(57)【要約】ＭＡＳＴ４（microtubule associated serine/threoninekinase family member 4）タンパク質またはその断片に特異的に結合することができるポリペプチドまたは化合物、またはＭＡＳＴ４タンパク質またはその断片をコーディングする核酸に特異的に結合することができるポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは化合物を含む、真核細胞から細胞外基質を生産するための組成物、及び該組成物を含む軟骨再生促進用組成物に係わるものである。
2020513849.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＡＳＴ４（microtubule associated serine/threonine kinase familymember 4）タンパク質またはその断片に特異的に結合することができる化合物、または前記ＭＡＳＴ４タンパク質またはその断片をコーディングする核酸に特異的に結合することができる化合物を含む、真核細胞で細胞外基質の生産を促進させるための組成物。
【請求項２】
前記ＭＡＳＴ４タンパク質は、配列番号１ないし７、及び１５のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含むものであり、前記ＭＡＳＴ４タンパク質をコーディングする核酸は、配列番号８ないし１４、及び１６のうちいずれか１つのポリヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＭＡＳＴ４タンパク質またはその断片に特異的に結合することができる化合物、または前記ＭＡＳＴ４タンパク質またはその断片をコーディングする核酸に特異的に結合することができる化合物は、前記ＭＡＳＴ４タンパク質の活性または発現を阻害する化学的に合成された化合物、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、またはそれらの組み合わせであることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ポリペプチドは、抗体またはその抗原結合断片であることを特徴とする請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＭＡＳＴ４タンパク質またはその断片をコーディングする核酸に特異的に結合することができる化合物は、前記ＭＡＳＴ４タンパク質またはその断片をコーディングする核酸に特異的なｍｉＲＮＡ（micro ＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ（small interfering ＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（short hairpin ＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（Ｐｉｗｉ−interactingＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ））、ｓｎＲＮＡ（small nuclear ＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、またはそれらの組み合わせであることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記ＭＡＳＴ４タンパク質またはその断片をコーディングする核酸に特異的に結合することができる化合物は、前記ＭＡＳＴ４タンパク質またはその断片をコーディングする核酸に特異的なガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓであることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記ガイドＲＮＡは、前記ＭＡＳＴ４タンパク質またはその断片をコーディングする核酸に特異的なｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ）及びｔｒａｃｒＲＮＡ(transactivating ｃｒＲＮＡ)を含む二重ＲＮＡ、または前述のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの部分を含み、前記ＭＡＳＴ４タンパク質またはその断片をコーディングする核酸と混成化する一本鎖ガイドＲＮＡであることを特徴とする請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記真核細胞は、線維芽細胞または軟骨細胞であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記真核細胞から軟骨形成を促進させるためのものであることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
関節疾患の予防、治療、または症状の改善のためのものであることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記軟骨形成促進は、軟骨再生を誘導するためのものであることを特徴とする請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
組織の再生または老化防止に使用するためのものであることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記組成物は、ＴＧＦ−β１をさらに含むことことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
請求項１の組成物を個体に投与する段階を含む、関節疾患の予防、治療または改善させる方法。
【請求項１５】
請求項１の真核細胞から細胞外基質生産を促進させるための組成物を真核細胞と接触させる段階を含む真核細胞から細胞外基質を生産する方法。
【請求項１６】
前記真核細胞は、個体から分離されたこと特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記真核細胞と接触させる段階は、前記組成物の存在下で、前記真核細胞を培養する段階を含むことを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記培養する段階は、軟骨形成を誘導する物質の存在下で培養することを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
接触産物から細胞外基質を分離する段階をさらに含む細胞外基質を生産することを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記真核細胞は、軟骨細胞である細胞外基質を生産することを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＭＡＳＴ４（microtubule associated serine/threoninekinase family member 4）遺伝子を利用し、真核細胞から細胞外基質を生産するための組成物、前記真核細胞から細胞外基質を生産する方法、及び前記組成物を含む軟骨再生促進用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ほとんどの骨の形成は、軟骨板（cartilaginous template）で開始するために、成功に至る骨格系の発達は、構造的面と分子的面とにおいて、完璧な協力が要求される。関節軟骨は、高度に組織化された組織であり、それに関与する生体内軟骨形成のメカニズムは、今のところ解明されていない。コラーゲン微小纎維と、それ以外の他の細胞外基質構成タンパク質との相互作用が、軟骨の構造的な完壁性を維持させると知られているが、それらの複雑な過程を調節する信号伝達メカニズムは、まだ明白に明らかにされていない。従って、軟骨形成を主導する中心調節子（master regulator）存在の究明とその機能とを明らかにすることは、学問的に意味が大きいだけではなく、国民健康に寄与することはもとより、それを利用して革新的な治療剤を開発することも可能であろう。
【０００３】
ＭＡＳＴ４（microtubule associated serine/threoninekinase family member 4）は、軟骨で発現すると知られているが（非特許文型Ｂ１）、その役割については、明確に究明されていない。特許文献１で、ＭＡＳＴ４を利用して軟骨治療を行うことができるということを開示するが、それは、単にＭＡＳＴ４が軟骨で発現するという確率的結果に根づくだけであり、その具体的な役割について明確に究明していない。
本発明者らは、軟骨形成に関与する新たな中心調節子としてＭＡＳＴ４を発見し、ＭＡＳＴ４の活性を調節する物質開発のための源泉技術を提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】ＣＮ１０５６３６６１４
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】ＢＭＣＧｅｎｏｍｉｃｓ２００７、８：１６５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
一様相は、ＭＡＳＴ４（microtubule associated serine/threonine kinase familymember 4）タンパク質またはその断片に特異的に結合することができる化合物、または前記ＭＡＳＴ４タンパク質またはその断片をコーディングする核酸に特異的に結合することができる化合物を含む、真核細胞において、細胞外基質の生産を促進させるための組成物を提供する。
【０００７】
他の様相は、ＭＡＳＴ４タンパク質またはその断片に特異的に結合することができる化合物、または前記ＭＡＳＴ４タンパク質またはその断片をコーディングする核酸に特異的に結合することができる化合物を含む、軟骨細胞から、軟骨形成（chondrogenesis）を促進させるための組成物を提供する。
【０００８】
さらに他の様相は、前記真核細胞から細胞外基質生産を促進させるための組成物を真核細胞と接触させる段階を含む真核細胞から細胞外基質を生産する方法を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
一様相による、細胞外基質の生産を促進させるための組成物を利用し、細胞外基質の供給が必要な個体に注入し、関節疾患を含む疾病を予防・治療して症状を改善させることができ、真核細胞から細胞外基質を効率的に生産する方法に適用することができる。
他の様相による、軟骨細胞から軟骨形成を促進させるための組成物を個体に注入し、関節疾患を含む疾病を予防・治療して症状を改善させることができ、個体から分離された軟骨細胞の軟骨再生を促進させ、軟骨再生現象によって生産される細胞外基質を含む多様な成分を効率的に生産する方法に適用することができる。
さらに他の様相による、真核細胞から細胞外基質を生産する方法により、真核細胞から細胞外基質を効率的に生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを利用したＭＡＳＴ４ノックアウトマウスを作製する方法を図式化した図面である。
【図２】図２Ａは、ＭＡＳＴ４ノックアウトマウスＡタイプ及びＢタイプにおいて、各遺伝子の発現量変化をＲＴ−ＰＣＲで確認した結果を示した図面である。図２Ｂは、ＭＡＳＴ４が、ノックアウトされたマウスのタンパク質発現状態を確認した図面であるである。
【図３】ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを利用し、ＭＡＳＴ４が、ノックアウトされたＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞において、ＭＡＳＴ４ノックアウトを確認したことを示した図面である。
【図４】ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを利用し、ＭＡＳＴ４が、ノックアウトされたＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞において、各遺伝子の発現量変化をＲＴ−ＰＣＲで確認した結果を示した図面である。
【図５】軟骨形成確認のためのマイクロマス培養（micromass culture）において、それぞれの遺伝子発現量の変化を、ＲＴ−ＰＣＲで確認した結果を示した図面である。
【図６】ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを利用し、ＭＡＳＴ４が、ノックアウトされたＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞において、軟骨分化程度の差をアルシアンブルー染色で確認した結果を示した図面である。
【図７】ヒト細胞のＭＡＳＴ４をノックアウトするために使用された標的配列の情報に係わる図面である。
【図８】図８Ａは、ＭＡＳＴ４をｓｉＲＮＡでノックダウンしたヒト軟骨細胞である。図８Ｂは、ＭＡＳＴ４をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを利用してノックアウトしたヒト軟骨細胞において、細胞外基質因子の発現程度を示した図面である。
【図９】ヒト原性軟骨細胞にＴＧＦ−β１を処理した後、ＭＡＳＴ４の発現量変化、及びそれによる細胞外基質因子の発現量を示した図面である。
【図１０】ＭＡＳＴ４がノックアウトされたマウスの頚骨において、軟骨の形成及び再生の効果を確認した図面である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
一様相による、ＭＡＳＴ４（microtubule associated serine/threonine kinasefamily member 4）タンパク質またはその断片に特異的に結合することができる化合物、または前記ＭＡＳＴ４タンパク質またはその断片をコーディングする核酸に特異的に結合することができる化合物を含む、真核細胞において、細胞外基質（extracellular matrix）の生産を促進させるための組成物を提供する。
【００１２】
他の様相による、ＭＡＳＴ４タンパク質またはその断片に特異的に結合することができる化合物、または前記ＭＡＳＴ４タンパク質またはその断片をコーディングする核酸に特異的に結合することができる化合物を含む、軟骨細胞から軟骨形成（chondrogenesis）を促進させるための組成物を提供する。
【００１３】
一具体例において、前記ＭＡＳＴ４タンパク質またはその断片に特異的に結合することができる化合物、または前記ＭＡＳＴ４タンパク質またはその断片をコーディングする核酸に特異的に結合することができる化合物は、前記タンパク質またはその断片、または前記核酸に少なくとも部分的に結合することができるものを含む。ここで、前記化合物は、化学的に合成された化合物、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、またはそれらの組み合わせでもある。それらは、ＭＡＳＴ４タンパク質の活性または発現を阻害するものでもある。
一具体例において、前記真核細胞において、細胞外基質の生産を促進させるための組成物は、真核細胞から軟骨形成を促進させるためのものである組成物でもある。
【００１４】
前記組成物において、前記ＭＡＳＴ４タンパク質の活性阻害剤、またはＭＡＳＴ４タンパク質の発現阻害剤は、ＭＡＳＴ４の遺伝子の発現を阻害、または前記ＭＡＳＴ４タンパク質の活性を阻害するものであるならば、いずれも含まれる。前記活性阻害剤または発現阻害剤は、前記ＭＡＳＴ４遺伝子の全部または一部の領域において、相補的なポリヌクレオチドでもある。前記ポリヌクレオチド配列は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはそれらの融合体（hybrid）でもある。
【００１５】
一具体例において、前記ＭＡＳＴ４タンパク質活性の阻害は、ＭＡＳＴ４タンパク質のキナーゼ活性を阻害するものでもある。
【００１６】
ＭＡＳＴ４は、キナーゼとして標的になる基質のＳｅｒまたはＴｈｒをリン酸化させることができるので、前記ＭＡＳＴ４タンパク質のキナーゼ活性の阻害は、ＭＡＳＴ４の標的になる基質のリン酸化、具体的には、ＳｅｒまたはＴｈｒのリン酸化を遮断することを意味する。
【００１７】
一具体例において、前記ＭＡＳＴ４タンパク質またはその断片に特異的に結合することができるポリペプチド、または前記ＭＡＳＴ４タンパク質またはその断片をコーディングする核酸に特異的に結合することができるポリペプチドは、抗体、またはその抗原結合断片でもある。
【００１８】
用語「抗体」とは、抗原性部位に対して指示される特異的な免疫グロブリンを意味し、ＭＡＳＴ４遺伝子を発現ベクターにクローニングし、前記遺伝子によってコーディングされるＭＡＳＴ４タンパク質を得て、前記タンパク質から、当該技術分野の一般的な方法によって抗体を製造することができる。前記抗体の形態は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を含み、全ての免疫グロブリン抗体が含まれる。前記抗体は、２個の全体長の軽鎖、及び２個の全体長の重鎖を有する完全な形態だけではなく、２個の軽鎖、及び２個の重鎖を有する完全な形態の完全な抗体構造を有さないものの、抗原性部位に対して指示される特異的な抗原結合部位（結合ドメイン）を有し、抗原結合機能を保有している抗体分子の機能的断片も含む。
【００１９】
用語「ポリヌクレオチド（nucleotide）」は、取り立てて言及されない限り、ヌクレオチドまたは核酸と同一意味で使用され、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを示し、特別に言及されていない限り、自然のヌクレオチドの類似体、及び糖部位または塩基部位が変形された類似体を含んでもよい。前記ポリヌクレオチドは、必要により、当該技術分野に公知された多様な方法を介して変形させることができる。そのような変形の例としては、メチル化、キャップ化、天然ヌクレオチド１以上の同族体への置換、及びヌクレオチド間の変形、例えば、荷電されていない連結体（例：メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、カルバメートなど）、または荷電された連結体（例：ホスホロチオエート、ポスポロジチオエートなど）への変形がある。
【００２０】
一具体例において、前記ＭＡＳＴ４タンパク質またはその断片をコーディングする核酸に特異的に結合することができる化合物として、前記ＭＡＳＴ４タンパク質またはその断片をコーディングする核酸に特異的に結合することができるポリヌクレオチドは、前記ＭＡＳＴ４タンパク質またはその断片をコーディングする核酸に特異的なｍｉＲＮＡ（micro ＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ（small interfering ＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（short hairpin ＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ−相互作用ＲＮＡ（Ｐｉｗｉ−interactingＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ））、ｓｎＲＮＡ（small nuclear ＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、またはそれらの組み合わせでもある。
【００２１】
他の具体例において、前記ＭＡＳＴ４タンパク質またはその断片をコーディングする核酸に特異的に結合することができる化合物は、前記ＭＡＳＴ４タンパク質またはその断片をコーディングする核酸に特異的に結合することができるポリヌクレオチドを含むものであり、前記ＭＡＳＴ４タンパク質またはその断片をコーディングする核酸に特異的なガイドＲＮＡ（guide ＲＮＡ）を含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓでもある。
【００２２】
一具体例において、前記Ｃａｓは、Ｃａｓ９でもある。
ＣＲＩＳＰＲｓ（clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats）は、遺伝子配列が明らかにされたバクテリアまたは古細菌の遺伝体で発見されるさまざまな短い直接反復を含む座位を意味し、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムにおいて、必須なタンパク質要素としてＣａｓ９を含み、ガイドＲＮＡ（具体的には、ガイドＲＮＡに含まれたＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びtrans−activating ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と命名された２つのＲＮＡ）と複合体を形成したとき、活性エンドヌクレアーゼ（endonuclease）として作用する。
【００２３】
一具体例において、前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムが標的遺伝子であるＭＡＳＴ４に特異的に作用するために、前記ガイドＲＮＡは、前記ＭＡＳＴ４タンパク質をコーディングする核酸に特異的なｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ）及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む二重ＲＮＡ（dual ＲＮＡ）、または前述のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの部分を含み、前記ＭＡＳＴ４タンパク質をコーディングする核酸と混成化する一本鎖ガイドＲＮＡ（single strand guide ＲＮＡ）の形態を有する。前記二重ＲＮＡ及び一本鎖ガイドＲＮＡは、ＭＡＳＴ４タンパク質をコーディングするポリヌクレオチドと少なくとも部分的に混成化することができ、具体的には、ＭＡＳＴ４タンパク質のアミノ酸配列をコーディングするポリヌクレオチド配列において、「５’−ＴＡＣＣＣＴＧＣＣＧＣＴＧＣＣＧＣＡＣＣ−３’（配列番号１７）」に該当する部分と混成化することができる。
【００２４】
具体的には、前記ガイドＲＮＡは、前記ＭＡＳＴ４タンパク質をコーディングするヌクレオチド配列のうちから選択された標的配列に混成化するｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む二重ＲＮＡ、または前述のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの部分を含み、前記ＭＡＳＴ４タンパク質をコーディングするヌクレオチドと混成化する一本鎖ガイドＲＮＡであり、前記標的配列であるＭＡＳＴ４遺伝子は、少なくとも部分的に、前述のｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと相補的な配列のポリヌクレオチド配列と、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ：protospacer-adjacent motif）を含む配列を含む。前記プロトスペーサー隣接モチーフは、当業界に周知された配列であり、ヌクレアーゼタンパク質が認識するのに適する配列を有するものでもある。前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの標的になるＭＡＳＴ４遺伝子は、内在的ＤＮＡ（endogenous ＤＮＡ）または人為的なＤＮＡ（artificial ＤＮＡ）でもあり、具体的には、前記ＭＡＳＴ４タンパク質をコーディングするヌクレオチドは、真核細胞の内在的ＤＮＡ、さらに具体的には、軟骨細胞の内在的ＤＮＡを意味するものでもある。
【００２５】
一具体例において、前述のｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、前記標的ＤＮＡと相補的な２０個の連続的なポリヌクレオチドを含むものでもあり、前記相補的な２０個の連続的なポリヌクレオチドの標的ＤＮＡは、５’−ＴＡＣＣＣＴＧＣＣＧＣＴＧＣＣＧＣＡＣＣ−３’（配列番号１７）でもあり、表６の配列番号７４，７６及び７７において、ボールド体で表示された配列のうちから選択されたものを含んでもよい。前記Ｃａｓ９タンパク質を暗号化する核酸またはＣａｓ９タンパク質は、ストレプトコッカス属（genus Streptococcus）微生物に由来するものでもある。前記ストレプトコッカス属微生物は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）でもある。前記ＰＡＭは、５’−ＮＧＧ−３’トリヌクレオチド（trinucledotide）を意味するものでもあり、前記Ｃａｓ９タンパク質は、効率を増進させるために、Ｃ末端またはＮ末端に、核位置信号（ＮＬＳ：nuclear localization signal））をさらに含んでもよい。
【００２６】
本発明の前記真核細胞において、細胞外基質の生産を促進させるための組成物において、前記真核細胞は、酵母、かび、原生動物（protozoa）、植物・高等植物・昆虫及び両生類の細胞、または哺乳動物の細胞でもある。前記哺乳動物は、ヒトを含み、猿、牛、馬、豚など多様でもある。前記真核細胞は、個体から分離されて培養された細胞（インビトロ）、移植された細胞（graft cell）、インビボ細胞、または組み換えられた細胞を含むが、それらに制限されるものではない。前記個体から分離された真核細胞は、前記真核細胞から生産された細胞外基質を含む生成物を注入する個体と同一個体から分離された真核細胞でもある。その場合、異なる個体から生産された生成物が注入されることによって発生しうる移植片体宿主反応を含む不要な過剰免疫反応または拒否反応などの副作用を防止することができるという長所がある。
【００２７】
一具体例において、前記真核細胞は、線維芽細胞（fibroblast）または軟骨細胞（chondrocyte）でもある。
【００２８】
一具体例において、前記真核細胞において、細胞外基質の生産を促進させるための組成物及び／または軟骨細胞から、軟骨形成を促進させるための組成物は、ＴＧＦ−β１をさらに含んでもよい。本発明者らは、ＴＧＦ−β１により、ヒト軟骨細胞において、ＭＡＳＴ４の発現が低減し、それにより、細胞外基質の生産が促進されるということを確認した。従って、真核細胞（または、軟骨細胞）において、ＭＡＳＴ４ノックアウト細胞において、細胞外基質をさらに効果的であって容易に促進させるために、ＴＧＦ−β１を併行処理するのが有利である。
【００２９】
前記ＭＡＳＴ４は、ヒト（Homo sapiens）由来またはマウス（Musmusculus）由来のタンパク質や、猿、牛、馬のような他の哺乳動物においても、同一タンパク質が発現される。
【００３０】
ヒト由来のＭＡＳＴ４は、ヒト細胞に存在する７個のイソ型（isoform）をいずれも含むものでもある。前記７個のイソ型は、ＮＣＢＩ reference sequence基準として、ＮＰ＿０５５９９８．１（配列番号１）、ＮＰ＿９４２１２３．１（配列番号２）、ＮＰ＿００１１５８１３６．１（配列番号３）、ＮＰ＿００１２７７１５５．１（配列番号４）、ＮＰ＿００１２７７１５６．１（配列番号５）、ＮＰ＿００１２７７１５７．１（配列番号６）またはＮＰ＿００１２８４５８０．１（配列番号７）のアミノ酸配列を含むものでもあり、前記それぞれのアミノ酸配列を有するタンパク質またはポリペプチドは、ＮＭ＿０１５１８３．２、ＮＭ＿１９８８２８．２、ＮＭ＿００１１６４６６４．１、ＮＭ＿００１２９０２２６．１、ＮＭ＿００１２９０２２７．１、ＮＭ＿００１２９０２２８．１またはＮＭ＿００１２９７６５１．１の配列のうち、各前記配列番号１ないし７のアミノ酸配列をコーディングする配列番号８ないし１４のポリヌクレオチド配列を含むｍＲＮＡからそれぞれ翻訳されたものでもある。
【００３１】
マウス由来のＭＡＳＴ４は、ＮＣＢＩ reference sequence基準として、ＮＰ＿７８０３８０．２（配列番号１５）のアミノ酸配列を含むものでもあり、前記アミノ酸配列を有するタンパク質またはポリペプチドは、ＮＭ＿１７５１７１．３の配列のうち、配列番号１５のアミノ酸配列をコーディングする配列番号１６のポリヌクレオチド配列を含むｍＲＮＡから翻訳されたものでもある。
【００３２】
前記配列番号１ないし７、及び１５のアミノ酸配列、または配列番号８ないし１４、及び１６のポリヌクレオチド配列と一致しないとしても、生物学的に同等な活性を有するアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列は、ＭＡＳＴ４タンパク質またはそのｍＲＮＡとも見なされる。
【００３３】
従って、一具体例において、前記ＭＡＳＴ４タンパク質は、配列番号１ないし７、及び１５のうちいずれか一つの配列を含むものであり、前記ＭＡＳＴ４タンパク質をコーディングするヌクレオチド配列は、配列番号８ないし１４、及び１６のうちいずれか一つの配列を含むものでもある。
【００３４】
前記ＭＡＳＴ４タンパク質またはポリペプチドは、配列番号１ないし７、及び１５と、６０％以上、例えば、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９９％以上または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものでもある。また、前記ＭＡＳＴ４タンパク質は、前記配列番号１ないし７、及び１５のアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸、２個以上のアミノ酸、３個以上のアミノ酸、４個以上のアミノ酸、５個以上のアミノ酸、６個以上のアミノ酸、または７個以上のアミノ酸が変化された配列を有するアミノ酸配列でもある。
【００３５】
前記ＭＡＳＴ４それぞれをコーディングするポリヌクレオチドは、配列番号８ないし１４、及び１６と、６０％以上、例えば、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９９％以上または１００％の配列同一性を有する配列を有することでもある。また、前記ＭＡＳＴ４をコーディングする核酸は、前記配列番号８ないし１４、及び１６の配列において、１個以上のヌクレオチド、２個以上のヌクレオチド、３個以上のヌクレオチド、４個以上のヌクレオチド、５個以上のヌクレオチド、６個以上のヌクレオチド、または７個以上のヌクレオチドが異なる配列を有するポリヌクレオチドでもある。
【００３６】
本発明者らは、軟骨細胞において、ＭＡＳＴ４遺伝子発現を阻害すれば、細胞外基質の生産が増大し、軟骨形成が促進されるということを最初に究明した。
従って、一具体例において、本発明の前記真核細胞において、細胞外基質の生産を促進させるための組成物、または軟骨細胞から軟骨形成を促進させるための組成物は、関節疾患の予防、治療、または症状の改善のためのものでもある。
また、一具体例において、本発明の前記真核細胞において、細胞外基質の生産を促進させるための組成物、または軟骨細胞から軟骨形成を促進させるための組成物は、軟骨再生を誘導するためのものでもある。
また一具体例において、前記真核細胞において、細胞外基質の生産を促進させるための組成物は、組織の再生または老化防止に使用するためのものでもある。
【００３７】
前記組織再生は、傷、やけど、外傷、老化、慢性炎症、疾病、遺伝的要因などによって損傷されたり変形されたりする皮膚の再生を意味するものであり、医療的目的または皮膚美容目的に使用されるものをいずれも含む。前述の損傷または変形は、前記要因により、組織内の細胞外基質が損失されたり、生産量が減少したりするか、あるいは回復不可能に誘発されたものであり、本発明の組成物により、細胞外基質生産を促進させることにより、症状の改善、緩和、回復または完治が可能であるということを意味する。
【００３８】
皮膚を含む組織が老化する場合、細胞外基質の生産が低減され、組織の弾力が低下し、外部刺激によって容易に変形されたり損傷されたりし、回復速度が遅くなる。それにより、本発明の組成物は、細胞外基質の生産を増大させるので、老化による組織の弾力低下、変形または損傷を予防したり、回復を促進させたりする。
【００３９】
他の具体例において、前述の組織再生用または老化防止用の組成物は、フィラ、コラーゲン補充用化粧品の成分に利用されるものでもある。さらに他の具体例において、前述の組織再生用または老化防止用の組成物は、微細ほこりまたは光物質の吸着を遮断するための機能性化粧品の成分に利用されるものでもある。
【００４０】
本発明の前記真核細胞において、細胞外基質の生産を促進させるための組成物、または軟骨細胞から軟骨形成を促進させるための組成物は、薬学的に許容可能な塩または担体をさらに含んでもよい。
【００４１】
用語「薬学的に許容可能な塩」とは、患者に比較的非毒性であって無害な有効作用を有する濃度でもって、該塩に起因した副作用が、本発明の組成物の望ましい効能を落とさない、本発明の組成物における化合物のいかなる有機または無機の付加塩を意味する。それら塩は、当業者に知られたものであるならば、いかなるものでも選択される。
【００４２】
本発明の組成物は、薬学的に許容可能な担体を追加して含んでもよい。薬学的に許容可能な担体を含む前記組成物は、経口または非経口のさまざまな剤形でもある。製剤化させる場合には、普通使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使用しても調剤される。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、トローチ剤などが含まれ、そのような固形製剤は、１以上の本発明の化合物に、少なくとも１以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロース（sucrose）またはラクトース（lactose）、あるいはゼラチンなどを混ぜても調剤される。また、単なる賦形剤以外に、ステアリン酸マグネシウムタルクのような潤滑剤も使用される。経口投与のための液状製剤としては、懸濁液剤、耐溶液剤、乳剤またはシロップ剤などが使用されるが、折々使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に、さまざまな賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれる。
非経口投与のための製剤には滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁溶剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤などが含まれてもよい。非水性溶剤、懸濁溶剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、エチルオレートのような注射可能なエステルなどが使用される。坐剤の基剤としては、ウイテプゾール（witepsol）、マクロゴール、ツイン（Tween）６１、カカオ脂、ラウリンジ、グリセロール、ゼラチンなどが使用される。
【００４３】
一様相は、前記組成物を個体に投与する段階を含む、関節疾患を予防、治療または改善させる方法を提供する。
他の様相は、、本発明の前記真核細胞から細胞外基質を生産するための組成物を真核細胞と接触させる段階を含む細胞外基質を生産する方法を提供する。
【００４４】
一具体例において、前記真核細胞は、個体から分離されたものでもある。一具体例において、前記真核細胞は、軟骨細胞でもある。
一具体例において、前記真核細胞と接触させる段階は、前記組成物を真核細胞に共同形質注入（co-transfecting）または段階的形質注入（serial-transfecting）する段階を含んでもよい。前記本発明の組成物を真核細胞内に効果的に伝達させるために、微細注入法（microinjection）、電気穿孔法（electroporation）、ＤＥＡＥ−デキストラン処理（ＤＥＡＥ−dextran treatment）、リポフェクション（lipofection）、ナノパーティクル媒介形質注入、タンパク質伝達ドメイン媒介導入、ウイルス媒介遺伝子伝達、及び原生動物において、ＰＥＧ媒介形質注入のような当業界の多様な方法を使用することができるが、それらに制限されるのではない。
一具体例において、前記真核細胞と接触させる段階は、前記組成物の存在下、前記真核細胞を培養する段階を含む。
一具体例において、前記培養する段階は、軟骨形成を誘導する物質の存在下で培養することを含む。
一具体例において、本発明の細胞外基質を生産する方法は、前記接触産物から細胞外基質を分離する段階をさらに含む細胞外基質を生産する方法である。
他の具体例において、前記細胞外基質を生産する方法は、本発明の軟骨形成を促進させるための組成物を軟骨細胞と接触させる段階を含むものでもある。
他の様相は、前記本発明の軟骨形成を促進させるための組成物を軟骨細胞と接触させる段階を含む軟骨を形成する方法を提供する。
一具体例において、前記軟骨細胞は、個体から分離されたものでもある。
一具体例において、前記軟骨細胞は、生成された軟骨が移植される個体に由来したものでもある。
【００４５】
さらに他の様相は、本発明の上昇した細胞外基質生産能を有する真核細胞を培養し、ＥＣＭを生産する段階と、培養物からＥＣＭを分離する段階と、を含むＥＣＭを生産する方法を提供する。
一具体例において、前記培養は、軟骨形成を誘導する物質の存在下で培養することでもある。
一具体例において、前記軟骨形成を誘導する物質は、ＢＭＰでもある。
【００４６】
以下、本発明について、実施例を介してさらに詳細に説明する。しかし、それら実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲は、それら実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４７】
実施例１．ＭＡＳＴ４ノックアウトマウスにおける軟骨構成成分の発現増加確認
１−１．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを利用したＭＡＳＴ４ノックアウトマウスの作製
ＭＡＳＴ４の発現が抑制される場合、軟骨構成成分である細胞外基質が増加するか否かということを確認するために、まず、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを利用し、ＭＡＳＴ４ノックアウトマウスを作製した。
具体的には、ＣＲＩＳＰＲノックアウトマウスを作るために、FengZhang博士（Congら、２０１３）から寄贈されたｐＸ３３０−Ｕ６−Ｃｈｉｍｅｒｉｃ＿ＢＢ−ＣＢｈ−ｈＳｐＣａｓ９（Ａｄｄｇｅｎｅ、＃４２２３０）でもって、Ｃａｓ９ｍＲＮＡとガイドＲＮＡとの発現が可能なプラスミドを使用した。ＭＡＳＴ４は、７ｋｂ以上の大きいタンパク質であるので、エクソン１及びエクソン１５の２部分を対象にし、遺伝子編集がなされるようにデザインし、ＭＡＳＴ４のエクソン１を標的とするガイドＲＮＡ配列は、５’−ＧＧＡＡＡＣＴＣＴＧＴＣＧＧＡＧＧＡＡＧＧＧＧ−３’、そしてエクソン１５を標的とする配列は、５’−ＧＧＣＡＣＡＡＡＧＡＧＴＣＣＣＧＣＣＡＧＡＧＧ−３’である。前記ガイドＲＮＡ配列について、作製者のプロトコル（http://crispr.mit.edu/, Zhang Feng Lab）により、下記ＭＡＳＴ４ＣＲＩＳＰＲオリゴマー表に示されたオリゴマーを作製し、ｐｘ３３０プラスミドに挿入し、それぞれエクソン１及び１５を標的とする２種プラスミドをクローニングした。
【表１】
2020513849.tif 000003
胚芽を得るために、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊめすマウスに、交配２日前、Pregnantmare serum gonadotrophin（ＰＭＳＧ；Ｐｒｏｓｐｅｃ、ｃａｔ．ｎｏ．ＨＯＲ−２７２）５ＩＵを投与し、４７時間後、Humanchorionic gonadotrophin（ｈＣＧ；Ｐｒｏｓｐｅｃ、ｃａｔ．ｎｏ．ＨＯＲ−２５０）５ＩＵを投与した。その後、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄鼠と交配させ、胚芽を卵管から得た。従来の標準的なプロトコルを参照し（Gordon and Ruddle、１９８１）、前記作製されたプラスミド５ｎｇ／ｕｌ及び１０ｎｇ ｓｓＤＮＡ供与者（ｓｓＤＮＡ donor）を含む微細注入混合物を、１細胞段階（one-cell-stage）の胚芽の前核（pronuclei）に注入した。注入された１細胞胚芽を仮妊娠ＩＣＲマウスに移した。
生まれた鼠に対する表現型分析は、エクソン１及びエクソン１５についてなされ、最終的に、２種ＭＡＳＴ４ノックアウトマウスを得ることができ、前記２種ＭＡＳＴ４ノックアウトマウスであるＡ類型及びＢ類型に係わる情報は、図１及び下記表２（５’→３’）に表示した通りである。
【表２】
2020513849.tif 000004
前記表２において 欠失される塩基は、太字で表示した。
【００４８】
１−２．ＭＡＳＴ４ノックアウトマウスにおける軟骨構成成分の発現変化確認のためのＲＮＡシーケシング
前記実施例１−１で作製されたＭＡＳＴ４ノックアウトマウスにおいて、軟骨構成成分である細胞外基質の変化を確認するために、各遺伝子に対してＲＮＡシーケシングを行った。
【００４９】
具体的には、前記実施例１−１で作製された生後１日のＭＡＳＴ４ノックアウトマウス、ヘテロタイプマウス及び野生型マウスを犠牲にした後、頚骨（tibia）を切開した。氷上にＤＥＰＣ−ＰＢＳが入れられたディッシュに、前記切開された頚骨を浸しておき、解剖燎微鏡を利用し、頚骨において、軟骨と骨との部分をニードルを利用して分離する。各群から分離されたそれぞれの組織をトリゾール（Invitrogenから購入）５００μｌに浸して各試料にし、当業界に周知された方法によってＲＮＡを抽出し、ナノドロップ（Thermo scientific）で定量した。
【００５０】
ＲＮＡシーケシングは、テラジェネテックスで行った。具体的には、各群のマウスから抽出された総ＲＮＡ ２μｇから、oligo（ｄＴ）を利用し、ｍＲＮＡを分離した。前記ｍＲＮＡを断片化（fragmentation）させ、無作為６量体プライミング（random hexamer priming）を介して、一本鎖ｃＤＮＡに合成した。それをテンプレートにし、二次鎖を合成し、二本鎖ｃＤＮＡを合成した。Blunt-endを作るために、End Repairを行い、Adapterを付けるために、Ａ−tailing及びAdapter ligationを行った。その後、ＰＣＲ（polymerasechain reaction）を利用し、ｃＤＮＡライブラリを増幅させた。２１００ BioAnalyzerを利用し、最終生成物の濃度とサイズとを確認した。生成されたライブラリは、ＫＡＰＡ library quantification kitを以下で最終定量した後、Ｈｉｓｅｑ２５００を利用し、配列を解読した。前記解読された配列において、低品質の配列を除去するために、配列情報において、Ｎで示された塩基の比率が全体配列の１０％以上含まれているか、あるいはＱ２０未満の塩基が４０％以上であるリードが除去され、平均品質がＱ２０以下であるリードも除去するフィルタリングを行った。前記フィルタリング全過程は、内部で作製されたプログラムによって遂行された。フィルタリングされた配列は、ＳＴＡＲｖ２．４．０ｂ（Dobin et al、２０１３）を利用し、当該種（species）参照遺伝体配列（ｈｇ１９）に整列させた。
【００５１】
発現量測定は、Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓ ｖ２．１．１（Trapnell C. etal、２０１０）を利用して計算し、計算された発現値をＦＰＫＭ（fragments read perkilobase of exon per million fragments mapped）で表現した。遺伝子情報データベースにおいて、ensemble ７２を使用し、non-coding遺伝子領域は、発現マスクオプションから除外した。発現量測定の正確性を高めるために、多重判読矯正（multi-read correction）と断片矯正（frag-bias-correct）とのオプションを追加して使用し、他のオプションは、基本値を使用した。
ＭＡＳＴ４ノックアウトによって変化される遺伝子を確認するために、Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓを介して得られた各群での試料の発現値を利用した。各発現値が、ＭＡＳＴ４野生型に比べて２倍以上、Ｐ値＜０．０１と、有意性ある遺伝子を選択し、選択された遺伝子の発現値及びその差を表３に並べた。
【００５２】
その結果、下記表３のように、多数の軟骨構成成分として存在する細胞外基質関連遺伝子の発現が増加したということが分かる。ただし、ＭＡＳＴ４ノックアウトマウスの２タイプのいずれにおいても、細胞外基質分解酵素であるｍｍｐ８及びｍｍｐ９は、発現が低減したと見られる。
【表３】
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【００５３】
１−３．ＭＡＳＴ４ノックアウトマウスにおける軟骨構成成分の発現変化確認のためのＲＴ−ＰＣＲ
前記実施例１−１で作製されたＭＡＳＴ４ノックアウトマウスにおいて、軟骨構成成分である細胞外基質の変化をさらに具体的に確認するために、前記実施例１−２のＲＮＡシーケシング結果において、発現が変化すると見られる遺伝子のうち一部を選別し、ＲＴ−ＰＣＲを行った。
具体的には、下記表４のプライマーセット及びＡｃｃｕＰｏｗｅｒ ＰＣＲ ｐｒｅｍｉｘ（BIONEER、韓国）を利用し、販売者の指針に従って遂行した。
【表４】
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【００５４】
その結果、実施例１−２でのＲＮＡシーケシング結果と一致し、軟骨構成成分として存在する細胞外基質関連遺伝子の発現が増大したということを確認した（図２）
【００５５】
１−４．ＭＡＳＴ４ノックアウトマウスの軟骨細胞マーカー発現量確認
ＭＡＳＴ４がノックアウトされた場合、軟骨細胞に及ぼす影響を確認するために、軟骨細胞マーカーとして知られたＣｏｌ２ａ１を、マウスの頚骨に蛍光染色して確認した。
具体的には、前記実施例１−１のマウスモデルから頚骨組織を得て、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ、Wako、Osaka、日本）に、０．０１Ｍリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）、４℃で一晩固定した。前記組織を、１０％ＥＤＴＡで脱カルシウム化させ、パラフィン（Leica Biosystems、ＭＯ、米国）に入れ（embed）、６ｍｍ厚に切片化（sectionize）した。試料スライドを、ヘマトキシリン（hematoxylin）及びエオシン（eosin）で染色し、前記組織切片を４℃で一晩一次抗体と共にインキュベーションした。前記一次抗体は、Ｃｏｌｌ２ａ１（Ａｂｃａｍ、Cambridge、英国）を標的とする。ＰＢＳで洗浄した後、前記組織切片を連続してＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（Invitrogen、ＣＡ、米国）で２時間室温でインキュベーションした。各イメージを、confocalmicroscope ＬＳＭ７００（Carl Zeiss、Oberkochen、ドイツ）を利用して得て、代表的な試料の切片を新たに準備した（freshly prepared）Russell-Movat modified pentachrome（American MasterTech、ＣＡ、米国）で染色した。
【００５６】
その結果、図１０は、観察された試料の特定部分を拡大したものであり、Ｃｏｌ２ａ１（蛍光緑色区域／灰色背景区域）が、ＭＡＳＴ４がノックアウトされたマウスモデルの頚骨で顕著に増大した。ＴＯＰＲＯ−３（赤色点／灰色点で表示された区域）は、軟骨細胞の核を染色したものである。従って、ＭＡＳＴ４ノックアウトにより、軟骨の形成及び再生が促進されるということが分かる。
【００５７】
実施例２．ＭＡＳＴ４ノックアウト細胞における軟骨構成成分の発現増大確認
２−１．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを利用したＭＡＳＴ４ノックアウト細胞の作製
ＭＡＳＴ４ノックアウトマウスで示された細胞外基質増大現象が、インビトロでも同一に再現されるか否かということを確認するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを利用し、ＭＡＳＴ４ノックアウト細胞を作製した。
【００５８】
具体的には、マウスに由来した線維芽細胞（fibroblast cell）において、軟骨細胞に分化が可能なＣ３Ｈ／１０Ｔ１／２、Clone ８（ＡＴＣＣ&reg; ＣＣＬ−２２６ＴＭ）（亜洲大学校医科大学医学遺伝学教室のチョン・ソンヨン教授研究室から贈与される（Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞））を購入した。前記細胞をノックアウトさせるるために、ｌｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲｖ２（Plasmid ＃５２９６１）、ｐＶＳＶｇ（ＡｄｄＧｅｎｅ ８４５４）及びｐｓＰＡＸ２（ＡｄｄＧｅｎｅ １２２６０）をＡｄｄｇｅｎｅから購入し、下記表５のオリゴマーを利用し、販売者の指針（ｌｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲｖ２and lentiGuide oligo cloning protocol）により、マウスＭＡＳＴ４遺伝子（ＥＮＳＭＵＳＧ００００００３４７５１）のエクソン１を標的とするガイドＲＮＡを、ＬｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲｖ２プラスミドに挿入し、ガイドＲＮＡとＣａｓ９酵素とを同時に発現するプラスミドを作製した（対照群には、ガイドＲＮＡが挿入されず、Ｃａｓ９のみ発現するプラスミドを使用した）。
【表５】
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【００５９】
本方法はレンチウイルスを基にしたＣＲＩＳＰＲノックアウト方法であるので、ウイルスを作製するために、２９３Ｔ細胞に、前述のところで作製された３種プラスミド（ＬｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲｖ２（＋ガイドＲＮＡ）：ガイドＲＮＡ＋Ｃａｓ９ expressing plasmid、ｐＶＳＶｇ：Virus envelop plasmid、ｐｓＰＡＸ２：Virus packagingplasmid）を、試薬ＰＥＩ（polyethyenimine）を利用して形質感染（transfection）させた。１８時間後、新鮮な培地に交換し、培地だけ収穫し、０．４５μｍフィルタを利用し、ウイルスを得た。前記得られたウイルスを、Ｃ３Ｈ１０Ｔ／１２が接種（seeding）された６ウェルディッシュに感染させ、ウイルス１ｍｌ＋ＤＭＥＭ／ＦＢＳ１ｍｌ＋ｐｏｌｙｂｒｅｎ ２μｌを処理した後、２４時間後、新たなＤＭＥＭ／ＦＢＳに交換した。２４時間後、プロミシンを処理し、感染された細胞だけ選択し、１０ｃｍディッシュに、４０％コンフルエントまで継代培養を進めた。ＣＲＩＳＰＲによる遺伝子編集は、細胞ごとにランダムに示されるために、単一菌集落（colony）選択を進めた。１０ｃｍディッシュに、各ディッシュ当たり５０個の細胞が存在するように接種し、経時的に細胞が菌集落を形成すれば、それを１つのクローンに指定し、各クローンのゲノムＤＮＡを抽出し、エクソン１を特異的に増幅するプライマー（Ｆ：５’→３’ＣＴＧＴＧＧＴＣＣＡＡＣＣＴＣＴＧＴＣＡ、Ｒ：５’→３’ＡＴＣＧＧＣＴＣＡＧＴＧＡＣＡＣＴＴＣＣ）を利用してＰＣＲを行った。増幅されたＰＣＲ結果物を、シーケシング業体に依頼して分析した。配列分析結果、フレーム移動による遺伝子編集が確認された細胞を、対照群細胞と共に実験に利用した。前記作製されたガイドＲＮＡが標的とする配列を、前記表５に太字で表示した。前記ＭＡＳＴ４ノックアウトした結果をシーケシングした結果マウスＭＡＳＴ４エクソン１から、２個のヌクレオチドが欠失され、フレーム移動が誘発されたことを確認した。
【００６０】
２−２．ＭＡＳＴ４ノックアウト細胞における軟骨構成成分の発現変化確認のためのＲＴ−ＰＣＲ
前記実施例１−１で作製されたＭＡＳＴ４ノックアウトマウスにおける軟骨構成成分である細胞外基質の変化を確認するために、各遺伝子に対してＲＴ−ＰＣＲを行った。
１２ウェル中央に、総１０５個の細胞を含む培養液１０μｌを入れ、２時間インキュベーションした後、各ウェルに、ＦＢＳ１０％を含むＤＭＥＭを１ｍｌずつ添加した。２４時間経過後、細胞を収穫し、easy−ＢＬＵＥ（ＴＭ） Total ＲＮＡ Extraction Kit（Intron、Ｃａｔ１７０６１）を利用し、販売者の指針によってＲＮＡを分離した。その後、Ｍ−ＭＬＶ Reverse Transcriptase（Promega、Ｍ１７０５）を利用し、販売者の指針によってｃＤＮＡを合成した。ＲＴ−ＰＣＲに使用されたプライマーは、表４に記載された通りである。
【００６１】
その結果、実施例１−２及び実施例１−３での結果と一致し、ＭＡＳＴ４ノックアウト細胞においても、軟骨構成成分として存在する細胞外基質関連遺伝子の発現が増大したことを確認することにより（図４）、インビトロにおいても、ＭＡＳＴ４ノックアウトマウスで示された結果と同一結果を得る可能性があるということを確認した。
【００６２】
実施例３．ＭＡＳＴ４ノックアウト細胞におけるマイクロマス培養及び軟骨分化活性上昇の確認
３−１．ＭＡＳＴ４ノックアウト細胞のマイクロマス培養（micromass culture）
前記実施例２−２のＭＡＳＴ４ノックアウト細胞の軟骨型性能を評価するために、マイクロマス培養を行った。
具体的には、ＭＡＳＴ４ノックアウト細胞を、前記実施例２−１のように作製し、マイクロマス培養のために、従来公知の方法（Differentiation andMineralization of MurineMesenchymal C3H10T1/2 Cells in Micromass Culture, 2010,Rani Roy）を参照して行った。まず、１２ウェルプレートの各ウェル中央に、線維芽細胞状態の総１０５個の細胞を含む培養液１０μｌを入れ、２時間インキュベーションした後、各ウェルに、ＦＢＳ１０％を含むＤＭＥＭを１ｍｌずつ添加した。その後、各培養物には、軟骨に誘導させる目的により、１００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ及び１，０００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ２をそれぞれ添加した。その後、培養液を３日ごとに新たに交換した。
【００６３】
３−２．マイクロマス培養されたＭＡＳＴ４ノックアウト細胞の効果再現確認
前記実施例３−１によって培養されたＭＡＳＴ４ノックアウト細胞においても、前記実施例２−２のＭＡＳＴ４ノックアウト細胞のように、軟骨構成成分である細胞外基質の生産が増加する否かということ、及び最終的に軟骨型性能が上昇するか否かということを確認するために、ＲＴ−ＰＣＲを行った。
【００６４】
具体的には、前記マイクロマス培養のために、プレートに接種した日を基準に、０日、３日間及び６日間培養したものをそれぞれ収穫し、同じ日にＲＮＡを分離させ、各遺伝子について、前記実施例１−３のようにＲＴ−ＰＣＲを行い、軟骨構成成分の生産増加いかんを確認した。
【００６５】
その結果、前記実施例２−２のＭＡＳＴ４ノックアウト細胞で観察されたところと一致し、各細胞外基質成分の発現が増大すると共に、アグレカン（aggrecan）の発現により、ＢＭＰ２を介した誘導により、３日目から軟骨細胞において、分化が始まるということが分かり、結果として、軟骨型性能が上昇するということを確認した（図５）。特に、ＭＡＳＴ４ノックアウトされたた場合、３日目には、一部大きい発現差を示さない遺伝子が存在するが（ｈａｐｌｎ１）、６日目には、表示された全ての細胞外基質成分関連遺伝子が過発現する一方、対照群の場合、一部タンパク質は、少なく発現するか、あるいは６日目にむしろ減少し（例えば、Ｍａｔｎ３またはＣｏｍｐ）、ＭＡＳＴ４ノックアウト細胞が多様な細胞外基質をいずれも過発現させるのに有用であるように見えた。
【００６６】
３−３．大量培養されたＭＡＳＴ４ノックアウト細胞の軟骨形成確認
前記実施例３−２で観察された各細胞外基質成分関連遺伝子過発現現象が、遺伝子発現単位ではない、実際に単離して得られるタンパク質単位で増大するか否かということを確認するために、アルシアンブルー染色を行った。
【００６７】
具体的には、前述の各日付に該当する細胞のプレートを、ＰＢＳで２回ずつ洗浄し、４％パラホルムアルデヒド１ｍｌを添加し、１５分間固定させた。その後、０．１ＮＨＣｌ（ｐＨ１．０）に溶かした１％アルシアンブルー８−ＧＸ（Sigma−Aldrich、Ａ５２６８）１ｍｌを添加し、一晩染色させた。その後、５００μｌの０．１ＮＨＣｌを利用して２回洗浄し、イメージを得た。
【００６８】
その結果、ＭＡＳＴ４ノックアウト細胞の場合、３日目から軟骨形成が増大し、細胞外基質分泌が増大するということを確認することができ、その程度は、ＢＭＰ２濃度が上昇するにつれて増大するように見られた（図６）。
【００６９】
実施例４．ヒト細胞におけるＭＡＳＴ４発現抑制による効果確認
実施例４−１．ヒト細胞におけるＭＡＳＴ４発現抑制による効果確認
前記ノックアウトマウスモデル及びマウス細胞で確認されたような結果が、ヒト細胞においても、同一に誘発されるか否かということを確認した。
具体的には、ヒト原性軟骨細胞（primary chondrocyte）に、（仁荷大学校医科大学から寄贈される）ＭＡＳＴ４ｓｉＲＮＡ（ｈ）（ｓｃ−１０６２０１；Santa Cruz biotechnology）を一時的（transient）に形質注入してノックダウンさせるか（図８Ａ）、ＭＡＳＴ４の発現を、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムによってノックアウトさせた。ＭＡＳＴ４ｓｉＲＮＡは、ThermoFisher SCIENCITFICのLipofectamine&reg;ＲＮＡｉＭＡＸ Transfection Reagentを使用して進め、そこに使用されたプライマー情報は、下記表６に開示された通りである。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの作製及び処理は、実施例１−１のように行うが、ThermoScientificのＧｅｎｅＡｒｔＴＭPrecision ｇＲＮＡ Synthesis Kit（Ａ２９３７７）を参照して進め、そこに使用されたプライマー情報は、下記表６に開示された通りである。
【００７０】
ｓｉＲＮＡの形質注入は、高い形質注入効率のために、細胞をプランティング（planting）しながら、同時に形質注入する逆順形質注入（reverse transfection）技術を利用し、形質注入試薬としては、ThermoFisherSCIENCITFICのLipofectamine&reg; ＲＮＡｉＭＡＸ TransfectionReagentを使用した。具体的には、１５ｎＭのＭＡＳＴ４ ｓｉＲＮＡと、４．５μｌのLipofectamine ＲＮＡｉＭａｘとを、GibcoＴＭＯｐｔｉ−ＭＥＭＴＭ ４０μｌで混合した後、１５分間インキュベーションした。その後、１．５ｘ１０５細胞／ウェルのヒト原性軟骨細胞（＊＊＊変更）を、６ウェルプレート（ＣｏｌＩ coated plate）に、ゲンタマイシン（gentamicin）が含まれていない培地２ｍｌ（ＦＢＳ１０％）と共にプランティングし、前記ｓｉＲＮＡ混合物を共に添加し、７２時間後に収穫し、ＲＮＡを分離した。ヒト原性軟骨細胞は、ＤＭＥＭ（１７−２０５−ＣＶＲ Corning）、ＦＢＳ Qualified（米国origin ５００ｍＬ ２６１４０−０７９、Gibco）、Ｌ−グルタミン（２００ｍＭ）（１００ｘ２５０３０−０８１、Gibco）及びゲンタマイシン（５ｍμｇ／ｍｌ）（１０ｍＬ １５７００−０６０、Thermofisher）の条件で、コラーゲンＩにコーティングされたフラスコ（１７５、Ｃｏｌ Ｉ Straight Vent ３５６４８７、Corning）で培養した。
【００７１】
ノックアウトは、ＭＡＳＴ４ゲノム上の２０ｎｔ（標的のための配列を表６でボールド体で表示）を標的にして行われ、具体的には、＃１、＃３は、Exon５、＃２は、Exon８を標的にしたものである。＃１と＃３は、Reverse方向に作製し、＃２は、Forward方向に作製した。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの作製に使用されたヒトＭＡＳＴ４遺伝子のレファレンスは、ＭＡＳＴ４ＥＮＳＧ００００００６９０２０（http://asia.ensembl.org/）を基準にした。標的になったExon配列情報、及びＣＲＩＳＰＲ欠失が発生するＮＧＧ ＰＡＭ配列（灰色ボックス）を図７に具体的に開示した。
【表６】
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【００７２】
その結果、図８Ａから分かるように、ＭＡＳＴ４ ｓｉＲＮＡを形質注入したとき、ＭＡＳＴ４の発現が低減したことが確認され、このとき、Ａｃａｎのような細胞外基質因子の発現が増大した。また、図８Ｂから分かるように、ＭＡＳＴ４がノックアウトされることにより、Ａｃａｎ及びＣｏｌ９ａ１のような細胞外基質因子の発現が増大した。そのような結果は、先に、マウスモデル及びマウス細胞を利用して立証されたところと同一である。従って、他の細胞外基質因子及び軟骨形成効果においても、ヒト細胞において、ＭＡＳＴ４の発現を阻害することにより、マウスで立証されたところと同一結果を得ることができるのである。
【００７３】
実施例４−２．ヒト細胞においけるＴＧＦ−β１のＭＡＳＴ４発現抑制、及びそれによる効果確認
実施例４−１で確認されたようなＭＡＳＴ４発現抑制が、ＴＧＦ−β１によって誘発され、それにより、細胞外基質因子の発現に及ぼす影響を確認した。
具体的には、実施例４−１のヒト原性軟骨細胞に、ＴＧＦ−β１を処理し、実施例１−２及び１−３のようなＲＴ−ＰＣＲ及びウェスタンブロッティングを利用し、その発現量を測定した。
【００７４】
その結果、図９から分かるように、ＴＧＦ−β１（５ｎｇ／ｍｌ）を、２４，４８，７２時間それぞれ処理すれば、ＭＡＳＴ４の発現が抑制され、それにより、細胞外基質因子の発現も増大するということが分かる。ＴＧＦ−β１（５ｎｇ／ｍｌ）とＴＧＦ−β１との阻害剤であるＴＥＷ−７１９７を同時に処理すれば（図９Ｂ）、ＴＧＦ−β１によって増大されたＡｃａｎの発現が抑制され、ＭＡＳＴ４発現も、ＴＧＦ−β１単独処理したところに比べ、抑制効果が低減された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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