(57)【要約】  本開示は、ＬＡＧ−３に特異的に結合し、薬学的応用に、例えば抗がん作用物質および／または免疫調節物質として、がん、感染性疾患、および自己免疫疾患などのヒト疾患の処置または予防に使用することができる、ヒト涙液リポカリンムテインを提供する。本開示はさらに、これらヒトリポカリンムテインが、ＭＨＣクラスＩＩを過剰発現している細胞におけるＭＨＣクラスＩＩに対するＬＡＧ−３の結合を阻害できることを示す。本開示は、本明細書に記載するＬＡＧ−３結合性リポカリンムテインを作製する方法、ならびにそのようなリポカリンムテインを含む組成物にも関する。本開示はさらに、そのようなリポカリンムテインをコードする核酸分子、ならびにそのようなリポカリンムテインおよび核酸分子を作製するための方法に関する。加えて、本願は、これらのリポカリンムテインの治療的および／または診断的使用ならびにそのようなリポカリンムテインのうちの１つもしくは複数を含む組成物を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｋｄで測定して約２５０ｎＭ以下である親和性でＬＡＧ−３に結合することができるリポカリンムテイン。
【請求項２】
Ｋｄで測定して約５０ｎＭ以下である親和性でＬＡＧ−３に結合することができる、請求項１に記載のリポカリンムテイン。
【請求項３】
Ｋｄで測定して約３ｎＭ以下である親和性でＬＡＧ−３に結合することができる、請求項１に記載のリポカリンムテイン。
【請求項４】
Ｋｄで測定して約０．１ｎＭ以下である親和性でＬＡＧ−３に結合することができる、請求項１に記載のリポカリンムテイン。
【請求項５】
Ｋｄで測定して約０．０５ｎＭ以下である親和性でＬＡＧ−３に結合することができる、請求項１に記載のリポカリンムテイン。
【請求項６】
前記Ｋｄ値が、実施例４に本質的に記載されるように表面プラズモン共鳴分析によって決定される、請求項１〜５のいずれか一項に記載のリポカリンムテイン。
【請求項７】
成熟ヒト涙液リポカリンの直鎖ポリペプチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）の配列位置５、７〜８、１０、１４、１６、２５〜３４、４４、４６、５２〜５３、５５〜５６、５８、６０〜６１、６３、６５〜６６、６９〜７０、７３、７９〜８０、８４〜８６、８９〜９０、９３、９６〜９８、１０１、１０５〜１０６、１０８、１１０〜１１４、１２１、１２４、１４８〜１５０、および１５２〜１５４における少なくとも２つ以上の変異アミノ酸残基を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のリポカリンムテイン。
【請求項８】
成熟ヒト涙液リポカリンの直鎖ポリペプチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）の配列位置１４、２５〜２６、２８、３１〜３２、５２、５５、５８、６６、７９、８４、８６、１０１、１０５〜１０６、１０８、１１０、１１２〜１１４、および１２１における少なくとも１つの変異アミノ酸残基を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のリポカリンムテイン。
【請求項９】
成熟ヒト涙液リポカリンの直鎖ポリペプチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）の配列位置５、７〜８、１０、１６、２６〜３４、４４、４６、５３、５６、５８、６０〜６１、６３、６５〜６６、６９〜７０、７３、７９〜８０、８５、８９〜９０、９３、９６〜９８、１０１、１０５〜１０６、１０８、１１０〜１１１、１１４、１２１、１２４、１４８〜１５０、１５２〜１５４、および１５６〜１５７における少なくとも１つまたは複数の変異アミノ酸残基をさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のリポカリンムテイン。
【請求項１０】
成熟ヒト涙液リポカリンの直鎖ポリペプチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）の配列位置５、７〜８、１０、１６、２６〜３４、４４、４６、５３、５６、５８、６０〜６１、６３、６５、６９〜７０、７３、７９〜８０、８５、８９〜９０、９３、９６〜９８、１０１、１０５〜１０６、１０８、１１１、１１４、１２４、１４８〜１５０、１５２〜１５４、および１５６〜１５７における少なくとも１つまたは複数の変異アミノ酸残基をさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のリポカリンムテイン。
【請求項１１】
成熟ヒト涙液リポカリンの直鎖ポリペプチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）の配列位置５、７〜８、１０、１６、４４、４６、６３、６５、６９〜７０、７３、８０、８４、８９〜９０、９３、９６〜９８、１１３、１２４、１４８〜１５０、１５２、および１５４における少なくとも１つまたは複数の変異アミノ酸残基を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のリポカリンムテイン。
【請求項１２】
前記ムテインのアミノ酸配列が、成熟ヒト涙液リポカリンの直鎖ポリペプチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と比較して、以下の変異アミノ酸残基：
2020505948.tif 000041
のうちの２つ以上を含む、請求項７に記載のリポカリンムテイン。
【請求項１３】
前記ムテインのアミノ酸配列が、成熟ヒト涙液リポカリンの直鎖ポリペプチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と比較して、以下の変異アミノ酸残基：
2020505948.tif 000042
のうちの少なくとも１つを含む、請求項７に記載のリポカリンムテイン。
【請求項１４】
前記ムテインのアミノ酸配列が、成熟ヒト涙液リポカリンの直鎖ポリペプチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と比較して、以下の変異アミノ酸残基：
2020505948.tif 000043
のうちの少なくとも１つを含む、請求項７に記載のリポカリンムテイン。
【請求項１５】
約３２０ｎＭ以下のＥＣ５０値でＬＡＧ−３に結合する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のリポカリンムテイン。
【請求項１６】
約１０ｎＭ以下のＥＣ５０値でＬＡＧ−３に結合する、請求項１５に記載のリポカリンムテイン。
【請求項１７】
約０．２ｎＭ以下のＥＣ５０値でＬＡＧ−３に結合する、請求項１５に記載のリポカリンムテイン。
【請求項１８】
前記ＥＣ５０値が、実施例５に本質的に記載されるように蛍光活性化細胞選別によって測定される、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載のリポカリンムテイン。
【請求項１９】
ヒトＬＡＧ−３およびカニクイザルＬＡＧ−３の両方と交差反応する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のリポカリンムテイン。
【請求項２０】
主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩに対するヒトＬＡＧ−３の結合を妨害することができる、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のリポカリンムテイン。
【請求項２１】
主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩに対するヒトＬＡＧ−３の結合を妨害する能力が、実施例６に本質的に記載されるように蛍光活性化細胞選別によって分析される、請求項２０に記載のリポカリンムテイン。
【請求項２２】
前記ムテインのアミノ酸配列が、以下のアミノ酸突然変異：
2020505948.tif 000044
と、以下のアミノ酸突然変異：
2020505948.tif 000045
のうちの１つまたは複数とを含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のリポカリンムテイン。
【請求項２３】
前記ムテインのアミノ酸配列が、以下のアミノ酸突然変異：
2020505948.tif 000046
と、以下のアミノ酸突然変異：
2020505948.tif 000047
のうちの１つまたは複数とを含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のリポカリンムテイン。
【請求項２４】
前記ムテインのアミノ酸配列が、以下のアミノ酸突然変異のセット：
2020505948.tif 000048
2020505948.tif 000049
2020505948.tif 000050
2020505948.tif 000051
のうちの１つを含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のリポカリンムテイン。
【請求項２５】
前記ムテインのアミノ酸配列が、以下のアミノ酸突然変異のセット：
2020505948.tif 000052
のうちの１つを含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のリポカリンムテイン。
【請求項２６】
前記ムテインのアミノ酸配列が、成熟ヒト涙液リポカリンの直鎖ポリペプチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）の配列位置６１および１５３におけるシステイン残基を含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載のリポカリンムテイン。
【請求項２７】
前記ムテインのアミノ酸配列が、成熟ヒト涙液リポカリンの直鎖ポリペプチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と比較して、以下の変異アミノ酸残基：
Ａｌａ５→ＴｈｒおよびＡｓｐ１２→Ａｓｎ
のうちの１つまたは２つをさらに含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載のリポカリンムテイン。
【請求項２８】
前記ムテインのアミノ酸配列が、成熟ヒト涙液リポカリンの直鎖ポリペプチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と比較して、以下の変異アミノ酸残基：
2020505948.tif 000053
のうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載のリポカリンムテイン。
【請求項２９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８〜１８、２０〜２８、５７〜７０、および８５〜９５またはこれらのフラグメントもしくは変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜２８のいずれか一項に記載のリポカリンムテイン。
【請求項３０】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８〜１８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０〜２８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７〜７０、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５〜９５からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７．５％または少なくとも９９％の配列同一性を有する、請求項１〜２８のいずれか一項に記載のリポカリンムテイン。
【請求項３１】
有機分子、酵素標識、放射性標識、着色標識、蛍光標識、発色性標識、発光性標識、ハプテン、ジゴキシゲニン、ビオチン、細胞分裂阻害剤、毒素、金属錯体、金属、およびコロイド金からなる群から選択される化合物にコンジュゲートされている、請求項１〜３０のいずれか一項に記載のリポカリンムテイン。
【請求項３２】
そのＮ末端および／またはそのＣ末端において、タンパク質、タンパク質ドメイン、またはペプチドである融合パートナーに融合されている、請求項１〜３１のいずれか一項に記載のリポカリンムテイン。
【請求項３３】
そのＮ末端および／またはそのＣ末端において、抗体または抗体フラグメントである融合パートナーに融合されている、請求項１〜３２のいずれか一項に記載のリポカリンムテイン。
【請求項３４】
前記ムテインの血清半減期を延ばす化合物にコンジュゲートされている、請求項１〜３３のいずれか一項に記載のリポカリンムテイン。
【請求項３５】
前記血清半減期を延ばす化合物が、ポリアルキレングリコール分子、ヒドロエチルデンプン、免疫グロブリンのＦｃ部分、免疫グロブリンのＣＨ３ドメイン、免疫グロブリンのＣＨ４ドメイン、アルブミン結合ペプチド、およびアルブミン結合タンパク質からなる群から選択される、請求項３４に記載のリポカリンムテイン。
【請求項３６】
前記ポリアルキレングリコール分子がポリエチレン（ＰＥＧ）またはその活性化誘導体である、請求項３５に記載のリポカリンムテイン。
【請求項３７】
請求項１〜３６のいずれか一項に記載のリポカリンムテインをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項３８】
請求項３７に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項３９】
請求項３８に記載の核酸分子を含有する宿主細胞。
【請求項４０】
請求項１〜３６のいずれか一項に記載のリポカリンムテインを生成する方法であって、前記ムテインが、前記ムテインまたはそのフラグメントをコードする核酸から出発して、遺伝子操作法によって生成される、方法。
【請求項４１】
対象におけるＬＡＧ−３への結合方法であって、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の１種類もしくは複数種類のリポカリンムテイン、またはこのようなムテインを含む１種類もしくは複数種類の組成物を適用することを含む、方法。
【請求項４２】
対象において免疫応答を刺激する方法であって、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の１種類もしくは複数種類のリポカリンムテイン、またはこのようなムテインを含む１種類もしくは複数種類の組成物を適用することを含む、方法。
【請求項４３】
対象においてＴリンパ球の増殖を誘発する方法であって、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の１種類もしくは複数種類のリポカリンムテイン、またはこのようなムテインを含む１種類もしくは複数種類の組成物を適用することを含む、方法。
【請求項４４】
対象において主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩに対するヒトＬＡＧ−３の結合を妨害する方法であって、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の１種類もしくは複数種類のリポカリンムテイン、またはこのようなムテインを含む１種類もしくは複数種類の組成物を適用することを含む、方法。
【請求項４５】
主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩを発現する細胞に対するヒトＬＡＧ−３の結合と競合する、請求項１〜３６のいずれか一項に記載のリポカリンムテイン。
【請求項４６】
実施例６に本質的に記載されるような蛍光活性化細胞選別アッセイで測定したときに、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩを発現する細胞に対するヒトＬＡＧ−３の結合と競合する、請求項１〜３６のいずれか一項に記載のリポカリンムテイン。
【請求項４７】
請求項１〜３６のいずれか一項に記載のリポカリンムテインと、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項４８】
治療薬に連結された請求項１〜３６のいずれか一項に記載のリポカリンムテイン、またはそのフラグメントを含む、イムノコンジュゲートまたは融合タンパク質。
【請求項４９】
ＬＡＧ−３への結合／ＬＡＧ−３の検出のための請求項１〜３６のいずれか一項に記載のムテインの使用であって、
（ａ）前記ムテインと、ＬＡＧ−３を含有する疑いのある試験試料とを接触させ、それにより前記ムテインとＬＡＧ−３との間の複合体の形成を可能にすること；および
（ｂ）前記ムテインとＬＡＧ−３との間の複合体を適切なシグナルにより検出すること
を含む、使用。
【請求項５０】
請求項１〜３６のいずれか一項に記載のムテインを含む、診断または分析キット。
【請求項５１】
生物学的試料中のＬＡＧ−３の存在を検出する方法であって、前記試料と、請求項１〜３６のいずれか一項に記載のムテインとを、前記ムテインおよびＬＡＧ−３の複合体の形成を可能にする条件下で接触させることを含む、方法。
【請求項５２】
前記ムテインおよびＬＡＧ−３の複合体を検出することをさらに含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記生物学的試料がヒトから単離される、請求項５１または５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記試料が体液を含む、請求項５１〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
Ｉ．背景
リンパ球活性化遺伝子−３、すなわちＬＡＧ−３（Ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ２２３、すなわちＣＤ２２３としても公知である）は免疫グロブリンスーパーファミリーの膜タンパク質である。ＬＡＧ−３は構造的にも遺伝子的にもＣＤ４と関連しており、それをコードする遺伝子は１２番染色体の短腕の遠位部、ＣＤ４遺伝子の近くにあることから、ＬＡＧ−３遺伝子は遺伝子重複によって進化した可能性が示唆される（Ｔｒｉｅｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，１９９０（非特許文献１））。ＬＡＧ−３は休止末梢血リンパ球上には発現しないが、活性化Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上に発現し（Ｔｒｉｅｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，１９９０（非特許文献１））、活性化Ｂ細胞上（Ｋｉｓｉｅｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００５（非特許文献２））および形質細胞様樹状細胞上（Ｗｏｒｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００９（非特許文献３））にも発現すると報告されている。
【０００２】
ＣＤ４と同様に、ＬＡＧ−３も主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子に結合するが、その親和性は高く、結合部位も異なる（Ｈｕａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，１９９７（非特許文献４））。ＬＡＧ−３による樹状細胞上のＭＨＣクラスＩＩエンゲージメントは、樹状細胞のサイトカインプロファイルおよびケモカインプロファイルの変化につながる（Ｂｕｉｓｓｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒｉｅｂｅｌ，Ｖａｃｃｉｎｅ，２００３（非特許文献５））。さらに、ＬＡＧ−３は、樹状細胞によるＩＬ−１２およびＴＮＦ−αの産生、ならびに同種異系Ｔ細胞による増殖およびＩＦＮ−γ応答を刺激する樹状細胞の能力の増加によって証明されるとおり、樹状細胞の成熟を引き起こすことが報告されている（Ａｎｄｒｅａｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００２（非特許文献６））。ＬＡＧ−３シグナリングおよびＭＨＣクラスＩＩの架橋は、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の一次活性化における初期事象を阻害すると報告されている（Ｍａｃｏｎ−Ｌｅｍａｉｔｒｅ  ａｎｄ  Ｔｒｉｅｂｅｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００５（非特許文献７））。これはＴ細胞の細胞増殖、活性化およびホメオスタシスを負に制御する。
【０００３】
ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１と同様に、ＬＡＧ−３は阻害性免疫受容体である。Ｔ細胞応答の負の制御物質としてのＬＡＧ−３の大きな役割は、特にＰＤ−１との関連において、ノックアウトマウスと標的特異的抗体の両方に基づく研究で、あざやかに証明されている（Ｗｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２０１２（非特許文献８））。この研究では、二重抗ＬＡＧ−３／抗ＰＤ−１抗体処置により、単一抗体処置にはほとんど抵抗性であった定着腫瘍を持つマウスの大半が治癒した。さらに、ＬＡＧ−３／ＰＤ−１二重ノックアウトマウスは、複数の移植可能な腫瘍からの生残およびそれらのクリアランスに、著しい増加を示した。免疫チェックポイントとしての、ＰＤ−１とＬＡＧ−３との強力な協同的役割については、二重ノックアウトマウスが致死的自己炎症を著しく起こしやすいという事実により、さらに強い実験的裏づけが得られた。
【０００４】
したがって当技術分野では、がん、臓器移植拒絶の処置もしくは予防、または自己免疫疾患もしくは自己炎症性疾患の処置に重要な用途を有し得る、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、および形質細胞様樹状細胞などのＬＡＧ−３＋リンパ球の応答を調節する化合物に、未だ満たされていないニーズが存在する。さらに、高い親和性でＬＡＧ−３に結合することができ、増強された生物学的安定性を有し、かつ薬学的および／または診断的応用において使用することができるリポカリンムテインを有することが望ましい。これに関して、本開示の目的は、このようなリポカリンムテインを提供することである。これらの高い結合親和性および増強された生物学的安定性の特徴を有するようなリポカリンムテインは、これまで記載されていない。
【０００５】
加えて、サルの代謝がヒトの代謝と最も類似していることは当然であると考えられており、従って、カニクイザルは、新しい生物製剤を含む新しい治療法の開発における薬物動態または薬物安全性の研究で広く使用されている。このような研究はさらに、規制の承認のための必要条件であり得る。従って、同等または類似の結合親和性を含む同等の結合パターンでヒトおよびカニクイザルＬＡＧ−３の両方と交差反応するリポカリンムテインを有することも望ましい。これらの交差反応性の特徴を有するようなリポカリンムテインは、これまで記載されていない。
【０００６】
本出願中の任意の参考文献の記載は、その参考文献が本出願に先行する技術であることの承認ではない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｔｒｉｅｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，１９９０
【非特許文献２】Ｋｉｓｉｅｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００５
【非特許文献３】Ｗｏｒｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００９
【非特許文献４】Ｈｕａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，１９９７
【非特許文献５】Ｂｕｉｓｓｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒｉｅｂｅｌ，Ｖａｃｃｉｎｅ，２００３
【非特許文献６】Ａｎｄｒｅａｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００２
【非特許文献７】Ｍａｃｏｎ−Ｌｅｍａｉｔｒｅ  ａｎｄ  Ｔｒｉｅｂｅｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００５
【非特許文献８】Ｗｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２０１２
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
これに関して、本開示は、ヒトおよびカニクイザルの両方のＬＡＧ−３に対して、高い親和性および増強された生物学的安定性の特徴を有して特異的に結合し、それによって免疫応答を調節する一群の新規の化合物を提供する。このような化合物はリポカリン由来のムテインであり、薬学的、診断的または他の応用で使用され得る。リポカリンのムテインは、急速に拡大しつつある一群の治療薬であり、所望の標的に対して高い親和性と高い特異性とを呈するように構築することができる（例えば、国際特許公開番号国際公開第９９／１６８７３号パンフレット、国際公開第００／７５３９８号パンフレット、国際公開第０３／０２９４７１号パンフレット、および国際公開第０５／１９２５６号パンフレット参照）。
【０００９】
ＩＩ．定義
以下の一覧では、本明細書の全体を通して使用される用語、語句、および略号を定義する。本明細書に列挙して定義する用語はいずれも、全ての文法形式を包含するものとする。
【００１０】
本明細書において、「ＬＡＧ−３」とは、別段の指定がある場合を除き、ヒトＬＡＧ−３（ｈｕＬＡＧ−３）を意味し、ヒトＬＡＧ−３の変異体、アイソフォームおよび種ホモログを包含する。ＬＡＧ−３は、「リンパ球活性化遺伝子３」、または「ＣＤ２２３（ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ２２３）」としても公知であり、これらは相互可換的に使用される。ヒトＬＡＧ−３は、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ１８６２７（２００９年７月７日のバージョン５）によって規定される完全長タンパク質、そのフラグメント、またはその変異体を意味する。カニクイザルＬＡＧ−３（ｃｙＬＡＧ−３）はカニクイザルのＬＡＧ−３を指す。ｃｙＬＡＧ−３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６の位置１〜４２８で示されるｃｙＬＡＧ−３の細胞外ドメインを指すために使用される場合もある。
【００１１】
本明細書において、「検出可能な親和性」とは、通常はＫｄまたはＥＣ５０を尺度として、最大でも約１０−５Ｍまたはそれ未満である親和性で、選択された標的に結合する能力を意味する（低いＫｄ値またはＥＣ５０値ほど、高い結合活性を表す）。これより低い親和性は、一般に、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）などの一般的方法ではもはや測定することができず、それゆえに、あまり重要ではない。
【００１２】
本明細書において、選択された標的（この場合はＬＡＧ−３）に対する本開示のタンパク質（例えば、リポカリンのムテイン）またはその融合ポリペプチドの「結合親和性」は、当業者に公知の数多くの方法によって測定することができる（そして、それによりムテイン−リガンド複合体のＫｄ値が決定され得る）。そのような方法には、蛍光滴定、競合ＥＬＩＳＡ、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）などの熱量測定法、および表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）などがあるが、それらに限定されるわけではない。そのような方法は当技術分野において確立されており、その例を以下にも詳述する。
【００１３】
また、それぞれの結合物質とそのリガンドとの間の複合体形成は、それぞれの結合パートナーの濃度、競合物質の存在、使用する緩衝系のｐＨおよびイオン強度、ならびに解離定数Ｋｄの決定に使用される実験方法（例えば蛍光滴定、競合ＥＬＩＳＡまたは表面プラズモン共鳴であるが、これらはほんのいくつかの例にすぎない）、さらには実験データの評価に使用される数学的アルゴリズムなどといった、多種多様な因子の影響を受けることにも注意されたい。
【００１４】
それゆえに、所与のリガンドに対する特定のリポカリンムテインの親和性を決定するために使用される方法および実験装置に依存して、Ｋｄ値（それぞれの結合物質とその標的／リガンドとの間に形成される複合体の解離定数）が一定の実験範囲内で変動し得ることは、当業者にとっては明らかである。これは、例えばそのＫｄ値が表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）で決定されたか、競合ＥＬＩＳＡで決定されたか、または直接ＥＬＩＳＡで決定されたかなどに依存して、計測されるＫｄ値にはわずかな偏差、または許容誤差範囲が存在し得ることを意味する。
【００１５】
本明細書にいう「ムテイン」、「変異（ｍｕｔａｔｅｄ）」実体（ｅｎｔｉｔｙ）（タンパク質であるか核酸であるかを問わない）、または「突然変異体（ｍｕｔａｎｔ）」とは、天然（野生型）の核酸またはタンパク質「リファレンス」スキャフォールドと比較した、１つまたは複数のヌクレオチドまたはアミノ酸の交換、欠失、または挿入を指す。この用語は、本明細書に記載するムテインおよび変異体のフラグメントも包含する。本発明のリポカリンムテイン、そのフラグメントまたは変異体は、好ましくは、本明細書に記載するようにＬＡＧ−３に結合する機能を有する。
【００１６】
本開示のムテインに関連して本明細書において使用する用語「フラグメント」は、Ｎ末端および／またはＣ末端が短縮された、すなわち、少なくとも１つのＮ末端および／またはＣ末端アミノ酸を欠く、完全長成熟ヒト涙液リポカリン（ｈＴｌｃまたはｈＴＬＰＣ）から誘導されるタンパク質またはペプチドに関する。そのようなフラグメントは、Ｎ末端および／またはＣ末端アミノ酸のうちの最大２個、最大３個、最大４個、最大５個、最大１０個、最大１５個、最大２０個、最大２５個、または最大３０個（これらの間の数字を全て含む）を欠き得る。具体例として、そのようなフラグメントは、４個のＮ末端アミノ酸および２個のＣ末端アミノ酸を欠き得る。フラグメントは、好ましくは、完全長涙液リポカリン（ムテイン）の機能的フラグメントであると理解され、これは、そのフラグメントが、好ましくは、そのフラグメントの元となった完全長涙液リポカリン（ムテイン）の結合ポケットを含むことを意味する。具体例として、そのような機能的フラグメントは、ネイティブ成熟ヒト涙液リポカリンの直鎖ポリペプチド配列の少なくともアミノ酸５〜１５６を含み得る。そのようなフラグメントは、成熟リポカリンの一次配列のうちの少なくとも１０個またはそれ以上、例えば２０個もしくは３０個またはそれ以上の連続アミノ酸を含むことができ、通常は、成熟涙液リポカリンのイムノアッセイで検出可能である。
【００１７】
概して、対応タンパク質リガンドであるＬＡＧ−３に関連して本明細書において使用する、本開示のリポカリンムテインの、または本開示による組み合わせの、または本明細書に記載する融合タンパク質の「フラグメント」という用語は、Ｎ末端および／またはＣ末端が短縮されたタンパク質またはペプチドリガンドであって、本開示のムテインによって認識されかつ／または結合されるという完全長リガンドの能力を保っているものに関する。
【００１８】
本明細書において使用する「突然変異誘発」という用語は、成熟リポカリンの所与の配列位置に本来存在するアミノ酸を、それぞれの天然ポリペプチド配列中のその特定位置には存在しない少なくとも１つのアミノ酸で置換することができるように、実験条件が選ばれることを意味する。「突然変異誘発」という用語は、１つまたは複数のアミノ酸の欠失または挿入による配列セグメントの長さの（付加的）修飾も包含する。したがって、例えば、選ばれた配列位置にある１つのアミノ酸が、一続きになった３つのランダム突然変異で置き換えられて、野生型タンパク質のそれぞれのセグメントの長さと比較して２つのアミノ酸残基が挿入されたことになるのは、本開示の範囲内である。そのような挿入または欠失は、本開示において突然変異誘発の対象となり得るペプチドセグメントのいずれにおいても、互いに独立して導入され得る。本開示の例示的一実施形態では、数個の突然変異の挿入が、選ばれたリポカリンスキャフォールドのループＡＢ中に導入され得る（国際特許出願公開第国際公開第２００５／０１９２５６号パンフレット参照。この特許出願は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。
【００１９】
「ランダム突然変異誘発」という用語は、前もって決定された単一アミノ酸（突然変異）が一定の配列位置に存在するのではなくて、突然変異誘発中に所定の配列位置に少なくとも２種類のアミノ酸が一定の確率で組み込まれ得ることを意味する。
【００２０】
「同一性」とは、配列間の類似性または関係性を測る配列の一特性である。本開示において使用する「配列同一性」または「同一性」という用語は、本開示のポリペプチドの配列を問題の配列と（相同）アラインメントした後の、それら２つの配列のうちの長い方の残基数を基準とした、ペアごとの同一残基のパーセンテージを意味する。配列同一性は、同一アミノ酸残基の数を残基の総数で割り、その結果に１００を掛けることによって測られる。
【００２１】
「相同性」という用語は、本明細書では、その通常の意味で使用され、本開示のポリペプチド（例えば本開示の任意のリポカリンムテイン）の直鎖アミノ酸配列において等価な位置にある同一アミノ酸ならびに保存的置換とみなされるアミノ酸（例えばアスパラギン酸残基によるグルタミン酸残基の交換）を包含する。
【００２２】
配列相同性または配列同一性のパーセンテージは、ここでは、例えばプログラムＢＬＡＳＴＰ、バージョンｂｌａｓｔｐ  ２．２．５（２００２年１１月１６日；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９７参照）を使って決定することができる。この実施形態において、相同性のパーセンテージは、プロペプチド配列を含む全ポリペプチド配列のアラインメントに基づき（行列：ＢＬＯＳＵＭ  ６２；ギャップコスト：１１．１；カットオフ値は１０−３に設定）、好ましくは野生型タンパク質スキャフォールドを、ペアワイズ比較におけるリファレンスとして使用する。これは、アラインメントのためにプログラムが選択したアミノ酸の総数で割った、ＢＬＡＳＴＰプログラム出力に結果として示される「ポジティブ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）」（相同アミノ酸）の数のパーセンテージとして計算される。
【００２３】
具体的には、リポカリン（ムテイン）のアミノ酸配列のアミノ酸残基が、野生型リポカリンのアミノ酸中の一定の位置に対応するアミノ酸残基と異なるかどうかを決定するために、当業者は、例えば手作業によるアラインメント、またはＢＬＡＳＴ２．０（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌの略）もしくはＣｌｕｓｔａｌＷなどのコンピュータプログラム、または配列アラインメントを作成するのに適した他の任意の適切なプログラムを使ったアラインメントなど、当技術分野において周知の手段および方法を使用することができる。したがって、リポカリンの野生型配列が「対象配列」または「リファレンス配列」となることができるのに対して、本明細書に記載する野生型リポカリンとは異なるリポカリンのアミノ酸配列は「クエリー配列」となる。「野生型配列」、「リファレンス配列」および「対象配列」という用語は、本明細書では相互可換的に使用される。好ましいリポカリンの野生型配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すｈＴｌｃの配列である。
【００２４】
「ギャップ」とは、アミノ酸の付加または欠失の結果であるアラインメント中の空白をいう。したがって、厳密に同じ配列である２つのコピーは１００％の同一性を有するが、それほど高度には保存されていなくて、欠失、付加、または置き換えを有する配列は、それより程度の低い配列同一性を有し得る。標準的なパラメータを使って配列同一性を決定するために、例えばＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５，３３８９−３４０２）、Ｂｌａｓｔ２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０）、およびＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ（Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７，１９５−１９７）など、いくつかのコンピュータプログラムが利用可能であることは、当業者にはわかるであろう。
【００２５】
本開示において使用する用語「変異体」は、置換、欠失、挿入または化学修飾などによるアミノ酸配列の修飾を含む、タンパク質またはペプチドの誘導体に関する。そのような修飾は、いくつかの実施形態では、タンパク質またはペプチドの機能性を低減しない。そのような変異体には、１つまたは複数のアミノ酸が各々のＤ−立体異性体で置き換えられているか、２０種類の天然アミノ酸以外のアミノ酸、例えばオルニチン、ヒドロキシプロリン、シトルリン、ホモセリン、ヒドロキシリジン、ノルバリンなどで置き換えられている、タンパク質が包含される。しかし、そのような置換は保存的であってもよく、すなわち、アミノ酸残基は、化学的に類似するアミノ酸残基で置き換えられる。保存的置換の例は、以下のグループのメンバー間での置き換えである：１）アラニン、セリン、およびスレオニン；２）アスパラギン酸およびグルタミン酸；３）アスパラギンおよびグルタミン；４）アルギニンおよびリジン；５）イソロイシン、ロイシン、メチオニン、およびバリン；ならびに６）フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン。対応タンパク質標的であるＬＡＧ−３に関連して本明細書において使用する、本開示のリポカリンムテインの、または本開示による組み合わせの、および／もしくは融合タンパク質の「変異体」という用語は、本明細書に記載するとおりＵｎｉＰｒｏｔに登録されたＬＡＧ−３リファレンスタンパク質などの野生型ＬＡＧ−３タンパク質と比較して、１つまたは複数の、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、４０、５０、６０、７０、８０個またはそれ以上のアミノ酸置換、欠失および／または挿入を有するＬＡＧ−３またはそのフラグメントに関する。ＬＡＧ−３変異体は、好ましくは、本明細書に記載するとおりＵｎｉＰｒｏｔに登録されたヒトＬＡＧ−３リファレンスタンパク質などの野生型ＬＡＧ−３に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％または９５％のアミノ酸同一性を有する。
【００２６】
「ネイティブ配列」のリポカリンとは、自然から得られる対応ポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するリポカリンを意味する。したがってネイティブ配列リポカリンは、任意の生物からの、特に哺乳動物からの、それぞれの天然リポカリンのアミノ酸配列を有することができる。そのようなネイティブ配列ポリペプチドは、自然から単離するか、組換え手段または合成手段によって生産することができる。「ネイティブ配列」ポリペプチドという用語は、リポカリンの天然切断型または天然分泌型、リポカリンの天然変異体型、例えば選択的スプライス型または天然対立遺伝子変異体を、特に包含する。ポリペプチド「変異体」とは、ネイティブ配列ポリペプチドに対して少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％または少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する、生物学的に活性なポリペプチドを意味する。そのような変異体には、例えば、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端において１つまたは複数のアミノ酸残基が付加されまたは欠失しているポリペプチドが含まれる。一般に変異体は、ネイティブ配列ポリペプチドに対して、少なくとも約７０％の、例えば少なくとも約８０％、例えば少なくとも約８５％の、アミノ酸配列同一性、例えば少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、または少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有する。具体例として、本開示のｈＴｌｃムテインでは、タンパク質の生物学的機能に影響を及ぼすことなく、Ｎ末端の最初の４アミノ酸残基（Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１）およびＣ末端の最後の２アミノ酸残基（Ｓｅｒ−Ａｓｐ）を欠失させるまたは変異させることができる。例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７〜２８、５７〜７０、および８５〜９５。
【００２７】
本開示において使用する場合、「位置」という用語は、本明細書に示すアミノ酸配列内でのアミノ酸の位置、または本明細書に示す核酸配列内でのヌクレオチドの位置を意味する。１種類または複数種類のリポカリンムテインのアミノ酸配列位置との関連で本明細書において使用される「対応する」または「対応」という用語を理解するために、対応位置は、先行するヌクレオチド／アミノ酸の数だけでは決定されない。したがって、本開示によれば、置換され得る所与のアミノ酸の位置は、（突然変異体または野生型）リポカリン中の他のどこかにあるアミノ酸の欠失または付加ゆえに、変動し得る。同様に、本開示によれば、置換され得る所与のヌクレオチドの位置も、ムテインまたは野生型リポカリン５’−非翻訳領域（ＵＴＲ）、例えばプロモーターおよび／または他の任意の制御配列もしくは制御遺伝子（エクソンおよびイントロンを含む）中の他のどこかにある欠失または追加ヌクレオチドゆえに、変動し得る。
【００２８】
このように、本開示による「対応位置」に関して、ヌクレオチド／アミノ酸の位置は、類似の隣接ヌクレオチド／アミノ酸とは、表示される数字の点で異なり得るが、交換、欠失または付加され得る該隣接ヌクレオチド／アミノ酸も、当該１つまたは複数の「対応位置」によって含まれると理解されることが好ましい。
【００２９】
加えて、本開示によるリファレンス配列に基づくリポカリンムテイン中の対応位置については、リポカリン間の高度に保存された全体的フォールディングパターンに照らして当業者には理解されるとおり、ヌクレオチド／アミノ酸の位置は、たとえそれらが表示される数字の点で異なっていたとしても、（突然変異体または野生型）リポカリン中の他のどこかにある位置と、構造的に対応すると理解されることが好ましい。
【００３０】
「アルブミン」という用語は、ヒト血清アルブミンまたはウシ血清アルブミンまたはラット血清アルブミンなど、全ての哺乳動物アルブミンを包含する。
【００３１】
非天然標的に関して本明細書において使用する用語「有機分子」または「小有機分子」は、少なくとも２つの炭素原子を含むが、回転可能な炭素結合の数は好ましくは７または１２を越えず、１００〜２，０００ダルトン、好ましくは１００〜１，０００ダルトンの範囲の分子量を有し、１つまたは２つの金属原子を含んでもよい有機分子を表す。
【００３２】
本明細書において使用する「検出する」、「検出」、「検出可能な」または「検出すること」という単語は、定量的レベルおよび定性的レベルの両方で、ならびにそれらの組み合わせで、理解される。したがってこれは、関心対象の分子の定量的、半定量的および定性的測定を包含する。
【００３３】
「対象」は脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。「哺乳動物」という用語は、本明細書では、哺乳動物に分類される任意の動物を指すために使用され、ヒト、家畜および農用動物、ならびに動物園動物、スポーツ動物、またはペット動物、例えばヒツジ、イヌ、ウマ、ネコ、ウシ、ラット、ブタ、サル、例えばカニクイザルを含むが、ここでは具体例をいくつか挙げただけで、これらに限定されるわけではない。好ましくは、本明細書における哺乳動物はヒトである。
【００３４】
「有効量」とは、有益な結果または所望の結果を達成するのに十分な量である。有効量は１回または複数回の投与で投与することができる。
【００３５】
「試料」は、任意の対象から採取された生物学的試料と定義される。生物学的試料には、血液、血清、尿、糞便、精液、または組織が包含されるが、それらに限定されるわけではない。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
ＩＩＩ．図面の説明
【図１−１】成熟ｈＴｌｃの直鎖ポリペプチド配列と比較して、最適化ＬＡＧ−３特異的ヒト涙液リポカリン（ｈＴｌｃ）ムテインのアミノ酸配列のアラインメントを示す。成熟ｈＴｌｃの直鎖ポリペプチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と比較して、これらのｈＴｌｃ由来のＬＡＧ−３結合性ムテイン（ｈＴｌｃムテインＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７〜２８および５７〜７０として記載される）および陰性対照ムテイン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３および４）では、最初の４個のＮ末端アミノ酸残基（Ｈｉｓ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｌｅｕ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０）および最後の２個のＣ末端アミノ酸残基（Ｓｅｒ、Ａｓｐ）が欠失されている。
【図１−２】図１−１の続きの図である。
【図１−３】図１−２の続きの図である。
【図１−４】図１−３の続きの図である。
【図１−５】図１−４の続きの図である。
【図２Ａ−１】実施例５に記載されるように哺乳動物細胞上でそれぞれ発現されるヒトＬＡＧ−３（図２Ａ）およびカニクイザルＬＡＧ−３（図２Ｂ）に対するリポカリンムテインの特異的結合を評価するために実行される蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）研究の結果を示す。ヒトまたはカニクイザルＬＡＧ−３が安定的にトランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞をリポカリンムテインと共にインキュベートし、蛍光標識抗ｈＴｌｃ抗体を用いて、結合したムテインを検出した。全てのリポカリンムテインは、試験基準抗体（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５および６）と同等のＥＣ５０で、ＣＨＯ細胞上で発現されるＬＡＧ−３に対する結合を示す。陰性リポカリンムテインＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３および陰性対照ヒトＩｇＧ４（ｈＩｇＧ４）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５および５６、Ｓｉｇｍａ＃Ｉ４６３９）は結合を示さなかった。蛍光強度の幾何平均を最大平均に対して正規化し、１：１結合モデルに適合させた。得られたＥＣ５０値は表３に提供される。
【図２Ａ−２】図２Ａ−１の説明を参照のこと。
【図２Ｂ−１】図２Ａ−１の説明を参照のこと。
【図２Ｂ−２】図２Ａ−１の説明を参照のこと。
【図３】競合的ＦＡＣＳ実験においてリポカリンムテインがＬＡＧ−３への結合に対して主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子（ＬＡＧ−３の天然リガンド）と競合することを示す。ＭＨＣクラスＩＩ陽性ヒト細胞株Ａ３７５を、リポカリンムテインおよびｈｕＬＡＧ−３−Ｆｃ（ヒトＩｇＧ１  Ｆｃフラグメントに融合されたヒトＬＡＧ−３細胞外ドメイン、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）と共にインキュベートし、フィコエリトリンとコンジュゲートさせたヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体を用いて、結合したｈｕＬＡＧ−３−Ｆｃを検出した（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，＃１０９−１  １６−０９８）。ＬＡＧ−３特異的リポカリンムテインによる、ＭＨＣクラスＩＩ分子に対するｈｕＬＡＧ−３−Ｆｃの結合の用量依存的阻害が示された。ＬＡＧ−３特異的リポカリンムテインおよびリファレンス分子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５および６）は、等しい濃度で、ＬＡＧ−３／ＭＨＣクラスＩＩ結合に対する阻害効果を示した。陰性対照リポカリンムテイン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）およびｈＩｇＧ４陰性対照は、ＭＨＣクラスＩＩ分子を発現するＡ３７５細胞に対するｈｕＬＡＧ−３−Ｆｃの結合の測定可能な阻害をもたらさなかった。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
ＩＶ．開示の詳細な説明
本明細書にいう「リポカリン」は、二つ一組で一方の端が複数（好ましくは４つ）のループにより接続されることで結合ポケットを規定している複数（好ましくは８つ）のβストランドを含む円筒状のβプリーツシート超二次構造領域を有する、重量が約１８〜２０ｋＤａの単量体型タンパク質と定義される。サイズ、形状、および化学的特徴が異なる標的を収容する能力をそれぞれが有するリポカリンファミリーメンバー間に、さまざまな異なる結合様式を生じさせるのは、他の点ではリジッドなリポカリンスキャフォールドにおける、ループの多様性である（例えばＳｋｅｒｒａ，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ，２０００，Ｆｌｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ，２０００，Ｆｌｏｗｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，１９９６に概説されている）。事実、リポカリンタンパク質ファミリーは、広範なリガンドに結合するように自然に進化しており、それらが共有する全体的配列保存のレベルは異常に低い（多くの場合、配列同一性は２０％未満である）にもかかわらず、高度に保存された全体的フォールディングパターンを保っている。さまざまなリポカリンにおける位置間の対応は当業者には周知である（例えば米国特許第７，２５０，２９７号明細書を参照）。
【００３８】
上記のとおり、リポカリンは、その超二次構造、すなわち、二つ一組で一方の端が４つのループにより接続されることで結合ポケットを規定している８つのβストランドを含む円筒状のβプリーツシート超二次構造領域によって規定される、ポリペプチドである。本開示は、本明細書において具体的に開示するリポカリンムテインに限定されない。この点に関して、本開示は、二つ一組で一方の端が４つのループにより接続されることで結合ポケットを規定している８つのβストランドを含む円筒状のβプリーツシート超二次構造領域を有するリポカリンムテインに関するものであり、該４つのループのうちの少なくとも３つのそれぞれの少なくとも１つのアミノ酸はリファレンス配列と比べて変異しており、該リポカリンムテインは、ＬＡＧ−３に検出可能な親和性で結合するのに有効である。
【００３９】
一特定実施形態において、本明細書に開示するリポカリンムテインは、リポカリン−１、ヒト涙液プレアルブミンまたはフォン・エブネル腺タンパク質とも呼ばれるヒト涙液リポカリン（ｈＴｌｃまたはｈＴＬＰＣ）のムテインである。本明細書において使用する用語「ヒト涙液リポカリン」または「ｈＴｌｃ」または「リポカリン−１」は、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ／ＵｎｉＰｒｏｔデータバンクアクセッション番号Ｐ３１０２５（アイソフォーム１）の成熟ヒト涙液リポカリンを指す。ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ／ＵｎｉＰｒｏｔデータバンクアクセッション番号Ｐ３１０２５に示されるアミノ酸配列は、好ましい「リファレンス配列」として使用することができ、より好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸配列がここで「リファレンス配列」として使用される。
【００４０】
いくつかの実施形態において、ＬＡＧ−３に検出可能な親和性で結合するリポカリンムテインは、リファレンス配列のネイティブシステイン残基の、別のアミノ酸による、例えばセリン残基によるアミノ酸置換を、少なくとも１つは含み得る。他のいくつかの実施形態において、ＬＡＧ−３に検出可能な親和性で結合するリポカリンムテインは、野生型リポカリンの１つまたは複数のアミノ酸を置換する１つまたは複数の非ネイティブシステイン残基を含み得る。さらなる一特定実施形態において、本開示によるリポカリンムテインは、システイン残基によるネイティブアミノ酸のアミノ酸置換を少なくとも２つは含み、それによって１つまたは複数のシステイン架橋を形成している。いくつかの実施形態において、該システイン架橋は少なくとも２つのループ領域を接続し得る。これらの領域の定義は、本明細書では、Ｆｌｏｗｅｒ  （Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，１９９６），（Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ，２０００）およびＢｒｅｕｓｔｅｄｔ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２００５）に従って使用される。関連実施形態において、本開示は、ＬＡＧ−３に結合することによってＬＡＧ−３の下流シグナリング経路を活性化する能力を有する１種類または複数種類のリポカリンムテインを教示する。
【００４１】
ＬＡＧ−３に向けられた、またはＬＡＧ−３に特異的な、本開示のタンパク質は、明確なタンパク質スキャフォールド、好ましくはリポカリンスキャフォールドに基づく多くの特異的結合タンパク質ムテインを包含する。交換され、欠失し、または挿入されるヌクレオチドまたはアミノ酸のそれぞれの数は、好ましくは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０個またはそれ以上、例えば２５、３０、３５、４０、４５または５０個であり、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１個は好ましく、９、１０または１１個はさらに好ましい。ただし、本開示のタンパク質ムテインは、依然として、ＬＡＧ−３に結合する能力を有することが好ましい。
【００４２】
一態様において、本開示は、ＬＡＧ−３に少なくとも検出可能な親和性で結合するさまざまなリポカリンムテインを包含する。この意味で、ＬＡＧ−３は、野生型リポカリンの非天然リガンドであるとみなすことができ、ここで「非天然リガンド」とは、生理的条件下で野生型リポカリンに結合しない化合物を指す。野生型リポカリンを一定の配列位置における１つまたは複数の突然変異で工学的に操作することにより、本発明者らは、非天然リガンドであるＬＡＧ−３に対する高い親和性および高い特異性が可能であることを証明した。いくつかの実施形態では、野生型リポカリン上の一定の配列位置をコードする１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２個またはさらにそれ以上のヌクレオチドトリプレットにおいて、ヌクレオチドトリプレットの部分集合でこれらの位置における置換を行うことによって、ランダム突然変異誘発を実行し得る。
【００４３】
さらに、本開示のリポカリンムテインは、リファレンスリポカリンの直鎖ポリペプチド配列の一定の配列位置に対応する配列位置のうちの任意の１つまたは複数に、例えば少なくとも任意の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個またはそれ以上に、変異アミノ酸残基を有し得る。
【００４４】
本開示のタンパク質は、変異アミノ酸配列位置以外では、「親」タンパク質スキャフォールド（リポカリンスキャフォールドなど）の野生型（天然）アミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、本開示によるリポカリンムテインは、１つまたは複数の配列位置おける１つまたは複数のアミノ酸突然変異も、そのような突然変異が当該ムテインの結合活性およびフォールディングを少なくとも本質的には阻止することも妨害することもないのであれば、保持し得る。そのような突然変異は、確立された標準的方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ）を使って、ＤＮＡレベルで非常に容易に実現することができる。アミノ酸配列改変の具体例は、挿入または欠失およびアミノ酸置換である。そのような置換は保存的であり得る。すなわち、アミノ酸残基は、特性が、とりわけ極性およびサイズに関して、化学的に類似しているアミノ酸残基で置き換えられる。保存的置換の例は、以下のグループのメンバー間での置き換えである：１）アラニン、セリン、およびスレオニン；２）アスパラギン酸およびグルタミン酸；３）アスパラギンおよびグルタミン；４）アルギニンおよびリジン；５）イソロイシン、ロイシン、メチオニン、およびバリン；ならびに６）フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン。他方、アミノ酸配列中に非保存的改変を導入することも可能である。加えて、単一のアミノ酸残基を置き換える代わりに、リファレンスリポカリン、好ましくはｈＴｌｃの一次構造のうちの１つまたは複数の連続アミノ酸を挿入または欠失させることも、それらの欠失または挿入が安定なフォールディングされた機能的なムテインをもたらす限りにおいて、可能である。そのようなムテインでは、例えば、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端において、１つまたは複数のアミノ酸残基を付加し、または欠失させる（例えば、Ｎ末端およびＣ末端が切断されたｈＴｌｃムテイン）。一般にそのようなムテインは、ｈＴｌｃ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）のアミノ酸配列に対して、およそ少なくとも７０％、例えば少なくとも約８０％、例えば少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有し得る。一具体例として、本開示は、成熟ヒト涙液リポカリンの配列のＮ末端の最初の４アミノ酸残基（Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１；位置１〜４）および／または成熟ヒト涙液リポカリンの直鎖ポリペプチド配列のＣ末端の最後の２アミノ酸残基（Ｓｅｒ−Ａｓｐ；位置１５７〜１５８）を欠失させた、上に定義したｈＴｌｃムテイン（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７〜２８、５７〜７０、および８５〜９５参照）も包含する。
【００４５】
本明細書において開示するリポカリンムテインのアミノ酸配列は、他のリポカリンとの配列同一性と比較した場合に、リファレンスリポカリン、好ましくはｈＴｌｃに対して高い配列同一性を有する。この一般的状況において、本開示のリポカリンムテインのアミノ酸配列は、リファレンスリポカリンのアミノ酸配列に、少なくとも実質的に類似している。ただし、ギャップ（以下に定義する）が、アミノ酸の付加または欠失の結果としてアラインメント中に存在する可能性はある。リファレンスリポカリンの配列に実質的に類似する本開示のリポカリンムテインのそれぞれの配列は、いくつかの実施形態では、リファレンスリポカリンの配列に対して、少なくとも７０％の同一性または配列相同性、少なくとも７５％の同一性または配列相同性、少なくとも８０％の同一性または配列相同性、少なくとも８２％の同一性または配列相同性、少なくとも８５％の同一性または配列相同性、少なくとも８７％の同一性または配列相同性、または少なくとも９０％の同一性もしくは配列相同性、例えば少なくとも９５％の同一性または配列相同性を有する。ただし、改変された位置または配列は保たれており、１つまたは複数のギャップが可能である。
【００４６】
本明細書において、本開示のリポカリンムテインは、それが、ある標的（例えばＬＡＧ−３）と１つまたは複数のリファレンス標的とを区別することができるのであれば、当該標的に「特異的に結合」する。結合特異性は絶対的特性ではなく相対的特性だからである。「特異的結合」は、例えばウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、ＲＩＡ（放射免疫測定（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ））、ＥＣＬ（電気化学発光法（ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ））、ＩＲＭＡ（免疫放射線測定法（ｉｍｍｕｎｏｒａｄｉｏｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ））、ＩＨＣ（免疫組織化学（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ））およびペプチドスキャンに従って決定することができる。
【００４７】
一実施形態において、本開示のリポカリンムテインは、そのＮ末端および／またはそのＣ末端において、ムテインの血清半減期を延ばすタンパク質ドメインである融合パートナーに融合されている。さらなる特定実施形態において、前記タンパク質ドメインは、免疫グロブリンのＦｃ部分、免疫グロブリンのＣＨ３ドメイン、免疫グロブリンのＣＨ４ドメイン、アルブミン結合ペプチド、またはアルブミン結合タンパク質である。
【００４８】
別の一実施形態において、本開示のリポカリンムテインは、ムテインの血清半減期を延ばす化合物にコンジュゲートされている。より好ましくは、ムテインは、ポリアルキレングリコール分子、ヒドロキシエチルデンプン、免疫グロブリンのＦｃ部分、免疫グロブリンのＣＨ３ドメイン、免疫グロブリンのＣＨ４ドメイン、アルブミン結合ペプチド、およびアルブミン結合タンパク質からなる群より選択される化合物にコンジュゲートされている。
【００４９】
さらに別の一実施形態において、本開示は、本明細書において開示するリポカリンムテインをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子に関係する。本開示は該核酸分子を含有する宿主細胞を包含する。
【００５０】
Ａ．ＬＡＧ−３に特異的なリポカリンムテイン
一態様において、本開示は、高い親和性でヒトＬＡＧ−３に結合するヒトリポカリンムテイン、およびそのようなムテインの有用な応用を提供する。本開示は、本明細書において記載するＬＡＧ−３結合タンパク質を作製する方法、ならびにそのようなタンパク質を含む組成物も提供する。本開示のＬＡＧ−３結合タンパク質およびその組成物は、試料中のＬＡＧ−３タンパク質を検出する方法において、または免疫応答を刺激もしくは阻害するための、対象におけるＬＡＧ−３の結合方法において、使用することができる。開示されるＬＡＧ−３結合タンパク質は増強された生物学的安定性を有すると共に、ヒトおよびカニクイザルＬＡＧ−３の両方に対して類似または同等の結合パターンを有する。最後に本開示は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子へのＬＡＧ−３の結合を阻害するために、ＬＡＧ−３に対するリポカリンのムテインを使用する方法を提供する。本開示が提供する用途に付随するこれらの特徴を有するそのようなヒトリポカリンムテインが、以前に記載されたことはなかった。
【００５１】
１．ＬＡＧ−３に特異的な例示的リポカリンムテイン
本開示のいくつかの実施形態は、約８０ｎＭ、６０ｎＭ、４０ｎＭ、２０ｎＭ、１５ｎＭ、１０ｎＭ、８ｎＭ、６ｎＭ、４ｎＭ、２ｎＭ、１．５ｎＭ、１ｎＭ、０．２ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０５ｎＭ、またはさらにより低いＫｄで測定される親和性でＬＡＧ−３、好ましくはヒトＬＡＧ−３（ｈｕＬＡＧ−３）に結合することができるリポカリンムテインに関する。このような親和性は、例えば、実施例４に本質的に記載される表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析によって決定することができる。
【００５２】
他の実施形態では、リポカリンムテインに結合するＬＡＧ−３はカニクイザルＬＡＧ−３（ｃｙＬＡＧ−３）と交差反応することが可能であり、いくつかのさらなる実施形態では、約８０ｎＭ、７０ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、０．５ｎＭ、またはさらにより低い約０．４６ｎＭなどのＫｄで測定される親和性でｃｙＬＡＧ−３に結合することができる。このような親和性は、例えば、実施例４に本質的に記載されるＳＰＲ分析によって決定することができる。
【００５３】
他の実施形態では、リポカリンムテインは、約５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２．５ｎＭ、２ｎＭ、１．５ｎＭ、１ｎＭ、０．５ｎＭまたはさらにより低い約０．２２ｎＭまたは０．０２ｎＭなどのＥＣ５０値で、ｈｕＬＡＧ−３がトランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞上のＬＡＧ−３に結合することができる。他の実施形態では、リポカリンムテインは、約３５０ｎＭ、３００ｎＭ、２５０ｎＭ、２００ｎＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、またはさらにより低い約９．３ｎＭなどのＥＣ５０で、ｃｙＬＡＧ−３がトランスフェクトされたＣＨＯ細胞上のＬＡＧ−３に結合することができる。ＥＣ５０値は、例えば、実施例５に本質的に記載されるように蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって決定することができる。
【００５４】
いくつかの実施形態において、本リポカリンムテインは、ＭＨＣクラスＩＩ、例えば抗原提示細胞（ＡＰＣ）または腫瘍細胞上に発現するものへの、ＬＡＧ−３の結合を阻害する能力を有する。阻害作用様式は、例えば、本質的に実施例６に記載するように、ＦＡＣＳ分析によって決定することができる。
【００５５】
一態様において、本開示はＬＡＧ−３結合性ｈＴｌｃムテインを提供する。
【００５６】
この点に関して、本開示は、約１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、４ｎＭ以下、３ｎＭ以下、２ｎＭ以下、１．５ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．７５ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下、０．２５ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、またはさらに約０．０５ｎＭ以下のＫｄで測定される親和性でＬＡＧ−３に結合することができる１つまたは複数のｈＴｌｃムテインを提供する。
【００５７】
いくつかの実施形態では、このようなｈＴｌｃムテインは、成熟ｈＴｌｃの直鎖ポリペプチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）の位置５、７〜８、１０、１４、１６、２５〜３４、４４、４６、５２〜５３、５５〜５６、５８、６０〜６１、６３、６５〜６６、６９〜７０、７３、７９〜８０、８４〜８６、８９〜９０、９３、９６〜９８、１０１、１０５〜１０６、１０８、１１０〜１１４、１２１、１２４、１４８〜１５０、および１５２〜１５４に対応する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個またはそれ以上の位置において変異アミノ酸残基を含む。
【００５８】
いくつかの特定の実施形態では、このようなｈＴｌｃムテインは、成熟ｈＴｌｃの直鎖ポリペプチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）の位置５、７〜８、１０、１６、２６〜３４、４４、４６、５３、５６、５８、６０〜６１、６３、６５、６９〜７０、７３、７９〜８０、８５、８９〜９０、９３、９６〜９８、１０１、１０５〜１０６、１０８、１１１、１１４、１２４、１４８〜１５０、および１５２〜１５４に対応する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個またはそれ以上の位置において変異アミノ酸残基を含有し得る。
【００５９】
いくつかの特定の実施形態では、このようなｈＴｌｃムテインは、成熟ｈＴｌｃの直鎖ポリペプチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）の位置１４、２５〜２６、２８、３１〜３２、５２、５５、５８、６６、７９、８４、８６、１０１、１０５〜１０６、１０８、１１０、１１２〜１１４、および１２１に対応する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２個の位置において変異アミノ酸残基を含有し得る。
【００６０】
いくつかの特定の実施形態では、このようなｈＴｌｃムテインは、成熟ｈＴｌｃの直鎖ポリペプチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）の位置５、８、２６〜３４、５６、５８、６０〜６１、６５、６９、８５、１０１、１０５〜１０６、１０８、１１１、１１４、および１５３〜１５４に対応する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６個の位置において変異アミノ酸残基を含み得る。
【００６１】
いくつかの特定の実施形態では、このようなｈＴｌｃムテインは、成熟ｈＴｌｃの直鎖ポリペプチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）の位置１４、２５〜２６、２８、３２、５２、５５、５８、６６、７９、８４、８６、１０１、１０５、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、および１２１に対応する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の位置において変異アミノ酸残基を含み得る。
【００６２】
いくつかの特定の実施形態では、このようなｈＴｌｃムテインは、成熟ｈＴｌｃの直鎖ポリペプチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）の位置２６〜３４、５６、５８、６０〜６１、６５、７０、１０１、１０５〜１０６、１０８、１１１、１１４、および１５３に対応する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２個の位置において変異アミノ酸残基を含み得る。
【００６３】
いくつかの特定の実施形態では、このようなｈＴｌｃムテインは、成熟ｈＴｌｃの直鎖ポリペプチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）の位置２６〜３４、５６、５８、６０〜６１、６３、６５、１０１、１０５〜１０６、１０８、１１１、１１４、１４９、および１５３に対応する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の位置において変異アミノ酸残基を含み得る。
【００６４】
いくつかの特定の実施形態では、このようなｈＴｌｃムテインは、成熟ｈＴｌｃの直鎖ポリペプチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）の位置５、７〜８、１０、１６、４４、４６、６３、６５、６９〜７０、７３、８０、８４、８９〜９０、９３、９６〜９８、１１３、１２４、１４８〜１５０、１５２、または１５４に対応する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７個の位置において変異アミノ酸残基を含み得る。
【００６５】
いくつかのさらなる実施形態では、ｈＴｌｃムテインは、成熟ｈＴｌｃの直鎖ポリペプチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）の配列位置５、８、６５、６９、８５、および１５４に対応する１つまたは複数の配列位置における少なくとも１、２、３、４、５、または６個の変異アミノ酸残基を含むことができ、ここで、前記ポリペプチドはＬＡＧ−３、特にｈｕＬＡＧ−３に結合する。
【００６６】
いくつかのさらなる実施形態では、ｈＴｌｃムテインは、成熟ｈＴｌｃの直鎖ポリペプチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）の配列位置６３、６５、および１４９に対応する１つまたは複数の配列位置における少なくとも１、２、または３個の変異アミノ酸残基を含むことができ、ここで、前記ポリペプチドは、ｈｕＬＡＧ−３を含むＬＡＧ−３に結合する。
【００６７】
いくつかのさらなる実施形態では、ｈＴｌｃムテインは、成熟ｈＴｌｃの直鎖ポリペプチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）の配列位置２６、８４、１０６、および１１２に対応する１つまたは複数の配列位置における少なくとも１、２、３、または４個の変異アミノ酸残基を含むことができ、ここで、前記ポリペプチドは、ｈｕＬＡＧ−３を含むＬＡＧ−３に結合する。
【００６８】
いくつかのまたさらなる実施形態では、本開示はポリペプチドに関し、前記ポリペプチドには、ｈＴｌｃの直鎖ポリペプチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と比較して配列位置８４において少なくとも１個の変異アミノ酸残基を含むｈＴｌｃムテインであり、ここで、前記ポリペプチドはＬＡＧ−３、特にｈｕＬＡＧ−３に結合する。
【００６９】
いくつかの実施形態において、本開示によるリポカリンムテインは、ネイティブシステイン残基の、例えばセリン残基によるアミノ酸置換を、少なくとも１つ含み得る。いくつかの実施形態において、本開示によるｈＴｌｃムテインは、位置６１および／または１５３にあるネイティブシステイン残基の、セリン残基などの別のアミノ酸によるアミノ酸置換を含む。これとの関連において、システイン残基６１および１５３によって形成される野生型涙液リポカリンの構造ジスルフィド結合（Ｂｒｅｕｓｔｅｄｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２００５参照）の（それぞれのナイーブ核酸ライブラリーのレベルでの）除去が、安定にフォールディングされるだけでなく、所与の非天然リガンドに高い親和性で結合することもできるｈＴｌｃムテインを与え得ることがわかっていることに注意されたい。いくつかの特定実施形態において、本開示によるｈＴｌｃムテインは、アミノ酸置換Ｃｙｓ６１→Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、ＰｒｏもしくはＴｒｐ、および／またはＣｙｓ１５３→ＳｅｒもしくはＡｌａを含む。そのような置換は、Ｃｙｓ６１とＣｙｓ１５３とを連結する天然ジスルフィド架橋の形成を防止するのに有用であり、よってムテインの取り扱いを容易にすることが判明している。ただし、ＬＡＧ−３に結合し、かつＣｙｓ６１とＣｙｓ１５３との間に形成されたジスルフィド架橋を有するｈＴｌｃムテインも、本発明の一部である。
【００７０】
いくつかの実施形態では、構造ジスルフィド結合の排除により、本開示のムテインへの非天然人工ジスルフィド結合の（自発的）生成または計画的導入が可能になり、それによってムテインの安定性が増加するという、さらなる利点が得られ得る。例えば、いくつかの実施形態では、位置６１、１０１および１５３にあるシステインコドンのうちの２つまたは３つ全てが、別のアミノ酸のコドンで置き換えられる。さらに、いくつかの実施形態において、本開示によるｈＴｌｃムテインは、位置１０１にあるネイティブシステイン残基の、セリン残基またはヒスチジン残基によるアミノ酸置換を含む。
【００７１】
しかしながら、ＬＡＧ−３に結合し、かつＣｙｓ６１とＣｙｓ１５３との間に形成されたジスルフィド架橋を有するｈＴｌｃムテインも、本開示の一部である。いくつかの特定の実施形態では、ｈＴｌｃムテインは位置６１および１５３において変異アミノ酸を含まず、かつＣｙｓ６１とＣｙｓ１５３との間に形成されたジスルフィド結合を有する。いくつかのさらなる特定の実施形態では、位置６１および／または１５３に変異アミノ酸を有するｈＴｌｃムテインは、位置６１および／または１５３を変異させてネイティブシステインに戻すことにより、さらなる突然変異誘発を受けて天然ジスルフィド結合を回復させる。
【００７２】
いくつかの実施形態において、本開示によるムテインは、ｈＴｌｃのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）に関して、位置２８または１０５における、システイン残基によるネイティブアミノ酸のアミノ酸置換を含む。
【００７３】
さらに、いくつかの実施形態において、本開示によるムテインは、ｈＴｌｃのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）に関して、位置１１１にあるネイティブアルギニン残基の、プロリン残基によるアミノ酸置換を含む。さらに、いくつかの実施形態において、本開示によるムテインは、ｈＴｌｃのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）に関して、位置１１４にあるネイティブリジン残基の、トリプトファン残基またはグルタミン酸によるアミノ酸置換を含む。
【００７４】
いくつかの実施形態では、本開示によるリポカリンムテインは、１つまたは複数のグリコシル化部位を導入するためにアスパラギン残基に変異された１つまたは複数のアミノ酸を含み得る。いくつかの好ましい実施形態では、本開示によるムテインは、成熟ｈＴｌｃの直鎖ポリペプチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）の位置１２においてアミノ酸突然変異を含む。例えば、本開示によるムテインは、ｈＴｌｃのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）に関して以下の変異アミノ酸残基：Ａｓｐ１２→Ａｓｎを有し得る。
【００７５】
いくつかの実施形態では、本開示によるムテインは、成熟ｈＴｌｃの直鎖ポリペプチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）の位置５においてアミノ酸置換を含む。例えば、本開示によるムテインは、ｈＴｌｃのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）に関して以下の変異アミノ酸残基：Ａｌａ５→Ｔｈｒを有し得る。
【００７６】
さらに、いくつかの実施形態では、本開示によるムテインは、中性（ｎｅｕｔｕｒａｌ）残基による、負に帯電したネイティブ残基の少なくとも１つのアミノ酸置換を含むことができ、ここで、負に帯電したネイティブ残基はＬＡＧ−３への結合に関与せず、置換によってムテインの等電点（ｐＩ）の上昇が生じる。いくつかの特定の実施形態では、このような負に帯電したネイティブ残基および位置は、ｈＴｌｃのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）に関して、Ａｓｐ７、Ｇｌｕ９、Ａｓｐ１２、Ｇｌｕ４５、Ａｓｐ７２、Ｇｌｕ７３、Ａｓｐ８０、およびＡｓｐ９５を含む。いくつかの特定の実施形態では、このような中性（ｎｅｕｔｕｒａｌ）アミノ酸残基は、Ａｓｎ、Ａｒｇ、およびＬｙｓを含む。いくつかのさらに特定の実施形態では、本開示によるムテインは、成熟ｈＴｌｃの直鎖ポリペプチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）の位置７、９、１２、４５、７２、７３、８０、および９５において、以下の変異アミノ酸残基：
2020505948.tif 000002
のうちの１つまたは複数を含む。例示的なムテインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７〜６０、６３、６６を含む。
【００７７】
いくつかの実施形態では、本開示によるＬＡＧ−３結合性ｈＴｌｃムテインは、成熟ｈＴｌｃの直鎖ポリペプチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）の位置５、７〜８、１０、１４、１６、２５〜３４、４４、４６、５２〜５３、５５〜５６、５８、６０〜６１、６３、６５〜６６、６９〜７０、７３、７９〜８０、８４〜８６、８９〜９０、９３、９６〜９８、１０１、１０５〜１０６、１０８、１１０〜１１４、１２１、１２４、１４８〜１５０、および１５２〜１５４に対応する１つまたは複数の位置において、以下の変異アミノ酸残基：
2020505948.tif 000003
のうちの１つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、本開示によるｈＴｌｃムテインは、成熟ｈＴｌｃ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）のこれらの配列位置における、２個以上、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個、またはさらにそれ以上、例えば、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７個またはさらにそれ以上の変異アミノ酸残基を含む。
【００７８】
いくつかの実施形態では、本開示によるＬＡＧ−３結合性ｈＴｌｃムテインは、成熟ｈＴｌｃの直鎖ポリペプチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）の位置１４、２５〜２６、２８、３１〜３２、５２、５５、５８、６６、７９、８４、８６、１０１、１０５〜１０６、１０８、１１０、１１２〜１１４、および１２１に対応する１つまたは複数の位置において、以下の変異アミノ酸残基：
2020505948.tif 000004
のうちの１つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、本開示によるｈＴｌｃムテインは、成熟ｈＴｌｃ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）のこれらの配列位置における、２個以上、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個、またはさらにそれ以上、例えば、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２個の変異アミノ酸残基を含む。
【００７９】
いくつかの実施形態では、本開示によるＬＡＧ−３結合性ｈＴｌｃムテインは、成熟ｈＴｌｃの直鎖ポリペプチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）の位置５、７〜８、１０、１６、２６〜３４、４４、４６、５３、５６、５８、６０〜６１、６３、６５〜６６、６９〜７０、７３、７９〜８０、８５、８９〜９０、９３、９６〜９８、１０１、１０５〜１０６、１０８、１１０〜１１１、１１４、１２１，１２４、１４８〜１５０、および１５２〜１５４に対応する１つまたは複数の位置において、以下の変異アミノ酸残基：
2020505948.tif 000005
のうちの１つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、本開示によるｈＴｌｃムテインは、成熟ｈＴｌｃ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）のこれらの配列位置における、２個以上、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個、またはさらにそれ以上、例えば、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７個またはさらにそれ以上の変異アミノ酸残基を含む。
【００８０】
いくつかの実施形態では、本開示によるＬＡＧ−３結合性ｈＴｌｃムテインは、成熟ｈＴｌｃの直鎖ポリペプチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）の位置５、７〜８、１０、１６、２６〜３４、４４、４６、５３、５６、５８、６０〜６１、６３、６５、６９〜７０、７３、７９〜８０、８５、８９〜９０、９３、９６〜９８、１０１、１０５〜１０６、１０８、１１１、１１４、１２４、１４８〜１５０、および１５２〜１５４に対応する１つまたは複数の位置において、以下の変異アミノ酸残基：
2020505948.tif 000006
のうちの１つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、本開示によるｈＴｌｃムテインは、成熟ｈＴｌｃ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）のこれらの配列位置における、２個以上、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個、またはさらにそれ以上、例えば、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７個またはさらにそれ以上の変異アミノ酸残基を含む。
【００８１】
いくつかの実施形態では、ＬＡＧ−３結合性ｈＴｌｃムテインは、成熟ｈＴｌｃの直鎖ポリペプチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と比較して、以下のアミノ酸突然変異：
2020505948.tif 000007
と、さらに以下のアミノ酸突然変異：
2020505948.tif 000008
のうちの１つまたは複数、例えば、２、３、４、５、６、または７個、またはさらにそれ以上とを含む。
【００８２】
いくつかの実施形態では、ＬＡＧ−３結合性ｈＴｌｃムテインは、成熟ｈＴｌｃの直鎖ポリペプチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と比較して、以下のアミノ酸突然変異：
2020505948.tif 000009
と、以下のアミノ酸突然変異：
2020505948.tif 000010
のうちの１つまたは複数、例えば、２、３、４、５、６、７個、またはさらにそれ以上とを含む。
【００８３】
いくつかの実施形態では、ＬＡＧ−３結合性ｈＴｌｃムテインは、成熟ｈＴｌｃの直鎖ポリペプチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と比較して、以下のアミノ酸突然変異：
2020505948.tif 000011
と、以下のアミノ酸突然変異：
2020505948.tif 000012
のうちの１つまたは複数、例えば、２、３、４、５、６、７個、またはさらにそれ以上とを含む。
【００８４】
いくつかの実施形態では、ＬＡＧ−３結合性ｈＴｌｃムテインは、成熟ｈＴｌｃの直鎖ポリペプチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と比較して、以下のアミノ酸突然変異：
2020505948.tif 000013
と、以下のアミノ酸突然変異：
2020505948.tif 000014
のうちの１つまたは複数、例えば、２、３、４、５、６、７個、またはさらにそれ以上とを含む。
【００８５】
いくつかの付加的な実施形態では、ＬＡＧ−３結合性ｈＴｌｃムテインは、成熟ｈＴｌｃの直鎖ポリペプチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と比較して、以下のアミノ酸突然変異のセット：
2020505948.tif 000015
2020505948.tif 000016
2020505948.tif 000017
2020505948.tif 000018
のうちの１つを含む。
【００８６】
いくつかの付加的な実施形態では、ＬＡＧ−３結合性ｈＴｌｃムテインは、成熟ｈＴｌｃの直鎖ポリペプチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と比較して、以下のアミノ酸突然変異のセット：
2020505948.tif 000019
のうちの１つを含む。
【００８７】
いくつかの付加的な実施形態では、ＬＡＧ−３結合性ｈＴｌｃムテインは、ｈＴｌｃの直鎖ポリペプチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と比較して、以下のアミノ酸突然変異：
位置１５６と１５７との間のＰｒｏの挿入
を含む。
【００８８】
残りの領域、すなわち、配列位置５、７〜８、１０、１４、１６、２５〜３４、４４、４６、５２〜５３、５５〜５６、５８、６０〜６１、６３、６５〜６６、６９〜７０、７３、７９〜８０、８４〜８６、８９〜９０、９３、９６〜９８、１０１、１０５〜１０６、１０８、１１０〜１１４、１２１、１２４、１４８〜１５０、１５２〜１５４、および１５７とは異なる領域において、本開示のｈＴｌｃムテインは、変異アミノ酸配列位置またはこのような位置の変異アミノ酸残基以外では、成熟ｈＴｌｃの野生型（天然）アミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を含み得る。
【００８９】
他に記載されない限り、本明細書に記載されるｈＴｌｃムテインの残基の位置は、ｈＴｌｃの直鎖ポリペプチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と比較して番号付けされる。
【００９０】
さらなる実施形態において、本開示によるｈＴｌｃムテインは、成熟ｈＴｌｃの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）に対して、少なくとも７０％の配列同一性または少なくとも７０％の配列相同性を有する。具体例としてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のムテインは、成熟ｈＴｌｃのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）に対して、約８１．８％のアミノ酸配列同一性または配列相同性を有する。
【００９１】
さらなる特定の実施形態において、本開示のｈＴｌｃムテインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７〜２８、５７〜７０、および８５〜９５のいずれか１つに示すアミノ酸配列、またはそのフラグメントもしくは変異体を含む。
【００９２】
さらに特定の実施形態では、本開示のｈＴｌｃムテインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８〜１８、２０〜２８、５７〜７０および８５〜９５からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％以上、少なくとも９０％以上、少なくとも９５％以上、少なくとも９７．５％以上、少なくとも９８％以上、または少なくとも９９％以上の配列同一性を有する。
【００９３】
本開示は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７〜２８、５７〜７０、および８５〜９５からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するｈＴｌｃムテインの構造ホモログであって、該ｈＴｌｃムテインとの関係において約６０％超、好ましくは６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、９２％超、最も好ましくは９５％超のアミノ酸配列相同性または配列同一性を有する構造ホモログも包含する。
【００９４】
本開示によるｈＴｌｃムテインは、天然型の成熟ｈＴｌｃ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）の突然変異誘発を使って得ることができる。突然変異誘発のいくつかの実施形態において、置換（すなわち置き換え）は保存的置換である。しかしながら、リポカリンムテインがＬＡＧ−３に結合するその能力を保っており、かつ／または、それが、成熟ｈＴｌｃのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）に対する少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％またはそれ以上の配列同一性であるという点で、その時置換される配列に対して配列同一性を有する限り、任意の置換（非保存的置換、または下記の例示的置換からの１つまたは複数を含む）が想定される。
【００９５】
いくつかの特定の実施形態では、本開示は、約１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、４ｎＭ以下、３ｎＭ以下、２ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下または０．０５ｎＭ以下のＫｄで測定される親和性でヒトＬＡＧ−３に結合するリポカリンムテインを提供する。いくつかの実施形態では、リポカリンムテインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７および１９のいずれか１つのアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％以上、例えば、９５％以上、９７．５％以上、９８％以上、または９９％以上の配列同一性を有する。
【００９６】
２．ＬＡＧ−３に特異的なリポカリンムテインの応用
本開示のＬＡＧ−３結合性リポカリンムテインには、医学において、数多くの可能な応用が存在する。
【００９７】
さらなる一態様において、本開示は、試料中のＬＡＧ−３を検出するための、本明細書に開示するＬＡＧ−３結合性リポカリンムテインの使用、およびそれぞれの診断方法に関する。
【００９８】
本開示は、ＬＡＧ−３との複合体形成について説明される１つまたは複数のＬＡＧ−３結合性リポカリンムテインの使用にも関係する。
【００９９】
それゆえに、本開示の別の一態様において、本開示のリポカリンムテインは、ＬＡＧ−３の検出に使用される。そのような使用は、１つまたは複数のムテインを、適切な条件下で、ＬＡＧ−３を含有すると疑われる試料と接触させ、それによってムテインとＬＡＧ−３との間の複合体の形成を可能にする工程、および適切なシグナルによって複合体を検出する工程を含み得る。上で説明したように、検出可能なシグナルは、標識によってもたらされるか、結合、すなわち複合体形成そのものによる物理的特性の変化によってもたらされ得る。一例は表面プラズモン共鳴であり、その値は、結合パートナー同士（そのうちの一方は、金箔などの表面に固定化されている）の結合中に変化する。
【０１００】
本明細書において開示するＬＡＧ−３結合性リポカリンムテインは、ＬＡＧ−３の分離にも使用され得る。そのような使用は、１つまたは複数のムテインを、適切な条件下で、ＬＡＧ−３を含有すると思われる試料と接触させ、それによって、ムテインとＬＡＧ−３との間の複合体の形成を可能にする工程、および複合体を試料から分離する工程を含み得る。
【０１０１】
ＬＡＧ−３の検出およびＬＡＧ−３の分離のための、本開示のムテインの使用では、ムテインおよび／もしくはＬＡＧ−３、またはそれらのドメインもしくはフラグメントは、適切な固相上に固定化され得る。
【０１０２】
さらに別の一態様において、本開示は、本開示によるＬＡＧ−３結合性リポカリンムテインを含む診断キットまたは分析キットを特徴とする。
【０１０３】
さらに別の一態様において、本開示では、診断におけるそれらの使用に加えて、本開示のムテインと薬学的に許容される賦形剤とを含む薬学的組成物も考えられる。
【０１０４】
さらにまた、本開示は、抗がん作用物質および／または免疫調節物質として使用するための、ＬＡＧ−３に結合するヒトリポカリンムテインを提供する。したがって、ＬＡＧ−３に結合するそのような本開示のリポカリンムテインは、がん、感染性疾患、および自己免疫疾患などのヒト疾患を処置または予防する方法において使用されることが想定される。したがって、がん、感染性疾患、および自己免疫疾患などのヒト疾患を処置または予防する必要がある対象において該ヒト疾患を処置または予防する方法であって、治療有効量の、ＬＡＧ−３に結合する本発明のリポカリンムテインを、対象に投与する工程を含む方法も提供される。
【０１０５】
Ｂ．本開示のリポカリンムテイン
リポカリンは、リガンドに結合するように自然に進化したタンパク質結合分子である。リポカリンは、脊椎動物、昆虫、植物および細菌を含む多くの生物に見いだされる。リポカリンタンパク質ファミリーのメンバー（Ｐｅｒｖａｉｚ  ａｎｄ  Ｂｒｅｗ，ＦＡＳＥＢ  Ｊ，１９８７）は、典型的には、小さな分泌タンパク質であり、単一のポリペプチド鎖を有する。それらは一連の異なる分子認識特性、すなわち、さまざまな、主として疎水性の小分子（レチノイド、脂肪酸、コレステロール、プロスタグランジン、ビリベルジン、フェロモン、味物質、およびにおい物質など）への、および特異的細胞表面受容体へのそれらの結合、ならびにそれらの高分子複合体形成によって特徴づけられる。リポカリンは以前は主に輸送タンパク質として分類されていたが、リポカリンはさまざまな生理学的機能を果たすことが、現在では明らかになっている。それらには、レチノール輸送、嗅覚、フェロモンシグナリング、およびプロスタグランジンの合成における役割が含まれる。リポカリンは、免疫応答の制御および細胞ホメオスタシスの媒介にも関係づけられている（例えばＦｌｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ，２０００，Ｆｌｏｗｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，１９９６に概説されている）。
【０１０６】
リポカリンが共有する全体的配列保存のレベルは異常に低く、多くの場合、配列同一性は２０％未満である。それとは著しく対照的に、それらの全体的フォールディングパターンは高度に保存されている。リポカリン構造の中心的部分は、一周して閉じることで途切れなく水素結合したβバレルを形成する単一の８ストランド逆平行βシートからなる。このβバレルは中心に空洞を形成する。バレルの一方の端は、その底を横切るＮ末端ペプチドセグメントおよびβストランドを接続する３つのペプチドループによって、立体的にブロックされている。βバレルの他方の端は溶媒に向かって開いており、４つのフレキシブルなペプチドループによって形成される標的結合部位を包含する。サイズ、形状、および化学的特徴が異なる標的を収容する能力をそれぞれが有するさまざまな結合様式を生じさせるのは、他の点ではリジッドなリポカリンスキャフォールドにおける、ループの多様性である（例えばＦｌｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ，２０００，Ｆｌｏｗｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，１９９６に概説されている）。
【０１０７】
ＬＡＧ−３に結合する本開示のリポカリンムテインに関連して本明細書において使用する場合、「〜に特異的」という用語は、当該リポカリンムテインが、ＬＡＧ−３に指向すること、ＬＡＧ−３に結合すること、またはＬＡＧ−３と反応することを包含する。したがって、指向すること、結合すること、または反応することは、当該リポカリンムテインがＬＡＧ−３に特異的に結合することを包含する。この文脈において「特異的に」という用語は、当該リポカリンムテインが、本明細書に記載するようにＬＡＧ−３タンパク質とは反応するが、他のタンパク質とは本質的に反応しないことを意味する。「他のタンパク質」という用語は、本明細書に開示するリポカリンが指向するＬＡＧ−３と近縁または相同であるタンパク質を含む任意の非ＬＡＧ−３タンパク質を包含する。しかし、ヒト以外の種、例えば「対象」の定義に関連して記載した種からのＬＡＧ−３タンパク質、フラグメントおよび／または変異体が、用語「他のタンパク質」によって除外されることはない。「本質的に結合しない」という用語は、本開示のリポカリンムテインが他のタンパク質に結合しないこと、すなわち３０％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１０％未満、特に好ましくは９、８、７、６または５％未満の交差反応性を示すことを意味する。リポカリンが本明細書において上に定義したように特異的に反応するかどうかは、とりわけ、本開示のリポカリンムテインのＬＡＧ−３との反応と、該リポカリンの他のタンパク質との反応とを比較することによって、容易に試験することができる。「特異的結合」は、例えばウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＣＬ、ＩＲＭＡ、ＦＡＣＳ、ＩＨＣおよびペプチドスキャンに従って決定することもできる。
【０１０８】
本開示によるリポカリンムテインのアミノ酸配列は、他のリポカリンとのそのようなムテインの配列同一性と比較すると、リファレンスリポカリン、例えばｈＴｌｃに対して高い配列同一性を有する。この総体的状況において、本発明による組み合わせのリポカリンムテインのアミノ酸配列は、対応する野生型リポカリンまたはリファレンスリポカリンのアミノ酸配列に、少なくとも実質的に類似している。対応するリファレンスリポカリンの配列に実質的に類似している本開示による組み合わせのリポカリンムテインのそれぞれの配列は、対応するリポカリンの配列に対して少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも９０％の同一性、例えば少なくとも９５％の同一性を有する。この点に関して、もちろん、本開示のリポカリンムテインは、比較すると、ＬＡＧ−３に結合する能力を当該リポカリンムテインに与える本明細書に記載の置換を含有し得る。典型的には、リポカリンのムテインは、リファレンスリポカリンの配列と比較して、リポカリンのリガンド結合部位の開放端にある４つのループ（上記参照）中のアミノ酸の突然変異を、１つまたは複数含む。上で説明したとおり、これらの領域は、所望の標的に対するリポカリンムテインの結合特異性を決定するのに不可欠である。
【０１０９】
本開示のムテインは、リポカリンの標的結合部位を形成する４つのフレキシブルなペプチドループ外の領域にも突然変異を含有し得る。例えば本開示のムテインは、リポカリンの閉鎖端でβストランドをつないでいる３つのペプチドループ（ＢＣ、ＤＥ、およびＦＧと呼ばれるもの）のうちの１つまたは複数に、１つまたは複数の突然変異を含有し得る。具体例として、涙液リポカリンまたはそれらのホモログのポリペプチドから誘導されるムテインは、Ｎ末端領域中の、および／または天然のリポカリン結合ポケットとは反対の位置にあるβバレル構造端部に配置された３つのペプチドループＢＣ、ＤＥ、およびＦＧ中の、任意の配列位置に、１つ、２つ、３つ、４つまたはそれ以上の変異アミノ酸残基を有し得る。さらなる具体例として、涙液リポカリンまたはそのホモログのポリペプチドから誘導されるムテインは、涙液リポカリンの野生型配列と比較して、βバレル構造の端部に配置されたペプチドループＤＥ中に変異アミノ酸残基を有さなくてもよい。
【０１１０】
本開示によるリポカリンムテインは、そのようなリポカリンムテインがＬＡＧ−３に結合する能力を有するという条件の下で、対応するネイティブリポカリンと比較して、１つまたは複数の置換、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９個、またはさらに２０個の置換を含む。例えば、リポカリンムテインは、例えばｈＴｌｃの野生型配列を有する野生型リポカリンの特異な位置に対応する位置（すなわち対応位置）に、置換を有することができる。いくつかの実施形態において、本開示による組み合わせのリポカリンムテインは、アルギニン残基によるネイティブアミノ酸のアミノ酸置換を、少なくとも２つ、例えば２、３、４、５個、またはさらにそれ以上含む。したがって、本明細書に記載する「リファレンスタンパク質」スキャフォールドの核酸は、ＬＡＧ−３に結合する能力を有するリポカリンムテインを生成させることを目的とする突然変異誘発の対象である。
【０１１１】
また、本開示のリポカリンムテインは、リポカリンムテインの生物学的活性（その標的、例えばＬＡＧ−３への結合）に影響を及ぼすことなく、そのＮ末端またはＣ末端に、好ましくはＣ末端に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４などの異種アミノ酸配列、例えばＳｔｒｅｐ−ｔａｇ  ＩＩ配列を含むことができる。
【０１１２】
同様に、本開示のリポカリンムテインは、それぞれの野生型涙液リポカリンと比較して、そのＮ末端の１、２、３、４個、もしくはそれ以上のアミノ酸、および／またはそのＣ末端の１、２個、もしくはそれ以上のアミノ酸を欠いてもよい。例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７〜２８、５７〜７０、および８５〜９５。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、置換（すなわち置き換え）は保存的置換である。しかしながら、リポカリンムテインがＬＡＧ−３に結合するその能力を保っており、かつ／または、それが、「リファレンス配列」と少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％またはそれ以上同一であるという点で、その時置換される配列に対して同一性を有する限り、任意の置換（非保存的置換、または以下に列挙する例示的置換の１つまたは複数を含む）が想定される。
【０１１４】
保存的置換は、一般に、変異させるアミノ酸別に列挙し、それぞれの後に、保存的であると解釈することができる１つまたは複数の置き換えを記した以下の置換：
2020505948.tif 000020
である。他の置換も許容され、それらは実験的に決定することができるか、または他の公知の保存的もしくは非保存的置換に一致し得る。さらなる指針として、以下の８つのグループは、それぞれが、典型的には互いに保存的置換を規定すると解釈することができるアミノ酸を含んでいる：
ａ．アラニン（Ａｌａ）、グリシン（Ｇｌｙ）；
ｂ．アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）；
ｃ．アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）；
ｄ．アルギニン（Ａｒｇ）、リジン（Ｌｙｓ）；
ｅ．イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、バリン（Ｖａｌ）；
ｆ．フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）；
ｇ．セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、および
ｈ．システイン（Ｃｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）。
【０１１５】
そのような置換が生物学的活性の変化をもたらすのであれば、例えば以下のような、またはアミノ酸クラスに関してさらに後述するような、より実質的な変化を導入して、その生成物を所望の特徴についてスクリーニングしてもよい。そのようなより実質的な変化の例は、
2020505948.tif 000021
である。
【０１１６】
リポカリンの生物学的特性の実質的修飾は、（ａ）置換領域中のポリペプチド主鎖の、例えばシートまたはらせんコンフォメーションなどの構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩高さ、を維持するその効果が、著しく異なる置換を選択することによって実現される。天然残基は、共通する側鎖の特性に基づいてグループ分けすることができる：（１）疎水性：ノルロイシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン；（２）中性親水性：システイン、セリン、スレオニン；（３）酸性：アスパラギン酸、グルタミン酸；（４）塩基性：アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リジン、アルギニン；（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：グリシン、プロリン；および（６）芳香族：トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン。
【０１１７】
非保存的置換ではこれらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスに交換することになるであろう。それぞれのリポカリンの適正なコンフォメーションの維持に関与しない任意のシステイン残基も、分子の酸化安定性を改善し、異常な架橋を防止するために、一般的にはセリンで置換し得る。逆に、リポカリンには、その安定性を改善するために、システイン結合を加えてもよい。
【０１１８】
上で考察した挿入を含む、突然変異はいずれも、確立された標準的方法を使って、核酸レベルで、例えばＤＮＡレベルで、極めて容易に実現することができる。アミノ酸配列の改変の具体例は、挿入または欠失、ならびにアミノ酸置換である。そのような置換は保存的であり得る。すなわち、アミノ酸残基は、特性が、とりわけ極性およびサイズに関して、化学的に類似する特性を持つアミノ酸残基で置き換えられる。保存的置換の例は、以下のグループのメンバー間での置き換えである：１）アラニン、セリン、およびスレオニン；２）アスパラギン酸およびグルタミン酸；３）アスパラギンおよびグルタミン；４）アルギニンおよびリジン；５）イソロイシン、ロイシン、メチオニン、およびバリン；ならびに６）フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン。他方、アミノ酸配列中に非保存的改変を導入することも可能である。加えて、単一のアミノ酸残基を置き換える代わりに、涙液リポカリンの一次構造のうちの１つまたは複数の連続アミノ酸を挿入または欠失させることも、それらの欠失または挿入が安定なフォールディングされた／機能的ムテインをもたらす限りにおいて、可能である。
【０１１９】
アミノ酸配列の修飾には、一定の制限酵素のための切断部位を組み入れることによって変異リポカリン遺伝子またはそのパーツのサブクローニングを簡単にするための、単一アミノ酸位置の指定突然変異誘発が含まれる。加えて、ＬＡＧ−３などの所与の標的に対するリポカリンムテインの親和性をさらに改善するために、これらの突然変異を組み入れることもできる。さらにまた、必要であれば、フォールディング安定性、血清中安定性、タンパク質耐性または水溶性を改善するため、または凝集傾向を低減するためなど、ムテインの一定の特徴を調節するために、突然変異を導入することができる。例えばジスルフィド架橋形成を防止するために天然のシステイン残基を他のアミノ酸に変異させることができる。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ビオチン、ペプチドまたはタンパク質などの他の化合物へのコンジュゲーションのために、または非天然のジスルフィド連結を形成させるために、新しい反応性基を導入する目的で、計画的に他のアミノ酸配列位置をシステインに変異させることも可能である。生成したチオール部分は、例えばそれぞれのリポカリンムテインの血清半減期を増加させる目的で、ムテインをＰＥＧ化またはＨＥＳ化するために使用し得る。ｈＴｌｃムテインのアミノ酸配列中にシステイン残基を導入するためのそのような突然変異の例示的選択肢には、置換Ｔｈｒ４０→Ｃｙｓ、Ｇｌｕ７３→Ｃｙｓ、Ａｒｇ９０→Ｃｙｓ、Ａｓｐ９５→Ｃｙｓ、およびＧｌｕ１３１→Ｃｙｓが含まれる。アミノ酸位置４０、７３、９０、９５および／または１３１のいずれかの側部に生成したチオール部分は、例えばそれぞれのｈＴｌｃムテインの血清半減期を増加させる目的で、ムテインをＰＥＧ化またはＨＥＳ化するために使用し得る。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、上記部分の１つを本開示のリポカリンムテインにコンジュゲートするのであれば、アミノ酸側鎖へのコンジュゲーションが有利である。適切なアミノ酸側鎖は、ヒトリポカリンのアミノ酸配列中に天然に存在するか、突然変異誘発によって導入することができる。適切な結合部位を突然変異誘発によって導入する場合、選択肢の１つは、適当な位置にあるアミノ酸のシステイン残基による置き換えである。例えばそのような突然変異には、ヒト涙液リポカリンの野生型配列におけるＴｈｒ４０→Ｃｙｓ、Ｇｌｕ７３→Ｃｙｓ、Ａｒｇ９０→Ｃｙｓ、Ａｓｐ９５→ＣｙｓまたはＧｌｕ１３１→Ｃｙｓ置換のうちの少なくとも１つが含まれる。これらの位置のいずれかに新しく作られたシステイン残基は、次に、ムテインの血清半減期を延ばす部分、例えばＰＥＧまたはその活性化誘導体にムテインをコンジュゲートするために、利用することができる。
【０１２１】
別の一実施形態では、上記化合物の１つを本開示のリポカリンムテインにコンジュゲートするために適切なアミノ酸側鎖を提供する目的で、人工アミノ酸を突然変異誘発によって導入することができる。一般に、そのような人工アミノ酸は、より高い反応性を持ち、よって所望の化合物へのコンジュゲーションを容易にするように設計される。人工ｔＲＮＡによって導入され得るそのような人工アミノ酸の一例は、パラアセチルフェニルアラニンである。
【０１２２】
本明細書に開示するムテインのいくつかの応用には、それらを融合タンパク質の形態で使用することが有利であり得る。いくつかの実施形態において、本開示のリポカリンムテインは、そのＮ末端またはそのＣ末端でタンパク質、タンパク質ドメインまたはペプチド、例えばシグナル配列および／またはアフィニティータグに融合されている。
【０１２３】
Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇまたはＳｔｒｅｐ−ｔａｇ  ＩＩ（Ｓｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，１９９６）、ｃ−ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、ＨｉｓタグまたはＨＡタグなどのアフィニティータグ、またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼなどのタンパク質は、組換えタンパク質の容易な検出および／または精製を可能にし、これらは適切な融合パートナーのさらなる例である。最後に、発色性または蛍光性を持つタンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）または黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）も、本開示のリポカリンムテインにとって適切な融合パートナーである。
【０１２４】
概して、本開示のリポカリンムテインは、化学的、物理的、光学的、または酵素的反応において検出可能な化合物またはシグナルを直接的または間接的に生成する任意の適当な化学物質または酵素で、標識することが可能である。物理的反応の、そして同時に光学的反応／マーカーの、一例は、照射時の蛍光の放射、または放射性標識を使った場合のＸ線の放射である。アルカリホスファターゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼは、発色性反応生成物の形成を触媒する酵素標識（同時に光学的標識）の例である。概して、抗体によく使用される標識は（もっぱら免疫グロブリンのＦｃ部分中の糖部分と共に使用するものを除けば）全て、本発明のリポカリンムテインへのコンジュゲーションにも使用することができる。本発明のリポカリンムテインは、任意の適切な治療活性作用物質と、そのような作用物質を所与の細胞、組織または器官に標的送達するために、または、周囲の正常細胞に影響を及ぼすことなく細胞（例えば腫瘍細胞）を選択的にターゲティングするために、コンジュゲートすることもできる。そのような治療活性作用物質の例には、放射性核種、毒素、小有機分子および治療ペプチド（例えば細胞表面受容体のアゴニスト／アンタゴニストとして作用するペプチド、または所与の細胞標的上のタンパク質結合部位に関して競合するペプチド）が包含される。ただし、本開示のリポカリンムテインは、治療上活性な核酸、例えばアンチセンス核酸分子、低分子干渉ＲＮＡ、マイクロＲＮＡまたはリボザイムなどとコンジュゲートすることもできる。そのようなコンジュゲートは当技術分野において周知の方法によって生産することができる。
【０１２５】
上記のように、本開示のリポカリンムテインは、いくつかの実施形態において、ムテインの血清半減期を延ばす部分にコンジュゲートされ得る（これについては、そのようなコンジュゲーション戦略がＣＴＬＡ−４に対する結合親和性を有するヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ｈＮＧＡＬ）のムテインに関して記述されている国際特許出願公開国際公開第２００６／０５６４６４号パンフレットも参照されたい）。血清半減期を延ばす部分は、ポリアルキレングリコール分子、ヒドロキシエチルデンプン、脂肪酸分子、例えばパルミチン酸（Ｖａｊｏ  ａｎｄ  Ｄｕｃｋｗｏｒｔｈ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｖ，２０００）、免疫グロブリンのＦｃ部分、免疫グロブリンのＣＨ３ドメイン、免疫グロブリンのＣＨ４ドメイン、アルブミン結合ペプチド、またはアルブミン結合タンパク質、トランスフェリンであり得るが、これらはほんの一例にすぎない。アルブミン結合タンパク質は、細菌のアルブミン結合タンパク質、抗体、ドメイン抗体を含む抗体フラグメント（例えば米国特許第６，６９６，２４５号）、またはアルブミンに対する結合活性を持つリポカリンムテインであり得る。したがって、本開示のリポカリンムテインの半減期を延ばすための適切なコンジュゲーションパートナーには、アルブミン結合タンパク質、例えば細菌のアルブミン結合ドメイン、例えば連鎖球菌プロテインＧのもの（Ｋｏｎｉｇ  ａｎｄ  Ｓｋｅｒｒａ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９８）が包含される。コンジュゲーションパートナーとして使用することができるアルブミン結合ペプチドの他の例は、例えば、米国特許出願公開第２００３／００６９３９５号またはＤｅｎｎｉｓら（Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２００２）に記載されている、Ｃｙｓ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｃｙｓコンセンサス配列を有するものであり、ここで、Ｘａａ１はＡｓｐ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＴｒｐであり、Ｘａａ２はＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、またはＬｙｓであり、Ｘａａ３はＡｌａ、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒであり、Ｘａａ４はＡｓｐ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒである。
【０１２６】
別の実施形態では、アルブミンそのもの（Ｏｓｂｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ，２００２）またはアルブミンの生物学的活性フラグメントを、本開示のリポカリンムテインのコンジュゲーションパートナーとして使用することができる。「アルブミン」という用語は、全ての哺乳動物アルブミン、例えばヒト血清アルブミンまたはウシ血清アルブミンまたはラットアルブミンを包含する。アルブミンまたはそのフラグメントは、米国特許第５，７２８，５５３号明細書または欧州特許出願公開ＥＰ０３３０４５１号明細書およびＥＰ０３６１９９１号明細書に記載されているように組換え生産することができる。組換えヒトアルブミン（例えばＮｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ｄｅｌｔａ  Ｌｔｄ．，英国ノッティンガムの、Ｒｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標））を、ムテインの半減期を延ばすために、本開示のリポカリンムテインにコンジュゲートまたは融合することができる。
【０１２７】
アルブミン結合タンパク質が抗体フラグメントである場合、それはドメイン抗体であり得る。ドメイン抗体（ｄＡｂ）は、産物の最適な安全性および有効性プロファイルをもたらすために、生物物理学的特性およびインビボ半減期の正確なコントロールが可能になるように操作される。ドメイン抗体は例えばＤｏｍａｎｔｉｓ  Ｌｔｄ．（英国ケンブリッジおよび米国マサチューセッツ州）から市販されている。
【０１２８】
本開示のリポカリンムテインの血清半減期を延ばすための部分としてトランスフェリンを使用する場合は、ムテインを非グリコシル化トランスフェリンのＮ末端、Ｃ末端またはその両方に遺伝子融合することができる。非グリコシル化トランスフェリンは１４〜１７日の半減期を有し、トランスフェリン融合タンパク質も同様に延長された半減期を有するであろう。トランスフェリン担体は、高いバイオアベイラビリティ、体内分布および循環安定性も提供する。この技術は、ＢｉｏＲｅｘｉｓ（ＢｉｏＲｅｘｉｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国ペンシルバニア州）から市販されている。タンパク質安定剤／半減期延長パートナーとして使用するための組換えヒトトランスフェリン（ＤｅｌｔａＦｅｒｒｉｎ（商標））も、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ｄｅｌｔ  Ｌｔｄ．（英国ノッティンガム）から市販されている。
【０１２９】
本開示のリポカリンムテインの血清半減期を延ばす目的で免疫グロブリンのＦｃ部分を使用する場合は、Ｓｙｎｔｏｎｉｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ（米国マサチューセッツ州）から市販されているＳｙｎＦｕｓｉｏｎ（商標）技術を使用し得る。このＦｃ融合物技術の使用は、より長時間作用する生物製剤を作ることを可能にし、例えば、薬物動態、溶解度、および生産効率を改善するために抗体のＦｃ領域に連結された２コピーのムテインからなり得る。
【０１３０】
本開示のリポカリンムテインの半減期を延ばすためのさらにもう一つの代替策は、ムテインのＮ末端またはＣ末端に、構造化されていない長いフレキシブルなグリシンリッチ配列（例えば約２０〜８０個の連続するグリシン残基を持つポリグリシン）を融合することである。例えば国際特許出願公開ＷＯ２００７／０３８６１９に開示されているこのアプローチは、「ｒＰＥＧ」（組換えＰＥＧ）とも呼ばれている。
【０１３１】
ＰＥＧをコンジュゲーションパートナーとして使用する場合、このポリアルキレングリコールは、置換、無置換、直鎖または分岐鎖であることができる。また、それは活性化ポリアルキレン誘導体であることもできる。適切な化合物の例は、インターフェロンとの関係において国際特許出願公開国際公開第９９／６４０１６号パンフレット、米国特許第６，１７７，０７４号明細書または米国特許第６，４０３，５６４号明細書に記載されているＰＥＧ分子、または他のタンパク質、例えばＰＥＧ修飾アスパラギナーゼ、ＰＥＧ−アデノシンデアミナーゼ（ＰＥＧ−ＡＤＡ）またはＰＥＧ−スーパーオキシドジスムターゼに関して記載されているＰＥＧ分子である（Ｆｕｅｒｔｇｅｓ  ａｎｄ  Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，１９９０）。ＰＥＧのようなポリマーの分子量は、例えば約１０，０００、約２０，０００、約３０，０００または約４０，０００ダルトンの分子量を持つポリエチレングリコールなど、約３００〜約７０，０００ダルトンの範囲に及び得る。さらに、例えば米国特許第６，５００，９３０号または同第６，６２０，４１３号に記載されているように、糖質オリゴマーおよび糖質ポリマー、例えばＨＥＳを、血清半減期を延ばす目的で、本開示のムテインにコンジュゲートすることができる。
【０１３２】
加えて、本明細書において開示するリポカリンムテインは、本開示のリポカリンムテインに、酵素活性または他の標的に対する結合親和性などの新しい特徴を付与し得る部分に融合し得る。適切な融合パートナーの例は、アルカリホスファターゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、プロテインＧのアルブミン結合ドメイン、プロテインＡ、抗体もしくは抗体フラグメント、オリゴマー化ドメインまたは毒素である。
【０１３３】
特に、結果として生じる融合タンパク質の両方の「構成要素」が所与の治療標的に一緒に作用するように、本明細書において開示するリポカリンムテインを、独立した酵素活性部位と融合することが可能であるだろう。リポカリンムテインの結合ドメインを疾患原因標的に結合することで、酵素ドメインが標的の生物学的機能を無効にすることを可能にする。
【０１３４】
本開示は、本開示のリポカリンムテインをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子（ＤＮＡおよびＲＮＡ）にも関係する。遺伝コードの縮重は、同じアミノ酸を指定する別のコドンによる一定のコドンの置換を可能にするので、本開示は、リポカリンムテインをコードする本明細書記載の具体的核酸分子に限定されず、機能的ムテインをコードするヌクレオチド配列を含む全ての核酸分子を包含する。この点に関して、本開示は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９〜５０、７１〜８４、および９６〜１０６に示す、いくつかの本開示のリポカリンムテインをコードするヌクレオチド配列を提供する。
【０１３５】
本開示による方法の別の実施形態では、ｈＴｌｃをコードする核酸分子は、まず、成熟ｈＴｌｃの直鎖ポリペプチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）のアミノ酸配列位置５、７〜８、１０、１４、１６、２５〜３４、４４、４６、５２〜５３、５５〜５６、５８、６０〜６１、６３、６５〜６６、６９〜７０、７３、７９〜８０、８４〜８６、８９〜９０、９３、９６〜９８、１０１、１０５〜１０６、１０８、１１０〜１１４、１２１、１２４、１４８〜１５０、１５２〜１５４、および１５７のうちの１つまたは複数における突然変異誘発を受ける。次に、ヒト涙液リポカリンをコードする核酸分子は、成熟ｈＴｌｃの直鎖ポリペプチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）のアミノ酸配列位置１０１、１１１、１１４および１５３の１つまたは複数における突然変異誘発も受ける。
【０１３６】
本開示は、表示した実験的突然変異誘発の配列位置以外に追加の突然変異を含む、本開示のリポカリンムテインをコードする核酸分子も包含する。そのような突然変異は許容されることが多く、例えばそれらがムテインのフォールディング効率、血清中安定性、熱安定性、処方安定性またはリガンド結合親和性の改善に寄与するのであれば、有利であると判明する場合さえある。
【０１３７】
本願において開示する核酸分子は、この核酸分子の発現を可能にするための１つ（または複数の）制御配列に「機能的に連結され」得る。
【０１３８】
ＤＮＡなどの核酸分子は、それが、転写制御および／または翻訳制御に関する情報を含有する配列要素を含み、そのような配列がポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に「機能的に連結され」ているのであれば、「核酸分子を発現する能力を有する」または「ヌクレオチド配列の発現を可能にする」能力を有するという。機能的連結とは、制御配列要素と発現すべき配列とが遺伝子発現を可能にするような形で接続されている連結である。遺伝子発現に必要な制御領域の正確な性質は種間で変動し得るが、一般にこれらの領域はプロモーターを含み、原核生物の場合、それは、プロモーターそのもの、すなわち転写の開始を指示するＤＮＡ要素と、ＲＮＡに転写されたときに翻訳開始のシグナルを出すことになるＤＮＡ要素との両方を含有する。そのようなプロモーター領域は通常、転写および翻訳の開始に関与する５’非コード配列、例えば原核生物における−３５／−１０ボックスおよびシャイン・ダルガノ配列、または真核生物におけるＴＡＴＡボックス、ＣＡＡＴ配列、および５’キャッピング要素を含む。これらの領域は、エンハンサー要素またはリプレッサー要素、ならびにネイティブポリペプチドを宿主細胞の特定コンパートメントに導くための、翻訳されるシグナル配列およびリーダー配列も含むことができる。
【０１３９】
加えて、３’非コード配列は、転写終結、ポリアデニル化などに関与する制御要素を含有し得る。ただし、これらの終結配列が特定の宿主細胞において十分に機能しない場合には、それらをその細胞において機能的なシグナルで置換し得る。
【０１４０】
それゆえに、本開示の核酸分子は、プロモーター配列などの制御配列を含むことができる。いくつかの実施形態において、本開示の核酸分子はプロモーター配列および転写終結配列を含む。適切な原核生物プロモーターには、例えばｔｅｔプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーターまたはＴ７プロモーターなどがある。真核細胞における発現に有用なプロモーターの例は、ＳＶ４０プロモーターまたはＣＭＶプロモーターである。
【０１４１】
本開示の核酸分子は、ベクター、または他の任意の種類のクローニング媒体、例えばプラスミド、ファージミド、ファージ、バキュロウイルス、コスミド、もしくは人工染色体の一部であることもできる。
【０１４２】
一実施形態では、核酸分子がファージミドに含まれる。ファージミドベクターとは、関心対象のｃＤＮＡに融合された、Ｍ１３またはｆ１などの溶原性ファージの遺伝子間領域またはそれらの機能的部分をコードするベクターを表す。そのようなファージミドベクターと適当なヘルパーファージ（例えばＭ１３Ｋ０７、ＶＣＳ−Ｍ１３またはＲ４０８）とによる細菌宿主細胞の重感染後に、インタクトなファージ粒子が生産され、それによって、コードされている異種ｃＤＮＡを、ファージ表面にディスプレイされたその対応ポリペプチドに物理的にカップリングすることが可能になる（Ｌｏｗｍａｎ，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｔｒｕｃｔ，１９９７，Ｒｏｄｉ  ａｎｄ  Ｍａｋｏｗｓｋｉ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１９９９）。
【０１４３】
そのようなクローニング媒体は、上述の制御配列および本明細書に記載のリポカリンムテインをコードする核酸配列の他にも、発現に使用される宿主細胞に適合する種に由来する複製配列およびコントロール配列、ならびに形質転換細胞またはトランスフェクト細胞に選択可能な表現型を付与する選択マーカーを含むことができる。当技術分野では数多くの適切なクローニングベクターが公知であり、市販されている。
【０１４４】
本明細書に記載するリポカリンムテインをコードするＤＮＡ分子、そして特に、そのようなムテインのコード配列を含有するクローニングベクターは、当該遺伝子を発現させる能力を有する宿主細胞中に形質転換することができる。形質転換は標準的技法を使って行うことができる。したがって本開示は、本明細書に開示する核酸分子を含有する宿主細胞にも向けられる。
【０１４５】
形質転換細胞は、本開示の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現に適した条件下で培養される。適切な宿主細胞は、原核細胞、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（Ｅ．ｃｏｌｉ）もしくは枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、または真核細胞、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ＳＦ９またはＨｉｇｈ５昆虫細胞、不死化哺乳動物細胞株（例えばＨｅＬａ細胞またはＣＨＯ細胞）または初代哺乳動物細胞であることができる。
【０１４６】
本開示は、本明細書に記載するリポカリンムテインの生産方法であって、ムテイン、ムテインのフラグメント、またはムテインと別のポリペプチド（例えば別のリポカリンムテインまたは抗体もしくは抗体フラグメント）との融合タンパク質が、ムテインをコードする核酸から出発して、遺伝子工学的方法を使って生産される方法にも関係する。本方法は、インビボで実行することができ、リポカリンムテインを、例えば細菌宿主細胞または真核宿主細胞中で生産し、次に、その宿主生物またはその培養物から単離することができる。タンパク質をインビトロで、例えばインビトロ翻訳系を使って生産することも可能である。
【０１４７】
リポカリンムテインをインビボで生産する場合は、そのようなムテインをコードする核酸を、組換えＤＮＡ技術（上で既に概説したもの）を使って、適切な細菌宿主細胞または真核宿主細胞中に導入する。この目的には、まず、確立された標準的方法を使って、本明細書に記載するリポカリンムテインをコードする核酸分子を含むクローニングベクターで宿主細胞を形質転換する。次に、異種ＤＮＡの発現を可能とし、したがって対応ポリペプチドの合成を可能とする条件下で、宿主細胞を培養する。次に、ポリペプチドを細胞から、または培養培地から、回収する。
【０１４８】
いくつかの実施形態において、本願において開示するＤＮＡなどの核酸分子は、本開示の融合タンパク質の発現が可能になるように、本開示の別の核酸分子に「機能的に連結され」得る。この点に関して、作動的連結とは、第１核酸分子の配列要素と、第２核酸分子の配列要素とが、単一ポリペプチドとしての融合タンパク質の発現を可能にするような形で、接続される連結である。
【０１４９】
加えて、本開示のｈＴｌｃムテインに関するいくつかの実施形態において、Ｃｙｓ６１とＣｙｓ１５３との間の天然ジスルフィド結合が除去され得る。したがって、そのようなムテインは、還元性の酸化還元環境を有する細胞コンパートメント、例えばグラム陰性菌の細胞質中で、生産することができる。
【０１５０】
本開示のリポカリンムテインが分子内ジスルフィド結合を含む場合は、適当なシグナル配列を使って、酸化性の酸化還元環境を有する細胞コンパートメントに新生ポリペプチドを向かわせることが好ましいであろう。そのような酸化性環境は、大腸菌などのグラム陰性菌のペリプラズムによって、またはグラム陽性菌の細胞外環境において、または真核細胞の小胞体の内腔において提供され得るものであり、通常は構造的ジスルフィド結合の形成に有利である。
【０１５１】
ただし、宿主細胞の、好ましくは大腸菌の、サイトゾルにおいて本開示のムテインを生産することも可能である。その場合は、ポリペプチドを可溶性の折りたたまれた状態で直接的に得るか、封入体の形態で回収した後、インビトロで復元させることができる。さらなる選択肢は、酸化性の細胞内環境を有し、それゆえに、サイトゾルにおけるジスルフィド結合の形成を可能とし得る、特別な宿主株の使用である（Ｖｅｎｔｕｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２００２）。
【０１５２】
しかし、本明細書に記載するリポカリンムテインは、必ずしも、遺伝子工学だけを使って作製または生産されるとは限らない。むしろ、そのようなムテインは、メリフィールド固相ポリペプチド合成などの化学合成によって得るか、インビトロでの転写および翻訳によって得ることもできる。例えば、分子モデリングを使って有望な突然変異を同定し、そのような突然変異を含むポリペプチドをインビトロで合成し、ＬＡＧ−３に対する結合活性および他の所望の特性（例えば安定性）を調べることが可能である。ポリペプチド／タンパク質の固相および／または液相合成法は当技術分野において周知である（例えばＢｒｕｃｋｄｏｒｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００４参照）。
【０１５３】
別の一実施形態では、当業者に公知の確立された方法を使用するインビトロ転写／翻訳によって、本開示のリポカリンムテインを生産し得る。
【０１５４】
本開示によって考慮されているがそのタンパク質配列または核酸配列が本明細書において明示的には開示されていないリポカリンムテインを調製するのに役立つ方法は、当業者には理解されるであろう。概要として、アミノ酸配列のそのような修飾には、例えば、一定の制限酵素のための切断部位を組み入れることによって変異リポカリン遺伝子またはそのパーツのサブクローニングを簡単にするための、単一アミノ酸位置の指定突然変異誘発が含まれる。加えて、リポカリンムテインのその標的（例えばＬＡＧ−３）に対する親和性をさらに改善するために、これらの突然変異を組み入れることもできる。さらにまた、必要であれば、フォールディング安定性、血清中安定性、タンパク質耐性または水溶性を改善するため、または凝集傾向を低減するためなど、ムテインの一定の特徴を調節するために、突然変異を導入することができる。例えばジスルフィド架橋形成を防止するために、天然のシステイン残基を別のアミノ酸に変異させ得る。
【０１５５】
本明細書において開示するリポカリンムテインおよびその誘導体は、抗体またはそのフラグメントと同様に、多くの分野において使用することができる。例えばリポカリンムテインは、酵素、抗体、放射性物質、または化学的活性もしくは明確な結合特徴を有する他の任意の基で標識するために使用することができる。そうすることにより、各々の標的またはそのコンジュゲートもしくは融合タンパク質を検出し、またはそれらと接触させることができる。加えて、本開示のリポカリンムテインは、確立された分析方法（例えばＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロット）によって、または顕微鏡法もしくはイムノセンソリックス（ｉｍｍｕｎｏｓｅｎｓｏｒｉｃｓ）によって、化学構造を検出するためにも役立ち得る。この点に関して、検出シグナルは、適切なムテインコンジュゲートまたは融合タンパク質の使用によって直接的に生成させるか、抗体を介して結合したムテインの免疫化学的検出によって間接的に生成させることができる。
【０１５６】
この開示のさらなる目的、利点、および特徴は、限定を意図しない以下の実施例および添付するその図面を検討すれば、当業者には明白になるであろう。したがって、例示的実施形態および随意の特徴によって本開示を具体的に開示するが、当業者は、本明細書に開示する、そこに体現されている開示の変更形態および変形形態を採用することができ、そのような変更形態および変形形態はこの開示の範囲内にあるとみなされることを理解すべきである。
【０１５７】
本発明はさらに、以下の項目によって特徴付けることができる。
【０１５８】
項目１．Ｋｄで測定して約２５０ｎＭ以下である親和性でＬＡＧ−３に結合することができるリポカリンムテイン。
【０１５９】
項目２．Ｋｄで測定して約５０ｎＭ以下である親和性でＬＡＧ−３に結合することができる、項目１のリポカリンムテイン。
【０１６０】
項目３．Ｋｄで測定して約３ｎＭ以下である親和性でＬＡＧ−３に結合することができる、項目１のリポカリンムテイン。
【０１６１】
項目４．Ｋｄで測定して約０．１ｎＭ以下である親和性でＬＡＧ−３に結合することができる、項目１のリポカリンムテイン。
【０１６２】
項目５．Ｋｄで測定して約０．０５ｎＭ以下である親和性でＬＡＧ−３に結合することができる、項目１のリポカリンムテイン。
【０１６３】
項目６．Ｋｄ値が、実施例４に本質的に記載されるように表面プラズモン共鳴分析によって決定される、項目１〜５のいずれか１つのリポカリンムテイン。
【０１６４】
項目７．ヒト涙液リポカリンの直鎖ポリペプチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）の配列位置５、７〜８、１０、１４、１６、２５〜３４、４４、４６、５２〜５３、５５〜５６、５８、６０〜６１、６３、６５〜６６、６９〜７０、７３、７９〜８０、８４〜８６、８９〜９０、９３、９６〜９８、１０１、１０５〜１０６、１０８、１１０〜１１４、１２１、１２４、１４８〜１５０、１５２〜１５４、および１５６〜１５７における少なくとも２つ以上の変異アミノ酸残基を含む、項目１〜７のいずれか１つのリポカリンムテイン。
【０１６５】
項目８．ヒト涙液リポカリンの直鎖ポリペプチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）の配列位置１４、２５〜２６、２８、３１〜３２、５２、５５、５８、６６、７９、８４、８６、１０１、１０５〜１０６、１０８、１１０、１１２〜１１４、および１２１における少なくとも１つの変異アミノ酸残基を含む、項目１〜６のいずれか１つのリポカリンムテイン。
【０１６６】
項目９．ヒト涙液リポカリンの直鎖ポリペプチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）の配列位置５、７〜８、１０、１６、２６〜３４、４４、４６、５３、５６、５８、６０〜６１、６３、６５〜６６、６９〜７０、７３、７９〜８０、８５、８９〜９０、９３、９６〜９８、１０１、１０５〜１０６、１０８、１１０〜１１１、１１４、１２１、１２４、１４８〜１５０、１５２〜１５４、および１５６〜１５７における少なくとも１つまたは複数の変異アミノ酸残基をさらに含む、項目１〜７のいずれか１つのリポカリンムテイン。
【０１６７】
項目１０．ｈＴｌｃの直鎖ポリペプチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）の配列位置５、７〜８、１０、１６、４４、４６、６３、６５、６９〜７０、７３、８０、８４、８９〜９０、９３、９６〜９８、１１３、１２４、１４８〜１５０、１５２、１５４、および１５６〜１５７における少なくとも１つまたは複数の変異アミノ酸残基を含む、項目１〜９のいずれか１つのリポカリンムテイン。
【０１６８】
項目１１．前記ムテインのアミノ酸配列が、ヒト涙液リポカリンの直鎖ポリペプチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と比較して、以下の変異アミノ酸残基：
2020505948.tif 000022
；位置１５６と１５７との間のＰｒｏの挿入
のうちの２つ以上を含む、項目７のリポカリンムテイン。
【０１６９】
項目１２．前記ムテインのアミノ酸配列が、ヒト涙液リポカリンの直鎖ポリペプチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と比較して、以下の変異アミノ酸残基：
2020505948.tif 000023
のうちの少なくとも１つを含む、項目７のリポカリンムテイン。
【０１７０】
項目１３．前記ムテインのアミノ酸配列が、ヒト涙液リポカリンの直鎖ポリペプチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と比較して、以下の変異アミノ酸残基：
2020505948.tif 000024
；位置１５６と１５７との間のＰｒｏの挿入
のうちの少なくとも１つを含む、項目７のリポカリンムテイン。
【０１７１】
項目１４．約３２０ｎＭ以下のＥＣ５０値でＬＡＧ−３に結合する、項目１〜１３のいずれか１つのリポカリンムテイン。
【０１７２】
項目１５．約１０ｎＭ以下のＥＣ５０値でＬＡＧ−３に結合する、項目１４のいずれか１つのリポカリンムテイン。
【０１７３】
項目１６．約０．２ｎＭ以下のＥＣ５０値でＬＡＧ−３に結合する、項目１４のいずれか１つのリポカリンムテイン。
【０１７４】
項目１７．前記ＥＣ５０値が、実施例５に本質的に記載されるように蛍光活性化細胞選別によって測定される、項目１４〜１６のいずれか１つのリポカリンムテイン。
【０１７５】
項目１８．ヒトＬＡＧ−３およびカニクイザルＬＡＧ−３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）の両方と交差反応する、項目１〜１７のいずれか１つのリポカリンムテイン。
【０１７６】
項目１９．主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩに対するヒトＬＡＧ−３の結合を妨害することができる、項目１〜１８のいずれか１つのリポカリンムテイン。
【０１７７】
項目２０．主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩに対するヒトＬＡＧ−３の結合を妨害する能力が、実施例６に本質的に記載されるように蛍光活性化細胞選別によって分析される、項目１９のリポカリンムテイン。
【０１７８】
項目２１．前記ムテインのアミノ酸配列が、以下のアミノ酸突然変異：
2020505948.tif 000025
と、以下のアミノ酸突然変異：
2020505948.tif 000026
；位置１５６と１５７との間のＰｒｏの挿入
のうちの１つまたは複数とを含む、項目１〜２０のいずれか１つのリポカリンムテイン。
【０１７９】
項目２２．前記ムテインのアミノ酸配列が、以下のアミノ酸突然変異：
2020505948.tif 000027
と、以下のアミノ酸突然変異：
2020505948.tif 000028
のうちの１つまたは複数とを含む、項目１〜２０のいずれか１つのリポカリンムテイン。
【０１８０】
項目２３．前記ムテインのアミノ酸配列が、以下のアミノ酸突然変異のセット：
2020505948.tif 000029
2020505948.tif 000030
2020505948.tif 000031
2020505948.tif 000032
のうちの１つを含む、項目１〜２２のいずれか１つのリポカリンムテイン。
【０１８１】
項目２４．前記ムテインのアミノ酸配列が、以下のアミノ酸突然変異のセット：
2020505948.tif 000033
のうちの１つを含む、項目１〜２２のいずれか１つのリポカリンムテイン。
【０１８２】
項目２５．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８〜１８および２０〜２８またはこれらのフラグメントもしくは変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、項目１〜２４のいずれか１つのリポカリンムテイン。
【０１８３】
項目２６．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８〜１８およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０〜２８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７．５％または少なくとも９９％の配列同一性を有する、項目１〜２５のいずれか１つのリポカリンムテイン。
【０１８４】
項目２７．有機分子、酵素標識、放射性標識、着色標識、蛍光標識、発色性標識、発光性標識、ハプテン、ジゴキシゲニン、ビオチン、細胞分裂阻害剤、毒素、金属錯体、金属、およびコロイド金からなる群から選択される化合物にコンジュゲートされている、項目１〜２６のいずれか１つのリポカリンムテイン。
【０１８５】
項目２８．そのＮ末端および／またはそのＣ末端において、タンパク質、タンパク質ドメイン、またはペプチドである融合パートナーに融合されている、項目１〜２７のいずれか１つのリポカリンムテイン。
【０１８６】
項目２９．そのＮ末端および／またはそのＣ末端において、抗体または抗体フラグメントである融合パートナーに融合されている、項目１〜２８のいずれか１つのリポカリンムテイン。
【０１８７】
項目３０．ムテインの血清半減期を延ばす化合物にコンジュゲートされている、項目１〜２９のいずれか１つのリポカリンムテイン。
【０１８８】
項目３１．血清半減期を延ばす化合物が、ポリアルキレングリコール分子、ヒドロエチルデンプン、免疫グロブリンのＦｃ部分、免疫グロブリンのＣＨ３ドメイン、免疫グロブリンのＣＨ４ドメイン、アルブミン結合ペプチド、およびアルブミン結合タンパク質からなる群から選択される、項目３０のリポカリンムテイン。
【０１８９】
項目３２．ポリアルキレングリコール分子がポリエチレン（ＰＥＧ）またはその活性化誘導体である、項目３１のリポカリンムテイン。
【０１９０】
項目３３．項目１〜３２のいずれか１つのリポカリンムテインをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【０１９１】
項目３４．項目３３の核酸分子を含む発現ベクター。
【０１９２】
項目３５．項目３４の核酸分子を含有する宿主細胞。
【０１９３】
項目３６．項目１〜３２のいずれか１つのリポカリンムテインを生成する方法であって、ムテインが、ムテインまたはそのフラグメントをコードする核酸から出発して、遺伝子操作法によって生成される、方法。
【０１９４】
項目３７．対象におけるＬＡＧ−３への結合方法であって、項目１〜３２のいずれか１つの１種類もしくは複数種類のリポカリンムテイン、またはこのようなムテインを含む１種類もしくは複数種類の組成物を適用することを含む、方法。
【０１９５】
項目３８．対象において免疫応答を刺激する方法であって、項目１〜３２のいずれか１つの１種類もしくは複数種類のリポカリンムテイン、またはこのようなムテインを含む１種類もしくは複数種類の組成物を適用することを含む、方法。
【０１９６】
項目３９．対象においてＴリンパ球の増殖を誘発する方法であって、項目１〜３２のいずれか１つの１種類もしくは複数種類のリポカリンムテイン、またはこのようなムテインを含む１種類もしくは複数種類の組成物を適用することを含む、方法。
【０１９７】
項目４０．対象において主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩに対するヒトＬＡＧ−３の結合を妨害する方法であって、項目１〜３２のいずれか１つの１種類もしくは複数種類のリポカリンムテイン、またはこのようなムテインを含む１種類もしくは複数種類の組成物を適用することを含む、方法。
【０１９８】
項目４１．主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩを発現する細胞に対するヒトＬＡＧ−３の結合と競合する、項目１〜３２のいずれか１つのリポカリンムテイン。
【０１９９】
項目４２．実施例６に本質的に記載されるような蛍光活性化細胞選別分析で測定したときに、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩを発現する細胞に対するヒトＬＡＧ−３の結合と競合する、項目１〜３２のいずれか１つのリポカリンムテイン。
【０２００】
項目４３．項目１〜３２のいずれか１つのリポカリンムテインと、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
【０２０１】
項目４４．治療薬に連結された項目１〜３２のいずれか１つのリポカリンムテイン、またはそのフラグメントを含む、イムノコンジュゲートまたは融合タンパク質。
【０２０２】
項目４５．ＬＡＧ−３への結合／ＬＡＧ−３の検出のための項目１〜３２のいずれか１つのムテインの使用であって、
（ａ）前記ムテインと、ＬＡＧ−３を含有する疑いのある試験試料とを接触させ、それにより前記ムテインとＬＡＧ−３との間の複合体の形成を可能にすること；および
（ｂ）前記ムテインとＬＡＧ−３との間の複合体を適切なシグナルにより検出すること
を含む、使用。
【０２０３】
項目４６．項目１〜３２のいずれか１つのムテインを含む、診断または分析キット。
【０２０４】
項目４７．生物学的試料中のＬＡＧ−３の存在を検出する方法であって、前記試料と、項目１〜３２のいずれか１つのムテインとを、前記ムテインおよびＬＡＧ−３の複合体の形成を可能にする条件下で接触させることを含む、方法。
【０２０５】
項目４８．ムテインおよびＬＡＧ−３の複合体を検出することをさらに含む、項目４７の方法。
【０２０６】
項目４９．生物学的試料がヒトから単離される、項目４７または４８の方法。
【０２０７】
項目５０．試料が体液を含む、項目４７〜４９のいずれか１つの方法。
【実施例】
【０２０８】
Ｖ．実施例
実施例１：成熟ライブラリーの作成およびＬＡＧ−３に特異的に結合する最適化ムテインの選択
ＬＡＧ−３特異的ムテインの最適化のために、ムテインＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７または１９に基づき、選択された位置のバイアスランダム化またはエラープローンポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく方法のいずれかを用いてライブラリーを作成した。バイアス設計は、選択された位置のそれぞれについて、コードされるアミノ酸が、５０〜７０％の確率でそれぞれの母クローン中で見出されるアミノ酸に対応するが、５０〜３０％の確率で異なるアミノ酸であり得るように行った。Ｎを標的とされる位置の数とし、Ｂをバイアスとして、１クローン当たりの交換の最確数はＮ×（１−Ｂ）である。
【０２０９】
生成したリポカリンムテインを、本質的に記載される（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ，２００９）ファージミドベクターに高効率でクローニングした。ファージディスプレイを用いて、熱安定性および結合親和性が改善された最適化ムテインを選択した。最初のムテイン選択と比較して増大したストリンジェンシーでファージミド選択を実行し、特に、高温および限界標的濃度でのプレインキュベーションステップを包含させた。
【０２１０】
実施例２：ハイスループットＥＬＩＳＡスクリーニングを使ったＬＡＧ−３に特異的に結合するムテインの同定
個々のコロニーを２×酵母エキス・トリプトン（２×ＹＴ）／Ａｍｐ培地への植え付けに使用し、それらを定常期まで一晩（１４〜１８時間）成長させた。次に、定常期培養物から、５０μＬの２×ＹＴ／Ａｍｐに植え付けを行い、３７℃で３時間インキュベートした後、ＯＤ５９５が０．６〜０．８に達するまで２２℃に移行させた。１．２μｇ／ｍＬのアンヒドロテトラサイクリンを補充した２×ＹＴ／Ａｍｐを１０μＬ添加することによって、ムテインの生産を誘導した。培養物を翌日まで２２℃でインキュベートした。ＰＢＳ／Ｔ中の５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ  ４０μＬを添加し、２５℃で１時間インキュベートした時点で、培養物はスクリーニングアッセイに使用する準備が整った。
【０２１１】
抗Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｇ抗体がコートされたマイクロタイタープレート上にＳｔｒｅｐ−ｔａｇを介してムテインが捕捉され、ビオチン化ＬＡＧ−３−Ｆｃが添加され、Ｅｘｔｒａｖｉｄｉｎ−セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Ｓｉｇｍａ）により検出される、逆スクリーニングフォーマットを適用した。
【０２１２】
親和性および安定性が増大されたムテインを選択するために、
ｉ）低減した抗原濃度、
ｉｉ）抗Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｇ抗体がコートされたマイクロタイタープレート上にＳｔｒｅｐ−ｔａｇを介してムテインが捕捉され、かつ異なる濃度の標的が添加されていずれかのＥｘｔｒａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ）により検出される、逆スクリーニングフォーマット
を使用し、そして部分的に、
ｉｉｉ）標的プレートへ添加する前にスクリーニング上清を７５℃でインキュベーション
することにより、スクリーニングを実施した。
【０２１３】
次に、スクリーニング結果に基づいてクローンを配列決定し、さらなる特徴づけのためにムテインを選択した。
【０２１４】
実施例３：ムテインの発現
発現後にＳｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎアフィニティークロマトグラフィーと分取用サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）とを使ってムテインを精製するために、ＳＡリンカーとＳｔｒｅｐ−ｔａｇ  ＩＩペプチド（ＷＳＨＰＱＦＥＫ）とのＣ末端配列ＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫを持つ選択されたムテインを、２ＸＹＴ／Ａｍｐ培地中の大腸菌において発現させた。ＳＥＣ精製の後、単量体タンパク質を含有する画分をプールし、分析用ＳＥＣを用いて再度分析した。Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ親和性クロマトグラフィーおよび分取用サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）の後のリポカリンムテインの収量は、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ精製後のリポカリンムテインの単量体含量と共に表１に示される。
【０２１５】
（表１）ムテインの発現
2020505948.tif 000034
【０２１６】
実施例４：表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定される、ヒトおよびカニクイザルＬＡＧ−３に結合するムテインの親和性
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使って、本明細書において開示する代表的なリポカリンムテインの結合動態および親和性を計測した。
【０２１７】
ｈｕＬＡＧ−３−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）およびｃｙＬＡＧ−３−Ｆｃに対する例示的なリポカリンムテインの結合は、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により決定した。カニクイザルからの組換えＬＡＧ−３（ｃｙＬＡＧ−３−Ｆｃ）は、カニクイザルＬＡＧ−３（ｃｙＬＡＧ−３）の細胞外ドメインを第Ｘａ因子切断部位および（Ｇ４Ｓ）３リンカーを介してヒトＩｇＧ１  Ｆｃフラグメントに融合させることにより作製した。
【０２１８】
標準的アミンケミストリーを使って抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をＣＭ５センサーチップに固定化した。すなわち、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を使って、チップ上のカルボキシル基を活性化した。次に、１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ）５中、濃度が２５μｇ／ｍＬの抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ抗体溶液（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、５μＬ／分の流速で、９０００〜１４０００レゾナンスユニット（ＲＵ）の固定化レベルが達成されるまで適用した。表面を横切るように１Ｍエタノールアミンの溶液を通過させることにより、残留未反応ＮＨＳエステルをブロッキングした。リファレンスチャネルを同様に処理した。次に、ＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液中の０．２５μｇ／ｍＬのｈｕＬＡＧ−３−Ｆｃまたは１．５μｇ／ｍＬのｃｙＬＡＧ−３−Ｆｃを、流速１０μＬ／分で１８０秒間、チップ表面において抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ抗体により捕捉した。
【０２１９】
親和性を決定するために、各ムテインの希釈物をＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液中で調製し、調製したチップ表面に適用した。ヒトＬＡＧ−３に対する親和性の測定のために、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９〜２８については１００ｎＭから４ｎＭまで、場合により０．８ｎＭまでの濃度を適用し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７および８５〜９４については、６ｎＭから０．５ｎＭまでの濃度を適用し、そしてカニクイザルＬＡＧ−３に対する親和性の測定のために、８ｎＭから０．５ｎＭまでの濃度を適用した。接触時間１８０秒、解離時間１５００または６００秒、および流速３０μＬ／分で結合アッセイを実行した。全ての測定を２５℃で実施した。チップ表面の再生は、３ＭのＭｇＣｌ２を６０秒間、および１０ｍＭのグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ１．７）を１８０秒間、流速１０μＬ／分で注入した後、ランニング緩衝液（ＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液）で追加洗浄し、安定化期間を１２０秒間として達成した。リポカリンムテインＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３も陰性対照として試験した。タンパク質の測定の前に、コンディショニングを目的として３回のスタートアップサイクルを実施した。データをＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ｖ２．０）で評価した。二重参照を使用し、１：１結合モデルを使用して生データを適合させた。
【０２２０】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７および１９、ならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５〜９４、２０〜２８、５７、６１、および６３〜６８の最適化リポカリンムテインについて、ｋｏｎ、ｋｏｆｆに対して決定された値および得られた平衡解離定数（Ｋｄ）は、表２に要約される。全ての最適化ＬＡＧ−３特異的リポカリンムテインは、ピコモルから低ナノモルの親和性でヒトおよびカニクイザルＬＡＧ−３に結合し、親和性は、最適化の後に６０倍まで改善される。
【０２２１】
（表２）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により決定されるＬＡＧ−３特異的ムテインの速度定数および親和性
2020505948.tif 000035
【０２２２】
実施例５：ヒトおよびカニクイザルＬＡＧ−３を発現する細胞に対するリポカリンムテインの結合の蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析
ｈｕＬＡＧ−３が安定にトランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（ＣＨＯ−ｈｕＬＡＧ−３）またはｃｙＬＡＧ−３（ＣＨＯ−ｃｙＬＡＧ−３）へのリポカリンムテインＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、１９〜２８、および８５〜９４の特異的結合を評価するために、本発明者らは蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）研究を使用した。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３を陰性対照として並行して試験した。細胞株は、Ｆｌｐ−Ｉｎシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造者の説明書に従って使用することにより、作製した。モックトランスフェクトＦｌｐ−Ｉｎ  ＣＨＯ細胞を陰性対照とした。
【０２２３】
トランスフェクトされたＣＨＯ細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）と５００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢ（Ｒｏｔｈ）とを補充したハムＦ１２培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で維持した。細胞は、製造者の説明に従い、標準条件下（３７℃、５％ＣＯ２雰囲気）、細胞培養フラスコ中で培養した。継代培養またはＦＡＣＳ実験のために接着細胞を解離させるためには、Ａｃｃｕｔａｓｅ（ＰＡＡ）を製造者の説明書に従って使用した。
【０２２４】
実験を実施するために、ＬＡＧ−３陽性および陰性Ｆｌｐ−Ｉｎ  ＣＨＯ細胞をリポカリンムテインと共にインキュベートし、蛍光標識抗ｈＴｌｃ抗体を用いて、結合したムテインを標識し、次に、本実施例に記載されるようにＦＡＣＳ分析を用いてシグナルを検出した。
【０２２５】
５％ウシ胎仔血清（ＰＢＳ−ＦＣＳ）を含有する氷冷ＰＢＳ中で、１ウェル当たり５×１０４個の細胞を１時間プレインキュベートした。次に、通常、１μＭから０．０１ｎＭまでの範囲のリポカリンムテイン、陰性対照リポカリンムテイン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、および基準抗ＬＡＧ−３抗体（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５および６）の希釈系列を細胞に添加し、氷上で１時間インキュベートした。５００×ｇの遠心分離を用いて細胞を氷冷ＰＢＳ中で２回洗浄し、次に、蛍光色素Ａｌｅｘａ４８８（Ｐｉｅｒｉｓ）で標識されたウサギ抗リポカリン抗体、またはＡｌｅｘａ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識されたヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体と共に氷上で３０分間インキュベートした。続いて細胞を洗浄し、ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ  ＩＱｕｅフローサイトメーター（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ）を用いて分析した。ＬＡＧ−３発現細胞に対するリポカリンムテインの結合により生成された蛍光データを、ＬＡＧ−３発現ＣＨＯ細胞に対してゲーティングし、Ｆｏｒｅｃｙｔ（登録商標）ソフトウェアを用いることにより分析し、得られた幾何蛍光平均を、Ｇｒａｐｈｐａｄソフトウェアを用いてプロットし、適合させた。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、１９〜２８、および８５〜９４について生成されたデータは図２および表３に示される。全ての最適化ＬＡＧ−３特異的ムテイン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５〜９４および２０〜２８）は、基準抗体と同等のＥＣ５０で、ｈｕＬＡＧ−３またはｃｙＬＡＧ−３のいずれかを発現するＣＨＯ細胞に対する明白な結合を示す。最適化ムテインの大部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７および１９と比べて低いＥＣ５０値を示し、親リポカリンムテインと比較して改善された結合が示される。ヒトおよびカニクイザルＬＡＧ−３に対する結合親和性の違いは、最適化ムテインのほとんどについて著しく低減されており、潜在的な薬物動態または薬物安全性の研究のために好ましい特徴が示される。ＬＡＧ−３に結合しない陰性対照リポカリンムテイン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）は、結合を全く示さなかった（図示せず）。モックトランスフェクトＦｌｐ−Ｉｎ  ＣＨＯ細胞においてリポカリンムテインの結合は検出されなかった（図示せず）。
【０２２６】
（表３）ｈｕＬＡＧ−３またはカニクイザルＬＡＧがトランスフェクトされたＣＨＯ細胞に対するＬＡＧ−３特異的リポカリンムテインおよびリファレンス分子（基準抗ＬＡＧ−３抗体、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５および６）の結合
2020505948.tif 000036
【０２２７】
実施例６：ヒトＬＡＧ−３に対するリポカリンムテインの、ＭＨＣクラスＩＩ発現細胞との競合的結合のＦＡＣＳ分析
所与のリポカリンムテインが、ＭＨＣクラスＩＩ陽性細胞上のＭＨＣクラスＩＩへのＬＡＧ−３の結合を妨害するかどうかを評価するために、競合ＦＡＣＳ実験を利用した。この実験では、一定の濃度のヒトＬＡＧ−３−Ｆｃ融合物（ｈｕＬＡＧ−３−Ｆｃ、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ）、および各リポカリンムテインの希釈系列を、ＭＨＣクラスＩＩ陽性ヒト細胞株Ａ３７５と共にインキュベートし、蛍光標識抗ＩｇＧ  Ｆｃ抗体を用いて、細胞に結合したｈｕＬＡＧ−３−Ｆｃを検出した。このアッセイでは、ｈｕＬＡＧ−３とそのリガンドＭＨＣクラスＩＩとの結合を妨害する競合的リポカリンムテインは、ＭＨＣクラスＩＩ陽性細胞株Ａ３７５へのｈｕＬＡＧ−３−Ｆｃの結合の低減をもたらす。
【０２２８】
メラノーマ細胞株Ａ３７５を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）を補充したＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に保持した。製造者の説明書に従う標準条件（３７℃、５％ＣＯ２雰囲気）下で、細胞を細胞培養フラスコ中で培養した。継代培養またはＦＡＣＳ実験用に接着細胞を解離させるために、Ａｃｃｕｔａｓｅ（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＧｍｂＨ）を製造者の説明書に従って使用した。
【０２２９】
ＦＡＣＳアッセイのために、１ウェル当たり５×１０４個のＡ３７５細胞をＰＢＳ−ＦＣＳ中で１時間インキュベートした後、３ｎＭのｈｕＬＡＧ−３−Ｆｃと、１μＭから０．０１ｎＭまでの範囲の様々な濃度のＬＡＧ−３特異的リポカリンムテインとを添加した。細胞を氷冷ＰＢＳ中で２回洗浄し、ＰＢＳ−ＦＣＳ中に再懸濁させ、フィコエリトリン標識抗ヒトＩｇＧＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）と共に氷上で３０分間インキュベートした。続いて細胞を洗浄し、Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ  ＩＱｕｅフローサイトメーター（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ）を用いて分析した。Ａ３７５細胞へのｈｕＬＡＧ−３−Ｆｃの結合により生成された蛍光データを、Ｆｏｒｅｃｙｔソフトウェアを用いて分析し、得られた幾何蛍光平均を、ｈｕＬＡＧ−３−Ｆｃ最大結合に対して正規化した。Ｇｒａｐｈｐａｄソフトウェアを用いて、ｈｕＬＡＧ−３−Ｆｃの結合パーセントをプロットし、適合させた。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、１９〜２８、および８５〜９４のＩＣ５０値は表４に要約され、選択された競合結合曲線は図３に提供される。データは、全ての最適化リポカリンムテインが、ヒトＭＨＣクラスＩＩ発現細胞上の、ｈｕＬＡＧ−３のリガンドＭＨＣクラスＩＩに対するｈｕＬＡＧ−３の結合と競合することを示す。このような実験は検出限界に到達し、従って、親ムテインと比較した最適化リポカリンムテインのＩＣ５０の改善（あったとしても）は観察されなかった。ＬＡＧ−３に結合しない陰性対照リポカリンムテイン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）は、競合を全く示さなかった。
【０２３０】
（表４）リポカリンムテインは、ＭＨＣクラスＩＩ発現細胞上の、ｈｕＬＡＧ−３のリガンドＭＨＣクラスＩＩに対するｈｕＬＡＧ−３の結合と競合する。
2020505948.tif 000037
【０２３１】
実施例７：リポカリンムテインの熱安定性評価
リポカリンムテインの融解温度（Ｔｍ）（総合的安定性の一般的な指標である）を決定するために、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）中１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度のＬＡＧ−３特異的ムテインを、キャピラリーｎａｎｏＤＳＣ機器（ＣＳＣ  ６３００、ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて１℃／分でスキャン（２５〜１００℃）した。表示されたサーモグラムから、統合Ｎａｎｏ  Ａｎａｌｙｚｅソフトウェアを用いてＴｍを計算した。
【０２３２】
例示的なリポカリンムテイン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、１９〜２８、８５〜９４、および６７）に対して得られた最大融解温度および融解開始温度は、以下の表５に記載される。ほとんど全てのリポカリンムテインは６０〜８０℃の範囲のＴｍを有し、これらのムテインのそれぞれに関して良好な総合的安定性が示される。
【０２３３】
（表５）ｎａｎｏＤＳＣで決定されるＬＡＧ−３特異的リポカリンムテインのＴｍおよび融解開始温度
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【０２３４】
本明細書に例示的に記載した実施形態は、本明細書において具体的に開示しない任意の１つまたは複数の要素、１つまたは複数の限定が存在しなくても、適切に実施し得る。したがって例えば「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「包含する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」などの用語は、拡大的、非限定的に解釈されるべきである。加えて、本明細書において使用する用語および表現は、説明のために使用されているのであって、限定のために使用されているのではなく、そのような用語および表現の使用には、示され記載された特徴またはその部分のいずれの等価物も排除しようという意図はなく、さまざまな変更形態が本願発明の範囲内で可能であると認識される。したがって、本実施形態を好ましい実施形態および随意の特徴によって具体的に開示したが、当業者はその変更形態および変形形態を採ることができ、そのような変更形態および変形形態は本発明の範囲内にあるとみなされると理解すべきである。本明細書において記載した特許、特許出願、教科書および査読付き刊行物は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。さらにまた、参照により本明細書に組み入れられた参考文献における用語の定義または用法が、本明細書に掲載した当該用語の定義と一致しないか相反する場合は、本明細書に掲載した当該用語の定義が適用され、参考文献における当該用語の定義は適用されない。一般的開示に含まれる狭い種概念および下位類概念群のそれぞれも、本発明の一部を形成する。これには、削除された事項が本明細書に具体的に陳述されているかどうかに関わらず、類概念から任意の内容を除去するただし書きまたは消極的限定の付いた本発明の一般的記述が包含される。加えて、特徴がマーカッシュ群で記載される場合、それによって本開示がそのマーカッシュ群の任意の個々の要素または任意の要素の部分群についても記載されることは、当業者にはわかるであろう。さらなる実施形態は、以下の特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【０２３５】
等価物：当業者は、本明細書に記載した本発明の具体的実施形態に対する多くの等価物を認識するか、せいぜい日常的な実験を使って確かめることができるであろう。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲によって包含されるものとする。この明細書において言及した刊行物、特許および特許出願は全て、あたかも個々の刊行物、特許または特許出願が参照により本明細書に組み込まれることを具体的かつ個別に示されたかのように、それと同程度に、参照により本明細書に組み入れられる。
【０２３６】
非特許参考文献
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図２Ａ−１】
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【図２Ａ−２】
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【図２Ｂ−１】
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【図２Ｂ−２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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