(57)【要約】  本発明は、2つ(またはそれ以上)の治療的トランスジーン、例えばCD80およびCD137Lを含む組み換えアデノウイルスを提供する。該トランスジーンは、好ましくはE1b-19K挿入部位および/またはE3挿入部位に挿入される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)  E1b-19K挿入部位に挿入される第1の治療的トランスジーンをコードする第1のヌクレオチド配列；ここで該E1b-19K挿入部位は、E1b-19Kの開始部位とE1b-55Kの開始部位の間に配置される；および
(b)  E3挿入部位に挿入される第2の治療的トランスジーンをコードする第2のヌクレオチド配列、ここで該E3挿入部位は、pVIIIの停止部位とFiberの開始部位の間に配置される、
を含む、組み換えアデノウイルス。
【請求項２】
5型アデノウイルス(Ad5)である、請求項１記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項３】
E1b-19K挿入部位が、E1b-19Kの開始部位とE1b-19Kの停止部位の間に配置される、請求項１または２記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項４】
E1b-19K挿入部位が、E1b-19Kの開始部位に隣接する約100〜約305、約100〜約300、約100〜約250、約100〜約200、約100〜約150、約150〜約305、約150〜約300、約150〜約250または約150〜約200ヌクレオチドの欠失を含む、請求項１〜３いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項５】
E1b-19K挿入部位が、E1b-19Kの開始部位に隣接する約200ヌクレオチドの欠失を含む、請求項１〜４いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項６】
E1b-19K挿入部位が、E1b-19Kの開始部位に隣接する202ヌクレオチドの欠失を含む、請求項１〜５いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項７】
E1b-19K挿入部位が、E1b-19Kの開始部位に隣接する203ヌクレオチドの欠失を含む、請求項１〜５いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項８】
E1b-19K挿入部位が、Ad5ゲノム(配列番号：23)のヌクレオチド1714〜1917に対応する欠失を含む、請求項１〜７いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項９】
E1b-19K挿入部位が、Ad5ゲノム(配列番号：23)のヌクレオチド1714〜1916に対応する欠失を含む、請求項１〜７いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１０】
第1の治療的トランスジーンが、Ad5ゲノム(配列番号：23)の1714に対応するヌクレオチドと1917に対応するヌクレオチドの間に挿入される、請求項１〜９いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１１】
第1の治療的トランスジーンが、Ad5ゲノム(配列番号：23)の1714に対応するヌクレオチドと1916に対応するヌクレオチドの間に挿入される、請求項１〜９いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１２】
第1の治療的トランスジーンがCTGACCTC(配列番号：1)とTCACCAGG(配列番号：2)の間に挿入される、請求項１〜１１いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１３】
5'〜3'の方向でCTGACCTC(配列番号：1)、第1の治療的トランスジーンおよびTCACCAGG(配列番号：2)を含む、請求項１〜１２いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１４】
E3挿入部位が、約500〜約3185、約500〜約3000、約500〜約2500、約500〜約2000、約500〜約1500、約500〜約1000、約1000〜約3185、約1000〜約3000、約1000〜約2500、約1000〜約2000、約1000〜約1500、約1500〜約3185、約1500〜約3000、約1500〜約2000、約2000〜約3185、約2000〜約3000、約2000〜約2500、約2500〜約3185、約2500〜約3000または約3000〜約3185ヌクレオチドの欠失を含む、請求項１〜１３いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１５】
E3挿入部位が、E3-gp19Kの停止部位とE3-14.7Kの停止部位の間に配置される、請求項１〜１４いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１６】
E3挿入部位が、E3-10.5Kの停止部位とE3-14.7Kの停止部位の間に配置される、請求項１〜１５いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１７】
E3挿入部位が、E3-10.5Kの停止部位に隣接する約500〜約1551、約500〜約1500、約500〜約1000、約1000〜約1551、約1000〜約1500または約1500〜約1551ヌクレオチドの欠失を含む、請求項１〜１６いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１８】
E3挿入部位が、E3-10.5Kの停止部位に隣接する約1050ヌクレオチドの欠失を含む、請求項１〜１７いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１９】
E3挿入部位が、E3-10.5Kの停止部位に隣接する1063ヌクレオチドの欠失を含む、請求項１〜１８いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項２０】
E3挿入部位が、E3-10.5Kの停止部位に隣接する1064ヌクレオチドの欠失を含む、請求項１〜１８いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項２１】
E3挿入部位が、Ad5 dl309 E3欠失に対応する欠失を含む、請求項１〜１８いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項２２】
E3挿入部位が、Ad5ゲノム(配列番号：23)のヌクレオチド29773〜30836に対応する欠失を含む、請求項１〜２１いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項２３】
第2の治療的トランスジーンが、Ad5ゲノム(配列番号：23)の29773に対応するヌクレオチドと30836に対応するヌクレオチドの間に挿入される、請求項１〜２２いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項２４】
第2の治療的トランスジーンが、CAGTATGA(配列番号：3)とTAATAAAAAA(配列番号：4)の間に挿入される、請求項１〜２３いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項２５】
5'〜3'の方向で、CAGTATGA(配列番号：3)、第2の治療的トランスジーンおよびTAATAAAAAA(配列番号：4)を含む、請求項１〜２４いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項２６】
E3挿入部位が、E3-gp19Kの停止部位に隣接する約500〜約1824、約500〜約1500、約500〜約1000、約1000〜約1824、約1000〜約1500または約1500〜約1824ヌクレオチドの欠失を含む、請求項１５記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項２７】
E3挿入部位が、E3-gp19Kの停止部位に隣接する約1600ヌクレオチドの欠失を含む、請求項２６記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項２８】
E3挿入部位が、E3-gp19Kの停止部位に隣接する1622ヌクレオチドの欠失を含む、請求項２６または２７記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項２９】
E3挿入部位が、Ad5ゲノム(配列番号：23)のヌクレオチド29218〜30839に対応する欠失を含む、請求項２６〜２８いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項３０】
第2の治療的トランスジーンが、Ad5ゲノム(配列番号：23)の29218に対応するヌクレオチドと30839に対応するヌクレオチドの間に挿入される、請求項２６〜２９いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項３１】
第2の治療的トランスジーンが、TGCCTTAA(配列番号：29)とTAAAAAAAAAT(配列番号：30)の間に挿入される、請求項２６〜３０いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項３２】
5'〜3'の方向で、TGCCTTAA(配列番号：29)、第2の治療的トランスジーンおよびTAAAAAAAAAT(配列番号：30)を含む、請求項２６〜３１いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項３３】
(a)  E1b-19K挿入部位に挿入される第1の治療的トランスジーンをコードする第1のヌクレオチド配列；および
(b)  E1b-19K挿入部位に挿入される第2の治療的トランスジーンをコードする第2のヌクレオチド配列
を含む組み換えアデノウイルスであって、E1b-19K挿入部位が、E1b-19Kの開始部位とE1b-55Kの開始部位の間に配置され、第1のヌクレオチド配列および第2のヌクレオチド配列が、第1の配列内リボソーム進入部位(IRES)により分離される、組み換えアデノウイルス。
【請求項３４】
5型アデノウイルス(Ad5)である、請求項３３記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項３５】
E1b-19K挿入部位が、E1b-19Kの開始部位とE1b-19Kの停止部位の間に配置される、請求項３３または３４記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項３６】
E1b-19K挿入部位が、E1b-19Kの開始部位に隣接する約100〜約305、約100〜約300、約100〜約250、約100〜約200、約100〜約150、約150〜約305、約150〜約300、約150〜約250または約150〜約200ヌクレオチドの欠失を含む、請求項３３〜３５いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項３７】
E1b-19K挿入部位が、E1b-19Kの開始部位に隣接する約200ヌクレオチドの欠失を含む、請求項３３〜３６いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項３８】
E1b-19K挿入部位が、E1b-19Kの開始部位に隣接する202ヌクレオチドの欠失を含む、請求項３３〜３７いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項３９】
E1b-19K挿入部位が、E1b-19Kの開始部位に隣接する203ヌクレオチドの欠失を含む、請求項３３〜３７いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項４０】
E1b-19K挿入部位が、Ad5ゲノム(配列番号：23)のヌクレオチド1714〜1917に対応する欠失を含む、請求項３３〜３９いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項４１】
E1b-19K挿入部位が、Ad5ゲノム(配列番号：23)のヌクレオチド1714〜1916に対応する欠失を含む、請求項３３〜３９いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項４２】
第1および第2の治療的トランスジーンが、Ad5ゲノム(配列番号：23)の1714に対応するヌクレオチドと1917に対応するヌクレオチドの間に挿入される、請求項３３〜４１いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項４３】
第1および第2の治療的トランスジーンが、Ad5ゲノム(配列番号：23)の1714に対応するヌクレオチドと1916に対応するヌクレオチドの間に挿入される、請求項３３〜４１いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項４４】
第1および第2の治療的トランスジーンが、CTGACCTC(配列番号：1)とTCACCAGG(配列番号：2)の間に挿入される、請求項３３〜４３いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項４５】
5'〜3'の方向で、CTGACCTC(配列番号：1)、第1の治療的トランスジーン、IRES、第2の治療的トランスジーンおよびTCACCAGG(配列番号：2)を含む、請求項３３〜４４いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項４６】
該組み換えアデノウイルスが、E1b-19K挿入部位に挿入される第3の治療的トランスジーンをコードする第3のヌクレオチド配列を含み、第2のヌクレオチド配列および第3のヌクレオチド配列が、第2の配列内リボソーム進入部位(IRES)により分離される、請求項３３〜４５いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項４７】
第1、第2および第3の治療的トランスジーンが、CTGACCTC(配列番号：1)とTCACCAGG(配列番号：2)の間に挿入される、請求項４６記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項４８】
5'〜3'の方向で、CTGACCTC(配列番号：1)、第1の治療的トランスジーン、第1のIRES、第2の治療的トランスジーン、第2のIRES、第3の治療的トランスジーンおよびTCACCAGG(配列番号：2)を含む、請求項４６または４７記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項４９】
組み換えアデノウイルスがE3欠失をさらに含み、E3欠失が、pVIIIの停止部位とFiberの開始部位の間に配置される、請求項３３〜４８いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項５０】
E3欠失が、約500〜約3185、約500〜約3000、約500〜約2500、約500〜約2000、約500〜約1500、約500〜約1000、約1000〜約3185、約1000〜約3000、約1000〜約2500、約1000〜約2000、約1000〜約1500、約1500〜約3185、約1500〜約3000、約1500〜約2000、約2000〜約3185、約2000〜約3000、約2000〜約2500、約2500〜約3185、約2500〜約3000または約3000〜約3185ヌクレオチドの欠失を含む、請求項４９記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項５１】
E3挿入部位が、E3-gp19Kの停止部位とE3-14.7Kの停止部位の間に配置される、請求項４９または５０記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項５２】
E3欠失が、E3-10.5Kの停止部位およびE3-14.7Kの停止部位およびFiberの開始部位の間に配置される、請求項４９〜５１いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項５３】
E3欠失が、E3-10.5Kの停止部位に隣接する約500〜約1551、約500〜約1500、約500〜約1000、約1000〜約1551、約1000〜約1500または約1500〜約1551ヌクレオチドの欠失を含む、請求項４９〜５２いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項５４】
E3欠失が、E3-10.5Kの停止部位に隣接する約1050ヌクレオチドの欠失を含む、請求項４９〜５３いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項５５】
E3欠失が、E3-10.5Kの停止部位に隣接する1063ヌクレオチドの欠失を含む、請求項４９〜５４いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項５６】
E3欠失が、E3-10.5Kの停止部位に隣接する1064ヌクレオチドの欠失を含む、請求項４９〜５４いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項５７】
E3欠失が、Ad5 dl309 E3欠失に対応する欠失を含む、請求項４９〜５４いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項５８】
E3欠失が、Ad5ゲノム(配列番号：23)のヌクレオチド29773〜30836に対応する欠失を含む、請求項４９〜５７いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項５９】
E3欠失が、E3-gp19Kの停止部位に隣接する約500〜約1824、約500〜約1500、約500〜約1000、約1000〜約1824、約1000〜約1500または約1500〜約1824ヌクレオチドの欠失を含む、請求項４９〜５１いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項６０】
E3欠失が、E3-gp19Kの停止部位に隣接する約1600ヌクレオチドの欠失を含む、請求項５９記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項６１】
E3欠失が、E3-gp19Kの停止部位に隣接する1622ヌクレオチドの欠失を含む、請求項５９または６０記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項６２】
E3欠失が、Ad5ゲノム(配列番号：23)のヌクレオチド29218〜30839に対応する欠失を含む、請求項５９〜６１いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項６３】
組み換えアデノウイルスが、E3挿入部位に挿入される第3の治療的トランスジーンをコードする第3のヌクレオチド配列を含み、E3挿入部位が、pVIIIの停止部位とFiberの開始部位の間に配置される、請求項３３〜４５いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項６４】
E3挿入部位が、約500〜約3185、約500〜約3000、約500〜約2500、約500〜約2000、約500〜約1500、約500〜約1000、約1000〜約3185、約1000〜約3000、約1000〜約2500、約1000〜約2000、約1000〜約1500、約1500〜約3185、約1500〜約3000、約1500〜約2000、約2000〜約3185、約2000〜約3000、約2000〜約2500、約2500〜約3185、約2500〜約3000または約3000〜約3185ヌクレオチドの欠失を含む、請求項６３記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項６５】
E3挿入部位が、E3-gp19Kの停止部位とE3-14.7Kの停止部位の間に配置される、請求項６３または６４記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項６６】
E3挿入部位が、E3-10.5Kの停止部位とE3-14.7Kの停止部位の間に配置される、請求項６３〜６５いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項６７】
E3挿入部位が、E3-10.5Kの停止部位に隣接する約500〜約1551、約500〜約1500、約500〜約1000、約1000〜約1551、約1000〜約1500または約1500〜約1551ヌクレオチドの欠失を含む、請求項６３〜６６いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項６８】
E3挿入部位が、E3-10.5Kの停止部位に隣接する約1050ヌクレオチドの欠失を含む、請求項６３〜６７いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項６９】
E3挿入部位が、E3-10.5Kの停止部位に隣接する1063ヌクレオチドの欠失を含む、請求項６３〜６８いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項７０】
E3挿入部位が、E3-10.5Kの停止部位に隣接する1064ヌクレオチドの欠失を含む、請求項６３〜６８いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項７１】
E3挿入部位が、Ad5 dl309 E3欠失に対応する欠失を含む、請求項６３〜６８いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項７２】
E3挿入部位が、Ad5ゲノム(配列番号：23)のヌクレオチド29773〜30836に対応する欠失を含む、請求項６３〜７１いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項７３】
第3の治療的トランスジーンが、Ad5ゲノム(配列番号：23)の29773に対応するヌクレオチドと30836に対応するヌクレオチドの間に挿入される、請求項６３〜７２いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項７４】
第3の治療的トランスジーンが、CAGTATGA(配列番号：3)とTAATAAAAAA(配列番号：4)の間に挿入される、請求項６３〜７３いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項７５】
5'〜3'の方向で、CAGTATGA(配列番号：3)、第3の治療的トランスジーンおよびTAATAAAAAA(配列番号：4)を含む、請求項６３〜７４いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項７６】
E3挿入部位が、E3-gp19Kの停止部位に隣接する約500〜約1824、約500〜約1500、約500〜約1000、約1000〜約1824、約1000〜約1500または約1500〜約1824ヌクレオチドの欠失を含む、請求項６３〜６５いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項７７】
E3挿入部位が、E3-gp19Kの停止部位に隣接する約1600ヌクレオチドの欠失を含む、請求項７６記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項７８】
E3挿入部位が、E3-gp19Kの停止部位に隣接する1622ヌクレオチドの欠失を含む、請求項７６または７７記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項７９】
E3挿入部位が、Ad5ゲノム(配列番号：23)のヌクレオチド29218〜30839に対応する欠失を含む、請求項７６〜７８いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項８０】
第3の治療的トランスジーンが、Ad5ゲノム(配列番号：23)の29218に対応するヌクレオチドと30839に対応するヌクレオチドの間に挿入される、請求項７６〜７９いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項８１】
第3の治療的トランスジーンが、TGCCTTAA(配列番号：29)とTAAAAAAAAAT(配列番号：30)の間に挿入される、請求項７６〜８０いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項８２】
5'〜3'の方向で、TGCCTTAA(配列番号：29)、第3の治療的トランスジーンおよびTAAAAAAAAAT(配列番号：30)を含む、請求項７６〜８１いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項８３】
IRESが、脳心筋炎ウイルスIRES、口蹄疫ウイルスIRESおよびポリオウイルスIRESからなる群より選択される、請求項３３〜８２いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項８４】
組み換えアデノウイルスがE4欠失をさらに含み、E4欠失が、E4-ORF6/7の開始部位と右逆方向末端反復(right inverted terminal repeat) (ITR)の間に配置される、請求項１〜８３いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項８５】
E4欠失が、E4-ORF6/7の開始部位とE4-ORF1の開始部位の間に配置される、請求項８４記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項８６】
E4欠失が、約500〜約2500、約500〜約2000、約500〜約1500、約500〜約1000、約1000〜約2500、約1000〜約2000、約1000〜約1500、約1500〜約2500、約1500〜約2000または約2000〜約2500ヌクレオチドの欠失を含む、請求項８４または８５記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項８７】
E4欠失が、E4-ORF6/7の開始部位に隣接する約250〜約1500、約250〜約1250、約250〜約1000、約250〜約750、約250〜約500、500〜約1500、約500〜約1250、約500〜約1000、約500〜約750、750〜約1500、約750〜約1250、約750〜約1000、約1000〜約1500、約1000〜約1250または約1250〜約1500ヌクレオチドの欠失を含む、請求項８４〜８６いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項８８】
E4欠失が、E4-ORF6/7の開始部位に隣接する約1450ヌクレオチドの欠失を含む、請求項８４〜８７いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項８９】
E4欠失が、E4-ORF6/7の開始部位に隣接する1449ヌクレオチドの欠失を含む、請求項８４〜８８いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項９０】
E4欠失が、Ad5ゲノム(配列番号：23)のヌクレオチド34078〜35526に対応する欠失を含む、請求項８４〜８９いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項９１】
第1および/または第2の治療的トランスジーンが、外来性プロモーター配列に操作可能に連結されない、請求項１〜９０いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項９２】
第1、第2および/または第3の治療的トランスジーンが、外来性プロモーター配列に操作可能に連結されない、請求項４６〜９０いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項９３】
治療的トランスジーンのいずれも、外来性プロモーター配列に操作可能に連結されない、請求項１〜９０いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項９４】
第1および第2の治療的トランスジーンを合わせたサイズが、約500〜約5000、約500〜約4000、約500〜約3000、約500〜約2000、約500〜約1000、約1000〜約5000、約1000〜約4000、約1000〜約3000、約1000〜約2000、約2000〜約5000、約2000〜約4000、約2000〜約3000、約3000〜約5000、約3000〜約4000または約4000〜約5000ヌクレオチドを含む、請求項１〜９３いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項９５】
第1および第2の治療的トランスジーンを合わせたサイズが、約500〜約7000、約500〜約6000、約500〜約5000、約500〜約4000、約500〜約3000、約500〜約2000、約500〜約1000、約1000〜約7000、約1000〜約6000、約1000〜約5000、約1000〜約4000、約1000〜約3000、約1000〜約2000、約2000〜約7000、約2000〜約6000、約2000〜約5000、約2000〜約4000、約2000〜約3000、約3000〜約7000、約3000〜約6000、約3000〜約5000、約3000〜約4000、約4000〜約7000、約4000〜約6000、約4000〜約5000ヌクレオチド、約5000〜約7000、約5000〜約6000または約6000〜約7000ヌクレオチドを含む、請求項１〜９３いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項９６】
第1、第2および第3の治療的トランスジーンを合わせたサイズが、約500〜約5000、約500〜約4000、約500〜約3000、約500〜約2000、約500〜約1000、約1000〜約5000、約1000〜約4000、約1000〜約3000、約1000〜約2000、約2000〜約5000、約2000〜約4000、約2000〜約3000、約3000〜約5000、約3000〜約4000または約4000〜約5000ヌクレオチドを含む、請求項４６〜９３いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項９７】
第1、第2および第3の治療的トランスジーンを合わせたサイズが、約500〜約7000、約500〜約6000、約500〜約5000、約500〜約4000、約500〜約3000、約500〜約2000、約500〜約1000、約1000〜約7000、約1000〜約6000、約1000〜約5000、約1000〜約4000、約1000〜約3000、約1000〜約2000、約2000〜約7000、約2000〜約6000、約2000〜約5000、約2000〜約4000、約2000〜約3000、約3000〜約7000、約3000〜約6000、約3000〜約5000、約3000〜約4000、約4000〜約7000、約4000〜約6000、約4000〜約5000ヌクレオチド、約5000〜約7000、約5000〜約6000または約6000〜約7000ヌクレオチドを含む、請求項４６〜９３いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項９８】
治療的トランスジーンのそれぞれを合わせたサイズが、約500〜約5000、約500〜約4000、約500〜約3000、約500〜約2000、約500〜約1000、約1000〜約5000、約1000〜約4000、約1000〜約3000、約1000〜約2000、約2000〜約5000、約2000〜約4000、約2000〜約3000、約3000〜約5000、約3000〜約4000または約4000〜約5000ヌクレオチドを含む、請求項１〜９７いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項９９】
治療的トランスジーンのそれぞれを合わせたサイズが、約500〜約7000、約500〜約6000、約500〜約5000、約500〜約4000、約500〜約3000、約500〜約2000、約500〜約1000、約1000〜約7000、約1000〜約6000、約1000〜約5000、約1000〜約4000、約1000〜約3000、約1000〜約2000、約2000〜約7000、約2000〜約6000、約2000〜約5000、約2000〜約4000、約2000〜約3000、約3000〜約7000、約3000〜約6000、約3000〜約5000、約3000〜約4000、約4000〜約7000、約4000〜約6000、約4000〜約5000ヌクレオチド、約5000〜約7000、約5000〜約6000または約6000〜約7000ヌクレオチドを含む、請求項１〜９７いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１００】
第1および第2の治療的トランスジーンを合わせたサイズが、少なくとも約500〜約5000、約500〜約4000、約500〜約3000、約500〜約2000、約500〜約1000、約1000〜約5000、約1000〜約4000、約1000〜約3000、約1000〜約2000、約2000〜約5000、約2000〜約4000、約2000〜約3000、約3000〜約5000、約3000〜約4000または約4000〜約5000ヌクレオチドを含む、請求項１〜９９いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１０１】
第1および第2の治療的トランスジーンを合わせたサイズが、少なくとも約500〜約7000、約500〜約6000、約500〜約5000、約500〜約4000、約500〜約3000、約500〜約2000、約500〜約1000、約1000〜約7000、約1000〜約6000、約1000〜約5000、約1000〜約4000、約1000〜約3000、約1000〜約2000、約2000〜約7000、約2000〜約6000、約2000〜約5000、約2000〜約4000、約2000〜約3000、約3000〜約7000、約3000〜約6000、約3000〜約5000、約3000〜約4000、約4000〜約7000、約4000〜約6000、約4000〜約5000ヌクレオチド、約5000〜約7000、約5000〜約6000または約6000〜約7000ヌクレオチドを含む、請求項１〜９９いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１０２】
第1、第2および第3の治療的トランスジーンを合わせたサイズが、少なくとも約500〜約5000、約500〜約4000、約500〜約3000、約500〜約2000、約500〜約1000、約1000〜約5000、約1000〜約4000、約1000〜約3000、約1000〜約2000、約2000〜約5000、約2000〜約4000、約2000〜約3000、約3000〜約5000、約3000〜約4000または約4000〜約5000ヌクレオチドを含む、請求項４６〜９９いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１０３】
第1、第2および第3の治療的トランスジーンを合わせたサイズが、少なくとも約500〜約7000、約500〜約6000、約500〜約5000、約500〜約4000、約500〜約3000、約500〜約2000、約500〜約1000、約1000〜約7000、約1000〜約6000、約1000〜約5000、約1000〜約4000、約1000〜約3000、約1000〜約2000、約2000〜約7000、約2000〜約6000、約2000〜約5000、約2000〜約4000、約2000〜約3000、約3000〜約7000、約3000〜約6000、約3000〜約5000、約3000〜約4000、約4000〜約7000、約4000〜約6000、約4000〜約5000ヌクレオチド、約5000〜約7000、約5000〜約6000または約6000〜約7000ヌクレオチドを含む、請求項４６〜９９いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１０４】
治療的トランスジーンのそれぞれを合わせたサイズが、少なくとも約500〜約5000、約500〜約4000、約500〜約3000、約500〜約2000、約500〜約1000、約1000〜約5000、約1000〜約4000、約1000〜約3000、約1000〜約2000、約2000〜約5000、約2000〜約4000、約2000〜約3000、約3000〜約5000、約3000〜約4000または約4000〜約5000ヌクレオチドを含む、請求項１〜９９いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１０５】
治療的トランスジーンのそれぞれを合わせたサイズが、少なくとも約500〜約7000、約500〜約6000、約500〜約5000、約500〜約4000、約500〜約3000、約500〜約2000、約500〜約1000、約1000〜約7000、約1000〜約6000、約1000〜約5000、約1000〜約4000、約1000〜約3000、約1000〜約2000、約2000〜約7000、約2000〜約6000、約2000〜約5000、約2000〜約4000、約2000〜約3000、約3000〜約7000、約3000〜約6000、約3000〜約5000、約3000〜約4000、約4000〜約7000、約4000〜約6000、約4000〜約5000ヌクレオチド、約5000〜約7000、約5000〜約6000または約6000〜約7000ヌクレオチドを含む、請求項１〜９９いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１０６】
第1および第2の治療的トランスジーンを合わせたサイズが、少なくとも約500、約1000、約2000、約3000、約4000または約5000ヌクレオチドを含む、請求項１〜１０５いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１０７】
第1および第2の治療的トランスジーンを合わせたサイズが、少なくとも約500、約1000、約2000、約3000、約4000、約5000、約6000または約7000ヌクレオチドを含む、請求項１〜１０５いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１０８】
第1、第2および第3の治療的トランスジーンを合わせたサイズが、少なくとも約500、約1000、約2000、約3000、約4000または約5000ヌクレオチドを含む、請求項４６〜１０５いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１０９】
第1、第2および第3の治療的トランスジーンを合わせたサイズが、少なくとも約500、約1000、約2000、約3000、約4000、約5000、約6000または約7000ヌクレオチドを含む、請求項４６〜１０５いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１１０】
治療的トランスジーンのそれぞれを合わせたサイズが、少なくとも約500、約1000、約2000、約3000、約4000または約5000ヌクレオチドを含む、請求項１〜１０９いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１１１】
治療的トランスジーンのそれぞれを合わせたサイズが、少なくとも約500、約1000、約2000、約3000、約4000、約5000、約6000または約7000ヌクレオチドを含む、請求項１〜１０９いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１１２】
第1および第2の治療的トランスジーンを合わせたサイズが、約1650ヌクレオチドを含む、請求項１〜１１１いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１１３】
第1および第2の治療的トランスジーンを合わせたサイズが、約3100ヌクレオチドを含む、請求項１〜１１１いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１１４】
第1、第2および第3の治療的トランスジーンを合わせたサイズが、約1650ヌクレオチドを含む、請求項４６〜１１１いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１１５】
第1、第2および第3の治療的トランスジーンを合わせたサイズが、約3100ヌクレオチドを含む、請求項４６〜１１１いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１１６】
治療的トランスジーンのそれぞれを合わせたサイズが、約1650ヌクレオチドを含む、請求項１〜１１５いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１１７】
治療的トランスジーンのそれぞれを合わせたサイズが、約3100ヌクレオチドを含む、請求項１〜１１５いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１１８】
第1および/または第2の治療的トランスジーンが、CD80、CD137L、IL-23A/p19、エンドスタチン、アンギオスタチン、ICAM-1およびTGF-βトラップからなる群より選択される治療的ポリペプチドをコードする、請求項１〜１１７いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１１９】
第1、第2および/または第3の治療的トランスジーンが、CD80、CD137L、IL-23A/p19、エンドスタチン、アンギオスタチン、ICAM-1およびTGF-βトラップからなる群より選択される治療的ポリペプチドをコードする、請求項４６〜１１７いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１２０】
治療的トランスジーンのいずれか1つが、CD80、CD137L、IL-23A/p19、エンドスタチン、アンギオスタチン、ICAM-1およびTGF-βトラップからなる群より選択される治療的ポリペプチドをコードする、請求項１〜１１７いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１２１】
第1および/または第2の治療的トランスジーンが、CD80、CD137L、IL-23A/p19、エンドスタチン、アンギオスタチン、ICAM-1、TGF-βトラップ、TGF-β、CD19、CD20、IL-1、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、CD154、CD86、BORIS/CTCFL、FGF、IL-24、MAGE、NY-ESO-1、アセチルコリン、インターフェロンγ、DKK1/Wnt、p53、チミジンキナーゼ、抗PD-1抗体重鎖または軽鎖および抗PD-L1抗体重鎖または軽鎖からなる群より選択される治療的ポリペプチドをコードする、請求項１〜１１７いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１２２】
第1、第2および/または第3の治療的トランスジーンが、CD80、CD137L、IL-23A/p19、エンドスタチン、アンギオスタチン、ICAM-1、TGF-βトラップ、TGF-β、CD19、CD20、IL-1、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、CD154、CD86、BORIS/CTCFL、FGF、IL-24、MAGE、NY-ESO-1、アセチルコリン、インターフェロンγ、DKK1/Wnt、p53、チミジンキナーゼ、抗PD-1抗体重鎖または軽鎖および抗PD-L1抗体重鎖または軽鎖からなる群より選択される治療的ポリペプチドをコードする、請求項４６〜１１７いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１２３】
治療的トランスジーンのいずれか1つが、CD80、CD137L、IL-23A/p19、エンドスタチン、アンギオスタチン、ICAM-1、TGF-βトラップ、TGF-β、CD19、CD20、IL-1、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、CD154、CD86、BORIS/CTCFL、FGF、IL-24、MAGE、NY-ESO-1、アセチルコリン、インターフェロンγ、DKK1/Wnt、p53、チミジンキナーゼ、抗PD-1抗体重鎖または軽鎖および抗PD-L1抗体重鎖または軽鎖からなる群より選択される治療的ポリペプチドをコードする、請求項１〜１１７いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１２４】
第1および/または第2の治療的トランスジーンが、CD80、CD137L、IL-23、IL-23A/p19、IL-27、IL-27A/p28、IL-27B/EBI3、エンドスタチン、アンギオスタチン、ICAM-1、TGF-βトラップ、TGF-β、CD19、CD20、IL-1、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、CD154、CD86、BORIS/CTCFL、FGF、IL-24、MAGE、NY-ESO-1、アセチルコリン、インターフェロンγ、DKK1/Wnt、p53、チミジンキナーゼ、抗PD-1抗体重鎖または軽鎖および抗PD-L1抗体重鎖または軽鎖からなる群より選択される治療的ポリペプチドをコードする、請求項１〜１１７いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１２５】
第1、第2および/または第3の治療的トランスジーンが、CD80、CD137L、IL-23、IL-23A/p19、IL-27、IL-27A/p28、IL-27B/EBI3、エンドスタチン、アンギオスタチン、ICAM-1、TGF-βトラップ、TGF-β、CD19、CD20、IL-1、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、CD154、CD86、BORIS/CTCFL、FGF、IL-24、MAGE、NY-ESO-1、アセチルコリン、インターフェロンγ、DKK1/Wnt、p53、チミジンキナーゼ、抗PD-1抗体重鎖または軽鎖および抗PD-L1抗体重鎖または軽鎖からなる群より選択される治療的ポリペプチドをコードする、請求項４６〜１１７いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１２６】
治療的トランスジーンのいずれか1つが、CD80、CD137L、IL-23、IL-23A/p19、IL-27、IL-27A/p28、IL-27B/EBI3、エンドスタチン、アンギオスタチン、ICAM-1、TGF-βトラップ、TGF-β、CD19、CD20、IL-1、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、CD154、CD86、BORIS/CTCFL、FGF、IL-24、MAGE、NY-ESO-1、アセチルコリン、インターフェロンγ、DKK1/Wnt、p53、チミジンキナーゼ、抗PD-1抗体重鎖または軽鎖および抗PD-L1抗体重鎖または軽鎖からなる群より選択される治療的ポリペプチドをコードする、請求項１〜１１７いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１２７】
第1および第2の治療的トランスジーンが、ヘテロダイマーサイトカインの第1および第2のサブユニットのそれぞれをコードする、請求項１〜１２６いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１２８】
第1および/または第2の治療的トランスジーンが、CD80およびCD137Lからなる群より選択される、請求項１〜１２６いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１２９】
第1、第2および/または第3の治療的トランスジーンが、CD80、CD137LおよびICAM-1からなる群より選択される、請求項４６〜１２６いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１３０】
第1の治療的トランスジーンがCD80をコードする、請求項１２７または１２８記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１３１】
第2の治療的トランスジーンがCD137Lをコードする、請求項１２７〜１３０いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１３２】
第3の治療的トランスジーンがICAM-1をコードする、請求項１２８〜１３１いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１３３】
配列番号：5によりコードされるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１２８〜１３２いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１３４】
配列番号：6のヌクレオチド配列を含む、請求項１２８〜１３３いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１３５】
配列番号：7によりコードされるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１２８〜１３４いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１３６】
配列番号：8のヌクレオチド配列を含む、請求項１２８〜１３５いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１３７】
配列番号：27のヌクレオチド配列を含む、請求項１２８〜１３６いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１３８】
配列番号：32によりコードされるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１２８〜１３７いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１３９】
配列番号：31または配列番号：9のヌクレオチド配列を含む、請求項１２８〜１３８いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１４０】
配列番号：31のヌクレオチド配列を含む、請求項１２８〜１３７いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１４１】
配列番号：22のヌクレオチド配列を含む、請求項１２８〜１３７いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１４２】
第1および/または第2の治療的トランスジーンが、IL-27A/p28およびIL-27B/EBI3からなる群より選択される、請求項１〜１２７いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１４３】
第1の治療的トランスジーンがIL-27A/p28をコードする、請求項１４２記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１４４】
第2の治療的トランスジーンがIL-27B/EBI3をコードする、請求項１４２または１４３記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１４５】
第1および/または第2の治療的トランスジーンが、エンドスタチンおよびアンギオスタチンからなる群より選択される、請求項１〜１２６いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１４６】
第1の治療的トランスジーンがエンドスタチンをコードする、請求項１４５記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１４７】
第2の治療的トランスジーンがアンギオスタチンをコードする、請求項１４５または１４６記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１４８】
配列番号：37または配列番号：38のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１４５〜１４７いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１４９】
配列番号：39、配列番号：40、配列番号：41、配列番号：42、配列番号：43または配列番号：44のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１４５〜１４８いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１５０】
配列番号：11のヌクレオチド配列を含む、請求項１４５〜１４９いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１５１】
Pea3結合部位またはその機能性断片の欠失をさらに含む、請求項１〜１５０いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１５２】
E1aの開始部位の上流約-300〜約-250に対応するヌクレオチドの欠失を含む、請求項１５１記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１５３】
E1aの開始部位の上流-305〜-255に対応するヌクレオチドの欠失を含む、請求項１５１または１５２記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１５４】
E1aの開始部位の上流-304〜-255に対応するヌクレオチドの欠失を含む、請求項１５１または１５２記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１５５】
配列番号：14または配列番号：14に対して80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の配列同一性を有する配列を含む、組み換えアデノウイルス。
【請求項１５６】
過増殖細胞中で選択的に複製する、請求項１〜１５５いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１５７】
過増殖細胞中で第1および/または第2の治療的トランスジーンを選択的に発現する、請求項１〜１５６いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１５８】
過増殖細胞中で第1、第2および/または第3の治療的トランスジーンを選択的に発現する、請求項４６〜１５７いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１５９】
過増殖細胞が癌細胞である、請求項１５６〜１５８いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１６０】
腫瘍崩壊性ウイルスである、請求項１〜１５９いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１６１】
請求項１〜１６０いずれか一項記載の組み換えアデノウイルスおよび少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体または希釈剤を含む、医薬組成物。
【請求項１６２】
標的細胞を、請求項１〜１６０いずれか一項記載の組み換えアデノウイルスの有効量に暴露して、2つの治療的トランスジーンを発現させる工程を含む、標的細胞において2つの治療的トランスジーンを発現させる方法。
【請求項１６３】
標的細胞を、請求項４６〜１６０いずれか一項記載の組み換えアデノウイルスの有効量に暴露して、2つの治療的トランスジーンを発現させる工程を含む、標的細胞において3つの治療的トランスジーンを発現させる方法。
【請求項１６４】
腫瘍細胞を、請求項１〜１６０いずれか一項記載の組み換えアデノウイルスの有効量に暴露して、腫瘍細胞の増殖を阻害する工程を含む、腫瘍細胞の増殖を阻害する方法。
【請求項１６５】
腫瘍増殖の阻害を必要とする被験体に、請求項１〜１６０いずれか一項記載の組み換えアデノウイルスの有効量を投与して、腫瘍の増殖を阻害する工程を含む、腫瘍増殖の阻害を必要とする被験体において腫瘍増殖を阻害する方法。
【請求項１６６】
癌の治療を必要とする被験体に、請求項１〜１６０いずれか一項記載の組み換えアデノウイルスの有効量を投与して、該被験体において癌を治療する工程を含む、癌の治療を必要とする被験体において癌を治療する方法。
【請求項１６７】
癌が、黒色腫、皮膚の扁平上皮癌、基底細胞癌、頭頸部癌、乳癌、肛門癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌、中皮腫、小細胞肺癌、腎細胞癌、前立腺癌、胃食道癌、結腸直腸癌、精巣癌、膀胱癌、卵巣癌、肝細胞癌、胆管癌、脳癌、子宮内膜癌、神経内分泌癌、メルケル細胞癌、胃腸管間質腫瘍、肉腫および膵臓癌からなる群より選択される、請求項１６６記載の方法。
【請求項１６８】
組み換えアデノウイルスが、手術、放射線、化学療法、免疫療法、ホルモン療法およびウイルス療法からなる群より選択される1つ以上の治療と組み合わせて投与される、請求項１６５〜１６７いずれか記載の方法。
【請求項１６９】
組み換えアデノウイルスの有効量が、102〜1015プラーク形成単位(pfu)である、請求項１６２〜１６８いずれか一項記載の方法。
【請求項１７０】
被験体がヒトである、請求項１６５〜１６９いずれか一項記載の方法。
【請求項１７１】
被験体が小児のヒトである、請求項１７０記載の方法。
【請求項１７２】
被験体における抗原に対する免疫応答を測定する工程をさらに含む、請求項１６５〜１７１いずれか一項記載の方法。
【請求項１７３】
組み換えウイルスの有効量が、被験体における抗原に対する免疫応答を測定することにより同定される、請求項１６５〜１７２いずれか一項記載の方法。
【請求項１７４】
抗原に対する免疫応答が、被験体の皮膚の注射部位で、被験体に抗原を注射することおよび注射部位での硬変のサイズを測定することにより測定すされる、請求項１７２または１７３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願についての相互参照
本願は、2017年1月30日に出願された米国仮特許出願第62/452,342号および2017年6月16日に出願された米国仮特許出願第62/520,945号の利益ならびにそれらに対する優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明の分野は、分子生物学およびウイルス学、特に2つ以上の治療的トランスジーンを発現する改変されたウイルスである。
【背景技術】
【０００３】
背景
癌を引き起こす基礎になる分子機構の広い知識に関わらず、ほとんどの進行した癌は、現在の化学療法および放射線プロトコルでは不治のままである。腫瘍崩壊性ウイルスは、種々の悪性疾患についての現在の標準的な治療を有意に増加させる可能性を有する基盤技術として明らかになっている(Kumar, S. et al. (2008) CURRENT OPINION IN MOLECULAR THERAPEUTICS 10(4):371-379; Kim, D. (2001) EXPERT OPINION ON BIOLOGICAL THERAPY 1(3):525-538; Kim D. (2000) ONCOGENE 19(56):6660-6669)。これらのウイルスは、感染-再生-溶解の連鎖反応により悪性細胞を直接的に破壊するだけでなく、抗腫瘍免疫を間接的に誘導もする腫瘍崩壊性剤としての将来性を示している。これらの免疫刺激特性は、ウイルスが複製するごとにコピーされて発現される治療的トランスジーンの挿入により高められる。
【０００４】
以前に開発された腫瘍崩壊性ウイルスとしては、正常細胞においては転写的に弱められるが癌細胞においては転写的に活性であるTAV-255と称される腫瘍崩壊性血清型5アデノウイルス(Ad5)が挙げられる(PCT公開公報WO2010/101921参照)。TAV-255ベクターがこの腫瘍選択性を達成する機構は、特異的なDNA配列への結合を介した、ウイルスが宿主細胞に侵入した後に転写される最初期遺伝子であるE1aのアデノウイルス発現を制御するタンパク質である転写因子Pea3およびE2Fについての3つの転写因子(TF)結合部位の標的化された欠失を介すると考えられる。
【０００５】
今日までの努力にかかわらず、ヒト患者において癌および過増殖障害を治療するための改善された腫瘍崩壊性ウイルスの必要性がある。
【発明の概要】
【０００６】
発明の概要
本発明は、部分的に、腫瘍崩壊性ウイルスなどのアデノウイルスが、特定の挿入部位に挿入された場合、予想外にも、外来性のプロモーターを使用することなく、複数(2つ以上)の治療的トランスジーンを効率的に発現し得るという発見、および該ウイルスが、ウイルスゲノムに組み込まれるトランスジーンのサイズに関わりなく、複製し得、かつ2つ以上の治療的トランスジーンを効率的に発現し得るという発見に基づく。
【０００７】
したがって、一局面において、本発明は、(a)E1b-19K挿入部位に挿入される第1の治療的トランスジーンをコードする第1のヌクレオチド配列；ここで該E1b-19K挿入部位は、E1b-19Kの開始部位とE1b-55kの開始部位の間に配置される；および(b)E3挿入部位に挿入される第2の治療的トランスジーンをコードする第2のヌクレオチド配列；ここで該E3挿入部位は、pVIIIの停止部位とFiberの開始部位の間に配置される、を含む組み換えアデノウイルスを提供する。
【０００８】
ある態様において、組み換えアデノウイルスは5型アデノウイルス(Ad5)である。
【０００９】
ある態様において、E1b-19K挿入部位は、E1b-19Kの開始部位とE1b-19Kの停止部位の間に配置される。ある態様において、E1b-19K挿入部位は、E1b-19Kの開始部位に隣接する約100〜約305、約100〜約300、約100〜約250、約100〜約200、約100〜約150、約150〜約305、約150〜約300、約150〜約250または約150〜約200ヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、E1b-19K挿入部位は、E1b-19Kの開始部位に隣接する約200ヌクレオチド、例えば202または203ヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、E1b-19K挿入部位は、Ad5ゲノム(配列番号：23)のヌクレオチド1714〜1917または1714〜1916に対応する欠失を含む。ある態様において、第1の治療的トランスジーンは、Ad5ゲノム(配列番号：23)の1714に対応するヌクレオチドと1917に対応するヌクレオチドの間または1714に対応するヌクレオチドと1916に対応するヌクレオチドの間に挿入される。ある態様において、第1の治療的トランスジーンは、CTGACCTC(配列番号：1)とTCACCAGG(配列番号：2)の間に挿入され、例えば組み換えアデノウイルスは、5'〜3'の方向で、CTGACCTC(配列番号：1)、第1の治療的トランスジーンおよびTCACCAGG(配列番号：2)を含む。
【００１０】
ある態様において、E3挿入部位は、約500〜約3185、約500〜約3000、約500〜約2500、約500〜約2000、約500〜約1500、約500〜約1000、約1000〜約3185、約1000〜約3000、約1000〜約2500、約1000〜約2000、約1000〜約1500、約1500〜約3185、約1500〜約3000、約1500〜約2000、約2000〜約3185、約2000〜約3000、約2000〜約2500、約2500〜約3185、約2500〜約3000または約3000〜約3185ヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、E3挿入部位は、E3-10.5Kの停止部位とE3-14.7Kの停止部位の間に配置される。ある態様において、E3挿入部位は、E3-10.5Kの停止部位に隣接する約500〜約1551、約500〜約1500、約500〜約1000、約1000〜約1551、約1000〜約1500または約1500〜約1551ヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、E3挿入部位は、E3-10.5Kの停止部位に隣接する約1050ヌクレオチドの欠失を含み、例えばE3挿入部位は、E3-10.5Kの停止部位に隣接する1063または1064ヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、E3挿入部位は、Ad5 dl309 E3欠失に対応する欠失を含む。ある態様において、E3挿入部位は、Ad5ゲノム(配列番号：23)のヌクレオチド29773〜30836に対応する欠失を含む。ある態様において、第2の治療的トランスジーンは、Ad5ゲノム(配列番号：23)の29773に対応するヌクレオチドと30836に対応するヌクレオチドの間に挿入される。ある態様において、第2の治療的トランスジーンは、CAGTATGA(配列番号：3)とTAATAAAAAA(配列番号：4)の間に挿入され、例えば組み換えアデノウイルスは、5'〜3'の方向で、CAGTATGA(配列番号：3)、第2の治療的トランスジーンおよびTAATAAAAAA(配列番号：4)を含む。ある態様において、E3挿入部位は、E3-gp19Kの停止部位とE3-14.7Kの停止部位の間に配置される。ある態様において、E3挿入部位は、E3-gp19Kの停止部位に隣接する約500〜約1824、約500〜約1500、約500〜約1000、約1000〜約1824、約1000〜約1500または約1500〜約1824ヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、E3挿入部位は、E3-gp19Kの停止部位に隣接する約1600ヌクレオチドの欠失を含み、例えばE3挿入部位は、E3-gp19Kの停止部位に隣接する1622ヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、E3挿入部位は、Ad5ゲノム(配列番号：23)のヌクレオチド29218〜30839に対応する欠失を含む。ある態様において、第2の治療的トランスジーンは、Ad5ゲノム(配列番号：23)の29218に対応するヌクレオチドと30839に対応するヌクレオチドの間に挿入される。ある態様において、第2の治療的トランスジーンは、TGCCTTAA(配列番号：29)とTAAAAAAAAAT(配列番号：30)の間に挿入され、例えば組み換えアデノウイルスは、5'〜3'の方向で、TGCCTTAA(配列番号：29)、第2の治療的トランスジーンおよびTAAAAAAAAAT(配列番号：30)を含む。
【００１１】
別の局面において、本発明は、(a)E1b-19K挿入部位に挿入される第1の治療的トランスジーンをコードする第1のヌクレオチド配列；および(b)E1b-19K挿入部位に挿入される第2の治療的トランスジーンをコードする第2のヌクレオチド配列を含む組み換えアデノウイルスを提供し、ここで該E1b-19K挿入部位は、E1b-19Kの開始部位とE1b-55kの開始部位の間に配置され、該第1のヌクレオチド配列および第2のヌクレオチド配列は、第1の配列内リボソーム進入部位(IRES)により分離される。
【００１２】
ある態様において、組み換えアデノウイルスは5型アデノウイルス(Ad5)である。
【００１３】
ある態様において、E1b-19K挿入部位は、E1b-19Kの開始部位とE1b-19Kの停止部位の間に配置される。ある態様において、E1b-19K挿入部位は、E1b-19Kの開始部位に隣接する約100〜約305、約100〜約300、約100〜約250、約100〜約200、約100〜約150、約150〜約305、約150〜約300、約150〜約250または約150〜約200ヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、E1b-19K挿入部位は、E1b-19Kの開始部位に隣接する約200ヌクレオチド、例えば202または203ヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、E1b-19K挿入部位は、Ad5ゲノム(配列番号：23)のヌクレオチド1714〜1917または1714〜1916に対応する欠失を含む。ある態様において、第1および第2の治療的トランスジーンは、Ad5ゲノム(配列番号：23)の1714に対応するヌクレオチドと1917に対応するヌクレオチドの間または1714に対応するヌクレオチドと1916に対応するヌクレオチドの間に挿入される。ある態様において、第1および第2の治療的トランスジーンは、CTGACCTC(配列番号：1)とTCACCAGG(配列番号：2)の間に挿入され、例えば組み換えアデノウイルスは、5'〜3'の方向で、CTGACCTC(配列番号：1)、第1の治療的トランスジーン、第1のIRES、第2の治療的トランスジーンおよびTCACCAGG(配列番号：2)を含む。
【００１４】
ある態様において、組み換えアデノウイルスはE3欠失を含む。ある態様において、E3欠失は、約500〜約3185、約500〜約3000、約500〜約2500、約500〜約2000、約500〜約1500、約500〜約1000、約1000〜約3185、約1000〜約3000、約1000〜約2500、約1000〜約2000、約1000〜約1500、約1500〜約3185、約1500〜約3000、約1500〜約2000、約2000〜約3185、約2000〜約3000、約2000〜約2500、約2500〜約3185、約2500〜約3000または約3000〜約3185ヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、E3欠失部位は、pVIIIの停止部位とFiberの開始部位の間に配置される。ある態様において、E3欠失部位は、E3-10.5Kの停止部位とE3-14.7Kの停止部位の間に配置される。ある態様において、E3欠失は、E3-10.5Kの停止部位に隣接する約500〜約1551、約500〜約1500、約500〜約1000、約1000〜約1551、約1000〜約1500または約1500〜約1551ヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、E3欠失は、E3-10.5Kの停止部位に隣接する約1050ヌクレオチドの欠失を含み、例えばE3欠失は、E3-10.5Kの停止部位に隣接する1063または1064ヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、E3欠失は、Ad5 dl309 E3欠失に対応する欠失を含む。ある態様において、E3欠失は、Ad5ゲノム(配列番号：23)のヌクレオチド29773〜30836に対応する欠失を含む。ある態様において、E3欠失は、E3-gp19Kの停止部位とE3-14.7Kの停止部位の間に配置される。ある態様において、E3欠失は、E3-gp19Kの停止部位に隣接する約500〜約1824、約500〜約1500、約500〜約1000、約1000〜約1824、約1000〜約1500または約1500〜約1824ヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、E3欠失は、E3-gp19Kの停止部位に隣接する約1600ヌクレオチドの欠失を含み、例えばE3挿入部位は、E3-gp19Kの停止部位に隣接する1622ヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、E3欠失は、Ad5ゲノム(配列番号：23)のヌクレオチド29218〜30839に対応する欠失を含む。
【００１５】
ある態様において、組み換えアデノウイルスは、第3の治療的トランスジーンをコードする第3のヌクレオチド配列を含む。第3の治療的トランスジーンは、E1b-19K挿入部位に挿入され得、例えば第2のヌクレオチド配列および第3のヌクレオチド配列は第2の配列内リボソーム進入部位(IRES)により分離される。ある態様において、第1、第2および第3の治療的トランスジーンは、CTGACCTC(配列番号：1)とTCACCAGG(配列番号：2)の間に挿入され、例えば組み換えアデノウイルスは、5'〜3'の方向で、CTGACCTC(配列番号：1)、第1の治療的トランスジーン、第1のIRES、第2の治療的トランスジーン、第2のIRES、第3の治療的トランスジーンおよびTCACCAGG(配列番号：2)を含む。第3の治療的トランスジーンはまた、E3欠失部位に挿入され得、すなわちある態様において、組み換えアデノウイルスは、E3挿入部位に挿入される第3の治療的トランスジーンをコードする第3のヌクレオチド配列を含む。ある態様において、第3の治療的トランスジーンは、Ad5ゲノムの29773に対応するヌクレオチドと30836に対応するヌクレオチドの間に挿入される。ある態様において、第3の治療的トランスジーンは、CAGTATGA(配列番号：3)とTAATAAAAAA(配列番号：4)の間に挿入され、例えば組み換えアデノウイルスは、5'〜3'の方向で、CAGTATGA(配列番号：3)、第3の治療的トランスジーンおよびTAATAAAAAA(配列番号：4)を含む。ある態様において、第3の治療的トランスジーンは、Ad5ゲノム(配列番号：23)の29218に対応するヌクレオチドと30839に対応するヌクレオチドの間に挿入される。ある態様において、第3の治療的トランスジーンは、TGCCTTAA(配列番号：29)とTAAAAAAAAAT(配列番号：30)の間に挿入され、例えば組み換えアデノウイルスは、5'〜3'の方向で、TGCCTTAA(配列番号：29)、第3の治療的トランスジーンおよびTAAAAAAAAAT(配列番号：30)を含む。
【００１６】
IRESは、例えば脳心筋炎ウイルス(EMCV)IRES、口蹄疫ウイルス(FMDV)IRESおよびポリオウイルスIRESからなる群より選択され得る。
【００１７】
ある態様において、前述のウイルスのいずれかにおいて、組み換えアデノウイルスはさらにE4欠失を含む。ある態様において、E4欠失は、E4-ORF6/7の開始部位と右逆方向末端反復(right inverted terminal repeat) (ITR)の間に配置される。ある態様において、E4欠失は、E4-ORF6/7の開始部位とE4-ORF1の開始部位の間に配置される。ある態様において、E4欠失は、約500〜約2500、約500〜約2000、約500〜約1500、約500〜約1000、約1000〜約2500、約1000〜約2000、約1000〜約1500、約1500〜約2500、約1500〜約2000または約2000〜約2500ヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、E4欠失は、E4-ORF6/7の開始部位に隣接する約250〜約1500、約250〜約1250、約250〜約1000、約250〜約750、約250〜約500、500〜約1500、約500〜約1250、約500〜約1000、約500〜約750、750〜約1500、約750〜約1250、約750〜約1000、約1000〜約1500または約1000〜約1250ヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、E4欠失は、E4-ORF6/7の開始部位に隣接する約1450ヌクレオチドの欠失を含み、例えばE4欠失は、E4-ORF6/7の開始部位に隣接する約1449ヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、E4欠失は、Ad5ゲノム(配列番号：23)のヌクレオチド34078〜35526に対応する欠失を含む。
【００１８】
ある態様において、前述のウイルスのいずれかにおいて、第1および/または第2の治療的トランスジーン、第1、第2および/または第3の治療的トランスジーンあるいは治療的トランスジーンの全ては、外来性のプロモーター配列に操作可能に連結されない。
【００１９】
ある態様において、第1および第2の治療的トランスジーンのサイズ、第1、第2および第3の治療的トランスジーンのサイズ、または治療的トランスジーンの全てのサイズは、合わせた場合、約500〜約5000、約500〜約4000、約500〜約3000、約500〜約2000、約500〜約1000、約1000〜約5000、約1000〜約4000、約1000〜約3000、約1000〜約2000、約2000〜約5000、約2000〜約4000、約2000〜約3000、約3000〜約5000、約3000〜約4000または約4000〜約5000ヌクレオチドを含む。ある態様において、第1および第2の治療的トランスジーンのサイズ、第1、第2および第3の治療的トランスジーンのサイズ、または全ての治療的トランスジーンのサイズは、合わせた場合、約500〜約7000、約500〜約6000、約500〜約5000、約500〜約4000、約500〜約3000、約500〜約2000、約500〜約1000、約1000〜約7000、約1000〜約6000、約1000〜約5000、約1000〜約4000、約1000〜約3000、約1000〜約2000、約2000〜約7000、約2000〜約6000、約2000〜約5000、約2000〜約4000、約2000〜約3000、約3000〜約7000、約3000〜約6000、約3000〜約5000、約3000〜約4000、約4000〜約7000、約4000〜約6000、約4000〜約5000ヌクレオチド、約5000〜約7000、約5000〜約6000または約6000〜約7000ヌクレオチドを含む。
【００２０】
ある態様において、第1および第2の治療的トランスジーンのサイズ、第1、第2および第3の治療的トランスジーンのサイズ、または全ての治療的トランスジーンのサイズは、合わせた場合、少なくとも約500、約1000、約2000、約3000、約4000または約5000ヌクレオチドを含む。ある態様において、第1および第2の治療的トランスジーンのサイズ、第1、第2および第3の治療的トランスジーンのサイズ、または全ての治療的トランスジーンのサイズは、合わせた場合、約1650ヌクレオチドを含む。ある態様において、第1および第2の治療的トランスジーンのサイズ、第1、第2および第3の治療的トランスジーンのサイズ、または全ての治療的トランスジーンのサイズは、合わせた場合、少なくとも約500、約1000、約2000、約3000、約4000、約5000、約6000または約7000ヌクレオチドを含む。ある態様において、第1および第2の治療的トランスジーンのサイズ、第1、第2および第3の治療的トランスジーンのサイズ、または全ての治療的トランスジーンのサイズは、合わせた場合、約3100ヌクレオチドを含む。
【００２１】
ある態様において、前述のウイルスのいずれかにおいて、第1および/または第2の治療的トランスジーン、第1、第2および/または第3の治療的トランスジーン、あるいは治療的トランスジーンのいずれかは、CD80、CD137L、IL-23A/p19、p40、エンドスタチン、アンギオスタチン、ICAM-1およびTGF-βトラップからなる群より選択される治療ポリペプチドをコードする。
【００２２】
ある態様において、前述のウイルスのいずれかにおいて、第1および/または第2の治療的トランスジーン、第1、第2および/または第3の治療的トランスジーン、あるいは治療的トランスジーンのいずれかは、CD80、CD137L、IL-23、IL-23A/p19、p40、IL-27、IL-27A/p28、IL-27B/EBI3、エンドスタチン、アンギオスタチン、ICAM-1、TGF-βトラップ、TGF-β、CD19、CD20、IL-1、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、CD154、CD86、BORIS/CTCFL、FGF、IL-24、MAGE、NY-ESO-1、アセチルコリン、インターフェロンγ、DKK1/Wnt、p53、チミジンキナーゼ、抗PD-1抗体の重鎖または軽鎖および抗PD-L1抗体の重鎖または軽鎖からなる群より選択される治療的ポリペプチドをコードする。
【００２３】
ある態様において、第1および第2の治療的トランスジーンは、ヘテロダイマーサイトカインの第1および第2のサブユニットのそれぞれをコードする。
【００２４】
ある態様において、前述のウイルスのいずれかにおいて、第1および/または第2の治療的トランスジーンは、CD80およびCD137Lからなる群より選択され、例えば第1の治療的トランスジーンはCD80をコードし、第2の治療的トランスジーンはCD137Lをコードする。ある態様において、組み換えアデノウイルスは、配列番号：5および/または配列番号：7によりコードされるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むか、あるいは配列番号：6および/または配列番号：8のヌクレオチド配列を含む。ある態様において、組み換えアデノウイルスは、配列番号：27のヌクレオチド配列を含む。
【００２５】
ある態様において、前述のウイルスのいずれかにおいて、第1、第2および/または第3の治療的トランスジーンは、CD80、CD137LおよびICAM-1からなる群より選択され、例えば第1の治療的トランスジーンはCD80をコードし、第2の治療的トランスジーンはCD137Lをコードし、第3の治療的トランスジーンはICAM-1をコードする。ある態様において、組み換えアデノウイルスは、配列番号：5、配列番号：7および/または配列番号：32によりコードされるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。ある態様において、組み換えアデノウイルスは、配列番号：31、配列番号：9または配列番号：22のヌクレオチド配列を含む。
【００２６】
ある態様において、前述のウイルスのいずれかにおいて、第1および/または第2の治療的トランスジーンは、ヘテロダイマーサイトカインIL-23を構成するIL-23A/p19およびp40からなる群より選択される。例えば、ある態様において、第1の治療的トランスジーンはIL-23A/p19をコードし、第2の治療的トランスジーンはp40をコードする。ある態様において、組み換えアデノウイルスは、配列番号：12および/または配列番号：10によりコードされるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むか、あるいは配列番号：13のヌクレオチド配列を含む。
【００２７】
ある態様において、前述のウイルスのいずれかにおいて、第1および/または第2の治療的トランスジーンは、ヘテロダイマーサイトカインIL-27を構成するIL-27A/p28およびIL-27B/EBI3からなる群より選択される。例えばある態様において、第1の治療的トランスジーンはIL-27A/p28をコードし、第2の治療的トランスジーンはIL-27B/EBI3をコードする。
【００２８】
ある態様において、前述のウイルスのいずれかにおいて、第1および/または第2の治療的トランスジーンは、エンドスタチンおよびアンギオスタチンからなる群より選択され、例えば第1の治療的トランスジーンはエンドスタチンをコードし、第2の治療的トランスジーンはアンギオスタチンをコードする。ある態様において、組み換えアデノウイルスは、配列番号：37または配列番号：38のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。ある態様において、組み換えアデノウイルスは、配列番号：39、配列番号：40、配列番号：41、配列番号：42、配列番号：43または配列番号：44のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。ある態様において、組み換えアデノウイルスは、配列番号：11のヌクレオチド配列を含む。
【００２９】
ある態様において、前述の組み換えアデノウイルスのいずれかは、少なくとも1つのPea3結合部位またはその機能性部分の欠失を含み得、例えば該ウイルスは、E1aの開始部位の上流約-300〜約-250に対応するヌクレオチドの欠失またはE1aの開始部位の上流-305〜-255もしくは-304〜-255に対応するヌクレオチドの欠失を含み得る。
【００３０】
ある態様において、前述の組成物のいずれかにおいて、組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスは、少なくとも1つのE2F結合部位またはその機能性部分の欠失を含み得る。ある態様において、組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスは、少なくとも1つのE2F結合部位またはその機能性部分の欠失を含み得、Pea3結合部位の欠失を含み得ない。
【００３１】
別の局面において、本発明は、配列番号：14または配列番号：14に対して80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の配列同一性を有する配列を含む組み換えアデノウイルスを提供する。
【００３２】
ある態様において、前述の組み換えアデノウイルスのそれぞれは、過増殖細胞において選択的に複製し得る。ある態様において、前述の組み換えアデノウイルスのいずれかは、過増殖細胞において2つ以上の治療的トランスジーンを選択的に発現し得る。過増殖細胞は、癌細胞、例えば肺癌細胞、結腸癌細胞および膵臓癌細胞であり得る。ある態様において、前述の組み換えアデノウイルスのそれぞれは腫瘍崩壊性アデノウイルスであり得る。
【００３３】
別の局面において、本発明は、前述の組み換えアデノウイルスのそれぞれおよび少なくとも1つの薬学的に許容可能な担体または希釈剤を含む医薬組成物を提供する。
【００３４】
別の局面において、本発明は、被験体において癌を治療する方法を提供する。該方法は、被験体に、本明細書に記載される組み換えアデノウイルスの有効量を投与して、被験体において癌疾患を治療する工程を含む。ある態様において、癌は、黒色腫、皮膚の扁平上皮癌、基底細胞癌、頭頸部癌、乳癌、肛門癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌、中皮腫、小細胞肺癌、腎細胞癌、前立腺癌、胃食道癌、結腸直腸癌、精巣癌、膀胱癌、卵巣癌、肝細胞癌、胆管癌、脳癌、子宮内膜癌、神経内分泌癌、メルケル細胞癌、胃腸管間質腫瘍、肉腫および膵臓癌からなる群より選択される。
【００３５】
別の局面において、本発明は、被験体において腫瘍細胞の増殖を阻害する方法を提供する。該方法は、被験体に、本明細書に記載される組み換えアデノウイルスの有効量を投与して、腫瘍細胞の増殖を阻害する工程を含む。
【００３６】
別の局面において、本発明は、被験体において腫瘍増殖を阻害する方法を提供する。該方法は、被験体に、本明細書に記載される組み換えアデノウイルスの有効量を投与して、腫瘍細胞の増殖を阻害する工程を含む。
【００３７】
前述の方法のそれぞれにおいて、組み換えアデノウイルスは、例えば手術、放射線、化学療法、免疫療法、ホルモン療法およびウイルス療法からなる群より選択される1つ以上の治療と組み合わせて投与され得る。前述の方法のそれぞれにおいて、組み換えアデノウイルスの有効量は、例えば102〜1015プラーク形成単位(pfu)であり得る。前述の方法のそれぞれにおいて、被験体は、例えばヒト、例えば小児のヒト、または動物であり得る。
【００３８】
前述の方法のそれぞれにおいて、組み換えウイルスの有効量は、例えば被験体における抗原に対する免疫応答を測定することにより同定され得る。ある態様において、抗原に対する免疫応答は、被験体の皮膚上の注射部位で被験体に抗原を注射することおよび注射部位での硬変のサイズを測定することにより測定される。
【００３９】
別の局面において、本発明は、標的細胞において2つ以上の治療的トランスジーンを発現させる方法を提供する。該方法は、細胞を、本明細書に記載される組み換えアデノウイルスの有効量に暴露して、標的トランスジーンを発現させる工程を含む。
【００４０】
本発明のこれらおよび他の局面および利点は、以下の図面、詳細な説明および特許請求の範囲により説明される。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
図面の説明
本発明は、以下の図面を参照してより完全に理解され得る。
【図１】図1は、5の感染多重度(multiplicity of infection) (MOI)での示されるウイルスでの感染の2日後のマウスCD80またはマウスCD137LについてのADS-12細胞の染色を示す。
【図２】図2は、5の感染多重度(MOI)での示されるウイルスでの感染の2日後のマウスCD80またはマウスCD137LについてのADS-12細胞の染色を示す。
【図３】図3は、示されるウイルスでの感染の3日後のマウスCD80またはマウスCD137Lについての4T1細胞の染色を示す。
【図４】図4は、示されるウイルスでの感染の3日後のマウスCD80またはマウスCD137Lについての4T1細胞の染色を示す。
【図５】図5は、2のMOIでの示されるウイルスでの感染の2日後のヒトCD80またはヒトCD137Lについての非癌性(WI-38およびMRC5)または癌性(A549)細胞の染色を示す。
【図６】図6は、5のMOIでの示されるウイルスでの感染の2日後のヒトCD80またはヒトCD137LについてのA549細胞の染色を示す。
【図７】図7は、10のMOIでのTAV-hCD80-hCD137Lウイルスの感染ありまたはなしで、示される時点での非癌性(WI-38およびMRC5)または癌性(A549)細胞のクリスタルバイオレット染色を示す。
【図８】図8は、10のMOIでの示されるウイルスの感染あるまたはなしで、示される時点でのADS-12細胞のクリスタルバイオレット染色を示す。
【図９】図9は、プラークアッセイにより決定されたADS細胞における示されるウイルスの複製を示す。
【図１０】図10は、0、4および8日目での示されるウイルスの5・107PFUの3回の腫瘍内注射による処理後のマウスにおける皮下ADS-12腫瘍の平均腫瘍体積(±SEM)を示す(n=10)。腫瘍体積は、長さ・幅2/2として評価した。
【図１１】図11は、0、4および8日目での示されるウイルスの1・107PFUの3回の腫瘍内注射による処理後のマウスにおける皮下ADS-12腫瘍の腫瘍体積を示す(n=3)。腫瘍体積は、長さ・幅2/2として評価した。
【図１２】図12は、0、4および8日目での示されるウイルスの5・107PFUの3回の腫瘍内注射による処理後のマウスの乳房脂肪パッドにおける同所的な(orthotopic)4T1腫瘍の平均腫瘍体積(±SEM)を示す(n=10)。腫瘍体積は、長さ・幅2/2として評価した。
【図１３】図13は、10のMOIでの示されるウイルスでの感染の4日後のマウスCD80、マウスCD137LおよびマウスICAM-1についてのADS-12細胞の染色を示す。
【図１４】図14は、5のMOIでの示されるウイルスでの感染の3日後のマウスCD80、マウスCD137LおよびマウスICAM-1についてのF244細胞の染色を示す。
【図１５】図15は、5のMOIでの示されるウイルスでの感染の3日後のマウスCD80、マウスCD137LおよびマウスICAM-1についてのHT29細胞の染色を示す。
【図１６−１】図16は、バッファ(図16A)、TAV-mCD80-137L(図16B)またはTAV-mCD80-137L-ICAM(図16C)のいずれかの腫瘍内注射により処理した皮下ADS-12腫瘍を保有する129S4マウスの腫瘍体積を示す。それぞれの処理は、合計3回の投与について、投与当たり1x109PFUで4日毎に投与した。それぞれの線は、それぞれの治療群当たり10匹のマウスを有する個々のマウスの腫瘍体積を示す。
【図１６−２】図16は、バッファ(図16A)、TAV-mCD80-137L(図16B)またはTAV-mCD80-137L-ICAM(図16C)のいずれかの腫瘍内注射により処理した皮下ADS-12腫瘍を保有する129S4マウスの腫瘍体積を示す。それぞれの処理は、合計3回の投与について、投与当たり1x109PFUで4日毎に投与した。それぞれの線は、それぞれの治療群当たり10匹のマウスを有する個々のマウスの腫瘍体積を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
詳細な説明
本発明は部分的に、腫瘍崩壊性ウイルスなどのアデノウイルスは、予想外にも、特定の挿入部位に挿入された場合に、外来性のプロモーターを使用することなく、複数(2つ以上)の治療的トランスジーンを効率的に発現し得るという発見、および該ウイルスは、ウイルスゲノムに組み込まれるトランスジーンのサイズに関係なく、複製し得、かつ2つ以上の治療的トランスジーンを効率的に発現し得るという発見に基づく。
【００４３】
したがって、一局面において、本発明は、(a)E1b-19K挿入部位に挿入される第1の治療的トランスジーンをコードする第1のヌクレオチド配列；ここで該E1b-19K挿入部位は、E1b-19Kの開始部位(すなわちE1b-19kの開始コドンをコードする、例えば配列番号：23のヌクレオチド1714〜1716に対応するヌクレオチド配列)とE1b-55kの開始部位(すなわちE1b-55kの開始コドンをコードする、例えば配列番号：23のヌクレオチド2019〜2021に対応するヌクレオチド配列)の間に配置される；および(b)E3挿入部位に挿入される第2の治療的トランスジーンをコードする第2のヌクレオチド配列、ここで該E3挿入部位は、pVIIIの停止部位(すなわちpVIIIの停止コドンをコードする、例えば配列番号：23のヌクレオチド27855〜27857に対応するヌクレオチド配列)とFiberの開始部位(すなわちFiberの開始コドンをコードする、例えば配列番号：23のヌクレオチド31042〜31044に対応するヌクレオチド配列)の間に配置される、を含む組み換えアデノウイルスを提供する。明細書および特許請求の範囲を通して、2つの部位の間の挿入、例えば(i)第1の遺伝子(例えばE1b-19k)の開始部位と第2の遺伝子(例えばE1b-55K)の開始部位、(ii)第1の遺伝子の開始部位と第2の遺伝子の停止部位、(iii)第1の遺伝子の停止部位と第2の遺伝子の開始部位または(iv)第1の遺伝子の停止部位と第2の遺伝子の停止部位の間の挿入は、挿入の周囲にある所定の開始部位または停止部位を構成するヌクレオチドの全部または一部が最終的なウイルス中に存在し得るまたは非存在であり得ることを意味すると理解される。同様に、2つのヌクレオチドの間の挿入は、挿入の周囲にあるヌクレオチドが、最終的なウイルス中に存在し得るまたは非存在であり得ることを意味すると理解される。用語「トランスジーン」は、外来性の遺伝子またはポリヌクレオチド配列をいう。用語「治療的トランスジーン」は、ウイルス内でまたはウイルスにより複製および/または発現される場合に標的細胞、体液、組織、臓器、生理学的系または被験体において治療効果を付与するトランスジーンをいう。
【００４４】
ある態様において、E1b-19K挿入部位は、E1b-19Kの開始部位(すなわちE1b-19kの開始コドンをコードする、例えば配列番号：23のヌクレオチド1714〜1716に対応するヌクレオチド配列)とE1b-19Kの停止部位(すなわちE1b-19kの停止コドンをコードする、例えば配列番号：23のヌクレオチド2242〜2244に対応するヌクレオチド配列)の間に配置される。ある態様において、E1b-19K挿入部位は、E1b-19Kの開始部位に隣接する約100〜約305、約100〜約300、約100〜約250、約100〜約200、約100〜約150、約150〜約305、約150〜約300、約150〜約250または約150〜約200ヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、E1b-19K挿入部位は、E1b-19Kの開始部位に隣接する約200ヌクレオチド、例えば202または203ヌクレオトドの欠失を含む。ある態様において、E1b-19K挿入部位は、Ad5ゲノム(配列番号：23)のヌクレオチド1714〜1917または1714〜1916に対応する欠失を含む。ある態様において、第1の治療的トランスジーンは、Ad5ゲノム(配列番号：23)の1714に対応するヌクレオチドと1917に対応するヌクレオチドの間または1714に対応するヌクレオチドと1916に対応するヌクレオチドの間に挿入される。ある態様において、第1の治療的トランスジーンは、CTGACCTC(配列番号：1)とTCACCAGG(配列番号：2)の間に挿入され、例えば組み換えアデノウイルスは、5'〜3'の方向で、CTGACCTC(配列番号：1)、第1の治療的トランスジーンおよびTCACCAGG(配列番号：2)を含む。CTGACCTC(配列番号：1)およびTCACCAGG(配列番号：2)は、Ad5ゲノム(配列番号：23)内のE1b-19K挿入部位について特有の境界配列を画定する。明細書および特許請求の範囲を通して、部位に隣接する欠失、例えば遺伝子の開始部位に隣接する欠失または遺伝子の停止部位に隣接する欠失は、欠失が所定の開始部位または停止部位を構成するヌクレオチドの全部、一部またはゼロ個の(none)欠失を含み得ることを意味すると理解される。
【００４５】
ある態様において、E3挿入部位は、約500〜約3185、約500〜約3000、約500〜約2500、約500〜約2000、約500〜約1500、約500〜約1000、約1000〜約3185、約1000〜約3000、約1000〜約2500、約1000〜約2000、約1000〜約1500、約1500〜約3185、約1500〜約3000、約1500〜約2000、約2000〜約3185、約2000〜約3000、約2000〜約2500、約2500〜約3185、約2500〜約3000または約3000〜約3185ヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、E3挿入部位は、E3-10.5Kの停止部位(すなわちE3-10.5Kの停止コドンをコードする、例えば配列番号：23のヌクレオチド29770〜29772に対応するヌクレオチド配列)とE3-14.7Kの停止部位(すなわちE3-14.7Kの停止コドンをコードする、例えば配列番号：23のヌクレオチド30837〜30839に対応するヌクレオチド配列)の間に配置される。ある態様において、E3挿入部位は、E3-10.5Kの停止部位に隣接する約500〜約1551、約500〜約1500、約500〜約1000、約1000〜約1551、約1000〜約1500または約1500〜約1551ヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、E3挿入部位は、E3-10.5Kの停止部位に隣接する約1050ヌクレオチドの欠失を含み、例えばE3挿入部位は、E3-10.5Kの停止部位に隣接する1063または1064ヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、E3挿入部位は、Ad5 dl309 E3欠失に対応する欠失を含む。ある態様において、E3挿入部位は、Ad5ゲノム(配列番号：23)のヌクレオチド29773〜30836に対応する欠失を含む。ある態様において、第2の治療的トランスジーンは、Ad5ゲノム(配列番号：23)の29773に対応するヌクレオチドと30836に対応するヌクレオチドの間に挿入される。ある態様において、第2の治療的トランスジーンは、CAGTATGA(配列番号：3)とTAATAAAAAA(配列番号：4)の間に挿入され、例えば組み換えアデノウイルスは、5'〜3'の方向で、CAGTATGA(配列番号：3)、第2の治療的トランスジーンおよびTAATAAAAAA(配列番号：4)を含む。CAGTATGA(配列番号：3)およびTAATAAAAAA(配列番号：4)は、Ad5ゲノム(配列番号：23)内のE3挿入部位について特有の境界配列を画定する。
【００４６】
ある態様において、E3挿入部位は、E3-gp19Kの停止部位(すなわちE3-gp19Kの停止コドンをコードする、例えば配列番号：23のヌクレオチド29215〜29217に対応するヌクレオチド配列)とE3-14.7Kの停止部位(すなわちE3-14.7Kの停止コドンをコードする、例えば配列番号：23のヌクレオチド30837〜30839に対応するヌクレオチド配列)の間に配置される。ある態様において、E3挿入部位は、E3-gp19Kの停止部位に隣接する約500〜約1824、約500〜約1500、約500〜約1000、約1000〜約1824、約1000〜約1500または約1500〜約1824ヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、E3挿入部位は、E3-gp19Kの停止部位に隣接する約1600ヌクレオチドの欠失を含み、例えばE3挿入部位は、E3-gp19Kの停止部位に隣接する1622ヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、E3挿入部位は、Ad5ゲノム(配列番号：23)のヌクレオチド29218〜30839に対応する欠失を含む。ある態様において、第2の治療的トランスジーンは、Ad5ゲノム(配列番号：23)の29218に対応するヌクレオチドと30839に対応するヌクレオチドの間に挿入される。ある態様において、第2の治療的トランスジーンは、TGCCTTAA(配列番号：29)とTAAAAAAAAAT(配列番号：30)の間に挿入され、例えば組み換えアデノウイルスは、5'〜3'の方向で、TGCCTTAA(配列番号：29)、第2の治療的トランスジーンおよびTAAAAAAAAAT(配列番号：30)を含む。TGCCTTAA(配列番号：29)およびTAAAAAAAAAT(配列番号：30)は、Ad5ゲノム(配列番号：23)内のE3挿入部位について特有の境界配列を画定する。
【００４７】
別の局面において、本発明は、(a)E1b-19K挿入部位に挿入される第1の治療的トランスジーンをコードする第1のヌクレオチド配列および(b)E1b-19K挿入部位に挿入される第2の治療的トランスジーンをコードする第2のヌクレオチド配列を含む組み換えアデノウイルスを提供し、ここで該E1b-19K挿入部位は、E1b-19kの開始(すなわちE1b-19kの開始コドンをコードする、例えば配列番号：23のヌクレオチド1714〜1716に対応するヌクレオチド配列)とE1b-55kの開始部位(すなわちE1b-55kの開始コドンをコードする、例えば配列番号：23のヌクレオチド2019〜2021に対応するヌクレオチド配列)の間に配置され、該第1のヌクレオチド配列および第2のヌクレオチド配列は第1の配列内リボソーム進入部位(IRES)により分離される。
【００４８】
ある態様において、E1b-19K挿入部位は、E1b-19Kの開始部位(すなわちE1b-19kの開始コドンをコードする、例えば配列番号：23のヌクレオチド1714〜1716に対応するヌクレオチド配列)とE1b-19Kの停止部位(すなわちE1b-19kの停止コドンをコードする、例えば配列番号：23のヌクレオチド2242〜2244に対応するヌクレオチド配列)の間に配置される。ある態様において、E1b-19K挿入部位は、E1b-19Kの開始部位に隣接する約100〜約305、約100〜約300、約100〜約250、約100〜約200、約100〜約150、約150〜約305、約150〜約300、約150〜約250または約150〜約200ヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、E1b-19K挿入部位は、E1b-19Kの開始部位に隣接する約200ヌクレオチド、例えば202または203ヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、E1b-19K挿入部位は、Ad5ゲノム(配列番号：23)のヌクレオチド1714〜1917または1714〜1916に対応する欠失を含む。ある態様において、第1および第2の治療的トランスジーンは、Ad5ゲノムの1714に対応するヌクレオチドと1917に対応するヌクレオチドの間または1714に対応するヌクレオチドと1916に対応するヌクレオチドの間に挿入される。ある態様において、第1および第2の治療的トランスジーンは、CTGACCTC(配列番号：1)とTCACCAGG(配列番号：2)の間に挿入され、例えば組み換えアデノウイルスは、5'〜3'の方向で、CTGACCTC(配列番号：1)、第1の治療的トランスジーン、IRES、第2の治療的トランスジーンおよびTCACCAGG(配列番号：2)を含む。
【００４９】
ある態様において、組み換えアデノウイルスはE3欠失を含む。ある態様において、E3欠失は、約500〜約3185、約500〜約3000、約500〜約2500、約500〜約2000、約500〜約1500、約500〜約1000、約1000〜約3185、約1000〜約3000、約1000〜約2500、約1000〜約2000、約1000〜約1500、約1500〜約3185、約1500〜約3000、約1500〜約2000、約2000〜約3185、約2000〜約3000、約2000〜約2500、約2500〜約3185、約2500〜約3000または約3000〜約3185ヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、E3欠失は、pVIIIの停止部位(すなわちpVIIIの停止コドンをコードする、例えば配列番号：23のヌクレオチド27855〜27857に対応するヌクレオチド配列)とFiberの開始部位(すなわちFiberの開始コドンをコードする、例えば配列番号：23のヌクレオチド31042〜31044に対応するヌクレオチド配列)の間に配置される。ある態様において、E3欠失部位は、E3-10.5Kの停止部位(すなわちE3-10.5Kの停止コドンをコードする、例えば配列番号：23のヌクレオチド29770〜29772に対応するヌクレオチド配列)とE3-14.7Kの停止部位(すなわちE3-14.7Kの停止コドンをコードする、例えば配列番号：23のヌクレオチド30837〜30839に対応するヌクレオチド配列)の間に配置される。ある態様において、E3欠失は、E3-10.5Kの停止部位に隣接する約500〜約1551、約500〜約1500、約500〜約1000、約1000〜約1551、約1000〜約1500または約1500〜約1551ヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、E3欠失は、E3-10.5Kの停止部位に隣接する約1050ヌクレオチドの欠失を含み、例えばE3欠失は、E3-10.5Kの停止部位に隣接する1063または1064ヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、E3欠失は、Ad5 dl309 E3欠失に対応する欠失を含む。ある態様において、E3欠失は、Ad5ゲノム(配列番号：23)のヌクレオチド29773〜30836に対応する欠失を含む。
【００５０】
ある態様において、E3欠失は、E3-gp19Kの停止部位(すなわちE3-gp19Kの停止コドンをコードする、例えば配列番号：23のヌクレオチド29215〜29217に対応するヌクレオチド配列)とE3-14.7Kの停止部位(すなわちE3-14.7Kの停止コドンをコードする、例えば配列番号：23のヌクレオチド30837〜30839に対応するヌクレオチド配列)の間に配置される。ある態様において、E3欠失は、E3-gp19Kの停止部位に隣接する約500〜約1824、約500〜約1500、約500〜約1000、約1000〜約1824、約1000〜約1500または約1500〜約1824ヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、E3欠失は、E3-gp19Kの停止部位に隣接する約1600ヌクレオチドの欠失を含み、例えばE3欠失は、E3-gp19Kの停止部位に隣接する1622ヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、E3欠失は、Ad5ゲノム(配列番号：23)のヌクレオチド29218〜30839に対応する欠失を含む。
【００５１】
ある態様において、組み換えアデノウイルスは、第3の治療的トランスジーンをコードする第3のヌクレオチド配列を含む。第3の治療的トランスジーンはE1b-19K挿入部位に挿入され得、例えば第2のヌクレオチド配列および第3のヌクレオチド配列は、第2の配列内リボソーム進入部位(IRES)により分離される。ある態様において、第1、第2および第3の治療的トランスジーンは、CTGACCTC(配列番号：1)とTCACCAGG(配列番号：2)の間に挿入され、例えば組み換えアデノウイルスは、5'〜3'の方向で、CTGACCTC(配列番号：1)、第1の治療的トランスジーン、第1のIRES、第2の治療的トランスジーン、第2のIRES、第3の治療的トランスジーンおよびTCACCAGG(配列番号：2)を含む。第3の治療的トランスジーンはまた、E3欠失部位に挿入され得、すなわちある態様において、組み換えアデノウイルスは、E3挿入部位に挿入される第3の治療的トランスジーンをコードする第3のヌクレオチド配列を含む。ある態様において、第3の治療的トランスジーンは、Ad5ゲノム(配列番号：23)の29772に対応するヌクレオチドと30837に対応するヌクレオチドの間に挿入される。ある態様において、第3の治療的トランスジーンは、CAGTATGA(配列番号：3)とTAATAAAAAA(配列番号：4)の間に挿入され、例えば組み換えアデノウイルスは、5'〜3'の方向で、CAGTATGA(配列番号：3)、第3の治療的トランスジーンおよびTAATAAAAAA(配列番号：4)を含む。ある態様において、第3の治療的トランスジーンは、Ad5ゲノム(配列番号：23)の29218に対応するヌクレオチドと30839に対応するヌクレオチドの間に挿入される。ある態様において、第3の治療的トランスジーンは、TGCCTTAA(配列番号：29)とTAAAAAAAAAT(配列番号：30)の間に挿入され、例えば組み換えアデノウイルスは、5'〜3'の方向で、TGCCTTAA(配列番号：29)、第3の治療的トランスジーンおよびTAAAAAAAAAT(配列番号：30)を含む。
【００５２】
IRESは、例えば脳心筋炎ウイルスIRES、口蹄疫ウイルスIRESおよびポリオウイルスIRESからなる群より選択され得る。
【００５３】
ある態様において、前述のウイルスのいずれかにおいて、組み換えアデノウイルスはさらにE4欠失を含む。ある態様において、E4欠失は、E4-ORF6/7の開始部位(すなわちE4-ORF6/7の開始コドンをコードする、例えば配列番号：23のヌクレオチド34075〜34077に対応するヌクレオチド配列)と右逆方向末端反復(ITR；例えば配列番号：23のヌクレオチド35836〜35938に対応する)の間に配置される。ある態様において、E4欠失は、E4-ORF6/7の開始部位とE4-ORF1の開始部位(すなわちE4-ORF1の開始コドンをコードする、例えば配列番号：23のヌクレオチド35524〜35526に対応するヌクレオチド配列)の間に配置される。ある態様において、E4欠失は、E4-ORF6/7の開始部位とE4-ORF1の開始部位の間のヌクレオチド配列の欠失を含む。ある態様において、E4欠失は、約500〜約2500、約500〜約2000、約500〜約1500、約500〜約1000、約1000〜約2500、約1000〜約2000、約1000〜約1500、約1500〜約2500、約1500〜約2000または約2000〜約2500ヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、E4欠失は、E4-ORF6/7の開始部位に隣接する約250〜約1500、約250〜約1250、約250〜約1000、約250〜約750、約250〜約500、500〜約1500、約500〜約1250、約500〜約1000、約500〜約750、750〜約1500、約750〜約1250、約750〜約1000、約1000〜約1500または約1000〜約1250ヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、E4欠失は、E4-ORF6/7の開始部位に隣接する約1450ヌクレオチドの欠失を含み、例えばE4欠失は、E4-ORF6/7の開始部位に隣接する約1449ヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、E4欠失は、Ad5ゲノム(配列番号：23)のヌクレオチド34078〜35526に対応する欠失を含む。
【００５４】
ある態様において、本発明の組み換えアデノウイルスは、腫瘍崩壊性ウイルス、例えば腫瘍選択的複製および/またはウイルス媒介性溶解を示すウイルスである。ある態様において、本発明の組み換えアデノウイルスは、過増殖細胞、例えば癌細胞において、非過増殖細胞と比較して治療的トランスジーンの選択的な発現を示す。ある態様において、非過増殖細胞における治療的トランスジーンの発現は、過増殖細胞における遺伝子の発現の約90%、約80%、約70%、約60%、約50%、約40%、約30%、約20%、約10%または約5%である。ある態様において、ウイルスは、非過増殖細胞において治療的トランスジーンの検出可能な発現を示さない。治療的トランスジーン発現は、当該技術分野において公知の任意の適切な方法、例えばウエスタンブロットまたはELISAにより決定され得る。
【００５５】
過増殖細胞は、癌細胞、例えば癌腫、肉腫、白血病、リンパ腫、前立腺癌、肺癌、胃腸管癌、結腸直腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、胃癌、甲状腺癌、中皮腫、肝臓癌、腎臓癌、皮膚癌、頭頸部癌または脳癌の細胞であり得る。
【００５６】
本発明の組み換えアデノウイルスの特徴、例えば外来性プロモーターの欠損は、他の組み換えアデノウイルスに対してさらなる治療的トランスジーンまたはより大きな治療的トランスジーンの発現を可能にし得る。例えばある態様において、前述のウイルスのいずれかにおいて、第1および/または第2の治療的トランスジーン、第1、第2および/または第3の治療的トランスジーンあるいは治療的トランスジーンの全ては、外来性のプロモーター配列に操作可能に連結されない。ある態様において、第1および第2の治療的トランスジーンのサイズ、第1、第2および第3の治療的トランスジーンのサイズまたは治療的トランスジーンの全てのサイズは、合わせた場合、約500〜約5000、約500〜約4000、約500〜約3000、約500〜約2000、約500〜約1000、約1000〜約5000、約1000〜約4000、約1000〜約3000、約1000〜約2000、約2000〜約5000、約2000〜約4000、約2000〜約3000、約3000〜約5000、約3000〜約4000または約4000〜約5000ヌクレオチドを含む。ある態様において、第1および第2の治療的トランスジーンのサイズ、第1、第2および第3の治療的トランスジーンのサイズまたは治療的トランスジーンの全てのサイズは、合わせた場合、約500〜約7000、約500〜約6000、約500〜約5000、約500〜約4000、約500〜約3000、約500〜約2000、約500〜約1000、約1000〜約7000、約1000〜約6000、約1000〜約5000、約1000〜約4000、約1000〜約3000、約1000〜約2000、約2000〜約7000、約2000〜約6000、約2000〜約5000、約2000〜約4000、約2000〜約3000、約3000〜約7000、約3000〜約6000、約3000〜約5000、約3000〜約4000、約4000〜約7000、約4000〜約6000、約4000〜約5000ヌクレオチド、約5000〜約7000、約5000〜約6000または約6000〜約7000ヌクレオチドを含む。
【００５７】
ある態様において、第1および第2の治療的トランスジーンのサイズ、第1、第2および第3の治療的トランスジーンのサイズまたは治療的トランスジーンの全てのサイズは、合わせた場合、少なくとも約500、約1000、約2000、約3000、約4000または約5000ヌクレオチドを含む。ある態様において、第1および第2の治療的トランスジーンのサイズ、第1、第2および第3の治療的トランスジーンのサイズまたは治療的トランスジーンの全てのサイズは、合わせた場合、約1650ヌクレオチドを含む。ある態様において、第1および第2の治療的トランスジーンのサイズ、第1、第2および第3の治療的トランスジーンのサイズまたは治療的トランスジーンの全てのサイズは、合わせた場合、少なくとも約500、約1000、約2000、約3000、約4000、約5000、約6000または約7000ヌクレオチドを含む。ある態様において、第1および第2の治療的トランスジーンのサイズ、第1、第2および第3の治療的トランスジーンのサイズまたは治療的トランスジーンの全てのサイズは、合わせた場合、約3100ヌクレオチドを含む。
【００５８】
ある態様において、組み換えアデノウイルスは、配列番号：14を含むかまたは配列番号：14に対して80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の配列同一性を有する配列を含む。
【００５９】
配列同一性は、当該技術分野における技術の範囲内にある種々の方法で、例えば公的に利用可能なコンピューターソフトウェア、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGNまたはMegalign (DNASTAR)ソフトウェアを使用して決定され得る。プログラムblastp、blastn、blastx、tblastnおよびtblastxにより使用されるアルゴリズムを使用したBLAST (Basic Local Alignment Search Tool)分析(Karlin et al., (1990) PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 87:2264-2268; Altschul, (1993) J. MOL. EVOL. 36, 290-300; Altschul et al., (1997) NUCLEIC ACIDS RES. 25:3389-3402、参照により援用される)は、配列類似性の検索のために調整される。配列データベースの検索における基本的な問題の議論については、参照により十分に援用されるAltschul et al., (1994) NATURE GENETICS 6:119-129参照。当業者は、比較される配列の全長にわたり最大のアラインメント(alignment)を達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメーターを決定し得る。ヒストグラム、ディスクリプション、アラインメント、エクスペクト(すなわちデータベース配列に対する適合を報告するための統計的有意さ閾値)、カットオフ、マトリックスおよびフィルターについての検索パラメーターは、デフォルト設定にある。blastp、blastx、tblastnおよびtblastxにより使用されるデフォルトスコアリングマトリックスは、BLOSUM62マトリックスである(Henikoff et al., (1992) PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 89:10915-10919、参照により十分に援用される)。4つのblastnパラメーターは以下の通りに調整され得る：Q=10(ギャップ生成ペナルティー)；R=10(ギャップ伸長ペナルティー(gap extension penalty))；wink=1(クエリに沿ってwink.sup.thの位置毎にワードヒットを生じる)；およびgapw=16(ギャップのあるアラインメントが生成されるウィンドウ幅を設定する)。同等のBlastpパラメーター設定は、Q=9；R=2；wink=1；およびgapw=32であり得る。検索はまた、NCBI (National Center for Biotechnology Information) BLAST Advanced Optionパラメーターを使用して実施され得る(例えば：-G、オープンギャップについてのコスト[整数]：デフォルト=ヌクレオチドについて5/タンパク質について11；-E、伸長ギャップについてのコスト[整数]：デフォルト=ヌクレオチドについて2/タンパク質について1；-q、ヌクレオチドミスマッチについてのペナルティー[整数]：デフォルト=-3；-r、ヌクレオチド適合についての報酬(reward)[整数]：デフォルト=1；-e、予測値[実数]：デフォルト=10；-W、ワードサイズ[整数]：デフォルト=ヌクレオチドについて11/megablastについて28/タンパク質について3；-y、ビットでのblast伸長についてのドロップオフ(X)：デフォルト=blastnについて20/その他について7；-X、ギャップのあるアラインメントについてのXドロップオフ値(ビット(in bit))：デフォルト=全てのプログラムについて15であるがblastnには適用可能ではない；および-Z、ギャップのあるアラインメントについての最終Xドロップオフ値(ビット)：blastnについて50、その他について25)。ペアワイズタンパク質アラインメントについてのClustalWも使用され得る(デフォルトパラメータは、例えばBlosum62マトリックスおよびギャップオープンペナルティー(Gap Opening Penalty)=10およびギャップ伸長ペナルティー=0.1を含み得る)。GCGパッケージバージョン10.0において利用可能な配列間の最適合比較はDNAパラメーターGAP=50(ギャップ生成ペナルティー)およびLEN=3(ギャップ伸長ペナルティ���)を使用し、タンパク質比較における同等の設定はGAP=8およびLEN=2である。
【００６０】
本発明はまた、1つ以上の治療的トランスジーン、特に免疫調節トランスジーンをE1、E3およびE4部位において右および左の配向(orientation)を発現するアデノウイルス5型ベクターを提供する。本明細書で使用する場合、「免疫調節」は、被験体の免疫系の機能を調節する治療的トランスジーンをいう。免疫調節トランスジーンは、例えばB細胞、T細胞の機能および/または抗体の産生を調節し得る。例示的な免疫調節トランスジーンとしては、チェックポイント阻害剤が挙げられる。例示的な免疫調節トランスジーンとしては、例えばPD-1もしくはPD-L1またはそれらの活性を調節する任意のトランスジーンが挙げられ得る。さらなる例示的な免疫調節トランスジーンとしては、抗PD-1抗体または抗PD-L1抗体が挙げられ得る。特定の免疫調節トランスジーンは、ペプチドリンカー、例えば免疫原性であり得る、すなわち中和抗体に攻撃されやすい、長さ2〜5000以上のアミノ酸のペプチドリンカーを含み得る。かかるリンカーの免疫原性は、免疫原性配列を非免疫原性配列で置き換えることにより低減され得ることが企図される。
【００６１】
本発明はさらに、開示される組み換えアデノウイルスを、例えば免疫チェックポイントを遮断するまたは抗原提示/抗原の包み込み(engulfment)を向上する、および/または腫瘍特異的なT細胞応答性を高める抗体と組み合わせて投与する工程を含む治療方法を提供する。
【００６２】
I. ウイルス
用語「ウイルス」は、タンパク質合成機構またはエネルギー生成機構を有さない偏性細胞内寄生体のいずれかをいうために本明細書において使用される。ウイルスゲノムはRNAまたはDNAであり得る。本発明の実施において有用なウイルスとしては、組み換えにより改変されたエンベロープを含むかまたはエンベロープを含まないDNAウイルスおよびRNAウイルスが挙げられ、好ましくはバキュロウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科(picornoviridiae)、ヘルペスウイルス科、ポックスウイルス科(poxyiridae)またはアデノウイルス科から選択される。組み換えにより改変されたウイルスは、本明細書において「組み換えウイルス」と称される。組み換えウイルスは、例えば複製欠陥、条件的複製もしくは複製コンピテントにするための組み換えDNA技術により改変され得るか、および/または外来性トランスジーンの発現を含むように組み換えDNA技術により改変され得る。親ベクターの特性のそれぞれの有利な要素を利用するキメラウイルスベクター(例えばFeng et al. (1997) NATURE BIOTECHNOLOGY 15:866-870参照)も、本発明の実施に有用であり得る。治療される種由来のウイルスを使用することが一般的に好ましいが、いくつかの例において、好ましい病原性特徴を有する異なる種由来のベクターを使用することが有利であり得る。例えば、ヒト遺伝子治療のためのウマヘルペスウイルスベクターがPCT公開公報WO98/27216に記載される。該ベクターは、ウマウイルスがヒトに対して病原性でないためにヒトの治療に有用であると記載される。同様に、ヒツジアデノウイルスベクターは、ヒトアデノウイルスベクターに対する抗体を回避することが主張されるので、ヒトの遺伝子療法に使用され得る。かかるベクターは、PCT公開公報WO97/06826に記載される。
【００６３】
好ましくは、組み換えウイルスはアデノウイルスである。アデノウイルスは、ヌクレオカプシドおよび二本鎖線状DNAゲノムで構成される、中程度の大きさ(90〜100nm)のエンベロープを有さない(ネイキッド)正二十面体ウイルスである。アデノウイルスは、宿主の複製機構を使用して哺乳動物細胞の核内で複製する。用語「アデノウイルス」は、アデノウイルス属(genus Adenoviridiae)の任意のウイルスをいい、限定されないが、ヒト、ウシ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ブタ、マウスおよびサルのアデノウイルス亜属が挙げられる。特に、ヒトアデノウイルスとしてはA〜F亜属およびそれらの個々の血清型が挙げられ、個々の血清型およびA〜F亜属としては限定されないが、ヒトアデノウイルスの1、2、3、4、4a、5、6、7、8、9、10、11(Ad11aおよびAd11p)、12、13、14、15、16、17、18、19、19a、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、34a、35、35p、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48および91型が挙げられる。ヒトアデノウイルスの2および5型由来の組み換えウイルスが好ましい。そうではないと記載されない限り、全てのアデノウイルス5型ヌクレオチド番号は、本明細書において配列番号：23に示されるNCBI参照配列AC_000008.1に関連する。
【００６４】
アデノウイルス複製サイクルは2つの段階：4つの転写単位E1、E2、E3およびE4が発現される初期段階ならびにウイルスDNA合成の開始後、後期転写産物が主要後期プロモーター(major late promoter)(MLP)から主に発現される際に起こる後期段階を有する。後期メッセージは、ウイルスの構造タンパク質のほとんどをコードする。E1、E2およびE4の遺伝子産物は、転写活性化、細胞形質転換、ウイルスDNA複製およびその他のウイルス機能の原因であり、ウイルス増殖に必要である。
【００６５】
用語「操作可能に連結された」は、機能的な関係にあるポリヌクレオチド因子の連結をいう。核酸配列は、別の核酸配列と機能的な関係に配置される場合に「操作可能に連結される」。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、遺伝子の転写に影響を及ぼす場合に、遺伝子に操作可能に連結される。操作可能に連結されたヌクレオチド配列は典型的に連続である。しかしながら、プロモーターから数キロベース離れ、イントロン配列が一定でない(variable)長さであり得る場合に一般的にエンハンサーが機能するので、いくつかのポリヌクレオチド因子は操作可能に連結され得るが、直接的に隣り合わず、異なる対立遺伝子または染色体からトランスに機能さえし得る。
【００６６】
ある態様において、ウイルスは、制御配列またはプロモーターに対して1つ以上の改変を有する。制御配列またはプロモーターに対する改変は、制御配列またはプロモーターの野生型配列と比較して、1つ以上のヌクレオチドの欠失、置換または付加を含む。
【００６７】
ある態様において、制御配列またはプロモーターの改変は、例えば転写因子結合部位の一部を欠失することによりまたは該結合部位に1つの点変異を挿入することにより、転写因子に対する親和性を低減するような、転写因子結合部位の配列の改変を含む。ある態様において、さらなる改変された制御配列は、新生物細胞における発現を高めるが、正常細胞における発現を弱める。
【００６８】
ある態様において、改変された制御配列は、タンパク質をコードする配列に操作可能に連結される。ある態様において、アデノウイルスE1aおよびE1b遺伝子(コーディング領域)の少なくとも1つは、改変された制御配列に操作可能に連結される。ある態様において、E1a遺伝子は、改変された制御配列に操作可能に連結される。
【００６９】
E1a制御配列は、Pea3 I、Pea3 II、Pea3 III、Pea3 IVおよびPea3 Vと命名される転写因子Pea3に対する5つの結合部位を含み、Pea3 Iは、E1a開始部位に対して最も近位にあるPea3結合部位であり、Pea3 Vは最も遠位にある。E1a制御配列はまた、本明細書でE2F IおよびE2F IIと命名される転写因子E2Fに対する結合部位を含み、E2F Iは、E1a開始部位に対して最も近位にあるE2F結合部位であり、E2F IIはより遠位にある。結合部位はE1a開始部位から以下のように整列される：Pea3 I、E2F I、Pea3 II、E2F II、Pea3 III、Pea3 IVおよびPea3 V。
【００７０】
ある態様において、これらの7つの結合部位またはそれらの機能性部分の少なくとも1つが欠失される。「機能性部分」は、欠失された場合に、機能性、例えば結合部位のそのそれぞれの転写因子(Pea3またはE2F)に対する結合親和性を、完全配列に対して例えば少なくとも40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%または100%だけ低減するかまたは排除さえする結合部位の一部である。ある態様において、1つ以上の結合部位全体が欠失される。ある態様において、1つ以上の結合部位の機能性部分が欠失される。「欠失された結合部位」は、結合部位全体の欠失および機能性部分の欠失の両方を包含する。2つ以上の結合部位が欠失される場合、結合部位全体の欠失と機能性部分の欠失の任意の組合せが使用され得る。
【００７１】
ある態様において、少なくとも1つのPea3結合部位またはその機能性部分が欠失される。欠失されたPea3結合部位はPea3 I、Pea3 II、Pea3 III、Pea3 IVおよび/またはPea3 Vであり得る。ある態様において、欠失されたPea3結合部位はPea3 II、Pea3 III、Pea3 IVおよび/またはPea3 Vである。ある態様において、欠失されたPea3結合部位はPea3 IVおよび/またはPea3 Vである。ある態様において、欠失されたPea3結合部位はPea3 IIおよび/またはPea3 IIIである。ある態様において、欠失されたPea3結合部位はPea3 IIおよびPea3 IIIの両方である。ある態様において、Pea3 I結合部位またはその機能性部分は保持される。
【００７２】
ある態様において、少なくとも1つのE2F結合部位またはその機能性部分が欠失される。ある態様において、少なくとも1つのE2F結合部位またはその機能性部分は保持される。ある態様において、保持されたE2F結合部位はE2F Iおよび/またはE2F IIである。ある態様において、保持されたE2F結合部位はE2F IIである。ある態様において、全欠失は本質的に、Pea3 II、Pea3 III、Pea3 IVおよび/またはPea3 Vまたはそれらの機能性部分の1つ以上からなる。ある態様において、ウイルスは、以降TAV-255欠失と称する、例えばAd5ゲノム(配列番号：23)の195〜244に対応するE1a開始部位の上流-304〜-255に配置される50塩基対の領域の欠失を有する。ある態様において、TAV-255欠失は、配列GGTGTTTTGG(配列番号：28)を含むE1aプロモーターを生じる。
【００７３】
アデノウイルスE1b-19k遺伝子は、主に抗アポトーシス遺伝子として機能し、細胞性抗アポトーシス遺伝子BCL-2のホモログである。子孫ウイルス粒子の成熟の前の宿主細胞死はウイルス複製を制限するので、E1b-19kは、成熟前の細胞死を防ぎ、それにより感染を進行させて成熟ビリオンを生じさせるためのElカセットの一部として発現される。したがって、ある態様において、E1b-19K挿入部位を含む組み換えアデノウイルスが提供され、例えばアデノウイルスはE1b-19K挿入部位に挿入される治療的トランスジーンをコードするヌクレオチド配列を有する。ある態様において、アデノウイルスは、E1b-19K挿入部位に挿入される治療的トランスジーンをコードするヌクレオチド配列を含み、該挿入部位は、E1b-19Kの開始部位(すなわちE1b-19kの開始コドンをコードする、例えば配列番号：23のヌクレオチド1714〜1716に対応するヌクレオチド配列)とE1b-55kの開始部位(すなわちE1b-55kの開始コドンをコードする、例えば配列番号：23のヌクレオチド2019〜2021に対応するヌクレオチド配列)の間に配置される。
【００７４】
II. ウイルス産生の方法
本発明の組み換えウイルスを産生するための方法は当該技術分野で公知である。典型的に、開示されるウイルスは、感染性ウイルス粒子を産生させるのに適した条件下で、トランスフェクトされたかまたは感染された宿主細胞を培養することを含む従来技術を使用して、適切な宿主細胞株中で産生される。ウイルス遺伝子をコードする核酸をプラスミドに組み込み得、従来のトランスフェクションまたは形質転換技術により宿主細胞に導入し得る。開示されるウイルスの産生に適した例示的な宿主細胞としては、HeLa、Hela-S3、HEK293、911、A549、HER96またはPER-C6細胞などのヒト細胞株が挙げられる。特定の産生および精製の条件は、使用するウイルスおよび産生系に応じて変化する。アデノウイルスについて、ウイルス粒子の生成のための伝統的な方法は、その後のシャトルプラスミド(通常アデノウイルスゲノムの小サブセットを含み、任意にあり得るトランスジーン発現カセットを含む)およびアデノウイルスヘルパープラスミド(全アデノウイルスゲノムのほとんどを含む)のインビボ組み換えへと続く共トランスフェクションである。
【００７５】
アデノウイルスの生成のための代替的な技術としては、細菌人工染色体(BAC)系、相補的アデノウイルス配列を含む2つのプラスミドを利用するrecA÷株系統におけるインビボ細菌組み換え、および酵母人工染色体(YAC)系の利用が挙げられる。
【００７６】
産生後、感染性ウイルス粒子を培養から回収して、任意に精製する。典型的な精製工程としては、プラーク精製、遠心分離、例えば塩化セシウム勾配遠心分離、清澄化、酵素処理、例えばベンゾナーゼまたはプロテアーゼ処理、クロマトグラフィー工程、例えばイオン交換クロマトグラフィーまたはろ過工程が挙げられ得る。
【００７７】
III. 治療的トランスジーン
開示される組み換えアデノウイルスは、治療的トランスジーンをコードするヌクレオチド配列を含み得る。ある態様において、開示される組み換えウイルス(recombinant comprise virus)は、第1および第2の治療的トランスジーンのそれぞれをコードする第1のヌクレオチド配列および第2のヌクレオチド配列を含み得る。ある態様において、開示される組み換えウイルスは、第1、第2および第3の治療的トランスジーンのそれぞれをコードする第1のヌクレオチド配列、第2のヌクレオチド配列および第3のヌクレオチド配列を含み得る。
【００７８】
治療的トランスジーンは、治療的核酸、例えばアンチセンスRNAまたはリボザイムRNAをコードし得る。治療的トランスジーンは、治療的ペプチドもしくは治療的ポリペプチド、例えば癌タンパク質、腫瘍サプレッサーペプチドもしくはポリペプチド、酵素、サイトカイン、免疫調節ペプチドもしくはポリペプチド、抗体、溶解性ペプチド、ワクチン抗原、体細胞における遺伝子欠陥を補うペプチドもしくはポリペプチドまたは細胞死を誘導するプロセスを触媒するペプチドもしくはポリペプチドをコードし得る。
【００７９】
ある態様において、前述のウイルスのいずれかにおいて、第1および/または第2の治療的トランスジーン、第1、第2および/または第3の治療的トランスジーンあるいは治療的トランスジーンのいずれかは、CD80、CD137L、IL-23A/p19、p40、エンドスタチン、アンギオスタチン、ICAM-1およびTGF-βトラップからなる群より選択される治療的ポリペプチドをコードする。
【００８０】
ある態様において、前述のウイルスのいずれかにおいて、第1および/または第2の治療的トランスジーン、第1、第2および/または第3の治療的トランスジーンあるいは治療的トランスジーンのいずれかは、CD80、CD137L、IL-23、IL-23A/p19、p40、IL-27、IL-27A/p28、IL-27B/EBI3、エンドスタチン、アンギオスタチン、ICAM-1、TGF-βトラップ、TGF-β、CD19、CD20、IL-1、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、CD154、CD86、BORIS/CTCFL、FGF、IL-24、MAGE、NY-ESO-1、アセチルコリン、インターフェロンγ、DKK1/Wnt、p53、チミジンキナーゼ、抗PD-1抗体の重鎖または軽鎖および抗PD-L1抗体の重鎖または軽鎖からなる群より選択される治療的ポリペプチドをコードする。
【００８１】
ある態様において、第1の治療的トランスジーンはCD80をコードし、および/または第2の治療的トランスジーンはCD137Lをコードする。さらなる態様において、第1の治療的トランスジーンはCD137Lをコードし、および/または第2の治療的トランスジーンはCD80をコードする。CD80は、ナイーブCD8+ T細胞の活性化において役割を果たし得る共刺激分子である。CD8+ T細胞は、T細胞受容体(TCR)が、TCRが認識するペプチドを提示する抗原提示細胞(APC)上のクラスI主要組織適合性複合体(MHC)に結合する際に活性化される。TCR-MHC相互作用に加えて、T細胞はまた、APC上のCD80またはCD86のいずれかに結合するT細胞上のCD28分子を介して共刺激信号を受けなければならない。次いでT細胞は、活性化され得、分裂し得、同じペプチドを提示する他の細胞に対する応答を高める能力を獲得し得る。活性化はまた、T細胞上のCTLA-4およびCD137を含む他の分子の発現をもたらす。CTLA-4は、CD28よりも高い親和性でCD80に結合し、CTLA-4のCD80への結合によりT細胞の不活性化がもたらされる。CD137はCD137Lに結合し、結合の際にCD137は、T細胞をさらに活性化し、細胞分裂および免疫応答の持続を促進する。
【００８２】
ある態様において、第1および/または第2の治療的トランスジーンは、CD80およびCD137Lからなる群より選択され、例えば第1の治療的トランスジーンはCD80をコードし、第2の治療的トランスジーンはCD137Lをコードする。ヒトCD80をコードする例示的なヌクレオチド配列を配列番号：5に示し、ヒトCD137Lをコードする例示的なヌクレオチド配列を配列番号：7に示す。ある態様において、組み換えアデノウイルスは、配列番号：5および/または配列番号：7にコードされるアミノ酸配列、あるいは配列番号：5および/または配列番号：7に対して80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の配列同一性を有する配列をコードするヌクレオチド配列を含む。ある態様において、組み換えアデノウイルスは、配列番号：6および/または配列番号：8のヌクレオチド配列、あるいは配列番号：6および/または配列番号：8に対して80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の配列同一性を有する配列を含む。ある態様において、組み換えアデノウイルスは、配列番号：27のヌクレオチド配列、または配列番号：27に対して80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の配列同一性を有する配列を含む。
【００８３】
ある態様において、前述のウイルスのいずれかにおいて、第1、第2および/または第3の治療的トランスジーンは、CD80、CD137LおよびICAM-1からなる群より選択され、例えば第1の治療的トランスジーンはCD80をコードし、第2の治療的トランスジーンはCD137Lをコードし、第3の治療的トランスジーンはICAM-1をコードする。ヒトICAM1をコードする例示的なヌクレオチド配列を配列番号：32に示す。ある態様において、組み換えアデノウイルスは、配列番号：5、配列番号：7および/または配列番号：32にコードされるアミノ酸配列、あるいは配列番号：5、配列番号：7および/または配列番号：32に対して80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の配列同一性を有する配列をコードするヌクレオチド配列を含む。ある態様において、組み換えアデノウイルスは、配列番号：31、配列番号：9または配列番号：22のヌクレオチド配列、あるいは配列番号：31、配列番号：9または配列番号：22に対して80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の配列同一性を有する配列を含む。
【００８４】
ある態様において、第1および第2の治療的トランスジーンは、ヘテロダイマーサイトカインの第1および第2のサブユニットのそれぞれをコードする。例えばある態様において、第1および/または第2の治療的トランスジーンは、ヘテロダイマーサイトカインIL-23を構成するIL-23A/p19およびp40からなる群より選択される。例えば、第1の治療的トランスジーンはIL-23A/p19をコードし得、第2の治療的トランスジーンはp40をコードし得る。ヒトIL-23A/p19をコードする例示的なヌクレオチド配列を配列番号：12に示し、ヒトp40をコードする例示的なヌクレオチド配列を配列番号：10に示す。ある態様において、組み換えアデノウイルスは、配列番号：12および/または配列番号：10にコードされるアミノ酸配列、あるいは配列番号：12および/または配列番号：10に対して80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の配列同一性を有する配列をコードするヌクレオチド配列を含む。ある態様において、組み換えアデノウイルスは、配列番号：13のヌクレオチド配列、または配列番号：13に対して80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の配列同一性を有する配列を含む。
【００８５】
さらに、ある態様において、第1および/または第2の治療的トランスジーンは、ヘテロダイマーサイトカインIL-27を構成するIL-27A/p28およびIL-27B/EBI3からなる群より選択される。例えば、第1の治療的トランスジーンはIL- IL-27A/p28をコードし得、第2の治療的トランスジーンはIL-27B/EBI3をコードし得る。
【００８６】
腫瘍が約2mm3の直径を超えて成長する場合、腫瘍は栄養および酸素を供給し、老廃物を除去するための血管の独立ネットワークの増殖を必要とする。この新規の血管形成、すなわち新生血管形成は、腫瘍脈管形成として公知である。前脈管形成因子としては、血管内皮増殖因子(VEGF)、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、血小板由来増殖因子(PDGF)、上皮増殖因子(EGF)、インターロイキン8(IL-8)およびアンギオポエチンが挙げられる。エンドスタチンおよびアンギオスタチンは、新生血管形成を阻害することが報告される天然に存在する抗脈管形成タンパク質である。
【００８７】
ある態様において、第1および/または第2の治療的トランスジーンは、エンドスタチンおよびアンギオスタチンからなる群より選択される。ある態様において、第1の治療的トランスジーンはエンドスタチンであり、第2の治療的トランスジーンはアンギオスタチンである。ある態様において、第1の治療的トランスジーンはアンギオスタチンであり、第2の治療的トランスジーンはエンドスタチンである。
【００８８】
エンドスタチンはコラーゲンXVIIIのタンパク質分解断片である。NCBI参照配列NP_085059.2に対応する例示的なヒトコラーゲンXVIIIアミノ酸配列を配列番号：33に示す。エンドスタチンは異なる部位でのコラーゲンXVIIIのタンパク質分解的切断により生じ得る。コラーゲンXVIIIのC末端の非コラーゲン性1(NC1)ドメインは一般的に、エンドスタチンの抗脈管形成効果の原因であると考えられる。例示的なヒトコラーゲンXVIII NC1ドメインアミノ酸配列を配列番号：37に示す。したがって、本明細書で使用する場合、用語「エンドスタチン」は、配列番号：37のアミノ酸配列を含むか、あるいは配列番号：37に対して80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%より高い配列同一性を有するアミノ酸配列または例えば配列番号：37中に存在する会合ドメインを介して非共有結合的に三量体へとオリゴマー化し得る前述のもののいずれかの断片を含むタンパク質を意味すると理解される。オリゴマー化は、例えばサイズ排除クロマトグラフィー、分析的超遠心分離、散乱技術、NMR分光学、等温滴定熱量測定、蛍光異方性および質量分光学などの当該技術分野で公知の任意の方法によりアッセイされ得る。
【００８９】
ある態様において、開示される組み換えウイルスは、配列番号：37または配列番号：38のアミノ酸配列、あるいは配列番号：37または配列番号：38に対して80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の配列同一性を有する配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００９０】
アンギオスタチンはプラスミノーゲンのタンパク質分解断片である。NCBI参照配列NP_000292.1に対応する例示的なヒトプラスミノーゲンアミノ酸配列を配列番号：34に示す。
【００９１】
アンギオスタチンは、異なる部位でのプラスミノーゲンのタンパク質分解性切断により生じ得る。プラスミノーゲンは、一般的に、アンギオスタチンの抗脈管形成効果の原因であると考えられる5つのクリングルドメインを有する。ヒトプラスミノーゲンの第1のクリングルドメインの例示的なアミノ酸配列を配列番号：39に示し、ヒトプラスミノーゲンの第2のクリングルドメインの例示的なアミノ酸配列を配列番号：40に示し、ヒトプラスミノーゲンの第3のクリングルドメインの例示的なアミノ酸配列を配列番号：41に示し、ヒトプラスミノーゲンの第4のクリングルドメインの例示的なアミノ酸配列を配列番号：42に示し、ヒトプラスミノーゲンの第5のクリングルドメインの例示的なアミノ酸配列を配列番号：43に示す。したがって、本明細書で使用する場合、用語「アンギオスタチン」は、配列番号：39、配列番号：40、配列番号：41、配列番号：42もしくは配列番号：43のアミノ酸配列を含むか、または配列番号：39、配列番号：40、配列番号：41、配列番号：42もしくは配列番号：43に対して80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%より高い配列同一性を有するアミノ酸配列または内皮細胞移動および/または内皮細胞増殖に拮抗し得る前述のもののいずれかの断片を含むタンパク質を意味すると理解される。内皮細胞移動および/または増殖は、例えばGuo et al. (2014) METHODS MOL. BIOL. 1135: 393-402に記載される方法を含む当該技術分野で公知の任意の方法によりアッセイされ得る。
【００９２】
ある態様において、開示される組み換えウイルスは、配列番号：39、配列番号：40、配列番号：41、配列番号：42、配列番号：43または配列番号：44のアミノ酸配列、あるいは配列番号：39、配列番号：40、配列番号：41、配列番号：42、配列番号：43または配列番号：44に対して80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の配列同一性を有する配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００９３】
ある態様において、開示される組み換えウイルスは、配列番号：11のヌクレオチド配列、または配列番号：11に対して80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の配列同一性を有する配列を含む。
【００９４】
IV. 治療の方法
治療的使用のために、組み換えアデノウイルスは、好ましくは薬学的に許容可能な担体と合わされる。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容可能な担体」は、過度の毒性、刺激、アレルギー反応または他の問題もしくは合併症を有さず、妥当な利益/リスク比と釣り合ったヒトおよび動物の組織との接触における使用に適切なバッファ、担体および賦形剤を意味する。担体(1つまたは複数)は、製剤の他の成分と適合性であり、レシピエントに対して有害でないという意味において「許容可能である」べきである。薬学的に許容可能な担体としては、医薬投与に適合性であるバッファ、溶媒、分散媒、コーティング、等張および吸収遅延剤等が挙げられる。薬学的に活性な物質についてのかかる媒体および剤の使用は当該技術分野で公知である。
【００９５】
本明細書に開示される組み換えウイルスを含む医薬組成物は、単位剤型で存在し得、任意の適切な方法で調製され得る。医薬組成物は、その意図される投与経路と適合性であるように製剤化されるべきである。投与経路の例は、静脈内(IV)、皮内、吸入、経皮、局所、経粘膜および直腸の投与である。融合タンパク質のための好ましい投与経路はIV注入である。有用な製剤は、医薬の分野で公知の方法により調製され得る。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed. (Mack Publishing Company, 1990)参照。非経口投与に適した製剤化成分としては、注射用水、食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムなどの酸化防止剤；EDTAなどのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などのバッファ；および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの等張性調整のための剤が挙げられる。
【００９６】
静脈内投与について、適切な担体としては、生理食塩水、静菌水、Cremophor ELTM (BASF, Parsippany, NJ)またはリン酸緩衝化食塩水(PBS)が挙げられる。担体は、製造および貯蔵の条件下で安定であるべきであり、微生物に対して保存されるべきである。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール(例えばグリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール)、およびそれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒であり得る。
【００９７】
好ましくは、医薬製剤は滅菌されている。滅菌は、任意の適切な方法、例えば滅菌濾過膜を用いた濾過により達成され得る。組成物が凍結乾燥される場合、濾過滅菌は、凍結乾燥および再構成の前または後に行われ得る。
【００９８】
本明細書で使用する場合、用語「有効量」は、有益または望ましい結果をもたらすのに十分な活性成分の量(例えば本発明の組み換えアデノウイルスの量)をいう。有効量は1つ以上の投与、適用または用量で投与され得、特定の製剤または投与経路に限定されることを意図しない。
【００９９】
ある態様において、活性成分の治療有効量は、0.1mg/kg〜100mg/kg、例えば1mg/kg〜100mg/kg、1mg/kg〜10mg/kgの範囲である。ある態様において、組み換えアデノウイルスの治療有効量は、102〜1015プラーク形成単位(pfu)、例えば102〜1010、102〜105、105〜1015、105〜1010または1010〜1015プラーク形成単位の範囲である。投与量は、治療される疾患または徴候(indication)の型および程度、患者の全体的な健康、抗体のインビボ効力、医薬製剤ならびに投与経路などの変数に依存する。所望の血液レベルまたは組織レベルを迅速に達成するために、初期用量は高い方のレベルを超えて増加され得る。代替的に、初期用量は最適よりも小さくあり得、日用量は治療の過程の間に段々に増加され得る。ヒト用量は、例えば0.5mg/kg〜20mg/kgで実施するように設計される従来の第I相用量増加試験において最適化され得る。投与頻度は、投与経路、投与量、抗体の血清半減期および治療される疾患などの要因に応じて変化し得る。例示的な投与頻度は、1日に1回、1週間に1回および2週間毎に1回である。好ましい投与経路は非経口、例えば静脈内注入である。モノクローナル抗体に基づく薬物の製剤化は当該技術分野における通常の技術の範囲内である。ある態様において、組み換えアデノウイルスは凍結乾燥され、次いで投与の時点で、緩衝化食塩水中で再構成される。
【０１００】
本明細書に開示される組み換えアデノウイルスは、種々の医学的徴候を治療するために使用され得る。例えば、組み換えアデノウイルスは癌を治療するために使用され得る。癌細胞は、癌細胞の増殖を阻害または低減するように組み換えアデノウイルスの治療有効量に暴露される。本発明は、被験体において癌を治療する方法を提供する。該方法は、被験体に、本発明の組み換えアデノウイルスの有効量を単独でまたは別の治療剤と組み合わせて投与して、被験体において癌を治療する工程を含む。ある態様において、被験体への組み換えアデノウイルスの有効量の投与は、該被験体における腫瘍負荷を少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%または少なくとも90%だけ低減する。
【０１０１】
本明細書で使用する場合、「治療する(treat)」、「治療すること(treating)」および「治療(treatment)」は、被験体、例えばヒトにおける疾患の治療を意味する。これは、(a)疾患を阻害すること、すなわちその進展を止めること；および(b)疾患を軽減すること、すなわち疾患状態の後退を引き起こすことを含む。本明細書で使用する場合、用語「被験体」および「患者」は、本明細書に記載される方法および組成物により治療される生物をいう。好ましくは、かかる生物としては限定されないが、哺乳動物(例えば、マウス、サル、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ等)が挙げられ、より好ましくはヒトが挙げられる。
【０１０２】
癌の例としては、固形腫瘍、軟部組織腫瘍、血液の腫瘍および転移性の病変が挙げられる。血液の腫瘍の例としては、白血病、急性白血病、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、B細胞、T細胞またはFAB ALL、急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病(CML)、慢性リンパ球白血病(CLL)、例えば変形(transformed)CLL、びまん性大B細胞リンパ腫(DLBCL)、濾胞性リンパ腫、毛様細胞性白血病、骨髄異形成症候群(MDS)、リンパ腫、ホジキン病、悪性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫またはリクター症候群(リクター形質転換(Richter's Transformation))が挙げられる。固形腫瘍の例としては悪性疾患、例えば種々の臓器系の肉腫、腺癌および癌腫、例えば頭部および頸部(咽頭を含む)、甲状腺、肺(小細胞または非小細胞肺癌(NSCLC))、乳房、リンパ系、胃腸(例えば口腔、食道、胃、肝臓、膵臓、小腸、結腸および直腸、肛門等)、生殖器および尿生殖器管(例えば腎臓、尿路上皮、膀胱、卵巣、子宮、子宮頸、子宮内膜、前立腺、精巣)、CNS(例えば神経またはグリア細胞、例えば神経芽腫または神経膠腫)、または皮膚(例えば黒色腫)が冒されるものが挙げられる。
【０１０３】
ある態様において、癌は、黒色腫、皮膚の扁平上皮癌、基底細胞癌、頭頸部癌、乳癌、肛門癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌、中皮腫、小細胞肺癌、腎細胞癌、前立腺癌、胃食道癌、結腸直腸癌、精巣癌、膀胱癌、卵巣癌、肝細胞癌、胆管癌、脳癌、子宮内膜癌、神経内分泌癌および膵臓癌からなる群より選択される。
【０１０４】
ある態様において、組み換えアデノウイルスは、1つ以上の治療、例えば手術、放射線、化学療法、免疫療法、ホルモン療法またはウイルス療法と組み合わせて被験体に投与される。
【０１０５】
ある態様において、本発明の組み換えアデノウイルスは、チロシンキナーゼ阻害剤、例えばエルロチニブと組み合わせて投与される。
【０１０６】
ある態様において、本発明の組み換えアデノウイルスは、チェックポイント阻害剤、例えば抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体または抗PD-L1抗体と組み合わせて投与される。例示的な抗PD-1抗体としては、例えばニボルマブ(Opdivo(登録商標)、Bristol-Myers Squibb Co.)、ペンブロリズマブ(Keytruda(登録商標)、Merck Sharp & Dohme Corp.)、PDR001 (Novartis Pharmaceuticals)およびピジリズマブ(pidilizumab) (CT-011、Cure Tech)が挙げられる。例示的な抗PD-L1抗体としては、例えばアテゾリズマブ(Tecentriq(登録商標)、Genentech)、デュバルマブ(duvalumab) (AstraZeneca)、MEDI4736、アベルマブおよびBMS 936559 (Bristol Myers Squibb Co.)が挙げられる。
【０１０７】
本明細書で使用する場合、用語「組み合わせて」投与されるは、被験体の障害による苦痛の過程において、患者に対する治療の効果が、ある時点で(at a point in time)重複するように、2つ(またはそれ以上)の異なる治療を被験体に送達することを意味すると理解される。ある態様において、1つの治療の送達は、第2の送達が開始された際に依然として行われているので、投与期間の重複がある。これは本明細書において時々「同時(simultaneous)」または「同時(concurrent)送達」と称される。他の態様において、1つの治療の送達は、他の治療の送達が開始する前に終了する。いずれかの場合のいくつかの態様において、組合せの投与のために治療はより効果的である。例えば、第2の治療はより効果的であり、例えばより少ない第2の治療で同等の効果が見られるか、または第2の治療は、第2の治療を第1の治療の非存在下で投与した場合に見られるよりも大きな程度まで症状を低減するか、または第1の治療により同様の状況が見られる。ある態様において、送達は、症状または障害に関連のある他のパラメーターの低減が他の治療の非存在下で1つの治療を送達した場合に観察されるものよりも大きくなるようなものである。2つの治療の効果は、部分的に相加的、全体的に相加的または相加的よりも大きくあり得る。送達は、送達される第1の治療の効果が第2のものを送達する際に依然として検出可能であるようなものであり得る。
【０１０８】
ある態様において、組み換えウイルスの有効量は、被験体における抗原に対する免疫応答を測定することにより同定され、および/または被験体を治療する方法は、被験体において抗原に対する免疫応答を測定する工程をさらに含む。過増殖疾患、例えば癌は免疫抑制により特徴付けられ得、被験体における抗原に対する免疫応答の測定は、被験体における免疫抑制のレベルを示し得る。したがって、被験体における抗原に対する免疫応答の測定は、治療の有効性および/または組み換えウイルスの有効量を示し得る。被験体における抗原に対する免疫応答は、当該技術分野で公知の任意の方法により測定され得る。ある態様において、抗原に対する免疫応答は、被験体の皮膚の注射部位で被験体に抗原を注射して、注射部位での硬変のサイズまたは炎症の量を測定することにより測定される。ある態様において、抗原に対する免疫応答は、抗原への暴露の際の被験体の細胞からのサイトカイン(例えばインターフェロンγ、IL-4および/またはIL-5)の放出により測定される。
【０１０９】
本明細書を通して、ウイルス、組成物および系が特定の成分を有する、含む(including)または含む(comprising)と記載される場合、またはプロセスおよび方法が特定の工程を有する、含む(including)または含む(comprising)と記載される場合、追加的に、記載される成分から本質的になるかまたは記載される成分からなる本発明の組成物、デバイスおよび系があることならびに記載されるプロセス工程から本質的になるかまたは記載されるプロセス工程からなる本発明のプロセスおよび方法があることが企図される。
【０１１０】
本願において、因子もしくは成分が記載される因子もしくは成分のリストに含まれるおよび/または該リストから選択されるといわれる場合、因子もしくは成分は、記載される因子もしくは成分のいずれか1つであり得るか、または因子もしくは成分は記載される因子もしくは成分の2つ以上からなる群より選択され得ることが理解されるべきである。
【０１１１】
さらに、本明細書に記載されるウイルス、組成物、系、方法またはプロセスの因子および/または特徴は、本明細書において明示的であるか黙示的であるのいずれにせよ、本発明の精神および範囲を逸脱することなく種々の方法で組み合され得ることが理解されるべきである。例えば、特定のウイルスについて参照がなされる場合、該ウイルスは、文脈からそうではないと理解されない限り、本発明の組成物および/または本発明の方法の種々の態様で使用され得る。すなわち、本願の範囲内で、態様は、記載および図示される明確かつ簡潔な適用を可能にする様式で記載され、示されるが、態様は、本教示および発明(1つまたは複数)から逸脱することなく、種々に組み合され得るかまたは分離され得ることが意図され理解される。例えば、本明細書に記載されかつ示される全ての特徴は、本明細書に記載されかつ示される発明(1つまたは複数)の全ての局面に適用可能であり得ることが理解される。
【０１１２】
文脈および使用からそうではないと理解されない限り、語句「の少なくとも1つ」は個々に、該語句の後の記載される対象のそれぞれおよび記載される対象の2つ以上の種々の組合せを含むことが理解されるべきである。3つ以上の記載される対象に関しての語句「および/または」は、文脈からそうではないと理解されない限り、同じ意味を有することが理解されるべきである。
【０１１３】
用語「含む(include)」、「含む(includes)」、「含む(including)」、「有する(have)」、「有する(has)」、「有する(having)」、「含む(contain)」、「含む(contains)」または「含む(containing)」の使用は、それらの文法上の同等物を含めて、そうではないと具体的に記されるかまたは文脈から理解されない限り、一般的に開放型であり非限定的である、例えば記載されないさらなる因子または工程を排除しないと理解されるべきである。
【０１１４】
本明細書の種々の場所において、ウイルス、組成物、系、プロセスおよび方法またはそれらの特徴は、群または範囲において開示される。該記載は、かかる群および範囲の構成メンバーのそれぞれおよび全ての個々の下位組合せ(subcombination)を含むことが具体的に意図される。他の例として、1〜20の範囲の整数は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19および20を個々に開示することが具体的に意図される。
【０１１５】
用語「約」の使用が量的値の前にある場合、そうではないと具体的に記されない限り、本発明は特定の量的値自身も含む。本明細書で使用する場合、用語「約」は、そうではないと示されるかまたは推測されない限り、名目上の値から±10%の変化をいう。
【０１１６】
工程の順序または特定の行為を行う順序は、本発明が操作可能なままである限りは重要ではないことが理解されるべきである。さらに、2つ以上の工程または行為は同時に行われてもよい。
【０１１７】
本明細書における任意および全ての例または例示的な用語、例えば「など(such as)」または「含む(including)」の使用は、単に本発明をよりよく説明することを意図し、特許請求されない限り本発明の範囲の限定を提示(pose)しない。本明細書において、用語は、任意の特許請求されない因子を本発明の実施についての必須のものとして示すと解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１１８】
実施例
以下の実施例は単なる例示であり、いかなる方法においても本発明の範囲または内容を限定することを意図しない。
【０１１９】
実施例1：CD80およびCD137Lを発現するアデノウイルスの構築
この実施例には、CD80およびCD137Lのマウス形態を発現する組み換えアデノウイルス5型(Ad5)の産生が記載される。
【０１２０】
(米国特許第9,073,980号に以前に記載されるように)E1a発現を癌選択的にするE1a開始の上流-304〜-255に配置されるヌクレオチド領域の欠失を保有するアデノウイルス5型ウイルスを構築した。得られるウイルスは、以降TAVと称する。
【０１２１】
治療的トランスジーンの挿入を容易にするために、TAVを、E1b-19k領域の開始部位にSalI部位およびSalI部位の200塩基対3'にXhoI部位を保有するようにさらに改変した。改変されたE1b-19k領域のヌクレオチド配列は、融合されたSalIおよびXhoI部位由来の残存塩基に下線を引いた以下のものである：
【化１】
2020505049.tif 000002
(配列番号：15)。
【０１２２】
TAVはさらに、E3領域のRIDα、RIDβおよび14.7k遺伝子のdl309破壊(disruption)を保有するように改変した。改変されたE3領域のヌクレオチド配列は、欠失の点をハイフンで示した以下のものである：
【化２】
2020505049.tif 000003
(配列番号：16)。
【０１２３】
改変されたE1b-19k領域および改変されたE3領域の両方を含む得られたウイルスは、以降TAV-Δ19kと称する。
【０１２４】
示される場合、マウスCD80(mCD80)またはヒトCD80(hCD80)を改変されたE1b-19k領域にクローニングした。
【０１２５】
改変されたE1b-19k領域中のmCD80の配列は、以下のとおりであり、コーディング領域は小文字であり、SalIおよびXhoI部位を含む隣接するアデノウイルス配列は大文字である：
【化３−１】
2020505049.tif 000004
【化３−２】
2020505049.tif 000005
(配列番号：17)。
【０１２６】
改変されたE1b-19k中のhCD80の配列は、以下のとおりであり、コーディング領域は小文字でありSalIおよびXhoI部位を含む隣接するアデノウイルス配列は大文字である：
【化４】
2020505049.tif 000006
(配列番号：18)。
【０１２７】
示される場合、マウスCD137L(mCD137L)またはヒトCD137L(hCD137L)を改変されたE3領域にクローニングした。
【０１２８】
改変されたE3領域中のmCD137Lの配列は、以下のとおりであり、コーディング領域は小文字であり隣接するアデノウイルス配列は大文字である：
【化５−１】
2020505049.tif 000007
【化５−２】
2020505049.tif 000008
(配列番号：19)。
【０１２９】
改変されたE3領域中のhCD137Lの配列は、以下のとおりであり、コーディング領域は小文字であり、隣接するアデノウイルス配列は大文字である：
【化６】
2020505049.tif 000009
(配列番号：20)。
【０１３０】
さらに、示される場合、ヒトのCD80およびCD137Lの両方を改変されたE1b-19k領域にクローニングし、配列内リボソーム進入部位(IRES)により分離した。これらの例において、E1b-19k領域は、停止コドンを含むヒトCD80遺伝子、続いて脳心筋炎ウイルス由来のIRES、続いてヒトCD137L遺伝子を含んだ。E1b-19k領域中のCD80およびCD137L遺伝子の両方の挿入は、アデノウイルスのパッケージング限界(packaging limit)を超えるウイルスゲノムサイズを生じるので、このウイルスは依然、E3領域中にRIDα、RIDβおよび14.7k遺伝子の欠失を有する。
【０１３１】
IRESにより分離された改変されたE1b-19k領域中のhCD80およびhCD137Lの配列は、以下のとおりであり、コーディング領域は小文字であり、隣接するアデノウイルス配列は大文字であり中央のIRESは大文字である：
【化７−１】
2020505049.tif 000010
【化７−２】
2020505049.tif 000011
(配列番号：21)。
【０１３２】
試験したウイルスの詳細を表1に示す。
【表１】
2020505049.tif 000012
【０１３３】
実施例2：CD80およびCD137L遺伝子発現
この実施例には、実施例1に記載されるように産生した組み換えアデノウイルスからのCD80および/またはCD137Lの発現が記載される。
【０１３４】
ADS-12細胞(マウス肺腺癌細胞)に、TAV-Δ19k、TAV-mCD80、TAV-mCD137LおよびTAV-mCD80-137Lウイルスを感染させ、感染した細胞を、免疫細胞化学によりCD80およびCD137Lについて染色した。図1および図2に示されるように、mCD80は、TAV-mCD80またはTAV-mCD80-137Lのいずれかでの感染後に発現され、CD137Lは、TAV-mCD137LまたはTAV-mCD80-137Lのいずれかでの感染後に発現された。重要なことに、両方の遺伝子はTAV-mCD80-137Lウイルスにより発現され、単一のウイルスが2つの治療的遺伝子の発現を駆動したことが示された。
【０１３５】
4T1細胞(マウス乳癌細胞)に、TAV-Δ19kおよびTAV-mCD80-137Lウイルスを感染させ、感染した細胞を、免疫細胞化学によりCD80およびCD137Lについて染色した。ADS-12細胞と同様に、CD80およびCD137Lの両方が、TAV-mCD80-137Lでの感染後に発現された(図3および図4)。
【０１３６】
A549細胞(ヒト肺癌細胞)、WI-38細胞(非癌性ヒト肺線維芽細胞)およびMRC5細胞(非癌性ヒト肺線維芽細胞)に、TAV-Δ19kおよびTAV-hCD80-137Lウイルスを感染させ、感染した細胞を、免疫細胞化学によりCD80およびCD137Lについて染色した。図5に示されるように、TAV-hCD80-137Lウイルスは、癌性A549細胞においてヒトCD80およびヒトCD137Lの発現を誘導し、非癌性WI-38およびMRC5細胞においては、発現はほとんど無し〜無しであった。これらの結果は、ヒトおよびマウスの細胞において2つのトランスジーンの発現が達成され得ること、ならびにトランスジーン発現が癌細胞に選択的であり得ることを示す。
【０１３７】
A549細胞(ヒト肺癌細胞)に、TAV-Δ19kおよびTAV-hCD80-IRES-137Lウイルスを感染させ、感染した細胞を、免疫細胞化学によりCD80およびCD137Lについて染色した。図6に示されるように、TAV-hCD80-IRES-137Lウイルスは、癌性A549細胞においてヒトCD80およびヒトCD137Lの両方の発現を誘導した。これらの結果は、両方のトランスジーンを単一のゲノム領域、例えば配列内リボソーム進入部位(IRES)により分離されたE1b-19k領域に挿入することにより2つのトランスジーンの発現が達成され得ることを示す。
【０１３８】
実施例3：CD80およびCD137L発現アデノウイルスの細胞傷害性
この実施例には、実施例1に記載されるように産生したCD80およびCD137L発現組み換えアデノウイルスの細胞傷害性が記載される。
【０１３９】
A549細胞(ヒト肺癌細胞)、WI-38細胞(非癌性ヒト肺線維芽細胞)およびMRC5細胞(非癌性ヒト肺線維芽細胞)に、TAV-Δ19kおよびTAV-hCD80-137Lウイルスを感染させ、感染した細胞を、感染後の示される時点で、生存細胞を青色に染色するクリスタルバイオレットにより染色した。
【０１４０】
図7に示されるように、TAV-hCD80-137LはA549において溶解性であったが、WI-38またはMRC5細胞においては溶解性ではなかった。これらの結果は、TAV-hCD80-137Lウイルスは、非癌性細胞と比較して、癌細胞を選択的に溶解し得ることを示す。
【０１４１】
ADS-12細胞に、TAV-Δ19k、TAV-mCD80、TAV-mCD137LおよびTAV-mCD80-137Lウイルスを感染させ、感染した細胞を、感染後の示される時点で、生存細胞を青色に染色するクリスタルバイオレットにより染色した。図8に示される結果は、TAV-mCD80、TAV-mCD137LおよびTAV-mCD80-137Lウイルスは、非癌性細胞と比較して、癌細胞を選択的に溶解し得ることを示す。
【０１４２】
実施例4：CD80およびCD137L発現アデノウイルスの複製
この実施例には、癌細胞において実施例1に記載されるように産生したCD80およびCD137L発現組み換えアデノウイルスの細胞における複製が記載される。
【０１４３】
ADS細胞に、1のMOIで、TAV-Δ19k、TAV-CD80、TAV-CD137LおよびTAV-CD80-137Lウイルスを3連で感染させた。感染の5日後に細胞および培地を回収し、プラークアッセイによりウイルス力価を測定した。
【０１４４】
図9に示されるように、ウイルスは癌細胞において効率的に複製し得る。
【０１４５】
実施例5：CD80およびCD137L発現アデノウイルスの抗癌活性
この実施例には、実施例1に記載されるように産生したCD80および/またはCD137L発現組み換えアデノウイルスの抗癌活性が記載される。
【０１４６】
ADS-12腫瘍を保有する129S4マウスを、TAV-Δ19k、TAV-mCD80、TAV-mCD137LまたはTAV-mCD80-137Lの3回の腫瘍内注射で処置した。結果を図10に示す。TAV-mCD80で処置したマウスは、TAV-Δ19kで処置したマウスと同等の腫瘍増殖を有した。TAV-mCD137Lで処置したマウスは、統計的有意に達しないより小さな腫瘍サイズに向かう傾向を示し、TAV-mCD80-137Lで処置したマウスの腫瘍は有意に小さいものであった。これらの結果は、CD80および137Lを発現する2遺伝子アデノウイルスは、腫瘍サイズの低減に最も効果的であったことを示す。
【０１４７】
別の実験において、ADS-12腫瘍を保有する129S4マウスを、TAV-Δ19k、TAV-mCD80、TAV-mCD137LまたはTAV-mCD80-137Lの3回の腫瘍内注射で処置した。結果を図11に示す。TAV-mCD80-137Lで処置したマウスはより小さい腫瘍サイズを有した。これらの結果は、CD80および137Lを発現する2遺伝子アデノウイルスは、腫瘍サイズの低減において最も効果的であったことを示す。
【０１４８】
乳房脂肪パッドに同所的に(orthotopically)埋め込んだ4T1腫瘍を保有するBALB/cマウスを、TAV-Δ19kまたはTAV-mCD80-137Lの3回の腫瘍内投与により処置した。再度、TAV-mCD80-137Lで処置したマウスは、対照ウイルスTAV-Δ19kで処置したマウスよりも有意に小さい腫瘍を有した(図12)。
【０１４９】
実施例6：CD80、CD137LおよびICAM-1発現アデノウイルスの構築
この実施例には、CD80、CD137LおよびICAM-1のマウス形態を発現する組み換えアデノウイルス5型(Ad5)の産生が記載される。ICAM-1は、抗原提示細胞(APC)により発現され、T細胞表面上のLFA1への結合によりAPCとT細胞の間の相互作用を安定化する細胞内接着分子である。
【０１５０】
(米国特許第9,073,980号に以前に記載されるように)E1a発現を癌選択的にする、E1a開始の上流-304〜-255に配置されるヌクレオチド領域の欠失を保有するアデノウイルス5型ウイルスを構築した。得られたウイルスは、以降TAVと称する。
【０１５１】
治療的トランスジーンの挿入を容易にするために、E1b-19k領域の開始部位にSalI部位およびSalI部位の200塩基対3'にXhoI部位を保有するようにTAVをさらに改変した。改変されたE1b-19k領域のヌクレオチド配列は、以下のとおりであり、融合されたSalIおよびXhoI部位由来の残存塩基に下線を引く：
【化８】
2020505049.tif 000013
(配列番号：15)。
【０１５２】
TAVはさらに、アデノウイルスデスタンパク質(ADP)、RIDα、RIDβおよび14.7k遺伝子をE3領域から欠失するように改変した。改変されたE3領域のヌクレオチド配列は、以下のとおりであり、ハイフンは欠失の点を示す：
【化９】
2020505049.tif 000014
(配列番号：24)。
【０１５３】
TAVはさらに、E4-ORF6/7を除いてE4領域を欠失するように改変した。改変されたE4領域のヌクレオチド配列は、以下のとおりであり、ハイフンは欠失の点を示す：
【化１０】
2020505049.tif 000015
(配列番号：25)。
【０１５４】
マウスCD80(mCD80)のタンパク質コーディング領域、続いてEMCV IRES、続いてマウスCD137L(mCD137L)のタンパク質コーディング領域、続いてFMDV IRES、続いてマウスICAM-1(mICAM-1)のタンパク質コーディング領域をE1b-19k部位にクローニングした。得られたウイルスは、以降TAV-mCD80-137L-ICAMと称する。
【０１５５】
E1b-19k領域中のmCD80-EMCV IRES-137L-FMDV IRES-ICAM挿入物のヌクレオチド配列は、以下のとおりであり、コーディング領域が大文字であり、IRESが小文字であり、SalIおよびXhoI制限部位を含む隣接するE1b-19k配列に下線を引く：
【化１１−１】
2020505049.tif 000016
【化１１−２】
2020505049.tif 000017
(配列番号：26)。
【０１５６】
さらに、ヒトCD80(hCD80)のタンパク質コーディング領域、続いてEMCV IRES、続いてヒトCD137L(hCD137L)のタンパク質コーディング領域、続いてFMDV IRES、続いてヒトICAM-1(hICAM-1)のタンパク質コーディング領域をE1b-19k部位にクローニングする。得られたウイルスは、以降TAV-hCD80-137L-ICAMと称する。
【０１５７】
E1b-19k領域中のhCD80-EMCV IRES-137L-FMDV IRES-ICAM挿入物のヌクレオチド配列は、以下のとおりであり、コーディング領域が大文字であり、IRESが小文字であり、SalIおよびXhoI制限部位を含む隣接するE1b-19k配列に下線を引く：
【化１２−１】
2020505049.tif 000018
【化１２−２】
2020505049.tif 000019
【化１２−３】
2020505049.tif 000020
(配列番号：31)。
【０１５８】
実施例7：CD80、CD137LおよびICAM-1遺伝子発現
この実施例には、実施例6に記載されるように産生された組み換えアデノウイルスからのCD80、CD137LおよびICAM-1の発現が記載される。
【０１５９】
ADS-12細胞(マウス肺腺癌細胞)に、10のMOIでTAV-mCD80-137L-ICAMウイルスを感染させたか、または非感染対照として保持し、免疫細胞化学により、感染の4日後にCD80、CD137LおよびICAM-1について染色した。図13に示されるように、それぞれの遺伝子は、TAV-mCD80-137L-ICAMウイルスにより発現され、これは、単一のウイルスが、3つの治療的遺伝子の発現を駆動したことを示した。
【０１６０】
F244細胞(マウス肉腫細胞)に、5のMOIでTAV-mCD80-137L-ICAMウイルスを感染させたか、または非感染対照として保持し、免疫細胞化学により、感染の3日後にCD80、CD137LおよびICAM-1について染色した。図14に示されるように、それぞれの遺伝子は、TAV-mCD80-137L-ICAMウイルスにより発現され、これは単一のウイルスが3つの治療的遺伝子の発現を駆動したことを示した。
【０１６１】
HT29(ヒト結腸直腸腺癌細胞)に、5のMOIでTAV-mCD80-mCD137L-mICAM-1ウイルスを感染させたか、または非感染対照として保持し、免疫細胞化学により、感染の3日後に、CD80、CD137LおよびICAM-1について染色した。図15に示されるように、それぞれの遺伝子は、TAV-mCD80-137L-ICAMウイルスにより発現され、これは単一のウイルスが、3つの治療的遺伝子の発現を駆動したことを示した。
【０１６２】
実施例8：CD80、CD137LおよびICAM-1発現アデノウイルスの抗癌活性
この実施例には、CD80およびCD137Lを発現する組み換えアデノウイルスならびにCD80、CD137LおよびICAM-1を発現するアデノウイルスの抗癌活性が記載される。
【０１６３】
ADS-12腫瘍を保有する129S4マウスを、バッファ、TAV-mCD80-137L(実施例1に記載されるように産生)またはTAV-mCD80-137L-ICAM(実施例6に記載されるように産生)の3回の腫瘍内注射で処置した。結果を図16に示す。TAV-mCD80-137Lで処置したマウスの腫瘍は、バッファで処置したものよりも小さかった。TAV-mCD80-137L-ICAMで処置したマウスの腫瘍は、TAV-mCD80-m137Lまたはバッファで処置したものよりも小さく、多くのマウスは腫瘍体積の完全な消失を示した。これらの結果は、CD80および137Lを発現するウイルスならびにCD80、CD137LおよびmICAM-1を発現するウイルスは、腫瘍サイズの低減に効果的であることを示す。
【０１６４】
実施例9：エンドスタチンおよびアンギオスタチン発現アデノウイルスの構築
この実施例には、エンドスタチンおよびアンギオスタチンを発現する組み換えアデノウイルス5型(Ad5)の構築が記載される。
【０１６５】
(米国特許第9,073,980号に以前に記載されるように)E1a発現を癌選択的にする、E1a開始部位の上流-304〜-255に配置されるヌクレオチド領域の欠失を保有するように、アデノウイルス5型ゲノム配列の5'部分を保有するプラスミドを改変した。改変されたプラスミドは、以降TAVプラスミドと称し、そこから産生された任意の得られたウイルス粒子は、以降TAVウイルスと称する。
【０１６６】
TAVプラスミドはさらに、治療的トランスジーンの挿入を容易にするために、E1b-19k領域の開始でSalI部位およびSalI部位の200塩基対3'でXhoI部位を保有するように改変する。200塩基対E1b-19k領域を欠失するために、プラスミドをSalIおよびXhoIで切断し、自己ライゲーションさせる。改変されたE1b-19k領域のヌクレオチド配列は、以下のとおりであり、融合された(fused)SalIおよびXhoI部位由来の残存残基に下線を引く：
【化１３】
2020505049.tif 000021
(配列番号：15)。
【０１６７】
さらに、ヒトコラーゲンXVIIIのアミノ酸残基1〜23(シグナルペプチドに対応)続いてヒトコラーゲンXVIIIの残基1318〜1516(C末端断片に対応する)をコードするヌクレオチド配列、続いて脳心筋炎ウイルス(EMCV)IRES、続いてヒトプラスミノーゲンのアミノ酸残基1〜19(シグナルペプチドに対応)続いてヒトプラスミノーゲンの残基97〜549(クリングルドメイン1〜5に対応)をコードするヌクレオチド配列を、改変されたE1b-19k領域にクローニングする。全てのヒトコラーゲンXVIIIアミノ酸残基番号は、NCBI参照配列:NP_085059.2に関連し、本明細書において配列番号：33で示される。全てのヒトプラスミノーゲンアミノ酸残基番号は、NCBI参照配列:NP_000292.1に関連し、本明細書において配列番号：34で示される。改変されたプラスミドは、以降TAV-hEndo-IRES-hAngプラスミドと称し、そこから産生された任意の得られるウイルス粒子は、以降TAV-hEndo-IRES-hAngウイルスと称する。E1b-19k領域中のTAV-hEndo-IRES-hAngプラスミドのヌクレオチド配列は、以下のとおりであり、コーディング領域が大文字であり、IRESが小文字であり、SalIおよびXhoI制限部位を含む隣接するE1b-19k配列に下線を引く：
【化１４−１】
2020505049.tif 000022
【化１４−２】
2020505049.tif 000023
(配列番号：35)。
【０１６８】
さらに、マウスコラーゲンXVIIIのアミノ酸残基1〜26(シグナルペプチドに対応)続いてマウスコラーゲンXVIIIの残基1577〜1774(C末端断片に対応)をコードするヌクレオチド配列、続いて脳心筋炎ウイルス(EMCV)IRES、続いてマウスプラスミノーゲンのアミノ酸残基1〜19(シグナルペプチドに対応)続いてマウスプラスミノーゲンの残基96〜549(クリングルドメイン1〜5に対応)をコードするヌクレオチド配列を、改変されたE1b-19k領域にクローニングする。改変されたプラスミドは、以降TAV-Endo-IRES-Angプラスミドと称し、そこから産生された任意の得られたウイルス粒子は、以降TAV-Endo-IRES-Angウイルスと称する。E1b-19k領域中のTAV-Endo-IRES-Angプラスミドのヌクレオチド配列は、以下のとおりであり、コーディング領域が大文字であり、IRESが小文字であり、SalIおよびXhoI制限部位を含む隣接するE1b-19k配列に下線を引く：
【化１５−１】
2020505049.tif 000024
【化１５−２】
2020505049.tif 000025
(配列番号：36)。
【０１６９】
記載される種々のプラスミドは、組み換えアデノウイルスを作製するために、(株dl309に基づいて)アデノウイルス5型ゲノム配列の残りを保有する他のプラスミドと共に使用される。
【０１７０】
参照による援用
本明細書に参照される特許文献および科学文献のそれぞれの全開示は、全ての目的で参照により援用される。
【０１７１】
均等物
本発明は、その精神または本質的な特徴から逸脱することなく、他の特定の形態において具体化され得る。そのため、前述の態様は、全ての局面において本明細書に記載される発明の限定ではなく例示とみなされる。したがって、本発明の範囲は、前述の記載ではなく添付の特許請求の範囲により示され、特許請求の範囲の均等物の意味および範囲内にある全ての変更が本発明に含まれることが意図される。
【図１】
2020505049.tif 000026
【図２】
2020505049.tif 000027
【図３】
2020505049.tif 000028
【図４】
2020505049.tif 000029
【図５】
2020505049.tif 000030
【図６】
2020505049.tif 000031
【図７】
2020505049.tif 000032
【図８】
2020505049.tif 000033
【図９】
2020505049.tif 000034
【図１０】
2020505049.tif 000035
【図１１】
2020505049.tif 000036
【図１２】
2020505049.tif 000037
【図１３】
2020505049.tif 000038
【図１４】
2020505049.tif 000039
【図１５】
2020505049.tif 000040
【図１６−１】
2020505049.tif 000041
【図１６−２】
2020505049.tif 000042
【配列表】
2020505049000001.app
【国際調査報告】
2020505049.tif 000043
2020505049.tif 000044
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