(57)【要約】  本発明は、抗がん治療における使用に適するＳＩＲＰαに対する抗体に関する。本発明は、さらに、ヒト固形腫瘍および血液悪性腫瘍の治療における抗ＳＩＲＰα抗体の、任意に他の抗がん治療剤と組み合わせた使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．配列番号３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、ならびに配列番号４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列；
ｂ．配列番号５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、ならびに配列番号６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列；
ｃ．配列番号７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、ならびに配列番号８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列；
ｄ．配列番号９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、ならびに配列番号１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列；
ｅ．配列番号１１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、ならびに配列番号１２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列；
ｆ．配列番号１３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、ならびに配列番号１４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列；
ｇ．配列番号１５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、ならびに配列番号１６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列；ならびに
ｈ．配列番号１７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、ならびに配列番号１８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列
からなる群から選択される、重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）可変領域（ＶＲ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み；
前記ＣＤＲはカバットによるナンバリングに従い決定される、
抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項２】
前記抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
ａ．配列番号７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、ならびに配列番号８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列；ならびに
ｂ．配列番号１３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、ならびに配列番号１４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列
からなる群から選択される、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲのＣＤＲを含み；
前記抗体が、ヒト化抗体である、
請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
ａ．配列番号７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、配列番号８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、配列番号３０のＨＣＶＲアミノ酸配列、ならびに配列番号３１のＬＣＶＲアミノ酸配列；
ｂ．配列番号７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、配列番号８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、配列番号３２のＨＣＶＲアミノ酸配列、ならびに配列番号３３のＬＣＶＲアミノ酸配列；
ｃ．配列番号７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、配列番号８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、配列番号３４のＨＣＶＲアミノ酸配列、ならびに配列番号８のＬＣＶＲアミノ酸配列；
ｄ．配列番号１３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、配列番号１４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、配列番号３５のＨＣＶＲアミノ酸配列、ならびに配列番号３６のＬＣＶＲアミノ酸配列；
ｅ．配列番号１３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、配列番号１４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、ならびに配列番号３５のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号３７のＬＣＶＲアミノ酸配列；
ｆ．配列番号１３のＨＣＶＲアミノ酸配列、配列番号１４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、ならびに配列番号３８のＬＣＶＲアミノ酸配列；または
ｇ．配列番号１３のＨＣＶＲアミノ酸配列、配列番号１４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、ならびに配列番号３７のＬＣＶＲアミノ酸配列
を含む、請求項３に記載のヒト化抗体。
【請求項５】
野生型Ｆｃ領域を含む抗ＳＩＲＰα抗体と比較して、ヒトＦｃαまたはＦｃγ受容体への結合の低減を示す修飾Ｆｃ領域を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の抗ＳＩＲＰα抗体。
【請求項６】
Ｅｕナンバリングで、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７、Ｄ２６５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ａ３２７、Ｐ３２８およびＰ３２９からなる群から選択される１以上の位置における、１以上のアミノ酸置換を含む修飾ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の抗ＳＩＲＰα抗体。
【請求項７】
アミノ酸置換がＬ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ、Ｌ２３４ＥおよびＬ２３５Ａ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ａ、またはＬ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇを含む、請求項６に記載の抗ＳＩＲＰα抗体。
【請求項８】
アミノ酸置換がＬ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ、またはＬ２３４ＥおよびＬ２３５Ａを含む、請求項７に記載の抗ＳＩＲＰα抗体。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか一項に記載の抗ＳＩＲＰα抗体および１以上の薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項１０】
医薬としての使用するための、請求項１から８のいずれか一項に記載の抗ＳＩＲＰα抗体、または請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
ヒト固形腫瘍および血液悪性腫瘍の治療における使用のための、抗ＳＩＲＰα抗体または請求項９に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項１２】
ヒト固形腫瘍および血液悪性腫瘍の治療における使用のための、抗ＳＩＲＰα抗体または請求項１０に記載の使用のための医薬組成物と、１以上の他の抗がん治療剤との組合せ。
【請求項１３】
前記１以上の抗がん治療剤が、ターゲティング療法剤または免疫療法剤である、請求項１２に記載の使用のための組合せ。
【請求項１４】
前記ターゲティング療法剤が、治療用抗体または抗体−薬物コンジュゲートである、請求項１２に記載の使用のための組合せ。
【請求項１５】
前記治療用抗体が、ヒト免疫エフェクター細胞上に存在する活性化Ｆｃ受容体に結合するヒトＦｃ領域を含む、腫瘍細胞表面の膜結合標的に対する治療用抗体である、請求項１４に記載の使用のための組合せ。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、ＳＩＲＰαに対する抗体、および、任意に他の抗がん治療剤と組み合わせたがんの治療におけるこれらの抗体の使用に関する。
【発明の背景】
【０００２】
１９９０年代後半以来、がんの処置において治療用抗体が利用できる。これらの治療用抗体は、異なる経路を介して悪性細胞に作用する。抗体と悪性細胞上の標的との結合により誘発されるシグナル伝達経路は、細胞増殖の阻害またはアポトーシスをもたらす。治療用抗体のＦｃ領域は、補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）および抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）を誘発する。しかし、治療用抗体は、単剤療法では効果的ではないことが多い。治療用抗体の効能を改善するための１つの選択肢は、ＡＤＣＣおよび／またはＡＤＣＰの改善による。これは、例えば、アミノ酸置換で、Ｆｃ領域のＦｃγ受容体に対する親和性を改善することにより（Richardsら、Mol. Cancer Ther. 2008, 7(8), 2517-2527）、またはＦｃ領域のグリコシル化に影響を及ぼすことにより（Hayesら、J. Inflamm. Res. 2016, 9, 209-219）なされている。
【０００３】
治療用抗体のＡＤＣＣおよび／またはＡＤＣＰを改善する別の方法は、治療用抗体を、シグナル調節タンパク質αに対するアンタゴニスト性抗体（抗ＳＩＲＰα）または抗ＣＤ４７抗体（国際公開第２００９／１３１４５３号）と組み合わせることである。ＣＤ４７が、単球、マクロファージ、樹状細胞および好中球上で発現する阻害性免疫受容体であるＳＩＲＰαに結合すると、ＳＩＲＰαは、免疫エフェクター細胞の食作用または他のＦｃ受容体依存性細胞破壊機構によるがん細胞の破壊を阻止する阻害性シグナルを伝達する。
【０００４】
腫瘍細胞は、治療用抗体により誘導される抗腫瘍免疫応答を回避する機構としてＣＤ４７の上方調節を使用する。抗ＣＤ４７または抗ＳＩＲＰα抗体は、ＣＤ４７−ＳＩＲＰα軸を介して発生した阻害性シグナル伝達を遮断し、ＡＤＣＣおよび／またはＡＤＣＰの増大をもたらす。
【０００５】
ＣＤ４７−ＳＩＲＰα間相互作用と関連する大半の臨床研究は、単剤療法として、および治療用抗体との組合せ療法として、抗ＣＤ４７抗体に焦点を合わせている（Weiskopf、Eur. J. Cancer, 2017, 76, 100-109）。抗がん治療剤としての抗ＣＤ４７抗体に関する研究は、ＣＤ４７が大半の正常組織内の細胞の表面上にもまた発現するという事実にもかかわらず、増大しつつある。
【０００６】
抗ＳＩＲＰα抗体を使用する抗がん単剤療法または組合せ療法についての研究は、ほとんど行われていない。抗ＳＩＲＰα抗体についての研究の大部分は、ＣＤ４７−ＳＩＲＰα間相互作用に関する機構についての研究であり、マウス抗ＳＩＲＰα抗体を使用して実施されており；例えば、マウス１２Ｃ４および１．２３Ａは、トラスツズマブの好中球媒介性ＡＤＣＣによるＳＫＢＲ３細胞のオプソニン化を増大させた（Zhaoら、PNAS, 2011, 108(45), 18342-18347）。国際公開第２０１５／１３８６００号は、とりわけ、セツキシマブによるin vitroにおける食作用を増大させるマウス抗ヒトＳＩＲＰα抗体である、ＫＷＡＲ２３およびそのキメラＦａｂ断片について開示している。国際公開第２０１８／０２６６００号では、Ｎ２９７Ａ突然変異を含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃを伴うヒト化ＫＷＡＲ２３が開示されている。国際公開第２０１３／０５６３５２号は、ＩｇＧ４ ２９ＡＭ４−５および他のＩｇＧ４ヒト抗ＳＩＲＰα抗体について開示している。毎週３回、４週間にわたり８ｍｇ／ｋｇで投与されたＩｇＧ４ ２９ＡＭ４−５は、NOD scidγ（ＮＳＧ）マウスの右大腿部に注入された初代ヒトＡＭＬ細胞の白血病性生着を軽減した。
【０００７】
ＳＩＲＰαは、免疫エフェクター細胞上に存在する細胞外Ｉｇ様ドメインを有する膜貫通糖タンパク質である、シグナル調節タンパク質（ＳＩＲＰ）ファミリーのメンバーである。ＳＩＲＰαのＮＨ２末端のリガンド結合ドメインは、高度に多型である（Takenakaら、Nature Immun. 2007, 8(12), 1313-1323）。しかし、この多型は、ＣＤ４７への結合にそれほど影響を及ぼさない。ＳＩＲＰαＢＩＴ（ｖ１）およびＳＩＲＰα１（ｖ２）は、最も一般的で、最も差違の大きい（１３残基異なる）多型体である（Hatherleyら、J. Biol. Chem. 2014, 289(14), 10024-10028）。他の、生物学的に特徴づけられたヒトＳＩＲＰファミリーメンバーは、ＳＩＲＰβ１およびＳＩＲＰγである。
【０００８】
ＳＩＲＰβ１はＣＤ４７に結合せず（van Beekら、J. Immunol. 2005, 175(12), 7781-7787, 7788- 7789）、かつ、少なくとも２つのＳＩＲＰβ１多型変異体であるＳＩＲＰβ１ｖ１(ENSP00000371018)およびＳＩＲＰβ１ｖ２(ENSP00000279477)が知られている。ＳＩＲＰβ１の天然リガンドは未知であるが、抗ＳＩＲＰβ１特異的抗体を使用するin vitro研究は、ＳＩＲＰβ１の結合が、ＤＡＰ１２、ＳｙｋおよびＳＬＰ−７６のチロシンリン酸化で誘導されたマクロファージの食作用と、その後の、ＭＥＫ−ＭＡＰＫ−ミオシン軽鎖キナーゼカスケードの活性化を促進することを示す（Matozakiら、J. Biol. Chem. 2004, 279(28), 29450-29460）。
【０００９】
ＳＩＲＰγは、Ｔ細胞および活性化ＮＫ細胞上で発現し、ＳＩＲＰαと比較して１０分の１の親和性でＣＤ４７に結合する。ＣＤ４７−ＳＩＲＰγ間相互作用は、抗原提示細胞とＴ細胞との接触、Ｔ細胞活性化の共刺激、およびＴ細胞増殖の促進に関与する（Piccioら、Blood, 2005, 105, 2421-2427）。さらに、ＣＤ４７−ＳＩＲＰγ間相互作用は、Ｔ細胞の経内皮遊走においても役割を果たす（Stefanisakisら、Blood, 2008, 112, 1280-1289）。
【００１０】
当技術分野で知られた抗ＳＩＲＰα抗体は、ヒトＳＩＲＰαに特異的でないか、または特異的過ぎるかのいずれかであるため、ＳＩＲＰαに方向付けられた単剤または組合せ療法における使用にあまり適していない。先行技術による抗体であるＫＷＡＲ２３、ＳＥ５Ａ５、２９ＡＭ４−５および１２Ｃ４は、ヒトＳＩＲＰγにも結合するので、特異的ではない。Ｔ細胞上で発現するＳＩＲＰγへの結合は、Ｔ細胞の増殖および動員に負の影響を及ぼす可能性がある。他の抗ＳＩＲＰα抗体、例えば、１．２３Ａ ｍＡｂは、ヒトＳＩＲＰαの多型変異体であるＳＩＲＰα１だけを認識し、少なくとも白色人種集団では主要な変異体であるＳＩＲＰαＢＩＴを認識しないというように、特異性があまりに限定的である（X.W.Zhaoら、PNAS, 2011, 108(45), 18342-18347）。
【００１１】
抗ＳＩＲＰα抗体を使用して治療用抗体のＡＤＣＣを増大させることに加え、これらの抗体は、ＳＩＲＰαを発現するがんを直接ターゲティングするのに使用してもよい。機能的Ｆｃ領域を有するマウス抗ＳＩＲＰα抗体は、ＳＩＲＰαを発現するＲｅｎｃａ細胞とＢ１６ＢＬ６黒色腫細胞が注入されたマウスにおいて腫瘍形成を緩徐化させたので、野生型ヒトＦｃを含む抗ＳＩＲＰα抗体は、腎細胞癌および悪性黒色腫のようなＳＩＲＰαを発現するがんの治療に適している可能性がある（Yanagitaら、JCI Insight, 2017, 2(1), e89140）。
【００１２】
結論として、ＳＩＲＰγへの結合が低く、ＳＩＲＰα１とＳＩＲＰαＢＩＴ多型変異体の両者に特異的に結合し、単独の抗がん治療または治療用抗体と組み合わせた抗がん治療のいずれかにおける使用に適する抗ＳＩＲＰα抗体が必要とされている。
【発明の簡単な説明】
【００１３】
本発明は抗がん治療における使用に適するＳＩＲＰαに対する抗体に関する。さらに、本発明はヒト固形腫瘍および血液悪性腫瘍の治療における抗体の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ヒト好中球をエフェクター細胞として使用し、ＳＫＢＲ３  ＨＥＲ２陽性乳がん細胞上で測定した、トラスツズマブ（Ｔｍａｂ）単独、マウス１２Ｃ４抗ＳＩＲＰα抗体（ｍｕ１２Ｃ４）と組み合わせたトラスツズマブ、マウス１２Ｃ４の可変領域をヒトＩｇＧ１定常領域とグラフトした抗体（１２Ｃ４ｈｕＩｇＧ１）と組み合わせたトラスツズマブ、および、マウス１２Ｃ４の可変領域をＬ２３４ＡおよびＬ２３５Ａのアミノ酸置換を含むヒトＩｇＧ１定常領域とグラフトした抗体（１２Ｃ４ｈｕＩｇＧ１ＬＡＬＡ）と組み合わせたトラスツズマブの、％細胞傷害作用により測定したＡＤＣＣの比較。
【図２】ＳＫＢＲ３細胞上の、トラスツズマブと組み合わせた、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａのアミノ酸置換を含むヒトＩｇＧ１定常領域を有する抗ＳＩＲＰα抗体１〜９、抗ＳＩＲＰα抗体である１２Ｃ４ｈｕＩｇＧ１ＬＡＬＡ（１２Ｃ４ＬＡＬＡ）、ならびに抗ＣＤ４７抗体であるＢ６Ｈ１２ｈｕＩｇＧ１ＬＡＬＡ（Ｂ６Ｈ１２ＬＡＬＡ）の、トラスツズマブ（１００％とした）に対するＡＤＣＣ％の比較。黒四角はＳＩＲＰαＢＩＴ変異体を有するドナーの好中球の実測値で、白丸はＳＩＲＰα１変異体を有するドナーの好中球の実測値である。柱グラフは、全てのドナーの平均であり；誤差バーは標準偏差を表す。
【図３】ＳＫＢＲ３細胞上の、トラスツズマブ単独、トラスツズマブと組み合わせた、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａのアミノ酸置換を含むヒトＩｇＧ１定常領域を有する様々な濃度（用量反応曲線）の抗ＳＩＲＰα抗体４、７、１０、１４、ならびに抗ＳＩＲＰα抗体である１２Ｃ４ｈｕＩｇＧ１ＬＡＬＡ（１２Ｃ４ＬＡＬＡ）の、ＡＤＣＣ％の比較。ＳＩＲＰαＢＩＴ変異体を有するドナー２例（白三角、白丸）の好中球。柱グラフは２例のドナーの平均である。
【図４】ＳＫＢＲ３細胞上の、トラスツズマブ単独、トラスツズマブと組み合わせたＬ２３４ＡおよびＬ２３５Ａのアミノ酸置換を含むヒトＩｇＧ１定常領域を有する抗ＳＩＲＰα抗体４、７、１０、１３、１４、１５および１６、ならびに抗ＳＩＲＰα抗体である１２Ｃ４ｈｕＩｇＧ１ＬＡＬＡ（１２Ｃ４ＬＡＬＡ）の、ＡＤＣＣ％の比較。ＳＩＲＰαＢＩＴ変異体を有するドナーの好中球（白三角、白六角形、逆白三角、白ひし形）、ＳＩＲＰα１変異体を有するドナーの好中球（白丸、上半分黒丸）、および変異体が決定されなかったドナーの好中球（白四角）を使用した。柱グラフはドナーの平均である。
【発明の詳細な説明】
【００１５】
ＳＩＲＰαは腫瘍免疫回避機構において重要な役割を果たすことが示されているにもかかわらず、ＳＩＲＰαに対する承認済みの治療剤はない。加えて、ＳＩＲＰαは多様な悪性細胞上で発現し、このことはＳＩＲＰαを潜在的な腫瘍関連抗原としている。
【００１６】
本発明は、２つの主要なＳＩＲＰα多型変異体であるＳＩＲＰαＢＩＴおよびＳＩＲＰα１に対して特異的結合を示し、ＳＩＲＰγに結合せず、治療用抗体のＡＤＣＣおよび／またはＡＤＣＰを増大させる、アンタゴニスト性の抗ＳＩＲＰα抗体に関する。
【００１７】
本明細書を通して使用される「抗体」という用語は、２つの重鎖および２つの軽鎖を含むモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を指す。抗体は、任意のアイソタイプ、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭ抗体であってもよい。好ましくは、抗体は、ＩｇＧ抗体、より好ましくは、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２抗体である。抗体は、キメラ、ヒト化またはヒト抗体であってもよい。好ましくは、本発明の抗体は、ヒト化抗体である。さらにより好ましくは、抗体は、ヒト化またはヒトＩｇＧ抗体、最も好ましくは、ヒト化またはヒトＩｇＧ１ｍＡｂである。抗体は、κ（カッパ）またはλ（ラムダ）軽鎖、好ましくはκ（カッパ）軽鎖を有してもよく、すなわち、ヒト化またはヒトＩｇＧ１κ抗体であってもよい。抗体は、例えば、半減期を延長しおよび／またはエフェクター機能を増大もしくは減少するために、１以上の突然変異を導入することにより操作された定常領域を含んでもよい。
【００１８】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」および「ｍＡｂ」という用語は、実質的に同種の抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、わずかに可能性のある自然発生の突然変異を除き、集団を構成する個々の抗体は同一である。抗体は、所望の抗原を表すペプチドの混合物で動物を免疫化することにより作出してもよい。Ｂリンパ球を単離し、骨髄腫細胞と融合させるか、または単一のＢリンパ球を、順化培地およびフィーダー細胞の存在下で、数日間にわたり培養する。適切なＢリンパ球またはハイブリドーマを選択するために、産生された抗体を含有する骨髄腫またはＢリンパ球の上清をテストする。モノクローナル抗体は、Koehlerら、Nature, 1975, 256, 495-497に最初に発表されたハイブリドーマ法により、適切なハイブリドーマから調製してもよい。あるいは、適切なＢ細胞またはリンパ腫のＲＮＡを溶解させ、ＲＮＡを単離し、逆転写し、シーケンシングしてもよい。抗体は、細菌、真核動物または植物細胞内で、組換えＤＮＡ法により作ってもよい（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書参照）。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、Clacksonら、Nature, 1919, 352, 624-628、およびMarksら、J. Mol. Biol. 1991, 222, 581-597に記載された技法を使用して、ファージ抗体ライブラリーから単離してもよい。
【００１９】
本明細書を通して使用される「抗原結合性断片」という用語は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２断片、単鎖（ｓｃ）抗体、ｓｃＦｖ、単一ドメイン（ｓｄ）抗体、ダイアボディーまたはミニボディーを含む。
【００２０】
ヒト化抗体では、重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）の可変領域（ＶＲ）内の抗原結合性相補性決定領域（ＣＤＲ）は、非ヒト種、一般に、マウス、ラットまたはウサギの抗体に由来する。これらの非ヒトＣＤＲは、抗体の機能的特性、例えば、結合の親和性および特異性が保持される方法で、ＨＣおよびＬＣの可変領域のヒトフレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）と組み合わせる。ヒトＦＲ内の選択されたアミノ酸を、対応する元の非ヒト種アミノ酸と交換して、低免疫原性を保持しながら、結合親和性を改善してもよい。代わりに、元の非ヒト種ＦＲの選択されたアミノ酸を、それらの対応するヒトアミノ酸と交換して、抗体の結合親和性を保持しながら、免疫原性を低減してもよい。このようにして、ヒト化可変領域をヒト定常領域と組み合わせる。
【００２１】
ＣＤＲは、カバット（Kabat, E.A.ら、Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD., NIH publication no. 91-3242, pp. 662, 680, 689 (1991)）、コチア（Chothiaら、Nature, 1989, 342, 877-883）、またはＩＭＧＴ（Lefranc, The Immunologist 1999, 7, 132-136）による手法を使用して決定できる。本発明の文脈では、抗体の重鎖および軽鎖定常領域内の位置を指し示すためにＥｕナンバリングを使用する。「Ｅｕナンバリング」という表現は、Kabat ,E.A.ら、Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD., NIH publication no. 91-3242, pp. 662, 680, 689 (1991)におけるＥｕインデックスを指す。
【００２２】
アンタゴニスト性の抗体は、特定の抗原に対して親和性を有し、当該抗体の抗原への結合は、受容体でアゴニストまたはインバースアゴニストの機能を阻害する。本発明の場合、アンタゴニスト性の抗ＳＩＲＰα抗体のＳＩＲＰαへの結合は、ＣＤ４７とＳＩＲＰαの結合を阻止するか、またはＣＤ４７−ＳＩＲＰα結合により誘発される阻害性シグナルを途絶する。
【００２３】
アンタゴニスト性の抗ＳＩＲＰα抗体は、ＣＤ４７が結合する部位と同じ部位に結合することで、ＣＤ４７によるＳＩＲＰαのライゲーションを阻止し、その結果、免疫エフェクター細胞のＦｃ受容体に依存する作用を負に調節するシグナル伝達を阻害することができる。アンタゴニスト性の抗ＳＩＲＰα抗体は、ＣＤ４７の結合部位と異なるＳＩＲＰαの部位、すなわち、アロステリックサイトに結合し、物理的なＣＤ４７−ＳＩＲＰα間相互作用を直接妨害せず、例えば、ＳＩＲＰαの三次元形状の変化よってＳＩＲＰαの阻害性シグナル伝達を阻害することができる。この三次元形状の変化は、ＣＤ４７の結合による（下流の）シグナル伝達を阻止する。ＳＩＲＰαがアロステリックサイトで結合される場合、ＣＤ４７は依然としてＳＩＲＰαと結合している可能性があり、このことは、トロンボスポンジン１（ＴＳＰ−１）への結合にＣＤ４７が利用できなくなる可能性がある。ＴＳＰ−１のＣＤ４７へのライゲーションは、例えば、Ｔ細胞活性化の負の調節において役割を果たす（Soto-Pantojaら、Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 2015, 50(3), 212-230）。
【００２４】
本明細書を通して使用される「結合親和性」という用語は、特定の抗原−抗体間相互作用の解離定数（ＫＤ）を指す。ＫＤとは、解離速度（ｋｏｆｆ）の会合速度（ｋｏｎ）に対する比である。従って、ＫＤはｋｏｆｆ／ｋｏｎに等しく、モル濃度（Ｍ）で表される。ＫＤが小さいほど結合親和性は強いということになる。一般に、ＫＤ値は、当技術分野で公知の方法（例えば、E.S.Dayら、Anal. Biochem. 2013, 440, 96-107）によるバイオセンサーシステム（例えば、Biacore（登録商標））を使用する、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により測定される。「結合親和性」という用語は、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイにより測定されるか、またはフローサイトメトリーにより測定される、最大結合の半分をもたらす抗体の濃度（ＥＣ５０）を指す場合もある。
【００２５】
本明細書を通して使用される「特異的結合」という用語は、２５℃で、ＳＰＲにより測定される、典型的には、１０−７Ｍ未満、例えば、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、またはさらに低いＫＤでの、抗体とその抗原との間の結合親和性を指す。
【００２６】
本明細書を通して使用される「低親和性」という用語は、「〜に結合しない」または「〜に結合していない」という語句と互換的であり、ＥＬＩＳＡアッセイで１５００ｎｇ／ｍｌを越えるＥＣ５０の、抗体とその抗原との間の結合親和性であるか、または、ＳＰＲで測定した時に、固定化された抗原と抗体との間で特異的結合が観察されない場合を指す。
【００２７】
本明細書を通して使用される「高親和性」という用語は、２５℃で、ＳＰＲにより測定される、典型的に、１０−１０Ｍ未満、１０−１１Ｍ、またはさらに低いＫＤでの、抗体とその抗原との間の結合親和性を指す。
【００２８】
特に、本発明は、
ａ．配列番号１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、ならびに配列番号２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列；
ｂ．配列番号３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、ならびに配列番号４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列；
ｃ．配列番号５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、ならびに配列番号６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列；
ｄ．配列番号７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、ならびに配列番号８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列；
ｅ．配列番号９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、ならびに配列番号１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列；
ｆ．配列番号１１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、ならびに配列番号１２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列；
ｇ．配列番号１３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、ならびに配列番号１４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列；
ｈ．配列番号１５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、ならびに配列番号１６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列；ならびに
ｉ．配列番号１７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、ならびに配列番号１８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列
からなる群から選択される、重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）可変領域（ＶＲ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み；
前記ＣＤＲはカバットによるナンバリングに従い決定される、
抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合性断片に関する。
【００２９】
好ましくは、本発明は、
ａ．配列番号３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、ならびに配列番号４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列；
ｂ．配列番号５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、ならびに配列番号６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列；
ｃ．配列番号７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、ならびに配列番号８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列；
ｄ．配列番号９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、ならびに配列番号１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列；
ｅ．配列番号１１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、ならびに配列番号１２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列；
ｆ．配列番号１３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、ならびに配列番号１４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列；
ｇ．配列番号１５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、ならびに配列番号１６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列；ならびに
ｈ．配列番号１７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、ならびに配列番号１８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列
からなる群から選択される、重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）可変領域（ＶＲ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み；
前記ＣＤＲはカバットによるナンバリングに従い決定される、
抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合性断片に関する。
【００３０】
より好ましくは、本発明は、
ａ．配列番号３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、ならびに配列番号４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列；
ｂ．配列番号５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、ならびに配列番号６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列；
ｃ．配列番号７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、ならびに配列番号８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列；
ｄ．配列番号９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、ならびに配列番号１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列；ならびに
ｅ．配列番号１３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、ならびに配列番号１４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列
からなる群から選択される、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲのＣＤＲを含み、
前記ＣＤＲはカバットによるナンバリングに従い決定される、
抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合性断片に関する。
【００３１】
さらにより好ましくは、本発明は、
ａ．配列番号５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、ならびに配列番号６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列；
ｂ．配列番号７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、ならびに配列番号８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列；ならびに
ｃ．配列番号１３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、ならびに配列番号１４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列
からなる群から選択される、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲのＣＤＲを含み、
前記ＣＤＲはカバットによるナンバリングに従い決定される、
抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合性断片に関する。
【００３２】
最も好ましくは、本発明は、
ａ．配列番号７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、ならびに配列番号８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列；ならびに
ｂ．配列番号１３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、ならびに配列番号１４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列
からなる群から選択される、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲのＣＤＲを含み、
前記ＣＤＲはカバットによるナンバリングに従い決定される、
抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合性断片に関する。
【００３３】
好ましい態様では、本発明は上述した抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合性断片に関し、ここで、抗体は、ＳＩＲＰαＢＩＴとＳＩＲＰα１の両者に対する特異的結合を示し、ＳＩＲＰγに結合しない。
【００３４】
より好ましい態様では、抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合性断片は、ＳＩＲＰαＢＩＴに１０−９Ｍを下回るＫＤで特異的に結合し、そして、ＳＩＲＰα１に１０−７Ｍを下回るＫＤで結合し、ここで、ＫＤはＳＰＲにより２５℃で測定される。好ましくは、抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合性断片は、ＳＩＲＰα１に、１０−８Ｍを下回るＫＤで結合する。
【００３５】
別のより好ましい態様では、抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合性断片は、ＳＩＲＰαＢＩＴおよびＳＩＲＰα１に１０−９Ｍを下回るＫＤで特異的に結合し、ここで、ＫＤはＳＰＲにより２５℃で測定される。
【００３６】
さらにより好ましい態様では、抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合性断片は、ＳＩＲＰαＢＩＴおよびＳＩＲＰα１に１０−１０Ｍを下回るＫＤで特異的に結合する。好ましくは、抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合性断片は、ＳＩＲＰαＢＩＴに１０−１０Ｍを下回るＫＤで、そして、ＳＩＲＰα１に１０−１１Ｍを下回るＫＤで特異的に結合する。典型的に、上述した抗ＳＩＲＰα抗体は、キメラ、ヒト化またはヒト抗体である。好ましくは、抗ＳＩＲＰα抗体はヒト化またはヒト抗体である。より好ましくは、抗ＳＩＲＰα抗体はヒト化抗体である。特定の態様では、本発明のヒト化抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合性断片は、
ａ．配列番号３０のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号３１のＬＣＶＲアミノ酸配列；
ｂ．配列番号３２のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号３３のＬＣＶＲアミノ酸配列；
ｃ．配列番号３４のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号８のＬＣＶＲアミノ酸配列；
ｄ．配列番号３５のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号３６のＬＣＶＲアミノ酸配列；
ｅ．配列番号３５のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号３７のＬＣＶＲアミノ酸配列；
ｆ．配列番号１３のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号３８のＬＣＶＲアミノ酸配列；ならびに
ｇ．配列番号１３のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号３７のＬＣＶＲアミノ酸配列
からなる群から選択されるＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含む。
【００３７】
好ましい態様では、ヒト化抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号３０のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号３１のＬＣＶＲアミノ酸配列を含む。
【００３８】
別の好ましい態様では、ヒト化抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号３２のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号３３のＬＣＶＲアミノ酸配列を含む。
【００３９】
さらに別の好ましい態様では、ヒト化抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号３４のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号８のＬＣＶＲアミノ酸配列を含む。
【００４０】
さらに別の好ましい態様では、ヒト化抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号３５のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号３６のＬＣＶＲアミノ酸配列を含む。
【００４１】
さらに別の好ましい態様では、ヒト化抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号３５のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号３７のＬＣＶＲアミノ酸配列を含む。
【００４２】
さらに別の好ましい態様では、ヒト化抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１３のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号３８のＬＣＶＲアミノ酸配列を含む。
【００４３】
さらに別の好ましい態様では、ヒト化抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１３のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号３７のＬＣＶＲアミノ酸配列を含む。
【００４４】
ヒト（ｈｕ）ＳＩＲＰαＢＩＴと（ｈｕ）ＳＩＲＰα１の両者への結合に加え、本発明の抗体はカニクイザルサル（ｃｙ）ＳＩＲＰαにも結合することができ、このことは、動物モデルによるin vivo研究を可能にする。
【００４５】
本発明の抗体は、ＣＤ４７の結合部位と異なるＳＩＲＰαの部位、すなわち、アロステリックサイトに結合し、物理的なＣＤ４７−ＳＩＲＰα間相互作用に直接妨害せず、ＳＩＲＰαの阻害性シグナル伝達を阻害することができる。代わりに、抗体は、ＣＤ４７が結合する同じ部位に結合することで、ＣＤ４７によるＳＩＲＰαのライゲーションを阻止し、その結果、免疫エフェクター細胞のＦｃ受容体に依存する作用を負に調節するシグナル伝達を阻害することができる。
【００４６】
上述した抗ＳＩＲＰα抗体またはそれらの抗原結合性断片は、公知の抗ＳＩＲＰα抗体よりも特異的で、ＳＩＲＰαＢＩＴとＳＩＲＰα１の両者に優れた親和性を示す。その上、本発明の抗ＳＩＲＰα抗体はＳＩＲＰγに結合しない。
【００４７】
特定の一態様では、本発明の抗ＳＩＲＰα抗体は、ヒト免疫エフェクター細胞上に存在する活性化Ｆｃ受容体に結合するＦｃ領域を含む。このような抗ＳＩＲＰα抗体は、ＡＤＣＣおよび／またはＡＤＣＰを誘導しうるので、ＳＩＲＰα陽性ヒト固形腫瘍および血液悪性腫瘍に対する単剤療法に適する。ヒト免疫エフェクター細胞は、ライゲーションされると、食作用、サイトカインの放出、ＡＤＣＣおよび／またはＡＤＣＰなどを誘発する、様々な活性化Ｆｃ受容体を有する。これらの受容体の例は、Ｆｃγ受容体、例えば、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）、ＦｃγＲＩＩＣおよびＦｃα受容体であるＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）である。多様な天然の抗体アイソタイプは、これらの受容体に結合する。例えば、ＩｇＧ１は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＣ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＢに結合し；ＩｇＧ２は、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＣ、ＦｃγＲＩＩＩＡに結合し；ＩｇＧ３は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＣ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＢに結合し；ＩｇＧ４は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＣ、ＦｃγＲＩＩＩＡに結合し；ＩｇＡはＦｃαＲＩに結合する。
【００４８】
好ましい態様では、本発明の抗ＳＩＲＰα抗体は、ＩｇＡまたはＩｇＧアイソタイプのＦｃ領域を含む。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプのＦｃ領域を含む抗ＳＩＲＰα抗体が、より好ましく；ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４アイソタイプが、さらにより好ましい。ＩｇＧ１アイソタイプのＦｃ領域を含む抗ＳＩＲＰα抗体が、最も好ましい。
【００４９】
ヒト免疫エフェクター細胞上に存在する活性化Ｆｃ受容体に結合するＦｃ領域を含む抗ＳＩＲＰα抗体は、ＳＩＲＰαを発現するがんの治療に適する可能性があるが、in vitroで、ヒト免疫エフェクター細胞上に存在する活性化Ｆｃ受容体に結合するヒトＦｃ領域を含む他の抗体（すなわち、ＡＤＣＣおよび／またはＡＤＣＰを誘導することが可能な抗体）と組み合わせて試験すると、キメラ抗ＳＩＲＰα ＩｇＧ１抗体は、期待される結果を示さなかった。in vitroでのＡＤＣＣアッセイの結果は、キメラＩｇＧ１抗ＳＩＲＰα抗体は、マウス抗体を使用した以前の結果に基づき期待されるほど、このような他の抗体のＡＤＣＣを増大させないことを示した。
【００５０】
したがって、本発明は、ヒト免疫エフェクター細胞上に存在する活性化Ｆｃ受容体への結合の低減、または当該受容体に対する低親和性を示す抗ＳＩＲＰα抗体に関する。このような抗ＳＩＲＰα抗体は、類似する非修飾のＦｃ領域と比較して、１以上のアミノ酸が他のアミノ酸により置換された修飾Ｆｃ領域を含む。結合の低減とは、修飾Ｆｃ領域を含む抗ＳＩＲＰα抗体の活性化Ｆｃ受容体に対する親和性が、類似する非修飾のＦｃ領域を含む同じ可変領域を有する抗ＳＩＲＰα抗体の親和性より小さいことを意味する。活性化Ｆｃ受容体に対する抗体の結合親和性は、一般に、当技術分野で公知の方法、例えば、Harrisonら、J. Pharm. Biomed. Anal. 2012, 63, 23-28に記載の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、またはフローサイトメトリーを使用して測定される。治療用抗体と組み合わせたとき、ヒトＦｃαまたはヒトＦｃγ受容体への結合の低減、または当該受容体に対する低親和性を示す抗体は、免疫エフェクター細胞のＡＤＣＣおよび／またはＡＤＣＰの増大によるがん細胞の破壊において、とりわけ効果的である。典型的に、本発明の抗ＳＩＲＰα抗体のＦｃ領域は、ヒト免疫エフェクター細胞上に存在する活性化Ｆｃ受容体への結合を低減するために修飾される。
【００５１】
したがって、本発明の抗ＳＩＲＰα抗体は、ヒトＦｃαまたはヒトＦｃγ受容体への結合の低減、または当該受容体に対する低親和性を示す修飾Ｆｃ領域を含む。例えば、Ｆｃγ受容体に対するＩｇＧ１の結合は、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７、Ｄ２６５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ａ３２７、Ｐ３２８およびＰ３２９（Ｅｕナンバリング）からなる群から選択される１以上のＩｇＧ１アミノ酸を置換することにより、低減することができ；ＩｇＧ２の結合は、例えば、以下のアミノ酸置換、Ｖ２３４Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓ、または、Ｈ２６８Ｑ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓ（ＩｇＧ１のＥｕナンバリングと同様のナンバリング）（Vafaら、Methods, 2014, 65, 114-126）のうちの１以上を導入することにより、低減することができ；ＩｇＧ３の結合は、例えば、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａのアミノ酸置換、または、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３３１Ｓのアミノ酸置換（Leohら、Mol. Immunol. 2015, 67, 407-415）を導入することにより、低減することができ；ＩｇＧ４の結合は、例えば、Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４ＡおよびＬ２３５Ａのアミノ酸置換（（ＩｇＧ１のＥｕナンバリングと同様のナンバリング）（Parekhら、mAbs, 2012, 4(3), 310-318）を導入することにより、低減することができる。Ｆｃα受容体に対するＩｇＡの結合は、例えば、Ｌ２５７Ｒ、Ｐ４４０Ａ、Ａ４４２Ｒ、Ｆ４４３ＲおよびＰ４４０Ｒのうちの１以上のアミノ酸置換（逐次的ナンバリング；Pleassら、J. Biol. Chem. 1999, 271(33), 23508-23514）を導入することにより、低減することができる。
【００５２】
好ましくは、本発明の抗ＳＩＲＰα抗体は、ヒトＦｃγ受容体への結合の低減、または当該受容体に対する低親和性を示す修飾Ｆｃ領域を含む。より好ましくは、修飾Ｆｃ領域はＩｇＧアイソタイプのＦｃ領域である。さらにより好ましくは、修飾Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４アイソタイプのＦｃ領域である。
【００５３】
好ましい態様では、本発明の抗ＳＩＲＰα抗体は、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７、Ｄ２６５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ａ３２７、Ｐ３２８およびＰ３２９（Ｅｕナンバリング）からなる群から選択される、１以上の位置における１以上のアミノ酸置換を含む修飾ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。
【００５４】
好ましくは、抗ＳＩＲＰα抗体は、Ｎ２９７ＡまたはＮ２９７Ｇのいずれかのアミノ酸置換を含まない修飾Ｆｃ ＩｇＧ１領域を含む。より好ましくは、抗ＳＩＲＰα抗体は、Ｎ２９７位におけるアミノ酸置換を含まない修飾Ｆｃ ＩｇＧ１領域を含む。
【００５５】
一態様では、修飾ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３４Ｅ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｄ２６５Ａ、Ｄ２６５Ｅ、Ｄ２６５Ｎ、Ｄ２７０Ａ、Ｄ２７０Ｅ、Ｄ２７０Ｎ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｇ、Ａ３２７Ｑ、Ｐ３２８Ａ、Ｐ３２９ＡおよびＰ３２９Ｇからなる群から選択される、１以上のアミノ酸置換を含む。好ましくは、１以上のアミノ酸置換は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３４Ｅ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｄ２６５Ａ、Ｄ２６５Ｅ、Ｄ２６５Ｎ、Ｎ２９７Ａ、Ｐ３２８Ａ、Ｐ３２９ＡおよびＰ３２９Ｇからなる群から選択される。
【００５６】
別の態様では、修飾ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３４Ｅ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｄ２６５Ａ、Ｄ２６５Ｅ、Ｄ２６５Ｎ、Ｄ２７０Ａ、Ｄ２７０Ｅ、Ｄ２７０Ｎ、Ａ３２７Ｑ、Ｐ３２８Ａ、Ｐ３２９ＡおよびＰ３２９Ｇからなる群から選択される、１以上のアミノ酸置換を含む。好ましくは、１以上のアミノ酸置換は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３４Ｅ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｄ２６５Ａ、Ｄ２６５Ｅ、Ｄ２６５Ｎ、Ｐ３２８Ａ、Ｐ３２９ＡおよびＰ３２９Ｇからなる群から選択される。より好ましくは、修飾Ｆｃ ＩｇＧ１領域はＮ２９７ＡまたはＮ２９７Ｇのいずれかのアミノ酸置換を含まない。さらにより好ましくは、修飾Ｆｃ ＩｇＧ１領域はＮ２９７位におけるアミノ酸置換を含まない。
【００５７】
好ましい態様では、修飾ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域は、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ、Ｌ２３４ＥおよびＬ２３５Ａ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ａ、またはＬ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇのアミノ酸置換を含む。好ましくは、修飾Ｆｃ ＩｇＧ１領域はＮ２９７ＡまたはＮ２９７Ｇのいずれかのアミノ酸置換を含まない。より好ましくは、修飾Ｆｃ ＩｇＧ１領域はＮ２９７位におけるアミノ酸置換を含まない。
【００５８】
別の好ましい態様では、本発明に従う抗ＳＩＲＰα抗体は、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ、またはＬ２３４ＥおよびＬ２３５Ａのアミノ酸置換、好ましくは、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａのアミノ酸置換を含む修飾ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。より好ましくは、修飾Ｆｃ ＩｇＧ１領域はＮ２９７ＡまたはＮ２９７Ｇのいずれかのアミノ酸置換を含まない。さらにより好ましくは、修飾Ｆｃ ＩｇＧ１領域はＮ２９７位におけるアミノ酸置換を含まない。
【００５９】
本発明は、さらに、上記抗ＳＩＲＰα抗体および１以上の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物に関する。抗体のような治療用タンパク質の典型的な医薬製剤は、静脈内注入の前に（水への）溶解（すなわち、再構成）が必要な凍結乾燥ケーキ（凍結乾燥粉末）、または使用の前に融解が必要な凍結（水）溶液の形態である。
【００６０】
典型的に、医薬組成物は凍結乾燥ケーキの形態で提供される。本発明において、医薬組成物（凍結乾燥前）に配合するのに適した薬学的に許容される賦形剤には、緩衝液（例えば、水中に塩を含有する、クエン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液またはコハク酸緩衝液）、凍結防止剤（例えば、スクロース、トレハロース）、等張性修飾剤（例えば、塩化ナトリウム）、界面活性剤（例えば、ポリソルベート）および増量剤（例えば、マンニトール、グリシン）が含まれる。凍結乾燥タンパク質製剤に使用される賦形剤は、凍結乾燥工程および保存時におけるタンパク質の変性を防止する能力で選ばれる。
【００６１】
本発明は、さらに、医薬としての使用のための、上記抗ＳＩＲＰα抗体または医薬組成物に関する。
【００６２】
第１の態様では、本発明は、ヒト固形腫瘍および血液悪性腫瘍の治療における使用のための上記抗ＳＩＲＰα抗体または医薬組成物に関する。本発明の抗ＳＩＲＰα抗体は、例えば、乳がん、腎臓がんまたは黒色腫のような固形腫瘍、、または、例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）のような血液悪性腫瘍の治療において使用してもよい。
【００６３】
第２の態様では、本発明は、ＳＩＲＰα陽性ヒト固形腫瘍および血液悪性腫瘍の治療における使用のための、ヒト免疫エフェクター細胞上に存在する活性化Ｆｃ受容体に結合するＦｃ領域を含む抗ＳＩＲＰα抗体に関する。好ましくは、ヒト免疫エフェクター細胞上に存在する活性化Ｆｃ受容体に結合するＦｃ領域は、ＩｇＡまたはＩｇＧアイソタイプのＦｃ領域である。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプのＦｃ領域を含む抗ＳＩＲＰα抗体が、より好ましく；ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４アイソタイプが、さらにより好ましい。ＳＩＲＰα陽性ヒト固形腫瘍および血液悪性腫瘍の治療における使用のための、ＩｇＧ１アイソタイプのＦｃ領域を含む抗ＳＩＲＰα抗体が、最も好ましい。
【００６４】
第３の態様では、本発明は、１以上の他の抗がん治療の使用と組み合わせた、ヒト固形腫瘍および血液悪性腫瘍の治療における使用のための、上記抗ＳＩＲＰα抗体または医薬組成物に関する。適切な抗がん治療は、手術、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、ターゲティング療法および免疫療法である。上記抗ＳＩＲＰα抗体または医薬組成物は、１以上の他の抗がん治療の使用と組み合わせた、ヒト固形腫瘍および血液悪性腫瘍の治療における同時使用または逐次的使用であってもよい。特に、上記抗ＳＩＲＰα抗体または医薬組成物は、１以上の他の抗がん治療の使用の後の、ヒト固形腫瘍および血液悪性腫瘍の治療における使用のためのものであってもよい。
【００６５】
好ましくは、本発明は、１以上の他の抗がん治療剤の使用と組み合わせた、ヒト固形腫瘍および血液悪性腫瘍の治療における使用のための、上記抗ＳＩＲＰα抗体または医薬組成物に関する。特に、上記抗ＳＩＲＰα抗体または医薬組成物は、１以上の他の抗がん治療剤の使用の後の、ヒト固形腫瘍および血液悪性腫瘍の治療における使用のためのものであってもよい。
【００６６】
適切な抗がん治療剤は、化学療法剤、放射線療法剤、ホルモン療法剤、ターゲティング療法剤および免疫療法剤を含む。適切な化学療法剤は、アルキル化剤、例えば、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、テトラジンおよびアジリジン；代謝拮抗剤、例えば、抗葉酸剤、フルオロピリミジン、デオキシヌクレオシド類似体およびチオプリン；抗微小管剤、例えば、ビンカアルカロイドおよびタキサン；トポイソメラーゼＩおよびＩＩ阻害剤；ならびに細胞傷害性抗生剤、例えば、アントラサイクリンおよびブレオマイシンを含む。
【００６７】
適切な放射線療法剤は、放射性同位元素、例えば、１３１Ｉメタヨードベンジルグアニジン（ＭＩＢＧ）、リン酸ナトリウムとしての３２Ｐ、２２３Ｒａ塩化物、８９Ｓｒ塩化物および１５３Ｓｍジアミンテトラメチレンホスホネート（ＥＤＴＭＰ）を含む。
【００６８】
ホルモン療法剤として使用されるのに適する薬剤は、ホルモン合成の阻害剤、例えば、アロマターゼ阻害剤およびＧｎＲＨ類似体；ならびにホルモン受容体アンタゴニスト、例えば、選択的エストロゲン受容体モジュレーターおよび抗アンドロゲンを含む。
【００６９】
ターゲティング療法剤とは、腫瘍形成および増殖に関与する特定のタンパク質を妨害する治療剤であり、低分子薬；タンパク質、例えば、治療用抗体；ペプチドおよびペプチド誘導体；またはタンパク質−低分子ハイブリッド体、例えば、抗体−薬物コンジュゲートであってもよい。ターゲティングされた低分子薬物の例は、ｍＴｏｒ阻害剤、例えば、エベロリムス、テムシロリムスおよびラパマイシン；キナーゼ阻害剤、例えば、イマチニブ、ダサチニブおよびニロチニブ；ＶＥＧＦ阻害剤、例えば、ソラフェニブおよびレゴラフェニブ；ならびにＥＧＦＲ／ＨＥＲ２阻害剤例えば、ゲフィチニブ、ラパチニブおよびエルロチニブを含む。ペプチドまたはペプチド誘導体であるターゲティング療法剤の例は、プロテアソーム阻害剤、例えば、ボルテゾミブおよびカルフィルゾミブを含む。
【００７０】
免疫療法剤は、免疫応答を誘導するか、増強するか、または抑制する薬剤、例えば、サイトカイン（ＩＬ−２およびＩＦＮ−α）；免疫調節性イミド薬、例えば、サリドマイド、レナリドマイドおよびポマリドマイド；治療用がんワクチン、例えば、タリモジェン ラヘルパレプベク；細胞ベースの免疫療法剤、例えば、樹状細胞ワクチン、養子Ｔ細胞およびキメラ抗原受容体改変Ｔ細胞；および、がん細胞上の膜結合型リガンドに結合した場合にＦｃ領域を介してＡＤＣＣ／ＡＤＣＰまたはＣＤＣを誘発しうる治療用抗体を含む。
【００７１】
好ましくは、本発明は、１以上の他の抗がん治療剤と組み合わせた、ヒト固形腫瘍および血液悪性腫瘍の治療における使用のための、上記抗ＳＩＲＰα抗体または医薬組成物に関し、ここで、抗がん治療剤はターゲティング療法剤または免疫療法剤である。本発明の好ましいターゲティング療法剤は、治療用抗体または抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）である。最も好ましいターゲティング療法剤は治療用抗体である。
【００７２】
本明細書を通して使用される「治療用抗体」という用語は、ヒト治療に適する上記抗体またはその抗原結合性断片を指す。ヒト治療に適する抗体は、特定のヒト疾患の治療において、十分な品質を有し、安全かつ有効である。品質は、ＧＭＰの確立されたガイドラインを使用して評価でき；安全性および有効性は、一般に、医薬品規制当局、例えば、欧州医薬品庁（ＥＭＡ）または米国食品医薬品局（ＦＤＡ）による確立されたガイドラインを使用して評価される。これらのガイドラインは当技術分野で周知である。
【００７３】
好ましくは、治療用抗体は、医薬品規制当局、例えば、ＥＭＡまたはＦＤＡにより承認された抗体である。大半の規制当局のオンラインデータベースが、抗体が承認されているのかどうかを調査するために利用できる。
【００７４】
本明細書を通して使用される「ＡＤＣ」という用語は、リンカーを介して上記抗体またはその抗原結合性断片とコンジュゲートさせた細胞傷害性薬を指す。典型的に、細胞傷害性薬、例えば、デュオカルマイシン、カリケアマイシン、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）二量体、メイタンシノイド、またはアウリスタチン誘導体は、高度に強力である。リンカーは、切断可能リンカー、例えば、バリン−シトルリン（ｖｃ）またはバリン−アラニン（ｖａ）を含む切断可能ジペプチドであってもよく、または、非切断可能リンカー、例えば、スクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート（ＳＭＣＣ）であってもよい。
【００７５】
典型的に、本発明の抗ＳＩＲＰα抗体と組み合わせて使用するための治療用抗体は、アネキシンＡ１、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＣＡ６、ＣＡ９、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、ＣＡ２７−２９、ＣＡ１２５、ＣＡ２４２、ＣＣＲ２、ＣＣＲ５、ＣＤ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ４７、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９、ＣＤ１１５、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ３０３、ＣＤ３３３、ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ、ＣＬＣＡ−１、ＣＬＬ−１、ｃ−ＭＥＴ、Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＴＬＡ−４、ＤＬＬ３、ＥＧＦＬ、ＥＧＦＲ、ＥＰＣＡＭ、ＥＰｈ（例えば、ＥｐｈＡ２またはＥＰｈＢ３）、エンドセリンＢ受容体（ＥＴＢＲ）、ＦＡＰ、ＦｃＲＬ５（ＣＤ３０７）、ＦＧＦ、ＦＧＦＲ（例えば、ＦＧＦＲ３）、ＦＯＬＲ１、ＧＣＣ、ＧＰＮＭＢ、ＨＥＲ２、ＨＭＷ−ＭＡＡ、インテグリンα（例えば、αｖβ３およびαｖβ５）、ＩＧＦ１Ｒ、ＴＭ４ＳＦ１（またはＬ６抗原）、ルイスＡ様炭水化物、ルイスＸ、ルイスＹ、ＬＩＶ１、メソテリン、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＮａＰｉ２ｂ、ネクチン４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＳＭＡ、ＰＴＫ７、ＳＬＣ４４Ａ４、ＳＴＥＡＰ−１、５Ｔ４抗原（またはＴＰＢＧ、栄養膜糖タンパク質(trophoblast glycoprotein)）、ＴＦ（組織因子）、トムセン−フリーデンライヒ抗原（ＴＦ−Ａｇ）、Ｔａｇ７２、ＴＮＦ、ＴＮＦＲ、ＴＲＯＰ２、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲおよびＶＬＡからなる群から選択される標的に結合する少なくとも１つのＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含む、単一特異性または二重特異性抗体または抗体断片である。
【００７６】
単一特異性治療用抗体が好ましい。腫瘍細胞表面上の膜結合標的に対する抗体がより好ましい。
【００７７】
本発明の抗ＳＩＲＰα抗体と組み合わせた使用に適する治療用抗体は、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、リツキシマブおよびトラスツズマブを含む。
【００７８】
本発明の抗ＳＩＲＰα抗体と組み合わせた使用に適するＡＤＣは、トラスツズマブエムタンシンおよびブレンツキシマブベドチンを含む。
【００７９】
好ましい態様では、本発明は、ヒト免疫エフェクター細胞上に存在する活性化Ｆｃ受容体に結合するヒトＦｃ領域を含む腫瘍細胞の表面上の膜結合標的に対する治療用抗体と組み合わせた、前述の使用のための上記抗ＳＩＲＰα抗体に関する。
【００８０】
上述のとおり、ヒト免疫エフェクター細胞上に存在する活性化Ｆｃ受容体に結合するヒトＦｃ領域を含む治療用抗体は、これらの活性化Ｆｃ受容体への結合を介して、ＡＤＣＣおよび／またはＡＤＣＰを誘導することができる。ヒトＩｇＧ、ＩｇＥまたはＩｇＡアイソタイプの治療用抗体は、ヒト免疫エフェクター細胞上に存在する活性化Ｆｃ受容体に結合するヒトＦｃ領域を含む。
【００８１】
本発明の使用に好ましい治療用抗体は、ＩｇＧまたはＩｇＡアイソタイプの治療用抗体である。ＩｇＧアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４抗体の治療用抗体が、より好ましい。ＩｇＧ１またはＩｇＧ２アイソタイプの治療用抗体が、さらにより好ましい。ＩｇＧ１アイソタイプの治療用抗体が最も好ましい。
【００８２】
好ましくは、本発明は、ヒト免疫エフェクター細胞上に存在する活性化Ｆｃ受容体に結合するヒトＦｃ領域を含む、腫瘍細胞の表面上の膜結合標的に対する治療用抗体の使用と組み合わせた、ヒト固形腫瘍および血液悪性腫瘍の治療における使用のための、
ａ．配列番号１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、ならびに配列番号２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列；
ｂ．配列番号３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、ならびに配列番号４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列；
ｃ．配列番号５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、ならびに配列番号６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列；
ｄ．配列番号７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、ならびに配列番号８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列；
ｅ．配列番号９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、ならびに配列番号１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列；
ｆ．配列番号１１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、ならびに配列番号１２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列；
ｇ．配列番号１３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、ならびに配列番号１４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列；
ｈ．配列番号１５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、ならびに配列番号１６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列；ならびに
ｉ．配列番号１７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、ならびに配列番号１８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、
からなる群から選択される、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲのＣＤＲを含むヒト化抗ＳＩＲＰα抗体に関し、ここで、当該抗ＳＩＲＰα抗体は、野生型Ｆｃ領域を含む抗ＳＩＲＰα抗体と比較した場合に、ヒトＦｃαまたはＦｃγ受容体への結合の低減を示す修飾Ｆｃ領域を含む。
【００８３】
好ましい態様では、治療用抗体と組み合わせた、ヒト固形腫瘍および血液悪性腫瘍の治療における使用のためのヒト化抗ＳＩＲＰα抗体は、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７、Ｄ２６５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ａ３２７、Ｐ３２８およびＰ３２９（Ｅｕナンバリング）からなる群から選択される、１以上の位置における、１以上のアミノ酸置換を含む修飾ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。
【００８４】
好ましくは、治療用抗体と組み合わせたヒト固形腫瘍および血液悪性腫瘍の治療における使用のためのヒト化抗ＳＩＲＰα抗体は、Ｎ２９７ＡまたはＮ２９７Ｇのいずれかのアミノ酸置換を含まない修飾Ｆｃ ＩｇＧ１領域を含む。より好ましくは、抗ＳＩＲＰα抗体は、Ｎ２９７位におけるアミノ酸置換を含まない修飾Ｆｃ ＩｇＧ１領域を含む。
【００８５】
一態様では、修飾ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３４Ｅ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｄ２６５Ａ、Ｄ２６５Ｅ、Ｄ２６５Ｎ、Ｄ２７０Ａ、Ｄ２７０Ｅ、Ｄ２７０Ｎ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｇ、Ａ３２７Ｑ、Ｐ３２８Ａ、Ｐ３２９ＡおよびＰ３２９Ｇからなる群から選択される、１以上のアミノ酸置換を含む。
【００８６】
別の態様では、治療用抗体と組み合わせたヒト固形腫瘍および血液悪性腫瘍の治療における使用のためのヒト化抗ＳＩＲＰα抗体は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３４Ｅ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｄ２６５Ａ、Ｄ２６５Ｅ、Ｄ２６５Ｎ、Ｄ２７０Ａ、Ｄ２７０Ｅ、Ｄ２７０Ｎ、Ａ３２７Ｑ、Ｐ３２８Ａ、Ｐ３２９ＡおよびＰ３２９Ｇからなる群から選択される、１以上のアミノ酸置換を含む修飾Ｆｃ ＩｇＧ１領域を含む。好ましくは、１以上のアミノ酸置換は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３４Ｅ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｄ２６５Ａ、Ｄ２６５Ｅ、Ｄ２６５Ｎ、Ｐ３２８Ａ、Ｐ３２９ＡおよびＰ３２９Ｇからなる群から選択される。より好ましくは、修飾Ｆｃ ＩｇＧ１領域はＮ２９７ＡまたはＮ２９７Ｇのいずれかのアミノ酸置換を含まない。さらにより好ましくは、修飾Ｆｃ ＩｇＧ１領域はＮ２９７位におけるアミノ酸置換を含まない。
【００８７】
好ましい態様では、修飾ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域は、アミノ酸置換であるＬ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ、Ｌ２３４ＥおよびＬ２３５Ａ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ａ、またはＬ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇを含む。好ましくは、修飾Ｆｃ ＩｇＧ１領域はＮ２９７ＡまたはＮ２９７Ｇのいずれかのアミノ酸置換を含まない。より好ましくは、修飾Ｆｃ ＩｇＧ１領域はＮ２９７位におけるアミノ酸置換を含まない。
【００８８】
別の好ましい態様では、治療用抗体と組み合わせたヒト固形腫瘍および血液悪性腫瘍の治療における使用のためのヒト化抗ＳＩＲＰα抗体は、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ、またはＬ２３４ＥおよびＬ２３５Ａのアミノ酸置換、好ましくは、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａのアミノ酸置換を含む修飾ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。より好ましくは、修飾Ｆｃ ＩｇＧ１領域はＮ２９７ＡまたはＮ２９７Ｇのいずれかのアミノ酸置換を含まない。さらにより好ましくは、修飾Ｆｃ ＩｇＧ１領域はＮ２９７位におけるアミノ酸置換を含まない。
【００８９】
好ましい態様では、ヒト免疫エフェクター細胞上に存在する活性化Ｆｃ受容体に結合するヒトＦｃ領域を含む、腫瘍細胞の表面上の膜結合標的に対する治療用抗体の使用と組み合わせた、ヒト固形腫瘍および血液悪性腫瘍の治療における使用のためのヒト化抗ＳＩＲＰα抗体は、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａのアミノ酸置換を含むＦｃ領域と、
ａ．配列番号３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、ならびに配列番号４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列；
ｂ．配列番号５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、ならびに配列番号６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列；
ｃ．配列番号７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、ならびに配列番号８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列；
ｄ．配列番号９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、ならびに配列番号１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列；ならびに
ｅ．配列番号１３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、ならびに配列番号１４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列
からなる群から選択される、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲのＣＤＲを含む。
【００９０】
第２の好ましい態様では、上記使用のためのヒト化抗ＳＩＲＰα抗体は、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａのアミノ酸置換を含むＦｃ領域と、
ａ．配列番号５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、ならびに配列番号６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列；
ｂ．配列番号７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、ならびに配列番号８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列；ならびに
ｃ．配列番号１３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、ならびに配列番号１４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列
からなる群から選択される、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲのＣＤＲを含む。
【００９１】
第３の好ましい態様では、上記使用のためのヒト化抗ＳＩＲＰα抗体は、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａのアミノ酸置換を含むＦｃ領域と、
ａ．配列番号７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、ならびに配列番号８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列；ならびに
ｂ．配列番号１３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、ならびに配列番号１４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列
からなる群から選択される、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲのＣＤＲを含む。
【００９２】
第４の好ましい態様では、上記使用のためのヒト化抗ＳＩＲＰα抗体は、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａのアミノ酸置換を含むＦｃ領域と、
ａ．配列番号３０のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号３１のＬＣＶＲアミノ酸配列；
ｂ．配列番号３２のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号３３のＬＣＶＲアミノ酸配列；
ｃ．配列番号３４のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号８のＬＣＶＲアミノ酸配列；
ｄ．配列番号３５のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号３６のＬＣＶＲアミノ酸配列；
ｅ．配列番号３５のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号３７のＬＣＶＲアミノ酸配列；
ｆ．配列番号１３のＨＣＶＲアミノ酸配列、および配列番号３８のＬＣＶＲアミノ酸配列；または
ｇ．配列番号１３のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号３７のＬＣＶＲアミノ酸配列を含む。
【００９３】
好ましい一態様では、上記使用のためのヒト化抗ＳＩＲＰα抗体は、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａのアミノ酸置換を含むＦｃ領域と、配列番号３０のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号３１のＬＣＶＲアミノ酸配列とを含む。より好ましくは、修飾Ｆｃ ＩｇＧ１領域はＮ２９７ＡまたはＮ２９７Ｇのいずれかのアミノ酸置換を含まない。さらにより好ましくは、修飾Ｆｃ ＩｇＧ１領域はＮ２９７位におけるアミノ酸置換を含まない。
【００９４】
別の好ましい態様では、上記使用のためのヒト化抗ＳＩＲＰα抗体は、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａのアミノ酸置換を含むＦｃ領域と、配列番号３２のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号３３のＬＣＶＲアミノ酸配列とを含む。
【００９５】
さらに別の好ましい態様では、上記使用のためのヒト化抗ＳＩＲＰα抗体は、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａのアミノ酸置換を含むＦｃ領域と、配列番号３４のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号８のＬＣＶＲアミノ酸配列とを含む。
【００９６】
さらに別の好ましい態様では、上記使用のためのヒト化抗ＳＩＲＰα抗体は、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａのアミノ酸置換を含むＦｃ領域と、配列番号３５のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号３６のＬＣＶＲアミノ酸配列とを含む。
【００９７】
さらに別の好ましい態様では、上記使用のためのヒト化抗ＳＩＲＰα抗体は、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａのアミノ酸置換を含むＦｃ領域と、配列番号３５のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号３７のＬＣＶＲアミノ酸配列とを含む。
【００９８】
さらに別の好ましい態様では、上記使用のためのヒト化抗ＳＩＲＰα抗体は、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａのアミノ酸置換を含むＦｃ領域と、配列番号１３のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号３８のＬＣＶＲアミノ酸配列とを含む。
【００９９】
さらに別の好ましい態様では、上記使用のためのヒト化抗ＳＩＲＰα抗体は、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａのアミノ酸置換を含むＦｃ領域と、配列番号１３のＨＣＶＲアミノ酸配列および配列番号３７のＬＣＶＲアミノ酸配列とを含む。
【０１００】
より好ましくは、上記使用のための上記ト化抗ＳＩＲＰα抗体は、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａのアミノ酸置換を含むＦｃ領域を含み、修飾Ｆｃ ＩｇＧ１領域はＮ２９７ＡまたはＮ２９７Ｇのいずれかのアミノ酸置換を含まない。さらにより好ましくは、修飾Ｆｃ ＩｇＧ１領域はＮ２９７位におけるアミノ酸置換を含まない。
【０１０１】
野生型Ｆｃ領域を含む抗ＳＩＲＰα抗体と比較した場合にヒトＦｃαまたはＦｃγ受容体への結合の低減を示す、上記修飾Ｆｃ領域を含む抗ＳＩＲＰα抗体は、ＳＩＲＰαＢＩＴまたはＳＩＲＰα１とホモ接合性の異なるドナーに由来するエフェクター細胞としての好中球を使用する、治療用抗体のin vitroにおけるＡＤＣＣを増強する。これらの抗体の全ては、大半のドナーの好中球を使用するin vitroにおけるＡＤＣＣを増大させ、好ましい抗体は、全てのドナーの好中球を使用するin vitroにおけるＡＤＣＣであってもなお、増大させる。
【０１０２】
［実施例］
免疫化プロトコールおよび選択
ウサギを、ヒト（ｈｕ）ＳＩＲＰαＢＩＴ、ヒト（ｈｕ）ＳＩＲＰα１およびカニクイザル（ｃｙ）ＳＩＲＰαの細胞外ドメイン領域を表すペプチドの混合物で、繰り返し免疫した。異なる時点で採血し、リンパ球を濃縮した。一つのＢ細胞を、マイクロプレートの一つのウェルに加えた。これらのＢ細胞を、順化培地およびフィーダー細胞の存在下で、数日間培養した。この期間中、Ｂ細胞はモノクローナル抗体を産生し、培養培地（Ｂ細胞上清）へと放出した。これらの各Ｂ細胞上清をＩｇＧの産生について解析し；その後、ｈｕＳＩＲＰαＢＩＴおよびｈｕＳＩＲＰα１、ｃｙＳＩＲＰα、ならびに抗Ｆｃ抗体への特異的結合を決定した。適切な上清は、ｈｕＳＩＲＰαＢＩＴとｈｕＳＩＲＰα１の両者、ならびにｃｙＳＩＲＰαに結合する上清であった。ヒットピッキング工程の後、マウス（ｍｕ）ＳＩＲＰαへの結合、ならびにｈｕＳＩＲＰβ１ｖ１、ｈｕＳＩＲＰβ１ｖ２およびｈｕＳＩＲＰγ（アンチターゲットとしての）への結合を測定した。加えて、ＳＩＲＰαＢＩＴおよびＳＩＲＰα１を過剰発現するＣＨＯ細胞への結合を決定した。親ＣＨＯ細胞への結合を対照アッセイとして用いた。
【０１０３】
ＲＮＡの単離、逆転写およびシーケンシングに適するＢ細胞溶解物を選択した。抗体の軽鎖および重鎖の可変領域を遺伝子合成し、それぞれ、抗体の定常領域配列（配列番号２６のκＬＣおよび配列番号２７のヒトＩｇＧ１ＨＣ−ＬＡＬＡ形態）の直前にクローニングした。
【０１０４】
Tecan Freedom Evoプラットフォーム上の自動式手順を使用して、プラスミドに含まれる抗体配列をＨＥＫ２９３細胞に一過性にトランスフェクトした。プレート用オートサンプラーを有するDionex Ultimate 3000 ＨＰＬＣシステムのアフィニティー精製（プロテインＡ）を使用して、免疫グロブリンを細胞上清から精製した。産生された抗体を、ＥＬＩＳＡアッセイ（ＥＬＩＳＡ：ｈｕＳＩＲＰα１、ｈｕＳＩＲＰαＢＩＴ、ｃｙＳＩＲＰα、ｍｕＳＩＲＰα、ｈｕＳＩＲＰβ１ｖ１／β１ｖ２／γ；細胞結合アッセイ：ｈｕＳＩＲＰα１、ｈｕＳＩＲＰαＢＩＴ）により調べた。
【０１０５】
抗体の一過性発現
ａ）ｃＤＮＡ構築物および発現ベクターの調製
抗体のＨＣＶＲアミノ酸配列の各々を、Ｎ末端において、リーダー配列（抗体１〜９、１５、１６について、配列番号２８；抗体１０〜１４について、配列番号３９）へと接続し、Ｃ末端において、配列番号２７のヒトＩｇＧ１ ＨＣ ＬＡＬＡの定常ドメインへと接続した。抗体１２Ｃ４ｈｕＩｇＧ１ＬＡＬＡ、１２Ｃ４ｈｕＩｇＧ１または２９ＡＭ４−５ｈｕＩｇＧ１ＬＡＬＡのＨＣＶＲアミノ酸配列の各々を、Ｎ末端において、ＨＡＶＴ２０リーダー配列（配列番号２９）へと接続し、Ｃ末端において、配列番号２７のヒトＩｇＧ１ ＨＣ ＬＡＬＡの定常ドメイン、または野生型ヒトＩｇＧ１ ＨＣ（配列番号２５）へと接続した。結果として得られるキメラアミノ酸配列を、ヒト細胞（Homo sapiens）での発現にコドン最適化したｃＤＮＡ配列へと、逆翻訳した。同様に、構築物のＬＣのためのキメラｃＤＮＡ配列は、リーダー配列（抗体１〜９、１２について、配列番号２８；抗体１０、１１、１３〜１６について、配列番号４０；１２Ｃ４ｈｕＩｇＧ１ＬＡＬＡ、１２Ｃ４ｈｕＩｇＧ１および２９ＡＭ４−５ｈｕＩｇＧ１ＬＡＬＡについて、配列番号２９）の配列を、Ｎ末端において、抗体１〜１６、１２Ｃ４ｈｕＩｇＧ１ＬＡＬＡ、１２Ｃ４ｈｕＩｇＧ１、および２９ＡＭ４−５ｈｕＩｇＧ１ＬＡＬＡのＬＣＶＲへと接続し、Ｃ末端において、ヒトＩｇＧ１κ軽鎖定常領域（配列番号２６）へと接続することにより得た。表１に示したＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ配列を使用した。
【０１０６】
【表１】
2020520370.tif 000002
【０１０７】
ｂ）ベクターの構築およびクローニング戦略
抗体鎖の発現のために、ＣＭＶ：ＢＧＨｐＡ発現カセットを含有する哺乳動物の発現ベクターを使用した。ＨＣまたはＬＣ発現カセット（それぞれ、ＣＭＶ：ＨＣ：ＢＧＨｐＡおよびＣＭＶ：ＬＣ−ＢＧＨｐＡ）のいずれかを含有する最終ベクターを大腸菌ＮＥＢ５α細胞へと導入し、この中で増やした。MaxiまたはMegaprepキット（Qiagen）を使用して、トランスフェクション用最終発現ベクターの大規模製造を行った。
【０１０８】
ｃ）哺乳動物細胞内での一過性発現
以下の製造元の指示に従い、ExpiFectamineトランスフェクション試薬を使用して、市販のＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Thermo Fisher）に発現ベクターをトランスフェクトした：細胞７５×１０７個を３００ｍＬのＦｏｒｔｉＣＨＯ培地中に播種し、３００μｇの発現ベクターを８００μｌのExpiFectamineトランスフェクション試薬と混合し、細胞へと添加した。トランスフェクションの１日後、１．５ｍｌのエンハンサー１および１５ｍｌのエンハンサー２を培養物へと添加した。トランスフェクションの６日後、４，０００ｇ、１５分間の遠心分離により細胞培養物上清を採取し、清澄化した採取物を、ＰＥＳボトルフィルター／ＭＦ ７５フィルター（Nalgene）により濾過した。
【０１０９】
抗体の結合および特異性
実験内容
ＥＬＩＳＡアッセイ：  ＥＬＩＳＡのために、ｈｕＳＩＲＰα１、ｈｕＳＩＲＰαＢＩＴ、ｈｕＳＩＲＰβ１ｖ１、ｈｕＳＩＲＰβ１ｖ２、ｈｕＳＩＲＰγおよびｃｙＳＩＲＰαのリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）の各々を、マルチプルウェル黒色ポリスチレンプレートへと添加し、室温で、１時間かけて吸着させた。結合しなかったタンパク質は、標準的な洗浄緩衝液を使用して、３回の洗浄工程により除去した。その後、ブロッキング緩衝液をウェルへと添加した。室温で１時間インキュベーションした後、ウェルを標準的な洗浄緩衝液で３回洗浄した。様々な濃度の抗体を含む緩衝液をウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。結合しなかった抗体は、標準的な洗浄緩衝液を使用して３回の洗浄工程により除去した。ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ’）２：西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）緩衝液をウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を添加し、十分な発色の後ＨＣｌを添加した。４５０ｎｍ／６２０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【０１１０】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイ：  親和性解析は、表面プラズモン共鳴装置（Biacore T200システム、GE Life Sciences）を用い、２５℃における単一サイクルの反応速度解析により実施した。１０μｌ／分で、６０秒間、ストレプトアビジンコンジュゲート（２０倍に希釈されたビオチン捕捉試薬、GE Life Sciences）を注入した後、ランニング緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡおよび０．００５％ ｖ／ｖのポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（Surfactant P20）を含む、ｐＨ７．４の１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液）に、５μｇ／ｍｌのＳＩＲＰ抗原を、１０μＬ／分で、６０秒間注入することにより、ビオチン化分子用チップ（Sensor Chip CAP、GE Life Sciences）の表面にビオチン化ＳＩＲＰ抗原を捕捉した。１分後にベースラインの安定化を施し、この後、ランニング緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡおよび０．００５％ ｖ／ｖのポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートを含む、ｐＨ７．４の１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液）中の濃度を５段階で増大させた抗ＳＩＲＰ抗体を注入した。各工程について１５０秒間の会合時間を使用したが、最高濃度に限り１２００秒間の解離時間を続け、全ての工程は３０μＬ／分の流量で行った。再生は、６Ｍのグアニジン−ＨＣｌ、０．２５ＭのＮａＯＨ溶液（３０μＬ／分の流量で６０秒間）により実施した。抗ＳＩＲＰ（ブランク）を固定化しない基準フローチャネル、およびランニング緩衝液の注入を使用して、観察されたセンサーグラムに対して二重のブランク減算を実施した。全ての被験抗ＳＩＲＰ抗体について、１：１のラングミュアモデルにより、センサーグラムを当てはめた。Biacore T200評価ソフトウェア（ｖ３．１）を使用して反応速度パラメータ（ｋａ、ｋｄおよびＫＤ）を計算した。
【０１１１】
フローサイトメトリー：  ヒトＳＩＲＰαＢＩＴ抗原を内因的に発現するＵ９３７細胞、およびヒトＳＩＲＰα１、ＳＩＲＰαＢＩＴまたはｃｙＳＩＲＰα抗原を発現するＣＨＯ−Ｓチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＥｘｐｉＣＨＯ−Ｓ）から、スクリーニングおよび単離された、非操作サブクローンに由来する細胞（９６ウェルプレート内のウェル１つ当たりの細胞１００，０００個）を、氷冷ＦＡＣＳ緩衝液（０．２％ ｖ／ｗのＢＳＡ（Sigma-Aldrich、St. Louis, MO）および０．０２％ ｖ／ｗのＮａＮ３（Sigma-Aldrich）を含有する、１倍濃度のＰＢＳ（LONZA））で３回洗浄し、続いて、氷冷ＦＡＣＳ緩衝液中に希釈した様々な濃度範囲の各一次ｍＡｂを（ウェル１つ当たり５０μＬずつ）添加した。４℃で３０分間のインキュベーションの後、氷冷ＦＡＣＳ緩衝液で細胞を３回洗浄し、ウェル１つ当たり５０μＬの二次ｍＡｂ（希釈率を１：６，０００とする、ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＡＰＣ、アフィニティー精製Ｆ（ａｂ’）２断片、Jackson Immuno Research）を添加した。４℃で３０分間後、細胞を２回洗浄し、１５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させた。蛍光強度をフローサイトメトリー（BD FACSVerse、Franklin Lakes, NJ）で決定し、Ｕ９３７細胞およびＥｘｐｉＣＨＯ−Ｓ細胞について、蛍光強度中央値（MFI-Median）として表示した。曲線は、GraphPad Prism（version 7.02 for Windows（登録商標）, GraphPad, San Diego, CA）において、傾きが変動可能なＳ字型用量反応式（４パラメータ）を使用する、非線形回帰により当てはめた。ＥＣ５０値は、４パラメータのロジスティックフィットを使用し、曲線の上部と下部との中間の応答を示すμｇ／ｍＬによる濃度として計算した。
【０１１２】
結果
ＥＬＩＳＡアッセイ：  抗体１〜９および基準抗体の、ＥＬＩＳＡにより得られた、ｈｕＳＩＲＰα１、ｈｕＳＩＲＰαＢＩＴ、ｈｕＳＩＲＰβ１、ｈｕＳＩＲＰβ１ｖ２、ｈｕＳＩＲＰγ、ｃｙＳＩＲＰαへの結合についてのＥＣ５０値を、表２にまとめる。全ての抗体は、ｈｕＳＩＲＰα１およびｈｕＳＩＲＰαＢＩＴに結合する。抗体２９ＡＭ４−５ｈｕＩｇＧ１ＬＡＬＡおよび１２Ｃ４ｈｕＩｇＧ１ＬＡＬＡは、ｈｕＳＩＲＰβ１ｖ１、ｈｕＳＩＲＰβ１ｖ２およびｈｕＳＩＲＰγに結合する。抗体２〜６、８および９は、ｈｕＳＩＲＰβ１ｖ１およびｈｕＳＩＲＰγに対する低親和性を示す。抗体７は、ｈｕＳＩＲＰβ１ｖ１に結合するが、ｈｕＳＩＲＰβ１ｖ２およびｈｕＳＩＲＰγに対する親和性は小さい。抗体１は、ｈｕＳＩＲＰβ１ｖ２およびｈｕＳＩＲＰγに結合する。
【０１１３】
【表２】
2020520370.tif 000003
【０１１４】
ＳＰＲアッセイ：  基準抗体であるＫＷＡＲ２３、ｈｕＩｇＧ１１２Ｃ４ＬＡＬＡおよびＳＥ５Ａ５（製造業者から購入）と比較した、抗体４、７、１０〜１４の、ｈｕＳＩＲＰα１、ｈｕＳＩＲＰαＢＩＴおよびｈｕＳＩＲＰγへの結合についてのＫＤ値を、表３にまとめる。抗体４、７、１０〜１４は、ｈｕＳＩＲＰα１とｈｕＳＩＲＰαＢＩＴの両者に結合し、ｈｕＳＩＲＰγに結合しない。全ての基準抗体はｈｕＳＩＲＰγに結合する。
【０１１５】
【表３】
2020520370.tif 000004
【０１１６】
フローサイトメトリーアッセイ：  多様な抗体の、細胞上に発現したｈｕＳＩＲＰα１、ｈｕＳＩＲＰαＢＩＴおよび／またはｃｙＳＩＲＰαへの結合を、フローサイトメトリーにより測定した。結合をＥＣ５０値で表示し、これを表４に示す。抗体２、４、５、７、８、１０〜１４は、ｈｕＳＩＲＰα１、ｈｕＳＩＲＰαＢＩＴおよびｃｙＳＩＲＰαに結合する。抗体２、４、５、７、８、１０〜１４は、低μｇ／ｍＬ範囲でｃｙＳＩＲＰαに結合する。
【０１１７】
【表４】
2020520370.tif 000005
【０１１８】
抗体によるＣＤ４７−ＳＩＲＰα結合の遮断
実験
ＳＩＲＰα１もしくはＳＩＲＰαＢＩＴのいずれかをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞、または対照としての親ＣＨＯ細胞を、底部が透明なウェルプレート内の２０μｌ細胞培地中に播種し、一晩インキュベートした。抗体１〜９、２９ＡＭ４−５ｈｕＩｇＧ１ＬＡＬＡ、または１２Ｃ４ｈｕＩｇＧ１ＬＡＬＡ基準抗体を、Ｈｉｓタグ（登録商標）ＣＤ４７と抗Ｈｉｓタグ（登録商標）蛍光検出抗体の混合物と併せでウェルに添加し、２時間インキュベートした。インキュベーションの後、細胞を細胞洗浄緩衝液で洗浄した。蛍光はスクリーニングシステム（CellInsight（登録商標）、ThermoScientific（登録商標））を使用して測定し、細胞１個当たりの全蛍光を決定した。
【０１１９】
結果
抗体２９ＡＭ４−５ｈｕＩｇＧ１ＬＡＬＡ、１２Ｃ４ｈｕＩｇＧ１ＬＡＬＡ、３および７は、ＣＤ４７の、ｈｕＳＩＲＰα１を発現するＣＨＯ細胞およびｈｕＳＩＲＰαＢＩＴを発現するＣＨＯ細胞の両者への結合を、完全に遮断し、抗体１、２、４〜６、８および９は、ＣＤ４７の、ｈｕＳＩＲＰα１を発現するＣＨＯ細胞への結合も、ｈｕＳＩＲＰαＢＩＴを発現するＣＨＯ細胞への結合も遮断しない。
【０１２０】
ＡＤＣＣアッセイ
ＳＩＲＰα１またはＳＩＲＰαＢＩＴのいずれかについてホモ接合性であるドナーの好中球を単離し、Chaoら、PNAS, 2011, 108(45), 18342-18347に示された方法に従い培養した。ＡＤＣＣは、５１Ｃｒ放出アッセイまたは非放射性ユーロピウムＴＤＡ（ＥｕＴＤＡ）細胞傷害作用アッセイ（DELFIA、PerkinElmer）を使用して測定した。ＳＫＢＲ３細胞を標的細胞として使用し、１００μＣｉの５１Ｃｒ（Perkin-Elmer）により、３７℃で９０分間、または、ビス（アセトキシメチル）2,2':6',2''-テルピリジン-6,6''-ジカルボキシレート）（Ｄｅｌｆｉａ ＢＡＴＤＡ試薬）により、３７℃で５分間、標識化した。ＰＢＳによる２回の洗浄の後、１ウェル当たり５×１０３個の標的細胞を、適切な抗体の存在下、エフェクター対標的細胞比を５０：１とする好中球と共に、９６ウェルのＵ字底のプレート内の１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を補充したＩＭＤＭ培養培地中で、３７℃、５％ＣＯ２の下、４時間インキュベートした。インキュベーションの後上清を採取し、ガンマカウンター（Wallac）で放射能について解析するか、またはユーロピウム溶液（DELFIA、PerkinElmer）を添加し、分光光度計（Envision、PerkinElmer）を使用してユーロピウム2,2':6',2''-テルピリジン-6,6''-ジカルボン酸（ＥｕＴＤＡ）の蛍光を測定した。細胞傷害作用の百分率は、［（被験放出−自然放出）／（総放出−自然放出）］×１００％として計算した。全ての測定は、二回および／または三回行った。
【０１２１】
１２Ｃ４ＩｇＧ１に対する１２Ｃ４ｈｕＩｇＧ１ＬＡＬＡのＡＤＣＣデータ
図１に、ＡＤＣＣアッセイの結果を％による細胞傷害作用として示す。エフェクター細胞としての好中球とトラスツズマブのみを使用し、ＳＫＢＲ３細胞を用いて測定された細胞傷害作用％は、マウス１２Ｃ４抗体（ｍｕ１２Ｃ４）と組み合わせたトラスツズマブの細胞傷害作用％より小さい。１２Ｃ４の可変領域をヒトＩｇＧ１定常領域とグラフトした抗体（１２Ｃ４ｈｕＩｇＧ１）と組み合わせたトラスツズマブは、１２Ｃ４ｈｕＩｇＧ１が低濃度の場合、トラスツズマブ単独の場合と同様な細胞傷害作用％を示す。１２Ｃ４ｈｕＩｇＧ１が高濃度では、細胞傷害作用％の減少が観察される。１２Ｃ４の可変領域を、アミノ酸置換であるＬ２３４ＡおよびＬ２３５Ａを含むヒトＩｇＧ１定常領域とグラフトした抗体（１２Ｃ４ｈｕＩｇＧ１ＬＡＬＡ）と組み合わせたトラスツズマブは、トラスツズマブ単独の細胞傷害作用％と比較して細胞傷害作用％の増大を示し、そして、１２Ｃ４ｈｕＩｇＧ１とトラスツズマブとの組合せと比較して、細胞傷害作用％の増大を示す。
【０１２２】
ＡＤＣＣデータ
図２は、トラスツズマブと組み合わせた、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａのアミノ酸置換（ＬＡＬＡ）を含むヒトＩｇＧ１定常領域を有する抗体１〜９の存在下における、トラスツズマブ単独（１００％とした）と比べた、ヒト好中球によるＡＤＣＣ％を、１２Ｃ４ｈｕＩｇＧ１ＬＡＬＡと比較する。マウス抗ＣＤ４７抗体のＶＲおよびＬ２３４ＡおよびＬ２３５Ａのアミノ酸置換を含むヒトＩｇＧ１定常領域を有するＢ６Ｈ１２ＩｇＧ１ＬＡＬＡ、ならびに媒体（トラスツズマブを伴わない）を、それぞれ、陽性対照および陰性対照として使用した。黒四角はＳＩＲＰαＢＩＴ変異体（ＳＩＲＰαＢＩＴについてホモ接合性）を有するドナーの好中球の実測値であり、白丸はＳＩＲＰα１変異体（ＳＩＲＰα１についてホモ接合性）を有するドナーの好中球の実測値である。全ての抗体について、平均ＡＤＣＣはトラスツズマブ単独と比較して増大した。抗体１、２、４、５、７および８について、平均ＡＤＣＣの増大は、１２Ｃ４ｈｕＩｇＧ１ＬＡＬＡに誘導されるＡＤＣＣの増大よりさらに増強された。抗体ごと、ドナーごとのＡＤＣＣの増大を比較したところ、抗体１、３〜６、８および９は、１２Ｃ４ｈｕＩｇＧ１ＬＡＬＡより小さなＡＤＣＣの増大％の変動を示す。
【０１２３】
図３は、トラスツズマブと組み合わせた、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａのアミノ酸置換（ＬＡＬＡ）を含むヒトＩｇＧ１定常領域を有する様々な濃度のキメラ抗体４および７、ならびにヒト化抗体１０および１４の存在下における、ヒト好中球によるＡＤＣＣ％を、トラスツズマブ単独、および様々な濃度の１２Ｃ４ｈｕＩｇＧ１ＬＡＬＡと組み合わせたトラスツズマブと比較する。ＳＩＲＰαＢＩＴについてホモ接合性のドナー２例の好中球を使用した。低濃度であってもなお、抗体４、７、１０および１４は、ＡＤＣＣを増大させた。ＡＤＣＣの増大は濃度依存的である。
【０１２４】
図４は、トラスツズマブ（Ｔｍａｂ）と組み合わせた、抗体４、７、１０、１３、１４、１５および１６の存在下における、ヒト好中球によるＡＤＣＣ％を、トラスツズマブ単独、および１２Ｃ４ｈｕＩｇＧ１ＬＡＬＡの存在下におけるＡＤＣＣ％と比較する。トラスツズマブ単独と比較して、全ての抗体でＡＤＣＣが増大した。トラスツズマブと組み合わせた抗体４、７、１０、１３、１４、１５および１６の存在下における大半のドナーの好中球によるＡＤＣＣの増大は、トラスツズマブと組み合わせた１２Ｃ４ｈｕＩｇＧ１ＬＡＬＡと比較して同等以上である。
【０１２５】
重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）可変領域（ＶＲ）のアミノ酸配列内の、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列に下線を付した配列表（カバットによる方法を使用して決定された）
【０１２６】
【化１−１】
2020520370.tif 000006
【０１２７】
【化１−２】
2020520370.tif 000007
【０１２８】
【化１−３】
2020520370.tif 000008
【０１２９】
【化１−４】
2020520370.tif 000009
【０１３０】
【化１−５】
2020520370.tif 000010
【０１３１】
【化１−６】
2020520370.tif 000011
【０１３２】
【化１−７】
2020520370.tif 000012
【０１３３】
【化１−８】
2020520370.tif 000013
【０１３４】
【化１−９】
2020520370.tif 000014
【図１】
2020520370.tif 000015
【図２】
2020520370.tif 000016
【図３】
2020520370.tif 000017
【図４】
2020520370.tif 000018
【配列表】
2020520370000001.xml
【手続補正書】
【提出日】令和2年1月31日(2020.1.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2020520370000001.app
【国際調査報告】
2020520370.tif 000033
2020520370.tif 000034
2020520370.tif 000035
2020520370.tif 000036
2020520370.tif 000037
2020520370.tif 000038
2020520370.tif 000039
2020520370.tif 000040
2020520370.tif 000041
2020520370.tif 000042
2020520370.tif 000043