１−ＩｇおよびＤ２−Ｉｇ）、直接的ＥＬＩＳＡアッセイに用いた（図６Ａ）。興味深いこととして、ｈＮＫｐ４６．０２ ｍＡｂは、Ｄ１ドメインに結合した。その上それは、受容体下方制御を誘導しないことが過去に示されている市販の抗ＮＫｐ４６ ｍＡｂおよび４Ｇ１Ｇ１抗ＮＫｐ４６ ｍＡｂと同じドメインに結合した（図２Ｂ参照）。結果的に、本発明者らは、ｈＮＫｐ４６．０２ ｍＡｂが４Ｇ１Ｇ１と異なるＤ１ドメイン上の特有の結合部位を有するか否かを決定したかった。それゆえ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を適用した。ＮＫｐ４６−Ｉｇ融合タンパク質をチップに固定し、その後、抗ＮＫｐ４６ ｍＡｂを注射した。ｈＮＫｐ４６．０２ ｍＡｂを最初に注射し、その後、４Ｇ１Ｇ１を注射した。４Ｇ１Ｇ１は、ｈＮＫｐ４６．０２ ｍＡｂを飽和させた後でも、ＮＫｐ４６−Ｉｇに結合することができた（図６Ｂの赤色の矢印に示す）。これらの結果から、ｈＮＫｐ４６．０２ および４Ｇ１Ｇ１ ｍＡｂがＤ１ドメイン上に異なる結合部位を有することが実証された。
【０２４３】
これまで言及された通り、ＮＫｐ４６は、Ｎｃｒ１で表されるマウス相同分子種を有する唯一のＮＣＲである。トリプトファンがアルギニンで置換された３２位のＮｃｒ１の突然変異が、ＥＲの受容体蓄積をもたらした。この突然変異は、受容体のＤ１ドメインで起こるため、本発明者らは、ヒトＮＫｐ４６上のこの突然変異がｈＮＫｐ４６．０２ ｍＡｂ結合に影響を及ぼすのだろうかと考えた。このため、ヒトＮＫｐ４６の３２位のトリプトファン残基を突然変異させて、アルギニンと置換した。ヒトＩｇＧに融合された細胞外突然変異ＮＫｐ４６からなる融合タンパク質（Ｗ３２Ｒ−Ｉｇ）を作製して、直接ＥＬＩＳＡアッセイに用いた。図６Ｃに認められる通り、４Ｇ１Ｇ１およびｈＮＫｐ４６．０２ ｍＡｂの両方が、突然変異ＮＫｐ４６タンパク質に結合するが、Ｄ１−Ｉｇまたは野生型ＮＫｐ４６−Ｉｇに比較して有意に低かった。つまり、３２位の突然変異は、おそらくタンパク質フォールディングに影響を及ぼすが、ｈＮＫｐ４６．０２ ｍＡｂ結合部位は厳密なこの位置に限定されない。
【０２４４】
本発明を具体的な実施形態と共に記載したが、多くの改変、改良および変更が当業者に自明となることは明らかである。したがって添付の特許請求の範囲の主旨および広い範囲に含まれるそのような改変、改良および変更の全てを包含するものとする。
【０２４５】
本明細書で言及された全ての刊行物、特許および特許出願は、個々の刊行物、特許および特許出願が参照により本明細書に組み入れられることを具体的かつ個別に示すのと同程度に、全体として本明細書に組み入れられる。加えて、本出願における任意の参考資料の列挙または同定が、そのような参考資料が本発明に先立って利用可能であることの承認と見なされるわけではない。節の見出しが用いられる限りにおいて、それらは、必ずしも限定と見なされるべきではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年3月18日(2019.3.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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2020501506.tif 000009
2020501506.tif 000010