(57)【要約】本発明は、第１の生分解性又は生体適合性ポリマーのフィラメントの布地片を提供するステップと、該フィラメントの配列に第２のポリマーのコーティングを適用するステップと、該片をその長手方向伸長軸に沿って延伸し、それによって整列した微小繊維状足場を得るステップとを含むポリマー足場の製造方法に関する。本発明はさらに、人工組織を提供するための方法、及び本発明の方法によって得られた整列フィラメントの微小繊維状足場に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリマー足場を調製するための方法であって、
ａ．第１のポリマーのフィラメントの布地片、特に不織布メッシュ、より詳細にはフェルト様布地を提供するステップ、ここで前記第１のポリマーは生分解性又は生体適合性であり、前記片は長手方向伸長軸によって特徴付けられる；
ｂ．コーティングステップにおいて、前記フィラメントの配列に第２のポリマーのコーティングを施すステップ、ここで前記第２のポリマーは、前記第１のポリマーの融点より低いガラス転移温度によって特徴付けられる；
ｃ．前記片をその長手方向の伸長軸に沿って延伸し、それによって、整列した微小繊維状足場を得るステップ
を含む、上記方法。
【請求項２】
ステップｃにおいて、前記布地片がその長手方向伸長軸に沿って１７５％を超えて、特に１７５％〜２５０％、さらには３００％まで、さらに特に約２００％延伸される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
‐ステップｃで延伸する前に、前記布地片は、前記フィラメントの第１の整列指数ｉＡ１によって特徴付けられ、
‐ステップｃで延伸した後、前記整列した微小繊維状足場は、第２の整列指数ｉＡ２によって特徴付けられ、
‐前記第１の整列指数に対する前記第２の整列指数の比ｉＡ２／ｉＡ１は、２以上、特に２．５以上、さらに特に３以上である、請求項１又は２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
‐ｉＡ１の値が≦３０％、特に≦２５％である、及び／又は
‐ｉＡ２の値が≧７０％、特に≧７５％である、及び／又は
‐比ｉＡ２／ｉＡ１の値は≧２、３、特に≧３である、
請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記第１及び第２のポリマーがそれぞれガラス転移温度Ｔｇ及び融解温度Ｔｍを特徴とし、ステップｃ．が、
‐第１のポリマーと第２のポリマーの両方のＴｇより高く、
‐第１のポリマーと第２のポリマーの両方のＴｍより低い温度で行われ、特に、ステップｃ．が５０℃から１５０℃、特に６０℃から８０℃の間の温度で行われる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ａ．前記第２のポリマーは生分解性及び／又は生体適合性ポリマーであり、及び／又は
ｂ．前記フィラメントに塗布される前記第２のポリマーの量は、前記第１のポリマーの前記フィラメントの質量に対して１０％から４０質量％の範囲である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ａ．第１のポリマーは、ポリエステル、ポリウレタン及びポリアニリンを含む群から選択され、特に第１のポリマーは、
‐ポリグリコリド、ポリ（乳酸）、ＰＬＧＡ、ポリ（トリメチレンカーボネート）、ポリヒドロキシブチレート、ポリ（４‐ヒドロキシブチレート）、ポリ（３‐ヒドロキシブチレート）、ポリ（グリコリド‐ｃｏ‐カプロラクトン）、ポリ（グリコリド‐ｃｏ‐トリメチレンカーボネート）、又はグリコール酸若しくは乳酸モノマーを含むコポリマーを含む第１の群から、又は
‐ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はＰＥＧコポリマー；ポリアニリン；ポリエチレンテレフタレート；ポリ（２‐メトキシエチルアクリレート）；ポリ（２‐メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）；ポリ（テトラヒドロフルフリルアクリレート）；ポリスチレン、又は第２の群に含まれる２つ若しくは３つのポリマー種を含むか又はそれらから本質的になるコポリマーを含む第２の群から選択され、及び／又は
ｂ．第２のポリマーは、前段落に記載の第１の群又は第２の群から選択されるが、第１のポリマーとは異なり；
特に、第２のポリマーはポリ‐ヒドロキシブチレート、より特にはポリ‐３‐ヒドロキシブチレート及びポリ‐４‐ヒドロキシブチレートからなる群から選択される、
請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記第２のポリマーが、
ａ．第１のポリマーが請求項７ａに記載の第１の群から選択される場合、請求項７ａに記載の第１の群、又は
ｂ．第１のポリマーが請求項７ａに記載の第２の群から選択される場合、請求項７ａに記載の第２の群
から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記コーティングステップにおいて、前記第２のポリマーが溶媒に溶解した状態で前記第１のポリマーの前記フィラメントに塗布され、前記第１のポリマー及び前記第２のポリマーが表１の１行から選択され、場合により、溶媒は表１の同じ行から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記フィラメントが、１００ｎｍから２５０μｍの間、特に１μｍから５０μｍの間、さらに特に１０μｍから２０μｍの間の直径を特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ａ．請求項１のステップａで提供された布地片は、第１のポリマーのかさ密度に対して５％〜１５％の足場比重を特徴とする、及び／又は
ｂ．請求項１のステップｃで得られた布地片は、第１のポリマーのかさ密度に対して１０％〜２０％の足場比重を特徴とする、及び／又は
ｃ．請求項１のステップｃで得られた布地片は、第１のポリマーのかさ密度に関して測定された足場比重が、請求項１のステップａで提供される布地片の足場比重よりも３０％以上、特に５０％以上、さらに特に１００％以上高いことを特徴とする請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
人工組織を提供するための生体外方法であって、
ａ．請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法に従って整列した微小繊維状足場を提供するステップ；
ｂ．哺乳動物細胞、特に線維芽細胞、筋芽細胞及びニューロンから選択される細胞を含む細胞培養培地中に前記整列した微小繊維状足場を懸濁するステップ
を含む上記生体外方法。
【請求項１３】
第２の生分解性又は生体適合性ポリマーで被覆された第１の生分解性又は生体適合性ポリマーの整列したフィラメントの微小繊維状足場であって、
ａ．前記足場の多孔度は８０％以上、特に８５％以上、さらに特に９０％以上であり、
ｂ．整列指数が５０％より高い（≧５０％）、特に≧６５％、より特に≧８０％であり、及び／又は
ｃ．前記フィラメントの直径は１００ｎｍから２５０μｍ、特に１μｍから５０μｍ、さらに特に１０μｍから２０μｍの範囲である
ことを特徴とする上記微小繊維状足場。
【請求項１４】
ａ．第１のポリマーは、
‐ポリグリコリド、ポリ（乳酸）、ＰＬＧＡ、ポリ（トリメチレンカーボネート）、ポリ（４‐ヒドロキシブチレート）、ポリ（３‐ヒドロキシブチレート）、ポリ（グリコリド‐ｃｏ‐カプロラクトン）、ポリ（グリコリド‐ｃｏ‐トリメチレンカーボネート）、又はグリコール酸若しくは乳酸モノマーを含むコポリマーを含む第１の群から、又は
‐ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はＰＥＧコポリマー；ポリアニリン；ポリエチレンテレフタレート；ポリ（２‐メトキシエチルアクリレート）；ポリ（２‐メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）；ポリ（テトラヒドロフルフリルアクリレート）；ポリスチレン、又は第２の群に含まれる２つ若しくは３つのポリマー種を含むか又はそれらから本質的になるコポリマーを含む第２の群から、及び／又は
ｂ．第２のポリマーは、前段落に記載の第１の群又は第２の群から選択されるが、第１のポリマーとは異なり、特に、第２のポリマーはポリ‐ヒドロキシブチレート、より特にはポリ‐３‐ヒドロキシブチレート及びポリ‐４‐ヒドロキシブチレートからなる群から選択される、
請求項１３に記載の微小繊維状足場。
【請求項１５】
前記足場が、前記第１のポリマーのかさ密度に対して１０〜４０％の足場比重によって特徴付けられる、請求項１３又は１４に記載の微小繊維状足場。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、人工組織の生成における真核細胞の付着又は適切な組織治癒のためのポリマー足場(スキャフォールド)の外科的移植のための生分解性又は生体適合性ポリマー足場の製造方法に関する。本発明はさらに、本発明の方法によって作製された足場、及びそれに由来する人工組織に関する。
【背景技術】
【０００２】
説明
インビボでの組織及び細胞は、発達及び形態形成において形成される優先配向で大部分が組織化されている。その目的がインビトロ条件で組織機能を複製することである人工組織の場合、特定の細胞組織化を達成することは、人工組織の将来の機能性に影響を及ぼし得る。いくつかの例には、筋線維の平行整列、腱のコラーゲン線維、及び血管平滑筋細胞のらせん整列が含まれる。例えば、組織化された筋繊維の累積的な微小収縮は強い収縮を達成することを可能にし、腱及び心臓弁のような耐荷重性組織において、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の一部としてのコラーゲン繊維の平行整列は組織の靭性を著しく改善する。さらに、脊髄などの軟組織では、神経索損傷の修復を改善するために、本来の組織化と同様に正しい方向に刺激を伝達するために軸索の整列した組織化が必要とされる。
【０００３】
三次元（３Ｄ）細胞増殖を利用する組織工学及び外科的再建用途は、インビボで機能的に保証するために適切な足場を必要とする。細胞はＥＣＭ沈着及びコラーゲンフィブリル（小線維）の成熟後に成熟マトリックスをほとんど再構築することができないので、インビトロでの細胞整列の早期誘導は重要である。
【０００４】
細胞整列を誘導するために現在様々な方法が使用されている。第１のアプローチは、接触ガイダンスとしてマイクロナノトポグラフィを有する加工表面又は材料上に細胞を閉じ込めることに基づく。第２のアプローチは、細胞の収縮活動又は外部のひずみのいずれかによって発生した機械的力の適用に基づいており、それによって整列を誘導する。表面、例えば内皮細胞培養物中の細胞上に播種細胞又は流動剪断応力（摩擦）を有するエラストマーシートに加えることができる引張応力などの外部の機械的な力もまた整列を誘導することができる。しかしながら、これらの方法は二次元組織化に限定されており、その二次元組織化では、細胞層が互いの上に成長することはほとんどない。ヒドロゲル系における３Ｄ細胞整列は、ヒドロゲル内の栄養灌流の欠如のために数細胞層に限定されている。
【０００５】
市販の不織布フェルト様ポリグリコール酸（ＰＧＡ）足場（Ｂｉｏｆｅｌｔ（登録商標））は、ＰＧＡ繊維を溶融紡糸し、さらにカーディング及びニードルパンチ加工することによって製造されてきた。このプロセスは産業機械を使って行われる。それ故、調製された足場は、異なる形状、サイズで入手可能であり、様々な生体吸収性ポリマーから製造することができる。この無溶媒プロセスは、電界紡糸のような溶媒キャスティング手順よりも危険性が低いが、処理が困難であるために足場材料を開発するためにはあまり実践されていない。重要なことに、そして電気紡糸足場とは対照的に、それは約９０％の高い多孔度をもたらし、細胞を急速に成長させ、３Ｄ組織構造を形成する能力を首尾よく実証した。足場材料としてＰＧＡメッシュを使用して、インサイチュ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）腱再生並びに恒常性心臓及び腹壁手術が報告された。しかしながら、そのような溶融紡糸足場は、主に足場の一体性の問題のために、３Ｄ整列組織を調製するために使用されたことはなかった。電界紡糸に使用される繊維整列技術は、マイクロファイバー（直径約１５μｍ）を有する溶融紡糸足場の繊維の一体性の損失をもたらすであろう。
【発明の概要】
【０００６】
上記の最新技術に基づいて、本発明の目的は、３Ｄ細胞培養及びその後の人工組織の生成に有用な方法及び材料を提供するための手段及び方法を提供することである。この目的は本明細書の特許請求の範囲によって達成される。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
用語と定義
本明細書の文脈における生分解性ポリマー又は生体吸収性ポリマーという用語は、人体内で、又は細胞培養条件下で能動的に（酵素的加水分解によって）又は受動的に（化学的加水分解によって）、日から年に及ぶ時間枠で、分解するポリマーに関する。生分解性ポリマーは、２つの品質によって特徴付けられる：ポリマーは、生物学的に意味のある時間枠内で生理学的条件下でその構成モノマー部分又はその誘導体にゆっくり溶解され、それらが含まれる生物体に対して、この分解の生成物は少なくとも溶解の条件下で生じる濃度で毒性はない。分解又は吸収に必要な時間は、ポリマーの性質、移植部位及びポリマーの寸法及び多孔度に依存する。典型的な生分解性又は生体吸収性ポリマーは、ＰＬＡ、ＰＧＡ、ＰＧＬＡ又はポリ酪酸である。
【０００８】
本明細書の文脈における生体適合性ポリマーという用語は、必ずしも溶解することなく、人体内で許容されるポリマーに関する。非分解性足場は、例えば再建／美容整形手術において、及び脊髄修復手術におけるニューロンの手引きとして使用することができる。ニューロンは保護組織を作り出すことができず、それ故その場での支持体によって保護される必要がある。脳神経外科では、神経成長は整列した足場を提供することによっても支持され、同時に非分解性足場によって機械的一体性を支持する。
【０００９】
本明細書の文脈における用語ポリグリコリド及びＰＧＡは、一般式
【化１】
2020501849.tif 000002
によって記載されるポリマー、ポリ［オキシ（１‐オキソ‐１，２‐エタンジイル）］（ＣＡＳ番号２６００９‐０９‐０）、特に、ｎが９００〜１２００であるか、又はポリマーの平均分子量が約６０，０００ｇ／ｍｏｌである上記式のポリマーに関する。
【００１０】
本明細書の文脈におけるポリ（乳酸）、ポリ乳酸及びＰＬＡという用語は、一般式
【化２】
2020501849.tif 000003
で表される乳酸のポリエステル（ＣＡＳ番号２６１００‐５１‐６）、特に、ｎが７００〜１０００であるか、又はポリマーの平均分子量が約６０，０００ｇ／ｍｏｌである上記式のポリマーに関する。
【００１１】
本明細書の文脈におけるポリ‐３‐ヒドロキシブチレート又はＰ３ＨＢという用語は、その生合成経路にもかかわらず、比較的単純な構造を有する強力な熱可塑性ポリエステルである３‐ヒドロキシ酪酸のポリエステルに関する。本明細書で有用なＰ３ＨＢの特定の調製物は、４００，０００〜６００，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を特徴とする。
【００１２】
本明細書の文脈におけるポリ‐４‐ヒドロキシブチレート又はＰ４ＨＢという用語は、その生合成経路にもかかわらず、比較的単純な構造を有する強力な熱可塑性ポリエステルである４‐ヒドロキシ酪酸のポリエステルに関する。本明細書で有用なＰ４ＨＢの特定の調製物は、４００，０００〜６００，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を特徴とする。
【００１３】
本明細書の文脈におけるガラス転移温度又はＴｇという用語は、温度が上昇するにつれて、ガラス転移、硬質で比較的脆い「ガラス状」状態から溶融状態又はゴム様状態への非晶質材料の可逆的転移が起こる温度範囲に関する。本明細書に記載のＴｇ値は、特に明記しない限り、示差走査熱量測定法によって決定される値に関する。測定プロトコルについては、ＩＳＯ  １１３５７‐２；プラスチック‐示差走査熱量測定（ＤＳＣ）‐第２部：ガラス転移温度の測定（１９９９）を参照せよ。
【００１４】
本明細書の文脈における整列指数という用語は、総繊維数に対して、延伸軸に対して±２０度の角度を有する顕微鏡検査によって計数された繊維の百分率に関する。
【００１５】
本明細書で使用される多孔質材料の多孔度という用語は、材料科学において知られている標準的なパラメータに関し、１（又は１００％）から、材料（又は足場、ｓｃ）サンプル密度に対するかさ（バルク）（ｂ）の比を引いたものとして計算される：
【数１】
2020501849.tif 000004
【００１６】
発明の説明
本発明は、哺乳動物細胞の増殖を可能にするのに十分な多孔度を特徴とする、高度に整列したマイクロファイバーの足場を作製する方法に関する。多孔度の典型的な値は、７５％、８０％、８５％又はさらには約９０％を超える範囲にある。
【００１７】
第１の態様によれば、本発明は、ポリマー足場を調製するための方法に関し、以下のステップを含む。
ａ．第１のポリマーのフィラメントの布地片を提供するステップ、ここで前記第１のポリマーは生分解性又は生体適合性であり、前記片は長手方向伸長軸によって特徴付けられる；
ｂ．前記フィラメントの配列に第２のポリマーのコーティングを適用するステップ、ここで前記第２のポリマーは、前記第１のポリマーの融点より低いガラス転移温度によって特徴付けられる；その後
ｃ．前記片をその長手方向伸長軸に沿って延伸し、それによって前記フィラメントを整列させる、
それによって、整列した微小繊維状足場が得られるステップ。
【００１８】
特定の実施形態では、第１のポリマーのフィラメントの布地片は、不織布メッシュである。特定の実施形態において、第１のポリマーのフィラメントの布地片は、フェルト様の布地である。
【００１９】
編み技術又は製織技術が布地を一軸方向に延伸することを可能にする限り、織物を布地として使用することも可能である。織物において新しい配向を見出すための繊維の変位は、所望の繊維配列を達成するために重要である。したがって、すべての編成技術が本発明の適用に適しているわけではないが、当業者は本明細書に提示されている手引きによって本発明の方法に適している布地を選択することができるであろう。
【００２０】
特定の実施形態では、布地片はステップｃでその長手方向伸長軸に沿って１７５％を超えて延伸される、すなわち長さ１０ｃｍの片は１７．５ｃｍ以上に延伸される。特定の実施形態では、布地片は、１７５％から２５０％の間、さらには３００％まで延伸される。特定の実施形態では、布地片は、約２００％に延伸される。
【００２１】
フィラメントにおいて要求される整列を達成するのに十分な延伸度は著しく変動する。それは第１のポリマー繊維の性質、その加工及び絡み合いの程度に依存する。本発明の利点をもたらす配向を達成するのに有効な延伸度は、様々な材料において１１０％から１０００％の延伸まで変化する。
【００２２】
特定の実施形態では、延伸プロセスは、ステップｃにおける延伸の前後に、ある程度の整列を適用することによって定量化することができる。それによって、プロセスに入る布地片は、フィラメントの第１の整列指数ｉＡ１によって特徴付けられ、整列微小繊維状足場は、ステップｃにおける延伸後の第２の整列指数ｉＡ２によって特徴付けられる。
【００２３】
第１の整列指数に対する第２の整列指数の比ｉＡ２／ｉＡ１は、布地が延伸された程度の尺度である。特定の実施形態では、この比は２より大きく、特に２．５より大きく、さらに特に３より大きい。
【００２４】
特定の実施形態では、上で定義された整列指数は、ランダム足場については２０〜２５％、その延伸前の長さの１５０％（１．５倍）まで延伸されたサンプルについては５５〜６０％、そして延伸前の長さの２００％（２．０倍）まで延伸されたサンプルについては７５〜８０％である。
【００２５】
単純なマイクロファイバー延伸によって得られる足場は、高い多孔度と細胞侵入を可能にするのに十分大きい孔とを組み合わせ、これはナノファイバーを超える利点を提供する。しかしながら、マイクロファイバーを整列させると、それらが崩壊することになる。第２のポリマーの適用は、繊維網目構造のこの破壊を防止し、それは細胞の移動及び培養に適した材料中でのマイクロファイバーの高い多孔度及びそれらの整列を組み合わせることを可能にする。特定の実施形態では、第１及び第２のポリマーはそれぞれガラス転移温度Ｔｇ及び融解温度Ｔｍによって特徴付けられ、ステップｃは第１及び第２のポリマーの両方のＴｇよりも高く、かつ第１及び第２のポリマーの両方のＴｍよりも低い温度で行われる。言い換えれば、整列を達成するために、ポリマーは、十分に可塑性であるためにそれらのガラス転移点を超えて加熱されていなければならないが、溶融してはならない。
【００２６】
特定の実施形態では、第１のポリマーは規定のＴｍを有していなくてもよい。当業者は、プロセス温度の主要点が足場マトリックスの融点より低いが両方のポリマーのガラス転移点より高い温度でプロセスを実施することであることを理解する。
【００２７】
特定の実施形態において、ステップｃ．は、５０℃から１５０℃、特に６０℃から８０℃の間の温度で行われる。これらの温度は、ＰＧＡ（及び／又はポリ‐Ｌ‐乳酸（ＰＬＬＡ）及びＰＬＧＡ）ベースの足場に対して特に良好に機能する。
【００２８】
特定の実施形態では、加えられた張力を解放する前に、足場はステップｃの後に冷却される。
【００２９】
特定の実施形態では、第２のポリマーは生分解性及び／又は生体適合性ポリマーである。
【００３０】
特定の実施形態において、フィラメントに塗布される第２のポリマーの量は、第１のポリマーのフィラメントの質量に対して１０％から４０％（質量％；ｍ／ｍ）の範囲である。例えば、ＰＧＡフィラメントからなる１０ｇの布は、ポリヒドロキシブチレートで被覆された後に１３ｇの質量を有し、これは３０％の第２のポリマーの塗布に相当する。
【００３１】
１つの特定の実施形態では、１０％〜４０％の量の第２のポリマーが、ＴＨＦ中の２％（ｗ／ｖ）ポリヒドロキシブチレートの溶液中の第１のポリマー足場の深層コーティングによって塗布される。
【００３２】
特定の実施形態では、第１のポリマーは、ポリエステル、ポリウレタン及びポリアニリンを含む群から選択される。特定の実施形態では、第１のポリマーは、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ乳酸グリコール酸（ＰＬＧＡ）、ポリ（トリメチレンカーボネート）（ＰＴＭＣ）、及びグリコール酸又は乳酸モノマーを含むコポリマーを含む群から選択される。
【００３３】
ポリアニリンはバイオセンサー技術で使用される導電性ポリマー（ＰＡＮＩ）である。それは生分解性ではないが生体適合性である。ＰＡＮＩは、本明細書では、脊髄損傷に対処する際に使用するために、特に神経成長の誘導又は切断された神経への刺激の適用におけるその有用性のために、永久足場を構築するための適切な材料として考えられる。
【００３４】
特定の実施形態では、第１のポリマーはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）；ポリ（２‐メトキシエチルアクリレート）（ＰＭＥＡ）；ポリ（２‐メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）（ＰＭＰＣ）；ポリ（テトラヒドロフルフリルアクリレート（ＰＴＨＦＡ）；及びポリスチレン（ＰＳＴ）を含む群から選択される。
【００３５】
第２のポリマーは、第１のポリマーのフィラメントを被覆し、延伸力が解放された後にそれらを整列状態に保つのに役立つ。第２のポリマーは第１のポリマーとは異なる。それは溶液中の浸漬コーティングにより塗布される。溶媒又はポリマー自体が第１のポリマーを溶解してはならないことは明らかである。第２のポリマーは、適用される条件下で第１のポリマーを完全には溶解しない溶媒中で第２のポリマーが溶解しなければならないという条件で、第１のポリマーについて与えられたリストから選択することができる。
【００３６】
特定の実施形態において、両方のポリマーを溶解することができる溶媒が使用されるが、少なくとも第１のものは、第２のポリマーが適用される条件下で非常にゆっくりとしか溶解されない。
【００３７】
例えば、第２のポリマーのポリマー溶液は、一晩溶解することによって得ることができ、次いでこれを溶液中にフラッシュ浸漬することによって第１のポリマー上に塗布し、その後足場を真空中に置いて乾燥させる。高分子量となるであろう第１のポリマーは構造を崩壊させる点まで溶解せず、第２のポリマーのコーティングは第１のポリマー上に残り、繊維接合部を形成する。
【００３８】
特定の実施形態では、第２のポリマーはポリヒドロキシブチレート、特にＰ４ＨＢ及びＰ３ＨＢである。非限定的な一例として、Ｐ４ＨＢをＴＨＦ（テトラヒドロフラン）に溶解して、ＰＧＡ、ＰＬＡ、ＰＬＬＡ、及びＰＬＧＡの繊維を被覆することができる。
【００３９】
第１のポリマー、第２のポリマー及び溶媒のさらなる有利な組み合わせは、非限定的な例として、表１に示される。
【表１】
2020501849.tif 000005
【００４０】
特定の実施形態では、フィラメントは、１００ｎｍから２５０μｍの間、特に１μｍから５０μｍの間、さらに特に１０μｍから２０μｍの間の直径を特徴とする。
【００４１】
特定の実施形態では、ステップａ．で提供される布地片は、第１のポリマーのかさ密度に対して５〜１５％の足場比重を特徴とする。特定の実施形態において、ステップｃ．で得られた布地片は、第１のポリマーのかさ密度に対して１０％〜２０％の足場比重を特徴とする。特定の実施形態において、ステップｃ．で得られた布地片は、第１のポリマーのかさ密度に対して測定した足場比重が１．５〜３倍、特に約２倍であり、ステップａ．で提供された布地片の足場比重よりも大きいことを特徴とする。
【００４２】
材料の多孔度は、式
【数２】
2020501849.tif 000006
を用いて足場密度及びかさ密度の値から計算することができる。ここで、
【数３】
2020501849.tif 000007
は、バルク材料の密度であり、
【数４】
2020501849.tif 000008
は、多孔質足場の密度である。
【００４３】
本発明の別の態様は、人工組織を提供するための生体外方法に関し、以下のステップを含む。
ａ．その実施形態のいずれかにおいて、本発明の第１の態様として上に述べた方法に従って整列した微小繊維状足場を提供するステップ；及び
ｂ．整列された微小繊維状足場を哺乳動物細胞を含む細胞培養培地に懸濁するステップ。
【００４４】
特定の実施形態では、哺乳動物細胞は線維芽細胞、筋芽細胞及びニューロンから選択される。特定の実施形態において、細胞培養培地は、３７℃で細胞増殖及び分化のためのすべての栄養素及び増殖因子をコンプロマイズし、細胞は２０日間まで培養中に保たれた。
【００４５】
さらに別の態様は、第２の生分解性又は生体適合性ポリマーで被覆された第１の生分解性又は生体適合性ポリマーのフィラメントの整列した微小繊維状足場に関し、以下を特徴とする。
ａ．前記足場の多孔度は８０％以上、特に８５％以上、さらに特に９０％以上である。
ｂ．整列指数は５０％より大きく、特に７５％以上、さらに特に８５％以上である、及び／又は
ｃ．前記フィラメントの直径は１００ｎｍから２５０μｍ、特に５μｍから５０μｍ、さらに特に１０μｍから２０μｍの範囲である。
【００４６】
骨再生のために適用される足場のような特定の用途は、例えば５０％のようなより低い多孔度値によって特徴付けられ得る。
【００４７】
特定の実施形態では、足場を構成する繊維又はフィラメントは、５μｍ以上５０μｍ以下の範囲の直径を特徴とする。
【００４８】
繊維又はフィラメントの直径のパラメータは、細胞浸潤に利用しやすい孔を形成することに関して重要である。例えば、ナノメートル範囲の繊維では、９０％の多孔度でも整列した足場を作製することができる。しかしながら、そのようなナノメートルの高多孔度足場の問題は、それらが、細胞が浸潤するには小さすぎる多数の細孔によって特徴付けられることである。細胞浸潤のための良好な孔径を有するマイクロメートル範囲のマイクロファイバーランダム足場は当該分野で公知であるが、これらの繊維は必要な整列を欠いている。
【００４９】
したがって、高度に多孔質の足場における孔の接近可能性は別々に評価されるべきである。発泡体及びヒドロゲルなどの非繊維状足場の他の例は、両方とも通常９５％を超える多孔度を有するが、それらの孔は細胞浸潤に十分にアクセス可能ではない。したがって、これらの足場は細胞の存在下でインサイチュ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）で作製する必要がある。
【００５０】
本発明のこの態様のある実施形態において、第１のポリマーはポリエステル、ポリウレタン及びポリアニリンを含む群から選択される。
【００５１】
特定の実施形態では、第１のポリマーは生分解性ポリマーを含む第１の群、特にポリグリコリド、ポリ（乳酸）、ＰＬＧＡ、ポリ（トリメチレンカーボネート）、ポリ（４‐ヒドロキシブチレート）、ポリ（３‐ヒドロキシブチレート）、ポリ（グリコリド‐コ‐カプロラクトン）、ポリ（グリコリド‐コ‐トリメチレンカーボネート）、又はグリコール酸若しくは乳酸モノマーを含むコポリマーを含む群から選択される。
【００５２】
多くの用途において、生分解性であるように選択された場合、この第１のポリマーは、足場全体を生分解性にするために生分解性でもある第２の（コーティング）ポリマーと組み合わされる。
【００５３】
本発明のこの態様の特定の実施形態において、第１のポリマーは、非生分解性だが生体適合性のポリマーを含む第２の群から選択され、特にポリアニリン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；ポリエチレンテレフタレート；ポリ（２‐メトキシエチルアクリレート）；ポリ（２‐メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）；ポリ（テトラヒドロフルフリルアクリレート）；ポリスチレン、又はこの第２の群に含まれる２つ若しくは３つの異なるポリマーのコポリマー、特にＰＥＧと他の第２の群のいずれかの非生分解性ポリマーとのコポリマーからなる群から選択されるポリマーである。
【００５４】
本発明のこの態様の特定の実施形態では、第２のポリマーは、特にＰ４ＨＢ及びＰ３ＨＢから選択されるポリヒドロキシブチレートである。
【００５５】
本発明のこの態様の特定の実施形態では、足場は、第１のポリマーのかさ密度に対して１０〜２０％の足場比重を特徴とする。
【００５６】
結論として、本発明者らは、足場の多孔度及び繊維の一体化を維持しながら、微小繊維状ポリマー足場において繊維の整列を誘導するための新規なアプローチを報告する。そのようなポリマー足場は、組織工学及び外科的用途に頻繁に使用されており、３Ｄ細胞及び組織培養のための適切なプラットフォームを提供する。本明細書に提示された単純なアプローチは、小線維足場における繊維整列のための普遍的な方法を提供する。実施例に提供される細胞研究は、足場繊維方向に沿った細胞及びマトリックスの整列を可能にし、ミリメートルスケールの３Ｄ整列組織構築物を成長させるための本発明の方法の適合性を例示する。本発明の方法は、心臓及び骨格筋、腱、神経、並びに血管組織修復及び工学を含む、足場内での細胞整列の真の３Ｄ誘導が必要とされる組織工学及び再建手術の多くの分野における適用に適している。
【００５７】
本明細書中に開示される方法によって提供される足場は、インビトロで人工組織を作製するために使用され得るか、又は指向性の組織治癒及び修復を促進するための外科用パッチとして直接使用され得る。第２の態様のために（パッチとして）提供される足場は、細胞培養物中での事前のインキュベーションなしに適用され得る。
【００５８】
本発明の別の態様は、細胞なしで足場を直接移植することによる又は体内に直接ＥＣＭによる、本明細書に開示される足場の外科的適用又はインビボ適用に関し、それは新しい組織生成を導き、それによって治癒過程を改善すると期待される。
【００５９】
例えば第１のポリマー又は第２のポリマー、多孔度又は細胞タイプなどの単一の分離可能な特徴に対する代替物が「実施形態」として本明細書に記載される場合は常に、そのような代替物は自由に組み合わされて本明細書に開示された本発明の個別の実施形態を形成し得ることを理解されたい。
【００６０】
本発明は、以下の実施例及び図面によってさらに説明され、これから、さらなる実施形態及び利点を引き出すことができる。これらの実施例は本発明を説明するためのものであり、その範囲を限定するためのものではない。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】図１は、整列したＰＧＡ足場の製造及び繊維整列分析を示す。（ａ）足場をＴｇより上及びＴｍより下に加熱し、続いて延伸装置を使用することによって一方向ひずみを加えることによってランダムＰＧＡ網目構造中に整列を誘導するプロセスの説明図（ｂ）長方形のランダムＰＧＡ足場の幅と長さは、異なる延伸を適用すると変化した（５０％と１００％）。（ｃ）様々に延伸されたＰＧＡ足場の整列分析。（ｄ）Ｐ４ＨＢ相互接続を用いて１００％延伸した際の高度に整列したＰＧＡ足場を視覚化した対応する足場の偽色蛍光画像及び（ｅ）電子顕微鏡写真。二重頭の矢印は加えられたひずみの方向を示し、小さい矢印はＰＧＡ繊維を相互接続するＰ４ＨＢコーティングを示す。スケールバー（ａ）５ｍｍ、（ｄ）２００μｍ（ｅ）５０μｍ。
【００６２】
【図２】図２は、延伸及び整列したＰＧＡ足場の物理的性質の変化を示す。（ａ）比重［ｍｇ／ｃｍ３］は、ＰＧＡ足場の１００％延伸後に有意に増加した。（ｂ）ＰＧＡ足場の足場多孔度（比重に反比例する）。（ｃ）繊維径は、ランダムＰＧＡ足場の加工における外部ひずみによって影響されなかった。（ｄ）様々な延伸ＰＧＡ足場のひずみ応力曲線。１００％延伸ＰＧＡ足場の曲線の傾き（ヤング率）が大幅に増加している。
【００６３】
【図３】図３は、様々に延伸したＰＧＡ足場上でヒツジ血管線維芽細胞を１週間培養した後の細胞核及びＦ‐アクチン整列分析を示す。（ａ）様々に延伸したＰＧＡ足場上に播種したＦ‐アクチン（紫）及び核（青）について染色した血管線維芽細胞の多面共焦点画像の最大Ｚ投影強度は、小線維足場の間及び上に細胞が成長していることを示す。（ｂ）それぞれのアクチン繊維整列定量化は、整列した小線維足場による整列誘導を示している。ひずみ軸の±１０度以内の整列した（ｃ）アクチン繊維及び（ｄ）細胞核の百分率は、無作為に配向したＰＧＡ足場と比較して、延伸サンプルにおける改善されたＦアクチン及び細胞核整列を示している。スケールバー：２００μｍ（ａ、左）及び５０μｍ（ａ、右）。
【００６４】
【図４】図４は、ウサギ腱線維芽細胞によって組み立てられたフィブロネクチンマトリックス、及びランダム及び整列ＰＧＡ足場上で３週間培養した後のその整列定量化を示す。３週間の培養中、培地中の標識化フィブロネクチン（緑色）の取り込みにより可視化された（ａ、ｂ、ｃ）整列及び（ｄ、ｅ、ｆ）ランダムＰＧＡ足場（灰色）上のフィブロネクチンマトリックス集合体の多面共焦点画像の最大Ｚ投影強度は、ＰＧＡ繊維の間及び周囲へのフィブロネクチン沈着を示す。（ｇ）足場の繊維方向に沿った繊維状フィブロネクチン束の整列の定量化は、整列したＰＧＡ足場内でより高いレベルの異方性を示す。（ｈ、ｋ）培養足場の断面図は、足場の種類及び流れに直面する側面に沈着した優先的により高いフィブロネクチンとは無関係に、足場を横切ってフィブロネクチンマトリックス形成が起こることを示している（白い矢印）。
【実施例】
【００６５】
例
本発明者らは、本明細書において、市販の生分解性／再吸収性ポリマー、特にＰＧＡを用いてセンチメートルスケールでマイクロファイバー整列を誘導するための簡単な方法を報告する。例示的実施形態として、本発明者らは不織ＰＧＡメッシュを使用した。本発明の方法は、基本的に他の任意の微小繊維状足場に適用することができる。
【００６６】
初めに、ＰＧＡ繊維をポリ４‐ヒドロキシブチレート（Ｐ４ＨＢ）で被覆し、次に両方のポリマーのガラス転移温度（Ｔｇ）より上に加熱し、一方向のひずみをＰＧＡ‐Ｐ４ＨＢ網目構造に適用することにより整列させた。加えられたひずみの結果として、ＰＧＡ繊維は巻きが解かれ、個々の繊維はひずみ軸に対して平行に整列した。そのような整列したＰＧＡマイクロファイバー網目構造は、細胞組織化を誘導し、その多孔質構造への細胞整列を開始するための足場として使用された。本明細書に提示された結果は、そのような多孔質かつ整列した足場が３Ｄ細胞浸潤を提供し、３Ｄ組織化を維持しながら、接触誘導によって細胞を効率的に整列させることができることを実証する。さらに、灌流装置及び適切な足場の多孔性による効率的な細胞播種を使用することにより、本発明者らは整列した３Ｄ微小組織を得ることができた。このアプローチは、提示された例に限定されず、組織工学、再建手術及び基本的な細胞研究のために使用されている他の小線維足場に適用可能である。
【００６７】
実施例１：Ｔｇより上のＰ４ＨＢ被覆ＰＧＡ足場の延伸は、網目構造をほどき、繊維整列を誘導する
ＰＧＡは、３５〜４５℃の転移温度（Ｔｇ）及び２２０〜２３０℃の融点（Ｔｍ）を有し、一方、ポリ４‐ヒドロキシブチレート（Ｐ４ＨＢ）のＴｇ及びＴｍは、それぞれ５〜１５℃及び１６８〜１８２℃の間で変化する。ＰＧＡ足場をＰ４ＨＢ溶液（テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中１．７５％）に浸漬し、続いて周囲温度で一晩乾燥することによってＰＧＡ足場をＰ４ＨＢで被覆する。Ｐ４ＨＢを添加すると、ＰＧＡ繊維の分解時間が延び、組織工学応用に用いた場合、足場上の保護層として作用し、同時に交差する繊維を橋渡しすることにより足場の一体性を改善する。両方のポリマーのＴｇを超えて８０℃まで足場を加熱することは、足場繊維及びＰ４ＨＢの軟化をもたらし、それ故、繊維の切断や足場の損傷を誘導することなく一方向のひずみの適用を可能にした。ＰＧＡのＴｇ以下の温度を例えば室温まで連続的に低下させると、繊維を相互に連結し、足場の一体性を保持しながら、Ｐ４ＨＢとともに、繊維網を新しい配置に固化及び設定することができた（図１ａ）。マクロスケールでは、一方向性のひずみによって、幅を減少させ、長さを増大することによりポリマー網目構造の長方形の形状が変形した。プラスチックフィルムとは対照的に、ＰＧＡ網目構造の形状の変化は、弾性フィルムで観察されたものとほぼ同じであり、中央のごく一部に蓄積するのではなく、延伸足場の全長にわたって幅の減少の分布を示した（図１ａ）。この挙動は、この処理アプローチを、初期にランダムに配向された足場のより大きな面積から整列された足場を得るのに適したものにする（図１）。巨視的測定は、延伸に伴うそれぞれ５０％及び１００％の長さの増大に関連して、最大５３％及び７３％の幅の減少を示した（図１ｂ）。足場の厚さは、無ひずみ状態の８５８±５５μｍから、５０％及び１００％延伸ＰＧＡ状態のそれぞれ１１７０±１７２μｍ及び１０３６±１９１μｍに増加した。繊維配列を定量化するために、我々は３Ｄ蛍光共焦点画像を分析した。１００％延伸サンプルでは、５３％の繊維が軸ひずみに対して整列（±１０度）したが、５０％の延伸は３４％の繊維整列をもたらした。非延伸ＰＧＡ網目構造は、軸ひずみに対して整列した繊維がわずか１４％であった（図１ｃ及びｄ）。電子顕微鏡写真はまた、ＰＧＡ繊維の整列、及び延伸を適用した後のＰＧＡ繊維へのＰ４ＨＢ相互接続の存在を確認した（図１ｅ、白い矢印）。
【００６８】
足場密度測定は、無ひずみ（１０５±６．９ｍｇ／ｃｍ３）及び５０％延伸（１０２±１８．３ｍｇ／ｃｍ３）足場について比重の有意な変化を示さなかったが、１００％延伸（１５７．４±２８．２ｍｇ／ｃｍ３）足場について有意な増加が観察された（図２ａ）。これは、バルクＰＧＡポリマーの密度（１５３０ｍｇ／ｃｍ３）よりもはるかに低い。足場の多孔度測定は、あたかも同量の足場がバルクＰＧＡで充填されているかのように仮定して行った。足場多孔度の計算は、９２．９±０．５％、９３．２±０．９％及び８９．６を示した。それぞれ０、５０及び１００％延伸足場について８±１．３％の多孔度（図２ｂ）。これは、足場の約９０％の多孔度及び比重測定に関しては逆の傾向を意味する。繊維径分析は、異なって延伸されたＰＧＡ足場についての繊維径のいかなる有意な変化も示さず、足場に加えられたひずみがプロセス中の個々の繊維に直接影響を及ぼさなかったことを意味する（図２ｃ）。最後に、様々に整列した繊維状ＰＧＡ足場の機械的性質を測定し、元のＰＧＡ足場と比較した（図２ｄ）。元の足場（１１．３ＭＰａ）と比較して５０％の延伸足場（１２．９ＭＰａ）のヤング率のわずかな増加が観察されたが、ＰＧＡ網目構造を１００％延伸すると９６．３ＭＰａまでヤング率が増加した。ランダムな元のＰＧＡ足場の破断ひずみは約４０％であり、このタイプの足場を１００％まで延伸するためには、Ｔｇを超えて足場を加熱することが極めて重要な点であることを示唆している。
【００６９】
第１のポリマー（特に：ＰＧＡ）繊維の一体性における第２のポリマー、特にＰ４ＨＢの役割は、足場に細胞懸濁液を直接播種すること、又はさらなる細胞浸潤のために身体に移植することを計画する場合に特に重要である。電子顕微鏡画像（図１ｃ、小さな矢印）は、Ｐ４ＨＢポリマーで充填された繊維間領域を示す。これらの高分子架橋は、延伸中も繊維網状構造の結合を維持し、弾性接着剤のように振る舞い、網目構造を安定させる。延伸プロセスの後、これらの相互接続はひずみの下で高度に変形したが、それでも接続を維持した（図１ｄ、ｅ）。室温よりわずかに低いＰ４ＨＢのＴｇに由来する変形能は、８０℃でのアニーリングプロセスと共に、このポリマーの変形及び成形を助けた。コーティング層なしでＰＧＡ足場を延伸すること、又は延伸プロセス後にコーティングを溶解することは足場の一体性を示し、これは二次ポリマーコーティングの重要な役割を示している。
【００７０】
実施例２：３Ｄ整列多孔質ＰＧＡ足場に埋め込まれた細胞を、ＰＧＡ繊維の方向に誘導し整列させた
足場に播種したときに細胞が増殖して培地から十分な栄養素を受け取ることを確実にするために、本発明者らは、細胞培養期間中に組織を灌流するために単純な円形シェーカーを使用した。このようなバイオリアクターにより、１ｍｍ厚までのかなり厚い組織シートで細胞を増殖させることができた。最初に、ヒツジ血管線維芽細胞をＰＧＡ‐Ｐ４ＨＢ足場を使用して１週間の間に装置内で培養した。その後、アクチン繊維と核整列を分析した（図３ａ及びｂ）。分析は、アクチンストレスファイバーの大部分が１００％延伸ＰＧＡ足場に整列していることを示した（図３ｂ）。計数された整列アクチン繊維から、５１．１±５．７％が１００％延伸足場でＰＧＡ繊維の延伸軸に対して±１０度、５０％延伸足場で３７．６±６．５％、及びランダムに配向したＰＧＡ足場で６．９％±４．７で整列した（図３ｂ、ｃ）。さらに、細胞核整列分析は、１００％、５０％及び非延伸ＰＧＡ足場について、それぞれ、ＰＧＡ繊維の延伸軸に対して±１０度で５２．６±１０．２％、３６．９±１３．６％及び１４．４±３．７％の整列細胞核を示した（図３ｄ）。これは、アクチン繊維整列分析において得られた結果を支持する。
【００７１】
足場を横切るフィブロネクチンマトリックスの三次元沈着
整列に関する研究の大部分は短時間（数時間〜数日）での細胞核又はアクチン整列を報告しているが、本発明者らは、一週間後の細胞核及びアクチン繊維整列だけでなく、３週間後の主要ＥＣＭ成分としてフィブロネクチンフィブリル（小線維）束整列も評価した。これを行うために、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８標識フィブロネクチンをウサギ腱線維芽細胞の培地に３週間かけて加えた。培養時間中、標識されたフィブロネクチンは灌流され、ＥＣＭに共集合し、足場を横切るフィブロネクチンフィブリル（小線維）ネットワークの可視化を可能にし、フィブロネクチンフィブリル（小線維）の配向角を分析するために使用された（図４）。小線維フィブロネクチン束整列の定量化は、１００％延伸サンプル（図４において「整列された足場」と称される）及びランダムＰＧＡ足場において行われた。これを行うために、最初に高解像度画像を包含オブジェクト（「しきい値処理済」）について分析し、次にしきい値オブジェクトの長軸の角度を束の配向角度として定義した。整列ＰＧＡ足場上の集合したフィブロネクチンマトリックスは、ランダムＰＧＡ足場と比較した場合、より高い整列を示した（図４ａ〜ｇ）。しかしながら、ランダムＰＧＡ足場におけるわずかに優先的な整列は可視であり、これは整列及び／又は組織収縮の軸に対して平行な流れ方向から生じ得る。断面画像（図４ｅ、ｆ）を用いて、フィブロネクチンがどのように足場を横切って沈着したかを示し、構築物の三次元性及び効率的な細胞播種及び浸潤に対する足場の孔径の適合性を示した。フィブロネクチンは足場を横切って沈着したが、沈着は側面に顕著であり、これは流れに直面し（画像ｈ、ｋ中の矢印）、前面での灌流の増強を示した。３週齢のＥＣＭの評価は、この年齢ではＥＣＭが安定しているので重要である可能性があり、そのような組織は採取及び動物への移植に適していることが以前に示されている。また、脱細胞化及びさらなるＥＣＭ足場の移植は、最近注目を集め、動物及びヒトの臨床研究において有望な結果を明らかにした別の選択肢である。通常、操作された組織の脱細胞化は、さらなる処理のために高品質のＥＣＭを採取するための適切な範囲と考えられる４〜８週間のインビトロ培養の後に行うことができる。脱細胞化ＥＣＭの短期２Ｄ再細胞化はまた、細胞が沈着したフィブロネクチン繊維に沿って整列し、繊維の方向性に従うことができることを示した。これを考慮して、ここで行われた３週齢のフィブロネクチンマトリックスの分析は、最終的な細胞整列結果を予測することができ、それは将来の臨床応用のための１つの関心点となるであろう。さらに、３週間後に整列を維持することは、そのような足場のインビボ移植がおそらく新しい組織形成を誘導するのに十分な時間を有するであろう予測指標となり得る。
【００７２】
脱細胞化整列ＥＣＭはさらなる細胞整列、「既製の」脱細胞化操作組織への応用を導く
ＰＧＡ又は他のポリマー足場からの脱細胞化組織工学マトリックスは、血管及び心臓弁の組織工学において、特に緊急事態及び発展途上国において異種移植片及び同種移植片に対する容易に入手可能な「既製の」代替物として有用であり得る。これに関連して、本発明者らは、脱細胞化プロセス後の整列ＥＣＭが細胞整列を誘導することができるかどうかを調べた。これを行うために、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）表面上のナノパターン化リッジをシリコン‐ＳＵ８型から複製した。型は従来のフォトリソグラフィー手法により製造され、Ａｌｄｏ  Ｆｅｒｒａｒｉ博士により寛大に提供された。ＰＤＭＳ表面は、深さ３５０ｎｍ、幅５００ｎｍ及びリッジ幅５００ｎｍの溝を有していた。ナノパターン化ＰＤＭＳ表面をフィブロネクチン（５０μｇ／ｍｌ）で被覆し、次いでヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）を被覆表面上に播種した。細胞接着後、ＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ（登録商標）４８８標識フィブロネクチンを細胞培養培地（５μｇ／ｍｌ）に添加し、細胞に３日間細胞外マトリックスを構築させた。３日後、表面をｐＨ８．５中０．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ１００を用いて１５分間脱細胞化し、かくして脱細胞化ＥＣＭマトリックスを得た。その後、無細胞ＥＣＭ足場にＨＦＦを播種し、２４時間インキュベートした。ここでは、イメージング、脱細胞化及び再細胞化のプロセスを容易にするために、３Ｄ構築物の代わりに２Ｄ表面を使用した。ＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ（登録商標）４８８標識フィブロネクチンを（培地に標識フィブロネクチンを添加することにより）組み込むと、平坦面と比較してフィブロネクチン小線維束が溝の方向に沿ってどのように整列しているかを容易に視覚化できた。脱細胞化プロセス後のフィブロネクチンＥＣＭ上への線維芽細胞の再播種は、新しく播種された細胞が組み立てられたマトリックスの方向に沿って整列することができ、古いＥＣＭが細胞整列（アクチン整列）を開始し、トポグラフィカルなガイダンスとして役立つことができることを示している。この知見は、さらなる再細胞化及び細胞整列が事前整列脱細胞化マトリックスによって引き起こされ得る既製用途のための代替マトリックスとしての事前整列化脱細胞化マトリックスの適用を支持する。
【００７３】
比較例３：
ＰＬＧＡをクロロホルムとエタノールの混合物（７５：２５ｗ／ｗ）に溶解することにより、最終ポリマー濃度６重量％のＰＬＧＡポリマー溶液を調製した。ポリマーを室温で一晩溶解し、均質性を得るために使用前に溶液を３０分間撹拌した。
【００７４】
電界紡糸足場の製造のために、ステンレス鋼管（内径１ｍｍ及び壁厚０．３ｍｍ、Ａｎｇｓｔ＆Ｐｆｉｓｔｅｒ  ＡＧ、チューリッヒ、スイス）、ＤＣ高圧電源（Ｇｌａｓｓｍａｎ  Ｈｉｇｈ  Ｖｏｌｔａｇｅ  Ｉｎｃ．、Ｈｉｇｈ  Ｂｒｉｄｇｅ、ＮＥ、ＵＳＡ）、コレクター及びシリンジポンプとしての中空円筒回転アルミニウムマンドレル（ＡＬ１０００  Ａｌａｄｄｉｎ、Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｉｎｃ．、ドイツ）で作られた鈍端を有する紡糸ヘッドからなる、社内で組み立てられた電界紡糸装置を使用した。ポリマー溶液を５ｍＬシリンジ（Ｂ．Ｂｒａｕｎ  Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ  ＡＧ、ドイツ）に充填し、０．７ｍＬ／ｈの流速で紡糸ヘッドにポンプで注入した。１１ｋＶの電圧を印加し、紡糸ヘッドとコレクターとの間の距離を１５ｃｍに固定した。生成した足場をアルミニウムホイル上に集め、室温で一晩真空乾燥した。次に布をＡＬホイルから集めて手動ストレッチャー装置に取り付けた。その後、布を６０℃まで加熱し、２倍（２００％）延伸した。この比較例では、第２のポリマーを塗布しなかった。延伸すると、ファイバーコイルは開かれ、８０％の整列指数で整列された。しかしながら、布地の張力が解放されると、二次ポリマーが存在しないために繊維の一体性及び整列性が失われた。繊維直径は１〜２μｍの範囲であると決定された。この比較例は、電界紡糸のような他の技術によって製造された他の種類のランダム織物及び織物の一体性を保つための第２のポリマーコーティングの適用の重要性に本発明を適用できることを示している。
【００７５】
材料と方法：
足場の調製
市販の不織布ＰＧＡ足場（厚さ１．０ｍｍ；比重７０ｍｇ／ｃｍ３；Ｂｉｏｆｅｌｔ、Ｂｅｒｅｌｄａｎｇｅ  Ｌｕｘｅｍｂｏｕｒｇ）をテトラヒドロフラン（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ、米国ミズーリ州セントルイス）中の１．７５％ポリ‐４‐ヒドロキシブチレート（Ｐ４ＨＢ；ＭＷ：１０００００；ＴＥＰＨＡ  Ｉｎｃ．、米国マサチューセッツ州レキシントン）でコーティングした。網目構造の一体性を高め、ＰＧＡの分解速度を遅くするためにＰ４ＨＢを添加した。整列したＰＧＡ足場を調製するために、一片のＰＧＡ足場を延伸装置に取り付け、オーブン中８０℃で２分間加熱した。試験片をオーブンから取り出した後、それらを手動で、それらの元の長さから１．５倍又は２倍に可能な限り速く延伸した。その後、足場を室温に冷却し、将来の分析及び細胞培養研究に使用した。
【００７６】
ＰＧＡ網目構造の整列解析
ＰＧＡ繊維を可視化するために、４０５ｎｍ又は４８８ｎｍで励起した際のＰＧＡ繊維の自己蛍光特性をレーザー走査共焦点顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、ＦＶ１０００、日本）で画像化した。ＰＧＡ足場の画像を得た後、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて繊維配向を決定した。手短に言えば、ＩｍａｇｅＪの粒子分析器オプションを介して１０°刻み（０〜９０°）で繊維角度をすべての走査面において計算し、各刻みに対する繊維の数を数え、繊維の総数からの平均百分率（％）として表した。
【００７７】
足場比重及び多孔度分析
ＰＧＡ足場の比重は、重量測定的に決定された、すなわち、足場の重量は、足場の総体積で割られた。足場の長さ及び幅は定規によって測定され、それらの厚さは明視野顕微鏡画像を用いてそれらの断面から測定された。結果はｍｇ／ｃｍ  ３で表される。さらに、足場の多孔度は、足場の比重をＰＧＡのかさ密度（１５３０ｍｇ／ｃｍ３）に割ることによって計算し、百分率として表した。
【００７８】
機械分析
１００Ｎ荷重セルを備えた一軸荷重試験機（Ｉｎｓｔｒｏｎ引張試験機、Ｈｉｇｈ  Ｗｙｃｏｍｂｅ、Ｂｕｃｋ、ＵＫ：モデル５８６４）を使用して測定された応力／ひずみ曲線から、異なる延伸ＰＧＡ足場の機械的性質を得た。長方形の形状及び１０×２ｍｍ２の試験領域及び８００〜１２００μｍの厚さ範囲を有するサンプルを使用した。破損するまで２０ｍｍ／分の伸長速度を適用した。ヤング率［ＭＰａ］と破断ひずみ［％］はすべての条件で決定された（ｎ＝３）。
【００７９】
ミニバイオリアクターへのＰＧＡ足場の設置
ＰＧＡ足場の３Ｄ環境で効果的に細胞増殖を可能にするために、我々は単純な拍動流ミニバイオリアクターを開発した。我々の以前の研究は、このバイオリアクターが静的条件（引用）と比較した場合に、工学的に作製されたＰＧＡ足場へのＥＣＭ沈着を改善することを示した。簡潔には、ＰＧＡ足場を、ＵＶ光学接着剤（Ｎｏｒｌａｎｄ光学接着剤、米国ニュージャージー州）を使用して、ペトリ皿（直径５ｃｍ）の周壁に固定した。足場はオービタルシェーカーの各パルスによって前後に動いていた。足場を取り付けた後、７０％エタノール中の１０％過酸化水素の混合物及びＵＶ光を１時間使用して装置を滅菌した。全設定を滅菌ＰＢＳで少なくとも３回洗浄し、乾燥させ、続いて１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）を補ったＤＭＥＭ‐Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）及び５０μｇ／ｍｌ  Ｌ‐アスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ、米国）からなる培地中で細胞播種前に一晩インキュベートした。
【００８０】
ＰＧＡ足場の細胞播種とコンディショニング
ヒト静脈筋線維芽細胞を大伏在大静脈から採取し、血管工学及び細胞整列分析のためのモデルとして増殖した。さらに、アキレス腱由来のウサギ腱細胞を、以前に記載されたように単離して培養したもの（Ｅｖｒｏｖａら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１６、１９、１０４８）を、工学的に作成された腱を再構築するためのモデルとして使用した。細胞播種は、以前に記載されているように（Ｍｏｅｔら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００５、２６、３１１３）、担体としてフィブリンゲルを使用して行った。手短に言えば、細胞を標準的な細胞培養プロトコルのように解凍し、増殖させ、トリプシン処理した。その後、細胞をＰＢＳ（１０ＩＵトロンビン／ｍｌ）中の滅菌ウシトロンビン（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）溶液中に再懸濁した。１０ｍｇ／ｍｌの活性フィブリノーゲンに等しい１４ｍｇの凍結乾燥ウシフィブリノーゲン粉末（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）を培地に溶解することによってフィブリノーゲン溶液を調製し、この溶液を０．２１μｍの滅菌フィルターを用いて濾過滅菌した。続いて、トロンビン溶液中の細胞を等容量の滅菌ウシフィブリノーゲン溶液に添加した。短時間混合した後、細胞を含むフィブリン溶液をＰＧＡ足場上にピペットで移した。フィブリンゲルの凝固時間は２０から４０秒の間で変化すると決定された。したがって、培養培地を添加する前に、構築物を３７℃及び１０％ＣＯ２で１５分間重合させた。全ての構築物を最初の２４時間静的条件下で培養し、その後オービタルシェーカー（ＶＷＲ、米国）及びミニバイオリアクタープラットフォームを用いて灌流を開始した。シェーカー（振盪機）の回転半径は１９ｍｍであり、１Ｈｚの回転速度（６０ｒｐｍ）を試験中の全てのサンプルに適用した。培地の半分を交換し、蒸発した培地を滅菌脱イオン水で調整することによって、培地を３日ごとに交換した。研究中の最適化されたＤＭＥＭ緩衝化のために、インキュベーションは３７℃及び１０％ＣＯ２で行われた。
【００８１】
ＰＧＡ足場上の細胞及び細胞外マトリックスのイメージング
特定の培養期間の後、サンプルをアクチン及び核について免疫染色した。免疫染色のために、サンプルをＰＢＳで洗浄し、次いでＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒド中で３０分間固定した。アルブミンを添加することにより抗体の非特異的吸着を防止した（ＢＳＡ、２％ｗ／ｖ、３０分）。アクチン細胞骨格は、Ａｌｅｘａｆｌｏｕｒ（登録商標）４８８結合ファロイジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）を用いて染色した。細胞核をＤＡＰＩで染色した（２μｇ／ｍｌ、１０分）。サンプルを最後にＰＢＳで３回洗浄し、画像化した。
【００８２】
細胞核、Ｆ‐アクチン及びフィブロネクチン整列分析
細胞核整列は、ＩｍａｇｅＪの共焦点画像及び粒子分析器オプションを使用して分析した。４０５ｎｍレーザーを使用するとＰＧＡ繊維の自己蛍光が干渉するので、核を円形度、サイズによって細分化し、さらにすべてのサンプルにおいて手動でチェックした。核の配向角度を定義した後、繊維の延伸軸に対して±１０度の核、すなわち好ましい繊維方向を数え、整列細胞核として提示した。
【００８３】
高解像度共焦点画像を用いて、アクチン細胞骨格とフィブロネクチン束の小線維ネットワークとの整列を分析するために同様のアプローチを用いた。最初に、画像を閾値処理してアクチン繊維又はフィブロネクチン束の周囲を規定した。次にＩｍａｇｅＪ粒子分析器を用いて各粒子の長軸とその配向角度を定義した。これらの角度はアクチン繊維及びフィブロネクチン束の配向角度として定義された。次いで、アクチン又はフィブロネクチンの配向角度を５度瓶（ビン）に分類して、０度と１８０度の間の角度についてのヒストグラムを得た。ＰＧＡ繊維の延伸軸に対して±１０度のアクチン繊維を整列アクチン繊維と仮定した。
【００８４】
統計
一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）と事後ボンフェローニ検定（ＰＡＳＷ統計  １８ソフトウェア）を用いてデータを比較した。エラーバーは標準偏差を表す。０．０５以下のｐ値は統計的に有意であると考えられた。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【国際調査報告】
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