(57)【要約】  ＣＳ１を標的とするキメラ抗原レセプターを使用してＡＬアミロイドーシスを治療する方法が記載される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
それを必要とする患者に、キメラ抗原レセプターをコードする発現カセットを含むベクターにより形質導入されたヒトT細胞の集団を投与することを含む、軽鎖アミロイドーシスの治療方法であって、キメラ抗原レセプターが：
ＣＳ１  ｓｃＦｖ；スペーサー領域；膜貫通ドメイン；共シグナル伝達ドメイン；及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン；
を含む、方法。
【請求項２】
前記キメラ抗原レセプターが、：
ＣＳ１  ｓｃＦｖ；スペーサー領域；ＣＤ２８膜貫通ドメイン；ＣＤ２８共シグナル伝達ドメイン；及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン；
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記キメラ抗原レセプターが、：
ＣＳ１  ｓｃＦｖ；スペーサー領域；ＣＤ４膜貫通ドメイン；４−１ＢＢ共シグナル伝達ドメイン；及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン；
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記キメラ抗原レセプターが、：
ＣＳ１  ｓｃＦｖ；配列番号２〜５及び９〜１２から選択されるアミノ酸配列を含むスペーサー領域；ＣＤ４膜貫通ドメイン；４−１ＢＢ共シグナル伝達ドメイン；及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン；
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記キメラ抗原レセプターが、：
ＣＳ１  ｓｃＦｖ；配列番号２〜５及び９〜１２から選択されるアミノ酸配列を含むスペーサー領域；ＣＤ２８膜貫通ドメイン；ＣＤ２８共シグナル伝達ドメイン；及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン；
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記キメラ抗原レセプターが、：
ＣＳ１  ｓｃＦｖ；スペーサー、配列番号２〜５及び９〜１２から選択されるアミノ酸配列を含むスペーサー；ＣＤ４膜貫通ドメイン；４−１ＢＢ共シグナル伝達ドメイン；及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン；
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記キメラ抗原レセプターが、：
スペーサー、配列番号２〜５及び９〜１２から選択されるアミノ酸配列を含むスペーサー；ＣＤ２８膜貫通ドメイン；ＣＤ２８共シグナル伝達ドメイン；及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン；
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記キメラ抗原レセプターが、配列番号３０、３１、３３、３４、３６、３７、３９、４０、４２、４３、４４及び４５から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％が同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記キメラ抗原レセプターが、配列番号３０、３１、３３、３４、３６、３７、３９、４０、４２、４３、４４及び４５から選択されるアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記キメラ抗原レセプターが、配列番号３０、３１、３３、３４、３６、３７、３９、４０、４２、４３、４４及び４５、それぞれ５個以下のアミノ酸置換を有する、から選択されるアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記形質導入されたヒトＴ細胞の少なくとも２０％、３０％、又は４０％がセントラルメモリーＴ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記形質導入されたセントラルメモリーＴ細胞の少なくとも３０％がＣＤ４＋及びＣＤ６２Ｌ＋又はＣＤ８＋及びＣＤ６２Ｌ＋である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ヒトＴ細胞の集団が前記患者に対して自己由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ヒトＴ細胞の集団が前記患者に対して同種異系である、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
軽鎖アミロイドーシス（ＡＬ  ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ）は、カッパ又はラムダ制限のモノクローナル軽鎖を産生する、骨髄の形質細胞のクローン集団によって特徴付けられる。アミロイド形成性軽鎖は不適切に折りたたまれ、それにより結合して原線維を形成するベータプリーツシートを形成する。これらのアミロイド線維は、心臓、腎臓、及び末梢神経を包含する組織や器官に沈着し、そこで構造と機能を徐々に妨害する（Ｆａｌｋ  ｅｔ  ａｌ．  １９９７  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３３７：  ８９８−９０９）。治療なしでは、予後は不良であり、生存期間中央値はわずか８ヶ月である（Ｋｙｌｅ  ｅｔ  ａｌ．  １９９７  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３３６：１２０２−１２０）。ＡＬアミロイドーシスの治療は、アミロイド線維の産生を阻止し、且つ臓器の回復を可能にするため、主に基礎となる形質細胞クローンを標的とすることに焦点を合わせている。治療の選択肢には、多発性骨髄腫の治療に使用される化学療法レジメンと、高用量のメルファランとその後の自家幹細胞移植とが含まれる。ＡＬアミロイドーシスの患者は、一般的に形質細胞疾患の治療のためになされた多数の進歩の恩恵を受けてきたが、アミロイド関連器官の機能不全と、残留クローンがさらなる原線維沈着を引き起こすのを防ぐために迅速で深い反応を得る必要があるため、治療は集団の虚弱な性質によって複雑になる。幹細胞移植とプロテオソーム阻害剤及び免疫調節薬を包含する新しい薬剤との両方で長期寛解が可能であるが、忍容性が高く効果的な新しい治療法が必要である。
【背景技術】
【０００２】
概要
本明細書に記載さているのは、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭ）受容体ファミリーのメンバーである細胞表面糖タンパク質ＣＳ１を標的としたキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）を使用してＡＬアミロイドーシスを治療する方法である。以下に、形質細胞疾患患者の骨髄標本を評価する研究の結果を説明する。患者は、多発性骨髄腫（ＭＭ）又はＡＬアミロイドーシスのいずれかの診断について、血液学的クローンの特徴並びに臓器病変(organic  involvement)を包含する完全な臨床評価を受けていた。細胞内カッパ／ラムダ鎖の異常な比率の分析により、悪性と正常の形質細胞を区別するのに、多色フローサイトメトリー分析を使用した。非常に歪んだカッパ及びラムダ比は、ＡＬアミロイドーシスの悪性クローンの信頼できる指標である。次いで、形質細胞のクローン集団を、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）の発現及びＣＳ１発現について評価した。これらの研究は、ＣＳ１がＡＬアミロイドーシス患者のクローン形質細胞に発現し、ＢＣＭＡがＡＬアミロイドーシス患者の形質細胞に有意に発現しないことを示した。これは、ＭＭとは対照的に、ＢＣＭＡが遍在的に発現されると考えられる。以下に説明する追加の研究は、ＣＳ１を標的とするＣＡＲがマウスモデルでＣＳ１を発現する細胞を効果的に除去できることを示している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本明細書に記載されているのは、それを必要とする患者に、キメラ抗原レセプターをコードする発現カセットを含むベクターにより形質導入されたヒトT細胞の集団を投与することを含む、軽鎖アミロイドーシスの治療方法であって、キメラ抗原レセプターが：
ＣＳ１  ｓｃＦｖ；スペーサー領域；膜貫通ドメイン；共シグナル伝達ドメイン；及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン；
を含む、方法である。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
様々な態様において、：  前記キメラ抗原レセプターが、：
ＣＳ１  ｓｃＦｖ；スペーサー領域；ＣＤ２８膜貫通ドメイン；ＣＤ２８共シグナル伝達(co-signalling)ドメイン；及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン；
を含む、；
前記キメラ抗原レセプターが、：
ＣＳ１  ｓｃＦｖ；スペーサー領域；ＣＤ４膜貫通ドメイン；４−１ＢＢ共シグナル伝達ドメイン；及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン；
を含む、；
前記キメラ抗原レセプターが、：
ＣＳ１  ｓｃＦｖ；配列番号２〜５及び９〜１２から選択されるアミノ酸配列を含むスペーサー領域；ＣＤ４膜貫通ドメイン；４−１ＢＢ共シグナル伝達ドメイン；及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン；
を含む、；
前記キメラ抗原レセプターが、：
ＣＳ１  ｓｃＦｖ；配列番号２〜５及び９〜１２から選択されるアミノ酸配列を含むスペーサー領域；ＣＤ２８膜貫通ドメイン；ＣＤ２８共シグナル伝達ドメイン；及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン；
を含む、；
前記キメラ抗原レセプターが、：
ＣＳ１  ｓｃＦｖ；スペーサー、配列番号２〜５及び９〜１２から選択されるアミノ酸配列を含むスペーサー；ＣＤ４膜貫通ドメイン；４−１ＢＢ共シグナル伝達ドメイン；及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン；
を含む、；
前記キメラ抗原レセプターが、：
スペーサー、配列番号２〜５及び９〜１２から選択されるアミノ酸配列を含むスペーサー；ＣＤ２８膜貫通ドメイン；ＣＤ２８共シグナル伝達ドメイン；及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン；
を含む、；
前記キメラ抗原レセプターが、配列番号３０、３１、３３、３４、３６、３７、３９、４０、４２、４３、４４及び４５から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％が同一であるアミノ酸配列を含む、；
前記キメラ抗原レセプターが、配列番号３０、３１、３３、３４、３６、３７、３９、４０、４２、４３、４４及び４５から選択されるアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む、；
前記キメラ抗原レセプターが、配列番号３０、３１、３３、３４、３６、３７、３９、４０、４２、４３、４４及び４５、それぞれ５個以下のアミノ酸置換を有する、から選択されるアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む、；
前記形質導入されたヒトＴ細胞の少なくとも２０％、３０％、又は４０％がセントラルメモリーＴ細胞である、；
前記形質導入されたセントラルメモリーＴ細胞の少なくとも３０％がＣＤ４＋及びＣＤ６２Ｌ＋又はＣＤ８＋及びＣＤ６２Ｌ＋である、；
前記ヒトＴ細胞の集団が前記患者に対して自己由来である；且つ、
前記ヒトＴ細胞の集団が前記患者に対して同種異系である。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
図面の説明
【図１】図１Ａ−Ｃは、ＡＬアミロイドーシスの腫瘍性形質細胞がＣＳ１を優先的に発現することを示す研究結果を表す。  （Ａ）骨髄単核細胞は、ＡＬアミロイドーシス及び多発性骨髄腫と診断された患者から分離され、且つ、ＣＳ１及びＢＣＭＡに対する抗体で標識した後、κ／lの細胞内染色を行った。ＣＳ１及びＢＣＭＡの発現は、ゲーテッドドミナント(gated  dominant)κ軽鎖について分析された。  （Ｂ）ＡＬアミロイドーシスのドミナントクローンにおけるＣＳ１及びＢＣＭＡ陽性細胞の割合が示されているす（Ｎ＝１４）。  （Ｃ）多発性骨髄腫のドミナントクローンにおけるＣＳ１及びＢＣＭＡ陽性細胞の割合が示されている（Ｎ＝１０）。
【図２】図２Ａ−Ｄは、ＣＳ１陽性細胞に対して細胞傷害性であり、マウスにおいて持続的な腫瘍退縮を誘導することを示すＣＳ１標的ＣＡＲ  Ｔ細胞を用いた研究の結果を表す。  （Ａ）ＣＳ１  ＣＡＲコンストラクトの概略図、それぞれが抗原特異的ｓｃＦｖ、ＩｇＧ４ヒンジ領域、及びＣＤ２８共刺激ドメイン並びにＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを包含する。ＩｇＧ４ヒンジ領域は、ＣＨ２部分を削除することにより短縮された。ＣＡＲ配列の後にはＴ２Ａリボソームスキップ配列が続き、次にＥＧＦＲｔ追跡／自殺遺伝子のコード配列が続く。  （Ｂ）精製されたセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）を活性化し、ＣＳ１  ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターで形質導入した。ＣＡＲ発現は、ＥＧＦＲセツキシマブに対する抗体で細胞を染色することにより検出された。  （Ｃ）増殖したＣＳ１  ＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞毒性を、５１Ｃｒ標識ＣＳ１陽性標的細胞、ＭＭ．１Ｓ、と共培養した後、４時間５１Ｃｒ放出アッセイを使用して評価した。ＯＫＴ３発現ＬＣＬを陽性対照として使用し、骨髄性白血病ＫＧ１Ａを陰性対照として使用した。非形質導入モックＴ細胞は、ネガティブエフェクター細胞であった。  （Ｄ）ルシフェラーゼ（ｆｆｌｕｃ）及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）細胞を発現するように操作された２×１０６ｆｆｌｕｃＧＦＰ  ＭＭ．１Ｓを、ＮＯＤ／Ｓｃｉｄ  ＩＬ２ＲγＣｎｕｌｌ（ＮＳＧ）マウスに脛骨内（intratibially,ｉ．ｔ．）注射した。腫瘍接種の５日後、マウスに１×１０６ＣＳ１  ＣＡＲ  Ｔ細胞をｉ．ｖ．注射し、非形質導入モック細胞をコントロールマウスに注入した。腫瘍シグナルは、Ｘｅｎｏｇｅｎイメージングで週に１回モニターされた。
【図３】図３は、レンチウイルスベクターを発現するＣＳ１  ＣＡＲの概略図である（ＣＳ１ｓｃＦｖ−ＩｇＧ４（ＨＬ−ＣＨ３）−ＣＤ２８ｇｇ−ゼータ（ＣＯ）−Ｔ２Ａ−ＥＧＦＲｔ＿ｅｐＨＩＶ７）。ＣＳ１  ＣＡＲ構築物は、：  ＧＭＣＳＦシグナル配列、ＣＳ１  ｓｃＦｖ、ＩｇＧ４ヒンジ領域、リンカー、ＣＨ３ドメイン、ＣＤ２８共刺激ドメイン及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン、を包含する。ＣＡＲ構築物の後には、Ｔ２Ａリボソームスキップシーケンスが続き、次に自殺遺伝子ＥＧＦＲｔコードシーケンスが続く。ＣＡＲ及びＥＧＦＲｔ分子は、単一の転写産物から発現される。
【図４】図４は、シグナルペプチド、リボソームスキップシーケンス及びＥＧＦＲｔを包含するＣＳ１  ＣＡＲのアミノ酸配列を表す（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）。
【図５】図５は、ＣＳ１ｓｃＦｖ−ＩｇＧ４（ＨＬ−ＣＨ３）−ＣＤ４ｔｍ−４１ＢＢ−Ｚｅｔａ−Ｔ２Ａ−ＥＧＦＲｔのアミノ酸配列を表す（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２）。
【図６】図６は、ＣＳ１ｓｃＦｖ−ＩｇＧ４（Ｌ２３５Ｅ，  Ｎ２９７Ｑ）−ＣＤ４ｔｍ−４１ＢＢ−Ｚｅｔａ−Ｔ２Ａ−ＥＧＦＲｔのアミノ酸配列を表す（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５）。
【図７】図７は、ＣＳ１ｓｃＦｖ−ＩｇＧ４（Ｌ２３５Ｅ，  Ｎ２９７Ｑ）−ＣＤ２８ｔｍ−ＣＤ２８ｇｇ−Ｚｅｔａ−Ｔ２Ａ−ＥＧＦＲｔのアミノ酸配列を表す（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８）。
【図８】図８は、ＣＳ１ｓｃＦｖ−Ｌｉｎｋｅｒ−ＣＤ４ｔｍ−４１ＢＢ−Ｚｅｔａ−Ｔ２Ａ−ＥＧＦＲｔのアミノ酸配列を表す（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）。
【図９】図９は、ＣＳ１ｓｃＦｖ−Ｌｉｎｋｅｒ−ＣＤ２８ｔｍ−ＣＤ２８ｇｇ−Ｚｅｔａ−Ｔ２Ａ−ＥＧＦＲｔのアミノ酸配列を表す（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
詳細な説明
実施例１：  ＡＬアミロイドーシス及び多発性骨髄腫におけるＣＳ１及びＢＣＭＡの発現
ＡＬアミロイドーシスの１４人の患者が研究された。これらの患者の腫瘍性形質細胞でのＣＳ１及びＢＣＭＡ発現の分析により、細胞はＢＣＭＡではなくＣＳ１を優先的に発現することが明らかになる。簡単に言えば、ＡＬアミロイドーシスと診断された患者から骨髄単核細胞を単離し、ＣＳ及びＢＣＭＡに対する抗体で標識した後、カッパ／ラムダで染色した。カッパ制限疾患を有する患者の形質細胞のクローン集団をゲーティングし、その後ＣＳ１発現を分析する一例を図１Ａに示す。すべてのＡＬアミロイドーシスサンプルは、高レベルのＣＳ１（７６．５±４．７％）を発現したが、ＢＣＭＡの陰性又は非常に低い発現を示した（４．９±０．８％）（図１Ｂ）。
比較のために、１０人の患者ＭＭからの骨髄標本を同じ方法論を使用して同じ期間にテストした（図１Ｃ）。ＭＭ患者のクローン形質細胞は、ＡＬにおいて見られるものと同様にＣＳ１を発現する。；ただし、ＢＣＭＡは比較的頻繁に発現される。興味深いことに、ＡＬ患者の形質細胞でのＢＣＭＡの発現の欠如は、ＡＬのクローン形質細胞が骨髄腫細胞と比較してユニークであることを示唆しているる。
【０００７】
実施例２：  ＣＳ１をターゲットとしたＣＡＲによるセルキリング
ＡＬアミロイドーシスのためのＣＡＲ  Ｔ細胞療法のための標的としてＣＳ１の有用性を調べるために、我々は以下で詳しく説明する、ＣＤ２８ｇｇ共刺激ドメイン、リボソームスキップＴ２Ａ配列、及び選択、追跡、及びアブレーション分子としてトランケートＥＧＦ受容体配列（ＥＧＦＲｔ）を含有し、且つ、ＳＩＮレンチウイルスベクターに組み込まれた、第２世代のＣＳ１  ＣＡＲ（図２Ａ）をテストした。精製されたセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）を活性化し、ＣＳ１  ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターで形質導入し、ＩＬ−２  ５０Ｕ／ｍＬ及びＩＬ−１５  ０．５ｎｇ／ｍＬの存在下で３週間増殖させた。細胞をセツキシマブ−ビオチン及びストレプトアビジン（ＳＡ）で染色することにより、ＣＡＲの発現をモニターした（図２Ｂ）。増殖したＣＳ１  ＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞毒性を、５１Ｃｒ−標識ＣＳ１＋標的細胞（ＭＭ．１Ｓ）との共培養後の４時間５１Ｃｒ放出アッセイを使用して評価した（図２Ｃ）
【０００８】
６〜１０週齢ＮＯＤ／Ｓｃｉｄ  ＩＬ２ＲγＣｎｕｌｌマウスに、ルシフェラーゼ（ｆｆｌｕｃ）及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するように操作された２ｘ１０６  ｆｆｌｕｃＧＦＰ  ＭＭ．１Ｓを脛骨内（ｉ．ｔ．）注射した。腫瘍接種の５日後、マウスに１ｘ１０６個のＣＳ１  ＣＡＲ  Ｔ細胞を静脈内（ｉ．ｖ．）注射し、非形質導入モック細胞をコントロールマウスに注入した。麻酔されたマウスは、ＸｅｎｏｇｅｎＩＶＩＳ  １００シリーズシステム（Ｘｅｎｏｇｅｎ、アラメダ、ＣＡ）を使用して毎週撮像された。ｆｆＬｕｃ＋腫瘍異種移植片からの光子は、ソフトウェアプログラムＬｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ（Ｘｅｎｏｇｅｎ）を使用して定量化され、生物発光シグナルは、露出時間及び表面積に対して正規化された総光子束として測定され、ステラジアンあたり１ｃｍ２あたりの光子の単位で表された。
【０００９】
抗腫瘍活性を試験するために、ＭＭ．１Ｓを脛骨内注射によりＮＳＧマウスに接種した。腫瘍の生着が確認されたら、１ｘ１０６個のＣＳ１  ＣＡＲ  Ｔ細胞を腫瘍を有するマウスに静脈内注入した。ＣＳ１  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＣＳ１陽性細胞（ＭＭ．１Ｓ）の特異的かつ効率的な死滅を示す（図２Ｃ）。動物モデルにおける抗腫瘍研究は、ＣＳ１  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、モックＴ細胞処理マウスと比較して有意な腫瘍寛解を誘導したことが示された（図２Ｄ）。
【００１０】
これらの知見は、ＡＬアミロイドーシス患者に対するＣＳ１指向ＣＡＲ  Ｔ細胞療法の使用を支持している。ＡＬは、ＣＡＲを介した治療法を探索するのに理想的な環境である。標的とする悪性細胞の数が比較的少ないことは、小さいが破壊的なクローンの根絶に成功する機会をもたらすとともに、サイトカイン放出症候群に関連する合併症のリスクを最小限に抑える。さらに、ＣＳ１ターゲティング抗体エロツズマブの比較的安全なプロファイルは、ＣＳ１  ＣＡＲ  Ｔ細胞が同様にこの点で好ましい結果をもたらす可能性があることを示す。我々の仕事は、ＭＭの前臨床経験とは対照的に、ＢＣＭＡは好適な標的ではないことを明らかにしながら、ＣＳ１指向のＣＡＲ  Ｔ細胞の新しい応用を表す。ＣＳ１指向のＣＡＲ  Ｔ細胞の有効性を示す我々の前臨床データにより、我々はＡＬにＣＳ１  ＣＡＲ  Ｔ細胞を使用した臨床試験を進める予定である。
【００１１】
実施例３：  ＣＳ１−標的ＣＡＲ
ＡＬアミロイドーシスの治療に使用するのに好適なＣＳ１標的ＣＡＲは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを包含する。細胞外ドメインは、ＣＳ１特異的ｓｃＦｖ領域又はその変異体(variant)、及び例えばヒトＦｃドメインの一部を含むスペーサーを含む。細胞外ドメインは、Ｔ細胞の表面上に発現されたときにＣＡＲがＴ細胞活性を、ＣＳ１を発現する細胞に向けることを可能にする。膜貫通ドメインは、例えば、ＣＤ４膜貫通ドメイン、ＣＤ８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、又はＣＤ３膜貫通ドメインを含む。細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ３複合体（ＣＤ３ζ）のゼータ（ζ）鎖由来のシグナル伝達ドメイン及び１つ以上の共刺激(costimulatory)ドメイン、例えば、４−１ＢＢ共刺激ドメインを含む。細胞内領域にＣＤ３ζと直列の４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）共刺激ドメインなどの共刺激ドメインを含めることにより、Ｔ細胞は共刺激シグナルを受け取ることができる。Ｔ細胞、例えば患者特異的な自己(autologous)Ｔ細胞は、本明細書に記載のＣＡＲを発現するように操作することができ、且つ、操作された細胞を増殖して(expanded)、治療的に使用することができる。アルファベータ（αβ）Ｔ細胞及びガンマデルタ（γδ）Ｔ細胞の両方を含む様々なＴ細胞サブセットを使用することができる。さらに、ＣＡＲは、ＮＫ細胞などの他の免疫細胞において発現され得る。患者が、本明細書に記載のＣＡＲを発現する免疫細胞で処置される場合、細胞は、自己Ｔ細胞又は同種異系(allogenic,アロジェニック)Ｔ細胞であり得る。いくつかの場合において、使用される細胞は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋セントラルメモリーＴ細胞（central  memory  T  cells,ＴＣＭ）の両方を含む細胞集団であって、これらはＣＤ６２Ｌ＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ４５ＲＯ＋、及びＣＤ４５ＲＡ−である。細胞集団は他のタイプのＴ細胞も同様に包含することができる。いくつかのＣＳ１ターゲティングＣＡＲは、ＷＯ  ２０１６／０９０３６９に詳細に記載されている。
【００１２】
ＣＳ−１ターゲティングｓｃＦｖ
本明細書に記載のＣＳ１標的ＣＡＲは、ＣＳ１−ターゲティングｓｃＦｖ（例えば、以下の配列を包含するｓｃＦｖ：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＤＦＳＲＹＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＧＥＩＮＰＤＳＳＴＩＮＹＡＰＳＬＫＤＫＦＩＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＰＤＧＮＹＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＳＴＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＶＧＩＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＶＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＨＴＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＶＡＴＹＹＣＱＱＹＳＳＹＰＹＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ；  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）又は１〜５（例えば、１又は２）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するその改変体；
を包含する。
【００１３】
有用なＣＳ１  ＣＡＲは、配列番号３１，３４，３７，４０，４３、及び４６のいずれかのアミノ酸配列（シグナル配列を欠く成熟ＣＡＲ）からなるかもしくはそれを含むか、又はＣＳ１  ＣＡＲは、配列番号３０，３３，３６，３９，４２、及び４５のいずれかのアミノ酸配列（ＧＭＣＳＦＲａシグナル配列を有する未成熟ＣＡＲ）からなるか、もしくはそれを含む。ＣＡＲは(The  CAR  and)、シグナル配列、例えば、ヒトＧＭ−ＣＳＦレセプターアルファシグナル配列（ＭＬＬＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰ；  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）を含む形態で発現され得る。ＣＡＲは、例えばＴ２Ａスキップ配列及び短縮型(truncated)ＥＧＦＲｔなど、発現をモニタリングするために有用なさらなる配列で発現され得る。したがって、ＣＡＲは、配列番号２９〜４６のいずれかのアミノ酸配列を含むかもしくはそれからなり得るか、又は、配列番号２９〜４６のいずれかと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むかもしくはそれからなり得る。ＣＡＲは、１，２，３，４又は５までのアミノ酸変化(changes)（好ましくは、保存的(conservative)アミノ酸変化）を有する配列番号２９〜４６のいずれかのアミノ酸配列を含むかもしくはそれからなり得る。
【００１４】
スペーサー領域
本明細書に記載のＣＡＲは、ＣＳ１標的ドメイン（すなわち、ＣＳ１  ＳｃＦｖ又はその変異体）と膜貫通ドメインとの間に位置するスペーサー領域を含むことができる。様々な異なるスペーサーを使用することができる。それらのいくつかは、ヒトＦｃ領域の少なくとも一部、例えばヒトＦｃ領域のヒンジ(hinge)部分、又はＣＨ３ドメイン又はその変異体を含む。以下の表１は、本明細書に記載されるＣＡＲにおいて使用され得る様々なスペーサーを提供する。
【００１５】
表１：スペーサーの例
【表１】
2020511498.tif 000002
2020511498.tif 000003
【００１６】
いくつかのスペーサー領域は、免疫グロブリン（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）ヒンジ領域の全部又は一部、すなわち免疫グロブリンのＣＨ1ドメインとＣＨ２ドメインとの間に入る配列、例えばＩｇＧ４  Ｆｃヒンジ又はＣＤ８ヒンジを含む。いくつかのスペーサー領域は、免疫グロブリンＣＨ３ドメイン、又はＣＨ３ドメイン及びＣＨ２ドメインの両方を含む。免疫グロブリン由来配列は、１つ以上のアミノ酸改変、例えば、１，２，３，４又は５の置換、例えば、オフターゲット結合を減少させる置換を含むことができる。
【００１７】
ヒンジ／リンカー領域はまた、配列ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰ（配列番号４）又はＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ（配列番号３）を有するＩｇＧ４ヒンジ領域を含むことができる。
【００１８】
ヒンジ／リンカー(linger)領域はまた、配列ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ（配列番号３）、続いてリンカー配列ＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧ（配列番号２）、続いてＩｇＧ４  ＣＨ３配列
ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号１２）を含むことができる。したがって、リンカー／スペーサー領域全体は、以下の配列を含むことができる：
ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号１１）。いくつかの場合において、スペーサーは、配列番号１１と比較して１，２，３，４又は５個の単一アミノ酸変化（例えば、保存的変化）を有する。いくつかの場合には、ＩｇＧ４  Ｆｃヒンジ／リンカー領域は、Ｆｃレセプター（ＦｃＲ）による結合を低下させるやり方で、２つの位置（Ｌ２３５Ｅ；Ｎ２９７Ｑ）において突然変異している。
【００１９】
膜貫通ドメイン
様々な膜貫通ドメインが、ＣＡＲＳにおいて使用され得る。表２は、適切な膜貫通ドメインの例を含む。スペーサー領域が存在する場合、膜貫通領域はスペーサー領域のカルボキシ末端に位置する。
【００２０】
表２：膜貫通ドメインの例
【表２】
2020511498.tif 000004
【００２１】
共刺激ドメイン
共刺激ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインとの使用に適したいずれのドメインであり得る。ＲＳＫＲＳＲＧＧＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳ（配列番号２３；ＬＬからＧＧへのアミノ酸変化に二重下線）に対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％同一である、又は同一である配列を含むＣＤ２８共刺激ドメインである。いくつかの場合において、ＣＤ２８共シグナル伝達(co-signaling)ドメインは、配列番号２３と比べて１、２、３、４もしくは５個のアミノ酸変化を有する（好ましくは保存的であり、且つ、好ましくは下線を引かれたＧＧ配列においてはない(not)）。いくつかの場合においては、共シグナル伝達ドメインは、
ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ（配列番号２４）に対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％同一である、又は同一である配列を含む４−１ＢＢ共シグナル伝達ドメインである。いくつかの場合においては、４−１ＢＢ共シグナル伝達ドメインは、配列番号２４と比較して１，２，３，４もしくは５個のアミノ酸変化（好ましくは保存的）を有する。
【００２２】
共刺激ドメイン（複数可）は、膜貫通ドメインとＣＤ３ζシグナル伝達ドメインとの間に位置する。表３は、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインの配列と共に適切な共刺激ドメインの例を含む。
【００２３】
表３：ＣＤ３ζドメイン及び共刺激ドメインの例
【表３】
2020511498.tif 000005
【００２４】
種々の実施形態において、：  共刺激ドメインは、
表３に示される共刺激ドメイン又は１〜５（例えば１又は２）のアミノ酸改変を有するその変異体、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１〜５（例えば、１又は２）のアミノ酸改変を有するその変異体、４−１ＢＢ共刺激ドメイン又は１〜５（例えば１又は２）のアミノ酸改変を有するその変異体及びＯＸ４０共刺激ドメイン又は１〜５（例えば、１又は２）のアミノ酸改変を有するその変異体、
からなる群から選択される。特定の実施形態では、４−１ＢＢ共刺激ドメイン又は１〜５（例えば１又は２）のアミノ酸改変を有するその変異体が存在する。いくつかの実施形態では、２つの共刺激ドメイン、例えばＣＤ２８共刺激ドメイン１〜５（例えば、１又は２）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するその変異体及び４−１ＢＢ共刺激ドメイン又は１〜５（例えば１又は２）のアミノ酸改変（例えば、置換）を有するその変異体、が存在する。様々な実施形態では、１〜５（例えば、１又は２）のアミノ酸改変が置換である。共刺激ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインに対するアミノ末端であり、且つ、いくつかの場合、２〜１０、例えば３アミノ酸（例えば、ＧＧＧ）からなる短いリンカーは、共刺激ドメインとＣＤ３ζシグナル伝達ドメインとの間に位置する。
【００２５】
ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン
ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインとの使用に適したいずれのドメインであり得る。いくつかの場合、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインは、
ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号２１）に対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％同一である、又は同一である配列を含む。いくつかの場合、ＣＤ３ζシグナル伝達(signaling)は、配列番号２１と比較して１，２，３，４もしくは５のアミノ酸変化（好ましくは保存的）を有する。
【００２６】
短縮型(truncated)ＥＧＦＲ
ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインの後には、リボソームスキップ配列（例えば、ＬＥＧＧＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰＲ；配列番号２７）、及び
ＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰＲＫＶＣＮＧＩＧＩＧＥＦＫＤＳＬＳＩＮＡＴＮＩＫＨＦＫＮＣＴＳＩＳＧＤＬＨＩＬＰＶＡＦＲＧＤＳＦＴＨＴＰＰＬＤＰＱＥＬＤＩＬＫＴＶＫＥＩＴＧＦＬＬＩＱＡＷＰＥＮＲＴＤＬＨＡＦＥＮＬＥＩＩＲＧＲＴＫＱＨＧＱＦＳＬＡＶＶＳＬＮＩＴＳＬＧＬＲＳＬＫＥＩＳＤＧＤＶＩＩＳＧＮＫＮＬＣＹＡＮＴＩＮＷＫＫＬＦＧＴＳＧＱＫＴＫＩＩＳＮＲＧＥＮＳＣＫＡＴＧＱＶＣＨＡＬＣＳＰＥＧＣＷＧＰＥＰＲＤＣＶＳＣＲＮＶＳＲＧＲＥＣＶＤＫＣＮＬＬＥＧＥＰＲＥＦＶＥＮＳＥＣＩＱＣＨＰＥＣＬＰＱＡＭＮＩＴＣＴＧＲＧＰＤＮＣＩＱＣＡＨＹＩＤＧＰＨＣＶＫＴＣＰＡＧＶＭＧＥＮＮＴＬＶＷＫＹＡＤＡＧＨＶＣＨＬＣＨＰＮＣＴＹＧＣＴＧＰＧＬＥＧＣＰＴＮＧＰＫＩＰＳＩＡＴＧＭＶＧＡＬＬＬＬＬＶＶＡＬＧＩＧＬＦＭ（配列番号２８）に対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％同一である、又は同一である配列を有する短縮型ＥＧＦＲが続いてもよい。いくつかの場合、短縮型ＥＧＦＲは、配列番号２８と比較して１，２，３，４もしくは５のアミノ酸変化（好ましくは保存的）を有する。
【００２７】
ＡＬアミロイドーシスに罹患している患者には、本明細書に記載のＣＳ１キメラ抗原レセプターをコードする発現カセットを含むベクターにより形質導入されたヒトＴ細胞の集団を投与することができる（例えば、配列番号２９−４６のいずれかのアミノ酸配列、又は配列番号２９−４６のいずれかと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列、又は最大１、２、３、４又は５個のアミノ酸変化（好ましくは保存的アミノ酸変化）を伴う配列番号２９−４６のいずれかのアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるＣＡＲ）。様々な実施形態において、：  ヒトＴ細胞の集団は、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）、例えばＣＤ８＋／ＣＤ４＋ＴＣＭなど、である。
【００２８】
アミノ酸修飾とは、タンパク質又はペプチド配列におけるアミノ酸の置換、挿入、及び／又は欠失を指す。「アミノ酸置換」又は「置換」とは、親ペプチド又はタンパク質配列の特定の位置にあるアミノ酸を別のアミノ酸に置き換えることを指す。置換を行って、得られるタンパク質のアミノ酸を非保存的（すなわち、特定のサイズ又は特性を有するアミノ酸のグループに属するアミノ酸から、別のグループに属するアミノ酸にコドンを変更することにより）又は保存的に（すなわち、特定のサイズ又は特性を有するアミノ酸のグループに属するアミノ酸から、同じグループに属するアミノ酸にコドンを変更することにより）変更することができる。そのような保存的な変化は、一般に、結果として生じるタンパク質の構造と機能の変化を少なくする。以下は、アミノ酸のさまざまなグループ化の例である。：
１）非極性Ｒ基を持つアミノ酸：  アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン。；
２）非荷電の極性Ｒ基を持つアミノ酸：  グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン。；
３）帯電した極性Ｒ基を持つアミノ酸（ｐＨ  ６．０で負に帯電）：  アスパラギン酸、グルタミン酸。；
４）塩基性アミノ酸（ｐＨ  ６．０で正に帯電）：  リジン、アルギニン、ヒスチジン（ｐＨ  ６．０において）。
別のグループ化は、フェニル基を持つアミノ酸である可能性がある：  フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシン。
【００２９】
ＣＳ１  ＣＡＲは、図４〜９に示されたアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％同一である、又は同一である配列を含むことができる（配列番号２９〜４６、ＧＭＣＳＦＲａシグナル配列を含むか又は除外するかのいずれかであり、且つ、Ｔ２Ａリボソームスキップ配列及び短縮型ＥＧＦＲｔを含むか又は除外するかのいずれかである）。
【００３０】
ＣＡＲを標的とする様々なＣＳ−１がＷＯ２０１６／０９０３６９に記載されており、且つ、これらのＣＡＲはＡＬアミロイドーシスの治療に有用であり得る。
【００３１】
本明細書に記載のＣＡＲ標的化ＣＳ１の中には、スペーサー領域、膜貫通ドメイン及び各ＣＡＲの共刺激ドメイン（複数可）が示されている表４にまとめたものがある。
【００３２】
表４：ＣＡＲ標的化ＣＳ１の例
【表４】
2020511498.tif 000006
【００３３】
＊  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ＧＭＣＳＦＲａシグナル配列、Ｔ２Ａ及びＥＧＦＲｔを含めて描かれた配列全体／／ＧＭＣＳＦＲａシグナル配列を含むが、Ｔ２Ａ及びＥＧＦＲｔを除く配列／／ＧＭＣＳＦＲａシグナル配列、Ｔ２Ａ及びＥＧＦＲｔを除く配列
についての配列番号。
【００３４】
場合によっては、ＣＳ１  ＣＡＲは、ＣＡＲオープンリーディングフレームの後に、Ｔ２Ａリボソームスキップ配列及び細胞質シグナル伝達尾部を欠く短縮型(truncated)ＥＧＦＲ（ＥＧＦＲｔ）が続くベクターを用いて作製することができる。この配置において、ＥＧＦＲｔの同時発現は、遺伝子改変細胞の正確な測定を可能にする、不活性で非免疫原性の表面マーカーを提供し、且つ、遺伝子改変細胞のポジティブな選択、並びに、養子移植後のin  vivoでの治療用Ｔ細胞の効率的な細胞追跡を可能にする。サイトカインストーム及び標的外の(off-target)毒性を避けるために増殖を効率的に制御することは、Ｔ細胞免疫療法の成功にとって重要なハードルである。ＣＳ１ＣＡＲレンチウイルスベクターに組み込まれたＥＧＦＲｔは、治療関連の毒性の場合にＣＡＲ＋  Ｔ細胞を切除するための自殺遺伝子として作用することができる。
【００３５】
本明細書に記載のＣＡＲは、当技術分野で公知の任意の手段によって製造することができるが、好ましくは組換えＤＮＡ技術を用いて製造される。キメラレセプターのいくつかの領域をコードする核酸は、当該分野で公知の標準的な分子クローニング技術（ゲノムライブラリースクリーニング、重複ＰＣＲ、プライマーアシストライゲーション、部位特異的変異誘発など）によって完全なコード配列に調製し、組み立てることができ、便利である。得られたコード領域は、好ましくは発現ベクターに挿入され、且つ、適切な発現宿主細胞株、好ましくはＴリンパ球細胞株、及び最も好ましくは自己Ｔリンパ球細胞株、を形質転換するために使用される。
【００３６】
患者から単離された様々なＴ細胞サブセットは、ＣＡＲ発現のためのベクターで形質導入され得る。セントラルメモリーＴ細胞は、１つの有用なＴ細胞サブセットである。セントラルメモリーＴ細胞は、所望のレセプターを発現する細胞を免疫学的に選択するために、例えばＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）装置を使用して、ＣＤ４５ＲＯ＋／ＣＤ６２Ｌ＋細胞を選択することにより末梢血単核細胞（peripheral  blood  mononuclear  cells,ＰＢＭＣ）から単離することができる。セントラルメモリーＴ細胞が富化された細胞は、例えば、ＣＳ１  ＣＡＲの発現を指示するレンチウイルスベクター、ならびにin  vivo検出、アブレーション、及び潜在的な生体外(ex  vivo)選択のための非免疫原性表面マーカーで形質導入された抗ＣＤ３／ＣＤ２８で活性化することができる。活性化／遺伝子改変されたＣＳ１セントラルメモリーＴ細胞は、ＩＬ−２／ＩＬ−１５でin  vitroで増殖され、及び次いで凍結保存され得る。
【００３７】
実施例４：  ＣＳ１特異的ＣＡＲの発現に使用されるｅｐＨＩＶ７の構築及び構造
ｐＨＩＶ７プラスミドは、ＣＳ１  ＣＡＲを発現する臨床ベクターを誘導することができる親プラスミドである。ＣＡＲの発現に使用したｅｐＨＩＶ７ベクターは、ｐＨＩＶ７ベクターから産生された（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１１  Ｂｌｏｏｄ  １１８：１２５５）。重要なことに、このベクターは、ヒトＥＦ１プロモーターを用いてＣＡＲの発現を駆動する。ベクターの５’及び３’配列の両方は、以前にＨＸＢｃ２プロウイルス由来のｐｖ６５３ＲＳＮに由来した。ポリプリントラクトＤＮＡフラップ配列（ｃＰＰＴ）は、ＮＩＨ  ＡＩＤＳ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ＲｅｐｏｓｉｔｏｒｙからのＨＩＶ−１株ｐＮＬ４−３由来であった。
【００３８】
ｐＨＩＶ７の構築は以下のように行った。簡潔には、介在ＳＬ３−ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（Ｎｅｏ）を有するｇａｇ−ｐｏｌプラス５’及び３’末端反復配列（long-terminal  repeats,ＬＴＲ）からの６５３ｂｐを含むｐｖ６５３ＲＳＮを以下のようにｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローニングした。ステップ１では、５’ＬＴＲからｒｅｖ応答配列(rev-responsive  element)（ＲＲＥ）まで配列は、ｐ５’ＨＩＶ−１５１を作製し、及び次いで５’ＬＴＲをＴＡＴＡボックスの上流の配列を除去することにより改変し、及び最初にＣＭＶエンハンサーに連結し、及び次に複製（ｐ５’ＨＩＶ−２）のＳＶ４０起点に連結した。ステップ２では、３’ＬＴＲをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングしてｐ３’ＨＩＶ−１を作製した後、３’ＬＴＲエンハンサー／プロモーターにおける４００ｂｐの欠失を行い、ＨＩＶ  Ｕ３中のｃｉｓ調節エレメントを除去し、且つ、ｐ３’ＨＩＶ−２を形成した。ステップ３では、ｐ５’ＨＩＶ−３及びｐ３’ＨＩＶ−２から単離した断片をライゲーションしてｐＨＩＶ−３を作製した。ステップ４では、ｐ３’ＨＩＶ−２は、追加の上流のＨＩＶ配列を除去してｐ３’ＨＩＶ−３を生成することによりさらに改変し、且つ、ＷＰＲＥを含有する６００ｂｐのＢａｍＨＩ−ＳａｌＩフラグメントをｐ３’ＨＩＶ−３に加えてｐ３’ＨＩＶ−４を作製した。ステップ５では、ｐＨＩＶ−３  ＲＲＥをＰＣＲによりサイズを減少させ、且つ、ｐＨＩＶ−３（図示せず）由来の５’断片に、及びｐ３’ＨＩＶ−４に連結して、ｐＨＩＶ−６を作製した。ステップ６では、ＨＩＶ−１  ｐＮＬ４−３（５５）由来のｃＰＰＴ  ＤＮＡフラップ配列を含有する１９０ｂｐのＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ断片をｐＮＬ４−３から増幅し、且つ、ｐＨＩＶ６におけるＲＲＥ配列とＷＰＲＥ配列との間に配置してｐＨＩＶ−７を作製した。この親プラスミドｐＨＩＶ７−ＧＦＰ（ＧＦＰ、緑色蛍光タンパク質）を用いて、４−プラスミド系を用いて親ベクターをパッケージングした。
【００３９】
ウイルスゲノムをベクターに効率的にパッケージングするためには、パッケージングシグナルｐｓｉΨが必要である。ＲＲＥ及びＷＰＲＥは、ＲＮＡ転写物の輸送及び導入遺伝子の発現を増強する。フラップ配列は、ＷＰＲＥと組み合わせて、哺乳動物細胞におけるレンチウイルスベクターの形質導入効率を高めることが実証されている。
【００４０】
ウイルスベクターの産生に必要なヘルパー機能は、３つの別個のプラスミドに分割され、組換えによる複製コンピテントレンチウイルスの生成の可能性を減少させる：
１）ｐＣｇｐはウイルスベクター構築(assembly)に必要なｇａｇ／ｐｏｌタンパク質をコードする。；
２）ｐＣＭＶ−Ｒｅｖ２は、効率的なパッケージングのためにウイルスゲノムの輸送を助けるためにＲＲＥ配列に作用するＲｅｖタンパク質をコードする。；及び
３）ｐＣＭＶ−Ｇは、ウイルスベクターの感染性のために必要とされる水疱性−口内炎ウイルス（vesiculo-stomatitis  virus,ＶＳＶ）の糖タンパク質をコードする。
【００４１】
ｐＨＩＶ７にコードされたベクターゲノムとヘルパープラスミドとの間に最小のＤＮＡ配列相同性が存在する。相同性の領域は、
ｐＣｇｐヘルパープラスミドのｇａｇ／ｐｏｌ配列中に位置する約６００ヌクレオチドのパッケージングシグナル領域；
３種全てのヘルパープラスミド中のＣＭＶプロモーター配列；及び
ヘルパープラスミドｐＣｇｐ中のＲＲＥ配列；
を含む。多数の組換え事象(events)を必要とするので、これらの領域の相同性のために複製コンピテント組換えウイルスが生成される可能性は非常に低い。さらに、得られたいずれの組換え体は、レンチウイルス複製に必要な機能的ＬＴＲ及びｔａｔ配列を欠いているであろう。
【００４２】
ＣＭＶプロモーターをＥＦ１α−ＨＴＬＶプロモーター（ＥＦ１ｐ）に置き換え、且つ、新しいプラスミドをｅｐＨＩＶ７と命名した。ＥＦ１ｐは５６３ｂｐを有し、且つ、ＣＭＶプロモーターを切除した後、ＮｒｕＩ及びＮｈｅＩを用いてｅｐＨＩＶ７に導入した。
【００４３】
野生型ウイルスの病原性に必要であり、且つ、標的細胞の生産的感染に必要とされるｇａｇ／ｐｏｌ及びｒｅｖを除くレンチウイルスゲノムは、この系から除かれている。さらに、ｅｐＨＩＶ７ベクター構築物はインタクトな３’ＬＴＲプロモーターを含有しないため、結果として生じる標的細胞中の発現された、且つ、逆転写ＤＮＡプロウイルスゲノムは不活性なＬＴＲを有するであろう。この設計の結果、ＨＩＶ−Ｉ由来配列はプロウイルスから転写されず、且つ、治療配列のみがそれぞれのプロモーターから発現されるであろう。ＳＩＮベクターにおけるＬＴＲプロモーター活性の除去は、宿主遺伝子の意図しない活性化の可能性を有意に減少させることが期待される。表５は、ｅｐＨＩＶ７に存在する種々のレギュレーター要素をまとめたものである。
【００４４】
図１は、ＣＳ１  ＣＡＲ（ＣＳ１ｓｃＦｖ−ＩｇＧ４（ＨＬ−ＣＨ３）−ＣＤ２８ｇｇ−Ｚｅｔａ（ＣＯ）−Ｔ２Ａ−ＥＧＦＲｔ＿ｅｐＨＩＶ７）ＣＳ１  ｓｃＦｖ、ＣＳ１  ｓｃＦｖ、ＩｇＧ４ヒンジ領域、リンカー、ＣＤ２８共刺激ドメイン及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン、からなるＣＡＲ構築物を含有するレンチウイルスベクター、の模式的な描写である。ＣＡＲ構築物に続いて、Ｔ２Ａリボソームスキップ配列、及び次いで自殺遺伝子ＥＧＦＲｔコード配列が続く。ＣＡＲ及びＥＧＦＲｔ分子は、単一の転写産物から発現される。ベクターの全ヌクレオチド配列を図１１に示し、且つ、表５はベクターの種々の要素の位置を示す。
【００４５】
表５：  ＣＡＲ＿ｅｐＨＩＶ７の機能要素
【表５】
2020511498.tif 000007
【００４６】
実施例５：  患者Ｔ細胞の形質導入のためのベクターの作製
各プラスミド（ＣＳ１  ＣＡＲ＿ｅｐＨＩＶ７；ｐＣｇｐ；ｐＣＭＶ−Ｇ；及びｐＣＭＶ−Ｒｅｖ２）について、十分な量のプラスミドＤＮＡを産生するために発酵槽に接種するために使用されるシードバンクが生成される。プラスミドＤＮＡは、レンチウイルスベクターの産生に使用する前に、同一性、無菌性及びエンドトキシンについて試験される。
【００４７】
簡単に説明すると、細胞は、無菌性及びウイルス汚染の存在を確認するために試験された２９３Ｔ作業(working)細胞（ＷＣＢ）から増殖される。２９３Ｔ  ＷＣＢからの２９３Ｔ細胞のバイアルを解凍する。十分な数の細胞が存在して、ベクター産生及び細胞培養の維持(cell  train  maintenance)のために適切な数の１０層細胞工場（cell  factroies,ＣＦｓ）をプレートするまで、細胞を増殖(grown)及び拡大する(expanded)。単一の細胞列を生産に使用することができる。
【００４８】
レンチウイルスベクターは、１０ＣＦまでのサブバッチで産生された。同じ週に２つのサブバッチを産生しすることができ、約２０Ｌのレンチウイルス上清／週になる。１つのロットの製品を製造するために、すべてのサブバッチから製造された材料を下流の処理段階でプールした。２９３Ｔ細胞を２９３Ｔ培地（１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ）中でＣＦ中に播種した(plated)。ファクトリーを３７℃のインキュベーターに置き、且つ、ＣＦのすべての層上に細胞の均一な分布を得るために水平に平らにした(leveled)。２日後、Ｔｒｉｓ：ＥＤＴＡ、２Ｍ  ＣａＣｌ２、２Ｘ  ＨＢＳ及び４つのＤＮＡプラスミドの混合物を含むＣａＰＯ４法を用いて、上記の４つのレンチウイルスプラスミドを細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション後３日目に、分泌されたレンチウイルスベクターを含有する上清を回収し、精製し、濃縮した。上清をＣＦから除去した後、各ＣＦから最終生産細胞(End-of-Production  Cells)を回収した。各工場から細胞をトリプシン処理し、遠心分離により収集した。細胞を凍結培地に再懸濁し、及び凍結保存した。これらの細胞は、その後、複製能力のあるレンチウイルス（ＲＣＬ）試験に使用された。
【００４９】
ベクターを精製及び製剤化する(formulate)ために、細胞の破片（debris）
を除去するために膜濾過によって粗製上清を清澄化した。宿主細胞ＤＮＡ及び残留プラスミドＤＮＡは、エンドヌクレアーゼ消化（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標））によって分解された。ウイルス上清を０．４５μｍのフィルターを用いて細胞破片を清澄化した。清澄化された上清を予め秤量した容器に採取し、そこにＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）を加えた（最終濃度５０Ｕ／ｍＬ）。残留プラスミドＤＮＡ及び宿主ゲノムＤＮＡに対するエンドヌクレアーゼ消化は、３７℃で６時間行った。エンドヌクレアーゼ処理した上清の初期接線流限外濾過（tangential  flow  ultrafiltration,ＴＦＦ）濃度を用いて、粗上清から残留低分子量成分を除去し、ウイルスを約２０倍濃縮した。浄化されたエンドヌクレアーゼ処理ウイルス上清を、５００ｋＤのＮＭＷＣＯを有する中空繊維カートリッジに、流速を最大にしながら、剪断速度を約４，０００秒−１以下に維持するように設計された流速で循環させた。ヌクレアーゼ処理された上清のダイアフィルトレーションは、カートリッジの性能を維持するために濃縮プロセスの間に開始された。ダイアフィルトレーション緩衝液としてＰＢＳ中に４％ラクトースを使用して、８０％透過物置換率を確立した。ウイルス上清を標的体積に持ってきて、２０倍濃度の粗上清を示し、且つ、透析液交換率を１００％として４回の追加交換容量でダイアフィルトレーションを続けた。
【００５０】
ウイルス産物のさらなる濃縮は、高速遠心分離技術を用いて達成された。レンチウイルスの各サブバッチを、Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＣ−２６プラス６０００ＲＰＭ（６，０８８  ＲＣＦ）で、６℃、１６〜２０時間遠心分離してペレット化した。次いで、各サブバッチからのウイルスペレットをＰＢＳ中の４％ラクトースを含む５０ｍＬ容量で再構成した。この緩衝液中の再構成されたペレットは、ウイルス調製のための最終製剤(formulation)を表す。ベクター濃縮プロセス全体は約２００倍の体積減少をもたらした。全ての部分バッチの完了後、材料を次に−８０℃に置き、その間、各部分バッチからの試料を無菌性について試験した。サンプルの無菌性を確認した後、サブバッチを頻繁に攪拌しながら３７℃で急速に解凍した。次いで、この物質をプールし、且つ、ウイルスベクタースイート(suite)のクラスＩＩ型Ａ／Ｂ３バイオセーフティキャビネット内に手でアリコートした。滅菌ＵＳＰクラス６、雄ネジ(externally  threaded)Ｏリングクリオバイアル中の濃縮レンチウイルス１ｍＬの充填構成を使用した。ＣＯＨにおける応用技術開発センター（ＣＡＴＤ）の品質システム（ＱＳ）は、ＣＢＧのためのポリシーと標準的な運用手順に従って、そして現在のグッド・マニュファクチャリング・プラクティス（current  Good  Manufacturing  Practics,ｃＧＭＰｓ）に準拠してすべての材料をリリースした。
【００５１】
レンチウイルスベクター調製物の純度を保証するために、残留宿主ＤＮＡ混入物、及び残留宿主及びプラスミドＤＮＡの移入について試験する。他の試験の中でも、正確なベクターが存在することを確実にするために、ＲＴ−ＰＣＲによってベクター同一性を評価する。すべての放出基準は、本研究での使用を意図したベクターについて満たされている。
【００５２】
実施例６：  ＣＳ−１  ＣＡＲの発現に適したＴＣＭ細胞の調製
Ｔリンパ球は、白血球フェレーシス（leukopheresis）によって患者から得られ、且つ、適切な同種異系又は自己Ｔ細胞サブセット、例えばセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）は、ＣＡＲを発現するように遺伝的に改変され、次いで、抗癌治療を達成するために、臨床上許容される手段によって、患者に投与されする。
【００５３】
ＣＤ８＋であるＴＣＭは、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌに記載されるように本質的に単離される（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３５：６８９，２０１２）。簡潔には、白血球フェレーシスの当日に、ＰＢＭＣをＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅによる密度勾配遠心分離により単離し、続いてＰＢＳ／ＥＤＴＡで２回洗浄した。次いで、ＰＢＭＣをＰＢＳ中で１回洗浄し、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含有するＸ  Ｖｉｖｏ１５培地に再懸濁し、３００ｃｃのトランスファーバッグに移し、室温（ＲＴ）で一晩３−Ｄローテーター上に保存した。翌日、臨床グレードの抗ＣＤ４（２．５ｍＬ）、抗ＣＤ１４（１．２５ｍＬ）、及び抗ＣＤ４５ＲＡ（２．５ｍＬ）マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を含む３００ｃｃトランスファーバッグ中で、５×１０９  ＰＢＭＣをインキュベートした１０％ＦＣＳを含有するＸ  Ｖｉｖｏ１５を、３０分間ＲＴでインキュベートした。ＣＤ４＋、ＣＤ１４＋及びＣＤ４５ＲＡ＋細胞は、製造業者の指示（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）に従ってＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（商標）枯渇様式を用いて直ちに枯渇させた。遠心分離後、０．５％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含有するＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（商標）ＰＢＳ／ＥＤＴＡ緩衝液（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）に細胞の非標識陰性画分を再懸濁し、且つ、臨床グレードビオチン化ＤＲＥＧ５６  ｍＡｂ（ＣＯＨＮＭＣ  ＣＢＧ）で０．１ｍｇ／１０６細胞を室温で３０分間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、０．５％ＨＳＡを含有する１００ｍＬのＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（商標）ＰＢＳ／ＥＤＴＡの最終容量に再懸濁し、新しい３００ｃｃのトランスファーバッグに移した。１．２５ｍＬの抗ビオチンマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）との３０分間のインキュベーション後、ＰＢＭＣ（ＣＤ８＋  ＴＣＭ）のＣＤ６２Ｌ＋画分をＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（商標）でのポジティブ選択により製造業者の説明書に従って精製し、且つ、１０％ＦＣＳを含むＸ  Ｖｉｖｏ１５に再懸濁した。
【００５４】
ＣＤ８＋／ＣＤ４＋であるＴＣＭは、ＣＤ４＋、ＣＤ１４＋及びＣＤ４５ＲＡ＋選択をＣＤ１４＋及びＣＤ４５ＲＡ＋選択に改変することによって、上記プロセスの改変を用いて調製される。この方法は、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（商標）デバイス上の２段階プロセスを使用して、まずＣＤ１４＋及びＣＤ４５ＲＡ＋細胞を枯渇させ、次いでＣＤ６２Ｌ＋細胞を陽性選択する。この改変されたプラットフォームは、単一の白血球フェレーシスから５０×１０６バルクＴＣＭを生成する。
【００５５】
富化後、ＴＣＭ細胞を、完全なＸ−Ｖｉｖｏ１５プラス５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２及び０．５ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１５中に配合し、且つ、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）細胞培養バッグに移し、Ｄｙｎａｌ  ＣｌｉｎＥｘ（登録商標）  Ｖｉｖｏ  ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで刺激した。刺激後５日目まで、細胞を約３の感染多重度（multiplicity  of  infection,ＭＯＩ）でＣＳ１  ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターで形質導入する。細胞増殖に必要とされる完全なＸ−Ｖｉｖｏ１５及びＩＬ−２及び」ＩＬ−１５サイトカインの添加により、培養物を最大４２日間維持する（３×１０５〜２×１０６生存細胞／ｍＬ、及び培養の月曜日、水曜日及び金曜日ごとにサイトカイン補充の間の細胞密度を維持するため）。細胞は、典型的には、２１日以内にこれらの条件下で約１０９細胞に拡大する。培養期間の終わりに、細胞を採取し、２回洗浄し、且つ、臨床グレードの凍結保存培地中で処方する。
【００５６】
Ｔ細胞注入の日（複数可）に、低温保存及び放出された生成物を解凍し、洗浄し、再注入のために調合する(formulated)。放出された細胞産物を含む凍結保存バイアルを液体窒素貯蔵から取り出し、解凍し、冷却し、且つ、ＰＢＳ／２％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）洗浄緩衝液で洗浄する。遠心分離後、上清を除去し、且つ、細胞を保存料なし遊離生理食塩水（Preservative-Free  Normal  Saline,ＰＦＮＳ）／２％ＨＳＡ輸液希釈液に再懸濁する。サンプルは品質管理テストのために削除される。
【００５７】
実施例７：  ＣＳ１  ＣＡＲ（ＣＳ１ｓｃＦｖ−ＩｇＧ４（ＨＬ−ＣＨ３）−ＣＤ２８ｔｍ−ＣＤ２８ｇｇ−Ｚｅｔａ−Ｔ２Ａ−ＥＧＦＲｔ）のアミノ酸配列
ＣＳ１ｓｃＦｖ−ＩｇＧ４（ＨＬ−ＣＨ３）−ＣＤ２８ｔｍ−ＣＤ２８ｇｇ−Ｚｅｔａ−Ｔ２Ａ−ＥＧＦＲｔの完全アミノ酸配列を図４に示す。全配列（配列番号２９）は、
２２アミノ酸のＧＭＣＳＦシグナルペプチド（配列番号２６）、ＣＳ１  ｓｃＦｖ配列（配列番号１）；
ＩｇＧ４ヒンジ配列（配列番号３；斜線で示すアミノ酸置換Ｓ〜Ｐを有する）；
１０アミノ酸のリンカー（配列番号２）；
ＩｇＧ４  ＣＨ３配列（配列番号１２）；
２８アミノ酸のＣＤ２８膜貫通ドメイン配列（配列番号１４）；
ＣＤ２８ｇｇ共刺激ドメイン配列（配列番号２３；ＬＬ  to  ＧＧアミノ酸の変化が強調表示されている）；
３アミノ酸のＧｌｙリンカー；
１１２アミノ酸のＣＤ３ζ配列（配列番号２１）；
２４アミノ酸のＴ２Ａスキップ配列（配列番号２７）；及び
ＥＧＦＲｔ配列（配列番号２８）；
を含む。
【配列表フリーテキスト】
【００５８】
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2020511498.tif 000009
【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
2020511498.tif 000011
【図２Ｂ】
2020511498.tif 000012
【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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