(57)【要約】操作されたシンセカイン及びその使用方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞における受容体ポリペプチドの非天然の組み合わせの選択的活性化のための方法であって、組成物が、非天然の組み合わせの２つ以上の受容体ポリペプチドの細胞外ドメインに結合して、それにより、前記受容体ポリペプチドの多量体化及びシグナル伝達の活性化を引き起こすシンセカインを含む、方法。
【請求項２】
前記シンセカインが、ポリペプチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記受容体ポリペプチドが、（ｉ）前記細胞におけるＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路を活性化するサイトカイン受容体、（ｉｉ）受容体チロシンキナーゼ、または、（ｉｉｉ）ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーのうちの１つ以上である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記サイトカイン受容体が、βｃ、γｃ、ＩＬ−３Ｒα、βＩＬ−３Ｒ、ＧＭ−ＣＳＦＲα、ＩＬ−５Ｒα、ＣＮＴＦα、ＣＲＬＦ１、ＬＩＦＲα、ｇｐ１３０、ＩＬ−６Ｒα、ＩＬ−１１Ｒα、ＯＳＭＲβ、ＩＬ−２Ｒα、ＩＬ−２Ｒβ、ＩＬ−２Ｒγ、ＩＬ−４Ｒα、ＩＬ−７Ｒα、ＩＬ−９Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα、ＩＬ−１５Ｒα、ＩＬ−２１Ｒα、ＩＦＮＡＲ２、ＩＬ−２３Ｒ、ＥｐｏＲ、ＩＬ−１２Ｒβ、ＩＦＮＡＲ１、Ｇ−ＣＳＦＲ、ｃ−ＭＰＬＲから選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記シンセカインが、そのような受容体の２つに結合し、ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達を活性化する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記シンセカインが、そのような受容体のうちの３つに結合し、ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達を活性化する、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記受容体チロシンキナーゼが、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＩｎｓＲ、ＩＧＦ１Ｒ、ＩｎｓＲＲ、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、ＣＳＦ１Ｒ／Ｆｍｓ、ｃＫｉｔ、Ｆｌｔ−３／Ｆｌｋ２、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＰＴＫ７／ＣＣＫ４、ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢ、ＴｒｋＣ、Ｒｏｒ１、Ｒｏｒ２、ＭｕＳＫ、Ｍｅｔ、Ｒｏｎ、Ａｘｌ、Ｍｅｒ、Ｔｙｒｏ３、Ｔｉｅ１、Ｔｉｅ２、ＥｐｈＡ１−８、ＥｐｈＡ１０、ＥｐｈＢ１−４、ＥｐｈＢ６、Ｒｅｔ、Ｒｙｋ、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、Ｒｏｓ、ＬＭＲ１、ＬＭＲ２、ＬＭＲ３、ＡＬＫ、ＬＴＫ、ＳｕＲＴＫ１０６／ＳＴＹＫ１から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記シンセカインが、そのような受容体のうちの２つに結合し、シグナル伝達を活性化する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーが、ＴＮＦＲ１（ＴＮＦＲＳＦ１Ａ）、ＴＮＦＲ２（ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ２）、４１−ＢＢ（ＴＮＦＲＳＦ９）、ＡＩＴＲ（ＴＮＦＲＳＦ１８）、ＢＣＭＡ（ＴＮＦＲＳＦ１７）、ＣＤ２７（ＴＮＦＲＳＦ７）、ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８）、ＣＤ４０（ＴＮＦＲＳＦ５）、死受容体１（ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ）、死受容体３（ＴＮＦＲＳＦ２５）、死受容体４（ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ）、死受容体５（ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ）、死受容体６（ＴＮＦＲＳＦ２１）、デコイ受容体−３（ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ）、デコイ受容体２（ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ）、ＥＤＡＲ、Ｆａｓ（ＴＮＦＲＳＦ６）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４）、ＬＴβ−Ｒ（ＴＮＦＲＳＦ３）、ＯＸ４０（ＴＮＦＲＳＦ４）、ＲＡＮＫ（ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ）、ＴＡＣＩ（ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ）、Ｔｒｏｙ（ＴＮＦＲＳＦ１９）、ＸＥＤＡＲ（ＴＮＦＲＳＦ２７）、オステオプロテグリン（ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ）、ＴＷＥＡＫ受容体（ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ）、ＢＡＦＦ受容体（ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ）、ＮＧＦ受容体（ＴＮＦＲＳＦ１６）から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
前記シンセカインが、そのような受容体のうちの２つ以上に結合し、シグナル伝達を活性化する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記シンセカインが、請求項３に記載の受容体の２つの異なる細胞外ドメインに対して高い親和性を有する結合ドメインを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記親和性が、約１×１０-7Ｍ未満である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記結合ドメインが、直接結合している、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記結合ドメインが、リンカーを介して結合している、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
結合ドメインが、変異形態の天然リガンドである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
結合ドメインが、ｄｅ  ｎｏｖｏ設計の結合ドメインである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
結合ドメインが、抗体由来の結合タンパク質である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
結合ドメインが、ナノボディ由来の結合ドメインである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
結合ドメインが、ノッティン操作足場である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
結合ドメインが、２〜１００アミノ酸を含むペプチドリンカーにより結合している、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
結合ドメインが、非ペプチドリンカーにより結合している、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法に使用されるシンセカイン。
【請求項２３】
請求項２２に記載のシンセカイン及び薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
細胞、特に、免疫細胞を操作して、分化させ、特異な機能を発現させ、数を増やすことは、臨床上の大きな関心事である。特に、サイトカイン及びケモカインを含む、これらの活性に影響を及ぼす多くのタンパク質因子が当該技術分野で既知である。しかし、これらのシグナル伝達分子は、操作対象ではない細胞に対して多面発現効果も有し、したがって、標的細胞集団でシグナル伝達を選択的に活性化する方法が望ましい。
【０００２】
サイトカイン、ケモカイン、成長因子アゴニストなどは、細胞内トランスリン酸化を介してシグナル伝達を誘発するホモもしくはヘテロ二量体、または高次オリゴマーの生成などの多量体化により、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、連結しているＲＴＫ、またはデスドメイン（ＴＮＦスーパーファミリー）受容体を活性化する。多量体（例えば、二量体または三量体）内の特定の受容体鎖が何であるかによって、シグナル伝達及び機能的応答が決定される。
【０００３】
サイトカインの場合、それらは、２つの受容体細胞外ドメインのそれぞれと特異的な接触を形成することにより、どの受容体が二量体に含まれるかを特定する二重特異性リガンドとして作用し、それにより、二量体シグナル伝達複合体を架橋（ｂｒｉｄｇｅ）またはクロスリンク（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋ）するように作用する。サイトカイン受容体の二量体化は、４つのヤーヌスキナーゼ（ＪＡＫ１〜３、ＴＹＫ２）及び７つのシグナル伝達兼転写活性化因子（ＳＴＡＴ１〜６）タンパク質からなる細胞内ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達経路の活性化をもたらす。
【０００４】
リガンドは、それらの受容体の細胞外ドメインに特異的であるが、ＪＡＫ／ＴＹＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達モジュールは、内因性受容体のシグナル伝達複合体中に多くの組み合わせで見出され、それにより、広範なクロストークが可能である。ＲＴＫ受容体のリガンド（例えば、ＥＧＦ、ＶＥＧＦなど）はまた、受容体の二量体化によって強制的にシグナル伝達をさせる。但し、分子機序は、サイトカインとは全く異なり得る。ＪＡＫ／ＳＴＡＴサイトカイン及びＲＴＫリガンドの両方の場合、それらの役割は、特定の受容体サブユニットの二量体への配置を誘導し、細胞内キナーゼドメインが、キナーゼ及び受容体細胞内ドメインの両方のトランスリン酸化を可能にするように配向及び近接するようにすることである。これらのチロシンキナーゼの配列要件（すなわち、基質特異性）は、むしろ変性している可能性があり、これらの酵素が、別の受容体二量体化リガンドにより、自然界で通常提示されるもの以外の受容体基質をリン酸化するように向き替えられる可能性を高め得る。
【０００５】
リガンドが受容体二量体の組成、ならびにＪＡＫ／ＴＹＫ及びＲＴＫ酵素の細胞内キナーゼ変質を決定することを考えると、自然に発生するサイトカイン及び成長因子受容体二量体ペアリングの数は、系により理論的に許容されるシグナル伝達能がある受容体対リングの総数のごく一部にすぎない。例えば、ヒトゲノムは、約４０個の異なるＪＡＫ／ＳＴＡＴサイトカイン受容体をコードする。原則として、異なるＪＡＫ／ＴＹＫ／ＳＴＡＴの組み合わせを介し、シグナル伝達する可能性がある約１６００個のユニークなホモ及びヘテロ二量体サイトカイン受容体対を生成することができる。しかし、ヒトゲノムは、５０個未満の異なるサイトカインリガンドをコードし、天然リガンドにより組み立てることができるものに、サイトカイン受容体二量体の範囲を限定する。ＲＴＫファミリーの受容体及びリガンドについて、同様の議論を行うことができる。さらに、死受容体が二量体または三量体としてシグナル伝達することができると示されていることを考えると、この概念は、このファミリーにも拡張することができる。
【０００６】
目的のシグナル伝達経路を選択的に活性化する能力は、非常に関心を引くものである。本発明は、この目的のための組成物及び方法を提供する。
【発明の概要】
【０００７】
本明細書で「シンセカイン」と称される、操作された合成シグナル伝達分子が提供される。シンセカインは、細胞表面受容体の遺伝子操作された二重特異性リガンドであり、シンセカインは、少なくとも１つ、多くの場合、２つの異なる細胞表面受容体ポリペプチドの細胞外ドメイン（複数可）に高い親和性で特異的に結合する。細胞表面受容体は、多量体化時のシグナル伝達の活性化を特徴とする。一部の実施形態では、シンセカインへの結合による受容体多量体の生成は、受容体の細胞内トランスリン酸化を生じさせる。シンセカインは、有機小分子及びポリペプチドを含むが、これらに限定されない。
【０００８】
シンセカインはまた、細胞表面受容体の三重特異性リガンド、またはそれ以上であってよく、シンセカインは具体的には、少なくとも３つの異なる細胞表面受容体ポリペプチドの細胞外ドメイン（複数可）に高い親和性で結合する。細胞表面受容体は、多量体化時のシグナル伝達の活性化を特徴とする。一部の実施形態では、シンセカインへの結合による受容体多量体の生成は、受容体の細胞内トランスリン酸化を生じさせる。シンセカインは、有機小分子及びポリペプチドを含むが、これらに限定されない。
【０００９】
一部の実施形態では、細胞表面受容体ポリペプチドは、（ｉ）細胞内のＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路を活性化するサイトカイン受容体、（ｉｉ）受容体チロシンキナーゼ、または、（ｉｉｉ）ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーのうちの１つ以上である。一部の実施形態では、多量体受容体ポリペプチドのそれぞれは、標的化単細胞で自然に発現される。一部の実施形態では、標的細胞は、多量体受容体ポリペプチドのうちの１つ以上を発現するように操作される。
【００１０】
一部の実施形態では、シンセカインは、多量体化により活性化される場合に、ＪＡＫ／ＳＴＡＴならびに限定されないが、ＥＲＫ、ＡＫＴ、及び他のシグナル伝達メッセンジャーを含む他の経路を介するトランスリン酸化及びシグナル伝達する２つ以上の異なるサイトカイン受容体に特異的に結合する。一部の実施形態では、サイトカイン受容体は、βｃ、γｃ、ＩＬ−３Ｒα、βＩＬ−３Ｒ、ＧＭ−ＣＳＦＲα、ＩＬ−５Ｒα、ＣＮＴＦα、ＣＲＬＦ１、ＬＩＦＲα、ｇｐ１３０、ＩＬ−６Ｒα、ＩＬ−１１Ｒα、ＯＳＭＲβ、ＩＬ−２Ｒα、ＩＬ−２Ｒβ、ＩＬ−２Ｒγ、ＩＬ−４Ｒα、ＩＬ−７Ｒα、ＩＬ−９Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα、ＩＬ−１５Ｒα、ＩＬ−２１Ｒα、ＩＦＮＡＲ２、ＩＬ−２３Ｒ、ＥｐｏＲ、ＩＬ−１２Ｒβ、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２、Ｇ−ＣＳＦＲ、ｃ−ＭＰＬＲから選択されるが、これらに限定されない。一部の特定の実施形態では、シンセカインは、そのような受容体のうちの２つに結合し、ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達を活性化する。一部の特定の実施形態では、シンセカインは、そのような受容体のうちの３つに結合し、ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達を活性化する。一般に、シンセカインは、受容体（複数可）を活性化する天然サイトカインの経路とは異なる経路を活性化する。
【００１１】
一部の実施形態では、シンセカインは、タンパク質が多量体化される場合に、トランスリン酸化により活性化される２つ以上の異なる受容体チロシンキナーゼタンパク質に結合する。一部の実施形態では、ＲＴＫ受容体は、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＩｎｓＲ、ＩＧＦ１Ｒ、ＩｎｓＲＲ、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、ＣＳＦ１Ｒ／Ｆｍｓ、ｃＫｉｔ、Ｆｌｔ−３／Ｆｌｋ２、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＰＴＫ７／ＣＣＫ４、ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢ、ＴｒｋＣ、Ｒｏｒ１、Ｒｏｒ２、ＭｕＳＫ、Ｍｅｔ、Ｒｏｎ、Ａｘｌ、Ｍｅｒ、Ｔｙｒｏ３、Ｔｉｅ１、Ｔｉｅ２、ＥｐｈＡ１−８、ＥｐｈＡ１０、ＥｐｈＢ１−４、ＥｐｈＢ６、Ｒｅｔ、Ｒｙｋ、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、Ｒｏｓ、ＬＭＲ１、ＬＭＲ２、ＬＭＲ３、ＡＬＫ、ＬＴＫ、ＳｕＲＴＫ１０６／ＳＴＹＫ１、Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｒ、ＢＭＰ−Ｒ、ＴＧＦ−β−Ｒ、Ｎｏｇｇｉｎ−Ｒから選択されるが、これらに限定されない。一部の特定の実施形態では、シンセカインは、そのような受容体のうちの２つに結合し、シグナル伝達を活性化する。一般に、シンセカインは、受容体（複数可）を活性化する天然リガンドの経路とは異なる経路を活性化する。
【００１２】
一部の実施形態では、シンセカインは、タンパク質が多量体化される場合に、活性化される２つ以上の異なるＴＮＦＲスーパーファミリーポリペプチドに結合する。一部の実施形態では、受容体は、ＴＮＦＲ１（ＴＮＦＲＳＦ１Ａ）、ＴＮＦＲ２（ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ２）、４１−ＢＢ（ＴＮＦＲＳＦ９）、ＡＩＴＲ（ＴＮＦＲＳＦ１８）、ＢＣＭＡ（ＴＮＦＲＳＦ１７）、ＣＤ２７（ＴＮＦＲＳＦ７）、ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８）、ＣＤ４０（ＴＮＦＲＳＦ５）、死受容体１（ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ）、死受容体３（ＴＮＦＲＳＦ２５）、死受容体４（ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ）、死受容体５（ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ）、死受容体６（ＴＮＦＲＳＦ２１）、デコイ受容体−３（ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ）、デコイ受容体２（ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ）、ＥＤＡＲ、Ｆａｓ（ＴＮＦＲＳＦ６）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４）、ＬＴβ−Ｒ（ＴＮＦＲＳＦ３）、ＯＸ４０（ＴＮＦＲＳＦ４）、ＲＡＮＫ（ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ）、ＴＡＣＩ（ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ）、Ｔｒｏｙ（ＴＮＦＲＳＦ１９）、ＸＥＤＡＲ（ＴＮＦＲＳＦ２７）、オステオプロテグリン（ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ）、ＴＷＥＡＫ受容体（ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ）、ＢＡＦＦ受容体（ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ）、ＮＧＦ受容体（ＴＮＦＲＳＦ１６）から選択される。一部の特定の実施形態では、シンセカインは、そのような受容体のうちの２つ以上に結合し、シグナル伝達を活性化する。一般に、シンセカインは、受容体（複数可）を活性化する天然リガンドの経路とは異なる経路を活性化する。
【００１３】
他の実施形態では、シンセカインは、混合クラスのうちの２つ以上の受容体、例えば、ＴＮＦＲＳＦ及び／またはＲＴＫ受容体と組み合わせたＪＡＫ／ＳＴＡＴ受容体、ＴＮＦＲＳＦ受容体と組み合わせたＲＴＫ受容体などに結合する。
【００１４】
本発明の一部の実施形態では、シンセカインは、受容体細胞外ドメイン（ＥＣＤ）ポリペプチドのそれぞれに結合する、離れたまたは隣接した結合ドメインまたは要素を含み得るポリペプチドである。ポリペプチドシンセカインは、単鎖、二量体、またはより高次の多量体であってよい。各受容体に対する結合ドメイン／要素は、直接結合していても、リンカー、例えば、ポリペプチドリンカーまたは非ペプチドリンカーにより隔てられてもよい。一部の実施形態では、シンセカインは、天然受容体のコンフィギュレーションを活性化しない。例えば、シンセカイン結合ドメインは、天然受容体の１つの鎖に結合するが、天然受容体の２番目の鎖に結合することができないことがある。そのような結合ドメインとしては、サイトカインのドミナントネガティブ変異体が挙げられるが、これに限定されない。
【００１５】
ポリペプチドの実施形態では、受容体結合ドメインは、高親和性、例えば、約１×１０-7Ｍ以下、約１×１０-8Ｍ以下、約１×１０-9Ｍ以下、または約１×１０-10 Ｍ以下のＫｄで、所望の受容体の細胞外ドメインに結合する任意のドメインから選択されてもよい。好適な結合ドメインとしては、ｄｅ  ｎｏｖｏ設計の結合タンパク質、抗体由来の結合タンパク質、例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂなど、ならびに、１つ以上の受容体ＥＣＤ配列に特異的に結合する抗体の他の部分、ナノボディ由来結合ドメイン、ノッティンベースの操作足場、ノリン及びそれに由来する、操作された結合フラグメント、天然に存在する結合ドメインなどが挙げられるが、これらに限定されない。サイトカイン、成長因子などの天然に存在する結合ドメインは一般に、天然受容体の活性化由来の活性を防止するように操作される。結合ドメインは、所望のＥＣＤへの結合を増強するために選択されるか、且つ／または望ましくないＥＣＤへの結合を防ぐために変異導入される親和性であってよい。
【００１６】
シンセカインポリペプチドは、受容体の活性化を増強させる薬剤と融合するか、連結させるか、または代わりに、同時投与することができる。シンセカインは、目的のサイトカイン、ケモカイン、または成長因子と融合させるか、連結させるか、または代わりに、同時投与することができる。
【００１７】
結合ドメインは、１つの球状ドメイン内で隣接しているか、またはリンカー、例えば、ポリペプチドリンカーもしくは非ペプチドリンカーなどにより隔てられていてもよい。結合ドメインの間のリンカーの長さ、それによる結合ドメイン間の間隔を、シグナル強度を調節するために使用することができ、シンセカインの所望の用途に応じて選択することができる。結合ドメイン間の実施される距離は変動し得るが、ある特定の実施形態では、約１００オングストローム未満、約９０オングストローム未満、約８０オングストローム未満、約７０オングストローム未満、約６０オングストローム未満、または約５０オングストローム未満であってよい。
【００１８】
一部の実施形態では、リンカーは、剛直なリンカーであり、他の実施形態では、リンカーは、柔軟なリンカーである。リンカーは、ペプチドリンカーである場合、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、またはそれ以上のアミノ酸長であってよく、結合ドメイン間の距離を強化するために十分な長さ及びアミノ酸組成のものである。一部の実施形態では、リンカーは、１つ以上のグリシン及び／またはセリン残基を含むか、またはそれからなる。
【００１９】
シンセカインは、例えば、Ｆｃドメインを介して、連結、コイルドコイル、ポリペプチドジッパー、ビオチン／アビジン、またはストレプトアビジン多量体化などにより、多量体化することができる。シンセカインは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの安定性を増強させるために当該技術分野で知られているように、ＰＥＧ、Ｆｃなどの部分に結合させることもできる。
【００２０】
目的の組成物は、薬学的に許容される賦形剤中に有効用量のシンセカインを含むが、これらに限定されない。組成物は、追加の薬剤、例えば、アジュバントなどを含んでもよい。シンセカインは、当該分野で既知の種々の好適な組み換え法などにより合成的に生成されてもよい。
【００２１】
本発明の一部の態様では、細胞において選択されたＪＡＫ／ＳＴＡＴ、ＤＤ、及び／またはＲＴＫシグナル伝達を活性化、増加、または増強させるための方法が提供される。そのような方法では、目的のシンセカインの同族受容体ポリペプチドを発現する細胞は、例えば、シンセカインの不存在下のシグナル伝達と比較して、シグナル伝達を増加させる、例えば、シグナル伝達を２５％、５０％、７５％、９０％、９５％、またはそれ以上増加させるために有効な濃度のシンセカインと接触させる。そのようなシグナル伝達活性化は、ＪＡＫ／ＳＴＡＴまたはＲＴＫシグナル伝達経路を誘導し得、限定されないが、免疫応答の調節、成長因子応答、デスドメイン応答の誘導などを含む。一部の方法では、受容体発現細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させる。他の実施形態では、受容体発現細胞を、ｉｎ  ｖｉｖｏで接触させる。
【００２２】
本発明の一部の態様では、疾患または障害を処置または予防することを、それを必要とする対象において行うための方法が提供され、方法は、対象に有効量のシンセカインを提供することを含む。特定の実施形態では、対象は、免疫疾患または機能障害を有する。
【００２３】
本発明は、添付の図面と併せて読まれる場合に、以下の詳細な説明から最もよく理解される。一般的な方法によれば、図面の種々の外観は、縮尺通りではないことが強調されている。逆に、種々の外観の寸法は、明確にするため、適宜拡大または縮小される。以下の図が、図面に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１Ａ】操作されたシンセカインリガンドによる非天然受容体対の二量体化を示す。シンセカインによる新しいサイトカイン受容体対の二量体化を詳述する概略図である。仮定的なシンセカインが受容体Ａ及びＤを動員して、サイトカインＸ及びＹにより形成される複合体とは異なる新しい三元複合体を形成する。
【図１Ｂ】操作されたシンセカインリガンドによる非天然受容体対の二量体化を示す。ＩＬ−１Ｒ１及びＩＬ−１Ｒ１ＡｃＰキメラ受容体のＩＬ−１媒介性複合体形成の概略図である。右の表に示されているサイトカイン受容体の細胞内ドメインを、ＩＬ−１Ｒ１またはＩＬ−１Ｒ１ＡｃＰ細胞外ドメインに移植した。各受容体により活性化されるＪＡＫ及びＳＴＡＴを、表に示す。
【図２Ａ】非天然サイトカイン受容体対は、シグナル伝達を活性化する。図１Ｂに記載のキメラ受容体マトリックスから生成された１００のサイトカイン受容体対の組み合わせにより活性化されたＳＴＡＴ分子のヒートマップの説明を示す。ウェスタンブロット分析において、結果を、１、バンドの存在、または０、バンドの不存在、二値コード化した。
【図２Ｂ】非天然サイトカイン受容体対は、シグナル伝達を活性化する。設計されたＩＬ−１誘導性キメラ受容体の模式図を示す（左）。ＥｐｏＲ膜近傍ドメインのアラニン挿入の変異導入が中央に詳述される。アラニン残基（１Ａ、２Ａ、３Ａ、または４Ａ）を、Ｒ251 の後に挿入した。アラニン残基の付加により導入されたレジスターツイストのαヘリカルホイール投影図を右下に提示する。各残基は、１０９°回転し、３Ａ残基の挿入は、レジスターを元の位置に近づける。
【図２Ｃ】非天然サイトカイン受容体対は、シグナル伝達を活性化する。示されたキメラ受容体対を発現するＩＬ−１活性化Ｊｕｒｋａｔ細胞における、ウェスタンブロットで測定されたホスホ−ＳＴＡＴ３（ｐＳＴＡＴ３）及びｐＳＴＡＴ５レベルを示す。２つのアラニンの挿入は、ＩＬ−１Ｒ１−ＥｐｏＲ／ＩＬ−１Ｒ１ＡｃＰ−γｃ受容体対によるシグナル伝達を回復する。ＴＹＫ２の合計レベルを、負荷対照として提示する。提示されたウェスタンブロットは、２つの独立した実験の代表例である。
【図２Ｄ−１】非天然サイトカイン受容体対は、シグナル伝達を活性化する。Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるキメラ受容体の細胞表面発現を表し、トランスフェクションの２４時間後のジャーカット細胞におけるＩＬ−１Ｒ１及びＩＬ−１Ｒ１Ａｃｐキメラ受容体表面発現レベルのフローサイトメトリーのドットプロットを示す。
【図２Ｄ−２】非天然サイトカイン受容体対は、シグナル伝達を活性化する。Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるキメラ受容体の細胞表面発現を表し、トランスフェクションの２４時間後のジャーカット細胞におけるＩＬ−１Ｒ１及びＩＬ−１Ｒ１Ａｃｐキメラ受容体表面発現レベルのフローサイトメトリーのドットプロットを示す。
【図２Ｄ−３】非天然サイトカイン受容体対は、シグナル伝達を活性化する。Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるキメラ受容体の細胞表面発現を表し、トランスフェクションの２４時間後のジャーカット細胞におけるＩＬ−１Ｒ１及びＩＬ−１Ｒ１Ａｃｐキメラ受容体表面発現レベルのフローサイトメトリーのドットプロットを示す。
【図２Ｄ−４】非天然サイトカイン受容体対は、シグナル伝達を活性化する。Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるキメラ受容体の細胞表面発現を表し、トランスフェクションの２４時間後のジャーカット細胞におけるＩＬ−１Ｒ１及びＩＬ−１Ｒ１Ａｃｐキメラ受容体表面発現レベルのフローサイトメトリーのドットプロットを示す。
【図２Ｄ−５】非天然サイトカイン受容体対は、シグナル伝達を活性化する。Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるキメラ受容体の細胞表面発現を表し、トランスフェクションの２４時間後のジャーカット細胞におけるＩＬ−１Ｒ１及びＩＬ−１Ｒ１Ａｃｐキメラ受容体表面発現レベルのフローサイトメトリーのドットプロットを示す。
【図２Ｄ−６】非天然サイトカイン受容体対は、シグナル伝達を活性化する。Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるキメラ受容体の細胞表面発現を表し、トランスフェクションの２４時間後のジャーカット細胞におけるＩＬ−１Ｒ１及びＩＬ−１Ｒ１Ａｃｐキメラ受容体表面発現レベルのフローサイトメトリーのドットプロットを示す。
【図２Ｄ−７】非天然サイトカイン受容体対は、シグナル伝達を活性化する。Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるキメラ受容体の細胞表面発現を表し、トランスフェクションの２４時間後のジャーカット細胞におけるＩＬ−１Ｒ１及びＩＬ−１Ｒ１Ａｃｐキメラ受容体表面発現レベルのフローサイトメトリーのドットプロットを示す。
【図２Ｄ−８】非天然サイトカイン受容体対は、シグナル伝達を活性化する。Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるキメラ受容体の細胞表面発現を表し、トランスフェクションの２４時間後のジャーカット細胞におけるＩＬ−１Ｒ１及びＩＬ−１Ｒ１Ａｃｐキメラ受容体表面発現レベルのフローサイトメトリーのドットプロットを示す。
【図２Ｄ−９】非天然サイトカイン受容体対は、シグナル伝達を活性化する。Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるキメラ受容体の細胞表面発現を表し、トランスフェクションの２４時間後のジャーカット細胞におけるＩＬ−１Ｒ１及びＩＬ−１Ｒ１Ａｃｐキメラ受容体表面発現レベルのフローサイトメトリーのドットプロットを示す。
【図２Ｄ−１０】非天然サイトカイン受容体対は、シグナル伝達を活性化する。Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるキメラ受容体の細胞表面発現を表し、トランスフェクションの２４時間後のジャーカット細胞におけるＩＬ−１Ｒ１及びＩＬ−１Ｒ１Ａｃｐキメラ受容体表面発現レベルのフローサイトメトリーのドットプロットを示す。
【図２Ｄ−１１】非天然サイトカイン受容体対は、シグナル伝達を活性化する。Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるキメラ受容体の細胞表面発現を表し、トランスフェクションの２４時間後のジャーカット細胞におけるＩＬ−１Ｒ１及びＩＬ−１Ｒ１Ａｃｐキメラ受容体表面発現レベルのフローサイトメトリーのドットプロットを示す。
【図２Ｄ−１２】非天然サイトカイン受容体対は、シグナル伝達を活性化する。Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるキメラ受容体の細胞表面発現を表し、トランスフェクションの２４時間後のジャーカット細胞におけるＩＬ−１Ｒ１及びＩＬ−１Ｒ１Ａｃｐキメラ受容体表面発現レベルのフローサイトメトリーのドットプロットを示す。
【図２Ｅ−１】非天然サイトカイン受容体対は、シグナル伝達を活性化する。Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるキメラ受容体により活性化されたシグナル伝達プロファイルを示す。示されたキメラ受容体対を発現するＩＬ−１活性化Ｊｕｒｋａｔ細胞における、ウェスタンブロットで測定されたｐＳＴＡＴ１、ｐＳＴＡＴ２、ｐＳＴＡＴ３、ｐＳＴＡＴ４、ｐＳＴＡＴ５、及びｐＳＴＡＴ６レベルを提示する。ＴＹＫ２の合計レベルを、負荷対照として提示する。
【図２Ｅ−２】非天然サイトカイン受容体対は、シグナル伝達を活性化する。Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるキメラ受容体により活性化されたシグナル伝達プロファイルを示す。示されたキメラ受容体対を発現するＩＬ−１活性化Ｊｕｒｋａｔ細胞における、ウェスタンブロットで測定されたｐＳＴＡＴ１、ｐＳＴＡＴ２、ｐＳＴＡＴ３、ｐＳＴＡＴ４、ｐＳＴＡＴ５、及びｐＳＴＡＴ６レベルを提示する。ＴＹＫ２の合計レベルを、負荷対照として提示する。
【図２Ｅ−３】非天然サイトカイン受容体対は、シグナル伝達を活性化する。Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるキメラ受容体により活性化されたシグナル伝達プロファイルを示す。示されたキメラ受容体対を発現するＩＬ−１活性化Ｊｕｒｋａｔ細胞における、ウェスタンブロットで測定されたｐＳＴＡＴ１、ｐＳＴＡＴ２、ｐＳＴＡＴ３、ｐＳＴＡＴ４、ｐＳＴＡＴ５、及びｐＳＴＡＴ６レベルを提示する。ＴＹＫ２の合計レベルを、負荷対照として提示する。
【図２Ｆ】非天然サイトカイン受容体対は、シグナル伝達を活性化する。Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＥｐｏＲキメラ受容体の細胞表面発現を表し、トランスフェクションの２４時間後のＪｕｒｋａｔ細胞における、示されたキメラ受容体の細胞表面レベルのフローサイトメトリーのドットプロットを示す。
【図２Ｇ−１】非天然サイトカイン受容体対は、シグナル伝達を活性化する。アラニン挿入は、ＩＬ−２３Ｒ−ＩＬ−１２Ｒβ、ＩＬ−２Ｒβ−ＩＬ２Ｒβ、及びＥｐｏＲ−ＥｐｏＲキメラ受容体によるシグナル伝達を回復しない。示されたアラニン挿入を有するキメラ受容体の場合の、ウェスタンブロットで測定されたＩＬ−１刺激時のＳＴＡＴ活性化（左パネル）及びフローサイトメトリーで測定されたＪｕｒｋａｔ細胞における細胞表面発現（右パネル）を提示する。
【図２Ｇ−２】非天然サイトカイン受容体対は、シグナル伝達を活性化する。アラニン挿入は、ＩＬ−２３Ｒ−ＩＬ−１２Ｒβ、ＩＬ−２Ｒβ−ＩＬ２Ｒβ、及びＥｐｏＲ−ＥｐｏＲキメラ受容体によるシグナル伝達を回復しない。示されたアラニン挿入を有するキメラ受容体の場合の、ウェスタンブロットで測定されたＩＬ−１刺激時のＳＴＡＴ活性化（左パネル）及びフローサイトメトリーで測定されたＪｕｒｋａｔ細胞における細胞表面発現（右パネル）を提示する。
【図２Ｇ−３】非天然サイトカイン受容体対は、シグナル伝達を活性化する。アラニン挿入は、ＩＬ−２３Ｒ−ＩＬ−１２Ｒβ、ＩＬ−２Ｒβ−ＩＬ２Ｒβ、及びＥｐｏＲ−ＥｐｏＲキメラ受容体によるシグナル伝達を回復しない。示されたアラニン挿入を有するキメラ受容体の場合の、ウェスタンブロットで測定されたＩＬ−１刺激時のＳＴＡＴ活性化（左パネル）及びフローサイトメトリーで測定されたＪｕｒｋａｔ細胞における細胞表面発現（右パネル）を提示する。
【図２Ｈ−１】非天然サイトカイン受容体対は、シグナル伝達を活性化する。アラニン挿入は、ＩＬ−２３Ｒ−ＩＬ−１２Ｒβ、ＩＬ−２Ｒβ−ＩＬ２Ｒβ、及びＥｐｏＲ−ＥｐｏＲキメラ受容体によるシグナル伝達を回復しない。示されたアラニン挿入を有するキメラ受容体の場合の、ウェスタンブロットで測定されたＩＬ−１刺激時のＳＴＡＴ活性化（左パネル）及びフローサイトメトリーで測定されたＪｕｒｋａｔ細胞における細胞表面発現（右パネル）を提示する。
【図２Ｈ−２】非天然サイトカイン受容体対は、シグナル伝達を活性化する。アラニン挿入は、ＩＬ−２３Ｒ−ＩＬ−１２Ｒβ、ＩＬ−２Ｒβ−ＩＬ２Ｒβ、及びＥｐｏＲ−ＥｐｏＲキメラ受容体によるシグナル伝達を回復しない。示されたアラニン挿入を有するキメラ受容体の場合の、ウェスタンブロットで測定されたＩＬ−１刺激時のＳＴＡＴ活性化（左パネル）及びフローサイトメトリーで測定されたＪｕｒｋａｔ細胞における細胞表面発現（右パネル）を提示する。
【図２Ｈ−３】非天然サイトカイン受容体対は、シグナル伝達を活性化する。アラニン挿入は、ＩＬ−２３Ｒ−ＩＬ−１２Ｒβ、ＩＬ−２Ｒβ−ＩＬ２Ｒβ、及びＥｐｏＲ−ＥｐｏＲキメラ受容体によるシグナル伝達を回復しない。示されたアラニン挿入を有するキメラ受容体の場合の、ウェスタンブロットで測定されたＩＬ−１刺激時のＳＴＡＴ活性化（左パネル）及びフローサイトメトリーで測定されたＪｕｒｋａｔ細胞における細胞表面発現（右パネル）を提示する。
【図２Ｉ−１】非天然サイトカイン受容体対は、シグナル伝達を活性化する。アラニン挿入は、ＩＬ−２３Ｒ−ＩＬ−１２Ｒβ、ＩＬ−２Ｒβ−ＩＬ２Ｒβ、及びＥｐｏＲ−ＥｐｏＲキメラ受容体によるシグナル伝達を回復しない。示されたアラニン挿入を有するキメラ受容体の場合の、ウェスタンブロットで測定されたＩＬ−１刺激時のＳＴＡＴ活性化（左パネル）及びフローサイトメトリーで測定されたＪｕｒｋａｔ細胞における細胞表面発現（右パネル）を提示する。
【図２Ｉ−２】非天然サイトカイン受容体対は、シグナル伝達を活性化する。アラニン挿入は、ＩＬ−２３Ｒ−ＩＬ−１２Ｒβ、ＩＬ−２Ｒβ−ＩＬ２Ｒβ、及びＥｐｏＲ−ＥｐｏＲキメラ受容体によるシグナル伝達を回復しない。示されたアラニン挿入を有するキメラ受容体の場合の、ウェスタンブロットで測定されたＩＬ−１刺激時のＳＴＡＴ活性化（左パネル）及びフローサイトメトリーで測定されたＪｕｒｋａｔ細胞における細胞表面発現（右パネル）を提示する。
【図２Ｉ−３】非天然サイトカイン受容体対は、シグナル伝達を活性化する。アラニン挿入は、ＩＬ−２３Ｒ−ＩＬ−１２Ｒβ、ＩＬ−２Ｒβ−ＩＬ２Ｒβ、及びＥｐｏＲ−ＥｐｏＲキメラ受容体によるシグナル伝達を回復しない。示されたアラニン挿入を有するキメラ受容体の場合の、ウェスタンブロットで測定されたＩＬ−１刺激時のＳＴＡＴ活性化（左パネル）及びフローサイトメトリーで測定されたＪｕｒｋａｔ細胞における細胞表面発現（右パネル）を提示する。
【図３Ａ】非天然サイトカイン受容体対を二量体化させるシンセカインは、シグナル伝達を活性化する。シンセカインによるレイアウト及び複合体形成を示す。２つのドミナントネガティブサイトカインバリアントは、Ｇｌｙ4 ／Ｓｅｒリンカーにより遺伝的に融合され、非天然のサイトカイン受容体ヘテロ二量体の形成を誘導する新しい分子をもたらす。フローサイトメトリーで測定された、Ｈｕｔ７８細胞における、示された濃度のＳｕｐｅｒ−２／ＩＬ−４（図３Ａ）、及びＩＬ−４／ＩＦＮサイトカインの組み合わせでの１５分間の刺激により誘導されたｐＳＴＡＴ１、ｐＳＴＡＴ３、ｐＳＴＡＴ５、及びｐＳＴＡＴ６活性化レベルを示す。データ（平均±標準偏差）は、３つの独立した実験からのものである。
【図３Ｂ】非天然サイトカイン受容体対を二量体化させるシンセカインは、シグナル伝達を活性化する。フローサイトメトリーで測定された、Ｈｕｔ７８  Ｔ細胞における、ＩＬ−４、Ｓｕｐｅｒ−２（ＩＬ−２の親和性成熟バリアント）、及びＩＦＮωサイトカイン（図３Ｂ）、ドミナントネガティブサイトカインバリアントＩＬ−４ＤＮ、ＩＬ−２ＤＮ、及びＩＦＮＤＮ（図３Ｃ）、またはＳＹ１  ＳＬ、ＳＹ１  ＬＬ、及びＳＹ２シンセカイン（図３Ｄ）により活性化されたｐＳＴＡＴ１、ｐＳＴＡＴ３、ｐＳＴＡＴ５、及びｐＳＴＡＴ６レベルを示す。データ（平均＋／−ＳＤ）は、２つの独立した実施からのものである。フローサイトメトリーで測定された、Ｈｕｔ７８細胞における、示された濃度のＳｕｐｅｒ−２／ＩＬ−４（図３Ａ）、及びＩＬ−４／ＩＦＮサイトカインの組み合わせでの１５分間の刺激により誘導されたｐＳＴＡＴ１、ｐＳＴＡＴ３、ｐＳＴＡＴ５、及びｐＳＴＡＴ６活性化レベルを示す。データ（平均±標準偏差）は、３つの独立した実験からのものである。
【図３Ｃ】非天然サイトカイン受容体対を二量体化させるシンセカインは、シグナル伝達を活性化する。フローサイトメトリーで測定された、Ｈｕｔ７８  Ｔ細胞における、ＩＬ−４、Ｓｕｐｅｒ−２（ＩＬ−２の親和性成熟バリアント）、及びＩＦＮωサイトカイン（図３Ｂ）、ドミナントネガティブサイトカインバリアントＩＬ−４ＤＮ、ＩＬ−２ＤＮ、及びＩＦＮＤＮ（図３Ｃ）、またはＳＹ１  ＳＬ、ＳＹ１  ＬＬ、及びＳＹ２シンセカイン（図３Ｄ）により活性化されたｐＳＴＡＴ１、ｐＳＴＡＴ３、ｐＳＴＡＴ５、及びｐＳＴＡＴ６レベルを示す。データ（平均±標準偏差）は、２つの独立した実施からのものである。
【図３Ｄ】非天然サイトカイン受容体対を二量体化させるシンセカインは、シグナル伝達を活性化する。フローサイトメトリーで測定された、Ｈｕｔ７８  Ｔ細胞における、ＩＬ−４、Ｓｕｐｅｒ−２（ＩＬ−２の親和性成熟バリアント）、及びＩＦＮωサイトカイン（図３Ｂ）、ドミナントネガティブサイトカインバリアントＩＬ−４ＤＮ、ＩＬ−２ＤＮ、及びＩＦＮＤＮ（図３Ｃ）、またはＳＹ１  ＳＬ、ＳＹ１  ＬＬ、及びＳＹ２シンセカイン（図３Ｄ）により活性化されたｐＳＴＡＴ１、ｐＳＴＡＴ３、ｐＳＴＡＴ５、及びｐＳＴＡＴ６レベルを示す。データ（平均±標準偏差）は、２つの独立した実施からのものである。
【図３Ｅ】非天然サイトカイン受容体対を二量体化させるシンセカインは、シグナル伝達を活性化する。Ｓｕｐｅｒ−２／ＩＬ−４及びＩＬ−４／ＩＦＮサイトカインの組み合わせでの刺激により活性化されたシグナル伝達プロファイルを示す。
【図３Ｆ】非天然サイトカイン受容体対を二量体化させるシンセカインは、シグナル伝達を活性化する。Ｓｕｐｅｒ−２／ＩＬ−４及びＩＬ−４／ＩＦＮサイトカインの組み合わせでの刺激により活性化されたシグナル伝達プロファイルを示す。
【図４Ａ】シンセカインは、ゲノムにコードされたサイトカインとは異なるシグナル伝達プログラムを活性化する。Ｈｕｔ７８  Ｔ細胞において１５、６０、または１２０分間刺激した後、示されたリガンドにより活性化されたシグナル伝達経路のバブルプロットの説明を示す。バブルのサイズは、活性化されたシグナルの強度を表す。
【図４Ｂ】シンセカインは、ゲノムにコードされたサイトカインとは異なるシグナル伝達プログラムを活性化する。Ｈｕｔ７８細胞において１５分間刺激した後の、ゲノムにコードされたサイトカイン及びシンセカインにより活性化されたシグナル伝達分子の塗りつぶしレーダーの説明を示す。リガンドにより活性化されたシグナル伝達分子は、円の周囲に示され、それぞれの活性化能は、円の半径で示される。種々のリガンドにより示された塗りつぶしレーダーの種々の形状が、異なるシグナル伝達シグネチャーを規定する。
【図４Ｃ】シンセカインは、ゲノムにコードされたサイトカインとは異なるシグナル伝達プログラムを活性化する。Ｈｕｔ７８細胞上で１５分間刺激した後の、サイトカイン及びシンセカインによるＳＴＡＴ活性化の比を示す。各カラムは、１００％に正規化された各リガンドによる合計ＳＴＡＴ活性化を表す。それに応じて、各ＳＴＡＴの相対的な活性化能が修正される。種々のリガンドによるＳＴＡＴ活性化の種々の分布は、ゲノムにコードされたサイトカイン及びシンセカイン間の差次的なＳＴＡＴ使用法を示唆する。データ（平均）は、２つの独立した実施からのものである。
【図４Ｄ】シンセカインは、ゲノムにコードされたサイトカインとは異なるシグナル伝達プログラムを活性化する。サイトカイン及びシンセカインが関与するシグナル伝達プログラムの教師なしクラスタリングを示す。Ｈｕｔ７８細胞において１５分及び６０分刺激した後の、ゲノムにコードされたサイトカイン及びシンセカインに関与するシグナル伝達プログラムの主成分分析（ＰＣＡ）を示す。ゲノムにコードされたサイトカイン及びシンセカインシグネチャーは、空間内で同等の距離により隔てられており、シンセカインシグナル伝達プログラムが、互いに異なるのと同じくらい親サイトカインと異なることが示される。
【図５Ａ】シンセカインは、ゲノムにコードされたサイトカインとは異なる細胞シグネチャー及び免疫活性を誘発する。マスサイトメトリー（ＣｙＴＯＦ）で測定された、ＰＢＭＣからプロファイリングされた２９の免疫細胞型において飽和用量の示されたリガンドにより誘導された６つのシグナルエフェクターの活性化レベルのヒートマップを示す。データ（平均）は、２つの独立した実施からのものである。
【図５Ｂ−１】シンセカインは、ゲノムにコードされたサイトカインとは異なる細胞シグネチャー及び免疫活性を誘発する。示されたリガンドで刺激されたＰＢＭＣ由来の６３のサイトカインの分泌プロファイルの詳細な分析を示す。バックグラウンドを２倍を超えて分泌されたサイトカインに名称が付されている。データ（平均±標準偏差）は、２つの独立した実施からのものである。
【図５Ｂ−２】シンセカインは、ゲノムにコードされたサイトカインとは異なる細胞シグネチャー及び免疫活性を誘発する。示されたリガンドで刺激されたＰＢＭＣ由来の６３のサイトカインの分泌プロファイルの詳細な分析を示す。バックグラウンドを２倍を超えて分泌されたサイトカインに名称が付されている。データ（平均±標準偏差）は、２つの独立した実施からのものである。
【図５Ｃ−１】シンセカインは、ゲノムにコードされたサイトカインとは異なる細胞シグネチャー及び免疫活性を誘発する。サイトカイン対シンセカインにより活性化されたシグナル伝達シグネチャーを特定する免疫細胞プロファイリングを示す。サイトカイン対シンセカイン処理に対するシグナルエフェクター活性化応答を評価するために使用された、全血から単離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）内の２９の異なる免疫細胞サブセットのマスサイトメトリーによる特定に対するゲーティングスキームを示す。
【図５Ｃ−２】シンセカインは、ゲノムにコードされたサイトカインとは異なる細胞シグネチャー及び免疫活性を誘発する。サイトカイン対シンセカインにより活性化されたシグナル伝達シグネチャーを特定する免疫細胞プロファイリングを示す。サイトカイン対シンセカイン処理に対するシグナルエフェクター活性化応答を評価するために使用された、全血から単離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）内の２９の異なる免疫細胞サブセットのマスサイトメトリーによる特定に対するゲーティングスキームを示す。
【図６Ａ】サイトカイン受容体及びチロシンキナーゼ受容体を二量体化させるシンセカインは、シグナル伝達を活性化する。ＩＬ１−Ｒ１−ＥＧＦＲ及びＩＬ−１Ｒ１ＡｃＰ−サイトカイン受容体キメラのＩＬ−１媒介性複合体形成の模式図を示す。
【図６Ｂ】サイトカイン受容体及びチロシンキナーゼ受容体を二量体化させるシンセカインは、シグナル伝達を活性化する。示されたキメラ受容体対を発現するＩＬ−１活性化Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるウェスタンブロット分析で測定されたホスホ−ＥＧＦＲ（ｐＹ  ＥＧＦＲ）、ｐＳＴＡＴ３、及びｐＳＴＡＴ５レベル。Ｅｒｋの合計レベルが負荷対照として提示される。提示されたウェスタンブロットは、２つの独立した実験の代表例である。
【図６Ｃ】サイトカイン受容体及びチロシンキナーゼ受容体を二量体化させるシンセカインは、シグナル伝達を活性化する。サイトカイン受容体及びチロシンキナーゼ受容体を二量体化させるシンセカインによるレイアウト及び複合体形成を示す。サイトカイン受容体及びチロシンキナーゼ受容体をそれぞれ結合させる２つのｓｃＦｖを、酸性または塩基性ロイシンジッパーに遺伝的に融合させて、自然界に存在しないヘテロ二量体受容体複合体を形成することができる新しい分子をもたらす。
【図６Ｄ】サイトカイン受容体及びチロシンキナーゼ受容体を二量体化させるシンセカインは、シグナル伝達を活性化する。ＴｐｏＲ及びｃＫｉｔ（ＳＹ３、ＳＹ４、及びＳＹ５）を二量体化するシンセカインで、示された期間刺激した後、Ｍｏ７Ｅ細胞のウェスタンブロットで測定されたホスホｃＫｉｔ  Ｙ７０３及びｐＪＡＫ２レベルを示す。ラミンの合計レベルを負荷対照として提示する。提示されたウェスタンブロットは、２つの独立した実験の代表例である。
【図６Ｅ】サイトカイン受容体及びチロシンキナーゼ受容体を二量体化させるシンセカインは、シグナル伝達を活性化する。フローサイトメトリーで測定された、Ｍｏ７ｅ細胞の示された用量のＳＣＦ、ＴＰＯ、または示されたシンセカインでの１０分の刺激により活性化されたＥｒｋ（左パネル）及びＳＴＡＴ５（右パネル）のリン酸化を示す。データ（平均±標準偏差）は、３つの独立した実施からのものである。
【図６Ｆ−１】サイトカイン受容体及びチロシンキナーゼ受容体を二量体化させるシンセカインは、シグナル伝達を活性化する。チロシンキナーゼ受容体／サイトカイン受容体の二量体化シンセカインの機能特性を示す。トランスフェクションの２４時間後のＪｕｒｋａｔ細胞における、示されたキメラ受容体の表面発現レベルを表すフローサイトメトリーのプロットを示す。
【図６Ｆ−２】サイトカイン受容体及びチロシンキナーゼ受容体を二量体化させるシンセカインは、シグナル伝達を活性化する。チロシンキナーゼ受容体／サイトカイン受容体の二量体化シンセカインの機能特性を示す。トランスフェクションの２４時間後のＪｕｒｋａｔ細胞における、示されたキメラ受容体の表面発現レベルを表すフローサイトメトリーのプロットを示す。
【図６Ｇ】サイトカイン受容体及びチロシンキナーゼ受容体を二量体化させるシンセカインは、シグナル伝達を活性化する。チロシンキナーゼ受容体／サイトカイン受容体の二量体化シンセカインの機能特性を示す。フローサイトメトリーで測定された、Ｍｏ７ｅ細胞における、示された用量のＳＣＦ、ＴＰＯ、及びＳＹ５＋／−ＪＡＫ２阻害薬での１０分間の刺激に対するＥｒｋ活性化応答を示す。データ（平均±標準偏差）は、３つの独立した実験からのものである。
【図７Ａ】サイトカイン受容体及びチロシンキナーゼ受容体を二量体化させるシンセカインは、天然リガンドとは異なるシグナル伝達プログラムを活性化する。Ｍｏ７ｅ細胞において１０、６０、及び１２０分間刺激した後、示されたリガンドにより活性化されたシグナル伝達経路のバブルプロットを示す。バブルのサイズは、活性化されたシグナルの強度を表す。
【図７Ｂ】サイトカイン受容体及びチロシンキナーゼ受容体を二量体化させるシンセカインは、天然リガンドとは異なるシグナル伝達プログラムを活性化する。Ｍｏ７ｅ細胞における１０分間の刺激後のＳＣＦ、ＴＰＯ、及びＳＹ５が関与するシグナル伝達分子のスタックカラムを示す。各分子に対し、３つのリガンドの組み合わされた活性化を１００％に正規化し、各リガンドの相対的寄与をそれに応じて補正した。一部の分子は、ＳＣＦでより良好に活性化され、他の分子は、ＴＰＯでより良好に活性化され、さらに、他の分子は、ＳＹ５でより良好に活性化された。パネルＡ及びＢに示されたデータは、３回実施された２つの独立した実験の平均値を表す。
【図７Ｃ】サイトカイン受容体及びチロシンキナーゼ受容体を二量体化させるシンセカインは、天然リガンドとは異なるシグナル伝達プログラムを活性化する。１０、６０及び１２０分間の刺激後のＭｏ７ｅ細胞において示されたリガンドにより誘導されたｐＰＬＣＧ２、ｐＥｒｋ、及びｐＬＣＫレベルを示す。データ（平均±標準偏差）は、３つの独立した実施からのものである。
【図８】ｇｌｙ4 ｓｅｒリンカーＩＬ−２を介して、ＩＬ−４Ｒαに特異的に結合するｓｃＦｖに結合する三量体シンセカイン（ＳＹ３）を設計し例を示す。したがって、三量体シンセカインは、３つの受容体ポリペプチドである、γｃ、ＩＬ−２Ｒβ、及びＩＬ−４Ｒαに結合する。
【図９】三量体シンセカインは、野生型対応物とは異なるｐＳＴＡＴ活性化プロファイルを誘導することを示す。
【図１０】三量体シンセカインは、野生型対応物とは異なるシグナル伝達活性化プロファイルを示すことを示す。
【図１１】三量体シンセカインは、野生型の対応する物とは非常に異なるサイトカイン分泌シグネチャーを誘導することを示す。
【図１２−１】三量体シンセカインは、単球を以前に特性決定されていない樹状細胞集団に分化させることを示す。
【図１２−２】三量体シンセカインは、単球を以前に特性決定されていない樹状細胞集団に分化させることを示す。
【図１３】三量体シンセカイン分化樹状細胞は、高度の貪食を示すことを示す。
【図１４】三量体シンセカイン分化樹状細胞は、高度の貪食を示すことを示す。
【図１５】三量体シンセカイン分化樹状細胞上の分化マーカーは、天然の細胞集団とは異なることを示す。
【図１６】ＩＬ−２λシンセカインに関し、シンセカイン（ＳＹ６）は、Ｉ型及びＩＩＩ型ＩＦＮ受容体を二量体化させるハイブリッドインターフェロンである。Ａは、ＩＦＮ受容体、その関連するＪＡＫ、及び受容体の二量体化時に活性化されたＳＴＡＴの表を示す。Ｂは、ＳＹ６が、ＩＦＮＡＲ１及びＩＦＮλＲ１受容体ならびにそれぞれのＪＡＫを二量体化するハイブリッドインターフェロンであることを示す。Ｃは、ＳＹ６によるホスホ−ＳＴＡＴ１の活性化のＥｍａｘが、Ｉ型ＩＦＮのものと等しく、ＩＩＩ型ＩＦＮにより誘導されたシグナルの２倍であることを示す。エラーバーは、±標準誤差を表す（ｎ＝３）。Ｄは、ＳＹ６が、抗増殖効果を強力に誘導するが、Ｉ型ＩＦＮ、ＩＩＩ型ＩＦＮ、またはＩ型及びＩＩＩ型ＩＦＮの組み合わせ処理は、効果がないことを示す。エラーバーは、±標準誤差を表す（ｎ＝３）。Ｉ型及びＩＩＩ型ＩＦＮの両方に自然に応答するＨａｐ１細胞において、ホスホ−ＳＴＡＴ１シグナル伝達及び抗増殖アッセイを実施した。
【図１７】ＩＬ−４ＤＮ−ＩＦＮβＤＮ２（ＳＹ７）は、ｇｌｙ／ｓｅｒリンカーを介してＩＬ−４ＤＮをＩＦＮβ２ＤＮ２と結合させる。リンパ球を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脾臓／ＬＮから単離し、プレート結合抗ＣＤ３（２．５μｇ／ｍｌ）＋可溶性抗ＣＤ２８（５μｇ／ｍｌ）で４８時間活性化した。次に、細胞を、１０ＩＵ／ｍｌのｍＩＬ２で一晩静置し、次に、示されたサイトカイン／シンセカインで２０分間刺激する４時間前に血清飢餓状態にした。細胞シグナル伝達を終結させ、細胞を、ＰＦＡで固定し、ＰｅｒｍＩＩＩ緩衝液（ＢＤ）透過処理し、及びホスホＳＴＡＴ６（Ｙ６４１）抗体（ＢＤ）で染色した。配列は、配列番号２として提供される。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本開示がより容易に理解されるために、ある特定の用語及び語句が、以下に且つ明細書全体にわたって規定される。本明細書で提供される定義は、非限定的であり、当業者が発明時に知っていることを考慮して読まれるべきである。
【００２６】
本方法及び組成物が記載される前に、本発明は、記載される特定の方法または組成物に限定されず、したがって、当然ながら変動し得ることが理解されるべきである。さらに、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明する目的のためのものであり、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、限定することを意図するものではないことを理解すべきである。
【００２７】
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限値及び下限値の間の、文脈が特に明確に指示しない限り下限値の単位の１０分の１までの各介在値も具体的に開示されると理解される。記載された範囲内の任意の記載値または介在値と他の任意の記載値または介在値の間のより小さい各範囲が本発明に包含される。これらのより小さい範囲の上限値及び下限値は独立して、範囲に含まれても、範囲から除外されてもよく、より小さな範囲に、記載の範囲において具体的に除外された任意の端にしたがって、いずれかの端が含まれるか、いずれかの端も含まれないか、または両端が含まれる各範囲もまた、本発明内に包含される。記載の範囲が端の一方または両方を含む場合、それらの含まれる端のいずれかまたは両方を除外する範囲も本発明に含まれる。
【００２８】
別途の記載がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の任意の方法及び材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、一部の可能性があり且つ好ましい方法及び材料がここに記載される。本明細書で言及される全ての刊行物は、刊行物が引用されることに関連する方法及び／または材料を開示及び説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。本開示は、矛盾がある範囲で、組み込まれた出版物の任意の開示に優先することが理解される。
【００２９】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈に別途の明示がない限り、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば、「細胞」への言及は、複数のそのような細胞を含み、「ペプチド」への言及は、当業者らに既知の１つ以上のペプチド及びその等価物、例えば、ポリペプチドへの言及などを含む。
【００３０】
本明細書で考察される刊行物は、本出願の出願日前の、その開示のためにのみ提供される。本明細書のいかなるものも、先行発明であるがゆえに、本発明が、そのような刊行物に先行する権利を与えられないことを認めるものとして解釈されるべきではない。さらに、提供される刊行物の日付は、実際の公開日と異なり得、これは、他と関係なく確認される必要があり得る。
【００３１】
「含むこと」は、列挙された要素は、組成物／方法／キットに必要とされることを意味するが、特許請求の範囲内で組成物／方法／キットなどを形成する他の要素が含まれてもよい。例えば、ｗｎｔシンセカインを含む組成物は、ｗｎｔシンセカイン（複数可）に加えて、他の要素、例えば、例えば、ｗｎｔシンセカインに結合している、例えば、共有結合しているポリペプチド、小分子、または核酸などの機能部分、任意の負の条件に包含される要素を除き、当該技術分野で容易に理解されるような、ｗｎｔシンセカイン組成物の安定性を促進する薬剤、Ｗｎｔシンセカイン組成物の溶解性を促進する薬剤、アジュバントなどを含み得る組成物である。
【００３２】
「から本質的になる」は、主題の発明の基本的且つ新規の特性（複数可）に実質的に影響を与えない特定の材料またはステップに記載される組成物または方法の範囲を制限することを意味する。例えば、開示された配列「から本質的になる」ｗｎｔシンセカインは、それが由来した配列に基づいて、開示された配列に、配列の境界で約５アミノ酸残基を加えるか、または差し引く、例えば、列挙された結合アミノ酸残基よりも約５残基、４残基、３残基、２残基、もしくは約１残基小さいか、または、列挙された結合アミノ酸残基よりも約１残基、２残基、３残基、４残基、もしくは５残基大きいアミノ酸配列を有する。
【００３３】
「からなる」は、特許請求の範囲で明記されていない任意の要素、ステップ、または成分を、組成物、方法、またはキットから除外することを意味する。例えば、開示された配列「からなる」ｗｎｔシンセカインは、開示されたアミノ酸配列のみからなる。
【００３４】
「機能部分」または「ＦＭ」は、組成物に機能的活性を付与するポリペプチド、小分子、または核酸組成物を意味する。機能部分の例としては、治療部分、結合部分、及び画像化部分を含むが、これらに限定されない。
【００３５】
「治療部分」または「ＴＭ」は、組成物に治療活性を付与するポリペプチド、小分子、または核酸組成物を意味する。治療部分の例としては、細胞毒素、例えば、小分子化合物、タンパク質毒素、及び放射線増感部分、すなわち、細胞に本質的に有害な放射性核種など、細胞の活性を変更する薬剤、例えば、小分子、ペプチド模倣物、サイトカイン、ケモカイン、及びＡＤＣＣまたはＣＤＣ依存性死のために細胞を標的とする部分、例えば、免疫グロブリンのＦｃ構成要素が挙げられる。
【００３６】
「画像化部分」または「ＩＭ」は、細胞、例えば、本出願の組成物により標的化されている細胞の位置を決め、任意に、これを可視化するために使用することができる非細胞傷害剤を意味する。
【００３７】
「処置」、「処置する」などの用語は、本明細書では、一般に、所望の薬理学的及び／または生理学的効果を得ることを意味するために使用される。効果は、疾患もしくはその症状を完全にもしくは部分的に予防するという点で予防的であってよく、且つ／または、疾患及び／もしくは疾患に起因する有害反応の部分的もしくは完全な治癒の観点で治療的であってよい。本明細書で使用される「処置」は、哺乳動物の疾患の任意の処置を包含し、（ａ）疾患に罹患しやすいことがあるが、まだそれを有すると診断されていない対象において、疾患が発生することを予防すること、（ｂ）疾患を抑制すること、すなわち、その発症を阻止すること、または、（ｃ）疾患を緩和すること、すなわち、疾患の退行を引き起こすことを含む。治療薬は、疾患または損傷の発症前、発症中、または発症後に投与されてもよい。処置が患者の望ましくない臨床症状を安定化または低減させる進行中の疾患の処置が特に興味深い。そのような処置は、罹患組織の機能が完全に消失する前に実施することが望ましい。主題の治療は、疾患の症候期の間に、一部の場合では、疾患の症候期の後に投与されてもよい。
【００３８】
「個体」、「対象」、「宿主」、及び「患者」という用語は、本明細書で互換的に使用され、診断、処置、または治療が望まれる哺乳動物対象、特に、ヒト、を指す。
【００３９】
分子細胞生化学における一般的な方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＣＳＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２００１）、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  Ｅｄ．（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９９９）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｂｏｌｌａｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９９６）、Ｎｏｎｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９９）、Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｋａｐｌｉｆｔ  ＆  Ｌｏｅｗｙ  ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ（Ｉ．Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ  ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９７）、及びＣｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄｏｙｌｅ  ＆  Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９９８）のような標準的な教科書に見出すことができ、この開示は、参照により本明細書に組み込まれる。本開示において言及された遺伝子操作のための試薬、クローニングベクター、及びキットは、ＢｉｏＲａｄ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、及びＣｌｏｎｔｅｃｈなどの販売業者から入手可能である。
【００４０】
天然受容体及びリガンドの対は、以下の受容体を含むが、これらに限定されない。
【００４１】
【表１−１】
2020511988.tif 000002
【００４２】
【表１−２】
2020511988.tif 000003
【００４３】
シンセカインは、上記の表の受容体ポリペプチドの任意の組み合わせに結合するように設計することができるが、通常、上記の天然リガンドと同じ組み合わせまたは受容体ポリペプチドを活性化しない。例えば、ＬＩＦは、ＬＩＦＲ及びｃｄ１３０のヘテロ二量体を活性化するが、シンセカインは、ＬＩＦＲ及びγｃ、またはＬＩＦＲ及びβｃなどを活性化し得る。シンセカインで活性化された受容体ポリペプチドの組み合わせが、目的の細胞内で自然に発現されても、細胞が、受容体ポリペプチドの所望の組み合わせを発現するように操作されてもよい。
【００４４】
ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路及び受容体。二量体化する場合にＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路を活性化する受容体は、βｃ、γｃ、ＩＬ−３Ｒα、βＩＬ−３Ｒ、ＧＭ−ＣＳＦＲα、ＩＬ−５Ｒα、ＣＮＴＦα、ＣＲＬＦ１、ＬＩＦＲα、ｇｐ１３０、ＩＬ−６Ｒα、ＩＬ−１１Ｒα、ＯＳＭＲβ、ＩＬ−２Ｒα、ＩＬ−２Ｒβ、ＩＬ−２Ｒγ、ＩＬ−４Ｒα、ＩＬ−７Ｒα、ＩＬ−９Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα、ＩＬ−１５Ｒα、ＩＬ−２１Ｒα、ＩＦＮＡＲ２、ＩＬ−２３Ｒ、ＥｐｏＲ、ＩＬ−１２Ｒβ、ＩＦＮＡＲ１、Ｇ−ＣＳＦＲ、ｃ−ＭＰＬＲを含むが、これらに限定されない。
【００４５】
ＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路は、細胞外化学シグナルから核に情報を伝達し、免疫、増殖、分化、アポトーシス、及び腫瘍形成に関与する遺伝子の転写及び発現をもたらす。ＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達カスケードは、３つの主要な構成要素、すなわち上記の細胞表面受容体、Ｊａｎｕｓキナーゼ（ＪＡＫ）、及び２つのシグナル伝達兼転写活性化因子（ＳＴＡＴ）タンパク質からなる。ＪＡＫ−ＳＴＡＴ機能の混乱または調節不全は、免疫不全症候群及びがんを引き起こし得る。
【００４６】
サイトカインが細胞表面の受容体に結合すると、受容体関連チロシンキナーゼであるＪＡＫの活性化がもたらされる。活性化されると、ＪＡＫは、互いをトランスリン酸化し、それにより、シグナル伝達兼転写活性化因子（ＳＴＡＴ）分子のドッキング部位が生成される。結合後、ＳＴＡＴは、ＪＡＫ媒介性チロシンリン酸化で活性化されて、ホモまたはヘテロ二量体を形成し、核に移行し、そこで、それが転写を制御する。４つの異なるＪＡＫキナーゼ（ＪＡＫ１、２、３、及びＴＹＫ２）ならびに７つの異なるＳＴＡＴタンパク質（ＳＴＡＴ１、２、３、４、５Ａ、５Ｂ、及び６）が存在する。１つのサイトカインは、複数のＪＡＫを活性化し得、各ＪＡＫは、複数のＳＴＡＴタンパク質を標的とする。この多層的で複雑な活性化パターンは場合により、複雑な表現型を生成する。Ｊａｋ−ＳＴＡＴシグナル伝達の概説は、例えば、Ｖｉｌｌａｒｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（４）：３７４−３８４、Ｍａｊｏｒｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：２９、Ｂａｎｎａｒｊｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｄｒｕｇｓ  ７７（５）：５２１−５４６’Ｐｅｎｃｉｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ８７：２６−３６を含み、それぞれは、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。
【００４７】
受容体チロシンキナーゼ経路。ＲＴＫ受容体ポリペプチドは、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＩｎｓＲ、ＩＧＦ１Ｒ、ＩｎｓＲＲ、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、ＣＳＦ１Ｒ／Ｆｍｓ、ｃＫｉｔ、Ｆｌｔ−３／Ｆｌｋ２、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＰＴＫ７／ＣＣＫ４、ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢ、ＴｒｋＣ、Ｒｏｒ１、Ｒｏｒ２、ＭｕＳＫ、Ｍｅｔ、Ｒｏｎ、Ａｘｌ、Ｍｅｒ、Ｔｙｒｏ３、Ｔｉｅ１、Ｔｉｅ２、ＥｐｈＡ１−８、ＥｐｈＡ１０、ＥｐｈＢ１−４、ＥｐｈＢ６、Ｒｅｔ、Ｒｙｋ、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、Ｒｏｓ、ＬＭＲ１、ＬＭＲ２、ＬＭＲ３、ＡＬＫ、ＬＴＫ、及びＳｕＲＴＫ１０６／ＳＴＹＫ１を含むが、これらに限定されない。
【００４８】
受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）は、多くのポリペプチド成長因子、サイトカイン、及びホルモンに対する高親和性細胞表面受容体である。例えば、参照により本明細書に具体的に組み込まれるＲｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９（４９）：５５４８−５７を参照のこと。ヒトは、５８の既知のＲＴＫを有し、これらは、２０のサブファミリーに分類される。全てのＲＴＫは、細胞外ドメインのリガンド結合領域、単一の膜貫通ヘリックス、ならびにタンパク質チロシンキナーゼ（ＴＫ）ドメインを含有する細胞質領域、ならびに、追加のカルボキシ（Ｃ−）末端及び膜近傍制御領域を有する同様の分子構造を有する。
【００４９】
一般に、成長因子結合は、受容体の二量体化を誘導することによりＲＴＫを活性化するが、ＲＴＫのサブセットは、活性化リガンドがなくてもオリゴマーを形成する。リガンド結合は、活性な多量体の構成において、個々の受容体分子を安定化させることにより、受容体を活性化する。次に、通常、ポリペプチド鎖の１つは、１つ以上のチロシンをリン酸化し、リン酸化受容体は、細胞内シグナル伝達タンパク質の組み立て及び活性化において活性である。ＲＴＫの細胞外領域のリガンド誘導二量体化は、細胞内チロシンキナーゼドメイン（ＴＫＤ）の活性化をもたらす。
【００５０】
ＲＴＫがリン酸化する第１の１次基質は、受容体自体である。キナーゼドメイン自体の自己リン酸化部位は、ほとんどのＲＴＫで重要な制御の役割を果たす。次に、ほとんどのＲＴＫの細胞質領域の他の部分で、さらなるチロシンが自己リン酸化される。結果として得られるホスホチロシンは、受容体に動員され且つ成長因子刺激に応答して活性化される下流シグナル伝達分子の集合体に対する特定の部位として機能する。自己リン酸化は、トランスで生じ、自己リン酸化部位は、正確な順序でリン酸化される。連続する各事象は、シス自己阻害の相互作用を不安定化させることにより、触媒特性に大きな影響を及ぼす。
【００５１】
ＲＴＫの自己リン酸化に対する細胞応答は、下流のシグナル伝達分子のホストの動員及び活性化である。これらの分子は、ホスホチロシンに特異的に結合するＳＨ２またはＰＴＢドメインを含有する。それらは、受容体のホスホチロシンに直接動員されても、それらは、会合するＲＴＫによりリン酸化されるドッキングタンパク質に結合することにより、間接的に動員されてもよい。これらのドッキングタンパク質は、ＦＲＳ２、ＩＲＳ１（インスリン受容体基質−１）、及びＧａｂ１（Ｇｒｂ２関連バインダー）を含む。ドッキングタンパク質は通常、アミノ末端に膜標的部位、続いて、下流のシグナル伝達タンパク質の異なるレパートリーの結合部位として機能するチロシンリン酸化部位の配列を含有する。多数のドッキングタンパク質（例えば、Ｇａｂ１）は、複数のＲＴＫにより動員されるが、他のものは、受容体の特定のサブセットに制限される。ほとんどの受容体の複数のホスホチロシン及び多数のドッキングタンパク質の関与を伴い、活性化ＲＴＫは、多数の異なるシグナル伝達分子を動員して、影響を与えることができる。シグナル伝達経路の概説は、例えば、参照により本明細書に具体的に組み込まれるＬｅｍｍｏｎ  ａｎｄ  Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ（２０１０）Ｃｅｌｌ  １４１（７）：１１１７−３４を含む。
【００５２】
ＴＮＦＲＳＦ経路。ＴＮＦＲＳＦポリペプチドは、ＴＮＦＲ１（ＴＮＦＲＳＦ１Ａ）、ＴＮＦＲ２（ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ２）、４１−ＢＢ（ＴＮＦＲＳＦ９）、ＡＩＴＲ（ＴＮＦＲＳＦ１８）、ＢＣＭＡ（ＴＮＦＲＳＦ１７）、ＣＤ２７（ＴＮＦＲＳＦ７）、ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８）、ＣＤ４０（ＴＮＦＲＳＦ５）、死受容体１（ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ）、死受容体３（ＴＮＦＲＳＦ２５）、死受容体４（ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ）、死受容体５（ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ）、死受容体６（ＴＮＦＲＳＦ２１）、デコイ受容体−３（ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ）、デコイ受容体２（ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ）、ＥＤＡＲ、Ｆａｓ（ＴＮＦＲＳＦ６）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４）、ＬＴβ−Ｒ（ＴＮＦＲＳＦ３）、ＯＸ４０（ＴＮＦＲＳＦ４）、ＲＡＮＫ（ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ）、ＴＡＣＩ（ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ）、Ｔｒｏｙ（ＴＮＦＲＳＦ１９）、ＸＥＤＡＲ（ＴＮＦＲＳＦ２７）、オステオプロテグリン（ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ）、ＴＷＥＡＫ受容体（ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ）、ＢＡＦＦ受容体（ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ）、ＮＧＦ受容体（ＴＮＦＲＳＦ１６）を含むが、これらに限定されない。
【００５３】
腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーは、細胞外ドメインに著しい相同性を有する２９の膜貫通受容体からなり、リガンド特異性を規定する最大６つのシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）の存在を特徴とする。このファミリーのメンバーは、Ｃ末端細胞内尾部、膜貫通領域、及び細胞外リガンド結合Ｎ末端ドメインを有するＩ型膜貫通タンパク質である。ＴＮＦＲのメンバーは、リガンド結合の原因となる細胞外ドメイン及びシグナル伝達経路の活性化を媒介する細胞内ドメインを含有する。ＴＮＦ相同性ドメイン（ＴＨＤ）は、非共有ホモ三量体の形成を引き起こす。ＴＮＦＲは、２つのグループ、すなわち活性化受容体及び死受容体（ＤＲ）に分けられ得る。
【００５４】
ＤＲは、外因性シグナル誘導細胞死を媒介する細胞内領域内のデスドメイン（ＤＤ）と呼ばれるタンパク質相互作用モジュールを有する、ＴＮＦＲ１及びＦａｓなどの８つのメンバーを含む。リガンドに結合すると、受容体の凝集及びアダプタータンパク質の動員がもたらされ、それにより、イニシエーターカスパーゼ８及び１０を動員及び活性化することにより、タンパク質分解カスケードが開始される。死受容体は、細胞の増殖及び分化の制御、ケモカイン産生、炎症反応、アポトーシス、及び腫瘍促進活性を含む複数のシグナル伝達経路を開始する。
【００５５】
死受容体は、ＴＮＦタンパク質ファミリーに属する相補的なサイトカインのグループである同族リガンドで活性化される。死受容体による細胞傷害性シグナル伝達は、１）同族リガンドへの結合、２）アダプター／ドッキングタンパク質の動員（それにより、イニシエーターカスパーゼ８及び１０を動員する）、ならびに、３）種々のアダプタータンパク質ならびにカスパーゼ８及び１０の化学量論に依存する別個のシグナル伝達経路、ならびに細胞内在化事象を介して進む。受容体／アダプタータンパク質複合体の、主に核因子κＢ（ＮＦ−κＢ）及びマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）の活性化により媒介される、多数の非細胞毒性シグナル伝達経路も関与し得る。
【００５６】
ほとんどのＴＮＦ受容体は、下流のシグナル伝達のために、ＴＲＡＤＤ、ＴＲＡＦ、ＲＩＰ、及びＦＡＤＤなどの特定のアダプタータンパク質を必要とし、最終的にＮＦ−κＢを活性化するように作用し得る。例えば、ＴＮＦαとの結合時に、ＴＮＦＲ１の細胞内ＤＤは、ＴＮＦ受容体関連ＤＤタンパク質（ＴＲＡＤＤ）を動員し、それにより、受容体相互作用タンパク質キナーゼ１（ＲＩＰ１）、アポトーシスタンパク質１及び２の細胞阻害薬（ｃＩＡＰ１及び２）、ならびにＴＮＦ受容体関連因子２を動員する。ＴＲＡＤＤは、ＴＮＦ誘導ＮＦ−κＢシグナル伝達経路に重要である。それは、ＴＲＡＤＤ欠損ＭＥＦにおいては、ＩκＢのリン酸化及び分解が完全になくなるからである。
【００５７】
発現構築物。本方法では、シンセカインは、組み換え法によりを産生されてもよい。シンセカインは、発現ベクターで操作されるべき細胞に導入されてもよい。シンセカインをコードするＤＮＡは、操作プロセス中に設計された種々の供給源から得られてもよい。
【００５８】
アミノ酸配列バリアントが、本明細書に記載される、コード配列に適切なヌクレオチド変化を導入することにより調製される。そのようなバリアントは、記載の通りの残基の挿入、置換、及び／または特定の欠失を表す。挿入、置換、及び／または特定の欠失の任意の組み合わせが、最終構築物に到達するように行われる。但し、最終構築物が本明細書で定義される所望の生物学的活性を有することを条件とする。
【００５９】
シンセカインをコードする核酸は、発現のために複製可能なベクターに挿入される。そのような多くのベクターが利用可能である。ベクター構成要素は一般に、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、及び転写終結配列のうちの１つ以上を含むが、これらに限定されない。ベクターは、ウイルスベクター、プラスミドベクター、組み込みベクターなどを含む。
【００６０】
シンセカインは、組み換えにより直接生成されるだけでなく、異種ポリペプチド、例えば、シグナル配列、または成熟タンパク質もしくはポリペプチドのＮ末端に特定の切断部位を有する他のポリペプチドとの融合ポリペプチドとしても生成されてもよい。一般に、シグナル配列は、ベクターの構成要素であっても、ベクターに挿入されるコード配列の一部であってもよい。選択される異種シグナル配列は、好ましくは、宿主細胞により認識及び処理される（すなわち、シグナルペプチダーゼにより切断される）ものである。哺乳動物細胞の発現では、天然シグナル配列が使用されても、他の哺乳動物のシグナル配列、例えば、同じ種または関連種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列、及びウイルス分泌リーダー、例えば、単純ヘルペスｇＤシグナルが適していてもよい。
【００６１】
発現ベクターは通常、選択マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含有する。この遺伝子は、選択培地で成長した形質転換宿主細胞の生存または成長に必要なタンパク質をコードする。選択遺伝子を含有するベクターで形質転換されていない宿主細胞は、培地中で生存しない。代表的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質もしくは他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート、もしくはテトラサイクリンに対する耐性を付与するか、（ｂ）栄養要求性欠損を補うか、または（ｃ）複合培地から入手で使用できない重要な栄養素を供給する、タンパク質をコードする。
【００６２】
発現ベクターは、宿主生物により認識され且つシンセカインコード配列に作動可能に連結されているプロモーターを含有する。プロモーターは、それらが機作動可能に連結されている特定の核酸配列の転写及び翻訳を制御する構造遺伝子の開始コドンの上流（５’）に位置する非翻訳配列（一般に約１００〜１０００ｂｐ以内）である。そのようなプロモーターは通常、誘導性及び構成性の２つのクラスに分類される。誘導性プロモーターは、培養条件の何らかの変化、例えば、栄養素の有無または温度の変化に応じてそれらの制御下で、ＤＮＡから、増加したレベルの転写を開始するプロモーターである。様々な潜在的な宿主細胞により認識される多数のプロモーターが周知である。
【００６３】
哺乳動物宿主細胞におけるベクターからの転写は、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス（例えば、マウス幹細胞ウイルス）、Ｂ型肝炎ウイルス、最も好ましくは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから、異種哺乳動物プロモーター、例えば、アクチンプロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）、または免疫グロブリンプロモーターから、熱ショックプロモーターから得られるプロモーターにより制御され得る。但し、そのようなプロモーターが宿主細胞系と適合することを条件とする。ＳＶ４０ウイルスの初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点も含有するＳＶ４０制限フラグメントとして都合よく得られる。
【００６４】
高度な真核生物による転写は多くの場合、エンハンサー配列をベクターに挿入することにより増加する。エンハンサーは、プロモーターに作用してその転写を増加させる、通常約１０〜３００ｂｐのＤＮＡのシス作用要素である。エンハンサーは、相対的配向及び位置に依存せず、イントロン内及びコード配列自体内で転写ユニットの５’及び３’に見出されている。哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、αフェトプロテイン、及びインスリン）由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている。しかし、通常、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーが使用される。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。エンハンサーは、コード配列の５’または３’位で発現ベクターにスプライスされてもよいが、プロモーター由来の部位５’に位置することが好ましい。
【００６５】
真核生物宿主細胞に使用される発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含有する。そのような配列は、真核生物またはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’及び場合により３’の非翻訳領域から一般に得ることができる。上記の構成要素の１つ以上を含有する好適なベクターの構築は、標準的な技術を用いる。
【００６６】
核酸は、別の核酸配列と機能的な関係に置かれた場合、「作動可能に連結」されている。例えば、シグナル配列のＤＮＡが、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結されているか、プロモーターもしくはエンハンサーが、配列の転写に影響を与える場合、コード配列に作動可能に連結されているか、またはリボソーム結合部位が、翻訳を促進するように配置されている場合、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、「作動可能に連結されている」は、連結されているＤＮＡ配列が隣接しており、分泌リーダーの場合、隣接し且つ読み取り段階にあることを意味する。しかし、エンハンサーは、隣接している必要はない。
【００６７】
組み換え産生されたシンセカインは、分泌ポリペプチドとして培地から回収することができるが、宿主細胞溶解物からも回収することができる。フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）などのプロテアーゼ阻害薬はまた、精製中のタンパク質分解を阻害するために有用であり得、外来の汚染物質の成長を予防する抗生物質が含まれてもよい。種々の精製ステップが当該技術分野で既知であり、例えば、アフィニティークロマトグラフィーが用いられる。アフィニティークロマトグラフィーは、生物学的巨大分子に通常存在する非常に特異的な結合部位を利用して、特定のリガンドに結合する能力で、分子を分離する。共有結合が、タンパク質試料にリガンドを明白に提示する方法で、リガンドを不溶性の多孔質支持培地に付着させ、それにより、１つの分子種の自然な生体特異的結合を使用して、２番目の種を混合物から分離及び精製する。抗体が、アフィニティークロマトグラフィーで一般に使用される。サイズ選択ステップも使用されてもよく、例えば、ゲル濾過クロマトグラフィー（サイズ排除クロマトグラフィーまたはモレキュラーシーブクロマトグラフィーとしても知られている）は、サイズに応じてタンパク質を分離するために使用される。ゲル濾過では、タンパク質溶液を、半透性多孔質樹脂が充填されたカラムを通過させる。半透性樹脂は、カラムで分離することができるタンパク質のサイズを決定する幅広い孔径を有する。陽イオン交換クロマトグラフィーが目的のものもある。
【００６８】
最終的なシンセカイン組成物は、当該分野で既知の方法を使用して、濃縮、濾過、透析などがなされてもよい。治療用途の場合、受容体ポリペプチドの適切な組み合わせを含むシンセカインを哺乳動物に投与することができる。投与は、ボーラスとしての、またはある期間にわたる連続注入による、静脈内投与であってよい。代替投与経路は、筋肉内、腹腔内、髄腔内、皮下、関節内、滑液嚢内、髄腔内、経口、局所、または吸入経路を含む。シンセカインはまた、局所及び全身治療効果を発揮するために、腫瘍内、腫瘍周囲、病巣内、もしくは病変部近傍経路により、またはリンパに、適切に投与される。
【００６９】
そのような剤形は、本質的に非毒性且つ非治療的な生理学的に許容される担体を包含する。そのような担体の例としては、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質、リン酸などの緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩、または、プロタミンスルファート、リン酸一水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイダルシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質、及びＰＥＧなどの電解質が挙げられる。局所またはゲルベースの形態のポリペプチドのための担体は、カルボキシメチルセルロースナトリウムまたはメチルセルロースなどの多糖類、ポリビニルピロリドン、ポリアクリラート、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ＰＥＧ、及び木蝋アルコールを含む。全ての投与に対し、従来のデポー形態が適切に使用される。そのような形態は、例えば、マイクロカプセル剤、ナノカプセル剤、リポソーム、硬膏剤、吸入形態、鼻スプレー、舌下錠、及び徐放性製剤を含む。ポリペプチドは通常、約０．１μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌの濃度でそのようなビヒクルで製剤化される。
【００７０】
シンセカインが「実質的に純粋」である場合に、それらは、少なくとも約６０重量％（乾燥重量）の目的のポリペプチド、例えば、シンセカインアミノ酸配列を含有するポリペプチドとし得る。例えば、ポリペプチドは、少なくとも約７５重量％、約８０重量％、約８５重量％、約９０重量％、約９５重量％、または約９９重量％の目的のポリペプチドとし得る。純度は、任意の適切な標準法、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはＨＰＬＣ分析、により測定することができる。
【００７１】
本発明の別の実施形態では、上記の状態の処置に有用な材料を含有する製造物品が提供される。製造物品は、容器及びラベルを含む。好適な容器は、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、及び試験管を含む。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成されてもよい。容器は、状態を処置するために有効である組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有してもよい（例えば、容器は、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針により穿刺可能な栓を有するバイアルであってよい）。組成物中の活性薬は、シンセカインである。容器上のラベルまたは容器に付属するラベルは、組成物が、最適の状態を処置するために使用されることを示す。さらに、容器（複数可）は、例えば、薬学的に許容される緩衝液、例えば、リン酸緩衝食塩水、リンガー液、またはデキストロース溶液を保持し得る製造物品と共に提供されてもよい。製造物品はさらに、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、注射器、及び使用説明書を有する添付文書を含む、商業的及びユーザーの観点から望ましい他の材料を含んでもよい。
【００７２】
ポリペプチドまたはＤＮＡ配列に関して本明細書で使用される「同一性」という用語は、２つの分子間のサブユニット配列同一性を指す。両方の分子においてサブユニットの位置が、同じ単量体サブユニット（例えば、同じアミノ酸残基またはヌクレオチド）により占められている場合、分子はその位置で同一である。２つのアミノ酸または２つのヌクレオチド配列間の類似度は、同一の位置の数の直接の関数である。一般に、配列は、最高次の一致が得られるようにアラインされる。必要に応じて、同一性は、公開された技術及び幅広く利用可能なコンピュータープログラム、例えば、ＧＣＳプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：３８７，１９８４）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌ．２１５：４０３，１９９０）を使用して計算することができる。配列同一性は、配列分析ソフトウェア、例えば、ウィスコンシン大学バイオテクノロジーセンターの遺伝コンピューターグループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ）（ウィスコンシン州マジソンユニバーシティアベニュー１７１０  ５３７０５）のＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅをデフォルトパラメーターで使用して測定することができる。
【００７３】
「ポリペプチド」、「タンパク質」、または「ペプチド」という用語は、長さまたは翻訳後修飾（例えば、グリコシル化もしくはリン酸化）に関わらず、アミノ酸残基の任意の鎖を指す。
【００７４】
本明細書における「タンパク質バリアント」または「バリアントタンパク質」または「バリアントポリペプチド」は、少なくとも１つのアミノ酸修飾による野生型タンパク質とは異なるタンパク質を意味する。親ポリペプチドは、天然または野生型（ＷＴ）ポリペプチドであっても、ＷＴポリペプチドの修飾バージョンであってもよい。バリアントポリペプチドは、ポリペプチド自体、ポリペプチドを含む組成物、またはそれをコードするアミノ配列を指し得る。好ましくは、バリアントポリペプチドは、親ポリペプチドと比較して少なくとも１つのアミノ酸修飾、例えば、親と比較して約１〜約１０アミノ酸修飾、好ましくは、約１〜約５アミノ酸修飾を有する。
【００７５】
本明細書で使用される「親ポリペプチド」、「親タンパク質」、「前駆体ポリペプチド」、または「前駆体タンパク質」は、バリアントを生成するようにその後に修飾される未修飾ポリペプチドを意味する。親ポリペプチドは、野生型（もしくは天然）ポリペプチド、または野生型ポリペプチドのバリアントまたは操作されたバージョンであってよい。親ポリペプチドは、ポリペプチド自体、親ポリペプチドを含む組成物、またはそれをコードするアミノ酸配列を指し得る。
【００７６】
本明細書の「野生型」または「ＷＴ」または「天然」は、対立遺伝子バリアントを含む、自然界に見られるアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を意味する。ＷＴタンパク質、ポリペプチド、抗体、免疫グロブリン、ＩｇＧなどは、意図的に修飾されていないアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を有する。
【００７７】
「レシピエント」、「個体」、「対象」、「宿主」、及び「患者」という用語は、本明細書で互換的に使用され、診断、処置、または治療が望まれる哺乳動物対象、特に、ヒトを指す。処置のための「哺乳動物」は、ヒト、飼育動物及び家畜、ならびに動物園、スポーツ、またはペット動物、例えば、イヌ、ウマ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタなどを含む、哺乳動物として分類される任意の動物を指す。好ましくは、哺乳動物は、ヒトである。
【００７８】
本明細書で使用される場合、「治療的有効量」は、疾患または障害を処置または管理するために十分な治療薬、例えば、養子Ｔ細胞及び直交性サイトカインの組み合わせの量を指す。治療的有効量は、疾患の発症を遅延もしくは最小化するために十分な治療薬の量、例えば、癌の広がりを遅延もしくは最小化すること、または目的の受容体からのシグナル伝達を減少もしくは増加させるために有効な量を指し得る。治療的有効量は、疾患の処置または管理において治療的有用性を提供する治療薬の量も指し得る。さらに、本発明の治療薬に関する治療的有効量は、疾患の処置または管理において治療的有用性を提供する、単独のまたは他の療法と組み合わせた治療薬の量を意味する。
【００７９】
本明細書で使用される場合、「予防する」、「予防すること」、及び「予防」という用語は、予防薬または治療薬の投与の結果として、対象における障害の１つ以上の症状が再発または発症することの予防を指す。
【００８０】
本明細書で使用される場合、「組み合わせて」という用語は、複数の予防薬及び／または治療薬の使用を指す。「組み合わせて」という用語の使用は、予防薬及び／または治療薬が障害を有する対象に投与される順序を制限しない。最初の予防薬または治療薬は、２番目の予防薬または治療薬を、障害を有する対象に投与する前に（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、もしくは１２週間前に）、同時に、または後に（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、もしくは１２数週間後に）投与することができる。
【００８１】
組成物
シンセカイン及びその使用方法が提供される。シンセカインは、標的経路、例えば、Ｊａｋ／ＳＴＡＴ、ＥＲＫ、ＡＫＴ、ＮＦ−κＢなどによるシグナル伝達レベルの測定可能な増加をもたらす。但し、シグナルの異なるプロファイルが天然リガンドと比較して活性化される。本発明のこれら及び他の目的、利点、及び特徴は、以下により完全に記載される組成物及び方法の詳細を読む場合に、当業者らに明らかになる。
【００８２】
シンセカイン分子は、その物理的及び生物学的特性により規定される。主要な特徴は、シンセカインが、細胞表面受容体の１つ以上の、通常は、２つ以上の異なる細胞外ドメインに特異的に結合することであり、この受容体は、トランスリン酸化による活性化をもたらす多くの場合では、リガンド誘導性多量体化、多くの場合、リガンド誘導性二量体化を介して活性化されることを特徴とする。シンセカインは、受容体の非天然の組み合わせを活性化し、一般に、天然のリガンド、すなわち、ゲノム的にコードされたリガンドで活性化される受容体の組み合わせを活性化しない。目的の受容体は、本明細書に記載のサイトカイン受容体に例示されるＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達を活性化する受容体、サイトカイン及び成長因子受容体に例示される受容体チロシンキナーゼ、ならびにＴＮＦ受容体を含む。
【００８３】
シンセカインは、所望の結合特性を有する任意の分子、例えば、タンパク質または医薬品とし得る。約１５Ｋｄ未満であり得る小分子は、関心の対象であり、本明細書に記載の化合物スクリーニングを通して開発することができる。ポリペプチドも関心の対象である。加えて、ある特定のシンセカインは、ポリペプチド領域またはドメインと非ポリペプチド領域またはドメインの両方を含んでもよい。
【００８４】
シンセカインは、２つの異なる受容体細胞外ドメインの結合ドメインが連結されているポリペプチドとし得る。ポリペプチドシンセカインは、単鎖、二量体、またはより高次の多量体であってよい。結合ドメインは、直接結合していても、リンカー、例えば、ポリペプチドリンカー、または非ペプチドリンカーなどにより隔てられていてもよい。
【００８５】
一部の実施形態では、結合ドメイン（複数可）のうちの１つまたは全ては、天然リガンドの結合ドメイン、すなわち、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１ＲＡ、ＩＬ−１８、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＩＬ−４、ＩＬ−１５、ＩＬ−３、ＩＬ−５、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＩＬ−１０、ＩＬ−２０、ＩＬ−１４、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＬＴ−β、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、４−１ＢＢＬ、ＣＤ７０、ＣＤ１５３、ＣＤ１７８、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、Ｅｐｏ、Ｔｐｏ、Ｆｌｔ−３Ｌ、ＳＣＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＳＰを含み、結合ドメインは、リガンドに対する天然受容体を活性化しない。例えば、結合ドメインは、天然受容体ポリペプチドの１つへの結合の欠如をもたらすが、他方への結合の欠如をもたらさない標的アミノ酸置換を含んでもよい。そのような多くの修飾結合ドメインは、当該技術分野で既知であり、例えば、天然受容体のコンフィギュレーションに関してドミナントネガティブ変異体をもたらし得る。
【００８６】
他の種々の実施形態では、結合ドメインは、受容体の１つの鎖に特異的に結合する抗体、またはそれに由来する結合部分であってよい。
【００８７】
「特異的結合」という用語は、共有結合性もしくは非共有結合性相互作用または共有結合性及び非共有結合性相互作用の組み合わせにより媒介され得る酵素／基質、受容体／リガンド、抗体／抗原、及びレクチン／炭水化物のような一対の種間で起こる結合を指す。２つの種の相互作用が非共有結合した複合体を生成する場合、発生する結合は通常、静電気、水素結合、または親油性相互作用の結果である。したがって、「特異的に結合すること」は、対になった種の間で生じ、抗体／抗原またはリガンド／受容体相互作用の特徴を有する結合複合体を生成する２つの種の間には相互作用がある。ｉｎ  ｖｉｖｏ投与後の機能的アッセイにおいて活性のレベルを決定すること、例えば、骨の再生を促進すること、幹細胞増殖を増強することなどにより、組成物中のｗｎｔシンセカインの生物学的活性、βカテニンの核局在化、ｗｎｔ応答性遺伝子の転写の増加などが決定されてもよい。
【００８８】
各結合ドメインは、小分子またはポリペプチドであってよく、高親和性、例えば、少なくとも約１×１０-7Ｍ、少なくとも約１×１０-8Ｍ、少なくとも約１×１０-9Ｍ、少なくとも約１×１０-10 ＭのＫD で、所望の受容体細胞外ドメインに結合する任意のドメインから選択することができる。好適な結合ドメインとしては、ｄｅ  ｎｏｖｏ設計の結合タンパク質、抗体由来結合タンパク質、例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂなど、及び１つ以上のタンパク質に特異的に結合する抗体の他の部分、ナノボディ由来結合ドメイン、ノッティンベースの操作足場などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８９】
結合ドメインは、所望の細胞外ドメインへの結合を増強させるように選択された親和性になり得る。この目的のための親和性選択の方法は任意に、標的アミノ酸変化を導入して、候補コード配列のライブラリーを生成し、例えば、酵母細胞に、候補コード配列で細胞の集団を形質転換し、所望の特異性について（例えば、所望の特異性について常磁性マイクロビーズを使用して）選択することによる、１回以上の選択ラウンドを利用してもよい。通常は、複数の選択ラウンドが実施されることになり、得られたベクターが配列決定され、タンパク質操作の基礎として使用される。例えば、限定されないが、修飾サイトカイン、抗体またはナノボディ由来ドメイン、操作タンパク質などを含む結合ドメインは、目的の細胞外ドメインに選択的に結合するように選択することができる。
【００９０】
バリアント。結合ドメインは、上記のポリペプチドの誘導体、バリアント、及び生物学的に活性なフラグメント、例えば、天然リガンドのバリアントも含んでもよい。「バリアント」ポリペプチドは、提供された配列と１００％未満の配列同一性を有する、以下に定義される生物学的に活性なポリペプチドを意味する。そのようなバリアントとしては、提供された配列と比較して、１つ以上のアミノ酸修飾、例えば、挿入、欠失、または置換を含むポリペプチド（例えば、１つ以上のアミノ酸残基が、天然配列のＮ末端もしくはＣ末端に、または天然配列内に付加され、約１〜４０アミノ酸残基が欠失され、任意に１つ以上のアミノ酸残基で置換される）及び上記ポリペプチドの誘導体が挙げられ、アミノ酸残基は、得られた産物が天然に存在しないアミノ酸を有するように共有結合的に修飾されている。通常、生物学的に活性なバリアントは、天然配列ポリペプチドと少なくとも約９０％、好ましくは、少なくとも約９５％、より好ましくは、少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００９１】
配列の「機能誘導体」は、初期配列と共通の定性的な生物学的特性を有する化合物である。「機能誘導体」は、配列のフラグメント及び配列の誘導体を含むが、これらに限定されない。但し、それらは、共通の生物学的活性を有する。「誘導体」という用語は、ポリペプチド及びその共有結合修飾の両方のアミノ酸配列バリアントを包含する。
【００９２】
主題の組成物及び方法に使用される結合ドメインは、タンパク質分解に対する耐性を改善するために、または溶解特性を最適化するために、またはそれらが治療薬としてより好適にするために、通常の分子生物学技術及び合成化学を使用して修飾されてもよい。そのようなポリペプチドのアナログは、天然に存在するＬ−アミノ酸以外の残基、例えば、Ｄ−アミノ酸または天然に存在しない合成アミノ酸を含有するものを含む。Ｄ−アミノ酸は、アミノ酸残基の一部または全てについて置換されてもよい。
【００９３】
シンセカインは、追加のポリペプチド配列と融合または結合していてもよい。例としては、シンセカインを免疫グロブリン配列、特に、Ｆｃ配列と組み合わせるイムノアドヘシン、及び「タグポリペプチド」に融合している天然阻害薬ポリペプチドまたはその一部を含むエピトープタグ付きポリペプチドが挙げられる。タグポリペプチドは、抗体を作製することができるエピトープを提供するために十分な残基を有し、さらに、天然の阻害薬ポリペプチドの生物学的活性を妨げないように十分に短い。好適なタグポリペプチドは一般に、少なくとも６つのアミノ酸残基を有し、通常約６〜６０のアミノ酸残基を有する。シンセカインはまた、製剤中に融合させても組み合わせても、活性を増強する薬剤、例えば、サイトカイン、成長因子、化学療法剤、免疫抑制剤などと同時投与されてもよい。
【００９４】
リンカー結合ドメインは、リンカー、例えば、ポリペプチドリンカー、または非ペプチドリンカーなどにより隔てられていてもよい。ドメインに結合するアミノ酸リンカーは、マルチドメインタンパク質の構造及び機能に重要な役割を果たし得る。触媒活性が適切なリンカー組成物を必要とするタンパク質の例は数多くある。一般に、ドメインを連結させるリンカーの長さを変更すると、タンパク質の安定性、フォールディング速度、及びドメイン−ドメイン配向に影響することが示されている（Ｇｅｏｒｇｅ  ａｎｄ  Ｈｅｒｉｎｇ（２００３）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１５：８７１−８７９を参照のこと）。シンセカインにおけるリンカーの長さ、それによる、結合ドメイン間の間隔は、シンセカインのシグナル強度を調節するために使用することができ、シンセカインの所望の用途に応じて選択することができる。シンセカインの結合ドメイン間の強化された距離は、変動し得るが、ある特定の実施形態では、約１００オングストローム未満、約９０オングストローム未満、約８０オングストローム未満、約７０オングストローム未満、約６０オングストローム未満、約５０オングストローム未満であってよい。
【００９５】
一部の実施形態では、リンカーは、剛直なリンカーであり、他の実施形態では、リンカーは、柔軟なリンカーである。一部の実施形態では、リンカー部分は、ペプチドリンカーである。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、２〜１００アミノ酸を含む。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９であるが１００以下のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、長さが５〜７５、５〜５０、５〜２５、５〜２０、５〜１５、５〜１０、または５〜９アミノ酸である。例示的なリンカーとしては、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒなどの少なくとも２つのアミノ酸残基を有する直鎖ペプチドが挙げられる。好適な線状ペプチドとしては、ポリグリシン、ポリセリン、ポリプロリン、ポリアラニン、ならびにアラニル及び／またはセリニル及び／またはプロリニル及び／またはグリシルアミノ酸残基からなるオリゴペプチドが挙げられる。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｇｌｙ9 、Ｇｌｕ9 、Ｓｅｒ9 、Ｇｌｙ5 −Ｃｙｓ−Ｐｒｏ2 −Ｃｙｓ、（Ｇｌｙ4 −Ｓｅｒ）3 、Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ、Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ、Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ、及びＧｌｙ9 −Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｎからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＫＧ、または（ＧＧＧＧＳ）n を含み、ｎは、１、２、３、４、５などであり、しかし、そのような多くのリンカーは、既知であり、当該技術分野で使用され、この目的を果たし得る。
【００９６】
シンセカインは、単鎖形態で提供することができ、このことは、結合ドメインがリンカーペプチドを介してペプチド結合により連結されているということを意味する。他の実施形態では、結合ドメインは、個々のペプチドであり、非ペプチドリンカーを介して結合させることができる。
【００９７】
結合ドメインを連結するために用いることができる化学基は、当技術分野で既知のカルバマート、アミド（アミン＋カルボン酸）、エステル（アルコール＋カルボン酸）、チオエーテル（ハロアルカン＋スルフヒドリル、マレイミド＋スルフヒドリル）、シッフ塩基（アミン＋アルデヒド）、尿素（アミン＋イソシアナート）、チオ尿素（アミン＋イソチオシアナート）、スルホンアミド（アミン＋塩化スルホニル）、ジスルフィド、ヒドラゾン、脂質などを含む。
【００９８】
結合ドメイン間の連結は、直鎖状または分枝状、一般的には直鎖状であり得るスペーサ、例えば、アルキルスペーサを含んでもよく、一般的には、１〜約３００の炭素原子、より一般的には、約１〜２５の炭素原子を有し、約３〜１２の炭素原子であり得る１つ以上の不飽和結合を含んでもよい。このタイプのスペーサは、アミン、エーテル、ホスホジエステルなどを含むヘテロ原子または官能基も含んでもよい。目的の特定の構造は、（ＣＨ2 ＣＨ2 Ｏ）ｎ（式中、ｎは、１〜約１２である）、（ＣＨ2 ＣＨ2 ＮＨ）n （式中、ｎは、１〜約１２である）、［（ＣＨ2 ）n （Ｃ＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ2 ）m ］z （式中、ｎ及びｍは、１〜約６であり、ｚは、１〜約１０である）、［（ＣＨ2 ）n ＯＰＯ3 （ＣＨ2 ）m ］z （式中、ｎ及びｍは、１〜約６であり、ｚは、１〜約１０である）を含む。そのようなリンカーとしては、直鎖状または分枝状であり得るポリエチレングリコールを挙げてもよい。
【００９９】
結合ドメインは、親水性頭部基に安定した連結を形成することが可能な一端に基を有し、且つ標的化部分に安定した連結を形成することが可能な反対端に基を有するホモまたはヘテロ二官能性リンカーを介して結合していてもよい。例示的な実体としては、アジドベンゾイルヒドラジド、Ｎ−［４−（ｐ−アジドサリチルアミノ）ブチル］−３′−［２′−ピリジルジチオ］プロピオンアミド）、ビス−スルホスクシンイミジルスベラート、ジメチルアジピミダート、ジスクシンイミジルタータラート、Ｎ−γ−マレイミドブチリルオキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル−４−アジドベンゾアート、Ｎ−スクシンイミジル［４−アジドフェニル］−１，３′−ジチオプロピオナート、Ｎ−スクシンイミジル［４−ヨードアセチル］アミノベンゾアート、グルタルアルデヒド、ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＭＡＬ、スクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシラート、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＰＤＰ）、Ｎ，Ｎ′−（１，３−フェニレン）ビスマレイミド、Ｎ，Ｎ′−エチレン−ビス−（ヨードアセトアミド）、または４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＭＣＣ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、及びスクシンイミド４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチラート（ＳＭＰＢ）、ＭＢＳの伸長鎖アナログが挙げられる。これらの架橋剤のスクシンイミジル基は、１級アミンと反応し、チオール反応性マレイミドは、システイン残基のチオールと共に共有結合を形成する。
【０１００】
この目的に有用な他の試薬としては、ｐ，ｐ′−ジフルオロ−ｍ，ｍ′−ジニトロジフェニルスルホン（アミノ及びフェノール基と不可逆的な架橋を形成する）、ジメチルアジピミダート（アミノ基に特異的である）、フェノール−１，４−ジスルホニルクロリド（主にアミノ基と反応する）、ヘキサメチレンジイソシアナート、もしくはジイソチオシアナート、またはアゾフェニル−ｐ−ジイソシアナート（主にアミノ基と反応する）、ジスジアゾベンジジン（ｄｉｓｄｉａｚｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）（主にチロシン及びヒスチジンと反応する）、Ｏ−ベンゾトリアゾリルオキシテトラメチルウロニウム（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｕｌｕｒｏｎｉｕｍ）ヘキサフルオロホスファート（ＨＡＴＵ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド、ブロモトリス（ピロリジノ）ホスホニウムブロミド（ＰｙＢｒｏＰ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、４−ピロリジノピリジン、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾールなどが挙げられる。ホモ二官能性架橋試薬は、ビスマレイミドヘキサン（「ＢＭＨ」）を含む。
【０１０１】
抗体。本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、特定の標的抗原に特異的結合を付与するために十分な標準的な免疫グロブリン配列要素を含むポリペプチドを指す。当該技術分野で知られているように、自然に産生されるインタクト抗体は、互いに会合して一般に「Ｙ字型」構造と呼ばれるものになる２つの同一の重鎖ポリペプチド（それぞれ約５０ｋＤ）及び２つの同一の軽鎖ポリペプチド（それぞれ約２５ｋＤ）からなる約１５０ｋＤの四量体作用物質である。各重鎖は、少なくとも４つのドメイン（それぞれ約１１０アミノ酸の長さ）−アミノ末端可変（ＶＨ）ドメイン（Ｙ構造の先端に位置する）、続いて、３つの定常ドメイン：ＣＨ１、ＣＨ２、及びカルボキシ末端ＣＨ３（Ｙの茎部の基部に位置する）からなる。「スイッチ」として知られる短い領域は、重鎖の可変領域及び定常領域を連結させる。「ヒンジ」は、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを抗体の残りの部分に連結させる。このヒンジ領域の２つのジスルフィド結合は、インタクト抗体内で２つの重鎖ポリペプチドを互いに連結させる。各軽鎖は、２つのドメイン：アミノ末端可変（ＶＬ）ドメイン、続く、カルボキシ末端定常（ＣＬ）ドメインからなり、別の「スイッチ」により互いに隔てられている。インタクト抗体の四量体は、重鎖及び軽鎖が単一のジスルフィド結合により互いに連結される２つの重鎖−軽鎖二量体からなり、他の２つのジスルフィド結合は、重鎖ヒンジ領域を互いに連結させ、その結果、二量体を相互に連結させて、四量体が形成される。天然に産生された抗体は通常、ＣＨ２ドメインでもグリコシル化される。天然抗体の各ドメインは、圧縮された逆平行βバレルで互いにパッキングされる２つのβシート（例えば、３、４、または５本鎖シート）から形成される「免疫グロブリンフォールド」を特徴とする構造を有する。各可変ドメインは、「相補性決定領域」（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）として知られる３つの超可変ループ及び４つの幾分不変の「フレームワーク」領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４）を含有する。天然の抗体のフォールディング時に、ＦＲ領域は、ドメインの構造的フレームワークを提供するβシートを形成し、重鎖及び軽鎖の両方のＣＤＲループ領域は、Ｙ構造の先端に位置する単一の超可変抗原結合部位を生成するように、３次元空間で一つにされる。
【０１０２】
天然に存在する抗体のＦｃ領域は、補体系の要素に結合し、さらに、例えば、細胞毒性を媒介するエフェクター細胞を含むエフェクター細胞上の受容体に結合する。当該技術分野で知られているように、Ｆｃ受容体に対するＦｃ領域の親和性及び／または他の結合属性は、グリコシル化または他の修飾により調節することができる。一部の実施形態では、本発明に従って産生及び／または利用される抗体は、そのようなグリコシル化が修飾または操作されたＦｃドメインを含むグリコシル化Ｆｃドメインを含む。
【０１０３】
天然の抗体に見られる十分な免疫グロブリンドメイン配列を含む任意のポリペプチドまたはポリペプチドの複合体は、そのようなポリペプチドが自然に生成されるか（例えば、抗原に反応する生物により生成されるか）、または組み換え工学、化学合成、もしくは他の人工システムもしくは方法論により生産されるかに関わらず、「抗体」と呼び、且つ／または「抗体」として使用することができる。一部の実施形態では、抗体配列要素は、当該技術分野で知られているようなヒト化、霊長類化、キメラなどである。
【０１０４】
さらに、本明細書で使用される「抗体」という用語は、適切な実施形態では（別途明記されるか、または文脈から明らかでない限り）、代替形態の抗体の構造的及び機能的特徴を利用するための、当該技術分野で既知の、または開発された構築物または構成のいずれかを指すことができる。例えば、実施形態では、本発明に従って利用される抗体は、限定されないが、インタクトなＩｇＧ、ＩｇＥ、及びＩｇＭ、二重または多重特異性抗体（例えば、Ｚｙｂｏｄｉｅｓ（登録商標）など）、単鎖Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｄｕｌａｒ  ＩｍｍｕｎｏＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（「ＳＭＩＰｓ（商標）」）、単鎖またはタンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ（登録商標））、ＶＨＨ、Ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ（登録商標）、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）、ミニボディ、ＢｉＴＥ（登録商標）、アンキリンリピートタンパク質またはＤＡＲＰＩＮ（登録商標）、Ａｖｉｍｅｒｓ（登録商標）、ＤＡＲＴ、ＴＣＲ様抗体、Ａｄｎｅｃｔｉｎｓ（登録商標）、Ａｆｆｉｌｉｎｓ（登録商標）、Ｔｒａｎｓ−ｂｏｄｉｅｓ（登録商標）、Ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ（登録商標）、ＴｒｉｍｅｒＸ（登録商標）、ＭｉｃｒｏＰｒｏｔｅｉｎｓ、Ｆｙｎｏｍｅｒｓ（登録商標）、Ｃｅｎｔｙｒｉｎｓ（登録商標）、及びＫＡＬＢＩＴＯＲ（登録商標）から選択される構成のものである。一部の実施形態では、抗体は、自然に産生される場合に有する共有結合的修飾（例えば、グリカンの結合）を欠損していてもよい。一部の実施形態では、抗体は、共有結合的修飾（例えば、グリカンの結合、ペイロード［例えば、検出可能な部分、治療的部分、触媒部分など〕、または他のペンダント基［例えば、ポリ−エチレングリコールなど］を含有してもよい。
【０１０５】
多くの実施形態では、抗体薬は、アミノ酸配列が、相補性決定領域（ＣＤＲ）として当業者らにより認識される１つ以上の構造要素を含むポリペプチドであるか、またはそれを含み、一部の実施形態では、抗体薬は、アミノ酸配列が、参照抗体に見られるものと実質的に同一である少なくとも１つのＣＤＲ（例えば、少なくとも１つの重鎖ＣＤＲ及び／または少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲ）を含むポリペプチドであるか、またはそれを含む。一部の実施形態では、含まれるＣＤＲは、参照ＣＤＲと比較して、配列が同一であるか、または１〜５つのアミノ酸置換を含有するという点で、参照ＣＤＲと実質的に同一である。一部の実施形態では、含まれるＣＤＲは、参照ＣＤＲと少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を示すという点で、参照ＣＤＲと実質的に同一である。一部の実施形態では、含まれるＣＤＲは、参照ＣＤＲと少なくとも９６％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を示すという点で、参照ＣＤＲと実質的に同一である。一部の実施形態では、含まれるＣＤＲは、参照ＣＤＲと比較して、含まれるＣＤＲ内の少なくとも１つのアミノ酸が欠失、付加、または置換されているという点で、参照ＣＤＲと実質的に同一であり、含まれるＣＤＲは、参照ＣＤＲのものと他の点では同一であるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、含まれるＣＤＲは、含まれるＣＤＲ内の１〜５つのアミノ酸が参照ＣＤＲと比較して、欠失、付加、または置換されているという点で、参照ＣＤＲと実質的に同一であり、含まれるＣＤＲは、参照ＣＤＲと他の点では同一であるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、含まれるＣＤＲは、含まれるＣＤＲ内の少なくとも１つのアミノ酸が参照ＣＤＲと比較して、置換されているという点で、参照ＣＤＲと実質的に同一であり、含まれるＣＤＲは、参照ＣＤＲのものと他の点では同一であるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、含まれるＣＤＲは、含まれるＣＤＲ内の１〜５つのアミノ酸が参照ＣＤＲと比較して、欠失、付加、または置換されているという点で、参照ＣＤＲと実質的に同一であり、含まれるＣＤＲは、参照ＣＤＲと他の点では同一であるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、抗体薬は、アミノ酸配列が免疫グロブリン可変ドメインとして当業者らにより認識される構造要素を含むポリペプチドであるか、またはそれを含む。一部の実施形態では、抗体薬は、免疫グロブリン結合ドメインと相同またはほとんど相同である結合ドメインを有するポリペプチドタンパク質である。
【０１０６】
小分子組成物。シンセカインは、有機分子、好ましくは、５０を超え且つ約２０，０００ダルトン未満の分子量を有する小さな有機化合物も含む。有用なシンセカインは、例えば、目的のＥＣＤの一方または両方への高親和性結合について分子がアッセイされるスクリーニングアッセイにより特定される。分子は、ポリペプチド薬について上述した通り、別の結合部分に結合するか、または結合ドメインに結合する結合部分を提供することができる。
【０１０７】
候補シンセカインは、受容体ＥＣＤとの構造的相互作用、特に、水素結合に必要な官能基を含み、通常、少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシル、またはカルボキシル基、好ましくは、官能化学基のうちの少なくとも２つを含む。候補シンセカインは多くの場合、上記官能基のうちの１つ以上で置換された環状炭素もしくは複素環構造及び／または芳香族もしくは多芳香族構造を含む。候補薬は、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造アナログ、またはそれらの組み合わせを含む生体分子にも見られる。
【０１０８】
候補シンセカインは、合成または天然化合物のライブラリーを含む多種多様な源から得られる。例えば、ランダム化されたオリゴヌクレオチド及びオリゴペプチドの発現を含む、多種多様な有機化合物及び生体分子のランダムで指向性がある合成のための多数の手段が利用可能である。あるいは、細菌、真菌、植物、及び動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリーが入手可能であるか、または容易に生成される。加えて、天然または合成的に生成されたライブラリー及び化合物は、従来の化学的手段、物理的手段、及び生化学的手段により容易に修飾され、組み合わせライブラリーを生成するために使用され得る。既知の薬理学的薬剤は、構造アナログを生成するために、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化などの指向性またはランダム化学修飾を受けてもよい。試験薬剤は、例えば、天然物生成物ライブラリーまたは組み合わせライブラリーなどのライブラリーから得ることができる。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９３／０６１２１、ＷＯ９５／１２６０８、ＷＯ９５／３５５０３、ＷＯ９４／０８０５１、及びＷＯ９５／３０６４２を含む、多くの異なるタイプの組み合わせライブラリー及びそのようなライブラリーを調製する方法が記載されており、これらのそれぞれは参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０９】
スクリーニングアッセイが結合アッセイである場合、分子の１つ以上を標識に結合していてもよく、標識は、検出可能なシグナルを直接または間接的に提供することができる。種々の標識は、放射性同位体、蛍光剤、化学発光剤、酵素、特異的結合分子、粒子、例えば、磁性粒子などを含む。特異的結合分子は、ビオチン及びストレプトアビジン、ジゴキシン及びアンチジゴキシンなどの対を含む。特異的結合メンバーの場合、相補的メンバーは通常、既知の手順に従って、検出を提供する分子で標識される。
【０１１０】
他の様々な試薬は、スクリーニングアッセイに含まれ得る。これらは、最適なタンパク質−タンパク質結合を促進し、且つ／または非特異的もしくは背景相互作用を低減させるために使用される、塩、中性タンパク質、例えば、アルブミン、界面活性剤などのような試薬を含む。プロテアーゼ阻害薬、ヌクレアーゼ阻害薬、抗菌薬などの、アッセイの効率を向上させる試薬が使用されてもよい。構成成分の混合物は、必要な結合を提供する任意の順序で添加される。インキュベーションは、任意の好適な温度で、通常は、４〜４０℃で、実施される。最適な活性のためのインキュベーション期間が選択されるが、さらに、迅速なハイスループットスクリーニングを促進するために最適化されてもよい。通常は、０．１〜１時間で十分である。
【０１１１】
目的の受容体ポリペプチド（複数可）に結合することが可能な化合物についてスクリーニングすることにより、予備スクリーニングを実施することができる。結合アッセイは通常、受容体ＥＣＤを１つ以上の試験化合物と接触させること、ならびにタンパク質及び試験化合物が結合複合体を形成する時間を十分にとることを含む。いかなる形成された結合複合体も、多数の確立された分析技術のいずれかを使用して検出することができる。タンパク質結合アッセイは、ウェスタンブロットの共沈、非変性ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの共泳動、及びウェスタンブロットの共泳動を測定する方法を含むが、これらに限定されない（例えば、Ｂｅｎｎｅｔ，Ｊ．Ｐ．ａｎｄ  Ｙａｍａｍｕｒａ，Ｈ．Ｉ．（１９８５）“Ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ，Ｈｏｒｍｏｎｅ  ｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，”ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ（Ｙａｍａｍｕｒａ，Ｈ．Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．），ｐｐ．６１−８９を参照のこと）。
【０１１２】
ある特定のスクリーニング法は、シグナル伝達活性を調節する化合物についてのスクリーニングを含む。そのような方法は、試験化合物を発現する１つ以上の細胞と接触させる細胞ベースのアッセイを実施すること、次に、応答遺伝子の発現の増加を検出すること、種々のアダプタータンパク質、Ｊａｋ、ＳＴＡＴ（複数可）などの変化を検出することなどを含んでもよい。
【０１１３】
発現または活性のレベルは、ベースライン値と比較することができる。上記のように、ベースライン値は、対照試料の値、または対照集団の発現レベルを表す統計値とすることができる。陰性対照として、受容体を発現しない細胞の発現レベルも決定することができる。そのような細胞は、一般に、試験細胞と、他の点では実質的に遺伝的に同じである。レポーター構築物を欠く細胞を用いるか、または、レポーター構築物を含む細胞を試験化合物と接触させないことにより、並行反応を実行することを含む、観察される活性は根拠があるものであることを確認する種々の制御を行うことができる。化合物は、下記のように、さらに検証することもできる。
【０１１４】
上述のスクリーニング法のいずれかにより最初に特定された化合物は、見かけの活性を検証するために、さらに試験することができる。そのような方法の基本的構成が、初期スクリーニング中に特定されたリード化合物を動物に、または細胞培養モデルで投与することを含み、それは、ヒトのモデルとして役立つ。検証に利用される動物モデルは一般に、哺乳動物である。好適な動物の具体例としては、霊長類、マウス、及びラットが含まれるが、これらに限定されない。
【０１１５】
本明細書に記載のスクリーニング法により特定された活性試験薬剤は、アナログ化合物の合成のためのリード化合物として役立ち得る。通常、アナログ化合物は、リード化合物のものと類似した電子構成及び分子配座を有するように合成される。アナログ化合物の特定は、自己無撞着場（ＳＣＦ）分析、配置間相互作用（ＣＩ）分析、及び通常モード動力学分析などの技術の使用を介して実施することができる。これらの技術を実行するためのコンピュータープログラムが利用可能である。例えば、Ｒｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｌｉｇａｎｄ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ（Ａｌａｎ  Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照のこと。
【０１１６】
医薬組成物
治療用途の場合、シンセカインは、ボーラスとして、またはある期間にわたる連続注入により、ヒトの静脈内に投与され得るものを含む生理学的に許容される剤形で、哺乳動物、好ましくは、ヒトに投与される。代替投与経路は、局所、筋肉内、腹腔内、髄腔内、皮下、関節内、滑液嚢内、髄腔内、経口、局所、または吸入経路を含む。シンセカインはまた、局所及び全身治療効果を発揮するために、腫瘍内、腫瘍周囲、病巣内、もしくは病変部近傍経路により、またはリンパに、適切に投与される。
【０１１７】
医薬組成物は、本発明の分子の、幹細胞、前駆細胞、免疫エフェクター細胞などを含む細胞との組み合わせも含んでもよい。そのような組み合わせにおいて、細胞は、使用前に本発明の分子で前処置、例えば、シンセカインを用いる免疫エフェクター細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ処置をすることができ、細胞は、別個のまたは組み合わせた製剤で本発明の分子と一緒に投与することができ、細胞は、本発明の分子を用いる処置の前に個体に提供することができる。
【０１１８】
医薬組成物は、所望の製剤に応じて、薬学的に許容される非毒性担体の希釈剤を含み得、これは、動物またはヒト投与用の医薬組成物を製剤化するために一般に使用されるビヒクルとして定義される。希釈剤は、組み合わせの生物学的活性に影響を及ぼさないように選択される。そのような希釈剤の例は、蒸留水、緩衝水、生理食塩水、ＰＢＳ、リンガー液、デキストロース溶液、及びハンクス液である。加えて、医薬組成物または製剤は、他の担体、アジュバント、または非毒性、非治療的、非免疫原性の安定剤、賦形剤などを含み得る。組成物は、生理学的条件に近づけるために、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、毒性調整剤、湿潤剤、及び界面活性剤などの追加の物質も含み得る。
【０１１９】
組成物は、例えば、酸化防止剤などの様々な安定化剤のいずれかも含み得る。医薬組成物がポリペプチドを含む場合、ポリペプチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏ安定性を増強するか、または別の方法で薬理学的特性を増強する周知の種々の化合物と複合化することができる（例えば、ポリペプチドの半減期を増加させ、毒性を低減させ、溶解度または取り込みを増強する）。そのような修飾または錯化剤の例としては、スルファート、グルコナート、シトラート、及びホスファートが挙げられる。組成物のポリペプチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏ属性を増強する分子と複合体化することもできる。そのような分子には、例えば、炭水化物、ポリアミン、アミノ酸、他のペプチド、イオン（例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、マンガン）、及び脂質を含む。
【０１２０】
種々のタイプの投与に適する製剤に関するさらなるガイダンスは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，１７ｔｈ  ｅｄ．（１９８５）に見出すことができる。薬物送達の方法の簡単な概説について、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）を参照のこと。
【０１２１】
医薬組成物は、予防的及び／または治療的処置のために投与することができる。活性成分の毒性及び治療有効性は、例えば、ＬＤ50（集団の５０％に致死的な用量）及びＥＤ50（集団の５０％で治療上有効な用量）を決定することを含む、細胞培養物及び／または実験動物における標準的な薬学的手順に従って決定することができる。毒性効果及び治療効果の用量比は、治療指数であり、ＬＤ50／ＥＤ50比として表し得る。大きな治療指数を示す化合物が好ましい。
【０１２２】
細胞培養及び／または動物試験から得られたデータを、ヒトの幅広い投薬量の製剤化に使用することができる。活性成分の投薬量は通常、低毒性のＥＤ50を含む循環濃度の範囲内にある。投薬量は、用いられる剤形及び利用される投与経路に応じてこの範囲内で変動し得る。
【０１２３】
経口投与の場合、活性成分は、カプセル剤、錠剤、及び散剤などの固体剤形で、またはエリキシル剤、シロップ剤、及び懸濁剤などの液体剤形で投与することができる。活性構成成分（複数可）は、不活性成分及び粉末担体、例えば、グルコース、ラクトース、スクロース、マンニトール、デンプン、セルロースまたはセルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、サッカリンナトリウム、タルカム、炭酸マグネシウムと共に、ゼラチンカプセルにカプセル化することができる。望ましい色、味、安定性、緩衝能力、分散、または他の既知の望ましい特徴を提供するために添加され得る追加の不活性成分の例は、ベンガラ、シリカゲル、ラウリル硫酸ナトリウム、二酸化チタン、及び食用白インクである。類似した希釈剤を、圧縮錠剤を作成するために使用することができる。錠剤及びカプセル剤の両方は、徐放性製品として製造し、数時間にわたって薬物を連続的に放出することができる。圧縮錠剤は、あらゆる不快な味をマスクし且つ錠剤を大気から保護するために糖衣コーティングするか、もしくはフィルムコーティングするか、または胃腸管における選択的崩壊のために腸溶コーティングすることができる。経口投与用の液体剤形は、患者の受け入れを高める着色剤及び着香剤を含有し得る。
【０１２４】
活性成分は、単独でまたは他の好適な構成成分と組み合わせて、吸入を介して投与されるために、エアロゾル製剤に作製することができる（すなわち、それらは、「噴霧」することができる）。エアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの加圧許容噴射剤に入れることができる。
【０１２５】
例えば、関節内（関節内）、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、及び皮下経路による非経口投与に適する製剤は、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、及び製剤を意図されるレシピエントの血液と等張にする溶質を含有し得る水性及び非水性等張滅菌注射溶液、ならびに、懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、及び防腐剤を含み得る水性及び非水性滅菌懸濁液を含む。
【０１２６】
医薬組成物を製剤化するために使用される構成成分は、好ましくは、高純度であり、潜在的に有害な汚染物質を実質的に含まない（例えば、少なくともＮａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｏｄ（ＮＦ）グレード、一般には、少なくとも分析グレード、より一般的には、少なくとも医薬品グレード）。さらに、ｉｎ  ｖｉｖｏでの使用が意図される組成物は通常、無菌である。使用前に所与の化合物が合成されなければならないという程度に、得られた製品は通常、合成または精製プロセス中に存在し得るいかなる潜在的な毒性物質、特に、いかなるエンドトキシンも実質的に含まない。非経口投与用の組成物はまた、無菌であり、実質的に等張であり、ＧＭＰ条件下で作成される。
【０１２７】
特定の患者に投与されるべき治療用組成物の有効量は、様々な要因に依存することになり、これらのいくつかは、患者によって異なる。製剤は、例えば、単位用量で提供されてもよい。有能な臨床医は、患者に投与する治療薬の有効量を決定することができる。シンセカインの投薬量は、処置、投与経路、治療薬の性質、治療薬に対する疾患の感受性などに依存する。ＬＤ50動物データ及び利用可能な他の情報を利用して、臨床医は、投与経路に応じて、個体の最大安全用量を決定することができる。身体から急速にクリアランスされる組成物は、治療濃度を維持するために、より高い用量で、または反復用量で投与されてもよい。通常の技能を利用して、有能な臨床医は、日常的な臨床試験の過程で、特定の治療薬またはイメージング組成物の投薬量を最適化することができる。通常、投薬量は、対象の体重１キログラム当たり０．００１〜１００ミリグラムの薬剤である。
【０１２８】
組成物は、一連の複数の投与で対象に投与することができる。治療用組成物の場合、規則的な定期投与（例えば、２〜３日毎）が場合により、必要になるか、または毒性を低減させることが望ましいことがある。反復投与レジメンで利用されることになる治療用組成物の場合、免疫応答を誘発しない部分が好ましい。
【０１２９】
本発明の別の実施形態では、本明細書に記載の状態の処置に有用な材料を含有する製造物品が提供される。製造物品は、容器及びラベルを含む。好適な容器は、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、及び試験管を含む。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成されてもよい。容器は、状態を処置するために有効である組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有してもよい（例えば、容器は、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針により穿刺可能な栓を有するバイアルであってよい）。組成物中の活性薬は、シンセカインである。容器上のラベルまたは容器に付属するラベルは、組成物が、選択された状態を処置するために使用されることを示す。さらに、容器（複数可）は、例えば、薬学的に許容される緩衝液、例えば、リン酸緩衝食塩水、リンガー液、またはデキストロース溶液を保持し得る製造物品と共に提供されてもよい。製造物品はさらに、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、注射器、及び使用説明書を有する添付文書を含む、商業的及びユーザーの観点から望ましい他の材料を含んでもよい。
【０１３０】
本明細書で使用される場合、「治療的有効量」という用語は、治療投与レジメンに従って、疾患、障害、及び／または状態に罹患しているまたは罹患しやすい集団に投与した場合に、疾患、障害、及び／または状態を処置するために十分な量を意味する。一部の実施形態では、治療的有効量は、疾患、障害、及び／もしくは状態の１つ以上の症状の発生率及び／もしくは重症度を低減させ、これらの１つ以上の特徴を安定化させ、且つ／またはこれらの発症を遅延させる量である。当業者らは、「治療的有効量」という用語が、実際に特定の個体で達成される成功した処置を必要としないことを理解する。むしろ、治療的有効量は、そのような処置を必要とする患者に投与された場合に、著しい数の対象において特定の望ましい薬理学的応答を提供する量であってよい。
【０１３１】
例えば、一部の実施形態では、「治療的有効量」という用語は、本発明の治療の文脈でそれを必要とする個体に投与される場合、該個体で生じる疾患プロセスを遮断し、安定化させ、減弱させ、または逆転させる量を指す。
【０１３２】
使用方法
シンセカインは、予防目的及び治療目的の両方に有用である。したがって、本明細書で使用される場合、「処置すること」という用語は、疾患の予防及び既存の状態の処置の両方を指すために使用される。ある特定の例では、予防は、疾患または状態を発症するリスクがあると特定された患者において、疾患または状態の発症を抑制すること、または遅延させることを示す。患者の臨床症状を安定化または改善するように、進行中の疾患の処置は、本発明により提供される特に重要な利点である。そのような処置は、望ましくは、罹患組織の機能が喪失する前に実施され、したがって、本発明により提供される予防的治療利益も重要である。治療効果の証拠は、疾患の重症度の任意の減少であってよい。治療効果は、臨床転帰の点で測定することができるか、または免疫学的もしくは生化学的試験により決定することができる。処置される患者は、哺乳動物、例えば、ヒトを含む霊長類、であってよく、実験動物、例えば、ウサギ、ラット、マウスなど、特に、治療の評価の場合、ウマ、イヌ、ネコ、家畜などであってよい。
【０１３３】
治療用製剤の投薬量、例えば、医薬組成物は、状態の性質、投与の頻度、投与の方法、宿主からの薬剤のクリアランスなどに応じて大きく変動する。特定の実施形態では、初期用量は、より大きいもの、続いて、より少ない維持用量とし得る。ある特定の実施形態では、用量は、有効な投薬量レベルを維持するために必要に応じて、週に１回もしくは２週に１回のような低頻度で投与し、または、より頻繁に小用量に細分し、１日に１回、半週に１回、もしくは別の方法で投与することができる。
【０１３４】
本発明の一部の実施形態では、シンセカインを含む組成物または製剤の投与は、局所投与により実施される。局所投与は、本明細書で使用される場合、局所投与することを指すだけでなく、処置の部位で体内に注射または他の導入も指し得る。そのような投与の例としては、筋肉内注射、皮下注射、腹腔内注射などが挙げられる。他の実施形態では、シンセカインを含む組成物または製剤は、全身的に、例えば、経口または静脈内に、投与される。一実施形態では、シンセカインを含む製剤の組成物は、注入、例えば、一定期間、例えば、１０分、２０分、３分、１時間、２時間、３時間、４時間またはそれ以上にわたる連続注入、により投与される。
【０１３５】
本発明の一部の実施形態では、組成物または製剤は、活性の急速で著しい増加を得るために、短期ベースで投与、例えば、単回投与、または、例えば１、２、３日以上、最大１もしくは２週間にわたって実施される一連の投与で、投与される。投与される用量のサイズは、医師により決定されなければならず、疾患の性質及び重大性、患者の年齢及び変更状態、ならびに患者の薬物自体に対する耐性などの多数の要因に依存する。
【０１３６】
本発明のある特定の方法では、所望の効果を達成するために、例えば、シグナル伝達、増殖などを増強するために、細胞を有効量のその組成物と接触させることにより、シンセカインを含む有効量の組成物が細胞に提供される。特定の実施形態では、接触は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｖｏで生じる。特定の実施形態では、細胞は、必要とする対象に由来するか、もしくは必要とする対象内に存在するか、またはシグナル伝達を増加させる。
【０１３７】
本発明の一部の方法では、細胞におけるシグナル伝達を増強するために、有効量の主題の組成物が提供される。生化学的に言えば、有効量または有効用量のシンセカインは、シンセカインの不存在下のシグナル伝達と比較して、細胞内のシグナル伝達を少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％増加させる量である。細胞の活性の調節の量は、生物学の当業者に既知の多数の方法により決定することができる。
【０１３８】
臨床上の意味では、有効用量のシンセカイン組成物は、好適な期間、例えば、少なくとも約１週間、あるいは、約２週間、またはそれ以上、最大約４週間、８週間、またはそれ以上の期間対象に投与される場合、シグナル伝達の欠如に関連する症状の変化を明白に示す用量である。一部の実施形態では、有効用量は、疾患状態の進行を低速または停止させる得るだけでなく、状態の逆転も誘導し得る。初期用量がそのような期間投与され、続いて、一部の場合では、低減した投薬量である維持用量が投与されてもよいことが、当業者らに理解される。
【０１３９】
投与されるべき有効量または有効用量のシンセカイン組成物の計算は、当業者の技術の範囲内であり、当業者には日常的である。言うまでもなく、投与されるべき最終量は、投与経路及び処置されるべき障害または状態の性質に依存する。
【０１４０】
主題の方法での使用に適する細胞は、１つ以上の受容体を含む細胞である。接触させるべき細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、つまり、培養物中に存在しても、ｉｎ  ｖｉｖｏで、つまり、対象内に存在してもよい。細胞は、任意の生物由来／任意の生物内であってよいが、好ましくは、ヒト、飼育動物及び家畜、ならびに動物園、実験動物またはペット動物、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、カエル、ゼブラフィッシュ、ショウジョウバエ、虫などを含む哺乳動物由来である。好ましくは、哺乳動物は、ヒトである。細胞は、任意の組織に由来のものであってよい。細胞は、凍結されても、新鮮であってもよい。それらは、初代細胞であっても、細胞株であってもよい。多くの場合、細胞は、レシピエントに導入する前に、ｉｎ  ｖｉｖｏで使用されるか、またはｅｘ  ｖｉｖｏ処置される初代細胞である。
【０１４１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞は、当該技術分野で周知の多数の方法のいずれかにより、シンセカインを含む組成物と接触させてもよい。例えば、組成物は、対象細胞が培養されている培地中の細胞に提供されてもよい。シンセカインをコードする核酸は、対象細胞に、または取り込み、例えば、エレクトロポレーション、塩化カルシウムトランスフェクション、及びリポフェクションを促進するための当該技術分野で周知の条件下で、ベクター上で対象細胞と共培養された細胞に、提供されてもよい。あるいは、シンセカインをコードする核酸は、対象細胞に、またはウイルスを介して対象細胞と共培養された細胞に提供されてもよく、すなわち、細胞を、ペプチドシンセカインポリペプチドをコードする核酸を含むウイルス粒子と接触させる。レトロウイルス、例えば、レンチウイルスは、非分裂細胞をトランスフェクトするために使用することができるので、本発明の方法に特に適する（例えば、Ｕｃｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．９５（２０）：１１９３９−４４を参照のこと）。一般に使用されるレトロウイルスベクターは、「不完全」であり、すなわち、生産的な感染に必要なウイルスタンパク質を産生することができない。むしろ、ベクターの複製は、パッケージング細胞株の成長を必要とする。
【０１４２】
同様に、ｉｎ  ｖｉｖｏの細胞は、ペプチド、小分子、または核酸を対象に投与するための当該技術分野で周知の多くの方法のいずれかにより、主題のシンセカイン組成物と接触させてもよい。シンセカイン組成物は、様々な製剤または医薬組成物に組み込むことができ、これは、一部の実施形態では、全長タンパク質の製剤について記載されているように、界面活性剤、リポソームなどの不存在下で製剤化される。
【０１４３】
一部の実施形態では、疾患または損傷組織の処置に使用され、組織再生に使用され、細胞成長及び増殖で使用され、且つ／または組織操作に使用される本発明の化合物が投与される。特に、本発明は、老化、外傷、感染、または他の病的状態に起因する組織損失または損傷の処置に使用される、ｗｎｔシンセカイン、または本発明による１つ以上のシンセカインを含む組成物を提供する。
【０１４４】
一部の実施形態では、シンセカインは、免疫エフェクター細胞に作用し、免疫応答を調節する。例えば、炎症性疾患に関与する経路が標的化されてもよい。炎症は、免疫系が感染または組織損傷に応答するプロセスである。炎症性疾患は、感染もしくは組織損傷の不存在下で、または病気を引き起こす応答レベルで、病気を引き起こす免疫系の活性化からもたらされる。炎症性疾患は、自己免疫疾患を含み、これは、身体の健康な細胞及び／または組織で、誤って向けられる免疫により引き起こされる任意の疾患である。自己免疫疾患は、自己タンパク質、自己ポリペプチド、自己ペプチド、及び／または身体（例えば、膵臓、脳、甲状腺、もしくは胃腸管）内の器官、組織、または細胞型の損傷及び／もしくは機能不全を引き起こす他の自己分子を異常に標的として、疾患の臨床症状を引き起こすＴリンパ球及びＢリンパ球を特徴とする。自己免疫疾患は、特定の組織に影響を及ぼす疾患、及び複数の組織に影響を及ぼし得る疾患を含み、これは、部分的には、応答が、特定の組織に限定される抗原に、または体内に広く分布している抗原に、向けられるか否かに依存し得る。
【０１４５】
免疫システムは、自己抗原に対する応答を防ぐと同時に、様々な外来病原体から哺乳動物を保護するための応答を生じるように設計された非常に複雑な機序を用いる。応答するか否かの決定（抗原特異性）に加えて、免疫系は、各病原体に対応する適切なエフェクター機能（エフェクター特異性）も選択しなければならない。目的の炎症性疾患は、２次性進行型多発性硬化症（ＳＰＭＳ）、原発性進行性多発性硬化症（ＰＰＭＳ）、視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、乾癬、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、潰瘍性大腸炎、クローン病、強直性脊椎炎（例えば、Ｍｅｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｃｌｉｎ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．３０：２６９−２７３を参照のこと）、１型（ＩＤＤＭ）、喘息、慢性閉塞性肺障害（ＣＯＰＤ）、慢性肝炎、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、アテローム性動脈硬化／心血管疾患、及び肥満／メタボリック症候群を含むが、これらに限定されない。
【０１４６】
他の実施形態では、シンセカインは、がんの処置のために免疫エフェクター細胞を活性化するか、またはがん細胞の死を誘導するか、もしくは成長を減少させるための経路を活性化する。本明細書で使用される「がん」という用語は、細胞の異常な制御不能な成長により引き起こされる様々な状態を指す。「がん細胞」と呼ばれる、がんを引き起こすことができる細胞は、制御不能な増殖、不死、転移能、急速な成長、及び増殖速度、ならびに／または特定の代表的な形態学的特徴などの特性を有する。がんは、限定されないが、（例えば、臨床的または放射線学的手段による）腫瘍（複数可）の存在を検出すること、腫瘍内または別の生体試料由来の細胞を試験すること（例えば、組織生検から）、癌を示す血液マーカーを測定すること、及び癌を表す遺伝子型を検出することを含む様々な方法のいずれかで検出することができる。しかし、上記の検出方法のうちの１つ以上における陰性結果により、必ずしもがんが存在しないことが示されるわけではなく、例えば、がん処置に完全奏効を示している患者は、その後の再発により明らかなように、依然としてがんを有し得る。
【０１４７】
本明細書で使用される「がん」という用語は、癌腫（例えば、上皮内癌、浸潤癌、転移癌）及び前悪性状態、すなわち、組織学的起源に依存しない新形態の変化を含む。「がん」という用語は、罹患組織または細胞凝集のいかなる段階、グレード、組織形態学的特徴、侵襲性、攻撃性、または悪性度にも限定されない。特に、０期がん、Ｉ期がん、ＩＩ期がん、ＩＩＩ期がん、ＩＶ期がん、グレードＩがん、グレードＩＩがん、グレードＩＩＩがん、悪性がん、及び原発がんが含まれる。
【０１４８】
処置することができるがん及びがん細胞は、白血病、リンパ腫、及び骨髄腫を含む血液癌、ならびに例えば、脳の腫瘍（神経膠芽腫、髄芽腫、星状細胞腫、乏突起膠腫、上衣腫）を含む固形がん、癌腫、例えば、肺、肝臓、甲状腺、骨、副腎、脾臓、腎臓、リンパ節、小腸、膵臓、結腸、胃、乳房、子宮内膜、前立腺、精巣、卵巣、皮膚、頭頸部、及び食道を含むが、これらに限定されない。
【０１４９】
本発明のシンセカインはまた、非治療的方法、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究方法に広く適用されている。シンセカインは、ｉｎ  ｖｉｖｏで細胞に直接投与されても、経口、静脈内、もしくは当該技術分野で既知の他の方法により患者に投与されても、ｅｘ  ｖｉｖｏで細胞に投与されてもよい。本発明のシンセカインがｅｘ  ｖｉｖｏで細胞に投与される一部の実施形態では、これらの細胞は、シンセカインの投与前、投与後、または投与中に、患者に移植されてもよい。
【０１５０】
ここで、本発明を完全に説明したが、本発明の趣旨または範囲から逸脱することなく、種々の変更及び修正を行うことができることは、当業者に明らかである。
【０１５１】
実験
シンセカイン：非天然受容体二量体を介して強制的にシグナル伝達させる合成サイトカイン及び成長因子アゴニスト
サイトカイン及び成長因子リガンドは通常、ＪＡＫ／ＴＹＫを介するホモもしくはヘテロ二量体の細胞表面受容体またはＲＴＫ媒介性リン酸化を通してシグナル伝達する。しかし、自然に発生するそのような受容体対形成の数は、ゲノム内にコードされた内因性リガンドにより駆動されるものに限られている。本発明者らは、内因性サイトカインにより形成されていないサイトカイン受容体対形成を駆動し、且つ異なるシグナル伝達プログラムを活性化する合成サイトカイン（シンセカイン）を操作している。広範囲の非天然サイトカイン受容体ヘテロ二量体が、シグナル伝達する能力があることを、本発明者らは示す。本発明者らは、自然に発生しないＩＬ−２Ｒβ／ＩＬ−４ＲαまたはＩＬ−４Ｒα／ＩＦＮＡＲ２受容体ヘテロ二量体を組み立てたシンセカインを設計して、天然のＩＬ−２、ＩＬ−４、及びＩＦＮサイトカインで活性化されるものとは異なるシグナル伝達及び機能的応答を引き起こした。さらに、ＪＡＫ／ＳＴＡＴサイトカイン受容体を受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）と二量体化したハイブリッドシンセカインリガンドは、シグナル伝達産物も誘発した。シンセカインは、ヒトゲノム内にコードされた二量体シグナル伝達受容体の完全な組み合わせ範囲を活用するための、合成「オーファン」リガンドの新しいファミリーである。
【０１５２】
ＪＡＫ／ＳＴＡＴサイトカイン受容体の場合、いくつかの系において、サイトカイン受容体の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）が、無関係な受容体の細胞内ドメイン（ＩＣＤ）に融合している遺伝子改変キメラ受容体が、リガンド依存的な方法でシグナル伝達を活性化したことが以前に示されている。しかし、この概念が実際に有用であるために、内因性受容体を共最適化し、且つ未改変細胞及び組織上で非天然二量体を組み立てる可溶性リガンドが必要とされる。これは、天然の内因性サイトカインにより形成されないサイトカイン受容体対の形成を駆動する合成サイトカイン、またはシンセカインにより達成することができる。
【０１５３】
シンセカインは、ゲノムにコードされたサイトカインと比較して、新しいシグナル伝達プログラムを活性化して、固有の免疫調節活性を誘発することができ、新しい機能を有するほぼ無制限供給のリガンドを提供する。以前の研究は、ポリペプチドリンカーを介して２つのサイトカインを遺伝的に融合させることにより、新しい活性を促進して、天然受容体シグナル伝達二量体の二量体をもたらすサイトカインバリアントの操作を報告している。このアプローチの重要な注意点は、２つの連結しているサイトカインがそれら単独で完全に活性であり、２つの天然のサイトカインシグナル伝達二量体の相加的な組み合わせをもたらすことである。それ故、それらは、一対の同族受容体のみを発現する細胞で、ならびに、２つのサイトカインに関与する４つの受容体サブユニットを発現する細胞で、シグナル伝達を活性化して、混合表現型をもたらし得る。したがって、これらの連結されたリガンドにより示される差次的な活性の分子的機序は不明である。
【０１５４】
応答性細胞の表面上の代表的な分子的に規定された１：１の化学量論で、２つの異なるサイトカイン受容体を二量体化させるサイトカインリガンド（シンセカイン）を操作すると、相加的ではなく、独自のシグナル伝達産物をもたらす代替アプローチが提示される。ゲノムにコードされたサイトカインにより形成されるような、規定された二量体複合体を形成すると、これらのリガンドが関与する新しいシグナル伝達プログラム及び活性を誘発するシグナル伝達複合体の性質に対する正確な機序的洞察が可能になる。シンセカインにより誘発されるシグナル伝達は、連結されたサイトカインのものよりも均一で標的化され、それにより、標的外効果に起因する多面発現性及び潜在的な毒性が減少する。シンセカインのアプローチにより、非天然サイトカイン受容体対が調査され、それらがシグナル伝達を活性化するか否かが決定されることが可能になる。
【０１５５】
この考えの一般性を調査するために、本発明者らは、共通の二量体化ユニットとして直交する細胞外ドメインを使用して、サイトカイン受容体細胞内ドメインに融合している１０×１０マトリックスのキメラサイトカイン受容体対を表して特性決定し、１００の異なるサイトカイン受容体二量体のシグナル伝達の評価を可能にした。このキメラ受容体マトリックスでサンプリングされたほとんどのサイトカイン受容体対は、シグナル伝達を活性化した。第２ステップでは、本発明者らは、遺伝的に、細胞表面上の非天然のサイトカイン受容体対を二量体化させるシンセカインを操作するために、ポリペプチドリンカーを用いて、ＩＬ−２、ＩＬ−４、及びインターフェロン（ＩＦＮ）の２つのアンタゴニストバージョンを遺伝的に融合させた。操作されたシンセカインによる細胞株及び末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の刺激は、親サイトカインとは異なるシグナル伝達及び細胞シグネチャーを明らかにした。
【０１５６】
本発明者らは、ｃ−ｋｉｔチロシンキナーゼ受容体、及びトロンボポエチン受容体（ＴｐｏＲ）、ＪＡＫ／ＳＴＡＴサイトカイン受容体を二量体化させるシンセカインの概念を拡張し、これにより、対応する内因性リガンドにより誘導されたものと質的に異なる測定可能なシグナル伝達産物をもたらした。本発明者らの結果は、非天然のＪＡＫ／ＳＴＡＴ及びＲＴＫ受容体の対の二量体化が、新たに発見されたオーファンサイトカインリガンドであるかのような機能的な結果を調査することができる新しいシグナル伝達プログラム及び活性を生じる実行可能なアプローチであるという概念の証拠として役立つ。
【０１５７】
キメラサイトカイン受容体により誘導されるシグナル活性化。多数の実施された非天然サイトカイン受容体二量体間のＪＡＫ／ＳＴＡＴクロストークの可能性を最初に決定すればよいと、本発明者らは考えた（図１Ａ）。本発明者らは、ＩＬ−１受容体（ＩＬ−１Ｒ１及びＩＬ−１Ｒ１Ａｃｐ）の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を、１０個の異なるサイトカイン受容体の膜貫通型（ＴＭ）及び細胞内ドメイン（ＩＣＤ）に融合させた数々のキメラ受容体を生成し、可能な受容体対の組み合わせの１０×１０マトリックスを生成した（図１Ｂ）。本発明者らは、２つの理由、すなわち１）ＩＬ−１は、受容体に対して非常に高い親和性で結合し、これより、低い受容体発現レベルであってもシグナル活性化が可能になり、２）ＩＬ−１は、標準的なＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路を介してシグナル伝達せず、内因性ＩＬ−１受容体の二量体化から生じるバックグラウンド活性を排除するという理由で、ＩＬ−１系を使用した。ＳＴＡＴ４を除く全てのＪＡＫ及びＳＴＡＴを発現するＪｕｒｋａｔ細胞に、示された組み合わせのキメラ受容体でエレクトロポレーションし、ＩＬ−１Ｒ１及びＩＬ−１Ｒ１Ａｃｐ表面発現の場合フローサイトメトリー（図２Ｄ）で、及びＩＬ−１依存性シグナル活性化の場合ウェスタンブロット（図２Ａ及び図２Ｅ）で分析した。
【０１５８】
ほとんどのＩＬ−１受容体の組み合わせが強力な細胞表面発現を示したが、非常に低レベルの発現が、一部の受容体対について検出された。但し、これは、ＩＬ−１刺激によるシグナル伝達の検出に大きな影響を及ばさなかった（図２Ｅ）。６つのＳＴＡＴのリン酸化を示す二値ヒートマップが、図２Ａに示される。赤い四角は、シグナル伝達を示し、黒い四角は、シグナル伝達がないことを示す。予想通り、ＳＴＡＴ２及びＳＴＡＴ４が、低いＳＴＡＴ２発現及びＪｕｒｋａｔ細胞におけるＳＴＡＴ４の発現の欠如に起因して、いかなる受容体結合によっても活性化されなかった（図２Ａ）。ＳＴＡＴ１及びＳＴＡＴ６タンパク質は、それぞれ、ＩＦＮＡＲ２及びＩＬ−４Ｒαを含有するキメラ受容体対によってのみ活性化され、ＩＦＮならびにＩＬ−４及びＩＬ−１３サイトカインによるこれら２つのＳＴＡＴの特異的活性化と一致した（図２Ａ）。
【０１５９】
対照的に、ＳＴＡＴ３及びＳＴＡＴ５タンパク質は、サイトカインによるこれら２つのＳＴＡＴのより多面的な使用と一致して、多くのキメラ受容体対の組み合わせで活性化された（図２Ａ）。受容体対の組み合わせの大部分は、シグナル伝達を活性化したが、本発明者らは、ＩＬ−２Ｒβホモ二量体及びＩＬ−１３Ｒα１ホモ二量体（図２Ａ及び図２Ｅ）などの強力な表面発現にもかかわらず生産的なシグナル伝達を誘導しなかった受容体対も発見した（図２Ｄ）。全体的な本発明者らのデータは、試験したほとんどの受容体二量体の組み合わせがＳＴＡＴタンパク質を活性化したことを示しており、サイトカイン−サイトカイン受容体システムの高い可塑性を明らかにしている。
【０１６０】
ＪＡＫ２／ＪＡＫ３サイトカイン受容体対によりもたらされるシグナル活性化。本発明者らのキメラ受容体研究の１つの顕著な観察結果は、ＪＡＫ２及びＪＡＫ３を対にするキメラ受容体の組み合わせ（すなわち、エリスロポエチン受容体（ＥｐｏＲ）／γｃ及びＩＬ−２３Ｒ／γｃ）がシグナル伝達を活性化できないことであった。興味深いことに、ＪＡＫ２／ＪＡＫ３の対は、自然界には見られず、この対によるシグナルの活性化の欠如が、クロス活性化を妨げるこれら２つのキナーゼ分子間の立体的衝突または適合しない形状に起因し得るか否かの疑問を呈する。
【０１６１】
この仮説を試験するために、本発明者らは、ＥｐｏＲの膜近傍ドメインにアラニン残基を挿入し、これは、受容体の膜近傍領域のレジスターを変更することによりシグナル伝達を調節することが示されている。具体的には、ＥＰＯＲ  ＩＣＤのＲ251 の後に、１〜４つのアラニンを挿入した（図２Ｂ）。これらのＥｐｏＲ変異体をＩＬ−１Ｒ１  ＥＣＤに融合させ、Ｊｕｒｋａｔ細胞でＩＬ−１Ｒ１Ａｃｐ−ＩＦＮＡＲ２（陽性対照）またはＩＬ−１Ｒ１Ａｃｐ−γｃと共に共トランスフェクトした（図２Ｆ）。ＥｐｏＲの膜近傍ドメインへの１、３、または４つのアラニンの挿入は、ＩＦＮＡＲ２と対にされた場合には、シグナル伝達能力には影響しなかったが、２つのアラニンの挿入は、この受容体対によるシグナル伝達を妨げた（図２Ｃ）。ＥｐｏＲの膜近傍ドメインへの１または３つのアラニンの挿入は、ＥｐｏＲ／γＣ（ＪＡＫ２／ＪＡＫ３）受容体対によるシグナル伝達を回復せず、４つのアラニンの挿入は、シグナル伝達をわずかに回復し、２つのアラニンの挿入は、この受容体対によるシグナル活性を完全に回復した（図２Ｃ）。
【０１６２】
これらの結果は、これらの２つのキナーゼが本発明者らのキメラ受容体系においてシグナル伝達を引き起こすことを防ぐＪＡＫ２及びＪＡＫ３間の構造的制約の存在を示唆する。しかし、ＪＡＫ２及びＪＡＫ３を使用して、非天然受容体対のリガンド−受容体の形状を変化させることが、シグナル伝達を回復する実行可能な選択肢であることを、この実験は明らかにする。
【０１６３】
以前に、シンセカインリガンドでＥｐｏＲの二量体の形状を変更すると、差次的なシグナル伝達産物がもたらされることを、本発明者らは示しており、したがって、シンセカインはこのパラメーターを活用することもでき得る。ＪＡＫ２／ＪＡＫ３の対に加えて、本発明者らは、シグナル伝達を活性化することができない他のキメラ受容体対を認めた。膜近傍ドメインへのアラニンの挿入が、これらの受容体によるシグナル伝達を回復するか否かを、本発明者らは問うた。ＩＬ−２Ｒβ、ＩＬ−１２Ｒβ、及びＥｐｏＲの膜近傍ドメインへのアラニンの挿入は、ＩＬ−２Ｒβ−ＩＬ−２Ｒβ、ＩＬ−１２Ｒβ−ＩＬ−２３Ｒ、及びＥｐｏＲ−ＥｐｏＲペアによるシグナル伝達を回復しなかった（図２Ｇ）。
【０１６４】
驚くべきことに、ＩＬ−１２Ｒβ−ＩＬ−２３Ｒ及びＥｐｏＲ−ＥｐｏＲの対は、それぞれＩＬ−２３とＥＰＯとが関与する受容体二量体を表している。ＩＬ−１受容体の細胞外の配向及び近接性は、一部の天然及び非天然のサイトカイン受容体対に好ましくない可能性が最も高いと、本発明者らは考える。これは、本発明者らが使用したキメラ受容体の方策の技術的制約であり、対の一部のシグナル伝達の欠如は、特定のＪＡＫ／ＴＹＫ／ＳＴＡＴの組み合わせが本質的に機能できないことによるものではない。キメラＩＬ−１受容体の実験からの総合的な結果は、ほとんどではないにしても、多くの非天然サイトカイン受容体対が、１つ以上のＳＴＡＴを介してシグナル伝達し得るが、ある特定の対が、シンセカインに依存する異なる二量体の配向及び近接性を有することである。
【０１６５】
シンセカインにより誘発されるシグナル活性化プロファイル。シンセカインによる非天然サイトカイン受容体対の二量体化が未改変細胞のシグナル伝達を活性化するか否かを調査したいと、本発明者らは考えた（図３Ａ）。本発明者らは、本発明者らが２つのサイトカインを一緒に融合した二重特異性方策を使用した。これらのうちのそれぞれは、２つの受容体のうち１つにしか結合することができず、それにより、規定された１：１受容体二量体が生成される。このアプローチを実行するために、本発明者らは、低親和性受容体サブユニット（ＩＬ−４に対するＩＬ−１３Ｒα１及びγｃ、ＩＬ−２に対するγｃ、ならびにＩＦＮに対するＩＦＮＡＲ１）への結合が破壊されていることを除いて、高親和性受容体サブユニット（ＩＬ−４に対するＩＬ−４Ｒα、ＩＬ−２に対するＩＬ−２Ｒβ、及びＩＦＮに対するＩＦＮＡＲ２）への結合を保存するＩＬ−４、ＩＬ−２、及びＩＦＮのアンタゴニスト、または「ドミナントネガティブ（ＤＮ）」バージョンを操作した。これらの「ＤＮ」サイトカインは、それら単独で、シグナル伝達活性がない高親和性結合モジュールとして機能する。予想通り、野生型サイトカインは、Ｈｕｔ７８  Ｔ細胞株においてシグナル伝達を活性化したが（図３Ｂ）、ドミナントネガティブ変異体は、ＩＬ−２Ｒβ受容体サブユニットに対して２００倍増強した親和性を有する、示されたＳｕｐｅｒ−２を促進することができなかった（図３Ｂ）。
【０１６６】
次に、本発明者らは、ドミナントネガティブサイトカイン変異体の対をＧｌｙ4 ／Ｓｅｒリンカーと遺伝的に融合させて、ＩＬ−２Ｒβ−ＩＬ−４Ｒα及びＩＬ−４Ｒα−ＩＦＮＡＲ２非天然受容体二量体の形成を誘導する新しいリガンドを生成した（図３Ａ）。未改変細胞株に添加される場合、これらの二重特異性ＤＮシンセカインは、親サイトカインにより誘導されるものと質的及び量的に異なるシグナル伝達プロファイルを活性化した（図３Ｄ）。
【０１６７】
ＩＦＮＡＲ２及びＩＬ−４Ｒαの二量体化を促進するＳＹ１  ＳＬによるＨｕｔ７８細胞の刺激は、ＳＴＡＴ５及びＳＴＡＴ６の活性化をもたらした（図３Ｄ）。特に、これら２つのドミナントネガティブタンパク質を１０残基（ＳＹ１  ＬＬ）で連結させるポリペプチドリンカーを長くすると、このシンセカインにより示されたシグナル伝達能を増加させた（図３Ｄ）。ＩＬ−２Ｒβ及びＩＬ−４Ｒαを二量体化させるＳＹ２シンセカインによるＨｕｔ７８細胞の刺激は、ＳＴＡＴ１の活性化とＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５、ＳＴＡＴ６の活性化の低下とをもたらした（図３Ｄ）。全ての場合において、シンセカインは、ゲノムにコードされたサイトカインで活性化されたものよりも有意に低い最大応答（Ｅｍａｘ）を誘発した。
【０１６８】
重要なことに、シンセカインで活性化される異なるシグナル伝達プログラムは、親サイトカインのペアを同時に添加することにより誘導されたシグナル伝達プログラムが、対応するシンセカインで誘導されるものと異なるので、単に２つの親サイトカインの相加効果の結果ではない（図３Ｅ）。シンセカインで活性化されるシグナル伝達プログラムが、ＩＬ−２、ＩＬ−４、及びＩＦＮで活性化されるものと異なるか否かを判定するために、本発明者らは、ＣＤ４+ Ｔ細胞株Ｈｕｔ７８において、ホスホ−フローサイトメトリーにより、１２０個の異なるシグナル伝達分子の活性化を試験した（図４）。試験された１２０個の分子のうち、２０個がリガンドにより活性化された。天然サイトカインプロファイルは、予想通りであり、Ｓｕｐｅｒ−２は、ＳＴＡＴ５及びＰＩ３Ｋ経路を強く活性化し（図４Ａ及び４Ｂ）、ＩＬ−４刺激は、ＳＴＡＴ６及びＰＩ３Ｋ経路の活性化を強く誘導し（図４Ａ及び４Ｂ）、ＩＦＮは、全てのＳＴＡＴ分子の強い活性化をもたらした（図４Ａ及び４Ｂ）。
【０１６９】
Ｈｕｔ７８細胞が異なるシンセカインで刺激された場合、本発明者らは、これらの操作されたリガンドが関与する新規のシグナル伝達プログラムを検出することができた。ＳＹ１  ＬＬ（ここで、ＳＹ１と呼ばれる）による刺激は、ＳＴＡＴ５及びＳＴＡＴ６を強く活性化し、さらに、より低い程度にＳＴＡＴ１及びＳＴＡＴ３を刺激した（図４Ａ及び４Ｂ）。加えて、このシンセカインは、ＰＩ３Ｋ経路（すなわち、ＧＳＫ３Ｂ、Ａｋｔ、ＲＰＳ６）の強力な活性化を誘導した（図４Ａ）。ＳＹ２刺激は、ＳＴＡＴ１の選択的な活性化を伴い、他のリガンドよりも全体的に弱いシグナルをもたらした（図４Ａ及び４Ｂ）。さらに、サイトカイン及びシンセカインにより誘発されるＳＴＡＴ活性化比は、大きく異なり、ＳＹ１は、ＳＴＡＴ５／ＳＴＡＴ６選好性を示し、ＳＹ２は、ＳＴＡＴ１選好性を示した（図４Ｃ）。ゲノムにコードされたサイトカイン及びシンセカインにより誘発されるシグナル伝達プログラムの主成分分析により、さらに、シンセカインが、親サイトカインが関与する元のプログラムのサブセットだけでなく、異なるシグナル伝達プログラムを活性化することが確認される（図４Ｄ）。
【０１７０】
シンセカインにより誘導される細胞及びシグナル伝達シグネチャー。本発明者らは、マスサイトメトリー（ＣｙＴＯＦ）により、ヒトＰＢＭＣからプロファイルされた３１の細胞集団におけるシンセカイン処置への応答を分析した（図５Ａ及び図５Ｃ）。天然サイトカインは、予想通りに挙動し、Ｓｕｐｅｒ−２は、ＳＴＡＴ５を強く活性化し、さらに、より少ない程度に、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、Ｅｒｋ、及びＳ６Ｒを活性化して、明らかなＴ細胞選好性を示し（図５Ａ）、ＩＬ−４刺激は、Ｌ−４Ｒα及びγｃ受容体サブユニットの遍在的発現と一致して、ＳＴＡＴ６の強力な活性化ならびにＴ細胞及び単球に対する均質なシグナル伝達のフットプリントをもたらした（図５Ａ）。ＩＦＮによる刺激は、以前の観察と一致して、ＳＴＡＴ５及びＳＴＡＴ６の強い活性化ならびにＳＴＡＴ１及びＳＴＡＴ３のより弱い活性化を促進した（図５Ａ）。ＩＦＮ誘導性ＳＴＡＴ活性化プロファイルは、２つの異なる細胞クラスターにマッピングし、Ｔ細胞は、より強いＳＴＡＴ５及びＳＴＡＴ６活性化を誘導し、Ｂ細胞及び単球は、強いＳＴＡＴ６活性化を示すが、弱いＳＴＡＴ５活性化を示す（図５Ａ）。内因性サイトカインにより誘発されたものとは異なるシンセカインにより誘発された細胞シグナル伝達パターンが見られた（図５Ａ）。ＳＹ１シンセカインは、Ｔ細胞において強力なＳＴＡＴ５活性化を誘導したが、ＮＫ、Ｂ細胞、及び単球においてシグナル伝達を活性化できなかった（図５Ａ）。ＳＹ２シンセカインは、ＳＴＡＴ１活性化への小さいバイアスを有する、全ての細胞集団で試験された各シグナルエフェクターの弱いシグナル活性化を誘発した（図５Ａ）。
【０１７１】
シンセカインにより誘導されるサイトカイン分泌プロファイル。リガンド刺激後、細胞外環境で分泌されたサイトカインレベルが、多くの場合、所与のサイトカインにより生じる免疫応答の性質を規定するために使用される。本発明者らは、シンセカイン対天然サイトカインにより誘導されるサイトカイン分泌シグネチャーを試験した。ＰＢＭＣをＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＦＮ、またはシンセカインで刺激し、６３個の異なる分析物のレベルを、ビーズベースの免疫アッセイにより刺激の２４時間後に測定した（図５Ｂ）。Ｓｕｐｅｒ−２及び２つのシンセカインは、サイトカイン分泌を増加させ、ＩＦＮは、中立の効果を有し、ＩＬ−４は、ＰＢＭＣにより分泌されるサイトカインの量を減少させた（図５Ｂ）。
【０１７２】
データのより詳細な分析により、予想通り、ＰＢＭＣのＳｕｐｅｒ−２による刺激が、高レベルのＬＩＦ、ＩＬ−１３、及びＩＦＮγの分泌を促進したことが明らかになった（図５Ｂ）。加えて、Ｓｕｐｅｒ−２は、ＰＢＭＣによるＩＬ−２２及びＣＤ４０Ｌの分泌をもたらした（図５Ｂ）。また、以前の報告と一致して、ＩＦＮ刺激は、ＩＬ−２７の分泌を誘導したが、ＩＬ−４刺激は、休止ＰＢＭＣにより分泌されるサイトカイン下方制御をもたらし、ＩＦＮγが、最も強力に下方制御されたサイトカインであった（図５Ｂ）。２つのシンセカインの刺激プロファイルは、天然サイトカインにより誘導されるものとは異なった。ＳＹ１刺激は、多くのサイトカイン：ＩＬ−１７Ｆ、ＩＬ−２７、ＩＬ−１３、ＩＬ１７Ａ、ＩＦＮγ、ＢＤＮＦ、ＩＬ−２３、ＦＧＦβ、ＰＤＧＦＢＢ、及びＥＮＡ７８の分泌を誘導し、ＳＹ２刺激は、限界レベルのＥｏｔａｘｉｎ、ＢＤＮＦ、及びＰＤＧＦＢＢ分泌をもたらした（図５Ｂ）。
【０１７３】
ＪＡＫ／ＳＴＡＴ受容体を伴うＲＴＫを二量体化させるシンセカインは、シグナル伝達を活性化する。ＪＡＫ／ＳＴＡＴサイトカイン受容体は、二量体化誘導性キナーゼ活性化を介してシグナル伝達するサブセット膜貫通受容体のみを表す。受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）（例えば、ＥＧＦＲ［表皮成長因子受容体］、ｃ−Ｋｉｔなど）は、細胞内キナーゼドメインのトランスリン酸化を介してシグナル伝達する細胞表面受容体の別の大きなファミリーを表す。本発明者らは、ＪＡＫ／ＳＴＡＴサイトカイン受容体及びＲＴＫ間のヘテロ二量体化及び活性化を強制する分子を含むように、シンセカインの範囲を拡張することができるか否かを疑問とする。
【０１７４】
ＲＴＫとのＪＡＫ／ＳＴＡＴ受容体のクロストークの可能性を評価するために、本発明者らは、ＩＬ−１Ｒ１のＥＣＤに上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）のＴＭ及びＩＣＤを融合し、Ｊｕｒｋａｔ細胞内の本発明者らの一連のＩＬ−１Ｒ１ＡｃＰ−サイトカイン受容体ＩＣＤと共にこの構築物をトランスフェクトした（図６Ａ及び６Ｂ）。１０個のサイトカイン受容体／ＥＧＦＲ対全てが、Ｊｕｒｋａｔ細胞の表面上に発現した（図６Ｆ）。ＩＬ−１で刺激すると、ＥＧＦＲの様々な程度のリン酸化、及び、はるかに少ない程度にＳＴＡＴ３及びＳＴＡＴ５タンパク質のリン酸化がもたらされ（図６Ｂ）、これらのサイトカイン及びチロシンキナーゼ受容体が、近接の強化を通して強制される場合に、トランスリン酸化が可能であることを示した。これは、そのようなクロストークの例が天然細胞で発生し得ることを示す以前の研究と一致している。しかし、これらのキメラ受容体研究の注意点は、キナーゼ連結受容体の過剰発現が、異常な人工的なリン酸化事象をもたらし得ることである。それ故、本発明者らは、シンセカインリガンドを使用して、過剰発現がない状態で、自然細胞上で通常発現されるＪＡＫ／ＳＴＡＴ及びＲＴＫ媒介性受容体のヘテロ二量体化を実施しようと試みた。
【０１７５】
本発明者らは、ｃＫＩＴ、チロシンキナーゼ受容体、及びトロンボポエチン受容体（ＴｐｏＲ）、サイトカイン受容体の二量体化を強制するシンセカインを作製した。シンセカイン二重特異性リガンドを作製するために、本発明者らは、ｃＫｉｔまたはＴｐｏＲ  ＥＣＤのいずれかに高親和性で結合する抗体の配列を特定した。本発明者らは、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）としてそれらを再フォーマットし、それぞれを相補的な酸性及び塩基性ロイシンジッパーと融合させること（図６Ｃ）及びそれらを急性巨核芽球性白血病Ｍｏ７ｅ細胞に適用することにより、ヘテロ二量体化を実施した。これらは、ｃＫｉｔ及びＴｐｏＲを発現することが知られている。ＳＹ４及びＳＹ５シンセカインは、バックグラウンドを超えるＭｏ７ｅ細胞のｃＫｉｔの適度なリン酸化を誘導したが、ＳＹ５のみがバックグラウンドを超えるＴｐｏＲ関連ＪＡＫ２の検出可能なリン酸化を誘導した（図６Ｄ）。ＳＹ５は、測定可能なＥｒｋ活性化を誘導した（天然リガンドである幹細胞因子［ＳＣＦ］と比較した５０％Ｅｍａｘ）が、弱いＳＴＡＴ５活性化のみを誘導し、これは、ＴｐｏＲを介したｃＫｉｔの見かけの非対称活性化と一致する（図６Ｅ）。実に、ＪＡＫ２小分子阻害薬を使用したＪＡＫ２の阻害は、ＳＹ５によるＥｒｋ活性化の喪失をもたらし、これらのシンセカインに関与するシグナル伝達プログラムは、少なくとも部分的に、ＪＡＫ２活性に依存することを示唆する（図６Ｇ）。したがって、ＴｐｏＲ／ｃＫｉｔヘテロ二量体内のトランスリン酸化の効率には、非対称性があるようである。本発明者らは、刺激されたＭｏ７ｅ細胞における１２０のシグナル伝達分子のシグナル伝達応答を分析するために、ハイスループットのホスホフローサイトメトリーベースの試験を実施した。
【０１７６】
図７Ａに示されるように、１２０個の異なるシグナル伝達分子のうちの５４個が、異なるリガンドにより有意なしきい値を超えて活性化された。興味深いことに、ＳＹ５により誘発されるシグナル伝達シグネチャーは、試験された経路エフェクターに応じて、ＳＣＦ、ＴＰＯ、または２つのリガンドの組み合わせとは質的に異なる産物を引き起こすように見えた（図７Ｂ及びＣ）。一括して、キメラ受容体及びシンセカインの試験は、天然リガンドと比較して効率が悪いが、ＪＡＫ／ＴＹＫ及びＲＴＫ媒介性シグナル伝達受容体が、クロストーク可能であることを示し、これは、ＪＡＫ及びＲＴＫ構成要素が互いの天然基質をリン酸化可能であることを示唆する以前の研究と一致する。
【０１７７】
この試験では、本発明者らは、「オーファン」または「シンセカイン」サイトカインに大まかに類推することができる合成リガンドを使用して、天然細胞上のキナーゼ連結二量体受容体シグナル伝達の範囲を拡大した。このアプローチは、ＪＡＫ／ＴＹＫ／ＳＴＡＴの完全なコンビナトリアル可能性、及び受容体二量体を介したＲＴＫシグナル伝達を活用することができる。このアプローチを本発明者らが調査するための説得力がある理論的根拠は、免疫療法の可能性にもかかわらず、多くの部分、多面発現及びオフターゲット効果のために、比較的少数のサイトカインが、臨床的に有用であることである。近年、活性がより明確で、毒性が低減したサイトカインバリアントが操作されている。しかし、このアプローチの本質的な制限は、操作されたサイトカインが、親サイトカインが占める生物活性空間内の活性のサブセットを示すことである。
【０１７８】
異なるシグナル伝達プログラムの活性化及び拡張により、免疫活性が、非天然サイトカイン受容体対を二量体化する合成サイトカイン（シンセカイン）の操作を介して達成することができることを示すために、本発明者らは、一連の概念実証実験を実施した。サイトカイン受容体の対形成が高い可塑性は、新しいシグナル伝達活性を誘発するために、シンセカインを活用することができ、健康及び疾患に関連する生物学的プロセスを特異的に標的とする「デザイナー」リガンドを可能にする。本発明者らのデータは、シンセカインが、異なった且つ新規シグナル伝達プログラムを活性化し、刺激されたＰＢＭＣによる新たなサイトカインシグネチャーの分泌を誘導することを示す。
【０１７９】
まず、ほとんどのシンセカインは、親サイトカインのものに部分的に似ているシグナルを誘発するが、活性化されたＳＴＡＴの比率は、サイトカイン及びシンセカイン間で大きく異なる。例えば、ＳＹ１は、ＩＬ−４及びＩＦＮで見られるＳＴＡＴ６＞ＳＴＡＴ１＞ＳＴＡＴ３＞ＳＴＡＴ５パターンでなく、ＳＴＡＴ６＞ＳＴＡＴ５＞ＳＴＡＴ１＞ＳＴＡＴ３パターンを誘発し、ＳＹ２は、ＩＬ−４及びＩＬ−２で見られるＳＴＡＴ６＞ＳＴＡＴ５＞ＳＴＡＴ３＞ＳＴＡＴ１パターンではなく、ＳＴＡＴ１＞ＳＴＡＴ６＞ＳＴＡＴ５＞ＳＴＡＴ３パターンを誘発する。ＳＴＡＴ活性化率の変化は、サイトカイン誘導性生物学的応答を変更させ得る。
【０１８０】
２番目に、シンセカインは、非天然サイトカイン受容体対の二量体化を誘導することを考えると、それらはまた、ＳＴＡＴヘテロ二量体の存在割合を変化させ、新規のＳＴＡＴヘテロ二量体の対の形成を誘導して、完全に新規な遺伝子発現プログラム及び活性の誘導をもたらし得る。シンセカインの生物学は、マウス系及び疾患モデルで試験されてもよい。
【０１８１】
シンセカインの生理学的効果は、天然のサイトカインと同じくらい複雑であるが、非天然の二量体を形成するために使用される親受容体鎖の活性を知ることで、シンセカインによる活性を予測することができる。例えば、一部の場合では、生理学的効果及び疾患適用性が、親受容体鎖のうちの１のものと類似するか、または関連し得るが、他の場合では、全く異なることを、本発明者らは予想する。
【０１８２】
シンセカインの設計パラダイムは、いくつかの重要な考察を包含する。１）同じ細胞で同時に発現される２つのサイトカイン受容体サブユニットの選択。サイトカインに対する細胞応答は、サイトカイン受容体サブユニットの表面発現パターンにより厳密に制御されている。したがって、シグナル伝達と適合性はあるが、２つの受容体サブユニットを同時に発現する天然の細胞サブセットの欠如のために、ｉｎ  ｖｉｖｏでの関連性がない多くのサイトカイン受容体対の組み合わせが存在する。２）シンセカインにより二量体化すべきサイトカイン受容体サブユニットタイプの選択。本発明者のキメラ受容体の試験から、ほとんどのサイトカイン受容体対の組み合わせが、ある程度までシグナル伝達を活性化すると、本発明者らは推測する。しかし、構造特性などの他のパラメーターが、シグナル伝達の活性化の程度及び性質に影響を与え得る。例えば、サイトカイン受容体は、ＩＣＤの長さに基づいて２つのクラスに細別することができる。長いＩＣＤを有する受容体は多くの場合、それらのリガンドに高親和性で結合し、ＪＡＫ１またはＪＡＫ２と対を形成し、ＳＴＡＴ結合部位をコードし、シグナル活性化を駆動する。対照的に、短いＩＣＤを有する受容体は多くの場合、それらのリガンドにより低い親和性で結合し、ＴＹＫ２またはＪＡＫ３と対を形成し、ＳＴＡＴの動員及び活性化への貢献は最小限である。
【０１８３】
興味深いことに、本発明者らのキメラ受容体の試験においてシグナル伝達を活性化しなかった多くの受容体対は、短いＩＣＤ受容体を含み、２つの短いＩＣＤ受容体サブユニットを二量体化させるシンセカインが、長いＩＣＤ受容体サブユニットを二量体化させるものよりも弱く小さい多種多様なシグナル活性化プログラムを誘発することを示唆する。加えて、本発明者らの結果は、２つの異なる細胞表面受容体ファミリー（特に、サイトカイン受容体及びチロシンキナーゼ受容体ファミリー）由来の受容体を二量体化させるシンセカインを生成することができることを示す。
【０１８４】
本発明者らが操作したシンセカインの非常に重要な側面は、規定された１：１の分子実体で、サイトカイン受容体対を二量体化させることであり、これにより、受容体二量体へのシグナル伝達経路の明確な属性づけを可能にする。操作されたリガンドによる、分子的に規定された表面複合体の形成は、これらのリガンドで活性化されるシグナル伝達及び表現型プログラムを特性決定するために、ならびにオフターゲット効果及び／または細胞相互作用から生じる潜在的な毒性を予測するために不可欠である。完全に機能的なサイトカインを連結することにより新規活性を有する合成リガンドの操作おける以前の試みにより、所与の細胞型により発現する受容体サブユニットの存在量及び存在割合に応じて、二量体から四量体までの複数の独立して機能する受容体複合体を形成し得るリガンドを生成した。これらのリガンドは新しい生物活性プログラムを誘発したが、それらが形成する複合体の不均質な性質は、特定の複合体にシグナル伝達もしくは活性シグネチャーを割り当てること、または全身投与から生じ得る毒性がある副作用を予測することを困難にしている。
【０１８５】
対照的に、ドミナントネガティブサイトカイン変異体を使用して表面受容体を二量体化させる本発明者らの標的化アプローチは、本発明者らが特定の二量体対の活性を調べることを可能にする。本発明者らの試験からの一貫した知見は、操作されたシンセカインは、シグナル伝達を活性化することにおいて、親ゲノムにコードされたサイトカインと比較して相対的に効率が悪く、良くても、本発明者らは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、またはＩＦＮにより誘導されるシグナル伝達の大きさの６０％を検出し得たことである。ｃＫｉｔ／ＴｐｏＲヘテロ二量体からのシグナル伝達を引き起こしたシンセカインは、さらに弱い活性化特性を示した。
【０１８６】
この観察に対する１つの説明は、サイトカイン受容体複合体の構造がシグナル能の決定因子であることである。操作されたシンセカインにより誘導される受容体結合トポロジが次善であり、及びシグナル伝達強度が、これらの分子の構造を変更することにより改善することができる可能性がある。
【０１８７】
材料及び方法
タンパク質の発現及び精製。（Ｌａｐｏｒｔｅ  ｅｔ  ａｌ．、２００５）に記載されるバキュロウイルス発現システムを使用して、ヒトＩＬ−４、Ｓｕｐｅｒ−２、ＩＦＮ、ドミナントネガティブサイトカイン、及びシンセカインを発現させ、精製した。ＩＬ−２のＳｕｐｅｒ−２バリアントの配列は（Ｌｅｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、２０１２）で提供される。単一（ＳＹ１  ＳＬ）または二重（ＳＹ１  ＬＬ）Ｇｌｙ4 Ｓｅｒリンカーを介して、ＩＬ−４ＤＮ及びＩＦＮＤＮタンパク質を遺伝的に融合させることにより、ＳＹ１  ＳＬ及びＬＬシンセカインを生成した。Ｇｌｙ4 Ｓｅｒリンカーを介してＩＬ−２ＤＮ及びＩＬ−４ＤＮタンパク質を遺伝的に融合させることにより、Ｓｙ２シンセカインを生成した。共通のγ鎖への結合を妨げる部位ＩＩに、以前に記載されているＲ１２１Ｄ／Ｙ１２４Ｄ変異を導入することにより、ＩＬ−４ＤＮを生成した（Ｗｅｎｚｅｌ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ  Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ、２００７）。ＩＦＮ−ＩＦＮＡＲ１結合界面に変異Ｆ６３Ａ及びＲ１２０Ｅを導入することにより、ＩＦＮＡＲ１への結合を破壊することにより、ＩＦＮＤＮを生成した。ＩＬ−２ＤＮ（ＩＬ−２ＲＥＴＲとしても知られている）は、Ｍｉｔｒａ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２０１５で以前に記載された。Ｎ末端ｇｐ６７シグナルペプチド及びＣ末端ヘキサヒスチジンタグを用いるｐＡｃＧＰ６７Ａベクター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）への可変領域の導入を介して、バキュロウイルスシステムで、ＳＹ３、ＳＹ４、及びＳＹ５の操作に使用される単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を同様に発現させ、精製した。二量体化のために酸性または塩基性ロイシンジッパーのいずれかに融合している１２アミノ酸（Ｇｌｙ4 Ｓｅｒ）3 リンカーにより隔てられている可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）を有する、ｓｃＦｖを発現させた。全てのタンパク質は、Ｃ末端ヘキサヒスチジンタグを含有し、ニッケルクロマトグラフィーで単離し、さらに、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨは７．３）及び１５０ｍＭのＮａＣｌ中で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のサイズ排除クロマトグラフィーで９８％を超える均質性まで精製した。
【０１８８】
キメラ受容体の生成。１０×１０シグナル伝達マトリックスを生成するために、１０個の異なる親サイトカイン受容体のＩＣＤを、ＩＬ−１Ｒ１及びＩＬ−１Ｒ１Ａｃｐ  ＥＣＤと融合させた。ＩＬ−１Ｒ１  ＥＣＤフォーマットにおいて、ＨＡタグをコードするヌクレオチド配列を、天然シグナル配列の末端及びＩＬ−１Ｒ１  ＥＣＤの最初の残基の間に挿入した。各ＩＣＤをＩＬ−１Ｒ１配列の３’末端に融合させた。Ｖ５タグが使用されたことを除いて同じ方法で、ＩＬ−１Ｒ１Ａｃｐキメラをクローン化した。ＳｉｇｎａｌＰ及びＴＭＨＭＭウェブサーバーを使用して、成熟タンパク質及び膜貫通スパンの境界を線引きした。ＩＬ−１Ｒ１に使用されるＤＮＡ配列を、生物としてのホモサピエンス（ｊｃａｔ．ｄｅ）での発現についてコドン最適化し、合成した（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。ＮｈｅＩ及びＫｐｎＩ制限部位（ＮＥＢ）を使用して、ｐｃＤＮＡ３．１＋ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にキメラ受容体をクローニングした。
【０１８９】
組織培養。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、ＤＭＥＭ完全培地（１０％のＦＢＳ、２ｍＭのグルタミン、及びペニシリンストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）が補充されたＤＭＥＭ培地）で培養した。Ｈｕｔ７８細胞を、ＲＰＭＩ完全培地（１０％のＦＢＳ、２ｍＭＬのグルタミン、及びペニシリンストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）が補充されたＲＰＭＩ１６４０培地）で培養した。Ｍｏ７ｅ細胞を、ＩＭＥＭ完全培地（１０％のＦＢＳ、２ｍＭＬのグルタミン、１０ｎＭのＧＭ−ＳＣＦ、及びペニシリンストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）が補充されたＩＭＥＭ培地）で培養した。刺激の前に、ＦＢＳ及びＧＭ−ＣＳＦを欠く改変成長培地で、Ｍｏ７ｅ細胞を一晩飢餓状態にした。全ての細胞株を、５％のＣＯ2 の加湿雰囲気中、３７℃で維持した。
【０１９０】
Ｈｕｔ７８及びＭｏ７ｅの細胞内シグナル伝達試験。ウェル当たり約３×１０5 個のＨｕｔ７８またはＭｏ７ｅ細胞を、９６ウェルプレートにプレーティングし、ＰＢＳＡ緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．２、１％のＢＳＡ）で洗浄し、示されるリガンドの連続希釈液を含有するＰＢＳＡに再懸濁させた。細胞を３７℃で所定の時間刺激し、すぐに１．５％までホルムアルデヒドを添加することにより固定し、続いて、室温で１０分間インキュベートした。次に、細胞を４℃で３０分間、１００％の氷冷したメタノールで透過処理した。固定及び透過処理した細胞を、ＰＢＳＡで２回洗浄し、ＰＢＳＡで希釈した蛍光標識２２検出抗体と共に室温で１時間インキュベートした。ｐＳＴＡＴ３、ｐＳＴＡＴ５、及びｐＳＴＡＴ６抗体を、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。ｐＳＴＡＴ１、ｐＥｒｋ、ｐｃＫｉｔ、ｐＥＧＦＲ抗体を、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。次に、細胞を、ＰＢＳＡ緩衝液で２回洗浄し、蛍光強度（ＭＦＩ）を、Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６フローサイトメーターで定量化した。用量反応曲線を、ロジスティックモデルに適合させ、ＥＣ50値を、未刺激細胞のＭＦＩを差し引いて、野生型サイトカイン刺激により誘発される最大シグナル強度に対し正規化した後、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍデータ分析ソフトウェアで計算した。
【０１９１】
ヒト全血からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の分離。製造業者のプロトコールに従い、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の勾配を使用して、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をヒト全血（Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｂａｎｋ）から単離した。新たに単離されたＰＢＭＣを、マスサイトメトリー試験及びビーズベースのイムノアッセイの両方に使用した。刺激の前に、ＰＢＭＣを、ＲＰＭＩ完全培地で３７℃、５％のＣＯ2 で１時間静置した。
【０１９２】
マスサイトメトリー免疫細胞シグナル伝達分析。このアッセイは、スタンフォード大学のヒト免疫モニタリングセンター（Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒ  ａｔ  Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）で実施した。新しく分離したＰＢＭＣを、９６ウェルプレートに１ウェル当たり５×１０5 個の細胞で播種し、完全ＲＰＭＩ中の示されたリガンドの連続希釈液で、３７℃、５％のＣＯ2 で、２０分間刺激した。次に、室温、パラホルムアルデヒド（最終濃度１．５％）中で１０分間インキュベートすることより、細胞を固定した。細胞を、洗浄し、金属キレート化ポリマー標識抗表面抗原抗体を含有するＣｙＦＡＣＳ緩衝液（２％のＢＳＡ、２ｍＭのＥＤＴＡ、及び０．１％のアジ化ナトリウムが補充されたＰＢＳ）に室温で３０分間再懸濁した。ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、またはＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製の精製された未コンジュゲートの担体タンパク質不含ストック由来の抗体を標識化し、ポリマー及び金属同位体は、ＤＶＳ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ製であった。細胞をＣｙＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し、次に、−８０℃のメタノール中で一晩透過処理した。翌日、細胞を、ＣｙＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し、金属キレート化ポリマー標識抗細胞内抗原抗体を含有するＣｙＦＡＣＳ緩衝液に室温で３０分間再懸濁した。細胞を、ＰＢＳ（ｐＨ７．２のリン酸緩衝生理食塩液）中で２回洗浄し、イリジウム含有ＤＮＡインターカレーター（ＰＢＳ中１：２００希釈、ＤＶＳ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に再懸濁し、２０分間氷上でインキュベートした。次に、細胞を、ＭｉｌｌｉＱ水で３回洗浄し、次に、ＣｙＴＯＦ装置（ＤＶＳ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に注入する前に、ＭｉｌｌｉＱ水中に７００μＬの総体積で希釈した。インターカレーターからのイリジウム同位体に基づいて細胞を、次に、１つのインターカレーターイリジウム同位体対細胞長のプロットに基づいてインタクトなシングレットをゲーティングし、続いて、細胞サブセット固有のゲーティングを行うことにより、ＦｌｏｗＪｏ（ＣｙＴＯＦ設定）を使用して、データ解析を実施した。各条件に対するシグナル強度が、刺激されていない対照試料のものを差し引いた９０番目のパーセンタイル強度として報告される。ＴＭ４  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙソフトウェアセット（Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（Ｓａｅｅｄ  ｅｔ  ａｌ．、２００３）を使用して、各処置の最大濃度に対する応答のヒートマップを生成し、各細胞型における最大シグナルエフェクター応答に対してシグナル強度を正規化した。マスサイトメトリー実験の２つの独立した複製を実施し、同様の結果が得られた。
【０１９３】
ビーズベースのイムノアッセイサイトカイン分泌試験。このアッセイを、スタンフォード大学のヒト免疫モニタリングセンター（Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒ  ａｔ  Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）で実施した。新たに単離したＰＢＭＣ（１ウェル当たり１．５×１０5 個）を、完全ＲＰＭＩ中１ｇ／ｍｌのフィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）の存在下で、示されたリガンドで刺激し、３７℃、５％のＣＯ2 で２４時間インキュベートした。次に、細胞を、遠心分離によりペレット化し、上清を、ＬＵＭＩＮＥＸ（登録商標）プラットフォーム（Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して、ビーズベースの免疫アッセイ分析のために採取した。ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ製ヒト６３プレックスキットを、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘから購入し、下記のように修正を加えた製造業者の推奨に従って使用した。要約すると、ビーズを９６ウェルプレートに添加し、Ｂｉｏｔｅｋ  ＥＬｘ４０５ウォッシャーで洗浄した。採取された上清を、混合抗体連結ビーズを含有するプレートに添加し、室温で１時間インキュベートし、続いて、４℃で一晩振とうしながらインキュベートした。低温及び室温でのインキュベーションステップを、５００〜６００ｒｐｍのオービタルシェーカーで実施した。一晩のインキュベーションの後、プレートをＢｉｏｔｅｋ  ＥＬｘ４０５ウォッシャーで洗浄し、ビオチニル化検出抗体を室温で７５分間振とうしながら添加した。プレートを、上記のように再度洗浄し、ストレプトアビジン−ＰＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加した。室温で３０分間インキュベートした後、最終洗浄を上記のように実施し、リーディング緩衝液をウェルに添加した。プレートを、サイトカイン当たり試料当たり５０ビーズの下限のＬＵＭＩＮＥＸ（登録商標）２００装置で分析した。カスタムアッセイコントロールビーズ（Ｒａｄｉｘ  Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）を全てのウェルに添加した。各試料は２回ずつ測定し、２回の測定から未加工のＭＦＩを平均した。結果は、ＰＨＡのみで刺激された対照細胞と比較した、処理された細胞のＭＦＩにおける倍数変化として表される。
【０１９４】
Ｐｒｉｍｉｔｙ  Ｂｉｏ  Ｐａｔｈｗａｙフェノタイピング。Ｈｕｔ７８またはＭｏ７ｅ細胞を、飽和濃度の示されたリガンドで、１５、６０、及び１２０分間刺激し、１％のＰＦＡで室温で１０分間固定した。標準プロトコール（Ｋｒｕｔｚｉｋ  ａｎｄ  Ｎｏｌａｎ、２００３）に従い、抗体染色用の固定された細胞を調製した。要約すると、固定された細胞を、９０％のメタノールで１５分間透過処理した。次に、示されたマーカーに特異的な抗体のパネルで細胞を染色し（Ｐｒｉｍｉｔｙ  Ｂｉｏ  Ｐａｔｈｗａｙフェノタイピングサービス）、ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カルフォルニア州サンノゼ）で分析した。刺激された試料のＭＦＩのｌｏｇ2 比を、刺激されていない対照試料で割った値を、応答の尺度として計算した。
【０１９５】
ウェスタンブロット分析。細胞を１％のＮＰ−４０溶解緩衝液で溶解させ、３０μｇのタンパク質を、記載されているように分析した（Ｍａｒｉｊａｎｏｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ．、２００７）。抗リン酸化Ｔｙｋ２、抗リン酸化ＳＴＡＴ１、抗リン酸化ＳＴＡＴ２、抗リン酸化ＳＴＡＴ３、抗リン酸化ＳＴＡＴ４、抗リン酸化ＳＴＡＴ５、抗リン酸化ＳＴＡＴ６、抗リン酸化ＥＧＦＲ、抗リン酸化ｃＫｉｔ  ｐＹ７０３（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、マサチューセッツ州ビバリー）のポリクローナル抗体を使用した。シグナルを、ＥＣＬ増強化学発光ウェスタンブロット試薬であるＷｅｓｔｅｒｎ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｌｕｓ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で明らかにした。
【０１９６】
エレクトロポレーション。０．５〜１．０×１０6 個／ｍｌの密度で維持された１５〜２０×１０6 個のＪｕｒｋａｔ細胞を、ＲＰＭＩ培地（滅菌）で２回洗浄し、０．２５ｍｌのＩｎｇｅｎｉｏエレクトロポレーション溶液（Ｍｉｒｕｓｂｉｏ）に再懸濁した。５〜３０μｇのＤＮＡ（総体積の１５％を超えない）を再懸濁したＪｕｒｋａｔ細胞に添加し、混合物を４ｍｍギャップのキュベット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に移し、１５〜２０分間室温でインキュベートした。細胞を、０．２８ｋＶ及び９６０μＦに設定されたＢｉｏｒａｄエレクトロポレーターでエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、細胞を予め温めた培地（ペニシリン／ストレプトマイシンを含まない）に移して、標準的に培養した。２４時間後に、タンパク質発現を監視した。
【０１９７】
細胞表面受容体の染色。ＨＡ及びＶ５タグに特異的な蛍光標識モノクローナル抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して、表面受容体レベルを、（Ｍａｒｉｊａｎｏｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ．、２００７）に記載されているように監視した。エレクトロポレーションされたＪｕｒｋａｔ細胞を、３％のウシ胎児血清を含有する冷ＰＢＳに再懸濁し、１時間示された抗体と共にインキュベートした。試料をＡｃｃｕｒｉ  Ｃ６フローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。
【０１９８】
実施例２
三量体シンセカイン
Ｇｌｙ／Ｓｅｒポリペプチドリンカーを使用して、サイトカイン（ＩＬ−２）をＩＬ−４Ｒαと結合したｓｃＦｖ（一価抗体）に連結した。この新しい分子実体は、３つのサイトカイン受容体ポリペプチド、すなわちγｃ、ＩＬ−２Ｒβ、及びＩＬ−４Ｒαに結合した。三量体シンセカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、またはＩＬ−２及びＩＬ−４の組み合わせのいずれの処理により活性化されたものとも異なるシグナル伝達シグネチャーを誘発した。加えて、この新しいサイトカインは、単球から、図８〜図１５に示される食作用活性が高い樹状細胞の特徴がないサブセットへの分化を誘導した。一部の実施形態では、新規シンセカインの組成物が提供される。一部の実施形態では、単球の集団を、有効量の三量体シンセカインとｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで接触させる。一部の実施形態では、三量体シンセカインで単球から分化した食細胞集団が提供される。
【０１９９】
実施例３
Ｉ型及びＩＩＩ型ＩＦＮ受容体を二量体化させるシンセカイン
ＩＦＮλＲ１結合配列（Ｈ１１ＤＮ）及びＩＦＮＡＲ１結合配列（ＩＦＮＷＤＮ２）を含むシンセカイン（ＳＹ６）を生成した。完全なシンセカイン配列は、配列番号１で提示される。このようにして生成されたシンセカインは、ＩＦＮＡＲ１及びＩＦＮλＲ１受容体ならびに対応するＪＡＫを二量体化させるハイブリッドインターフェロンである。図１５に示された、ＳＹ６によりホスホ−ＳＴＡＴ１活性化のＥｍａｘは、Ｉ型ＩＦＮのものと等しく、ＩＩＩ型ＩＦＮにより誘導されたシグナルの２倍である。エラーバーは、±標準誤差を表す（ｎ＝３）。重要なことに、図１５Ｄに示されるように、ＳＹ６は、抗増殖効果を強力に誘導するが、Ｉ型ＩＦＮ、ＩＩＩ型ＩＦＮ、またはＩ型及びＩＩＩ型ＩＦＮの組み合わせ処理は効果がない。エラーバーは、±標準誤差を表す（ｎ＝３）。Ｉ型及びＩＩＩ型ＩＦＮの両方に自然に応答するＨａｐ１細胞において、ホスホ−ＳＴＡＴ１シグナル伝達及び抗増殖アッセイを実施した。
【０２００】
さらに、ＳＹ６などのハイブリッドポリペプチドに連結されていない限り、Ｉ型及びＩＩＩ型インターフェロンの組み合わせが、この活性を提供しないことに留意することも重要である。シンセカインの活性及び特異性は、抗増殖活性及び抗ウイルス活性の強力な薬剤を提供し、これは、作用の選択性を提供し、それにより、Ｉ型インターフェロンの望ましくない副作用を回避する。
【０２０１】
実施例４
ｍＩＬ４ＤＮ−ｍＩＦＮβＤＮ２シンセカイン
Ｇｌｙ4 Ｓｅｒリンカーを介してマウスＩＬ−４ＤＮ及びｍＩＦＮβＤＮ２タンパク質を遺伝的に融合させることにより、このシンセカイン（ＳＹ７）を生成した。配列は、図１６に示される通りである。リンパ球を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脾臓／ＬＮから単離し、プレート結合抗ＣＤ３（２．５μｇ／ｍｌ）＋可溶性抗ＣＤ２８（５μｇ／ｍｌ）で４８時間活性化した。次に、細胞を１０ＩＵ／ｍｌのｍＩＬ２中で一晩静置させ、次に、示されたサイトカイン／シンセカインを用いる２０分間の刺激の４時間前に血清飢餓状態にした。細胞シグナル伝達を終結させ、細胞を、ＰＦＡで固定し、ＰｅｒｍＩＩＩ緩衝液（ＢＤ）透過処理し、及びホスホＳＴＡＴ６（Ｙ６４１）抗体（ＢＤ）で染色した。
【０２０２】
【表２】
2020511988.tif 000004
【０２０３】
高親和性受容体サブユニット（ＩＬ−４に対するＩＬ−４Ｒα、ＩＬ−２に対するＩＬ−２Ｒβ、及びＩＦＮに対するＩＦＮＡＲ２）への結合を保存するが、低親和性受容体サブユニット（ＩＬ−４に対するＩＬ−１３Ｒα１及びγＣ、ＩＬ−２に対するγｃ、ならびにＩＦＮに対するＩＦＮＡＲ１）への結合が破壊されている、ＩＬ−４、ＩＬ−２、及びＩＦＮのアンタゴニストまたは「ドミナントネガティブ（ＤＮ）」バージョンを操作した。これらの「ＤＮ」サイトカインは、それら単独で、シグナル伝達活性がない高親和性結合モジュールとして機能する。ＳＹ１及びＳＹ２について上記の表に示されるように、ドミナントネガティブサイトカイン変異体の対をＧｌｙ4 ／Ｓｅｒリンカーと融合させて、ＩＬ−２Ｒβ−ＩＬ−４Ｒα及びＩＬ−４Ｒα−ＩＦＮＡＲ２非天然受容体二量体の形成を誘導する新しいリガンドを生成した。共通のγ鎖への結合を妨げる部位ＩＩに、以前に記載されているＲ１２１Ｄ／Ｙ１２４Ｄ変異を導入することにより、ＩＬ−４ＤＮを生成した（Ｗｅｎｚｅｌ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ  ＴｈｅＬａｎｃｅｔ、２００７）。ＩＦＮ−ＩＦＮＡＲ１結合界面に変異Ｆ６３Ａ及びＲ１２０Ｅを導入することにより、ＩＦＮＡＲ１への結合を破壊することにより、ＩＦＮＤＮを生成した。ＩＬ−２ＤＮ（ＩＬ−２ＲＥＴＲとしても知られている）は、Ｍｉｔｒａ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２０１５で以前に記載されている。
【０２０４】
ＳＹ３、ＳＹ４、及びＳＹ５の操作に使用される単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を、二量体化のための酸性または塩基性のいずれかのロイシンジッパーに融合されている１２アミノ酸（Ｇｌｙ4 Ｓｅｒ）3 リンカーにより隔てられている可変重（ＶＨ）鎖及び可変軽（ＶＬ）鎖で表現させた。ＳＹ４及びＳＹ５構築物は、ｃＫｉｔまたはＴｐｏＲ  ＥＣＤのいずれかに高い親和性で結合する抗体を利用した。本発明者らは、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）としてそれらを再フォーマットし、それぞれを相補的な酸性及び塩基性ロイシンジッパーと融合させることにより、ヘテロ二量体化を実施した。
【０２０５】
ＳＹ３タンパク質は、Ｇｌｙ／Ｓｅｒポリペプチドリンカーを使用して、サイトカイン（ＩＬ−２）をＩＬ−４Ｒαに結合したｓｃＦｖ（一価抗体）と連結させる。この新しい分子実体は、３つのサイトカイン受容体ポリペプチド、すなわちγｃ、ＩＬ−２Ｒβ、及びＩＬ−４Ｒαに結合した。
【０２０６】
ＳＹ６配列は、配列番号１として提供され、参照ヒトＩＦＮλ３配列（Ｇｅｎｂａｎｋ照会ＸＰ＿００５２５８８２２．１）のＱ２６Ａ、Ｑ９９Ａ、Ｈ１０２Ａ、Ｈ１３１Ｒ、Ｔ１６１Ａ、及びＶ１７４Ｅに対応する残基にアミノ酸置換を有する、残基１〜１６３にヒトＩＦＮλのバリアント形態を含み、バリアント配列は、参照ＩＦＮλ３タンパク質の残基１〜１１の欠失により切断される。残基１６４〜１６８は、ｇｌｙ／ｓｅｒリンカーであり、残基１６９〜３４２は、ヒトＩＦＮωのバリアント型を含む。
【０２０７】
ＳＹ７配列は、配列番号２として提示され、図１７に示されるように、残基１〜１７は、シグナルペプチドであり、残基１８〜１３８は、ｍＩＬ−４ＤＮであり、Ｑ１１６Ｄ及びＹ１１９Ｄに対応する残基にアミノ酸置換を有し、残基１３９〜１４３は、ｇｌｙ／ｓｅｒリンカーであり、残基１４４〜３０４は、ｍＩＦＮβＤＮ２に対応し、Ｒ１５Ａ、Ｌ３０Ａ、Ｒ３３Ａ、Ｒ１４７Ａに対応する残基にアミノ酸置換を有する。
【０２０８】
相互参照
本出願は、２０１７年３月３１日に出願された米国仮特許出願第６２／４７９，９９３号の利益を主張し、この出願は全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【図１Ａ】
2020511988.tif 000005
【図１Ｂ】
2020511988.tif 000006
【図２Ａ】
2020511988.tif 000007
【図２Ｂ】
2020511988.tif 000008
【図２Ｃ】
2020511988.tif 000009
【図２Ｄ−１】
2020511988.tif 000010
【図２Ｄ−２】
2020511988.tif 000011
【図２Ｄ−３】
2020511988.tif 000012
【図２Ｄ−４】
2020511988.tif 000013
【図２Ｄ−５】
2020511988.tif 000014
【図２Ｄ−６】
2020511988.tif 000015
【図２Ｄ−７】
2020511988.tif 000016
【図２Ｄ−８】
2020511988.tif 000017
【図２Ｄ−９】
2020511988.tif 000018
【図２Ｄ−１０】
2020511988.tif 000019
【図２Ｄ−１１】
2020511988.tif 000020
【図２Ｄ−１２】
2020511988.tif 000021
【図２Ｅ−１】
2020511988.tif 000022
【図２Ｅ−２】
2020511988.tif 000023
【図２Ｅ−３】
2020511988.tif 000024
【図２Ｆ】
2020511988.tif 000025
【図２Ｇ−１】
2020511988.tif 000026
【図２Ｇ−２】
2020511988.tif 000027
【図２Ｇ−３】
2020511988.tif 000028
【図２Ｈ−１】
2020511988.tif 000029
【図２Ｈ−２】
2020511988.tif 000030
【図２Ｈ−３】
2020511988.tif 000031
【図２Ｉ−１】
2020511988.tif 000032
【図２Ｉ−２】
2020511988.tif 000033
【図２Ｉ−３】
2020511988.tif 000034
【図３Ａ】
2020511988.tif 000035
【図３Ｂ】
2020511988.tif 000036
【図３Ｃ】
2020511988.tif 000037
【図３Ｄ】
2020511988.tif 000038
【図３Ｅ】
2020511988.tif 000039
【図３Ｆ】
2020511988.tif 000040
【図４Ａ】
2020511988.tif 000041
【図４Ｂ】
2020511988.tif 000042
【図４Ｃ】
2020511988.tif 000043
【図４Ｄ】
2020511988.tif 000044
【図５Ａ】
2020511988.tif 000045
【図５Ｂ−１】
2020511988.tif 000046
【図５Ｂ−２】
2020511988.tif 000047
【図５Ｃ−１】
2020511988.tif 000048
【図５Ｃ−２】
2020511988.tif 000049
【図６Ａ】
2020511988.tif 000050
【図６Ｂ】
2020511988.tif 000051
【図６Ｃ】
2020511988.tif 000052
【図６Ｄ】
2020511988.tif 000053
【図６Ｅ】
2020511988.tif 000054
【図６Ｆ−１】
2020511988.tif 000055
【図６Ｆ−２】
2020511988.tif 000056
【図６Ｇ】
2020511988.tif 000057
【図７Ａ】
2020511988.tif 000058
【図７Ｂ】
2020511988.tif 000059
【図７Ｃ】
2020511988.tif 000060
【図８】
2020511988.tif 000061
【図９】
2020511988.tif 000062
【図１０】
2020511988.tif 000063
【図１１】
2020511988.tif 000064
【図１２−１】
2020511988.tif 000065
【図１２−２】
2020511988.tif 000066
【図１３】
2020511988.tif 000067
【図１４】
2020511988.tif 000068
【図１５】
2020511988.tif 000069
【図１６】
2020511988.tif 000070
【図１７】
2020511988.tif 000071
【配列表】
2020511988000001.app
【国際調査報告】
2020511988.tif 000072
2020511988.tif 000073