(57)【要約】本発明は、アラビノースを代謝するのに適した酵母株を得る方法、および、例えば酢酸などの阻害剤の存在下で、アラビノースならびにキシロースおよびグルコースを代謝する能力に関して良好な性能を有する改善された株に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アラビノースを代謝できる酵母株を得るおよび選択するための方法であって、
−酵母株におけるａｒａＡ、ａｒａＢおよびａｒａＤ遺伝子、有利にはＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのａｒａＡ、Ｅ．ｃｏｌｉのａｒａＢおよびａｒａＤの染色体組み込み；
−アラビノースを代謝できる株の選択のために、該形質転換株を、唯一の炭素源としてアラビノースを含有する培地中の直接培養に置くこと；
−所望により、０．００２Ｕ／ｇタンパク質以下、またはさらに０．０００５Ｕ／ｇタンパク質以下のアルドースレダクターゼ活性について代謝アラビノースを有する形質転換株を選択すること
を含む、方法。
【請求項２】
使用される酵母株が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｙａｒｒｏｗｉａ、Ｐａｆｆｉａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ、Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ、ＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓおよびＤｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ、有利には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
使用される酵母株が、例えば酢酸などの非解離型の有機酸の存在下で、キシロースを発酵することができる、有利には、２０１５年１月２９日に番号Ｉ−４９５３の下でＣＮＣＭに登録された株であることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
０．００２Ｕ／ｇタンパク質以下、またはさらに０．０００５Ｕ／ｇタンパク質以下のアルドースレダクターゼ活性をさらに示すことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法を用いて得られる酵母株。
【請求項５】
２０１６年５月１９日にＣＮＣＭ(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15)に登録された、Ｉ−５０８５株であることを特徴とする、請求項４に記載の酵母株。
【請求項６】
酢酸などの非解離型の有機酸の存在下で、アラビノース、グルコースおよびキシロースを発酵する改善された能力を有する酵母株を得るおよび選択するための方法であって、かかる能力を示す酵母株、有利には、請求項４および５の一つに記載の株が、以下の条件：
−唯一の炭素源として、アラビノースおよびキシロースをバイオマスの製造のための限界濃度で、有利にはそれぞれ５ｇ／Ｌおよび４ｇ／Ｌの量で含有する培地中の嫌気性または低酸素培養；次いで
−一方は、唯一の炭素源としてグルコースを含有する培地中での、他方は、唯一の炭素源としてキシロースを含有する培地中での、非解離型の有機酸、有利には酢酸の存在下での２回の連続した嫌気性または低酸素培養；
−場合により、唯一の炭素源として、厳密な呼吸用炭素源、有利にはグリセロールを含有する最小培地中での好気性培養
の下で連続的に育成される、方法。
【請求項７】
種々の培地中での株の連続した培養を少なくとも２回繰り返すことを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
２０１６年５月１９日にＣＮＣＭ(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15)に登録されたＩ−５０８６株であることを特徴とする、請求項６〜７のいずれか一項に記載の方法により得ることができる酵母株。
【請求項９】
有利にはＧＲＥ３遺伝子のレベルで挿入された、ＨＡＡ１遺伝子の少なくとも１つの過剰コピーを有することを特徴とする、請求項４〜５および８のいずれか一項に記載の酵母株。
【請求項１０】
請求項４〜５および８〜９のいずれか一項に記載の株の培養により得られる酵母。
【請求項１１】
有利にはアラビノースおよび／またはキシロースを含有する、材料の発酵のための、および／またはエタノールの製造のための、請求項４〜５および８〜９のいずれか一項に記載の株、または請求項１０に記載の酵母の使用。
【請求項１２】
以下の工程：
−アラビノースおよび／またはキシロースを含有する材料または培地と、請求項４〜５または８〜９のいずれか一項に記載の株または請求項１０に記載の酵母とのインキュベーション；
−嫌気性または半嫌気性条件下での発酵；
−１以上の発酵産物、またはエタノールの回収
を含む、発酵産物またはエタノールの製造のための方法。
【請求項１３】
該材料または培地が、グルコースも含有することを特徴とする、請求項１２に記載の発酵産物またはエタノールの製造のための方法。
【請求項１４】
該材料または培地が、ヘミセルロースまたは「トウモロコシ繊維」であることを特徴とする、請求項１２または１３に記載の発酵産物またはエタノールの製造のための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有利には、非解離型の酢酸などの、キシロースおよびグルコースの２つの発酵の阻害剤の存在下でキシロースおよびグルコースを発酵する能力と組み合わせて、アラビノースを代謝できる酵母株に関する。
【０００２】
より具体的には、本発明は、リグノセルロースヒドロシレート（ｈｙｄｒｏｓｙｌａｔｅ）中に回収される両方のタイプのペントースである、アラビノースおよびキシロースも代謝する能力において機能する、アラビノースを代謝できる株およびその改善された株の選択のための方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
主に農業および農産業活動に由来するリグノセルロースまたは植物バイオマスは、セルロース、ヘミセルロースおよびリグニンである３つの主要画分からなる複雑な基質である。これは、エタノールの製造に使用されるリサイクル可能な廃棄物に関し、その需要は、例えばバイオ燃料としての使用のために増加し続ける。
【０００４】
リグノセルロースバイオマスからエタノールを製造するための方法は、セルロースおよびヘミセルロース画分中に存在するできるだけ多くの糖を加水分解により回収し、次いで発酵によりエタノールに変換することからなる。
【０００５】
Ｃ６糖（ヘキソース）およびＣ５糖（ペントース）の両方を含む、該バイオマス中に存在する糖の発酵に関して、特に、グルコースを発酵する能力がよく制御および開発されるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを使用した、酵母による嫌気性発酵が好ましい。
【０００６】
しかしながら、リグノセルロースバイオマス中に含有される全糖の２５〜４０％までを表すことができるペントース、特にキシロースの発酵に十分な注意が与えられる。したがって、グルコースを発酵することができる酵母株は、ペントースを代謝することもできるように改変された。
【０００７】
例として、文献ＷＯ２０１０／０００４６４は、酵母により代謝できるキシロースをキシルロースに変換するキシロースイソメラーゼ（ＸＩ）をコードする細菌遺伝子のために、ペントースを発酵することができる酵母株を得たことを報告する。
【０００８】
代替の方法において、キシリトールを生成するキシロースレダクターゼ（ＸＲまたはＸＹＬ１）およびキシリトールデヒドロゲナーゼ（ＸＤＨまたはＸＹＬ２）を含む経路も、キシルロースを製造することができることに留意すべきである。
【０００９】
したがって、文献ＷＯ２０１２／０７２７９３は、キシロースイソメラーゼおよびキシロースイソメラーゼの阻害剤であることが証明されているキシリトールを除去することができるキシリトールデヒドロゲナーゼをコードする外因性遺伝子を組み合わせた改善された酵母株を記載する。かかる株、特に２０１１年１０月５日に番号Ｉ−４５３８の下でＣＮＣＭ(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes)に寄託された株は、収量が改善され、したがってエタノールの製造に対する産業上の利用性が証明されている。
【００１０】
別の重大な問題は、リグノセルロース加水分解物において、発酵阻害剤の存在を示しており；それらの中には、フルアルデヒド（フルフラールおよびＨＭＦ）、フェノール化合物および有機酸（酢酸、レブリン酸、ギ酸など）がある。５ｇ／ｋｇ（初期培地）を超え、１０ｇ／ｋｇに達することができる高濃度の酢酸の存在は、本質的に、ヘミセルロース分子に共有結合したアセチル基の存在に関連している。
【００１１】
以前の研究は、発酵前の液（ｍｕｓｔ）中の酢酸の存在に対する株の耐性の改善に関して行った。したがって、文献ＷＯ２０１１／０８０４１１は、グルコースの酢酸に対する改善された耐性を有する酵母株を得たことを報告した。
【００１２】
しかしながら、酢酸もキシロース発酵の阻害剤である。該阻害は、キシロースの消費の動態の減少を特徴とし（Bellisimi et al., FEMS Yeast Res., 2009, 9:358-364）、一方グルコースに関しては、該阻害は、発酵の開始の遅延により反映され、動態はその後不変のままである。培地中のグルコースおよびキシロースの両方の存在下で、異化代謝産物阻害のために、酵母株は最初にグルコースを発酵することに留意すべきである。
【００１３】
したがって、ＷＯ２０１３／１７８９１５およびＷＯ２０１３／１７８９１８は、ペントース、特にキシロースを代謝でき、発酵阻害剤、特に酢酸に対して耐性である酵母株を得るための方法を記載する。
【００１４】
特に酢酸の存在下でグルコースおよびキシロースを発酵する能力において、さらにより改善された株は、文献ＷＯ２０１５／１２１５９５およびＦＲ  ３  ０３５  ４０５に記載される。
【００１５】
全ての該研究は、目的のペントースとしてキシロースに集中する。たとえ一般にヘミセルロース中の主なペントースと考えられていても、キシロースは唯一のものではない。したがって、時には４０％を超える割合で(Schadel et al., 2010, Physiologia Plantarum 139, 241-255)、植物構造中にアラビノースを見いだすことも可能である(Saddler, 1993, Wallingford, Oxon, UK: CAB International)。さらに、アラビノースはバガス中に見いだされ(Hanko and Rohrer, 2000, Anal. Biochem. 283, 192-199)、または「トウモロコシ繊維」と呼ばれるトウモロコシ由来の繊維中に見いだされる(Gulati et al.,1996, Bioresource Technology 58, 253-264)。
【００１６】
アラビノースの追加発酵の明白な経済的価値に加えて、以前に述べられているように(Schell et al., 2007, Bioresour. Technol. 98, 2942-2948)、残留アラビノースをグルコースおよびキシロースの発酵の阻害剤である有機酸に場合により変換することができる汚染微生物の開発のための選択の基質を、残留アラビノースが形成してもよいことも注目に値する。
【００１７】
多くの微生物が、真菌微生物、特にＳｃｈｅｆｆｅｒｓｏｍｙｃｅｓ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ、担子菌類および糸状菌などの半子嚢菌類においてのみならず、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓおよびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍなどの細菌においても、アラビノースを代謝できると記載されている。
【００１８】
しかしながら、産業的に使用することができる酵母株、特にＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ酵母により許容されるのと同じくらい高いエタノール力価を支持することができるものの中で、アラビノースを天然に発酵することができると報告されるものはない。
【００１９】
文献ＷＯ０３／０９５６２７は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの（Ｌ−アラビノースイソメラーゼをコードする）遺伝子ａｒａＡ、Ｅ．ｃｏｌｉの（有利に変異したＬ−リブロキナーゼをコードする）ａｒａＢおよび（Ｌ−リブロース−５−Ｐ−４エピメラーゼをコードする）ａｒａＤを特に有するマルチコピープラスミドにより実験株を形質転換することによりアラビノースで成長できるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株を得る可能性を報告している。該文献は、キシロースを共発酵することができる株を得る可能性の問題を公然と掲げる。
【００２０】
文献ＷＯ２００８／１２２３５４は、唯一の炭素源としてアラビノースを含有するアエロビオース（ａｅｒｏｂｉｏｓｅ）培地またはアンアエロビオース（ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｅ）培地中で成長することができる、有利にはコドン最適化された、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓの遺伝子ａｒａＡ、Ｅ．ｃｏｌｉの（有利に変異した）ａｒａＢおよびａｒａＤを保有する自己複製ベクターを使用して形質転換したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株を記載する。形質転換体は、炭素源としてグルコースを含有する培地中での培養により選択される。
【００２１】
文献ＷＯ２００８／０４１８４０は、酵母にアラビノースを代謝する能力を与える、該場合はＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ由来の、ａｒａＡ、ａｒａＢおよびａｒａＤの特定の配列を記載する。実際、アルドースレダクターゼ遺伝子ＧＲＥ３を欠失し、ペントースリン酸経路（ＴＡＬ、ＴＫＬ１、ＲＰＥ１およびＲＫＩ１）を過剰発現し、そしてキシロース発酵経路（ＸＩまたはＸｙｌＡおよびＸＫＳ１）を発現する実験用のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中にプラスミドを介して遺伝子を導入する。著者らによれば、かかる株は、アラビノースを含有する培地上で直接成長することはできず、ガラクトースを含有する培地上での前培養が必要である。さらに、該培養から得られる株は、キシロースを代謝する能力を失っている。
【００２２】
文献ＷＯ２０１２／１４３５１３は、ＷＯ２００９／１１２４７２に記載されるＳｅｑｕｅｎｔｉａｌ  Ｂａｔｃｈ  Ｒｅｐｅａｔ法を用いた、２０ｇ／Ｌのアラビノースおよび２０ｇ／Ｌのキシロースを含有する培地中での培養後に、グルコース、キシロースおよびアラビノースを発酵する能力を与える、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓタイプの酵母種における少なくともａｒａＡ、ａｒａＢおよびａｒａＤならびにＸｙｌＡ遺伝子の染色体組み込みを報告する。様々な遺伝子（ＳＳＹ１、ＹＪＲ１５４ｗ、ＣＥＰ３、ＧＡＬ８０、ＰＭＲ１）の突然変異が、観察された。
【００２３】
しかしながら、酢酸の存在下でさえグルコースおよびキシロースを発酵する能力に加え、アラビノースを代謝できる酵母株を得る必要性が現れた。
【発明の概要】
【００２４】
本発明は、以下の種々の態様に関連して本発明者らの貢献に基づいて、少なくともアラビノースを代謝するのに適した新規の酵母の株の同定に関する：
−アラビノース代謝経路を導入することは必要であるが、アラビノースの効果的な代謝を保証するには不十分であるという事実を強調すること；
−アラビノース代謝経路を、唯一の炭素源としてアラビノースを含有する培地上に組み込んだ形質転換体を直接選択する可能性を強調すること；
−アラビノースの効率的な発酵を確実にするために、ポリオールの製造の厳密な制御に対する必要性を強調すること；
−キシロースおよびアラビノースの発酵が、安定した環境で共存できることを強調すること；
−アラビノース、キシロースおよびグルコースの発酵を同時に改善することができる酵母株の選択のためのプロトコルであって、酢酸などの発酵阻害剤の存在下での後ろ２つの糖の発酵を含むプロトコルを完成させること。
【００２５】
第一の態様によれば、本発明は、以下の工程を含む、アラビノースを代謝できる酵母株を得るおよび／または選択するための方法に関する：
−アラビノースを代謝するための経路の酵母株中への導入；
−以下の基準：
ａ／唯一の炭素源としてアラビノースを含有する培養培地中に存在するアラビノースを代謝する能力、および／または
ｂ／低いまたはゼロでさえあるアルドースレダクターゼ活性
のうちの少なくとも１つに基づいて、該経路を発現することができる株の選択。
【００２６】
特定の実施形態によれば、該方法は以下を含む：
−酵母株におけるａｒａＡ、ａｒａＢおよびａｒａＤ遺伝子、有利にはＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのａｒａＡ、Ｅ．ｃｏｌｉのａｒａＢおよびａｒａＤの染色体組み込み；
−アラビノースを代謝できる株の選択のための、唯一の炭素源としてアラビノースを含有する培地中への形質転換株の直接培養に配置。
【００２７】
有利には、該方法はさらに、０．００２Ｕ／ｇタンパク質以下の、さらには０．０００５Ｕ／ｇタンパク質以下のアルドースレダクターゼ活性に基づく、代謝アラビノースを有する形質転換株の選択を含む。
【００２８】
本発明の文脈において、「酵母株」は、遺伝的観点から厳密に同一の酵母の集団であると理解される。これは、実験株と呼ばれる株および産業株と呼ばれる株の両方を包含する。
【００２９】
有利には、該方法において使用される酵母株は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｙａｒｒｏｗｉａ、Ｐａｆｆｉａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ、Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ、ＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓおよびＤｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ株、有利には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株から選択される。これらの酵母は、アラビノースを、天然に代謝できないかまたは産業的に適用可能ではない非常に低いレベルで代謝することで知られる。さらに、それらは、嫌気性発酵能力、さらにより有利には嫌気性アルコール発酵について有利に選択される。
【００３０】
特定の実施形態によれば、本出願の目的である該方法は、キシロースを発酵するのに適した、有利には酢酸などの非解離型の有機酸の存在下でキシロースを発酵するのに適した株に対して行われる。先行技術において広く開示されるように、キシロースを代謝する能力は、例えばＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ由来のキシロースイソメラーゼおよび／またはキシルロキナーゼをコードする遺伝子の導入をもたらすことができる。
【００３１】
有利には、これらは以下の株である：
−２０１１年１０月５日に番号Ｉ−４５３８の下でＣＮＣＭに登録された株；
−２０１３年５月１６日に番号Ｉ−４７４９の下でＣＮＣＭに登録された株；
−２０１３年１２月１２日に番号Ｉ−４８２９の下でＣＮＣＭに登録された株；
−２０１５年４月９日に番号Ｉ−４９６６の下でＣＮＣＭに登録された株；
より有利には、２０１５年１月２９日に番号Ｉ−４９５３の下でＣＮＣＭに登録された株。
【００３２】
本発明の目的のため、アラビノースを代謝できる酵母株は、培養培地中に存在するアラビノース、有利にはＬ−アラビノースを消費または使用することができる株である。したがって、特に培養条件に基づいて、酵母株は、バイオマスの製造および／または発酵産物の生成のためにアラビノースを使用することができる。本出願の目的のため、アラビノースの発酵は、低酸素状態および／または嫌気的に、すなわち酸素の利用可能性が低い（典型的には２０％未満）かまたは完全に酸素が存在しない条件下で起こるアラビノースの代謝であると理解される。
【００３３】
したがって、本発明の意味の範囲内で、「代謝する」なる語は、成長を確実にするためにアラビノースを使用する酵母株の能力および、エタノールまたはイソブタノールを含むヒドロキシ誘導体および／または有機酸を含むカルボン酸塩などの種々の発酵産物においてアラビノースを発酵する能力を対象とすることができる。
【００３４】
特定の実施形態によれば、Ｌ−アラビノースを、Ｌ−リブロースおよび／またはＬ−リブロース−５−ホスフェートに、および／またはＤ−キシルロース−５−ホスフェートに、および／またはエタノールなどの発酵産物に変換する能力が言及される。１つの有利な実施形態によれば、そして図１に見られるように、Ｌ−アラビノースは、アラビノースイソメラーゼ（ａｒａＡ：ＥＣ：５．３．１．４）の作用下でＬ−リブロースに変換される。Ｌ−リブロースはそれ自体、リブロキナーゼ（ａｒａＢ；ＥＣ：２．７．１．１６）の作用下でＬ−リブロース−５−ホスフェートに変換されることができる。従って、Ｌ−リブロース−５−ホスフェートは、リブロース−５−リン酸エピメラーゼ（ａｒａＤ；ＥＣ：５．１．３．４）によりＤ−キシルロース−５−ホスフェートに変換されることができる。有利には、Ｄ−キシルロース−５−ホスフェートは、ペントースリン酸経路の非酸化的部分により行われ、そしてエタノールの製造をもたらすことができる。
【００３５】
本発明による方法の初期の工程において、アラビノースの代謝を可能にする遺伝子が酵母株に導入され、次いでそれは形質転換株と呼ばれる。
【００３６】
以下において、「遺伝子」または「配列」なる語は、調節配列、特にプロモーターまたはターミネーターが隣接している可能性があるコード配列（例えば、目的の経路からの酵素をコードする）を含む核酸配列を意味する。コード配列は、最適化可能、すなわち該配列が発現される宿主、ここでは酵母の好ましいコドンを組み込むように改変可能である。
【００３７】
特定の実施形態によれば、アラビノースの代謝経路をコードする遺伝子は、外因性または異種要素と呼ばれる遺伝的要素であり、合成的であることができ、または他の生物（または供給源）に由来することができる。有利には、それらは、アラビノースを代謝できる微生物、有利にはＳｃｈｅｆｆｅｒｓｏｍｙｃｅｓ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ、担子菌類および糸状菌などの半子嚢菌類、または、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓまたはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍなどの細菌に由来する。特定の実施形態によれば、これらの遺伝子は、細菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓおよび／またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉに由来する。別の好ましい実施形態によれば、これらの遺伝子は、ＷｉｄｅｍａｎｎおよびＢｏｌｅｓ（2008,Applied and Environmental Microbiology 74, 2043-2050; WO 2008/122354）により記載されているように、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来の遺伝子ａｒａＡ、Ｅ．ｃｏｌｉの遺伝子ａｒａＢ、およびＥ．ｃｏｌｉの遺伝子ａｒａＤに対応する。
【００３８】
ＤＮＡを宿主に導入（または形質転換）するために使用される技術は当業者に周知であり、熱を用いて（熱ショックの適用）電場をかけること（エレクトロポレーション）によって、または化学的に、例えば酢酸リチウムを使用することによって、膜の透過化を含む。
【００３９】
導入された遺伝子は、特に相同組換えまたは染色体組み込みにより、有利には組み込みカセットを用いて宿主のゲノムに組み込むことができ、またはプラスミドもしくはベクターを使用して染色体外で発現させることができる。特に複製起点、プロモーター（誘導可能または構成的）、マーカー（抗生物質に対する耐性または選択的培地上で成長する能力）および細胞あたりのコピー数により異なる、有利には自己複製する様々なタイプのプラスミドは、当業者に周知である。
【００４０】
一実施形態によれば、アラビノース代謝経路をコードする遺伝子は、有利には酵母株のＨＯ遺伝子座レベル、より有利には酵母株のすべてのＨＯ遺伝子座レベルで染色体上に組み込まれる。
【００４１】
有利には、この（これらの）遺伝子を保有し、酵母株に取り込む（ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅ)または組み込むのに役立つカセットは、マーカー、特に抗生物質耐性を欠く。
【００４２】
別の好ましい実施形態によれば、この（これらの）遺伝子を保有するカセットは、アラビノース担体をコードする遺伝子、特に遺伝子ａｒａＴを保有しない。
【００４３】
遺伝子の適切な導入は、当業者に公知の技術により、例えば発現カセットにより場合により収容されているマーカーを使用して、または好ましくは導入される遺伝子を標的とするプライマーを使用してＰＣＲを行うことにより、容易に確認することができる。さらに、標的とされる遺伝子座での遺伝子の組み込みを確認するために、特に該遺伝子座を標的とするプライマーを使用して、同じＰＣＲ技術を使用することができる。
【００４４】
本発明による方法の後の工程において、アラビノース代謝経路を取り込んで効果的に発現している目的の株は、唯一の炭素源として培養培地中に存在するアラビノースを代謝する能力について選択される。
【００４５】
本発明による特徴的な様式において、形質転換体の選択は、唯一の炭素源としてアラビノースを含有する培地上で直接行われる。言い換えれば、アラビノースを代謝する酵母株の能力は、唯一の炭素源としてアラビノースを含有する培地上で該株を培養することによりテストされる。このことは、いかなる以前の誘導、特にガラクトースの存在下または培地へのガラクトースの添加下での以前の培養、またはグルコースなどの他の炭素源を含有する培地上での形質転換体の事前選択をも排除する。
【００４６】
本発明の範囲において、培養または成長培地は、存在する株の増殖に必要な成分を含有する培地である。有利には、それは、塩、緩衝液、酵母抽出物または酵母が代謝できる他の任意の窒素源、ビタミンなどの従来の成分を含有することができる酵母の成長に適した完全培地に関する。本発明の文脈において、「合成培地」は、化学組成が既知の培地であると理解される。
【００４７】
適切な様式において、使用される培養条件は、特に以下のような、酵母の成長に有益な（ｆａｖｏｒａｂｌｅ）条件である：
−酸性ｐＨ、有利には４〜６、さらには４．５〜５．５、より有利には５または５．４に等しいｐＨを有する培養培地；
−２８〜３７℃、さらには３０〜３５℃、有利には３２℃に等しい温度；
−２４時間から数日の範囲、例えば７２時間の成長時間。
【００４８】
有利には、該成長は固体培地中で起こり、実際にアラビノースを代謝できる株を単離することを可能にする。別の有利な実施形態によれば、目的の株の選択は、ペトリ皿中での培養を使用してなされる。既知の様式において、該固体培地は、有利には１５〜２０ｇ／Ｌの濃度で、寒天を含有する。
【００４９】
第一の実施形態によれば、アラビノースを代謝できる酵母株は、唯一の炭素源としてアラビノースを含有する成長培地中で該株を好気的に成長させることにより選択される。
【００５０】
該好気性成長に適した１つの培地は、有利には１０ｇ／Ｌの濃度で、唯一の炭素源としてアラビノースを含有し、正確な組成が実施例において与えられる、以下ＹＮＢ−Ａｒａと呼ばれる培地などの合成培地ＹＮＢＤｉｆｃｏ（登録商標）である。
【００５１】
あるいは、アラビノースを代謝できる酵母株は、唯一の炭素源としてアラビノースを含有する成長培地中での嫌気性条件下または低酸素下での成長により選択することができる。
【００５２】
該嫌気性成長または低酸素成長に適した１つの培地は、有利には７０ｇ／Ｌの濃度で、唯一の炭素源としてアラビノースを含有し、正確な組成が実施例において与えられる、以下ＹＦ−ａｒａと呼ばれる培地などの合成培地ＹＦである。
【００５３】
有利には、該培地は、例えば寒天を添加し、ゆえに目的の株の直接的な単離を可能にする固体培地中での成長に適している。
【００５４】
代替の実施形態によれば、アラビノース代謝経路が導入された酵母株は、固体培地、有利には上記のＹＮＢ−Ａｒａ培地などの選択培地中で培養し、次いで、上記のＹＦ−ａｒａ培地などの適切な培地に液体培地中で嫌気条件下あるいは低酸素状態で選択することにより単離される。該液体培養は、Ｄｅｅｐ  Ｗｅｅｌなどのマイクロプレート中またはバイアル中で、低撹拌下、例えば１００ｒｐｍで、または撹拌なしでかつ酸素供給を減少させた条件下で（制限されたＯ２または嫌気性下で）行うことができる。
【００５５】
これらの条件下で、酵母株がアラビノースを代謝する能力は、以下により評価することができる：
−特に、有利には６００ｎｍで測定された培養培地の光学密度（ＯＤ）をモニターすることによる、それらの成長；および／または
−特に、該培養培地中に存在するアラビノースの濃度を、例えばＨＰＬＣによりモニターすることによる、またはエタノールのものと化学量論的なＣＯ２の製造と直接相関する質量の減少を評価することによる、アラビノースの発酵。
【００５６】
出願人の知る限り、アラビノースを唯一の炭素源として含有する培地上で酵母株を成長させることにより、アラビノースを直接代謝できる酵母株を選択する可能性が報告されたのは、これが初めてであることに留意してください。反対に、かかる直接選択はうまくいかないと報告したＷｉｓｓｅｌｉｎｋら(2007; Appl Environ Microbiol 73, 4881-4891; WO 2008/041840)における情報があれば、当業者はかかるアプローチを使用することを断念したであろうと考えられた。
【００５７】
別の有利な実施形態によれば、得られた酵母株はまた、同時にまたは続いて以下の条件下でテストすることができる：
−例えば、上記のようなＹＦ培地上であるが、１５０ｇ／Ｌのグルコースを含有する、唯一の炭素源としてグルコースを含有する成長培地上で、そして上で与えられる培養条件下で。該工程は、選択された株の有効性、特にグルコースを発酵する能力を確認することを可能にする。唯一の炭素源としてアラビノースを含有する培地（上記）上で、該選択された株を成長させ、表現型［ａｒａ＋］が安定かつ保存されていることを確認する前に、グルコース培地上への１以上の継代（ｐａｓｓａｇｅ）を行うことができる；
−例えば、上記のようなＹＦ培地上であるが、７０ｇ／Ｌのキシロースを含有する、唯一の炭素源としてキシロースを含有する成長培地（実施例におけるＹＦ−キシロース培地）上で、そして上で与えられる培養条件下で。該工程は、選択された株が、キシロースを発酵する能力を保持し、そして、本発明の方法が使用される酵母株がキシロースを発酵することができる場合に、興味を示すことを確認することを可能にする。
【００５８】
さらに、そして本発明の枠組みにおいて、アラビノースの代謝に対する目的の株の選択における重要な基準は、ポリオール製造レベルであることが示された。
【００５９】
既知の様式において、キシリトールなどのポリオールは、キシロースイソメラーゼ（ｘｙｌＡ）活性に対して阻害効果を有する(Kovalevsky et al., 2012, Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 68, 1201-1206)。本発明の枠組みにおいて、ポリオールはまた、アラビノースイソメラーゼ活性を阻害し（ａｒａＡ；図１）、それにより本発明による方法により選択された株のアラビノース代謝を減少させることができることが証明されている。
【００６０】
アラビトールは、キシリトールがキシロースから生成されるのと同じ方法で、アルドースレダクターゼの作用下でアラビノースから生成される可能性が高い。既知の様式において、ＧＲＥ３遺伝子が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける主要なアルドースレダクターゼをコードするが、それが欠失または不活性化されても、アルドースレダクターゼ活性が持続できることに留意すべきである。さらに、酵母株におけるキシリトールデヒドロゲナーゼ活性の存在は、キシリトールを排除する可能性を有する。
【００６１】
したがって、そして該仮定によれば、特定の目的に対して選択された株は、以下を示す：
−有利には０．００１Ｕ／ｇタンパク質以上、さらにより有利には０．００２Ｕ／ｇタンパク質以上の、強力なポリオールデヒドロゲナーゼ活性；および／または
−低いアルドースレダクターゼ活性。
【００６２】
実際に、そして本発明の枠組みにおいて、目的の株は、低い、ゼロでさえあるアルドースレダクターゼ活性に基づいて選択できることが強調されている。有利には、該活性は、０．００５Ｕ／ｇタンパク質より低い、さらには０．００４、０．００３、またはさらには０．００２Ｕ／ｇタンパク質である。より好ましくは、それは、０．００１５Ｕ／ｇタンパク質以下、さらには０．００１Ｕ／ｇタンパク質以下、より有利には０．０００５Ｕ／ｇタンパク質以下である。
【００６３】
アルドースレダクターゼ活性を測定するための詳細なプロトコルは、「実施例」に記載される。
【００６４】
さらに、そして有利には、本発明による方法において使用される酵母株は、１以上の欠失または不活性ＧＲＥ３遺伝子を示す。
【００６５】
別の好ましい実施形態によれば、本発明で使用される酵母株は、転写調節因子Ｈａａ１ｐをコードするＨＡＡ１遺伝子の少なくとも１つの過剰コピーを示す。既知の様式において、前者は酵母株、特にＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに酢酸に抵抗する能力を与えることができ、それにより酢酸などの有機酸タイプの発酵阻害剤を含有する培地中での成長を改善する。さらに、出願人は、該遺伝子の過剰発現により、他のフェノール化合物阻害剤、特にバニリンに対して耐性になることを示した。
【００６６】
有利には、Ｈａａ１ｐをコードする過剰遺伝子の発現は、異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇ）プロモーター、例えばｐＰＧＫ１プロモーターの制御下に置かれる。遺伝子ＨＡＡ１の該過剰コピーは、ネイティブタンパク質またはその変異型、例えば、Ｓｗｉｎｎｅｎら(2017, Microbial Cell Factories 16:7)により記載された構成的に活性なバージョンＨＡＡ１Ｓ１３５Ｆをコードしてもよい。
【００６７】
好ましい実施形態によれば、ＨＡＡ１遺伝子の追加のコピーは、さらにより有利にはＧＲＥ３遺伝子レベルで挿入することにより、染色体レベルで組み込まれる。そのことから、本発明の枠組みにおいて、以下の２つの有利な結果がある：
−アルドースレダクターゼをコードするＧＲＥ３遺伝子の不活性化；
−ＨＡＡ１遺伝子の過剰発現が、酵母株を、酢酸のみでなくバニリンに対してもより耐性にする。
【００６８】
目的の酵母株の選択工程に対応する本発明による方法の第二の工程は、前述の2つの基準のいずれか、有利には両方を評価するために使用することができる。特定の実施形態によれば、培養培地中に存在するアラビノースを代謝する能力が最初に評価され、次いで選択された株がアルドースレダクターゼ活性についてテストされる。
【００６９】
このように選択された株、特にアラビノースのみでなくグルコース、および場合によりキシロースも発酵する能力への興味は、混合物中の様々な糖、すなわちアラビノースおよびグルコース、さらにはキシロースを発酵することができる起源の株の場合、アラビノース、グルコースおよびキシロースを含有する合成培地上での性能を評価することにより確かめることができる。実際の発酵条件を模倣するために、これらの培地は、グルコースおよびキシロースの発酵を阻害することが知られている、有利には濃度１〜１０ｇ／Ｌの、酢酸をも含有する。
【００７０】
かかる培地の例は、ＹＰＦまたはＹＦＣＦであり、それらの組成を下に与える：
【００７１】
ＹＦＣＦ培地：
−酵母抽出物１０ｇ／Ｌ；
−バクトペプトン１０ｇ／Ｌ；
−グルコース６３ｇ／Ｌ；
−キシロース２８ｇ／Ｌ（２８ｇ／Ｌ  ｄｅｘｙｌｏｓｅ）；
−アラビノース２８ｇ／Ｌ；
−酢酸４ｇ／Ｌ（ｐＨ５で培養培地に添加される量）。
【００７２】
ＹＦＰ培地：
−酵母抽出物１０ｇ／Ｌ；
−バクトペプトン１０ｇ／Ｌ；
−グルコース６３ｇ／Ｌ；
−キシロース５２ｇ／Ｌ（５２ｇ／Ｌ  ｄｅ  ｘｙｌｏｓｅ）；
−アラビノース６．１ｇ／Ｌ；
−酢酸４ｇ／Ｌ（ｐＨ５で培養培地に添加される量）。
【００７３】
酵母におけるエタノールの製造に有益な標準的な培養条件は、以下である：
−有利には４〜６、例えば５に等しい、酸性で安定したｐＨ；
−２８〜３７℃、さらには３０〜３５℃、有利には３０℃に等しい温度；
−低撹拌、たとえば１００ｒｐｍ；
−酸素供給の低下された条件（制限されたＯ２下）。実際には、製造されるＣＯ２の排出を可能にしながら、培地中のＯ２の供給を減らすキャップを使用して、栓付きフラスコ中で該培養を行うことができる；
−飽和状態で２４時間ＹＰＧで増殖させた０．２５ｇ／ｋｇＭＳ等価の株の接種源を用いた播種；
−少なくとも２４時間、たとえば７２時間の成長時間。
【００７４】
本発明の枠組みにおいて、該手順により選択された株は、以下を明らかにする：
−バイオマスの製造を確実にするための、唯一の炭素源としてアラビノースを使用する能力；
−アラビノースを発酵する能力；
−非解離型の有機酸、特に酢酸の存在下でさえ、グルコース、および場合によりキシロースを発酵する能力。
【００７５】
上記の条件下での７２時間の発酵後に、以下が観察された：
−バイオマス、またはエタノールおよびＣＯ２のいずれかに変換された培養培地に存在するグルコースおよびキシロースの９５％、さらにはすべての消費；
−該培養培地中に存在するアラビノースの５０％、さらには６０％、７０％、またはさらには８０％を超える消費。
【００７６】
したがって、そして追加の態様によれば、本発明は、記載の方法を使用して得ることができ、（有利には、１〜１００ｇ／Ｌ、例えば６３ｇ／Ｌの濃度の）グルコース、（有利には、１〜１００ｇ／Ｌ、例えば２８または５２ｇ／Ｌの濃度の）キシロース、（有利には、１〜１００ｇ／Ｌ、例えば６．１または２８ｇ／Ｌの濃度の）アラビノース、および（有利には、１〜１０ｇ／Ｌ、例えば４ｇ／Ｌの濃度の）酢酸を含む培地中での７２時間の発酵後、アラビノースの少なくとも５０％、さらには６０％、７０％またはさらには８０％を発酵できる酵母株に関する。好ましくは、かかる酵母株は、存在するグルコースおよびキシロースの少なくとも９０％、さらには９５％も同時に発酵することができる。
【００７７】
有利には、かかる株はまた、以下の特徴の少なくとも１つ、さらにはすべてを示す：
−有利には染色体レベルで、より有利には少なくとも１つのＨＯ遺伝子座のレベルで組み込まれた、好ましくはＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍａ由来の遺伝子ａｒａＡの少なくとも１つのコピー；
−有利には染色体レベルで、より有利には少なくとも１つのＨＯ遺伝子座のレベルで組み込まれた、好ましくはＥ．ｃｏｌｉ由来の遺伝子ａｒａＢの少なくとも１つのコピー；
−有利には染色体レベルで、より有利には少なくとも１つのＨＯ遺伝子座のレベルで組み込まれた、好ましくはＥ．ｃｏｌｉ由来の遺伝子ａｒａＤの少なくとも１つのコピー；
−有利にはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ由来の、キシロースイソメラーゼをコードする外因性遺伝子の少なくとも１つのコピー；
−キシロースの捕捉を確実にすることができるヘキソースの輸送体をコードする遺伝子ＧＡＬ２の少なくとも１つの過剰コピー。別の実施形態によれば、該株は、ＧＡＬ２遺伝子の少なくとも２つの過剰コピーを含む。これは、ｐＡＤＨ１タイプの強力で構成的なプロモーターの制御下に置くことができる；
−有利には遺伝子座ＧＲＥ３のレベルでのＨＡＡ１遺伝子の挿入による、ＧＲＥ３によりコードされるアルドースレダクターゼ活性の抑制；
−特にプロモーターの改変または過剰コピーの導入による、キシルロキナーゼ（ＸＫＳ１）の過剰製造；
−ペントースリン酸経路の発現または過剰製造（ＲＰＥ１、ＲＫＬ１、ＴＫＬ１、ＴＡＬ１など）；
−キシロースレダクターゼ（ＸＲ）活性の欠如。
【００７８】
特定の実施形態によれば、かかる株は、以下の遺伝子：ＳＳＹ１、ＹＪＲ１５４ｗ、ＣＥＰ３、ＧＡＬ８０および／またはＰＭＲ１レベルで変異していない（ｎｏｔ  ｍｕｔｅｄ）。別の特定の実施形態によれば、該株は、以下：ＳＳＹ１遺伝子のＧ１３６３Ｔ、ＹＪＲ１５ｗ遺伝子のＡ５１２Ｔ、ＣＥＰ３遺伝子のＡ１１８６Ｇ、ＧＡＬ８０遺伝子のＡ４３６Ｃ、ＰＭＲ１遺伝子のＡ１１３Ｇの変異を保有しない。
【００７９】
特許請求の範囲に記載された方法を使用することにより得られた目的の特定の株は、２０１６年５月１９日に番号１−５０８５の下でＣＮＣＭ（Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15）に登録された株である。
【００８０】
別の態様によれば、本発明は、特にエタノールの製造の増加および培地中に存在するアラビノースのより多くの消費を特徴とする、有機酸発酵阻害剤、特に酢酸の存在下でアラビノース、キシロースおよびグルコースを発酵する能力が改善された酵母株を得るおよび/または選択するための方法に関する。
【００８１】
本発明はまた、有利には酢酸などの非解離型の有機酸の存在下で、グルコース、キシロースおよびアラビノースを発酵する能力が改善された酵母株を得るおよび／または選択するための方法に関し、ここで、酵母株は、以下の条件下で連続的に育成されるような能力を示す：
−バイオマスの製造のために、唯一の炭素源として、アラビノースおよびキシロースを制限された量で含有する第一の培地中での嫌気性培養；次いで
−連続した２つの嫌気性培養、１つは唯一の炭素源としてグルコースを含有する培地、もう１つは非解離型の有機酸、有利には酢酸の存在下で唯一の炭素源としてキシロースを含有する培地；
−所望により、唯一の炭素源として、厳密な呼吸炭素源、有利にはグリセロールを含有する最小培地中での好気性培養。
【００８２】
したがって、かかる方法は、使用される酵母株の誘導進化（ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）を達成することである。いずれの理論に固執することも望まず、以下で定義される成長培地中での連続した培養により発揮される選択圧により、該株はアラビノースを発酵する能力を高めるのに必要な表現型特性を取得し、そして、非解離型の有機酸、特に酢酸の存在下で、キシロースおよびグルコースを発酵する能力を保持することができる。
【００８３】
したがって、本発明による方法は、単離された株または株の混合物から、これら３つの糖および非解離型の該有機酸を含有する培地上での成長に関して選択的利点を有する１つの株を選択することを可能にする。
【００８４】
本出願の主題でもある該方法は、単離された株、特に２０１６年５月１９日に番号Ｉ−５０８５の下でＣＮＣＭ（Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15）に登録された株に使用できる。
【００８５】
該方法によれば、酵母株または株の混合物は、少なくとも3つの成長培地中で連続的に（ｃｏｎｓｅｃｕｔｉｖｅｌｙ）育成される。前述のように、「成長培地」および「培養培地」なる表現は、存在する酵母の増殖に必要な成分を含む培地を示すために交換可能に使用される。
【００８６】
有利には液体である第一の成長培地は、唯一の炭素源としてペントース、アラビノースおよびキシロースを含有することを特徴とする。
【００８７】
酵母の集団が2つの糖を有する場合、一般に、１つのみを使用してバイオマスを作ることが伝統的に同意されることに留意すべきである。該第一の糖が消費されると、該第二の糖を使用できる。したがって、キシロースおよびアラビノースなる２つのペントースの発酵表現型の安定性には実際のリスクがあった。
【００８８】
本発明による特徴的な様式において、第一の培地は、酵母株の炭素需要の１００％、有利にはそれぞれ５０％をカバーすることを可能にするペントースの濃度を含有する。別の実施形態によれば、アラビノースおよびキシロース（ｘｙｌｏｎｅ）は、等価な濃度、例えば、アラビノースについて５ｇ／Ｌ、キシロースについて４ｇ／Ｌの割合で存在する。
【００８９】
別の好ましい特徴によれば、正確な組成が制御され、有利には化学化合物が完全に決定される培地は、合成培地である。かかる培地は、例えば「ＧＯキシロースアラビノース」と名付けられ、組成が実施例において与えられる。かかる培地において、目下のキシロース（４ｇ／Ｌ）およびアラビノース（５ｇ／Ｌ）の場合、窒素源（（ＮＨ４）２ＰＯ４  １０ｇ／Ｌ）ではなく炭素源の量が、バイオマス製造を制限することに留意してください。したがって、かかる培地は、両方の糖を使用する酵母株の成長および増殖（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ）に有利である。
【００９０】
以下の工程は、選択された株の阻害剤、特に非解離型の酢酸に対する耐性が失われる起こりうるリスクを予測するために設計される。
【００９１】
したがって、該工程において、以下の２つの連続した嫌気性培養が実施される：
−唯一の炭素源としてグルコースを含有する成長培地中での１つ；および
−唯一の炭素源としてキシロースを含有する成長培地中でのもう一方。
【００９２】
２つの培養培地上での継代の順序は、所望により逆（キシロース培地、次いでグルコース培地）にすることができる。
【００９３】
有利には、成長培地中のグルコースまたはキシロースの濃度は、唯一の炭素源として使用される場合に一般に実施される濃度であり、特に、例えば、グルコースに対して１５０ｇ／Ｌ、キシロースに対して７０ｇ／Ｌに等しい、液体培地の場合の５〜２００ｇ／Ｌ（固体培地の場合の５〜２００ｇ／ｋｇ）を含む。
【００９４】
有利には、該培地は、両方の糖の発酵を阻害することができる有機酸をも含む。有利には、それは、酢酸またはギ酸、さらにより有利には酢酸を含む。
【００９５】
かかる酸の非解離型または非イオン化型のみが、阻害能力を有することが知られていることに留意すべきである。本発明の文脈において、カルボン酸の「非イオン化型または非解離型」は、そのプロトン化型として理解される。実際には、かかる有機酸の型は、組み込まれる培地のｐＨに依存する。酸のｐＫａよりも高いｐＨでは、酸はほとんど解離型またはＣＯＯ−イオンで見つかる。対照的に、より低いｐＨでは、大部分の型は非解離または非イオン化型（ＣＯＯＨ）である。本明細書の残りの部分において、培地のｐＨによる解離型および非解離型を包含する該培地に添加された酢酸が言及される。
【００９６】
有利には、成長培地中の非解離型の有機酸、有利には酢酸としての有機酸の濃度は、液体培地中に０．５〜５ｇ／Ｌ（固体培地中の０．５〜５ｇ／ｋｇに等価）、有利には１．３〜２．６ｇ／Ｌに含まれる。実際には、そして例として、該最終的な範囲は、３〜６ｇ／Ｌ、例えば４または５ｇ／Ｌに含まれる、ｐＨ５の成長培地に添加される酢酸の濃度に対応する。
【００９７】
これらの２つの成分に加えて、有利には、該成長培地は、嫌気的または低酸素状態での酵母の成長に適合した完全な合成培地、例えば正確な組成が実施例において与えられるＹＦ培地である。
【００９８】
本発明による方法の第二の工程の実施に適した培地は、例えば、ＹＦ−グルコース酸およびＹＦ−キシロース酸と呼ばれる培地であり、組成が実施例に詳述される。
【００９９】
これらの成長培地の特定の組成を超えて、本発明による方法のこれらの第一および第二の工程における酵母株または株の混合物の培養は、特に以下のような、酵母、特にＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓタイプの成長に有益な標準的な条件下、嫌気状態または低酸素状態およびそれらの発酵活性下で有利になされる：
−有利には４〜６、さらには４．５〜５．５に含まれる、さらにより有利には５または５．４に等しい酸性ｐＨ；
−２８〜３７°Ｃ、さらには３０〜３５°Ｃ、有利には３２°Ｃに等しい温度；
−例えば１００ｒｐｍに等しい、穏やかな撹拌下；
−酸素供給の制限された条件下（制限されたＯ２下）。実際には、キャップを使用して栓をしたフラスコ中で、製造されたＣＯ２を排出させる一方で培地中のＯ２の供給を減らしながら、培養を行うことができる。
【０１００】
一般に、加水分解可能な糖質炭素の供給源が完全に消費されると、培養は停止される。実際には、そして有利には、該培養は、少なくとも２４時間、さらには数日間、有利には最大７日間放置される。
【０１０１】
特定の実施形態によれば、本発明による方法は、特に機能的ミトコンドリアを有する呼吸できる細胞を選択することを目的とする、有利には液体である第四の成長培地中への酵母の継代をさらに含む。実際には、該方法における各サイクルでまたは少なくとも１回実施できる該工程は、産業用酵母の製造方法の文脈において呼吸不全表現型が不利になる可能性がある「プチ突然変異体（ｐｅｔｉｔｅ）」の出現を克服するのに役立つ。
【０１０２】
有利には、該第四の培地は、機能的なミトコンドリアを保持した細胞によりのみ使用されることができる炭素を唯一の炭素源として含有する貧弱なまたは最小の培地である。この場合、これは、厳密な呼吸炭素源のことを示し、系統的にミトコンドリアの酸化に関与し、エタノールを製造しない炭素源を意味する。有利には、それは、グリセロールまたは場合によりエタノールであることができる。言い換えれば、かかる培地は発酵可能な糖を含まない。
【０１０３】
有利には、成長培地のグリセロール濃度は、次のサイクルの第一の培養培地を接種するのに十分なバイオマスを得るために唯一の炭素源として使用される場合に、一般に使用される濃度であり、具体的には５〜５０ｇ／Ｌ、有利には１０〜５０ｇ／Ｌに含まれる、例えば１０ｇ／Ｌに等しい濃度である。
【０１０４】
定義により、最小培地は、炭素源に加えて、窒素源、カリウム源、リン源、硫黄源、マグネシウム源、カルシウム源、鉄源、微量元素源および水源をさらに含有する。
【０１０５】
該培養培地の調製に使用できる培地は、以下を含んでもよい：
−有利には３．４ｇ／Ｌの濃度での、ＤＩＦＣＯ（登録商標）酵母窒素塩基などの塩基；
−および所望により、有利には５ｇ／Ｌの濃度での硫酸アンモニウム。
【０１０６】
該成長培地の特定の組成を超えて、酵母株または株の混合物の培養は、特に以下のような、好気性下での酵母の成長に有益な標準的な条件下で有利になされる：
−有利には４〜６、さらには４．５〜５．５に含まれる、例えば５に等しい酸性ｐＨ；
−温度が２８〜３７°Ｃ、さらには３０〜３５°Ｃ、有利には３２°Ｃに等しい温度；
−例えば１５０ｒｐｍに等しい、中程度の撹拌下；
−好気性下で。実際には、該培養は、培地中でのＯ２の供給を可能にする多孔性キャップにより栓をしたバッフル付きフラスコ中でなされることができる。
【０１０７】
炭素源、有利にはグリセロールが完全に消費されると、再び培養は停止される。実際には、有利には、該培養は数時間、有利には４８時間にわたってなされる。
【０１０８】
これらの３つ、さらには４つの培地中での、および前述の条件下での該一連の培養は、１サイクルを構成する。
【０１０９】
実際には、本発明による選択サイクルは、以下であることができる：
−キシロースおよびアラビノースの存在下での第一の嫌気性または低酸素培養；
−グルコースおよび酢酸の存在下での第二の嫌気性または低酸素培養；
−キシロースおよび酢酸の存在下での第三の嫌気性または低酸素培養；
−場合により、グリセロールの存在下での第四の嫌気性培養；
または
−キシロースおよびアラビノースの存在下での第一の嫌気性または低酸素培養；
−キシロースおよび酢酸の存在下での第二の嫌気性または低酸素培養；
−グルコースおよび酢酸の存在下での第三の嫌気性または低酸素培養；
−場合により、グリセロールの存在下での第四の嫌気性培養。
【０１１０】
本発明によれば、これらの様々な培養は、例えば存在する培養培地を更新せずに、「シングルバッチリピート（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｂａｔｃｈ  Ｒｅｐｅａｔ）」法に従ってなされる。
【０１１１】
特定の実施形態によれば、かかるサイクルは、少なくとも２回（「マルチプルバッチリピート（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｂａｔｃｈ  Ｒｅｐｅａｔ）」）、例えば２回繰り返される。
【０１１２】
該方法は、アラビノース、グルコース、キシロースおよび酢酸を含有する天然培地に近い培地上での発酵中に、改善されたエタノール製造（より高いアルコール強度）および該培地中に存在するアラビノースのより良好な消費を示す酵母株の選択を可能にした。
【０１１３】
別の態様によれば、本発明は、上記の方法を使用することにより得られた酵母株に関する。それにより、該選択方法の終わりに、培地中に存在するアラビノースの消費能力が少なくとも１０％、さらには２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、またはさらには８０％を超えて増加した酵母株を単離することが可能であった。有利には、これらの性能は、培地ＹＦＣＦに関して上述した発酵条件下で、１６０時間後に評価される。
【０１１４】
実際、これらの条件下で、培養培地中に存在するアラビノースの９０％、さらには９５％またはさらには９７．５％を超える消費が観察された。
【０１１５】
したがって、追加の態様によれば、本発明は、記載された方法を使用して得ることができ、（有利には、１〜１００ｇ／Ｌ、例えば６３ｇ／Ｌの量の）グルコース、（有利には、１〜１００ｇ／Ｌ、例えば２８ｇ／Ｌの量の）キシロース、（有利には、１〜１００ｇ／Ｌ、例えば２８ｇ／Ｌの量の）アラビノース、および（有利には、１〜１０ｇ／Ｌ、例えば４ｇ／Ｌの量の）酢酸を含む培地中での１６０時間の発酵後に、少なくとも９０％、さらには９５％、またはさらには９７．５％のアラビノースを発酵することができる酵母株に関する。好ましくは、かかる酵母株は、存在するグルコースおよびキシロースの少なくとも９０％、さらには９５％、またはさらには１００％を同時に発酵することができる。
【０１１６】
有利には、かかる株はまた、以下の特徴の少なくとも１つ、さらにはすべての特徴を示す：
−有利には染色体レベルで、より有利には全ＨＯ遺伝子座のレベルで組み込まれた、好ましくはＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍａ由来のａｒａＡ遺伝子の少なくとも１つのコピー；
−有利には染色体レベルで、より有利にはすべてのＨＯ遺伝子座のレベルで組み込まれた、好ましくは大腸菌由来のａｒａＢ遺伝子の少なくとも１つのコピー；
−有利には染色体レベルで、より有利にはすべてのＨＯ遺伝子座のレベルで組み込まれた、好ましくは大腸菌由来のａｒａＤ遺伝子の少なくとも１つのコピー；
−有利にはクロストリジウムフィトフェルメンタンス由来の、キシロースイソメラーゼをコードする外因性遺伝子の少なくとも１つのコピー；
−キシロースの捕捉を確実にすることもできるヘキソースの輸送体をコードする、ＧＡＬ２遺伝子の少なくとも１つの過剰コピー。別の実施形態によれば、該株は、ＧＡＬ２遺伝子の少なくとも２つの過剰コピーを含む。これは、ｐＡＤＨ１タイプの強力で構成的なプロモーターの制御下に置くことができる；
−有利にはＧＲＥ３遺伝子座中へのＨＡＡ１遺伝子の挿入による、ＧＲＥ３によりコードされるアルドースレダクターゼ活性の抑制；
−特にプロモーターの改変または過剰コピーの導入による、キシルロキナーゼ（ＸＫＳ１）の過剰製造；
−ペントースリン酸経路（ＲＰＥ１、ＲＫＩ１、ＴＫＬ１、ＴＡＬ１など）の発現または過剰製造；
−キシロースレダクターゼ（ＸＲ）活性の欠如。
【０１１７】
別の有利な実施形態によれば、かかる株は、以下の特徴の少なくとも１つ、有利には両方を示す：
−有利には０．００１Ｕ／ｇタンパク質以上、さらにより有利には０．００２Ｕ／ｇタンパク質以上の、強力なポリオールデヒドロゲナーゼ活性；
−０．００５Ｕ／ｇタンパク質、さらには０．００４、０．００３、または０．００２Ｕ／ｇタンパク質未満、好ましくは０．００１５Ｕ／ｇタンパク質以下、さらには０．００１Ｕ／ｇタンパク質以下、最も好ましくは０．０００５Ｕ／ｇタンパク質以下の、アルドースレダクターゼ活性。
【０１１８】
特定の実施形態によれば、かかる株は、以下の遺伝子：ＳＳＹ１、ＹＪＲ１５４ｗ、ＣＥＰ３、ＧＡＬ８０および／またはＰＭＲ１のレベルで変異していない。別の特定の実施形態によれば、該株は、以下：ＳＳＹ１遺伝子のＧ１３６３Ｔ、ＹＪＲ１５４ｗ遺伝子のＡ５１２Ｔ、ＣＥＰ３遺伝子のＡ１１８６Ｇ、ＧＡＬ８０遺伝子のＡ４３６Ｃ、ＰＭＲ１遺伝子のＡ１１３Ｇの変異を保有しない。
【０１１９】
特に目的とされる株は、２０１６年５月１９日に番号Ｉ−５０８６の下でＣＮＣＭ（Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Doctor Roux, 75724 Paris Cedex 15）に登録された株である。
【０１２０】
特定の実施形態によれば、かかる株は、有利にはＧＲＥ３遺伝子レベルで挿入される、ＨＡＡ１遺伝子の少なくとも1つの過剰コピーを有する。
【０１２１】
別の態様によれば、本発明は、上記で定義された株の培養により得られた酵母も標的とする。
【０１２２】
本発明の文脈において、「酵母」は、酵母株の製造のための方法を実施することにより得られる市販製品であると理解される。したがって、単一の株から様々な特性を有する酵母を得ることができ、これらの違いは実施された製造方法に関連する。
【０１２３】
別の態様によれば、本発明は、有利にはアラビノースおよび／またはキシロースおよび／またはグルコースを含有する材料の発酵、および／またはエタノールの製造のための、上記で定義された株または酵母の使用に関する。
【０１２４】
特定の実施形態によれば、材料はリグノセルロース材料である。典型的に、かかる材料は以下を含有する：
−ペントース、特にＤ−キシロースおよびＬ−アラビノース；
−ヘキソース、特にＤ−マンノース、Ｄ−ガラクトース、Ｌ−ラムノースおよびＤ−グルコース；
−ウロン酸。
【０１２５】
特定の態様によれば、本発明は、以下の工程を含む発酵産物またはエタノールの製造方法に関する：
−アラビノースおよび／またはキシロースおよび／またはグルコース、有利にはアラビノース、キシロースおよび酢酸を含有する材料または培地の、上記で定義された株または酵母とのインキュベーション；
−嫌気性または半嫌気性（低酸素）条件下での発酵；
−１以上の発酵産物、またはエタノールの回収。
【０１２６】
特定の実施形態によれば、材料または培地は、ヘミセルロース、または「トウモロコシ繊維」である。
【０１２７】
本発明は、添付の図面により支持される以下の実施例を使用して、より前方に実証される。しかしながら、それらは範囲を限定しない。
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
【図１】Ｌ−アラビノースおよびＤ−キシロースをＤ−キシルロース−５−ホスフェートに変換する代謝経路を示す図である。
【０１２９】
【図２】Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＨＯ遺伝子座のレベルでの遺伝子ａｒａＡ／ａｒａＢ／ａｒａＤの組み込みを可能にするプラスミドｐＬ１２８５−０５５を示す図である。
【０１３０】
【図３】以下の表１におけるオリゴヌクレオチドを使用することにより得られたＰＣＲ産物を示す図である。トラック１は、サイズマーカー（１ｋｂＤＮＡラダー）に対応し、トラック２〜９は、テストした８つの形質転換体（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ）のＤＮＡゲノムマトリックスを使用することにより得られたＰＣＲ産物に対応し、トラック１０は、非形質転換株を用いて得られる。トラック１１は、該技術の陰性対照（水）であり、トラック１２は、プラスミドｐＬ１２８５−０５５をマトリックスとする陽性対照である。
【０１３１】
【図４】ＹＰＧ培地＋ブラストサイジン５０ｍｇ／Ｌ（Ａ）および１０ｇ／Ｌのアラビノースを含有するＹＮＢ−Ａｒａ培地（Ｂ）上でのコロニーの成長を実証する図である。
【０１３２】
【図５】唯一の炭素源としてアラビノース（Ａ）またはキシロース（Ｂ）を含有する培地上での、選択されたクローンの成長を実証する図である。
【０１３３】
【図６】アラビノースを発酵する能力について選択されたクローン１３（Ａ）および１２６（Ｂ）による、ＹＦＣＦ培地（６３ｇ／ｋｇのグルコース、２８ｇ／ｋｇのキシロース、２８ｇ／ｋｇのアラビノース、および４ｇ／ｋｇの酢酸ｐＨ＝５）上での発酵時間に基づく種々の成分の（ｇ／ｋｇで表される）濃度の変化（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）を表す図である。値は、生物学的に独立した３つの実験の平均値を表す。
【０１３４】
【図７】テストした種々の遺伝子プール（Ｉ−４９５３；クローン１３；クローン１２６）において測定したアルドースレダクターゼ活性を表す図である。値は、生物学的に独立した２つの実験の平均値を表す。
【０１３５】
【図８】クローン１２６および（ｐＡＤＨ１−ＧＲＥ３で形質転換された）形質転換体において４８時間の発酵後に観察された質量損失を表す図である。
【０１３６】
【図９】（Ａ）ＥＧ３１株からの誘導進化後に選択された様々なクローンのＹＦＣＦ培地上での発酵時間の関数としてのエタノール濃度（ｇ／ｋｇ）の変化を示す図であり;（Ｂ）これらの同じクローンおよびＥＧ３１株のＹＦＣＦ培地上での１６０時間の発酵後のアラビノースの濃度（ｇ／ｋｇ）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０１３７】
実施例
Ｉ／アラビノースを発酵できるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株を得ること：
１．アラビノース経路による形質転換：
アラビノースを発酵する経路を図１に示す。
【０１３８】
２０１５年１月２９日に番号ＣＮＣＭ  Ｉ−４９５３の下でＣＮＣＭ（Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15）に登録されたＩ−４９５３という株を、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの該株のＨＯ遺伝子座のレベルで、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｆｏｒｍｉｓの遺伝子ａｒａＡおよび大腸菌のａｒａＢ／ａｒａＤの組み込みを可能にするアラビノース経路の発現カセットを有するプラスミドｐＨＤ２２の誘導体である、プラスミドｐＬ１２８５−０５５（図２）で形質転換した。
【０１３９】
該株は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ由来のキシロースイソメラーゼをコードする外因性遺伝子の少なくとも１つのコピーの存在により、キシロースを代謝する能力でも知られる。
【０１４０】
さらに、該株は、ペントースリン酸経路の非酸化部分からの酵素をコードする遺伝子、特に遺伝子ＴＡＬ１およびＴＫＬ１を過剰発現する。
【０１４１】
２．アラビノース経路の染色体組み込みの検証：
アラビノースの代謝経路を形成する酵素をコードする種々の遺伝子、特に遺伝子Ａ、ＢおよびＤの適切な組み込みを、マトリックスとしての形質転換体のゲノムＤＮＡ、および対応する３つのＯＲＦそれぞれの断片を増幅するオリゴヌクレオチドを使用するＰＣＲにより確認した。該オリゴヌクレオチドおよびそれらの配列を、以下の表１に示す。
【表１】
2020506678.tif 000002
【０１４２】
得られたＰＣＲ産物を、ＴＡＥ０．５ｘ中での５０ボルトでの１時間の泳動後、０．８％のアガロースゲル上で分析した。
【０１４３】
図３に示す結果は、テストしたすべての形質転換体（８）において、アラビノース経路の３つの遺伝子に対して、ＰＣＲ産物が実際に増幅されたことを示す。該知見は、これらの遺伝子が酵母のゲノムに効果的に組み込まれたことを示唆する。
【０１４４】
さらに、遺伝子ａｒａＡ、ＢおよびＤが変異していないことをチェックするために、標準的な配列決定が行われた（データは示さず）。
【０１４５】
３．アラビノースを実際に代謝できる株の選択：
さらに研究を進めるために、アラビノース経路の発現システムを簡素化することを選択した。その趣旨で、アラビノース輸送体（ａｒａＴ）に対するコード配列が除かれながらも遺伝子ａｒａＡ、ＢおよびＤを発現するように、カセットを修飾した。
【０１４６】
アラビノースを代謝できる株の出現頻度を測定するために、２０１５年１月２９日にＣＮＣＭに登録されたＩ−４９５３株を、ａｒａＡ、ＢおよびＤを有する１．３μｇの該カセットを使用して形質転換した。
【０１４７】
形質転換の産物を、以下の２つのタイプの培地に散布した：
−５０ｍｇ／Ｌの量のブラスチシジンを含有するＹＰＧ（１０ｇ／Ｌの酵母抽出物；１０ｇ／Ｌのペプトン；２０ｇ／Ｌの唯一の炭素源としてのグルコース）に対応する第一の培地。目的は、カセットをゲノム中に組み込んだ細胞の数を決定することである；
−１０ｇ／Ｌの唯一の炭素源としてのアラビノースを含有する最小培地（ＹＮＢ  Ｄｉｆｃｏ（登録商標））に対応するＹＮＢ−Ａｒａと呼ばれる第二の培地。該培地は、表現型［ａｒａ＋］を取得した細胞の数を決定することを可能にしなければならない。
【０１４８】
番号０３３５−１５の下で参照されるＹＮＢ  Ｄｉｆｃｏ（登録商標）（「アミノ酸および硫酸アンモニウムを含まない酵母窒素ベース（Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ）」）の培地は、以下を含有する：
−ビオチン２μｇ／Ｌ
−パントテン酸塩（カルシウム）４００μｇ／Ｌ
−葉酸２μｇ／Ｌ
−イノシトール２０００μｇ／Ｌ
−ナイアシン４００μｇ／Ｌ
−ｐ−アミノ安息香酸２００μｇ／Ｌ
−ピリドキシン（塩素酸塩）４００μｇ／Ｌ
−リボフラビン２００μｇ／Ｌ
−チアミン（塩素酸塩）４００μｇ／Ｌ
−ホウ酸５００μｇ／Ｌ
−硫酸銅４０μｇ／Ｌ
−ヨウ化カリウム１００μｇ／Ｌ
−塩化第二鉄２００μｇ／Ｌ
−硫酸マグネシウム４００μｇ／Ｌ
−モリブデン酸ナトリウム２００μｇ／Ｌ
−硫酸亜鉛４００μｇ／Ｌ
−一塩基性リン酸カリウム１ｇ／Ｌ
−硫酸マグネシウム５００ｍｇ／Ｌ
−塩化ナトリウム１００ｍｇ／Ｌ
−塩化カルシウム１００ｍｇ／Ｌ
最終ｐＨ＝５．４
硫酸アンモニウム（５ｇ／Ｌ）
図４は、両方のタイプの培地上で得られた結果を実証する。
【０１４９】
両方の培地中での６日間の成長後、コロニーを数えた。ＹＮＢ−Ａｒａ培地中のコロニーの数は、ＹＰＧ＋ブラスチシジン培地上で観察されたもののおよそ１８％であることを観察した。言い換えれば、アラビノースを唯一の炭素源として使用することにより、遺伝子ａｒａＡ、ＢおよびＤをゲノム中に組み込んだコロニーの１８％のみが成長できるようであった。
【０１５０】
以下のことが、上記より明らかである：
−遺伝子ａｒａＡ、ＢおよびＤをコードするカセットは必要であるが、表現型［ａｒａ＋］を得るには十分ではない；
−唯一の炭素源としてアラビノースを含有する培地上での形質転換体の直接選択は可能であり、このことは、ガラクトースの存在下での成長の前の工程は不要であることを明らかにするＷｉｓｓｅｌｉｎｋらの教示(2007; Appl Environ Microbiol 73, 4881-4891)に反する。
【０１５１】
続けるために、カセットをさらに簡素化し、いかなる選択マーカー、特に抗生物質に対する耐性をも除いた。
【０１５２】
ＹＮＢ−Ａｒａ培地上で成長した１１５６個の形質転換体を、次いでディープウェル形式（＝９６個のウェルを有するマイクロプレート）でテストし、アラビノースで嫌気的に成長する能力を確かめ、またキシロースおよびグルコースを発酵する能力の維持を確認した。
【０１５３】
該結果に使用される培地の構成を、以下に詳述する：
【０１５４】
ＹＦ培地＝
−酵母抽出物（ＥＸＬ）５ｇ／Ｌ；
−リン酸二アンモニウム４．７ｇ／Ｌ；
−クエン酸１１．４ｇ／Ｌ；
−クエン酸三ナトリウム１３．５ｇ／Ｌ；
−ＺｎＳＯ４２１．２ｍｇ／Ｌ；
−ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ１ｇ／Ｌ；
−チアミン１８．２４ｍｇ／Ｌ；
−ピリドキシン５．２８ｍｇ／Ｌ；
−ビオチン１．７６ｇ／Ｌ；
−パントテン酸塩３．８ｍｇ／Ｌ；
−ナイアシン２０ｍｇ／Ｌ；
−ミオイノシトール５０ｍｇ／Ｌ；
−リボフラビン１ｍｇ／Ｌ；
−パラアミノ安息香酸１．２ｍｇ／Ｌ；
−Ｔｗｅｅｎ８０、１ｇ／Ｌ。
培地ＹＦ−ａｒａ：７０ｇ／Ｌのアラビノースを含有する培地ＹＦ
培地ＹＦ−キシロース：７０ｇ／Ｌのキシロースを含有する培地ＹＦ
該培地のｐＨは５に保たれる。培養は３２℃で行われる。
【０１５５】
図５は、炭素の唯一の供給源としてアラビノース（Ａ）またはキシロース（Ｂ）を含有する培地上で成長を同時に続いた一連の株で得られた結果を実証し、後者の培地は、キシロースを代謝する能力を保持する株を選択することを可能にする。
【０１５６】
図５に示す結果は、株［ａｒａ＋］の選択方法が依然として改善されていることを示す：図５Ａは、テストした９１個のクローンのうちの１５個が、アラビノースを使用して再び増殖を開始できないようであることを示す。このことは、抗生物質に対する耐性に基づく選択とは対照的に、ＹＮＢ−Ａｒａでの選択は、表現型［ａｒａ＋］を取得した形質転換体の８５％を得ることを可能にすることを示唆する。
【０１５７】
図５に示す結果から現れた別の態様は、キシロースおよびアラビノースの２つの代謝経路の共存に関する。したがって、特定の株が表現型［ａｒａ＋］を取得して表現型［ｘｙｌ＋］を失うことは明らかである。一方、他のものは、グルコースでの継代培養後に表現型［ａｒａ＋］を保持していない（結果は示さず）。しかしながら、テストした９１個の株のうち、形質転換体のほぼ３／４である６７個が、二重表現型［ａｒａ＋；ｘｙｌ＋］を取得し、保持しているようである。
【０１５８】
４．２つの選択された株間の比較：
−ＹＦＣＦ培地上での発酵：
上記の（それぞれクローン１３および１２６と呼ばれる）２つの単離されたクローンの性能を、炭素源としてのグルコースのみでなく、バランスよく表された（ｂａｌａｎｃｅ  ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ）アラビノースおよびキシロース、ならびに酢酸を含有し、ゆえに天然発酵培地に近いｐＨ５のＹＦＣＦ培地中での発酵中に比較した。
【０１５９】
より具体的には、培地ＹＦＣＦの組成は以下である：
−酵母エキス１０ｇ／Ｌ；
−バクトペプトン１０ｇ／Ｌ；
−グルコース６３ｇ／Ｌ；
−キシロース２８ｇ／Ｌ；
−アラビノース２８ｇ／Ｌ；
−酢酸４ｇ／Ｌ（ｐＨ５で該培養培地に添加される量）。
【０１６０】
発酵条件は以下である：
−ｐＨ：５
−温度：３２°Ｃ
−Ｏ２条件：酸素供給なし
−撹拌：１００ｒｐｍ
−培養の持続時間：最大７２時間
−前培養／インキュベーション：２４時間以上ＹＰＧ培地中で飽和状態で以前に増殖させた、０．２５ｇ／ｋｇ等価の乾物（ＤＭ）の酵母。
【０１６１】
エタノール製造を、発酵フラスコからの質量損失を測定することにより間接的に測定し、該質量損失は、アルコールと化学量論的なＣＯ２製造と直接相関する。それを、培地１キログラムあたりのグラムで表す。
【０１６２】
培地中のグルコース、キシロース、アラビノースおよびグリセロールの濃度を、ＨＰＬＣにより追跡する。
【０１６３】
バイオマス変動を、４時間後に１０５°Ｃで残留乾燥材料を測定することにより評価する。
【０１６４】
図６に示す結果は、以下を明らかにする：
−より低いエタノール製造速度とも一致する、クローン１２６と比較したクローン１３に対するキシロースの消費速度の低下；
−アラビノースの消費速度がクローン１２６よりもクローン１３において低いことは注目に値する。したがって、３２時間の発酵後、クローン１３は１２．１＋／−０．６ｇ／ｋｇ、クローン１２６は１５．３＋／−０．５ｇ／ｋｇのアラビノースを消費した。
【０１６５】
ペントースは消費された一方、細胞外グルコースの濃度はゼロではなかったことも、注目に値する。
【０１６６】
クローン１３と１２６との間で観察された違い、特にアラビノース発酵速度を説明する試みをした。
【０１６７】
経路の活性の分析：
アラビノースおよびキシロースの代謝経路に関与する細胞内酵素活性をテストした。
【０１６８】
第一に、キシリトールデヒドロゲナーゼ活性レベルで顕著な差は観察されなかった（結果は示さず）。
【０１６９】
他方、クローン１３と１２６との間で異なるアラビノースイソメラーゼ活性（ａｒａＡによりコードされる）のプロファイルを観察し、クローン１３に対するより有意な競合的阻害があった（結果は示さず）。
【０１７０】
図７に示すように、該違いは両方のクローンのアルドースの減少レベル、より正確にはアルドースレダクターゼ活性の違いと相関する可能性がある。初代株Ｉ−４９５３において、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの主要なアルドースレダクターゼをコードする遺伝子ＧＲＥ３を欠失させたが、残存活性は残った（図７を参照）。
【０１７１】
細胞抽出物中のアルドースレダクターゼ活性の量（ｄｏｓａｇｅ）：
株の増殖
テストされる株を、成長させるためにリッチ培地（ＹＰＧ）中に置いた。十分なバイオマスを得るために、撹拌下での、３０°Ｃで２４時間の２つの連続した増殖期が必要であった。該バイオマスを採取すると、４時間１０５℃のオーブンを通過させた後、各クリーム１ｍｌについて乾物を測定した。発酵は、１００ｇの発酵培地ＹＦ−キシロースを含有する２５０ｍｌフラスコ中で行った。各フラスコに、０．５ｇ／ｋｇ等価の乾物の割合で播種した。発酵は、３日間１１０ｒｐｍでの撹拌下で、３２°Ｃで進行した。その段階で、５０ｍｌの発酵産物を回収し、次いでサンプルの様々な酵素活性およびタンパク質濃度を決定するのに役立てる。
【０１７２】
細胞抽出物の調製
遠心分離（４７００ｒｐｍ、２分、４°Ｃ）により５０ｍｌの発酵産物を回収し、次いで３ｍｌの０．１Ｍ、ｐＨ７のリン酸カリウムバッファー中に再懸濁する。別の遠心分離後、次いで各ペレットを、１ｍｌの０．１Ｍ、ｐＨ７のリン酸カリウムバッファー中に再懸濁する。
【０１７３】
次いで、１ｍｌの再懸濁ペレットを、Ｆａｓｔ  Ｐｒｅｐ用の１本のチューブ（２５０μｌのボールで充填済み）に移行させ、次いで４°Ｃで、各３０秒間隔で４ｘ３０秒（６ｍ／ｓ）粉砕する。次に、（細胞の破片と一緒に該ボールを回転させるため）ホモジネートを、３分間１００００ｒｐｍまで遠心分離し、上清全体を、氷上で冷却したエッペンドルフチューブに移行させる。
【０１７４】
酵素活性の量
酵素活性の量を、３４０ｎｍでの吸光度をモニターすることにより行う。測定を、サーモスタットで制御された環境で３２°Ｃで行う。
2020506678.tif 000003
【０１７５】
図７に示す結果は、親株Ｉ−４９５３と比較した、クローン１３および１２６のアルドースレダクターゼ活性の非常に急激な低下を示す。しかしながら、該活性は、クローン１３においてクローン１２６の２倍の高さであることに留意する。該観察は、クローン１２６と比較したクローン１３の低い性能を説明できるようである。該結果をキシロースおよび／またはアラビノースの発酵性能を用いて裏付けるため、クローン１２６のアルドースレダクターゼ活性を増加させる試みをした。
【０１７６】
アラビノースを代謝する細胞の能力に対する、アルドースレダクターゼをコードする遺伝子の再導入の影響：
クローン１２６と１３との間には、キシロースおよびアラビノースを発酵する能力および、それらをそれぞれキシリトールおよびアラビトールに還元する能力における２つの主な違いがある。これらの２つの表現型が反相関するようである限り、クローン１２６の細胞において該活性を強化する試みをした。
【０１７７】
その意味で、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの主要なアルドースレダクターゼをコードするＧＲＥ３遺伝子(Garay-Arroyo and Covarrubias, 1999, Yeast 15, 879-892; Traff et al., 2001 Appl. Environ. Microbiol. 67, 5668-5674)を再導入した。実際には、ＡＤＨ１遺伝子のプロモーターの依存下に置かれた遺伝子ＧＲＥ３のコピーを、クローン１２６のゲノム中のＧＲＥ３のネイティブ遺伝子座のレベルで組み込んだ。
【０１７８】
正しい遺伝子座での遺伝子の良好な組み込みを検証するために、ＰＲＣ反応において以下のプライマーを使用した：
−選択マーカーのターミネーターにおいてハイブリダイズするＢ６Ｃ２（ＣＣＴＡＴＴＧＣＴＧＴＴＴＣＣＴＣＴＴＣＡＡＡＧＴＡＣ；配列番号７）；
−遺伝子ＧＲＥ３のターミネーターの領域に相補的な、Ｂ１３Ｂ１（Ｔ８）、ＡＧＴＴＧＴＣＡＧＴＧＣＡＡＴＣＣＴＴＣ；（配列番号８）。
【０１７９】
選択された形質転換体のゲノム中でのカセットの組み込みの確認後（結果は示さず）、嫌気性条件下で唯一の炭素源としてアラビノースを使用する能力をテストした。該意味で、形質転換体およびクローン１２６の両方を、ＹＦ−Ａｒａ培地中に２ｇ（ｅｑ  ＭＳ）／ｋｇの量で接種した。
【０１８０】
４８時間の発酵後の質量損失を図８に示す。これらの結果は、ＧＲＥ３遺伝子を組み込んだすべてのクローンが、クローン１２６と比較して減少したアラビノースを発酵する能力を有することを示す。したがって、該結果は、あまりに強力なアルドースレダクターゼ活性は、アラビノースを発酵する細胞の能力を制限するという仮説を支持する。
【０１８１】
結論：
唯一の炭素源としてアラビノースを含有する培地上でのスクリーニングがその後に続く、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＩ−４９５３株の遺伝子座ＨＯのレベルでのアラビノース発酵経路、すなわち遺伝子ａｒａＡ（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）／ａｒａＢ（Ｅ．ｃｏｌｉ）／ａｒａＤ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の組み込みは、アラビノースを発酵できる菌株を選択することを可能にした。さらに、これらの株の中で、低アルドースレダクターゼ活性を示すものが最も有益であることが示された。該骨格において、特に興味深い株、すなわちＥＧ３１株を単離し、２０１６年５月１９日に番号ＣＮＣＭ  Ｉ−５０８５の下でＣＮＣＭ(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15)に登録した。
【０１８２】
ＩＩ／アラビノースおよびキシロースの発酵に最適化されたＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株を得ること：
１．誘導進化によるアラビノースおよびキシロースを発酵できる株の選択：
ペントース、特にアラビノースの発酵にさらに最適化された株を選択する目的で、ＥＧ３１株をバッチで誘導進化に供した。
【０１８３】
したがって、求められる表現型を得ることを可能にする誘導進化のプロトコルを完成させた。このため、２つの糖のうちの１つのみを消費する酵母が不利になるであろう培地を定義し、実施した。実際には、「ＧＯキシロースアラビノース」と名付けられ、以下で定義される第一の培地において、窒素源ではなく、炭素源を制限する。実際には、該培地は、１０ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＰＯ４を含有するが、４ｇ／Ｌのキシロースおよび５ｇ／Ｌのアラビノースしか含有しない。
【０１８４】
培地１：ＧＯキシロースアラビノース（ｐＨ５）：
−キシロース  ４ｇ／Ｌ
−アラビノース  ５ｇ／Ｌ
−（ＮＨ４）２ＨＰＯ４（ＤＡＰ）  １０ｇ／Ｌ
−クエン酸  １１．４ｇ／Ｌ
−クエン酸三ナトリウム  １３．５ｇ／Ｌ
−ＺｎＳＯ４（０．００４ｇ／Ｌ）
−ＭｇＳＯ４  ０．５ｇ／Ｌ
−ＫＨ２ＰＯ４  １ｇ／Ｌ
−ＮａＣｌ  ０．１ｇ／Ｌ
−ＣａＣｌ２  ０．１ｇ／Ｌ
−ＣｕＳＯ４  ０．００００６ｇ／Ｌ
−Ｈ３ＢＯ３  ０．０００５ｇ／Ｌ
−ＫＩ  ０．０００１ｇ／Ｌ
−ＭｎＳＯ４  ０．０００４ｇ／Ｌ
−Ｎａ２ＭｏＯ４  ０．０００２ｇ／Ｌ
−ＦｅＣｌ３  ０．０００２ｇ／Ｌ
−ピリドキシン  ０．００２ｇ／Ｌ
−ビオチン  ０．０００８ｇ／Ｌ
−パントテン酸塩（０．００２ｇ／Ｌ）
−ニコチン酸  ０．００１ｇ／Ｌ
−ミオイノシトール０．００１ｇ／Ｌ
−Ｔｗｅｅｎ８０、１ｇ／Ｌ
【０１８５】
培養を、培地中の酸素の供給を減らし、該培養を通して過剰な圧力で製造されるＣＯ２を逃がすのに役立つキャップにより栓をしたフラスコ中で、１００ｒｐｍで撹拌しながら３２℃で行う。これらの条件下で、該培養は約７日間続く。
【０１８６】
２．酢酸の存在下でグルコースおよび／またはキシロースを発酵する能力を保持している株の選択
阻害剤、特に非解離型の酢酸に対する耐性の損失の可能性のあるリスクを予測するために、２つの連続培養物を、バッチで誘導進化サイクルに導入し、、グルコースまたはキシロースのいずれかを唯一の炭素源として含有する培地中に、両方の場合において強い濃度の酢酸の存在下に、導入した。  
【０１８７】
培地２：ＹＦ−グルコース酸：
ＹＦ−グルコース酸培地は、１５０ｇ／Ｌのグルコースを含有し、５ｇ／Ｌに等しい酢酸の濃度（ｐＨ４．４で該培養培地中に導入される量）を示す上記のＹＦ培地に対応する。
【０１８８】
培地３：ＹＦ−キシロース酸：
ＹＦ−キシロース酸培地は、４ｇ／Ｌに等しい酢酸の濃度（ｐＨ５で該培養培地に導入される量）を有する上記のＹＦ−キシロース培地に対応する。
【０１８９】
培養条件：
培養は、培地中の酸素の供給を減らし、該培養を通して過剰圧力で製造されるＣＯ２を逃がすのに役立つキャップにより栓をしたフラスコ中で、１００ｒｐｍで撹拌しながら３２℃で行う。これらの条件下で、該培養は約７日間続く。
【０１９０】
３．「プチ突然変異体」の排除：
また、産業製造方法に適合しないであろうミトコンドリアを除いた株の選択を避けるために、唯一の炭素源としてグリセロールを含有する培地上で培養する工程を追加した。該工程は、細胞が増殖できるようにする機能的な電子の細胞中への移行のためのチェーン（ｃｈａｉｎ）の存在を必要とする。
【０１９１】
培地４：ＹＮＢグリセロール：
−３．４ｇ／ＬのＤＩＦＣＯ（登録商標）窒素ベースの酵母；
−５ｇ／Ｌの硫酸アンモニウム；
−１０ｇ／Ｌの唯一の炭素源としてのグリセロール。
【０１９２】
培養を、培地中への酸素の供給を可能にする多孔性キャップにより栓をしたバッフル付きフラスコ中で、１５０ｒｐｍで撹拌しながら３０℃で行う。これらの条件下で、該培養は２４〜４８時間続く。
【０１９３】
実際には、誘導進化サイクルは以下を特徴とする：
−ＧＯキシロースアラビノース培地上での培養；次いで 
−ＹＦグルコース酸培地上での培養；次いで 
−ＹＦキシロース酸培地上での培養；次いで 
−ＹＮＢグリセロール培地上での培養。
【０１９４】
４．そのようにして得られたクローンの評価：
実際には、２サイクルの培養を行った。
【０１９５】
該誘導進化の終わりに、クローンを完全培地のディッシュ上で個別化し、得られたクローンの性能を、組成が上で与えられるＹＦＣＦ培地上で評価した。図９Ａは、得られた６つのより良好なクローンに対する、発酵時間の関数としてのエタノール製造の変化を示す。
【０１９６】
これらの結果は、６個のクローンのうちの５個が、ＥＧ３１株の動態に近い動態を有するが、ＥＧ３１株のものよりも高い最終的なアルコール力価を有することを明らかにする。Ｃ７という最後のクローンが、６個の炭素を有する糖の代謝から５個の炭素を有する糖の代謝への移行で、より迅速であるようである。その後、発酵の動態は、他のクローンのものと同じようである。発酵の終わりに、他のクローンの実施中よりも、その株はアルコール強度が大きいようである。
【０１９７】
該改善が実際にアラビノースのより良好な消費に関連していることを検証するために、残っている糖を定量化するためにＨＰＬＣによる定量を行った。図９Ｂは、１６０時間の発酵後の発酵培地中のアラビノースの濃度を示す。結果は、誘導進化から選択されたすべてのクローンがＥＧ３１株よりも多くのアラビノースを消費したことを確かめ、Ｃ７というクローンがより効率的であると思われる。該クローンを、２０１６年５月１９日に番号ＣＮＣＭ  Ｉ−５０８６の下でＣＮＣＭ (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15)に登録された株ＥＧ３２に改名した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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