(57)【要約】  ヒトおよびマウスの遺伝子組換え核酸、遺伝子組換えmRNA、遺伝子組換えポリペプチドおよび遺伝子組換え五量体化ポリペプチドを提供する。これらの遺伝子組換え核酸、遺伝子組換えmRNA、遺伝子組換えポリペプチドおよび遺伝子組換え五量体化ポリペプチドは、いずれもVISTA、ICOS-L、PD-L1またはB7-H4の細胞外ドメインの配列を含み、これらの各細胞外ドメイン配列が、COMPの五量体形成ドメインに作動可能に連結されていることを特徴とする。VISTA、PD-L1またはB7H4の五量体化ポリペプチドの可溶性形態はＴ細胞抑制活性を有し、ICOS-Lの五量体化ポリペプチドの可溶性形態はＴ細胞刺激活性を有する。Ｔ細胞調節活性を必要とする対象の治療にこれらを使用する方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔ細胞刺激活性を有する五量体化ポリペプチドであって、
５つのモノマーを含み、各モノマーが、ICOS-Lの細胞外ドメイン（配列番号４９）と実質的な類似性を有するポリペプチドを含み、該ポリペプチドが、軟骨オリゴマー基質タンパク質（COMP）の五量体形成ドメイン（配列番号１１）と実質的な類似性を有するポリペプチドに連結されている、五量体化ポリペプチド。
【請求項２】
可溶性形態である、請求項１に記載の五量体化ポリペプチド。
【請求項３】
増強されたＴ細胞刺激活性を有する、請求項１に記載の五量体化ポリペプチド。
【請求項４】
組換えポリペプチドであって、
ICOS-Lの細胞外ドメイン（配列番号４９）と実質的な類似性を有するポリペプチドを含み、該ポリペプチドが、軟骨オリゴマー基質タンパク質（COMP）の五量体形成ドメイン（配列番号１１）と実質的な類似性を有するポリペプチドに連結されている、組換えポリペプチド。
【請求項５】
可溶性形態である、請求項４に記載の組換えポリペプチド。
【請求項６】
組換え核酸であって、
配列番号４８の配列を有しICOS-Lポリペプチドの細胞外ドメインをコードする核酸と実質的な類似性を有する核酸と；
配列番号３の配列を有し軟骨オリゴマー基質タンパク質（COMP）の五量体形成ドメインをコードする核酸と実質的な類似性を有する核酸とを含み、
ICOS-Lポリペプチドの細胞外ドメインをコードする前記核酸が、COMPの五量体形成ドメインをコードする前記核酸に作動可能に連結されている、組換え核酸。
【請求項７】
請求項６に記載の組換え核酸を含む発現ベクター。
【請求項８】
少なくとも１つの制御配列をさらに含む、請求項７に記載の発現ベクター。
【請求項９】
請求項７または８に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１０】
請求項４または５に記載のポリペプチド、請求項９に記載の宿主細胞および請求項１〜３のいずれか１項に記載の五量体化ポリペプチドのうちの１種以上と、薬学的に許容される担体、希釈剤または添加剤とを含む医薬組成物。
【請求項１１】
生物学的応答の誘導を必要とする個体において生物学的応答を誘導する方法であって、
ICOS-Lと軟骨オリゴマー基質タンパク質（COMP）の融合ポリペプチド（ICOS-L.COMP）の治療有効量を前記個体に投与することを含み、
前記ICOS-L.COMPポリペプチドが配列番号４９を有し、配列番号１１に連結されていること、ならびに
前記生物学的応答が、Ｔ細胞活性化の刺激、Ｔ細胞増殖の刺激、Ｔ細胞による１種以上の炎症性サイトカインの分泌の増加、細胞傷害性Ｔリンパ球（CTL）の誘導の増加、および腫瘍微小環境における制御性Ｔ細胞に対するエフェクターＴ細胞の割合の増加のうちの１つ以上であること
を特徴とする方法。
【請求項１２】
前記ICOS-L.COMPポリペプチドが、チェックポイント阻害分子と組み合わせて投与される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ICOS-L.COMPポリペプチドが、前記チェックポイント阻害分子の投与と同時、投与前または投与後に投与される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記チェックポイント阻害分子が、抗PD-1抗体または抗CTLA-4抗体である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
Ｔ細胞抑制活性を有する五量体化ポリペプチドであって、
５つのモノマーを含み、各モノマーが、V-domain Ig Suppressor of T cell Activation（VISTA）の細胞外ドメイン（配列番号９）と実質的な類似性を有するポリペプチドを含み、該ポリペプチドが、軟骨オリゴマー基質タンパク質（COMP）の五量体形成ドメイン（配列番号１１）と実質的な類似性を有するポリペプチドに連結されている、五量体化ポリペプチド。
【請求項１６】
可溶性形態である、請求項１５に記載の五量体化ポリペプチド。
【請求項１７】
前記可溶性形態の五量体化ポリペプチドが、VISTAの細胞外ドメイン（配列番号９）を含む可溶性の二量体化ポリペプチドよりも増強されたＴ細胞抑制活性を有する、請求項１６に記載の五量体化ポリペプチド。
【請求項１８】
前記増強されたＴ細胞抑制活性が、Ｔ細胞活性化抑制の増強およびＴ細胞増殖抑制の増強のうちの１つ以上を含む、請求項１７に記載の五量体化ポリペプチド。
【請求項１９】
前記可溶性形態の五量体化ポリペプチドが、インビボにおいて、VISTAの細胞外ドメイン（配列番号９）を含む可溶性の二量体化ポリペプチドよりも増強された免疫抑制活性を有する、請求項１６に記載の五量体化ポリペプチド。
【請求項２０】
前記増強された免疫抑制活性が、サイトカインの分泌抑制の増強および細胞障害性リンパ球（CTL）の産生抑制の増強のうちの１つ以上を含む、請求項１９に記載の五量体化ポリペプチド。
【請求項２１】
組換えポリペプチドであって、
V-domain Ig Suppressor of T cell Activation（VISTA）の細胞外ドメイン（配列番号９）と実質的な類似性を有するポリペプチドを含み、該ポリペプチドが、軟骨オリゴマー基質タンパク質（COMP）の五量体形成ドメイン（配列番号１１）と実質的な類似性を有するポリペプチドに連結されている、組換えポリペプチド。
【請求項２２】
可溶性形態である、請求項２１に記載の組換えポリペプチド。
【請求項２３】
組換え核酸であって、
配列番号１の配列を有しV-domain Ig Suppressor of T cell Activation（VISTA）ポリペプチドのIgV含有細胞外ドメインをコードする核酸と実質的な類似性を有する核酸と；
配列番号３の配列を有し軟骨オリゴマー基質タンパク質（COMP）の五量体形成ドメインをコードする核酸と実質的な類似性を有する核酸とを含み、
VISTAポリペプチドのIgV含有細胞外ドメインをコードする前記核酸が、COMPの五量体形成ドメインをコードする前記核酸に作動可能に連結されている、組換え核酸。
【請求項２４】
請求項２３に記載の組換え核酸を含む発現ベクター。
【請求項２５】
少なくとも１つの制御配列をさらに含む、請求項２４に記載の発現ベクター。
【請求項２６】
請求項２４または２５に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項２７】
請求項２１または２２に記載のポリペプチド、請求項２６に記載の宿主細胞および請求項１５〜２０のいずれか１項に記載の五量体化ポリペプチドのうちの１種以上と、薬学的に許容される担体、希釈剤または添加剤とを含む医薬組成物。
【請求項２８】
生物学的応答の誘導を必要とする個体において生物学的応答を誘導する方法であって、
V-domain Ig Suppressor of T cell Activation（VISTA）と軟骨オリゴマー基質タンパク質（COMP）の融合ポリペプチド（VISTA.COMP）の治療有効量を前記個体に投与することを含み、
前記VISTA.COMPポリペプチドが配列番号９を有し、配列番号１１に連結されていること、ならびに
前記生物学的応答が、Ｔ細胞活性化の抑制、Ｔ細胞増殖の抑制、Ｔ細胞による１種以上の炎症性サイトカインの分泌の減少、細胞傷害性Ｔリンパ球（CTL）の誘導の抑制、および制御性表現型を有するＴ細胞の増加のうちの１つ以上であること
を特徴とする方法。
【請求項２９】
前記炎症性サイトカインが、IL-2およびIFNγのうちの１種以上を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
Ｔ細胞抑制活性を有する五量体化ポリペプチドであって、
５つのモノマーを含み、各モノマーが、B7-H4の細胞外ドメイン（配列番号２５）と実質的な類似性を有するポリペプチドを含み、該ポリペプチドが、軟骨オリゴマー基質タンパク質（COMP）の五量体形成ドメイン（配列番号１１）と実質的な類似性を有するポリペプチドに連結されている、五量体化ポリペプチド。
【請求項３１】
可溶性形態である、請求項３０に記載の五量体化ポリペプチド。
【請求項３２】
増強されたＴ細胞抑制活性を有する、請求項３０に記載の五量体化ポリペプチド。
【請求項３３】
組換えポリペプチドであって、
B7-H4の細胞外ドメイン（配列番号２５）と実質的な類似性を有するポリペプチドを含み、該ポリペプチドが、軟骨オリゴマー基質タンパク質（COMP）の五量体形成ドメイン（配列番号１１）と実質的な類似性を有するポリペプチドに連結されている、組換えポリペプチド。
【請求項３４】
可溶性形態である、請求項３３に記載の組換えポリペプチド。
【請求項３５】
組換え核酸であって、
配列番号２６の配列を有しB7-H4ポリペプチドの細胞外ドメインをコードする核酸と実質的な類似性を有する核酸と；
配列番号３の配列を有し軟骨オリゴマー基質タンパク質（COMP）の五量体形成ドメインをコードする核酸と実質的な類似性を有する核酸とを含み、
B7-H4ポリペプチドの細胞外ドメインをコードする前記核酸が、COMPの五量体形成ドメインをコードする前記核酸に作動可能に連結されている、組換え核酸。
【請求項３６】
請求項３５に記載の組換え核酸を含む発現ベクター。
【請求項３７】
少なくとも１つの制御配列をさらに含む、請求項３６に記載の発現ベクター。
【請求項３８】
請求項３６または３７に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項３９】
請求項３３または３４に記載のポリペプチド、請求項３８に記載の宿主細胞および請求項３０〜３２のいずれか１項に記載の五量体化ポリペプチドのうちの１種以上と、薬学的に許容される担体、希釈剤または添加剤とを含む医薬組成物。
【請求項４０】
生物学的応答の誘導を必要とする個体において生物学的応答を誘導する方法であって、
B7-H4と軟骨オリゴマー基質タンパク質（COMP）の融合ポリペプチド（B7-H4.COMP）の治療有効量を前記個体に投与することを含み、
前記B7-H4.COMPポリペプチドが配列番号２５を有し、配列番号１１に連結されていること、ならびに
前記生物学的応答が、Ｔ細胞活性化の抑制、Ｔ細胞増殖の抑制、Ｔ細胞による１種以上の炎症性サイトカインの分泌の減少、細胞傷害性Ｔリンパ球（CTL）の誘導の抑制、および制御性表現型を有するＴ細胞の増加のうちの１つ以上であること
を特徴とする方法。
【請求項４１】
Ｔ細胞抑制活性を有する五量体化ポリペプチドであって、
５つのモノマーを含み、各モノマーが、PD-L1の細胞外ドメイン（配列番号３６）と実質的な類似性を有するポリペプチドを含み、該ポリペプチドが、軟骨オリゴマー基質タンパク質（COMP）の五量体形成ドメイン（配列番号１１）と実質的な類似性を有するポリペプチドに連結されている、五量体化ポリペプチド。
【請求項４２】
可溶性形態である、請求項４１に記載の五量体化ポリペプチド。
【請求項４３】
増強されたＴ細胞抑制活性を有する、請求項４１に記載の五量体化ポリペプチド。
【請求項４４】
組換えポリペプチドであって、
PD-L1の細胞外ドメイン（配列番号３６）と実質的な類似性を有するポリペプチドを含み、該ポリペプチドが、軟骨オリゴマー基質タンパク質（COMP）の五量体形成ドメイン（配列番号１１）と実質的な類似性を有するポリペプチドに連結されている、組換えポリペプチド。
【請求項４５】
可溶性形態である、請求項４４に記載の組換えポリペプチド。
【請求項４６】
組換え核酸であって、
配列番号３７の配列を有しPD-L1ポリペプチドの細胞外ドメインをコードする核酸と実質的な類似性を有する核酸と；
配列番号３の配列を有し軟骨オリゴマー基質タンパク質（COMP）の五量体形成ドメインをコードする核酸と実質的な類似性を有する核酸とを含み、
PD-L1ポリペプチドの細胞外ドメインをコードする前記核酸が、COMPの五量体形成ドメインをコードする前記核酸に作動可能に連結されている、組換え核酸。
【請求項４７】
請求項４６に記載の組換え核酸を含む発現ベクター。
【請求項４８】
少なくとも１つの制御配列をさらに含む、請求項４７に記載の発現ベクター。
【請求項４９】
請求項４７または４８に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項５０】
請求項４４または４５に記載のポリペプチド、請求項４９に記載の宿主細胞および請求項４１〜４３のいずれか１項に記載の五量体化ポリペプチドのうちの１種以上と、薬学的に許容される担体、希釈剤または添加剤とを含む医薬組成物。
【請求項５１】
生物学的応答の誘導を必要とする個体において生物学的応答を誘導する方法であって、
PD-L1と軟骨オリゴマー基質タンパク質（COMP）の融合ポリペプチド（PD-L1.COMP）の治療有効量を前記個体に投与することを含み、
前記PD-L1.COMPポリペプチドが配列番号３６を有し、配列番号１１に連結されていること、ならびに
前記生物学的応答が、Ｔ細胞活性化の抑制、Ｔ細胞増殖の抑制、Ｔ細胞による１種以上の炎症性サイトカインの分泌の減少、細胞傷害性Ｔリンパ球（CTL）の誘導の抑制、および制御性表現型を有するＴ細胞の増加のうちの１つ以上であること
を特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
先行出願の相互参照
本出願は、パリ条約の下、2017年3月29日に出願された米国仮特許出願第62/478,198号および2017年11月27日に出願された米国仮特許出願第62/590,848号に基づく優先権を主張するものであり、これらの出願は本明細書の一部を構成するものとしてその全体が援用される。
【０００２】
本開示は、概して、遺伝子組換えＴ細胞調節分子に関する。より具体的には、本開示は、いずれもＴ細胞を抑制する遺伝子組換えV-domain Immunoglobulin suppressor of T-cell activation（VISTA）分子、遺伝子組換えprogrammed death-ligand 1（PD-L1）分子および遺伝子組換えＢ７ホモログ４（B7-H4）分子、ならびにＴ細胞を刺激する遺伝子組換えinducible costimulatory ligand（ICOS-L）分子に関する。
【背景技術】
【０００３】
Ｔ細胞の活性は、Ｔ細胞上に存在する免疫チェックポイント（IC）細胞表面分子と抗原提示細胞（APC）／がん細胞の結合により発生する共刺激シグナルおよび共抑制シグナルにより調節される。これらのシグナルは、自己免疫寛容を維持しながらも、侵入病原体および／または悪性細胞に対する防御を促進する。Ｔ細胞応答は、CD28:CD80/CD86、ICOS:ICOS-L、OX-40:OX-40L、4-1BB:4-1BBLなどの共刺激チェックポイント分子のペアによりアップレギュレートされるか、かつ／またはCTLA-4:CD80/CD86、PD-1:PD-L1などの共抑制チェックポイント分子によりダウンレギュレートされる（引用文献１〜４）。Ｔ細胞の共抑制免疫チェックポイント分子のペアのいくつかは、いまだその特性が完全には理解されておらず、たとえばVISTAやB7-H4により認識される受容体の特性はよく分かっていない。現在までに、Ｔ細胞活性に対して抑制機能を有する負のチェックポイント受容体がいくつか同定されており、たとえばPD-1やCTLA-4が同定されている。これらの経路を抗体で阻害することによって、抗腫瘍免疫応答を促進できることが示されており（引用文献１〜３）、その一方、これらの免疫抑制経路を活性化するリガンドは、自己免疫疾患および／または炎症性疾患を引き起こす免疫応答制御不全を抑制しうることが示されている（引用文献４〜６）。これに対して、ICOS:ICOS-LやOX40:OX40LなどのＴ細胞共刺激経路を活性化することによって、Ｔ細胞の活性化、増殖およびサイトカイン産生を誘導することができ、その結果、抗腫瘍免疫応答を促進することができる。
【０００４】
公知の免疫チェックポイント分子ペアの多くは、Ig-V/Ig-C含有細胞外ドメインによりその構造の一部が定義されるB7-CD28表面タンパク質ファミリーのメンバーである。このような免疫チェックポイント分子ペアとして、ICOS:ICOS-L、CTLA-4:CD80/CD86、PD-1:PD-L1、ならびにVISTAおよびB7-H4が挙げられる（引用文献７）。
【０００５】
V-domain Immunoglobulin suppressor of T-cell activation（「VISTA」、PD-1H、DD1α、SISP1、Dies1、c10Orf54および／またはGi24とも呼ばれる）は、CD11bhigh骨髄系細胞において主に発現されるチェックポイントリガンドであり、推定上の細胞表面受容体（VISTA受容体）と結合してＴ細胞応答を負に調節する（引用文献８〜９）。また、VISTAはナイーブCD4+Ｔ細胞およびナイーブCD8+Ｔ細胞でも発現されており、Ｔ細胞応答を負に調節すると見られていることから、VISTAは、チェックポイントリガンドと受容体の両方の役割を果たしていることが示唆されている（引用文献１０）。VISTAは、PD-1およびPD-L1と構造上有意な相同性を有しており、Ｎ末端にIgVドメインを有し、これに１回膜貫通型ドメインと細胞質尾部が続く。PD-1:PD-L1経路と同様に、モノクローナル抗体でVISTAを阻害することによって、マウスモデルの抗腫瘍免疫応答を誘導できることが実証されていることから、VISTA:VISTA受容体のシグナル伝達は腫瘍免疫回避の促進に一定の役割を果たしていることが示唆されている（引用文献１１〜１２）。さらに、VISTAは、自己免疫疾患の進行の調節に一定の役割を果たしている可能性がある。たとえば、全身性エリテマトーデスに罹患しやすい遺伝背景のVISTA欠損（VISTA-/-）マウスは、進行性の重度の全身性エリテマトーデス（SLE）を発症した（引用文献１３）。また、VISTA-/-2D2 Ｔ細胞受容体トランスジェニックマウスでは、末梢での脳炎誘発性Ｔ細胞数が上昇し、悪化した実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）を発症した（引用文献１４）。C57BL/6を遺伝背景とするVISTA-/-マウスは、樹状細胞の増加やＴ細胞活性化マーカーの上昇といった炎症促進性表現型を軽度に示したが、炎症性疾患を発症したという報告はされていない（引用文献１４）。これとはやや対照的に、別の研究では、VISTA-/-C57BL/6マウスが１０ヶ月齢で糸球体腎炎を発症したという重症度のより高い表現型が報告されている（引用文献１５）。これらの研究結果を考え合わせると、VISTAを介した免疫抑制の促進は、自己免疫疾患および／または炎症性疾患の治療に有用であることが示唆される。
【０００６】
作動性の抗VISTA抗体が報告されており（引用文献１６）、また、固体表面に固相化したVISTAの二量体形態（VISTA.Fc）が、インビトロにおいてＴ細胞の活性化を抑制することが報告されている（引用文献８および１１）。
【０００７】
programmed death-1（PD-1）として知られている抑制性共刺激分子は、活性化されたＴ細胞、Ｂ細胞、単球およびマクロファージで発現され、（造血細胞および非造血細胞上の）PD-L1ならびに（樹状細胞およびマクロファージ上の）PD-L2に結合する（引用文献６および１７〜２０）。リンパ球上のPD-1にPD-L1が結合すると、Ｔ細胞に抑制性シグナルが伝達され、TCRのシグナル伝達、Ｔ細胞およびＢ細胞の増殖、サイトカインの産生ならびにCD8+Ｔ細胞の細胞傷害性が阻害される（引用文献４および１７）。PDL-2は、PD-1の第２のリガンドであり、Ｔ細胞の活性化を抑制する（引用文献２０）。PD-1のアゴニストであるPD-L1.Fcは、２種のコラーゲン誘導性関節炎（CIA）マウスモデルにおいて疾患の転帰を改善することが示されている（引用文献５および２１）。
【０００８】
B7-H4は、別のB7ファミリーメンバーであり、IgVドメインを含む抑制性リガンドである。B7-H4の受容体としてBTLA-4が最初に推定されているが、いまだ明らかになっていない（引用文献２２）。B7-H4.Fcは、たとえば、マウスにおいてConA誘導性肝損傷を抑制することができることから、インビボで免疫応答を弱めることが示されており（引用文献２３）、また、マウスにおいてコラーゲン誘導性関節炎（CIA）の進行を制限することが示されている（引用文献２４）。
【０００９】
Inducible T-cell Costimulator（（ICOS）、CD278、H4またはAILIMとも呼ばれる）は、B7結合タンパク質のCD28ファミリーに属する受容体であり（引用文献２５〜２７）、活性化Ｔ細胞において発現を誘導することができる（引用文献２５、２８および２９）。ICOSが、抗原提示細胞（APC）に発現されるリガンドであるICOS-L（B7-H2）に結合すると（引用文献３０および３１）、ICOSによりＴ細胞が共刺激されて、エフェクターサイトカイン（IL-4、IL-5、IL-10、IL-21、IFNγ、TNFα）が産生され、Th1およびTh2の機能が向上する（引用文献３２〜３４）。
【００１０】
前臨床腫瘍試験では、（ICOSのシグナル伝達を作動させるために）ICOS-Lを発現する腫瘍細胞を移植したマウスにおいて抗CTLA-4療法を行ったところ、腫瘍の増殖が低下し、生存率が改善したことが示されている（引用文献３５）。同様に、抗CTLA-4剤で治療を行った患者の臨床試験では、ICOS-hi Ｔ細胞の存在が、この免疫チェックポイント抑制剤に対する治療反応性の向上と相関することが示されている（引用文献３６および３７）。これらの結果から、抗腫瘍免疫応答を向上させる戦略としてICOSアゴニストを使用できる可能性が示唆されている。また、PCT出願WO2016US23524では、ICOSを標的とした作動性モノクローナル抗体が記載されている。この抗体は、免疫細胞を刺激して腫瘍細胞を殺傷するとともに、抗腫瘍免疫を抑制するTregの数を制限するとされている。
【００１１】
Ｔ細胞の活性を制御または調節し、免疫抑制を誘導し、かつ／または抗腫瘍免疫応答を向上させるための改良された化合物および方法が現在必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本明細書において、ヒトおよびマウスの遺伝子組換え核酸、遺伝子組換えmRNA、遺伝子組換えポリペプチドおよび遺伝子組換え五量体化ポリペプチドを提供する。これらの遺伝子組換え核酸、遺伝子組換えmRNA、遺伝子組換えポリペプチドおよび遺伝子組換え五量体化ポリペプチドは、いずれもVISTA、B7-H4、PD-L1またはICOS-Lの細胞外ドメインの配列を含み、これらの各細胞外ドメイン配列は、COMPの五量体形成ドメインに作動可能に連結されている。本発明の五量体化ポリペプチドの可溶性形態は、インビトロおよびインビボにおいてＴ細胞調節活性を有する。Ｔ細胞調節活性を必要とする対象を治療するために、これらを使用する方法も提供する。
【００１３】
一態様において、組換え核酸を提供する。該組換え核酸は、配列番号１または２の配列を有しV-domain Ig Suppressor of T cell Activation（VISTA）のIgV含有細胞外ドメインをコードする核酸と実質的な類似性を有する核酸と；配列番号３または４の配列を有し軟骨オリゴマー基質タンパク質（COMP）の五量体形成ドメインをコードする核酸と実質的な類似性を有する核酸とを含み、細胞外IgVドメイン含有VISTAポリペプチドをコードする前記核酸が、COMPの五量体形成ドメインをコードする前記核酸に作動可能に連結されている。
【００１４】
一実施形態において、前記組換え核酸は、配列番号３に作動可能に連結された配列番号１を含む。一実施形態において、前記組換え核酸は、配列番号４に作動可能に連結された配列番号２を含む。
【００１５】
別の一態様において、別の組換え核酸を提供する。該組換え核酸は、配列番号２６の配列を有しB7-H4の細胞外ドメインをコードする核酸と実質的な類似性を有する核酸と；配列番号３の配列を有し軟骨オリゴマー基質タンパク質（COMP）の五量体形成ドメインをコードする核酸と実質的な類似性を有する核酸とを含み、B7-H4ポリペプチドの細胞外ドメインをコードする前記核酸が、COMPの五量体形成ドメインをコードする前記核酸に作動可能に連結されている。
【００１６】
別の一態様において、別の組換え核酸を提供する。該組換え核酸は、配列番号３７の配列を有しPD-L1の細胞外ドメインをコードする核酸と実質的な類似性を有する核酸と；配列番号３の配列を有し軟骨オリゴマー基質タンパク質（COMP）の五量体形成ドメインをコードする核酸と実質的な類似性を有する核酸とを含み、PD-L1ポリペプチドの細胞外ドメインをコードする前記核酸が、COMPの五量体形成ドメインをコードする前記核酸に作動可能に連結されている。
【００１７】
別の一態様において、別の組換え核酸を提供する。該組換え核酸は、配列番号４８の配列を有しICOS-Lの細胞外ドメインをコードする核酸と実質的な類似性を有する核酸と；配列番号３の配列を有し軟骨オリゴマー基質タンパク質（COMP）の五量体形成ドメインをコードする核酸と実質的な類似性を有する核酸とを含み、ICOS-Lポリペプチドの細胞外ドメインをコードする前記核酸が、COMPの五量体形成ドメインをコードする前記核酸に作動可能に連結されている。
【００１８】
一実施形態において、本開示の組換え核酸を含む発現ベクターを提供する。一実施形態において、前記発現ベクターは少なくとも１つの制御配列をさらに含む。一実施形態において、前記発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００１９】
一態様において、組換えメッセンジャーリボ核酸（mRNA）を提供する。該mRNAは、配列番号５または６の配列を有しV-domain Ig Suppressor of T cell Activation（VISTA）の細胞外ドメインをコードするmRNAと実質的な類似性を有するmRNAと；配列番号７または８の配列を有し軟骨オリゴマー基質タンパク質（COMP）の五量体形成ドメインをコードするmRNAと実質的な類似性を有するmRNAとを含み、VISTA mRNAの細胞外ドメインをコードする前記mRNAが、COMPの五量体形成ドメインをコードする前記mRNAに作動可能に連結されている。
【００２０】
一実施形態において、前記組換えmRNAは、配列番号７に作動可能に連結された配列番号５を含む。一実施形態において、前記組換えmRNAは、配列番号８に作動可能に連結された配列番号６を含む。
【００２１】
一態様において、別の組換えメッセンジャーリボ核酸（mRNA）を提供する。該mRNAは、配列番号２７の配列を有しB7-H4の細胞外ドメインをコードするmRNAと実質的な類似性を有するmRNAと；配列番号７の配列を有し軟骨オリゴマー基質タンパク質（COMP）の五量体形成ドメインをコードするmRNAと実質的な類似性を有するmRNAとを含み、B7-H4 mRNAの細胞外ドメインをコードする前記mRNAが、COMPの五量体形成ドメインをコードする前記mRNAに作動可能に連結されている。
【００２２】
一態様において、別の組換えメッセンジャーリボ核酸（mRNA）を提供する。該mRNAは、配列番号６２の配列を有しPD-L1の細胞外ドメインをコードするmRNAと実質的な類似性を有するmRNAと；配列番号７の配列を有し軟骨オリゴマー基質タンパク質（COMP）の五量体形成ドメインをコードするmRNAと実質的な類似性を有するmRNAとを含み、PD-L1 mRNAの細胞外ドメインをコードする前記mRNAが、COMPの五量体形成ドメインをコードする前記mRNAに作動可能に連結されている。
【００２３】
一態様において、別の組換えメッセンジャーリボ核酸（mRNA）を提供する。該mRNAは、配列番号６１の配列を有しICOS-Lの細胞外ドメインをコードするmRNAと実質的な類似性を有するmRNAと；配列番号７の配列を有し軟骨オリゴマー基質タンパク質（COMP）の五量体形成ドメインをコードするmRNAと実質的な類似性を有するmRNAとを含み、ICOS-L mRNAの細胞外ドメインをコードする前記mRNAが、COMPの五量体形成ドメインをコードする前記mRNAに作動可能に連結されている。
【００２４】
一態様において、組換えポリペプチドを提供する。該組換えポリペプチドは、V-domain Ig Suppressor of T cell Activation（VISTA）の細胞外ドメイン（配列番号９または１０）と実質的な類似性を有するポリペプチドを含み、該ポリペプチドは、軟骨オリゴマー基質タンパク質（COMP）の五量体形成ドメイン（配列番号１１または１２）と実質的な類似性を有するポリペプチドに連結されている。
【００２５】
一実施形態において、前記組換えポリペプチドは、配列番号１１に作動可能に連結された配列番号９を含む。一実施形態において、前記組換えポリペプチドは、配列番号１２に作動可能に連結された配列番号１０を含む。
【００２６】
別の一態様において、別の組換えポリペプチドを提供する。該組換えポリペプチドは、B7-H4の細胞外ドメイン（配列番号２５）と実質的な類似性を有するポリペプチドを含み、該ポリペプチドは、軟骨オリゴマー基質タンパク質（COMP）の五量体形成ドメイン（配列番号１１）と実質的な類似性を有するポリペプチドに連結されている。
【００２７】
別の一態様において、別の組換えポリペプチドを提供する。該組換えポリペプチドは、PD-L1の細胞外ドメイン（配列番号３６）と実質的な類似性を有するポリペプチドを含み、該ポリペプチドは、軟骨オリゴマー基質タンパク質（COMP）の五量体形成ドメイン（配列番号１１）と実質的な類似性を有するポリペプチドに連結されている。
【００２８】
別の一態様において、別の組換えポリペプチドを提供する。該組換えポリペプチドは、ICOS-Lの細胞外ドメイン（配列番号４９）と実質的な類似性を有するポリペプチドを含み、該ポリペプチドは、軟骨オリゴマー基質タンパク質（COMP）の五量体形成ドメイン（配列番号１１）と実質的な類似性を有するポリペプチドに連結されている。
【００２９】
一実施形態において、本明細書で提供される組換えポリペプチドは可溶性形態である。
【００３０】
一態様において、Ｔ細胞抑制活性を有する五量体化ポリペプチドを提供する。Ｔ細胞抑制活性を有する該五量体化ポリペプチドは、５つのモノマーを含み、各モノマーは、V-domain Ig Suppressor of T cell Activation（VISTA）の細胞外ドメイン（配列番号９または１０）と実質的な類似性を有するポリペプチドを含み、該ポリペプチドは、軟骨オリゴマー基質タンパク質（COMP）の五量体形成ドメイン（配列番号１１または１２）と実質的な類似性を有するポリペプチドに連結されている。
【００３１】
一実施形態において、前記組換えポリペプチドは、配列番号１１に作動可能に連結された配列番号９を含む。一実施形態において、前記五量体化ポリペプチドは、配列番号１２に作動可能に連結された配列番号１０を含む。一実施形態において、前記五量体化ポリペプチドは可溶性形態である。一実施形態において、前記可溶性形態の五量体化ポリペプチドは、VISTAの細胞外ドメイン（配列番号９または１０）を含む可溶性の二量体化ポリペプチドよりも増強されたＴ細胞抑制活性を有する。一実施形態において、前記増強されたＴ細胞抑制活性は、Ｔ細胞活性化抑制の増強およびＴ細胞増殖抑制の増強のうちの１つ以上を含む。一実施形態において、前記可溶性形態の五量体化ポリペプチドは、インビボにおいて、VISTAの細胞外ドメイン（配列番号９または１０）を含む可溶性の二量体化ポリペプチドよりも増強された免疫抑制活性を有する。一実施形態において、前記増強された免疫抑制活性は、サイトカインの分泌抑制の増強および細胞障害性リンパ球（CTL）の産生抑制の増強のうちの１つ以上を含む。
【００３２】
別の一態様において、Ｔ細胞抑制活性を有する別の五量体化ポリペプチドを提供する。Ｔ細胞抑制活性を有する該五量体化ポリペプチドは、５つのモノマーを含み、各モノマーは、B7-H4の細胞外ドメイン（配列番号２５）と実質的な類似性を有するポリペプチドを含み、該ポリペプチドは、軟骨オリゴマー基質タンパク質（COMP）の五量体形成ドメイン（配列番号１１）と実質的な類似性を有するポリペプチドに連結されている。
【００３３】
一実施形態において、前記五量体化ポリペプチドは可溶性形態である。一実施形態において、前記可溶性形態の五量体化ポリペプチドは、B7-H4の細胞外ドメイン（配列番号２５）を含む可溶性の二量体化ポリペプチドよりも増強されたＴ細胞抑制活性を有する。一実施形態において、前記増強されたＴ細胞抑制活性は、Ｔ細胞活性化抑制の増強およびＴ細胞増殖抑制の増強のうちの１つ以上を含む。一実施形態において、前記可溶性形態の五量体化ポリペプチドは、インビボにおいて、B7-H4の細胞外ドメイン（配列番号２５）を含む可溶性の二量体化ポリペプチドよりも増強された免疫抑制活性を有する。一実施形態において、前記増強された免疫抑制活性は、サイトカインの分泌抑制の増強および細胞障害性リンパ球（CTL）の産生抑制の増強のうちの１つ以上を含む。
【００３４】
別の一態様において、Ｔ細胞抑制活性を有する別の五量体化ポリペプチドを提供する。Ｔ細胞抑制活性を有する該五量体化ポリペプチドは、５つのモノマーを含み、各モノマーは、PD-L1の細胞外ドメイン（配列番号３６）と実質的な類似性を有するポリペプチドを含み、該ポリペプチドは、軟骨オリゴマー基質タンパク質（COMP）の五量体形成ドメイン（配列番号１１）と実質的な類似性を有するポリペプチドに連結されている。
【００３５】
一実施形態において、前記五量体化ポリペプチドは、可溶性形態である。一実施形態において、前記可溶性形態の五量体化ポリペプチドは、PD-L1の細胞外ドメイン（配列番号３６）を含む可溶性の二量体化ポリペプチドよりも増強されたＴ細胞抑制活性を有する。一実施形態において、前記増強されたＴ細胞抑制活性は、Ｔ細胞活性化抑制の増強およびＴ細胞増殖抑制の増強のうちの１つ以上を含む。一実施形態において、前記可溶性形態の五量体化ポリペプチドは、インビボにおいて、PD-L1の細胞外ドメイン（配列番号３６）を含む可溶性の二量体化ポリペプチドよりも増強された免疫抑制活性を有する。一実施形態において、前記増強された免疫抑制活性は、サイトカインの分泌抑制の増強および細胞障害性リンパ球（CTL）の産生抑制の増強のうちの１つ以上を含む。
【００３６】
別の一態様において、Ｔ細胞刺激活性を有する五量体化ポリペプチドを提供する。Ｔ細胞刺激活性を有する該五量体化ポリペプチドは、５つのモノマーを含み、各モノマーは、ICOS-Lの細胞外ドメイン（配列番号４９）と実質的な類似性を有するポリペプチドを含み、該ポリペプチドは、軟骨オリゴマー基質タンパク質（COMP）の五量体形成ドメイン（配列番号１１）と実質的な類似性を有するポリペプチドに連結されている。
【００３７】
一実施形態において、前記五量体化ポリペプチドは可溶性形態である。一実施形態において、前記可溶性形態の五量体化ポリペプチドは、ICOS-Lの細胞外ドメイン（配列番号４９）を含む可溶性の二量体化ポリペプチドよりも増強されたＴ細胞刺激活性を有する。一実施形態において、前記増強されたＴ細胞刺激活性は、Ｔ細胞活性化刺激の増強およびＴ細胞増殖刺激の増強のうちの１つ以上を含む。一実施形態において、前記可溶性形態の五量体化ポリペプチドは、インビボにおいて、ICOS-Lの細胞外ドメイン（配列番号４９）を含む可溶性の二量体化ポリペプチドよりも増強された免疫刺激活性を有する。一実施形態において、前記増強された免疫刺激活性は、サイトカインの分泌刺激の増強および細胞障害性リンパ球（CTL）の産生刺激の増強のうちの１つ以上を含む。一実施形態において、前記可溶性形態の五量体化ポリペプチドは、制御性Ｔ細胞に対するエフェクターＴ細胞の割合を増加させる。
【００３８】
一態様において、医薬組成物を提供する。該医薬組成物は、本明細書で提供されるポリペプチド、本明細書で提供される宿主細胞および本明細書で提供される五量体化ポリペプチドのうちの１種以上と；薬学的に許容される担体、希釈剤または添加剤とを含む。
【００３９】
一態様において、生物学的応答の誘導を必要とする個体において生物学的応答を誘導する方法を提供する。該方法は、V-domain Ig Suppressor of T cell Activation（VISTA）と軟骨オリゴマー基質タンパク質（COMP）の融合ポリペプチド（VISTA.COMP）の治療有効量を前記個体に投与することを含み、前記VISTA.COMPポリペプチドが配列番号９を有し、配列番号１１に連結されているか、または配列番号１０を有し、配列番号１２に連結されていること、ならびに前記生物学的応答が、Ｔ細胞活性化の抑制、Ｔ細胞増殖の抑制、Ｔ細胞による１種以上の炎症性サイトカインの分泌の減少、細胞傷害性Ｔリンパ球（CTL）の誘導の抑制、および制御性表現型を有するＴ細胞の増加のうちの１つ以上であることを特徴とする。一実施形態において、前記炎症性サイトカインは、IL-2およびIFNγのうちの１種以上を含む。
【００４０】
一態様において、生物学的応答の誘導を必要とする個体において生物学的応答を誘導する方法を提供する。該方法は、B7-H4と軟骨オリゴマー基質タンパク質（COMP）の融合ポリペプチド（B7-H4.COMP）の治療有効量を前記個体に投与することを含み、前記B7-H4.COMPポリペプチドが配列番号２５を有し、配列番号１１に連結されていること、ならびに前記生物学的応答が、Ｔ細胞活性化の抑制、Ｔ細胞増殖の抑制、Ｔ細胞による１種以上の炎症性サイトカインの分泌の減少、細胞傷害性Ｔリンパ球（CTL）の誘導の抑制、および制御性表現型を有するＴ細胞の増加のうちの１つ以上であることを特徴とする。
【００４１】
一態様において、生物学的応答の誘導を必要とする個体において生物学的応答を誘導する方法を提供する。該方法は、PD-L1と軟骨オリゴマー基質タンパク質（COMP）の融合ポリペプチド（PD-L1.COMP）の治療有効量を前記個体に投与することを含み、前記PD-L1.COMPポリペプチドが配列番号３６を有し、配列番号１１に連結されていること、ならびに前記生物学的応答が、Ｔ細胞活性化の抑制、Ｔ細胞増殖の抑制、Ｔ細胞による１種以上の炎症性サイトカインの分泌の減少、細胞傷害性Ｔリンパ球（CTL）の誘導の抑制、および制御性表現型を有するＴ細胞の増加のうちの１つ以上であることを特徴とする。
【００４２】
一態様において、生物学的応答の誘導を必要とする個体において生物学的応答を誘導する方法を提供する。該方法は、ICOS-Lと軟骨オリゴマー基質タンパク質（COMP）の融合ポリペプチド（ICOS-L.COMP）の治療有効量を前記個体に投与することを含み、前記ICOS-L.COMPポリペプチドが配列番号４９を有し、配列番号１１に連結されていること、ならびに前記生物学的応答が、Ｔ細胞活性化の刺激、Ｔ細胞増殖の刺激、Ｔ細胞による１種以上の炎症性サイトカインの分泌の増加、細胞傷害性Ｔリンパ球（CTL）の誘導の増加、および腫瘍微小環境における制御性Ｔ細胞に対するエフェクターＴ細胞の割合の増加のうちの１つ以上であることを特徴とする。一実施形態において、前記ICOS-L.COMPポリペプチドは、チェックポイント阻害分子と組み合わせて投与される。一実施形態において、前記ICOS-L.COMPポリペプチドは、前記チェックポイント阻害分子の投与と同時、投与前または投与後に投与される。一実施形態において、前記チェックポイント阻害分子は、抗PD-1抗体または抗CTLA-4抗体である。
【００４３】
本発明の前記特徴を、添付の図面を参照しながら、以下の詳細な説明においてさらに詳しく述べる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１Ａ−Ｇ】五量体VISTA.COMPはインビトロで可溶性リガンドとしてT細胞の活性化および増殖を抑制するが、二量体VISTA.Fcではこのような効果は認められないことを示す。
【００４５】
【図１Ａ】固相化（左パネル）もしくは可溶性（右パネル）のVISTA.Fc（10μg/mL）の存在下（濃灰色）またはこれらの非存在下（薄灰色）において、プレートに結合させた抗CD3抗体（2.5μg/mL）で４８時間活性化を行ったCFSE標識精製マウスCD4+T細胞を示す。VISTA.Fcは、固相化した場合にCD4+T細胞の増殖を抑制したが、可溶性リガンドとして培地に加えた場合にはCD4+T細胞の増殖を抑制できなかった。
【００４６】
【図１Ｂ】「方法」の節の記載に従って組換えVISTA.COMPを発現させ、還元剤（DTT）の存在下または非存在下においてSDS-PAGEおよびウエスタンブロットを実施し、純度と五量体化を確認したことを示す。還元条件下のVISTA.COMPは、約50kDaの単一バンドとして泳動され、ジスルフィド結合で安定化された五量体の見かけ上の質量は250kDaであった。
【００４７】
【図１Ｃ】コーティングした（9μg/mL、左パネル）または可溶性（12μg/mL、右パネル）のVISTA.COMP（濃灰色）またはCOMP（薄灰色）の存在下において活性化させたCD4+T細胞の増殖アッセイの結果を示す。可溶性VISTA.COMPによって、T細胞の増加（上パネル、FSC&SSCスキャッタプロファイル）および増殖（下パネル、CFSEの希釈）が抑制された。
【００４８】
【図１Ｄ−Ｅ】COMPまたはVISTA.COMP（10μg/mL）の存在下において抗CD3で４８時間または７２時間活性後にCD4+T細胞から回収した培地の分析結果を示す。IL-2（図１Ｄ）およびIFNγ（図１Ｅ）の分泌をELISAで定量した。VISTA.COMPは、T細胞の増殖を抑制するだけでなく、インビトロにおけるT細胞からのIL-2およびIFNγの分泌を有意に抑制することが見出された（COMPコントロールに対して***p<0.005、n=3）。
【００４９】
【図１Ｆ】COMP（薄灰色）またはVISTA.COMP（濃灰色）の存在下において、図に示した濃度の固相化抗CD3抗体でCFSE標識CD4+T細胞が活性化されたことを示す。VISTA.COMPによるT細胞増殖の抑制は、強いTCR刺激により打ち消された。
【００５０】
【図１Ｇ】同種混合白血球培養（MLC）アッセイの結果を示す。野生型マウス由来の応答細胞またはCD200R1-/-マウス由来の応答細胞における細胞傷害性Tリンパ球（CTL）の誘導は、VISTA.COMPの添加によって有意に抑制された（n=3、CD200Fcに対して*p<0.05）。
【００５１】
【図１Ｈ】ヒトVISTA（hVISTA-COMP）の五量体形態およびmVISTA-COMPの五量体形態を発現させ、SDS-PAGEで分析した結果を示す。
【００５２】
【図１Ｉ】インビトロにおいて、可溶性のCOMPまたはhVISTA.COMPの存在下において、コンカナバリンンＡで刺激したヒトT細胞の増加（上パネル）およびCFSE増殖アッセイ（下パネル）を示す。これらのT細胞において誘導された増殖はVISTA-COMPによって抑制される。
【００５３】
【図１Ｊ】VISTA.COMPの存在下においてConAを添加してCD3+T細胞、CD4+T細胞およびCD8+T細胞を培養したところ、COMPまたはVISTA-Fcの存在下での培養と比較してT細胞活性化マーカーCD25のアップレギュレーションが低下したことを示す。
【００５４】
【図２Ａ−Ｈ】VISTA.COMP（図２Ｃ、濃灰色）がT細胞株クローン（染色なしのコントロール、白色）に結合し、その活性化を抑制することを示す（図２Ａ〜図２Ｂ）。
【００５５】
【図２Ａ】固相化または可溶性のVISTA.FcまたはVISTA.COMP（10μg/mL）の存在下において、固相化抗CD3抗体（3μg/mL）で活性化することにより2.10 T細胞クローンを２４時間培養し、培養終了の６時間前に３Ｈ−チミジンで細胞をパルスすることによって増殖を測定した結果を示す。初代CD4+T細胞を使用した観察結果と同様に、五量体VISTA.COMPは、固相化した場合でも培地中に加えて溶解した場合でも増殖を抑制したが、VISTA.Fcは、固相化した場合にのみ抑制活性を示した（n=3、抗CD3刺激コントロールに対して**p<0.01）。
【００５６】
【図２Ｂ】パネルＡと同様にして活性化した2.10細胞における可溶性VISTA.COMP（濃灰色）または可溶性VISTA.Fc（薄灰色）の滴定を示す。データは、高濃度の可溶性VISTA.Fcで処理した細胞では抗増殖機能が見られないことを示す（n=3、**p<0.01）。
【００５７】
【図２Ｃ】2.10 T細胞クローンに対するビオチン標識COMP、ビオチン標識VISTA.COMPおよびビオチン標識VISTA.Fcの結合を（色つきヒストグラム）、染色なしのコントロール（無色のヒストグラム）と比較したFACS分析を示す。
【００５８】
【図２Ｄ】可溶性VISTA.FcまたはVISTA.COMPで４時間処理した抗CD3活性化2.10 T細胞、および細胞内フローサイトメトリー（ICFC）により測定したIL-2の産生を示す。VISTA.COMPのみによって、IL-2分泌細胞の数が有意に抑制された（n=3、VISTA.Fcまたは非処理細胞に対して*p<0.05）。
【００５９】
【図２Ｅ】抗CD3抗体を固相化した６ウェルプレートにおいて、VISTA.COMPの存在下または非存在下で１０分間培養した1×106個の2.10 T細胞クローンを示す。各ウェルの細胞を溶解し、次いで各ウェルに結合したタンパク質を回収することによって、T細胞受容体（TCR）と複合体化したタンパク質を回収した（「方法」の節に記載の固相免疫沈降法（SPIP）を参照されたい）。次に、回収したタンパク質を、抗ホスホチロシン抗体を用いた免疫ブロット法で分析した（pY：クローン4G10）。VISTA.COMPは、TCRのシグナル伝達により誘導されたTCR複合タンパク質のリン酸化を実質的に低下させた。
【００６０】
【図２Ｆ−Ｈ】T細胞クローンに対するVISTA-FcまたはVISTA.COMPの結合の安定性を示す。
【００６１】
【図２Ｆ】FACS染色バッファーで洗浄を１段階で実施後の、2.10 T細胞に対するVISTA-FcまたはコントロールFc（アイソタイプコントロール）の結合を示す。
【００６２】
【図２Ｇ】FACS分析の前に洗浄を２段階で行った後のVISTA-Fcの結合を示す。Ａと比較して結合シグナルが欠如していることから、細胞株とVISTA-Fcの相互作用が一時的な弱いものであることが分かる。
【００６３】
【図２Ｈ】洗浄を２段階で行った後でも、2.10細胞およびJurkat細胞に対するビオチン標識VISTA.COMPの結合が維持されていることから、これらの細胞に対するVISTA.COMPの相互作用がより安定していることが分かる。
【００６４】
【図３Ａ−Ｅ】VISTA.COMPがインビボで免疫応答を抑制することを示す。
【００６５】
【図３Ａ】皮膚同種移植片拒絶モデルの概略図を示す。０日目に、C57BL/6マウスから採取した皮膚をBALB/Cマウスに移植し、VISTA.COMP（15μg、静脈注射）またはPBSによる処置を１５日間行った（矢印）。盲検化した評価者によって移植片の生着を毎日観察した。
【００６６】
【図３Ｂ】VISTA.COMPによる処置により皮膚同種移植片の生着が有意に延長されたことを示す（n=6、マン・ホイットニーのＵ検定により*p<0.05）。
【００６７】
【図３Ｃ】Con-A注射の１時間前にVISTA.COMPで処置したところ、２４時間後において致死性の肝損傷からC57BL/6マウスがレスキューされたことを示す（n=4）。
【００６８】
【図３Ｄ−Ｅ】Con-A注射の３時間後におけるTNFα（n=5、*p<0.05）（図３Ｄ）およびIL-6（n=5、*p<0.05）（図３Ｅ）の血清中濃度の有意な低下が、生着率と相関していたことを示す。
【００６９】
【図４Ａ−Ｂ】VISTA.COMPの活性に対する２種のタグの影響を示す。
【００７０】
【図５Ａ】B7-H4.COMP五量体およびPD-L1.COMP五量体の概略図である。
【００７１】
【図５Ｂ】Expi293F細胞に発現されたB7-H4.COMPコンストラクト、PD-L1.COMPコンストラクト、VISTA.COMPコンストラクト（＋コントロール）およびCOMPコンストラクトをNi-NTAで精製し、還元条件または酸化条件で泳動したSDS-PAGEゲルを示す。
【００７２】
【図６】グラフに示した各可溶性リガンドの存在下において、CFSE標識精製マウスCD4+T細胞をプレート結合抗CD3抗体（2C11）で７２時間活性化した結果を示す。CFSEの希釈をFACSで分析したところ、PD-L1.COMP、B7-H4.COMPおよびVISTA.COMPはいずれも、COMP単独やリガンドなし（−）の場合と比べて、T細胞の増加（上パネル）および増殖（下パネル）を抑制したことが示された。
【００７３】
【図６】可溶性のVISTA.COMPは、CD3-TCR複合体によるシグナル伝達に応答したT細胞の増殖を抑制できるが、可溶性のVISTA.Fc二量体ではこのような効果は見られないことを示す。
【００７４】
【図７Ａ】VISTA.COMPの静脈注射［３日ごと］は、処置を中止するまで（アスタリスク）マウスの皮膚同種移植片拒絶を阻止するが、VISTA.Fcではこのような効果は見られないことを示す。
【００７５】
【図７Ｂ】Con-Aの投与の１時間前にVISTA.COMPの腹腔内注射でC57BL/6マウスを処置したところ、２４時間後において致死性の肝損傷からマウスの50%がレスキューされたことを示す（n=13、p<0.05）。VISTA.Fcではこのような効果は認められなかった。瀕死マウスは無反応個体として分類した。３つの独立した実験のデータを合わせた。VISTA.COMP処置マウスは、Con-A注射の３時間後の血清中TNFα（n=5、*p<0.05）およびIL-6（n=5、*p<0.05）が有意に低下した。
【００７６】
【図８Ａ】ヒトICOS-L.COMP五量体の概略図である。
【００７７】
【図８Ｂ】ICOS-L.COMP五量体の純度および分子量を示すウエスタンブロットおよびSDS-PAGEである。
【００７８】
【図９Ａ】Biacore T200を使用した表面プラズモン共鳴実験により測定したところ、hICOS-L.COMPはヒトICOSにもマウスICOSにも結合したが、CD28には結合しなかったことを示す。
【００７９】
【図９Ｂ】表面プラズモン共鳴法により評価した、ヒトICOS-L.COMP、hICOSL-FcおよびCOMPに対するICOS.Fcの結合の特性を示す。ヒトICOS-L.COMPでは解離速度（kd）が遅く、解離定数（0.9nM）がICOSL-Fc（2.9nM）よりも小さいことから、ICOSに対するヒトICOS-L.COMPのアビディティが強いことが示されている。
【００８０】
【図９Ｃ】ヒトCD3+CD4+T細胞およびヒトCD3+CD4-T細胞に対するFITC標識ICOS-L.COMPの結合を実証したFACS分析を示す。
【００８１】
【図９Ｄ】活性化ヒトCD3+T細胞に対するhICOS-L.Fcの結合が、ヒトICOS-L.COMPによって競合置換されることを実証したFACS分析を示す。
【００８２】
【図９Ｅ】活性化マウスCD4+T細胞に対するmICOSL-Fcの結合が、hICOS-L.COMPによって競合置換されることを実証したFACS分析を示す。
【００８３】
【図１０Ａ】可溶性のICOS-L.COMPによるヒトCD4+T細胞およびヒトCD8+T細胞の強力な共刺激を実証したCFSE希釈によるT細胞増殖アッセイを示す。
【００８４】
【図１０Ｂ】ヒトICOS-L.COMPでT細胞を活性化することによって、T細胞上のCD25の発現が増加することを実証したFACS分析を示す（灰色のヒストグラム）。
【００８５】
【図１０Ｃ】可溶性のhICOS-L.COMPが、臍帯血から単離されたCD3+CD4+ヒトT細胞を共刺激するが、ICOSL-Fcではこのような効果は認められないことを実証したCFSE希釈によるT細胞増殖アッセイを示す。
【００８６】
【図１０Ｄ】抗CD3で誘導したT細胞受容体シグナル伝達の非存在下では、ICOSL-COMPは、臍帯血から単離されたヒトT細胞の増殖を誘導しないことを実証したFACS分析を示す。
【００８７】
【図１０Ｅ】可溶性のhICOSL-COMPが、抗CD3または抗CD3／抗CD28で誘導されたシグナル伝達と組み合わせた場合にCD3+CD4+T細胞およびCD3+CD4-T細胞の増殖を共刺激するが、ICOSL-Fcではこのような効果は認められないことを実証したCFSE希釈によるT細胞増殖アッセイを示す。T細胞は成人ドナーのPBMCから単離した。
【００８８】
【図１０Ｆ】可溶性のCOMP、ICOSL-COMPまたはICOSL-Fcの存在下において、抗CD3でCD3+T細胞（成人PBMC由来）を７２時間刺激した後のサイトカインの分泌（IL-2、IL-6、IFNγ、TNFα、IL-10）を示す。
【００８９】
【図１１Ａ】インビボMC38腫瘍モデル実験における各化合物の投与の詳細を示す概略図である。
【００９０】
【図１１Ｂ】ICOS-L.COMPが抗PD-1モノクローナル抗体と相乗的に作用して、定着した皮下マウス結腸直腸MC38腫瘍を有するC57BL/6マウス（治療モデル）において予防的な抗腫瘍免疫を誘導することを示す。
【００９１】
【図１１Ｃ】各マウスの腫瘍体積の概要を時間の関数として示す。
【００９２】
【図１２Ａ】ICOS-L.COMP単独療法では、MC38腫瘍モデルにおける腫瘍の増殖を低減できなかったことを示す。
【００９３】
【図１２Ｂ】MC38腫瘍を有するマウスを抗PD-1で処置すると、腫瘍内CD45+CD4+T細胞およびCD45+CD8+T細胞においてICOSの発現が増加することを示す。
【００９４】
【図１２Ｃ】MC38腫瘍を有するマウスを処置した後の腫瘍浸潤リンパ球（TIL）のプロファイルを示す。抗PD-1とICOS-L.COMPを併用することによって、腫瘍浸潤リンパ球（TIL）集団中のCD45+CD4+FoxP3-細胞の存在量が有意に増加する。
【００９５】
【図１２Ｄ】MC38腫瘍を有するマウスを処置した後の腫瘍浸潤リンパ球（TIL）のプロファイルを示す。抗PD-1とICOS-L.COMPを併用しても、腫瘍浸潤リンパ球（TIL）集団中のCD45+CD4+FoxP3+T制御性細胞の存在量に変化は認められなかった。
【００９６】
【図１３】ナイーブ2.10 T細胞または抗CD3で２４時間活性化した2.10 T細胞を、ビオチンで標識したPD-L1.COMP、B7-H4.COMPまたはCOMPで染色した結果を示す。このT細胞株に対するCOMPの結合は、PD-L1.COMPやB7-H4.COMPと比べて、無視できる程度の非特異的結合しか示さない。
【００９７】
【図１４】固相化抗CD3抗体で活性化された2.10 T細胞の増殖が、固相化したB7-H4.COMPおよび可溶性のB7-H4.COMPによって抑制されることを示す。
【００９８】
【図１５】可溶性のB7-H4.COMP（10μg/mL）が、インビトロにおいて抗CD3の誘導により７２時間活性化された初代マウスCD4+T細胞の増加（上パネル）と細胞分裂（下パネル）を実質的に抑制することを示す。
【００９９】
【図１６】可溶性のB7-H4.COMP（10μg/mL）が、インビトロにおいて抗CD3の誘導により４８時間活性化された初代マウスCD4+T細胞からのサイトカインIL-2の分泌を抑制することを示す。
【発明を実施するための形態】
【０１００】
別段の記載がない限り、本明細書で使用されている技術用語および科学用語は、通常、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味を有する。
【０１０１】
V-domain Immunoglobulin suppressor of T-cell activation（VISTA）は、近年発見された免疫チェックポイントリガンドであり、Ｔ細胞の活性を抑制する機能を有する。その他の免疫チェックポイントリガンドとして、B7-H4やPD-L1が挙げられる。このような免疫チェックポイントの経路を対象において活性化することによって治療を行える可能性があり、この理由として少なくとも、これらの免疫チェックポイント経路の活性化によりＴ細胞の活性を抑制することができ、これによって該対象における炎症反応が低減されうることが挙げられる。これとは逆に、ICOS-LなどのＴ細胞活性を刺激するリガンドは、免疫増強を介した治療が可能であると考えられ、たとえば、がん免疫療法などに利用できると考えられる。
【０１０２】
VISTAのIgVドメインの二量体コンストラクト（VISTA-Fc）は、インビトロにおいてＴ細胞の活性化を抑制することが示されている。しかしながら、この効果を得るには、固体基質にVISTA-Fcを固相化する必要があった。活性が固相化に依存することから、インビボでのVISTA受容体アゴニストとしてのVISTA-Fcの有効性は限定的である可能性が示唆される。
【０１０３】
本明細書において、五量体ポリペプチドおよびこれを構成するモノマーを提供する。各モノマーは、軟骨オリゴマー基質タンパク質（COMP）の五量体形成ドメインに遺伝子融合または連結されたVISTA、B7-H4、PD-L1またはICOS-Lの細胞外ドメインを含む。
【０１０４】
COMPは、５つのサブユニットからなる524kDaのホモ五量体である。各サブユニットは、Ｎ末端の７残基反復領域（cc）、４つの上皮成長因子（EGF）様ドメイン（EF）、７つのカルシウム結合ドメイン（T3）およびＣ末端球状ドメイン（TC）をこの順で含む。本明細書で使用されるCOMP五量体形成ドメインは、４５アミノ酸長の配列であり、５本のαヘリックスが平行に配置され、ジスルフィド架橋により安定化された束状構造を自然にとる。過去の研究によれば、COMPの五量体形成ドメインに融合した血管新生促進因子アンジオポエチン１（COMP-Ang1）は、天然のAng1よりも高い安定性を示し、インビボにおいて血管新生の誘導を増強する21。
【０１０５】
本発明者らは、ヒトおよびマウスの遺伝子組換え核酸、遺伝子組換えポリペプチドおよび遺伝子組換え五量体化ポリペプチドであって、いずれもVISTA、B7-H4、PD-L1またはICOS-Lの細胞外ドメインの配列を含み、これらの各細胞外ドメイン配列が、COMPの五量体形成ドメインに作動可能に連結された、遺伝子組換え核酸、遺伝子組換えポリペプチドおよび遺伝子組換え五量体化ポリペプチドを作製した。「細胞外ドメイン」（または「ECD」）は、ポリペプチドの細胞外領域またはそれをコードする核酸を意味し、１つ以上の免疫グロブリン様ドメインが含まれ、この免疫グロブリン様ドメインは、リガンドと受容体の間の効率的な結合に一定の役割を果たしている。VISTA、B7-H4、PD-L1およびICOS-LのECDは、IgVドメインを含む。B7-H4、PD-L1およびICOS-LのECDは、さらにIgCドメインを含む。本明細書で提供される前記遺伝子組換え核酸および／またはポリペプチドに対応する遺伝子組換えmRNAも本明細書中に包含される。
【０１０６】
COMPの五量体形成ドメインに作動可能に連結されたVISTA、B7-H4、PD-L1またはICOS-L細胞外ドメインの調製において使用した核酸配列およびポリペプチド配列を補遺１に示す。
【０１０７】
一実施形態において、COMPの五量体形成ドメインに連結されたVISTA、B7-H4、PD-L1またはICOS-Lの細胞外ドメインをコードする核酸配列を有する組換え核酸を提供する。いくつかの実施形態において、VISTAのIgV含有細胞外ドメインをコードする核酸は、配列番号１（ヒトVISTAのIgV含有ドメイン）または配列番号２（マウスVISTAのIgV含有ドメイン）と実質的な類似性を有する。いくつかの実施形態において、B7-H4の細胞外ドメインをコードする核酸は、配列番号２６と実質的な類似性を有する。いくつかの実施形態において、PD-L1の細胞外ドメインをコードする核酸は、配列番号３７と実質的な類似性を有する。いくつかの実施形態において、ICOS-Lの細胞外ドメインをコードする核酸は、配列番号４８と実質的な類似性を有する。いくつかの実施形態において、COMPの五量体形成ドメインをコードする核酸は、配列番号３（ヒトCOMPの五量体形成ドメイン）または配列番号４（マウスCOMPの五量体形成ドメイン）と実質的な類似性を有する。
【０１０８】
配列における「実質的な類似性」とは、本明細書で提供される配列と同一である配列または本明細書で提供される配列のバリアントであって、本明細書に記載の生物学的活性を含む配列もしくはそのバリアント、または本明細書に記載の生物学的活性を含むポリペプチドをコードする配列もしくはそのバリアントを意味する。
【０１０９】
たとえば、核酸配列の場合、実質的に類似する配列は、遺伝子コードの縮重によって、本明細書で提供されるポリペプチドのいずれか１つのアミノ酸配列をコードする保存的バリアントを含む。バリアントのヌクレオチド配列は、合成的に誘導されたヌクレオチド配列を含む。通常、本発明の特定のヌクレオチド配列のバリアントは、当技術分野で公知の配列アライメントプログラムをデフォルトパラメータで使用して測定した場合、本明細書で提供されるヌクレオチド配列のいずれか一つと少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有する。いくつかの好ましい実施形態において、実質的に類似する配列は参照配列と同一の配列である。いくつかの好ましい実施形態において、核酸配列は、遺伝子コンストラクトにおいて使用するために（たとえば、プラスミドにおいて使用するために）コドン最適化されている。
【０１１０】
本発明に含まれるポリペプチドのバリアントは、生物学的に活性であり、すなわち、本明細書に記載の五量体化ポリペプチドの生物学的活性を保持している。このようなバリアントは、たとえば、遺伝子多型または人為操作により得られるものであってもよい。本発明のポリペプチドの生物学的活性バリアントは、当技術分野で公知の配列アライメントプログラムをデフォルトパラメータで使用して測定した場合、本明細書で提供されるアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有する。
【０１１１】
一実施形態において、前記組換え核酸は、配列番号３に作動可能に連結された配列番号１（すなわち、ヒトCOMPの五量体形成ドメインに連結されたヒトVISTAのIgV含有ドメイン）を含む。一実施形態において、前記組換え核酸は、配列番号４に作動可能に連結された配列番号２（すなわち、マウスCOMPの五量体形成ドメインに連結されたマウスVISTAのIgV含有ドメイン）を含む。
【０１１２】
特定の核酸分子と別の核酸分子が機能的に関連して配置されている場合、これらの核酸分子は作動可能に連結されていると言える。たとえば、２つの核酸分子が連結されており、これらの核酸分子によってコードされるアミノ酸配列が適切に翻訳される場合、これら２つの核酸分子は作動可能に連結されていると言える。このような核酸は、リンカー配列を介して作動可能に連結されていてもよい。本明細書で開示された組換え核酸との使用に適したリンカー配列は、当業者によって決定されてもよい。いくつかの好ましい実施形態において、前記リンカー配列はある程度柔軟なペプチドまたはポリペプチド（たとえば、グリシンリッチなペプチドまたはポリペプチド）をコードするように遺伝子組換えされる。
【０１１３】
一態様において、COMPの五量体形成ドメインに連結されたVISTAの細胞外ドメインをコードするmRNA配列を有する組換えメッセンジャーリボ核酸（mRNA）を提供する。いくつかの実施形態において、VISTAの細胞外ドメインをコードするmRNAは、配列番号５（ヒトVISTAのIgV含有ドメイン）または配列番号６（マウスVISTAのIgV含有ドメイン）と実質的な類似性を有する。いくつかの実施形態において、COMPの五量体形成ドメインをコードするmRNAは、配列番号７（ヒトCOMPの五量体形成ドメイン）または配列番号８（マウスCOMPの五量体形成ドメイン）と実質的な類似性を有する。
【０１１４】
一実施形態において、前記組換えmRNAは、配列番号７に作動可能に連結された配列番号５（すなわち、ヒトCOMPの五量体形成ドメインに連結されたヒトVISTAのIgV含有ドメイン）を含む。一実施形態において、前記組換え核酸は、配列番号８に作動可能に連結された配列番号６（すなわち、マウスCOMPの五量体形成ドメインに連結されたマウスVISTAのIgV含有ドメイン）を含む。本明細書で開示された組換え核酸との使用に適したリンカー配列は、当業者によって決定されてもよい。いくつかの好ましい実施形態において、前記リンカー配列はある程度柔軟なペプチドまたはポリペプチド（たとえば、グリシンリッチなペプチドまたはポリペプチド）をコードするように遺伝子組換えされる。
【０１１５】
一態様において、COMPの五量体形成ドメインに連結されたB7-H4の細胞外ドメインをコードするmRNA配列を有する組換えメッセンジャーリボ核酸（mRNA）を提供する。いくつかの実施形態において、B7-H4の細胞外ドメインをコードするmRNAは、配列番号２７（ヒトB7-H4のECD）と実質的な類似性を有する。いくつかの実施形態において、COMPの五量体形成ドメインをコードするmRNAは、配列番号７（ヒトCOMPの五量体形成ドメイン）と実質的な類似性を有する。
【０１１６】
一態様において、COMPの五量体形成ドメインに連結されたPD-L1の細胞外ドメインをコードするmRNA配列を有する組換えメッセンジャーリボ核酸（mRNA）を提供する。いくつかの実施形態において、VISTAの細胞外ドメインをコードするmRNAは、配列番号６２（ヒトPD-L1のECD）と実質的な類似性を有する。いくつかの実施形態において、COMPの五量体形成ドメインをコードするmRNAは、配列番号７（ヒトCOMPの五量体形成ドメイン）と実質的な類似性を有する。
【０１１７】
一態様において、COMPの五量体形成ドメインに連結されたICOS-Lの細胞外ドメインをコードするmRNA配列を有する組換えメッセンジャーリボ核酸（mRNA）を提供する。いくつかの実施形態において、VISTAの細胞外ドメインをコードするmRNAは、配列番号６１（ヒトICOS-LのECD）と実質的な類似性を有する。いくつかの実施形態において、COMPの五量体形成ドメインをコードするmRNAは、配列番号７（ヒトCOMPの五量体形成ドメイン）と実質的な類似性を有する。
【０１１８】
一態様において、COMPの五量体形成ドメインに連結されたVISTA、B7-H4、PD-L1またはICOS-Lの細胞外ドメインをコードするアミノ酸配列を有する組換えポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態において、VISTAのIgV含有細胞外ドメインをコードするアミノ酸配列は、配列番号９（ヒトVISTAのIgV含有ドメイン）または配列番号１０（マウスVISTAのIgV含有ドメイン）と実質的な類似性を有する。いくつかの実施形態において、B7-H4の細胞外ドメインをコードするアミノ酸配列は、配列番号２５と実質的な類似性を有する。いくつかの実施形態において、PD-L1の細胞外ドメインをコードするアミノ酸配列は、配列番号３６と実質的な類似性を有する。いくつかの実施形態において、ICOS-Lの細胞外ドメインをコードするアミノ酸配列は、配列番号４９と実質的な類似性を有する。いくつかの実施形態において、COMPの五量体形成ドメインをコードするアミノ酸は、配列番号１１（ヒトCOMPの五量体形成ドメイン）または配列番号１２（マウスCOMPの五量体形成ドメイン）と実質的な類似性を有する。
【０１１９】
本明細書において、「連結」は、なんらかの結合方法で、共有結合または非共有結合を介して、特定のポリペプチドを別のポリペプチドと結合することを意味する。一実施形態において、前記結合は共有結合（ペプチド結合など）である。たとえば、本発明のVISTA、B7-H4、PD-L1またはICOS-Lの細胞外ドメインをコードするアミノ酸配列を有するペプチドは、本発明のCOMPの五量体形成ドメインに連結することができる。このようなリンカーの例は、当技術分野で公知であり、たとえばChenら（引用文献３８）に記載されている。一実施形態において、本発明のVISTA、B7-H4、PD-L1またはICOS-Lの細胞外ドメインは、VISTA、B7-H4、PD-L1またはICOS-Lの細胞外ドメインとCOMPの五量体形成ドメインの融合タンパク質を形成させることによって、COMPの五量体形成ドメインに連結することができる。このような融合タンパク質は、当技術分野で公知の標準的な方法および本明細書の記載に従って、VISTA、B7-H4、PD-L1またはICOS-LのECDとCOMPの五量体形成ドメインとをコードする発現ベクターを使用して宿主細胞において産生させることができる。
【０１２０】
一実施形態において、前記組換えポリペプチドは、配列番号１１に作動可能に連結された配列番号９（すなわち、ヒトCOMPの五量体形成ドメインに連結されたヒトVISTAのIgV含有細胞外ドメイン）を含む。一実施形態において、前記組換え核酸は、配列番号１２に作動可能に連結された配列番号１０（すなわち、マウスCOMPの五量体形成ドメインに連結されたマウスVISTAのIgV含有細胞外ドメイン）を含む。本明細書で開示された組換え核酸との使用に適したリンカー配列は、当業者によって決定されてもよい。いくつかの好ましい実施形態において、前記リンカー配列はある程度柔軟なペプチドまたはポリペプチド（たとえば、グリシンリッチなペプチドまたはポリペプチド）をコードするように遺伝子組換えされる。
【０１２１】
本明細書に記載のいくつかの実施形態において、前記組換えポリペプチドは、組換えタンパク質、遺伝子組換えタンパク質または融合タンパク質と呼んでもよい。「融合タンパク質」とは、元来は別々のポリペプチドをコードする２つ以上の遺伝子を連結することによって作製されたタンパク質を意味する。このような融合遺伝子を翻訳することによって、元の各ポリペプチドに由来する機能特性を持つ単一のポリペプチドが得られる。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、本発明の核酸またはポリペプチドは、組換えタンパク質の分泌を可能とするＮ末端リーダー配列、および／または精製を目的としたヒスチジンタグもしくはその他のアフィニティータグを含んでいてもよい。Ｎ末端リーダー配列および／またはヒスチジンタグもしくはその他のアフィニティータグを導入する方法は、当技術分野で公知である。
【０１２３】
一実施形態において、前記組換えポリペプチドを可溶性形態で提供する。本明細書において「可溶性」は、固体基質や固体表面に固相化されていないことを意味する。一実施形態において、前記組換えポリペプチドの活性は、基質への固相化とは無関係である（すなわち、前記組換えポリペプチドの活性は、固体基質または固体表面への固相化に左右されない）。
【０１２４】
一実施形態において、本明細書で開示された組換えポリペプチドを含む発現ベクターを提供する。いくつかの実施形態において、前記発現ベクターは、少なくとも１つの制御配列をさらに含む。「制御配列」とは、作動可能に連結されたコード配列を特定の宿主生物において発現させるために必要な１つ以上の配列を意味する。好適な制御配列としては、たとえば、プロモーター、ポリアデニル化シグナルおよび／またはエンハンサーが挙げられる。組換えポリペプチドが組み込まれた発現ベクターを作製する方法およびそのツールは当技術分野で知られており、本明細書で提供される発現ベクターの作製に好適であってもよい。
【０１２５】
一態様において、本明細書で開示された発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。前記宿主細胞は、たとえば、HEK-293細胞もしくはHEK-293由来細胞、CHO細胞もしくはCHO由来細胞、またはNS01細胞もしくはNS01由来細胞であってもよい。発現ベクターが組み込まれた宿主細胞を作製する方法およびそのツールは当技術分野で知られており、本明細書で提供される宿主細胞の作製に好適であってもよい。一実施形態において、遺伝物質として（本明細書で提供される）VISTAとCOMP、B7-H4とCOMP、PD-L1とCOMP、またはICOS-LとCOMPがゲノムに組み込まれた遺伝子組換え細胞株を提供する。
【０１２６】
一態様において、Ｔ細胞調節活性を有する五量体化ポリペプチドを提供する。該五量体化ポリペプチドは、５つのモノマーを含み、各モノマーは、V-domain Ig Suppressor of T cell Activation（VISTA）の細胞外ドメイン（配列番号９または１０）と実質的な類似性を有するポリペプチド；B7-H4の細胞外ドメイン（配列番号２５）と実質的な類似性を有するポリペプチド；PD-L1の細胞外ドメイン（配列番号３６）と実質的な類似性を有するポリペプチド；またはICOS-Lの細胞外ドメイン（配列番号４９）と実質的な類似性を有するポリペプチドを含み、これらの各細胞外ドメインは、軟骨オリゴマー基質タンパク質（COMP）の五量体形成ドメイン（配列番号１１または１２）と実質的な類似性を有するポリペプチドに連結されている。
【０１２７】
一実施形態において、前記五量体化ポリペプチドは、配列番号１１に作動可能に連結された配列番号９を含む。
【０１２８】
一実施形態において、前記五量体化ポリペプチドは、配列番号１２に作動可能に連結された配列番号１０を含む。
【０１２９】
いくつかの実施形態において、前記五量体化ポリペプチドは可溶性形態である。本明細書で提供される五量体化VISTA.COMP、B7-H4.COMPおよびPD-L1.COMPは、二量体化VISTA-Fcとは異なり、可溶性形態で生物学的活性を発揮する。当業者であれば、可溶性形態で生物学的活性を呈する薬剤が、固相化形態でのみ生物学的活性を発揮する薬剤よりも優れている利点を認識することができる。たとえば、可溶性VISTA受容体アゴニスト、可溶性B7-H4受容体アゴニストまたは可溶性PD-1受容体アゴニストは、アクセサリー細胞との結合およびアクセサリー細胞上でのクラスター化が免疫抑制の誘導に必要とされることがある二量体形態（VISTA-Fc、B7-H4-FcまたはPD-L1-Fc）よりも、インビボにおいて増強された活性を発揮する場合がある。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、前記可溶性形態の五量体化ポリペプチドのＴ細胞抑制活性は、VISTAのIgV含有ドメイン（配列番号９または１０）を含む可溶性の二量体化ポリペプチドよりも（たとえばVISTA-Fcよりも）増強しているか、B7-H4のECDを含む可溶性の二量体化ポリペプチドよりも（たとえばB7-H4-Fcよりも）増強しているか、またはPD-L1のECDを含む可溶性の二量体化ポリペプチドよりも（たとえばPD-L1-Fcよりも）増強している。前記可溶性形態の五量体化ポリペプチドのＴ細胞抑制活性は、VISTAのIgV含有ドメイン（配列番号９または１０）を含む可溶性の二量体化ポリペプチド（たとえばVISTA-Fc）、またはB7-H4のECDを含む可溶性の二量体化ポリペプチド（たとえばB7-H4-Fc）、またはPD-L1のECDを含む可溶性の二量体化ポリペプチド（たとえばPD-L1-Fc）のＴ細胞抑制活性よりも、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％増強していてもよい。いくつかの実施形態において、前記Ｔ細胞抑制活性の増強は、Ｔ細胞活性化抑制の増強およびＴ細胞増殖抑制の増強のうちの１つ以上を含む。Ｔ細胞抑制活性の測定方法、Ｔ細胞活性化の測定方法およびＴ細胞増殖の測定方法は当技術分野で公知であり、たとえば本明細書に記載されている。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、前記可溶性形態のVISTA.COMP五量体化ポリペプチド、B7-H4.COMP五量体化ポリペプチドまたはPD-L1.COMP五量体化ポリペプチドのインビボにおける免疫抑制活性は、VISTAの細胞外ドメイン（ECD）（配列番号９または１０）を含む可溶性の二量体化ポリペプチドよりも（たとえばVISTA-Fcよりも）増強しているか、B7-H4のECDを含む可溶性の二量体化ポリペプチドよりも（たとえばB7-H4-Fcよりも）増強しているか、またはPD-L1のECDを含む可溶性の二量体化ポリペプチドよりも（たとえばPD-L1-Fcよりも）増強している。前記可溶性形態の五量体化ポリペプチドの免疫抑制活性は、VISTAのIgV含有ドメイン（配列番号９または１０）を含む可溶性の二量体化ポリペプチド（たとえばVISTA-Fc）、またはB7-H4のECDを含む可溶性の二量体化ポリペプチド（たとえばB7-H4-Fc）、またはPD-L1のECDを含む可溶性の二量体化ポリペプチド（たとえばPD-L1-Fc）の免疫抑制活性よりも、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％増強していてもよい。たとえば、前記免疫抑制活性の増強は、サイトカイン（たとえばIL-2および／またはIFNγ）の分泌抑制の増強および細胞障害性リンパ球（CTL）の産生抑制の増強のうちの１つ以上を含んでいてもよい。免疫抑制活性の測定方法、サイトカイン分泌の測定方法および細胞障害性リンパ球（CTL）の産生抑制の測定方法は、当技術分野で公知であり、たとえば本明細書に記載されている。免疫抑制活性の増強は、たとえば、インビボでの炎症反応の抑制を含んでいてもよく、実施例のデータでは、マウス皮膚同種移植片の生着期間が延長すること、および致死性の急性肝炎からマウスが保護されることが実証されている。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、前記可溶性形態のICOS-L.COMP五量体化ポリペプチドのＴ細胞刺激活性は、ICOS-Lの細胞外ドメイン（ECD）（配列番号４９）を含む可溶性の二量体化ポリペプチド（たとえばICOS-L-Fc）よりも増強している。前記可溶性形態の五量体化ポリペプチドのＴ細胞刺激活性は、ICOS-LのECD（配列番号４９）を含む可溶性の二量体化ポリペプチド（たとえばICOS-L-Fc）のＴ細胞刺激活性と比べて、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％増強していてもよく、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍、６０倍、６５倍、７０倍、７５倍、８０倍、８５倍、９０倍、９５倍もしくは１００倍またはそれ以上増強していてもよい。いくつかの実施形態において、前記Ｔ細胞刺激活性の増強は、Ｔ細胞活性化刺激の増強およびＴ細胞増殖刺激の増強のうちの１つ以上を含む。Ｔ細胞刺激活性の測定方法、Ｔ細胞活性化の測定方法およびＴ細胞増殖の測定方法は当技術分野で公知であり、たとえば本明細書に記載されている。
【０１３３】
いくつかの実施形態において、前記可溶性形態のICOS-L.COMP五量体化ポリペプチドのインビボにおける免疫刺激活性は、ICOS-Lの細胞外ドメイン（ECD）（配列番号４９）を含む可溶性の二量体化ポリペプチド（たとえばICOS-L-Fc）よりも増強している。前記可溶性形態の五量体化ポリペプチドの免疫刺激活性は、ICOS-LのECD（配列番号４９）を含む可溶性の二量体化ポリペプチド（たとえばICOS-L-Fc）の免疫刺激活性と比べて、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％増強していてもよく、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍、６０倍、６５倍、７０倍、７５倍、８０倍、８５倍、９０倍、９５倍もしくは１００倍またはそれ以上増強していてもよい。たとえば、前記免疫刺激活性の増強は、サイトカイン分泌の増強および細胞障害性リンパ球（CTL）の産生の増強のうちの１つ以上を含んでいてもよい。免疫刺激活性の測定方法、サイトカイン分泌の測定方法および細胞障害性リンパ球（CTL）の産生の測定方法は、当技術分野で公知であり、たとえば本明細書に記載されている。
【０１３４】
いくつかの実施形態において、前記可溶性形態のICOS-L.COMP五量体化ポリペプチドは、ICOS-Lの細胞外ドメイン（配列番号４９）を含む可溶性の二量体化ポリペプチド（たとえばICOS-L-Fc）よりも、制御性Ｔ細胞に対するエフェクターＴ細胞の割合を増加させる。前記可溶性形態の五量体化ポリペプチドによって、制御性Ｔ細胞に対するエフェクターＴ細胞の割合が、適切なコントロールと比べて、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％増加してもよく、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍または１０倍増加してもよい。制御性Ｔ細胞に対するエフェクターＴ細胞の割合の測定方法は当技術分野で公知であり、たとえば本明細書に記載されている。
【０１３５】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるVISTA.COMP五量体化ポリペプチド、B7-H4.COMP五量体化ポリペプチドまたはPD-L1.COMP五量体化ポリペプチドの可溶性形態は、インビトロおよび／またはインビボにおいて、推定上のVISTA受容体、推定上のB7-H4受容体またはPD-1受容体のアゴニストとしての活性を発揮する。「アゴニスト」とは、受容体に結合して該受容体を活性化することにより、生物学的応答を惹起する薬剤を意味する。
【０１３６】
一実施形態において、本明細書に記載のポリペプチド、宿主細胞および五量体化ポリペプチドのうちの１種以上と、薬学的に許容される担体、希釈剤または添加剤とを含む医薬組成物を提供する。
【０１３７】
本発明のポリペプチド、またはVISTA.COMP五量体化ポリペプチド、B7-H4.COMP五量体化ポリペプチドもしくはPD-L1.COMP五量体化ポリペプチドは、当技術分野において公知の技術を用いた様々な方法で製剤化することができる。いくつかの実施形態において、本発明の治療用組成物は、単独で投与することができ、または最低限の追加成分を添加して投与することができ、任意で好適な薬学的に許容される担体を添加して製剤化してもよい。本明細書において「薬学的に許容される担体」は、当技術分野で公知の添加剤、溶媒、アジュバントおよび希釈剤を含み、医薬製剤用の市販品を利用することができる（たとえば、Gennaro (2003) Remington: The Science and Practice of Pharmacy with Facts and Comparisons: Drugfacts Plus, 20th ed., Mack Publishing；Ansel et al. (2004) Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7th ed., Lippencott Williams and Wilkins；Kibbe et al.(2000) Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd ed., Pharmaceutical Press.を参照されたい）。
【０１３８】
適切な薬学的に許容される担体は、比較的不活性であり、ポリペプチド、宿主細胞または五量体化ポリペプチドの投与を容易とすることが可能な物質、またはポリペプチド、宿主細胞または五量体化ポリペプチドのプロセシングを補助して、作用部位への送達が薬学的に最適化された製剤へと変換することが可能な物質を含む。
【０１３９】
このような薬学的に許容される担体としては、製剤の形態、一貫性、粘度、ｐＨ、等張性、安定性、オスモル濃度、薬物動態、タンパク質凝集または溶解度を変化させることができる薬剤が挙げられ、緩衝剤、湿潤剤、乳化剤、希釈剤、カプセル化剤および皮膚透過促進剤が挙げられる。担体として、具体的には、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、アルギニン、スクロース、水、グリセリン、エタノール、ソルビトール、デキストラン、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよびこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。全身投与用のポリペプチド、宿主細胞または五量体化ポリペプチドは、経腸投与用、非経口投与用または局所投与用に製剤化してもよい。特定の実施形態において、本明細書で開示された組成物は、静脈内投与用に製剤化され、好ましくは静注用容器（たとえば静注用点滴バッグ）を使用して注入される。さらに、有効成分を全身投与するために、前記３種の製剤すべてを同時に使用してもよい。非経口経路を介した薬物送達および経口経路を介した薬物送達のための添加剤および製剤は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2000) 20th Ed. Mack Publishingに記載されている。
【０１４０】
一態様において、生物学的応答の誘導を必要とする個体において生物学的応答を誘導する方法を提供する。該方法は、ａ）配列番号１１に作動可能に連結された配列番号９もしくはｂ）配列番号１２に作動可能に連結された配列番号１０を含むVISTA-COMP融合ポリペプチド（VISTA.COMP）；配列番号１１に作動可能に連結された配列番号２５を含むB7-H4-COMP融合ポリペプチド（B7-H4.COMP）；または配列番号１１に作動可能に連結された配列番号３６を含むPD-L1-COMP融合ポリペプチド（PD-L1.COMP）の治療有効量を前記個体に投与することを含む。前記方法において、前記生物学的応答は、Ｔ細胞活性化の抑制、Ｔ細胞増殖の抑制、Ｔ細胞による１種以上の炎症性サイトカインの分泌の減少、細胞傷害性Ｔリンパ球（CTL）の誘導の抑制、および制御性表現型を有するＴ細胞の増加のうちの１つ以上である。
【０１４１】
可溶性形態のVISTA.COMP五量体化ポリペプチド、B7-H4.COMP五量体化ポリペプチドまたはPD-L1.COMP五量体化ポリペプチドを投与した前記個体におけるＴ細胞の活性化は、適切なコントロール（たとえば、ポリペプチドを投与していない個体または可溶性の二量体化ポリペプチドを投与した個体）と比べて、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％抑制されていてもよい。前記可溶性形態の五量体化ポリペプチドを投与した前記個体におけるＴ細胞の増殖は、適切なコントロール（たとえば、ポリペプチドを投与していない個体または可溶性の二量体化ポリペプチドを投与した個体）と比べて、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％抑制されていてもよい。前記可溶性形態の五量体化ポリペプチドを投与した前記個体におけるＴ細胞による１種以上の炎症性サイトカインの分泌は、適切なコントロール（たとえば、ポリペプチドを投与していない個体または可溶性の二量体化ポリペプチドを投与した個体）と比べて、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％減少していてもよい。前記可溶性形態の五量体化ポリペプチドを投与した前記個体における細胞傷害性Ｔリンパ球（CTL）の誘導は、適切なコントロール（たとえば、ポリペプチドを投与していない個体または可溶性の二量体化ポリペプチドを投与した個体）と比べて、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％抑制されていてもよい。前記可溶性形態の五量体化ポリペプチドを投与した前記個体における制御性表現型のＴ細胞の増加は、適切なコントロール（たとえば、ポリペプチドを投与していない個体または可溶性の二量体化ポリペプチドを投与した個体）と比べて、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％増強されていてもよく、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍または１０倍増強されていてもよい。
【０１４２】
Ｔ細胞活性化の抑制を測定する方法、Ｔ細胞増殖の抑制を測定する方法、Ｔ細胞による１種以上の炎症性サイトカインの分泌の減少を測定する方法、細胞傷害性Ｔリンパ球（CTL）の誘導の抑制を測定する方法、および制御性表現型のＴ細胞の増加を測定する方法は当技術分野で公知であり、たとえば本明細書に記載されている。
【０１４３】
一実施形態において、生物学的応答の誘導を必要とする個体において生物学的応答を誘導する方法を提供する。該方法は、配列番号１１に作動可能に連結された配列番号４９を含むICOS-L-COMP融合ポリペプチド（ICOS-L.COMP）の治療有効量を前記個体に投与することを含む。前記方法において、前記生物学的応答は、Ｔ細胞活性化の増強、Ｔ細胞増殖の増強、Ｔ細胞による１種以上の炎症性サイトカインの分泌の増加、細胞傷害性Ｔリンパ球（CTL）の誘導の増強、および制御性Ｔ細胞に対するエフェクターＴ細胞の割合の増加のうちの１つ以上である。
【０１４４】
前記可溶性形態のICOS-L.COMP五量体化ポリペプチドを投与した前記個体におけるＴ細胞の活性化は、適切なコントロール（たとえば、ポリペプチドを投与していない個体または可溶性の二量体化ポリペプチド（たとえばICOS-L-Fc）を投与した個体）と比べて、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％増加または増強されていてもよく、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍、６０倍、６５倍、７０倍、７５倍、８０倍、８５倍、９０倍、９５倍もしくは１００倍またはそれ以上増加または増強されていてもよい。前記可溶性形態の五量体化ポリペプチドを投与した前記個体におけるＴ細胞の増殖は、適切なコントロール（たとえば、ポリペプチドを投与していない個体または可溶性の二量体化ポリペプチドを投与した個体）と比べて、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％増加または増強されていてもよく、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍、６０倍、６５倍、７０倍、７５倍、８０倍、８５倍、９０倍、９５倍もしくは１００倍またはそれ以上増加または増強されていてもよい。前記可溶性形態の五量体化ポリペプチドを投与した前記個体におけるＴ細胞による１種以上の炎症性サイトカインの分泌は、適切なコントロール（たとえば、ポリペプチドを投与していない個体または可溶性の二量体化ポリペプチドを投与した個体）と比べて、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％増加していてもよく、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍、６０倍、６５倍、７０倍、７５倍、８０倍、８５倍、９０倍、９５倍もしくは１００倍またはそれ以上増加していてもよい。前記可溶性形態の五量体化ポリペプチドを投与した前記個体における細胞傷害性Ｔリンパ球（CTL）の誘導は、適切なコントロール（たとえば、ポリペプチドを投与していない個体または可溶性の二量体化ポリペプチドを投与した個体）と比べて、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％増加または増強されていてもよく、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍または１０倍増加または増強されていてもよい。前記可溶性形態の五量体化ポリペプチドを投与した前記個体における制御性Ｔ細胞に対するエフェクターＴ細胞の割合の増加は、適切なコントロール（たとえば、ポリペプチドを投与していない個体または可溶性の二量体化ポリペプチドを投与した個体）と比べて、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％���４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％増強されていてもよく、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍または１０倍増強されていてもよい。
【０１４５】
Ｔ細胞活性化の増強を測定する方法、Ｔ細胞増殖の増強を測定する方法、Ｔ細胞による１種以上の炎症性サイトカインの分泌の増加を測定する方法、細胞傷害性Ｔリンパ球（CTL）の誘導の増強を測定する方法、および制御性Ｔ細胞に対するエフェクターＴ細胞の割合の増加を測定する方法は当技術分野で公知であり、たとえば本明細書に記載されている。
【０１４６】
「治療有効量」とは、意図とした目的の達成に有効な量（すなわち、特定の生物学的応答の誘導を必要とする個体において、該生物学的応答を誘導するのに十分な量）を意味する。治療有効量は当業者により容易に決定される。
【０１４７】
前記ICOS-L.COMPポリペプチドは、チェックポイント阻害分子と組み合わせて投与してもよい。本明細書において「チェックポイント阻害分子」は、免疫抑制シグナルを遮断して抗腫瘍免疫応答を向上することができる薬剤である。また、前記ICOS-L.COMPポリペプチドは、チェックポイント阻害分子の投与と同時、投与前または投与後に投与することができる。一実施形態において、前記チェックポイント阻害分子は阻害剤であり、たとえば、PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、VISTAまたはTIM3に対するアンタゴニスト抗体である。
【０１４８】
本明細書で開示された組み合わせによる所望の帰結は、コントロールまたはベースライン測定との比較によって定量される。本明細書において「改善」、「増加」または「低下」などの相対的な用語は、コントロールと比較した値を示し、コントロールとしては、たとえば、本明細書に記載の処置を開始する前の同一個体における測定値や、本明細書に記載の可溶性形態の五量体化ポリペプチドの非存在下かつ標準的な治療薬などのその他の治療成分の存在下におけるコントロール個体（または複数のコントロール個体）における測定値などが挙げられる。代表的なコントロール個体は、処置を受けている個体と同じ病態に罹患している個体である。
【０１４９】
治療に反応した変化または改善は、（相加効果によるものでも相乗効果によるものでも）統計的に有意であると判断される場合がある。本明細書において「有意性」または「有意である」という用語は、測定された２つ以上の応答の間に無作為ではない関連性があるかどうかの確率の統計分析に関する。特定の関係性が「有意である」または「有意性」を有するかどうかを決定するため、「ｐ値」を算出してもよい。ｐ値が、分析者によって定義されたカットオフ値を下回る場合に有意であると見なされる。本発明の目的を達成するにあたり、ｐ値が、０．１以下、０．０５未満、０．０１未満、０．００５未満、または０．００１未満であれば、有意であると見なすことができる。
【０１５０】
相乗的な治療効果は、単一の治療成分により誘導された治療効果または単一の治療成分の所定の組み合わせにより誘導された治療効果の総和の少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約５０倍または少なくとも約１００倍の効果であってもよい。また、相乗的な治療効果は、単一の治療成分により誘導された治療効果または単一の治療成分の所定の組み合わせにより誘導された治療効果の総和と比較して、少なくとも１０％の治療効果の増加、少なくとも２０％の治療効果の増加、少なくとも３０％の治療効果の増加、少なくとも４０％の治療効果の増加、少なくとも５０％の治療効果の増加、少なくとも６０％の治療効果の増加、少なくとも７０％の治療効果の増加、少なくとも８０％の治療効果の増加、少なくとも９０％の治療効果の増加、少なくとも１００％の治療効果の増加、またはそれ以上の治療効果の増加として観察されてもよい。さらに、相乗効果は、治療剤を組み合わせて使用した場合に各治療剤の用量を低下させるという効果でもある。
【０１５１】
特定の投与計画、すなわち用量、投与のタイミングおよび頻度は、個々の対象に左右され、さらに薬物動態（たとえば、半減期、クリアランス率など）などの実験に基づく検討に応じて決まる。投与頻度は、処置を受ける病態の状態および重症度、処置を受ける対象の年齢および全体的な健康状態などを考慮に入れて、主治医などの当業者によって決定されてもよい。また、投与頻度は、選択された組成物の有効性および投与計画を評価することにより、治療期間を通して調節してもよい。このような評価は、特定の疾患、障害もしくは状態のマーカー、または個体の健康状態の評価（生活の質（QOL）の評価や日常生活動作などを用いて測定される）に基づいて行うこともできる。
【実施例】
【０１５２】
実施例１：VISTA.COMP法
組換えタンパク質の発現および精製
ヒトIgG-1 Fc領域の上流にマウスVISTA細胞外ドメイン（ECD）（配列番号１０の１６〜１９４番目の残基）をコードする合成dsDNA（GeneArt；サーモフィッシャーサイエンティフィック）をpcDNA-3.4発現プラスミド（サーモフィッシャーサイエンティフィック）にクローニングすることによってVISTA.Fcを作製した。同様に、Ｃ末端にヘキサヒスチジンタグが付加された軟骨オリゴマー基質タンパク質の五量体形成ドメイン（COMP）（配列番号１２の２８〜７２番目の残基）の上流に、５’側および３’側にEcoRI制限消化部位を持つVISTA細胞外ドメイン（ECD）をコードする合成dsDNAを挿入することによって、マウスVISTA.COMP（配列番号１４）遺伝子をコードするプラスミドを作製した。また、EcoRIを用いた制限消化によってVISTA.COMPプラスミドからVISTAのECD領域を切り取って、COMPドメインのみをコードする発現プラスミド（コントロール）を構築した。いずれのプラスミドも、哺乳動物細胞におけるタンパク質の分泌を増加させるための５’末端Igκリーダー配列をコードしていた。Expi-293TM transient expression system（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いて組換えタンパク質を発現させた。さらに、マウスVISTA ECDの代わりにhVISTA ECD（配列番号９）をコードし、マウスCOMPドメインの代わりにヒトCOMP配列（配列番号１１）をコードするDNAを使用したこと以外は前記と同様にして、ヒトVISTA.COMP（hVISTA.COMP、配列番号２４）を作製した。分泌されたVISTA.Fcは、HiTrap Protein A HPカラム（GEヘルスケア）を使用して培地から精製し、ヒスチジンタグ付加VISTA.COMPおよびCOMPは、Ni-NTA樹脂（キアゲン）を使用して精製後、PD-10カラム（GEヘルスケア）を使用してPBS（pH7.4）で脱塩した。SDS-PAGEを用いてタンパク質の純度を確認し、BCAアッセイ（Pierce）または280nmにおける吸光度の測定によってタンパク質の濃度を定量した。
【０１５３】
動物
本願の研究において使用されたC57BL/6マウスは、Sunnybrook Research Institute Comparative Research（SRICR）の施設内の無菌環境で飼育し、CD200R1-/-マウスは、Toronto Research Institute Animalの施設内で飼育した。プロトコルはいずれも、Canadian Council of Animal Careの信任を受けたSunnybrook Research Institute Comparative Researchの動物実験委員会により承認された。
【０１５４】
細胞培養
EasySep Mouse CD4+ T-cell isolation kit（STEMCELL）を使用してC57BL/6マウスの脾臓からCD4+T細胞を単離し、10%FBS、ペニシリン（100U/mL）、ストレプトマイシン（100μg/mL）および0.05mM ２−メルカプトエタノールを添加したRPMI-1640培地中で培養した。マウス2.10 T細胞クローンは、IL-2（3.5μg/mL）、レシチン（20μg/mL）およびBSA（0.5mg/mL）を添加した完全IMDM中で培養した。
【０１５５】
2.10 T細胞クローンの活性化
抗CD3抗体（PBS中3μg/mL、クローン145-2C11、BioXcell）を96ウェルマイクロタイタープレートに加えて４℃で一晩コーティングした。2.10細胞の活性化に対する固相化チェックポイントリガンドの効果を観察するため、抗CD3抗体でコーティングしたウェルを洗浄し、PBSに溶解したVISTA.COMPまたは別の組換えタンパク質を加えて３７℃で１時間コーティングした。各ウェルをPBSで洗浄（３回）し、残っていた未結合タンパク質を除去した。培養したマウス2.10 T細胞を回収し、IMDMで洗浄（３回）後、前記タンパク質でコーティングしたウェル中に分注した（1×104個／ウェル）。また、増殖を測定するため、１８時間培養した後、１μCiの［３Ｈ］−チミジンで細胞を６時間パルスし、TopCount NXTシンチレーションカウンター（パーキンエルマー）で取り込み量を定量した。さらに、可溶性チェックポイントリガンドに対する2.10 T細胞の感受性を分析するため、グラフに示した各組換えタンパク質を培地で希釈し、抗CD3抗体でコーティングしたウェルに2.10細胞とともに加えた。
【０１５６】
CD4+T細胞の増殖およびサイトカインの分泌（マウス）
単離したマウスCD4+T細胞を、メーカー（サーモフィッシャーサイエンティフィック）のプロトコルに従ってCFSEで標識し、抗CD3抗体であらかじめコーティングした96ウェルマイクロタイタープレートに加え、（固相化または可溶性）マウスVISTA.Fc、マウスVISTA.COMPまたはマウスCOMP単独の存在下で刺激した。４８時間後または７２時間後に細胞を回収し、CFSEの希釈をフローサイトメトリー（FACSCalibur、ベクトン・ディッキンソン）で定量した。また、刺激したCD4+T細胞を４８時間後または７２時間後に培地から回収し、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA、R&Dシステム）で分析して、VISTA.COMPによるIL-2の分泌抑制およびIFNγの分泌抑制を定量した。
【０１５７】
ヒトT細胞の活性化アッセイおよび増殖アッセイ
健康なドナーから単離した末梢血単核細胞（PBMC）（STEMCELL Technologies）を、VISTA.Fc、VISTA.COMPまたはCOMPの存在下で、5μg/mLのConAとともに４８時間もしくは７２時間培養するか、または固相化抗CD3抗体（OKT3、1μg/mL）とともに培養した。いくつかの実験では、培養前に細胞をCFSEで標識し、増殖を追跡した。培養終了後、細胞を回収し、グラフに示した抗体（抗CD3、抗CD4、抗CD8および／または抗CD25）で染色し、フローサイトメトリーで分析した。
【０１５８】
フローサイトメトリー結合アッセイ
フローサイトメトリーを使用して、T細胞に対するVISTA.COMP、VISTA.Fcまたはコントロールタンパク質の結合を評価した。まず、メーカーの指示に従ってEZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin試薬（サーモサイエンティフィック）を使用して、各タンパク質をビオチン標識した。反応終了後、PD-10脱塩カラム（GEヘルスケア）を用いて過剰なビオチンを除去した。各タンパク質のビオチン標識量が等量であることを確認するため、HABA/アビジン試薬（シグマ）を用いて各リガンドに結合したビオチンの量を測定した。FACS染色バッファー（1%FBSおよび0.09%NaN3を添加したPBS）中で、グラフに示した各ビオチン標識タンパク質（10μg/100μL）またはVISTA.Fcとともに2.10 T細胞を４℃で０．５時間インキュベートした。結合しなかったタンパク質を除去した後、FACS染色バッファー中でストレプトアビジン−PE（1:300、BioLegend）またはPE標識抗ヒトIgG（1:100、BioLegend）とともに細胞を１５分間インキュベートし、FACSCaliburセルアナライザーを用いてPEの蛍光シグナルを分析した。
【０１５９】
マウス同種混合白血球培養アッセイ（allo-MLC）
過去の報告に従って（引用文献３９）、VISTA.COMPまたはCD200Fc（ポジティブコントロール）をマウス同種混合白血球培養に加えて５日間培養し、細胞傷害性Tリンパ球（CTL）の誘導を分析した。簡潔に述べると、グラフに示した濃度の各組換えタンパク質の存在下において、C57BL/6脾臓由来の応答細胞を、放射線照射した同数のBALB/c由来刺激細胞とインキュベートした。５時間にわたって傷害を受けたP815肥満細胞腫由来標的細胞からの51Crの放出を観察することによって、誘導された細胞傷害性Tリンパ球（CTL）を分析した（エフェクター細胞：標的細胞＝２５：１）。
【０１６０】
同種皮膚移植片移植
過去の報告に従って（引用文献３９）、マウス皮膚同種移植片モデルを用いて、VISTA.COMPの免疫抑制効果をインビボで試験した。BALB/CマウスにC57BL/6由来の皮膚移植片を移植し（０日目）、低用量ラパマイシン（0.5mg/kg、４８時間ごとに腹腔内注射）を併用して、VISTA.COMP（15μgを静脈注射）で３日に１回、計５回処置した。盲検化した評価者によって移植片の生着を毎日観察した。
【０１６１】
コンカナバリンＡ誘導性急性肝炎
急性肝炎のCon-Aモデルを用いて、致死的な急性炎症からマウスをレスキューするVISTA.COMPの能力を評価した。致死量（15mg/kg）のCon-A（シグマ アルドリッチ）を静脈注射する２時間前に、雄性C57BL/6マウスにVISTA.COMP（200μg）またはPBSを腹腔内注射した。３時間後に一部のマウスを屠殺し、ELISA（R&Dシステムズ）によりIL-6およびTNFαの血清中濃度を定量し、残りのマウスは２４時間にわたり生存を観察した。
【０１６２】
固相免疫沈降アッセイ
TCRのリン酸化によるシグナル伝達カスケードに対するVISTA.COMPの抑制効果を評価するため、固相免疫沈降アッセイを実施した。抗CD3抗体でコーティングしたプレートに（VISTA.COMPの存在下または非存在下において）2.10 T細胞を１５分間曝露させた。ウェル中の培地を除去した後、溶解バッファー（50mM Tris pH7.4、150mM NaCl、1% NP40、5mM Na4O7P2、5mM NaF、2mM Na3VO4およびシグマ社製１×プロテアーゼインヒビターカクテル）中において４℃で３０分間のインキュベートすることによって、インサイチューで細胞を溶解した。ウェルを溶解バッファーで激しく３回洗浄後、ウェルに結合したタンパク質を3.5%NH4OHで溶出した。溶出したタンパク質を凍結乾燥し、SDSサンプルバッファーに再懸濁し、抗ホスホチロシン抗体（クローン4G10；Sunnybrook Antibody Core Facility）を用いたウエスタンブロットにより、総リン酸化タンパク質を可視化した。
【０１６３】
統計分析
スチューデントのｔ検定、または特記されている場合はマン・ホイットニーのＵ検定を使用して、GraphPad Prismソフトウェア（v6.0.2）により統計分析を行った。グラフおよび図表もGraphPad Prismソフトウェアを使用して作成した。
【０１６４】
実施例２：VISTA.COMPの結果
二量体VISTAは固相化した場合のみT細胞の増殖を抑制する
T細胞上の免疫チェックポイント受容体の活性化は、抗原提示細胞（APC）および腫瘍細胞上に発現されるPD-L1などのタンパク質リガンドにより提示されるIgVドメインが、該タンパク質リガンドによって認識されるT細胞上の免疫チェックポイント受容体PD-1の相補的なIgVドメインに結合することにより開始される場合がある。過去の研究では、PD1:PD-L1およびCD28:CD80/CD86に関与するIgVドメインの単量体形態は、通常、低マイクロモル（μＭ）範囲のKd値が観察されることから、中程度の親和力で互いに相互作用することが実証されている（引用文献４０および４１）。インビトロにおいてT細胞上のチェックポイント受容体を活性化させるため、免疫チェックポイントリガンドをFc融合タンパク質などのオリゴマーの形態で発現させ、表面に固相化することがなされている。このような免疫チェックポイントドメインがAPCとT細胞の表面で提示されれば、固相化によってドメイン間の相互作用（アビディティ）を模倣することができる。
【０１６５】
過去の報告（引用文献８および９）と一致して、VISTAのIgVドメインをIgG1のFc領域と融合することによって構築したVISTAの二量体形態（VISTA-Fc）は、培養皿に固相化した場合にのみ、抗CD3刺激CD4+T細胞の増殖を抑制した（図１Ａ）。CD4+T細胞を刺激した際に可溶性のVISTA-Fcを培地に加えたが、細胞増殖に対するその効果は無視できる程度であったことから、推定上のVISTA受容体を十分に作動させる能力が不足しているため、インビボでVISTA-Fcを使用しても限定的にしかT細胞活性を抑制できないことが示唆された。
【０１６６】
特定の理論に拘束されるものではないが、インビトロにおける可溶性VISTA-Fcの活性の欠如は、受容体に対するアビディティが不十分であること、および／または細胞表面においてVISTA受容体をクラスター化させる能力が欠如していることが要因であると考えられる。
【０１６７】
インビトロでもインビボでもT細胞刺激を効果的に抑制することができるアゴニストを作製するため、高次構造のVISTAオリゴマーを作製した。VISTAのIgVドメインをCOMPの五量体形成ドメインに遺伝子融合させることによって、組換えVISTA五量体（VISTA.COMP；配列は補遺１の配列番号１４を参照されたい）を構築した。組換えVISTA.COMPを哺乳動物発現系において産生させることによって、COMPの五量体形成ドメインの分子内ジスルフィド結合により安定化された約250kDaの五量体タンパク質を得た（図１Ｂ）。
【０１６８】
VISTA.COMPはインビトロで可溶性リガンドとしてT細胞の活性化および増殖を抑制する
VISTA-Fcとは対照的に、可溶性VISTA.COMPは、単離後に抗CD3で刺激したCD4+T細胞の増加および増殖を実質的に抑制した（図１Ｃ）。組換えCOMPドメイン単独では、T細胞の増加および増殖に対する効果は無視できる程度であったことから、VISTA.COMPの活性は、COMPドメインに関連したオフターゲット効果によるものではなく、VISTAのシグナル伝達によるものであることが示唆された。さらに、可溶性のVISTA.COMPは、刺激されたCD4+T細胞からの炎症性サイトカインIL-2（図１Ｄ）およびIFNγ（図１Ｅ）の分泌を有意に減少させた（p<0.01）。抗CD3による刺激を増加したところ、VISTA.COMPの存在下においてT細胞の分裂が増加したことから、VISTA.COMPによる抑制効果は、T細胞受容体（TCR）に対する刺激の強度と逆相関することが分かった（図１Ｆ）。VISTA.COMPは、ポリクローナルな刺激に応答したT細胞増殖を抑制する能力に加えて、同種混合白血球培養において用量依存的に細胞傷害性Tリンパ球（CTL）の誘導を容易に抑制した（図１Ｇ）。これらの結果から、VISTA.COMPが、T細胞上のVISTA受容体を活性化してT細胞の活性を制御することができる効果的なアゴニストであることが実証された。VISTA-Fcとは異なり、VISTA.COMPは、アゴニスト活性を奏するのに固体表面への固相化を必要としない。
【０１６９】
hVISTA.COMPはヒトT細胞の活性化および増殖を抑制する
マウスVISTAのECDをhVISTA.COMPのECDに置き換え、マウスCOMPの五量体形成ドメインをヒトCOMPの五量体形成ドメインに置き換えたこと以外はmVISTA.COMPの作製方法と同様にしてヒトVISTA.COMP（配列番号２４）を構築した。このタンパク質、すなわちhVISTA.COMP（配列番号２４）は、Expi293F細胞において容易に発現させることができ、均質に精製することができた（図１Ｈ）。マウスT細胞を使用した先の実験で観察されたのと同様に、hVISTA.COMPは、ConAにより誘導された成人PBMC由来ヒトT細胞の増殖を容易に抑制するが、COMP単独ではこのような効果は認められないことが見出された（図１Ｉ）。さらに、hVISTA.COMPは、抗CD3の誘導により活性化されたヒトCD4+T細胞およびヒトCD8+T細胞におけるT細胞活性化マーカーCD25のアップレギュレーションを抑制した（図１Ｊ）。これらの結果を考え合わせると、mVISTA.COMPを使用した先の観察結果と同様に、ヒトVISTA.COMPは、VISTAを介して免疫抑制シグナル伝達を誘導し、ヒトT細胞の活性化を抑制できることが示された。
【０１７０】
VISTA.COMPはT細胞株クローンに結合し、その活性化を抑制する
初代CD4+T細胞に加えて、CD4陰性マウスIL-2依存性T細胞クローン（2.10）（引用文献４２）もVISTAの抑制性シグナル伝達に感受性を示すことから、VISTA受容体アゴニストの効果を分析するための制御系を提供できることが見出された。初代CD4+T細胞での観察結果と一致して、VISTA-Fcは固体表面に固相化した場合にのみ抗CD3誘導性増殖を抑制したが、VISTA.COMPは、固相化した場合でも培地中に溶解した場合でも抗CD3誘導性増殖活性を抑制した（p<0.01）（図２Ａ）。可溶性のVISTA.COMPおよび可溶性のVISTA-Fcを滴定したところ、VISTA.COMPは、１μg/mLという低濃度でも抗CD3誘導性の2.10細胞の増殖を抑制したが（p<0.01）、VISTA-Fcは30μg/mLという高濃度でも検出可能な活性を示さなかった（図２Ｂ）。また、増殖の抑制に加え、細胞内フローサイトメトリーを実施したところ、可溶性のVISTA.COMPに曝露してから４時間以内に、刺激した2.10細胞からのIL-2の分泌が抑制されたが（p<0.05）、VISTA-Fcではこのような抑制は見られず、このことから、VISTA.COMPが即時かつ迅速な効果を発揮することが示唆された（図２Ｄ）。また、VISTA.COMPは、抗CD3による2.10細胞の刺激により誘導されたTCR複合体のシグナル伝達タンパク質におけるチロシン残基の急速なリン酸化を抑制した（図２Ｅ）。これらの結果は、固相化VISTA-FcにナイーブCD4+T細胞を曝露した後、（さらなるVISTA-Fcの非存在下において）抗CD3でコーティングしたウェルに移すとT細胞が長期間にわたって抑制されるという先の知見と機構的には一致しており、VISTAのシグナル伝達がT細胞の活性化の早期調節因子として一定の役割を果たしていることが示唆された９。次に、VISTA-Fc、COMPまたはVISTA.COMPを用いて、2.10細胞株のフローサイトメトリーを実施し、可溶性VISTA-FcがT細胞上のVISTA受容体に対して結合能を有していないことが抑制活性の欠如の原因であるのかどうかを判定した。VISTA.COMPおよびCOMPを同数のビオチン基で標識し、細胞に結合したビオチン標識タンパク質をPE−ストレプトアビジンで検出するとともに、細胞に結合したVISTA-FcをPE標識抗IgGで検出した。VISTA-FcおよびVISTA.COMPはいずれも、ナイーブ2.10 T細胞に結合することが見出されたが、COMPにおいて観察されたベースラインシグナルから、COMPの五量体形成ドメイン単独では非特異的結合が見られないことが確認された（図２Ｃ）。また、VISTA-Fcのシグナルは、VISTA.COMPとは異なり、さらに洗浄工程を実施することによって容易に取り除くことができたことから、推定上のVISTA受容体との相互作用の親和力は低いことが示唆された（図２Ｆ〜Ｈ）。これらの試験結果から、VISTA-Fcなどの低いアビディティを示す可溶性VISTAリガンドは、この経路を介した免疫抑制シグナル伝達をインビトロで活性化するには不十分であることが実証された。高いアビディティを示すVISTA.COMPリガンドによってのみ、VISTA受容体を刺激することができた。
【０１７１】
VISTA.COMPはインビボで免疫応答を抑制する
可溶性リガンドとしてのVISTA.COMPがインビトロでT細胞の活性を抑制することが示されたデータを考慮すると、可溶性のVISTA.COMPは、インビボにおいて炎症促進反応を抑制するのに有用なアゴニストであると考えられる。これを踏まえ、まず、マウス皮膚同種移植片モデルにおいてVISTA.COMPを試験した。BALB/Cマウスに、非組織適合性の皮膚同種移植片（C57BL/6ドナー由来）を移植した後、VISTA.COMPまたは生理食塩水コントロールと低用量のラパマイシンとを組み合わせて処置を行った（図３Ａ）。この用量のラパマイシンを単独療法として使用した場合、移植片の生着になんら効果を発揮しないことは過去に実証されている（引用文献３９）。VISTA.COMPは、皮膚同種移植片の生着を有意に延長した。処置の最終日（１５日目）に、VISTA.COMP処置群では６匹中１匹においてのみ同種移植片の拒絶が認められたが、これに対して、生理食塩水コントロール群では６匹すべてにおいて同種移植片の拒絶が認められた（p<0.05、マン・ホイットニーのＵ検定）（図３Ｂ）。また、コンカナバリンＡ（ConA）誘導性肝炎と呼ばれる急性肝炎モデルにおいてVISTA.COMPの免疫抑制効果を評価した。このモデルでは、ConAを投与することによって、CD4+T細胞およびNKT細胞がポリクローナルに活性化されて急性肝炎が誘導される（引用文献４３）。このモデルを使用して、インビボのT細胞に対するVISTA.COMPの抑制活性を評価した。このモデルを使用した過去の研究では、T細胞上のVISTAに対する作動性の抗VISTA抗体により致死性の肝損傷からマウスをレスキューできることが示唆されている（引用文献１０）。しかしながら、VISTA受容体アゴニストによる処置の効果は不明であった。VISTA.COMPによる予防処置をマウスに行ったところ、致死量のConAによる死亡から雄性C57BL/6マウス４匹中３匹をレスキューできることが見出された（図３Ｃ）。また、この結果と一致して、ConA注射の３時間後におけるTNFαおよびIL-6の血清中濃度は、VISTA.COMPによる処置により有意に低下することが見出された（p<0.05）（図３Ｄ）。これら２種の急性炎症疾患モデルから得られた結果から、VISTA.COMPが強力なアゴニストとして、インビボにおける炎症反応を抑制できる可能性が示唆された。
【０１７２】
VISTA.COMPの活性に対するタグの影響
コーティングしたVISTAコンストラクトまたは可溶性のVISTAコンストラクトの存在下における抗CD3刺激CFSE標識脾臓CD4+T細胞の増殖を示す（図４Ａ）。可溶性のVISTA.FcはCD4+T細胞に対して抑制効果を示さなかったが、VISTA.COMPは、固相化を必要とすることなくCD4+T細胞に対して免疫抑制活性を示した。さらに、ヒスチジンタグ付加VISTA.COMP（VISTA.COMP.his；補遺１に記載の配列番号１４）は、strepIIタグ付加VISTA.COMP（VISTA.COMP.SS；配列番号６０）よりも活性が高かったことから、タンパク質の安定性にタグが影響を及ぼす可能性が示唆された。また、表面プラズモン共鳴（SPR）結合アッセイ行ったところ、市販の抗VISTA抗体（クローン730802、R&Dシステムズ）はVISTA.COMP.hisを認識したが、VISTA.COMP.SSは認識せず（図４Ｂ）、このことから、エピトープの露出が本質的に変化したことが示唆された（「＋」はSPRによって検出可能な結合を示し、「−」は結合が全く存在しないことを示す）。
【０１７３】
VISTA.COMPは高いアビディティを示すチェックポイント受容体アゴニストである
本研究で得られたデータから、VISTA.COMPは、高いアビディティを示すチェックポイント受容体アゴニストであり、インビトロにおいてT細胞の活性を抑制することができ、かつインビボにおいて炎症反応を抑制することができることが示唆された。固相化または可溶性のVISTA-FcとVISTA.COMPを比較したところ、VISTA受容体アゴニストとしての活性はオリゴマー化の程度に依存し、溶液中で（すなわち基質に固相化せずに）活性を発揮するには、COMP五量体形成ドメインを用いて作製したアビディティの高い多量体が必要であることが示された。本発明者らは、COMPドメインが、安定したVISTA五量体の発現用足場として有用であることを見出した。本研究で得られたデータと、マウスのVISTA遺伝子を欠失させた際に観察された自己免疫疾患の増悪の所見を考え合わせると、VISTAを介した免疫抑制経路のターゲッティングは、臨床における望ましくない免疫応答の抑制に有用である可能性が示唆される。
【０１７４】
実施例３：ICOS-L.COMP法
組換えICOS-L.COMPの発現および精製
ヒトCOMP五量体形成ドメイン（配列番号１１）をコードするdsDNAの上流にヒトICOS-L細胞外ドメイン（ECD）（配列番号４９）をコードするdsDNAを含み、Ｃ末端にヒスチジンタグが付加されたdsDNAコンストラクトを合成し（GeneArt；サーモフィッシャーサイエンティフィック）、pcDNA3.4発現プラスミドに挿入した（GeneArt；サーモフィッシャーサイエンティフィック）。このヌクレオチド配列はICOS-L ECDの５’末端にIgκリーダー配列を含み、ヒト由来細胞株からの分泌収量が高くなるようにコドン最適化されていた（ICOS-L.COMP；配列は補遺１の配列番号５７を参照されたい）。ICOS-L.COMPをコードするこのプラスミドを、メーカーの推奨に従って（GeneArt；サーモフィッシャーサイエンティフィック）Expi293F細胞にトランスフェクトし、トランスフェクトした細胞をジェネティシン（GeneArt；サーモフィッシャーサイエンティフィック）に２週間曝露することによりICOS-L.COMPを分泌する安定な細胞株を選択した。分泌されたヒスチジンタグ付加ICOS-L.COMPを、HisTrap HPカラム（GEヘルスケア）を用いて細胞培養上清から精製した。精製後、PD10カラム（GEヘルスケア）を使用して、タンパク質試料をPBS（pH7.4）で脱塩した。SDS-PAGEを用いてタンパク質の純度を確認し、BCAアッセイ（Pierce）または280nmにおける吸光度の測定によってタンパク質の濃度を定量した。
【０１７５】
動物
本願の研究において使用されたC57BL/6マウスは、Sunnybrook Research Institute Comparative Research（SRICR）の施設内の無菌環境で飼育した。プロトコルはいずれも、Canadian Council of Animal Careの信任を受けたSunnybrook Research Institute Comparative Researchの動物実験委員会により承認された。
【０１７６】
ヒトT細胞の増殖および活性化
ICOS-L.COMPまたはICOSL-Fc（R&Dシステムズ）がインビトロで可溶性リガンドとしてヒトT細胞を共刺激する能力を分析した。EasySep Human T-cell Isolation Kit（STEMCELL Technologies）を使用してヒト臍帯血細胞または成人PBMCをFicoll-Paqueで分離し、ヒトT細胞を単離した。単離したT細胞を、メーカーのプロトコル（サーモフィッシャー）に従ってCFSEで標識し、抗CD3抗体（クローンOKT3、BioXcell）でコーティングした96ウェルプレートで刺激した。10%FBS、ペニシリン（100U/mL）、ストレプトマイシン（100μg/mL）および0.05mM ２−メルカプトエタノールを添加したRPMI-1640培地中で各ウェルの細胞を培養した。滴定濃度の可溶性COMPまたはICOS-L.COMPを加えて選択したウェルをインキュベートした。４８〜７２時間後に細胞を回収し、適切な抗体（抗CD4、抗CD8および／または抗CD25）で染色し、フローサイトメトリー（FACSCalibur、ベクトン・ディッキンソン）により増殖（CFSE）および活性化マーカー（すなわちCD25）のアップレギュレーションを分析した。また、７２時間後に各ウェルの細胞培養上清をサイトカイン分析用に回収し、ヒトLEGENDplex Th1炎症パネル（Biolegend）を使用してIFNγ、TNFα、IL-10、IL-2およびIL-6の分泌を定量した。
【０１７７】
hICOS、mICOSおよびCD28に対するICOS-L.COMPの結合
Biacore T-200表面プラズモン共鳴（SPR）実験を利用して、hICOS、mICOSおよびhCD28に対するICOS-L.COMPの直接結合を評価した。CM5チップ（GEヘルスケア）にあらかじめアミンカップリングしたプロテインＡ（シグマ アルドリッチ）でhICOS-Fc、mICOS-FcまたはhCD28-Fc（いずれもR&Dシステムズから入手）をアフィニティー捕捉した（350〜400RU）。HBS-EPランニングバッファー（GEヘルスケア）に25nMの濃度で添加したhICOS-L.COMPを注入して、アフィニティー捕捉した各タンパク質上に流した。
【０１７８】
ICOS-L.COMPの結合速度論
Biacore T200を使用したSPR法によるシングルサイクルカイネティクス解析により、固相化hICOS-Fcに対するhICOSL-COMP、hICOSL-FcおよびCOMPの結合の速度論を測定した。簡潔に述べると、CM5センサーチップ（GEヘルスケア）にhICOS-Fc（R&Dシステムズ）をあらかじめ固相化し、滴定濃度のICOS-L.COMP、ICOSL-Fc（R&Dシステムズ）またはCOMP（ネガティブコントロール）を注入して、hICOS-Fc上に流した。得られたセンサーグラムを１:１結合モデルにフィッティングし、結合速度定数（ka）、解離速度定数（kd）および解離定数（KD）を求めた。
【０１７９】
ヒトT細胞に対するICOS-L.COMPの結合
フローサイトメトリーによりヒトT細胞に対するICOSL-COMPの結合能を確認した。メーカーの説明書（サーモフィッシャー）に従って、FITCでICOS-L.COMPを誘導体化した。あらかじめヒトドナーPBMCから単離しておいた1×105個のCD3+T細胞（STEMCELL Technologies社製のhuman CD3+ Isolation Kit）を、FACSバッファー（PBS＋2%FBS＋0.09%NaN3）中において100nM ICOS-L.COMP.FITCとPE-Cy7抗CD4（Biolegend）とともに２０分間インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、BD社製LSRサイトメーターを用いたフローサイトメトリーにより分析を行った。DAPIを使用して死細胞を除外した。
【０１８０】
ICOS-L.COMP競合実験（ヒト）
抗CD3/CD28で刺激した１日目のヒトCD3+T細胞上のICOSへの結合におけるhICOS-L.COMPとhICOS-Fcの競合をフローサイトメトリーにより評価した。簡潔に述べると、200nMのICOS-L.COMP.FITCまたは等量のPBS（ICOS-L.COMPなし）を、刺激したCD3+T細胞とともに氷上で１５分間プレインキュベートした後、100nMのhICOS-L.Fcを加えた。細胞を洗浄し、PE標識抗ヒトIgG-Fc二次抗体（Biolegend）を加えてインキュベートし、BD社製LSRサイトメーターを用いたフローサイトメトリーにより分析を行った。
【０１８１】
ICOS-L競合実験（マウス）
初代マウスCD4+細胞上のICOSへの結合におけるhICOS-L.COMPとmICOS-Igの競合をフローサイトメトリーにより評価した。EasySep Mouse CD4+ T-cell isolation kit（STEMCELL Technologies）を用いてマウス脾臓CD4+T細胞を単離し、固相化抗CD3抗体（クローン145-2C11、BioXcell）に曝露することにより４８時間活性化して、ICOSの発現をアップレギュレートした。mICOS-Ig単独またはICOS-L.COMPと組み合わせたmICOS-Igを活性化T細胞に加えてインキュベートし、PE標識抗ヒトIgG-Fc抗体（BioLegend）を用いてmICOS-Igの結合を検出した。
【０１８２】
MC38結腸癌マウスモデル
ICOS-L.COMPが抗PD-1チェックポイント阻害剤との相乗作用によって抗腫瘍免疫応答を回復させ、定着腫瘍の進行を遅延させる能力を有することを、MC38結腸癌モデルを用いて確認した。2×105個のMC38腫瘍細胞を雄性C57BL/6マウスに注射し、処置を行う前に７〜１０日間かけて腫瘍を50〜150mm3の大きさまで増殖させた。その後、PBS、抗PD-1（200μg、クローンRMPI-14）、ICOS-L.COMP（100μg）または抗PD-1とICOS-L.COMPの組み合わせを２〜３日ごとに計５回注射した。腫瘍の大きさを１日おきにノギスで測定し、式：長径×短径２×π／６を用いて体積を求めた。一部のマウスは、処置開始後１０〜１２日目に腫瘍を摘出し、酵素で解離して単一細胞懸濁液を調製し、抗CD45、抗CD4、抗CD8、抗FOXP3および抗ICOSで染色して、処置後の腫瘍浸潤リンパ球（TIL）集団の特性を分析した。
【０１８３】
実施例４：ICOS-L.COMPの結果
五量体ICOS-L融合タンパク質の原理および設計
T細胞は、インビトロおよびインビボでの活性化に２種のシグナルを必要とする。第１のシグナルは、主要組織適合遺伝子複合体（MHC）上に提示された抗原をT細胞受容体（TCR）が認識することによって伝達される。第２のシグナルは共刺激シグナルであり、B7-1/2:CD28などの様々なリガンドと受容体の相互作用により伝達され、T細胞の活性を増強する。ICOSはB7/CD28ファミリーのメンバーであり、T細胞の活性化によりアップレギュレートされる共刺激受容体である。ICOSが、抗原提示細胞（APC）上に発現されるリガンドであるICOS-Lと結合すると、T細胞の増殖およびサイトカインの産生が増強される。過去の研究では、抗CTLA-4（イピリムマブ）で治療したがん患者のT細胞においてICOSの発現が増加していることが示されており、このアップレギュレーションは、臨床転帰の改善と相関する。前臨床実験では、ICOSのシグナル伝達を作動させることによって有益な抗腫瘍免疫応答を促進できるという治療的有用性が確立された。具体的には、全細胞ワクチン（B16悪性黒色腫の腫瘍細胞上に発現されたICOS-L）を抗CTLA-4と併用してICOSを作動させることによって、B16悪性黒色腫モデルにおける腫瘍増殖を遅延させることができることが示された。これらの結果をまとめると、確立されたチェックポイント阻害治療薬（抗PD-1モノクローナル抗体および抗CTLA-4モノクローナル抗体）と相乗効果を発揮する治療薬として、ICOSアゴニストが一定の役割を果たすことが確認された。
【０１８４】
これを実証するため、ICOS-L細胞外結合ドメインを五量体化することによって可溶性のICOSアゴニストを誘導可能であるという仮説を立てた。また、ICOSの天然リガンド（ICOS-L）の五量体形態は、アビディティおよびクラスター化が増強されるため、作動性のICOSモノクローナル抗体やICOS-L ECDの二量体形態（すなわちICOS-Fc）よりも強力にICOSのシグナル伝達を作動させることができるという仮説を立てた。
【０１８５】
COMPの五量体形成ドメインにICOS-L ECD（IgV＋IgCドメイン）を遺伝子融合させることによって、五量体ICOS-Lコンストラクトを作製した（ICOS-L.COMP；配列は補遺１の配列番号５７を参照されたい）。ICOS-L.COMPを哺乳動物細胞の発現系で発現させることによって、非還元条件下において分子量約300kDaの安定なホモ五量体が得られた（図８Ｂ）。
【０１８６】
ICOSL.COMPはヒトおよびマウスのICOSに結合するが、CD28には結合しない
表面プラズモン共鳴法（SPR）により、ICOSおよびこれと密接に関連したファミリーメンバーであるCD28に対するhICOS-L.COMPの結合の特性を評価した。予想されたとおり、hICOSL-COMPは25nMの濃度においてマウスICOSとヒトICOSの両方に容易に結合した（図９Ａ）。hCD28に対しては非常に弱い結合または無視できる程度の結合が観察され、hICOSL-COMPとICOSの相互作用の特異性が実証された。
【０１８７】
ICOS-L.COMPはICOSL-Fcよりも優れたアフィニティー／アビディティでICOSに結合する
表面プラズモン共鳴（SPR）アッセイを使用して、hICOSに対するhICOS-L.COMPおよびICOSL-Fcの結合親和性の特性を評価した。hICOS-L.COMPの結合の見かけ上のKDは0.9nMであり、hICOSL-Fcの結合（2.9nM）の約３倍の親和性であった。COMPはICOSに結合しなかったことから、hICOS-L.COMPとhICOSの相互作用が特異的なICOSL-ICOS結合によるものであることが実証された（図９Ｂ）。
【０１８８】
hICOS-L.COMPはヒトT細胞に直接結合し、ICOSL-Fcと競合する
ICOS発現ヒトCD3+T細胞に対する結合能の特性についてもhICOSL-COMPを評価した。この評価を行うため、FITCでhICOSL-COMPを誘導体化し、１分子あたり約１３〜１５個のFITC分子を付加した。hICOSL.COMP.FITCは、ヒトPBMCから単離されたCD3+CD4+T細胞およびCD3+CD4-T細胞に容易に結合することが見出された（図９Ｃ）。さらに、刺激したヒトT細胞に対するICOSL-Fcの結合は、ICOS-L.COMPがこのヒトT細胞に結合することによって完全に抑制されたことから、ICOS-L.COMPとICOSL-Fcが、細胞に発現されたICOSへの結合において競合することが確認された（図９Ｄ）。
【０１８９】
ICOS-L競合実験（マウス）
初代マウスCD4+細胞上に提示されたICOSへの結合に対する競合において、hICOS-L.COMPはmICOS-Igに勝ることをフローサイトメトリーにより評価した。五量体hICOS-L.COMPは、活性化T細胞により発現されたICOSへの結合に対する競合においてmICOS-L-Igに十分に勝る（図９Ｅ）。
【０１９０】
ICOS-L.COMPはヒトT細胞を共刺激する
ICOSのシグナル伝達を作動させてヒトT細胞を共刺激するICOS-L.COMPの機能を確認した。新鮮なヒト臍帯血から単離し、CFSEで標識したCD3+T細胞をインビトロにおいて抗CD3抗体により刺激し、ICOS-L.COMPまたはCOMP（ネガティブコントロール）を培地に加えて溶解した。細胞の増加および増殖をFACSで７２時間にわたり追跡したところ、ICOS-L.COMPはCD4+T細胞およびCD8+T細胞の増殖を顕著に刺激するが、COMPではこのような効果は認められないことが実証された（図１０Ａ）。さらに、ICOS-L.COMPは、T細胞活性化マーカーであるCD25のアップレギュレーションを誘導した（図１０Ｂ）。hICOSL-COMPとは全く対照的に、可溶性リガンドとしてのICOSL-Fcは、CD3+CD4+T細胞の増加および増殖を誘導することができなかった（図１０Ｃ）。さらに、抗CD3で誘導したT細胞受容体シグナル伝達の非存在下ではICOSL-COMPはT細胞を刺激しなかったことから、ICOSL-COMPが共刺激リガンドとして機能することが確認された（図１０Ｄ）。成人PBMCから単離されたT細胞の共刺激でも同様の結果が認められた（図１０Ｅ）。さらに、可溶性のICOSL-COMPによる共刺激は、Th1サイトカインであるIFNγ、TNFαおよびIL-10の分泌を実質的に増加させ、IL-2およびIL-6の分泌は、増加量はそれほど多くはないものの有意に増加したが、ICOSL-Fcではこのような効果は認められなかった（図１０Ｆ）。これらの実験結果を考え合わせると、可溶性のICOS-L.COMPはICOSのシグナル伝達経路を容易に作動させ、ヒトT細胞の増殖および活性化を刺激することが実証された。
【０１９１】
ICOS-L.COMPはチェックポイント阻害剤と相乗してマウスにおいて予防的抗腫瘍免疫を促進する
チェックポイント阻害剤を併用した場合のICOS-L.COMPの抗腫瘍作用を測定するため、MC38結腸癌モデルを使用した。この実験では、免疫適合C57BL/6マウスにMC38細胞を皮下注射し、腫瘍を50〜150mm3の体積まで増殖させ、PBS（コントロール）、抗PD-1単独療法、ICOS-L.COMP単独療法、またはICOS-L.COMPと抗PD-1の併用療法（組み合わせ）で処置した（図１１Ａ）。ICOS-L.COMPと抗PD-1の併用処置によって、抗PD-1単独療法よりも腫瘍の増殖が有意に遅延した（**P<0.01）（図１１Ｂ）。各マウスの腫瘍を個別に追跡したところ、最後の処置の時点で、併用群では１２匹中３匹のマウスにおいて完全奏効が観察されたが（図１１Ｃ）、その他の群では完全退縮した事例は認められなかった。また、ICOS-L.COMP単独療法群のマウスは、PBSコントロールと比べて転帰の改善を示さなかったことから、このモデルではチェックポイント阻害剤の併用が必要であることが示唆された（図１２Ａ）。腫瘍浸潤CD4+T細胞およびCD8+T細胞では、ICOSの発現が有意に高く、腫瘍内のICOS+細胞が全体に増加したことから、併用療法が果たす役割が裏付けられた（図１２Ｂ）。これらを考え合わせると、ICOS発現をアップレギュレートし、腫瘍浸潤リンパ球（TIL）の存在量を増加させるチェックポイント阻害抗体の有効性は、可溶性のICOSアゴニストとの併用療法によって増強できることが示唆される。これを裏付けるものとして、抗PD-1とICOS-L.COMPを使用した併用療法によって、腫瘍浸潤リンパ球（TIL）コンパートメント内（CD45+）のCD4+FOXP3-（CD4エフェクター）細胞が、抗PD-1単独療法のみの場合と比べて、それほど多くはないものの有意に増加した（*P<0.05）（図１２Ｃ）。Treg細胞（CD4+FOXP3+）の存在量に変化は認められなかった（図１２Ｄ）。
【０１９２】
以上のデータから、ICOS-L ECD五量体（ICOS-L.COMP）は、高いアビディティでICOSに容易に結合してヒトT細胞を共刺激することができることが示された。重要なことには、インビボにおけるこの共刺激は、チェックポイント阻害剤（抗PD-1抗体）を併用した場合に抗腫瘍活性を増強することができ、その結果、腫瘍組織量を減少させることができる。
【０１９３】
実施例５：PD-L1.COMP法
PD-L1五量体（PD-L1.COMP）発現ベクターの設計
EcoRI制限部位（５’側）およびKpnl制限部位（３’側）を有するマウスPD-L1 ECDをコードするコドン最適化dsDNAコンストラクトを合成した（IDT社）。このコンストラクトを消化し、PD-L1 ECD（配列番号４２）がIgκリーダー配列の下流かつCOMP五量体形成ドメイン（配列番号１２）の上流に位置するように（PD-L1.COMP；配列は補遺１の配列番号４６を参照されたい）EcoRI／Kpnlダブル消化プラスミドにライゲートした（COMP.HIS8-pcDNA3.4）。
【０１９４】
キメラPD-L1.COMPの発現および精製
PD-L1.COMPをコードするこのプラスミドを、メーカーの推奨に従って（GeneArt；サーモフィッシャーサイエンティフィック）Expi293F細胞にトランスフェクトし、トランスフェクトした細胞をジェネティシン（GeneArt；サーモフィッシャーサイエンティフィック）に２週間曝露することによりPD-L1.COMPを分泌する安定な細胞株を選択した。分泌されたヒスチジンタグ付加PD-L1.COMPを、HisTrap HPカラム（GEヘルスケア）を用いて細胞培養上清から精製した。精製後、PD10カラム（GEヘルスケア）を使用して、タンパク質試料をPBS（pH7.4）で脱塩した。SDS-PAGEを用いてタンパク質の純度を確認し、BCAアッセイ（Pierce）または280nmにおける吸光度の測定によってタンパク質の濃度を定量した。
【０１９５】
T細胞株の活性化アッセイおよび増殖アッセイ
IL-2（3.5μg/mL）、レシチン（20μg/mL）およびBSA（0.5mg/mL）を添加した完全IMDM中でマウス2.10 T細胞クローンを培養した。活性化アッセイを行うため、細胞を回収し、３回洗浄し、抗CD3（3μg/mL、BioXcell）でコーティングした96ウェルプレートに2×104個／ウェルの密度で播種した。10μg/mLの濃度となるようにPBS（pH7.4）に溶解したPD-L1.COMPもしくはCOMP（ネガティブコントロール）を抗CD3コーティングウェルに加えて３７℃で１時間コーティングするか、または2.10細胞を含むウェルにPD-L1.COMPもしくはCOMP（ネガティブコントロール）を10μg/mLの濃度で加えて溶解した。細胞を１８時間培養後、１μCiの［３Ｈ］−チミジンでパルスし、さらに６時間培養した。TopCount NXTシンチレーションカウンター（パーキンエルマー）で、［３Ｈ］−チミジンの取り込みと増殖を定量した。
【０１９６】
PD-1発現T細胞クローンへの結合
2.10 T細胞株を用いたフローサイトメトリーによって、PD-1発現細胞に対するPD-L1.COMPの結合を調べた。メーカーの説明書（サーモサイエンティフィック）に従ってEX-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin試薬を用いてPD-L1.COMPをビオチン標識し、PD10カラムを用いてPBSで脱塩することにより過剰なビオチン試薬を除去した。静止期2.10細胞または抗CD3で活性化した2.10細胞を、ビオチン標識COMPまたはビオチン標識PD-L1.COMPとともに４℃で３０分間インキュベートした。その後、細胞をPBSで洗浄し、ストレプトアビジン−PE（1:100、BioLegend）を使用して４℃で３０分間染色した。細胞をPBSで洗浄し、DAPI（生細胞／死細胞の除外）を添加したPBS中に再懸濁し、FACSCaliburセルアナライザー（ベクトン・ディッキンソン）で測定した。
【０１９７】
初代CD4+T細胞株の活性化および増殖
mouse CD4+ T-cell isolation kit（STEMCELL Technologies）を用いて、マウス脾臓細胞からCD4+T細胞を単離した。メーカーのプロトコル（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いてCD4+T細胞をCFSEで標識し、抗CD3（3μg/mL）でコーティングした96ウェルプレートに播種し、PD-L1.COMP、hB7-H4.COMP、mVISTA.COMPまたはCOMPを10μg/mLの濃度で培地に加えて溶解した。７２時間後に細胞を回収し、FACS（FACSCalibur、ベクトン・ディッキンソン）によりCFSEの希釈を分析した。いくつかの実験では、４８時間後および７２時間後に培地からCFSE標識細胞を回収し、IL-2およびIFNγの分泌をELISA（R&Dシステムズ）で定量した。
【０１９８】
実施例６：PD-L1.COMPの結果
負のチェックポイント受容体の刺激は、抗原提示細胞（APC）および腫瘍細胞上に発現されるタンパク質リガンド（PD-L1など）により提示されるIgVドメインが、該タンパク質リガンドによって認識されるT細胞上の免疫チェックポイント受容体（PD-1など）の相補的なIgVドメインに結合することにより起こる。過去の研究では、PD1:PD-L1およびCD28:CD80/CD86に関与するIgVドメインの単量体形態は、通常、低マイクロモル（μM）範囲のKd値が観察されることから、中程度の親和力で互いに相互作用することが実証されている（引用文献４０および４１）。インビトロにおいてT細胞上のチェックポイント受容体を活性化させるため、免疫チェックポイントリガンドをFc融合タンパク質などの二量体の形態で発現させ、表面に固相化することがなされている。このような免疫チェックポイントドメインがAPCとT細胞の表面で提示されれば、固相化によってドメイン間の相互作用（アビディティ）を模倣することができる。過去の報告では、PD-1の免疫抑制性シグナル伝達を作動させるには、プレートまたはビーズにPD-L1-Fcを固相化する必要があることが示されている。このことから、PD-L1-Fcは、PD-1を十分に作動させる能力が不足しており、インビボでPD-L1-Fcを使用しても限定的にしかT細胞活性を抑制できないことが示唆された。
【０１９９】
特定の理論に拘束されるものではないが、インビトロにおける可溶性PD-L1の活性の欠如は、受容体に対するアビディティが不十分であること、および／またはPD-1をクラスター化させる能力が欠如していることが要因であると考えられる。この仮説は、可溶性のVISTA IgV五量体（VISTA.COMP）が、インビトロにおいてT細胞増殖を容易に抑制できたのに対して、二量体VISTA-Fcではこのような抑制が認められなかったという知見によりさらに裏付けられた。
【０２００】
PD-L1ホモ五量体:PD-L1.COMPの設計、発現および精製
インビトロでもインビボでもT細胞刺激を効果的に抑制することができるPD-1アゴニストを作製するため、高次構造のPD-L1 ECD多量体を作製した。マウスPD-L1のECDドメインをCOMPの五量体形成ドメインに遺伝子融合させることによって、組換えPD-L1五量体（PD-L1.COMP；配列は補遺１の配列番号４６を参照されたい）を構築した。組換えPD-L1.COMPを哺乳動物発現系において産生させることによって、COMPの五量体形成ドメインの分子内ジスルフィド結合により安定化された約250〜300kDaの五量体タンパク質を得た（図５Ａ）。
【０２０１】
PD-L1.COMPはT細胞株により発現されたPD-1に結合する
ビオチンで標識したPD-L1.COMPまたはCOMPを使用して、2.10 T細胞株のフローサイトメトリーを実施し、細胞上に発現されたPD-1にPD-L1.COMPが結合することを確認した。PD-L1.COMPおよびCOMPを同数のビオチン基で標識し、ナイーブ2.10細胞または抗CD3で活性化した2.10細胞の染色に使用した。PD-L1.COMPは、ナイーブ2.10 T細胞に容易に結合し、T細胞の活性化に伴って結合量が増加したが、COMPではこのような効果は見られなかった。この結果は、T細胞の活性化において確認されたPD-1のアップレギュレーションの速度論と一致していた（図１３）。
【０２０２】
初代CD4+T細胞株の活性化および増殖
PD-1を作動させてT細胞の活性を抑制するためには固相化が必要とされるPD-L1-Fcとは異なり、可溶性のPD-L1.COMPは、抗CD3抗体により刺激したCFSE標識初代マウスCD4+T細胞の増加および増殖を完全に抑制した。重要なことには、組換えCOMPドメイン単独では、T細胞の増殖を有意に抑制できなかったことから、PD-L1.COMPで認められた免疫抑制効果は、COMP五量体形成ドメインやヒスチジンタグに起因するオフターゲット効果によるものではないことが確認された（図６Ａ）。
【０２０３】
実施例７：B7-H4.COMP法
五量体B7-H4コンストラクトの設計
COMPの五量体形成ドメインに融合したヒトB7-H4をコードするコドン最適化遺伝子フラグメントを合成し（GeneArt、サーモフィッシャーサイエンティフィック）、５’末端Igκリーダー配列を付加してpcDNA3.4発現プラスミドにクローニングした。最終的に得られたコンストラクトは、ヒトB7-H4 ECD（配列番号２５）の下流に、スペーサー配列、COMP五量体形成ドメイン（配列番号１１）、別のスペーサー配列およびHIS8タグをこの順でコードするdsDNAで構成される（B7-H4.COMP；配列は補遺１の配列番号３０を参照されたい）。
【０２０４】
五量体B7-H4.COMPの発現および精製
メーカーのプロトコル（サーモフィッシャーサイエンティフィック）に従って、Expi293一過性哺乳動物発現系を用いてhB7-H4.COMPを発現させた。分泌されたhB7-H4.COMPをPBSに対して透析し、HisTrap HPカラムを用いたNi-NTA精製により精製した。PD-10カラム（GEヘルスケア）を用いてタンパク質をPBS（pH7.4）で脱塩し、SDS-PAGEで純度を確認し、280nmにおける吸光度の測定によって濃度を測定した。
【０２０５】
2.10 T細胞活性化アッセイ
IL-2（3.5μg/mL）、レシチン（20μg/mL）およびBSA（0.5mg/mL）を添加した完全IMDM中でIL-2依存性2.10 T細胞クローンを培養した。細胞を回収し、３回洗浄し、IL-2およびレシチンを含んでいない完全IMDMに再懸濁し、抗CD3（3μg/mL、BioXcell）でコーティングした96ウェルプレートに2×104個／ウェルの密度で播種した。PBSに溶解したhB7-H4.COMP、VISTA.COMP（ポジティブコントロール）もしくはCOMP（ネガティブコントロール）を抗CD3コーティングウェルに加えて３７℃で１時間コーティングした後、洗浄を行うか、または2.10細胞を含むウェルにhB7-H4.COMP、VISTA.COMP（ポジティブコントロール）もしくはCOMP（ネガティブコントロール）を直接加えて溶解した。細胞を１８時間培養後、1μCiの［３Ｈ］−チミジンでパルスし、さらに６時間培養した。TopCount NXTシンチレーションカウンター（パーキンエルマー）で、［３Ｈ］−チミジンの取り込みと増殖を定量した。
【０２０６】
初代CD4+T細胞株の活性化および増殖
mouse CD4+ T-cell isolation kit（STEMCELL Technologies）を用いて、マウス脾臓細胞からCD4+T細胞を単離した。メーカーのプロトコル（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いてCD4+T細胞をCFSEで標識し、抗CD3（3μg/mL）でコーティングした96ウェルプレートに播種し、PD-L1.COMP、hB7-H4.COMP、mVISTA.COMPまたはCOMPを10μg/mLの濃度で培地に加えて溶解した。７２時間後に細胞を回収し、FACS（FACSCalibur、ベクトン・ディッキンソン）によりCFSEの希釈を分析した。いくつかの実験では、４８時間後および７２時間後に培地からCFSE標識細胞を回収し、IL-2およびIFNγの分泌をELISA（R&Dシステムズ）で定量した。
【０２０７】
T細胞クローンへの結合
2.10 T細胞株を用いたフローサイトメトリーによって、T細胞上に発現された推定上の受容体（B7-H4R）に対するB7-H4.COMPの結合を調べた。メーカーの説明書（サーモサイエンティフィック）に従ってEX-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin試薬を用いてB7-H4.COMPをビオチン標識し、PD10カラムを用いてPBSで脱塩することにより過剰なビオチン試薬を除去した。静止期2.10細胞または抗CD3で活性化した2.10細胞を、ビオチン標識COMPまたはビオチン標識B7-H4.COMPとともに４℃で３０分間インキュベートした。その後、細胞をPBSで洗浄し、ストレプトアビジン−PE（1:100、BioLegend）を使用して４℃で３０分間染色した。細胞をPBSで洗浄し、DAPI（生細胞／死細胞の除外）を添加したPBS中に再懸濁し、FACSCaliburセルアナライザー（ベクトン・ディッキンソン）で測定した。
【０２０８】
実施例８：B7-H4.COMPの結果
過去の報告では、T細胞における免疫抑制性シグナル伝達を作動させるには、プレートまたはビーズにB7-H4-Fcを固相化する必要があることが示されている。このことから、FcRによる架橋の非存在下では推定上の受容体を十分に作動させる能力が不足しているため、インビボでB7-H4-Fcを使用しても限定的にしかT細胞活性を抑制できないことが示唆された。
【０２０９】
特定の理論に拘束されるものではないが、インビトロにおける可溶性B7-H4-Fcの活性の欠如は、受容体に対するアビディティが不十分であること、および／または細胞表面において推定上の受容体をクラスター化させる能力が欠如していることが要因であると考えられる。この仮説は、可溶性のVISTA IgV五量体（VISTA.COMP）が、インビトロにおいてT細胞増殖を容易に抑制できたのに対して、二量体VISTA-Fcではこのような抑制が認められなかったという知見によりさらに裏付けられた。
【０２１０】
B7-H4五量体の設計および発現
アビディティの不足またはクラスター化の欠如という問題を解決するため、B7-H4 ECDとCOMP五量体形成ドメインとを融合させて、ヒトB7-H4の五量体形態を作製した（B7-H4.COMP；配列は補遺１の配列番号３０を参照されたい）。B7-H4.COMPは、哺乳動物細胞において容易に産生され、250〜300kDaの分子量の安定な五量体として均質に精製された（図５Ａ）。
【０２１１】
hB7-H4.COMPはT細胞株クローンに結合し、その活性化を抑制する
ビオチンで標識したB7-H4.COMPまたはCOMPを使用して、2.10 T細胞株のフローサイトメトリーを実施し、T細胞上に発現された推定上のB7-H4RにB7-H4.COMPが結合することを確認した。B7-H4.COMPおよびCOMPを同数のビオチン基で標識し、ナイーブ2.10細胞または抗CD3で活性化した2.10細胞の染色に使用した。B7-H4.COMPは、ナイーブ2.10 T細胞および活性化2.10 T細胞に容易に結合したが、COMPではこのような結合は認められなかった（図１３）。
【０２１２】
IL-2依存性2.10 T細胞株をリポーター系として使用して、B7-H4.COMPがT細胞の活性化を抑制できるかどうかを分析した。五量体VISTA.COMPを使用した先の観察結果と一致して、B7-H4.COMPは、固相化リガンドとして存在する場合でも、培地中に溶解した場合でも、抗CD3の誘導による増殖を抑制した（p<0.01）（図１４）。これに対して、COMPの五量体形成ドメインは可溶性リガンドとして添加した場合は、増殖に影響を及ぼさなかったことから、VISTA.COMPおよびB7-H4.COMPのオンターゲット効果が確認された。
【０２１３】
B7-H4.COMPは初代CD4+T細胞株の活性化および増殖を抑制する
B7-H4Rを作動させてT細胞の活性を抑制するためには固相化が必要とされるB7-H4-Fcとは異なり、可溶性のB7-H4.COMPは、抗CD3抗体により刺激したCFSE標識初代マウスCD4+T細胞の増加および増殖を完全に抑制した（図１５）。重要なことには、組換えCOMPドメイン単独では、T細胞の増殖を有意に抑制できなかったことから、B7-H4.COMPで認められた免疫抑制効果は、COMP五量体形成ドメインやヒスチジンタグに起因するオフターゲット効果によるものではないことが確認された。さらに、可溶性のB7-H4.COMPは、刺激したCD4+T細胞からの炎症性サイトカインIL-2の分泌を有意に減少させた（p<0.01）（図１６）。
【０２１４】
高いアビディティを示すチェックポイント受容体アゴニストを設計する戦略としての、チェックポイントリガンドの五量体化
本研究で得られたデータから、３種のチェックポイントリガンド、すなわちPD-L1、B7-H4およびVISTAを五量体化することによって、インビトロにおいてT細胞の活性を抑制することができ、かつインビボにおいて炎症反応を抑制することができる高いアビディティのチェックポイント受容体アゴニストを設計できることが示された。固相化または可溶性のVISTA-FcとVISTA.COMPを比較したところ、チェックポイント受容体アゴニストとしての活性はオリゴマー化の程度に依存し、溶液中で（すなわち基質に固相化せずに）活性を発揮するには、COMP五量体形成ドメインを用いて作製したアビディティの高い多量体が必要であることが示された。本発明者らは、COMPドメインが、チェックポイントリガンド由来のECDと融合させて安定した五量体を発現させるための足場として有用であることを見出した。本研究で得られたデータと、マウスにおいてチェックポイントリガンドおよびその受容体を欠失させた際に観察された自己免疫疾患の増悪の所見を考え合わせると、五量体アゴニストによるこれらのチェックポイント受容体の作動は、臨床における望ましくない免疫応答の抑制に有用である可能性が示唆される。
【０２１５】
特定の実施形態を参照しながら本発明を説明してきたが、当業者であれば、添付の請求項で概説されるような本発明の目的および範囲から逸脱することなく、これらの実施形態の様々な変更も可能であることを容易に理解するであろう。本明細書において提供された実施例はいずれも、本発明を例示することのみを目的として記載されたものであり、本発明をなんら限定するものではない。また、本明細書において提供された図面はいずれも、本発明の様々な態様を例示することのみを目的として記載されたものであり、本発明を規定または限定するために作製されたものでは一切ない。本明細書において引用により開示された先行技術は、本明細書の一部を構成するものとしてその全体が援用される。
【０２１６】
補遺１：配列
VISTA細胞外ドメインのcDNA配列（ヒト）（配列番号1）
2020511992.tif 000002
VISTA細胞外ドメインのcDNA配列（マウス）（配列番号2）
2020511992.tif 000003
COMPの五量体形成ドメインのcDNA配列（ヒト）（配列番号3）
2020511992.tif 000004
COMPの五量体形成ドメインのcDNA配列（マウス）（配列番号4）
2020511992.tif 000005
VISTA細胞外ドメインのmRNA配列（ヒト）（配列番号5）
2020511992.tif 000006
VISTA細胞外ドメインのmRNA配列（マウス）（配列番号6）
2020511992.tif 000007
COMPの五量体形成ドメインのmRNA配列（ヒト）（配列番号7）
2020511992.tif 000008
COMPの五量体形成ドメインのmRNA配列（マウス）（配列番号8）
2020511992.tif 000009
VISTA細胞外ドメインのアミノ酸配列（ヒト）（配列番号9）
2020511992.tif 000010
VISTA細胞外ドメインのアミノ酸配列（マウス）（配列番号10）
2020511992.tif 000011
COMPの五量体形成ドメインのアミノ酸配列（ヒト）（配列番号11）
2020511992.tif 000012
COMPの五量体形成ドメインのアミノ酸配列（マウス）（配列番号12）
2020511992.tif 000013
コドン最適化したmVISTA.COMPのDNA配列（マウス）（配列番号13）
2020511992.tif 000014
太字なし＝非翻訳ヌクレオチド
波下線＝Igκ分泌シグナルをコードするDNA配列
下線なしの大文字（黒色）＝VISTAの細胞外ドメイン
実線の下線（灰色）＝スペーサー配列
イタリック体の小文字＝COMPの五量体形成ドメイン
破線の下線＝hisタグをコードするDNA配列
二重下線＝終止コドン
太字＝翻訳ヌクレオチド
mVISTA.COMPのアミノ酸配列（マウス）（配列番号14）
2020511992.tif 000015
波下線＝Igκ分泌シグナル
太字（黒色）＝IgVドメインを含むVISTA細胞外ドメイン
イタリック体の小文字＝COMPの五量体形成ドメイン
破線の下線＝ヒスチジンタグ
下線（灰色）＝スペーサー配列
VISTA全長のアミノ酸配列（ヒト）（配列番号15） 
ACCESSION   Q9H7M9
2020511992.tif 000016
下線付きの太字＝IgVドメインを含むVISTA細胞外ドメイン（31〜193番目のアミノ酸）
VISTA全長のアミノ酸配列（マウス）（配列番号16）
ACCESSION   Q9D659
2020511992.tif 000017
下線付きの太字＝IgVドメインを含むVISTA細胞外ドメイン（31〜193番目のアミノ酸）
COMP全長のアミノ酸配列（ヒト）（配列番号17）
ACCESSION   NP_000086
2020511992.tif 000018
下線付きの太字＝五量体形成ドメイン（28〜73番目のアミノ酸）
COMP全長のアミノ酸配列（マウス）（配列番号18） 
ACCESSION   NP_057894
2020511992.tif 000019
下線付きの太字＝五量体形成ドメイン（28〜72番目のアミノ酸）
VISTA cDNAのヌクレオチド配列（ヒト）（配列番号19）
ACCESSION   NM_022153
2020511992.tif 000020
2020511992.tif 000021
下線付きの太字＝IgVドメインを含むVISTA細胞外ドメイン（235〜720番目）
VISTA cDNAのヌクレオチド配列（マウス）（配列番号20）
ACCESSION   XR_380449
2020511992.tif 000022
2020511992.tif 000023
下線付きの太字＝IgVドメインを含むVISTA細胞外ドメイン（101〜574番目）
COMP cDNA全長のヌクレオチド配列（ヒト）（配列番号21）
ACCESSION   NM_000095
2020511992.tif 000024
下線付きの太字＝五量体形成ドメイン（121〜255番目）
COMP cDNAのヌクレオチド配列（マウス）（配列番号22）
ACCESSION   NM_016685
2020511992.tif 000025
下線付きの太字＝五量体形成ドメイン（105〜240番目）
コドン最適化したVISTA.COMPのDNA配列（ヒト）（配列番号23）
2020511992.tif 000026
波下線＝Igκ分泌シグナルをコードするDNA配列
下線（灰色）＝スペーサー配列
下線なしの大文字（黒色）＝VISTAの細胞外ドメイン
イタリック体の小文字＝COMPの五量体形成ドメイン
二重下線＝終止コドン
破線の下線＝hisタグをコードするDNA配列
VISTA.COMPのアミノ酸配列（ヒト）（配列番号24）
2020511992.tif 000027
波下線＝Igκ分泌シグナル
太字の小文字（黒色）＝IgVドメインを含むVISTA細胞外ドメイン
イタリック体の小文字＝COMPの五量体形成ドメイン
破線の下線＝ヒスチジンタグ
下線（灰色）＝スペーサー配列
B7-H4細胞外ドメインのアミノ酸配列（ヒト）（配列番号25）
2020511992.tif 000028
B7-H4細胞外ドメインのcDNA配列（ヒト）（配列番号26）
2020511992.tif 000029
B7-H4細胞外ドメインのmRNA配列（ヒト）（配列番号27）
2020511992.tif 000030
B7-H4全長のアミノ酸配列（ヒト）（配列番号28）
ACCESSION Q7Z7D3
2020511992.tif 000031
B7-H4全長のcDNAのヌクレオチド配列（ヒト）（配列番号29）
ACCESSION   AY280972
2020511992.tif 000032
B7-H4.COMPのアミノ酸配列（ヒトB7-H4.COMP）（配列番号30） 
2020511992.tif 000033
波下線＝Igκ分泌シグナル
太字（黒色）＝含有B7-H4細胞外ドメイン
イタリック体の小文字＝COMPの五量体形成ドメイン
破線の下線＝ヒスチジンタグ
下線（灰色）＝スペーサー配列
コドン最適化したB7-H4.COMPのDNA配列（ヒトB7-H4）（配列番号31）
2020511992.tif 000034
B7-H4.COMPのアミノ酸配列（マウス）（配列番号32）
2020511992.tif 000035
波下線＝Igκ分泌シグナル
太字（黒色）＝含有B7-H4細胞外ドメイン
イタリック体の小文字＝COMPの五量体形成ドメイン
破線の下線＝ヒスチジンタグ
下線（灰色）＝スペーサー配列
コドン最適化したB7-H4.COMPのDNA配列（マウス）（配列番号33）
2020511992.tif 000036
波下線＝Igκ分泌シグナルをコードするDNA配列
下線なしの大文字（黒色）＝PD-L1の細胞外ドメイン
下線（灰色）＝スペーサー配列
イタリック体の小文字＝COMPの五量体形成ドメイン
破線の下線＝hisタグをコードするDNA配列
二重下線＝終止コドン
B7-H4全長のアミノ酸配列（マウス）（配列番号34）
ACCESSION Q7TSP5
2020511992.tif 000037
B7-H4全長のcDNAのヌクレオチド配列（マウス）（配列番号35）
ACCESSION   AY280973
2020511992.tif 000038
PD-L1細胞外ドメインのアミノ酸配列（ヒト）（配列番号36）
2020511992.tif 000039
PD-L1細胞外ドメインのcDNAのヌクレオチド配列（ヒト）（配列番号37）
2020511992.tif 000040
PD-L1全長のアミノ酸配列（ヒト）（配列番号38）
ACCESSION Q9NZQ7
2020511992.tif 000041
PD-L1全長のヌクレオチド配列（ヒト）（配列番号39）
ACCESSION   AF177937
2020511992.tif 000042
PD-L1.COMPのアミノ酸配列（ヒト）（配列番号40）
2020511992.tif 000043
波下線＝Igκ分泌シグナル
太字（黒色）＝IgVドメインを含むPD-L1細胞外ドメイン
イタリック体の小文字＝COMPの五量体形成ドメイン
破線の下線＝ヒスチジンタグ
下線（灰色）＝スペーサー配列
コドン最適化したPD-L1.COMPをコードするヌクレオチド配列（ヒト）（配列番号41）
2020511992.tif 000044
波下線＝Igκ分泌シグナルをコードするDNA配列
下線なしの大文字（黒色）＝PD-L1の細胞外ドメイン
下線（灰色）＝スペーサー配列
イタリック体の小文字＝COMPの五量体形成ドメイン
破線の下線＝hisタグをコードするDNA配列
二重下線＝終止コドン
PD-L1細胞外ドメインのアミノ酸配列（マウス）（配列番号42）
2020511992.tif 000045
PD-L1細胞外ドメインのcDNAのヌクレオチド配列（マウス）（配列番号43）
2020511992.tif 000046
PD-L1全長のアミノ酸配列（マウス）（配列番号44）
ACCESSION Q9EP73
2020511992.tif 000047
PD-L1全長のcDNAのヌクレオチド配列（マウス）（配列番号45）
ACCESSION   AF317088
2020511992.tif 000048
PD-L1.COMPのアミノ酸配列（マウス）（配列番号46）
2020511992.tif 000049
波下線＝Igκ分泌シグナル
太字（黒色）＝IgVドメインを含むPD-L1細胞外ドメイン
イタリック体の小文字＝COMPの五量体形成ドメイン
破線の下線＝ヒスチジンタグ
下線（灰色）＝スペーサー配列
PD-L1.COMPをコードするヌクレオチド配列（マウス）（配列番号47）
2020511992.tif 000050
波下線＝Igκ分泌シグナルをコードするDNA配列
下線なしの大文字（黒色）＝PD-L1の細胞外ドメイン
下線（灰色）＝スペーサー配列
イタリック体の小文字＝COMPの五量体形成ドメイン
破線の下線＝hisタグをコードするDNA配列
二重下線＝終止コドン
ICOS-L細胞外ドメインのcDNAのヌクレオチド配列（ヒト）（配列番号48）
2020511992.tif 000051
ICOS-L細胞外ドメインのアミノ酸配列（ヒト）（配列番号49）
2020511992.tif 000052
ICOS-L全長のcDNAのヌクレオチド配列（ヒト）（配列番号50）
ACCESSION AF289028
2020511992.tif 000053
ICOS-L全長のアミノ酸配列（ヒト）（配列番号51）
ACCESSION O75144
2020511992.tif 000054
ICOS-L細胞外ドメインのcDNAのヌクレオチド配列（マウス）（配列番号52）
2020511992.tif 000055
ICOS-L細胞外ドメインのアミノ酸配列（マウス）（配列番号53）
2020511992.tif 000056
ICOS-L全長のアミノ酸配列（マウス）（配列番号54）
ACCESSION Q9JHJ8
2020511992.tif 000057
ICOS-L全長のcDNAのヌクレオチド配列（マウス）（配列番号55）
ACCESSION   AF199027
2020511992.tif 000058
コドン最適化したICOS-L.COMPをコードするヌクレオチド配列（ヒト）（配列番号56）
2020511992.tif 000059
波下線＝Igκ分泌シグナルをコードするDNA配列
下線なしの大文字（黒色）＝ICOS-Lの細胞外ドメイン
下線（灰色）＝スペーサー配列
イタリック体の小文字＝COMPの五量体形成ドメイン
破線の下線＝hisタグをコードするDNA配列
二重下線＝終止コドン
ICOS-L.COMPのアミノ酸配列（ヒト）（配列番号57)
2020511992.tif 000060
波下線＝Igκ分泌シグナル
太字（黒色）＝IgVドメインを含むICOS-L細胞外ドメイン
イタリック体の小文字＝COMPの五量体形成ドメイン
破線の下線＝ヒスチジンタグ
下線（灰色）＝スペーサー配列
コドン最適化したICOS-L.COMPのヌクレオチド配列（マウス）（配列番号58）
2020511992.tif 000061
波下線＝Igκ分泌シグナルをコードするDNA配列
下線なしの大文字（黒色）＝ICOS-Lの細胞外ドメイン
下線（灰色）＝スペーサー配列
イタリック体の小文字＝COMPの五量体形成ドメイン
破線の下線＝hisタグをコードするDNA配列
二重下線＝終止コドン
コドン最適化したICOS-L.COMPのアミノ酸配列（マウス）（配列番号59）
2020511992.tif 000062
波下線＝Igκ分泌シグナル
太字（黒色）＝IgVドメインを含むICOS-L細胞外ドメイン
イタリック体の小文字＝COMPの五量体形成ドメイン
破線の下線＝ヒスチジンタグ
下線（灰色）＝スペーサー配列
Strep-tag-II VISTA.COMPのアミノ酸配列（マウス）（配列番号60）
2020511992.tif 000063
ヒトICOS-L細胞外ドメインのmRNA配列（配列番号61）
2020511992.tif 000064
ヒトPD-L1細胞外ドメインのmRNA配列（配列番号62）
2020511992.tif 000065
【０２１７】
引用文献：
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【図１Ａ−Ｅ】
2020511992.tif 000066
【図１Ｆ−Ｇ】
2020511992.tif 000067
【図１Ｈ−Ｊ】
2020511992.tif 000068
【図２Ａ−Ｃ】
2020511992.tif 000069
【図２Ｄ−Ｅ】
2020511992.tif 000070
【図２Ｆ−Ｈ】
2020511992.tif 000071
【図３Ａ−Ｅ】
2020511992.tif 000072
【図４Ａ−Ｂ】
2020511992.tif 000073
【図５Ａ−Ｂ】
2020511992.tif 000074
【図６】
2020511992.tif 000075
【図７Ａ−Ｂ】
2020511992.tif 000076
【図８Ａ−Ｂ】
2020511992.tif 000077
【図９Ａ−Ｅ】
2020511992.tif 000078
【図１０Ａ−Ｄ】
2020511992.tif 000079
【図１０Ｅ−Ｆ】
2020511992.tif 000080
【図１１Ａ−Ｃ】
2020511992.tif 000081
【図１２Ａ−Ｄ】
2020511992.tif 000082
【図１３】
2020511992.tif 000083
【図１４】
2020511992.tif 000084
【図１５】
2020511992.tif 000085
【図１６】
2020511992.tif 000086
【配列表】
2020511992000001.app
【国際調査報告】
2020511992.tif 000087
2020511992.tif 000088
2020511992.tif 000089
2020511992.tif 000090
2020511992.tif 000091
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