(57)【要約】本明細書の実施形態は、タンパク分解酵素、ペプシンを含む人工胃液（ＳＧＦ）中の測定が困難なまたは膜結合型のタンパク質のインビトロでの安定性を分析する方法を、正確な分解産物をモニタリングするためのＬＣ−ＭＳ／ＭＳなどの最先端の質量分析アプローチを採用する新規なペプシン・トリプシン・アッセイと組み合わせて、提供する。タンパク質消化の程度は、ペプシンの産物の出現、および、（無傷のタンパク質の代理としての）トリプシンペプチド産物の消失によって評価可能である。本実施形態はさらに、高感受性ＬＣ−ＭＲＭ−ＭＳ定量化を使用する、タンパク質定量化のための方法を提供する。本明細書で具体化された方法は、長鎖オメガ−３多価不飽和脂肪酸を産生するために遺伝子操作されたキャノーラなどのトランスジェニック植物中で産生されたタンパク質を特徴づける際にとりわけ役に立つ。【選択図】図１
2020513100.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的タンパク質の安定性を特徴づけるための方法であって、
標的タンパク質をペプシン消化に晒す工程、
ペプシン消化からサンプルの少なくとも１回の時間経過を得る工程、  
各少なくとも１回の時間経過サンプルの一部をトリプシン消化に晒す工程、
ペプシン・トリプシン消化からサンプルの時間経過を得る工程、
各ペプシンおよびペプシン・トリプシンのサンプルについてＬＣ−ＭＳ／ＭＳのデータを集める工程；および、
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳデータから、標的タンパク質消化の速度論と、標的タンパク質の特定領域のタンパク質分解に対する感受性とを決定する工程、
を含む、方法。
【請求項２】
標的タンパク質が組換えタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
タンパク質が、測定が困難なタンパク質または膜結合型タンパク質である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
タンパク質はトランスジェニック植物から得られる、請求項１−３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項５】
タンパク質はトランスジェニックアブラナから得られる、請求項１−５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６】
標的タンパク質を定量化するための方法であって、前記方法が、
標的タンパク質をトリプシン消化に晒す工程、
標的タンパク質の代理として作用するようにペプチドを選択する工程、
選択された代理となるペプチドの軽および重合成バージョンを生成する工程、
代理となるペプチドの合成の軽および重バージョンに関するＬＣ−ＭＳ／ＭＳデータを得る工程、
トリプシン消化された標的タンパク質に関するＬＣ−ＭＳ／ＭＳデータを得る工程、および、
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳデータから代理となるペプチドの濃度を決定する工程であって、
代理となるペプチドの濃度が標的タンパク質の量と相関する、工程、
を含む、方法。
【請求項７】
本明細書に開示される標的タンパク質の安定性を特徴づけるための方法。
【請求項８】
本明細書に開示される標的タンパク質を定量化する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１７年３月７日に出願された米国仮特許出願第６２／４６８，３３１号の優先権を主張するものであり、当該文献はすべての目的のために本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、すべての目的のために本明細書に組み込まれる配列表を含む。
【０００３】
本明細書に記載される実施形態は、標的タンパク質、特に測定が困難な標的タンパク質の安定性と量を特徴づけるための方法、アッセイ、および組成物を提供する。
【背景技術】
【０００４】
標的タンパク質、特に、現在の手法では容易に特徴づけられない測定が困難なトランスジェニックタンパク質あるいは薄結合性タンパク質の安定性および量を特徴づける方法とアッセイに対するニーズがある。
【発明の概要】
【０００５】
本明細書に記載される実施形態は、高感受性ＬＣ−ＭＲＭ−ＭＳを使用して、標的タンパク質の安定性（消化性）および量を特徴づけるための新規な技術を提供する。例えば、食物、飼料、および環境上のリスクアセスメントは、植物の組織と種子内でのタンパク質の安定性と発現レベルを含むトランスジェニックタンパク質の完全な評価を必要とする。例えば、実際のサンプル中の標的タンパク質の量が検出レベルを欺くことがあるため、標的タンパク質の量は抗体を産生させるのに必要な量を欺くことがあるため、あるいは、標的タンパク質は選択的または高感受性なエピトープをもたらさないことがあるため、抗体はトランスジェニックタンパク質を特徴づけるのに必ずしも役立つとは限らない。確かに、特定の酵素のタンパク質の類似性は非特異的抗体交差反応をもたらす。さらに、緊密な薄結合性がエピトープを覆うため、抗体は多くの膜タンパク質を特徴づけるのに必ずしも役立つとは限らず、そのような膜タンパク質はしばしば低レベルで発現される。本実施形態が最小限の処理で総タンパク質抽出を利用するため、本明細書に記載されるＬＣ  ＭＳ／ＭＳの方法をスケールアップして、ハイスループットを可能にすることができる。ゆえに、本実施形態は、測定が困難な標的タンパク質を評価するための都合の良い代替的な手法を提供する。
【０００６】
本実施形態は、トランスジェニックキャノーラ中で発現された測定が困難な膜関連タンパク質などのトランスジェニックまたは膜タンパク質を含む標的タンパク質を評価するＬＣ−ＭＳ／ＭＳベースの方法を提供する。
【０００７】
本実施形態の態様は、植物の組織と種におけるトランスジェニック膜結合タンパク質の発現、安定性（消化性としての）、および、量の特徴づけをもたらす。少なくとも１つの実施形態は、正確な分解産物を直接モニタリングするために質量分析法を採用して、デュアルペプシン−トリプシン分解アッセイと組み合わせて、ペプシンによる人工胃液（ＳＧＦ）タンパク質分解を用いて、トランスジェニック膜結合タンパク質のインビトロでの消化性を評価する方法を提供する。
【０００８】
方法の１つの実施形態では、標的タンパク質はペプシンを用いて消化され、その後、トリプシンで完全に消化される。トリプシンペプチドの減少を、無傷のタンパク質の代理として使用することができ、消化性ペプチドの出現と消失を、標的タンパク質のインビトロの消化性を示すために使用することができる。この時間経過比較は、標的タンパク質の詳細な安定性の特徴づけをもたらす。測定が困難な／処理が困難なタンパク質を特徴づける際にこの手法はとりわけ有利である。
【０００９】
少なくとも１つの実施形態では、デュアルペプシンおよびペプシン／トリプシンタンパク質消化性アッセイは、遺伝子組み換え作物へ新しく導入されたタンパク質の全体的なアレルゲン性評価の１つの態様として使用可能である。本明細書に記載される方法は、標的タンパク質のアレルギーの可能性の予測に対して証拠の重み付けアプローチ中の追加の証拠を与える。
【００１０】
少なくとも１つの実施形態は、添加された内部標準と直接ＬＣ−ＭＳ／ＭＳの分析を駆使して、既知量の総タンパク質中のペプチドマーカーを使用して、植物などのトランスジェニック生物の様々な組織中の標的タンパク質の量を決定するためのアッセイを提供する。例えば、本明細書に記載された方法を使用して、トランスジェニックキャノーラの組織と種子で発現された測定が困難なトランスジェニック膜結合性タンパク質を特徴づけることができる。特定の実施形態では、本明細書に記載される方法を使用して、有意なレベルのオメガ−３長鎖（≧Ｃ２０）多価不飽和脂肪酸（ω３ＬＣＰＵＦＡ）を生成するアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）のトランスジェニック酵素を特徴づけるために使用することができる。
【００１１】
少なくとも１つの実施形態は、以下の工程を含む標的タンパク質の安定性を特徴づけるための方法を提供する：標的タンパク質をペプシン消化に晒す工程、ペプシン消化からサンプルの時間経過を得る工程、各時間経過サンプルの一部をトリプシン消化に晒す工程、ペプシン・トリプシン消化のサンプルの時間経過を得る工程、各ペプシンおよびペプシン・トリプシンのサンプルについてＬＣ−ＭＳ／ＭＳのデータを集める工程；および、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳデータから、標的タンパク質消化の速度論と、標的タンパク質の特定領域のタンパク質分解に対する感受性とを決定する工程。
【００１２】
少なくとも１つの実施形態は、以下の工程を含む標的タンパク質を定量化するための方法を提供する：標的タンパク質をトリプシン消化に晒す工程、標的タンパク質の代理として作用するようにペプチドを選択する工程、選択された代理となるペプチドの軽および重合成バージョンを生成する工程、代理となるペプチドの合成の軽および重バージョンに関するＬＣ−ＭＳ／ＭＳデータを得る工程、トリプシン消化された標的タンパク質に関するＬＣ−ＭＳ／ＭＳデータを得る工程、および、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳデータから代理となるペプチドの濃度を決定する工程であって、代理となるペプチドの濃度が標的タンパク質の量と相関する、工程。
【００１３】
より具体的には、例えば、油糧種子作物中のω３ＬＣＰＵＦＡの代謝工学は、高い配列相同性と膜結合の両方を示す複数のトランスジェニック脂肪酸デサチュラーゼおよびエロンガーゼの発現を必要とする。本明細書に記載されるように、そのようなトランスジェニック植物にＬＣ−ＭＳ／ＭＳベースの方法を適用することにより、種子に特有のプロモーターが導入遺伝子の発現を、発育中の種子と成熟した種子に正確に限定したこと、および、酵素のタンパク質が低レベル（ｍｇの総タンパク質あたりｎｇの標的）で存在したことが実証された。（標的のトランスジェニックタンパク質に特有の）特定のペプチドを調べることにより、この手法は、測定が困難なタンパク質、この場合には膜タンパク質の高選択的かつ高感受性な測定をもたらす。本明細書に記載されるＬＣ−ＭＳ／ＭＳベースの方法は、食物、飼料、および環境上の安全性評価に広く適用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】アブラナ属（キャノーラ）に組み込まれたトランスジェニック生合成経路の一例を例証する。より具体的には、キャノーラ中で発現された７つの組み換え酵素は、オレイン酸（ＯＡ）をドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）：酵母からの２つの脂肪酸デサチュラーゼ（Δ１２デサチュラーゼとω３／Δ１５−デサチュラーゼ）、微細藻類からの２つのエロンガーゼ（Δ６エロンガーゼとΔ５エロンガーゼ）、および微細藻類からの３つの「フロントエンド（ｆｒｏｎｔ−ｅｎｄ）」デサチュラーゼ（Δ６デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼとΔ４デサチュラーゼ）に変える。
【図２】図１の生合成酵素におけるトリプシンペプチドのアミノ酸配列を示す。様々な宿主発現系を用いて、組み換え酵素はトリプシン消化後のＬＣ  ＭＳ／ＭＳによって特徴づけられ、トリプシンペプチドの実施形態はトランスジェニック植物の組織と種子においてタンパク質を定量化するために選択された。太字：＞９５％の信頼度で同定されたペプチドの例；太字のイタリック体：５０−９５％の信頼度で同定されたペプチドの例；通常文字：＜５０％の信頼度で同定されたペプチド；イタリック体：検知されなかった。実線と破線の下線は、隣接する完全なトリプシンペプチド（６−２０アミノ酸長さ）を同定するために使用される。
【図３Ａ】合成Ｌａｃｋｌ−Δ１２Ｄペプチドの品質管理を反映するクロマトグラムである。（上パネル）５．３８分のＬａｃｋｌ−Δ１２ＤペプチドＧＳＳＳＮＴＥＱＥＶＰＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸残基「“ａａ”］１６−２６）ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳの全イオンクロマトグラム（「ＴＩＣ」）、他の有意なピークは検知されなかった；（中パネル）５．３８分のピークについて６３１．７９２＋の決定されたｍ／ｚ値は、理論上のｍ／ｚ値６３１．７９２＋と一致する；（下パネル）適切なペプチド配列のＭＳ／ＭＳのスペクトル、理論上のｍ／ｚ値が示されている（挿入図）。
【図３Ｂ】合成Ｌａｃｋｌ−Δ１２Ｄペプチドの品質管理を反映するクロマトグラムである。（上パネル）５．３９分のＧＳＳＳＮＴＥＱＥＶ＊ＰＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のａａ１６−２６）のＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ  ＴＩＣ。他の有意なピークは検知されなかった；（中パネル）５．３８分のピークについて６３４．８０２＋の決定されたｍ／ｚ値は、理論上のｍ／ｚ値６３４．８０２＋と一致する；（下パネル）適切なペプチド配列のＭＳ／ＭＳのスペクトル、理論上のｍ／ｚ値が示されている（挿入図）。
【図４Ａ】Ｐｉｃｐａ−ω３Ｄペプチドの品質管理を反映するクロマトグラムである。（上パネル）８．３４分でのＰｉｃｐａ−ω３ＤペプチドＩＰＦＹＨＡＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のａａ３５１−３５８）のＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ  ＴＩＣ。他の有意なピークは検知されなかった；（中パネル）８．３４分でのピークについて４５２．２４２＋の決定されたｍ／ｚ値は、理論上のｍ／ｚ値４５２．２４２＋と一致する；（下パネル）適切なペプチド配列のＭＳ／ＭＳのスペクトルと理論上のｍ／ｚ値が示されている（挿入図）。
【図４Ｂ】Ｐｉｃｐａ−ω３Ｄペプチドの品質管理を反映するクロマトグラムである。（上パネル）８．３６分でのペプチドＩＰＦＹＨＡ＊Ｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のａａ３５１−３５８）のＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ  ＴＩＣ。他の有意なピークは検知されなかった；（中パネル）４５４．２５２＋の８．３６分でのピークについて決定されたｍ／ｚ値は、理論上のｍ／ｚ値４５４．２５２＋と一致する；（下パネル）適切なペプチド配列のＭＳ／ＭＳのスペクトルと理論上のｍ／ｚ値が示されている（挿入図）。
【図５Ａ】Ｍｉｃｐｕ−Δ６Ｄペプチドについての品質管理クロマトグラムである。（上パネル）７．９６分でのＭｉｃｐｕ−Δ６ＤペプチドＤＡＳＴＡＰＶＤＬＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のａａ３０−３９）のＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ  ＴＩＣ。他の有意なピークは検知されなかった；（中パネル）５０８．７６２＋の７．９６分でのピークについて決定されたｍ／ｚ値は、理論上のｍ／ｚ値５０８．７６２＋と一致する；（下パネル）適切なペプチド配列を明らかにするＭＳ／ＭＳスペクトルと理論上のｍ／ｚ値が示されている（挿入図）。
【図５Ｂ】Ｍｉｃｐｕ−Δ６Ｄペプチドについての品質管理クロマトグラムである。（上パネル）７．９４分でのペプチドＤＡＳＴＡＰＶＤＬ＊Ｋ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のａａ３０−３９）のＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ  ＴＩＣ。他の有意なピークは検出されなかった；（中パネル）５１２．２７２＋の７．９４分でのピークについて決定されたｍ／ｚ値は、理論上のｍ／ｚ値５１２．２７２＋と一致する；（下パネル）適切なペプチド配列を明らかにするＭＳ／ＭＳのスペクトルと理論上のｍ／ｚ値（挿入図）。
【図６Ａ】Ｐｙｒｃｏ−Δ６Ｅペプチドの品質管理を示すクロマトグラムである。（上パネル）１０．６４分でのＰｙｒｃｏ−Δ６ＥペプチドＧＱＤＰＦＬＬＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のａａ８３−９０）のＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ  ＴＩＣ。他の有意なピークは検知されなかった；（中パネル）４５９．２６２＋の１０．６４分でのピークについて決定されたｍ／ｚ値が示されており、４５９．２６２＋の理論上のｍ／ｚ値と一致する；（下パネル）適切なペプチド配列のＭＳ／ＭＳのスペクトルと理論上のｍ／ｚ値が示されている（挿入図）。
【図６Ｂ】Ｐｙｒｃｏ−Δ６Ｅペプチドの品質管理を示すクロマトグラムである。（上パネル）１０．６３分でのペプチドＧＱＤＰＦＬＬ＊Ｋ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のａａ８３−９０）のＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ  ＴＩＣ。他の有意なピークは検出されなかった；（中パネル）４６２．７６２＋の１０．６４分でのピークについて決定されたｍ／ｚ値が示されており、４６２．７６２＋の理論上のｍ／ｚ値と一致する；（下パネル）適切なペプチド配列のＭＳ／ＭＳのスペクトルと理論上のｍ／ｚ値（挿入図）。
【図７Ａ】Ｐａｖｓａ−Δ５Ｄペプチドについての品質管理クロマトグラムである。（上パネル）１０．１４分でのＰａｖｓａ−Δ５ＤペプチドＡＹＤＶＴＮＦＶＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５のａａ３７−４５）のＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ  ＴＩＣ。他の有意なピークは検知されなかった；（中パネル）５２８．７７２＋の１０．１４分でのピークについて決定されたｍ／ｚ値は、理論上のｍ／ｚ値５２８．７７２＋と一致する；（下パネル）適切なペプチド配列のＭＳ／ＭＳのスペクトルと理論上のｍ／ｚ値（挿入図）。
【図７Ｂ】Ｐａｖｓａ−Δ５Ｄペプチドについての品質管理クロマトグラムである。（上パネル）１０．１８分でのペプチドＡＹＤＶＴＮＦＶ＊Ｋ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５のａａ３７−４５）のＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ  ＴＩＣ。他の有意なピークは検知されなかった；（第２のパネル）１０．１８分でのピークについて５３１．７７２＋の決定されたｍ／ｚ値は、理論上のｍ／ｚ値５３１．７７２＋と一致する；（第３のパネル）適切なペプチド配列のＭＳ／ＭＳのスペクトルと理論上のｍ／ｚ値（挿入図）。
【図８Ａ】Ｐｙｒｃｏ−Δ５Ｅペプチドの品質管理クロマトグラムである。（上パネル）８．４４分でのＰｙｒｃｏ−Δ５ＥペプチドＳＱＰＦＧＬＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のａａ６６−７２）のＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ  ＴＩＣ。他の有意なピークは検知されなかった；（中パネル）８．４４分でのピークについて決定されたｍ／ｚ値、３８８．７２２＋と７７６．４３１＋は、理論上のｍ／ｚ値：３８８．７２２＋と７７６．４３１＋と一致する；（下パネル）適切なペプチド配列のＭＳ／ＭＳのスペクトルと理論上のｍ／ｚ値（挿入図）。
【図８Ｂ】Ｐｙｒｃｏ−Δ５Ｅペプチドの品質管理クロマトグラムである。（上パネル）８．４６分でのペプチドＳＱＰＦＧＬ＊Ｋ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のａａ６６−７２）のＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ  ＴＩＣ。他の有意なピークは検知されなかった；（第２のパネル）８．４６分でのピークについて決定されたｍ／ｚ値、３９２．２２２＋と７８３．４５１＋は、理論上のｍ／ｚ値：３９２．２２２＋と７８３．４３１＋と一致する；（第３のパネル）適切なペプチド配列のＭＳ／ＭＳのスペクトルと理論上のｍ／ｚ値（挿入図）。
【図９Ａ】Ｐａｖａ−Δ４Ｄペプチドの品質管理クロマトグラムである。（上パネル）８．３６分でのＰａｖｓａ−Δ４ＤペプチドＬＡＰＬＶＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のａａ４０３−４０８）のＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ  ＴＩＣ。他の有意なピークは検知されなかった；（第２のパネル）８．３６分でのピークについて決定されたｍ／ｚ値、３２０．７２２＋と６４０．４４１＋は、理論上のｍ／ｚ値：３２０．７２２＋と６３９．４４１＋（≦１ｐｐｍの質量誤差をそれぞれ表す）と一致する；（下パネル）適切なペプチド配列を明らかにするＭＳ／ＭＳのスペクトルと理論上のｍ／ｚ値（挿入図）。
【図９Ｂ】Ｐａｖａ−Δ４Ｄペプチドの品質管理クロマトグラムである。（上パネル）ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ  ＴＩＣは、８．３５分でのＬＡＰＬＶ＊Ｋ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のａａ４０３−４０８）ペプチドを示す。他の有意なピークは検知されなかった；（中パネル）８．３５分でのピークについて決定されたｍ／ｚ値、３２３．７３２＋と６４６．４５１＋は、理論上のｍ／ｚ値：３２３．７３２＋と６４５．４５１＋（≦１ｐｐｍの質量誤差をそれぞれ表す）と一致する；（下パネル）適切なペプチド配列のＭＳ／ＭＳのスペクトルと理論上のｍ／ｚ値（挿入図）。
【図１０Ａ】マーカーペプチドＲの品質管理を示すクロマトグラムである。（上パネル）１３．４５分でのペプチドＴＥＰＱＴＰＱＥＷＩＤＤＬＥＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）のＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ  ＴＩＣ。（中パネル）１３．４５分でのピークについて決定されたｍ／ｚ値、６１９．６３３＋と９２８．９５２＋は、理論上のｍ／ｚ値６１９．６３３＋と９２８．９４２＋と一致する；（下パネル）適切なペプチド配列（下パネル）を明らかにするＭＳ／ＭＳのスペクトルと理論上のｍ／ｚ値（挿入図）。
【図１０Ｂ】マーカーペプチドＲの品質管理を示すクロマトグラムである。（上パネル）ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ  ＴＩＣは、１３．４６分でのＴＥＰＱＴＰＱＥＷＩＤＤＬ＊ＥＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）ペプチドを示しており、３つのピークは、Ｔｒｐの人工的な修飾によって引き起こされた１０．２５、１０．６７、および１１．３９分に検出された；（第２のパネル）１３．４６分でのピークについて決定されたｍ／ｚ値、６２１．９７３＋と９３２．４６２＋は、理論上のｍ／ｚ値６２１．９６３＋と９３２．４４２＋と一致する；（下パネル）適切なペプチド配列のＭＳ／ＭＳのスペクトルと理論上のｍ／ｚ値（挿入図）。
【図１１】ＩＳペプチドの品質管理クロマトグラムを示す：（上パネル）８．３５分でのＩＳペプチドＷＥＧＥＰＩ＊ＳＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のａａ２７４−２８１）を示すＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ  ＴＩＣ。他の有意なピークは検知されなかった；（第２のパネル）８．３５分でのピークについて決定されたｍ／ｚ値：４７６．７５２＋と９５２．４８３＋が示されており、理論上のｍ／ｚ値：４７６．７４２＋と９５２．４７１＋（＊０．０１ｐｐｍの質量誤差をそれぞれ表す）と一致する；（下パネル）適切なペプチド配列を明らかにするＭＳ／ＭＳスペクトルと理論上のｍ／ｚ値が示されている（挿入図）。
【図１２Ａ】ペプチド濃度の補間のための三次（三次多項式）の近似の使用の正当化の理由を提供するグラフを提示する。黒い破線はプロットした基準を介して点と点をつなぐグラフである。ＭＲＭピーク面積（分析物／ＩＳ）（表１３を参照）の比率に関するデータは、オンカラム（ｏｎ−ｃｏｌｕｍｎ）で１，０００  ｆｍｏｌを超え、Ｒ２＝０．９６６４（Ａ）の直線関係から逸脱することが顕著であった。ペプチド範囲の減少をプロットすることで、適合度、Ｒ２＝０．９９８４（Ｂ）は改善された。Δ４ＤペプチドＬＡＰＬＶＫは、拡張した濃度範囲（最大４，０００ｆｍｏｌ）を必要とするＭＳ応答で観察された。三次の近似は、Ｒ２＝０．９９９３（Ｃ）の適合度を有するより優れた補間を与えた。灰色の破線は、実験的に決定されたＭＳ応答の２つの例における２つのモデルを使用して決定されることになるペプチド量を示す。
【図１２Ｂ】トランスジェニック植物中でＤＨＡを生合成するトランスジェニック経路の一例における各酵素に関するクオンティファイア（ｑｕａｎｔｉｆｉｅｒ）ペプチドの較正曲線を示す。パネル：（Ａ）Ｌａｃｋｌ−Δ１２Ｄ；（Ｂ）Ｐｉｃｐａ−ω３Ｄ；（Ｃ）Ｍｉｃｐｕ−Δ６Ｄ；（Ｄ）Ｐｙｒｃｏ−Δ６Ｅ；（Ｅ）Ｐａｖｓａ−Δ５Ｄ；（Ｆ）Ｐｙｒｃｏ−Δ５Ｅ；および、（Ｇ）Ｐａｖｓａ−Δ４Ｄ。
【図１３】トランスジェニックキャノーラにおけるＬａｃｋｌ−Δ１２ＤペプチドＧＳＳＳＮＴＥＱＥＶＰＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のａａ１６−２６）の検出を示す。パネル：（Ａ）野生型（「ＷＴ」）のキャノーラ（オンカラムで２ｐｍｏｌ）から発育中の胎芽タンパク質バックグラウンドへ添加された重標識参照標準ＧＳＳＳＮＴＥＱＥＶＰ＊Ｋ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のａａ１６−２６）；（Ｂ）ＷＴキャノーラからの発育中の胎芽タンパク質；（Ｃ）トランスジェニックキャノーラの発育中の胎芽タンパク質；（Ｄ）（ＷＴ）のキャノーラ（オンカラムで２ｐｍｏｌ）からの成熟種子タンパク質バックグラウンドへ添加された重標識参照標準ＧＳＳＳＮＴＥＱＥＶＰ＊Ｋ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のａａ１６−２６）；（Ｅ）ＷＴキャノーラからの成熟種子タンパク質；（Ｆ）トランスジェニックキャノーラからの成熟種子タンパク質。
【図１４】トランスジェニックキャノーラにおけるＰｉｃｐａ−ω３ＤペプチドＩＰＦＹＨＡＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のａａ３５１−３５８）の検出を示す。パネル：（Ａ）ＷＴキャノーラ（オンカラムで２ｐｍｏｌ）の発育中の胎芽タンパク質バックグラウンドへ添加された重標識参照標準ＩＰＦＹＨＡ＊Ｒ；（Ｂ）ＷＴキャノーラからの発育中の胎芽タンパク質；（Ｃ）ＤＨＡキャノーラからの発育中の胎芽タンパク質；（Ｄ）（ＷＴ）のキャノーラ（オンカラムで２ｐｍｏｌ）からの成熟種子タンパク質バックグラウンドへ添加された重標識参照標準ＩＰＦＹＨＡ＊Ｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のａａ３５１−３５８）；（Ｅ）ＷＴキャノーラからの成熟種子タンパク質；（Ｆ）トランスジェニックキャノーラからの成熟種子。
【図１５】トランスジェニックキャノーラにおけるＭｉｃｐｕ−Δ６ＤペプチドＤＡＳＴＡＰＶＤＬＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の残基３０−３９）の検出を示す。パネル：（Ａ）ＷＴのキャノーラ（オンカラムで２ｐｍｏｌ）からの発育中の胎芽タンパク質バックグラウンドへ添加された重標識参照標準ＤＡＳＴＡＰＶＤＬ＊Ｋ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のａａ３０−３９）；（Ｂ）ＷＴキャノーラからの発育中の胎芽タンパク質；（Ｃ）トランスジェニックキャノーラの発育中の胎芽タンパク質；（Ｄ）ＷＴのキャノーラ（オンカラムで２ｐｍｏｌ）からの成熟種子タンパク質バックグラウンドへ添加された重標識参照標準ＤＡＳＴＡＰＶＤＬ＊Ｋ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のａａ３０−３９）；（Ｅ）ＷＴキャノーラからの成熟種子タンパク質；（Ｆ）トランスジェニックキャノーラからの成熟種子タンパク質。
【図１６】トランスジェニックキャノーラにおけるＰｙｒｃｏ−Δ６ＥペプチドＧＱＤＰＦＬＬＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のａａ８３−９０）の検出を示す。パネル：（Ａ）ＷＴのキャノーラ（オンカラムで２ｐｍｏｌ）からの発育中の胎芽タンパク質バックグラウンドへ添加された重標識参照標準ＧＱＤＰＦＬＬ＊Ｋ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のａａ８３−９０）；（Ｂ）ＷＴキャノーラからの発育中の胎芽タンパク質；（Ｃ）トランスジェニックキャノーラからの発育中の胎芽；（Ｄ）ＷＴのキャノーラ（オンカラムで２ｐｍｏｌ）からの成熟種子タンパク質バックグラウンドへ添加された重標識参照標準ＧＱＤＰＦＬＬ＊Ｋ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のａａ８３−９０）；（Ｅ）ＷＴキャノーラからの成熟種子；（Ｆ）トランスジェニックキャノーラからの成熟種子。
【図１７】トランスジェニックキャノーラにおけるＰａｖｓａ−Δ５ＤペプチドＡＹＤＶＴＮＦＶＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５のａａ３７−４５）の検出を示す。パネル：（Ａ）ＷＴのキャノーラ（オンカラムで２ｐｍｏｌ）からの発育中の胎芽タンパク質バックグラウンドへ添加された重標識参照標準ＡＹＤＶＴＮＦＶ＊Ｋ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５のａａ３７−４５）；（Ｂ）ＷＴキャノーラからの発育中の胎芽タンパク質；（Ｃ）トランスジェニックキャノーラの発育中の胎芽タンパク質；（Ｄ）ＷＴのキャノーラ（オンカラムで２ｐｍｏｌ）からの成熟種子タンパク質バックグラウンドへ添加された重標識参照標準ＡＹＤＶＴＮＦＶ＊Ｋ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５のａａ３７−４５）；（Ｅ）ＷＴキャノーラからの成熟種子タンパク質；（Ｆ）トランスジェニックキャノーラからの成熟種子タンパク質。
【図１８】トランスジェニックキャノーラにおけるＰｙｒｃｏ−Δ５ＥペプチドＳＱＰＦＧＬＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のａａ６６−７２）の検出を示す。パネル：（Ａ）ＷＴのキャノーラ（オンカラムで２ｐｍｏｌ）からの発育中の胎芽タンパク質バックグラウンドへ添加された重標識参照標準ＳＱＰＦＧＬ＊Ｋ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のａａ６６−７２）；（Ｂ）ＷＴキャノーラからの発育中の胎芽タンパク質；（Ｃ）トランスジェニックキャノーラの発育中の胎芽タンパク質；（Ｄ）ＷＴのキャノーラ（オンカラムで２ｐｍｏｌ）からの成熟種子タンパク質バックグラウンドへ添加された重標識参照標準ＳＱＰＦＧＬ＊Ｋ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のａａ６６−７２）；（Ｅ）ＷＴキャノーラからの成熟種子タンパク質；（Ｆ）トランスジェニックキャノーラからの成熟種子タンパク質。
【図１９】キャノーラにおけるＰａｖｓａ−Δ４ＤペプチドＬＡＰＬＶＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のａａ４０３−４０８）の検出を示す。パネル：（Ａ）ＷＴのキャノーラ（オンカラムで２ｐｍｏｌ）からの発育中の胎芽タンパク質バックグラウンドへ添加された重標識参照標準ＬＡＰＬＶ＊Ｋ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のａａ４０３−４０８）；（Ｂ）ＷＴキャノーラからの発育中の胎芽タンパク質；（Ｃ）トランスジェニックキャノーラの発育中の胎芽タンパク質；（Ｄ）ＷＴのキャノーラ（オンカラムで２ｐｍｏｌ）からの成熟種子タンパク質バックグラウンドへ添加された重標識参照標準ＬＡＰＬＶ＊Ｋ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のａａ４０３−４０８）；（Ｅ）ＷＴキャノーラからの成熟種子タンパク質；（Ｆ）トランスジェニックキャノーラからの成熟種子タンパク質。
【図２０】Ｐａｖｓａ−Δ４ＤがトランスジェニックキャノーラＴＧ１５植物全体では検出されなかったことを示す。Ｐａｖｓａ−Δ４Ｄは、種子において検出された７つの導入遺伝子産物で最も豊富であったが、キャノーラＴＧ１５植物全体では検出されなかった。パネル：（Ａ）ＷＴキャノーラタンパク質へ添加された重標識参照標準；（Ｂ）ＷＴキャノーラタンパク質；（Ｃ）トランスジェニックキャノーラタンパク質。
【図２１】Ｐａｖｓａ−Δ４ＤがトランスジェニックキャノーラＴＧ３５植物全体では検出されなかったことを示す。Ｐａｖｓａ−Δ４Ｄは、種子において検出された７つの導入遺伝子産物で最も豊富であったが、キャノーラＴＧ３５植物全体では検出されなかった。パネル：（Ａ）ＷＴキャノーラタンパク質へ添加された重標識参照標準；（Ｂ）ＷＴキャノーラタンパク質；（Ｃ）トランスジェニックキャノーラタンパク質。
【図２２】Ｐａｖｓａ−Δ４ＤがトランスジェニックキャノーラＴＧ６５根では検出されなかったことを示す。Ｐａｖｓａ−Δ４Ｄは、キャノーラ種子において検出された７つの導入遺伝子産物では最も豊富であったが、ＴＧ６５根では検出されなかった。パネル：（Ａ）ＷＴキャノーラタンパク質へ添加された重標識参照標準；（Ｂ）ＷＴキャノーラタンパク質；（Ｃ）トランスジェニックキャノーラタンパク質。
【図２３】Ｐａｖｓａ−Δ４ＤがトランスジェニックキャノーラＴＧ６５花では検出されなかったことを示す。Ｐａｖｓａ−Δ４Ｄは、種子において検出された７つの導入遺伝子産物では最も豊富であったが、キャノーラＴＧ６５花では検出されなかった。パネル：（Ａ）ＷＴキャノーラタンパク質へ添加された重標識参照標準；（Ｂ）ＷＴキャノーラタンパク質；（Ｃ）トランスジェニックキャノーラタンパク質。
【図２４】Ｐａｖｓａ−Δ４ＤがトランスジェニックキャノーラＴＧ６５組織では検出されなかったことを示す。Ｐａｖｓａ−Δ４Ｄは、種子において検出された７つの導入遺伝子産物では最も豊富であったが、他のキャノーラＴＧ６５組織では検出されなかった。パネル：（Ａ）ＷＴキャノーラタンパク質へ添加された重標識参照標準；（Ｂ）ＷＴキャノーラタンパク質；（Ｃ）トランスジェニックキャノーラタンパク質。
【図２５】キャノーラ種子における、マーカー、Ｒの発現を示す。パネル（Ａ）：ＷＴのキャノーラ（オンカラムで２ｐｍｏｌ）からの発育中の胎芽タンパク質バックグラウンドへ添加された重標識参照標準ＴＥＰＱＴＰＱＥＷＩＤＤＬ＊ＥＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）は、ＷＴキャノーラ（オンカラムで２ｐｍｏｌ）から発育中の胎芽バックグラウンドへ添加された。トランスジェニックキャノーラ植物部分におけるＲのトレースレベルの検出、パネル：（Ｂ）発育中の種子；（Ｃ）成熟種子；（Ｄ）植物全体（ＴＧ１５）；（Ｅ）植物全体（ＴＧ３５）；（ｆ）根（ＴＧ６５）；（Ｇ）花（ＴＧ６５）、および、他の組織（ＴＧ６５）。
【図２６】トランスジェニック植物で発現されたマーカーＲのウエスタンブロット解析を描く。左の部分は、ベンサミアナタバコ葉（Ｂｅｎｔｈ）からの総タンパク質を示す。重量：ＷＴ、未処理；Ｔｒ：５日間のマーカータンパク質の一時的発現。中央部分はＷＴキャノーラからの総タンパク質を示す。右部分はトランスジェニックキャノーラの総タンパク質を示す。Ｍ：ゲルの左側に示されたｋＤａでの分子量マーカー。レーン１５、３５、および７９は、ＴＧ１５（植物全体）、ＴＧ３５（植物全体）、およびＴＧ７９（発育中の種子）のキャノーラ材料を表す。２０μｇのタンパク質が各レーンで充填され、その後、１：１０００稀釈液で抗Ｒ抗体（Ｓｉｇｍａ）を用いて発育された。
【図２７Ａ】実施例で使用されたタンパク分解酵素の特異性を示すスキームであり、基質は、位置Ｐｎ、Ｐ４などからＰｍ’（Ｎ末端からＣ末端方向に＃１〜＃８）までアミノ酸残基を有する。位置Ｐ１におけるトリプシン切断部位Ｋ（リジン）あるいはＲ（アルギニン）を示す。位置Ｐ１’（＃５）におけるアミノ酸Ｐ（プロリン）は、タンパク質分解を妨害する。
【図２７Ｂ】実施例で使用されたタンパク分解酵素の特異性を示すスキームであり、基質は、位置Ｐｎ、Ｐ４などからＰｍ’（Ｎ末端からＣ末端方向に＃１〜＃８）までアミノ酸残基を有する。芳香族と疎水性のアミノ酸、Ｆ（フェニルアラニン）、Ｌ（ロイシン）、Ｗ（トリプトファン）、およびＹ（チロシン）の両側におけるペプシン切断部位を示す。位置Ｐ３（＃２）におけるアミノ酸Ｋ、Ｒ、およびＨ（ヒスチジン）はタンパク質分解を妨害し、その一方で、Ｐ３（＃２）あるいはＰ４（＃１）におけるアミノ酸Ｐはタンパク質分解を促進する。画像はＷｅｂＬｏｇｏを使って作成された。Ｃｒｏｏｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ＷｅｂＬｏｇｏ：  Ａ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｌｏｇｏ  ｇｅｎｅｒａｔｏｒ，  １４  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．  １１８８  （２００４）を参照。
【図２８Ａ】ＬＣ−ＭＳと提案された消化性アッセイを使用し作成可能な理論的な消化曲線を表す：ペプシンの理論的な消化曲線；●  実線：急速かつ完全な消化；▼  破線：ゆっくりかつ完全な消化；○  実線：急速であるが不完全な消化；▽  破線：ゆっくりであるがが不完全な消化。
【図２８Ｂ】ＬＣ−ＭＳと提案された消化性アッセイを使用し作成可能な理論的な消化曲線を表す：トリプシンポストペプシンの理論的な消化曲線；●  破線：消化できないタンパク質；■  破線：部分的に消化可能なタンパク質；▼  実線：消化可能なタンパク質。
【図２９Ａ】バキュロウィルスに感染した昆虫細胞中で発現されたＨｉｓ−Ｐａｖｓａ−Δ４Ｄタンパク質の特徴づけを示す写真を提示する。バキュロウィルス感染細胞からの総タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。
【図２９Ｂ】バキュロウィルスに感染した昆虫細胞中で発現されたＨｉｓ−Ｐａｖｓａ−Δ４Ｄタンパク質の特徴づけを示す写真を提示する。抗Ｈｉｓタグ抗体（１：１０００希釈）で育成されたＨｉｓ−Ｐａｖｓａ−Δ４Ｄのウエスタンブロット解析。Ｍ：傍らに示された分子量を有するタンパク質マーカー；レーン１：総ペレットタンパク質；レーン２：上清中の総タンパク質。
【図３０Ａ】Ｐａｖｓａ−Δ４Ｄの理論的なペプシン切断地図である。潜在的なペプシン切断部位は太字の下線で示されており、ペプシンはこれらの残基のアミノ側とカルボキシル側の両方で切断される。
【図３０Ｂ】ペプシン消化後に得られたＰａｖｓａ−Δ４Ｄのタンパク質シーケンスカバー率を示す。太字：＞９５％の信頼度で同定されたペプチド；太字のイタリック体：５０−９５％の信頼度で同定されたペプチド；下線：＜５０％の信頼度で同定されたペプチド；無罫：検知されなかった。波線の下線（両方の図）は、Ｎ末端Ｈｉｓタグおよびプロテアーゼ切断部位と、その後の、融合タンパク質中の天然のＰａｖｓａ−Δ４ＤのＭである。
【図３０Ｃ】Ｐａｖｓａ−Δ４Ｄの理論的なトリプシン切断地図を示す。潜在的なトリプシン切断部位は下線の太字のフォントで示される。トリプシンは太字の残基のカルボキシル側で切断される。
【図３０Ｄ】トリプシン消化後に得られたタンパク質シーケンスカバー率を示す。太字：＞９５％の信頼度で同定されたペプチド；太字のイタリック体：５０−９５％の信頼度で同定されたペプチド；下線：＜５０％の信頼度で同定されたペプチド；無罫：検知されなかった。波線の下線（両方の図）は、Ｎ末端Ｈｉｓタグおよびプロテアーゼ切断部位と、その後の、融合タンパク質中の天然のＰａｖｓａ−Δ４ＤのＭを示す。
【図３１Ａ】パネル（Ａ）−（Ｈ）はペプシンのタンパク質分解断片のＬＣ−ＭＲＭ−ＭＳの分析を示す。ＬＣ−ＭＳ系における応答（ピーク面積として測定される）は、ペプシン消化中に観察された最大ピーク面積に対する割合に変換された。対照実験はペプシン添加のない時間０であった。ペプチドはタンパク質Ｎ末端からＣ末端まで順番に図示されている。ペプチド配列（と計算された分子量）は各グラフの上に表示される。矢印は第２の切断変異体を産出するためのその後の切断を示す；エラーバーはＳＤを示す；第２のペプシン切断のための潜在的な部位は以下の通りである：パネル（Ａ）：Ｆ；（Ｃ）：Ｆ、Ｆ（Ｄ）：ＹＬＬ；（Ｅ）：Ｗ、Ｗ、Ｌ；（Ｆ）：Ｌ、ＬＬ；（Ｇ）：Ｌ、Ｌ；（Ｈ）：Ｌであり；対照：時間０、ペプシンなし。
【図３１Ｂ】結合したペプシン・トリプシン消化後にＨｉｓ１０：：Ｐａｖｓａ−Δ４Ｄのトリプシンペプチド産物の定量化を示す。トリプシンデータは、時点（０、５、１０、１５、３０、６０分）での１つのペプチド当たり０分（ペプシン添加はなし、ＭＲＭピーク面積として測定される、３つのトランジションの合計）における実験対照に対する平均割合（ｎ＝５回の反復消化）減少として提示されている。ペプチドはタンパク質Ｎ末端からＣ末端まで順番に図示されている。ペプチド配列（と計算された分子量）は各グラフの上に表示される。エラーバーはＳＤを示す；第２のペプシン切断のための潜在的な部位は以下の通りである：パネル（Ａ）：Ｆ；（Ｂ）：Ｌ、Ｙ；（Ｃ）：Ｆ、ＬＦ（Ｄ）：Ｆ、Ｌ、ＹＬ、Ｌ；（Ｅ）：Ｆ、Ｙ；（Ｆ）：Ｙ、Ｌ；（Ｇ）：Ｌ、Ｌ；（Ｈ）：Ｙ、Ｌである。
【図３１Ｃ】抗体産生（（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，  ＵＳＡ）に選択されたＰａｖｓａ−Δ４Ｄペプチドの配列である。ポリクローナル抗体を産生させるために使用されるペプチドは下線が引かれており、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の両方のペプチドは二重下線が引かれている。
【図３２Ａ】バキュロウィルスに感染した昆虫細胞中で発現されたＨｉｓ−Ｐｙｒｃｏ−Δ５Ｅタンパク質のゲル特徴づけを示す写真である。バキュロウィルス感染細胞からの総タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。
【図３２Ｂ】バキュロウィルスに感染した昆虫細胞中で発現されたＨｉｓ−Ｐｙｒｃｏ−Δ５Ｅタンパク質のゲル特徴づけを示す写真である。抗−Ｈｉｓ−タグ抗体（１：１０００希釈）で育成されたＨｉｓ−Ｐｙｒｃｏ−Δ５Ｅのウエスタンブロット解析。ＭＷ：傍らに示された分子量を有するタンパク質マーカー。
【図３３Ａ】Ｐｙｒｃｏ−Δ５Ｅタンパク質の理論的なペプシン切断地図を示し、潜在的なペプシン切断部位は下線が引かれている。
【図３３Ｂ】ペプシン消化後に得られたタンパク質シーケンスカバー率を示す。太字：＞９５％の信頼度で同定されたペプチド；イタリック体：５０−９５％の信頼度で同定されたペプチド；下線：＜５０％の信頼度で同定されたペプチド；灰色：検出されなかった；波線の下線は、Ｎ末端Ｈｉｓ−タグおよびプロテアーゼ切断部位と、その後の、融合タンパク質中の天然のＰｙｒｃｏ−Δ５ＥのＭである。
【図３３Ｃ】Ｐｙｒｃｏ−Δ５Ｅタンパク質の理論的なトリプシン切断地図を示し、潜在的なトリプシン切断部位は下線が引かれている。
【図３３Ｄ】トリプシン消化後に得られたタンパク質シーケンスカバー率を示す。太字：＞９５％の信頼度で同定されたペプチド；イタリック体：５０−９５％の信頼度で同定されたペプチド；下線：＜５０％の信頼度で同定されたペプチド；灰色：検出されなかった；波線の下線は、Ｎ末端Ｈｉｓ−タグおよびプロテアーゼ切断部位と、その後の、融合タンパク質中の天然のＰｙｒｃｏ−Δ５ＥのＭである。太字の同定された２つのペプチド（＞９５％の信頼度）は完全にはトリプシン作用性ではなかった（Ｋ／Ｒで切断された）。
【図３４】単一のＰｙｒｃｏ−Δ５Ｅトリプシンペプチド：ＳＱＰＦＧＬＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６の残基６６−７２）に対するペプチドスペクトル一致の手動による検証を示すクロマトグラフである。
【図３５】パネル（Ａ）−（Ｈ）は、Ｈｉｓ−Ｐｙｒｃｏ−Δ５Ｅペプシンのタンパク質分解断片のＬＣ−ＭＲＭ−ＭＳ分析を示すグラフである。ＬＣ−ＭＳ系における応答（ピーク面積として測定される）は、ペプシン消化中に観察された最大ピーク面積に対する割合に変換された。実験対照：時間０、ペプシンなし。ペプチドはタンパク質Ｎ末端からＣ末端まで順番に図示されている。ペプチド配列（と計算された分子量）は各グラフの上に表示される。矢印は第２の切断変異体を産出するためのその後の切断を示す。１枚のパネル当たり、配列内の第２のペプシン切断の潜在的な部位は、（Ａ）：ＹＦ；（Ｂ）：Ｙ；（Ｃ）：Ｆ、Ｌ、および、Ｌ；（Ｄ）：ＦおよびＬ；（Ｅ）：ＬＦおよびＬ；（Ｆ）：Ｗ；（Ｇ）：ＬおよびＹ；（Ｈ）：Ｆ（予想された切断）；あるいは、パネル（Ｇ）：ＬＬ（場合によっては妨害される）である。エラーバー：ＳＤ。
【図３６】結合したペプシン−トリプシン消化後にＨｉｓ−Ｐｙｒｃｏ−Δ５Ｅの単一のトリプシンペプチド産物の定量化を示すグラフである。単一のトリプシンのタンパク質分解断片のＬＣ−ＭＲＭ−ＭＳ分析が検出された。ＬＣ−ＭＳ系における応答（ピーク面積として測定される）は、実験対照（時間０、ペプシンなし）に対する最大ピーク面積に対する減少率に変換された。ペプチド配列（と計算された分子量）はグラフの上に表示され、ペプシン切断のための潜在的な部位はＦとＬである。
【図３７】抗体産生のために選択されたＰｙｒｃｏ−Δ５Ｅのペプチドを示す。イタリック体：ポリクローナル抗体のペプチド；下線：ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の両方のペプチド。
【図３８Ａ】大腸菌Ｃ４１において発現されたＨｉｓ−ＧＦＰ−Ｐｉｃｐａ−ω３Ｄタンパク質を特徴づける写真である。分子量マーカーと５μＬのＨｉｓ  ＧＦＰ−Ｐｉｃｐａω３Ｄは、ＮｕＰＡＧＥ  ４−１２％のビス−トリスゲル上で実行された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥはクーマシーブルーで染色された。
【図３８Ｂ】大腸菌Ｃ４１において発現されたＨｉｓ−ＧＦＰ−Ｐｉｃｐａ−ω３Ｄタンパク質を特徴づける写真である。分子量マーカーと５μＬのＨｉｓ  ＧＦＰ−Ｐｉｃｐａω３Ｄは、ＮｕＰＡＧＥ  ４−１２％のビス−トリスゲル上で実行された。ウエスタンブロットは抗Ｈｉｓ−タグ抗体（１：１０００希釈）で展開された。ＭＷ：傍らに示された分子量を有するタンパク質マーカー。
【図３９Ａ】Ｐｉｃａ−ω３Ｄのための理論的なペプシン切断地図を示す。潜在的なペプシン切断部位は下線が引かれている。
【図３９Ｂ】ペプシン消化後に得られたアミノ酸配列カバー率を示す。太字：＞９５％の信頼度で同定されたペプチド；イタリック体：５０−９５％の信頼度で同定されたペプチド；下線：＜５０％の信頼度で同定されたペプチド；灰色：検出されなかった；波線の下線はＮ末端からＧＧＳまでのすべてのアミノ酸を含み、Ｎ末端のＨｉｓ−ＧＦＰ領域と、その後の、融合タンパク質中の天然のＰｉｃｐａ−ω３Ｄ（つまり、Ｍはない）の第２のアミノ酸残基を示す。
【図３９Ｃ】理論的なトリプシン切断地図を示し、潜在的なトリプシン切断部位は下線が引かれている。
【図３９Ｄ】トリプシン消化後に得られたタンパク質シーケンスカバー率を描いている。太字：＞９５％の信頼度で同定されたペプチド；イタリック体：５０−９５％の信頼度で同定されたペプチド；灰色：検出されなかった；波線の下線は、Ｎ末端Ｈｉｓ−ＧＦＰ領域と、その後の、融合タンパク質中の天然のＰｉｃｐａ−ω３Ｄ（つまり、メチオニンはない）の第２のアミノ酸である。
【図４０】ペプシン消化後のＨｉｓ−ＧＦＰ−Ｐｉｃｐａ−ω３Ｄペプチドの定量化と、ペプシンのタンパク質分解断片のＬＣ−ＭＲＭ−ＭＳ分析を提示するクロマトグラフを示す。ＬＣ−ＭＳ系における応答（ピーク面積として測定される）は、ペプシン消化中に観察された最大ピーク面積に対する割合に変換された。ペプチドはタンパク質Ｎ末端からＣ末端まで順番に図示されている。ペプチド配列（と計算された分子量）は各グラフの上に表示される。矢印は第２の切断変異体を産出するためのその後の切断を示す。配列内の第２のペプシン切断の潜在的な部位は、パネル（Ａ）：Ｆ、Ｙ、Ｌ；（Ｂ）：Ｆ、Ｙ；（Ｃ）：Ｌ；（Ｅ）：Ｙ、ＬＬ、Ｆ；（Ｆ）：Ｙ、ＬＬ；（Ｇ）：Ｆ、ＹＷ、Ｆ；（Ｈ）：Ｙ、Ｆ、Ｆである。実験対照：時間０、ペプシンなし；エラーバー：ＳＤ。
【図４１】ペプシン消化後に産生されたＨｉｓ−ＧＦＰ−Ｐｉｃｐａ−ω３Ｄ切断変異体のペプシンのタンパク質分解断片のＬＣ−ＭＲＭ−ＭＳの分析を提示するクロマトグラフを示す。ＬＣ−ＭＳ系における応答（ピーク面積として測定される）は、ペプシン消化中に観察された最大ピーク面積に対する割合に変換された。ペプチドはタンパク質Ｎ末端からＣ末端まで順番に図示されている。ペプチド配列（と計算された分子量）は各グラフの上に表示される。矢印は第２の切断変異体を産出するためのその後の切断を示す。第２のペプシン切断のための潜在的な部位は：パネル（Ａ）：Ｙ、ＬＬ、Ｆ；（ｂ）ＬＬ、Ｆ；（Ｃ）：Ｙ、ＬＬ；（Ｄ）：ＬＬ；（Ｅ）：Ｙ、ＬＬである。対照：時間０、ペプシンなし。
【図４２】結合したペプシン−トリプシン消化後にＨｉｓ−ＧＦＰ−Ｐｉｃｐａ−ω３Ｄのトリプシンペプチドの定量化を提示するクロマトグラフを示す。トリプシンデータは、時点（０、５、１０、１５、３０、６０分）での１つのペプチド当たり０分（ペプシンなし、ＭＲＭピーク面積として測定される、３つのトランジションの合計）における実験対照に対する平均的な割合（ｎ＝５回の反復消化）減少として提示されている。ペプチドはタンパク質Ｎ末端からＣ末端まで順番に図示されている。ペプチド配列（と計算された分子量）は各グラフの上に表示される。これらのペプチド配列のペプシン切断のための潜在的な部位はパネル（Ａ）：Ｌ；（Ｂ）：Ｆ；（Ｃ）：Ｆ、Ｆ；（Ｄ）：Ｙ；（Ｇ）：Ｗ、Ｗ；（Ｈ）：Ｆ、Ｙ、Ｆ（予想された切断）あるいは（Ｅ）：Ｌ（場合によっては妨害される）文字である。エラーバーは標準偏差（ＳＤ）を表示する。
【図４３】抗体産生に選択されたペプチドを示す。イタリック体：ポリクローナル抗体のペプチド；下線：ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の両方のペプチド。
【図４４】ペプシン消化後にＨｉｓ１０：：Ｐａｖｓａ−Δ５Ｄのペプチド生成物の定量化のデータを提示する。ペプシンのタンパク質分解断片のＬＣ−ＭＲＭ−ＭＳ分析。ＬＣ−ＭＳ系における応答（ピーク面積として測定される）は、ペプシン消化中に観察された最大ピーク面積に対する割合に変換された。対照実験はペプシン添加のない時間０であった。ペプチドはタンパク質Ｎ末端からＣ末端まで順番に図示されている。ペプチド配列（と計算された分子量）は各グラフの上に表示される。矢印は第２の切断変異体を産出するためのその後の切断を示す。これらのペプチド配列のペプシン切断のための潜在的な部位はパネル（Ａ）：Ｙ、Ｌ；（Ｂ）：Ｙ、Ｌ；（Ｃ）：Ｆ；（Ｆ）：Ｆ；（Ｇ）：Ｌ；（Ｈ）：ＹＬ、Ｌ（予想された切断）あるいは（Ｅ）：Ｌ、Ｌ、Ｙ；（Ｇ）：Ｆ；（Ｈ）：Ｌ、Ｙ；（Ｉ）：ＹＦ；（Ｄ）：Ｙ（場合によっては妨害される）である。エラーバーはＳＤを表示する。
【図４５】組み合わせたペプシン−トリプシン消化後にＨｉｓ１０：：Ｐａｖｓａ−Δ５Ｄのトリプシンペプチド産物の定量化のデータを提示する。トリプシンデータは、時点（０、５、１０、１５、３０、６０分）での１つのペプチド当たり０分（ペプシン添加はなし、ＭＲＭピーク面積として測定される、３つのトランジションの合計）における実験対照に対する平均割合（ｎ＝５回の反復消化）減少として提示されている。ペプチドはタンパク質Ｎ末端からＣ末端まで順番に図示されている。ペプチド配列（と計算された分子量）は各グラフの上に表示される。これらのペプチド配列のペプシン切断のための潜在的な部位は：パネル（Ａ）：Ｙ、Ｙ、Ｌ；（Ｃ）：Ｆ；（Ｆ）：Ｆ、Ｆ；（Ｇ）：Ｆ、Ｌ；（Ｈ）：Ｌ、Ｌ、Ｌ、Ｆ；（Ｄ）：Ｌ、Ｌ；（Ｋ）：Ｌ、Ｙ；（Ｌ）：Ｆ、Ｌ（予想された切断）あるいは（Ｂ）：Ｙ：（Ｃ）：Ｙ；（Ｄ）：Ｙ、Ｙ；（Ｅ）Ｌ；（Ｆ）：Ｌ；（Ｇ）：Ｙ；（Ｉ）：ＷＬ；（Ｄ）：Ｙ；および、（Ｌ）：ＹＦ（場合によっては妨害される）である。エラーバーは標準偏差（ＳＤ）を表示する。
【図４６】ペプシン消化後のＨｉｓ１０：：Ｐｙｒｃｏ−Δ６Ｅのペプチド生成物の定量化を示す。ペプシンのタンパク質分解断片のＬＣ−ＭＲＭ−ＭＳ分析。ＬＣ−ＭＳ系における応答（ピーク面積として測定される）は、ペプシン消化中に観察された最大ピーク面積に対する割合に変換された。対照実験はペプシン添加のない時間０であった。ペプチドはタンパク質Ｎ末端からＣ末端まで順番に図示されている。ペプチド配列（と計算された分子量）は各グラフの上に表示される。矢印は第２の切断変異体を産出するためのその後の切断を示す。第２のペプシン切断の潜在的な部位は、パネル（Ａ）：Ｆ、Ｌ；（Ｂ）：Ｙ；（Ｃ）：Ｗ、Ｌ：（Ｄ）：Ｗ、Ｌ；（Ｅ）：Ｌ、Ｌ；（Ｆ）：Ｆ、Ｌ；（Ｇ）：Ｙ；（Ｉ）：Ｌ；（Ｄ）：Ｙ、Ｙ；（Ｋ）：Ｙ、Ｙ、Ｆ；（Ｌ）：ＹＹ（予想された切断）、あるいは（Ｇ）：Ｙ；（Ｉ）：配列内のＦ（場合によっては妨害された）文字であり；エラーバーはＳＤを表示する。
【図４７】組み合わせたペプシン−トリプシン消化後のＨｉｓ１０：：Ｐｙｒｃｏ−Δ６Ｅのトリプシンペプチド生成物の定量化を示す。トリプシンデータは、時点（０、５、１０、１５、３０、６０分）での１つのペプチド当たり０分（ペプシン添加はなし、ＭＲＭピーク面積として測定される、３つのトランジションの合計）における実験対照に対する平均割合（ｎ＝５回の反復消化）減少として提示されている。ペプチドはタンパク質Ｎ末端からＣ末端まで順番に図示されている。ペプチド配列（と計算された分子量）は各グラフの上に表示される。これらのペプチド配列のペプシン切断のための潜在的な部位は：パネル（Ａ）：ＦＬＬ；（Ｂ）：Ｌ、Ｙ；（Ｃ）：ＦＹ；（Ｄ）：Ｙ、Ｗ、Ｙ（予想された切断）あるいは（Ｂ）：Ｙ；（Ｃ）：Ｗ；（Ｄ）：Ｆ（場合によっては妨害される）文字であり、エラーバーはＳＤを表示する。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
すべての特許および他の公開公報は、例えば、本発明に関連して使用されてもよいこうした公開公報に記載される方法を記載および開示する目的のために参照により本明細書に明示的に組み込まれる。こうした公開公報は本出願の出願日の前に開示するためだけに与えられる。この点に関して、発明者が先の発明によって、または他のいかなる理由によってもそのような開示に先行する資格がないという承認として解釈されるべきものはなにもない。こうした書類の日付に関する記述または内容に関する表現はすべて、出願人が入手可能な情報に基づき、こうした書類の日付または内容の正確さに関していかなる承認を構成するものではない。
【００１６】
本明細書および請求項で使用されるように、単数形は、別段、文脈で逆の意味に示されない限り、複数の基準を含み、その逆もまた然りである。本明細書全体にわたって、特段の定めのない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）、（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）、および（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、排他的ではなく包括的に用いられ、結果として、記載される整数または整数のグループは１つ以上の他の記載されていない整数または整数のグループを含むことがある。用語「または（ｏｒ）」は、例えば「いずれか（ｅｉｔｈｅｒ）」によって修正されない限り、包括的である。操作例以外に、あるいは、別段の定めのある場合、本明細書に使用される多くの成分あるいは反応条件を表現する数はすべて、「約」という用語によってすべての例において修正されるものと理解されなければならず、それは当業者によって判定されるような文脈次第で、通常±１％から±１０％である。
【００１７】
特段の定めのない限り、本明細書に記載される製剤に関して使用される学術用語と専門用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態だけを記載することを目的としており、本発明の範囲を制限することを意図しておらず、それは請求項によってのみ定義される。
【００１８】
本明細書に記載される実施形態は、高感受性ＬＣ−ＭＲＭ−ＭＳを使用して、標的膜タンパク質を定量化および特徴づけるための新規な技術を与える。特に、アブラナ属へクローン化され、および、しばしばインビボで膜と関連付けられるω３ＬＣＰＵＦＡ合成経路のトランスジェニックタンパク質は、例えば、従来のウエスタンブロット解析で使用されるような抗体では現在十分には特徴づけられていない。タンパク質の含有量と機能の特徴づけに関して、（膜の脂質を置き換えるための洗浄薬を使用する）可溶化と精製はタンパク質のレベルを増大させることができるが、膜からの解離は、おそらくは、補助因子（その一部はまだ知られていない）と同様に、膜で共存している他のタンパク質を必要とすることから）、典型的にはデサチュラーゼあるいはエロンガーゼ活性を除去する。本手法は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ系を使用する前に、ミクロソームなどの膜画分を最初に富化することなく、あるいは、電気泳動によって推定標的タンパク質を分離／富化することなく、測定が困難なタンパク質を直接分析するために使用可能である。Ｓｋｉｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ６４  Ｊ．  Ａｇ．  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．  ５２５１  （２０１６）を参照。したがって、現在のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ検出と比較して、本実施形態は、多くのサンプルの分析を可能にするハイスループット方法を提供する。さらに、細胞膜あるいはミクロソームの富化は、特定の細胞分画では捉えられないタンパク質の特徴づけを除外することがある。例えば、１２ｋｘｇでの細胞溶解物の当初の遠心分離の後に廃棄された「異物」は、標的タンパク質を含有することがある：仮定のＥＲタンパク質（Δ４デサチュラーゼ）は、１５ｋｘｇペレットで検出され、その後の１００ｋｘｇミクロソームのペレットから除外されたことになる。Ｓｋｉｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１６を参照。
【００１９】
本明細書に記載された方法はオレイン酸をＤＨＡに変換するために生合成経路を提供した、７つのトランスジェニック酵素（脂肪酸デサチュラーゼとエロンガーゼ）を特徴づけるために採用された。より具体的には、油糧作物中の、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、２０：５ω３）やドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、２２：６ω３）のような、ω３ＬＣＰＵＦＡの代謝工学は、ω３ＬＣＰＵＦＡ生合成経路における複数の脂肪酸デサチュラーゼおよびエロンガーゼのトランスジェニック発現に関与していた。トランスジェニック酵素（図１）は、ラカンセア・クルイヴェリ（Ｌａｃｈａｎｃｅａ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）Δ１２デサチュラーゼ（Ｗａｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ６８  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ７２１  （２００４））；ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ω３／Δ１５デサチュラーゼ（Ｐｉｃｐａ−ω３Ｄ；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２５  Ｙｅａｓｔ  ２１  （２００８））；ミクロモナスプシラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎａｓ  ｐｕｓｉｌｌａ）Δ６−デサチュラーゼ（Ｍｉｃｐｕ−Δ６Ｄ；Ｐｅｔｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １２  Ｍｅｔａｂ．  Ｅｎｇ．  ２３３  （２０１０ｂ））；ピラミモナス・コルダタ（Ｐｙｒａｍｉｍｏｎａｓ  ｃｏｒｄａｔａ）Δ−６エロンガーゼ（Ｐｙｒｃｏ−Δ６；Ｐｅｔｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １２  Ｍａｒ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ４３０  （２０１０ａ））；パブロバ・サリナ（Ｐａｖｌｏｖａ  ｓａｌｉｎａ）Δ−５デサチュラーゼ（Ｐａｖｓａ−Δ５Ｄ；Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ６８  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ．  ７８５  （２００７））；Ｐ．コルダタ（Ｐ．ｃｏｒｄａｔａ）Δ５−エロンガーゼ（ＰｙｒｃｏΔ５Ｅ；Ｐｅｔｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０ａ）；および、Ｐ．サリナ（Ｐ．  ｓａｌｉｎａ）Δ４−デサチュラーゼ（Ｐａｖｓａ−Δ４Ｄ；Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）。酵素はそれぞれ、種子に特有のプロモーターおよび他の適切な遺伝子制御領域の管理下で独立して発現された。
【００２０】
これらの酵素の機能と活性は、トランスジェニックアラビドプシス、カメリナ（Ｃａｍｅｌｉｎａ）、およびアブラナの種子を含む、様々な異種発現系で実証されてきた。Ｐｅｔｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ７：  ｅ４９１６５  （２０１２）；  Ｐｅｔｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ９：  ｅ８５０６１  （２０１４）。配列の類似性と機能に基づいて、これらの７つのタンパク質は、３つの群、（１）それぞれΔ１２とΔ１５位置で二重結合を導入するＬａｃｋｌ−Δ１２ＤとＰｉｃｐａ−ω３Ｄを含む酵母アシル−ＣｏＡタイプの脂肪酸デサチュラーゼ；（２）脂肪酸のカルボキシル末端に２つの炭素を添加する、Ｐｙｒｃｏ−Δ６ＥおよびＰｙｒｃｏ−Δ５Ｅを含む、藻類脂肪酸エロンガーゼ；および、（３）Ｍｉｃｐｕ−Δ６Ｄ、Ｐａｖｓａ−Δ５Ｄ、およびＰａｖｓａ−Δ４Ｄを含む、脂肪酸の既存の二重結合とカルボキシル末端との間に二重結合を導入する、藻類「フロントエンド」脂肪酸デサチュラーゼに、それぞれ分類可能である。Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７。操作されたＤＨＡ合成経路遺伝子は種子に特有のプロモーターの制御下であったが、本明細書に記載されるように、種子に加えて他の組織も評価された。
【００２１】
タンパク質に対する経口でのアレルギー感作の可能性はまず、胃腸内消化に対するタンパク質の安定性によって影響を受ける。Ａｓｔｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，  １４  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １２６９  （１９９６）。発現レベルとタンパク質安定性を含む個々のトランスジェニックタンパク質の十分な評価は、証拠の重み付け（ｗｅｉｇｈｔ  ｏｆ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ）アプローチを使用して、アレルギーの可能性を評価する際に有益な情報を提供する。これらのトランスジェニックω３ＬＣＰＵＦＡ酵素は膜と密接に関連しており、低レベルで発現されるが、しかしながら、イムノアッセイなどの従来の手段による特徴づけを妨げる。本実施形態は、膜タンパク質を評価するためにＬＣ−ＭＳ／ＭＳに基づいた方法を提供する。本実施形態の態様は、ペプシンによって消化することによりω３ＬＣＰＵＦＡ産生キャノーラに導入された脂肪酸生合成酵素のインビトロの消化性を評価する。
【００２２】
インビトロの消化モデルは、摂取されたタンパク質の栄養的価値を、そのアミノ酸バイオアベイラビリティに基づいて評価するために広く使用される。インビトロのペプシン消化アッセイにおけるタンパク質アレルゲン性とタンパク質安定性との間の相関は、以前から報告されている。Ａｓｔｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６。タンパク質が非常に消化されやすいと分かると、全身曝露の可能性は減少する。現在の安全性評価戦略（Ｃｏｄｅｘ，２００３）は、単一のエンドポイントではヒトのアレルゲン性可能性を予測することができないことを認識している証拠の重み付けアプローチに基づいている。この戦略に基づいて、多くの因子が遺伝子植物：遺伝子源の文脈で評価され、既知のアレルゲンに対する新しく発現されたタンパク質のアミノ酸配列の類似性を判定すること、作物中のタンパク質の存在量、およびインビトロ消化に対するタンパク質の消化性を決定する。
【００２３】
三連四重極質量分析計を使用する多重反応モニタリング（ＭＲＭ）によるタンパク質定量化が、臨床検査室試験に適用されてきた。Ｒａｕｈ，  ８８３  Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．  Ｂ，  ５９  （２０１２）；  Ｇｉｌｌｅｔｔｅ  ＆  Ｃａｒｒ，  １０  Ｎａｔ．  Ｍｅｔｈ．  ２８  （２０１３）。ＭＲＭによるタンパク質の現在の分析は、典型的にはトリプシンによって標的タンパク質のタンパク質分解消化に由来するペプチドの検出に基づく。複合サンプルマトリックス中のトリプシンペプチドの測定は、分析前に、内部標準（ＩＳ）として既知濃度の同位元素標識されたペプチド異性体を、上記複合サンプルに加えることによって達成されることもある。標識されたペプチド異性体（「重」と呼ばれる）は、安定同位体で、典型的には１５Ｎあるいは１３Ｃで標識されたアミノ酸を含有しており、結果として、天然のペプチド異性体（「軽」と呼ばれる）のそれと比較して質量を増加させる。クロマトグラフ分離に晒されると、重および軽のペプチドは、ほとんど同一の溶出プロファイルを示し、マトリックスバックグラウンドで軽ペプチド（分析物）の検出が可能となる。ペプチドが衝突誘起解離の条件下でＭＳ／ＭＳに晒されると、重および軽のペプチドはさらに、同一の断片化メカニズム（トランジション）を経て、ペプチド同一性を確認する際にさらなるレベルの品質管理をもたらす。
【００２４】
ペプシンのみによる消化の際、生じ得る多くのシナリオがある（図２８Ａ）。最も簡素なものは、タンパク質が急速に消化して完全なペプシン断片を生成するときであり、このとき、反応は急激に増加し、最大に到達してプラトーを形成する（黒丸）。２番目に簡素なものは、実験時間内にプラトーには到着しない低速消化に関与している（黒三角形）。このシナリオは、ＬＣ−ＭＳがペプチド応答（ペプチドピーク強度あるいは面積）をモニタリングするため、完全性について判断するのが難しい。３番目に簡素なものは、ペプチド応答でプラトーによって判断されるような完了しているように見えることもある迅速であるが不完全な消化に関与する（白丸）。最後に、低速で不完全な消化が観察されることもある（白三角）。
【００２５】
トリプシンポストペプシン（図２８Ｂを参照）を採用することにより、遊離したトリプシンペプチドが最大値（この例では、ＭＲＭピーク面積として）で現れる実験対照（時間ゼロ、添加するペプシンはなし）との比較によって、消化の完全性を判断することが可能である。タンパク質が消化されない場合、いかなるペプチド応答の減少も観察されない（円、破線）。タンパク質が部分的に消化される場合、ペプチド応答の部分的な減少が観察される（正方形、点線）。タンパク質が完全に消化される場合、ペプチド応答は実験時間内にゼロまで落ちる（三角形、実線）。
【００２６】
したがって、ペプシンのタンパク質分解断片を調べることにより、タンパク質の分解をモニタリングすることができるが、分解が完了にまで到達したかどうかを判定することは困難なタスクである。この欠陥を克服するために、トリプシンペプチド産物は無傷のタンパク質の代理として使用され、ペプシンがない状態では、トリプシンペプチドの量は、１００％のタンパク質が存在しているのと当量であった。（消化中の様々な時点での）ペプシンの存在下において、トリプシンペプチドのレベルは、ペプシン切断部位を含有していたペプチドでは減少すると予想されることになる。このように、タンパク質の完全な分解はモニタリング可能である。
【００２７】
１つの特定の実施形態では、ω３ＬＣＰＵＦＡ経路のトランスジェニック酵素は、０分から６０分間ペプシンで消化され、その後、完全なトリプシン消化によって消化され、その間、一定の間隔でサンプルを採取する。トリプシンペプチドの減少を、無傷のタンパク質の代理として使用し、消化性ペプチドの出現と消失を、トランスジェニックタンパク質のインビトロの消化性を示すために使用した。さらに、既知量の総タンパク質中のトリプシンペプチドマーカーのレベルは、添加された内部標準（ＩＳ）を用いて定量化された。（標的のトランスジェニックタンパク質に特有の）特定のペプチドを調べることにより、この手法は、標的膜タンパク質の高選択的かつ高感受性な測定をもたらす。
【００２８】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを採用する同様の原則は、様々な植物の組織と種子において各標的タンパク質を定量化するために用いられた。トランスジェニック植物においてＬＣ−ＭＳ／ＭＳベースの方法を適用することにより、種子に特有のプロモーターが、トランスジェニックタンパク質が低レベル（ｎｇ標的／ｍｇタンパク質）で存在していた発育中の種子と成熟種子においてのみ導入遺伝子の発現を正確に方向付けられたことが実証された。
【００２９】
より具体的には、いくつかの実施形態では、較正曲線が生成され、ここで、分析物濃度は変動し、定義された量のＩＳが基準に添加された。質量分析計の応答は、各ＭＲＭトランジションに関する一体化されたピーク面積であった。上位３つのＭＲＭトランジションが合計された（分析物とＩＳの両方について）。（合計された分析物ピーク面積）／（合計されたＩＳピーク面積）の比率が、既知の分析物濃度に対してプロットされた。内因性のペプチド応答が決定され、濃度は較正曲線から補間され、こうして、１００μｇの総タンパク質あたりのｆｍｏｌの標的ペプチドとしてペプチドの定量化が可能となる。この値は、各標的タンパク質の分子量に基づいて、１ｍｇの総タンパク質あたり１ｎｇの当量に変換された。
【００３０】
キャノーラと、いずれかの酵母、細菌またはバキュロウィルスの発現系において発現された組換えタンパク質とからの総タンパク質抽出物を含む、様々な源からのタンパク質抽出物を使用して、トリプシン消化後に遊離したペプチドを評価した。ω３ＬＣ−ＰＵＦＡの生合成性酵素はこうして特徴づけられ、定量化のための各タンパク質のバイオマーカーとしてペプチドの選択が可能となる。酵素のアミノ酸配列は図２で提供され、ペプチドマーカーとして場合によっては有用となる完全なトリプシンペプチドには下線が引かれている。図２は、各酵素について検出されたペプチドのスコア、タンパク質配列カバー率（９５％の信頼度）、および数を提示する。メチオニン（Ｍ、一般的に酸化によって修飾された）を含有していたか、あるいは、隣接する二塩基部位（切断を阻害するＫＫ、ＫＲ、ＲＫ、ＲＲ）を含有していた場合には、必要に応じてペプチドはマーカーとして除外され、そうすることで消化効率のばらつきを抑えた。ペプチドは、例えば、（ａ）ＬＣ  ＭＳ／ＭＳ分析を受けやすいサイズ（６〜２０のアミノ酸）、および（ｂ）（複数の消化において）一貫して検出される最も高いシグナル強度にしたがって、タンパク質定量化で使用されるペプチドが選択された。
【００３１】
キャノーラと、いずれかの酵母、細菌またはバキュロウィルスの発現系において発現された組換えタンパク質とからの総タンパク質抽出物を含む、様々な源からのタンパク質抽出物が使用された。タンパク質は溶解して、あるいは、切除されたゲルスライスとして提供された。ゲルバンドは消化された。Ｂｙｒｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １２  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  １  （２０１２）を参照。溶液はフィルタで準備したサンプル調製液（ＦＡＳＰ）にさらされた。Ｗｉｓｎｉｅｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ６  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈ．  ３５９  （２００９）；  Ｃｏｌｇｒａｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １３７０  Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．  Ａ  １０５  （２０１４）。
【００３２】
タンパク質分解的に消化されたタンパク質は、質量分析計に直接つながれたナノＨＰＬＣ系を使用するクロマトグラフ分離と、タンパク分析に使用されたソフトウェアとを用いて分析された。Ｓｈｉｌｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  ６  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍ．  １６３８  （２００７）を参照。タンデム質量分析データは、システインアルキル化のために修飾されたヨードアセトアミドとして、および、消化酵素としてトリプシンとして定義されるパラメータを使用して、トランスジェニックタンパク質を含むデータベースのインシリコのトリプシン消化に対して探索された。
【００３３】
ω３ＬＣＰＵＦＡトランスジェニックキャノーラ組織または種子からの、あるいは、酵母、細菌、またはバキュロウィルス発現系において発現された組換えタンパク質からの総タンパク質抽出物は、ω３ＬＣＰＵＦＡ経路の各標的タンパク質、例えば、デサチュラーゼまたはエロンガーゼについて生成されたトリプシンペプチドの検出のための非標的ＬＣ−ＭＳによって最初に分析された。一時的に発現されたマーカータンパク質を伴うベンサミアナタバコ葉からの総タンパク質も、マーカータンパク質のトリプシンペプチドの検出に使用された。カスタムタンパク質データベースに対して生成されたデータをすべて検索した後に、定量化で使用される代理として各標的タンパク質から２つのペプチドが選択された。ペプチドの選択は、基準：良好なＭＳ応答（高強度）；必要に応じて、修飾される（例えばメチオニンの酸化）または誤切断される（一方の末端での二塩基の残基の存在）可能性があるペプチド配列内のアミノ酸の不在；標的タンパク質に特異的／特有である；および、ＬＣ−ＭＳを受けやすいサイズ（６−２０アミノ酸長さ）に基づいた。個々の選択されたペプチドについては、内因性（軽）ペプチド、および、１５Ｎと１３Ｃで標的された（重）ペプチドの両方が合成された。
【００３４】
トリプシン消化後に遊離したペプチドは、キャノーラと、いずれかの酵母、細菌またはバキュロウィルスの発現系において発現された組換えタンパク質とからの総タンパク質抽出物を含む、様々な源からのタンパク質抽出物を用いて評価された。ω３ＬＣＰＵＦＡの生合成性酵素はこうして特徴づけられ、定量化のための各タンパク質のバイオマーカーとしてペプチドの選択が可能となった。図２を参照。
【実施例】
【００３５】
＜実施例１＞ペプチドの選択
標的タンパク質−ω３ＬＣＰＵＦＡキャノーラで発現された７つのトランスジェニック生合成経路酵素はすべて、栽培期のトランスジェニックキャノーラの様々な組織中のタンパク質含有量の定量化を含む特徴づけのために標的とされた。
【００３６】
キャノーラと、いずれかの酵母、細菌またはバキュロウィルスの発現系において発現された組換えタンパク質とからの総タンパク質抽出物を含む、様々な源からのタンパク質抽出物を使用して、トリプシン消化後に遊離したペプチドを評価した。タンパク質配列が図２で提供され、ここでは、場合によってはペプチドマーカーとして有用な完全トリプシンペプチドには下線が引かれている。この図は、各標的タンパク質について検出されたペプチドのスコア、タンパク質配列カバー率（９５％の信頼度）、および数を提供する。必要に応じて、一般的に酸化によって修飾されたメチオニン（Ｍ）を含有していたか、あるいは、一般に未切断と、ゆえに、消化効率のばらつきを引き起こす隣接する二塩基部位（ＫＫ、ＫＲ、ＲＫ、ＲＲ）を含有していた場合には、ペプチドはマーカーとして除外された。ペプチドは、ＬＣ  ＭＳ／ＭＳの分析を受けやすいサイズ（：６−２０アミノ酸長さ）にとって理想的に選択された。（ａ）最も高いシグナル強度を与え、および、（ｂ）複数の消化で一貫して検出されたペプチドが、タンパク質定量化のためのペプチド合成に選択された。
【００３７】
定量化のペプチドの選択−ＤＨＡキャノーラ種子から、あるいは、いずれかの酵母、細菌またはバキュロウィルスの発現系において発現された組換えタンパク質とからの総タンパク質抽出物は、各標的タンパク質（つまり、ω３ＬＣＰＵＦＡ生合成経路のデサチュラーゼあるいはエロンガーゼ）のために生成されたトリプシンペプチドの検出のための非標的ＬＣ−ＭＳによって分析された。一時的に発現されたＲを伴うＮ．ベンサミアナ（Ｎ．  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）葉からの総タンパク質も、Ｒタンパク質のトリプシンペプチドの検出に使用された。カスタムタンパク質データベースに対して生成されたデータをすべて検索した後に、定量化のために用いられる代理として各標的タンパク質から２つのペプチドが選択された。ペプチドの選択は、複数の基準：（ａ）良好なＭＳ応答（高強度）、（ｂ）修飾される（例えば、メチオニンの酸化）あるいは誤って切断される（一方の末端での二塩基の残基の存在）可能性があるペプチド配列内のアミノ酸の不在、（ｃ）標的タンパク質に特異的／特有のアミノ酸、および、（ｄ）ＬＣ−ＭＳを受けやすいサイズ（６−２０アミノ酸長さ）に基づいた。個々の選択されたペプチドについては、内因性（軽）ペプチド、および、１５Ｎと１３Ｃで標的された（重）ペプチドの両方が合成された。
【００３８】
合成ペプチドのための応答の線形性の品質管理評価および判定の両方からの予備的な結果に基づいて、各タンパク質に関する最適な性能特性（例えば、高いシグナル強度、良好なクロマトグラフ特性）を備えるペプチドは、定量化のための代理となるタンパク質として選択された。ＤＨＡ合成経路酵素（図１を参照）のための最後に選択されたペプチドが表２に示される。
【００３９】
【表１】
2020513100.tif 000003
【００４０】
ペプチドの合成−選択されたペプチドは９９％の純度でＣｒｅａｔｉｖｅ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ（Ｓｈｉｒｌｅｙ，  Ｎ．Ｙ．，  ＵＳ）で合成された。各合成されたペプチドの量はＡｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ（Ｓｙｄｎｅｙ、ＡＵ）において高感受性アミノ酸分析（ＡＡＡ）によって判定された。すべてのサンプルを繰り返し分析した。アミノ酸（μｇ／ｍＬ）の計算量は、タンパク質中のアミノ酸残基質量（分子量マイナスＨ２Ｏ）に基づいた。決定された濃度を使用して、貯蔵液を１００ｐｍｏｌ／μＬで調製した。合成されたペプチドの純度はＬＣ−ＭＳによって分析された。〜５ｐｍｏｌ／μＬと当量の希釈液を水溶液（１％のギ酸）中で調製して、ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳによって分析した。切断した、修飾された、または、合成の副産物の存在を含む著しい汚染を示すいかなるペプチドもさらなる分析から除外した。
【００４１】
合成されたペプチドの純度はＬＣ−ＭＳによって分析され、その結果が図３−図１１に示される。各図では、上パネルは青（ＭＳ）とピンク（ＭＳ／ＭＳ）で、軽（Ａ）と重（Ｂ）ペプチドの全イオンクロマトグラム（ＴＩＣ）を示す。中パネルは、軽（Ａ）と重（Ｂ）ペプチドについて決定されたｍ／ｚ値を示す。下パネルは、適切なアミノ酸配列のＭＳ／ＭＳのスペクトルを示し、理論的なｍ／ｚ値は挿入物中で示されている。
【００４２】
合成ペプチドの濃度は高感受性アミノ酸分析によって決定され、その結果は二重反復測定値の平均として表現された（表３−１１）。アミノ酸（μｇ／ｍＬ）の計算量は、タンパク質中のアミノ酸残基質量（分子量マイナスＨ２Ｏ）に基づいた。決定された濃度を使用して、貯蔵液を１００ｐｍｏｌ／μＬペプチドで調製した。
【００４３】
【表２】
2020513100.tif 000004
【００４４】
【表３】
2020513100.tif 000005
【００４５】
【表４】
2020513100.tif 000006
【００４６】
【表５】
2020513100.tif 000007
【００４７】
【表６】
2020513100.tif 000008
【００４８】
【表７】
2020513100.tif 000009
【００４９】
【表８】
2020513100.tif 000010
【００５０】
【表９】
2020513100.tif 000011
【００５１】
【表１０】
2020513100.tif 000012
【００５２】
図１２Ａで描かれるように、線形回帰モデルは、Δ４ＤペプチドＬＡＰＬＶＫの定量化には適さなかった。２つの実験的に決定されたＭＳ応答を調べて、補間された結果が図表の解釈とは異なることに留意した。線形回帰モデル（図３Ａ）を用いて、１．０８３のピーク面積比率の分離個体１４Ｅ−０３６８−０４−０３成熟種子は、１，３４５ｆｍｏｌの量をもたらし、２．６４２のピーク面積比率のＮＳ−Ｂ５００２７−４種子は、３，１１５ｆｍｏｌをもたらすことになる。１，８３６ｆｍｏｌと３，３０７ｆｍｏｌの量を産出することになる三次回帰モデルと比較して、分離個体１４Ｅ−０３６８−０４−０３種子量が（それぞれ２７％および６％ずつ）過小評価されたことは明白であった。検出限界（ＬＯＤ）、定量化の下限（ＬＬＯＱ）、および定量化の上限（ＵＬＯＱ）が、調整されたＵＬＯＱ、残差（Ｓｙ．ｘ）の標準偏差、および、平方和（ＳＳ）とともに、非線形回帰モデルについてフェムトモルで与えられている、キャノーラペプチドの定量化の分析的なパラメータが表Ａで列挙されている：
【００５３】
【表１１】
2020513100.tif 000013
【００５４】
＜実施例２＞サンプルの調製
トランスジェニックキャノーラを産生するω３ＬＣＰＵＦＡで発現された７つの生合成経路酵素はすべて、別々の植栽場所で栽培期を通じてトランスジェニックキャノーラの様々な組織と種子において定量化の標的とされた。
【００５５】
キャノーラサンプルの採取−野生型（ＷＴ）およびトランスジェニックのキャノーラは、野外試験場に植えられた。各試験場のＷＴおよびトランスジェニックの植物の両方のためにサンプリングされた組織を、表Ｂに列挙する。サンプリング時間は、葉、根、鞘、および繁殖組織を含む様々な組織タイプを考慮して、キャノーラの特定の成長段階を表わす。Ｌａｎｃａｓｈｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １１９  Ａｎｎａｌｓ  Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｌ．  ５６１  （１９９１）を参照。収穫された植物組織を、冷凍にしておくためにドライアイス中で保存し、次の処理まで−８０°Ｃの冷凍庫に移した。
【００５６】
【表１２】
2020513100.tif 000014
【００５７】
キャノーラからの総タンパク質抽出−採取されたサンプル（あらかじめ−８０°Ｃで保存された）を、乳鉢と乳棒を用いて粉砕して微粉末にして液体窒素を含ませた；すべてのサンプルをプロセスの間ドライアイスで冷凍のまま維持した。相互汚染を回避するために、ＷＴサンプルを最初に処理し、その後、トランスジェニックサンプル：ＴＧ１５、ＴＧ３５、ＴＧ６５の根、ＴＧの他の組織、ＴＧの花、ＴＧ７９、および、最後にＴＧ９０を順番に処理した。１ｍｇ以上の総タンパク質を得るために、２ｍＬのプラスチックチューブ中の１００ｍｇの複数のアリコートから総タンパク質を抽出した。その後、各チューブをアセトン中の１０％のＴＣＡ１ｍＬで満たし、ボルテックスし、その後、デジタル・プローブ・ソニケーター（Ｂｒａｎｓｏｎ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  Ｍｏ．，  ＵＳ）を使用して２０秒間、２５％の振幅頻度で超音波処理した。サンプルを４°Ｃで３分間１６，０００ｘｇで遠心分離にかけた。上清を注意深くデカントして取り除いた。ペレット剤を８０％のＭｅＯＨ中の０．１Ｍの酢酸アンモニウム（ＮＨ４ＣＨ３ＣＯ２）１ｍＬにおいて再懸濁し、ボルテックスして混合し、４°Ｃで１６，０００ｘｇで３分間、遠心分離機にかけた。上清を注意深くデカントして捨てた。その後、ペレットを１ｍＬの８０％のアセトン中で再懸濁し、ペレットが完全に分散するまでボルテックスし、４°Ｃで１６，０００ｘｇで３分間遠心分離機にかけた。上清を捨て、ペレットを空気乾燥させることで残ったアセトンを取り除いた。
【００５８】
空気乾燥させたペレットを、０．６ｍＬのＵｌｔｒａＰｕｒｅ緩衝飽和フェノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．，  ＵＳ）、および、０．６ｍＬの新しく調製したＳＤＳ緩衝液（３０％のスクロース、２％のＳＤＳ、０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ８．８、０．１ＭのＤＴＴ）中で再懸濁し、徹底的に混ぜ、室温で５分間インキュベートした。その後、サンプルを室温で５分間１６，０００ｘｇで遠心分離にかけた。上部のフェノール相を新しい２ｍＬのチューブに移し、８０％のＭｅＯＨ中の０．１ＭのＮＨ４ＣＨ３ＣＯ２の１ｍＬを加えた。タンパク質を−２０°Ｃで夜通し沈殿させた。サンプルを４°Ｃで５分間１６，０００ｘｇで遠心分離にかけた。上清を注意深く捨てて、ペレットを１００％のＭｅＯＨで洗浄し、その後、８０％のアセトンで洗浄した。タンパク質を４°Ｃで５分間、１６，０００ｘｇで遠心分離機にかけることによってペレット化した。最終的なタンパク質ペレットを空気乾燥させた。
【００５９】
キャノーラタンパク質消化−様々な植物組織または種子から抽出したタンパク質をＵＡ緩衝液（８Ｍの尿素、０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５）に溶かした。タンパク質評価は、試薬メーカーの説明書（バージョン：Ｌｉｔ３３  Ｒｅｖ  Ｃ）に従って、マイクロタイターＢｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｓ．，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  Ｃａｌｉｆ．，  ＵＳ）を使用して行われた。サンプルを３回の希釈で、水中で希釈して二度繰り返し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐｌｕｓを用いて５９５ｎｍで測定を行った。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）基準を、線形範囲０．０５ｍｇ／ｍＬ〜０．５  ｍｇ／ｍＬで使用した。民間の研究所（Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ，  Ｓｙｄｎｅｙ，  ＡＵ）で高感受性ＡＡＡによってＢＳＡ標準濃度を判定した。ブランク補正した標準曲線を繰り返し実行した。線形回帰を用いて標準曲線に適合させた。
【００６０】
タンパク質サンプル−処理の前にタンパク質サンプルを−８０°Ｃで保存した。タンパク質をＦＡＳＰに晒して、ここで、ＵＡ緩衝液中のタンパク質抽出物（２５０μｇ）を、１０ｋＤａ分子量のカットオフ（ＭＷＣＯ）フィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｓｙｄｎｅｙ、ＡＵ）に適用して、遠心分離（２０，８００ｘｇ、１５分）の前にＵＡ緩衝液を用いて２００μＬに希釈した。フィルタ上のタンパク質を２つの２００μＬ容量のＵＡ緩衝液で洗浄して遠心分離にかけた（２０，８００ｘｇ、１５分）。フィルタ上のタンパク質を減らすために、ＤＴＴ（１００ｍＭ、１００μＬ）を加え、溶液を振動させながら５０分間室温でインキュベートした。フィルタを２つの２００μＬ容量のＵＡ緩衝液で洗浄して遠心分離（２０，８００ｘｇ、１５分）にかけた。
【００６１】
システイン残基をアルキル化するために、ヨードアセトアミド（ＩＡＭ）（５０ｍＭ、１００μＬ）をフィルタ上のタンパク質に適用して、暗所において室温で２０分間インキュベーションした。フィルタを２つの２００μＬ容量のＵＡ緩衝液で洗浄して遠心分離（２０，８００ｘｇ、１５分）にかけた。緩衝液を、２回の連続した洗浄／遠心分離サイクルによって、５０ｍＭ（ＮＨ４）ＨＣＯ３（ｐＨ８．０）を用いて交換した。その後、２５μｇの配列グレートのブタのトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，  Ａｌｅｘａｎｄｒｉａ，  ＡＵ）（２００μＬの５０ｍＭの（ＮＨ４）ＨＣＯ３、１ｍＭのＣａＣｌ２中の０．１２５μｇトリプシン／μＬ）を、１０ｋＤａのＭＷＣＯフィルタ上のタンパク質に加え、湿った部屋で３７°Ｃで１６時間インキュベートした。その後、フィルタを新しい遠心分離チューブに移し、濾液（消化されたペプチド）を遠心分離（２０，８００ｘｇ、１０分）後に採取した。フィルタを、２００μＬの１００ｍＭの（ＮＨ４）ＨＣＯ３で洗浄し、濾液を組み合わせて凍結乾燥させた。結果として生じたペプチドを、ＩＳペプチドＷＥＧＥＰＩ＊ＳＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のａａ２７４−２８１）の０．０４ｐｍｏｌ／μＬを含有する６２．５μＬの１％ギ酸中で再懸濁し、２５μＬ（総タンパク質の〜１００μｇと１ｐｍｏｌのＩＳと当量）をＬＣ  ＭＳ／ＭＳによって分析した。
【００６２】
ＬＣ−ＭＳ方法による発育のためのサンプル調製−キャノーラからの総タンパク質抽出物、いずれかの酵母、細菌あるいはバキュロウィルス発現系で発現された組換えタンパク質を含む、様々な源からのタンパク質抽出物を試験した。タンパク質は溶液中で提供されたか、あるいは、切除されたゲルスライスとして提供された。溶液を先に記載されたようにＦＡＳＰに晒した。Ｃｏｌｇｒａｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；  Ｃｏｌｇｒａｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １４７  Ｊ．  Ｐｒｏｔｅｏｍ．  １６９  （２０１６）を参照。ゲルバンドを先に記載されたように消化させた。Ｂｙｒｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２。
【００６３】
＜実施例３＞ＬＣ−ＭＳ分析
予備ＬＣ−ＭＳ分析−タンパク質分解的に消化されたタンパク質を、ＴｒｉｐｌｅＴＯＦ  ５６００＋ＭＳ／ＭＳ系（ＡＢ  ＳＣＩＥＸ  ＬＬＣ，  Ｒｅｄｗｏｏｄ  Ｃｉｔｙ，  Ｃａｌｉｆ．，  ＵＳ）に直接つないだナノ流ＨＰＬＣ系（Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ  Ｎａｎｏ，  Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｃｏｒｐ．，  Ｒｙｄａｌｍｅｒｅ，  Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を使用して、クロマトグラフ分離（２％−４０％アセトニトリルの２％／ｍｉｎ直線濃度勾配）を用いて分析した。Ｐａｒａｇｏｎ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ（Ｓｈｉｌｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）を備えるＰｒｏｔｅｉｎＰｉｌｏｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖ４．０（ＡＢ  ＳＣＩＥＸ）をタンパク同定に使用した。タンデム質量分析データを、トランスジェニックタンパク質を含むインシリコトリプシン消化データベースに対して検索した。検索パラメータを、システインアルキル化のために修飾されたヨードアセトアミドとして、および、消化酵素としてトリプシンとして定義した。
【００６４】
ＬＣ−ＭＲＭ−ＭＳ定量化−二重ブランク（分析物なし、ＩＳなし）、ブランク（ＩＳのみ）、および、既知の変動量の各ペプチド（０．０８〜５，０００ｆｍｏｌ）と１ｐｍｏｌのＩＳペプチド（ＷＥＧＥＰＩ＊ＳＫ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のａａ２７４−２８１）を含む１７の基準を含んでいる一連の基準（ｎ＝４回の反復）を、ＬＣ−ＭＲＭ−ＭＳによって分析した。データは、ＱＴＲＡＰ  ６５００＋  ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ系（ＡＢ  ＳＣＩＥＸ）でＡｎａｌｙｓｔ  １．６．３ソフトウェアを使用して獲得された。データをＭｕｌｔｉＱｕａｎｔ  ｖ３．０（ＡＢ  ＳＣＩＥＸ）へインポートし、各々の５つのモニタリングされたＭＲＭトランジションに関するピーク面積を統合した。上位３つのＭＲＭトランジション（クオンティファイア）の各々のピーク面積を合計し、残る２つのＭＲＭトランジションを、クオリファイファ（保持時間（ＲＴ）の評価とＭＲＭトランジションの強度の順序によるペプチド同定の確認を可能にする）として使用した。予備データを使用して、１つのタンパク質当たりパフォーマンスの最も優れたペプチドを、クロマトグラフィーパフォーマンス（良好なピーク形状）、干渉のないＭＳの強度（サンプルマトリックスで評価されるように）などの基準に基づいて、各酵素の代理として選択した。各組織のプールされた（ｎ＝６）ＷＴまたはトランスジェニックキャノーラサンプルに重ペプチドを添加して、これらは、適切な保持時間（ＲＴ、分）とＭＲＭトランジション順序を判定するための参照標準として役立った。Ｐａｖｓａ−Δ４Ｄに由来する重ペプチドＷＥＧＥＰＩ＊ＳＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のａａ２７４−２８）は、その高ＭＳ応答、再現可能な検出、および優れたクロマトグラフィーパフォーマンス（半分の最大値にて〜１．６秒ピーク幅で３．２分で溶出）に基づいてＩＳとして選択された。
【００６５】
キャノーラタンパク質のＬＣ−ＭＲＭ−ＭＳ定量化−添加されたＩＳを含有するＷＴとトランスジェニックの両方のキャノーラ（ｎ＝３回の反復、合計で８４サンプル）を含む、２つの発育部位からの５つの成長段階（７つのサンプル）を表す抽出および消化されたタンパク質サンプルは、水性のペプチド基準とあわせてＬＣ  ＭＲＭ−ＭＳによって分析された。水性の基準またはキャノーラのペプチド抽出物のアリコート（２５μＬ）を、Ｎｅｘｅｒａ  ＵＨＰＬＣ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）でクロマトグラフィーにより分離させ、ＱＴＲＡＰ  ６５００＋質量分析計で分析した。Ｃｏｌｇｒａｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４を参照。定量化は、各ＭＲＭトランジションについて１２０秒の検出窓と０．３秒のサイクル時間を使用して、スケジュールを組まれたＭＲＭスキャン実験を駆使して達成された。ピークはＭｕｌｔｉＱｕａｎｔ  ｖ３．０（ＡＢ  ＳＣＩＥＸ）を使用して統合され、３つのすべてのトランジションは、検出には＞３の信号対雑音（Ｓ／Ｎ）と、定量化には＞５のＳ／Ｎで、同じ保持時間（ＲＴ、分）で共溶出することを要求された。合成ペプチドの較正曲線を示すグラフは、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖ６（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，  Ｉｎｃ．，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  Ｃａｌｉｆ．，  ＵＳ）で生成された。個々の標的とされた光ペプチドに関する上位３つのＭＲＭの干渉のないトランジションのピーク面積の合計は、ＭＲＭ応答比率を生成するためにＩＳペプチドのＭＲＭピーク面積に合計と比較された。（１００μｇの総タンパク質あたりのｆｍｏｌとして）個々の標的のペプチドの量は、適切な較正曲線の補間によって決定された。その後、これらのサンプル中で検出されたタンパク質の量は、１ｍｇの総タンパク質あたり１ｎｇ当量への転換によって、タンパク質分子質量に基づいて計算された。
【００６６】
定量のＬＣ−ＭＲＭ−ＭＳ方法の開発−トランスジェニックω３ＬＣＰＵＦＡ生合成経路の酵素のトリプシン消化から集められたデータを用いて、ペプチド質量、ゆえに、前駆体の質量電荷（ｍ／ｚ）比を決定した。その後、標的のペプチドを代表する５つのフラグメントイオンを選択した。ともに、Ｑ１  ｍ／ｚとＱ３  ｍ／ｚは、「ＭＲＭトランジション」と呼ばれ、ＭＲＭトランジションは、軽ペプチドに関する表１２Ａと多ペプチドに関する表１２Ｂで提示され、重ペプチドは定性的評価の参照標準として使用された。さらなるトランジション情報は表１３にある。
【００６７】
【表１３】
2020513100.tif 000015
【００６８】
【表１４】
2020513100.tif 000016
【００６９】
【表１５−１】
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【００７０】
【表１５−２】
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【００７１】
ＬＣ−ＭＲＭ−ＭＳによるタンパク質定量化の検証−軽ペプチド（分析物）のＭＳ応答（ピーク面積）を測定し、ＬＣ−ＭＳ系にロードしたペプチドの量に対してプロットした。ペプチドはすべて０ｆｍｏｌから１，２５０ｆｍｏｌの範囲にかけて線形応答を与え、例外的にＰａｖｓａ−Δ４ＤペプチドＬＡＰＬＶ＊Ｋ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のａａ４０３−４０８）であり、線形範囲は図１２Ｂで示されるように、２，５００ｆｍｏｌまで延長された。検出限界（ＬＯＤ）、定量化の下限（ＬＬＯＱ）、および定量化の上限（ＵＬＯＱ）がｆｍｏｌで与えられている、キャノーラペプチドの定量化の分析的なパラメータが表１４に列挙されている。
【００７２】
【表１６】
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【００７３】
トランスジェニックキャノーラ中のω３ＬＣＰＵＦＡ生合成経路酵素のレベル−ＬＣ  ＭＲＭ−ＭＳの定量化によって、２つの野外試験場から集められた５つの成長段階の７つのサンプリング地点すべてで得られたＷＴキャノーラからの総タンパク質抽出物において標的ペプチドのいずれも検出されなかったことが確認された。さらに、２つの野外試験場から集められた５つの成長段階の７つのサンプリング地点から得られたトランスジェニックω３ＬＣＰＵＦＡキャノーラの非種子組織中の総タンパク質抽出物でも標的ペプチドのいずれも検出されなかった（表１５）。
【００７４】
【表１７】
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【００７５】
ω３ＬＣＰＵＦＡ生合成経路酵素を表す７つのペプチドはすべて、トランスジェニックキャノーラの発育中あるいは成熟した種子において検出され、表１６に示されるように定量化された。
【００７６】
【表１８】
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【００７７】
Ｐｙｒｃｏ−Δ５ＥとＰｙｒｃｏ−Δ６Ｅのタンパク質は、トランスジェニックキャノーラ（６４−９０ｆｍｏｌの範囲）中の最少のタンパク質存在量を呈した。Ｐｙｒｃｏ−Δ５Ｅは発育中の種子で検出限界未満であり、Ｐｙｒｃｏ−Δ６Ｅタンパク質は成熟種子で検出限界未満であった。Ｐａｖｓａ−Δ４Ｄは、成熟種子において最大１，５００ｆｍｏｌで、７つの酵素のうち最高量で存在した。各タンパク質の分子質量に基づいて、個々のトランスジェニックタンパク質のレベルを、表１７に示されるように（１ｍｇの総タンパク質に基づいて）判定した。具体的には、最少のタンパク質は、２０／ｍｇ総タンパク質のＰｙｒｃｏ−Δ５Ｅであり、最高のタンパク質は７４０ｎｇ／ｍｇの総タンパク質のＰａｖｓａ−Δ４Ｄであった。図１３−図１９で示されるように、検出されたペプチドはすべて確認された。
【００７８】
【表１９】
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【００７９】
ω３ＬＣＰＵＦＡ生合成経路酵素の種子に特有の発現は、一連の植物組織を調べることによって確認された。トランスジェニックキャノーラの非種子組織では標的ペプチドの検出はなかった。Ｐａｖｓａ−Δ４Ｄタンパク質は、発育中あるいは成熟した種子で検出された７つの導入遺伝子産物の中で最も豊富であり、したがって、図２０−図２４に描かれるような代表的なタンパク質に選ばれた。ＴＧ１５植物全体、ＴＧ３５植物全体、ＴＧ６５根、ＴＧ６５花、あるいはＴＧ６５の他の組織では、Ｐａｖｓａ−Δ４ＤペプチドＬＡＰＬＶＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のａａ４０３−４０８）の検出はなかった。
【００８０】
タンパク質含有量は、脂肪酸生合成経路において７つの酵素すべてについてトランスジェニックキャノーラ中で検出され、定量化された。種子に特有のプロモーターの制御下で発現された酵素によって促されるω３ＬＣＰＵＦＡ産生は、発育中の種子と成熟種子でのみ検出され、かつ、低レベル（２０−７４０ｎｇ／ｍｇの総タンパク質）であった。反対に、ω３ＬＣＰＵＦＡ経路酵素のいずれも、サンプリング時間にかかわらず、トランスジェニックキャノーラの他の組織では検出されなかった。最後に、トランスジェニックタンパク質はＷＴキャノーラ組織あるいは種子では検出されなかった。
【００８１】
選択マーカータンパク質の検出−図２５に示されるように、選択マーカー遺伝子（Ｒ）の低レベル発現（検出の限界以下）がキャノーラにおいて確認され、ここで、マーカータンパク質（Ｒ）の微量はすべての試験済みの組織において検出された。最も高いＲシグナル強度が、植物全体の段階ＴＧ１５およびＴＧ３５について検出された（図２５Ｄ−図２５Ｅ）。試験植物におけるＲの低い発現もまた、抗Ｒ抗体を使用したウエスタンブロット分析によって支援された（図２６）。予想されたサイズの一時的に発現されたＲタンパク質は、トランスジェニックＮ．ベンサミアナ（ｂｅｎｔｈｍｉａｎａ）葉の総タンパク質で検出されたが、ＷＴ  Ｎ．ｂｅｎｔｈｍｉａｎａ葉の総タンパク質では検出されなかった。特定のＲバンドは、トランスジェニックキャノーラＴＧ１５植物全体、ＴＧ３５植物全体、またはＴＧ７９発育中の種子では検出されず、Ｒの量がウェスタンブロットアッセイの検出可能なレベルより低いことを示唆した。
【００８２】
＜実施例４＞パブロバ・サリナΔ４−デサチュラーゼ（Ｐａｖｓａ−Δ４Ｄ）のインビトロでの安定性
この実施例は、正確な分解産物をモニタリングするために、最先端の質量分析アプローチを利用した新規なペプシン−トリプシンアッセイと組み合わせて、ペプシンを含むＳＧＦ中のＰａｖｓａ−Δ４Ｄタンパク質のインビトロでの消化性の評価を提供する。タンパク質消化の程度を、無傷のタンパク質の代理としての消化性ペプチド産物の出現および消失、ならびにトリプシンペプチド産物の消失によって評価した。単一の方法ではタンパク質のアレルゲン性を予測することができないため、タンパク質のアレルゲン性の可能性は証拠の重み付けアプローチによって決定される。タンパク質の消化性は、遺伝子組み換え作物で新しく発現されたタンパク質について行なわれる、全体的なアレルゲン性評価の１つの側面である。
【００８３】
この実施例の結果は、Ｐａｖｓａ−Δ４Ｄ（測定が困難な内在性膜タンパク質）がペプシンまたはトリプシンにおいて容易に消化可能であったことを示す。特定の実施形態では、本明細書で提供される結果は、ペプシンにおけるインキュベーションの際に、およびＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用して分析される際に、完全長のＰａｖｓａ−Δ４Ｄタンパク質の＞８０％が１０分以内に消化され、完全長のＰａｖｓａ−Δ４Ｄタンパク質の＞９３％が６０分以内に消化されたことを示す。別の実施形態では、本明細書で提供された結果は、ペプシンにおけるインキュベーションの際に、およびＬＣ  ＭＳ／ＭＳを使用して分析される際に、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ、完全長のＰａｖｓａ−Δ４Ｄタンパク質の９９％が１０分以内に消化され、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる分析時に完全長のＰａｖｓａ−Δ４Ｄタンパク質の９９．６％が６０分以内に消化されたことを示す。完全長のタンパク質の急速な消化は、トランスジェニックタンパク質の安全性を示す多くの要因の１つである。
【００８４】
ω３ＬＣＰＵＦＡ、エイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、およびドコサヘキサエン酸（ＥＰＡ、２０：５ω３；ＤＰＡ、２２：５ω３；およびＤＨＡ、２２：６ω３のそれぞれ）は、ヒトの健康（特に、心血管性および炎症性の健康と関係するもの）におけるそれらの有益な役割のために広く認識される。ＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡは、天然魚油および藻類油から主に供給され、藻類は海洋食物網中の最初の生産者である。しかし、海洋資源は、水産養殖、栄養補助食品、および医薬品の用途によるω３ＬＣＰＵＦＡへの需要の増加によって圧力をかけられている。
【００８５】
これらの脂肪酸の追加の資源は、種子油中の天然の脂肪酸を海洋型のω３ＬＣＰＵＦＡに変換するために、地上ベースの油糧種子作物を設計することによって産生された。例えば、キャノーラは、２０１５／２０１６年に世界的に産生された６７００万トン（ＭＭＴ）の菜種を有する一般に成長した油糧種子であり、種子油中にＤＨＡを含むかなりの量のω３ＬＣＰＵＦＡを産生するトランスジェニックキャノーラ（セイヨウアブラナ）系統が開発されている。上記のように、単一の発現ベクターにおいて７つの脂肪酸デサチュラーゼおよびエロンガーゼがキャノーラへと導入され、オレイン酸（ＯＡ）のＤＨＡへの転換のための合成経路を提供した。例えば、ＷＯ２０１０／０５７２４６を参照。
【００８６】
簡潔に言えば、トランスジェニックω３ＬＣＰＵＦＡキャノーラの中で使用されるΔ４−デサチュラーゼ遺伝子を、藻類Ｐ．サリナからクローン化し、コドン最適化し（例えば、ＷＯ２０１０／０５７２４６を参照）、Ｈｉｓ−タグおよびＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ切断部位（ＳＬＥＶＬＦＱ↓ＧＰ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  Ｐａｒｒａｍａｔｔａ，ＡＵ）と融合し、バキュロウィルスｐＦａｓｔＢａｃベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）にクローン化し、Ｓｆ９昆虫細胞株において発現させ、その後、以下のように精製し：Ｈｉｓ−Ｐａｖｓａ−Δ４Ｄを発現する約１００ｍｇの昆虫細胞ペレット剤を、５００μＬの溶解緩衝液（イミダゾール、ＤＴＴ、およびＰＭＳＦを有する１ｘリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ））中で再撹拌した。最終の溶解緩衝液は、１４０ｍＭのＮａＣｌ、２７ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１．８ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、２０ｍＭのイミダゾール、１０ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＰＭＳＦを含んだ。細胞を、Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｐｒｏｂｅ  Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ（（Ｅｍｅｒｓｏｎ  Ｅｌｅｃ．Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．，ＵＳ）を使用して超音波処理し、４°Ｃで、３０分間、２１，７００ｘｇで遠心分離機にかけた。上清中のペレットタンパク質および残りのタンパク質を、マウス抗−Ｈｉｓ−タグ抗体（１：１０００の希釈）を使用したＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析によって評価した。タンパク質をアッセイ時間まで−８０°Ｃで冷凍庫で保存した。
【００８７】
消化性のアッセイは２つの酵素を使用した：トリプシンおよびペプシン。トリプシンは消化器系で見られるセリンプロテアーゼである。トリプシンは、塩基性アミノ酸リジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）のカルボキシル側のポリペプチド鎖を切断し、その切断は、前述のアミノ酸（Ｐ１’位置、図２７Ａ）としてのプロリンの存在によって妨げられる。ペプシンは胃中で産生されたプロテアーゼであり、切断において有能であり、非特異的な様式であり、芳香族および疎水性アミノ酸フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、およびロイシン（Ｌ）に隣接しているペプチド結合である（図２７Ｂ）。Ｐ３位置のヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、およびアルギニン（Ｒ）は、タンパク質分解を妨げるように機能する一方、Ｐ３位置またはＰ４位置のプロリン（Ｐ）はタンパク質分解を促進する。
【００８８】
２つのテストシステム、つまり、ペプシン消化（人工胃液（ＳＧＦ）を表す）、および組み合わせたペプシン−トリプシン消化は、Ｈｉｓ−Ｐａｖｓａ−Δ４Ｄタンパク質の安定性をテストするために独立して利用した。ＳＧＦは、ペプシンの高度に精製された形態を使用して、酸性ｐＨ１．２に調節された緩衝液中にタンパク分解酵素ペプシンを含んでいた。消化反応で３：１の酵素：タンパク質比率になるようにＳＧＦを製剤した。Ｐａｖｓａ−Δ４Ｄタンパク質の消化をＬＣ−ＭＳ／ＭＳによってモニタリングした。本明細書に記載されるペプシン消化性アッセイプロトコル、複数の臨床検査において国際生命科学研究所（ＩＬＳＩ）によって標準化されたプロトコルを参照し、その結果は、一般的なプロトコルに従った場合に、インビトロでのペプシン消化アッセイが再現可能であることを示した。Ｔｈｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ３９  Ｒｅｇ．  Ｔｏｘ．  Ｐｈａｒｍ．  ８７  （２００４）。シーケンシンググレードブタトリプシンおよびペプシン（カタログ＃Ｖ１９５Ａ；比活性＞２，５００ユニット／ｍｇ）の高度に精製された形態を、配列決定グレード、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｓ．，  ＵＳ）から購入した。マウスの抗−Ｈｉｓ−抗体（カタログ＃Ａ７０５８）をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｙｄｎｅｙ、ＡＵ）から購入した。
【００８９】
ＳＧＦは、酸性ｐＨ１．２に調節された緩衝液中のタンパク分解酵素ペプシンによって表された。その消化を５、１０、１５、３０、および６０分間実施し、対照としては０分（添加されたペプシンなし）であり、各々を５回繰り返した。ペプシン消化後に５回繰り返したものを濾過し洗浄するため、最も早い実際の時点はペプシンの添加から５分後であった。標的消化性ペプチドの存在量の増加を、タンパク質の消化性の指標として使用した。さらに、上記の時点でのＳＧＦ消化後、組み合わせたペプシン−トリプシン消化と呼ばれるトリプシンを用いた１６時間の消化を行った。ペプシンなし（０分）、その後のトリプシン消化におけるペプチドの存在量と比較されたトリプシンペプチドの相対存在量は、タンパク質の消化性の指標を提供した。
【００９０】
ペプシン処理について、３０μｇのタンパク質（３０μＬ、ｎ＝３０（５回繰り返した消化および６つの時点を含む））を、１０ｋＤａの分画分子量フィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，  Ａｕｓｔｒａｌｉａ）に適用し、２００μＬ容量のＵＡ緩衝液で２度洗浄して、遠心分離にかけた（２０，８００ｘｇ、１５分）。該緩衝液を、２つの連続する洗浄／遠心分離の工程によって、５０ｍＭ（ＮＨ４）ＨＣＯ３（ｐＨ８．０）を使用して交換した。ｐＨは、酸性化された５０ｍＭの（ＮＨ４）ＨＣＯ３（ｐＨ１．２）を用いた２つの連続する洗浄／遠心分離の工程によって低下した。ＨＣｌ、酢酸、またはクエン酸などの多数の酸が、緩衝液を酸性化し、かつペプシンが活動性である低いｐＨ（つまり、ｐＨ〜１．２からｐＨ〜３．０）を達成するために使用されてもよい。１０ｋＤａのフィルタを、新しい遠心分離管に移し、および９０μｇのペプシン（１５０μＬ、０．６μｇ／ｍＬ中の酸性化された５０ｍＭの（ＮＨ４）ＨＣＯ３、ｐＨ１．２）を加えて、３：１の酵素：タンパク質の比率を得た。複製された管を、５つの時点（５、１０、１５、３０、６０分）にわたって、３７°Ｃでインキュベートした。ペプシンを０の時点に適用せず、それは、酸加水分解の実験的対照として機能した。ペプシンを不可逆的に不活性化した２００μＬの５０ｍＭの（ＮＨ４）ＨＣＯ３、ｐＨ８．０の添加によって、その消化を止めた。１０ｋＤａのフィルタを直ちに遠心分離機にかけ（２０，８００ｘｇ、１５分）、消化されたペプチドを含む濾液を収集した。該フィルタを、２００μＬの５０ｍＭの（ＮＨ４）ＨＣＯ３、ｐＨ８．０で２度洗浄し、濾液を組み合わせて凍結乾燥し、その後、さらなる分析まで−８０°Ｃで保存した。ＬＣ−ＭＳについて、消化性ペプチドを、１２μＬの１％のギ酸中で再撹拌し、ＱＴＲＡＰ  ６５００＋  ＬＣ−ＭＳシステムで実行し、定量化した。
【００９１】
デュアルペプシン−トリプシン消化については、各時点からの１０ｋＤａのフィルタを新しい遠心分離管に移し、および、残余タンパク質を、遠心分離（２０，８００ｘｇ、１５分）に先立って、４５分間、ミキサー上で、６００ｒｐｍで、２００μＬの５０ｍＭのＤＴＴ（５０ｍＭ（ＮＨ４）ＨＣＯ３）、ｐＨ８．５で４５分間還元した。タンパク質を、遠心分離（２０，８００ｘｇ、１５分）に先立って、暗所で、２０分間、２００μＬの５０ｍＭのＩＡＭ（５０ｍＭの（ＮＨ４）ＨＣＯ３）、ｐＨ８．５でアルキル化した。１０ｋＤａのフィルタを新しい遠心分離管に写し、２μｇのトリプシン（２００μＬ、５０ｍＭの（ＮＨ４）ＨＣＯ３中の０．０１μｇ／ｍＬ、ｐＨ  ８．５、および１ｍＭのＣａＣｌ２）を加えて、〜１：１５の酵素：タンパク質の比率を得た。複製された管を３７°Ｃで１６時間インキュベートした。インキュベートした後、フィルタを遠心分離機にかけ（２０，８００ｘｇ、１５分）、消化されたペプチドを含む濾液を収集した。フィルタを、２００μＬの５０ｍＭの（ＮＨ４）ＨＣＯ３、ｐＨ８．５で２度洗浄し、濾液を組み合わせて凍結乾燥し、さらなる分析まで−８０°Ｃで保存した。ＬＣ−ＭＳについて、トリプシンペプチドを１２μＬの１％のギ酸中で再撹拌し、ＱＴＲＡＰ  ６５００＋  ＬＣ−Ｍで実行し、定量化した。
【００９２】
６０分のペプシン消化について、Ｈｉｓ−Ｐａｖｓａ−Δ４Ｄタンパク質を、ＵＡ緩衝液中で〜１．３μｇ／μＬに希釈した。タンパク質抽出物（〜２００μｇに相当）のアリコートを、フィルタ補助サンプル調製（ＦＡＳＰ）にさらした。Ｗｉｓｎｉｅｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９を参照。タンパク質抽出物を、１０ｋＤａのＭＷＣＯフィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に適用し、２つの２００μＬ容量のＵＡ緩衝液で洗浄し、遠心分離にかけた（２０，８００ｘｇ、１５分）。緩衝液を、２つの連続する洗浄工程／遠心分離工程を、５０ｍＭの（ＮＨ４）ＨＣＯ３、ｐＨ８．０を用いて交換した。２つの連続する洗浄工程／遠心分離工程によって、酸性化された５０ｍＭの（ＮＨ４）ＨＣＯ３（ｐＨ１．２）でｐＨを調節した。１０ｋＤａのフィルタを新しい遠心分離管に移し、６００μｇのペプシン（２００μＬ、５０ｍＭの酸性化された（ＮＨ４）ＨＣＯ３中の３μｇ／μＬ、ｐＨ１．２）を加えて、３：１の酵素：タンパク質の比率を得た。該フィルタを、３７°Ｃで６０分間ペプシンを用いてインキュベートし、その後、管をきれいにするために移動させた。濾液（消化されたペプチドを含む）を、遠心分離（２０，８００ｘｇ、１０分）後に収集した。フィルタを、２００μＬの１００ｍＭの（ＮＨ４）ＨＣＯ３で洗浄し、濾液を組み合わせて凍結乾燥し、その後、さらなる分析まで−２０°Ｃで保存した。ＬＣ  ＭＳ／ＭＳについて、結果として生じたペプチドを、１２．５μＬの１％のギ酸およびＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析された１０μＬのアリコート中で再構成した。
【００９３】
トリプシン消化について、Ｈｉｓ−Ｐａｖｓａ−Δ４Ｄタンパク質を、ＵＡ緩衝液（８Ｍの尿素、０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５）中で〜１．３μｇ／μＬに希釈した。タンパク質を１００ｍＭのＤＴＴの添加によって還元させ、室温で振盪機上で５０分間インキュベートした。タンパク質抽出物（〜３００μｇに相当）のアリコートをＦＡＳＰにさらした。Ｍｉｇｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９。タンパク質抽出物を、１０ｋＤａのＭＷＣＯフィルタに適用し、２つの２００μＬ容量のＵＡ緩衝液で洗浄して、遠心分離にかけた（２０，８００ｘｇ、１５分）。その後、緩衝液を、２つの連続する洗浄／遠心分離の工程によって、５０ｍＭの（ＮＨ４）ＨＣＯ３、ｐＨ８．０を使用して交換した。その後、１００ｍＭの（ＮＨ４）ＨＣＯ３中１μｇ／μＬの濃度の３０μＬのシーケンシンググレードブタトリプシンを、１０ｋＤａのフィルタ上のタンパク質に加え、湿ったチャンバ内で３７°Ｃで１６時間インキュベートした。その後、それぞれのフィルタを新しい遠心分離管に写し、消化されたペプチドを含む濾液を遠心分離（２０，８００ｘｇ、１０分）後に収集した。フィルタを、２００μＬの１００ｍＭの（ＮＨ４）ＨＣＯ３で洗浄し、濾液を組み合わせて凍結乾燥した。トリプシンペプチドを、３０μＬの１％のギ酸（ＦＡ）およびＬＣ  ＭＳ／ＭＳによって分析された１２のμＬのアリコート中で再撹拌した。
【００９４】
タンパク分解性消化（ペプシンまたはトリプシンのいずれか）されたタンパク質を、ＴｒｉｐｌｅＴＯＦ  ５６００  ＭＳ（ＡＢ  ＳＣＩＥＸ）に直接結合されたナノＨＰＬＣシステム（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｓｃｉ．，  Ｒｙｄａｌｍｅｒｅ，  ＡＵ）を使用して、クロマトグラフ分離（２％−４０％のアセトニトリルからの２％／分の直線勾配）で分析した。Ｃｏｌｇｒａｖｅ  ｅｔ  ａｌ，  ２０１４．を参照。Ｐａｒａｇｏｎアルゴリズムを用いたＰｒｏｔｅｉｎＰｉｌｏｔ（商標）４．０ソフトウェア（ＡＢ  ＳＣＩＥＸ）をタンパク分析に使用した。Ｓｈｉｌｏｖ  ｅｔ  ａｌ，  ２００７。タンデム質量分析データを、特注のデータベースのインシリコでのトリプシン消化に対して探索した。データベース（７６，１１０の配列）は、トランスジェニックタンパク質が追加されたＵｎｉｐｒｏｔ−ＫＢデータベース（ｖ２０１５／１１）のヤガ科およびバキュロウィルスのタンパク質を含み、夾雑タンパク質（外来性のタンパク質の一般的リポジトリとして知られる）のデータベースに対してさらに探索した。検索パラメータを以下のように定義した：（１）消化酵素としてのシステインおよびペプシンへの修飾がない；または、（２）システインアルキル化のために修飾されたヨードアセトアミドおよび消化酵素としてのトリプシン。追加の修飾および切断を前もって定義した。Ｃｏｌｇｒａｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４。データベースの検索結果を手動で精選して、ＰｒｏｔｅｉｎＰｉｌｏｔソフトウェア内の組み込みＦＤＲツールによって決定された１％のグローバル偽発見率（ＦＤＲ）を使用してタンパク質を同定した。Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ７  Ｊ．  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ．  ３６６１  （２００８）。
【００９５】
５μＬの天然の消化性ペプチド（表１８）または還元されアルキル化されたトリプシンペプチド（表１９）のいずれかを、Ｎｅｘｅｒａ  ＵＨＰＬＣ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）でクロマトグラフィー分離し、ＱＴＲＡＰ  ６５００＋質量分析計（ＡＢ  ＳＣＩＥＸ）で分析した。Ｃｏｌｇｒａｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４。各ＭＲＭトランジションの６０秒の検出窓および０．２秒のサイクルタイムを使用して、実験を走査するスケジュールされたＭＲＭを使用して、定量化を達成した。ピークをＭｕｌｔｉＱｕａｎｔ  ｖ３．０（ＡＢ  ＳＣＩＥＸ）を使用して統合し、ここで、検出のために信号対雑音（Ｓ／Ｎ）＞３で、定量化のためにＳ／Ｎ＞５で、３つのトランジションを同じ保持時間（室温、分）で共溶出する必要があった。Ｐａｖｓａ−Δ４Ｄタンパク質の消化性を示すグラフを、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖ６ソフトウェアを用いて生成した。
【００９６】
トリプシンのデータについて、強いピークを産出し、かつ完全にトリプシン性であったペプチド（つまり、異常な切断あるいは未切断がない）を選択するためにＰｒｏｔｅｉｎＰｉｌｏｔソフトウェアによって生成されたペプチド概要（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｕｍｍａｒｉｅｓ）を使用した。ペプシンのデータについて、ＰｒｏｔｅｉｎＰｉｌｏｔによって生成されたペプチド概要を、（ａ）強いピークを産出し、（ｂ）繰り返された消化において一貫して観察され、および（ｃ）３０分および６０分のペプシンを用いたインキュベーションの後に存在したペプチドを選択するために使用した。ペプシンが非特異的のため、これらのペプチド産物の多くが重複していたか、または未切断を含んでいた。ＭＲＭトランジション（表１８および表１９）が各ペプチドについて決定され、前駆イオン（Ｑ１）ｍ／ｚおよびフラグメントイオン（Ｑ３）ｍ／ｚ値が発見実験において収集されたデータから決定された。３つのトランジションを１つのペプチド（ＰａｖｓａΔ４Ｄからの８つのペプチドを有する）ごとに使用し、ここで、３つのＭＲＭのピーク面積を合計した。
【００９７】
アレルゲン性反応は、マスト細胞脱顆粒を誘導するために、タンパク質またはタンパク質の断片が２つのＩｇＥ分子と同時に結合することを必要とする（Ｌａｃｋ  ｅｔ  ａｌ，  ２００２）。このＩｇＥ結合は、１５００〜３５００Ｄａのペプチドサイズに理論的な制限を設ける。特に、ペプシンなどの非特異的酵素を使用する場合は、単一の酵素によるタンパク質の完全な消化を判断するのが難しい。ゲル上またはウエスタンブロット技術によって無傷のタンパク質の消失を判断することは可能であるが、該タンパク質は、一度あるいは複数回加水分解され（一つの部位で切断され）、小さく重複する断片をしばしば産出する。様々な染色または酵素抗体法を使用するゲル分析は、典型的には〜３，０００Ｄａより大きなペプチドを検出することができる。消化の完全性を判断するために単独でゲル分析を使用することは、高レベルの純度を必要とする。抗体を使用する場合、タンパク分解酵素によるタンパク質の加水分解はエピトープの切断をもたらし、それにより、抗体ベースの検出方法を不適切にする。同様に、一つの部位でのタンパク質の切断は、１つの断片だけがエピトープを含むが、別の断片は、該エピトープを含まない２つのタンパク質断片を産出することができる。その例では、大きなタンパク質断片は検出を回避することもある。
【００９８】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳの分析の使用によって、ペプシン消化およびトリプシン消化の両方に起因するペプチド産物を、質的および定量的に決定することができる。ＬＣ−ＭＳ分析は、タンパク質分解性消化によって産生される、タンパク質の長さ全体に及ぶペプチドを同時にモニタリングすることができる。この実施例のように、消化性を分析するための組み合わせたペプシントリプシンアプローチは、腸の通過中にペプシン（胃）酵素およびトリプシン（腸管）酵素の両方に食物タンパク質をさらす典型的な哺乳類の消化器系を模倣する。
【００９９】
沈殿したペレット剤および上清からの総タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価したため、抽出された総Ｐａｖｓａ−Δ４Ｄタンパク質の濃度は〜５．７  ｍｇ／ｍＬと予想された（図２９Ａ）。タンパク質もまたＰＶＤＦ膜に転写し、抗−Ｈｉｓタグ抗体を使用したウエスタンブロットを用いて確認した。Ｈｉｓ−Ｐａｖｓａ−Δ４Ｄ融合タンパク質の予測された分子量（ＭＷ）は、５１ｋＤａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６を参照）である。５０ｋＤａに近い特定のタンパク質バンドがタンパク質ペレット剤中で検出されたが、非常に低レベルが上清中では検出され（図２９Ｂ）、これは、タンパク質沈澱による無傷のタンパク質の良好な回収を示唆している。
【０１００】
図２７Ａに示されるように、ペプシンは、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、およびＬｅｕ（Ｌ）での切断をもたらし、未切断が一般に観察される数百の可能性のあるＰａｖｓａ−Δ４Ｄペプチド断片を結果的にもたらす。ペプシンによって消化されるＰａｖｓａ−Δ４Ｄタンパク質のインシリコ分析では、図３０Ａに示される理論的なペプシンの切断地図を示唆した。この実施例では、６０分間のペプシン消化後も存続するＨｉｓ  Ｐａｖｓａ−Δ４Ｄのペプチド断片は、図３０Ｂに示されるように、非標的ＬＣ  ＭＳ／ＭＳを特徴とした。完全なトリプシンペプチド産物である、ＦＨＶＧＳＬＡＳＴＥＥＰＶＡＡＤＥＧＹＬＱＬＣＡＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７の残基８８−１１２）は、この消化において検出されなかった（代表的な配列包括度が示される）；しかし、このペプチドは代替消化においては検出され、したがって、ＭＲＭ方法に含まれていた。
【０１０１】
トリプシンは比較的特異的であり、消化はＬｙｓ（Ｋ）およびＡｒｇ（Ｒ）での切断をもたらし、結果的に３７つの可能性のあるＰａｖｓａ−Δ４Ｄペプチド切断が生じ、そのうちの２２つがＬＣ−ＭＳ／ＭＳの分析に適した質量範囲にあった。図３０Ｃを参照する。この実施例において、トリプシン消化（１６時間）後に存在するＰａｖｓａ−Δ４Ｄペプチド断片は、図３０Ｄに示されるような非標的ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを特徴とした。
【０１０２】
Ｈｉｓ−Ｐａｖｓａ−Δ４Ｄタンパク質の消化性を評価するために、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）質量分析法（ＭＳ）の使用に基づいて、標的ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ方法を開発した。Ｌａｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ４  Ｍｏｌ．  Ｓｙｓｔ．  Ｂｉｏｌ．  ２２２  （２００８）を参照する。ペプシン消化の時間的経過中の消化性ペプチドの出現および増加の両方を、タンパク質の消化性の証拠として使用した。さらに、ペプシン消化に続くトリプシンペプチドの急速な減少は、タンパク質の消化性を確認するものとして役立った。
【０１０３】
この方法によって定量化するペプチドを選択するために、ペプシン消化およびトリプシン消化の両方に起因する消化産物を特徴付けた。９５％の信頼度で同定され、かつＭＳにおいて強いシグナルをもたらしたペプチドを相対的な定量化のために選択した。Ｈｉｓ−Ｐａｖｓａ−Δ４Ｄタンパク質の長さに及ぶ８つのペプチドをＨｉｓ−Ｐａｖｓａ−Δ４Ｄタンパク質の消化から選択し、表１８および表１９にまとめた。
【０１０４】
【表２０】
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【０１０５】
【表２１】
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【０１０６】
ＳＧＦ中にＨｉｓ−Ｐａｖｓａ−Δ４Ｄの消化性を上記のＬＣ−ＭＲＭ−ＭＳ方法によって評価した。標的消化性ペプチドの特徴付けおよび定量化は、Ｈｉｓ−Ｐａｖｓａ−Δ４Ｄの急速な分解を示した。ペプシン消化データが、時点（０、５、１０、１５、３０、６０分）での１つのペプチド当たりの、最大の検出されたＭＲＭピーク面積（３つのトランジションの合計）の５回繰り返した消化の相対的割合の平均として図３１Ａに示される。
【０１０７】
Ｈｉｓ−ＰａｖｓａΔ４Ｄのペプシン消化後に特徴づけられ、定量化されたペプチドのうち４つは、切断変異体であった（図３１Ａ）。図３１Ａのパネル（Ａ）→（Ｂ）およびパネル（Ｇ）→（Ｈ）における黒色の矢印は、左のパネルに表示されたペプチドがペプシンによってさらに切断されて、右パネル中のペプチドを産出したことを示す。モニタリングされたすべての消化性ペプチドが、急速に（＜１５分）生成され、その多くがこの時間枠で平衡に達した。しかし、ペプシンが比較的非特異的であるため、モニタリングされた消化性ペプチドは、完全に切断された最終産物とならないこともある。場合によっては、ペプチド量の減少が経時的に認められた。例えば、ＰＲＬＡＰＬＶＫＡＥＬ（ａａ  ４０１−４１１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）（図３１（Ｃ））は５分後に減少し、その産物であるＡＰＬＶＫＡＥＬ（ａａ  ４０４−４１１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）は、減少する前に１０分−１５分間増加した。さらに、ＡＰＬＶＫＡＥＬ（ａａ  ４０４−４１１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）は、モニタリングされなかったさらに小さなペプチド断片、例えばＬＶＫＡＥＬ／ＶＫＡＥＬ（ａａ  ４０６  ４１１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）／（ａａ  ４０７  ４１１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）を産出するために、さらに切断され得る。未切断（ペプチド配列中の下線が引かれたフォントによって示される）を含み、したがって、さらなる分解を受けやすいペプシンタンパク質分解産物の他のいくつかの例をモニタリングした（図３１Ａ、パネル（Ａ）、（Ｃ）−（Ｈ））。実際に、１つのＰａｖｓａ−Δ４Ｄペプチド、ＴＲＫＤＶＡＤＲＰＤＬ（ａａ  ２６−３６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）だけが、予測された第２の切断部位を含まない（図３０Ｂ）。消化中のこれらのペプチドの出現は、Ｐａｖｓａ−Δ４Ｄタンパク質の分解、したがって、Ｐａｖｓａ−Δ４Ｄタンパク質の消化性の証拠としてみなされる。モニタリングされた８つのペプチドのうち６つが５分でピークに達した。残りの２つのペプチドは、ペプシン時間経過中の５分までに最大の反応の７０％に達し、３０分までにピークに達した（図３０Ｃ）。これらの２つのペプチドは、無傷のＰａｖｓａΔ４Ｄタンパク質の中央領域に位置した（表１８）。
【０１０８】
消化性ペプチドの急速な増加によって示されるＨｉｓ−Ｐａｖｓａ−Δ４Ｄタンパク質の急速な分解は、ペプシン消化後のトリプシン消化（組み合わせたペプシン・トリプシン消化）におけるトリプシンペプチドの迅速な減少によってさらに示された。ペプシン消化後にモニタリングされたトリプシンペプチドは、最初の５−１０分で急速に減少し、その後、６０分の持続時間実験の残り時間にわたってさらに減少することが示される（図３１Ｂ）。未消化の対照としてのペプシン消化（０分）のないトリプシンペプチドの合計ＭＲＭピーク面積。５、１０、１５、３０、４５、および６０分のペプシンによる消化後、その後、トリプシンによる消化後のトリプシンペプチドの合計ＭＲＭピーク面積を、タンパク質切断の指標としての未消化の対照に対する割合として計算した。トリプシンペプチドの消失に基づいて、タンパク質の＞９３％が６０分後に切断されたと推定される。複数のペプシン切断部位（Ｘ↓Ｘがペプシン切断部位を表す）を含むペプチドは：ＤＶＡＤＲＰＤＬ↓ＴＩＶＧＤＳＶＹ↓ＤＡＫ  （ａａ  ２９  ４７，  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）；ＳＥＨＰＧＧＡＨＦ↓ＶＳＬ↓Ｆ↓ＧＧＲ（ａａ  ２９  ４７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）；ＳＥＨＰＧＧＡＨＦ↓ＶＳＬ↓Ｆ↓ＧＧＲ  （ａａ  ２９  ４７，  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）；ＤＡＴＥＡＦ↓Ｍ↓ＥＹ↓ＨＲ  （ａａ  ６７−７７，  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）；Ｌ↓ＡＰＬ↓ＶＫ  （ａａ  ４０３−４０８，  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）；および、ＨＭ↓Ｙ↓ＡＬ↓ＧＲ  （ａａ  ４３４  ４４０，  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）；であり、ならびに、これらは、未消化の対照の３．０、０．４、０．６、１．２、６．７、および２．８％にそれぞれ減少した（図３１Ｂのパネル（Ａ）−（Ｈ））。この解釈は、ＴｒｉｐｌｅＴＯＦ  ５６００  ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにおける消化されたペプチドの分析によってサポートされ、それは、これらのペプチドがより頻繁に断片化され、３０分−６０分後により小さな断片を産出することを示した。より少数の部位を含むトリプシンペプチド：ＱＭＧＡＳＴＧＶＨＡＧＶＴＤＳＳＡＦ↓ＴＲ（ａａ  ８−２７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）（１つの部位を有する）またはＶＨＨＧＦ↓Ｙ↓ＰＲ（ａａ  ３９５−４０２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）（位置Ｐ３におけるヒスチジンがペプシン切断を妨げることが知られている場合）が、５．８％および５．１％までそれぞれ減少した。観察されたＬＡＰＬＶＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のａａ  ４０３−４０８）のより高い割合は、２つの潜在的ペプシン切断部位（Ｌ１およびＬ４）を含むにもかかわらず、不完全なペプシン消化産物：ＰＲＬＡＰＬＶＫＡＥＬ（ａａ  ４０１−４１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）に関して説明し、６０分で存続することが認められ、従って、断片ＬＡＰＬＶＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のａａ  ４０３−４０８）を産出するためのトリプシン消化に利用可能であり得る。全体として、タンパク質のＮ末端から中央までのペプチドが急速に遊離し、１０分後に＜１５％残っていることが観察された。
【０１０９】
【表２２】
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【０１１０】
６０分の消化後にいくつかのペプチドがまだ残っていたが、わずか１０分以内には、トリプシンペプチドＳＥＨＰＧＧＡＨＦＶＳＬＦＧＧＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のａａ  ２９  ４７）の１％しか残っておらず、無傷のタンパク質の９９％が分解されたことを示した（表２０）。６０分後の低いレベルのいくつかのトリプシンペプチドの存在は、無傷のタンパク質がペプシンによって小さなペプチドへと分解され、これらのペプチドが検知可能であったことを単に示唆する。トリプシンペプチドＳＥＨＰＧＧＡＨＦＶＳＬＦＧＧＲ（ａａ  ２９  ４７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）が６０分後に０．４％まで減少し、本質的に、このペプシン消化時間を超えて残った無傷のタンパク質がなかったことを示した。
【０１１１】
さらに、Ｈｉｓ−タグ−融合タンパク質として発現されるＰａｖｓａ−Δ４Ｄを、抗−Ｈｉｓ−タグ抗体を使用したウエスタンブロットによって分析することができるが、ウエスタンブロット分析は、タンパク質全体ではなく融合領域しかモニタリングできず、これは、Ｈｉｓ−タグが切断される場合に（例えば、ＳＧＦ消化中に）問題がある。加えて、抗−Ｈｉｓ−タグ抗体は、トランスジェニックキャノーラ中の天然Ｐａｖｓａ−Δ４Ｄ（非融合）タンパク質の定量化に適していない。したがって、ＬＣ−ＭＲＭ−ＭＳ分析を使用した代替アプローチを開発し、それは、標的タンパク質の定量化および安定性の両方に適用することができる。本明細書に記載される結果は、ＬＣ  ＭＳアプローチがそのような用途に適していることを示す。この方法は、少なくとも従来のウエスタンブロット同じくらい敏感であり、それは、通常、μｇからｎｇの範囲で検出する：ＬＣ−ＭＲＭ−ＭＳアプローチは、７．８ｆｍｏｌ／ｍｇ（オンカラムで注入）と同じくらい低いＰａｖｓａ−Δ４Ｄレベルを検出し、それは、タンパク質スケールの〜３８５ｐｇに相当する。さらに、ウエスタンブロットはタンパク質の限られた数のエピトープ（１または２）を検出することができるが、本実施形態は、無傷のＰａｖｓａ−Δ４Ｄタンパク質に及ぶ８つのペプチドを標的とし、ゆえに、消化の速度論、およびタンパク質分解へのＰａｖｓａ−Δ４Ｄタンパク質の特定領域の感受性についてのより完全な理解を提供する。５回繰り返したペプシン消化後の濾過工程および洗浄工程のため、この特定のプロトコル中の最も早い実際の時点は５分であった。それにもかかわらず、この例は、タンパク質の消化性の分析にＬＣ  ＭＲＭ−ＭＳの使用を可能にする。
【０１１２】
トランスジェニック、あるいは測定が困難または薄膜関連のω３ＬＣＰＵＦＡ酵素の安定性分析については、ω３ＬＣＰＵＦＡキャノーラにおいて設計された３つのフロントエンドのデサチュラーゼの代表としてＰａｖｓａ−Δ４Ｄタンパク質を使用した。フロントエンドのデサチュラーゼは、既存の二重結合と脂肪酸のカルボキシル末端の間に二重結合を導入する。さらに、フロントエンドのデサチュラーゼはすべて、デサチュラーゼ活性に必要な３つの保存されたヒスチジンモチーフを有するデサチュラーゼドメインと融合したＮ末端にシトクロムｂ５様ドメインを含む。Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７．Δ４−、Δ５−、Δ６−、およびΔ８−デサチュラーゼを含むフロントエンドのデサチュラーゼは、藻類、珪藻、菌類、蘚類、細菌、ならびに植物を含む広範囲の生物中に存在する。これらのフロントエンドのデサチュラーゼのいくつかは、食品または食品生産においても一般的である。この実施例の結果は、完全長のＰａｖｓａ−Δ４Ｄタンパク質の８０％または９９％以上が１０分以内に消化され、および完全長のＰａｖｓａ−Δ４Ｄタンパク質の＞９３％または９９．６％は、ＬＣ  ＭＳ／ＭＳによる分析時に、ペプシンにおけるインキュベーションの６０分以内に消化されたことを示した。組み合わせたペプシントリプシンアッセイは、無傷のタンパク質の存在の代理として使用されたトリプシンペプチドの急速な減少を示した。ＳＧＦ中の完全長のＰａｖｓａΔ４Ｄタンパク質の急速な消化に加えて、Ｐａｖｓａ−Δ４Ｄタンパク質は、トランスジェニックキャノーラ成熟種子に存在する総タンパク質のわずかな部分を表わす。
【０１１３】
＜実施例５＞ピラミモナス・コルダタ（Ｐｙｒａｍｉｍｏｎａｓ  ｃｏｒｄａｔａ）Δ５エロンガーゼ（Ｐｙｒｃｏ−Δ５Ｅ）タンパク質のインビトロでの安定性
この実施例は、トランスジェニックキャノーラのエンジニアリングに含まれる微細藻類脂肪酸エロンガーゼ、Ｐｙｒｃｏ−Δ５Ｅを特徴づけて、ＤＰＡへのＥＰＡの伸長を触媒する（２０：５Δ５、８、１１、１４、１７→２２：５Δ７、１０、１３、１６、１９）。この実施例は、正確な分解／消化の産物をモニタリングするためにＭＳ使用をして、ペプシン−トリプシンアッセイと組み合わせて、ペプシンを含む両方のＳＧＦにおけるこの測定が困難／処理が困難なの薄膜関連タンパク質のインビトロでの安定性を評価する。ペプシン産物の出現および消失、ならびに無傷のタンパク質の代理としてのトリプシンペプチド産物の消失によって、タンパク質消化の程度を評価した。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳの分析の使用によって、ペプシン消化およびトリプシン消化の両方に起因するペプチド産物を初めに質的に決定し、続いて、これらのペプチド断片の検出のために定量的ＬＣ  ＭＳ／ＭＳを開発した。ＬＣ−ＭＳ分析は、タンパク質配列全体に及ぶペプチドを同時にモニタリングすることができ、それはタンパク質分解性消化によって生成される。この実施例における消化性を分析するアプローチは、腸の通過中にペプシン（胃）酵素およびトリプシン（腸管）酵素の両方に食物タンパク質をさらす典型的な哺乳類の消化器系を模倣する。本明細書に記載される結果は、７５％以上のＰｙｒｃｏ−Δ５Ｅタンパク質が５分以内に消化され、完全長のＰｙｒｃｏ−Δ５Ｅタンパク質がペプシンにおけるインキュベーションの６０分以内に急速に消化され、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用した分析時にタンパク質の全長に及ぶ一連のペプシンペプチド産物＜３，０００Ｄａを産生したことを示す。その結果は、この内在性膜タンパク質がペプシンまたはトリプシンにおいて容易に消化可能であったことを示す。完全長のタンパク質の急速な消化は、Ｐｙｒｃｏ−Δ５Ｅがヒトの健康に対する安全性への懸念をもたらす可能性が非常に低いことを示す。
【０１１４】
Ｐｙｒｃｏ−Δ５Ｅ遺伝子を最適化したコドンを、Ｐ．コルダタからクローン化し、実施例４に記載されるアプローチを使用して、Ｓｆ９細胞において発現させた。Ｐｙｒｃｏ−Δ５Ｅタンパク質が、タンパク質のＮ末端で１０のヒスチジン残基（Ｈｉｓ）タグを有する融合タンパク質として、バキュロウィルスに感染したＳｆ９昆虫細胞株で発現された（Ｈｉｓ−Ｐｙｒｃｏ−Δ５Ｅ）。ＧｅｎｅＡｒｔ（１：１００のウイルス希釈で感染し、収穫された感染後４８時間に収集されたＳｆ９９細胞における２Ｌの発現）によって、細胞を成長させ、１００ｍＬ（Ｒｏｃｈｅ）当たり、２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール、５ｍＭのＤＴＴ、５ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＰＭＳＦ、および２つのプロテアーゼ阻害剤錠剤を含んでいる溶解緩衝液（２０ｇの細胞ペレット剤当たり１００ｍＬ）中で解凍された細胞を再撹拌した。該細胞を音波粉砕によって溶解し、細胞の残骸を遠心分離によって除去した。結果として生じた上清を、４°Ｃで２００，０００ｘｇで６０分間遠心分離機にかけて、膜画分を単離した。ペレット剤を、５０ｍＬの２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール、５ｍＭのＤＴＴ、および１０ｍＭのイミダゾール中で再撹拌した。膜画分からＨｉｓ−Ｐｙｒｃｏ−Δ５Ｅを可溶化するために、１％（ｗ／ｖ）のＦｏｓＣｈｏｌｉｎｅ−１６（Ｇｌｙｃｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ＧｍｂＨ）を混合物に加え、４°Ｃで２時間インキュベートした。その後、その混合物を４°Ｃで２００，０００ｘｇで６０分間遠心分離機にかけ、１０ｍＬのＮｉセファロースＦＦ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＡＵ）を上清に加え、スラリーを４°Ｃで夜通し結合させた。結合後、樹脂を空のカラムに注ぎ、結合緩衝液で洗浄した。イミダゾールグラジエントを用いてタンパク質を溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットによって画分を分析した。
【０１１５】
Ｈｉｓ−Ｐｙｒｃｏ−Δ５Ｅを含む画分をプールし、緩衝液を、ＨｉＰｒｅｐ  ２６／１０脱塩カラム（ＧＥ  Ｈｅａｔｈｃａｒｅ、ＡＵ）を使用して、ＭＥＳ緩衝液（２０ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６．０、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール、５ｍＭのＤＴＴ、および０．０１％のＦｏｓＣｈｏｌｉｎｅ−１６）に交換した。サンプルを５ｍＬのＨｉＴｒａｐ  ＳＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＡＵ）上に注入し、ＮａＣｌグラジエントを用いて溶出した。該画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、Ｈｉｓ−Ｐｙｒｃｏ−Δ５Ｅを含む画分をプールし、緩衝液を、ＨｉＰｒｅｐ  ２６／１０カラムを使用して、１０％のグリセロールおよび０．０１％のＦｏｓＣｈｏｌｉｎｅ−１６を含むＰＢＳ緩衝液に交換した。Ｈｉｓ−Ｐｙｒｃｏ−Δ５Ｅを含む該画分を、プールし、１．７ｍｇ／ｍＬに濃縮し、液体窒素中で瞬間冷凍し、−８０°Ｃで保存した。濃縮したタンパク質を、抗Ｈｉｓ  ＨＲＰ複合化抗体（Ａ７０５８、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットによって分析した（図３２）。評価された純度は〜９０％であった。
【０１１６】
抽出後、Ｈｉｓ−Ｐｙｒｃｏ−Δ５Ｅタンパク質溶液を、ＰＢＳ、０．０１％のＦｏｓＣｈｏｌｉｎｅ−１６、および１０％のグリセロール中で１．７ｍｇ／ｍＬに濃縮した。タンパク質抽出物（〜５μｇに相当）のアリコートをＦＡＳＰにさらした。Ｗｉｓｎｉｅｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９。その抽出物を１０ｋＤａ  ＭＷＣＯフィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＡＵ）に適用し、遠心分離（２０，８００ｘｇ、１５分）の前にＵＡ緩衝液（８Ｍの尿素、０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５）で２００μＬに希釈し、および該フィルタを２つの２００μＬ容量のＵＡ緩衝液で洗浄して、遠心分離（２０，８００ｘｇ、１５分）にかけた。該フィルタ上のタンパク質を、ＤＴＴ（５０ｍＭ、１００μＬ）インキュベーションによって、室温で、５０分間還元し、振盪させた。該フィルタを２つの２００μＬ容量のＵＡ緩衝液で洗浄し、遠心分離にかけた（２０，８００ｘｇ、１５分）。システイン残基を、暗所で、室温で、２０分間、ＩＡＭ（５０ｍＭ、１００μＬ）インキュベーションによってアルキル化し、その後、該フィルタを、２つの２００μＬの容量のＵＡ緩衝液で洗浄し、遠心分離にかけた（２０，８００ｘｇ、１５分）。該緩衝液を、２つの連続した洗浄／遠心分離の工程で、５０ｍＭ（ＮＨ４）ＨＣＯ３（ｐＨ８．０）によって交換した。シーケンシンググレードブタトリプシン（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｇｒａｄｅ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｔｒｙｐｓｉｎ  ）（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ａｌｅｘａｎｄｒｉａ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を、１０のｋＤａフィルタ上のタンパク質に加え（５０ｍＭ（ＮＨ４）ＨＣＯ３、１ｍＭのＣａＣｌ２の２００μＬ中の０．５μｇ）、湿ったチャンバにおいて３７°Ｃで１６時間インキュベートした。該フィルタを新しい遠心分離管に移し、および遠心分離（２０，８００ｘｇ、１０分）の後で、濾液（消化されたペプチドを含む）を収集した。該フィルタを２００μＬの１００ｍＭ（ＮＨ４）ＨＣＯ３で洗浄し、濾液を結合して、凍結乾燥した。トリプシンペプチドを５０μＬの１％のギ酸（ＦＡ）中で再撹拌し、２５μＬをＬＣ  ＭＳ／ＭＳシステム上に注入した。
【０１１７】
Ｈｉｓ−Ｐｙｒｃｏ−Δ５Ｅタンパク質抽出物（〜５μｇに相当）のアリコートを、ＦＡＳＰ消化にさらした。タンパク質抽出物を、１０ｋＤａ  ＭＷＣＯフィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に適用し、遠心分離（２０，８００ｘｇ、１５分）の前にＵＡ緩衝液で２００μＬに希釈した。該フィルタ上のタンパク質を、２つの２００μＬ容量のＵＡ緩衝液で洗浄し、遠心分離にかけた（２０，８００ｘｇ、１５分）。該緩衝液を、２つの連続する洗浄／遠心分離の工程によって、５０ｍＭ（ＮＨ４）ＨＣＯ３（ｐＨ８．０）を使用して交換した。２つの連続する洗浄／遠心分離の工程により、酸性化した５０ｍＭ（ＮＨ４）ＨＣＯ３（ｐＨ１．２）で洗浄することによって、ｐＨを調節した。該１０ｋＤａフィルタを新しい遠心分離管に移し、１５μｇペプシン（１５０μＬ、５０ｍＭ（ＮＨ４）ＨＣＯ３中０．１μｇ／μＬ、ｐＨ１．２）を加えて、３：１の酵素対タンパク質の比率を得た。該フィルタを３７℃で１２０分間インキュベートした。濾液（消化されたペプチドを含む）を、遠心分離（２０，８００ｘｇ、１０分）の後で収集した。該フィルタを、２００μＬの１００ｍＭ（ＮＨ４）ＨＣＯ３で洗浄し、濾液を組み合わせ、凍結乾燥し、分析まで２０°Ｃで保存した。結果として生じたペプチドを５０μＬの１％のギ酸中で再構成し、そのうち２５μＬをＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析した。
【０１１８】
タンパク分解性消化された（ペプシンまたはトリプシンのいずれか）Ｈｉｓ−Ｐｙｒｃｏ−Δ５Ｅタンパク質（２５μＬ）を、ＴｒｉｐｌｅＴＯＦ  ５６００  ＭＳ（ＡＢ  ＳＣＩＥＸ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＵＳ）に直接結合されたＮｅｘｅｒａ  ＵＨＰＬＣシステム（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｓｃｉ．，  Ｒｙｄａｌｍｅｒｅ，  ＡＵ）を使用して、クロマトグラフ分離（２％−４０％のアセトニトリルからの０．２３％／分の直線勾配）を用いて分析した。Ｐａｒａｇｏｎアルゴリズム（Ｓｈｉｌｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）を用いたＰｒｏｔｅｉｎＰｉｌｏｔ（商標）４．０ソフトウェア（ＡＢ  ＳＣＩＥＸ）を、タンパク分析に使用した。タンデム質量分析データを、特注のデータベースのインシリコでのトリプシン消化に対して探索した。該データベース（７６，１１０の配列）は、トランスジェニックタンパク質、およびさらに夾雑タンパク質（外来性タンパク質の一般のリポジトリとして知られる）のデータベースを追加した、Ｕｎｉｐｒｏｔ−ＫＢデータベース（ｖ２０１５／１１）のヤガ科およびバキュロウィルスのタンパク質を含んだ。検索パラメータを以下のように定義した：（ａ）消化酵素としてのシステインおよびペプシンへの修飾はない；または（ｂ）システインアルキル化のために修飾されたヨードアセトアミドおよび消化酵素としてのトリプシン。データベースの検索結果を手動で精選して、ＰｒｏｔｅｉｎＰｉｌｏｔソフトウェア内の組み込みＦＤＲツールによって決定された１％のグローバルＦＤＲを使用して、タンパク質を同定した。Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８。
【０１１９】
トリプシンのデータについて、強いピークを産出し、かつ完全にトリプシン性であった（つまり、異常な切断あるいは未切断がない）ペプチドを選択するために、ＰｒｏｔｅｉｎＰｉｌｏｔによって生成されたペプチド概要を使用した。ペプシンのデータについて、ペプシンを用いた１２０分のインキュベーション後に、強いピークを産出したペプチドを選択するためにＰｒｏｔｅｉｎＰｉｌｏｔによって生成されたペプチド概要を使用した。ペプシンが非特異的であるため、これらのペプチド産物の多くが重複していたか、あるいは未切断を含んでいた。ＭＲＭトランジション（表２１−２２）が各ペプチドについて決定され、前駆イオン（Ｑ１）ｍ／ｚおよびフラグメントイオン（Ｑ３）ｍ／ｚ値が収集されたデータから決定された。３つのトランジションをペプチド（８つの消化性ペプチドおよびＨｉｓ−Ｐｙｒｃｏ−Δ５Ｅからの単一のトリプシンペプチドを有する）ごとに使用し、ここで、３つのＭＲＭトランジションのピーク領域を合計した。
【０１２０】
Ｈｉｓ−Ｐｙｒｃｏ−Δ５Ｅタンパク質の安定性をテストするために、２つのテストシステム、ペプシン消化（ＳＧＦを表わす）、および組み合わせたペプシン−トリプシン消化を独立して利用した。ＳＧＦは、酸性ｐＨ１．２に調節された緩衝液中に、タンパク分解酵素ペプシンの高度に精製された形態を含んでいた。消化反応で３：１の酵素：タンパク質の比率になるようにＳＧＦを製剤した。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（本明細書に記載されるような）によって、Ｐｙｒｃｏ−Δ５Ｅタンパク質の消化をモニタリングした。
【０１２１】
ペプシン処理について、タンパク質（６７μＬ、ｎ＝２４（４回繰り返した消化および６つの時点を含む））の６．７μｇのアリコートを、１０ｋＤａ  ＭＷＣＯフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に適用し、遠心分離（２０，８００ｘｇ、１５分）の前に２００μＬのＵＡ緩衝液に希釈した。該フィルタ上のタンパク質を、２００μＬ容量のＵＡ緩衝液で２度洗浄して、遠心分離にかけた（２０，８００ｘｇ、１５分）。該緩衝液を、２つの連続する洗浄／遠心分離の工程によって、５０ｍＭ（ＮＨ４）ＨＣＯ３（ｐＨ８．０）を使用して交換した。２つの連続する洗浄／遠心分離の工程により、酸性化した５０ｍＭ（ＮＨ４）ＨＣＯ３（ｐＨ１．２）で洗浄することによって、ｐＨを下げた。該１０ｋＤａフィルタを新しい遠心分離管に移し、２０μｇペプシン（１５０μＬ、５０ｍＭ（ＮＨ４）ＨＣＯ３中の０．１３３μｇ／μＬ、ｐＨ１．２）を加えて、３：１の酵素：タンパク質の比率を得た。５つの時点（５、１０、１５、３０、または６０分）にわたって、複製された管を３７°Ｃでインキュベートした。ペプシンを０の時点に適用せず、それは、酸加水分解の実験的対照として機能した。ペプシンを不可逆的に不活性化した２００μＬの５０ｍＭ（ＮＨ４）ＨＣＯ３（ｐＨ８．０）の添加によって、消化が止められた。１０ｋＤａフィルタを、直ちに遠心分離機にかけ（２０，８００ｘｇ、１５分）、および消化したペプチドを含む濾液を収集した。該フィルタを、２００μＬの５０ｍＭ（ＮＨ４）ＨＣＯ３（ｐＨ８．０）で２度洗浄し、濾液を組み合わせ、凍結乾燥し、分析されるまで−８０°Ｃの冷凍庫に保存した。消化性ペプチドを、５０μＬの１％のギ酸中で再撹拌し、その後、２０μＬのアリコートを、ＱＴＲＡＰ  ６５００＋  ＬＣ  ＭＳシステム上で実行し、定量化した。
【０１２２】
トリプシン消化について、１０ｋＤａフィルタを新しい遠心分離管に移し、および、遠心分離（２０，８００ｘｇ、１５分）に先立って、残余タンパク質を、４５分間、６００ｒｐｍで、ミキサー上で、２００μＬの５０ｍＭのＤＴＴ、５０ｍＭ（ＮＨ４）ＨＣＯ３、ｐＨ８．５で還元した。該タンパク質を、遠心分離（２０，８００ｘｇ、１５分）に先立って、２０分間、暗所で、２００μＬの５０ｍＭのＩＡＭ、５０ｍＭ（ＮＨ４）ＨＣＯ３、ｐＨ８．５でアルキル化した。該１０ｋＤａフィルタを新しい遠心分離管に移し、０．５μｇのトリプシン（２００μＬ、５０ｍＭ（ＮＨ４）ＨＣＯ３中の２．５μｇ／μＬ、ｐＨ８．５、および１ｍＭのＣａＣｌ２）を加えて、〜１：１５の酵素：タンパク質の比率を得た。複製された管を３７℃で１６時間インキュベートした。該フィルタを遠心分離機にかけ（２０，８００ｘｇ、１５分）、消化したペプチドを含む濾液を取集した。該フィルタを、２００μＬの５０ｍＭ（ＮＨ４）ＨＣＯ３、ｐＨ８．５で２度洗浄し、および、濾液を組み合わせ、凍結乾燥し、分析されるまで−８０°Ｃの冷凍庫に保存した。トリプシンペプチドを５０μＬの１％のギ酸中で再撹拌し、２０μＬのアリコートをＱＴＲＡＰ  ６５００＋  ＬＣ−ＭＳ上で実行し、定量化した。
【０１２３】
２０μＬの天然の消化性ペプチド（表２１）、または還元かつアルキル化されたトリプシンペプチド（表２２）のいずれかを、Ｎｅｘｅｒａ  ＵＨＰＬＣの上でクロマトグラフィー分離し、ＱＴＲＡＰ  ６５００＋質量分析計で分析した。各ＭＲＭトランジションの６０秒の検出窓および０．５秒のサイクルタイムを使用したスケジュールされたＭＲＭ走査実験を使用して、定量化を達成した。検出ために信号対雑音（Ｓ／Ｎ）＞３で、定量化のためにＳ／Ｎ＞５で、３つのトランジションのすべてを同じ保持時間（室温、分）で共溶出する必要があるＭｕｌｔｉＱｕａｎｔ  ｖ３．０を使用してピークを統合した。Ｐｙｒｃｏ−Δ５Ｅタンパク質の消化性を示すグラフを、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖ６ソフトウェアで生成した。
【０１２４】
デュアルペプシン（ｄｕａｌ  ｐｅｐｓｉｎ）について、酸性ｐＨ１．２に調節された緩衝液中のタンパク分解酵素ペプシンによって、ペプシン−トリプシンアッセイ、ＳＧＦを表わした。消化を５、１０、１５、３０、および６０分間実施し、対照としては０分（ペプシンが添加されない）であり、各々を５回繰り返した。標的消化性ペプチドの存在量の増加を、タンパク質の消化性の指標として使用した。ＳＧＦ消化を、同じ時点でペプシン消化のサンプルを収集することにより拡張し、その後、トリプシンを用いた１６時間の消化を行い、組み合わせたペプシン−トリプシン消化として指定した。ペプシン消化なし（０分）、その後、トリプシン消化におけるペプチドの存在量と比較されたトリプシンペプチドの相対存在量を、タンパク質の消化性の指標として使用した。
【０１２５】
抽出された総タンパク質は、１．７ｍｇ／ｍＬであると推定した。精製からの総タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価した（図３２Ａ）。タンパク質もまたＰＶＤＦ膜に移し、抗−Ｈｉｓ１０−タグ抗体を使用したウエスタンブロットを用いて確認した。Ｈｉｓ１０−Ｐｙｒｃｏ−Δ５Ｅの予想された分子量（ＭＷ）は、〜３３．７ｋＤａである。２７ｋＤａに近い特定のタンパク質バンドを検出した（図３２Ｂ）。このバンド上でおよび３０ｋＤａ−１２０ｋＤａにわたって、この領域内に認められるいくつかのかすかなバンドを有するレーンにおいて、明白ないくつかの不鮮明さがあった。これはウエスタンブロットで複製され、該かすかなバンドが３０、４０、５０、および６２ｋＤａの見かけ上の分子量でより明確に見える。しかし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の予測された分子量より低いことは、一般的かつ膜タンパク質でよく実証された現象であり、洗浄液の存在および洗浄液の疎水性領域への結合によって引き起こされる。Ｒａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９。不鮮明さは、洗浄液ミセル中のタンパク質の濃度に対する洗浄液の効果による可能性が最も高く、および、予想されたよりも大きな分子量Ｈｉｓ陽性バンドは、Ｈｉｓ−Ｐｙｒｃｏ−Δ５Ｅのマルチマーの形成による可能性がある。
【０１２６】
タンパク質をＬＣ−ＭＳ／ＭＳの分析によって同定／特徴づけた。識別された５つの主要バンドをゲル中で同定し、ウエスタンブロットを切除し、トリプシンを用いたタンパク質分解の消化にさらした。すべての５つのバンドは、Ｈｉｓ−ＰｙｒｃｏΔ５Ｅ（微量の夾雑タンパク質を含むか、または含まない）を含んでいるため、＞９９％の信頼度で同定された。より高いＭＷバンドは、オリゴマー化（二量体、三量体、六量体）またはタンパク質間の相互作用によることもある。
【０１２７】
概して、膜タンパク質を発現および精製する難しさのために、原核生物系および真核生物系においては、ここで選択されるヒスチジンタグのようなアフィニティータグが一般に使用される。大腸菌などの系から発現されたタンパク質の収率より何倍も少ないが、膜タンパク質の発現に広く使用されているため、昆虫細胞／バキュロウィルス系が選択された。
【０１２８】
ペプシンは比較的非特異的酵素であり、その使用は、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、  Ｔｒｐ（Ｗ）、およびＬｅｕ（Ｌ）での切断をもたらし、未切断が一般に観察される数百の可能性のあるペプチド断片が結果的に生じる。ペプシン消化を用いたＰｙｒｃｏ−Δ５Ｅタンパク質のインシリコでの分析は、図３３Ａに示される理論的なペプシン切断地図を示唆した。この実施例において、１２０分間のペプシン消化後も存続するＨｉｓ−Ｐｙｒｃｏ−Δ５Ｅのペプチド断片は、非標的ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを特徴とした。図２のＢを参照する。
【０１２９】
トリプシンは比較的特異的酵素であり、その使用はＬｙｓ（Ｋ）およびＡｒｇ（Ｒ）での切断をもたらし、２２の可能性のあるペプチド断片が結果的に生じ、そのうち８つはＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析に適した質量範囲にあった。図３３Ｃを参照する。この実施例において、１６時間のトリプシン消化後に存在するペプチド断片は、図３３Ｄに示されるような非標的ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを特徴とした。Ｐｙｒｃｏ−Δ５Ｅ配列内のトリプシン部位の分配のために、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳに適したサイズのトリプシンペプチドがほとんどなかった。さらに、５μｇのタンパク質負荷を使用して、単一の完全なトリプシンペプチドを８５％の信頼度で同定することができた：ＳＱＰＦＬＧＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６の残基６６−７２）。図３３Ｄを参照する。
【０１３０】
ペプチド−スペクトルの一致を、デノボペプチド配列決定によって手動で検証した。６つの可能性のあるｙ−イオン、加えて、２つのｂ−イオンからの６つの存在が、ペプチドが確信的に同定されたことを確認した（図３４）。
【０１３１】
Ｈｉｓ−Ｐｙｒｃｏ−Δ５Ｅタンパク質の消化性を評価するために、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）、質量分析法（ＭＳ）の使用に基づいて標的ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ方法を開発した。ペプシン消化の時間経過中の消化性ペプチドの出現および増加を、タンパク質の消化性の証拠として使用した。さらに、ペプシン消化後のトリプシンペプチドの急速な減少は、タンパク質の消化性を確認するものとして役立った。この方法で定量化するペプチドを選択するために、ペプシン消化およびトリプシン消化の両方に起因する消化産物を特徴付けた。９５％の信頼度で同定され、かつＭＳにおいて強いシグナルをもたらしたペプシン由来のペプチドを、相対的な定量化のために選択した。Ｈｉｓ−Ｐｙｒｃｏ−Δ５Ｅタンパク質のペプシン消化から選択された８つのペプチド、および単一のトリプシンペプチドを表２１−２２にまとめた。選択したペプシン由来のペプチドは、タンパク質の長さに及んだ。
【０１３２】
【表２３】
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【０１３３】
利用可能なタンパク質の不足は、消化プロトコルをより小規模（６．７μｇ充填）に調節することを必要とした。したがって、単一のトリプシンペプチドだけをモニタリングすることができる（図３４、表２２）。
【０１３４】
【表２４】
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【０１３５】
ＳＧＦ中のＨｉｓ−Ｐｙｒｃｏ−Δ５Ｅの消化性を、上記のようなＬＣ−ＭＲＭ−ＭＳ方法によって評価した。標的消化性ペプチドの特徴付けおよび定量化は、Ｐｙｒｃｏ−Δ５Ｅの急速な分解を示した。ペプシン消化データが、時点（０、４、１０、１５、３０、６０分）での１つのペプチド当たりの、最大の検出されたＭＲＭピーク面積（３つのトランジションの合計）の５回繰り返した消化の相対的割合の平均として図３５に示される。
【０１３６】
消化性ペプチドの急速な遊離によって示されるＨｉｓ−Ｐｙｒｃｏ−Δ５Ｅタンパク質の急速な分解を、トリプシン消化（組み合わせたペプシン−トリプシン消化における）後に単一のトリプシンペプチドの減少によってさらに確認した。ペプシン消化後に特徴づけられ、かつ定量化されたペプチドのうち４つは、切断変異体であり（図３５、パネル（Ａ）（Ｄ））、黒色の矢印は、左のパネル中のペプチドがペプシンによってさらに切断されて、右パネル中のペプチドを産出することを示す。モニタリングされたＮ末端の消化性ペプチドが急速に（＜５分）産生され、実験の持続時間にわたって平衡に達した。ペプシンが比較的非特異的であるため、モニタリングされた消化性ペプチドは、完全に切断された最終産物とならないこともある。図３５に表示されたペプシンタンパク質分解産物のすべてが、未切断を含んでおり、したがって、さらなる分解を受けやすい。Ｐ３位置にあるリジン（Ｋ）が、チロシン（Ｙ）の前のさらなる切断を妨げる可能性が高いため、ペプシン消化の最終産物と考えられるかもしれないペプチドは、ＮＶＡＮＰＤＩＰＡＳＥＫＶＰＡＹ（ａａ  ２０−３５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）である（図３５、パネル（Ｂ））。このペプチドは１５分までに平衡プラトーに到達する。消化中のこれらのペプチドの出現は、Ｈｉｓ−Ｐｙｒｃｏ−Δ５Ｅタンパク質分解、したがってＨｉｓ−Ｐｙｒｃｏ−Δ５Ｅタンパク質の消化性の証拠としてみなされる。
【０１３７】
Ｈｉｓ−Ｐｙｒｃｏ−Δ５Ｅタンパク質の場合には、小規模（６．７μｇ充填）消化、さらに、タンパク質配列内のトリプシン部位の分布により、単一のトリプシン産物だけを検出することができ、ＬＣ−ＭＳに適したペプチドをほとんどもたらさなかった。モニタリングされた単一のペプチドであるＳＱＰＦ↓ＧＬ↓Ｋ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６の残基６６−７２）は、２つのペプシン切断部位（矢印によって示されるように）を含んでおり、および、ペプシンがこのペプチドを切断し、ペプシン消化の時間経過にわたってペプチドの存在量の減少をもたらすことが予想された。５分後、ペプチドピーク領域が３倍に増加するが、次の５分にわたって比較的一定のままであり、次の５０分にわたってゆっくり減少することが認められた（図３６）。同様の現象がΔ４Ｄに由来するペプチドで以前に観察され、ここで、ペプシンを用いたタンパク質の５分のインキュベーション後に、トリプシンペプチド（ＷＥＧＥＰＩＳＫ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７の残基２７４−２８１）のピーク領域の２倍の増加が認められた。両方のシナリオは、その天然の立体構造（ｎａｔｉｖｅ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）がトリプシン消化から部分的に保護される、分子の核内に存在するモニタリングされたペプチドから生じると仮定される。ペプシンを用いた短いインキュベーション（５分）後、タンパク質（Ｐｙｒｃｏ−Δ５Ｅ）の３次構造は破壊され、トリプシン部位への完全なアクセス、したがって、その最大のレベルでのトリプシンペプチド（ＳＱＰＦＧＬＫ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のａａ  ６６−７２）の遊離を可能にする（図３６）。Ｐｙｒｃｏ−Δ５Ｅタンパク質に由来する検出可能なトリプシンペプチドの不在は、Δ４−デサチュラーゼおよびω３−デサチュラーゼについて本明細書で決定されるような分解の最終的な割合（表Ｂ）の決定を妨げたが、ペプシン産物の出現（図３５）は、実験の時間経過にわたってＰｙｒｃｏ−Δ５Ｅタンパク質がペプシンによって消化され、Ｎ末端領域の＞７５％の切断が＜５分で達成されたことを示した（図３５Ａ−Ｂ）。
【０１３８】
【表２５】
2020513100.tif 000028
【０１３９】
Ｐｙｒｃｏ−Δ５Ｅは内在性膜タンパク質である。現在、ω３ＬＣＰＵＦＡキャノーラ中のトランスジェニックタンパク質の含有量の定量化、または天然タンパク質としてのＰｙｒｃｏ−Δ５Ｅの安定性の検出に利用可能なウエスタンブロット分析のための機能的な抗体が存在しない。ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  Ｎ．Ｊ．，  ＵＳ）によって商業的に産生されたポリ抗体およびモノクローナル抗体は、ＰｙｒｃｏΔ５Ｅへの特定のシグナルを生成しなかった。該抗体は、抗原の潜在的エピトープとして予測された合成ペプチドに対して産生された（図３７）。
【０１４０】
Ｈｉｓ−タグ融合タンパク質として発現されるＰｙｒｃｏ−Δ５Ｅを、抗−Ｈｉｓ−タグ抗体を使用したウエスタンブロットによって分析することができるが、そのような分析は、タンパク質全体ではなく融合領域しかモニタリングすることができず、これは、Ｈｉｓ−タグが切断されると（例えば、ＳＧＦ消化中に）問題が残る。加えて、抗−Ｈｉｓ−タグ抗体は、ω３ＬＣＰＵＦＡキャノーラ中の天然Ｐｙｒｃｏ−Δ５Ｅ（非融合）タンパク質の定量化に適していない。したがって、ＬＣ−ＭＲＭ−ＭＳ分析を使用した代替アプローチが本明細書に記載されるように開発され、それは、発現された標的タンパク質の定量化および標的タンパク質の安定性アッセイの両方に適用することができる。これらの結果は、ＬＣ−ＭＳアプローチがそのような適用に適していることを示す。この方法は、通常、μｇからｎｇスケールでタンパク質を検出することができる従来のウエスタンブロットと同じくらい敏感である。これに対して、使用されたＬＣ−ＭＲＭ−ＭＳアプローチは、２．４４ｐｇのタンパク質に相当する７．８０ｆｍｏｌ／ｍｇ（オンカラムに注入）と同じくらい低い検出されたＰｙｒｃｏ−Δ５Ｅレベルを示した。加えて、抗体を使用するウエスタンブロットは、標的タンパク質から限られた数のエピトープ（１または２）を検出するだけかもしれない。これに対して、無傷のタンパク質に及ぶ８つのペプチドを標的とした本明細書に記載される方法は、消化の速度論およびタンパク質分解に対するタンパク質の特定領域の感受性についての理解を提供する。ペプシン消化を４回繰り返した後の濾過工程および洗浄工程に含まれる技術的困難により、最も早い実際の時点は５分であった。しかし、その結果は、タンパク質の消化性の分析へのＬＣ−ＭＲＭ−ＭＳ適用の成功を示している。
【０１４１】
Ｐｙｒｃｏ−Δ５Ｅタンパク質は、脂肪酸のカルボキシル末端に炭素を導入する微細藻類脂肪酸エロンガーゼのサブファミリーに属する。この実施例で提示された消化分析のためのＰｙｒｃｏ−Δ５Ｅタンパク質は、２つの微細藻類脂肪酸エロンガーゼの代表であり、両方は測定が困難な膜関連タンパク質であり、ω３ＬＣＰＵＦＡキャノーラに設計される。微細藻類脂肪酸エロンガーゼは、Δ５−、Δ６−、およびΔ９−エロンガーゼを含み、藻類、珪藻、菌類、蘚類、ならびに細菌を含む広範囲の生物中に存在する。必要な基質が添加される場合、粗抽出液中でデサチュラーゼ活性を分析したが（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２５２  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ５１３−１９  （１９９８））、ＤＨＡキャノーラではそれがはるかに困難であり、なぜなら、キャノーラ種子中に発現された複数のデサチュラーゼおよびエロンガーゼが存在し、かつ種子中のトランスジェニックタンパク質のレベルが非常に低かったためである。例えば、Ｐｙｒｃｏ−Δ５Ｅは成熟種子中のｍｇ総タンパク質当たり４０９ｎｇで発現され、１ｇの種子から抽出された総タンパク質はわずか２．７８ｍｇであった。
【０１４２】
この実施例の結果は、実験の時間経過にわたってＨｉｓ−Ｐｙｒｃｏ−Δ５Ｅタンパク質が急速に消化され、Ｎ末端領域の＞７５％の切断が＜５分で達成されたことを示す。ペプシンインキュベーションの６０分以内に、ペプチド配列全体に及ぶ一連のペプシン産物＜３，０００Ｄａが産生された。ＳＧＦ中の完全長のＨｉｓ−Ｐｙｒｃｏ−Δ５Ｅタンパク質の急速な消化に加えて、Ｐｙｒｃｏ−Δ５Ｅタンパク質は、ω３ＬＣＰＵＦＡキャノーラ成熟種子の中に存在する総タンパク質のわずかな部分を表わした。急速な消化および低い発現レベルは、Ｐｙｒｃｏ−Δ５Ｅタンパク質のタンパク質の安全性を示す多くの要因のうちの２つである。
【０１４３】
＜実施例６＞ピキア・パストリス（  Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ）ω３−／Δ１５−デサチュラーゼ（Ｐｉｃｐａ−ω３Ｄ）タンパク質のインビトロでの安定性
この特定の実施例は、αリノール酸ＡＬＡへのリノール酸ＬＡの脱飽和を触媒するために、ω３ＬＣＰＵＦＡキャノーラのエンジニアリングに使用された経路（Ｐ．  ｐａｓｔｏｒｉａ  ω３−／Δ１５−デサチュラーゼ（Ｐｉｃｐａ−ω３Ｄ）タンパク質）の代表的な酵母アシル−ＣｏＡタイプの脂肪酸デサチュラーゼに焦点を当てる（１８：２Δ９、１２→１８：３Δ９、１２、１５）。
【０１４４】
この実施例は、正確な分解産物をモニタリングするために、最先端の質量分析アプローチを利用した新規なペプシン−トリプシンアッセイと組み合わせて、タンパク分解酵素（ペプシン）を含むＳＧＦをピキアｐａｓｔｏｒｉｓω３−／Δ１５−デサチュラーゼ（Ｐｉｃｐａ−ω３Ｄ）タンパク質のインビトロでの安定性を評価する。ペプシン産物の出現および、ならびに（無傷のタンパク質の代理としての）トリプシンペプチド産物の消失によって、タンパク質消化の程度を評価した。実施例は、ＬＣ  ＭＳ／ＭＳを使用して決定されるように、５分以内に＞８０％が消化され、および完全長のＰｉｃｐａ−ω３Ｄタンパク質の９７％がペプシンにおけるインキュベーションの６０分以内に消化されたこと；または、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用して分析されるように、完全長のＰｉｃｐａ−ω３Ｄタンパク質の９８．７％が５分以内に消化され、完全長のＰｉｃｐａ−ω３Ｄタンパク質の９９．５％がペプシンにおけるインキュベーションの６０分以内に消化されたことを示し；ならびに、内在性膜タンパク質Ｐｉｃｐａ−ω３Ｄがペプシンまたはトリプシンにおいて容易に消化可能であったことを示す。
【０１４５】
ＤＨＡキャノーラにおいて使用されるω３−／Δ１５−デサチュラーゼ遺伝子を、藻類Ｐ．  ｐａｓｔｏｒｉａ（例えば、ＷＯ２０１０／０５７２４６参照）からクローン化した。Ｐｉｃｐａ−ω３Ｄタンパク質が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を有する融合タンパク質、その後、タンパク質（Ｈｉｓ−ＧＦＰ−Ｐｉｃｐａ−ω３Ｄ）のＮ末端に８つのヒスチジン残基（８ｘＨｉｓ）を有する融合タンパク質として大腸菌Ｃ４１株において発現され、その後、精製された。ベクターは、Ｈｉｓ−タグ（Ｈｉｓ）をコード化するコード配列およびコドン最適化Ｐｉｃｐａ−ω３Ｄ遺伝子に融合したＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）切断部位（ＳＬＥＶＬＦＱ↓ＧＰ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）を含んでいた。
【０１４６】
タンパク質抽出について、ω３Ｄのタンパク質に形質転換された大腸菌Ｃ４１細胞を０．８のＯＤ６００に成長させ、およびタンパク質発現を４時間、３７°Ｃで０．５ｍＭのＩＰＴＧで誘発した。その後、細胞をスピンダウンし、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．６、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール、２ｍＭのＭｇＣｌ２、１５０ｍＬ（Ｒｏｃｈｅ）当たり３つのＵｌｔｒａ完全プロテアーゼ阻害剤錠剤、１ｍＭのＰＭＳＦ、１ｍＭのＤＴＴ、および１２００ユニットのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を含む溶解緩衝液（６０ｇの細胞ペースト当たり１５０ｍＬ）を再撹拌した。細胞を、１５，０００ｐｓｉでの３回の通過によって、ＥｍｕｌｓｉＦｌｅｘＣ５細胞破砕機（Ａｖｅｓｔｉｎ）を使用して溶解した。溶解後、細胞残屑を遠心分離によって除去し、その後、上清を４°Ｃで００，０００のｘｇで９０分間さらに遠心分離機にかけて、膜画分を単離した。膜ペレット剤を、５０ｍＬのＨＮＧ緩衝液（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール、ｐＨ７．６）中で再撹拌した。膜画分からＨｉｓ−ＧＦＰ−Ｐｉｃｐａ−ω３Ｄを可溶化するために、１％（ｗ／ｖ）のＦｏｓＣｈｏｌｉｎｅ１６（Ｇｌｙｃｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ＧｍｂＨ）を加え、混合物を４°Ｃで３時間インキュベートした。その後、その混合物を４°Ｃで２００，０００のｘｇで４５分間遠心分離機にかけ、および１０ｍＭのイミダゾールおよび１ｍＭのＤＴＴの存在下において、５ｍＬのＨｉｓＴｒａｐ  ＦＦカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  ＡＵ）に上清を負荷した。イミダゾールグラジエントを用いてタンパク質を溶出した。ウエスタンブロットを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥによって画分を分析した。Ｈｉｓ−ＧＦＰ−Ｐｉｃｐａ−ω３Ｄ融合タンパク質を含む画分をプールし、１００ｋＤａのＭＷＣＯの濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して２．５ｍＬに濃縮した。０．０１％のＦｏｓＣｈｏｌｉｎｅ−１６および１ｍＭのＤＴＴの存在下において、濃縮サンプルを、ＨＮＧ緩衝液中で平衡したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００  １６／６０ｐｇゲル濾過カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に注入した。精製したＨｉｓ−ＧＦＰ−Ｐｉｃｐａω３Ｄタンパク質を含む画分を、プールし、１．３ｍｇ／ｍＬに濃縮し、液体窒素中で急速冷凍し、−８０°Ｃで保存した。濃縮したタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗−Ｈｉｓ−ＨＲＰ共役抗体（Ａ７０５８、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用したウエスタンブロットによって分析した（図３８を参照）。推定された純度は〜９０％であった。
【０１４７】
ペプシン消化に続くＬＣ−ＭＳ／ＭＳについて、Ｈｉｓ−ＧＦＰ−Ｐｉｃｐａ−ω３Ｄタンパク質を、ＵＡ緩衝液（８Ｍの尿素、０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５）中で〜０．１２５μｇ／μＬに希釈した。タンパク質抽出物（〜２５μｇに相当）のアリコートをＦＡＳＰにさらした。Ｗｉｓｎｉｅｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９。タンパク質抽出物を、１０ｋＤａのＭＷＣＯフィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に適用し、２つの２００μＬ容量のＵＡ緩衝液で洗浄し、遠心分離にかけた（２０，８００ｘｇ、１５分）。フィルタに保持されたタンパク質を、室温で５０分間インキュベートすることによって、ＤＴＴ（５０ｍＭ、２００μＬ）で還元し、振盪させた。該フィルタを、２００μＬのＵＡ緩衝液で２度洗浄して、遠心分離にかけた（２０，８００ｘｇ、１５分）。その後、システイン残基を、ＩＡＭ（５０ｍＭ、１００μＬ）でアルキル化し、暗所で室温で４０分間インキュベートした。該フィルタを、２００μＬのＵＡ緩衝液で２度洗浄し、遠心分離にかけた（２０，８００のｘｇ、１５分）。緩衝液交換では、５０ｍＭ（ＮＨ４）ＨＣＯ３（ｐＨ８．０）および２つの連続する洗浄／遠心分離の工程を使用した。０．０１  μｇ／μＬの濃縮におけるシーケンシンググレードブタトリプシン（２００μＬの１ｍＭのＣａＣｌ２を有する５０ｍＭ（ＮＨ４）ＨＣＯ３中の２μｇ）を、１０ｋＤａのフィルタ上のタンパク質に加え、湿ったチャンバにおいて３７°Ｃで１６時間インキュベートした。該フィルタを新しい遠心分離管に移し、および濾液（消化されたペプチド）を遠心分離（２０，８００ｘｇ、１０分）後に収集した。該フィルタを、２００μＬの１００ｍＭ（ＮＨ４）ＨＣＯ３で洗浄し、濾液を組み合わせ、凍結乾燥した。トリプシンペプチドを５０μＬの１％のギ酸中で再撹拌し、１０μＬをＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステム上で注入した。
【０１４８】
さらにＬＣ−ＭＳ／ＭＳに関して、タンパク分解性消化（ペプシンまたはトリプシンのいずれか）されたタンパク質を、ＴｒｉｐｌｅＴＯＦ  ５６００  ＭＳ（ＡＢ  ＳＣＩＥＸ，  Ｒｅｄｗｏｏｄ  Ｃｉｔｙ，  Ｃａｌｉｆ．，  ＵＳ）に直接結合されたナノＨＰＬＣシステム（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｒｙｄａｌｍｅｒｅ，  Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を使用して、クロマトグラフ分離（２％−４０％のアセトニトリルからの２％／分の直線勾配）で上記のように分析した。Ｐａｒａｇｏｎアルゴリズムを用いるＰｒｏｔｅｉｎＰｉｌｏｔ（商標）４．０ソフトウェア（ＡＢ  ＳＣＩＥＸ）を、タンパク質の同定に使用した。Ｓｈｉｌｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７。タンデム質量分析データを、特注のデータベースのインシリコでのトリプシン消化に対して探索した。該データベース（５７，６５２の配列）は、トランスジェニックタンパク質、さらに夾雑タンパク質（外来性タンパク質の一般のリポジトリとして知られる）のデータベースを追加した、Ｕｎｉｐｒｏｔ−ＫＢデータベース（バージョン２０１６／０２）の大腸菌タンパク質を含んだ。検索パラメータを以下のように定義した：（ａ）消化酵素としてのシステインおよびペプシンへの修飾はない；または（ｂ）システインアルキル化のために修飾されたヨードアセトアミドおよび消化酵素としてのトリプシン。追加の修飾および切断をあらかじめ定義した。データベースの検索結果を手動で精選して、ＰｒｏｔｅｉｎＰｉｌｏｔソフトウェア内の組み込みＦＤＲツールによって決定された１％のグローバル偽発見率（ＦＤＲ）を使用して、タンパク質を同定した。Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８。
【０１４９】
トリプシンのデータについて、強いピークを産出し、かつ完全にトリプシン性であった（つまり、異常な切断あるいは未切断がない）ペプチドを選択するために、ＰｒｏｔｅｉｎＰｉｌｏｔによって生成されたペプチド概要を使用した。ペプシンのデータについて、ペプシンを用いた１２０分のインキュベーション後に、強いピークを産出したペプチドを選択するためにＰｒｏｔｅｉｎＰｉｌｏｔによって生成されたペプチド概要を使用した。ペプシンが非特異的であるため、これらのペプチド産物の多くが重複していたか、あるいは未切断を含んでいた。ＭＲＭトランジション（表２３−表２４）が各ペプチドについて決定され、前駆イオン（Ｑ１）ｍ／ｚおよびフラグメントイオン（Ｑ３）ｍ／ｚ値が発見実験において収集されたデータから決定された。３つのトランジションをペプチド（Ｈｉｓ−ＧＦＰ−Ｐｉｃｐａ−ω３Ｄからの１１の消化性および８つのトリプシンペプチドを有する）ごとに使用し、３つのＭＲＭトランジションのピーク領域を合計した。
【０１５０】
Ｈｉｓ−ＧＦＰ−Ｐｉｃｐａ−ω３Ｄタンパク質の安定性をテストするために、２つのテストシステム、ペプシン消化（人工胃液（ＳＧＦ）を表す）、および組み合わせたペプシン−トリプシン消化を独立して利用した。ＳＧＦは、ペプシンの高度に精製された形態を使用して、酸性ｐＨ１．２に調節された緩衝液中にタンパク分解酵素ペプシンを含んでいた。消化反応で３：１の酵素：タンパク質の比率になるようにＳＧＦを製剤した。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（本明細書に記載されるような）によって、Ｐｉｃｐａ−ω３Ｄ  タンパク質の消化をモニタリングした。
【０１５１】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳの分析の使用によって、ペプシン消化およびトリプシン消化の両方に起因するペプチド産物を初めに質的に決定し、続いて、これらのペプチド断片の検出のために定量的ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを開発した。ＬＣ−ＭＳ分析は、タンパク質配列全体に及ぶペプチドを同時にモニタリングすることができ、それはタンパク質分解性消化によって生成される。この実施例における消化性を分析するアプローチは、腸の通過中にペプシン（胃）酵素およびトリプシン（腸管）酵素の両方に食物タンパク質をさらす典型的な哺乳類の消化器系を模倣することができる。
【０１５２】
ペプシン消化について、２５μｇのタンパク質（５８．４μＬ、ｎ＝３０（５回繰り返した消化および６つの時点を含む））を、１０ｋＤａの分画分子量フィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，  Ａｕｓｔｒａｌｉａ）に適用し、２００μＬ容量のＵＡ緩衝液で２度洗浄して、遠心分離にかけた（２０，８００ｘｇ、１５分）。該緩衝液を、２つの連続する洗浄／遠心分離の工程によって、５０ｍＭ（ＮＨ４）ＨＣＯ３（ｐＨ８．０）を使用して交換した。２つの連続する洗浄／遠心分離の工程により、酸性化した５０ｍＭ（ＮＨ４）ＨＣＯ３（ｐＨ１．２）で洗浄することによって、ｐＨを調節した。消化緩衝液のｐＨをｐＨ１．５−ｐＨ２．５にするために、ＨＣｌ、酢酸、またはクエン酸などの多くの酸を使用した。該１０ｋＤａフィルタを新しい遠心分離管に移し、８４μｇのペプシン（１５０μＬ、５０ｍＭ（ＮＨ４）ＨＣＯ３中の０．５６２  μｇ／ｍＬ  、ｐＨ１．２）を加えて、３：１の酵素対タンパク質の比率を得た。５つの時点（５、１０、１５、３０、６０分）にわたって、複製された管を３７°Ｃでインキュベートした。ペプシンを０の時点に適用せず、それは、酸加水分解の実験的対照として機能した。酵素を不可逆的に不活性化した２００μＬの５０ｍＭ（ＮＨ４）ＨＣＯ３（ｐＨ８．０）の添加によって消化を止めた。１０ｋＤａフィルタを、直ちに遠心分離機にかけ（２０，８００ｘｇ、１５分）、および消化したペプチドを含む濾液を収集した。該フィルタを、２００μＬの５０ｍＭ（ＮＨ４）ＨＣＯ３で、ｐＨ８．０で２度洗浄し、および、濾液を組み合わせ、凍結乾燥し、さらなる分析まで−８０°Ｃの冷凍庫に保存した。Ｃ−ＭＳについて、消化性ペプチドを、５０μＬの１％のギ酸中で再撹拌し、３μＬのアリコートを、ＱＴＲＡＰ  ６５００＋  ＬＣ  ＭＳシステム上で実行し、定量化した。
【０１５３】
トリプシン消化について、１０ｋＤａフィルタを新しい遠心分離管に移し、および、遠心分離（２０，８００ｘｇ、１５分）に先立って、残余タンパク質を、４５分間、６００ｒｐｍで、ミキサー上で、２００μＬの５０ｍＭのＤＴＴ、５０ｍＭ（ＮＨ４）ＨＣＯ３（ｐＨ８．５）で還元した。該タンパク質を、遠心分離（２０，８００ｘｇ、１５分）に先立って、２０分間、暗所で、２００μＬの５０ｍＭのヨードアセトアミド（ＩＡＭ）、５０ｍＭ（ＮＨ４）ＨＣＯ３）、ｐＨ８．５でアルキル化した。該１０ｋＤａのフィルタを新しい遠心分離管に移し、２μｇのトリプシン（２００μＬ、５０ｍＭ（ＮＨ４）ＨＣＯ３中の０．０１μｇ／ｍＬ、ｐＨ８．５、および１ｍＭのＣａＣｌ２）を加えて、１：１５の酵素：タンパク質の比率を得た。複製された管を３７℃で１６時間インキュベートした。該フィルタを遠心分離機にかけ（２０，８００ｘｇ、１５分）、消化したペプチドを含む濾液を取集した。該フィルタを、２００μＬの５０ｍＭ（ＮＨ４）ＨＣＯ３で、ｐＨ８．５で２度洗浄し、および、濾液を組み合わせ、凍結乾燥し、さらなる分析まで−８０°Ｃの冷凍庫に保存した。ＬＣ−ＭＳについて、トリプシンペプチドを５０μＬの１％のギ酸中で再撹拌し、３μＬのアリコートを、ＱＴＲＡＰ  ６５００＋  ＬＣ  ＭＳシステム上で実行し、定量化した。
【０１５４】
消化産物のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ定量化について、３μＬの天然の消化性ペプチド（表２３）、または還元かつアルキル化されたトリプシンペプチド（表２４）のいずれかを、Ｎｅｘｅｒａ  ＵＨＰＬＣ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）でクロマトグラフ分離し、ＱＴＲＡＰ  ６５００＋質量分析計（ＡＢ  ＳＣＩＥＸ）で分析した。各ＭＲＭトランジションの６０秒の検出窓および０．３秒のサイクルタイムを使用したスケジュールされたＭＲＭ走査実験を使用して、定量化を達成した。検出のために信号対雑音（Ｓ／Ｎ）＞３で、定量化のためにＳ／Ｎ＞５で、３つのトランジションを同じ保持時間（室温、分）で共溶出する必要がある、ＭｕｌｔｉＱｕａｎｔ  ｖ３．０（ＡＢ  ＳＣＩＥＸ）を使用してピークを統合した。Ｐｉｃｐａ−ω３Ｄタンパク質の消化性を示すグラフを、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖ６ソフトウェアを用いて生成した。
【０１５５】
ペプシンは胃中で産生されるプロテアーゼであり、芳香族フェニルアラニンおよび疎水性アミノ酸フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ならびにロイシンに隣接しているペプチド結合を切断するのに効率的である（図２７Ｂ）。Ｐ３位置でのヒスチジン、リジン、およびアルギニンはタンパク質分解を妨げるように作用する一方、Ｐ３またはＰ４の位置でのプロリンはタンパク質分解を促進する。ペプシンのみを用いた消化に際して、起こり得る多くのシナリオが存在する（図２８Ａを参照）。最も単純なものは、タンパク質が急速に消化されて、完全にペプシン断片を産生する場合であり、ここで、反応が急速に増加し、最大値に達して、プラトー（黒丸）を作成する。第２のものは、実験の持続時間内にプラトーに到達しない遅い消化に関与する（黒三角形）。このシナリオは、ＬＣ−ＭＳがペプチド反応（ペプチドピーク強度または領域）をモニタリングするので、完全性を判断するのが難しい。第３のものは、ペプチド反応中のプラトーによって判断されるように完全であるように見える場合もある、急速だが不完全な消化に関与する（白丸）。最後に、遅くかつ不完全な消化を観察することができる（白三角形）。これらの理由で、ペプシンタンパク質分解の断片を調べることは、タンパク質の消化のモニタリングを可能にするが、分解が完了したか否かを判断するのは困難である。
【０１５６】
ペプシンポストトリプシンを利用することによって（図２８Ｂを参照）、実験の対照（時間０、添加されたペプシンなし）との比較によって消化の完全性を判断することが可能であり、ここで、遊離したトリプシンペプチドが最大値で（ＭＲＭピーク面積としてのこの場合では）現われる。トリプシンは消化器系中に見られるセリンプロテアーゼである。トリプシンは、塩基性アミノ酸リジンまたはアルギニンのカルボキシル側でポリペプチド鎖を切断するが、その切断は、前述のアミノ酸（Ｐ１’位置、図２７Ａ）としてのプロリンの存在によって妨げられる。タンパク質が消化されない場合、ペプチド反応の減少が観察されない（丸、破線）。タンパク質が部分的に消化される場合、ペプチド反応の部分的な減少が観察される（正方形、点線）。タンパク質が完全に消化される場合、ペプチド反応は実験持続時間内に０まで減少する（三角形、実線）。
【０１５７】
したがって、この消化性のアッセイについては、２つの酵素を使用した：ペプシンおよびトリプシン。トリプシンペプチド産物は、無傷のタンパク質の代理として使用され、それによって、ペプシンの不在下において、存在するトリプシンペプチドの量は存在するタンパク質の１００％と同等であった。ペプシン（消化中の様々な時点での）の存在下において、トリプシンペプチドのレベルが、ペプシン切断部位を含むペプチドについて減少すると予想される。このように、タンパク質の完全な分解をモニタリングした。
【０１５８】
ＳＧＦは酸性のｐＨ１．２に調節された緩衝液中のタンパク分解酵素ペプシンによって表された。消化を５、１０、１５、３０、および６０分間実施し、対照としては０分（ペプシンが添加されない）であり、各々を５回繰り返した。５回繰り返した濾過および洗浄に関与する困難により、早い実際の時点はペプシンの添加から５分後であった。標的消化性ペプチドの存在量の増加を、タンパク質の消化性の指標として使用した。ＳＧＦ消化を、上記のような同じ時点でのペプシン消化によってさらに拡張し、その後、トリプシンを用いた１６時間の消化を行い、「組み合わせたペプシン−トリプシン消化」として指定した。ペプシン消化なし（０分、ペプシンなし）、その後のトリプシン消化における同じペプチドの存在量と比較したトリプシンペプチドの相対存在量を、タンパク質の消化性の指標として使用した。
【０１５９】
Ｈｉｓ−ＧＦＰ−Ｐｉｃｐａ−ω３Ｄ融合タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットによって決定されるような５０ｋＤａおよび６０ｋＤａの見かけ上の分子量を有する二重線として電気泳動中に実行された。しかし、Ｈｉｓ−ＧＦＰ−Ｐｉｃｐａ−ω３Ｄ融合構築物の予測された分子量は７６．４ｋＤａであるが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の予測された見かけ上の分子量より低いことは、洗浄液の存在および洗浄液の疎水性領域への結合によって引き起こされる膜タンパク質の一般的かつ十分に立証された現象である。Ｒａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９．加えて、２本の別個のバンド（図３８、Ｈｉｓ−ＧＦＰ−Ｐｉｃｐａ−ω３Ｄ）の存在は、融合でＧＦＰが（部分的に）折り重ねられたままである集団であるために、ＧＦＰが完全に変性される集団（上部バンド）よりも速く遊走させることもある（下部バンド）。Ｇｅｅｒｔｓｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  １０５  ＰＮＡＳ  ５７２２  （２００８）．Ｈｉｓ−ＧＦＰ−Ｐｉｃｐａ−ω３ＤのＣ末端の部分的なタンパク質分解は、観察された二重線の他の説明を提供することができるが、この場合、このより低い潜在的に切断されたバンドが微量な夾雑物にすぎないことはクーマシー染色ゲルから明らかである。抽出された総タンパク質は〜１．３ｍｇ／ｍＬであると推測された。
【０１６０】
タンパク質もまた、トリプシンおよびペプシンの両方を使用して、タンパク質分解性消化後にＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析によって同定／特徴づけた。一般に、原核生物系または真核生物系で膜タンパク質を発現することが困難であるため、戦略は、精製を援助するために加えられたＨｉｓ−タグを有する大腸菌中のＧＦＰ融合として、Ｐｉｃｐａ−ω３Ｄを発現することであった。ＧＦＰは、可溶性発現の融合パートナーとして広く使用され、その蛍光をモニタリングすることによってタンパク質の発現を追跡することができる。融合パートナー（Ｈｉｓ−ＧＦＰ）の存在は、Ｈｉｓ−ＧＦＰ−Ｐｉｃｐａ−ω３Ｄタンパク質のタンパク質分解およびＬＣ−ＭＳの特徴付けに影響を与える可能性が低く、混合物中の夾雑タンパク質の存在も影響を与える可能性が低い。
【０１６１】
上で認められるように、ペプシンは比較的非特異的酵素であり、その使用は、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、  Ｔｒｐ（Ｗ）、およびＬｅｕ（Ｌ）での切断をもたらし、未切断が一般に観察される数百の可能性のあるペプチド断片が結果的に生じる。ペプシン消化を用いた天然Ｐｉｃｐａ  ω３Ｄタンパク質のインシリコでの分析は、図３９Ａに示される理論的なペプシン切断地図を示唆した。この実施例では、１２０分間のペプシン消化後も存続するＰｉｃｐａ−ω３Ｄのペプチド断片は、図３９Ｂに示されるように、非標的ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを特徴とした。
【０１６２】
これに対して、トリプシンは比較的特異的酵素であり、その使用はＬｙｓ（Ｋ）およびＡｒｇ（Ｒ）での切断をもたらし、３６の可能性のあるペプチド断片（図３９Ｃ）が結果的に生じ、そのうちの２０はＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析に適した質量範囲にあった。この実施例において、１６時間のトリプシン消化後に存在するペプチド断片は、図３９Ｄに示されるような非標的ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを特徴とした。
【０１６３】
Ｐｉｃｐａ−ω３Ｄタンパク質の消化性を評価するために、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）（Ｌａｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）質量分析法（ＭＳ）の使用に基づいた標的ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ方法を開発した。ペプシン消化の時間経過中の消化性ペプチドの出現および増加を、タンパク質の消化性の証拠として使用した。さらに、ペプシン消化に続くトリプシンペプチドの急速な減少は、タンパク質の消化性を確認するものとして役立った。
【０１６４】
この方法で定量化するペプチドを選択するために、ペプシン消化およびトリプシン消化の両方に起因する消化産物を最初に特徴付けた。９５％の信頼度で同定され、かつＭＳにおいて強いシグナルをもたらしたペプチドを、相対的な定量化のために選択した。１１つのペプチドを、ペプシンを有するＨｉｓ−ＧＦＰ−Ｐｉｃｐａ−ω３Ｄタンパク質の消化から選択し、トリプシン消化のための８つのペプチドを表２３−表２４にまとめた。選択したペプチドは、タンパク質の長さに及んだ。
【０１６５】
【表２６】
2020513100.tif 000029
【０１６６】
【表２７】
2020513100.tif 000030
【０１６７】
ＳＧＦ中のＨｉｓ−ＧＦＰ−Ｐｉｃｐａ−ω３Ｄの消化性を、本明細書に記載されるようなＬＣ−ＭＲＭ−ＭＳ方法によって評価した。標的消化性ペプチドの特徴付けおよび定量化は、Ｈｉｓ−ＧＦＰ−Ｐｉｃｐａ−ω３Ｄタンパク質の急速な分解を示した。ペプシン消化データが、時点（０、５、１０、１５、３０、６０分）での１つのペプチド当たりの、最大の検出されたＭＲＭピーク面積（３つのトランジションの合計）の５回繰り返した消化の相対的割合の平均として図４０に示される。
【０１６８】
ペプシン消化後に特徴付けられ、かつ定量化されたペプチドのうち５つは、切断変異体であった（図４０、パネル（Ａ）−（Ｃ）、（Ｆ）−（Ｅ））。図４０の黒色の矢印は、上部の左パネル中のペプチドがペプシンによってさら切断されて、上部の右パネル中のペプチドおよびすぐ下のパネル中のペプチドを産出することを示す。モニタリングされたすべての消化性ペプチドを、急速に（＜１５分）産生した。ペプチドＮＡＴＧＱＰＹＰＧＶＳＫＦ（ａａ  ２２１−２３３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）（図４０、パネル（Ｄ））は、この時間枠にわたって平衡に到達し、注目すべきは、それが完全にペプシン性であったただ一つのペプチドであった（つまり、ペプシンによってさらなる加水分解を受けられなかった）。ペプシンが比較的非特異的であるため、モニタリングされた消化性ペプチドの大部分は、完全に切断された最終産物とならなかった。場合によっては、ペプチドレベルの減少が経時的に認められ、例えば、ＴＹＩＰＬＬＰＮＥＦ（ａａ  ８８−９７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）（図４０、パネル（Ｅ））は〜５分からゆっくり減少し、その産物であるＴＹＩＰＬＬＰＮＥ（ａａ  ８８−９６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）（図４０、パネル（Ｆ））は１０−６０分から濃度が増加する。未切断を含むペプシンタンパク質分解産物（さらなる分解を受けやすい）のいくつかの他の例をモニタリングした（図４０、パネル（Ａ）−（Ｂ）、（Ｈ）−（Ｅ））。実際、ＮＡＴＧＱＰＹＰＧＶＳＫＦ（ａａ  ２２１−２３３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）（図４０、パネル（Ｄ））だけが、予測された切断部位を含んでいない。消化におけるこれらのペプチドの出現は、ｉｃｐａ−ω３Ｄタンパク質の分解、したがってＰｉｃｐａ−ω３Ｄタンパク質の消化性の証拠としてみなされる。モニタリングされた８つのペプチドのうち３つが５分でピークに達した。ペプシンの低い特異性および複数の関連する分解産物の生成をさらに例示するために、ＴＹＩＰＬＬＰＮＥＦ（ａａ  ８８  ９７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）の５つの切断変異体をモニタリングした（図４１）。より大きな断片はプラトーに達したが、より小さなペプチド断片は、６０分の消化期間の終わりに依然として濃度を増加していたことが認められた。
【０１６９】
ペプシン消化後にモニタリングされたトリプシンペプチドは、最初の５分で急速に減少し、その後、実験（６０分の持続時間）の残り時間にわたってさらに減少することを示した。これらの８つのトリプシンペプチドの消失に基づいて、タンパク質の＞９７％が６０分後に切断されると推定される。多数のペプシン切断部位を含むペプチド：ＴＡＩＤＴＦ↓ＧＮＶＦ↓Ｋ（ａａ  ３３−４３，  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１），ＨＴＤＥＮＭＷ↓ＶＳＬ↓Ｗ↓Ｋ（ａａ  ３７４  ３８５  ｏｆ  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１），ＳＣ［ＣＡＭ］ＱＦ↓ＶＥＮＨＤＧＶＹ↓ＭＦ↓Ｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）（ここで、Ｘ↓Ｘはペプシン切断部位を表す）は、未消化の対照（ペプシン消化なし）の０．９、１．１、および０．３％にそれぞれ減少する。これは、ＴｒｉｐｌｅＴＯＦ  ５６００  ＬＣ  ＭＳ／ＭＳにおける消化されたペプチドの分析によってサポートされ、それは、これらのペプチドがより頻繁に断片化され、３０−６０分後により小さな断片を産出することを示す。より少数の部位を含むトリプシンペプチド：ＶＴＶＳＧＳＥＩＬ↓ＥＧＳＴＫ（ａａ  ４−１７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、ＳＧＮＶＡＳＦ↓Ｋ（ａａ  ２２−２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）およびＶＰＤＹ↓ＴＩＫ（ａａ  ４４−５０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）（単一の部位を有する）またはＤＩＬ↓ＤＡＩＰＫ（ａａ  ５１−５８，  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）（ここで、位置Ｐ３におけるリジンはペプシン切断を妨げることが知られている）は、０．７、０．５、１．３、ならびに１．４％にそれぞれ減少した。このペプチド配列内のペプシン消化部位の不在によって、観察された（５分で１７．５％および６０分で２．７％）ＥＡＴＥＣＩＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）のより高い割合を説明することができる。全体として、タンパク質の末端（Ｎ末端および極Ｃ末端）からペプチドが急速に遊離し、５分後に＜６％残っていることが観察された（表２５）。わずか５分以内に、トリプシンペプチドであるＳＧＮＶＡＳＦＫ（ａａ  ２２−２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）の１．３％だけが残り（表２５）、無傷のタンパク質の９８．７％が分解されたことを示した。６０分後の低レベルのいくつかのトリプシンペプチドの存在は、無傷のタンパク質がペプシンによって小さなペプチドへ分解され、これらのペプチドは検出可能であったことを単に示唆した。トリプシンペプチドであるＳＧＮＶＡＳＦＫ（ａａ  ２２−２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）が６０分後に０．５％に減少し、このことは、このペプシン消化時間を超えて残った無傷のタンパク質が本質的にはなかったことを示した。
【０１７０】
【表２８】
2020513100.tif 000031
【０１７１】
Ｐｉｃｐａ−ω３Ｄは内在性膜タンパク質である。最近まで、トランスジェニックキャノーラ中のトランスジェニックタンパク質の含有量の定量化、または天然タンパク質としてのＰｉｃｐａ−ω３Ｄの安定性の検出に利用可能なウエスタンブロット分析のための機能的な抗体が存在していない。商業的に産生されたポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ，  ＵＳ）は、Ｐｉｃｐａ−ω３Ｄへの特定のシグナルを生成しなかった。該抗体は、抗原の潜在的エピトープとして予測された合成ペプチドに対して産生された（図４３）。
【０１７２】
Ｈｉｓ−ＧＦＰ融合タンパク質として発現されるＰｉｃｐａ−ω３Ｄを、抗−Ｈｉｓ−タグ抗体に対するウエスタンブロットによって分析することができるが、そのようなウエスタンブロット分析は、Ｈｉｓ−ＧＦＰが切断される場合（例えば、ＳＧＦ消化後）、タンパク質全体ではなく融合領域しかモニタリングすることができない。加えて、抗−Ｈｉｓ−タグ抗体は、トランスジェニックω３ＬＣＰＵＦＡキャノーラ中の天然  Ｐｉｃｐａ  ω３Ｄ（非融合）タンパク質の定量化に適していない。したがって、ＬＣ−ＭＲＭ−ＭＳ分析を使用した代替アプローチが本明細書において開発され、それは、キャノーラ中で発現されたタンパク質の定量化および安定性アッセイの両方に適用することができる。本明細書に示される結果は、ＬＣ−ＭＳアプローチがそのような用途に適していることを明確に示す。この方法は、通常、μｇからｎｇのタンパク質を検出することができる従来のウエスタンブロットと同じくらい敏感である。本明細書に記載されるＬＣ−ＭＲＭ−ＭＳアプローチは、〜３７２ｐｇに相当するわずか７．８６ｆｍｏｌ（オンカラム注入）を検出した。加えて、抗体を使用するウエスタンブロットは、タンパク質から限られた数のエピトープ（１または２）を検出するだけかもしれない。ここで、無傷のタンパク質と共に、１１（ペプシン）および８（トリプシン）のペプチドが標的とされ、それは、消化の速度論、およびタンパク質分解へのタンパク質の特定領域の感受性についての理解を提供する。５回繰り返したペプシン消化後の濾過工程および洗浄工程に含まれる技術的困難により、最も早い実際の時点は５分であった。しかし、その結果は、標的タンパク質の消化性分析へのＬＣ−ＭＲＭ−ＭＳ適用の成功を示す。例えば、Ｐｉｃｐａ−ω３Ｄは成熟種子中の総タンパク質の１ｍｇ当たり３５２ｎｇで発現され、１ｇの種子から抽出された総タンパク質はわずか２．７８ｍｇであった。
【０１７３】
Ｐｉｃｐａ−ω３Ｄタンパク質は、脂肪酸のカルボキシル末端のΔ１５位置間の二重結合を導入する酵母アシル−ＣｏＡタイプの脂肪酸デサチュラーゼのサブファミリーに属する。酵母アシル−ＣｏＡタイプの脂肪酸デサチュラーゼはΔ１２およびω３／Δ１５−デサチュラーゼを含む。これらの酵母アシルＣｏＡタイプ脂肪酸デサチュラーゼのいくつかはまた、食物、動物飼料、または食品生産において一般的である。Ｐｉｃｐａ−ω３Ｄタンパク質を、ω３ＬＣＰＵＦＡキャノーラへと設計される２つの酵母アシル−ＣｏＡタイプの脂肪酸デサチュラーゼ（Ｐｉｃｐａ−ω３ＤおよびＬａｃｋｌ−Δ１２デサチュラーゼ）の代表として使用した。
【０１７４】
組み合わせたペプシン−トリプシンアッセイが、無傷のタンパク質の存在の代理として使用されたトリプシンペプチドの急速な減少を示したことを、この実施例の結果は実証した。完全長のＰｉｃｐａω３Ｄタンパク質の９８．７％が５分以内に消化され、９９．５％がペプシンにおけるインキュベーションの６０分以内に消化された。ＳＧＦ中のＰｉｃｐａ−ω３Ｄタンパク質の急速な消化に加えて、Ｐｉｃｐａ−ω３Ｄタンパク質は、トランスジェニックω３ＬＣＰＵＦＡ中に存在する総タンパク質のわずかな部分を表わす。
【０１７５】
＜実施例７＞パブロバ・サリナΔ５デサチュラーゼタンパク質の安定性のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析
正確な分解産物をモニタリングするために、新規なペプシン−トリプシンアッセイおよびＬＣ−ＭＳ／ＭＳと組み合わせて、タンパク質分解酵素、ペプシンを含む人工胃液（ＳＧＦ）中のパブロバ・サリナΔ５−デサチュラーゼ（Ｐａｖｓａ−Δ５Ｄ）タンパク質のインビトロでの安定性を評価する。ペプシン産物の出現および、ならびに（無傷のタンパク質の代理としての）トリプシンペプチド産物の消失によって、タンパク質消化の程度を評価した。この実施例の該方法は、完全長のＰａｖｓａ−Δ５Ｄタンパク質の９９．９％が５分以内に消化され、および、１２のペプチドのうち６つのペプチドが、ペプシンにおける６０分のインキュベーション後に＜０．２％存在することを示した。
【０１７６】
ＤＨＡキャノーラの中で使用されるΔ５デサチュラーゼ遺伝子を、前もって藻類Ｐ．サリナからクローン化した。Ｐａｖｓａ−Δ５Ｄタンパク質が、ｐＦａｓｔＢａｃベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＤＥ）を使用して構築された組換えバキュロウィルスに感染したＳｆ９昆虫細胞株中のＨｉｓ−タグ融合として発現され、その後、精製された。ベクターは、融合タンパク質Ｈｉｓ１０：：Ｐａｖｓａ−Δ５Ｄを産生するために、Ｈｉｓ−タグ（Ｈｉｓ１０）をコード化するコード配列、およびコドン最適化Ｐａｖｓａ−Δ５Ｄ遺伝子に融合されたＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ切断部位（ＳＬＥＶＬＦＱ↓ＧＰ）を含んだ。主要なバンドをゲル中で同定し、ウエスタンブロットを切除し、トリプシンを用いたタンパク質性分解の消化にさらした。該バンドは、Ｈｉｓ１０：：Ｐａｖｓａ−Δ５Ｄ（微量の夾雑タンパク質を含むか、または含まない）を含んでいるとして＞９９％の信頼度で同定された。他のマイナーバンドは昆虫細胞タンパク質である可能性が高い。組換えタンパク質もＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析された。タンパク質抽出、消化、タンパク質のポストトリプシン消化およびポストペプシン消化のＬＣ−ＭＳ特徴付け、ペプチド概要、ならびに一般的なアッセイを上記のように実施した。３つのトランジションをペプチド毎に使用し（Ｐａｖｓａ−Δ５Ｄからの１１のペプチドを有する）、ここで、３つのＭＲＭトランジションのピーク領域を合計した。
【０１７７】
Ｈｉｓ１０：：Ｐａｖｓａ−Δ５Ｄタンパク質の安定性をテストするために、２つのテストシステム、ペプシン消化（人工胃液（ＳＧＦ）を表す）、および組み合わせたペプシン−トリプシン消化を独立して利用した。ＳＧＦは、ペプシンの高度に精製された形態を使用して酸性ｐＨ１．２に調節された緩衝液中に、タンパク分解酵素ペプシンを含んでいた。消化反応で３：１の酵素：タンパク質の比率になるようにＳＧＦを製剤した。Ｐａｖｓａ−Δ５Ｄタンパク質の消化をＬＣ−ＭＳ／ＭＳによってモニタリングした。
【０１７８】
この研究において、１２０分間のペプシン消化後も存続するＨｉｓ１０：：Ｐａｖｓａ−Δ５Ｄのペプチド断片は、非標的ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを特徴とした。ペプシン消化後に得られたタンパク質配列の適用範囲を以下に示し、太字は＞９５％の信頼度で同定されたペプチドを示し；イタリック体は、５０−９５％の信頼度で同定されたペプチドを示し；下線は、＜５０％の信頼度で同定されたペプチドを示し；通常の文字は、残基が検出されなかったことを意味し；波状の下線は、融合タンパク質中のＮ末端Ｈｉｓ−タグおよびプロテアーゼ切断部位、その後、天然のＰａｖｓａ−Δ５Ｄのメチオニンである：
【０１７９】
【数１】
2020513100.tif 000032
【０１８０】
トリプシン消化後に得られたタンパク質配列の適用範囲は、ＬＣ  ＭＳ／ＭＳを特徴とし、以下に示され、太字は＞９５％の信頼度で同定されたペプチドを示し；イタリック体は、５０−９５％の信頼度で同定されたペプチドを示し；下線は、＜５０％の信頼度で同定されたペプチドを示し；通常の文字は、残基が検出されなかったことを意味し；波状の下線は、融合タンパク質中のＮ末端Ｈｉｓ−タグおよびプロテアーゼ切断部位、その後、天然のＰａｖｓａ−Δ５Ｄのメチオニンである：
【０１８１】
【数２】
2020513100.tif 000033
【０１８２】
９５％の信頼度で同定され、かつＭＳにおいて強いシグナルをもたらしたペプチドを、相対的な定量化のために選択した。Ｈｉｓ１０：：Ｐａｖｓａ−Δ５Ｄタンパク質の消化から選択された１１のペプシン由来のペプチドおよび１２のトリプシン由来のペプチドを、表１−２にまとめる。選択したペプチドは、タンパク質の長さに及んだ。詳細は表２６および２７に示される。
【０１８３】
【表２９】
2020513100.tif 000034
【０１８４】
【表３０】
2020513100.tif 000035
【０１８５】
ＳＧＦ中のＨｉｓ１０：：Ｐａｖｓａ−Δ５Ｄの消化性を上記のＬＣ−ＭＲＭ−ＭＳ方法によって評価した。標的消化性ペプチドの特徴付けおよび定量化は、Ｈｉｓ１０：：Ｐａｖｓａ−Δ５Ｄの急速な分解を示した。ペプシン消化データが、時点（０、５、１０、１５、３０、６０分）での１つのペプチド当たりの、最大の検出されたＭＲＭピーク面積（３つのトランジションの合計）の平均（ｎ＝５）相対的割合として図４４に示される。
【０１８６】
タンパク質の長さに及ぶ１１のペプチドをＬＣ−ＭＲＭ−ＭＳによってモニタリングした。ペプシン消化後に特徴付けられ、かつ定量化された多くのペプチドが、切断変異体であった（図４４（Ａ）−（Ｂ）、（Ｃ）−（Ｄ）、（Ｉ）−（Ｊ））。図４４の黒色の矢印は、左パネル中のペプチドがペプシンによってさら切断されて、右パネル中のペプチドを産出することを示す。モニタリングされたすべての消化性ペプチドが、急速に（＜１５分）産生され、その多くがこの時間枠で平衡に達した。ペプシンが比較的非特異的であるため、モニタリングされた消化性ペプチドは、完全に切断された最終産物とならないこともある。ペプシンタンパク質分解産物のいくつかの例は未切断を含み、ペプチド配列中の赤色のフォント（予想された切断部位）またはオレンジ色のフォント（潜在的に妨げられた部位）によって示される。これらのペプチドはさらなる分解を受けやすく、図４４のパネル（Ｂ）、（Ｄ）、および（Ｊ）に例証される。実際、ペプチドＶＫＲＨＰＧＧＫＩＩＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）およびＤＮＶＡＨＡＰＥＫＫＭＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）だけが、予測される二次切断部位を含んでいない。消化におけるこれらのペプチドの出現は、Ｐａｖｓａ−Δ５Ｄタンパク質の分解、したがって、Ｐａｖｓａ−Δ５Ｄタンパク質の消化性の証拠としてみなされる。モニタリングされた１１のペプチドのうち７つが、５分で最大値に達した＞７５％をした。ペプシン時間経過中において５分までに残りの５つのペプチドが最大のペプチド遊離の５５％に達し、６０分までに１１のすべてのペプチドがプラトーに到達した（図４４）。
【０１８７】
【表３１】
2020513100.tif 000036
【０１８８】
消化性ペプチドの急速な増加によって示されるＨｉｓ１０：：Ｐａｖｓａ−Δ５Ｄタンパク質の急速な分解は、ペプシン消化（組み合わせたペプシントリプシン消化）後のトリプシン消化におけるトリプシンペプチドの迅速な減少によってさらに示された。ペプシン消化後にモニタリングされたトリプシンペプチドの大部分（９／１２）は、最初の５−１０分で急速に減少し、その後、６０分の持続時間実験の残り時間にわたってさらに減少することが示される（図４５）。ペプシン消化（０分）のないトリプシンペプチドの合計ＭＲＭピーク面積を未消化の対照として使用した。５、１０、１５、３０、４５、および６０分のペプシンの消化後、その後のトリプシン消化後のトリプシンペプチドの合計ＭＲＭピーク面積を、タンパク質切断の指標としての未消化の対照に対する割合として計算した。これらの１２のトリプシンペプチドの消失に基づいて、タンパク質の＞９３％（すべてのペプチドの平均とみなされる）が６０分後に切断されると推定される。１２のペプチドのうち６つが、わずか５分後に未消化の対照（ペプシン消化なし）の＜１％に急速に減少した。１０分までに、９つのペプチドが＜１０％に減少した。モニタリングされた１２のペプチドのうち３つだけがより遅い分解を示し、ここで、２つのペプチド（図４５、パネル（Ｇ）、（Ｊ））が、５分のペプシン消化後に増加し、それらがタンパク質の部分的に保護された領域に位置したことを示唆する。一旦ペプシンがタンパク質を部分的に分解すると、これらのトリプシンペプチドは遊離し、その後、減少するが、モニタリングされた他の９つのペプチドより遅い速さで減少する。全体として、タンパク質のＮ末端から中間領域までのペプチドが急速に遊離し、５分後に＜１％残っていることが観察された（表３）。タンパク質のＣ末端領域はまた、より遅い速度での分解を明らかにし、１０分後に〜７０−８０％が分解された。
【０１８９】
さらに、完全長のＰａｖｓａ−ΔＤタンパク質の９９．９％が１分以内に消化され、および、１２のペプチドのうち６つが、ペプシンにおける６０分のインキュベーション後に０．２％未満残ったことが示された。組み合わせたペプシントリプシンアッセイは、無傷のタンパク質の存在の代理として使用されたトリプシンペプチドの急速な減少を示した。無傷のタンパク質に及ぶ１２のペプチドを使用したこのＬＣ−ＭＲＭ−ＭＳアプローチは、消化の速度論、およびタンパク質分解へのタンパク質の特定領域の感受性についての理解を提供し、タンパク質スケールで〜３７６ｐｇに相当する７．８０ｆｍｏｌ／ｍｇ（オンカラム注入）と同じくらい少ない、検出されたＰａｖｓａ−Δ５Ｄの量をもたらした。
【０１９０】
＜実施例８＞ピラミモナス・コルダタΔ６−エロンガーゼタンパク質安定性のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析
この実施例は、正確な分解産物をモニタリングするために、最先端の質量分析アプローチを利用した新規なペプシン−トリプシンアッセイと組み合わせて、タンパク質分解酵素、ペプシンを含む人工胃液（ＳＧＦ）中のピラミモナス・コルダタΔ６−エロンガーゼ（Ｐｙｒｃｏ−Δ６Ｅ）タンパク質のインビトロでの安定性を評価する。ペプシン産物の出現および、ならびに（無傷のタンパク質の代理としての）トリプシンペプチド産物の消失によって、タンパク質消化の程度を評価した。この実施例は、この内在性膜タンパク質が、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析される時、ペプシンおよび／またはトリプシンにおいて容易に消化可能であったことを示し：Ｐｙｒｃｏ−Δ６Ｅタンパク質のＮ末端およびＣ末端の領域の＞９５％が５分以内に消化され、および、完全長のタンパク質がペプシンにおけるインキュベーションの６０分以内に急速に消化され、ペプチド配列全体に及ぶ一連のペプシン産物＜２，０００Ｄａを産生する。
【０１９１】
このΔ６−エロンガーゼ遺伝子を前もって藻類Ｐ．コルダタからクローン化した。Ｐｙｒｃｏ−Δ６Ｅタンパク質が、ｐＦａｓｔＢａｃベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＤＥ）を使用して構築された組換えバキュロウィルスに感染した昆虫細胞株（Ｓｆ９）中のＨｉｓ１０：：タグ融合として発現され、その後、精製された。ベクターは、融合タンパク質Ｈｉｓ１０：：Ｐｙｒｃｏ−Δ６Ｅを産生するために、Ｈｉｓ−タグ（Ｈｉｓ１０）をコード化するコード配列、およびコドン最適化Ｐｙｒｃｏ−Δ６Ｅ遺伝子に融合されたＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ切断部位（ＳＬＥＶＬＦＱ↓ＧＰ）を含んだ。
【０１９２】
１２０分間のペプシン消化後も存続するＨｉｓ１０：：Ｐｙｒｃｏ−Δ６Ｅのペプチド断片は、非標的ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを特徴とし、太字で示される（波状の下線は、融合タンパク質中のＮ末端Ｈｉｓ１０：：タグおよびプロテアーゼ切断部位、続いて、天然Ｐｙｒｃｏ−Δ６Ｅのメチオニンを示す）：
【０１９３】
【数３】
2020513100.tif 000037
【０１９４】
トリプシン消化（１６時間）後に存在するペプチド断片は、以下に示されるような非標的ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを特徴とし、太字が＞９５％の信頼度で同定されたペプチドを示し、イタリック体が５０−９５％の信頼度で同定されたペプチドを示し、および、下線が＜５０％の信頼度で同定されるペプチドを示す：
【０１９５】
【数４】
2020513100.tif 000038
【０１９６】
９５％の信頼度で同定され、かつＭＳにおいて強いシグナルをもたらしたペプシン由来のペプチドを、相対的な定量化のために選択した。Ｈｉｓ１０：：Ｐｙｒｃｏ−Δ６Ｅタンパク質のペプシン消化から選択された１２のペプチド、および４つのトリプシンペプチドを表２９−３０まとめた。選択したペプシン由来のペプチドは、タンパク質の長さに及んだ。
【０１９７】
【表３２】
2020513100.tif 000039
【０１９８】
【表３３】
2020513100.tif 000040
【０１９９】
ＳＧＦ中のＨｉｓ１０：：Ｐｙｒｃｏ−Δ６Ｅの消化性を上記のＬＣ−ＭＲＭ−ＭＳ方法によって評価した。標的消化性ペプチドの特徴付けおよび定量化は、Ｈｉｓ１０：：Ｐｙｒｃｏ−Δ６Ｅの急速な分解を示した。ペプシン消化データが、時点（０、４、１０、１５、３０、６０分）での１つのペプチド当たりの、最大の検出されたＭＲＭピーク面積（３つトランジションの合計）の５回繰り返した消化の相対的割合の平均として図４６に示される。
【０２００】
消化性ペプチドの急速な遊離によって示されるＨｉｓ１０：：Ｐｙｒｃｏ−Δ６Ｅタンパク質の急速な分解を、トリプシン消化（組み合わせたペプシン−トリプシン消化における）後に単一のトリプシンペプチドの減少によってさらに確認した。ペプシン消化後に特徴付けられ、かつ定量化されたペプチドのうち４つが、切断変異体であった（図４６、パネル（Ｃ）（Ｄ）、（Ｇ）−（Ｈ）。図４６の黒色の矢印は、左パネル中のペプチドがペプシンによってさらに切断されて、右パネル中のペプチドを産出することを示す。モニタリングされたＮ末端消化性ペプチドが、急速に（＜５分、図４６、パネル（Ａ）−（Ｃ））産生され、実験の持続時間にわたって平衡に達した。ペプシンが比較的非特異的であるため、モニタリングされた消化性ペプチドは、完全に切断された最終産物とならないこともある。図４６に表示されたペプシンタンパク質分解産物のすべてが、未切断を含んでおり、したがって、さらなる分解を受けやすい。Ｎ末端ペプチドＳＡＴＤＳＩＧＷＧＬＫＰＩＳＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）（図４６、パネル（Ｃ））の場合には、この切断変異体が急速に産生され、５分後に９７％に達し、その後、実験の持続時間にわたって安定した増加を示すＷＧＬＫＰＩＳＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）（図４６、パネル（Ｄ））を含む様々な産物に急速に切断される。ペプシン消化の最終産物と考えられ得るただ一つのペプチドはＶＳＫＩＹＥ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）であり、ここで、Ｐ３位置にあるリジン（Ｋ）がＹの前のさらなる切断を妨げる可能性が高い（図４６、パネル（Ｈ））。このペプチドは、〜３０％減少する前に３０分までに最大レベルに到達し、ペプシン消化プロファイルは直接その中間産物ＹＶＳＫＩＹＥ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）を模倣した（図４６、パネル（G））。ペプシン消化中のタンパク質の全長に及ぶこれらのペプチドの出現は、Ｈｉｓ１０：：Ｐｙｒｃｏ−Δ６Ｅタンパク質の分解、したがって、Ｈｉｓ１０：：Ｐｙｒｃｏ−Δ６Ｅタンパク質の消化性の証拠としてみなされる。
【０２０１】
【表３４】
2020513100.tif 000041
【０２０２】
Ｈｉｓ１０：：Ｐｙｒｃｏ−Δ６Ｅタンパク質の場合には、より少ないトリプシン産物が確信的に同定され、したがって、タンパク質消化のモニタリングに利用可能であった。これは、タンパク質配列内のトリプシン部位の頻度および分布の減少によるものであり、タンパク質の中央領域に限局されたＬＣ−ＭＳに適したペプチドをほとんどもたらさなかった。モニタリングされた最初のペプチドであるＧＱＤＰＦ↓Ｌ↓Ｌ↓Ｋ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）は、３つの潜在的ペプシン切断部位（矢印によって示される）を含み、および、ペプシンがこのペプチドを切断することが予想され、ペプシン消化の時間経過にわたるペプチド存在量の減少を結果的にもたらす。しかし、ペプチドピーク領域が、５分後に４倍に増加し、次の１０分にわたって比較的一定のままであり、次の４５分にわたってゆっくり減少することが認められた（図４７、パネル（Ａ））。同様の現象がＰｙｒｃｏ−Δ５Ｅに由来するペプチドで以前に観察され、ここで、ペプシンを用いたタンパク質の５分のインキュベーション後に、トリプシンペプチド（ＳＱＰＦＧＬＫ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）のピーク領域の３倍の増加が認められた。両方のシナリオは、その天然の立体構造がトリプシン消化から部分的に保護される、分子の核内に存在するモニタリングされたペプチドから生じると仮定される。ペプシンを用いた短いインキュベーション（５分）後、タンパク質（Ｐｙｒｃｏ−Δ６Ｅ）の３次構造が破壊され、トリプシン部位への完全なアクセスを可能にし、したがって、その最大レベルでのトリプシンペプチド（ＧＱＤＰＦＬＬＫ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）の遊離を可能にする（図４６）。同様のプロファイルが、ＶＩＷ↓ＩＦ↓Ｙ↓ＶＳＫおよびＹ↓ＳＦ↓Ｗ↓ＧＮＡＹ↓ＮＰＡＱＴＥＭＡＫ（図４７（Ｃ）−（Ｄ））で観察された。ＬＶＹ↓ＥＡＹ↓ＶＮＫ（図４７（Ｂ））の場合には、最大レベルが３０分で検出され、６０分で＞７０％減少した。Ｐｙｒｃｏ−Δ６Ｅタンパク質のＮ末端およびＣ末端に由来する検出可能なトリプシンペプチドの不在は、Ｐｉｃｐａ−ω３ＤおよびＰａｖｓａ−Δ４Ｄのために決定される最終的な分解率の決定を妨げ、ペプシン産物の出現（図４６）は、Ｐｙｒｃｏ−Δ６Ｅタンパク質が実験の時間経過にわたってペプシンによって消化され、＜５分でＮ末端およびＣ末端の領域の＞９５％の切断を達成したことを示した（図４６、パネル（Ａ）−（Ｃ）、（Ｌ））。
【０２０３】
【数５−１】
2020513100.tif 000042
【０２０４】
【数５−２】
2020513100.tif 000043
【０２０５】
【数５−３】
2020513100.tif 000044
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９Ａ】
2020513100.tif 000084
【図２９Ｂ】
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【図３０Ａ】
2020513100.tif 000086
【図３０Ｂ】
2020513100.tif 000087
【図３０Ｃ】
2020513100.tif 000088
【図３０Ｄ】
2020513100.tif 000089
【図３１Ａ】
2020513100.tif 000090
【図３１Ｂ】
2020513100.tif 000091
【図３１Ｃ】
2020513100.tif 000092
【図３２Ａ】
2020513100.tif 000093
【図３２Ｂ】
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【図３３Ａ】
2020513100.tif 000095
【図３３Ｂ】
2020513100.tif 000096
【図３３Ｃ】
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【図３３Ｄ】
2020513100.tif 000098
【図３４】
2020513100.tif 000099
【図３５】
2020513100.tif 000100
【図３６】
2020513100.tif 000101
【図３７】
2020513100.tif 000102
【図３８Ａ】
2020513100.tif 000103
【図３８Ｂ】
2020513100.tif 000104
【図３９Ａ】
2020513100.tif 000105
【図３９Ｂ】
2020513100.tif 000106
【図３９Ｃ】
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【図３９Ｄ】
2020513100.tif 000108
【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【国際調査報告】
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