(57)【要約】  本開示は、ジカウイルスを用いて、グリオブラストーマを治療する組成物及び方法を含む。【選択図】図１３
2020529395.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子操作した腫瘍溶解性ジカウイルス（ＺＩＫＶ）と、製薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物であって、前記遺伝子操作したＺＩＫＶが、野生型ＺＩＫＶと比較して弱毒化されている前記医薬組成物。
【請求項２】
前記弱毒化ＺＩＫＶにおいて、野生型ＺＩＫＶと比較して、２’−Ｏメチルトランスフェラーゼ活性が低減されているか、糖鎖結合が低減されているか、短鎖フラビウイルスＲＮＡの産生が阻止されているか、内皮バリアを通じた伝播が制限されているか、またはＩ型インターフェロンに感作されており、前記遺伝子操作したＺＩＫＶが、正常細胞では弱毒化されている一方で、がん細胞では溶解作用を保持している、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記遺伝子操作したＺＩＫＶが、そのＮＳ５タンパク質に対する変異を１つ以上含み、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＹ７８５４８０．１との配列アラインメントによって求めた場合に、少なくとも１つの変異が、２１８位のアミノ酸に対応する位置に見られる、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記遺伝子操作したＺＩＫＶが、２１８位のアミノ酸に対応する位置に点変異を含み、２１８位のグルタミン酸が、アラニンに変異している、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記遺伝子操作したＺＩＫＶが、そのエンベロープ（Ｅ）タンパク質に対する変異を少なくとも１つ含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項６】
前記遺伝子操作したＺＩＫＶが、前記Ｅタンパク質に１つ以上の変異を含み、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＹ７８５４８０．１との配列アラインメントによって求めた場合に、少なくとも１つの変異が、前記Ｅタンパク質のＶＮＤ配列に対応するアミノ酸で見られる、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記遺伝子操作したＺＩＫＶが、前記Ｅタンパク質に１つ以上の変異を含み、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＹ７８５４８０．１との配列アラインメントによって求めた場合に、少なくとも１つの変異が、前記Ｅタンパク質の１５４位のアミノ酸または１５６位のアミノ酸に対応する位置に見られる、請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
前記遺伝子操作したＺＩＫＶが、１５４位のアミノ酸に対応する位置に点変異を含み、１５４位のアスパラギンが、グルタミンに変異しているか、または１５６位のアミノ酸に対応する位置に点変異を含み、１５６位のトレオニンが、バリンに変異している、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記遺伝子操作したＺＩＫＶが、前記ＮＳ１タンパク質に１つ以上の変異を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記遺伝子操作したＺＩＫＶが、そのＺＩＫＶゲノムの３’非翻訳領域に、少なくとも１つの変異を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記遺伝子操作したＺＩＫＶが、前記ＺＩＫＶゲノムの３’ＵＴＲにおいて、ヌクレオチドの欠失を少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも２６個、少なくとも２７個、少なくとも２８個、少なくとも２９個、少なくとも３０個またはそれを上回る数含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記遺伝子操作したＺＩＫＶが、そのＮＳ４Ｂタンパク質に少なくとも１つの変異を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記遺伝子操作したＺＩＫＶが、前記ＮＳ４Ｂタンパク質に１つ以上の変異を含み、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＹ７８５４８０．１との配列アラインメントによって求めた場合に、少なくとも１つの変異が、１８位のアミノ酸に対応する位置に見られる、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記遺伝子操作したＺＩＫＶが、前記ＮＳ４Ｂタンパク質の１８位のアミノ酸に対応する位置に点変異を含み、１８位のグリシンが、アルギニンに変異している、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記遺伝子操作したＺＩＫＶが、そのＮＳ３タンパク質に少なくとも１つの変異を含み得る、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
前記遺伝子操作したＺＩＫＶが、前記ＮＳ３タンパク質に１つ以上の変異を含み、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＹ７８５４８０．１との配列アラインメントによって求めた場合に、少なくとも１つの変異が、３９９位のアミノ酸に対応する位置に見られる、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記遺伝子操作したＺＩＫＶが、前記ＮＳ３タンパク質の３９９位のアミノ酸に対応する位置に点変異を含み、３９９位のリシンが、アルギニンに変異している、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
がん幹細胞が化学療法または放射線から受ける影響を大きくする、いずれかの先行請求項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記がん幹細胞が、静止グリオブラストーマ幹細胞である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
対象のがんの治療方法であって、
前記方法を必要とする対象に、遺伝子操作したＺＩＫＶを含む組成物を投与して、前記がんを治療することを含み、前記遺伝子操作したＺＩＫＶが、弱毒化されている前記方法。
【請求項２１】
前記弱毒化ＺＩＫＶにおいて、野生型ＺＩＫＶと比較して、２’−Ｏメチルトランスフェラーゼ活性が低減されているか、糖鎖結合が低減されているか、短鎖フラビウイルスＲＮＡの産生が阻止されているか、内皮バリアを通じた伝播が制限されているか、またはＩ型インターフェロンに感作されており、前記遺伝子操作したＺＩＫＶが、正常細胞では弱毒化されている一方で、がん細胞では溶解作用を保持している、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記遺伝子操作したＺＩＫＶが、前記ＮＳ５タンパク質に対する変異を１つ以上含み、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＹ７８５４８０．１との配列アラインメントによって求めた場合に、少なくとも１つの変異が、２１８位のアミノ酸に対応する位置に見られる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記遺伝子操作したＺＩＫＶが、２１８位のアミノ酸に対応する位置に点変異を含み、２１８位のグルタミン酸が、アラニンに変異している、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記遺伝子操作したＺＩＫＶが、前記エンベロープ（Ｅ）タンパク質に対する変異を少なくとも１つ含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記遺伝子操作したＺＩＫＶが、前記Ｅタンパク質に対する変異を１つ以上含み、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＹ７８５４８０．１との配列アラインメントによって求めた場合に、少なくとも１つの変異が、前記Ｅタンパク質のＶＮＤ配列に対応するアミノ酸で見られる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記遺伝子操作したＺＩＫＶが、前記Ｅタンパク質に対する変異を１つ以上含み、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＹ７８５４８０．１との配列アラインメントによって求めた場合に、少なくとも１つの変異が、前記Ｅタンパク質の１５４位のアミノ酸または１５６位のアミノ酸に対応する位置に見られる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記遺伝子操作したＺＩＫＶが、１５４位のアミノ酸に対応する位置に点変異を含み、１５４位のアスパラギンが、グルタミンに変異しているか、または１５６位のアミノ酸に対応する位置に点変異を含み、１５６位のトレオニンが、バリンに変異している、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記遺伝子操作したＺＩＫＶが、前記ＮＳ１タンパク質に１つ以上の変異を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２９】
前記遺伝子操作したＺＩＫＶが、前記ＺＩＫＶゲノムの３’非翻訳領域に、少なくとも１つの変異を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３０】
前記遺伝子操作したＺＩＫＶが、前記ＺＩＫＶゲノムの３’ＵＴＲにおいて、ヌクレオチドの欠失を少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも２６個、少なくとも２７個、少なくとも２８個、少なくとも２９個、少なくとも３０個またはそれを上回る数含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記遺伝子操作したＺＩＫＶが、前記ＮＳ４Ｂタンパク質に少なくとも１つの変異を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３２】
前記遺伝子操作したＺＩＫＶが、前記ＮＳ４Ｂタンパク質に対する変異を１つ以上含み、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＹ７８５４８０．１との配列アラインメントによって求めた場合に、少なくとも１つの変異が、１８位のアミノ酸に対応する位置に見られる、請求項２０に記載の方法。
【請求項３３】
前記遺伝子操作したＺＩＫＶが、前記ＮＳ４Ｂタンパク質の１８位のアミノ酸に対応する位置に点変異を含み、１８位のグリシンが、アルギニンに変異している、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記遺伝子操作したＺＩＫＶが、前記ＮＳ３タンパク質に少なくとも１つの変異を含み得る、請求項２０に記載の方法。
【請求項３５】
前記遺伝子操作したＺＩＫＶが、前記ＮＳ３タンパク質に対する変異を１つ以上含み、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＹ７８５４８０．１との配列アラインメントによって求めた場合に、少なくとも１つの変異が、３９９位のアミノ酸に対応する位置に見られる、請求項２０に記載の方法。
【請求項３６】
前記遺伝子操作したＺＩＫＶが、前記ＮＳ３タンパク質の３９９位のアミノ酸に対応する位置に点変異を含み、３９９位のリシンが、アルギニンに変異している、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記遺伝子操作したＺＩＫＶが、がん幹細胞を選択的に標的とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項３８】
前記組成物を投与することが、腫瘍内送達、大脳内送達、頸動脈内送達またはこれらを組み合わせたものを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３９】
前記組成物を投与することが、静脈内送達または皮下送達を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項４０】
化学療法剤の投与、免疫チェックポイント阻害剤の投与、放射線療法、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法、インターフェロンベース療法またはインターロイキンベース療法を前記対象に行う工程をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項４１】
前記がんが、グリオブラストーマ、鼻咽頭癌、滑膜癌、肝細胞癌、腎臓癌、結合組織の癌、メラノーマ、肺癌、腸癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、脳腫瘍、咽喉癌、口腔癌、肝臓癌、骨癌、膵臓癌、絨毛癌、ガストリノーマ、褐色細胞腫、プロラクチノーマ、Ｔ細胞白血病／リンパ腫、神経腫、フォンヒッペル・リンドウ病、ゾリンジャー・エリソン症候群、副腎癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、尿管癌、脳腫瘍、希突起神経膠腫、神経芽腫、髄膜腫、脊髄腫瘍、骨癌、骨軟骨腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、原発部位不明癌、カルチノイド、胃腸管のカルチノイド、線維肉腫、乳癌、パジェット病、子宮頸癌、結腸直腸癌、直腸癌、食道癌、胆嚢癌、頭部癌、眼癌、頸部癌、腎臓癌、ウィルムス腫瘍、肝臓癌、カポジ肉腫、前立腺癌、肺癌、睾丸癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、口腔癌、皮膚癌、中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、内分泌性膵臓癌、グルカゴノーマ、膵臓癌、副甲状腺癌、陰茎癌、下垂体癌、軟部組織肉腫、網膜芽腫、小腸癌、胃癌、胸腺癌、甲状腺癌、トロホブラスト癌、胞状奇胎、子宮癌、子宮体癌、膣癌、外陰癌、聴神経腫、菌状息肉腫、インスリノーマ、カルチノイド症候群、ソマトスタチノーマ、歯肉癌、心臓癌、口唇癌、髄膜癌、口腔癌、神経癌、口蓋癌、耳下腺癌、腹膜癌、咽頭癌、胸膜癌、唾液腺癌、舌癌及び扁桃癌からなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項４２】
がんに対する腫瘍溶解作用の誘導方法であって、前記方法を必要とする対象に、遺伝子操作したＺＩＫＶを含む組成物を投与して、前記がんに対する前記腫瘍溶解作用を誘導することを含み、前記ＺＩＫＶが弱毒化されている前記方法。
【請求項４３】
前記弱毒化ＺＩＫＶにおいて、野生型ＺＩＫＶと比較して、２’−Ｏメチルトランスフェラーゼ活性が低減されているか、糖鎖結合が低減されているか、短鎖フラビウイルスＲＮＡの産生が阻止されているか、内皮バリアを通じた伝播が制限されているか、またはＩ型インターフェロンに感作されている、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記遺伝子操作したＺＩＫＶが、前記ＮＳ５タンパク質に対する変異を１つ以上含み、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＹ７８５４８０．１との配列アラインメントによって求めた場合に、少なくとも１つの変異が、２１８位のアミノ酸に対応する位置に見られる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記遺伝子操作したＺＩＫＶが、２１８位のアミノ酸に対応する位置に点変異を含み、２１８位のグルタミン酸が、アラニンに変異している、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記遺伝子操作したＺＩＫＶが、前記エンベロープ（Ｅ）タンパク質に少なくとも１つの変異を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４７】
前記遺伝子操作したＺＩＫＶが、前記Ｅタンパク質に対する変異を１つ以上含み、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＹ７８５４８０．１との配列アラインメントによって求めた場合に、少なくとも１つの変異が、前記Ｅタンパク質のＶＮＤ配列に対応するアミノ酸で見られる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４８】
前記遺伝子操作したＺＩＫＶが、前記Ｅタンパク質に対する変異を１つ以上含み、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＹ７８５４８０．１との配列アラインメントによって求めた場合に、少なくとも１つの変異が、前記Ｅタンパク質の１５４位のアミノ酸または１５６位のアミノ酸に対応する位置に見られる、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記遺伝子操作したＺＩＫＶが、１５４位のアミノ酸に対応する位置に点変異を含み、１５４位のアスパラギンが、グルタミンに変異しているか、または１５６位のアミノ酸に対応する位置に点変異を含み、１５６位のトレオニンが、バリンに変異している、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記遺伝子操作したＺＩＫＶが、前記ＮＳ１タンパク質に１つ以上の変異を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項５１】
前記遺伝子操作したＺＩＫＶが、前記ＺＩＫＶゲノムの３’非翻訳領域に、少なくとも１つの変異を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項５２】
前記遺伝子操作したＺＩＫＶが、前記ＺＩＫＶゲノムの３’ＵＴＲにおいて、ヌクレオチドの欠失を少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも２６個、少なくとも２７個、少なくとも２８個、少なくとも２９個、少なくとも３０個またはそれを上回る数含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項５３】
前記遺伝子操作したＺＩＫＶが、前記ＮＳ４Ｂタンパク質に少なくとも１つの変異を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項５４】
前記遺伝子操作したＺＩＫＶが、前記ＮＳ４Ｂタンパク質に対する変異を１つ以上含み、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＹ７８５４８０．１との配列アラインメントによって求めた場合に、少なくとも１つの変異が、１８位のアミノ酸に対応する位置に見られる、請求項４２に記載の方法。
【請求項５５】
前記遺伝子操作したＺＩＫＶが、前記ＮＳ４Ｂタンパク質の１８位のアミノ酸に対応する位置に点変異を含み、１８位のグリシンが、アルギニンに変異している、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記遺伝子操作したＺＩＫＶが、前記ＮＳ３タンパク質に少なくとも１つの変異を含み得る、請求項４２に記載の方法。
【請求項５７】
前記遺伝子操作したＺＩＫＶが、前記ＮＳ３タンパク質に対する変異を１つ以上含み、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＹ７８５４８０．１との配列アラインメントによって求めた場合に、少なくとも１つの変異が、３９９位のアミノ酸に対応する位置に見られる、請求項４２に記載の方法。
【請求項５８】
前記遺伝子操作したＺＩＫＶが、前記ＮＳ３タンパク質の３９９位のアミノ酸に対応する位置に点変異を含み、３９９位のリシンが、アルギニンに変異している、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記遺伝子操作したＺＩＫＶが、がん幹細胞を選択的に標的とする、請求項４２に記載の方法。
【請求項６０】
前記組成物を投与することが、腫瘍内送達、大脳内送達、頸動脈内送達またはこれらを組み合わせたものを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項６１】
前記組成物を投与することが、静脈内送達または皮下送達を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項６２】
化学療法剤の投与、免疫チェックポイント阻害剤の投与、放射線療法、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法、インターフェロンベース療法またはインターロイキンベース療法を前記対象に行う工程をさらに含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項６３】
前記がんが、グリオブラストーマ、鼻咽頭癌、滑膜癌、肝細胞癌、腎臓癌、結合組織の癌、メラノーマ、肺癌、腸癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、脳腫瘍、咽喉癌、口腔癌、肝臓癌、骨癌、膵臓癌、絨毛癌、ガストリノーマ、褐色細胞腫、プロラクチノーマ、Ｔ細胞白血病／リンパ腫、神経腫、フォンヒッペル・リンドウ病、ゾリンジャー・エリソン症候群、副腎癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、尿管癌、脳腫瘍、希突起神経膠腫、神経芽腫、髄膜腫、脊髄腫瘍、骨癌、骨軟骨腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、原発部位不明癌、カルチノイド、胃腸管のカルチノイド、線維肉腫、乳癌、パジェット病、子宮頸癌、結腸直腸癌、直腸癌、食道癌、胆嚢癌、頭部癌、眼癌、頸部癌、腎臓癌、ウィルムス腫瘍、肝臓癌、カポジ肉腫、前立腺癌、肺癌、睾丸癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、口腔癌、皮膚癌、中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、内分泌性膵臓癌、グルカゴノーマ、膵臓癌、副甲状腺癌、陰茎癌、下垂体癌、軟部組織肉腫、網膜芽腫、小腸癌、胃癌、胸腺癌、甲状腺癌、トロホブラスト癌、胞状奇胎、子宮癌、子宮体癌、膣癌、外陰癌、聴神経腫、菌状息肉腫、インスリノーマ、カルチノイド症候群、ソマトスタチノーマ、歯肉癌、心臓癌、口唇癌、髄膜癌、口腔癌、神経癌、口蓋癌、耳下腺癌、腹膜癌、咽頭癌、胸膜癌、唾液腺癌、舌癌及び扁桃癌からなる群から選択される、請求項４２に記載の方法。
【請求項６４】
前記遺伝子操作したＺＩＫＶが、分化細胞または周囲の成人神経細胞に感染しない、請求項４２に記載の方法。
【請求項６５】
前記がん細胞に対する腫瘍溶解作用の増強のために、化学療法剤の投与、免疫チェックポイント阻害剤の投与または放射線療法を行うことをさらに含む、請求項４２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１７年６月１２日に出願した米国特許仮出願第６２／５１８，３００号及び２０１７年１０月１９日に出願した米国特許仮出願第６２／５７４，５３７号に基づく利益を主張するものであり、これらの開示内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される。
【０００２】
本発明の技術分野
本開示は、がん治療のためのウイルス療法を提供する。特には、本開示は、腫瘍溶解療法で弱毒化ウイルスを使用する組成物及び方法に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
正常な組織ホメオスタシスは、高度に調節された細胞増殖及び細胞死プロセスである。細胞増殖または細胞死のいずれかの不均衡によって、がん性状態に発展し得る。いくつかの悪性腫瘍の治癒率は著しく改善しているが、進行固形腫瘍の患者の転帰は、残酷なことに、この数十年にわたり横ばいである。
【０００４】
現在では、多くの一般的なタイプのがんの治療に対する有効な選択肢はわずかである。所定の個体に対する治療方針は、診断、疾患が進展している病期、ならびに患者の年齢、性別及び全身の健康状態のような要因に左右される。がん治療で最も慣習的な選択肢は、手術、放射線療法及び化学療法である。がんの診断及び治療では、手術が中心的な役割を果たす。典型的には、生検及び癌性増殖の除去には、外科的アプローチが必要になる。しかしながら、がんが転移して広がっている場合には、手術によって治癒する可能性は低く、別のアプローチを取る必要がある。
【０００５】
グリオブラストーマ（ＧＢＭ）は、原発性の内在性脳腫瘍である。ＧＢＭは、従来型の腫瘍治療に対して耐性であることがあり、通常は致死性であり、患者の生存期間中央値は２年未満である。ＧＢＭは、不均一な疾患であり、腫瘍塊には、非形質転換細胞及び形質転換細胞（グリオブラストーマ幹細胞（ＧＳＣ）という幹様細胞の前駆体集団を含む）が含まれる。ＧＳＣは、自己再生性の造腫瘍幹様腫瘍細胞集団である腫瘍開始細胞である。ＧＳＣは、持続的な増殖、血管新生の促進、侵襲能、免疫逃避及び治療耐性により、腫瘍悪性化に寄与する。多くの致死性のがんとは異なり、ＧＢＭは、転移するのはまれであり、大部分（７０〜８０％）の患者は、元の切除腔の２〜３ｃｍ以内で再発し、この腫瘍挙動により、腫瘍溶解性ウイルスを含む局所療法の研究が促されてきた。試験されたいくつかの腫瘍溶解性ウイルスは、脳内の正常な周辺細胞にも感染して、それらの細胞も殺傷するので、毒性があることが分かっている。
【０００６】
ジカウイルス（ＺＩＫＶ）は、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ科のメンバーである。ＺＩＫＶは、主要なヒト病原体として明らかになったものであり、胎生期発達不全（小頭症）、妊娠転帰の不良及びギラン・バレー症候群の発生と関連している。感染した個体、特に成人は、無症状であるか、または発熱、頭痛、発疹、結膜炎及び関節痛／筋肉痛のような軽度な症状を呈することがある。ジカウイルスは、１９４７年に、ウガンダのジカ森林のおとりサルから初めて単離された。血清学的エビデンスに基づくと、ヒトでの最初の症例は、１９５２年に報告された。ジカウイルス媒介性の組織障害、及び感染に対する宿主応答は、今まさに明らかになってきている。アポトーシス細胞死は、フラビウイルス感染の様々な臨床症状に寄与している。
【０００７】
他の細胞を殺傷したり、または毒性を引き起こしたりせずに、腫瘍悪性化に寄与するがん細胞を特異的に殺傷する腫瘍溶解性ウイルスが必要とされている。
【発明の概要】
【０００８】
一態様では、本開示は、腫瘍を治療するための組成物を提供する。その組成物は、腫瘍に対する腫瘍溶解作用を誘導できる腫瘍溶解性ウイルスであって、グリオブラストーマ幹細胞（ＧＳＣ）を特異的に標的とする腫瘍溶解性ウイルスを含む。その腫瘍溶解性ウイルスは、ジカウイルス（ＺＩＫＶ）であってよい。そのＺＩＫＶは、Ｉ型インターフェロン、及び特に、自然免疫遺伝子のＩＦＩＴファミリーに対する感受性の向上により、ＧＳＣ周辺の非ＧＳＣにおいて、そのウイルスの複製能を制限するＥ２１８Ａ変異によって、弱毒化されていてよい。
【０００９】
本開示の別の態様は、ＧＳＣを特異的に殺傷する腫瘍溶解性ウイルス組成物を対象に投与することによって、対象のＧＢＭを治療する方法を提供する。その腫瘍溶解性ウイルスは、ＺＩＫＶまたはＺＩＫＶの弱毒変異株であってよい。その治療方法は、ＺＩＫＶ組成物と化学療法剤を組み合わせたものであってよい。
【００１０】
さらに別の態様では、本開示は、ＺＩＫＶの組成物を投与することによって、ＧＳＣを殺傷する方法を提供する。そのＺＩＫＶは、ＺＩＫＶの弱毒変異株であってよい。そのＺＩＫＶは、ＧＳＣに特異的に感染して、ＧＳＣを殺傷してよい。周辺の分化グリオーマ細胞、成人神経細胞または増殖細胞は、ＺＩＫＶに感染したり、またはＺＩＫＶによって殺傷されたりしないことができる。
【００１１】
本出願ファイルには、カラーで作成した図面が少なくとも１つ含まれる。カラー図面（複数可）を含む本特許出願公開のコピーは、必要な費用を支払えば、要請に応じて、当局から提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ、図１Ｄ、図１Ｅ、図１Ｆ、図１Ｇ、図１Ｈ、図１Ｉ、図１Ｊ、図１Ｋ、図１Ｌ、図１Ｍ及び図１Ｎは、ＺＩＫＶが、ヒトグリオブラストーマ幹細胞（ＧＳＣ）の自己複製及び増殖を喪失させることを示している。図１Ａ及び図１Ｂでは、７ｈｐｉに、ＧＳＣをＺＩＫＶ−ダカールに感染させないか（図１Ａ）、または感染させるかした（図１Ｂ）ことを示している。図１Ｃ〜図１Ｆでは、４８ｈｐｉに、ＧＳＣをＺＩＫＶ−ダカールに感染させないか（図１Ｃ、図１Ｅ）、または感染させるかし（図１Ｄ、図１Ｆ）、ＺＩＫＶエンベロープ（Ｅ）タンパク質（ＺＩＫＶ、緑色）及びＤＡＰＩ（青色）（図１Ｃ〜図１Ｆ）、ならびにＺＩＫＶ、ＤＡＰＩ及びＳｏｘ２（赤色）（図１Ｅ、図１Ｆ）に対して免疫蛍光染色を行った。図１Ｇ、図１Ｈは、ＭＯＩ５で７日間、ＺＩＫＶ−ダカールまたはＺＩＫＶ−ブラジルに感染させたＧＳＣ対（３８７、３５６５及び４１２１）（図１Ｇ）、ならびにＤＧＣ対（図１Ｈ）の相対的な細胞生存能であり、いずれのデータも、０日目に対して標準化した。図１Ｉは、示されているＺＩＫＶ株またはコントロールに感染させた３８７ＧＳＣ、３５６５ＧＳＣ、４１２１ＧＳＣのスフェア形成能である。図１Ｊ〜図１Ｍでは、４８ｈｐｉに、ＧＳＣをＺＩＫＶ−ダカールに感染させないか（図１Ｊ、図１Ｌ）、または感染させるかし（図１Ｋ、図１Ｍ）、ＺＩＫＶ（緑色）、ＤＡＰＩ（青色）及びＫｉ−６７（赤色）（図１Ｊ、図１Ｋ）またはＺＩＫＶ、ＤＡＰＩ及びＡＣ３（赤色）（図１Ｌ、図１Ｍ）に対して免疫蛍光染色を行った。図１Ｎでは、４日目に、ＺＩＫＶに感染させたかまたは感染させなかった３つのＧＳＣ株において、目視定量によって、Ｓｏｘ２陽性細胞、Ｋｉ−６７陽性細胞及びＡＣ３陽性細胞の頻度を測定した。データは、２連で行った実験から抽出し、３つの独立した実験からプールする。エラーバーは、標準偏差（ＳＤ）を示している（＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１、一元ＡＮＯＶＡ及び多重比較のためのＴｕｋｅｙ法）。スケールバーは、図１Ａ、図１Ｂでは２００μｍ、図１Ｃ〜図１Ｆ、図１Ｊ〜図１Ｍでは１００μｍである。
【図２】図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃ、図２Ｄ、図２Ｅ、図２Ｆ、図２Ｇ、図２Ｈ、図２Ｉ、図２Ｊ、図２Ｋ、図２Ｌ、図２Ｍ、図２Ｎ、図２Ｏ及び図２Ｐは、ＺＩＫＶへの感染によって、ヒトグリオブラストーマ由来のオルガノイドの自己複製及び増殖が喪失することを示している。図２Ａ〜図２Ｆは、２つのＺＩＫＶ株に感染後のＧＳＣオルガノイドの明視野画像である。ＧＳＣは、マトリゲル中で３日間（ａ）または３週間（図２Ｂ）インキュベートした。オルガノイドは、ＺＩＫＶ−ブラジル（図２Ｃ、図２Ｅ）またはＺＩＫＶ−ダカール（図２Ｄ、図２Ｆ）に、２週間（図２Ｃ、図２Ｄ）または４週間（図２Ｅ、図２Ｆ）感染させた。図２Ｇは、３つのＧＳＣオルガノイドモデル（３８７、３５６５、４１２１）において、ＺＩＫＶへの感染から２週間後または４週間後のオルガノイド面積を求めたものである。図２Ｈ〜図２Ｏは、感染から２週間時点の非感染コントロール及びＺＩＫＶ−ダカールに感染させたＧＳＣオルガノイドであって、ＺＩＫＶ（緑色）（図２Ｈ〜図２Ｏ）及びＤＡＰＩ（青色）とともに、Ｓｏｘ２（赤色）（図２Ｈ、図２Ｉ）、ＡＣ３（赤色）（図２Ｊ、図２Ｋ）、Ｋｉ−６７（赤色）（図２Ｌ、図２Ｍ）またはＧＦＡＰ（赤色）（図２Ｎ、図２Ｏ）に対して染色したＧＳＣオルガノイドの代表的な画像である。図２Ｐは、ＤＡＰＩ＋細胞のＳｏｘ２＋サブ集団、Ｋｉ−６７＋サブ集団、ＡＣ３＋サブ集団及びＧＦＡＰ＋サブ集団の定量結果であり、各条件において、ｎ＝６オルガノイドである。値は、平均±ＳＤを表している（＊＊：Ｐ＜０．０１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１、一元ＡＮＯＶＡ及び多重比較のためのＴｕｋｅｙ法）。スケールバーは、図２Ａ〜図２Ｆでは４００μｍ、図２Ｈ〜図２Ｏでは２００μｍである。
【図３】図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃ、図３Ｄ、図３Ｅ、図３Ｆ、図３Ｇ、図３Ｈ、図３Ｉ、図３Ｊ、図３Ｋ、図３Ｌ、図３Ｍ、図３Ｎ、図３Ｏ、図３Ｐ、図３Ｑ、図３Ｒ、図３Ｓ、図３Ｔ、図３Ｕ、図３Ｖ、図３Ｗ、図３Ｘ、図３Ｙ及び図３Ｚは、ＺＩＫＶが、新鮮単離ヒトグリオブラストーマには感染できるが、正常な脳組織切片には感染できないことを示している。ａ〜ｃは、Ｈ＆Ｅ（図３Ａ）、Ｋｉ−６７（図３Ｂ）またはＧＦＡＰ（図３Ｃ）で染色後の新鮮切除グリオブラストーマを示している代表的な画像である。図３Ｄ〜図３Ｒは、ＺＩＫＶ−ダカール（図３Ｇ〜図３Ｌ）またはＺＩＫＶ−ブラジル（図３Ｍ〜図３Ｒ）に感染させなかったか（ｄ〜ｆ）、または感染させたグリオブラストーマ組織を７日後に、ＺＩＫＶ（緑色）及びＤＡＰＩ（青色）とともに、Ｓｏｘ２（赤色）（図３Ｄ、図３Ｇ、図３Ｊ、図３Ｍ、図３Ｐ）、Ｋｉ−６７（赤色）（図３Ｅ、図３Ｈ、図３Ｋ、図３Ｎ、図３Ｑ）またはＧＦＡＰ（赤色）（図３Ｆ、図３Ｉ、図３Ｌ、図３Ｏ、図３Ｒ）で免疫蛍光染色したものである。図３Ｓは、ＺＩＫＶに感染した腫瘍細胞、及びＺＩＫＶ＋細胞のＳｏｘ２サブ集団、Ｋｉ−６７サブ集団、ＧＦＡＰサブ集団の定量結果である。図３Ｔ〜図３Ｚは、Ｈ＆Ｅ（図３Ｔ）、またはＫｉ−６７（図３Ｕ）もしくはＧＦＡＰ（Ｖ）で染色後の正常な新鮮切除脳を示している代表的な画像である。図３Ｗ〜図３Ｚは、ＺＩＫＶ−ダカールに感染させないか（図３Ｗ、図３Ｙ）、または感染させるかした（図３Ｘ、図３Ｚ）正常な脳組織を７日後に、ＺＩＫＶ（緑色）及びＤＡＰＩ（青色）とともに、ＮｅｕＮ（赤色）（図３Ｗ、図３Ｘ）またはＧＦＡＰ（赤色）（図３Ｙ、図３Ｚ）に対して染色したものである。図３Ｓでは、値は、平均±ＳＤを表しており、いずれの結果も、３つの独立した実験からプールされている（両側独立ｔ検定、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１、ｎｓ：有意差なし）。スケールバーは、図３Ａ〜図３Ｉ、図３Ｍ〜図３Ｏ、図３Ｔ〜図３Ｖでは１００μｍ、図３Ｊ〜図３Ｌ、図３Ｐ〜図３Ｒ及び図３Ｗ〜図３Ｚでは２００μｍである。
【図４】図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ、図４Ｄ、図４Ｅ、図４Ｆ、図４Ｇ、図４Ｈ、図４Ｉ、図４Ｊ、図４Ｋ、図４Ｌ、図４Ｍ、図４Ｎ、図４Ｏ、図４Ｐ、図４Ｑ、図４Ｒ、図４Ｓ、図４Ｔ及び図４Ｕは、マウス適合型ＺＩＫＶ−ダカールが、インビトロにおいて、分化細胞と比べて、マウスグリオーマ細胞の成長を減弱させ、インビボにおいて、グリオーマのマウスの生存期間を延ばすことを示している。図４Ａでは、マウスグリオーマ細胞（Ｃ５７ＢＬ／６のバックグラウンド：ＧＬ２６、ＧＬ２６１及びＣＴ−２Ａ）、ミクログリア細胞（ＢＶ２）及び神経幹細胞分化細胞（ＭＳ−ＤＮＣ）を親株またはマウス適合型のＺＩＫＶ−ダカールに感染させ、相対的な細胞生存能を１週間にわたって評価した（０日目に対して標準化した）。図４Ｂでは、ＺＩＫＶ−ダカールに感染させた細胞（ＧＬ２６、ＧＬ２６１、ＣＴ−２Ａ、ＢＶ２及びＭＳ−ＤＮＣ）の上清のウイルス力価を１週間時点に、フォーカス形成アッセイ（ＦＦＡ）によって測定した。図４Ｃ〜図４Ｉは、ＧＬ２６１及びＣＴ−２Ａによるマウスグリオーマモデルである。移植の１週間後に、生物発光イメージング（ＢＬＩ）（図４Ｃ）及びＨ＆Ｅ染色（図４Ｄ、図４Ｅ）によって、グリオーマを証明した。ＧＬ２６１（図４Ｆ、図４Ｇ）及びＣＴ−２Ａ（図４Ｈ、図４Ｉ）の移植から３週間後に、マウス適合型ＺＩＫＶ−ダカールによる処置を行わないか（図４Ｆ、図４Ｈ）、または処置を行うかした（図４Ｇ、図４Ｉ）。図４Ｊ、図４Ｋは、ＰＢＳコントロール、または１０３ＦＦＵ（図４Ｊ）もしくは１０５ＦＦＵ（図４Ｋ）のマウス適合型ＺＩＫＶ−ダカールで処置したグリオーマ腫瘍モデルのカプラン・マイヤー生存曲線である。図４Ｌ〜図４Ｓは、ＧＬ２６１−グリオーマ腫瘍を有するマウスをエンドポイント時に、ＰＢＳコントロール（図４Ｌ、図４Ｎ、図４Ｐ）、または１０３ＦＦＵの適合型ＺＩＫＶ−ダカール（図４Ｍ、図４Ｏ、図４Ｑ、図４Ｒ、図４Ｓ）で処置後、ＺＩＫＶ（緑色）とともに、ＤＡＰＩ（青色）（図４Ｌ〜図４Ｑ）、Ｓｏｘ２（赤色）（図４Ｌ、図４Ｍ、図４Ｒ）、ＧＦＡＰ（赤色）（図４Ｎ、図４Ｏ）、Ｋｉ−６７（赤色）（図４Ｐ、図４Ｑ）及びＢｒＤＵ（青色）（図４Ｒ、図４Ｓ）に対して免疫蛍光染色したものである。図４Ｔは、マウスＧＬ２６１グリオーマにおけるＺＩＫＶ＋細胞またはＢｒｄＵ＋／Ｋｉ６７＋細胞の定量結果（左）、及びＺＩＫＶ＋細胞のＳｏｘ２サブ集団、Ｋｉ６７サブ集団、ＢｒｄＵ＋サブ集団の定量結果（右）である。インビトロ実験は、３つの独立した実験からプールして、２連で行った。マウス生存実験では、２つの独立した実験からプールした（ＧＬ２６では、ｎ＝１５（コントロール）またはｎ＝１８（１０３ＦＦＵのＺＩＫＶで処置）、ＣＴ−２Ａでは、ｎ＝７（コントロール）またはｎ＝８（１０３ＦＦＵのＺＩＫＶで処置）、ＧＬ２６１では、ｎ＝６（コントロール）またはｎ＝６（１０５ＦＦＵのＺＩＫＶで処置））。図４Ｕ（左）は、ＺＩＫＶ−ダカールまたはＰＢＳによる処置から２週間後の、ＣＴ２Ａグリオーマを有するマウスにおけるウイルスＲＮＡに対するインサイチュハイブリダイゼーション染色の代表的な低倍率及び高倍率画像（２回の実験の代表的な画像）である。矢印は、陽性染色を示している。図４Ｕ（右）は、同じ腫瘍に対する切断カスパーゼ−３染色の代表的な高倍率画像である。インビトロ実験は、３つの独立した実験からプールし、２連で行った。免疫染色の定量結果は、６匹のマウスから得た。値は、平均±ＳＤを表している（図４Ａ〜図４Ｂでは、多重比較補正を施した一元ＡＮＯＶＡを行った。＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１）。図４Ｊ〜図４Ｋでは、ログランク検定を用いた。スケールバーは、図４Ｄ、図４Ｆ〜図４Ｉでは、２００μｍである。スケールバーは、図４Ｅ、図４Ｌ〜図４Ｓでは、１００μｍである。
【図５】図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図５Ｅ、図５Ｆ、図５Ｇ、図５Ｈ、図５Ｉ及び図５Ｊは、ＺＩＫＶ−Ｅ２１８Ａが、ＧＳＣの成長を阻害するとともに、テモゾロミドとの相加作用を有することを示している。図５Ａ、図５Ｂでは、ＧＳＣは、ＺＩＫＶ親株（ＭＯＩ５）、ＺＩＫＶ−Ｅ２１８Ａ（ＭＯＩ５）、ＴＭＺ（２５０μＭ）、またはＺＩＫＶ−Ｅ２１８Ａ（ＭＯＩ５）及びＴＭＺ（２５０μＭ）を組み合わせたもの（Ｅ２１８ＡＴ）でモック処理するか、またはインキュベートした。１週間の処理後、７日目に、３つのＧＳＣ株（３８７、３５６５、４１２１）の相対的な細胞生存能（０日目に対して標準化した）（図５Ａ）及びスフェア形成（図５Ｂ）についてアッセイした。図５Ｃ〜図５Ｆは、非感染コントロールで処理したＧＳＣ（図５Ｃ、図５Ｅ）及びＺＩＫＶ−Ｅ２１８Ａで処理したＧＳＣ（図５Ｄ、図５Ｆ）を７日目に、Ｓｏｘ２（赤色）、ＤＡＰＩ（青色）及びＺＩＫＶ−Ｅ２１８Ａ（緑色）に対して免疫蛍光染色したものである。図５Ｇ、図５Ｈは、テモゾロミドと組み合わせずに（図５Ｇ）及びテモゾロミド（２５０μＭ）と組み合わせて（図５Ｈ）、ＺＩＫＶ−Ｅ２１８Ａに感染させたＧＳＣを７日目に、ＡＣ３（赤色）、ＤＡＰＩ（青色）及びＺＩＫＶ−Ｅ２１８Ａ（緑色）に対して免疫蛍光染色したものである。図５Ｉは、テモゾロミド（ＴＭＺ）、ＺＩＫＶ−Ｅ２１８Ａ、またはＴＭＺ（２５０μＭ）と組み合わせたＺＩＫＶ−Ｅ２１８Ａ（Ｅ２１８ＡＴ）で処理した３つのＧＳＣ株におけるＡＣ３＋アポトーシス細胞の定量結果である。図５Ｊは、１週間にわたって、ＺＩＫＶ親株に感染させたＧＳＣ及びＥ２１８Ａ  ＺＩＫＶに感染させたＧＳＣの上清のウイルス力価であって、フォーカス形成アッセイ（ＦＦＡ）によって測定したウイルス力価である。いずれのデータも、３つの独立した実験からプールし、２連で行った。値は、平均±ＳＤを表している（図５Ａ、図５Ｂ及び図５Ｇは、一元ＡＮＯＶＡ及び多重比較のためのＴｕｋｅｙ法、図５Ｈは両側独立ｔ検定である。＊＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１）。
【図６】図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃ、図６Ｄ、図６Ｅ、図６Ｆ、図６Ｇ、図６Ｈ、図６Ｉ及び図６Ｊは、ＺＩＫＶへの感染効率が、ＤＧＣにおいて、ＧＳＣにおけるよりも低いことを示している。図６Ａは、血清暴露の１４日後の４つのＧＳＣ株（３８７、３５６５、３６９１及び４１２１）に由来する幹細胞（Ｓｏｘ２及びＯｌｉｇ２）及び分化マーカー（ＧＦＡＰ）タンパク質に対するイムノブロッティング結果である。図６Ｂは、３５６５  ＧＳＣでのＤＡＰＩ＋細胞におけるＺＩＫＶ＋細胞、及びＺＩＫＶ＋ＧＳＣにおけるＳｏｘ２＋細胞の４８ｈｐｉでの定量結果である（同様のデータである３８７及び４１２１は示されていない）。図６Ｃ〜図６Ｉは、ＧＳＣ（図６Ｃ〜図６Ｅ）及びＤＧＣ（図６Ｇ〜図６Ｉ）の感染効率を示しているフローサイトメトリーヒストグラムである。４つの実験のうちの代表的な実験の１つが示されている。コントロール（左）、ＭＯＩ０．０１のＺＩＫＶ−ダカール（中央）またはＭＯＩ５（右）のＺＩＫＶ−ダカールに暴露したＧＳＣの２４時間（図６Ｃ）、４８時間（図６Ｄ）及び７２時間（図６Ｅ）の時点のヒストグラム、コントロール（左）、ＭＯＩ０．０１のＺＩＫＶ（中央）またはＭＯＩ５のＺＩＫＶ（右）に暴露したＧＤＣの２４時間（図６Ｇ）、４８時間（図６Ｈ）及び７２時間（図６Ｉ）の時点のヒストグラム、ならびにＧＳＣ（図６Ｆ）及びＤＧＣ（図６Ｊ）におけるＺＩＫＶ−ダカール感染効率の定量結果である。実験ごとに、データは、４つの独立した実験からプールした。値は、平均±ＳＤを表している。
【図７Ａ】ＺＩＫＶの産生量が、ＧＳＣにおいて、ＤＧＣにおけるよりも多いことを示している。ＧＳＣ３８７、３５６５及び４１２１をＺＩＫＶ−ブラジル（図７Ａ）に感染させてから１週間後に、上清におけるウイルス力価をＦＦＡによって求めた。実験ごとに、データは、４つの独立した実験からプールした。値は、平均±ＳＤを表している（図７Ａでは両側独立ｔ検定、＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１）。
【図７Ｂ】ＺＩＫＶの産生量が、ＧＳＣにおいて、ＤＧＣにおけるよりも多いことを示している。ＧＳＣ３８７、３５６５及び４１２１をＺＩＫＶ−ダカール（図７Ｂ）に感染させてから１週間後に、上清におけるウイルス力価をＦＦＡによって求めた。実験ごとに、データは、４つの独立した実験からプールした。値は、平均±ＳＤを表している（図７Ｂでは両側独立ｔ検定、＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１）。
【図８】図８Ａ、図８Ｂ、図８Ｃ、図８Ｄ、図８Ｅ、図８Ｆ、図８Ｇ、図８Ｈ、図８Ｉ、図８Ｊ、図８Ｋ、図８Ｌ及び図８Ｍは、ＷＮＶが、ＧＳＣ、ＤＧＣ及び正常な神経細胞（ＮＮＣ）に感染して、その成長を減弱させることを示している。図８Ａ、図８Ｂでは、ＷＮＶ−ＮＹ（ＭＯＩ５）に感染させた３つのマッチしたＧＳＣ株（図８Ａ）及びＤＧＣ株（図８Ｂ）（３８７、３５６５及び４１２１）について相対的な細胞生存能を求めた（０日目に対して標準化した）。図８Ｃでは、ＷＮＶ−ＮＹ（ＭＯＩ０．０１）に感染後、ＧＳＣ株とＤＧＣ株の３つの対から得た上清に基づき、１週間にわたって、ウイルス力価をＦＦＡによって求めた。図８Ｄ〜図８Ｇは、示されているＭＯＩ及び時点におけるＧＳＣ（図８Ｄ）、ＤＧＣ（図８Ｅ〜図８Ｇ）のＷＮＹ−ＮＹ感染効率を示しているフローサイトメトリーヒストグラムである。３回の実験のうちの代表的な実験の１つが示されている。図８Ｈ〜図８Ｋでは、正常なヒト脳組織を１週間、ＷＮＹ−ＮＹ（ＭＯＩ０．０１）に感染させないか（図８Ｈ、図８Ｉ）、または感染させるかした（図８Ｉ、図８Ｋ）。ＷＮＶ  Ｅ（緑色）及びＤＡＰＩ（青色）とともに、ＮｅｕＮ（赤色）またはＧＦＡＰ（赤色）に対して免疫蛍光染色を行った。図８Ｌでは、ＭＯＩ０．０１で感染させた３つの独立した正常なヒト脳組織（ＮＭ２６５、ＮＭ２６６、ＮＭ２６７）の上清から、ＷＮＶの力価をＦＦＡによって、１週間にわたって求めた。図８Ｍでは、ＭＯＩ５のＷＮＶ−ＮＹに感染させた３つの正常なヒト神経細胞株（ＮＭ５５、ＮＭ１７７及びＨｕ−ＤＮＣ）について、相対的な細胞生存能を求めた（０日目に対して標準化した）。いずれのデータも、３つの独立した実験からプールし、２連で行った。値は、平均±ＳＤを表している（図８Ａ、図８Ｂ、図８Ｃ、図８Ｍでは両側独立ｔ検定、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１）。
【図９】図９Ａ、図９Ｂ、図９Ｃ、図９Ｄ、図９Ｅ、図９Ｆ、図９Ｇ、図９Ｈ、図９Ｉ、図９Ｊ及び図９Ｋは、ＺＩＫＶが正常な成人脳に及ぼす作用が、ＧＳＣ及びＤＧＣと比べて最小限であることを示している。図９Ａ、図９Ｂでは、感染組織から得た上清中のウイルスの力価測定をＦＦＡによって行った。新鮮なヒトグリオブラストーマ標本（１４３、３７８８及び３９０２）（図９Ａ）または正常な脳組織（２６７、２６６、２７０）（図９Ｂ）を直接的な注射または浸漬によって、ＺＩＫＶ−ブラジルまたはＺＩＫＶ−ダカールに暴露させた。図９Ｃ〜図９Ｆでは、単層で培養して、ＭＯＩ５のＺＩＫＶに４８時間感染させたＧＳＣ（図９ｃ）及びＤＧＣ（図９Ｄ）の免疫蛍光染色を行った（ＺＩＫＶ：緑色、ＤＡＰＩ：青色）。図９Ｅ、図９Ｆでは、ＤＧＣの免疫蛍光染色をＺＩＫＶ（緑色）及びＤＡＰＩ（青色）とともに、ＧＦＡＰ（赤色）（図９Ｅ）またはＴｕｊ１（赤色）（図９Ｆ）に対して行った。図９Ｇ、図９Ｈでは、ＺＩＫＶ（ＭＯＩ５）に４８時間感染させた正常なヒト神経細胞の免疫蛍光染色をＺＩＫＶ（緑色）及びＤＡＰＩ（青色）とともに、ＧＦＡＰ（赤色）（図９Ｇ）またはＴｕｊ１（赤色）（図９Ｈ）に対して行った。図９Ｉでは、ＭＯＩ５のＺＩＫＶ−ブラジルまたはＺＩＫＶ−ダカールに感染させた３つの正常なヒト神経細胞株（ＮＭ５５、ＮＭ１７７及びＨｕ−ＤＮＣ）について、相対的な細胞生存能を１週間にわたって求めた（０日目に対して標準化した）。図９Ｊ、図９Ｋは、ＺＩＫＶ−ブラジルまたはＺＩＫＶ−ダカールに感染させた正常なヒト神経細胞（ＨＤＮＣ、ＮＭ５５、ＮＭ１７７）（図９Ｊ）及びＤＧＣ（３８７、３５６５、４１２１）（図９Ｋ）から得た上清のウイルス力価のＦＦＡ解析結果である。いずれの実験も２連で行い、３つの独立した実験からプールした。値は、平均±ＳＤを表している（Ｉでは、多重比較補正を施した一元ＡＮＯＶＡを使用した。＊：Ｐ＜０．０５）。スケールバーは、図９Ａでは２００μｍ、図９Ｃ及び図９Ｅでは１００μｍである。
【図１０】図１０Ａ、図１０Ｂ、図１０Ｃ、図１０Ｄ、図１０Ｅ、図１０Ｆ及び図１０Ｇは、ＧＳＣ及びＤＣＣのＲＮＡシーケンシングによって、ＩＦＮシグナル伝達の差が明らかになることを示している。図１０Ａは、マッチしたＧＳＣ及びＤＧＣ（３８７、３５６５、４１２１）由来の転写産物の、教師なしの階層クラスタリングであり、ＩＳＧの発現差が際立っている。図１０Ｂは、Ｉ型ＩＦＮ及びＩＩ型ＩＦＮ−γシグナル伝達経路に対する細胞応答に関する遺伝子セットエンリッチメント解析である。図１０Ｃは、ＤＧＣにおいて、ＧＳＣと比べて有意にアップレギュレートしたＩ型及びＩＩ型ＩＦＮ−γ応答経路のＧｅｎｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙ（ＧＯ）Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍプロセスである。図１０Ｄ〜Ｇは、ＺＩＫＶ−ダカールに感染させなかったか（図１０Ｄ、図１０Ｅ）、または感染させた（図１０Ｆ、図１０Ｇ）ヒトグリオブラストーマをＺＩＫＶ（緑色）及びＤＡＰＩ（青色）とともに、Ｉｆｎａｒ−１（赤色）（図１０Ｄ、図１０Ｆ）及びＳｔａｔ１（赤色）（図１０Ｅ、図１０Ｇ）に対して免疫蛍光染色したものである。
【図１１】図１１Ａ、図１１Ｂ、図１１Ｃ及び図１１Ｄは、ＺＩＫＶ−ダカールに感染させたＧＳＣのＲＮＡシーケンシングによって、ＩＳＧの転写活性化が明らかになることを示している。図１１Ａ、図１１Ｂは、非感染ＧＳＣ及びＺＩＫＶ−ダカールに感染させたＧＳＣ（３８７、３５６５、４１２１）におけるＩ型及びＩＩ型ＩＦＮ−γ応答経路のＧＯプロセスのヒートマップである。図１１Ｃは、３５６５及び４１２１ＤＧＣ（赤色）におけるＩＳＧ（Ｉｆｎａｒ１、Ｓｔａｔ１、Ｉｒｆ１、Ｉｆｉｔ１、Ｏａｓ２及びＩｆｈ１）のｑＰＣＲの結果である（マッチしたＧＳＣ（黒色）に対して標準化した）。図１１Ｄは、ＧＳＣをＺＩＫＶ−ダカール（ＭＯＩ５）に４８時間感染させた後に、アップレギュレートしたＧＯ経路（赤色）及びダウンレギュレートしたＧＯ経路（青色）の上位１０個である。処理条件ごとに、２連でシーケンシングした。
【図１２】図１２Ａ及び図１２Ｂは、テモゾロミドの細胞毒性アッセイ結果を示している。２つのＧＳＣ株（３８７及び３５６５）を、示されている濃度のテモゾロミドで７日間処理した。７日目に、相対細胞数をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏによってアッセイし、ＰＢＳコントロールに対して標準化した。
【図１３】免疫特権ニッチとしてのＧＳＣのモデルを示している。グリオブラストーマに存在するＧＳＣの治療耐性は、免疫応答の細胞傷害作用から悪性ＧＳＣを保護する免疫抑制性の微小環境に起因している。我々は、ヒトＧＳＣにおけるＩ型及びＩＩ型ＩＦＮシグナル伝達のダウンレギュレーションが、免疫特権ニッチの形成において重要な役割を果たすことを見出した。これにより、腫瘍溶解性ＺＩＫＶへの感染がＧＳＣ生存能を減弱させることへの理由付けがなされ、そして、ヒトグリオブラストーマを治療するための代替的なアプローチが提示される。
【図１４】ｃＤＮＡクローンから作製したＺＩＫＶが、グリオーマを有するマウスの生存期間を延ばすことを示している。ＧＬ２６１グリオーマを有するマウスをＰＢＳ（ｎ＝９）、１０５ＦＦＵのマウス適合型ＺＩＫＶダカール（ｎ＝１０）（Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）、またはｃＤＮＡから作製した１０５ＦＦＵもしくは１０７ＦＦＵのＺＩＫＶダカールＮＳ４Ｂ（Ｇ１８Ｒ）で処置した（それぞれｎ＝１０）。有意性は、ログランク検定によって解析した（＊：Ｐ＜０．０５）。
【図１５】ｃＤＮＡクローンから作製した弱毒化ＺＩＫＶが、ヒトグリオブラストーマを有するマウスの生存期間を延ばすことを示している。ヒト０３０８グリオブラストーマ幹細胞（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）を有する免疫不全マウス（ＮＯＤ−ｓｃｉｄＩＬ２Ｒγｎｕｌｌ）をＰＢＳ（ｎ＝６）、１０５ＦＦＵのＺＩＫＶダカールＮＳ４Ｂ（Ｇ１８Ｒ）−ＮＳ５（Ｅ２１８Ａ）−Δ３’ＵＴＲ（ｎ＝６）、または１０５ＦＦＵのＺＩＫＶダカールＮＳ４Ｂ（Ｇ１８Ｒ）−ＮＳ５（Ｅ２１８Ａ）−Δ３’ＵＴＲ（ｎ＝５）で処置した。
【図１６】ＺＩＫＶによる処置によって、免疫細胞が腫瘍に浸潤することを示している。ＧＬ２６１グリオーマを有するマウスをＰＢＳ（ｎ＝６）または１０５ＦＦＵのマウス適合型ＺＩＫＶダカール（ｎ＝７）で処置した。処置の１４日後に、脳を摘出し、フローサイトメトリーにかけた。有意性は、独立両側スチューデントｔ検定によって解析した（＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１）。
【図１７】ＺＩＫＶが、多発性骨髄腫細胞において腫瘍溶解活性を有することを示している。０日目に、ＭＭ１Ｓヒト多発性骨髄腫細胞をＰＢＳコントロールで処理するか、またはＺＩＫＶ−ダカール（ＭＯＩ＝５）で処理するかした。Ｃｅｌｌｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、相対細胞数を発光によって評価した。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の化合物、組成物、物品、装置及び／または方法を開示及び説明する前に、これらが、別段の定めのない限り、特定の合成方法もしくは特定の組み換えバイオテクノロジー方法に限定されたり、または別段の定めのない限り、特定の試薬に限定されたりしないので、当然ながら、変更し得ることを理解されたい。また、本明細書で使用されている専門用語は、特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、限定するようには意図されていないことも理解されたい。
【００１４】
本開示は、腫瘍を腫瘍溶解性ウイルスによって治療するための組成物及び方法を含む。
【００１５】
Ｉ．組成物
開示されているのは、開示する組成物を調製するのに使用する成分、及び本発明で開示する方法で使用する組成物そのものである。これらの材料及びその他の材料が、本明細書で開示されており、これらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、群などが開示されているときには、これらの化合物の様々な個別的及び集合的なそれぞれの組み合わせ及び順列の具体的言及は明示的に開示されているとは限らない場合でも、それぞれが、本発明において具体的に企図及び説明されていることが理解される。例えば、特定の腫瘍溶解性ウイルスが開示及び議論されており、その腫瘍溶解性ウイルスを含む多くの分子に対して加えることのできる多くの改変について論じられている場合には、特に反対の記載がない限り、腫瘍溶解性ウイルス及び考え得る改変形態のそれぞれ及びすべての組み合わせ及び順列が具体的に企図されている。したがって、分子Ａ、Ｂ及びＣという種類、分子Ｄ、Ｅ及びＦという種類、ならびに分子Ａ−Ｄという組み合わせの例が開示されている場合には、それぞれが個別に示されていなくても、それぞれが、個別かつ集合的に企図されており、Ａ−Ｅ、Ａ−Ｆ、Ｂ−Ｄ、Ｂ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、Ｃ−Ｄ、Ｃ−Ｅ及びＣ−Ｆの組み合わせが開示されているものとみなす。同様に、これらのあらゆるサブセットまたは組み合わせも開示されている。したがって、例えば、Ａ−Ｅ、Ｂ−Ｆ及びＣ−Ｅのサブ群も開示されているとみなすことになる。この概念は、本願のすべての態様に適用され、その態様としては、開示する組成物の作製方法及び使用方法の工程が挙げられるが、これらに限らない。すなわち、行うことができる様々な追加の工程がある場合には、これらの追加の工程はそれぞれ、開示されている方法のいずれの具体的な実施形態または実施形態の組み合わせでも行うことができると理解される。
【００１６】
（ａ）腫瘍溶解性ウイルス
がん細胞に優先的に感染して、がん細胞を殺傷する腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）は、がん治療法として有望性が高い。ＯＶは、がん細胞内で選択的に広がり、強力な細胞変性作用を発揮する。ウイルス感染したこれらの死にかけたがん細胞はさらに、ＮＫ細胞または細胞傷害性Ｔ細胞のような免疫細胞を動員して、ウイルスによる殺傷作用から免れた感染がん細胞を「一掃」する。
【００１７】
組み換え核酸改変法の使用を通じて、がん細胞を標的とする能力を維持しながら、腫瘍溶解性ウイルスを遺伝子操作または別段の形式で改変して、弱毒化できることが理解されるとともに、本発明で企図されている。本明細書で使用する場合、「弱毒化」とは、対象に投与すると、野生型ウイルスと比べて、ウイルス関連疾患の臨床徴候が軽減するか、またはその臨床徴候が見られないようになるウイルスを意味し得る。したがって、一態様では、本発明で開示するのは、遺伝子操作した腫瘍溶解性ウイルスであって、腫瘍細胞に対する有効性が向上しており、及び／または正常細胞に対する毒性が最小限である腫瘍溶解性ウイルスである。一態様では、本発明で開示する腫瘍溶解性ウイルスは、ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓファミリーに由来するウイルス骨格から構築できる。フラビウイルスは、ジカウイルス（ＺＩＫＶ）、デングウイルス、ウエストナイルウイルス（ＷＮＶ）及び黄熱ウイルスを含むポジティブ鎖ＲＮＡウイルスである。ＷＮＶのような他のフラビウイルスも腫瘍溶解特性を有し得るが、ＷＮＶは、ＧＳＣ細胞に加えて、他の正常神経細胞に感染して、それらの細胞を殺傷する。一態様では、本発明で開示する腫瘍溶解性ウイルスは、ジカウイルス骨格から構築できる。一態様では、そのウイルスは、改変または遺伝子操作したジカウイルスである。
【００１８】
いくつかの実施形態では、本開示は、腫瘍の治療で効率的かつ安全に使用し得る改変または遺伝子操作したＯＶを提供する。本開示の遺伝子操作または改変したＺＩＫＶは、腫瘍細胞の感染及び／または溶解を促進し得るとともに、周辺の正常細胞に対する毒性が低下し得る。一態様では、ＯＶを改変または遺伝子操作することによって、ＯＶを変異させる。特には、「変異」または「変異体」という用語は、少なくとも１つのアミノ酸の置換、付加または欠失、例えばアルギニン置換を有することによって、その対応する野生型ポリペプチドと異なるいずれのポリペプチドまたはその表記が含まれるように意図されている。フラビウイルスの１つのＯＲＦは、３つの構造タンパク質（Ｃ−ｐｒＭ／Ｍ−Ｅ）及び７つの非構造タンパク質（ＮＳ１−ＮＳ２Ａ−ＮＳ２Ｂ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５）をコードする。いくつかの実施形態では、本開示の改変または遺伝子操作したＺＩＫＶは、非構造タンパク質の１つ以上に変異を含んでよい。一態様では、本開示の改変または遺伝子操作したＺＩＫＶは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＸ２８００２６．１（参照により、本明細書に援用される）との同一性が少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％であるアミノ酸配列を含んでよい。一態様では、本開示の改変または遺伝子操作したＺＩＫＶは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＸ２８００２６．１との同一性が少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％であるヌクレオチド配列を含んでよい。配列アラインメント及び％配列同一性のスコアは、Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．，９６８５  Ｓｃｒａｎｔｏｎ  Ｒｏａｄ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ  ９２１２１−３７５２  ＵＳＡから入手可能なＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ（バージョン１０．３）、またはオープンソースソフトウェアのＥｍｂｏｓｓ  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（例えばバージョン２．１０．０）のようなコンピュータープログラムを用いて、例えばプログラム「ニードル」（上記のギャップ開始ペナルティ及びギャップ伸長ペナルティによる）を用いて求めてよい。あるいは、類似性または同一性は、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなどのようなデータベースを検索することによって求めてもよい。
【００１９】
いくつかの実施形態では、本開示は、弱毒化されている遺伝子操作または改変したＺＩＫＶを提供する。いくつかの実施形態では、その遺伝子操作または改変したＺＩＫＶは、対応する野生型ＺＩＫＶと比較して、正常細胞における複製能が制限されている。この複製制限により、ＺＩＫＶ組成物の安全性を向上し得る。一態様では、ＺＩＫＶを遺伝子操作または改変することで、そのウイルスが、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）による翻訳阻害に感作される。別の態様では、遺伝子操作または改変したＺＩＫＶは、ＺＩＫＶ２’−Ｏメチルトランスフェラーゼ活性に影響を及ぼす変異を有する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＮＳ５遺伝子を含む改変または遺伝子操作したＺＩＫＶであって、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＹ７８５４８０．１（参照により、本明細書に援用される）との同一性が少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である改変または遺伝子操作したＺＩＫＶを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＮＳ５タンパク質に少なくとも１つの変異を含む改変または遺伝子操作したＺＩＫＶを提供する。別の態様では、本開示は、ＮＳ５タンパク質に対する１つ以上の変異を含む改変または遺伝子操作したＺＩＫＶであって、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＹ７８５４８０．１との配列アラインメントによって求めた場合に、２１８位のアミノ酸に対応する位置に少なくとも１つの変異が見られる改変または遺伝子操作したＺＩＫＶを提供する。一態様では、遺伝子操作または改変したＺＩＫＶは、２１８位のアミノ酸に対応する位置に点変異を含み、２１８位のグルタミン酸が、アラニンに変異している。
【００２０】
いくつかの実施形態では、本開示は、野生型ＺＩＫＶと比較して、糖鎖結合が低減されている改変または遺伝子操作したＺＩＫＶを提供する。野生型ＺＩＫＶのいずれの糖鎖結合部位も、変異させるのに適している。いくつかの実施形態では、その改変または遺伝子操作したＺＩＫＶでは、野生型ＺＩＫＶと比較して、内皮バリアを通じたウイルス伝播が制限される。非限定的な例では、本開示の改変または遺伝子操作したＺＩＫＶは、エンベロープ（Ｅ）タンパク質に対する少なくとも１つの変異を含んでよい。一態様では、改変または遺伝子操作したＺＩＫＶは、Ｅタンパク質に対する１つ以上の変異を含んでよく、その少なくとも１つの変異は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＹ７８５４８０．１との配列アラインメントによって求めた場合に、Ｅタンパク質のＶＮＤ配列に見られる。ＶＮＤモチーフが欠失されているか、またはＮ−結合型糖鎖結合部位が、単一のアミノ酸置換によって変異している遺伝子操作または改変したＺＩＫＶは、高度に弱毒化されており、非致死性である。いくつかの実施形態では、改変または遺伝子操作したＺＩＫＶは、Ｅタンパク質に対する１つ以上の変異を含み、その少なくとも１つの変異は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＹ７８５４８０．１との配列アラインメントによって求めた場合に、Ｅタンパク質の１５４位のアミノ酸及び／または１５６位のアミノ酸に対応する位置に見られる。一態様では、遺伝子操作または改変したＺＩＫＶは、１５４位のアミノ酸または１５６位のアミノ酸に対応する位置に点変異を含み、１５４位のアスパラギンがグルタミンに変異しており、１５６位のトレオニンがバリンに変異している。いくつかの実施形態では、糖鎖結合が低減されたかまたは見られない改変または遺伝子操作したＺＩＫＶは、ＮＳ１タンパク質に少なくとも１つの変異を含む。
【００２１】
別の態様では、改変または遺伝子操作したＺＩＫＶは、ＺＩＫＶゲノムの３’非翻訳領域に少なくとも１つの変異を含む。いくつかの実施形態では、改変または遺伝子操作したＺＩＫＶでは、野生型ＺＩＫＶと比較して、短鎖フラビウイルスＲＮＡの産生が阻止される。非限定的な例では、本開示の改変または遺伝子操作したＺＩＫＶは、３’ＵＴＲにおいて、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個またはそれを上回る数のヌクレオチドの欠失を含んでよい。
【００２２】
いくつかの実施形態では、改変または遺伝子操作したＺＩＫＶは、ＮＳ４Ｂタンパク質に少なくとも１つの変異を含んでよい。一態様では、その改変または遺伝子操作は、インターフェロン拮抗作用またはオートファジー経路に影響を及ぼす変異を含む。いくつかの実施形態では、本開示は、ＮＳ４Ｂタンパク質に対する１つ以上の変異を含む改変または遺伝子操作したＺＩＫＶであって、その少なくとも１つの変異が、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＹ７８５４８０．１との配列アラインメントによって求めた場合に、１８位のアミノ酸に対応する位置に見られる改変または遺伝子操作したＺＩＫＶを提供する。一態様では、遺伝子操作または改変したＺＩＫＶは、１８位のアミノ酸に対応する位置に点変異を含み、１８位のグリシンがアルギニンに変異している。いくつかの実施形態では、改変または遺伝子操作したＺＩＫＶは、ＮＳ３タンパク質に少なくとも１つの変異を含んでよい。いくつかの実施形態では、本開示は、ＮＳ３タンパク質に対する１つ以上の変異を含む改変または遺伝子操作したＺＩＫＶであって、その少なくとも１つの変異が、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＹ７８５４８０．１との配列アラインメントによって求めた場合に、３９９位のアミノ酸に対応する位置に見られる改変または遺伝子操作したＺＩＫＶを提供する。一態様では、遺伝子操作または改変したＺＩＫＶは、３９９位のアミノ酸に対応する位置に点変異を含み、３９９位のリシンがアルギニンに変異している。
【００２３】
一態様では、がん細胞のような標的細胞へのウイルスの膜融合を促すと、その腫瘍溶解性ウイルスから標的細胞への遺伝物質送達の速度及び効率を向上できることが認識されている。標的細胞への腫瘍溶解性ウイルスの融合を促進できる方法の１つは、融合誘導性のペプチド、ポリペプチド及びタンパク質の使用を通じた方法である。融合誘導性のペプチド、ポリペプチド及びタンパク質としては、例えば、インフルエンザヘマグルチニンペプチド（ＨＡ）、デング融合誘導ペプチド、ＨＩＶエンベロープ（Ｅｎｖ）、パラミクソウイルス（例えば、パラインフルエンザウイルス及びＳＶ５）融合タンパク質（Ｆ）、ならびにパラミクソウイルスヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）のような、ウイルスの融合誘導性のペプチド、ポリペプチド及びタンパク質を挙げることができるが、これらに限らない。したがって、一態様では、本発明で開示するのは、１つ以上の外来性膜結合型標的化リガンドと、非切断型シグナルアンカーとを含む腫瘍溶解性ウイルスであり、その遺伝子操作した腫瘍溶解性ウイルスは、融合誘導性の腫瘍溶解性ウイルスである。一態様では、融合ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、腫瘍溶解性ウイルスに対して外来性であることができ、または、そのウイルスは、外来性の融合ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を発現するように遺伝子操作されていることができる。換言すると、その腫瘍溶解性ウイルスは、天然の状態で融合誘導性であることも、または融合誘導性となるように遺伝子操作／改変されていることもできる。例えば、骨格の腫瘍溶解性ウイルスは、ＺＩＫＶであることができ、そのＺＩＫＶを改変／遺伝子操作して、融合誘導性のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を含むように、すなわち、融合誘導性となるようにできる。したがって、一態様では、本発明で開示するのは、改変または遺伝子操作した腫瘍溶解性ウイルスであって、非切断型シグナルアンカーを含む外来性の膜結合型標的化リガンドを発現する腫瘍溶解性ウイルスであり、その改変または遺伝子操作した腫瘍溶解性ウイルスは、例えば改変または遺伝子操作したＺＩＫＶのようなパラインフルエンザウイルスであり、その腫瘍溶解性ウイルスは、パラミクソウイルスＦ及び／またはＨＮを発現する。一態様では、天然において融合誘導性の腫瘍溶解性ウイルスを遺伝子操作して、さらなる融合ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を含むようにすることもできる。このように遺伝子操作した融合誘導性の腫瘍溶解性ウイルスは、超融合誘導性である。したがって、一態様では、本発明で開示するのは、腫瘍細胞を融合させる超融合誘導性特性を可能にするペプチドをコードする遺伝子を含む融合誘導性の腫瘍溶解性ウイルスである。
【００２４】
一態様では、本開示は、グリオブラストーマ幹細胞（ＧＳＣ）を特異的に標的として、ＧＳＣを殺傷する腫瘍溶解性ウイルスを含む組成物を含む。一態様では、腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍細胞に感染することによって、腫瘍細胞を殺傷できる。本開示の組成物の標的となる腫瘍細胞は、ＧＢＭの前駆細胞であるＧＳＣであってよい。腫瘍溶解性ウイルスの殺傷効率は、細胞に感染し、複製を行って、腫瘍細胞を特異的に殺傷する能力に依存し得る。いくつかの実施形態では、改変または遺伝子操作したＺＩＫＶは、ＧＳＣを優先的に殺傷し、他の正常神経細胞の殺傷は最小限であり、ＧＢＭの効率的で安全な治療に適する可能性がある（図８）。
【００２５】
一態様では、本開示の組成物で用いる腫瘍溶解性ウイルスは、ＺＩＫＶであってよい。本開示の組成物中のＺＩＫＶは、薬理学的に許容可能な製剤に分散していてもよい。その組成物は、生理食塩水、またはその組成物の治療能力に影響を及ぼさない緩衝剤であってよい好適な担体を含んでよい。その担体は、腫瘍内注射またはその他の所望の注射経路に適する製薬学的に許容可能な担体であってよい。当該技術分野において知られている好適な製薬学的に許容可能な担体を本開示の組成物で用いてよい。
【００２６】
（ｂ）本開示の組成物の成分
本開示は、医薬組成物も提供する。その医薬組成物は、本明細書で開示されているような改変または遺伝子操作したＯＶ、及び少なくとも１つの製薬学的に許容可能な賦形剤を含む。
【００２７】
その製薬学的に許容可能な賦形剤は、希釈剤、結合剤、充填剤、緩衝剤、ｐＨ調整剤、崩壊剤、分散剤、保存剤、滑沢剤、矯味剤、香味剤または着色剤であってよい。医薬組成物を形成するために用いる賦形剤の量及び種類は、薬学の既知の原則に従って選択してよい。
【００２８】
（ｉ）希釈剤
一実施形態では、賦形剤は、希釈剤であってよい。希釈剤は、圧縮性（すなわち、塑性変形可能）であっても、または摩耗に弱くてもよい。好適な圧縮性希釈剤の非限定的な例としては、微結晶性セルロース（ＭＣＣ）、セルロース誘導体、セルロース粉末、セルロースエステル（すなわち、酢酸と酪酸の混合エステル）、エチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、リン酸化コーンスターチ、アルファ化コーンスターチ、コメデンプン、バレイショデンプン、タピオカデンプン、デンプン−ラクトース、デンプン−炭酸カルシウム、デンプングリコール酸ナトリウム、グルコース、フルクトース、ラクトース、ラクトース一水和物、スクロース、キシロース、ラクチトール、マンニトール、マルチトール、ソルビトール、キシリトール、マルトデキストリン及びトレハロースが挙げられる。摩耗に弱い好適な希釈剤の非限定的な例としては、二塩基性リン酸カルシウム（無水または二水和物）、リン酸カルシウム三塩基性、炭酸カルシウム及び炭酸マグネシウムが挙げられる。
【００２９】
（ｉｉ）結合剤
別の実施形態では、賦形剤は、結合剤であってよい。好適な結合剤としては、デンプン、アルファ化デンプン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、セルロース、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、ポリアクリルアミド、ポリビニルオキソアゾリジン、ポリビニルアルコール、Ｃ１２−Ｃ１８脂肪酸アルコール、ポリエチレングリコール、ポリオール、サッカリド、オリゴ糖、ポリペプチド、オリゴペプチド及びこれらを組み合わせたものが挙げられるが、これらに限らない。
【００３０】
（ｉｉｉ）充填剤
別の実施形態では、賦形剤は、充填剤であってよい。好適な充填剤としては、炭水化物、無機化合物及びポリビニルピロリドンが挙げられるが、これらに限らない。非限定的な例として、充填剤は、硫酸カルシウム（二塩基性及び三塩基性の両方）、デンプン、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、微結晶性セルロース、二塩基性リン酸カルシウム、炭酸マグネシウム、酸化マグネシウム、ケイ酸カルシウム、タルク、変性デンプン、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールであってよい。
【００３１】
（ｉｖ）緩衝剤
さらに別の実施形態では、賦形剤は、緩衝剤であってよい。好適な緩衝剤の代表的な例としては、リン酸塩、炭酸塩、クエン酸塩、トリス緩衝液及び緩衝生理食塩水（例えば、トリス緩衝生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水）が挙げられるが、これらに限らない。
【００３２】
（ｖ）ｐＨ調整剤
各種実施形態では、賦形剤は、ｐＨ調整剤であってよい。非限定的な例として、ｐＨ調整剤は、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸またはリン酸であってよい。
【００３３】
（ｖｉ）崩壊剤
さらなる実施形態では、賦形剤は、崩壊剤であってよい。崩壊剤は、非発泡性であっても、発泡性であってもよい。非発泡性崩壊剤の好適な例としては、コーンスターチ、バレイショデンプン、アルファ化デンプン及びこれらの変性デンプンのようなデンプン、甘味剤、ベントナイトのような粘土、微結晶性セルロース、アルギン酸塩、デンプングリコール酸ナトリウム、寒天、グアー、ローカストビーン、カラヤ、ペクチン及びトラガカントのようなガムが挙げられるが、これらに限らない。好適な発泡性崩壊剤の非限定的な例としては、クエン酸と組み合わせた重炭酸ナトリウム、及び酒石酸と組み合わせた重炭酸ナトリウムが挙げられる。
【００３４】
（ｖｉｉ）分散剤
さらに別の実施形態では、賦形剤は、分散剤または分散促進剤であってよい。好適な分散剤としては、デンプン、アルギン酸、ポリビニルピロリドン、グアーガム、カオリン、ベントナイト、精製木材セルロース、デンプングリコール酸ナトリウム、非等晶質ケイ酸塩及び微結晶性セルロースを挙げてよいが、これらに限らない。
【００３５】
（ｖｉｉｉ）賦形剤
別の代替的な実施形態では、賦形剤は、保存剤であってよい。好適な保存剤の非限定的な例としては、ＢＨＡ、ＢＨＴ、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥまたはパルミチン酸レチニル、クエン酸、クエン酸ナトリウムのような抗酸化剤、ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡのようなキレーター、及びパラベン、クロロブタノールまたはフェノールのような抗微生物剤が挙げられる。
【００３６】
（ｉｘ）滑沢剤
さらなる実施形態では、賦形剤は、滑沢剤であってよい。好適な滑沢剤の非限定的な例としては、タルクまたはシリカのような鉱物、及び植物ステアリン、ステアリン酸マグネシウムまたはステアリン酸のような脂肪が挙げられる。
【００３７】
（ｘ）矯味剤
さらに別の実施形態では、賦形剤は、矯味剤であってよい。矯味物質としては、セルロースエーテル、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルコール及びポリエチレングリコールのコポリマー、モノグリセリドまたはトリグリセリド、アクリルポリマー、アクリルポリマーとセルロースエーテルの混合物、酢酸フタル酸セルロース、ならびにこれらを組み合わせたものが挙げられる。
【００３８】
（ｘｉ）香味剤
代替的な実施形態では、賦形剤は、香味剤であってよい。香味剤は、合成風味油、香味付与芳香剤及び／または天然油、植物、葉、花、果実のエキス、ならびにこれらを組み合わせたものから選択してよい。
【００３９】
（ｘｉｉ）着色剤
さらなる実施形態では、賦形剤は、着色剤であってよい。好適な着色添加剤としては、食品・医薬品・化粧品着色料（ＦＤ＆Ｃ）、医薬品・化粧品着色料（Ｄ＆Ｃ）または外用医薬品・化粧品着色料（Ｅｘｔ．Ｄ＆Ｃ）が挙げられるが、これらに限らない。
【００４０】
本開示の組成物中の賦形剤または賦形剤を組み合わせたものの重量分率は、本開示の組成物の総重量の約９９％以下、約９７％以下、約９５％以下、約９０％以下、約８５％以下、約８０％以下、約７５％以下、約７０％以下、約６５％以下、約６０％以下、約５５％以下、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約２％または約１％以下であってよい。
【００４１】
各種実施形態では、ＯＶを含む医薬組成物は、ウイルス粒子（ＶＰ）を約１０ｅ３〜１０ｅ１１個（ログスケール）含む。各種実施形態では、ＯＶを含む医薬組成物は、ウイルス粒子（ＶＰ）を約１０ｅ４〜１０ｅ１１個（ログスケール）含む。各種実施形態では、ＯＶの量は、約１０ｅ３個、１０ｅ４個、１０ｅ５個、１０ｅ６個、１０ｅ７個、１０ｅ８個、１０ｅ９個、１０ｅ１０個または１０ｅ１１個である。ウイルス粒子の実際の量は、腫瘍体積または推定腫瘍体積によって決まり得る。例えば、約１ｃｍ３の腫瘍体積は、約１０ｅ３〜１０ｅ９個のウイルス粒子で治療でき、約１００ｃｍ３の腫瘍体積は、約１０ｅ６〜１０ｅ１１個のウイルス粒子で治療できる。
【００４２】
各種実施形態では、ＯＶを含む組成物は、感染多重度（ＭＯＩ）が１、２、３、４、５、１０、２５、５０もしくは１００、または約１、２、３、４、５、１０、２５、５０もしくは１００の量のウイルス粒子を含む。
【００４３】
（ｃ）投与
本開示の組成物は、様々な剤形に調合して、治療有効量の活性成分を送達する多種多様な手段によって投与できる。このような組成物は、所望に応じて従来の製薬学的に許容可能な非毒性の担体、アジュバント及びビヒクルを含む投与単位製剤で、経口（例えば吸入）投与、非経口投与または局所投与できる。局所投与には、経皮パッチまたはイオントフォレシス装置のような経皮投与の利用を伴うこともある。非経口という用語は、本明細書で使用する場合、皮下、静脈内、筋肉内、関節内または胸骨内への注射または注入技法を含む。薬物製剤については、例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．Ｒ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１８ｔｈ  ｅｄ，１９９５）及びＬｉｂｅｒｍａｎ，Ｈ．Ａ．ａｎｄ  Ｌａｃｈｍａｎ，Ｌ．，Ｅｄｓ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９８０）で論じられている。具体的な実施形態では、組成物は、食品補助剤であってよく、または組成物は、化粧品であってよい。
【００４４】
経口投与用の固体剤形としては、カプセル剤、錠剤、カプレット、丸剤、散剤、ペレット及び顆粒剤が挙げられる。このような固体剤形では、活性成分は通常、１つ以上の製薬学的に許容可能な賦形剤と混ぜ合わせるが、その賦形剤の例は、上に詳述されている。経口調製剤は、水性懸濁剤、エリキシル剤またはシロップ剤として投与してもよい。これらの薬剤では、活性成分は、各種の甘味剤、香味剤、着色剤、所望の場合には乳化剤及び／または懸濁化剤、ならびに、水、エタノール、グリセリン及びこれらを組み合わせたもののような希釈剤と混ぜ合わせてよい。吸入投与では、化合物は、好適な噴射剤、例えば、二酸化炭素のような気体を含む加圧容器もしくはディスペンサー、またはネブライザーから、エアゾールスプレーの形態で送達する。
【００４５】
非経口投与（皮下投与、皮内投与、静脈内投与、筋肉内投与、関節内投与及び腹腔内投与を含む）用では、調製物は、水性溶液または油性溶液であってよい。水性溶液は、水、生理食塩水、製薬学的に許容可能なポリオール（グリセロール、プロピレングリコールなど）もしくはその他の合成溶媒のような滅菌希釈剤、ベンジルアルコール、メチルパラベン、クロロブタノール、フェノール、チメロサールなどのような抗菌剤及び／または抗真菌剤、アスコルビン酸もしくは亜硫酸水素ナトリウムのような抗酸化剤、エチレンジアミンテトラ酢酸のようなキレート剤、酢酸塩、クエン酸塩もしくはリン酸塩のような緩衝剤、及び／または塩化ナトリウム、デキストロースもしくは多価アルコール（マンニトールもしくはソルビトールなど）のような浸透圧調整剤を含んでよい。水性溶液のｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムのような酸または塩基によって調整してよい。油性溶液または懸濁液は、ゴマ油、ラッカセイ油、オリーブ油または鉱油をさらに含んでよい。本開示の組成物は、単位用量または複数回用量の容器、例えば、密閉アンプル及びバイアルで供給してよく、使用直前に滅菌液体担体、例えば注射用水を加えるだけでよい凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｉｅｄ）（凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ））状態で保存してよい。用時注射溶液及び懸濁液は、滅菌散剤、顆粒剤及び錠剤から調製してよい。
【００４６】
局所（例えば、経皮または経粘膜）投与用では、透過させるバリアに適する浸透剤が、調製物に概ね含まれている。局所投与用に適合した医薬組成物は、軟膏剤、クリーム、懸濁剤、ローション剤、散剤、液剤、パスタ剤、ゲル剤、噴霧剤、エアゾール剤またはオイルとして調合してもよい。いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物は、局所軟膏剤またはクリームとして塗布する。軟膏剤で調合するときには、活性成分は、パラフィン系または水混和性のいずれかの軟膏剤基剤とともに用いてよい。あるいは、活性成分は、水中油型のクリーム基剤または油中水型の基剤とともに、クリームで調合してもよい。眼への局所投与用に適合した医薬組成物としては、活性成分が好適な担体、特に水性溶媒に溶解または懸濁している点眼剤が挙げられる。口内への局所投与用に適合した医薬組成物としては、ロゼンジ剤、香錠及び含嗽剤が挙げられる。経粘膜投与は、点鼻スプレー、エアゾールスプレー、錠剤または坐剤の使用を通じて行ってよく、経皮投与は、当該技術分野において概ね知られているように、軟膏剤（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏剤（ｓａｌｖｅ）、ゲル剤、パッチまたはクリームを介するものであってよい。
【００４７】
特定の実施形態では、ＯＶを含む組成物は、標的細胞への化合物の送達を補助するか、その組成物の安定性を向上させるか、またはその組成物の潜在的な毒性を最小限にするために、好適なビヒクルに封入されている。当業者には明らかであるように、様々なビヒクルが、本発明の組成物を送達するのに適している。好適な構造化流体送達システムの非限定的な例としては、ナノ粒子、リポソーム、マイクロエマルジョン、ミセル、デンドリマー及びその他のリン脂質含有システムを挙げてよい。組成物を送達ビヒクルに組み込む方法は、当該技術分野において知られている。
【００４８】
代替的な一実施形態では、リポソーム送達ビヒクルを用いてよい。リポソームは、実施形態に応じては、その構造及び化学的特性に鑑みると、ＯＶの送達に適している。一般的に言えば、リポソームは、リン脂質二重膜を有する球形の小胞である。リポソームの脂質二重層は、他の二重層（例えば細胞膜）と融合して、その結果、リポソームの内容物を細胞に送達し得る。このように、ＯＶは、標的細胞の膜と融合するリポソームに封入することによって、細胞に選択的に送達し得る。
【００４９】
リポソームは、炭化水素鎖長が様々である多種多様なリン脂質で構成されていてもよい。リン脂質は概ね、グリセロールリン酸を介して、様々な極性基の１つに連結した２つの脂肪酸を含む。好適なリン脂質としては、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ジホスファチジルグリセロール（ＤＰＧ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）及びホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）が挙げられる。リン脂質を含む脂肪酸鎖は、約６〜約２６個の炭素原子の長さの範囲であってよく、脂質鎖は、飽和または不飽和であってよい。好適な脂肪酸鎖としては（括弧内に一般的な名称を示す）、ｎ−ドデカン酸塩（ラウリン酸塩）、ｎ−テトラデカン酸塩（ミリスチン酸塩）、ｎ−ヘキサデカン酸塩（パルミチン酸塩）、ｎ−オクタデカン酸塩（ステアリン酸塩）、ｎ−エイコサン酸塩（アラキン酸塩）、ｎ−ドコサン酸塩（ベヘン酸塩）、ｎ−テトラコサン酸塩（リグノセリン酸塩）、シス−９−ヘキサデセン酸塩（パルミトレイン酸塩）、シス−９−オクタデカン酸塩（オレイン酸塩）、シス，シス−９，１２−オクタデカン二酸塩（リノレン酸塩）、オールシス−９，１２，１５−オクタデカトリエン酸塩（リノレン酸塩）及びオールシス−５，８，１１，１４−エイコサテトラエン酸塩（アラキドン酸塩）が挙げられる。リン脂質の２本の脂肪酸鎖は、同じであっても、異なっていてもよい。許容可能なリン脂質としては、ジオレオイルＰＳ、ジオレオイルＰＣ、ジステアロイルＰＳ、ジステアロイルＰＣ、ジミリストイルＰＳ、ジミリストイルＰＣ、ジパルミトイルＰＧ、ステアロイル、オレオイルＰＳ、パルミトイル、リノレニルＰＳなどが挙げられる。
【００５０】
リン脂質は、いずれかの天然の供給源に由来してよく、したがって、リン脂質の混合物を含んでよい。例えば、卵黄は、ＰＣ、ＰＧ及びＰＥが豊富で、大豆は、ＰＣ、ＰＥ、ＰＩ及びＰＡを含み、動物の脳または脊髄は、ＰＳが豊富である。リン脂質は、合成供給源にも由来してよい。個々のリン脂質の比率が様々であるリン脂質混合物を用いてよい。異なるリン脂質の混合物によって、有益な活性または活性特性の安定性を有するリポソーム組成物を得ることができる。上述のリン脂質は、Ｎ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム塩化物、１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニン過塩素酸塩、３，３’−ジヘプチルオキサカルボシアニンヨウ化物、１，１’−ジドデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニン過塩素酸塩、１，１’−ジオレイル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニンメタンスルホン酸塩、Ｎ−４−（ジリノレイルアミノスチリル）−Ｎ−メチルピリジニウムヨウ化物または１，１，−ジリノレイル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニン過塩素酸塩のようなカチオン性脂質と、最適な比率で混合してよい。
【００５１】
リポソームは任意に、スフィンゴ脂質（そのスフィンゴシンは、ホスホグリセリドのグリセロール及び脂肪酸のうちの１つの構造的な対応物である）またはコレステロール（動物の細胞膜の主要成分である）を含んでよい。リポソームは任意に、ポリマーのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に共有結合した脂質であるペグ化脂質を含んでよい。ＰＥＧは、約５００〜約１０，０００ダルトンの範囲の大きさであってよい。
【００５２】
リポソームは、好適な溶媒をさらに含んでよい。その溶媒は、有機溶媒または無機溶媒であってよい。好適な溶媒としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、メチルピロリドン、Ｎ−メチルピロリドン、アセトニトリル、アルコール、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフランまたはこれらを組み合わせたものが挙げられるが、これらに限らない。
【００５３】
ＯＶを運ぶリポソームは、例えば、米国特許第４，２４１，０４６号、同第４，３９４，４４８号、同第４，５２９，５６１号、同第４，７５５，３８８号、同第４，８２８，８３７号、同第４，９２５，６６１号、同第４，９５４，３４５号、同第４，９５７，７３５号、同第５，０４３，１６４号、同第５，０６４，６５５号、同第５，０７７，２１１号及び同第５，２６４，６１８号（これらの本開示内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される）に詳述されているような、薬物送達用のリポソームを調製するいずれかの既知の方法によって調製し得る。例えば、リポソームは、水溶液中での脂質の超音波処理、溶媒注射、脂質の水和、逆蒸発、または凍結及び融解の繰り返しによる凍結乾燥によって調製し得る。好ましい実施形態では、リポソームは、超音波処理によって形成する。リポソームは、タマネギのように多くの層を有する多重膜であっても、または単層膜であってもよい。リポソームは、大型であっても小型であってもよい。高せん断超音波処理を継続するほど、小型の単層膜リポソームが形成される傾向がある。
【００５４】
当業者であれば明らかであるように、リポソームの形成を左右するいずれのパラメーターも、変更し得る。これらのパラメーターとしては、温度、ｐＨ、ＯＶの濃度、脂質の濃度及び組成、多価カチオンの濃度、混合速度、溶媒の存在及び濃度が挙げられるが、これらに限らない。
【００５５】
別の実施形態では、本発明の組成物は、マイクロエマルジョンとして細胞に送達し得る。マイクロエマルジョンは、水性溶液、界面活性剤及び「油」を含む概ね透明で熱力学的に安定な溶液である。この場合の「油」は、超臨界流体相である。界面活性剤は、油と水の界面に存在する。様々な界面活性剤のいずれも、本明細書に記載されているかまたは当該技術分野において別段に知られているものを含め、マイクロエマルジョン製剤での使用に適している。本発明での使用に適する水性マイクロドメインは概ね、約５ｎｍ〜約１００ｎｍの特徴的な構造寸法となる。この大きさの凝集体は、可視光をあまり散乱させないので、これらの溶液は、光学的に透明である。当業者には明らかとなるように、マイクロエマルジョンは、球状、棒状または円盤状の凝集体を含む多種多様な微視的構造を有することができるとともに、多種多様な微視的構造を有することになる。一実施形態では、その構造は、概ね球形または円柱形の物体である最も簡潔なマイクロエマルジョン構造であるミセルであってよい。ミセルは、水中の油滴のようなものであり、逆ミセルは、油中の水滴のようなものである。代替的な実施形態では、マイクロエマルジョン構造はラメラである。ラメラは、界面活性剤の層によって分離された、水及び油の連続する層を含む。マイクロエマルジョンの「油」は最適なことに、リン脂質を含む。リポソームに関して上で詳述したリン脂質のいずれも、マイクロエマルジョンに関する実施形態に適している。ＯＶは、当該技術分野において概ね知られているいずれかの方法によって、マイクロエマルジョンに封入してよい。
【００５６】
さらに別の実施形態では、ＯＶは、樹状高分子、すなわちデンドリマーで送達してよい。一般的に言えば、デンドリマーは、分岐した木のような分子であり、その各枝は、特定の長さの後、２本の新たな枝（分子）に分かれる分子の連結鎖である。枝（分子）が密集してまとまって、その天蓋によって球が形成されるようになるまで、この枝分かれが続く。概ね、デンドリマーの特性は、その表面の官能基によって決まる。例えば、カルボキシル基のような親水性の末端基であれば、典型的には、水溶性デンドリマーが作られることになる。あるいは、デンドリマーの表面にリン脂質を組み込んで、皮膚を介した吸収を促進し得る。リポソームの実施形態で使用するものとして詳述されているリン脂質のいずれも、デンドリマーの実施形態で使用するのに適している。当該技術分野において概ね知られているいずれかの方法を用いて、デンドリマーを作製して、その中に、本発明の組成物を封入し得る。例えば、反復する一連の反応工程によって、デンドリマーを作製してよい（反復を追加するごとに、高次のデンドリマーが得られる）。その結果、デンドリマーは、高度に分岐した規則的な３Ｄ構造を有するとともに、ほぼ均一な大きさ及び形状となる。さらに、デンドリマーの最終的な大きさは典型的には、合成の際に使用する反復工程の回数によって制御される。様々な大きさのデンドリマーが、本発明での使用に適している。概ね、デンドリマーの大きさは、約１ｎｍ〜約１００ｎｍの範囲であってよい。
【００５７】
各種実施形態では、本発明によるＯＶを含む医薬組成物は、いずれかの投与経路を介した送達用に調合してよい。「投与経路」とは、当該技術分野において知られているいずれかの投与経路を指してよく、エアゾール経路、経鼻経路、経口経路、経粘膜経路、経皮経路または非経口経路が挙げられるが、これらに限らない。「経皮」投与は、局所クリームもしくは軟膏剤を用いるか、経皮パッチによって行ってよい。「非経口」とは、概ね注射と関連する投与経路を指し、眼窩内経路、注入経路、動脈内経路、嚢内経路、心腔内経路、皮内経路、筋肉内経路、腹腔内経路、肺内経路、髄腔内経路、胸骨内経路、髄腔内経路、子宮内経路、静脈内経路、クモ膜下経路、被膜下経路、皮下経路、経粘膜経路または経気管経路が挙げられる。非経口経路を介する際には、本開示の組成物は、注入もしくは注射用の液剤もしくは懸濁剤の形態、または凍結乾燥粉末であってよい。経腸経路を介する際には、本開示の医薬組成物は、制御放出を可能にする錠剤、ゲルカプセル、糖衣錠、シロップ剤、懸濁剤、液剤、散剤、顆粒剤、乳剤、マイクロスフィアもしくはナノスフィア、または脂質小胞もしくはポリマー小胞の形態であることができる。非経口経路を介する際には、本開示の組成物は、注入または注射用の液剤または懸濁剤の形態であってよい。局所経路を介する際には、本発明による化合物をベースとする医薬組成物は、皮膚及び粘膜の治療用に調合してよく、軟膏剤、クリーム、ミルク、軟膏、散剤、含浸パッド、液剤、ゲル剤、噴霧剤、ローション剤または懸濁剤の形態である。その組成物は、制御放出を可能にするマイクロスフィア、ナノスフィア、脂質小胞、ポリマー小胞、またはポリマーパッチ及びヒドロゲルの形態であることもできる。これらの局所経路用組成物は、臨床適応に応じて、無水形態または水性形態のいずれかであることができる。眼局所経路を介する際には、本開示の組成物は、点眼剤の形態であってよい。
【００５８】
いくつかの実施形態では、ＯＶは、単一の部位または複数の部位で、腫瘍内送達を介して投与する。いくつかの実施形態では、ＯＶは、大脳内送達を介して投与する。別の実施形態では、ＯＶは、静脈内投与または皮下投与する。別の実施形態では、ＯＶは、頸動脈内送達を介して投与する。別の実施形態では、ＯＶは、体腔への送達を介して腹腔内投与する。別の実施形態では、ＯＶは、鼻腔内送達を介して投与する。別の実施形態では、ＯＶは、経口送達を介して投与する。別の実施形態では、ＯＶは、直腸内送達を介して投与する。別の実施形態では、ＯＶは、結腸内送達を介して投与する。別の実施形態では、ＯＶは、眼局所送達を介して送達する。
【００５９】
ＩＩ．本開示の組成物の使用方法
腫瘍溶解性ウイルスは、がん治療のための有効な治療剤であることが当該技術分野において示されている。そのウイルスは、放出時に、感染したがん細胞を溶解させ、がん細胞の感染は、宿主の免疫応答も刺激して、感染細胞を殺傷する。開示されている改変または遺伝子操作したＯＶも同様に、がんの治療に有用であり、がん細胞を選択的に標的として、そのがん細胞を殺傷するような腫瘍溶解性ウイルスの有効性を向上させる。したがって、一態様では、開示されているＯＶを用いて、がんを治療できる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されているＯＶを用いて、がんの治療が必要な対象のがん幹細胞を殺傷することによって、がんを治療できる。
【００６０】
腫瘍またはがんとは、無秩序な細胞成長または細胞死によって通常特徴付けられる状態を指す。腫瘍は、周囲組織または身体のその他の部分が、その腫瘍によって浸潤されているときに悪性であり得る。腫瘍は従来的には、外科的切除、放射線療法または化学療法によって治療し得る。悪性腫瘍及び良性腫瘍の両方、ならびに原発腫瘍及び転移を含むいずれのがんまたは腫瘍も、本発明で開示する腫瘍溶解性ウイルスの標的となり得る。具体的な実施形態では、本開示は、がんを治療する方法であって、そのがんが、いずれかの固形腫瘍である方法を提供する。本発明のいくつかの実施形態では、そのがんは、グリオブラストーマ、鼻咽頭癌、滑膜癌、肝細胞癌、腎臓癌、結合組織の癌、メラノーマ、肺癌、腸癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、脳腫瘍、咽喉癌、口腔癌、肝臓癌、骨癌、膵臓癌、絨毛癌、ガストリノーマ、褐色細胞腫、プロラクチノーマ、Ｔ細胞白血病／リンパ腫、神経腫、フォンヒッペル・リンドウ病、ゾリンジャー・エリソン症候群、副腎癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、尿管癌、脳腫瘍、希突起神経膠腫、神経芽腫、髄膜腫、脊髄腫瘍、骨癌、骨軟骨腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、原発部位不明癌、カルチノイド、胃腸管のカルチノイド、線維肉腫、乳癌、パジェット病、子宮頸癌、結腸直腸癌、直腸癌、食道癌、胆嚢癌、頭部癌、眼癌、頸部癌、腎臓癌、ウィルムス腫瘍、肝臓癌、カポジ肉腫、前立腺癌、肺癌、睾丸癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、口腔癌、皮膚癌、中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、内分泌性膵臓癌、グルカゴノーマ、膵臓癌、副甲状腺癌、陰茎癌、下垂体癌、軟部組織肉腫、網膜芽腫、小腸癌、胃癌、胸腺癌、甲状腺癌、トロホブラスト癌、胞状奇胎、子宮癌、子宮体癌、膣癌、外陰癌、聴神経腫、菌状息肉腫、インスリノーマ、カルチノイド症候群、ソマトスタチノーマ、歯肉癌、心臓癌、口唇癌、髄膜癌、口腔癌、神経癌、口蓋癌、耳下腺癌、腹膜癌、咽頭癌、胸膜癌、唾液腺癌、舌癌及び扁桃癌からなる群から選択する。
【００６１】
したがって、一態様では、本発明で開示するのは、がんの治療方法であって、遺伝子操作した腫瘍溶解性ウイルスを１つ以上含む組成物を対象に投与することを含む方法である。好適なＯＶは、第Ｉ節に上記されている。例示として、がん患者、またはがんに罹患しやすいか、もしくはがんである疑いのある患者を、本明細書に記載されているように治療してよい。本明細書に記載されているような腫瘍溶解性ウイルスを個体に投与して、長期間留まらせてよい。その個体には、そのウイルスを１回以上投与してもよい。いくつかの実施形態では、そのウイルスは、免疫認識を阻害して、腫瘍部位に配置されるように、封入されている。
【００６２】
各種実施形態では、本発明で開示するＯＶを含む発現コンストラクト、核酸配列、ベクター、宿主細胞及び／または医薬組成物は、腫瘍性疾患のようながん性疾患の予防、治療または改善のために使用する。特定の実施形態では、本開示の医薬組成物は、例えば、固形腫瘍を有するがんを含むがんを予防、改善及び／または治療するのに特に有用であり得る。
【００６３】
特定の実施形態では、本発明は部分的には、単独で、または別の療法といずれかに組み合わせて、少なくともいくつかの態様では、製薬学的に許容可能な担体または賦形剤とともに投与できるウイルス、発現コンストラクト、核酸分子及び／またはベクターを企図している。特定の実施形態では、これらは、ウイルスの投与前に、当該技術分野において周知である好適な製剤用担体及び賦形剤と組み合わせてよい。本開示に従って調製した組成物は、がんの予防もしくは治療、またはがんの発症もしくは悪化の遅延のために使用できる。
【００６４】
さらに、本開示は、がん性疾患（腫瘍性疾患を含む）の予防、治療または改善方法であって、その方法を必要とする対象に、本開示の腫瘍溶解性ウイルスを有効量投与する工程を含み、そのウイルスが、腫瘍細胞の感染及び／または溶解を促進するとともに、周辺の正常細胞に対する毒性が低下するように改変または遺伝子操作されている方法に関するものである。いくつかの実施形態では、本開示は、がんに対する腫瘍溶解作用を誘導することに関するものである。いくつかの実施形態では、その方法は概ね、その方法を必要とする対象に、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＸ２８００２６との同一性が少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％であるアミノ酸配列を含む、本開示の改変または遺伝子操作したＺＩＫＶを有効量含む組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態では、その方法は概ね、その方法を必要とする対象に、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＸ２８００２６．１との同一性が少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％であるヌクレオチド配列を含み得る、本開示の改変または遺伝子操作したＺＩＫＶを有効量含む組成物を投与することを含む。別の態様では、その方法は概ね、その方法を必要とする対象に、対応する野生型ＺＩＫＶと比較して、正常細胞における複製能が制限された改変または遺伝子操作したＺＩＫＶを有効量含む組成物を投与することを含む。さらに別の態様では、その方法は概ね、その方法を必要とする対象に、野生型ＺＩＫＶと比較して、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）による翻訳阻害を受けやすい改変または遺伝子操作したＺＩＫＶを有効量含む組成物を投与することを含む。さらに別の態様では、その方法は概ね、その方法を必要とする対象に、野生型ＺＩＫＶと比較して、２’−Ｏメチルトランスフェラーゼ活性が低減された改変または遺伝子操作したＺＩＫＶを有効量含む組成物を投与することを含む。別の態様では、その方法は概ね、その方法を必要とする対象に、野生型ＺＩＫＶと比較して、内皮バリアを通じたウイルス伝播が低減された改変または遺伝子操作したＺＩＫＶを有効量含む組成物を投与することを含む。さらに別の態様では、その方法は概ね、その方法を必要とする対象に、野生型ＺＩＫＶと比較して、短鎖フラビウイルスＲＮＡの産生が阻止される改変または遺伝子操作したＺＩＫＶを有効量含む組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態では、その方法は概ね、その方法を必要とする対象に、野生型ＺＩＫＶと比較して、糖鎖結合の低減を含む改変または遺伝子操作したＺＩＫＶを有効量含む組成物を投与することを含む。
【００６５】
いくつかの実施形態では、その方法は概ね、その方法を必要とする対象に、ＮＳ５遺伝子に対する少なくとも１つの変異を含む組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態では、その方法は概ね、その方法を必要とする対象に、ＮＳ５タンパク質に対する変異を１つ以上含む改変または遺伝子操作したＺＩＫＶを有効量含む組成物を投与することを含み、その少なくとも１つの変異は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＹ７８５４８０．１との配列アラインメントによって求めた場合に、２１８位のアミノ酸に対応する位置に見られる。いくつかの実施形態では、その方法は概ね、その方法を必要とする対象に、２１８位のアミノ酸に対応する位置に点変異を含む遺伝子操作または改変したＺＩＫＶを有効量含む組成物を投与することを含み、その２１８位のグルタミン酸は、アラニンに変異している。
【００６６】
いくつかの実施形態では、その方法は概ね、その方法を必要とする対象に、野生型ＺＩＫＶと比較して、糖鎖結合が低減されている改変または遺伝子操作したＺＩＫＶを有効量含む組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態では、その方法は概ね、その方法を必要とする対象に、エンベロープ（Ｅ）タンパク質に対する変異を少なくとも１つ含む改変または遺伝子操作したＺＩＫＶを有効量含む組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態では、その方法は概ね、その方法を必要とする対象に、Ｅタンパク質に対する変異を１つ以上含む改変または遺伝子操作したＺＩＫＶを有効量含む組成物を投与することを含み、その少なくとも１つの変異は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＹ７８５４８０．１との配列アラインメントによって求めた場合に、Ｅタンパク質のＶＮＤ配列に見られる。いくつかの実施形態では、その方法は概ね、その方法を必要とする対象に、Ｅタンパク質に対する変異を１つ以上含む改変または遺伝子操作したＺＩＫＶを有効量含む組成物を投与することを含み、その少なくとも１つの変異は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＹ７８５４８０．１との配列アラインメントによって求めた場合に、Ｅタンパク質の１５４位のアミノ酸または１５６位のアミノ酸に対応する位置に見られる。いくつかの実施形態では、その方法は概ね、その方法を必要とする対象に、１５４位のアミノ酸または１５６位のアミノ酸に対応する位置に点変異を含む遺伝子操作または改変したＺＩＫＶを有効量含む組成物を投与することを含み、その１５４位のアミノ酸のアスパラギンは、グルタミンに変異しており、１５６位のアミノ酸のトレオニンは、バリンに変異している。いくつかの実施形態では、その方法は概ね、その方法を必要とする対象に、ＮＳ１タンパク質に少なくとも１つの変異を含む改変または遺伝子操作したＺＩＫＶを有効量含む組成物を投与することを含む。
【００６７】
いくつかの実施形態では、その方法は概ね、その方法を必要とする対象に、ＺＩＫＶゲノムの３’非翻訳領域に少なくとも１つの変異を含む改変または遺伝子操作したＺＩＫＶを有効量含む組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態では、その方法は概ね、その方法を必要とする対象に、ＺＩＫＶゲノムの３’ＵＴＲにおいて、ヌクレオチドの欠失を１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個またはこれを上回る数含む改変または遺伝子操作したＺＩＫＶを有効量含む組成物を投与することを含む。
【００６８】
いくつかの実施形態では、その方法は概ね、その方法を必要とする対象に、ＮＳ４Ｂタンパク質［ＮＳ４Ｂタンパク質のａａ配列を示してください］に少なくとも１つの変異を含む改変または遺伝子操作したＺＩＫＶを有効量含む組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態では、その方法は概ね、その方法を必要とする対象に、ＮＳ４Ｂタンパク質に対する変異を１つ以上含む改変または遺伝子操作したＺＩＫＶを有効量含む組成物を投与することを含み、その少なくとも１つの変異は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＹ７８５４８０．１との配列アラインメントによって求めた場合に、１８位のアミノ酸に対応する位置に見られる。いくつかの実施形態では、その方法は概ね、その方法を必要とする対象に、ＮＳ４Ｂタンパク質に１つ以上の変異を含む遺伝子操作または改変したＺＩＫＶを有効量含む組成物を投与することを含み、その少なくとも１つの変異は、１８位のアミノ酸に対応する位置の点変異であり、その１８位のグリシンは、アルギニンに変異している。いくつかの実施形態では、その方法は概ね、その方法を必要とする対象に、ＮＳ３タンパク質に少なくとも１つの変異を含む改変または遺伝子操作したＺＩＫＶを有効量含む組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態では、その方法は概ね、その方法を必要とする対象に、ＮＳ３タンパク質に対する変異を１つ以上含む改変または遺伝子操作したＺＩＫＶを有効量含む組成物を投与することを含み、その少なくとも１つの変異は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＹ７８５４８０．１との配列アラインメントによって求めた場合に、３９９位のアミノ酸に対応する位置に見られる。いくつかの実施形態では、その方法は概ね、その方法を必要とする対象に、３９９位のアミノ酸に対応する位置に点変異を含む遺伝子操作または改変したＺＩＫＶを有効量含む組成物投与することを含み、その３９９位のリシンは、アルギニンに変異している。
【００６９】
対象は、齧歯類、ヒト、家畜、コンパニオンアニマルまたは動物園の動物であってよい。一実施形態では、対象は、齧歯類、例えば、マウス、ラット、モルモットなどであってよい。別の実施形態では、対象は、家畜であってよい。好適な家畜の非限定的な例としては、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ラマ及びアルパカを挙げてよい。さらに別の実施形態では、対象は、コンパニオンアニマルであってよい。コンパニオンアニマルの非限定的な例としては、イヌ、ネコ、ウサギ及びトリのようなペットを挙げてよい。さらに別の実施形態では、対象は、動物園の動物であってよい。本明細書で使用する場合、「動物園の動物」とは、動物園で見られ得る動物を指す。このような動物としては、ヒト以外の霊長類、大型のネコ、オオカミ及びクマを挙げてよい。好ましい実施形態では、対象は、ヒトである。一態様では、対象は、がんであるか、またはがんを発現するリスクのある対象であってよい。対象は、以前に腫瘍の切除を受けたことがあってよい。一態様では、対象は、以前に、腫瘍の外科的縮小、放射線療法及び／または化学療法を含め、がんに対する療法を受けたことがあってよい。
【００７０】
いくつかの実施形態では、本開示のジカウイルス組成物を投与して、グリオブラストーマ幹細胞（ＧＳＣ）を殺傷することによって、対象のグリオブラストーマ（ＧＢＭ）を治療してよい。
【００７１】
本明細書で使用する場合、グリオーマとは、脳または脊髄の支持組織細胞または結合組織細胞に起因するいずれかの腫瘍を指してよい。本明細書で使用する場合、グリオブラストーマ（ＧＢＭ）は、悪性グリオーマの一種である。
【００７２】
ＧＢＭは、手術、放射線及び化学療法のような従来の療法に対する奏効が非常に低いことがある。ＧＢＭは、腫瘍を外科的に取り除いても、元の切除腔の近辺で再発することがある。
【００７３】
ＧＢＭの腫瘍細胞は不均一であり、非形質転換細胞及び腫瘍性細胞が寄与するものである。腫瘍細胞の主な寄与因子は、グリオブラストーマ幹細胞（ＧＳＣ）である。ＧＳＣは、自己再生性の造腫瘍幹様腫瘍細胞集団である。ＧＳＣは、腫瘍開始細胞または腫瘍前駆細胞としても知られており、持続的な増殖、血管新生の促進、侵襲能、免疫逃避及び治療耐性により、腫瘍悪性化に寄与する。ＧＳＣは、増殖して、ＧＳＣプールを再生できるとともに、ＧＢＭの異なる種類の細胞に分化できる。ＧＢＭに対する有効な治療には、周辺細胞を殺傷せずに、これらのＧＳＣを特異的に殺傷することが必要となり得る。
【００７４】
一態様では、ＧＳＣ細胞は、幹様特性を有し、ＧＳＣの特定を補助する幹細胞マーカーを示す。本明細書で使用する場合、幹様特性としては、あらゆる種類の細胞を発生させることができるとともに、持続的に増殖できるような特徴を挙げてよい。この場合、ＧＳＣ細胞の幹様特徴は、腫瘍の血管新生及び侵襲能を促進し得る。ＧＳＣは、ＧＳＣを特定可能にするＳＯＸ２及びＯＬＩＧ２のような幹細胞マーカーを示し得る。ＧＳＣは、分化グリオーマ細胞に分化し得る。分化グリオーマ細胞は、ＳＯＸ２及びＯＬＩＧ２のような前駆体マーカーを喪失して、分化マーカーＧＦＡＰを獲得し得る。
【００７５】
一態様では、本開示の組成物は、静止状態のＧＳＣを標的として、殺傷し得る。本明細書で使用する場合、静止状態は、細胞周期の非分裂期である。静止幹細胞または静止ＧＣＳは、自己再生性幹細胞プールの供給及び維持に不可欠である。これらの細胞は、幹細胞がんの再発の重要な因子であり、特に、化学療法及び他の標的療法に対する耐性がある。
【００７６】
一態様では、本開示のＺＩＫＶ組成物は、対象の腫瘍または腫瘍切除部位に直接投与してよい。様々な態様では、本開示の組成物は、頭蓋内経路、静脈内経路、筋肉内経路、鼻腔内経路、皮下経路、気管内経路または腫瘍内経路のような様々な経路を通じて投与してよい。
【００７７】
本開示の組成物を有効な用量を、対象に投与してよい。本明細書で使用する場合、有効な用量は、治療効果を有することになる組成物用量である。腫瘍の場合には、治療上有効な用量によって、がん細胞の数を減少させ、腫瘍の大きさを縮小させ、侵襲を低減し、他の身体部分もしくは周辺組織への腫瘍の転移を阻止し、及び／または腫瘍の成長を阻害し得る。一態様では、その治療効果は、対象におけるがん幹細胞の殺傷、がん幹細胞の増殖の低減、ＧＳＣのアポトーシスの増加、ＧＢＭの治療、またはがんの再発の阻止であり得る。一態様では、その治療効果は、ＧＳＣの殺傷であり得る。
【００７８】
有効な用量は、１回用量であっても、または複数回用量であってもよい。その用量は、対象の異なる要因によって決定してよく、その要因としては、体重、腫瘍の病期、がん細胞の数及びがんの予後が挙げられるが、これらに限らない。一態様では、ＺＩＫＶの有効な用量は、約１０２ＦＦＵ〜約１０９ＦＦＵであり得る。その用量は、異なる要因に応じて、約５ｕｌ〜約１０ｍｌの範囲の組成物体積で投与してよく、その要因としては、対象の特徴、ならびに投与の経路及び部位のような要因が挙げられるが、これらに限らない。
【００７９】
本発明で開示するようなＯＶ組成物は、単独で有効であるが、従来の療法のようないずれかの他の療法と組み合わせた方が、それぞれを単独で用いた場合よりも有効であり得る。例えば、併用療法の各薬剤は、腫瘍組織で独立して作用することができ、ＯＶは、化学療法もしくは放射線療法に対して細胞を感作でき、及び／または化学療法剤は、ウイルス複製レベルを向上させるか、もしくは標的細胞の受容体状態を生じさせることができる。併用療法の薬剤は、同時または順次に投与してよい。
【００８０】
本発明の好ましい実施形態では、本発明の方法または使用法は、併用放射線療法を対象に行うことをさらに含む。本発明の別の好ましい実施形態では、本発明の方法または使用法は、併用化学療法を対象に行うことをさらに含む。本明細書で使用する場合、「併用」とは、本発明の遺伝子療法の前、本発明の遺伝子療法の後、または本発明の遺伝子療法と同時に行っている療法を指す。併用療法の期間は、数分から数週間まで様々であり得る。好ましくは、併用療法は、数時間継続する。
【００８１】
併用療法に適する薬剤としては、オールトランスレチノイン酸、アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン、ベバシズマブ、カルボプラチン、カペシタビン、ＣＣＮＵ、シスプラチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、シタラビン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、エピルビシン、エポチロン、エトポシド、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イマチニブ、レナリドマイド、メクロレタミン、メルカプトプリン、メトトレキセート、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、ポマリドミド、プロカルバジン、テモゾロミド、テニポシド、チオグアニン、サリドマイド、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン及びビノレルビンが挙げられるが、これらに限らない。いくつかの実施形態では、併用療法に適する薬剤としては、免疫チェックポイント阻害剤が挙げられるが、これに限らない。免疫チェックポイント阻害剤の非限定的な例としては、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＩＤＯ、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＢＴＬＡ、ＶＩＳＴＡ、ＩＣＯＳ、ＫＩＲ、ＣＤ３９の阻害剤、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、イピリムマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブが挙げられる。いくつかの実施形態では、併用療法に適する薬剤としては、ＣＡＲ  Ｔ−細胞療法が挙げられる。いくつかの実施形態では、併用療法に適する薬剤としては、インターロイキンベースの療法が挙げられ、非限定的な例としては、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１及びそれらの長時間作用型の誘導体が挙げられる。いくつかの実施形態では、併用療法に適する薬剤としては、インターフェロンベースの療法（例えばＩＦＮ−α、β、γ）が挙げられる。
【００８２】
ＩＩＩ．キット
本発明は、がんを治療するためのキットに対するものでもある。そのキットは、腫瘍を治療する本発明の方法を実施するのに有用である。そのキットは、本発明の組成物の少なくとも１つを含む物質または成分をまとめたものである。したがって、いくつかの実施形態では、そのキットは、上記のようなジカウイルスを含む組成物を含む。
【００８３】
本発明のキットで構成される成分の厳密な性質は、意図する目的によって決まる。例えば、いくつかの実施形態は、グリオーマ及びグリオブラストーマのような脳腫瘍を治療する目的で構成されている。その他の実施形態は、脳腫瘍、眼腫瘍、皮膚癌、消化管癌及び肺癌のような腫瘍／がんを治療するか、これらの腫瘍／がんに対する腫瘍溶解作用を誘導する目的で構成されている。一実施形態では、本発明のキットは特に、哺乳類の対象を治療するか、または哺乳類の対象に対する腫瘍溶解作用を誘導する目的で構成されている。別の実施形態では、本発明のキットは特に、ヒトの対象を治療するか、またはヒト対象に対する腫瘍溶解作用を誘導する目的で構成されている。さらなる実施形態では、本発明のキットは、獣医用途で、対象（飼育動物、家畜及び実験動物などであるが、これらに限らない）を治療するように構成されている。
【００８４】
使用説明書をキットに含めてもよい。「使用説明書」には典型的には、グリオーマ及びグリオブラストーマのような脳腫瘍を治療するか、または腫瘍に対する腫瘍溶解作用を誘導するなどの所望の結果を得る目的でキットの成分を使用する際に用いる技法について説明している有形の表現物が含まれる。任意に、本発明のキットは、当業者には容易に認識されるような希釈剤、緩衝剤、製薬学的に許容可能な担体、注射器、カテーテル、アプリケーター、ピペッティングツール、測定ツール、包帯材またはその他の有用な器具のような他の有用な成分も含む。
【００８５】
キットにまとめられた物質または成分は、それらの実施性及び有用性を維持するいずれかの利便的かつ好適な方法で保存した状態で、医療実施者に供給できる。例えば、その成分は、溶解形態、脱水形態または凍結乾燥形態であることができ、室温、冷蔵温度または冷凍温度で供給できる。その成分は典型的には、好適な包装材（複数可）に入れることができる。本明細書で用いる場合、「包装材」という語句は、本発明の組成物などのような、キットの中身を収容するのに用いる１つ以上の物理的な構造体を指す。包装材は、好ましくは、夾雑物を含まない無菌環境をもたらすように、周知の方法によって構築する。本発明のキットで用いる包装材は、腫瘍の治療及び／またはウイルス粒子の投与の際に慣例的に用いられている包装材である。本明細書で使用する場合、「包装」という用語は、個々のキット成分を保持できるガラス、プラスチック、紙、ホイルなどのような好適な固体のマトリックスまた材料を指す。したがって、例えば、包装は、ジカウイルスを含む本発明の組成物を好適な量収容するのに用いるガラスバイアルであることができる。包装材は概ね、キット及び／またはその成分の内容及び／または目的を示す外側ラベルを有する。
【００８６】
定義
本開示の要素またはその好ましい態様（複数可）を示す場合には、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」及び「前記」という冠詞は、その要素が１つ以上存在することを意味するように意図されている。したがって、例えば、「製剤用担体」に言及する際には、２つ以上のそのような担体の混合物などが含まれる。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「有する」という用語は、包括的であるように意図されているとともに、列挙されている要素以外の追加の要素が存在し得ることを意味する。
【００８７】
本明細書では、「約」を付した特定の値から、及び／または「約」を付した特定の別の値までとして、範囲が表されていることがある。このような範囲が述べられているときには、別の実施形態には、その特定の値から及び／またはその特定の他の値までが含まれる。同様に、「約」という先行詞を用いることによって、値が近似値として述べられているときには、その特定の値によって別の実施形態が形成されると理解するものとする。さらに、その各範囲の端点は、他方の端点との関連で有意であるとともに、他方の端点から独立して有意であると理解するものとする。また、本明細書には多くの数値が開示されていること、及び各数値が、その値自体に加えて、その値に「約」を付したものとしても開示されていると理解するものとする。例えば、「１０」という値が開示されている場合には、「約１０」も開示されている。また、ある値が開示されているときには、当業者によって適宜理解されるように、その値に「以下」または「以上」を付したもの、及び値の間の考え得る範囲も開示されていると理解するものとする。例えば、「１０」という値が開示されている場合には、「１０以下」及び「１０以上」も開示されている。また、本出願全体を通じて、データは、多種多様な形式で示されており、このデータは、端点及び開始点、ならびにそのデータポイントをいずれかに組み合わせたものの範囲を表していると理解するものとする。例えば、特定のデータポイントの「１０」及び特定のデータポイントの「１５」が開示されている場合、１０超、１０以上、１０未満、１０以下、１０、及び１５超、１５以上、１５未満、１５以下及び１５、ならびに１０〜１５が開示されているとみなされると理解するものとする。また、２つの特定の単位値の間の各単位値も開示されていると理解するものとする。例えば、１０及び１５が開示されている場合、１１、１２、１３及び１４も開示されている。
【００８８】
本明細書及び添付の請求の範囲では、多くの用語に言及することになるが、それらの用語は、以下の意味を有するように定義するものとする。
【００８９】
「任意の」または「任意に」とは、その後に記載されている事象または状況が存在してもしなくてもよく、その記載には、前記事象または状況が存在する場合、及び前記事象または状況が存在しない場合が含まれることを意味する。
【００９０】
「治療有効量」とは、本明細書で使用する場合、腫瘍、例えば脳腫瘍を有する患者に有益な結果をもたらすことができる量を指す。治療有効量は、個体ベースで定めることができ、少なくとも部分的に、その哺乳類の生理学的特徴、使用する送達系または治療技法の種類、及びその疾患の進行に対する投与時間の考察に基づくことになる。
【００９１】
「治療」及び「治療すること」とは、本明細書で使用する場合、治療的処置、及び予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）または予防（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）的手段の両方を指し、その処置が最終的に奏効しない場合には、その目的は、疾患を予防、遅延及び／または抑制することである。
【実施例】
【００９２】
下記の実施例は、本開示の各種実施形態を示す目的で含まれている。下記の実施例に開示されている技法は、本発明の実施の際に充分に機能するように、本発明者が見出した技法であるので、本発明を実施するための好ましい形態を構成するとみなすことができることを当業者は認識するはずである。しかしながら、当業者は、本開示に鑑み、本発明の趣旨及び範囲から逸脱せずに、開示されている具体的実施形態に、多くの変更を加えることができるとともに、それらの変更によって、同様の結果を得ることができると認識するはずである。
【００９３】
実施例の序論
グリオブラストーマ（ＧＢＭ）は、最も多く見られる原発性の内因性脳腫瘍である。ＧＢＭは、手術、放射線及び化学療法の集学的療法を行っても、本質的に致死性のままであり、患者の生存期間中央値は２年未満である１。ＧＢＭは、不均一な疾患であり、非形質転換細胞の寄与が大きいが、腫瘍性区画内の細胞階層の寄与もある。その階層の頂点には、自己再生性の造腫瘍幹様腫瘍細胞集団（ＧＳＣまたは腫瘍開始細胞という）が位置する２。ＧＳＣは、持続的な増殖、血管新生の促進、侵襲能、免疫逃避及び治療耐性により、腫瘍の悪性化に寄与する３，４。
【００９４】
多くの致命的ながんとは異なり、ＧＢＭは、転移するのはまれであり、患者の大半（７０〜８０％）は、元の切除腔の２〜３ｃｍ内で再発し５、この腫瘍挙動によって、腫瘍溶解性ウイルスを含む局所療法の研究が促されている６〜１０，１１。毒性を制限しながら、腫瘍細胞を殺傷するように、いくつかの腫瘍溶解性ＤＮＡウイルスが開発されている９，１０。腫瘍に対するウイルス療法の有効性は、細胞に感染し、複製を行い、腫瘍細胞を特異的に殺傷する能力に依存する８。ＺＩＫＶは、デングウイルス、ウエストナイルウイルス（ＷＮＶ）及び黄熱ウイルスを含む、ポジティブ鎖ＲＮＡウイルスのフラビウイルス属のメンバーである。ＺＩＫＶ誘発性の胎児小頭症の最近の流行により、ＺＩＫＶの生態に対する鋭意研究が進められてきた１２〜１７。ＺＩＫＶは、発生過程の中枢神経系（ＣＮＳ）に感染して、神経幹細胞及び前駆細胞に顕著な影響を及ぼす。ＺＩＫＶに感染した神経前駆細胞は、分化し、増殖能を喪失し、細胞死に至る１３，１５，１６，１８。対照的に、成人におけるＺＩＫＶの作用は概ね、あまり重篤ではなく、髄膜脳炎の症例がわずかに報告されているに過ぎず、ＺＩＫＶ感染が成人の脳において有害な作用を及ぼすことはほとんどないことが示唆されている１９。神経前駆細胞に対するＺＩＫＶのトロピズムを利用できるという仮説を我々は立てた１３，１５〜１８。
【００９５】
ＧＳＣに対するＺＩＫＶの作用を調べるために、充分に特徴付けられた、患者由来のＧＳＣであって、異種移植時に幹細胞マーカーを発現し、自己再生し、腫瘍を形成するＧＳＣ、及び分化グリオーマ細胞（ＤＧＣ）を使用した４，２０。ＧＳＣは、自己再生、分化能及び腫瘍伝播の測定を通じて、機能的に定義される。ＧＳＣは、乏突起膠腫前駆細胞（ＯＰＣ）のマーカーを含む幹細胞マーカー及び前駆細胞マーカーを発現することが多く、グリオーマにおいて起源細胞として機能し得る２１。
【００９６】
実施例１：グリオブラストーマ細胞のウイルス感染
主な転写ＧＢＭサブタイプである４つのＧＳＣモデル（ｐｒｏｎｅｕｒａｌ、ｃｌａｓｓｉｃａｌ及びｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ）を選択した。血清への暴露を通じて、細胞分化を誘導した４。予想どおり、分化の誘導により、すべてのモデルで、前駆体マーカー（ＳＯＸ２及びＯＬＩＧ２）の喪失、ならびに分化マーカー（ＧＦＡＰ）の増加が見られた（図６Ａ）。ＧＳＣを代表的なアジア／アメリカＺＩＫＶ株（ブラジル、２０１５年）及びアフリカＺＩＫＶ株（ダカール、１９８４年）に感染させた（感染多重度ＭＯＩ＝５）１２。免疫蛍光顕微鏡観察またはフローサイトメトリーによって測定したところ、４８時間後に、６０％超のＧＳＣがいずれかの株に感染した（図１Ｄ、図６Ｂ、図７Ａ〜図７Ｃ、及び図７Ｊ、図９Ａ）。対照的に、ＤＧＣは、ウイルス感染率が比較的低く（図７Ｄ〜図７Ｆ、及び図７Ｋ、図９Ｂ〜図９Ｄ、及び図９Ｈ）、すべての腫瘍細胞がＺＩＫＶに感染するが、ＺＩＫＶは、ＧＳＣにおける方が多く複製されることが示唆された。この観察結果を確認するために、ＧＳＣマーカー（ＳＯＸ２）を発現したＺＩＫＶ感染細胞の割合を解析したところ、感染細胞の９０％超が、ＳＯＸ２陽性であった（図１Ｆ及び図６Ｂ）。
【００９７】
実施例２：マッチしたＧＳＣ及びＤＧＣの増殖に対して感染が及ぼす影響
ＺＩＫＶは、胎児神経前駆細胞において細胞死を誘導するので、マッチしたＧＳＣ及びＤＧＣの増殖に対して感染が及ぼす影響を割り出した。いずれのＺＩＫＶ株によっても、ＧＳＣの成長はほぼ停止したが（図１Ｂ及び図１Ｋ）、ＤＧＣは、影響をほとんど受けなかった（図１Ｌ、図６Ｃ〜図６Ｄ）。ＺＩＫＶへの感染によって、ＧＳＣマーカー（ＳＯＸ２）のレベルは低下し（図１Ｎ）、増殖が低下したが（Ｋｉ−６７によって測定）（図１Ｈ及び図１Ｎ）、アポトーシスマーカー（ＡＣ３）のレベルは上昇した（図１Ｊ及び図１Ｎ）。無血清条件でのスフェア形成が、自己複製の代替策として用いられている（ただし、注意点がある）２２。ＺＩＫＶは、ＧＳＣを優先的に標的とすることと整合して、ＧＳＣのスフェア形成も低減させた（図１Ｍ）。
【００９８】
実施例３：ウエストナイル病ウイルス（ＷＮＶ）とＺＩＫＶの比較
６０年余り前、ＷＮＶの腫瘍溶解性有効性について試験が行われたが、有効性どころか、かなりの毒性が見られた２３，２４。ＺＩＫＶに対して、ＷＮＶ（ニューヨーク、１９９９）の作用をモデルにおいて比較した２５。ＷＮＶは、ＧＳＣ及びＤＧＣの両方に高レベルで感染し（図８Ａ〜図８Ｇ）、細胞死を無差別に誘導した（図８Ａ、図８Ｂ）。ＷＮＶは、新鮮な切除てんかん組織由来の培養液及び脳切片の正常なヒト神経細胞にも感染し、ＮｅｕＮ＋ニューロン及びＧＦＡＰ＋アストロサイトの両方を標的とした（図８Ｈ〜図８Ｋ、脳切片）。正常神経細胞のＷＮＶ感染により、有意な細胞死が誘導された（図８Ｍ）。したがって、ＺＩＫＶのＧＳＣ特異性は、関連性のある神経向性フラビウイルスの一般的特性ではない１６，１７。
【００９９】
実施例４：インビトロオルガノイドモデルを用いた、ＺＩＫＶ  ＧＳＣ特異性の試験
患者に存在する細胞不均一性との関連で、ＺＩＫＶのＧＳＣ特異性の試験を行うために、インビトロオルガノイドモデルを使用した。脳オルガノイドは、正常な脳の構造を再現して、摂動に対するヒト脳の応答を調査可能にする１３。脳ＧＢＭオルガノイドの作製が最近報告された２６。ヒトＧＢＭオルガノイドにおいて、ＺＩＫＶの潜在的な有用性を求めるために、３つのＧＳＣモデル（Ｔ３８７、Ｔ３５６５及びＴ４１２１）をマトリゲルでコーティングして、小さいオルガノイドを３日で形成したところ（図２Ａ）、３週間で、成熟オルガノイドに成長した（図２Ｂ）１３，２６。これらの３つのＧＳＣを成熟オルガノイドの段階で、ＺＩＫＶ−ブラジルまたはＺＩＫＶ−ダカールに感染させた。オルガノイド面積を測定することによって評価したところ、ＺＩＫＶへの感染によって、２週間（図２Ｃ、図２Ｄ）及び４週間（図２Ｅ、図２Ｆ）において、オルガノイドの成長が減速した（図２Ｇ）。次に、ＧＢＭオルガノイドにおいて、ＺＩＫＶに感染した腫瘍細胞集団を調べた。ＺＩＫＶは、オルガノイドにおいて、２週間以内に高効率で（図２Ｉ、図２Ｋ、図２Ｍ及び図２Ｏ）、ＧＳＣマーカーのＳＯＸ２を発現している細胞に対して優先的に（図２Ｉ）、腫瘍細胞に感染した。ＺＩＫＶ感染細胞及びアポトーシスマーカーＡＣ３の共局在によって、ＺＩＫＶが、腫瘍細胞死を誘導したことが確認された（図２Ｍ及び図２Ｐ）。ＧＢＭオルガノイドでは、ＺＩＫＶは、Ｋｉ６７によって明らかになったように、増殖腫瘍細胞に効率的には感染しなかったか（図２Ｋ）、または分化腫瘍細胞に感染しなかった（図２Ｏ）。ＳＯＸ２（図２Ｈ、図２Ｉ及び図２Ｐ）とＫｉ６７（図２Ｊ、図２Ｋ及び図２Ｐ）の染色の変化、ならびにアポトーシス（ＡＣ３によって明らかにした。図２Ｌ、図２Ｍ及び図２Ｐ）の染色の増加によって示されたように、ＺＩＫＶ感染によって、ＧＢＭオルガノイドにおける未分化ＧＳＣが有意に減少し、その結果、ＤＧＣ（ＧＦＡＰによって明らかにした。図２Ｎ〜図２Ｐ）が、非感染コントロールと比較して相対的に増加した。勘案すると、これらの結果によって、ＺＩＫＶが、感染、分化及びアポトーシスに関して、最も悪性度の高い腫瘍細胞である未分化の静止ＧＢＭ  ＧＳＣを標的とすることが示されている２７。
【０１００】
実施例５：患者由来のＧＢＭ腫瘍における、ＺＩＫＶのＧＳＣ特異性の試験
非培養下でのこれらの結果を確認するために、外科的切除直後の患者由来のＧＢＭ腫瘍切片を採取し（図３Ｈ〜図３Ｊ）、２つのＺＩＫＶ株に感染させた。１週間の期間にわたって、ＺＩＫＶをこれらの腫瘍細胞に進行性に感染させた（図３Ｋ〜図３Ｚ、図６Ｆ）。ＺＩＫＶ抗原及びＧＳＣマーカーＳＯＸ２に対する共染切片（図３Ｎ、図３Ｏ、図３Ｔ、図３Ｕ）によって、２つのＺＩＫＶ株間で多少変動はあるものの、ＺＩＫＶ感染細胞の大半がＳＯＸ２を発現したことが明らかになった（図３Ｚ）。ＺＩＫＶは、ＳＯＸ２＋  ＧＢＭ細胞（図３Ｚ）と比較して低い割合で、急速に分裂する腫瘍細胞（図３Ｐ、図３Ｑ、図３Ｖ及び図３Ｗ）に感染し、分化ＧＢＭ細胞（図３Ｒ、図３Ｓ、図３Ｘ〜図３Ｚ）にはあまり感染しなかった。これらの結果から、ＺＩＫＶが、ＧＳＣを特異的に標的として殺傷するという仮説が裏付けられている。
【０１０１】
実施例６：ＺＩＫＶが正常なヒト神経細胞に及ぼす作用の試験
腫瘍溶解性ウイルスの治療指数は、正常細胞に対する作用が限られた状態で、腫瘍細胞に感染して、その腫瘍細胞を殺傷するその能力に由来する６，８。ＺＩＫＶが正常な成人ヒト神経細胞に及ぼす作用を試験するために、てんかん手術を受けた成人の手術標本から非悪性の神経組織を得た（てんかん患者２６６、２６７及び２７０の脳原発組織、図３Ａ〜図３Ｃ）。ＧＢＭ組織に対する作用とは対照的に、ＺＩＫＶは、ＮｅｕＮ＋ニューロン（図３Ｄ及び図３ｆ）またはＧＦＡＰ＋グリア細胞（図３Ｅ及び図３Ｇ）を含む正常なヒト脳組織には感染しなかった。ＧＢＭ（図６Ｆ）と比較して、ウイルス複製の検出は限定的であったからである（図６Ｅ）。加えて、てんかん患者（ＮＭ５５及びＮＭ１７７）または分化ヒト神経幹細胞（Ｈｕ−ＤＮＣ）から採取したばかりのヒト脳神経細胞株では、ＺＩＫＶ感染が限定的であったことが示された（図７Ｇ〜図７Ｉ、図９Ｅ、図９Ｆ）。２つのＺＩＫＶ株を用いた、１週間の時間経過による細胞生存能アッセイを用いて、これらの神経細胞モデルにおける限定的な毒性を確認したところ（図９Ｇ）、ＤＧＣとは対照的に、ＺＩＫＶは、正常な神経細胞株ではあまり複製されなかった（図９ｈ、図９Ｉ）。
【０１０２】
実施例７：マウス適合型ＺＩＫＶ−ダカールを用いた、マウスにおけるＺＩＫＶの作用の試験
腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍細胞の直接的な殺傷と、抗腫瘍免疫応答の活性化の組み合わせによって、抗腫瘍作用を誘発する２８。マウスを用いることによって、ヒト脳腫瘍治療の関連状態を再現した。マウスは、ＺＩＫＶの自然宿主ではないので、発症機序研究では、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）のシグナル伝達が後天的または遺伝的に欠損した動物が用いられている１２。しかしながら、このような免疫不全は、免疫応答性のバックグラウンドを必要とする腫瘍溶解療法試験として、ＺＩＫＶの有効性をモデル化することができない場合がある。この制限を解消するために、Ｒａｇ１−／−宿主による連続継代を通じて、ビルレンスを得たマウス適合型ＺＩＫＶ−ダカール２９を使用した。まず、Ｃ５７ＢＬ／６のバックグラウンドで発症させた３つのマウスグリオーマモデル（ＧＬ２６１、ＧＬ２６、ＣＴ−２Ａ）２０、ならびに２つの正常なマウスＣＮＳ株（ＢＶ２及びＭＳ−ＤＮＣ）に対して、インビトロで、親株及びマウス適合型ＺＩＫＶ−ダカール株の有効性を比較した。マウス適合型ＺＩＫＶ−ダカール株は、マウスグリオーマ細胞の成長を減弱させたが、ＺＩＫＶ親株は、１週間の時間経過において、マウス適合型よりも有効性が低かった（図４Ａ）。対照的に、ＺＩＫＶ親株も、マウス適合型ダカールＺＩＫＶも、正常なマウスＣＮＳ細胞（ＢＶ２及びＭＳ−ＤＮＣ）またはその他のタイプのマウス細胞の成長を阻害しなかった（Ｍ．Ｇｏｒｍａｎ及びＭ．Ｄｉａｍｏｎｄの非公開データ）。マウスグリオブラストーマ細胞（ＧＬ２６、ＧＬ２６１及びＣＴ−２Ａ）による１週間のウイルス力価測定によって、これらの結果を確認したところ、ウイルス力価の向上が見られたが、正常なマウス神経細胞（ＢＶ２及びＭＳ−ＤＮＣ）またはその他の野生型マウス細胞では見られなかった（図４Ｂ、及びデータ非提示）。したがって、マウス適合型ＺＩＫＶは、マウスＧＳＣに対する特異性を保持しているうえに、正常な神経細胞に対する毒性が限られている。
【０１０３】
実施例８：インビボにおけるＺＩＫＶの腫瘍溶解作用の評価
インビボにおけるＺＩＫＶの腫瘍溶解作用を評価するために、同系宿主で成長させた２つのマウスＧＢＭ（ＧＬ２６１及びＣＴ−２Ａ）を作製した。ＧＢＭ細胞に、ルシフェラーゼレポーターをトランスダクションし、腫瘍を形成できるようにし、その形成を生物発光イメージングによって確認した（図４Ｃ）。腫瘍が立証されたマウス（移植の１週間後、図４Ｄ、図４Ｅ）を２つの群に無作為に分け、移植の２週間後に、ＰＢＳコントロールまたはマウス適合型ＺＩＫＶ−ダカール（１０μｌ中に１０３ＦＦＵ）で処置した。注目すべきことに、ＺＩＫＶ感染によって、腫瘍を有するマウスの寿命が有意に延びた（図４Ｊ）。ＧＢＭの移植の１週間後に組織学的検査を行ったところ、ウイルスで処置したＧＢＭ（図４Ｇ及び図４Ｉ）の体積の方が、ＰＢＳで処置したマウスのＧＢＭ（図４Ｆ及び図４Ｈ）よりも小さいことが示された。腫瘍を有するマウスが、もっと多い用量のウイルスから効果を得ることができるか確かめるために、移植の１週間後に、１０５ＦＦＵのマウス適合型ＺＩＫＶ−ダカールを接種した。興味深いことに、コントロールまたは１０３ＦＦＵの用量と比較して、腫瘍を有するマウスの生存期間が延びた（図４Ｋ）。細胞ターゲティングの特異性を判断するために、ＺＩＫＶ抗原、ならびに幹細胞、増殖、及び分化のマーカーを染色した（図４Ｌ〜図４Ｔ）。ＺＩＫＶは、エンドポイントにおいて、グリオーマ細胞の約６％に感染し（図４Ｔ）、これらの細胞の大半は、前駆体マーカーＳｏｘ２を発現していた（図４Ｍ、図４Ｔ）。対照的に、ＧＦＡＰ＋分化腫瘍細胞の感染率は低かった（図４Ｑ）。Ｋｉ６７染色、ならびにＢｒｄＵ処置及び染色によって、増殖細胞集団に対する作用を測定した。ＺＩＫＶ陽性細胞の大半は、Ｋｉ６７に対して陰性であるか（＞７０％）（図４Ｏ、図４Ｔ）、またはＢｒｄＵに対して陰性であった（＞８０％）（図４Ｒ〜図４Ｔ）。これらの結果から、静止幹様細胞に対するインビボでのＺＩＫＶの有効性が裏付けられている１３，１５。
【０１０４】
実施例９：ＧＳＣ及びＤＧＣの全ゲノムシーケンシング
ＺＩＫＶが、ＧＳＣを優先的に、感染または殺傷の標的とする機序は、依然として不明であるが、ＧＳＣは、抗腫瘍免疫応答を強力に抑制し得る３。ＺＩＫＶの考え得る標的特異性について検討するために、全トランスクリプトームＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡ−ｓｅｑ）を行って、ＧＳＣとＤＧＣを比較し、Ｉ型ＩＦＮ刺激遺伝子（ＩＳＧ）を含め、示差的に発現する免疫遺伝子群を明らかにした（図１０）。Ｉ型ＩＦＮ応答は、脳の領域においてウイルス感染を制御するのに不可欠である２５。Ｉ型及びＩＩ型ＩＦＮシグナル伝達経路遺伝子のＧＥＳＡエンリッチメントマップによって、ＤＧＣにおいて、多くのＩＳＧがアップレギュレートしたことが明らかになった（図１０ａ〜図１０Ｃ）。Ｉｆｎａｒ１またはＳｔａｔ１とＺＩＫＶ  Ｅの染色によって、ヒトＧＢＭ細胞において、共局在が見られないことが示された（図１０Ｄ〜図１０Ｇ）。ＺＩＫＶによるＧＳＣのターゲティングを調節するシグナル伝達経路をさらに解明するために、我々は、３つのＧＳＣモデル（Ｔ３８７、Ｔ３５６５、Ｔ４１２１）をＺＩＫＶ−ダカール株に４８〜５６時間感染させてから、ＲＮＡ−ｓｅｑを行った。ＩＦＮシグナル伝達は、ＺＩＫＶ感染によって活性化される最上位の遺伝子オントロジー経路であった（図１１）。そのＲＮＡ−ｓｅｑデータをｑＰＣＲによって確認した（図１１Ｃ）。ＺＩＫＶは、ＩＳＧを完全にはアンタゴナイズできないので、ＩＦＮ応答は、ＧＳＣの成長を阻害するＺＩＫＶの特異性に寄与し得るが、ＤＧＣまたは正常な脳ニューロン細胞及びグリア細胞の殺傷は、より限定的である。
【０１０５】
実施例１０：野生型ＺＩＫＶ及びその組み換え誘導体ＺＩＫＶ−Ｅ２１８Ａの殺腫瘍作用の比較
大半の腫瘍溶解性ウイルスでは、腫瘍細胞に対する有効性を最大化して、正常細胞に対する毒性を最小限にするには、遺伝子操作が必要となる８〜１０。フラビウイルスＮＳ５遺伝子（Ｅ２１８Ａ）の変異によって、ウイルスを、Ｉ型ＩＦＮ及びＩＦＩＴ１による翻訳阻害に感作すると３０、Ｉ型ＩＦＮに応答する細胞内での複製が減弱することが以前、報告された。したがって、腫瘍溶解性ＺＩＫＶの安全性を潜在的に高めるために、３つのＧＳＣモデルに対する野生型ＺＩＫＶ（ＦＳＳ１３０２５、カンボジア、２０１０）及びその組み換え誘導体ＺＩＫＶ−Ｅ２１８Ａの殺腫瘍作用を比較した１４（図５）。細胞生存能及びスフェア形成によって測定したところ、親株及びＥ２１８Ａ変異体ＺＩＫＶ株の両方で、抗ＧＳＣ活性が見られた（図５Ａ、図５Ｂ）。ＺＩＫＶ親株の方が、ＧＳＣの成長を強力に低減したが、いずれの株も有効であった。親株及びＥ２１８Ａ弱毒化株のいずれも、ＳＯＸ２陽性腫瘍細胞に優先的に感染して、アポトーシスを誘導した（図５Ｃ〜図５Ｈ）。ＧＳＣは、標準ケアのテモゾロミド（ＴＭＺ）を含む化学療法に対して耐性を示すことが多いので１，２、ＴＭＺ及びＺＩＫＶ  Ｅ２１８Ａの併用の有効性を評価した。有効なＴＭＺ濃度（２５０μＭ）を細胞毒性アッセイによって求めた（図１２）。ＴＭＺ単独では、ＧＳＣに対する作用が限定的であったが、ＴＭＺとＺＩＫＶ−Ｅ２１８Ａを１週間、併用したところ、抗腫瘍有効性（図５Ａ、図５Ｂ）及びアポトーシスの誘導（図５Ｇ〜図５Ｉ）の向上が見られた。ＧＢＭ患者に対するＺＩＫＶ−Ｅ２１８Ａの安全性を考慮して、１週間の時間経過でのその複製能を試験した。３つのＧＳＣモデル（Ｔ３８７、Ｔ３５６５、Ｔ４１２１）において、ＺＩＫＶ−Ｅ２１８Ａは、ＺＩＫＶ親株と比較して、自己限定性の複製能を有していた（図５Ｊ）。これらのデータによって、遺伝子操作した変異体ＺＩＫＶ株が、ＧＳＣの感染及び溶解を促進し得るとともに、周囲の分化神経細胞に対する毒性が低いことが示唆されている。
【０１０６】
実施例１〜１０の材料及び方法
倫理声明
本研究は、Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈの勧告に従って行った。プロトコールは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅによる承認を受けた（保証番号Ａ３３８１０１）。接種は、塩酸ケタミン及びキシラジンで誘導及び維持した麻酔下で行い、動物の苦痛を最小限にするためのあらゆる努力を行った。
【０１０７】
グリオブラストーマ幹細胞及び分化細胞の単離及び培養
グリオブラストーマ組織は、適切なインフォームドコンセントのうえで、ＩＲＢに認められたプロトコール（２５５９）に従って、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃで、神経病理診断後に、患者由来の余分な手術切除材料から得た。培養によって誘発される変動を予防するために、患者由来の皮下異種移植片をＮＯＤ−ｓｃｉｄ  ＩＬ２Ｒｇｎｕｌｌマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）で作製し、試験のために、腫瘍細胞の再発源として維持した。異種移植片を取り出したら、パパイン解離システム（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）を使用して、メーカーの指示に従って、腫瘍を解離した。続いて、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ完全培地（ビタミンＡを含まない１×Ｂ２７（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、２ｍＭのＬ−グルタミン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、１０ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）及び１０ｎｇ／ｍｌの上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））で、細胞を培養した。グリオブラストーマ幹細胞（ＧＳＣ）を一律に定めるマーカーはないので、我々は、いくつかの基準を用いて、ＧＳＣを検証した。ＧＳＣ及び分化グリオブラストーマ細胞（ＤＧＣ）のいずれも、解離直後、または免疫不全マウスにおける一過性の異種移植継代後に、予期的なソーティングに続いて、幹細胞マーカーの発現、スフェア形成及び二次性腫瘍の開始を確認するアッセイを用いて、得た２０。マッチしたＧＳＣ及びＤＧＣの培養液を用いる実験のために、我々は、以前に説明されたように２０、ＣＤ１３３／１抗体コンジュゲート磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて、ＡＣ１３３マーカー陽性集団とマーカー陰性集団を分離した。幹細胞マーカーＯＬＩＧ２（Ｒ＆Ｄ、ＡＦ２４１８、ストック：０．２ｍｇ／ｍｌ、希釈率１／１０００）及びＳＯＸ２（Ｒ＆Ｄ、ＡＦ２０１８、ストック：０．２ｍｇ／ｍｌ、希釈率１／１０００）の発現、自己複製の機能アッセイ（ニューロスフェア連続継代）、ならびにインビボ限界希釈を用いた腫瘍伝播によって、ＧＳＣ表現型を検証した。
【０１０８】
増殖及びスフェア形成アッセイ
細胞生存能は、Ｃｅｌｌ−Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。ＺＩＫＶを加えた後、すべてのデータを０日目に対して標準化して、相対細胞数として表した。ニューロスフェア形成を以前、説明されたように２０測定した。簡潔に述べると、ＧＳＣ（１，０００細胞）を９６ウェルプレートに播種した。０日目、３日目、５日目、７日目に、各ウェルのニューロスフェアの存在及び数を記録した。
【０１０９】
ＺＩＫＶ株
ＺＩＫＶダカール４１５１９株（セネガル、１９８４）及びブラジル（パライバ、２０１５）は、Ｗｏｒｌｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  Ａｒｂｏｖｉｒｕｓｅｓ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｒａｎｃｈ）及びＳ．Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）から入手した。親株及びＺＩＫＶ−Ｅ２１８Ａ（ＮＳ５遺伝子の変異株）は、以前、説明されたように１４、部位特異的変異誘発法を用いて、カンボジア株ＦＳＳ１３０２５（２０１０）の感染性ｃＤＮＡクローンから作製した。ＺＩＫＶストックは、ＭＯＩ０．０１で接種し、７２時間インキュベートした後、ベロ細胞において増殖させた。以前、説明されたように３１、プラークアッセイによって、ウイルス力価を定量し、ストックを−８０℃で、１回使用分量で保存した。ＺＩＫＶ株ダカール４１５１９を３回、Ｒａｇ１−／−マウスにおいて継代して、より病原性の高いマウス適合型変異株のＺＩＫＶ−ダカールを作製した３１。
【０１１０】
細胞
１０％ウシ胎児血清（Ａｔｌａｓ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地で、ベロ細胞（アフリカミドリザル腎臓上皮細胞、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−８１）、ＢＶ２細胞（ミクログリア）、ＧＬ２６１（マウスグリオーマ）、ＧＬ２６（マウスグリオーマ、Ｍａｒｉａ  Ｃａｓｔｒｏ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｈｉｇａｎから寄贈）、ＣＴ２Ａ３２（マウスグリオーマ、Ｔｈｏｍａｓ  Ｓｅｙｆｒｉｅｄ，Ｂｏｓｔｏｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ）、ＮＭ５５、ＮＭ１７７またはＤＧＣを維持した。動物実験用に、ＧＬ２６１細胞及びＣＴ２Ａ細胞に、ルシフェラーゼコンストラクトをウイルスによってトランスダクションし、ピューロマイシン（１μｇ／ｍＬ）で選択した。ＧＳＣ、てんかん組織及びグリオブラストーマ組織をＮｅｕｒｏｂａｓａｌ完全培地で維持した。５％  ＣＯ２を添加した加湿インキュベーターで、すべての細胞を３７℃でインキュベートした。いずれの細胞株も、マイコプラズマ陰性であった。ヒト脳標本は、マイコプラズマについては試験しなかった。
【０１１１】
インビトロでのウイルス感染及び薬物処置実験
ＧＳＣを１，０００細胞／ウェルで９６ウェルの組織培養処理プレート（ＴＰＰ）に播種し、一晩付着させた。ウイルス感染及び成長阻害アッセイでは、野生型ＺＩＫＶ−ダカール、ＺＩＫＶ−ブラジルまたはマウス適合型ＺＩＫＶ−ダカールをＭＯＩ５で使用した。薬物・ウイルス併用療法実験では、野生型のＺＩＫＶ−カンボジア親株及びその誘導体ＺＩＫＶ−Ｅ２１８Ａを感染用に使用した。テモゾロミド（ＴＭＺ、Ｓｉｇｍａ）は、ＰＢＳに溶解し、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ完全培地で希釈した。ＺＩＫＶを単独でＭＯＩ５で加えるか、またはＴＭＺ（２５０μＭ）を加える４時間前に加えるかした。後で行う解析のために、細胞上清を−８０℃で保存した。
【０１１２】
感染性ウイルス力価測定
以前、説明されたように３１、ベロ細胞を用いて、フォーカス形成アッセイ（ＦＦＡ）を行った。ＺＩＫＶを含む上清試料を段階希釈し、９６ウェルプレートのベロ細胞単層に加えた。ウイルスに２〜４時間感染させてから、８％ＦＢＳ及び２％メチルセルロースを含む２×ＤＭＥＭの１：１溶液を１００μｌ、細胞に加えた。プレートを４８時間インキュベートしてから、２％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を加えることによって固定した。続いて、細胞を５００ｎｇ／ｍＬのフラビウイルス交差反応性マウスモノクローナル抗体Ｅ６０３１とともに２時間、室温でインキュベートした。１時間、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）の１：５，０００希釈液とともにインキュベート後、ＴｒｕｅＢｌｕｅ基質（ＫＰＬ）を加えることによって、病巣を検出した。病巣は、ＣＴＬ  Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔという計器を用いて解析した。
【０１１３】
組織診断
ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｐｉｃｒｏ−Ｓｉｒｉｕｓ  Ｒｅｄ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ならびにマッソントリクローム（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）をメーカーの指示に従って用いて、パラフィン包埋組織の切片（５μｍ）を解析した。４倍、１０倍及び２０倍の画像を明視野顕微鏡Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ８０ｉ（Ｎｉｋｏｎ）でキャプチャーした。ソフトウェアのＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）及びＭｅｔａｍｏｒｐｈ  ｖ７．７．０．０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて、陽性染色について閾値処理を行い、総組織面積に対して標準化することによって、画像解析を行った３３。
【０１１４】
免疫蛍光染色及び顕微鏡観察
凍結切片（厚さ８μｍ）を風乾し、４％ＰＦＡで１５分固定してから、ＰＢＳで２回洗浄した。スライドをＰＢＳ中の１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で１５分、室温でインキュベートすることによって、組織を透過処理し、１％過酸化水素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で１０分、室温でインキュベートすることによって、ペルオキシダーゼのクエンチを行った。１時間、室温で、ブロッキング緩衝液（１×ＰＢＳ中の５％ヤギ血清、２．５％ＢＳＡ）においてブロックした後、スライドを一晩、加湿チャンバーにおいて４℃で、一次抗体、ＺＩＫＶ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＡＢ１０２１６、希釈率１／１０００）、Ｓｏｘ２（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＡＢ５６０３、ストック：１ｍｇ／ｍｌ、希釈率１／４００）、Ｋｉ−６７（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＡＢ９６２０、希釈率１／４００）、ＧＦＡＰ（Ｓｉｇｍａ、Ｇ９２６９、希釈率１／１０００）、ＰＡＸ６（Ａｂｃａｍ、＃ＡＢ５７９０、ストック：１ｍｇ／ｍｌ、希釈率１／２００）、ＮｅｕＮ（Ａｂｃａｍ、ＡＢ１７７４８７、希釈率１／５００）、Ｓｔａｔ１（Ａｂｃａｍ、ＡＢ３１３６９、ストック：１ｍｇ／ｍｌ、希釈率１／１０００）、ＢｒｄＵ（Ａｂｃａｍ、ＡＢ６３２６、ストック：１ｍｇ／ｍｌ、希釈率１／１０００）、Ｉｆｎａｒ１（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、５０４６９、ストック：１ｍｇ／ｍｌ、希釈率１／１０００）でインキュベートしてから、ＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む１×ＰＢＳ）で洗浄した後、スライドをＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８、５９４または６４７コンジュゲート抗マウス、ラットまたはウサギ二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とともにインキュベートした。その後、スライドを洗浄し、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ  ｗ／ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）を用いて封入した。細胞免疫蛍光染色のために、１０５個の細胞を１２ウェルのチャンバースライド（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に播種し、一晩培養した。続いて、スライドを組織染色のために、上記のように処理した。１０倍、２０倍及び４０倍の画像をＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ８０ｉ  Ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ）で収集した３３。ＤＡＰＩに基づき、細胞を同定した。ソフトウェアのＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）及びＭｅｔａｍｏｒｐｈ  ｖ７．７．０．０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて、陽性染色について閾値処理を行い、総組織面積に対して標準化することによって、画像解析を行った。最初は、定量を非盲検的に行った。しかしながら、重要な結果の多くは、第２の個体によって盲検的に再定量して、バイアスを排除した。
【０１１５】
免疫組織化学
以前、説明されたように３３、組織を１０％ホルマリンで固定し、パラフィン包埋し、抗体とともにインキュベートした。簡潔に述べると、厚さ６μｍの切片をキシレンで脱パラフィンし、段階的なエタノールで再水和し、Ｃｉｔｒａ抗原賦活化液（ＢｉｏＧｅｎｅｘ）において蒸気加熱することによって、抗原賦活化を行った。１時間、室温で、ブロッキング緩衝液（１×ＰＢＳ中の５％ヤギ血清、２．５％ＢＳＡ）においてブロックした後、スライドを一晩、加湿チャンバーにおいて４℃で、一次抗体Ｋｉ−６７（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＡＢ９６２０、希釈率１／４００）またはＧＦＡＰ（Ｓｉｇｍａ、Ｇ９２６９、希釈率１／１０００）とともにインキュベートした。続いて、スライドを室温で３０分、抗ウサギまたは抗マウス二次抗体（ＥｎＶｉｓｉｏｎ＋Ｓｙｓｔｅｍ−ＨＲＰ  Ｌａｂｅｌｌｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒ、Ｄａｋｏ）とともにインキュベートした。３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を用いて、染色を検出した。画像の取得及び解析は、免疫蛍光画像化の場合と同様であった。
【０１１６】
オルガノイド
腫瘍細胞をマトリゲルに懸濁させて、パラフィルムモールド上に２０ｍｌのパールを形成させてから培養することによって、オルガノイドを形成した。オルガノイドを６ウェルまたは１０ｃｍプレートで培養し、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ完全培地中で振とうした。顕微鏡撮像用のＥＶＯＳ  ＦＬ  Ｃｅｌｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、成長オルガノイドの画像を取得した。３５日まで、これらの条件下でオルガノイドを成長させた。オルガノイドをＺＩＫＶ−ダカールまたはＺＩＫＶ−ブラジルに１０６ＦＦＵで２時間感染させてから、培地を除去した。その後、オルガノイドを３回、ＰＢＳで洗浄してから、新鮮なＮｅｕｒｏｂａｓａｌ完全培地を加えた２０。ＥＶＯＳ  Ｃｅｌｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  ３（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、画像を取得した。ＩｍａｇｅＪによって、個々のオルガノイドの面積を測定した。
【０１１７】
イムノブロッティング
細胞を回収し、プロテアーゼ阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、ＥＤＴＡ非含有）を含むＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．５％ＮＰ−４０、５０ｍＭのＮａＦ）で溶解し、氷上で３０分インキュベートした。溶解液を１４，０００×ｒｐｍで、４℃において１０分遠心分離し、上清を回収した。Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、タンパク質濃度を求めた。等量のタンパク質試料をローディングバッファーＳＤＳ  Ｌａｅｍｍｌｉと混合し、煮沸し、ＮｕＰＡＧＥ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて電気泳動してから、ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に転写した。５％脱脂粉乳を添加したＴＢＳＴを用いて、４５分、ブロックを行い、一次抗体によって、４℃で１６時間、ブロッティングを行った。Ｓｏｘ２（Ｒ＆Ｄ、ＡＦ２０１８、ストック：０．２ｍｇ／ｍｌ、希釈率１／１０００）、Ｏｌｉｇ２（Ｒ＆Ｄ、ＡＦ２４１８、ストック：０．２ｍｇ／ｍｌ、希釈率１／１０００）、ＧＦＡＰ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ＰＲＢ−５７１Ｃ、希釈率１／１０００）及びα−チューブリン（Ｓｉｇｍａ、Ｔ６０７４、ストック：２ｍｇ／ｍｌ、希釈率１／１０００）という抗体を使用した。
【０１１８】
動物実験
（ａ）マウス及び腫瘍移植：１０％血清を添加したＤＭＥＭにおいて、ルシフェラーゼをトランスダクションしたマウスグリオブラストーマ細胞（ＧＬ２６１及びＣＴ２Ａ）を成長させた。細胞をトリプシン処理によって回収してから、洗浄し、ＰＢＳに再懸濁した。合計で２×１０４個の細胞を６週齢のＣ５７ＢＬ／６雌マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に移植した。簡潔に述べると、ケタミン（１０ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（１００ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射によってマウスを麻酔し、定位装置（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ）に配置し、頭蓋正中線を横断するように切開した。ラムダ線の１．５ｍｍ前方、かつ正中線の２．５ｍｍ右側に、穿頭を施した。２９．５ゲージのハミルトンシリンジを深さ３ｍｍまで挿入し、深さ２．５ｍｍまで、０．５ｍｍ引き上げた。３μｌのＧＬ２６１またはＣＴ−２Ａ−ｌｕｃ２細胞を５分間にわたって注射した。切開部位をＶｅｔｂｏｎｄ（３Ｍ）によって閉じた。
【０１１９】
（ｂ）処置及びマウスのモニタリング：腫瘍移植から１週間後（ＧＬ２６１）または２週間後（ＧＬ２６１もしくはＣＴ２Ａ）に、マウス適合型ＺＩＫＶ−ダカールの接種または生理食塩水の注射用に、マウスを２群に分けた。正式なマウス無作為化プロセスはなく、マウスを連続的なケージから取り、コントロールまたはウイルスで処置した。１０３または１０５ＦＦＵのマウス適合型ＺＩＫＶ−ダカールを１０μｌの体積で希釈した。この処置には、手術と同じ座標を使用した。マウスの神経学的障害の徴候について、毎日モニタリングした。そのモニターは、行った処置に対して非盲検であった。
【０１２０】
フローサイトメトリー
ＺＩＫＶ感染後の異なる時点に、ＰＢＳで希釈した２％ＰＦＡで細胞を１０分、室温で固定し、ＨＢＳＳ緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１％（ｗ／ｖ）サポニン（Ｓｉｇｍａ）及び０．０２５％ＮａＮ３）で１０分、室温で透過処理した。ＧＳＣをＶ底プレート（Ｃｏｓｔａｒ）に移し、２μｇ／ｍＬのＺＶ−６４ｍＡｂで１時間、４℃でインキュベートした３４。洗浄後、細胞をＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに３０分、４℃でインキュベートし、ＨＢＳＳ緩衝液で２回洗浄し、ＦＡＣＳ  Ａｒｒａｙ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で処理し、ソフトウェアのＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ）を用いて解析した。
【０１２１】
生物発光イメージング
腫瘍細胞の移植の１週間後に開始して、生物発光イメージングを用いて、脳腫瘍形成を検出した。イソフルラン麻酔（Ｏ２中で２％気化）下のマウスに、Ｄ−ルシフェリン（ＰＢＳ中の１５０ｍｇ／ｋｇ、Ｇｏｌｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を腹腔内注射し、ＩＶＩＳ５０（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて画像化した。暴露時間は、１０秒または６０秒であり、ソフトウェアによって定義した当該輪郭領域を使用して、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  ２．６を用いて全光子束（光子／秒）を測定した。
【０１２２】
ＺＩＫＶ  ＲＮＡの定量ＲＴ−ＰＣＲ
標準的なサイクル条件を用いて、ＡＢＩ  ７５００  Ｆａｓｔ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔでの１段階定量逆転写酵素ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）によって、ＺＩＫＶ  ＲＮＡレベルを求めた。ウイルス負荷量は、ＺＩＫＶ  ＲＮＡの１０倍段階希釈液を用いて作成した検量線と比較後に、ｌｏｇ１０スケールで、１ｇ当たりのウイルスＲＮＡ相当量として表した。ＺＩＫＶでは、５’−ＣＣＡＣＣＡＡＴＧＴＴＣＴＣＴＴＧＣＡＧＡＣＡＴＡＴＴＧ−３’（フォワード）（配列番号１）、５’−ＴＴＣＧＧＡＣＡＧＣＣＧＴＴＧＴＣＣＡＡＣＡＣＡＡＧ−３’（リバース）（配列番号２）及び５’−５６−ＦＡＭ／ＡＧＣＣＴＡＣＣＴ  ＴＧＡＣＡＡＧＣＡＧＴＣ／３ＩＡＢｋＦＱ−３’（プローブ）（配列番号３）というプライマーセットを使用した。
【０１２３】
ＧＳＣ及びＤＧＣの定量ＲＴ−ＰＣＲ
Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて全細胞ＲＮＡを単離してから、ｑＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｑｕａｎｔａ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、ｃＤＮＡに逆転写した。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７９００ＨＴというサイクラーを用いて、ＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、リアルタイムＰＣＲを行った。遺伝子特異的プライマーセットの配列は、以下のとおりであった。
【０１２４】
ヒトＩＦＮＡＲ１のフォワードプライマーは、５’−ＡＡＣ  ＡＧＧ  ＡＧＣ  ＧＡＴ  ＧＡＧ  ＴＣＴ  ＧＴＣ−３’（配列番号４）であり、リバースプライマーは、５’−ＴＧＣ  ＧＡＡ  ＡＴＧ  ＧＴＧ  ＴＡＡ  ＡＴＧ  ＡＧＴ  ＣＡ−３’（配列番号５）であり、ヒトＳＴＡＴ１のフォワードプライマーは、５’−ＣＡＧ  ＣＴＴ  ＧＡＣ  ＴＣＡ  ＡＡＡ  ＴＴＣ  ＣＴＧ  ＧＡ−３’（配列番号６）であり、リバースプライマーは、５’−ＴＧＡ  ＡＧＡ  ＴＴＡ  ＣＧＣ  ＴＴＧ  ＣＴＴ  ＴＴＣ  ＣＴ−３’（配列番号７）であり、ヒトＩＲＦ１のフォワードプライマーは、５’−ＡＴＧ  ＣＣＣ  ＡＴＣ  ＡＣＴ  ＣＧＧ  ＡＴＧ  Ｃ−３’（配列番号８）であり、リバースプライマーは、５’−ＣＣＣ  ＴＧＣ  ＴＴＴ  ＧＴＡ  ＴＣＧ  ＧＣＣ  ＴＧ−３’（配列番号９）であり、ヒトＩＦＩＴ１のフォワードプライマーは、５’−ＡＴＧ  ＡＣＧ  ＡＴＧ  ＡＡＡ  ＴＧＣ  ＣＴＧ  Ａ’（配列番号１０）であり、リバースプライマーは、５’−ＣＡＧ  ＧＴＣ  ＡＣＣ  ＡＧＡ  ＣＴＣ  ＣＴＣ  ＡＣ−３’（配列番号１１）であり、ヒトＯＡＳ２−１のフォワードプライマーは、５’−ＣＴＣＡＧＡＡＧＣＴＧＧＧＴＴＧＧＴＴＴＡＴ−３’（配列番号１２）であり、リバースプライマーは、５’−ＡＣＣＡＴＣＴＣＧＴＣＧＡＴＣＡＧＴＧＴＣ−３’（配列番号１３）であり、ヒトＩＦＩＨ１のフォワードプライマーは、５’−ＴＣＧ  ＡＡＴ  ＧＧＧ  ＴＡＴ  ＴＣＣ  ＡＣＡ  ＧＡＣ  Ｇ−３’（配列番号１４）であり、リバースプライマーは、５’−ＧＴＧ  ＧＣＧ  ＡＣＴ  ＧＴＣ  ＣＴＣ  ＴＧＡ  Ａ−３’（配列番号１５）であり、１８Ｓ  ＲＮＡのフォワードプライマーは、５’−ＡＡＣＣＣＧＴＴＧＡＡＣＣＣＣＡＴＴ−３’（配列番号１６）であり、リバースプライマーは、５’−ＣＣＡＴＣＣＡＡＴＣＧＧＴＡＧＴＡＧＣＧ−３’（配列番号１７）であり、ＧＡＰＤＨのフォワードプライマーは、５’−ＣＣＴＧＴＴＣＧＡＣＡＧＴＣＡＧＣＣＧ−３’（配列番号１８）であり、リバースプライマーは、５’−ＣＧＡＣＣＡＡＡＴＣＣＧＴＴＧＡＣＴＣＣ−３’（配列番号１９）であった。
【０１２５】
ＲＮＡ−シーケンシングデータの取得、品質管理及び処理
ＺＩＫＶ−ダカールに４８〜５６時間感染させたＧＳＣからＲＮＡを得た。ＲＮｅａｓｙ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、全細胞ＲＮＡを単離した。ＳＴＡＲ（バージョン２．５．１ａ）によって、ＲＮＡ配列リードをＥｎｓｅｍｂｌ  ｒｅｌｅａｓｅ  ７６のアセンブリーにアラインメントした。Ｓｕｂｒｅａｄ：ｆｅａｔｕｒｅ  Ｃｏｕｎｔ（バージョン１．４．６ｐ５）によって一意にアラインメントされた非曖昧（ｕｎａｍｂｉｇｕｏｕｓ）リードの数から、遺伝子数を抽出した。転写産物カウントをＳａｉｌｆｉｓｈ（バージョン０．６．３）によって生成した。ＲＳｅＱＣ（バージョン２．６．２）によって、アラインメントされたリードの総数、一意にアラインメントされたリードの総数、検出された遺伝子及び転写産物、リボソーム分画、既知の連結部の飽和度、ならびに既知の遺伝子モデルにわたるリード分布に関して、シーケンシング性能を評価した。
【０１２６】
すべての遺伝子レベル及び転写産物の数をＲ／ＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージＥｄｇｅＲにインポートし、ＴＭＭ正規化サイズ係数を算出して、試料のライブラリーサイズの差を調整した。いずれかの試料で発現しなかった遺伝子または転写産物を、さらなる解析から除外した。ＴＭＭサイズ係数及びカウントマトリックスをＲ／ＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージＬｉｍｍａにインポートし、すべての試料において、Ｖｏｏｍ機能によって、すべての遺伝子／転写産物の平均と分散の関係の観察結果に基づく重み付き尤度を算出した。スピアマンの相関マトリックス及び多次元尺度プロットによって、試料の性能を評価した。ロバストな当て嵌めを行った残差傾向線を用いて、全遺伝子の平均ログカウントに対する全遺伝子の残差標準偏差をプロットすることによって、遺伝子／転写産物の性能を評価した。一般化線形モデルを作成して、遺伝子／転写産物レベルの発現差について試験した。続いて、０．０５以下であるＦＤＲ補正済みのｐ値で、示差的に発現した遺伝子及び転写産物をフィルタリングした。
【０１２７】
大規模な転写産物セットの生物学的解釈を増強するために、Ｒ／ＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージのＧＡＧＥ及びＰａｔｈｖｉｅｗを用いて、機能類似性に基づく、遺伝子／転写産物のグループ分けを行った。ＫＥＧＧがキュレーションした既知のシグナル伝達経路及び代謝経路の経路マップを作成するのにも、ＧＡＧＥ及びＰａｔｈｖｉｅｗを用いた。
【０１２８】
マッチしたＧＳＣ及びＤＧＣ株に関して、遺伝子セットエンリッチメント解析を用いて、ＧＳＣ及びＤＧＣ間のＩ型及びＩＩ型ＩＦＮシグネチャーについて、ＲＮＡシーケンシングデータを評価し、Ｓｕｖａ  ｅｔ  ａｌの文献３５に由来する、マッチした追加の細胞株に関するＲＮＡシーケンシングデータを用いて検証した。ＩＦＮシグネチャーは、Ｂｒｏａｄ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅがキュレーションしたＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ３６（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｒｏａｄ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｇｓｅａ／）から得た。マッチしたＴＰＣ株及びＤＧＣ株から得たＦＰＫＭ値を用いて、教師なしの階層クラスタリングを行った。
【０１２９】
統計解析
ソフトウェアのＰｒｉｓｍ７．０（Ｇｒａｐｈｐａｄ）を用いて、すべての統計解析を行った。マウスの数及び反復インビトロ実験の回数は、図の各凡例に明記されている。サンプルサイズを予め定めるのに、統計的な方法を用いなかったが、サンプルサイズの選択は、過去の文献２０，３３に報告されているものと同様である。腫瘍移植及びウイルス注入手術後に生存し続けたすべてのマウスを解析に含めた。図の各凡例に示されているように、グループ分けしたデータはすべて、平均±ＳＤまたはＳＥＭとして表した。スチューデントｔ検定、多重比較補正を施した一元ＡＮＯＶＡ、及び多重比較補正を施した二元ＡＮＯＶＡを用いて、群間差の有意性を評価した。それぞれ、平均が正規分布するか、または残差分布が正規性であると仮定されるほど、サンプルサイズが充分に大きかった場合に、これらの検定を行った。統計的に比較する群では、データの分散は同程度であった。マウスの生存解析の際には、カプラン・マイヤー曲線を作成し、ログランク検定を行って、群間の統計的有意性を評価した。
【０１３０】
データ可用性
承認の際に、すべてのＲＮＡシーケンシングデータをＧｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓ（ＧＥＯ）のデータレポジトリーに寄託することになる。
【０１３１】
実施例１〜１０の考察
ＧＢＭ及びその他のタイプのがんでは、がん幹細胞は、放射線療法、化学療法、分子標的療法及び免疫療法に対する耐性により、腫瘍悪性化に寄与し、有効な抗ＣＳＣ療法に対する差し迫ったニーズの裏付けとなっている３。この知見によって、神経前駆細胞に対するＺＩＫＶの独特のトロピズムにより、ＺＩＫＶによって、混合腫瘍細胞集団を標的とする、より従来型の療法（例えば細胞傷害性化学療法）と併用できるテーラーメイド療法を実現し得ることが示唆されている。今後の遺伝子操作如何により、ＺＩＫＶは、神経腫瘍学における重要なツールとなり得る。
【０１３２】
実施例１１：グリオブラストーマのジカウイルスによる治療を促進するための免疫チェックポイント阻害剤
上記のように、我々は最近、ＧＳＣを殺傷するために、ＺＩＫＶを初めて使用したことを示した。我々は、このウイルスが、患者由来のＧＳＣを殺傷し、分化（非ＧＳＣ）腫瘍細胞または正常なヒト脳細胞に及ぼす作用が最小限であることを示した。ＺＩＫＶによる治療は、同系脳腫瘍を有するマウスの生存期間を２〜３倍延長し、このウイルスは、腫瘍床に留まる。インビトロでの我々の知見は、患者由来のＧＢＭオルガノイド及び脳切片を用いて再現され、ＺＩＫＶは、新鮮な脳切片内のＧＳＣを標的とした一方で、てんかん手術から得た正常な脳切片に対する影響は見られなかった。重要なことに、我々がマウスで観察した生存結果及び腫瘍の縮小により、ＺＩＫＶによる治療には、ＧＳＣの死滅を超越した間接的な作用があったことが示唆されている。我々は、ＺＩＫＶが、腫瘍指向性の免疫応答を開始させると提議する。
【０１３３】
免疫チェックポイント阻害剤は、脳転移に対して顕著な作用を有し、脳における活性、または脳に入り込む免疫細胞に対する活性を有することが示唆されている。しかしながら、ＧＢＭにおけるチェックポイント阻害剤の試験では、これまでのところ効果が見られていない。例えば、ニボルマブの有効性及び安全性を試験した無作為化第ＩＩＩ相試験の予備的な結果（ＣｈｅｃｋＭａｔｅ１４３試験）が、２０１７年６月に、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙの年次会合で示された。ニボルマブは、安全であるが、再発ＧＢＭにおける全奏効率は、現在の標準薬であるベバシズマブ（血管新生をブロックするモノクローナル抗体）よりも低かったことをＲｅａｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌが示した。興味深いことに、奏効を示し患者では、奏効は、ニボルマブ群における方が、顕著に持続性が高かった。これにより、チェックポイント阻害剤は、安全であり、おそらく有効であり得ることが示唆されているが、我々は、有効性を得るには、さらに強い免疫刺激が必要となるという仮説を立てている。
【０１３４】
我々は、本発明では、弱毒化ジカウイルスの後に、免疫チェックポイント阻害剤を用いて、ＧＢＭを治療することを提案する。我々は、最も攻撃性の高い脳腫瘍に対する新たな治療パラダイムを開発しているので、この研究は重要である。この研究は、ＺＩＫＶの狙い撃ち能力を用いて、ＧＳＣを標的として殺傷するとともに、有効性はそのままで、安全性が向上するように、我々が遺伝子操作した独自の弱毒化ＺＩＫＶを用いるので、革新的である。加えて、脳腫瘍を治療するために、今まで、チェックポイント阻害剤と組み合わされた腫瘍溶解性ウイルスは、他にはない。
【０１３５】
我々の療法レジメンは、すべての再発グリオブラストーマ患者に有益と思われ、我々は、有益と分かった場合には、診断時の初期段階において、標準的なテモゾロミド及び放射線と組み合わせて、本発明のレジメンを提議するであろう。第Ｉ相試験では、主要評価項目は、静脈内送達するチェックポイント阻害剤（ジカウイルスの２週間後に開始）の既知の最大用量と組み合わせて、頭蓋内送達するジカウイルスの最大安全濃度（最大で１０８ＦＦＵ）となる。副次評価項目は、処置した腫瘍における免疫浸潤の判定、及び血中の活性化Ｔ細胞集団との相関となる。インサイチュハイブリダイゼーションによって、腫瘍内で、注射部位と関連させて、ジカウイルス分布を検出することになる。第ＩＩ相試験では、主要評価項目は、ＧＢＭの再発までの時間となる。この試験では、我々は、ＺＩＫＶ及びチェックポイント阻害剤を、現在の再発時の標準治療剤であるベバシズマブと比較することになる。ＧＢＭにおいて、腫瘍溶解性ウイルスと免疫チェックポイント阻害剤の組み合わせについて調べた試験は、他にはない。
【０１３６】
実施例１２：弱毒化ジカウイルス株の作製
我々は、クローニングしたｃＤＮＡ骨格（ＺＩＫＶダカール４１５２５株）からジカウイルス株を作製した。このクローンに、ヒト細胞におけるビルレンスを維持したままで、マウスに適合するようにするＮＳ４Ｂ（Ｇ１８Ｒ）変異を加えた（Ｇｏｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８）。ｃＤＮＡクローンからこのように作製することで、我々の生成物に一貫性を持たせるとともに、より安全な生成物となる。このジカウイルス株において、継代株と同様の作用が見られることを我々は確認した（図１４）。我々は、クローニングしたｃＤＮＡ骨格から弱毒化株を作製するのに成功し、下記の株を作製した。
ａ）ＺＩＫＶダカールＮＳ４Ｂ（Ｇ１８Ｒ）−ＮＳ３（Ｋ３９９Ｒ）
ｂ）ＺＩＫＶダカールＮＳ３（Ｋ３９９Ｒ）
ｃ）ＺＩＫＶダカールＮＳ４Ｂ（Ｇ１８Ｒ）−ＮＳ５（Ｅ２１８Ａ）
ｄ）ＺＩＫＶダカールＮＳ４Ｂ（Ｇ１８Ｒ）−Ｅ（Ｎ１５４Ｑ  Ｔ１５６Ｖ）
ｅ）ＺＩＫＶダカールＮＳ４Ｂ（Ｇ１８Ｒ）−Δ３’ＵＴＲ
【０１３７】
マウス適合型の継代株において、ＮＳ３（Ｋ３９９Ｒ）変異が見られるが、適合のために必要となる可能性は低い（Ｇｏｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８）。ＮＳ５（Ｅ２１８Ａ）変異によって、ウイルスが、Ｉ型インターフェロン及びＩＦＩＴ１による翻訳阻害に感作され、その結果、Ｉ型インターフェロンに応答する細胞において弱毒化される（Ｄａｆｆｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。エンベロープタンパク質Ｅ（Ｎ１５４Ｑ  Ｔ１５６Ｖ）の変異によって、内皮バリアを通じたウイルス伝播が制限される。３’非翻訳領域における１０ヌクレオチドの欠失（Δ３’ＵＴＲ）により、短鎖フラビウイルスＲＮＡの産生が阻止され、この欠失によっても、Ｉ型インターフェロンに応答する細胞において弱毒化される。
【０１３８】
ヒトＧＢＭ細胞におけるＮＳ５変異体ウイルスの活性を我々は確認した（Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）。また、我々は、クローニングしたｃＤＮＡから作製した弱毒化ＺＩＫＶ株が、インビボで、ヒトグリオブラストーマ幹細胞において有意な有効性を有することを試験して確認した（図１５）。
【０１３９】
我々は、ＺＩＫＶによる治療は、腫瘍細胞に対する直接的な腫瘍溶解作用に加えて、腫瘍領域において、免疫細胞の浸潤を引き起こすことを見出した（図１６）。このことから、免疫系に影響を与える療法と組わせて、ＺＩＫＶによる治療を用いことによって、がんに対して、新たな治療パラダイムをもたらし得ることが示唆されている。
【０１４０】
がんの治療で用いられる弱毒化ＺＩＫＶとしては、以下のものが挙げられる。
ａ）ＺＩＫＶ２’−Ｏメチルトランスフェラーゼ活性に影響を及ぼすすべての変異（例えば、ＮＳ５  Ｅ２１８Ａ）
ｂ）ＺＩＫＶ  Ｅ及びＮＳ１タンパク質のＮ−結合型糖鎖結合に影響を及ぼすすべての変異
ｃ）ｓｆＲＮＡの産生またはインターフェロン拮抗作用に影響を及ぼす、３’−ＵＴＲにおける欠失をもたらすすべての変異
ｄ）インターフェロン拮抗作用またはオートファジー経路に影響を及ぼす、ＮＳ４Ｂにおけるすべての変異
【０１４１】
そして、我々は、ＺＩＫＶが、多発性骨髄腫において活性を有することを見出した（図１７）。
【０１４２】
実施例の参照文献
１．Ｓｔｕｐｐ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔ  ａｎｄ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ  ｖｅｒｓｕｓ  ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｌｏｎｅ  ｏｎ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｉｎ  ａ  ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ  ｐｈａｓｅ  ＩＩＩ  ｓｔｕｄｙ：５−ｙｅａｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＥＯＲＴＣ−ＮＣＩＣ  ｔｒｉａｌ．Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ．  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １０，４５９−４６６，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｓ１４７０−２０４５（０９）７００２５−７（２００９）．
２．Ｃｈｅｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｐｒｏｐａｇａｔｅｓ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｆｔｅｒ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔｕｒｅ  ４８８，５２２−５２６，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１１２８７（２０１２）．
３．Ａｌｖａｒａｄｏ，Ａ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｅｖａｄｅ  Ｉｎｎａｔｅ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｅｌｆ−Ｒｅｎｅｗａｌ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｒｅｄｕｃｅｄ  ＴＬＲ４  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｃｅｌｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ２０，４５０−４６１．ｅ４５４，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍ．２０１６．１２．００１（２０１７）．
４．Ｂａｏ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｌｉｏｍａ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｒａｄｉｏｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｂｙ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ４４４，７５６−７６０，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０５２３６（２００６）．
５．Ｗａｌｌｎｅｒ，Ｋ．Ｅ．，Ｇａｌｉｃｉｃｈ，Ｊ．Ｈ．，Ｋｒｏｌ，Ｇ．，Ａｒｂｉｔ，Ｅ．＆  Ｍａｌｋｉｎ，Ｍ．Ｇ．Ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｏｆ  ｆａｉｌｕｒｅ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ  ａｎｄ  ａｎａｐｌａｓｔｉｃ  ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ＊Ｂｉｏｌｏｇｙ＊Ｐｈｙｓｉｃｓ  １６，１４０５−１４０９，ｄｏｉ：１０．１０１６／０３６０−３０１６（８９）９０９４１−３（１９８９）．
６．Ｋａｕｆｍａｎｎ，Ｊ．Ｋ．＆  Ｃｈｉｏｃｃａ，Ｅ．Ａ．Ｇｌｉｏｍａ  ｖｉｒｕｓ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｂｅｎｃｈ  ａｎｄ  ｂｅｄｓｉｄｅ．Ｎｅｕｒｏ−ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １６，３３４−３５１，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎｅｕｏｎｃ／ｎｏｔ３１０（２０１４）．
７．Ｍｉｓｋａ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉ−ＧＩＴＲ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｇｌｉｏｍａ  ｉｎ  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ６５，１５５５−１５６７，ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ００２６２−０１６−１９１２−８（２０１６）．
８．Ｃａｔｔａｎｅｏ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｈｏｗ  ｔｏ  ｄｅｖｅｌｏｐ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｉｎｔｏ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｗｅａｐｏｎｓ．ＰＬＯＳ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ  １３，ｅ１００６１９０，ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｐａｔ．１００６１９０（２０１７）．
９．Ｍａｒｔｕｚａ，Ｒ．，Ｍａｌｉｃｋ，Ａ．，Ｍａｒｋｅｒｔ，Ｊ．，Ｒｕｆｆｎｅｒ，Ｋ．＆  Ｃｏｅｎ，Ｄ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｇｌｉｏｍａ  ｂｙ  ｍｅａｎｓ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｍｕｔａｎｔ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）  ２５２（１９９１）．
１０．Ａｌｏｎｓｏ，Ｍ．Ｍ．，Ｊｉａｎｇ，Ｈ．，Ｇｏｍｅｚ−Ｍａｎｚａｎｏ，Ｃ．＆  Ｆｕｅｙｏ，Ｊ．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｂｒａｉｎ  ｔｕｍｏｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）  ７９７，１１１−１２５，ｄｏｉ：１０．１００７／９７８−１−６１７７９−３４０−０＿９（２０１２）．
１１．Ｃａｓｓａｄｙ，Ｋ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｅ−ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃ１３４，ａ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  Ｈｅｒｐｅｓ  Ｓｉｍｐｌｅｘ  Ｖｉｒｕｓ，ｉｎ  Ｍｉｃｅ  ａｎｄ  Ｎｏｎ−ｈｕｍａｎ  Ｐｒｉｍａｔｅｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｎｃｏｌｙｔｉｃｓ  ５，１−１０，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｏｍｔｏ．２０１７．０２．００１（２０１７）．
１２．Ｌａｚｅａｒ，Ｈ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｚｉｋａ  Ｖｉｒｕｓ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｃｅｌｌ  ｈｏｓｔ  ＆  ｍｉｃｒｏｂｅ  １９，７２０−７３０，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｈｏｍ．２０１６．０３．０１０（２０１６）．
１３．Ｑｉａｎ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｒａｉｎ−Ｒｅｇｉｏｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｏｒｇａｎｏｉｄｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｍｉｎｉ−ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ＺＩＫＶ  Ｅｘｐｏｓｕｒｅ．Ｃｅｌｌ  １６５，１２３８−１２５４，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１６．０４．０３２（２０１６）．
１４．Ｓｈａｎ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ａｎ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｃＤＮＡ  Ｃｌｏｎｅ  ｏｆ  Ｚｉｋａ  Ｖｉｒｕｓ  ｔｏ  Ｓｔｕｄｙ  Ｖｉｒａｌ  Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ，Ｍｏｓｑｕｉｔｏ  Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ，ａｎｄ  Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ｃｅｌｌ  Ｈｏｓｔ  ＆  Ｍｉｃｒｏｂｅ  １９，８９１−９００，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｈｏｍ．２０１６．０５．００４（２０１６）．
１５．Ｌｉ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｃｅｌｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  Ｖｏｌ．１９  ５９３−５９８（２０１６）．
１６．Ｍｉｎｇ，Ｇ．−ｌ．，Ｔａｎｇ，Ｈ．＆  Ｓｏｎｇ，Ｈ．Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｚｉｋａ  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ：Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｄｅｌｓ，Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ，ａｎｄ  Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ．Ｃｅｌｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  １９，６９０−７０２，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍ．２０１６．１１．０１４（２０１６）．
１７．Ｇａｒｃｅｚ，Ｐ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ｚｉｋａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｍｐａｉｒｓ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅｓ  ａｎｄ  ｂｒａｉｎ  ｏｒｇａｎｏｉｄｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）  ３５２（２０１６）．
１８．Ｇａｂｒｉｅｌ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｃｅｌｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  Ｖｏｌ．２０  ３９７−４０６．ｅ３９５（２０１７）．
１９．Ｐａｒｒａ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｕｉｌｌａｉｎ−Ｂａｒｒｅ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｚｉｋａ  Ｖｉｒｕｓ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｏｌｏｍｂｉａ．Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３７５，１５１３−１５２３，ｄｏｉ：１０．１０５６／ＮＥＪＭｏａ１６０５５６４（２０１６）．
２０．Ｗａｎｇ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｕｒｉｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  ｂｒａｉｎ  ｔｕｍｏｒ  ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｇｌｉｏｍａ．Ｎａｔｕｒｅ  ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｎ．４５３７（２０１７）．
２１．Ｌｉｕ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｓａｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｗｉｔｈ  ｄｏｕｂｌｅ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｏｆ  ｏｒｉｇｉｎ  ｉｎ  ｇｌｉｏｍａ．Ｃｅｌｌ  １４６，２０９−２２１，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１１．０６．０１４（２０１１）．
２２．Ｐａｓｔｒａｎａ，Ｅ．，Ｓｉｌｖａ−Ｖａｒｇａｓ，Ｖ．＆  Ｄｏｅｔｓｃｈ，Ｆ．Ｅｙｅｓ  ｗｉｄｅ  ｏｐｅｎ：ａ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｓｐｈｅｒｅ−ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｓ  ａｎ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ８，４８６−４９８，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍ．２０１１．０４．００７（２０１１）．
２３．Ｓｏｕｔｈａｍ，Ｃ．Ｍ．＆  Ｍｏｏｒｅ，Ａ．Ｅ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｓ  ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ａｇｅｎｔｓ，ｗｉｔｈ  ｐａｒｔｉｃｕｌａｒ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｔｏ  ｅｇｙｐｔ  １０１  ｖｉｒｕｓ．Ｃａｎｃｅｒ  ５，１０２５−１０３４，ｄｏｉ：１０．１００２／１０９７−０１４２（１９５２０９）５：５＜１０２５：：ＡＩＤ−ＣＮＣＲ２８２００５０５１８＞３．０．ＣＯ；２−Ｑ（１９５２）．
２４．Ｍｏｏｒｅ，Ａ．Ｅ．Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｖｉｒｕｓｅｓ  ｏｎ  Ｔｕｍｏｒｓ．Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ８，３９３−４１０，ｄｏｉ：１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ．ｍｉ．０８．１００１５４．００２１４１（１９５４）．
２５．Ｃｈｏ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｐｒｏｇｒａｍｓ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｓｕｂｔｙｐｅｓ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｒａｉｎ  ｂｙ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ  ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １９，４５８−４６４，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ．３１０８（２０１３）．
２６．Ｈｕｂｅｒｔ，Ｃ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  Ｔｈｒｅｅ−Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｏｒｇａｎｏｉｄ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａｓ  Ｒｅｃａｐｉｔｕｌａｔｅｓ  ｔｈｅ  Ｈｙｐｏｘｉｃ  Ｇｒａｄｉｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｒｓ  Ｆｏｕｎｄ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ．Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７６，２４６５−２４７７，ｄｏｉ：１０．１１５８／０００８−５４７２．ｃａｎ−１５−２４０２（２０１６）．
２７．Ｓｉｎｇｈ，Ｓ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｂｒａｉｎ  ｔｕｍｏｕｒ  ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４３２，３９６−４０１，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０３１２８（２００４）．
２８．Ｂｒｏｗｎ，Ｍ．Ｃ．＆  Ｇｒｏｍｅｉｅｒ，Ｍ．Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １３，８１−８５，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｏｖｉｒｏ．２０１５．０５．００７（２０１５）．
２９．Ｓａｐｐａｒａｐｕ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｐｒｅｖｅｎｔ  Ｚｉｋａ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｅｔａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ５４０，４４３−４４７，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ２０５６４（２０１６）．
３０．Ｄａｆｆｉｓ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．２’−Ｏ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｖｉｒａｌ  ｍＲＮＡ  ｃａｐ  ｅｖａｄｅｓ  ｈｏｓｔ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ＩＦＩＴ  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒｓ．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０９４８９．
３１．Ｇｏｖｅｒｏ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｚｉｋａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｄａｍａｇｅｓ  ｔｈｅ  ｔｅｓｔｅｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ５４０，４３８−４４２，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ２０５５６（２０１６）．
３２．Ｏｈ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １２，１０７，ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７９−５８７６−１２−１０７（２０１４）．
３３．Ｊｉａｎｇ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｆｏｃａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｒｅｎｄｅｒｓ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒｓ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｔｏ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２２，８５１−８６０，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ．４１２３（２０１６）．
３４．Ｚｈａｏ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｚｉｋａ  Ｖｉｒｕｓ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ  １６６，１０１６−１０２７，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１６．０７．０２０（２０１６）．
３５．Ｓｕｖａ，Ｍ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｔｈｅ  ｔｕｍｏｒ−ｐｒｏｐａｇａｔｉｎｇ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｓｔｅｍ−ｌｉｋｅ  ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ  １５７，５８０−５９４，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１４．０２．０３０（２０１４）．
３６．Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  ｓｅｔ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ：ａ  ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ−ｂａｓｅｄ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｒｐｒｅｔｉｎｇ  ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０２，１５５４５−１５５５０，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０５０６５８０１０２（２００５）．
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図１−７】
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【図１−８】
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【図１−９】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図２−６】
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【図２−７】
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【図２−８】
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【図２−９】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図３−６】
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【図３−７】
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【図３−８】
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【図３−９】
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【図３−１０】
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【図３−１１】
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【図３−１２】
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【図３−１３】
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【図３−１４】
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【図３−１５】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図４−５】
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【図４−６】
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【図４−８】
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【図４−９】
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【図４−１０】
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【図４−１１】
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【図４−１２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【図５−６】
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【図５−７】
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【図６−１】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−６】
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【図８−７】
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【図８−８】
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【図８−９】
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【図８−１０】
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【図８−１１】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−４】
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【図９−６】
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【図９−７】
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【図９−８】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１０−５】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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