(57)【要約】  本発明は、幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含む、かゆみの予防、抑制、緩和、改善、又は治療用組成物を提供する。本発明の組成物は、かゆみを引き起こす複数のサイトカイン標的、例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−３１及びＴＳＬＰに対して作用し、様々な原因に起因するかゆみに対する広範囲の適用が可能であり、効果的にかゆみを抑制及び緩和させることができる。また、本発明の組成物をヒトの皮膚に直接適用した場合、かゆみ関連の臨床指数及び紅斑などを顕著に改善させることができる。したがって、本発明の組成物は、かゆみの予防、抑制、緩和、改善、又は治療用の薬学組成物、皮膚外用剤及び化粧料組成物として有用に使用することができる。【選択図】図９Ｂ
2020532489.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含む、かゆみの予防、抑制、緩和、改善、又は治療用薬学組成物。
【請求項２】
前記エキソソームは、次のステップを実行して得られる、請求項１に記載の薬学組成物：
（ａ）幹細胞培養液にトレハロースを添加するステップ、（ｂ）前記トレハロースが添加された幹細胞培養液をろ過するステップ、（ｃ）前記ろ過された幹細胞培養液から、ＴＦＦ（Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を用いてエキソソームを分離するステップ、及び（ｄ）脱塩とバッファー交換（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）に使用される緩衝溶液にトレハロースを添加し、前記トレハロースが添加された緩衝溶液を用いたＴＦＦ（Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を用いて、前記分離されたエキソソームに対する脱塩とバッファー交換（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を行うステップ。
【請求項３】
前記脱塩とバッファー交換は連続的に行われるか、又は断続的に行われることを特徴とする、請求項２に記載の薬学組成物。
【請求項４】
開始体積（ｓｔａｒｔｉｎｇ  ｖｏｌｕｍｅ）に対して少なくとも４倍の体積を有する緩衝溶液を用いて脱塩とバッファー交換を行うことを特徴とする、請求項２に記載の薬学組成物。
【請求項５】
ＴＦＦ（Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）のためにＭＷＣＯ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｃｕｔｏｆｆ）１００，０００Ｄａ、３００，０００Ｄａ、５００，０００Ｄａ又は７５０，０００ＤａのＴＦＦフィルタ、又は０．０５μｍＴＦＦフィルタを使用することを特徴とする、請求項２に記載の薬学組成物。
【請求項６】
前記（ｃ）ステップは、ＴＦＦ（Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を用いて、１／１００乃至１／２５の体積まで濃縮する過程をさらに含む、請求項２に記載の薬学組成物。
【請求項７】
前記ろ過された幹細胞培養液は、ＴＦＦの前に超音波処理（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）されることを特徴とする、請求項２に記載の薬学組成物。
【請求項８】
前記エキソソームは、皮膚組織又は皮膚細胞でＩＬ−４、ＩＬ−３１、及びＴＳＬＰ（Ｔｈｙｍｉｃ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｌｙｍｐｈｏｐｏｉｅｔｉｎ）の発現量を減少させることを特徴とする、請求項１乃至７のいずれか一項に記載の薬学組成物。
【請求項９】
幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含む、かゆみの予防、抑制、緩和、改善、又は治療用の皮膚外用剤。
【請求項１０】
前記エキソソームは、ハイドロゲル、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩、又はヒアルロン酸ゲルのうち少なくとも１種に担持又は混合されている、請求項９に記載の皮膚外用剤。
【請求項１１】
前記ハイドロゲルは、ゲル化ポリマーを多価アルコールに分散させて得られたハイドロゲルであることを特徴とする、請求項１０に記載の皮膚外用剤。
【請求項１２】
前記ゲル化ポリマーは、プルロニック、精製寒天、アガロース、ゲランガム、アルギン酸、カラギーナン、カシアガム、キサンタンガム、ガラクトマンナン、グルコマンナン、ペクチン、セルロース、グアーガム、及びローカストビーンガムからなる群から選ばれた少なくとも１種であり、前記多価アルコールは、エチレングリコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、イソブチレングリコール、ジプロピレングリコール、ソルビトール、キシリトール、及びグリセリンからなる群から選ばれた少なくとも１種であることを特徴とする、請求項１１に記載の皮膚外用剤。
【請求項１３】
幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含む、かゆみの予防、抑制、緩和、又は改善用の化粧料組成物。
【請求項１４】
パッチ、マスクパック、シートマスク、クリーム、トニック、軟膏、懸濁液、乳濁液、ペースト、ローション、ゲル、オイル、パック、スプレー、エアゾール、ミスト、ファンデーション、パウダー、及び油紙で構成された群から選ばれた少なくとも１種の形態に適用することを特徴とする、請求項１３に記載の化粧料組成物。
【請求項１５】
パッチ、マスクパック又はシートマスクの少なくとも一面に塗布又は浸漬されることを特徴とする、請求項１４に記載の化粧料組成物。
【請求項１６】
（ａ）請求項１３に記載の化粧料組成物を哺乳動物の皮膚に直接塗布すること、（ｂ）前記化粧料組成物が塗布又は浸漬されたパッチ、マスクパック又はシートマスクを哺乳動物の皮膚に接触又は付着すること、若しくは前記（ａ）及び（ｂ）を順次進行することを含む、治療用を除く哺乳動物の皮膚の状態を調節する美容方法。
【請求項１７】
（ｃ）前記化粧料組成物が適用された哺乳動物の皮膚に微細電流を流してイオントフォレシス（ｉｏｎｔｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）を行うことをさらに含む、請求項１６に記載の美容方法。
【請求項１８】
イオントフォレシス装置を前記哺乳動物の皮膚に接触又は付着させることをさらに含む、請求項１７に記載の美容方法。
【請求項１９】
前記イオントフォレシス装置は、可撓性電池、リチウムイオン二次電池、アルカリ電池、乾電池、水銀電池、リチウム電池、ニッケルカドミウム電池、及び逆電気透析(ｒｅｖｅｒｓｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｄｉａｌｙｓｉｓ)電池で構成された群から選ばれた少なくとも１種の電池を含むか、前記少なくとも１種の電池が装着されたパッチ、マスクパック又はシートマスクを含む、請求項１８に記載の美容方法。
【請求項２０】
請求項１乃至７のいずれか一項に記載の薬学組成物の治療学的に有効な量を哺乳動物に投与するステップを含む、かゆみの予防、抑制、緩和、改善、又は治療する方法。
【請求項２１】
前記哺乳動物はヒト、イヌ、ネコ、齧歯類、ウマ、ウシ、サル、又はブタである、請求項２０に記載のかゆみの予防、抑制、緩和、改善、又は治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含む組成物のかゆみの予防、抑制、緩和、改善、又は治療の用途に関する。
【０００２】
また、本発明は、前記組成物を含むかゆみの予防、抑制、緩和、改善、又は治療用薬学組成物、皮膚外用剤及び化粧料組成物に関する。
【０００３】
さらに、本発明は、かゆみの予防、抑制、緩和、改善、又は治療において臨床的適用が可能な高純度でありながら、粒子サイズ分布が均一な幹細胞由来のエキソソームを大量に得ることができ、このように得られた機能的活性に優れた幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含む組成物を低価で大量に提供することができる臨床的及び商業的に優れた技術に関する。
【背景技術】
【０００４】
かゆみ又は掻痒症（ｐｒｕｒｉｔｕｓ）は、基本的にかゆみが病気そのものである症状である。かゆみは、様々な病態及び疾患として現れる不快な症状であり、特に皮膚疾患と全身疾患としてよく見られる症状である。かゆみは、痛みとともにほとんどの皮膚疾患でよく誘発される感覚であり、臨床では、皮膚を掻いたりこすりたい欲望を引き起こす不快な感覚と定義することができる。
【０００５】
かゆみのために皮膚を掻くと傷が生じて細菌感染及び炎症が伴われる。このような細菌感染及び炎症によりＴ細胞及びマクロファージのような免疫細胞が活性化されて、複数のサイトカイン等が分泌され、かゆみをさらに悪化させる。かゆみがある患者は、意識的又は無意識のうちに患部を掻く。患部をひどく掻いたりこすったりする場合、掻いた痕跡がひどく残ったり、紅斑、亀裂、潰瘍、蕁麻疹又は色素沈着等の様々な副作用が発生することがある。
【０００６】
かゆみの原因としては、皮膚科的原因、全身性原因、神経病症性原因及び心因性原因等が知られている。また、かゆみは物理的、機械的、化学的又は生物学的因子をはじめ様々な刺激によって誘発されたり、さらに悪化することもある。例えば、かゆみは気候、粒子状物質、洗剤、カビやバクテリアの皮膚感染、昆虫に刺されるなどの体内侵入物を含む環境的誘発因子、糖尿病、尿毒症、胆道閉鎖、悪性腫瘍、肝臓疾患、腎不全、腎臓透析、痛風、甲状腺疾患、血液疾患、鉄分欠乏、寄生虫症の妄想、真性赤血球増加症（ｐｏｌｙｃｙｔｈｅｍｉａ  ｒｕｂｒａ  ｖｅｒａ）、胆汁うっ滞及びホジキン病（Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）等の疾患、妊娠、薬剤性又は心因性により起こることがある。かゆみとしての感覚は、かゆみ刺激物質が表皮−真皮境界部に存在する多刺激対応性の神経終末（かゆみ受容器）に作用し、発生したインパルスが脊髄視床路、視床、大脳皮質の順に到達して起こると考えられている（非特許文献１）。
【０００７】
原因に応じたかゆみを分類すると、１）発作的に発生する発作性のかゆみ、２）冬季のかゆみ、肛門のかゆみ、外陰のかゆみ、陰嚢のかゆみ、水因性のかゆみ、頭皮のかゆみを含む皮膚のかゆみ、３）胆汁かゆみ、慢性腎不全、悪性腫瘍、鉄欠乏性貧血、真性赤血球増加症、甲状腺機能亢進症と機能低下症、糖尿病、エイズを含む内科疾患に伴うかゆみ、４）慢性単純性苔癬、痒疹、抜毛癖、神経症性擦創、皮膚を侵す行動障害、寄生虫症妄想などの精神皮膚疾患のかゆみがあり、５）その他、風邪などに伴う鼻のかゆみ及びのどのかゆみ、結膜炎などの眼科疾患に伴う眼球のかゆみ、歯科的疾患に伴う口腔内のかゆみなどがある。
【０００８】
現在までの研究結果によると、かゆみ媒介物質が複数の皮膚疾患でかゆみを誘発することが知られているが、免疫細胞（Ｔ細胞、マクロファージ等）から分泌された複数のサイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＩＬ−３１等）及びヒスタミンがかゆみを引き起こすことが知られている。また、最近では、ＴＳＬＰ（Ｔｈｙｍｉｃ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｌｙｍｐｈｏｐｏｉｅｔｉｎ）が皮膚炎の重症度と関連しており、かゆみの症状の原因と知られている（非特許文献２）。
【０００９】
国家健康情報ポータル医学情報（http://health.mw.go.kr）によると、かゆみを誘発する媒介物質としては、ヒスタミン、セロトニン（Ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ）、プロスタグランジンＥ（Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｅ）、タキキニン（Ｔａｃｈｙｋｉｎｉｎ）、サイトカイン（Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）、プロテアーゼ（Ｐｒｏｔｅａｓｅ）、オピオイドペプチド（ｏｐｉｏｉｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ）、血小板活性因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）等があると知られている。
【００１０】
前記かゆみ誘発物質のうちサイトカインは、すべての真核細胞（ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｃｅｌｌ）で生成される低分子量のタンパク質で、細胞表面受容体に作用し、インターロイキン、ケモカイン、インターフェロン等を含む。これらのうちＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＩＬ−３１、ＴＳＬＰ等は、かゆみを誘発する代表的なサイトカインとして知られている。
【００１１】
かゆみの治療法として、現在までに、抗ヒスタミン剤、ステロイド、抗生剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、麻酔剤、生菌剤、免疫抑制剤、光線治療等の様々な治療法があるが、その治療効果が一時的であったり、限定的にかゆみの種類に応じて特異性を示す問題があり、副腎皮質ホルモン剤及びコルチコステロイド（ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄ）は副作用を考慮して、急性又は重度の場合に限り、短期間の使用をすべき問題がある。
【００１２】
このような問題点を勘案して天然物を用いて、かゆみを抑制ないしは緩和しようとする研究が活発である。このような天然物を原料とするかゆみの抑制又は緩和用組成物の場合、天然抽出物内の有効成分の含有量が少ない関係でかゆみの抑制又は緩和効果を得るためには、大量の使用が必要であり、これらの大部分は、天然物素材という点をマーケティングに活用しているだけであり、かゆみの抑制又は緩和の実質的効能については、科学的な研究がもっと必要な状況である。
【００１３】
一方、幹細胞を用いて、皮膚の状態や疾患を改善又は治療しようとする方法が提案されている。胚性幹細胞又は胎児組織由来幹細胞は、分化能及び再生治療能力に優れており、拒否反応が少ないが、倫理的な問題で臨床に適用することができず、腫瘍を形成する危険性がある。これに対する代案として、成体幹細胞を用いて、皮膚の状態や疾患を改善又は治療する方法が提案された。しかし、患者自身の成体幹細胞でなく他人の成体幹細胞を用いた場合、移植片対宿主病（ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｈｏｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ）を引き起こす危険性があり、自己成体幹細胞を用いて治療をするためには、患者から成体幹細胞を採取した後、これを培養する過程が必要で、複雑で費用が多くかかるという問題がある。
【００１４】
最近では、前述のような幹細胞の問題点を勘案して成体幹細胞を培養して得られた培養液を用いて、皮膚の状態や疾患を改善又は治療しようとする試みがある。しかし、成体幹細胞の培養液には、成体幹細胞が分泌する様々なタンパク質、サイトカイン、成長因子などが含まれているのに対し、細胞が成長して分泌された老廃物、汚染防止のために添加された抗生剤、動物由来の血清等の成分も含まれているので、皮膚に使用する場合、様々な危険にさらされる可能性が高い。
【００１５】
最近、細胞分泌物（ｓｅｃｒｅｔｏｍｅ）に細胞の行動（ｂｅｈａｖｉｏｒ）を調節する様々な生体活性因子が含まれているという研究が報告されており、特に細胞分泌物内には細胞間シグナル伝達機能を有する「エキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）」が含まれており、その成分と機能に対する研究が活発に進められている。
【００１６】
細胞は、細胞外環境に様々な膜（ｍｅｍｂｒａｎｅ）タイプの小胞体を放出するが、通常、このような放出小胞体を細胞外小胞（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ、ＥＶｓ）と呼んでいる。細胞外小胞は、細胞膜由来小胞体、エクトソーム（ｅｃｔｏｓｏｍｅｓ）、シェディング小胞体（ｓｈｅｄｄｉｎｇ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ）、マイクロパーティクル（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）、エキソソーム等と呼ばれており、場合によっては、エキソソームとは区別されて用いられることもある。
【００１７】
エキソソームは細胞膜の構造と同じ二重リン脂質膜からなる数十ないし数百ナノメートルの大きさの小胞体で内部にはエキソソームカーゴ（ｃａｒｇｏ）と呼ばれるタンパク質、核酸（ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等）などが含まれている。エキソソームカーゴには、広範囲のシグナル伝達要素（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒｓ）が含まれており、これらのシグナル伝達要素は、細胞タイプに特異的で分泌細胞の環境に応じて異なるように調節されることが知られている。エキソソームは細胞が分泌する細胞間のシグナル伝達媒体で、これにより伝達された様々な細胞シグナルは、標的細胞の活性化、成長、移動、分化、脱分化、死滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）、壊死（ｎｅｃｒｏｓｉｓ）を含む細胞の行動を調節することが知られている。エキソソームは由来した細胞の性質及び状態に応じて特異的な遺伝物質と生体活性因子が含まれている。増殖する幹細胞由来のエキソソームの場合、細胞の移動、増殖及び分化のような細胞行動を調節し、組織再生に関する幹細胞の特性が反映されている（非特許文献３）。
【００１８】
しかし、エキソソームを用いた一部疾患の治療に対する可能性の提示など、様々な研究が行われているにもかかわらず、より綿密な臨床及び非臨床研究が必要であり、特にエキソソームが作用する様々な標的を科学的に究明してエキソソームを様々な疾患の治療に応用できる技術の開発が必要なのが実情である。
【００１９】
本発明者らは、かゆみと関連して、従来知られている治療剤に比べて効果が優れ、安全なかゆみの抑制及び緩和用組成物を開発しようと努力した。そこで、本発明者らは、幹細胞由来のエキソソームの新たな用途について鋭意研究を重ねていたところ、幹細胞培養液から分離されたエキソソームが前述したような幹細胞自体や幹細胞培養液の安全性の問題を解決することができ、かゆみの予防、抑制、緩和、改善、又は治療に効果的であることを確認して、本発明を完成した。
【００２０】
一方、前記した背景技術として説明された事項は、本発明の背景に対する理解を進めるためのものであり、本発明の「先行技術」として利用されうるという承認として引用したものではないことを理解しなければならない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２１】
【非特許文献１】宮地良樹著、「皮膚掻痒症治療に対するアプローチ」、先端医学社、１９９６、ｐ．２２
【非特許文献２】Ｗｉｌｓｏｎ  ＳＲ  ｅｔ  ａｌ．、“Ｔｈｅ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ａｔｏｐｉｃ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ＴＳＬＰ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｔｏ  ｉｎｄｕｃｅ  ｉｔｃｈ”、Ｃｅｌｌ、２０１３、  １５５、２、  ｐ．２８５−２９５
【非特許文献３】Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２００２、２、  ｐ．５６９−５７９
【非特許文献４】Ｖａｓｉｌｉｙ  Ｓ．  Ｃｈｅｒｎｙｓｈｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｓｉｚｅ  ａｎｄ  ｓｈａｐｅ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙｄｒａｔｅｄ  ａｎｄ  ｄｅｓｉｃｃａｔｅｄ  ｅｘｏｓｏｍｅｓ”、  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０１５、４０７、１２、  ｐ．３２８５−３３０１、  ＤＯＩ  １０．１００７／ｓ００２１６−０１５−８５３５−３
【非特許文献５】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ、２００１、１１７、４、  ｐ．９７７  −９８３
【非特許文献６】Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２００６、１１７、２、  ｐ．４１１−４１７
【非特許文献７】Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２０１８、７３、１、  ｐ．２９−３６
【非特許文献８】Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２０１７、３７６、９、  ｐ．８２６−８３５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
本発明の目的は、幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含む組成物のかゆみの予防、抑制、緩和、改善、又は治療の用途を提供することにある。
【００２３】
本発明の他の目的は、前記組成物を含むかゆみの予防、抑制、緩和、改善、又は治療用の薬学組成物、皮膚外用剤、及び化粧料組成物を提供することにある。
【００２４】
本発明のさらなる目的は、高純度でありながら、粒子サイズ分布が均一な幹細胞由来のエキソソームを大量に得ることができ、このように得られた機能的活性に優れた幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含む組成物を提供することにある。
【００２５】
本発明のさらなる目的は、前記組成物を用いて、かゆみの予防、抑制、緩和、改善、又は治療する方法を提供することにある。
【００２６】
本発明のさらなる目的は、前記組成物を用いて、治療用を除く哺乳動物の皮膚の状態を調節する美容方法を提供することにある。
【００２７】
しかし、前述したような本発明の課題は例示的なものであり、これにより本発明の範囲が制限されるものではない。また、本発明の他の目的及び利点は、下記の発明の詳細な説明、請求の範囲及び図面によってより明確になる。
【課題を解決するための手段】
【００２８】
前記のような目的を達成するために、本発明は、幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含む、かゆみの予防、抑制、緩和、改善、又は治療用組成物を提供する。
【００２９】
また、本発明は、かゆみの予防、抑制、緩和、改善、又は治療において臨床的適用が可能な高純度でありながら、粒子サイズ分布が均一な幹細胞由来のエキソソームを大量に得ることができ、このように得られた機能的活性に優れた幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含む組成物を低価で大量に提供することができる臨床的及び商業的に優れた新規な技術を提供する。
【００３０】
本明細書において、用語「エキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅｓ）」は、細胞膜の構造と同じ二重の脂質膜からなる数十ないし数百ナノメートル（好ましくは約３０〜２００ｎｍ）サイズの小胞体を意味する（ただし、分離対象となる細胞の種類、分離方法及び測定方法に従って、エキソソームの粒子サイズは可変でありうる）（非特許文献４）。エキソソームにはエキソソームカーゴ（ｃａｒｇｏ）と呼ばれるタンパク質、核酸（ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等）等が含まれている。エキソソームカーゴには広範囲のシグナル伝達要素（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒｓ）が含まれており、これらのシグナル伝達要素は、細胞タイプに特異的で分泌細胞の環境に応じて異なるように調節されることが知られている。エキソソームは細胞が分泌する細胞間のシグナル伝達媒体であり、これにより伝達された様々な細胞シグナルは、標的細胞の活性化、成長、移動、分化、脱分化、死滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）、壊死（ｎｅｃｒｏｓｉｓ）を含む細胞の行動を調節すると知られている。
【００３１】
本明細書において、用語「かゆみ」又は「掻痒症」は、特に制限されず、一つの例示であり、発作性のかゆみ、冬季のかゆみ、肛門のかゆみ、外陰のかゆみ、陰嚢のかゆみ、水因性のかゆみ、頭皮のかゆみ、鼻のかゆみ、のどのかゆみ、口腔内のかゆみ、及び眼球のかゆみ；胆汁かゆみ、慢性腎不全、悪性腫瘍、鉄欠乏性貧血、真性赤血球増加症、甲状腺機能亢進症、甲状腺機能低下症、糖尿病、及びエイズなどの内科疾患に伴うかゆみ；及び慢性単純性苔癬、痒疹、抜毛癖、神経症性擦創、皮膚を侵す行動障害、及び寄生虫症妄想などの精神皮膚疾患に伴うかゆみを挙げることができる。しかし、本発明では、以上に列挙したかゆみ以外の様々な原因のかゆみを排除するものではないのは言うまでもない。本発明は、当業界に知られているすべてのかゆみ、例えば皮膚科的原因のかゆみ、全身性原因のかゆみ、神経病症性原因のかゆみ、及び心因性原因のかゆみなどを含む。
【００３２】
本明細書において、用語「イオントフォレシス（ｉｏｎｔｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）」は、有効物質が適用された皮膚に微細電流を流して電位差を与え、皮膚の電気的環境を変化させることによりイオン化した有効成分を電気的反発力で皮膚を透過させる方法を意味する。本発明の一具体例に用いられるイオントフォレシス（ｉｏｎｔｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）は、皮膚上の電極パッチに外部電源からの電流が流れ込み、皮膚に微細電流が導入される方式、電極パッチ自体にバッテリーが装着されて、皮膚に微細電流が導入される方式、高濃度電解質溶液及び低濃度電解質溶液との間のイオン濃度差により電流を発生させる逆電気透析（Ｒｅｖｅｒｓｅｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏｄｉａｌｙｓｉｓ）手段が装着されたパッチを介して皮膚に微細電流が導入される方式などを含んでもよい。しかし、本発明はこれに限定されるものではなく、様々な方式のイオントフォレシスを用いることができるのは言うまでもない。
【００３３】
一方、幹細胞由来のエキソソームを用いた、限定的なシワ改善及び皮膚再生効果が報告されている。しかし、前記従来技術におけるエキソソームを用いた皮膚再生は、かゆみの予防、抑制、緩和、改善、又は治療に関するものではなく、皮膚組織の再生によりしわを改善したり、皮膚の弾力を回復させることに関するものであった。そして幹細胞、幹細胞培養液などを用いて、皮膚の真皮層を再生して創傷を治療し、皮膚組織を再生して皮膚の弾力を改善しようとした試みはあるが、幹細胞培養液から分離精製されたエキソソームを使用するとき、前述したように定義された「かゆみの予防、抑制、緩和、改善、又は治療」の効果があるものについては公知されたところはなかった。
【００３４】
現在までに大量培養が可能な幹細胞を培養した後、幹細胞培養液から大量に経済的に分離精製されたエキソソームをかゆみの予防、抑制、緩和、改善、又は治療に臨床的に適用可能に具現した治療剤は開発されたことがない。例えば、脂肪由来の脂肪幹細胞（ａｄｉｐｏｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）は、脂肪吸引術のような簡単な施術により大量に入手可能であり、骨髄、臍帯又は臍帯血などに比べて約４０倍程度の幹細胞があり、商業的には最も原価が安く生産量が多いが、脂肪内に細胞残骸物、老廃物、タンパク質及び巨大粒子のような不純物が多く、脂肪由来幹細胞培養液から高純度でありながら、粒子サイズ分布が均一なエキソソームを経済的で大量に分離することは難しい。したがって、経済性の面で幹細胞培養液から高純度の粒子サイズ分布が均一なエキソソームを大量に分離することは、技術的な障壁があるといえる。
【００３５】
本発明の組成物は、薬学組成物、皮膚外用剤又は化粧料組成物として適用されるとき、有効成分として含有された幹細胞由来のエキソソームがかゆみの予防、抑制、緩和、改善、又は治療に有意な効果を示し、幹細胞自体や幹細胞培養液の安全性の問題を解決することができる。したがって、本発明のかゆみの予防、抑制、緩和、改善、又は治療用組成物に含まれる幹細胞由来のエキソソームは、従来の公知の制限的なシワ改善及び皮膚再生とは全く異なるメカニズムでかゆみを予防、抑制、緩和、改善、又は治療し、このような効能は、従来技術からは全く予測できないものであることを明らかにしておく。
【００３６】
本発明の一具体例のかゆみの予防、抑制、緩和、改善、又は治療用組成物は、幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含む。
【００３７】
本発明の一具体例の組成物において、前記エキソソームは次のステップを実行して得ることができる：（ａ）幹細胞培養液にトレハロースを添加するステップ、（ｂ）前記トレハロースが添加された幹細胞培養液をろ過するステップ、（ｃ）前記ろ過された幹細胞培養液から、ＴＦＦ（Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を用いてエキソソームを分離するステップ、及び（ｄ）脱塩とバッファー交換（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）に使用される緩衝溶液にトレハロースを添加し、前記トレハロースが添加された緩衝溶液を用いたＴＦＦ（Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を用いて、分離された前記エキソソームに対する脱塩とバッファー交換（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を行うステップ。
【００３８】
本発明の一具体例の組成物において、前記（ｄ）ステップで脱塩とバッファー交換（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）に使用される緩衝溶液にトレハロースを添加すると、粒子サイズ分布が均一で純度の高いエキソソームを効果的に得ることができる（図６Ａ〜図６Ｅ参照）。
【００３９】
一方、本発明においてトレハロースは、細胞残骸物、老廃物、タンパク質及び巨大粒子のような不純物に対してエキソソームを効率的に分別できる機能を付与する。
【００４０】
本発明の一具体例の組成物において、前記脱塩とバッファー交換は連続的又は断続的に行うことができる。開始体積（ｓｔａｒｔｉｎｇ  ｖｏｌｕｍｅ）に対して少なくとも４倍、好ましくは６倍〜１０倍以上、より好ましくは１２倍以上の体積を有する緩衝溶液を用いて脱塩とバッファー交換を行うことができる。
【００４１】
本発明の一具体例の組成物において、ＴＦＦのためにＭＷＣＯ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｃｕｔｏｆｆ）１００，０００Ｄａ（Ｄａｌｔｏｎ）、３００，０００Ｄａ、５００，０００Ｄａ又は７５０，０００ＤａのＴＦＦフィルタ、又は０．０５μｍＴＦＦフィルタを使用することができる。
【００４２】
本発明の一具体例の組成物において、前記（ｃ）のステップは、ＴＦＦ（Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を用いて１／１００乃至１／２５の体積まで濃縮する過程をさらに含むことができる。本発明の一具体例の組成物において、前記ろ過された脂肪幹細胞培養液はＴＦＦの前に超音波処理（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）されてもよい。
【００４３】
本発明の一具体例の組成物において、前記エキソソームは、皮膚組織又は皮膚細胞でＩＬ−４、ＩＬ−３１、及びＴＳＬＰ（Ｔｈｙｍｉｃ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｌｙｍｐｈｏｐｏｉｅｔｉｎ）の発現量を減少させることを特徴とする。
【００４４】
本発明の一具体例の組成物において、前記幹細胞の種類は限定されないが、間葉系幹細胞、例えば脂肪、骨髄、臍帯又は臍帯血由来の幹細胞であることが好ましく、脂肪由来幹細胞であることがより好ましい。前記脂肪由来幹細胞の種類は、病原体による感染の危険性がなく、免疫拒否反応を起こさないものであれば制限されないが、ヒト脂肪由来幹細胞であることが好ましい。
【００４５】
本発明の一具体例の組成物は、先に列挙されたような様々な原因に起因するかゆみの予防、抑制、緩和、改善、又は治療に効果的に使用することができる。
【００４６】
本発明の一具体例の組成物は、薬学組成物として製造することができる。本発明の一具体例の組成物が薬学組成物として製造される場合、本発明の一具体例による薬学組成物は、経口又は非経口の様々な剤形であってもよい。
【００４７】
本発明の一具体例の薬学組成物は、薬学的に許容可能な担体、賦形剤又は希釈剤等を含むことができる。前記担体、賦形剤及び希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、トレハロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース（ｍｉｃｒｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、及び鉱物油などを挙げることができ、これに限定されない。本発明の一具体例の薬学組成物は、通常の方法によって散剤、丸剤、錠剤、カプセル剤、懸濁剤、エマルジョン、シロップ、顆粒剤、エリキシル剤（ｅｌｉｘｉｒｓ）、エアロゾルなどの経口投与用製剤、外用剤、坐剤、又は滅菌注射溶液の形態に製剤化して使用することができる。
【００４８】
本発明の一具体例の薬学組成物の投与は、任意の適切な方法で患者に所定の物質を導入することを意味し、前記薬学組成物の投与経路は、薬物が目的の組織に到達することができる限り、あらゆる一般的な経路を通じて投与することができる。例えば、本発明の一具体例の薬学組成物は、経口又は非経口投与することができ、非経口投与には、経皮投与、腹腔内投与、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、局所投与、直腸内投与などを挙げことができる。しかし、これに制限されるものではなく、当業界で知られている様々な投与方法を排除しない。また、本発明の一具体例の薬学組成物は、活性物質が標的組織又は細胞に移動することができる任意の装置によって投与することができる。また、本発明の一具体例の薬学組成物の有効量は、疾患の治療効果を期待するために投与に要求される量を意味する。
【００４９】
本発明の一具体例の薬学組成物の非経口投与用製剤は、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、又は坐剤であってもよい。本発明の一具体例の薬学組成物の非経口投与用製剤は、注射剤として製造されてもよい。本発明の一具体例の注射剤は、水性注射剤、非水性注射剤、水性懸濁注射剤、非水性懸濁注射剤、若しくは溶解又は懸濁して使用する固形注射剤などであってもよいが、これらに限定されるものではない。本発明の一具体例の注射剤は、その種類に応じて注射用蒸留水、植物油（例えば、落花生油、ごま油、ツバキ油等）、モノグリセリド、ジグリセリド、プロピレングリコール、カンフル、安息香酸エストラジオール、次サリチル酸ビスマス、アルセノベンゾールナトリウム、又は硫酸ストレプトマイシンの少なくとも１種を含むことができ、選択的に安定剤や防腐剤を含むことができる。
【００５０】
本発明の一具体例の薬学組成物の配合比率は、前述のような追加成分の種類や量、形態などに応じて適当に選択することができる。例えば、注射剤全量に対して、本発明の薬学組成物は、約０．１〜９９重量％、好ましくは約１０〜９０重量％程度含まれてもよい。また、本発明の一具体例の薬学組成物の適切な投与量は、患者の疾患の種類、疾患の軽重、剤形の種類、製剤化方法、患者の年齢、性別、体重、健康状態、食餌、排泄率、投与時間及び投与方法によって調節することができる。例えば、成人に本発明の一具体例の薬学組成物を投与する場合、一日に０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの用量で１回〜数回に分けて投与することができる。
【００５１】
一方、本発明の一具体例の組成物が皮膚外用剤及び／又は化粧料組成物として製造される場合、本発明の効果を損なわない範囲内で、通常、化粧品や皮膚外用剤に用いられる成分、例えば保湿剤、酸化防止剤、油性成分、紫外線吸収剤、乳化剤、界面活性剤、増粘剤、アルコール類、粉末成分、色材、水性成分、水、各種皮膚栄養剤等を必要に応じて適宜配合することができる。
【００５２】
また、本発明の一具体例の皮膚外用剤は、幹細胞由来のエキソソーム以外に、その作用（かゆみの予防、抑制、緩和、改善、又は治療等）を損なわない限度で、従来から使用されてきたかゆみ治療剤及び／又は保湿剤を共に混合して使用することができる。例えば、本発明のエキソソームは、ハイドロゲル、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩（例えば、ヒアルロン酸ナトリウム等）、又はヒアルロン酸ゲルのうち少なくとも１種に担持又は混合されてもよい。本発明の一具体例の皮膚外用剤において、前記ハイドロゲルの種類は限定されないが、 ゲル化ポリマーを多価アルコールに分散させて得られたハイドロゲルであることが好ましい。前記ゲル化ポリマーは、プルロニック、 精製寒天、アガロース、ゲランガム、アルギン酸、カラギーナン、カシアガム、キサンタンガム、ガラクトマンナン、グルコマンナン、ペクチン、セルロース、グアーガム、及びローカストビーンガムからなる群から選ばれた少なくとも１種であってもよく、前記多価アルコールは、エチレングリコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、イソブチレングリコール、ジプロピレングリコール、ソルビトール、キシリトール、及びグリセリンからなる群から選ばれた少なくとも１種であってもよい。
【００５３】
本発明の一具体例の皮膚外用剤及び／又は化粧料組成物は、例えば、パッチ、マスクパック、シートマスク、クリーム、トニック、軟膏、懸濁液、乳濁液、ペースト、ローション、ゲル、オイル、パック、スプレー、エアゾール、ミスト、ファンデーション、パウダー、油紙などの様々な形態に適用することができる。例えば、前記皮膚外用剤及び／又は化粧料組成物は、パッチ、マスクパック又はシートマスクの少なくとも一面に塗布又は浸漬することができる。
【００５４】
本発明の一具体例の皮膚外用剤が化粧料組成物として製造される場合、かゆみの予防、抑制、緩和又は改善させる目的で使用され、化粧品剤形は、当業界で通常的に製造されるいかなる剤形でも製造することができる。例えばパッチ、マスクパック、シートマスク、柔軟化粧水、栄養化粧水、収斂化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、アイクリーム、クレンジングクリーム、エッセンス、アイエッセンス、クレンジングローション、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、サンスクリーン、口紅、石鹸、シャンプー、界面活性剤含有クレンジング、入浴剤、ボディローション、ボディクリーム、ボディオイル、ボディエッセンス、ボディ洗浄剤、染毛剤、ヘアトニックなどに剤形化することができるが、これに限定されるものではない。
【００５５】
本発明の一具体例の皮膚外用剤及び／又は化粧料組成物は、皮膚外用剤及び／又は化粧品に通常的に用いられる成分を含み、例えば抗酸化剤、安定化剤、溶解化剤、ビタミン、顔料、及び香料のような通常の補助剤そして担体を含むことができる。また、皮膚外用剤及び／又は化粧料組成物に対するそれぞれの剤形において、他の成分は、皮膚外用剤及び／又は化粧料組成物の種類又は使用目的などによって、当業者が困難なく、適宜選定して配合することができる。
【００５６】
本発明の他の具体例は、前記化粧料組成物を用いて、治療用を除く哺乳動物の皮膚の状態を調節する美容方法を提供する。本発明の美容方法において、皮膚の状態の調節とは皮膚の状態を改善させること及び／又は、皮膚の状態を予防的に調節することを意味し、皮膚の状態の改善とは皮膚組織の外観及び感覚の視覚的及び／又は触覚的に知覚することができる肯定的な変化を意味する。
【００５７】
本発明の一具体例の美容方法は、（ａ）前記化粧料組成物を哺乳動物の皮膚に直接塗布すること、（ｂ）前記化粧料組成物が塗布又は浸漬されたパッチ、マスクパック又はシートマスクを哺乳動物の皮膚に接触又は付着すること、若しくは前記（ａ）及び前記（ｂ）を順次進行することを含む。
【００５８】
本発明の一具体例の美容方法は、前記化粧料組成物が適用された哺乳動物の皮膚に微細電流を流してイオントフォレシス（ｉｏｎｔｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）を行うことをさらに含むことができる。また、本発明の一具体例の美容方法は、イオントフォレシス装置を前記哺乳動物の皮膚に接触又は付着させることをさらに含むことができる。
【００５９】
本発明の一具体例の美容方法において、前記イオントフォレシス装置は、可撓性電池、リチウムイオン二次電池、アルカリ電池、乾電池、水銀電池、リチウム電池、ニッケルカドミウム電池、及び逆電気透析(ｒｅｖｅｒｓｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｄｉａｌｙｓｉｓ)電池から構成された群から選ばれた少なくとも１種の電池を含むか、前記少なくとも１種の電池が装着されたパッチ、マスクパック又はシートマスクを含むことができる。
【００６０】
本発明のもう一つの具体例は、前記薬学組成物の治療学的に有効な量を哺乳動物に投与するステップを含む、かゆみの予防、抑制、緩和、改善、又は治療する方法を提供する。
【００６１】
本発明のかゆみの予防、抑制、緩和、改善、又は治療する方法において、前記哺乳動物はヒト、イヌ、ネコ、齧歯類、ウマ、ウシ、サル、又はブタであってもよい。
【発明の効果】
【００６２】
本発明の組成物は、かゆみを引き起こす複数のサイトカイン標的、例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−３１及びＴＳＬＰに対して作用し、様々な原因に起因するかゆみに対する広範囲の適用が可能であり、効果的にかゆみを抑制及び緩和させることができる。また、本発明の組成物をヒトの皮膚に直接適用した場合、かゆみ関連の臨床指数及び紅斑などを顕著に改善させることができる。したがって、本発明の組成物は、かゆみの予防、抑制、緩和、改善、又は治療用の薬学組成物、皮膚外用剤及び化粧料組成物として有用に使用することができる。
【００６３】
また、本発明は、高純度でありながら、粒子サイズ分布が均一な幹細胞由来のエキソソームを低価で大量に得ることができる。したがって、本発明は、機能的活性に優れた幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含む組成物を低価で大量に提供することができる。また、本発明の組成物は、スケールアップ（ｓｃａｌｅ−ｕｐ）が可能であり、ＧＭＰ（Ｇｏｏｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ）にも適している。
【００６４】
一方、前述のような効果によって、本発明の範囲が制限されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】本発明の一具体例により幹細胞培養液からエキソソームを製造する方法においてエキソソームを分離及び精製する過程を説明するフローチャートである。
【図２】本発明の一具体例により幹細胞培養液からエキソソームを製造するステップ（ｓｔｅｐ）別に溶液内に含まれているタンパク質の総量の割合（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を測定した結果を示す。各ステップ別のタンパク質総量の割合は、幹細胞培養液全体に対するタンパク質総量の相対的な割合で示した。実験結果は、２つの異なるバッチから得られた結果をそれぞれ示した。
【図３】本発明の一具体例により得られたエキソソームの生産性（ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）と純度（ｐｕｒｉｔｙ）を測定した結果を図示したものである。エキソソームの生産性は、「幹細胞培養液（ＣＭ）単位ｍＬ当り得られたエキソソームの粒子数」で計算し、エキソソームの純度は、「最終分画物に含まれているタンパク質の単位μｇ当りエキソソームの粒子数」で計算した。実験結果は、５つの異なるバッチ（ｂａｔｃｈ）から得られた結果を示した。
【図４Ａ】本発明の一具体例によって得られたエキソソームの物理的特性の分析結果を示したものである。ＴＲＰＳ（ｔｕｎａｂｌｅ  ｒｅｓｉｓｔｉｖｅ  ｐｕｌｓｅ  ｓｅｎｓｉｎｇ）分析による粒子サイズ分布と粒子数を示す。
【図４Ｂ】本発明の一具体例によって得られたエキソソームの物理的特性の分析結果を示したものである。ＮＴＡ（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｔｒａｃｋｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓ）分析による粒子サイズ分布と粒子数を示す。
【図４Ｃ】本発明の一具体例によって得られたエキソソームの物理的特性の分析結果を示したものである。ＴＥＭ（ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）分析による粒子画像を倍率により図示した。
【図４Ｄ】本発明の一具体例によって得られたエキソソームの物理的特性の分析結果を示したものである。本発明の一具体例によって得られたエキソソームのウエスタンブロットの結果を示す。
【図４Ｅ】本発明の一具体例によって得られたエキソソームの物理的特性の分析結果を示したものである。本発明の一具体例によって得られたエキソソームに対するマーカー分析においてＣＤ６３及びＣＤ８１のフローサイトメトリー分析の結果を示す。
【図５Ａ】トレハロース添加によって、粒子サイズ分布が均一で純度の高いエキソソームが得られることを示す粒子サイズ分布に関するＮＴＡ分析結果を示す。添加されたトレハロースの量が増加するにつれて、単一のピークを有する粒子サイズ分布の結果を得ることができる。
【図５Ｂ】トレハロース添加によって、粒子サイズ分布が均一で純度の高いエキソソームが得られることを示す粒子サイズ分布に関するＮＴＡ分析結果を示す。添加されたトレハロースの量が増加するにつれて、単一のピークを有する粒子サイズ分布の結果を得ることができる。
【図５Ｃ】トレハロース添加によって、粒子サイズ分布が均一で純度の高いエキソソームが得られることを示す粒子サイズ分布に関するＮＴＡ分析結果を示す。添加されたトレハロースの量が増加するにつれて、単一のピークを有する粒子サイズ分布の結果を得ることができる。
【図６Ａ】本発明の一具体例によるエキソソームの製造過程でトレハロース添加の有無による粒子サイズ分布を示すＮＴＡ分析結果を示す。製造過程の全過程でトレハロースを添加した場合に製造した結果を示す。
【図６Ｂ】本発明の一具体例によるエキソソームの製造過程でトレハロース添加の有無による粒子サイズ分布を示すＮＴＡ分析結果を示す。細胞培養液を凍結保管し、解凍後、トレハロースを添加した場合に製造した結果を示す。
【図６Ｃ】本発明の一具体例によるエキソソームの製造過程でトレハロース添加の有無による粒子サイズ分布を示すＮＴＡ分析結果を示す。トレハロースを添加せずに製造した結果を示す。
【図６Ｄ】図６Ａ乃至図６Ｃの方法により分離したエキソソームの相対的な生産性（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）と相対的な濃度（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）を比較した結果を示した。
【図６Ｅ】図６Ａ乃至図６Ｃの方法により分離したエキソソームの平均粒子サイズ（Ｍｅａｎ  ｓｉｚｅ）を示した。
【図７】かゆみを伴うアトピーが誘発されたマウス（動物モデル１）に、本発明の一具体例によるエキソソームを処理した後、皮膚の損傷領域のサンプルからかゆみの原因となるＩＬ−４及びＩＬ−３１のｍＲＮＡの変化量を確認したリアルタイムＰＣＲの結果を示すグラフである。
【図８】かゆみを伴うアトピーが誘発されたマウス（動物モデル２）に、本発明の一具体例によるエキソソームを処理した後、皮膚の損傷領域のサンプルからかゆみの原因となるＩＬ−４及びＩＬ−３１のｍＲＮＡの変化量を確認したリアルタイムＰＣＲの結果を示すグラフである。
【図９Ａ】ヒト皮膚角質細胞（ｈｕｍａｎ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）であるＨａＣａＴ細胞に、本発明の一具体例によるエキソソームを処理した結果、ＴＳＬＰ（Ｔｈｙｍｉｃ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｌｙｍｐｈｏｐｏｉｅｔｉｎ）のｍＲＮＡ発現量及びタンパク質生成量が減少した結果を示す。
【図９Ｂ】ヒト皮膚角質細胞（ｈｕｍａｎ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）であるＨａＣａＴ細胞に、本発明の一具体例によるエキソソームを処理した結果、ＴＳＬＰ（Ｔｈｙｍｉｃ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｌｙｍｐｈｏｐｏｉｅｔｉｎ）のｍＲＮＡ発現量及びタンパク質生成量が減少した結果を示す。
【図１０】ＰＫＨ６７で染色されたエキソソームを確認した蛍光強度の測定結果を示す。
【図１１】ブタ皮膚組織内部に、蛍光染色されたエキソソームが伝達された程度を確認した蛍光顕微鏡画像である。
【図１２】マウス皮膚組織内部に、蛍光染色されたエキソソームが伝達された程度を確認した共焦点蛍光顕微鏡画像である。
【図１３】図１２の各画像上の蛍光強度を測定して得られた総蛍光強度を比較して示したグラフである。
【図１４】ヒト皮膚繊維芽細胞であるＨＳ６８細胞に本発明の一具体例によるエキソソームを処理した後、細胞毒性がないことを確認した結果を示す。
【図１５】本発明の一具体例によるエキソソームを含む試験製品をヒトの皮膚に処理し、処理前後の皮膚の状態を比較する写真である。
【図１６】本発明の一具体例によるエキソソームを含む組成物をヒトの皮膚（患部）に塗布した後、前記組成物が塗布された皮膚（患部）に微細電流を流すイオントフォレシスを行った結果、皮膚（患部）の紅斑などが著しく改善されたことを示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００６６】
以下、本発明を下記の実施例でより詳細に記述する。ただし、下記の実施例は、本発明の内容を例示するものに過ぎず、本発明の権利範囲を制限したり限定するものではない。本発明の詳細な説明及び実施例から、本発明が属する技術分野の通常の技術者が容易に類推できることは本発明の権利範囲に属するものと解釈される。本発明に引用された参考文献は、本発明に参考として統合される。
【００６７】
明細書全体で、ある部分がある構成要素を「含む」とするとき、これは特に反対となる記載がない限り、他の構成要素を除外するのではなく、他の構成要素をさらに含みうることを意味する。
【実施例】
【００６８】
実施例１：細胞の培養
ヒト皮膚繊維芽細胞（ｈｕｍａｎ  ｄｅｒｍａｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）であるＨＳ６８細胞はＡＴＣＣから購入し、１０％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ：ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）及び１％抗生剤−抗真菌剤（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ−ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃｓ：ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）が含有されたＤＭＥＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）培地に５％ＣＯ２、３７℃の条件で継代培養した。また、ヒト皮膚角質細胞（ｈｕｍａｎ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）であるＨａＣａＴ細胞は、１０％のＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ）及び１体積％のペニシリン−ストレプトマイシンが補充されたＤＭＥＭ培地に５％ＣＯ２、３７℃の条件で継代培養した。
【００６９】
当該発明の属する技術分野で公知の細胞培養方法により、５％ＣＯ２、３７℃の条件で脂肪由来幹細胞を培養した。次に、リン酸緩衝塩類溶液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）で洗浄した後、無血清、無フェノールレッド培地に交換して、１日〜１０日間培養し、その上清（以下、培養液）を回収した。
【００７０】
エキソソームの分離過程で粒子サイズ分布が均一で純度の高いエキソソームを得るために培養液にトレハロースを２重量％添加した。トレハロースを添加した後、培養液を０．２２μｍフィルタでろ過して細胞残骸物、老廃物及び巨大粒子等の不純物を除去した。ろ過された培養液は、すぐに分離過程を経てエキソソームを分離した。また、ろ過された培養液は、冷蔵庫（１０℃以下）で保管した後、エキソソーム分離に使用した。また、ろ過された培養液は、−６０℃以下の超低温冷凍庫で凍結保管してから解凍した後、エキソソームの分離を行った。その後、培養液からタンジェント流ろ過装置（Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ；ＴＦＦ）を用いて、エキソソームを分離した。
【００７１】
実施例２：ＴＦＦ法によるエキソソームの分離及び精製
実施例１で０．２２μｍフィルタでろ過された培養液からエキソソームを分離、濃縮、脱塩とバッファー交換（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）をするためにＴＦＦ（Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）法を使用した。ＴＦＦ法を用いてエキソソームを分離、濃縮する前に培養液を超音波処理（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）して潜在的なエキソソームの塊を解いた。ＴＦＦ法のためのフィルタとしては、カートリッジフィルタ（ｃａｒｔｒｉｄｇｅ  ｆｉｌｔｅｒ、別名ｈｏｌｌｏｗ  ｆｉｂｅｒ  ｆｉｌｔｅｒ；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから購入）、又はカセットフィルタ（ｃａｓｓｅｔｔｅ  ｆｉｌｔｅｒ；Ｐａｌｌ又はＳａｒｔｏｒｉｕｓ又はＭｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから購入）を使用した。ＴＦＦフィルタは、様々な分画分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｃｕｔｏｆｆ；ＭＷＣＯ）によって選択されてもよい。選択されたＭＷＣＯによって選別的にエキソソームを分離、濃縮し、ＭＷＣＯよりも小さい粒子やタンパク質、脂質、核酸、低分子化合物等は除去した。
【００７２】
エキソソームを分離、濃縮するためにＭＷＣＯ  １００，０００Ｄａ（Ｄａｌｔｏｎ）、３００，０００Ｄａ、又は５００，０００ＤａのＴＦＦフィルタを使用した。培養液をＴＦＦ法を用いて１／１００〜１／２５程度の体積になるまで濃縮し、ＭＷＣＯよりも小さい物質は除去してエキソソームを分離した。
【００７３】
分離、濃縮されたエキソソーム溶液はＴＦＦ法を用いて、さらに脱塩とバッファー交換（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を行った。このとき、脱塩とバッファー交換は連続的に実行（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）又は断続的に実行（ｄｉｓｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）し、開始体積（ｓｔａｒｔｉｎｇ  ｖｏｌｕｍｅ）に対して少なくとも４倍、好ましくは６倍〜１０倍以上、より好ましくは１２倍以上の体積を有する緩衝溶液を用いて行った。緩衝溶液には、粒子サイズ分布が均一で純度の高いエキソソームを得るためにＰＢＳに溶かした２重量％のトレハロースを添加した。トレハロース処理により、高純度でありながら、粒子サイズ分布が均一なエキソソームを高収率で得ることができる効果を確認した結果は、図６Ａ〜図６Ｅに示した。
【００７４】
実施例３：分離されたエキソソームの特性の分析
分離されたエキソソーム、培養液、及びＴＦＦ分離過程の分画物におけるタンパク質の量は、ＢＣＡ発色法（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）、又はフルオロプロファイル（ＦｌｕｏｒｏＰｒｏｆｉｌｅ）蛍光法（Ｓｉｇｍａから購入）を用いて測定した。本発明の一具体例のＴＦＦ法によりエキソソームが分離、濃縮されてタンパク質、脂質、核酸、低分子化合物等が除去される程度は、タンパク質定量法によってモニタリングし、その結果を図２に示した。その結果、本発明の一具体例のＴＦＦ法によって非常に効果的に培養液に存在するタンパク質が除去されることが分かった。
【００７５】
本発明の一具体例のＴＦＦ法によりエキソソームを分離する場合、生産性と純度を独立した５つのバッチで比較した結果を図３に示した。独立した５つのバッチから得られた結果を分析した結果、本発明の一具体例のＴＦＦ法によって非常に安定的にエキソソームを分離できることを確認した。
【００７６】
分離されたエキソソームはナノ粒子トラッキング解析（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｔｒａｃｋｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓ：ＮＴＡ；Ｍａｌｖｅｒｎから購入）、又は可変抵抗パルス検出（ｔｕｎａｂｌｅ  ｒｅｓｉｓｔｉｖｅ  ｐｕｌｓｅ  ｓｅｎｓｉｎｇ：ＴＲＰＳ；Ｉｚｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅから購入）によって粒子のサイズと濃度を測定した。分離されたエキソソームの均一度とサイズは、透過型電子顕微鏡（ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：ＴＥＭ）を用いて分析した。本発明の一具体例の分離方法によって分離されたエキソソームのＴＲＰＳ、ＮＴＡ、ＴＥＭの分析結果は、図４Ａ〜図４Ｃに示した。
【００７７】
ＴＦＦ法でエキソソームを分離した後、トレハロースの添加の有無によるエキソソームのサイズ分布をＮＴＡ分析した結果を図５Ａ〜図５Ｃに示した。トレハロース濃度を０重量％、１重量％及び２重量％に増加させ（図５Ａ〜図５Ｃの上から下）、３回繰り返して実験した。トレハロースが存在しない場合、３００ｎｍ以上の大きさを有する粒子が確認されるのに対し、トレハロースの添加量を増やすと３００ｎｍ以上の大きさを有する粒子が減少し、エキソソームのサイズ分布が均一になることを確認した。
【００７８】
ＴＦＦ法でエキソソームを分離する過程でトレハロースの添加による効果をさらに調査した。図６Ａ〜図６Ｃに示すようにエキソソームの製造過程の全過程にＰＢＳに溶かした２重量％のトレハロースを添加した場合、均一のサイズ分布を有するエキソソームを得ることができた（図６Ａ）。一方、トレハロースを添加せずに凍結保存した培養液を使用するが、脱塩とバッファー交換の過程においてのみトレハロースを添加してＴＦＦ過程を進めた場合や、トレハロースを全く添加せずにＴＦＦ過程を進めた場合、サイズが大きい粒子が多く含まれる不均一なエキソソームを得た（図６Ｂ及び図６Ｃ）。
【００７９】
分離されたエキソソームの相対的な生産性と濃度を比較した結果、エキソソームの製造過程の全過程にトレハロースを添加した場合、非常に高い生産性でエキソソームを得ることができ、得られたエキソソームの濃度も５倍以上高かった（図６Ｄ）。ＮＴＡ分析の結果から示されたように、分離されたエキソソームの平均サイズもエキソソームの製造過程の全過程にトレハロースを添加した場合、２００ｎｍで均一に確認された（図６Ｅ）。
【００８０】
図４Ｄは、本発明の一具体例の分離方法によって分離されたエキソソームに対してウエスタンブロットを行った結果として、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、及びＴＳＧ１０１マーカーの存在を確認した。各マーカーに対する抗体には、それぞれ抗ＣＤ９（Ａｂｃａｍから購入）、抗ＣＤ６３（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入）、抗ＣＤ８１（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入）、及び抗ＴＳＧ１０１（Ａｂｃａｍから購入）を使用した。
【００８１】
図４Ｅは、本発明の一具体例の分離方法によって分離されたエキソソームに対してフローサイトメトリーを用いて分析した結果としてＣＤ６３及びＣＤ８１マーカーの存在を確認した。ＣＤ６３に対して陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）であるエキソソームを分離するためにエキソソームヒューマンＣＤ６３分離／検出キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）をメーカーの方法に従って使用し、ＰＥ―マウス抗ヒトＣＤ６３（ＰＥ−Ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＣＤ６３）（ＢＤから購入）及びＰＥ―マウス抗ヒトＣＤ８１（ＰＥ−ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＣＤ８１）（ＢＤから購入）を使用してマーカーを染色した後、フローサイトメトリー（ＡＣＥＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。
【００８２】
前記の結果を総合すると、本発明の一具体例の分離方法は、タンジェント流ろ過を用いた分離及び／又は精製の過程でトレハロースを添加して、高純度でありながら、粒子サイズ分布が均一なエキソソームを高収率で経済的で、かつ効率的に分離及び精製できることが確認できた。また、本発明の一具体例の分離方法の工程は、スケールアップが可能でありＧＭＰにも適合することが分かった。
【００８３】
実施例４：エキソソーム処理による細胞毒性の測定
ヒト皮膚繊維芽細胞であるＨＳ６８細胞で本発明の一具体例の分離方法によって得られたエキソソームの毒性を評価するために、細胞に濃度別にエキソソームを処理し、細胞の増殖率を確認した。ＨＳ６８細胞を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭに懸濁させた後、８０〜９０％の密集度（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）を有するように分株し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで２４時間培養した。２４時間後、培養液を除去し、実施例２で準備されたエキソソームを濃度別に処理して、２４〜７２時間培養しながら細胞生存率を評価した。細胞生存率をＷＳＴ−１試薬（ＷＳＴ−１  ｒｅａｇｅｎｔ）（Ｔａｋａｒａから購入）、ＭＴＴ試薬（Ｓｉｇｍａから購入）、セルタイターグロ試薬（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  ｒｅａｇｅｎｔ）（Ｐｒｏｍｅｇａから購入）、又はアラマールブルー試薬（ａｌａｍａｒＢｌｕｅ  ｒｅａｇｅｎｔ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）とマイクロプレートリーダー（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓから購入）を用いて測定した。
【００８４】
比較群はエキソソームが処理されていない一般の細胞培養培地で培養された細胞数を基準にしており、試験された濃度範囲内で、本発明のエキソソームによる細胞毒性が示されないことを確認した（図１４）。
【００８５】
実施例５：動物モデル１
雄ＮＣ／Ｎｇａマウス（１６〜１８ｇ、５週齢；中央実験動物から購入）を購入して７日間の適応期を通じて本実験に使用した。適応期を経たマウスはかゆみを伴う皮膚炎誘発後、以下のようにそれぞれ５群に分類した。
（１）Ｎｏｒｍａｌ：正常対照群
（２）Ｖｅｈｉｃｌｅ（皮膚炎誘発群）：イエダニ抽出物によりかゆみを伴う皮膚炎を誘発した陰性対照群
（３）ＩＶ：イエダニ抽出物によりかゆみを伴う皮膚炎誘発後、実施例２で準備されたエキソソームを個体別に２．８μｇの用量で週３回ずつ２週間、血管内投与（ＩＶ：ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した実験群
（４）ＳＣ：イエダニ抽出物によりかゆみを伴う皮膚炎誘発後、実施例２で準備されたエキソソームを個体別に２．８μｇの用量で週３回ずつ２週間、皮下投与（ＳＣ：ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した実験群
（５）Ｐｒｅｄ：イエダニ抽出物によりかゆみを伴う皮膚炎誘発後、プレドニゾロン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ）を毎日経口投与した実験群
ＮＣ／Ｎｇａマウス（中央実験動物から購入）の耳介部分をカミソリで除毛した後、除毛剤を適量塗布して除毛した。除毛剤をふき取った後、ＡＤ誘発試薬（イエダニ抽出物；ＢｉｏＳｔｉｒ  Ｉｎｃ．から購入）をマイクロピペットチップ（ｍｉｃｒｏ  ｐｉｐｅｔ  ｔｉｐ）を用いて、耳介部分に均一に塗布した。必要に応じてカミソリで除毛した後、４％ＳＤＳ水溶液１５０μＬをマイクロピペットチップ（ｍｉｃｒｏ  ｐｉｐｅｔ  ｔｉｐ）を用いて、耳介部分に均一に塗布した。ドライヤーを用いて冷風で乾燥させた後、約２〜３時間自然乾燥させた後、ＡＤ誘発試薬をマイクロピペットチップ（ｍｉｃｒｏ  ｐｉｐｅｔ  ｔｉｐ）を用いて耳介部分に均一に塗布した。すべての前処理は、１週間に２回、計３週間、６回の処理で行った。
【００８６】
実施例２で準備されたエキソソーム投与開始前の皮膚臨床指数の評価を実施して順位化したスコアに基づいて、各群の平均スコアが最大限均一に分布するように、ランダム法で分配して群を分離した。
【００８７】
実施例６：動物モデル２
エキソソームの用量依存的な効果を確認するために、実施例５と同様に、かゆみを伴う皮膚炎を誘発した後、以下のように９群に分類した。
（１）Ｎｏｒｍａｌ：正常対照群（図８で「Ｎ」と表記）
（２）Ｃｏｎｔｒｏｌ（皮膚炎誘発群）：イエダニ抽出物によりかゆみを伴う皮膚炎を誘発した陰性対照群（図８で「Ｃ」と表記）
（３）ＩＶ、Ｌ（ｅｘｏｓｏｍｅ、ｌｏｗ）：イエダニ抽出物によりかゆみを伴う皮膚炎誘発後、実施例２で準備されたエキソソームを個体別に０．１４μｇの用量で週３回ずつ４週間、血管内投与（ＩＶ：ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した実験群
（４）ＩＶ、Ｍ（ｅｘｏｓｏｍｅ、ｍｅｄｉｕｍ）：イエダニ抽出物によりかゆみを伴う皮膚炎誘発後、実施例２で準備されたエキソソームを個体別に１．４μｇの用量で週３回ずつ４週間、血管内投与（ＩＶ：ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した実験群
（５）ＩＶ、Ｈ（ｅｘｏｓｏｍｅ、ｈｉｇｈ）：イエダニ抽出物によりかゆみを伴う皮膚炎誘発後、実施例２で準備されたエキソソームを個体別に１０μｇの用量で週３回ずつ４週間、血管内投与（ＩＶ：ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した実験群
（６）ＳＣ、Ｌ（ｅｘｏｓｏｍｅ、ｌｏｗ）：イエダニ抽出物によりかゆみを伴う皮膚炎誘発後、実施例２で準備されたエキソソームを個体別に０．１４μｇの用量で週３回ずつ４週間、皮下投与（ＳＣ：ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した実験群
（７）ＳＣ、Ｍ（ｅｘｏｓｏｍｅ、ｍｅｄｉｕｍ）：イエダニ抽出物によりかゆみを伴う皮膚炎誘発後、実施例２で準備されたエキソソームを個体別に１．４μｇの用量で週３回ずつ４週間、皮下投与（ＳＣ：ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した実験群
（８）ＳＣ、Ｈ（ｅｘｏｓｏｍｅ、ｈｉｇｈ）：イエダニ抽出物によりかゆみを伴う皮膚炎誘発後、実施例２で準備されたエキソソームを個体別に１０μｇの用量で週３回ずつ４週間、皮下投与（ＳＣ：ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した実験群
（９）Ｐｒｅｄ：イエダニ抽出物によりかゆみを伴う皮膚炎誘発後、プレドニゾロン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ）を毎日経口投与した実験群（図８で「Ｐ」と表記）
【００８８】
皮膚炎誘発は実施例５と同様に行い、ＡＤ誘発試薬を過量に塗布してエキソソームを投与する時点で平均皮膚臨床指数が９になるようにした。実施例２で準備されたエキソソーム投与開始前の皮膚臨床指数の評価を実施して順位化したスコアに基づいて、各群の平均スコアが最大限均一に分布するように、ランダム法で分配して群を分離した。
【００８９】
実施例７：サイトカインｍＲＮＡ発現量の測定
本発明のエキソソームがかゆみを抑制及び緩和させる効果があるか否かと、様々な原因に起因するかゆみに対して広範囲の適用が可能か否かを確認するために、ＩＬ−４  ｍＲＮＡ及びＩＬ−３１のｍＲＮＡ発現レベルを分析した。ＩＬ−４は、かゆみを誘発するサイトカインとして広く知られており、表皮でＩＬ−４を発現する形質転換マウスで皮膚のかゆみが誘発されることが報告されたところがある（非特許文献５）。そしてＩＬ−３１は、かゆみを示すアトピー性皮膚炎患者で過発現され、ＩＬ−３１を過発現するように形質転換されたマウスでかゆみが誘発されることが報告されたところがある（非特許文献６）。また、ＩＬ−３１は、ＩＬ−３１ＲＡ／ＯＳＭＲ受容体と結合して、かゆみを引き起こすことが報告されており（非特許文献７）、ＩＬ−３１受容体Ａに対する抗体を処理した場合、かゆみが緩和されることが報告されたところがある（非特許文献８）。したがって、候補物質処理後、皮膚組織や血液内のＩＬ−４及びＩＬ−３１の生成量や発現量を分析すると、候補物質のかゆみ抑制及び緩和に対する効能を評価することができる。
【００９０】
まず、実施例５の動物モデル１及び実施例６の動物モデル２を犠牲にして、皮膚の損傷部位の組織を摘出した。そして、動物モデル１から摘出された組織から得られた総ＲＮＡからｃＤＮＡを製造してリアルタイムＰＣＲ法を用いて、かゆみの主な原因となるＩＬ−４及びＩＬ−３１のｍＲＮＡの変化量を測定した。また、動物モデル２から摘出された組織から得られた総ＲＮＡからｃＤＮＡを製造してリアルタイムＰＣＲ法を用いて、かゆみの主な原因となるＩＬ−４及びＩＬ−３１のｍＲＮＡの変化量を測定した。前記遺伝子を定量するための標準遺伝子としてＧＡＰＤＨ遺伝子を使用した。リアルタイムＰＣＲに使用したプライマーの種類と配列は下記表１の通りである。
【００９１】
【表１】
2020532489.tif 000003
【００９２】
前記動物モデル１に対する実験を通じて、本発明のエキソソームが処理された群（ＩＶ及びＳＣの両方）でかゆみの原因となるＩＬ−４及びＩＬ−３１の発現量がすべて減少することを確認し（図７Ａ及び図７Ｂ）、前記動物モデル２に対する実験を通じて、本発明のエキソソームが処理された群（ＩＶ及びＳＣの両方）でかゆみの原因となるＩＬ−４及びＩＬ−３１の発現量が、いずれも用量依存的に減少することを確認した（図８Ａ及び図８Ｂ）。したがって、本発明のエキソソームはかゆみを引き起こす主要な標的であるＩＬ−４及びＩＬ−３１の両方に作用して、様々な原因に起因するかゆみに対する広範囲の適用が可能であり、効果的にかゆみを抑制及び緩和させることができるものと期待される。
【００９３】
実施例８：ＨａＣａＴ細胞を用いたＴＳＬＰ抑制効果の測定
ＴＳＬＰは、かゆみがひどい患者の上皮細胞や皮膚角質細胞（ｈｕｍａｎ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ）で過度に増加しており、皮膚のかゆみの原因となる物質として知られている。したがって、特定の候補物質が皮膚角質細胞で誘導されるＴＳＬＰを抑制するか否かを確認すれば候補物質のかゆみ抑制ないし緩和効果を確認することができる。ヒト皮膚角質細胞であるＨａＣａＴ細胞を、１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）、１％アムホテリシンＢ（Ｓｉｇｍａから購入）及び１％ペニシリン−ストレプトマイシンが補充されたＤＭＥＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）培地に懸濁させた後、１２ウェルプレート（１２  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ）の各ウェルに１×１０５の密度で接種し、２４時間培養した。その後、無血清ＤＭＥＭ培地でさらに２４時間培養した後、付着した細胞をＰＢＳで２回洗浄し、図９Ａに示された実験群の分類に基づいて無血清培地でポリＩ：Ｃ（Ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ）（Ｓｉｇｍａから購入）及びヒスタミン（Ｈｉｓｔａｍｉｎｅ）（Ｓｉｇｍａから購入）と、本発明のエキソソーム（実施例２で準備されたエキソソーム）を処理して、２４時間培養した。各実験群のＨａＣａＴ細胞から分離したＲＮＡからｃＤＮＡを製造してリアルタイムＰＣＲ法を用いて、かゆみの主な原因となるＴＳＬＰのｍＲＮＡの変化量を測定した。ＴＳＬＰ遺伝子を定量するための標準遺伝子としてβ−アクチン遺伝子を使用した。リアルタイムＰＣＲに使用したプライマーの種類と配列は下記表２の通りである。
【００９４】
【表２】
2020532489.tif 000004
【００９５】
また、ヒト皮膚角質細胞であるＨａＣａＴ細胞を、１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）、１％アムホテリシンＢ（Ｓｉｇｍａから購入）及び１％ペニシリン−ストレプトマイシンが補充されたＤＭＥＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）培地に懸濁させた後、６ウェルプレート（６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ）の各ウェルに５×１０５の密度で接種し、２４時間培養した。その後、無血清ＤＭＥＭ培地でさらに２４時間培養した後、付着した細胞をＰＢＳで２回洗浄し、図９Ｂに示された実験群の分類に基づいて無血清培地でポリＩ：Ｃ（Ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ）（Ｓｉｇｍａから購入）及び本発明のエキソソーム（実施例２で準備されたエキソソーム）を処理して、２４時間培養した。各実験群でのＴＳＬＰタンパク質の発現量をＴＳＬＰ抗体（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を用いたウエスタンブロットにより測定した。タンパク質の量は、標準物質であるＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）を使用したＢＣＡ法で定量した。各実験群でのＴＳＬＰタンパク質の量はＧＡＰＤＨタンパク質の量に正規化（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）して補正した。
【００９６】
その結果、本発明のエキソソームは、皮膚角質細胞で、かゆみの原因となるＴＳＬＰのｍＲＮＡ発現量及びタンパク質の生成量を減少させることを確認した（図９Ａ及び図９Ｂ）。したがって、本発明のエキソソームはかゆみを引き起こす主な標的であるＴＳＬＰに対して作用し、かゆみを効果的に抑制及び緩和させることができる。
【００９７】
実施例９：エキソソームの皮膚透過能力試験
蛍光染色されたエキソソームを製造するためにＰＫＨ６７染料（Ｓｉｇｍａから購入）を使用した。１ｍＭのＰＫＨ６７をＤｉｌｕｅｎｔ  Ｃ（Ｓｉｇｍａから購入）に希釈して、１０μＭのＰＫＨ６７溶液を製造した後、適正濃度のエキソソーム溶液と混合して、常温で光を遮断した状態で１０分間反応させた。反応が終わった後、ＰＫＨ６７で染色されたエキソソーム（以下、「ＰＫＨ−エキソソーム」と略称）から残りのＰＫＨ６７染料を除去するためにＭＷ３０００スピンカラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）を使用した。蛍光測定器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓから購入）を用いて確認した結果、エキソソームと反応しないＰＫＨ６７を除去した後、ＰＫＨ−エキソソームで十分な強度の蛍光が検出されることを確認した（図１０）。
【００９８】
ＰＫＨ−エキソソームを適正濃度、例えば１×１０５粒子／ｍＬ〜１×１０９粒子／ｍＬの濃度でリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）に分散させた後、ブタ皮膚の外側面に塗布した。塗布されたＰＫＨ−エキソソームの乾燥を防ぐために不織布を被せた後、適正時間、例えば３０分〜１時間反応させ、ＰＫＨ−エキソソームが皮下組織に伝達されるようにした。さらに、ＰＫＨ−エキソソームをブタ皮膚の外側面に塗布して不織布を被せた後、一定時間、例えば３０分〜１時間微細電流を流した。反応が終了した後、ブタ皮膚組織を３．７％ホルムアルデヒド溶液に浸し、一晩反応させ、リン酸緩衝塩類溶液で５分間ずつ３回洗浄した。洗浄されたブタ皮膚組織を３０％スクロース溶液に浸して処理した後、ＯＣＴ化合物を処理した。再びリン酸緩衝塩類溶液で５分間ずつ３回洗浄した後、ミクロトームを用いて縦断面で切片を作製し、スライドガラス上に組織切片を位置させた。一方、組織切片の作製は、ホルムアルデヒド溶液で組織を固定する前に行うこともできる。組織切片でＰＫＨ−エキソソームから検出される蛍光は、蛍光顕微鏡を用いて観察した。以上の方法でブタ皮膚組織の表皮を透過して皮下組織に伝達されたＰＫＨ−エキソソームを確認した（図１１）。図１１で確認されるように、本発明のエキソソームは皮膚バリアを効果的に通過して皮膚組織の内部に深く伝達でき、皮膚に対して効果的に吸収される。
【００９９】
したがって、前記エキソソームを有効成分として含有する皮膚外用剤又は化粧料組成物は、かゆみの予防、抑制、緩和、改善、又は治療などにおいて、効果的に作用すると期待される。
【０１００】
次に、ヘアレスマウスの皮膚組織を摘出してフランツ拡散セル（Ｆｒａｎｚ  Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  Ｃｅｌｌ）のチャンバの上部に位置させた。このとき、拡散セルの内部はリン酸緩塩類衝溶液で満たされた。ＰＫＨ−エキソソームを適正濃度、例えば１×１０５粒子／ｍＬ〜１×１０９粒子／ｍＬの濃度でリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）に分散させた後、マウスの皮膚組織の外側に塗布した。このとき、ＰＫＨ−エキソソームの乾燥を防ぐために不織布をマウスの皮膚組織の外側に予め位置させ、不織布と皮膚組織の間にＰＫＨ−エキソソームを注入した。その後、３０分〜１時間反応させた。さらに、ＰＫＨ−エキソソームを不織布と皮膚組織の間に注入した後、一定時間、例えば３０分〜１時間微細電流を流した。反応が終わった後、すぐに共焦点蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ、ＳＰ８Ｘ）を用いて皮膚組織の内部に伝達されたＰＫＨ−エキソソームを確認し、１時間〜６時間、皮膚組織とＰＫＨ−エキソソーム溶液をさらに反応させた後、共焦点蛍光顕微鏡でＰＫＨ−エキソソームを確認した。以上の方法で確認した結果、本発明のエキソソームは皮膚バリアを効果的に通過して皮膚組織の内部に深く伝達でき、皮膚に効果的に吸収される（図１２及び図１３）。
【０１０１】
したがって、前記エキソソームを有効成分として含有する皮膚外用剤又は化粧料組成物は、かゆみの予防、抑制、緩和、改善、又は治療などにおいて、効果的に作用すると期待される。
【０１０２】
実施例１０：ヒト皮膚に対するエキソソームを有効成分として含む組成物の処理
本発明の一具体例の分離方法によって得られたエキソソームを含有するアンプル（半透明乳液状組成物を含む）、液状浸漬シートマスク（前記半透明乳液状が浸漬された白色シートマスク）及び経皮透過促進シートマスク（イオントフォレシスデバイスを含む銀色シートマスク）で構成された「試験製品」をかゆみと関連のある紅潮症状と皮膚のトラブルがひどい人（以下、「ケース１」という）の顔に１回適用して皮膚のトラブルと紅潮症状が緩和ないしは改善されるかを評価した。また、前記試験製品を紅潮症状のある人（以下、「ケース２」という）の顔に１回適用して、全体的な皮膚のトーンと紅潮症状が改善されるかを評価した。
【０１０３】
本発明のエキソソームを含有する「試験製品」の１回の使用だけで「ケース１」で紅潮及び皮膚のトラブルが顕著に改善され（図１５のケース１参照）、「ケース２」でも、全体的な皮膚のトーンが改善されて紅潮が緩和された（図１５のケース２参照）。したがって、本発明のエキソソームを有効成分として含有する皮膚外用剤又は化粧料組成物は、かゆみと関連のある紅潮症状及び皮膚のトラブルを予防、抑制、緩和ないしは改善させる効果があるといえる。
【０１０４】
また、本発明の一具体例の分離方法によって得られたエキソソームを含有する組成物（本発明のエキソソームを含む懸濁液）を、かゆみを訴える重症アトピー患者３人の患部（手、首、腕など）に１〜２週間、週３回にわたって塗布した後、イオントフォレシス装置を使用して、前記組成物が塗布された患部に微細電流を流すイオントフォレシスを行った。その結果、患者らの激しいかゆみが著しく緩和され、紅斑症状も顕著に改善された（図１６）。本発明のエキソソームを含有する組成物を適用した患者全員において激しいかゆみと紅斑が緩和され、ステロイドや抗ヒスタミン製剤の処方を中止してもよい程度に症状が改善された。
【０１０５】
したがって、本発明の一具体例の分離方法によって得られたエキソソームを有効成分として含有する皮膚外用剤又は化粧料組成物は、前記のような臨床試験で確認されるように、かゆみの予防、抑制、緩和、改善、又は治療効果を示すことがわかる。
【０１０６】
実施例１１：本発明のエキソソームを含む化粧料組成物の製造
前記実施例２で準備された１７０４μｇ／ｍＬの濃度のエキソソームを下記表３に記載された成分と混合して懸濁した後、化粧料組成物（ローション）を製造した。各成分の含有量は下記表３の通りである。
【０１０７】
【表３】
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【０１０８】
以上、本発明を前記実施例を挙げて説明したが、本発明はこれに限定されるものではない。当業者であれば、本発明の趣旨及び範囲を逸脱することなく修正、変更をすることができ、このような修正と変更も本発明に属するものであることがわかるであろう。
【図１】
2020532489.tif 000006
【図２】
2020532489.tif 000007
【図３】
2020532489.tif 000008
【図４Ａ】
2020532489.tif 000009
【図４Ｂ】
2020532489.tif 000010
【図４Ｃ】
2020532489.tif 000011
【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
2020532489.tif 000013
【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
2020532489.tif 000018
【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７】
2020532489.tif 000022
【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年2月6日(2020.2.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含む、ＴＳＬＰ（Ｔｈｙｍｉｃ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｌｙｍｐｈｏｐｏｉｅｔｉｎ）を媒介とするかゆみの予防、抑制、緩和、改善、又は治療用薬学組成物。
【請求項２】
前記エキソソームは、次のステップを実行して得られる、請求項１に記載の薬学組成物：
（ａ）幹細胞培養液にトレハロースを添加するステップ、（ｂ）前記トレハロースが添加された幹細胞培養液をろ過するステップ、（ｃ）前記ろ過された幹細胞培養液から、ＴＦＦ（Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を用いてエキソソームを分離するステップ、及び（ｄ）脱塩とバッファー交換（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）に使用される緩衝溶液にトレハロースを添加し、前記トレハロースが添加された緩衝溶液を用いたＴＦＦ（Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を用いて、前記分離されたエキソソームに対する脱塩とバッファー交換（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を行うステップ。
【請求項３】
前記脱塩とバッファー交換は連続的に行われるか、又は断続的に行われることを特徴とする、請求項２に記載の薬学組成物。
【請求項４】
開始体積（ｓｔａｒｔｉｎｇ  ｖｏｌｕｍｅ）に対して少なくとも４倍の体積を有する緩衝溶液を用いて脱塩とバッファー交換を行うことを特徴とする、請求項２に記載の薬学組成物。
【請求項５】
ＴＦＦ（Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）のためにＭＷＣＯ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｃｕｔｏｆｆ）１００，０００Ｄａ、３００，０００Ｄａ、５００，０００Ｄａ又は７５０，０００ＤａのＴＦＦフィルタ、又は０．０５μｍＴＦＦフィルタを使用することを特徴とする、請求項２に記載の薬学組成物。
【請求項６】
前記（ｃ）ステップは、ＴＦＦ（Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を用いて、１／１００乃至１／２５の体積まで濃縮する過程をさらに含む、請求項２に記載の薬学組成物。
【請求項７】
前記エキソソームは、皮膚組織又は皮膚細胞でＩＬ−４、ＩＬ−３１、及びＴＳＬＰ（Ｔｈｙｍｉｃ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｌｙｍｐｈｏｐｏｉｅｔｉｎ）の発現量を減少させることを特徴とする、請求項１乃至６のいずれか一項に記載の薬学組成物。
【請求項８】
幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含む、ＴＳＬＰ（Ｔｈｙｍｉｃ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｌｙｍｐｈｏｐｏｉｅｔｉｎ）を媒介とするかゆみの予防、抑制、緩和、改善、又は治療用の皮膚外用剤。
【請求項９】
前記エキソソームは、ハイドロゲル、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩、又はヒアルロン酸ゲルのうち少なくとも１種に担持又は混合されている、請求項８に記載の皮膚外用剤。
【請求項１０】
前記ハイドロゲルは、ゲル化ポリマーを多価アルコールに分散させて得られたハイドロゲルであることを特徴とする、請求項９に記載の皮膚外用剤。
【請求項１１】
前記ゲル化ポリマーは、プルロニック、精製寒天、アガロース、ゲランガム、アルギン酸、カラギーナン、カシアガム、キサンタンガム、ガラクトマンナン、グルコマンナン、ペクチン、セルロース、グアーガム、及びローカストビーンガムからなる群から選ばれた少なくとも１種であり、前記多価アルコールは、エチレングリコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、イソブチレングリコール、ジプロピレングリコール、ソルビトール、キシリトール、及びグリセリンからなる群から選ばれた少なくとも１種であることを特徴とする、請求項１０に記載の皮膚外用剤。
【請求項１２】
幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含む、ＴＳＬＰ（Ｔｈｙｍｉｃ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｌｙｍｐｈｏｐｏｉｅｔｉｎ）を媒介とするかゆみの予防、抑制、緩和、又は改善用の化粧料組成物。
【請求項１３】
パッチ、マスクパック、シートマスク、クリーム、トニック、軟膏、懸濁液、乳濁液、ペースト、ローション、ゲル、オイル、パック、スプレー、エアゾール、ミスト、ファンデーション、パウダー、及び油紙で構成された群から選ばれた少なくとも１種の形態に適用することを特徴とする、請求項１２に記載の化粧料組成物。
【請求項１４】
パッチ、マスクパック又はシートマスクの少なくとも一面に塗布又は浸漬されることを特徴とする、請求項１３に記載の化粧料組成物。
【請求項１５】
（ａ）請求項１２に記載の化粧料組成物を哺乳動物の皮膚に直接塗布すること、（ｂ）前記化粧料組成物が塗布又は浸漬されたパッチ、マスクパック又はシートマスクを哺乳動物の皮膚に接触又は付着すること、若しくは前記（ａ）及び（ｂ）を順次進行することを含む、治療用を除くＴＳＬＰ（Ｔｈｙｍｉｃ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｌｙｍｐｈｏｐｏｉｅｔｉｎ）を媒介とするかゆみによる哺乳動物の皮膚の紅潮症状、皮膚のトラブル又は紅斑を緩和させる美容方法。
【請求項１６】
（ｃ）前記化粧料組成物が適用された哺乳動物の皮膚に微細電流を流してイオントフォレシス（ｉｏｎｔｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）を行うことをさらに含む、請求項１５に記載の美容方法。
【請求項１７】
イオントフォレシス装置を前記哺乳動物の皮膚に接触又は付着させることをさらに含む、請求項１６に記載の美容方法。
【請求項１８】
前記イオントフォレシス装置は、可撓性電池、リチウムイオン二次電池、アルカリ電池、乾電池、水銀電池、リチウム電池、ニッケルカドミウム電池、及び逆電気透析(ｒｅｖｅｒｓｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｄｉａｌｙｓｉｓ)電池で構成された群から選ばれた少なくとも１種の電池を含むか、前記少なくとも１種の電池が装着されたパッチ、マスクパック又はシートマスクを含む、請求項１７に記載の美容方法。
【国際調査報告】
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