(57)【要約】本発明は、実質的にコアギュローゲンを含まない清澄化リムルスアメボサイトライセート（ＬＡＬ）を含む組成物、及びそのような組成物を生成する方法に関する。本発明はさらに、発色アッセイを使用してサンプル中のエンドトキシンを検出する方法であって、本方法は、（ａ）サンプルを清澄化ＬＡＬ及び発色基質を含む試薬と接触させるステップと、（ｂ）サンプル中のエンドトキシンの存在下における発色基質の変化によって生じる発色効果を測定するステップとを含み、ＬＡＬが、実質的にコアギュローゲンを含まない、方法に関する。本発明はまた、実質的にコアギュローゲンを含まない清澄化ＬＡＬを含むキット、及びそのようなものを生成する方法に関する。【選択図】  図１
2020505007.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
清澄化リムルスアメボサイトライセート（ＬＡＬ）を含む組成物であって、実質的にコアギュローゲンを含まない、組成物。
【請求項２】
バッファーをさらに含み、３０％〜６０％（ｖ／ｖ）の清澄化ＬＡＬを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記バッファーが、トリスバッファーである、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記バッファーが、約２５ｍＭ〜約５０ｍＭの濃度である、請求項２又は３に記載の組成物。
【請求項５】
界面活性剤をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記界面活性剤が、両性イオン界面活性剤である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記界面活性剤が、約０．００２％〜約０．０２％の濃度を有する、請求項５又は６に記載の組成物。
【請求項８】
約５０％の清澄化ＬＡＬを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
発色基質をさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記発色基質が、３個を超えるアミノ酸と共有結合したｐ−ニトロアニリン（ｐＮＡ）である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記発色基質が、Ａｃ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ｐＮＡである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記発色基質が、約０．１１ｍｇ／ｍＬ〜約０．７７ｍｇ／ｍＬの濃度を有する、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
凍結乾燥されている、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
水溶液中にある、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
ａ．請求項１に記載の清澄化リムルスアメボサイトライセート（ＬＡＬ）と、
ｂ．バッファーと、
ｃ．界面活性剤と、
ｄ．発色基質とを含む組成物であって、
３０％〜５０％のＬＡＬ（ｖ／ｖ）及び１０％〜３０％（ｖ／ｖ）の発色基質を含む、組成物。
【請求項１６】
３５％〜４５％のＬＡＬ及び１５％〜２５％の発色基質を含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
４０％のＬＡＬ及び２０％の発色基質を含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１８】
清澄化ＬＡＬを含み、実質的にコアギュローゲンを含まない組成物であって、
ａ．溶解されたアメリカカブトガニ由来のアメボサイト由来の溶液を４℃において２，０００ｒｐｍで８分間遠心分離し、上澄みを生成するステップと、
ｂ．（ａ）の上澄みをバッファーと合わせるステップと、
ｃ．（ｂ）の組み合わせを３０ｋＤａメンブランフィルターを使用したタンジェンシャルフローろ過に供し、保持液を生成するステップと、
ｄ．（ｃ）の保持液を４℃において５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄みを生成するステップであり、前記上澄みが、実質的にコアギュローゲンを含まない清澄化ＬＡＬである、ステップとを含む、
方法により生成される、組成物。
【請求項１９】
清澄化ＬＡＬを含み、実質的にコアギュローゲンを含まない組成物であって、
ａ．溶解されたアメリカカブトガニ由来のアメボサイト由来の溶液を得るステップと、
ｂ．（ａ）の溶液をバッファーと合わせるステップと、
ｃ．（ｂ）の組み合わせを２０ｋＤａ〜５０ｋＤａメンブランフィルターを使用した連続的なタンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）に供し、保持液を生成するステップと、
ｄ．（ｃ）の保持液を２０，０００×ｇ超において２５分を超える間遠心分離し、上澄みを生成するステップであり、前記上澄みが、実質的にコアギュローゲンを含まない清澄化ＬＡＬである、ステップとを含む、
方法により生成される、組成物。
【請求項２０】
前記連続的なＴＦＦ（ｃ）が、少なくとも４のダイアフィルトレーション容量を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ステップ（ｃ）の前記連続的なＴＦＦ（ｃ）が、少なくとも６のダイアフィルトレーション容量を含む、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２２】
発色アッセイを使用して、サンプル中のエンドトキシンを検出する方法であって、前記方法が、
ａ．前記サンプルをリムルスアメボサイトライセート（ＬＡＬ）及び発色基質を含む試薬と接触させるステップと、
ｂ．前記サンプル中のエンドトキシンの存在下における前記発色基質の変化によって生じる発色効果を測定するステップとを含み、
前記ＬＡＬが、清澄化されており、実質的にコアギュローゲンを含まない、方法。
【請求項２３】
前記基質が、３個を超えるアミノ酸と共有結合したｐ−ニトロアニリン（ｐＮＡ）である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記発色基質が、Ａｃ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ｐＮＡである、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記発色基質の前記変化が、酵素反応により起こる、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記酵素反応が、ポリペプチドからの発色団の切断である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
発色効果を測定する前記ステップが、３８０ｎｍ〜４２０ｎｍにおける吸光度を測定することによって達成される、請求項２２〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
発色効果を測定する前記ステップが、４０５ｎｍにおける吸光度を測定することによって達成される、請求項２２〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記試薬が、液体である、請求項２２〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記試薬が、水性液体である、請求項２２〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記試薬が、凍結乾燥され、その後、前記サンプルと接触させるステップに先立って水性液体中で再構成される、請求項２２〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＬＡＬが、凍結乾燥され、その後、前記サンプルと接触させるステップに先立って再構成される、請求項２２〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＬＡＬが、凍結され、その後、サンプルと接触させるステップに先立って解凍される、請求項２２〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記発色基質が、凍結乾燥され、その後、サンプルと接触させるステップに先立って再構成される、請求項２２〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記サンプルが、生物学的サンプルである、請求項２２〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記サンプルが、非経口剤形、ワクチン、抗生剤、治療用タンパク質、治療用核酸、治療用抗体、及び生物学的製剤からなる群から選択される、請求項２２〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
実質的にコアギュローゲンを含まない前記清澄化ＬＡＬが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びタンパク質染色によって測定される場合に、前記ＬＡＬ中の総タンパク質に対して５％（ｗｔ／ｗｔ）未満のコアギュローゲンを有する、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の組成物又は方法。
【請求項３８】
実質的にコアギュローゲンを含まない前記清澄化ＬＡＬが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びタンパク質染色によって測定される場合に、前記ＬＡＬ中の総タンパク質に対して２％（ｗｔ／ｗｔ）未満のコアギュローゲンを有する、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の組成物又は方法。
【請求項３９】
実質的にコアギュローゲンを含まない前記清澄化ＬＡＬが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びタンパク質染色によって測定される場合に、前記ＬＡＬ中の総タンパク質に対して０．５％（ｗｔ／ｗｔ）未満のコアギュローゲンを有する、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の組成物又は方法。
【請求項４０】
実質的にコアギュローゲンを含まない前記清澄化ＬＡＬが、５μｇ／μＬ未満のコアギュローゲン濃度を有する、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の組成物又は方法。
【請求項４１】
実質的にコアギュローゲンを含まない前記清澄化ＬＡＬが、３μｇ／μＬ未満のコアギュローゲン濃度を有する、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の組成物又は方法。
【請求項４２】
実質的にコアギュローゲンを含まない前記清澄化ＬＡＬが、２μｇ／μＬ未満のコアギュローゲン濃度を有する、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の組成物又は方法。
【請求項４３】
前記発色アッセイが、シングルキュベット分光測定、マルチキュベット分光測定、又はマイクロプレートリーダーを使用して行われる、請求項２２〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記発色効果を標準と比較して、前記サンプル中のエンドトキシンの量を求めるステップをさらに含む、請求項２２〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
発色アッセイを使用して、生物学的サンプル中のエンドトキシンを検出する方法であって、前記方法が、
ａ．前記生物学的サンプルを清澄化ＬＡＬ及びＡｃ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ｐＮＡを含む試薬と接触させるステップと、
ｂ．前記サンプル中のエンドトキシンの存在下におけるＡｃ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ｐＮＡからのｐＮＡの酵素切断によって生じる４０５ｎｍにおける吸光度の変化を測定するステップとを含み、
前記ＬＡＬが、実質的にコアギュローゲンを含まない、方法。
【請求項４６】
前記試薬が、バッファー及び界面活性剤をさらに含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
（ａ）の前に、バッファー、界面活性剤、及び清澄化ＬＡＬを含む溶液が、Ａｃ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ｐＮＡを含む溶液と混合される、請求項４５又は４６に記載の方法。
【請求項４８】
バッファー、界面活性剤、及び清澄化ＬＡＬを含む前記溶液が、４５％〜５５％の清澄化ＬＡＬを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
バッファー、界面活性剤、及び清澄化ＬＡＬを含む前記溶液が、５０％の清澄化ＬＡＬを含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記試薬が、１５％〜２５％のＡｃ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ｐＮＡを含む、請求項４５〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記試薬が、２０％のＡｃ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ｐＮＡを含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
０．０００１ＥＵ／ｍＬ〜１．０ＥＵ／ｍＬエンドトキシンの感度を有する、請求項４５〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
ａ．清澄化されており、実質的にコアギュローゲンを含まないリムルスアメボサイトライセート（ＬＡＬ）と、
ｂ．発色基質と、
ｃ．前記ＬＡＬ及び発色基質を使用してエンドトキシンを検出するための説明書と
を含む、キット。
【請求項５４】
前記ＬＡＬが、凍結乾燥されている、請求項５３に記載のキット。
【請求項５５】
前記ＬＡＬが、水溶液中にある、請求項５３に記載のキット。
【請求項５６】
前記ＬＡＬ及び前記発色基質が、単一の容器に入れてある、請求項５３〜５５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５７】
前記ＬＡＬを含む滅菌容器をさらに含む、請求項５３〜５６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５８】
前記滅菌容器が、滅菌バイアルである、請求項５７に記載のキット。
【請求項５９】
対照標準エンドトキシンをさらに含む、請求項５３〜５８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項６０】
実質的にコアギュローゲンを含まない清澄化リムルスアメボサイトライセート（ＬＡＬ）を生成する方法であって、
ａ．溶解されたアメリカカブトガニ由来のアメボサイト由来の溶液を２〜１０℃において１０００〜３０００ｒｐｍで２〜１５分間遠心分離し、上澄みを生成するステップと、
ｂ．（ａ）の上澄みをバッファーと合わせるステップと、
ｃ．（ｂ）の組み合わせを２０ｋＤａ〜５０ｋＤａフィルターを使用してろ過し、保持液を生成するステップと、
ｄ．（ｃ）の保持液を２〜１０℃において３０００〜７０００ｒｐｍで２〜１０分間遠心分離し、上澄みを生成するステップであり、前記上澄みが、実質的にコアギュローゲンを含まない清澄化ＬＡＬを含む、ステップとを含む、
方法。
【請求項６１】
（ａ）の遠心分離する前記ステップが、２０００ｒｐｍにおいて遠心分離するステップを含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
（ａ）の遠心分離する前記ステップが、８分間遠心分離するステップを含む、請求項６０又は６１に記載の方法。
【請求項６３】
（ａ）の遠心分離する前記ステップが、４℃において遠心分離するステップを含む、請求項６０〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
（ｃ）のろ過する前記ステップが、３０ｋＤａフィルターを使用するステップを含む、請求項６０〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
（ｄ）の遠心分離する前記ステップが、５０００ｒｐｍにおいて遠心分離するステップを含む、請求項６０〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
（ｄ）の遠心分離する前記ステップが、５分間遠心分離するステップを含む、請求項６０〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
（ｄ）の遠心分離する前記ステップが、４℃において遠心分離するステップを含む、請求項６０〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記バッファーが、トリスバッファー又はＭＥＳバッファーである、請求項６０〜６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記バッファーが、約７．０〜８．０のｐＨを有する、請求項６０〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記ろ過が、タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）である、請求項６０〜６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
前記ＴＦＦが、３５０ｍｌ／分〜５００ｍｌ／分の流量で実施される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記フィルターが、修飾ポリエーテルスルホン（ｍＰＥＳ）メンブランフィルターである、請求項６０〜７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
実質的にコアギュローゲンを含まない清澄化リムルスアメボサイトライセート（ＬＡＬ）を生成する方法であって、
ａ．溶解されたアメリカカブトガニ由来のアメボサイト由来の溶液を得るステップと、
ｂ．（ａ）の溶液をバッファーと合わせるステップと、
ｃ．（ｂ）の組み合わせを２０ｋＤａ〜５０ｋＤａメンブランフィルターを使用した連続的なタンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）に供し、保持液を生成するステップと、
ｄ．（ｃ）の保持液を２０，０００×ｇ超において２５分を超える間遠心分離し、上澄みを生成するステップであり、前記上澄みが、実質的にコアギュローゲンを含まない清澄化ＬＡＬである、ステップとを含む、
方法。
【請求項７４】
実質的にコアギュローゲンを含まない清澄化リムルスアメボサイトライセート（ＬＡＬ）を生成する方法であって、
ａ．溶解されたアメリカカブトガニ由来のアメボサイト由来の溶液を得るステップと、
ｂ．（ａ）の溶液をバッファーと合わせるステップと、
ｃ．（ｂ）の組み合わせを２０ｋＤａ〜５０ｋＤａメンブランフィルターを使用した連続的なタンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）に供し、保持液を生成するステップと、
ｄ．（ｃ）の保持液を２０，０００×ｇ超において遠心分離し、上澄みを生成するステップであり、前記上澄みが、実質的にコアギュローゲンを含まない清澄化ＬＡＬである、ステップとを含む、
方法。
【請求項７５】
（ａ）の前記溶液が、溶解されたアメリカカブトガニ由来のアメボサイトを２〜１０℃において１０００〜３０００ｒｐｍで２〜１５分間遠心分離するステップから入手した、上澄みを含む、請求項７３又は７４に記載の方法。
【請求項７６】
（ａ）の遠心分離する前記ステップが、２０００ｒｐｍにおいて遠心分離するステップを含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
（ａ）の遠心分離する前記ステップが、８分間遠心分離するステップを含む、請求項７５又は７６に記載の方法。
【請求項７８】
（ｄ）の遠心分離する前記ステップが、２〜１０℃において遠心分離するステップを含む、請求項７３〜７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
（ｃ）の前記連続的なＴＦＦが、少なくとも４のダイアフィルトレーション容量を含む、請求項７３〜７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
（ｃ）の前記連続的なＴＦＦが、少なくとも６のダイアフィルトレーション容量を含む、請求項７３〜７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
（ｄ）の遠心分離する前記ステップが、４０，０００×ｇにおいて遠心分離するステップを含む、請求項７３〜８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
（ｄ）の遠心分離する前記ステップが、３０分間遠心分離するステップを含む、請求項７３〜８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
（ｄ）の遠心分離する前記ステップが、少なくとも２０分間遠心分離するステップを含む、請求項７４〜８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
前記バッファーが、トリスバッファー又はＭＥＳバッファーである、請求項７３〜８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
前記バッファーが、約７．０〜８．０のｐＨを有する、請求項７３〜８４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0001]本発明は、実質的にコアギュローゲンを含まない清澄化リムルスアメボサイトライセート（ＬＡＬ）を含む組成物、及び組成物を生成する方法に関する。本発明はさらに、発色アッセイを使用してサンプル中のエンドトキシンを検出する方法であって、本方法は、（ａ）サンプルを清澄化ＬＡＬ及び発色基質を含む試薬と接触させるステップと、（ｂ）サンプル中のエンドトキシンの存在下における発色基質の変化によって生じる発色効果を測定するステップとを含み、ＬＡＬが、実質的にコアギュローゲンを含まない、方法に関する。本発明はまた、実質的にコアギュローゲンを含まない清澄化ＬＡＬを含むキット、及びそのようなものを生成する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
[0002]グラム陰性菌エンドトキシンは、静脈内に導入されたときに発熱の原因となる生物学的パイロジェンである。リポ多糖（ＬＰＳ）としても知られているエンドトキシンは、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）及びナイセイラ（Ｎｅｉｓｓｅｉｒａ）などのグラム陰性菌の外膜に見られる。エンドトキシンが引き起こす毒性機構は、リポ多糖の脂質部分が原因となることが報告されている。例えば、生物内において細菌の溶解が起きると、血流に導入される脂質に対する応答は、補体系の活性化による可能性がある。この脂質部分がインターロイキン１及び８などのさまざまなサイトカインの放出につながる。腫瘍壊死因子の産生も活性化される場合がある。もたらされた感染症は、炎症過程と関連づけられ、感染した生物に大きな危険性を与える可能性がある。インターロイキン１は、免疫応答として、炎症に対して生物が放出するサイトカインファミリーである。この応答は、感染症が起こった場所への好中球の遊走につながり、走化性をもたらす。これは、ファゴサイトーシスが生じるのを促進するが、ある場合には、個体の免疫系の状態及び感染のレベルに応じて、エンドトキシンが敗血症によってもたらされるリスクとともに、全身敗血症に至ることもあろう。グラム陰性菌が高等な哺乳動物において全身感染症による多臓器不全及びさらには死を引き起こした多くの症例が報告されてきた。エンドトキシンと関連する有害な影響のため、医薬産業及び医療界にとってエンドトキシンの早期の高感度の検出があることが重要である。
【０００３】
[0003]リムルスアメボサイトライセート（ＬＡＬ）試験は、エンドトキシンを検知するために１９７０年代に商業的に導入された。ＬＡＬは、カブトガニ、アメリカカブトガニ（Ｌｉｍｕｌｕｓ  ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓ）の血液細胞、又はアメボサイト由来のものである。もともとのＬＡＬ試験は、セリンプロテアーゼのカスケードを構成し、このカスケードはわずかなレベルのエンドトキシンによって引き起こされ、反応の終わりにゲル凝塊となる。通常、酵素前駆体として存在するＣ因子は、この凝固カスケードのプライマーである。インビボにおいて、Ｃ因子は、グラム陰性感染菌の存在をカブトガニに警告する完璧なバイオセンサーである。血流停止の終点は、感染菌を捕捉し、感染菌を死滅させ、さらなる感染を制限する。
【０００４】
[0004]ＬＡＬ試験は、エンドトキシンに対するアメボサイトの応答を測定するためのさまざまな方法を使用するために改変することができる。こうした方法としては、いわゆるゲル化法、比濁法及び発色法が挙げられる。これらのＬＡＬ試験は、薬剤を製造するために使用される及び最終製品に対して使用される原料中の両方の細菌毒素を検出するための方法として国際的薬局方において推奨されている。こうした試験は、ＦＤＡ（食品医薬品局）が推奨するパイロジェンの検出のための方法であるため、化粧品産業に対して及び食物生産においても有用である。
【発明の概要】
【０００５】
[0005]清澄化リムルスアメボサイトライセート（ＬＡＬ）を含む組成物であって、本組成物は、実質的にコアギュローゲンを含まない、組成物が本明細書において提供される。実施形態において、清澄化ＬＡＬを含む組成物は、バッファー及び界面活性剤をさらに含む。実施形態において、組成物は５０％の清澄化ＬＡＬを含む。
【０００６】
[0006]実施形態において、本発明は、（ａ）組成物が実質的にコアギュローゲンを含まない清澄化ＬＡＬと、（ｂ）発色基質とを含む、組成物を提供する。
【０００７】
[0007]本明細書中の実施形態は、清澄化ＬＡＬ、バッファー、界面活性剤、及び発色基質を含む組成物であって、本組成物は、３０％〜５０％のＬＡＬ（ｖ／ｖ）及び１０％〜３０％（ｖ／ｖ）の発色基質を含む、組成物をさらに対象とする。
【０００８】
[0008]実施形態において、本発明は、清澄化ＬＡＬを含み、実質的にコアギュローゲンを含まない組成物であって、（ａ）溶解されたアメリカカブトガニ由来のアメボサイト由来の溶液を４℃において２，０００ｒｐｍで８分間遠心分離し、上澄みを生成するステップと、（ｂ）（ａ）の上澄みをバッファーと合わせるステップと、（ｃ）（ｂ）の組み合わせを３０ｋＤａメンブランフィルターを使用したタンジェンシャルフローろ過に供し、保持液を生成するステップと、（ｄ）（ｃ）の保持液を４℃において５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄みを生成するステップであり、上澄みが、実質的にコアギュローゲンを含まない清澄化ＬＡＬである、ステップとを含む、方法により生成される、組成物をさらに提供する。
【０００９】
[0009]実施形態において、本発明は、清澄化ＬＡＬを含み、実質的にコアギュローゲンを含まない組成物であって、（ａ）溶解されたアメリカカブトガニ由来のアメボサイト由来の溶液を得るステップと、（ａ）の溶液をバッファーと合わせるステップと、（ｂ）（ａ）の溶液をバッファーと合わせるステップと、（ｃ）（ｂ）の組み合わせを２０ｋＤａ〜５０ｋＤａメンブランフィルターを使用した連続的なタンジェンシャルフローろ過に供し、保持液を生成するステップと、（ｄ）（ｃ）の保持液を２０，０００×ｇ超において２５分を超える間遠心分離し、上澄みを生成するステップであり、上澄みが、実質的にコアギュローゲンを含まない清澄化ＬＡＬである、ステップとを含む、方法により生成される、組成物をさらに提供する。いくつかの実施形態において、（ｃ）の連続的なＴＦＦは、少なくとも４のダイアフィルトレーション容量を含む。いくつかの実施形態において、（ｃ）の連続的なＴＦＦは、少なくとも６のダイアフィルトレーション容量を含む。
【００１０】
[0010]本明細書中の実施形態は、発色アッセイを使用して、サンプル中のエンドトキシンを検出する方法であって、本方法は、（ａ）サンプルを清澄化リムルスアメボサイトライセート（ＬＡＬ）及び発色基質を含む試薬と接触させるステップと、（ｂ）サンプル中のエンドトキシンの存在下における発色基質の変化によって生じる発色効果を測定するステップとを含み、ＬＡＬが、実質的にコアギュローゲンを含まない、方法を対象とする。
【００１１】
[0011]いくつかの実施形態において、発色基質は、３個を超えるアミノ酸と共有結合したｐ−ニトロアニリンである。いくつかの実施形態において、発色基質は、Ａｃ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ｐＮＡである。いくつかの実施形態において、発色基質の変化は、酵素反応により起こる。いくつかの実施形態において、酵素反応は、ポリペプチドからの発色団の切断である。いくつかの実施形態において、発色効果は、３８０ｎｍ〜４２０ｎｍにおける吸光度を検出することによって測定される。いくつかの実施形態において、発色効果は、４０５ｎｍにおける吸光度を検出することによって測定される。
【００１２】
[0012]いくつかの実施形態において、試薬は、液体である。いくつかの実施形態において、試薬は、水性液体である。いくつかの実施形態において、試薬は、凍結乾燥され、その後、サンプルと接触させるステップに先立って水性液体中で再構成される。
【００１３】
[0013]いくつかの実施形態において、ＬＡＬは、凍結乾燥され、その後、サンプルと接触させるステップに先立って再構成される。いくつかの実施形態において、ＬＡＬは、凍結され、その後、サンプルと接触させるステップに先立って解凍される。いくつかの実施形態において、発色基質は、凍結乾燥され、その後、サンプルと接触させるステップに先立って再構成される。
【００１４】
[0014]いくつかの実施形態において、サンプルは、生物学的サンプルである。いくつかの実施形態において、サンプルは、非経口剤形、ワクチン、抗生剤、治療用タンパク質、治療用核酸、治療用抗体、及び生物学的製剤からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、実質的にコアギュローゲンを含まない清澄化ＬＡＬは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定され、ウエスタンブロットによって確認される場合に、ＬＡＬ中の総タンパク質に対して５％（ｗｔ／ｗｔ）未満のコアギュローゲンを有する。いくつかの実施形態において、実質的にコアギュローゲンを含まない清澄化ＬＡＬは、ＬＡＬ中の総タンパク質に対して２％（ｗｔ／ｗｔ）未満のコアギュローゲンを有する。いくつかの実施形態において、実質的にコアギュローゲンを含まない清澄化ＬＡＬは、ＬＡＬ中の総タンパク質に対して０．５％（ｗｔ／ｗｔ）未満のコアギュローゲンを有する。
【００１５】
[0015]いくつかの実施形態において、実質的にコアギュローゲンを含まない清澄化ＬＡＬは、５μｇ／μＬ未満のコアギュローゲン濃度を有する。いくつかの実施形態において、実質的にコアギュローゲンを含まない清澄化ＬＡＬは、３μｇ／μＬ未満のコアギュローゲン濃度を有する。いくつかの実施形態において、実質的にコアギュローゲンを含まない清澄化ＬＡＬは、２μｇ／μＬ未満のコアギュローゲン濃度を有する。いくつかの実施形態において、発色アッセイは、シングルキュベット分光測定、マルチキュベット分光測定、又はマイクロプレートリーダーを使用して行われる。
【００１６】
[0016]いくつかの実施形態において、本方法は、発色効果を標準と比較して、サンプル中のエンドトキシンの量を求めるステップをさらに含む。
【００１７】
[0017]いくつかの実施形態において、本開示は、発色アッセイを使用して、生物学的サンプル中のエンドトキシンを検出する方法であって、本方法は、（ａ）生物学的サンプルを清澄化リムルスアメボサイトライセート（ＬＡＬ）及びＡｃ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ｐＮＡを含む水性試薬と接触させるステップと、（ｂ）サンプル中のエンドトキシンの存在下におけるＡｃ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ｐＮＡからのｐＮＡの酵素切断によって生じる４０５ｎｍにおける吸光度の変化を測定するステップとを含み、ＬＡＬが、実質的にコアギュローゲンを含まない、方法を対象とする。
【００１８】
[0018]いくつかの実施形態において、本開示の方法は、高い感度を有する。いくつかの実施形態において、本方法は、＜０．００１ＥＵ／ｍＬエンドトキシンの感度を有する。
【００１９】
[0019]いくつかの実施形態において、本開示の方法は、キットであって、（ａ）実質的にコアギュローゲンを含まない清澄化リムルスアメボサイトライセート（ＬＡＬ）と、（ｂ）発色基質と、（ｃ）ＬＡＬ及び発色基質を使用してエンドトキシンを検出するための説明書とを含む、キットを対象とする。
【００２０】
[0020]いくつかの実施形態において、清澄化ＬＡＬは、凍結乾燥されている。いくつかの実施形態において、清澄化ＬＡＬは、水溶液中にある。いくつかの実施形態において、ＬＡＬ及び発色基質は、単一の容器に入れてある。いくつかの実施形態において、キットは、清澄化ＬＡＬを含む滅菌容器をさらに含む。いくつかの実施形態において、滅菌容器は、滅菌バイアルである。いくつかの実施形態において、キットは、対照標準エンドトキシンをさらに含む。
【００２１】
[0021]いくつかの実施形態において、本開示は、実質的にコアギュローゲンを含まない清澄化リムルスアメボサイトライセート（ＬＡＬ）を生成する方法であって、本方法は、溶解されたアメリカカブトガニ由来のアメボサイト由来の溶液を２〜１０℃において１０００〜３０００ｒｐｍで２〜１５分間遠心分離し、上澄みを生成するステップと、（ａ）の上澄みをバッファーと合わせるステップと、（ｂ）の組み合わせを２０ｋＤａ〜５０ｋＤａフィルターを使用してろ過し、保持液を生成するステップと、（ｃ）の保持液を２〜１０℃において３０００〜７０００ｒｐｍで２〜１０分間遠心分離し、上澄みを生成するステップとを含み、上澄みが、実質的にコアギュローゲンを含まない清澄化ＬＡＬを含む、方法を対象とする。
【００２２】
[0022]いくつかの実施形態において、フィルターは、タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）である。いくつかの実施形態において、ＴＦＦフィルターは、修飾ポリエーテルスルホン（ｍＰＥＳ）メンブランフィルターである。いくつかの実施形態において、ＴＦＦは、３５０ｍＬ／分〜５００ｍＬ／分の流量で実施される。いくつかの実施形態において、バッファーは、トリスバッファー又はＭＥＳバッファーである。いくつかの実施形態において、バッファーは、約７．０〜８．０のｐＨを有する。
【００２３】
[0023]いくつかの実施形態において、本開示は、実質的にコアギュローゲンを含まない清澄化リムルスアメボサイトライセート（ＬＡＬ）を生成する方法であって、（ａ）溶解されたアメリカカブトガニ由来のアメボサイト由来の溶液を得るステップと、（ｂ）（ａ）の溶液をバッファーと合わせるステップと、（ｃ）（ｂ）の組み合わせを２０ｋＤａ〜５０ｋＤａメンブランフィルターを使用した連続的なタンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）に供し、保持液を生成するステップと、（ｄ）（ｃ）の保持液を２０，０００×ｇ超において２５分を超える間遠心分離し、上澄みを生成するステップであり、上澄みが、実質的にコアギュローゲンを含まない清澄化ＬＡＬである、ステップとを含む、方法を対象とする。いくつかの実施形態において、（ａ）の溶液は、溶解されたアメリカカブトガニ由来のアメボサイトを２〜１０℃において１０００〜３０００ｒｐｍで２〜１５分間遠心分離するステップから得られた、上澄みを含む。いくつかの実施形態において、（ａ）の遠心分離するステップは、２０００ｒｐｍにおいて遠心分離するステップを含む。いくつかの実施形態において、（ａ）の遠心分離するステップは、８分間遠心分離するステップを含む。
【００２４】
[0024]いくつかの実施形態において、遠心分離するステップは、２〜１０℃、例えば、４℃において遠心分離するステップを含む。いくつかの実施形態において、（ｃ）の連続的なＴＦＦは、少なくとも４のダイアフィルトレーション容量を含む。いくつかの実施形態において、（ｃ）の連続的なＴＦＦは、少なくとも６のダイアフィルトレーション容量を含む。いくつかの実施形態において、（ｄ）の遠心分離するステップは、４０，０００×ｇにおいて遠心分離するステップを含む。いくつかの実施形態において、（ｄ）の遠心分離するステップは、３０分間遠心分離するステップを含む。いくつかの実施形態において、バッファーは、トリスバッファー又はＭＥＳバッファーである。いくつかの実施形態において、バッファーは、約７．０〜８．０のｐＨを有する。
【００２５】
[0025]本技術の前述及び他の特徴及び態様は、実施形態の以下の説明から、さらに添付の図面に示されているとおり、さらに良好に理解可能である。本明細書に組み込まれ、明細書の一部を形成する添付の図面は、本技術の原理を説明するためにさらに役立つ。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】実質的にコアギュローゲンを含まない清澄化ＬＡＬ（「ＬＡＬ−ｃｏ」）（サンプル１〜６）及び未清澄化ＬＡＬ−ｃｏ（サンプル７〜１２）を、５０／５０／５０配合又は５０／８０／２０配合のいずれかにおいて含む、配合物の反応特性を示す図である。実施例１参照。
【図２】実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬ（「ＬＡＬ−ｃｏ」）対ＬＡＬ−ｃｏを４℃において５０００ｒｐｍで５分間遠心分離するステップにより調製した清澄化ＬＡＬ−ｃｏの実施形態の視覚的比較を示す図である。
【図３】実質的にコアギュローゲンを含まない清澄化ＬＡＬを調製する方法の実施形態の概略図である。溶解されたアメリカカブトガニのアメボサイトの複数バッチをともにプールし（「ＬＡＬデイプール（Ｄａｙｐｏｏｌ）」）且つ遠心分離し、得られた上澄みをタンジェンシャルフローろ過を使用してろ過して実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬを含有する保持液を生成し、続いて保持液を遠心分離して実質的にコアギュローゲンを含まない清澄化ＬＡＬである上澄みを生成する。
【図４】発色アッセイを使用してエンドトキシンを検出する方法の実施形態を示すグラフであり、アッセイ性能の向上、例えば０ＥＵ／ｍＬ対照からの滑らかな反応特性及び大きな分離を示している。
【図５】４０％（ｖ／ｖ）のコアギュローゲンを含有しない清澄化ＬＡＬ及び２０％の発色基質を含む配合物（５０／８０／２０配合）中の、１年経過、２年経過及び３年経過したＬＡＬ源の実質的にコアギュローゲンを含まない清澄化ＬＡＬに関する、時間関数としての光学密度の変化を示すグラフである。
【図６】４０％（ｖ／ｖ）のコアギュローゲンを含有しない清澄化ＬＡＬ及び２０％の発色基質を含む配合物（５０／８０／２０配合）中の、１年経過、２年経過、及び３年経過したＬＡＬ源の実質的にコアギュローゲンを含まない清澄化ＬＡＬに関する、反応パラメーターを示す表である。
【図７】本発明の発色アッセイにおける、０．００５ＥＵ／ｍＬ標準（右列）又はブランク標準（左列）のいずれかを用いた５０／８０／２０配合物が５０ｍＯＤ、３０ｍＯＤ、及び２０ｍＯＤに達するまでの時間（秒）を、清澄化ＬＡＬ−ｃｏ源の年数（１年、２年又は３年）の関数として示す棒グラフである。
【図８】４０％（ｖ／ｖ）のコアギュローゲンを含有しない清澄化ＬＡＬ及び２０％の発色基質を含む配合物（５０／８０／２０配合）中の、１年経過、２年経過、及び３年経過したＬＡＬ源の実質的にコアギュローゲンを含まない清澄化ＬＡＬに関する、０．００５ＥＵ／ｍＬ標準の反応時間の箱ひげ図である。４０％（ｖ／ｖ）のＬＡＬ及び２０％の発色基質を含有する配合物（５０／８０／２０配合）中の、１年経過、２年経過、及び３年経過したＬＡＬ源のＬＡＬに関する、０．００５ＥＵ／ｍＬ標準の反応時間の箱ひげ図である。
【図９】４０％（ｖ／ｖ）のコアギュローゲンを含有しない清澄化ＬＡＬ及び２０％の発色基質を含む配合物（５０／８０／２０配合）中の、実質的にコアギュローゲンを含まない清澄化ＬＡＬに関する、時間関数としての光学密度の変化を示すグラフである。４０％（ｖ／ｖ）のＬＡＬ及び２０％の発色基質を含有する配合物（５０／８０／２０配合）中の、ＬＡＬに関する、時間関数としての光学密度の変化を示すグラフである。表は、０．００５ＥＵ／ｍＬ標準に関する反応時間、並びに０．００５ＥＵ／ｍＬ及び０ＥＵ／ｍＬブランクの反応時間間の分離を比較する。
【図１０】３０ｋＤａフィルターを使用した連続的なタンジェンシャルフローろ過のそれぞれのダイアフィルトレーション容量（ＤＶ）後の、０ＥＵ／ｍＬブランク又は０．００５ＥＵ／ｍＬ保持液の反応時間を比較した棒グラフである。０．０００５ＥＵ／ｍＬ保持液の目標の反応時間は、点線で示されている１２００秒である。それぞれの組の棒下部の数字は、ブランクの反応時間と０．００５ＥＵ／ｍＬの反応時間との間の絶対差（「分離（秒）」）及び百分率差（「％分離」）を表す。正の差異は、ブランクが０．００５ＥＵ／ｍＬよりも遅く反応したことを示す。負の差異は、ブランクが０．００５ＥＵ／ｍＬよりも速く反応したことを示す。
【図１１】それぞれのダイアフィルトレーション容量後の、連続的なタンジェンシャルフローろ過からの保持液のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。およそ２０ｋＤａのバンドは、コアギュローゲンを示す。
【図１２】図１１に示したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの、２０ｋＤａのタンパク質バンドの定量を示す表及び棒グラフである。表（左）は、示された数のダイアフィルトレーション容量後に得られたそれぞれの保持液のμｇ／μＬでの総タンパク質濃度、及びそれぞれの保持液に関して計算されたゲルの全レーンにおける２０ｋＤａのバンドの百分率を示す。
【図１３】連続的なタンジェンシャルフローろ過のそれぞれのダイアフィルトレーション容量後の、μｇ／μＬでのコアギュローゲンの推定濃度を示す棒グラフである。
【図１４】ＬＡＬ中に存在する既知のタンパク質及びペプチドを示す表である。強調されたタンパク質及びペプチドは３０ｋＤａ未満の分子量を有し、３０ｋＤａの分子量カットオフフィルターを用いて除去することができる。Ｉｗａｎａｇａ及びＫａｗａｂａｔａ、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ３：ｄ９７３〜９８４（１９９８）より引用。
【図１５】ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより示された、３０ｋＤａフィルターを使用した連続的なタンジェンシャルフローろ過からの保持液（左）対１０ｋＤａフィルターを使用した連続的なタンジェンシャルフローろ過からの保持液（右）の比較を示す図及び表である。それぞれのゲル画像の下の表は、ゲル中のバンド強度により推定されるような、コアギュローゲン除去の百分率を示す。
【図１６】元の配合及びアッセイ方式（左）、並びに変更した配合及びアッセイ方式（右）を使用して調製した、未ろ過ＬＡＬ、３０ｋＤａの保持液、及び１０ｋＤａの保持液を使用したアッセイ反応時間の比較を示すグラフである。線は、０．００５ＥＵ／ｍＬ（固体）と比較した、ブランク（非固体）の反応時間差を示す。
【図１７】遠心分離速度の、ブランクと０．００５ＥＵ／ｍＬとの間の反応時間差に対する影響を比較した棒グラフである。それぞれの棒上部の数字は、反応時間を示す。
【図１８Ａ】３００〜５００ｎｍにおける吸光度により決定された未清澄化清澄化の３０ｋＤａの保持液と、４０，０００×ｇ、３０，０００×ｇ、及び２０，０００×ｇにおける遠心分離により清澄化された３０ｋＤａの保持液との光学密度の比較を示すグラフである。
【図１８Ｂ】図１７に示すような、ブランクと０．００５ＥＵ／ｍＬとの間の反応時間差（「％分離」）と遠心分離速度との相関を示すグラフである。
【図１９】凍結していない保持液（左）、又は凍結してその後、アッセイに先立って解凍した保持液を使用した、ブランク又は０．００５ＥＵ／ｍＬの反応時間の比較を示す棒グラフである。０．００５ＥＵ／ｍＬ保持液の目標の反応時間は、点線で示されている１２００秒である。それぞれの組の棒下部の数字は、保持液における、ブランクの反応時間と０．００５ＥＵ／ｍＬの反応時間との間の絶対差（「分離（秒）」）及び百分率差（「％分離」）を表す。正の差異は、ブランクが０．００５ＥＵ／ｍＬよりも遅く反応したことを示す。負の差異は、ブランクが０．００５ＥＵ／ｍＬよりも速く反応したことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
[0045]本明細書において示され、記載されている実装は例であり、別の方法で本出願の範囲を限定することは全く意図されないことが理解されるべきである。
【００２８】
[0046]本明細書において言及される公開特許、特許出願、ウェブサイト、企業名、及び科学文献は、それぞれが参照により組み込まれることを具体的に個別に示したのと同じ程度までその全体を参照により本明細書に組み込んだものとする。本明細書中で引用される任意の文献と本明細書の特定の教示の間のいかなる矛盾も後者を優先して決定されるものとする。同様に、語又は語句の本分野において理解されている定義と本明細書において具体的に教示されている語又は語句の定義の間のいかなる矛盾も後者を優先して決定されるものとする。
【００２９】
[0047]本明細書において使用される場合、内容が明らかに別のことを指示しない限り、単数形の「１つ（ａ、ａｎ）」及び「前記（ｔｈｅ）」は、具体的にそれらが言及する用語の複数形も包含する。「約」という用語は、ほぼ、〜の辺り、だいたい、又はおよそを意味するよう本明細書中で使用される。「約」という用語が数値的な範囲と共に使用される場合、その用語は、記載した数値を超える及び下回る境界に拡大することによってその範囲を変更する。一般に、「約」という用語は、２０％の変動だけ明記された値を上回る及び下回る数値に変更するよう本明細書中で使用される。
【００３０】
[0048]本明細書中で使用される技術及び科学用語は、別に定義されない限り、本出願が属する分野の当業者が一般的に理解する意味を有する。本明細書では、当業者に知られているさまざまな技法及び材料に対する参照を行う。本明細書中で引用されるいかなる文献の開示も、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００３１】
[0049]いくつかの実施形態において、本発明は、エンドトキシンを検出する方法を対象とする。「エンドトキシン」という用語は、一般にグラム陰性菌の外膜と関連づけられるリポ多糖複合体を指す。「エンドトキシン」という用語は、ときとして、任意の細胞関連細菌毒素を指すために使用される。エンドトキシンは細胞関連リポ多糖を指すが、エクソトキシンは細菌が分泌する毒素を指し、本質的に主としてポリペプチドである。
【００３２】
[0050]エンドトキシンの生物学的活性は、リポ多糖（ＬＰＳ）と関連づけられる。リポ多糖は、グラム陰性菌の細胞壁の外膜の部分である。リポ多糖は、微生物が病原性であろうとなかろうと常にグラム陰性菌と関連づけられる。毒性は、脂質成分（リピドＡ）と関連づけられ、免疫原性は、多糖成分と関連づけられる。グラム陰性菌の細胞壁抗原（Ｏ抗原）は、ＬＰＳの多糖成分である。さらに、ＬＰＳは、動物においてさまざまな炎症反応を誘発する可能性がある。
【００３３】
[0051]動物内のグラム陰性菌は、増殖している間に微量のエンドトキシンを放出することがある。エンドトキシンが、自然免疫の刺激をもたらすこともある。実験室で増殖された幼若培養菌によって少量のエンドトキシンが可溶型で放出されることもあることが知られている。しかしながら、大部分に関して、エンドトキシンは微生物の崩壊まで細胞壁と関連づけられたままである。細菌性生物の崩壊は、細菌細胞の自己溶解、補体及びリゾチームが関係する外因的溶解、並びに食細胞消化によって生じる場合がある。細菌性エンドトキシンは、ヒト腸内に豊富にある。高濃度のエンドトキシンは、いくつかのメタボリックシンドローム疾患を含む多くの状態と関連づけられる。メタボリックシンドローム疾患としては、例えば、アテローム動脈硬化症、インスリン耐性、真性糖尿病、及び肥満が挙げられる。エンドトキシンレベルの増加は、脂肪肝疾患及びクローン病とも関連づけられている。高いレベルで存在する場合、胃腸管からエンドトキシンが漏れ出す可能性もある。エンドトキシンは強力な炎症性抗原であり、エンドトキシンの漏出は、全身性炎症反応をもたらす可能性がある。
【００３４】
[0052]細菌の典型的なエクソトキシンと比較して、エンドトキシンは、酵素的に作用しないため、作用があまり強力でなく、あまり特異的でない。エンドトキシンは熱安定性である（３０分間の煮沸はエンドトキシンを不安定にしない）が、スーパーオキシド、ペルオキシド及び次亜塩素酸塩などの特定の強力な酸化剤がエンドトキシンを中和することが報告されている。これらの酸化剤は、強力な酸化剤であるため、エンドトキシンを中和するための治療用組成物にはあまり適用できない。
【００３５】
[0053]本発明のエンドトキシンは、グラム陰性菌から作り出すことができる。例となるグラム陰性菌としては、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）菌種、シゲラ菌種、サルモネラ菌種、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）菌種、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）菌種、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）菌種、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）菌種、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）菌種、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）菌種、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）菌種、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）菌種、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）菌種、コリネバクテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）菌種、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）菌種、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）菌種、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）菌種、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）菌種、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）菌種及びビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）菌種が挙げられるが、これらに限定されるものではない。グラム陰性細菌はまた、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、シュードモナス科（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、ナイセリア科（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ）、ベイヨネラ科（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａｃｅａｅ）、バクテロイデス科（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ）、ビブリオ科（Ｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅ）、パスツレラ科（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅ）、及びフソバクテリア科（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）に入るものでもよい。いくつかの実施形態において、エンドトキシンは、サルモネラ又はエシェリキア菌種由来である。
【００３６】
[0054]本明細書中で使用される場合、「エンドトキシン活性」という用語は、発熱性及び敗血症性ショックを含む毒性の原因となり得るグラム陰性菌の部分を指す。エンドトキシンによる毒の影響は、グラム陰性菌の外膜に存在するか、又はそれに由来するリポ多糖分子のグリコシル化リピドＡ部分と関連づけられることがわかっている。
【００３７】
[0055]「リポ多糖」（ＬＰＳ）という用語は、共有結合によって結合した脂質及び多糖からなる大きな分子（糖リン脂質）を指す。ＬＰＳは、３つの部分：１）Ｏ抗原、２）コアオリゴ糖、及び３）リピドＡを含む。Ｏ抗原は、コアオリゴ糖と結合した反復グリカンポリマーであり、ＬＰＳ分子の最も外側の領域を含む。コアオリゴ糖は、リピドＡと直接結合しており、一般的にヘプトース及び３−デオキシ−Ｄ−マンノオクツロソン酸（ＫＤＯ、ケトデオキシオクツロソナートとしても知られている）などの糖を含有する。リピドＡは、複数の脂肪酸と結合したリン酸化グルコサミン二糖である。脂肪酸は、ＬＰＳを細菌膜に固定し、ＬＰＳの残りの部分は、細胞表面から突き出ている。ＬＰＳが変化したか、又は除去された場合、細菌死が起こることもある。
【００３８】
[0056]エンドトキシン活性は、ＬＰＳのリピドＡ領域部分に存在する。細菌細胞が免疫系によって溶解されると、リピドＡを含有する膜の断片が血液循環に放出され、発熱（発熱性）、下痢、及び場合によっては、命にかかわるショック（エンドトキシン又は敗血症性ショックと呼ばれる）を引き起こす。ＬＰＳの毒性は、宿主に対して命にかかわる結果がある場合もある、炎症性サイトカイン、主に腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の分泌に至るプロセスである哺乳動物の免疫系のＢ細胞及びマクロファージとの相互作用によりリピドＡによって示される。リピドＡはまた、「インビトロにおいて」ヒトＴリンパ球（Ｔｈ−１）並びに「インビボにおいて」マウスのＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化し、その特性が、宿主の免疫系がＬＰＳの可変サイズの炭水化物鎖に対して特異的な既往ＩｇＧ抗体応答を開始するのを可能にする。これらに基づいて、ＬＰＳは、「インビボにおける」Ｔ細胞依存性抗原として最近、認識されている。したがって、いくつかの実施形態において、本発明の方法は、リピドＡを検出することを対象とする。
【００３９】
[0057]いくつかの実施形態において、エンドトキシンは、発色アッセイを使用して検出される。本明細書中で使用される場合、発色アッセイは、エンドトキシンの存在下における発色基質（すなわち、色原体）の吸光度の変化を測定又は検出する。いくつかの実施形態において、発色基質の吸光度の変化は、酵素活性によるものである。いくつかの実施形態において、「発色基質」という用語は、酵素活性の前及び後の基質を指す。例えば、発色基質が、酵素によって切断されて、ペプチドと発色団を生じるペプチド発色団である場合、「発色基質」という用語は、ペプチド発色団、切断されたペプチド、及び放出発色団を指すであろう。いくつかの実施形態において、合成色原体が使用されてもよい。いくつかの実施形態において、天然に産生される色原体が使用されてもよい。いくつかの実施形態において、発色基質は、合成ペプチドである。いくつかの実施形態において、基質は、極めて高感度であり、すなわち、非常に低い酵素活性を検出することができる。
【００４０】
[0058]低い酵素濃度を検出するための発色基質を含む試薬の能力は、発色基質を、例えば、研究又は品質管理手順のいずれかにおけるエンドトキシンと関連づけられる特定の酵素活性の存在に関する調査に対して有用にする。場合によっては、特定の酵素調製物に対する基質の応答が天然発色基質（すなわち、酵素に対する天然基質）と合成発色基質との間で一致しないこともある。いくつかの実施形態において、発色基質は、天然基質と比較して選択性が低く、すなわち、関連酵素に対する反応性において低い識別力を有する。
【００４１】
[0059]「発色基質」という用語は、エンドトキシンの存在下において基質の吸光度スペクトルを変化させる、例えば、色を変化させる、アッセイにおける基質、例えば、化合物又はポリペプチドを指す。発色基質は、特定の波長において（ｉ）吸収する、及び／又は（ｉｉ）吸収しない、の両方の基質を指す。したがって、例えば、本開示によると、発色基質は、特定の波長をもともと吸収しない場合もあり（例えば、可視波長において非吸収）、その後、エンドトキシンの存在下において、特定の波長で（例えば、可視波長において）吸収し始める場合もある。或いは、例えば、発色基質は、特定の波長においてもともと吸収する場合もあり（例えば、可視波長において吸収する）、その後、エンドトキシンの存在下において、特定の波長において吸収しない場合もある（例えば、可視波長において吸収しない）。いくつかの実施形態において、発色基質は、エンドトキシンの非存在下で所与の波長において吸収し、その後、エンドトキシンの存在下で異なる波長において吸収する場合もある。１つ以上の特定の波長における吸光度特性すなわち、発色効果の変化は、エンドトキシンの存在と相互に関連する場合がある。
【００４２】
[0060]いくつかの実施形態において、発色基質は、発色ペプチド基質である。いくつかの実施形態において、発色ペプチド基質は、初めは無色である。いくつかの実施形態において、発色ペプチド基質は、初めに色、例えば、可視スペクトル（およそ３９０〜７００ｎｍ）の色を有する。いくつかの実施形態において、発色ペプチド基質が、酵素によって切断されると、色の変化が生じる場合があり、例えば、発色団が放出されて、得られた生成物の色の変化を引き起こす。いくつかの実施形態において、切断が生成物の光学的性質を変化させ、この性質は切断されていない基質の性質とは異なり、分光光度測定によって測定することができる。ペプチド基質と結合できる発色基の非限定例は、パラ−ニトロアニリン（ｐＮＡ）、５−アミノ−２−ニトロ安息香酸（ＡＮＢＡ）、７−アミノ−４−メトキシクマリン（ＡＮＣ）、キノニルアミド（ＱＵＡ）、ジメチル５−アミノイソフタレート（ＤＰＡ）及びそれらの誘導体である。蛍光基質としては、Ｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＡＭＣ［Ｚ＝ベンジルオキシカルボニル；ＡＭＣ＝７−アミノ−４−メチルクマリン］、ホモバニリン酸、４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル酢酸、還元型フェノキサジン、還元型ベンゾチアジン、アンプレックス（Ａｍｐｌｅｘ）（登録商標）、レゾルフィンβ−Ｄ−ガラクトピラノシド、フルオレセインジガラクトシド（ＦＤＧ）、フルオレセインジグルクロニド及びそれらの構造的変形（参照により組み込まれる、米国特許第５，２０８，１４８号、同第５，２４２，８０５号、同第５，３６２，６２８号、同第５，５７６，４２４号、及び同第５，７７３，２３６号）、４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド、カルボキシウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド及びフッ素化クマリンβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（参照により組み込まれる、米国特許第５，８３０，９１２号）が挙げられるが、それらに限定されない。
【００４３】
[0061]非限定発色アッセイは、Ｃ因子／Ｂ因子カスケードに基づく酵素活性アッセイである。そのカスケードにおける第１の成分であるＣ因子は、エンドトキシン結合によって活性化されるプロテアーゼ前駆体である。いくつかの実施形態において、発色アッセイは、組換え型のＣ因子（ｒＦＣ）を使用する。この経路において、Ｂ因子は、Ｃ因子によって活性化される。Ｂ因子は、凝固酵素前駆体を凝固酵素に活性化する。いくつかの実施形態において、凝固酵素前駆体は、発色基質の発色変化を引き起こす。いくつかの実施形態において、発色アッセイは、ＬＡＬアッセイ、例えば、ロンザのエンドポイント発色ＬＡＬアッセイ（Ｅｎｄｐｏｉｎｔ  Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ  ＬＡＬ  Ａｓｓａｙ）である。
【００４４】
[0062]いくつかの実施形態において、発色アッセイは、ＬＡＬアッセイであり、この場合、ＬＡＬエンドトキシン反応の最初の部分が、凝固酵素前駆体を活性化し、酵素が、次に合成基質からｐ−ニトロアニリン（ｐＮＡ）を酵素的に切断して、黄色の色を生じさせる。
【００４５】
酵素前駆体＋エンドトキシン→酵素
基質＋Ｈ２Ｏ＋酵素→ペプチド＋ｐＮＡ（黄色）
[0063]いくつかの実施形態において、グラム陰性菌エンドトキシンは、ＬＡＬ中の酵素前駆体の活性化を間接的に触媒することが可能である。活性化の最初の速度は、存在するエンドトキシンの濃度によって決まる可能性がある。
【００４６】
[0064]いくつかの実施形態において、発色基質の変化は、酵素反応により生じる。いくつかの実施形態において、酵素反応は、ペプチド結合の切断をもたらし、それによって、ポリペプチドから発色団置換基（例えば、ｐ−ＮＡ）を切断する。例えば、活性化酵素は、無色のペプチド基質、例えば、Ａｃ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ｐＮＡからのｐＮＡの放出を触媒することができる。いくつかの実施形態において、ペプチド基質は、３個を超えるアミノ酸と共有結合したｐ−ニトロアニリンである。いくつかの実施形態、実施形態において、発色基質は、Ａｃ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ｐＮＡである。いくつかの実施形態において、発色アッセイは、遊離ｐＮＡを測定する。いくつかの実施形態において、発色アッセイは、３８０ｎｍ〜４１０ｎｍ、例えば、４００ｎｍ〜４１０ｎｍ、又は４０５ｎｍの吸光度において遊離ｐＮＡを測光法で測定する。吸光度を測定する方法は、当業者に周知である。いくつかの実施形態において、発色アッセイは、吸光度を測定するために、シングルキュベット分光測定、マルチキュベット分光測定、又はマイクロプレートリーダーを使用して行われる。
【００４７】
[0065]遊離ｐＮＡは、反応が停止試薬により停止された後、３８０ｎｍ〜４１０ｎｍ、例えば、４０５ｎｍにおいて測光法で測定することができる。サンプル中のエンドトキシンの濃度は、既知の量のエンドトキシン標準を含有する溶液の吸光度値の標準曲線から算出される。
【００４８】
[0066]エンドトキシンを検出するための標準的な発色アッセイの１つは、サンプルを試薬と接触させるステップを含み、試薬は、リムルスアメボサイトライセート（ＬＡＬ）を含む。いくつかの実施形態において、試薬は、液体、例えば、水性液体である。或いは、試薬は、凍結乾燥され、その後、サンプルと接触させられる前に水性液体、例えば、滅菌水又はバッファー溶液中で再構成されてもよい。いくつかの実施形態において、試薬は、液体である。いくつかの実施形態において、試薬は、水性液体である。いくつかの実施形態において、試薬は、凍結乾燥され、その後、サンプルと接触させるステップに先立って水性液体中で再構成される。いくつかの実施形態において、ＬＡＬは、凍結乾燥され、その後、サンプルと接触させるステップに先立って水性液体中で再構成される。いくつかの実施形態において、発色基質は、凍結乾燥され、その後、サンプルと接触させるステップに先立って水性液体中で再構成される。いくつかの実施形態において、凍結乾燥は、発色アッセイにおける試薬、ＬＡＬ、及び／又は発色基質のより長い及び／又はより確固とした保管を可能にする。例えば、いくつかの実施形態において、凍結乾燥試薬、ＬＡＬ及び／又は発色基質は、発色アッセイにおける非凍結乾燥試薬、ＬＡＬ、及び又は発色基質と比較して、２０％を超える、３０％を超える、４０％を超える、５０％を超える、６０％を超える、７０％を超える、８０％を超える、９０％を超える又は１００％を超える安定性の時間の増加を可能にする。この文脈において使用される場合の「安定性」は、意図した目的のため、すなわち、同じ速度及び感度でエンドトキシンを検出するために働くアッセイを指す。例えば、非凍結乾燥試薬が３週間安定であった場合、６週間安定の凍結乾燥試薬が、安定性の時間の「１００％の増加」を有することになろう。
【００４９】
[0067]いくつかの実施形態において、ＬＡＬは、凍結され、その後、サンプルと接触させるステップに先立って解凍される。いくつかの実施形態において、ＬＡＬの凍結は、ＬＡＬのより長い及び／又はより確固とした保管を可能にする。いくつかの実施形態において、凍結されてその後解凍されたＬＡＬは、凍結されなかったＬＡＬと同じ又は実質的に同じアッセイ性能を有する。この文脈において、「同じ又は実質的に同じ」アッセイ性能は、ブランク反応とＬＡＬを使用する反応とを比較する場合、反応時間が同様に減少することを指す。いくつかの実施形態において、凍結されなかったＬＡＬと凍結されてその後解凍されたＬＡＬとの間の反応時間減少量の違いは、２０％未満である。いくつかの実施形態において、反応時間の減少量の違いは、１０％未満である。いくつかの実施形態において、反応時間の減少量の違いは、５％未満である。いくつかの実施形態において、反応時間の減少量の違いは、１％未満である。いくつかの実施形態において、ＬＡＬは凍結され、約−２０℃で保管される。いくつかの実施形態において、ＬＡＬは凍結され、約−３０、約−４０、約−５０、約−６０、約−７０、又は約−８０℃において保管される。いくつかの実施形態において、ＬＡＬは、急速冷凍される。いくつかの実施形態において、ＬＡＬは、ドライアイス又は液体窒素を使用して急速冷凍される。
【００５０】
[0068]いくつかの実施形態において、ＬＡＬは１週間を超える、１ヵ月を超える、３ヵ月を超える、６ヵ月を超える、９ヵ月を超える、１２ヵ月を超える、１５ヵ月を超える、１８ヵ月を超える、又は２４ヵ月を超える間凍結され、その後、凍結されたＬＡＬは解凍され、凍結されなかったＬＡＬと同じ又は実質的に同じアッセイ性能を有する。いくつかの実施形態において、ＬＡＬは１週間〜５年、１ヵ月〜４年、３ヵ月〜３年、又は６ヵ月〜２年の間凍結され、その後、凍結されたＬＡＬは解凍され、凍結されなかったＬＡＬと同じ又は実質的に同じアッセイ性能を有する。
【００５１】
[0069]本開示は、サンプル中のエンドトキシンを検出するための改善された方法を提供する。「サンプル」という用語は、任意の物質、化合物、ツール又は機器を含んでもよい。但し、実際的な目的に対して、サンプルとしては、生物学的な生物、例えば、哺乳動物、ヒト、飼育動物、又は動物園の動物と接触した物質、化合物、ツール又は機器を挙げることができる。「サンプル」という用語は、（製造プロセスの終わりまでに受け取る原料からの）エンドトキシンの発生源が、サンプルを脳脊髄液又は心血管系と接触させるのには適していないものにする可能性のあるあらゆる医療機器、医薬品及びバイオテクノロジー製品を指す場合がある。いくつかの実施形態において、サンプルという用語は、インビボで脳脊髄液又は心血管系、例えば、ヒトと接触させることになる医療機器を指す。いくつかの実施形態において、サンプルという用語は、生物学的サンプルを指す。いくつかの実施形態において、サンプルは、非経口剤形、ワクチン、抗生剤、治療用タンパク質、治療用核酸、治療用抗体、及び生物学的製剤からなる群から選択される。
【００５２】
[0070]「リムルスアメボサイトライセート」（ＬＡＬ）という用語は、カブトガニ、アメリカカブトガニ由来の血液細胞の水性抽出物（アメボサイト）を指す。カブトガニ由来の血液細胞の水性抽出物は、感染菌を動けなくすることによって感染菌の広がりを妨げる血リンパのゲル形成タンパク質であるコアギュローゲンを含む。例えば、Ｉｗａｎａｇａ  Ｓら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９８：３０５〜３１８ページ（１９８５年）及びＩｗａｎａｇａ  Ｓら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９５（６）：１７９３〜１８０１ページ（１９８４年）参照。
【００５３】
[0071]カブトガニ（リムルス）の凝固カスケード系は、血流停止及び宿主防御の両方に関与する。このカスケードは、可溶性タンパク質であるコアギュローゲンの不溶性コアギュリンゲルへの変換をもたらす。凝固酵素は、コアギュローゲンから断片ペプチドＣを削り取り、モノマーの凝集を引き起こす。
【００５４】
[0072]「コアギュローゲン」という用語は、Ｉｗａｎａｇａ（１９８４年）及びＩｗａｎａｇａ（１９８５年）において見られるとおりのポリペプチド鎖を指し、このポリペプチド鎖は、単一の１７５残基のポリペプチド鎖であり、血球に含有される凝固酵素によってＡｒｇ−１８及びＡｒｇ−４６の後で切断され、細菌性エンドトキシン（リポ多糖）によって活性化される。切断は、ペプチドＣとともに、２つのジスルフィド結合によって連結されコアギュリンの２つの鎖、Ａ及びＢを放出する。ゲル形成は、コアギュリン分子の連結の結果生じる。二次構造予測は、コアギュローゲンからコアギュリンゲルへのタンパク質分解性変換中に放出されるＣペプチドがアルファ−ヘリックスを形成することを示唆する。分子中に見られるベータ−シート構造及び１６ハーフシスチンが、酸及び熱に対して安定な小型のタンパク質をもたらすようである。
【００５５】
[0073]コアギュローゲンは、ゲル形成（例えば、凝固アッセイ）に重要であるが、本開示は、発色アッセイには必須ではないことを発見している。本開示は、天然に生じる量のコアギュローゲンを伴う、清澄化されていないＬＡＬを含む発色アッセイと比較して、実質的にコアギュローゲンを含まない清澄化ＬＡＬを含む発色アッセイが高いレベルの速度、感度、及び分離を達成したことを発見している。したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、実質的にコアギュローゲンを含まない清澄化ＬＡＬを含む発色アッセイを対象とする。
【００５６】
[0074]いくつかの実施形態において、清澄化ＬＡＬは、実質的にコアギュローゲンを含まない。便宜上、本明細書のいくつかの実施形態において、実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬは、「ＬＡＬ−ｃｏ」とも称される。当業者は、本開示を読むと、さまざまな量のコアギュローゲンの減少が発色アッセイ、例えば、ＬＡＬアッセイにおける速度、感度及び／又は分離のレベルを高めることになることを理解するであろう。いくつかの実施形態において、「実質的に含まない」という用語は、タンパク質染色を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定され、ウエスタンブロットによって確認された場合に、ＬＡＬ中の総タンパク質に対して５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、２％未満、１％未満又は０．５％（ｗｔ／ｗｔ）未満のコアギュローゲンを有するＬＡＬを指す。いくつかの実施形態において、「実質的に含まない」という用語は、タンパク質染色を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定され、ウエスタンブロットによって確認された場合に、ＬＡＬ中の総タンパク質に対して１０％未満又は５％（ｗｔ／ｗｔ）未満のコアギュローゲンを有するＬＡＬを指す。いくつかの実施形態において、「実質的に含まない」という用語は、約２０μｇ／μＬ未満、約１５μｇ／μＬ未満、約１０μｇ／μＬ未満、約５μｇ／μＬ未満、約４μｇ／μＬ未満、約３μｇ／μＬ未満、約２μｇ／μＬ未満、又は約１μｇ／μＬ未満のコアギュローゲン濃度を有するＬＡＬを指す。いくつかの実施形態において、「実質的に含まない」という用語は、２０μｇ／μＬ〜０．００１μｇ／μＬ、１５μｇ／μＬ〜０．０１μｇ／μＬ、１０μｇ／μＬ〜０．１μｇ／μＬ、５μｇ／μＬ〜０．５μｇ／μＬ、４μｇ／μＬ〜０．５μｇ／μＬ、３μｇ／μＬ〜０．５μｇ／μＬ、２μｇ／μＬ〜０．５μｇ／μＬ、又は１μｇ／μＬ未満のコアギュローゲン濃度を有するＬＡＬを指す。いくつかの実施形態において、「実質的に含まない」という用語は、１０μｇ／μＬ〜１μｇ／μＬ、５μｇ／μＬ〜１μｇ／μＬ、４μｇ／μＬ〜１μｇ／μＬ、３μｇ／μＬ〜１μｇ／μＬ、２μｇ／μＬ〜１μｇ／μＬ、又は１μｇ／μＬ未満のコアギュローゲン濃度を有するＬＡＬを指す。コアギュローゲン濃度は、例えば、吸光分光測定（ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルバンド若しくはウエスタンブロットバンドの定量、又はコアギュローゲン濃度を測定するものとして知られるその他任意の方法を使用して決定することができる。いくつかの実施形態において、「実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬ」中のコアギュローゲンの測定濃度は、従来の検出方法を使用した最小検出量の誤差範囲内であるため、正確に決定することができない。
【００５７】
[0075]いくつかの実施形態において、実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬという用語は、コアギュローゲンが除去されていないＬＡＬ中のコアギュローゲンの量と比較して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は少なくとも９９．５％（ｗｔ／ｗｔ）のコアギュローゲンが除去されたＬＡＬを指す。
【００５８】
[0076]当業者は、ＬＡＬからコアギュローゲンを除去するためにさまざまな方法を使用することが可能であることを理解することができる。これらのそれぞれの方法は、効率、精製率、費用、及び労力が異なる場合もあるが、当業者の知識の範囲内である。本開示は、タンジェンシャルフローろ過を使用して、実質的にコアギュローゲンを含まない清澄化ＬＡＬを生成する方法を含む。タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）は、供給流の大部分がフィルターの中へではなく、フィルターの面を横切って接線方向に移動するクロスフローろ過を指す。ＴＦＦを使用することによって、（フィルターを詰まらせる可能性がある）大半のＬＡＬタンパク質を含む保持液が、ろ過プロセスの間に実質的に洗い流され、コアギュローゲンが透過液にろ過される。いくつかの実施形態において、ＴＦＦは、バッチ式デッドエンドろ過とは異なる連続的なプロセス、すなわち、連続的なタンジェンシャルフローろ過又は連続的なＴＦＦである。いくつかの実施形態において、連続的なＴＦＦは、ダイアフィルトレーション溶液、すなわち水又はバッファーを透過液の生成と同じ速度でサンプルに加えるステップを含み、したがって、フィルターを自由に透過できる成分が洗い流される間、サンプル体積は一定のままである。いくつかの実施形態において、ダイアフィルトレーションは、タンジェンシャルフローろ過の一種である。ダイアフィルトレーションは、最終的に体積を変化させることなく、膜又はフィルターを通してより小さな分子を洗い、より大きな分子を保持液に残す分画プロセスを指す。ダイアフィルトレーション容量、すなわちＤＶは、ダイアフィルトレーション溶液が加えられる前のサンプル体積である。実施形態において、タンジェンシャルフローろ過においてより多くのダイアフィルトレーション容量を使用することは、透過液のより多くの除去をもたらす。
【００５９】
[0077]実質的にコアギュローゲンを含まない「清澄化リムルスアメボサイトライセート」（又は「清澄化ＬＡＬ」）という用語は、ＬＡＬの濁った外観を作り出す成分を除去するためにさらに処理した、上述の、実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬを指す。実施形態において、清澄化ＬＡＬは、実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬを遠心分離するプロセスにより生成される。いくつかの実施形態において、「清澄化ＬＡＬ」という用語は、ＬＡＬが視覚的に十分に澄むまでの期間、酵素を破壊することなく、１８００ｇ（すなわち、１８００×重力加速度）超、２２００ｇ超、２６００ｇ超、３０００ｇ超、３４００ｇ超、３８００ｇ超、４２００ｇ超、４６００ｇ超、５０００ｇ超、５４００ｇ超、５８００ｇ超、６０００ｇ超、６１００ｇ超、又は６２００ｇ超において、遠心分離されたＬＡＬを指す。いくつかの実施形態において、「清澄化ＬＡＬ」という用語は、ＬＡＬが視覚的に十分に澄むまでの期間、酵素を破壊することなく、１８００〜８０００ｇ、２２００ｇ〜７６００ｇ、２６００ｇ〜７２００ｇ、３０００ｇ〜７２００ｇ、３４００ｇ〜７２００ｇ、３８００ｇ〜７２００ｇ、４２００ｇ〜７２００ｇ、４６００ｇ〜７２００ｇ、５０００ｇ〜７２００ｇ、５４００ｇ〜７２００ｇ、５８００ｇ〜７２００ｇ、又は６１００ｇ〜７２００ｇにおいて、遠心分離されたＬＡＬを指す。
【００６０】
[0078]いくつかの実施形態において、実質的にコアギュローゲンを含まない「清澄化リムルスアメボサイトライセート」（又は「清澄化ＬＡＬ」）という用語は、ＬＡＬの濁った外観を作り出す成分を除去するために、実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬを、２０，０００×ｇ超、２２，０００×ｇ超、２４，０００×ｇ超、２５，０００×ｇ超、２６，０００×ｇ超、２８，０００×ｇ超、３０，０００×ｇ超、３５，０００×ｇ超、４０，０００×ｇ超、４５，０００×ｇ超、又は５０，０００×ｇ超において遠心分離するプロセスによりさらに処理した、上述の、実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬを指す。いくつかの実施形態において、実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬは、２０，０００〜５０，０００×ｇ超、２０，０００〜４０，０００×ｇ、２５，０００〜５０，０００×ｇ、２５，０００〜４０，０００×ｇ、又は３０，０００〜４０，０００×ｇにおいて遠心分離される。いくつかの実施形態において、実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬは、２０分を超える、３０分を超える、４０分を超える、又は６０分を超える間、遠心分離される。いくつかの実施形態において、実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬは、２０〜１２０分間、２０〜９０分間、２０〜６０分間、２０〜４０分間、又は約３０分間、遠心分離される。
【００６１】
[0079]いくつかの実施形態において、「清澄化ＬＡＬ」という用語は、３分を超える、４分を超える、５分を超える、６分を超える、７分を超える、８分を超える、９分を超える、又は１０分を超える間、遠心分離されたＬＡＬを指す。いくつかの実施形態において、「清澄化ＬＡＬ」という用語は、３分間〜３０分間、４分間〜２５分間、４分間〜２０分間、５分間〜１５分間、又は５分間〜１０分間、遠心分離されたＬＡＬを指す。当業者は、遠心分離速度がより遅いと、より長い遠心分離時間が必要となる場合があり、時間及び／又は速度をしかるべく調節してＬＡＬの視覚的な濁りを減少させることになるということを理解することができる。いくつかの実施形態において、「清澄化ＬＡＬ」という用語は、約５０００ｇ〜約７０００ｇで約３分間〜約１０分間、又は約６１２０ｇで５分間遠心分離した、実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬを指す。実施形態において、実質的にコアギュローゲンを含まない清澄化ＬＡＬは、溶解されたアメリカカブトガニ由来のアメボサイト由来の溶液を、４℃において２０００ｒｐｍ（９８０ｇ）で８分間遠心分離するステップにより生成される。清澄化ＬＡＬは、遠心分離後の上澄みに見られる。いくつかの実施形態において、その後、得られた上澄みをバッファーと合わせ、その後、得られた上澄み及びバッファーの組み合わせを３０ｋＤａメンブランフィルターを使用したタンジェンシャルフローろ過に供して保持液を生成し、保持液を４℃において５，０００ｒｐｍ（６１２０ｇ）で５分間遠心分離して上澄みを生成する。上澄みは、実質的にコアギュローゲンを含まない清澄化ＬＡＬである。実施形態において、溶解されたアメリカカブトガニ由来のアメボサイト由来の溶液は、複数の、アメリカカブトガニの溶解されたアメボサイトのプールである。
【００６２】
[0080]いくつかの実施形態において、実質的にコアギュローゲンを含まない清澄化ＬＡＬは、溶解されたアメリカカブトガニ由来のアメボサイト由来の溶液を得ることにより生成される。いくつかの実施形態において、その後、溶液をバッファーと合わせ、その後、得られた溶液及びバッファーの組み合わせを２０ｋＤａ〜５０ｋＤａメンブランフィルターを使用した連続的なタンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）に供して保持液を生成し、保持液を、４℃において２０，０００×ｇ超で２５分を超える間遠心分離して、上澄みを生成する。上澄みは、実質的にコアギュローゲンを含まない清澄化ＬＡＬである。実施形態において、溶解されたアメリカカブトガニ由来のアメボサイト由来の溶液は、複数の、アメリカカブトガニの溶解されたアメボサイトのプールである。いくつかの実施形態において、連続的なＴＦＦは、少なくとも４のダイアフィルトレーション容量（ＤＶ）を含む。いくつかの実施形態において、連続的なＴＦＦは、少なくとも５のダイアフィルトレーション容量を含む。いくつかの実施形態において、連続的なＴＦＦは、少なくとも６のダイアフィルトレーション容量を含む。いくつかの実施形態において、連続的なＴＦＦは、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、又は少なくとも１５のダイアフィルトレーション容量を含む。
【００６３】
[0081]いくつかの実施形態において、本開示による実質的にコアギュローゲンを含まない清澄化ＬＡＬは、本明細書に記載されている技術的特徴の任意の組み合わせを利用する方法により、生成される。したがって当業者は、実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬを生成するのに十分な、列挙されたフィルター、フィルターサイズ、フィルター流量、バッファー、遠心分離速度、遠心分離温度、遠心分離時間などのいずれかを使用することができる。例えば、いくつかの実施形態において、ＬＡＬは、（ｉ）２０，０００×ｇ超、２２，０００×ｇ超、２４，０００×ｇ超、２５，０００×ｇ超、２６，０００×ｇ超、２８，０００×ｇ超、３０，０００×ｇ超、３５，０００×ｇ超、４０，０００×ｇ超、４５，０００×ｇ超、又は５０，０００×ｇ超において遠心分離され、（ｉｉ）２℃〜１０℃、２℃〜８℃、又は４℃の温度で遠心分離され、（ｉｉｉ）２０〜１２０分間、２０〜９０分間、２０〜６０分間、２０〜４０分間、又は約３０分間遠心分離され、（ｉｖ）５００ｍＬ／分を超える、例えば、５００ｍＬ／分〜２０００ｍＬ／分、８００ｍＬ／分〜１５００ｍＬ／分、又は１０００ｍＬ／分〜１２００ｍＬ／分の流量でＴＦＦを受け、（ｖ）５０ｋＤａフィルター、４５ｋＤａフィルター、４０ｋＤａフィルター、３５ｋＤａフィルター、３０ｋＤａフィルター、２５ｋＤａフィルター、又は２０ｋＤａフィルターを使用するＴＦＦを受け、（ｖｉｉ）少なくとも４ＤＶ、少なくとも５ＤＶ、少なくとも６ＤＶ、少なくとも７ＤＶ、又は少なくとも８ＤＶを使用するＴＦＦを受ける、などである。
【００６４】
[0082]いくつかの実施形態において、発色アッセイは、サンプル中のエンドトキシンの有無を判断する。他の実施形態において、発色アッセイは、サンプル中のエンドトキシンの量を定量することができる。いくつかの実施形態において、本方法は、サンプル中のエンドトキシンの量を求めるために、サンプル中のエンドトキシンの発色効果を既知のエンドトキシン標準と比較するステップをさらに含む。
【００６５】
[0083]いくつかの実施形態において、本開示は、発色アッセイを使用して、生物学的サンプル中のエンドトキシンを検出する方法であって、本方法は、（ａ）生物学的サンプルを清澄化リムルスアメボサイトライセート（ＬＡＬ）及びＡｃ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ｐＮＡを含む水性試薬と接触させるステップと、（ｂ）サンプル中のエンドトキシンの存在下におけるＡｃ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ｐＮＡからのｐＮＡの酵素切断によって生じる４０５ｎｍにおける吸光度の変化を測定するステップとを含み、ＬＡＬが、実質的にコアギュローゲンを含まない、方法を対象とする。
【００６６】
[0084]実施形態において、本発明は、発色アッセイを使用して、サンプル中のエンドトキシンを検出する方法であって、本方法は、（ａ）３０％〜６０％（ｖ／ｖ）の実質的にコアギュローゲンを含まない清澄化ＬＡＬを含む第１の溶液を、発色基質を含む第２の溶液と合わせて第３の溶液を生成するステップであって、第３の溶液の７５％〜８５％（ｖ／ｖ）が第１の溶液であり、第３の溶液の１５％〜２５％（ｖ／ｖ）が第２の溶液である、ステップと、（ｂ）第３の溶液をエンドトキシンを含有するサンプルと合わせるステップと、（ｃ）発色基質の吸光度の変化を測定するステップとを含む、方法を提供する。実施形態において、本発明は、発色アッセイを使用して、サンプル中のエンドトキシンを検出する方法であって、本方法は、（ａ）５０％（ｖ／ｖ）の実質的にコアギュローゲンを含まない清澄化ＬＡＬを含む第１の溶液を、発色基質を含む第２の溶液と合わせて第３の溶液を生成するステップであって、第３の溶液の８０％（ｖ／ｖ）が第１の溶液であり、第３の溶液の２０％（ｖ／ｖ）が第２の溶液である、ステップと、（ｂ）第３の溶液をエンドトキシンを含有するサンプルと合わせるステップと、（ｃ）発色基質の吸光度の変化を測定するステップとを含む、方法を提供する。実施形態において、第１の溶液は、バッファー及び界面活性剤をさらに含む。実施形態において、本発明は、発色アッセイを使用して、サンプル中のエンドトキシンを検出する方法であって、本方法は、（ａ）３５〜４５％（ｖ／ｖ）の実質的にコアギュローゲンを含まない清澄化ＬＡＬ及び１５％〜２５％（ｖ／ｖ）の発色基質を含む溶液を、生物学的サンプルと接触させるステップと、（ｂ）発色基質の吸光度の変化を測定するステップとを含む、方法を提供する。実施形態において、本発明は、発色アッセイを使用して、サンプル中のエンドトキシンを検出する方法であって、本方法は、（ａ）４０％（ｖ／ｖ）の実質的にコアギュローゲンを含まない清澄化ＬＡＬ及び２０％（ｖ／ｖ）の発色基質を含む溶液を、生物学的サンプルと接触させるステップと、（ｂ）発色基質の吸光度の変化を測定するステップとを含む、方法を提供する。実施形態において、実質的にコアギュローゲンを含まない清澄化ＬＡＬを含む溶液は、バッファー及び界面活性剤をさらに含む。
【００６７】
[0085]実施形態において、ＬＡＬからコアギュローゲンを除去し、コアギュローゲンを含まないＬＡＬを清澄化することで、発色アッセイは驚くほどに高い感度を有する。いくつかの実施形態において、本方法は、０．０００１ＥＵ／ｍＬ〜１．０ＥＵ／ｍＬエンドトキシンの感度を有する。実施形態において、本方法は、０．０００５ＥＵ／ｍＬ〜１．０ＥＵ／ｍＬエンドトキシン、０．００８ＥＵ／ｍＬ〜１．０ＥＵ／ｍＬエンドトキシン、０．００１ＥＵ／ｍＬ〜１．０ＥＵ／ｍＬエンドトキシン、０．００５ＥＵ／ｍＬ〜１．０ＥＵ／ｍＬエンドトキシン、０．０１ＥＵ／ｍＬ〜１．０ＥＵ／ｍＬエンドトキシン、０．０２ＥＵ／ｍＬ〜１．０ＥＵ／ｍＬエンドトキシン、０．０３ＥＵ／ｍＬ〜１．０ＥＵ／ｍＬエンドトキシン、又は０．０５ＥＵ／ｍＬ〜１．０ＥＵ／ｍＬエンドトキシンの感度を有する。実施形態において、０．０５ＥＵ／ｍＬ未満、０．０３ＥＵ／ｍＬ未満、０．０１ＥＵ／ｍＬ未満、０．００８ＥＵ／ｍＬ未満、０．００６ＥＵ／ｍＬ未満、０．００５ＥＵ／ｍＬ未満、０．００４ＥＵ／ｍＬ未満、０．００３ＥＵ／ｍＬ未満、０．００２ＥＵ／ｍＬ未満、又は０．００１ＥＵ／ｍＬ未満である。
【００６８】
[0086]いくつかの実施形態において、清澄化ＬＡＬ−ｃｏは、清澄化されていないＬＡＬ−ｃｏと比較してより滑らかな反応特性をもたらす。いくつかの実施形態において、別バッチ間の反応特性は、反応特性がより滑らかなためによりばらつきが少ない。いくつかの実施形態において、清澄化ＬＡＬ−ｃｏの反応特性は、清澄化されていないＬＡＬ−ｃｏと比較して曲線により良く適合する。
【００６９】
[0087]いくつかの実施形態において、清澄化ＬＡＬ−ｃｏは、清澄化されていないＬＡＬ−ｃｏと比較してより滑らかな反応特性をもたらす。いくつかの実施形態において、別バッチ間の反応特性は、反応特性がより滑らかなためによりばらつきが少ない。いくつかの実施形態において、清澄化ＬＡＬ−ｃｏの反応特性は、清澄化されていないＬＡＬ−ｃｏと比較して曲線により良く適合する。
【００７０】
[0088]いくつかの実施形態において、清澄化ＬＡＬ−ｃｏは、清澄化されていないＬＡＬ−ｃｏと比較して、指定の光学密度により速く到達する。いくつかの実施形態において、清澄化ＬＡＬ−ｃｏは、清澄化されていないＬＡＬ−ｃｏと比較して、３０ｍＯＤにより速く到達する。いくつかの実施形態において、清澄化ＬＡＬ−ｃｏは、清澄化されていないＬＡＬ−ｃｏと比較して、３０ｍＯＤに２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、又は８０％速く到達する。いくつかの実施形態において、清澄化ＬＡＬ−ｃｏは、清澄化されていないＬＡＬ−ｃｏと比較して、５０ｍＯＤにより速く到達する。いくつかの実施形態において、清澄化ＬＡＬ−ｃｏは、清澄化されていないＬＡＬ−ｃｏと比較して、５０ｍＯＤに２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、又は８０％速く到達する。
【００７１】
[0089]いくつかの実施形態において、清澄化ＬＡＬ−ｃｏは、清澄化されていないＬＡＬ−ｃｏと比較して、０ＥＵ／ｍＬ標準（ブランク標準）と０．００５ＥＵ／ｍＬ標準との間に、より大きな（時間）分離を有する。いくつかの実施形態において、清澄化ＬＡＬ−ｃｏは、清澄化されていないＬＡＬ−ｃｏと比較して、０ＥＵ／ｍＬ標準（ブランク標準）と０．００５ＥＵ／ｍＬ標準との間に、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、又は８０％大きな（時間）分離を有する。いくつかの実施形態において、清澄化ＬＡＬ−ｃｏは、清澄化されていないＬＡＬ−ｃｏと比較して、０ＥＵ／ｍＬ標準（ブランク標準）と０．０００５ＥＵ／ｍＬ標準との間に、より大きな（時間）分離を有する。いくつかの実施形態において、清澄化ＬＡＬ−ｃｏは、清澄化されていないＬＡＬ−ｃｏと比較して、０ＥＵ／ｍＬ標準（ブランク標準）と０．０００５ＥＵ／ｍＬ標準との間に、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、又は８０％大きな（時間）分離を有する。本発明は、（ａ）実質的にコアギュローゲンを含まない清澄化ＬＡＬ（「ＬＡＬ−ｃｏ」）と（ｂ）バッファーとを含む組成物を、さらに提供する。実施形態において、このような組成物は３０％〜６０％（ｖ／ｖ）の清澄化ＬＡＬ−ｃｏを含み、実施形態においては、４０％〜６０％（ｖ／ｖ）、実施形態においては、５０％（ｖ／ｖ）の清澄化ＬＡＬ−ｃｏを含む。実施形態において、本発明は、（ａ）実質的にコアギュローゲンを含まない清澄化ＬＡＬと、（ｂ）バッファーと、（ｃ）界面活性剤とを含む組成物を提供する。実施形態において、このような組成物は３０％〜６０％の実質的にコアギュローゲンを含まない清澄化ＬＡＬを含み、実施形態においては、４０％〜６０％（ｖ／ｖ）、実施形態においては、５０％の清澄化ＬＡＬ−ｃｏを含む。実施形態において、実質的にコアギュローゲンを含まない清澄化ＬＡＬを含む本発明の組成物は、７．４〜７．５のｐＨのトリスバッファーを含む。実施形態において、実質的にコアギュローゲンを含まない清澄化ＬＡＬを含む本発明の組成物は、トリスバッファー、塩化ナトリウム、トレハロース、及び塩化マグネシウムを含む。実施形態において、本発明の組成物は、実質的にコアギュローゲンを含まない清澄化ＬＡＬ、約２５ｍＭ〜約５０ｍＭのトリスバッファー、約８０ｍＭの塩化ナトリウム、約７０ｍＭのトレハロース、及び約１０ｍＭの塩化マグネシウムを含む。実施形態において、本発明の組成物は、実質的にコアギュローゲンを含まない清澄化ＬＡＬ、約５０％のＬＡＬ−ｃｏ、約５０ｍＭのトリスバッファー、約７５ｍＭのトレハロース、約７７ｍＭの塩化ナトリウム、及び約１０ｍＭの塩化マグネシウムを含み、ｐＨは７．４〜７．５である。実施形態において、本発明は、実質的にコアギュローゲンを含まない清澄化ＬＡＬ、バッファー、及び広いｐＨ範囲にわたり両性イオン性を保持する両性イオン界面活性剤を含む組成物を提供する。実施形態において、バッファーは、分子式Ｃ１９Ｈ４１ＮＯ３Ｓを有するｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート（ズイッタージェント（ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ）（登録商標）３−１４界面活性剤）である。実施形態において、界面活性剤は、実質的にコアギュローゲンを含まない清澄化ＬＡＬを含む組成物中に、約０．２ｍＭ〜０．５ｍＭ、約０．３ｍＭ〜０．４ｍＭ、又は約０．４４ｍＭにて存在する。実施形態において、本発明の組成物は、実質的にコアギュローゲンを含まない清澄化ＬＡＬ、約２５ｍＭ〜約５０ｍＭのトリスバッファー、約２０ｍＭ〜約９０ｍＭのトレハロース、約８０ｍＭの塩化ナトリウム、及び約１０ｍＭの塩化マグネシウムを含む。実施形態において、本発明の組成物は、約５０％のＬＡＬ−ｃｏ、約５０ｍＭのトリスバッファー、約７５ｍＭのトレハロース、約７７ｍＭの塩化ナトリウム、約１０ｍＭの塩化マグネシウム、及び分子式Ｃ１９Ｈ４１ＮＯ３Ｓを有する約０．４４ｍＭのｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホナート（ズイッタージェント（登録商標）３−１４界面活性剤）を含み、ｐＨは約７．４〜７．５である。
【００７２】
[0090]本開示は、清澄化ＬＡＬを含み、実質的にコアギュローゲンを含まない組成物であって、溶解されたアメリカカブトガニ由来のアメボサイト由来の溶液を４℃において２０００ｒｐｍで８分間遠心分離し、上澄みを生成するステップと、（ａ）の上澄みをバッファーと合わせるステップと、（ｂ）の組み合わせを３０ｋＤａメンブランフィルターを使用したタンジェンシャルフローろ過に供し、保持液を生成するステップと、（ｃ）の保持液を４℃において５０００ｒｐｍ（例えば６１２０ｇ）で５分間遠心分離し、上澄みを生成するステップであり、上澄みが、実質的にコアギュローゲンを含まない清澄化ＬＡＬである、ステップとを含む、方法により生成される、組成物をさらに対象とする。
【００７３】
[0091]本開示は、（１）実質的にコアギュローゲンを含まない清澄化ＬＡＬ、バッファー、及び界面活性剤と、（２）発色基質とを含む、組成物をさらに対象とする。いくつかの実施形態において、組成物中の発色基質は、ｐＮＡを含む。いくつかの実施形態において、組成物中の発色基質は、Ａｃ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ｐＮＡである。いくつかの実施形態において、組成物は、３０％〜５０％の実質的にコアギュローゲンを含まない清澄化ＬＡＬ調製物と、１０％〜３０％の発色基質とを含む（ｖ／ｖ）。いくつかの実施形態において、組成物は、約３５％〜約４５％の実質的にコアギュローゲンを含まない清澄化ＬＡＬと、１５％〜２５％の発色基質とを含む。いくつかの実施形態において、組成物は、４０％の実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬ調製物と、２０％の発色基質（ｗｔ／ｗｔ）とを含む。いくつかの実施形態において、組成物は、約４０％の実質的にコアギュローゲンを含まない清澄化ＬＡＬ調製物と、２０％のＡｃ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ｐＮＡとを含む（ｗｔ／ｗｔ）。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている組成物は、単一の容器、例えば、単一のバイアルに入れてある。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている組成物は、凍結乾燥されている。例えば、本開示は、４０％の実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬ調製物と、３０％のＡｃ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ｐＮＡ（ｗｔ／ｗｔ）とを含む、凍結乾燥組成物を特に示す。
【００７４】
[0092]いくつかの実施形態において、本発明は、発色アッセイキットを対象とする。本キットは、清澄化ＬＡＬ及び発色基質を含む試薬を含む、ＬＡＬ発色アッセイと通常関連づけられる１つ以上の成分を含んでもよい。いくつかの実施形態において、本開示の方法は、（ａ）実質的にコアギュローゲンを含まない清澄化リムルスアメボサイトライセート（ＬＡＬ）と、（ｂ）発色基質と、（ｃ）ＬＡＬ及び発色基質を使用してエンドトキシンを検出するための説明書とを含む、キットを対象とする。いくつかの実施形態において、本キットは、さまざまな試薬を含み、それぞれの試薬が異なる量のコアギュローゲンが除去された清澄化ＬＡＬを含む。
【００７５】
[0093]本キットは、１つ以上の容器を含むことが可能である。いくつかの実施形態において、清澄化ＬＡＬ及び発色基質は、単一の容器に入れてある。いくつかの実施形態において、清澄化ＬＡＬ及び発色基質は、２つの別個の容器に入れてある。いくつかの実施形態において、本キットは、清澄化ＬＡＬを含む滅菌容器を含む。いくつかの実施形態において、本キットは、アッセイに使用するための清澄化ＬＡＬ及び／又は発色基質を再構成することができる再構成バッファーを含む。いくつかの実施形態において、滅菌容器は、滅菌バイアルである。いくつかの実施形態において、本キットは、陽性エンドトキシン対照として使用することが可能であるか、又は標準中のエンドトキシンの量を定量するために使用可能である対照標準エンドトキシンをさらに含む。いくつかの実施形態において、本キットは、２つ以上の対照標準エンドトキシンを１つ以上の濃度で含む。
【００７６】
[0094]当業者は、ＬＡＬからコアギュローゲンを除去するためにさまざまな方法を使用することが可能であることを理解することができる。これらのそれぞれの方法は、効率、精製率、費用、及び労力が異なる場合もあるが、当業者の知識の範囲内である。本開示は、タンジェンシャルフローろ過を使用して、実質的にコアギュローゲンを含まない清澄化ＬＡＬを生成する方法を含む。タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）は、供給流の大部分がフィルターの中へではなく、フィルターの面を横切って接線方向に移動するクロスフローろ過を指す。ＴＦＦを使用することによって、（フィルターを詰まらせる可能性がある）大半のＬＡＬタンパク質を含む保持液が、ろ過プロセスの間に実質的に洗い流され、コアギュローゲンが透過液にろ過される。いくつかの実施形態において、ＴＦＦは、バッチ式デッドエンドろ過とは異なる連続的なプロセスである。
【００７７】
[0095]いくつかの実施形態において、本開示は、実質的にコアギュローゲンを含まない清澄化ＬＡＬを生成する方法であって、本方法は、溶解されたアメリカカブトガニ由来のアメボサイト由来の溶液を２〜１０℃において１０００〜３０００ｒｐｍで２〜１５分間遠心分離し、第１の上澄みを生成するステップ（「第１の遠心分離」）と、上澄みをバッファーと合わせるステップと、組み合わせを２０ｋＤａ〜５０ｋＤａフィルターを使用してろ過し、保持液を生成するステップと、保持液を２〜１０℃において３０００〜７０００ｒｐｍで２〜１０分間遠心分離し、第２の上澄みを生成するステップ（「第２の遠心分離」）とを含み、第２の上澄みが、実質的にコアギュローゲンを含まない清澄化ＬＡＬを含む、方法を対象とする。実施形態において、ろ過するステップは、ＬＡＬをＴＦＦに供するステップである。いくつかの実施形態において、当該ＬＡＬは、ＴＦＦに先立ってバッファーに入れられる。いくつかの実施形態において、バッファーは、トリスバッファー又はＭＥＳバッファーである。いくつかの実施形態において、バッファーは、約６．０〜約９．０、又は約７．０〜約８．０のｐＨを有する。実施形態において、第１の遠心分離は、２０００ｒｐｍにおいて遠心分離するステップを含む。実施形態において、第１の遠心分離は、８分間遠心分離するステップを含む。実施形態において、第１の遠心分離は、４℃において遠心分離するステップを含む。実施形態において、第２の遠心分離は、５０００ｒｐｍにおいて遠心分離するステップを含む。実施形態において、第２の遠心分離は、５分間遠心分離するステップを含む。実施形態において、第２の遠心分離は、４℃において遠心分離するステップを含む。
【００７８】
[0096]さまざまな膜をＴＦＦに使用することができる。得られる保持液中で減少させる所望タンパク質のサイズに応じて、さまざまな孔径のフィルターをＴＦＦに使用することができる。本開示において、Ｃ因子、Ｂ因子、Ｇ因子、及び凝固酵素前駆体は、ＬＡＬの凝固カスケード系に関与し、コアギュローゲンの不溶性コアギュリンゲルへの変換をもたらすことが知られている。本明細書において提供される開示の目的のために、コアギュローゲンの減少、並びにＣ因子、Ｂ因子、Ｇ因子、及び凝固酵素前駆体の保持をもたらす任意のＴＦＦ操作（並びに付随のフィルター孔径、孔タイプ、及びバッファー系）を使用することができる。したがって、いくつかの実施形態において、ＴＦＦ操作は、５０ｋＤａフィルター、４５ｋＤａフィルター、４０ｋＤａフィルター、３５ｋＤａフィルター、３０ｋＤａフィルター、２５ｋＤａフィルター、又は２０ｋＤａフィルターを使用する。いくつかの実施形態において、４０ｋＤａ〜２５ｋＤａフィルターを使用する。いくつかの実施形態において、膜は、１０〜８０ｋＤａフィルター又は２０〜５０ｋＤａフィルターである。いくつかの実施形態において、フィルターは、３０ｋＤａフィルターである。
【００７９】
[0097]本明細書中で開示されている方法に使用される膜としては、修飾ポリエーテルスルホン（ｍＰＥＳ）、ポリスルホン（ＰＳ）及びポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態において、実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬを生成する方法は、修飾ポリエーテルスルホン（ｍＰＥＳ）メンブランフィルターを使用したＴＦＦを使用して実施される。ＬＡＬからのコアギュローゲンの除去を最適化するために、膜を横切るＬＡＬの流量を調節することができる。いくつかの実施形態において、ＴＦＦは、２００ｍＬ／分〜８００ｍＬ／分、３００ｍＬ／分〜６００ｍＬ／分、又は３５０ｍＬ／分〜５００ｍＬ／分の流量で実施される。いくつかの実施形態において、ＴＦＦは、５００ｍＬ／分を超える、例えば、５００ｍＬ／分〜２０００ｍＬ／分、８００ｍＬ／分〜１５００ｍＬ／分、又は１０００ｍＬ／分〜１２００ｍＬ／分の流量で実施される。いくつかの実施形態において、ＴＦＦは、１０００ｍＬ／分、１１００ｍＬ／分、１２００ｍＬ／分、１３００ｍＬ／分又は１４００ｍＬ／分において実施される。いくつかの実施形態において、ＴＦＦは、１１００ｍＬ／分において実施される。
【００８０】
[0098]実施形態において、本発明は、実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬを遠心分離するステップにより、実質的にコアギュローゲンを含まない清澄化ＬＡＬを製造する方法を提供する。
【実施例】
【００８１】
実施例１
清澄化ＬＡＬ−ｃｏを使用したエンドトキシン検出の改善
[0099]実質的にコアギュローゲンを含まないＬＡＬ（ＬＡＬ−ｃｏ）及び清澄化ＬＡＬ−ｃｏを含有するサンプルの発色エンドトキシンアッセイ（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ  ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  ａｓｓａｙ）の反応速度及び感度を、図１に示すように、９６ウェルプレート上で試験した。行Ａ〜Ｆは、エンドトキシン標準の量を増加させることを含む。５０％のＬＡＬ−ｃｏ又は清澄化ＬＡＬ−ｃｏを含有する第１の溶液を発色基質を含有する第２の溶液と合わせて第３の最終溶液を形成し、その後、第３の溶液をエンドトキシンを含有するサンプルと接触させた。図１の列１〜３では、第３の溶液は、５０％の清澄化ＬＡＬ−ｃｏの第１の溶液、及び５０％の第２の溶液を含有していた（すなわち、第３の最終溶液の２５％が清澄化ＬＡＬ−ｃｏを含有していた）（５０／５０／５０溶液）。図１の列４〜６では、第３の溶液は、８０％の清澄化ＬＡＬ−ｃｏの溶液、及び２０％の第２の溶液を含有していた（すなわち、第３の最終溶液の４０％が清澄化ＬＡＬ−ｃｏを含有している）（５０／８０／２０溶液）。図１の列７〜９では、第３の溶液は、５０％の全ＬＡＬ−ｃｏの溶液、及び５０％の第２の溶液を含有していた（すなわち、最終溶液の２５％が全ＬＡＬ−ｃｏを含有している）。図１の列１０〜１２では、第３の溶液は、８０％の全ＬＡＬ−ｃｏの溶液、及び２０％の第２の溶液を含有している（すなわち、最終溶液の４０％が全ＬＡＬ−ｃｏを含有している）。
【００８２】
[00100]図１は、清澄化ＬＡＬ−ｃｏ並びにより多くのＬＡＬ−ｃｏ及びより少ない基質の配合物を使用すると、驚くべきことに、速度及び滑らかな反応特性を有するブランク分離間の分離の増加がもたらされることを示している。図４は、この観察結果をさらに示している。３つの異なる５０／８０／２０溶液を調製し、０．０００５ＥＵ／ｍＬ及び０．００５ＥＵ／ｍＬ標準で試験した。これらの清澄化ＬＡＬ−ｃｏの溶液は、それぞれ３１分及び１７分の平均３０ｍＯＤ時間（ｍＯＤ  ｔｉｍｅ）を有した。反応曲線はより滑らかで、よりばらつきが少なかった。さらに、０ＥＵ／ｍＬサンプル及び０．０００５ＥＵ／ｍＬサンプル（９４０秒）と０ＥＵ／ｍＬサンプル及び０．００５ＥＵ／ｍＬサンプル（１７５５秒）との間には、より大きな時間分離があった。したがって、清澄化ＬＡＬ−ｃｏは、改善されたアッセイ性能（例えば、増加した反応速度、０ＥＵ／ｍＬ対照からのより大きな差別化）、より少量の基質、及びよりばらつきが少なくなるより滑らかな反応曲線をもたらす。
【００８３】
実施例２
清澄化ＬＡＬ−ｃｏの調製
[00101]図３は、清澄化ＬＡＬ−ｃｏを調製する方法を示す概略図である。最初に、溶解されたアメリカカブトガニ由来のアメボサイトの複数バッチをプールし、ＬＡＬデイプールを形成した。ＬＡＬデイプールを、４℃において２０００ｒｐｍで８分間遠心分離した。上澄みを注意深く除去し、バッファーと合わせた。得られた溶液を、３０ｋＤａｍＰＥＳメンブランフィルターを使用したタンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）によりろ過した。保持液は、ＬＡＬ−ｃｏを含有していた。その後、保持液を４℃において５０００ｒｐｍで５分間遠心分離し（図２参照）、上澄みを保管容器に移し、４℃において保管した。
【００８４】
実施例３
実質的にコアギュローゲンを含まない清澄化ＬＡＬを形成するために使用するＬＡＬデイプールの安定性
[00102]清澄化ＬＡＬ−ｃｏを形成するために使用するＬＡＬデイプールの安定性を、０．０００５ＥＵ／ｍＬ及び０．００５ＥＵ／ｍＬ標準を使用して調査した。ＬＡＬデイプールを１年間、２年間、及び３年間保管し、清澄化ＬＡＬ−ｃｏを形成するために使用した。示した期間の終わりに、清澄化ＬＡＬ−ｃｏサンプルを使用して５０％の清澄化ＬＡＬ−ｃｏを含有する溶液を形成し、その後溶液をＬＡＬ発色試薬と８０：２０の比率で混合して９６ウェルプレートに入れ、その後４０５ｎｍにおける吸光度を測定するインキュベートプレートリーダーに入れた。その反応を黄色の外観により経時的に自動的に監視した。
【００８５】
[00103]エンドトキシンの存在下において、ライセートは、発色基質を切断して、溶液を黄色くすることになる。変化に必要とされる時間は、存在するエンドトキシンの量と反比例する。それぞれのサンプルに関して反応及び分離時間は、図５、図６、図７、図８、及び図９でわかる。図５、６、及び７は、同じサンプル及び実験に由来するものである。図８及び９は、同じ実施例及び実験に由来するものである。図５のｘ軸は時間（秒）、ｙ軸はｍＯＤの変化である。図７のｙ軸は時間（秒）である。このデータは、清澄化ＬＡＬ−ｃｏを形成するために使用するＬＡＬデイプールは少なくとも３年間安定であり、その増加した反応時間、滑らかな反応曲線、並びにブランク標準（０ＥＵ／ｍＬ）とエンドトキシン対照（０．００５ＥＵ／ｍＬ及び０．０００５ＥＵ／ｍＬ）との間のより大きな分離が保持されていることを示唆している。図８のｙ軸は０．００５ＥＵ／ｍＬの秒単位の反応時間、ｘ軸はさまざまな年数のＬＡＬ源を表す。左側のプロットは清澄化ＬＡＬ−ｃｏのデータ、右は未処理ＬＡＬのデータである。このデータは、ＴＦＦを使用してＬＡＬを処理し、得られたＬＡＬ−ｃｏを遠心分離することで、ＬＡＬ性能の経時的な差異を克服することができることを示唆している。図９のグラフのｙ軸はｍＯＤの変化を示し、ｘ軸は秒単位の時間である。このテーブルは、０．００５ＥＵ／ｍＬ標準に関してグラフから取得した反応時間及びこの時間と０ＥＵ／ｍＬブランクとの間の分離を含有する。このデータは、清澄化ＬＡＬ−ｃｏは、その未処理ＬＡＬ対照物よりも、標準に対するより速い反応時間、及びブランクと低い標準との間のより大きな分離を有することを示唆している。
【００８６】
実施例４
[00104]連続的なタンジェンシャルフローろ過のさまざまなダイアフィルトレーション容量（ＤＶ）を調査し、（ブランクと０．００５ＥＵ／ｍＬ標準とを比較して）どの容量が、１２００秒の反応時間を達成しながらにして最良の感度を示したかを決定した。図１０参照。４ＤＶを超えるとコアギュローゲンが除去され、１２００秒未満の反応時間を達成することを発見した。５、６、及び７ＤＶが、所望の反応時間を示すと同時に、最も高い感度を示してダイアフィルトレーション容量を最小化した。
【００８７】
[00105]それぞれのＤＶからの保持液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、ＬＡＬ洗浄のためにより多くのダイアフィルトレーション容量を使用するに伴い、２０ｋＤａバンド（コアギュローゲンのおよそのＭＷ）のバンド密度が減少することを実証した。例えば、図１１参照。ＳＤＳ−ＰＡＧＥからのバンド密度を使用することは、コアギュローゲンが未ろ過ＬＡＬ中の総染色タンパク質の約３７％を占め、それぞれのダイアフィルトレーション容量が２０ｋＤａタンパク質バンドを減少させることを示唆している。それぞれのダイアフィルトレーション容量後に収集したそれぞれの保持液中の総タンパク質濃度は、２８０ｎｍにおける吸光度を測定することにより決定した。例えば、図１２参照。ＳＤＳ−ＰＡＧＥからのデータを使用したコアギュローゲンからなるそれぞれの保持液サンプルの百分率にタンパク質の総濃度を掛けることにより、それぞれの保持液中のコアギュローゲン濃度の推定値を計算することができた。それぞれのＤＶ後のコアギュローゲン濃度を、図１３に示す。
【００８８】
実施例５
[00106]未ろ過ＬＡＬ組成物中には、多数のタンパク質が存在することが知られている。いくつかの既知のタンパク質の一覧を図１４に示す。Ｉｗａｎａｇａ  Ｓら、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ３．  ９７３：９７３〜９８４（１９９８）。３０ｋＤａ未満の分子量のタンパク質は、影付きにされている。他の小分子の除去が性能向上に寄与するかどうかを決定するための調査を実施した。ＬＡＬ組成物を、３０ｋＤａフィルター又は１０ｋＤａフィルターのいずれかを使用した連続的なタンジェンシャルフローろ過に供した。予想通り、ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、コアギュローゲン（およそ２０ｋＤａ）は３０ｋＤａフィルターを使用して除去されるが、１０ｋＤａフィルターでは除去されないことを実証した。図１５参照。３０ｋＤａフィルターを使用した連続的なタンジェンシャルフローろ過は、未ろ過ＬＡＬ及び１０ｋＤａフィルターを使用した連続的なタンジェンシャルフローろ過の両方と比較して、反応時間を減少させることが示された。３０ｋＤａフィルターを使用した連続的なタンジェンシャルフローろ過はまた、未ろ過ＬＡＬ及び１０ｋＤａフィルターを使用した連続的なタンジェンシャルフローろ過の両方と比較して、ブランクと０．００５ＥＵ／ｍＬサンプルとの間の分離を改善した。
【００８９】
実施例６
[00107]遠心分離速度が反応速度及び分離に及ぼす影響を評価した。ＬＡＬ組成物を調製し、その後、１０，０００×ｇ、２０，０００×ｇ、３０，０００×ｇ又は４０，０００×ｇのいずれかにおいて、３０分間遠心分離した。その後、ブランク及び０．００５ＥＵ／ｍＬ標準の両方を使用して、反応時間及び分離に関して保持液を試験した。それぞれの保持液の光学密度もまた、測定した。結果は、図１７及び図１８でわかる。未清澄化材料は、遠心分離した保持液よりも高い光学密度を有する。分離と遠心分離速度との間の相関もまた観察し、この場合、遠心分離速度を増加させると、ブランクと０．００５ＥＵ／ｍＬ標準との間のより大きな分離がもたらされる。清澄化された保持液の性能を評価するために実施する、４０５ｎＭにおける吸光プレートリーダーを利用したカイネティック-比色法アッセイ（Ｋｉｎｅｔｉｃ  ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ  ａｓｓａｙｓ）（デルタｔ（秒）：３０、デルタｍＯＤ：５０）は、遠心分離が、エンドトキシンとは無関係に基質が切断されることに寄与する何かを除去していることを示唆しており、これは清澄化ステップのさらなる効果を示唆するものである。
【００９０】
実施例７
[00108]実質的にコアギュローゲンを含まない清澄化ＬＡＬを凍結及び解凍することにより引き起こされる、性能に対する影響を調査した。本明細書に記載されている方法（３０ｋＤａの連続的なＴＦＦ、３０，０００×ｇにおいて遠心分離）により調製した保持液の活性を、凍結前、及びその後保持液を凍結して室温において解凍した後に測定した。結果を図１９に示す。この調査は、凍結／解凍前後の同等の性能を示唆していた。
【００９１】
[00109]実施形態のいずれの範囲からも逸脱することなく、本明細書に記載されている方法及び用途に対する他の適した変更及び適応が行えることは、関連分野の当業者には明らかであろう。上述の実施例は、例示する目的のためだけに含まれ、限定することは意図しない。
【００９２】
[00110]特定の実施形態が本明細書中で例示され、記載されてきたが、特許請求の範囲は、記載され、示されている特定の形態又は部分の配置に限定されないことが理解されるべきである。本明細書には、実例となる実施形態が開示されてきており、特定の用語が利用されているが、それらの用語は、一般的で説明的な意味でのみ使用され、限定の目的ではない。上記の教示を考慮して、実施形態の変更及び変形が可能である。したがって、実施形態が具体的に記載されている以外の方法で実施されてもよいことが理解されるべきである。
【００９３】
[00111]各種実施形態が上に記載されてきたが、それら実施形態は、本技術の実例及び例として提示されたにすぎず、限定の意図ではない。本技術の趣旨及び範囲から逸脱することなく、形態及び細部にさまざまな変更を行うことができることは関連分野の当業者には明白であろう。したがって、本技術の広さ及び範囲は、上記の実施形態のいずれによっても限定されるべきではなく、添付の特許請求の範囲及びその等価物によってのみ定義されるべきである。本明細書において述べられているそれぞれの実施形態、及び本明細書中で引用されるそれぞれの文献のそれぞれの特徴を、任意のその他の実施形態の特徴と組み合わせて使用することができることも理解されるであろう。本明細書において述べられているすべての特許及び公報は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【図１】
2020505007.tif 000003
【図２】
2020505007.tif 000004
【図３】
2020505007.tif 000005
【図４】
2020505007.tif 000006
【図５】
2020505007.tif 000007
【図６】
2020505007.tif 000008
【図７】
2020505007.tif 000009
【図８】
2020505007.tif 000010
【図９】
2020505007.tif 000011
【図１０】
2020505007.tif 000012
【図１１】
2020505007.tif 000013
【図１２】
2020505007.tif 000014
【図１３】
2020505007.tif 000015
【図１４】
2020505007.tif 000016
【図１５】
2020505007.tif 000017
【図１６】
2020505007.tif 000018
【図１７】
2020505007.tif 000019
【図１８Ａ】
2020505007.tif 000020
【図１８Ｂ】
2020505007.tif 000021
【図１９】
2020505007.tif 000022
【国際調査報告】
2020505007.tif 000023
2020505007.tif 000024
2020505007.tif 000025