(57)【要約】本発明は、ヒトＣＤ１６０に特異的に結合し、配列番号１４又は配列番号１３で定義される軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）と、配列番号１１、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９及び配列番号３０から選択される重鎖の可変ドメイン（ＶＨ）とを有する結合物、それらのフラグメント、又はそれらの誘導体に関する。【選択図】無し【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＣＤ１６０に特異的に結合し、
配列番号１４又は配列番号１３から選択される軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）と、
配列番号１１、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９及び配列番号３０から選択される重鎖の可変ドメイン（ＶＨ）と
を有する結合物、それらのフラグメント、又はそれらの誘導体。
【請求項２】
請求項１に記載の結合物において、
前記結合物は、定常領域として、ＩｇＧ、好ましくはＩｇＧ１又はＩｇＧ４の定常領域を有するモノクローナル抗体であることを特徴とする結合物。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の結合物において、
重鎖定常ドメインとして、配列番号１５，配列番号１６，配列番号３１〜配列番号３５，配列番号４３及び配列番号４４及びそれらの非グリコシル化変異体から選択される配列と、
軽鎖定常ドメインとして、配列番号２２〜２４から選択される配列と
を有するモノクローナル抗体であることを特徴とする結合物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の結合物において、
配列番号５７で定義される配列を含む軽鎖と、
配列番号４５〜５１，９，１０，１２，５８〜６４から選択される重鎖と
を有することを特徴とする結合物。
【請求項５】
請求項１に記載の結合物において、
前記結合物はＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２から選択されるフラグメントであって、
配列番号５７で定義される軽鎖と、
配列番号３６〜３８から選択される配列を含む重鎖と
を有する
ことを特徴とする結合物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の結合物において、以下より選択される、結合物の誘導体であることを特徴とする結合物：
特に、ｓｃＦｖ、Ｆｃフラグメントに融合した多量体ｓｃＦｖ、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、四量体（ｔｅｔｒａｍｅｒｉｃ）ｓｃＦｖ、各単量体が単数の重鎖フラグメントに結合したｓｃＦｖである二量体（ｄｉｍｅｒ）、各単量体が複数の重鎖フラグメントに結合したｓｃＦｖである二量体、Ｃ末端位置でロイシンジッパードメインに融合したＦ（ａｂ’）２、シングルドメイン抗体、ヘッドトゥーテールで結合した少なくとも２つのＦａｂを含む形態、特に、配列番号４０又は４１で定義される重鎖と配列番号５７の軽鎖とを有する結合物、
及び四価の抗体、特に、配列番号４２で定義される重鎖と配列番号５７で定義される軽鎖とを含む結合物。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の結合物において、
多重特異性又は少なくとも二重特異性の誘導体であり、ＣＤ１６０結合部位及び他の抗原との結合部位を少なくとも１つ含み、
特に配列番号５２によって定義される結合物である
ことを特徴とする結合物。
【請求項８】
請求項７に記載の結合物において、
前記他の抗原は特に以下の抗原から選択されることを特徴とする結合物：
ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＰｌＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｒ２、アンジオポエチン２、アンジオポエチン様（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｌｉｋｅ）４、ＣＤ２００Ｒ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＣＣ、ＰＤＧＦ−ＤＤ、ＰＤＧＦ−Ｒ、ＦＧＦ２又はＦＧＦβなどのＦＧＦ、βアミロイド、スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）、Ｃ’５、ＩＬ６、ＭＥＲ  ＴＫ、ＣＤ１１５、ＴＮＦα、ＩＬ８、ＨＧＦ、ＴＧＦβ、ＩＧＦ１、ＩＬ１、ＩＬ２、ＥＧＦ、ＫＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、α−ｖ、β−３又はα−ｖ，β−５インテグリン、膜貫通型又は可溶性ＣＤ１４６、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＭＴ１−ＭＭＰ、ＴＩＭＰ−２、アンギオゲニン、ＰＤ−ＥＣＧＦ、血小板活性化因子、プロスタグランジンＥ、プレイオトロピン、クラスＩＩ  ＭＨＣ、ｔ  ＨＰ５９、ＣＭ１０１、ＣＤ３、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、４−１ＢＢ、ＬＡＧ−３、ＩＣＯＳ、ＣＤ１６、ＣＤ３、ＣＤ４７、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ５、ＣＤ１８０、ＣＤ２００、ＣＤ４０、ＣＤ２０、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ１４８、ＣＤ１８０及びその他のＢ型リンパ腫に特異的な抗原。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の結合物を少なくとも１種含む組成物。
【請求項１０】
請求項９に記載の組成物において、
特に、以下の抗原の少なくとも１種を対象とする少なくとも１種の他の抗体を更に含むことを特徴とする結合物：
ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＰｌＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｒ２、アンジオポエチン２、アンジオポエチン様４、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＣＣ、ＰＤＧＦ−ＤＤ、ＰＤＧＦ−Ｒ、ＦＧＦ２又はＦＧＦβなどのＦＧＦ、βアミロイド、スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）、Ｃ’５、ＩＬ６、ＭＥＲ  ＴＫ、ＣＤ１１５、ＴＮＦα、ＩＬ８、ＨＧＦ、ＴＧＦβ、ＩＧＦ１、ＩＬ１、ＩＬ２、ＥＧＦ、ＫＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、α−ｖ，β−３又はα−ｖ，β−５インテグリン、膜貫通又は可溶性ＣＤ１４６、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＭＴ１−ＭＭＰ、ＴＩＭＰ−２、アンギオゲニン、ＰＤ−ＥＣＧＦ、血小板活性化因子、プロスタグランジンＥ、プレイオトロピン、クラスＩＩ  ＭＨＣ、ＨＰ５９、ＣＭ１０１、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、４−１ＢＢ、ＬＡＧ−３、ＩＣＯＳ、ＣＤ１６、ＣＤ３、ＣＤ４７、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ５、ＣＤ１８０、ＣＤ２００、ＣＤ４０、ＣＤ２０、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ１４８、ＣＤ１８０、及びＢ型リンパ腫に特異的な他の抗原、リツキシマブ、オファツムマブ、オビヌツズマブ、オカラツズマブ又はベルツズマブ。
【請求項１１】
薬剤として使用される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の結合物、又は請求項９若しくは１０に記載の組成物。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の結合物及び請求項１０に記載の抗原の１種を対象とする少なくとも１つの抗体を含む製品であって、
特に、新生血管性の眼病、糖尿病、糖尿病性失明、原発性糖尿病性網膜症又は加齢黄斑変性症、関節リウマチ、子癇前症、子癇又は癌から選択される、血管新生を引き起こす病理学的状態の治療及び／又は予防における同時、個別又は逐次使用のための製品。
【請求項１３】
抗血管新生剤、免疫調節剤及び／又は細胞毒性薬剤として使用される請求項１１に記載の結合物又は組成物。
【請求項１４】
請求項１１又は１３に記載の結合物であって、
特に、血管新生性の眼の病理学的状態、糖尿病、糖尿病性失明、原発性糖尿病性網膜症又は加齢黄斑変性症、関節リウマチ、子癇前症、子癇又は癌から選択される、病理学的状態の予防及び／又は治療のために使用する結合物。
【請求項１５】
以下の癌の治療のために使用される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の結合物、又は、請求項９若しくは１０に記載の結合物：
乳癌、大腸癌、非小細胞肺癌、非ホジキンリンパ腫、腎臓癌（ｋｉｄｎｅｙ  ｃａｎｃｅｒ）、前立腺癌、膀胱癌又は腎細胞癌（ｒｅｎａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）などの泌尿生殖器腫瘍、結腸癌、ホジキンリンパ腫、肝臓癌、子宮頸癌、悪性黒色腫、卵巣癌、中皮腫及び膠芽腫、血液癌、特にＡＭＬ、ＭＭ、リンパ腫、慢性リンパ性白血病若しくは有毛細胞白血病、又は固形腫瘍、特に黒色腫、ＲＣＣ、肺がん、特に類表皮肺がん、神経芽細胞腫、卵巣がん、乳がん、胃がん。
【請求項１６】
少なくとも１種の他の抗ＣＤ２０抗体、特にレツキシマブ、オファツムマブ、オビヌツズマブ、オカラツズマブ又はベルツズマブ、
抗ＣＤ３７抗体、抗ＣＤ３８抗体又は抗ＣＤ４０抗体
と組み合わせて血液癌の治療に使用する、
請求項１〜８のいずれか１項に記載の結合物、又は、請求項９若しくは１０に記載の組成物。
【請求項１７】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の結合物の１種をコードする単離された核酸。 
【請求項１８】
請求項１７に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１９】
請求項１８に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２０】
請求項１９に記載の宿主細胞の培養物を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の結合物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、軽鎖の可変領域（ＶＬ）として配列番号１４又は配列番号１３で定義される配列を有し、そして重鎖の可変領域（ＶＨ）として配列番号１１、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９及び配列番号３０から選択される配列、それらのフラグメント又はそれらの誘導体を有する、ヒトＣＤ１６０に特異的に結合する結合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
今日、モノクローナル抗体は、癌、自己免疫疾患、慢性炎症性疾患、移植拒絶反応、感染症、心血管疾患及び目に関するある種の病理学的状態を含む様々な病理学的状態を治療するための療法として使用されている。モノクローナル抗体の約２０種以上又はそのフラグメントのうちいくつかが市販されており、４００種を超える種類が臨床開発中である。
【０００３】
それ故、治療において、考えられる候補としての抗体の選択は、戦略的関心が高い。特に、選択された抗体は、可能な限り非免疫原性である一方、同時に、その標的に対する良好な親和性及び良好な特異性を有し、その考えられる毒性に関して最適な効能があることが必要である。
【０００４】
ＣＬ１−Ｒ２抗体は、ＣＤ１６０受容体に特異的に結合する既存の抗体の１つである。これは、欧州特許第１７７６３８７号に記載されているヒトＣＤ１６０受容体に対するマウスのモノクローナル（ｔｈｅ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ）抗体である。このＣＬ１−Ｒ２抗体は、重鎖の可変領域（ＶＨ）として配列番号１を有し、軽鎖の可変領域（ＶＬ）として配列番号２を有する。それは抗血管新生作用（ａｎｔｉ−ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）及び免疫調節作用も有する。しかしながら、ヒトへの投与は、ヒト抗マウス抗体（ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉ−ｍｕｒｉｎｅ  （ｍｏｕｓｅ）  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  （ＨＡＭＡ））の開発に関する「ＨＡＭＡ応答」によるその過剰な免疫原性のために制限されている。ＨＡＭＡの開発は、（ｉ）最終的に抗体を中和（又は抗体除去の促進）し、それゆえその治療効果を誘導し、及び（ｉｉ）毒性の潜在的なリスク（アナフィラキシー又は血清疾患などの有害な免疫反応）をも誘導する可能性があった。
【０００５】
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の阻害剤などの利用可能な現在の抗ＶＥＧＦ治療に加えて、血管新生（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）を含む病理学的状態の治療に有効な結合物、特に抗体を提供する必要がある。
【０００６】
実際は、既存の脈管構造からの新しい血管の形成である血管新生は生理学的に起こる。しかし、それはまた、主として虚血性網膜症（ＩＲ）を伴う角膜―網膜血管新生疾患又は滲出型若しくは「ウェット型」加齢黄斑変性症（ｗＡＭＤ）などの脈絡膜の疾患としての、様々な病理学において役割を果たす。それらは、先進国における中度及び重度の視力喪失の第１の要因である。
【０００７】
ｗＡＭＤ及びＩＲにおける血管新生及びその病因に関する知見が増えたことによって、ＶＥＧＦ経路を標的とする薬物の開発がもたらされた。抗ＶＥＧＦ治療薬の硝子体（ＩＶＴ）注射は、過去１０年間にわたって、ｗＡＭＤ、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）及び黄斑浮腫（ＤＭＥ）における治療の最初の選択肢として出現した。
【０００８】
抗ＶＥＧＦ療法は一般に安全であるように思われるが、その効能及び安全性に関するいくつか制限があることが明らかとなっている。完全な効能を得るためには頻繁なＩＶＴ注射がしばしば必要とされる。抗ＶＥＧＦを長期使用すると、タキフィラキシー又は寛容現象に関連して、長期効能が低下する。ｗＡＭＤ患者の３０％以上が依然として反応が乏しく、したがって抗ＶＥＧＦに耐性がある。さらに、抗ＶＥＧＦの反復投与後の血圧上昇、脳卒中、及び心筋梗塞のリスク増加などの局所的及び全身的な有害作用が、ｗＡＭＤ患者において報告されている。
【０００９】
これらの制限は、許容回数又は安全性の問題の割合を増加させることなく、並びに注射の回数を減らすことなく、抗ＶＥＧＦについての持続送達アプローチを改善する必要性を強調する。反応がよくないか又は全く反応しない多くの患者の反応を増大させることが必要である。したがって、正常な成熟組織脈管構造にはほとんど又は全く影響を及ぼさずに病的な血管新生を阻害する、ＶＥＧＦ非依存の相補的かつ相乗的な治療法を開発することが差し迫って必要とされている。
【００１０】
これらの結合物は、ヒトにおいては耐性が高く、そして特に非免疫原性である一方、良好な生物学的活性があり且つその標的に対する特異的親和性を有する必要がある。
【００１１】
また、特にＮＫ細胞などのエフェクター免疫細胞を刺激し及び／又は細胞傷害性Ｔ細胞のアネルギー（ｔｈｅ  ａｎｅｒｇｙ）を引き上げる、現在の治療法と組み合わせることができる新しい薬剤もまた必要とされている。
【発明の概要】
【００１２】
本発明はこれらの問題を解決することを可能にする。本発明は、ヒトＣＤ１６０に特異的に結合し、配列番号１４又は配列番号１３によって定義される軽鎖の可変領域（ＶＬ）として選択された配列並びに重鎖可変ドメイン（ＶＨ）として配列番号１１、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９及び配列番号３０から選択される配列を有する結合物、並びにそれらのフラグメント又はそれらの結合物の誘導体である。本発明に係る結合物は、ヒトにおいては耐性が高くまた免疫原性でなく、ヒトへの投与に特に適している。
【００１３】
本発明に係る結合物は、抗体、より具体的にはモノクローナル抗体、フラグメント又は誘導体の形態であってもよく、そして非常に高い親和性でヒトＣＤ１６０に結合することができる。
【００１４】
本発明に係る結合物は、同じ可変領域及びヒトの定常領域を有する親のＣＬ１−Ｒ２抗体又はその組換えキメラバージョンよりも、組換えＣＤ１６０タンパク質及びＣＤ１６０陽性細胞に対してはるかに優れた親和性を示すことが発見された。このことは、ヒトにおける投与に適合し得るキメラバージョンは依然としてある程度の潜在的免疫原性を示すことから、非常に有利である。さらに、そのような抗体並びにそのフラグメント及び誘導体は優れた活性を有する。
【００１５】
これは、以下の実施例、特に実施例１で示される。実施例１では、親和性の測定によって、予想に反して、ＩｇＧ１及びＩｇＧ４フォーマットのＨ７が、マウスＣＬ１−Ｒ２並びにそれぞれのキメラヒトＩｇＧ１及びＩｇＧ４の形態よりも、ヒトＣＤ１６０に良好な親和性を有することを明らかに示される。親のＣＬ１−Ｒ２抗ＣＤ１６０のＫＤと比較したＫＤの増加（ゲイン）（実施例１、表１、８列目、ＫＤ増加を参照のこと）は、ヒトＩｇＧ１及びＩｇＧ４フォーマットにおけるＨ７についてそれぞれ約３．７５及び３．３４である。同一濃度の５０ｎＭの抗体では、Ｈ７  ＩｇＧ４及びＣＬ１−Ｒ２よりもＨ７  ＩｇＧ１に対してより良好な応答、並びにキメラフォーマットの２つの抗ＣＤ１６０に対してより悪い応答も得られた（実施例１、表１参照、９列目）。
【００１６】
さらに、実施例８で示されるように、本発明に係る結合物はすべて、ＣＬ１−Ｒ２及び代表的なヒトＩｇＧ１であるベバシズマブと比較して血流中で非常に異なる消失プロファイルを有し、ウサギにおける全身の薬物動態学的パラメータによって測定される血清のクリアランスが速い。
【００１７】
「ヒトＣＤ１６０」とは、ヒトＣＤ１６０受容体を意味する。それは、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）モチーフにより細胞膜に固定され、免疫グロブリンスーパーファミリー（免疫グロブリン様ドメインの存在）に属する従来型のＨＬＡ分子（ＨＬＡ  Ａ及びＣ）及び非従来型のＨＬＡ分子（ＨＬＡ  Ｇ）及びＨＶＥＭ（ヘルペスウイルス侵入媒体）を認識する２７ｋＤａの受容体である。このタンパク質はさらにＣＤ１６０  ＧＰＩと命名されている。このタンパク質は、以下の免疫細胞によって生理学的に発現される：ＮＫ  ＣＤ５６ｄｉｍ  ＣＤ１６ｂｒｉｇｈｔ、Ｔ  ＣＤ８サブセット、Ｔガンマ―デルタ及びＴ  ＣＤ４細胞サブセット。ＣＤ１６０はまた、血液癌におけるＢ細胞上又は新血管性眼病理における活性化内皮細胞上では、Ｂ−ＣＬＬとして、病的状態で上方制御される。ヒトＣＤ１６０のｃＤＮＡは、国際公開第９８／２１２４０号パンフレットに記載の配列番号１の配列に対応する。ヒトＣＤ１６０のｍＲＮＡは、ジェンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）からアクセッション番号ＡＦ０６０９８１で入手可能である。ヒトＣＤ１６０のタンパク質配列は、ＷＯ９８／２１２４０に記載されている配列番号２の配列に対応し、Ｇｅｎｂａｎｋからアクセッション番号ＡＡＣ７２３０２で入手可能である。
【００１８】
ＣＤ１６０タンパク質は、膜貫通（ＴＭ）ドメインを有する別のアイソフォームでも存在することに留意すべきである（以下、ＣＤ１６０  ＴＭという。）。ＣＤ１６０  ＧＰＩアイソフォームタンパク質のタンパク質配列は、ＣＤ１６０  ＴＭアイソフォームタンパク質配列の最初のＮ末端部分７６．５％と１００％相同である。ヒトＣＤ１６０  ＴＭアイソフォームのｃＤＮＡは、ＷＯ２００８／１５５３６３に記載されている。ヒトＣＤ１６０のｍＲＮＡは、アクセッション番号ＥＵ０１６１００．１でＧｅｎｂａｎｋから入手可能である。ヒトＣＤ１６０  ＴＭのタンパク質配列は、Ｇｅｎｂａｎｋにおいてアクセッション番号ＡＢＶ８９７３６．１から入手可能である。
【００１９】
ＢＹ５５の抗ＣＤ１６０  ＩｇＭ及びＣＬ１−Ｒ２はＣＤ１６０  ＧＰＩフォームに特異的であり、それぞれ文献（Ｇｉｕｓｔｉｎｉａｎｉら、２００９年、及び、Ｅｌ−Ｆａｒら、２０１４年）に記載されているようにＣＤ１６０  ＴＭアイソフォームを認識することはできない。従来技術では、ＣＤ１６０の両方のアイソフォームを認識するとされる抗ＣＤ１６０  ｍＡｂはない。
【００２０】
本発明に係る結合物の他の有利な特徴は、ＣＤ１６０の両方のアイソフォームを認識することができるが、親のＣＬ１―Ｒ２抗体はそうではないこと、及び、これら２つのアイソフォームが同じ細胞上（例えば、まさにＴ及びＮＫリンパ腫のように）に存在する場合の適応を広げることである。
【００２１】
本発明の文脈において、結合物の「可変領域（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ）」又は「可変ドメイン」という用語は、抗体の重鎖又は軽鎖のアミノ末端ドメインに関連する領域又はドメインを意味する。重鎖可変ドメインは「ＶＨ」という。軽鎖可変ドメインは「ＶＬ」という。これらのドメインは一般に抗体の最も可変的な部分であり、そして抗原結合部位を含む。この結合物は抗体、特にモノクローナル抗体の形をとることができる。
【００２２】
軽鎖又は重鎖の可変領域（ＶＬ又はＶＨ）は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲｓ」と呼ばれる３つの超可変領域によって割り込まれた「フレームワーク領域」を含む。
【００２３】
６つのＣＤＲ全てによって、抗体のその標的抗原への結合が可能となる。例えば、ＣＬ１−Ｒ２抗体は、ＣＤＲとして、ＡｂＭのＣＤＲ用語（より広く、抗体親和性成熟技術に適合されている）に従って配列番号３〜８の配列を有する。これらのＣＤＲｓは本発明の結合物Ｈ７中に存在する。
【００２４】
本発明に係る結合物は、それらの標的であるヒトＣＤ１６０に対して優れた親和性を有し、それはＣＬ１−Ｒ２のそれよりも大きいか、又はこのＣＬ１−Ｒ２のキメラ形態よりも大きい（実施例１参照）。
【００２５】
好ましくは、本発明に係る結合物は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）としての配列番号１１の配列、及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）としての配列番号１４の配列を有する。そのような抗体は、特に、実施例１の「Ｈ７」抗体に対応する。
【００２６】
実施例２に記載するように、Ｈ７抗体のバリアントが得られた。
【００２７】
本発明の他の実施態様では、結合物は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）としての配列番号２５の配列、及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）としての配列番号１４の配列を有する。そのような結合物は、特に、「Ｆ０４」抗体に対応する。
【００２８】
本発明の他の実施態様において、結合物は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）としての配列番号２６の配列、及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）としての配列番号１４の配列を有する。そのような結合物は、特に、「Ｄ０９」抗体に対応する。
【００２９】
本発明の他の実施態様において、結合物は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）としての配列番号２７の配列、及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）としての配列番号１４の配列を有する。そのような結合物は、特に、「Ａ１２」抗体に対応する。
【００３０】
本発明の他の実施態様において、結合物は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）としての配列番号２８の配列、及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）としての配列番号１４の配列を有する。そのような結合物は、特に、「Ｇ０５」抗体に対応する。
【００３１】
本発明の他の実施態様において、結合物は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）としての配列番号２９の配列、及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）としての配列番号１４の配列を有する。そのような結合物は、特に、「Ｄ１２」抗体に対応する。
【００３２】
本発明の他の実施態様において、結合物は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）としての配列番号３０の配列、及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）としての配列番号１４の配列を有する。そのような結合物は特に「Ａ０９」抗体に対応する。
【００３３】
本発明の一実施態様において、結合物はヒトＣＤ１６０を標的とするモノクローナル抗体であり、これは好ましくは、定常領域として、免疫グロブリン（ＩｇＧ）、好ましくはＩｇＧ１又はＩｇＧ４の定常領域を有する。
【００３４】
本願で定義する「定常ドメイン」又は「定常領域」という用語は、重鎖又は軽鎖免疫グロブリン定常領域遺伝子の１つによってコードされる抗体に由来する定常領域を意味する。
【００３５】
本発明の文脈において使用される「定常軽鎖」又は「軽鎖定常領域」という用語は、カッパ（Ｃκ）又はラムダ（Ｃλ）軽鎖によってコードされる抗体の領域を意味する。定常軽鎖は、一般的に固有のドメインを含み、本願で定義されるところによると、Ｃκ又はＣλの位置１０８〜２１４を指す。ここで、番号はＥＵインデックス（Ｋａｂａｔら、１９９１）に従う。
【００３６】
「定常重鎖」又は「重鎖定常領域」という用語は、本願において、抗体のアイソタイプとしてＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ又はＩｇＥを定義するために、μ、δ、γ、α又はε遺伝子によってコードされる抗体の領域を意味する。全長ＩｇＧ抗体については、本願で定義されるように、定常重鎖は、ＣＨ１ドメインのＮ末端からＣＨ３ドメインのＣ末端までを指し、従って１１８〜４４７の位置を含む。ここで番号付けはＥＵインデックスに従う。
【００３７】
好ましくは、本発明に係るヒトＣＤ１６０を標的とする結合物の定常領域は、ＩｇＧの定常領域であり、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４の定常領域から選択できる。
【００３８】
好ましくは、本発明に係るヒトＣＤ１６０を標的とする結合物の定常領域は、腫瘍学のための、ＩｇＧ１（配列番号１６）、ＩｇＧ１  Ｅ３４５Ｋ（配列番号４３）若しくはＥ４３０Ｇ（配列番号４４）の定常領域、又は眼科学のためのＩｇＧ４  Ｓ２２８Ｐ／Ｒ４０９Ｋ（配列番号１５）、ＩｇＧ４−（Ｓ２２８Ｐ／Ｒ４０９Ｋ）＋Ｌ２３５Ｅ（配列番号３１）、ＩｇＧ１  Ｎ２９７Ｑ若しくは他のバリアントＩｇＧ４−（Ｓ２２８Ｐ／Ｒ４０９Ｋ）＋Ｈ３１０Ａ／Ｈ４３５Ｑ（配列番号３２）、ＩｇＧ４−（Ｓ２２８Ｐ／Ｒ４０９Ｋ）＋Ｉ２５３Ａ（配列番号３３）、ＩｇＧ１−（Ｎ２９７Ｑ）＋Ｈ３１０Ａ／Ｈ４３５Ｑ（配列番号３４）、ＩｇＧ１−（Ｎ２９７Ｑ）＋Ｉ２５３Ａ（配列番号３５）及びそれらの非グリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）変異体の定常領域である。
【００３９】
ＩｇＧ４サブクラス及びその変異体は、補体カスケード及びＦｃガンマ受容体（又はＦｃｇＲＩＩａ、ＦｃｇＲＩＩＩａ及びＦｃｇＲＩを含むＦｃＲ）に関与するエフェクターに対して非常に低い親和性を有し、ＣＤＣ（補体依存性細胞傷害）効果及び／又はＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害）効果及び／又はＡＤＣＰ（抗体依存性細胞食作用）が望ましくなく、得られる抗体における考えられる毒性リスクを制限することが望ましい場合には利点がある。
【００４０】
逆に、ＩｇＧ１サブクラス及びそのバリアントは、強いＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣ活性及び／又はＡＤＣＰの原因となり、そして、それらを標的細胞の細胞溶解を増加させるために有利であるが、毒性リスクが高くなる。
【００４１】
本発明の一実施態様に係る結合物は、ヒトＣＤ１６０を対象とするモノクローナル抗体であって、軽鎖定常ドメインとして配列番号２２（Ａｌａ１５３／Ｖａｌ１９１に対応するＫｍ３多型）、配列番号２３（Ｖａｌ１５３／Ｌｅｕ１９１に対応するＫｍ１多型）、配列番号２４（Ｖａｌ１５３／Ｌｅｕ１９１に対応するＫｍ１，２多型）、並びに、重鎖定常ドメインとして配列番号１５、配列番号１６、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５及びそれらの非グリコシル化変異体から選択される配列を有する。
【００４２】
ヒトＣＤ１６０を対象とする本発明に係る結合物は、より好ましくは、重鎖定常ドメインとして配列番号１５、配列番号１６、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３２、及びそれらの非グリコシル化変異体、並びに、軽鎖定常ドメインとして配列番号２２の配列を有する。
【００４３】
本発明に係る結合物は、一価（ヒトＣＤ１６０の場合は単一の抗原結合部位）又は多価（ヒトＣＤ１６０への結合のために少なくとも２つの結合部位）であるが、その一方で、ＣＤ１６０に対して単一特異性又は単一機能性（ｍｏｎｏｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）であってもよい。
【００４４】
本発明に係る結合物は、多重特異性結合物、例えば二重特異性抗体（ｂｓａｂ）又は類似の分子でもあってもよい。多重特異性結合物は、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する結合物であり、それらは典型的には重複しない。これらのエピトープは、同一又は異なる標的上にあってもよい。エピトープが異なる標的上にある場合、これらの標的は同じ細胞上又は異なる細胞上又は異なる細胞型上にあってもよい。特定の実施形態では、これらの結合特異性のうちの一方はＣＤ１６０、特にヒトＣＤ１６０の細胞外ドメインに対するものであり、他方は他の抗原に対するものである。
【００４５】
本発明に係る多重特異性結合物は、ＩｇＧフォーマット（例えば、ｂｓａｂ、直交Ｆａｂ、鎖交換操作ドメイン（ｓｔｒａｎｄ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｄｏｍａｉｎ）ＳＥＥＤ又はシードボディ（Ｓｅｅｄ−ｂｏｄｙ））、Ｆａｂ又はＳｃＦｖフラグメントを付加したＩｇＧ（例えば、ＤＶＤ  ｌｇｓ、二重ドメインダブルヘッド抗体（Ｄｕａｌ  ｄｏｍａｉｎ  ｄｏｕｂｌｅ  ｈｅａｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、ジ‐ダイアボディ（Ｄｉ  ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、アフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ）、ビオニューネクス（Ｂｉｏｍｕｎｅｘ）、フィノマブ（Ｆｙｎｏｍａｂ））、抗体フラグメント（二重特異性抗体フラグメント、Ｆｖ二量体、ＢＩＴＥ、ＩｍｍＴＡＣＳ、ＤＡＲＴ、ＢＩＫＥ）に基づくｂｓａｂ、三重特異性抗体、融合タンパク質に基づくｂｓａｂ（例えば、ｓｃＦＶ融合体ＢｓＡｂ）、凝集抗体などの二重特異性抗体の形態をとることができる。
【００４６】
多重特異性結合物（すなわち、ＣＤ１６０及びＣＤ１６０以外の少なくとも１つの抗原に特異的に結合することができる結合物）によって標的化されたエピトープ又は本発明に係る結合物とは異なる抗体によって標的化され本発明による組成物中に存在するエピトープは、活性化又は中和が血管形成又はこの血管形成過程に関連する炎症の阻害において重要な役割を果たし得る標的である以下の抗原に存在する：ＶＥＧＦ（ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ又はＶＥＧＦ−Ｄ）、そしてＰｌＧＦ（胎盤増殖因子）、ＶＥＧＦ−Ｒ２、アンジオポエチン２；アンジオポエチン様４、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＰＤＧＦ（ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＣＣ又はＰＤＧＦ−ＤＤ）、ＰＤＧＦ−Ｒ、ＦＧＦ２又はＦＧＦベータなどのＦＧＦ、βアミロイド、スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）、Ｃ’５、ＩＬ６、ＭＥＲ  ＴＫ、ＣＤ１１５、ＴＮＦα、ＩＬ８、ＨＧＦ、ＴＧＦβ、ＩＧＦ１、ＩＬ１、ＩＬ２、ＥＧＦ、ＫＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、α−ｖ、β−３  α−ｖ、β−５インテグリン、膜貫通型及び可溶性ＣＤ１４６；メタロプロテアーゼ（ＭＭＰ１、２及び９並びにＭＴ１−ＭＭＰなど）；ＴＩＭＰ−２；アンギオゲニン；内皮細胞増殖因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）；血小板活性化因子；プロスタグランジンＥ；プレイオトロピン又はクラスＩＩ  ＭＨＣ、ＨＰ５９又はＣＭ１０１；Ｔリンパ球（Ｔ細胞）の再活性化において活性化又は中和が重要な役割を果たす可能性のある標的、その免疫抑制が予後不良及び癌の進行と相関する例えばＣＤ３、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、４−１ＢＢ、ＬＡＧ−３若しくはＩＣＯＳなどの分子、又はその対象がＣＤ１６０陽性細胞の免疫系における重要な役割を果たすことを可能にする例えばＣＤ１６、ＣＤ３、ＣＤ４７などの分子、又はその対象がＢ型リンパ腫に対するｂｓａｂ抗体の特異性を強化する、例えばＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ５、ＣＬＬに対するＣＤ２００、辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）に対するＣＤ１８０及びマントル細胞リンパ腫に対するＣＤ１４８分子、又はｓｃＦｖ、Ｆａｂ若しくは他の誘導体の安定性及び薬物動態を増加させることを可能にする、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ＣＤ１８０、ＣＤ２００、ＣＤ４０、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ１４８、ＣＤ１８０及びＢ型リンパ腫に特異的な他の抗原、などの抗原が挙げられる。
【００４７】
本発明に係るヒトＣＤ１６０を標的とする結合物の「フラグメント」及び「誘導体」という用語は、ヒトＣＤ１６０に対する前記結合物の結合親和性及び特異性を保持しているフラグメント及び誘導体をそれぞれ意味する。そのようなフラグメント及び誘導体は前記結合物の機能的等価物である。それらは前記結合物と実質的に同じエピトープに結合し、及び／又はヒトＣＤ１６０への結合について前記結合物と競合することができ、ＣＤ１６０以外のＨＬＡ受容体に結合しないヒトＣＤ１６０に対する十分な結合特異性を保持する。
【００４８】
本発明に係る「フラグメント」及び「誘導体」は、ＣＤ１６０に対して本発明に係る結合物と同様の親和性を有する。
【００４９】
本発明に係るヒトＣＤ１６０を標的とする結合物の「フラグメント」という用語は、好ましくは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’（例えば、β−メルカプトエタノールによるＦ（ａｂ’）２の還元）、Ｆ（ａｂ’）２又は重鎖若しくは軽鎖フラグメントなどのフォーマットを意味する。本発明に係るヒトＣＤ１６０を標的とするフラグメントは、上記で定義したように少なくとも１つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び／又は１つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を有する。
【００５０】
本発明の特定の一実施態様に係る結合物は、配列番号５７によって定義される軽鎖（ＶＬ）と、配列番号３６、配列番号３７及び配列番号３８から選択される配列を有する重鎖とを含むフラグメントである。
【００５１】
本発明に係るヒトＣＤ１６０を標的とする結合物の「誘導体」という用語は、少なくとも１つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び／又は１つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、（例えば、配列番号３９又は他のタンパク質配列などのリンカー、特に受容体又はそのフラグメントなど）天然の配列とは異なる少なくとも１つの配列に融合した、この結合物のフォーマットを意味する。前記誘導体は、本発明に係る結合物全体のそれに匹敵するヒトＣＤ１６０に対する結合親和性、及びまた前記結合物のそれに匹敵するヒトＣＤ１６０に対する結合特異性を有する。本発明では、「匹敵する」とは、結合親和性又は結合特異性が２５％の限度内で変動し得ることを意味する。誘導体は、酵素反応、合成及び／又は遺伝子操作によって、当業者の一般的な知識に従って得ることができる。
【００５２】
本発明の特定の一実施態様に係る結合物は、配列番号５７によって定義される軽鎖（ＶＬ）と、配列番号４０又は配列番号４１から選択される配列を含む重鎖とを含むフラグメントである。
【００５３】
本発明に係る誘導体は、一価（例えばヒトＣＤ１６０などの抗原に結合するための単一部位）又は多価（ヒトＣＤ１６０を含む１つ又はいくつかの抗原に結合するための少なくとも２つの部位）であってもよい。好ましい多価誘導体としては、二価、三価及び四価の誘導体が挙げられる。
【００５４】
本発明の一実施形態に係る誘導体は、多重特異性又は多機能性結合物、例えば二重特異性抗体（ｂｓａｂ）又は類似の分子であり、そのエピトープは同一の又は異なる標的上にあり得る。一実施形態では、二重特異性抗体はＣＤ１６０の２つの異なるエピトープに結合することができる。他の実施形態では、二重特異性抗体はＣＤ１６０のエピトープ及びＣＤ１６０以外の抗原のエピトープに結合することができる。対象とするエピトープは、本明細書中上記に記載されている。
【００５５】
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体誘導体は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。
【００５６】
本発明に係る他の誘導体は、単一特異性の多価ｓｃＦｖであり、これは少なくとも２つの一価誘導体を互いに結合させることによって得ることができる。その結合は、共有結合でも非共有結合でもよい。いくつかのＣＤ１６０結合部位の存在は、この抗原に対する結合能を高める。
【００５７】
本発明に係る他の誘導体は、多重特異性多価ｓｃＦｖである。
【００５８】
他の誘導体の中で、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体誘導体を表す「ダイアボディ（ｄｉａｂｏｉｅｓ）」を挙げることができ、前記フラグメントは、同じポリペプチド中の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を有する。多価ｓｃＦｖは、好ましくは、ダイアボディ（二価であり、そして２個のｓｃＦｖからなる）、トリアボディ（これは、三価でありそして３個のｓｃＦｖからなる）及び四量体ｓｃＦｖから選択される。
【００５９】
本発明に係る他の多価誘導体は二量体であり、各単量体は重鎖フラグメント、例えばＣＨ３フラグメントに結合したｓｃＦｖを含む。これはミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）に対応する。ミニボディ中に存在する２つのｓｃＦｖは、同一（ヒトＣＤ１６０にのみ結合するのでミニボディは単一特異性である）又は異なる（一方でヒトＣＤ１６０に結合し、他方で他の抗原に結合するので、ミニボディは二重特異性である）。
【００６０】
本発明に係る他の多価誘導体は二量体であってもよく、各単量体は重鎖フラグメント、例えばＣＨ２及びＣＨ３フラグメント、に結合したｓｃＦｖを含む。存在する２つのｓｃＦｖは、同一であっても異なっていてもよい。異なる場合、それらは二重特異性抗体と呼ばれる。
【００６１】
本発明に係る他の多価誘導体は、単一の単量体重鎖可変ドメインからなる抗体フラグメントである。これは単一ドメイン抗体（ＡｂｌｙｎｘよりナノボディとよばれるＶＨＨ又はｓｄＡｂ）
に相当する。
【００６２】
四価で単一特異性の抗ＣＤ１６０誘導体の例として、重鎖の各可変領域の上流で、ＶＨ及びＣＨ１領域が実施例３における配列番号４２で示すように重複している抗ＣＤ１６０分子もまた挙げることができる。次いで、四価で機能的単一特異性の抗ＣＤ１６０の機能的なバージョンを得るために、哺乳動物細胞において、配列番号４２及び配列番号５７によって定義される抗ＣＤ１６０軽鎖をコードする遺伝子を共発現させることが可能である。
【００６３】
本発明に係る他の誘導体は、本発明に係るヒトＣＤ１６０対に結合するキメラマウス軽鎖／重鎖結合の１つを用いて、ＩｇＭを組換えて生成することによって得られる。
【００６４】
他の実施形態では、本発明は、本発明に係る結合物の少なくとも１つを含有する組成物である。特定の一実施形態に係る組成物は、本発明に係る少なくとも１つの結合物と、本発明に係る結合物以外の少なくとも１つの抗体とを含有する。
【００６５】
本発明の一実施態様では、前記結合物又は組成物は医薬として使用される。
【００６６】
本発明に係るヒトＣＤ１６０を標的とする結合物、そのフラグメント及び／又はその誘導体は、医薬組成物又は医薬品中に存在してもよい。この医薬組成物は、好ましくは薬学的に許容される担体を含む。「薬学的に許容される」とは、細胞、細胞培養物、組織又は有機体などの生物学的システムと適合性があり、かつその組成物中の活性物質における生物学的活性の効能を妨害しない非毒性の物質を指す。前記の担体の特徴は、投与方法に依存する。
【００６７】
医薬組成物又は医薬は、患者に投与することができる任意の形態であってよく、特に溶液、懸濁液、凍結乾燥粉末、カプセル及び錠剤であってもよい。
【００６８】
医薬組成物又は医薬は、注射、すなわち局所注射、すなわち硝子体内注射、粘膜を介した投与、吸入、経口投与及び目的に合うより一般的な任意の形態であってもよい。
【００６９】
本発明はまた、本明細書に記載の結合物と、ＣＤ１６０と同一又は異なる少なくとも１つの他の抗原（特に前述した抗原のエピトープのうちの１つ）に特異的に結合する抗体とを含む製品であって、特に、新生血管性の眼病、原発性糖尿病性網膜症若しくは加齢黄斑変性症（ＡＲＭＤ）、糖尿病、糖尿病性失明、慢性関節リウマチ、子癇前症、子癇又は癌から選択される、血管新生を引き起こす病的状態の治療及び／又は予防における同時、個別又は逐次使用のための製品である。
【００７０】
「病的状態の予防」とは、疾患がまだ現れていない対象（特にヒト）におけるこの疾患の発生の予防を意味する。
【００７１】
「病的状態の治療」とは、この疾患の抑制、すなわちその発症の停止、その後退、又は疾患の症状及び結果の消失、あるいは疾患の原因の消失を意味する。
【００７２】
より好ましくは、本発明に係る結合物又は本発明に係る組成物は、抗血管新生剤、免疫調節剤及び／又は細胞毒性薬剤（細胞傷害剤）として使用される。
【００７３】
本発明は、より具体的には、抗血管新生剤としての使用のための本発明の結合物である。
【００７４】
本発明において、「抗血管新生剤」又は「血管新生阻害剤」は、直接的又は間接的に、血管新生、脈管形成、又は望ましくない血管透過性を阻害する結合物を意味する。
【００７５】
好ましくは、本発明に係る結合物は、血管新生病態、好ましくは新生血管性の眼病、糖尿病、糖尿病性網膜症若しくは加齢黄斑変性症、慢性関節リウマチ、子癇前症、子癇又は癌の予防及び／又は治療に使用することができる。
【００７６】
「新生血管性の眼病」とは、すべての新生血管性の眼病又は障害を意味する。いくつかの眼の障害は、病的血管形成と関連している。例えば、ＡＲＭＤの発症は、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）と呼ばれるプロセスに関連している。糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）は、血管新生に関する他の眼の障害である。ＤＭＥは、糖尿病を患っている患者における中等度の視力喪失の最も広範な原因であり、網膜の血球に影響を与える糖尿病性網膜症の一般的な合併症である。
【００７７】
異常な新生血管性に関連する他の眼病は、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）である。ＣＲＶＯは網膜の中心静脈の閉塞によって引き起こされ、その結果、網膜に血液と体液が蓄積する。網膜は虚血性になり、不適切な新しい血管が成長し、視力がさらに失われ、より深刻な合併症を引き起こす可能性がある。
【００７８】
網羅的ではないが、特にノーリー病から選択される他の新生血管性の眼病について言及すると、以下のようになる；すべての形態の脈絡膜血管新生、ポリープ状網膜脈絡膜血管障害、近視及びソルビーのジストロフィ（Ｓｏｒｓｂｙ’ｓ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉａ）に関連する後葉脈絡膜脈絡膜血管；ブドウ膜黒色腫；虹彩ルベオーシス及び血管新生緑内障、網膜血管腫状増殖（ＲＡＰ）、角膜移植合併症及び／又は角膜感染及び／又は環境による角膜発作の後に起こる血管新生、病原性感染及び化学火傷から選択されるもの；又は糖尿病性及び浮腫性虚血、早発性糖尿病性網膜症、増殖性及び非増殖性の網膜症、嚢胞性黄斑浮腫、すべての形態の加齢黄斑変性（ＡＲＭＤ）、特に湿性型のもの、ベスト病など、すべての卵黄様黄斑変性を含むすべての型の網膜症；フォン・ヒッペル・リンドウ病などの眼の血管腫；イールズ病；コーツ病。
【００７９】
「糖尿病」とは、あらゆる種類の糖尿病、特にインスリンに関連した糖尿病及び抗利尿ホルモンに関連した尿崩症を意味するものとする。糖尿病の形態においては、１型糖尿病（インスリン依存性）、２型糖尿病（インスリン感受性の低下）、妊娠性糖尿病又は新生児糖尿病が挙げられる。尿崩症の形態の中で、下垂体による抗利尿ホルモンの生成が低いことによる中枢糖尿病、又は抗利尿ホルモンに対する腎臓の感受性が低いことによる末梢糖尿病が挙げられる。
【００８０】
「癌」とは、細胞のあらゆる異常な増殖を意味するものとする。癌は、特に、乳癌、結腸直腸癌、膀胱癌、肺癌、及び前立腺癌から選択される。
【００８１】
本発明に係る抗血管新生の結合物は、特に、血管新生成分が疾患の伝播の重要なベクターである癌の治療に使用することができる。例えば、特に、乳癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、非ホジキンリンパ腫、腎癌、前立腺癌、膀胱癌又は腎細胞癌（ｒｅｎａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）などの泌尿生殖器腫瘍、結腸癌、ホジキンリンパ腫、肝臓癌、子宮頸癌、黒色腫、卵巣癌、中皮腫、膠芽腫が挙げられる。
【００８２】
特定の一実施形態では、本発明に係る結合物は細胞傷害剤として使用することができる。
【００８３】
「細胞傷害性抗体」、「細胞傷害性薬剤」又は「抗腫瘍剤」とは、抗体依存性エフェクター細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞障害（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）、又は抗体依存性細胞介在性食作用（ＡＤＣＰ）及び腫瘍細胞のアポトーシスの直接誘導を誘発する、治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はそのフラグメント若しくは誘導体を意味する。
【００８４】
本発明に係る他の誘導体は、細胞傷害活性が改善された結合物である。細胞傷害活性が改善された結合物は、抗ＣＤ１６０の可変鎖を、Ｆｃ領域が最適なグリコシル化（例えば、脱フコシル化）を受けた、ＩｇＧフォーマットにグラフトするか、又は、対象とする抗体におけるＦｃ領域のアミノ酸配列を操作することにより改変して得られる。例えば、ＤＬＥ三重突然変異体（Ｓ２９３Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ）を導入する。このような結合物は、ヘキサボディフォーマット（ｔｈｅ  Ｈｅｘａｂｏｄｙ  ｆｏｒｍａｔ）、又はＢＩＴＥ若しくはＢｉＫＥフォーマット（ＣＤ１６０に対する１の価数及びＣＤ１６に対する２価数）又はＴｒｉＫＥフォーマットによる結合物のフォーマットを生成することによっても得ることができる。これらの改良の例は、本発明の実施例３に示す。抗体の１つ以上の残基がシステイン残基で置換され、その遊離チオール基が免疫毒素、放射性免疫複合体（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）又は抗体薬物複合体（ＡＤＣ）などの治療薬を作成するために使用され得る発明に係る結合物を作成することも可能である。
【００８５】
本発明に係る、他の二価の二重特異性結合物では、一方でＮＫ細胞に関係し、他方で非ＣＤ１６０価の腫瘍抗原に関係する抗体の価数として、ＣＤ１６の代替としてＣＤ１６０を使用することも可能である。これは、ＣＤ１６０もまた、ＮＫ細胞で発現される活性化物質受容体であるためである（本発明の実施例１５及び１６を参照）。この結合物とＮＫ細胞のＣＤ１６０との相互作用により、ＮＫ細胞が活性化され、これらのエフェクター細胞が腫瘍標的に近づく。
【００８６】
本発明による他の誘導体は、その細胞毒性活性を改善するために、全身半減期（ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）が改善された結合物である。
【００８７】
本発明に係る結合物又は組成物は、血液癌又は固形腫瘍の治療に使用することができる。本発明に係る細胞毒性結合物の例は、実施例３及び４に示されている。
【００８８】
ＣＤ１６０は特定の腫瘍細胞、特にＢ細胞慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ及び有毛細胞白血病（ＨＣＬ））の大部分における特定の腫瘍細胞に対し抗原特異的で、且つ、辺縁帯リンパ腫及びマントル細胞リンパ腫の患者の機能としてのより異種の発現を伴う抗原であると知られている。しかし、ＣＤ１６０は正常な循環Ｂ細胞ではまったく発現しない抗原である。したがって、抗ＣＤ１６０抗体を使用して、これらのＢリンパ腫の腫瘍増殖を特異的に殺すか、阻害することができる。
【００８９】
したがって、本発明に係る結合物は、血液癌、特に慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、有毛細胞白血病、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）の治療、又は固形腫瘍、特に黒色腫、腎細胞癌、肺癌、そして、特に類表肺癌、神経芽細胞腫、卵巣癌、乳癌、胃癌の治療に使用することができる。
【００９０】
本発明に係る結合物は、例えば、抗ＣＤ２０抗体、特にリツキシマブ、オファツムマブ、オビヌツズマブ、オカラツズマブ、又はベルツズマブ、抗ＣＤ３７抗体、抗ＣＤ３８抗体又は抗ＣＤ４０抗体など、少なくとも１種の他の抗体と組み合わせて血液癌の治療に使用することができる。
【００９１】
本発明に係る抗ＣＤ１６０結合物は、免疫チェックポイント阻害剤、特に黒色腫、非小細胞肺癌、膀胱がんや腎がんなどのなどの泌尿生殖器腫瘍、結腸がん、ホジキンリンパ腫、又は乳がんに有利に応答する癌の治療において、免疫のＮＫ及びＴ細胞におけるＣＤ１６０免疫調節活性を調節するために使用することができる。
【００９２】
「ＣＤ１６０免疫調節活性」とは、ＣＤ１６０に関連する１つ以上の免疫調節活性を意味する。
【００９３】
「調節」及び「免疫調節剤」及びそれらに関連する用語は、抗ＣＤ１６０抗体との相互作用によるＴリンパ球又はＮＫ細胞応答のアップレギュレーションに関連するＣＤ１６０の活性の減少又は増加を指す。ここで、増加とは、同じ抗体の非存在下でのＣＤ１６０の活性と相対的なものである。活性の減少又は増加は、好ましくは少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれ以上である。ＣＤ１６０の活性が低下するときは、「調節剤」及び「調節」という用語は、「阻害剤」及び「阻害」という用語と交換可能である。ＣＤ１６０の活性が上昇すると、「調節剤」及び「調節」という用語は、「活性剤」及び「活性」という用語と交換可能である。
【００９４】
ＣＤ１６０の活性は、実施例１４及び１５にそれぞれ示すように、ＮＫ活性（ＣＤ６９などのマーカーをアッセイすることによる）又はＩＦＮ−γなどのサイトカインの分泌の測定によって定量的に決定できる。ＣＤ１６０の活性は、また、実施例１９に示すように、サイトカイン分泌又はＣＤ６９としての活性化マーカーの上昇の測定によるＴ細胞活性を評価することで決定できる。
【００９５】
免疫調節剤の組み合わせは、免疫チェックポイント阻害剤に対する臨床反応を改善するための鍵である。
【００９６】
したがって、特定の一実施形態では、本発明に係る結合物は、これらの免疫調節剤の１種、好ましくは抗ＰＤ１、抗ＣＴＬＡ−４又は抗ＰＤ−Ｌ１と、組成物で組み合わせられ、前記組成物は免疫調節剤として使用される。
【００９７】
本発明の他の特定の実施形態に係る抗ＣＤ１６０結合物は、ＣＤ１６０を発現する上皮内生来リンパ系細胞の活性化によって、腸（特に、大腸菌、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ））又は肺（特に、肺炎レンサ球菌）に感染する病原性細菌に対する防御を促す、細菌感染治療のための免疫調節剤として使用される。
【００９８】
本発明はまた、本発明に係る結合物又はそのフラグメント若しくはその誘導体をコードする核酸である。「核酸」とは、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又はＲＮＡ配列を意味するものとする。
【００９９】
本発明はまた、前記核酸を含む発現ベクター、又は前記核酸を含む発現カセットである。本発明によれば、適切な発現ベクターは、核酸に機能的に連結された少なくとも１つの発現制御要素を含むことができる。発現制御要素はベクターに挿入され、核酸の発現を調節することを可能にする。
【０１００】
本発明はまた、前記の発現ベクター、又は前記の１つ以上の核酸を含む組換え細胞である。本発明によれば、使用できる細胞は、例えば、動物、植物、昆虫及び酵母細胞などの真核細胞並びに大腸菌などの原核細胞である。遺伝子を運ぶベクターを細胞に導入できる手段は、特に、マイクロインジェクション、電気穿孔法、形質導入、トランスフェクション又はＤＥＡＥ−デキストラン、リポフェクション若しくはリン酸カルシウムを使用したトランスフェクション、又は当業者に知られている他の方法を含む。好ましい一実施形態では、真核細胞で機能する真核発現ベクターが使用される。
【０１０１】
そのようなベクター及び核酸は、目的のタンパク質を（本発明に係る結合物の場合は宿主生物によって）生成させるために、遺伝子治療又は細胞治療で使用することができる。
【０１０２】
本発明はまた、対象（好ましくはヒト）を治療する方法でもあり、本発明に係る結合物の治療有効量が前記対象に投与される。したがって、本発明に係る結合物は、治療有効量が投与される。治療的有効量とは、標的の血管新生の病的状態を予防及び／又は治療するのに十分な量に対応する。この量は、対象の年齢、性別、及び疾患の段階によって異なり得るものであり、当業者によって決定されるであろう。治療有効量は、１日以上の期間、１回又は毎日の投与で、０．０１〜５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．１〜２ｍｇ／ｋｇで変化し得る。
【０１０３】
投与方法は、注射でも、少しずつ点滴してもよい。注射は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、経皮、結膜、眼内又は硝子体内に行ってもよい。結膜下又は硝子体内注射の場合、本発明に係る結合物の治療有効量は０．１〜１０ｍｇであり得る。
【０１０４】
非経口投与用の製剤には、無菌の水性若しくは非水性溶液、懸濁液又はエマルションが含まれる。非水性溶媒としては、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、又はオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルなどが挙げられる。水性担体としては、水、アルコール／水の溶液、エマルジョン又は懸濁液が挙げられる。非経口投与用の製剤には、糖及び／又は塩も含まれ得る。
【０１０５】
本発明に係る結合物は標識することができる。標識の例には、毒素、酵素、放射性同位体、蛍光結合物、コロイド材料、化学発光結合物、及び生物発光結合物が挙げられる。標識を抗体に結合する方法は、当業者に周知である。
【０１０６】
他の標識技術として、抗体を低分子量ハプテンに結合するものがある。これらのハプテンは、第２の反応によって特異的に修飾できる場合がある。ハプテンの例として、アビジンと反応するビオチン、又は抗ハプテン特異的抗体と反応できるジニトロフェノール、ピリドキサール又はフルオレセインなどが挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１Ａ】実施例５に係る蛍光強度中央値の測定結果を示す。
【図１Ｂ】実施例５に係る蛍光強度中央値の測定結果を示す。
【図１Ｃ】実施例５に係る蛍光強度中央値の測定結果を示す。
【図２】実施例６に係る血管新生の割合の評価結果を示す。
【図３Ａ】実施例８に係るＨ７及びＨ７バリアントの平均血清濃度の時間変化を示す。
【図３Ｂ】実施例８に係るＨ７及びＨ７バリアントの平均血清濃度の時間変化を示す。
【図４】実施例９に係るレーザー誘発性脈絡膜血管新生についてのサルのモデルでの臨床的関連病変の総数を示す。
【図５】実施例９に係るレーザー誘発性病変の瘢痕について、治癒された又は未治癒の開口状のスポットの割合を示す。
【図６Ａ】実施例１０に係るスポットの総数に対する臨床関連病変（グレード３及び４）の割合を示す。
【図６Ｂ】実施例１０に係る漏出の重症度の経時変化に対するＥＬＢ０１１０３の影響を示す。
【図６Ｃ】実施例１０に係る臨床関連病変のＣｈＮＶ面積の平均的な変化に対する、ＥＬＢ０１１０３の用量増加（０．３〜３ｍｇ）の影響を示す。
【図６Ｄ】実施例１０に係るいくつかの種類の病変における網膜厚さの平均的な変化に対する、ＥＬＢ０１１０３（１ｍｇ）の影響を示す。
【図７Ａ】実施例１０に係る臨床関連病変（グレード３及び４）の割合を示す。
【図７Ｂ】実施例１０に係る経時的な漏出の重症度の変化を示す
【図７Ｃ】実施例１０に係る臨床関連病変のＣｈＮＶ面積の変化を示す。
【図７Ｄ】実施例１０に係る網膜厚さの変化を示す。
【図８】実施例１１に係るＰＢＭＣの蛍光強度中央値の測定結果を示す。
【図９】実施例１２に係るフローサイトメトリー分析の結果を示す。
【図１０Ａ】実施例１３に係る蛍光プロファイルのヒストグラムを示す。
【図１０Ｂ】実施例１３に係るＩＦＮ−γのＥＬＩＳＡによる分析の結果を示す。
【図１０Ｃ】実施例１３に係るフローサイトメトリー分析の結果を示す。
【図１１】実施例１３に係るＣＤ６９陽性のＮＫ細胞の割合を示す。
【図１２Ａ】実施例１３に係るＩＦＮ−γのＥＬＩＳＡによる分析の結果を示す。
【図１２Ｂ】実施例１３に係るＣＤ６９陽性のＮＫ細胞の割合を示す。
【図１３Ａ】実施例１５に係る陽性細胞の割合を示す。
【図１３Ｂ】実施例１５に係る陽性細胞の割合を示す。
【図１４】実施例１８に係るＨ７バリアントの結合能力の測定結果を示す。
【図１５】実施例１９に係るＨ７  Ａ０９バリアントによるＨＶＥＭ−ＣＤ１６０相互作用の遮断によるＴ  ＣＤ４の再活性化の割合を示す。
【０１０８】
本発明を、以下の実施例及び図面を用いて説明する。
【０１０９】
まず、図面について説明する。
図１Ａは、Ｈ７候補並びにＩｇＧ１フォーマット及びＩｇＧ１  Ｅ３４５ＫにおけるそのバリアントのＣＨＯ  ＷＴと比較したＣＨＯ−ｈＣＤ１６０への結合を示す。
図１Ｂは、Ｈ７候補並びにＩｇＧ４フォーマット及びＩｇＧ４  Ｈ３１０Ａ−Ｈ４３５ＱにおけるそのバリアントのＣＨＯ  ＷＴと比較したＣＨＯ−ｈＣＤ１６０への結合を示す。
図１Ｃは、Ｈ７候補ＩｇＧ４（ＥＬＢ０１１０１）並びにＩｇＧ４フォーマットにおけるＨ７  Ｄ１２バリアント（ＥＬＢ０１１０３）、ＦｃＲｎヌル変異（ＥＬＢ０１１０４）、Ｆａｂバリアント（ＥＬＢ０１１２２）及びＦａｂ−リンカー−Ｆａｂバリアント（ＥＬＢ０１１３２）のＹＴ２Ｃ２（ＮＫ細胞株）への結合を示す。図１Ｃでは、各曲線は、以下のものに対応する：黒い円：ヒトＩｇＧ４、黒い三角形：ＥＬＢ０１１０１（Ｈ７  ＩｇＧ４）、黒い逆三角形：ＥＬＢ０１１０３、黒い正方形：ＥＬＢ０１１０４、黒いひし形：ＥＬＢ０１１２２、黒い星：ＥＬＢ０１１３２。
図２は、ラットの角膜血管新生モデルにおけるＡｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ（Ｅｙｌｅａ（登録商標））と比較した、ＩｇＧ４フォーマットにおける抗ＣＤ１６０抗体（ＥＬＢ０１１０１）の経時的有効性の評価を示す。このバーグラフには、平均と標準誤差が示されている。図２では、２種類のバーのうち、白いバー（％）は８日目の血管新生を示し、黒いバー（％）は１２日目の血管新生を示す。
図３Ａは、親ＣＬ１−Ｒ２、ベバシズマブ、ラニビズマブと比較した、ウサギの硝子体内ルートの投与に続く、異なるＩｇＧフォーマットにおけるＨ７及びＨ７バリアントの平均血清濃度の時間変化を示す。
図３Ｂは、親ＣＬ１−Ｒ２、ベバシズマブ、ラニビズマブと比較した、ウサギの静脈内ルートの投与に続く、異なるＩｇＧフォーマットにおけるＨ７及びＨ７バリアントの平均血清濃度の時間変化を示す。
図４は、レーザー誘発性脈絡膜血管新生についてのサルのモデル（１０８のレーザー照射部位についてグレード３及び４の合計スコア）での臨床的関連病変の総数（グレード３及び４）に対する抗ＣＤ１６０  Ｈ７  ＩｇＧ４（ＥＬＢ０１１０１）の影響。レーザー誘発病変の総数は、抗ＣＤ１６０（Ｈ７  ＩｇＧ４  ＥＬＢ  ０１１０１）で治療された動物又は担体対照について１０８個（９回のレーザー照射を行った１２個の目に相当）であった。
図５は、サルのモデルにおける脈絡膜血管新生のレーザー誘発性病変の瘢痕の治癒に対する抗ＣＤ１６０  Ｈ７（ＥＬＢ０１１０１）の影響を示す。治癒の状態と病変の開口部は、フォンヴィレブランド因子に対する抗体で標識した後、免疫組織化学分析により個別に推定された。治癒中（つまり、ＲＰＥ膜で覆われているということ）のスポットの割合（％）を、治癒された又は未治癒の開口状のスポットの割合（％）と比較したものを、棒グラフで表す。中央の脈絡膜瘢痕がある開口状のスポットの割合は、グラフ上、プレーンな黒いバーとして表され、中央の脈絡膜瘢痕のない開口状スポットの割合は黒い斜線入りのバーとして表され、治癒中のスポットの割合（ＲＰＥ瘢痕で覆われたスポット）は白色のバーとして表される。
【０１１０】
図６は、サルのレーザー誘発性ＣｈＮＶモデルにおけるＩｇＧ４フォーマットのＨ７  Ｄ１２（ＥＬＢ０１１０３）の用量効能についてのデータを示す。
【０１１１】
図６Ａは、スポットの総数に対する臨床関連病変（グレード３及び４）の割合の、ＥＬＢ０１１０３の経時的な影響／発生率（０〜１４日目及び０〜２８日目）を示す。１４日目と２８日目の効能データを、それぞれ、黒いバーと斜線入り（グレー）バーで表す。このモデルの文献で報告されている抗ＶＥＧＦの平均効能レベルを、黒い矢印で示す。
【０１１２】
図６Ｂは、漏出の重症度の経時変化に対するＥＬＢ０１１０３の影響を示す。漏出の重症度の変化は、臨床関連の個々のＣｈＮＶ病変におけるグレードスコアの経時変化（１４〜２８日目）に見られる。
【０１１３】
図６Ｃは、１４〜２８日目における臨床関連病変のＣｈＮＶ面積の平均的な変化に対する、ＥＬＢ０１１０３の用量増加（０．３〜３ｍｇ）の影響を示す。
【０１１４】
図６Ｄは、１４〜２８日目におけるいくつかの種類の病変における網膜厚さの平均的な変化に対する、ＥＬＢ０１１０３（１ｍｇ）の影響を示す。グレーのバーは、すべての病変（グレード１、２、３及び４）への影響を示し、斜線入りバーは、臨床関連病変（グレード３及び４）への影響を示し、黒色のバーは、グレード４の病変のみを考慮したときの影響を示す。
【０１１５】
図７は、サルのレーザー誘発性ＣｈＮＶモデルにおけるＦａｂリンカーＦａｂフォーマット（ＥＬＢ０１１３２）のＨ７  Ｄ１２の用量効能データを示す。
【０１１６】
図７Ａは、スポット総数に対する臨床関連病変（グレード３及び４）の割合への、ＥＬＢ０１１３２の経時的な影響／発生率（０〜１４日目及び０〜２８日目）を示す。１４日目及び２８日目における効能データを、それぞれ、黒いバーと斜線入りバーとして表す。このモデルの文献で報告されている抗ＶＥＧＦの平均効能レベルを、黒い矢印で示す。
【０１１７】
図７Ｂは、経時的な漏出の重症度の変化に対するＥＬＢ０１１３２の影響を示す。漏出の重症度の変化は、臨床関連の個々のＣｈＮＶ病変のグレードスコアの経時変化（１４日目から２８日目）からわかる。
【０１１８】
図７Ｃは、１４日目から２８日目までの臨床関連病変のＣｈＮＶ面積の平均的な変化に対するＥＬＢ０１１３２の用量増加（０．２５〜２ｍｇ）の影響を示す。
【０１１９】
図７Ｄは、１４日目から２８日目までの数種類の病変における網膜厚さの平均的な変化に対するＥＬＢ０１１３２（０．６  ｍｇ）の影響を示す。グレーのバーはすべての病変への影響（グレード１、２、３及び４）を示し、斜線入りバーは臨床関連病変（グレード３及び４）への影響を示し、黒いバーはグレード４の病変のみを考慮した場合の影響を示す。
【０１２０】
図８は、ＩｇＧ１フォーマットにおける抗ＣＤ１６０  Ｈ７抗体は、ＣＬＬ患者のＣＤ１６０陽性腫瘍細胞を認識する。
【０１２１】
７人のＣＬＬ患者から単離されたＰＢＭＣは、抗体ＣＬ１−Ｒ２（マウス抗ＣＤ１６０  ＩｇＧ１）、ＩｇＧ１フォーマットにおける本発明に係る抗ＣＤ１６０  Ｈ７、ＢＹ５５（マウス抗ＣＤ１６０  ＩｇＭ）（ＣＤ１９／ＣＤ５／ＣＤ３／ＣＤ５６パネル）で標識された。ＣＤ１６０標識の蛍光強度を測定するために、ＣＤ５＋ＣＤ１９＋腫瘍細胞を分析した。ＣＤ１６０発現は、すべてのＣＬＬサンプルで様々な強度で検出される。Ｈ７  ＩｇＧ１抗体は、ＣＬＬサンプルの６／７の腫瘍細胞に効果的に結合する。
【０１２２】
図８では、ａｕｔｏ＝細胞の自己蛍光、アイソタイプ＝ＩｇＧ１、ＩｇＭ、マウス、無関係、陰性対照、を意味する。
【０１２３】
図９は、ＩｇＧ１フォーマットにおける抗ＣＤ１６０  Ｈ７抗体は、ＡＤＣＣメカニズムによってＣＤ１６０を発現している細胞を殺す。
【０１２４】
健康なドナーの血液から精製したＮＫ細胞を、抗ＣＤ１６０  Ｈ７  ＩｇＧ１抗体のＡＤＣＣ活性を測定する試験のエフェクターとして使用した。Ｅ３００−ＣＤ１６０標的細胞（ＣＤ１６０を発現するトランスフェクションされたプレＢヒト細胞株）を、ＣＦＳＥで標識し、示唆されたエフェクター／標的比率（１／１、１／５及び１／１０）でＨ７  ＩｇＧ１抗体又はヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照の存在下でエフェクターＮＫ細胞でインキュベートした。殺した標的細胞の割合は、７ＡＡＤでの標識とフローサイトメトリー分析により測定した。二重標識７ＡＡＤ＋ＣＦＳＥ＋死細胞の割合は、表示されたドットプロットの右上の象限に示されている。
【０１２５】
図１０は、ＩｇＧ１フォーマットにおける抗ＣＤ１６０  Ｈ７抗体はＮＫ細胞を活性化する。
【０１２６】
図１０Ａは、Ｈ７  ＩｇＧ１抗体は、ヒトＮＫ細胞に結合する。ＮＫ細胞は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉキット（参照１３０−０９２−６５７）及びａｕｔｏＭＡＣＳＴＭ（商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  参照１３０−０９２−５４５）を使用して、健康なドナーの血液から精製した。細胞表面Ｆｃ受容体をヒトＩｇＧ  Ｆｃフラグメント（Ｒｏｃｋｌａｎｄ  参照００９−０１０３）で１５分間飽和させた後、５×１０５個のＮＫ細胞を０．２５μｇのＨ７  ＩｇＧ１抗体又はヒトＩｇＧ１（アイソタイプ対照）とともに４℃で２０分間インキュベートし、抗体結合キット（Ｌｙｎｘ  参照ＰＥ  ＬＮＫ０２１ＲＰＥ）及びＣＤ５６−ＡＰＣ抗体を使用してフィコエリトリンに結合させた。ヒストグラムは、ＣＤ５６陽性集団で分析された、Ｈ７  ＩｇＧ１（黒色）又はｈＩｇＧ１対照（グレー）で得られた蛍光プロファイルを示す。
【０１２７】
図１０Ｂは、Ｈ７  ＩｇＧ１は、ＮＫ細胞によるインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）の産生を誘発する。健康なドナーの血液から精製したＮＫ細胞を、９６ウェルプレートのウェル（ウェルあたり１×１０６の細胞）単独又はＨ７  ＩｇＧ１抗体若しくはヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照の存在下（濃度は１μｇ／ｍｌ又は１０μｇ／ｍｌ）で２４時間培養した。ＩＦＮ−γを、培養上清でＥＬＩＳＡによって分析した。表示結果は、３回の平均と＋／−標準誤差である。
【０１２８】
図１０Ｃは、Ｈ７  ＩｇＧ１は、ＮＫ細胞で活性化マーカーＣＤ６９の発現を誘導する。同じ実験で、ＮＫ細胞を培養２４時間後に回収し、蛍光色素ＡＰＣに結合した抗ＣＤ６９抗体で標識した。ＣＤ６９陽性細胞の割合をフローサイトメトリーで分析した。３つの値の平均値（及び＋／−標準誤差）を計算した。
【０１２９】
図１１において、ＩｇＧ４ではなくＩｇＧ１フォーマットにおける抗ＣＤ１６０  Ｈ７抗体がＮＫ細胞を活性化する。
【０１３０】
健康なドナーの血液から精製したＮＫ細胞を単独で、又は５μｇ／ｍｌに濃縮された以下の抗体の存在下で培養した：Ｈ７  ＩｇＧ１、Ｈ７  ＩｇＧ４、それぞれのヒトＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４アイソタイプ対照、又は、ＩｇＧ４フォーマットのＨ７抗体に由来するバリアントである抗体ＥＬＢ０１１０３、ＥＬＢ０１１０４及びＥＬＢ０１１０６。抗ＣＤ１６抗体（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ｃａｔ＃１６  ０１６６）を陽性対照として使用する。ＮＫ細胞（ウェルあたり５×１０５）を培養の２４時間後に収集し、蛍光色素ＡＰＣに結合した抗ＣＤ６９抗体で標識した。ＣＤ６９陽性細胞の割合をフローサイトメトリーで分析した（３つの値の平均値と＋／−標準偏差）。ＩｇＧ１フォーマットにおける抗ＣＤ１６０  Ｈ７は、ＮＫ細胞上で活性化マーカーＣＤ６９の発現を誘導するが、ＩｇＧ４フォーマットにおける同じ抗体は効果がない。Ｈ７バリアントＩｇＧ４（ＥＬＢ０１１０３、ＥＬＢ０１１０４及びＥＬＢ０１１０６）も、ＮＫ細胞に対する活性化効果を示さない。
【０１３１】
図１２において、ＩｇＧ１及びＥ３４５Ｋ／ＩｇＧ１フォーマットにおける抗ＣＤ１６０  Ｈ７抗体由来のバリアントは、ＮＫ細胞を活性化する能力が高くなっている。
【０１３２】
健康なドナーの血液から精製されたＮＫ細胞を、単独又は抗ＣＤ１６０  Ｈ７  ＩｇＧ１抗体の存在下で、又は、ＥｌｓａＬｙｓによって０．００１〜１０μｇ／ｍｌの用量で製造されたバリアントＥＬＢ０２１０２、ＥＬＢ０２１０３、若しくはＥＬＢ０２１０４（３つのうちいずれもＩｇＧ１フォーマットで）、ＥＬＢ０２１１２、ＥＬＢ０２１１３若しくはＥＬＢ０２１１４（３つのうちいずれもＥ３４５Ｋ／ＩｇＧ１フォーマットで）の存在化で９６ウェルプレートのウェル（１ウェルあたり１×１０６細胞）で２４時間培養した。１０μｇ／ｍｌのヒトＩｇＧ１を陰性アイソタイプ対照として使用し、抗ＣＤ１６（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ｃａｔ＃１６−０１６６）を陽性アイソタイプ対照として使用した。
【０１３３】
図１２Ａは、ＩＦＮ−γを培養上清中のＥＬＩＳＡで分析した。表示結果は、３つの値の平均値と＋／−標準誤差である。
【０１３４】
図１２Ｂでは、ＮＫ細胞を回収し、蛍光色素ＡＰＣに結合した抗ＣＤ６９抗体で標識した。ＣＤ６９陽性細胞の割合をフローサイトメトリーで分析した。平均値（及び＋／−標準誤差）は３つの値から計算した。
【０１３５】
これらの結果はすべて、ＮＫ細胞の活性化に関して、ＩｇＧ１フォーマットにおける３つのＨ７バリアント（ＥＬＢ０２１０２、ＥＬＢ０２１０３、ＥＬＢ０２１０４）が元のＨ７  ＩｇＧ１抗体よりもはるかに強力であり、ＥＣ５０値が２ｌｏｇから３ｌｏｇ改善されていることを示している。
【０１３６】
Ｅ３４５Ｋ／ＩｇＧ１フォーマットにおける３つのＨ７バリアントは、ＩＦＮ−γ産生を誘導する能力がさらに向上し、ＥＣ５０値で２ｌｏｇのさらなる改善があることを示している。（元のＨ４  ＩｇＧ１抗体と比較して４ｌｏｇ）。
【０１３７】
図１３において、ＩｇＧ１及びＥ３４５Ｋ／ＩｇＧ１フォーマットにおける抗ＣＤ１６０  Ｈ７抗体由来のバリアントは、ＮＫ（図１３Ａ）細胞及びＣＤ８＋Ｔ（図１３Ｂ）細胞を効率的に標識する。
【０１３８】
２人の健康なドナーからのＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）を、抗ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８及びＣＤ１９抗体及び示された抗ＣＤ１６０抗体（ＰＢＭＣ５×１０５個について０．２５μｇ）で免疫標識した後、フローサイトメトリーで分析した。無関係なヒトＩｇＧ１（ｈＩｇＧ１）を陰性対照として使用した。斜線のないバーはドナー１の結果を、ハッチングされたバーはドナー２の結果を示す。
【０１３９】
図１４は、ＣＨＯ−ＣＤ１６０  ＴＭ（膜貫通）、ＣＨＯ−ＣＤ１６０  ＧＰＩ（グリコシルホスファチジルイノシトール）及びＣＬ１Ｒ２のＣＨＯ、ＥＬＢ０２１０１（Ｈ７  ＩｇＧ１）候補及びバリアントＥＬＢ０２１０４、ＥＬＢ０２１１４及びＥＬＢ０１１０３の結合を示す。
【０１４０】
ヒト化ＥＬＢ０２１０１（Ｈ７  ＩｇＧ１）及びそのＥＬＢ０２１０４、ＥＬＢ０２１１４及びＥＬＢ０１１０３は、ＣＨＯ−Ｓ細胞によって組換えられ発現されたヒトＣＤ１６０−ＴＭに予想に反して結合するが、親ＣＬ１Ｒ２  ｍＡｂは結合しない。黒いバーはＣＨＯ、ハッチングされたバーはＣＨＯ−ＣＤ１６０−ＧＰＩ（グリコシルホスファチジルイノシトール）、チェッカーボードバーはＣＨＯ−ＣＤ１６０ＴＭ（膜貫通）の結果を示す。
【０１４１】
図１５は、ＩｇＧ１フォーマット（ＥＬＢ０２１０４）におけるＨ７  Ａ０９バリアントによるＨＶＥＭ−ＣＤ１６０相互作用の遮断によるＴ  ＣＤ４の再活性化を示す。
【０１４２】
健康なドナーの血液から精製したＴ  ＣＤ４リンパ球細胞を、抗ＣＤ１６０  ｍＡｂ（ＥＬＢ０２１０４又は適切な対照アイソタイプ１０μｇ／ｍｌ及びプレートにコーティングした抗ＣＤ３（クローンＵＴＣＨ１）、ｍＡｂ＋／−抗ＣＤ２８（クローンＣＤ２８．２）ｍＡｂ＋／−ＨＶＥＭタンパク質（１０３３４−Ｈ０８Ｈ、Ｓｉｎｏ  ｂｉｏ））の存在下、９６ウェルプレート（１ウェルあたり１×１０６細胞）で１６時間培養した。Ｔ  ＣＤ４リンパ球を収集し、生存マーカー（ゾンビＮＩＲ、ナイーブ／メモリー細胞を標的とする蛍光色素ＢＢ５１５に結合した抗ＣＤ４５ＲＡ抗体、ＣＤ１６０発現細胞を標的とする蛍光色素Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ６４７に結合した抗ＣＤ１６０（クローンＢＹ５５）抗体細胞、活性化細胞を標的とする蛍光色素ＰＥに結合した抗ＣＤ６９抗体）で標識する。ゾンビＮＩＲ−／ＣＤ４５ＲＡｈｉｇｈ＋／ＣＤ１６０＋／ＣＤ６９＋陽性細胞の割合をフローサイトメトリーで分析した。平均値（＋／−標準誤差）は２つの値から計算した。ＥＬＢ０２１０４は、ＨＶＥＭ−ＣＤ１６０相互作用を遮断し、Ｔ  ＣＤ４  ＣＤ４５ＲＡＨｉｇｈ  ＣＤ１６０＋細胞によって発現される活性化マーカーであるＣＤ６９のアップレギュレーションによって示されるように、ＨＶＥＭタンパク質によって誘導されるＴＣＤ４細胞の阻害を取り除く。図１５では、白いバーはヒトＩｇＧ１対照アイソタイプ、黒いバーはＥＬＢ０２１０４の結果を示す。
【実施例】
【０１４３】
［実施例１：本発明に係る抗体の結合の研究］
実験に応じて様々なタイプの光ファイバーバイオセンサーを実装したＯｃｔｅｔ  Ｋ２機器（Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用し、バイオレイヤー干渉法の原理を利用して、マウス抗ｈＣＤ１６０  ＣＬ１−Ｒ２若しくはその誘導体（キメラＩｇＧ１及びキメラＩｇＧ４）又は本発明に係る結合物（Ｈ７  ＩｇＧ１、Ｈ７  ＩｇＧ４）の、表１に記載の親和性の決定及び比較を実施した。本発明に係る抗体がそれらの標的に結合する能力は、ヒトＣＤ１６０タンパク質／抗体相互作用を測定することにより研究された。
【０１４４】
このために、高純度の単量体抗ヒトＣＤ１６０抗体（プロテインＡで精製し、その後ゲルろ過により精製した）を当業者に周知の技術により調製した。６つのヒスチジン残基のＣ末端タグを有する組換えヒトＣＤ１６０タンパク質の可溶型に対応するタンパク質領域（Ｒ＆Ｄ  ＳＹＳＴＥＭＳから）は、その市販の製剤に使用されている。
【０１４５】
試験する様々な抗ＣＤ１６０候補、すなわち本発明に係る結合物の親和性を、キメラ抗体及びＣＬ１−Ｒ２の親和性と比較した。
【０１４６】
すべての実験は、Ｆｏｒｔｅｂｉｏが推奨するランニングバッファー（０．１％（ｐ／ｖ）のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び０．０２％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）で３０°Ｃで行った。このバッファーは、様々なリガンドや検体の希釈にも使用した。９６ウェルマイクロプレート（ｃａｔ＃７３８  ００２６、Ｄｕｔｓｃｈｅｒ）に入れたサンプルを、毎分１０００回転で揺り動かした。
【０１４７】
ビオチン化された６つのヒスチジン残基タグを含むＣＤ１６０タンパク質は、ストレプトアビジンバイオセンサーのリガンドとして使用され、本発明に係る結合物、抗ｈＣＤ１６０（ＩｇＧ１及びＩｇＧ４フォーマット）及び抗ＣＤ１６０及びキメラ結合物は分析物として使用される。
【０１４８】
このｈＣＤ１６０−ｈｉｓタンパク質は、サプライヤーの推奨に従ってＥＺ−ＬｉｎｋスルホＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン法（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してビオチン化され、その均一性、凝集体の不在、及び抗ＣＤ１６０ｓ及び非ビオチン化タンパク質によって認識される能力について検証された。様々なタンパク質濃度での固定化試験により、１０ｎＭの濃度が最適であることが示された。したがって、ビオチン化ＣＤ１６０タンパク質は、ストレプトアビジンバイオセンサー上で１０分間０．３μｇ／ｍｌ（すなわち１０ｎＭ）の濃度で固定化された。典型的な固定化では、２＋／−０．３ｎｍのシグナルという結果となる。
【０１４９】
６種の濃度の抗体（３．１２５、６．２５、１２．５、２５、５０及び１００ｎＭ）を添加することにより、各精製抗体（分子量１５０ｋＤａ）の動力学定数（ＫＤ、ｋｏｎ、ｋｏｆｆ、またＫｄｉｓともいう）を決定した。測定の間に、バイオセンサーの表面を、１０ｍＭグリシンにｐＨ２で５秒間、続いてランニングバッファーに５秒間、３サイクルでさらすことにより再生した。結合及び解離フェーズは３００秒間測定された。すべての測定値は、ランニングバッファーのみに曝したリガンドにより参照ウェルを差し引くことにより、基本的なずれを補正された。
【０１５０】
各抗体の解離定数と結合（ｋｏｎ）及び解離（ｋｄｉｓ）速度定数を、１：１相互作用モデルを適用し、ＦｏｒｔｅＢｉｏ  ９．０のデータ解析ソフトウェアでの曲線（フィット）（Ｒｍａｘがセンサーに束縛されている）の数学的モデルを全体的に使用して計算した。ソフトウェアを使用して確実にモデル化できなかった曲線（ほとんどの場合、全Ｒ２＜０．９２５）（一般に異種モード（ａ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｍｏｄｅ）による結合によって引き起こされる）は、解析から除外した。
【０１５１】
各抗ＣＤ１６０について、濃度５０ｎＭにおける抗ＣＤ１６０抗体について、解離定数（ＫＤ）、結合（ｋｏｎ）及び解離（ｋｄｉｓ）速度定数、及び結合応答を比較し、表１に示す。
【０１５２】
表１は、マウスＣＬ１−Ｒ２抗体、ＣＬ１−Ｒ２から発生したキメラ抗体（ヒトＩｇＧ１（ｃｈＩｇＧ１）又はＩｇＧ４（ｃｈＩｇＧ４）フォーマット）、及び本発明に係るＨ７抗体（ヒトＩｇＧ１（Ｈ７  ＩｇＧ１）又はＩｇＧ４（Ｈ７  ＩｇＧ４）フォーマット）に対する組換えヒトＣＤ１６０／抗ｈＣＤ１６０相互作用の親和性についてのバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）による測定結果を示す。
【０１５３】
【表１】
2020505013.tif 000002
【０１５４】
この親和性測定によれば、予想に反して、ＩｇＧ１及びＩｇＧ４フォーマットのＨ７が、マウスＣＬ１−Ｒ２及びそのそれぞれのキメラヒトＩｇＧ１及びＩｇＧ４フォーマットよりも、ヒトＣＤ１６０に対してはるかに大きな親和性を有することを明確に示している。親ＣＬ１−Ｒ２からの抗ＣＤ１６０  ＫＤの増加（ＫＤ増加、表１、８列目を参照）は、ヒトＩｇＧ１及びＩｇＧ４フォーマットのＨ７でそれぞれ約３．７５及び３．３４である。同一濃度５０ｎＭの抗体について、Ｈ７  ＩｇＧ４及びＣＬ１−Ｒ２と比較して、Ｈ７  ＩｇＧ１の応答がよりよく、キメラフォーマットの２つの抗ＣＤ１６０の応答がより悪かった（表１、９列目）。
【０１５５】
また、ヒトＣＤ１６０を過剰発現している組換えＥ３００−ｈＣＤ１６０細胞のフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）法と、ヒトＣＤ１６０配列のペプチドスキャンにより同定されたＣＤ１６０タンパク質及び抗ｈＣＤ１６０抗体の結合に必要十分なタンパク質配列のペプチドにおけるＥＬＩＳＡ法とによって、Ｈ７が標的によく結合することも確認された。
【０１５６】
Ｈ７候補は、残りの実験、特に親和性成熟され、標的とされる様々な臨床的適応に適した様々なフォーマットのＩｇＧ又はＩｇＧフラグメントに誘導されるために選択された候補である。
【０１５７】
［実施例２：Ｈ７抗体のバリアント（細菌のペリプラズム抽出物で生成されたファージ及び可溶性Ｆａｂの形態のＨ７バリアントのパネルのＥＬＩＳＡ法、ＦＡＣＳ法及びＳＰＲ法による結合プロファイル）］
ヒト化抗ＣＤ１６０候補Ｈ７に由来するバリアントを得るために、Ｈ７抗体の重鎖及び軽鎖可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）の特定の相補性決定領域（ＣＤＲ）における残基の部位特異的変異導入を、Ｆａｂフォーマットのバリアントのファージディスプレイにより、タンパク質及びｈＣＤ１６０を過剰発現するＣＨＯ細胞での選択と組み合わせた。
【０１５８】
このようにして、ファージクローンが生成され、未精製の可溶性Ｆａｂを含む細菌のペリプラズム抽出物を生成することも可能となる。個々のクローンは、ＥＬＩＳＡ法によるヒトＣＤ１６０タンパク質及びＦＡＣＳ法によるヒトＣＤ１６０発現細胞への結合する能力で選択された。これは、ｉ）繊維状ファージの表面で発現される遺伝子ＩＩＩ−Ｆａｂ融合タンパク質の形態で又はｉｉ）未精製の可溶性Ｆａｂのフラグメントを含むペリプラズム抽出物の形態であった。ファージＥＬＩＳＡ及びファージＦＡＣＳと呼ばれる実験の結果を表２に示す。個々のクローン（可溶性Ｆａｂのフラグメントを含むペリプラズム抽出物の形で）も、その解離速度定数（ｋｄｉｓ）に従って分類した。
【０１５９】
６種のＨ７バリアントについて得られたデータの要約を、未精製の可溶性Ｆａｂのフラグメントを含むペリプラズム抽出物の形（ＰＥ  ＥＬＩＳＡ及びＰＥ  ＦＡＣＳ）で、表２に示す。
【０１６０】
実用的な観点から、抗Ｍ１３  ＨＲＰコンジュゲート抗体を使用して、ファージのヒトＣＤ１６０への結合が検出された。ＣＤ１６０を発現している細胞へのファージの結合は、ストレプトアビジン−ＰＥに結合されたマウス抗Ｍ１３ビオチン抗体を使用して検出された。
【０１６１】
ファージＥＬＩＳＡで、ほとんどのファージは、４５０  ｎｍにおける高い光学密度（ＯＤ）値（ＯＤ  ４５０：１．０−６．０）で、且つ、８３％の結合成功度（４５０ｎｍでのＯＤ≧１０のバックグラウンドノイズの平均）でヒトＣＤ１６０タンパク質に結合することができた。Ｈ７  ＷＴ  Ｆａｂファージの場合、得られたＯＤ  ４５０値が０．０６−０．０７と低いことに注意することが重要である。
【０１６２】
ファージＦＡＣＳの評価より、成功率９１％の同様の結果が得られた（ＣＤ１６０を発現する細胞への結合が５％を超え、バージンＭＦＩ値の３倍、及び、ＣＨＯ−Ｓ  ＷＴ細胞へ結合しなかったクローンはポジティブとはみなされなかった）。ファージＥＬＩＳＡの場合と同様に、Ｆａｂ  Ｈ７  ＷＴファージＦＡＣＳで得られた結合値は、他のクローンと比較してはるかに低かった。
【０１６３】
可溶性Ｆａｂとして選択されたクローンの結合（ＣＤ１６０タンパク質及びＣＨＯ−ＣＤ１６０細胞での選択のラウンドから）も、ペリプラズム抽出物（Ｐ．Ｅ）を使用したＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳによって調べられた。ＥＬＩＳＡを用いたヒトＣＤ１６０タンパク質への可溶性Ｆａｂの結合は、抗マウスＨＲＰコンジュゲート抗体に結合された抗ｃ−ｍｙｃ抗体を使用して検出された。ヒトＣＤ１６０を過剰発現しているＣＨＯ細胞への可溶性Ｆａｂの結合は、ヤギ抗マウスＡＰＣコンジュゲート抗体に結合された抗ｃ−ｍｙｃ抗体を使用して検出された。ファージの表面において又はペリプラズム抽出物において発現したＦａｂを使用したＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳ実験の結果によって、親和性成熟Ｈ７クローンのそれぞれのヒトＣＤ１６０への結合能力が確認された。
【０１６４】
表２は、細菌のペリプラズム抽出物で産生されるファージ及び可溶性Ｆａｂの形態の親和性成熟重鎖Ｈ７バリアントの分類、クローン同定、並びに、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ及びＳＰＲによる結合プロファイルを示す。
【０１６５】
【表２】
2020505013.tif 000003
【０１６６】
ＣＬＣ  Ｍａｉｎ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈソフトウェアを使用して、異なるラウンドの選択（ＦＪ１５１６ＭＰ０２及びＦＪ１５１６ＭＰ０３）に由来する様々なクローンのアミノ酸配列を抽出した。変異体ＶＫ及びＶＨ配列は、参照Ｈ７  ＶＨ及びＶＫ配列の観点から別々に整列された。選択されたすべてのクローンには、Ｈ７  ＷＴのＶＫ配列に対応するＶＫ配列が含まれている。１５６の有効な配列から始まる重鎖の場合、６つはＨ７  ＷＴのＶＨ配列にも対応していた。他のすべてのＶＨ配列は、ＷＴと比較して（ライブラリーで設計された）２から６の変異を含み、６つの異なるクラス（ＶＨバリアントの配列１から６）にグループ化された（表２の第２列目、ＶＨファミリーを参照）。
【０１６７】
残りの特性評価実験では、ペリプラズム抽出物（Ｐ．Ｅ）におけるファージ及び可溶性Ｆａｂの産生のために、それぞれ異なるＶＨバリアントを代表するクローンを含むパネルを選択した。選択された代表のリストは表２の１列目に示し、対応するＶＨファミリーは２列目に示す。クラス５のクローン代表はＤ１２、クラス１のクローン代表はＦ０４、クラス６のクローン代表はＡ０９である。抗ＣＤ１６０  Ｈ７のバリアントの様々なクラス１〜６を表すクローンのＶＨアミノ酸配列を表２に示す。
【０１６８】
これらの６つのクラスのＨ７バリアントのＶＨ領域のタンパク質配列のアラインメントは、バリアント残基の位置及び導入されたバリアントの性質に関して、様々なクラスのバリアント間で共通の定数を示した。
【０１６９】
＜細菌のペリプラズム抽出物で産生された可溶性Ｆａｂを用いたＨ７の６つのバリアントＦａｂのヒトＣＤ１６０との相互作用のＳＰＲ測定＞
Ｈ７バリアントの結合能力を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって試験した。このために、Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した。ｐＨ  ４．５の酢酸緩衝液中のヒトＣＤ１６０（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）５０μｇ／ｍｌを、ＣＭ５チップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に１２５０−２０００レゾナンスユニット（ＲＵ）で固定した。固定したヒトＣＤ１６０の完全性は、抗ｈｕＣＤ１６０  Ｈ７  ＩｇＧ１抗体を使用して確認した。動態測定のために、２倍ずつ希釈（０．１５μＭ−１０μＭ）して得られた段階的濃度のヒトＥＣＤ１６０を、２５℃、流速３０μｌ／ｍｉｎのＢｉａｃｏｒｅＰ２０緩衝液でもって、ＰＢＳに２回注入した。
【０１７０】
再生条件を試験し、１０ｍＭ  ＮａＯＨ／１Ｍ  ＮａＣｌをサンプル注入間の再生のために注入した。クローンのヒトＣＤ１６０への結合を分析するために、可溶性Ｆａｂを含むペリプラズム抽出物をＢＩＡＣＯＲＥ  Ｐ２０の緩衝液（１０  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０  ｍＭ  ＮａＣｌ、３  ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ−２０）中で、結合のために１２０秒間３０μｌ／ｍｉｎの速度で、１：５に希釈した。解離は３００秒間測定された。
【０１７１】
表３は、親和性成熟Ｈ７バリアントの様々なクラスを代表する可溶性Ｆａｂを含むペリプラズム抽出物の結合の絶対応答を示す。
【０１７２】
【表３】
2020505013.tif 000004
【０１７３】
これらの各バリアントの結合の最大絶対応答（抗体の注入後１２０秒での任意の応答単位の測定値として表される）は、ＣＤ１６０タンパク質でコーティングされた表面で評価した。これらのデータを表３に示す。
【０１７４】
次に、各バリアントの結合の、対照として産生されたＨ７  Ｆａｂ又はスクリーニング中にファージ上で単離されたＨ７  Ｆａｂの結合に対する比を計算することができた（表３、列４及び５を参照）。
【０１７５】
表３は、可溶性ＦａｂがＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳによって前に観察された結果と一致してヒトＣＤ１６０に結合できることを示している。
【０１７６】
クローンＦ０４、Ｄ１２及びＡ０９（それぞれクラス１、５、及び６のバリアントＶＨ）は、最大の結合値（ＲＵ）及び高いＲＵ比（列４、バリアントＲＵ／ＷＴ  ＲＵ表３を参照）、すなわち、それぞれ８．３、７．２倍及び２．７倍を示した。
【０１７７】
［実施例３：腫瘍学及び眼科学の適応症のためのバリアントについての様々な単一特異性抗体フォーマットの設計及び生成］
クローンＦＪ１５１６ＭＰ０２Ｆ０４又はＦ０４及びＦＪ１５１６ＭＰ０２Ｄ１２又はＤ１２は、存在するバリアントによりＨ７抗体よりも高い親和性でＣＤ１６０に結合できるかどうかを調べるために、ＩｇＧでフォーマットした。ＦＪ１５１６ＭＰ０２Ａ０９又はＡ０９バリアントは、他とは大きく異なる結合／解離プロファイルも持つ唯一の代表であり、この点で、ＩｇＧフォーマットでもさらに調べる。
【０１７８】
３．１）Ｈ７及びそのバリアントを使用した眼科学で試験される抗ＣＤ１６０コンストラクトのタンパク質配列
眼科学の場合、Ｆ０４及びＤ１２バリアントは、抗体の全身半減期を短縮するバリアントを産生することにより、又は、Ｆｃ領域のない抗体フラグメントのフォーマットを提案することにより、硝子体内半減期を減少させすぎることなく、治療用抗ＣＤ１６０抗体又はフラグメントの全身半減期を短縮するために、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）及び／若しくはその他のものと相互作用しないか又は最小限の相互作用を行うように選択されたフォーマット（たとえば、ＩｇＧ４又はＩｇＧ１  Ｎ２９７Ｑ）で生成された。
＜Ｈ７候補とそのバリアントをＩｇＧ４又はＩｇＧ１  Ｎ２９７Ｑ＋／−ＦｃＲｎヌル突然変異でフォーマットすることによる全身半減期並びにＦｃＲ及びＦｃＲｎの関与の低減＞
眼科学の場合、治療用抗ＣＤ１６０抗体の全身半減期を短縮する最初の可能性は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）と相互作用しないように又は最小限で相互作用するように選択されたＩｇＧ４  Ｓ２２８Ｐ−Ｒ４０９Ｋ又はＩｇＧ１  Ｎ２９７Ｑ構造上の可変領域をクローニングすることにより、Ｆ０４及びＤ１２バリアントをフォーマットすることである。このバックボーンでは、ＭａｂのＦｃ領域にＳ２２８Ｐ／Ｒ４０９Ｋ／Ｈ３１０Ａ／Ｈ４３５Ｑ又はＩ２５３Ａの変異体を挿入して、ヒト新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ及び「ＦｃＲｎヌル変異体」（Ｏｌａｆｓｅｎ、２０１２））との相互作用を減らすことも可能である。これは、表４で示すような、重鎖と軽鎖の様々な組み合わせによって実現できる。
【０１７９】
表４は、結合物の名前並びにＶＨ及びＶＬ配列を示す。
【０１８０】
【表４】
2020505013.tif 000005
【０１８１】
配列番号５７は、配列番号１４によって定義される可変領域と、配列番号２２によって定義される定常領域との融合によって生じる。
【０１８２】
＜Ｈ７候補とそのバリアントを抗体フラグメントでフォーマットすることによる全身半減期並びにＦｃＲ及びＦｃＲｎｓの関与の低減＞
全身半減期を低減し、硝子体（ＩＶＴ）に注射された治療用抗体のＦｃＲとＦｃＲｎｓの関与を減らす他の方法は、Ｈ７抗体とそのバリアントを抗体フラグメント（Ｆａｂ、Ｆａｂ’２など）でフォーマットすることである。したがって、Ｈ７とそのバリアントは、対応するフォーマット（表４を参照）を生成するために、Ｈ７の軽鎖（配列番号５７）を次の重鎖の１つと組み合わせることにより、Ｆａｂフォーマット（遺伝子操作によって合成され、細菌又はＣＨＯ細胞で産生される以下のＦａｂ定常鎖を含む）でフォーマットされる。
【０１８３】
−Ｆａｂ  ＣＨ１  ＩｇＧ１  ＥＬＢ０１１２１（配列番号３６）
−Ｆａｂ  ＣＨ１  ＩｇＧ１  Ｄ１２  ＥＬＢ０１１２２（配列番号３７）
Ｆａｂ’２フォーマットは、Ｄ１２バリアント（配列番号３８）（組換え又は酵素切断（ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｃｌｅａｖａｇｅ）（Ｉｄｅｓ  Ｆａｂｒｉｃａｔｏｒ、ＧｅＮｏｖｉｓ））に対して、１つではなく２つのジスルフィド架橋を使用して、又はロイシンジッパーを使用して若しくは使用せずに生成される。
【０１８４】
リンカータンパク質配列（配列番号３９）により、重鎖の２つの配列が第１のＦａｂのＣ末端と第２のＦａｂのＮ末端との間で結合する、ＦａｂリンカーＦａｂが生成された。これは、配列番号４０により定義されるＦａｂ−リンカー−Ｆａｂ分子ＥＬＢ０１１３１及び配列番号４１により定義されるＥＬＢ０１１３２の重鎖を与える。
【０１８５】
４価の重鎖としてＩｇＧ１  Ｎ２９７Ｑ  Ｈ３１０Ａ−Ｈ４３５Ｑ  Ｄ１２（配列番号４２；ＥＬＢ０１２００１）を使用して、４つの抗ＣＤ１６０  Ｄ１２  Ｆａｂを有する４価フォーマットを作成した。
【０１８６】
これらの重鎖の配列はすべて成熟重鎖の配列であり、配列番号１８又は１９などのシグナルペプチドの配列をＮ末端に追加する必要がある。
【０１８７】
３．２）Ｈ７及びそのバリアントを使用して腫瘍学で試験される抗ＣＤ１６０コンストラクトのタンパク質配列
腫瘍学で比較された様々なフォーマットは、Ｈ７及びＩｇＧ１フォーマットの３つのバリアントＤ１２、Ｆ０４、Ａ０９、そしてＧｅｎｍａｂのＨｅｘａｂｏｄｙフォーマット及びＤ１２についてのＢｉｔｅフォーマットである。
【０１８８】
ヘキサボディフォーマット（Ｄｉｅｂｏｌｄｅｒら、２０１４；  ｄｅ  Ｊｏｎｇら、２０１６）は、ＣＤ１６０陽性腫瘍細胞のＣＤＣ及びＡＤＣＣによって、補体を活性化し、抗体が溶解を誘導する能力を向上させるために、抗ＣＤ１６０の細胞毒性を最適化するために生成された。Ｗａｎｇら（Ｗａｎｇら、２０１６）は、エフェクター機能（ＣＤＣ及びＡＤＣＣ）を保持しながら同時に同等の薬物動態及び医薬品開発可能性を保持する単量体ヘキサボディの生産を可能にする変異Ｅ３４５Ｋ（配列番号４３）又はＥ４３０Ｇ（配列番号４４）を同定した。このように変異したＩｇＧ１は、標的細胞によって発現された抗原への抗体の結合後に六量体化し、この六量体化は抗体のエフェクター機能（ＣＤＣ及びＡＤＣＣ）を改善する。前臨床ツールとして、ＩｇＧ２ａ／マウスのκフォーマットのＤ１２及びＦ０４バリアントの分子構築も実施された。
【０１８９】
表５は、結合物及びＶＨ及びＶＬ配列の名前とＥｌｓａＬｙｓコード（ＥＬＢ）を示す。
【０１９０】
【表５】
2020505013.tif 000006
【０１９１】
さらに、ＢＩＴＥフォーマットのＤ１２バリアントのタンパク質配列ＥＬＢ０２１２２は、配列番号５２で規定される。
【０１９２】
［実施例４：ＩｇＧ４、ＩｇＧ１及びＩｇＧ１  Ｅ３４５ＫフォーマットのＨ７バリアントの生物物理学的特性評価］
４．１）抗ＣＤ１６０の熱安定性に対するＨ７バリアントの変異の影響の評価
タンパク質の安定性の研究では、熱安定性を評価する。熱安定性は、ｉ）その一次配列に由来する３次元構造にリンクしたタンパク質の固有の安定性（凝集体を形成する性質）、並びにｉｉ）サンプルの保存及び製剤条件（ｐＨ、塩、及びサンプルの成分）によるものである。Ｓｙｐｒｏ  Ｏｒａｎｇｅ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓ  ６６５０、バッチ１６０８４９５）のもとの形態又は変性形態のタンパク質の疎水性領域に結合する能力に基づく方法によって、様々なＩｇＧフォーマットにおける抗ｈＣＤ１６０  Ｈ７候補のバリアントの熱安定性が評価された。
【０１９３】
サンプルは、９６ウェルＰＣＲプレートにおいて４連で、１  ｘ  ＰＢＳ、５  ｘ  Ｓｙｐｒｏ  Ｏｒａｎｇｅの最終濃度０．１ｍｇ／ｍｌ、最終容量３０μｌで試験する。Ｓｙｐｒｏ  Ｏｒａｎｇｅのストック溶液（１００％ＤＭＳＯで５０００  ｘストック）は、１ｘ  ＰＢＳで１０ｘの最終濃度で調製する。次に、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）７５００  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲシステムデバイスで、プレートを２２〜９９℃の温度勾配（約１時間３０分）にかける。データ解析（生データと各抗体ドメインのＴｍを示す一次微分）は、ソフトウェアＴｈｅｒｍａｌ  Ｓｈｉｆｔ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して実行した。結果を表６に示す。
【０１９４】
表６は、Ｈ４及びＩｇＧ４、ＩｇＧ１、ＩｇＧ１  Ｅ３４５ＫフォーマットのＨ７バリアントのＴｍ結果を示す。
【０１９５】
【表６】
2020505013.tif 000007
【０１９６】
表６の結果の分析から、ＩｇＧ１フォーマット（Ｈ７  ＩｇＧ１  ＷＴ）のＨ７の平均Ｔｍは、ＩｇＧ４フォーマット（Ｈ７  ＩｇＧ４  ＷＴ）のＨ７と比較して３．５°Ｃ高いことがわかる。Ｈ７バリアントに関して、抗体のＴｍはＨ７に非常に近い。
【０１９７】
４．２）組換えヒトＣＤ１６０、Ｈ７、及びその異なるバリアントの異なるＩｇＧフォーマットにおける親和性を比較するためのＢＬＩ測定
親和性は、ビオチン化ＣＤ１６０タンパク質がストレプトアビジンバイオセンサー上で１０  ｎＭで捕捉され、分析物が抗ＣＤ１６０である設計で、実施例２に記載のように測定された。試験した抗ＣＤ１６０の濃度は３．１３、６．２５、１２．５、２５、５０及び１００ｎＭであり、グリシン濃度（ｐＨ２）は各再生について１０ｍＭであった。
【０１９８】
抗ＣＤ１６０  Ｈ７抗体及びそのバリアントについての、ＣＤ１６０タンパク質に対しての、測定されたセンサーグラムと親和性を表７に示す。
【０１９９】
表７は、ＩｇＧ４  Ｓ２２８Ｐ−Ｒ４０９Ｑフォーマットでの抗ＣＤ１６０  Ｈ７抗体及びそのＤ１２バリアントの、ＣＤ１６０タンパク質に対する親和性の測定結果を示す。
【０２００】
【表７】
2020505013.tif 000008
【０２０１】
表８は、ＩｇＧ４  Ｓ２２８Ｐ−Ｒ４０９Ｑ−Ｈ３１０Ａ−Ｈ４３５Ｑフォーマットの抗ＣＤ１６０  Ｈ７抗体及びそのバリアントの、ＣＤ１６０タンパク質に対する親和性の測定結果を示す。
【０２０２】
【表８】
2020505013.tif 000009
【０２０３】
表９は、ＩｇＧ１フォーマットでの抗ＣＤ１６０  Ｈ７抗体及びそのバリアントの、ＣＤ１６０タンパク質に対する親和性の測定結果を示す。
【０２０４】
【表９】
2020505013.tif 000010
【０２０５】
表１０は、ＩｇＧ１  Ｅ３４５Ｋフォーマットでの抗ＣＤ１６０  Ｈ７抗体及びそのバリアントの、ＣＤ１６０タンパク質に対する親和性の測定結果を示す。
【０２０６】
【表１０】
2020505013.tif 000011
【０２０７】
バリアントやアイソタイプの性質（ＩｇＧ４、ＩｇＧ４  Ｈ３１０Ａ−Ｈ４３５Ｑ、ＩｇＧ１及びＩｇＧ１  Ｅ３４５Ｋ）に関係なく、バリアントは常に、対応するＨ７と比較して、組換えＣＤ１６０に対する親和性が少なくとも２倍向上している。バイオレイヤーは、より大きなｋｏｎ及び親Ｈ７よりも２倍低い解離定数を反映して、２倍の厚さである。
【０２０８】
Ｈ７バリアントは、バリアントやアイソタイプの性質（ＩｇＧ４、ＩｇＧ４  Ｈ３１０Ａ−Ｈ４３５Ｑ、ＩｇＧ１及びＩｇＧ１  Ｅ３４５Ｋ）に関係なく、Ｈ７及びその異なるバリアントの組換えヒトＣＤ１６０に対する親和性の比較のための、Ｈ７．４．３−ビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）（ＳＰＲ）測定結果よりも速度特性が優れている。これは異なるＩｇＧフォーマットによる。
【０２０９】
Ｈ７及びその異なるバリアントの、組換えヒトＣＤ１６０に対する親和性を比較するために、実施例２に記載されているものに近い設計のビアコア（ＳＰＲ）測定も実施した。
【０２１０】
表１１は、ビアコア（ＳＰＲ）及びバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）によって測定された、Ｈ７抗体と異なるフォーマットにおけるそのバリアントの組換えヒトＣＤ１６０／抗ｈＣＤ１６０相互作用の親和性を示す。
【０２１１】
【表１１】
2020505013.tif 000012
【０２１２】
表１１によれば、第２の方法（ＳＰＲ）による抗ＣＤ１６０／ＣＤ１６０相互作用の測定で得られた結果は、ＢＬＩによる同じ抗体についての親和性の測定結果と同様に、Ｈ７バリアントで得られた増加値が、アイソタイプの性質（ＩｇＧ４、ＩｇＧ４  Ｈ３１０Ａ−Ｈ４３５Ｑ、ＩｇＧ１及びＩｇＧ１  Ｅ３４５Ｋ）に拘わらず、対応するＨ７と比較して、組換えＣＤ１６０に対する親和性がいずれも少なくとも２倍向上していることを示している。そして、対応する親Ｈ７よりもと比較してＫｏｎの増大を反映してＲｍａｘが２倍高くなっており、解離定数が１／２に低くなっている。
【０２１３】
［実施例５：ＣＨＯ  ＣＤ１６０細胞及びトランスフェクションされていないＣＨＯ細胞及びＮＫ細胞株ＹＴ２Ｃ２  ＣＤ１６０細胞上のＩｇＧ４及びＩｇＧ１フォーマット及びＩｇＧ１  Ｅ３４５Ｋフォーマットにおける抗ｈＣＤ１６０  Ｈ７及びそのＨ７バリアントの結合］
抗ＣＤ１６０  Ｈ７抗体並びにＩｇＧ４及びＩｇＧ１フォーマット及びＩｇＧ１  Ｅ３４５Ｋフォーマットにおけるそのバリアント（Ｄ１２及びＡ０９）の結合能力は、蛍光強度中央値（ｔｈｅ  ｍｅｄｉａｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎｄｅｘ）（ＭＦＩ）を測定することにより、非トランスフェクト（トランスフェクションされていない）ＣＨＯ−Ｓ細胞と比較して、組換えＣＨＯ−Ｓ−ｈＣＤ１６０株（クローン２Ｇ１０）で発現される表面ＣＤ１６０の標識中に評価された（図１を参照）。このために、５×１０５  ２Ｇ１０（ＣＨＯ−Ｓ−ＣＤ１６０）及び非トランスフェクトＣＨＯ−Ｓ細胞を、これらの各抗体２μｇ及び適切な対照アイソタイプで標識した。図１によると、試験されたすべての抗ＣＤ１６０（アイソタイプ、ＩｇＧフォーマット、又はバリアントに関係なく）は、ＣＨＯ−Ｓ細胞によって組換え的に発現されたヒトＣＤ１６０を特異的に認識する。
【０２１４】
図１Ａによれば、ＩｇＧ１バリアントはＨ７  ＩｇＧ１よりもＣＨＯ−ｈＣＤ１６０トランスフェクタントに効率よく結合する（Ｈ７  ＩｇＧ１と比較して蛍光中央値が３倍増加する）。これは、ＩｇＧ１又はＩｇＧ  Ｅ３４５Ｋフォーマットの場合に当てはまる。バリアントのＦｃにＥ３４５Ｋバリアントが存在しても、これらの細胞への結合は改善されない。
【０２１５】
図１Ｂによれば、ＩｇＧ４バリアントはＨ７よりもＣＨＯ  ｈＣＤ１６０トランスフェクタントに効率よく結合し（Ｈ７  ＩｇＧ４  ＥＬＢ０１１０１又はＨ７  ＩｇＧ４  Ｈ３１０Ａ−Ｈ４３５Ｑ  ＥＬＢ０１１０２と比較して、蛍光中央値が２倍増加する）、これはＨ３１０Ａ−Ｈ４３５Ｑバリアントが存在していても当てはまる。実際、ＥＬＢ０１１０１とＥＬＢ０１１０２との間で結合を比較するとわかるように、抗ＣＤ１６０のＦｃｓにＨ３１０Ａ−Ｈ４３５Ｑバリアントが存在しても、標的への結合を妨げない。
【０２１６】
ＮＫ細胞株（ＹＴ２Ｃ２）のクローンに自然に発現するＣＤ１６０表面の標識中に、抗ＣＤ１６０  Ｈ７抗体とＩｇＧ４、Ｆａｂ、ＦａｂリンカーＦａｂフォーマットのＨ７  Ｄ１２バリアントの結合能力を、標識された細胞の割合（＝結合の割合）を測定することにより評価した（図１Ｃを参照）。このために、２×１０５のＹＴ２Ｃ２細胞を、抗体の濃度を増加させて（５０ｎＭから０．３９ｎＭまで）適切なコントロールアイソタイプで標識した。これらの結果は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して解析し、非線形回帰曲線（Ｌｏｇ（作動薬）に対する応答、３パラメータ方程式）を生成し、有効濃度の中央値（ＥＣ５０）を計算した。図１Ｃによれば、ＩｇＧ４バリアントＥＬＢ０１１０３及びＥＬＢ０１１０４は、Ｈ７  ＩｇＧ４  ＥＬＢ０１１０１よりも効率よくＹＴ２Ｃ２細胞に結合する（その結果、ＥＣ５０はＨ７  ＩｇＧ４と比較して１０倍増加する）。これは、Ｆａｂ−リンカー−ＦａｂフォーマットＥＬＢ０１１３２にも当てはまる。対照的に、ＦａｂフォーマットＥＬＢ０１１２２は、Ｈ７  ＩｇＧ４  ＥＬＢ０１１０１と比較して、ＹＴ２Ｃ２細胞と効率よく結合ない（その結果、ＥＣ５０は、Ｈ７  ＩｇＧ４と比較して２倍少ない）。これは、Ｆａｂフォーマットの一価性によるものである。
【０２１７】
［実施例６：ＨＵＶＥＣ血管形成の阻害に対する本発明に係る抗ＣＤ１６０抗体の効果及びＨＵＶＥＣ上のＣＤ１６０発現の誘導の特定］
Ｃｅｌｌ  Ｐｌａｙｅｒ  ＧＦＰ−ＡｎｇｉｏＫｉｔアッセイ（Ｅｓｓｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で、ＶＥＧＦ又はＦＧＦによって誘発される血管形成に対する効果について、１０個の抗体を評価した。このサンプルセットは、Ａｖａｓｔｉｎ抗ＶＥＧＦ抗体とＬｕｃｅｎｔｉｓ抗体フラグメントで構成されている。レンチウイルス発現システムを使用して蛍光タンパク質（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ又はＧＦＰ）で事前標識された凍結ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を解凍し、６枚の９６ウェルアッセイプレートで２日間、ヒト皮膚線維芽細胞と共培養した。抗体及び参照物質（ＶＥＧＦ、ＦＧＦ−２、対照培地）を、様々な濃度で様々なウェルに加え、そのアッセイプレートをＩｎｃｕＣｙｔｅ生細胞イメージングシステムに入れた。蛍光及び位相差（１０×）画像を１０日間１２時間ごとに撮影し、管の長さと分岐点の数を解析しました。培養培地（必要に応じて抗体とともに）及びアッセイの上澄みを２〜３日ごとに交換した。
【０２１８】
［実施例７：ラットの角膜血管新生モデルにおけるＡｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ（Ｅｙｌｅａ（登録商標））と比較したＩｇＧ４フォーマットにおける抗ＣＤ１６０  Ｈ７候補（ＥＬＢ０１１０１）の結膜下注射の有効性の評価］
角膜血管新生モデルをラットで開発した。このモデルは、特に、角膜内の新生血管の出現をモニターする容易な観察を可能にし、これにより、本発明に係る抗体を含む、抗血管新生特性を有する分子の評価が可能となる。
【０２１９】
抗体バッチは、硝子体内及び結膜下注射用のバッチを調製するプロセスに従って生成、製造、精製、及び特定した。
【０２２０】
６週齢のオスのルイスラット（Ｌｅｗｉｓ  ｒａｔｓ）のグループを使用した。
【０２２１】
＜ラットの角膜血管新生の誘導＞
Ｄ０：麻酔後、各ラットの片目に手術用顕微鏡下での外科的介入を行った。このため、７０°Ｃでエタノールを塗布して角膜を完全に上皮除去し、角膜輪部を切開すると、Ｄ４の角膜新血管が出現する。
【０２２２】
右目のみを使用する。この動物は、右大腿筋にケタミン（Ｉｍａｌｇｅｎｅ  ５００）をラットあたり１００μｌ、及びキシラジン（Ｒｏｍｐｕｎ  ２％）をラットあたり１００μｌ注射することにより麻酔される。一滴のテトラカインが右目に点滴される。操作は手術用顕微鏡下で行われる。血管新生は、７０％アルコールに浸した「マイクロスポンジ」を角膜の表面に作用させることにより、角膜の上皮を破壊することによって誘導する。並行して、マイクロハサミで角膜周囲の結膜の厚さ約１．５ｍｍを取り除く。抗生物質の軟膏（フシジン）を目に塗布する。縫合（５−０の絹糸）後５日間、瞳を閉じる。４日後、抜糸して瞳を開く。角膜の新血管の変化を、麻酔後のＤ４、Ｄ８、及びＤ１２の手術用顕微鏡下で調べる。
【０２２３】
＜処置＞
グループあたり１０匹のラット（ＩｇＧ４対照アイソタイプの３匹を除く）を次のように使用する。
【０２２４】
Ｄ０：上記のように、片目に手術を行う。
【０２２５】
Ｄ８：写真を撮り、これらの動物をそれぞれ１０匹のラットからなる８つのグループに分け、手術を行った目の治療を行う。
【０２２６】
Ｄ４及びＤ８に２９  １／２Ｇの針（Ｍｙｊｅｃｔｏｒ）を装着したシリンジを使用して、動物に結膜下注射を行う。
【０２２７】
−グループ１：ＰＢＳ５０μｌの結膜下注射（陰性対照）
−グループ２：５０μｌで、Ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ（登録商標）（Ｅｙｌｅａ）２５０μｇの結膜下注射
−グループ３：５０μｌで、ＩｇＧ４対照アイソタイプ５００μｌの結膜下注射
−グループ４：５０μｌで、本発明に係るＨ７  ＩｇＧ４抗体５００μｇの結膜下注射
Ｄ８及びＤ１２について：角膜の血管新生に対する治療の効果を評価するために、手術を行った目の写真を手術用顕微鏡で観察した後に撮影する。血清及び硝子体液のサンプルを、Ｄ＋１２の解剖時に採取する。
【０２２８】
ラットの目の写真（．ＪＰＥＧ）を、ソフトウェア（Ｃａｌｏｐｉｘ、ＴＲＩＢＶＮ）を使用して解析した。解析は、グループや写真撮影のタイミングについて知らない状態で、盲検（ブラインド）で行った。血管新生の評価は、定量化ソフトウェアを使用して決定する。血管新生は、解析された目の全表面積（すなわち、上皮除去された領域）に対する血管の表面積で評価した。図２に、全表面積に対する血管新生の割合（％）を示す。
【０２２９】
＜結果＞
手術が行われた目の写真は、Ｄ０と２つの異なる日：Ｄ７とＤ１２に撮影された。撮影された写真は、Ｄ１２までの、角膜血管新生の変化、特にアイソタイプ対照における血管密度と血管の長さの発達を示している。
【０２３０】
図２に示される結果は、陰生対照（この場合はＩｇＧ４対照アイソタイプ）を注射された動物と比較した、本発明に係るＨ７モノクローナル抗体で処置された動物の血管密度の減少を示す。
【０２３１】
Ｈ７  ＩｇＧ４（ＥＬＢ０１１０１）の投与は、ラットＣＤ１６０に対して交差反応性が弱いにも拘わらず（データは示さず）、ＶＥＧＦに対する高親和性可溶性受容体である融合タンパク質（Ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ（登録商標））（加齢黄斑変性（ＡＲＭＤ）の治療に使用される抗血管新生薬）２５０μｇの用量に匹敵して、このラットモデルの角膜血管新生を減少させることもわかる。これは、ＩｇＧ１  Ｎ２９７ＱフォーマットのＨ７抗体でも得られた。
【０２３２】
したがって、本発明に係るＩｇＧ４及びＩｇＧ１  Ｎ２９７ＱフォーマットのＨ７抗体は、抗血管新生活性を有する。
【０２３３】
［実施例８：硝子体内及び静脈内投与後のウサギにおける抗ｈＣＤ１６０  ＥＬＢ候補の様々なフォーマットの全身及び眼の薬物動態（ＰＫ）プロファイルの、親ＣＬ１−Ｒ２、ベバシズマブ及びラニビズマブとの比較］
本実施例の目的は、抗ｈＣＤ１６０  ＥＬＢ候補（ＥＬＢ０１１候補を含む）の様々なフォーマットの全身及び眼の薬物動態（ＰＫ）プロファイルを、マウスＩｇＧ１抗ＣＤ１６０  ＣＬ１−Ｒ２及びベバシズマブのプロファイルと比較することである。眼での滞在時間が長く、全身半減期が最も短い最適化された抗ＣＤ１６０候補をスクリーニングするために、５４匹の有色ウサギ（ＨＹ７９ｂ株）を使用したＰＫ実験を行った。ウサギに硝子体内（ＩＶＴ）又は静脈内（ＩＶ）注射で同量（０．５ｍｇ）の試験物質を投与し、ＥＬＢ０１１リード（並びにＥＬＢ０２１プログラムからのＥＬＢ０２１０４及びＥＬＢ０２１１４抗ＣＤ１６０  ｍＡｂｓ）に対するＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより、又はＣＬ１−Ｒ２及びＩｇＧ及びＦａｂコンパレーター用の市販のＥＬＩＳＡを使用して（ここではそれぞれ市販の製剤のベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ）及びラニビズマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ）を使用）、血清抗体濃度を決定した。これにより、各候補の静脈内ボーラス投与後の薬物動態パラメータをモデル化することができ、したがって各薬物の出力動態パラメータを計算することができた。
【０２３４】
＜硝子体内注射の方法（試験されたグループ及びＰＫ血液サンプル）＞
様々な抗ＣＤ１６０の薬物動態（ＰＫ）及び硝子体内（ＩＶＴ）注射による５００μｇの１回の投与後のそれらの対照の実験は、ニュージーランド白ウサギを用いて行う。
【０２３５】
健康なウサギ（動物における細菌及びウイルスの状態が既知、性別同じ）（ＫＢＬ  Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）（体重２７５０−３０００ｇ、治療開始時の年齢：１４−１８週間）で実験を行った。ウサギは、ランダム化の１週間前と実験中の４連続週間、コンベンショナルケアユニットのケージに入れられた（１つのケージに１〜２匹入れられて飼育された）。実験プロトコルは、開始前にプロバイダーの倫理委員会に従った。
【０２３６】
実験の設計を、表１２に示す。この実験には、エンドトキシンレベルが０．５ＥＵ／ｍｌであり、濃度５ｍｇ／ｍｌの６種類の抗ＣＤ１６０フォーマット（表１２を参照）並びに２つのコントロール（ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ）及びラニビズマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ））を有する８グループ（１グループあたり３匹のウサギ）が含まれる。
【０２３７】
薬物の投与（片方の目あたり５０μｌ）は、全身麻酔下で、各薬物２５０μｇを最終容量５０μｌで両側に注射して行った。
【０２３８】
ウサギは、臨床的兆候及び体重を週ごとにモニターし、眼刺激の巨視的兆候（最小限であっても）、並びに、視神経頭、（網膜及び脈絡膜の）血管網、及びＲＰＥとブルッフの色素沈着膜／着色の特徴の完全性について眼の後部を広範に調べる（スリットランプ及び間接検眼鏡を使用）ための眼の耐性についての検査を行った。
【０２３９】
動物の死後、両眼は摘出され、すぐに−８０℃で凍結した。分析の前に、凍結した眼は、硝子体、房水、網膜／脈絡膜の３つの部分に分けられた。房水サンプルと硝子体サンプル（均質化及び遠心分離後）の体積を測定する。凍結した網膜／脈絡膜の重量を測定した。
【０２４０】
ウサギの耳の中心動脈からの約０．５ｍｌの総血液サンプルを、投与前（投与前Ｔ０）、並びに、投与後２時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間（Ｄ２）、９６時間（Ｄ４）、１６８時間（Ｄ７）及び３３６時間（Ｄ１４）のものについて、抗凝固剤なしのチューブに採取した。分析するまで、血清を凍結保存した。血清サンプルを分析して、抗ＣＤ１６０濃度を決定した。
【０２４１】
＜静脈内注射の方法（試験されたグループ及びＰＫ血液サンプル）＞
実験の設計を表１２に示す。この実験には、エンドトキシンレベルが０．５ＥＵ／ｍｌであり、濃度５ｍｇ／ｍｌの８種類の抗ＣＤ１６０フォーマット（表１２を参照）並びに２つのコントロール、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ）及びラニビズマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ）を有する、１０グループ（１グループあたり３匹のウサギ）が含まれる。
【０２４２】
薬物の投与は、全身麻酔下で、最大５０〜２００μｌで５００μｇの単回ボーラス静脈注射によって行った（ＩｇＧ全体又はｍＡｂフラグメントのモル当量）。
【０２４３】
約０．５ｍｌの総血液サンプルを、投与前（投与前Ｔ０）、並びに、投与後５分、１５分、３０分、６０分、２時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間（Ｄ２）、９６時間（Ｄ４）、１６８時間（Ｄ７）及び３３６時間（Ｄ１４）のものについて、抗凝固剤なしのチューブに採取した。分析するまで、血清を凍結保存した。血清サンプルを分析して、抗ＣＤ１６０濃度を決定した。
【０２４４】
表１２は、０．５ｍｇ（０．１９ｍｇ／Ｋｇ）の静脈内及び硝子体内投与後のウサギにおける薬物動態実験のグループを示す。
【０２４５】
【表１２】
2020505013.tif 000013
【０２４６】
＜ウサギ血清サンプルにおける経時的なＥＬＢ０１１及びＥＬＢ０２１  Ｈ７由来の抗ＣＤ１６０  ｍＡｂｓ及びフラグメントの所定濃度での生物分析＞
２つの注射ルート（静脈内（ＩＶ）対硝子体内（ＩＶＴ））でのウサギ血清サンプルにおける異なるＥＬＢ０１１抗ヒトＣＤ１６０候補（インタクト（ｉｎｔａｃｔ）ＩｇＧ及びＩｇＧフラグメントとして）の定量化は、高速液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）法により行った。方法開発の戦略は、ウサギ血清中のすべてのＥＬＢ０１１（及びＥＬＢ０２１）薬物の濃度の測定に適した１つの汎用ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法を得ることを目的とした。サンプルは、磁気ビーズでのプロテインＬアフィニティー精製による対象薬物の濃縮、その後のＤＴＴ及びヨードアセトアミドを使用した還元及びアルキル化、先のトリプシン消化によって調製した。最終抽出物は、陽イオンエレクトロスプレーを使用したＭＳ／ＭＳ検出を備えたＨＰＬＣで分析した。Ｈ７ヒト化候補に基づくすべての抗ＣＤ１６０（ＥＬＢ０１１及びＥＬＢ０２１プログラムから）に共通する１つのトリプシンペプチド（ＶＬ軽鎖の１つのＣＤＲを含むＡＳＱＳＩＳＮＨＬＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲ）を、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）法によりモニターした。選択されたペプチドは軽鎖のＣＤＲ領域にマップされ、他の前臨床マトリックスへのアッセイの直接転送が可能になり、ヒトマトリックスでの分析が可能になる。この方法は、最初に適格性が確認され、次にウサギ血清中の各結合物の定量に適用された。
【０２４７】
注射時の静脈内のルートのみが試験された
２つの他の抗ＣＤ１６０  ｍＡｂ（それぞれＩｇＧ１及び六量体ＩｇＧ１Ｅ３４５ＫフォーマットとしてのＥＬＢ０２１０４及びＥＬＢ０２１１４、Ｈ７−Ａ０９抗ＣＤ１６０）も同じ方法に従って定量化した。
【０２４８】
＜ウサギ血清サンプルにおける経時的なＣＬ１−Ｒ２、ベバシズマブ及びラニビズマブの濃度の生物分析＞
Ｈ７及びＨ７バリアントの薬物動態パラメータを、親のマウス抗ヒトＣＤ１６０  ＣＬ１−Ｒ２の薬物動態パラメータと比較するために、ウサギ血清中のマウスＩｇＧ１濃度を、市販のマウスＩｇＧ１  ＥＬＩＳＡ定量セットを使用し、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）を利用して、製造元の推奨に従って測定した（Ｃａｔ．Ｎｏ．  Ｅ９０−１０５、Ｌｏｔ  Ｎｏ．  Ｅ９０−１０５−３９、Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから）。
【０２４９】
ラニビズマブとベバシズマブは、それらの分子フォーマット（ＩｇＧ１及びＦａｂそれぞれ）から、比較用に選択した。これらの結合物について、ラニビズマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ）の投与にはＢｉｏｖｉｓｉｏｎのＥ４３１２−１００を、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ）の投与にはＢｉｏｖｉｓｉｏｎのＫ４２５４−１００をそれぞれ、ウサギ血清に投与した。
【０２５０】
＜薬物動態パラメータ解析の方法＞
両方の注射ルートについて、ノンコンパートメント解析を使用し、測定された血清濃度より、すべての血清濃度時間曲線について次の薬物動態パラメータを観察し及び計算した。
【０２５１】
−  Ｃ  Ｍａｘ（μｇ  ／  ｍｌ）（プロファイルで発生する血清ピーク濃度）、
−  ＴＭａｘ（Ｈ）（血清ピーク濃度の時間）、
−  ＴＬａｇ（Ｈ）（薬物投与と最初に観察された血清濃度と間の遅延（十分なデータがある場合））、
−  ＡＵＣ０−ｔ  ｏｂｓ（Ｈ  μｇ／ｍｌ）（対数台形規則を使用した、０からＣラストまでの血清濃度時間曲線下の面積）、
−  ＡＵＣ０−ｉｎｆ  ｏｂｓ（Ｈ  μｇ／ｍｌ）（０から無限大まで推定された血清濃度時間曲線下の面積（ＡＵＣ０−ｔ  ＋  Ｃラスト／Ｋｅ））、
−  Ｃラスト（最後に観察された濃度）、
−  除去Ｋｅ（Ｈ−１）（対数線形回帰で得られた血清濃度の時間曲線の末端部分の勾配（十分なデータがある場合））、
−  末端Ｔ１／２（Ｈ）（観察された半減期又は末端半減期、Ｔ１／２＝−ｌｎ２／Ｋｅによって計算）、
−  Ｖｄ（静脈内ボーラス投与後の分布量（Ｌ）、Ｖｄ＝投与量／（Ｋｅ×ＡＵＣ０−ｉｎｆ）（静脈内ボーラス投与のみ））
−ＣＬ（クリアランス（Ｌ／Ｈ）ＣＬ＝Ｋｅ×Ｖｄ（静脈内ボーラスのみ））。
【０２５２】
硝子体内より注射されたのみの場合、追加のパラメータを次のように評価した。
【０２５３】
Ｆ％（ＡＵＣ０−ｔ）（参照の静脈ボーラスへの絶対生物利用能（Ａｂｓｏｌｕｔｅ  ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ）＝ＡＵＣ０−ｔ試験×参照用量／ＡＵＣ０−ｔ参照×試験用量）及び
Ｆ％（ＡＵＣ０−ｉｎｆ）（参照フォームへの絶対生物利用能＝ＡＵＣ０−ｉｎｆ試験×参照用量／ＡＵＣ０−ｉｎｆ参照×試験用量（ＡＵＣ０−ｉｎｆが測定可能な場合））。
【０２５４】
そして、静脈内ボーラス薬物動態２段階モデル化を行って、薬物動態学のパラメータと速度定数を計算し、コンパートメントモデルと薬物固有の動態（分布と消失）に関する情報を得た（Ｗａｇｎｅｒ、ＪＧ  １９７５）。各候補の動態モデルと静脈内ボーラス投与量のモデル依存薬物動態パラメータは、デコンボリューション法による硝子体内投与後の硝子体についての出力の計算に役立つ。このモデル化を実施して、各試験項目について、各ウサギの血清における薬物動態モデルを決定した。
【０２５５】
この段階で、血清中における目の薬物消失の速度定数と硝子体内投与後における血清中の薬物消失の割合を、その薬物について計算された静脈内ボーラス動態モデルを使用したコンパートメントデコンボリューション法によって計算する。２つ以上のコンパートメントが観察される場合、Ｌｏｏ−Ｒｉｅｇｅｌｍａｎの方法（Ｌｏｏ  ＪＣ、Ｒｉｅｇｅｌｍａｎ  Ｓ．、１９６８）が適用され、１つのコンパートメントが観察される場合、Ｗａｇｎｅｒ  Ｎｅｌｓｏｎの方法（Ｗａｇｎｅｒ  ＪＧ、Ｎｅｌｓｏｎ  Ｅ．１９６８）が適用される。その結果は、時間に対する、血清に入る薬物の累積量（薬物投与量）及びその速度（薬物投入速度）である。薬物の硝子体内投与後、累積血清投与量プロファイルは目の出力プロファイルであり、その速度は出力速度である。その間に、以下の他のパラメータも決定できる。
【０２５６】
−  Ｔｌａｇ（Ｈ）：ラグタイム（十分なデータがある場合）
−  目の出力（ｍｇ）：血清中に放出された薬物の総不変量
−  出力（％量）：血清中に放出された薬物の％量（これは硝子体投与後の目についての薬物量の絶対生物利用能である）
−  ５０％の出力時間（±）：血清に入った注入量の５０％を観察するまでの時間（グラフから推定）
−  最大時間％（Ｈ）：累積薬物出力動態が平坦になるまでの時間（＝薬物の眼内滞留時間）
−  出力速度（ｍｇ／Ｈ）：血清中の薬物投与速度
−  最大出力速度（ｍｇ／Ｈ）：出力速度曲線のピーク
−  最大出力速度の時間（Ｈ）：ピークの時間
表１３は、静脈内に０．５ｍｇ（０．１９ｍｇ／Ｋｇ）投与した後の、主に観察された薬物動態パラメータを示す。
【０２５７】
【表１３】
2020505013.tif 000014
【０２５８】
【表１４】
2020505013.tif 000015
【０２５９】
表１４は、硝子体内に０．５ｍｇ（０．１９ｍｇ／Ｋｇ）投与した後の、血清で主に観察された薬物動態パラメータを示す。
【０２６０】
表１３（ＩＶルート）及び表１４（ＩＶＴルート）に示すように、０．５ｍｇ（０．１９ｍｇ／Ｋｇ）の静脈内投与（ＩＶ）又は硝子体内投与（ＩＶＴ）後のＥＬＢ０１１及びＥＬＢ０２１候補についての予想される血清ＰＫプロファイル（すなわち、観察される主な血清薬物動態パラメータ）並びにそれらの血清中半減期（Ｔ１／２とも表記）の順位は、対応するフォーマットにより予想される差異に従っている（Ｇａｄｋａｒら、２０１５、によって説明されている）。
【０２６１】
＜静脈内ボーラスの観察とモデル化＞
図３Ａからわかるように、静脈内ボーラス後、ＥＬＢ０１１０１、ＥＬＢ０１１０３、ＥＬＢ０１１０４、ＥＬＢ０１１２２、ＥＬＢ０１１３２、ＥＬＢ０２１０４、及びＥＬＢ０２１１４の血清濃度は、注射後急速に減少し（分布期）、そして、ＥＬＢ０１１２２及びＥＬＢ０１１３２（１，９及び４，６Ｈ）を除いて古典的な緩やかな消失期である第２段階（Ｔ１／２の範囲：５２から１８８時間）が続く。表１３に示すように、ＣＭａｘ（３．３６０〜４．２９７μｇ／ｍｌ）は、ＥＬＢ０１１２２、ＥＬＢ０１１３２、ＥＬＢ０２１０４及びＥＬＢ０２１１４の最初のサンプリング時間である０．０８３時間（２分）で観察されるが、ＥＬＢ０１１０１、ＥＬＢ０１１０３及びＥＬＢ０１１０４については最長時間の後（０．１３９〜０．４４４時間）で観察される。平均分布容積とクリアランスは、それぞれ０．０５〜０．３５Ｌ及び０．００５〜０．１０５１Ｌ／Ｈである。
【０２６２】
予想通り、抗ＣＤ１６０フラグメントは、ＩｇＧ型フォーマットと比較してＩＶ注射後の血清ＰＫパラメータを低下させた。特に、ＥＬＢ０１１３２の血清半減期は、ＥＬＢ０１１２２の血清半減期よりわずかに長い。
【０２６３】
ベバシズマブのＩＶ投与後の薬物動態パラメータに関して、観察されたデータを文献データと比較すると、ウサギ血清中のベバシズマブの観察された血清Ｔ１／２は、文献と比較して低い（３日対５．３２日、ベバシズマブのＥＭＥＡファイル（ＡＶＡＳＴＩＮ））。
【０２６４】
ＩｇＧフォーマットのＥＬＢ０１１及びＥＬＢ０２１候補に関して、ＥＬＢ０１１０１の血清半減期は最も長く、ＣＬ１−Ｒ２又はベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ）の１つよりも長い。ＥＬＢ０１１０３及びＥＬＢ０２１０４は、血清半減期がベバシズマブとほぼ同じであり、ＥＬＢ０１１０４、ＥＬＢ０２１１４及びＣＬ１−Ｒ２は、ベバシズマブ、ＥＬＢ０１１０３及びＥＬＢ０２１０４よりも血清半減期が短い。しかし、ＡｕＣ、Ｃｍａｘ及びＴｍａｘパラメータをベバシズマブ及びＣＬ１−Ｒ２のパラメータと比較すると、これらはすべてのＥＬＢ０１１候補（及びＥＬＢ０２１候補）で大幅に減少している。実際、ＣＬ１−Ｒ２及びベバシズマブの血清濃度は、ＥＬＢ０１１及びＥＬＢ０２１候補とは異なり、ＣＭａｘは最も高い：ＣＬ１−Ｒ２については０．３８９時間で、ベバシズマブについては２４．７時間で、６．９８０μｇ／ｍｌ及び６．０９１μｇ／ｍｌ（ベバシズマブのゆっくりした注入との対応からは予想外のＴＭａｘ）。Ｔ１／２、Ｖｄ、及びＣＬは、ＣＬ１−Ｒ２及びベバシズマブについて、それぞれ５４．５時間及び７４時間、０．０５Ｌ及び０．０９Ｌ、０，００１０  Ｌ／Ｈ及び０，０００９Ｌ／Ｈである。これは、おそらくベバシズマブ及びＣＬ１−Ｒ２の異化が最も低いためと考えられる。
【０２６５】
ＥＬＢ０１１０１（非親和性成熟バリアント）の薬物動態パラメータと他の親和性成熟ＥＬＢ０１１及びＥＬＢ０２１候補のパラメータとを比較すると、抗ＣＤ１６０ｍＡｂの親和性成熟によってウサギのこれらの抗体の血清半減期が短くなっている。実際、すべての親和性成熟候補の血清中のクリアランスは増加している。これは、特に、ＥＬＢ０１１０１及びベバシズマブの半減期に比べて、血清中の半減期が著しく減少しているＥＬＢ０１１０３、ＥＬＢ０１１０４、ＥＬＢ０２１０４及びＥＬＢ０２１１４で示されている。このより速いクリアランスは、例えば血液中のＣＤ１６０陽性細胞での抗ＣＤ１６０ｍＡｂのインターナリゼーション増加のような、ＣＤ１６０駆動の特定の生物学的プロセスによる可能性がある。これは、ＣＤ１６０についての高い親和性のため、抗ＣＤ１６０のクリアランスに対する影響を明確にするために、他の種で確認する必要がある。
【０２６６】
ＥＬＢ０１１０３及びＥＬＢ０２１０４の血清半減期Ｔ１／２は、非親和性成熟ネイティブＥＬＢ０１１０１の１つとは異なり、ＥＬＢ０１１０４（新生児ＦｃＲｎ受容体を介したＩｇＧリサイクルを防ぐための追加のＦｃＲｎヌル変異を有する親和性成熟バリアント）の１つと同等である。ＥＬＢ０１１０４については、（予想されるように、そして（Ｏｌａｆｓｅｎ、２０１２）で説明されたように）ＦｃＲｎ変異はＥＬＢ０１１０３の血清半減期と比較してＥＬＢ０１１０４の血清半減期をわずかに短くしている。しかし、同じＦｃＲｎヌル変異を有するＥＬＢ０１１０１の薬物動態パラメータがわからないため、ＦｃＲｎ変異単独の影響を評価することは困難である。しかし、ＥＬＢ０１１０３及びＥＬＢ０１１０４対ＥＬＢ０１１０１のＰＫプロファイルの違いは、ＥＬＢ０１１０３及びＥＬＢ０１１０４の違いよりも重要である。ＥＬＢ０１１０３のＰＫパラメータにおける親和性成熟の結果は、低減されたＩｇＧリサイクルの結果よりも影響が大きい。
【０２６７】
＜硝子体内注射についての観察＞
図３Ｂからわかるように、血清濃度は注射後の眼からの薬物のゆっくりとした放出に従ってゆっくりと増加し、最高プロファイルレベルはベバシズマブの硝子体内投与後に観察され、最低プロファイルレベルはＥＬＢ０１１２２及びＥＬＢ０１１３２の硝子体内投与後に観察される。
【０２６８】
表１４に示すように、平均ＣＭａｘはＣＬ１−Ｒ２、ＥＬＢ０１１０３、ＥＬＢ０１１０４、及びＥＬＢ０１１０１について０．５６７〜０．７８７μｇ／ｍｌの範囲にあるが、ＥＬＢ０１１２２及びＥＬＢ０１１３２については最低（０．０４１μｇ／ｍｌ及び０．１１４μｇ／ｍｌ）、ベバシズマブでは最高（１．７３６μｇ／ｍｌ）である。ＴＭａｘは４８〜１６８時間の間に観察され、Ｔ１／２はすべてのウサギで決定できない（目の出力の終了後について、血清消失勾配を観察するためのデータは、全く無いか又は不十分である）。
【０２６９】
硝子体内投与した場合、すべてのＥＬＢ０１１候補は、親ＣＬ１−Ｒ２と同様に、ベバシズマブと比較して全身Ｃｍａｘが低く、Ｔｍａｘが低く、平均ＡｕＣが低い。予想されるように、ＥＬＢ０１１抗ＣＤ１６０フラグメント（ＥＬＢ０１１３２及びＥＬＢ０１１２２）は、硝子体内に注射されたすべてのＩｇＧフォーマットと比較して、観察された血清ＰＫパラメータを減少させた。これらのフラグメントは、すべてのＩｇＧベースの分子よりも迅速に血流から消失する（ＥＬＢ０１１０１と比較して血清Ｔ１／２が少なくとも３０倍小さい）。硝子体内注射後、ＥＬＢ０１１３２の血清半減期は、静脈内注射後の場合からわかるように、ＥＬＢ０１１２２の血清半減期よりもわずかに長い。
【０２７０】
硝子体内注射後、ＥＬＢ０１１  ＩｇＧ候補（ＥＬＢ０１１０１、ＥＬＢ０１１０３、ＥＬＢ０１１０４）については、ＣＬ１−Ｒ２に近い血清ＰＫパラメータが観察されており、それは硝子体内投与ＩｇＧフォーマットについて予想されていたものである（例えば、（Ｇａｄｋａｒら、２０１５）に記載されている）。Ｔｍａｘは、ＥＬＢ０１１０３を除き、各フォーマットで予想される値である。ＥＬＢ０１１０３は、ＩｇＧ４（ＥＬＢ０１１０１）とＦｃＲｎ（ＥＬＢ０１１０４）を介したリサイクルのないＩｇＧとの中間の挙動（ＰＫパラメーターで示される）を示す。文献と比較すると、静脈内注射後の場合においても観察されたように、Ｇａｄｋａｒら２０１５年のデータによれば、ＥＬＢ０１１０４のＣｍａｘ、Ｃｍａｘ比（ＥＬＢ０１１０１に対して）、血清のＡｕＣ  ｏ−ｔ及び血清のＡＵＣ比（ＥＬＢ０１１０１に対して）に対するＦｃＲｎ変異の影響はそれほど顕著ではない。
【０２７１】
＜硝子体出力速度の決定＞
表１５は、各項目の両投与ルートに従う平均血清濃度のデコンボリューション解析後のＥＬＢ０１１候補のウサギにおける薬物動態パラメータを示す。
【０２７２】
【表１５】
2020505013.tif 000016
【０２７３】
硝子体内注射後の血清中のＣｍａｘ及びウサギの平均血液量１２５ｍＬに基づいて、Ｔｍａｘでの物質の最大濃度を計算し、Ｃｍａｘ及びＴｍａｘにおける血清中の初期の硝子体内投与量の最大割合として表すこともできる（ＩＶＴ初期投与の最大％）。これは、両ルートで注入された抗ＣＤ１６０候補各々について、そして、ＣＬ１−Ｒ２及びベバシズマブについても計算した。
【０２７４】
表１５にまとめた計算された薬物動態パラメータに関して、０．５ｍｇのＩＶＴ注射後、ＥＬＢ０１１０１、ＥＬＢ０１１０３、ＥＬＢ０１１０４、ＣＬ１−Ｒ２及びベバシズマブの計算された血清入力に対応する目の出力は、それぞれ硝子体投与量の６８％、５５％、６９％、３５％及び８４％対応して、０．３４１ｍｇ、０．１８４ｍｇ、０．３４６ｍｇ、０．１７６ｍｇ及び０．４２０ｍｇであった。目の出力の平均持続時間（最大％の時間）は、それぞれ１６８、９６、８８、１０４、及び１６８時間である。
【０２７５】
第一に、ＥＬＢ０１１  ＩｇＧ（及びフラグメント）候補は、その全身暴露が、ベバシズマブと比較してすべてのＥＬＢ０１１候補（ＥＬＢ０１１０１で最大１９％、ＥＬＢ０１１０３で１６．７５％）でより低い（ベバシズマブ４３％）。これは、ＥＬＢ０１１候補では、全身に行き渡ったＩＶＴ注射物質の総量が、ベバシズマブよりも少ないことを意味する。実際、ベバシズマブは、目の出力、出力量及びＩＶＴ初期投与量の最大割合が、すべてのＥＬＢ０１１候補と比較して、非常に高くなっている。
【０２７６】
第二に、ＥＬＢ０１１のＩｇＧ候補をＣＬ１−Ｒ２と比較すると、ＥＬＢ０１１０１及びＥＬＢ０１１０４の目の総出力及び初期投与量の出力％は、ＥＬＢ０１１０３及びＣＬ１−Ｒ２と比較してわずかに高い。ＦｃＲｎヌル変異も親和性成熟も、目の出力と出力量に大きな影響を与えないことがわかる。ＥＬＢ０１１０３については、血清に入った製品の量が、ＥＬＢ０１１０１及びＥＬＢ０１１０４（６８％及び６９％）と比較してより少ない（初期ＩＶＴ総量の５０％未満）。ＥＬＢ０１１０３は、血清半減期がＥＬＢ０１１０１よりも短いＩｇＧ候補であるため、一部の製品が血清に入った場合でも、ＥＬＢ０１１０３の全身の製品はＥＬＢ０１１０１の全身の製品よりも２倍速く除去される。
【０２７７】
出力速度は、０．００４〜０．００９ｍｇ／ｈの範囲である。ＥＬＢ０１１０４の出力速度が最も大きく、そしてＥＬＢ０１１０３とＥＬＢ０１１３２の出力速度が同じで、ＥＬＢ０１１０１とＥＬＢ０１１２２の出力速度が最も小さい。
【０２７８】
ＥＬＢ０１１フラグメント候補を、他のＥＬＢ０１１  ＩｇＧ候補と比較すると、硝子体内投与後のＥＬＢ０１１３２及びＥＬＢ０１１２２の除去が、ＩｇＧフォーマットの抗ＣＤ１６０の除去とは明らかに異なる。両フラグメントは、目からの除去のＰＫプロファイルが似ている（目について総出力が同じで、出力量がほぼ同じ）。さらに、ＥＬＢ０１１３２及びＥＬＢ０１１２２はすべてのＩｇＧベース分子よりも、血流から迅速に除去されるため、これら２つの製品のいずれかの全身のコンパートメントにおける含有量は非常に低い（Ｔｍａｘにおいて初期ＩＶＴ投与量２．８５％の最大％未満）。これは、同じ条件で５００μｇのＩＶＴ注射を行った後、ウサギの血清のいずれにおいても製品が検出されなかったＬｕｃｅｎｔｉｓの場合と同じである。
【０２７９】
ＥＬＢ０１１３２とＥＬＢ０１１２２を比較すると、ＥＬＢ０１１３２の除去はＥＬＢ０１１２２とは異なる。ＩＶＴ後の除去に関しては、ＥＬＢ０１１２２は血流から除去されるのが最も速い。実際、血流に流入する初期ＩＶＴ量が最低％で、目における出力が最低である。目から除去されるＥＬＢ０１１３２製品が少し多い（目の出力はＥＬＢ０１１２２の出力の２倍である）。ＥＬＢ０１１３２は、ＥＬＢ０１１２２よりも少し速く血流に入る。ＥＬＢ０１１３２の除去のＴ１／２（血清半減期）はより長く、これは他のＰＫパラメータに影響する。ＥＬＢ０１１２２については、初期ＩＶＴ注射量の７５％が目に残留するようであるが、これに対してＥＬＢ０１１２２は６０％が目に残留する。しかし、ＥＬＢ０１１３２の平均残留時間は、ＥＬＢ０１１２２の平均残留時間よりもわずかに長いようである。したがって、両フラグメント候補は、ＩｇＧ候補の場合よりも、目のＴ１／２と全身のＴ１／２との比が非常に好ましいが、ＩｇＧフォーマットの候補よりも目における残留時間は短い。
【０２８０】
なお、ＥＬＢ０１１３２及びＥＬＢ０１１２２のデコンボリューションからの薬物血清入力は、血清濃度が検出可能な時点がより少ないこと、血清半減期が非常に短いこと、そして目からの製品流出の初期の遅延のせいで、他のＥＬＢ０１１  ＩｇＧ候補よりも精度が低いことに注意すべきである。
【０２８１】
＜まとめ  −  ＥＬＢ０１１及びＥＬＢ０２１候補のＩＶ及びＩＶＴ投与後のすべてのＰＫパラメータに関する結論＞
静脈内（ＩＶ）又は硝子体内（ＩＶＴ）に０．５ｍｇ（０．１９ｍｇ／Ｋｇ）を投与した後のＥＬＢ０１１及びＥＬＢ０２１の候補の予想される血清ＰＫプロファイル（すなわち、観察される主な血清薬物動態パラメータ）及び血清半減期の順位（Ｔ１／２とも表記）は、対応するフォーマットにより予想される差異に従っている（Ｇａｄｋａｒら、２０１５）によって説明されている。
【０２８２】
目のＰＫパラメータに対するＦｃＲｎヌル変異又は親和性成熟の影響はない。
【０２８３】
ＥＬＢ０１１及びＥＬＢ０２１候補は、ＣＬ１−Ｒ２及びベバシズマブよりも血清でのクリアランスが速く、ＣＬ１−Ｒ２及びベバシズマブとは異なる血清ＰＫパラメータを持っている。しかし、これは他の種（専用的な研究では、マウス及び非ヒト霊長類）で確認する必要がある。
【０２８４】
血清のＴ１／２の順位は、目の残留時間（Ｇａｄｋａｒら、２０１５に記載されている）の順位とよく似ている：ＥＬＢ０１１０１＞＞ＥＬＢ０１１０３〜ＥＬＢ０１１０４＞ＥＬＢ０１１３２〜ＥＬＢ０１１２２。驚くべきことは、ＥＬＢ０１１０３についてである。ＥＬＢ０１１０３は、ＩｇＧ４よりも、ＦｃＲｎ結合のないＩｇＧ４に近い挙動を示す。様々な抗ＣＤ１６０フォーマットにより、全身に到達する硝子体内注射抗体の割合及び血清Ｔ１／２が大幅に減少し、ＥＬＢ０１１候補のＩＶＴ後の全身暴露はＣＬ１−Ｒ２の１つと同等であり、ベバシズマブよりも低い。
【０２８５】
ＩｇＧ型の抗ＣＤ１６０  ＥＬＢ０１１０１及びＥＬＢ０１１０４の目における総出力及び初期量の出力％は、ＥＬＢ０１１０３よりも高い。
【０２８６】
目に残留した割合については、ＥＬＢ０１１２２がより優れており、ＥＬＢ０１１２２＞ＥＬＢ０１１３２＞ＥＬＢ０１１０３＞ＥＬＢ０１１０４＞ＥＬＢ０１１０１である。目における出力速度については、０．００４〜０．００９ｍｇ／ｈである。ＥＬＢ０１１０４の出力速度が最も大きく、次にＥＬＢ０１１０３とＥＬＢ０１１３２の出力速度が同じで、最後にＥＬＢ０１１０１とＥＬＢ０１１２２の出力速度が最も小さい。
【０２８７】
目における残留時間については（表１５において「最大％の時間」の列を参照）、ＥＬＢ０１１の候補間のランキングは、ＥＬＢ０１１０１＞＞ＥＬＢ０１１０３〜ＥＬＢ０１１０４＞＞ＥＬＢ０１１３２〜ＥＬＢ０１１２２である。
【０２８８】
＜インビボ（Ｉｎ  ｖｉｖｏ）前臨床モデルでさらに試験する候補の選択＞
可能性のあるＥＬＢ０１１候補の中から、適切なＮＨＰモデルにおける用量効果試験で比較する２つの候補、１つのＩｇＧフラグメントと１つの全ＩｇＧを最終的に選択した。
【０２８９】
良好な残留時間と最も低い全身半減期をもつ最適な抗ＣＤ１６０候補のスクリーニングに関しては、ＩｇＧ型ｍＡｂについての目における滞留時間とＴ１／２血清との比率は、ＥＬＢ０１１０４、ＥＬＢ０１１０３、ＥＬＢ０１１０１の順に大きい（ＥＬＢ０１１０４＞ＥＬＢ０１１０３＞＞ＥＬＢ０１１０１）。しかし、一方で、ＥＬＢ０１１０４については、初期の量の７０％が全身に行き渡る（ＥＬＢ０１１０３の場合は５０％のみ）。つまり、ＥＬＢ０１１０３よりもＥＬＢ０１１０４の方が、目に残る製品は少なくなる。したがって、ＩｇＧフォーマットとしてのＥＬＢ０１１候補間の最終的な順位は、ＥＬＢ０１１０３＞ＥＬＢ０１１０４＞ＥＬＢ０１１０１である。
【０２９０】
Ｍａｂフラグメントの選択では、両フラグメントの目からの除去についてのＰＫプロファイルは似ている（目における総出力は同じで、出力量はほぼ同じ）。両フラグメント候補は、ＩｇＧの候補よりも目のＴ１／２と全身のＴ１／２との比率が非常に好ましい。ＥＬＢ０１１３２の目における平均残留時間は、ＥＬＢ０１１２２の平均残留時間よりも少し長い。最後に、ＰＫパラメータ及び他の開発可能性パラメータ（理想的なＣＤ１６０結合、生産性及び生産されたフラグメントの品質の要件）を考慮して、さらなる効果試験のためにＥＬＢ０１１３２（ＦａｂリンカーＦａｂ）を選択することが推奨された。
【０２９１】
［実施例９：非ヒト霊長類（ＮＨＰ）（カニクイザル）におけるレーザー誘発性脈絡膜新生血管のモデルにおける抗ｈＣＤ１６０  Ｈ７（ＩｇＧ４（ＥＬＢ０１１０１））及びＨ７（ＩｇＧ１  Ｎ２９７Ｑ（ＥＬＢ０１１１１））の硝子体内注射の効果／耐性のパイロットスタディ］
この研究の目的は、（１）抗ｈＣＤ１６０の２つのフォーマット（Ｈ７  ＩｇＧ４（ＥＬＢ０１１０１）及び非グリコシル化Ｈ７  ＩｇＧ１（ＥＬＢ０１１１１））を単回硝子体内注射によりカニクイザルに投与した場合において、これらに関する目の耐性を決定すること、並びに、（２）カニクイザル（ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）モデルにおけるレーザー誘発性脈絡膜新生血管に対するこれらのアイソフォームの１つの可能性のある予防効果を評価することである。
【０２９２】
＜モデル選択、試験システムの暴露経路及び動物数の正当性＞
有効性（予防効果）の安全性及び用量の評価は、最も関連性の高いＮＨＰレーザー誘発性ｃｈＮＶモデルで開始した。実際、この動物モデルは、新生血管型（すなわちウェット型）の加齢性黄斑変性を有するヒトにおける抗血管新生薬の薬理学的効能の予測因子としての確立された実績がある。
【０２９３】
目への暴露経路は、ヒトの暴露経路を考慮して選択した。
【０２９４】
カニクイザルがこの研究の動物モデルとして選択されたのは、規制機関による目の前臨床毒性試験で認められている非げっ歯類であるためである。この研究で使用する動物の総数は、試験抗体の効果を正確に特定するために必要な最小数であると考えられる。この研究は、目的を達成するために不必要な数の動物を必要としないように設計している。
【０２９５】
ＥＬＢ０１１０１  ＩｇＧ４  ｍＡｂ、ＥＬＢ０１１１１（耐性のみ）又はレーザー誘発性ＣｈＮＶモデルの対照（ｃｏｎｔｒｏｌ  ｖｅｈｉｃｌｅ）について、片目あたり１ｍｇの硝子体内注射したときの目の耐性、臨床パラメータ及び予防効果を、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｓｅｎｎｅｖｉｌｌｅ、カナダ）で評価した。このＮＨＰモデル研究におけるすべての手順は、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒの標準的な手順であり、以下で簡単に説明する。１９８２年にＲｙａｎ  ＳＪによって最初に開発された初期のサルモデルプロトコルと比較すると、いくつかのマイナーチェンジがなされた。
【０２９６】
＜研究／実験計画＞
（動物及び動物飼育条件）
合計１７匹のオスのカニクイザル（２〜３歳）を使用した。これらは、投与開始時には２．７〜３．２ｋｇの体重があった。動物を実験室環境に慣れさせるために、動物を受け入れてから治療を開始するまでの間に、最低４週間の順応期間を設けた。動物は、自動散水弁を備えたステンレス鋼ケージに社会的に収容した（１ケージ１グループあたり最大３匹）。相対湿度３０％〜７０％、温度２０°Ｃ〜２６°Ｃを通常維持した。１２時間の光／１２時間の暗闇のサイクルを維持した。食物は、動物のサイズと年齢に適した量を提供した（ＰＭＩ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｐｒｉｍａｔｅ  Ｃｈｏｗ  Ｎｏ．５０４８を１日２回提供した）。逆浸透及び紫外線放射によって処理された水は、各動物が自動給水システムから自由に利用できた。サルは、眼科研究における動物の使用に関するＡＲＶＯ宣言に従って使用した。
【０２９７】
＜実験設計＞
表１６に記載されているように、第１段階では、２つのＩｇＧフォーマット（ＩｇＧ４及びＩｇＧ１  Ｎ２９７Ｑ）におけるＨ７バリアント１ｍｇの硝子体内投与の耐性（全体及び眼の耐性）を、レーザー誘発されていない３つのサルの目で比較した。
【０２９８】
第２段階では、レーザー誘発されたＣｈＮＶモデルにおける、毒性の低いアイソフォーム（又は耐性が同等であれば、ＩｇＧ４フォーマットのＨ７（ＥＬＢ０１１０１））の効能が評価された。
【０２９９】
表１６は、実験計画の第１段階（耐性）と第２段階（有効性／拡張された耐性）の概要を示す。
【０３００】
【表１６】
2020505013.tif 000017
【０３０１】
＜試験物質の準備＞
試験物質（凝集物がなく、エンドトキシン含有量が非常に低い（０．０２５ＥＵ／ｍｇ未満）もの（表１７を参照））を、使用日に、用量要件を満たすのに適切な濃度の参照製品（ＰＢＳ）で希釈して２０ｍｇ／ｍＬに調製した。
【０３０２】
表１７は、試験する物質と対照の識別を示す。
【０３０３】
【表１７】
2020505013.tif 000018
【０３０４】
＜モニターするパラメータ＞
この研究では、以下のパラメータについて評価した：死亡率と臨床徴候、体重、体重の変化、食欲、眼科検査、フルオレセイン血管造影、肉眼的病理学検査及び免疫組織化学検査。
【０３０５】
＜実施、観察及び測定の手順＞
死亡／死亡寸前のコントロールを、研究の期間全体において、通常、１日２回（午前中に１回及び午後中に１回）実施した。投与期間と観察期間について、詳細な検査を毎週実施した。個々の体重を毎週測定した。飼料の個々の評価は、食欲を目視検査して毎日評価して行った。
【０３０６】
眼科検査は、第１段階では、試験前に１回及び試験２日目、５日目、７日目、第２段階では、レーザーによるＣＮＶ誘発後、試験前に１回及び試験１日目、９日目、そして２８日目に行った。
【０３０７】
検眼鏡検査及び生体顕微鏡検査（スリットランプ）は、認定された獣医眼科医が行った。散瞳薬にはトロピカミド１％を使用した。適切な絶食期間の後、鎮静剤であるケタミン（登録商標）注射用塩酸（米国薬局方（ＵＳＰ））を筋肉内注射により投与した。
【０３０８】
＜イメージング手順＞
活性のあるＣｈＮＶ病変の発生は、フルオレセイン血管造影法（ＦＡ）により評価した。これは、レーザー照射の前に一度行い、レーザー傷害後の１４日目と２９日目に行った。１４日目と２９日目の静止画像上の個々のレーザースポットによって定義されたＣｈＮＶ病変は、漏出ついて半定量的に評価した。
【０３０９】
＜蛍光血管造影＞
効能評価の第２段階で、イメージングデータ（フルオレセイン血管造影又は蛍光血管造影）を１日目（レーザー後、投与前）に取得し、次のように光凝固後１４日目及び２９日目に再び取得した。
【０３１０】
手順は以下のように行った。試験の少なくとも２５分前に、散瞳薬（１％トロピカミド）を各目に使用した。目の水分は、生理食塩水で頻繁に洗浄することにより維持した。動物に、ケタミン（５ｍｇ／ｋｇ）、グリコピロレート（０．０１ｍｇ／ｋｇ）及びデクスメデトミジン（０．０１ｍｇ／ｋｇ）の鎮静混合物の筋肉内注射をして、イソフルラン／酸素混合物を投与するために気管内チューブを挿管した。血管造影が終了すると、動物は必要に応じて、デクスメデトミジンの拮抗薬であるアチパメゾール０．１ｍｇ／ｋｇの筋肉内注射を受ける。フリー赤外線及び／又は赤色モードでのシンプル及び／又はリアルタイムの網膜画像を、血管造影の参照画像のために取得した。１０％の注射用フルオレセインナトリウム（ＵＳＰ）１．０ｍｌを急速静脈内注射（橈側皮静脈又は伏在静脈（ｃｅｐｈａｌｉｃ  ｏｒ  ｓａｐｈｅｎｏｕｓ  ｖｅｉｎ））で投与し、続いて生理食塩水０．５ｍｌで洗い流した。フルオレセイン注射の少なくとも２分後及び遅くとも５分後に、両眼の固定画像を記録した。さらに、フルオレセイン注射の少なくとも８分後及び遅くとも１１分後に、両眼の固定画像を記録した。蛍光血管造影画像は、データを確実にマスクするために、ランダム化された動物の番号ではなく、動物の到着番号によって識別した。病変の重症度のレベル（個々のレーザー病変に対応する度合い）は、固定画像において、フルオレセインの漏出の程度によって、マスクされ経験豊富な２人の判定人が０−４スケールで評価した。そして、判定人は、次のスケールによってコンセンサススコアを決定した：グレード０：漏れなし、グレード１：最小漏れ、グレード２：わずかな漏れ、グレード３：中程度の漏れ（半固体から固体のハイパーフルオレッセンス（ｈｙｐｅｒ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）が通常レーザー誘発性欠陥領域内に残る）、グレード４：実質的な漏れ（レーザー誘発性欠陥領域を越えて広がる固体のハイパーフルオレッセンス領域）。
【０３１１】
関連する臨床病変（グレード３及び４）の総数と％を計測した。１日目の画像は、手順とレーザースポット形成の確認に使用した。
【０３１２】
臨床関連病変の数は、グレード３と４の病変の組み合わせによって定義した。
【０３１３】
臨床関連病変の発生率を、文献（Ｋｒｚｙｓｔｏｌｉｋら、２００２）で定義されている発生率と発生率との比によって表現することもできる。発生率は、臨床的に関連する病変の数（特定の期間中に発生した病変）をレーザー誘発性病変／スポットの総数で割ったものとして定義した。発生率はパーセンテージで表すこともできる。そして、予防眼における臨床関連病変の発生率と対照眼における発生率との比を指す発生率比（ＩＲＲ）を計算した。ＩＲＲが１の場合、発生率に差がないことを意味する。ＩＲＲ数が１よりはるかに小さいことは、予防グループにおける臨床関連病変の発生率が、対照グループに対して減少したことを意味する。
【０３１４】
＜ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ（ｖｗｆ）標識による免疫組織化学＞
安楽死させた後、眼球を摘出し、硝子体液を収集し、ドライアイス上に置いた後、冷凍庫で−８０℃に保管した。第２段階におけるすべての動物の左目の残りの組織は、免疫組織化学分析に使用した。特定された左目の脈絡膜を準備し、「フラットマウント」としてマウントし、ＩＨＣ研究によりフォンヴィレブランド因子（ｖＷＦ）で染色した。簡単に説明すると、フラットマウントをＰＢＳ＋１％Ｔｒｉｔｏｎバッファーによって各ステップ間で少なくとも５分間３回洗浄し、ＰＢＳ＋１％Ｔｒｉｔｏｎ＋０．１％アジ化ナトリウム中の１％ＢＳＡで３０分間ブロックし、ウサギポリクローナル、フォンヴィレブランド因子（ａｂ６９９４の１／２００、Ａｂｃａｍ）に送り、又は陰性対照（１／３５０  Ｘ０９３６  Ｄａｋｏ／ＮＲｂＩｇＧ）ターゲットに４°Ｃで４８時間さらし、最後にＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ４８８結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ａ１１００８／Ｌｉｆｅ  テクノロジー）に４°Ｃで一晩さらした。抗ＣＤ１６０で治療され又は治療されていないレーザースポット病変は、陽性ｖＷＦ染色について半定量的に個別に評価され、２０倍の対物倍率での視野と比較して、病変のサイズ及び性質に基づいて１、２又は３のスコアが与えられた。共焦点顕微鏡を使用したさらなる分析を行い、必要に応じて病変の性質を確認した。
【０３１５】
レーザーによる病変は、ｖＷＦの陽性染色について半定量的に個別に評価され、レーザー病変のサイズと性質についてスコアが与えられた。病変は、スポット病変が開いていて中心脈絡膜瘢痕があるか又はＲＰＥ瘢痕で完全に覆われているかによって特徴付けた。最小の（１）は、スポット蛍光が存在する場合、軽度（２）は、ｖＷＦ陽性血管／毛細血管が存在する場合、そして中程度（３）は、血管の量が対象領域中心部及びスポット周辺において平均より多い場合、に相当する。ｖＷＦ陽性血管の存在は、レーザースポットの中心とその周辺で別々に評価した。
【０３１６】
＜検査のための血液サンプル＞
サルの血液は大腿静脈穿刺によって採取した。
【０３１７】
−  第１段階（耐性）：治療開始前及び１日目、２日目、３日目、６日目、７日目。
【０３１８】
−  第２段階（効能）：治療開始前及び１日目、２日目、３日目、６日目、１２日目、２８日目。
【０３１９】
サンプルをゆっくり混合し、遠心分離するまで周辺条件下で維持し、遠心分離はできるだけ早く実行した。サンプルを標準手順に従って遠心分離した。得られた血清を分離し、一意にマークされた透明ポリプロピレンチューブに移し、すぐにドライアイスで凍結し、−８０℃の冷凍庫に移した。その後の考えられる検査には、ＩＶＴ注射後における全身にコンパートメントでの抗ＣＤ１６０抗体濃度の測定が含まれる。
【０３２０】
＜終了手順＞
予定された安楽死まで生き残った動物は、予定された剖検（解剖）の前に一晩絶食させた。動物室から剖検エリアに移す前に、鎮静剤（注射用ケタミンＨＣｌ（ＵＳＰ））を筋肉内注射で投与した。動物は、ペントバルビタールナトリウムの静脈内注射による麻酔後の脇下又は大腿動脈の切開による放血させる。
【０３２１】
＜カニクイザルの目での２つのフォーマット（Ｈ７  ＩｇＧ４（ＥＬＢ０１１０１）及びＨ７  ＩｇＧ１  Ｎ２９７Ｑ（ＥＬＢ０１１１１））における抗ｈＣＤ１６０のＩＶＴ注射に対する耐性＞
局所抗生物質（トブラマイシン０．３％）を、治療の前日、注射後、注射の翌日に２回、２つの目に使用した。
【０３２２】
投薬治療の前に、耐性評価のための第１段階動物は、ケタミン（５ｍｇ／ｋｇ）及びデクスメデトミジン（０．０１ｍｇ／ｋｇ）の鎮静混合物の筋肉内注射を受け、その後、マスクを通してイソフルラン／酸素混合物が投与され、麻酔を維持することが必要か判断された。投与の完了後（必要であると判断された場合）、動物は、必要に応じてデクスメデトミジンの拮抗薬であるアチパメゾールの０．１ｍｇ／ｋｇの筋肉内注射を受けた。
【０３２３】
第１段階では、３匹のサルの目に、抗ｈＣＤ１６０  Ｈ７  ＩｇＧ４及びＨ７  ＩｇＧ１  Ｎ２９７Ｑそれぞれ１  ｍｇを硝子体内（ＩＶＴ）注射（Ｈ７  ＩｇＧ４を右目、Ｈ７  ＩｇＧ１  Ｎ２９７Ｑを左目）して、耐性を確認した。
【０３２４】
抗ＣＤ１６０  Ｈ７  ＩｇＧ４抗体及び参照担体対照は、獣医眼科医により１日目に両側硝子体内注射により適切な動物に投与された。各動物の投与量は各目に対して５０μｌであった。
【０３２５】
第１段階の用量は、１ｍｌの注射器と３０×１／２インチの針を使用して投与した。第１段階では、Ｈ７  ＩｇＧ４を右目に投与し、非グリコシル化Ｈ７  ＩｇＧ１  Ｎ２９７Ｑを左目に投与した。
【０３２６】
＜担体（ＰＢＳ）と比較したＨ７  ＩｇＧ４のＩＶＴ注射のレーザー誘発性脈絡膜血管新生に対する予防効果の実証＞
６匹のオスのカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）（１．５〜３．５歳、体重１．５〜６ｋｇ）の２つのグループで、脈絡膜血管新生（ＣＮＶを次のようにして誘発した。目の洗浄前に、散瞳薬（塩化ベンザルコニウム（Ｚｅｐｈｉｒａｎ（商標）））を処置前に各目にさした。
【０３２７】
第２段階（有効性）における動物は、第１段階（耐性）の動物と同じように麻酔した（前述の記載を参照）。
【０３２８】
抗ＣＤ１６０  Ｈ７  ＩｇＧ４抗体及び参照対照担体を、１日目に適切な動物に投与した。それらは１日目に、獣医眼科医によって、各目に対してＨ７  ＩｇＧ４（第１段階の後に選択されたアイソフォーム）２０ｍｇ／ｍｌの５０μｌ又は担体の５０μｌが両側硝子体内（ＩＶＴ）注射された。各動物の目標投与量は、１ｍｇの結合物で各目に５０μｌであった。第２段階での投与には、２９×1/2インチの針を備えたＥｘｅｌｉｎｔ  Ｕ−１００  ０．５  ｃｃインスリンシリンジを使用した。投与量の投与後、局所的抗生物質を各目に点滴した。
【０３２９】
＜脈絡膜血管新生（ＣｈＮＶ）のレーザー誘初の手順−第２段階＞
第２段階の１日目、ＣｈＮＶ処置の前に、散瞳薬を両目にさした。病変のレーザー誘発段階又は硝子体内（ＩＶＴ）注射の前に、動物に鎮静剤ケタミン（５ｍｇ／ｋｇ）、グリコピロレート（０．０１ｍｇ／ｋｇ）及びデクスメデトミジン（０．０１ｍｇ／ｋｇ）の混合物を筋肉内注射した。そして、適切な麻酔を維持するためにイソフルラン／酸素混合物を投与するための気管内チューブを挿管し、ケタミン（５ｍｇ／ｋｇ）の混合物で動物を麻酔した。投与（必要と考えられる場合のみ）の手順終了後、動物に、必要に応じて、デクスメデトミジンの拮抗薬であるアチパメゾール０．１ｍｇ／ｋｇの筋肉内注射をした。動物はまた、治療グループに分け、体重でランダム化した。
【０３３０】
麻酔中、１日目に、レーザー処置は、中心窩に対して同心円状に１つの目につき９つの病変を生成することにより行われ、１つの病変は黄斑部にあり、８つの病変は網膜の主要血管の間の周辺部にある。初期病変サイズ８０μｍのレーザー病変は、初期出力３００ｍＷ、持続時間０．１秒の８１０ｎｍダイオードレーザーを使用して生成した。そのため、各処置について各グループで合計１０８のレーザー部位を評価した（１グループあたり動物６匹、各動物２つの目、各目で９の部位が試験対象物質ごとにある）。レーザー処置は再現性よく行われ、ブルッフ膜の破裂の特徴である網膜内の小さな蒸気の泡の出現を確認した。中心窩に直接病変は生じなかった。ブルッフの膜の破裂（気泡の形成と相関）を確実に起させるために、必要に応じてレーザーパラメータを調整し、研究データとして記録した。網膜出血などの、各レーザー病変についてのすべての注目すべき事実を記録した。必要に応じて、処置中、目を生理食塩水及び／又は１．０％カルボキシメチルセルロースナトリウム溶液によって潤った状態に保たれた。投与の位置と外観を確認し、投与手順に起因する異常を記録するために、各治療が終了した後、両目についてスリットランプ生体顕微鏡検査及び／又は間接検眼鏡による検査を行った。
【０３３１】
＜結果の分析＞
＜耐性についての結果、まとめ＞
＜死亡率と臨床徴候＞
臨床検査及び眼科検査では、出血、体重の変化又は肉眼的所見に対する治療の影響は、偶発的な又は処置関連の及び実験室で飼育される霊長類に典型とされるもの以外のものはないことが示された。治療の体重の増加などの体重に関連する影響はなかった。体重に対する治療に関連した影響はなく、肉眼で見える影響もなかった。Ｈ７  ＩｇＧ１  Ｎ２９７Ｑを投与された動物に２８日目で、非常にわずかな硝子体の混濁が観察された。それらは臨床的に重要であるとは考えられず、そのような変化は硝子体内投与ルートを使用した場合に一般的に観察される。
【０３３２】
＜目の耐性−眼科的観察＞
前処理でいくつかのマイナーな二次観察が記録された。しかし、すべての動物は研究に利用できると判断した。第１段階では、投与後にわずかな変化のみが観察された。３／６目の硝子体及び前房に少数の細胞が認められた（Ｎｏ．１００２及びＮｏ．１００３）。
【０３３３】
第２段階では、レーザー照射により、処置したすべての眼に、網膜瘢痕、出血、及び中心窩出血などの処置に関連した同様の目の変化が生じていた。脈絡網膜の出血（ｔｈｅ  ｃｈｏｒｉｏｒｅｔｉｎａｌ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅｓ）は、時間の経過とともに改善し、２８日までにほとんどの目で消失した。Ｄ−ＰＢＳを投与した対照動物Ｎｏ．２００４も、９日目と２８日目にこれらの細胞が両側に認められた。
【０３３４】
＜レーザー誘発性脈絡膜血管新生に対する予防効果により評価されたＨ７  ＩｇＧ４のＩＶＴ注射の効能＞
＜蛍光血管造影の結果の分析＞
１日目に、すべての動物の眼は、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）を評価するための、９つのレーザー病変についての計画／設計通りに処置された。一部の動物では９つ以上の病変が認められたが、９つの病変のみについて評価した。
【０３３５】
図４及び表１８にまとめられた結果からわかるように、臨床関連の病変の数を考慮すると（グレード３：中程度の漏出、グレード４：実質的な漏出；組み合わせ）、１４日目及び２９日目のグループでこれらの病変の数が多くなっていた。１４日目では、対照と比較してＣｈＮＶの減少においてＩｇＧ４  Ｈ７（ＥＬＢ０１１０１）のわずかな効果があった。２９日目の病変の評価後、抗ＣＤ１６０  Ｈ７  ＩｇＧ４で処置した動物において、差がより顕著になった。
【０３３６】
実際、２９日目に、ＥＬＢ０１１０１が投与された投与動物は、ＰＢＳグループ（ビヒクル群）と比較して、臨床関連の病変（グレード３：中程度の漏出、グレード４：重大な漏出、組み合わせ）の数が少なかった（ＥＬＢ０１１０１：１３、ＰＢＳグループ：１５）。レーザーによる病変の総数に対する臨床的に関連する病変の発生率は、Ｈ７  ＩｇＧ４を投与した目では１２％であったが、ビヒクル群では２３．１％であった。臨床関連の病変の数を考慮すると、１４日目と２９日目にＰＢＳ群でこれらの病変の数が多くなった。
【０３３７】
表１８に示すように、ＥＬＢ０１１０１の場合、１４日目にグレード０の病変が多く、２９日目にグレード１及び２の数が多いことにも注意すべきである。ＥＬＢ０１１０１は、大きな病変についての予防効果に加えて、他の小さな病変については病変の進行を遅らせたようである。
【０３３８】
表１８は、サルの目で観察されたＣｈＮＶレーザー誘発性病変のグレードに対する対照又はＨ７  ＩｇＧ４による治療の影響を示す。
【０３３９】
【表１８】
2020505013.tif 000019
【０３４０】
文献（Ｋｒｚｙｓｔｏｌｉｋ  ｅｔ  ａｌ．、２００２）で定義されているように、この研究について発生率と発生率比を計算すると、２９日目で、レーザースポットの総数に対する臨床関連病変の発生率（ＩＲ）は、ビヒクル群では０．２３１（１０８のうち２５）すなわち２３．１％（割合）であったのに対し、ＥＬＢ０１１０１投与の目では０．１２（１０８のうち１３）すなわち１２％（割合）であった。これは、発生率比（ＩＲＲ）０．５１９に対応する。
【０３４１】
＜ＮＨＰ組織の免疫組織化学によるフォンヴィレブランド因子（ｖＷＦ）によるレーザー病変の評価＞
レーザー病変をｖＷＦの陽性染色について半定量的に個別に評価し、レーザー病変のサイズと性質にスコアが与えた。
【０３４２】
最小限の分類を使用した：
（１）蛍光標識の存在、少量の場合
（２）ｖＷＦ陽性の血管／毛細血管の存在、中程度の場合
（３）血管の量が、関心領域（病変の中心及び周辺）の平均よりも大きかった場合。
【０３４３】
ｖＷＦ陽性染色の平均スコアは、レーザー病変の中心においては、Ｈ７  ＩｇＧ４を投与したグループでわずかに高かった（約１０％）が、病変の周辺においては、処置単独と比較して対照群のスコアがわずかに高かった。
【０３４４】
＜点状病変スコア＞
２０倍の倍率で、レーザー病変の点は、視野に対する病変のサイズに応じて１、２又は３のスコアを与え、その病変は、点状病変が開いているか、中心脈絡膜を有するか、又はＲＰＥ瘢痕で完全に覆われているかによって特徴付けた。
【０３４５】
開いた病変とは、ブルッフ膜及びＲＰＥ膜による病変の被覆がないことを意味する。脈絡膜瘢痕は、しばしば線維のように見えてバックグラウンド蛍光が高い部位の中心にある、密な組織凝集体の存在によって特徴付けられる。同様に、ＲＰＥ瘢痕とは、ＲＰＥ細胞又は中心部の微細繊維構造のバックグラウンド蛍光が大きい凝集体の、変化した結合を指す。ｖＷＦ蛍光の結果と同様に、Ｈ７  ＩｇＧ４で処理したグループの病変サイズスコアは、対照とそれほど違いはなかった。
【０３４６】
しかし、ＲＰＥによる病変点の被覆状態、その開口状態及び脈絡膜瘢痕の有無を評価することにより、病変の外観を考慮すると、Ｈ７  ＩｇＧ４で処理されたグループのレーザー病変は、ＲＰＥ膜による完全に治癒覆された病変の総数はより多かった（３２〜１６個の病変）。その一方で、対照群では中心瘢痕を伴う又は伴わない多数の開口状の病変があった（２６〜１９個の病変）（表１９を参照）。これは、レーザー病変の初期誘発中に差がなかったという条件で、Ｈ７  ＩｇＧ４で治療されたグループの治癒ポイントの数が多いことを示唆している。網膜及び付着ＲＰＥ膜の除去中に、病変被覆の完全性が影響を受けたため、Ｎｏ．２１０１の動物については記録しなかった。
【０３４７】
表１９は、存在するレーザー病変の特徴を示す。
【０３４８】
【表１９】
2020505013.tif 000020
【０３４９】
＜まとめ＞
図４及び図５並びに表１８及び表１９に見られるように、担体（ＰＢＳ）と比較したＨ７  ＩｇＧ４のＩＶＴ注射のレーザー誘発性脈絡膜血管新生に対する効能と予防効果は次のように示された。
【０３５０】
１４日目に、ＰＢＳ対照と比較した脈絡膜血管新生を減少させるＩｇＧ４  Ｈ７の効果が明らかとなった。２９日目に、Ｈ７  ＩｇＧ４で処置した動物の場合、差はさらに顕著であった。２９日目に、レーザー病変の総数に対する臨床的に重要な病変の発生率は、ＰＢＳ群の２３．１％であるのに対し、Ｈ７  ＩｇＧ４を投与した目では１２％であった。臨床関連病変の総数（グレード３：中程度の漏出、グレード４：著しい漏出）を考慮した場合、図４に示すように、１４日目と２９日目にＰＢＳグループでこれらの病変の数が多くなった。
【０３５１】
図５に見られるように、ｖＷＦ  ＩＨＣを使用して各斑点病変の網膜色素上皮（ＲＰＥ）被覆状態を評価すると（図５を参照）、斑点サイズのコアはＥＬＢ０１１０１処理された動物と対照動物とで違いがなかった。Ｈ７  ＩｇＧ４の投与は、レーザー病変点の中心でわずかに高い血管新生スコアと関連していたが、ｖＷＦ陽性染色で示されるように、対照治療よりも周辺部でわずかに低く、これは臨床関連病変に対するＨ７  ＩｇＧ４の影響と相関している。さらに、中央の脈絡膜瘢痕を伴う又は伴わない「開口状」レーザー病変の発生率が増加した対照動物と比較して、ＲＰＥ瘢痕で完全に覆われたレーザー病変の発生率が高かった。これらの結果は、レーザーによって発生した初期病変が対照動物と治療動物とで同様という条件で、Ｈ７  ＩｇＧ４を投与された動物の病変の治癒が加速するプロセスを示唆している。ポイントサイズのスコアは、ＩｇＧ４で処理した動物と対照動物とで違いはない。
【０３５２】
結論として、各目１ｍｇの単回両側硝子体内注射によるＨ７  ＩｇＧ４（ＥＬＢ０１１０１）の投与は、カニクイザルにおいて臨床的に十分に許容できるものだった。これは、ＩｇＧ１  Ｎ２９７Ｑフォーマット（ＥＬＢ０１１１１）の抗ＣＤ１６０  Ｈ７の場合にも当てはまる。誘発された病変の中心部での血管新生が周辺部よりも発生率わずかに多い担体対照（ＰＢＳ）と比較して、Ｈ７  ＩｇＧ４は、脈絡膜血管新生の減少に関わっており、ＲＰＥ膜の治癒を伴う病変の発生率が高かった。これは、抗ＣＤ１６０  Ｈ７  ＩｇＧ４（ＥＬＢ０１１０１）で処置された目の回復が加速されるプロセスを示唆している。
【０３５３】
［実施例１０：ＮＨＰのレーザー誘導性（ＣｈＮＶ）モデルにおける２つの最適化された抗ＣＤ１６０  ｍＡｂフォーマット（ＩｇＧ４（ＥＬＢ０１１０３）及びＦａｂ−リンカーＦａｂフォーマット（ＥＬＢ０１１３２）としてのＨ７バリアントＤ１２）の硝子体内注射の耐性及び有効性評価］
実施例９で示したように、最適化されていない抗ＣＤ１６０  ＩｇＧ４（ＥＬＢ０１１０１）の各目あたり１ｍｇの単回硝子体内注射は、眼の主要な毒性の兆候がなく臨床関連病変の発生をレーザースポットの総数に対して５０％防止した。
【０３５４】
次に、この第１世代の抗ＣＤ１６０抗体を実施例２に記載の親和性成熟によって最適化し、実施例３に記載のように異なるｍＡｂｓフォーマットを設計した。実施例８では、眼科学的目的で設計された抗ＣＤ１６０の異なるフォーマットをウサギを用いた薬物動態研究で比較し、そのうちの２つ、ＥＬＢ０１１０３（ＩｇＧ４として親和性が最適化された抗ＣＤ１６０）とＥＬＢ０１１３２（Ｆａｂ−ｌｉｎｋｅｒ−Ｆａｂとしての親和性成熟）が選択された。
【０３５５】
ＥＬＢ０１１０１と比較して、ＥＬＢ０１１０３の全身半減期は短いが、それでも硝子体内半減期（ウサギでは４日）は良好である。親和性成熟のため、ＥＬＢ０１１０１と同等又はそれ以上の有効性がある。この親和性最適化抗ＣＤ１６０は、ＥＬＢ０１１０３と比較して硝子体内半減期がわずかに短く、全身半減期が非常に短い、目の浸透性を高めるＦａｂ−リンカーＦａｂフォーマットとしても生成された。試験するＥＬＢ０１１３２用量は、ＥＬＢ０１１０３と等モルを基礎として計算した。実際、抗ＣＤ１６０の分子量は、ＩｇＧ  ＥＬＢ０１１０３では約１５０  ＫＤａであり、ＥＬＢ０１１３２では９０  ＫＤａに減る。
【０３５６】
この研究の目的は次のとおりである：（１）両側硝子体内の単回注射でカニクイザルに投与された場合、３用量（ＥＬＢ０１１０３の場合は片目あたり０．３５ｍｇ、１ｍｇ及び３ｍｇ、ＥＬＢ０１１３２の場合は０．２５ｍｇ、０．６ｍｇ及び２ｍｇ）で２つの抗ＣＤ１６０フォーマットの耐性を決定すること、並びに、（２）レーザー誘発ＣｈＮＶサルモデルにおける脈絡膜血管新生に対する可能性のある予防効果を評価すること。
【０３５７】
動物の追跡調査及び試験項目（ＥＬＢ０１１の候補）の耐性と有効性の評価のために、この研究でのプロトコルは、以下の変更点を除き、実施例９と同じである。各抗ＣＤ１６０アイソフォームの効能に関する安全性及び用量評価の実験の設計（１グループあたり５匹の７グループ、オスのみ）を表２０に示す。
【０３５８】
表２０は、ＮＨＰ実験における用量評価実験の設計を示す。
【０３５９】
【表２０】
2020505013.tif 000021
【０３６０】
表２１に示す試験及び参照項目は、０日目に両側硝子体内注射によって投与した。各動物の目標投与量は、各目あたり試験対象投与量で５０μｌであった。投与には、１ｍＬシリンジと２９ゲージ×１／２インチの針を備えたＥｘｅｌｉｎｔ  Ｕ−１００インスリン０．５  ｃｃシリンジを使用した。
【０３６１】
試験項目のバッチの詳細を、表２１に示す。
【０３６２】
表２１は、用量有効性試験で注射される物質を示す。
【０３６３】
【表２１】
2020505013.tif 000022
【０３６４】
＜レーザー誘発性脈絡膜血管新生（ＣｈＮＶ）手順と活性ＣｈＮＶの評価＞
レーザー誘発性ＣｈＮＶ手順は、実施例９の手順と同じである。１日目に、ＣｈＮＶを評価するために、グループあたり５匹の動物の目を、初期出力３００ｍＷ、８０μｍの初期スポットサイズ、０．１秒の持続時間で８１０ｎｍダイオードレーザーを使用して、各目の黄斑の領域の周りにある網膜の主要血管の間に９つのスポットレーザー創傷パターンを生成させた。各処置で、１グループあたり合計９０のレーザーサイト（試験項目ごとに、１グループあたり５匹の動物、１匹あたり２つの目、各目あたり９つのサイト）を評価した。
【０３６５】
活性ＣｈＮＶ病変の進行は、フルオレセイン血管造影法（ＦＡ）によって評価した。１回は損傷前の事前評価、レーザー損傷後１４日目及び２８日目に、静止画像上の個々のレーザースポットについても、実施例９と同じ手順で、２人の独立した判定人によって漏出を０−４のスケールで半定量的に評価した。
【０３６６】
＜スペクトル領域−光干渉断層法（ＳＤ−ＯＣＴ）＞
病変レベル部位での網膜の厚さに対する抗ＣＤ１６０候補の影響を評価するために、網膜及び異なる病変部位のスペクトル領域光干渉断層法（ＳＤ−ＯＣＴ）分析による追加のステップを実施した。ＳＤ−ＯＣＴ分析は、中間用量群（ＥＬＢ０１１０３について１ｍｇ、ＥＬＢ０１１３２について０．６ｍｇ）並びに１４日目及び２８日目におけるビヒクル群でのみ実施した。そのため、散瞳薬（トロピカミド１％及び／又は２．５％フェニレフリン）によって瞳孔を広げる。実施例９に示したように、フルオレセイン血管造影を行うために動物を麻酔する。両目における５つのレーザー病変部位の連続画像を取得した。線維血管膜面積を各部位で測定し、各スポットの総体積を計算した。各病変の外側の（通常の網膜の厚さとしての）３つの網膜厚さの測定値と比較した、各病変部位の網膜厚さの測定を行った。必要に応じて、追加のスキャン又は画像を取得した。
【０３６７】
臨床関連の各病変についての個々の網膜の厚さの経時変化は、個々の網膜の厚さの経時的な（１４日目〜２８日目の）平均の変化として追跡できる。ＥＬＢ０１１候補の有効性は、臨床関連の各病変（グレード３及び４）又は各グレード４病変の網膜厚さ、及び病変部位における網膜厚さの経時変化（１４日目〜２８日目）から確認した。
【０３６８】
＜最終手順と生物分析（ＴＫ）＞
動物の最終手順は、実施例９に示した手順と同じであった。動物には、限定的な剖検検査を行い、採取した組織の評価をする。
【０３６９】
強膜−脈絡膜−ＲＰＥ複合体、硝子体液及び房水を個別に採取し、分析を行うまで−８０°Ｃで凍結保存した。
【０３７０】
すべての動物についていくつかの血清サンプル（０．７５ｍＬ）を、経時的に（１回の事前採取、投与後２時間、６時間、１２時間、２４時間及び４８時間、４日目、７日目、１４日目及び２８日目）大腿静脈から採取した。これらの血清サンプルは、抗ＣＤ１６０候補濃度を評価するための生物分析及び／又は抗ＣＤ１６０候補に対する最終的な抗薬物抗体の調査及び定量化を行うまで、−８０℃で維持した。
【０３７１】
＜候補についての予防及び治療効能の評価＞
この研究では、実施例９と比較して、これら２つの抗ＣＤ１６０候補の効能を評価するための分析をさらに行う。実際、各抗ＣＤ１６０アイソフォームの効能を評価するために、まず、１４日目と２８日目にそれぞれの予防効果を評価した（以下の内容について）。
【０３７２】
−  個々の臨床関連のレーザー誘発性病変の数及びグレードスコア
−  臨床関連の個々の病変のＣｈＮＶ面積と網膜の厚さ
−  そして、第二に、それらのそれぞれの治療効果を、１４日目に確立したアクティブな病変に対する経時的影響（１４〜２８日目）を調べることによって評価した。
【０３７３】
−  臨床関連の病変の平均グレード
−  臨床関連病変の個々の平均ＣｈＮＶ面積（ピクセル単位）
−  病変の種類（すべてのグレード、臨床関連病変（グレード３及び４）並びにグレード４のみ）に応じた、２つの中間用量（ＥＬＢ０１１０３について１ｍｇ及びＥＬＢ０１１３について０．６ｍｇ）についての個々及び平均の網膜厚さ。
【０３７４】
＜結果＞
ＮＨＰ  ＣｈＮＶモデルで得て、ＥＬＢ０１１０３及びＥＬＢ０１１３２の効能と耐性に関するプロファイリングの結果を以下に示す。
【０３７５】
（ＥＬＢ０１１０３及びＥＬＢ０１１３２の安全性評価）
ＥＬＢ０１１０１について、使用されたＥＬＢ０１１０３又はＥＬＢ０１１３２の硝子体内の用量が何であれ、臨床検査及び眼科検査では、出血、体重の変化又は肉眼的所見に対する治療の影響は、偶発的な又は処置関連の及び実験室で飼育される霊長類の典型的とされるもの以外のものはないことが示された。レーザー曝露により、処置がされたすべての目で同様の手順関連の目の変化が生じ、例えば網膜瘢痕、出血、中心窩出血が生じた。脈絡網膜の出血は時間とともに改善し、２８日目までにほとんどの目で消失した。
【０３７６】
＜ＮＨＰ  ＣｈＮＶモデルでのＥＬＢ０１１０３とビヒクル対照及びＥＬＢ０１１０１（Ｈ７  ＩｇＧ４）の用量有効性＞
図６Ａに示すように、有意なフルオレセイン漏出の時間経過（０〜１４日目及び０〜２８日目）に伴う高グレードの臨床関連病変（グレード３及び４）の発生率を調べることによって、ＩｇＧ４（ＥＬＢ０１１０３）としてのＨ７バリアントＤ１２の阻害セッティングにおける有効性を最初に評価した。フルオレセイン血管造影図の半定量的評価によって有効性データを示す可能性がいくつかある。
【０３７７】
まず、図６Ａに示すように、効能に関するデータは、レーザー誘発性病変の総数に対する臨床関連病変の割合への、試験物質の影響によって表すことができる。この割合は、臨床関連病変の数を潜在的病変の総数（ここでは９０（レーザーによって誘発されたサルの目の数は１０））で割って１００を掛けた数値である。ＥＬＢ０１１０３の２つの用量（１ｍｇ及び３ｍｇ）で明らかな用量依存の有効性がある。０．３ｍｇ及び１ｍｇのグループでは、病変に対する影響は１４日目よりも２８日目でより大きいことがわかる。１４日目では、３ｍｇの用量で最大の効果が得られた。２８日目では、１ｍｇのＥＬＢ０１１０３（親和性成熟ｍＡｂ）は、同じ用量のＥＬＢ０１１０１（非親和性成熟Ｈ７  ＩｇＧ４候補）よりも大きな有効性がある。
【０３７８】
グレード４の病変が少なくとも１つある目の割合に対する影響、又は、臨床関連病変（グレード３及び４）が少なくとも１つある目の割合への影響に着目した有効性データを提示することもできる。ＥＬＢ０１１０３の用量有効性は、臨床関連の漏出（グレード３又は４）をグループ間で比較し及び縦断的に比較した値（少なくとも１つのグレード４病変のある目の数又は目の割合、データは示していない）を調べることによっても観察できる。
【０３７９】
次に、経時的な漏出の重症度の変化に対するＥＬＢ０１１０３の影響を評価し、これを図６Ｂに示す。漏出の重症度の変化は、臨床関連の個々のＣｈＮＶ病変のグレードスコアの経時変化（１４〜２８日目）かわらかる。図６Ｂによれば、ＥＬＢ０１１０３を硝子体内に注射すると、１４日目から２８日目で、特に中程度用量（１ｍｇ／目）及び低用量（０．３ｍｇ／目）で、漏出が平均的に減少する。実際、１４日目と２８日目の間のグレードスコアの平均変化は、これらの用量で明らかに減少している。３ｍｇ用量については、経時的な漏出の重症度の制御が小さいようにみえるが、３ｍｇ用量では１４日目での抗体の効能がより良好であることにより、分析は１４日目と２８日目の間で変化した９つの病変のみで行われる。しかし、３ｍｇ用量の漏出重症度の制御は、対照群よりも優れている。
【０３８０】
さらに、１４日目から２８日目までの臨床関連病変のＣｈＮＶ面積の平均的な変化に対するＥＬＢ０１１０３の用量増加（０．３〜３ｍｇ）の影響を、図６Ｃに示す。病変の面積の測定により、ＥＬＢ０１１０３で処理した目は１４日目に対照に匹敵し、２８日目までを対照と比較した場合、すべての用量レベルで漏出がより低かったことが示された。実際、ＣＨＮＶ面積はビヒクル対照群では経時的に進行したが、１４日目に予防されなかった臨床関連病変の進行は、ＥＬＢ０１１０３が与えられると１４〜２８日目の間に止まった。これには用量反応効果があった。ＥＬＢ０１１０３の用量が何であれ、１４日目と２８日目の間に及び平均ＣｈＮＶ面積及びその変化が顕著に減少し（個々のデータは示していない）、これには用量反応効果がある。
【０３８１】
ＥＬＢ０１１０３（１ｍｇ）の投与が１４日目と２８日目との間での病変のグレードに応じた網膜厚さの平均変化に与える影響を、図６Ｄに示す。ビヒクル対照群の網膜厚さは経時的に増加した一方、ＥＬＢ０１１０３を投与した場合では、１４〜２８日目において臨床関連病変の進行及びそれに続く網膜の厚さの増大が止まった。１４〜２８日目の間におけるＥＬＢ０１１０３によってもたらされる平均の網膜厚さのこの減少は、分析された病変のグレードとは無関係に見られる。
【０３８２】
＜ＮＨＰ  ＣｈＮＶモデルにおけるＥＬＢ０１１３２とビヒクル対照及びＥＬＢ０１１０１（Ｈ７  ＩｇＧ４）の用量効果＞
図７Ａに示すように、有意なフルオレセイン漏出の時間経過に伴う高グレードの臨床関連病変（グレード３及び４）の発生率を調べることによって、Ｆ７リンカーＦａｂ（ＥＬＢ０１１３２）としてのＨ７バリアントＤ１２の予防における効能を最初に評価した。２つの低用量（０．２３ｍｇ及び０．６ｍｇ）で効能がある。しかし、最高用量（２ｍｇ）ではＣｈＮＶ病変の予防はまったくない。一貫して、ＥＬＢ０１１３２の中程度の用量（０．６  ｍｇ）は、観察された効能の読み取り値（データは示していない）が何であれ、１４日目までにＣｈＮＶ病変の出現を防ぐことに非常に効果的である。このことは、臨床関連の漏出（グレード３又は４）をグループ間で、及び縦断的に（少なくとも１つのグレード４の病変の目の数又は目の割合で（データは示していない）、比較した場合に当てはまる。ＥＬＢ０１１３２の０．６ｍｇの用量の効能は、ＥＬＢ０１１０１の効能よりも優れている。
【０３８３】
次に、漏出の重症度の経時変化に対するＥＬＢ０１１３２の影響を評価し、これを図７Ｂに示す。漏出の重症度の変化は、臨床関連の個々のＣｈＮＶ病変におけるグレードスコアの経時変化（１４日目から２８日目）からわかる。図７Ｂによれば、ＥＬＢ０１１３２を硝子体内に注射すると、ＣｈＮＶ病変の変化は低用量での注射のみで制御された。対照的に、中用量及び高用量では、漏出が増加した。中用量については、２ｍｇ用量の経時的な漏出重症度の制御を示しているが、その分析は１４日目の抗体効能から、５つの病変のみで行われている。最高用量（２ｍｇ）についてのデータに関して、この用量でのＥＬＢ０１１３２は、漏出を全く制御しない。
【０３８４】
さらに、１４日目から２８日目までの間の臨床関連病変のＣｈＮＶ面積の平均変化に対するＥＬＢ０１１３２の用量増加（０．２５から２ｍｇ）の影響を、図７Ｃに示す。
【０３８５】
ＥＬＢ０１１３２が投与された目では、中用量の投与（０．６ｍｇ／目）によって、１４日目と２８日目における病変面積が対照の目と比較してより小さかった。１４日目から２８日目までの間で、漏出の発生は、対照の目よりもわずかに減少した。２つの高用量のみが、１４日目から２８日目の間に平均ＣｈＮＶ面積の増加をわずかに減少させる傾向がある。
【０３８６】
いくつかのタイプの病変の網膜厚さの平均的な経時変化に対する、０．６ｍｇのＥＬＢ０１１３２投与の影響を、図７Ｄに示す。１４日目から２８日目までの間でビヒクル対照群の網膜厚さは大きくなったが、その一方で、病変の平均的な網膜厚さの経時変化に対する０．６ｍｇ用量ＥＬＢ０１１３２の制御は、ＥＬＢ０１１０３と比較して病変のグレードによる変動がかなり大きい。実際、グレード３及び４の臨床関連病変に関しては、網膜厚さの平均変化は０．６ｍｇＥＬＢ０１１３２によって大きく減少するが、これは、すべてのグレードの病変又はグレード４のみの病変を独立して考慮した場合はもはや当てはまらない（図１４を参照）。しかし、グレード４の病変の分析の場合、分析は１４日目の抗体の効能のため、５つのグレード４の病変に対してのみ行っている。
【０３８７】
＜結論＞
単回の両側硝子体内注射によるＨ７バリアントＤ１２抗ＣＤ１６０の２つのアイソフォームの投与は、カニクイザルで最大３ｍｇのＥＬＢ０１１０３／目及び２ｍｇのＥＬＢ０１１３２／目で臨床的に十分に許容できる。対照と比較した場合、両方の試験項目は、臨床関連病変の面積及び／又は厚さの変化によって測定されるように、ＣｈＮＶ進行の減少と関連していた。一般に、ＥＬＢ０１１０３の効能は、ＥＬＢ０１１３２で観察されたものよりも高かった。実際、ＥＬＢ０１１０３２の効能は用量の関数及び読み取られた効能の関数として大きく変動するが、ＥＬＢ０１１０３は、分析された効能の読み取り値が何であれ、明確な用量効果がある。しかし、一貫して、ＥＬＢ０１１３２の中間用量（０．６ｍｇ）はＣｈＮＶ病変の出現を防ぐために非常に効果的である。
【０３８８】
［実施例１１：ＣＬＬ患者の腫瘍細胞へのＨ７  ＩｇＧ１抗体の結合］
７人のＣＬＬ患者から単離されたＰＢＭＣは、抗体ＣＬ１−Ｒ２（ネズミ抗ＣＤ１６０  ＩｇＧ１）、ＩｇＧ１フォーマットの抗ＣＤ１６０  Ｈ７、又はＢＹ５５（ネズミ抗ＣＤ１６０  ＩｇＭ）（ＣＤ１９／ＣＤ５／ＣＤ３／ＣＤ５６パネル）で標識した（図８を参照）。ＣＤ１６０標識の蛍光強度を測定するために、ＣＤ５＋ＣＤ１９＋腫瘍細胞を分析した。ＣＤ１６０発現は、すべてのＣＬＬサンプルにおいて様々な強度検出できる。図８によれば、Ｈ７  ＩｇＧ１抗体は、ＣＬＬサンプル６／７の腫瘍細胞に効率的に結合し、これはＣＬ１−Ｒ２又は市販のＢＹ５５抗ＣＤ１６０  ｍＡｂよりも優れている。
【０３８９】
このように、ＩｇＧ１フォーマットのＨ７抗体はＣＬＬの腫瘍細胞に結合することができ、したがって、特にＡＤＣＣ又はＣＤＣなどの細胞毒性メカニズムによってこれらの悪性細胞を標的として殺すために使用できる。
【０３９０】
［実施例１２：ＣＤ１６０陽性細胞へのＩｇＧ１フォーマットのＨ７抗体により誘起されるＡＤＣＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価］
ＩｇＧ１フォーマットの抗ＣＤ１６０抗体Ｈ７は、ＡＤＣＣのメカニズムによりＣＤ１６０を発現している細胞を殺す（図９を参照）。
【０３９１】
健康なドナーの血液から精製したＮＫ細胞を、抗ＣＤ１６０  Ｈ７  ＩｇＧ１抗体のＡＤＣＣ活性を測定する試験のエフェクターとして使用した。Ｅ３００−ＣＤ１６０標的細胞（ＣＤ１６０を発現するトランスフェクションされたプレＢヒト細胞株）をＣＦＳＥで標識し、示唆されたエフェクター／標的比率（１／１、１／５及び１／１０）でＨ７  ＩｇＧ１抗体又はヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照の存在下でエフェクターＮＫ細胞でインキュベートした。殺した標的細胞の割合は、７ＡＡＤでの標識とフローサイトメトリー分析により測定した。二重標識７ＡＡＤ＋ＣＦＳＥ＋死細胞の割合は、表示されたドットプロットの右上の象限に示されている。
【０３９２】
これらの結果と図８（実施例１１）に示されている結果は、ＡＤＣＣのメカニズムにより、ＩｇＧ１フォーマットのＨ７抗体を使用して、表面にＣＤ１６０を発現している細胞を標的化し、殺すことができることを示している。
【０３９３】
［実施例１３：ＩｇＧ１フォーマットにおけるＨ７抗体によるＮＫ細胞の活性化及びインターフェロンγの産生］
図１０、図１１及び図１２が示すように、ＩｇＧ１フォーマットにおける抗ＣＤ１６０  Ｈ７抗体はＮＫ細胞を活性化する。
【０３９４】
図１０Ａに示すように、Ｈ７  ＩｇＧ１抗体は、末梢血から精製されたヒトＮＫ細胞の表面に結合できる。
【０３９５】
図１０Ｂは、Ｈ７  ＩｇＧ１がＮＫ細胞によるインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）の産生を誘発することを示している。健康なドナーの血液から精製したＮＫ細胞を、９６ウェルプレートのウェル（１ウェルあたり１×１０６細胞）単独又はＨ７  ＩｇＧ１抗体若しくはヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照の存在下で、１又は１０μｇ／ｍｌに濃縮し、２４時間培養した。ＩＦＮ−γは、培養上清でＥＬＩＳＡによって分析した。示される結果は、３回の平均と＋／−標準誤差（ｓｅｍ）である。
【０３９６】
図１０Ｃは、Ｈ７  ＩｇＧ１がＮＫ細胞上のＣＤ６９活性化マーカーの発現を誘導することを示している。図１０Ｂと同じ実験で、ＮＫ細胞を培養２４時間後に収集し、蛍光色素ＡＰＣに結合した抗ＣＤ６９抗体で標識した。ＣＤ６９陽性細胞の割合をフローサイトメトリーで分析した。平均値（＋／−標準誤差）を３つの値から計算した。
【０３９７】
ＩｇＧ４フォーマットではなくＩｇＧ１フォーマットにおける抗ＣＤ１６０  Ｈ７抗体は、図１１に示すように、ＮＫ細胞を活性化する。健康なドナーの血液から精製したＮＫ細胞は、単独で、又は以下の抗体の存在下（濃度５μｇ／ｍｌ）で培養した：Ｈ７  ＩｇＧ１、Ｈ７  ＩｇＧ４、それぞれのヒトＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４アイソタイプコントロール、又はＩｇＧ４フォーマットにおけるＨ７抗体に由来するバリアントである抗体ＥＬＢ０１１０３、ＥＬＢ０１１０４及びＥＬＢ０１１０６。すべての抗体を制御して、エンドトキシンによる汚染がないことを確実にした。抗ＣＤ１６抗体（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ｃａｔ＃１６−０１６６）を陽性対照として使用する。ＮＫ細胞（１ウェルあたり５×１０５細胞）を培養の２４時間後に収集し、蛍光色素ＡＰＣに結合した抗ＣＤ６９抗体で標識した。ＣＤ６９陽性細胞の割合をフローサイトメトリーで分析した（３つの値の平均＋／−標準偏差（ＳＤ））。ＩｇＧ１フォーマットにおける抗ＣＤ１６０  Ｈ７は、ＮＫ細胞上でＣＤ６９活性化マーカーの発現を誘導するが、ＩｇＧ４フォーマットにおける同じ抗体は効果がない。ヒトＩｇＧ４フォーマットにおけるＨ７のバリアント（ＥＬＢ０１１０３、ＥＬＢ０１１０４及びＥＬＢ０１１０６）も、ＮＫ細胞に対する活性化効果を示さない。
【０３９８】
［実施例１４：ＩｇＧ１及びＥ３４５Ｋ／ＩｇＧ１フォーマットにおけるＨ７の異なるバリアントによるＮＫ細胞刺激活性の増加］
図１２が示すように、ＩｇＧ１及びＥ３４５Ｋ／ＩｇＧ１フォーマットにおける抗ＣＤ１６０  Ｈ７抗体に由来するバリアントは、ＮＫ細胞を活性化する能力が高くなっている。健康なドナーの血液から精製されたＮＫ細胞を、単独又は抗ＣＤ１６０  Ｈ７  ＩｇＧ１抗体の存在下で、又は、ＥｌｓａＬｙｓによって０．００１〜１０μｇ／ｍｌの用量で作成されたバリアントＥＬＢ０２１０２、ＥＬＢ０２１０３、若しくはＥＬＢ０２１０４（３つのうちいずれもＩｇＧ１フォーマットで）、ＥＬＢ０２１１２、ＥＬＢ０２１１３若しくはＥＬＢ０２１１４（３つのうちいずれもＥ３４５Ｋ／ＩｇＧ１フォーマットで）の存在化で９６ウェルプレートのウェル（１ウェルあたり１×１０６細胞）で２４時間培養した。１０μｇ／ｍｌのヒトＩｇＧ１を陰性アイソタイプ対照として使用し、抗ＣＤ１６（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ｃａｔ＃１６−０１６６）を陽性アイソタイプ対照として使用した。
【０３９９】
ＩＦＮ−γを培養上清中のＥＬＩＳＡで分析した。表示結果は、３つの値の平均値＋／−標準誤差である。
【０４００】
ＮＫ細胞を収集し、蛍光色素ＡＰＣに結合した抗ＣＤ６９抗体で標識した。ＣＤ６９陽性細胞の割合をフローサイトメトリーで分析した。平均値（＋／−標準誤差）は３つの値から計算した。
【０４０１】
これらの結果を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して解析し、非線形回帰曲線（Ｌｏｇ（作動薬）に対する応答、３パラメータ方程式）を生成し、有効濃度の中央値（ＥＣ５０）を計算した。ＣＤ６９の誘導のＥＣ５０は、３つのバリアントＥＬＢ０２１１２、ＥＬＢ０２１１３又はＥＬＢ０２１１４については計算しなかった。これは、０．１μｇ／ｍｌ以上の濃度で細胞死が観察されたためである。これらのＥ３４５Ｋ／ＩｇＧ１フォーマットによって刺激されたＮＫの死は、おそらく細胞の強力な活性化に続いて誘導される。
【０４０２】
これらの結果はすべて、ＩｇＧ１フォーマットにおけるＨ７の３つのバリアント（ＥＬＢ０２１０２、ＥＬＢ０２１０３、ＥＬＢ０２１０４）がＮＫ細胞の活性化に関して元のＨ７  ＩｇＧ１抗体（ＥＬＢ０２１０１）よりもはるかに強力であり、ＥＣ５０を２〜３ｌｏｇ改善している。
【０４０３】
Ｅ３４５Ｋ／ＩｇＧ１フォーマットにおけるＨ７の３つのバリアント（つまり、ＥＬＢ０２１１２、ＥＬＢ０２１１３、ＥＬＢ０２１１４）は、ＩＦＮ−γ産生を誘導する能力がさらに向上し、ＥＣ５０が更に２ｌｏｇ（元のＨ７  ＩｇＧ１抗体（ＥＬＢ０２１０１）に対して４ｌｏｇ）改善している。
【０４０４】
実施例１３及び１４の結果は、Ｈ７抗体及びそのＩｇＧ１及びＥ３４５Ｋ／ＩｇＧ１フォーマットにおけるバリアントがＮＫ細胞を活性化し、それらのＩＦＮ−γ産生を誘導できることを示している。これらの特性により、がん患者の免疫応答を、ＮＫ細胞を介して、並びに、ＩＦＮ−γ（Ｔｈ１型応答を活性化することが知られているサイトカイン）によって活性化されたＴリンパ球及び抗原提示細胞を介して間接的に、刺激することができる。
【０４０５】
さらに、これらの特性により、ＩｇＧ１及びＥ３４５Ｋ／ＩｇＧ１フォーマットにおけるＨ７に由来する抗体は、この作用モードを有する、共投与される他の抗体によって誘導されるＡＤＣＣ細胞傷害活性を潜在的に増加させることができ、したがって、それらの治療効果の改善を可能にする。
【０４０６】
［実施例１５：ＩｇＧ１及びＥ３４５Ｋ／ＩｇＧ１フォーマットにおけるＨ７抗体のバリアントによるＮＫ及びＣＤ８＋Ｔ細胞の標識］
ＩｇＧ１及びＥ３４５Ｋ／ＩｇＧ１フォーマットにおける抗ＣＤ１６０  Ｈ７抗体に由来するバリアントは、ＮＫ及びＣＤ８＋Ｔ細胞をより効果的に標識する（図１３を参照）。
【０４０７】
２人の健康なドナーのＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）を、抗ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８及びＣＤ１９抗体及びＰＥに結合した抗ＣＤ１６０抗体（Ｌｙｎｘ  Ｒａｐｉｄ  ＲＰＥ抗体結合キット  参照ＬＮＫ０２２ＲＰＥ）（ＰＢＭＣの５×１０５について０．２５μｇ）で免疫標識した後、フローサイトメトリーで分析した。無関係なヒトＩｇＧ１（ｈＩｇＧ１）を陰性対照として使用し、Ｆｃ受容体を１５分ＡＴでヒトＦｃ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）で飽和させた。
【０４０８】
図１３Ａは、ＩｇＧ１フォーマット（ＥＬＢ０２１０２、ＥＬＢ０２１０３、ＥＬＢ０２１０４）又はＥ３４５Ｋ／ＩｇＧ１フォーマット（ＥＬＢ０２１１２、ＥＬＢ０２１１３、ＥＬＢ０２１１４）におけるＨ７のバリアントは、元のＨ７  ＩｇＧ１抗体よりも効率よくＮＫ細胞に結合すること（陽性標識されたＮＫ細胞の６０％〜８０％）を示している。図１３Ｂは、２人のドナーで明確に検出されたＣＤ８＋Ｔ細胞の集団も、Ｈ７バリアントでより効率的に標識されたことを示している。
【０４０９】
これらの結果は、ＩｇＧ１及びＥ３４５Ｋ／ＩｇＧ１フォーマットにおける抗ＣＤ１６０  Ｈ７抗体に由来するバリアントが、元のＨ７  ＩｇＧ１抗体よりも効率的にＮＫ及びＣＤ８＋Ｔ細胞に結合することを示している。
【０４１０】
これらの結果と前の実施例で示した結果は、Ｈ７  ＩｇＧ１抗体並びにＩｇＧ１及びＥ３４５Ｋ／ＩｇＧ１フォーマットにおけるそのバリアントが、ＮＫ細胞に結合してその活性を刺激するだけでなく、ＣＤ８＋ＣＤ１６０＋Ｔリンパ球の集団にも結合でき、その活動を変調することもできることを示している。
【０４１１】
［実施例１６：眼科及び腫瘍学向けに最適化された抗ＣＤ１６０候補の二重特異性抗体（ｂｓａｂ）の設計及び生成］
＜眼科適応症に対する抗ＣＤ１６０との可能な二重特異性（ｂｓａｂ）：抗ＣＤ１６０  Ｈ７又は親和性成熟と組み合わせられる潜在的な第２結合価＞
文献（Ｌａｂｒｉｊｎら、２０１４）に記載されている手順を、親抗体である抗ｈＣＤ１６０  ＩｇＧ１  Ｆ４０５Ｌ（クローンＨ７）又はその誘導体由来の二重特異性ＩｇＧの開発と、実証実験として抗ｈアンジオポエチン２からなるＩｇＧ１  Ｋ４０９Ｒに適用した。
【０４１２】
抗体の１つは、表２２（眼科学適用）又は表２３（腫瘍学適用）から選択される。第１抗体は、眼科学ではＩｇＧ１  Ｎ２９７Ｑ  Ｈ３１０Ａ−Ｈ４３５Ｑ  Ｋ４０９Ｒフォーマット、腫瘍学ではＩｇＧ１  Ｋ４０９Ｒフォーマットである。第２抗体は、抗ＣＤ１６０  Ｈ７（又はそのバリアント）である。第２抗体は、眼科学適応症では、ＩｇＧ１  Ｎ２９７Ｑ  Ｈ３１０Ａ−Ｈ４３５Ｑ  Ｆ４０５Ｌフォーマット、腫瘍学ではＩｇＧ１  Ｆ４０５Ｌフォーマットである。
【０４１３】
表２２は、抗ＣＤ１６０  ｂｓａｂを産生するための潜在的な第２結合価として眼科学で使用できる、又は、抗ＣＤ１６０  Ｈ７若しくはそのバリアントとの併用療法で使用できる抗原標的抗体を示す。
【０４１４】
【表２２】
2020505013.tif 000023
【０４１５】
表２３は、抗ＣＤ１６０  ｂｓａｂを産生するための潜在的な第２結合価として腫瘍学で使用できる、又は抗ＣＤ１６０  Ｈ７又はそのバリアントとの併用療法で使用できる抗原標的抗体を示す。
【０４１６】
【表２３】
2020505013.tif 000024
【０４１７】
この技術を使用して、対象とする眼科学、腫瘍学又は免疫療法における適応に従い、抗ＣＤ１６０  ｂｓａｂ候補を生成できる。
【０４１８】
［実施例１７：抗ｈＣＤ１６０／抗ヒトアンジオポエチン２又は抗ｈＣＤ１６０／抗ヒトＣＤ２００Ｒの併用療法及び二重特異性の評価］
抗ＣＤ１６０及びその抗Ｘパートナー抗体（特にＸがアンジオポエチン２又はＣＤ２００Ｒの場合）や抗ＣＤ１６０／抗−Ｘ二重特異性の併用療法は、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）バッファーで誘導された角膜血管新生のウサギモデルにおける各抗体（１００μｇ及び５００μｇ）又はｂｓａｂの１００μｇ及び５００μｇでの効能や、効能の相加性及び／又は相乗効果について評価される（文献（Ｃａｍｐｏｓ−Ｍｏｌｌｏら、２０１１）に記載されているように）。
【０４１９】
［実施例１８：ＣＬ１−Ｒ２抗体はＣＤ１６０  ＧＰＩのみを認識するが、本発明に係る抗体はＣＤ１６０  ＧＰＩ及びＣＤ１６０  ＴＭに結合することができる。］
抗ＣＤ１６０  ＣＬ１−Ｒ２、ＥＬＢ０２１０１（Ｈ７  ＩｇＧ１）抗体、及びＥＬＢ０２１０４、ＥＬＢ０２１１４及びＥＬＢ０１１０３フォーマットにおけるＨ７バリアントの結合能力を、標識された細胞の割合（＝結合の割合）を測定することにより（図１４を参照）、組換え細胞株ＣＨＯ−Ｓ−ｈＣＤ１６０−ＧＰＩ（クローン２Ｇ１０）で発現した表面ヒトＣＤ１６０−ＧＰＩ（グリコシルホスファチジルイノシトール）の標識中に、及び、トランスフェションされていないＣＨＯ−Ｓ細胞と比較して組換え細胞株ＣＨＯ−Ｓ−ｈＣＤ１６０−ＴＭで発現した表面ヒトＣＤ１６０−ＴＭ（膜貫通）の標識中に評価した。このために、２×１０５個のＣＨＯ−Ｓ−ｈＣＤ１６０−ＧＰＩ、ＣＨＯ−Ｓ−ｈＣＤ１６０−ＴＭ及び非トランスフェクトＣＨＯ−Ｓ細胞を、これらの抗体それぞれ１μｇ及び適切な対照アイソタイプで標識した。
【０４２０】
図１４では、試験したすべての抗ＣＤ１６０（アイソタイプ、ＩｇＧフォーマット、又はバリアントに関係なく）は、ＣＨＯ−Ｓ細胞によって組換えられ発現されたヒトＣＤ１６０−ＧＰＩを特異的に認識する。ヒト化ＥＬＢ０２１０１（Ｈ７  ＩｇＧ１）及びフォーマットの異なるＨ７バリアントＥＬＢ０２１０４、ＥＬＢ０２１１４及びＥＬＢ０１１０３は、親ＣＬ１−Ｒ２よりもＣＨＯ−ｈＣＤ１６０−ＧＰＩトランスフェクタントにより効率的に結合する。予想に反して、ヒト化ＥＬＢ０２１０１（Ｈ７  ＩｇＧ１）及びそのバリアントＥＬＢ０２１０４、ＥＬＢ０２１１４及びＥＬＢ０１１０３は、ＣＨＯ−Ｓ細胞によって組換えられ発現されたヒトＣＤ１６０−ＴＭにも結合するが、親ＣＬ１−Ｒ２  ｍＡｂは試験用量に関係なく結合できない。
【０４２１】
［実施例１９：Ｈ７バリアント（ＥＬＢ０２１０４）によるＨＶＥＭ−ＣＤ１６０相互作用の遮断を通じてのＴ  ＣＤ４の再活性化］
図１５に示すように、ＩｇＧ１フォーマット（ＥＬＢ０２１０４）の抗ＣＤ１６０  Ｈ７抗体に由来するＡ０９バリアントは、対照アイソタイプと比較してＴ  ＣＤ４  ＣＤ４５Ｈｉｇｈ  ＣＤ１６０＋リンパ球を再活性化できる。ＥＬＢ０２１０４は、ＨＶＥＭ−ＣＤ１６０の相互作用を遮断することにより、ＨＶＥＭタンパク質によって誘導されるＴＣＤ４細胞の阻害を取り除く。
【０４２２】
健康なドナーの血液から精製したＴ  ＣＤ４リンパ球細胞を、抗ＣＤ１６０  ｍＡｂ（ＥＬＢ０２１０４又は適切な対照アイソタイプ１０μｇ／ｍｌ及びプレートにコーティングした抗ＣＤ３（クローンＵＴＣＨ１）、ｍＡｂ＋／−抗ＣＤ２８（クローンＣＤ２８．２）ｍＡｂ＋／−ＨＶＥＭタンパク質（１０３３４−Ｈ０８Ｈ、Ｓｉｎｏ  ｂｉｏ））の存在下、６ウェルプレート（１ウェルあたり１×１０６細胞）で１６時間培養した。
【０４２３】
Ｔ  ＣＤ４リンパ球を回収し、適切な生存マーカー（ゾンビＮＩＲ、ナイーブ／メモリー細胞を標的とする蛍光色素ＢＢ５１５に結合した抗ＣＤ４５ＲＡ抗体、ＣＤ１６０発現細胞を標的とする蛍光色素Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ６４７に結合した抗ＣＤ１６０（クローンＢＹ５５）抗体細胞、活性化細胞を標的とする蛍光色素ＰＥに結合した抗ＣＤ６９抗体）で標識した。ゾンビＮＩＲ−／ＣＤ４５ＲＡｈｉｇｈ＋／ＣＤ１６０＋／ＣＤ６９＋陽性細胞の割合をフローサイトメトリーで分析した。平均値（＋／−標準誤差）は２つの値から計算した。その結果によれば、ＩｇＧ１フォーマットのＨ７  Ａ０９バリアント（ＥＬＢ０２１０４）は、ＨＶＥＭ−ＣＤ１６０相互作用を遮断し、Ｔ  ＣＤ４  ＣＤ４５ＲＡＨｉｇｈ  ＣＤ１６０＋細胞によって発現される活性化マーカーであるＣＤ６９のアップレギュレーションによって示されるように、ＨＶＥＭタンパク質によって誘導されるＴＣＤ４細胞の阻害を取り除く。
【０４２４】
ＨＶＥＭは、いくつかの癌によって発現され、腫瘍の進行と免疫回避の役割を果たす。Ｔ  ＣＤ４細胞のＨＶＥＭ−ＣＤ１６０相互作用を遮断すると、Ｔ  ＣＤ８細胞傷害性生成による抗腫瘍応答が回復する場合がある。
【０４２５】
［実施例２０：Ｈ７  ＩｇＧ１（ＥＬＢ０２１０１）並びにＩｇＧ１（ＥＬＢ０２１０４）及びＥ３４５Ｋ／ＩｇＧ１（ＥＬＢ０２１１４）フォーマットにおけるＨ７  Ａ０９のＮＫ細胞刺激活性によるＤＣ（樹状細胞）成熟］
ＩｇＧ１（ＥＬＢ０２１０４）及びＥ３４５Ｋ／ＩｇＧ１（ＥＬＢ０２１１４）フォーマットにおけるＨ７  Ａ０９バリアント抗体は、Ｈ７  ＩｇＧ１（ＥＬＢ０２１０１）及び親ＣＬ１−Ｒ２  ｍＡｂと比較して、ＮＫ細胞刺激活性によりＤＣ成熟細胞を誘導する能力が向上している。
【０４２６】
健康なドナーの血液から精製された単球細胞は、ＧＭ−ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）及びＩＬ−４（２０ｎｇ／ｍＬ）で６日間未熟な樹状細胞に分化した。健康なドナーの血液から精製したＮＫ細胞を、９６ウェルプレート（１ウェルあたり１×１０６細胞）を用いて、単独で、又は抗ＣＤ１６０  ｍＡｂｓ（ＣＬ１−Ｒ２、Ｈ７  ＩｇＧ１（ＥＬＢ０２１０１）、若しくはバリアントＥＬＢ０２１０４（ＩｇＧ１フォーマット）、ＥＬＢ０２１１４（Ｅ３４５Ｋ／ＩｇＧ１フォーマット）、ＥＬＢ０１１０３（ＩｇＧ４フォーマット））の１０μｇ／ｍｌ及び適切なコントロールアイソタイプの存在化で、１６時間培養した。未成熟ＤＣ（１×１０５の細胞／ウェル）は、事前に抗ＣＤ１６０  ｍＡｂｓと２４時間インキュベートしたＮＫと共培養した。
【０４２７】
ＤＣ／ＮＫ共培養細胞を収集し、生存マーカー（ゾンビＮＩＲ、ＤＣ細胞を標的とする蛍光色素ＰＥ−Ｃｙ７に結合した抗ＣＤ１１ｃ抗体、ＮＫを標的とする蛍光色素Ｖｉｏｂｒｉｇｈｔ  ５１５に結合した抗ＣＤ５６抗体、成熟ＤＣ細胞を標的とする蛍光色素ＢＶ４２１に結合した抗ＣＤ８６抗体）で標識した。ゾンビＮＩＲ−／ＣＤ１１ｃ＋／ＣＤ８６＋陽性細胞の割合をフローサイトメトリーで分析した。２つの値から平均（＋／−標準誤差）を計算した。
【０４２８】
結果は、ＩｇＧ１（ＥＬＢ０２１０４）及びＥ３４５Ｋ／ＩｇＧ１（ＥＬＢ０２１１４）フォーマットにおけるＨ７  Ａ０９バリアントは、Ｈ７  ＩｇＧ１（ＥＬＢ０２１０１）と比較して、ＮＫ細胞刺激活性を介したＤＣ成熟細胞（ＣＤ８６アップレギュレーションによって示される）を誘導する能力が高いことを示す。驚くべきことに、親のＣＬ１Ｒ２  ｍＡｂにはＤＣ成熟を誘発する特性がない。
【０４２９】
実施例１３及び実施例１４に示される結果は、Ｈ７抗体並びにＩｇＧ１及びＥ３４５Ｋ／ＩｇＧ１フォーマットのそのバリアントがＮＫ細胞を活性化し、それらのＩＦＮ−γ産生を誘導できることを示している。これらの特性により、ＤＣ成熟が刺激され、成熟したＤＣとＴリンパ球との間のクロストークを介して、間接的に癌患者において抗腫瘍特性を持つ細胞傷害性Ｔリンパ球の生成を促進される。
【０４３０】
参考文献
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【図１Ａ】
2020505013.tif 000025
【図１Ｂ】
2020505013.tif 000026
【図１Ｃ】
2020505013.tif 000027
【図２】
2020505013.tif 000028
【図３Ａ】
2020505013.tif 000029
【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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