(57)【要約】  本発明は、Sghrtおよび/またはGas5 lincRNAの阻害剤、特に該lincRNAのコード配列および非コード配列に相補的なポリヌクレオチド、ならびに該阻害剤の製造方法に関する。心臓細胞を増殖、再生または脱分化するための前述の薬剤の使用；前述の薬剤を使用して心疾患を予防および治療するための方法；ならびにSghrtおよび/またはGas5 lincRNAの存在または量を決定することを含む、心臓治療計画の前、後、または最中に、心臓組織の再生または増殖能力を評価するための予後診断または診断アッセイ、もまた開示される。本開示はまた、治療剤の存在下および非存在下で、Sghrtおよび／またはGas5 lincRNAの、機能的発現および／または発現レベルを分析することを含む、心臓障害を治療または予防するために使用することができる治療剤をスクリーニングするための方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下：
a）Sghrt lincRNAおよび/またはGas5 lincRNA;
b）Sghrt lincRNAおよびGas５ lincRNAを生成するためのSghrt遺伝子および／またはGas５遺伝子転写の一方または両方;
のいずれか１以上を阻害するための、少なくとも１つの阻害剤であって：
i）Sghrt lincRNAのいずれか１つおよび／もしくはGas５ lincRNAのいずれか１つ、またはそれらのコード配列、すなわち配列番号１〜５４あるいはそれらの一部と相補的である配列；または
ii）配列番号６７で提供されるgDNA Sgrt非コード配列、もしくはその一部、および／または配列番号６８で提供されるgDNA Gas５非コード配列、もしくはその一部のいずれか１つに相補的である配列；
iii）ｉ）および／またはｉｉ）のポリヌクレオチドと少なくとも７５％の相同性を共有する配列、
を含むか、またはからなる単離されたポリヌクレオチドを含む、阻害剤。
【請求項２】
前記単離されたポリヌクレオチドが、その相補的配列と相互作用してその機能を遮断する、請求項１に記載の阻害剤。
【請求項３】
前記単離されたポリヌクレオチドが、Sghrtおよび/またはGas5の前記lincRNAと相互作用し、したがって配列番号１、３、５、７、９、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51〜53、またはそれらの一部のいずれか１つと相補的である、請求項１または請求項２に記載の阻害剤。
【請求項４】
前記単離されたポリヌクレオチドが、Sgrtの前記lincRNAと相互作用し、したがって配列番号５１〜５３、またはそれらの一部のいずれか１つと相補的である、請求項３に記載の阻害剤。
【請求項５】
前記単離されたポリヌクレオチドが、Gas５の前記lincRNAと相互作用し、したがって配列番号１、３、５、７、９、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47および49、またはそれらの一部のいずれか１つと相補的である、請求項３に記載の阻害剤。
【請求項６】
前記単離されたポリヌクレオチドが、Sghrtの前記lincRNAに対する前記コード領域と相互作用し、したがって配列番号54、またはその一部と相補的である、請求項１または請求項２に記載の阻害剤。
【請求項７】
前記単離されたポリヌクレオチドが、Gas５の前記lincRNAのための前記コード領域と相互作用し、したがって配列番号２、４、６、８、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48および50、またはそれらの一部のいずれか１つと相補的である、請求項１または２に記載の阻害剤。
【請求項８】
前記単離されたポリヌクレオチドが、前記SghrtおよびGas５遺伝子と相互作用し、したがってそれぞれ配列番号６７〜６８、またはそれらの一部で提供される非コード配列のいずれか１つに相補的である、請求項１または２に記載の阻害剤。
【請求項９】
前記単離されたポリヌクレオチドが：アンチセンスオリゴヌクレオチド；ギャップマー；低分子干渉RNA；低分子ヘアピンRNA；ペプチドおよびCRISPR-Cas、を含むか、またはからなる群から選択される、前述の請求項のいずれか一項に記載の阻害剤。
【請求項１０】
前記阻害剤が、CRISPR-Cas９を含む、請求項９に記載の阻害剤。
【請求項１１】
前記単離されたポリヌクレオチドが、i）またはii）のポリヌクレオチドと：76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、97％、99％および100％、を含むか、またはからなる群から選択される配列同一性の割合を共有する、前述の請求項のいずれか一項に記載の阻害剤。
【請求項１２】
前記単離されたポリヌクレオチドが:
Sghrt miR RNAi GGGTCTTTGCCTGGGTTTGTT (配列番号57); 
Sghrt miR RNAi TGGAATGTATCTGGCTCAGAA (配列番号58); 
Sghrt sgRNA1 TTTCGTCTGAGAGTCGGCTG (配列番号61);  
Sghrt sgRNA2 ACCAGGTAGCCACTGACCGT (配列番号62);
Sghrt KD: TTCGGAACTTGAAGGA (配列番号64);
Gas5 miR RNAi AGGTATGCAATTTCCTGAGTA (配列番号55); 
Gas5 miR RNAi CTCTGTGATGGGACATCTTGT (配列番号56); 
Gas5 sgRNA1 GGAGCGAGCGACGTGCCGGA (配列番号59); 
Gas5 sgRNA2 CATGCTGAGTCGTCTTTGTC (配列番号60); 
Gas5 KD: AGAACTGGAAATAAGA (配列番号63);
を含むか、またはからなる群から選択される配列を含む、前述の請求項のいずれか一項に記載の阻害剤。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の阻害剤、および適切な担体、補助剤、希釈剤および／または賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の前記単離されたポリヌクレオチドを含むか、またはコードするベクター。
【請求項１５】
前記ベクターが：プラスミド；ウイルス粒子；ファージ；バキュロウイルス；酵母プラスミド；脂質ベースのビヒクル；ポリマーミクロスフェア、リポソーム、ならびに細胞ベースのビヒクル；金コロイド粒子；リポ多糖類；ポリペプチド;多糖類;ウイルスビヒクル；アデノウイルス；レトロウイルス；レンチウイルス；アデノ随伴ウイルス；ヘルペスウイルス；ワクシニアウイルス；泡沫状ウイルス；サイトメガロウイルス；セムリキ森林ウイルス；ポックスウイルス；仮性狂犬病ウイルス；RNAウイルスベクター；DNAウイルスベクターおよびプラスミドとファージDNAとの組み合わせに由来するベクター、
を含むかまたはからなる群から選択される、請求項１４に記載のベクター。
【請求項１６】
前記ポリヌクレオチドが、RNA合成に導くための発現制御配列（複数可）に作動可能に連結されている、請求項１４または請求項１５に記載のベクター。
【請求項１７】
ベクターが、形質転換された宿主細胞の選択のための表現型形質を提供するための１つ以上の選択可能なマーカー遺伝子を含む、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１８】
請求項１４〜１７のいずれか一項に記載のベクターで形質転換もしくはトランスフェクトされたか、またはそれを含む宿主細胞。
【請求項１９】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の阻害剤の製造方法であって：
前記ポリヌクレオチドの産生を可能にするのに適切な条件下で請求項１８に記載の宿主細胞を培養すること；および
そうして生成した前記ポリヌクレオチドを回収すること、
を含む、方法。
【請求項２０】
医薬として使用するための、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の阻害剤。
【請求項２１】
心疾患の予防または治療において使用するための、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の阻害剤。
【請求項２２】
心疾患を治療するための医薬の製造において使用するための、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の阻害剤。
【請求項２３】
治療される個体に、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の前記阻害剤、または請求項１３に記載の医薬組成物、または請求項１４〜１７のいずれか一項に記載のベクターの有効量を投与することを含む、心疾患を予防または治療するための方法。
【請求項２４】
前記個体がヒトを含む哺乳動物である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記心疾患が：心筋梗塞；心不全；冠動脈疾患；動脈の狭窄；心臓発作；心拍リズムの異常；不整脈；心不全；心臓弁膜症；先天性心疾患；心筋疾患；心筋症；心膜疾患；大動脈疾患；マルファン症候群；遺伝性心筋症；非遺伝性心筋症；心肥大；圧負荷による心機能障害；および損傷した心臓組織、
を含むか、またはからなる群から選択される、請求項２１もしくは２２に記載の阻害剤、または請求項２３もしくは２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記心疾患の予防または治療が、心機能を回復させまたは改善することまたは以下：駆出率；左心室壁厚；右心室壁厚；左心室壁張力；右心室壁張力；心室質量；収縮機能；心肥大；拡張末期容量；収縮末期容量；心拍出量；心係数；肺毛細血管楔入圧および肺動脈圧、の１以上を少なくとも部分的に回復させもしくは改善することを含む、請求項２１もしくは２２に記載の阻害剤、または請求項２３もしくは２４に記載の方法。
【請求項２７】
心臓再生剤または心臓増殖剤として使用するための、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の阻害剤、または請求項１３に記載の医薬組成物、または請求項１４〜１７のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項２８】
心臓細胞の増殖、再生または脱分化のための方法であって、心臓細胞と、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の阻害剤、または請求項１３に記載の医薬組成物、または請求項１４〜１７のいずれか一項に記載のベクターとを接触させることを含む、方法。
【請求項２９】
心臓細胞が心筋細胞を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記心筋細胞が成体心筋細胞である、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
方法がインビトロで行われる、請求項２８〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
心臓治療計画の前、後または最中に心臓組織の再生または増殖能力を評価するための、予後診断または診断の方法であって：
前記心臓組織の心臓サンプルにおけるSghrt lincRNA（複数可）および／またはGas5 lincRNA（複数可）の存在または量を決定すること；ならびに
Sghrt lincRNA（複数可）および/またはGas5 lincRNA（複数可）のいずれか１以上が存在する場合、前記心臓組織の増殖能は不十分であると結論づけ；ならびに
Sghrt lincRNA（複数可）および/またはGas5 lincRNA（複数可）のいずれの１以上も存在しない場合、前記心臓組織の増殖能は十分であると結論付けることを含む、方法。
【請求項３３】
前記決定する工程が、ＲＮＡを抽出し、および単一核RNA配列決定を行い、次いで得られたRNA配列を配列番号１〜５３のいずれか１以上と比較して、lincRNA Sghrtおよび/またはGas5のいずれか１つ以上が存在するかどうかを決定することを含む、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
前記RNA配列決定の前に増幅が行われる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記決定する工程が、lincRNA標的に対する競合的結合アッセイの使用を含む、前記lincRNAの機能的活性についてアッセイすることを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
配列番号１、３、５、７、９、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51〜53のいずれか１つのポリヌクレオチドを増幅するためのＰＣＲプライマーおよび/または前記ポリヌクレオチド（複数可）にハイブリダイズするためのプローブを含むキット。
【請求項３７】
個体における心臓障害を治療または予防するために使用することができる治療剤をスクリーニングするための方法であって：
候補治療剤の存在下および非存在下における、1以上のlincRNA（複数可）Sghrtおよび/またはlincRNA（複数可）Gas5の機能的発現および/または発現レベルを分析すること；ならびに
候補治療剤の存在下および候補治療剤の非存在下における、Sghrt lincRNA（複数可）および/またはGas5 lincRNA（複数可）の1以上の機能的発現および/または発現レベルの差に基づいて、候補治療剤が心臓障害を治療または予防するのに有用な治療剤であるかどうかを決定すること、
を含む、方法。
【請求項３８】
Sghrt転写産物および/またはGas5転写産物を生成するためのSghrt遺伝子および/またはGas5遺伝子転写の一方または両方；
を阻害するための阻害剤であって：
gDNA Sghrt 配列番号67、もしくはその一部、および/またはgDNA Gas5 配列番号68、もしくはその一部と相補的である配列；あるいは
ｉ）のポリヌクレオチドと少なくとも７５％の同一性を共有する配列、
を含むか、またはからなる単離されたポリヌクレオチドを含む、阻害剤。
【請求項３９】
前記阻害剤が、Sghrtおよび/またはGas5の機能を阻害して、遺伝子をサイレンシングさせ、したがってそれが転写産物を産生するのを妨げる、請求項38に記載の阻害剤。
【請求項４０】
前記転写物がmRNAまたはlincRNAである、請求項39に記載の阻害剤。
【請求項４１】
前記阻害剤が、心疾患の治療または予防における使用のためのものである、請求項３８〜４０のいずれか一項に記載の阻害剤。
【請求項４２】
前記阻害剤が、心臓再生または心臓増殖または心臓脱分化をもたらす、請求項４１に記載の、使用のための阻害剤。
【請求項４３】
前記心疾患が：心筋梗塞；心不全；冠動脈疾患；動脈の狭窄；心臓発作；心拍リズムの異常；不整脈；心不全；心臓弁膜症；先天性心疾患；心筋疾患；心筋症；心膜疾患；大動脈疾患；マルファン症候群；遺伝性心筋症；非遺伝性心筋症；心肥大；圧負荷による心機能障害および損傷した心臓組織、
を含むか、またはからなる群から選択される、請求項４１または４２に記載の阻害剤。
【請求項４４】
前記心疾患の予防または治療が、心機能を回復させもしくは改善すること、または以下：駆出率；左心室壁厚；右心室壁厚；左心室壁張力；右心室壁張力；心室質量；収縮機能；心肥大；拡張末期容量；収縮末期容量；心拍出量；心係数；肺毛細血管楔入圧および肺動脈圧、の１以上を少なくとも部分的に回復させもしくは改善することを含む、請求項４１または４２に記載の阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心筋細胞における遺伝子またはlincRNA（LINCM）の阻害剤、特に心臓の再生または増殖を刺激する能力を有するポリヌクレオチド、および心臓保護剤および／または心臓再生剤としてのそれらの使用；前述の薬剤を使用して心疾患を予防および治療するための方法；心疾患を予防または治療するための前述の薬剤の使用；および心臓治療計画の前後または最中に心臓組織の再生能力または増殖能力を評価するための予後診断または診断アッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
成体のマウスまたはヒトの心臓の生存期間の間に、新しい心筋細胞（CM）が、〜１％の非常に低い割合ではあるが、生成される。一方、成体ゼブラフィッシュおよび新生児マウス心臓は、外科的切除または梗塞傷害に際し完全に再生することができる。ゼブラフィッシュおよび新生児マウスと同様に、成体のマウスの新しいCMは既存のCMの有糸分裂によって生じるように思われるが、しかし、疾患進行中の十分な再生および修復を可能にするのに十分なレベルの内因性有糸分裂はない。再生する全能力が失われることは、新生児マウス心臓のCMが細胞周期を終了する７日目の出生後日（Ｐ７）のすぐ後に起こる。
【０００３】
これは心臓再生の分野に関する2つの重要な質問を強調する：a）何が成体CMの分裂を妨げるのか、b）あらゆる成体CMが分裂するよう誘導され得るか。確かにゼブラフィッシュおよび新生児マウスの再生中の心臓における系譜追跡研究では、増殖能力が既存のCMの細胞周期再進入によって達成されることを示している。これと整合して、Hippo/Yap経路構成要素、転写因子Meis1、およびmiR-15ファミリー、miR-199a、miR-590、miR-17-92クラスター、miR-99/10、およびLet-7a/cのメンバーを含む一連のマイクロRNAは、CM増殖の調節に別々に関与している。他には、成体のマウスの心臓におけるCMの大部分は、細胞周期を永久に離脱するが、比較的低酸素の心筋の微環境に存在する稀なサブセットは、増殖性新生児CMの特徴を保持し、および、より小さいサイズ、単核形成およびより低い酸化ＤＮＡ損傷を有する。CMのこの特殊なサブセットは成体心筋における〜１％の内因性増殖能力を説明し得るのだが、ストレス応答遺伝子発現の変化の不均一性が、大多数の細胞周期停止CMにおいて、細胞周期に再び進入するように刺激され得る亜集団を明らかにするかどうかは未だ探求されていない。
【０００４】
成体哺乳動物心筋細胞（CM）はめったに増殖せず、既存のCMにおけるこの低率の有糸分裂および成体心臓における低パーセンテージの内因性心臓前駆細胞により、心筋梗塞または心不全のような病理学上の状態の間の新しいCMの有効な再生を妨げる。
【０００５】
どのように増殖ウィンドウが出生後のCMにおいて調節されているか、および成体のマウスのCMが、細胞周期に再進入する前に脱分化の段階を必要とするかどうか、または実際にそれらが病理学上の疾患ストレス応答の間に脱分化することなく直接細胞周期に再進入するように誘導され得るかはまだ不明である。心筋梗塞と心不全の両方の病態生理学は、CM細胞喪失を決定的に含み、そして両方の場合において、心臓再生は、各疾患の経過を食い止めることができる新規の治療法となるであろう。
【発明の概要】
【０００６】
CM増殖の複雑さにもかかわらず、思いがけなく、本発明者らはCM増殖の２つの新規な内因性調節因子を同定した。この知見を用いて、本発明者らは、CM増殖を好ましい様式で調節し、したがって心臓の修復を促進することができる阻害剤を発明した。
【０００７】
実際に、本発明者らは、CMの亜集団における脱分化および細胞周期遺伝子発現を調節する重要なノードのlincRNAs(Gas5およびSghrt)を含む遺伝子調節ネットワークを作成した。本発明者らは、これらのlincRNAの機能的役割を調べ、およびGas5とSghrtがインビトロとインビボで脱分化と細胞周期チェックポイントを調節することを示した。さらに、Gas5とSghrtは、新生児CMの増殖ウィンドウを、P７を超えて拡張することができる。本発明者らの研究により、このように出生後のCMの細胞周期をネガティブに調節し、したがって細胞増殖を抑制する最初のlincRNAを同定した。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】単一核RNA配列決定が、不均一性およびマウス左心室におけるシャムおよびTAC核サブグループに特異的な遺伝子調節モジュールを明らかにすることを示す。  A〜B、各CM核において最も高度に発現されるコア心臓遺伝子（A）は、低い変動係数で高い発現を示す（B）。  C、TAC核において高度に発現される遺伝子は、シャム核において高度に発現される遺伝子よりも高い浸透度を有する。スピアマンの順位相関（r=0.90、p<2.2e-16）は、平均発現レベルおよび浸透度の間に良好な相関を示す。  D、TAC核の方がシャム核よりも相関の密度分布が高い相関を示す。マンホイットニーU検定によりp<2.2e-16。  E〜F、CMの単一核RNA配列決定の教師なし階層クラスタリング（E）およびPCA（F）は、CM核が、シャムまたはTACサブグループ（サブグループA、B）に特異的なクラスターに正確に分離し、各生物学的反復（Rep）で再現されることを明らかにする。  G、スピアマンの順位相関プロットは、シャム核よりもTAC核においてより高い相関を示す（各生物学的反復（Rep）で再現される）。
【図２】単一CM核RNA配列決定のWGCNAが、遺伝子制御ネットワークにおけるノーダルハブ（nodal hub）としてのlincRNAを同定することを示す。  A〜B、WGCNAは、シャム核およびTAC核において、特定のシャム核またはTAC核サブグループの発現シグネチャ（B）を表す３つの異なる遺伝子モジュール（健康、疾患１および疾患２）（A）を同定する。  C〜E、WGCNAは、遺伝子調節ネットワークモジュール内の他の遺伝子との最も高い接続性を有するノーダルハブにおける候補lincRNAを明らかにする。Gas5およびSghrtは、疾患モジュール2（E）内のノーダルハブにあり、Nppa、Dstn、Ccng1、Ccnd2のようなネットワーク内の他の遺伝子の発現と高い相関をしている。泡の大きさは、接続性の強さと重要性を表す。各モジュールについて、濃縮された主な遺伝子オントロジー（GO）の用語が記載されている（p<0.05フィッシャーの直接確率検定）。  F〜H、単一核レベル（F）、プールされた核レベル（G）、および対応するバルクの左心室組織RNA配列決定（H）で、３つの遺伝子モジュールからの遺伝子の発現を示す散布図である。  I、シャムサンプルとTACサンプルとの間の３つの遺伝子モジュール由来の遺伝子の有意な差次的発現は、単一核RNA配列決定によってのみ検出され、プール核またはバルクの組織RNA配列決定によっては検出されない。
【図３】４分割分析により、増殖、心筋前駆細胞、転写因子および脱分化遺伝子を共発現するCMの亜集団が明らかになることを示す。  A〜C、増殖遺伝子と増殖のネガティブ調節因子との比較についての４分割分析は、単一核RNA配列決定（A）によってのみ検出可能で、およびプールされた核（B）や適合したバルクの左心室RNA配列決定（C）ではそうでない、個々のTAC核における共発現の増加を特定する（Q2; 44.4％; p= 3.237e-07 フィッシャーの直接確率検定）。挿入図：各象限に分布する核のヒストグラムである。  D〜F、心筋前駆細胞遺伝子と心臓転写因子遺伝子発現との比較についての４分割分析は、単一CM核（D）におけるTACストレス時の共発現の増加（やはりプールされた核またはバルクの組織RNA配列決定（E、F）では検出されない）を示す（Q2; 42.9％; p=2.548e-05 フィッシャーの直接確率検定）。  G〜I、TACストレス下での胎児初期化遺伝子および脱分化マーカーの共発現の増加は、単一核RNA配列決定（G）でのみ検出され（Q2; 58.73％; p=0.001371 フィッシャーの直接確率検定）、非単一アプローチでは検出されない（H〜I）。  J、心臓前駆細胞、心臓転写因子、脱分化、増殖および増殖のネガティブマーカーの高い共発現は、Q2およびQ4における単一核TACサンプルに限定されている。  K〜L、単一分子RNA FISHは、シャム（K）と比較して、TAC心臓（L）から単離された成体のマウスCMにおいて、Sca1アップレギュレーションおよびTnnt2の共発現を示す。Sca1+シャム CMの数：5/13; Sca1+TAC CM：38/55;2回のシャムおよび3回のTACの生物学的反復からまとめて。  M〜N、免疫蛍光法により、シャム（M）と比較して、TAC CM（N）における細胞表面SCA１タンパク質発現の増加が確認される。SCA1+シャムCMの数：8/23; SCA1+TAC CM：43/66;2回のシャムおよび３回のTACの生物学的反復からまとめて。スケールバーは20μｍを表す。
【図４】単一分子RNA FISHは、単離された成体のマウスCMにおけるLINCMの細胞発現を確認することを示す。  A、単一核RNA配列決定は、現在の公的データベース（ENSEMBL、NONCODE）にもなく、公開されている心臓トランスクリプトームデータセットにもない、CMの核中の141個の新規lincRNA（LINCM）を同定する。  B、単一核RNA配列決定は、対応する左心室バルクの組織RNA配列決定において検出されないLINCMを同定し、これは細胞質mRNAプールにおけるリードの希釈によって説明される。  C、LINCMに近接した活性H3K27Acエンハンサークロマチン領域は、MEF２転写因子結合モチーフが豊富であり、およびGREAT分析によって、心臓発現および表現型を有すると機能的アノテーションが付けられている。  D、核内のエキソンおよびイントロンプローブ（アスタリスク）の共局在化によって明示された活性転写の部位。スケールバーは5μｍを表す。  E〜M’、単一分子RNA FISHは、単離された成体のマウスCMにおけるLINCMの発現を確認する。  N〜Q’、非常に豊富なコア遺伝子Tpm1、Tnnt2、Myl2およびMalat1についてのポジティブコントロール。  R〜S'、シグナル特異性を確認するためのプローブなしコントロール（NPC）（R、R'）およびセンスプローブ（S、S'）によるネガティブコントロール。スケールバーは10μｍを表す。E'〜S'、E-Sと同じ画像の拡大表示。  T〜U、Gas５は、TAC CMにおいて上方制御され、核周囲のNppa転写物と共局在化する。  V〜W、Sghrtは上方制御されおよびTAC CMの細胞質に局在する。  X〜Y、LINCM５は、TAC CMで下方制御される。スケールバーは10μｍを表す。
【図５】Gas 5およびSghrtは、TACストレスの間に成体CMのS期およびM期への進入を転写的に調節することを示す。  A、単離された成体TAC CMにおいてGas5またはSghrtを独立してインビトロでノックダウンするための戦略。  B〜C、GapmeRを用いた成体のマウスCMにおけるGas5またはSghrtのインビトロのノックダウンは、効率的であり、および各生物学的反復で再現可能である。N＝５の生物学的反復。  D〜G、Tac CMにおけるGas５ノックダウンは、Nppa、Dstn、Ccng１およびCcnd２の発現の有意な減少をもたらす。TAC CMにおけるSghrtノックダウンは、Ccng１の有意な増加およびCcnd２発現の減少をもたらす。  H、M期の再進入を示すpH３+ DAPＩ+成体CMの代表的な画像。スケールバーは20μｍ。  I、単離された成体のマウスTAC CMにおけるGas5またはSghrtのいずれかのノックダウンは、pH3+核を有するCMの割合を増加させる。平均±標準誤差。3,600を超えるCMを、TAC手術されたマウスのN=3の生物学的反復から画像化し、計数した。  J、S期の再進入における初期のDNA合成を伴うEdu+ DAPI+ CMの代表的な画像。スケールバーは20μｍを表す。  K、単離された成体のマウスのTAC CMにおける、Sgrtのノックダウンにより、Edu+ DAPI+ 核を有するCMの割合が増加するが、Gas5のノックダウンではしない。平均±標準誤差。3,600を超えるCMを、TAC手術されたマウスのN=3の生物学的反復から画像化し、計数した。  L、脱分化マーカーを発現するDAB２+ CMの代表的な画像。  M、単離された成体のマウスTAC CMにおけるGas５またはSgrtのいずれかのノックダウンにより、DAB２+ CMの割合が増加する。N〜P、Gas５ノックダウンは、G1/S期活性化因子（Cdk4、Cdk6、Ccne1、Ccnd2）の発現を減少させるが、Sgrtノックダウンは、Cdk6発現の有意な増加をもたらす。  Q、Gas5ノックダウンは、Nrg1発現を増加させる。R〜S、Sghrtのノックダウンにより、G２/M期活性化因子（Cdk1、Cdc25a）の発現が増加するが、Gas5のノックダウンはしない。  T、Gas5およびSghrtによるG1/S期およびG2/M期の転写調節の概略図。  全ての遺伝子発現分析は、ハウスキーピング転写物（Rplp0）に対して標準化される。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001、n.s. 有意差なし；平均±標準誤差。全てはTAC手術されたマウスのN＝3〜5の生物学的反復を代表する。
【図６】Gas5およびSghrtが、インビボでS期への進入、M期への進入およびCMの増殖を調節することを示す。  A〜B、出生後各段階のマウス心臓における内因性Gas５（A）およびSghrt（B）の発現。Gas5の発現は、P7〜P10でピークに達しおよび年齢とともに減少する（A）。Sghrt発現は、P7でピークに達し、年齢とともに徐々に増加する（B）。P7でのGas5およびSghrtの発現の増加は、CM増殖能の内因性の喪失と一致する。  C、インビボでのマウスCMにおいてGas5またはSghrt特異的にノックダウンするための戦略。  D、強いeGFPレポーター発現を示すAAV９-TNNT２-eGFP-RNAi注射マウスの心臓組織切片の代表的画像。スケールバーは100μｍ。  E〜F、LINCMのインビボノックダウンは、各生物学的反復で有意および再現可能である。E〜QにおけるAAV9-TNNT2-eGFP-RNAi実験のために注射された動物：N=8マウス Gas5 KD #1、N=7マウス Gas5 KD #2、N=7マウスSghrt KD #1、N=8マウス Sghrt KD #2、N=5マウス LacZ KD、N=8マウス PBS。  G、インビボでのM期への進入を伴うpH３+ TNNT２+ DAPＩ+ CM（アスタリスク）の代表的な画像。矢頭は、定量化に含まれていないpH３＋ DAPI＋ TNNT２-非CMを示す。スケールバーは30μｍ。  H、Gas5またはSghrtのノックダウンは、インビボでCMのM期への進入を有意に増加させた。  I、インビボでS期に進入したEdU+ TNNT２+ DAPI+ CM（アスタリスク）の代表的な画像。矢頭は、定量化に含まれていないEdU+ DAPI+ TNNT２-非CMを示す。スケールバーは30μｍ。  J、Gas５ノックダウンは、インビボでCMのS期への進入を有意に減少させたが、一方Sghrtノックダウンは、S期への進入を有意に増加させた。  K、インビボでのアポトーシスを伴うCC３+ TNNT２+ DAPI+ CM（アスタリスク）の代表的な画像。スケールバーは30μｍ。  L、インビボでのGas５またはSghrtのノックダウンによって誘導されるアポトーシスに有意な変化はない。  M、インビボでの脱分化を伴うDAB２+ TNNT２+ DAPI+ CM（アスタリスク）の代表的な画像。矢頭は、定量に含まれていないDAB2+ DAPI+ TNNT2- 非CMを示す。スケールバーは30μｍ。  N、Gas5またはSghrtのノックダウンにより、インビボでCM脱分化が有意に増加した。  O、インビボでM期を経ている２つの隣接するpH３+ PCM１+ TNNT２+ DAPI+ CM核（アスタリスク）の代表的な画像。スケールバーは3μｍ。  P、定量化のためのWGA染色されたCMの代表的な画像。スケールバーは30μｍ。  Q、インビボでGas5またはSghrtをノックダウンした後のmm2あたりのCM数の有意な増加。  R、LacZ KDと比較してGas5 KDまたはSghrt KD後のCMの断面積の減少を示す、組織切片中のWGA染色されたCMの代表的な画像。スケールバーは50μｍ。  S、LacZ KDと比較してGas5 KDまたはSghrt KDにおける断面積（μm2）の有意な減少は、ノックダウン後の細胞サイズがより小さいことを示唆する。  T、インビボで細胞質分裂を検出するAuroraB+ TNNT2+ CM（アスタリスク）の代表的な画像。スケールバーは20μｍ、挿入スケールバーは5μｍ。  U、インビボでのGas5またはSgrtのノックダウン後のAuroraB+ TNNT２+ CMの有意な増加。  V、ｐ21細胞周期阻害剤を発現するp21+ TNNT２+ CM（アスタリスク）の代表的な画像。スケールバーは30μｍ。  W、インビボでGas5またはSghrtをノックダウン後のp21+ TNNT2+ CMの有意な減少。  X、p21タンパク質翻訳を遮断するカルレティキュリンを発現するCALR+ DAPI+ TNNT２+ CM（アスタリスク）の代表的な画像。矢頭は、定量化に含まれていないCALR+ DAPI+ TNNT2- 非CMを示す。���ケールバーは30μｍ。  Y、インビボでのGas5またはSghrtのノックダウン後のCALR+ DAPI+ TNNT2+ CMの有意な増加。
【図７】インビボでのAAV9-CRISPR Cas9媒介のゲノム欠失は、インビボでCMのGas5およびSghrt調節性の増殖を再現する。  A、Gas5またはSghrtのプロモーターおよび第一エキソンを含むゲノム領域を欠失させるためのsgRNA対の概略設計。  B、インビボでマウス心臓においてGas5またはSghrt特異的なゲノム欠失を生成するための戦略。  C、AAV9-CRISPR Cas9は、インビボでマウス心臓の標的ゲノム領域を特異的に切断する。切断されたPCRアンプリコン（アスタリスク）は、確認のためにクローン化および配列決定した。ネガティブコントロール（AAV9-TNNT2-mRuby2）および相互のゲノム領域により、クロスオーバーオフターゲット編集がないことが確認された。  D、インビボでのU6-sgRNA-TNNT2-mRuby2との、Cas9-eGFP導入遺伝子の確固とした共発現を示すAAV9注射のマウス心臓の代表的な画像。Ｅ〜ＶでのAAV9-CRISPR Cas9実験のために注射された動物：N=8 マウス Gas5 sgRNA；N=10 マウスSghrt sgRNA；N=7 マウス mRuby2 コントロール。  E、インビボでS期に進入したEdU+ TNNT2+ DAPI+ CM（アスタリスク）の代表的な画像。矢頭は、定量化に含まれていないEdU+ DAPI+ TNNT2- 非CMを示す。スケールバーは30μｍを表す。  F、Gas5 AAV9-CRISPR Cas9 KDは、インビボでのCMのS期への進入を有意に減少させたが、一方 Sghrt AAV9-CRISPR Cas9 KDは、S期への進入を有意に増加させた。  G、インビボでM期に進入したpH3+ TNNT2+ DAPI+ CM（アスタリスク）の代表的な画像。スケールバーは30μｍ。  H、AAV9-CRISPR Cas9によるGas5またはSghrtのノックダウンは、インビボでのCMのM期への進入を有意に増加させた。  I、インビボでの細胞質分裂についての証拠のAurora B+ TNNT2+ CM（アスタリスク）の代表的な画像。スケールバーは30μｍ。  J、インビボでのAAV9-CRISPR Cas9によるGas5またはSghrt KD後のAurora B+ TNNT2+ CMの有意な増加。  K、インビボでの脱分化を伴うDAB2+ TNNT2+ DAPI+ CM（アスタリスク）の代表的な画像。矢頭は、定量化に含まれていないDAB2+ DAPI+ TNNT2- 非CMを示す。スケールバーは30μｍ。  L、AAV9-CRISPR Cas9によるGas5またはSghrtのノックダウンは、インビボでのCM脱分化を有意に増加させた。  M、定量化のためのWGA染色されたCMの代表的な画像。スケールバーは30μｍ。  N、インビボでのAAV9-CRISPR Cas9によるGas5またはSghrt KD後のmm2あたりのCMの数の有意な増加。  O、インビボでのAAV9-CRISPR Cas9によるGas5またはSghrt KD後のCMの断面積の減少を示す、組織切片中のWAG染色されたCMの代表的な画像。スケールバーは50μｍ。  P、断面積（μｍ2）の有意な減少は、インビボでのAAV9-CRISPR Cas9によるGas5またはSghrt KD後の細胞サイズがより小さいことを示唆する。  Q、インビボでのアポトーシスを伴うCC3+ TNNT2+ DAPI+ CM（アスタリスク）の代表的な画像。矢頭は、定量化に含まれていないCC3+ TNNT2- 非CMを示す。スケールバーは30μｍ。  R、インビボでのAAV9-CRISPR Cas9によるGas5またはSghrt KD後に誘導されるアポトーシスにおいて有意な変化はない。  S、p21細胞周期阻害剤を発現するp21+ TNNT2+ CM（アスタリスク）の代表的な画像。スケールバーは30uｍを表す。  T、インビボでのAAV9-CRISPR Cas9によるGas5またはSghrt KD後のp21+ TNNT2+ CMの有意な減少。  U、p21タンパク質翻訳を遮断するカルレティキュリンを発現するCALR+ DAPI+ TNNT2+ CM（アスタリスク）の代表的な画像。矢頭は、定量化に含まれていないCALR+ DAPI+ TNNT2-非CMを示す。スケールバーは30μｍ。  V、インビボでのAAV9-CRISPR Cas9によるGas5またはSghrt KD後のCALR+ DAPI+ TNNT2+ CMの有意な増加。  G、I、K、Q、S、Uの画像は、mRuby2またはeGFPとのスペクトルの重複を避けるためにAlexa647二次抗体で染色した。
【図８】肥大発症後の心不全のTACマウスモデルにおける、インビボでのSghrtのノックダウンによる心機能の回復。  A、TACの４週間後（肥大の発症後および駆出率の減少後）にインビボでGas5またはSghrtをノックダウンし、続いてAAV9注射の6週間後までに心エコー検査によって毎週モニタリングするための戦略。TAC回復実験のための注射された動物：N=6マウス Gas5 KD＃1 TAC、N=6マウスGas5 KD＃2 TAC、N=5 マウスSghrt KD ＃1 TAC、N=7 マウスSghrt KD ＃2 TAC、N=9マウス LacZ KD TAC、N=14 マウス PBS注射のシャム。  B〜C、TAC後4週目のGas 5 KDは、駆出率（EF％）の有意な回復をもたらさなかった（B）、一方、TAC後4週目のSghrt KDは、AAV9注射後開始の5週からEF％の部分的回復をもたらした（C）。  D〜E、TAC後4週目のGas5 KDは、心拡張期の左心室後壁厚（LVPWd）による測定で肥大に有意な影響を示さず（D）、一方、TAC後4週目のSghrt KDは、AAV9注射後6週目から始まるLVPWdの有意な退縮をもたらした（E）。  F、AAV9-TNNT2-eGFP-RNAiを注射したTACマウス心臓の代表的な画像は、AAV9注射6週間後でさえもインビボで確固とした発現を示す。スケールバーは1000μｍ。  G、Sghrt KDは、AAV9の6週間後にCM（pH3+ TNNT2+ DAPI+）のＭ期への進入における有意な増加をもたらした。  H、Sghrt KDは、AAV9の6週間後にCM（AuroraB+ TNNT2+）の細胞質分裂の有意な増加をもたらした。  I、Sghrt KDは、AAV9の6週間後にCM（DAB2+ TNNT2+ DAPI+）の脱分化の有意な増加をもたらした。  J、Sghrt KDは、AAV9の6週間後にCMアポトーシス（CC3+ TNNT2+ DAPI+）に有意な影響を及ぼさなかった。  K、Sghrt KDは、AAV9の6週間後にmm2あたりでCMの有意な数をもたらした。  L、Sghrt KDは、AAV9の6週間後にCMの断面積（μm2）の有意な減少をもたらした。  M、Sghrt KDは、AAV9の６週間後にCM（p21+ TNNT2+）におけるp21細胞周期阻害因子タンパク質レベルの有意な減少をもたらした。  N、Sghrt KDは、AAV9の６週間後にCM（CALR+ TNNT2+ DAPI+）におけるp21翻訳を遮断するカルレティキュリンの有意な増加をもたらした。
【図９】（補足図３）心筋細胞のヒト単一核RNA配列決定は、マウス単一核RNA配列決定と類似している。  A、ヒトCMのコア心臓遺伝子は、マウスに似ている。  B〜D、教師なし階層クラスタリング（B）、PCA（C）およびスピアマン相関分析（D）は、コントロールおよび拡張型心筋症（DCM）核のそれぞれにおいて2つの異なるサブグループを生成した。  E、相関の密度分布は、コントロールと比較してDCM核についてより狭い分布を示す。P値はマンホイットニーのU検定から。  F、WGCNAは、DCMまたはコントロールの核サブグループに特異的な遺伝子モジュール（Healthy 1、Healthy 2、Disease 1、Disease 2）を同定する。  G〜H、ヒト遺伝子モジュールからのクラシファイヤー（classifier）は、単一核レベルで異なった発現を示すが（G）、対応するバルクの左心室のRNA配列決定では示さない（H）。
【図１０】（補足図５）。RT-PCRによる心臓におけるLINCMの確認。  A〜A'、ゲノムDNAの混入を排除するためのDNAse処理をされたRNAでのRT-PCRによるLINCMの増幅の成功。右パネル、LINCM6*を再泳動すると、別のゲル（A'）に正しいサイズのかすかなバンドが表示される。生成物をゲル抽出し、およびサンガー配列決定して同一性を確認した。  B、LINCM遺伝子座から離れる染色体上の直線距離の増加と共に遺伝子発現の相関関係が増加した。
【図１１】（補足図６）LINCMノックダウン効率のインビトロでの試験。  A、ノックダウン効率のインビトロ試験のための、HEK293T細胞におけるIRES-eGFPでタグ付けされた全長LINCM（FL）およびmCherry-miR RNAiの同時トランスフェクションに使用されるプラスミド。  B〜C、全長のGas5-IRES-eGFPとmCherry-miR RNAiオリゴとの同時トランスフェクションにより、蛍光（B）によって最良のノックダウン効率（qPCR（C）により確認される）のGas5オリゴ＃1およびGas5オリゴ＃6（以降、図６のGas5 KD＃2として知られる）が同定される。  D〜E、全長Sghrt-IRES-eGFPとmCherry-miR RNAiオリゴとの同時トランスフェクションにより、蛍光（B）によって最良のノックダウン効率（qPCR（C）により確認される）のSghrtオリゴ＃1およびSghrtオリゴ＃2が同定される。全長LINCM-eGFP（FL）単独では、LINCM-eGFPについて強いシグナルを与えたが、mCherry-miR RNAiについてはそうではなかった。
【図１２】（補足図８）CRISPR Cas9によって生じたGas5またはSghrtのゲノム欠失のインビトロおよびインビボ確認。  A、Gas5またはSghrt標的ゲノム領域に対するsgRNAのインビトロ試験に使用されるpCAG-EGxxFP相補アッセイの模式図。標的ゲノム領域の欠失の成功は、eGFP蛍光の再構成をもたらす。  B〜C、Gas5またはSghrtゲノム領域に対するsgRNAのインビトロ試験の代表的な画像。ネガティブコントロールは、非蛍光性であるsgRNAのみおよびLINCM-EGxxFPのみからなる。  D〜E、インビボでのAAV9-CRISPR Cas9媒介ゲノム欠失後のマウス心臓の切除された心尖におけるGas5またはSghrt転写産物レベルの減少の確認。  F〜G、TOPOクローニングおよびサンガー配列決定されたゲノムバンドのENSEMBL BLATは、Gas5 sgRNA注射マウス（F）のGas5標的領域において明らかな欠失（アスタリスク）を示すが、Sghrt sgRNA注射マウス（G）では示さない。  H〜I、TOPOクローニングおよびサンガー配列決定されたゲノムバンドのENSEMBL BLATは、Sghrt sgRNA注射マウスではSghrt標的領域に明らかな欠失（アスタリスク）を示すが（H）、Gas5 sgRNA注射マウス（I）では示さない。
【図１３】（補足図９）AAV9注射後6週目のTACマウス心臓におけるノックダウンの確認。  A〜B、TACマウス心臓におけるAAV9注射後6週間後でさえも、Gas5 (A)またはSghrt (B)転写産物レベルのノックダウンが観察される。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の第１の態様によれば、以下：
a）Sghrt lincRNAおよび/またはGas5 lincRNA；
b）Sghrt lincRNAおよびGas5 lincRNAを生成するためのSghrt遺伝子および／またはGas5遺伝子転写の一方または両方;
のうちのいずれか１以上を阻害するための少なくとも１つの阻害剤であって：
ｉ）Sghrt lincRNAのいずれか１つおよび／もしくはGas5 lincRNAのいずれか１つまたはそれらのコード配列、すなわち配列番号1〜54あるいはそれらの一部と相補的である配列；または
ｉｉ）配列番号67で提供されるgDNA Sghrt非コード配列、もしくはその一部、および／または配列番号68で提供されるgDNA Gas５非コード配列、もしくはその一部のいずれか１つと相補的である配列；または
ｉｉｉ）ｉ）および／またはｉｉ）のポリヌクレオチドと少なくとも７５％の相同性を共有する配列、
を含むまたはそれからなる単離されたポリヌクレオチドを含む阻害剤が提供される。
【００１０】
本明細書において阻害剤は、前記Sghrtおよび／またはGas5のlincRNAと、それらの機能を妨げる様式で相互作用することができるポリヌクレオチド、または前記Sghrt遺伝子および／またはGas5遺伝子と、それらの転写がlincRNA SghrtおよびGas5を産生するための転写を妨げる様式で相互作用することができるポリヌクレオチドを指す。このようにして、阻害剤は、前記lincRNAのネガティブの調節的役割を克服することができ、したがって心臓細胞の分裂、増殖、再生および／または脱分化を促進または支持することができる。
【００１１】
このように、本発明には、SghrtおよびGas5のlincRNAが、心臓組織の増殖または再生に対して阻害効果を有するという具体化、したがってそれらの阻害、またはそれらのネガティブな影響を除去することは、心臓組織の増殖または再生を促進、維持または提供するために使用することができるという具体化が関係する。
【００１２】
本発明の好ましい態様において、前記単離された相補的ポリヌクレオチドは、その相補的配列と相互作用してその機能を遮断する。
【００１３】
最も好ましくは、前記単離された相補的ポリヌクレオチドは、さらにSghrtおよび／またはGas5の前記lincRNAと相互作用し、したがって配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51〜53、またはそれらの一部のいずれか1つと相補的である。より具体的には、前記単離された相補的なポリヌクレオチドは、前記SghrtのlincRNAと相互作用し、したがって配列番号51〜53、またはそれらの一部のいずれか1つと相補的である。あるいは、前記単離された相補的ポリヌクレオチドはGas5の前記lincRNAと相互作用し、したがって配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47および49、またはそれらの一部のいずれか1つと相補的である。
【００１４】
最も好ましくは、前記単離された相補的ポリヌクレオチドは、さらに、Sghrtの前記lincRNAについて前記コード領域と相互作用し、したがって配列番号54またはその一部と相補的である。より具体的には、前記単離された相補的ポリヌクレオチドは、Gas5の前記lincRNAについて前記コード領域と相互作用し、したがって配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48および50、またはそれらの一部のいずれか1つと相補的である。
【００１５】
あるいは、前記単離され相補的なポリヌクレオチドは前記Sghrtおよび／またはGas5遺伝子と相互作用し、したがって配列番号67〜68で提供される非コード配列、またはそれらの一部のいずれか１つと相補的である。
【００１６】
したがって、前記単離された相補的ポリヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ギャップマー、低分子干渉RNA、低分子ヘアピンRNA、ペプチドおよびCRISPR-Casを含むかまたはそれらからなる群から選択される。理想的にはポリヌクレオチドは、CRISPR-Casであり、そしてさらにより理想的にはそれはCRISPR-Cas9を含む。
【００１７】
当業者は、lincRNA SghrtおよびGas5、またはSghrtおよびGas5の遺伝子配列構造の知識により、当業者が、前者の場合、前記lincRNAの、または、後者の場合、前記lincRNAを産生する前記遺伝子の転写機能を妨げるポリヌクレオチドを作製することが可能になることを認識するであろう。実際に、本目的のために、BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）、すなわちRNA/DNA配列のヌクレオチドのような、生物学的な一次配列情報を比較し、および特定の閾値を超える、クエリ配列に似ている配列を同定するためのアルゴリズムのようなオンラインツールが利用できる。
【００１８】
本発明の好ましい態様において、前記単離された相補的ポリヌクレオチドは、ｉ）またはｉｉ）のポリヌクレオチドと少なくとも約75％、および、好ましいものの昇順で、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、97％、99％および100％の配列同一性を共有する。
【００１９】
当業者は、ポリヌクレオチドの相同体、オルソログまたは機能的派生物もまた、本発明の文脈において用途があろうことを理解するであろう。このように、例えば、１つ以上の付加、欠失、置換等を含むポリヌクレオチドは、本発明に包含される。さらに、１つのヌクレオチドを類似の「タイプ」の別のものと置き換えることが可能であり得る。
【００２０】
このように、本明細書で使用される場合、用語「相同体／相同な」とは、特許請求されているポリヌクレオチド配列と少なくとも７５％などの相同性または類似性または同一性を有する配列を有する配列を指す。
【００２１】
本発明のその上さらなる好ましい実施形態では、前記ポリヌクレオチドは：
Sghrt miR RNAi GGGTCTTTGCCTGGGTTTGTT (配列番号57); 
Sghrt miR RNAi TGGAATGTATCTGGCTCAGAA (配列番号58); 
Sghrt sgRNA1 TTTCGTCTGAGAGTCGGCTG (配列番号61); 
Sghrt sgRNA2 ACCAGGTAGCCACTGACCGT (配列番号62); 
Sghrt KD: TTCGGAACTTGAAGGA (配列番号64);
Gas5 miR RNAi AGGTATGCAATTTCCTGAGTA (配列番号55); 
Gas5 miR RNAi CTCTGTGATGGGACATCTTGT (配列番号56); 
Gas5 sgRNA1 GGAGCGAGCGACGTGCCGGA (配列番号59);および
Gas5 sgRNA2 CATGCTGAGTCGTCTTTGTC (配列番号60).
Gas5 KD: AGAACTGGAAATAAGA (配列番号63);
を含む、またはからなる群から選択される配列を有する。
【００２２】
本発明のさらなる態様によれば、前述の（afore said）ポリヌクレオチドおよび適切な担体、補助剤、希釈剤および／または賦形剤を含む医薬組成物が提供される。
【００２３】
本発明のその上さらなる態様によれば、本発明の前記単離されたポリヌクレオチドを含むまたはコードするベクターが提供される。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、用語「ベクター」とは、発現ベクターをいい、および例えばプラスミド、ウイルス粒子、ファージ、脂質ベースのビヒクルおよび細胞ベースのビヒクルの形態であり得る。そのような送達ビヒクルの例としては、生分解性ポリマーミクロスフェア、リポソーム担体などの脂質系製剤、金コロイド粒子上への構築物のコーティング、リポ多糖、ポリペプチド、多糖、ウイルスビヒクルのペグ化などが挙げられる。さらに、そのようなベクターとしては、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、フォーミーウイルス、サイトメガロウイルス、セムリキ森林ウイルス、ポックスウイルス、偽狂犬病、RNAウイルスベクターおよびDNAウイルスベクターも挙げられ得る。そのようなウイルスベクターは当技術分野において周知である。さらに本発明では、細菌プラスミド、ファージDNA、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージDNAの組み合わせ由来のベクターを含む。多数の適切なベクターは、当業者に公知でありおよび市販されている。
【００２５】
しかしながら、宿主内で複製可能および生存可能である限り、他の任意のベクターが使用され得る。ポリヌクレオチド配列、好ましくはベクター中のDNA配列は、mRNA合成に導くための適切な発現制御配列（複数可）（プロモーター）に作動可能に連結されている。そのようなプロモーターの代表的な例として、CMV即時初期、HSVチミジンキナーゼ、初期および後期SV40、レトロウイルス由来のLTR、ならびにマウスメタロチオネイン-1などの原核生物または真核生物プロモーターを挙げることができる。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写ベクターを含む。ベクターはまた、発現を増幅するための適切な配列を含み得る。
【００２６】
さらに、ベクターは、好ましくは、真核細胞培養のためのジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、または大腸菌におけるテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性のような、形質転換された宿主細胞の選択のための表現型形質を提供するための1以上の選択マーカー遺伝子を含む。
【００２７】
本発明のその上さらなる態様によれば、前記ベクターで形質転換もしくはトランスフェクトされたか、または前記ベクターを含む宿主細胞が提供される。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、用語「宿主細胞」は、ポリヌクレオチドまたは前述のベクターを形質導入、形質転換またはトランスフェクトされている、宿主細胞に関する。適切な宿主細胞の代表例としては、大腸菌、ストレプトミセス、ネズミチフス菌などの細菌細胞、酵母などの真菌細胞、Sf9などの昆虫細胞、CHOまたはCOSなどの動物細胞、または植物細胞などが使用され得る。適切な宿主の選択は、本明細書の教示から当業者の適応範囲内にあると考えられる。好ましくは、前記宿主細胞は、動物細胞であり、および最も好ましくはヒト細胞である。
【００２９】
本発明のこの上さらなる態様によれば、本発明の単離されたポリヌクレオチドを産生するための方法が提供され、前記方法は：
ポリヌクレオチドの産生を可能にするのに適した条件下で、本発明の宿主細胞を培養すること；および
そうして生成したポリヌクレオチドを回収すること、
を含む。
【００３０】
本発明のさらなる態様によれば、医薬として使用するために本発明の前記ポリヌクレオチドが提供される。
【００３１】
本発明のこの上さらなる態様によれば、心疾患の予防または治療において使用するための本発明の前記ポリヌクレオチドが提供される。
【００３２】
本発明のこの上さらなる態様によれば、心疾患を治療するための医薬の製造において使用するための本発明の前記ポリヌクレオチドが提供される。
【００３３】
本発明のさらなる態様によれば、治療される個体に、本発明の前記ポリヌクレオチドの有効量を投与することを含む、心疾患を予防または治療するための方法が提供される。
理想的には、前記個体は哺乳動物、および最も理想的にはヒトである。
【００３４】
本明細書における心疾患への言及は、心筋梗塞、心不全、冠状動脈疾患（動脈の狭窄、心臓発作、心拍リズムの異常、不整脈、心不全、心臓弁膜症、先天性心疾患、心筋疾患（心筋症）、心膜疾患、大動脈疾患、マルファン症候群、遺伝性心筋症、非遺伝性心筋症、心肥大、圧負荷による心機能不全および損傷した心臓組織を含むが、これらに限定されない。
【００３５】
本発明の好ましい実施形態では、前記心疾患を予防または治療することは、心機能を回復させまたは改善すること、または以下：駆出率、左心室壁厚、右心室壁厚、左心室壁張力、右心室壁張力、心室質量、収縮機能、心肥大、拡張末期容量、収縮末期容量、心拍出量、心係数、肺毛細血管楔入圧そして肺動脈圧のうちの１つ以上を少なくとも部分的に回復させまたは改善することを含む。
【００３６】
本明細書において、ポリヌクレオチドまたはそれを含む組成物の「有効量」は、所望の生物学的効果、この場合は心臓保護および／または心臓修復を達成するのに十分な量を指す。効果的な投与量は、レシピエントの年齢、性別、健康状態、および体重、もしあれば併用治療の種類、治療の頻度、および所望の効果の特質に依存することが理解される。典型的には、有効量は治療を施す者によって決定される。
【００３７】
医療に使用するための化合物は、一般に医薬または獣医組成物中に提供され、およびそれゆえ本発明のこの上さらなる態様によれば、本明細書で定義されるポリヌクレオチドおよび医薬上許容される担体、補助剤、希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物が提供される。
【００３８】
本発明のこの上さらなる態様によれば、心臓再生剤または心臓増殖剤または心臓脱分化剤として使用するための前記ポリヌクレオチドが提供される。
【００３９】
本発明のさらなる態様によれば、心臓細胞を増殖、再生または脱分化させるための方法であって、心臓細胞と、本発明による阻害剤またはポリヌクレオチドとを接触させることを含む方法が提供される。
【００４０】
好ましい実施形態では、心臓細胞は、心筋細胞、理想的には成体心筋細胞を含み、および、この方法はインビボで実施することもでき得るが、さらに理想的にはインビトロで行われる。
【００４１】
本発明のさらなる態様によれば：
心臓治療計画の前、後、または最中に心臓組織の再生または増殖能力を評価するための予後診断または診断の方法であって、前記心臓組織の心臓サンプル中のlincRNA（複数可） Sghrtおよび/またはlincRNA（複数可）Gas5の存在または量を決定すること；および
lincRNA（複数可） Sghrtおよび／またはlincRNA（複数可） Gas5のいずれか１以上が存在する場合、前記心臓組織の増殖能は不十分であると結論づけ；および
lincRNA（複数可） Sghrtおよび／またはlincRNA（複数可） Gas5のいずれの１以上も存在しない場合、前記心臓組織の増殖能は十分であると結論付けること、
を含む方法が提供される。
【００４２】
本発明の好ましい方法においては、前記決定する工程は、RNAを抽出し、および単一核RNA配列決定を行い、次いで得られたRNA配列を配列番号1〜53のいずれか1以上と比較して、lincRNA（複数可） Sghrtおよび／または Gas5のいずれか1以上が存在するかどうかを決定することを含む。理想的には、増幅は、前記RNA配列決定工程の前に行われる。
【００４３】
本発明の代替方法において、前記決定する工程は、例えば、前記lincRNA標的に対する競合的結合アッセイの使用を介して、前記lincRNAの機能的活性についてアッセイすることを含む。
【００４４】
本発明のこの上さらなる態様によれば、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51〜53のいずれか1つのポリヌクレオチドを増幅するためのPCRプライマーおよび／または前記ポリヌクレオチド（複数可）にハイブリダイズするためのプローブを含むキットが提供される。
【００４５】
本発明はまた、個体における心臓障害を治療または予防するために使用することができる治療剤をスクリーニングするための方法にも及び、該方法は：
候補治療剤の存在下および非存在下における、1以上のlincRNA（複数可）Sghrtおよび/またはlincRNA（複数可） Gas5の機能的発現および/または発現レベルを分析すること；ならびに
候補治療剤の存在下および候補治療剤の非存在下における、lincRNA（複数可）Sghrtおよび/またはlincRNA（複数可）Gas5の１以上の機能的発現および/または発現レベルの違いに基づいて、候補治療剤が心臓障害を治療または予防するのに有用な治療剤であるかどうかを決定すること、
を含む。
【００４６】
本発明の好ましい方法では、候補治療剤は、候補治療剤の非存在下と比較して、候補治療剤の存在下でポリヌクレオチドの機能的発現および／または発現レベルが低下する場合、心臓障害を治療または予防するための有用な治療剤として同定される。
【００４７】
本発明のこの上さらなる態様によれば：
i) gDNA Sghrt 配列番号67、もしくはその一部、および／またはgDNA Gas5 配列番号68、もしくはその一部と相補的である配列か；あるいは
ii) i)のポリヌクレオチドと少なくとも７５％の同一性を共有する配列、
を含むまたはからなる単離されたポリヌクレオチドを含む、
ａ）Sghrt転写産物および／またはGas5転写産物を生成するための、Sghrt遺伝子および／またはGas5遺伝子転写の一方または両方を阻害するための少なくとも１つの阻害剤が提供される。
【００４８】
本発明のこの態様の好ましい実施形態では、阻害剤は、理想的には、Sghrtおよび／またはGas5の機能を阻害して遺伝子をサイレンシングさせ、したがって転写産物、典型的にはRNA−任意の種類のもの−しかし特にmRNAまたはlincRNAを産生するのを妨げるが、これに限られない。そのような阻害剤は、当業者に知られている。本明細書では、CRISPRに基づくSghrtおよびGas5ノックダウン、すなわち、Gas5またはSghrtのいずれかのプロモーターおよび第一エキソンを特異的に欠失させるsgRNAについて説明する。しかしながら、SghrtまたはGas5遺伝子のいずれかをサイレンシングさせる他の阻害剤が、本発明を実施するために使用され得る。理想的には、前述の阻害剤の使用は、心疾患を治療するために使用され、したがって心臓再生または心臓増殖または心臓脱分化をもたらす。
【００４９】
本明細書の説明および特許請求の範囲を通して、単語「含む」およびその変形、例えば「含む（comprising）」および「含む（comprises）」は、「含むがこれに限定されない」を意味し、および他の部分、付加物、成分、整数またはステップを除外しない。本明細書の説明および特許請求の範囲を通して、文脈上別段の要求がない限り、単数形は複数形を包含する。特に、不定冠詞が使用されている場合、本明細書は、文脈上別段の要求がない限り、単数形だけでなく複数形も企図すると理解されるべきである。
【００５０】
任意の特許または特許出願を含む、本明細書中に引用された全ての参考文献は、参照により本明細書に組み込まれる。任意の参照が先行技術を構成することのいかなる承認もしない。さらに、先行技術のいずれかがその技術分野における共通の一般常識の一部を構成することのいかなる承認もしない。
【００５１】
本発明の各態様の好ましい特徴は、他の態様のいずれかに関連して説明したものであり得る。
【００５２】
本発明の他の特徴は、以下の実施例から明らかになるであろう。一般的に言えば、本発明は、（添付の特許請求の範囲および図面を含む）本明細書に開示されている特徴の任意の新規なもの、または任意の新規な組み合わせに及ぶ。したがって、本発明の特定の態様、実施態様または例に関連して説明された、特徴、整数、特性、化合物または化学的部分は、本明細書に開示された任意の他の態様、実施形態または例に、それらと不適合でない限り適用可能であると理解される。さらに、特に明記しない限り、本明細書に開示された任意の特徴は、同じまたは類似の目的を果たす代替の特徴によって置き換えられ得る。
【００５３】
これより、以下の実施例および後の図面を参照して、単なる例として本発明を説明する。
【実施例】
【００５４】
方法および材料
実験手順
単一核RNA配列決定ライブラリ調製
単一核を急速凍結マウスおよびヒト左心室から単離し、LysonatorTMカートリッジ（SG Microlab devices）中で4000 Hz（4×20秒パルス）の機械的解離によって処理し、DAPIで対比染色した。CM核をPCM1抗体（1:500、HPA023374、Sigma）、二次抗ウサギALEXA 488抗体またはAlexa 568抗体で染色し、およびC1シングルセルAuto Prep system（10〜17uM mRNA配列チップ、Fluidigm）を用いて個々に捕捉した。捕捉された核の自動イメージングを、10倍対物レンズ（Olympus）およびCCDカメラ（Axiocam MR3、Zeiss）を備えた倒立顕微鏡（Olympus）で行い、捕捉された単一のPCM1+CMのみを含むウェルのアイデンティティを確認した。PCM1+CM核RNA配列決定ライブラリは、Nextera XT DNAサンプル調製キット（Illumina）を用いて調製した。各サンプルを、HiSeq 2500（Illumina）で読み、ペアエンド2×101 bpを配列決定した。
【００５５】
ヒト左心室サンプル
ヒト左心室は、パップワース（ケンブリッジ）病院組織バンク審査委員会およびケンブリッジシャー研究倫理委員会（英国）によって承認されたプロトコールを用いて収集した。書面による同意を、パップワース組織バンクのプロトコールにしたがってすべての個人から得た。DCM左心室は、66、67で以前に記載されたように収集された、末期ＤＣＭのために心臓移植を受けている患者からのものであった。健康な正常左心室は、英国ヒト組織局によって管理されている、パップワース病院またはEthical Tissue（Bradfordの大学）を通じて、対応する年齢の男性個体からのものであった。
【００５６】
マウスTAC手術およびFISHのための成体のマウス心室CMの単離
TAC手術は以前に68で発表されたように標準的なプロトコールによって行われた。CMの単離は、2ml/分の速度で、パーフュージョンバッファー、37℃に予め温めた40ｍｌの酵素溶液（コラゲナーゼＩＩ 0.5ｍｇ／ｍｌ（Worthington）、コラゲナーゼＩＶ 0.5ｍｇ／ｍｌ（Worthington）、およびプロテアーゼＸＩＶ 0.05ｍｇ／ｍｌ）を用いた酵素的解離によって行った。酵素は、ウシ胎児血清（FBS）（最終濃度５％）で中和した。細胞懸濁液を100μｍナイロンメッシュセルストレーナー（Thermo Fisher Scientific）を通して濾過し、そして重力により沈降させた。カルシウム濃度は1.0ｍＭまで徐々に増加させた。細胞を、グルタミン（２ｍＭ）、BDM（10ｍＭ）およびFBS（５％）を含むM199培地を含むプレーティング培地に再懸濁し、ラミニンコートカバーガラス（#1、Thermo Fisher Scientific）上に平板培養し、および空気中5％CO2の加湿環境で、37℃で１時間インキュベートした。接着していない細胞は、PBS中で穏やかに洗浄することによって除去した。
【００５７】
単一分子RNA FISH
ラミニンコート#1カバーガラス（Thermoscientific）に接着した単離したCMを、固定バッファー（PBS中3.7％ホルムアルデヒド）で室温室圧で10分間固定し、1×PBSで2回洗浄し、および4℃で70％EtOHで少なくとも1時間透過処理した。RNA FISHは、LINCM用の20-merStellaris Biosearchプローブおよびクエーサー670またはCALフルオロレッド610に接合したコア遺伝子を使用して実施した。簡単に言うと、細胞を洗浄バッファー（2×SSC中10％ホルムアミド）で洗浄した後、ハイブリダイゼーションバッファー（100ｍg/ml硫酸デキストラン、2×SSC中10％ホルムアミド）中の標的プローブ（125nM）と37℃で一晩ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、細胞を37℃で30分間洗浄バッファー中で洗浄し、37℃で30分間DAPI（洗浄バッファー中５ng/ml）で対比染色し、および室温で2×SSC中で洗浄した。封入剤（Vectashield）と共にカバーガラスをスライドガラス上に移し、冷却CCD/CMOSカメラ（Qi-1、Qi-2、Nikon）で、100倍対物レンズ（Nikon）を備えた正立顕微鏡（Nikon Ni-E）で直ちにイメージングを行った。
【００５８】
Sca1/Tnnt2 RNA FISH共染色という明らかな例外については、RNA FISHは、プローブ設計のために使用可能なSca1の短い独特の配列、およびLy6ファミリーの他のメンバーと高い相同性の程度のために50-mer ZZ ACD RNAScopeプローブを用いて行った。細胞を固定し、70％EtOH中で上記のように透過処理し、1×PBSおよび1×Hybwashバッファー中でそれぞれ室温で10および30分間洗浄し、その後1×Target Probe Mixと40℃で3時間インキュベートした。細胞を室温で1×Hybwash中で３回洗浄し、40℃で40分間1×Pre Amp Mix中でインキュベートし、室温で1×Hybwash中で3回洗浄し、40℃で30分間1×Amp Mix中でインキュベートし、40℃で25分間1×Label Probe Mix（Alexa Fluo 488、ATTO0550）中でインキュベートする前に、1×Hybwash中で2回洗浄した。細胞を室温、暗所で1×Hybwash中で3回洗浄し、マウントおよび画像化の前にDAPI（5ng/ml）で対比染色した。
【００５９】
免疫蛍光法
カバーガラス上に接着した単離されたCMは、４％ホルムアルデヒド中で固定し、および室温で10分間0.5％TritonＸで透過処理し、その後室温で３０分間５％BSA/PBS中でブロッキングした。次に細胞を３％BSA/PBSで希釈した一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。使用される一次抗体は、TNNT2（1：100、ab8295、Abcam）、DAB2（1：200、sc-13982、Santa Cruz）、CC3（1：300、＃9661、Cell Signaling）を含む。細胞を１×PBS中で３回洗浄し、適切な蛍光二次抗体ロバ抗ラットAlexa Fluo 488、ロバ抗ヤギAlexa Fluo 488またはウサギ抗マウスAlexa Fluo 568およびDAPI（５ｎｇ/ｍｌ）中で暗所で、室温で60分間インキュベートした。細胞をスライド上にマウントする前に１×PBS中で暗所で３回洗浄し、および正立顕微鏡Ni-E（Nikon）上で画像化した。SCA1免疫蛍光は、技術的確認のためにSCA1（1：50、E13 161-7、Abcam）、SCA1（1：100、AF1226、R&D）の異なる会社からの2つの独立した抗体を用いて行い、Sca-1の細胞表面エピトープを保存するために、透過処理にTriton-Xを用いなかった。
【００６０】
pH3/EdUイメージングおよび分析
リン酸化-ヒストンH3（pH3）免疫蛍光法のために、細胞をまずPBST中0.5％TritonＸで室温室圧で10分間透過処理した後、５％BSA/PBST中、室温室圧で30分間ブロッキングし、残りの手順は、上記の通りであり、抗pH3(Ser10)抗体(1:100、06-570、Millipore)を用いた。EdU染色は、製造業者の指示書にしたがって行った（Click-iT EdU Alexa Fluor 488 / Fluo 594、Life Technologies）。単離された成体CMのイメージングは、正立顕微鏡Ni-E（Nikon）上の20倍対物レンズ（Nikon）を使用して、条件ごとに20〜40のランダムな視野を含んだ。全部で8026個の成体CMを画像化し、およびそれぞれpH3およびEdUについて、TAC手術したマウスの３つの独立した各生物学的反復の定量化に使用した。P7でAAV9構築物を注射したマウスに、９日目から13日目までの間、１日当たりEdU（Life Technologies、５ｍｇ/ｋｇ）の腹腔内注射を施した。
【００６１】
免疫組織化学
免疫組織化学に関して、プロトコールは、上記に記載の免疫蛍光法と同様であるが、0.2Ｍホウ酸（pH7.2）と55℃で１時間インキュベートすることによる抗原賦活化工程を含む。完成した組織切片（厚さ４μｍ）は、プログラムによる取得の下で10倍対物レンズ（Nikon）を用いて画像を撮り、切片ごとに大きな4x4（P14マウス）または6x6（成体ＴＡＣマウス）の画像を自動的につなぎ合わせた。WGA染色切片上の筋細胞定量化は、以前に記載された56と同様にFijiを使用して実施した。流域アルゴリズムを使用して、10μm2から1000μm2のサイズ範囲を含めた接近して分離された粒子および細胞を分離した。全ての定量化は、組織切片の面積（mm2）に対して標準化した。
【００６２】
LINCMのノックダウン
LNATM GapmeRはExiqonから設計および注文された。トランスフェクションの48時間後に、qPCRにより、１つのLINCMにつき５つの異なるオリゴをノックダウン効率について試験し、および最良のLINCMノックダウン効率を有するオリゴをその後の実験に使用した。単離されたシャムまたはＴＡＣ成体CMを100ｎＭの濃度のリポフェクタミン/GapmeRでトランスフェクトし、トランスフェクションの48時間後にRNAを抽出した。重要なことに、胎児初期化遺伝子（Nppa）は、RNA回収時に、シャムCMと比較してTAC CMにおいて高度にアップレギュレートされ（平均〜27倍）、このことは、ストレス遺伝子応答が、短時間の培養の間、単離されたTAC細胞において完全に維持されたことを示す。モックトランスフェクト細胞（リポフェクタミンのみ）と同様にマウスまたはヒトにおけるmRNA、lncRNA、miRNA標的が未知であるネガティブコントロールオリゴを、ネガティブコントロールとして使用した。各qPCR実験について、少なくとも3から5回の独立した生物学的反復を行った。各実験により、標的LINCMのノックダウンを確認した。使用されたGapmeRの配列は以下の通りである。
Gas5 KD：AGAACTGGAAATAAGA 配列番号63
Sghrt KD：TTCGGAACTTGAAGGA 配列番号64
ネガティブコントロール KD：AACACGTCTATACGC 配列番号65
【００６３】
LINCMのノックダウン後のリアルタイムqPCR
ポリ（A）RNAをcDNAに逆転写するために、SuperScript（登録商標）III First-Strand Synthesis Reverse Transcriptase（Life Technologies）を使用した。LightCycler（登録商標）480 装置（Roche）中で、SYBR（登録商標）Green master mix（SensiFAST、Bioline）を用いてqPCR反応を行った。閾値サイクル（Ct）および融解曲線の測定値は、LightCycler（登録商標）480ソフトウェアによって決定した。各qPCRサンプルは、同じqPCRプレート上に少なくとも３つの技術的反復をした。Rplp0をハウスキーピング遺伝子として使用し、およびCt値をモックトランスフェクト（オリゴなし、リポフェクタミンのみ）サンプルに対して標準化した。P値は、スチューデントのt検定によっており、およびエラーバーは、標準誤差を表す。各遺伝子のqPCR分析のために、成体の単離TAC CMの少なくとも３から５つの生物学的反復を使用した。使用したプライマーを、拡張された実験手順に記載する。
【００６４】
AAV9ウイルスの生産と精製
Gas5、Sghrt、LacZまたはp21を標的とする21bpのmiR RNAiオリゴヌクレオチドを、AAV9-TNNT2-eGFP-miR RNAiベクターにクローニングした。標的AAV9ベクターを、以前に記載された55、56のように、ヘルパープラスミドpAdΔF6およびpAAV2/9（Pennベクターコア）を用いたトリプルトランスフェクション法によってパッケージングした。使用したmiR RNAiオリゴヌクレオチドの配列は、以下：
Gas5 KD #1：AGGTATGCAATTTCCTGAGTA 配列番号55
Gas5 KD #2：CTCTGTGATGGGACATCTTGT 配列番号56
Sghrt KD #：GGGTCTTTGCCTGGGTTTGTT 配列番号57
Sghrt KD #2：TGGAATGTATCTGGCTCAGAA 配列番号58
LacZ KD コントロール：GACTACACAAATCAGCGATTT 配列番号66
の通りである。
【００６５】
AAV9-CRISPR-Cas9
pCAG-EGxxFPは、Masahito Ikawaから入手した（Addgeneプラスミド＃50716）。AAV9-TNNT2-eGFP-miR RNAiベクターは、Cas9-eGFPレポーターとのスペクトルの重複を避けるために、eGFPをmRuby2レポーターに置き換えるように改変した。それぞれsgRNA 1およびsgRNA 2の発現をドライブする２つのU6プロモーターをAAV9-TNNT2-mRuby2ベクターにクローニングした。20bpのsgRNAの配列を以下：
Gas5 sgRNA 1：GGAGCGAGCGACGTGCCGGA 配列番号59
Gas5 sgRNA 2：CATGCTGAGTCGTCTTTGTC 配列番号60
Sghrt sgRNA 1：TTTCGTCTGAGAGTCGGCTG 配列番号61
Sghrt sgRNA 2：ACCAGGTAGCCACTGACCGT 配列番号62
の通り列記する。
【００６６】
結果
インビボでの左心室CMの単一核RNA配列決定
成体CMは、主に二核性であり、心不全の間に、倍数体化および多核化を経る。異なる数の核を有する単細胞を比較する際の違いの混同を避けるために、本発明者らは、各単一のＣＭ核が最も単純な転写の単位を表すと判断した。したがって、心不全の横大動脈狭窄（Transverse Aortic Constriction）（TAC）マウスモデルおよびシャム手術コントロールマウスならびにヒト末期不全心臓（非虚血性拡張型心筋症：DCM）および対応する年齢と性別の健康なコントロールの左心室から単離されたP1+CM核の単一核RNA配列決定を行った。心不全の病理学上の開始の主要な部位であるので、本発明者らは、左心室に注目した。PCM1はCM核の確立されたマーカーである。単一細胞の転写産物の検出は、低いリード深度で安定化するので、本発明者らは、よく公表されているマイクロ流体の単一細胞トランスクリプトームプラットフォーム20、21、23、24を使用し、マウスおよびヒトの両方の左心室からの合計359の単一PCM1+CM核について、サンプルあたり平均8.5±3.29Mのマッピングリードの深度でRNA配列決定を行った。相関関係は、単一核発現と、対応する実験的にプールされたCM核との（r=0.83 シャム、r=0.86 TAC）、対応するインシリコでプールされたCM核との(r=0.94 シャム, r=0.98 TAC)、およびCMも、線維芽細胞および内皮細胞のような他の細胞型も含む対応するバルクの左心室とでさえ(r=0.61 シャム, r=0.68 TAC)、良好な一致を示した。全ての場合において、以前の単一細胞RNA配列決定報告で観察された飽和と同様に、〜30の核をサンプリングする時点で相関値は頭打ちになり、選択したサンプルサイズがこの飽和の限界を十分に超えたことを実証した。TAC時点から8週間後の同様のTAC誘発圧負荷マウスモデルを用いた最近のマウスRNA配列決定の論文では、バルクのマウス心臓組織における心臓関連遺伝子を検出するために、少なくとも1つの心臓において、少なくともFPKM>=3（細胞あたり〜1コピー）のカットオフを用いることが報告された。単一核RNA配列決定における潜在的なノイズ問題を考慮して、遺伝子について、少なくとも５つの試料において少なくともFPKM >=4を有するならば発現することになる、より厳重な基準を設定した。全体で、本発明者らは、マップされた〜42.9億のリードを達成し、それぞれシャムおよびTACマウスCM核で発現した合計4,787および7,642の遺伝子を同定した。特に、TACとシャムのマウス心臓の以前の全組織RNA配列決定比較により、TAC後１週間と比較して、TAC後８週間の時点の心臓において、差次的に発現される遺伝子（1,435遺伝子）の数の劇的な増加が報告された。これは、8週目のはるかに広範囲の心臓リモデリングと整合し、および本発明者らが見出したこの同じ時点の発現遺伝子の大幅な増加と類似する。
【００６７】
単一核RNA配列決定における技術的ばらつきの任意の潜在的な問題に対処するために、本発明者らはいくつかのコントロールを行った。最初に、本発明者らは３つの独立したライブラリ調製物を使用して同じ核RNA配列決定サンプルの技術的反復を行い、３回の各技術的反復すべてで、良好な相関（r=0.99）を見出した。このことは、一貫したライブラリ作成手順およびこの点でバッチの影響がないことを反映している。次に、本発明者らは以前に配列決定し、および再び配列決定を行った同一のライブラリ調製物を用いて同じ核RNA配列決定サンプルを取り、同様に良好な相関（r=0.94）を見出した。次に、ERCCスパイクインミックスをあらかじめ決められた濃度で2つの別々のマイクロ流体C1チップにロードし、および同じチップ内の1つのサンプル間で良好な相関（r=0.99）を再び回復し、および2つの独立した各C1チップも良好な相関（r=0.99）を回復した。スパイクインミックスについて観察されたFPKMレベルは、予想される濃度で一貫していた。まとめると、これらのコントロールは、本発明者らの単一核RNA配列決定手順において何らの有意な技術的ばらつきの余地も与えなかった。
【００６８】
コアCM遺伝子ネットワーク
最初に、本発明者らの単一核RNA配列決定データセットにより、本発明者らがすべての健康なCM核に存在する分子マーカーを定義することが可能となった。本発明者らは、低い変動係数で、全てのシャム核において、そしてまた健康な手術なしの核においても、最も高度に発現される６つの「コア遺伝子」を同定した。本発明者らは、Tnnt2、Tpm1およびMyl2の一貫した特異的高発現を認識し、ミオシン重鎖遺伝子のような他に以前想定されたマーカーではしなかった。このことは、それらのCMアイデンティティのマーカーとしての理想的な適合性を意味する。興味深いことに、他の３つのコア遺伝子は、非コードRNAであり、CM核におけるこれらの非コードRNAの以前には認められていなかった豊富さまたは機能を反映している。
【００６９】
健康および不全心臓におけるCMの不均一性および亜集団
次に、サンプル間の不均一性を調べた。各遺伝子の発現レベルのスペクトルを評価する代わりに、本発明者らは、各サンプルを、各遺伝子を発現するかまたは発現しないかのどちらかとして分類的に検討し；遺伝子を発現するサンプルの割合として定義される、各遺伝子の「浸透度」の値を導き出した。一般に、高度に発現された遺伝子は、大多数のサンプルにおいて発現されたが（スピアマン順位相関 r=0.90、p<2.2e-16）、本発明者らは、この結果が、シャムよりもTACの方がそのようであることに注目した（図１Ｃ）。CMが個々の各核に統一的な転写プログラムを活性化することによってTACストレスに応答したという考えと整合して、TAC核の中では、シャムよりも相関値の分布がより狭いことが分かった（p<2.2e-16 マンホイットニー U検定）。さらに、教師なし階層クラスタリング、主成分分析、またはスピアマン順位相関のいずれかを使用することによって、本発明者らは一貫してそれぞれシャムおよびTACにおいて核の二つの異なる大きなサブグループのみを検出し、さらなる一連の生物学的反復で再現した（図１Ｅ〜Ｇ）。
【００７０】
核サブグループについて加重遺伝子相関ネットワーク分析（WGCNA）を行い、および高度に相関した遺伝子モジュールを同定した（図２Ａ〜Ｂ）。健康モジュールについての遺伝子オントロジー（GO）分析は、RNA結合、mRNAプロセシング、RNAスプライシング、心筋細胞分化、細胞周期停止、心筋細胞の発生および心臓収縮のための遺伝子の有意な濃縮を示す（図２Ｃ）。疾患モジュール１は、アポトーシスおよびオートファジー遺伝子を含み、心不全においてよく知られている経路を反映し、および細胞運動、転写因子結合、アクチンフィラメントベースのプロセスおよびアクチン細胞骨格構成の調節における遺伝子の濃縮を反映していた（図２Ｄ）。疾患モジュール２は、翻訳、前駆体代謝産物の生成、酸化的リン酸化、酸化ストレスに対する応答、細胞増殖、および心筋組織の発生の遺伝子が濃縮しており、よく知られている重大な（featal）初期化マーカーNppaおよびNppbを含んでいた（図２Ｅ）。3つのモジュールはすべて、ヒト拡張型心筋症、肥大型心筋症および先天性心疾患を引き起こすことが知られている重要な心臓発現遺伝子も含み、心機能に対する本発明者らの遺伝子モジュールの全体的な生理学的関連性を反映している。
【００７１】
特に、これらのモジュール内の遺伝子は、シャムおよびTACの各CM核の亜集団で有意に差次的に発現されるので、今や一連の新規分類マーカーを形成し（図２Ｆ、Ｉ）、他の方法では、プールされた、およびバルクの組織のRNA配列決定アプローチによってマスクされる（図２Ｇ〜Ｉ）。バルクの組織レベルであっても容易に検出可能なストレス遺伝子である、Myh7、NppaおよびNppbのような古典的な胎児初期化遺伝子が、これに対する顕著な例外であり続けている（図２Ｈ）。
【００７２】
ヒト左心室からのCMの単一核RNA配列決定
末期心不全の男性DCM患者の左心室由来のヒトCM核に対して、対応する年齢の男性の健常コントロールと比較して、同じ分析を広げた。注目すべきことに、本発明者らは、コントロールと比較して、DCMにおいて、同様に高度に発現されたコア心臓遺伝子、核サブグループ、および減少した不均一性を見出した（図９、Ｓ３Ａ〜Ｆ）。遺伝子モジュールについての遺伝子オントロジー分析は、マウスと同様の機能のアノテーションを与えた。脱分化マーカーDSTNの差次的発現は、単一核レベルで検出されたが、バルクの組織RNA配列決定では検出されず（図９、S3G-H）、ヒトDCM患者生検におけるDSTNタンパク質の増加の報告と整合する。
【００７３】
インビボストレス応答中のCMの亜集団における細胞周期遺伝子の不均一な活性化
単一核分析を利用して遺伝子共発現について詳細な洞察を与えるため、関連するCMの生物学の既知の重要性に基づいて選択した候補遺伝子のセットの発現プロファイルを比較する「4分割分析」（Extended Experimental Procedures）を行った（方法参照）。本発明者らは、シャムおよびTACマウスサンプルにおいて、「増殖」および「増殖のネガティブの調節因子」マーカーから始め、Q3（第3象限：どちらのマーカーセットも発現していない）のシャムから、Q2（第2象限：両方のマーカーセットの共発現：44.4％；p<3.237e-07フィッシャーの正確確率検定；図３Ａ）のTACへの核の有意なシフトが見られた。これは、TAC核が増殖遺伝子転写を活性化し、および同じ核が同時に「分子ブレーキ」として作用する増殖のネガティブの調節因子を発現し、したがって細胞質分裂の達成を妨げることを示唆した。候補マーカーの中で、Ccnd2およびCcng1は、TAC核のサブグループにおいて差次的に発現される主要なものであった。注目すべきことに、Ccnd2のトランスジェニック過剰発現は、成体のマウスCMが細胞周期に再び入り、増殖することを誘導し、一方、Ccng1の過剰発現は、細胞質分裂を阻害することによって細胞周期停止を誘導し、および倍数性をもたらした。その他の点では、既存の成体のマウスCMの内因性分裂速度は非常に遅く、心筋ストレスの間、わずかな増加しかなかった１。したがって、高増殖マーカー単独の発現を有するQ4核（6.4％、Q4；図３Ａ）は、細胞質分裂の阻害されていない可能性を保持した核であり得る。あるいは、Q４核にまだ同定されていないネガティブの調節因子が存在し得る。注目すべきことに、同じ集団シフトが、プールされたCM核においてもバルクの左心室組織においても見られなかったので、本発明者らがこれらの結果を達成することができたのは単一核分析によってのみであった（図３Ｂ〜Ｃ）。
【００７４】
初期の前駆細胞マーカーおよび脱分化のマーカーの不均一なストレス応答
次に、心臓前駆細胞および心臓転写因子の共発現について4分割分析を行い、TAC核の大きなサブセットにおいて両方のマーカーの上方制御を観察した（Q2：42.9％、フィッシャーの正確確率検定、p=2.548e-05、図３Ｄ）。これもまた、単一核分析によってのみ検出可能であり、プールされたか、またはバルクの組織の分析によっては検出されなかった（図３Ｅ〜Ｆ）。Hand2、Nkx2-5、Mef2a、Mef2cと同様にSca1/Ly6a、Kdr、CD34は、TAC CMのサブセットにおける主要な発現マーカーであった（図３Ｊ）。CM由来の内因性c-Kitは、以前にインビボでマウス心臓において〜0.03％という非常に低い割合でのみ検出された34。本発明者らのサンプルの中で、c-Kitは、3つのマウス核（全ての核の0.83％）でのみ検出された。心臓前駆細胞マーカーIsl1は、すべてのサンプルにおいて検出されなかった。これに対し、不全の成体CMにおけるSca1/Ly6a、Kdr、CD34の高発現は驚くべきことであり、なぜなら、これらは造血および内皮前駆細胞のマーカーであり、これらはインビボでごくわずかな成体CMにしか生じないからである35、36。さらに、Sca1+心臓前駆細胞は、心臓収縮遺伝子を発現しない。したがって、本発明者らのSca1+核が、前駆細胞由来のものか、既存の成体CM由来のものかを評価した。後者を支持して、本発明者らのSca1+核は、多量のコア心臓遺伝子（Tnnt2、Myl2、Tpm1）を共発現した（図３Ｊ）。さらに、Sca1+核は、各生物学的反復で、大きな割合のTAC核（Q2およびQ4：81.0％；図３Ｊ）を構成し（70.3%）、これらが前駆細胞由来のCMであるという代わりの可能性を否定する。本発明者らは、単一分子RNA FISHおよび免疫蛍光法により、シャムCMにおけるSca1 RNAの低い基礎の発現および細胞表面SCA1タンパク質の発現、ならびにTAC CMにおける強い上方制御を確認した（図３Ｋ〜Ｎ）。特に、本発明者らは、Sca1+CMがTnnt2 RNAおよびタンパク質を共発現することを示し（図３Ｋ〜Ｎ）、このことは、線維芽細胞や内皮細胞ではなく、成体CMとしてのアイデンティティを確認する。
【００７５】
本発明らはさらに、重大な（featal）遺伝子応答を示すストレスを受けた核が、脱分化マーカーを共発現するであろうと仮定した。実際に、TAC核が明らかに重大な遺伝子の高い発現を示したが、脱分化マーカーとの高い共発現は、やはり単一核分析によってのみ明らかにされた（図３Ｇ〜I）。全体として、ストレス応答の不均一なスペクトルの鍵は、前駆細胞マーカー（Sca1、Kdr）、脱分化マーカー（Dstn、Msn、Actn2）および細胞周期遺伝子（Ccnd2、Ccng1）の上方制御された共発現が、Q2およびQ4におけるTAC核のサブセットに限定されることであった（図３Ｊ）。インビボでのストレス応答の間の脱分化および細胞周期進入遺伝子の転写が、これらの核のそれぞれの中の共通の調節因子（複数可）によって制御され得ることを示唆するので、この知見は重要である。
【００７６】
CMの核における新規の長い遺伝子間非コードRNA（lincRNA）
本発明者らの核RNA配列決定データセットにおいて新規遺伝子調節因子を同定するために、本発明者らは、CMの核内のlincRNA（LINCM）を多数発見した。これらのうちのいくつかは、我々の健康および疾患モジュール内の遺伝子と高度に共発現しており（図２Ｃ〜Ｆ）、このことは、いくつかのLINCMが、遺伝子モジュール内でストレス応答と協調するための調節の役割を果たすことができるという可能性を指摘する。LINCMの信頼性の高いアノテーションを確実にするために、発明者らは、コーディングポテンシャル評価ツール（CPAT）を使用して、コーディングポテンシャルのある転写産物を除外した。これは464のLINCMの精選されたリストをもたらし、その内の30.4％（141/464）が新規で、および69.6％（323/464）が以前に公共のデータベース（ENSEMBL、NONCODE）または独立した公開心臓トランスクリプトームデータセットで報告されていた（図４Ａ）。本発明者らのRNA配列決定は細胞全体ではなく核で行われたので、本発明者らはより多くのlincRNAを検出したと推論した。実際、本発明者らのLINCMの40.3％（187/464）が、本発明者らの核RNA配列決定においてのみ特異的に検出され、および対応するバルクの左心室のRNA配列決定中には検出されなかった（図４Ｂ）。単一核およびバルクの組織のRNA配列決定の間の公平な比較を確実にするために、本発明者らは、バルクの組織において同様の配列決定深度または〜８倍高い配列決定深度のいずれかを使用したが、結論は同じであり：本発明者らの新規のLINCMは、核のアプローチによってのみ検出可能であり、バルクの組織中では検出されなかった。したがって、バルクの組織のRNA配列決定のリードが、主に細胞質mRNAの大きなプールによって占められている可能性があり、特異的に核に保持されている、より低発現のlincRNAを希釈し、およびそれゆえ、それらはバルクのRNA配列決定では容易に検出されない。実際一例として、本発明者らは、LINCM6がRT-PCRによってバルクの左心室ではほとんど検出されないが、本発明者らの単一核RNA配列決定には多量に存在することを見出し、およびRNA FISHによって核局在化されることを確認した（図４Ｈ〜Ｈ’）。
【００７７】
本発明者らは、転写因子および本発明者らのリストのLINCMとの間の相互作用の可能性を、LINCM遺伝子座に近接する活性エンハンサークロマチン領域43を画定する経験的H3K27Ac ChIP配列決定ピークのモチーフ分析を行うことによって調べた。これらの遺伝子座において心臓転写因子の共占有モチーフの有意な濃縮があった（図４Ｃ）。特に、心臓の発生および心筋のストレス応答の中心的な転写因子のMEF2 43は、遺伝子座の57.1％で濃縮されていた。LINCM遺伝子座の機能のアノテーションを提供するために、ゲノム領域アノテーション濃縮（GREAT）分析は、心臓の発現および機能の有意な特異的濃縮を示した（図４Ｃ）。心臓タンパク質コード遺伝子を含む、近くの遺伝子とLINCMの間の発現レベルの全体的な相関関係は、LINCM遺伝子座からの直線的な染色体上の距離の増加に伴って強化され（図10、S5B）、LINCMが遠位の調節相互作用または長距離染色体ループ相互作用を介して作用し得ることを意味している。まとめると、これは本発明者らのLINCMが、CMと生物学的に関連性があり、および重要なエピジェネティックな調節機能を果たすことができることを示唆している。
【００７８】
本発明者らのLINCMが、CMに存在し、および単に配列アーティファクトではないことを確実にするために、本発明者らは、12の候補LINCMを、それらの細胞内局在パターンを同時に実証する、単離された成体CMにおけるRT-PCR (図10, S5A)および単分子RNA FISHにより確認した（図４Ｄ〜Ｓ’）。イントロンおよびエキソンプローブは、核内の明るい焦点に共局在し（図４Ｄ、アスタリスク）、活性転写の部位を表す。ポジティブコントロールは、非常に豊富なコア心臓遺伝子Tpm1、Tnnt2、Myl2およびMalat1を含み（図４Ｎ〜Ｑ’）、ならびにネガティブコントロールは、プローブのないコントロール（NPC）およびセンスプローブコントロール（図４Ｒ〜Ｓ’）を含んだ。LINCM3（Gas5とも呼ばれる）およびLINCM9（以前は1810058i24Rikと表記されていたが、これらは現在「Singheart」、Sghrtと呼んでいる）が、TAC CMで上方制御されることを確認し、一方、LINCM5は、シャムCMと比較してTAC CMでは下方制御されていた（図４Ｔ〜Ｙ）。Gas5は、シャムＣＭの核内に位置するが（図４Ｔ）、TACストレス下で上方制御され、TAC CMの核周囲領域内のNppa転写物と共局在している（図４Ｕ）。Sghrtは、シャムCMの核および細胞質において低い基礎発現を有するが（図４Ｖ）、TACストレス下で上方制御される（図４Ｗ）。Gas5およびSghrtは、特に疾患モジュール2内で高度に相互接続されたノーダルハブを占有しており（それぞれEigengeneベースの接続性kME 0.87、0.67；図２Ｅ）、遺伝子調節ネットワークにおける他の遺伝子の重要な調節因子としてのそれらの潜在的な役割を示唆している。
【００７９】
Gas5とSghrtは成体CMの細胞周期の再進入を調節する
主要なノーダルハブでのGas5およびSghrtの本発明者らの発見は、それらが、細胞周期遺伝子：Ccng1およびCcnd2および他：NppaおよびDstn、を含む同じ遺伝子ネットワーク内の共発現遺伝子を調節するという確認可能な仮説を提示した（図２Ｅ）。この仮説を機能的に試験するために、本発明者らは、アンチセンスLNAベースのGapmeRを用いて、単離した成体のマウスCM（TAC手術したマウス）に対してGas5またはSghrtのノックダウン（KD）を別々に行い、およびKDの48時間後にRNAを抽出した（図５Ａ）。確実にノックダウンが達成されたことを保証するために、本発明者らはqPCRを行い、ならびにGas5およびSghrtがそれぞれ67.3％と86.0％著しく減少することを確認した（図５Ｂ〜Ｃ；KD後のGas5発現レベル：32.7％±8.29％標準誤差；ＫＤ後のSghrt発現レベル：14.0％±3.50％；標準誤差）。ネガティブコントロールとして、本発明者らは、標的なしのネガティブコントロールオリゴおよびモックトランスフェクトコントロールを両方使用した。
【００８０】
成体TAC CMにおけるGas5のノックダウンは、Nppa、Dstn、Ccng1およびCcnd2の発現を有意に抑制した（図５Ｄ〜Ｇ）。以前の証拠によると、Gas5は、増殖停止時に蓄積し48、心臓を含む多くの組織で発現し49、および癌細胞においてアポトーシス50と増殖51を調節している。一方、Sghrtは、これまでに記載された機能がない新規なlincRNAである。Sghrtのノックダウンは、Ccng1の有意な増加、Ccnd2の減少を引き起こしたが、NppaまたはDstn発現の有意な変化はなかった（図５Ｄ〜Ｇ）。
【００８１】
本発明者らは、Gas5またはSghrtが、特にTACストレス応答の間に、成体のCM細胞周期の再進入をどのように調節するかの試験を続行した。この目的のために、本発明者らは再び単離されたTAC CMでGas5またはSghrtノックダウンを独立して行い、およびpH3（リン酸化H3 Ser-10）について免疫染色してM期進入の変化について確認した。Gas5またはSghrtの両方のノックダウンは、Ｍ期の再進入の増加をもたらし、ネガティブコントロールオリゴと比較して、pH3+ DAPI+ CM核の％でそれぞれ3.6倍または3.7倍の有意な増加であった（図５Ｈ〜Ｉ）。Gas5またはSghrtがS期進入にどのように影響するかを調べるために、本発明者らは、EdUを用いて初期のDNAを合成する細胞を標識し、Sghrt KD後にEdU+ DAPI+ CMの％において〜2.1倍の有意な増加を見出した（図５Ｊ〜Ｋ）。驚いたことに、Gas5 KD後のEdU+ DAPI+ CMの％に有意な変化はなく（図５Ｋ）、2つのLINCMがCM細胞周期の再進入を制御し得る二分効果（dichotomous effect）を示唆している。さらに、DAB２は、CM脱分化のマーカーとして使用されており、および心臓発生調節因子であることが最近報告されている。Gas5 KDまたはSghrt KDの後、DAB2+ CMの％のそれぞれ1.78倍または1.69倍の有意な増加を見出し（図５Ｌ〜Ｍ）、それらはCMの脱分化も調節することを反映している。
【００８２】
Gas5およびSghrtはCMのG1/SおよびG2/M細胞周期チェックポイントを調節する
Gas5およびSghrtがどのように機能するかについての本発明者らの理解を深めるために、本発明者らは、G1/SおよびG2/M期の重要な細胞周期チェックポイント調節因子の発現レベルをプロファイルした。S期への進入がないことと整合して、Gas5 KDは、G1/S活性化因子Cdk4、Cdk6、Ccne1およびCcnd2のレベルの低下をもたらした（図５Ｇ、Ｎ〜Ｐ）。代わりに、Nrg1の同時増加（図５Ｑ）およびG2/M阻害剤Ccng1のレベルの減少（図５Ｆ）があり、これら全てがGas5 KD後のG2/M停止からの細胞の解放を説明している。成体のCMは、G2/M期で停止され、およびGas5の阻害のような適切なシグナルを与えられた場合、細胞周期に再び進入するために解放される準備をすることができる。
【００８３】
一方、Sghrt KDは、G1/S活性化因子Cdk6の発現増加（図５Ｏ）、ならびにG2/M活性化因子Cdk1およびCdc25aの発現増加（図５Ｒ〜Ｓ）をもたらし（図５Ｒ〜Ｓ）、このことは、それぞれ増大したS期およびM期の進入の両方を共に説明する。Gas5 KDまたはSghrt KDの後、他のG1/S活性化因子（Ccne2、Ccnd1、Cdk2）およびG2/M活性化因子（Ccnb1、Cdc25b）のレベルに有意な変化はなかった（データ示さず）。本発明者らのデータは、Gas5およびSghrtが、下流の細胞周期エフェクターの特定のサブセットの転写調節を介して、CM細胞周期の再進入を調節するという細胞周期遺伝子発現の証拠を提供する（図５Ｔ）。
【００８４】
Gas5とSghrtはインビボでCM細胞周期の再進入と増殖を調節する。
マウスCMは、出生後およそ7日目（P7）4にそれらの増殖ウィンドウの最後に細胞周期を離脱する。それゆえ、本発明者らは、この増殖時間経過ウィンドウの各所で、正常なマウス心臓発生の間のGas5およびSghrt転写産物レベルを評価した。P1〜P56の単離したマウス心臓に対するqPCRにより、本発明者らは、Gas5発現がP7〜P10の間で増加し、および年齢と共にP10から減少することを見出した（図６Ａ）。逆に、Sghrt発現は一時的にP7で急上昇し、P10から、年齢が上がるとともに次第に増加する（図６Ｂ）。それゆえ、P7での増殖ウィンドウの終わりは、Gas5およびSghrtの両方における発現急上昇と一致し、この発生段階の間のCMの細胞周期離脱の調節におけるそれらの潜在的役割と整合する。
【００８５】
Gas5またはSghrtが、インビボでCM細胞周期離脱を制御するかどうかを試験し、およびインビトロでのノックダウンデータを確認するために、本発明者らは、AAV9-TNNT2-eGFP RNAi送達システム55、56を用いて、P7マウスでのインビボCM標的ノックダウンの実施に移った（図６Ｃ、Ｄ）。本発明者らは、最初に標的当たり５から７個のmiR RNAiオリゴをインビトロでスクリーニングし、およびGas5またはSghrtのそれぞれについて、HEK細胞において、IRC-eGFPレポーターでタグ付けされた全長Gas5またはSghrtと一緒に共発現されたmCherryタグ付けされたmiR RNAiオリゴによって確認された（図11、Ｓ６Ａ）、最良のノックダウン効率をもたらす上位２つのオリゴを選択した。ノックダウン効率は、Gas5では平均71.8％±0.03標準誤差、Sghrtでは87.1％±0.04％標準誤差であった（図11、Ｓ６Ｂ〜Ｅ）。
【００８６】
P7マウスにAAV9-TNNT2-eGFP-Gas5 KDまたはAAV9-TNNT2-eGFP-Sghrt KDのいずれかを注射した後、P14に心臓を摘出し、pH 3（M期マーカー）およびEdU（S期マーカー）の変化を調べた（６Ｇ〜Ｊ）。ネガティブコントロールは、いずれの既知のマウス転写産物も標的としないAAV9-Tnnt2-eGFP-LacZ RNAi56、およびリン酸緩衝生理食塩水（PBS）のみの同腹仔への注射を含んだ（N=8 マウス Gas5 KDオリゴ＃1、N=7 マウス Gas5 KDオリゴ＃2、N=7 マウスSghrt KDオリゴ＃1、N=8 マウス Sghrt KDオリゴ＃2、N=5 マウス LacZ KD、N=８ マウス ＰＢＳ注射）。インビトロよりもインビボノックダウン効率がより限定的であるにもかかわらず（図６Ｅ〜Ｆ）、本発明者らは、本発明者らのインビトロでの知見を強く裏付ける表現型の程度を見出した（図６Ｈ、Ｊ、Ｎ）。pH3+ TNNT2+ DAPI+ CM核は、インビボでのGas5またはSghrtのいずれかのノックダウン後に、有意に増加した（Ｍ期進入）（図６Ｇ〜Ｈ）。EdU+ TNNT2+ DAPI+ CM核は、Gas5のノックダウン後に有意に減少した（S期進入）が、Sghrtのノックダウン後に増加した（図６Ｉ〜Ｊ）。切断カスパーゼ３（CC3+ TNNT2+ DAPI+ CM核）によって評価されるようなアポトーシスの増加はなく（図６Ｋ〜Ｌ）、これはGas5またはSghrtの喪失が細胞死を引き起こさなかったことを意味する。代わりに、DAB2+ TNNT2+ CMの増加（図６Ｍ〜Ｎ）は、Gas5またはSghrtノックダウンがインビボでの細胞周期の再進入に加えて、CMの脱分化をもたらすことを再度実証した。
【００８７】
マウス心臓の組織切片には、CMの他に、線維芽細胞および内皮細胞などの他の細胞型が含まれているため、TNNT2+CMのみを評価することに集中するように注意深く予防策をとった。EdU+ TNNT2+ DAPI+およびpH3+ TNNT2+ DAPI+核が他の細胞型ではなくCMに由来するという特異性をさらに確認するため、本発明者らはまた、CM核膜マーカーPCM1で共染色し、および共焦点ｚスライスにおいて一貫した共局在化を確認した（図６Ｏ）。組織切片において小麦胚芽アグルチニン（WGA）を用いて細胞輪郭を染色し、およびインビボでのGas5またはSghrtのノックダウン後のCM数（mm2あたり#CM）の有意な増加を確認した（図６Ｐ〜Ｑ）。CMの断面積は、LacZ KDコントロールと比較して、Gas5 KDまたはSghrt KDのいずれにおいても有意に小さかった（図６Ｒ〜Ｓ）。同様に、本発明者らは、Aurora Bについて染色し、および細胞質分裂の証拠と整合して、Gas5 KDまたはSghrt KDの後にAurora B+ TNNT2+ CMの有意な増加を見出した（図６Ｔ〜Ｕ）。全体として、結果は、Gas5およびSghrtが、インビボでCMの細胞周期の再進入および増殖を調節するという結論を支持する。
【００８８】
インビボにおける、AAV9-CRISPR Cas9媒介のGas5またはSghrtの欠失によって再現された細胞周期の変化
本発明者らが観察した表現型が、RNAiノックダウンによるオフターゲット効果によらないことを確実にするために、本発明者らは、Gas5またはSghrtのいずれかのプロモーターおよび第一エキソンを特異的に欠失させるCRISPR sgRNA対を設計し（図７Ａ）、インビトロでpCAG-EGxxFP相補性アッセイ58を介してそれらの個々の切断効率についてスクリーニングし（図12、Ｓ８Ａ〜Ｃ）および構成的CAGプロモーター59の下でCas9-eGFPを発現するP7ホモ接合型Rosa26-Cas9-eGFPノックインマウスに、AAV9-U6-sgRNA1-U6-sgRNA2-TNNT2-mRuby2を注射した59（図７Ｂ）。本発明者らは、CMおよび他の心臓細胞型も含む注射されたマウス心臓の切除された心尖からの転写産物の対応する減少（図１２、Ｓ８Ｄ〜Ｅ）を伴う、インビボでのマウス心臓に効率的および特異的なゲノム編集があることを最初に確認した（図７Ｃ）。本発明者らはまた、注射されたCas9-eGFPホモ接合性マウスの心臓の至る所で、CAG-Cas9-eGFPを伴うAAV9-U6-sgRNA1-U6-sgRNA2-TNNT2-mRuby2の確固とした共発現を確認した（図７Ｄ）。インビボにおいて、AAV9-CRISPR Cas9でゲノム編集されたPCRフラグメントをゲル抽出し、クローニングし、そしてサンガー配列決定し、それらの同一性を確認した（図１２、Ｓ８Ｆ〜Ｉ）。ネガティブコントロールは、ホモ接合性Cas9-eGFP同腹仔へのsgRNAなしのAAV9-TNNT2-mRuby2の注射であった（図７Ｃ；N=8 マウス Gas5 sgRNA；N=10 マウスSghrt sgRNA；N=7 マウス mRuby2 コントロール）。また本発明者らは、相互のゲノム領域を調べることによって、任意の交差オフターゲット効果（crossover off-target effect）がないことを確認した（図７Ｃ；図１２、Ｓ８Ｇ、Ｉ）。
【００８９】
特に、S期（EdU）、M期（pH3）、細胞質分裂（AuroraB）、脱分化（DAB2）、アポトーシス（CC3）、増殖（細胞数/ mm2）、細胞サイズ（断面積）、細胞周期阻害（p21、CALR）における同様の効果（図７Ｅ〜Ｖ）は、以前のAAV9-TNNT2-eGFP-miR RNAi KDインビボデータと整合することが確認された。したがって、これは、AAV9-RNAi KDから得られたデータが、インビボでのAAV9-CRISPR Cas9媒介のゲノム欠失の独立したアプローチによって確認されるという証拠を提供する。
【００９０】
心不全のTACモデルにおけるSghrt KDによる機能の部分的回復
最後に、インビボでのLINCMの標的化阻害が心不全の病理学的モデルにおいて何らかの治療上の利益をもたらし得るかどうかを調べるために、TAC手術後4週後、マウスが、心肥大（ＬＶ後壁寸法）および減少した駆出率（EF％）を伴うＴＡＣの明白な効果を示した時点に、高力価（5×1013ウイルスゲノム/kg）のAAV9-TNNT2-eGFP-Sghrt RNAiまたはAAV9-TNNT2-eGFP-Gas5 RNAiのいずれかをマウスに注射した（図８Ａ〜Ｅ）。発明者らは、毎週の心エコー検査を通してそれらの進行をモニターし始めた。ネガティブコントロールは、TAC同腹仔に注射したAAV9-TNNT2-eGFP-LacZ RNAiおよびシャム同腹仔に注射したＰＢＳであった（N=6 マウス Gas5 KDオリゴ＃1 TAC、N=6 マウス Gas 5 KDオリゴ＃2 TAC、N=5 マウス Sghrt KD オリゴ＃1 TAC、N=7 マウス Sghrt KD オリゴ＃2 TAC、N=9ウスacZ KD TAC、N=14 マウス PBSを注射したシャム）。AAV9注射後の最初の4週間の間、Gas5 KDまたはSghrt KD TACマウスのいずれにも変化はなかった（図８Ｂ〜Ｃ）。代わりに、注射後５週以降、Sghrt KD TACマウスではEF％およびLV壁厚の部分的および有意な回復が明らかになるが、Gas5 KD TACマウスではそうではない（図８Ｂ〜Ｅ）ことは注目に値した。Sghrt KDによるEF％のこの回復は、AAV9注射TACマウスの6週間後の心臓におけるSghrt転写産物のノックダウンのレベルとよく相関していた（図１３、Ｓ９Ｂ）。本発明者らは、AAV9注射の6週間後にマウスを採取し、およびAAV9注射の6週間後であってもTNNT2-eGFPレポーターの確固とした発現を確認した（図８Ｆ）。M期（pH3）、細胞質分裂（AuroraB）、脱分化（DAB2）、アポトーシス（CC3）、増殖（細胞数/mm2）、細胞サイズの変化（WGA）、細胞周期の阻害（p21、CALR）（図８Ｇ〜Ｎ）の変化を定量し、インビボでのAAV9-TNNT2-eGFP-Sghrt RNAiノックダウン後のP14採取マウスからのデータと特に整合した。まとめると、本発明者らは、Sghrtの標的化阻害が、心不全マウスモデルにおいて肥大の発症後であってもインビボでの増殖を誘導し、および心機能を回復することができることを示す。
【００９１】
考察
インビボでの不全および不全でない哺乳動物の心臓からのCMの本発明者らの単一核RNA配列決定研究は、初めて心筋ストレス-遺伝子応答の不均一性を明らかにする。本発明者らは、CM核亜集団に特異的な遺伝子調節ネットワークを明らかにし、およびその多くが主要なノーダルネットワークハブを占めている数百のLINCMを同定する。特に、Gas5およびSghrtは、インビボでのCM細胞周期の再進入および増殖のネガティブの調節因子として同定された。現在までに、Gas5およびSghrtは、CM増殖を調節することが報告された最初のlincRNAである。
【００９２】
参考文献
22. Shalek, A. K. et al. Single-cell transcriptomics reveals bimodality in expression and splicing in immune cells. Nature 498, 236-240 (2013).
23. Treutlein, B. et al. Reconstructing lineage hierarchies of the distal lung epithelium using single-cell RNA-seq. Nature 509, 371-375 (2014).
24. Wu, A. R. et al. Quantitative assessment of single-cell RNA-sequencing methods. Nat. Methods (2013). doi:10.1038/nmeth.2694
55. Jiang, J., Wakimoto, H., Seidman, J. G. & Seidman, C. E. Allele-specific silencing of mutant Myh6 transcripts in mice suppresses hypertrophic cardiomyopathy. Science 342, 111-114 (2013).
56. Jiang, J. et al. Cardiac myosin binding protein C regulates postnatal myocyte cytokinesis. Proceedings of the National Academy of Sciences 112, 9046-9051 (2015).
66. Movassagh, M. et al. Distinct epigenomic features in end-stage failing human hearts. Circulation 124, 2411-2422 (2011).
67. Movassagh, M., Vujic, A. & Foo, R. Genome-wide DNA methylation in human heart failure. Epigenomics 3, 103-109 (2011).
【図１】
2020513407.tif 000002
【図２】
2020513407.tif 000003
【図３】
2020513407.tif 000004
【図４】
2020513407.tif 000005
【図５】
2020513407.tif 000006
【図６】
2020513407.tif 000007
【図７】
2020513407.tif 000008
【図８】
2020513407.tif 000009
【図９】
2020513407.tif 000010
【図１０】
2020513407.tif 000011
【図１１】
2020513407.tif 000012
【図１２】
2020513407.tif 000013
【図１３】
2020513407.tif 000014
【配列表】
2020513407000001.app
【国際調査報告】
2020513407.tif 000015
2020513407.tif 000016
2020513407.tif 000017