(57)【要約】本開示により、造血幹/前駆細胞移植に有用な薬学的組成物を構成する独特な治療用細胞集団を提供する。例えば、本開示により、造血幹/前駆細胞、メモリーT細胞、制御性T細胞の富化集団を含む治療用細胞集団が提供され、該細胞の集団は、通常のナイーブαβ-T細胞が枯渇されている。本開示は、該治療用細胞集団を用いた処置方法をさらに提供する。他の態様では、本開示は治療用細胞集団の作製方法を提供する。2020511464.tif 000010
2020511464.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
造血幹/前駆細胞（HSPC）、メモリーT細胞（Tmem）および制御性T細胞（Treg）が富化されている治療用細胞集団を含む薬学的組成物であって、
該細胞集団が、通常のナイーブαβ-T細胞が枯渇されており、該薬学的組成物が、1:5未満である通常のナイーブαβ-T細胞とTregの比を構成している、
薬学的組成物。
【請求項２】
インバリアントナチュラルキラーT細胞（iNKT）の富化集団をさらに含む、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項３】
1回分または複数回分の単位用量の細胞移植片を含む、前記薬学的組成物であって、
該細胞移植片の各単位用量が、該細胞移植片を受容する対象の体重1キログラム（kg）あたりの治療用細胞集団を含み、各単位用量の治療用細胞集団が、
3×105より多くの造血幹/前駆細胞（HSPC）、
3×105より多くのメモリーT細胞（Tmem）、
5×105より多くの制御性T細胞（Treg）、および
3×105より少ない通常のナイーブαβ-T
を含む、請求項1または2記載の薬学的組成物。
【請求項４】
単位用量が0.5×103より多くのiNKT細胞をさらに含む、請求項3記載の薬学的組成物。
【請求項５】
各単位用量の治療用細胞集団が、
1.0×106〜50×106の造血幹/前駆細胞（HSPC）、
0.3×106〜1000×106のメモリーT細胞（Tmem）、
0.5×106〜1000×106の制御性T細胞（Treg）、および
3×105より少ない通常のナイーブαβ-T
を含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項６】
単位用量が、0.5×103〜2000×103細胞/kgの濃度のインバリアントナチュラルキラーT（iNKT）細胞をさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項７】
Tregが、ナイーブTregの集団、メモリーTregの集団、または両方を含む、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項８】
Tmemが、セントラルメモリーT細胞（TCM）の集団、エフェクターメモリーT細胞（TEM）の集団、またはそれらの任意の組み合わせを含む、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項９】
セントラルメモリーT幹細胞（TSCM）の集団を含む、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
HSPCがCD34+である、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
HSPCが、CD133+、CD90+、CD38-、CD45RA-、Lin-、またはそれらの任意の組み合わせである、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
HSPCがcKIT+である、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
HSPCが、CD19-、TCRα-、またはそれらの組み合わせである、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
Tmemが、CD3+、CD45RA-、CD45RO+、またはそれらの任意の組み合わせである、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
Tregが、CD4+、CD25+、CD127-/lo、FoxP3+、またはそれらの任意の組み合わせである、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
ナイーブTregが、CD4+、CD25+、CD127-/lo、FoxP3+、CD45RA+、CD45RO-、またはそれらの任意の組み合わせである、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
メモリーTregが、CD4+、CD25+、CD127-/lo、FoxP3+、CD45RA-、CD45RO+、またはそれらの任意の組み合わせである、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
TSCMが、CD45RA+およびCD4+またはCD8+である、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項１９】
TSCMが、CD95+、CD122+、CXCR3+、LFA-1+、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項18記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
TCMが、CD45RO+およびCD4+またはCD8+である、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
TCMが、CD45RA-、CD62L+、CCR7+、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項20記載の薬学的組成物。
【請求項２２】
TEMが、CD4+、CD45RO+、CD45RA-、CD62L-、CCR7-、またはそれらの任意の組み合わせである、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項２３】
iNKTが、CD1d-tet+、6B11+、または両方である、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項２４】
iNKTがVα24Jα18+である、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項２５】
通常のナイーブαβ-T細胞が、CD25-、CD127+、または両方、ならびにTCRα+およびCD45RA+である、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項２６】
通常のナイーブαβ-T細胞が、TCRα+ TCRβ+ CD45RA+ CD45RO- CD25- CD95- IL-2Rβ- CD127+である、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項２７】
HSPCとTmemの比が500:1〜1:1,000である、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項２８】
HSPCとTregの比が約100:1〜約1:30である、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項２９】
HSPCとナイーブTregの比が1:500〜100:1である、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項３０】
HSPCとメモリーTregの比が1:500〜10,000:1である、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項３１】
HSPCとiNKTの比が1:2〜500,000:1である、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項３２】
通常のナイーブαβ-T細胞とHSPCの比が1:3未満、好ましくは1:400未満である、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項３３】
通常のナイーブαβ-T細胞とTmemの比が1:30未満、好ましくは1:800未満である、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項３４】
通常のナイーブαβ-T細胞とナイーブTregの比が1:1未満、好ましくは1:10未満である、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項３５】
通常のナイーブαβ-T細胞とメモリーTregの比が1:1未満、好ましくは1:100未満である、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項３６】
通常のナイーブαβ-T細胞とiNKTの比が100:1未満、好ましくは1:1未満である、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項３７】
TmemとTregの比が2000:1〜1:10、好ましくは30:1〜1:1である、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項３８】
TmemとナイーブTregの比が3:1〜0.1:1である、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項３９】
TmemとメモリーTregの比が27:1〜0.9:1である、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項４０】
iNKTとTmemの比が約5:1〜約1:1,000,000である、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項４１】
単位用量が1.0×106〜50×106のHSPCを含む、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項４２】
単位用量が0.3×106〜1000×106のメモリーT細胞を含む、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項４３】
単位用量が0.5×106〜1000×106のTreg細胞を含む、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項４４】
単位用量が0.2×106〜500×106のナイーブTreg細胞を含む、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項４５】
単位用量が0.5×106〜500×106のメモリーTreg細胞を含む、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項４６】
単位用量が0.5×103〜2000×103のiNKT細胞を含む、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項４７】
単位用量が3×105より少ない通常のナイーブαβ-T細胞を含む、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項４８】
前記細胞集団が、1回または複数回の組織採取を加工処理することにより得られる、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項４９】
1回または複数回の組織採取が1例または複数例のドナーからである、請求項48記載の薬学的組成物。
【請求項５０】
組織採取が、HLA適合兄弟姉妹ドナー、HLA適合非血縁ドナー、一部適合非血縁ドナー、ハプロタイプ一致の血縁ドナー、自己ドナー、HLA不適合同種異系ドナー、ドナープール、またはそれらの任意の組み合わせからである、請求項48または49記載の薬学的組成物。
【請求項５１】
HSPCが、前記対象とハプロタイプが一致しているドナーによって提供される、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項５２】
Treg、Tmem、iNKT、またはそれらの任意の組み合わせが、HLA適合兄弟姉妹ドナーまたはHLA適合非血縁ドナーであるドナーによって提供される、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項５３】
細胞が輸注または注射用に製剤化される、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項５４】
前記細胞集団が、対象に対する投与のための製剤を構成する、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項５５】
製剤がNormosol-Rおよびヒト血清を含む、請求項54記載の薬学的組成物。
【請求項５６】
ヒト血清が製剤全体の1%である、請求項54または55記載の薬学的組成物。
【請求項５７】
疾患または障害の処置における前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物の使用。
【請求項５８】
疾患または障害が、白血病、リンパ腫、慢性感染、または自己免疫疾患、悪性もしくは非悪性の血液疾患、AML、ALL、CML、CLL、多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、MDS、リンパ増殖性疾患、1型糖尿病、先天性代謝異常、遺伝性疾患、鎌状赤血球貧血、β-サラセミア、多発性硬化症、実質臓器移植、クローン病、潰瘍性大腸炎、狼瘡、血球貪食性リンパ組織球症、糖原病、ムコ多糖症、またはHSPC移植の恩恵を受けるであろう任意の他の疾患である、請求項57記載の使用。
【請求項５９】
各治療用細胞集団が、前記対象に個々の薬学的組成物として投与される、請求項57または58のいずれか一項記載の使用。
【請求項６０】
治療用細胞集団が、前記対象に単一の薬学的組成物として投与される、請求項57または58のいずれか一項記載の使用。
【請求項６１】
前記細胞が、HLA適合兄弟姉妹ドナー、HLA適合非血縁ドナー、一部適合非血縁ドナー、ハプロタイプ一致の血縁ドナー、自己ドナー、HLA不適合ドナー、ドナープール、またはそれらの任意の組み合わせであるドナーから単離される、請求項57〜60のいずれか一項記載の使用。
【請求項６２】
治療用細胞集団が同種異系または自己である、請求項57〜61のいずれか一項記載の使用。
【請求項６３】
治療用細胞集団が自己である、請求項57〜62のいずれか一項記載の使用。
【請求項６４】
治療用細胞集団のハプロタイプが一致している、請求項57〜63のいずれか一項記載の使用。
【請求項６５】
治療用細胞集団が、動員末梢血、動員アフェレーシス血液製剤、骨髄、臍帯血、非動員血、非動員アフェレーシス血液製剤、またはそれらの任意の組み合わせから単離される、請求項57〜64のいずれか一項記載の使用。
【請求項６６】
治療用細胞集団が1回の組織採取に由来する、請求項57〜65のいずれか一項記載の使用。
【請求項６７】
治療用細胞集団が1回または複数回の組織採取に由来する、請求項57〜66のいずれか一項記載の使用。
【請求項６８】
治療用細胞集団が、少なくとも第1のドナーによって提供されたHSPCと、少なくとも第2のドナーによって提供されたTregおよびTmemとを含む、請求項57〜67のいずれか一項記載の使用。
【請求項６９】
治療用細胞集団が、少なくとも第2のドナーによって提供されたiNKT細胞を含む、請求項68記載の使用。
【請求項７０】
第1のドナーのハプロタイプが前記対象と一致している、請求項68または69記載の使用。
【請求項７１】
第2のドナーが、HLA適合兄弟姉妹ドナーまたはHLA適合もしくは一部適合非血縁ドナーである、請求項68〜70のいずれか一項記載の使用。
【請求項７２】
前記対象が、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ、マウス、ウサギ、ラット、またはモルモットである、請求項57〜71のいずれか一項記載の使用。
【請求項７３】
少なくとも1種類の試料を加工処理して、
（a）富化された造血幹/前駆細胞（HSPC）の集団、
（b）富化された制御性T細胞（Treg）の集団、
（c）富化されたメモリーT細胞（Tmem）の集団
を得る工程; ならびに
（d）富化されたHSPC、メモリーT細胞、およびTregの集団を、対象に対する投与に適した薬学的組成物として製剤化する工程
を含み、
ここで、（a）〜（c）の該集団は通常のナイーブαβ-T細胞が枯渇されている、
前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物を作製する方法。
【請求項７４】
前記試料を加工処理して、Lin+細胞を枯渇させた細胞の集団を得る工程をさらに含む、請求項73記載の方法。
【請求項７５】
富化されたTregの集団を得ることが、富化されたナイーブTregの集団、富化されたメモリーTregの集団、または両方を得ることを含む、請求項73または74記載の方法。
【請求項７６】
富化されたTmemの集団を得ることが、富化されたセントラルメモリーT細胞（TCM）の集団、富化されたエフェクターメモリーT細胞（TEM）の集団、またはそれらの任意の組み合わせを得ることを含む、請求項73〜75のいずれか一項記載の方法。
【請求項７７】
前記試料を加工処理して、富化されたiNKT細胞の集団を得る工程をさらに含む、請求項73〜76のいずれか一項記載の方法。
【請求項７８】
富化されたHSPCの集団が少なくとも50%のCD34+ HPSCを含む、請求項73〜77のいずれか一項記載の方法。
【請求項７９】
Lin+細胞を枯渇させた細胞集団が1%〜30%のLin+細胞、好ましくは1%未満のLin+細胞を含む、請求項73〜78のいずれか一項記載の方法。
【請求項８０】
富化されたTregの集団が20%〜99.9%のTregを含む、請求項73〜79のいずれか一項記載の方法。
【請求項８１】
富化されたTmemの集団が10%〜99.9%のTmemを含む、請求項73〜80のいずれか一項記載の方法。
【請求項８２】
富化されたiNKTの集団が10%〜99.9%のiNKTを含む、請求項73〜81のいずれか一項記載の方法。
【請求項８３】
前記薬学的組成物の製剤化が、富化されたHSPC集団、メモリーT細胞集団、Treg集団、iNKT集団、またはそれらの任意の組み合わせを、富化細胞の混合集団へと組み合わせることを含む、請求項73〜82のいずれか一項記載の方法。
【請求項８４】
前記富化細胞の混合集団が、500:1〜1:1,000のHSPCとメモリーT細胞の比を含む、請求項83記載の方法。
【請求項８５】
前記富化細胞の混合集団が、1:500〜100:1のHSPCとナイーブTregの比を含む、請求項83または84記載の方法。
【請求項８６】
前記富化細胞の混合集団が、1:500〜10,000:1のHSPCとメモリーTregの比を含む、請求項83〜85のいずれか一項記載の方法。
【請求項８７】
前記富化細胞の混合集団が、1:2〜500,000:1のHSPCとiNKTの比を含む、請求項83〜86のいずれか一項記載の方法。
【請求項８８】
前記富化細胞の混合集団が、1:3未満、好ましくは1:400未満である通常のナイーブαβ-T細胞とHSPCの比を含む、請求項83〜87のいずれか一項記載の方法。
【請求項８９】
前記富化細胞の混合集団が、1:30未満、好ましくは1:800未満である通常のナイーブαβ-T細胞とTmemの比を含む、請求項83〜88のいずれか一項記載の方法。
【請求項９０】
前記富化細胞の混合集団が、1:1未満、好ましくは1:10未満である通常のナイーブαβ-T細胞とナイーブTregの比を含む、請求項83〜89のいずれか一項記載の方法。
【請求項９１】
前記富化細胞の混合集団が、1:1未満、好ましくは1:100未満である通常のナイーブαβ-T細胞とメモリーTregの比を含む、請求項83〜90のいずれか一項記載の方法。
【請求項９２】
前記富化細胞の混合集団が、100:1未満、好ましくは1:1未満である通常のナイーブαβ-T細胞とiNKTの比を含む、請求項83〜91のいずれか一項記載の方法。
【請求項９３】
前記富化細胞の混合集団が、30:1〜1:1であるTmemとTregの比を含む、請求項83〜92のいずれか一項記載の方法。
【請求項９４】
前記富化細胞の混合集団が、3:1〜0.1:1であるTmemとナイーブTregの比を含む、請求項83〜93のいずれか一項記載の方法。
【請求項９５】
前記富化細胞の混合集団が、27:1〜0.9:1であるTmemとメモリーTregの比を含む、請求項83〜94のいずれか一項記載の方法。
【請求項９６】
前記富化細胞の混合集団が、0.0014%未満の通常のナイーブαβ-T細胞を含む、請求項83〜95のいずれか一項記載の方法。
【請求項９７】
Lin+細胞が、CD19、CD11c、CD66B、CD14、CD20、またはそれらの任意の組み合わせを発現する、請求項74〜96のいずれか一項記載の方法。
【請求項９８】
HSPCがCD34+である、請求項73〜97のいずれか一項記載の方法。
【請求項９９】
HSPCがCD19-およびTCRα/β-である、請求項73〜98のいずれか一項記載の方法。
【請求項１００】
HSPCが、CD133+、CD90+、CD38-、CD45RA-、Lin-、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項73〜99のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０１】
Tmemが、CD45RA-、CD45RO+、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項73〜100のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０２】
TmemがTCMである、請求項101記載の方法。
【請求項１０３】
TCMが、CD45RO+およびCD4+またはCD8+である、請求項102記載の方法。
【請求項１０４】
TCMが、CD45RA-、CD62L+、CCR7+、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項102または103記載の方法。
【請求項１０５】
TmemがTEMである、請求項101記載の方法。
【請求項１０６】
TEMが、CD4+、CD45RA+、CD45RO-、CD62L-、CCR7-、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項105記載の方法。
【請求項１０７】
Tregが、CD4+、CD25+、CD127-/lo、FoxP3+、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項73〜106のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０８】
Tregが、ナイーブTreg、メモリーTreg、または両方である、請求項107記載の方法。
【請求項１０９】
ナイーブTregが、CD4+、CD25+、CD127-/lo、FoxP3+、CD45RA+、CD45RO-、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項108記載の方法。
【請求項１１０】
メモリーTregが、CD4+、CD25+、CD127-/lo、FoxP3+、CD45RA-、CD45RO+、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項108記載の方法。
【請求項１１１】
前記試料が、動員末梢血、動員アフェレーシス血液製剤、骨髄、臍帯血、非動員血、非動員アフェレーシス血液製剤、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項73〜110のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１２】
前記試料が、密度勾配、Ficoll、Percoll、赤血球低浸透圧性溶解、塩化アンモニウム-カリウム（ACK）バッファー、またはそれらの任意の組み合わせの処理用に調製される、請求項73〜111のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１３】
前記試料が1回の組織採取により得られる、請求項73〜111のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１４】
前記試料が1回または複数回の組織採取により得られる、請求項73〜111のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１５】
富化された細胞集団が、密度による分離、四量体型抗体複合体媒介性の富化/枯渇、磁気活性化細胞選別、マルチパラメータ蛍光ベース分子表現型、またはそれらの任意の組み合わせによって得られる、請求項73〜114のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１６】
（A）前記試料を、CD34に特異的に結合する分子と、CD34+細胞の集団およびCD34-細胞の集団が形成される条件下で接触させ、CD34+細胞の集団を該試料から回収し、かつCD34-細胞の集団を該試料から回収する工程; ならびに
（B）CD34-細胞の集団を加工処理し、Treg、Tmem、iNKT、またはそれらの任意の組み合わせを含む富化された治療用細胞の最小の1つの集団を得る工程
を含む、請求項73〜115のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１７】
工程Bが、富化された治療用細胞の集団を得るために精密選別を行なうことを含む、請求項116記載の方法。
【請求項１１８】
工程Bが、
CD34-細胞の集団を、CD45RAに特異的に結合する分子、CD45ROに特異的に結合する分子、CD4に特異的に結合する分子、CD8に特異的に結合する分子、CD25に特異的に結合する分子、CD127に特異的に結合する分子、CD1d-tet、6B11モノクローナル抗体もしくはその機能性断片、またはそれらの任意の組み合わせと接触させること
を含む、請求項116または117記載の方法。
【請求項１１９】
工程Bが、
（i）CD34-細胞の集団を、CD45RAに特異的に結合する少なくとも1つの分子と、CD45RA+細胞の集団およびCD45RA-細胞の集団が形成される条件下で接触させ、CD45RA-細胞の集団を回収すること; ならびに
（ii）富化された治療用細胞の集団を得るためにCD45RA+細胞の集団からの精密選別を行なうこと
を含む、請求項116記載の方法。
【請求項１２０】
精密選別が、
CD45RA+細胞の集団を、CD4に特異的に結合する分子、CD8に特異的に結合する分子、CD25に特異的に結合する分子、CD127に特異的に結合する分子、CD1d-tet、6B11モノクローナル抗体もしくはその機能性断片、またはそれらの任意の組み合わせと接触させること
を含む、請求項119記載の方法。
【請求項１２１】
精密選別が、
CD45RA-細胞の集団を、CD45RAに特異的に結合する分子、CD45ROに特異的に結合する分子、またはそれらの組み合わせと接触させること
をさらに含む、請求項120記載の方法。
【請求項１２２】
工程Bが、
（i）CD34-細胞の集団を、Lin+マーカーに特異的に結合する少なくとも1つの結合分子と、Lin+細胞の集団およびLin-細胞の集団が形成される条件下で接触させ、Lin-細胞の集団を回収すること; ならびに
（ii）富化された治療用細胞の集団を得るためにLin-細胞の集団からの精密選別を行なうこと
を含む、請求項116記載の方法。
【請求項１２３】
Lin+マーカーが、CD19、CD11c、CD66B、CD14、CD20、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項122記載の方法。
【請求項１２４】
精密選別が、
Lin-細胞の集団を、CD45RAに特異的に結合する分子、CD45ROに特異的に結合する分子、CD4に特異的に結合する分子、CD8に特異的に結合する分子、CD25に特異的に結合する分子、CD127に特異的に結合する分子、CD1d-tet分子、6B11モノクローナル抗体もしくはその機能性断片、またはそれらの任意の組み合わせと接触させること
を含む、請求項122または123記載の方法。
【請求項１２５】
工程Bが、
（i）CD34-細胞の集団を、少なくとも1つのLin+マーカーに特異的に結合する少なくとも1つの結合分子と、Lin+細胞の集団およびLin-細胞の集団が形成される条件下で接触させ、Lin-細胞の集団を回収すること; ならびに
（ii）Lin-細胞の集団を、CD25に特異的に結合する結合分子と、CD25+細胞の集団およびCD25-細胞の集団が形成される条件下で接触させ、CD25+細胞集団を回収し、それによりTregを含む細胞の集団を作製し、CD25-細胞の集団を回収すること; ならびに
（iii）CD25-細胞の集団をCD45RAに特異的に結合する結合分子と、CD45RA+細胞の集団およびCD45RA-細胞の集団が形成される条件下で接触させ、CD45RA-細胞の集団を回収すること
を含む、請求項116記載の方法。
【請求項１２６】
Lin+マーカーが、CD19、CD11c、CD66B、CD14、CD20、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項125記載の方法。
【請求項１２７】
工程（ii）が、
Lin-細胞を、CD1d-tet、6B11モノクローナル抗体もしくはその機能性断片またはそれらの組み合わせと、CD1d-tet+細胞の集団、6B11+細胞の集団、またはそれらの組み合わせ、およびCD1d-tet-細胞の集団、6B11-細胞、またはそれらの組み合わせが形成される条件下で接触させ、CD1d-tet+細胞の集団を回収すること
をさらに含む、請求項125または126記載の方法。
【請求項１２８】
CD25+細胞の集団およびCD1d-tet+細胞の集団、6B11+細胞または両方が同時に回収される、請求項119〜127のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２９】
ナイーブTreg細胞の集団、メモリーTreg細胞の集団、iNKT細胞の集団、またはそれらの任意の組み合わせを得るために、工程（ii）のCD25+細胞の集団の精密選別を行なうことをさらに含む、請求項125〜128のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３０】
CD45RA+細胞の集団が回収され、Treg、iNKTまたは両方の集団を得るために精密選別がさらに行なわれる、請求項125〜129のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３１】
精密選別が、マルチパラメータ蛍光ベース分子表現型を使用する精製を含む、請求項117〜130のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３２】
（A）少なくとも第1の試料に対して第1の粗選別を行ない、それによりCD34+細胞の富化集団を得ること;
（B）第2の試料に対して第2の粗選別を行ない、それによりLin-細胞の集団を得ること;
（C）Lin-細胞の集団に対して第3の粗選別を行ない、それによりCD45RA-メモリーT細胞の集団を得ること、およびCD45RA+細胞の集団を得ること; ならびに
（D）CD45RA+細胞の集団に対して精密選別を行ない、それによりTregの集団を得ること
を含む、請求項73〜115のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３３】
第2の試料が、工程Aで回収されたCD34-細胞の集団を含む、請求項132記載の方法。
【請求項１３４】
第1の試料が少なくとも1種類のハプロタイプ一致試料を含む、請求項132または133記載の方法。
【請求項１３５】
第1の試料が少なくとも2種類のハプロタイプ一致試料を含む、請求項132または133記載の方法。
【請求項１３６】
第1の試料が、動員末梢血、動員アフェレーシス血液製剤、骨髄、臍帯血、非動員血、非動員アフェレーシス血液製剤、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項132〜135のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３７】
第2の試料が、末梢血単核細胞（PBMC）、動員末梢血、動員アフェレーシス血液製剤、骨髄、臍帯血、非動員血、非動員アフェレーシス血液製剤、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項132〜136のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３８】
第1、第2、または第3の粗選別が、密度による分離、四量体型抗体複合体媒介性の富化/枯渇、磁気活性化細胞選別、アフェレーシス、白血球アフェレーシス、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項132〜137のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３９】
精密選別が、マルチパラメータ蛍光ベース分子表現型を使用する精製を含む、請求項132〜138のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４０】
精密選別により、ナイーブTreg細胞の集団、メモリーTreg細胞の集団、iNKT細胞の集団、またはそれらの任意の組み合わせが得られる、請求項132〜139のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４１】
精密選別が、
CD45RA+細胞を、CD25に特異的に結合する結合分子と、CD25+細胞の集団およびCD25-細胞の集団が得られる条件下で接触させ、かつCD25+細胞の集団を回収し、それによりTregの集団を得ること
を含む、請求項132〜140のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４２】
CD25+細胞の集団が、ナイーブTreg細胞の集団が得られる条件下でさらに選別される、請求項141記載の方法。
【請求項１４３】
精密選別が、
CD45RA+細胞を、CD1d-tet、6B11モノクローナル抗体もしくはその機能性断片、またはそれらの組み合わせと、CD1d-tet+細胞の集団、6B11+細胞、または両方が得られる条件下で接触させ、CD1d-tet+細胞の集団、6B11+細胞、または両方を回収すること
を含む、請求項132〜142のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４４】
第1の試料または第2の試料が、同種異系、自己、またはそれらの組み合わせである、請求項132〜143のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４５】
第2の試料が、HLA適合非血縁ドナー、HLA適合兄弟姉妹ドナー、またはそれらの組み合わせに由来する、請求項132〜144のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４６】
Lin+マーカーが、CD19、CD11c、CD66B、CD14、CD20、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項132〜145のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４７】
（A）前記試料を、Lin+マーカーに特異的に結合する結合分子と、Lin+細胞の集団およびLin-細胞の集団が得られる条件下で接触させ、Lin-細胞の集団を回収する工程; ならびに
（B）Lin-細胞を、CD34に特異的に結合する結合分子およびCD25に特異的に結合する結合分子と、CD34+細胞の集団、CD25+細胞の集団、およびCD34- CD25-細胞の集団が得られる条件下で接触させ、CD34+細胞およびCD25+細胞を回収し、かつCD34- CD25-細胞の集団を回収する工程; ならびに
（C）CD34- CD25-細胞の集団を、CD45RAに特異的に結合する結合分子と、CD45RA+細胞の集団およびCD45RA-細胞の集団が得られる条件下で接触させ、CD45RA-の集団を回収する工程
を含む、請求項73〜115のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４８】
Lin+マーカーが、CD19、CD11c、CD66B、CD14、CD20、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項147記載の方法。
【請求項１４９】
工程Bが、
Lin-細胞を、CD1d-tet、6B11モノクローナル抗体もしくはその機能性断片、またはそれらの組み合わせと、CD1d-tet+細胞の集団、6B11+細胞、またはそれらの組み合わせが得られる条件下で接触させ、CD1d-tet+細胞、6B11+細胞、またはそれらの組み合わせを回収すること
をさらに含む、請求項147または148記載の方法。
【請求項１５０】
CD34+細胞、CD25+細胞、CD1d-tet+細胞、6B11+細胞、またはそれらの任意の組み合わせの精密選別を行ない、それによりCD34+細胞、CD25+細胞、CD1d-tet+細胞、6B11+細胞、またはそれらの任意の組み合わせの集団を得る工程をさらに含む、請求項147〜149のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５１】
精密選別が、
CD34+細胞、CD25+細胞、CD1d-tet+細胞、6B11+細胞、またはそれらの任意の組み合わせを、CD34に特異的に結合する結合分子、CD4に特異的に結合する結合分子、CD25に特異的に結合する結合分子、CD127に特異的に結合する結合分子、CD1d-tet、6B11モノクローナル抗体もしくはその機能性断片、またはそれらの任意の組み合わせと、CD34+細胞、CD4+CD25+CD127-/Lo細胞、CD1d-tet+細胞、またはそれらの組み合わせが高度に富化された細胞の集団が得られる条件下で接触させること
を含む、請求項150記載の方法。
【請求項１５２】
（A）前記試料の粗選別を行ない、Lin+細胞の集団およびLin-細胞の集団を得、かつLin-細胞の集団を回収する工程; ならびに
（B）Lin-細胞の集団の粗選別を行なうことにより、HSPCとTmemが富化された集団およびCD45RA+細胞の集団を得、HSPCとTmemの集団を回収し、かつCD45RA+細胞の集団を回収する工程; ならびに
（C）CD45RA+細胞の集団の精密選別を行ない、Tregの集団を得る工程
を含む、請求項73〜115のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５３】
精密選別が、
CD45RA+細胞の集団を、CD34に特異的に結合する結合分子、CD4に特異的に結合する結合分子、およびCD127に特異的に結合する結合分子と、CD34+細胞の集団およびCD4+ CD25+ CD127-/Lo細胞の集団が得られる条件下で接触させ、CD34+細胞の集団およびCD4+ CD25+ CD127-/Lo細胞の集団を回収すること
をさらに含む、請求項152記載の方法。
【請求項１５４】
精密選別が、
CD45RA+細胞集団を、CD1d-tet、6B11モノクローナル抗体もしくはその機能性断片、またはそれらの組み合わせと接触させ、CD1d-tet+細胞の集団、6B11+細胞、またはそれらの組み合わせを回収すること
をさらに含む、請求項152〜153記載の方法。
【請求項１５５】
粗選別が、密度による分離、四量体型抗体複合体媒介性の富化/枯渇、磁気活性化細胞選別、アフェレーシス、白血球アフェレーシス、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項152〜154のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５６】
精密選別が、マルチパラメータ蛍光ベース分子表現型を使用する精製を含む、請求項152〜155のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５７】
（A）前記試料を、CD34に特異的に結合する結合分子と、CD34+細胞の集団およびCD34-細胞の集団が得られる条件下で接触させ、CD34+細胞の集団を回収し、かつCD34-細胞の集団を回収する工程; ならびに
（B）CD34-細胞の集団を、CD25に特異的に結合する結合分子と、CD25+細胞の集団およびCD25-細胞の集団が得られる条件下で接触させ、CD25+細胞の集団を回収し、かつCD25-細胞の集団を回収する工程; ならびに
（C）CD25-細胞の集団を、CD45RAに特異的に結合する結合分子と、CD45RA+細胞の集団およびCD45RA-細胞の集団が得られる条件下で接触させ、CD45RA-細胞の集団を回収する工程
を含む、請求項73〜115のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５８】
工程Bが、
（i）CD34-細胞の集団を、CD1d-tet、6B11モノクローナル抗体もしくはその機能性断片、またはそれらの組み合わせと、CD1d-tet+細胞の集団、6B11+細胞の集団、またはそれらの組み合わせ、およびCD1d-tet-細胞の集団、6B11-細胞の集団、またはそれらの組み合わせが得られる条件下で接触させ、CD1d-tet+細胞の集団、6B11+細胞の集団、またはそれらの組み合わせを回収し、CD1d-tet-細胞の集団、6B11-細胞の集団、または両方を回収し、それによりiNKT枯渇細胞の集団を得ること; ならびに
（ii）iNKT枯渇細胞の集団を、CD25に特異的に結合する結合分子と、CD25+細胞の集団およびCD25-細胞の集団が得られる条件下で接触させ、CD25+細胞の集団を回収し、かつCD25-細胞の集団を回収すること
をさらに含む、請求項157記載の方法。
【請求項１５９】
工程Bが、
CD34-細胞の集団を、CD25に特異的に結合する結合分子、およびCD1d-tet、6B11モノクローナル抗体もしくはその機能性断片、またはそれらの組み合わせと、CD25+細胞の集団、およびCD1d-tet+細胞の集団、6B11+細胞、またはそれらの組み合わせ、およびCD34- CD25- iNKT枯渇細胞の集団が得られる条件下で接触させ、CD25+細胞の集団およびCD1d-tet+細胞の集団、6B11+細胞、またはそれらの組み合わせを回収し、かつCD34- CD25- iNKT枯渇細胞の集団を回収すること
を含む、請求項157記載の方法。
【請求項１６０】
工程Bが、
（i）CD34-細胞の集団を、CD25に特異的に結合する結合分子、およびCD1d-tet、6B11モノクローナル抗体もしくはその機能性断片、またはそれらの組み合わせと、CD25+細胞の集団およびCD1d-tet+細胞の集団、6B11+細胞、またはそれらの組み合わせおよびCD34- CD25- iNKT枯渇細胞の集団が得られる条件下で接触させ、CD25+細胞の集団およびCD1d-tet+細胞の集団、6B11+細胞、またはそれらの組み合わせを回収し、かつCD34- CD25- iNKT枯渇細胞の集団を回収すること; ならびに
（ii）CD25+細胞の集団およびCD1d-tet+細胞の集団、6B11+細胞、またはそれらの組み合わせの精密選別が、CD4に特異的に結合する結合分子、CD25に特異的に結合する結合分子、CD127に特異的に結合する結合分子、CD1d-tet、6B11モノクローナル抗体もしくはその機能性断片、またはそれらの任意の組み合わせと、該細胞を接触させることにより行われ、CD4+CD25+CD127-/Lo細胞、CD1d-tet+細胞、6B11+細胞、またはそれらの任意の組み合わせが富化された細胞の集団を得ること
を含む、請求項157記載の方法。
【請求項１６１】
工程（i）が、
CD34-細胞の集団を、タグを含む抗CD25抗体およびビオチン化6B11モノクローナル抗体と接触させること、および6B11-ビオチンを、コンジュゲートタグであるストレプトアビジンと接触させること
を含む、請求項160記載の方法。
【請求項１６２】
前記タグがフィコエリトリン（PE）である、請求項161記載の方法。
【請求項１６３】
ストレプトアビジンをPE/Cy7にコンジュゲートさせる、請求項161または162記載の方法。
【請求項１６４】
CD34-細胞を次いで、抗タグ磁気粒子と接触させる、請求項161〜163のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６５】
抗タグ磁気粒子が抗PE磁気粒子である、請求項164記載の方法。
【請求項１６６】
CD25+細胞と6B11+細胞が磁気選別を用いて分離される、請求項160〜165のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６７】
（ii）が、
CD25+細胞と6B11+細胞の該集団の精密分取を、CD4に特異的に結合する結合分子およびCD127に特異的に結合する結合分子と、該細胞を、CD4+CD25+CD127-/Lo細胞が富化された細胞の集団および6B11+CD127+細胞が富化された細胞の集団、またはそれらの任意の組み合わせが得られる条件下で接触させることにより行なうこと
を含む、請求項160〜166のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６８】
CD4結合分子が抗CD4 PerCP標識抗体であるか、CD127結合分子が抗CD127 APC標識抗体であるか、またはそれらの組み合わせである、請求項167記載の方法。
【請求項１６９】
精密選別が、PE標識CD25、PE/Cy7標識6B11、PerCP標識CD4、およびAPC標識CD127の蛍光活性細胞選別および検出を含む、請求項167または168記載の方法。
【請求項１７０】
工程Aで回収されたCD34+細胞の集団、工程Bで回収されたCD25+細胞の集団、または両方が、CD34+細胞、CD25+細胞、またはそれらの組み合わせを、CD34に特異的に結合する結合分子、CD127に特異的に結合する結合分子、CD45RAに特異的に結合する結合分子、またはそれらの任意の組み合わせと接触させることを含む精密選別によって、さらに加工処理される、請求項157記載の方法。
【請求項１７１】
（A）前記試料を、CD34に特異的に結合する結合分子およびCD25に特異的に結合する結合分子と、CD34+細胞の集団、CD25+細胞の集団、およびCD34- CD25-細胞の集団が得られる条件下で接触させ、CD34+細胞集団およびCD25+細胞の集団を回収し、かつCD34- CD25-細胞の集団を回収する工程; ならびに
（B）CD34- CD25-細胞の集団を、CD45RAに特異的に結合する結合分子と、CD45RA+細胞の集団およびCD45RA-細胞の集団が得られる条件下で接触させ、CD45RA-細胞の集団を回収する工程
を含む、請求項73〜115のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７２】
工程Aが、
前記試料を、CD1d-tet、6B11モノクローナル抗体もしくはその機能性断片、またはそれらの組み合わせと、CD1d-tet+細胞の集団、6B11+細胞の集団、またはそれらの組み合わせが得られる条件下で接触させ、CD1d-tet+細胞の集団、6B11+細胞の集団、またはそれらの組み合わせを回収すること
をさらに含む、請求項171記載の方法。
【請求項１７３】
工程Aで得られた細胞集団の精密選別を、CD34に特異的に結合する結合分子、CD4に特異的に結合する結合分子、CD25に特異的に結合する結合分子、CD127に特異的に結合する結合分子、CD1d-tet、またはそれらの任意の組み合わせと、該細胞を接触させることにより行ない、CD34+細胞、CD4+CD25+CD127-/Lo細胞、CD1d-tet+細胞、またはそれらの任意の組み合わせが富化された細胞の集団を得る工程
をさらに含む、請求項171または172記載の方法。
【請求項１７４】
前記試料を同時に加工処理して、HSPC、Tmem、ナイーブTreg、メモリーTregを含みかつ5%未満の望ましくない細胞型を含む細胞の富化集団を得る工程
を含む、請求項73〜115のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７５】
前記試料を、CD34に特異的に結合する結合分子、CD4に特異的に結合する結合分子、CD8に特異的に結合する結合分子、CD25に特異的に結合する結合分子、CD127に特異的に結合する結合分子、CD45RAに特異的に結合する結合分子、CD45ROに特異的に結合する結合分子、またはそれらの任意の組み合わせと接触させる、請求項174記載の方法。
【請求項１７６】
前記試料を、CD1d-tet、6B11モノクローナル抗体もしくはその機能性断片、またはそれらの組み合わせと接触させ、CD1d-tet+細胞の集団、6B11+細胞の集団、またはそれらの組み合わせを回収する工程
をさらに含む、請求項175記載の方法。
【請求項１７７】
前記試料をCD34に特異的に結合する結合分子と接触させ、CD34+細胞の集団を回収し、それによりHSPCの集団を作製する、請求項174〜176のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７８】
前記試料を、CD3に特異的に結合しかつCD45RAに特異的に結合する結合分子には結合しない結合分子、CD45ROに特異的に結合する結合分子、またはそれらの組み合わせと接触させ、CD3+ CD45RA- CD45RO+細胞の集団を回収する、請求項174〜177のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７９】
前記試料を、CD4に特異的に結合する結合分子、CD25に特異的に結合する結合分子、CD127に特異的に結合する結合分子、CD45RAに特異的に結合する結合分子、CD45ROに特異的に結合する結合分子、またはそれらの任意の組み合わせと接触させ、CD4+ CD25+ CD127-/lo CD45RA+ CD45RO-細胞の集団、CD4+ CD25+ CD127-/lo CD45RA- CD45RO+細胞の集団を回収する、請求項174〜178のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８０】
治療用細胞集団が、2%未満の通常のナイーブαβ-T細胞を含む、請求項73〜179のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８１】
CD34、Lin+ マーカー、CD25、CD45RA、CDR45RO、CD4、CD8、CD127、CD90、CD133、CD38、CD95、CD122、CXCR3、LFA-1、CD62L、CCR7、または任意の他の細胞マーカーに特異的に結合する分子が、抗体または抗体断片である、請求項73〜180のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８２】
前記抗体または抗体断片を、蛍光色素、ハプテン、または磁気粒子にカップリングさせる、請求項73〜181のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８３】
前記細胞が単離されたばかりである、請求項73〜182のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2017年3月15日に出願された米国特許仮出願第62/471,769号の35 U.S.C.§ 119（e）に基づく恩典を主張するものであり、この仮出願は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
背景
同種異系造血幹細胞移植（HSCT）は通常、免疫適合性の健常者（ドナー）由来の造血細胞を前処置レジメン後の患者に移入することを伴う。健常造血幹細胞（HSC）は、患者の損傷した造血組織と置き換わることができ、特定のドナー由来免疫細胞が、がん、感染症および免疫系疾患に対して治療効果を有し得る。しかしながら、同種異系HSCTの現在使用されている方法は、治療用でない混入細胞を含む不均一系細胞混合物または完全な移植片の潜在的治療有益性がない精製されているが限定的である細胞混合物のいずれかを含む。前者の状況において、治療上重要な細胞に混入している非治療用細胞の多くは無害であるが、特定の不良細胞型は少量集団であっても、レシピエントに重度に有害な帰結をもたらすことがあり得る。例えば、移植細胞集団に混入している残存腫瘍細胞または奇形腫幹細胞様細胞は、患者において腫瘍の種となり得る。別の例では、循環T細胞のサブセットにより、同種異系HSCTの重篤でしばしば致命的な合併症である移植片対宿主病（GVHD）が起こることがあり得る。このような場合、混入細胞によって生じる病態が、移植時に導入された他のT細胞の治療有益性より優先される。多くの場合、同種異系HSCTは、原因となっている障害に対する治癒的治療であるが、移植片の混入細胞がその新しい宿主環境に対して反応する場合、実に、医療処置自体が患者に対して有害となる。したがって、有害な細胞の数が少なく、最適な治療用細胞混合物を有する移植用HSC組成物のまだ対処されていない大きな必要性が存在している。
【発明の概要】
【０００３】
概要
いくつかの態様では、本明細書において、1回分または複数回分の単位用量の細胞移植片を含み、該細胞移植片の各単位用量が該細胞移植片を受容する対象の体重1キログラム（kg）あたりの治療用細胞集団を含む、薬学的組成物を開示する。いくつかの態様では、各単位用量の治療用細胞集団が、3×105より多くの造血幹/前駆細胞（HSPC）、3×105より多くのメモリーT細胞（Tmem）、5×105より多くの制御性T細胞（Treg）および3×105より少ない通常のナイーブαβ-T細胞を含む。いくつかの態様では、単位用量が、0.5×103〜2000×103のインバリアントナチュラルキラーT（iNKT）細胞をさらに含む。いくつかの態様では、HSPCがCD34+であり、TmemがCD3+CD45RA- CD45RO+であり、TregがCD4+CD25+CD127-/lo、CD45RA+またはそれらの組み合わせであり、通常のナイーブαβ-T細胞がCD3+CD45RA+CD25- Va24Ja18-である。いくつかの態様では、iNKTがCD3+Vα24Jα18+である。
【０００４】
いくつかの態様では、本明細書に開示の薬学的組成物が、HSPC）、メモリーT細胞（Tmem）およびTregが富化された治療用細胞集団であって、通常のナイーブαβ-T細胞が枯渇されており、1:5未満の通常のナイーブαβ-T細胞とTregの比を含む治療用細胞集団を含む。いくつかの態様では、薬学的組成物がインバリアントiNKTをさらに含み、治療用細胞集団が、100:1未満の通常のナイーブαβ-T細胞とiNKTの比を含む。いくつかの態様では、治療用細胞集団が、1:400未満である通常のナイーブαβ-T細胞とHSPCの比;および1:800未満の通常のナイーブαβ-T細胞とTmemの比を含む。いくつかの態様では、治療用細胞集団がiNKTを含み、該治療用細胞集団は、1:400未満の通常のナイーブαβ-T細胞とHSPCの比;1:800未満の通常のナイーブαβ-T細胞とTmemの比を含み; 通常のナイーブαβ-T細胞とiNKTの比が100:1未満である。いくつかの態様では、治療用細胞集団が、1:400未満の通常のナイーブαβ-T細胞とHSPCの比を含む。いくつかの態様では、治療用細胞集団が、1:3未満の通常のナイーブαβ-T細胞とTmemの比を含む。
【０００５】
いくつかの態様では、本明細書において、治療用細胞集団を、これを必要とする対象に投与することを含む、疾患または障害の処置方法であって、該治療用細胞集団が、1.0×106〜50×106細胞/kg対象体重の濃度のHSPC、0.1×106〜1000×106細胞/kg対象体重の濃度のTmem、0.1×106〜1000×106細胞/kg対象体重の濃度のTreg、および3×105より少ない細胞/kg対象体重の濃度の通常のナイーブαβ-Tを含む方法を開示する。いくつかの態様では、治療用細胞集団が、0.5×103〜2000×103細胞/kg対象体重の濃度のiNKT細胞をさらに含む。
【０００６】
いくつかの態様では、本明細書において、
（A）試料をCD34に特異的に結合する結合分子と、CD34+細胞が富化された集団およびCD34枯渇細胞の集団が得られる条件下で接触させ、CD34+細胞が富化された該集団を回収し、CD34枯渇細胞の該集団を回収すること;ならびに
（B）CD34枯渇細胞の該集団をCD25に特異的に結合する結合分子と、CD25+細胞が富化された集団およびCD25枯渇細胞の集団が得られる条件下で接触させ、CD25+細胞が富化された該集団を回収し、CD25枯渇細胞の該集団を回収すること;ならびに
（C）CD25枯渇細胞の該集団をCD45RAに特異的に結合する結合分子と、CD45RA+細胞が富化された集団およびCD45RA枯渇細胞の集団が得られる条件下で接触させ、CD45RA枯渇細胞の集団を回収すること;ならびに
（D）CD34+細胞が富化された該集団、CD25+細胞が富化された該集団およびCD45枯渇細胞の該集団を、対象に対する投与に適した薬学的組成物として製剤化すること
により、少なくとも1種類の試料を加工処理して治療用細胞集団を得ることを含む薬学的組成物の作製方法を開示する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１Ａ】図1Aは、スカルプト（sculpt）移植片細胞組成物を作製するための方法の概略図を示す。
【図１Ｂ】図1Bは、スカルプト移植片細胞組成物を作製するための方法の概略図を示す。
【図２Ａ】図2Aは、スカルプト移植片細胞組成物を作製するための方法の概略図を示す。
【図２Ｂ】図2Bは、スカルプト移植片細胞組成物を作製するための方法の概略図を示す。
【図３】図3は、スカルプト移植片細胞組成物を作製するための方法の概略図を示す。
【図４】図4は、スカルプト移植片細胞組成物を作製するための方法の概略図を示す。
【図５】図5は、スカルプト移植片細胞組成物を作製するための方法の概略図を示す。
【図６】図6は、スカルプト移植片細胞組成物を作製するための方法の概略図を示す。
【図７】図7は、スカルプト移植片細胞組成物を作製するための方法の概略図を示す。
【図８】図8は、スカルプト移植片細胞組成物を作製するための方法の概略図を示す。
【図９】図9は、スカルプト移植片細胞組成物を作製するための方法の概略図を示す。
【図１０】図10は、スカルプト移植片細胞組成物を作製するための方法の概略図を示す。
【図１１】図11は、スカルプト移植片細胞組成物を作製するための方法の概略図を示す。
【図１２】図12は、スカルプト移植片細胞組成物を作製するための方法の概略図を示す。
【図１３】図13は、スカルプト移植片細胞組成物を作製するための方法の概略図を示す。
【図１４】図14は、スカルプト移植片細胞組成物を作製するための方法の概略図を示す。
【図１５】図15は、スカルプト移植片細胞組成物を作製するための方法の概略図を示す。
【図１６】図16は、スカルプト細胞移植片のパフォーマンスを骨髄移植（BMT）組成物および造血幹細胞移植（HSCT）組成物と比較して評価するための実験計画を示す。
【図１７】図17A〜Dは、骨髄移植（BMT）組成物および造血幹細胞移植（HSCT）組成物と比較したスカルプト細胞移植片のパフォーマンスを示す。図17A：経時的な生存率パーセントのカプラン-マイヤー曲線。図17B：全生存率、再発、生着不全およびGVHDとして評価した最終転帰。図17C：HSCTマウスから切除分離した脾臓内のJ774 GPF-Luc腫瘍の例示的な顕微鏡写真。図17D：+10日目にXenogen IVIS100を用いて生成させたGFP+細胞の存在を比較した代表的な生物発光（bioluminiescent）画像。
【図１８】図18は、磁気選別（MACS）と蛍光活性化選別（FACS）を用いて作製したスカルプト細胞移植片で処置したマウスの生存率パーセントのカプラン-マイヤー曲線を、MACSのみを用いて作製したスカルプト細胞移植片と比較して示す。
【図１９】図19は、スカルプト細胞移植片を投与したマウス 対 単離後に追加輸注したT細胞を含むCD34+細胞組成物を投与したマウスの生存率を示すカプラン-マイヤー曲線を示す。
【図２０】図20は、養子移入の異種移植片モデルのマウス生存率を示すカプラン-マイヤー曲線を示し、ここで、マウスコホートには、ヒトPBMCまたはヒト組織由来スカルプト細胞移植片組成物のいずれかを投与した。
【図２１】図21A〜Bは、MACSを用いた末梢血単球（PBMC）からの制御性T細胞とiNKT細胞の富化を示す。図21Aは、選別前のPBMCおよび富化集団中のTregの純度%および収率%を示すフローサイトメトリーデータを示す。図21Bは、選別前のPBMCおよび富化集団中のiNKT細胞の純度%および収率%を示すフローサイトメトリーデータを示す。
【図２２】図22A〜Bは、磁気選別を用いたPBMCからのメモリーT細胞の富化を示す。図22Aは、PBMCの磁気選別を用いて得られたCD3+CD45RO+細胞の収率%およびナイーブT:メモリーT細胞の比を示す。図22Bは、プールPBMCおよびCD45RA枯渇試料中のCD45ROおよびCD45RA細胞を示すフローサイトメトリーデータを示す。
【図２３】図23A〜Bは、CD25+細胞の磁気分離を示す。図23Aは、磁気分離されたCD25+細胞のフローサイトメトリー解析を示し、CD25+ CD127+ Tregの効率的な分離を示し、メモリーTregおよびナイーブTreg細胞の亜集団を特性評価している。図23Bは、2例のドナー由来のTregおよびナイーブTregでの磁気分離ストラテジーの例示的なパフォーマンスを示す。
【図２４】図24A〜Bは6B11抗体のビオチン化滴定を示す。図24Aは、ゼロから1μg/μLまでの漸増濃度の6B11抗体における、3例の別々のドナーの試料に対する6B11.1、6B11.2および6B11.3ビオチン化抗体の結合を示す。図24Bは、6B11なし対照または100μM（条件1）、250μM（条件2）もしくは1 mM（条件3）のビオチンでビオチン化した6B11抗体を用いた、試料に対する6B11ビオチン/ストレプトアビジンPE-Cy7染色およびCD127 APC染色のフローサイトメトリー解析を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
詳細な説明
一部の特定の態様では、本開示により、造血幹/前駆細胞移植に有用な薬学的組成物を構成する独特な治療用細胞集団を提供する。例えば、本開示のいくつかの態様により、造血幹/前駆細胞（HSPC）、メモリーT細胞（Tmem）、制御性T細胞（Treg）の富化集団を含み、通常のナイーブαβ-T細胞が枯渇されている治療用細胞集団を提供する。いくつかの態様では、治療用細胞集団がインバリアントナチュラルキラーT（iNKT）細胞をさらに含む。さらに本開示により、該治療用細胞集団を用いた処置方法を提供する。他の態様では、本開示により治療用細胞集団の作製方法を提供する。
【０００９】
治療用細胞集団は、治療有益性を有する細胞の数を富化し、移植片レシピエントに対して有害である（例えば、二次疾患を誘導する）細胞集団を枯渇させるためにスカルプトされる。HSPCは、血液および免疫系の機能の再構築、例えば赤血球数、血小板数および好中球数の復活という短期的有益性をもたらす。HSPCの永続的生着により、T細胞集団およびB細胞集団が生じることによる適応免疫機能の再構築がもたらされる。一般集団としてのドナーT細胞は生着に対して有益でも有害でもある。Tmem細胞は、移植片対感染効果と移植片対白血病効果の両方を媒介し、移植片対宿主病（GVHD）のリスクが低いため有益性をもたらす。ナイーブおよびメモリーTreg細胞は、移植片拒絶の抑制を補助し、GVHDを抑制するため有益性をもたらす。対照的に、通常のナイーブT細胞は、GVHDおよび不適切な免疫再構築の原因となる。したがって、本明細書に開示のスカルプト移植片において通常のナイーブT細胞が低減または排除されていることにより、移植片レシピエントにおいてGVHDの発生が低減されることによって治療有益性が向上する。
【００１０】
定義
本記載において、濃度範囲、パーセンテージ範囲、比率範囲または整数範囲はいずれも、特に記載のない限り、記載の範囲内の任意の整数の値ならびに、適切な場合は、その分数（例えば、整数の10分の1および100分の1）、を含むと理解されたい。また、任意の物理的特徴、例えばポリマーのサブユニット、サイズまたは厚さに関する本明細書に記載の任意の数値範囲は、特に記載のない限り、記載の範囲内の任意の整数を含むと理解されたい。本明細書で用いる場合、用語「約」は、特に記載のない限り、標示した範囲、値または構造の±20%を意味する。用語「本質的に〜からなる」は、請求項の範囲を、明示した材料もしくは工程に、または請求項に記載の発明の基本的で新規な特徴に実質的に影響しないものに限定する。用語「a」および「an」は、本明細書で用いる場合、「1つまたは複数の」列挙された要素を示していると理解されたい。代替の（例えば、「または」）の使用は、選択肢のいずれか一方、両方、またはそれらの任意の組み合わせを意味していると理解されたい。本明細書で用いる場合、用語「〜を含む」、「〜を有する」、および「〜を含む」は同義的に用いており、これらの用語およびその変化形は、非限定的と解釈されることを意図している。
【００１１】
本明細書で用いる場合、用語「治療用細胞」は、細胞が対象に対して治療有益性をもたらす能力に基づいて対象に選択または投与される該細胞をいう。例示的な治療用細胞としては、造血幹/前駆細胞、メモリーT細胞、制御性T細胞およびインバリアントナチュラルキラーT細胞が挙げられる。治療用細胞集団は、1つより多くの型の治療用細胞、例えば、HSPC、Tmem、Treg、iNKT、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。治療用細胞集団は本質的に1つの型の治療用細胞で構成されていてもよい。治療用細胞集団との関連において、治療用細胞のパーセンテージ（%）は、治療用細胞の総数が100%までであり、特定の治療用細胞型が治療用細胞の総数の一部分である治療用細胞の組み合わせまたは組成物中に含まれている細胞型のパーセントを示す。例えば、30%のHSPCを含む治療用細胞の集団は、治療用細胞集団全体のおよそ30%がHSPCであることを示す。治療用細胞集団を、対象に対して中立的効果を有するより大きな細胞集団内に存在させてもよいが、該中立的な細胞は治療用細胞の総数の計算に含めない。
【００１２】
本明細書で用いる場合、用語「造血幹/前駆細胞」または「HSPC」は、他の型の造血細胞と比べて高レベルの表現型マーカーCD34、CD133、CD90、またはそれらの任意の組み合わせを発現している造血幹細胞および/または造血前駆細胞をいう（例えば、該細胞は、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット、または当技術分野において公知の他の方法による測定時、該表現型マーカーの発現について陽性である）。また、HSPCは、発現マーカーについて他の型の造血細胞と比べて陰性であってもよい。例えば、かかるマーカーとしては、CD19、TCRα、TCRβ、CD45RA、Lin、CD38、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。好ましくは、HSPCはCD34+細胞および/またはCD19- TCRα-である。HSPCは自己複製し得るか、あるいは（i）骨髄系前駆細胞（これは最終的に単球およびマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球/血小板もしくは樹状細胞となる）;または（ii）リンパ系前駆細胞（これは最終的にT-細胞、B-細胞、およびナチュラルキラー細胞（NK-細胞）と称されるリンパ球様細胞となる）に分化し得る。造血およびHSPCの分化の一般的な論考については、Rowe et al.Cell Stem Cell.2016.18:707-720を参照のこと。
【００１３】
本明細書で用いる場合、用語「通常のナイーブαβ-T細胞」または「ナイーブTcon」は、表現型マーカーTCRα/β、CD45RAを発現しており、中程度から高レベルのCD127（CD127+）を発現しており、CD45ROおよびCD25を発現していないか、または低発現である非抗原感作T細胞をいう。いくつかの態様では、ナイーブTconは、ナイーブTconの表現型マーカー、例えばTCRα、TCRβ、CD3、CD4またはCD8、CD62L、CCR7、CD28、CD127およびCD45RAの発現を特徴とする。いくつかの態様では、ナイーブTconがCD3+ CD25- CD45RA+であり、多型性TCRαおよび多型性TCRβを含む。いくつかの態様では、ナイーブTconは、本明細書に定義するナイーブ制御性T細胞ではない。ナイーブTcon細胞は、iNKT細胞上にみられるVα24Jα18 TCRを発現しない。
【００１４】
本明細書で用いる場合、用語「制御性T細胞」または「Treg」は、自己免疫反応を抑制する能力を有し、表現型マーカーCD4、CD25を発現し、CD127の発現を有しないか、または低発現であるT細胞のサブクラスをいう。また、TregはFOXP3も発現するが、CD127発現はCD4+CD25+細胞上のFOXP3発現と逆相関することが実証されており、CD4+CD25+CD127-/low表現型は、Tregの許容され得るサロゲートマーカーおよびFOXP3の細胞内染色の実用的代用であるとみなされる（Cozzo C,et al.J Immunol.2003 Dec 1;171:5678-82;Liu W,et al.J Exp.Med.2006.203（7）:1701-1711;Seddiki N,et al.J Exp.Med.2006;203（7）:1693-1700）。Tregには、本明細書においてナイーブTregおよびメモリーTregと称する少なくとも2つのサブクラスが含まれ得る。
【００１５】
本明細書で用いる場合、用語「ナイーブTreg」は、一次細胞としての表現型マーカーCD4、CD25およびCD45RAを発現し、CD45ROおよびCD127を発現しないか、または低発現である非抗原感作制御性T細胞である。ナイーブTregは、抗原に対する応答に関して抗原感作Tregより高い柔軟性を有するため好都合である。また、ナイーブTregは抗原感作Tregと比べて長い寿命を有する。
【００１６】
本明細書で用いる場合、用語「メモリーTreg」は、自己免疫に対して抑制効果をもたらす能力を有し、表現型マーカーCD4、CD25およびCD45ROを発現し、CD127およびCD45RAを発現しないか、または低発現である抗原感作制御性T細胞である。
【００１７】
本明細書で用いる場合、用語「メモリーT細胞」または「Tmem」は、表現型マーカーTCRα、TCRβ、CD3、CD4またはCD8、CD95およびIL-2Rβを発現する抗原感作T細胞をいう。メモリーT細胞は、免疫をもたらし、不活性な状態で長期間持続的に存在する能力を有する。メモリーT細胞は、抗原に再刺激されると速やかにエフェクター機能を獲得する能力を有する。メモリーT細胞集団は、サブクラスのセントラルメモリーT細胞（TCM）およびエフェクターメモリーT細胞（TEM）のその任意の組み合わせを含み得る。
【００１８】
本明細書で用いる場合、「セントラルメモリーT細胞」または「TCM」は、表現型マーカーCD4またはCD8、CD62L、CD45RO、CCR7、IL-2Rβ、CD28、CD127およびCD95を発現し、CD45RAを発現しないか、またはナイーブTcon細胞と比べて低発現である抗原感作T細胞をいう。セントラルメモリーT細胞は抗原再刺激後、TEM細胞に分化し得る。
【００１９】
本明細書で用いる場合、「エフェクターメモリーT細胞」または「TEM」は、表現型マーカーCD4またはCD8、CD45RO、CD127、IL-2RβおよびCD95を発現し、CD45RA、CD62L、CCR7およびCD28を発現しないか、または低発現である抗原感作T細胞をいう。エフェクターメモリーT細胞は、抗原による再刺激後、最終分化され、エフェクター機能を獲得する。
【００２０】
本明細書で用いる場合、「セントラルメモリーT幹細胞」または「TSCM」は、表現型マーカーCD4またはCD8、CD45RA、CD62L、CD95、IL-2Rβ、CCR7、CXCR3、CD122およびLFA-1を発現する抗原感作T細胞をいう。TSCM細胞は、抗原再刺激後にエフェクター機能を速やかに獲得するというメモリーT細胞の能力を有するが、向上した幹細胞様の特質、例えば、TCM細胞と比べて長期間の持続的存在を有する。TSCM細胞はセントラルメモリー、エフェクターメモリーおよびエフェクターT細胞サブセットとなり得る。
【００２１】
本明細書で用いる場合、「インバリアントナチュラルキラーT細胞」または「iNKT」は、ヒトのVα24Jα18 TCRα鎖を含む（本明細書において“Vα24Jα18+”と称する）高度に保存されたαβ-T細胞受容体を発現するCD1d拘束性ナチュラルキラーT（NKT）細胞のサブクラスである。iNKT細胞は、α-ガラクトシルセラミド（GalCer）、PBS-57、PBS-44または他の天然もしくは合成の糖脂質が負荷され、四量体、デンドリマーおよび他の構造体、Fc融合体、またはそれらの任意の組み合わせとして見出され得るようなCD1d多量体との結合によって同定され得る。別の同定方法は、Vα24Jα18領域を特異的に認識する抗体または抗体の組み合わせである。例としては、Vα24抗体、Jα18抗体、またはVα24Jα18 TCRの特有の領域に特異的に結合し、iNKT細胞を同定するために使用され得るモノクローナル抗体クローン6B11が挙げられる（Montoya et al.Immunology.2007.122（1）:1-14）。いくつかの態様では、iNKT細胞がCD1dテトリマー（tetrimer）負荷糖脂質+（CD1d-tet+）、6B11+または両方である。iNKT細胞は本明細書において互換的にCD1d-tet+、6B11+またはVα24Jα18+細胞と称され得る。特定の機構に限定されることを望まないが、iNKT細胞はTregおよびHSPCの活性を促進/加速させると考えられる。
【００２２】
本明細書において言及している場合、「系統陽性」または“Lin+”細胞は、表現型マーカー、例えばCD19、CD11c、CD66B、CD14、CD20、またはそれらの任意の組み合わせを発現する。本明細書において言及している場合、「系統陰性」または“Lin-”細胞は、表現型マーカーCD19、CD11c、CD66B、CD14、CD20、またはそれらの任意の組み合わせを発現しないか、またはHSPC、Treg、TmemもしくはiNKT細胞と比べて低発現である。Lin+細胞は、成熟赤血球系細胞、顆粒球、マクロファージ、NK細胞ならびにBおよびTリンパ球上に存在する表現型マーカーを発現する。
【００２３】
本明細書で用いる場合、「試料」は、集団細胞が単離、富化または枯渇され得る細胞源（例えば、生体組織）をいう。いくつかの態様では、試料は一般的に、事前に加工処理されていないか、または最小限の加工処理がなされている。例えば、試料は動員末梢血、動員アフェレーシス血液製剤、骨髄、臍帯血、非動員血、非動員アフェレーシス血液製剤、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。いくつかの態様では、試料が、密度勾配、Ficoll、Percoll、赤血球低浸透圧性溶解、塩化アンモニウム-カリウム（ACK）バッファーを用いて、pH平衡等張性バッファー中で洗浄して、またはそれらの任意の組み合わせで加工処理することにより調製されるか、または最小限の加工処理がなされる。いくつかの態様では、試料が1回の組織採取により得られる。いくつかの態様では、試料が1回または複数回の組織採取により得られる。
【００２４】
本明細書で用いる場合、「ドナー」は、試料を採取する1例または複数例の個体をいう。例えば、ドナーは、ヒト白血球抗原（HLA）適合兄弟姉妹、HLA適合非血縁ドナー、一部適合非血縁ドナー、ハプロタイプ一致の血縁ドナー、自己ドナー、HLA不適合同種異系ドナー、ドナープール、またはそれらの任意の組み合わせを示し得る。いくつかの態様では、ドナーが対象であり得る。「ドナー組織」は、ドナーから採取された組織をいう。ドナー組織は試料であり得る。ドナー組織は一般的に対象と同じ種である。
【００２５】
本明細書で用いる場合、「対象」または「レシピエント」は、処置、治療、または本明細書に開示の細胞移植片を受けることを必要とする1例または複数例の個体をいう。本発明によって処置され得る対象は一般にヒトである。しかしながら、さらなる対象としては、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ、マウス、ウサギ、ラットまたはモルモットが挙げられる。対象は男性/雄であっても女性/雌であってもよく、任意の適切な年齢、例えば幼児、年少者、青年期の若者、成人および老齢期の対象であり得る。処置中および処置後、対象はレシピエントまたは移植片レシピエントとなる。
【００２６】
本明細書で用いる場合、「組織採取」は、ドナーからドナー組織または試料を収集するプロセスをいう。組織採取の非限定的な例としては、骨髄、末梢血、臍帯血などをドナーから収集することが挙げられる。組織採取は、当技術分野において公知の任意の方法によって行なわれ得る。
【００２７】
本明細書で用いる場合、混合物中の細胞集団または細胞型に関する「富化された」とは、富化させる細胞型の相対量または相対比を混合物中の他の細胞（例えば、勘定される細胞型）と比べて増大させるために細胞集団が加工処理されていることを示す。したがって、富化プロセスに供される元の細胞集団の供給源にもよるが、混合物または組成物には、該混合物中の他の細胞と比べて30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%またはそれ以上（数またはカウント数が）「富化された」細胞集団が含まれ得る。いくつかの態様では、富化プロセスにより、該混合物中の他の細胞と比べて1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、50倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1,000倍、5,000倍、10,000倍またはそれ以上に「富化された」細胞集団がもたらされ得る。例えば、いくつかの態様では、iNKT細胞が富化された細胞混合物には約0.03〜1%のiNKT細胞、0.05%〜0.5%のiNKT細胞、0.1%〜1%のiNKT細胞、またはそれらの任意の組み合わせが含まれ得る。細胞集団の例示的な富化方法としては、磁気活性化細胞選別（MACS）および蛍光標示式細胞選別（FACS）が挙げられる。
【００２８】
本明細書で用いる場合、混合物中の細胞集団または細胞型に関する「枯渇された」とは、枯渇させる細胞型の相対量または相対比を混合物中の他の細胞（例えば、勘定される細胞型）と比べて減少させるために細胞集団が加工処理されていることを示す。いくつかの態様では、細胞を枯渇プロセスに供することにより、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%もしくは0.1%、0.01%、0.001%、0.0001%、0.00001%、0.000001%、0.0000001%、0.00000001%またはそれ以下に（数またはカウント数が）「枯渇された」細胞集団を含む混合物または組成物がもたらされ得る。いくつかの態様では、細胞を枯渇プロセスに供することにより、未加工処理試料と比べて10倍、100倍、1,000倍、10,000倍、100,000倍、1,000,000倍、10,000,000倍またはそれ以下に枯渇された集団を含む混合物または組成物がもたらされ得る。いくつかの態様では、枯渇された細胞型は、該細胞型を枯渇させる加工処理工程後、もはや慣用的な方法を用いて検出可能でない。
【００２９】
一部の特定の態様では、混合物中のある特定の細胞型の量が富化され、異なる細胞型の量が枯渇され、例えばCD34+細胞が富化され、一方でCD34-細胞が枯渇される。
【００３０】
マーカーについて「陽性の」細胞集団は、アイソタイプ対照でみられるレベルより上の該細胞集団の一様な染色を示す。いくつかの態様では、1種類または複数種のマーカーの発現の減少または低発現は、平均蛍光強度（MFI）の少なくとも1 log10の低下または参照対照より少なくとも1 log10小さい測定値を示す。いくつかの態様では、1種類または複数種のマーカーの発現の増大または高発現は、MFIの少なくとも1 log10の増大またはアイソタイプ対照または参照対照より少なくとも1 log10大きい測定値を示す。いくつかの態様では、参照集団と比べて少なくとも2倍のMFIの増大は細胞がマーカーの発現について陽性であることを示す。例えば、マーカーについて陽性である細胞集団は、アイソタイプ対照と比べて2倍〜4倍、4倍〜10倍、10倍〜100倍および100倍〜1,000倍、1,000倍〜10,000倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、50倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1,000倍、5,000倍、10,000倍またはそれ以上大きいMFIを示し得る。いくつかの態様では、1種類または複数種のマーカーについて陽性の細胞集団とは、参照細胞集団と比較したとき、該マーカーを示す細胞のパーセンテージが少なくとも細胞の50%、細胞の55%、細胞の60%、細胞の65%、細胞の70%、細胞の75%、細胞の80%、細胞の85%、細胞の90%、細胞の95%、および細胞の100%、ならびに50%〜100%の間の任意の%であり得ることを示す。
【００３１】
マーカーについて「陰性の」細胞集団は、アイソタイプ対照より上の特異的抗体での該細胞集団の有意な染色がないことを示す。いくつかの態様では、参照集団と比べて少なくとも2倍のMFIの減少は細胞がマーカーの発現について陰性であることを示す。例えば、マーカーについて陰性である細胞集団は、陽性対照と比べて2倍〜4倍、4倍〜10倍、10倍〜100倍および100倍〜1,000倍、1,000倍〜10,000倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、50倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1,000倍、5,000倍、10,000倍またはそれ以上小さいMFIを示し得る。いくつかの態様では、1種類または複数種のマーカーの発現の減少または低発現とは、参照細胞集団と比較したとき、集団細胞中の該マーカーを示す細胞の減少パーセンテージが少なくとも細胞の20%、細胞の25%、細胞の30%、細胞の35%、細胞の40%、細胞の45%、細胞の50%、細胞の55%、細胞の60%、細胞の65%、細胞の70%、細胞の75%、細胞の80%、細胞の85%、細胞の90%、細胞の95%、および細胞の100%、ならびに20%〜100%の間の任意の%であること示す。
【００３２】
本明細書で用いる場合、「純度パーセント」または「純度%」は、目的細胞の数に100をかけ算し、次いで、フローサイトメーター、血球計算盤、コールターカウンター、顕微鏡法または他の細胞計数法での測定時に計数された細胞の事象数でわり算したもの（目的細胞の数×100/細胞の事象数）をいう。
【００３３】
本明細書で用いる場合、「全収率パーセント」または「全収率%」は、加工処理工程後の目的細胞の数を100倍し、次いで、元の集団中の目的細胞の数でわり算したもの（加工処理工程後の目的細胞の数×100/元の集団中の目的細胞の数）をいう。「加工処理工程の収率パーセント」または「加工処理工程の収率%」は、加工処理工程後の目的細胞の数を100倍し、次いで、加工処理前の集団中の目的細胞の数でわり算したもの（加工処理工程後の目的細胞の数×100/加工処理前の集団中の目的細胞の数）をいう。
【００３４】
本明細書で用いる場合、「粗選別」は、集団細胞を富化または枯渇させる方法であって、粗選別に供される元の細胞集団の供給源にもよるが、得られる集団に、ある特定の細胞集団が出発細胞混合物と比べて少なくとも30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%またはそれより多く含まれ得る方法をいう。粗選別を行なう方法は当技術分野において周知であり、密度による分離、アフェレーシス/白血球アフェレーシス、四量体型抗体複合体媒介性の富化/枯渇、および磁気活性化細胞選別（MACS）、例えばCLINIMACS（登録商標)、PRODIGY（登録商標)、またはEASYSEP（商標)/ROBOSEP（商標)が挙げられ得る。
【００３５】
本明細書で用いる場合、「精密選別」は、集団細胞を富化または枯渇させる方法であって、得られる集団に、ある特定の細胞集団が出発細胞混合物と比べて少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%またはそれより多く含まれ得る方法をいう。精密選別を行なう方法は当技術分野において周知であり、マルチパラメータ蛍光ベース分子表現型（multi-parameter fluorescence based molecular phenotype）、例えば蛍光標示式細胞選別（FACS）およびマイクロ流路ベースの選別が挙げられ得る。精密選別を行なうさらなる方法は、例えば米国特許仮出願第62/421,979号に示されており、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【００３６】
本明細書で用いる場合、用語「結合分子」は、任意の大量数のいろいろな分子、または凝集体であり得、この用語は互換的に用いている。タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、核酸（ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド）、抗体、糖類、多糖類、脂質、受容体、試験化合物（特に、コンビナトリアルケミストリーによって作製されるものもの）が各々、または組み合わせで（それだけで、もしくは標的リガンドによって互いに結合する場合）、結合分子であり得る。
【００３７】
本明細書で用いる場合、「〜に特異的に結合する」または「〜に特異的な」は、結合分子（例えば、抗体）または結合ドメインの標的（分子または複合体）との、105 M-1（これは、この会合反応でのオフレート[koff]に対するオンレート[kon]の比である）以上の親和性またはKa（すなわち、ある特定の結合相互作用の平衡会合定数,単位は1/M）で会合または合体するが、試料中の他の分子または成分とは有意に会合または合体しないことを示す。結合分子または結合ドメインは、「高親和性」結合分子または結合ドメインまたは「低親和性」結合分子または結合ドメインと分類され得る。「高親和性」結合分子または結合ドメインは、少なくとも107 M-1、少なくとも108 M-1、少なくとも109 M-1、少なくとも1010 M-1、少なくとも1011 M-1、少なくとも1012 M-1または少なくとも1013 M-1のKaを有する結合分子または結合ドメインをいう。「低親和性」結合分子または結合ドメインは、107 M-1まで、106 M-1まで、105 M-1までのKaを有する結合分子または結合ドメインをいう。あるいはまた、親和性は、単位はMで、ある特定の結合相互作用の平衡解離定数（Kd）で規定され得る（例えば、10-5 M〜10-13 M）。
【００３８】
本明細書で用いる場合、「スカルプト細胞移植片」または「スカルプト移植片」は、指定の範囲内の数の特定の細胞型を得、望ましくない細胞型を指定の範囲まで低減または除去するために出発細胞集団から加工処理されている細胞集団をいう。範囲は、典型的には、ある特定に1つの種類の細胞の患者の体重1kgあたりの数として示しているが、移植片内の総数として表している場合もあり得る。スカルプト細胞移植片は、勘定される（accounting）細胞に対する目的細胞の天然には存在しない比または天然には存在しない表示パーセンテージを含む細胞混合物を構成し得る。
【００３９】
本明細書で用いる場合、〜の「単位用量」は、スカルプト細胞移植片を受容する対象の体重1キログラム（kg）あたりの治療用細胞集団の指定された最小数、指定された数または範囲をいう。単位用量の数は対象の体格に応じてさまざまであることは認識されよう。単位用量を対象の体重に応じて単位用量の分数量に分割してもよい。いくつかの態様では、治療用細胞集団（例えば、HPSC、Tmem、Treg、iNKTなど）が、対象に対する投与のための個々の容器内に分割され得る。
【００４０】
治療用細胞組成物
一部の特定の態様では、本開示により、造血幹/前駆細胞移植に有用な薬学的組成物を構成する独特な治療用細胞集団を提供した。治療用細胞集団は、造血幹/前駆細胞（HSPC）、メモリーT細胞（Tmem）、制御性T細胞（Treg）の富化集団を含み得、通常のナイーブαβ-T細胞が枯渇されている。いくつかの態様では、TregがナイーブTreg、メモリーTregまたは両方を含む。いくつかの態様では、TmemがセントラルメモリーT幹細胞（TSCM）、セントラルメモリーT細胞（TCM）の集団、エフェクターメモリーT細胞（TEM）の集団、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様では、該治療用集団がインバリアントナチュラルキラーT細胞（iNKT）の富化集団を含む。
【００４１】
いくつかの態様では、該治療用組成物がHSPCとTmemを含み得る。いくつかの場合では、該治療用組成物がHSPC、TmemおよびTregを含み得る。いくつかの場合では、該治療用組成物がHSPCとTregを含み得る。いくつかの場合では、該治療用組成物がHSPCとiNKT細胞を含み得る。いくつかの場合では、該治療用組成物がHSPC、Treg、TmemおよびiNKT細胞を含み得る。
【００４２】
本開示の一部の特定の態様では、HSPCがCD34+である。HSPCはさらに、または代替的にCD133+、CD90+、CD38-、CD45RA-、Lin-、またはそれらの任意の組み合わせとして記載され得る。いくつかの態様では、HSPCがCD19-、TCRα/β-またはその組み合わせである。いくつかの態様では、TregがCD25+、CD4+およびCD127-/lo細胞、またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの態様では、TregがCD4+、CD25+、CD127-/lo、FoxP3+、またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの態様では、ナイーブTregがCD4+、CD25+、CD127-/lo、FoxP3+、CD45RA+、CD45RO-、またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの態様では、メモリーTregがCD4+、CD25+、CD127-/lo、FoxP3+、CD45RA-、CD45RO+、またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの態様では、TmemがCD25-、CD45RA-細胞、またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの態様では、TmemがCD3+、CD45RA-、CD45RO+、またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの態様では、TSCMがCD45RA+およびCD4+またはCD8+である。TSCMはさらにCD95+、CD122+、CXCR3+、LFA-1+、またはそれらの任意の組み合わせとして記載され得る。いくつかの態様では、TCMがCD45RO+およびCD4+またはCD8+である。TCMはさらにCD45RA-、CD62L+、CCR7+、またはそれらの任意の組み合わせとして記載され得る。いくつかの態様では、TEMがCD4+、CD45RO+、CD45RA-、CD62L-、CCR7-、またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの態様では、iNKTがCD1d-tet+、6B11+または両方である。いくつかの態様では、iNKTがVα24Jα18+である。いくつかの態様では、iNKT細胞がCD25+、6B11+、CD4+、Vα24Jα18+、CD127dim/-細胞、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。本明細書に記載の任意の態様において、通常のナイーブαβ-T細胞はCD25-、CD45RA+、またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの態様では、通常のナイーブαβ-T細胞がTCRα/β+ CD45RA+およびCD25-、CD127+または両方であり得る。通常のナイーブαβ-T細胞はさらにTCRα+ TCRβ+ CD45RA+ CD45RO- CD25- CD95- IL-2Rβ- CD127+ Vα24Jα18-として記載され得る。
【００４３】
一部の特定の態様では、治療用細胞の濃度が、HSPCと別の細胞型の比として記載される。いくつかの態様では、HSPCとTmemの比が、500:1〜1:1,000、400:1〜1:1,000、300:1〜1:1,000、200:1〜1:1,000、100:1〜1:1,000、50:1〜1:1,000、10:1〜1:1,000、5:1〜1:1,000、4:1〜1:1,000、3:1〜1:1,000、2:1〜1:1,000、1:1〜1:1,000、500:1〜1:900、500:1〜1:800、500:1〜1:700、500:1〜1:600、500:1〜1:500、500:1〜1:400、500:1〜1:300、500:1〜1:200、500:1〜1:100、500:1〜1:50、500:1〜1:20、500:1〜1:10、500:1〜1:9、500:1〜1:8、500:1〜1:7、500:1〜1:6、500:1〜1:5、500:1〜1:4、500:1〜1:3、500:1〜1:2、500:1〜1:1、400:1〜1:900、300:1〜1:800、200:1〜1:700、100:1〜1:600、50:1〜1:500、10:1〜1:400、5:1〜1:300、4:1〜1:200、3:1〜1:100、2:1〜1:50、または1:1〜1:20の範囲を含む。
【００４４】
いくつかの態様では、HSPCとTmemの比が、10:1〜1:200、100:1〜1:2,000、または1,000:1〜1:20,000の範囲を含む。
【００４５】
HSPCとTregの比は、20:1〜1:3、100:1〜1:30、または200:1〜1:300の範囲を含み得る。HSPCとナイーブTregの比は、1:500〜100:1、1:400〜100:1、1:300〜100:1、1:200〜100:1、1:100〜100:1、1:50〜100:1、1:20〜100:1、1:10〜100:1、1:5〜100:1、1:1〜100:1、1:200〜50:1、1:200〜20:1、1:200〜10:1、1:200〜5:1、1:100〜1:1、40:1〜1:3、200:1〜1:15、または400:1〜1:150の範囲を含み得る。HSPCとメモリーTregの比は、1:500〜10,000:1、1:400〜10,000:1、1:300〜10,000:1、1:200〜10,000:1、1:100〜10,000:1、1:50〜10,000:1、1:20〜10,000:1、1:10〜10,000:1、1:5〜10,000:1、1:1〜10,000:1、1:500〜5,000:1、1:500〜1,000:1、1:500〜900:1、1:500〜800:1、1:500〜700:1、1:500〜600:1、1:500〜500:1、1:500〜400:1、1:500〜300:1、1:500〜200:1、1:500〜100:1、1:500〜50:1、1:500〜20:1、1:500〜10:1、1:500〜5:1、または1:500〜1:1の範囲を含み得る。
【００４６】
HSPCとiNKTの比は、1:2〜1,000,000:1、1:2〜500,000:1、1:1〜500,000:1、100:1〜1,000,000:1、100:1〜500,000:1、100:1〜100,000:1、500:1〜1,000,000:1、500:1〜500,000:1、500:1〜100,000:1、1,000:1〜100,000:1、1,000:1〜1,000,000:1、1,000:1〜500,000:1、1,000:1〜100,000:1、10,000:1〜1:2、100,000:1〜1:20、または1,000,000:1〜1:200の範囲を含み得る。
【００４７】
一部の特定の態様では、治療用細胞の濃度が、通常のナイーブαβ-T細胞と治療用細胞型の比として記載される。通常のナイーブαβ-T細胞とHSPCの比は1:3未満、1:50未満、1:100未満、1:200未満、1:300未満、1:400未満. 1:500未満、1:600未満、1:700未満、1:800未満、1:900未満、1:1,000未満、1:1,500未満、1:2,000未満、1:3,000未満、1:4,000未満、1:5,000未満、1:6,000未満、1:7,000未満、1:8,000未満、1:9,000未満、1:10,000未満、1:50,000未満、1:100,000未満、1:200,000未満、1:300,000未満、1:400,000未満、1:500,000未満、1:600,000未満、1:700,000未満、1:800,000未満、1:900,000未満、1:1,000,000未満であり得る。
【００４８】
通常のナイーブαβ-T細胞とTmemの比は1:30未満、1:200未満、1:300未満、1:400未満、1:500未満、1:600未満、1:700未満、1:800未満、1:900未満、1:1000未満、1:5000未満、1:10000未満、1:15000未満、1:20000未満、1:25000未満、1:30000未満、1:35000未満、1:40000未満、1:45000未満、または1:50000未満であり得る。
【００４９】
通常のナイーブαβ-T細胞とTregの比は1:1未満、1:2未満、1:3未満、1:4未満、1:5未満、1:6未満、1:7未満、1:8未満、1:9未満、1:10未満、1:15未満、1:20未満、1:30未満、1:200未満、1:300未満、1:400未満、1:500未満、1:600未満、1:700未満、1:800未満、1:900未満、1:1000未満、1:5000未満、1:10000未満、1:15000未満、1:20000未満、1:25000未満、1:30000未満、1:35000未満、1:40000未満、1:45000未満、または1:50000未満であり得る。通常のナイーブαβ-T細胞とナイーブTregの比は1:1未満、1:2未満、1:3未満、1:4未満、1:5未満、1:6未満、1:7未満、1:8未満、1:9未満、1:10未満、1:15未満、1:20未満、1:30未満、1:200未満、1:300未満、1:400未満、1:500未満、1:600未満、1:700未満、1:800未満、1:900未満、1:1000未満、1:5000未満、1:10000未満、1:15000未満、1:20000未満、1:25000未満、1:30000未満、1:35000未満、1:40000未満、1:45000未満、または1:50000未満であり得る。通常のナイーブαβ-T細胞とメモリーTregの比は1:1未満、1:2未満、1:3未満、1:4未満、1:5未満、1:6未満、1:7未満、1:8未満、1:9未満、1:10未満、1:15未満、1:20未満、1:30未満、1:200未満、1:300未満、1:400未満、1:500未満、1:600未満、1:700未満、1:800未満、1:900未満、1:1000未満、1:5000未満、1:10000未満、1:15000未満、1:20000未満、1:25000未満、1:30000未満、1:35000未満、1:40000未満、1:45000未満、または1:50000未満であり得る。
【００５０】
通常のナイーブαβ-T細胞とiNKTの比は100:1未満、1:1未満、1:2未満、1:3未満、1:4未満、1:5未満、1:6未満、1:7未満、1:8未満、1:9未満、1:10未満、1:15未満、1:20未満、1:30未満、1:200未満、1:300未満、1:400未満、1:500未満、1:600未満、1:700未満、1:800未満、1:900未満、1:1000未満、1:5000未満、1:10000未満、1:15000未満、1:20000未満、1:25000未満、1:30000未満、1:35000未満、1:40000未満、1:45000未満、1:50000未満であり得る。
【００５１】
本開示のいくつかの態様では、TmemとTregの比が初期細胞濃度に依存しない（例えば、初期濃度から実質的に変更される）。これにより、Tmemの濃度をTregの濃度に関係なく制御（例えば、用量漸増）できるため利点がもたらされる。TmemとTregの比は30:1〜1:1、25:1〜1:1、20:1〜1:1、15:1〜1:1、10:1〜1:1、9:1〜1:1、8:1〜1:1、7:1〜1:1、6:1〜1:1、5:1〜1:1、4:1〜1:1、3:1〜1:1、2:1〜1:1であり得る。一部の特定の態様では、TmemとTregの比が1:1〜200:1、1:10〜2000:1、または1:100〜20,000:1であり得る。TmemとナイーブTregの比は5:1〜1:10、3:1〜1:10、3:1〜1:10、2:1〜1:10、または1:1〜1:10であり得る。TmemとメモリーTregの比は27:1〜0.9:1、30:1〜1:10、25:1〜1:10、20:1〜1:10、15:1〜1:10、10:1〜1:10、30:1〜1:9、30:1〜1:8、30:1〜1:7、30:1〜1:6、30:1〜1:5、30:1〜1:4、30:1〜1:3、30:1〜1:2、または30:1〜1:1であり得る。
【００５２】
本開示のいくつかの態様では、TregとiNKTの比が20,000:1〜1:5、200,000:1〜1:50、または2,000,000:1〜1:500であり得る。
【００５３】
本開示のいくつかの態様では、iNKTとTmemの比が2:1〜1:100,000、5:1〜1:1,000,000、または10:1〜1:10,000,000であり得る。
【００５４】
いくつかの態様では、組成物中の通常のナイーブaβ-T細胞の数がHSPCの数の約2%、5%、7%、10%、12%、15%、17%、20%、25%、27%、30%、32%または35%未満であり得る。いくつかの態様では、組成物中の通常のナイーブaβ-T細胞の数がHSPCの数の約2%、5%、7%、10%、12%、15%、17%、20%、25%、27%、30%、32%または35%であり得る。いくつかの態様では、組成物中の通常のナイーブaβ-T細胞の数がHSPCの数の約2%〜約7%、約2%〜約10%、約2%〜約15%、約2%〜約20%、約2%〜約25%、約2%〜約30%、約2%〜約35%、約7%〜約10%、約7%〜約15%、約7%〜約20%、約7%〜約25%、約7%〜約30%、約7%〜約35%、約10%〜約15%、約10%〜約20%、約10%〜約25%、約10%〜約30%、約10%〜約35%、約15%〜約20%、約15%〜約25%、約15%〜約30%、約15%〜約35%、約20%〜約25%、約20%〜約30%、約20%〜約35%、約25%〜約30%、約25%〜約35%または約30%〜約35%であり得る。
【００５５】
いくつかの態様では、組成物中の通常のナイーブaβ-T細胞の数がTmem細胞の数の約0.1%、1%、2%、5%、7%、10%、12%、15%、17%、20%、22%または25%未満であり得る。いくつかの態様では、組成物中の通常のナイーブaβ-T細胞の数が最大約20%であり得る。いくつかの態様では、組成物中の通常のナイーブaβ-T細胞の数がTmem細胞の数の約0.1%〜約2%、約0.1%〜約5%、約0.1%〜約10%、約0.1%〜約15%、約0.1%〜約20%、約2%〜約5%、約2%〜約10%、約2%〜約15%、約2%〜約20%、約5%〜約10%、約5%〜約15%、約5%〜約20%、約10%〜約15%、約10%〜約20%または約15%〜約20%であり得る。
【００５６】
いくつかの態様では、組成物中の通常のナイーブaβ-T細胞の数がTreg細胞の数の約0.05%、0.5%、1%、2%、5%、7%、10%、12%、15%、17%、20%、22%、25%または30%未満であり得る。いくつかの態様では、組成物中の通常のナイーブaβ-T細胞の数がTreg細胞の数の約0.05%〜約1%、約0.05%〜約5%、約0.05%〜約10%、約0.05%〜約15%、約0.05%〜約20%、約0.05%〜約30%、約1%〜約5%、約1%〜約10%、約1%〜約15%、約1%〜約20%、約1%〜約30%、約5%〜約10%、約5%〜約15%、約5%〜約20%、約5%〜約30%、約10%〜約15%、約10%〜約20%、約10%〜約30%、約15%〜約20%、約15%〜約30%または約20%〜約30%であり得る。
【００５７】
いくつかの態様では、組成物中の通常のナイーブaβ-T細胞の数がiNKT細胞の数の約1%、10%、20%、50%、70%、80%または90%未満であり得る。いくつかの態様では、組成物中の通常のナイーブaβ-T細胞の数がiNKT細胞の数の約1%〜約10%、約1%〜約20%、約1%〜約50%、約1%〜約70%、約1%〜約80%、約1%〜約90%、約10%〜約20%、約10%〜約50%、約10%〜約70%、約10%〜約80%、約10%〜約90%、約20%〜約50%、約20%〜約70%、約20%〜約80%、約20%〜約90%、約50%〜約70%、約50%〜約80%、約50%〜約90%、約70%〜約80%、約70%〜約90%または約80%〜約90%であり得る。
【００５８】
一部の特定の態様では、治療用細胞集団が10%〜65%のHSPCを含む。一部の特定の態様では、治療用細胞集団が2%〜20%のTregを含む。一部の特定の態様では、治療用細胞集団が25%〜90%のTmemを含む。一部の特定の態様では、治療用細胞集団に含まれる通常のナイーブαβ-T細胞が2%未満である。一部の特定の態様では、治療用細胞集団が:10%〜65%のHSPC;2%〜20%のTreg;25%〜90%のTmem;および2%未満の通常のナイーブαβ-T細胞を含む。いくつかの態様では、Tregの集団が、2%〜5%、2%〜10%、2%〜20%、2%〜30%、2%〜40%、2%〜50%、5%〜10%、5%〜20%、5%〜30%、5%〜40%、5%〜50%、10%〜20%、10%〜30%、10%〜40%、10%〜50%、15%〜20%、15%〜30%、15%〜40%または15%〜50%のナイーブTregを含む。いくつかの態様では、Tregの集団が75%〜95%のメモリーTregを含む。いくつかの態様では、ナイーブT細胞の集団が0.1%〜10%のTSCMを含む。いくつかの態様では、Tmemの集団が0%〜99%のTCMを含む。いくつかの態様では、Tmemの集団が0%〜99%のTEMを含む。一部の特定の態様では、該集団が、0.01%〜5%、0.05%〜5%、0.1%〜5%、0.5%〜5%、1%〜5%、0.01%〜1.5%、0.05%〜1.5%、0.1%〜1.5%、0.5%〜1.5%または1%〜1.5%のiNKTをさらに含む。
【００５９】
本明細書に開示の任意の態様において、該細胞集団は、1回または複数回の組織採取による試料を加工処理することによって得られ得る。いくつかの態様では、試料または組織採取は1例のドナーに由来する。該1回または複数回の組織採取は1例または複数例のドナーからであり得る。例えば、組織採取は、HLA適合兄弟姉妹ドナー、HLA適合非血縁ドナー、一部適合非血縁ドナー、ハプロタイプ一致の血縁ドナー、自己ドナー、完全HLA不適合同種異系ドナー、ドナープール、またはそれらの任意の組み合わせからであり得る。
【００６０】
本明細書に開示の任意の態様において、該細胞集団は、対象に対する投与のための製剤であり得る。いくつかの場合では、細胞集団が賦形剤を用いて製剤化され得る。いくつかの態様では、該細胞が輸注または注射用に製剤化される。賦形剤はNormosol-Rおよびヒト血清を含み得る。ヒト血清は製剤全体の0.2%であり得る。ヒト血清は製剤全体の0.5%であり得る。ヒト血清は製剤全体の1%であり得る。ヒト血清は製剤全体の2%であり得る。また、製剤にはpHバッファー、例えば0.1 mM〜100 mMのリン酸塩 pH 6.0〜9.0、0.1〜100 mM HEPES pH 6.0〜9.0、0.1 mM〜100 mMの重炭酸塩 pH 6.0〜9.0、0.1 mM〜100 mMのクエン酸塩 pH 6.0〜9.0、0.1〜100 mMの酢酸塩 pH 4.0〜8.0、またはそれらの任意の組み合わせが含められ得る。製剤には電解質、例えば5 mM〜400 mMのNaCl、0.5 mM〜50 mMのKCl、0.05 mM〜50 mMのCaCl2、0.05 mM〜50 mMのMgCl2、0.05 mM〜50 mMのLiCl2、0.05 mM〜50 mMのMnCl2、またはそれらの任意の組み合わせが含められ得る。製剤にはエネルギー源、例えば0.1 mM〜100 mMのグルコース、0.1 mM〜100 mMのピルベート、0.1 mM〜100 mMのフルクトース、0.1〜100 mMのスクロース、0.1〜50 mMのグリセロール、0.1 mM〜100 mMのグルコノラクトン、0.1〜100 mMのグルコネート、またはそれらの任意の組み合わせが含められ得る。製剤には酸化防止剤、例えば0.05〜10 mMのグルタチオン（還元型）、0.05〜10 mMのグルタチオン（酸化型）、0.001 mM〜10 mMのβ-メルカプトエタノール、0.001 mM〜10 mMのジチオトレイトール、0.01〜100 mMのアスコルベート、0.001〜10 mMのトリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン、またはそれらの任意の組み合わせが含められ得る。製剤には安定剤、例えば0.01%〜10%のヒト血清アルブミン、0.01%〜10%のウシ血清アルブミン、0.1%〜99%のヒト血清、0.1%〜99%のウシ胎仔血清、0.01%〜10%のIgG、0.1%〜10%のイムノグロビン（immunoglobin）、0.06%〜60%のトレハロース、もしくは0.1%〜20%のポリエチレングリココール（glycocol）（MW 200〜20,000,000）などの重合体分子、またはそれらの任意の組み合わせが含められ得る。
【００６１】
本明細書に開示のいくつかの態様では、該細胞集団は、対象の体重に基づいて該対象に対する投与のために製剤化される（例えば、細胞数/kg対象体重）。該細胞集団は薬学的組成物として製剤化され得る。いくつかの態様では、薬学的組成物が、単位用量の細胞移植片（例えば、該細胞集団）を含み、該細胞移植片の各単位用量は、該細胞移植片を受容する対象の体重1キログラム（kg）あたりの治療用細胞集団を含む。いくつかの態様では、該集団または単位用量の細胞が対象1kgにつき約1×106 HSPC〜約20×106 HSPCを含む。いくつかの態様では、該集団または単位用量の細胞が対象1kgにつき少なくとも約1×106 HSPCを含む。いくつかの態様では、該集団または単位用量の細胞が対象1kgにつき最大約20×106 HSPCを含む。いくつかの態様では、該集団または単位用量が、約0.5×106〜50×106、1.0×106〜20×106または2.0×106〜10×106細胞/kg対象体重の範囲のHSPC細胞を含む。
【００６２】
いくつかの態様では、該集団または単位用量の細胞が対象1kgにつき約1×106 HSPC〜約2×106 HSPC、約1×106 HSPC〜約5×106 HSPC、約1×106 HSPC〜約7×106 HSPC、約1×106 HSPC〜約10×106 HSPC、約1×106 HSPC〜約15×106 HSPC、約1×106 HSPC〜約20×106 HSPC、約2×106 HSPC〜約5×106 HSPC、約2×106 HSPC〜約7×106 HSPC、約2×106 HSPC〜約10×106 HSPC、約2×106 HSPC〜約15×106 HSPC、約2×106 HSPC〜約20×106 HSPC、約5×106 HSPC〜約7×106 HSPC、約5×106 HSPC〜約10×106 HSPC、約5×106 HSPC〜約15×106 HSPC、約5×106 HSPC〜約20×106 HSPC、約7×106 HSPC〜約10×106 HSPC、約7×106 HSPC〜約15×106 HSPC、約7×106 HSPC〜約20×106 HSPC、約10×106 HSPC〜約15×106 HSPC、約10×106 HSPC〜約20×106 HSPCまたは約15×106 HSPC〜約20×106 HSPCを含む。いくつかの態様では、該細胞集団が対象1kgにつき約1×106 HSPC、約2×106 HSPC、約5×106 HSPC、約7×106 HSPC、約10×106 HSPC、約15×106 HSPCまたは約20×106 HSPCを含む。
【００６３】
いくつかの態様では、該集団または単位用量の細胞が対象1kgにつき約1×106 Tmem細胞〜約100×106 Tmem細胞を含む。いくつかの態様では、該集団または単位用量の細胞が対象1kgにつき少なくとも約1×106 Tmem細胞を含む。いくつかの態様では、該集団または単位用量の細胞が対象1kgにつき最大約100×106 Tmem細胞を含む。いくつかの態様では、該集団または単位用量の細胞が対象1kgにつき約1×106 Tmem細胞〜約10×106 Tmem細胞、約1×106 Tmem細胞〜約20×106 Tmem細胞、約1×106 Tmem細胞〜約50×106 Tmem細胞、約1×106 Tmem細胞〜約75×106 Tmem細胞、約1×106 Tmem細胞〜約100×106 Tmem細胞、約10×106 Tmem細胞〜約20×106 Tmem細胞、約10×106 Tmem細胞〜約50×106 Tmem細胞、約10×106 Tmem細胞〜約75×106 Tmem細胞、約10×106 Tmem細胞〜約100×106 Tmem細胞、約20×106 Tmem細胞〜約50×106 Tmem細胞、約20×106 Tmem細胞〜約75×106 Tmem細胞、約20×106 Tmem細胞〜約100×106 Tmem細胞、約50×106 Tmem細胞〜約75×106 Tmem細胞、約50×106 Tmem細胞〜約100×106 Tmem細胞または約75×106 Tmem細胞〜約100×106 Tmem細胞を含む。いくつかの態様では、該集団または単位用量の細胞が対象1kgにつき約1×106 Tmem細胞、約10×106 Tmem細胞、約20×106 Tmem細胞、約50×106 Tmem細胞、約75×106 Tmem細胞または約100×106 Tmem細胞を含む。
【００６４】
いくつかの態様では、該集団または単位用量の細胞が対象1kgにつき約0.5×106 Treg細胞〜約2.5×106 Treg細胞を含む。いくつかの態様では、該集団または単位用量の細胞が対象1kgにつき少なくとも約0.5×106 Treg細胞を含む。いくつかの態様では、該集団または単位用量の細胞が対象1kgにつき最大約2.5×106 Treg細胞を含む。いくつかの態様では、該集団または単位用量の細胞が対象1kgにつき約0.5×106 Treg細胞〜約1×106 Treg細胞、約0.5×106 Treg細胞〜約1.5×106 Treg細胞、約0.5×106 Treg細胞〜約2×106 Treg細胞、約0.5×106 Treg細胞〜約2.5×106 Treg細胞、約1×106 Treg細胞〜約1.5×106 Treg細胞、約1×106 Treg細胞〜約2×106 Treg細胞、約1×106 Treg細胞〜約2.5×106 Treg細胞、約1.5×106 Treg細胞〜約2×106 Treg細胞、約1.5×106 Treg細胞〜約2.5×106 Treg細胞または約2×106 Treg細胞〜約2.5×106 Treg細胞を含む。いくつかの態様では、該集団または単位用量の細胞が対象1kgにつき約0.5×106 Treg細胞、約1×106 Treg細胞、約1.5×106 Treg細胞、約2×106 Treg細胞または約2.5×106 Treg細胞を含む。いくつかの態様では、該集団または単位用量の細胞が約0.1×106〜約500×106、約0.2×106〜約500×106、約0.3×106〜約500×106、約0.4×106〜約500×106、約0.5×106〜約500×106、約0.6×106〜約500×106、約0.7×106〜約500×106、約0.8×106〜約500×106、約0.9×106〜約500×106または約1×106〜約500×106細胞/kg対象体重の範囲のナイーブTregを含む。いくつかの態様では、該集団または単位用量の細胞が0.005×106〜500×106細胞/kg対象体重の範囲のメモリーTregを含む。
【００６５】
いくつかの態様では、該集団または単位用量の細胞が0.5×103〜2000×103細胞/kg対象体重、0.5×103〜1×107細胞/kg対象体重または1.0×104〜2.5×106細胞/kg対象体重の範囲のiNKT細胞を含む。いくつかの態様では、該集団または単位用量の細胞が対象1kgにつき約0.01×106 iNKT細胞〜約3×106 iNKT細胞を含む。いくつかの態様では、該集団または単位用量の細胞が対象1kgにつき少なくとも約0.01×106 iNKT細胞を含む。いくつかの態様では、該集団または単位用量の細胞が対象1kgにつき最大約3×106 iNKT細胞を含む。いくつかの態様では、該集団または単位用量の細胞が対象1kgにつき約0.01×106 iNKT細胞〜約0.1×106 iNKT細胞、約0.01×106 iNKT細胞〜約1×106 iNKT細胞、約0.01×106 iNKT細胞〜約1.5×106 iNKT細胞、約0.01×106 iNKT細胞〜約2×106 iNKT細胞、約0.01×106 iNKT細胞〜約3×106 iNKT細胞、約0.1×106 iNKT細胞〜約1×106 iNKT細胞、約0.1×106 iNKT細胞〜約1.5×106 iNKT細胞、約0.1×106 iNKT細胞〜約2×106 iNKT細胞、約0.1×106 iNKT細胞〜約3×106 iNKT細胞、約1×106 iNKT細胞〜約1.5×106 iNKT細胞、約1×106 iNKT細胞〜約2×106 iNKT細胞、約1×106 iNKT細胞〜約3×106 iNKT細胞、約1.5×106 iNKT細胞〜約2×106 iNKT細胞、約1.5×106 iNKT細胞〜約3×106 iNKT細胞または約2×106 iNKT細胞〜約3×106 iNKT細胞を含む。いくつかの態様では、該集団または単位用量の細胞が対象1kgにつき約0.01×106 iNKT細胞、約0.1×106 iNKT細胞、約1×106 iNKT細胞、約1.5×106 iNKT細胞、約2×106 iNKT細胞または約3×106 iNKT細胞を含む。
【００６６】
いくつかの態様では、該集団または単位用量の細胞が1×106細胞/kg対象体重より少ない範囲の通常のナイーブαβ-T細胞を含む。いくつかの態様では、該集団または単位用量の細胞が3×105細胞/kg対象体重より少ない範囲の通常のナイーブαβ-T細胞を含む。いくつかの態様では、該集団または単位用量の細胞が7.5×104細胞/kg対象体重より少ない、5×104細胞/kgより少ない、1×104細胞/kgより少ない、0.5×104細胞/kgより少ない、または1×103細胞/kg対象体重より少ない範囲の通常のナイーブαβ-T細胞を含む。
【００６７】
いくつかの態様では、各単位用量の治療用細胞集団が、1.0×106〜50×106の造血幹/前駆細胞（HSPC）、0.1×106〜1000×106のメモリーT細胞（Tmem）、0.1×106〜1000×106の制御性T細胞（Treg）および3×105より少ない通常のナイーブαβ-Tを含む。いくつかの態様では、各単位用量の治療用細胞集団が、3.0×106〜50×106の造血幹/前駆細胞（HSPC）、0.3×106〜1000×106のメモリーT細胞（Tmem）、0.5×106〜1000×106の制御性T細胞（Treg）および3×105より少ない通常のナイーブαβ-Tを含む。いくつかの態様では、各単位用量の治療用細胞集団が、1.0×106〜50×106の造血幹/前駆細胞（HSPC）、0.3×106〜1000×106のメモリーT細胞（Tmem）、0.5×106〜1000×106の制御性T細胞（Treg）および3×105より少ない通常のナイーブαβ-Tを含む。
【００６８】
本明細書に開示の任意の1つの態様において、HSPCは対象とハプロタイプが一致しているドナーによって提供され得る。いくつかの態様では、Treg、Tmem、iNKT、またはそれらの任意の組み合わせが、HLA適合兄弟姉妹ドナーまたはHLA適合非血縁ドナーまたは一部適合HLA非血縁ドナーであるドナーによって提供される。いくつかの態様では、HSPCが、該対象とハプロタイプが一致しているドナーによって提供され、Treg、Tmem、iNKT、またはそれらの任意の組み合わせが、HLA適合兄弟姉妹ドナーまたはHLA適合非血縁ドナーであるドナーによって提供される。
【００６９】
処置方法
本開示により、疾患、病状または障害を有する対象において細胞移植片療法を行なう方法であって:本明細書に記載の任意の治療用細胞移植片組成物を該対象に投与することを含む方法を提供する。例えば、細胞を含む治療用組成物は、これを必要とする対象に輸注され得る。
【００７０】
処置され得る対象としては、白血病、リンパ腫、慢性感染、または自己免疫疾患、悪性もしくは非悪性の血液疾患、AML、ALL、CML、CLL、多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、MDS、リンパ増殖性疾患、1型糖尿病、先天性代謝異常、遺伝性疾患、重症複合免疫不全、鎌状赤血球貧血、β-サラセミア、多発性硬化症、実質臓器移植、クローン病、潰瘍性大腸炎、狼瘡、血球貪食性リンパ組織球症、糖原病、乳がん、他の充実性腫瘍、白質ジストロフィ、ムコ多糖症、またはHSPC移植の恩恵を受けるであろう任意の他の疾患に苦しんでいる対象が挙げられる。いくつかの態様では、対象が、再発のALLもしくはAMLまたは芽球が10%より少ない原発性難治性ALLもしくはAMLに苦しんでいる。いくつかの態様では、対象が≧CR1または微小残存病変陽性の高リスクのAMLに苦しんでいる。いくつかの態様では、対象が>=CR1または微小残存病変陽性の高リスクのALLに苦しんでいる。いくつかの態様では、対象が高リスクのCMLに苦しんでいる。いくつかの態様では、対象が高リスクの骨髄増殖性障害に苦しんでいる。いくつかの態様では、対象が、治療に応答性の再発非ホジキンリンパ腫に苦しんでいる。いくつかの態様では、対象が、移植時に芽球が10%より少ない芽球数を有するMDSに苦しんでいる。一部の特定の態様では、対象が、以下の特徴:年齢18〜65、カルノフスキースコア≧60またはECOG≦2、HCT-併存症指数≦4、クレアチニン＜1.5 mg/dL、心臓駆出分＞45%、DLCO補正値＞予測値の60%、総ビリルビン＜正常値上限（ULN）の3倍（ジルベール症候群のためでない限り）、ASTおよびALT＜ULNの3倍、妊娠または授乳期でない、HIV陰性、ならびに余命を＜6ヶ月に制限し得る併存疾患なしのうちの1つまたは複数を有する。一部の特定の態様では、対象が、以下の特徴:患者年齢0〜3、3〜6、6〜12、12〜14、12〜18、18〜65、65〜70、70〜75、75〜80、80〜90またはそれ以上、またはその間の任意の範囲、カルノフスキースコア≧60もしくは≧80、またはECOG≦2、HCT-併存症指数≦4、クレアチニン＜1.5 mg/dL、心臓駆出分＞45%、DLCO補正値＞予測値の60%、総ビリルビン＜上限の3倍または＜正常値上限（ULN）の1.5倍（ジルベール症候群のためでない限り）、ASTおよびALT＜ULNの3倍または＜1.5倍、妊娠または授乳期でない、HIV陰性、ならびに余命を＜6ヶ月に制限し得る併存疾患なしのうちの1つまたは複数を有する。
【００７１】
本明細書に記載の治療用細胞組成物は従来のHCTの代わりに投与することができる。例示的な治療用細胞組成物は強度減弱前処置（RIC）および骨髄破壊的（MA）レジメンと適合性である。GVHDのリスクが低いため、MA前処置は一部の患者に対して、特に、原因となっている悪性腫瘍を有する患者に対してRICの代わりに使用され得る。本明細書に開示の治療用細胞組成物はGVHDが少ないため、GVHDのリスクが同種反応性より勝り、現在、自己移植が臨床使用されている多発性骨髄腫の場合に同種反応性が有益であり得る。非悪性の病状は、免疫再構築の増大、したがって、低感染率および高生着率および永続的キメリズムの恩恵を受ける可能性が高い。
【００７２】
本明細書に記載の治療用細胞組成物は対象に、公知の手法または当業者明らかなその変形法に従って投与される。
【００７３】
「有効量」または「治療有効量」は、対象（例えば、ヒト）に投与したときに疾患の処置が補助されるのに充分な、本明細書に記載の組成物の量をいう。「治療有効量」を構成する組成物の量は、細胞調製物、病状およびその重症度、投与様式ならびに処置される対象の年齢に応じてさまざまであるが、当業者は自身の知識と本開示内容を考慮して常套的に決定することができよう。単独で投与される個々の活性成分または組成物に言及している場合、治療有効用量は該成分または組成物単独をいう。組み合わせたものに言及している場合、治療有効用量は、連続投与であれ並行投与であれ同時投与であれ、治療効果をもたらす活性成分、組成物または両方の合算量をいう。
【００７４】
いくつかの態様では、HSPC細胞がCD34+細胞1.0×106〜50×106細胞/kg対象体重、1.0×106〜20×106細胞/kg対象体重、または2.0×106〜10×106細胞/kg対象体重の濃度で投与される。いくつかの態様では、HSPC細胞が対象1kgにつき約1×106 HSPC〜約20×106 HSPCの濃度で投与される。いくつかの態様では、HSPC細胞が対象1kgにつき少なくとも約1×106 HSPCの濃度で投与される。いくつかの態様では、HSPC細胞が対象1kgにつき最大約20×106 HSPCの濃度で投与される。いくつかの態様では、HSPC細胞が対象1kgにつき約1×106 HSPC〜約2×106 HSPC、約1×106 HSPC〜約5×106 HSPC、約1×106 HSPC〜約7×106 HSPC、約1×106 HSPC〜約10×106 HSPC、約1×106 HSPC〜約15×106 HSPC、約1×106 HSPC〜約20×106 HSPC、約2×106 HSPC〜約5×106 HSPC、約2×106 HSPC〜約7×106 HSPC、約2×106 HSPC〜約10×106 HSPC、約2×106 HSPC〜約15×106 HSPC、約2×106 HSPC〜約20×106 HSPC、約5×106 HSPC〜約7×106 HSPC、約5×106 HSPC〜約10×106 HSPC、約5×106 HSPC〜約15×106 HSPC、約5×106 HSPC〜約20×106 HSPC、約7×106 HSPC〜約10×106 HSPC、約7×106 HSPC〜約15×106 HSPC、約7×106 HSPC〜約20×106 HSPC、約10×106 HSPC〜約15×106 HSPC、約10×106 HSPC〜約20×106 HSPCまたは約15×106 HSPC〜約20×106 HSPCの濃度で投与される。いくつかの態様では、HSPC細胞が対象1kgにつき約1×106 HSPC、約2×106 HSPC、約5×106 HSPC、約7×106 HSPC、約10×106 HSPC、約15×106 HSPCまたは約20×106 HSPCの濃度で投与される。
【００７５】
いくつかの態様では、Tmemが0.1×106〜1000×106細胞/kg対象体重、1.0×106〜250×106細胞/kg対象体重、または2.9×106〜10.1×106細胞/kg対象体重、10.1×106〜30.1×106細胞/kg対象体重、30.1×106〜101×106細胞/kg対象体重、1.0×106〜100×106細胞/kg対象体重の濃度で投与される。いくつかの態様では、Tmem細胞が対象1kgにつき約1×106 Tmem細胞〜約100×106 Tmem細胞の濃度で投与される。いくつかの態様では、Tmem細胞が対象1kgにつき少なくとも約1×106 Tmem細胞の濃度で投与される。いくつかの態様では、Tmem細胞が対象1kgにつき最大約100×106 Tmem細胞の濃度で投与される。いくつかの態様では、Tmem細胞が対象1kgにつき約1×106 Tmem細胞〜約10×106 Tmem細胞、約1×106 Tmem細胞〜約20×106 Tmem細胞、約1×106 Tmem細胞〜約50×106 Tmem細胞、約1×106 Tmem細胞〜約75×106 Tmem細胞、約1×106 Tmem細胞〜約100×106 Tmem細胞、約10×106 Tmem細胞〜約20×106 Tmem細胞、約10×106 Tmem細胞〜約50×106 Tmem細胞、約10×106 Tmem細胞〜約75×106 Tmem細胞、約10×106 Tmem細胞〜約100×106 Tmem細胞、約20×106 Tmem細胞〜約50×106 Tmem細胞、約20×106 Tmem細胞〜約75×106 Tmem細胞、約20×106 Tmem細胞〜約100×106 Tmem細胞、約50×106 Tmem細胞〜約75×106 Tmem細胞、約50×106 Tmem細胞〜約100×106 Tmem細胞または約75×106 Tmem細胞〜約100×106 Tmem細胞の濃度で投与される。いくつかの態様では、Tmem細胞が対象1kgにつき約1×106 Tmem細胞、約10×106 Tmem細胞、約20×106 Tmem細胞、約50×106 Tmem細胞、約75×106 Tmem細胞または約100×106 Tmem細胞の濃度で投与される。
【００７６】
いくつかの態様では、Tregが0.1×106〜1000×106細胞/kg対象体重、0.1×106〜5×106細胞/kg対象体重、または0.5×106〜2.5×106細胞/kg対象体重の濃度で投与される。いくつかの態様では、Tregが対象1kgにつき約0.5×106 Treg細胞〜約2.5×106 Treg細胞の濃度で投与される。いくつかの態様では、Tregが対象1kgにつき少なくとも約0.5×106 Treg細胞の濃度で投与される。いくつかの態様では、Tregが対象1kgにつき最大約2.5×106 Treg細胞の濃度で投与される。いくつかの態様では、Tregが対象1kgにつき約0.5×106 Treg細胞〜約1×106 Treg細胞、約0.5×106 Treg細胞〜約1.5×106 Treg細胞、約0.5×106 Treg細胞〜約2×106 Treg細胞、約0.5×106 Treg細胞〜約2.5×106 Treg細胞、約1×106 Treg細胞〜約1.5×106 Treg細胞、約1×106 Treg細胞〜約2×106 Treg細胞、約1×106 Treg細胞〜約2.5×106 Treg細胞、約1.5×106 Treg細胞〜約2×106 Treg細胞、約1.5×106 Treg細胞〜約2.5×106 Treg細胞または約2×106 Treg細胞〜約2.5×106 Treg細胞の濃度で投与される。いくつかの態様では、Tregが対象1kgにつき約0.5×106 Treg細胞、約1×106 Treg細胞、約1.5×106 Treg細胞、約2×106 Treg細胞または約2.5×106 Treg細胞の濃度で投与される。
【００７７】
いくつかの態様では、ナイーブTregが約0.1×106〜約500×106、約0.2×106〜約500×106、約0.3×106〜約500×106、約0.4×106〜約500×106、約0.5×106〜約500×106、約0.6×106〜約500×106、約0.7×106〜約500×106、約0.8×106〜約500×106、約0.9×106〜約500×106または約1×106〜約500×106細胞/kg対象体重の濃度で投与される
【００７８】
いくつかの態様では、メモリーTregが0.005×106〜500×106細胞/kg対象体重の濃度で投与される。
【００７９】
いくつかの態様では、iNKT細胞が0.5×102〜2000×103細胞/kg対象体重、0.5×102〜1×104細胞/kg対象体重、0.5×103〜1×105細胞/kg対象体重、0.5×104〜1×106細胞/kg対象体重、0.5×105〜1×107細胞/kg対象体重 0.5×102〜1×107細胞/kg対象体重または1.0×104〜2.5×106細胞/kg対象体重の濃度で投与される。いくつかの態様では、iNKT細胞が対象1kgにつき約0.01×106 iNKT細胞〜約3×106 iNKT細胞の濃度で投与される。いくつかの態様では、iNKT細胞が対象1kgにつき少なくとも約0.01×106 iNKT細胞の濃度で投与される。いくつかの態様では、iNKT細胞が対象1kgにつき最大約3×106 iNKT細胞の濃度で投与される。いくつかの態様では、iNKT細胞が対象1kgにつき約0.01×106 iNKT細胞〜約0.1×106 iNKT細胞、約0.01×106 iNKT細胞〜約1×106 iNKT細胞、約0.01×106 iNKT細胞〜約1.5×106 iNKT細胞、約0.01×106 iNKT細胞〜約2×106 iNKT細胞、約0.01×106 iNKT細胞〜約3×106 iNKT細胞、約0.1×106 iNKT細胞〜約1×106 iNKT細胞、約0.1×106 iNKT細胞〜約1.5×106 iNKT細胞、約0.1×106 iNKT細胞〜約2×106 iNKT細胞、約0.1×106 iNKT細胞〜約3×106 iNKT細胞、約1×106 iNKT細胞〜約1.5×106 iNKT細胞、約1×106 iNKT細胞〜約2×106 iNKT細胞、約1×106 iNKT細胞〜約3×106 iNKT細胞、約1.5×106 iNKT細胞〜約2×106 iNKT細胞、約1.5×106 iNKT細胞〜約3×106 iNKT細胞または約2×106 iNKT細胞〜約3×106 iNKT細胞の濃度で投与される。いくつかの態様では、iNKT細胞が対象1kgにつき約0.01×106 iNKT細胞、約0.1×106 iNKT細胞、約1×106 iNKT細胞、約1.5×106 iNKT細胞、約2×106 iNKT細胞または約3×106 iNKT細胞の濃度で投与される。
【００８０】
いくつかの態様では、投与される細胞が、3×105細胞/kg対象体重より少ない通常のナイーブαβ-T細胞を含む。いくつかの態様では、投与される細胞が、2×105細胞/kg対象体重より少ない、1×105細胞/kg対象,体重より少ない 7.5×104細胞/kgより少ない、5×104細胞/kgより少ない、1×104細胞/kgより少ない、0.5×104細胞/kgより少ない、または1×103細胞/kg対象体重より少ない通常のナイーブαβ-T細胞を含む。
【００８１】
本実施例にさらに論考しているように、治療用細胞組成物の純度は処置の臨床転帰に重要なであり得る。例えば、治療用細胞とともにナイーブTcon混入細胞が含まれているかもしれない細胞画分を、低純度をもたらす方法を用いて加工処理すると、高忠実度選別手法（例えば、FACS）を用いて調製された治療用細胞組成物と比べてGVHD、急性GVHD 3〜4級、ステロイド抵抗性急性GVHD 3〜4級、慢性GVHD、移植不全、移植片拒絶、重篤な感染、臓器不全、VOD/SOSおよび再発が高レベルになることによって治療有効性が障害され得る。
【００８２】
理論に拘束されることを望まないが、本明細書に開示の治療用細胞組成物では、HSPCにより得られるTreg、TmemおよびiNKT細胞が、従来の骨髄破壊的HSPC移植術と比べて早期の対象の免疫系の救済をもたらすため、骨髄破壊的移植術において卓越した治療有益性がもたらされると考えられる。対象が従来の骨髄破壊的HSPC移植を受けると、免疫系が1年間までかけて有意に回復し始め、防御免疫がもたらされ得る。比較において、本開示の治療用組成物にHSPCとともにTreg、TmemまたはiNKT細胞を導入することにより、対象の破壊された免疫細胞に対する補給がもたらされると考えられる。このような補給細胞は、投与直後に有意な免疫機能をもたらし始める。したがって、本開示の治療用細胞組成物により、従来のHSPC移植と比べて卓越した治療有益性が提供される。また、制御性T細胞は、充実性組織内の同種反応性T細胞を抑制することによって生着およびGVHD抑制を補助しているのかもしれないと考えられる。また、iNKT細胞はTregに、特に充実性組織内において抑制的環境を推進させるための正のフィードバックシグナルを供給していると考えられる。また、HSPCは、骨髄破壊された患者の血液および免疫系を再構築、例えばNK細胞を再構築すると考えられ、これにより、移植片対白血病効果がもたらされるとさらに考えられる。また、メモリーT細胞は、限定的な期間（5年未満）、抗感染効果および抗白血病効果をもたらすと考えられる。これらの細胞は、その限られた寿命のため、長期の移植片対宿主病反応を持続させることができない。
【００８３】
いくつかの態様では、治療用細胞集団が対象に別々の薬学的組成物として投与される。例えば、HSPC、Tmem、TregまたはiNKTの富化細胞集団は逐次投与され得る。いくつかの態様では、治療用細胞集団が反復用量で投与される。いくつかの場合では、ある用量の該細胞集団がHSPCを含むものであり得る。いくつかの場合では、ある用量の該細胞集団がTreg細胞を含むものであり得る。いくつかの場合では、ある用量の該細胞集団がTmem細胞を含むものであり得る。いくつかの場合では、ある用量の該細胞集団がiNKT細胞を含むものであり得る。いくつかの態様では、治療用細胞集団が対象に単一の薬学的組成物として同時投与される。該用量は治療過程として投与され得る。治療過程は、ある用量を対象に1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日間隔で投与することを含み得る。治療過程は、ある用量を対象に1週、2週、3週または4週間隔で投与することを含むものであってもよい。治療過程は、ある用量を対象に1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月または4ヶ月間隔で投与することを含むものであってもよい。
【００８４】
いくつかの態様では、本明細書に記載の治療用組成物が別々の細胞集団として投与され得る。例えば、第1用量の治療用組成物は、HSPCの集団、Treg細胞の集団またはTmem細胞の集団のいずれかの単独または任意の組み合わせでの投与を構成し得る。次いで、後続用量は、第1用量に存在しない上記の細胞型のいずれかを含み得る。また、用量にiNKT細胞を含めてもよい。一例として、第1用量はHSPCを含むものであり得、一方、第2用量はTregおよびTmem細胞を含む。また、対象に他の組み合わせでの用量を投与してもよい。
【００８５】
いくつかの態様では、完全用量の該治療用組成物は複数の用量を含み得る。本明細書に記載の完全治療用組成物は少なくとも1回用量で投与され得る。本明細書に記載の完全治療用組成物は最大30回の用量で投与され得る。いくつかの場合では、本明細書に記載の完全治療用組成物が約2回用量、5回用量、10回用量、15回用量、20回用量、25回用量または30回用量で投与され得る。いくつかの場合では、ある用量の完全治療用組成物がHSPC、Treg細胞、Tmem細胞を含み得る。いくつかの場合では、完全治療用組成物の個々の用量が異なる細胞集団を含み得る。
【００８６】
いくつかの態様では、単位用量が対象1kgにつき少なくとも3×105 HSPCを含み得る。いくつかの態様では、単位用量が対象1kgにつき少なくとも3×105 Treg細胞を含み得る。いくつかの態様では、単位用量が対象1kgにつき少なくとも3×105 Tmem細胞を含み得る。いくつかの態様では、単位用量が対象1kgにつき少なくとも3×105 iNKT細胞を含み得る。いくつかの態様では、単位用量が対象1kgにつき3×105より少ないTcon細胞を含み得る。
【００８７】
いくつかの態様では、完全治療用組成物が約1日で投与され得る。いくつかの場合では、完全治療用組成物が最大30日間で投与され得る。例えば、第1用量の本明細書に記載の治療用組成物が1日で投与され得、第2用量が10日後に投与される。いくつかの場合では、完全治療用組成物が約1日、2日間、5日間、10日間、15日間、20日間または30日間で投与され得る。
【００８８】
いくつかの態様では、該細胞が、HLA適合兄弟姉妹ドナー、HLA適合非血縁ドナー、一部適合非血縁ドナー、ハプロタイプ一致の血縁ドナー、自己ドナー、HLA不適合ドナー、ドナープール、またはそれらの任意の組み合わせであるドナーから単離される。いくつかの態様では、治療用細胞集団が同種異系である。いくつかの態様では、治療用細胞集団が自己である。いくつかの態様では、治療用細胞集団のハプロタイプが一致している。いくつかの態様では、治療用細胞集団が、動員末梢血、動員アフェレーシス血液製剤、骨髄、臍帯血、非動員血、非動員アフェレーシス血液製剤、またはそれらの任意の組み合わせから単離される。
【００８９】
いくつかの態様では、治療用細胞集団が1回の組織採取により得られる。いくつかの態様では、治療用細胞集団が1回または複数回の組織採取により得られる。いくつかの態様では、治療用細胞集団が、少なくとも第1のドナーによって提供されたHSPCと、少なくとも第2のドナーによって提供されたTregおよびTmemとを含む。いくつかの態様では、治療用細胞集団が、該少なくとも第2のドナーによって提供されたiNKT細胞を含む。一部の特定の態様では、第1のドナーのハプロタイプが該対象と一致している。一部の特定の態様では、第2のドナーがHLA適合兄弟姉妹ドナーまたはHLA適合もしくは一部適合非血縁ドナーである。
【００９０】
いくつかの態様では、対象が、処置の前に放射線、化学療法、組換えタンパク質、抗体、または毒素コンジュゲート抗体、またはそれらの任意の組み合わせで前処置されている。いくつかの態様では、対象が、まず該対象を骨髄破壊的療法で処置することによって細胞移植片療法のために前処置される。例示的な骨髄破壊的療法としては化学療法または放射線療法が挙げられる。骨髄破壊的療法は、腫瘍を減量することによって治療有益性をもたらすと考えられる。がん細胞は一般的に、多くの正常細胞より化学療法/放射線療法に対して感受性である。しかしながら、腫瘍浸潤細胞が化学療法/放射線療法の過程を乗り越えたならば、対象は再発リスクを有する。したがって、高レベルの化学療法は腫瘍浸潤集団の排除の改善を補助し得る;しかしながら、この濃度では正常細胞に対して毒性が起こり得る。一部の感受性正常細胞は必須でないが、造血幹細胞は高レベルの化学療法によって致死性程度まで死滅される。骨髄破壊的レジメンでは充分な量のHSCが根絶され、患者は通常、移植なしでは死亡するであろう。骨髄破壊された対象にHSPCが輸注されると、ドナー細胞によって該対象が救済され得、該対象の血液および免疫系が一生、再構築され得る。いくつかの態様では、骨髄破壊的療法が、ブスルファン、シクロホスファミド、TBI、フルダラビン、エトポシド、またはそれらの任意の組み合わせの投与を含む。いくつかの態様では、骨髄破壊的療法が抗cKIT抗体の投与を含む。いくつかの態様では、骨髄破壊的療法が抗体薬物コンジュゲートの投与を含む。抗体薬物コンジュゲートは、例えば抗CD45-サポリンまたは抗cKit-サポリン治療用抗体であり得る。いくつかの態様では、骨髄破壊的療法が強度減弱前処置療法である。
【００９１】
一部の特定の態様では、治療用細胞集団が該対象に、免疫抑制剤を含む併用療法として投与される。例示的な免疫抑制剤としては、シロリムス、タクロリムス、シクロスポリン、ミコフェノール酸（mycophenolate）、抗胸腺細胞グロブリン、コルチコステロイド、カルシニューリン阻害薬、代謝拮抗薬、例えばメトトレキサート、移植後シクロホスファミド、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。いくつかの態様では、対象が、GVHDに対する予防としてシロリムスまたはタクロリムスのみで前処置される。いくつかの態様では、治療用細胞集団が該対象に免疫抑制剤の前に投与される。いくつかの態様では、治療用細胞集団が該対象に免疫抑制剤の後に投与される。いくつかの態様では、治療用細胞集団が該対象に免疫抑制剤と同時に投与される。いくつかの態様では、治療用細胞集団が該対象に免疫抑制剤なしで投与される。いくつかの態様では、治療用細胞集団の投与を受けている患者は6ヶ月、5ヶ月、4ヶ月、3ヶ月、2ヶ月、1ヶ月、3週間、2週間または1週間未満で免疫抑制剤の投与を受ける。
【００９２】
いくつかの態様では、Bu/Fluおよび/またはBu/Cyの投与を受けている対象に、タクロリムスが+3日目に0.03 mg/kg/日の初期用量の静脈内輸注で、目標4〜8 ng/mlで開始される。いくつかの態様では、Cy/TBI（また、TBI/VP-16またはTBI/VP-16/Cy）の投与を受けている対象には、シロリムスが+3日目に6 mg負荷用量の初期用量の後、2 mgを毎日、目標3〜8 ng/mlで開始される。対象がその特定のGVHD予防に不寛容になったか、または変更すべき他の理由が処置担当医によって判断されたならば、処置担当医の自己判断で予防が変更され得、タクロリムス、シロリムスまたはミコフェノール酸モフェチルを使用することが推奨される。GVHDが起こったならば、適切な処置スケジュールおよび用量を開始する。急性GVHDが発生したレシピエントは処置担当医の自己判断で処置される。
【００９３】
細胞集団の選択および選別
治療用細胞の製剤化または投与の前に、治療用細胞を富化または枯渇させる細胞供給源（1つまたは複数）がドナーから採取される（例えば、末梢血単核細胞、骨髄、臍帯血）。細胞混合物中の特定のサブセット細胞集団を富化または枯渇させるための方法は当技術分野において周知である。例えば、細胞集団は、密度による分離、ロゼット式（rosetting）四量体型抗体複合体媒介性の富化/枯渇、磁気活性化細胞選別（MACS）、マルチパラメータ蛍光ベース分子表現型、例えば蛍光標示式細胞選別（FACS）、またはそれらの任意の組み合わせによって富化または枯渇され得る。細胞集団を富化または枯渇させるさらなる方法は、例えば米国特許仮出願第62/421,979号;米国特許出願公開第2014/0011690号;および米国特許出願公開第2016/0245805号に示されており、これらは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。集合的に、細胞集団を富化または枯渇させるこれらの方法は、本明細書において一般的に細胞集団の「選別」、または細胞を富化（+）または枯渇（-）された細胞集団が形成される、もしくは得られる「条件下で」接触させると称され得る。
【００９４】
したがって、本開示の態様は、少なくとも1種類の試料を加工処理して:（a）富化された造血幹/前駆細胞（HSPC）の集団;（b）富化された制御性T細胞（Treg）の集団;（c）富化されたメモリーT細胞（Tmem）の集団を得ること;ならびに（d）富化された該HSPC、メモリーT細胞およびTregの集団を、対象に対する投与に適した薬学的組成物として製剤化することを含み、ここで、（a）〜（c）の該集団は通常のナイーブαβ-T細胞が枯渇されている、薬学的組成物を作製するための方法を含む。いくつかの態様では、該方法は、該試料を加工処理して、富化されたiNKT細胞の集団を得ることをさらに含み得る。
【００９５】
いくつかの態様では、該方法が、該試料を加工処理して、Lin+細胞を枯渇させた細胞の集団を得ることをさらに含む。該方法は、富化されたナイーブTregの集団、富化されたメモリーTregの集団または両方を得ることを含み得る。いくつかの態様では、富化されたTmemの該集団を得ることが、富化されたセントラルメモリーT幹細胞（TSCM）の集団、富化されたセントラルメモリーT細胞（TCM）の集団、富化されたエフェクターメモリーT細胞（TEM）の集団、またはそれらの任意の組み合わせを得ることを含む。いくつかの態様では、該方法は、該試料を加工処理して、富化されたiNKT細胞の集団を得ることをさらに含み得る。
【００９６】
いくつかの態様では、富化されたHSPCの該集団が、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%またはそれ以上のCD34+ HSPCを含む。いくつかの態様では、Lin+細胞を枯渇させた該細胞集団が1%〜30%のLin+細胞、好ましくは1%未満のLin+細胞を含む。いくつかの態様では、富化されたTregの該集団が20%〜99.9%のTregを含む。いくつかの態様では、富化されたTmemの該集団が10%〜99.9%のTmemを含む。いくつかの態様では、富化されたiNKTの該集団が10%〜99.9%のiNKTを含む。
【００９７】
いくつかの態様では、薬学的組成物の製剤化が、富化されたHSPC集団、メモリーT細胞集団、Treg集団、iNKT集団、またはそれらの任意の組み合わせを、富化細胞の混合集団へと組み合わせることを含む。
【００９８】
いくつかの態様では、富化細胞の混合集団が、500:1〜1:1,000、400:1〜1:1,000、300:1〜1:1,000、200:1〜1:1,000、100:1〜1:1,000、50:1〜1:1,000、10:1〜1:1,000、5:1〜1:1,000、4:1〜1:1,000、3:1〜1:1,000、2:1〜1:1,000、1:1〜1:1,000、500:1〜1:900、500:1〜1:800、500:1〜1:700、500:1〜1:600、500:1〜1:500、500:1〜1:400、500:1〜1:300、500:1〜1:200、500:1〜1:100、500:1〜1:50、500:1〜1:20、500:1〜1:10、500:1〜1:9、500:1〜1:8、500:1〜1:7、500:1〜1:6、500:1〜1:5、500:1〜1:4、500:1〜1:3、500:1〜1:2、500:1〜1:1、400:1〜1:900、300:1〜1:800、200:1〜1:700、100:1〜1:600、50:1〜1:500、10:1〜1:400、5:1〜1:300、4:1〜1:200、3:1〜1:100、2:1〜1:50、または1:1〜1:20の範囲を含むHSPCとTmemの比を含む。いくつかの態様では、富化細胞の混合集団が、10:1〜1:200、100:1〜1:2,000、または1,000:1〜1:20,000の範囲を含むHSPCとTmemの比を含む。
【００９９】
いくつかの態様では、富化細胞の混合集団が、20:1〜1:3、100:1〜1:30、または200:1〜1:300の範囲を含み得るHSPCとTregの比を含む。HSPCとナイーブTregの比は、1:500〜100:1、1:400〜100:1、1:300〜100:1、1:200〜100:1、1:100〜100:1、1:50〜100:1、1:20〜100:1、1:10〜100:1、1:5〜100:1、1:1〜100:1、1:200〜50:1、1:200〜20:1、1:200〜10:1、1:200〜5:1、1:100〜1:1、40:1〜1:3、200:1〜1:15、または400:1〜1:150の範囲を含み得る。
【０１００】
いくつかの態様では、富化細胞の混合集団が、1:500〜10,000:1、1:400〜10,000:1、1:300〜10,000:1、1:200〜10,000:1、1:100〜10,000:1、1:50〜10,000:1、1:20〜10,000:1、1:10〜10,000:1、1:5〜10,000:1、1:1〜10,000:1、1:500〜5,000:1、1:500〜1,000:1、1:500〜900:1、1:500〜800:1、1:500〜700:1、1:500〜600:1、1:500〜500:1、1:500〜400:1、1:500〜300:1、1:500〜200:1、1:500〜100:1、1:500〜50:1、1:500〜20:1、1:500〜10:1、1:500〜5:1、または1:500〜1:1の範囲を含み得るHSPCとメモリーTregの比を含む。
【０１０１】
いくつかの態様では、富化細胞の混合集団が、1:2〜1,000,000:1、1:2〜500,000:1、1:1〜500,000:1、100:1〜1,000,000:1、100:1〜500,000:1、100:1〜100,000:1、500:1〜1,000,000:1、500:1〜500,000:1、500:1〜100,000:1、1,000:1〜100,000:1、1,000:1〜1,000,000:1、1,000:1〜500,000:1、1,000:1〜100,000:1、10,000:1〜1:2、100,000:1〜1:20、または1,000,000:1〜1:200の範囲を含み得るHSPCとiNKTの比を含む。
【０１０２】
いくつかの態様では、富化細胞の混合集団が、1:3未満、1:50未満、1:100未満、1:200未満、1:300未満、1:400未満. 1:500未満、1:600未満、1:700未満、1:800未満、1:900未満、1:1,000未満、1:1,500未満、1:2,000未満、1:3,000未満、1:4,000未満、1:5,000未満、1:6,000未満、1:7,000未満、1:8,000未満、1:9,000未満、1:10,000未満、1:50,000未満、1:100,000未満、1:200,000未満、1:300,000未満、1:400,000未満、1:500,000未満、1:600,000未満、1:700,000未満、1:800,000未満、1:900,000未満、または1:1,000,000未満の通常のナイーブαβ-T細胞とHSPCの比を含む。
【０１０３】
いくつかの態様では、富化細胞の混合集団が、1:30未満、1:200未満、1:300未満、1:400未満、1:500未満、1:600未満、1:700未満、1:800未満、1:900未満、1:1000未満、1:5000未満、1:10000未満、1:15000未満、1:20000未満、1:25000未満、1:30000未満、1:35000未満、1:40000未満、1:45000未満、または1:50000未満であり得る通常のナイーブαβ-T細胞とTmemの比を含む。
【０１０４】
通常のナイーブαβ-T細胞とTregの比は1:1未満、1:10未満、1:30未満、1:200未満、1:300未満、1:400未満、1:500未満、1:600未満、1:700未満、1:800未満、1:900未満、1:1000未満、1:5000未満、1:10000未満、1:15000未満、1:20000未満、1:25000未満、1:30000未満、1:35000未満、1:40000未満、1:45000未満、または1:50000未満であり得る。通常のナイーブαβ-T細胞とナイーブTregの比は1:1未満、1:10未満、1:30未満、1:200未満、1:300未満、1:400未満、1:500未満、1:600未満、1:700未満、1:800未満、1:900未満、1:1000未満、1:5000未満、1:10000未満、1:15000未満、1:20000未満、1:25000未満、1:30000未満、1:35000未満、1:40000未満、1:45000未満、または1:50000未満であり得る。通常のナイーブαβ-T細胞とメモリーTregの比は1:1未満、1:2未満、1:3未満、1:4未満、1:5未満、1:6未満、1:7未満、1:8未満、1:9未満、1:10未満、1:15未満、1:20未満、1:30未満、1:200未満、1:300未満、1:400未満、1:500未満、1:600未満、1:700未満、1:800未満、1:900未満、1:1000未満、1:5000未満、1:10000未満、1:15000未満、1:20000未満、1:25000未満、1:30000未満、1:35000未満、1:40000未満、1:45000未満、または1:50000未満であり得る。通常のナイーブαβ-T細胞とiNKTの比は100:1未満、1:1未満、1:2未満、1:3未満、1:4未満、1:5未満、1:6未満、1:7未満、1:8未満、1:9未満、1:10未満、1:15未満、1:20未満、1:30未満、1:200未満、1:300未満、1:400未満、1:500未満、1:600未満、1:700未満、1:800未満、1:900未満、1:1000未満、1:5000未満、1:10000未満、1:15000未満、1:20000未満、1:25000未満、1:30000未満、1:35000未満、1:40000未満、1:45000未満、1:50000未満であり得る。
【０１０５】
本開示のいくつかの態様では、TmemとTregの比が初期細胞濃度に依存しない（例えば、初期濃度から実質的に変更される）。これにより、Tmemの濃度をTregの濃度に関係なく制御（例えば、用量漸増）できるため利点がもたらされる。TmemとTregの比は30:1〜1:1、25:1〜1:1、20:1〜1:1、15:1〜1:1、10:1〜1:1、9:1〜1:1、8:1〜1:1、7:1〜1:1、6:1〜1:1、5:1〜1:1、4:1〜1:1、3:1〜1:1、2:1〜1:1であり得る。一部の特定の態様では、TmemとTregの比が1:1〜200:1、1:10〜2000:1、または1:100〜20,000:1であり得る。TmemとナイーブTregの比は5:1〜1:10、3:1〜1:10、3:1〜1:10、2:1〜1:10、または1:1〜1:10であり得る。TmemとメモリーTregの比は27:1〜0.9:1、30:1〜1:10、25:1〜1:10、20:1〜1:10、15:1〜1:10、10:1〜1:10、30:1〜1:9、30:1〜1:8、30:1〜1:7、30:1〜1:6、30:1〜1:5、30:1〜1:4、30:1〜1:3、30:1〜1:2、または30:1〜1:1であり得る。
【０１０６】
本開示のいくつかの態様では、TregとiNKTの比が20,000:1〜1:5、200,000:1〜1:50、または2,000,000:1〜1:500であり得る。
【０１０７】
本開示のいくつかの態様では、iNKTとTmemの比が2:1〜1:100,000、5:1〜1:1,000,000、または10:1〜1:10,000,000であり得る。
【０１０８】
いくつかの態様では、HSPCがCD34+である。HSPCはさらにCD133+、CD90+、CD38-、CD45RA-、Lin-、またはそれらの任意の組み合わせとして記載され得る。いくつかの態様では、HSPCがCD19-、TCRα/β-、またはそれらの組み合わせである。いくつかの態様では、Lin+細胞がCD19、CD11c、CD66B、CD14、CD20、またはそれらの任意の組み合わせを発現している。いくつかの態様では、TregがCD4+、CD25+、CD127-/lo、FoxP3+、またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの態様では、ナイーブTregがCD4+、CD25+、CD127-/lo、FoxP3+、CD45RA+、CD45RO-、またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの態様では、メモリーTregがCD4+、CD25+、CD127-/lo、FoxP3+、CD45RA-、CD45RO+、またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの態様では、TmemがCD3+、CD45RA-、CD45RO+、またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの態様では、TSCMがCD45RA+およびCD4+またはCD8+である。TSCMはさらにCD95+、CD122+、CXCR3+、LFA-1+、またはそれらの任意の組み合わせとして記載され得る。いくつかの態様では、TCMがCD45RO+およびCD4+またはCD8+である。TCMはさらにCD45RA-、CD62L+、CCR7+、またはそれらの任意の組み合わせとして記載され得る。いくつかの態様では、TEMがCD4+、CD45RO+、CD45RA-、CD62L-、CCR7-、またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの態様では、iNKTがCD1d-tet+、6B11+、Va24Ja18+、またはそれらの任意の組み合わせである。本明細書に記載の任意の態様において、通常のナイーブαβ-T細胞はTCRα/β+ CD45RA+およびCD25-、CD127+または両方である。通常のナイーブαβ-T細胞はさらにTCRα+ TCRβ+ CD45RA+ CD45RO- CD25- CD95- IL-2Rβ- CD127+として記載され得る。
【０１０９】
いくつかの態様では、生体試料が、関心対象の集団、例えばHSPC、Treg細胞、Tmem細胞またはそれらの組み合わせが単離されるように選別され得る。いくつかの場合では、生体試料が、HSPCの単離のためにCD34に特異的に結合する分子と接触され得る。該試料はCD34+が富化され、CD34+細胞集団とCD34-細胞集団が得られ得る。いくつかの場合では、CD34-細胞集団がCD25に特異的に結合する分子と接触され得る。次いで該試料は、CD25+細胞集団のCD34-細胞集団の選別によってCD25+細胞が富化され、それによりCD34-CD25-細胞集団とCD34-CD25+細胞集団が得られ得る。CD34-CD25+細胞集団は、Treg細胞集団が得られるようにさらに選別され得る。CD34-CD25+細胞は、CD4に特異的に結合する分子およびCD127に特異的に結合する分子と接触され得る。次いで該細胞は、CD34-CD25+CD4+CD127dim/- Treg細胞集団が得られるように選別され得る。いくつかの場合では、CD34-CD25-細胞集団が、Tmem細胞が富化されるようにさらに選別され得る。該細胞はCD45RAに特異的に結合する分子と接触され得る。該細胞試料は、CD34-CD25-CD45RA- Tmem細胞集団が得られるように選別され得る。CD45RA+の通常のナイーブαβ-T細胞は、通常のナイーブαβ-T細胞の枯渇のために廃棄され得る。
【０１１０】
いくつかの態様では、生体試料が、関心対象の集団、例えばHSPC、Treg細胞、Tmem細胞、iNKT細胞、またはそれらの組み合わせが単離されるように選別され得る。いくつかの場合では、生体試料が、HSPCの単離のためにCD34に特異的に結合する分子と接触され得る。該試料はCD34+が富化され、CD34+細胞集団とCD34-細胞集団が得られ得る。いくつかの場合では、CD34-細胞集団がCD25に特異的に結合する分子および6B11に特異的に結合する分子と接触され得る。次いで該試料は、CD25+細胞集団のCD34-細胞集団の選別によってCD25+および6B11+細胞が富化され、それによりCD34-CD25- 6B11-細胞集団とCD34-CD25+ 6B11+細胞集団が得られ得る。CD34-CD25+ 6B11+細胞集団は、TregおよびiNKT細胞集団が得られるようにさらに選別され得る。CD34-CD25+ 6B11+細胞はCD4に特異的に結合する分子およびCD127に特異的に結合する分子と接触され得る。次いで該細胞は、CD34-CD25+6B11+CD4+CD127dim/- Treg細胞集団が得られるように選別され得る。いくつかの場合では、CD34-CD25-6B11-細胞集団が、Tmem細胞が富化されるようにさらに選別され得る。該細胞はCD45RAに特異的に結合する分子と接触され得る。該細胞試料は、CD34-CD25-6B11-CD45RA- Tmem細胞集団が得られるように選別され得る。CD45RA+の通常のナイーブαβ-T細胞は、通常のナイーブαβ-T細胞の枯渇のために廃棄され得る。いくつかの態様では、本明細書に記載の治療用組成物の作製方法は、異なる細胞集団を別々に選別することを含み得る。例えば、HSPC、Treg細胞、Tmem細胞および/またはiNKT細胞は別々に選別され得る。別々に選別された該集団は、治療用組成物を形成するために混合され得る。いくつかの場合では、該別々の細胞集団が異なるドナーから単離され得る。例えば、HSPCはドナー1から単離され得、TregおよびTmem細胞はドナー2から選別され得る。あるいはまた、すべての細胞集団が同じドナーから単離され得る。いくつかの態様では、試料が動員末梢血、動員アフェレーシス血液製剤、骨髄、臍帯血、非動員血、非動員アフェレーシス血液製剤、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様では、試料が、PBMCに由来する培養細胞を含む。いくつかの態様では、試料が、人工多能性幹細胞（iPSC）に由来する培養細胞を含む。いくつかの態様では、試料が、密度勾配、Ficoll、Percoll、赤血球低浸透圧性溶解、塩化アンモニウム-カリウム（ACK）バッファー、またはそれらの任意の組み合わせの処理用に調製される。いくつかの態様では、試料が1回の組織採取により得られる。いくつかの態様では、試料が1回または複数回の組織採取により得られる。
【０１１１】
選別スキーム例1
一部の特定の態様では、薬学的組成物を作製するための方法が:A.試料をCD34に特異的に結合する分子と、CD34+細胞の集団およびCD34-細胞の集団が形成される条件下で接触させ、CD34+細胞の該集団を該試料から回収し、CD34-細胞の該集団を該試料から回収すること;ならびにB.CD34-細胞の該集団を加工処理し、Treg、Tmem、iNKT、またはそれらの任意の組み合わせを含む富化された治療用細胞の最小の1つの集団を得ることを含む（図1AおよびB参照）。いくつかの態様では、工程Bが、富化された治療用細胞の該集団を得るために精密選別を行なうことを含む（図1A参照）。例えば、工程Bは、CD34-細胞の該集団をCD45RAに特異的に結合する分子、CD45ROに特異的に結合する分子、CD4に特異的に結合する分子、CD8に特異的に結合する分子、CD25に特異的に結合する分子、CD127に特異的に結合する分子、CD1d-tet、6B11モノクローナル抗体もしくはその機能性断片、またはそれらの任意の組み合わせと接触させることを含み得る。
【０１１２】
一部の特定の態様では、工程Bが、（i）CD34-細胞の該集団をCD45RAに特異的に結合する少なくとも1つの分子と、CD45RA+細胞の集団およびCD45RA-細胞の集団が形成される条件下で接触させ、CD45RA-細胞の該集団を回収すること；ならびに（ii）富化された治療用細胞の該集団を得るためにCD45RA+細胞の該集団からの精密選別を行なうことを含む。精密選別は、CD45RA+細胞の該集団をCD4に特異的に結合する分子、CD8に特異的に結合する分子、CD25に特異的に結合する分子、CD127に特異的に結合する分子、CD1d-tet、6B11モノクローナル抗体もしくはその機能性断片、またはそれらの任意の組み合わせと接触させることを含み得る。精密選別は、CD45RA-細胞の該集団をCD45RAに特異的に結合する分子、CD45ROに特異的に結合する分子、またはそれらの組み合わせと接触させることをさらに含み得る。
【０１１３】
一部の特定の態様では、工程Bが、（i）CD34-細胞の該集団を、Lin+マーカーに特異的に結合する少なくとも1つの結合分子と、Lin+細胞の集団およびLin-細胞の集団が形成される条件下で接触させ、Lin-細胞の該集団を回収すること；ならびに（ii）富化された治療用細胞の該集団を得るためにLin-細胞の該集団からの精密選別を行なうことを含む。いくつかの態様では、精密選別が、Lin-細胞の該集団をCD45RAに特異的に結合する分子、CD45ROに特異的に結合する分子、CD4に特異的に結合する分子、CD8に特異的に結合する分子、CD25に特異的に結合する分子、CD127に特異的に結合する分子、CD1d-tet分子、6B11モノクローナル抗体もしくはその機能性断片、またはそれらの任意の組み合わせと接触させることを含む。
【０１１４】
一部の特定の態様では、工程Bが、（i）CD34-細胞の該集団を、少なくとも1つのLin+マーカーに特異的に結合する少なくとも1つの結合分子と、Lin+細胞の集団およびLin-細胞の集団が形成される条件下で接触させ、Lin-細胞の該集団を回収すること;ならびに（ii）Lin-細胞の該集団をCD25に特異的に結合する結合分子と、CD25+細胞の集団およびCD25-細胞の集団が形成される条件下で接触させ、該CD25+細胞集団を回収し、それによりTregを含む細胞の集団を作製し、CD25-細胞の該集団を回収すること；ならびに（iii）CD25-細胞の該集団をCD45RAに特異的に結合する結合分子と、CD45RA+細胞の集団およびCD45RA-細胞の集団が形成される条件下で接触させ、CD45RA-細胞の該集団を回収することを含む（図1A参照）。いくつかの態様では、工程（ii）が、該Lin-細胞をCD1d-tet、6B11モノクローナル抗体もしくはその機能性断片またはそれらの組み合わせと、CD1d-tet+細胞の集団、6B11+細胞の集団、またはそれらの組み合わせおよびCD1d-tet-細胞の集団、6B11-細胞、またはそれらの組み合わせが形成される条件下で接触させ、CD1d-tet+細胞の該集団を回収することをさらに含む。いくつかの態様では、CD25+細胞の該集団およびCD1d-tet+細胞の該集団、6B11+細胞または両方が同時に回収される。いくつかの態様では、該方法が、ナイーブTreg細胞の集団、メモリーTreg細胞の集団、iNKT細胞の集団、またはそれらの任意の組み合わせを得るために工程（ii）のCD25+細胞の該集団の精密選別を行なうことをさらに含む。いくつかの態様では、CD45RA+細胞の該集団が回収され、Treg、iNKTまたは両方の集団を得るために精密選別がさらに行なわれる。
【０１１５】
選別スキーム例2
一部の特定の態様では、薬学的組成物を作製するための方法が：（A）少なくとも第1の試料に対して第1の粗選別を行ない、それによりCD34+細胞の富化集団を得ること；（B）第2の試料に対して第2の粗選別を行ない、それによりLin-細胞の集団を得ること；（C）Lin-細胞の該集団に対して第3の粗選別を行ない、それによりCD45RA-メモリーT細胞の集団を得、CD45RA+細胞の集団を得ること；ならびに（D）CD45RA+細胞の該集団に対して精密選別を行ない、それによりTregの集団を得ることを含む（図2および3参照）。
【０１１６】
いくつかの態様では、第2の試料が、工程Aで回収されたCD34-細胞の集団を含む（図3参照）。いくつかの態様では、第1の試料が少なくとも1種類のハプロタイプ一致試料を含む（図2A参照）。いくつかの態様では、第1の試料が少なくとも2種類のハプロタイプ一致試料を含む（図2B参照）。いくつかの態様では、第1の試料が、動員末梢血、動員アフェレーシス血液製剤、骨髄、臍帯血、非動員血、非動員アフェレーシス血液製剤、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様では、第2の試料が、末梢血単核細胞（PBMC）、動員末梢血、動員アフェレーシス血液製剤、骨髄、臍帯血、非動員血、非動員アフェレーシス血液製剤、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様では、第1の試料または第2の試料が同種異系、自己の、またはそれらの組み合わせである。いくつかの態様では、第2の試料がHLA適合非血縁ドナー、HLA適合兄弟姉妹ドナー、またはそれらの組み合わせに由来する（図2AおよびB参照）。
【０１１７】
いくつかの態様では、第1、第2または第3の粗選別が、密度による分離、四量体型抗体複合体媒介性の富化/枯渇、磁気活性化細胞選別、アフェレーシス、白血球アフェレーシス、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【０１１８】
いくつかの態様では、精密選別がマルチパラメータ蛍光ベース分子表現型を使用する精製を含み得る。精密選別によりナイーブTreg細胞の集団、メモリーTreg細胞の集団、iNKT細胞の集団、またはそれらの任意の組み合わせが得られ得る。精密選別は、該CD45RA+細胞をCD25に特異的に結合する結合分子と、CD25+細胞の集団およびCD25-細胞の集団が得られる条件下で接触させ、CD25+細胞の集団を回収し、それによりTregの集団を得ることを含み得る。いくつかの態様では、CD25+細胞の該集団が、ナイーブTreg細胞の集団が得られる条件下でさらに選別される。いくつかの態様では、精密選別が、該CD45RA+細胞をCD1d-tet、6B11モノクローナル抗体もしくはその機能性断片、またはそれらの組み合わせと、CD1d-tet+細胞の集団、6B11+細胞または両方が得られる条件下で接触させ、CD1d-tet+細胞の該集団、6B11+細胞または両方を回収することを含む。
【０１１９】
選別スキーム例3
一部の特定の態様では、薬学的組成物を作製するための方法が：（A）試料をLin+マーカーに特異的に結合する結合分子と、Lin+細胞の集団およびLin-細胞の集団が得られる条件下で接触させ、Lin-細胞の該集団を回収すること；（B）該Lin-細胞を、CD34に特異的に結合する結合分子およびCD25に特異的に結合する結合分子と、CD34+細胞の集団、CD25+細胞の集団およびCD34- CD25-細胞の集団が得られる条件下で接触させ、該CD34+細胞およびCD25+細胞を回収し、CD34- CD25-細胞の該集団を回収すること；ならびに（C）CD34- CD25-細胞の該集団をCD45RAに特異的に結合する結合分子と、CD45RA+細胞の集団およびCD45RA-細胞の集団が得られる条件下で接触させ、CD45RA-の集団を回収することを含む（図4参照）。
【０１２０】
いくつかの態様では、工程Bが、該Lin-細胞をCD1d-tet、6B11モノクローナル抗体もしくはその機能性断片またはそれらの組み合わせと、CD1d-tet+細胞の集団、6B11+細胞またはそれらの組み合わせが得られる条件下で接触させ、該CD1d-tet+細胞、6B11+細胞、またはそれらの組み合わせを回収することをさらに含む（図4参照）。いくつかの態様では、該方法が、該CD34+細胞、CD25+細胞、CD1d-tet+細胞、6B11+細胞、またはそれらの任意の組み合わせの精密選別を行ない、それによりCD34+細胞、CD25+細胞、CD1d-tet+細胞、6B11+細胞、またはそれらの任意の組み合わせの集団を得ることをさらに含む（図4参照）。いくつかの態様では、精密選別が、該CD34+細胞、CD25+細胞、CD1d-tet+細胞、6B11+細胞、またはそれらの任意の組み合わせを、CD34に特異的に結合する結合分子、CD4に特異的に結合する結合分子、CD25に特異的に結合する結合分子、CD127に特異的に結合する結合分子、CD1d-tet、6B11モノクローナル抗体もしくはその機能性断片、またはそれらの任意の組み合わせと、CD34+細胞、CD4+ CD25+ CD127-/Lo細胞、CD1d-tet+細胞、またはそれらの組み合わせが高度に富化された細胞の集団が得られる条件下で接触させることを含む（図4参照）。
【０１２１】
選別スキーム例4
一部の特定の態様では、薬学的組成物を作製するための方法が：（A）試料の粗選別を行ない、Lin+細胞の集団およびLin-細胞の集団を得、Lin-細胞の該集団を回収すること；（B）Lin-細胞の該集団の粗選別を行なうことにより、HSPCとTmemが富化された集団およびCD45RA+細胞の集団を得、HSPCとTmemの該集団を回収し、CD45RA+細胞の該集団を回収すること；ならびに（C）CD45RA+細胞の該集団の精密選別を行ない、Tregの集団を得ることを含む（図5参照）。いくつかの態様では、精密選別が、CD45RA+細胞の該集団をCD34に特異的に結合する結合分子、CD4に特異的に結合する結合分子およびCD127に特異的に結合する結合分子と、CD34+細胞の集団およびCD4+ CD25+ CD127-/Lo細胞の集団が得られる条件下で接触させ、CD34+細胞の集団およびCD4+ CD25+ CD127-/Lo細胞の集団を回収することをさらに含む。いくつかの態様では、精密選別が、該CD45RA+細胞集団をCD1d-tet、6B11モノクローナル抗体もしくはその機能性断片またはそれらの組み合わせと接触させ、CD1d-tet+細胞の集団、6B11+細胞、またはそれらの組み合わせを回収することをさらに含む。いくつかの態様では、粗選別が、密度による分離、四量体型抗体複合体媒介性の富化/枯渇、磁気活性化細胞選別、アフェレーシス、白血球アフェレーシス、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【０１２２】
選別スキーム例5
一部の特定の態様では、薬学的組成物を作製するための方法が：（A）試料をCD34に特異的に結合する結合分子と、CD34+細胞の集団およびCD34-細胞の集団が得られる条件下で接触させ、CD34+細胞の該集団を回収し、CD34-細胞の該集団を回収すること；（B）CD34-細胞の該集団をCD25に特異的に結合する結合分子と、CD25+細胞の集団およびCD25-細胞の集団が得られる条件下で接触させ、CD25+細胞の該集団を回収し、CD25-細胞の該集団を回収すること；ならびに（C）CD25-細胞の該集団をCD45RAに特異的に結合する結合分子と、CD45RA+細胞の集団およびCD45RA-細胞の集団が得られる条件下で接触させ、CD45RA-細胞の集団を回収することを含む（図6、10、11、12参照）。
【０１２３】
いくつかの態様では、工程Bが、（i）CD34-細胞の該集団をCD1d-tet、6B11モノクローナル抗体もしくはその機能性断片またはそれらの組み合わせと、CD1d-tet+細胞の集団、6B11+細胞の集団、またはそれらの組み合わせおよびCD1d-tet-細胞の集団、6B11-細胞の集団、またはそれらの組み合わせが得られる条件下で接触させ、CD1d-tet+細胞の集団、6B11+細胞の集団、またはそれらの組み合わせを回収し、それによりiNKT枯渇細胞の集団を得、CD1d-tet-細胞の集団、6B11-細胞の集団または両方を回収し、それによりiNKT枯渇細胞の集団を得ること；ならびに（ii）iNKT枯渇細胞の該集団をCD25に特異的に結合する結合分子と、CD25+細胞の集団およびCD25-細胞の集団が得られる条件下で接触させ、CD25+細胞の該集団を回収し、CD25-細胞の集団を回収することをさらに含む（図6参照）。
【０１２４】
いくつかの態様では、工程Bが、CD34-細胞の該集団をCD25に特異的に結合する結合分子、およびCD1d-tet、6B11モノクローナル抗体もしくはその機能性断片またはそれらの組み合わせと、CD25+細胞の集団およびCD1d-tet+細胞の集団、6B11+細胞またはそれらの組み合わせおよびCD34- CD25- iNKT枯渇細胞の集団が得られる条件下で接触させ、CD25+細胞の該集団およびCD1d-tet+細胞の該集団、6B11+細胞またはそれらの組み合わせを回収し、CD34- CD25- iNKT枯渇細胞の該集団を回収することを含む（図10参照）。
【０１２５】
いくつかの態様では、工程Bが、（i）CD34-細胞の該集団をCD25に特異的に結合する結合分子、およびCD1d-tet、6B11モノクローナル抗体もしくはその機能性断片またはそれらの組み合わせと、CD25+細胞の集団およびCD1d-tet+細胞の集団、6B11+細胞またはそれらの組み合わせおよびCD34- CD25- iNKT枯渇細胞の集団が得られる条件下で接触させ、CD25+細胞の該集団およびCD1d-tet+細胞の該集団、6B11+細胞またはそれらの組み合わせを回収し、CD34- CD25- iNKT枯渇細胞の該集団を回収すること；ならびに（ii）CD25+細胞の該集団およびCD1d-tet+細胞の該集団、6B11+細胞またはそれらの組み合わせの精密選別を、該細胞をCD4に特異的に結合する結合分子、CD25に特異的に結合する結合分子、CD127に特異的に結合する結合分子、CD1d-tet、6B11モノクローナル抗体もしくはその機能性断片、またはそれらの任意の組み合わせと接触させることにより行ない、CD4+CD25+CD127-/Lo細胞、CD1d-tet+細胞、6B11+細胞、またはそれらの任意の組み合わせが富化された細胞の集団を得ることを含む（図11参照）。
【０１２６】
いくつかの態様では、工程Bが、（i）CD34-細胞の該集団を、タグ（例えば、蛍光性のフィコエリトリン）を含む抗CD25抗体およびビオチン化6B11モノクローナル抗体（6B11-ビオチン）と接触させることを含む。次いで6B11-ビオチンを、該抗CD25抗体と同じタグとコンジュゲートさせたストレプトアビジンと接触させる。いくつかの態様では、ストレプトアビジンをフィコエリトリン/Cy7にコンジュゲートさせる（SAv-PE/Cy7）。次いで該細胞を抗タグ磁気粒子と接触させる。いくつかの態様では、磁気粒子が抗PE磁気粒子（例えば、磁気ビーズ）である。次いでCD25+細胞および6B11結合細胞を、MACSを用いて分離し、CD25+細胞と6B11+細胞の集団およびCD34- CD25- iNKT枯渇細胞の集団を作製する（図15参照）。いくつかの態様では、工程Bが、（ii）CD25+細胞と6B11+細胞の該集団の精密選別を、CD4に特異的に結合する結合分子およびCD127に特異的に結合する結合分子と該細胞を、CD4+CD25+CD127-/Lo細胞が富化された細胞の集団および6B11+CD127+細胞が富化された細胞の集団、またはそれらの任意の組み合わせが得られる条件下で接触させることにより行なうことをさらに含む。いくつかの態様では、CD4結合分子が抗CD4 PerCP標識抗体である。いくつかの態様では、CD127結合分子が抗CD127 APC標識抗体である。精密選別は、該CD25-PE、6B11-ビオチン-SAv-PE/Cy7、CD4-PerCPおよびCD127-APCが検出されるFACSを含み得る。
【０１２７】
いくつかの態様では、工程Aで回収されたCD34+細胞の該集団、工程Bで回収されたCD25+細胞の該集団または両方が、該CD34+細胞、該CD25+細胞またはそれらの組み合わせをCD34に特異的に結合する結合分子、CD127に特異的に結合する結合分子、CD45RAに特異的に結合する結合分子、またはそれらの任意の組み合わせと接触させることを含む精密選別によってさらに加工処理される（図12参照）
【０１２８】
選別スキーム例6
一部の特定の態様では、薬学的組成物を作製するための方法が:A.試料をCD34に特異的に結合する結合分子およびCD25に特異的に結合する結合分子と、CD34+細胞の集団、CD25+細胞の集団およびCD34- CD25-細胞の集団が得られる条件下で接触させ、該CD34+細胞集団およびCD25+細胞の該集団を回収し、CD34- CD25-細胞の該集団を回収すること;ならびにB.CD34- CD25-細胞の該集団をCD45RAに特異的に結合する結合分子と、CD45RA+細胞の集団およびCD45RA-細胞の集団が得られる条件下で接触させ、CD45RA-細胞の該集団を回収することを含む（図7参照）。いくつかの態様では、工程Aが、該試料をCD1d-tet、6B11モノクローナル抗体もしくはその機能性断片またはそれらの組み合わせと、CD1d-tet+細胞の集団、6B11+細胞の集団またはそれらの組み合わせが得られる条件下で接触させ、CD1d-tet+細胞の該集団、6B11+細胞の該集団またはそれらの組み合わせを回収することをさらに含む（図7参照）。いくつかの態様では、該方法が、工程Aで得られた該細胞集団の精密選別を、CD34に特異的に結合する結合分子、CD4に特異的に結合する結合分子、CD25に特異的に結合する結合分子、CD127に特異的に結合する結合分子、CD1d-tet、またはそれらの任意の組み合わせと、該細胞を接触させることにより行ない、CD34+細胞、CD4+CD25+CD127-/Lo細胞、CD1d-tet+細胞、またはそれらの任意の組み合わせが富化された細胞の集団を得ることをさらに含む（図8参照）。
【０１２９】
選別スキーム例7
一部の特定の態様では、薬学的組成物を作製するための方法が、試料を同時に加工処理して、HSPC、Tmem、ナイーブTreg、メモリーTregを含み、含まれた望ましくない細胞型が5%未満である細胞の富化集団を得ることを含む（図13参照）。いくつかの態様では、試料を、CD34に特異的に結合する結合分子、CD4に特異的に結合する結合分子、CD8に特異的に結合する結合分子、CD25に特異的に結合する結合分子、CD127に特異的に結合する結合分子、CD45RAに特異的に結合する結合分子、CD45ROに特異的に結合する結合分子、またはそれらの任意の組み合わせと接触させる。いくつかの態様では、該方法が、該試料をCD1d-tet、6B11モノクローナル抗体もしくはその機能性断片またはそれらの組み合わせと接触させ、CD1d-tet+細胞の集団、6B11+細胞の集団またはそれらの組み合わせを回収することをさらに含む。いくつかの態様では、試料をCD34に特異的に結合する結合分子と接触させ、CD34+細胞の集団を回収し、それによりHSPCの集団を作製する。いくつかの態様では、試料を、CD3に特異的に結合し、CD45RAに特異的に結合する結合分子に結合しない結合分子、CD45ROに特異的に結合する結合分子またはそれらの組み合わせと接触させ、CD3+ CD45RA- CD45RO+細胞の集団を回収する。いくつかの態様では、試料を、CD4に特異的に結合する結合分子、CD25に特異的に結合する結合分子、CD127に特異的に結合する結合分子、CD45RAに特異的に結合する結合分子、CD45ROに特異的に結合する結合分子、またはそれらの任意の組み合わせと接触させ、CD4+ CD25+ CD127-/lo CD45RA+ CD45RO-細胞の集団、CD4+ CD25+ CD127-/lo CD45RA- CD45RO+細胞の集団を回収する。
【０１３０】
前述の任意の態様において、治療用細胞集団に含まれる通常のナイーブαβ-T細胞は2%より少ない、1%より少ない、0.5%より少ない、0.1%より少ない、0.01%より少ない、0.001%より少ない。
【０１３１】
前述の任意の態様において、Lin+マーカーはCD19、CD11c、CD66B、CD14、CD20、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。
【０１３２】
前述の任意の態様において、CD34、Lin+マーカー、CD25、CD45RA、CDR45RO、CD4、CD8、CD127、CD90、CD133、CD38、CD95、CD122、CXCR3、LFA-1、CD62L、CCR7または任意の他の細胞マーカーに特異的に結合する分子は抗体または抗体断片である。
【０１３３】
用語「抗体」は、本明細書で用いる場合、広義での用語であり、その通常の意味で使用され、例えば非限定的に、天然に存在する抗体ならびに天然に存在しない抗体、例えば、一本鎖抗体、キメラ、二重機能性およびヒト化抗体など、ならびにその抗原結合断片をいう。抗体が生じる対象分子のエピトープまたは領域の選択によって、例えば、該分子の種々の形態（存在する場合）または全体（例えば、該分子の全部もしくは実質的に全部）に対するその特異性が決定されることは認識されよう。
【０１３４】
抗体を作製するための方法は充分に確立されている。当業者には、抗体の作製には、例えば、Antibodies,A Laboratory Manual,Ed Harlow and David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory（1988）,Cold Spring Harbor,N.Y.に記載されているような多くの手順が利用可能であることが認識されよう。また、当業者には、抗体を模倣する結合断片またはFab断片が遺伝情報から、種々の手順によって調製され得ることも認識されよう（Antibody Engineering:A Practical Approach（Borrebaeck,C.,ed.）,1995,Oxford University Press,Oxford;J.Immunol.149,3914-3920（1992））。また、分子、例えばタンパク質およびマーカーに対するモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体は市販もされている（R and D Systems,Minneapolis,Minn.;HyTest Ltd.,Turk,Finland;Abcam Inc.,Cambridge,Mass.,USA,Life Diagnostics,Inc.,West Chester,Pa.,USA;Fitzgerald Industries International,Inc.,Concord,Mass.,USA;BiosPacific,Emeryville,Calif.）。
【０１３５】
いくつかの態様では、該抗体がポリクローナル抗体である。他の態様では、該抗体がモノクローナル抗体である。諸態様において、本開示の抗体は、本方法に従って抽出される細胞集団の下流用途と適合性がある。例えば、本開示の抗体は非免疫原性のヒト化抗体であり得る。いくつかの態様では、本開示の抗体は、試料の抽出前または後に該抗体を固定化させ、それにより、該抗体を抽出された細胞集団から枯渇させるのに有用なエピトープタグを含む。
【０１３６】
いくつかの態様では、該抗体がビオチン化6B11抗体である。6B11は、インバリアントTCR Va24Ja18に結合する抗体である。いくつかの態様では、6B11抗体が、pH 5.5〜6.0、6.0〜6.5、6.5〜7、7.5〜8、8〜8.5、8.5〜9、9〜9.5または9.5〜10でビオチン化される。いくつかの態様では、6B11抗体が、緩衝剤であるリン酸塩、ホウ酸塩またはヘペス中でビオチン化される。いくつかの態様では、バッファーがアミン非含有のバッファーである。ビオチン化反応は、約0 mM NaCl、50 mM NaCl、100mM NaCL、150 mM NaCl、300 mM NaClもしくは500mM NaClまたはその中間値で行なわれ得る。タンパク質（例えば、抗体）の修飾部位としては、遊離アミン、遊離チオールおよび糖鎖、人工的導入アジドおよび人工的導入アルキンが挙げられる。ビオチン濃度は10μM〜50μM、50μM〜100μM、100μM〜250μM、250μM〜500μM、500μM〜1 mM、1 mM〜2mM、2mM〜5mM、5 mM〜10 mMでさまざまであり得る。反応時間は、10〜30分間、30分間〜1時間、1時間 1.5時間、1.5時間〜2.5時間、2.5時間〜6時間、6時間〜10時間、10時間〜18時間でさまざまであり得る。本明細書に開示のビオチン化6B11抗体は、本明細書に開示の任意の方法において、Va24Ja18+細胞（iNKT細胞）の集団を選別、精製または単離するために使用され得る。
【０１３７】
捕捉結合パートナーと検出結合パートナーのペア、例えば捕捉抗体と検出抗体のペアが本開示の諸態様において使用され得る。したがって、いくつかの態様では、典型的には2種類の結合パートナー、例えば2種類の抗体を使用する選別/精製プロトコルが使用される。一方の結合パートナーは捕捉パートナーであり、通常、粒子上に固定化され、他方の結合パートナーは検出結合パートナーであり、典型的には、検出可能な標識が結合されている。かかる抗体ペアは、いくつかの市販の供給元、例えばBiosPacific,Emeryville,Calif.から入手可能である。また、抗体ペアは、当技術分野において周知の方法によって設計し、調製することもできる。具体的な一態様では、抗体がビオチン化されるか、またはビオチン標識される。
【０１３８】
いくつかの態様では、初期細胞集団のすべての構成員に非特異的に結合する第2のイメージング要素を存在させる。したがって、このシグナルは読み取られ、空洞間の蛍光量が正規化され得る。一例は、出発細胞集団の細胞表面上にユビキタスに発現されるタンパク質に結合する抗体である。
【０１３９】
いくつかの態様では、該抗体または抗体断片が蛍光色素、ハプテンもしくは磁気粒子とカップリングされるか、または蛍光色素、ハプテンもしくは磁気粒子で標識される。
【０１４０】
粒子混合物中での検出または識別を可能にするために結合パートナーを標識するのに使用され得るいくつかのストラテジーが当技術分野において周知である。標識は、任意の公知の手段、例えば、非特異的相互作用または特異的相互作用を利用する方法によって結合され得る。また、標識は直接、または結合パートナーを介して行なわれ得る。
【０１４１】
該部分からの発光、例えば蛍光は、本明細書に記載のような検出器を用いた検出が可能となるのに充分であるのがよい。一般的に、本開示の組成物および方法では、高度に蛍光性の部分、例えば、該部分の励起波長で電磁放射線源で刺激されると電磁放射線を放射する能力を有する部分が使用される。本開示の組成物および方法にはいくつかの部分が好適である。
【０１４２】
また、電磁放射線以外のエネルギーによって活性化可能な標識も本開示において有用である。かかる標識は、例えば電気、熱または化学反応（例えば、化学発光標識）によって活性化され得る。また、いくつかの酵素活性型標識が当業者に周知である。
【０１４３】
典型的には、該部分の蛍光は、アッセイの所望の検出限界、正確度および精度に必要な調和を伴って、本開示の検出器でバックグラウンドレベルより上で該部分が検出可能であるのに充分な量子効率と光褪色の欠如との組み合わせを伴う。
【０１４４】
さらに、該部分は、その第一選択のアッセイにおける使用と調和する特性を有する。いくつかの態様では、該アッセイはイムノアッセイであり、この場合、蛍光性の該部分が抗体に結合される;該部分は、他の抗体もしくはタンパク質と凝集しないような、または該アッセイの必要とされる正確度および精度との調和を超える凝集を起こさないような特性を有するものでなければならない。いくつかの態様では、蛍光性部分は、1）高い吸光係数;2）高い量子収量;3）高い光安定性（低い光褪色）;および4）関心対象の分子（例えば、タンパク質）の標識との適合性の組み合わせを有する分子を、該分子が本開示の解析装置およびシステムを用いて解析され得る（例えば、関心対象のタンパク質の沈降または該部分が結合されているタンパク質の沈降を引き起こさない）ように染色する。
【０１４５】
蛍光性部分は、単一の実体（量子ドットまたは蛍光性分子）を含むものであっても複数の実体（例えば、複数の蛍光性分子）を含むものであってもよい。「部分」は、この用語を本明細書で用いている場合、一群の蛍光性の実体、例えば複数の蛍光色素分子をいい、個々の各実体は結合パートナーに別々に結合されてもよく、該実体は、該実体が1つの群として検出されるのに充分な蛍光をもたらす限り一緒に結合されてもよいことは認識されよう。
【０１４６】
いくつかの態様では、蛍光色素分子が、インドリウム環の3位の炭素上の置換基が化学反応性基またはコンジュゲートされた物質を含む少なくとも1つの置換インドリウム環系を含む。例としてはAlexa Fluor分子が挙げられる。
【０１４７】
いくつかの態様では、標識が、第1の型および第2の型の標識、例えば2種類の異なるALEXA FLUOR（登録商標)色素（Invitrogen）を含み、ここで、第1の型および第2の型の色素分子は異なる発光スペクトルを有する。
【０１４８】
蛍光性部分における使用のための有用な蛍光性の実体の非包括的なリストには:ALEXA FLUOR（登録商標)488、ALEXA FLUOR（登録商標)532、ALEXA FLUOR（登録商標)555、ALEXA FLUOR（登録商標)647、ALEXA FLUOR（登録商標)700、ALEXA FLUOR（登録商標)750、フルオレセイン、B-フィコエリトリン、アロフィコシアニン、PBXL-3、Atto 590およびQdot 605が含まれる。
【０１４９】
標識は粒子または結合パートナーに、当技術分野において公知の任意の方法、例えば吸収、共有結合、ビオチン/ストレプトアビジンまたは他の結合ペアによって結合され得る。また、標識を、リンカーを介して結合させてもよい。いくつかの態様では、標識が、被検物質によって切断され、それにより該標識が粒子から放出される。あるいはまた、被検物質がリンカーの切断を妨げ得る。
【０１５０】
分離された細胞集団は、すぐに使用してもよく、単離後、当技術分野において周知の方法を用いてインビトロで培養してもよい。該細胞集団は培地中で、例えばRPMI-1640、DMEM、X-Vivo 10、X-vivo 15、またはその改変培地および組み合わせ中で培養され得る。培地は1〜20%のヒト血清を含み得る。培地は、サイトカインまたは、例えばラパマイシン、SCF、SDF-1、TPO、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-15、IL-17、IL-18、IL-23、IL-33、TGF-b、IFNg、IFNaの受容体を活性化させる分子およびそれらの組み合わせを含み得る。該細胞集団は、結合分子、例えば抗CD3、抗CD28、CD64、CD86、抗IL-21R、CD137またはそれらの組み合わせの多価ディスプレイを含む作動薬、例えば粒子（マイクロ粒子、ナノ粒子、タンパク質または細胞）で刺激され得る。
【０１５１】
また、細胞は凍結され得るか、または分離前もしくは分離後に凍結され得る。細胞を長期間保存する場合は、該細胞が、解凍後にまた使用され得ることを確実にするために-80℃前後または液体窒素中でそうすることが好ましい。この目的のため、細胞は通常、DMSOおよび/またはFCS/HSを一緒に含む培地、グルコースなどの中で保存される。細胞を解凍した直後、該細胞は、治療目的もしくはインビトロ実験のために直接使用され得るか、あるいは拡大培養され得る、および/または増殖因子、抗原、細胞などを用いて分化され得るかのいずれかである。
【実施例】
【０１５２】
実施例1
スカルプト細胞移植片の作製
細胞の富化および枯渇は、輸注用の最終製品の製剤化のための複数工程で行なわれる。各選択手順を以下に、手順の簡単な説明とともに記載する。この方法の概略を図14に示す。
【０１５３】
工程A：CD34+細胞の富化を、CLINIMACS Cell Selection System（Miltenyi Biotec,Bergish-Gladbach,Germany）での免疫磁気による細胞選択を用いて行なった。簡単には、2種類のアフェレーシス血液製剤を収集した場合は、プールしたドナーアフェレーシス血液製剤を洗浄して、過剰の血漿および血小板を除去した。製造業者のガイドラインに基づいて、0.5%のHSA（ワーキングバッファー）を補給し、細胞へのMiltenyiマイクロビーズ試薬の非特異的結合を低減させるためのIVIgを添加したCLINIMACSバッファーを用いて細胞数およびCD34+細胞計数について表示されたものに、量を調整した。この細胞製品を、CLINIMACS CD34試薬で、製品内容に関する製造業者のガイドラインを用いて標識した。未結合試薬を、ワーキングバッファーでの希釈および遠心分離による除去によって減らした。標識された細胞製品を、標識細胞の免疫磁気選択のための使い捨てチュービングセット内への細胞負荷を制御するCLINIMACSデバイスに連結させた。保持された細胞を、磁場を除くことによって解放し、CLINIMACSチュービングセットに取り付けられた陽性画分バッグに入るようにした。CD34+富化細胞を、指定の輸注媒体としての2%HSA補給Normosol-R中に再懸濁させた。陰性画分（CD34選択のフロースルー）は、さらなる細胞加工処理のために保持した。
【０１５４】
工程B：制御性T細胞およびiNKT細胞を工程Aの陰性画分（CD34選択のフロースルー）から、CLINIMACSシステムを用いた免疫磁気選択によって富化した。画分の量を調整し、細胞をPE/Cy7コンジュゲートCD1d（糖脂質が負荷されている）四量体試薬およびMiltenyi Biotecの抗CD25 PE試薬で標識した。未結合試薬を細胞懸濁液から除去するために洗浄した後、細胞を抗PEマイクロビーズ試薬で標識し、洗浄して未結合ビーズを除去し、LSチュービングセットを用いてCLINIMACSに負荷した。標識された細胞は、磁化されたカラム上に保持された。磁場を除くと、CD25+およびCD1d（糖脂質が負荷されている）四量体+細胞が、カラムから、チュービングセットに取り付けられた陽性画分バッグに放出された。CD25+およびCD1d（糖脂質が負荷されている）四量体+細胞が枯渇された細胞を含むフロースルー（陰性画分）を後続の細胞選択手順（以下の工程C）のために保持した。CD25+細胞およびCD1d（糖脂質が負荷されている）四量体+細胞の富化は、以下の工程Dでのさらなる富化のための中間工程であった。
【０１５５】
工程C：CD25/CD1d富化陰性画分の細胞を、CD45RA発現をドナーメモリー細胞のインジケータとして用いる免疫磁気選択によって、ナイーブサブセットとメモリーサブセットに分離した。細胞を調製し、CLINIMACS CD45RA試薬で標識した。未結合試薬を細胞懸濁液から除去するために洗浄した後、細胞を、枯渇チュービングセットを備えたCLINIMACSに段階的に負荷した。標識された細胞は、磁化されたカラム上に保持され、カラムから、チュービングセットに取り付けられた目的細胞バッグに取り出された。CD45RA+細胞が枯渇された細胞を含むフロースルー画分を最終製品に添加し、ドナーメモリー細胞の含有を確実にした。
【０１５６】
工程D：TregおよびiNKT細胞を、BD FACS ARIAを用いた細胞選別によってさらに精製した。工程BでCD25+およびCD1d（糖脂質が負荷されている）四量体+細胞の富化によって回収されたCD25+細胞を、PerCPコンジュゲートマウス抗ヒトCD4およびAPCコンジュゲートマウス抗ヒトCD127モノクローナル抗体試薬ならびにさらなるCD25 PE（Miltenyi Biotec）およびCD1d（糖脂質が負荷されている）四量体PE-Cy7での標識のために、量を調整した。未結合試薬を除去するために洗浄した後、細胞を、CD4-PerCP+ x CD25 PE+,CD127-APC dim/neg細胞（Treg）およびCD127+ x CD1d（糖脂質が負荷されている）四量体-PE/Cy7+（iNKT）の分子表現型を含む1種類のリンパ球細胞用に設定したゲートで選別した。
【０１５７】
細胞選択手順により回収され、輸注が意図される細胞サブセットを、0.5%のHSA（Albumin-Human,25%,Grifols,Clayton,NC）を補給したNormosol-R,pH 7.2（Hospira,Lake Forest,IL）中に再懸濁させた。細胞画分を1つのブラッドトランスファーバッグ内に1×108細胞/mlの最大密度で合わせ、2〜8℃で連続モニタリングセキュア（secure）冷蔵庫内に入れた。
【０１５８】
実施例2
抗iNKT抗体を用いたスカルプト細胞移植片の作製
細胞の富化および枯渇は、輸注用の最終製品の製剤化のための複数工程で行なわれる。各選択手順を以下に、手順の簡単な説明とともに記載する。この方法の概略を図15に示す。
【０１５９】
工程A:CD34+細胞の富化を、CLINIMACS Cell Selection System（Miltenyi Biotec,Bergish-Gladbach,Germany）での免疫磁気による細胞選択を用いて行なった。簡単には、ドナーアフェレーシス血液製剤を洗浄して過剰の血漿および血小板を除去した。2例のドナーアフェレーシス血液製剤を収集した場合は、これらをプールした。製造業者のガイドラインに基づいて、0.5%のHSA（ワーキングバッファー）を補給し、細胞へのMiltenyiマイクロビーズ試薬の非特異的結合を低減させるためのIVIgを添加したCLINIMACSバッファーを用いて細胞数のCD34+細胞計数について表示されたものに、量を調整した。この細胞製品をCLINIMACS CD34試薬で、製品内容に関する製造業者のガイドラインを用いて標識した。未結合試薬を、ワーキングバッファーでの希釈および遠心分離による除去によって減らした。標識された細胞製品を、標識細胞の免疫磁気選択のための使い捨てチュービングセット内への細胞負荷を制御するCLINIMACSデバイスに連結させた。保持された細胞を、磁場を除くことによって解放し、CLINIMACSチュービングセットに取り付けられた陽性画分バッグに入るようにした。CD34+富化細胞を、指定の輸注媒体としての2%HSA補給Normosol-R中に再懸濁させた。陰性画分（CD34選択のフロースルー）は、さらなる細胞加工処理のために保持した。
【０１６０】
工程B:制御性T細胞およびiNKT細胞を工程Aの陰性画分（CD34選択のフロースルー）から、CLINIMACSシステムを用いた免疫磁気選択によって富化した。画分の量を調整し、細胞を、抗CD25-PE（Miltenyi Biotec）およびビオチンコンジュゲート6B11モノクローナル抗体（抗iNKT）で標識した。未結合試薬を細胞懸濁液から除去するために洗浄した後、細胞をPE/Cy7コンジュゲートストレプトアビジンで標識し、再度洗浄した。次いで細胞を抗PEマイクロビーズ試薬（Miltenyi Biotec）で標識し、洗浄して未結合ビーズを除去し、LS TSチュービングセットを用いてCD133富化プログラムを用いてCLINIMACSに負荷した。標識された細胞は、磁化されたカラム上に保持された。磁場を除くと、CD25+および6B11+細胞がカラムから、チュービングセットに取り付けられた目的画分バッグに放出された。CD25+および6B11+細胞が枯渇された細胞を含むフロースルー（非目的画分）を、後続の細胞選択手順（以下の工程D）のために保持した。CD25+細胞および6B11+細胞の富化は、以下の工程Cでのさらなる富化のための中間工程である。
【０１６１】
工程C:TregおよびiNKT細胞を蛍光標示式細胞選別によってさらに精製した。工程BでのCD25+および6B11+細胞の富化によって回収されたCD25+細胞を、PerCPコンジュゲートマウス抗ヒトCD4（Miltenyi Biotec）およびAPCコンジュゲートマウス抗ヒトCD127モノクローナル抗体試薬（Miltenyi Biotec）、ならびにさらなるCD25 PE（Miltenyi Biotec）およびストレプトアビジンPE-Cy7での標識のために、量を調整した。未結合試薬を除去するために洗浄した後、細胞を、CD4-PerCP+ x CD25 PE+,CD127-APC dim/neg細胞（Treg）およびCD127+ x 6B11-PE/Cy7+（iNKT）の分子表現型を含む1種類のリンパ球細胞の設定ゲートで選別した。
【０１６２】
工程D:CD25/6B11陰性画分の細胞を、CD45RA発現をドナーメモリー細胞のインジケータとして用いる免疫磁気選択によってナイーブサブセットとメモリーサブセットに分離した。細胞を調製し、CLINIMACS CD45RA試薬で標識した。未結合試薬を細胞懸濁液から除去するために洗浄した後、細胞を、枯渇チュービングセットを備えたCLINIMACSに段階的に負荷した。標識された細胞は、磁化されたカラム上に保持され、カラムから、チュービングセットに取り付けられた目的細胞バッグに取り出された。CD45RA+細胞が枯渇された細胞を含むフロースルー画分を最終製品に添加し、ドナーメモリー細胞の含有を確実にした。
【０１６３】
細胞選択手順により回収され、輸注が意図される細胞サブセットを、0.5%のHSA（Albumin-Human,25%,Grifols,Clayton,NC）を補給したNormosol-R,pH 7.2（Hospira,Lake Forest,IL）中に再懸濁させた。細胞画分を1つのブラッドトランスファーバッグ内に1×108細胞/mlの最大密度で合わせ、2〜8℃で連続モニタリングセキュア冷蔵庫内に入れた。
【０１６４】
（表１）例示的なスカルプト移植片組成物に関する試薬および目的細胞の数
2020511464.tif 000003
【０１６５】
実施例3
骨髄破壊的造血細胞移植（alloMA-HCT）のマウスモデルにおけるスカルプト細胞移植片 対 T細胞非枯渇およびT細胞枯渇の同種異系移植片
骨髄破壊および細胞移植片移植のマウスモデルを使用し、本明細書に記載の例示的なスカルプト細胞移植片のパフォーマンスを公知の細胞移植片と比べて評価した。図16は実験手順の図表を示す。骨髄破壊された患者をモデリングするため、8〜12週齢のBALB/cレシピエントマウスの体重を測り、次いで400/400 radの分割線量をRad-Source RS2000照射器から160 KeVで、0.5 mm Cuのフィルターを通して-2日目に照射した。マウスを6週間、抗生物質含有飼料に切り換えた。残存病変をモデリングするため、2,500〜10,000個のJ774 GFP-Luc細胞を各マウスに尾静脈から-1日目に静脈内注射した。J774細胞株は、起源がBALB/cマウスに由来する骨髄系細胞株であり、BALB/cレシピエントマウスと同系である。J774細胞を、GFPとルシフェラーゼの導入遺伝子を発現するように改変した。表2に要約した3種類の異なる細胞組成物を使用し、同種異系造血細胞移植（HCT）をモデリングした。細胞組成物は、後述するようにして、C57Bl/6マウスの造血組織から調製し、BALB/cマウスの後眼窩静脈叢から0日目に静脈内輸注した。実験コホートは一般的に5〜9匹のマウスであった。7つの独立した実験のデータをプールし、図17に示した。
【０１６６】
（表２）BALB/cマウスに投与した細胞組成物
2020511464.tif 000004
【０１６７】
マウスを苦痛について毎日確認した。ボディーコンディション（BC）スコアおよび体重を週2回測定した。BC≦1.5を有するマウスを安楽死させた。元の体重の＜70%の体重で死亡したマウスをGVHDと記録した。移植後30日以内に>70%体重で死亡したマウスを生着不全と記録した。死亡したマウスはすべて解剖し、肝臓および脾臓内の腫瘍増殖について蛍光顕微鏡を用いて検査した。GFP+ 腫瘍結節の存在を再発と記録した（図17C参照）。一部のマウスコホートを+10日目に、Xenogen IVIS100での生物発光イメージングに供した（図17D参照）。 
【０１６８】
スカルプト細胞移植片組成物の投与を受けたマウスは、他のすべてのコホートよりパフォーマンスが優れていた（図17AおよびB参照）。このマウスの94%が、再発の形跡なく+175日目まで生存した。このマウスの3%がGVHDで死亡し、3%が生着不全で死亡した。BMTおよびHSPC組成物と比べて改善されたパフォーマンスは、GvL効果が維持されているが、GVHDおよび生着不全の割合が有意に低下していることを示す。
【０１６９】
比較において、BMT細胞組成物の投与を受けたマウスはすべて、+30日目より前にGVHDで死亡した。これらのマウスでは、+10日目の生物発光イメージングにおいて再発の形跡はみられなかった。さらに、死後解剖の解析では造血器に腫瘍結節の成長は観察されなかった。この結果は、移植片中のT細胞が、がん細胞に対抗するのに充分であったことを示し、一様に致死性GVHDの背景にもかかわらず移植片による強いGvLを示す。ヒト患者では、同種異系移植片の供給源はレシピエントとHLA-ハプロタイプが密に適合しているが、BALB/cマウスとC57Bl/6マウスは完全に不適合であることに留意されたい。したがって、クリニックで観察されるGVHD反応は、ここで観察されたGVHD反応と比べて大きく緩和される。
【０１７０】
HSCT細胞組成物の投与を受けたマウスは混合転帰を有した。マウスの51%は+175日目まで長期間生存した。HSCTレシピエントの9%は、体重>70%で+30日目より前での死亡で示されるように、生着不全で死亡した。マウスの3%は、死亡時の前の最後の測定時の体重＜70%で示されるように、GVHDで死亡した。マウスの36%は死亡時に再発の形跡を有した。このコホートの高い再発率は、T細胞計数が移植後、初期の数週間において低いままであるため、HSCT後の長期間の免疫抑制に起因する。比較において、ヒトHSCTレシピエントもまた、移植後の最初の年はT細胞計数が少なく、再発率が高い。したがって、HSCT移植モデルは、ヒト患者におけるT細胞枯渇によるGvLの欠如を反映している。CD34+同種異系移植片で処置したヒト患者では、T細胞非枯渇（replete）同種異系移植片と比べて、高い再発率が観察される。
【０１７１】
実施例4
MACS/FACS対MACSのみで作製したスカルプト細胞移植片の比較  alloMA-HCTのマウスモデル
この実験では、上記に示したスカルプト細胞移植片組成物のデータを別のマウスコホートと比較する。GVLおよびGVHDを、MACSのみによって作製したスカルプト細胞移植片またはMACSとFACSの組み合わせによって作製したスカルプト細胞移植片で処置した動物において評価した（表3参照）。これらのマウスは上記のようにして準備し、追跡した。コホートは5〜7匹のマウスであり、3つの独立した実験のデータをプールしている。
【０１７２】
（表３）MACSのみまたはMACSとFACSの組み合わせによって作製したスカルプト細胞移植片
2020511464.tif 000005
【０１７３】
MACS/FACSスカルプト細胞移植マウスは、MACSとFACSの組み合わせを用いて実施例3に記載のようにして準備した。FACS純度は典型的には95%より高い。比較において、MACSのみでの富化試料の純度は、典型的には20%〜80%である。MACSのみのマウスの同種異系リンパ球はFACSによってさらに精製せず、この組成物の治療有益性はひどく障害された。MACSのみのマウスは54%だけが+175日目までは生存したのに対して、MACS/FACSスカルプト細胞移植マウスの生存率は94%であった（図18参照）。すべての致命的症例で開始時の体重の＜70%の体重が示され、GVHDが死因であることが示された。これらのマウスではいずれも、死後解剖で再発の形跡が示されなかった。MACS/FACS製作法と比べてMACSのみでの製作における高レベルの致死性GVHDは、骨髄破壊的造血細胞移植（MA-HCT）の移植片改変操作の状況におけるこのような細胞集団の純度の重要性を示す。理論に拘束されることを望まないが、MACSのみでのスカルプト細胞移植片で処置したマウスにおける優勢なGVHDは、Tcon細胞の混入の結果であると考えられる。
【０１７４】
実施例5
alloMA-HCTのマウスモデルにおけるスカルプト細胞移植片 対 T細胞の追加輸注を伴うBMTの比較
スカルプト細胞移植片組成物を、cKIT+ HSPC画分に添加したさまざまな量のT細胞（HSPC + T細胞の追加輸注）とともにBMT組成物を投与したコホートと比較した。背景として、T細胞の追加輸注は、骨髄移植に対する実験的臨床アプローチである。一例として、臨床センターでT細胞枯渇（例えば、通常、CD34+ 細胞CLINIMACS単離）が行なわれ、次いで後日、該T細胞の一部が移植片に追加輸注されるか、または移植される。追加輸注手順においてT細胞は、収集されたCD34-画分から得て、さらに加工処理しないためバルクT細胞であることに注意のこと。T細胞は典型的には、BMT移植片に天然に存在するレベルより10〜1000倍少ないレベルで再導入される。
【０１７５】
本実施例では、各追加輸注コホートに、脾細胞由来の1×105、2×105、4×105、または2×106追加輸注T細胞を含むcKIT+ HSPC画分を投与した。比較において、スカルプト細胞移植片には、平均2.5×105のT細胞が含まれていた。しかしながら、一部のスカルプト細胞移植片実験では5×106もの多くのスカルプトT細胞を、他の一部のものでは1×105という少ないスカルプトT細胞を使用した。
【０１７６】
完全に不適合のC57Bl/6リンパ球をBALB/cマウスに養子移入する状況において、1×105 T細胞であっても、100%のレシピエントにおいて致死性GVHDを誘導するのに充分であった（図19）。1×105〜4×105の追加輸注T細胞を投与したマウスでは、死亡までの時間が長くなったが、長期間生存したマウスはいなかったことに注意のこと。対照的に、スカルプト細胞移植片処置マウスの94%（30匹/32匹）で、+175日目までの長期生存が示された。いずれのマウスでも、死後解剖で再発の形跡は示されなかった。したがって、スカルプト細胞移植片組成物のT細胞成分は、GVHD応答を緩和するとともにGVL治療有益性を付与する。cKIT+ 磁気富化骨髄細胞への少数のT細胞の単純な追加輸注では同様の結果は観察されない。
【０１７７】
実施例6
allo-HCTの異種移植片モデルにおけるヒト由来スカルプト細胞移植片 対 未加工処理PBMCでのGVHDの開始までの時間遅延
TrimaAccel（登録商標)LRSチャンバの白血球濃縮液を、血小板フェレーシス処置後、4例のヒトドナーから回収した。赤血球を密度勾配（Ficoll）およびACK溶解によって除去した。得られたPBMCを洗浄し、各ドナー由来の2.5×108細胞をスカルプト細胞移植片リンパ球画分に加工処理した。より詳しくは、TregおよびiNKTを、最初にMACSを用いて加工処理した（すなわち、粗選別）。この試料を、抗CD25 PEおよびビオチンコンジュゲート抗iNKT抗体の6B11で染色し、次いで洗浄し、ストレプトアビジンPE-Cy7で染色し、次いで再度洗浄し、抗PEマイクロビーズで染色した。次いで試料を、MiltenyiのAutoMACSのPossel_Sプログラムを用いて陽性富化した。陽性富化画分を、抗CD127 APCおよび抗CD4 PerCPでさらに染色し、BD FACSAriaIIで>98純度%まで、パラメータ:Treg:CD4+CD25+CD127-およびiNKT:CD127+6B11+に従ってさらに精製した。
【０１７８】
AutoMACSカラムの陰性画分を抗CD45RAマイクロビーズでさらに染色し、Deplete_Sプログラムを用いてCD45RA+ 画分中のナイーブT細胞を枯渇させた。残った細胞はCD45RA-CD45RO+であった。これはメモリーT細胞を示す。
【０１７９】
スカルプト細胞移植片を、ドナー間で異なる各サブタイプの最終収率に基づいて配合した。PBMCコホートを、適合ドナー由来のスカルプト細胞移植片組成物中において等しい数のCD3+ T細胞がメモリーT細胞の数に適合するように配合した。最終配合範囲を表4に示す。
【０１８０】
（表４）リンパ球の配合
2020511464.tif 000006
【０１８１】
異種移植片の実験には、免疫不全（NSG）マウスを使用した。これは、機能性のマウス免疫系が、入ってくるヒト組織を種特異的差異に基づいて速やかに拒絶するであろうためである。NSGマウスにはB、T、およびNK細胞がなく、異種移植片の実験に好適な宿主となる。リンパ球を生着させるために宿主をさらに調製するため、マウスに、非致死線量の放射線を投与する。NSGには250 radをRad-Source RS2000照射器から160 KeVで、0.5 mm Cuのフィルターを通して照射し、抗生物質含有飼料に切り換えた。同じ日に、製剤化細胞を各ドナーのコホートあたり5匹のマウスに注射し、上記のようにして追跡した。これとの関連において、ヒトPBMCはロバストなGVHD応答を誘起することが公知である。結果は、スカルプト細胞移植片のリンパ球の投与を受けたマウスの70%が+90日目まで生存しているのに対して、PBMC中の等用量のCD3+細胞の投与を受けたマウスではわずか15%であることを示す（図20参照）。すべての死亡例でGVHDが死因と記録された。マウス組織に対するヒトリンパ球の異種間応答はロバストである;しかしながら、スカルプト細胞移植片は、致死性GVHDの開始を遅延させる（これは、臨床的価値を有し得る）だけでなく、むしろ有意な割合のマウスの持続的生存をもたらす。
【０１８２】
実施例7
制御性T細胞およびiNKTの単離
以下の実験は、スカルプト細胞移植片組成物および治療における使用のためのTregおよびiNKT細胞画分を作製するための方法を示す。末梢血単球（PBMC）を、実施例6に記載のようなバフィーコートLRSチャンバにより3例のドナーから単離した。PBMCをプールし、次いで再懸濁させ、2×108細胞/mlの濃度で染色した。Tregは抗CD25 PEで染色し、iNKT細胞はビオチンコンジュゲート6B11抗体（抗iNKT）で室温にて30分間染色し、洗浄し、次いでストレプトアビジンPE-Cy7で室温にて10分間染色した。過剰の抗体を、細胞をバッファーで洗浄することによって除去した後、抗PEマイクロビーズで2×108細胞/mLにて染色した。細胞を抗PEマイクロビーズで室温にて30分間染色した。染色後、細胞をバッファーで洗浄し、分離前に40ミクロン細孔メッシュのフィルターに通して塊を除去した。CLINIMACS LS TSチュービングセットを使用し、製造業者のCD133富化プロトコル（負荷速度:10 mL/分,3回の再負荷）を用いて、細胞を選別した。TregおよびiNKT富化細胞を陽性画分に収集し、残りの細胞を陰性画分に収集した。各試料の試料の量の測定値との比較で既知量の画分を取り出し、Beckman Coulter Cytoflexで参照ビーズを用いて計数し、収率の計算に使用した。
【０１８３】
PBMCからのTregおよびiNKT細胞の分離のパフォーマンスを、富化画分中のTregおよびiNKT細胞の純度および収率を計算することにより富化前の細胞と比較して評価した。抗PEビーズを用いた代表的な一例の実験では、Tregの純度が約5%から60%に上がった（図21Aおよび表5）。試験した抗PEビーズにより、NKT細胞の純度は0.02%から0.04%に上がった（図21Bおよび表6）。
【０１８４】
（表５）Treg細胞の純度および収率のパーセント
2020511464.tif 000007
【０１８５】
（表６）iNKT細胞の純度および収率のパーセント
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【０１８６】
このデータは、磁気選択試薬を注意深く滴定することにより、高純度の富化細胞を、収率を有害に損なうことなく得ることができることを示す。また、陰性画分は粗製PBMC製品と同様または同一の条件で再加工処理され、より多くの目的細胞が回収され得ることを示す。この予期しない所見により、CLINIMACS後Treg/iNKT画分の目的仕様に合う方法が可能になる。
【０１８７】
実施例8
メモリーT細胞の単離
PBMCを、実施例6に記載のようなバフィーコートLRSチャンバにより3例のドナーから単離した。PBMCをプールし、次いで1×109細胞を2×108細胞/mLで再懸濁させた。細胞を、製造業者の推奨使用量の半分のCD45RAマイクロビーズ（1.0μLの抗CD45RA/6.6×106 PBMCではなく0.5μLの抗CD45RA/6.6×106 PBMC）で染色した。細胞を洗浄し、CLINIMACS Depletion 2.1（6 mL/分の流速）で分離した。陽性画分と陰性画分の両方を採取し、解析した。各試料の試料画分の量の測定値との比較で既知量の画分を取り出し、CD3、CD45RA、およびCD45ROに対する蛍光コンジュゲートモノクローナル抗体で染色し、洗浄し、Beckman Coulter CYTOFLEXフローサイトメーターで参照ビーズを用いて計数し、純度および収率を計算した（図22）。
【０１８８】
ナイーブT細胞（Tn）およびメモリーT細胞の分離のパフォーマンスを、富化画分中のCD3+CD45RA+およびCD3+CD45RO+細胞の純度および収率を計算することにより富化前の細胞と比較して評価した。製造業者の推奨使用量の半分のCD45RAマイクロビーズを使用すると、TmemとTnの比は、出発PBMC試料中での2.25:1から、加工処理試料中では50298:1になった（表7）。さらに、この加工処理後のTmemの収率は27.5%であった。この試験は、より少ない量のCD45RAマイクロビーズを用いたスカルプト細胞移植片の製造の実現可能性を示す。
【０１８９】
（表７）枯渇CD45RA+細胞に対して磁気選別を用いたメモリーT細胞富化のパフォーマンス
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【０１９０】
実施例9
制御性T細胞およびナイーブ制御性T細胞の単離
以下の実験は、Treg集団が本明細書に開示の例示的な方法をもたらす特徴を示す。PBMCを、実施例6に記載のようなバフィーコートLRSチャンバにより、2例のドナーから単離した。PBMCをプールし、次いで再懸濁させ、2×108細胞/mlの濃度で染色した。Tregを、抗CD25磁気マイクロビーズを用いて選別した。CLINIMACS LS TSチュービングセットを使用し、製造業者のCD133枯渇プロトコル（負荷速度:10 mL/分,3回の再負荷）を用いて、細胞を選別した。Treg富化細胞を陽性画分に収集し、残りの細胞を陰性画分に収集した。
【０１９１】
Treg富化画分を、抗CD25 PE、CD4PerCP、CD127APC、CD45RA-FITC、およびCD45RO-APC-Cy7で、製造業者の使用説明書に従って染色した。細胞をバッファーで洗浄することによって、過剰の抗体を除去した。Treg富化画分をBeckman Coulter Cytoflexで参照ビーズを用いて計数し、純度および収率のパーセントの計算に使用した。PBMCからのTregの分離のパフォーマンスを、富化画分中のTreg細胞の純度および収率を計算することにより富化前の細胞と比較して評価した。
【０１９２】
図23Aは、Treg陽性画分が88.5%のCD4+CD25+細胞を含んでおり、そのうち81.0%がCD127+であったことを示す。また、図23Aは、CD4+CD25+CD127+細胞集団（Treg）が67.1%のメモリーTreg（CD45RO+）および17.8%のナイーブTreg（CD45RA+）を含むことを示す。図23Bは、Treg陽性画分中の全TregおよびナイーブTregの純度および収率の要約を示す。
【０１９３】
このデータは、本明細書に記載の方法により、通常はCD45RA枯渇工程中に失われるであろう有意な数のナイーブTregを含むTregの集団が得られることを示す。
【０１９４】
実施例9
6B11のビオチン化
6B11は、インバリアントTCR Va24Ja18に結合する抗体である。しかしながら、この試薬の効力および特異性は、二次フルオロフォアまたは他の分子ハンドルにコンジュゲートさせると、パフォーマンスは通常、不充分なものとなる。しかしながら、用いてビオチン化条件を変えると予期しない良好なパフォーマンスが得られ得る。
【０１９５】
6B11ハイブリドーマを、PBS中pH7.5にて2時間、3つの異なる濃度のEZ-LINK Sulfo-NHS-Biotin（ThermoFisher）で1時間改変し、次いで脱塩した。ビオチン化抗体および条件は以下のとおりである：6B11.1 = 100μM（条件1）、6B11.2 = 250μM（条件2）、および6B11.3 = 1 mM（条件3）。
【０１９６】
iNKT細胞を、6B11.1（条件1）、6B11.2（条件2）、または6B11.3（条件3）抗体を用いて解析し、3例の異なるドナー（ドナー73、ドナー74、およびドナー75）に由来する細胞試料に対する結合を、漸増6B11抗体濃度（0μg/μL、0.015μg/μL、0.032μg/μL、0.062μg/μL、0.0125、0.25μg/μL、0.5μg/μL、および1μg/μL）で評価した。図24Aは、6B11.2ビオチン化抗体が卓越したパフォーマンスを有したことを示す。
【０１９７】
iNKT細胞を、6B11.1（条件1）、6B11.2（条件2）、または6B11.3（条件3）抗体を、CD127およびストレプトアビジンPE-Cy7とともに用いて解析した。図24Bは、条件2で最も明白なiNKT細胞の分離（4.85%）が示されたことを示す。図示した散布図はCD3+ 単一細胞リンパ球に関して予備ゲーティングした。
【０１９８】
上記の種々の態様を合わせてさらなる態様が得られ得る。本明細書において言及した米国特許、米国特許出願公開公報、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許刊行物、例えば非限定的に、2016年11月14日に出願された米国特許仮出願第62/421,979号および2017年3月15日に出願された米国特許仮出願第62/471,769号はすべて、参考文献またはその一部分の組み入れが本開示と矛盾する場合を除き、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。本態様の諸局面は、必要であれば、該種々の特許、出願および刊行物の思想を用いてなおさらなる態様を得るために修正され得る。
【０１９９】
これらおよび他の変更は、本態様に対して上記の詳細説明に鑑みてなされ得る。一般に、以下の特許請求の範囲において、使用している用語は、特許請求の範囲を本明細書および請求項の開示された特定の態様に限定するものと解釈されるべきでなく、考えられ得るあらゆる態様を、かかる特許請求の範囲の権利が及ぶ均等物の完全な範囲とともに含むと解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は本開示によって限定されない。
【図１Ａ】
2020511464.tif 000011
【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【国際調査報告】
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