(57)【要約】本発明は、経鼓室経路の投与を用いる難聴に関連する聴覚障害の治療、特に突発性難聴、爆発誘発性聴力損失、中毒性難聴、ＡＲＨＬ（加齢性聴力損失）および騒音障害の治療におけるニューロトロフィンの使用に関する。本発明はさらに、聴覚障害の治療における、ニューロトロフィン、特にＮＧＦを含有する組成物の使用に関する。
2020520956.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
鼓室内経路により投与されることを特徴とする、聴覚障害の治療における使用のためのニューロトロフィン。
【請求項２】
前記ニューロトロフィンが、ＮＧＦ、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン３およびニューロトロフィン４から選択され、好ましくはＮＧＦであることを特徴とする、請求項１に記載の使用のためのニューロトロフィン。
【請求項３】
前記障害が、突発性難聴、爆発誘発性聴力損失、中毒性難聴、ＡＲＨＬ（加齢性聴力損失）、および騒音障害から選択されることを特徴とする、請求項１または２に記載の使用のためのニューロトロフィン。
【請求項４】
少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含む組成物により投与されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用のためのニューロトロフィン。
【請求項５】
前記薬学的に許容可能な賦形剤が、ヒアルロン酸、ポリビニルアルコール、グリセロール、乳酸−グリコール酸共重合体、およびＰＥＧ４００から選択され、好ましくは、ヒアルロン酸、ポリビニルアルコールまたはグリセロールであることを特徴とする、請求項４に記載の使用のためのニューロトロフィン。
【請求項６】
前記組成物が溶液、懸濁液、微粒子またはゲルであることを特徴とする、請求項４または５に記載の使用のためのニューロトロフィン。
【請求項７】
前記微粒子がＰＬＧＡの微粒子である、請求項６に記載の使用のためのニューロトロフィン。
【請求項８】
前記組成物が、さらなる活性成分と組み合わせて、同時に、個別に、または逐次的に投与され得ることを特徴とする、請求項４〜７のいずれか一項に記載の使用のためのニューロトロフィン。
【請求項９】
前記さらなる活性成分が、デキサメタゾン、メチルプレドニゾロンおよびプレドニゾロンから選択されるステロイドであることを特徴とする、請求項７に記載の使用のためのニューロトロフィン。
【請求項１０】
前記組成物が１μｇ〜１．２ｍｇのＮＧＦ、好ましくは１０μｇ〜２００μｇのＮＧＦ、より好ましくは２μｇ〜２０μｇのＮＧＦを含有することを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用のためのニューロトロフィン。
【請求項１１】
前記溶液が、１μｇ／ｍｌ〜１．２ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１０μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌ、より好ましくは２μｇ／ｍｌ〜２０μｇ／ｍｌの範囲の濃度のＮＧＦを含有することを特徴とする、請求項６に記載の使用のためのニューロトロフィン。
【請求項１２】
前記懸濁液が、１μｇ／ｍｌ〜１．２ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１０μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌ、より好ましくは２μｇ／ｍｌ〜２０μｇ／ｍｌの範囲の濃度のＮＧＦを含有することを特徴とする、請求項６に記載の使用のためのニューロトロフィン。
【請求項１３】
前記微粒子が、１μｇ／ｍｌ〜１．２ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１０μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌ、より好ましくは２μｇ／ｍｌ〜２０μｇ／ｍｌの範囲の濃度のＮＧＦを含有することを特徴とする、請求項６に記載の使用のためのニューロトロフィン。
【請求項１４】
前記ニューロトロフィンがマウスまたはヒト由来ニューロトロフィン、もしくはヒト組換えニューロトロフィンであることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の使用のためのニューロトロフィン。
【請求項１５】
前記ニューロトロフィンがマウスまたはヒト由来ＮＧＦ、もしくはヒト組換えＮＧＦであることを特徴とする、請求項１４に記載のニューロトロフィン。
【請求項１６】
前記組成物が毎日投与され、好ましくは１日に１回以上投与されることを特徴とする、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の使用のためのニューロトロフィン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は経鼓室（ｔｒａｎｓｔｙｍｐａｎｉｃ）経路の投与を用いた、聴力損失と関連する聴覚障害の治療、特に、突発性難聴、爆発誘発性聴力損失、中毒性難聴、ＡＲＨＬ（加齢性聴力損失）および騒音障害の治療におけるニューロトロフィンの使用に関する。本発明はさらに、聴覚障害の治療における、ニューロトロフィン、特にＮＧＦを含有する組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
難聴は新生児の０．１〜０．２％に発生し、難聴は７５歳以上の人口の最大７０％に影響を及ぼす（Ｓｐｒｉｎｚｌ  ＧＭ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ  ２０１０；５６（３）：３５１−８（非特許文献１））。音の信号は、蝸牛にある聴覚有毛細胞により電気的刺激に変換される。有毛細胞の変性は、感染症、機械的損傷、アミノグリコシド系抗生物質、音響外傷、加齢、および化学的に誘発された中毒性難聴に起因し、聴力障害または聴力損失の主な原因である（Ｄｅｌｔｅｒｎｅ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ  １９９３；１１３：３１２−３７７（非特許文献２））。
【０００３】
耳毒性薬剤は、グラム陰性菌により引き起こされる感染症の治療に一般的に使用される、ゲンタマイシン等のアミノグリコシド系抗生物質、広く使用される化学療法剤であるシスプラチンおよびその類似体、キニーネおよびその類似体、サリチレート（ｓａｌｙｃｉｌａｔｅ）およびその類似体、並びにループ利尿薬を含む。聴細胞およびらせん神経節ニューロンに対するこれらの薬剤の毒性作用は多くの場合、それら薬剤の治療的有用性にとって制限要因である。例えば、ゲンタマイシン等のような抗菌性のアミドグリコシド類は、深刻な毒性、特に耳毒性および腎臓毒性を有することが知られており、それはそのような抗菌剤の有用性を低減させる（Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｖｏｌ  ７０，Ｉｓｓｕｅ  ５，Ｍａｙ１９８１，ｐａｇｅ  ５８１−６th  ｅｄ．（非特許文献３））。
【０００４】
中耳炎は、中耳の感染症を表すために使用される用語である。典型的に、中耳の感染症に対して抗生物質が全身投与される。抗生物質の全身投与は、通常、中耳で治療濃度に達するまでに長時間のラグタイムを生じ、その濃度に達するために高い初期投与量を必要とする。全身投与は、感染症が進行期に達した際に最も多くの場合に有効であるが、この時点で既に中耳および内耳構造に永久的な損傷が起きている可能性がある。明らかに、中毒性難聴は抗生物質投与の用量制限副作用である。
【０００５】
聴覚器は、外耳および中耳、内耳および聴細胞並びに中枢聴覚伝達路に分けることができる。種によっていくらかの変化はあるが、一般的な特性は全ての哺乳類に共通である。聴覚刺激は、外耳道、鼓膜、および耳小骨連鎖を通って、内耳へと機械的に伝達される。
【０００６】
多くの研究が、中毒性難聴、ＡＲＨＬ（加齢性難聴）および騒音障害への潜在的な治療的介入として、様々な薬剤および物質を提案している。これらは大まかに、２つのカテゴリーに分類される：細胞死経路の特定の部分を阻害することを目的とするもの、並びにアポトーシスおよびネクローシスにつながるシグナル伝達機構を遮断することを目的とするものである。介入のいくつかの戦略は、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）などの抗酸化剤を用いることによるＲＯＳ（活性酸素種）の低減に基づき、既にいくつかの臨床試験で使用されている。
【０００７】
過去数年で有毛細胞の再生に関する多くの研究が行われた。それらの多くは、特定の遺伝子操作の後に、ほ乳類のコルチ器の支持細胞に細胞分裂を誘導し得ることを示している。最近の証拠は、出生後の哺乳類の内耳が前駆細胞を含むことを示唆しており、それは、インビトロにおいて増殖または内耳細胞塊（ｏｔｏｓｐｈｅｒｅｓ）を形成することができ、多様な表現型に分化することができる。
【０００８】
従来使用されているリハビリの手段は技術的解決法基づき、主に入ってくる音の信号を増幅およびフィルターするための補聴器を用いる。一方、より深刻な機能障害の場合は、聴覚神経細胞を直接的に刺激する人工内耳による選択肢が与えられる。有毛細胞の分化に関与する特定の遺伝子の発現の改変（Ｍｉｚｕｔａｒｉ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ  ２０１３；７７（１）：５８−６９（非特許文献４））または幹細胞治療（Ｏｋａｎｏ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ａｍｐｌｉｆ．２０１２；１６（１）：４−１８（非特許文献５））は、聴覚機能の回復の解決策になり得る。変性プロセスを遅らせることのできる有毛細胞保護の方法または戦略もまた、活発に追究されている。しかし、効果的な臨床治療は未だ見出されていない。
【０００９】
ニューロトロフィン類のＮＧＦファミリーは、ほ乳類において内耳の神経支配に必要とされる新たな分子群である（Ｅｒｎｆｏｒｓ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ  １９９５；１４：１１５３−６４（非特許文献６））；ヒトにおけるそれらの潜在的な治療的用途は活発に評価されている。このファミリーは神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）並びにニューロトロフィン３およびニューロトロフィン４（ＮＴ３、ＮＴ４）を含む。これら４つの分子は、それら全てが共通の祖先遺伝子に由来するため、類似の配列および構造を共有し、４つ全てが、発達段階およびその後の神経成長および分化の指揮に活性がある（Ｈｕａｎｇ  ＥＪ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２００１；２４：６７７−７３６（非特許文献７））。それぞれのニューロトロフィンは、高い親和性でＴｒｋ受容体の特定のサブタイプと結合し、他のＴｒｋ受容体およびｐ７５受容体とのいくらかの低親和性交差結合もまた起こる。
【００１０】
脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）は中枢神経系および末梢神経系の特定のニューロンに作用し、既存のニューロンの生存を助け、新しいニューロンおよびシナプスの成長および分化を促進するのに役立つ。
【００１１】
ニューロトロフィン３は、末梢神経系および中枢神経系の特定のニューロンに活性を有するタンパク質成長因子である。それは既存のニューロンの生存および分化を助け、新しいニューロンおよびシナプスの成長および分化を促進するのに役立つ。
【００１２】
ニューロトロフィン４は、主にＴｒｋＢ受容体チロシンキナーゼを介してシグナル伝達をする神経栄養因子である。
【００１３】
ＮＧＦはα、βおよびγの３つのサブユニットからなるポリペプチドである。βサブユニットそれ自体は、１１８のアミノ酸から構成されるペプチドのホモダイマーであり、ＮＧＦの全ての生物活性に関与している。その構造は異なる種の間でもよく保存されており、マウスＮＧＦとヒトＮＧＦとの間で９０％以上の相同性を有する。ＮＧＦは神経細胞の成長および生存を調節し、若者および成人の両者の神経系の発達に大いに影響する。
【００１４】
成人においてＮＧＦは、神経栄養性角膜炎、視神経切断、高眼圧症および網膜剥離等のいくつかの眼疾患だけでなく、疼痛／痛覚過敏に有効であることが示された。そのデータは、マウスの唾液腺から抽出されたＮＧＦについて主に報告しているが、これらの試料でさえ異なるダイマーの不均一な混合物である。
【００１５】
最近、遺伝子工学技術を用いてヒトＮＧＦが合成され、それは患者に投与されるタンパク質のより均一な構造を得ることに利点を有した（Ｉｗａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１７１：１１６，１９９０（非特許文献８）、欧州特許第０９９１８８号明細書（特許文献１）、国際公開第２０１３／０９２７７６号（特許文献２））。内耳に対する損傷の形態学的および生理学的効果を刺激および調査するために、様々な動物モデルが用いられた。動物モデルの失聴した蝸牛に投与した場合、ニューロトロフィンは、らせん神経節ニューロンの生存を劇的に改善し、末梢聴覚繊維の再生を促進できることが示された。
【００１６】
さらに、爆発誘発性聴力損失を患い、筋肉内注射によりＮＧＦで処置された患者は、早期に処置された場合に聴覚の改善を示した（Ｓ．Ｑ．Ｚｈａｉ，Ｎ．ＹＵ．Ｅｕｒ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，２０１５；１９：３１４６−５１（非特許文献９））。治療効果は、神経性難聴および耳鳴りの治療におけるＮＧＦのポイント注射に続いて認められた（Ｓｈａｎｘｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｔｒａｄ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｍｅｄ  ２００９；２９：３９−４２（非特許文献１０））。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】欧州特許第０９９１８８号明細書
【特許文献２】国際公開第２０１３／０９２７７６号
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Ｓｐｒｉｎｚｌ  ＧＭ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ  ２０１０；５６（３）：３５１−８
【非特許文献２】Ｄｅｌｔｅｒｎｅ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ  １９９３；１１３：３１２−３７７
【非特許文献３】Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｖｏｌ  ７０，Ｉｓｓｕｅ  ５，Ｍａｙ１９８１，ｐａｇｅ  ５８１−６th  ｅｄ．
【非特許文献４】Ｍｉｚｕｔａｒｉ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ  ２０１３；  ７７（１）：５８−６９
【非特許文献５】Ｏｋａｎｏ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ａｍｐｌｉｆ．  ２０１２；１６（１）：４−１８
【非特許文献６】Ｅｒｎｆｏｒｓ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ  １９９５；１４：１１５３−６４
【非特許文献７】Ｈｕａｎｇ  ＥＪ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２００１；２４：６７７−７３６
【非特許文献８】Ｉｗａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１７１：１１６，１９９０
【非特許文献９】Ｓ．Ｑ．Ｚｈａｉ，Ｎ．ＹＵ．Ｅｕｒ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，２０１５；１９：３１４６−５１
【非特許文献１０】Ｓｈａｎｘｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｔｒａｄ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｍｅｄ  ２００９；２９：３９−４２
【非特許文献１１】Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，ｓｉｘｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ  ２００９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
長時間のＮＧＦの作用が求められる場合に、ＮＧＦの非経口投与、特に筋肉内経路および血管内投与が必要であるが、それらの投与経路は内耳で高いＮＧＦ量に到達すること、特に治療的および有効な迷路内（ｉｎｔｒａｌａｂｙｒｉｎｔｈ）濃度を達成することという主な問題を解決していない。
【００２０】
さらに、全身投与および血管内投与を含む、内耳にＮＧＦを送達するためのいくつかの既知の方法が知られているが、それらの経路は選択的ではなく、内耳の内部で治療濃度に達することは困難である。
【００２１】
したがって、ＮＧＦの治療効果を保証できるほど十分に高い薬剤濃度を内耳で達成することのできる、より特異的で局所的な治療の必要性が存在する。
【００２２】
（定義）
他に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語、表記、および他の科学用語は、本開示が属する分野の当業者によって通常理解される意味を有することが意図される。場合により、通常理解される意味を有する用語は、明確にするために、および／又はただちに参照できるように、本明細書において定義される。したがって、本明細書におけるそのような定義の包含は、当技術分野で通常理解される定義を越えて実質的な違いを表すと解釈されるべきではない。
【００２３】
本明細書において、用語「薬学的に許容可能な賦形剤」は、それ自身は何らの薬学的効果もなく、ほ乳類、好ましくはヒトに投与された場合に有害反応を起こさない物質を示す。薬学的に許容可能な賦形剤は当技術分野において周知であり、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，ｓｉｘｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ  ２００９（非特許文献１１）に開示されている。
【００２４】
本明細書において、用語「同時投与、個別投与、または逐次投与」は、第１および第２の化合物を同時に、またはその２つの化合物が患者の体内で同時に作用するような方法で投与すること、もしくは治療効果をもたらすような方法で他方の化合物の後にもう一方の化合物を投与することを示す。
【００２５】
本明細書において、用語「およそ」および「約」は実験誤差の範囲を示し、それは測定の際に起こり得る。
【００２６】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は非限定的な用語（すなわち、「含むが、それに限定されない」を意味する）と解釈されるべきであり、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ、ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」、または「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｏｆ、ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」としての用語もまたサポートすると見なされる。
【００２７】
用語「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ、ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は半限定的な用語と解釈されるべきであり、本発明の基礎的および新規の特性に実質的に影響するいかなる成分も含まないことを意味する（したがって、任意選択的な賦形剤は含み得る）。
【００２８】
用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｏｆ、ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は限定的な用語と解釈されるべきである。
【００２９】
用語「鼓室内（ｉｎｔｒａｔｙｍｐａｎｉｃ）投与」は、少量の薬剤を、鼓膜を通り抜けて中耳に直接注入する外科的処置を意味する。それは、正円窓、すなわち「内耳の入り口」の高さにある、鼓膜の後下四分の一で通常行われる。正円窓は一部の薬剤に対して透過性の膜を持つためである。
【００３０】
本明細書において、用語「制御放出」は、本発明の薬物送達製剤により送達される生物活性分子の速度および／または量の制御を示す。制御放出の動態は、長期放出、高速放出、遅延放出または拍動性薬物送達システムであり得る。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】損傷蝸牛のｒｈＮＧＦ処置後の細胞生存率。
【図２】製剤２からのｒｈＮＧＦ−ＭＰＳのインビトロにおける累積放出プロファイル。
【図３】製剤２から一日ごとに放出されたｒｈＮＧＦの量（ｎｇ）。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
驚くべきことに、全身曝露を制限する鼓室内投与を含む局所ニューロトロフィン送達アプローチが、聴力損失の治療において特に有望であることが見出された。なぜなら、ニューロトロフィンが内耳内で、特に内部の迷路領域（ｌａｂｙｒｉｎｔｈｉｑｕｅ  ｒｅｇｉｏｎ）において、より早く、より高い濃度で、適切な治療濃度に達することをそれが可能にするためである。
【００３３】
この投与経路は、血管内投与または経口投与などの他の一般的な経路よりも良好な結果をもたらす。得られた結果は、ゲンタマイシン処置後の有毛細胞の生存能力の復元におけるニューロトロフィン活性、および蝸牛内のニューロトロフィンの良好な分布をもたらす経鼓室投与に帰する。
【００３４】
特に、本発明において報告される実験データは、ｒｈＮＧＦの経鼓室投与が内耳組織、特に内耳上皮有毛細胞を再生できることを示し、したがって、既存の治療を超えた改善、並びに経口および非経口投与の両者によるコルチコステロイド治療の代替手段を示した。
【００３５】
したがって、本発明の第一の実施形態は、ニューロトロフィンが鼓室内経路により投与されることを特徴とする、聴覚障害の治療におけるニューロトロフィンの使用に関する。
【００３６】
本発明の好ましい実施形態において、ニューロトロフィンは、ＮＧＦ、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン３およびニューロトロフィン４から選択され、より好ましくはＮＧＦである。
【００３７】
好ましくは、聴覚障害は、突発性難聴、爆発誘発性聴力損失、中毒性難聴、ＡＲＨＬ（加齢性聴力損失）、および騒音障害から選択される。
【００３８】
好ましい実施形態において、ニューロトロフィンは、少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含む組成物により投与される。
【００３９】
好ましくは、投与されるニューロトロフィンはＮＧＦ、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン３およびニューロトロフィン４であり、より好ましくはＮＧＦである。
【００４０】
本発明の目的のために、鼓室内経路に好適な薬学的に許容可能な賦形剤は、ヒアルロン酸、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、グリセロール、乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）およびＰＥＧ４００から選択され、好ましくはヒアルロン酸、ポリビニルアルコールまたはグリセロールである。
【００４１】
本発明の好ましい実施形態において、組成物は溶液、懸濁液、微粒子またはゲルである。微粒子は、好ましくは乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）から作られる。
【００４２】
好ましくは、組成物がゲルである場合、ゲルは温度感受性ゲルまたは接着性ゾル−ゲル転移ヒドロゲルから選択される。より好ましくは、ゲルは、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７およびヒアルロン酸（ＨＡ）を含む。
【００４３】
本発明のさらに好ましい実施形態において、ニューロトロフィンは、ＰＬＧＡの固体微粒子と、少なくとも１つの有機溶媒と、ヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびトレハロースから選択される少なくとも１つのさらなる分子とを含む、制御放出組成物を用いて投与される。
【００４４】
好ましくは、有機溶媒はハロゲン化（例えば、フッ素化または塩素化）されていない。より好ましくは、非ハロゲン化有機溶媒は、酢酸エチルおよびアセトンからなる群から選択される。
【００４５】
好ましくは、微粒子の組成物は、ヒト血清由来アルブミン、酢酸エチルおよびＤ−トレハロース脱水物を含有する。
【００４６】
好ましくは、制御放出組成物は、徐放性組成物である。
【００４７】
さらなる実施形態において、本発明の組成物は、少なくとも１つのさらなる活性成分と組み合わせて、同時に、個別に、または逐次的に投与されてもよい。また、それぞれの活性成分の異なる投与経路にしたがってもよい。
【００４８】
好ましい実施形態において、少なくとも１つのさらなる活性成分は、デキサメタゾン、メチルプレドニゾロンおよびプレドニゾロンから選択されるステロイドである。
【００４９】
好ましくは、さらなる活性成分は、経口的に、筋肉内に、または局所的に投与できる。
【００５０】
さらなる実施形態において、本発明の組成物は１μｇ〜１．２ｍｇのニューロトロフィン、好ましくは１０μｇ〜２００μｇのニューロトロフィン、より好ましくは２μｇ〜２０μｇのニューロトロフィンを含有する。
【００５１】
好ましくは、ニューロトロフィンは、ＮＧＦ、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン３およびニューロトロフィン４であり、より好ましくはＮＧＦである。
【００５２】
好ましい実施形態によれば、本発明の組成物は１μｇ〜１．２ｍｇのＮＧＦ、好ましくは１０μｇ〜２００μｇのＮＧＦ、より好ましくは２μｇ〜２０μｇのＮＧＦを含有する。
【００５３】
本発明の組成物が懸濁液の形態である場合、ニューロトロフィンの濃度は１μｇ／ｍｌ〜１．２ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１０μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌ、より好ましくは２μｇ／ｍｌ〜２０μｇ／ｍｌのニューロトロフィンである。
【００５４】
好ましくは、ニューロトロフィンはＮＧＦ、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン３およびニューロトロフィン４であり、より好ましくはＮＧＦである。
【００５５】
前記懸濁液におけるより好ましい実施形態において、ＮＧＦの濃度は１μｇ／ｍｌ〜１．２ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１０μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌ、より好ましくは２μｇ／ｍｌ〜２０μｇ／ｍｌのＮＧＦである。
【００５６】
本発明の組成物が溶液の形態である場合、ニューロトロフィンの濃度は、１μｇ／ｍｌ〜１．２ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１０μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌ、より好ましくは２μｇ／ｍｌ〜２０μｇ／ｍｌのニューロトロフィンである
【００５７】
好ましくは、ニューロトロフィンはＮＧＦ、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン３およびニューロトロフィン４であり、より好ましくはＮＧＦである。
【００５８】
本発明の組成物が溶液の形態である場合、ＮＧＦの濃度は１μｇ／ｍｌ〜１．２ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１０μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌ、より好ましくは２μｇ／ｍｌ〜２０μｇ／ｍｌのＮＧＦである。
【００５９】
本発明の組成物が微粒子の形態である場合、ＮＧＦの濃度は１μｇ／ｍｌ〜１．２ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１０μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌ、より好ましくは２μｇ／ｍｌ〜２０μｇ／ｍｌのＮＧＦである。
【００６０】
さらなる実施形態において、本発明のニューロトロフィンはマウスまたはヒト由来ニューロトロフィン、もしくはヒト組換えニューロトロフィンである。
【００６１】
好ましくは、ニューロトロフィンはマウスまたはヒト由来ＮＧＦ、もしくはヒト組換えＮＧＦである。
【００６２】
好ましい実施形態によれば、本発明の使用のための組成物は、毎日投与され、好ましくは１日に１回以上投与される。
【００６３】
好ましくは、使用のための組成物は１日に１回〜４回、少なくとも４週間にわたって投与される。
【００６４】
本発明によれば、本発明の組成物はヒトに投与されてよく、成人および「小児集団」（用語「小児集団」は生後から１８歳までの範囲の集団の部分として理解される）の両方を含むことが意図される。
【００６５】
以下の実施例は、本発明の理解を高めるために記載され、本発明を制限するいかなる効果も有しない。
【実施例】
【００６６】
本発明に従う以下の製剤を調製した。
【００６７】
製剤１
徐放性微粒子
製剤１のＰＬＧＡ／ＮＧＦ微粒子を以下のとおりに調製した。収率は７４．３１％であり、理論量は０．００８８％（ｍｇ  ＮＧＦ／１００ｍｇ  ｍｐ）である。ＮＧＦ（５０μｌ）、ＨＳＡ（１．９９ｍｇ）およびＰＥＧ４００（５０μｌ）（１：４０：１の比、体積／重量／体積）を含有する１００μｌの水溶液を、ＰＬＧＡ  ７５２Ｈの２０％酢酸エチル溶液２．５ｍｌ（０．５ｇのポリマーを含有する）中で、８Ｇプローブを備えたＵｌｔｒａｔｕｒｒａｘ  ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ  Ｔ２５  Ｂａｓｉｃ（ＩＫＡ）を１７５００ｒｐｍに設定することにより、１分間乳化した。得られたエマルション（Ａ１／Ｏ）は、３００μｌの酢酸エチルと混合したＰＶＡ（Ｍｏｗｉｏｌ（登録商標）４０−８８）  １％  ｐ／ｖ水溶液１０ｍｌに迅速に加え、１２６００ｒｐｍで３０分間ホモジナイズした。得られた二重エマルション（Ａ１／Ｏ／Ａ２）は、５００ｒｐｍに設定したＲＷ２０Ｄ（ＩＫＡ）ロッドスターラーを用いて室温で３時間電磁攪拌下に置き、有機溶媒の蒸発およびＰＬＧＡ粒子の析出を促進させた。懸濁液は５０ｍｌチューブに回収し、４℃、７０００ｒｐｍで、１５分間遠心分離した。
【００６８】
単離した微粒子を５０ｍｌのＭｉｌｌｉＱ水で４回洗浄し、遠心分離（７０００ｒｐｍ、４℃、１５分）し、次に３ｍｌの２％  ｗ／ｖトレハロース水溶液に再懸濁させた。得られた懸濁液は２つの二重シリコーンガラスバイアルに移し、−８０℃で冷凍し、次に２４時間の凍結乾燥サイクルにかけた。
【００６９】
【表１】
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【００７０】
製剤２
【００７１】
【表２】
2020520956.tif 000004
【００７２】
微粒子の特徴
粒度分布（ＰＳＤ）  ３μｍ≦ＰＳＤ（０．５）≦１５μｍ
モルホロジー  平滑表面の球形粒子
封入効率  ＞５０％（約６５％）
制御放出  ≧５０ｇｇ（平均２０ｎｇ／１日当たりのｒｈＮＧＦ）
生物活性（有効性）  ７０〜１３０％（参照物質に対し）
【００７３】
製剤２の調製手順
理論量が０．００７６％（ｍｇ  ｒｈＮＧＦ／１００ｍｇ  ｍｐｓ）のＰＬＧＡ／ｒｈＮＧＦ微粒子を以下の方法で調製した：製剤化緩衝液（ＦＢ）（１５０μｌ）、ＨＳＡ（６．０１ｍｇ）およびＰＥＧ４００（１５０μｌ）（比率  １：４０：１、ｖ／ｗ／ｖ）中のｒｈＮＧＦ溶液を含有する３００μｌの水溶液を、ＰＬＧＡ  ７５２Ｈの２０％  ｗ／ｖ酢酸エチル溶液７．５ｍＬ（１．５ｇのポリマーを含有する）中で、ホモジナイザーＵｌｔｒａｔｕｒｒａｘ  ｔ２５  ｂａｓｉｃ（ＩＫＡ）により、８Ｇプローブを用いて、１７４００ｒｐｍで３分間乳化した。
【００７４】
得られたエマルション（Ｗ１／Ｏ）を、９００μＬの酢酸エチルを添加した１％  ｗ／ｖ  ＰＶＡ（Ｍｏｗｉｏｌ（登録商標）４０−８８）水溶液３０ｍｌに素早く加え、１２０００ｒｐｍで３分間、再びホモジナイズした。得られた二重エマルション（Ｗ１／Ｏ／Ｗ２）を、ＰＴＦＥでコーティングされた２枚プロペラスターラーを備えたオーバーヘッドスターラーＲＷ２０Ｄ（ＩＫＡ）を用いて、室温、５００ｒｐｍで３時間攪拌し、有機溶媒を蒸発させ、ＰＬＧＡ微粒子を析出させた。懸濁液を２本の５０ｍｌ  ＰＰチューブ（ｆａｌｃｏｎ）に回収し、７４００ｒｐｍ、１５分間、４℃で遠心分離した。単離した微粒子を、７０００ｒｐｍ、１５分、４℃で遠心分離することにより、５０ｍｌのｍｉｌｌｉＱ水にて６回洗浄した。その後、微粒子を２％  ｗ／ｖトレハロースの水溶液に再懸濁した。得られた懸濁液をＩＳＯ  ６Ｒガラスタイプシリコン化Ｃｌａｓｓ  １バイアルに移し、−８０℃で冷凍し、次いで凍結乾燥させた。
【００７５】
同じ方法で、ｒｈＮＧＦを含まない微粒子のバッチを調製した（プラセボ）。ｒｈＮＧＦ溶液の代わりに、製剤化緩衝液をＷ１の相に用いた。
【００７６】
ｒｈＮＧＦ放出の動態の検討
要求された時間（４０−６０ｇｇ）における、微粒子のｒｈＮＧＦを放出する能力を評価するため、およびｍｐｓ系により放出されるタンパク質を決定するために、以下の手順を用いた。
【００７７】
（手順）
−  ２ｍＬ  ＰＰ  ＬｏＢｉｎｄ  ｐｒｏｄｅｉｎチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）内で、１０ｍｇの微粒子を１ｍＬのＰＢＳ  ｐＨ７．４（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に懸濁させた。
−  ３秒間渦流攪拌した
−  チューブを回した（７５００ｒｐｍ、７分、４℃）
−  ビヒクル全てを回収し、新しい媒体で最初の体積（１ｍＬ）に戻した。
−  粒子を再懸濁した。
−  環状の振とう下（８０ｒｐｍ）、チューブを３７℃の恒温振とう機に放置した。
−  すぐに分析しない場合は、回収した試料は−２０℃の冷凍庫に保管した。
【００７８】
ｒｈＮＧＦの物理化学的および生物学的特性をより良く保存するために、最大で３〜４日で試料を回収することが重要である。試料は、放出動態の条件（特に３７℃）のために損なわれる恐れがある。
【００７９】
ＥＬＩＳＡによる試料の分析
ＥＬＩＳＡによる分析の前に試料を製剤バッファで希釈し、ＮＧＦの濃度が使用するキットの検出限界の範囲内（１４−５０００ｐｇ／ｍＬ）になるようにした。ＥＬＩＳＡ分析には、Ｒａｙｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．から提供されたキット、ＲａｙＢｉｏ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  ｂｅｔａ−ＮＧＦ，ｃｏｄ．ＥＬＨ−ＮＧＦを使用した。
【００８０】
図２および図３は、製剤２を用いたｒｈＮＧＦ−ＭＰＳのインビトロでの累積および日ごと（ｎｇ／ｄａｙ）の放出プロファイルを示す。
【００８１】
１．インビトロ試験
蝸牛培養物は、聴力損失の低減または予防に有効である可能性がある化合物の能力を試験するための標準的なモデルを表す。本明細書に記載する試験において、蝸牛は新生マウス（５日〜１５日）から摘出し、ゲンタマイシン処置で障害した（５０μｇ／ｍｌで１４時間）。次に、ｒｈＮＧＦを異なる濃度（６、５０、１００、３００ｎｇ／ｍｌ）で７２時間使用した。細胞生存率はヘキスト染色により評価した。
【００８２】
未処置細胞（ＮＴ）、障害したが未処置の細胞（ＧＮＴ）およびビヒクルで処置した細胞を対照として用いた。
【００８３】
結果
図１に報告するように、障害蝸牛のｒｈＮＧＦ処置は、細胞生存率において統計的に優位な増加をもたらした。
【００８４】
特に、本試験で得られたデータは、マウスの蝸牛の器官培養において、ゲンタマイシン曝露による傷害後の有毛細胞の生存能力を復元するｒｈＮＧＦの能力を示した。
【００８５】
２．モルモットにおける経鼓室投与後のｒｈＮＧＦの薬物動態
経鼓室注入は特定の内視鏡を用いて麻酔された動物に行い、鼓膜の損傷を抑えた。モルモットの右側を下に温熱パッド上に横たえさせ、モルモットの左中耳に薬剤を投与した。注入後０．５、２、４、６、２４時間後に外リンパを回収した。
【００８６】
単回静脈内（ｉｖ）投与（１．２ｍｇ／ｋｇ）および経鼓室（ＴＴ）投与（３０μｇ／ｍＬ）後のｒｈＮＧＦの薬物動態プロファイルを、雌アルビノハートレーモルモットで調査した。
【００８７】
ｒｈＮＧＦを緩衝生理食塩水中で可溶化し、人工外リンパで希釈して最終濃度を得た。
【００８８】
経鼓室注入は特定の内視鏡を用いて麻酔された動物に行い、鼓膜の損傷を抑えた。モルモットの右側を下に温熱パッド上に横たえさせ、モルモットの左中耳に薬剤を投与した。
【００８９】
投与後０．５、２、４、６および２４時間に、蝸牛の流体５μＬを５モルモット／時間から回収した。ｒｈＮＧＦが外リンパに検出された（ＥＬＩＳＡ）。
【００９０】
表３に単回ｉ．ｖ．投与およびＴＴ投与後に得られたｒｈＮＧＦの主な薬物動態パラメータを示す。
【００９１】
【表３】
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【００９２】
これらのデータは、経鼓室注入（ＴＴ）がｉ．ｖ．よりも優れていることを示す。ｒｈＮＧＦの投与量はＴＴ投与においてｉ．ｖ．投与よりも４０倍低いにも関わらず、Ｃｍａｘ（外リンパにおける投与後の薬物の最高濃度）が４０倍高く、ＡＵＣtot（曲線下面積は、ＡＵＣ  ｌａｓｔおよびＡＵＣ  ｅｘｔｒａ（それぞれ、最後の投与時間のＡＵＣおよび薬物曝露から２４時間後の全ての投与時間のＡＵＣ）の合計により与えられる経時的な総薬物曝露を表す）（５４４，７９９μｇ／ｍＬ*分）が３８倍高いと共に、ｔ1/2がおよそ２倍長いという結果になるからである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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