(57)【要約】本発明は、ＦＤＣＡの製造のための真菌細胞に関する。真菌細胞は、遺伝子修飾を欠いた対応する親細胞と比較して、細胞内の特異的な２，５−フランジカルボン酸（ＦＤＣＡ）脱炭酸モノオキシゲナーゼ活性を低減させる遺伝子改変を有する。真菌細胞は、さらに遺伝子改変されて、フランアルデヒドを対応するフランカルボン酸へと酸化する細胞の能力を高めることができる。本発明はまた、本発明の細胞がＦＤＣＡのフラン前駆体のＦＤＣＡへの酸化に使用される、２，５−フラン−ジカルボン酸（ＦＤＣＡ）の製造方法にも関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子改変を含む真菌細胞であって、前記遺伝子改変が、前記遺伝子改変を欠いた対応する親細胞と比較して、細胞内の特異的な２，５−フランジカルボン酸（ＦＤＣＡ）脱炭酸モノオキシゲナーゼ活性を低減させるものであり、前記遺伝子改変が、プロモーター及び遺伝子のコード配列のうちの少なくとも１つの少なくとも一部の欠失により、ＦＤＣＡ脱炭酸モノオキシゲナーゼをコードする内因性遺伝子の発現を排除する、真菌細胞。
【請求項２】
対応する親細胞の前記内因性遺伝子が、配列番号４の少なくとも１つと少なくとも４５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＦＤＣＡ脱炭酸モノオキシゲナーゼをコードする、請求項１に記載の真菌細胞。
【請求項３】
少なくともＦＤＣＡ脱炭酸モノオキシゲナーゼをコードする内因性遺伝子の完全な前記コード配列が欠失している、請求項１又は２に記載の真菌細胞。
【請求項４】
ＦＤＣＡ脱炭酸モノオキシゲナーゼをコードする前記内因性遺伝子の全てのコピーの発現が排除されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の真菌細胞。
【請求項５】
前記細胞がＨＭＦをＦＤＣＡに酸化する天然の能力を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の真菌細胞。
【請求項６】
前記細胞が、
ａ）遺伝子改変を欠いた対応する野生型細胞と比較して、５−ヒドロキシメチル−２−フランカルボン酸（ＨＭＦＣＡ）を５−ホルミル−２−フロ酸（ＦＦＣＡ）に酸化する能力を細胞に付与する、又は細胞内でＨＭＦＣＡをＦＦＣＡに酸化する酵素の比活性を増加させる、遺伝子改変；及び
ｂ）遺伝子改変を欠いた対応する野生型細胞と比較して、フランアルデヒドを対応するフランカルボン酸に酸化する能力を細胞に付与する遺伝子改変、又は細胞内でフランアルデヒドを対応するフランカルボン酸に酸化する酵素の比活性を増加させる、遺伝子改変
のうちの少なくとも１つである、さらなる遺伝子改変を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の真菌細胞。
【請求項７】
ａ）における前記遺伝子改変が、ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を増加させる改変であり、前記ポリペプチドが、配列番号１及び２のうちの少なくとも１つのアミノ酸配列と少なくとも４５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；及び／又は、
ｂ）における前記遺伝子改変が、フランアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を増加させる改変であり、前記アルデヒドデヒドロゲナーゼが、ｉ）ＨＭＦをＨＭＦＣＡに酸化する、ｉｉ）ＤＦＦをＦＦＣＡに酸化する、及びｉｉｉ）ＦＦＣＡをＦＤＣＡに酸化する能力の少なくとも１つを有し、前記ポリペプチドが、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも４５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の真菌細胞。
【請求項８】
前記細胞が、
ａ）ＨＭＦ及び／又はＦＦＣＡを対応するアルコールに還元する短鎖デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の発現を低減又は排除する遺伝子改変であって、好ましくは前記遺伝子が、配列番号５及び２５のうちの少なくとも１つと少なくとも４５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子の少なくとも１つである、遺伝子改変；
ｂ）少なくとも１つのフラン化合物を輸送するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を増加させる遺伝子改変であって、前記ポリペプチドが、好ましくは配列番号６〜１０のうちの少なくとも１つのアミノ酸配列と少なくとも４５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、遺伝子改変；及び
ｃ）フラン異化に関与する遺伝子の転写活性化因子をコードする遺伝子の発現を変化させる遺伝子改変であって、好ましくは前記遺伝子が、配列番号１１と少なくとも４５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子である、遺伝子改変
から選択される遺伝子改変をさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の真菌細胞。
【請求項９】
ＨＭＦをＦＤＣＡに酸化する能力を有し、少なくとも１つのフラン化合物を輸送するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を増加させる遺伝子改変を含む真菌細胞であって、前記ポリペプチドが、好ましくは配列番号９及び１０のうちの少なくとも１つのアミノ酸配列と少なくとも４５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、真菌細胞。
【請求項１０】
前記細胞が、
ａ）遺伝子改変を欠いた対応する親細胞と比較して、細胞内の特異的なＦＤＣＡ脱炭酸モノオキシゲナーゼ活性を排除又は低減する遺伝子改変；
ｂ）ＨＭＦＣＡをＦＦＣＡに酸化する能力を細胞に付与する、又は遺伝子改変を欠いた対応する野生型細胞と比較して、ＨＭＦＣＡをＦＦＣＡに酸化する酵素の比活性を細胞内で増加させる遺伝子改変；
ｃ）遺伝子改変を欠いた対応する野生型細胞と比較して、フランアルデヒドを対応するフランカルボン酸に酸化する能力を細胞に付与する遺伝子改変、又は細胞内でフランアルデヒドを対応するフランカルボン酸に酸化する酵素の比活性を増加させる遺伝子改変；
ｄ）ＨＭＦ及び／又はＦＦＣＡを対応するアルコールに還元する短鎖デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の発現を低減又は排除する遺伝子改変であって、好ましくは、前記遺伝子が、配列番号５及び２５のうちの少なくとも１つと少なくとも４５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子の少なくとも１つである、遺伝子改変；
ｅ）少なくとも１つのフラン化合物を輸送するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を増加させる遺伝子改変であって、前記ポリペプチドが、好ましくは配列番号６〜８のうちの少なくとも１つのアミノ酸配列と少なくとも４５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、遺伝子改変；及び
ｆ）フラン異化に関与する遺伝子の転写活性化因子をコードする遺伝子の発現を変化させる遺伝子改変であって、好ましくは前記遺伝子が、配列番号１１と少なくとも４５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子である、遺伝子改変
から選択される遺伝子改変をさらに含む、請求項９に記載の真菌細胞。
【請求項１１】
前記細胞が、
アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、オーレオバシジウム属（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フィリバシジウム属（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコーラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルテ属（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリマスチクス属（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペシロミセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ピロミセス属（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾフィラム属（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、タラロマイセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスカス属（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、及びウスチラゴ属（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）からなる群からの属から選択される糸状菌細胞であり、好ましくは前記細胞が、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フォエチダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・ソジャエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、タラロマイセス・エメルソニイ（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、ミセリオフトラ・テルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、トリコデルマ・レーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、ペニシリウム・クリソゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、ペニシリウム・シンプリシッシマム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｉｍｐｌｉｃｉｓｓｉｍｕｍ）、及びペニシリウム・ブラシリアヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｂｒａｓｉｌｉａｎｕｍ）からなる群からの種から選択される糸状菌細胞であり；
又は、前記細胞が、サッカロミケス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、シゾサッカロミケス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クロケラ属（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）、シュワンニオミセス属（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、デバロミセス属（Ｄｅｂａｒｏｍｙｃｅｓ）、サッカロミコプシス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｃｏｐｓｉｓ）、サッカロミコード属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｄｅｓ）、ウィッカーハミア属（Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉａ）、デバリオミセス属（Ｄｅｂａｙｏｍｙｃｅｓ）、ハンセニアスポラ属（Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ）、オガタエア属（Ｏｇａｔａｅａ）、クライシア属（Ｋｕｒａｉｓｈｉａ）、コマガタエラ属（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ）、メチニコウイア属（Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ）、ウィリオプシス属（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ）、ナカザワエア属（Ｎａｋａｚａｗａｅａ）、トルラスポラ属（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）、ブレラ属（Ｂｕｌｌｅｒａ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、及びスポロボロミセス属（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）からなる群からの属から選択される酵母細胞であり、好ましくは前記細胞が、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）及びピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）からなる群からの種から選択される酵母細胞である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１２】
ＨＭＦＣＡをＦＦＣＡに酸化する方法であって、ＨＭＦＣＡの存在下、細胞によるＨＭＦＣＡの酸化をもたらす条件下で、請求項５〜１１のいずれか一項に記載の真菌細胞をインキュベートするステップを含み、前記細胞が、ＨＭＦＣＡをＦＦＣＡに酸化する能力を有する酵素を発現する、方法。
【請求項１３】
ＦＤＣＡを製造する方法であって、ＦＤＣＡの１つ又は複数のフラン前駆体を含む培地中、好ましくは細胞によるＦＤＣＡのフラン前駆体のＦＤＣＡへの酸化、及び任意選択でＦＤＣＡの回収をもたらす条件下で、請求項５〜１１のいずれか一項に記載の真菌細胞をインキュベートするステップを含み、好ましくはＦＤＣＡの少なくとも１つのフラン前駆体が、ＨＭＦ、２，５−ジヒドロキシメチルフラン（ＤＨＦ）、ＨＭＦＣＡ、ＦＦＣＡ及び２，５−ジホルミルフラン（ＤＦＦ）からなる群から選択され、そのうちＨＭＦが最も好ましく、
前記ＦＤＣＡのフラン前駆体が、１つ又は複数のヘキソース糖、好ましくはリグノセルロースバイオマスから得られる１つ又は複数のヘキソース糖から、好ましくは酸触媒脱水により得られ、
好ましくは前記ＦＤＣＡが、酸沈殿とそれに続く冷却結晶化及び／又は溶媒抽出を含む方法によって前記培地から回収される、方法。
【請求項１４】
前記培地が、２．０〜３．０の範囲のｐＨを有し、好ましくは前記ＦＤＣＡが、それが生成する酸性培地から沈殿し、酸沈殿とそれに続く冷却結晶化を含む方法によって前記培地から回収される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも２つのＦＤＣＡモノマーからポリマーを製造する方法であって、
ａ）請求項１３又は１４に記載の方法でＦＤＣＡモノマーを調製するステップ；及び、
ｂ）ステップａ）で得られた前記ＦＤＣＡモノマーからポリマーを製造するステップ
を含む方法。
【請求項１６】
前記ポリマーが、ＦＤＣＡモノマーとジオールモノマーを混合し、前記混合物をＦＤＣＡモノマーとジオールモノマーが重合する条件に導くことにより製造される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＦＤＣＡへの１つ又は複数のフラン前駆体の生物学的変換のための、請求項５〜１１のいずれか一項に記載の真菌細胞、又はＦＤＣＡのフラン前駆体をＦＤＣＡに変換する能力を有する１つ又は複数の細菌酵素を発現する真菌細胞の使用であって、好ましくは、少なくとも１つのＦＤＣＡのフラン前駆体が、ＨＭＦ、ＤＨＦ、ＨＭＦＣＡ、ＦＦＣＡ及びＤＦＦからなる群から選択され、そのうちＨＭＦが最も好ましい、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子遺伝学、代謝工学、生物学的変換及び発酵技術の分野に関する。特に、本発明は、ヒドロキシメチルフルフラールから２，５−フランジカルボン酸を生成するように遺伝子改変されている真菌に関する。本発明は、ヒドロキシメチルフルフラールの２，５−フランジカルボン酸への生物学的変換のための方法における、そのような真菌の使用にさらに関する。
【背景技術】
【０００２】
２，５−フランジカルボン酸（ＦＤＣＡ）は、多大な経済的影響を有するポリエステルの製造に適用され得るモノマー化合物である。この分野において非常に重要な化合物は、テレフタル酸（ＰＴＡ）とエチレングリコールから製造されるポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）である。ＦＤＣＡは、ポリエステルＰＥＴにおけるＰＴＡに代替し得、その場合、ポリエチレンフランジカルボキシレート（ＰＥＦ）が生じる。ＰＥＦは、大規模なポリエステル市場においてＰＥＴを置き換える潜在性を持つ。それはＰＥＴに比べて優れた特性を備えているだけでなく、再生可能な原材料から誘導され得るためである。ＦＤＣＡは糖から化学的（Ｄｅ  Ｊｏｎｇら，２０１２．Ｂｉｏｂａｓｅｄ  Ｍｏｎｏｍｅｒｓ，Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，ａｎｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ；Ｓｍｉｔｈ，Ｐ．ら；ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ：Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ）に、又は化学生物学的な組合せ経路（Ｗｉｅｒｃｋｓら，２０１１．Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ９２：１０９５−１１０５）で製造され得る。後者の場合、グルコースやフルクトースなどの単糖が５−（ヒドロキシメチル）−２−フルアルデヒド（ＨＭＦ）に化学的に変換され、その後、酵素によってＦＤＣＡに酸化され得る。
【０００３】
ＨＭＦからＦＤＣＡを製造する生物学的経路は、カプリアビダス・バシレンシス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｂａｓｉｌｅｎｓｉｓ）ＨＭＦ１４のＨＭＦ分解株の単離に基づいて開発された（Ｗｉｅｒｃｋｘら，２０１０．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３：３３６−３４３）。Ｃ．バシレンシスＨＭＦ１４におけるＨＭＦ分解経路に関与する酵素をコードする遺伝子のクラスターが同定され、関連する遺伝子がシュードモナス・プチダＳ１２株（Ｋｏｏｐｍａｎら，２０１０．ＰＮＡＳ  １０７：４９１９−４９２４）において異種性に発現され、それにより、ＨＭＦを代謝する能力が獲得された。ｈｍｆＨ遺伝子−主にＨＭＦ酸（ＨＭＦＣＡ）にオキシダーゼとして作用するが、ＨＭＦ又はＦＦＣＡも酸化し得るＨＭＦ酸化還元酵素をコードする−のみの異種性発現は、Ｐ．プチダＳ１２がＨＭＦからＦＤＣＡを生成することを可能とする（Ｋｏｏｐｍａｎら，２０１０．Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０１：６２９１−６２９６；及び国際公開第２０１１／０２６９１３号）。さらなる最適化作業（Ｗｉｅｒｃｋｘら，２０１１，上記；及び国際公開第２０１２／０６４１９５号）において、ＨＭＦＣＡトランスポーター及び特異性が不明なアルデヒドデヒドロゲナーゼをそれぞれコードする２つの追加の遺伝子が、Ｐ．プチダＳ１２において発現された。
【０００４】
米国特許第７，０６７，３０３号は、真菌コニオケタ・リグニアリア（Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ  ｌｉｇｎｉａｒｉａ）（テレオモルフ）、又はそのレシトフォラ（Ｌｅｃｙｔｈｏｐｈｏｒａ）のアナモルフ状態が、農業バイオマス加水分解物中のフラン、特にフルフラールとＨＭＦの毒性レベルを大幅に減少させる能力を持つことを開示している。糖含有加水分解物の解毒における生物学的因子としてのＣ．リグニアリアの使用は、その後の多くの論文でさらに実証された（Ｌｏｐｅｚら，２００４．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ６４：１２５−１３１；Ｎｉｃｈｏｌｓら，２００５．Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｓｐｒｉｎｇ；１２１−１２４：３７９−９０；Ｎｉｃｈｏｌｓら，２００８．Ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４２：６２４−６３０；Ｎｉｃｈｏｌｓら，２０１０．Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  １９：７５４５−５０；Ｎｉｃｈｏｌｓら，２０１４．Ｂｉｏｍａｓｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｅｒｇｙ  ６７：７９−８８）。より毒性の低い化合物へのＨＭＦの解毒とは別に、この生物は増殖のためにＨＭＦを代謝することもできた。
【０００５】
Ｚｈａｎｇら（２０１０，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｆｕｅｌｓ  ３：２６）は、それぞれアモルフォテカ・レジナエ（Ａｍｏｒｐｈｏｔｈｅｃａ  ｒｅｓｉｎａｅ）とユーペニシリウム・バルネンセ（Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｂａａｒｎｅｎｓｅ）として同定された、コーンストーバーの加水分解物を解毒する２つのＨＭＦ代謝真菌の単離について記述した。後続の論文（Ｒａｎら，２０１４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｆｕｅｌｓ  ７：５１）では、ＺＮ１と命名されたＡ．レジナエ株の増殖が、ＨＭＦを含む多くの化合物によって支持されると報告された。ＨＭＦが分解され、ＨＭＦアルコールとＨＭＦＣＡが次第に蓄積したが、ＦＤＣＡの蓄積は報告されなかった。
【０００６】
Ｇｏｖｉｎｄａ  Ｒａｊｕｌｕら（２０１４，Ｍｙｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  １３：１０４９−１０５６）も同様に、フルフラール及び／又はＨＭＦを唯一の炭素源として利用する能力を持つ多くの真菌を分離したが、ＦＤＣＡの蓄積は報告されなかった。
【０００７】
このように、ＨＭＦを消費して増殖するか、又はＨＭＦを含有する原材料を解毒する、いくつかの真菌が記載されている。酵母と同様に、これらの生物は、原材料を解毒する目的でＨＭＦをＨＭＦアルコールに還元する観点から研究された。しかしながら、酵母又は糸状菌によるＦＤＣＡの生産は記述されていない。しかし、ＨＭＦからのＦＤＣＡの真菌による生産は、当技術分野の細菌による方法を上回るいくつかの固有の利点を提供すると予想される。例えば、多くの真菌は、増殖のためにｐＨ＝３以下まで低いｐＨ値を許容するが、ほとんどの細菌は中性のｐＨ環境を好む。ＦＤＣＡの大規模製造の特定の状況では、下流プロセシング（ＤＳＰ）の利点及び感染との闘いのために、低ｐＨ値での全細胞製造方法が利用可能であれば、非常に有利と予想される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、真菌細胞及びＨＭＦからＦＤＣＡを製造する方法におけるそれらの使用を提供することが、本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
第１の側面において、本発明は、遺伝子改変を含む真菌細胞であって、前記遺伝子改変が、前記遺伝子改変を欠いた対応する親細胞と比較して、細胞内の特異的な２，５−フランジカルボン酸（ＦＤＣＡ）脱炭酸モノオキシゲナーゼ活性を低減させるものであり、前記遺伝子改変が、プロモーター及び遺伝子のコード配列のうちの少なくとも１つの少なくとも一部の欠失により、ＦＤＣＡ脱炭酸モノオキシゲナーゼをコードする内因性遺伝子の発現を排除する、真菌細胞に関する。細胞において、対応する親細胞の前記内因性遺伝子が、配列番号４の少なくとも１つと少なくとも４５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＦＤＣＡ脱炭酸モノオキシゲナーゼをコードすることが好ましい。遺伝子改変は、細胞のゲノム中の遺伝子からの少なくとも完全なＦＤＣＡ脱炭酸モノオキシゲナーゼをコードする内因性遺伝子のコード配列の欠失を含むか、又はそれからなることがさらに好ましい。１つより多い内因性遺伝子のコピーを含む細胞では、ＦＤＣＡ脱炭酸モノオキシゲナーゼをコードする内因性遺伝子の全てのコピーの発現が排除されていることが好ましい。
【００１０】
本発明に従う真菌細胞は、ＨＭＦをＦＤＣＡに酸化する天然の能力を有する細胞であることが好ましい。
【００１１】
本発明に従う好ましい真菌細胞は、好ましくは、ａ）遺伝子改変を欠いた対応する野生型細胞と比較して、５−ヒドロキシメチル−２−フランカルボン酸（ＨＭＦＣＡ）を５−ホルミル−２−フロ酸（ＦＦＣＡ）に酸化する能力を細胞に付与する、又は細胞内でＨＭＦＣＡをＦＦＣＡに酸化する酵素の比活性を増加させる、遺伝子改変；及びｂ）フランアルデヒドを対応するフランカルボン酸に酸化する能力を細胞に付与する遺伝子改変、又は遺伝子改変を欠いた対応する野生型細胞と比較して、細胞内でフランアルデヒドを対応するフランカルボン酸に酸化する酵素の比活性を増加させる遺伝子改変のうちの少なくとも１つである、さらなる遺伝子改変を含む。細胞において、ａ）における前記遺伝子改変は、ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を増加させる改変であり、前記ポリペプチドが、配列番号１及び２のうちの少なくとも１つのアミノ酸配列と少なくとも４５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；及び／又は、ｂ）における前記遺伝子改変は、フランアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を増加させる改変であり、前記アルデヒドデヒドロゲナーゼが、ｉ）ＨＭＦをＨＭＦＣＡに酸化する、ｉｉ）ＤＦＦをＦＦＣＡに酸化する、及びｉｉｉ）ＦＦＣＡをＦＤＣＡに酸化する能力の少なくとも１つを有し、前記ポリペプチドが、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも４５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことが好ましい。
【００１２】
本発明に従う真菌細胞は、好ましくは、ａ）ＨＭＦ及び／又はＦＦＣＡを対応するアルコールに還元する短鎖デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の発現を低減又は排除する遺伝子改変であって、好ましくは前記遺伝子が、配列番号５及び２５のうちの少なくとも１つと少なくとも４５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子の少なくとも１つである、遺伝子改変；ｂ）少なくとも１つのフラン化合物を輸送するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を増加させる遺伝子改変であって、前記ポリペプチドが、好ましくは配列番号６〜１０のうちの少なくとも１つのアミノ酸配列と少なくとも４５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、遺伝子改変；及びｃ）フラン異化に関与する遺伝子の転写活性化因子をコードする遺伝子の発現を変化させる遺伝子改変であって、好ましくは前記遺伝子が、配列番号１１と少なくとも４５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子である、遺伝子改変から選択される遺伝子改変をさらに含む。
【００１３】
別個の側面において、本発明は、ＨＭＦをＦＤＣＡに酸化する能力を有し、少なくとも１つのフラン化合物を輸送するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を増加遺伝子改変を含む真菌細胞であって、前記ポリペプチドが、好ましくは配列番号９及び１０のうちの少なくとも１つのアミノ酸配列と少なくとも４５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、真菌細胞に関係する。この側面に従う細胞は、ａ）遺伝子改変を欠いた対応する親細胞と比較して、細胞内の特異的なＦＤＣＡ脱炭酸モノオキシゲナーゼ活性を排除又は低減する遺伝子改変；ｂ）ＨＭＦＣＡをＦＦＣＡに酸化する能力を細胞に付与する、又は遺伝子改変を欠いた対応する親細胞と比較して、ＨＭＦＣＡをＦＦＣＡに酸化する酵素の比活性を細胞内で増加させる遺伝子改変；ｃ）フランアルデヒドを対応するフランカルボン酸に酸化する能力を細胞に付与する遺伝子改変、又は遺伝子改変を欠いた対応する野生型細胞と比較して、細胞内でフランアルデヒドを対応するフランカルボン酸に酸化する酵素の比活性を増加させる遺伝子改変；ｄ）ＨＭＦ及び／又はＦＦＣＡを対応するアルコールに還元する短鎖デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の発現を低減又は排除する遺伝子改変であって、好ましくは、前記遺伝子が、配列番号５及び２５のうちの少なくとも１つと少なくとも４５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子の少なくとも１つである、遺伝子改変；ｅ）少なくとも１つのフラン化合物を輸送するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を増加させる遺伝子改変であって、前記ポリペプチドが、好ましくは配列番号６〜８のうちの少なくとも１つのアミノ酸配列と少なくとも４５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、遺伝子改変；及びｆ）フラン異化に関与する遺伝子の転写活性化因子をコードする遺伝子の発現を変化させる遺伝子改変であって、好ましくは前記遺伝子が、配列番号１１と少なくとも４５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子である、遺伝子改変から選択されるさらなる遺伝子改変を含むことが好ましい。
【００１４】
本発明の上記側面に従う細胞は、好ましくは、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、オーレオバシジウム属（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フィリバシジウム属（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコーラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルテ属（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリマスチクス属（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペシロミセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ピロミセス属（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾフィラム属（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、タラロマイセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスカス属（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、及びウスチラゴ属（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）からなる群からの属から選択される糸状菌細胞であり、より好ましくは、細胞は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フォエチダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・ソジャエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、タラロマイセス・エメルソニイ（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、ミセリオフトラ・テルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、トリコデルマ・レーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、ペニシリウム・クリソゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、ペニシリウム・シンプリシッシマム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｉｍｐｌｉｃｉｓｓｉｍｕｍ）、及びペニシリウム・ブラシリアヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｂｒａｓｉｌｉａｎｕｍ）からなる群からの種から選択される糸状菌細胞であり；又は、細胞は、サッカロミケス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、シゾサッカロミケス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クロケラ属（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）、シュワンニオミセス属（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、デバロミセス属（Ｄｅｂａｒｏｍｙｃｅｓ）、サッカロミコプシス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｃｏｐｓｉｓ）、サッカロミコード属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｄｅｓ）、ウィッカーハミア属（Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉａ）、デバリオミセス属（Ｄｅｂａｙｏｍｙｃｅｓ）、ハンセニアスポラ属（Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ）、オガタエア属（Ｏｇａｔａｅａ）、クライシア属（Ｋｕｒａｉｓｈｉａ）、コマガタエラ属（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ）、メチニコウイア属（Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ）、ウィリオプシス属（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ）、ナカザワエア属（Ｎａｋａｚａｗａｅａ）、トルラスポラ属（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）、ブレラ属（Ｂｕｌｌｅｒａ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、及びスポロボロミセス属（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）からなる群からの属から選択される酵母細胞であり、より好ましくは、細胞は、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）及びピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）からなる群からの種から選択される酵母細胞である。
【００１５】
さらなる側面において、本発明は、ＨＭＦＣＡの存在下、細胞によるＨＭＦＣＡの酸化をもたらす条件下で、本発明に従う真菌細胞をインキュベートするステップを含む、ＨＭＦＣＡをＦＦＣＡに酸化する方法であって、前記細胞が、ＨＭＦＣＡをＦＦＣＡに酸化する能力を有する酵素を発現する、方法に関する。
【００１６】
別の側面において、本発明は、ＦＤＣＡの１つ又は複数のフラン前駆体を含む培地中、好ましくは細胞によるＦＤＣＡのフラン前駆体のＦＤＣＡへの酸化、及び任意選択でＦＤＣＡの回収をもたらす条件下で、本発明に従う真菌細胞をインキュベートするステップを含む、ＦＤＣＡを製造する方法であって、好ましくはＦＤＣＡの少なくとも１つのフラン前駆体が、ＨＭＦ、２，５−ジヒドロキシメチルフラン（ＤＨＦ）、ＨＭＦＣＡ、ＦＦＣＡ及び２，５−ジホルミルフラン（ＤＦＦ）からなる群から選択され、そのうちＨＭＦが最も好ましく、前記ＦＤＣＡのフラン前駆体が、１つ又は複数のヘキソース糖、好ましくはリグノセルロースバイオマスから得られる１つ又は複数のヘキソース糖から、好ましくは酸触媒脱水により得られ、好ましくは前記ＦＤＣＡが、酸沈殿とそれに続く冷却結晶化及び／又は溶媒抽出を含む方法によって培地から回収される、方法に関する。本方法において、前記培地は、２．０〜３．０の範囲のｐＨを有し、好ましくは前記ＦＤＣＡが、それが生成する酸性培地から沈殿し、酸沈殿とそれに続く冷却結晶化を含む方法によって培地から回収されることが好ましい。
【００１７】
なおさらなる側面において、本発明は、少なくとも２つのＦＤＣＡモノマーからポリマーを製造する方法であって、ａ）本発明に従う方法でＦＤＣＡモノマーを調製するステップ；及びｂ）ステップａ）で得られた前記ＦＤＣＡモノマーからポリマーを製造するステップを含む方法に関係し、ここで、前記ポリマーは、ＦＤＣＡモノマーとジオールモノマーを混合し、混合物をＦＤＣＡモノマーとジオールモノマーが重合する条件に導くことにより製造されることが好ましい。
【００１８】
最後の側面において、本発明は、ＦＤＣＡへの１つ又は複数のフラン前駆体の生物学的変換のための、本発明に従う真菌細胞、又はＦＤＣＡのフラン前駆体をＦＤＣＡに変換する能力を有する１つ又は複数の細菌酵素を発現する真菌細胞の使用であって、好ましくは、ＦＤＣＡの少なくとも１つのフラン前駆体が、ＨＭＦ、ＤＨＦ、ＨＭＦＣＡ、ＦＦＣＡ及びＤＦＦからなる群から選択され、そのうちＨＭＦが最も好ましい、使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】それぞれｈｙｇＢ及びｐｈｌｅｏ抗生物質マーカーを使用した、ｈｍｆＫ１（上）及びｈｍｆＫ３（下）の欠失を作成するためのスプリットマーカーアプローチ。
【図２Ａ】５ｍＭのグルコースと６ｍＭのＨＭＦを添加した最小培地において、２５０ｒｐｍの振盪フラスコ中、３０℃で増殖させた、野生型Ｐ．ブラシリアヌムＣ１（Ａ）、及びＰ．ブラシリアヌムＣ１破壊変異株ΔｈｍｆＫ１＃２６（Ｂ）、ΔｈｍｆＫ１＃３０（Ｃ）及びΔｈｍｆＫ３＃４３（Ｄ）の培養上清中において測定されたＨＭＦ、ＦＤＣＡ、及び中間体の濃度。
【図２Ｂ】５ｍＭのグルコースと６ｍＭのＨＭＦを添加した最小培地において、２５０ｒｐｍの振盪フラスコ中、３０℃で増殖させた、野生型Ｐ．ブラシリアヌムＣ１（Ａ）、及びＰ．ブラシリアヌムＣ１破壊変異株ΔｈｍｆＫ１＃２６（Ｂ）、ΔｈｍｆＫ１＃３０（Ｃ）及びΔｈｍｆＫ３＃４３（Ｄ）の培養上清中において測定されたＨＭＦ、ＦＤＣＡ、及び中間体の濃度。
【図２Ｃ】５ｍＭのグルコースと６ｍＭのＨＭＦを添加した最小培地において、２５０ｒｐｍの振盪フラスコ中、３０℃で増殖させた、野生型Ｐ．ブラシリアヌムＣ１（Ａ）、及びＰ．ブラシリアヌムＣ１破壊変異株ΔｈｍｆＫ１＃２６（Ｂ）、ΔｈｍｆＫ１＃３０（Ｃ）及びΔｈｍｆＫ３＃４３（Ｄ）の培養上清中において測定されたＨＭＦ、ＦＤＣＡ、及び中間体の濃度。
【図２Ｄ】５ｍＭのグルコースと６ｍＭのＨＭＦを添加した最小培地において、２５０ｒｐｍの振盪フラスコ中、３０℃で増殖させた、野生型Ｐ．ブラシリアヌムＣ１（Ａ）、及びＰ．ブラシリアヌムＣ１破壊変異株ΔｈｍｆＫ１＃２６（Ｂ）、ΔｈｍｆＫ１＃３０（Ｃ）及びΔｈｍｆＫ３＃４３（Ｄ）の培養上清中において測定されたＨＭＦ、ＦＤＣＡ、及び中間体の濃度。
【図３Ａ】５ｍＭのクエン酸及び６ｍＭのＨＭＦを添加した最小培地において、２５０ｒｐｍの振盪フラスコ中、３０℃で増殖させた、野生型Ｐ．ブラシリアヌムＣ１（Ａ）、及びＰ．ブラシリアヌムＣ１破壊変異株ΔｈｍｆＫ１＃２６（Ｂ）、ΔｈｍｆＫ１＃３０（Ｃ）及びΔｈｍｆＫ３＃４３（Ｄ）の培養上清中で測定されたＨＭＦ、ＦＤＣＡ及び中間体の濃度。４日後、＃２６及び＃３０のグルコース含有培養物の約１％が、クエン酸を含むフラスコに再播種するために使用された。
【図３Ｂ】５ｍＭのクエン酸及び６ｍＭのＨＭＦを添加した最小培地において、２５０ｒｐｍの振盪フラスコ中、３０℃で増殖させた、野生型Ｐ．ブラシリアヌムＣ１（Ａ）、及びＰ．ブラシリアヌムＣ１破壊変異株ΔｈｍｆＫ１＃２６（Ｂ）、ΔｈｍｆＫ１＃３０（Ｃ）及びΔｈｍｆＫ３＃４３（Ｄ）の培養上清中で測定されたＨＭＦ、ＦＤＣＡ及び中間体の濃度。４日後、＃２６及び＃３０のグルコース含有培養物の約１％が、クエン酸を含むフラスコに再播種するために使用された。
【図３Ｃ】５ｍＭのクエン酸及び６ｍＭのＨＭＦを添加した最小培地において、２５０ｒｐｍの振盪フラスコ中、３０℃で増殖させた、野生型Ｐ．ブラシリアヌムＣ１（Ａ）、及びＰ．ブラシリアヌムＣ１破壊変異株ΔｈｍｆＫ１＃２６（Ｂ）、ΔｈｍｆＫ１＃３０（Ｃ）及びΔｈｍｆＫ３＃４３（Ｄ）の培養上清中で測定されたＨＭＦ、ＦＤＣＡ及び中間体の濃度。４日後、＃２６及び＃３０のグルコース含有培養物の約１％が、クエン酸を含むフラスコに再播種するために使用された。
【図３Ｄ】５ｍＭのクエン酸及び６ｍＭのＨＭＦを添加した最小培地において、２５０ｒｐｍの振盪フラスコ中、３０℃で増殖させた、野生型Ｐ．ブラシリアヌムＣ１（Ａ）、及びＰ．ブラシリアヌムＣ１破壊変異株ΔｈｍｆＫ１＃２６（Ｂ）、ΔｈｍｆＫ１＃３０（Ｃ）及びΔｈｍｆＫ３＃４３（Ｄ）の培養上清中で測定されたＨＭＦ、ＦＤＣＡ及び中間体の濃度。４日後、＃２６及び＃３０のグルコース含有培養物の約１％が、クエン酸を含むフラスコに再播種するために使用された。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
定義
用語「相同性」、「配列同一性」などは、本明細書では互換的に使用される。本明細書では、配列同一性は、配列を比較することにより決定される、２つ以上のアミノ酸（ポリペプチド又はタンパク質）配列又は２つ以上の核酸（ポリヌクレオチド）配列間の関係として定義される。当該技術分野において、「同一性」は、場合によっては、そのような配列の連なり間の一致により決定されるアミノ酸又は核酸配列間の配列関連性の程度も意味する。２つのアミノ酸配列間の「類似性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列とその保存されたアミノ酸置換を第２のポリペプチドの配列と比較することにより決定される。「同一性」及び「類似性」は、既知の方法で容易に計算され得る。
【００２１】
「配列同一性」及び「配列類似性」は、２つの配列の長さに応じて、グローバル又はローカルアラインメントアルゴリズムを使用した、２つのペプチド又は２つのヌクレオチド配列のアラインメントによって決定され得る。同様な長さの配列は、配列を全長にわたって最適にアライメントするグローバルアライメントアルゴリズム（例えば、ニードルマン−ウンシュ）を用いてアライメントされるのが好ましく、一方、実質的に異なる長さの配列は、ローカルアライメントアルゴリズム（例えば、スミス−ウォーターマン）を用いてアライメントされるのが好ましい。配列が（例えば、デフォルトのパラメーターを使用してＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴプログラムによって最適にアライメントされた際に）少なくとも特定の最小割合の配列同一性（以下で定義）を共有する場合、それらは「実質的に同一」又は「本質的に類似」と呼ばれ得る。ＧＡＰは、ニードルマンとウンシュのグローバルアライメントアルゴリズムを使用して、２つの配列をその全長（完全長）にわたってアライメントし、一致の数を最大化し、ギャップの数を最小化する。グローバルアライメントは、好適には２つの配列が同様な長さを有する場合に配列の同一性を決定するために用いられる。一般的に、ギャップ作成ペナルティ＝５０（ヌクレオチド）／８（タンパク質）及びギャップ拡張ペナルティ＝３（ヌクレオチド）／２（タンパク質）のＧＡＰデフォルトパラメーターが使用される。ヌクレオチドの場合、使用されるデフォルトのスコアリングマトリクスはｎｗｓｇａｐｄｎａであり、タンパク質の場合、デフォルトのスコアリングマトリクスはＢｌｏｓｕｍ６２である（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ，１９９２，ＰＮＡＳ  ８９，９１５−９１９）。配列アライメント及びパーセント配列同一性のスコアは、Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．，９６８５  Ｓｃｒａｎｔｏｎ  Ｒｏａｄ，サンディエゴ，ＣＡ  ９２１２１−３７５２  ＵＳＡから入手可能なＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅバージョン１０．３などのコンピュータープログラムを使用して、又はＥｍｂｏｓｓＷＩＮバージョン２．１０．０の「ｎｅｅｄｌｅ」プログラム（グローバルニードルマン−ウンシュアルゴリズムを使用）若しくは「ｗａｔｅｒ」（ローカルスミス−ウォーターマンアルゴリズムを使用）などのオープンソースソフトウェアを使用して、上記のＧＡＰと同じパラメーターを用いるか、又はデフォルトの設定を用いて決定され得る（「ｎｅｅｄｌｅ」と「ｗａｔｅｒ」の両方、及びタンパク質とＤＮＡアライメントの両方について、デフォルトのギャップ開放ペナルティは１０．０であり、デフォルトのギャップ拡張ペナルティは０．５である；デフォルトのスコアリングマトリクスは、タンパク質ではＢｌｏｓｓｕｍ６２、ＤＮＡではＤＮＡＦｕｌｌである）。配列が全長にわたって実質的に異なる場合は、スミス−ウォーターマンアルゴリズムを用いるもののような、ローカルアラインメントが好ましい。
【００２２】
或いは、パーセント類似性又は同一性は、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなどのアルゴリズムを使用して、公的データベースに対して検索することにより決定されてもよい。したがって、本発明の核酸及びタンパク質配列は、例えば、他のファミリーメンバー又は関連する配列を同定するために、公的データベースに対して検索を行うための「クエリ配列」としてさらに使用され得る。そのような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０のＢＬＡＳＴｎ及びＢＬＡＳＴｘプログラム（バージョン２．０）を使用して実行され得る。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索をＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて実行して、本発明の酸化還元酵素核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索をＢＬＡＳＴｘプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて実行して、本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のためにギャップのあるアライメントを取得するには、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２に記載されているようにＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴが利用され得る。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴｘ及びＢＬＡＳＴｎ）のデフォルトパラメーターが使用され得る。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／の米国バイオテクノロジー情報センターのホームページを参照されたい。
【００２３】
任意選択的に、アミノ酸類似性の程度を決定する際、当業者には明らかなように、当業者は、いわゆる「保存的」アミノ酸置換を考慮に入れてもよい。保存的アミノ酸置換とは、類似の側鎖を持つ残基の互換性を指す。保存的置換のためのアミノ酸残基の分類の例が、以下の表に示される。
【表１】
2020513816.tif 000002
【００２４】
代替的な保存的アミノ酸残基置換の分類。
【表２】
2020513816.tif 000003
【００２５】
代替的なアミノ酸残基の物理的及び機能的分類。
【表３】
2020513816.tif 000004
【００２６】
本明細書で使用される場合、用語「選択的にハイブリダイズしている」、「選択的にハイブリダイズする」及び類似の用語は、互いに少なくとも６６％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％、又はより好ましくは少なくとも９９％相同であるヌクレオチド配列が、典型的に互いにハイブリダイズしたままとなるハイブリダイゼーション及び洗浄の条件を記述することが意図されている。すなわち、そのようなハイブリダイズする配列は、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％、又はより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を共有し得る。
【００２７】
そのようなハイブリダイゼーション条件の非限定的な好ましい例は、約４５℃での６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）でのハイブリダイゼーション、それに続く約５０℃、好ましくは約５５℃、好ましくは約６０℃、さらにより好ましくは約６５℃における１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの１回以上の洗浄である。
【００２８】
非常にストリンジェントな条件は、例えば、約６８℃での５×ＳＳＣ／５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液／１．０％ＳＤＳにおけるハイブリダイゼーションと室温での０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳにおける洗浄を含む。或いは、洗浄は４２℃で行われてもよい。
【００２９】
当業者には、どの条件をストリンジェント及び非常にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に適用すべきかがわかると予想される。そのような条件に関する追加のガイダンスは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク；及びＡｕｓｕｂｅｌら（編），ＳａｍｂｒｏｏｋとＲｕｓｓｅｌｌ（２００１）“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク  １９９５，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ニューヨーク）において、当技術分野で容易に入手可能である。
【００３０】
もちろん、ポリＡ配列（ｍＲＮＡの３’末端ポリ（Ａ）領域など）又はＴ（又はＵ）残基の相補的区間にのみハイブリダイズするポリヌクレオチドは、そのようなポリヌクレオチドはポリ（Ａ）領域又はその相補体を含む任意の核酸分子（例えば、事実上あらゆる二本鎖ｃＤＮＡクローン）にハイブリダイズすると予想されることから、本発明の核酸の一部に特異的にハイブリダイズするために使用される本発明のポリヌクレオチドには含まれないと予想される。
【００３１】
「核酸構築物」又は「核酸ベクター」とは、本明細書において、組換えＤＮＡ技術の使用から生じる人工核酸分子を意味すると理解される。したがって、用語「核酸構築物」は、天然に存在する核酸分子を含まないが、核酸構築物は、天然に存在する核酸分子（の一部）を含み得る。「発現ベクター」又は「発現構築物」という用語は、そのような配列と適合する宿主細胞又は宿主生物において遺伝子の発現をもたらすことができるヌクレオチド配列を指す。これらの発現ベクターは典型的には、少なくとも適切な転写調節配列と、任意選択的に３’転写終結シグナルを含む。発現エンハンサー要素など、発現に影響を与えるのに必要又は役立つ追加の因子も存在し得る。発現ベクターは、適切な宿主細胞に導入され、宿主細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養においてコード配列の発現をもたらすことができると予想される。発現ベクターは、本発明の宿主細胞又は生物における複製に適していると予想される。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「プロモーター」又は「転写調節配列」という用語は、１つ又は複数のコード配列の転写を制御するように機能し、コード配列の転写開始部位の転写の方向に関して上流に位置し、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位、転写開始部位、及び転写因子結合部位、リプレッサー及びアクチベータータンパク質結合部位、並びにプロモーターからの転写量を調節するために直接又は間接的に作用することが当業者公知のヌクレオチドの任意の他の配列を含むがこれらに限定されない任意の他のＤＮＡ配列の存在によって構造的に同定される核酸断片を指す。「構成的」プロモーターは、ほとんどの生理学的及び発生的な条件下のほとんどの組織で活性なプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、例えば化学的誘導物質の適用により、生理学的又は発生的に調節されるプロモーターである。
【００３３】
用語「選択マーカー」は、当業者周知の用語であり、本明細書においては、発現時に、選択マーカーを含む１つ又は複数の細胞を選択するために使用され得る任意の遺伝子実体を記述するために使用される。用語「レポーター」は、マーカーと交換可能に使用され得るが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの可視マーカーを指すために主に使用される。選択可能なマーカーは、優勢又は劣性又は双方向性であり得る。
【００３４】
本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」という用語は、機能的関係にあるポリヌクレオチド要素の連結を指す。核酸は、別の核酸配列と機能的な関係に置かれる際、「作動可能に連結」される。例えば、転写調節配列は、コード配列の転写に影響を与える場合、コード配列に作動可能に連結されている。作動可能に連結されているとは、連結されているＤＮＡ配列が典型的に連続しており、２つのタンパク質コード領域を結合するために必要な場合には、連続して読み枠にあることを意味する。
【００３５】
「タンパク質」又は「ポリペプチド」という用語は、交換可能に使用され、特定の作用機序、大きさ、３次元構造又は起源に関係なく、アミノ酸の鎖からなる分子を指す。
【００３６】
用語「遺伝子」は、適切な調節領域（例えばプロモーター）に作動可能に連結されている、細胞内でＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）に転写される領域（転写領域）を含むＤＮＡ断片を意味する。遺伝子は通常、プロモーター、５’リーダー配列、コード領域、及びポリアデニル化部位を含む３’非翻訳配列（３’末端）など、いくつかの作動可能に連結された断片を含む。「遺伝子の発現」とは、適切な調節領域、特にプロモーターに作動可能に連結されたＤＮＡ領域が、生物学的に活性な、すなわち生物学的に活性なタンパク質又はペプチドに翻訳されることが可能なＲＮＡに転写されるプロセスを指す。「同種」という用語は、所与の（組換え）核酸又はポリペプチド分子と所与の宿主生物又は宿主細胞との関係を指し示すために使用される場合、本質的に核酸又はポリペプチド分子が同じ種、好ましくは同じ品種又は株の宿主細胞又は生物によって生成されることを意味すると理解される。宿主細胞に対して同種である場合、ポリペプチドをコードする核酸配列は（必ずしもそうではないが）通常、その天然の環境におけるものとは別の（異種の）プロモーター配列、及び該当する場合は、別の（異種の）分泌シグナル配列及び／又はターミネーター配列に作動可能に連結されると予想される。調節配列、シグナル配列、ターミネーター配列なども宿主細胞と同種であり得ることが理解される。これに関連して、「同種」の配列要素のみの使用は「自己クローン化」遺伝子改変生物（ＧＭＯ）の構築を可能とする（本明細書において自己クローン化は欧州指令９８／８１／ＥＣ付属書ＩＩにおけるように定義される）。２つの核酸配列の関連性を指し示すために使用される場合、「相同」という用語は、１つの一本鎖核酸配列が相補的な一本鎖核酸配列にハイブリダイズし得ることを意味する。ハイブリダイゼーションの程度は、配列間の同一性の量及び後述する温度や塩濃度などのハイブリダイゼーション条件を含む、多くの要因に依存し得る。
【００３７】
核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）又はタンパク質に関して使用される場合、「異種」及び「外因性」という用語は、それが存在する生物、細胞、ゲノム又はＤＮＡ又はＲＮＡ配列の一部として天然には生じない、又は、それが天然に見出されるのとは異なる細胞中、又はゲノム若しくはＤＮＡ若しくはＲＮＡ配列中の１つ又は複数の位置に見出される、核酸又はタンパク質を指す。異種及び外因性の核酸又はタンパク質は、それが導入される細胞にとって内因性ではなく、別の細胞から得られたか、合成的又は組換え的に生成されたものである。一般に、そのような核酸は、必ずしもそうではないが、ＤＮＡが転写又は発現される細胞によって通常は生成されないタンパク質、すなわち外因性タンパク質をコードする。同様に、外因性ＲＮＡは、外因性ＲＮＡが存在する細胞では通常発現されないタンパク質をコードする。異種／外因性の核酸及びタンパク質は、外来核酸又はタンパク質とも呼ばれる。本明細書では、それが発現される細胞にとって外来性であると当業者が認識すると予想される任意の核酸又はタンパク質が、異種又は外因性の核酸又はタンパク質という用語に包含される。異種及び外因性という用語は、核酸又はアミノ酸配列の非天然の組合せ、すなわち、組み合わされた配列のうちの少なくとも２つが互いに外来である組合せにも適用される。
【００３８】
本明細書において、酵素の「比活性」は、総宿主細胞タンパク質１ｍｇあたりの酵素活性の単位で通常表される、総宿主細胞タンパク質量あたりの特定の酵素の活性量を意味すると理解される。本発明の文脈において、特定の酵素の比活性は、（他の点では同一である）野生型宿主細胞におけるその酵素の比活性と比較して、増加又は減少され得る。
【００３９】
「フラン化合物」は、本明細書では、２，５−フラン−ジカルボン酸（ＦＤＣＡ）、及びＦＤＣＡに酸化され得るフラン基を有する任意の化合物であると理解されるが、後者は、本明細書では「ＦＤＣＡの前駆体」又は「ＦＤＣＡのフラン前駆体」と呼ばれる。ＦＤＣＡの前駆体は、少なくとも５−ヒドロキシメチルフルフラール（ＨＭＦ）、ＨＭＦ−ＯＨと呼ばれる２，５−ジヒドロキシメチルフラン（ＤＨＦ）又は２，５−ビス（ヒドロキシメチル）フラン（ＢＨＦ）、５−ヒドロキシメチル−２−フランカルボン酸又は５−ヒドロキシメチル−２−フロ酸（ＨＭＦＣＡ）、５−ホルミル−２−フロ酸（ＦＦＣＡ）、及び２，５−ジホルミルフラン（ＤＦＦ）を含む。「フラン化合物」において、フラン環又はその置換可能な任意の側基は、フラン環の任意の位置において、例えばＯＨ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルキル、アリル、アリール又はＲＯ−エーテル部分（環式基を含む）で置換されていてもよいことがさらに理解される。
【００４０】
「好気性条件」「酸素条件」又は好気性又は酸素発酵プロセスは、本明細書において、酸素の存在下で実行され、好ましくは少なくとも０．５、１、２、５、１０、２０、又は５０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈの速度で酸素が消費され、有機分子が電子供与体として働き、酸素が電子受容体として働く条件又は発酵プロセスと定義される。
【００４１】
「嫌気性又は無酸素条件」又は「嫌気性又は無酸素発酵プロセス」は、本明細書において、酸素の非存在下で実質的に実行され、有機分子が電子供与体と電子受容体の両方として機能する条件又は発酵プロセスと定義される。無酸素状態では、実質的に酸素は消費されず、好ましくは５、２、１、又は０．５ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ未満、より好ましくは０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈが消費され（すなわち、酸素消費は検出できない）、又は、発酵培地中に溶存酸素が実質的に検出不能であり、好ましくは、培地中の溶存酸素濃度は、空気飽和の２、１、０．５、０．２、０．１％未満、すなわち市販の酸素プローブの検出限界未満である。
【００４２】
本明細書における公的配列データベースで入手可能なヌクレオチド又はアミノ酸配列への言及は、この文書の提出日に入手可能な配列エントリーのバージョンを指す。
【００４３】
実施形態の説明
親宿主細胞
本発明は、宿主細胞が適切なフラン前駆体から２，５−フランジカルボン酸（ＦＤＣＡ）を生成できるようにするための宿主細胞の遺伝子改変に関する。この目的のために、本発明に従って多くの遺伝子改変が親宿主細胞に導入され得る。これらの改変は、多数の異種遺伝子の発現の導入、並びに、いくつかの内因性遺伝子の減少又は除去による、及び／又は、他の内因性遺伝子の発現を増加させる、すなわち過剰発現させることによる、親宿主細胞に既に存在する多くの内因性遺伝子の発現の改変を含む。これらの遺伝子改変は、本明細書の以下でさらに説明される。したがって、親宿主細胞は、本発明に従う遺伝子改変のいずれかが宿主細胞に導入される前の宿主細胞であると理解される。
【００４４】
本発明の親宿主細胞は、好ましくはフラン化合物を代謝する能力を天然に有する宿主細胞である。親宿主細胞は少なくともＦＤＣＡを分解する天然の能力を有するのが、より好ましい。本発明の親宿主細胞は、ＨＭＦをＦＤＣＡに酸化する天然の能力をさらに有し得る。所与の宿主細胞株が天然にＨＭＦをＦＤＣＡに酸化する、及び／又はＦＤＣＡを分解する能力を有するか否かは、１つ又は複数のＨＭＦ、ＨＭＦ−アルコール、ＨＭＦＣＡ及びＦＤＣＡを、好ましくは唯一の炭素源として消費して増殖する株の能力を、例えば本明細書の実施例に記載されるようにして決定することによって試験され得る。親宿主細胞は、ＦＤＣＡの分解を触媒する酵素をコードする内因性遺伝子を含むことが好ましい。内因性遺伝子は、ＦＤＣＡの分解を触媒する酵素を発現する機能的遺伝子であることが好ましい。ＦＤＣＡの分解を触媒する酵素は、本明細書においてさらに定義されるＦＤＣＡ脱炭酸モノオキシゲナーゼであることが好ましい。
【００４５】
本発明の親宿主細胞は、例えば、哺乳動物、昆虫、植物、真菌、又は藻類細胞などの真核細胞を含む、任意の適切な宿主細胞であり得る。しかしながら、宿主細胞は微生物細胞であることが好ましい。微生物宿主細胞は、原核細胞、好ましくは、例えばグラム陰性及びグラム陽性微生物の両方を含む細菌細胞であり得る。
【００４６】
しかしながら、本発明の親宿主細胞は、例えば真菌宿主細胞などの真核微生物宿主細胞であることが、より好ましい。本発明に従って改変される最も好ましい親宿主細胞は、酵母又は糸状菌宿主細胞である。
【００４７】
「真菌」は、本明細書において真核微生物と定義され、ユーミコチナ（Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ）亜種の全ての種を含む（Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｓ，Ｃ．Ｊ．，１９６２，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｏｒｙ  Ｍｙｃｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ニューヨーク）。したがって、「真菌」及び「真菌性」という用語は、糸状菌及び酵母の両方を含む、又は指す。
【００４８】
「糸状菌」は本明細書において、ユーミコチナ亜種及びオーミコタ（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）の全ての糸状形態を含む真核微生物として定義される（“Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｆｕｎｇｉ”，第１０版，２００８，ＣＡＢＩ，英国，ｗｗｗ．ｃａｂｉ．ｏｒｇにおける定義）。糸状菌は、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン、及びその他の複雑な多糖類で構成される菌糸壁によって特徴付けられる。栄養成長は菌糸伸長によるものであり、炭素異化作用は絶対好気性である。糸状菌株は、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、オーレオバシジウム属（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フィリバシジウム属（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコーラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルテ属（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリマスチクス属（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペシロミセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ピロミセス属（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾフィラム属（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、タラロマイセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスカス属（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、及びウスチラゴ属（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）の株を含むが、これらに限定はされない。
【００４９】
本発明のための親宿主細胞として好ましい糸状菌種は、アスペルギルス属、ミセリオフトラ属、ペニシリウム属、タラロマイセス属又はトリコデルマ属の種に属し、より好ましくは、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・フォエチダス、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・ソジャエ、アスペルギルス・フミガーツス、タラロマイセス・エメルソニイ、アスペルギルス・オリゼ、ミセリオフトラ・テルモフィラ、トリコデルマ・レーセイ、ペニシリウム・クリソゲヌム、ペニシリウム・シンプリシッシマム、及びペニシリウム・ブラシリアヌムから選択される種に属する。これらの糸状菌種の適切な株は、それ自体が当業者公知の寄託機関から入手可能である。
【００５０】
「酵母」は、本明細書では真核微生物と定義され、主に単細胞形態で増殖するユーミコチナ亜種の全ての種を含む（Ｙｅａｓｔｓ：ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｊ．Ａ．Ｂａｒｎｅｔｔ，Ｒ．Ｗ．Ｐａｙｎｅ，Ｄ．Ｙａｒｒｏｗ，２０００，第３版，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，英国ケンブリッジ；及び、Ｔｈｅ  ｙｅａｓｔｓ，ａ  ｔａｘｏｎｏｍｉｃ  ｓｔｕｄｙ，ＣＰ．Ｋｕｒｔｚｍａｎ及びＪ．Ｗ．Ｆｅｌｌ（編）１９９８，第４版，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌ．Ｂ．Ｖ．，アムステルダム、オランダ）。酵母は、単細胞の葉状体の出芽によって増殖するか、又は生物の分裂のいずれかによって増殖し得る。本発明における使用に好ましい酵母細胞は、サッカロミケス属、クルイベロミセス属、カンジダ属、ピキア属、シゾサッカロミケス属、ハンセヌラ属、クロケラ属、シュワンニオミセス属、ヤロウィア属、クリプトコッカス属、デバロミセス属、サッカロミコプシス属、サッカロミコード属、ウィッカーハミア属、デバリオミセス属、ハンセニアスポラ属、オガタエア属、クライシア属、コマガタエラ属、メチニコウイア属、ウィリオプシス属、ナカザワエア属、トルラスポラ属、ブレラ属、ロドトルラ属、及びスポロボロミセス属に属する。親酵母宿主細胞は、天然に嫌気性発酵、より好ましくはアルコール発酵、最も好ましくは嫌気性アルコール発酵が可能な細胞であり得る。クルイベロミセス・ラクティス、Ｓ．セレビシエ、ハンセヌラ・ポリモルファ（新名称：オガタエア・ヘンリチー（Ｏｇａｔａｅａ  ｈｅｎｒｉｃｉｉ））、ヤロウィア・リポリティカ、カンジダ・トロピカリス、及びピキア・パストリス（新名称：コマガタエラ・パストリス（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ））などの種からの酵母が、より好ましい。
【００５１】
特に細菌と比較すると、真菌は、例えば、酸、エタノール、及び他の有害な化合物に対する高い耐性、高い浸透圧耐性、高い発酵能力、及び一部の酵母については嫌気性増殖能力を含む、工業発酵プロセスのための多くの魅力的な特徴を有する。
【００５２】
宿主細胞は、好ましくは、低ｐＨに対する高い耐性をさらに有し、すなわち、５．０、４．０、３．５、３．２、３．０、２．９、２．８、２．７、２．６、２．５、２．４、２．３又は２．２８以下のｐＨで増殖することができ、乳酸、酢酸、ギ酸、及びフラン酸のような有機酸に対する耐性、及び高温への高い耐性を有する。宿主細胞のこれらの特徴又は活性のいずれかは、宿主細胞に天然に存在するか、遺伝子改変、好ましくは自己クローニング又は以下に記載される本発明の方法により、導入又は改変され得る。
【００５３】
適切な細胞は、培養細胞であり、発酵プロセス、例えば、液内発酵又は固体発酵で培養され得る細胞である。
【００５４】
本発明に従う真菌宿主細胞において生成される化合物の特定の用途に関して、宿主細胞の選択は、そのような用途に従ってなされ得る。例えば、本発明に従う宿主細胞において生成された化合物が食品用途に使用される場合、宿主細胞は、例えば、サッカロミケス種、例えば、Ｓ．セレビシエ、食品グレードのペニシリウム種又はヤロウィア・リポリティカのような食品グレードの生物から選択され得る。特定の用途は、食品、（動物）飼料、医薬品、作物保護などの農業、及び／又はパーソナルケア用途を含むが、これらに限定はされない。
【００５５】
遺伝子組み換え細胞
第１の側面において、本発明は、細胞、好ましくは遺伝子改変を含む真菌細胞に関係する。細胞の遺伝子改変は、好ましくは、遺伝子改変を欠いた対応する野生型細胞と比較して、少なくとも２，５−フランジカルボン酸（ＦＤＣＡ）の分解を触媒する酵素の比活性を低減又は排除する遺伝子改変である。
【００５６】
本発明の細胞は、さらに好ましくは、ａ）５−ヒドロキシメチル−２−フランカルボン酸（ＨＭＦＣＡ）を５−ホルミル−２−フロ酸（ＦＦＣＡ）に酸化する能力を細胞に付与する、又は遺伝子改変を欠いた対応する野生型細胞と比較して、細胞内でＨＭＦＣＡをＦＦＣＡに酸化する酵素の比活性を増加させる、遺伝子改変；及び／又は、ｂ）フランアルデヒドを対応するフランカルボン酸に酸化する能力を細胞に付与する遺伝子改変、又は遺伝子改変を欠いた対応する野生型細胞と比較して、細胞内でフランアルデヒドを対応するフランカルボン酸に酸化する酵素の比活性を増加させる遺伝子改変のうちの１つを含む。
【００５７】
これらの遺伝子改変を有する好ましい細胞は、本明細書において以下にさらに特定される。
【００５８】
特異的な２，５−フランジカルボン酸（ＦＤＣＡ）脱炭酸モノオキシゲナーゼ活性の低減又は排除
本発明の細胞は、好ましくはＦＤＣＡを分解する能力を欠いた細胞である。本発明の細胞は、通常はＦＤＣＡを分解する能力を天然に有する真菌種の遺伝子改変細胞であり、その細胞は、ＦＤＣＡを分解するその本来の能力を低減又は排除するように遺伝子改変されている。所与の真菌株が天然にＦＤＣＡを分解する能力を有するか否かは、１つ又は複数のＨＭＦ、ＨＭＦ−アルコール、ＨＭＦＣＡ及びＦＤＣＡを唯一の炭素源として消費して増殖する株の能力を、例えば本明細書の実施例に記載されるようにして決定することによって試験され得る。ＦＤＣＡを分解する能力を天然に有する真菌種の例は、本明細書の実施例に示されるペニシリウム・ブラシリアヌム、又はアスペルギルス・ニガーである（Ｒｕｍｂｏｌｄら，２０１０，Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｂｕｇｓ  １：５，３５９−３６６）。対照的に、サッカロミケス及びヤロウィア種などの酵母は、ＦＤＣＡを分解する能力を天然に欠いた真菌種の例である。
【００５９】
したがって、本発明の１つの実施形態では、細胞はＦＤＣＡを分解する細胞の天然の能力を低減又は排除するように遺伝子改変される。ＦＤＣＡを分解する細胞の能力を低減又は排除するために改変される遺伝子は、ＦＤＣＡ脱炭酸モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子であることが好ましい。
【００６０】
本発明の細胞における特異的なＦＤＣＡ脱炭酸モノオキシゲナーゼ活性を低減又は排除するために改変されるＦＤＣＡ脱炭酸モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子は、好ましくは、配列番号４（ｈｍｆＫ１）の少なくとも１つに対して、少なくとも４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子である。細胞内の特異的なＦＤＣＡ脱炭酸モノオキシゲナーゼ活性を低減又は排除するために改変される適切なｈｍｆＫ１オルソログは、例えば受託番号ＸＰ００１３９７３５３．２（配列番号２６）のアスペルギルス・ニガーｈｍｆＫ１オルソログである。本発明の細胞において、特異的なＦＤＣＡ脱炭酸モノオキシゲナーゼ活性は、活性の低減を引き起こす遺伝子改変を除いて遺伝的に同一である株の細胞と比較して、好ましくは、少なくとも１．０５、１．１、１．２、１．５、２．０、５．０、１０、２０、５０又は１００分の１に低減される。
【００６１】
ペニシリウム・ブラシリアヌムｈｍｆＫ１のオルソログがＦＤＣＡ脱炭酸モノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするか否かは、ＦＤＣＡの分解ができない適切な宿主細胞でのポリペプチドの発現と、ポリペプチドの発現が細胞にＦＤＣＡを分解する能力を付与するか否かを検出することによりアッセイされ得る。ＦＤＣＡ脱炭酸モノオキシゲナーゼ活性は、例えば、ＦＤＣＡ脱炭酸モノオキシゲナーゼについてアッセイされるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列がＰ．プチダ宿主細胞で発現される発現構築物を用いて、例えば国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０７２４０６の実施例に記載されるようにして、ＦＤＣＡを分解する能力について形質転換体を試験することでアッセイされ得る。或いは、ｈｍｆＫ１オルソログは、本明細書の実施例に記載されるようなペニシリウム・ブラシリアヌムのｈｍｆＫ１−破壊変異を補完する能力について、唯一の炭素源としてＦＤＣＡ上で増殖する変異体の能力を回復する能力を試験することによりアッセイされ得る。
【００６２】
本発明の細胞において比活性が好ましくは低減又は排除されるＦＤＣＡ脱炭酸モノオキシゲナーゼをコードする本発明のヌクレオチド配列は、真菌、酵母又は細菌、例えば上記の起源生物と同じ門、綱又は属に属するもののゲノム及び／又はｃＤＮＡから、それ自体公知のヌクレオチド配列の単離方法を使用して入手可能であり、それらにおいて同定され得る（例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋとＲｕｓｓｅｌｌ（２００１）“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨークを参照）。本発明のヌクレオチド配列は、例えば、ａ）縮重ＰＣＲプライマー（保存されたアミノ酸配列に基づいて設計）を適切な生物のゲノム及び／又はｃＤＮＡに対して使用して、本発明の細胞において比活性が好ましくは低減又は排除される酵素をコードするヌクレオチド配列の一部を含むＰＣＲ断片を生成し；ｂ）ステップａ）で得られたＰＣＲ断片をプローブとして使用して、生物のｃＤＮＡ及び／又はゲノムライブラリーをスクリーニングし；ｃ）その比活性が好ましくは本発明の細胞において低減又は排除される酵素をコードするヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを生成する、プロセスにおいて入手可能である。そのような保存された配列は、表４に提示された配列アラインメントにおいて同定可能であり、ここで、不変の位置は「＊」で指し示され、強く保存されている位置は「：」で指し示される。また、本発明の適切な宿主細胞は、表４から導かれ得、宿主は好ましくは、表４において同定されるオルソログの起源生物と同じ門、綱、目、科又は属に属する非病原性真菌又は酵母である。表４は、ペニシリウム・ブラシリアヌムｈｍｆＫ１と、公的データベースで利用可能な１０個の最も近いそのオルソログとのアミノ酸配列アライメントを示す。表４Ａは、Ｐ．ブラジリアヌムの配列とそのオルソログ間のパーセントアミノ酸同一性、及びオルソログの受託番号を示す。
【００６３】
したがって、好ましい実施形態では、本発明は、遺伝子改変を含む真菌細胞であって、前記遺伝子改変が、前記遺伝子改変を欠いた対応する親細胞と比較して、細胞内の特異的なＦＤＣＡ脱炭酸モノオキシゲナーゼ活性を低減させるものであり、前記遺伝子改変が、細胞のゲノムからプロモーター及び遺伝子のコード配列の少なくとも１つの少なくとも一部の欠失により、ＦＤＣＡ脱炭酸モノオキシゲナーゼをコードする内因性遺伝子の発現を排除する、真菌細胞に関する。ＦＤＣＡ脱炭酸モノオキシゲナーゼ遺伝子のコード配列の少なくとも一部が、細胞のゲノムから欠失していること、例えば、コード配列の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００％が削除されていることが好ましい。コード配列の少なくとも一部の欠失は、好ましくは、フレームシフトを引き起こす欠失及び／又は翻訳開始コドンを除去する欠失である。しかしながら、少なくともＦＤＣＡ脱炭酸モノオキシゲナーゼをコードする内因性遺伝子の完全なコード配列が欠失していることが最も好ましい。
【００６４】
本発明の遺伝子改変真菌細胞では、ＦＤＣＡ脱炭酸モノオキシゲナーゼをコードする内因性遺伝子の全てのコピーの発現が排除されていることがさらに好ましい。したがって、遺伝子改変を欠いた対応する親細胞が、例えば二倍体、異数体若しくは倍数体、及び／又は遺伝子増幅の結果として、ＦＤＣＡ脱カルボキシル化モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子の内在性コピーを１以上含む場合、ＦＤＣＡ脱炭酸モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子のありとあらゆるコピーの発現が排除されることが好ましい。
【００６５】
真菌ゲノムからの配列の欠失をもたらすための方法及び手段は、本明細書において以下に記載されている。
【００６６】
本発明の遺伝子改変真菌細胞は、ＨＭＦによって誘導されることが見出された別のヒドロキシラーゼ、すなわちＰ．ブラシリアヌムのｈｍｆＫ３にコードされるヒドロキシラーゼ又はそのオルソログの比活性を低減又は排除する遺伝子改変をさらに含み得る。本明細書の実施例で使用される条件下では、Ｐ．ブラジリアヌムのｈｍｆＫ３にコードされるヒドロキシラーゼの破壊は、真菌がＦＤＣＡを分解する能力に影響しなかったが、これは他の真菌及び／又は異なる条件下では異なり得る。そのような状況下では、本発明の真菌細胞は、配列番号２３（ｈｍｆＫ３）の少なくとも１つに対して、少なくとも４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むヒドロキシラーゼの比活性を低減又は排除する遺伝子改変を含むことが有用となり得る。本発明の細胞において、特異的なｈｍｆＫ３にコードされるヒドロキシラーゼ活性は、活性の低減を引き起こす遺伝子改変を除いて遺伝的に同一である株の細胞と比較して、少なくとも１．０５、１．１、１．２、１．５、２．０、５．０、１０、２０、５０又は１００分の１に低減していることが好ましい。
【００６７】
しかしながら、本明細書の実施例は、ｈｍｆＫ１にコードされるＦＤＣＡ脱炭酸モノオキシゲナーゼの破壊が、ＦＤＣＡを分解する細胞の能力を排除するのに十分であることを示す。したがって、無傷及び／又は機能的な内因性ｈｍｆＫ３遺伝子又はそのオルソログを含む遺伝子改変真菌細胞は、本発明に明白に含まれる。
【００６８】
ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ活性の導入又は増大
本発明の細胞は、好ましくは、５−ヒドロキシメチル−２−フランカルボン酸（ＨＭＦＣＡ）を５−ホルミルフロ酸（ＦＦＣＡ）に酸化する能力を有する細胞である。ＨＭＦＣＡをＦＦＣＡに酸化する細胞の能力は、例えば、ペニシリウム・ブラシリアヌムなどの細胞の内因性の活性であるか、又は、例えばアスペルギルス・ニガーなどの細胞に与えられる外因性の活性であり得る。ＨＭＦＣＡをＦＦＣＡに酸化する能力は、細胞の遺伝子改変、例えば、ＨＭＦＣＡをＦＦＣＡに酸化する能力を有するデヒドロゲナーゼ又はオキシダーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物を用いた細胞の形質転換により、細胞に付与されるか、又は細胞内で高められることが好ましい。デヒドロゲナーゼは、好ましくはアルコールデヒドロゲナーゼである（すなわちＥＣ１．１活性を有する）。したがって、細胞は好ましくは、ＨＭＦＣＡをＦＦＣＡに酸化する能力を有するデヒドロゲナーゼ又はオキシダーゼをコードするヌクレオチド配列の発現のための発現構築物を含む細胞である。本発明の好ましい細胞では、発現構築物は細胞内で発現可能であり、デヒドロゲナーゼ又はオキシダーゼの発現は好ましくは、細胞内でＨＭＦＣＡをＦＦＣＡへと酸化する能力を付与するか、又は、発現構築物を欠いた対応する細胞、例えば野生型細胞と比較して、細胞内でＨＭＦＣＡをＦＦＣＡへ酸化する酵素の比活性を増加させる。ＨＭＦＣＡをＦＦＣＡへと酸化する酵素の比活性は、好ましくは、発現構築物を欠いた対応する細胞と比較して、細胞内で少なくとも１．０５、１．１、１．２、１．５、２．０、５．０、１０、２０、５０又は１００倍増加している。
【００６９】
ＨＭＦＣＡをＦＦＣＡに酸化する能力を有する酵素は、好ましくはアルコールデヒドロゲナーゼである。ＨＭＦＣＡをＦＦＣＡに酸化する能力を有する好ましい酵素は、ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ活性を有するアルコールデヒドロゲナーゼである。ポリペプチドがＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ活性を有するか否かは、ＨＭＦＣＡをＦＦＣＡに酸化できない適切な宿主細胞におけるポリペプチドの発現と、ポリペプチドの発現が細胞にＨＭＦＣＡをＦＦＣＡに酸化する能力を付与するか否かを検出することによりアッセイされ得る。ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ活性は、例えば、ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ活性についてアッセイされるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、ｐＢＴ’ｈｍｆＨ−ａｄｈ（国際公開第２０１２／０６４１９５号に記載）のＣ．バシレンシスｈｍｆＨ遺伝子を置換しており、その後、ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ活性についてアッセイされるポリペプチドのコード配列を含むプラスミドが、ｐＪＮＮｈｍｆＴ１（ｔ）を含むＰ．プチダＫＴ２４４０Δｇｃｄに導入される（国際公開第２０１２／０６４１９５号にも記載されている）、発現構築物を使用してアッセイされ得る。ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ活性についてアッセイされるポリペプチドを発現するＰ．プチダの形質転換体が、ＨＭＦと共にインキュベートされ、試料がＦＤＣＡの分析のために定期的に採取される。ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ活性についてアッセイされるポリペプチド（及びＣ．バシレンシスｈｍｆＨ遺伝子）を欠いた対応するＰ．プチダ形質転換体と比較した、ＦＤＣＡの生産の増加は、ポリペプチドがＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ活性を有することの指標とみなされる。或いは、ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ活性についてアッセイされるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、例えば国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０７２４０６の実施例に記載されているように、真菌宿主細胞、好ましくはＳ．セレビシエ宿主細胞において発現されて、ポリペプチドの発現が、ＨＭＦからＦＦＣＡ及び／又はＦＤＣＡの両方を生成する能力を真菌宿主細胞に付与するか否かを検出することができる。
【００７０】
本発明の細胞において発現されるＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼは、好ましくはＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨなどのアデニンジヌクレオチド、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）、及びピロロキノリンキノロン（ＰＱＱ）から選択される補因子に依存するデヒドロゲナーゼである。本発明の細胞において発現されるＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼは、好ましくは二価カチオンに結合し、ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼがＺｎ結合性デヒドロゲナーゼであることが、より好ましい。
【００７１】
本発明の細胞において発現されるＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼは、さらに好ましくは、他のフランアルコール、好ましくは２位にヒドロキシ基を有するフランアルコールを、対応するアルデヒドに酸化する能力を有する（そのような能力も有する）アルコールデヒドロゲナーゼである。したがって、ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼは、好ましくは５−ヒドロキシメチルフルフラール（ＨＭＦ）を２，５−ジホルミルフラン（ＤＦＦ）に酸化する能力を有する。
【００７２】
１つの実施形態では、ＨＭＦＣＡをＦＦＣＡに酸化する能力を有するデヒドロゲナーゼをコードするヌクレオチド配列は、
（ａ）ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドであって、少なくとも配列番号１及び２（それぞれｈｍｆＬ１及びｈｍｆＬ２）のうちの１つ、より好ましくは配列番号１のアミノ酸配列に対して、少なくとも４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｂ）相補鎖が（ａ）のヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列；及び、
（ｃ）遺伝暗号の縮重のために、その配列が（ｂ）のヌクレオチド配列の配列と異なるヌクレオチド配列
からなる群から選択される。
【００７３】
したがって、本発明の好ましいヌクレオチド配列は、アスペルギルス属、ビソクラミス属（Ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｓ）、コクシジオイデス属（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）、ケトミウム属（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ）、ユータイパ属（Ｅｕｔｙｐａ）、エンドカルポン属（Ｅｎｄｏｃａｒｐｏｎ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ミクロスポルム属（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ）、ネオサルトリア属（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ）、ペニシリウム属、スポロトリクス属（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ）及びトリコフィトン属（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ）からなる群から選択される属の真菌、より好ましくは、コクシジオイデス・イミティス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ）、コクシジオイデス・ポサダシイ（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｐｏｓａｄａｓｉｉ）、エンドカルポン・プシルム（Ｅｎｄｏｃａｒｐｏｎ  ｐｕｓｉｌｌｒｕｍ）、ミクロスポルム・ギプセウム（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ  ｇｙｐｓｅｕｍ）、ペニシリウム・ブラジリアヌム及びスポロトリクス・シェンキー（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ  ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ）からなる群から選択される種の真菌、最も好ましくはＰ．ブラジリアヌムＣ１又はＭＧ１１株である真菌から得られ得る（又は天然に存在する）ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼの配列と同一のアミノ酸配列を有するＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼをコードする。
【００７４】
１つの実施形態において、ヌクレオチド配列は、例えば、野生型起源生物から単離され得るような、天然に存在するＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。或いは、ヌクレオチド配列は、上で定義された、対応する天然に存在するＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼと比較して、１つ又は複数のアミノ酸置換、挿入、及び／又は欠失を含むが、本明細書で定義される同一性又は類似性の範囲内である、ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼの任意の改変形態をコードし得る。したがって、１つの実施形態では、本発明のヌクレオチド配列は、そのアミノ酸配列が（表１及び２において「＊」で指し示される）各不変位置において、不変位置に存在するアミノ酸を少なくとも含む、ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼをコードする。アミノ酸配列はまた、強く保存された位置に存在するアミノ酸の１つを（表１及び２において「：」で指し示される）強く保存された位置に含むことが好ましい。また、アミノ酸配列は（表１及び２において「．」で指し示される）それほど強く保存されていない位置に、それほど強く保存されていない位置に存在するアミノ酸の１つもさらに含むことが、より好ましい。これらの不変で保存された位置以外のアミノ酸置換は、ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ活性に影響を与える可能性が低い。表１及び２は、ペニシリウム・ブラシリアヌムｈｍｆＬ１及びｈｍｆＬ２の各々と、公的データベースで入手可能な１０個の最も近いオルソログとのアミノ酸配列アラインメントをそれぞれ示す。表１Ａ及び２Ａは、Ｐ．ブラジリアヌムの配列とそれらのオルソログの間のパーセントアミノ酸同一性、及びオルソログの受託番号を示す。
【００７５】
ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする本発明のヌクレオチド配列は、真菌、酵母又は細菌、例えば上記の起源生物と同じ門、綱又は属に属するもののゲノム及び／又はｃＤＮＡから、それ自体は当該技術分野で周知のヌクレオチド配列の単離方法を使用して、入手可能である（例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋとＲｕｓｓｅｌｌ（２００１）“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨークを参照）。本発明のヌクレオチド配列は、例えば、ａ）縮重ＰＣＲプライマー（保存されたアミノ酸配列に基づいて設計）を適切な生物のゲノム及び／又はｃＤＮＡに対して使用して、ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の一部を含むＰＣＲ断片を生成し；ｂ）ステップａ）で得られたＰＣＲ断片をプローブとして使用して、生物のｃＤＮＡ及び／又はゲノムライブラリーをスクリーニングし；ｃ）ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを生成する、プロセスにおいて入手可能である。
【００７６】
本発明のＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼが本発明の細胞において十分なレベルで活性型で発現される可能性を高めるために、これらの酵素をコードするヌクレオチド配列、及び本発明の他の酵素（下記参照）は、好ましくは、対象の宿主細胞のコドン使用頻度に最適化するように適合される。宿主細胞のコドン使用頻度に対するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の適合性は、コドン適合指数（ＣＡＩ）として表され得る。本明細書において、コドン適合指数は、特定の宿主細胞又は生物において高度に発現される遺伝子のコドン使用頻度に対する遺伝子のコドン使用頻度の相対的適合性の測定値として定義される。各コドンの相対的な適合性（ｗ）は、同じアミノ酸の最も豊富なコドンの使用に対する、各コドンの使用の比率である。ＣＡＩ指数は、これらの相対的な適合値の幾何平均として定義される。非同義コドン及び終止コドン（遺伝暗号に依存）は除外される。ＣＡＩ値の範囲は０〜１であり、値が大きいほど、最も豊富なコドンの割合が高いことを指し示す（ＳｈａｒｐとＬｉ，１９８７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １５：１２８１−１２９５を参照；また、Ｊａｎｓｅｎら，２００３，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１（８）：２２４２−５１も参照）。適合されたヌクレオチド配列は、好ましくは少なくとも０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８又は０．９のＣＡＩを有する。適切なコドン最適化配列は、例えば、酵母細胞、好ましくはＳ．セレビシエ細胞での発現にコドン最適化された配列番号２７〜２９に挙げられている。
【００７７】
本発明のＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼをコードするヌクレオチド配列の発現のための核酸構築物で形質転換される真菌宿主細胞は、原則として、本発明のＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼが、好ましくは機能的、すなわち活性形態で適切に発現され得る任意の真菌宿主細胞であり得る。本発明の真菌宿主細胞は、好ましくは、フラン化合物の細胞内外への能動的又は受動的輸送が可能な宿主細胞である。本発明の好ましい宿主細胞は、特にＨＭＦＣＡ、ＦＦＣＡ及びＦＤＣＡなどのカルボキシル化されたフラン化合物を分解（例えば、脱炭酸）する検出可能な活性を欠くか、又は持たない。そのような宿主細胞は、好ましくはカルボキシル化されたフラン化合物を分解する能力を天然に欠いている。或いは、真菌宿主細胞は、本明細書で以下に記載されるように、カルボキシル化フラン化合物の分解を触媒する１つ又は複数の酵素の比活性を低減又は排除するように遺伝子改変され得る。
【００７８】
本発明のＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼをコードするヌクレオチド配列の発現のための発現構築物は、好ましくは、構築物で形質転換された宿主細胞に対して異種又は外因性の発現構築物である。構築物は、本明細書において、構築物が、宿主細胞中において天然に存在しない少なくとも１つの配列又は配列要素を含む場合、並びに／又は、構築物が、要素自体が宿主細胞中に天然に存在しても、宿主細胞では天然に存在しない組合せ及び／若しくは順序で少なくとも２つの配列要素を含む場合、構築物を含む宿主細胞に対して異種又は外因性であると理解される。
【００７９】
適切な宿主細胞における本発明のＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼをコードするヌクレオチド配列の発現のためのベクター及び発現構築物は、本明細書において以下、より詳細に説明される。
【００８０】
フランアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性の導入又は増大
本発明のＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼを発現する細胞は、上記のように、さらに好ましくはアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する（つまり、ＥＣ１．２の活性を有する）。アルデヒドデヒドロゲナーゼは、フランアルデヒドを変換できることが好ましい。アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性は、フランアルデヒドを対応するフランカルボン酸に酸化できることが、より好ましい。より具体的には、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性は、好ましくはｉ）ＨＭＦをＨＭＦＣＡに酸化すること、ｉｉ）２，５−ジホルミルフラン（ＤＦＦ）を５−ホルミル−２−フロ酸（ＦＦＣＡ）に酸化すること、及びｉｉｉ）ＦＦＣＡからＦＤＣＡへ酸化することのうち少なくとも１つを行うことができる。そのようなフランアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性は、細胞の内因性活性であっても、又は細胞に付与された外因性活性であってもよい。フランアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性は、発現構築物、例えば、細胞が既にＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼの発現のための第１の発現構築物を含む場合は、第２の発現構築物による細胞の形質転換によって細胞に付与されるか、又は細胞内で高められることが好ましい。
【００８１】
本発明の好ましい細胞においては、フランアルデヒドデヒドロゲナーゼの発現のための発現構築物が細胞内で発現可能であり、フランアルデヒドデヒドロゲナーゼの発現は、好ましくは、ｉ）ＨＭＦをＨＭＦＣＡへ酸化すること、ｉｉ）ＤＦＦをＦＦＣＡに酸化すること、ｉｉｉ）ＦＦＣＡをＦＤＣＡに酸化することのうちの少なくとも１つの酸化能力を付与するか、又は、発現構築物を欠いた対応する細胞、例えば、野生型細胞と比較して、これらの能力の少なくとも１つを備えたフランアルデヒドデヒドロゲナーゼの比活性を細胞内で増加させる。フランアルデヒドデヒドロゲナーゼの比活性は、発現構築物を欠いた対応する細胞と比較して、好ましくは、細胞内で少なくとも１．０５、１．１、１．２、１．５、２．０、５．０、１０、２０、５０又は１００倍増加する。
【００８２】
ポリペプチドのｉ）ＨＭＦからＨＭＦＣＡ、ｉｉ）ＤＦＦからＦＦＣＡ、及びｉｉｉ）ＦＦＣＡからＦＤＣＡへの酸化のうちの少なくとも１つの酸化能力は、例えば、国際公開第２０１２／０６４１９５号の実施例ＩＶに記載されているように、Ｐ．プチダ宿主細胞、好ましくはＰ．プチダＫＴ２４４０宿主細胞におけるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とＣ．バシレンシスＨＭＦ１４のＨｍｆＨ及びＨｍｆＴ１遺伝子との同時発現、１０ｍＭのＨＭＦ中でのＰ．プチダ細胞のインキュベーション、及びポリペプチドを発現しない対応するＰ．プチダ細胞と比較した蓄積ＦＤＣＡの増加の検出により、アッセイされ得る。ＨＭＦをＨＭＦＣＡに酸化するポリペプチドの能力は、Ｋｏｏｐｍａｎら  ２０１０，ＰＮＡＳ（上記）に記載されているようにしてもアッセイされ得る。本明細書において、Ｃ．バシレンシスＨＭＦ１４のｈｍｆＴ１遺伝子を発現する株は、配列番号５５のアミノ酸配列を有する遺伝子産物を発現すると理解される。或いは、ｉ）ＨＭＦからＨＭＦＣＡ、ｉｉ）ＤＦＦからＦＦＣＡ、及びｉｉｉ）ＦＦＣＡからＦＤＣＡへの酸化のうちの少なくとも１つの酸化能力についてアッセイされるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、例えば、国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０７２４０６の実施例で説明されているように、ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼを有する真菌宿主細胞、好ましくはＳ．セレビシエ宿主細胞において共発現されることができ、ポリペプチドの発現がポリペプチドを発現しない対応する真菌宿主細胞と比較して蓄積ＦＤＣＡの増加を引き起こすか否かが検出される。
【００８３】
本発明の細胞において発現されるフランアルデヒドデヒドロゲナーゼは、好ましくはＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨなどのアデニンジヌクレオチド、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）、及びピロロキノリンキノロン（ＰＱＱ）から選択される補因子に依存するデヒドロゲナーゼである。
【００８４】
１つの実施形態では、フランアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするヌクレオチド配列は、
ａ）配列番号３（ｈｍｆＮ１にコードされるアルデヒドデヒドロゲナーゼ）の少なくとも１つのアミノ酸配列に対して少なくとも４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ｉ）ＨＭＦをＨＭＦＣＡに酸化する、ｉｉ）ＤＦＦをＦＦＣＡに酸化する、及びｉｉｉ）ＦＦＣＡをＦＤＣＡに酸化する能力のうちの少なくとも１つを有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
ｂ）相補鎖が（ａ）のヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列；及び、
ｃ）遺伝暗号の縮重のために、その配列が（ｂ）のヌクレオチド配列の配列と異なるヌクレオチド配列
からなる群から選択される。
【００８５】
したがって、本発明の好ましいヌクレオチド配列は、アスペルギルス属、ユータイパ属、ネオサルトリア属、ペニシリウム属、ポドスポラ属（Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ）、セドスポリウム属（Ｓｃｅｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）及びスポロトリクス属からなる群から選択される属の真菌、より好ましくは、ユータイパ・ラタ（Ｅｕｔｙｐａ  ｌａｔａ）、ペニシリウム・ブラジリアヌム、ポドスポラ・アンセリーナ、セドスポリウム・アピオススペルマム（Ｓｃｅｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ａｐｉｏｓｐｅｒｍｕｍ）及びスポロトリクス・シェンキーからなる群から選択される種の真菌、最も好ましくはＰ．ブラジリアヌムＣ１又はＭＧ１１株である真菌から得られ得る（又はその中に天然に存在する）フランアルデヒドデヒドロゲナーゼと同一のアミノ酸配列を有するフランアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする。
【００８６】
１つの実施形態において、ヌクレオチド配列は、例えば、野生型起源生物から単離され得るような、天然に存在するフランアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。或いは、ヌクレオチド配列は、上で定義された、対応する天然に存在するフランアルデヒドデヒドロゲナーゼと比較して、１つ又は複数のアミノ酸置換、挿入、及び／又は欠失を含むが、本明細書で定義される同一性又は類似性の範囲内である、フランアルデヒドデヒドロゲナーゼの任意の改変形態をコードし得る。したがって、１つの実施形態では、本発明のヌクレオチド配列は、そのアミノ酸配列が（表３において「＊」で指し示される）各不変位置において、不変位置に存在するアミノ酸を少なくとも含む、フランアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする。アミノ酸配列はまた、強く保存された位置に存在するアミノ酸の１つを（表３において「：」で指し示される）強く保存された位置に含むことが好ましい。また、アミノ酸配列は（表３において「．」で指し示される）それほど強く保存されていない位置に、それほど強く保存されていない位置に存在するアミノ酸の１つもさらに含むことが、より好ましい。これらの不変で保存された位置以外のアミノ酸置換は、フランアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性に影響を与える可能性が低い。表３は、ペニシリウム・ブラシリアヌムｈｍｆＮ１と、公的データベースで利用可能な１０個の最も近いそのオルソログとのアミノ酸配列アライメントを示す。表３Ａは、Ｐ．ブラジリアヌムの配列とそのオルソログ間のパーセントアミノ酸同一性、及びオルソログの受託番号を示す。
【００８７】
フランアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする本発明のヌクレオチド配列は、真菌、酵母又は細菌、例えば上記の起源生物と同じ門、綱又は属に属するもののゲノム及び／又はｃＤＮＡから、それ自体は当該技術分野で周知のヌクレオチド配列の単離方法を使用して、入手可能である（例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋとＲｕｓｓｅｌｌ（２００１）“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨークを参照）。本発明のヌクレオチド配列は、例えば、ａ）（保存されたアミノ酸配列に基づき設計された）縮重ＰＣＲプライマーが、適切な生物のゲノム及び／又はｃＤＮＡに対して使用されて、フランアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の一部を含むＰＣＲ断片を生成し；ｂ）ステップａ）で得られたＰＣＲ断片をプローブとして使用して、生物のｃＤＮＡ及び／又はゲノムライブラリーをスクリーニングし；ｃ）フランアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを生成する方法で入手可能である。
【００８８】
本発明のフランアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするヌクレオチド配列の発現のための核酸構築物で形質転換される真菌宿主細胞は、好ましくは、ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼをコードするヌクレオチド配列の発現のための核酸構築物による形質転換のための上記の真菌宿主細胞であって、細胞中で、フランアルデヒドデヒドロゲナーゼが、好ましくは機能的、すなわち活性な形態で適切に発現され得る、真菌宿主細胞である。フランアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするヌクレオチド配列の発現のための核酸構築物で形質転換される真菌宿主細胞は、ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼをコードするヌクレオチド配列も発現するのが好ましく、細胞が、ＨＭＦＣＡをＦＦＣＡに酸化する能力を細胞に付与するか、又は細胞中で増加させるＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼの発現構築物を含むことがより好ましい。上記のように、そのような真菌宿主細胞は、好ましくは細胞内外へのフラン化合物の能動的又は受動的輸送が可能であり、好ましくはカルボキシル化フラン化合物を分解する（例えば、脱炭酸する）検出可能な活性を欠くか、又は有さない。
【００８９】
本発明のフランアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするヌクレオチド配列の発現のための発現構築物は、好ましくは、構築物で形質転換された宿主細胞に対して異種又は外因性の発現構築物である。構築物は、本明細書において、構築物が、宿主細胞中において天然に存在しない少なくとも１つの配列又は配列要素を含む場合、並びに／又は、構築物が、要素自体が宿主細胞中に天然に存在しても、宿主細胞では天然に存在しない組合せ及び／若しくは順序で少なくとも２つの配列要素を含む場合、構築物を含む宿主細胞に対して異種又は外因性であると理解される。
【００９０】
適切な宿主細胞における本発明のフランアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするヌクレオチド配列の発現のためのベクター及び発現構築物は、本明細書において以下、より詳細に説明される。
【００９１】
フラン化合物の代謝のための代替経路の低減又は排除
ＨＭＦ及びＦＤＣＡの他のフラン前駆体の代謝のための代替内因性経路もまた、本発明の細胞中に存在し得る。そのような代替経路は、ＨＭＦ及びＦＤＣＡの他のフラン化合物前駆体からのＦＤＣＡの生成と競合する。したがって、そのような代替経路における酵素の比活性もまた、本発明の細胞において低減又は排除されることが好ましい。そのような内因性の代替経路の１つは、例えば短鎖デヒドロゲナーゼなどのデヒドロゲナーゼによるＨＭＦ及び／又はＦＦＣＡの対応するアルコールへの還元である。ＨＭＦ及びＦＤＣＡの他のフラン前駆体を代謝するための代替経路の比活性を低減又は排除するために改変されるそのような短鎖デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、好ましくは、配列番号５（ｈｍｆＭ）に対して、少なくとも４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子である。本発明の細胞において、特異的な短鎖デヒドロゲナーゼ活性は、活性の低減を引き起こす遺伝子改変を除いて遺伝的に同一である株の細胞と比較して、好ましくは、少なくとも１．０５、１．１、１．２、１．５、２．０、５．０、１０、２０、５０又は１００分の１に低減される。
【００９２】
本発明の細胞において比活性が好ましくは低減又は排除される短鎖デヒドロゲナーゼをコードするヌクレオチド配列は、真菌、酵母又は細菌、例えば上記の起源生物と同じ門、綱又は属に属するもののゲノム及び／又はｃＤＮＡから、それ自体公知のヌクレオチド配列の単離方法を使用して入手可能であり、それらにおいて同定され得る（例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋとＲｕｓｓｅｌｌ（２００１）“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨークを参照）。本発明のヌクレオチド配列は、例えば、ａ）（保存されたアミノ酸配列に基づき設計された）縮重ＰＣＲプライマーが、適切な生物のゲノム及び／又はｃＤＮＡに対して使用されて、比活性が好ましくは本発明の細胞において低減又は排除されている酵素をコードするヌクレオチド配列の一部を含むＰＣＲ断片を生成し；ｂ）ステップａ）で得られたＰＣＲ断片をプローブとして使用して、生物のｃＤＮＡ及び／又はゲノムライブラリーをスクリーニングし；ｃ）比活性が好ましくは本発明の細胞において低減又は排除されている酵素をコードするヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを生成する方法で入手可能である。そのような保存された配列は、表５に提示された配列アラインメントにおいて同定可能であり、ここで、不変の位置は「＊」で指し示され、強く保存されている位置は「：」で指し示される。また、本発明の適切な宿主細胞は、表５から導かれ得、宿主は好ましくは、表５において同定されるオルソログの起源生物と同じ門、綱、目、科又は属に属する非病原性真菌又は酵母である。表５は、ペニシリウム・ブラシリアヌムｈｍｆＭと、公的データベースで入手可能な１０個の最も近いそのオルソログのそれぞれとのアミノ酸配列アライメントを示す。表５Ａは、Ｐ．ブラジリアヌムｈｍｆＭの配列とそのオルソログ間のパーセントアミノ酸同一性、及びオルソログの受託番号を示す。
【００９３】
ＨＭＦをＨＭＦアルコールに還元することが知られている別の内因性デヒドロゲナーゼは、Ｐｅｔｅｒｓｓｏｎら（２００６，Ｙｅａｓｔ，２３：４５５−４６４）により記述されたＳ．セレビシエＡＤＨ６遺伝子によりコードされるＮＡＤＰＨ依存性アルコールデヒドロゲナーゼである。したがって、ＨＭＦを代謝するための代替経路の比活性を低減又は排除するために改変される遺伝子は、好ましくはＳ．セレビシエＡＤＨ６遺伝子又は別の真菌宿主種のそのオルソログである。アミノ酸配列の同一性が５０〜６０％の範囲にあるアペルギルス及びペニシリウムなどの糸状菌のＳ．セレビシエＡＤＨ６遺伝子のオルソログは、公的配列データベースにおいて同定され得る。したがって、ＮＡＤＰＨ依存性ＨＭＦ還元デヒドロゲナーゼの比活性を低減又は除去するために改変される遺伝子は、配列番号２５（Ｓ．セレビシエＡＤＨ６）に対して、少なくとも４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子であることが好ましい。本発明の細胞において、ＮＡＤＰＨ依存性ＨＭＦ還元デヒドロゲナーゼに特異的な活性は、活性の低減を引き起こす遺伝子改変を除いて遺伝的に同一である株の細胞と比較して、好ましくは少なくとも１．０５、１．１、１．２、１．５、２．０、５．０、１０、２０、５０又は１００分の１に低減される。
【００９４】
フラン化合物のトランスポーターを発現する細胞
上記のように、本発明の細胞は、さらに好ましくは、フラン化合物の輸送能力を有するポリペプチドをコードする１つ又は複数のヌクレオチド配列を発現する。フラン化合物の輸送能力を有するそのようなポリペプチドは、細胞の内因性活性であっても、又は細胞に付与された外因性活性であってもよい。好ましくは、フラン化合物の輸送能力を有するポリペプチドの活性は、発現構築物、例えば、細胞が既にＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼの発現のための第１の発現構築物を含む場合は、第３の発現構築物と、フランアルデヒドデヒドロゲナーゼ又はオキシダーゼの発現のための第２の発現構築物とによる細胞の形質転換によって細胞に付与されるか、又は細胞内で高められることが好ましい。
【００９５】
細胞は、フラン化合物の輸送能力を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現のための発現構築物により形質転換されることが好ましい。フラン化合物の輸送能力を有するポリペプチドは、好ましくは、ＨＭＦＣＡの輸送能力を有するポリペプチドであり、これは、少なくともＨＭＦＣＡを細胞中に輸送する能力を含む。細胞は、少なくともＨＭＦＣＡを細胞中に輸送する能力を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現のための発現構築物を含み、このポリペプチドは配列番号６〜１０（それぞれ、ｈｍｆＴ３、ｈｍｆＴ４、ｈｍｆＴ５、ｈｍｆＴ６、及びｈｍｆＴ７）のうちの少なくとも１つに対して、少なくとも４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、発現構築物は、細胞内で発現可能であり、ポリペプチドの発現は、発現構築物を欠いた対応する野生型細胞と比較して、少なくともＨＭＦＣＡを細胞中に輸送する能力を細胞に付与するか、又は細胞内において高めることが好ましい。
【００９６】
フラン化合物、特にＨＭＦＣＡを細胞内に輸送するポリペプチドの能力は、例えば、国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０７２４０６の実施例で説明されているように、酵母宿主細胞、好ましくはＳ．セレビシエＣＥＮ．ＰＫ宿主細胞において、トランスポーターポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、Ｃ．バシレンシスＨＭＦ１４由来のｈｍｆＨ遺伝子及びＣ．バシレンシスＨＭＦ１４由来のＨＭＦ分解オペロンに関連したフランアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（国際公開第２０１２／０６４１９５号の配列番号１９のアミノ酸配列を有する）との同時発現、形質転換されたＳ．セレビシエ細胞の４ｍＭのＨＭＦ中でのインキュベーション、及びトランスポーターポリペプチドを発現しない対応する（すなわち他の点では同一の）Ｓ．セレビシエ細胞との比較での累積ＦＤＣＡの増加の検出によりアッセイされ得る。
【００９７】
したがって、本発明の好ましいヌクレオチド配列は、アスペルギルス属、フザリウム属、ネクトリア属（Ｎｅｃｔｒｉａ）、ペニシリウム属、スポロトリクス属及びトグニニア属（Ｔｏｇｎｉｎｉａ）からなる群から選択される属の真菌、より好ましくは、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）、ペニシリウム・ブラシリアヌム、ペニシリウム・デジタタム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｄｉｇｉｔａｔｕｍ）、ペニシリウム・ルーベンス（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｒｕｂｅｎｓ）、スポロトリクス・シェンキー及びトグニニア・ミニマ（Ｔｏｇｎｉｎｉａ  ｍｉｎｉｍａ）からなる群から選択される種の真菌、最も好ましくはＰ．ブラジリアヌムＣ１又はＭＧ１１株である真菌から得られ得る（又はその中に天然に存在する）フラン化合物トランスポーターポリペプチドのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有するフラン化合物トランスポーターポリペプチドをコードする。
【００９８】
１つの実施形態において、ヌクレオチド配列は、例えば、野生型の起源生物から単離され得るような、天然に存在するフラン化合物トランスポーターポリペプチドをコードする。或いは、ヌクレオチド配列は、上で定義された、対応する天然に存在するフラン化合物トランスポーターポリペプチドと比較して、１つ又は複数のアミノ酸置換、挿入及び／又は欠失を含むが、本明細書で定義される同一性又は類似性の範囲内である、フラン化合物トランスポーターポリペプチドの任意の改変形態をコードし得る。したがって、１つの実施形態では、本発明のヌクレオチド配列は、そのアミノ酸配列が（表６〜１０において「＊」で指し示される）各不変位置において、不変位置に存在するアミノ酸を少なくとも含む、フラン化合物トランスポーターポリペプチドをコードする。アミノ酸配列はまた、強く保存された位置に存在するアミノ酸の１つを（表６〜１０において「：」で指し示される）強く保存された位置に含むことが好ましい。また、アミノ酸配列は（表６〜１０において「．」で指し示される）それほど強く保存されていない位置に、それほど強く保存されていない位置に存在するアミノ酸の１つもさらに含むことが、より好ましい。これらの不変で保存された位置以外のアミノ酸置換は、フラン化合物トランスポーターポリペプチド活性に影響を与える可能性が低い。表６〜１０は、ペニシリウム・ブラシリアヌムｈｍｆＴ３、ｈｍｆＴ４、ｈｍｆＴ５、ｈｍｆＴ６及びｈｍｆＴ７の各々と、公的データベースで入手可能な１０個の最も近いオルソログとのアミノ酸配列アラインメントをそれぞれ示す。表６Ａ〜１０Ａは、Ｐ．ブラジリアヌムの配列とそれらのオルソログの間のパーセントアミノ酸同一性、及びオルソログの受託番号を示す。
【００９９】
フラン化合物トランスポーター活性を有するポリペプチドをコードする本発明のヌクレオチド配列は、真菌、酵母又は細菌、例えば上記の起源生物と同じ門、綱又は属に属するもののゲノム及び／又はｃＤＮＡから、それ自体は当該技術分野で周知のヌクレオチド配列の単離方法を使用して、入手可能である（例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋとＲｕｓｓｅｌｌ（２００１）“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨークを参照）。本発明のヌクレオチド配列は、例えば、ａ）（保存されたアミノ酸配列に基づき設計された）縮重ＰＣＲプライマーが、適切な生物のゲノム及び／又はｃＤＮＡに対して使用されて、フラン化合物トランスポーターの活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の一部を含むＰＣＲ断片を生成し；ｂ）ステップａ）で得られたＰＣＲ断片をプローブとして使用して、生物のｃＤＮＡ及び／又はゲノムライブラリーをスクリーニングし；ｃ）フラン化合物トランスポーターポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを生成する方法で入手可能である。
【０１００】
フラン化合物トランスポーターポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現のための核酸構築物で形質転換される真菌宿主細胞は、好ましくは上記の本発明の真菌宿主細胞である。
【０１０１】
本発明のフラン化合物トランスポーターポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現のための発現構築物は、好ましくは、構築物で形質転換された宿主細胞に対して異種又は外因性の発現構築物である。構築物は、本明細書において、構築物が、宿主細胞中において天然に存在しない少なくとも１つの配列又は配列要素を含む場合、並びに／又は、構築物が、要素自体が宿主細胞中に天然に存在しても、宿主細胞では天然に存在しない組合せ、及び／若しくは順序で少なくとも２つの配列要素を含む場合、構築物を含む宿主細胞に対して異種又は外因性であると理解される。
【０１０２】
別個の側面において、本発明は、ＨＭＦをＦＤＣＡに酸化する能力を有し、少なくとも１つのフラン化合物を輸送するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を増加させる遺伝子改変を含む真菌細胞であって、前記ポリペプチドが、好ましくは配列番号９及び１０のうちの少なくとも１つのアミノ酸配列と少なくとも４５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、真菌細胞に関する。真菌細胞は、ａ）上記のように、遺伝子改変を欠いた対応する親細胞と比較して、細胞内の特異的な２，５−フランジカルボン酸（ＦＤＣＡ）脱炭酸モノオキシゲナーゼ活性を排除又は低減する遺伝子改変；ｂ）上記のように、５−ヒドロキシメチル−２−フランカルボン酸（ＨＭＦＣＡ）を５−ホルミル−２−フロ酸（ＦＦＣＡ）に酸化する能力を細胞に付与する、又は遺伝子改変を欠いた対応する野生型細胞と比較して、細胞内でＨＭＦＣＡをＦＦＣＡに酸化する酵素の比活性を増加させる、遺伝子改変；ｃ）上記のように、フランアルデヒドを対応するフランカルボン酸に酸化する能力を細胞に付与する遺伝子改変、又は遺伝子改変を欠いた対応する野生型細胞と比較して、細胞内でフランアルデヒドを対応するフランカルボン酸に酸化する酵素の比活性を増加させる遺伝子改変；ｄ）上記のように、ＨＭＦ及び／又はＦＦＣＡを対応するアルコールに還元する短鎖デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の発現を低減又は排除する遺伝子改変であって、好ましくは、前記遺伝子が、配列番号５及び２５のうちの少なくとも１つと少なくとも４５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子の少なくとも１つである、遺伝子改変；ｅ）上記のように、少なくとも１つのフラン化合物を輸送するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を増加させる遺伝子改変であって、前記ポリペプチドが、好ましくは配列番号６〜８のうちの少なくとも１つのアミノ酸配列と少なくとも４５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、遺伝子改変；及びｆ）上記のように、フラン異化に関与する遺伝子の転写活性化因子をコードする遺伝子の発現を変化させる遺伝子改変であって、好ましくは前記遺伝子が、配列番号１１と少なくとも４５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子である、遺伝子改変から選択される１つ又は複数の遺伝子改変をさらに含むことが好ましい。
【０１０３】
適切な宿主細胞における本発明のフラン化合物トランスポーターポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現のためのベクター及び発現構築物は、本明細書において以下、より詳細に説明される。
【０１０４】
転写活性化因子の発現の調節が変更された細胞
本発明の細胞の１つの実施形態では、フラン異化に関与する遺伝子の転写活性化因子の発現の調節が変更される。転写活性化因子の発現は、ＦＤＣＡ分解のための内因性遺伝子を含み、好ましくは転写活性化因子とは独立して発現するＨＭＦをＦＤＣＡに変換する酵素をコードする遺伝子を含む細胞内のＦＤＣＡの分解を防ぐために低減又は排除され得る。或いは、転写活性化因子の発現は、ＨＭＦ及び／又は他のフラン前駆体をＦＤＣＡに変換するための内因性遺伝子の発現を増加させるために、ＦＤＣＡ分解を防ぐために遺伝子改変された細胞において増加及び／又は構成的にされ得る。
【０１０５】
本発明の細胞において、発現の調節が変更される転写活性化因子は、配列番号１１（ｈｍｆＲ）に対して、少なくとも４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、フラン異化に関与する少なくとも１つの遺伝子の転写を活性化する能力を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列によってコードされることが好ましい。
【０１０６】
したがって、本発明の好ましいヌクレオチド配列は、フザリウム属、ペニシリウム属、セシドスポリウム属（Ｓｃｅｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）、スポロトリクス属及びスタキボトリス属（Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ）からなるから選択される属の真菌、より好ましくは、フサリウム・オキシスポルム、ペニシリウム・ブラジリアヌム、セドスポリウム・アピオススペルマム（Ｓｃｅｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ａｐｉｏｓｐｅｒｍｕｍ）、スポロトリクス・シェンキー及びスタキボトリス・クロロハロナタ（Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ  ｃｈｌｏｒｏｈａｌｏｎａｔａ）からなる群から選択される種の真菌、最も好ましくはＰ．ブラジリアヌムＣ１又はＭＧ１１株である真菌から得られ得る（又はその中に天然に存在する）転写活性化因子のものと同一のアミノ酸配列を有する転写活性化因子をコードする。
【０１０７】
１つの実施形態において、ヌクレオチド配列は、例えば、野生型の起源生物から単離され得るような、天然に存在する転写活性化因子をコードする。或いは、ヌクレオチド配列は、上で定義された、対応する天然に存在する転写活性化因子ポリペプチドと比較して、１つ又は複数のアミノ酸置換、挿入及び／又は欠失を含むが、本明細書で定義される同一性又は類似性の範囲内である、転写活性化因子ポリペプチドの任意の改変形態をコードし得る。したがって、１つの実施形態では、本発明のヌクレオチド配列は、そのアミノ酸配列が（表１１において「＊」で指し示される）各不変位置において、不変位置に存在するアミノ酸を少なくとも含む、転写活性化因子ポリペプチドをコードする。アミノ酸配列はまた、強く保存された位置に存在するアミノ酸の１つを（表１１において「：」で指し示される）強く保存された位置に含むことが好ましい。また、アミノ酸配列は（表１１において「．」で指し示される）それほど強く保存されていない位置に、それほど強く保存されていない位置に存在するアミノ酸の１つもさらに含むことが、より好ましい。これらの不変で保存された位置以外のアミノ酸置換は、転写活性化因子活性に影響を与える可能性が低い。表１１は、ペニシリウム・ブラシリアヌムｈｍｆＲと、公的データベースで利用可能な１０個の最も近いそのオルソログとのアミノ酸配列アライメントを示す。表１１Ａは、Ｐ．ブラジリアヌムの配列とそのオルソログ間のパーセントアミノ酸同一性、及びオルソログの受託番号を示す。
【０１０８】
転写活性化因子活性を有するポリペプチドをコードする本発明のヌクレオチド配列は、真菌、酵母又は細菌、例えば上記の起源生物と同じ門、綱又は属に属するもののゲノム及び／又はｃＤＮＡから、それ自体は当該技術分野で周知のヌクレオチド配列の単離方法を使用して、入手可能である（例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋとＲｕｓｓｅｌｌ（２００１）“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨークを参照）。本発明のヌクレオチド配列は、例えば、ａ）（保存されたアミノ酸配列に基づき設計された）縮重ＰＣＲプライマーが、適切な生物のゲノム及び／又はｃＤＮＡに対して使用されて、転写活性化因子の活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の一部を含むＰＣＲ断片を生成し；ｂ）ステップａ）で得られたＰＣＲ断片をプローブとして使用して、生物のｃＤＮＡ及び／又はゲノムライブラリーをスクリーニングし；ｃ）フラン転写活性化因子をコードするヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを生成する方法で入手可能である。
【０１０９】
フラン転写活性化因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現のための核酸構築物で形質転換される真菌宿主細胞は、好ましくは上記の本発明の真菌宿主細胞である。
【０１１０】
本発明のフラン転写活性化因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現のための発現構築物は、好ましくは、構築物で形質転換された宿主細胞に対して異種又は外因性の発現構築物である。構築物は、本明細書において、構築物が、宿主細胞中において天然に存在しない少なくとも１つの配列又は配列要素を含む場合、並びに／又は、構築物が、要素自体が宿主細胞中に天然に存在しても、宿主細胞では天然に存在しない組合せ、及び／若しくは順序で少なくとも２つの配列要素を含む場合、構築物を含む宿主細胞に対して異種又は外因性であると理解される。
【０１１１】
適切な宿主細胞における本発明のフラン転写活性化因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現のためのベクター及び発現構築物は、本明細書において以下、より詳細に説明される。
【０１１２】
本発明の細胞の遺伝子改変のためのベクター、遺伝子構築物及び方法
本発明の親宿主細胞の遺伝子改変、すなわち、本発明の改変宿主細胞の構築のためには、当技術分野で一般的に公知であり、例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋとＲｕｓｓｅｌｌ（２００１，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ”（第３版），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）及びＡｕｓｕｂｅｌら（１９８７年版，“Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ニューヨーク）に記述されている標準的な遺伝学的及び分子生物学的技術が使用される。
【０１１３】
より具体的には、酵母の遺伝子改変のための手段及び方法は、標準的で当業者に公知であり、例えば、遺伝子の（過剰）発現のためのプロモーター、エピソーム及び／又は組込み型の発現構築物及びベクター、選択可能マーカー、内因性酵母遺伝子又はその一部を破壊及び／又は削除するための方法及び遺伝子構築物、及び酵母の形質転換方法を含む。そのような手段及び方法は、例えばＳｈｅｒｍａｎら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ニューヨーク（１９７８）；Ｇｕｔｈｒｉｅら（編）Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１９４，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，サンディエゴ（１９９１）；Ｓｕｄｂｅｒｙ，Ｐ．Ｅ．（２００１）Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｙｅａｓｔ，ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｓｅｔ，第２版（Ｈ．−Ｊ．Ｒｅｈｍ及びＧ．Ｒｅｅｄ編），Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ  ＧｍｂＨ，ヴァインハイム，ドイツ．ｄｏｉ：１０．１００２／９７８３５２７６２０９９９．ｃｈ１３ａ；及びＧａｉｌｌａｒｄｉｎ，Ｃ．とＨｅｓｌｏｔ，Ｈ．（１９８８），Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｉｎ  Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ．Ｊ．Ｂａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２８：１６１−１７４．ｄｏｉ：１０．１００２／ｊｏｂｍ．３６２０２８０３０３に記載されており、これらは全て参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１４】
同様に、糸状菌の遺伝子改変のための手段及び方法は、標準的で当業者に公知であり、例えば、遺伝子の（過剰）発現のためのプロモーター、エピソーム及び／又は組込み型の発現構築物及びベクター、選択可能マーカー、並びに内因性真菌遺伝子又はその一部を破壊及び／又は削除するための方法及び遺伝子構築物、及び糸状菌の形質転換方法を含む。そのような手段及び方法は、例えばＭｏｏｒｅ，Ｍ．Ｍ．（２００７，“Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｆｕｎｇａｌ  ｃｅｌｌｓ”，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．ＩＩＩ．（Ｈ．Ｗ．Ｄｏｅｌｌｅ及びＥ．Ｊ．Ｄａｓｉｌｖａ編），ＥＯＬＳＳ，Ｏｎｔａｒｉｏ，カナダ．ｐｐ．３６−６３；Ｌｕｂｅｒｔｏｚｚｉ，Ｄ．，及びＫｅａｓｌｉｎｇ，Ｊ．Ｄ．（２００９），“Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｓ  ａ  ｈｏｓｔ  ｆｏｒ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ”，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｄｖａｎｃｅｓ，２７（１），５３−７５；Ｍｅｙｅｒ，Ｖ．（２００８）“Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｆｕｎｇｉ−−ｐｒｏｇｒｅｓｓ，ｏｂｓｔａｃｌｅｓ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ｔｒｅｎｄｓ”，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｄｖａｎｃｅｓ，（２６），１７７−８５；Ｋｕｃｋ  ａｎｄ  Ｈｏｆｆ（２０１０）“Ｎｅｗ  ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｆｕｎｇｉ．Ａｐｐｌｉｅｄ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”，８６（１），５１−６２；及び国際公開第２０１４／１４２６４７号に記載されており、これらは全て参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１５】
したがって、別の側面では、本発明は、本発明のポリヌクレオチド、例えば、本発明のＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ又はフランアルデヒドデヒドロゲナーゼ又はその機能的等価物をコードするヌクレオチド配列を含むクローニングベクター及び発現ベクターを含む、ベクターなどの核酸構築物、並びに、そのようなベクターで適切な宿主細胞を形質転換又はトランスフェクトする方法に関する。本明細書で使用される場合、「ベクター」及び「構築物」という用語は、互換的に使用され、本発明のポリヌクレオチドを含む構築された核酸分子を指す。
【０１１６】
本発明に従うベクターは、自律的に複製するベクター、すなわち染色体外の実体として存在するベクターであってもよく、その複製は染色体の複製から独立しており、例えばプラスミドである。或いは、ベクターは、宿主細胞に導入されると、宿主細胞ゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであってもよい。便宜のため、ベクターはシャトルベクターであってもよく、また、操作と生産を容易にするため、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような細菌において使用するための複製起点及び選択マーカーも含む。
【０１１７】
１つの実施形態において、核酸構築物は、（過剰）発現される本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物又は発現ベクターであり、ここで、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、対象の宿主細胞におけるコーディングヌクレオチド配列の発現を達成及び（発現の割合を）制御できる調節配列に作動可能に連結されている。そのような調節配列は、典型的にはコード配列の転写を制御する機能を果たすプロモーターを少なくとも含み、これは通常、コード配列の上流に位置し、好ましくは作動可能に連結されている。プロモーターに加えて、上流転写調節配列は、エンハンサー、上流活性化配列、転写因子結合部位、リプレッサー及びアクチベータータンパク質結合部位などの、さらなる要素を含んでいてもよい。プロモーター配列は通常、転写開始部位を含む。酵母又は糸状菌におけるコード配列の発現に適したプロモーター及び転写調節配列は、上記の引用文献に記載されている。プロモーター及び転写開始部位の下流において、発現構築物は、翻訳開始コドン、すなわちコード配列の最初のコドンを取り囲む真核生物コザックコンセンサス配列などの翻訳開始配列を含む。コード配列は翻訳停止コドンで終了する。コード配列の下流において、発現構築物は、１つ又は複数の転写終結部位、例えばターミネーターを含む３’−非翻訳領域を含んでいてもよく、これは、好ましくはポリアデニル化部位も含んでいる。ターミネーターの起源はあまり重要ではない。ターミネーターは、例えば、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に固有のものであり得る。しかしながら、酵母ターミネーターは、酵母宿主細胞において使用され、糸状菌ターミネーターは、糸状菌宿主細胞において使用されることが好ましい。ターミネーターは（ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が発現されることになる）宿主細胞にとって内因性であることが、より好ましい。適切な上流及び下流の調節配列に作動可能に連結されたコード配列を含む機能的発現ユニットは、発現カセットと呼ばれ得る。本発明の発現ベクター又は発現構築物は、任意選択的に、複数の異なるコード配列の発現のために、複数の発現カセットを含んでいてもよい。
【０１１８】
少なくとも１つの発現カセットに加えて、本発明の発現ベクター又は発現構築物は、好ましくはベクター又は構築物で形質転換された宿主細胞の選択のための選択可能マーカーも含む。好ましい実施形態では、発現ベクター又は発現構築物中の選択マーカーは、形質転換体の最初の選択後に宿主細胞中に一旦入れば、例えば欧州特許第０６３５５７４号に記載されている相同組換えを使用するか、又はＧｕｌｄｅｎｅｒｅｔら（１９９６，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：２５１９−２５２４）によって記載されるＣｒｅ−ｌｏｘ系を使用して、発現構築物／ベクターからマーカーを切り出すことが可能になるような構成を有する。
【０１１９】
本発明はさらに、本発明のポリペプチド、例えば、ＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド、フランアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有し、本発明の細胞においてその発現が低減／排除されるポリペプチドを含む、ポリペプチドの調製方法に関する。本方法は、ポリペプチドの発現を促す条件下で本発明に従う細胞を培養すること、及び任意選択的に、発現されたポリペプチドを回収することを含む。本発明はまた、そのような方法により得られ得るポリペプチドにも関する。
【０１２０】
したがって、別の側面では、本発明は、コードされた標的タンパク質の発現及び／又は活性を低減又は排除するように、本発明の細胞内の内因性標的遺伝子を改変する手段及び方法に関係する。標的タンパク質の発現を低減又は排除するために使用され得る改変は、標的タンパク質をコードする遺伝子全体又は遺伝子の一部の欠失、タンパク質が発現されない、又は低いレベルで発現されるようにＤＮＡ断片を標的遺伝子（プロモーター又はコード領域のいずれか）に挿入すること、機能的タンパク質が発現されないように終止コドン又はフレームシフトを追加する変異を標的コード領域に導入すること、並びに、非機能的な標的タンパク質、又は酵素活性が低下した標的タンパク質が発現されるように、１つ又は複数の変異を標的コード領域に導入してアミノ酸を変更することを含むがそれらに限定されない破壊である。加えて、標的遺伝子の発現は、アンチセンスＲＮＡ又は干渉性ＲＮＡの発現によってブロックされてもよく、共抑制をもたらす構築物が導入されてもよい。さらに、この準最適なコード配列が対応する内因性標的コード配列に置換されると、希少なコドンが豊富なものに置換されるため、発現が低い標的コード配列が合成され得る。そのような準最適なコード配列は、０．５、０．４、０．３、０．２、又は０．１未満のコドン適合指数（上記参照）を有することが好ましい。そのような準最適なコード配列は、同じポリペプチドを生成するが、非効率的な翻訳のために低い速度で生成すると予想される。加えて、転写産物の合成又は安定性は、変異によって低減され得る。同様に、タンパク質がｍＲＮＡから翻訳される効率は、変異により、例えば準最適な翻訳開始コドンを使用することにより、調節され得る。これらの方法は全て、標的タンパク質をコードする配列を利用して、当業者によって容易に実施され得る。
【０１２１】
特に、標的コード配列を囲むゲノムＤＮＡ配列は、相同組換えを使用した改変方法にとって有用となる。例えば、この方法では、標的遺伝子に隣接する配列が、選択可能なマーカー遺伝子のいずれかの部位に配置されて、相同組換えを媒介し、それによりマーカー遺伝子が標的遺伝子を置き換える。また、選択可能なマーカー遺伝子に接する部分的標的遺伝子配列及び標的遺伝子隣接配列が使用されて、相同組換えを媒介し、それによりマーカー遺伝子が標的遺伝子の一部を置き換えてもよい。加えて、不活化構築物中の選択可能マーカーは、宿主細胞のゲノムに組み込まれた後、例えば欧州特許第０６３５５７４号に記載されている相同組換えを使用するか、Ｇｕｌｄｅｎｅｒら（１９９６，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：２５１９−２５２４）によって記載されているＣｒｅ−ｌｏｘ系を使用して、不活化構築物発現構築物／ベクターからのマーカーの切除を可能とするような方法で構成されてもよい。
【０１２２】
標的遺伝子の削除は、Ｗａｃｈら（１９９４，Ｙｅａｓｔ  １０：１７９３−１８０８）に記載されているように、有糸分裂組換えを使用して行われることもできる。この方法は、２０ｂｐほどの短いゲノム領域間に選択可能なマーカーを含み、標的ＤＮＡ配列に接する、すなわち隣接する、ＤＮＡ断片を調製することを含む。このＤＮＡ断片は、マーカー遺伝子の末端にハイブリダイズし、真菌ゲノムと組換え可能なゲノム領域を含むオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、選択可能なマーカー遺伝子のＰＣＲ増幅により調製され得る。線状ＤＮＡ断片は、酵母又は糸状菌に効率的に形質転換され、ゲノム中に組み換えられて、標的ＤＮＡ配列の欠失を含む遺伝子置換をもたらすことができる（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９９１，ｖ  １９４，ｐｐ  ２８１−３０１に記載）。さらに、Ｍｎａｉｍｎｅｈら（２００４，Ｃｅｌｌ  １１８（１）：３１−４４）及び本明細書の実施例に記載されているように、内因性転写制御エレメントを交換するために、プロモーター置換法が使用されて、発現を調節する別の手段を可能としてもよい。
【０１２３】
加えて、任意の細胞における標的タンパク質又は遺伝子の活性が、ランダム変異誘発を使用して破壊され、その後、スクリーニングにより標的タンパク質の活性が低下した株が同定されてもよい。この種の方法を使用すると、標的タンパク質をコードするＤＮＡ配列、又は標的タンパク質の発現に影響を与えるゲノムの他の領域を知る必要さえない。遺伝子変異を作成する方法は一般的で、当技術分野で周知であり、変異体を作成する作業に適用され得る。一般的に使用されるランダムな遺伝子改変法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ニューヨークに概説）は、自然変異誘発、変異遺伝子により引き起こされる変異誘発、化学的変異誘発、紫外線又はＸ線の照射、又はトランスポゾン変異誘発を含む。
【０１２４】
真菌の化学的変異誘発は一般に、次のＤＮＡ変異原、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）、亜硝酸、硫酸ジエチル、又はＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソ−グアニジン（ＭＮＮＧ）のいずれかによる細胞の処理を含む。これらの変異誘発法は、Ｓｐｅｎｃｅｒら（Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ，１９９６，Ｙｅａｓｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，トトワ，ニュージャージー州）に概説されている。ＥＭＳを用いた化学的変異誘発は、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州に記載されているようにして実施され得る。紫外線（ＵＶ）光又はＸ線の照射もまた、酵母細胞においてランダムな変異誘発を引き起こすために使用され得る。ＵＶ照射による変異誘発の主な効果は、ＤＮＡ複製の忠実度を乱すピリミジン二量体の形成である。酵母のＵＶ変異誘発のプロトコルはＳｐｅｎｃｅｒら（Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ，１９９６，Ｙｅａｓｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，トトワ，ニュージャージー州）の中に見出され得る。ミューテーター表現型の導入もまた、酵母でのランダムな染色体変異の生成に使用され得る。一般的なミューテーター表現型は、以下の遺伝子の１つ又は複数の破壊により取得され得る：ＰＭＳ１、ＭＡＧ１、ＲＡＤ１８又はＲＡＤ５１又は、それらのＳ．セレビシエ以外の真菌のオルソログ。非ミューテーター表現型の回復は、野生型アレルの挿入により容易に得られ得る。これら又は他の既知のランダム変異誘発プロセスのいずれかから生成された改変細胞の集団は、標的タンパク質の活性の低減についてスクリーニングされ得る（米国特許出願公開第２００９／０３０５３６３号）。
【０１２５】
フラン化合物の酸化のための方法
さらなる側面では、本発明は、フラン化合物を酸化するための方法に関係する。特に、本発明は、ＦＤＣＡのフラン前駆体が酸化される方法に関係する。本発明の方法は、生成物をもたらす単一の酸化反応ステップを含み得る（例えば、ＨＭＦＣＡのＦＦＣＡへの酸化）。或いは、本発明の方法は、各ステップが中間体をもたらし、最後の中間体が最終生成物である、１つより多い酸化反応ステップを含んでいてもよい。ＨＭＦがＦＤＣＡへの連続酸化ステップにおいて酸化される、そのような一連のステップの例は、例えば、１）ＨＭＦが最初にＨＭＦＣＡに酸化され、第２のステップでＦＦＣＡに酸化され、それから最終的にＦＦＣＡに酸化されるか、或いは、Ｄｉｊｋｍａｎら（２０１４，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．５３（２０１４）６５１５−８）に記述されているように、２）ＨＭＦが最初にＤＦＦに酸化され、第２のステップでＦＦＣＡに酸化され、それから最終的にＦＦＣＡに酸化されるものを含む。したがって、本発明の好ましい方法では、ＦＤＣＡの１つ又は複数のフラン前駆体が一連のステップで最終的にＦＤＣＡにまで酸化される。
【０１２６】
１つの実施形態では、本発明は、少なくともＨＭＦＣＡからＦＦＣＡへの酸化を含む方法に関する。方法は、ＨＭＦＣＡの存在下で細胞をインキュベートするステップを含む、ＨＭＦＣＡをＦＦＣＡに酸化する方法であることが好ましい。細胞は、好ましくは、ＨＭＦＣＡをＦＦＣＡに酸化する能力を有する酵素を発現する細胞である。細胞は、ＨＭＦＣＡをＦＦＣＡに酸化する能力を有するように遺伝子改変された細胞であり得る。好ましい実施形態では、細胞は、本明細書で上記において定義された遺伝子改変真菌細胞である。細胞は、例えば、以下に特定されるように、ＨＭＦＣＡの存在下、細胞によるＨＭＦＣＡの酸化をもたらす条件下で、インキュベートされることが好ましい。
【０１２７】
別の実施形態では、本発明はＦＤＣＡの製造方法に関する。ＦＤＣＡを製造する方法は、好ましくは、１つ又は複数のＦＤＣＡのフラン前駆体を含む培地中で細胞をインキュベートするステップを含む。細胞は、好ましくは、ＦＤＣＡのフラン前駆体をＦＤＣＡに変換する能力を有する１つ又は複数の酵素を発現する細胞である。ＦＤＣＡのフラン前駆体をＦＤＣＡに変換する能力を有する酵素は、例示された真菌酵素を含む、上記のアルコール及び／又はアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素であり得る。よって、好ましい実施形態では、細胞は、本明細書で上記において定義された遺伝子改変真菌細胞である。
【０１２８】
細胞は、例えば、以下に特定されるように、１つ又は複数のＦＤＣＡのフラン化合物前駆体の存在下、細胞によるＦＤＣＡのフラン化合物前駆体のＦＤＣＡへの酸化をもたらす条件下で、インキュベートされることが好ましい。
【０１２９】
この方法において、少なくとも１つのＦＤＣＡのフラン前駆体は、ＨＭＦ、ＤＨＦ、ＨＭＦＣＡ、ＦＦＣＡ及びＤＦＦからなる群から選択されることが好ましく、これらのうちＨＭＦが最も好ましい。ＦＤＣＡのフラン前駆体は、好ましくは１つ又は複数のヘキソース糖から、好ましくは酸触媒脱水により、例えば、従来的な方法において、酸の存在下で加熱することにより得られる。フルクトースからＨＭＦを生成する技術は、十分に確立され、ロバストである（例えば、ｖａｎ  Ｐｕｔｔｅｎら，２０１３，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１１３，１４９９−１５９７を参照）。グルコースが豊富な原料もまた利用され得るが、ＨＭＦの熱化学的形成は、フルクトースからより効率的に進行する。したがって、グルコースイソメラーゼを使用してグルコースをフルクトースに変換するための追加の酵素ステップが含められ得る。後者の方法は、例えば、加水分解されたデンプンから高フルクトースコーンシロップ（ＨＦＣＳ）を製造するために、食品業界において十分に確立されている。グルコースはまた、例えばｖａｎ  Ｐｕｔｔｅｎら（２０１３、上記）に記載されているように、触媒と溶媒の組合せを使用してフルクトースに化学的にも異性化され得る。
【０１３０】
ヘキソース糖は通常、バイオマスから得られる。「バイオマス」という用語は、製品、廃棄物、及び農業（作物残留物などの植物性物質、動物性物質を含む）、林業（木材資源など）及び漁業や養殖を含む関連産業由来の生物起源の残留物の生分解性画分、並びに、都市固形ゴミや古紙などの産業廃棄物及び都市ゴミの生分解性画分を意味すると理解される。好ましい実施形態では、バイオマスは植物バイオマスであり、より好ましくは、例えばサトウキビなどの（発酵性の）ヘキソース／グルコース／糖に富むバイオマス、デンプン含有バイオマス、例えば小麦粒、トウモロコシのわら、又はトウモロコシ、小麦、大麦、又はそれらの混合物などの穀物でさえある。フラクタンが天然に豊富な農作物（例えば、トピナンブル又はチコリの根）が好ましい。
【０１３１】
ヘキソース糖は、そのようなバイオマスの加水分解によって得られ得る。バイオマスの加水分解方法は、それ自体当技術分野で公知であり、例えば、蒸気及び／又はグルコアミラーゼなどのカルボヒドラーゼの使用を含む。
【０１３２】
本発明の方法において使用するための別の好ましい種類のバイオマスは、いわゆる「第２世代」リグノセルロース原料であり、これは大量のＦＤＣＡがより持続可能な方法で生産される場合に好ましい。リグノセルロース原料は、例えば耕作限界の土地で栽培される専用のエネルギー作物から入手され得るため、食用作物と直接競合しない。又は、リグノセルロース原料は、例えば、都市固形ゴミ、古紙、木材残留物（製材所や製紙工場の廃棄物を含む）、作物残留物などが考えられ得る、副産物として入手され得る。作物残留物の例は、サトウキビからのバガスと、また、いくつかのトウモロコシと小麦の廃棄物も含む。トウモロコシの副産物の場合、３つの廃棄物は繊維、穂軸及び茎である。さらに、森林バイオマスが原料として使用されてもよい。第２世代の原料を本発明の発酵生成物に変換するためには、セルロース及びヘミセルロースが、単糖類として放出される必要がある。これには、熱化学的アプローチ（通常、前処理と呼ばれる）、酵素的アプローチ、又は２つの方法の組合せが適用される。前処理は、糖を完全に遊離させるか、又はその後の酵素攻撃に対してポリマー化合物をより利用しやすくするために役立つ。異なる種類の前処理は、液体温水、蒸気爆発、酸前処理、アルカリ前処理、及びイオン液体前処理を含む。さまざまな化合物の相対量は、使用する原料と使用する前処理の両方に依存する。そのようなリグノセルロース原料からの単糖の放出のために、例えばアラビナーゼ、キシラナーゼ、グルカナーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、グルカナーゼなどを含む適切なカルボヒドラーゼが使用される。
【０１３３】
本発明の酸化方法は、好ましくは、細胞及び／又は細胞に含まれるオキシドレダクターゼ酵素に最も適した温度で行われる。したがって、好熱性細胞及び／又は好熱性酵素の場合、温度は、好ましくは４０〜６５℃の範囲、例えば少なくとも４０、４２、又は４５℃であり、及び／又は例えば６５、６０、５５又は５０℃以下である。しかしながら、中温菌細胞及び／又は中温菌由来の酵素の場合、酸化反応は、好ましくは、比較的温和な温度、例えば１０〜４５℃の範囲、より好ましくは２０〜４０℃、例えば少なくとも１０、１５、１８、２０、２２又は２５℃、及び／又は４５、４２、４０、３８、３５、３２又は３０℃以下で行われる。
【０１３４】
本発明の酸化方法は、好ましくは酸性ｐＨで実施される。下流プロセシング（ＤＳＰ）、すなわち回収と精製は、あらゆるバイオテクノロジープロセスにおける一般的な関心事であるが、これは、特にポリマー製造のためのモノマー化合物の製造においては、モノマーの純度が制御されたポリマー形成に不可欠であるためである。ＦＤＣＡは、３未満のｐＨ値では非常に限られた溶解度を有する（約２．２８のｐＫａ）。方法が酸性ｐＨで実行される場合、生成されたＦＤＣＡは、好ましくは既にその生成の間に、生成された培地から沈殿し、それによりその回収が大幅に容易となる。したがって、本発明の方法において、細胞、好ましくは真菌細胞は、１つ又は複数のフランの存在下、５．０、４．０、３．０、２．９、２．８、２．７、２．６、２．５又は２．４以下のｐＨで、好ましくは２．０、２．１、２．２又は２．２５、２．２７又は２．２８以上のｐＨでインキュベートされることが好ましい。本発明の方法では、細胞、好ましくは、真菌宿主細胞は、この範囲のｐＨに対して高い耐性を有するものが選択されることが好ましい。酸性ｐＨで方法を実施することの追加の利点は、ほとんど全ての細菌が低ｐＨで悪影響を受けるため、方法の微生物汚染の問題が少なくなることである。酵母と真菌は、感染源として、細菌と比較して問題が少なく、比較的簡単に処理できる。
【０１３５】
反応時間は６〜１５０時間、より好ましくは６〜１８時間であり得る。酸素は、例えば、純粋な酸素又は空気中若しくは水中の分子酸素などの酸素源、又はフラン酸化酵素の要件に応じて異なる酸素源から反応培地中の細胞に供給されることが好ましい。空気は分子状酸素源として好都合に使用され得る。
【０１３６】
反応器は、任意の適切な（曝気された）バイオリアクターであり得る。それはバッチ式、連続式、又は好ましくは流加式で運転され得る。
【０１３７】
本発明の方法は、好ましくは、ＦＤＣＡ又はＨＭＦＣＡなどの、本方法で生成された酸化生成物を回収するステップをさらに含む。酸化生成物は、酸化ステップを実施する細胞がインキュベートされる培地から回収されることが好ましい。ＦＤＣＡ、ＨＭＦＣＡなどの酸化生成物は、例えば（酸）沈殿、その後の冷却結晶化、及び結晶化酸化生成物、例えば結晶化ＦＤＣＡの分離により、反応混合物又は培地から回収され得る。しかしながら、当技術分野で公知であるように、例えば酸沈殿及び溶媒抽出などの他の回収方法が適している。
【０１３８】
フラン化合物を酸化するための本発明の方法は、バイオ燃料及び生化学物質の製造のための発酵のための原料など、フラン化合物が有害であると考えられる原料からのフラン化合物の除去に有利に適用され得る。フラン化合物を酸化するための方法は、ポリエステル（プラスチック）の製造のためのモノマー前駆体としてのＦＤＣＡの生物生産に適用されることが、より好ましく、ここで、ＦＤＣＡはポリエステルＰＥＴにおけるＰＴＡに置き換わることができ、その場合、バイオベースのポリエチレンフランジカルボキシレート（ＰＥＦ）が生じる。また、ＦＤＣＡは、例えば、コハク酸、２，５−ビス（アミノメチル）−テトラヒドロフラン、２，５−ジヒドロキシメチル−テトラヒドロフラン、２，５−ジヒドロキシメチルフラン及び２，５−フランジカルバルデヒドの製造のための基質を含む、さまざまな貴重な化合物の基質としても使用され得る。ＦＤＣＡは、例えば、アルキド樹脂や熱可塑性コーティングなどのコーティングの製造に使用され得る。また、それはバイオ燃料のキシレン同等物として、また溶剤としても使用され得る。ＦＤＣＡはエステル化されてもよく、エステルは可塑剤として使用され得る。ＦＤＣＡはそのジオールに変換されてもよく、ＰＥＴ様ポリエステル及びポリウレタンにおいて使用され得る。さらにＦＤＣＡはそのジアミンに変換されてもよく、ジアミンは鎖延長剤として使用されることができ、また、ジアミンはポリウレタンの製造に使用可能なジイソシアネートに変換され得る。
【０１３９】
したがって、さらなる側面では、本発明は、１つ又は複数、又は少なくとも２つのＦＤＣＡモノマーからポリマーを製造する方法に関し、この方法は、ａ）上記の本発明の酸化方法でＦＤＣＡモノマーを調製するステップ；及びｂ）ステップａ）で得られたＦＤＣＡモノマーからポリマーを製造するステップを含む。好ましい方法において、ポリマーは、ＦＤＣＡモノマーを１つ又は複数の種類のジオールモノマーと混合し、混合物をＦＤＣＡモノマー及びジオールモノマーが重合する条件に導くことにより製造される。したがって、重合は、エステル化又はエステル交換であり得、どちらも（重）縮合反応とも呼ばれる。ジオールモノマーは、芳香族、脂肪族又は脂環式ジオール、例えばアルキレングリコールであり得る。したがって、適切なジオール及びポリオールモノマーの例は、エチレングリコール、ジエチレングリコール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、１，４−ブタンジオール、１，５−ペンタンジオール、１，６−ヘキサンジオール、１，４−シクロヘキサンジメタノール、１，１，３，３−テトラメチルシクロブタンジオール、１、４−ベンゼンジメタノール、２，２−ジメチル−１，３−プロパンジオール、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（テトラヒドロフラン）、２，５−ジ（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン、イソソルビド、グリセロール、２５ペンタエリスリトール、ソルビトール、マンニトール、エリスリトール、スレイトールを含む。エチレングリコール、１，３−プロパンジオール、１，４−ブタンジオール、１，４−シクロヘキサンジメタノール、１，６−ヘキサンジオール、２，２−ジメチル−１，３−プロパンジオール、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（テトラヒドロフラン）、グリセロール、及びペンタエリスリトールは、好ましいジオールである。エチレングリコールが特に好ましい。エチレングリコール（モノエチレングリコール−−ＭＥＧ）は、好ましくは生物起源である。例えば、生物起源のＭＥＧは、エタノールから得ることができ、これはまた、作物又は農業副産物、林業副産物又は固形都市ゴミから、デンプン、セルロース、又はヘミセルロースの加水分解により得られ得る糖（例えばグルコース、フルクトース、キシロース）の発酵によって調製され得る。或いは、生物起源のＭＥＧは、グリセロールから取得でき、それ自体はバイオディーゼルからの廃棄物として取得され得る。ポリマーはポリエチレンフランジカルボキシレート（ＰＥＦ）であることが好ましい。
【０１４０】
また、ポリマーは、他の二酸モノマー、例えばジカルボン酸又はポリカルボン酸、例えばテレフタル酸、イソフタル酸、シクロヘキサンジカルボン酸、マレイン酸、コハク酸、１，３，５−ベンゼントリカルボン酸などのＦＤＣＡ及び／又はアルキレングリコールモノマーとは異なる構造を有する（少）量の他の反応性モノマーを含むこともできる。また、ラクトンは、２，５−フランジカルボン酸エステルと組み合わせて使用されてもよい：ピバロラクトン、エピピロン−カプロラクトン及びラクチド（Ｌ，Ｌ；Ｄ，Ｄ；Ｄ，Ｌ）。本発明の最も好ましい実施形態ではない場合であっても、ポリマーは、多官能性モノマー（１分子あたり２個を超える酸又はヒドロキシル官能基）、酸及び／又はヒドロキシルモノマーのいずれか、例えば多官能性芳香族、脂肪族又は脂環式ポリオール、又はポリ酸の使用のおかげで、非直線状、分岐状であり得る。１つの実施形態では、ポリマー中のアルキレングリコールは、アルキレンジアミンによって部分的又は完全に置き換えられる。
【０１４１】
さらに別の側面では、本発明は、ＦＤＣＡからＦＤＣＡへの１つ又は複数のフラン前駆体の生物学的変換のための細胞、好ましくは本発明の細胞の使用に関し、ここで、細胞は、本明細書で上記において定義したＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼを発現する細胞、又はフラン化合物輸送能力を有するポリペプチドを発現し、さらに、本明細書で上記において定義したＨＭＦＣＡデヒドロゲナーゼ活性を含む細胞である。ＦＤＣＡに生物学的変換される少なくとも１つのＦＤＣＡのフラン前駆体は、ＨＭＦ、ＤＨＦ、ＨＭＦＣＡ、ＦＦＣＡ及びＤＦＦからなる群から選択されることが好ましく、これらのうちＨＭＦが最も好ましい。
【０１４２】
この文書及びその請求項において、「含む（ｔｏ  ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という動詞及びその活用形は、その語に続く項目が含まれることを意味する非限定的な意味で使用されるが、特に言及されない項目は除外されない。加えて、不定冠詞「１つの（「ａ」又は「ａｎ」）」による要素への言及は、要素が１つしかないことを文脈が明確に要求しない限り、１つより多い要素が存在する可能性を排除しない。したがって、不定冠詞の「１つの（「ａ」又は「ａｎ」）」は、通常、「少なくとも１つ」を意味する。
【０１４３】
本明細書で引用された全ての特許及び文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。
【０１４４】
以下の実施例は、例示のみを目的として提供されており、本発明の範囲を限定することを意図するものでは決してない。
【表４】
2020513816.tif 000005
2020513816.tif 000006
【０１４５】
【表５】
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2020513816.tif 000008
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【０１４６】
【表６】
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2020513816.tif 000011
2020513816.tif 000012
【０１４７】
【表７】
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2020513816.tif 000014
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【０１４８】
【表８】
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【０１４９】
【表９】
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【０１５０】
【表１０】
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【０１５１】
【表１１】
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【０１５２】
【表１２】
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2020513816.tif 000036
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【０１５３】
【表１３】
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【０１５４】
【表１４】
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【０１５５】
【表１５】
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【０１５６】
【表１６】
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【０１５７】
【表１７】
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【０１５８】
【表１８】
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【０１５９】
【表１９】
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【０１６０】
【表２０】
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【０１６１】
【表２１】
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【０１６２】
【表２２】
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【０１６３】
【表２３】
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【０１６４】
【表２４】
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【０１６５】
【表２５】
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【実施例】
【０１６６】
イントロダクション
同時係属中の国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０７２４０６において、発明者らは、ペニシリウム・ブラシリアヌム株のオランダの土壌からの単離について記述した。国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０７２４０６においてＰ．ブラジリアヌムＣ１と呼ばれている、このＰ．ブラジリアヌムは、ＦＤＣＡの前駆体であるＨＭＦ上での増殖選択によって単離された。本明細書において、Ｐ．ブラジリアヌムＣ１株は、野生型（ＷＴ）ＷＴのＰ．ブラジリアヌム株又はＷＴ株と呼ばれる。国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０７２４０６は、Ｐ．ブラジリアヌムＣ１のゲノムの配列決定とアノテーション、並びに、ＨＭＦ及びクエン酸で増殖した株のトランスクリプトームの配列決定について記述している。ゲノムアノテーションと公的データベースに対する遺伝子のブラスト検索並びに差示的発現ＲＮＡ配列決定の結果に基づき、サリチル酸ヒドロキシラーゼｈｍｆＫ１、２つのアルコールデヒドロゲナーゼｈｍｆＬ１及びｈｍｆＬ２、並びにサリチルアルデヒドデヒドロゲナーゼｈｍｆＮ１を含む、提案されたＨＭＦからフロ酸への（ＦＤＣＡを介した）経路を介したＰ．ブラシリアヌムＣ１によるＨＭＦの異化に関与する酵素のコード化に関与する候補遺伝子のリストがまとめられた。シュードモナス株における異種発現により、国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０７２４０６の実施例は、Ｐ．ブラシリアヌムｈｍｆＫ１ヒドロキシラーゼが実際に、ＦＤＣＡの脱炭酸モノオキシゲナーゼとして作用し、したがってＰ．ブラシリアヌムにおけるＦＤＣＡの分解に関与していることを示す。さらに、酵母におけるＰ．ブラシリアヌムｈｍｆＬ１及びｈｍｆＬ２アルコールデヒドロゲナーゼとＰ．ブラシリアヌムｈｍｆＮ１サリチルアルデヒドデヒドロゲナーゼの異種発現により、国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０７２４０６の実施例は、これらの酵素が実際にＨＭＦをＦＤＣＡに効率的に酸化する能力を有することを示す。
【０１６７】
Ｐ．ブラシリアヌムｈｍｆＫ１、ｈｍｆＬ１、ｈｍｆＬ２及びｈｍｆＮ１遺伝子に加えて、国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０７２４０６の実施例は、Ｐ．ブラシリアヌムのＨＭＦの異化に関与するタンパク質又は酵素をコードする多くの遺伝子を記載しており、それらは表１２に列挙されている。
【表２６】
2020513816.tif 000057
【０１６８】
実施例１：ｈｍｆＫ１を削除する試みとｈｍｆＫ３の同定
最初の試みは、ｎｉａ１選択マーカーを使用して、第１のサリチル酸ヒドロキシラーゼ遺伝子ｈｍｆＫ１を欠失させるために行われた。診断的ＰＣＲはｈｍｆＫ１の削除を確認したが、ＲＮＡｓｅｑ分析は、ｈｍｆＫ１がまだ発現していることを明らかにし、これは、欠失が成功しなかったことを指し示す。興味深いことに、分析された推定上の変異株では、さらに別のサリチル酸ヒドロキシラーゼ、ｈｍｆＫ３（配列番号２３、配列番号２４によりコード）が上方制御されていたが、これは国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０７２４０６の実施例では上方制御されているとは同定されていなかった。推定上のｈｍｆＫ１欠失形質転換体は、次に、より詳細に分析された。この分析から、どちらのｈｍｆＫ１欠失形質転換体も正しくなかったと本発明者らは結論付けた。最も高い可能性としては、欠失構築物は他の部位（複数可）、おそらくｈｍｆＫ１の上流／下流及び／又はｎｉａ１遺伝子自体に組み込まれていた（両変異体で異なる）。
【０１６９】
実施例２：ＲＮＡｓｅｑデータの評価
本発明者らは、クエン酸で増殖させ、それからクエン酸をＨＭＦに置き換えたケモスタット培養物から、ＷＴ及び推定上のｈｍｆＫ１欠失形質転換体ΔＳＨ＃２Ｅ４（正しいｈｍｆＫ１欠失を有していないことが判明した）のＲＮＡｓｅｑデータを取得した。ＦＤＣＡを介したＨＭＦの分解におそらく関与する一群の遺伝子が同定された。ｈｍｆＫ１遺伝子は、ＷＴ株のＨＭＦ供給培養において最も強い誘導を示した遺伝子であった。ＨＭＦにより誘導される多くの遺伝子は、ｈｍｆＫ１と同じコンティグ（７３０番）上に位置しており、ＨＭＦ分解経路をコードする遺伝子クラスターの存在を指し示す。上に既に述べたように、ｈｍｆＫ１は形質転換体ΔＳＨ＃２Ｅ４において、なおも強く誘導されていた。加えて、現在はｈｍｆＫ３と呼ばれるｈｍｆＫ１に相同な第２のヒドロキシラーゼ遺伝子が、この形質転換体で誘導されることが発見されたが、ＷＴ株では誘導されていなかった。ＷＴと変異体の両方の培養でＦＤＣＡの蓄積は観察されなかったことから、本発明者らは、改良されたＦＣＤＡ株の設計のための潜在的な代替標的（例えば、分解特異的調節遺伝子）の同定のために利用可能なＲＮＡｓｅｑ  ＲＰＫＭデータを再分析した。
【０１７０】
データの再分析は、以下の（ｌｏｇ２）比に焦点を当てた：
１．ＷＴ＿ＨＭＦ対ＷＴ＿Ｃｉｔｒａｔｅ
２．Ｍ＿ＨＭＦ対Ｍ＿Ｃｉｔｒａｔｅ
３．Ｍ＿ＨＭＦ  ｖｓ  ＷＴ＿ＨＭＦ
４．Ｍ＿Ｃｉｔｒ対ＷＴ＿Ｃｉｔｒ
【０１７１】
データは、比率「０」及び「ｄｉｖ０」の遺伝子を見ることができるように、最初に切り下げ（＋２）を行った。遺伝子の選択は、同等の量（約１００）の誘導された遺伝子を取得するために、任意のカットオフ値を使用して行った（表２及び補足Ｅｘｃｅｌファイルを参照）。
【０１７２】
変異体（ＷＴと比較して）の培養では、ＨＭＦ条件とクエン酸条件の両方で、多数の遺伝子セットが同様に誘導され、抑制されていた。これは、これらの遺伝子の誘導／抑制がＨＭＦに非依存的であり、変異体及び／又は培養に特異的であることを示唆する。例外はサリチル酸ヒドロキシラーゼｈｍｆＫ３の誘導である。
【０１７３】
以前に得られた結果（ｈｍｆＫ１、ｈｍｆＫ３、アルコールデヒドロゲナーゼ、転写活性化因子、ラクトナーゼなどの誘導）をＨＭＦで処理した培養で確認した。サリチル関連遺伝子とデカルボキシラーゼは、ＨＭＦと主にＨＭＦによって調節される酸化還元酵素によってのみ誘導される。ＨＭＦはまた、ＨＭＦ又はその誘導体の細胞内外への輸送に役割を果たす可能性のあるＭＦＳタンパク質をコードするｇ１０３７５（コンティグ５７０）やｇ５９６４（コンティグ２２６）などのさまざまなトランスポーターも誘導する。
【０１７４】
国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０７２４０６の実施例において以前に同定され、おそらくＦＤＣＡを介したＨＭＦ分解に関与するｈｍｆ遺伝子のＢＬＡＳＴ結果を再評価した。興味深いのは、ｈｍｆＫ１（コンティグ７３０）付近のＨＭＦが誘導する遺伝子クラスターが、真菌の二次代謝産物クラスターと明確な類似性を示すことである。最も高い同一性（７０％）は、スポロトリクス・シェンキーＡＴＣＣ５８２５１のオルソログ遺伝子クラスターで発見された。ｈｍｆＬ１遺伝子（アルコールデヒドロゲナーゼをコード）は、ｈｍｆＫ１（コンティグ７３０）とは異なるコンティグ（８２）上に位置する。しかし、Ｓ．シェンキーのｈｍｆＬ１オルソログは、同じ遺伝子クラスター内にある。公開されているＰ．ブラシリアヌムＭＧ１１ゲノム（Ｈｏｒｎら，２０１５．Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎｎｏｕｎｃ  ３（５）：ｅ００７２４−１５．ｄｏｉ：１０．１１２８／ｇｅｎｏｍｅＡ．００７２４−１５；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＤＨＫ０１０００００１．１）において、ｈｍｆ遺伝子クラスター（ｈｍｆＫ１を含む）はｈｍｆＬ１も含んでいる。したがって、コンティグ８２と７３０は互いに隣接していると本発明者らは結論する。
【０１７５】
ｈｍｆ遺伝子クラスター（コンティグ７３０及び８２）中のデヒドロゲナーゼの補因子依存性についても調査した。真菌はＮＡＤＰよりもＮＡＤを再生する能力が高いため、真菌におけるＦＤＣＡの経済的に実現性のある生産のためには、コファクターとしてＮＡＤが好ましい。
【表２７】
2020513816.tif 000058
【０１７６】
ｈｍｆＬ１によるＢＬＡＳＴの結果は、補因子としてのＮＡＤの優先性を示す。ｈｍｆＮ１によるＢＬＡＳＴの結果は、ＮＡＤとＮＡＤＰの依存性を区別しない。しかしながら、ｈｍｆＮ１のベストマッチは、シュードモナスＣ１８株の上部ナフタレン異化経路に関与するサリチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＤｏｘＦ、ＳａｌｉＡＤＨ、ＥＣ＝１．２．１．６５）である。ＤｏｘＦについては、ＮＡＤが優先される補因子のようである。
【０１７７】
ＲＮＡｓｅｑデータの再評価結果に基づき、本発明者らは、ＨＭＦをＦＤＣＡに酸化するが、生成されるＦＤＣＡを分解しない宿主細胞を構築するために、サリチル酸ヒドロキシラーゼｈｍｆＫ１、第２にｈｍｆＫ３が削除に最適な最初の候補であるとも結論付けている。
【０１７８】
実施例３：ｈｍｆＫ１とｈｍｆＫ３の単独及び二重変異株の開発
遺伝子欠失の設計と合成
ＷＴのＰ．ブラジリアヌム株をフレオマイシン及びハイグロマイシン感受性について試験し、遺伝子破壊のためのｐｈｌｅｏ又はｈｙｇＢ抗生物質選択マーカーの適合性を確認した（上記参照）。遺伝子欠失の設計はＤＤＮＡによって行い、ｈｍｆＫ１欠失変異体のｈｙｇＢ選択マーカーとｈｍｆＫ３欠失変異体のｐｈｌｅｏ選択マーカーを用いたスプリットマーカーアプローチ（Ａｒｅｎｔｓｈｏｒｓｔら，２０１５，“Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｉｎ  Ｆｕｎｇｉ”，Ｖｏｌｕｍｅ  １．ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ  Ｍ．Ａ．，Ｍａｒｕｔｈａｃｈａｌａｍ  Ｋ．，（編）．スイス：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，ｐｐ．２６３−２７２）に基づいている（図１）。スプリットマーカーアプローチは、相同組換えを受けたＤＮＡ断片のみが、完全な抗生物質選択マーカー遺伝子を生じることから、誤った（ｈｍｆＫ１又はｈｍｆＫ３でない）部位への組込みの頻度を減らすために適用される。ｈｍｆＫ１／ｈｍｆＫ３二重変異体を作成する試みを、１回の形質転換実験において両方の選択マーカーを使用して行った。図１に概要が示されている遺伝子破壊断片の合成は、サーモフィッシャー・サイエンティフィック（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のジーンアート（ＧｅｎｅＡｒｔ）に外注した。断片の配列は、配列表に記載されている（配列番号３０〜３３）。
【０１７９】
形質転換と選択
形質転換体を行う前に、ＷＴのＰ．ブラシリアヌム株について、ＦＤＣＡ分解スクリーニングを準備した。ＷＴ株はＦＤＣＡを炭素源として使用できる。これを行うことができない変異体を作成すると、ＦＤＣＡを唯一の炭素源として含む培地では増殖しないと予想される。このアッセイは、正しいｈｍｆＫ１（及びｈｍｆＫ３）欠失形質転換体のスクリーニングを容易にすると予想される（これらの遺伝子の欠失がＦＤＣＡ分解を損なうと仮定）。
【０１８０】
脱塩水１リットルあたり２．０ｍｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１ｇのＭｇＣｌ２  ６Ｈ２０、１０ｍｇのＥＤＴＡ、２ｍｇのＺｎＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、１ｍｇのＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、５ｍｇのＦｅＳＯ４  ７Ｈ２Ｏ、０．２ｍｇのＮａ２ＭｏＯ４．２Ｈ２Ｏ、０．２ｍｇのＣｕＳＯ４  ５Ｈ２Ｏ、０．４ｍｇのＣｏＣｌ２６Ｈ２Ｏ及び１ｍｇのＭｎＣｌ２  ２Ｈ２Ｏ、２５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４及び２５ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４を含むコービオン（Ｃｏｒｂｉｏｎ）最小培地を使用した。実験に応じて、次の炭素源、０．２  ｇ／ｌの酵母エキス、１５ｍＭのＦＤＣＡ、５ｍＭのグルコース、５ｍＭのクエン酸、６ｍＭのＨＭＦのうちの１つ又は複数を追加した。ＦＤＣＡの沈殿を避けるために、ＦＤＣＡを唯一の炭素源として使用した場合を除き、ｐＨは３．０に設定した。
【０１８１】
ＷＴのＰ．ブラジリアヌムは、液体培地と寒天プレートの両方において、唯一の炭素源として１５ｍＭのＦＤＣＡを含むコービオン最小培地上で増殖できた。ネガティブコントロール（炭素源を含まない最小培地）は、極小量のバックグラウンドの増殖を示したが、これは、この株が寒天成分で増殖する能力によるものであるに違いない。形質転換体のスクリーニングにおいて、このバックグラウンドの増殖は、胞子の実際の移転のポジティブコントロールとなることから、これは有益な副作用である。本発明者らは、ＦＤＣＡを含み、ＹＥを含まない、つまり唯一の炭素源として１５ｍＭのＦＤＣＡを含む寒天プレート上で形質転換体（下記参照）を最初にスクリーニングすることに決めた（より明確な結果、より迅速）。
【０１８２】
標準的なＤＤＮＡ真菌形質転換プロトコルを用いて、遺伝子断片をＷＴのＰ．ブラジリアヌム株に形質転換した（Ｐｕｎｔとｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｎｄｅｌ，１９９２，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６１：４４７−４５７）。ＷＴ株のプロトプラストを断片で形質転換して、ΔｈｍｆＫ１を作成し、ＨｙｇＢを含む選択プレート上に播種した。加えて、ＷＴ株のプロトプラストを断片で形質転換して、ΔｈｍｆＫ１及びΔｈｍｆＫ３の両方を作成し、ＨｙｇＢのみ、Ｐｈｌｅｏのみ、及びＨｙｇＢとＰｈｌｅｏの両方を含む選択プレート上に播種した。合計、４８個の一次形質転換体が、さまざまな選択プレート上で生成された。ＦＤＣＡを唯一の炭素源として含むプレート上での増殖がないか、増殖が弱いことに基づき、これらの一次形質転換体をスクリーニングした。３５のうち１７（約５０％）のＨｙｇＢ＋（ΔｈｍｆＫ１）形質転換体が、プレート上で強い表現型を示し（ＦＤＣＡでの増殖がない）、これはＦＤＣＡ分解経路が完全なｈｍｆＫ１遺伝子を伴うことを示唆した。潜在的なΔｈｍｆＫ３変異体はプレート上で表現型を示さなかった。抗生物質マーカーの存在について、全ての形質転換体をさらに試験した。
【０１８３】
次に、プレート上で表現型を示した１７個のＨｙｇＢ＋（ΔｈｍｆＫ１）クローン及び、全てのｈｍｆＫ１＋ｈｍｆＫ３形質転換体をプレート上で精製し、液体培地±１５ｍＭのＦＤＣＡ（−ＹＥ）中で試験した。寒天プレート上で強い表現型を示した全てのΔｈｍｆＫ１クローンについて、唯一の炭素源としてＦＤＣＡを含む液体培地では、増殖が完全に消失していた。
【０１８４】
診断的ＰＣＲ分析を異なるｈｍｆＫ１欠失形質転換体について実施して、無傷のｈｍｆＫ１遺伝子と完全に欠失したｈｍｆＫ１遺伝子とを区別した。異なるプライマーの組合せを試験し（表１３、１４、及び１５を参照）、結果は、表現型（ＦＤＣＡで増殖しない）を示す全てのｈｍｆＫ１クローンが正しいことを示した（データは示さず）。逆に、表現型を示さないｈｍｆＫ１＋ｈｍｆＫ３形質転換体＃３１及び＃３３は、なおもＷＴのｈｍｆＫ１ＰＣＲバンドを生じた。また、診断的ＰＣＲ分析をｈｍｆＫ１＋ｈｍｆＫ３形質転換体に対しても行い、正しいｈｍｆＫ３欠失について試験した（表１４及び１６を参照）。形質転換体＃４３（ΔｈｍｆＫ１＋ΔｈｍｆＫ３；ＨｙｇＢ＋Ｐｈｌｅｏで選択）はＰＣＲに基づき、正しいｈｍｆＫ３欠失を有することが判明した（データは示さず）。この形質転換体はＨｙｇＢに耐性であるが、ｈｍｆＫ１欠失を含んでいない（ＰＣＲの結果に基づく）。また、全ての精製ｈｍｆＫ１＋ｈｍｆＫ３形質転換体をｈｍｆＫ１形質転換体と同様にして液体培養中でも試験した。形質転換体＃４３（正しいｈｍｆＫ３欠失）はＦＤＣＡ上で増殖した。
【０１８５】
結果から、本発明者らは、正しいｈｍｆＫ１欠失が生成され、ｈｍｆＫ１遺伝子の欠失は、試験された条件下においてＦＤＣＡを唯一の炭素源として増殖することを１００％不可能とし、これは、ｈｍｆｋ１がＦＤＣＡ分解の重要な遺伝子であることを確認していると結論付ける。加えて、ｈｍｆＫ３の欠失は１つのクローン（＃４３）において正しく、表現型を示さず、これは、少なくとも試験された条件下でなければ、ｈｍｆｋ３がＦＤＣＡの分解に関与していないことを示唆すると本発明者らは結論付けることができる。
【表２８】
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【表２９】
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【表３０】
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【表３１】
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【０１８６】
実施例４：ＨＭＦの変換とＦＤＣＡの生成
次に、ＨＭＦの変換とＦＤＣＡの生成を適時にモニターするための実験を準備した。上の結果から、ＷＴ株、確認されたｈｍｆＫ１欠失＃２６及び＃３０、並びに確認されたｈｍｆＫ３欠失＃４３を選択して、振盪フラスコ培養での発酵についてアッセイした。６ｍＭのＨＭＦを添加した、５ｍＭのグルコース又は５ｍＭのクエン酸塩を含み、酵母抽出物を含まないコービオン最小培地上で株を増殖させた。培養物を７日間増殖させ、１、２、３、４、及び７日後に試料を回収した。試料の上清を、国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０７２４０６の実施例に記載されているようにして、ＨＰＬＣによってＨＭＦ、ＦＤＣＡ、及び中間体について分析した。
【０１８７】
全ての株がグルコースを含む培地でよく増殖した。ｈｍｆＫ１欠失株＃２６及び＃３０は、クエン酸含有培地では有意に増殖しなかった。したがって、４日目に、グルコース含有培養物（＃２６及び＃３０）の約１％を使用して、クエン酸含有フラスコ（＝ｃｉｔｒ＊）に再播種した。しかし、その場合でも、これらの培養では、（明確な）さらなる増殖は観察されなかった。ｈｍｆＫ３欠失株＃４３は、クエン酸含有培地上でＷＴ株と同等に増殖した。１週間後にｐＨを測定した（データは示さず）。興味深いことに、１週間のインキュベーション後のｈｍｆＫ１欠失株の培養のｐＨは、両方の培地におけるＷＴ及びｈｍｆＫ３欠失株の培養のものよりも低く、これは酸（ＦＤＣＡ）の生成を指し示す。
【０１８８】
図２及び図３は、それぞれグルコース又はクエン酸上で増殖させた培養のＨＰＬＣ分析の結果を示す。グルコースを含む培養では、即時のＨＭＦ変換が観察された。最初の試料の分析においてさえ、わずかな微量のＨＭＦしか測定されなかった。ＷＴとΔｈｍＫ３培養の両方で、全てのフランのレベルが同様に、非常に低いレベルに低下し、予想どおり、ＦＤＣＡの蓄積はまったく観察されなかった（図２Ａ及び図２Ｄ）。一方、非常に再現性のあるＦＤＣＡの蓄積が両方のｈｍｆＫ１欠失株において測定された（図２Ｂ及び図２Ｃ）。ＨＭＦからＦＤＣＡへの変換は、７日後に６０〜７０％にまで達した。ＨＭＦ酸は、グルコース上で増殖させたｈｍｆＫ１欠失培養において観察された主要な一時的な中間化合物であった。
【０１８９】
クエン酸含有培養では、ＦＤＣＡの蓄積もＷＴ及びΔｈｍＫ３培養の両方において測定されなかった（図３Ａ及び図３Ｄ）。グルコースを含む培養よりも遅い速度ではあるが、全てのフランが経時的に分解された。４日後、クエン酸含有培地ではｈｍｆＫ１欠失＃２６及び＃３０の有意な増殖は観察されなかったが、約５０％のＨＭＦ−＞ＨＭＦＣＡー＞ＦＤＣＡ変換が測定された（図３Ｂ及び図３Ｄ）。これは、（出芽した）胞子によって行われるＨＭＦからＦＤＣＡへの生物変換の可能性を指し示す。
【０１９０】
これらの結果から、本発明者らはｈｍｆＫ１がＦＤＣＡ分解における重要な遺伝子であると結論付けた。ｈｍｆＫ１の削除は、ＨＭＦが培養に提供された場合、ＦＤＣＡの蓄積を導く。（出芽）胞子ベースの生物変換が可能と思われ、細胞の増殖は必要ないことを示唆する。しかしながら、グルコース含有培地における増殖の培養では、ＦＤＣＡの蓄積はより速くなる。試験した条件下において、ｈｍｆＫ３遺伝子はＦＤＣＡの分解に関与していない。
【０１９１】
実施例５：低ｐＨでのＨＭＦの結晶ＦＤＣＡへの変換
より制御された条件下でｈｍｆＫ１欠失変異体がＦＤＣＡを生成する可能性をさらに実証するために、７−Ｌガラス発酵槽において生体内変化実験を実施した。細胞をミネラル塩培地中、３０℃で培養した（１Ｌあたり：ＫＣｌ、１．３ｇ；ＫＨ２ＰＯ４、３．８ｇ；ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、１．２３ｇ；Ｎａ２ＥＤＴＡ．２Ｈ２Ｏ、１２５ｍｇ；ＺｎＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、５５ｍｇ；Ｈ３ＢＯ３、２７．５ｍｇ；ＭｎＣｌ２．４Ｈ２Ｏ、１２．５ｍｇ、ＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、１２．５ｍｇ；ＣｏＣｌ２．６Ｈ２Ｏ、４．２５ｍｇ；ＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ、４ｍｇ；Ｎａ２ＭｏＯ４．２Ｈ２Ｏ、３．７５ｍｇ、グルコース、１０ｇ；（ＮＨ４）２ＳＯ４、７．６ｇ又はＮａＮＯ３、９．８ｇ）。必要に応じて消泡剤を添加し、溶存酸素圧を空気飽和レベルの２０％に維持した。増殖中に、ＨＭＦを最終濃度１ｍＭまで供給して、ＦＤＣＡ生成酵素系を誘導した。初期のグルコースが枯渇した後、バイオマス密度が細胞乾燥重量で２０ｇ／Ｌに達するまでグルコースを連続的に供給した。ＨＭＦＣＡ又はＨＭＦの蓄積を防ぐために手動で調整された２．５ｍｍｏｌ／Ｌブロス／ｈの開始速度でＨＭＦ供給をオンにすることにより、生体内変化段階を開始させた。ＨＭＦと共に、生物学的変換中の細胞のエネルギー需要をカバーするため、グルコースの供給を行った。グルコースを全体を通してモニターし、グルコースが蓄積しないように供給速度を手動で調整した。ｐＨを初期値（５．５）から２．７の設定点まで低下させた後、ＮａＯＨの自動添加により、それを制御した。或いは、ｐＨを調整せずに低下させ、この場合、値は約２．３で安定した。生物学的変換の間にＨＭＦはＦＤＣＡに変換され、ｐＨ３．５未満ではＦＤＣＡは固体化合物として結晶化した。ＨＭＦの供給速度が高すぎる場合、ＨＭＦＣＡの一時的な蓄積が観察された；供給量を減らすと、蓄積されたＨＭＦＣＡは通常、ＦＤＣＡへと酸化されると予想される。生物学的変換は９０ｇ／Ｌまでの全体滴定量のＦＤＣＡを生じた。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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