(57)【要約】  本発明は、コロナウイルス、コロナウイルスを備えるワクチン、および疾患予防方法を提供する。本発明の実施形態の１つには、非構造タンパク質（ｎｓｐ）−１５を備えるポリタンパク質をコードする、変異レプリカーゼ遺伝子を備え、該レプリカーゼ遺伝子は、ｎｓｐ１５をコードし、ｎｓｐ１５の安定性または活性に影響を与える変異および／または欠失を含む変更を生じさせる、生で弱辱である、コロナウイルスが含まれる。
2020513845.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非構造タンパク質ｎｓｐ１５を備えるポリタンパク質をコードする、変異レプリカーゼ遺伝子を備え、該レプリカーゼ遺伝子は、前記ｎｓｐ１５をコードして、前記ｎｓｐ１５の安定性および活性に影響を与える、変異および／または欠失を含む変更を生じさせる、生でかつ弱毒である、コロナウイルス。
【請求項２】
前記変更は、位置９８におけるトレオニンからメチオニンへのアミノ酸変異、または、位置２６２における触媒ヒスチジンからアラニンへのアミノ酸変異からなる、請求項１に記載のコロナウイルス。
【請求項３】
前記コロナウイルスは、野生型コロナウイルスの変種である、請求項１に記載のコロナウイルス。
【請求項４】
前記野生型コロナウイルスは、コロナウイルス亜科に属するコロナウイルスからなる、請求項３に記載のコロナウイルス。
【請求項５】
前記コロナウイルス亜科に属するコロナウイルスは、ＳＡＲＳコロナウイルス、ＭＥＲＳコロナウイルス、ヒトコロナウイルス２２９Ｅ、ヒトコロナウイルスＯＣ４３、ヒトコロナウイルスＨＫＵ１、ヒトコロナウイルスＮＬ６３、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス、イヌコロナウイルス、鶏伝染性気管支炎ウイルス、ウシコロナウイルス、および、伝染性胃腸炎ウイルス、ブタデルタコロナウイルス、ブタ流行性下痢ウイルス、ブタ呼吸器型コロナウイルス、ブタ血球凝集性脳脊髄炎コロナウイルスを含むブタコロナウイルスからなる群から選択される、請求項４に記載のコロナウイルス。
【請求項６】
請求項１に記載の前記変異レプリカーゼ遺伝子。
【請求項７】
請求項６に記載の前記変異レプリカーゼ遺伝子によりコードされたタンパク質。
【請求項８】
請求項６に記載の前記変異レプリカーゼ遺伝子を備えるプラスミド。
【請求項９】
キャリアと、請求項１に記載のコロナウイルスとを備えるワクチン。
【請求項１０】
請求項９に記載したワクチンをヒト対象に投与することからなる、ヒト対象の疾患を予防する方法。
【請求項１１】
前記ワクチンを投与することにより、ヒト対象のＩ型インターフェロンを活性化させ、対応する野生型レプリカーゼ遺伝子を発現するコロナウイルスに関して、該コロナウイルスの病原性を低減させる、請求項１０に記載のヒト対象の疾患を予防する方法。
【請求項１２】
ヒト対象のＩ型インターフェロンを活性化させて、該Ｉ型インターフェロンの活性化により、コロナウイルスの病原性を低減させる、ヒト対象の疾患を予防する方法。
【請求項１３】
野生型コロナウイルスを改質して、ポリタンパク質をコードし、ｎｓｐ１５の安定性および活性に影響を与える、該ｎｓｐ１５における変異および／または欠失を含む変更を生じさせる、変異レプリカーゼ遺伝子を備える、生でかつ弱毒である、コロナウイルスを生産し、および、
該コロナウイルと、キャリアとを備え、ヒト対象に投与されることで、該ヒト対象のＩ型インターフェロンを活性化させ、前記野生型コロナウイルスの行現姓を低減させることが可能である、ワクチンを生産する、
ワクチンの製造方法。
【請求項１４】
前記変更は、位置９８におけるトレオニンからメチオニンへのアミノ酸変異、または、位置２６２における触媒ヒスチジンからアラニンへのアミノ酸変位からなる、請求項１３に記載のワクチンの製造方法。
【請求項１５】
前記野生型コロナウイルスは、コロナウイルス亜科に属するコロナウイルスからなる、請求項１３に記載のワクチンの製造方法。
【請求項１６】
前記コロナウイルス亜科に属するコロナウイルスは、ＳＡＲＳコロナウイルス、ＭＥＲＳコロナウイルス、ヒトコロナウイルス２２９Ｅ、ヒトコロナウイルスＯＣ４３、ヒトコロナウイルスＨＫＵ１、ヒトコロナウイルスＮＬ６３、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス、イヌコロナウイルス、鶏伝染性気管支炎ウイルス、ウシコロナウイルス、および、伝染性胃腸炎ウイルス、ブタデルタコロナウイルス、ブタ流行性下痢ウイルス、ブタ呼吸器型コロナウイルス、ブタ血球凝集性脳脊髄炎コロナウイルスを含むブタコロナウイルスからなる群から選択される、請求項１３に記載のワクチンの製造方法。
【請求項１７】
前記ヒト対象に前記ワクチンを投与することをさらに備える、請求項１６に記載のワクチンの製造方法。
【請求項１８】
前記ヒト対象に前記ワクチンを投与することをさらに備える、請求項１３に記載のワクチンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、２０１７年３月３日に出願された米国特許仮出願第６２／４６６，７７９号に基づく優先権の利益を主張し、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【連邦政府による資金提供を受けた研究の記載】
【０００２】
本発明は、アメリカ国立衛生研究所により付与された認可または契約番号第Ｒ０１Ａｌ０８５０８９号、および、アメリカ合衆国農務省により付与された農業研究局プロジェクト第５０５０−１１８−１１Ｓに基づく、アメリカ合衆国政府の支援を伴いなされたものである。
【背景技術】
【０００３】
本発明はコロナウイルスに関する。より具体的には、本発明は、既存のおよび新たに出現するコロナウイルスに対するワクチンおよびワクチンの製造方法に関する。
【０００４】
コロナウイルスは、コロナウイルス科のコロナウイルス亜科に属するウイルスの種であり、ヒトおよび動物に感染し、呼吸器、胃腸、または神経性の疾患を発症させるプラス鎖ＲＮＡウイルスである。コロナウイルスは、保菌動物から出現して、ヒトに対して大規模な伝染病を引き起こすことが可能であり、たとえば、２００２年および２００３年に流行した重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）、および、中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ−ＣｏＶ）などが挙げられ、２０１２年に出現ウイルスの一つとして認識されようになった。注目すべきことに、これらのウイルスは、侵入する病原体を検出および除去するための重要かつ生得のセンチネルとして機能すると考えられている細胞の一種である、マクロファージの細胞質において複製される。コロナウイルスは、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）およびインターフェロン誘導性遺伝子（ＩＳＧ）群の活性化を妨げたり遅延させたりする機能を有する複数のアンタゴニスト（拮抗物質）をコードする。一群のアンタゴニストの発現は発病の一因となる。ＳＡＲＳ−ＣｏＶに感染したマウスを用いた最近の研究により、インターフェロンの産生の遅延および抑制が病気の一因となることが明らかにされている。
【０００５】
コロナウイルス疾患に対する既存のワクチンを用いた手段は、自発性の自然減衰、ウイルスの不活化、および、発現ベクターを介した組み換えウイルス構造タンパク質に基礎を置いている。既存のワクチン候補は、強力な防御免疫反応を引き出さない。長期間にわたる保護が実現できないことが、適応免疫および免疫記憶を促進するための重要な分子であるＩ型インターフェロンなどの自然免疫応答の非効率な誘導に起因している可能性がある。
【０００６】
このことから、コロナウイルス感染症を治療する継続的な需要があり、かつ、強い自然免疫応答および効果的な適応性のある免疫保護の両者を刺激できるワクチンを含む、ヒト対象に接種可能であるコロナウイルスに対するワクチンが要望されていると認められる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、変異コロナウイルス、変異コロナウイルスを備えるワクチン、ワクチンの製造方法、および、ヒト対象の疾患を予防する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一態様によれば、非構造タンパク質（ｎｓｐ）−１５を備えるポリタンパク質をコードする変異型レプリカーゼ遺伝子を含む、弱毒化された生コロナウイルスが提供される。該レプリカーゼ遺伝子は、ｎｓｐ１５をコードし、ｎｓｐ１５の安定性または活性に影響を与える変異および／または欠失を含む変更を生じさせる。
【０００９】
本発明のその他の態様は、前記コロナウイルスを備える変異型レプリカーゼ遺伝子、かかる変異型レプリカーゼ遺伝子によりコードされるタンパク質、かかる変異型レプリカーゼ遺伝子を備えるプラスミド、前記コロナウイルスを備えるワクチン、および、かかるワクチンをヒト対象に投与することによりヒト対象の疾患を治療または予防するための方法を含む。
【００１０】
本発明の別の態様によれば、ヒト対象のＩ型インターフェロンを活性化させることにより、コロナウイルスの病原性を低減させることを含む、ヒト対象の疾患を防止する方法が提供される。
【００１１】
本発明の別の態様によれば、野生型コロナウイルスを変性させて、ポリタンパク質をコードし、非構造タンパク質（ｎｓｐ）−１５の安定性または活性に影響を与える、ｎｓｐ１５における変異および／または欠失を含む変更を生じさせる、変異型レプリカーゼ遺伝子を備える、弱毒化された生コロナウイルスを製造することを含む、ワクチンの製造方法が提供される。前記コロナウイルスおよびキャリアを含むワクチンが製造可能である。該ワクチンをヒト対象に投与することにより、ヒト対象のＩ型インターフェロンが活性化され、前記野生型コロナウイルスの病原性を低減させることができる。
【００１２】
上述したコロナウイルスの技術的効果は、ウイルスの複製、拡散、およびウイルス性疾患を制限する、Ｉ型インターフェロンを活性化させるコロナウイルスをヒト対象に接種させる能力を含むことが好ましい。
【００１３】
本発明のその他の態様および利点は、以下の詳細な説明により明らかにされる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
［図１］
図１Ａ〜図１Ｄは、非構造タンパク質１５および保存残基トレオニン９８（Ｔ９８）をハイライトしたマウスコロナウイルスゲノムの模式図を含む。図１Ａは、マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）Ａ５９（ＭＨＶ−Ａ５９）ゲノムの模式図である。ＰＬＰ１／２：パパイン様プロテアーゼ１／２、ＡＤＲＰ：ＡＤＰ−リボース−１′−モノホスファターゼ、３ＣＬｐｒｏ：３Ｃ様プロテアーゼ、ＲＤＲＰ：ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、Ｈｅｌ：ヘリカーゼ、ＥｘｏＮ：３′→５′エキソヌクレアーゼ、ＮｅｎｄｏＵ：ニドウイルスウリジル酸特異エンドリボヌクレアーゼ、２′ＯＭＴ：リボース−２′−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ、である。図１Ｂは、ｎｓｐ１５の結晶構造を示し、Ｎドメイン、Ｍドメイン、Ｃドメインは９０度回転して示されている。Ｔ９８は、Ｌ５７（Ｎドメイン）および触媒残基（Ｃドメイン）に関連して示される。タンパク質データベースＩＤは、２ＧＴＨである。図１Ｃは、各コロナウイルスの遺伝子型における変異部位と、ウイルス感染した骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）におけるＩ型インターフェロンの誘導を示す。図１Ｄは、ＣｌｕｓｔａｌＷ（クラスタルダブル）を用いたコロナウイルスのサブグループの代表株群からのｎｓｐ１５  Ｔ９８領域の配列アライメントを示す。
【００１５】
［図２］
図２Ａ〜図２Ｄは、ＭＨＶｎｓｐ１５変異ウイルスが、Ｉ型インターフェロンの発現を活性化し、および、ＢＭＤＭにおける複製が損なわれることを示す。図２Ａは、定量ＲＴ−ＰＣＲにより、野生型（ＷＴ）ＭＨＶまたはＮ１５ｍ１に感染したＢＭＤＭにおけるＩＦＮ−α１１ｍＲＮＡレベルを示す。値は、βアクチンにより標準化され、独立Ｔ検定を用いて分析された。図２Ｂは、定量ＥＬＩＳＡ法によって検出された、感染したＢＭＤＭの上清中における分泌されたＩＦＮαタンパク質レベルを示す。値は、２元配置分散分析テストを用いて分析された。図２Ｃおよび図２Ｄは、Ｂ６ＢＭＤＭおよびｉｆｎａｒ−／−ＢＭＤＭにおけるＷＴおよびＮ１５ｍ１の増殖速度をそれぞれ示す（ＭＯＩ（感染多重度）＝０．１）。表示されたｈｐｉ（感染後時間）において上清のウイルスを収集し、１７Ｃｌ−１細胞を用いたプラークアッセイによってウイルス価を判定した。値は、独立Ｔ検定を用いて分析された。データは２〜３の独立した実験の代表であり、平均±ＳＤで示されている。
【００１６】
［図３］
図３Ａ〜図３Ｄは、ＭＨＶ ｎｓｐ１５変異ウイルスが、ＢＭＤＭにおける急速なアポトーシス細胞死を誘導することを示す。図３Ａは、ＢＭＤＭがＷＴ、Ｎ１５ｍ１、または紫外線で不活性化したＮ１５ｍ１（ＵＶ−Ｎ１５ｍ１）のＭＨＶにそれぞれ感染したことを示す。２４ｈｐｉ（感染後２４時間）における、ウイルスに感染したＢＭＤＭの細胞生存率は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏアッセイを用いて定量化された。値は、独立Ｔ検定を用いて分析された。図３Ｂは、ＢＭＤＭがＷＴまたはＮ１５ｍ１のＭＨＶに感染し、その後、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、ｚＶＡＤ（２０μＭ）、ネクロスタチン−１（Ｎｅｃ−１）（２５μＭ）、またはＶＸ−７６５（２０μＭ）のいずれかによって処理されたことを示す。細胞生存率は、２４ｈｐｉにＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏアッセイによって計測された。値は、独立Ｔ検定を用いて分析された。図３Ｃは、ＢＭＤＭにＷＴまたはＮ１５ｍ１のＭＨＶを接種し、培地にｚＶＡＤ（２０μＭ）が追加されたことを示す。２４ｈｐｉにおけるカスパーゼ３／７活性が、カスパーゼ３／７―Ｇｌｏ活性化アッセイによって判定された。値は、相対発光量（ＲＬＵ）で示され、２元配置分散分析テストを用いて分析された。図３Ｄは、ＢＭＤＭがＷＴまたはＮ１５ｍ１のＭＨＶに感染し、表示された時点ごとに細胞溶解物を回収したことを示す。切断されたカスパーゼ３およびＮタンパク質のウエスタンブロット試験の結果を示す。すべての感染はＭＯＩ＝０．１におけるものである。データは、２〜３の独立した実験を代表するものであり、平均値±ＳＤとして表される。
【００１７】
［図４］
図４Ａ〜図４Ｄは、ＭＨＶｎｓｐ１５変異ウイルスの感染が、ホストのｄｓＲＮＡ（二重鎖リボ核酸）センサを活性化させることを示す。図４Ａは、ＢＭＤＭがＷＴまたはＮ１５ｍ１のＭＨＶ（ＭＯＩ＝０．１）に感染したことを示す。１６ｈｐｉにおいて、細胞を溶解し、４０μｇの細胞溶解物について、ホスホ（ｐ）−ｅｌＦ２α、ｅｌＦ２α、およびウイルス性Ｎタンパク質の検出をウエスタンブロットにより行った。カルネキシンは、ローディング管理として機能する。図４Ｂは、ＰＫＲ（ＲＮＡ活性化プロテインキナーゼ）阻害物質が、Ｂ６ＢＭＤＭにおけるＮ１５ｍ１による誘導アポトーシスを阻止することを示す。細胞は、ＷＴまたはＮ１５ｍ１（ＭＯＩ＝０．１）に感染し、その後、ＰＫＥ阻害剤Ｃ１６（1μＭ）で処理された。細胞を収集し、表示時点ごとに、カスパーゼ３／７活性について評価した。値は、相対発光量（ＲＬＵ）で示され、２元配置分散分析テストを用いて分析された。図４Ｃは、バイオアナライザ（ＭＯＩ＝１）を用いた、感染したＢＭＤＭから抽出した全ＲＮＡ３００ｎｇのＲＮＡ分解パターンを示す。ＲＩＮ（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  ｎｕｍｂｅｒ）、並びに、２８Ｓ、１８Ｓ、ｒＲＮＡ、およびｔＲＮＡの位置は、図面の下部と右側にそれぞれ示した。図４Ｄは、１８ｈｐｉにおいてＣ１６阻害剤（１μＭ）またはｚＶＡＤ（２０μＭ）で処理した、感染したＢＭＤＭ（ＭＯＩ＝０．１）から得たＲＮＡのＲＮＡ分解パターンを示す。データは２〜３の独立した実験の代表である。
【００１８】
［図５］
図５Ａ〜図５Ｄは、Ｔ９８Ｍの変異が、ｎｓｐ１５タンパク質の不安定性を生じさせることを示す。図５Ａは、ＭＯＩ＝０．１における、ＷＴまたはＮ１５ｍ１のウイルスに感染したＢＭＤＭを、１６ｈｐｉにおいて溶解し、ウイルス性Ｎタンパク質、ｎｓｐ１５、およびβアクチンが、ウエスタンブロット法によって検出した結果を示す。図５Ｂは、大腸菌から発現し精製された、ＷＴのｎｓｐ１５とＴ９８Ｍ変異のｎｓｐ１５を示す。クーマシーブルー染色は、ウエスタンブロット法（下部）を用いてｎｓｐ１５抗体に検出された、精製されたＳＵＭＯタグ付きｎｓｐ１５およびＴ９８Ｍを示す。図５Ｃは、野生型ｎｓｐ１５タンパク質（黒色）およびｎｓｐ１５−Ｔ９８Ｍ変異タンパク質（赤色）についての示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）熱シフト分析を示す。図５Ｄは、５ｍＭのＭｎ２＋存在下における、野生型（ＷＴ）のｎｓｐ１５またはＴ９８Ｍを用いて時間をかけて処理された、放射標識されたＲＮＡ分子であるＲ１６．４を示す。表示時点ごとに、一定分量の反応を変性２０％ポリアクリルアミドゲル上で分析した。ＲＮＡ  Ｒ１６．４の配列を、ゲル画像の上部に示す。位置１３に存在する唯一のウリジラートに下線を引いた。データは２〜３の独立した実験の代表である。
【００１９】
［図６］
図６Ａ〜図６Ｄは、Ｎ１５ｍ３ウイルス（ｎｓｐ１５−Ｈ２６２Ａ）が、インターフェロン拮抗作用の不在下において、Ｎ１５ｍ１ウイルスの表現型模写を行うことを示す。図６Ａは、ＢＭＤＭがＷＴまたはｎｓｐ１５変異ウイルス（Ｎ１５ｍ１またはＮ１５ｍ３）に感染したことを示す（ＭＯＩ＝０．１）。１２ｈｐｉにおいて、すべてのＲＮＡを抽出して、ＩＦＮ−α１１ｍＲＮＡレベルについて分析した。値は、平均±ＳＤとして示され、独立Ｔ検定を用いて分析された。図６Ｂは、Ｂ６またはｉｆｎａｒ−／−ＢＭＤＭが、ＷＴまたはＮ１５ｍ３に感染したことを示す（ＭＯＩ＝０．１）。表示時点ごとに、１７ＣＬ−１細胞におけるプラークアッセイのために細胞上清を収集した。値は、平均±ＳＤとして示され、独立Ｔ検定を用いて分析された。図６Ｃは、Ｂ６ＢＭＤＭがＷＴまたはＮ１５ｍ３に感染し（ＭＯＩ＝０．１）、表示時点ごとに収集され、カスパーゼ３／７活性の分析を行った結果を示す。値は、平均±ＳＤとして示され、独立Ｔ検定を用いて分析された。図６Ｄは、感染したＢＭＤＭからバイオアナライザ（ＭＯＩ＝０．１）を用いて抽出した、５００ｎｇの全ＲＮＡのＲＮＡ分解パターンを示す。ＲＩＮを底部に示し、２８Ｓと１８ＳのｒＲＮＡの位置は、図面にそれぞれ矢印で示した。データは２〜３の独立した実験の代表である。
【００２０】
［図７］
図７Ａおよび図７Ｂは、ｎｓｐ１５の変異が、ウイルス感染したＢＭＤＭにおけるｄｓＲＮＡ分布に影響を与えることを示す。図７Ａおよび図７Ｂにおいて、ＢＭＤＭは、ＷＴまたはＮ１５ｍ３に感染した（ＭＯＩ＝０．１）。細胞を６ｈｐｉにおいて固定し、抗ｄｓＲＮＡ、抗ｎｓｐ２／３、およびＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２を用いて（図７Ａ）、または、抗ｄｓＲＮＡ、抗ｎｓｐ１５、およびＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２を用いて（図７Ｂ）、それぞれ染色した。ｄｓＲＮＡ蛍光に基づき、斑点を有する表面が形成され、それぞれの表面内においてｎｓｐ蛍光が計測された。２５点の画像における蛍光輝点の数は、ＩＭＡＲＩＳソフトウェアプログラムを用いて計測された。ｄｓＲＮＡ／ｎｓｐ２／３の比は、総ｄｓＲＮＡ蛍光輝点の数をｎｓｐ２／３蛍光輝点の数で除することにより算出した（図７Ａ）。ｄｓＲＮＡとのｎｓｐ１５の共局在率は、ｄｓＲＮＡ＋ｎｓｐ１５＋の蛍光輝点を、総ｄｓＲＮＡ蛍光輝点で除することにより算出した。値は、独立Ｔ検定によって分析された。スケールバーは、５μＭである。
【００２１】
［図８］
図８Ａ〜図８Ｇは、ＭＨＶ  ｎｓｐ１５変異ウイルスが、マウスにおいては非常に弱毒であり、防御免疫反応を誘導することを示す。図８Ａは、ＷＴまたはＮ１５ｍ１ウイルスに感染したマウスの臓器におけるウイルス負荷を示す。生後６週のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝４）に、６．０×１０４ＰＦＲウイルスを腹腔内接種した。表示時点ごとに、肝臓および脾臓を摘出し、プラークアッセイによりウイルス価をテストした。赤色の破線は、検出限界を示す。図８Ｂは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、６．０×１０４ＰＦＵウイルスを腹腔内接種したしたことを示す。２４ｈｐｉに、腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）を摘出し、ウイルスゲノムを、Ｎ遺伝子を標的とする定量ＲＴ−ＰＣＲによって計測した。値は、βアクチンに標準化される。＊＊＊、ｐ＜０．００１、独立Ｔ検定。図８Ｃは、ＷＴおよびＮ１５ｍ１に感染したマウスにおける、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色による肝病理を、矢印で示す。データは、マウス５匹の代表である。図８Ｄおよび図８Ｅは、６００ＰＦＵのＷＴまたはＮ１５ｍ１ウイルスを頭蓋内（ＩＣ）注射によりマウスに接種した結果を示す。ウイルスの病原性について、体重減少率（図８Ｄ）および生存率（図８Ｅ）によって計測した。図８Ｆおよび図８Ｇにおいて、生後１３週の生まれたままのマウスと、図８ＤでＮ１５ｍ１に感染したマウスに対し、６．０×１０３ＰＦＵのＷＴウイルスを頭蓋内（ＩＣ）注射した。ウイルスの病原性は、体重減少率（図８Ｆ）および生存率（図８Ｇ）によって計測した。マウスの数（ｎ）を図示した。生存率のｐ値は、ログランク検定を用いて算出した。
【００２２】
［図９］
図９Ａおよび図９Ｂは、ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）ＥｎｄｏＵ欠損変異が、感染したブタのマクロファージ内におけるＩ型インターフェロンを増強させることを示す。図９Ａは、野生型ＰＥＤＶ（ｉｃＰＥＤＶ）およびＰＥＤＶ  ｎｓｐ１５変異ウイルス（ｉｃＰＥＤＶ−ｄｅＥｎｄｏＵ）の感染性クローンの模式図である。図９Ｂは、０．１プラーク形成ユニット／細胞のｉｃＰＥＤＶまたはｉｃＰＥＤＶ−ｄｅＥｎｄｏＵに、ベロ細胞が感染したことを示す。表示時点ごとに、ウイルス滴定のために細胞上清を収集した。データは、ｉｃＰＥＤＶおよびｉｃＰＥＤＶ−ｄｅＥｎｄｏＵのいずれもベロ細胞において効率的に増殖し、同等の増殖速度であったことを示す。図９Ｃは、生まれたままのブタ肺胞マクロファージ（ＰＡＭ）がｉｃＰＥＤＶまたはｉｃＰＥＤＶ−ｄｅＥｎｄｏＵウイルスのいずれかに感染し、表示時点ごとに採取されたことを示す。採取された細胞から全ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡに転写した。Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−β）の生産は、定量ＰＣＲを用いたｍＲＮＡレベルを検査することにより評価した。データは、ＰＥＤＶ−ｄｅＥｎｄｏＵ変異ウイルスは、野生型ＰＥＤＶ感染と比較すると、非常に高レベルでＩ型ＩＦＮ生産を刺激することを示す（Ｎ．Ｄ．は、非検出を意味する）。
【００２３】
［図１０］
図１０Ａおよび１０Ｂは、Ｎ１５ｍ１がＩＦＮ活性化を誘導するが、Ｎ３ｍウイルスはＩＦＮ活性化を誘導しないことを示す。図１０Ａは、ＢＭＤＭがＷＴまたはＮ１５ｍ１のＭＨＶに感染したことを示す（ＭＯＩ＝０．１）。１２ｈｐｉにおいて、感染した細胞を４％ホルムアルデヒドで固定し、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（核；青色）、抗ヌクレオカプシド（Ｎ；赤色）、および抗ＩＳＧ５４（緑色）で染色した。共焦点顕微鏡によって免疫蛍光を検出した。図１０Ｂは、ＢＭＤＭが、ＷＴ、Ｎ３ｍ、またはＮ１５ｍ１のＭＨＶに感染したことを示す（ＭＯＩ＝０．１）。ＩＦＮ−α１１  ｍＲＮＡレベルは、１２ｈｐｉにおいて定量ＲＴ−ＰＣＲによって判定された。値は、βアクチンに標準化された。ｎ．ｓ．は、有意でないことを示す。独立Ｔ検定が用いられた。
【００２４】
［図１１］
図１１Ａおよび図１１Ｂは、Ｎ１５ｍ１が急速なアポトーシス細胞死を誘導することを示す。図１１Ａは、Ｂ６  ＢＭＤＭが、ＷＴ、Ｎ１５ｍ１１、または紫外線で不活性化されたＮ１５ｍ１（ＵＶ−Ｎ１５ｍ１）のＭＨＶに感染したことを示す。２４ｈｐｉにおいて、明視野顕微鏡のもとで細胞変性効果が確認された。図１１Ｂは、スタウロスポリン（１μＭ）で処理され、ＷＴまたはＮ１５ｍ１のＭＨＶに感染した、ＢＭＤＭにおいて、１６ｈｐｉにおいてアポトーシスが生じていることが、電子顕微鏡により観察された核クロマチン（黒色矢印）の凝縮により確認されたことを示す。
【００２５】
［図１２］
図１２Ａおよび図１２Ｂは、Ｎ１５ｍ１の誘導によるアポトーシスは、ＰＫＲ阻害剤Ｃ１６によって阻止され、Ｉ型ＩＦＮ受容体が必要であることを示す。図１２Ａは、Ｂ６  ＢＭＤＭが、ＷＴまたはＮ１５ｍ１に感染したことを示す（ＭＯＩ＝０．１）。細胞変性効果および細胞生存率を、１８ｈｐｉにおいて評価した。＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１、独立Ｔ検定。図１２Ｂは、Ｂ６またはｉｆｎａｒ−／−ＢＭＤＭが、ＷＴまたはＮ１５ｍ１に感染したことを示す（ＭＯＩ＝０．１）。カスパーゼ３／７活性は、１８ｈｐｉにおいて、カスパーゼ３／７―Ｇｌｏアッセイによって計測した。＊＊＊＊、ｐ＜０．００００１、２元配置分散分析テスト。データは、２〜３の独立した実験の代表である。図１２Ｂに示したデータは、相対発光量（ＲＬＵ）および平均±ＳＤで表される。
【００２６】
［図１３］
図１３は、Ｔ９８Ｍ変異が、ｎｓｐ１５のオリゴマー化を変更させることを示す。動的光散乱法により、ＷＴおよびＴ９８Ｍ  ｎｓｐ１５の濃度を増加させながら、モノマーとヘキサマーの割合を評価した。
【００２７】
［図１４］
図１４Ａおよび図１４Ｂは、Ｎ１５ｍ３が、Ｂ６  ＢＭＤＭにおいて急速な細胞死を誘導することを示す。Ｂ６  ＢＭＤＭは、ＷＴ、Ｎ１５ｍ１、またはＮ１５ｍ３のウイルスに感染した（ＭＯＩ＝０．１）。図１４Ａは、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏアッセイを用いて判定した、２４ｈｐｉにおける細胞生存率を示す。図１４Ｂは、１２ｈｐｉにおいて細胞を採取し、２０ｕｇの全溶解液を用いて行った、ｎｓｐ１５、Ｎタンパク質、およびローディングコントロール（βアクチン）の検出結果を示す。
【００２８】
［図１５］
図１５Ａおよび図１５Ｂは、ｎｓｐ１５のエンドヌクレアーゼ活性は、感染したＢＭＤＭにおけるｄｓＲＮＡ量を変化させないことを示す。Ｂ６（図１５Ａ）またはｉｆｎａｒ−／−ＢＭＤＭ（図１５Ｂ）は、ＷＴまたはＮ１５ｍ３のウイルスに感染した（ＭＯＩ＝０．１）。６ｈｐｉにおいて、細胞にｄｓＲＮＡ用の染色を施し、流動細胞計測法によって分析した。
【００２９】
［図１６］
図１６Ａおよび図１６Ｂは、ｎｓｐ１５が、感染したＢＭＤＭにおけるｄｓＲＮＡの分布に影響を与えることを示す。ＢＭＤＭは、ＷＴまたはＮ１５ｍ３に感染した（ＭＯＩ＝０．１）。細胞を６ｈｐｉで固定し、抗ｄｓＲＮＡ、抗ｎｓｐ２／３、およびＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色した。２５点の画像から、ＩＭＡＲＩＳソフトウェアプログラムを用いて蛍光輝点数をカウントした。図１６Ａは、ｉｆｎａｒ−／−ＢＭＤＭにおける、ｄｓＲＮＡおよびｎｓｐ２／３の蛍光輝点数を示す。図１６Ｂは、Ｂ６  ＢＭＤＭにおける、ｄｓＲＮＡおよびｎｓｐ２／３の局在性を示す。ｄｓＲＮＡおよびｎｓｐ２／３の蛍光輝点をカウントし、ｄｓＲＮＡ／ｎｓｐ２／３の比は、総ｄｓＲＮＡ蛍光輝点数をｎｓｐ２／３蛍光輝点数で除することにより算出した（図１６Ａ）。値は、独立Ｔ検定によって分析された。スケールバーは、５μＭである。
【００３０】
［図１７］
図１７Ａおよび図１７Ｂは、ｎｓｐ１５変異ウイルスが、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいては弱毒であるが、ｉｆｎａｒ−／−マウスにおいては弱毒化されないことを示す。生後６週のＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５）に、６．０×１０４ＰＦＵウイルスを腹腔内接種した。５ｄｐｉ（感染後５日）において、Ｈ＆Ｅ染色によって肝病理を判定した（図１７Ａ）。３ｄｐｉおよび５ｄｐｉにおいて肝臓を摘出し、１７Ｃｌ−１細胞を用いたプラークアッセイによってウイルス価を測定した。赤色の破線は検出限界を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明は、変異コロナウイルス、変異コロナウイルスを備えるワクチン、ワクチンの製造方法、および、疾患の予防方法を提供する。
【００３２】
ｄｓＲＮＡ（二重鎖ＲＮＡ）中間体を介して複製されるＲＮＡウイルスは、細胞質のＲＩＧ様受容体（ＲＬＲ）を含む、ホストのｄｓＲＮＡセンサによって「非自己」であるとして検出される。ＲＩＧ様受容体の活性化は、ＰＫＲ（プロテインキナーゼＲ）およびＯＡＳ（２′，５′−オリゴアデニル酸シンテターゼ）／ＲＮａｓｅ（リボヌクレアーゼ）Ｌシステムなどの追加的なｄｓＲＮＡを増加させるインターフェロンと、数百の抗ウイルスインターフェロン誘導遺伝子（ＩＳＧ）の生産を刺激する。さらに、ｄｓＲＮＡを感知する、ウイルスに感染した細胞から分泌されたインターフェロンは、隣接する細胞内において抗ウイルス状態を誘導し、侵入の可能性があるＲＮＡウイルスの複製を制限する。このため、多くのウイルスは、ホストセンサによる検出を逃れるためにｄｓＲＮＡを隔離する戦略を進化させている。本明細書では、これまで認識されずにいた、マクロファージ内におけるｄｓＲＮＡセンサの活性化を阻害するコロナウイルスのｎｓｐ（非構造タンパク質）１５の役割を開示し、子ウイルスの複製および播種を可能にするものである。
【００３３】
インターフェロン応答のコロナウイルス拮抗作用を調査するための、本発明に至る調査では、マクロファージを含む複数のマウス細胞タイプにおいて複製し、投与部位に応じて急性肝炎または致死的な脳炎を引き起こす、典型的なコロナウイルスである、マウス肝炎ウイルス株Ａ５９（ＭＨＶ−Ａ５９）をテストした。ウイルスゲノムＲＮＡは３２キロベースであり、ゲノムの３分の２は大きなレプリカーゼポリタンパク質をコードし、残りのゲノムは構造タンパク質および株特異的補助タンパク質をコードする（図１Ａ）。レプリカーゼポリタンパク質は、ウイルスプロテアーゼによって１６の非構造タンパク質（ｎｓｐ）に変換される。ウイルスｎｓｐは、ホスト小胞体とともに、ウイルスＲＮＡ合成の部位である回旋状の膜組織と二重膜構造ベシクル（ＤＭＶ）を生成する。コロナウイルスＲＮＡの複製は、新規なプラス鎖ゲノムおよびｍＲＮＡの合成のためのテンプレートとして機能するマイナス鎖ＲＮＡの入れ子セットの生成を介して行われる。細胞質の先天性のセンサの有力な刺激要因である二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）中間体は、この工程中に生産され、ＤＭＶとともに視覚化される。コロナウイルスのＤＭＶの潜在的な機能は、ウイルスｄｓＲＮＡをホストのｄｓＲＮＡセンサから隔離することである。しかしながら、ＤＭＶのみで、ホストの自然免疫反応の活性化を阻止するために十分であるかについては不明である。本明細書に記載した調査では、意外にも、エンドリボヌクレアーゼ活性を備えた、高度に保存されたニドウイルス（コロナウイルスおよびアルテリウイルス）の構成成分である、コロナウイルス非構造タンパク質１５（ｎｓｐ１５）が、ウイルス複製複合体とともに、ウイルスｄｓＲＮＡのホストｄｓＲＮＡセンサへの暴露を制限するために機能することが示されたのである。
【００３４】
ｎｓｐ１５は、レプリカーゼポリタンパク質のウイルスプロテアーゼ媒介処理によって生成される、非構造タンパク質である（図１Ａ）。生物情報学的分析により、ｎｓｐ１５は、ＮｅｎｄｏＵと呼ばれる、脊椎動物をホストとするニドウイルスにおいて高度に保存される細胞性エンドリボヌクレアーゼと、遠い同族性を有するドメインを含むことが明らかになった。構造および生化学的研究により、ＳＡＲＳ−ＣｏＶおよびＭＨＶｎｓｐ１５、並びに、アルテリウイルスのオルソログ（相同分子株）であるｎｓｐ１１は、オリゴマーを形成するために集合し、ｓｓＲＮＡおよびｄｓＲＮＡ分子を３′ウリジニル酸選択により分裂させることが明らかとなった。しかしながら、ニドウイルス複製および発病についてのエンドリボヌクレアーゼ活性の役割については、これまでよく解明されていなかった。研究者は、エンドリボヌクレアーゼ触媒部位の変異をコードするヒトＣｏＶ２２９Ｅウイルスを回復させることができなかったため、ｎｓｐ１５はコロナウイルスの複製に必須である一方、ｎｓｐ１５触媒部位の変異をコードするＭＨＶを複製することで、線維芽細胞株における力価（ウイルス価）を低減させる（約１ログ）ことができるとの結論が得られた。
【００３５】
本発明に至る調査では、ｎｓｐ１５は、ウイルスＲＮＡ合成自体には不要であるが、ホストｄｓＲＮＡセンサの回避を仲介する機能を有すると特定された。具体的には、ｎｓｐ１５における変異をコードするコロナウイルスは、ｎｓｐ１５を不安定化またはエンドリボヌクレアーゼ活性を無効化し、インターフェロンおよびｄｓＲＮＡセンサであるＰＫＲおよびＯＡＳを活性化し、マクロファージにおけるアポトーシス細胞死を促進させる。したがって、ｎｓｐ１５は、ウイルス感染およびマウス内での播殖に必要であり、また、ｎｓｐ１５変異ウイルスは防御免疫反応を誘導することが可能である。
【００３６】
本発明の限定されない実施例を、発明に至るまでの実験的調査に関連して説明する。
【００３７】
自然免疫反応、特にＩ型インターフェロン（ＩＦＮ−α／β）の活性化をブロックするためにコロナウイルスが用いるメカニズムを特定するために、スクリーニング法を用いた。その結果、マウス骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）に感染時にＩＦＮ−αの生産を誘導する、Ｎ１５ｍ１と呼ばれるウイルス単離株が特定された（図１Ｃに概略を示す）。ウイルスゲノムＲＮＡのディープシーケンシングにより、Ｎ１５ｍ１は、ｎｓｐ１５（トレオニン９８からメチオニン［Ｔ９８ｍ］）、および、ｎｓｐ３（アルギニン９７１からアラニン［Ｒ９７１Ａ］）において、変異を含むことが明らかとなった。マクロファージがＮ１５ｍ１に感染すると、ＩＦＮ−αの転写が活性化されることが、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって検出され（図２Ａ）、ＩＦＮ−αタンパク質の分泌量が増加することが、ＥＬＩＳＡにより検出された（図２Ｂ）。Ｉ型インターフェロンの活性化の結果、インターフェロン刺激遺伝子ＩＳＧ５４の発現増加が生じることが、免疫蛍光染色によって検出された（図１０Ａ）。ｎｓｐ１５におけるトレオニン９８残基は、コロナウイルスにおいて高度に保存され（図１Ｄ）、機能性の点で重要である。さらに、Ｎ３ｍと呼ばれる、クリーンなｎｓｐ３変異ウイルス（図１Ｃ）は、Ｒ９７１Ａ変異のみを保有するよう設計された。Ｎ３ｍは、ＷＴウイルスと同様にインターフェロンに拮抗する能力を有するが（図１０Ｂ）、さらに、ｎｓｐ１５におけるＴ９８Ｍの変異がＩＦＮ−αの拮抗作用の喪失に関与することを示唆する。
【００３８】
ＩＦＮ−αおよびＩＳＧの発現が、ウイルスの複製速度またはウイルス価を変化させたか否かを判定するために、野生株（Ｂ６）のＢＭＤＭおよびＩ型インターフェロン受容体欠損（ｉｆｎａｒ−／−）のＢＭＤＭに、ＷＴウイルスまたはＮ１５ｍ１ウイルスに低多重度（ＭＯＩ＝０．１）で感染させ、時間の経過に応じてウイルスの産生を観察した。Ｂ６のＢＭＤＭでは、Ｎ１５ｍ１の複製は大幅に遅れかつ複製量は低く、産生された子ウイルス量は、８ｈｐｉ後のＷＴウイルス量よりも大幅に低かった（図２Ｃ）。ｉｆｎａｒ−／−のＢＭＤＭでは、Ｎ１５ｍ１は、ＷＴウイルスと同様の反応速度を有し、Ｎ１５ｍ１の複製不足は確認されなかった（図２Ｄ）。このことは、インターフェロンがウイルスの複製を制限する理論と一致する。また、ｎｓｐ１５におけるＴ９８Ｍの変異により、ウイルスが、マクロファージにおけるＩ型インターフェロンの活性化を阻害することができなくなると結論づけられた。これらの結果から、野生株のｎｓｐ１５は、ウイルス感染においてＩ型ＩＦＮのアンタゴニスト（拮抗物質）として機能することが示された。
【００３９】
前記増殖速度実験を行ったところ、Ｎ１５ｍ１に感染したマクロファージは、ＷＴウイルスまたは紫外線不活性化ウイルスのいずれかに感染した細胞よりも早く細胞死することが確認された。図３Ａに示すように、Ｎ１５ｍ１に感染したＢＭＤＭは、２４ｈｐｉにおいて非常に低い細胞生存率を示した（図１１Ａも参照）。また、汎カスパーゼ阻害剤ｚＶＡＤは、ウイルスに誘発される細胞死を阻止したが、ＲＩＰＫ１阻害剤Ｎｅｃ−１、カスパーゼ−１阻害剤ＶＸ−７６５には、このような効果はなかった（図３Ｂ）。これらの結果から、Ｎ１５ｍ１感染は、ＲＩＰＫ１／ＲＩＰＫ３依存のネクロトーシス、あるいは、カスパーゼ−１を介したピロトーシスではなく、アポトーシス細胞死を活性化させることが示された。この発見は、アポトーシスのその他の特徴を評価することによって支持された。すなわち、Ｎ１５ｍ１に感染したＢＭＤＭにけるカスパーゼ３／７活性の増強は、ｚＶＡＤにより阻害される（図３Ｃ）。カスパーゼ３／７に依存するアポトーシス経路の活性化は、切断されたカスパーゼ３生成物のレベルが増加することによっても実証された（図３Ｄ）。ＷＴ感染ＢＭＤＭとの比較において、、Ｎ１５ｍ１感染ＢＭＤＭにおいて、凝縮かつ衰退化したクロマチンおよび核断片化が電子顕微鏡によって確認された（図１１Ｂ）。これらのデータが、Ｎ１５ｍ１感染が、マクロファージにおけるアポトーシスを誘発することを示したことから、ＷＴのｎｓｐ１５が、Ｉ型インターフェロンの活性化に拮抗するだけでなく、アポトーシス細胞死をも阻止することが示唆された。
【００４０】
Ｉ型インターフェロンの合成とアポトーシス細胞死は、ウイルスｄｓＲＮＡを認識する、ホストの膜に関連するセンサあるいは細胞質センサによって、引き起こされる。インターフェロン誘導遺伝子２′５′−オリゴアデニル酸シンテターゼ（ＯＡＳ）およびタンパク質キナーゼＲ（ＰＫＲ）のｄｓＲＮＡに依存した活性化は、アポトーシス細胞死を引き起こす。これまでの研究により、ＳＡＲＳ−ＣｏＶおよびＭＨＶのｎｓｐ１５は、ウイルスエンドリボヌクレアーゼであり、両者ともＲＮＡ分子（ｓｓＲＮＡおよびｄｓＲＮＡ）の結合および切断ができることがわかっている。したがって、ＷＴのｎｓｐ１５が、ｄｓＲＮＡをホストのセンサから隔離することにより、インターフェロンの合成を阻害し、アポトーシスを阻止していると仮定された。ｎｓｐ１５がｄｓＲＮＡセンサの活性化を阻止するか否かを検証するために、リン酸化ｅｌＦ２α、ＰＫＲ活性指示薬、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）の分解、活性２′５′―ＯＡＳ／ＲＮａｓｅＬシステムシグナリング指示薬のレベルをそれぞれ評価した。ＷＴウイルス感染ＢＭＤＭとの比較において、Ｎ１５ｍ１感染ＢＭＤＭでは、ｅｌＦ２αのリン酸化が増加したことが確認された（図４Ａ）。特定のＰＫＲキナーゼ阻害剤Ｃ１６を添加すると、Ｎ１５ｍ１に感染した細胞における、アポトーシスに関係するカスパーゼ３／７活性のレベルが非常に低減した（図４Ｂおよび図１２Ａ）。
【００４１】
１２ｈｐｉおよび２４ｈｐｉにおけるｒＲＮＡの分解（図４Ｃ）から、２′５′−ＯＡＳ／ＲＮａｓｅＬ経路の活性化も確認された。ホストｒＲＮＡの分解は、ｚＶＡＤまたはＣ１６によって阻害されておらず（図４Ｄ）、２′５′―ＯＡＳ／ＲＮａｓｅＬの活性化は、アポトーシスの結果ではないこと、および、ＰＫＲ経路とは無関係であることが示された。最後に、Ｎ１５ｍ１に感染したマクロファージにおける、カスパーゼ−３の切断またはカスパーゼ−３／７の活性化は、ＩＦＮ受容体に依存しており（図４Ｃおよび図１２Ｂ）、観察されたアポトーシスがインターフェロン誘導遺伝子に依存していることをさらに示唆している。これらのデータは、マクロファージがＮ１５ｍ１に感染すると、ウイルスのｄｓＲＮＡの検出が、ｅｌＦ２αaのリン酸化、ＲＮＡの分解、カスパーゼ３／７の活性化、およびアポトーシスを誘発することを示唆する。これらの結果は、ＷＴのｎｓｐ１５が、ｄｓＲＮＡを介した自然免疫反応の活性化を阻止する機能があるという仮説を支持する。
【００４２】
Ｔ９８Ｍの変異は、ｎｓｐ１５のＮ末端ドメインと中間（Ｍ）ドメインとの境界面に存在するため（図１Ｂ）、オリゴマーの安定性または集合に影響を与える可能性がある。実際に、ｎｓｐ１５のレベルは、ＷＴに感染した細胞と比較すると、Ｎ１５ｍ１に感染した細胞内においては非常に低減した一方で、Ｎタンパク質のレベルは微減したのみであった（図５Ａ）。Ｎ１５ｍ１に感染したｉｆｎａｒ−／−ＢＭＤＭにおいても、ｎｓｐ１５の低減が観察された（図５Ａ）が、いずれのウイルスも、同等のＮタンパク質レベルおよび増殖速度を有していた（図２Ｄ）ことから、Ｎ１５ｍ１に感染したＢ６のＢＭＤＭにおいてｎｓｐ１５のレベルが低減した理由は、ウイルスの複製が低減したことだけに起因するものではない。大腸菌から精製された野生型のタンパク質およびＴ９８Ｍｎｓｐ１５タンパク質のいずれもが、等しくｎｓｐ１５ポリクローナル抗血清によって検出されているため（図５Ｂ、底部）、前記検出が減少した理由は、変異タンパク質に対するｎｓｐ１５抗体の類似性に起因するものでもない。これらの結果は、Ｔ９８Ｍの変異が、ｎｓｐ１５を不安定化し、Ｎ１５ｍ１に感染した細胞におけるタンパク質の定常状態レベルを低下させたことを示す。
【００４３】
ｎｓｐ１５タンパク質におけるＴ９８Ｍの変異の効果をさらに評価するため、コドンを最適化させた野生型ｎｓｐ１５タンパク質およびＴ９８Ｍ  ｎｓｐ１５タンパク質をクローン化し、大腸菌におけるＳＵＭＯフュージョンタンパク質として発現させた（図３Ｂ、上部）。ｎｓｐ１５の構造に基づき、ＳＵＭＯタグは、ｎｓｐ１５について上述したヘキサマーなどのオリゴマーの集合には影響を与えない。Ｔ９８Ｍの変異がタンパク質を不安定化させるかについてさらに評価するため、示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）を用いて、熱に対するｎｓｐ１５の安定性を測定した（図５Ｃ）。ＷＴのｎｓｐ１５は、４７℃において変性状態への主な遷移を示す。対照的に、Ｔ９８Ｍ変異ｎｓｐ１５は、ＷＴのｎｓｐ１５よりも７℃低い４０℃で変性し、Ｔ９８Ｍの変異がｎｓｐ１５を不安定にすることをさらに示している。
【００４４】
動的光散乱（ＤＬＳ）分光法を用いることにより、ＷＴｎｓｐ１５の大半はタンパク質濃度０．０５ｍｇ／ｍｌにおいてオリゴマーを形成するために集合することが確認された（図１３）。対照的に、ｎｓｐ１５−Ｔ９８Ｍ変異は、これらの条件下においてモノマーの形態で検出された（図１３）。ｎｓｐ１５−Ｔ９８Ｍのオリゴマー化の障害または欠如がエンドリボヌクレアーゼ活性に影響を与えたか否かを判断するための評価を行った結果、Ｔ９８Ｍの変異は、ＷＴタンパク質と比較すると、ＲＮＡ切断活性に関して大きな減少を示した（図５Ｄ）。また、ＷＴおよびＴ９８Ｍのｎｓｐ１５タンパク質の生体外特性評価は、Ｔ９８Ｍの変異は、タンパク質の安定性を低下させ、エンドリボヌクレアーゼ活性を阻害することを示した。これらの結果は、ｎｓｐ１５を備えるポリタンパク質をコードし、ｎｓｐ１５における変異および／または欠失を含む変更を生じさせる、変異レプリカーゼ遺伝子が、ｎｓｐ１５の安定性（不安定化）または活性（不活性化）に影響を与えることをさらに示すものと解釈される。
【００４５】
変異Ｔ９８Ｍは、タンパク質の欠損を引き起こし、ｎｓｐ１５のエンドリボヌクレアーゼ活性を阻害することから、ホストのｄｓＲＮＡセンサの回避に、エンドリボヌクレアーゼ活性が重要であるのかを判定するための実験を行った。エンドヌクレアーゼ不活性型ｎｐｓ１５（Ｈ２６２Ａ）を備える変異ウイルスＮ１５ｍ３を生成した。マクロファージがＮ１５ｍ３に感染すると、ＩＦＮ−αの転写が促進され（図６Ａ）、Ｂ６のＢＭＤＭでは複製が不十分となるが、ｉｆｎａｒ−／−ＢＭＤＭにおいては複製が不十分とはならず（図６Ｂ）、急速なアポトーシス細胞死が生じ（図６Ｃおよび図１４Ａ）、および、ｒＲＮＡの分解が生ずる（図６Ｄ）。このことから、Ｎ１５ｍ３は、Ｎ１５ｍ１ウイルスの表現型模写を行うことが示されている。Ｎ１５ｍ１と異なり、Ｎ１５ｍ３は、ｉｆｎａｒ−／−ＢＭＤＭにおいてＷＴウイルスと同等レベルのｎｓｐ１５を発現したため（図１４Ｂ）、Ｈ２６２の変異は、ｎｓｐ１５の定常レベルに影響を与えなかったといえる。したがって、エンドリボヌクレアーゼ活性（Ｈ２６２Ａ）の欠損が、Ｔ９８Ｍの変異によるｎｓｐ１５タンパク質の欠損に関連する表現型の再現をもたらすと判断された。これらの結果は、ｎｓｐ１５のエンドリボヌクレアーゼ活性が、ホストのｄｓＲＮＡセンサの回避に重要であることを示す。
【００４６】
大腸菌からの精製ＭＨＶは、マンガンの存在下においてエンドヌクレアーゼ活性を示し、触媒ヒスチジン２６２からアラニン（Ｈ２６２Ａ）への置換により、不活性酵素が生じる結果となった。したがって、ホストのｄｓＲＮＡセンサの活性化を阻止する際のエンドリボヌクレアーゼ活性の役割をさらに判定するために、触媒不活性型のｎｓｐ１５（Ｈ２６２Ａ）を保有するＮ１５ｍ３ウイルスが選択された。ＣｏＶの感染により、ウイルス複製中にｄｓＲＮＡ中間体が生成されるため、ｎｓｐ１５がｄｓＲＮＡの蓄積を阻止するためにウイルスｄｓＲＮＡを分解させるとの仮定がなされた。この仮説を検証するため、Ｂ６のＢＭＤＭまたはｉｆｎａｒ−／−ＢＭＤＭをＷＴウイルスまたはＮ１５ｍ３ウイルスに感染させ、ｄｓＲＮＡレベルを計測した。驚くべきことに、ｄｓＲＮＡの蛍光発光強度あるいは流動細胞計測法を用いたｄｓＲＮＡ陽性細胞の割合から測定される、Ｎ１５ｍ３感染細胞におけるｄｓＲＮＡレベルの増加が観察されなかった。このことは、ｎｓｐ１５の拮抗機能が、ウイルスｄｓＲＮＡの分解に媒介されるものではないことを示唆する。
【００４７】
これまでは、ＣｏＶのｄｓＲＮＡは、主に複製複合体に関連し、ホストのセンサからウイルスＲＮＡを保護すると考えられたＤＭＶよって隠されていると考えられていた。したがって、ｎｓｐ１５はｄｓＲＮＡと複製複合体との関連性を維持する、あるいは、ＤＭＶへのｄｓＲＮＡのパッキングを促進するように機能すると仮定された。そこで、ｎｓｐ１５変異ウイルスは、より多くのフリーなｄｓＲＮＡを生成し、これらのフリーなｄｓＲＮＡがホストセンサを活性化させることが予測された。この仮説を検証するため、ｄｓＲＮＡおよび複製複合体（インジケータとしてのｎｓｐ２／３）の細胞内局在を、特異抗体を用いた免疫蛍光法で評価した。Ｎ１５ｍ３の感染は、特にｉｆｎａｒ−／−ＢＭＤＭにおいて、ｎｓｐ２／３とは共局在化しなかったｄｓＲＮＡの蛍光輝点をより多く生成することが確認された（図７Ａ）。
【００４８】
フリーなｄｓＲＮＡを定量化するため、ＩＭＡＲＩＳソフトウェアプログラムを用いて、ｄｓＲＮＡの蛍光輝点およびｎｓｐ２／３の蛍光輝点をカウントした。ｉｆｎａｒ−／−ＢＭＤＭにおけるｎｓｐ２／３の蛍光輝点と同等数を有する場合に、Ｎ１５ｍ３は、ＷＴウイルスよりも多くｄｓＲＮＡ蛍光輝点を生産した（図７Ａ左パネルおよび図１６Ａ）。フリーなｄｓＲＮＡの蛍光輝点数とＮ１５ｍ３のｄｓＲＮＡ／ｎｓｐ２／３の比は、ＷＴウイルスよりも非常に高かった（図７Ａ右パネル）。Ｂ６のＢＭＤＭにおいては、Ｎ１５ｍ３ウイルスは同等数のｄｓＲＮＡ蛍光輝点を生産したが、複製障害により、ｎｓｐ２／３蛍光輝点数は非常に少なかった（図６Ｂ）。ｄｓＲＮＡ／ｎｓｐ２／３の比は、ＷＴウイルスよりもＮ１５ｍ３において依然として高いことが確認され（図１６Ｂ）、ｉｆｎａｒ−／−ＢＭＤＭで得られた結果（図７Ａ）と一致していた。以上のことから、これらのデータは、ｎｓｐ１５は、細胞中のｄｓＲＮＡ量には影響を与えないが、ｄｓＲＮＡとｎｓｐ２／３との関係と、後述するｄｓＲＮＡのＤＭＶへのパッキングを維持するよう機能すると考えられる。
【００４９】
ｎｓｐ１５とｄｓＲＮＡとの関係をさらに理解するために、ｎｓｐ１５およびｄｓＲＮＡの局在化を調べた。ｎｓｐ１５は、ウイルスレプリカーゼタンパク質を含む固有の斑点において新規に合成されたウイルスＲＮＡに関係し、ウイルスＲＮＡ合成用のサイトであると考えられている。ｎｓｐ１５およびｄｓＲＮＡは、特異抗体を用いた免疫蛍光法によって視覚化された。ｎｓｐ１５と共局在化されたｄｓＲＮＡの蛍光輝点数は、ＷＴ感染細胞と比較して、Ｎ１５ｍ３感染細胞において非常に低減していた（図７Ｂ）。これらの結果は、ｎｓｐ１５はｄｓＲＮＡおよびウイルス複製複合体と関係する可能性をさらに支持する。したがって、エンドリボヌクレアーゼ活性が喪失することにより、ｄｓＲＮＡと複製複合体との結びつきが破壊されるため、より多くのフリーなｄｓＲＮＡが、ホストのセンサにより感知されたと結論付けられる。
【００５０】
ｎｓｐ１５変異ウイルスは、強力なインターフェロン応答を誘発し、ホストのｄｓＲＮＡセンサを活性化させることから、ｎｓｐ１５を介した自然免疫反応の拮抗作用の喪失が、マウスコロナウイルスの病原性を変更するか否かを判定するため、さらなる調査が行われた。この目的を達成するため、感染後５日目（５ｄｐｉ）に、ＷＴのＭＨＶ−Ａ５９のウイルス価がピークを迎えると考えられる非致死モデルの感染を採用した。マウスに６０，０００ＰＦＵを腹腔内注射し、ウイルスの複製を計測するために、感染後３日目および５日目に肝臓および脾臓を摘出した。感染粒子を数えるための通常のプラークアッセイでは、Ｎ１５ｍ１を接種したマウスにおけるウイルスについては陰性であった（図８Ａ）。ＭＨＶのＮ遺伝子ｍＲＮＡを検出するための、より感度の高いＲＴ−ｑＰＣＲアッセイでは、感染後１日目における腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）において最小レベルのＮ１５ｍ１のＲＮＡを識別したが、それ以降では確認されなかった（図８Ｂ、データ図示せず）。肝臓の組織学的検査では、ＷＴのＭＨＶによる感染に伴う典型的な病変が示されたが、Ｎ１５ｍ１に感染したマウスでは確認されなかった（図８Ｃ）。同様に、Ｎ１５ｍ３に感染したマウスは、Ｎ１５ｍ１に感染したマウスと同様に肝病理を一切示さなかった（図１７Ａ）。
【００５１】
Ｎ１５ｍ１ウイルスが弱毒であるか否かを判定するために、致死的な攻撃モデルを利用した。６００ＰＦＵのＷＴウイルスは、マウスの頭蓋内に接種するだけで、致死的な脳炎を引き起こす。ＷＴに感染したマウスは、体重が減少し、感染後７日までに感染症により死亡する。対照的に、Ｎ１５ｍ１に感染したマウスはすべて、感染後も生存し続け、感染後１日目に一時的な体重の減少を示した後、時間の経過とともに体重が増加した（図８Ｄおよび図８Ｅ）。これらのデータは、敏感な生体モデルにおいても、Ｎ１５ｍ１は非常に弱毒であり、一切の病因とならなかったことを示す。さらに、ｉｆｎａｒ−／−マウスの腹腔内に５０ＰＦＵのＷＴまたは変異ウイルスを接種したところ、すべてのマウスが感染症により急速に死亡したことから、変異ウイルスにおけるｎｓｐ１５のＩＦＮ拮抗作用を喪失することは、Ｂ６のマウスの感染中における弱毒化に寄与するという理論が裏付けられる（図１７Ｂ）。重要なことに、マウスにＮ１５ｍ１を接種することにより、６０００ＰＦＵ（１０倍の致死量）のＷＴのＭＨＶによる攻撃から完全に保護された。
【００５２】
これらの実験的な調査により、ＷＴウイルス感染中において、ウイルスｄｓＲＮＡがホストセンサを活性化することを防止するｎｓｐ１５の役割が示された。ウイルス複製中にｎｓｐ１５を喪失することにより、高速なｄｓＲＮＡの感知、Ｉ型インターフェロン、２′５′−ＯＡＳ／ＲＮａｓｅＬおよびＰＫＲの活性化がなされ、これによってウイルスの複製、拡散、および疾患が制限される。ＩＦＮシグナルの不在下においては、ｎｓｐ１５変異ウイルスはＷＴウイルスと同様に複製することから、ウイルスＲＮＡを合成するにあたりｎｓｐ１５のエンドリボヌクレアーゼ活性は不要であることが示された。一方、ｎｓｐ１５は、マクロファージにおけるコロナウイルス複製に対する自然免疫反応を妨げるのに重要である。
【００５３】
ｄｓＲＮＡセンサのアンタゴニスト（拮抗物質）としてのｎｓｐ１５の効果は、これまでのコロナウイルスレプリカーゼにコードされたアンタゴニストの研究により明らかである。ＣｏＶは、ホストＰＲＲ認識を回避するために、自身のｍＲＮＡの５′末端にキャップ構造を提供するよう２′Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ｎｓｐ１６）をコードする。２′Ｏ−メチルトランスフェラーゼ活性を有しないＳＡＲＳ−ＣｏＶおよびＭＨＶ変異ウイルスは、Ｉ型ＩＦＮ応答を引き起こし、マクロファージおよびマウス内において弱毒であった。ＳＡＲＳ−ＣｏＶおよびＭＨＶのｎｓｐ１は、ホストのｍＲＮＡを分解させることによってＩＦＮ誘導を阻止することができる。しかしながら、ｎｓｐ１欠失変異体を有するマクロファージの感染はＩＦＮ誘導を変化させず、むしろＢ６マウス内において弱毒であった。ＣｏＶは、ｎｓｐ３内において必須パパイン様プロテアーゼ（ＰＬＰ２またはＰＬｐｒｏ）ドメインをコードし、細胞基質からユビキチン分子を切断することにより自然免疫反応を調節不全にすることができる。ｎｓｐ１５は、通常の風邪を引き起こす、ＨＣｏＶ−２２９ＥやＯＣ４３などの比較的良性のコロナウイルスを含む、すべてのコロナウイルス内において高度に保存されていることから、ウイルスにとって、マクロファージ内においてホストｄｓＲＮＡセンサによる認識を阻止し、標識組織においてウイルスの播殖を可能とするために、ｎｓｐ１５は必須である。
【００５４】
これまでの研究により、コロナウイルスは、ＯＡＳ／ＲＮａｓｅＬシステムやＰＫＲなどのホストのセンサのｄｓＲＮＡを介した活性化を阻害するウイルス因子をコードすることが示されている。たとえば、上述した調査で使用されたマウスコロナウイルス株も、ＯＡＳ／ＲＮａｓｅＬシステムのもう一つの重要なアンタゴニストであるアクセサリータンパク質ｎｓ２をコードする。Ｎｓ２は、マクロファージにおけるＲＮａｓｅＬを介したｒＲＮＡ分解を阻止するため、ＯＡＳの産物である２′，５′−オリゴアデニル酸を切断する、２′，５′−ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）酵素をコードする。ｎｓ２変異ウイルスによる頭蓋内感染は致死的であることから、コロナウイルスｎｓ２は肝特異効果を付与する。そのままのｎｓ２を有するｎｓｐ１５変異ウイルスは、マクロファージにおいてｒＲＮＡ分解を誘発することができ、肝炎および脳炎マウスモデルのいずれにおいても非常に弱毒であることがわかった。ＭＥＲＳ−ＣｏＶのアクセサリータンパク質に関する調査により、ＮＳ４ｂは、ＭＨＶのｎｓ２と同様のＰＤＥ活性を有し、ＲＮａｓｅＬ活性を阻止することが示された。ＭＥＲＳ−ＣｏＶのＮＳ４ａは、ＰＫＲの活性化を制限するｄｓＲＮＡ結合タンパク質をコードする。ウイルスに関してＮＳ４ａを削除することは、ＰＫＲの活性化およびストレス応答の生成には不十分であるため、ＭＥＲＳ−ＣｏＶは、ｄｓＲＮＡセンサの識別と活性化を抑制するために冗長メカニズムを有さなければならない。本明細書中に示した結果は、ｎｓｐ１５は、ＣｏＶ感染中にｄｓＲＮＡセンサの活性化を抑制する保護されたウイルス因子として働き、ｎｓ２、ＮＳ４ａ、またはＮＳ４ｂによるＰＫＲおよび／またはＯＡＳ／ＲＮａｓｅＬの追加的な抑制は、ウイルス病原に貢献する可能性のある組織特異的メカニズムまたは冗長メカニズムによる制御を提供することを示す。
【００５５】
ウイルスＲＮＡセンサの活性化を抑制するためにｎｓｐ１５が用いる正確なメカニズムの解明が残されている。特に、ｄｓＲＮＡセンサの拮抗作用におけるｎｓｐ１５のエンドリボヌクレアーゼ活性の役割は不明である。リボヌクレアーゼ活性については、リボヌクレアーゼ活性をコードする２つのウイルスが自然免疫反応を抑制する機能を示している。ペスチウイルスＲＮａｓｅ  Ｅｒｎｓは、リソソーム内でウイルスＲＮＡを分解させる、酵素活性誘発受容体として機能し、これにより、ホストのｄｓＲＮＡセンサに対するＲＮＡの暴露が制限される。ラッサ熱ウイルスの核タンパク質も、フリーなｄｓＲＮＡを消化し、インターフェロン調節因子３の転座およびホストの自然免疫反応システムの活性化を抑制するために必須である、３′〜５′エキソヌクレアーゼドメインを含む。したがって、ｎｐｓ１５が、ホストのｄｓＲＮＡセンサによる検出を防止するために、ウイルスｄｓＲＮＡを分解させているだろうと仮説を立てることは合理的であった。それにも拘わらず、ｎｓｐ１５変異ウイルスに感染したマクロファージにおいて、ｄｓＲＮＡレベルの増加は確認されなかったため（図１４）、ｎｓｐ１５はＲＮＡを広範囲に分解するのではなく、特定の標的を有する可能性が示唆された。これらの調査により、ｎｓｐ１５は、ｄｓＲＮＡと複製複合体との関連性を維持するか、ｄｓＲＮＡのＤＭＶパッキングを仲介する可能性があることが示された。
【００５６】
以上から、上述した調査は、マクロファージにおける自然免疫反応を効果的に調節するためにコロナウイルスによって利用されるメカニズムに対する理解を提供するとともに、ｎｓｐ１５を標的とする治療法の開発と、生かつ弱毒のワクチンの開発に対するいくつかの新しい指針を提供する。たとえば、ポリタンパク質をコードする変異レプリカーゼ遺伝子を備える生かつ弱毒のコロナウイルスを備えるワクチンを投与することにより、さまざまなコロナウイルスに対してヒト対象被験者に接種を行うことで、ｎｓｐ１５の安定性または活性に影響を与える変異または欠失を含む変化を生じさせることができる。非限定的であるが特定の例として、位置９８においてトレオニンからメチオニンへのアミノ酸変異、あるいは、位置２６２において触媒ヒスチジンからアラニンへのアミノ酸変異を備えるタンパク質を挙げることができる。該ワクチンは、水、生理食塩水、緩衝食塩水、リン酸緩衝液、アルコール／水溶液、乳液または懸濁液などの薬剤的に許容されるキャリアを含む。
【００５７】
ｎｓｐ１５はすべてのコロナウイルス内で高度に保存されているため、上述したアプローチを、既存のコロナウイルスから新型コロナウイルスまでのコロナウイルス科に属するすべてのコロナウイルスに対するワクチンの製造に適用することができると考えられる。したがって、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）、中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ−ＣｏＶ）、ヒトコロナウイルス２２９Ｅ（ＨＣｏＶ−２２９Ｅ）、ＯＣ４３（ＨＣｏＶ−ＯＣ４３）、ＨＫＵ１（ＨＣｏＶ−ＨＫＵ１）、およびＮＬ６３（ＨＣｏＶ−ＮＬ６３）、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰＶ）、イヌコロナウイルス（ＣＣｏＶ）、鶏伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、ウシコロナウイルス（Ｂ０Ｃ０Ｖ）、および、伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）、ブタデルタコロナウイルス（ＰＤＣｏＶ）、ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）、ブタ呼吸器コロナウイルス（ＰＲＣＶ）、ブタ血球凝集性脳脊髄炎コロナウイルス（ＰＨＥ−ＣｏＶ）を含むブタコロナウイルスなどのさまざまなコロナウイルスのｎｓｐ−１５において変異を形成することにより、ワクチンを製造することが可能であると考えられる。
【００５８】
感染性クローンの変異によるブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）のｎｓｐ１５／ＥｎｄｏＵの不活化により、組織培養において効率的に複製するともに、感染したマクロファージにおいてインターフェロンを生成する自然免疫反応を活性化させる（図９）、ウイルスが提供される。ヒトまたは動物に感染するコロナウイルスにおけるｎｓｐ１５／ＥｎｄｏＵ活性の不活化は、該ウイルスのワクチン株を生成する。この不活化により、ウイルス感染したマクロファージにおけるインターフェロンの急速な活性化が可能となり、適応免疫反応が刺激される。この効果は複数種のコロナウイルスにおいて発揮されうる。たとえば、Ｉ型インターフェロン応答などの自然免疫反応の活性化を刺激するウイルスが提供される。
【００５９】
上述した研究の態様と結論の裏付けは、以下の刊行物よって開示されている。Ｄｅｎｇらの『マクロファージにおけるコロナウイルス非構造タンパク質１５を介したｄｓＲＮＡセンサの回避およびアポトーシスの制限（Coronavirus nonstructural protein 15 mediates evasion of dsRNAsensors and limits apoptosis in macrophages）』（米国科学アカデミー（National Academy of Sciences）論文集、２０１７年５月、１１４（２１）Ｅ４２５１−Ｅ４２６０；ＤＯＩ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１６１８３１０１  １４）、および、Ｋｉｎｄｌｅｒらの『エンドヌクレアーゼを介したＲＮＡセンシングの早期回避による効率的なコロナウイルス複製の確立（Early endonuclease-mediated evasion of RNA sensing ensures efficientcoronavirus replication）』（ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ  １３（２）：ｅ１００６１９５．  ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．  ｐｐａｔ．１００６１９５（２０１７））である。これらの２つの文献のすべての内容は、参照により本明細書の一部に組み込まれるものとする。
【００６０】
本明細書に記載した調査に関連する以下の追加的な詳細は、調査の際に用いられた実験手順の説明である。かかる説明により、本発明の範囲は限定されるものではなく、あくまでも調査の範囲や具体的内容を開示することを目的とする。
【００６１】
以下、図１Ａ〜図８Ｇに関連する特定の実験手順を説明する。
【００６２】
細胞、抗体、および化学物質。遅延脳腫瘍（ＤＢＴ）細胞を、１０％トリプトースリン酸ブロス、５％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２％ペニシリン／ストレプトマイシン、および２％グルタミンで補充した基礎培地（ＭＥＭ）において、成長させた。ＭＨＶ受容体（ＢＨＫ−Ｒ）を発現するＢＨＫ−２１細胞を、１０％ＦＣＳおよびＧ４１８（０．８ｍｇ／ｍｌ）（ＳＶ３００６９、ＨｙＣｌｏｎｅ社）で補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。１７ＣＩ−１細胞系は、５％ＦＣＳのＤＭＥＭにおいて維持した。ウサギ抗ｎｓｐ２／３血清（抗Ｄ３）および抗ｎｓｐ１５血清（抗Ｄ２３）。マウス抗ヌクレオカプシド（Ｊ３．３）は、ウィスコンシン大学マディソン校から得たものである。抗体は市販のものを購入した：ｄｓＲＮＡ（Ｋ１、Ｓｃｉｃｏｎｓ社）、ＩＳＧ５４（ＰＡ３８４５、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）、ｅｌＦ２α（ｓｃ−１３３１３２）およびｐ−ｅｌＦ２α（ｓｃ−１２４１２）は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社から得た。化学阻害剤は以下の入手源から得た。汎カスパーゼ阻害剤ｚＶＡＤ（６２７６１０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）、ネクロスタチン−１（Ｎｅｃ−１）（４８００６５、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）、ＰＫＲ阻害剤Ｃ１６（５２７４５０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）、スタウロスポリン（ＡＬＸ−３８０−０１４、Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）およびＶＸ−７６５（Ｆ７１２０、ＵＢＰｂｉｏ社）。
【００６３】
ウイルスおよびディープシーケンシング。ＷＴのＭＨＶ株Ａ５９（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃ＡＹ９１０８６１）をリバースジェネティクスによって生成した。ＭＨＶ変異ウイルスを生成するため、ＰＣＲ変異導入（プライマーは要求に応じて入手可能）を通じて、ＭＨＶ−Ａ５９ゲノムのｃＤＮＡフラグメントにヌクレオチド変化を組み込んだ。リバースジェネティクスにより、その後のウイルス生成を行った。レスキューされたウイルスをプラーク精製し、ＢＨＫ−Ｒ細胞上で増殖し、１７ＣＩ−１細胞上においてウイルス価を測定した。変異ウイルスは、ＢＨＫ−Ｒ細胞においてのみ維持された。本研究で使用されたすべてのウイルスストック調製物およびプラーク精製分離物は、全ゲノムについてディープシーケンスしたものである（カンザス州立大学臨床検査室）。
【００６４】
感染およびマウス実験。１２ウェルまたは２４ウェルのウェルプレート中のＢＭＤＭを、無血清培地において、ＭＯＩ（感染多重度）＝０．１またはＭＯＩ＝１で、指示されたウイルス株に感染させた。増殖速度分析については、指示時点ごとに、細胞培養上清を回収し、１７Ｃｌ−１細胞上にてプラークアッセイによってウイルス価を測定した。マウス感染については、すべての実験はロヨラ大学シカゴＩＡＣＵＣによって審査され承認されたプロトコルを用いて行われた。頭蓋内（ｉ．ｅ．）感染については、生後６週のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雌マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社）に対してウイルスを６００ＰＦＵ接種し、体重を毎日観察し、ＩＡＣＵＣプロトコルに基づいて２５％以上の体重減少が確認された場合には安楽死させた。腹腔内（ｉ．ｐ．）感染については、生後６週のマウスに対し、６０，０００ＰＦＵを接種し、指示時点ごとに臓器を摘出した。Ｈ＆Ｅ染色により、肝病理を判定した。
【００６５】
細胞死アッセイ。細胞生存率およびカスパーゼ３／７活性は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（Ｇ７５７１、Ｐｒｏｍｅｇａ社）、または。Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ３／７（Ｇ８０９１、Ｐｒｏｍｅｇａ社）をそれぞれ用い、メーカーのプロトコルに基づき、修正を加えて計測された。
【００６６】
示差走査蛍光分析（ＤＳＦ）アッセイ。示差走査蛍光分析は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＭＸ３００５Ｐ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ装置内で行われた。サンプルは、１ｘ（１倍の）ＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅ、組換タンパク質１０μＭを含む。すべてのサンプルは、０．５℃／分の速度で加熱され、その蛍光強度およびＴｍ（融解温度）が特定された。
【００６７】
ＲＮＡ切断アッセイ。標準ＲＮＡ切断アッセイは、１×１０４ＣＰＭの５′末端放射標識ＲＮＡ基質（１μＭの最終ＲＮＡ濃度）および０．０２５μＭのｎｓｐ１５を、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（トリスヒドロキシメチルアミノメタンー塩酸）（ｐＨ  ７．５）、５０ｍＭの塩化カリウム、１ｍＭのジチオトレイトール、５ｍＭの塩化マンガン中で、３０℃で使用した。エンドリボヌクレアーゼ反応は、７．５Ｍの尿素を含むゲルローディングバッファの添加により終了した。生成物は、７．５Ｍの尿素７．５を含む２０％ポリアクリルアミドにおいて電気泳動により分離した。ゲルはラップで包み、定量化のためにＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ社のソフトウェアを用いて、ホスフォイメージャースクリーンに曝した。
【００６８】
以下、図１０Ａ〜図１７Ｂに関連する特定の実験手順を説明する。
【００６９】
細胞、抗体、および他の試薬。遅延脳腫瘍（ＤＢＴ）細胞を、１０％トリプトースリン酸ブロス、５％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２％ペニシリン／ストレプトマイシン、および２％グルタミンを補充した基礎培地（ＭＥＭ）（６１  １００−０６１、Ｇｉｂｃｏ社）で成長させた。ＭＨＶ受容体発現の選択を維持するため、ＭＨＶ受容体（ＢＨＫ−Ｒ）を発現しているベビーハムスター腎臓２１細胞を、熱不活化ＦＣＳおよびＧ４１８（０．８ｍｇ／ｍｌ）（ＳＶ３００６９、ＨｙＣｌｏｎｅ）を補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（１２１００−０４６、Ｇｉｂｃｏ）で培養した。１７ＣＩ−１細胞系は、５％ＦＣＳのＤＭＥＭ中で維持した。ＷＴのＭＨＶ株Ａ５９（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃ＡＹ９１０８６１）を逆遺伝学によって生産し、全ゲノムについてシーケンスした。分化した（下記参照）骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）は、３０％Ｌ９２９細胞上清、２０％ＦＣＳ、１％Ｌ−グルタミン、１％ピルビン酸ナトリウム、および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ（１０−０１７−ＣＶ、Ｃｏｒｎｉｎｇ社）を含む骨髄マクロファージ（ＢＭＭ）培地において維持した。ウサギ抗ｎｓｐ２／３血清（抗Ｄ３）および抗ｎｓｐ１５血清（抗Ｄ２３）。マウス抗ヌクレオカプシド（Ｊ３．３）は、ウィスコンシン大学マディソン校から得た。抗体は市販のものを購入した。マウス抗βアクチン（Ａ００７０２、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社）、マウス抗カルネキシン（６１０５２３、ＢＤ）、ロバ抗ウサギＨＲＰ（７１１−０３５−１５２、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）、ヤギ抗マウスＨＲＰ（１０１０−０５、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）、ｄｓＲＮＡ（Ｋ１、Ｓｃｉｃｏｎｓ社）、ＩＳＧ５４（ＰＡ３８４５、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社）、ｅｌＦ２α（ｓｃ−１３３１３２）、およびｐ−ｅｌＦ２α（ｓｃ−１２４１２）はＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社から得た。化学阻害剤は、以下の入手源から得た。汎カスパーゼ阻害剤ｚＶＡＤ（６２７６１０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）、ネクロスタチン１（Ｎｅｃ−１）（４８００６５、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）、ＰＫＲ阻害剤Ｃ１６（５２７４５０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）、およびＶＸ−７６５（Ｆ７１２０、ＵＢＰｂｉｏ社）。
【００７０】
骨髄由来マクロファージの生成。骨髄は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（０００６６４、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ社）マウスあるいはセントルイスのワシントン大学から入手したｉｆｎａｒ−／−マウスの大腿骨から得た。５×１０６の骨髄細胞を、５０μＭのβ−メルカプトエタノールを含む、１５ｍＬのＢＭＭ培地を備える１００×２６ｍｍのペトリ皿（２５３８７−０３０、ＶＷＲ社）で培養した。３７℃／５％ＣＯ２で３日間培養後、ＢＭＭ培地を１０ｍＬ追加した。さらに３日間の分化後、ＢＭＤＭを冷たい１ｘ（１倍の）ＰＢＳで洗浄し、１０ｍＬの１ｘＰＢＳで３０分間４℃で培養し、手動ピペットでプレートから穏やかに洗い流した。１×１０７細胞／ｍＬを、１０％ＤＭＳＯを含むＢＭＭ培地で懸濁し、使用するまで液体窒素液相で保存した。Ｌ９２９細胞の上清を調製するために、３．７５×１０５のＬ９２９細胞を、Ｔ１５０フラスコ（１０−１２６−３４、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社）中で、７５ｍＬの培地（ＤＭＥＭ［１０−０１７−ＣＶ、Ｃｏｒｎｉｎｇ社］、１０％ＦＣＳ、１％Ｌ−グルタミン、１％ピルビン酸ナトリウム、１％非必須アミノ酸、および１％ペニシリン／ストレプトマイシン）に播いた。３７℃／５％ＣＯ２で６日間培養後、上清を採取し、濾過し、使用するまで−２０℃で保存した。ウイルス感染のため、ＢＭＤＭを解凍し、ＢＭＭ培地における１００×２６ｍｍのペトリ皿に、β−メルカプトエタノールを用いずに播いた。３７℃／５％ＣＯ２で３日間培養後、２４時間培養後の感染実験用の組織培養皿に、細胞を播いた。
【００７１】
変異ウイルスおよびディープシーケンシング。ＭＨＶ変異ウイルスを生成するため、ｃＤＮＡフラグメントのＰＣＲ変異導入（プライマーは要求に応じて入手可能）を通じて、ＭＨＶ−Ａ５９ゲノムにヌクレオチド変化を組み込んだ。リバースジェネティクスによるウイルスのその後の生成を行った。連結されたｃＤＮＡフラグメントの生体外転写（ｍＭＥＳＳＡＧＥ  ｍＭＡＣＨＩＮＥ  Ｔ７  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ；ＡＭ１３４４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ａｍｂｉｏｎ社）からのウイルスゲノムＲＮＡを、ＢＨＫ−Ｒ細胞にエレクトロポレーション法で導入した。細胞上清は、細胞変性効果の観察後にウイルスストックとして回収した。感染性クローンをプラーク精製し、ＢＨＫ−Ｒ細胞上で増殖させ、１７ＣＩ−１細胞上でウイルス価を測定した。変異ウイルスは、インターフェロンの生成またはインターフェロンへの応答をしないＢＨＫ−Ｒ細胞のみで維持された。本研究で使用されたすべてのウイルスストック調整物およびプラーク精製分離物は、全ゲノムについてディープシーケンスされた（カンザス州立大学臨床検査室）。簡潔には、ウイルスＲＮＡは、ＱＩＡａｍｐ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｖｉｒｕｓ  Ｓｐｉｎ  Ｋｉｔ（５７７０４、ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてウイルスストックから抽出され、ｃＤＮＡライブラリを生成するために使用され、ＭｉｓｅｑまたはＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔの技術によってシーケンス解読された。変異ＭＨＶシーケンスは、野生型ＭＨＶ−Ａ５９合成構築物（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃ＡＹ９１０８６１）に、シーケンスアラインメントされた。
【００７２】
プラークアッセイによるウイルス複製の評価。ウイルスの増殖速度を判定するために、無血清培地において、２４ウェルのウェルプレート中のＢＭＤＭを、ＭＯＩ＝０．１で指示されたウイルス株に感染させた。１時間の培養後、接種材料を新鮮で完全な培地で交換した。細胞培養上清を指示された時点において回収し、１７ＣＩ−１細胞上でプラークアッセイによってウイルス価を測定した。臓器におけるウイルス価を判定するために、組織の一部を、自動ホモジナイザー（６．０ｍ／秒、４０秒間）（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社）を用いて、無血清ＤＭＥＭ中で、直径１．０ｍｍのジルコニア／シリコンビーズ（１１０７９１１０ｚ、ＢｉｏＳｐｅｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社）と均質化した。均質化した臓器は、１０，０００×ｇで５分間遠心分離し、清澄化された上清を１７ＣＩ−１細胞上のウイルスプラークに対してウイルス価測定を行った。ウイルス価は、それぞれのサンプルについて３つの独立したアッセイから得た。ウイルス増殖速度のグラフは、Ｐｒｉｓｍ７ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社）を用いて作成した。
【００７３】
細胞死アッセイ。細胞生存率およびカスパーゼ３／７活性は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（Ｇ７５７１、Ｐｒｏｍｅｇａ社）とＣａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ  ３／７（Ｇ８０９１、Ｐｒｏｍｅｇａ社）をそれぞれについて用い、メーカーのプロトコルに基づき、修正を加えて計測された。簡潔には、３．０×１０５ＢＭＤＭ／ウェルを、２４ウェルのウェルプレートに播き、無血清培地において１時間、ＭＯＩ＝０．１で感染させた。培地を完全な培地と交換する、あるいは、化学阻害剤を追加するために、ウイルス接種材料は指示された濃度の阻害剤を含む完全なＢＭＭ培地と交換された。感染したＢＭＤＭは、２４時間、３７℃／５％Ｃｏ２で培養した。ＢＭＤＭを１ｘＰＢＳで２回洗浄し、１００μＬのＧｌｏ試薬／培地混合物（１：１）で溶解した。発光シグナルを計測するために、５０μＬの細胞溶解物を使用した。標準偏差および独立Ｔ検定を技術的に３回繰り返し行い、データは３つの独立した実験の代表である。細胞生存率のグラフは、Ｐｒｉｓｍ７ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社）を用いて作成した。
【００７４】
免疫蛍光。ＢＭＤＭ（１．５×１０５細胞／ウェル）を２４ウェルのウェルプレートのガラスカバースリップにて２４時間培養し、その後、無血清培地において、ＭＯＩ＝０．１の野生型ウイルスまたは変異ウイルスに感染させた。６ｈｐｉまたは１２ｈｐｉにおいて、感染した細胞を０．０９５  Ｍ  ＰＩＰＥＳバッファ（Ｐ１８５１、Ｓｉｇｍａ社）において、４％ホルムアルデヒドで固定し、１ｘＰＢＳにおいて、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ×−１００（Ｔ８７８７、Ｓｉｇｍａ社）で透過処理し、２％ＢＳＡでブロックした。一次および二次抗体を次の通り使用した。抗ＮＳＰ２／３（１：１５００）、抗ｄｓＲＮＡ（１：５００）、抗ＩＳＧ５４（１：５００）、抗ヌクレオカプシド（１：５００）、ロバ抗ウサギＩｇＧ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（１：１０００）（Ａ−２１４４１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、およびヤギ抗マウスＩｇＧ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８（１：１０００）（Ａ１１００４、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ社）。核は、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（１：２５００）（Ｈ１３３９、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で視覚化した。細胞は、デジタルカメラ（ＣｏｏｌＳＮＡＰ  ＨＱ、Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｅｓ社）を備えるＤｅｌｔａＶｉｓｉｏｎ広視野蛍光顕微鏡（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ、ＧＥ社）によって、Ｚ−スタック画像を収集することにより画像化された。画像は、２０ｘまたは１００ｘレンズで撮影された。サンプルは、Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＳＳＩソリッドステート照明モジュール（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ、ＧＥ社）によって生成された光と、ＳｏｆｔＷｏＲｘでデコンボリューションソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ、ＧＥ社）によってデコンボリューション（逆重畳積分）処理された。すべての画像は、同一の取得条件下で収集され、Ｉｍａｒｉｓ  ７．６．４（Ｂｉｔｐｌａｎｅ社）を用いて処理された。
【００７５】
ＦＡＣＳ分析。ＢＭＤＭ（６．０×１０５）を１２ウェルのウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）にて２４時間培養し、その後、ＭＯＩ＝０．１の野生型ウイルスまたは変異ウイルスに感染させた。６ｈｐｉにおいて細胞を回収し、１ｘＰＢＳにおいて４％ホルムアルデヒドで固定し、１ｘＰＢＳにおいて０．１％Ｔｒｉｔｏｎ×−１００で透過処理し、２％ＦＣＳおよび０．５％アジ化ナトリウムを含む１ｘＰＢＳでブロックした。細胞を、生死判別染色試薬（６５−０８６５−１４、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、指示された一次抗体および二次抗体に対する抗体、および、ロバ抗ウサギＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５６８でラベル化されたヤギ抗マウス一次抗体により、ラベル化した。細胞は、ＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓｓａセルアナライザー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて分析した。フローサイトメトリーデータは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ社）を用いて分析した。
【００７６】
逆転写定量ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）およびＥＬＩＳＡによるＩＦＮ−α生産の定量化。１２ウェルまたは２４ウェルのウェルプレートにおけるＢＭＤＭは、ＭＯＩ＝０．１のウイルスにモック感染または感染させた。指示された時点において、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット（７４１０４、ＱＩＡＧＥＮ社）を用いたＲＮＡ抽出に単層細胞を使用し、細胞培養上清をＥＬＩＳＡ用に回収した。ＩＦＮ−α１１、βアクチンまたはＭＨＶ−Ａ５９Ｎ遺伝子のｍＲＮＡ生産を判定するため、全ＲＮＡを抽出し、同量のＲＮＡ（〜１μｇ）を、Ｒｔ２ＨＴ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｋｉｔ（３３０４０１、ＱＩＡＧＥＮ社）を用いたｃＤＮＡ合成に使用した。定量ＰＣＲは、特定のプライマーとともに、マウスＩＦＮ−α１１（ＰＰＭ０３０５０Ｂ−２００、ＱＩＡＧＥＮ社）、マウスβアクチン（ＰＰＭ０２９４５Ｂ−２００、ＱＩＡＧＥＮ社）またはＭＨＶ−Ａ５９Ｎ遺伝子について、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ９６システムにおけるＲＴ２ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ｑＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（３３０５０２、ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて行われた。サーモサイクラーは、以下の通り設定した。９５℃での１ステップ（１０分）、９５℃の４０サイクル（１５秒）、６０℃（１分）およびプレートリード、９５℃での１ステップ（１０秒）および６５℃〜９５℃から０．５℃／０．０５秒で増加する融解曲線。サンプルは、三通りで評価し、データは３つの独立した実験の代表である。分泌されたＩＦＮ−αを計測するため、マウスＩＦＮ−α  ＥＬＩＳＡキット（ＢＭＳ６０２７、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いたアッセイのために５０μＬの細胞培養上清をメーカーの指示通りに使用した。グラフは、Ｐｒｉｓｍ７ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社）を用いて作成した。
【００７７】
電子顕微鏡法。１ｍＬのＢＭＭ培地において、１２ウェルのウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）のウェル毎に、６．０×１０５Ｂ６のＢＭＤＭを播いた。２４時間後、無血清ＤＭＥＭにおいて、ＭＯＩ＝０．１のウイルスに感染させた。対照細胞は、ＢＭＭ培地で処理した。３７℃／５％ＣＯ２で１時間培養後、培地をＢＭＭ培地と交換した。感染していない対照細胞は、アポトーシスを誘発するためにＢＭＭ培地に準備された１μＭのスタウロスポリン（ＡＬＸ−３８０−０１４、Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で処理した。細胞を３７℃／５％ＣＯ２で１６時間さらに培養した後、ＥＭのための準備をした。細胞を１ｘＰＢＳで洗浄し、１ｘＰＢＳにおいて４℃で３０分間培養した。ピペットを用いて、プレートから細胞を丁寧に回収し、１２００ｒｐｍかつ４℃で５分間ペレット化し、固定した（カコジル酸緩衝液０．１Ｍにおける４％グルタルアルデヒド）。細胞切片を用意し、イリノイ州シカゴ郊外メイウッドのロヨラ大学における電子顕微鏡コア・ファシリティによって画像化した。
【００７８】
ウエスタンブロット法。ＢＭＭ培地に６．０×１０５  Ｂ６  ＢＭＤＭ／ウェルを含む１２ウェルのウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）を、培養処理するか、無血清ＤＭＥＭにおいてＭＯＩ＝０．１で１時間、３７℃／５％ＣＯ２でウイルスに感染させた。培地を新鮮なＢＭＭ培地に交換し、細胞はインキュベータに戻した。６時間、１２時間または２４時間後、細胞は１００μＬの冷たい溶解バッファ（２０ｍＭのトリス、ｐＨ７．５、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、１ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２．５ｍＭのピロリン酸ナトリウム、１ｍＭのβ−グリセロリン酸、１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム、１μｇ／ｍＬのロイペプチン、１ｍＭのＰＳＭＦ）で溶解し、細胞はチューブに削り採られた。溶解バッファ中の細胞は、氷上で１０分間培養した後、４℃で１０分間１４，０００ｒｐｍでペレット化した。無細胞上清は、２×サンプルバッファ（１０％のグリセロール、５％のβ−ΜΕ、３％のＳＤＳ、７．５ｍｇ／ｍＬのＴｒｉｓ緩衝塩基、ブロモフェノールブルー）において希釈した。サンプルは１２％アクリルアミドＰＡＧＥゲルを介して電気泳動によって分離し、セミドライ輸送システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いてＰＶＤＦイムノブロットメンブレン（１６２−０１７７、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）に輸送した。メンブレンは、室温で１．５時間、１ｘＴＢＳＴ（トリス緩衝食塩水＋１％Ｔｗｅｅｎ−２０）に５％ｗ／ｖの脱脂粉乳を含む、ブロッキングバッファで懸濁した。活性化されたカスパーゼ３を検出するために、ウサギモノクローナル抗体を切断したカスパーゼ３（Ａｓｐ１７５；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）に夜通し４℃で穏やかに揺すりながら添加した（１：１０００）。メンブレンの２番目のセットは、マウス抗βアクチン（１：５０００）を介して細胞のタンパク質発現を判定するため、あるいは、マウス抗Ｊ３．３Ｎタンパク質（１：２００）を介して相対的なウイルス複製を判定するために使用されるものであり、室温で１．５時間培養した。すべてのメンブレンを１ｘＴＢＳＴで３回洗浄し、二次抗体、カスパーゼ３モノクローナル用のロバ抗ウサギ−ＨＲＰ（１：２５００）、あるいは、Ｎタンパク質およびβアクチン用のヤギ抗マウス−ＨＲＰ（１：５０００）を、室温で１．５時間穏やかに揺すりながら添加した。メンブレンを１ｘＴＢＳＴで３回洗浄し、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｐｌｕｓ−ＥＣＬ試薬（５０−９０４−９３２６、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を用いて化学発光を視覚化した。
【００７９】
大腸菌からの組換ＭＨＶのｎｓｐ１５タンパク質の精製。ＷＴのＭＨＶのｎｓｐ１５およびＴ９８ＭのｃＤＮＡ配列は、適切なプライマーを用いて増幅され、融合ＰＣＲを用いてｐＥＴ−Ｈｉｓ−ＳＵＭＯベクターにサブクローン化された。ＷＴのｎｓｐ１５またはＴ９８Ｍの変異遺伝子を保有する構築物は、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬｙｓ細胞に転換された。５０μｇ／ｍＬのアンピシリンと１７μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールの存在下において、１００ｍＬのＴＢ培地に、単一コロニーを接種し、３７℃で夜通し培養した。培養したものを３ＬのＴＢ培地に移し、ＯＤ６００が０．８に到達するまで培養した。温度は１６℃まで下げ、最終濃度０．２ｍＭとなるよう、２０時間でＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド）を添加した。細胞を１０分間８０００×ｇで遠心分離することにより回収し、細胞ペレットを、１０％のグリセロール、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ  ７．０）、４００ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭのβ−ΜΕ、および１０ｍＭのイミダゾールを含む溶解バッファで懸濁した。溶解物を３０分間、１５，０００×ｇで遠心分離し、上清をＮｉ−ＮＴＡカラムにロードした。その後、Ｎｉ−ＮＴＡカラムを、２０ｍＭのイミダゾールを含む溶解バッファで３回洗浄した。タンパク質は、５００ｍＭのイミダゾールを含む溶出バッファで溶出した後、バッファを、１０％のグリセロール、２０ｍＭのトリス−ＣＩ（ｐＨ  ７．５）、および５ｍＭのβ−ΜΕに変更した。サンプルを、０〜１Ｍの塩化ナトリウムを含むトリスバッファの勾配を有するＭｏｎｏ  Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅによってさらに精製した。ｎｓｐ１５は、ＢＳＡの既知の濃度と比較してＳＤＳ−ＰＡＧＥによって定量化され、１０％のグリセロール、２０ｍＭのトリス−ＣＩ、ｐＨ７．５、３００ｍＭの塩化ナトリウム、および１０ｍＭのβ−ΜΕを含むバッファにおいて−８０℃で保存された。
【００８０】
動的光散乱法（ＤＬＳ）。組換ＭＨＶのｎｓｐ１５またはＴ９８Ｍタンパク質を、ストレージバッファ（１０％のグリセロール、２０ｍＭのトリス−ＣＩ、ｐＨ７．５、３００ｍＭの塩化ナトリウム、および５ｍＭのβ−ΜΕ）において異なる濃度で希釈した。サイズの計測は、室温においてＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ−Ｓ動的光散乱装置（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）によって行われた。それぞれのサンプルは、少なくとも３回計測された。平均強度およびサイズを示した。
【００８１】
示差走査蛍光分析（ＤＳＦ）アッセイ。ＤＳＦは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＭＸ３００５ＰリアルタイムＰＣＲ装置内で行われた。サンプルは、１ｘＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅ、１０μＭの組換タンパク質を含む。すべてのサンプルは、０．５℃／分の速度で加熱され、蛍光強度およびＴｍ（融解温度）が特定された。
【００８２】
バイオアナライザＲＮＡ分析。ＢＭＤＭから精製した全ＲＮＡの等量を、ＲＮＡ  Ｎａｎｏ  ＬａｂＣｈｉｐｓを用いた、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒで分析した。
【００８３】
マウスの実験。すべての実験は、ロヨラ大学シカゴＩＡＣＵＣによって審査され承認されたプロトコルを用いて行われた。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスは、ジャクソン研究所から購入した。頭蓋内（ｉ．ｅ．）感染については、生後６週のマウスに対し、ＷＴまたはＭＨＶ変異体６００ＰＦＵ／２０μＬを接種した。感染したマウスについては体重を毎日観察し、ＩＡＣＵＣプロトコルに基づいて２５％以上の体重減少が確認された場合には安楽死させた。生存率のグラフは、Ｐｒｉｓｍ７ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社）を用いて作成した。生存率の統計分析は、ログランク検定を用いて実施した。腹腔内（ｉ．ｐ．）感染については、生後６週のマウスに対し、１００μＬの１ｘＰＢＳ内の６０，０００ＰＦＵを接種した。指示された時点において臓器を摘出し、ウイルス複製について評価した。ウイルス病原の証拠は、Ｈ＆Ｅ染色によって判定された。
【００８４】
配列アライメント。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗを用いたコロナウイルスのサブグループの代表株からのｎｓｐ１５  Ｔ９８領域。アルファコロナウイルス：ＮＬ６３（アムステルダムＩ株、ＡＹ５６７４８７）、ＰＥＤＶ（ＣＶ７７７株、ＮＣ＿００３４３６）；ベータコロナウイルス：ＭＨＶ，（Ａ５９株、ＡＹ９１０８６１）；ＳＡＲＳ−ＣｏＶ（ＭＡ１５株、ＦＪ８８２９５７）；ＭＥＲＳ−ＣｏＶ（ＥＭＣ株、ＪＸ８６９０５９）；ガンマコロナウイルス：ＩＢＶ（Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ株、ＮＣ＿００１４５１）；デルタコロナウイルス：ＰＤＣｏＶ（ＫＪ５６７０５０）。
【００８５】
本発明は、特定または具体的な実施形態および調査について説明したが、当該分野における当業者によって改変が適用可能であることは明らかである。たとえば、特定の変異コロナウイルスは、上述したものとは異なり得るし、さらなる変異を有することも可能である。したがって、本発明は、本明細書または図面に記載された実施形態により不必要に限定されるものではない。本明細書中に使用された語法と用語は、開示された実施形態と調査を説明する目的で使用されたのであり、本発明の範囲を限定するものではない。したがって、本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ−８Ｃ】
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【図８Ｄ−８Ｇ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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