(57)【要約】本明細書において、オトペトリンポリペプチドを含む組成物及び装置、並びに、オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分を通るプロトン転移活性の調節物質を同定するためのその使用が提示される。【選択図】  図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
オトペトリン介在性のプロトン転移活性の調節物質を同定する方法であって、
（ａ）オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分を、試験化合物と接触させるステップ、及び
（ｂ）オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分が介在するプロトン転移活性を判定するステップ
を含み、試験化合物の非存在下で判定されたプロトン転移活性の量と比較した前記プロトン転移活性の少なくとも１％の増大又は低減が、前記試験化合物を、オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分が介在するプロトン転移活性の調節物質として同定する、方法。
【請求項２】
（ｂ）で判定された前記プロトン転移活性と、前記試験化合物の非存在下でオトペトリンポリペプチド又はその機能的部分について判定されたプロトン転移活性とを比較するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
プロトン転移活性の少なくとも１％の増大が、前記試験化合物を、オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分が介在するプロトン転移活性のアゴニストであると同定する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
プロトン転移活性の少なくとも１％の減少が、前記試験化合物を、オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分が介在するプロトン転移活性のアンタゴニストであると同定する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記オトペトリンポリペプチドが、哺乳動物のオトペトリンポリペプチド又はその機能的部分を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記哺乳動物のオトペトリンポリペプチドが、Ｏｔｏｐ１、Ｏｔｏｐ２、Ｏｔｏｐ３、及びその機能的部分から選択されるポリペプチド配列を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記オトペトリンポリペプチドが、昆虫のオトペトリンポリペプチド又はその機能的部分を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分が、内在性膜タンパク質である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分が、細胞膜又は合成膜と共役している、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記プロトン転移活性を判定するステップが、伝導性、電流、細胞内ｐＨ、細胞内カルシウム、又はオトペトリンポリペプチド若しくはその機能的部分を含む膜にわたる電圧電位若しくは抵抗を測定することを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記伝導性、前記電流、前記細胞内ｐＨ、前記細胞内カルシウム、前記電圧電位、又は前記抵抗が、ｐＨの変化に応答して測定される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記プロトン転移活性を判定するステップが、パッチクランプ技術、電圧クランプ技術、ホールセル電流の測定、放射性標識されたイオン流束アッセイ、又はｐＨ感受性の指標の使用を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ｐＨ感受性の指標が、ｐＨｌｕｏｒｉｎ又はｐＨｒｏｄｏレッドを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記プロトン転移活性を判定するステップが、オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分を細胞で発現させることを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞が、トランスフェクトされた哺乳動物細胞である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞が卵母細胞である、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記試験化合物が、有機低分子、無機低分子、求電子剤、多糖、ペプチド、タンパク質、抗体、核酸、及び抽出物からなる群から選択され、前記抽出物が、細菌、植物、真菌、動物細胞、及び動物組織から選択される生物学的材料に由来する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記試験化合物が５０〜５０００００ダルトンの範囲の分子量を有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記試験化合物が、約０．１ｕＭ〜約１０００ｍＭの範囲の濃度である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
オトペトリン介在性のプロトン転移活性の調節物質を同定する方法であって、
（ａ）（ｉ）試験化合物の存在下で、及び（ｉｉ）試験化合物の非存在下で、オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分が介在するプロトン転移活性を測定するステップ、及び
（ｂ）（ａ）の（ｉ）で測定されたプロトン転移活性と、（ａ）の（ｉｉ）で測定されたプロトン転移活性とを比較した差を判定し、この判定によって、試験化合物を、オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分が介在するプロトン転移活性の調節物質として同定するステップ
を含む、方法。
【請求項２１】
前記差が少なくとも１％の差である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
（ａ）の（ｉ）で測定された前記プロトン転移活性が、（ａ）の（ｉｉ）で測定されたプロトン転移活性よりも少なくとも１％大きく、前記試験化合物が（ｂ）において、オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分が介在するプロトン転移活性のアゴニストとして同定される、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２３】
（ａ）の（ｉ）で測定された前記プロトン転移活性が、（ａ）の（ｉｉ）で測定されたプロトン転移活性よりも少なくとも１％小さく、前記試験化合物が（ｂ）において、オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分が介在するプロトン転移活性のアンタゴニストとして同定される、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記オトペトリンポリペプチドが、哺乳動物のオトペトリンポリペプチド又はその機能的部分を含む、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記哺乳動物のオトペトリンポリペプチドが、マウス又はヒトのＯｔｏｐ１、Ｏｔｏｐ２、Ｏｔｏｐ３、及びその機能的部分から選択されるポリペプチド配列を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記オトペトリンポリペプチドが、昆虫のオトペトリンポリペプチド又はその機能的部分を含む、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分が内在性膜タンパク質である、請求項２０〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分が、細胞膜若しくは合成膜と共役しているか又は細胞膜若しくは合成膜に組み込まれる、請求項２０〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記プロトン転移活性を測定するステップが、伝導性、電流、オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分を含む膜にわたる電圧電位又は抵抗を測定することを含む、請求項２０〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記プロトン転移活性を測定するステップが、ｐＨの変化に応答した、伝導性、電流、細胞内ｐＨ、細胞内カルシウム、又はオトペトリンポリペプチド若しくはその機能的部分を含む膜にわたる電圧電位若しくは抵抗を測定することを含む、請求項２０〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
ｐＨの変化をオトペトリンポリペプチドの一方の側で誘発するステップを含む、請求項２０〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記ｐＨの変化が細胞外ｐＨの変化である、請求項３０又は３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ｐＨの変化がｐＨの増大である、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記ｐＨの変化がｐＨの減少である、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記ｐＨの変化が少なくとも０．１ｐＨ単位である、請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記プロトン転移活性を測定するステップが、パッチクランプ技術、ホールセル電流の測定、２電極の電圧クランプ、放射性標識されたイオン流束アッセイ、又は電圧感受性の染料を使用する蛍光アッセイを含む、請求項２０〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記プロトン転移活性を測定するステップが、異種又は同種の細胞においてオトペトリンポリペプチド又はその機能的部分を発現させることを含む、請求項２０〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記異種又は同種の細胞が哺乳動物細胞である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記異種又は同種の細胞が卵母細胞である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記異種又は同種の細胞が味覚受容体細胞である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記試験化合物が、有機低分子、無機低分子、多糖、ペプチド、タンパク質、抗体、核酸、及び抽出物からなる群から選択され、前記抽出物が、細菌、植物、真菌、動物細胞、及び動物組織から選択される生物学的材料に由来する、請求項２０〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記試験化合物が５０〜５０００００ダルトンの範囲の分子量を有する、請求項２０〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記試験化合物が、約０．１ｕＭ〜約１０００ｍＭの範囲の濃度である、請求項２０〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
細胞外膜と、細胞外膜に組み込まれたオトペトリンポリペプチド又はその機能的部分とを含む細胞。
【請求項４５】
クセノプス属卵母細胞である、請求項４４に記載の細胞。
【請求項４６】
哺乳動物細胞である、請求項４４に記載の細胞。
【請求項４７】
前記オトペトリンポリペプチドが細胞に対して異種である、請求項４４に記載の細胞。
【請求項４８】
前記オトペトリンポリペプチドが、修飾された非天然のオトペトリンポリペプチドである、請求項４４に記載の細胞。
【請求項４９】
オトペトリンポリペプチドを含む合成膜又は合成脂質二重層。
【請求項５０】
膜チャネルを通るプロトン転移活性を感知するためのシステムであって、
細胞の膜に組み込まれた１つ又は複数の異種オトペトリンポリペプチド
を含み、前記細胞が、１つ又は複数の異種オトペトリンポリペプチドの発現を指示する１つ又は複数の核酸を含み、前記細胞が蛍光ｐＨの指標又は蛍光カルシウムの指標を含む、システム。
【請求項５１】
前記細胞が不死化細胞である、請求項５０に記載のシステム。
【請求項５２】
前記細胞がＨＥＫ−２９３又はＣｏｓ−７である、請求項５０又は５１に記載のシステム。
【請求項５３】
１つ又は複数の前記異種オトペトリンポリペプチドが、Ｏｔｏｐ１、Ｏｔｏｐ２、及びＯｔｏｐ３から選択される、請求項５０〜５２のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項５４】
前記細胞が蛍光レポーターでトランスフェクトされている、請求項５０〜５３のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項５５】
前記蛍光レポーターがｐＨｌｕｏｒｉｎである、請求項５０〜５４のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項５６】
前記蛍光ｐＨの指標が、ｐＨｒｏｄｏレッド、ＤＦＦＤＡ、及びＢＣＥＣＦから選択されるか、又は蛍光カルシウムの指標がＦｕｒａ  ２  ＡＭである、請求項５０〜５５のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項５７】
蛍光イメージングプレートリーダー（ＦＬＩＰＲ）をさらに含む、請求項５０〜５６のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項５８】
試験化合物をさらに含む、請求項５０〜５７のいずれか一項に記載のシステムであって、前記試験化合物が１つ又は複数のオトペトリンポリペプチドと接触している、システム。
【請求項５９】
異種オトペトリンポリペプチドを含む細胞。
【請求項６０】
前記オトペトリンポリペプチドが、Ｏｔｏｐ１、Ｏｔｏｐ２、及びＯｔｏｐ３から選択される、請求項５９に記載の細胞。
【請求項６１】
前記細胞が、異種オトペトリンポリペプチドの発現を指示する核酸でトランスフェクトされている、請求項５９又は６０に記載の細胞。
【請求項６２】
前記細胞が昆虫細胞又は爬虫類細胞であり、前記異種オトペトリンポリペプチドが哺乳動物のオトペトリンポリペプチドである、請求項５９〜６１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項６３】
前記細胞が非ヒト細胞であり、前記異種オトペトリンポリペプチドがヒトオトペトリンポリペプチドである、請求項５９〜６２のいずれか一項に記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
【関連する特許出願】
【０００１】
[0001]この特許出願は、発明者名がＥｍｉｌｙ  Ｌｉｍａｎであり、代理人案件番号第０４３８７１−０４５２０４６号によって指定される「医薬品開発のための標的としてのオトペトリンプロトンチャネル」という名称の２０１７年７月２７日に出願された特許仮出願第６２／５３７，９００号の利益を主張する。全てのテキスト、表、及び図面を含む、先の特許出願の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
［政府支援］
[0002]本発明は、一部は、米国国立衛生研究所の認可番号Ｒ０１ＤＣ０１３７４１及びＲ２１ＤＣ０１２７４７の下で政府支援を受けてなされた。政府は、本発明においてある一定の権利を有する。
【技術分野】
【０００３】
[0003]本発明の実施形態は、オトペトリン介在性のプロトン転移の調節因子を同定するための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
[0004]脂質二重層はプロトンにとって透過不可能であり、細胞内への及び細胞からのプロトンの移動は、イオンチャネルを含む膜タンパク質によって厳しく調節される。本明細書において提示されるように、膜貫通タンパク質であるオトペトリン１（Ｏｔｏｐ１）及びある特定の関連する膜貫通タンパク質が、プロトン選択性のイオンチャネルとして同定されている。
【０００５】
[0005]図面は、本技術の実施形態を説明するものであり、限定するものではない。説明を明瞭且つ平易にするために、図面は同じ縮尺では作成されておらず、一部の場合では、特定の実施形態の理解を容易にするために、様々な態様が誇張又は拡大されて示される場合がある。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】Ｏｔｏｐ１がクセノプス属（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞及びＨＥＫ−２９３細胞において、酸誘発された電流を生じさせることを示す図である。図１ａは、減少するｐＨの、Ｎａ＋を含有しない細胞外溶液に応答した、Ｏｔｏｐ１を発現するクセノプス属卵母細胞における、ＴＥＶＣによって測定された電流を示す（Ｖｍ＝−８０ｍＶ）。図１ｂは、図１ａにおける電流のＩ−Ｖの関係を示す。電圧は、１Ｖ／ｓで−８０ｍＶ〜８０ｍＶまで傾斜させた。図１ｃは、Ｏｔｏｐ１  ｍＲＮＡを注射されたクセノプス属卵母細胞（ｎ＝４）及び注射されていない卵母細胞（灰色の丸、ｎ＝４）における、ｐＨに対する、誘起された電流の規模のアベレージ（平均±ＳＥＭ）（ΔＩ）の関数を示す。図１ｄは、Ｎａ＋を含有しない溶液中でＯｔｏｐ１でトランスフェクトされたＨＥＫ−２９３細胞における、ホールセルパッチクランプ記録法によって測定された電流を示す（Ｖｍ＝−８０ｍＶ）。図１ｅは、電圧を傾斜させた（１Ｖ／ｓ）実験から示されるような、ｐＨ０での、Ｏｔｏｐ１でトランスフェクトされたＨＥＫ−２９３細胞において誘起された電流のＩ−Ｖの関係を示す。図１ｆは、Ｏｔｏｐ１でトランスフェクトされたＨＥＫ−２９３細胞（四角、ｎ＝５）及びトランスフェクトされていない細胞（灰色の四角、ｎ＝３）における、ｐＨに対する、誘起された電流の規模のアベレージ（平均±ＳＥＭ）（ΔＩ）の関数を示す。図１ｇは、細胞質タンパク質タグ−ＲＦＰでコトランスフェクトされ、共焦点顕微鏡法で画像化された、Ｏｔｏｐ１とＹＦＰとの融合タンパク質（ＹＦＰ−Ｏｔｏｐ１）を示す。ラインスキャン（図１ｇ、下のパネル）は、ＹＦＰ−Ｏｔｏｐ１が細胞表面に多くあることを示す。図１ｈは、ｐＨｒｏｄｏレッドで測定したところ、Ｏｔｏｐ１でトランスフェクトされた細胞は細胞外ｐＨの変化に応答して細胞内ｐＨを大きく変化させたが、偽トランスフェクトされた細胞はそうではなかったことを示す（平均±ＳＥＭ、ｎ＝９〜１１）。類似の結果が、３回の反復で得られた。データのアベレージ（平均±ＳＥＭ、ｎ＝２８〜２９細胞）を両側ｔ検定によって分析した。＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１。ＨＯＡｃを陽性対照として用いた。
【図２】Ｏｔｏｐ１のイオン選択性及び生物物理学的特性を示す図である。図２ａは、Ｏｔｏｐ１の電流が、示した時点で、細胞外溶液中のＮＭＤＧ＋をＮａ＋、Ｌｉ＋、若しくはＣｓ＋（それぞれ１６０ｍＭ）、又はＣａ２＋（４０ｍＭ）で置き換えた低ｐＨ溶液に応答して誘起されたことを示す（Ｖｍ＝−８０ｍＶ）。電流の変化のパーセンテージのアベレージが示される。図２ｂは、Ｏｔｏｐ１の電流が、イオン蓄積を最小にし、Ｏｔｏｐ１の電流の単離を可能にする条件下の、変化する細胞外ｐＨで、電圧ランプ（１Ｖ／ｓ）に応答して誘起されたことを示す（ｐＨｉ＝６．０、Ｚｎ２＋感受性の成分が示される）。図２ｃは、図２ｂの実験から得られたΔｐＨ（ｐＨｉ−ｐＨｏ）に対する、Ｅｒｅｖの関数を示す。赤のラインは、純粋にＨ＋選択性のコンダクタンスについての予測を示す。データを、５３ｍＶ／ΔｐＨの傾斜及び３．６ｍＶのＹ切片を有する線形回帰にフィッティングした（Ｒ２＝０．９９）。図２ｄ及び図２ｅは、１４０ｍＭのＮＭＤＧ＋、４ｍＭのＣｌ−（Ｅｒｅｖ＝３４．４±１．０、ｎ＝５）；１４０ｍＭのＮａ＋、４ｍＭのＣｌ−（Ｅｒｅｖ＝３４．４±１．０、ｎ＝５）；１４０ｍＭのＮａ＋、２０ｍＭのＣｌ−（Ｅｒｅｖ＝３３．８±１．０、ｎ＝５）；又は（ｄ）１４０ｍＭのＮＭＤＧ＋、４ｍＭのＣｌ−（３５．２±１．２、ｎ＝５）；ＮＭＤＧ＋、２０ｍＭのＣｌ−（３５．５±０．５、ｎ＝４）の存在下で測定されたＯｔｏｐ１の電流（Ｚｎ２＋感受性の成分）を示す。いずれの条件の間にも有意差はなく、ＡＮＯＶＡによってｐ＞０．０５であった。図２ｆは、ＨＥＫ−２９３細胞におけるＯｔｏｐ１の電流がＺｎ２＋によって用量依存性の様式で遮断されることを示す（ピンク色のバー、示される濃度はｍＭ単位である）。図２ｇは、データのアベレージ（平均±ＳＥＭ、ｎ＝６〜１４）が、０．１９ｍＭのＩＣ５０及び０．８９のＨｉｌｌ係数でＨｉｌｌ方程式にフィッティングしたことを示す。
【図３】オトペトリンが多様な種においてプロトンチャネルをコードすることを示す図である。図３ａは、１３のオトペトリンファミリータンパク質のマルチシーケンスアラインメントから作成された最大尤度系統樹を示す。スケールバーは、０．１置換／部位である。図３ｂは、３つのマウスホモログ（Ｏｔｏｐ１、Ｏｔｏｐ２、及びＯｔｏｐ３、左側）の間の、及び、ｍＯｔｏｐ１とｄｍＯＴＯＰＬｃとの間（右側）の、膜貫通ドメイン、細胞質ドメイン、及び細胞外ドメインにおける配列同一性を示す。ＴＭドメイン１１は、哺乳動物タンパク質の間で高度に保存されるが、ＴＭドメイン５は、脊椎動物タンパク質と無脊椎動物タンパク質との間で最も高度に保存される。ＴＭドメイン１２は全ての間で高度に保存される。図３ｃ及び図３ｅは、電流が、変化するｐＨＯに応答して、Ｏｔｏｐ２、Ｏｔｏｐ３（ｃ）、又はｄｍＯＴＯＰＬｃ（ｅ）を発現するクセノプス属卵母細胞において誘起されたことを示す。代表的なトレース（Ｖｍ＝−８０ｍＶ）及びＩ−Ｖの関係（１Ｖ／ｓでの電圧ランプからの）が示される。プロトン選択性イオンチャネルで予想されたように、Ｅｒｅｖは、Ｏｔｏｐ３及びｄｍＯＴＯＰＬｃでは、ｐＨｏが低減するにつれ右にシフトした。Ｏｔｏｐ２は、変則的な挙動を示した。図３ｄ及び図３ｆは、チャネルの各々でのｐＨに対する、誘起された電流のアベレージ（ΔＩ）の関数を示す（黒い丸、平均±ＳＥＭ、ｎ＝３−７）。灰色の三角は、注射されていない卵母細胞からの応答を示す（ｎ＝３、平均±ＳＥＭ）。ΔＩとｐＨとの間の関係がチャネル間で変化し、ｍＯｔｏｐ３が最も急勾配の関係を示したことに留意されたい。
【図４】Ｏｔｏｐ１の電流を安定化させる条件下でのＥｒｅｖの測定を示す図である。図４ａは、Ｏｔｏｐ１の電流を安定化させ、［Ｈ＋］ｉの変化を低減させるように設計された、電圧及び溶液交換プロトコルを示す。細胞内溶液をｐＨｉ＝６．０に調節し、ＶｍをＥＨの近くで維持し（ｐＨｏ＝７．０では−６０ｍＶ、ｐＨｏ＝５．５では＋３０ｍＶ）、１Ｖ／ｓで−８０ｍＶ〜＋８０ｍＶまで電圧を傾斜させた。ｐＨ５．５の溶液（ＮＭＤＧベースの）に対する、Ｏｔｏｐ１でトランスフェクトされたＨＥＫ−２９３細胞及びトランスフェクトされていない細胞の応答が示される（キャパシタンスのアーティファクトは除去した）。Ｏｔｏｐ１を発現する細胞においてｐＨ５．５に応答して誘起された電流は記録の期間を通して安定なままであったことに留意されたい。図４ｂは、ａの実験で得られたＩ−Ｖ曲線を示す。Ｚｎ２＋への曝露の後にｐＨ５．５に応答して引き起こされた電流を、Ｚｎ２＋への曝露の前の電流から差し引いて、純粋なＯｔｏｐ１依存性の電流を得（３−４）、そこからＥｒｅｖを測定した。
【図５】Ｏｔｏｐ１の電流が穏やかな電圧依存性のみを示すことを示す図である。図５は、ｐＨ５．５の溶液への曝露の前及び最中の、一群の電圧ステップ（示される）に応答した、クセノプス属卵母細胞におけるＯｔｏｐ１の電流を示す。右側は、示された時間で測定されたデータのアベレージ（ｎ＝４）である。−８０ｍＶまでの最も過分極する電圧ステップでのみ、電流振幅に何らかの時間依存性の変化があった。
【図６】Ｏｔｏｐ２及びＯｔｏｐ３が、内向きに伝導するプロトンチャネルを形成することを示す図である。図６ａ及び図６ｂは、クセノプス属卵母細胞で発現するＯｔｏｐ１及びＯｔｏｐ２のｐＨに対するＥｒｅｖの関数を示す。赤のラインは、傾きがＯｔｏｐ２及びＯｔｏｐ３でそれぞれ２０．７及び４６．３ｍＶ／ｌｏｇ［Ｈ＋］の、ｐＨ５と６との間のデータの線形フィッティングを示す。点線はＥＨを示し、仮定のｐＨｉは７．２である。図６ｂは、クセノプス属卵母細胞において、中性及び酸性ｐＨでの過分極電圧ステップに対するＯｔｏｐ２及びＯｔｏｐ３の応答が、穏やかな電圧依存性のゲーティングに対して最小であることを示す。データは、ｎ＞３の実験の代表である。本発明者らが、ｐＨ７．４の溶液中で、０ｍＶで、Ｏｔｏｐ２を発現する卵母細胞において外向き電流を一貫して観察したことに留意されたい。このことは、チャネルを通るプロトンの外向きの動きに起因し得る。図６ｃは、ｐＨの指標であるｐＨｒｏｄｏレッドでモニタリングした、酢酸を添加されていない及び添加されたｐＨ５の溶液に応答した、Ｏｔｏｐ２若しくはＯｔｏｐ３でトランスフェクトされた、又は偽トランスフェクトされたＨＥＫ−２９３細胞の細胞内ｐＨの変化を示す（平均±ＳＥＭ）。図６ｄは、応答のピークで測定された、ｃの実験で得られたデータのアベレージ（平均±ＳＥＭ）を示す。有意性を両側ｔ検定によって判定した。＊＊＊：Ｐ＜０．００１。類似の結果が、３回の反復実験で得られた。
【図７】ＨＥＫ−２９３細胞におけるＯｔｏｐ２の生物物理学的特性を示す図である。図７ａは、トランスフェクトされたＨＥＫ−２９３細胞のホールセルパッチクランプ記録法で測定されたＯｔｏｐ２の電流を示す。溶液を交換し、示されるように、−８０ｍＶ〜＋１６０ｍＶまで膜電圧を傾斜させた（１Ｖ／ｓ）。図７ｂは、（ａ）で示された実験で得られたＩ−Ｖの関係を示す。図７ｃは、図７ａ及び７ｂの実験で得られたＥｒｅｖのアベレージ（平均±ＳＥＭ）を示す。傾きが２５．３ｍＶ／ｌｏｇ［Ｈ＋］の、ｐＨ５と６との間のデータの線形フィッティングが示される。クセノプス属卵母細胞におけるＯｔｏｐ２についての対応する関係も示される。
【図８】ヒトＯｔｏｐ１がプロトンチャネルを形成することを示す図である。図８は、Ｏｔｏｐ１がプロトンチャネルを形成することを示すさらなる証拠を示す。図８ａは、変化する外部ｐＨに応答して、ｈＯｔｏｐ１でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞において引き起こされた電流を示す。図８ｂは、トランスフェクトされた細胞及びトランスフェクトされていない細胞における、ｐＨ５．０での、図８ａの実験で得られた電流の規模のアベレージを示す。図８ｃ及び図８ｄは、ｐＨの指標であるｐＨｒｏｄｏレッドで測定された、酢酸を添加した及び添加していないｐＨ５の溶液に応答した、ｈＯｔｏｐ２でトランスフェクトされた、又は偽トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞の細胞内ｐＨの変化を示す（平均＋／−ＳＥＭ）。誤差のバーは、ＳＥＭを表す。有意性をＡＮＯＶＡによって計算する。＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１。類似の結果が、少なくとも３回の反復実験で得られた。
【図９】細胞外ｐＨの変化に応答した、Ｏｔｏｐ１でトランスフェクトされたＨＥＫ−２９３細胞における細胞内カルシウムの上昇を示す図である。図９は、ｍＯｔｏｐ１でトランスフェクトされた、又は偽トランスフェクトされたＨＥＫ−２９３細胞における細胞内カルシウムの変化を示す。トランスフェクトされた細胞に、カルシウムの指標であるＦｕｒａ  ２  ＡＭをロードし、７．４〜５．０までの細胞外ｐＨの変化に曝露させた。図９（左側のパネル）は、Ｏｔｏｐ１でトランスフェクトされた細胞のみが応答した（ｎ＝８細胞）ことを示す。両方の細胞型が、細胞膜に侵入し細胞内の酸性化を生じさせ、それによって、細胞内の緩衝液からカルシウムを遊離させることで細胞内カルシウムを上昇させる、ｐＨ５のＨＯＡｃに応答した。応答の規模のピークは、右側のパネルで示される。Ｏｔｏｐ１でトランスフェクトされた細胞と偽トランスフェクトされた細胞との間の差は有意である（ステューデントｔ検定。＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図１０】様々なｐＨに応答した、異なるオトペトリンのｐＨｌｕｏｒｉｎイメージングを示す図である。ＨＥＫ−２９３細胞に、ｐＨｌｕｏｒｉｎ及び示されるオトペトリンポリペプチドの１つでコトランスフェクトしたか、又は対照でコトランスフェクトした（図１０Ｄ、ｐＨｌｕｏｒｉｎのみでトランスフェクトされた）。図１０は、Ｏｔｏｐ１（図１０Ａ）、Ｏｔｏｐ２（図１０Ｂ）、及びＯｔｏｐ３（図１０Ｃ）でトランスフェクトされたＨＥＫ−２９３細胞が、細胞への酸性ｐＨ溶液のアプライ（ＨＣｌによって調節された）に応答して、細胞内のｐＨｌｕｏｒｉｎ蛍光の減少を示す（このことは、細胞内ｐＨが低減したことを示した）ことを示す。細胞内ｐＨの低減は、ｐＨｌｕｏｒｉｎのみでトランスフェクトされた対照では見られなかった（図１０Ｄ）。しかし、塩基性溶液（ｐＨ８．５）をアプライすると、Ｏｔｏｐ１及びＯｔｏｐ２を有する細胞のみがｐＨｌｕｏｒｉｎ蛍光の増大を示し（細胞内のアルカリ化）、それはＯｔｏｐ３を有する細胞では示されなかった。ｐＨ５．０の酢酸溶液（弱酸）をアプライすると細胞内の酸性化が誘発され、これは、細胞内ｐＨが低減した後にｐＨｌｕｏｒｉｎ蛍光が全ての細胞において減少したことを示すための対照として機能する。黒のライン：ｐＨｌｕｏｒｉｎ蛍光強度のアベレージ。薄い灰色のライン：ｐＨｌｕｏｒｉｎ蛍光強度のｓ．ｅ．ｍ．。濃い灰色のバー：アプライされた異なるｐＨ溶液（ブランク：ｐＨ７．４）。ＨＯＡｃ：酢酸。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
[0016]一部の態様では、本明細書において、オトペトリン介在性のプロトン転移活性の調節物質を同定するための方法であって、（ａ）オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分を、試験化合物と接触させるステップ、及び（ｂ）オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分が介在するプロトン転移活性を判定するステップを含み、試験化合物の非存在下で判定されたプロトン転移活性と比較したプロトン転移活性の少なくとも１％の増大又は減少が、その試験化合物を、オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分が介在するプロトン転移活性の調節物質として同定する、方法が提示される。一部の実施形態では、オトペトリンポリペプチドが介在するプロトン転移活性は、ｐＨの変化に応答して判定される。ｐＨの変化は、ｐＨの増大又は減少であり得る。一部の実施形態では、ｐＨの変化は、少なくとも０．１ｐＨ単位の変化である。一部の実施形態では、オトペトリンポリペプチドが介在するプロトン転移活性は、細胞外ｐＨの変化に応答して判定される。一部の実施形態では、本方法は、ｐＨ（例えば、細胞外ｐＨ）の変化を誘発するステップを含む。一部の実施形態では、オトペトリンポリペプチドは脂質二重層に組み込まれており、本方法は、（ａ）の前又は（ｂ）の前に酸又は塩基をオトペトリンポリペプチドの一方の側（例えば、細胞外の側）に添加することによってｐＨの変化を誘発するステップを含む。
【０００８】
[0017]一部の態様では、本明細書において、オトペトリン介在性のプロトン転移活性の調節物質を同定する方法であって、（ａ）（ｉ）試験化合物の存在下で、及び（ｉｉ）試験化合物の非存在下で、オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分が介在するプロトン転移活性を測定するステップ、及び（ｂ）（ａ）の（ｉ）で測定されたプロトン転移活性と、（ａ）の（ｉｉ）で測定されたプロトン転移活性とを比較した差を判定し、この判定によって、試験化合物を、オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分が介在するプロトン転移活性の調節物質として同定するステップを含む、方法が提示される。
【０００９】
[0018]一部の態様では、本明細書において、細胞外膜と、細胞の細胞外膜に組み込まれたオトペトリンポリペプチド（例えば、異種オトペトリンポリペプチド）とを含む細胞が提示される。一部の実施形態では、細胞は、クセノプス属卵母細胞である。一部の実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、細胞は、味覚受容体細胞である。ある特定の実施形態では、オトペトリンポリペプチドは、異種オトペトリンポリペプチド（例えば、オトペトリンポリペプチドを含む細胞に対して異種の）である。例えば、一部の実施形態では、オトペトリンポリペプチドは、異種の昆虫細胞、爬虫類細胞、又は非ヒト哺乳動物細胞において発現されるヒトオトペトリンポリペプチドである。一部の実施形態では、オトペトリンポリペプチドは、オトペトリンポリペプチドを天然には発現しない不死化細胞又は不活化細胞型において発現されるヒトオトペトリンポリペプチドである。
【００１０】
[0019]一部の実施形態では、本明細書において記載される方法は、オトペトリンポリペプチドの発現を指示する核酸を哺乳動物細胞又は卵母細胞に導入するステップを含む。一部の実施形態では、オトペトリンポリペプチドの発現を指示する核酸は、オトペトリンポリペプチドをコードするｃＤＮＡである。例えば、ある特定の実施形態では、哺乳動物細胞又は卵母細胞は、オトペトリンポリペプチドをコードするｃＤＮＡでトランスフェクトされる。オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分をコードする任意の適切な核酸又はｃＤＮＡを、本明細書において記載される方法に使用することができる。
【００１１】
[0020]一部の実施形態では、プロトン転移活性は、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞に対して２電極の電圧クランプを行うこと、トランスフェクトされたＨＥＫ−２９３細胞をパッチクランプすること、又は細胞内ｐＨの指標をイメージングすることを含む方法によって、判定、測定、検出、又はアッセイされる。例えば、ある特定の実施形態では、オトペトリンポリペプチドタンパク質、その機能的部分、又はそのホモログをコードする核酸が、クセノプス属卵母細胞に注入されて、卵母細胞膜でのオトペトリンポリペプチドの発現及び組み込みに介在するようになる。プロトン転移活性を次いで、膜の極性化の変化（例えば、膜電位の変化）を測定することによって評価することができる。ある特定の実施形態では、プロトン転移活性は、ｐＨ及び／又はｐＨの変化（例えば、細胞内ｐＨの変化）を適切なｐＨ感受性の指標で測定することによって判定される。ｐＨ感受性の指標は、ｐＨ感受性の染料（例えば、ｐＨｒｏｄｏレッド）又はｐＨ感受性のタンパク質（例えば、ｐＨ感受性の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又はｐＨｌｕｏｒｉｎ）であり得る。一部の実施形態では、ｐＨ及び／又はｐＨの変化は、ｐＨｒｏｄｏレッドで測定することができる。ある特定の実施形態では、プロトン転移活性は、細胞内のＣａ２＋又は亜鉛のレベルの変化を測定することによって判定される。例えば、カルシウムレベルは、Ｆｕｒａ−２などの蛍光カルシウム指標染料を使用することによって測定することができる。典型的な顕微蛍光測定アッセイでは、単一のＣａ２＋イオンを結合すると蛍光が変化するＦｕｒａ−２などの染料が、Ｏｔｏｐ発現細胞の細胞質基質にロードされる。試験化合物に曝露された際の細胞質性のカルシウムの増大は、カルシウムが結合すると生じるＦｕｒａ−２の蛍光の変化に反映される。
【００１２】
[0021]一部の実施形態では、オトペトリンポリペプチドのプロトン転移活性は、機能的、化学的、及び物理的影響を判定するための様々なインビトロアッセイ及びインビボアッセイを使用して、例えば、他の分子（例えば、ペプチドや、ペプチド、有機低分子、及び脂質を含むシグナル伝達分子）へのオトペリンの結合を測定すること、並びに／又は、オトペトリン依存性のプロトン転移の結果生じる細胞内ｐＨの変化に応答したタンパク質発現（例えば、転写レベル、タンパク質レベルなど）の増大若しくは減少を測定することで、間接的に評価される。一部の実施形態では、プロトン転移活性は、細胞の成長又は生存能力の各々でオトペトリン依存性のプロトン転移が介在する場合には、細胞の成長又は生存能力の変化を評価することによって判定される。ある特定の実施形態では、プロトン転移活性は、細胞内の第２のメッセンジャー（例えば、ＩＰ３、ｃＧＭＰ、又はｃＡＭＰ）の量又は修飾（例えばリン酸化）がオトペトリン依存性のプロトン転移によって調節又は誘発される場合には、このような量の変化を検出すること、又は修飾を検出することによって、間接的に判定又は測定される。
【００１３】
[0022]ある特定の実施形態では、プロトン転移活性は、膜にオトペトリンポリペプチド又はその機能的部分が組み込まれた細胞又は卵母細胞でパッチクランプ技術を使用して判定される。一部の実施形態では、オトペトリン依存性のプロトン転移活性の存在は、少なくとも０．１ｐＨ単位のｐＨの変化に応答した、少なくとも０．１ｐＡ、少なくとも１ｐＡ、少なくとも５ｐＡ、少なくとも１０ｐＡ、少なくとも５０ｐＡ、少なくとも１００ｐＡ、少なくとも５００ｐＡ、少なくとも１０００ｐＡ、少なくとも５０ｎＡ、少なくとも１００ｎＡ、少なくとも５００ｎＡ、少なくとも０．１μＡ、少なくとも０．２μＡ、少なくとも０．５μＡ、少なくとも１．０μＡ、又は少なくとも２μＡの電流の純変化として判定される。一部の実施形態では、電流の変化は、適切な数学アルゴリズムを使用して容易に変換されるパラメータである抵抗又は電圧電位の対応する変化を測定又は検出することによって、判定、測定、又は検出される。一部の実施形態では、オトペトリン依存性のプロトン転移活性の調節は、オトペトリン依存性のプロトン転移活性における少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも２倍、少なくとも５倍、又は少なくとも１０倍の純変化（例えば、プロトン転移活性の増大又は減少）である。純変化は、試験化合物の非存在下で判定されたオトペトリン介在性のプロトン転移活性を、試験化合物の存在下で判定されたオトペトリン介在性のプロトン転移活性と比較することによって判定することができる。一部の実施形態では、試験化合物の非存在下で判定されるオトペトリン介在性のプロトン転移活性の量は、参照レベル又は対照と呼ばれる。例えば、プロトン転移活性の減少は、一部の実施形態では、試験化合物の存在下でのオトペトリンポリペプチドのプロトン転移活性の量を、試験化合物の非存在下で判定されたオトペトリンポリペプチドのプロトン転移活性（例えば、参照レベル）と比較することによって判定される。ある特定の実施形態では、プロトン転移活性の増大は、試験化合物の存在下でのオトペトリンポリペプチドのプロトン転移活性の量を、試験化合物の非存在下で判定されたオトペトリンポリペプチドのプロトン転移活性（例えば、参照レベル）と比較することによって判定される。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
[0023]プロトンを真核細胞に輸送することができるプロトンチャネルは、分子的に同定されていない。味細胞のトランスクリプトームのプロファイリングに基づく不偏のスクリーニングを使用して、膜貫通タンパク質オトペトリン１（Ｏｔｏｐ１）を、新規な生物物理学的特性を有するプロトン選択性イオンチャネルをコードすると同定した。関連するマウス遺伝子であるＯｔｏｐ２及びＯｔｏｐ３、並びにショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）遺伝子のｄｍＯＴＯＰＬｃもまた、プロトンチャネルをコードする。Ｏｔｏｐ１がＺｎ２＋感受性のプロトン伝導性に必要であることも、本明細書において判定された。
【００１５】
[0024]一部の実施形態では、本明細書において、オトペトリン介在性のプロトン転移活性の調節物質を同定する方法が提示される。一部の実施形態では、本方法は、試験化合物をオトペトリンポリペプチド又はその機能的部分と接触させるステップ、及びオトペトリンポリペプチド又はその機能的部分が介在するプロトン転移活性を判定するステップを含む。用語「判定する」は、「プロトン転移活性を判定する」文脈で本明細書において使用する場合、これらに限定されないが、「測定する」、「検出する」、及び／又は「得る」ことを意味し、含む。
【００１６】
オトペトリンポリペプチド
[0025]オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分は、脂質二重層内のチャネルを形成する複数回貫通型の内在性膜タンパク質である。したがって、本明細書において言及されるオトペトリンポリペプチド又はその機能的変異体は、脂質二重層（例えば、細胞膜又は合成脂質二重層）に組み込まれるオトペトリンポリペプチドである。細胞膜に組み込まれる場合、オトペトリンポリペプチドは、第１の側（例えば、細胞外の側）及び第２の側（例えば、細胞内の側）を含む。本明細書において示されるように、オトペトリンポリペプチドは、膜の一方の側でのｐＨの変化（例えば、プロトンの増大又は減少）に多くは応答して、オトペトリンポリペプチドの一方の側（例えば、膜の一方の側）からオトペトリンポリペプチドの他方の側（例えば、膜の他方の側）へのプロトンの転移をもたらす。一部の実施形態では、ｐＨの変化がオトペトリンポリペプチドの一方の側で誘発され（例えば、塩基又は酸の添加によって）、その後、オトペトリンポリペプチドを通るプロトン転移が検出される。
【００１７】
[0026]一部の実施形態では、オトペトリンポリペプチドは、任意の適切な生物学的生物から得られる、発現される、又は由来するオトペトリンポリペプチドを含むか又はそれからなり、任意の適切な生物学的生物の非限定的な例としては、動物、植物、原生生物、刺胞動物（淡水水生動物又は海洋動物）、節足動物、真菌、細菌、環形動物、棘皮動物、脊索動物、及び軟体動物、及びそれに類するものが含まれる。オトペトリンポリペプチドは、任意の適切な種から得られ得るか、発現され得るか、又は由来し得る。オトペトリンポリペプチドは、一部の実施形態では、昆虫由来のオトペトリンポリペプチド（例えば、ショウジョウバエ属に由来するオトペトリンポリペプチド又はその機能的部分）を含むか又はそれからなる。ある特定の実施形態では、オトペトリンポリペプチドは、適切な哺乳動物から得られる、発現される、又は由来するオトペトリンポリペプチドを含むか又はそれからなる。一部の実施形態では、オトペトリンポリペプチドは哺乳動物オトペトリンポリペプチドを含み、哺乳動物オトペトリンポリペプチドの非限定的な例としては、オトペトリン−１（Ｏｔｏｐ１）、オトペトリン−２（Ｏｔｏｐ２）、及びオトペトリン−３（Ｏｔｏｐ３）が含まれる。一部の実施形態では、オトペトリンポリペプチドは、齧歯動物から得られる、発現される、又は由来するオトペトリンポリペプチドを含むか又はそれからなり、齧歯動物の非限定的な例としては、マウス及びラットが含まれる。ある特定の実施形態では、オトペトリンポリペプチドは、適切な霊長類から得られる、発現される、又は由来するオトペトリンポリペプチドを含むか又はそれからなる。霊長類は、非ヒト霊長類であり得るか、又はヒトを含み得る。ある特定の実施形態では、オトペトリンポリペプチドは、ヒトオトペトリンポリペプチドを含むか、それからなるか、それから得られるか、又はそれに由来し、ヒトオトペトリンポリペプチドの非限定的な例としては、オトペトリン−１（Ｏｔｏｐ１、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｑ７ＲＴＭ１、配列番号１）、オトペトリン−２（Ｏｔｏｐ２、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｑ７ＲＴＳ６、配列番号２）、及びオトペトリン−３（Ｏｔｏｐ３、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｑ７ＲＴＳ５、配列番号３）が含まれる。ある特定の実施形態では、オトペトリンポリペプチドはマウスオトペトリンポリペプチドを含み、マウスオトペトリンポリペプチドの非限定的な例としては、オトペトリン−１（Ｏｔｏｐ１、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｑ８０ＶＭ９、配列番号４）、オトペトリン−２（Ｏｔｏｐ２、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｑ８０ＳＸ５、配列番号５）、オトペトリン−３（Ｏｔｏｐ３、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｑ８０ＵＦ９、配列番号６）、又はその機能的部分が含まれる。ある特定の実施形態では、オトペトリンポリペプチドは、ショウジョウバエ属のＯｔｏｐポリペプチドを含むか若しくはそれからなるオトペトリンポリペプチドを含むか又はそれからなり、ショウジョウバエ属のＯｔｏｐポリペプチドの非限定的な例としては、ショウジョウバエ属ＯＴＯＰ変異体Ｄ（ＮＭ＿００１２７２３２５．１（ＣＧ４２４９２））（配列番号７）、ショウジョウバエ属ＯＴＯＰ変異体Ａ（ＮＭ＿１３４９１４．３（ＣＧ３３２）（配列番号８）、及びショウジョウバエ属ＯＴＯＰ変異体Ｄ（ＮＭ＿００１１４４６８８．３（ＣＧ４２２６５））（配列番号９）が含まれる。オトペトリンポリペプチドは、オトペトリンポリペプチドをコードする適切な核酸（例えば、ｃＤＮＡ）を使用して、細胞の細胞膜において発現させることができる。一部の実施形態では、適切な細胞は、オトペトリンポリペプチドをコードするｃＤＮＡでトランスフェクトされる。ショウジョウバエ属のオトペトリンポリペプチドをコードするｃＤＮＡの非限定的な例は、ＮＣＢＩ参照番号ＮＭ＿００１２７２３２５．１（ＣＧ４２４９２）、ＮＭ＿１３４９１４．３（ＣＧ３３２）、及びＮＭ＿００１１４４６８８．３（ＣＧ４２２６５）で提供される。
【００１８】
[0027]ある特定の実施形態では、オトペトリンポリペプチドは、１つ又は複数のアミノ酸の付加、欠失、又は置換を含む。オトペトリンポリペプチドは、本明細書において記載されるオトペトリンポリペプチドに少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であり得る。ある特定の実施形態では、オトペトリンポリペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、又は６のうちのいずれか１つのオトペトリンポリペプチド配列に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一なオトペトリンポリペプチドを含むか又はそれからなる。一部の実施形態では、オトペトリンポリペプチドは、１つ若しくは複数のアミノ酸類似体又は１つ若しくは複数の修飾されたアミノ酸を含む。アミノ酸の置換、アミノ酸の欠失、アミノ酸の付加、又はアミノ酸の類似体を含む修飾されたオトペトリンポリペプチドは、ペプチド配列を改変するための適切な方法によって調製することができ、ペプチド配列を改変するための適切な方法の非限定的な例は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、又はＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋにおいて記載される。オトペトリンポリペプチドはまた、適切な組換え核酸技術を使用して修飾及び作製することができる。
【００１９】
[0028]用語「同一なパーセント」又は「パーセント同一性」は、２つのアミノ酸配列の間の配列同一性を指す。同一性は、比較を目的としてアラインされ得る各配列内の位置を比較することによって決定することができる。比較された配列内の同等な位置に同じアミノ酸がある場合、分子は、その位置で同一である。同等な部位に同じ又は類似のアミノ酸残基（例えば、立体的性質及び／又は電子的性質が類似の）がある場合、分子は、その位置で相同（類似）であると言うことができる。相同性、類似性、又は同一性のパーセンテージとしての表現は、比較される配列が共有する位置での同一又は類似のアミノ酸の数の関数を指す。相同性、類似性、又は同一性のパーセンテージという表現は、比較される配列が共有する位置での同一又は類似のアミノ酸の数の関数を指す。ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、又はＥＮＴＲＥＺを含む様々なアラインメントアルゴリズム及び／又はプログラムを使用することができる。ＦＡＳＴＡ及びＢＬＡＳＴは、ＧＣＧ配列分析パッケージ（ウィスコンシン大学、マディソン、ウィスコンシン州）の一部として利用可能であり、例えばデフォルトの設定で使用することができる。ＥＮＴＲＥＺは、米国立生物工学情報センター、米国国立医薬図書館、米国国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランド州を介して利用可能である。一実施形態では、２つの配列の同一性パーセントは、例えば、各アミノ酸ギャップがこのギャップが２つの配列の間の単一のアミノ酸又はヌクレオチドミスマッチであるかのように重み付けされるものであるギャップウェイト１を用いて、ＧＣＧプログラムによって決定することができる。
【００２０】
[0029]ある特定の実施形態では、本明細書において記載されるオトペトリンポリペプチドは、任意の量の検出可能なプロトン転移活性を提供する。ある特定の実施形態では、本明細書において記載される方法において使用するためのオトペトリンポリペプチドは、天然であるか、トランケートされるか、突然変異しているか、又は遺伝子改変されるが、任意の量の検出可能なプロトン転移活性を保持する。一部の実施形態では、本明細書において記載されるオトペトリンポリペプチドは、野生型オトペトリンポリペプチドのペプチド配列のプロトン転移活性の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上を保持する。一部の実施形態では、本明細書において記載されるオトペトリンポリペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、又は９のうちのいずれか１つのオトペトリンポリペプチドのプロトン転移活性の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上を保持する。
【００２１】
[0030]ある特定の実施形態では、オトペトリンポリペプチドは、本明細書において記載されるオトペトリンポリペプチドの機能的部分を含む。オトペトリンポリペプチドの機能的部分は、膜に組み込まれた場合に、本明細書において記載される方法によって測定するとプロトン転移活性を示す、オトペトリンポリペプチドの任意の部分である。オトペトリンポリペプチドの機能的部分は、当技術分野において公知の適切な組換え方法を使用して作製する及び／又は発現させることができ、本明細書において記載される方法によってプロトン転移活性を試験することができる。したがって、当業者であれば、本明細書において記載される方法を使用して、オトペトリンポリペプチドの機能的部分を容易に同定することができる。オトペトリンポリペプチドの機能的部分は、ある特定の実施形態では、野生型オトペトリンポリペプチド（例えば、配列番号１〜９のうちのいずれか１つのオトペトリンポリペプチド）のプロトン転移活性の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％を保持する。
【００２２】
[0031]一部の実施形態では、オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分は、共有結合によって又は他の様式で、別のポリペプチド、核酸、糖質、脂肪酸、又は検出可能な試薬に連結している。ある特定の実施形態では、オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分は、別のポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分は、プロトン転移活性を保持したまま、別のポリペプチド又はその部分に共有結合し得る。一部の実施形態では、オトペトリンポリペプチドは、別の膜貫通タンパク質又はその部分に連結している。
【００２３】
[0032]一部の実施形態では、オトペトリンポリペプチドは、区別可能な識別子に連結している（共有結合によって又は非共有結合によって）。一部の実施形態では、オトペトリンポリペプチドは、１つ又は複数の区別可能な識別子を含む。任意の適切な区別可能な識別子は、オトペトリンポリペプチドに連結又は共役していてもよい。一部の実施形態では、区別可能な識別子は、検出可能な標識である。区別可能な識別子の非限定的な例としては、金属標識、蛍光標識、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ））、ｐＨ感受性のタンパク質若しくはｐＨ感受性のＧＦＰ（例えば、ｐＨｌｕｏｒｉｎ若しくはそれに類するもの）、任意の適切なフルオロフォア（例えば、ｍＣｈｅｒｒｙ）、発色団、化学発光標識、電気化学発光標識（例えば、オリゲン（Ｏｒｉｇｅｎ）（商標））、燐光標識、クエンチャー（例えば、フルオロフォアクエンチャー）、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の対（例えば、ドナー及びアクセプター）、タンパク質（例えば酵素（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、若しくはそれに類するもの））、抗原若しくはその部分、リンカー、結合対のメンバー）、酵素基質、低分子（例えば、ビオチン、アビジン）、質量タグ、量子ドット、ナノ粒子、それに類するもの、又はその組み合わせが含まれる。任意の適切なフルオロフォア又は光放出材料を、区別可能な識別子として使用することができる。光放出する区別可能な識別子は、例えば、フローサイトメトリー、ゲル電気泳動、タンパク質−チップ分析（例えば、任意のチップ方法論）、マイクロアレイ、質量分析、細胞蛍光分析、蛍光顕微鏡法、共焦点レーザー走査型顕微鏡、レーザースキャンサイトメトリー、それに類するもの、及びその組み合わせなどの様々な適切な技術によって、検出及び／又は定量することができる。一部の実施形態では、オトペトリンポリペプチドは、ＧＦＰに融合している。一部の実施形態では、オトペトリンポリペプチドは、ｐＨｌｕｏｒｉｎに融合している。
【００２４】
[0033]ある特定の実施形態では、区別可能な識別子は、オトペトリンポリペプチドと間接的に会合している（例えば結合している）。一部の実施形態では、区別可能な識別子は、オトペトリンポリペプチドと可逆的に会合している。ある特定の実施形態では、オトペトリンポリペプチドと可逆的に会合している区別可能な識別子は、適切な方法を使用して（例えば、塩濃度の増大、変性、洗浄、適切な溶媒及び／若しくは塩の添加、適切な競合物質の添加、並びに／又は加熱によって）、オトペトリンポリペプチドから除去することができる。
【００２５】
プロトン転移活性
[0034]本明細書において記載するように（例えば、実施例を参照されたい）、オトペトリンポリペプチドは、脂質二重層に組み込まれた場合に脂質二重層の一方の側から他方の側へのプロトンの転移を選択的に可能にするイオンチャネル又は孔を形成する、複数回貫通型の膜貫通タンパク質である。したがって、表現「プロトン転移活性」は、プロトンが、オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分によって形成されたイオンチャネル又は孔を通って、脂質二重層の一方の側から脂質二重層の他方の側に転移することを指す。プロトン転移活性は、能動的又は受動的なプロセスであり得る。一部の実施形態では、オトペトリンポリペプチドによるプロトン転移活性は、受動的プロセスである。膜に組み込まれたオトペトリンポリペプチドのプロトン転移活性は、適切なインビトロ又はインビボ方法を使用してアッセイ又は測定することができる。オトペトリンポリペプチドによって形成されたチャネル又は孔にわたる又は通るプロトンの転移は、直接的に（例えば、細胞内ｐＨ、電流、抵抗、若しくは電圧電位の変化（例えば、増大若しくは減少）を直接的に測定若しくは検出することによって）、又は間接的に（例えば、細胞内カルシウム若しくは亜鉛の変化（例えば、増大若しくは減少）を測定若しくは検出することによって（例えばイメージング、例えばカルシウムイメージングによって））、オトペトリン介在性の細胞シグナル伝達若しくは他のオトペトリン介在性の事象を検出することによって、又はｐＨ感受性の指標から放出された光を測定若しくは検出することによって（例えば、イメージングによって）、判定、測定、検出、又はアッセイすることができる。ｐＨ感受性の指標の非限定的な例としては、ｐＨ感受性のフルオロフォア、ｐＨ感受性の染料、ｐＨ感受性のタンパク質、それに類するもの、及びその組み合わせが含まれる。一部の実施形態では、ｐＨ感受性の指標は、ｐＨｌｕｏｒｉｎを含む。一部の実施形態では、ｐＨ感受性の指標は、ｐＨｒｏｄｏレッドを含む。ｐＨ感受性の指標であるｐＨｒｏｄｏレッドは、中性ｐＨで弱く蛍光性であるが、ｐＨが減少するにつれて蛍光性を増していく。この試薬は、細胞の細胞質性のｐＨを定量するために使用することができる。任意の適切なｐＨ指標を、ｐＨの変化（細胞内又は細胞外の）を検出するために、本明細書において記載される方法に使用することができ、任意の適切なｐＨ指標の非限定的な例は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ’ｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（２０１０）第１１版、第２０章に列挙される。
【００２６】
[0035]一部の実施形態では、プロトン転移活性は、電圧クランプ（例えば、アフリカツメガエル卵母細胞に対する２電極の電圧クランプ、若しくはトランスフェクトされたＨＥＫ−２９３細胞に対するパッチクランプ）を行うこと、又は細胞内ｐＨの指標をイメージングすることを含む方法によって、判定、測定、検出、又はアッセイされる。例えば、ある特定の実施形態では、オトペトリンポリペプチドタンパク質、その機能的部分、又はそのホモログをコードする核酸が、クセノプス属卵母細胞に注入されて、卵母細胞膜でのオトペトリンポリペプチドの発現及び組み込みに介在するようになる。プロトン転移活性を次いで、電流を測定することによって、又は膜の極性化の変化（例えば、膜電位の変化）を測定することによって、評価することができる。ある特定の実施形態では、プロトン転移活性は、ｐＨｌｕｏｒｉｎなどのｐＨ指標の使用によって細胞内ｐＨの変化を測定することによって判定される。ある特定の実施形態では、プロトン転移活性は、細胞内Ｃａ２＋レベルの変化を測定することによって判定される。例えば、カルシウム流量は、Ｃａ２＋の取り込みを評価することによって、又はＦｕｒａ−２などの蛍光色素を使用することによって、測定することができる。典型的な顕微蛍光測定アッセイでは、単一のＣａ２＋イオンを結合すると蛍光が変化するＦｕｒａ−２などの染料が、Ｏｔｏｐ発現細胞の細胞質基質にロードされる。試験化合物に曝露された際の細胞質性のカルシウムの増大は、カルシウムが結合すると生じるＦｕｒａ−２の蛍光の変化に反映される。他の適切な蛍光カルシウム指標もまた、本明細書において開示される方法に使用することができる。
【００２７】
[0036]一部の実施形態では、オトペトリンポリペプチドのプロトン転移活性は、機能的、化学的、及び物理的影響を判定するための様々なインビトロアッセイ及びインビボアッセイを使用して、例えば、他の分子（例えば、ペプチドや、ペプチド、有機低分子、及び脂質を含むシグナル伝達分子）へのオトペトリンの結合を測定すること、並びに／又は、オトペトリン依存性のプロトン転移の結果生じる細胞内ｐＨの変化に応答したタンパク質発現（例えば、転写レベル、タンパク質レベルなど）の増大若しくは減少を測定することで、間接的に評価される。一部の実施形態では、プロトン転移活性は、細胞の成長又は生存能力の各々でオトペトリン依存性のプロトン転移が介在する場合には、細胞の成長又は生存能力の変化を評価することによって判定される。ある特定の実施形態では、プロトン転移活性は、細胞内の第２のメッセンジャー（例えば、ＩＰ３、ｃＧＭＰ、又はｃＡＭＰ）の量又は修飾（例えばリン酸化）がオトペトリン依存性のプロトン転移によって調節又は誘発される場合には、このような量の変化を検出すること、又は修飾を検出することによって、間接的に判定又は測定される。
【００２８】
[0037]一部の実施形態では、オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分のプロトン転移活性は、電流、抵抗、又は脂質二重層にわたる電圧電位の変化を測定又は検出することによって判定される。脂質二重層は、細胞の脂質二重層であっても、合成であってもよい。一部の実施形態では、プロトン転移活性は、脂質二重層の一方の側でのｐＨ（すなわち、プロトン濃度）の変化に応答して判定される。一部の実施形態では、プロトン転移活性は、脂質二重層の一方の側でのｐＨ（すなわち、プロトン濃度）の変化によって誘発される。ｐＨの変化は、膜の一方の側の流体にプロトン（例えば酸）を添加することによって生じさせることができる。ｐＨの変化は、ｐＨの増大又は減少であり得る。一部の実施形態では、ｐＨの変化は、少なくとも０．０１、少なくとも０．０５、少なくとも０．１、少なくとも０．５、又は少なくとも１．０ｐＨ単位の変化である。一部の実施形態では、ｐＨの変化は、少なくとも０．５ｐＨ単位の変化である。ｐＨの変化は、膜のいずれかの側で生じさせることができる。ある特定の実施形態では、プロトンは、膜の細胞外の側に添加され、それによって、細胞外のｐＨの変化が生じる。プロトン転移活性を判定する、アッセイする、又は測定するために使用され得る方法の非限定的な例としては、任意の適切なバージョンのパッチクランプ技術（例えば、セルアタッチパッチ、インサイド−アウトパッチ、ホールセル記録、アウトサイド−アウトパッチ、穿孔パッチ、ルーズパッチ、２電極の電圧クランプ、及び哺乳動物細胞のパッチクランプ（例えば、トランスフェクトされたＨＥＫ−２９３細胞を使用する））、染料（例えば、ＤＦＦＤＡ  ＢＣＥＣＦ、ｐＨｒｏｄｏレッド、若しくはＦｕｒａ  ２−ＡＭ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号１０８９６４−３２−５））での又は例えばｐＨｌｕｏｒｉｎとのコトランスフェクションによる哺乳動物細胞のｐＨイメージング、並びにイメージング（例えば、カルシウムイメージング）、それに類するもの、並びにその組み合わせが含まれる。プロトン転移活性を判定する、アッセイする、又は測定するために使用され得る方法のさらなる非限定的な例は、Ｔｓｉｅｎ  ＲＹ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８０）１９（１１）：２３９６〜４０４；Ｒｉｎｋ  ＴＪ、Ｔｓｉｅｎ  ＲＹ、Ｐｏｚｚａｎ  Ｔ．、（１９８２）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９５（１）：１８９〜９６；Ｇｒｙｎｋｉｅｗｉｃｚ  Ｇ、Ｐｏｅｎｉｅ  Ｍ、Ｔｓｉｅｎ  ＲＹ．（１９８５）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６０（６）：３４４０〜５；Ｔｓｉｅｎ  ＲＹ、（１９８９）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３０：１２７〜５６；Ｃｏｈｅｎ−Ａｒｍｏｎ  Ｍ、Ｓｏｋｏｌｏｖｓｋｙ  Ｍ、Ｄａｓｃａｌ  Ｎ．、（１９８９）Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．４９６（１〜２）：１９７〜２０３；Ｌｉｍａｎ  ＥＲ、Ｔｙｔｇａｔ  Ｊ、Ｈｅｓｓ  Ｐ．、（１９９２）Ｎｅｕｒｏｎ．９（５）：８６１〜７１；Ｓｈｉｍｂｏ  Ｋ、Ｂｒａｓｓａｒｄ  ＤＬ、Ｌａｍｂ  ＲＡ、Ｐｉｎｔｏ  ＬＨ．、（１９９６）Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ．７０（３）：１３３５〜４６；及びＣｈａｎｇ  ＲＢ、Ｗａｔｅｒｓ  Ｈ、Ｌｉｍａｎ  ＥＲ．、（２０１０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ���ｉ．（ＵＳＡ）１０７（５１）：２２３２０〜５で見ることができる。先の参考文献の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００２９】
[0038]ある特定の実施形態では、プロトン転移活性は、膜に組み込まれたオトペトリンポリペプチド又はその機能的部分を含む細胞又は卵母細胞で電圧クランプ技術を使用して判定される。一部の実施形態では、オトペトリン依存性のプロトン転移活性の存在は、少なくとも１ｐＨ単位のｐＨの変化に応答した、少なくとも５０ｐＡ、少なくとも１００ｐＡ、少なくとも５００ｐＡ、少なくとも１０００ｐＡ、少なくとも５０ｎＡ、少なくとも１００ｎＡ、少なくとも５００ｎＡ、少なくとも０．１μＡ、少なくとも０．２μＡ、少なくとも０．５μＡ、少なくとも１．０μＡ、又は少なくとも２μＡの電流の純変化として判定される。
【００３０】
[0039]一部の実施形態では、プロトン転移活性は、蛍光−イメージングプレートリーダー（ＦＬＩＰＲ）を使用して判定される。ＦＬＩＰＲは、蛍光の読み出しを捕捉するためにプレート全体の電荷結合素子イメージングを利用する、ファースト・イン・クラスの機器であった（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ及びＮｅａｇｌｅ（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎ．１：７５〜８０頁；また、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１４）２１（９）：１１６２〜１１７０も参照されたい）。ある特定の実施形態では、システムは、ＦＬＩＰＲを含む。一部の実施形態では、システムは、ＦＬＩＰＲを含むハイスループットシステムである。
【００３１】
[0040]一部の実施形態では、電流の変化は、直接的に決定、測定、又は検出される。一部の実施形態では、電流の変化は、適切な数学アルゴリズムを使用して容易に変換されるパラメータである抵抗又は電圧電位の対応する変化を測定又は検出することによって、判定、測定、又は検出される。一部の実施形態では、オトペトリン依存性のプロトン転移活性の調節は、オトペトリン依存性のプロトン転移活性における少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも２倍、少なくとも５倍、又は少なくとも１０倍の純変化（例えば、プロトン転移活性の増大又は減少）である。純変化は、試験化合物の非存在下で判定されたオトペトリン介在性のプロトン転移活性を、試験化合物の存在下で判定されたオトペトリン介在性のプロトン転移活性と比較することによって判定することができる。一部の実施形態では、試験化合物の非存在下で判定されるオトペトリン介在性のプロトン転移活性の量は、参照レベル又は対照と呼ばれる。例えば、プロトン転移活性の減少は、一部の実施形態では、試験化合物の存在下でのオトペトリンポリペプチドのプロトン転移活性の量を、試験化合物の非存在下で判定されたオトペトリンポリペプチドのプロトン転移活性（例えば、参照レベル）と比較することによって判定される。ある特定の実施形態では、プロトン転移活性の増大は、試験化合物の存在下でのオトペトリンポリペプチドのプロトン転移活性の量を、試験化合物の非存在下で判定されたオトペトリンポリペプチドのプロトン転移活性（例えば、参照レベル）と比較することによって判定される。
【００３２】
[0041]用語「減少する」又は「低減した」、及びその文法上の変型は、本明細書において使用する場合、参照レベル又は対照と比較して少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも２倍、少なくとも５倍、又は少なくとも１０倍の減少を意味する。ある特定の実施形態では、オトペトリンポリペプチドのプロトン転移活性の減少を誘発する試験化合物は、本明細書において記載される方法によって、オトペトリン介在性のプロトン転移活性の調節物質であると同定される。オトペトリンポリペプチドのオトペトリン介在性のプロトン転移活性を減少又は低減させる試験化合物又は調節物質は、本明細書において、アンタゴニスト（例えば、オトペトリンポリペプチドのアンタゴニスト、オトペトリン介在性のプロトン転移活性のアンタゴニスト）と呼ばれる。
【００３３】
[0042]用語「増大する」又は「増強させる」、及びその文法上の変型は、本明細書において使用する場合、参照レベル又は対照と比較して少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも２倍、少なくとも５倍、又は少なくとも１０倍の増大を意味する。ある特定の実施形態では、オトペトリンポリペプチドのプロトン転移活性の増大を誘発する試験化合物は、本明細書において記載される方法によって、オトペトリン介在性のプロトン転移活性の調節物質であると同定される。オトペトリンポリペプチドのオトペトリン介在性のプロトン転移活性を増大又は増強させる試験化合物又は調節物質は、本明細書において、アゴニスト（例えば、オトペトリンポリペプチドのアゴニスト、オトペトリン介在性のプロトン転移活性のアゴニスト）と呼ばれる。
【００３４】
[0043]一部の実施形態では、オトペトリンを結合した化合物は、オトペトリンの機能に関連する生物学的活性、例えば、オトペトリンを発現する宿主細胞内の細胞内プロトンレベル（例えば、プロトン、カルシウム、亜鉛）に対する影響、ｐＨによって活性化される伝導性、細胞死（すなわち、例えば形態学的アッセイ、化学的アッセイ、若しくは免疫学的アッセイを使用してモニタリングされ得る、受容体介在性の細胞死）、オトペトリン発現細胞の脱分極（例えば、蛍光電圧感受性の染料の使用）、ラジオイムノアッセイ若しくはＥＬＩＳＡによって検出され得る第２のメッセンジャーの生産、カルシウムによって誘発されるレポーター遺伝子の発現、又はオトペトリン活性若しくはオトペトリン活性の阻害に関連する他の容易にアッセイ可能な生物学的活性をモニタリングする機能的アッセイにおいて、アゴニスト作用又はアンタゴニスト作用についてスクリーニングされる。ある特定の実施形態では、機能的アッセイは、複数の試料のハイスループットスクリーニングを同時に使用してアッセイされ得るオトペトリンの生物学的活性の検出に基づき、例えば、機能的アッセイは、オトペトリン活性の変化に関連する蛍光の変化の検出に基づく。このような機能的アッセイは、候補作用物質をオトペトリンのアゴニスト又はアンタゴニストのいずれかとしての活性についてスクリーニングするために使用することができる。
【００３５】
[0044]一部の実施形態では、オトペトリン発現細胞（例えば、組換えオトペトリン発現細胞）は、蛍光標識されたｐＨ指標（例えば、ｐＨｒｏｄレッド）を事前にロードされる。オトペトリン発現細胞は次いで、オトペトリンを結合した候補化合物に曝露され、化合物への曝露の影響がモニタリングされる。オトペトリンアゴニスト活性を有する候補化合物は、オトペトリン発現細胞と接触した場合に、対照細胞（例えば、候補化合物の非存在下でのオトペトリン発現細胞、オトペトリンをコードする核酸を有さない宿主細胞）よりも、細胞内ｐＨ又は細胞内カルシウムのオトペトリン介在性の変化を引き起こすものであることが多い。同様に、機能的オトペトリンアッセイを使用して、オトペトリンの活性を遮断する（例えば、細胞外ｐＨの変化によって誘発される細胞内ｐＨの変化を遮断する）候補化合物を同定することができる。
【００３６】
[0045]一部の実施形態では、オトペトリン介在性のプロトン転移活性の調節物質を同定する方法は、ハイスループットスクリーニングプロセスを含む。ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）は、数千から数百万の試験化合物を比較的短い時間でスクリーニングするために、ロボット工学、データの処理及び制御ソフトウェア、リキッドハンドリング装置、及び受動型検出機を使用する、科学的発見のための方法である。任意の適切なハイスループットスクリーニングプロセスを、本明細書において記載される方法に使用することができ、任意の適切なハイスループットスクリーニングプロセスの非限定的な例は、米国特許第５，９７６，８１３号、米国特許第６，４７２，１４４号、米国特許第６，６９２，８５６号、米国特許第６，８２４，９８２号、及び米国特許第７，０９１，０４８号において記載されており、これらの特許の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００３７】
[0046]一部の実施形態では、プロトン転移活性の差が判定される。プロトン転移活性の差は、試験化合物の非存在下で判定された第１のプロトン転移活性と、試験化合物の存在下で判定された第２のプロトン転移活性とを比較することによって判定することができる。ある特定の実施形態では、試験化合物をオトペトリンプロトン転移活性の調節物質として同定することは、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも２倍、少なくとも５倍、又は少なくとも１０倍のプロトン転移活性の差を判定することを含む。
【００３８】
試験化合物
[0047]任意の適切な試験化合物を、本明細書において記載される方法によって試験することができる。一部の実施形態では、試験化合物は、試験される濃度で、水性培地（例えば細胞培養培地）に溶解可能である。一部の実施形態では、試験化合物は、試験される濃度で、水性培地に完全に溶解可能である。一部の実施形態では、試験化合物は、試験される濃度で、水性培地に部分的に溶解可能である。ある特定の実施形態では、試験化合物は、試験される濃度で、哺乳動物細胞に対して無毒である。例えば、ある特定の実施形態では、試験化合物は、試験される濃度で、（ｉ）成長を阻害しない、（ｉｉ）生存能力を低減させない、（ｉｉｉ）ネクローシス若しくはアポトーシスを誘発しない、（ｉｖ）ＤＮＡ若しくはＲＮＡの損傷を誘発しない、（Ｖ）細胞膜を損傷しない、又は（ｖｉ）細胞タンパク質のタンパク質分解性の切断を誘発しない。一部の実施形態では、試験化合物は、発がん性物質でも補発がん性物質でもない。一部の実施形態では、試験化合物は、催奇性物質ではない。
【００３９】
[0048]本明細書において使用する場合、表現「試験化合物」は、オトペトリンポリペプチドのプロトン転移活性を特異的に調節する能力についてスクリーニングされ得る、任意の適切な化合物を指す。試験化合物の非限定的な例としては、低分子化合物（例えば、低分子の有機分子又は無機分子）、高分子化合物（例えば、５０００Ｄａを超える）、多糖、糖質、糖類、脂肪酸、脂質、生物学的高分子（例えば、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ペプチド類似体及びペプチド誘導体、ペプチド模倣体、核酸、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体）、天然化合物又は合成化合物、結合剤（例えば、非天然結合剤及び合成結合剤（例えば、ＴａｎｄＡｂ、ナノボディ、アプタマー、ＢｉＴＥ、ＳＭＩＰ、ＤＡＲＰｉｎ、ＤＮＬ、アフィボディ、デュオカリン、アドネクチン、フィノマー（ｆｙｎｏｍｅｒ）、ＫｕｎｉｔｚドメインＡｌｂｕ−ｄａｂ、ＤＡＲＴ、ＤＶＤ−ＩＧ、Ｃｏｖｘ−ボディ、ペプチボディ、ｓｃＦｖ−Ｉｇ、ＳＶＤ−Ｉｇ、ｄＡｂ−Ｉｇ、ノブ・イン・ホール、ｔｒｉｏｍＡｂ、及びそれに類するものを含む、抗体又はその結合断片）、その誘導体、そのポリマー、その塩、その異性体、その多形、並びにその組み合わせが含まれる。一部の実施形態では、試験化合物は、細菌の、植物の、真菌の、動物細胞の、又は動物組織の抽出物などの生物学的材料から作られた抽出物に含有される。一部の実施形態では、試験化合物は、生体液に含有される。したがって、一部の実施形態では、試験化合物は、抽出物又は生体液を含む。低分子化合物としては、約４０ダルトン（Ｄａ）よりも大きいが５０００Ｄａよりも小さい、３０００Ｄａよりも小さい、又は１０００Ｄａよりも小さい分子量を有する分子が含まれ得る。低分子化合物は、任意の適切な化学的部分又は基を含み得、任意の適切な化学的部分又は基の非限定的な例としては、アルカン、アルケン、アルキン、アルコール、ハロゲン、ケトン、アルデヒド、カルボン酸、エーテル、エステル、アミン、アミド、飽和した、部分的に飽和した、又は不飽和の環状構造、ヌクレオチド、ヌクレオシド、多原子の非金属（例えば、Ｐ、Ｓ、Ｓｅ）、遷移金属、ポスト遷移金属、半金属、それに類するもの、その塩、及びその組み合わせが含まれる。
【００４０】
[0049]ある特定の実施形態では、試験化合物としては、適切なライブラリーの合成の又は天然の化合物が含まれる。多数の低分子ライブラリーが当技術分野において知られており、その一部は市販されている。市販されている化合物ライブラリーは、例えば、ＡｒＱｕｌｅ、Ｐｈａｒｍａｃｏｐｉａ、ｇｒａｆｆｉｎｉｔｙ、Ｐａｎｖｅｒａ、Ｖｉｔａｓ−Ｍ  Ｌａｂ、Ｂｉｏｍｏｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、及びＯｘｆｏｒｄから入手することができる。低分子の、ポリマー性の、及びゲノムに基づくライブラリーを開発するための方法は、例えば、Ｄｉｎｇら、Ｊ  Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：１５９４〜１５９６（２００２）、及びＬｙｎｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２３：８１５５〜８１５６（２００１）において記載される。例えばＮＩＨ  Ｒｏａｄｍａｐ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒｓ  Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＭＬＳＣＮ）の化学化合物ライブラリーもまた使用することができる。あらゆる適切な方法を、低分子化合物ライブラリーを作製するために使用することができる。化合物ライブラリーを、適切なＨＴＳスクリーニング方法及び／又は本明細書において記載される方法を使用してスクリーニングして、オトペトリン介在性のプロトン転移活性を調節する試験化合物をライブラリー内で同定することができる。
【００４１】
[0050]ある特定の実施形態では、試験化合物は、４０〜５００，０００Ｄａ、４０〜２００，０００Ｄａ、４０〜１００，０００Ｄａ、４０〜５０，０００Ｄａ、４０〜２５，０００Ｄａ、４０〜１０，０００Ｄａ、４０〜５０００Ｄａ、又は４０〜１０００Ｄａの分子量を含む。ある特定の実施形態では、試験化合物は、５０００〜５００，０００Ｄａ、１０，０００〜５００，０００Ｄａ、２５ＦＦ０Ｃ０００〜５００，０００Ｄａ、又は５０００〜１００，０００Ｄａの分子量を含む。
【００４２】
[0051]試験化合物は、任意の適切な濃度で試験することができる。一部の実施形態では、試験化合物は、少なくとも１ｐＭ、少なくとも１０ｐＭ、少なくとも１００ｐＭ、少なくとも１ｎＭ、少なくとも１０ｎＭ、少なくとも１００ｎＭ、少なくとも１μＭ、少なくとも１０μＭ、少なくとも１００μＭ、又は少なくとも１ｍＭの濃度で試験される。一部の実施形態では、試験化合物は、１ｐＭ〜１００ｍＭ、１ｐＭ〜１０ｍＭ、１ｐＭ〜１ｍＭ、１０ｐＭ〜１００ｍＭ、１０ｐＭ〜１０ｍＭ、１０ｐＭ〜１ｍＭ、１００ｐＭ〜１００ｍＭ、１００ｐＭ〜１０ｍＭ、又は１００ｐＭ〜１ｍＭの範囲の濃度で試験される。一部の実施形態では、試験化合物は、１００ｍＭより小さい、１０ｍＭより小さい、１ｍＭより小さい、又は１００ｎＭより小さい濃度で試験される。一部の実施形態では、試験化合物は、１つ又は複数の異なる濃度で試験又はアッセイされる。
【００４３】
[0052]ある特定の実施形態では、試験化合物は、求電子剤を含むか又はそれからなる。求電子剤は、オトペトリンポリペプチドと共有結合を形成し得る化合物である。ある特定の実施形態では、試験化合物は、酵素（例えばプロテアーゼ）を含む。
【００４４】
細胞及び膜
[0053]ある特定の実施形態では、オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分は、細胞膜又は合成膜と共役している。表現「細胞膜又は合成膜と共役している」は、オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分が膜に組み込まれ、それによって、プロトン転移活性を含む機能的なプロトンチャネルを形成することを意味する。
【００４５】
[0054]オトペトリンポリペプチドは、適切な方法を使用して脂質二重層に組み込むことができる。オトペトリンポリペプチドは、適切な細胞の脂質二重層に組み込むことができ、適切な細胞の非限定的な例としては、動物細胞、植物細胞、原生生物細胞、淡水水生動物又は海洋動物の細胞、節足動物細胞、真菌細胞、細菌細胞、環形動物細胞、棘皮動物細胞、脊索動物細胞、軟体動物細胞、及びそれに類するものが含まれる。ある特定の実施形態では、オトペトリンポリペプチドは、哺乳動物細胞、霊長類細胞、非ヒト霊長類細胞、又はヒト細胞の脂質二重層に組み込まれる。ある特定の実施形態では、細胞は、一次細胞又は不死化細胞（例えば、組織培養細胞株）であり、一次細胞又は不死化細胞の非限定的な例としては、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、ＤＵ１４５、Ｈ２９５Ｒ、ＨＴ２９、ＫＢＭ−７、ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＰＣ３、ＴＨＰ−１、ＰＣ１２、Ａ５４９、ＣＨＯ、ＣＯＳ、Ｃａｃｏ−２、ＥＬ４、ＨＥＰ  Ｇ２、ＨＬ−６０、それに類するもの、及びその誘導体が含まれる。一部の実施形態では、細胞は、味覚受容体細胞（例えば、酸味細胞）である。ある特定の実施形態では、細胞は、卵細胞（例えば卵母細胞、例えばクセノプス属卵母細胞）である。ある特定の実施形態では、細胞は、赤血球又はその誘導体である。ある特定の実施形態では、細胞は、ゴースト細胞又は無核細胞である。オトペトリンポリペプチドは、あらゆる適切な方法を使用して、細胞の脂質二重層に組み込むことができる。ある特定の実施形態では、オトペトリンポリペプチドは、オトペトリンポリペプチドの発現を指示する細胞に核酸を導入することによって、細胞の脂質二重層に組み込まれる。したがって、一部の実施形態では、本明細書において記載される方法は、オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分を細胞で発現させることを含む。したがって、一部の実施形態では、細胞は、トランスフェクトされた細胞、例えば、オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分の発現を指示する核酸でトランスフェクトされた細胞である。一部の実施形態では、細胞は、形質導入された細胞、例えば、オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分の発現を指示する核酸を含む組換えウイルスを形質導入された細胞である。ある特定の実施形態では、細胞は、細胞の細胞膜に組み込まれたオトペトリンポリペプチド又はその機能的部分を含む。ある特定の実施形態では、細胞は、異種オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分を含む。表現「異種オトペトリンポリペプチド」は、オトペトリンポリペプチドが、オトペリンペプチドが発現する細胞とは異なる種に由来することを示す。ある特定の実施形態では、細胞は、異種オトペトリンポリペプチドを含むクセノプス属卵母細胞である。ある特定の実施形態では、細胞は、異種オトペトリンポリペプチドを含む味覚受容体細胞である。
【００４６】
[0055]ある特定の実施形態では、オトペトリンポリペプチドは、本明細書において記載される方法において使用するための、適切なリポソーム、ミセル、ナノディスク、二重層シート、又はバイセルに組み込まれる。ある特定の実施形態では、オトペトリンポリペプチドは、本明細書において記載される方法において使用するための、適切な合成膜に組み込まれる。一部の実施形態では、オトペトリンは、本明細書において記載される方法において使用するための、適切なナノポア装置の開口部内に形成された適切な合成膜に組み込まれる。
【００４７】
[0056]ある特定の実施形態では、ナノポア装置は、合成膜を含む開口部によって分離した、流体で満たされた第１のチャンバー及び流体で満たされた第２のチャンバーを含み、ここで、膜は、１つ又は複数のオトペトリンポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、流体で満たされた第１のチャンバーは第１の電極を含み、流体で満たされた第２のチャンバーは第２の電極を含み、ここで、第１の電極及び第２の電極は、少なくとも電圧電位、電流、及び／又は抵抗を測定又は検出するための手段に機能可能に連結される。ある特定の実施形態では、電圧電位、電流、及び／又は抵抗を測定又は検出するための手段は、電流計、電圧計、電気抵抗器、オシロスコープ、それに類するもの、又はその組み合わせを含む装置である。ある特定の実施形態では、第１及び又は第２のチャンバーは、光放出分子プローブを検出するための１つ又は複数のフォトセルを含む。
【００４８】
[0057]ある特定の実施形態では、本明細書において、オトペトリンポリペプチドのプロトン転移活性を判定するためのシステムが提供される。ある特定の実施形態では、本明細書において、オトペトリンポリペプチドのプロトン転移活性の調節物質（すなわち、オトペトリン介在性のプロトン転移活性の調節物質）を同定するためのシステムが提供される。ある特定の実施形態では、システムは、膜に組み込まれた１つ又は複数のオトペトリンポリペプチド、流体で満たされた第１のチャンバー、及び流体で満たされた第２のチャンバーを含み、ここで、流体で満たされた第１のチャンバー及び流体で満たされた第２のチャンバーは、膜の反対側に位置する。ある特定の実施形態では、開口部は膜を含む。例えば、一部の実施形態では、システムは開口部を含み、膜は開口部内に収納される。一部の実施形態では、膜は合成膜である。一部の実施形態では、システムはナノポア装置を含む。
【実施例】
【００４９】
実施例１−Ｏｔｏｐ１は固有の生物物理学的特性を有するプロトン選択性イオンチャネルを形成する
[0058]Ｏｔｏｐ１の機能的特性を特徴付けするために、本発明者らはｐＨｏを変化させ、Ｏｔｏｐ１を発現するクセノプス属卵母細胞で誘起された電流を測定した。別段の記載がない限り、これらの及び全ての他の実験は、細胞外溶液中のＮａ＋に代えて、イオンチャネルを一般に透過しない大きな陽イオンであるＮＭＤＧ＋で行った。クセノプス属卵母細胞におけるＯｔｏｐ１の電流は、ｐＨｏがｐＨ６〜４の範囲で低減するにつれて、規模が単調増加し（図１ａ〜ｃ）、電流の逆転電位（Ｅｒｅｖ）は、よりプラスの電圧の方にシフトした。これらの実験において、内因性電流及びリーク電流は差し引かれなかったため、Ｏｔｏｐ１の電流がネルンストの挙動からはずれることに留意されたい３、５。
【００５０】
[0059]Ｏｔｏｐ１が細胞の状況に関係なくイオンチャネルの孔形成サブユニットを生成し得るかどうかを判定するために、本発明者らは、Ｏｔｏｐ１をＨＥＫ−２９３細胞で発現させた（図１ｄ〜ｆ）。Ｎ末端でＹＦＰをタグ付けされたチャネルは、細胞表面での発現を裏付けた（図１ｇ）。Ｏｔｏｐ１でトランスフェクトされた細胞では、ｐＨｏの低減に応答して大きな内向き電流が引き起こされ（トランスフェクトしていない細胞で１４±４ｐＡであるのに対し、ｐＨｏ＝５．０でＩ＝１１３０±１９２ｐＡ）、電流の規模は、卵母細胞においてそうであったように、ｐＨｏで単調増加した（図１ｆ）。ＨＥＫ−２９３細胞におけるＯｔｏｐ１の電流は数秒以内に減衰し、より酸性の刺激に応答して、より速い動態が観察された（図１ｃ）。電流の減衰は、プロトンの移動又はチャネルのゲーティングのための推進力に影響し得る、チャネルのそばでのプロトンの蓄積（又は枯渇）に起因し得る３、５。例えば、最大２０ｍＭ３ごとのＨ＋の総（結合型＋遊離）細胞内濃度を増大させるために、例えば本発明者らが観察するところでは、１０μｍの直径（５２４ｆＬの容積）の細胞において１秒間で１０００ｐＡのＨ＋電流が流れるように計算することができる。さらに、過剰なＨ＋の除去は、かさの大きいｐＨ緩衝液に結合しているＨ＋の拡散が遅いため、６０〜９０秒を要し得る３。実際、本発明者らが、膜透過性染料であるｐＨｒｏｄｏレッドを使用して細胞内ｐＨをイメージングしたところ、本発明者らは、Ｏｔｏｐ１でトランスフェクトされた細胞において、ｐＨｏが７．４〜５．０まで低減するとｐＨｉが大きく変化することを観察し、この応答は、偽トランスフェクトされた細胞では観察されなかった（図１ｈ）。
【００５１】
[0060]本発明者らは、Ｏｔｏｐ１の詳細な生物物理学的特徴付けを行って、Ｏｔｏｐ１がプロトン選択性であるかどうかを判定した。まず、本発明者らは、イオン条件を変えながら、低減するｐＨに対する応答を測定することによって、Ｏｔｏｐ１が他の陽イオンに対して透過性であるかどうかを判定した。細胞外溶液中のＮＭＤＧ＋をＮａ＋で置き換えると（図２ａ）、ｐＨ５．５に応答して引き起こされる電流の振幅は変化せず（両側ｔ検定によってｐ＞０．０５）、このことは、チャネルがＮａ＋に対して測定可能な程度に透過性ではないことを示す。同様に、ＮＭＤＧ＋をＣｓ＋、Ｌｉ＋、又はＣａ２＋で置換すると、電流規模の３％未満の増大が生じ、このことは、Ｏｔｏｐ１がまた、これらの一価及び二価の陽イオンに対して認められる程度に透過性ではないことを示す（図２ａ）。
【００５２】
[0061]Ｎａ＋及びＣｌ−に対するＨ＋の相対的透過性を判定するために、本発明者らは、１４０のＮａ＋で１４０のＮＭＤＧを置き換えた条件下、及びＮａ＋の存在下又は非存在下のいずれかで［Ｃｌ−］が増大した条件下で、Ｅｒｅｖを測定した。どのケースにおいても、本発明者らは、Ｅｒｅｖの変化を全く観察しなかった（図２ｄ、ｅ）。ゴールドマン・ホジキン・カッツ（ＧＨＫ）の方程式を使用して３０、本発明者らは、５ｍＶの変化が、これは容易に検出可能であったであろうが、Ｎａ＋の＞２×１０５倍の、Ｈ＋に対する選択性、及びＣｌ−の＞１×１０５倍の、Ｈ＋に対する選択性に繋がることを計算する。本発明者らはＥｒｅｖの変化を観察しなかったため、Ｈｖ１のように、チャネルがＣｌ−及びＮａ＋よりもＨ＋に対して完全に選択性である可能性がある３。
【００５３】
[0062]遷移金属であるＺｎ２＋は、ゲーティングを調節する２つの外部ヒスチジン残基に結合する、Ｈｖ１の強力な阻害剤である７、３１、３２。Ｚｎ２＋はまた、味細胞におけるプロトンチャネルを含む２０、プロトン輸送に関与する他の分子を阻害する３。Ｏｔｏｐ１によるイオン透過に関与する構造要素への見通しを得るために、本発明者らは、Ｚｎ２＋による阻害に対するＯｔｏｐ１の感度を測定した。ｐＨ５．５に応答して誘起された、ＨＥＫ−２９３細胞におけるＯｔｏｐ１の電流は、用量依存性の様式でＺｎ２＋によって阻害され、ＩＣ５０は０．１９ｍＭ±０．０１であった（図２ｆ、ｇ）。１に近いＨｉｌｌ係数（０．８９±０．０６）は、単一のＺｎ２＋イオンがチャネルに結合して阻害することを示す。
【００５４】
[0063]Ｏｔｏｐ１を試験して、Ｏｔｏｐ１が電圧依存性であり得るかどうかを判定した。−８０〜＋４０ｍＶの間の電圧ステップ（０ｍＶの保持電位から）に対する、ｐＨ５．５の溶液によって誘起されたＯｔｏｐ１の電流の応答を測定した。電流は、振幅の時間依存性の変化についてほとんど証拠を示さず、このことは、Ｏｔｏｐ１のゲーティングが、生理学的に関連する電圧の範囲にわたり、認められる程度に電圧依存性ではないことを示す（図５）。
【００５５】
[0064]これらのデータを総合すると、Ｏｔｏｐ１が、固有の構造的及び生物物理学的特性を有するプロトン選択性のイオンチャネルをコードすることが立証される。
実施例２−オトペトリンは、進化的に保存されたプロトンチャネルファミリーを構成する
[0065]オトペトリンは、線虫からヒトまで、進化的に保存されている２８、３３（図３ａ）。このファミリーが一般にプロトンチャネルとして機能するかどうかを判定するために、本発明者らは、関連が最も遠いメンバーの一部を試験した。
【００５６】
[0066]Ｏｔｏｐ１は、２つのマウスホモログであるｍＯｔｏｐ２及びｍＯｔｏｐ３を有し２８（図３ａ）、これらは、Ｏｔｏｐ１と３０％〜３４％のアミノ酸同一性を有する（図３ｂ）。クセノプス属卵母細胞で発現すると、Ｏｔｏｐ２及びＯｔｏｐ３の両方が、ＮＭＤＧベースの溶液中で、ｐＨｏが低減すると、大きな電流を生じさせた（図３ｃ）。Ｏｔｏｐ３は、Ｈ＋についての高い選択性の証拠を示し、Ｏｔｏｐ３の電流の規模は、試験したｐＨ範囲の全体にわたってｐＨｏの関数として線形的に増大し（ｐＨ４〜６、図３ｃ、ｄ）、Ｅｒｅｖは、４６．３ｍＶ／ｌｏｇ［Ｈ＋]にシフトした（図６ａ）。逆に、Ｏｔｏｐ２の電流は変則的な挙動を示した。Ｏｔｏｐ２の電流は約ｐＨ５で飽和し（図３ｃ、ｄ）、Ｅｒｅｖは、ｐＨ４〜６の範囲にわたりほとんどシフトしなかった（図６ａ）。Ｏｔｏｐ２のこれらの予想外の特徴は、ＨＥＫ−２９３細胞において測定されたＯｔｏｐ２の電流が非常に類似の特性を示したことから、チャネルタンパク質に固有である（図７）。Ｏｔｏｐ２の電流及びＯｔｏｐ３の電流の両方は、Ｏｔｏｐ１のように、電圧依存性の証拠をほとんど示さなかった（図６ｂ）。ＨＥＫ−２９３細胞で発現し、顕微蛍光測定法で測定されると、Ｏｔｏｐ２及びＯｔｏｐ３の両方は、低減するｐＨｏに応答して、プロトンを細胞の細胞質基質内に伝導する（図６ｃ、ｄ）。興味深いことに、Ｏｔｏｐ３でトランスフェクトされた細胞におけるｐＨｉは、中性ｐＨｏに戻った後に回復することができず、その一方で、Ｏｔｏｐ２は、Ｏｔｏｐ１と比較して速い回復を示し、このことは、チャネルによるＨ＋の伝導の差を指摘している。したがって、Ｏｔｏｐ２及びＯｔｏｐ３は異なる特性を有するが、両者ともプロトンを透過させる。
【００５７】
[0067]ショウジョウバエ属ゲノムにはｍＯｔｏｐ１に関連する３つの遺伝子が存在する。これらの遺伝子は、予測されるタンパク質であるｄｍＯＴＯＰＬａ、ｄｍＯＴＯＰＬｂ、及びｄｍＯＴＯＰＬｃをコードし（図３ａ）、これらのタンパク質のいずれもこれまでに特徴付けされていない。１５７６アミノ酸からなるタンパク質であるｄｍＯｔｏｐＬｃは、相同性領域にわたってＯｔｏｐ１と１４．１％のアミノ酸同一性を、及びその膜貫通ドメインのいくつかにおいて＞３０％のアミノ酸同一性を示す（図３ｂ）。クセノプス属卵母細胞で発現すると、ｄｍＯＴＯＰＬｃは、低減する細胞外ｐＨに応答して大きな電流を生じさせた（図３ｅ）。Ｏｔｏｐ１及びＯｔｏｐ３と同様に、ｄｍＯＴＯＰＬｃの電流はｐＨｏが低減すると増大し、Ｅｒｅｖはよりプラスの電圧の方にシフトし、これは、プロトン選択性の指標である（図３ｅ、ｆ）。興味深いことに、ｄｍＯＴＯＰＬｃは、Ｏｔｏｐ１又はＯｔｏｐ３よりも、ｐＨ６で比較的大きな電流を伝導し、電流振幅とｐＨとの間の関連（図３ｆ）は、より浅かった。このことは、チャネルに、より広いダイナミックレンジをもたらし得る。
【００５８】
[0068]これらのデータを総合すると、オトペトリンファミリーの大きく分岐して進化的に遠位のメンバーが、機能的特性は異なるがプロトンを透過させる能力は共通なチャネルを形成することが示される。
【００５９】
実施例３−オトペトリンチャネルを通る電流は、顕微蛍光測定法で測定され得る細胞内のｐＨ及びカルシウムの変化を生じさせる。
【００６０】
[0069]オトペトリンチャネルｍＯｔｏｐ１、ｍＯｔｏｐ２、ｍＯｔｏｐ３、及びｈＯｔｏｐ１を通るプロトンの流入が、細胞内ｐＨ感受性の指標染料で検出され得る細胞内ｐＨの変化をもたらし得るかどうかを判定するために、本発明者らは、各チャネルをＨＥＫ−２９３細胞において一時的に発現させた。実際、本発明者らが、膜透過性のｐＨ感受性染料であるｐＨｒｏｄｏレッドを使用して、ｍＯｔｏｐ１でトランスフェクトされた細胞から細胞内ｐＨをイメージングし、細胞外ｐＨを７．４〜５．０に低減させると、本発明者らは、細胞内ｐＨの大きな変化の指標である蛍光の大きな変化を観察した（図１ｈ）。ｐＨの指標であるｐＨｒｏｄｏレッドを使用して、ｈＯｔｏｐ１でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞の細胞内ｐＨの変化をモニタリングすると、ｐＨ５の溶液に応答して、類似の結果が観察された（図８ｃ及び図８ｄ）（平均＋／−ＳＥＭ）。両方のケースで、偽トランスフェクトされた細胞では類似の応答は観察されず（図１ｈ）、このことは、細胞内ｐＨの変化が、Ｏｔｏｐ１チャネルを通るプロトン移入の結果であることを示す。図７は、Ｏｔｏｐ２又はＯｔｏｐ３でトランスフェクトされ、ｐＨｒｏｄｏレッドをロードされたＨＥＫ２９３細胞が、細胞外ｐＨの低減で蛍光の大きな変化を示したことを示し、このことは、両チャネルが、低減する細胞外ｐＨに応答してプロトンを細胞の細胞質基質内に伝導することを示す（図６ｃ、ｄ）。興味深いことに、Ｏｔｏｐ３でトランスフェクトされた細胞の細胞内ｐＨは、中性ｐＨｏに戻した後も回復することができず、その一方で、Ｏｔｏｐ２は、Ｏｔｏｐ１と比較して速い回復を示し、このことは、チャネルによるＨ＋伝導の差を指摘している。
【００６１】
[0070]本発明者らはまた、Ｏｔｏｐ１（図１０Ａ）、Ｏｔｏｐ２（図１０Ｂ）、及びＯｔｏｐ３（図１０Ｃ）を通るプロトン輸送を、遺伝的にコードされたｐＨ指標でモニタリングし得るかどうかを試験した。このために、本発明者らは、チャネルの各々でコトランスフェクトされたか又は単独でトランスフェクトされた（対照として）、ｐＨｌｕｏｒｉｎを使用した。ＯｔｏｐチャネルでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞では、外部ｐＨが低減した場合（Ｏｔｏｐ１、Ｏｔｏｐ２、及びＯｔｏｐ３）又は外部ｐＨが増大した場合（Ｏｔｏｐ１及びＯｔｏｐ２）に、蛍光発光の大きな変化がｐＨｌｕｏｒｉｎから検出された。これらの応答は、３つのＯｔｏｐのうちの１つでトランスフェクトされた細胞でのみ観察され、トランスフェクトされていない細胞では観察されなかった。
実施例４−細胞外ｐＨの変化に応答した、Ｏｔｏｐ１でトランスフェクトされたＨＥＫ−２９３細胞における細胞内カルシウムの上昇。
【００６２】
本発明者らはまた、Ｏｔｏｐチャネルを通るプロトンの移入が、顕微蛍光測定法によって検出され得る細胞内カルシウムの変化を生じさせ得るかどうかを試験した。トランスフェクトされた細胞に、カルシウムの指標であるＦｕｒａ  ２  ＡＭをロードし、７．４〜５．０までの細胞外ｐＨの変化に曝露させた。図９（左側のパネル）は、Ｏｔｏｐ１でトランスフェクトされた細胞のみが細胞内カルシウムの上昇に応答した（ｎ＝８細胞）ことを示す。Ｏｔｏｐ１でトランスフェクトされた細胞と偽トランスフェクトされた細胞との間の差は、有意である（ステューデントｔ検定。＊＊＊ｐ＜０．００１）。対照として、本発明者らは、トランスフェクトされた細胞及びトランスフェクトされていない細胞の両方が、細胞膜に侵入し細胞内の酸性化を生じさせ、それによって、細胞内の緩衝液からカルシウムを遊離させることで細胞内カルシウムを上昇させる、ｐＨ５のＨＯＡｃに応答することを示した。
【００６３】
実施例５−材料及び方法
動物
[0071]全ての実験手順は、南カリフォルニア大学のＩＡＣＵＣによって承認された。ｅＧＦＰの発現がＴＲＰＭ５プロモーターによって駆動されたマウス２２、２３と、ＹＦＰがＰｋｄ２ｌ１プロモーターによって駆動されたマウス（Ｐｋｄ２ｌ１−ＹＦＰ）２０とを交配して、ＧＦＰ及びＹＦＰの両方が陽性のマウスを生成した（Ｔｒｐｍ５−ＧＦＰ／Ｐｋｄ２ｌ１−ＹＦＰ）。
【００６４】
[0072]ＨＥＫ−２９３細胞での発現のために、ｃＤＮＡをイン−フュージョン（Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ）（登録商標）ＨＤクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）でｐｃＤＮＡ３ベクター内にクローニングした。Ｎ末端でＹＦＰをタグ付けされたｍＯｔｏｐ１を、開始コドンを除去し、Ｏｔｏｐ１をｐｃＤＮＡ３の５’ＹＦＰにインフレームでサブクローニングすることによって生成した。全ての配列をサンガーシーケンシング（Ｇｅｎｅｗｉｚ）によって検証した。インビトロでの転写を、Ｔ７  ｍＭＥＳＳＡＧＥ  ｍＭＡＣＨＩＮＥキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で行った。ｍＲＮＡをＴＵＲＢＯ  ＤＮａｓｅで処理し（３７℃で１５分間）、ＲＮＡ  Ｃｌｅａｎ  ＆  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒキット（Ｚｙｍｏ）で精製し、ゲル電気泳動及びＮａｎｏｄｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で完全性及び濃度について確認した。
【００６５】
クセノプス属卵母細胞の電気生理学
[0073]アフリカツメガエル卵母細胞は、Ｅｃｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅによって提供された。ｍＲＮＡ（０．２〜２０ｎｇ、５０ｎＬ）を、Ｎａｎｏｊｅｃｔ  ＩＩ  Ａｕｔｏ−Ｎａｎｏｌｉｔｅｒ  Ｉｎｊｅｃｔｏｒ（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ）で卵母細胞に注入し、標準Ｂａｒｔｈ溶液（ＳＢＳ、Ｅｃｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）中で、１８℃で１〜３日間インキュベートし、その後、記録した。
【００６６】
[0074]２電極の電圧クランプ（ＴＥＶＣ）を、以前に記載されるようにして行った４２。ホウケイ酸ガラスピペットをＰ−９７  Ｆｌａｍｉｎｇ／Ｂｒｏｗｎタイプのマイクロピペットプラーで引き伸ばし、その抵抗は、０．５〜５ＭΩの範囲内であった。電流を、ＧｅｎｅＣｌａｍｐ  ５００増幅器（Ａｘｏｎ）で測定した。溶液の交換は、重力駆動型のかん流によって行った。ほとんどの実験で、膜電位は−８０ｍＶで保持され、電圧ランプを１秒毎に−８０ｍＶ〜＋８０ｍＶまで（１Ｖ／ｓ）適用した。卵母細胞を、Ｎａ＋を含有しない細胞外溶液中で、１００μＭのＤＩＤＳと２〜３分間インキュベートして、Ｃａ２＋によって活性化されるＣｌ−チャネルを阻害し４３、４４、その後、酸をアプライした。有意性をＡＮＯＶＡによって決定した。
【００６７】
卵母細胞の電気生理学的溶液
[0075]クセノプス属卵母細胞を、ＨＣｌで７．４にｐＨ調整された、１００のＮａＣｌ、２のＫＣｌ、１．８のＣａＣｌ２、２のＭｇＣｌ２、１０のＨＥＰＥＳ（ｍＭ単位で）を含有するＮＤ９６溶液中でインキュベートした。ｐＨｏの変化に応答した電流の変化を測定するために、１０ｍＭのＨＥＰＥＳでｐＨ６．５〜７．４に、又は２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ、１０ｍＭ）でｐＨ４〜６に緩衝された、１００のＮ−メチル−Ｄ−グルカミン（ＮＭＤＧ）、２のＫＣｌ、１．８のＣａＣｌ２、２のＭｇＣｌ２を含有する、ナトリウムを有さない溶液を使用した。ｐＨをＨＣｌで調整した。以下の化学物質を、図に示すように、ナトリウムを有さない溶液に添加した：１００μＭの４，４’−ジイソチオシアノ−２，２’−スチルベンジスルホン酸（ＤＩＤＳ）、０．０３〜１０のＺｎＣｌ２、１００μＭのアマンタジン。
【００６８】
ＨＥＫ−２９３細胞のトランスフェクション
[0076]Ｏｔｏｐ及びＧＦＰ（５：１）を、ＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１トランスフェクション試薬（Ｍｉｒｕｓ  Ｂｉｏ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して、ＨＥＫ−２９３細胞（ＣＲＬ−１５７３、ＡＴＣＣ）にコトランスフェクトした。ＧＦＰ陽性細胞でのパッチクランプの記録及びイメージング実験を、トランスフェクションの約２４〜４８時間後に室温で行った。
【００６９】
パッチクランプの電気生理学
[0077]ホールセルパッチクランプ記録法を、以前に記載されるようにして行った４９。簡潔に述べると、記録をＡｘｏｐａｔｃｈ  ２００Ａ増幅器又はＡｘｏｐａｔｃｈ  ２００Ｂ増幅器で行い、ｐＣｌａｍｐ  ８．２を備えたＤｉｇｉｄａｔａ  １３２２ａ  １６ビットデータ収集システムでデジタル化し、そしてＣｌａｍｐｆｉｔ  ８．２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）で分析した。記録を５ｋＨｚでサンプリングし、１ｋＨｚでフィルタリングした。２〜４ＭΩの抵抗を有するパッチピペットをホウケイ酸ガラスから作製し、ギガオームシールが達成された記録のみを分析で使用した。ほとんどの実験で、ホールセルの立体構造が達成された後、膜電位は−８０ｍＶで保持されたか、又は１秒当たり−８０ｍＶ〜＋８０ｍＶまで傾斜させた（１Ｖ／ｓ）。Ｏｔｏｐ１のプロトン選択性を判定するための実験では、膜電位は、細胞を細胞外溶液に漬けるためにＥＨで保持され、１秒当たり−８０ｍＶ〜＋８０ｍＶまで傾斜させた（１Ｖ／ｓ）。溶液は、微小潅流パイプ（Ｗａｒｎｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｈａｍｄｅｎ、ＣＴ）の線形配列を使用して変化させた。
【００７０】
パッチクランプの電気生理学溶液
[0078]タイロード溶液は、１４５ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのＣａＣｌ２、２０ｍＭのデキストロース、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ＮａＯＨでｐＨ７．４）を含有していた。ピペット溶液は、１２０ｍＭのＣｓ−アスパルテート、１５ｍＭのＣｓＣｌ、２ｍＭのＭｇ−ＡＴＰ、５ｍＭのＥＧＴＡ、２．４ｍＭのＣａＣｌ２（１００ｎＭの遊離Ｃａ２＋）、及び１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ＣｓＯＨでｐＨ７．３）を含有していた。ｐＨｏが変化した実験では（図１ｄ〜ｆ）、細胞外溶液は、１６０ｍＭのＮＭＤＧと、２ｍＭのＣａＣｌ２と、ＨＣｌでｐＨ調整された１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４に）、１０ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ６〜５．５に）、又は１０ｍＭのＨｏｍｏＰＩＰＥＳ（ｐＨ５〜４に）のいずれかとを含有していた。イオン置換実験では（図２ａ）、溶液が含有していた１６０ｍＭのＮＭＤＧ−Ｃｌが等モル濃度のＮａＣｌ、ＬｉＣｌ、又はＣｓＣｌで置き換えられ、２００μＭのアミロライドが、内因性のＥＮａＣチャネルを遮断するために添加された。高カルシウム溶液では、一貫した重量モル浸透圧濃度を維持するために、６０ｍＭのＮＭＤＧを４０ｍＭのＣａＣｌ２で置き換えた。図１ｄ〜ｆ、３ｆ〜ｇ、及び図７で示す実験では、内因性のＣｌ−電流を遮断するために、１００μＭのＤＩＤＳを添加した４５。ＤＩＤＳは、全ての他の実験では省略した。
【００７１】
[0079]プロトン選択性の測定では（図２ｂ〜ｅ）、ピペット溶液は、約１５ｍＭのＴＭＡ−ＯＨで（６．０）に滴定され、ｄＨ２Ｏで３０５ｍＯｓｍに調整された、１３０ｍＭのＴＭＡ−メタンスルホネート、５ｍＭのＴＥＡ−Ｃｌ、２ｍＭのＭｇＡＴＰ、５ｍＭのＥＧＴＡ、２．４ｍＭのＣａＣｌ２、及び８０ｍＭのＭＥＳを含有していた。ＮＭＤＧベースの（Ｎａを有さない）外部溶液は、約１０〜１５ｍＭのＮＭＤＧ−ＯＨでｐＨ調整され、ｄＨ２Ｏで３０５ｍＯｓｍに調整された、１３０ｍＭのＮＭＤＧ−メタンスルホネート、２ｍＭのＣａＣｌ２、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０〜７．４）、又は１００ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ５．５〜６．５）、又は１００ｍＭのＨｏｍｏＰＩＰＥＳ（ｐＨ４．５〜５．２５）を含有していた。Ｎａ含有溶液は、ＮａＯＨでｐＨ調整された、１３０ｍＭのＮａ−メタンスルホネート、２ｍＭのＣａＣｌ２、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、又は１００ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ５．５）を含有していた。示される場合、ＺｎＣｌ２（１０ｍＭ、最終濃度）、ＮＭＤＧ−Ｃｌ（２０ｍＭ）、ＮａＣｌ（２０ｍＭ）、又はＭｇＣｌ２（１０ｍＭ）を、Ｎａを有さない溶液又はＮａ含有溶液に添加し、モル浸透圧濃度を、ｄＨ２Ｏで調整した。各溶液のｐＨを使用の前に測定し、必要に応じて調整した。測定は、＋／−０．０１ｐＨ単位程度のｐＨのわずかな変化、又はｐＨ５．５での［Ｈ＋］の約＋／−３％の変化の分、正確度が限定されていたことに留意されたい。これにより、図２ａで見られるように、示されるものなどの異なるイオンの存在下での応答を測定する場合に、電流規模にわずかな変化が生じ得る。５ｍＶの液間電位差をピペット溶液とバス溶液（Ｔｙｒｏｄｅの）との間で測定し、事後的に補正した。下水管によって送達される溶液とバス溶液との間の液間電位差を最小にするために、１ＭのＫＣｌ寒天橋を利用し、バス溶液を調整して、使用した下水管と類似のイオン組成を含むようにした４６。＜２ｍＶの液間電位は補正されなかった。
【００７２】
ｐＨのイメージング
[0080]Ｏｔｏｐ及びＧＦＰでコトランスフェクトされたＨＥＫ−２９３細胞を、ＣＦＰでトランスフェクトされたＨＥＫ−２９３細胞と混合し、３７℃で、プロタミンで被覆したカバースリップ上で平板培養した。少なくとも１時間後、製造者の指示に従ってＰｏｗｅｒＬｏａｄ濃縮物を使用して（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、細胞に、細胞内ｐＨの指標であるｐＨｒｏｄｏレッドＡＭをロードした。Ｏｔｏｐ及びＧＦＰでコトランスフェクトされた細胞を、Ｕ−ＭＮＩＢＡ２  ＧＦＰフィルターキューブ（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を使用して同定し、その一方で、ＣＦＰを発現する「偽」トランスフェクト細胞を、Ｕ−Ｎ３１０４４ｖ２  ＣＦＰフィルターキューブ（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を使用して、又は蛍光の非存在によって、同定した。ｐＨのイメージングオプティクス及び画像の取得は、以前に記載されるものと同一であった２３、２１。ＭＥＳ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭＥＳ、２ｍＭのＣａＣｌ２）で又は酢酸（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭの酢酸、２ｍＭのＣａＣｌ２）で緩衝したｐＨ５．０の溶液に応答した、各細胞のｐＨｒｏｄｏレッドの蛍光強度を測定した。フルオロフォアを５６０ｎｍの光で励起させ、６３０ｎｍでの発光を、Ｕ−Ｎ３１００４  Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ／Ｃｙ３．５フィルターキューブ（Ｃｈｒｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ７１顕微鏡に取り付けられたＨａｍａｍａｔｓｕデジタルＣＣＤカメラによって検出した。各細胞のｐＨｒｏｄｏレッドの蛍光強度を、ｐＨ７．４の溶液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＣａＣｌ２）中でのそのベースライン蛍光に対して正規化し、その後、最初の酸のアプライを行った。
【００７３】
データ分析及び統計
[0081]全てのデータは、別段の記載がない限り、平均±ＳＥＭで表される。統計分析（ＡＮＯＶＡ又はステューデントｔ検定）は、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ（Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｓｏｆｔｏｗａｒｅ  Ｉｎｃ）を使用して行った。本研究における試料のサイズは、類似の研究についての文献で報告されたものに類似している。図で示される代表的なデータは、一部のケースでは、グラフィクスプログラムであるＯｒｉｇｉｎ（Ｍｉｃｒｏｃａｌ）及びＣｏｒｅｌｄｒａｗ（Ｃｏｒｅｌ）にエクスポートする前に、１０倍デシメートされた。
【００７４】
[0082]図３では、最大尤度系統樹を、Ａｌｉｇｎ−Ｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＮＪｐｌｏｔを使用して４８、１３のオトペトリンファミリータンパク質のマルチシーケンスアラインメントから作成した。受託番号は以下の通りである：ヒト、ＮＰ＿８１９０５６；ウシ、ＮＰ＿００１１９３７１３；マウス、ＮＰ＿７６６２９７；イヌ、ＸＰ＿５４５９４３；ニワトリ、ＸＰ＿０１５１４１３５１；カエル、ＸＰ＿０１２８１１１７０；ゼブラフィッシュ、ＮＰ＿９４２０９８；ｍ＿ＯＴＯＰ２、ＮＰ＿７６６３８９；ｍ＿ＯＴＯＰ３、ＮＰ＿０８１４０８；ｄｍ＿ＯＴＯＰＬａ、ＡＡＦ４６０５０；ｄｍ＿ＯＴＯＰＬｂ、ＡＡＮ１０３８５；ｄｍ＿ＯＴＯＰＬｃ、ＡＣＬ８２８９３；ｃｅ＿ＯＴＯＰＬ１、ＣＣＤ６１３３７。Ｈｕｇｈｅｓらを参照されたい２８。膜貫通トポロジーを、ＴＭＨＭＭサーバ２．０（２０１７年４月２４日にアクセスしたインターネット＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ／＞上）を使用して予測した。
【００７５】
実施例６−細胞外ｐＨの変化に応答した、Ｏｔｏｐ１でトランスフェクトされたＨＥＫ−２９３細胞における細胞内カルシウムの上昇。
【００７６】
[0083]カルシウムイメージングを使用して、３７℃で、プロタミンで被覆したカバースリップ上で培養した、Ｏｔｏｐ及びＧＦＰでコトランスフェクトされたＨＥＫ−２９３細胞、並びにＣＦＰでトランスフェクトされたＨＥＫ−２９３細胞における細胞内カルシウムの変化についてアッセイした（図９）。少なくとも１時間後、製造者の指示に従ってＰｏｗｅｒＬｏａｄ濃縮物を使用して（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、細胞に、細胞内カルシウムの指標であるｆｕｒａ−２  ＡＭをロードした。Ｏｔｏｐ及びＧＦＰでコトランスフェクトされた細胞を、Ｕ−ＭＮＩＢＡ２  ＧＦＰフィルターキューブ（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を使用して同定し、その一方で、「偽」トランスフェクトされた細胞は、Ｕ−Ｎ３１０４４ｖ２  ＣＦＰフィルターキューブ（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を使用してＣＦＰを発現することが同定されたか、又は蛍光を示さなかった。カルシウムのイメージングオプティクス及び画像の取得は、記載されるものと同一であった（Ｃｈａｎｇら、２０１０）。ＭＥＳ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭＥＳ、２ｍＭのＣａＣｌ２）で又は酢酸（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭの酢酸、２ｍＭのＣａＣｌ２）で緩衝したｐＨ５．０の溶液に応答した、各細胞のＦｕｒａ−２励起の比を測定した。
【００７７】
実施例７−参考文献
以下の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。
【００７８】
実施例８−オトペトリンの配列
[0084]ヒトＯＴＯＰ１（配列番号１）：
ＭＬＥＧＬＧＳＰＡＳＰＲＡＡＡＳＡＳＶＡＧＳＳＧＰＡＡＣＳＰＰＳＳＳＡＰＲＳＰＥＳＰＡＰＲＲＧＧＶＲＡＳＶＰＱＫＬＡＥＭＬＳＳＱＹＧＬＩＶＦＶＡＧＬＬＬＬＬＡＷＡＶＨＡＡＧＶＳＫＳＤＬＬＣＦＬＴＡＬＭＬＬＱＬＬＷＭＬＷＹＶＧＲＳＳＡＨＲＲＬＦＲＬＫＤＴＨＡＧＡＧＷＬＲＧＳＩＴＬＦＡＶＩＴＶＩＬＧＣＬＫＩＧＹＦＩＧＦＳＥＣＬＳＡＴＥＧＶＦＰＶＴＨＳＶＨＴＬＬＱＶＹＦＬＷＧＨＡＫＤＩＩＱＳＦＫＴＬＥＲＦＧＶＩＨＳＶＦＴＮＬＬＬＷＡＮＧＶＬＮＥＳＫＨＱＬＮＥＨＫＥＲＬＩＴＬＧＦＧＮＩＴＴＶＬＤＤＨＴＰＱＣＮＣＴＰＰＴＬＣＴＡＩＳＨＧＩＹＹＬＹＰＦＮＩＥＹＱＩＬＡＳＴＭＬＹＶＬＷＫＮＩＧＲＫＶＤＳＨＱＨＱＫＭＱＦＫＳＤＧＶＭＶＧＡＶＬＧＬＴＶＬＡＡＴＩＡＶＶＶＶＹＬＩＨＩＧＲＳＫＴＫＳＥＳＡＬＩＭＦＹＬＹＡＩＴＬＬＭＬＭＧＡＡＧＬＡＧＩＲＩＹＲＩＤＥＫＳＬＤＥＳＫＮＰＡＲＫＬＤＳＤＬＬＶＧＴＡＳＧＳＷＬＩＳＷＧＳＩＬＡＩＬＣＡＥＧＨＰＲＹＴＷＹＮＬＰＹＳＩＬＡＩＶＥＫＹＩＱＮＬＦＩＦＥＳＩＨＲＥＰＥＫＬＳＥＤＩＱＴＬＲＶＶＴＶＣＮＧＮＴＭＰＬＡＳＳＣＰＫＳＧＧＶＡＲＤＶＡＰＱＧＫＤＭＰＰＡＡＮＧＮＶＣＭＲＥＳＨＤＫＥＥＥＫＱＥＥＳＳＷＧＧＳＰＳＰＶＲＬＰＲＦＬＱＧＮＡＫＲＫＶＬＲＮＩＡＡＦＬＦＬＣＮＩＳＬＷＩＰＰＡＦＧＣＲＰＥＹＤＮＧＬＥＥＩＶＦＧＦＥＰＷＩＩＶＶＮＬＡＭＰＦＳＩＦＹＲＭＨＡＡＡＳＬＦＥＶＹＣＫＩ
【００７９】
[0085]ヒトＯＴＯＰ２（配列番号２）：
ＭＳＥＥＬＡＱＧＰＫＥＳＰＰＡＰＲＡＧＰＲＥＶＷＫＫＧＧＲＬＬＳＶＬＬＡＶＮＶＬＬＬＡＣＴＬＩＳＧＧＡＦＮＫＶＡＶＹＤＴＤＶＦＡＬＬＴＡＭＭＬＬＡＴＬＷＩＬＦＹＬＬＲＴＶＲＣＰＣＡＶＰＹＲＤＡＨＡＧＰＩＷＬＲＧＧＬＶＬＦＧＩＣＴＬＩＭＤＶＦＫＴＧＹＹＳＳＦＦＥＣＱＳＡＩＫＩＬＨＰＬＩＱＡＶＦＶＩＩＱＴＹＦＬＷＶＳＡＫＤＣＶＨＶＨＬＤＬＴＷＣＧＬＭＦＴＬＴＴＮＬＡＩＷＭＡＡＶＶＤＥＳＶＨＱＳＨＳＹＳＳＳＨＳＮＡＳＨＡＲＬＩＳＤＱＨＡＤＮＰＶＧＧＤＳＣＬＣＳＴＡＶＣＱＩＦＱＱＧＹＦＹＬＹＰＦＮＩＥＹＳＬＦＡＳＴＭＬＹＶＭＷＫＮＶＧＲＦＬＡＳＴＰＧＨＳＨＴＰＴＰＶＳＬＦＲＥＴＦＦＡＧＰＶＬＧＬＬＬＦＶＶＧＬＡＶＦＩＩＹＥＶＱＶＳＧＤＧＳＲＴＲＱＡＬＶＩＹＹＳＦＮＩＶＣＬＧＬＴＴＬＶＳＬＳＧＳＩＩＹＲＦＤＲＲＡＭＤＨＨＫＮＰＴＲＴＬＤＶＡＬＬＭＧＡＡＬＧＱＹＡＩＳＹＹＳＩＶＡＶＶＡＧＴＰＱＤＬＬＡＧＬＮＬＴＨＡＬＬＭＩＡＱＨＴＦＱＮＭＦＩＩＥＳＬＨＲＧＰＰＧＡＥＰＨＳＴＨＰＫＥＰＣＱＤＬＴＦＴＮＬＤＡＬＨＴＬＳＡＣＰＰＮＰＧＬＶＳＰＳＰＳＤＱＲＥＡＶＡＩＶＳＴＰＲＳＱＷＲＲＱＣＬＫＤＩＳＬＦＬＬＬＣＮＶＩＬＷＩＭＰＡＦＧＡＲＰＨＦＳＮＴＶＥＶＤＦＹＧＹＳＬＷＡＶＩＶＮＩＣＬＰＦＧＩＦＹＲＭＨＡＶＳＳＬＬＥＶＹＶＬＳ
【００８０】
[0086]ヒトＯＴＯＰ３（配列番号３）：
ＭＧＲＧＡＲＡＡＡＡＱＳＲＷＧＲＡＳＲＡＳＶＳＰＧＲＴＩＲＳＡＰＡＶＧＥＡＱＥＴＥＡＡＰＥＫＥＮＲＶＤＶＧＡＥＥＲＡＡＡＴＲＰＲＱＫＳＷＬＶＲＨＦＳＬＬＬＲＲＤＲＱＡＱＫＡＧＱＬＦＳＧＬＬＡＬＮＶＶＦＬＧＧＡＦＩＣＳＭＩＦＮＫＶＡＶＴＬＧＤＶＷＩＬＬＡＴＬＫＶＬＳＬＬＷＬＬＹＹＶＡＳＴＴＲＲＰＨＡＶＬＹＱＤＰＨＡＧＰＬＷＶＲＧＳＬＶＬＦＧＳＣＴＦＣＬＮＩＦＲＶＧＹＤＶＳＨＩＲＣＫＳＱＬＤＬＶＦＳＶＩＥＭＶＦＩＧＶＱＴＷＶＬＷＫＨＣＫＤＣＶＲＶＱＴＮＦＴＲＣＧＬＭＬＴＬＡＴＮＬＬＬＷＶＬＡＶＴＮＤＳＭＨＲＥＩＥＡＥＬＧＩＬＭＥＫＳＴＧＮＥＴＮＴＣＬＣＬＮＡＴＡＣＥＡＦＲＲＧＦＬＭＬＹＰＦＳＴＥＹＣＬＩＣＣＡＶＬＦＶＭＷＫＮＶＧＲＨＶＡＰＨＭＧＡＨＰＡＴＡＰＦＨＬＨＧＡＩＦＧＰＬＬＧＬＬＶＬＬＡＧＶＣＶＦＶＬＦＱＩＥＡＳＧＰＡＩＡＣＱＹＦＴＬＹＹＡＦＹＶＡＶＬＰＴＭＳＬＡＣＬＡＧＴＡＩＨＧＬＥＥＲＥＬＤＴＶＫＮＰＴＲＳＬＤＶＶＬＬＭＧＡＡＬＧＱＭＧＩＡＹＦＳＩＶＡＩＶＡＫＲＰＨＥＬＬＮＲＬＩＬＡＹＳＬＬＬＩＬＱＨＩＡＱＮＬＦＩＩＥＧＬＨＲＲＰＬＷＥＴＶＰＥＧＬＡＧＫＱＥＡＥＰＰＲＲＧＳＬＬＥＬＧＱＧＬＱＲＡＳＬＡＹＩＨＳＹＳＨＬＮＷＫＲＲＡＬＫＥＩＳＬＦＬＩＬＣＮＩＴＬＷＭＭＰＡＦＧＩＨＰＥＦＥＮＧＬＥＫＤＦＹＧＹＱＩＷＦＡＩＶＮＦＧＬＰＬＧＶＦＹＲＭＨＳＶＧＧＬＶＥＶＹＬＧＡ
【００８１】
[0087]マウスＯＴＯＰ１（配列番号４）：
ＭＰＧＧＰＧＡＰＳＳＰＡＡＳＳＧＳＳＲＡＡＰＳＧＩＡＡＣＰＬＳＰＰＰＬＡＲＧＳＰＱＡＳＧＰＲＲＧＡＳＶＰＱＫＬＡＥＴＬＳＳＱＹＧＬＮＶＦＶＡＧＬＬＦＬＬＡＷＡＶＨＡＴＧＶＧＫＳＤＬＬＣＶＬＴＡＬＭＬＬＱＬＬＷＭＬＷＹＶＧＲＳＹＭＱＲＲＬＩＲＰＫＤＴＨＡＧＡＲＷＬＲＧＳＩＴＬＦＡＦＩＴＶＶＬＧＣＬＫＶＡＹＦＩＧＦＳＥＣＬＳＡＴＥＧＶＦＰＶＴＨＡＶＨＴＬＬＱＶＹＦＬＷＧＨＡＫＤＩＩＭＳＦＫＴＬＥＲＦＧＶＩＨＳＶＦＴＮＬＬＬＷＡＮＳＶＬＮＥＳＫＨＱＬＮＥＨＫＥＲＬＩＴＬＧＦＧＮＩＴＩＶＬＤＤＨＴＰＱＣＮＣＴＰＰＡＬＣＳＡＬＳＨＧＩＹＹＬＹＰＦＮＩＥＹＱＩＬＡＳＴＭＬＹＶＬＷＫＮＩＧＲＲＶＤＳＳＱＨＱＫＭＱＣＲＦＤＧＶＬＶＧＳＶＬＧＬＴＶＬＡＡＴＩＡＶＶＶＶＹＭＩＨＩＧＲＳＫＳＫＳＥＳＡＬＩＭＦＹＬＹＡＩＴＶＬＬＬＭＧＡＡＧＬＶＧＳＷＩＹＲＶＤＥＫＳＬＤＥＳＫＮＰＡＲＫＬＤＶＤＬＬＶＡＴＡＳＧＳＷＬＬＳＷＧＳＩＬＡＩＡＣＡＥＴＲＰＰＹＴＷＹＮＬＰＹＳＶＬＶＩＶＥＫＹＶＱＮＩＦＩＩＥＳＶＨＬＥＰＥＧＶＰＥＤＶＲＴＬＲＶＶＴＶＣＳＳＥＡＡＡＬＡＡＳＴＬＧＳＱＧＭＡＱＤＧＳＰＡＶＮＧＮＬＣＬＱＱＲＣＧＫＥＤＱＥＳＧＷＥＧＡＴＧＴＴＲＣＬＤＦＬＱＧＧＭＫＲＲＬＬＲＮＩＴＡＦＬＦＬＣＮＩＳＬＷＩＰＰＡＦＧＣＲＰＥＹＤＮＧＬＥＥＩＶＦＧＦＥＰＷＩＩＶＶＮＬＡＭＰＦＳＩＦＹＲＭＨＡＡＡＡＬＦＥＶＹＣＫＩ
【００８２】
[0088]マウスＯＴＯＰ２（配列番号５）：
ＭＳＥＥＬＶＰＨＰＮＥＳＬＰＧＰＲＡＳＰＲＥＶＷＫＫＧＧＲＬＬＳＶＬＬＡＶＮＶＬＬＬＡＣＴＬＩＳＧＧＡＦＮＫＶＡＶＹＤＴＤＶＦＡＬＬＴＴＭＭＬＬＡＡＬＷＩＶＦＹＬＬＲＴＡＲＣＰＤＡＶＰＹＲＤＡＨＡＧＰＩＷＬＲＧＧＬＶＬＦＧＩＣＴＬＶＭＤＶＦＫＴＧＹＹＳＳＦＦＥＣＱＳＡＩＫＩＬＨＰＩＩＱＡＶＦＶＩＶＱＴＹＦＬＷＩＳＡＫＤＣＩＨＴＨＬＤＬＴＲＣＧＬＭＦＴＬＡＴＮＬＡＩＷＭＡＡＶＶＤＥＳＶＨＱＡＨＳＹＳＧＳＨＧＮＴＳＨＴＲＬＮＰＤＳＫＲＡＧＧＡＡＥＥＤＰＣＬＣＳＴＡＩＣＱＩＦＱＱＧＹＦＹＬＹＰＦＮＩＥＹＳＬＦＡＳＴＭＬＹＶＭＷＫＮＶＧＲＬＬＡＳＴＨＧＨＧＨＴＰＳＲＶＳＬＦＲＥＴＦＦＡＧＰＶＬＧＬＬＬＦＶＶＧＬＡＶＦＩＬＹＥＶＱＶＳＧＥＲＧＨＴＲＱＡＬＶＩＹＹＳＦＮＩＶＣＬＧＬＭＴＬＶＳＬＳＧＳＶＩＹＲＦＤＲＲＡＭＤＨＨＫＮＰＴＲＴＬＤＶＡＬＬＭＧＡＡＬＧＱＹＡＩＳＹＹＳＩＶＡＶＶＶＧＳＰＲＤＬＱＧＡＬＮＬＳＨＡＬＬＭＩＡＱＨＴＦＱＮＶＦＩＩＥＳＬＨＲＧＰＰＧＡＥＰＲＥＭＰＰＫＥＰＣＱＧＩＴＦＡＮＬＤＡＩＲＴＬＰＳＣＰＰＴＰＲＬＶＩＰＮＬＥＳＰＱＥＡＶＡＩＩＳＡＰＲＣＨＷＲＲＲＣＬＫＤＩＳＬＦＬＬＬＣＮＶＩＬＷＩＭＰＡＦＧＡＲＰＨＦＳＮＴＶＥＶＤＦＹＧＹＳＬＷＡＡＩＶＮＩＣＬＰＦＧＩＦＹＲＭＨＡＶＳＳＬＬＥＶＹＶＬＳ
【００８３】
[0089]マウスＯＴＯＰ３（配列番号６）：
ＭＡＳＱＴＳＡＰＡＥＰＡＰＭＰＳＰＥＡＫＴＴＥＧＡＳＳＹＤＱＡＤＭＥＴＫＨＡＧＳＰＣＰＰＫＱＫＳＷＬＡＲＨＦＳＬＬＬＲＲＤＲＱＡＱＫＡＧＱＬＦＳＧＬＬＡＬＮＶＶＦＬＧＧＡＦＩＣＳＭＩＦＮＫＶＳＶＴＬＧＤＶＷＩＬＬＡＡＬＫＶＬＳＬＬＷＬＬＹＹＴＶＧＴＴＲＫＰＨＡＶＬＹＲＤＰＨＡＧＰＩＷＶＲＧＳＬＶＬＦＧＳＣＴＶＣＬＮＩＦＲＭＧＹＤＶＳＨＩＨＣＫＳＥＶＥＬＩＦＰＡＩＥＩＶＦＭＩＩＱＴＷＶＬＷＲＨＣＫＤＣＶＱＶＱＴＮＦＴＲＣＧＬＭＬＴＬＡＴＮＬＬＭＷＶＬＡＶＴＮＤＳＭＨＲＥＩＥＡＥＬＤＡＬＭＥＫＦＳＧＮＧＴＮＴＣＭＣＬＮＴＴＶＣＥＶＦＲＫＧＹＬＭＬＹＰＦＳＴＥＹＣＬＩＣＣＡＶＬＦＶＭＷＫＮＶＳＲＳＬＡＡＨＴＧＡＨＰＮＲＳＰＦＲＬＨＧＴＩＦＧＰＬＬＧＬＬＡＬＶＡＧＶＣＶＦＶＬＦＱＩＥＡＳＧＰＤＩＡＲＱＹＦＴＬＹＹＡＦＹＶＡＶＬＰＴＭＳＬＡＣＬＡＧＴＡＩＨＧＬＥＥＲＥＬＤＴＬＫＮＰＴＲＳＬＤＶＶＬＬＭＧＡＡＬＧＱＭＧＩＡＹＦＳＩＶＡＩＶＡＴＱＰＨＥＬＬＮＱＬＩＬＡＹＳＬＬＬＩＬＱＨＩＴＱＮＬＦＩＩＥＧＬＨＲＲＰＬＷＥＰＡＶＳＧＶＭＥＫＱＤＶＥＬＰＲＲＧＳＬＲＥＬＧＱＤＬＲＲＡＳＲＡＹＩＨＳＦＳＨＬＮＷＫＲＲＭＬＫＥＩＳＬＦＬＩＬＣＮＩＴＬＷＭＭＰＡＦＧＩＨＰＥＦＥＮＧＬＥＫＤＦＹＧＹＲＴＷＦＴＩＶＮＦＧＬＰＬＧＶＦＹＲＭＨＳＶＧＧＬＶＥＶＹＬＧＡ
【００８４】
[0090]ショウジョウバエ属ＯＴＯＰ変異体Ｄ（ＣＧ４２４９２），（配列番号７）：
ＭＱＲＣＰＹＩＨＥＭＲＥＲＬＬＤＱＰＲＥＴＬＱＬＥＮＭＥＲＡＮＬＬＤＮＲＱＳＡＳＥＳＮＱＬＱＧＤＧＹＨＴＳＰＡＨＱＲＴＰＬＶＰＨＤＬＧＥＤＦＮＬＤＦＤＤＤＦＰＩＤＡＲＲＰＫＮＡＮＤＩＨＰＡＶＬＴＲＰＱＱＲＴＳＬＦＩＶＴＳＬＶＹＡＩＬＬＩＶＶＣＩＡＹＶＩＳＤＶＴＴＨＲＬＰＶＬＹＹＥＴＦＦＴＹＬＹＧＶＳＩＬＦＬＬＹＶＦＣＦＬＬＱＥＳＳＣＣＮＧＧＮＧＧＳＫＰＫＰＱＰＫＥＫＫＳＫＫＡＫＮＡＤＰＡＤＳＫＤＡＫＧＳＫＤＳＧＫＡＡＫＧＡＡＹＱＨＴＬＡＫＦＬＥＡＰＶＤＡＥＶＡＶＴＰＫＮＶＲＫＲＫＴＴＨＳＤＬＴＨＧＳＦＦＬＲＶＧＡＩＡＦＧＬＧＡＭＩＹＩＧＬＥＦＧＳＦＦＥＩＰＦＤＳＰＣＨＨＩＬＩＧＶＮＰＬＬＱＭＩＦＴＦＭＱＭＹＦＩＦＭＮＡＲＴＲＰＰＦＱＬＮＩＨＲＦＫＶＩＡＲＦＧＬＭＨＶＶＡＴＮＩＣＶＷＩＲＴＬＶＫＥＳＬＬＥＩＴＩＹＨＱＫＮＥＰＥＡＧＡＳＳＩＡＨＳＩＲＱＨＡＬＲＨＡＧＴＶＬＲＴＨＡＧＰＮＳＥＦＥＶＬＤＧＥＤＩＬＰＫＤＶＹＫＳＤＮＶＬＳＫＬＶＲＮＴＶＤＧＩＳＫＳＬＧＭＧＧＤＱＡＬＤＳＳＴＴＳＳＳＴＴＴＴＴＲＡＰＦＴＴＰＮＹＱＷＨＳＴＴＭＡＲＫＬＫＫＦＩＴＳＡＴＴＡＡＴＴＡＡＧＳＳＳＴＡＳＳＴＴＴＩＳＰＴＩＳＳＴＴＩＰＳＴＴＩＳＳＴＴＩＳＳＳＴＴＦＳＰＦＳＰＳＴＴＴＴＴＴＴＴＡＡＡＬＮＬＥＴＳＧＳＥＳＰＦＧＧＬＱＲＩＬＳＳＡＡＰＰＳＬＡＰＶＤＧＦＧＳＡＳＡＡＴＰＴＳＧＳＧＡＧＳＦＶＤＳＦＬＡＳＴＬＳＰＡＳＳＴＥＧＳＡＳＩＭＮＮＬＦＧＱＧＰＭＥＮＳＦＱＴＹＴＤＬＧＨＥＥＡＴＧＬＶＳＦＥＮＬＥＳＬＤＮＩＹＰＡＡＬＳＳＮＩＧＴＬＮＳＴＡＣＧＲＩＤＩＭＧＴＩＶＹＤＳＡＰＹＬＹＰＦＩＩＥＹＳＬＩＧＡＶＶＬＹＶＭＷＫＨＩＧＲＹＰＧＲＭＮＤＥＤＬＥＨＲＬＥＶＭＬＳＲＲＡＶＡＭＡＱＱＡＲＳＧＲＶＤＣＶＧＳＳＫＧＬＦＦＧＬＬＬＬＶＧＡＬＩＣＬＩＬＦＦＶＬＶＲＨＱＱＦＳＬＬＡＩＹＬＡＤＡＳＨＣＩＬＭＡＦＡＩＬＡＩＩＶＧＦＩＲＶＫＮＬＫＦＲＣＥＥＱＳＮＬＮＤＩＬＬＲＩＳＡＦＧＬＦＴＹＳＶＦＳＩＩＡＧＳＬＫＶＬＥＳＥＰＳＬＬＶＴＴＴＧＧＶＡＶＦＱＶＩＬＱＬＬＦＩＡＤＶＳＲＲＲＶＨＬＰＥＨＤＲＳＫＰＧＲＱＩＶＴＦＬＬＩＣＮＶＡＭＦＡＩＹＴＦＥＡＱＫＶＦＡＮＰＶＳＲＹＶＱＬＥＦＹＧＦＶＰＷＳＩＩＱＲＩＴＬＰＬＣＩＦＨＲＦＨＳＡＶＴＬＡＥＩＷＫＴＴＹＫＡＲＬＥ
【００８５】
[0091]ショウジョウバエ属ＯＴＯＰ変異体Ａ（配列番号８）：
ＭＳＬＩＮＬＫＳＫＤＭＹＤＥＰＩＮＬＷＲＴＫＱＲＶＨＹＨＨＤＶＩＳＫＧＮＤＳＨＲＳＳＤＡＣＥＹＩＴＩＳＡＰＫＫＳＧＳＦＳＲＳＰＰＳＳＬＰＴＳＶＰＧＴＰＲＨＳＶＡＡＴＳＮＱＶＩＲＹＡＲＴＳＣＤＨＣＧＨＨＳＩＰＶＭＳＰＨＰＩＳＰＬＡＫＳＱＴＮＬＤＬＶＥＨＧＳＱＲＱＡＬＬＰＬＰＴＶＧＭＨＨＥＤＳＡＣＴＬＱＶＳＲＲＰＳＬＬＬＱＥＩＬＴＱＲＰＰＬＦＧＲＲＤＧＮＧＦＬＳＰＲＴＡＫＮＧＮＬＱＧＴＡＳＧＳＴＡＴＩＮＦＱＳＧＡＴＳＡＲＮＧＳＴＡＦＦＤＮＧＡＫＳＦＱＡＫＱＱＫＤＫＮＲＲＴＧＮＤＡＩＳＳＡＬＳＡＴＹＣＫＬＬＶＬＬＧＶＣＬＰＩＴＥＶＩＳＤＱＩＰＴＹＶＹＱＧＦＹＶＹＬＹＶＧＳＩＬＦＶＩＦＬＹＩＳＡＦＲＮＲＳＬＦＮＡＬＫＤＹＨＥＫＮＳＮＶＨＬＫＨＫＶＴＨＦＧＳＦＹＬＲＶＧＡＩＡＦＡＩＧＴＭＶＹＳＧＬＥＦＧＱＦＦＥＬＮＧＨＰＧＣＲＤＶＦＶＡＩＴＰＩＣＲＭＶＬＣＩＡＱＶＱＦＩＦＬＮＴＴＹＭＤＭＡＲＨＫＶＴＳＲＦＧＬＭＨＭＶＡＴＮＬＣＥＷＬＹＶＬＶＥＥＴＫＨＥＩＦＨＩＳＱＨＥＶＤＰＡＨＤＬＶＩＨＮＳＳＭＳＲＴＤＷＡＡＶＮＥＳＬＨＱＨＨＨＨＨＡＬＮＮＴＬＶＡＮＶＳＳＶＩＶＮＭＴＩＴＰＳＰＴＰＡＡＦＳＧＣＳＲＴＴＩＭＧＡＬＶＱＱＬＳＰＦＬＦＰＣＴＩＥＹＳＬＩＣＡＶＩＬＦＥＭＷＫＴＶＫＳＩＰＤＩＤＫＴＲＫＮＳＶＫＰＡＡＡＫＰＡＨＨＦＳＶＤＣＳＱＳＨＫＧＬＦＦＧＩＬＩＩＶＭＴＩＩＳＭＩＭＹＦＶＬＹＴＱＰＧＹＥＬＶＡＴＱＥＶＴＬＷＥＴＦＭＹＦＭＣＡＡＡＶＩＴＧＭＩＬＭＲＤＬＲＹＩＫＮＴＳＤＥＨＨＳＭＤＬＤＮＬＬＬＩＶＡＱＴＧＶＹＬＹＧＭＦＳＩＬＧＳＹＦＡＫＷＤＴＶＰＤＲＶＥＧＩＩＡＥＶＦＧＶＶＱＴＳＬＱＴＭＦＩＬＨＳＳＨＲＲＣＲＧＴＮＱＶＲＲＫＰＧＲＥＩＩＴＦＬＬＶＡＮＩＡＩＷＦＶＮＴＬＩＫＧＲＡＶＦＲＥＳＨＬＥＦＦＧＶＷＧＷＴＩＩＴＨＩＳＭＰＬＡＩＦＹＲＦＨＳＴＩＣＬＦＥＶＷＫＩＴＹＫＡＫＡＨ
【００８６】
[0092]ショウジョウバエ属ＯＴＯＰ変異体Ｄ（ＣＧ４２２６５）（配列番号９）：
ＭＤＳＳＰＤＬＳＬＫＬＲＲＧＳＳＤＳＲＤＮＦＹＭＤＦＡＱＧＩＤＳＤＩＥＥＶＤＮＴＡＮＮＱＥＡＧＥＶＰＰＰＰＬＰＴＶＳＬＡＥＥＶＬＬＬＶＡＰＰＰＰＰＰＳＬＬＧＱＰＬＰＴＬＴＥＴＤＤＩＰＰＴＰＴＰＰＰＱＱＫＤＤＥＧＤＤＥＤＥＲＥＥＰＶＰＥＱＤＱＧＡＰＡＡＰＳＰＰＧＳＰＩＮＳＶＬＥＬＥＬＩＰＰＰＰＬＳＰＭＤＤＡＧＬＲＴＤＤＤＧＥＧＥＥＴＤＤＡＥＥＶＡＡＩＰＰＰＨＥＭＬＤＩＥＳＮＰＤＥＥＥＥＥＥＥＱＥＱＡＳＱＥＤＴＰＫＥＥＤＥＥＥＤＤＤＫＳＴＰＰＰＰＬＰＰＬＰＳＮＦＳＹＶＱＧＨＮＬＧＱＶＴＰＰＬＴＫＳＰＳＮＳＰＳＰＰＶＴＰＰＰＣＰＥＬＮＩＳＲＭＶＳＰＰＡＱＨＩＳＱＩＰＰＬＴＰＳＤＥＳＥＧＥＡＥＳＱＰＮＳＰＰＬＲＬＤＡＥＱＰＰＰＤＭＤＱＰＥＰＥＤＱＰＰＥＰＥＮＥＰＥＰＥＰＥＰＥＰＥＰＥＰＶＳＧＡＲＥＤＹＳＲＳＬＤＮＥＤＥＳＴＴＩＴＴＰＰＳＮＧＹＳＡＳＳＩＩＡＰＰＰＥＨＦＡＥＬＤＥＤＲＧＦＩＰＰＰＰＬＥＱＥＰＥＥＥＶＥＥＥＥＥＥＥＥＥＥＬＴＫＥＴＤＥＩＳＶＤＲＥＳＬＱＤＱＧＧＤＳＩＳＳＰＲＰＡＳＩＬＴＧＳＩＳＴＳＶＧＧＧＡＧＧＳＰＫＰＥＳＲＧＰＳＲＳＧＳＱＲＳＱＬＲＳＧＳＱＱＧＳＩＡＥＳＲＧＧＳＲＩＧＳＲＴＧＳＶＡＳＡＱＡＡＧＶＬＳＰＱＡＳＬＫＳＱＴＳＩＲＳＱＧＱＡＧＶＲＳＰＡＧＳＩＫＳＧＳＱＲＭＱＳＰＱＡＧＥＧＡＰＡＭＰＳＰＰＬＭＲＳＰＰＰＥＬＡＲＱＭＨＳＰＰＲＩＴＴＰＰＲＶＣＳＰＰＬＶＳＳＰＰＫＬＡＥＳＡＡＡＡＶＧＶＡＡＴＶＫＥＱＩＧＳＳＳＳＴＡＥＰＬＥＰＳＫＰＥＰＬＫＰＰＩＡＴＶＳＹＱＤＥＱＫＰＳＰＰＰＴＡＡＡＡＰＡＶＴＴＴＡＡＴＴＡＶＴＳＱＰＲＳＨＦＴＳＳＨＨＨＹＨＬＰＨＱＦＱＨＰＨＨＱＮＨＨＴＨＳＶＲＶＰＴＰＴＶＰＳＳＹＡＰＰＰＰＰＤＳＧＳＳＳＳＰＶＤＲＲＲＬＦＭＡＧＶＡＰＰＩＡＡＧＡＧＳＬＭＡＭＰＡＥＰＡＶＡＩＳＰＧＲＶＳＡＲＳＧＳＱＨＨＶＴＩＤＥＳＳＬＰＳＨＫＧＮＩＱＥＴＰＧＰＳＧＬＩＩＧＧＧＤＧＤＧＤＲＤＩＧＧＧＧＧＰＤＳＳＤＰＰＳＳＰＧＧＳＳＳＱＰＡＬＳＧＳＱＡＤＧＱＬＡＬＭＹＨＳＨＱＬＴＮＹＰＶＬＰＡＩＫＲＴＨＲＰＳＦＶＹＰＰＭＰＲＶＫＡＧＤＡＬＡＴＬＦＳＡＬＹＧＫＬＬＶＶＭＧＩＡＦＰＭＡＥＶＩＳＴＹＩＰＰＳＦＹＥＶＹＹＬＹＬＹＩＧＳＭＩＦＬＬＦＭＹＡＴＬＩＷＧＲＰＫＬＰＶＰＩＡＳＰＳＫＳＡＴＫＡＳＧＴＤＳＭＤＥＳＤＴＤＳＮＳＶＨＨＲＬＰＰＰＩＰＶＲＲＰＳＬＬＳＰＬＧＲＲＤＡＨＹＧＳＦＹＬＲＭＧＡＶＡＦＧＩＧＳＭＩＹＳＧＬＥＦＧＱＹＦＥＬＮＰＤＴＫＣＨＮＶＬＬＡＬＴＰＡＴＲＭＡＦＩＦＩＱＭＹＦＩＦＬＮＮＥＱＩＫＶＹＲＹＫＩＩＡＲＦＧＬＭＨＭＩＧＴＮＬＡＶＷＬＮＶＬＩＱＥＴＫＨＥＩＬＴＦＹＮＰＥＮＲＴＬＲＩＳＨＲＩＰＧＨＳＲＧＨＡＩＩＱＨＤＰＴＡＨＬＲＶＰＲＧＬＫＧＰＹＱＩＦＥＣＲＲＴＮＩＩＧＴＬＶＱＤＡＳＰＦＬＦＰＣＴＩＥＹＳＬＩＣＡＡＩＬＹＶＭＷＲＳＩＳＲＰＱＴＰＴＰＱＲＰＤＭＩＳＳＰＭＫＲＳＰＨＨＹＳＶＤＣＡＲＡＨＫＧＬＦＶＧＩＬＩＬＶＬＴＩＩＳＬＩＩＦＦＶＬＩＳＲＰＥＦＶＡＭＡＶＴＥＶＴＩＣＥＬＬＩＹＧＴＡＴＩＡＴＬＶＧＭＩＱＩＲＨＬＱＹＤＡＹＲＳＦＳＬＤＤＩＬＬＶＧＡＱＴＧＳＦＬＹＮＩＦＴＶＩＡＧＨＦＴＬＲＳＤＤＭＬＶＰＩＮＡＬＡＳＩＶＱＴＡＣＱＴＭＦＩＬＤＡＳＲＲＱＡＶＳＰＥＨＬＲＫＫＰＧＲＥＩＶＴＦＭＬＶＶＮＬＡＭＷＡＩＳＴＬＥＫＳＲＡＥＳＨＰＩＱＬＮＦＹＧＬＷＡＷＴＩＩＴＨＶＳＭＰＬＡＩＦＹＲＦＨＳＴＶＣＬＣＥＩＷＫＲＡＹＫＬＫＰＴＹＭＸＥＦＡＲＳＲＩＱＳＩＡＱＱＱＱＦＣＥＤＬＫＴＮＬＳＹＣＹＣＳＴＴＬＡＧＧＥＬＥＴＶＥＥＶＤＳＧＥＳＮＳＡＥＤＡＧＡＧＡＧＳＧＧＳＲＧＳＧＧＧＡＧＡＡＥＡＧＥＡＧＥＥＧＱＱＧＧＤＳＳＣＧＬＫＡＰＩＲＡＬＳＰＱＳＬＮＴＥＫＡＦＣＰＶＹＶＩＮＧＥ
【００８７】
[0100]詳細な説明、図面、及び特許請求の範囲に記載される例示的な実施形態は、限定を意図しない。本明細書において提示される発明の主題の趣旨又は範囲から逸脱することなく、他の実施形態を利用してもよいし、他の変更がなされてもよい。本明細書の全体で記載され図面で例示された本開示の態様は、アレンジされ得、置換され得、組み合わされ得、及び広範な異なる立体配置で設計され得、その全てが明確に検討され、本開示の一部を成すことは容易に理解されよう。
【００８８】
[0101]本明細書における実質的に全ての複数形の及び／又は単数形の用語の使用に関して、当業者は、文脈及び／又は適用に適切なように、複数形から単数形に、及び／又は単数形から複数形に変換することができる。様々な単数形／複数形の入れ替えは、明確にするために、本明細書において明示的に示され得る。
【００８９】
[0102]当業者には、通常、本明細書において、特に添付の特許請求の範囲（例えば、請求項のボディ）において使用される用語は、一般に、「非排他的な」用語を意図する（例えば、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は「これらに限定されないが、〜が挙げられる」として解釈されるべきであり、用語「有する」は「少なくとも〜を有する」として解釈されるべきであり、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」は「これらに限定されないが、〜が挙げられる」として解釈されるべきである等）ことが理解されよう。当業者には、具体的な数の導入された請求項の詳述が意図される場合、このような意図は請求項において明確に詳述され、このような詳述が存在しない場合にはこのような意図は存在しないことがさらに理解されよう。例えば、理解の手助けとして、以下の添付の特許請求の範囲は、請求項の詳述を導入するために、導入のための表現「少なくとも１つの」及び「１つ又は複数の」の使用を含み得る。しかし、このような表現の使用は、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」による請求項の詳述の導入が、このような導入された請求項の詳述を含む任意の特定の請求項を、同一の請求項が導入のための表現「１つ又は複数の」或いは「少なくとも１つの」及び「ａ」又は「ａｎ」などの不定冠詞（例えば、「ａ」及び／又は「ａｎ」は「少なくとも１つの」或いは「１つ又は複数の」を意味すると典型的には解釈されるべきである）を含む場合であっても、このような詳述を１つだけ含む発明に限定することを暗に示すと解釈されるべきではない。同様のことが、請求項の列挙を導入するために使用される定冠詞の使用にも当てはまる。さらに、具体的な数の導入される請求項の列挙が明確に列挙されていても、当業者は、このような列挙が少なくとも列挙された数を意味する（例えば、他の修飾語句を伴わない「２つの列挙」という無冠詞の列挙は、少なくとも２つの列挙又は２つ以上の列挙を典型的には意味する）と典型的には解釈されるべきであることが認識されよう。さらに、「Ａ、Ｂ、及びＣなどの少なくとも１つ」に類似の規定が使用される場合、通常、このような構文は、当業者がその規定を理解するであろう意味で意図される（例えば、「Ａ、Ｂ、及びＣの少なくとも１つを有するシステム」は、これらに限定されないが、例えばＡのみを、Ｂのみを、Ｃのみを、Ａ及びＢを共に、Ａ及びＣを共に、Ｂ及びＣを共に、並びに／又はＡ、Ｂ、及びＣを共に有するシステムを含む）。「Ａ、Ｂ、又はＣなどの少なくとも１つ」に類似の規定が使用される場合では、通常、このような構文は、当業者がその規定を理解する意味で意図される（例えば、「Ａ、Ｂ、又はＣの少なくとも１つを有するシステム」は、これらに限定されないが、例えばＡのみを、Ｂのみを、Ｃのみを、Ａ及びＢを共に、Ａ及びＣを共に、Ｂ及びＣを共に、並びに／又はＡ、Ｂ、及びＣを共に有するシステムを含む等）。当業者には、事実上全ての、２つ以上の代替的な用語を表す離接語及び／又は表現が、明細書、特許請求の範囲、又は図面のいずれにおいても、その用語の一方、その用語のいずれか、又はその用語の両方を含む可能性を検討すると理解されるべきであることがさらに理解されよう。例えば、表現「Ａ又はＢ」は、「Ａ」又は「Ｂ」又は「Ａ及びＢ」の可能性を含むと理解されよう。
【００９０】
[0103]当業者には、多くの及び様々な修正が、本技術の趣旨から逸脱することなくなされ得ることが理解されよう。したがって、本技術の形式が例示的なものにすぎず、本技術の範囲を限定することを意図したものではないことが、明らかに理解される。
【００９１】
[0104]本明細書において引用される全ての参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【図１】
2020529201.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2020529201.tif 000007
【図６】
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【図７ａ】
2020529201.tif 000009
【図７ｂ】
2020529201.tif 000010
【図７ｃ】
2020529201.tif 000011
【図８】
2020529201.tif 000012
【図９】
2020529201.tif 000013
【図１０】
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【配列表】
2020529201000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年3月30日(2020.3.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オトペトリン介在性のプロトン転移活性の調節物質を同定する方法であって、
（ａ）オトペトリンポリペプチド若しくはその機能的部分又はオトペリンポリペプチドを発現する宿主細胞を、試験化合物と接触させるステップ、及び
（ｂ）オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分が介在するプロトン転移活性を判定するステップ
を含み、
試験化合物の非存在下で判定されたプロトン転移活性の量と比較した前記プロトン転移活性の少なくとも１％の増大又は低減が、前記試験化合物を、オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分が介在するプロトン転移活性の調節物質として同定し、
任意選択的に、
（ｂ）で判定された前記プロトン転移活性と、前記試験化合物の非存在下でオトペトリンポリペプチド又はその機能的部分について判定されたプロトン転移活性とを比較するステップを含み、
プロトン転移活性の少なくとも１％の増大が、前記試験化合物を、オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分が介在するプロトン転移活性のアゴニストであると同定し、及び／又は、
プロトン転移活性の少なくとも１％の減少が、前記試験化合物を、オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分が介在するプロトン転移活性のアンタゴニストであると同定する、方法。
【請求項２】
前記オトペトリンポリペプチドが、哺乳動物のオトペトリンポリペプチド又はその機能的部分を含み、
任意選択的に、
前記哺乳動物のオトペトリンポリペプチドが、Ｏｔｏｐ１、Ｏｔｏｐ２、Ｏｔｏｐ３、及びその機能的部分から選択されるポリペプチド配列を含み、
前記オトペトリンポリペプチドが、昆虫のオトペトリンポリペプチド又はその機能的部分を含み、
前記オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分が、細胞膜又は合成膜と共役し、及び／又は、
前記オトペリンポリペプチドは、配列番号１〜９のいずれか１つのオトペリンポリペプチド配列に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プロトン転移活性を判定するステップが、オトペトリンポリペプチド若しくはその機能的部分を含む膜における伝導性、電流、抵抗若しくは電圧電位、又は、オトペリンポリペプチド若しくはその機能的部分を発現する宿主細胞における細胞内ｐＨ若しくは細胞内カルシウムを測定することを含み、
任意選択的に、
前記伝導性、前記電圧電位、前記電流、前記抵抗、前記細胞内ｐＨ又は前記細胞内カルシウムが、ｐＨの変化に応答して測定され、
前記プロトン転移活性を判定するステップが、パッチクランプ技術、電圧クランプ技術、ホールセル電流の測定、放射性標識されたイオン流束アッセイ、又はｐＨ感受性の指標若しくはカルシウム感受性の指標の使用を含み、
前記ｐＨ感受性の指標が、ｐＨｌｕｏｒｉｎ、ｐＨｒｏｄｏレッド、ＤＦＦＤＡ又はＢＣＥＣＦを含み、
前記カルシウム感受性の指標が、Ｆｕｒａ−２、Ｆｌｕｏ−４又はＦｌｕｏ−３を含み、
前記ｐＨの変化が細胞外ｐＨの変化であり、
前記ｐＨの変化が細胞内ｐＨの変化であり、
前記ｐＨの変化がｐＨの増大であり、
前記ｐＨの変化がｐＨの減少であり、及び／又は、
前記ｐＨの変化が少なくとも０．１ｐＨ単位である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記プロトン転移活性を判定するステップが、オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分を細胞で発現させることを含み、
任意選択的に、
前記細胞が哺乳動物細胞であり、
前記細胞が卵母細胞であり、及び／又は、
前記細胞がＨＥＫ−２９３細胞又はＣＨＯ細胞である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記試験化合物が、有機低分子、無機低分子、求電子剤、多糖、ペプチド、タンパク質、抗体、核酸、及び抽出物からなる群から選択され、前記抽出物が、細菌、植物、真菌、動物細胞、及び動物組織から選択される生物学的材料に由来し、
任意選択的に、
前記試験化合物が５０〜５０００００ダルトンの範囲の分子量を有し、
前記試験化合物が、１ｐＭ〜１００ｍＭ、１ｐＭ〜１０ｍＭ、１ｐＭ〜１ｍＭ、１０ｐＭ〜１００ｍＭ、１０ｐＭ〜１０ｍＭ、１０ｐＭ〜１ｍＭ、１００ｐＭ〜１００ｍＭ、１００ｐＭ〜１０ｍＭ、又は１００ｐＭ〜１ｍＭの範囲の濃度であり、及び／又は、
前記試験化合物が、少なくとも１ｐＭ、少なくとも１０ｐＭ、少なくとも１００ｐＭ、少なくとも１ｎＭ、少なくとも１０ｎＭ、少なくとも１００ｎＭ、少なくとも１μＭ、少なくとも１０μＭ、少なくとも１００μＭ、又は少なくとも１ｍＭの濃度である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
オトペトリン介在性のプロトン転移活性の調節物質を同定する方法であって、
（ａ）（ｉ）試験化合物の存在下で、及び（ｉｉ）試験化合物の非存在下で、オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分が介在するプロトン転移活性を測定するステップ、及び
（ｂ）（ａ）の（ｉ）で測定されたプロトン転移活性と、（ａ）の（ｉｉ）で測定されたプロトン転移活性とを比較した差を判定し、この判定によって、試験化合物を、オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分が介在するプロトン転移活性の調節物質として同定するステップ
を含み、
任意選択的に、
前記差が少なくとも１％の差であり、
（ａ）の（ｉ）で測定された前記プロトン転移活性が、（ａ）の（ｉｉ）で測定されたプロトン転移活性よりも少なくとも１％大きく、前記試験化合物が（ｂ）において、オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分が介在するプロトン転移活性のアゴニストとして同定され、
（ａ）の（ｉ）で測定された前記プロトン転移活性が、（ａ）の（ｉｉ）で測定されたプロトン転移活性よりも少なくとも１％小さく、前記試験化合物が（ｂ）において、オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分が介在するプロトン転移活性のアンタゴニストとして同定され、
前記プロトン転移活性を測定するステップが、パッチクランプ技術、ホールセル電流の測定、２電極の電圧クランプ、又は電圧感受性の染料を使用する蛍光アッセイを含み、及び／又は、
前記プロトン転移活性を測定するステップが、異種又は同種の細胞においてオトペトリンポリペプチド又はその機能的部分を発現させることを含む、方法。
【請求項７】
前記オトペトリンポリペプチドが、哺乳動物のオトペトリンポリペプチド又はその機能的部分を含み、
前記哺乳動物のオトペトリンポリペプチドが、マウス又はヒトのＯｔｏｐ１、Ｏｔｏｐ２、Ｏｔｏｐ３、及びその機能的部分から選択されるポリペプチド配列を含み、
前記オトペトリンポリペプチドが、昆虫のオトペトリンポリペプチド又はその機能的部分を含み、
前記オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分が、細胞膜若しくは合成膜と共役しているか又は細胞膜若しくは合成膜に組み込まれ、及び／又は、
前記オトペトリンポリペプチドは、配列番号１〜９のいずれか１つのオトペトリンポリペプチド配列に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記プロトン転移活性を測定するステップが、オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分を含む膜における伝導性、電流、電圧電位又は抵抗を測定することを含み、及び／又は、
前記プロトン転移活性を測定するステップが、ｐＨの変化に応答した、オトペトリンポリペプチド又はその機能的部分を含む膜における伝導性、電流、細胞内ｐＨ、細胞内カルシウム、又は電圧電位若しくは抵抗を測定することを含む、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
ｐＨの変化をオトペトリンポリペプチドの一方の側で誘発するステップを含み、
任意選択的に、
前記ｐＨの変化が細胞外ｐＨの変化であり、
前記ｐＨの変化がｐＨの増大であり、
前記ｐＨの変化がｐＨの減少であり、
前記ｐＨの変化が少なくとも０．１ｐＨ単位である、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記異種又は同種の細胞が哺乳動物細胞であり、及び／又は、
前記異種又は同種の細胞が卵母細胞である、請求項６〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記試験化合物が、有機低分子、無機低分子、多糖、ペプチド、タンパク質、抗体、核酸、及び抽出物からなる群から選択され、前記抽出物が、細菌、植物、真菌、動物細胞、及び動物組織から選択される生物学的材料に由来し、
前記試験化合物が５０〜５０００００ダルトンの範囲の分子量を有し、
前記試験化合物が、１ｐＭ〜１００ｍＭ、１ｐＭ〜１０ｍＭ、１ｐＭ〜１ｍＭ、１０ｐＭ〜１００ｍＭ、１０ｐＭ〜１０ｍＭ、１０ｐＭ〜１ｍＭ、１００ｐＭ〜１００ｍＭ、１００ｐＭ〜１０ｍＭ、又は１００ｐＭ〜１ｍＭの範囲の濃度であり、及び／又は、
前記試験化合物が、少なくとも１ｐＭ、少なくとも１０ｐＭ、少なくとも１００ｐＭ、少なくとも１ｎＭ、少なくとも１０ｎＭ、少なくとも１００ｎＭ、少なくとも１μＭ、少なくとも１０μＭ、少なくとも１００μＭ、又は少なくとも１ｍＭの濃度である、請求項６〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
膜チャネルを通るプロトン転移活性を感知するためのシステムであって、
細胞の膜に組み込まれた１つ又は複数の異種オトペトリンポリペプチドを含み、
前記細胞が、１つ又は複数の異種オトペトリンポリペプチドの発現を指示する１つ又は複数の核酸を含み、前記細胞が蛍光ｐＨの指標又は蛍光カルシウムの指標を含み、
任意選択的に、
前記細胞が不死化細胞であり、
前記細胞がＨＥＫ−２９３又はＣｏｓ−７であり、
１つ又は複数の前記異種オトペトリンポリペプチドが、Ｏｔｏｐ１、Ｏｔｏｐ２、Ｏｔｏｐ３、又はこれらの機能的部分から選択され、
前記オトペトリンポリペプチドは、配列番号１〜９のいずれか１つのオトペトリンポリペプチド配列に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であり、
前記細胞が蛍光レポーターでトランスフェクトされ、
前記細胞が蛍光レポーターをロードされ、
前記蛍光レポーターがｐＨｌｕｏｒｉｎであり、
前記蛍光ｐＨの指標が、ｐＨｒｏｄｏレッド、ＤＦＦＤＡ、及びＢＣＥＣＦから選択され、及び／又は蛍光カルシウムの指標がＦｕｒａ  ２  ＡＭ、Ｆｌｕｏ−４またはＦｌｕｏ−３である、システム。
【請求項１３】
蛍光イメージングプレートリーダー（ＦＬＩＰＲ）をさらに含み、及び／又は、
試験化合物をさらに含み、前記試験化合物が１つ又は複数のオトペトリンポリペプチドと接触している、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１４】
異種オトペトリンポリペプチドを含む細胞であって、
任意選択的に、
前記オトペトリンポリペプチドが、Ｏｔｏｐ１、Ｏｔｏｐ２、及びＯｔｏｐ３から選択され
前記オトペトリンポリペプチドは、配列番号１〜９のいずれか１つのオトペトリンポリペプチド配列に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であり、
前記細胞が、異種オトペトリンポリペプチドの発現を指示する核酸でトランスフェクトされ、
前記細胞が昆虫細胞又は爬虫類細胞であり、前記異種オトペトリンポリペプチドが哺乳動物のオトペトリンポリペプチドであり、
前記細胞が非ヒト細胞であり、前記異種オトペトリンポリペプチドがヒトオトペトリンポリペプチドである、細胞。
【請求項１５】
オトペリンポリペプチドを含む合成膜又は合成脂質二重層。
【国際調査報告】
2020529201.tif 000015
2020529201.tif 000016
2020529201.tif 000017