(57)【要約】本発明は、改善された遺伝子治療用ベクター、組成物、および方法を提供する。ＨＩＶ−１株ＮＬ４−３の５’長末端反復（ＬＴＲ）と、ヒトＢＣＬ１１Ａ  ｍＲＮＡにハイブリダイズするアンチセンス配列を含むｓｈｍｉＲをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された赤血球特異的プロモーターと、ＨＩＶ−１株ＮＬ４−３の３’ＬＴＲと、を含む、レンチウイルスベクター。ＨＩＶ−１のｇａｇおよびｐｏｌをコードする１つ以上のポリヌクレオチドと、ＶＳＶ−Ｇと、本願レンチウイルスベクターと、を含む、細胞。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＩＶ−１株ＮＬ４−３の５’長末端反復（ＬＴＲ）と、ヒトＢＣＬ１１Ａ  ｍＲＮＡにハイブリダイズするアンチセンス配列を含むｓｈｍｉＲをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された赤血球特異的プロモーターと、ＨＩＶ−１株ＮＬ４−３の３’ＬＴＲと、を含む、レンチウイルスベクター。
【請求項２】
５’から３’に向かって、プサイ（Ψ）パッケージングシグナルと、ＨＩＶ−１株ＮＬ４−３のセントラルポリプリン配列（ｃＰＰＴ）／ＦＬＡＰエレメントと、ＲＮＡ核外輸送因子と、ＨＩＶ−１  ｅｎｖスプライスアクセプター配列と、をさらに含む、請求項１に記載のレンチウイルスベクター。
【請求項３】
改変された５’ＬＴＲと、ＨＩＶ−１の３’ＳＩＮ  ＬＴＲと、をさらに含む、請求項１または請求項２に記載のレンチウイルスベクター。
【請求項４】
改変された５’ＬＴＲであって、前記改変された５’ＬＴＲのプロモーターがＣＭＶプロモーターで置換されている、改変された５’ＬＴＲと、ＨＩＶ−１の３’ＳＩＮ  ＬＴＲと、をさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター。
【請求項５】
レンチウイルスベクターであって、
（ａ）ＨＩＶ−１の５’ＬＴＲと、
（ｂ）プサイ（Ψ）パッケージングシグナルと、
（ｃ）レンチウイルスｃＰＰＴ／ＦＬＡＰエレメントと、
（ｄ）ＲＮＡ核外輸送因子と、
（ｅ）ＨＩＶ−１  ｅｎｖスプライスアクセプター配列と、
（ｆ）ヒトＢＣＬ１１Ａ  ｍＲＮＡにハイブリダイズするアンチセンス配列をコードするｓｈｍｉＲに作動可能に連結された赤血球特異的プロモーターと、
（ｇ）ＨＩＶ−１の３’ＬＴＲと、を含む、レンチウイルスベクター。
【請求項６】
改変された５’ＬＴＲであって、前記改変された５’ＬＴＲのプロモーターがＣＭＶプロモーターで置換されている、改変された５’ＬＴＲと、ＨＩＶ−１の３’ＳＩＮ  ＬＴＲと、をさらに含む、請求項５に記載のレンチウイルスベクター。
【請求項７】
ＨＩＶ−１株ＨＸＢ３由来のＲＲＥ  ＲＮＡ核外輸送因子をさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター。
【請求項８】
前記赤血球特異的プロモーターが、βグロビンプロモーターを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター。
【請求項９】
前記赤血球特異的プロモーターが、ヒトβグロビンプロモーターを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター。
【請求項１０】
βグロビンＬＣＲをさらに含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター。
【請求項１１】
ヒトβグロビンＬＣＲをさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター。
【請求項１２】
自己不活性化（ＳＩＮ）レンチウイルスベクターであって、
（ａ）改変されたＨＩＶ−１株ＮＬ４−３の５’ＬＴＲであって、前記改変された５’ＬＴＲのプロモーターがＣＭＶプロモーターで置換されている、改変されたＨＩＶ−１株ＮＬ４−３の５’ＬＴＲと、
（ｂ）プサイ（Ψ）パッケージングシグナルと、
（ｃ）ＨＩＶ−１株ＮＬ４−３のｃＰＰＴ／ＦＬＡＰエレメントと、
（ｄ）ＨＩＶ−１株ＨＸＢ３のＲＲＥ  ＲＮＡ核外輸送因子と、
（ｅ）ＨＩＶ−１株ＮＬ４−３  ｅｎｖスプライスアクセプター配列と、
（ｆ）ヒトＢＣＬ１１Ａ  ｍＲＮＡにハイブリダイズするアンチセンス配列をコードするｓｈｍｉＲに作動可能に連結されたβグロビンプロモーターと、
（ｇ）βグロビンＬＣＲと、
（ｇ）ＨＩＶ−１株ＮＬ４−３の３’ＳＩＮ  ＬＴＲと、を含む、自己不活性化（ＳＩＮ）レンチウイルスベクター。
【請求項１３】
ＨＳ３およびＨＳ２  ＤＮＡｓｅ  Ｉ過敏性部位を含むヒトβグロビンＬＣＲをさらに含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター。
【請求項１４】
ＨＳ３およびＨＳ２  ＤＮＡｓｅ  Ｉ過敏性部位を含むヒトβグロビンＬＣＲをさらに含むが、ＨＳ４  ＤＮＡｓｅ  Ｉ過敏性部位を欠く、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター。
【請求項１５】
ｇａｇタンパク質をコードする約４５９ヌクレオチドのポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター。
【請求項１６】
１つ以上の変異ＡＴＧ配列を含む前記ｇａｇタンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター。
【請求項１７】
約１７６ヌクレオチドのＨＩＶ−１  ｅｎｖスプライスアクセプター配列をさらに含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター。
【請求項１８】
約３８１ヌクレオチドのｃＰＰＴ／ＦＬＡＰエレメントをさらに含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター。
【請求項１９】
約６３８ヌクレオチドのＨＳ２  ＤＮＡｓｅ  Ｉ過敏性部位をさらに含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター。
【請求項２０】
約８４７ヌクレオチドのＨＳ３  ＤＮＡｓｅ  Ｉ過敏性部位をさらに含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター。
【請求項２１】
ＨＩＶ−１  ｅｎｖスプライスアクセプター配列と前記ｓｈｍｉＲとの間に配置された合成ポリ（Ａ）配列をさらに含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター。
【請求項２２】
前記ｓｈｍｉＲが、配列番号１に記載の配列をコードする、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター。
【請求項２３】
前記ｓｈｍｉＲが、配列番号２に記載のガイド鎖配列を含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター。
【請求項２４】
前記ｓｈｍｉＲが、配列番号３に記載の標的配列にハイブリダイズするガイド鎖配列を含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター。
【請求項２５】
前記赤血球特異的プロモーターと、前記ｓｈｍｉＲをコードする前記ポリヌクレオチドとを含む発現カセットが、前記レンチウイルスゲノムＲＮＡの転写と比較して逆配向である、請求項１〜２４のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター。
【請求項２６】
配列番号４に記載のポリヌクレオチド配列を含む、レンチウイルス導入ベクター。
【請求項２７】
請求項１〜２６のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクターを含む、細胞。
【請求項２８】
ＨＩＶ−１のｇａｇおよびｐｏｌをコードする１つ以上のポリヌクレオチドと、ＶＳＶ−Ｇと、請求項１〜２６のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクターと、を含む、細胞。
【請求項２９】
請求項２８に記載の細胞から産生された、レンチウイルスベクター粒子。
【請求項３０】
請求項１〜２６のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクターで形質導入された、細胞。
【請求項３１】
前記細胞が、ポロキサマー２８８、ポロキサマー３３５、ポロキサマー３３８、およびポロキサマー４０７からなる群から選択される有効量のポロキサマー、ならびにＰＧＥ２受容体アゴニストの存在下で形質導入される、請求項３０に記載の細胞。
【請求項３２】
請求項２９に記載のレンチウイルスベクター粒子で形質導入された、細胞。
【請求項３３】
前記細胞が、ポロキサマー２８８、ポロキサマー３３５、ポロキサマー３３８、およびポロキサマー４０７からなる群から選択される有効量のポロキサマー、ならびにＰＧＥ２受容体アゴニストの存在下で形質導入される、請求項３２に記載の細胞。
【請求項３４】
前記細胞が、造血幹細胞または造血前駆細胞である、請求項３０〜３３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３５】
前記細胞が、造血幹細胞または前駆細胞である、請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３６】
前記細胞が、ＣＤ３４＋である、請求項３０〜３５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３７】
前記細胞が、ＣＤ１３３＋である、請求項３０〜３６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３８】
前記細胞が、ＣＤ３４＋ＣＤ３８ＬｏＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ−である、請求項３０〜３７のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３９】
前記細胞が、ヘモグロビン異常症に関連する１つ以上の変異βグロビン対立遺伝子を含む、請求項３０〜３８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項４０】
前記細胞が、βＥ／β０、βＣ／β０、β０／β０、βＥ／βＥ、βＣ／β＋、βＥ／β＋、β０／β＋、β＋／β＋、βＣ／βＣ、βＥ／βＳ、β０／βＳ、βＣ／βＳ、β＋／βＳおよびβＳ／βＳからなる群から選択される１つ以上の変異βグロビン対立遺伝子を含む、請求項３０〜３９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項４１】
前記細胞が、βＥ／β０、βＣ／β０、β０／β０、βＣ／βＣ、βＥ／βＥ、βＥ／β＋、βＣ／βＥ、βＣ／β＋、β０／β＋、およびβ＋／β＋からなる群から選択される１つ以上の変異βグロビン対立遺伝子を含む、請求項３０〜３９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項４２】
前記細胞が、βＥ／βＳ、β０／βＳ、βＣ／βＳ、β＋／βＳおよびβＳ／βＳからなる群から選択される１つ以上の変異βグロビン対立遺伝子を含む、請求項３０〜３９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項４３】
請求項３０〜４２のいずれか一項に記載の複数の細胞を含む、細胞集団。
【請求項４４】
請求項３０〜４２のいずれか一項に記載の複数の細胞を含む細胞集団を含む、組成物。
【請求項４５】
薬学的に許容される担体と、請求項３０〜４２のいずれか一項に記載の複数の細胞を含む細胞集団と、を含む、薬学的組成物。
【請求項４６】
造血細胞集団を形質導入する方法であって、請求項１〜２６のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター、ポロキサマー、およびＰＧＥ２受容体アゴニストの存在下で、培地中で細胞を培養することを含む、方法。
【請求項４７】
前記ポロキサマーが、ポロキサマー２８８、ポロキサマー３３５、ポロキサマー３３８、およびポロキサマー４０７からなる群から選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記ＰＧＥ２受容体アゴニストが、１５ｄ−ＰＧＪ２、Δ１２−ＰＧＪ２、２−ヒドロキシヘプタデカトリエン酸（ＨＨＴ）、トロンボキサンＡ２、トロンボキサンＢ２、イロプロスト、トレプロスチニル、トラボプロスト、カルボプロストトロメタミン、タフルプロスト、ラタノプロスト、ビマトプロスト、ウノプロストンイソプロピル、クロプロステノール、エストロファン、スーパーファン、ミソプロストール、ブタプロスト、リノール酸、１３（ｓ）−ＨＯＤＥ、ＬＹ１７１８８３、ミード酸、エイコサトリエン酸、エポキシエイコサトリエン酸、ＯＮＯ−２５９、Ｃａｙ１０３９、ＰＧＥ２受容体アゴニスト、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２、１９（Ｒ）−ヒドロキシＰＧＥ２、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２ｐ−（ｐ−アセトアミドベンズアミド）フェニルエステル、１１−デオキシ−１６，１６−ジメチルＰＧＥ２、９−デオキシ−９−メチレン−１６，１６−ジメチルＰＧＥ２、９−デオキシ−９−メチレンＰＧＥ２、スルプロストン、ＰＧＥ２セリノールアミド、ＰＧＥ２メチルエステル、１６−フェニルテトラノルＰＧＥ２、１５（Ｓ）−１５−メチルＰＧＥ２、および１５（Ｒ）−１５−メチルＰＧＥ２からなる群から選択される、請求項４６または請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記ＰＧＥ２受容体アゴニストが、ＰＧＥ２または１６，１６−ジメチルＰＧＥ２である、請求項４６〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記レンチウイルスベクターが、約１０〜約３０のＭＯＩまたは約１０〜約２５のＭＯＩで存在する、請求項４６〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記レンチウイルスベクターが、約１０〜約２０のＭＯＩで存在する、請求項４６〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記レンチウイルスベクターが、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、または約３０のＭＯＩで存在する、請求項４６〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
請求項４３に記載の細胞集団、請求項４４に記載の組成物、または請求項４５に記載の薬学的組成物の有効量を、対象に投与することを含む、前記対象におけるヘモグロビン異常症を治療する方法。
【請求項５４】
対象におけるヘモグロビン異常症の少なくとも１つの症状を寛解させる方法であって、請求項４３に記載の細胞集団、請求項４４に記載の組成物、または請求項４５に記載の薬学的組成物の有効量を、前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項５５】
前記対象の前記βグロビン対立遺伝子が、βＥ／β０、βＣ／β０、β０／β０、βＥ／βＥ、βＣ／β＋、βＥ／β＋、β０／β＋、β＋／β＋、βＣ／βＣ、βＥ／βＳ、β０／βＳ、βＣ／βＳ、β＋／βＳまたはβＳ／βＳである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
対象におけるサラセミアを治療する方法であって、請求項４３に記載の細胞集団、請求項４４に記載の組成物、または請求項４５に記載の薬学的組成物の有効量を、前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項５７】
前記サラセミアが、αサラセミアである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記サラセミアが、βサラセミアである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
前記対象の前記βグロビン対立遺伝子が、βＥ／β０、βＣ／β０、β０／β０、βＣ／βＣ、βＥ／βＥ、βＥ／β＋、βＣ／βＥ、βＣ／β＋、β０／β＋、またはβ＋／β＋である、請求項５６に記載の方法。
【請求項６０】
対象における鎌状赤血球症を治療する方法であって、請求項４３に記載の細胞集団、請求項４４に記載の組成物、または請求項４５に記載の薬学的組成物の有効量を、前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項６１】
前記対象の前記βグロビン対立遺伝子は、βＥ／βＳ、β０／βＳ、βＣ／βＳ、β＋／βＳまたはβＳ／βＳである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
対象におけるβサラセミアを治療する方法であって、有効量の請求項４３に記載の細胞集団、請求項４４に記載の組成物、または請求項４５に記載の薬学的組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項６３】
前記対象の前記βグロビン対立遺伝子が、βＥ／β０、βＣ／β０、β０／β０、βＣ／βＣ、βＥ／βＥ、βＥ／β＋、βＣ／βＥ、βＣ／β＋、β０／β＋、またはβ＋／β＋である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記造血幹細胞集団が、静脈内経路、髄内経路、または骨内経路で投与される、請求項５３〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記造血幹細胞集団が、静脈内に投与される、請求項５３〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年４月２９日に出願された米国仮特許出願６２／４８９，１４９号および２０１７年３月２９日に出願された米国仮特許出願６２／４７８，３７５号の利益を、米国特許法第１１９条の下で主張するものであり、これらは各々、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、
【０００２】
配列表に関する記述
本出願に関連する配列リストは、紙コピーの代わりにテキスト形式で提供され、参照により本明細書に組み込まれる。配列リストを含むテキストファイルの名称は、ＢＬＢＤ＿０８５＿０２ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。本テキストファイルは、１２ＫＢであり、２０１８年３月２８日に作成され、本明細書の出願と同時に、ＥＦＳ−Ｗｅｂを経由して電子的に提出される。
背景
[技術分野]
【０００３】
本発明は、概して、改善された遺伝子治療用ベクター、組成物、およびそれを作製する方法に一部関する。
【背景技術】
【０００４】
ヘモグロビン異常症は、ヘモグロビンの構造および／または合成における変化から生じる多様な遺伝性の単因子血液障害である。最も一般的なヘモグロビン異常症は、鎌状赤血球症（ＳＣＤ）、αサラセミア、およびβサラセミアである。世界の人口の約５％がグロビン遺伝子変異を保有している。世界保健機関は、毎年３０万人以上の重度ヘモグロビン疾患を有する新生児が生まれていると推定している。ヘモグロビン異常症は、軽度の低色素性貧血から中程度の血液病、多臓器関与を伴う重度の生涯にわたる輸血依存性貧血まで、非常に多様な臨床症状を呈する。
【０００５】
ヘモグロビン異常症に利用可能な唯一の潜在的に根治的な治療は、同種造血幹細胞移植である。しかしながら、ＨＬＡ適合性のＨＳＣ移植片は、発症している個体の２０％未満に利用可能であり、長期毒性が著しいと推定されている。加えて、ＨＳＣ移植片は、ＳＣＤまたは重度のサラセミアを有する対象における有意な死亡率および疾病率とも関連している。有意な死亡率および疾病率は、とりわけ、ＨＳＣ移植前の輸血関連鉄過剰、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、および対象の移植前処置のために必要とされる高線量の化学療法／放射線に一部起因している。
遺伝子治療の分野における最近の進歩により、βサラセミアおよび鎌状赤血球貧血等のヘモグロビン異常症に罹患する患者が新規治療手段の恩恵を受けるという期待が高まっている。Ｃａｖａｚｚａｎａ−Ｃａｌｖｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２０１０。βグロビン遺伝子を保有するレンチウイルスベクターで改変した造血細胞（ＨＳＣ）の移植は、ヘモグロビン疾患のいくつかのマウスモデルの長期補正をもたらした：例えば、Ｉｍｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２００２；９９（２２）：１４３８０−１４３８５；Ｍａｌｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．２００５；１０５４：２３８−２４９；Ｍａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０００；４０６（６７９１）：８２−８６；Ｐａｗｌｉｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００１；２９４（５５５０）：２３６８−２３７１）。しかしながら、食品医薬品局（ＦＤＡ）は、いずれのヒト遺伝子治療用製品の販売も許可していない。現在の遺伝子治療は実験的であり、臨床試験における結果はまちまちである。Ｇｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ  ２０１３およびＮａｌｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗ  ２０１５。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｉｍｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２００２；９９（２２）：１４３８０−１４３８５
【非特許文献２】Ｍａｌｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．２００５；１０５４：２３８−２４９
【非特許文献３】Ｍａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０００；４０６（６７９１）：８２−８６
【非特許文献４】Ｐａｗｌｉｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００１；２９４（５５５０）：２３６８−２３７１
【発明の概要】
【０００７】
ヘモグロビン異常症の少なくとも１つの症状を治療する、予防する、または寛解させるための改善された遺伝子治療用ベクター、組成物、およびそれらを使用する方法が本明細書において企図される。
【０００８】
様々な実施形態において、ヒトＢＣＬ１１Ａ  ｍＲＮＡにハイブリダイズするアンチセンス配列を含むｓｈｍｉＲをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された赤血球特異的プロモーターを含むＨＩＶ−１レンチウイルスベクターが企図される。
【０００９】
様々な実施形態において、５’長末端反復（ＬＴＲ）と、ヒトＢＣＬ１１Ａ  ｍＲＮＡにハイブリダイズするアンチセンス配列を含むｓｈｍｉＲをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された赤血球特異的プロモーターと、ＨＩＶ−１株ＮＬ４−３の３’ＬＴＲとを含む、ＨＩＶ−１株ＮＬ４−３のレンチウイルスベクターが企図される。
【００１０】
特定の実施形態において、レンチウイルスベクターは、５’から３’に向かって、プサイ（Ψ）パッケージングシグナルと、レンチウイルスのセントラルポリプリン配列（ｃＰＰＴ）／ＦＬＡＰエレメントと、ＲＮＡ核外輸送因子と、ＨＩＶ−１  ｅｎｖスプライスアクセプター配列とを含む。
【００１１】
特定の実施形態において、レンチウイルスベクターは、５’から３’に向かって、プサイ（Ψ）パッケージングシグナルと、ＨＩＶ−１株ＮＬ４−３のセントラルポリプリン配列（ｃＰＰＴ）／ＦＬＡＰエレメントと、ＲＮＡ核外輸送因子と、ＨＩＶ−１  ｅｎｖスプライスアクセプター配列とを含む。
【００１２】
ある特定の実施形態において、レンチウイルスベクターは、改変された５’長末端反復（ＬＴＲ）およびＨＩＶ−１の３’ＳＩＮ  ＬＴＲを含む。
【００１３】
いくつかの実施形態において、レンチウイルスベクターは、改変された５’ＬＴＲであって、改変された５’ＬＴＲのプロモーターがＣＭＶプロモーターで置換されている、改変された５’ＬＴＲと、ＨＩＶ−１の３’ＳＩＮ  ＬＴＲとを含む。
【００１４】
様々な実施形態において、ＨＩＶ−１株ＮＬ４−３の５’長末端反復（ＬＴＲ）と、ＨＩＶ−１株ＮＬ４−３のプサイ（Ψ）パッケージングシグナルと、ＨＩＶ−１株ＮＬ４−３のセントラルポリプリン配列（ｃＰＰＴ）／ＦＬＡＰエレメントと、ＲＮＡ核外輸送因子と、ＨＩＶ−１株ＮＬ４−３  ｅｎｖスプライスアクセプター配列と、ヒトＢＣＬ１１Ａ  ｍＲＮＡにハイブリダイズするアンチセンス配列をコードするｓｈｍｉＲに作動可能に連結された赤血球特異的プロモーターと、ＨＩＶ−１株ＮＬ４−３の３’ＬＴＲとを含む、レンチウイルスベクターが企図される。
【００１５】
様々な実施形態において、ＨＩＶ−１の５’長末端反復（ＬＴＲ）と、プサイ（Ψ）パッケージングシグナルと、レンチウイルスのセントラルポリプリン配列（ｃＰＰＴ）／ＦＬＡＰエレメントと、ＲＮＡ核外輸送因子と、ＨＩＶ−１  ｅｎｖスプライスアクセプター配列と、ヒトＢＣＬ１１Ａ  ｍＲＮＡにハイブリダイズするアンチセンス配列をコードするｓｈｍｉＲに作動可能に連結された赤血球特異的プロモーターと、ＨＩＶ−１の３’ＬＴＲとを含む、レンチウイルスベクターが企図される。
【００１６】
特定の実施形態において、レンチウイルスベクターは、改変された５’ＬＴＲであって、改変された５’ＬＴＲのプロモーターがＣＭＶプロモーターで置換されている、改変された５’ＬＴＲと、ＨＩＶ−１の３’ＳＩＮ  ＬＴＲとを含む。
【００１７】
特定の実施形態において、レンチウイルスベクターは、ＲＲＥ  ＲＮＡ核外輸送因子を含む。
【００１８】
特定の実施形態において、レンチウイルスベクターは、ＨＩＶ−１株ＨＸＢ３から単離されたＲＲＥ  ＲＮＡ核外輸送因子を含む。
【００１９】
追加の実施形態において、赤血球特異的プロモーターは、βグロビンプロモーターを含む。
【００２０】
さらなる実施形態において、赤血球特異的プロモーターは、ヒトβグロビンプロモーターを含む。
【００２１】
いくつかの実施形態において、レンチウイルスベクターは、βグロビンＬＣＲを含む。
【００２２】
ある特定の実施形態において、レンチウイルスベクターは、ヒトβグロビンＬＣＲを含む。
【００２３】
様々な実施形態において、改変されたＨＩＶ−１株ＮＬ４−３の５’長末端反復（ＬＴＲ）であって、改変された５’ＬＴＲのプロモーターがＣＭＶプロモーターで置換されている、改変されたＨＩＶ−１株ＮＬ４−３の５’ＬＴＲと、ＨＩＶ−１株ＮＬ４−３のプサイ（Ψ）パッケージングシグナルと、ＨＩＶ−１株ＮＬ４−３のｃＰＰＴ／ＦＬＡＰエレメントと、ＨＩＶ−１株ＨＸＢ３のＲＲＥ  ＲＮＡ核外輸送因子と、ＨＩＶ−１株ＮＬ４−３  ｅｎｖスプライスアクセプター配列と、ヒトＢＣＬ１１Ａ  ｍＲＮＡにハイブリダイズするアンチセンス配列をコードするｓｈｍｉＲに作動可能に連結されたβグロビンプロモーターと、βグロビンＬＣＲと、ＨＩＶ−１株ＮＬ４−３の３’ＳＩＮ  ＬＴＲとを含む、自己不活性化（ＳＩＮ）レンチウイルスベクターが企図される。
【００２４】
様々な実施形態において、改変された５’長末端反復（ＬＴＲ）であって、改変された５’ＬＴＲのプロモーターがＣＭＶプロモーターで置換されている、改変された５’長末端反復（ＬＴＲ）と、プサイ（Ψ）パッケージングシグナルと、レンチウイルスのセントラルポリプリン配列（ｃＰＰＴ）／ＦＬＡＰエレメントと、ＲＲＥ  ＲＮＡ核外輸送因子と、ＨＩＶ−１  ｅｎｖスプライスアクセプター配列と、ヒトＢＣＬ１１Ａ  ｍＲＮＡにハイブリダイズするアンチセンス配列をコードするｓｈｍｉＲに作動可能に連結されたβグロビンプロモーターと、βグロビンＬＣＲと、ＨＩＶ−１の３’ＳＩＮ  ＬＴＲとを含む、自己不活性化（ＳＩＮ）レンチウイルスベクターが企図される。
【００２５】
特定の実施形態において、レンチウイルスベクターは、ＨＳ３およびＨＳ２  ＤＮＡｓｅ  Ｉ過敏性部位を含むヒトβグロビンＬＣＲを含む。
【００２６】
いくつかの実施形態において、レンチウイルスベクターは、ＨＳ３およびＨＳ２  ＤＮＡｓｅ  Ｉ過敏性部位を含むヒトβグロビンＬＣＲを含むが、ＨＳ４  ＤＮＡｓｅ  Ｉ過敏性部位を欠く。
【００２７】
ある特定の実施形態において、レンチウイルスベクターは、ｇａｇタンパク質をコードする約４５９ヌクレオチドのポリヌクレオチドを含む。
【００２８】
特定の実施形態において、レンチウイルスベクターは、１つ以上の変異ＡＴＧ配列を含むｇａｇタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。
【００２９】
追加の実施形態において、レンチウイルスベクターは、約１７６ヌクレオチドのＨＩＶ−１  ｅｎｖスプライスアクセプター配列を含む。
【００３０】
さらなる実施形態において、レンチウイルスベクターは、約３８１ヌクレオチドのｃＰＰＴ／ＦＬＡＰエレメントを含む。
【００３１】
いくつかの実施形態において、レンチウイルスベクターは、約６３８ヌクレオチドのＨＳ２  ＤＮＡｓｅ  Ｉ過敏性部位を含む。
【００３２】
特定の実施形態において、レンチウイルスベクターは、約８４７ヌクレオチドのＨＳ３  ＤＮＡｓｅ  Ｉ過敏性部位を含む。
【００３３】
特定の実施形態において、レンチウイルスベクターは、ＨＩＶ−１  ｅｎｖスプライスアクセプター配列とｓｈｍｉＲとの間に配置された合成ポリ（Ａ）配列を含む。
【００３４】
ある特定の実施形態において、ｓｈｍｉＲは、配列番号１に記載の配列をコードする。
【００３５】
さらなる実施形態において、ｓｈｍｉＲは、配列番号２に記載のガイド鎖配列を含む。
【００３６】
特定の実施形態において、ｓｈｍｉＲは、配列番号３に記載の標的配列にハイブリダイズするガイド鎖配列を含む。
【００３７】
いくつかの実施形態において、赤血球特異的プロモーターと、ｓｈｍｉＲをコードするポリヌクレオチドとを含む発現カセットは、レンチウイルスゲノムＲＮＡの転写と比較して逆配向である。
【００３８】
様々な実施形態において、配列番号４に記載のポリヌクレオチド配列を含むレンチウイルス導入ベクターが企図される。
【００３９】
様々な実施形態において、本明細書において企図されるレンチウイルスベクターを含む細胞が提供される。
【００４０】
ある特定の実施形態において、ＨＩＶ−１のｇａｇおよびｐｏｌをコードする１つ以上のポリヌクレオチドと、ＶＳＶ−Ｇと、本明細書において企図されるレンチウイルスベクターとを含む細胞が提供される。
【００４１】
特定の実施形態において、ＨＩＶ−１のｇａｇおよびｐｏｌをコードする１つ以上のポリヌクレオチドと、ＶＳＶ−Ｇと、本明細書において企図されるレンチウイルスベクターとを含む細胞から産生されたレンチウイルスベクター粒子が提供される。
【００４２】
様々な実施形態において、本明細書において企図されるレンチウイルスベクターで形質導入された細胞が提供される。
【００４３】
いくつかの実施形態において、細胞は、ポロキサマー２８８、ポロキサマー３３５、ポロキサマー３３８、およびポロキサマー４０７からなる群から選択される有効量のポロキサマー、ならびにＰＧＥ２受容体アゴニストの存在下で形質導入される。
【００４４】
様々な実施形態において、本明細書において企図されるレンチウイルスベクター粒子で形質導入された細胞が提供される。
【００４５】
ある特定の実施形態において、細胞は、ポロキサマー２８８、ポロキサマー３３５、ポロキサマー３３８、およびポロキサマー４０７からなる群から選択される有効量のポロキサマー、ならびにＰＧＥ２受容体アゴニストの存在下で形質導入される。
【００４６】
特定の実施形態において、細胞は、造血幹細胞または造血前駆細胞である。
【００４７】
ある特定の実施形態において、細胞は、造血幹細胞または前駆細胞である。
【００４８】
さらなる実施形態において、細胞はＣＤ３４＋である。
【００４９】
ある特定の実施形態において、細胞はＣＤ１３３＋である。
【００５０】
特定の実施形態において、細胞はＣＤ３４＋ＣＤ３８ＬｏＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ−である。
【００５１】
追加の実施形態において、細胞は、ヘモグロビン異常症に関連する１つ以上の変異βグロビン対立遺伝子を含む。
【００５２】
いくつかの実施形態において、細胞は、βＥ／β０、βＣ／β０、β０／β０、βＥ／βＥ、βＣ／β＋、βＥ／β＋、β０／β＋、β＋／β＋、βＣ／βＣ、βＥ／βＳ、β０／βＳ、βＣ／βＳ、β＋／βＳおよびβＳ／βＳからなる群から選択される１つ以上の変異βグロビン対立遺伝子を含む。
【００５３】
ある特定の実施形態において、細胞は、βＥ／β０、βＣ／β０、β０／β０、βＣ／βＣ、βＥ／βＥ、βＥ／β＋、βＣ／βＥ、βＣ／β＋、β０／β＋、およびβ＋／β＋からなる群から選択される１つ以上の変異βグロビン対立遺伝子を含む。
【００５４】
特定の実施形態において、細胞は、βＥ／βＳ、β０／βＳ、βＣ／βＳ、β＋／βＳおよびβＳ／βＳからなる群から選択される１つ以上の変異βグロビン対立遺伝子を含む。
【００５５】
様々な実施形態において、本明細書において企図される複数の細胞を含む細胞集団が提供される。
【００５６】
様々な実施形態において、本明細書において企図される複数の細胞を含む細胞集団を含む組成物が提供される。
【００５７】
様々な実施形態において、薬学的に許容される担体と、複数の本明細書において企図される細胞を含む細胞集団とを含む薬学的組成物が提供される。
【００５８】
様々な実施形態において、造血細胞集団を形質導入する方法であって、本明細書において企図されるレンチウイルスベクター、ポロキサマー、およびＰＧＥ２受容体アゴニストの存在下で、培地中で細胞を培養することを含む、方法が提供される。
【００５９】
いくつかの実施形態において、ポロキサマーは、ポロキサマー２８８、ポロキサマー３３５、ポロキサマー３３８、およびポロキサマー４０７からなる群から選択される。
【００６０】
特定の実施形態において、ＰＧＥ２受容体アゴニストは、１５ｄ−ＰＧＪ２、Δ１２−ＰＧＪ２、２−ヒドロキシヘプタデカトリエン酸（ＨＨＴ）、トロンボキサンＡ２、トロンボキサンＢ２、イロプロスト、トレプロスチニル、トラボプロスト、カルボプロストトロメタミン、タフルプロスト、ラタノプロスト、ビマトプロスト、ウノプロストンイソプロピル、クロプロステノール、エストロファン、スーパーファン、ミソプロストール、ブタプロスト、リノール酸、１３（ｓ）−ＨＯＤＥ、ＬＹ１７１８８３、ミード酸、エイコサトリエン酸、エポキシエイコサトリエン酸、ＯＮＯ−２５９、Ｃａｙ１０３９、ＰＧＥ２受容体アゴニスト、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２、１９（Ｒ）−ヒドロキシＰＧＥ２、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２ｐ−（ｐ−アセトアミドベンズアミド）フェニルエステル、１１−デオキシ−１６，１６−ジメチルＰＧＥ２、９−デオキシ−９−メチレン−１６，１６−ジメチルＰＧＥ２、９−デオキシ−９−メチレンＰＧＥ２、スルプロストン、ＰＧＥ２セリノールアミド、ＰＧＥ２メチルエステル、１６−フェニルテトラノルＰＧＥ２、１５（Ｓ）−１５−メチルＰＧＥ２、および１５（Ｒ）−１５−メチルＰＧＥ２からなる群から選択される。
【００６１】
さらなる実施形態において、ＰＧＥ２受容体アゴニストは、ＰＧＥ２または１６，１６−ジメチルＰＧＥ２である。
【００６２】
ある特定の実施形態において、レンチウイルスベクターは、約１０〜約３０のＭＯＩまたは約１０〜約２５のＭＯＩで存在する。
【００６３】
特定の実施形態において、レンチウイルスベクターは、約１０〜約２０のＭＯＩで存在する。
【００６４】
いくつかの実施形態において、レンチウイルスベクターは、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、または約３０のＭＯＩで存在する。
【００６５】
様々な実施形態において、対象におけるヘモグロビン異常症を治療する方法であって、本明細書において企図される細胞集団、組成物、または薬学的組成物の有効量を、対象に投与することを含む、方法が提供される。
【００６６】
様々な実施形態において、対象におけるヘモグロビン異常症の少なくとも１つの症状を寛解させる方法であって、本明細書において企図される細胞集団、組成物、または薬学的組成物の有効量を、対象に投与することを含む、方法が提供される。
【００６７】
特定の実施形態において、対象のβグロビン対立遺伝子は、βＥ／β０、βＣ／β０、β０／β０、βＥ／βＥ、βＣ／β＋、βＥ／β＋、β０／β＋、β＋／β＋、βＣ／βＣ、βＥ／βＳ、β０／βＳ、βＣ／βＳ、β＋／βＳおよびβＳ／βＳである。
【００６８】
様々な実施形態において、対象におけるサラセミアを治療する方法であって、本明細書において企図される細胞集団、組成物、または薬学的組成物の有効量を、対象に投与することを含む、方法が提供される。
【００６９】
追加の実施形態において、サラセミアはαサラセミアである。
【００７０】
ある特定の実施形態において、サラセミアはβサラセミアである。
【００７１】
ある特定の実施形態において、対象のβグロビン対立遺伝子は、βＥ／β０、βＣ／β０、β０／β０、βＣ／βＣ、βＥ／βＥ、βＥ／β＋、βＣ／βＥ、βＣ／β＋、β０／β＋、およびβ＋／β＋である。
【００７２】
様々な実施形態において、対象における鎌状赤血球症を治療する方法であって、本明細書において企図される細胞集団、組成物、または薬学的組成物の有効量を、対象に投与することを含む、方法が提供される。
【００７３】
いくつかの実施形態において、対象のβグロビン対立遺伝子は、βＥ／βＳ、β０／βＳ、βＣ／βＳ、β＋／βＳおよびβＳ／βＳである。
【００７４】
様々な実施形態において、対象におけるβサラセミアを治療する方法であって、本明細書において企図される細胞集団、組成物、または薬学的組成物の有効量を、対象に投与することを含む、方法が提供される。
【００７５】
特定の実施形態において、対象のβグロビン対立遺伝子は、βＥ／β０、βＣ／β０、β０／β０、βＣ／βＣ、βＥ／βＥ、βＥ／β＋、βＣ／βＥ、βＣ／β＋、β０／β＋、およびβ＋／β＋である。
【００７６】
ある特定の実施形態において、造血幹細胞集団は、静脈内経路、髄内経路、または骨内経路で投与される。
【００７７】
特定の実施形態において、造血幹細胞集団は、静脈内に投与される。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】Ｄ１２Ｇ５およびＢＢ６９４レンチウイルスベクターのベクターマップを示す。
【図２】様々な条件下で形質導入し、６日間液体培養した後の、正常な健常ドナーおよびＳＣＤのＣＤ３４＋細胞からの代表的なＶＣＮを示す。
【図３Ａ】様々な条件下で形質導入し、１４日間メチルセルロース培養した後の、正常な健常ドナーのＣＤ３４＋細胞のクローン原性分析を示す。
【図３Ｂ】様々な条件下で形質導入し、１４日間メチルセルロース培養した後の、ＳＣＤのＣＤ３４＋細胞のクローン原性分析を示す。
【図４】様々な条件下で形質導入し、１４日間メチルセルロース培養した後の、正常な健常ドナーおよびＳＣＤのＣＤ３４＋細胞からプールしたコロニーのＶＣＮを示す。
【図５】様々な条件下で形質導入し、１４日間赤血球分化培養した後の、正常な健常ドナーのＣＤ３４＋細胞からのＨｂＦおよびＨｂＡレベルを示す（左パネル）。図５はまた、様々な条件下で形質導入し、１４日間赤血球分化培養した後の、ＳＣＤのＣＤ３４＋細胞からのＨｂＦおよびＨｂＳレベルも示す（右パネル）。
【図６】様々な条件下で形質導入された正常な健常ドナーおよび鎌状赤血球のＣＤ３４＋細胞からの、１４日目の赤血球分化培養におけるベクター陽性赤血球コロニーの割合を示す。
【図７】様々な条件下で形質導入された正常な健常ドナーおよび鎌状赤血球のＣＤ３４＋細胞由来の個々のＢＦＵｅコロニーからのＨｂＦの誘発の割合を示す。
【図８】１４〜１６日間メチルセルロース培養した後の、モック形質導入された正常な健常ドナーのＣＤ３４＋細胞、またはｂｂ６９４で形質導入されたＣＤ３４＋細胞のクローン原性分析を示す。
【図９】モック形質導入されたｈＣＤ３４＋細胞、またはｂｂ６９４レンチウイルスベクターで形質導入されたｈＣＤ３４＋細胞から取り出した赤血球コロニーのＶＣＮおよびＬＶＶ陽性コロニー％を示す。
【図１０】モック形質導入されたｈＣＤ３４＋細胞、またはＢＢ６９４レンチウイルスベクターで形質導入されたｈＣＤ３４＋細胞から分化した赤血球細胞のグロビン鎖分析を示す。
【図１１】モック形質導入されたｈＣＤ３４＋細胞、またはＢＢ６９４レンチウイルスベクターで形質導入されたｈＣＤ３４＋細胞を移植したＮＳＧマウスの骨髄由来ｈＣＤ４５＋細胞のパーセンテージを示す。
【図１２】モック形質導入されたｈＣＤ３４＋細胞、またはＢＢ６９４レンチウイルスベクターで形質導入されたｈＣＤ３４＋細胞を移植したＮＳＧマウスの骨髄由来ＣＤ１９＋ＣＤ４５＋細胞のパーセンテージおよびＣＤ３３＋ＣＤ４５＋細胞のパーセンテージを示す。
【図１３】移植後４ヶ月目に骨髄細胞から回収したゲノムＤＮＡの定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）による評価を示す。
【発明を実施するための形態】
【００７９】
配列識別子の簡単な説明
配列番号１は、ｓｈｍｉｒＲのポリヌクレオチド配列を示す。
配列番号２は、ｓｈｍｉｒＲガイド鎖のポリヌクレオチド配列を示す。
配列番号３は、ｓｈｍｉｒＲ標的配列のポリヌクレオチド配列を示す。
配列番号４は、ＢＢ６９４レンチウイルスベクターのポリヌクレオチド配列を示す。
（発明を実施するための形態）
【００８０】
Ａ．概要
本開示は、概して、ヘモグロビン異常症の少なくとも１つの症状を治療する、予防する、または寛解させるための改善された遺伝子治療用ベクター、組成物、および使用方法に一部関する。いずれか特定の理論に拘束されることを望むものではないが、本明細書において企図される遺伝子治療用組成物は、ヘモグロビン異常症に関連する症状を治療する、予防する、または寛解させるために、細胞における胎児ヘモグロビンの量を増加させるために使用される。したがって、本明細書において企図される組成物は、ヘモグロビン異常症を有する対象に潜在的に根治的な解決策を提供する。
【００８１】
正常な成人のヘモグロビンは、２つのアルファ（α）グロビンタンパク質および２つのベータ（β）グロビンタンパク質の四量体複合体を含む。発達過程において、胎児は、２つのβグロビンタンパク質の代わりに２つのガンマ（γ）グロビンタンパク質を含む胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を産生する。周産期発生のある時点に「グロビンスイッチ」が起こり、赤血球がγグロビンの発現を下方制御し、βグロビンを優勢に産生するように切り替わる。このスイッチは、主に、γグロビン遺伝子の転写の減少と、βグロビン遺伝子の転写の増加とによるものである。ＧＡＴＡ結合タンパク質−１（ＧＡＴＡ−１）は、グロビンスイッチングに影響を及ぼす転写因子である。ＧＡＴＡ−１は、Ｂ細胞ＣＬＬ／リンパ腫１１Ａ遺伝子（ＢＣＬ１１Ａ）の発現のトランス活性化を通して、βグロビン遺伝子の発現を直接的にトランス活性化し、γグロビン遺伝子の発現を間接的に抑圧または抑制する。スイッチの薬理学的または遺伝子操作は、βグロビン遺伝子の突然変異に起因するβサラセミアまたは鎌状赤血球症に罹患する患者にとって魅力的な治療方針を意味する。
【００８２】
様々な実施形態において、本明細書において企図される遺伝子治療用ベクターは、赤血球細胞におけるＢＣＬ１１Ａの発現を減少させるポリヌクレオチドをコードする改善されたレンチウイルスベクターである。いずれか特定の理論に拘束されることを望むものではないが、赤血球細胞におけるＢＣＬ１１Ａの発現を低下させるまたは排除することにより、γグロビン遺伝子発現の再活性化または抑制解除、およびβグロビン遺伝子発現の減少をもたらし、それによってＨｂＦ発現を増加させて、ヘモグロビン異常症を有する対象に関連する１つ以上の症状を効果的に治療するおよび／または寛解させることが企図される。
【００８３】
様々な実施形態において、遺伝子治療用組成物は、ＢＣＬ１１Ａ  ｍＲＮＡに結合してそれを切断するように設計された阻害性ＲＮＡをコードするレンチウイルスベクターを含む１つ以上の細胞を含む。特定の実施形態において、レンチウイルスベクターは、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはそれらの組み合わせをコードする。好ましい実施形態において、レンチウイルスベクターは、ｍｉＲＮＡ骨格に埋め込まれたｓｈＲＮＡ、すなわち、ｓｈｍｉＲをコードする。さらなる好ましい実施形態において、レンチウイルスベクターは、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３骨格に埋め込まれたＢＣＬ１１Ａに対するｓｈＲＮＡを含む。特定の実施形態において、レンチウイルスベクターのＬＴＲ、ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ、およびｅｎｖ  Ｓ／Ａ配列は、ＨＩＶ−１株ＮＬ４−３から単離される。特定の実施形態において、レンチウイルスＲＮＡ核外輸送因子は、ＨＩＶ−１株ＨＸＢ３から単離されたＲＲＥエレメントである。
【００８４】
様々な他の実施形態において、本明細書において企図されるレンチウイルスベクターで形質導入された１つ以上の造血細胞を含む細胞集団が提供される。好ましい実施形態において、細胞は、ヘモグロビン異常症に関連する１つ以上の変異βグロビン対立遺伝子を含む。いずれか特定の理論に拘束されることを望むものではないが、ヘモグロビン異常症に関連する１つ以上の変異βグロビン対立遺伝子を含み、かつ本明細書において企図されるレンチウイルスベクターをさらに含む改変された造血細胞は、減少したＢＣＬ１１Ａ発現、減少したβグロビン発現欠損、増加したγグロビン発現を有し、それによって治療用細胞組成物を提供することが企図される。
【００８５】
特定の実施形態において、本明細書において企図される１つ以上のレンチウイルスベクターで改変した細胞の有効量を、対象に投与することを含む、ヘモグロビン異常症と診断されたまたはヘモグロビン異常症を有する対象を治療するための方法が企図される。
【００８６】
本明細書において企図される様々な実施形態は、そうではないと具体的に示されない限り、当該技術分野の技能の範囲内である、化学、生化学、有機化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技術、遺伝学、免疫学、および細胞生物学の従来の方法を用い、それらの多くは、例示の目的のために以下に記載される。そのような技術は、文献において十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）；Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８２）；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，ｕｐｄａｔｅｄ  Ｊｕｌｙ  ２００８）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｇｌｏｖｅｒ，ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８５）；Ａｎａｎｄ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｇｅｎｏｍｅｓ，（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．，１９８４）；Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９９８）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｑ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ  ａｎｄ  Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ，ｅｄｓ．，１９９１）；Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；およびＡｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ等の定期刊行物におけるモノグラフを参照されたい。
【００８７】
Ｂ．定義
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の方法および材料が、特定の実施形態の実施または試験において使用され得るが、組成物、方法、および材料の好ましい実施形態を本明細書に記載する。本開示の目的のために、下記の用語を以下に定義する。
【００８８】
冠詞「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、その冠詞の文法上の指示対象となる１つのまたは１つ以上の（すなわち、少なくとも１つ、または１つ以上の）ものを指すために本明細書で使用される。例として「エレメント（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つのエレメントまたは１つ以上のエレメントを意味する。
【００８９】
選択肢（例えば、「または」）の使用は、その選択肢のいずれか一方、両方、またはそれらの任意の組み合わせを意味すると理解されるべきである。
【００９０】
「および／または」という用語は、その選択肢のいずれか一方または両方を意味すると理解されるべきである。
【００９１】
本明細書で使用される場合、「約」または「およそ」という用語は、基準となる量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さに対して３０％、２５％、２０％、２５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％だけ異なる量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さを指す。特定の実施形態において、ある数値を超過する場合の「約」または「およそ」という用語は、その値プラスまたはマイナス１５％、１０％、５％、または１％の範囲を示唆する。
【００９２】
本明細書で使用される場合、「実質的に」という用語は、基準となる量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さと比較して８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上高い量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さを指す。一実施形態において、「実質的に同じ」は、基準となる量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さとおよそ同じ効果、例えば、生理学的効果をもたらす量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さを指す。
【００９３】
本明細書全体を通して、文脈上他の意味に解釈すべき場合を除いて、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語は、記載されるステップもしくは要素、またはステップもしくは要素の群の包含を暗示するが、任意の他のステップもしくは要素、またはステップもしくは要素の群の除外を暗示するものではないことを理解されたい。本明細書で使用される場合、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語は同義に使用される。「〜からなる」は、「〜からなる」という句に続くあらゆるものを含み、それに限定されることを意味する。したがって、「〜からなる」という句は、列挙される要素が必要または必須であり、他の要素は存在しなくてもよいことを示唆する。「〜から本質的になる」は、該句の後に列挙される任意の要素を含み、列挙される要素に関して本開示に明記されている活性または作用に干渉または寄与しない他の要素に限定されることを意味する。したがって、「〜から本質的になる」という句は、列挙される要素は必要または必須であるが、列挙される要素の活性または作用に実質的に影響を及ぼす他の要素は存在しないことを示唆する。
【００９４】
本明細書全体を通して、「一実施形態」、「ある実施形態」、「特定の実施形態」、「関連する実施形態」、「ある特定の実施形態」、「追加の実施形態」、もしくは「さらなる実施形態」、またはそれらの組み合わせへの言及は、実施形態に関連して記載される特定の特徴、構造、または特性が、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体を通して様々な箇所に出現する上記の句は、必ずしも全てが同じ実施形態について言及しているわけではない。さらに、特定の特徴、構造、または特性が、１つ以上の実施形態において任意の適切な様式で組み合わされてもよい。また、一実施形態におけるある特徴についての肯定の記述は、特定の実施形態においてその特徴を排除する根拠となることも理解されたい。
【００９５】
「ベクター」という用語は、別の核酸分子を導入または輸送することが可能な核酸分子を指すために本明細書において使用される。導入された核酸は、通常、ベクター核酸分子に連結され、例えば、挿入される。ベクターは、細胞における自律複製を誘導する配列を含んでもよいか、または宿主細胞ＤＮＡへの組み込みを可能にするのに十分な配列を含んでもよい。有用なベクターは、例えば、プラスミド（例えば、ＤＮＡプラスミドまたはＲＮＡプラスミド）、トランスポゾン、コスミド、細菌人工染色体、およびウイルスベクターを含む。有用なウイルスベクターは、例えば、レンチウイルスベクターを含む。
【００９６】
当業者には明らかであるように、「ウイルスベクター」という用語は、典型的には、核酸分子の導入もしくは細胞のゲノム内への組み込みを容易にするウイルス由来の核酸エレメントを含む核酸分子（例えば、導入プラスミド）、または、核酸導入を媒介するウイルスもしくはウイルス粒子のいずれかを指すために広く使用されている。ウイルス粒子は、典型的には、核酸（複数可）に加えて、様々なウイルス成分、および時には宿主細胞成分も含む。
【００９７】
「ウイルスベクター」という用語は、核酸を細胞内にまたは導入された核酸自体に導入することができるウイルスまたはウイルス粒子のいずれかを指してもよい。ウイルスベクターおよび導入プラスミドは、主にウイルスに由来する構造的および／または機能的な遺伝因子を含有する。「レンチウイルスベクター」という用語は、主にレンチウイルスに由来するＬＴＲを含む、構造的および機能的な遺伝因子またはその一部を含有するレトロウイルスベクターまたはプラスミドを指す。
【００９８】
「レンチウイルスベクター」および「レンチウイルス発現ベクター」という用語は、特定の実施形態においてレンチウイルス導入プラスミドおよび／または感染性レンチウイルス粒子を指すために使用されてもよい。本明細書において、クローニング部位、プロモーター、調節エレメント、異種核酸等の要素に言及する場合、これらの要素の配列は、本発明において企図されるレンチウイルス粒子中にはＲＮＡ形態で存在し、本発明において企図されるＤＮＡプラスミド中にはＤＮＡ形態で存在すると理解されたい。
【００９９】
「長末端反復（ＬＴＲ）」という用語は、レトロウイルスＤＮＡの末端に位置する塩基対のドメインを指し、それらの天然の配列状況において直接反復であり、Ｕ３、Ｒ、およびＵ５領域を含有する。ＬＴＲは、通常、レトロウイルス遺伝子の発現（例えば、遺伝子転写物の促進、開始およびポリアデニル化）およびウイルス複製の基礎となる機能を提供する。ＬＴＲは、転写制御エレメント、ポリアデニル化シグナル、ならびにウイルスゲノムの複製および組み込みに必要な配列を含む、多数の調節シグナルを含有する。ウイルスのＬＴＲは、Ｕ３、Ｒ、およびＵ５と称される３つの領域に分割される。Ｕ３領域は、エンハンサーおよびプロモーターエレメントを含有する。Ｕ５領域は、プライマー結合部位とＲ領域との間の配列であり、ポリアデニル化配列を含有する。Ｒ（反復）領域は、Ｕ３およびＵ５領域と隣接している。ＬＴＲは、Ｕ３、Ｒ、およびＵ５領域からなり、ウイルスゲノムの５’末端および３’末端の両方に出現する。５’ＬＴＲには、ゲノムの逆転写に必要な配列（ｔＲＮＡプライマー結合部位）およびウイルスＲＮＡの粒子への効率的なパッケージングに必要な配列（プサイ部位）が隣接している。プロウイルスインサートは、３’ウイルスＬＴＲの２つのコピー、５’ウイルスＬＴＲの代わりとなる１つのコピー、および３’ウイルスＬＴＲを含む。
【０１００】
本明細書で使用される場合、「パッケージングシグナル」または「パッケージング配列」という用語は、ウイルスＲＮＡのウイルスカプシドまたはウイルス粒子への挿入に必要とされる、レトロウイルスゲノム内に位置する配列を指す（例えば、Ｃｌｅｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５．Ｊ．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６９，Ｎｏ．４；ｐｐ．２１０１−２１０９を参照のこと）。いくつかのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムのカプシド形成に必要な最小限のパッケージングシグナル（プサイ［Ψ］または［Ψ＋］配列とも称される）を使用する。したがって、本明細書で使用される場合、「パッケージング配列」、「パッケージングシグナル」、「プサイ」という用語、および「Ψ」という記号は、ウイルス粒子形成中にレトロウイルスＲＮＡ鎖のカプシド形成のために必要とされる非コード配列に関連して使用される。
【０１０１】
本明細書で使用される場合、「改変されたＬＴＲ」という用語は、天然のＨＩＶ−１の５’ＬＴＲおよび／または３’ＬＴＲにおける１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、または置換を指す。当業者は、参照ＬＴＲと比較することによりＬＴＲが改変されているかどうかを判定することができる。
【０１０２】
本明細書で使用される場合、「複製欠損」という用語は、レンチウイルスを複製欠損にすることによってレンチウイルス系の安全性を向上させる改変された５’ＬＴＲおよび／または３’ＬＴＲを含むレンチウイルスを指す。
【０１０３】
「自己不活性化」（ＳＩＮ）ベクターは、１回目のウイルス複製以降のウイルス転写を防止するように、Ｕ３領域として知られる右側の（３’）ＬＴＲエンハンサー−プロモーター領域が（例えば、欠失または置換によって）改変されている複製欠損ベクター、例えば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターを指す。自己不活性化は、好ましくは、ベクターＤＮＡ、すなわち、ベクターＲＮＡを産生するために使用されるＤＮＡの３’ＬＴＲのＵ３領域に欠失を導入することによって達成される。したがって、逆転写の間、この欠失はプロウイルスＤＮＡの５’ＬＴＲに導入される。ＨＩＶに基づくレンチベクターの場合、そのようなベクターが、ベクター力価を有意に低下させることなく、ＬＴＲ  ＴＡＴＡボックスの除去（例えば、−４１８〜−１８の欠失）を含むＵ３の大幅な欠失に耐えることが分かっている。
【０１０４】
本明細書で使用される場合、「キメラ５‘ＬＴＲ」という用語は、ウイルス粒子の産生中にウイルスゲノムの転写を駆動するために、Ｕ３領域が異種プロモーター、例えば、ＣＭＶプロモーターによって置換された５’ＬＴＲを指す。プロモーターは、Ｔａｔ非依存的に高レベルの転写を駆動することができる。ウイルス産生系には完全なＵ３配列が存在しないため、この置換によって複製コンピテントなウイルスを生成するための組換えの可能性が低下する。
【０１０５】
「ＴＡＲ」という用語は、レンチウイルス（例えば、ＨＩＶ）ＬＴＲのＲ領域に位置する「トランス活性化応答」遺伝因子を指す。この因子は、ウイルス複製を増強するためにレンチウイルストランスアクチベーター（ｔａｔ）遺伝因子と相互作用する。しかしながら、この因子は、５’ＬＴＲのＵ３領域が異種プロモーターによって置換された実施形態では必要とされない。
【０１０６】
「Ｒ領域」は、キャッピング基の開始（すなわち、転写の開始）で始まり、ポリＡトラクトの開始直前で終わるレトロウイルスＬＴＲ内の領域を指す。Ｒ領域はまた、Ｕ３およびＵ５領域と隣接しているとも定義される。Ｒ領域は、ゲノムの一方の末端から他方の末端への新生ＤＮＡの移動を可能にする際の逆転写中に役割を果たす。
【０１０７】
本明細書で使用される場合、「ＦＬＡＰエレメント」という用語は、その配列がレトロウイルス、例えば、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２のセントラルポリプリン配列およびセントラルターミネーション配列（ｃＰＰＴおよびＣＴＳ）を含む核酸を指す。いくつかの実施形態において、「ＦＬＡＰエレメント」および「ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ」という用語は、上述のＦＬＡＰエレメントを指すために互換的に使用される。好適なＦＬＡＰエレメントは、米国特許第６，６８２，９０７号およびＺｅｎｎｏｕ，  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１：１７３に記載されている。ＨＩＶ−１の逆転写の間、セントラルポリプリン配列（ｃＰＰＴ）にあるプラス鎖ＤＮＡの中心開始点およびセントラルターミネーション配列（ＣＴＳ）にある中心終結点が、３本鎖ＤＮＡ構造：ＨＩＶ−１中心ＤＮＡフラップの形成をもたらす。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、ＤＮＡフラップは、レンチウイルスのゲノム核内移行のシス活性決定因子として作用することができ、かつ／またはウイルスの力価を増大させることができる。一実施形態において、本発明のベクターは、ＨＩＶ−１株ＮＬ４−３から単離されたＦＬＡＰエレメントを含む。
【０１０８】
「核外輸送因子」という用語は、細胞の核から細胞質へのＲＮＡ転写物の輸送を調節するシス作用性転写後調節エレメントを指す。ＲＮＡ核外輸送因子の例として、限定されないが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ｒｅｖ応答配列（ＲＲＥ）（例えば、例えば、Ｃｕｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：１０５３、およびＣｕｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１．Ｃｅｌｌ  ５８：４２３を参照）、およびＢ型肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＨＰＲＥ）が挙げられる。通常、ＲＮＡ核外輸送因子は、遺伝子の３’ＵＴＲ内に配置され、１つのまたは複数のコピーとして挿入することができる。
【０１０９】
本明細書で使用される場合、「転写後調節エレメント」または「ＰＲＥ」という用語は、例えば、キャッピングの調節、スプライシング、ポリ（Ａ）テールの付加、およびｍＲＮＡの安定性によってｍＲＮＡレベルで発現を調節するシス作用性エレメントを指す。ＰＴＥの実例として、限定されないが、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３：２８８６）、Ｂ型肝炎ウイルスに存在する転写後調節エレメント（ＨＰＲＥ）（Ｈｕａｎｇ  ａｎｄ  Ｙｅｎ，１９９５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５：３８６４）等（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，９：１７６６）が挙げられる。
【０１１０】
本明細書で使用される「ポリ（Ａ）部位」または「ポリ（Ａ）配列」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる新生ＲＮＡ転写物の終結およびポリアデニル化の両方を誘導するＤＮＡ配列を示す。ポリアデニル化配列は、コード配列の３’末端にポリ（Ａ）テールを付加することによりｍＲＮＡの安定性を促進することができ、したがって転写効率の増加に寄与する。切断およびポリアデニル化は、ＲＮＡのポリ（Ａ）配列によって誘導される。哺乳動物のプレｍＲＮＡのコアポリ（Ａ）配列は、切断−ポリアデニル化に隣接する２つの認識エレメントを有する。典型的には、ほぼ不変のＡＡＵＡＡＡ六量体が、ＵまたはＧＵ残基に富んだ、より可変性の高いエレメントの２０〜５０ヌクレオチド上流に位置する。それらの２つのエレメント間で新生転写物の切断が起こるが、それは５’切断産物への最大２５０個のアデノシンの付加に関連している。特定の実施形態において、コアポリ（Ａ）配列は、合成ポリＡ配列（例えば、ＡＡＴＡＡＡ、ＡＴＴＡＡＡ、ＡＧＴＡＡＡ）である。ポリ（Ａ）配列の実例として、限定されないが、ＳＶ４０ポリ（Ａ）配列、ウシ成長ホルモンポリ（Ａ）配列（ＢＧＨｐＡ）、ウサギβグロビンポリ（Ａ）配列（ｒβｇｐＡ）、または当該技術分野で既知の別の好適な異種もしくは内因性ポリ（Ａ）配列が挙げられる。
【０１１１】
「トランスフェクション」は、非ウイルス法によって裸のＤＮＡを細胞に導入するプロセスを指す。
【０１１２】
「感染」は、ウイルスベクターを用いて外来ＤＮＡを細胞に導入するプロセスを指す。
【０１１３】
「形質導入」は、ウイルスベクターを用いて細胞のゲノムに外来ＤＮＡを導入することを指す。
【０１１４】
「ベクターコピー数」または「ＶＣＮ」は、細胞のゲノムにおけるベクターまたはその一部のコピー数を指す。平均ＶＣＮは、細胞集団からまたは個々の細胞コロニーから決定され得る。ＶＣＮを決定するための例示的な方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびフローサイトメトリーを含む。
【０１１５】
「形質導入効率」は、ベクターの少なくとも１つのコピーで形質導入された細胞のパーセンテージを指す。例えば、１×１０６個の細胞がウイルスに曝露され、０．５×１０６個の細胞がそれらのゲノム中のウイルスの少なくとも１つのコピーを有すると判定される場合、形質導入効率は５０％である。形質導入効率を決定するための例示的な方法は、ＰＣＲおよびフローサイトメトリーを含む。
【０１１６】
「小分子」、「小有機分子」、または「小分子化合物」は、約５ｋＤ未満、約４ｋＤ未満、約３ｋＤ未満、約２ｋＤ未満、約１ｋＤ未満、または約０．５ｋＤ未満の分子量を有する低分子量化合物を指す。特定の実施形態において、小分子は、核酸、ペプチド、ペプチド模倣物、ペプトイド、他の小さな有機化合物または薬物等を含むことができる。真菌抽出物、細菌抽出物、または藻類抽出物等の化学的および／または生物学的混合物のライブラリーは、当該技術分野で既知であり、本発明のアッセイのいずれかを用いてスクリーニングすることができる。分子ライブラリーの合成のための方法の例は、（Ｃａｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４ａ；Ｃａｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４ｂ；Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；ＤｅＷｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｇａｌｌｏｐ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）に見出すことができる。
【０１１７】
「類似体」または「誘導体」は、構造および機能において別の化学物質と類似し、しばしば、単一のエレメントまたは基によって構造的に異なるが、親化学物質と同じ機能を保持する場合には１つより多くの基（例えば、２つ、３つ、または４つの基）の改変によって異なり得る分子に関する。そのような改変は、当業者には日常的なものであり、例えば、酸のエステルまたはアミド等の付加または置換された化学的部分、保護基、例えば、アルコールまたはチオールに対するベンジル基およびアミンに対するｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基を含む。また、アルキル側鎖に対する改変、例えば、アルキル置換（例えば、メチル、ジメチル、エチル等）、側鎖の飽和または不飽和のレベルに対する改変、ならびに置換フェニルおよびフェノキシ等の改変された基の付加も含まれる。誘導体はまた、ビオチン部分またはアビジン部分等のコンジュゲート、西洋ワサビペルオキシダーゼ等の酵素を含んでよく、放射性標識部分、生物発光部分、化学発光部分、または蛍光部分を含む。また、本明細書に記載の薬剤に部分を付加して、それらの薬物動態特性を変更すること、例えば、他の望ましい特性の中でも、インビボもしくはエクスビボにおける半減期を増加させること、またはそれらの細胞透過性を増加させることもできる。また、医薬品の多数の望ましい品質（例えば、溶解性、バイオアベイラビリティ、製造等）を高めることが分かっているプロドラッグも含まれる（例えば、例示的なＥＰアゴニストプロドラッグについては、そのようなアゴニストのその開示に関して参照により組み込まれるＷＯ／２００６／０４７４７６を参照のこと）。
【０１１８】
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）およびＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを指す。ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖であってもよく、組換え、合成、または単離されているのいずれかであり得る。ポリヌクレオチドは、限定されないが、プレメッセンジャーＲＮＡ（プレｍＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＲＮＡ、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡが埋め込まれたマイクロＲＮＡ（ｓｈｍｉＲ）リボザイム、ゲノムＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、プラス鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（＋））、マイナス鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（−））、ｔｒａｃｒＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、合成ＲＮＡ、合成ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ、相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、合成ＤＮＡ、または組換えＤＮＡを含む。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載の参照配列（例えば、配列番号１〜４を参照）のいずれかに対して少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドまたは変異体を含み、典型的には、変異体は、参照配列の少なくとも１つの生物学的活性を維持する。様々な例示的な実施形態において、ウイルスベクターおよび導入プラスミドのポリヌクレオチド配列、ならびにそれを含む組成物が企図される。特定の実施形態において、１つ以上の治療用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび／または対象となる他の遺伝子が企図される。特定の実施形態において、本明細書において企図されるレンチウイルスベクターは、ＢＣＬ１１Ａ  ｍＲＮＡにハイブリダイズする阻害性ＲＮＡを含む（例えば、配列番号１〜２を参照のこと）。
【０１１９】
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド変異体」および「変異体」等の用語は、参照ポリヌクレオチド配列、または以下に定義されるストリンジェントな条件下で参照配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドと実質的な配列同一性を示すポリヌクレオチドを指す。これらの用語は、参照ポリヌクレオチドと比較して１つ以上のヌクレオチドが付加されているもしくは欠失しているか、または異なるヌクレオチドで置換されているポリヌクレオチドを含む。この点について、参照ポリヌクレオチドに対して、変異、付加、欠失、および置換を含むある特定の変更を行うことができ、それによって変更されたポリヌクレオチドが参照ポリヌクレオチドの生物学的機能または活性を保持することが当該技術分野において十分に理解されている。
【０１２０】
本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、その天然の状態では通常それに付随する構成成分を実質的にまたは本質的に含まない材料、例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、細胞を意味する。特定の実施形態において、「得られた」または「由来する」という用語は、単離されたと同義に使用される。例えば、「単離されたポリヌクレオチド」は、本明細書で使用される場合、天然に存在する状態でそれに隣接する配列から精製されたポリヌクレオチド、例えば、通常はその断片に近接する配列から取り出されたＤＮＡ断片を指す。
【０１２１】
本明細書で使用される場合、「ｓｈＲＮＡ」または「短ヘアピンＲＮＡ」という用語は、単一の自己相補的ＲＮＡ鎖によって形成される二本鎖構造を指す。
【０１２２】
本明細書で使用される場合、「ｍｉＲＮＡ」または「マイクロＲＮＡ」という用語は、典型的には、プレｍｉＲＮＡとして知られる約７０ヌクレオチドのフォールドバックＲＮＡ前駆体構造から切り取られた２０〜２２ヌクレオチドの小さい非コードＲＮＡを指す。ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡと標的との間の相補性の程度に依存して、２つの方法のうちの一方でそれらの標的を負に調節する。最初に、タンパク質コードｍＲＮＡ配列に完全なまたはほぼ完全な相補性で結合するｍｉＲＮＡが、ＲＮＡ媒介干渉（ＲＮＡｉ）経路を誘発する。それらのｍＲＮＡ標的の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）内の不完全な相補部位に結合することによって調節作用を発揮するｍｉＲＮＡは、ＲＮＡｉ経路に使用されるものと類似するかまたはおそらく同一であるＲＩＳＣ複合体を通して、見かけ上は翻訳のレベルで、翻訳後に標的遺伝子発現を抑制する。翻訳制御と一致して、この機構を使用するｍｉＲＮＡは、それらの標的遺伝子のタンパク質レベルを低下させるが、これらの遺伝子のｍＲＮＡレベルは最小限の影響しか受けない。
【０１２３】
本明細書で使用される場合、「ｓｈＲＮＡが埋め込まれたｍｉＲＮＡ」、「ｓｈｍｉＲ」、および「ｓｃｈｍｉｒ」は、互換的に使用され、そのセンス鎖およびアンチセンス鎖が、ｍｉＲＮＡ隣接領域およびループを保持するｍｉＲＮＡ骨格に埋め込まれたｓｈＲＮＡを指す。例えば、一実施形態において、当業者は、ｍｉＲ−２２３一次転写物から発現される短ヘアピンＲＮＡを設計することができる。この設計によりｓｈＲＮＡ構築物にＤｒｏｓｈａプロセシング部位が付加され、ノックダウン効率が大幅に増加することが示されている（Ｐｕｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。特定の実施形態において、ｓｈｍｉｒのヘアピンステムは、２１ｎｔのｄｓＲＮＡと、ヒトｍｉＲＮＡ由来の１５ｎｔのループとを含む。ヘアピンの片側または両側のいずれかにｍｉＲＮＡループおよび隣接配列を付加することにより、マイクロＲＮＡを用いない従来のｓｈＲＮＡ設計と比較した場合、発現されたヘアピンのＤｒｏｓｈａおよびＤｉｃｅｒプロセシングに１０倍を上回る増加がもたらされる。ＤｒｏｓｈａおよびＤｉｃｅｒプロセシングの増加は、より多くのｓｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ産生および発現されるヘアピンのより高い効力につながる好ましい実施形態において、ｓｈｍｉｒは２１ｎｔのガイド鎖を含み、その約１７ｎｔが標的ｍＲＮＡに結合するアンチセンスＲＮＡに対応し、約４ｎｔがＧＣリッチ配列、例えば、ＲＮＡ二本鎖における３’末端の熱力学的安定性を改善し、意図されるガイド鎖の優先的ＲＩＳＣローディングを促進するＧＣＧＣに対応する。例えば、配列番号１〜３を参照のこと。一実施形態において、ポリヌクレオチドはｓｈｍｉＲをコードする。様々な他の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドｓｈｍｉＲをコードするポリヌクレオチドを含む。
【０１２４】
ポリヌクレオチドの配向を説明する用語は、５’（通常、遊離リン酸基を有するポリヌクレオチドの末端）および３’（通常、遊離ヒドロキシル（ＯＨ）基を有するポリヌクレオチドの末端）を含む。ポリヌクレオチド配列は、５’から３’の配向または３’から５’の配向で注釈付けされ得る。
【０１２５】
「相補的」および「相補性」という用語は、塩基対合規則によって関連付けられたポリヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）を指す。例えば、ＤＮＡ配列５’ＡＧＴＣＡＴＧ３’の相補鎖は、３’ＴＣＡＧＴＡＣ５’である。後者の配列は、しばしば、左側に５’末端および右側に３’末端を有する逆相補体として、５’ＣＡＴＧＡＣＴ３’と記載される。その逆相補体と等しい配列は、パリンドローム配列であると言える。相補性は、塩基対合規則に従って核酸の塩基の一部のみがマッチする場合に「部分的」であり得る。または、核酸間には「完全な」または「全体的な」相補性が存在してもよい。
【０１２６】
本明細書で使用される「核酸カセット」または「発現カセット」という用語は、ポリヌクレオチドを発現することができるベクター内の遺伝子配列を指す。一実施形態において、核酸カセットは、対象となるポリヌクレオチド（複数可）を含有する。別の実施形態において、核酸カセットは、１つ以上の発現制御配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリ（Ａ）配列、および対象となるポリヌクレオチド（複数可）を含有する。ベクターは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれより多くの核酸カセットを含んでもよい。核酸カセットは、カセット内の核酸がＲＮＡに転写され得るように、ベクター内で位置的にかつ連続的に配向される。好ましくは、カセットは、ベクター内への容易な挿入に適合された３’末端および５’末端を有し、例えば、各末端に制限エンドヌクレアーゼ部位を有する。好ましい実施形態において、核酸カセットは、遺伝的障害を治療する、予防する、または寛解させるために使用することができる治療用ＲＮＡ、例えば、ｓｈｍｉＲ、および／またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された１つ以上の発現制御配列を有する。カセットは、単一の単位としてプラスミドまたはウイルスベクターから除去することおよびそれに挿入することができる。
【０１２７】
本明細書で使用される場合、「対象となるポリヌクレオチド（複数可）」という用語は、１つ以上のポリヌクレオチド、例えば、発現することが所望される発現ベクターに挿入された、ポリペプチド（すなわち、対象となるポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドを指す。好ましい実施形態において、本発明のベクターおよび／またはプラスミドは、１つ以上の治療用ＲＮＡ、例えば、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、もしくはｓｈｍｉＲ、および／または治療用ポリペプチド、例えば、グロビンをコードする１つ以上の対象となるポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、対象となるポリヌクレオチドは、ＢＣＬ１１Ａ  ｓｈｍｉＲ、およびヘモグロビン異常症の治療のために治療機能を提供するポリペプチド、例えば、αグロビン、βグロビン、またはβグロビンＡ−Ｔ８７Ｑをコードする導入遺伝子である。例示的な実施形態において使用するのに適したグロビンポリヌクレオチド配列の実例として、限定されないが、αグロビン、βグロビン、βグロビンＡ−Ｔ８７Ｑ、抗鎌状化グロビン、γ−グロビン、およびδ−グロビンをコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
【０１２８】
本明細書で使用される「グロビン」という用語は、ヘム部分と共有結合または非共有結合することができ、したがって、酸素を輸送または貯蔵することができるタンパク質またはタンパク質サブユニットを指す。脊椎動物および無脊椎動物のヘモグロビンのサブユニット、脊椎動物および無脊椎動物のミオグロビンまたはその突然変異体は、グロビンという用語に含まれる。この用語は、ヘモシアニンを含まない。グロビンの例として、αグロビンもしくはその変異体、βグロビンもしくはその変異体、γグロビンもしくはその変異体、およびδグロビンもしくはその変異体が挙げられる。
【０１２９】
ポリヌクレオチドは、コード配列自体の長さにかかわらず、他のＤＮＡ配列、例えば、本明細書の他の箇所で開示されているか、または当該技術分野で既知の、プロモーターおよび／またはエンハンサー、非翻訳領域（ＵＴＲ）、コザック配列、ポリアデニル化シグナル、追加的な制限酵素部位、多重クローニング部位、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、リコンビナーゼ認識部位（例えば、ＬｏｘＰ、ＦＲＴ、およびＡｔｔ部位）、終止コドン、転写終結シグナル、および自己切断性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、エピトープタグ等と組み合わせることができるため、それらの全体的な長さは大幅に変動し得る。したがって、ほぼあらゆる長さのポリヌクレオチド断片が用いられ得、その全長は、好ましくは、調製し易さおよび意図される組換えＤＮＡプロトコルにおける使用によって限定されることが企図される。
【０１３０】
「発現制御配列」という用語は、作動可能に連結したポリヌクレオチドの転写または発現を誘導すること、増大させること、調節すること、または制御することができる、１つ以上のプロモーター、エンハンサー、もしくは他の転写制御エレメント、またはそれらの組み合わせを含むポリヌクレオチド配列を指す。特定の実施形態において、本発明のベクターは、特定の赤血球細胞、赤血球細胞型、または赤血球細胞系列に特異的な１つ以上の発現制御配列を含む。好ましい実施形態において、ベクターは、赤血球細胞に特異的な１つ以上の発現制御配列、例えば、赤血球特異的発現制御配列を含む。
【０１３１】
「内因性」発現制御配列は、ゲノムにおける所与の遺伝子と天然において連結している制御配列である。「外因性」発現制御配列は、遺伝子操作（すなわち、分子生物学的技術）によって遺伝子の近位に配置され、その遺伝子の転写が連結したエンハンサー／プロモーターによって誘導されるような制御配列である。「異種性」発現制御配列は、遺伝的に操作される細胞とは異なる種に由来する外因性の配列である。「合成」発現制御配列は、１つ以上の内因性配列および／もしくは外因性配列、ならびに／または、特定の遺伝子治療に最適なプロモーターおよび／もしくはエンハンサー活性を提供することがインビトロでもしくはインシリコで決定された配列のエレメントを含んでもよい。特定の実施形態において、ベクターは、プロモーターおよび／またはエンハンサー等の外因性、内因性、または異種性の発現制御配列を含む。
【０１３２】
本明細書で使用される「プロモーター」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼが結合するポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の認識部位を含む発現制御配列を指すために本明細書で使用される。「エンハンサー」という用語は、増強された転写を提供することができる配列を含有し、ある場合には、別の制御配列に対するそれらの配向に関係なく機能することができるＤＮＡのセグメントを含む発現制御配列を指す。エンハンサーは、プロモーターおよび／または他のエンハンサーエレメントと協同的または相加的に機能することができる。「プロモーター／エンハンサー」という用語は、プロモーター機能とエンハンサー機能の両方を提供することができる配列を含有するＤＮＡのセグメントを指す。
【０１３３】
「作動可能に連結した」という用語は、記載される構成成分がそれらの意図される様式で機能することを可能にする関係にある並置を指す。一実施形態において、この用語は、核酸発現制御配列（プロモーター、および／もしくはエンハンサー、または他の発現制御配列等）と、第２のポリヌクレオチド配列、例えば、対象となるポリヌクレオチドとの間の機能的な連結を指し、発現制御配列が、第２の配列に対応する核酸の転写を誘導する。
【０１３４】
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーならびにその変異体および合成類似体を指すために本明細書において互換的に使用される。したがって、これらの用語は、１つ以上のアミノ酸残基が合成の天然に存在しないアミノ酸、例えば、対応する天然に存在するアミノ酸の化学的類似体であるアミノ酸のポリマーだけでなく、天然に存在するアミノ酸のポリマーにも適用される。ポリペプチドの実例として、限定されないが、特定の実施形態の組成物および方法において使用するのに適したグロビンポリペプチドが挙げられる。また、例えば、米国特許第６，０５１，４０２号、同第７，９０１，６７１号、および同第９，０６８，１９９号も参照されたく、その完全な開示および特許請求の範囲は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１３５】
本明細書において企図される特定の実施形態は、ポリペプチド「変異体」も含む。ポリペプチド「変異体」という記述は、少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、欠失、切断、改変、および／または置換によって参照ポリペプチドと区別される、生物学的活性を保持するポリペプチドを指す。ある特定の実施形態において、当該技術分野で既知のように、ポリペプチド変異体は、保存されていても保存されていなくてもよい１つ以上の置換によって参照ポリペプチドと区別される。ある特定の実施形態において、ポリペプチド変異体は、参照ポリペプチドの対応する配列に対して少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性または配列類似性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、アミノ酸の付加または欠失は、参照ポリペプチドのＣ末端および／またはＮ末端で起こる。
【０１３６】
「宿主細胞」は、本明細書において企図される組換えベクターまたはポリヌクレオチドを用いて、インビボ、エクスビボ、またはインビトロで、トランスフェクトした、感染させた、または形質導入した細胞を含む。宿主細胞は、パッケージング細胞、プロデューサー細胞、およびウイルスベクターに感染させた細胞を含み得る。特定の実施形態において、本発明のウイルスベクターで感染させた宿主細胞が、治療を必要とする対象に投与される。ある特定の実施形態において、「標的細胞」という用語は、宿主細胞と互換的に使用され、所望の細胞型のトランスフェクトした、感染させた、または形質導入した細胞を指す。好ましい実施形態において、標的細胞は、幹細胞または前駆細胞である。ある特定の好ましい実施形態において、標的細胞は、体細胞、例えば、成人の幹細胞、前駆細胞、または分化細胞である。特定の好ましい実施形態において、標的細胞は、造血細胞、例えば、造血幹細胞または前駆細胞である。さらなる治療標的細胞は、以下で論じられる。
【０１３７】
本明細書で使用される「初代細胞」という用語は、組織から単離され、インビトロまたはエクスビボで増殖させるために確立された細胞を指すために当該技術分野において既知である。対応する細胞は、たとえあったとしても、非常に少ない集団倍加を経験しており、したがって連続継代性細胞株と比較して、それらが由来する組織の主な機能成分をより代表しているため、インビボ状態よりも代表的なモデルを意味する。様々な組織から試料を得るための方法、および初代細胞株を確立するための方法は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｊｏｎｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９９７を参照のこと）。本発明の方法で使用される初代細胞は、例えば、血液に由来する。一実施形態において、初代細胞は、造血幹細胞または前駆細胞である。
【０１３８】
「幹細胞」という用語は、（１）長期の自己再生、または元の細胞の少なくとも１つの同一のコピーを生成する能力、（２）単一細胞レベルで、多数の、またある場合には唯一の、特殊化した細胞型への分化、（３）インビボでの組織の機能的再生が可能な、未分化細胞である細胞を指す。幹細胞は、それらの発生の潜在性に従って、全能性、多能性、多分化能、および少能性／単能性に細分類される。「自己再生」は、変化しない娘細胞を産生する、および特殊化した細胞型を生成する特有の能力（潜在能）を有する細胞を指す。自己再生は、二通りに達成することができる。非対称細胞分裂は、親細胞と同一の娘細胞を１つ、および親細胞とは異なり、前駆細胞または分化細胞である娘細胞を１つ産生する。対称細胞分裂は、２つの同一の娘細胞を産生する。細胞の「増殖」または「増大」は、対称的に分割する細胞を指す。
【０１３９】
本明細書で使用される場合、「前駆体」または「前駆細胞」という用語は、自己再生する能力、およびより成熟した細胞に分化する能力を有する細胞を指す。多くの前駆細胞は、単一の系列に沿って分化するが、かなり大規模な増殖能を有する場合がある。
【０１４０】
「造血幹細胞」または「ＨＳＣ」は、骨髄細胞系列（例えば、単球およびマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞）、およびリンパ球系列（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）、および当該技術分野で既知の他の系列を含む、生物体の血液細胞の種類の全てを生じさせる多分化能幹細胞を指す（Ｆｅｉ，Ｒ．らの米国特許第５，６３５，３８７号、ＭｃＧｌａｖｅらの米国特許第５，４６０，９６４号、Ｓｉｍｍｏｎｓ，Ｐ．らの米国特許第５，６７７，１３６号、Ｔｓｕｋａｍｏｔｏらの米国特許第５，７５０，３９７号、Ｓｃｈｗａｒｔｚらの米国特許第５，７５９，７９３号、ＤｉＧｕｉｓｔｏらの米国特許第５，６８１，５９９号、Ｔｓｕｋａｍｏｔｏらの米国特許第５，７１６，８２７号を参照のこと）。致死的に放射線照射した動物またはヒトに移植すると、造血幹細胞および前駆細胞は、赤血球、好中球−マクロファージ、巨核球およびリンパ球造血細胞プールを再配置させることができる。
【０１４１】
「増強する」もしくは「促進する」、または「増加させる」もしくは「増大させる」は、本明細書において企図される組成物および／または方法が、ビヒクルまたは対照分子のいずれかと比較して、ＨｂＦレベルの増加、γグロビン発現の増加、および／または形質導入効率の増加を誘発する、引き起こす、またはもたらす能力を一般的に指す。「増加された」または「増強された」量は、典型的には、「統計的に有意な」量であり、基準量の１．１倍、１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、またはそれ以上の倍数（例えば、５００倍、１０００倍）（１の間および１を超える全ての整数および小数点、例えば、１．５、１．６、１．７、１．８等を含む）である増加を含。
【０１４２】
「減少させる」もしくは「低減する」、または「減らす」、または「低下させる」、または「軽減する」は、異常なグロビンレベルを誘発する、引き起こす、もしくは低下させ、βグロビン遺伝子発現を減少させ、かつ／またはＢＣＬ１１Ａ遺伝子発現レベルを減少させる組成物または方法を一般的に指す。「減少された」または「低下された」量は、「統計的に有意な」量であり、基準量の１．１倍、１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、またはそれ以上の倍数（例えば、５００倍、１０００倍）（１の間および１を超える全ての整数および小数点、例えば、１．５、１．６、１．７、１．８等を含む）である減少を含み得る。
【０１４３】
「維持する」もしくは「保存する」、または「維持」、または「変化なし」、または「実質的な変化なし」、または「実質的な減少なし」は、ビヒクル、対照分子／組成物のいずれかによって引き起こされる応答、または特定の細胞における応答に相当する生理学的応答を一般的に指す。相当する応答は、参照応答と有意差がない応答または測定可能な差のない応答である。
【０１４４】
以下の説明において、本明細書において企図される本発明の様々な例示的実施形態の完全な理解を提供するために、ある特定の具体的な詳細が記載される。しかしながら、当業者は、これらの詳細なしで特定の例示的な実施形態が実施され得ることを理解するであろう。
【０１４５】
Ｃ．ＢＣＬ１１Ａ  ＳＨＭＩＲレンチウイルスベクター
本明細書において企図されるレンチウイルスベクターは、ヘモグロビン異常性疾患の少なくとも１つの症状を治療する、予防する、または寛解させるために、赤血球細胞に治療用ＲＮＡを効率的に形質導入して発現させるという課題に強く望まれている解決策を提供する。本明細書において企図されるレンチウイルスベクターの改善されたレンチウイルスベクター構造は、既存のレンチウイルスベクター構造と比較して、ベクター力価の増加、形質導入性の増加、ベクターコピー数の増加、および形質導入効率の増加をもたらす。
【０１４６】
特定の実施形態において、レンチウイルスベクターは、ＢＣＬ１１Ａ  ｓｈｍｉＲをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された１つ以上の赤血球細胞発現制御配列を含む。ｓｈｍｉＲは、ｍｉＲＮＡ隣接領域およびループを保持するｍｉＲＮＡ骨格と、ＢＣＬ１１Ａを標的とするｓｈＲＮＡ構築物由来の最適化されたメッセンジャー鎖およびガイド鎖とを含む。いずれか特定の理論に拘束されることを望むものではないが、ガイド鎖の３’末端へのＧＣＧＣの付加は、ＲＮＡ二本鎖における３’末端の熱力学的安定性を増加させ、それによって意図されるガイド鎖の優先的ＲＩＳＣローディングを促進することが企図される。
【０１４７】
好ましい実施形態において、レンチウイルスベクターは、ＲＲＥを除く全ての天然レンチウイルスベクター配列がＨＩＶ−１株ＮＬ４−３に由来するＨＩＶ−１株ＮＬ４−３レンチウイルスベクターである。特定の実施形態において、本明細書において企図されるレンチウイルスベクターは、ＢＣＬ１１Ａ  ｓｈｍｉＲをコードする既存のレンチウイルスベクター構造と比較して１つ以上の差異を含む。１つ以上の差異によって、本明細書において企図されるレンチウイルスベクターは、既存のレンチウイルスベクターよりも優れた性能を有し、改善された遺伝子治療用製品を得ることが可能となる。１つ以上の差異の実例として、限定されないが、レンチウイルスベクターＬＴＲ、ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ、およびｅｎｖ  Ｓ／Ａ配列がＨＩＶ−１株ＮＬ４−３から単離される；ＲＲＥ配列がＨＩＶ−１株ＨＸＢ３から単離される；レンチウイルスベクターエレメントの構造が５’ＬＴＲ−プサイ（Ψ）パッケージングシグナル−ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ−ＲＲＥ−ｅｎｖスプライスアクセプター（Ｓ／Ａ）部位である；レンチウイルスベクターが５’ＬＴＲを含み、内因性プロモーターがＣＭＶプロモーターで置換されている；レンチウイルスベクターが、約４５９ヌクレオチドの切断されたｇａｇタンパク質をコードし、かつ少なくとも２つの変異ＡＴＧコドンを含むポリヌクレオチドを含む；レンチウイルスベクターが約１７６ヌクレオチドのｅｎｖスプライスアクセプター（Ｓ／Ａ）部位を含む；レンチウイルスベクターが約３８１ヌクレオチドのｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ配列を含む；レンチウイルスベクターが約６３８ヌクレオチドのβグロビンＬＣＲ  ＨＳ２  ＤＮＡｓｅ  Ｉ過敏性部位を含む；レンチウイルスベクターが約８４７ヌクレオチドのβグロビンＬＣＲ  ＨＳ３  ＤＮＡｓｅ  Ｉ過敏性部位を含む；およびレンチウイルスベクターがｓｈｍｉＲ発現カセットの３’末端に合成ポリアデニル化配列を含む、が挙げられる。
【０１４８】
特定の実施形態において企図されるレンチウイルスベクターは、ヒトβグロビンプロモーター、ヒトβグロビンＬＣＲ、ならびに、ＢＣＬ１１Ａ  ｍＲＮＡにハイブリダイズしてその切断を促進するように設計されたｓｈｍｉＲ、すなわち、ＢＣＬ１１Ａ  ｓｈｍｉＲをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたヒトαグロビンＨＳ４０エンハンサーおよびアンキリン−１プロモーターからなる群から選択される赤血球特異的プロモーターを含む。
【０１４９】
本明細書において企図されるレンチウイルスベクターのレンチウイルスベクター構造は、５’から３’に向かって、プサイ（Ψ）パッケージングシグナルと、レンチウイルスセントラルポリプリン配列（ｃＰＰＴ）／ＦＬＡＰエレメント（任意選択的に、ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰエレメントが約３８１ヌクレオチド長のポリヌクレオチド配列を含み、ｃＰＰＴエレメントおよびＣＴＳ配列をさらに含む）と、ＲＮＡ核外輸送因子（任意選択的に、ＲＮＡ核外輸送因子がＲＥＶ応答エレメントまたはＲＲＥである）と、ＨＩＶ−１  ｅｎｖスプライスアクセプター配列とを含む。
【０１５０】
レンチウイルスベクターの安全性は、あらゆる潜在的なレンチウイルス遺伝子治療にとって最も重要である。本明細書において企図されるレンチウイルスベクターは、レンチウイルスを複製欠損にするために、限定されないが、１つ以上のＬＴＲに対する改変を含む１つ以上の改変を含む。特定の実施形態において、レンチウイルスは、改変された５’長末端反復（ＬＴＲ）を含み、該改変は、５’ＬＴＲの内因性プロモーターを異種ＣＭＶプロモーターで置換することを含む。特定の実施形態において、レンチウイルスは、改変された３’ＬＴＲを含み、該改変は、３’ＬＴＲのＵ３領域におけるウイルスプロモーターおよびエンハンサーの欠失を含み、任意選択的に、欠失は約４００ヌクレオチド長である。
【０１５１】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるレンチウイルスベクターは、Ｕ３領域がＣＭＶプロモーターで置換されたＨＩＶ−１株ＮＬ４−３の５’ＬＴＲと、プサイ（Ψ）パッケージングシグナルと、ｃＰＰＴエレメントおよびＣＴＳ配列を含むＨＩＶ−１株ＮＬ４−３のセントラルポリプリン配列（ｃＰＰＴ）／ＦＬＡＰエレメントと、ＨＩＶ−１株ＨＸＢ３のＲＲＥ  ＲＮＡ核外輸送因子と、ＨＩＶ−１株ＮＬ４−３  ｅｎｖスプライスアクセプター配列と、ヒトＢＣＬ１１Ａ  ｍＲＮＡにハイブリダイズするＲＮＡ配列をコードするｓｈｍｉＲに作動可能に連結された赤血球特異的プロモーターと、ＨＩＶ−１株ＮＬ４−３の３’ＳＩＮ  ＬＴＲとを含む。
【０１５２】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるレンチウイルスベクターは、Ｕ３領域がＣＭＶプロモーターで置換されたＨＩＶ−１株ＮＬ４−３の５’ＬＴＲと、プサイ（Ψ）パッケージングシグナルと、ＣＰＰＴエレメントおよびＣＴＳ配列を含むＨＩＶ−１株ＮＬ４−３のセントラルポリプリン配列（ｃＰＰＴ）／ＦＬＡＰエレメントと、ＨＩＶ−１株ＨＸＢ３のＲＲＥ  ＲＮＡ核外輸送因子と、ＨＩＶ−１株ＮＬ４−３  ｅｎｖスプライスアクセプター配列と、ヒトＢＣＬ１１Ａ  ｍＲＮＡにハイブリダイズするＲＮＡ配列をコードするｓｈｍｉＲに作動可能に連結されたヒトβグロビンＬＣＲおよびヒトβグロビンプロモーターと、ＨＩＶ−１株ＮＬ４−３の３’ＳＩＮ  ＬＴＲとを含む。
【０１５３】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるレンチウイルスベクターは、Ｕ３領域がＣＭＶプロモーターで置換されたＨＩＶ−１株ＮＬ４−３の５’ＬＴＲと、プサイ（Ψ）パッケージングシグナルと、ＣＰＰＴエレメントおよびＣＴＳ配列を含むＨＩＶ−１株ＮＬ４−３のセントラルポリプリン配列（ｃＰＰＴ）／ＦＬＡＰエレメントと、ＨＩＶ−１株ＨＸＢ３のＲＲＥ  ＲＮＡ核外輸送因子と、ＨＩＶ−１株ＮＬ４−３  ｅｎｖスプライスアクセプター配列と、ヒトＢＣＬ１１Ａ  ｍＲＮＡにハイブリダイズするＲＮＡ配列をコードするｓｈｍｉＲに作動可能に連結されたヒトβグロビンＬＣＲおよびヒトβグロビンプロモーター由来のＨＳ３およびＨＳ２  ＤＮＡｓｅＩ過敏性部位と、ＨＩＶ−１株ＮＬ４−３の３’ＳＩＮ  ＬＴＲとを含む。
【０１５４】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるレンチウイルスベクターは、Ｕ３領域がＣＭＶプロモーターで置換されたＨＩＶ−１株ＮＬ４−３の５’ＬＴＲと、プサイ（Ψ）パッケージングシグナルと、切断されたｇａｇタンパク質をコードし、かつ１つ以上の変異ＡＴＧコドンを含むポリヌクレオチドと、ＣＰＰＴエレメントおよびＣＴＳ配列を含むＨＩＶ−１株ＮＬ４−３のセントラルポリプリン配列（ｃＰＰＴ）／ＦＬＡＰエレメントと、ＨＩＶ−１株ＨＸＢ３のＲＲＥ  ＲＮＡ核外輸送因子と、ＨＩＶ−１株ＮＬ４−３  ｅｎｖスプライスアクセプター配列と、ヒトＢＣＬ１１Ａ  ｍＲＮＡにハイブリダイズするＲＮＡ配列をコードするｓｈｍｉＲに作動可能に連結されたヒトβグロビンＬＣＲおよびヒトβグロビンプロモーター由来のＨＳ３およびＨＳ２  ＤＮＡｓｅＩ  過敏性部位と、合成ポリ（Ａ）シグナルと、ＨＩＶ−１株ＮＬ４−３の３’ＳＩＮ  ＬＴＲとを含む。
【０１５５】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるレンチウイルスベクターは、Ｕ３領域がＣＭＶプロモーターで置換されたＨＩＶ−１株ＮＬ４−３の５’ＬＴＲと、プサイ（Ψ）パッケージングシグナルと、切断されたｇａｇタンパク質をコードし、かつ１つ以上の変異ＡＴＧコドンを含むポリヌクレオチドと、約３８１ヌクレオチド長であり、ｃＰＰＴエレメントおよびＣＴＳ配列を含む、ＨＩＶ−１株ＮＬ４−３のセントラルポリプリン配列（ｃＰＰＴ）／ＦＬＡＰエレメントと、ＨＩＶ−１株ＨＸＢ３のＲＲＥ  ＲＮＡ核外輸送因子と、ＨＩＶ−１株ＮＬ４−３  ｅｎｖスプライスアクセプター配列と、約８４７ヌクレオチド長のヒトβグロビンＬＣＲ由来のＨＳ３  ＤＮＡｓｅＩ過敏性部位と、約６３８ヌクレオチド長のヒトβグロビンＬＣＲ由来のＨＳ２  ＤＮＡｓｅＩ過敏性部位と、配列番号１に記載の配列を含むｓｈｍｉＲ発現カセットに作動可能に連結されたヒトβグロビンプロモーターと、合成ポリ（Ａ）シグナルと、ＨＩＶ−１株ＮＬ４−３の３’ＳＩＮ  ＬＴＲとを含む。
【０１５６】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるレンチウイルスベクターは、Ｕ３領域がＣＭＶプロモーターで置換されたＨＩＶ−１株ＮＬ４−３の５’ＬＴＲと、プサイ（Ψ）パッケージングシグナルと、切断されたｇａｇタンパク質をコードし、かつ１つ以上の変異ＡＴＧコドンを含む、約４５９ヌクレオチド長のポリヌクレオチドと、約３８１ヌクレオチド長であり、ｃＰＰＴエレメントおよびＣＴＳ配列を含む、ＨＩＶ−１株ＮＬ４−３セントラルポリプリン配列（ｃＰＰＴ）／ＦＬＡＰエレメントと、ＨＩＶ−１株ＨＸＢ３のＲＲＥ  ＲＮＡ核外輸送因子と、ＨＩＶ−１株ＮＬ４−３  ｅｎｖスプライスアクセプター配列と、約８４７ヌクレオチド長のヒトβグロビンＬＣＲ由来のＨＳ３  ＤＮＡｓｅＩ過敏性部位と、約６３８ヌクレオチド長のヒトβグロビン  ＬＣＲ由来のＨＳ２  ＤＮＡｓｅＩ過敏性部位と、配列番号１に記載の配列を含むｓｈｍｉＲ発現カセットに作動可能に連結されたヒトβグロビンプロモーターと、合成ポリ（Ａ）シグナルと、ＨＩＶ−１株ＮＬ４−３の３’ＳＩＮ  ＬＴＲとを含む。
【０１５７】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるレンチウイルスベクターは、Ｕ３領域がＣＭＶプロモーターで置換されたＨＩＶ−１株ＮＬ４−３の５’ＬＴＲと、プサイ（Ψ）パッケージングシグナルと、切断されたｇａｇタンパク質をコードし、かつ１つ以上の変異ＡＴＧコドンを含む、約４５９ヌクレオチド長のポリヌクレオチドと、約３８１ヌクレオチド長であり、ｃＰＰＴエレメントおよびＣＴＳ配列を含む、ＨＩＶ−１株ＮＬ４−３セントラルポリプリン配列（ｃＰＰＴ）／ＦＬＡＰエレメントと、ＨＩＶ−１株ＨＸＢ３のＲＲＥ  ＲＮＡ核外輸送因子と、ＨＩＶ−１株ＮＬ４−３  ｅｎｖスプライスアクセプター配列と、約８４７ヌクレオチド長のヒトβグロビンＬＣＲ由来のＨＳ３  ＤＮＡｓｅＩ過敏性部位と、約６３８ヌクレオチド長のヒトβグロビンＬＣＲ由来のＨＳ２  ＤＮＡｓｅＩ過敏性部位と、配列番号３に記載の配列にハイブリダイズするガイド鎖を含むｓｈｍｉＲ発現カセットに作動可能に連結されたヒトβグロビンプロモーターと、合成ポリ（Ａ）シグナルと、ＨＩＶ−１株ＮＬ４−３の３’ＳＩＮ  ＬＴＲとを含む。
【０１５８】
好ましい実施形態において、ｓｈｍｉＲ発現カセット（ｓｈｍｉＲおよびポリ（Ａ）シグナルに作動可能に連結された１つ以上の発現制御配列）の配向は、５’ＬＴＲによって媒介されるゲノムレンチウイルスＲＮＡの配向の反対である。
【０１５９】
妥当なウイルス力価を達成するためには、しばしば、大規模なウイルス粒子産生が必要である。ウイルス粒子は、ウイルス構造遺伝子および／またはアクセサリー遺伝子、例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｐｘ、もしくはｎｅｆ遺伝子、または他のウイルスの遺伝子を含むパッケージング細胞株に導入ベクターをトランスフェクトすることによって産生される。
【０１６０】
本明細書で使用される場合、「パッケージングベクター」という用語は、パッケージングシグナルを欠き、１つ、２つ、３つ、４つまたはそれより多くのウイルス構造遺伝子および／またはアクセサリー遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターまたはウイルスベクターを指す。典型的には、パッケージングベクターは、パッケージング細胞に含まれ、トランスフェクション、形質導入または感染によって細胞に導入される。トランスフェクション、形質導入または感染のための方法は、当業者に周知である。特定の実施形態において企図されるレンチウイルス導入ベクターは、プロデューサー細胞または産生細胞株を生成するために、トランスフェクション、形質導入または感染によってパッケージング細胞株に導入することができる。
【０１６１】
ウイルスエンベロープタンパク質（ｅｎｖ）は、細胞系から生成される組換えレトロウイルスによって最終的に感染させて形質転換することができる宿主細胞の範囲を決定する。好ましい一実施形態において、本明細書において企図されるレンチウイルスは、ＶＳＶ−Ｇ糖タンパク質によってシュードタイピングされる。本明細書で使用される「シュードタイプ」または「シュードタイピング」という用語は、ウイルスエンベロープタンパク質が、好ましい特性を保有する別のウイルスのエンベロープタンパク質で置換されているウイルスを指す。
【０１６２】
本明細書で使用される場合、「パッケージング細胞株」という用語は、パッケージングシグナルを含有しないが、ウイルス粒子の正しいパッケージングに必要なウイルス構造タンパク質および複製酵素（例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ）を安定にまたは一過性に発現する細胞株に関連して使用される。特定の実施形態において、好適な細胞株は、本発明のパッケージング細胞を調製するために用いることができる。通常、細胞は哺乳動物細胞である。特定の実施形態において、パッケージング細胞株を産生するために使用される細胞は、ヒト細胞である。使用することができる好適な細胞株として、例えば、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、Ｃ３Ｈ  １０Ｔ１／２細胞、ＦＬＹ細胞、プサイ−２細胞、ＢＯＳＣ  ２３細胞、ＰＡ３１７細胞、ＷＥＨＩ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＳＣ  １細胞、ＢＳＣ  ４０細胞、ＢＭＴ  １０細胞、ＶＥＲＯ細胞、Ｗ１３８細胞、ＭＲＣ５細胞、Ａ５４９細胞、ＨＴ１０８０細胞、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、Ｂ−５０細胞、３Ｔ３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｓａｏｓ−２細胞、Ｈｕｈ７細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｗ１６３細胞、２１１細胞、および２１１Ａ細胞が挙げられる。好ましい実施形態において、パッケージング細胞は、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、２９３Ｆ細胞、またはＡ５４９細胞である。
【０１６３】
本明細書で使用される場合、「プロデューサー細胞株」という用語は、パッケージング細胞株と、パッケージングシグナルを含む導入ベクター構築物とを含む組換えレトロウイルス粒子を産生することができる細胞株を指す。感染性ウイルス粒子およびウイルスストック溶液の産生は、従来の技術を用いて行うことができる。ウイルスストック溶液を調製する方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｙ．Ｓｏｎｅｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：６２８−６３３およびＮ．Ｒ．Ｌａｎｄａｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：５１１０−５１１３によって例示されている。感染性ウイルス粒子は、従来の技術を用いてパッケージング細胞から回収されてもよい。例えば、感染性粒子は、当該技術分野で既知のように、細胞溶解、または細胞培養物の上清を回収することによって回収することができる。任意選択的に、回収されたウイルス粒子は、必要に応じて精製されてもよい。好適な精製技術は当業者に周知である（例えば、Ｋｕｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００９；９：１０．ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７２−６７５０−９−１０；Ｋｕｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２００９；４（４）：４９５−５０５．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２００９．２２）。
【０１６４】
Ｄ．組成物および製剤
本明細書において企図される組成物および製剤は、単独で、または１つ以上の他の治療モダリティと組み合わせて、細胞、組織、器官、または動物に投与するために薬学的に許容されるまたは生理学的に許容される溶液（例えば、培養培地）中に製剤化される、本明細書に記載されるような、任意の数の形質導入細胞もしくは非形質導入細胞またはそれらの組み合わせ、ウイルスベクター、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ならびに形質導入効率および／またはＶＣＮを増加させる１つ以上の薬剤、例えば、ポロキサマー、およびプロスタグランジンシグナル伝達を増加させる薬剤の組み合わせを含んでもよい。
【０１６５】
本明細書において企図される特定のエクスビボおよびインビトロ製剤ならびに組成物は、単独で、または１つ以上の他の治療モダリティと組み合わせて、細胞、組織、器官、または動物に投与するために薬学的に許容されるまたは生理学的に許容される溶液（例えば、培養培地）中に製剤化される、ＢＣＬ１１Ａ  ｓｈｍｉＲをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された１つ以上の赤血球細胞発現制御配列を含むレンチウイルスベクターで形質導入されたヒトＣＤ３４＋細胞の集団を含んでもよい。
【０１６６】
本明細書において企図される特定のインビボ製剤および組成物は、単独で、または１つ以上の他の治療モダリティと組み合わせて、細胞、組織、器官、または動物に投与するために薬学的に許容されるまたは生理学的に許容される溶液（例えば、培養培地）中に製剤化される、本明細書に記載されるような、ウイルスベクター、ならびに形質導入効率および／またはＶＣＮを増加させる１つ以上の薬剤、例えば、ポロキサマー、およびプロスタグランジンシグナル伝達を増加させる薬剤の組み合わせを含んでもよい。
【０１６７】
ある特定の実施形態において、本明細書において企図される組成物は、１つ以上の薬学的に許容される担体（添加剤）および／または希釈剤（例えば、薬学的に許容される細胞培養培地）と一緒に製剤化される、ＢＣＬ１１Ａ  ｓｈｍｉＲをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された１つ以上の赤血球細胞発現制御配列を含むレンチウイルスベクターで形質導入された治療有効量の造血幹細胞または前駆細胞、例えば、ＣＤ３４＋細胞を含む細胞集団を含む。
【０１６８】
特定の実施形態において、組成物は、１つ以上の薬学的に許容される担体（添加剤）および／または希釈剤（例えば、薬学的に許容される細胞培養培地）と一緒に製剤化される、本明細書に記載されるような、幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団、ＢＣＬ１１Ａ  ｓｈｍｉＲをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された１つ以上の赤血球細胞発現制御配列を含むレンチウイルスベクター、ならびに形質導入効率および／またはＶＣＮを増加させる１つ以上の薬剤、例えば、ポロキサマー、およびプロスタグランジンシグナル伝達を増加させる薬剤を含む。関連する実施形態において、細胞集団は、造血幹細胞および前駆細胞を含む。一実施形態において、細胞集団は、ＣＤ３４＋細胞を含む。一実施形態において、細胞集団は、ＣＤ１３３＋細胞を含む。一実施形態において、細胞集団は、ＣＤ３４＋選択細胞である。
【０１６９】
好ましい実施形態において、細胞集団は、以下のβグロビン対立遺伝子のうちの１つを有するＣＤ３４＋細胞を含む：βＥ／β０、βＣ／β０、β０／β０、βＥ／βＥ、βＣ／β＋、βＥ／β＋、β０／β＋、β＋／β＋、βＣ／βＣ、βＥ／βＳ、β０／βＳ、βＣ／βＳ、β＋／βＳまたはβＳ／βＳ。
【０１７０】
好ましい実施形態において、細胞集団は、以下のβグロビン対立遺伝子のうちの１つを有するＣＤ３４＋細胞を含む：βＥ／β０、βＣ／β０、β０／β０、βＣ／βＣ、βＥ／βＥ、βＥ／β＋、βＣ／βＥ、βＣ／β＋、β０／β＋、またはβ＋／β＋。
【０１７１】
好ましい実施形態において、細胞集団は、以下のβグロビン対立遺伝子のうちの１つを有するＣＤ３４＋細胞を含む：βＥ／βＳ、β０／βＳ、βＣ／βＳ、β＋／βＳまたはβＳ／βＳ。
【０１７２】
本明細書の特定の実施形態において企図される薬学的組成物は、本明細書に記載される方法に従って産生される形質導入細胞と、薬学的に許容される担体とを含む。
【０１７３】
他の実施形態において、薬学的組成物は、ＢＣＬ１１Ａ  ｓｈｍｉＲをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された１つ以上の赤血球細胞発現制御配列を含むレンチウイルスベクターと、限定されないがポロキサマーを含む、形質導入効率および／またはＶＣＮを増加させる１つ以上の薬剤と、プロスタグランジンシグナル伝達を増加させる薬剤とを含む。
【０１７４】
「薬学的に許容される」という句は、ヒトに投与されたときにアレルギー反応または同様の有害反応を生じさせない分子実体および組成物を指す。特定の実施形態において、「薬学的に許容される」という用語は、連邦政府もしくは州政府の規制当局によって承認されていること、または米国薬局方もしくは他の一般に認識されている動物用の、より具体的にはヒト用の薬局方に列挙されていることを意味する。
【０１７５】
「担体」という用語は、治療用細胞とともに投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。薬学的担体の実例は、滅菌液体、例えば、細胞培養培地、水および油（石油、動物、植物または合成起源のものを含む）、例えば、落花生油、大豆油、鉱物油、ゴマ油等であり得る。食塩溶液、ならびに水性デキストロースおよびグリセロール溶液も、特に注射液用の液体担体として用いることができる。特定の実施形態における好適な薬学的賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等を含む。任意の従来の培地または薬剤が活性成分と不適合である場合を除いて、治療用組成物におけるその使用が企図される。補助的な活性成分も、組成物に組み込むことができる。
【０１７６】
一実施形態において、担体を含む組成物は、非経口投与、例えば、血管内（静脈内または動脈内）、腹腔内、または筋肉内投与に適している。薬学的に許容される担体は、滅菌水溶液、細胞培養培地、または分散剤を含む。薬学的に活性な物質へのそのような培地および薬剤の使用は、当該技術分野で周知である。任意の従来の培地または薬剤が形質導入細胞と不適合である場合を除いて、薬学的組成物におけるその使用が企図される。
【０１７７】
特定の実施形態において、本明細書において企図される組成物は、遺伝子改変された造血幹細胞および／または前駆細胞と、薬学的に許容される担体、例えば、薬学的に許容される細胞培養培地とを含む。本明細書において企図される細胞に基づく組成物を含む組成物は、所望の治療目標を達成するように、腸内投与もしくは非経口投与方法によって別個に、または他の好適な化合物と組み合わせて投与され得る。
【０１７８】
薬学的に許容される担体は、治療されるヒト対象への投与に適したものであるために、十分に高純度かつ十分に低毒性でなければならない。担体はさらに、組成物の安定性を維持するかまたは増加させるべきである。薬学的に許容される担体は、液体または固体であり得、計画された投与様式を考慮に入れて、組成物の他の構成成分と組み合わせたときに、所望の嵩、粘稠度等を提供するように選択される。例えば、薬学的に許容される担体は、限定されないが、結合剤（例えば、糊化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース等）、充填剤（例えば、ラクトースおよび他の糖類、微結晶性セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレート、リン酸水素カルシウム等）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、ステアリン酸金属、水素化植物油、トウモロコシデンプン、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム等）、崩壊剤（例えば、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウム等）、または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム等）であり得る。本明細書において企図される組成物のための他の好適な薬学的に許容される担体として、限定されないが、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。
【０１７９】
そのような担体溶液はまた、緩衝液、希釈剤、および他の好適な添加剤を含み得る。本明細書で使用される「緩衝液」という用語は、その化学組成が、ｐＨを著しく変化させることなく、酸または塩基を中和する溶液または液体を指す。本明細書において企図される緩衝液の例として、限定されないが、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、リンゲル液、５％ブドウ糖液（Ｄ５Ｗ）、正常／生理食塩水（０．９％  ＮａＣｌ）が挙げられる。
【０１８０】
薬学的に許容される担体および／または希釈剤は、約７の治療用組成物のｐＨを維持するのに十分な量で存在し得る。代替として、治療用組成物は、約６．８〜約７．４の範囲、例えば、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、および７．４のｐＨを有する。さらに別の実施形態において、治療用組成物は、約７．４のｐＨを有する。
【０１８１】
本明細書において企図される組成物は、非毒性の薬学的に許容される培地を含んでもよい。組成物は懸濁液であってもよい。本明細書で使用される「懸濁液」という用語は、細胞が、固体支持体に結合していない非接着性状態を指す。例えば、懸濁液として維持される細胞は、撹拌または振盪されてもよく、培養皿等の支持体に接着しない。
【０１８２】
特定の実施形態において、本明細書において企図される組成物は、懸濁液中で製剤化され、造血幹細胞および／または前駆細胞は、許容される液体培地または溶液、例えば、静脈内（ＩＶ）バッグ等の生理食塩水または無血清培地内に分散される。許容される希釈剤として、限定されないが、水、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ、リンゲル液、等張塩化ナトリウム（生理食塩水）溶液、無血清細胞培養培地、ならびに極低温貯蔵に好適な培地、例えば、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ（登録商標）培地が挙げられる。
【０１８３】
ある特定の実施形態において、薬学的に許容される担体は、ヒトまたは動物起源の天然タンパク質を実質的に含まず、例えば、造血幹細胞および前駆細胞の細胞集団を含む組成物を保存するのに好適である。治療用組成物は、ヒト患者に投与されることが意図され、したがって、ウシ血清アルブミン、ウマ血清、およびウシ胎仔血清等の細胞培養成分を実質的に含まない。
【０１８４】
いくつかの実施形態において、組成物は、薬学的に許容される細胞培養培地中で製剤化される。そのような組成物は、ヒト対象への投与に好適である。特定の実施形態において、薬学的に許容される細胞培養培地は、無血清培地である。
【０１８５】
無血清培地は、簡素化されてより明確に定義された組成物、汚染物質の程度の低下、感染病原体の潜在的な源の排除、およびより低いコストを含む、血清含有培地を上回るいくつかの利点を有する。様々な実施形態において、無血清培地は、動物質を含まず、任意選択的にタンパク質を含まない場合がある。任意選択的に、培地は、生物薬学的に許容される組換えタンパク質を含んでもよい。「動物質を含まない」培地は、構成成分が非動物源に由来する培地を指す。組換えタンパク質は、動物質を含まない培地中の天然動物タンパク質に取って代わり、栄養素は、合成源、植物源、または微生物源から得られる。対照的に、「タンパク質を含まない」培地は、タンパク質を実質的に含まないと定義される。
【０１８６】
特定の組成物に使用される無血清培地の実例として、限定されないが、ＱＢＳＦ−６０（Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｉｎｃ．）、ＳｔｅｍＰｒｏ−３４（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、およびＸ−ＶＩＶＯ  １０が挙げられる。
【０１８７】
好ましい実施形態において、造血幹細胞および／または前駆細胞を含む組成物は、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅに製剤化される。
【０１８８】
様々な実施形態において、造血幹細胞および／または前駆細胞を含む組成物は、凍結保存培地中で製剤化される。例えば、凍結保存剤を用いた凍結保存培地は、解凍後に高い細胞生存率の結果を維持するために使用され得る。特定の組成物に使用される凍結保存培地の実例として、限定されないが、ＣｒｙｏＳｔｏｒ  ＣＳ１０、ＣｒｙｏＳｔｏｒ  ＣＳ５、ＣｒｙｏＳｔｏｒ  ＣＳ２が挙げられる。
【０１８９】
特定の実施形態において、組成物は、マイコプラズマ、内毒素、および微生物汚染を実質的に含まない。内毒素に関して「実質的に含まない」とは、１日当たり５ＥＵ／体重１ｋｇの全内毒素であり、平均的な７０ｋｇのヒトの場合、細胞の全用量当たり３５０ＥＵである、生物製剤に関してＦＤＡによって認可されているものより少ない細胞の１用量当たりの内毒素が存在することを意味する。特定の実施形態において、本明細書において企図されるレトロウイルスベクターで形質導入された造血幹細胞または前駆細胞を含む組成物は、約０．５ＥＵ／ｍＬ〜約５．０ＥＵ／ｍＬ、または約０．５ＥＵ／ｍＬ、１．０ＥＵ／ｍＬ、１．５ＥＵ／ｍＬ、２．０ＥＵ／ｍＬ、２．５ＥＵ／ｍＬ、３．０ＥＵ／ｍＬ、３．５ＥＵ／ｍＬ、４．０ＥＵ／ｍＬ、４．５ＥＵ／ｍＬ、または５．０ＥＵ／ｍＬを含有する。
【０１９０】
ある特定の実施形態において、限定されないがレトロウイルス（例えば、レンチウイルス）ベクターを含む、ウイルスベクター系の送達（すなわち、ウイルス媒介性形質導入）に適した組成物および製剤が企図される。
【０１９１】
エクスビボ送達のための例示的な製剤はまた、当該技術分野で既知の様々なトランスフェクション剤、例えば、リン酸カルシウム、電気穿孔、熱ショック、および様々なリポソーム製剤（すなわち、脂質媒介性トランスフェクション）等の使用も含み得る。後により詳細に説明されるように、リポソームは、水性流体の画分を封入した脂質二重層である。ＤＮＡは、自発的にカチオン性リポソームの外面と会合し（その電荷による）、これらのリポソームは、細胞膜と相互作用する。
【０１９２】
特定の実施形態において、薬学的に許容される賦形剤および担体溶液の製剤は、例えば、腸内および非経口、例えば、血管内、静脈内、動脈内、骨内、および髄内への投与および製剤を含む多様な治療レジメンにおいて本明細書に記載される特定の組成物を使用するための好適な投薬および治療レジメンの開発と同様に、当業者に周知である。当業者は、本明細書において企図される特定の実施形態が、他の製剤、例えば、製薬分野で周知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるような製剤を含んでもよいことを理解されたい。
【０１９３】
Ｅ．細胞培養組成物
全体を通して本明細書で論じられるように、特定の実施形態において、本明細書において企図される組成物および方法は、エクスビボおよびインビボでの細胞に基づく遺伝子治療に有用である。特定の実施形態において、組成物は、培養中の細胞、すなわち、細胞培養組成物を含み得る。細胞培養組成物は、造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団、好適な細胞培養培地、１つ以上のポロキサマー、プロスタグランジンシグナル伝達を増加させる１つ以上の薬剤を含み得る。
【０１９４】
特定の実施形態において、培養細胞は、ＢＣＬ１１Ａ  ｓｈｍｉＲをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された１つ以上の赤血球細胞発現制御配列を含むレンチウイルスベクターで形質導入された造血幹細胞または前駆細胞またはＣＤ３４＋細胞であり、細胞は以下のβグロビン対立遺伝子を有する：βＥ／β０、βＣ／β０、β０／β０、βＥ／βＥ、βＣ／β＋、βＥ／β＋、β０／β＋、β＋／β＋、βＣ／βＣ、βＥ／βＳ、β０／βＳ、βＣ／βＳ、β＋／βＳまたはβＳ／βＳ。
【０１９５】
特定の実施形態において、培養細胞は、ＢＣＬ１１Ａ  ｓｈｍｉＲをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された１つ以上の赤血球細胞発現制御配列を含むレンチウイルスベクターで形質導入された造血幹細胞または前駆細胞またはＣＤ３４＋細胞であり、細胞は以下のβグロビン対立遺伝子を有する：βＥ／β０、βＣ／β０、β０／β０、βＣ／βＣ、βＥ／βＥ、βＥ／β＋、βＣ／βＥ、βＣ／β＋、β０／β＋、またはβ＋／β＋。
【０１９６】
特定の実施形態において、培養細胞は、ＢＣＬ１１Ａ  ｓｈｍｉＲをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された１つ以上の赤血球細胞発現制御配列を含むレンチウイルスベクターで形質導入された造血幹細胞または前駆細胞またはＣＤ３４＋細胞であり、細胞は以下のβグロビン対立遺伝子を有する：βＥ／βＳ、β０／βＳ、βＣ／βＳ、β＋／βＳまたはβＳ／βＳ。
【０１９７】
一実施形態において、細胞培養組成物は、造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団、ヒトへの投与に適した細胞培養培地、ＢＣＬ１１Ａ  ｓｈｍｉＲをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された１つ以上の赤血球細胞発現制御配列を含むレンチウイルスベクターで形質導入された細胞、ポロキサマー、およびプロスタグランジンシグナル伝達を増加させる薬剤を含む。
【０１９８】
いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、薬学的に許容される細胞培養培地である。
【０１９９】
形質導入された造血幹細胞または前駆細胞を含む、本明細書において企図される細胞培養組成物は、所望の治療目標を達成するために、それを必要とする対象に全身投与され得るかまたは直接注入によって投与され得る。
【０２００】
Ｆ．形質導入法
特定の実施形態において、本明細書において企図される方法および組成物は、ＶＣＮを増加させ、有意により少ないウイルスを用いて有意により多くの細胞を形質導入し、それによって治療用細胞のゲノムにおけるゲノム変化および／または癌原遺伝子の挿入活性化のリスクを最小限に抑える一方で、製造される医薬製品の治療効果を同時に増加させる。したがって、本明細書において企図される組成物および方法は、より安全な遺伝子治療薬の製造をもたらすだけでなく、よりロバストな、かつ治療的に有効な医薬製品をもたらす。
【０２０１】
トランスフェクションによるものではなく、ウイルス感染によるレンチウイルスベクターを用いた遺伝子（複数可）または他のポリヌクレオチド配列の送達は、形質導入と称される。一実施形態において、レンチウイルスベクターは、感染およびプロウイルス組み込みによって細胞に形質導入される。ある特定の実施形態において、細胞、例えば、標的細胞は、レンチウイルスベクターを用いた感染によって細胞に送達された遺伝子または他のポリヌクレオチド配列を含む場合に形質導入されている。特定の実施形態において、形質導入細胞は、その細胞のゲノム内に、レンチウイルスベクターによって送達された１つ以上の遺伝子または他のポリヌクレオチド配列を含む。
【０２０２】
特定の実施形態において、ウイルスベクターで形質導入された宿主細胞または標的細胞は、ヘモグロビン異常症またはヘモグロビン異常症の少なくとも１つの症状を治療および／または予防するために対象に投与される。
【０２０３】
感染性ウイルス粒子およびウイルスストック溶液の産生は、従来の技術を用いて行うことができる。ウイルスストック溶液を調製する方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｙ．Ｓｏｎｅｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：６２８−６３３およびＮ．Ｒ．Ｌａｎｄａｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：５１１０−５１１３によって例示されている。
【０２０４】
特定の実施形態において、ＨＩＶ１型（ＨＩＶ−１）に基づくウイルス粒子は、プロデューサー細胞においてビリオンパッケージエレメントと導入ベクターとを共発現させることによって生成されてもよい。これらの細胞は、いくつかのプラスミドで一過性にトランスフェクトすることができる典型的には、３〜５つのプラスミドが用いられるが、この数はレンチウイルス成分が別々の単位に分割される程度に応じてより大きくてもよい。例えば、１つのプラスミドは、ＨＩＶ−１に由来するビリオンのコアおよび酵素成分をコードし得る。このプラスミドは、パッケージングプラスミドと称される。別のプラスミドは、典型的には、エンベロープタンパク質（複数可）、最も一般的には、その高い安定性および広いトロピズムのために、水疱性口内炎ウイルスのＧタンパク質（ＶＳＶ  Ｇ）をコードする。このプラスミドは、エンベロープ発現プラスミドと称され得る。さらに別のプラスミドは、標的細胞に導入されるゲノム、すなわち、導入ベクターと称されるベクター自体をコードする。パッケージングプラスミドは、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポフェクション、または電気穿孔を含む既知の技術によってヒト細胞株に導入することができる。１ミリリットル当たりの形質導入単位（ＴＵ／ｍｌ）の力価が数百万の組換えウイルスが、この技術およびその変形例によって生成され得る。超遠心分離後に、約１０８ＴＵ／ｍＬ、１０９ＴＵ／ｍＬ、１０１０ＴＵ／ｍＬ、１０１１ＴＵ／ｍＬ、１０１２ＴＵ／ｍＬ、または約１０１３  ＴＵ／ｍＬの濃縮ストックを得ることができる。
【０２０５】
感染性ウイルス粒子は、従来の技術を用いてパッケージング細胞から回収されてもよい。例えば、感染性粒子は、当該技術分野で既知のように、細胞溶解、または細胞培養物の上清を回収することによって回収することができる。任意選択的に、回収されたウイルス粒子は、必要に応じて精製されてもよい。好適な精製技術は当業者に周知である（例えば、Ｋｕｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００９；９：１０．ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７２−６７５０−９−１０；Ｋｕｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２００９；４（４）：４９５−５０５．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２００９．２２）。
【０２０６】
ウイルスは、当該技術分野で周知の技術を用いて、インビボ、エクスビボ、またはインビトロで細胞を感染させるために用いられ得る。例えば、細胞、例えば、動員末梢血細胞、骨髄細胞、ＣＤ３４＋細胞、または造血幹細胞もしくは前駆細胞がエクスビボで形質導入される場合、通常、１０５細胞当たり１×１０５〜５０×１０５形質導入単位のウイルスベクターにも対応する、約１〜５０感染多重度（ＭＯＩ）の用量を用いて、ベクター粒子を細胞とともにインキュベートすることができる。これは、当然ながら、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、および５０ＭＯＩ、ならびにその間の全ての整数値に対応するベクターの量を含む。
【０２０７】
ウイルスは、治療を必要とする細胞、組織、または器官への直接注入によってインビボで対象に送達されてもよい。直接注入は、１０５細胞当たり１×１０５〜１００×１０５形質導入単位のウイルスベクターにも対応する、約１〜１００感染多重度（ＭＯＩ）を必要とする。これは、当然ながら、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、５０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、および１００ＭＯＩ、ならびにその間の全ての整数値に対応するベクターの量を含む。
【０２０８】
ウイルスはまた、例えば、ｐ２４ウイルスコートタンパク質に対するＥＬＩＳＡである市販のｐ２４力価アッセイを使用することによって測定することができるウイルス力価（ＴＵ／ｍＬ）に従って送達されてもよい。以下の式を用いてｐ２４のｐｇ／ｍＬを算出することができる：レンチウイルスの物理的粒子（ＰＰ）当たり約２０００分子のｐ２４が存在する。（２×１０３）×（ＰＰ当たり２４×１０３Ｄａのｐ２４）、４８×１０６／アボガドロ＝（４８×１０６）／（６×１０２３）＝ＰＰ当たり８×１０−１７ｇのｐ２４、１×１０−１６ｇのｐ２４当たり約１ＰＰ、１ｐｇのｐ２４当たり１×１０４ＰＰ。合理的にパッケージングされ、ＶＳＶ−Ｇでシュードタイピングされたレンチウイルスベクターは、１０００物理的粒子（ＰＰ）当たり１ＴＵ〜１００ＰＰ当たり１ＴＵ（またはそれ未満）の範囲内の感染指数を有する。したがって、その範囲は約１０〜１００ＴＵ／ｐｇのｐ２４である。この変換によってＴＵ／ｍＬが得られる。
【０２０９】
以前の経験に基づいて、直接注入されるレンチウイルスの量は、総ＴＵによって決定され、実行可能な方法で部位に注射することができる体積および注射される組織の種類の両者に基づいて変動し得る。例えば、骨髄の注射部位は、非常に少量のウイルスしか注射することができないため、力価の高い調製物が好ましく、注射当たり約１×１０６〜１×１０７、約１×１０６〜１×１０８、１×１０６〜１×１０９、約１×１０７〜１×１０１０、１×１０８〜１×１０１１、約１×１０８〜１×１０１２、もしくは約１×１０１０〜１×１０１２、またはそれ以上のＴＵが用いられ得る。しかしながら、全身送達は、はるかに高いＴＵに対応することができ、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、１×１０１４、または１×１０１５の負荷量が送達され得る。
【０２１０】
本明細書において企図される組成物および方法は、本明細書に提供される組成物および方法の非存在下で同等の形質導入効率を達成するために、上で開示されるものよりも低いウイルス力価を用いて、インビトロ、エクスビボ、およびインビボで造血細胞の高い形質導入効率およびＶＣＮを提供する。
【０２１１】
本明細書において企図されるある特定の実施形態は、本明細書に記載の特定の実施形態で企図されるレンチウイルスベクター、ならびにポロキサマーおよびプロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達経路を刺激する１つ以上の薬剤の存在下で細胞が形質導入される場合、特定のレンチウイルスベクター構造が、当該技術分野に存在するレンチウイルス構造と比較してインビトロ、エクスビボ、またはインビボで造血細胞におけるより高い形質導入効率および／またはＶＣＮをもたらすという予期せぬ発見に起因する（例えば、ＷＯ２００７／１１２０８４およびＷＯ２０１０／１０８０２８を参照されたい）。
【０２１２】
特定の実施形態において、ポロキサマーおよびプロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達経路を刺激する１つ以上の薬剤の存在下で、ＢＣＬ１１Ａ  ｓｈｍｉＲをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された１つ以上の赤血球細胞発現制御配列を含む本明細書において企図されるレンチウイルスベクターの存在下で細胞を培養することによって、造血幹細胞または前駆細胞を含む細胞集団において形質導入効率が増加される。本明細書で使用される場合、「ポロキサマー」という用語は、ポリオキシエチレンの２つの親水性鎖と隣接するポリオキシプロピレンの中央疎水性鎖からなる非イオン性トリブロックコポリマーを指す。ポロキサマーはまた、「Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ」または「Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃｓ」（ＢＡＳＦ）の商標によっても知られている。ブロックコポリマーは、以下の式によって表すことができる：ＨＯ（Ｃ２Ｈ４０）ｘ（Ｃ３Ｈ６０）ｙ（Ｃ２Ｈ４０）ｚＨ。
【０２１３】
ポリマーブロックの長さはカスタマイズすることができ、その結果、多くの異なるポロキサマーが存在する。特定の実施形態において使用するのに適したポロキサマーは、約１０ｋＤａ、少なくとも約１１．４ｋＤａ、少なくとも約１２．６ｋＤａ、少なくとも約１３ｋＤａ、少なくとも約１４．６ｋＤａ、または少なくとも約１５ｋＤａの平均分子量を有する。特定の実施形態において、ｙは、約３９〜約７０の範囲内であり得る。
【０２１４】
ブロックコポリマーの合成は正確でない可能性があるため、上記の所与の値は、合成時に必ずしも達成可能ではない場合があり、平均値はある程度異なるであろう。したがって、本明細書で使用される「ポロキサマー（単数）」という用語は、別途明示的に記載されていない場合、「ポロキサマー（複数）」という用語（いくつかのポロキサマーの実体を表す、ポロキサマーの混合物とも称される）と互換的に使用することができる。（単数の）本明細書で使用されるポロキサマー（複数可）のモノマー単位の数または分子量に関する「平均」という用語は、全てが同一の組成を有する、したがって同一の分子量を有するポロキサマーを製造する技術的能力がないことの結果である。最先端の方法に従って製造されるポロキサマーは、各々がそれらの分子量に関して多様性を示すポロキサマーの混合物として存在するが、該混合物は、全体として、本明細書に特定される分子量を平均している。ＢＡＳＦおよびＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈは、本明細書において企図される特定の実施形態に使用されるポロキサマーの好適な源である。
【０２１５】
一実施形態において、本明細書において企図される特定の実施形態において使用するのに適したポロキサマーは、ポロキサマー２８８、ポロキサマー３３５、ポロキサマー３３８、およびポロキサマー４０７からなる群から選択される。
【０２１６】
一実施形態において、ポロキサマーはポロキサマー２８８である。
【０２１７】
一実施形態において、ポロキサマーはポロキサマー３３５である。
【０２１８】
一実施形態において、ポロキサマーはポロキサマー３３８である。
【０２１９】
一実施形態において、ポロキサマーはポロキサマー４０７である。
【０２２０】
一実施形態において、ポロキサマー２８８（Ｆ９８；ＨＯ（Ｃ２Ｈ４０）ｘ（Ｃ３Ｈ６０）ｙ（Ｃ２Ｈ４０）ｚＨ；ｘ＋ｙ＝２３６．３６、ｚ＝４４．８３；平均分子量１３ｋＤａ）が、造血幹細胞または前駆細胞を含む造血細胞集団における形質導入効率および／またはＶＣＮを増加させるために使用される。Ｆ９８は、形質導入効率および／またはＶＣＮを増加させるために、単独で、またはプロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達経路を刺激する薬剤もしくはスタウロスポリンと組み合わせて、使用することができる。
【０２２１】
一実施形態において、ポロキサマー３３５（Ｐ１０５；ＨＯ（Ｃ２Ｈ４０）ｘ（Ｃ３Ｈ６０）ｙ（Ｃ２Ｈ４０）ｚＨ；ｘ＋ｙ＝７３．８６、ｚ＝５６．０３；平均分子量６．５ｋＤａ）が、造血幹細胞または前駆細胞を含む造血細胞集団における形質導入効率および／またはＶＣＮを増加させるために使用される。Ｐ１０５は、形質導入効率および／またはＶＣＮを増加させるために、単独で、またはプロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達経路を刺激する薬剤もしくはスタウロスポリンと組み合わせて、使用することができる。
【０２２２】
一実施形態において、ポロキサマー３３８（Ｆ１０８；ＨＯ（Ｃ２Ｈ４０）ｘ（Ｃ３Ｈ６０）ｙ（Ｃ２Ｈ４０）ｚＨ；ｘ＋ｙ＝２６５．４５、ｚ＝５０．３４；平均分子量１４．６ｋＤａ）が、造血幹細胞または前駆細胞を含む造血細胞集団における形質導入効率および／またはＶＣＮを増加させるために使用される。Ｆ１０８は、形質導入効率および／またはＶＣＮを増加させるために、単独で、またはプロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達経路を刺激する薬剤もしくはスタウロスポリンと組み合わせて、使用することができる。
【０２２３】
一実施形態において、ポロキサマー４０７（Ｆ１２７；ＨＯ（Ｃ２Ｈ４０）ｘ（Ｃ３Ｈ６０）ｙ（Ｃ２Ｈ４０）ｚＨ；ｘ＋ｙ＝２００．４５、ｚ＝６５．１７；平均分子量１２．６ｋＤａ）が、造血幹細胞または前駆細胞を含む造血細胞集団における形質導入効率および／またはＶＣＮを増加させるために使用される。Ｆ１２７は、形質導入効率および／またはＶＣＮを増加させるために、単独で、またはプロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達経路を刺激する薬剤もしくはスタウロスポリンと組み合わせて、使用することができる。
【０２２４】
形質導入された造血細胞に用いられる例示的な最終ポロキサマー濃度として、限定されないが、約１０μｇ／ｍＬ〜約５０００μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ〜約２５００μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ〜約１０００μｇ／ｍＬ、約５０μｇ／ｍＬ〜約１０００μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ〜約１０００μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ〜約１０００μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ〜約５００μｇ／ｍＬ、または約１０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ、約３０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ、約５０μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ、約７０μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ、約９０μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ、約３００μｇ／ｍＬ、約４００μｇ／ｍＬ、約５００μｇ／ｍＬ、約６００μｇ／ｍＬ、約７００μｇ／ｍＬ、約８００μｇ／ｍＬ、約９００μｇ／ｍＬ、約１０００μｇ／ｍＬ、約１２５０μｇ／ｍＬ、約１５００μｇ／ｍＬ、約１７５０μｇ／ｍＬ、約２０００μｇ／ｍＬ、約２５００μｇ／ｍＬ、もしくは約５０００μｇ／ｍＬ、またはそれ以上、およびそれらの任意の介在する濃度が挙げられる。
【０２２５】
驚くべきことに、本発明者らは、ＢＣＬ１１Ａ  ｓｈｍｉＲをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された１つ以上の赤血球細胞発現制御配列を含む本明細書において企図されるレンチウイルスベクターとともに造血幹細胞および前駆細胞を含む細胞集団の形質導入効率および／またはＶＣＮは、ポロキサマーおよびプロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達経路を刺激する１つ以上の薬剤の存在下で細胞を形質導入することにより増加させることができることを発見した。
【０２２６】
本明細書で使用される場合「プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を刺激する」、「プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を活性化する」、または「プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を増加させる」という用語は、１つ以上の薬剤の非存在下でのプロスタグランジンＥＰ受容体の下流の細胞シグナル伝達活性と比較して、１つ以上の薬剤と接触した細胞におけるプロスタグランジンＥＰ受容体の下流の細胞シグナル伝達活性を増加させる薬剤の能力を一般的に指す。プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達を刺激する薬剤として、限定されないが、小分子、またはＷＯ２００７／１１２０８４およびＷＯ２０１０／１０８０２８に開示される化合物（各々、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）が挙げられる。プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達経路の活性化または刺激を測定するために使用することができるアッセイは、当該技術分野で既知であり、例えば、ＷＯ２０１０／１０８０２８（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０２２７】
プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達経路を刺激する薬剤の実例として、限定されないが、小分子、例えば、小有機分子、プロスタグランジン、Ｗｎｔ経路アゴニスト、ｃＡＭＰ／ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路アゴニスト、Ｃａ２＋二次メッセンジャー経路アゴニスト、一酸化窒素（ＮＯ）／アンジオテンシンシグナル伝達アゴニスト、ならびにメベベリン、フルランドレノリド、アテノロール、ピンドロール、ガボキサドール、キヌレン酸、ヒドララジン、チアベンダゾール、ビククリン、ベサミコール、ペルボシド、イミプラミン、クロルプロパミド、１，５−ペンタメチレンテトラゾール、４−アミノピリジン、ジアゾキシド、ベンフォチアミン、１２−メトキシドデセン酸、Ｎ−ホルミル−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ、ガラミン、ＩＡＡ  ９４、クロロトリアニセンからなる群から選択されるプロスタグランジンシグナル伝達経路を刺激することが既知である他の化合物、およびこれらの化合物の誘導体が挙げられる。
【０２２８】
特定の実施形態において、プロスタグランジン経路を刺激する薬剤は、典型的には、プロスタグランジンＥＰ受容体に関連する下流のシグナル伝達経路のうちの１つ以上を活性化するまたは増加させるようにＥＰ受容体に結合するおよび／またはそれと相互作用する、天然に存在するまたは合成の化学分子またはポリペプチドである。
【０２２９】
一実施形態において、プロスタグランジン経路を刺激する薬剤は、ＰＧＡ２；ＰＧＢ２、ＰＧＤ２、ＰＧＥ１（アルプロスタジル）、ＰＧＥ２、ＰＧＦ２、ＰＧＩ２（エポプロステノール）、ＰＧＨ２、ＰＧＪ２、ならびにそれらの誘導体および類似体からなる群から選択される。
【０２３０】
プロスタグランジン経路を刺激するさらなる例示的な薬剤として、限定されないが、１５ｄ−ＰＧＪ２；Δ１２−ＰＧＪ２；２−ヒドロキシヘプタデカトリエン酸（ＨＨＴ）；トロンボキサン（ＴＸＡ２およびＴＸＢ２）；ＰＧＩ２類似体、例えば、イロプロストおよびトレプロスチニル；ＰＧＦ２類似体、例えば、トラボプロスト、カルボプロストトロメタミン、タフルプロスト、ラタノプロスト、ビマトプロスト、ウノプロストンイソプロピル、クロプロステノール、エストロファン，およびスーパーファン；ＰＧＥ１類似体、例えば、１１−デオキシＰＧＥ１、ミソプロストールおよびブタプロスト；ならびにコーリーアルコール−Ａ［［３ａα，４α，５β，６ａα］−（−）−［ヘキサヒドロ−４−（ヒドロキシメチル）−２−オキソ−２Ｈ−シクロペンタ／ｂ／フラン−５−イル］［１，１′−ビフェニル］−４−カルボキシレート］；コーリーアルコール−Ｂ［２Ｈ−シクロペンタ［ｂ］フラン−２−オン，５−（ベンゾイルオキシ）ヘキサヒドロ−４−（ヒドロキシメチル）［３ａＲ−（３ａα，４α，５β，６ａα）］］；およびコーリージオール（（３ａＲ，４Ｓ，５Ｒ，６ａＳ）−ヘキサヒドロ−５−ヒドロキシ−４−（ヒドロキシメチル）−２Ｈ−シクロペンタ［ｂ］フラン−２−オン）が挙げられる。
【０２３１】
一実施形態において、薬剤は、限定されないが、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、ならびにその「類似体」または「誘導体」を含むプロスタグランジンＥＰ受容体リガンドである。
【０２３２】
ＰＧＥ２「類似体」または「誘導体」の実例として、限定されないが、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２、１６−１６ジメチルＰＧＥ２ｐ−（ｐ−アセトアミドベンズアミド）フェニルエステル、１１−デオキシ−１６，１６−ジメチルＰＧＥ２、９−デオキシ−９−メチレン−１６，１６−ジメチルＰＧＥ２、９−デオキシ−９−メチレンＰＧＥ２、９−ケトフルプロステノール、５−トランスＰＧＥ２、１７−フェニル−ω−トリノールＰＧＥ２、ＰＧＥ２セリノールアミド、ＰＧＥ２メチルエステル、１６−フェニルテトラノルＰＧＥ２、１５（Ｓ）−１５−メチルＰＧＥ２、１５（Ｒ）−１５−メチルＰＧＥ２、８−イソ−１５−ケトＰＧＥ２、８−イソＰＧＥ２イソプロピルエステル、２０−ヒドロキシＰＧＥ２、ノクロプロスト、スルプロストン、ブタプロスト、１５−ケトＰＧＥ２、および１９（Ｒ）ヒドロキシＰＧＥ２が挙げられる。
【０２３３】
特定の実施形態において、形質導入効率を向上させる方法は、ＢＣＬ１１Ａ  ｓｈｍｉＲをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された１つ以上の赤血球細胞発現制御配列を含む本明細書において企図されるレンチウイルスベクターおよびポロキサマー、ならびにＰＧＥ２、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２、１６−１６ジメチルＰＧＥ２ｐ−（ｐ−アセトアミドベンズアミド）フェニルエステル、１１−デオキシ−１６，１６−ジメチルＰＧＥ２、９−デオキシ−９−メチレン−１６，１６−ジメチルＰＧＥ２、９−デオキシ−９−メチレンＰＧＥ２、９−ケトフルプロステノール、５−トランスＰＧＥ２、１７−フェニル−ω−トリノールＰＧＥ２、ＰＧＥ２セリノールアミド、ＰＧＥ２メチルエステル、１６−フェニルテトラノルＰＧＥ２、１５（Ｓ）−１５−メチルＰＧＥ２、１５（Ｒ）−１５−メチルＰＧＥ２、８−イソ−１５−ケトＰＧＥ２、８−イソＰＧＥ２イソプロピルエステル、２０−ヒドロキシＰＧＥ２、ノクロプロスト、スルプロストン、ブタプロスト、１５−ケトＰＧＥ２、および１９（Ｒ）ヒドロキシＰＧＥ２からなる群から選択されるプロスタグランジンＥＰ受容体のリガンドである１つ以上の薬剤を用いて、細胞集団を培養することを含む。
【０２３４】
特定の実施形態において、プロスタグランジンＥＰ受容体経路を刺激する薬剤は、ＰＧＥ２または１６，１６−ジメチルＰＧＥ２である。
【０２３５】
一実施形態において、プロスタグランジンＥＰ受容体経路を刺激する薬剤は、ＰＧＥ２である。
【０２３６】
様々な実施形態において、細胞集団は、ＢＣＬ１１Ａ  ｓｈｍｉＲをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された１つ以上の赤血球細胞発現制御配列を含む本明細書において企図されるレンチウイルスベクター、ポロキサマー２８８、ポロキサマー３３５、ポロキサマー３３８、およびポロキサマー４０７からなる群から選択されるポロキサマー、ならびにＰＧＥ２、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２、１６−１６ジメチルＰＧＥ２ｐ−（ｐ−アセトアミドベンズアミド）フェニルエステル、１１−デオキシ−１６，１６−ジメチルＰＧＥ２、９−デオキシ−９−メチレン−１６，１６−ジメチルＰＧＥ２、９−デオキシ−９−メチレンＰＧＥ２、９−ケトフルプロステノール、５−トランスＰＧＥ２、１７−フェニル−ω−トリノールＰＧＥ２、ＰＧＥ２セリノールアミド、ＰＧＥ２メチルエステル、１６−フェニルテトラノルＰＧＥ２、１５（Ｓ）−１５−メチルＰＧＥ２、１５（Ｒ）−１５−メチルＰＧＥ２、８−イソ−１５−ケトＰＧＥ２、８−イソＰＧＥ２イソプロピルエステル、２０−ヒドロキシＰＧＥ２、ノクロプロスト、スルプロストン、ブタプロスト、１５−ケトＰＧＥ２、および１９（Ｒ）ヒドロキシＰＧＥ２からなる群から選択されるプロスタグランジンＥＰ受容体のリガンドである１つ以上の薬剤の存在下で形質導入される。
【０２３７】
形質導入された造血細胞に用いられるプロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達経路アゴニストの例示的な最終濃度として、限定されないが、約１０μＭ〜約２００μＭ、約１０μＭ〜約１００μＭ、約５０μＭ〜約１００μＭ、または約１０μＭ、約２０μＭ、約３０μＭ、約４０μＭ、約５０μＭ、約６０μＭ、約７０μＭ、約８０μＭ、約９０μＭ、もしくは約１００μＭ、またはそれ以上、およびそれらの任意の介在する濃度が挙げられる。
【０２３８】
様々な実施形態において、細胞集団は、ＢＣＬ１１Ａ  ｓｈｍｉＲをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された１つ以上の赤血球細胞発現制御配列を含む本明細書において企図されるレンチウイルスベクター、ポロキサマー２８８、ポロキサマー３３５、ポロキサマー３３８、およびポロキサマー４０７からなる群から選択されるポロキサマー、ならびにＰＧＥ２の存在下で形質導入される。
【０２３９】
様々な実施形態において、細胞集団は、ＢＣＬ１１Ａ  ｓｈｍｉＲをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された１つ以上の赤血球細胞発現制御配列を含む本明細書において企図されるレンチウイルスベクター、ポロキサマー２８８、ポロキサマー３３５、ポロキサマー３３８、およびポロキサマー４０７からなる群から選択されるポロキサマー、ならびに１６，１６−ジメチルＰＧＥ２の存在下で形質導入される。
【０２４０】
特定の実施形態において、造血細胞は、レンチウイルスの存在下で培養することができ、ポロキサマーおよびプロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達経路を刺激する１つ以上の薬剤に、約１０分間、約３０分間、約１時間、約２時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間、約４８時間、もしくは約７２時間、または任意の介在する時間の期間にわたって曝露させる（接触させる）ことができる。
【０２４１】
様々な実施形態において、本明細書において企図されるレンチウイルスベクター構造、組成物、および方法は、形質導入効率を、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％（任意の介在するパーセンテージを含む）増加させる。
【０２４２】
様々な実施形態において、本明細書において企図されるレンチウイルスベクター構造、組成物、および方法は、平均ＶＣＮを、少なくとも約０．５〜少なくとも約５．０、少なくとも約０．５〜少なくとも約３、少なくとも約０．５〜少なくとも約１．０、少なくとも約１．０〜少なくとも約５．０、少なくとも約１．０〜少なくとも約３．０、または少なくとも約０．５、少なくとも約１．０、少なくとも約１．５、少なくとも約２．０、少なくとも約２．５、少なくとも約３．０、少なくとも約３．５、少なくとも約４．０、少なくとも約４．５、もしくは少なくとも約５．０増加させる。
【０２４３】
様々な実施形態において、本明細書において企図されるレンチウイルスベクター構造、組成物、および方法で形質導入された造血細胞は、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％の形質導入効率と、少なくとも約０．５、少なくとも約１．０、少なくとも約１．５、少なくとも約２．０、または少なくとも約２．５のＶＣＮとを有する。
【０２４４】
ある特定の実施形態は、細胞集団の単離および形質導入を企図する。本明細書で使用される場合、「細胞集団」という用語は、任意の数および／または組み合わせの、本明細書の他の箇所に記載される同種または異種細胞型で構成され得る複数の細胞を指す。例えば、造血幹細胞または前駆細胞の形質導入のために、細胞集団を、臍帯血、胎盤血、骨髄、または末梢血から単離するかまたは得ることができる。細胞集団は、１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％の形質導入される標的細胞型を含み得る。ある特定の実施形態において、造血幹細胞または前駆細胞は、当該技術分野で既知の方法を用いて異種細胞の集団から単離または精製することができる。
【０２４５】
本明細書において企図される組成物および方法で形質導入される好ましい標的細胞型は、造血細胞、例えば、ヒト造血細胞を含む。
【０２４６】
本明細書において企図される組成物および方法で形質導入された造血細胞を得るための例示的な源として、限定されないが、臍帯血、骨髄、または動員末梢血が挙げられる。
【０２４７】
造血細胞の実例として、ＣＤ３４＋細胞が挙げられる。本明細書で使用される「ＣＤ３４＋細胞」という用語は、その細胞表面上のＣＤ３４タンパク質を発現する細胞を指す。本明細書で使用される、「ＣＤ３４」は、しばしば、細胞間接着因子として作用する細胞表面糖タンパク質（例えば、シアロムチンタンパク質）を指す。ＣＤ３４＋は、造血幹細胞および前駆細胞の両方の細胞表面マーカーである。
【０２４８】
造血幹細胞または前駆細胞のさらなる実例として、ＣＤ３４＋ＣＤ３８ＬｏＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ−である造血細胞、ＣＤ３４＋、ＣＤ５９＋、Ｔｈｙ１／ＣＤ９０＋、ＣＤ３８Ｌｏ／−、Ｃ−ｋｉｔ／ＣＤ１１７＋、およびＬｉｎ（−）である造血細胞、ならびにＣＤ１３３＋である造血細胞が挙げられる。
【０２４９】
特定の実施形態において、ＢＣＬ１１Ａ  ｓｈｍｉＲをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された１つ以上の赤血球細胞発現制御配列を含むレンチウイルスベクターで形質導入されたＣＤ３４＋細胞および本明細書において企図される組成物は、以下のβグロビン対立遺伝子を有する：βＥ／β０、βＣ／β０、β０／β０、βＥ／βＥ、βＣ／β＋、βＥ／β＋、β０／β＋、β＋／β＋、βＣ／βＣ、βＥ／βＳ、β０／βＳ、βＣ／βＳ、β＋／βＳまたはβＳ／βＳ。
【０２５０】
特定の実施形態において、ＢＣＬ１１Ａ  ｓｈｍｉＲをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された１つ以上の赤血球細胞発現制御配列を含むレンチウイルスベクターで形質導入されたＣＤ３４＋細胞および本明細書において企図される組成物は、以下のβグロビン対立遺伝子を有する：βＥ／β０、βＣ／β０、β０／β０、βＣ／βＣ、βＥ／βＥ、βＥ／β＋、βＣ／βＥ、βＣ／β＋、β０／β＋、またはβ＋／β＋。
【０２５１】
特定の実施形態において、ＢＣＬ１１Ａ  ｓｈｍｉＲをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された１つ以上の赤血球細胞発現制御配列を含むレンチウイルスベクターで形質導入されたＣＤ３４＋細胞および本明細書において企図される組成物は、以下のβグロビン対立遺伝子を有する：βＥ／βＳ、β０／βＳ、βＣ／βＳ、β＋／βＳまたはβＳ／βＳ。
【０２５２】
Ｇ．遺伝子治療法
ＢＣＬ１１Ａ  ｓｈｍｉＲをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された１つ以上の赤血球細胞発現制御配列を含むレンチウイルスベクターを含む造血細胞をより高い割合で含み、各細胞のベクターコピー数もより高い医薬製品は、より治療的に有効な遺伝子治療を提供する。本明細書で使用される場合、「医薬製品」という用語は、本明細書において企図される組成物および方法を用いて製造される遺伝子改変された細胞を指す。特定の実施形態において、医薬製品は、遺伝子改変された造血幹細胞または前駆細胞、例えば、ＣＤ３４＋細胞を含む。いずれか特定の理論に拘束されることを望むものではないが、医薬製品中の治療薬の量を増加させることにより、インビボで対応する遺伝子の発現がないかまたは最小限の発現を有する対象の治療を可能にし、それによって以前は遺伝子治療が実行可能な治療選択肢ではなかった対象に遺伝子治療を提供する機会が著しく拡大される。
【０２５３】
本明細書において企図される形質導入細胞および対応するレンチウイルスベクターは、改善された遺伝子治療の方法を提供する。本明細書で使用される場合、「遺伝子治療」という用語は、細胞のゲノムへの遺伝子の導入を指す。様々な実施形態において、ＢＣＬ１１Ａ  ｓｈｍｉＲをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された１つ以上の赤血球細胞発現制御配列を含むレンチウイルスベクターは、ヘモグロビン異常症またはヘモグロビン異常の状態を有すると診断された対象またはそれを有する疑いがある対象に治癒的、予防的、または軽減的利益を提供する。
【０２５４】
本明細書で使用される場合、「ヘモグロビン異常症」または「ヘモグロビン異常の状態」という用語は、ヘモグロビンの構造および／または合成における変化から生じる異常なヘモグロビン分子の存在に関与する様々な遺伝性血液障害を指す。通常、ヘモグロビンは、βグロビンの２つのサブユニットおよびαグロビンの２つのサブユニットの、４つのタンパク質サブユニットからなる。これらのタンパク質サブユニットの各々は、ヘムと称される鉄含有分子に付着（結合）し、各ヘムがその中央に１つの酸素分子と結合することができる鉄分子を含有する。赤血球内のヘモグロビンは、肺内の酸素分子と結合する。次いで、これらの細胞は、血流を通って移動し、体中の組織に酸素を送達する。
【０２５５】
ヘモグロビンＡ（ＨｂＡ）は、出生後に存在する正常なヘモグロビンの名称である。ヘモグロビンＡは、２つのα鎖および２つのβ鎖（α２β２）を有する四量体である。ヘモグロビンＡ２は、出生後に赤血球に見られるヘモグロビンの副構成成分であり、２つのα鎖および２つのδ鎖（α２δ２））からなる。ヘモグロビンＡ２は、通常、全赤血球ヘモグロビンの３％未満を占める。ヘモグロビンＦは、胎児の発達中の主なヘモグロビンである。分子は、２つのα鎖および２つのγ鎖（α２γ２）の四量体である。
【０２５６】
最も一般的なヘモグロビン異常症は、鎌状赤血球症、βサラセミア、およびαサラセミアを含む。
【０２５７】
特定の実施形態において、本明細書において企図される組成物および方法は、鎌状赤血球症を有する対象に遺伝子治療を提供する。「鎌状赤血球貧血」または「鎌状赤血球症」という用語は、赤血球細胞の鎌状化に起因する任意の症候性の貧血状態を含むように本明細書において定義される鎌状赤血球症（ＳＣＤ）の一般的な形態である鎌状赤血球貧血βＳ／βＳは、ヘモグロビンＳ（ＨｂＳ）によって引き起こされる。ＨｂＳは、Ｇｌｕ６ＶａｌまたはＥ６Ｖとして知られるβグロビンの６位におけるバリン（Ｖ）によるグルタミン酸（Ｅ）の置換によって生成される。グルタミン酸をバリンで置換することにより、異常なＨｂＳサブユニットが一緒に固着して、赤血球を鎌状（三日月形）の形状に湾曲させる長くて硬い分子を形成する。鎌状細胞は早期に死滅するため、赤血球の不足（貧血）を引き起こし得る。加えて、鎌状細胞は硬いため、微小血管を閉塞して重度の疼痛および臓器損傷を引き起こす可能性がある。いずれか特定の理論に拘束されることを望むものではないが、本明細書において企図されるレンチウイルスベクターは、赤血球細胞におけるＢＣＬ１１Ａの発現を低下させるかまたは排除し、γグロビン遺伝子発現の再活性化または抑制解除、およびβＳグロビン遺伝子発現の減少をもたらし、それによってＨｂＦ発現を増加させて、ヘモグロビン異常症を有する対象に関連する１つ以上の症状を効果的に治療するおよび／または寛解させる。
【０２５８】
βグロビン遺伝子におけるさらなる突然変異は、βグロビンにおける他の異常も引き起こし、他の種類の鎌状赤血球症をもたらし得る。これらのβグロビンの異常な形態は、しばしば、アルファベットの文字で、または時には名称で示される。これらの他の種類の鎌状赤血球症において、あるβグロビンサブユニットはＨｂＳで置換され、他のβグロビンサブユニットは、異なる異常な変異体、例えば、ヘモグロビンＣ（ＨｂＣ：βＣとして知られるβグロビン対立遺伝子）またはヘモグロビンＥ（ＨｂＥ：βＥとして知られるβグロビン対立遺伝子）で置換される。
【０２５９】
ヘモグロビンＳＣ（ＨｂＳＣ）疾患において、βグロビンサブユニットはＨｂＳおよびＨｂＣによって置換される。ＨｂＣは、βグロビン遺伝子における突然変異に起因し、ＨｂＣ疾患を有する人々に見られる優勢なヘモグロビン（α２βＣ２）である。ＨｂＣは、Ｇｌｕ６ＬｙｓまたはＥ６Ｋとして知られる、βグロビンの６位でアミノ酸のリジンがアミノ酸のグルタミン酸に置換するときに生じる。ＨｂＣ疾患は、比較的良性であり、軽度の溶血性貧血および脾腫をもたらすＨｂＳＣ疾患の重症度は可変であるが、鎌状赤血球貧血と同じくらい重度であり得る。
【０２６０】
ＨｂＥは、Ｇｌｕ２６ＬｙｓまたはＥ２６Ｋとして知られる、βグロビンの２６位でアミノ酸のグルタミン酸がアミノ酸のリジンに置換されるときに生じる。ＨｂＥ疾患を有する人々は、軽度の溶血性貧血および軽度の脾腫を有する。ＨｂＥは、東南アジアで極めて一般的であり、ある地域では頻度においてヘモグロビンＡに等しい。場合によっては、ＨｂＥの突然変異はＨｂＳとともに存在する。これらの場合、ある人は、疼痛、貧血、および異常な脾臓機能のエピソード等の鎌状赤血球貧血に関連するより重度の兆候および症状を有し得る。
【０２６１】
ヘモグロビン鎌状βサラセミア（ＨｂＳＢｅｔａＴｈａｌ）として知られる他の状態は、ヘモグロビンＳおよびβサラセミアをもたらす突然変異が一緒に生じる場合に引き起こされる。鎌状赤血球症をβゼロ（β０：βグロビン産生を妨げる遺伝子変異）サラセミアと組み合わされた突然変異は、重度の疾患をもたらすが、βプラス（β＋、βグロビン産生を減少させる遺伝子変異）サラセミアと組み合わされた鎌状赤血球症は、より軽度である。
【０２６２】
本明細書で使用される場合、「サラセミア」は、ヘモグロビンの産生不全によって特徴付けられる遺伝性疾患を指す。サラセミアの例として、αサラセミアおよびβサラセミアが挙げられる。
【０２６３】
特定の実施形態において、本明細書において企図される組成物および方法は、βサラセミアを有する対象に遺伝子治療を提供する。βサラセミアは、βグロビン鎖における突然変異によって引き起こされ、重症型または軽症型として起こり得る。βグロビン遺伝子において４００個近い突然変異がβサラセミアを引き起こすことが分かっている。突然変異のほとんどは、βグロビン遺伝子内またはその付近で単一のＤＮＡ構築ブロック（ヌクレオチド）の変化を伴う。他の突然変異は、βグロビン遺伝子において少数のヌクレオチドを挿入または欠失する。上述のように、βグロビン産生を減少させるβグロビン遺伝子変異は、ベータ−プラス（β＋）サラセミアと称される一種の状態をもたらす。細胞が任意のβグロビンを産生することを妨げる突然変異は、βゼロ（β０）サラセミアをもたらす。重症型のβサラセミアでは、小児は出生時には正常であるが、生後１年の間に貧血を発症する。軽症型のβサラセミアは、小さな赤血球を産生する。軽症型サラセミアは、一方の親のみから欠陥のある遺伝子を受け取った場合に起こる。この型の障害を有する人物は、疾患の保有者であり、通常は症状を有しない。いずれか特定の理論に拘束されることを望むものではないが、本明細書において企図されるレンチウイルスベクターは、赤血球細胞におけるＢＣＬ１１Ａの発現を低下させるかまたは排除し、γグロビン遺伝子発現の再活性化または抑制解除、およびβサラセミアグロビン遺伝子発現の減少をもたらし、それによってＨｂＦ発現を増加させて、βサラセミアを有する対象に関連する１つ以上の症状を効果的に治療するおよび／または寛解させる。
【０２６４】
ＨｂＥ／βサラセミアは、ＨｂＥとβサラセミアとの組み合わせ（βＥ／β０、βＥ／β＋）から生じ、ＨｂＥ形質またはβサラセミア形質のいずれかに見られるよりも重度の状態をもたらす。この障害は、中間型サラセミアのカテゴリーに属する中間型サラセミアとして現れる。ＨｂＥ／βサラセミアは、東南アジア出身の人々に最もよく見られる。
【０２６５】
特定の実施形態において、本明細書において企図される組成物および方法は、αサラセミアを有する対象に遺伝子治療を提供する。αサラセミアは、世界的に非常に一般的な血液疾患である。特に東南アジアにおいて、毎年、何千人ものＨｂ  Ｂａｒｔ症候群およびＨｂＨ疾患に罹患した新生児が生まれている。また、αサラセミアは、地中海諸国、北アフリカ、中東、インド、および中央アジアの人々にも頻繁に発生する。αサラセミアは、典型的には、ＨＢＡ１およびＨＢＡ２遺伝子を含む欠失から生じる。これらの遺伝子はどちらも、ヘモグロビンの構成成分（サブユニット）であるαグロビンと称されるタンパク質を作製するための指示を提供する。人々は、各細胞にＨＢＡ１遺伝子の２つのコピーおよびＨＢＡ２遺伝子の２つのコピーを有する。異なる種類のαサラセミアは、ＨＢＡ１およびＨＢＡ２対立遺伝子のいくつかまたは全ての喪失に起因する。
【０２６６】
αサラセミアの最も重度の形態であるＨｂ  Ｂａｒｔ症候群は、４つ全てのαグロビン対立遺伝子の喪失に起因する。ＨｂＨ疾患は、４つのαグロビン対立遺伝子のうちの３つの喪失によって引き起こされる。これら２つの状態において、αグロビンの不足は、細胞が正常なヘモグロビンを作製するのを妨げる。代わりに、細胞は、ヘモグロビンＢａｒｔ（Ｈｂ  Ｂａｒｔ）またはヘモグロビンＨ（ＨｂＨ）と称される異常な形態のヘモグロビンを産生する。これらの異常なヘモグロビン分子は、身体の組織に酸素を効果的に運ぶことができない。正常なヘモグロビンに対するＨｂ  ＢａｒｔまたはＨｂＨの置換は、αサラセミアに関連する貧血および他の深刻な健康問題を引き起こす。
【０２６７】
αサラセミアの２つの追加の変異体は、αグロビンの量の低下に関連する。細胞は、依然としていくつかの正常なヘモグロビンを産生するため、これらの変異体は健康問題をほとんどまたは全く引き起こさない傾向がある。４つのαグロビン対立遺伝子のうちの２つが喪失すると、αサラセミア形質が生じる。αサラセミア形質を有する人々は、異常に小さくて淡い赤血球および軽度の貧血を有し得る。１つのαグロビン対立遺伝子の喪失は、αサラセミアの無症候性キャリアに見られる。これらの個体は、典型的には、サラセミアに関連する徴候または症状を有しない。
【０２６８】
好ましい実施形態において、本明細書において企図される遺伝父療法は、ヘモグロビンＣ症、ヘモグロビンＥ症、鎌状赤血球貧血、鎌状赤血球症（ＳＣＤ）、サラセミア、βサラセミア、重症型サラセミア、中間型サラセミア、αサラセミア、ヘモグロビンＢａｒｔ症候群、およびヘモグロビンＨ症からなる群から選択されるヘモグロビン異常症を治療する、予防する、または寛解させるために用いられる。いずれか特定の理論に拘束されることを望むものではないが、本明細書において企図されるレンチウイルスベクターは、赤血球細胞におけるＢＣＬ１１Ａの発現を低下させるかまたは排除し、γグロビン遺伝子発現の再活性化または抑制解除、および欠陥のあるβグロビン遺伝子発現の減少をもたらし、それによってＨｂＦ発現を増加させて、ヘモグロビン異常症を有する対象に関連する１つ以上の症状を効果的に治療するおよび／または寛解させる。
【０２６９】
好ましい実施形態において、本明細書において企図される遺伝父療法は、βＥ／β０、βＣ／β０、β０／β０、βＥ／βＥ、βＣ／β＋、βＥ／β＋、β０／β＋、β＋／β＋、βＣ／βＣ、βＥ／βＳ、β０／βＳ、βＣ／βＳ、β＋／βＳまたはβＳ／βＳからなる群から選択されるβグロビン遺伝子型を有する対象におけるヘモグロビン異常症を治療する、予防する、または寛解させるために用いられる。
【０２７０】
様々な実施形態において、レトロウイルスベクターは、遺伝子治療を必要とする対象の細胞、組織、または器官への直接注入によってインビボで投与される。様々な他の実施形態において、細胞は、本発明のベクターで、インビトロまたはエクスビボで形質導入され、任意選択的にエクスビボで増殖される。形質導入細胞は、次いで、遺伝子治療を必要とする対象に投与される。
【０２７１】
本明細書において企図される遺伝子治療法における形質導入および投与に適した細胞として、限定されないが、本明細書の他の箇所に記載される幹細胞、前駆細胞、および分化細胞が挙げられる。ある特定の実施形態において、形質導入細胞は、本明細書の他の箇所に記載される造血幹細胞または前駆細胞である。
【０２７２】
本明細書において企図される遺伝子治療用組成物および方法に使用される好ましい細胞は、自家／自律性（「自己」）細胞を含む。
【０２７３】
特定の実施形態において、遺伝子治療の源として使用される細胞は、以下のβグロビン対立遺伝子を有する：βＥ／β０、βＣ／β０、β０／β０、βＥ／βＥ、βＣ／β＋、βＥ／β＋、β０／β＋、β＋／β＋、βＣ／βＣ、βＥ／βＳ、β０／βＳ、βＣ／βＳ、β＋／βＳまたはβＳ／βＳ。
【０２７４】
特定の実施形態において、遺伝子治療の源として使用される細胞は、以下のβグロビン対立遺伝子を有する：βＥ／β０、βＣ／β０、β０／β０、βＣ／βＣ、βＥ／βＥ、βＥ／β＋、βＣ／βＥ、βＣ／β＋、β０／β＋、またはβ＋／β＋。
【０２７５】
特定の実施形態において、遺伝子治療の源として使用される細胞は、以下のβグロビン対立遺伝子を有する：βＥ／βＳ、β０／βＳ、βＣ／βＳ、β＋／βＳまたはβＳ／βＳ。
【０２７６】
本明細書で使用される「対象」は、遺伝子治療ベクター、細胞に基づく治療薬、および本明細書の他の箇所で開示される方法を用いて治療することができる、単一遺伝子疾患、障害、または状態の症状を呈する任意の動物を含む。好ましい実施形態において、対象は、遺伝子治療ベクター、細胞に基づく治療薬、および本明細書の他の箇所で開示される方法を用いて治療することができる、造血系の疾患、障害、または状態、例えば、ヘモグロビン異常症の症状を呈する任意の動物を含む。好適な対象（例えば、患者）は、実験動物（マウス、ラット、ウサギ、またはモルモット等）、家畜、および飼育動物またはペット（ネコまたはイヌ等）を含む。非ヒト霊長類、および好ましくはヒト患者が含まれる。典型的な対象は、遺伝子治療によって調節され得る、異常な量（「正常な」または「健常な」対象よりも低いまたは高い量）の１つ以上の生理学的活性を呈する動物を含む。
【０２７７】
本明細書で使用される場合、「治療」または「治療すること」は、疾患または病態の症状または病理に対する任意の有益なまたは所望の効果を含み、治療される疾患または状態の１つ以上の測定可能なマーカーの最低限の減少を含み得る。治療は、任意選択的に、疾患もしくは状態の症状の減少もしくは寛解、または疾患もしくは状態の進行の遅延のいずれかを含み得る。「治療」は、必ずしも疾患もしくは状態、またはその関連する症状の完全な根絶または治癒を意味するわけではない。
【０２７８】
本明細書で使用される場合、「予防する」、および「予防される」、「予防すること」等の類似する語句は、疾患または状態の発生または再発の可能性を防止する、阻害する、または低減するためのアプローチを意味する。それはまた、疾患もしくは状態の発症もしくは再発を遅延させること、または疾患もしくは状態の発生もしくは再発を遅延することを指す。本明細書で使用される場合、「予防」および類似する語句は、疾患または状態の発症または再発前に、疾患または状態の強さ、効果、症状、および／または負荷を減少させることも含む。
【０２７９】
本明細書で使用される場合、「量」という用語は、臨床結果を含む、有益なまたは所望の予防的または治療的結果を達成するために、ウイルスまたは形質導入された治療用細胞の「有効な量」または「有効量」を指す。
【０２８０】
「予防的に有効な量」は、所望の予防的結果を達成するために有効なウイルスまたは形質導入された治療用細胞の量を指す必ずではないが、典型的には、予防的用量は、疾患の前に、または疾患のより初期の段階で対象に使用されるため、予防的に有効な量は治療的に有効な量よりも少ない。
【０２８１】
ウイルスまたは形質導入された治療用細胞の「治療的に有効な量」は、個体の病状、年齢、性別、および体重、ならびに、個体において幹細胞および前駆細胞の所望の応答を誘発する能力等の要因に応じて変化し得る。治療的に有効な量はまた、治療的に有益な効果が、ウイルスまたは形質導入された治療用細胞のいかなる毒性または有害作用をも上回る量でもある。「治療的に有効な量」という用語は、対象（例えば、患者）を「治療する」ために効果的な量を含む。
【０２８２】
いずれか特定の理論に拘束されることを望むものではないが、本発明のベクター、組成物、および方法によって提供される重要な利点は、既存の方法と比較して高いパーセンテージの形質導入された細胞を含む細胞集団を投与することによって達成され得る遺伝子治療の高い有効性である。
【０２８３】
形質導入細胞は、骨髄切除療法を受けたまたは受けていない個体において骨髄移植または臍帯血移植の一部として投与されてもよい。一実施形態において、本発明の形質導入細胞は、化学的切除（ｃｈｅｍｏａｂｌａｔｉｖｅ）または放射線切除による骨髄療法を受けた個体に、骨髄移植において投与される。
【０２８４】
一実施形態において、ある用量の形質導入細胞が対象の静脈内に送達される。好ましい実施形態において、形質導入された造血幹細胞は、対象に静脈内投与される。
【０２８５】
例示的な一実施形態において、対象に提供される有効量の形質導入細胞は、少なくとも２×１０６細胞／ｋｇ、少なくとも３×１０６細胞／ｋｇ、少なくとも４×１０６細胞／ｋｇ、少なくとも５×１０６細胞／ｋｇ、少なくとも６×１０６細胞／ｋｇ、少なくとも７×１０６細胞／ｋｇ、少なくとも８×１０６細胞／ｋｇ、少なくとも９×１０６細胞／ｋｇ、もしくは少なくとも１０×１０６細胞／ｋｇ、またはそれ以上の細胞／ｋｇ（全ての介在する用量の細胞を含む）である。
【０２８６】
例示的な別の実施形態において、対象に提供される有効量の形質導入細胞は、約２×１０６細胞／ｋｇ、約３×１０６細胞／ｋｇ、約４×１０６細胞／ｋｇ、約５×１０６細胞／ｋｇ、約６×１０６細胞／ｋｇ、約７×１０６細胞／ｋｇ、約８×１０６細胞／ｋｇ、約９×１０６細胞／ｋｇ、もしくは約１０×１０６細胞／ｋｇ、またはそれ以上の細胞／ｋｇ（全ての介在する用量の細胞を含む）である。
【０２８７】
例示的な別の実施形態において、対象に提供される有効量の形質導入細胞は、約２×１０６細胞／ｋｇ〜約１０×１０６細胞／ｋｇ、約３×１０６細胞／ｋｇ〜約１０×１０６細胞／ｋｇ、約４×１０６細胞／ｋｇ〜約１０×１０６細胞／ｋｇ、約５×１０６細胞／ｋｇ〜約１０×１０６細胞／ｋｇ、２×１０６細胞／ｋｇ〜約６×１０６細胞／ｋｇ、２×１０６細胞／ｋｇ〜約７×１０６細胞／ｋｇ、２×１０６細胞／ｋｇ〜約８×１０６細胞／ｋｇ、３×１０６細胞／ｋｇ〜約６×１０６細胞／ｋｇ、３×１０６細胞／ｋｇ〜約７×１０６細胞／ｋｇ、３×１０６細胞／ｋｇ〜約８×１０６細胞／ｋｇ、４×１０６細胞／ｋｇ〜約６×１０６細胞／ｋｇ、４×１０６細胞／ｋｇ〜約７×１０６細胞／ｋｇ、４×１０６細胞／ｋｇ〜約８×１０６細胞／ｋｇ、５×１０６細胞／ｋｇ〜約６×１０６細胞／ｋｇ、５×１０６細胞／ｋｇ〜約７×１０６細胞／ｋｇ、５×１０６細胞／ｋｇ〜約８×１０６細胞／ｋｇ、または６×１０６細胞／ｋｇ〜約８×１０６細胞／ｋｇ（全ての介在する用量の細胞を含む）である。
【０２８８】
投与量におけるある程度の変動は、治療される対象の状態に応じて必然的に起こる。投与に責任のある者は、いずれにしても、個々の対象に対して適切な用量を決定するであろう。
【０２８９】
本明細書において引用される全ての刊行物、特許出願、および発行された特許は、個々の刊行物、特許出願、または発行された特許の各々が参照により組み込まれることが具体的にかつ個別に示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２９０】
前述の発明は、明確な理解のために図および例によってある程度詳細に記載されているが、本発明の教示に照らして、添付の特許請求の範囲の主旨または範囲から逸脱することなく、それらに対してある特定の変更および修正が行われ得ることは、当業者には容易に明らかになるであろう。以下の実施例は、限定としてではなく、例示として提供されるに過ぎない。当業者は、本質的に同様の結果を得るために変更または修正され得る様々な重要ではないパラメータを容易に認識するであろう。
【実施例】
【０２９１】
実施例１
ＢＢ６９４レンチウイルスベクター
Ｓｈｍｉｒ発現を改善するために、ｓｈｍｉＲ  ＢＣＬ１１Ａカセット（配列番号１）をｐＤ１２Ｇ５レンチウイルスベクターから別のレンチウイルスベクター骨格にクローニングした。新しいベクターは、ＢＢ６９４と称される。図１。
【０２９２】
ＢＢ６９４レンチウイルスベクターは、少なくとも以下の態様においてｐＤ１２Ｇ５レンチウイルスベクターと異なる：ＢＢ６９４レンチウイルスベクター骨格はＨＩＶ−１  ＮＬ４３株に由来するのに対し、ｐＤ１２Ｇ５レンチウイルスベクター骨格はＨＩＶ−１  ＨＸＢ２株に基づいている；ＢＢ６９４におけるレンチウイルスベクターエレメントの構造は、５’ＬＴＲ−プサイ（Ψ）パッケージングシグナル−ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ−ＲＲＥ−ｅｎｖスプライスアクセプター（Ｓ／Ａ）部位であるのに対し、ＢＢ６９４におけるレンチウイルスベクターエレメントの構造は５’ＬＴＲ−プサイ（Ψ）パッケージングシグナル−ＲＲＥ−ｅｎｖ  Ｓ／Ａ−ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰである；ＢＢ６９４レンチウイルスベクターは、約４５９ヌクレオチドの切断されたｇａｇタンパク質をコードし、かつ少なくとも２つの変異ＡＴＧコドンを有するポリヌクレオチドを含むのに対し、ｐＤ１２Ｇ５レンチウイルスベクターは、約３３９ヌクレオチドの切断されたｇａｇタンパク質をコードし、かつ変異ＡＴＧコドンを有しないポリヌクレオチドを含む；ＢＢ６９４レンチウイルスベクターは、約１７６ヌクレオチドのｅｎｖスプライスアクセプター（Ｓ／Ａ）部位を含むのに対し、Ｄ１２Ｇ５レンチウイルスベクターは、約３３４ヌクレオチドのｅｎｖ  Ｓ／Ａを含む；ＢＢ６９４レンチウイルスベクターは、約３８１ヌクレオチドのｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ配列を含むのに対し、Ｄ１２Ｇ５レンチウイルスベクターは、約１１８ヌクレオチドのｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ配列を含む；ＢＢ６９４レンチウイルスベクターは、約６３８ヌクレオチドのＨＳ２  ＤＮＡｓｅ  Ｉ過敏性部位を含むのに対し、Ｄ１２Ｇ５レンチウイルスベクターは、約１４３５ヌクレオチドのＨＳ２  ＤＮＡｓｅ  Ｉ過敏性部位を含む；ＢＢ６９４レンチウイルスベクターは、約８４７ヌクレオチドのＨＳ３  ＤＮＡｓｅ  Ｉ過敏性部位を含むのに対し、Ｄ１２Ｇ５レンチウイルスベクターは、約１２０２ヌクレオチドのＨＳ３  ＤＮＡｓｅ  Ｉ過敏性部位を含む；ＢＢ６９４レンチウイルスベクターは、合成ポリアデニル化部位を含むのに対し、Ｄ１２Ｇ５レンチウイルスベクターは、ウシ成長ホルモン遺伝子由来のポリアデニル化配列を含む。
【０２９３】
ＢＢ６９４ベクターの態様およびそれらの位置は、表１および配列番号４に記載される。
【表１】
2020511991.tif 000003
【０２９４】
実施例２
ＢＢ６９４レンチウイルスベクターは、正常な赤血球細胞および鎌状赤血球症突然変異を含有する赤血球細胞において胎児ヘモグロビンを誘導する。
背景
ｐＤ１２Ｇ５およびＢＢ６９４レンチウイルスベクターの特徴を比較した。どちらのベクターも、ＢＣＬ１１Ａ  ｍＲＮＡに対するｓｈｍｉＲを含む。ＢＣＬ１１Ａは、γグロビン遺伝子発現を調節し、したがって胎児ヘモグロビンレベル（ＨｂＦ）の調節に寄与する転写因子である（Ｂａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１３）。ＢＣＬ１１Ａ発現の減少は、ＨｂＦの上昇と相関している。しかしながら、低下したＢＣＬ１１Ａ発現はまた、初期Ｂ細胞およびＣＬＰにおいてアポトーシスを引き起こし、ＨＳＣからＢ細胞、Ｔ細胞、およびＮＫ細胞へのリンパ球発達の可能性を完全に消滅させる（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＥＭ  ２０１２）。加えて、ＢＣＬ１１Ａの不足は、老化様表現型を伴う造血幹細胞欠損を引き起こす（Ｌｕｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ  ２０１６）。ＢＣＬ１１Ａ  ｓｈｍｉｒの発現を駆動する赤血球特異的プロモーター／エンハンサーの使用により、発達中にＢＣＬ１１Ａが適切に機能できるようにする。
【０２９５】
Ｄ１２Ｇ５およびＢＢ６９４のためにレンチウイルスベクターを調製した。２．０３×１０６ＴＵ／ｍＬの力価（ＨＯＳ細胞に対するｑＰＣＲ力価）を有する４リットルのＤ１２Ｇ５を回収し、１．２５×１０８ＴＵ／ｍＬの力価を有し、最終体積が２３ｍＬになるまで濃縮した。１３．７×１０６ＴＵ／ｍＬの力価（ＨＯＳ細胞に対するｑＰＣＲ力価）を有する２リットルのＢＢ６９４を回収し、５．６５×１０８ＴＵ／ｍＬの力価を有し、最終体積が３０ｍＬになるまで濃縮した。全体的に、Ｄ１２Ｇ５の収率（３５％）よりもＢＢ６９４の収率がはるかに高かった（５９％）。
【０２９６】
ＣＤ３４＋細胞の形質導入
ヒト（ｈ）ＣＤ３４＋細胞を正常なドナーまたは鎌状赤血球症を有する対象から単離し、標準的な加湿組織培養インキュベーター（５％ＣＯ２）内の、ｈＳＣＦ、ｈＴＰＯ、およびｈＦｌｔ−３Ｌを補充したＣｅｌｌＧｒｏ（登録商標）Ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ  Ｍｅｄｉａ（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）で４８時間、１×１０６細胞／ｍＬで前刺激した。次いで、細胞を計数し、２１ウェルに分配し（１つの条件当たり３つの複製）、表２に要約した実験デザインに従って４×１０６細胞／ｍＬで２４時間形質導入した。
【表２】
2020511991.tif 000004
【０２９７】
形質導入後、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で細胞を洗浄した。１つの条件当たり５００個の細胞をクローン原性培養に使用し（ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ、Ｈ４４３４、ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、残りの細胞は、６日目（Ｄ６）のＶＣＮ評価のためのＳＣＧＭ中での液体培養と、ヘモグロビン分析のための液体培養における赤血球分化とに均等に分割した。
【０２９８】
Ｄ６  ＶＣＮ評価のためのＳＣＧＭ中での液体培養
形質導入されたｈＣＤ３４＋細胞を、標準的な加湿組織培養インキュベーター（５％  ＣＯ２）内の、ｈＳＣＦ、ｈＴＰＯ、ｈＦｌｔ−３Ｌ、およびＩＬ−３を補充したＣｅｌｌＧｒｏ（登録商標）Ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ  Ｍｅｄｉａ（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）で６日間、ＶＣＮ評価のためにＳＣＧＭ中で培養した。細胞を回収し、ゲノムＤＮＡ抽出物を抽出し、二倍体ゲノム当たりの平均ベクターコピー数をｑＰＣＲにより決定した。表２の形質導入条件でのＤ６  ＶＣＮを図２に示す。
【０２９９】
クローン原性アッセイ
各形質導入条件からの５００個の細胞を洗浄し、サイトカイン補充メチルセルロース（例えば、Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔ  Ｍ４４３４  Ｃｌａｓｓｉｃ）の３ｍＬアリコートに移した。次いで、先の丸い１６ゲージ針を用いて、１．１ｍＬを並列３５ｍｍ組織培養皿に移した。３７℃および５％  ＣＯ２の標準的な加湿組織培養インキュベーター内に皿を１４〜１６日間維持し、サイズ、形態、および細胞組成物についてコロニーをスコア化した。クローン原性頻度または毒性増加において、形質導入条件による予想外の差異はもたらされなかった。図３Ａ〜３Ｂ。
【０３００】
個々のコロニーをプールして、ＶＣＮ分析に供した。図４。
【０３０１】
液体培地における赤血球の分化
標準的な加湿組織培養インキュベーター内の赤血球分化培地で１４〜１６日間、３７℃および５％  ＣＯ２で形質導入細胞の約半分を培養した。赤血球分化培地（ＨＦ培地）は、ペニシリン／ストレプトマイシン、ｈＳＣＦ、ｈＩＬ−３、エリスロポエチン（Ｒ＆Ｄ、番号２８７−ＴＣ）、および２０％熱不活性化ＦＢＳ（ロット１６５８３９６）を補充したＩＭＤＭを含む。１４日後、細胞を遠心分離し（約３００ｇ、１０分）、ＰＢＳ中で洗浄し、ＨＰＬＣグレードの水に溶解した。高速遠心分離（２０，０００ｇ、３０分、４℃）した後、上清中のヘモグロビン含有量をイオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分析した。
【０３０２】
ＨＰＬＣによるヘモグロビン分析
Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅクロマトグラフ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）を用いてヘモグロビンを分析した：ＤＧＵ−２０Ａ  ３Ｒ脱気ユニット、ＣＢＭ−２０Ａシステムと直列する２つのＬＣ−２０ＡＤ移動相送達ユニット（ポンプ）、ＳＩＬ−２０ＡＣ  ＨＴポンプ、ＣＴＯ−２０ＡＣカラムオーブン、およびＳＰＯ−２０Ａ二波長ＵＶ−ｖｉｓ検出器。ＳＩＬ−２０ＡＣ  ＨＴオートサンプラーを用いて自動試料注入を行った。
【０３０３】
１〜３０マイクロリットルの上清を、１００×２．１ｍｍ、粒径５μｍ、細孔１０００オングストロームのＰｏｌｙＣＡＴ  Ａカラム（ＰｏｌｙＬＣ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ）上に注入した。０．３ｍｌ／分の流速で異なるイオン強度の２つのトリス緩衝液（緩衝液Ａ：トリス４０ｍＭ、ＫＣＮ  ３ｍＭ、酢酸でｐＨ６．５に調整；緩衝液Ｂ：トリス４０ｍＭ、ＫＣＮ  ３ｍＭ、ＮａＣｌ  ２００ｍＭ、酢酸でｐＨ６．５に調整）の勾配を用いてヘモグロビンを溶出した。使用した勾配は、０〜２分は２％のＢ；２〜６分は２０％のＢ；８〜１２分は６０％のＢ；１２〜１２：３０分１００％のＢ；および１３分は２％のＢであった。カラムオーブンは３０℃に設定した。検出波長は４１８ｎｍであった。データ収集およびデータ分析は、ＳｈｉｍａｄｚｕのＬＣ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎソフトウェアを用いて行った。ヘモグロビンを、それらの滞留時間および同じバッチで測定された参照基準によって同定した。異なるヘモグロビンの割合を、４１８ｎｍの各ピークのピーク面積で評価した。
【０３０４】
図５は、表２に示す条件下で形質導入された健常な（左パネル）およびＳＣＤ（右パネル）のＣＤ３４＋ドナー細胞由来の赤血球細胞によって産生された相対的な胎児ヘモグロビン、正常なヘモグロビン、および鎌状ヘモグロビンのレベルを示す。
【０３０５】
ベクター陽性コロニーおよびＨｂＦの産生
顕微鏡下で赤血球コロニーを個々に取り出した。コロニーをＰＢＳ（約３００ｇ、１０分）中で洗浄し、１００μＬのＨＰＬＣグレードの水に再懸濁した。２０μＬをｑＰＣＲによるＶＣＮ評価に使用し、８０μＬをイオン交換ＨＰＬＣによるヘモグロビン分析に使用した。
【０３０６】
ベクター陽性コロニーの割合を図６に示す。ｂｂ６９４、Ｆ１０８、およびＰＧＥ２の存在下での形質導入は、正常なヒトドナー細胞およびＳＣＤ細胞の両方で８０％を上回る形質導入細胞をもたらした。
【０３０７】
予想された通り、コロニーにおいてＨｂＦのバックグラウンドが高かった（最大５０％）。ＭＯＣＫコロニーのいずれも＞５０％のＨｂＦを有さず、ｂｂ６９４、Ｆ１０８、およびＰＧＥ２で形質導入されたコロニーの９３％超が＞５０％のＨｂＦを有していた。図７。ＨｂＦのパーセンテージは、ＶＣＮが増加すると増加し、二倍体ゲノム当たりの平均ベクターコピー数が５より高い場合に８０％〜１００％で定常に達する。
【０３０８】
結論
全ての試験条件下で、ｂｂ６９４レンチウイルスベクターはＤ１２Ｇ５ベクターよりも優れていた。ｂｂ６９４レンチウイルスベクターは高い力価（＞１．１０８ＴＵ／ｍＬ）で産生され、Ｆ１０８およびＰＧＥ２の存在下では、ＭＯＩ２５でほぼ４０％の赤血球前駆細胞を形質導入することができ、２５のＭＯＩで８０％超の赤血球前駆細胞を形質導入することができる。後者の条件下では、ＨｂＦのパーセンテージは７０％よりも高かった。
【０３０９】
実施例３
ＮＳＧマウスに投与したＢＢ６９４レンチウイルスベクターで形質導入されたＨＣＤ３４＋細胞の生着能
ｂｂ６９４レンチウイルスベクターで形質導入されたｈＣＤ３４＋細胞の生着能を、ＮＳＧマウスモデルにおいて評価した。
【０３１０】
標準的な加湿組織培養インキュベーター（５％ＣＯ２）内の、ｈＳＣＦ、ｈＴＰＯ、およびｈＦｌｔ−３Ｌを補充した無血清培地で４８時間、１×１０６細胞／ｍＬでｈＣＤ３４＋細胞を前刺激した。前刺激後、ｈＳＣＦ  １００ｎｇ／ｍＬ、ｈＴＰＯ  １００ｎｇ／ｍＬ、ｈＦｌｔ−３Ｌ  １００ｎｇ／ｍＬと、３０のＭＯＩでｂｂ６９４（６Ｅ＋８ＴＵ／ｍＬ）とを含むＳＣＧＭ中で、Ｆ１０８およびＰＧＥ２の存在下で、細胞を２〜４×１０６細胞／ｍＬで２４時間形質導入した。
【０３１１】
雌ＮＯＤ−Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ  １  Ｗｊｌ／Ｓｚ（ＮＳＧ）マウスを４０ｍｇ／ｋｇブスルファンでコンディショニングし、ｂｂ６９４レンチウイルスベクターまたはモック形質導入細胞で形質導入されたヒトＣＤ３４＋細胞を単回静脈内投与により移植した。
【０３１２】
各条件ごとに、洗浄した５００個の細胞をサイトカイン補充メチルセルロース（例えば、Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔ  Ｍ４４３４  Ｃｌａｓｓｉｃ）の３ｍＬアリコートに移した。次いで、１．１ｍＬを３５ｍｍ組織培養皿に移し、１４〜１６日間、３７℃および５％  ＣＯ２で培養した。サイズ、形態、および細胞組成物についてコロニーをスコア化した。後続のベクターコピー数分析のために個々のコロニーを選択するか、または３５ｍｍ皿全体の内容物をプールし、次いで、ベクターコピー数分析に供した。メチルセルロース中に播種した５００個の細胞のコロニー数を図８に示す。２つの群間に統計的に有意な差は観察されなかった。
【０３１３】
顕微鏡下で赤血球コロニーを個々に取り出した。次いで、ＶＣＮおよびＬＶＶ陽性コロニー％について個々のコロニーのｑＰＣＲにより各コロニーを分析した。図９。
【０３１４】
標準的な加湿組織培養インキュベーター内の赤血球分化培地で１４〜１６日間、３７℃および５％  ＣＯ２で形質導入細胞の約半分を培養した。赤血球分化培地。１４日後、細胞を遠心分離し（約３００ｇ、１０分）、ＰＢＳ中で洗浄し、ＨＰＬＣグレードの水中に溶解した。高速遠心分離（２０，０００ｇ、３０分、４℃）した後、上清を用いて逆相ＨＰＬＣによりグロビン鎖を分析した。図１０。
【０３１５】
以下の抗体、ＣＤ３（番号５６０８３５）、ＣＤ１９（番号５６０３５３）、ＣＤ３３（番号５５５４５０）、ＣＤ４５（番号５６１８６４）、およびＢＤフローサイトメーター用いたフローサイトメトリーにより、移植ＮＳＧマウスからの骨髄細胞を分析した。形質導入されたｈＣＤ３４＋細胞の生着を評価するために、ｈＣＤ４５＋細胞のパーセンテージを評価した。モック形質導入細胞とｂｂ６９４−形質導入細胞との間に統計的に有意な差は見られなかった。図１１。Ｂ細胞と骨髄系細胞との間のバランスを評価するために、ＣＤ１９＋ＣＤ４５＋細胞のパーセンテージおよびＣＤ３３＋ＣＤ４５＋細胞のパーセンテージを評価した。２つの群間に統計的に有意な差は観察されなかった。図１２。
【０３１６】
移植後４ヶ月目に、骨髄細胞を採取し、ゲノムＤＮＡを抽出し、二倍体ゲノム当たりの平均ベクターコピー数を定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により評価した。図１３。
【０３１７】
ヒトＣＤ３４＋細胞は、ｂｂ６９４で効率的に形質導入されており（プールしたコロニーに３．１ｃｐｄ）、液体培養における赤血球分化後にヘモグロビンＦの３．５倍の誘発が観察された（γ鎖の割合は、モックで１３．５％、ｂｂ６９４で４７％であった）。形質導入後の細胞について評価したコロニーの頻度は、２つの群間で同様であった。ヒトＣＤ４５＋細胞の生着レベルは、予想された範囲内であり、２つの群間で統計的な差は見られなかった。系列の偏り（ｌｉｎｅａｇｅ  ｓｋｅｗｉｎｇ）は観察されなかった。ＣＤ１９＋ＣＤ４５＋細胞のパーセンテージまたはＣＤ３３＋ＣＤ４５＋細胞のパーセンテージについて群間に統計的に有意な鎖は見られなかった。
【０３１８】
一般に、以下の特許請求の範囲において、使用されている用語は、請求項を本明細書および特許請求の範囲に開示される特定の実施形態に限定するものと解釈されるべきではなく、そのような請求項が権利を与えられる等価物の全範囲とともに、可能性のある全ての実施形態を含むものと解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は本開示によって限定されるものではない。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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