(57)【要約】  本発明は、標的タンパク質ＤＤＢ１およびＣＵＬ４関連因子４様２（ＤＣＡＦ４Ｌ２）に由来する、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する抗原認識コンストラクトに関する。本発明は、特に本発明のＴＡＡに選択的かつ特異的である、新規Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ベースの分子を提供する。本発明のＴＣＲ、およびそれに由来するＴＡＡ結合断片は、がん性疾患を発現するＴＡＡの診断、治療、および予防に有用である。さらに、本発明の抗原認識コンストラクトをコードする核酸、これらの核酸を含んでなるベクター、抗原認識コンストラクトを発現する組換え細胞、および本発明の化合物を含んでなる医薬組成物が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３、９、１５、２１、２７、および３３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有する、少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）３を含んでなる抗原認識コンストラクト。
【請求項２】
請求項１に記載の抗原認識コンストラクトであって、前記抗原認識コンストラクトが、配列番号４９、および５０〜５７から選択されるアミノ酸配列を含んでなり、またはそれからなるエピトープに、特異的におよび／または選択的に結合できる、抗原認識コンストラクト。
【請求項３】
請求項１または２に記載の抗原認識コンストラクトであって、前記抗原認識コンストラクトが、抗体、またはその誘導体もしくは断片、またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、またはその誘導体もしくは断片である、抗原認識コンストラクト。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗原認識コンストラクトであって、前記ＴＣＲαまたはγ鎖が、配列番号３、１５、および２７から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するＣＤＲ３を含んでなり；および／または前記ＴＣＲβまたはδ鎖が、配列番号９、２１、および３３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するＣＤＲ３を含んでなる、ＴＣＲαまたはγ鎖および／またはＴＣＲβまたはδ鎖を含んでなる、抗原認識コンストラクト。
【請求項５】
請求項４に記載の抗原認識コンストラクトであって、前記ＴＣＲαまたはγ鎖が、配列番号１、１３、および２５から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するＣＤＲ１；および／または配列番号２、１４、および２６から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するＣＤＲ２をさらに含んでなる、抗原認識コンストラクト。
【請求項６】
請求項４または５に記載の抗原認識コンストラクトであって、前記ＴＣＲβまたはδ鎖が、配列番号７、１９、および３１から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するＣＤＲ１；および／または配列番号８、２０、および３２から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するＣＤＲ２をさらに含んでなる、抗原認識コンストラクト。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗原認識コンストラクトであって、配列番号４、１０、１６、２２、２８、および３４から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するＴＣＲ可変鎖領域を含んでなる、抗原認識コンストラクト。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗原認識コンストラクトであって、ＴＣＲ結合断片を含んでなり、前記結合断片が、任意選択的に、配列番号１、２、３、または７、８、９または１３、１４、１５、または１９、２０、２１、または２５、２６、２７または３１、３２、３３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１〜ＣＤＲ３配列から選択されるＣＤＲ１〜ＣＤＲ３を含んでなる、抗原認識コンストラクト。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗原認識コンストラクトをコードする核酸、または前記核酸を含んでなるベクター。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗原認識コンストラクト、または請求項９に記載の核酸もしくはベクター、好ましくはリンパ球、好ましくはＴリンパ球もしくはリンパ球前駆体、より好ましくはＣＤ４もしくはＣＤ８陽性Ｔ細胞、なおもより好ましくはγ／δＴ細胞であるＴ細胞を含んでなる、宿主細胞。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗原認識コンストラクト、または請求項９に記載の核酸もしくはベクター、または請求項１０に記載の宿主細胞、および薬学的に許容可能な担体、安定剤および／または賦形剤を含んでなる、医薬組成物。
【請求項１２】
医療で使用するための、好ましくは増殖性疾患、特にがんの診断、予防、および／または治療で使用するための、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗原認識コンストラクト、または請求項９に記載の核酸、または請求項１０に記載のベクター、または請求項１１に記載の宿主細胞、または請求項１２に記載の医薬品組成物であって、前記がんが、好ましくは、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、腎細胞、脳がん、胃がん、結腸直腸がん、肝細胞がん、頭頸部がん、膵臓がん、前立腺がん、白血病、乳がん、メルケル細胞がん、黒色腫、卵巣がん、膀胱がん、子宮がん、胆嚢および胆管がん、食道がん、またはそれらの組み合わせから選択される、医薬品組成物。
【請求項１３】
ａ）前記生物学的サンプルを請求項３〜８のいずれか一項に記載のＴＣＲに接触させるステップと、
ｂ）前記生物学的サンプルへの前記ＴＣＲの結合を検出するステップと
を含んでなる、生物学的サンプル中のがんを検出する方法。
【請求項１４】
前記ＴＣＲが検出可能な標識を含んでなる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記検出可能な標識が、放射性核種、フルオロフォア、およびビオチンからなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記検出が、生体外、生体内または原位置で実施される、請求項１３〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記がんが、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、腎細胞、脳がん、胃がん、結腸直腸がん、肝細胞がん、頭頸部がん、膵臓がん、前立腺がん、白血病、乳がん、メルケル細胞がん、黒色腫、卵巣がん、膀胱がん、子宮がん、胆嚢および胆管がん、食道がん、またはそれらの組み合わせである、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の方法
【請求項１８】
請求項３〜８のいずれか一項に記載のＴＣＲである抗原認識コンストラクトであって、前記ＴＣＲが可溶性ＴＣＲである、抗原認識コンストラクト。
【請求項１９】
請求項３〜８のいずれか一項に記載のＴＣＲである抗原認識コンストラクトであって、前記α鎖が配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるＴＣＲα可変ドメインを含んでなり、前記β鎖が配列番号１０と少なくとも１０％同一であるＴＣＲβ可変ドメインを含んでなり、前記ＴＣＲがＩＴＡＡ−ペプチド−ＭＨＣ分子複合体に特異的に結合する、抗原認識コンストラクト。
【請求項２０】
請求項３〜８のいずれか一項に記載のＴＣＲであって、配列番号４に対して前記α鎖に少なくとも１つの変異を有し、および／または配列番号１０に対して前記β鎖に少なくとも１つの変異を有し、前記ＴＣＲが、ＴＡＡペプチド−ＨＬＡ分子複合体に対して、非変異ＴＣＲの少なくとも２倍の結合親和性および／または結合半減期を有する、ＴＣＲ。
【請求項２１】
請求項３〜８に記載の抗原認識コンストラクトであって、配列番号４に対してα鎖中に少なくとも１つの変異を有し、および／または配列番号１０に対してβ鎖中に少なくとも１つの変異を有し、前記ＴＣＲが非変異ＴＣＲと比較して修飾グリコシル化を有する、抗原認識コンストラクト。
【請求項２２】
配列番号４のα鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３からなる群から選択される少なくとも１つのα鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）および／または配列番号１０のβ鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３からなる群から選択される少なくとも１つのβ鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでなり、ＴＡＡペプチド−ＭＨＣ分子複合体に特異的に結合する、ＴＣＲ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的タンパク質ＤＤＢ１およびＣＵＬ４関連因子４様２（ＤＣＡＦ４Ｌ２）に由来する、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する抗原認識コンストラクトに関する。本発明は、特に本発明のＴＡＡに対して選択的かつ特異的である、新規Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ベースの分子を提供する。本発明のＴＣＲ、およびそれに由来するＴＡＡ結合断片は、がん性疾患を発現するＴＡＡの診断、治療、および予防に有用である。さらに、本発明の抗原認識コンストラクトをコードする核酸、これらの核酸を含んでなるベクター、抗原認識コンストラクトを発現する組換え細胞、および本発明の化合物を含んでなる医薬組成物が提供される。
【背景技術】
【０００２】
Ｔ細胞ベースの免疫療法標的は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）の分子によって提示される腫瘍関連または腫瘍特異的タンパク質に由来する、ペプチドエピトープに相当する。これらの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）は、酵素、受容体、転写因子などの全てのタンパク質クラスに由来するペプチドであり得て、それらは各腫瘍細胞内で発現され、同一起源の非改変細胞内と比較して、通常、上方制御される。
【０００３】
細胞性免疫応答の特異的要素は、腫瘍細胞を選択的に認識して破壊できる。腫瘍浸潤性細胞集団からの、または末梢血からのＴ細胞の単離は、がんに対する自然免疫防御において、このような細胞が重要な役割を果たすことを示唆する。特に、細胞質ゾル内に位置するタンパク質または欠陥リボソーム産物（ＤＲｉＰ）に由来する、通常は８〜１０アミノ酸残基の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）保有ペプチドのクラスＩ分子を認識するＣＤ８陽性Ｔ細胞が、この応答において重要な役割を果たす。ヒトのＭＨＣ分子はまた、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）とも称される。
【０００４】
ＭＨＣ分子には、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩの２つのクラスがある。ペプチドとＭＨＣクラスＩの複合体が、適切なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有するＣＤ８陽性Ｔ細胞によって認識される一方で、ペプチドとＭＨＣクラスＩＩ分子の複合体は、適切なＴＣＲを有するＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞によって認識される。ＣＤ８依存性およびＣＤ４依存性の双方のタイプの応答が、抗腫瘍効果と共同して相乗的に寄与するので、腫瘍関連抗原および対応するＴ細胞受容体の同定と特性解析は、ワクチンおよび細胞療法などのがん免疫療法の開発において重要である。
【０００５】
ＭＨＣクラスＩ依存免疫反応において、ペプチドは腫瘍細胞によって発現される特定のＭＨＣクラスＩ分子に結合できるだけでなく、それらはまた、引き続いて特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を有するＴ細胞によって認識されなくてはならない。したがって、ＴＡＡは、腫瘍ワクチンおよび細胞療法をはじめとするが、これに限定されるものではない、Ｔ細胞ベースの治療法開発の出発点である。
【０００６】
末梢血Ｔ細胞の約９０％は、αポリペプチドとβポリペプチドからなるＴＣＲを発現する。αβＴ細胞の他にも、低百分率のＴ細胞（全Ｔ細胞の約５％）が、γポリペプチドおよびδポリペプチドからなるＴＣＲを発現することが示されている。γδＴ細胞は、上皮内リンパ球（ＩＥＬ）として知られているリンパ球の集団内で、腸粘膜中に最も豊富に見られる。γδＴ細胞を活性化する抗原性分子は、未だに広く知られていない。しかしγδＴ細胞はＭＨＣ拘束されておらず、ペプチドが抗原提示細胞上のＭＨＣ分子によって提示されることを要求せず、むしろ全タンパク質を認識できるようであるが、いくつかはＭＨＣクラスＩＢ分子を認識する。末梢血中の主要なγδＴ細胞集団を構成するヒトＶγ９／Ｖδ２Ｔ細胞は、小型の非ペプチド性微生物代謝産物であるイソペンテニルピロリン酸前駆体、ＨＭＢ-ＰＰに、それらが特異的かつ迅速に応答するという点で独特である。
【０００７】
Ｔ細胞クローンのＴ細胞抗原受容体の鎖はそれぞれ、可変（Ｖ）、［多様性（Ｄ）］、結合（Ｊ）、および定常（Ｃ）と命名されたドメインの独自の組み合わせからなる。各Ｔ細胞クローンにおいて、α鎖およびβ鎖双方のまたはδ鎖およびγ鎖双方のＶ、Ｄ、およびＪドメインの組み合わせは、そのＴ細胞クローンの独特の特徴である様式で抗原認識に関与し、Ｔ細胞クローンのイディオタイプとしても知られる独特の結合部位を規定する。対照的に、Ｃドメインは抗原結合に関与しない。
【０００８】
ＴＣＲは、シグナル伝達媒介に関与するＣＤ３複合体のインバリアントタンパク質に関連する、免疫グロブリンスーパーファミリーのヘテロ二量体細胞表面タンパク質である。ＴＣＲはαβおよびγδ形態で存在し、それらは構造的に類似しているが、かなり異なる解剖学的位置と、恐らくは機能とを有する。天然のヘテロ二量体αβＴＣＲおよびγδＴＣＲの細胞外部分は、それぞれ２つのポリペプチドを含有し、そのそれぞれは膜近位定常ドメインおよび膜遠位可変ドメインを有する。定常ドメインおよび可変ドメインのそれぞれは、鎖内ジスルフィド結合を含む。可変ドメインは、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）に類似した、高度に多型性のループを含有する。ＴＣＲ遺伝子治療の使用は、いくつかの現在のハードルを克服する。それは、患者自身のＴ細胞に所望の特異性を与えて、十分な数のＴ細胞を短期間で生成できるようにし、それらの枯渇を回避する。ＴＣＲは、中央記憶Ｔ細胞または幹細胞の特徴を有するＴ細胞に形質導入され、それは移植時におけるより良好な持続性と機能を確実にしてもよい。ＴＣＲ操作Ｔ細胞は、化学療法または照射によってリンパ球減少症になったがん患者に注入され、効率的な生着を可能にするが、免疫抑制は阻害する。
【０００９】
遺伝子ＤＣＡＦ４Ｌ２は、ＤＤＢ１およびＣＵＬ４関連因子４様２をコードする。このタンパク質の特異的機能は未だに解明されていない；それにもかかわらず、ＤＣＡＦ４Ｌ２遺伝子は、視神経乳頭形態および口唇裂発生と関連することが示されたＳｐｒｉｎｇｅｌｋａｍｐ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．  Ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｏｍｅ−Ｗｉｄｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  Ｎｏｖｅｌ  Ｌｏｃｉ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｗｉｔｈ  Ｏｐｔｉｃ  Ｄｉｓｃ  Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ．Ｇｅｎｅｔ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．２０１５  Ｍａｒ；３９（３）：２０７−１６。Ｂｅａｔｙ  ＴＨ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｎｆｉｒｍｉｎｇ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ  ｒｉｓｋ  ｔｏ  ｃｌｅｆｔ  ｌｉｐ  ｗｉｔｈ／ｗｉｔｈｏｕｔ  ｃｌｅｆｔ  ｐａｌａｔｅ  ｉｎ  ａ  ｃａｓｅ−ｐａｒｅｎｔ  ｔｒｉｏ  ｓｔｕｄｙ．  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ．２０１３  Ｊｕｌ；１３２（７）：７７１−８１）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
がん治療のための分子標的薬の開発が進歩しているものの、当該技術分野において、がん細胞に高度に特異的な分子を特異的に標的化する新たな抗がん剤を開発する必要性がなおもある。本明細書は、ＤＣＡＦ４Ｌ２由来のＴＡＡエピトープを標的化する新規ＴＣＲ、開示されるようなＴＡＡエピトープ特異的に結合するそれぞれの組換え体ＴＣＲコンストラクト、核酸、ベクター、および宿主細胞と；がんの治療においてこのような分子を使用する方法とを提供することによって、その必要性に対処する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の目的は、配列番号３、９、１５、２１、２７、および３３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または好ましくは１００％の配列同一性を有する、少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）３を含んでなる抗原認識コンストラクトによって、その第１の態様において解決される。
【００１２】
本発明による抗原認識コンストラクトは、本明細書で「ＤＣＡＦ４Ｌ２−００１」と命名され、または時には単に本発明の「ペプチド」または「エピトープ」と命名される、配列番号４９に記載のアミノ酸配列「ＩＬＱＤＧＱＦＬＶ」（一文字コード）を含んでなり、またはそれからなる、本発明のエピトープを認識し、特異的に認識する。ペプチドは、好ましくはＭＨＣに結合した際に認識される。米国特許第２０１６−０２８０７３８Ａ１号明細書（その全体が本明細書に援用される）は、ＤＣＡＦ４Ｌ２−００１ペプチド、およびその使用を開示する）。
【００１３】
いくつかの実施形態では（以下もまた参照されたい）、本発明の抗原認識コンストラクトは、ＴＡＡ−ペプチド−ＨＬＡ分子複合体に特異的に結合し、ＴＡＡペプチドは、本発明の配列番号４９に記載のＴＡＡのアミノ酸配列と少なくとも６６％、好ましくは少なくとも７７％、より好ましくは少なくとも８８％相同的な（好ましくは少なくとも７７％、または少なくとも８８％同一の）ＴＡＡの変異型を含んでなり、または代案としてはそれからなり、前記変異型は、ＨＬＡクラスＩまたはクラスＩＩ分子に結合し、および／または前記ペプチドまたはその薬学的に許容可能な塩と交差反応するＴ細胞を誘導し、前記ペプチドは、基礎となる完全長ポリペプチドでない。
【００１４】
本明細書の用法では、「同一の」またはパーセント「同一性」という用語は、２つ以上の核酸またはタンパク質／ポリペプチド配列の文脈において本明細書の任意の箇所で使用される場合、配列比較アルゴリズムを用いた測定で、または手動アライメントと目視検査によって（例えば、ＮＣＢＩウェブサイトを参照されたい）、指定された百分率の同一アミノ酸残基またはヌクレオチドを有する（または少なくとも有する）（すなわち、比較ウィンドウまたは指定された領域で最大の一致が得られるように比較および整列されたときに、特定の領域にわたり、好ましくはそれらの完全長配列にわたり、少なくとも約６０％同一であり、好ましくは少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％または９４％同一である、より好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一である）、２つ以上の配列または部分配列を指す。特定の実施形態では、例えば、本発明の抗原認識コンストラクトのタンパク質または核酸配列が、その他のタンパク質／遺伝子と比較される場合、同一性百分率は、Ｈｕｍａｎ  Ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  Ｄａｔａ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（例えば、ｈｔｔｐｓ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｗｅｉｚｍａｎｎ．ａｃ．ｉｌ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｈｏｒｄｅ／ｂｌａｓｔＨｏｒｄｅ．ｐｌ）でサポートされているＢｌａｓｔ検索によって判定され得て；特にアミノ酸同一性については、ＢＬＡＳＴＰ  ２．２．２８＋が以下のパラメータで用いられる：マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップペナルティ：存在：１１、伸長：１；隣接する単語の閾値：１１；複数のヒットウィンドウ：４０。
【００１５】
本発明の文脈では、本発明の特定の特徴「を含んでなる」と言及される任意の実施形態は、いくつかのより好ましい実施形態において、本発明の全く同じ特徴「からなる」または「から本質的になる」という、より限定された記述を含むものと理解される。
【００１６】
別の追加的または代替的実施形態では、抗原認識コンストラクトは、ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２ドメイン配列をさらに含んでなってもよい。可変ドメイン内で、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２は、ポリペプチド鎖の可変（Ｖ）領域に見いだされ、ＣＤＲ３は、Ｖの一部と、多様性（Ｄ）および連結（Ｊ）領域の全てとを含む。ＣＤＲ３は最も可変性であり、抗原を特異的かつ選択的に認識することに関与する主要ＣＤＲである。ＣＤＲ１およびＣＤＲ２配列は、ヒト可変鎖対立遺伝子のＣＤＲ配列から選択されてもよい。
【００１７】
天然α−βヘテロ二量体ＴＣＲは、α鎖およびβ鎖を有する。各鎖は可変領域、連結領域、および定常領域を含んでなり、β鎖は通常、可変領域と連結領域の間の短い多様性領域もまた含有するが、この多様性領域はしばしば連結領域の一部と見なされる。各可変領域はフレームワーク配列に埋め込まれた３つのＣＤＲ（相補性決定領域）を含んでなり、そのうちの１つはＣＤＲ３と命名される超可変領域である。それらのフレームワークによって、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２配列によって、ならびに部分的に定義されたＣＤＲ３配列によって区別される、数種類のα鎖可変（Ｖα）領域および数種類のβ鎖可変（Ｖβ）領域がある。Ｖα型は、ＩＭＧＴ命名法では固有のＴＲＡＶ番号によって示され、Ｖβ型は固有のＴＲＢＶ番号によって示される。（免疫グロブリン抗体およびＴＣＲ遺伝子についてより詳しくは、国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）、Ｌｅｆｒａｎｃ  Ｍ−Ｐｅｔａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１５  Ｊａｎ；４３（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ４１３−２２；およびｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／を参照されたい）。
【００１８】
したがって、１つの追加的または代替的実施形態では、本発明の抗原認識コンストラクトは、以下の表１に示すように組み合わされたＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含んでなり、それはＣＤＲ３配列と共にそれぞれの可変鎖対立遺伝子を提示する。したがって、少なくとも１つの、好ましくは３つ全てのＣＤＲ配列ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含んでなる本発明の抗原認識コンストラクトが好ましい。好ましくは、本発明の抗原認識コンストラクトは、本明細書で開示される本発明のＴＣＲ可変領域の一個体の各ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３を含んでなる（下記の表１および実施例のセクションを参照されたい）。
【００１９】
「特異性」または「抗原特異性」または所与の抗原「に特異的な」という用語は、本明細書の用法では、前記抗原がＨＬＡによって、好ましくはＨＬＡ  Ａ２によって提示される場合、抗原認識コンストラクトが、前記抗原に、好ましくはＴＡＡ抗原に、より好ましくは高い結合活性で特異的に結合し得ることを意味する。例えば、抗原認識コンストラクトとしてのＴＣＲは、以下に提供されるＴＡＡエピトープおよび抗原などの低濃度のＴＡＡ抗原でパルスされた標的細胞との共培養に際して、ＴＣＲを発現するＴ細胞が、少なくとも２００ｐｇ／ｍｌ以上（例えば、２５０ｐｇ／ｍｌ以上、３００ｐｇ／ｍｌ以上、４００ｐｇ／ｍｌ以上、５００ｐｇ／ｍｌ以上、６００ｐｇ／ｍｌ以上、７００ｐｇ／ｍｌ以上、１０００ｐｇｍｌ以上、２，０００ｐｇ／ｍｌ以上、２，５００ｐｇ／ｍ以上、５，０００ｐｇ／ｍｌ以上）のインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）を分泌する場合に、ＴＡＡに対する「抗原性特異性」を有すると見なされてもよい（例えば、約１０−１１ｍｏｌ／Ｌ、１０−１０ｍｏｌ／Ｌ、１０−９ｍｏｌ／Ｌ、１０−８ｍｏｌ／Ｌ、１０−７ｍｏｌ／Ｌ、１０−６ｍｏｌ／Ｌ、１０−５ｍｏｌ／Ｌ）。代案としては、またはそれに加えて、ＴＣＲを発現する細胞が、低濃度のＴＡＡ抗原でパルス処理された標的細胞との同時培養時に、ＩＦＮ−γの非形質導入バックグラウンドレベルの少なくとも２倍量のＩＦＮ−γを分泌する場合、ＴＣＲはＴＡＡに対する「抗原特異性」を有すると見なされてもよい。上記のこのような「特異性」は、例えば、ＥＬＩＳＡを用いて分析され得る。
【００２０】
本発明の代替または追加の一実施形態では、抗原認識コンストラクトはＴＡＡ由来抗原ペプチドに選択的に結合し；好ましくはＴＡＡ抗原性ペプチドは、配列番号４９に示されるアミノ酸配列またはそれらの変異型を有するタンパク質エピトープまたはペプチドである。変異型は、３つ以下、好ましくは２つ、最も好ましくは１つ以下のアミノ酸位置のアミノ酸の欠失、付加、挿入または置換である。抗原認識コンストラクトは、ＴＡＡペプチドＤＣＡＦ４Ｌ２−００１＿Ａ１〜Ａ９（配列番号５０〜５８に示される）の修飾型（変異型）に、およびＤＣＡＦ４Ｌ２−００１＿Ｔ１〜Ｔ９（配列番号７０〜７８に示される）に選択的に結合してもよい。対照的に、抗原認識コンストラクトは、ＤＣＡＦ４Ｌ２−００１（配列番号５９〜６８に示される）と類似した配列を有するペプチドに結合しない。
【００２１】
「選択性」または「選択的に認識／結合する」という用語は、好ましくは１つの特異的エピトープのみを選択的に認識しまたはそれに結合し、好ましくは別のエピトープに対する交差反応性を示さないかまたは実質的に示さない、ＴＣＲまたは抗体などの抗原認識コンストラクトの特性を指すものと理解される。好ましくは「選択性」または「選択的に認識／結合する」は、好ましくは１つの特異的エピトープのみを選択的に認識しまたはそれに結合し、好ましくは別のエピトープに対する交差反応性を示さないかまたは実質的に示さない、抗原認識コンストラクト（例えばＴＣＲ）を意味し、前記エピトープは１つのタンパク質に固有であり、その結果、抗原認識コンストラクトは、その他のエピトープおよびその他のタンパク質に対して交差反応性を示さないかまたは実質的に示さない。
【００２２】
本発明によるコンストラクトを認識する抗原は、好ましくは抗体、またはその誘導体もしくは断片、またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、またはその誘導体もしくは断片から選択される。本発明の抗体またはＴＣＲの誘導体または断片は、好ましくは、親分子の抗原結合／認識能力、特に上で説明したようなその特異性および／または選択性を保持しなければならない。そのような結合機能は、本明細書で定義されるＣＤＲ３領域の存在によって保持されてもよい。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明の一実施形態では、本発明のＴＣＲは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ依存性様式でＴＡＡ抗原を認識できる。「ＭＨＣクラスＩ依存性様式」は、本明細書の用法では、ＴＣＲが、ＭＨＣクラスＩ分子の文脈内で、ＴＡＡ抗原への結合時に免疫応答を誘発することを意味する。ＭＨＣクラスＩ分子は、例えば、ＨＬＡ−Ａ分子などの当該技術分野で公知の任意のＭＨＣクラスＩ分子であり得る。本発明の好ましい実施形態では、ＭＨＣクラスＩ分子は、ＨＬＡ−Ａ２分子である。
【００２４】
本発明は、一本鎖抗原を認識するコンストラクトと、二本鎖を認識するコンストラクトとの双方を提供する。
【００２５】
一実施形態では、ＴＣＲα可変ドメインは、表１に示されるＴＣＲαドメインに対して少なくとも１つの変異を有し；および／またはＴＣＲβ可変ドメインは、表１に示されるＴＣＲαドメインに対して少なくとも１つの変異を有する。一実施形態では、ＴＣＲα可変ドメインおよび／またはＴＣＲβ可変ドメインに少なくとも１つの変異を含んでなるＴＣＲは、ＴＡＡペプチド−ＨＬＡ分子複合体に対して、非変異ＴＣＲαドメインおよび／または非変異ＴＣＲβ可変ドメインを含んでなるＴＣＲの少なくとも倍の結合親和性および／または結合半減期を有する。
【００２６】
本明細書のＴＣＲα鎖は、ＴＣＲα膜貫通ドメインおよび／またはＴＣＲα細胞内ドメインをさらに含んでなってもよい。本明細書のＴＣＲβ鎖は、ＴＣＲβ膜貫通ドメインおよび／またはＴＣＲβ細胞内ドメインをさらに含んでなってもよい。
【００２７】
本発明は、特に抗原認識コンストラクトとしてのＴＣＲまたはその断片もしくは誘導体を提供する。ＴＣＲは、好ましくはヒトＴＣＲであり、ヒトＴＣＲ遺伝子座から生じ、したがってヒトＴＣＲ配列を含んでなるものとして理解される。さらに、本発明のＴＣＲは、ヒト起源であること、そして本発明のＴＡＡ抗原を特異的に認識することを特徴としてもよい。
【００２８】
本発明の別の実施形態は、それに加えてまたは代案として、免疫応答を誘導する上述の抗原認識コンストラクトを提供し、好ましくは免疫応答は、インターフェロン（ＩＦＮ）γレベルの増加によって特徴付けられる。
【００２９】
本発明のＴＣＲは、一本鎖αまたはβ、またはγおよびδ、分子として、または代案としては、α鎖およびβ鎖双方、またはγおよびδ鎖双方から構成される、二本鎖コンストラクトとして提供されてもよい。
【００３０】
本発明の抗原認識コンストラクトは、ＴＣＲαまたはγ鎖；および／またはＴＣＲβまたはδ鎖を含んでなってもよく；ＴＣＲαまたはγ鎖は、配列番号３、１５、および２７から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するＣＤＲ３を含んでなり、および／またはＴＣＲβまたはδ鎖は、配列番号９、２１、および３３から選択されるアミノ酸配列と少なくともｔ５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するＣＤＲ３を含んでなる。
【００３１】
最も好ましくは、本開示が、本明細書で開示されるＴＣＲ鎖（表１を参照されたい）のＣＤＲ１〜ＣＤＲ３領域の任意の１つ、２つまたは全てを含んでなる抗原認識コンストラクトに言及するいくつかの追加的な実施形態では、３つ以下、２つ、好ましくは１つのみの修飾アミノ酸残基を有する本発明の各ＣＤＲ配列を含んでなる抗原認識コンストラクトが、好ましくあってもよい。修飾されたアミノ酸残基は、アミノ酸の挿入、欠失または置換から選択されてもよい。最も好ましくは、３つ、２つ、好ましくは唯一の修飾アミノ酸残基は、それぞれのＣＤＲ配列の最初または最後のアミノ酸残基である。修飾が置換である場合、いくつかの実施形態では、置換は保存的アミノ酸置換であることが好ましい。
【００３２】
本発明の抗原認識コンストラクトが、二本鎖ＴＣＲなどの少なくとも２つのアミノ酸鎖またはその抗原結合断片から構成される場合、抗原認識コンストラクトは、第１のポリペプチド鎖中の配列番号３に記載のアミノ酸配列、および第２のポリペプチド鎖中の配列番号９に記載のアミノ酸配列；または第１のポリペプチド鎖中の配列番号１５に記載のアミノ酸配列、および第２のポリペプチド鎖中の配列番号２１に記載のアミノ酸配列；または第１のポリペプチド鎖中の配列番号２７に記載のアミノ酸配列、および第２のポリペプチド鎖中の配列番号３３に記載のアミノ酸配列を含んでなってもよい。上記二本鎖ＴＣＲ、またはその抗原結合断片のいずれか１つが、本発明の好ましいＴＣＲである。いくつかの態様において、本発明の二本鎖ＴＣＲのＣＤＲ３は変異していてもよい。上記の配列番号９〜２８のＣＤＲ３配列の変異は、好ましくは３つ以下、好ましくは２つ、そして最も好ましくは１つ以下のアミノ酸残基の置換、欠失、付加または挿入を含む。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド鎖はＴＣＲαまたはγ鎖であってもよく、第２のポリペプチド鎖はＴＣＲβまたはδ鎖であってもよい。αβまたはγδＴＣＲの組み合わせが好ましい。
【００３３】
ＴＣＲ、またはその抗原結合断片は、いくつかの実施形態では、ＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖、またはγ鎖とδ鎖から構成される。このような二本鎖ＴＣＲは各鎖内に可変領域を含んでなり、可変領域はそれぞれ１つのＣＤＲ１、１つのＣＤＲ２、および１つのＣＤＲ３配列を含んでなる。ＴＣＲは、配列番号４および配列番号１０（Ｒ３６Ｐ３Ｆ９）；または配列番号１６および配列番号２２（Ｒ５２Ｐ２Ｇ１１）；または配列番号２８および配列番号３４（Ｒ５３Ｐ２Ａ９）の可変鎖アミノ酸配列に含まれるＣＤＲ３〜ＣＤＲ９の配列を含んでなる。
【００３４】
本発明のいくつかの実施形態は、ＴＣＲαおよびＴＣＲβ鎖から構成されるＴＣＲ、またはその断片に関し、前記ＴＣＲは、それぞれ配列番号４および１０、またはそれぞれ１６および２２；またはそれぞれ２８および３４に記載のα鎖およびβ鎖から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または好ましくは１００％の配列同一性を有する可変領域配列を含んでなる。
【００３５】
本発明のＴＣＲは、例えば、ヒト、ラット、サル、ウサギ、ロバ、またはマウスなどの任意の哺乳類などの任意の適切な生物種に由来する、定常領域をさらに含んでなってもよい。本発明の一実施形態では、本発明のＴＣＲは、ヒト定常領域をさらに含んでなる。いくつかの好ましい実施形態では、本発明のＴＣＲの定常領域は、例えば、好ましくはマウス配列である、ＴＣＲ発現および安定性を増加させてもよい異種配列の導入によって、わずかに修飾されてもよい。
【００３６】
本発明のいくつかの実施形態は、ＴＣＲαおよびＴＣＲβ鎖から構成されるＴＣＲ、またはその断片に関し、前記ＴＣＲは、それぞれ配列番号５および１１、またはそれぞれ１７および２３；またはそれぞれ２９および３５に記載のα鎖およびβ鎖から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または好ましくは１００％の配列同一性を有する定常領域配列を含んでなる。
【００３７】
本発明のＴＣＲαまたはγ鎖は、配列番号１、１３、および２５から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するＣＤＲ１；および／または配列番号２、１４、および２６から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するＣＤＲ２をさらに含んでなってもよい。
【００３８】
本発明によれば、ＴＣＲβまたはδ鎖は、配列番号１、１９、および３１から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するＣＤＲ１；および／または配列番号８、２０、および３２から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するＣＤＲ２をさらに含んでなってもよい。
【００３９】
抗原認識コンストラクトは、さらなる実施形態では、ＴＣＲ結合断片を含んでなってもよく、前記結合断片は、任意選択的に、配列番号１、２、３、または７、８、９または１３、１４、１５、または１９、２０、２１、または２５、２６、２７または３１、３２、３３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１〜ＣＤＲ３配列から選択されるＣＤＲ１〜ＣＤＲ３を含んでなる。
【００４０】
本発明のさらなる実施形態では、本明細書の他の場所に記載される抗原認識コンストラクトは、少なくとも１つのＴＣＲα鎖配列および１つのＴＣＲβ鎖配列から構成される、ＴＣＲまたはその断片であり、前記ＴＣＲα鎖配列は、配列番号１〜３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１〜ＣＤＲ３配列を含んでなり、前記ＴＣＲβ鎖配列は、配列番号７〜９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１〜ＣＤＲ３配列を含んでなり；または前記ＴＣＲα鎖配列は、配列番号１３〜１５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１〜ＣＤＲ３配列を含んでなり、前記ＴＣＲβ鎖配列は、配列番号１９〜２１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１〜ＣＤＲ３配列を含んでなり；または前記ＴＣＲα鎖配列は、配列番号２５〜２７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１〜ＣＤＲ３配列を含んでなり、前記ＴＣＲβ鎖配列は、配列番号３１〜３３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１〜ＣＤＲ３配列を含んでなる。
【００４１】
本発明のさらなる実施形態では、本明細書で前述した抗原認識コンストラクトは、少なくとも１つのＴＣＲα鎖配列および１つのＴＣＲβ鎖配列を含んでなる、ＴＣＲまたはその断片であり、前記ＴＣＲα鎖配列は、配列番号４のアミノ酸配列を有する可変領域配列を含んでなり、前記ＴＣＲβ鎖配列は、配列番号１０のアミノ酸配列を有する可変領域配列を含んでなり、または前記ＴＣＲα鎖配列は、配列番号１６のアミノ酸配列を有する可変領域配列を含んでなり、前記ＴＣＲβ鎖配列は、配列番号２２のアミノ酸配列を有する可変領域配列を含んでなり、または前記ＴＣＲα鎖配列は、配列番号２８のアミノ酸配列を有する可変領域配列を含んでなり、前記ＴＣＲβ鎖配列は、配列番号３４のアミノ酸配列を有する可変領域配列を含んでなる。
【００４２】
本発明のさらなる実施形態では、本明細書で前述した抗原認識コンストラクトは、ＴＣＲまたはその断片であり、配列番号５、１１、１７、２３、２９、および３５から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するＴＣＲ定常領域をさらに含んでなり、好ましくはＴＣＲは、少なくとも１つのＴＣＲαおよび１つのＴＣＲβ鎖配列から構成され、ＴＣＲα鎖配列は、配列番号５、１７、および２９から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する定常領域を含んでなる。
【００４３】
配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する第１のＴＣＲ鎖と、配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する第２のＴＣＲ鎖とを含んでなる、本明細書で前述した抗原認識コンストラクトもまた開示される。本発明はまた、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する第１のＴＣＲ鎖と、配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する第２のＴＣＲ鎖とを含んでなるＴＣＲも提供する。さらなる実施形態では、本発明は、ＴＣＲである抗原認識コンストラクトを提供し、それは、配列番号３０のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する第１のＴＣＲ鎖と、配列番号３６のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する第２のＴＣＲ鎖とを含んでなる。
【００４４】
本明細書の用法では、「マウス」または「ヒト」という用語は、抗原認識コンストラクト、またはＴＣＲ、または本明細書に記載のＴＣＲの任意の構成要素（例えば、相補性決定領域（ＣＤＲ）、可変領域、定常領域、α鎖、および／またはβ鎖）に言及する場合、それぞれ、マウスまたはヒト非再構成型ＴＣＲ遺伝子座に由来するＴＣＲ（またはその構成要素）を意味する。
【００４５】
本発明の一実施形態では、キメラＴＣＲが提供され、ＴＣＲ鎖は複数の生物種からの配列を含んでなる。好ましくは、本発明のＴＣＲは、α鎖のヒト可変領域と、例えば、マウスＴＣＲα鎖のマウス定常領域とを含んでなる、α鎖を含んでなってもよい。
【００４６】
一実施形態では、本発明のＴＣＲは、上記の実施形態に従ったヒト可変領域と、ヒト定常領域とを含んでなるヒトＴＣＲである。
【００４７】
いくつかの実施形態では、抗原認識コンストラクトは、マウス化またはヒト化される。これらの用語は、異種由来のアミノ酸配列が本発明のコンストラクトに導入される場合に使用される。マウス化は、ヒトＴＣＲαおよびＴＣＲβ定常領域をそれらのマウス対応物で置換してもよく、または機能的効果の増強を媒介する必須のマウス（アミノ酸）残基を配列に導入してもよい。ヒト化配列では、マウスの配列は、ヒト対応物または残基を導入することによって修飾される。
【００４８】
本発明のＴＣＲは、ＴＣＲ鎖の誤対合を避けるために修飾されてもよい。「誤対合」という用語は、それぞれ本発明のＴＣＲα／γまたはβ／δ導入遺伝子のＴＣＲ鎖と内在性ＴＣＲα／γまたはβ／δ鎖との間の不正確な対合に関し、それは遺伝子組換えＴＣＲαβ／γδヘテロ二量体の細胞表面発現の希釈をもたらし、修飾Ｔ細胞の機能的結合活性を低下させる。好ましくは、ＩＭＧＴ番号付けによるＴＣＲ可変ドメインの４４位のＱは、本発明のＴＣＲの片方または双方の鎖において別のアミノ酸によって置換されている。置換は、好ましくは、Ｒ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｉ、Ｗ、およびＶからなる群から選択される。
【００４９】
本発明のＴＣＲは、一本鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ）として提供されてもよい。ｓｃＴＣＲは、第１のＴＣＲ鎖（例えば、α鎖）の可変領域のポリペプチドと、全（完全長）第２のＴＣＲ鎖（例えば、β鎖）のポリペプチドとを含んでなり得て、または逆もまた然りである。さらに、ｓｃＴＣＲは、任意選択的に、２つ以上のポリペプチドを一緒に連結する、１つまたは複数のリンカーを含んでなり得る。リンカーは、例えば、本明細書に記載されるように、２つの一本鎖を一緒に結合するペプチドであり得る。また、ＩＬ−２、ＩＬ−７またはＩＬ−１５などのヒトサイトカインに融合された、本発明のｓｃＴＣＲも提供される。
【００５０】
本発明による抗原認識コンストラクトはまた、少なくとも２つのｓｃＴＣＲ分子を含んでなる多量体複合体の形態で提供され得て、前記ｓｃＴＣＲ分子は、それぞれ、少なくとも１つのビオチン部分に、またはその他の相互接続分子／リンカーに融合され、前記ｓｃＴＣＲは、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用によって相互連結され、前記多量体複合体が形成できるようにする。多量体ＴＣＲを生成するための当該技術分野で公知の同様のアプローチも可能であり、本開示に含まれる。本発明のｓｃＴＣＲを２つを超えて含んでなる、より高次の多量体複合体もまた提供される。
【００５１】
本発明の目的で、ＴＣＲは、少なくとも１つのＴＣＲαまたはγおよび／またはＴＣＲβまたはδ可変ドメインを有する部分である。一般に、それらは、ＴＣＲα可変ドメインおよびＴＣＲβ可変ドメインの双方を含んでなり、代案としては、ＴＣＲγ可変ドメインおよびＴＣＲδ可変ドメインの双方を含んでなる。それらは、αβ／γδヘテロ二量体であってもよく、または一本鎖形態であってもよい。養子療法における使用のために、αβまたはγδヘテロ二量体ＴＣＲは、例えば、細胞質ドメインおよび膜貫通ドメインの双方を有する完全長鎖として形質移入されてもよい。所望ならば、導入されたジスルフィド結合が、それぞれの定常ドメインの残基間に存在してもよい。
【００５２】
好ましい実施形態では、抗原認識コンストラクトは、ヒトＴＣＲ、その断片または誘導体である。ヒトＴＣＲまたはその断片もしくは誘導体は、対応するヒトＴＣＲ配列の５０％超を含んでなるＴＣＲである。好ましくは、ＴＣＲ配列のごく一部のみが人工起源であり、またはその他の生物種に由来する。しかし、例えば、ヒト起源に由来して定常ドメインにマウス配列を有するものなどのキメラＴＣＲが有利であることが知られている。したがって、それらの定常ドメインの細胞外部分にマウス配列を含有する、本発明によるＴＣＲが特に好ましい。
【００５３】
したがって、本発明の抗原認識コンストラクトが、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）依存的様式、好ましくはＨＬＡ−Ａ０２依存的様式で、その抗原を認識できることもまた好ましい。「ＨＬＡ依存的様式」という用語は、本発明の文脈では、抗原ペプチドが前記ＨＬＡによって提示される場合にのみ、抗原認識コンストラクトが抗原に結合することを意味する。
【００５４】
本発明による抗原認識コンストラクトは、一実施形態では、好ましくは免疫応答を誘導し、好ましくは免疫応答は、インターフェロン（ＩＦＮ）γレベルの増加によって特徴付けられる。
【００５５】
例えば、実施例セクションおよび表１に記載のＲ３６Ｐ３Ｆ９、Ｒ５２Ｐ２Ｇ１１、およびＲ５３Ｐ２Ａ９から選択されるＴＣＲのいずれか１つなどの、本明細書に記載のＴＣＲ（またはそれらの機能的変異型）のいずれかの機能的部分を含んでなるポリペプチドもまた、本発明によって提供される。「ポリペプチド」という用語は、本明細書の用法では、オリゴペプチドを含み、１つまたは複数のペプチド結合によって連結されたアミノ酸の一本鎖を指す。本発明のポリペプチドについて、機能的部分は、それがその一部であるＴＣＲ（またはその機能的変異型）の連続アミノ酸を含んでなる任意の部分であり得るが、ただし機能的部分は、ＴＡＡ抗原由来ペプチドＤＣＡＦ４Ｌ２−００１（配列番号４９、および配列番号５０〜５８の変異型）に特異的に結合する。「機能的部分」という用語は、ＴＣＲ（またはその機能的変異型）に関して使用される場合、本発明のＴＣＲ（またはその機能的変異型）の任意の部分または断片を指し、その部分または断片は、それがその一部である（親ＴＣＲまたはその親機能的変異型）、ＴＣＲ（またはその機能的変異型）の生物学的活性を保持する。機能的部分は、例えば、ＴＣＲ（またはその機能的変異型）の部分を包含する親ＴＣＲ（またはその機能的変異型）と同様の程度に、同一程度に、またはより高い程度に、ＴＡＡ抗原に（ＨＬＡ依存的様式で）特異的に結合する能力を保持し、またはがんを検出し、治療し、または予防する。親ＴＣＲ（またはその機能的変異型）に関して、機能的部分は、例えば、約１０％、２５％、３０％、５０％、６８％、８０％、９０％、９５％以上の親ＴＣＲの可変配列（またはその機能的変異型）を含んでなり得る。
【００５６】
機能的部分は、部分のアミノまたはカルボキシ末端に、または双方の末端に、追加的なアミノ酸を含んでなり得て、追加的なアミノ酸は、親ＴＣＲまたはその機能的変異型のアミノ酸配列中に見いだされない。望ましくは、追加的なアミノ酸は、例えば、ＴＡＡ抗原に特異的に結合する；および／またはがんを検出し、がんを治療または予防するなどの能力を有する、機能的部分の生物学的機能に干渉しない。より望ましくは、追加的なアミノ酸は、親ＴＣＲまたはその機能的変異型の生物学的活性と比較して、生物学的活性を増強する。
【００５７】
ポリペプチドは、本発明のＴＣＲまたはその機能的変異型のα鎖および／またはβ鎖の可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および（好ましくは）ＣＤＲ３の１つまたは複数を含んでなる機能的部分などの、本発明のＴＣＲまたはその機能的変異型のα鎖およびβ鎖のどちらかまたは双方の機能的部分を含んでなり得る。本発明の一実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３、９、１５、２１、２７、および３３のアミノ酸配列を含んでなる機能的部分（本発明のＴＣＲの可変領域のＣＤＲ３）、またはそれらの組み合わせを含んでなり得る。本発明の一実施形態では、本発明のポリペプチドは、例えば、上記のＣＤＲ領域の組み合わせを含んでなる、本発明のＴＣＲの可変領域またはその機能的変異型を含んでなり得る。この点において、ポリペプチドは、配列番号４、１０、１６、２２、２８、および３４のいずれかのアミノ酸配列（本発明のＴＣＲαまたはβ鎖の可変領域）を含んでなり得る。
【００５８】
場合によっては、本発明のコンストラクトは、配列番号１〜３６のいずれかに記載の配列（ＣＤＲ配列、定常領域、可変領域、および完全長配列）、またはその機能的断片を含んでなる、１つまたは２つのポリペプチド鎖を含んでなってもよく、例えば、免疫グロブリンまたはその一部をコードするアミノ酸配列などのその他のアミノ酸配列をさらに含んでなり、本発明のタンパク質は融合タンパク質であり得る。この点において、本発明はまた、少なくとも１つの他のポリペプチドと共に、本明細書に記載される本発明のポリペプチドの少なくとも１つを含んでなる融合タンパク質も提供する。もう１つのポリペプチドは、融合タンパク質の別個のポリペプチドとして存在し得るか、または本明細書に記載される本発明のポリペプチドの１つと共にフレーム（タンデム）で発現されるポリペプチドとして存在し得る。もう１つのポリペプチドは、免疫グロブリン、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＭＨＣ分子、例えば、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄなどのＣＤ１分子をはじめとするが、これに限定されるものではない、任意のペプチド分子またはタンパク分子、またはその一部を含んでもよい。
【００５９】
融合タンパク質は、本発明のポリペプチドの１つまたは複数のコピーおよび／またはもう１つのポリペプチドの１つまたは複数のコピーを含んでなり得る。例えば、融合タンパク質は、本発明のポリペプチドおよび／またはもう１つのポリペプチドの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上のコピーを含んでなり得る。融合タンパク質を作製する適切な方法は、当該分野で公知であり、例えば、組換え法が挙げられる。本発明のいくつかの実施形態では、本発明のＴＣＲ（およびそれらの機能的部分および機能的変異型）、ポリペプチド、およびタンパク質は、α鎖およびβ鎖を連結し、γ鎖およびδ鎖を連結するリンカーペプチドを含んでなる、単一タンパク質として発現されてもよい。この点において、本発明のＴＣＲ（およびそれらの機能的変異型および機能的部分）、ポリペプチド、およびタンパク質は、本発明のＴＣＲの可変領域のアミノ酸配列を含んでなり、リンカーペプチドをさらに含んでなってもよい。リンカーペプチドは、宿主細胞内で、組換えＴＣＲ（それらの機能的部分および機能的変異型を含む）、ポリペプチド、および／またはタンパク質の発現を有利に促進してもよい。リンカーペプチドは、任意の適切なアミノ酸配列を含んでなってもよい。一本鎖ＴＣＲコンストラクトのためのリンカー配列は、当該技術分野で周知である。このような一本鎖コンストラクトは、１つまたは２つの定常ドメイン配列をさらに含んでなってもよい。リンカーペプチドを含むコンストラクトの宿主細胞による発現に際して、リンカーペプチドもまた切断されて、α鎖とβ鎖が分離され、γ鎖とδ鎖が分離されてもよい。
【００６０】
既に上述したように、本発明のＴＣＲの結合機能性は、抗体のフレームワークにおいて提供されてもよい。例えば、おそらく３、２または１つの追加的なＮおよび／またはＣ末端フレームワーク残基を含む、本発明のＴＣＲのＣＤＲ配列は、抗体可変重鎖／軽鎖配列に直接グラフトされてもよい。その様々な文法的形態における「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子を指すために、および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち抗原結合部位またはパラトープを含有する分子を指すために、本明細書で使用される。このような分子は、免疫グロブリン分子の「抗原結合断片」とも称される。本発明は、本明細書に記載の抗原に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合部分をさらに提供する。抗体は、当該技術分野で公知の任意のタイプの免疫グロブリンであり得る。例えば、抗体は、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭなどの任意のアイソタイプであり得る。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得る。抗体は、例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマ、ニワトリ、ハムスター、ヒトなどの哺乳類から単離されたおよび／または精製された抗体などの天然抗体であり得る。代案としては、抗体は、例えば、ヒト化抗体またはキメラ抗体などの遺伝子改変抗体であり得る。抗体は、単量体または重合体形態であり得る。
【００６１】
「抗体」という用語は、細胞内抗体、キメラ抗体、完全ヒト抗体、ヒト化抗体（例えば、「ＣＤＲ−グラフト」によって作製される）、抗体断片、およびヘテロコンジュゲート抗体（例えば、二重特異性抗体、二特異性抗体、三特異性抗体、四特異性抗体など）などの遺伝子操作されまたは別の様式で修飾された形態の免疫グロブリンを含むが、これに限定されるものではない。「抗体」という用語は、ｃｙｓ二特異性抗体およびミニ抗体を含む。したがって、本明細書で提供されるありとあらゆる実施形態は、「抗体」または「抗体様コンストラクト」に関し、他に明確に示されていない限り、二重特異性抗体、二特異性抗体、ｓｃＦｖ断片、キメラ抗体受容体（ＣＡＲ）コンストラクト、二特異性抗体および／または小型抗体実施形態であることも想定される。「抗体」という用語は、免疫グロブリンファミリーのポリペプチドを含み、または本明細書に開示されるように、好ましくは本発明のＴＡＡである対応する抗原に、非共有結合的、可逆的、および特異的様式で結合できる免疫グロブリンの断片を含んでなるポリペプチドを含む。例示的な抗体構造単位は、四量体を構成する。いくつかの実施形態では、完全長抗体は２つの同一対のポリペプチド鎖から構成され得て、各対は、１つの「軽」鎖および１つの「重」鎖（ジスルフィド結合を介して連結される）を有する。抗体の構造およびアイソタイプは、当業者に周知である（例えばＪａｎｅｗａｙ’ｓ  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，９ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１６）。
【００６２】
哺乳類の認識された免疫グロブリン遺伝子としては、κ、λ、α、γ、δ、ε、およびμ定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。（免疫グロブリン遺伝子についてより詳しくは、国際Ｉｍ−ＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）、Ｌｅｆｒａｎｃ  Ｍ−Ｐｅｔａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１５  Ｊａｎ；４３（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ４１３−２２；およびｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／を参照されたい）完全長鎖では、軽鎖はκまたはλのどちらかに分類される。完全長鎖では、重鎖は、γ、μ、α、δ、またはεに分類され、それは次に、それぞれ免疫グロブリンクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥを規定する。各鎖のＮ末端は、抗原認識に主に関与する、約１００〜１１０以上のアミノ酸の可変領域を規定する。可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）という用語は、それぞれ軽鎖および重鎖のこれらの領域を指す。本発明における用法では、「抗体」は、抗体およびその断片の全ての変異型を包含する。したがって、この概念の範囲内で、完全長抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびこれらの断片の多量体バージョン（例えば、Ｆ（ａｂ’）２）は、本質的に同一または類似結合特異性を有する。いくつかの実施形態では、抗体は、本発明のペプチドＴＡＡに特異的に結合する。本発明による好ましい抗原認識コンストラクトとしては、抗体重鎖、好ましくはその可変ドメイン、またはその抗原結合断片、および／または抗体軽鎖、好ましくはその可変ドメイン、またはその抗原結合断片が挙げられる。同様に、ジスルフィド安定化可変領域断片（ｄｓＦｖ）は、組換えＤＮＡ技術によって調製され得るが、本発明の抗体断片は、これらの例示的なタイプの抗体断片に限定されない。また、抗体、またはその抗原結合部分は、例えば、放射性同位体、フルオロフォア（例えば、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ））、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、および元素粒子（例えば、金粒子）などの検出可能な標識を含んでなるように修飾され得る。場合によっては、ＴＣＲ  ＣＤＲ３配列は、配列番号３、９、１５、２１、２７、および３３に提供されるＣＤＲ９配列と比較して、好ましくは３つ以下のアミノ酸残基で、好ましくは２つのみ、最も好ましくは１つのみのアミノ酸位置で、わずかに修飾されてもよい。好ましくは、抗体は、表１の本発明のＴＣＲについて示されるように、ＣＤＲ３、好ましくは全てのＣＤＲ１〜ＣＤＲ１領域の組合せを含んでなり、いずれの場合にも独立して、これらの配列と比較して、任意選択的に、それぞれ３つまたは２つ以下、好ましくは１つのアミノ酸置換、挿入および／または欠失を有する。
【００６３】
抗体を作製する適切な方法は、当該技術分野で公知である。例えば、標準的なハイブリドーマ法は、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，５，５１  １−５１９（１９７６），Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（ｅｄｓ．），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８），ａｎｄ  Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，８  Ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（２０１１））に記載される。代案としては、ＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Ｈａｓｋａｒｄ  ａｎｄ  Ａｒｃｈｅｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，７４（２），３６１−６７（１９８４）、およびＲｏｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，１２１，１４０−６７（１９８６））、バクテリオファージベクター発現系（例えば、Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６，１２７５−８１（１９８９）を参照されたい）などのその他の方法が当該技術分野で公知である。さらに、非ヒト動物において抗体を製造する方法は、例えば、米国特許第５，５４５，８０６号明細書、米国特許第５，５６９，８２５号明細書、および米国特許第５，７１４，３５２号明細書、および米国特許出願公開第２００２／０１９７２６６号明細書に記載される。
【００６４】
本発明のいくつかの実施形態はまたＴＣＲまたはその機能的断片およびポリペプチドにも関し、それらは可溶性ＴＣＲである、。本明細書の用法では、「可溶性Ｔ細胞レセプター」という用語は、天然ＴＣＲのヘテロ二量体切断変異型を指し、それは、例えばジスルフィド結合によって連結されているが、天然タンパク質の膜貫通および細胞質ゾルドメインを欠く、ＴＣＲα鎖およびβ鎖の細胞外部分を含んでなる。「可溶性Ｔ細胞受容体α鎖配列および可溶性Ｔ細胞受容体β鎖配列」という用語は、膜貫通および細胞質ドメインを欠くＴＣＲα鎖およびβ鎖配列を指す。可溶性ＴＣＲα鎖およびβ鎖の配列（アミノ酸または核酸）は、天然ＴＣＲ中の対応する配列と同一であってもよく、または対応する天然ＴＣＲ配列と比較して、変異型の可溶性ＴＣＲα鎖およびβ鎖配列を含んでなってもよい。「可溶性Ｔ細胞受容体」という用語は、本明細書の用法では、変異型または非変異型の可溶性ＴＣＲα鎖およびβ鎖配列を有する、可溶性ＴＣＲを包含する。変異型は、可溶性ＴＣＲα鎖およびβ鎖配列の可変領域または定常領域にあってもよく、アミノ酸の欠失、挿入、置換変異、ならびにアミノ酸配列を変化させない核酸配列変化を含み得るが、これに限定されるものではない。いずれにしても、本発明の可溶性ＴＣＲは、それらの親分子の結合機能を保持する。
【００６５】
上記の問題は、本発明の抗原認識コンストラクトをコードする核酸、または上記タンパク質もしくはポリペプチドコンストラクトのいずれかによってさらに解決される。核酸は、好ましくは、（ａ）本発明による抗原認識コンストラクトをコードする鎖を有し；（ｂ）（ａ）の鎖に相補的な鎖を有し；または（ｃ）ストリンジェントな条件下で（ａ）または（ｂ）に記載の分子にハイブリダイズする鎖を有する。ストリンジェントな条件は、特にＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”から当業者に知られている。それに加えて、核酸は、タンパク質に対応する核酸配列を発現するために、特に哺乳類／ヒト細胞における発現のために必要なさらなる配列を任意選択的に有する。使用される核酸は、細胞内のペプチドに対応する核酸配列の発現を可能にするのに適したベクターに含まれ得る。しかし、核酸は、それら自体がそれらの細胞表面に対応タンパク質を産生するように、樹状細胞などの古典的抗原提示細胞に限定されなくてもよい抗原提示細胞を形質転換するためにも使用され得る。
【００６６】
いくつかの実施形態では、抗原認識コンストラクトのポリペプチドは核酸によってコードされ、生体内または生体外で発現され得る。したがって、いくつかの実施形態では、抗原認識コンストラクトをコードする核酸が提供される。いくつかの実施形態では、核酸は、本発明の抗原認識コンストラクトの一部またはモノマー（例えば、本発明のＴＣＲの２本の鎖の１つ）をコードし、および／または別の核酸が、本発明の抗原認識コンストラクトの別の部分またはモノマー（例えば、ＴＣＲの２つの鎖のもう１つ）をコードする。いくつかの実施形態では、核酸は、２つ以上の抗原認識コンストラクトポリペプチド鎖、例えば、少なくとも２つのＴＣＲ鎖をコードする。複数の抗原認識コンストラクト鎖をコードする核酸は、少なくとも２つの鎖配列間の核酸切断部位を含み得て、２つ以上の鎖配列間の転写または翻訳開始部位をコードし得て、および／または２つ以上の抗原認識コンストラクト鎖間のタンパク質分解性標的部位をコードし得る。
【００６７】
「核酸」は、本明細書の用法では、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、および「核酸分子」を含み、一般にＤＮＡまたはＲＮＡのポリマーを意味し、それは、合成されたまたは天然原料から取得された（例えば、単離および／または精製された）一本鎖または二本鎖であり得て、天然、非天然または改変ヌクオチドを含有し得て、未修飾オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間に見いだされるリン酸ジエステルの代わりに、ホスホロアミデート結合またはホスホロチオエート結合などの天然、非天然または改変ヌクレオチド間結合を含有し得る。
【００６８】
好ましくは、本発明の核酸は組換え体である。本明細書の用法では、「組換え体」という用語は、（ｉ）天然または合成核酸セグメントを生きている細胞内で自己複製し得る核酸分子に連結することで、生きている細胞の外部に構築される分子、または（ｉｉ）上記（ｉ）に記載されるものの複製から生じる分子を指す。本明細書の目的のために、自己複製は生体外複製または生体内複製であり得る。核酸は、本明細書に記載のＴＣＲ、ポリペプチド、またはタンパク質、またはそれらの機能的部分または機能的変異型のいずれかをコードする、任意のヌクレオチド配列を含んでなり得る。
【００６９】
さらに、本発明は、上記の本発明による核酸を含んでなるベクターを提供する。望ましくは、ベクターは、発現ベクターまたは組換え発現ベクターである。「組換え発現ベクター」という用語は、本発明の文脈では、適切な宿主細胞におけるｍＲＮＡ、タンパク質またはポリペプチドの発現を可能にする核酸コンストラクトを指す。本発明の組換え発現ベクターは、任意の適切な組換え発現ベクターであり得て、任意の適切な宿主を形質転換または形質移入するために使用され得る。適切なベクターとしては、例えば、プラスミドおよびウイルスなどの、増殖および拡張のために、または発現またはその双方のために、設計されたものなどのベクターが挙げられる。動物発現ベクターの例としては、ｐＥＵＫ−Ｃｌ、ｐＭＡＭ、およびｐＭＡＭｎｅｏが挙げられる。好ましくは、組換え発現ベクターは、例えば、レトロウイルスベクターなどのウイルスベクターである。組換え発現ベクターは、その中にベクターが導入され、その中で本発明の核酸の発現が実施されてもよい、宿主細胞のタイプ（例えば、細菌、真菌、植物、または動物）に特異的な、転写および翻訳開始および終止コドンなどの制御配列を含んでなる。さらに、本発明のベクターは、形質転換または形質移入された宿主の選択を可能にする、１つまたは複数のマーカー遺伝子を含んでもよい。組換え発現ベクターは、天然または規範的プロモーターを含んでなり得て、それは本発明のコンストラクトをコードするヌクレオチド配列に、または本発明のコンストラクトをコードするヌクレオチド配列と相補的なまたはそれとハイブリダイズするヌクレオチド配列に、作動可能に連結される。プロモーターの選択肢としては、例えば、強いプロモーター、弱いプロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター、および発達特異的プロモーターが挙げられる。プロモーターは、非ウイルスプロモーターまたはウイルスプロモーターであり得る。本発明の組換え発現ベクターは、一過性発現、安定発現のどちらか、またはその双方のために設計され得る。また、組換え発現ベクターは、構成的発現または誘導的発現のために作製され得る。
【００７０】
本発明はまた、本発明による抗原認識コンストラクトを含んでなる宿主細胞にも関する。具体的には、本発明の宿主細胞は、本明細書中で上に記載されるような核酸またはベクターを含んでなる。宿主細胞は、例えば、植物、動物、真菌、または藻類などの真核細胞であり得て、または例えば、細菌または原虫など原核細胞であり得る。宿主細胞は、培養細胞または初代細胞、すなわち、例えば、ヒトなどの生物から直接単離された細胞であり得る。宿主細胞は、接着細胞または懸濁細胞、すなわち、懸濁状態で増殖する細胞であり得る。組換えＴＣＲ、ポリペプチド、またはタンパク質を生成する目的のために、宿主細胞は、好ましくは哺乳類細胞である。最も好ましくは、宿主細胞はヒト細胞である。宿主細胞は任意の細胞型であり得て、任意の種類型に由来し得て、任意の発達段階であり得るものの、宿主細胞は好ましくは、末梢血白血球（ＰＢＬ）または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。より好ましくは、宿主細胞はＴ細胞である。Ｔ細胞は、例えば、初代Ｔ細胞などの培養Ｔ細胞などの任意のＴ細胞；または例えば、ジャーカット、ＳｕｐＴ１などの培養Ｔ細胞株由来のＴ細胞；または哺乳類から得られたＴ細胞、好ましくはヒト患者由来のＴ細胞またはＴ細胞前駆体であり得る。哺乳類から得られた場合、Ｔ細胞は、血液、骨髄、リンパ節、胸腺、またはその他の組織または体液をはじめとするが、これに限定されるものではない多数の起源から得られ得る。Ｔ細胞はまた、富化または精製され得る。好ましくは、Ｔ細胞はヒトＴ細胞である。より好ましくは、Ｔ細胞はヒトから単離されたＴ細胞である。Ｔ細胞は、ＣＤ４陽性および／またはＣＤ８陽性、ＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞、例えば、Ｔｈ１およびＴｈ２細胞、ＣＤ８陽性Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）、腫瘍浸潤性細胞（ＴＩＬ）、記憶Ｔ細胞、未感作Ｔ細胞などをはじめとするが、これに限定されるものではない、任意のＴ細胞型であり得て、任意の発達段階のものであり得る。好ましくは、Ｔ細胞は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞またはＣＤ４陽性Ｔ細胞である。
【００７１】
好ましくは、本発明の宿主細胞は、リンパ球、好ましくはＣＤ４陽性またはＣＤ８陽性Ｔ細胞などのＴリンパ球である。宿主細胞は、さらに好ましくは、ＴＡＡ発現腫瘍細胞に特異的な腫瘍反応性Ｔ細胞である。
【００７２】
本発明の目的は、
ａ）適切な宿主細胞を提供するステップと、
ｂ）本明細書で開示される発明による抗原認識コンストラクトをコードするコード配列を含んでなる遺伝子コンストラクトを提供するステップと、
ｃ）前記遺伝子コンストラクトを前記適切な宿主細胞に導入するステップと、
ｄ）前記適切な宿主細胞によって前記遺伝子コンストラクトを発現させるステップと
を含んでなる、ＴＡＡ特異的抗原認識コンストラクトの製造、またはＴＡＡ特異的抗原認識コンストラクト発現細胞株の製造方法によっても解決される。
【００７３】
方法はさらに、前記適切な宿主細胞上で、前記抗原認識コンストラクトを細胞表面提示させるステップをさらに含んでなってもよい。
【００７４】
その他の好ましい実施形態では、遺伝子コンストラクトは、前記コード配列に作動可能に連結されたプロモーター配列を含んでなる、発現コンストラクトである。
【００７５】
好ましくは、前記抗原認識コンストラクトは、哺乳類起源、好ましくはヒト起源である。本発明の方法で使用するための好ましい適切な宿主細胞は、ヒト細胞、特にヒＴリンパ球などの哺乳類細胞である。本発明で使用するためのＴ細胞は、本明細書中で上に詳述される。
【００７６】
前記抗原認識コンストラクトが修飾ＴＣＲであり、前記修飾が標識または治療活性物質などの機能ドメインの付加である実施形態もまた、本発明に包含される。さらに、内在性膜貫通領域の代わりに代案の膜アンカードメインなどの代案のドメインを有する、ＴＣＲが包含される。
【００７７】
望ましくは、遺伝子コンストラクトを前記適切な宿主細胞に導入するための形質移入システムは、レトロウイルスベクターシステムである。このようなシステムは、当業者に周知である。
【００７８】
一実施形態における、細胞からの抗原認識コンストラクトの単離および精製の追加的方法段階、任意選択的に、Ｔ細胞中の翻訳された抗原認識コンストラクト断片の再構成もまた、本発明に含まれる。
【００７９】
本発明の代案の態様では、Ｔ細胞は、本明細書中で上に記載されるように、腫瘍細胞に特異的であり高い結合活性を有するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を製造する方法によって提供され、入手され、または入手可能である。このようなＴ細胞は、本発明の方法で使用される宿主細胞、例えば、ヒトまたは非ヒトＴ細胞、好ましくはヒトＴＣＲに依存する。
【００８０】
抗原認識コンストラクト（その一例は抗体であり得る）などのポリペプチドの文脈において本明細書で使用される「単離された」という用語は、その治療的、診断的、予防的、研究的またはその他の使用を妨害するであろう、タンパク質またはポリペプチドまたはその他の混入物から精製されたポリペプチドを指す。本発明による抗原認識コンストラクトは、組換え体、合成または修飾された（非天然）抗原結合コンストラクトであってもよい。核酸または細胞の文脈において本明細書で使用される「単離された」という用語は、その治療的、診断的、予防的、研究的またはその他の使用を妨害するであろう、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質またはポリペプチドまたはその他の混入物（その他の細胞など）から精製された核酸または細胞を指し、またはそれは組換え体、合成または修飾された（非天然）核酸を指す。この文脈で、「組換え」タンパク質／ポリペプチドまたは核酸は、組換え技術を用いて作製されたものである。組換え核酸およびタンパク質の製造方法および技術は、当該技術分野で周知である。
【００８１】
本発明のさらなる一態様は、医療で使用するための本明細書で開示された抗原認識コンストラクト、核酸、ベクター、医薬組成物および／または宿主細胞に関する。医療における使用は、好ましい一実施形態では、悪性または良性腫瘍疾患などの腫瘍疾患の診断、予防および／または治療における使用を含む。腫瘍疾患は、例えば、前記腫瘍疾患のがんまたは腫瘍細胞におけるＴＡＡの発現によって特徴付けられる腫瘍疾患である。
【００８２】
本開示に従って、抗原認識性コンストラクトおよびそれに由来する、またはそれをコードするその他の物質の上述の医学的用途に関して、治療および／または診断される疾患は、任意の増殖性疾患であり得て、好ましくは、本発明のＴＡＡまたはＴＡＡエピトープ配列の発現によって、例えば、急性リンパ球性がん、急性骨髄性白血病、肺胞横紋筋肉腫、骨がん、脳がん、乳がん、肛門がん、肛門管または直腸がん、眼のがん、肝内胆管がん、関節がん、頸部がん、胆嚢または胸膜がん、鼻がん、鼻腔がん、中耳がん、口腔がん、膣がん、外陰部がん、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性がん、結腸がん、食道がん、子宮頸がん、消化管カルチノイド腫瘍、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、腎臓がん、喉頭がん、肝臓がん、肺がん、悪性中皮腫、黒色腫、多発性骨髄腫、鼻咽頭がん、非ホジキンリンパ腫、口腔咽頭がん、卵巣がん、陰茎がん、膵臓がん、腹膜がん、大網腸間膜がん、咽頭がん、前立腺がん、直腸がん、腎臓がん、皮膚がん、小腸がん、軟部組織がん、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、子宮がん、尿管がん、および膀胱がんのいずれかなどの任意のがんによって特徴付けられる。好ましいがんは、子宮頸部、口腔咽頭、肛門、肛門管、肛門直腸、膣、外陰部、または陰茎のがんである。特に好ましいがんは、好ましくは胃腸および胃がんなどのＴＡＡ陽性（すなわち、ＤＣＡＦ４Ｌ２−００１−ペプチド提示）がんである。
【００８３】
本発明のコンストラクト、タンパク質、ＴＣＲ抗体、ポリペプチドおよび核酸は、特に免疫療法、好ましくは養子Ｔ細胞療法における使用のためのものである。本発明の化合物の投与は、例えば、前記患者への本発明のＴ細胞の注入を伴い得る。好ましくは、このようなＴ細胞は患者の自己Ｔ細胞であり、本発明の核酸または抗原認識コンストラクトで生体外形質導入されたものである。
【００８４】
本明細書で以後、集合的に「本発明のＴＣＲ材料」と称される、本発明の抗原認識コンストラクト、ＴＣＲ、ポリペプチド、タンパク質（それらの機能的変異型を含む）、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞（それらの集団を含む）、および抗体（その抗原結合部分を含む）は、医薬組成物などの組成物に調合され得る。この点において、本発明は、本明細書に記載の抗原認識コンストラクト、ＴＣＲ、ポリペプチド、タンパク質、機能的部分、機能的変異型、核酸、発現ベクター、宿主細胞（それらの集団を含む）、および抗体（それらの抗原結合部分を含む）のいずれかと、薬学的に許容可能な担体、賦形剤および／または安定剤とを含んでなる、医薬組成物を提供する。本発明のＴＣＲ材料のいずれかを含有する本発明の医薬組成物は、例えば、ポリペプチドおよび核酸などの２つ以上の発明のＴＣＲ材料、または、２つ以上の異なるＴＣＲ（それらの機能的部分および機能的変異型を含む）を含んでなり得る。代案としては、医薬組成物は、例えば、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、メトトレキサート、パクリタキセル、リツキシマブ、ビンブラスチン、ビンクリスチンなどの化学療法剤のような別の薬学的に活性な薬剤または薬物と組み合わされた、発明のＴＣＲ材料を含んでなり得る。好ましくは、担体は、薬学的に許容可能な担体である。医薬組成物に関して、担体は、検討中の特定の本発明のＴＣＲ材料のために従来使用されているもののいずれかであり得る。このような薬学的に許容可能な担体は当業者に周知であり、一般に容易に入手可能である。薬学的に許容可能な担体は、使用条件下で有害な副作用または毒性がないものであることが好ましい。
【００８５】
したがって、本明細書に記載される本発明の任意の生成物および本発明のＴＣＲ材料、具体的には任意のタンパク質、核酸または宿主細胞を含んでなる医薬組成物もまた提供される。好ましい実施形態では、医薬組成物は、免疫療法、好ましくは養子細胞療法のためのものである。
【００８６】
好ましくは、本発明のＴＣＲ材料は、例えば静脈内などの注射によって投与される。本発明のＴＣＲ材料が本発明のＴＣＲ（またはその機能的変異型）を発現する宿主細胞である場合、注射用細胞のための薬学的に許容可能な担体は、例えば、生理食塩水（水中の約０．９０％ｗ／ｖのＮａＣｌ、水中の約３００ｍＯｓｍ／ＬのＮａＣｌ、または水１リットルあたり約９．０ｇのＮａＣｌ）、ＮＯＲＭＯＳＯＬＲ電解質溶液（Ａｂｂｏｔｔ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）、ＰＬＡＳＭＡ−ＬＹＴＥ  Ａ（Ｂａｘｔｅｒ，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）、水中の約５％デキストロース、または乳酸リンゲル液などの任意の等張性担体を含んでもよい。一実施形態では、薬学的に許容可能な担体にはヒト血清卵白が添加されている。
【００８７】
本発明の目的のために、投与される本発明のＴＣＲ材料の量または用量（例えば、本発明のＴＣＲ材料が１つまたは複数の細胞である場合は細胞数）は、妥当な時間枠にわたり対象または動物において、例えば、治療的または予防的応答などの影響を及ぼすのに十分であってもよい。例えば、本発明のＴＣＲ材料の用量は、投与時から例えば１２〜２４時間以上などの約２時間以上の期間において、がん抗原に結合し、またはがんを検出し、治療または予防するのに十分であるべきである。特定の実施形態では、期間はさらに長くなり得る。用量は、特定の本発明のＴＣＲ材料の有効性および動物（例えば、ヒト）の病状、ならびに治療される動物（例えば、ヒト）の体重によって決定されるであろう。
【００８８】
本発明の医薬組成物、抗原認識コンストラクト、ＴＣＲ（それらの機能的変異型を含む）、ポリペプチド、タンパク質、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、または細胞集団は、がんまたはＴＡＡ陽性前がんを治療または予防する方法で使用され得ることが検討される。本発明のＴＣＲ（およびそれらの機能的変異型）は、本発明のＴＡＡと特異的に結合すると考えられ、その結果、ＴＣＲ（または関連する発明のポリペプチドまたはタンパク質およびそれらの機能的変異型）は、Ｔ細胞などの細胞によって発現される、または細胞上に発現される場合、本発明のＴＡＡを発現する、好ましくは前記標的細胞の表面のＭＨＣＩまたはＩＩを通じてＴＡＡペプチドを提示する、標的細胞に対する免疫応答を媒介できる。この点において、本発明は、本明細書に記載の医薬組成物、特にＴＣＲ（およびそれらの機能的変異型）である抗原認識コンストラクト、ポリペプチド、またはタンパク質；本明細書に記載のＴＣＲ（およびそれらの機能的変異型）とポリペプチドとタンパク質とのいずれかをコードするヌクレオチド配列を含んでなる、任意の核酸または組換え発現ベクター；または本明細書に記載の本発明のコンストラクト（およびそれらの機能的変異型）またはポリペプチドまたはタンパク質のいずれかをコードする核酸または組換えベクターを含んでなる、任意の宿主細胞または細胞集団のいずれかを哺乳類において病状を治療または予防するのに有効な量で、哺乳類に投与するステップを含んでなる、哺乳類における病状、特にがんを治療または予防する方法を提供し、病状は、好ましくは、本発明のＴＡＡを発現するがんなどのがんである。
【００８９】
本発明で有用な薬学的に許容可能な担体または希釈剤の例としては、ＳＰＧＡ、炭水化物（例えば、ソルビトール、マンニトール、デンプン、スクロース、グルコース、デキストラン）、アルブミンまたはカゼインなどのタンパク質、ウシ乳清または脱脂乳などのタンパク質含有作用物質などの安定剤および緩衝剤（例えば、リン酸緩衝液）が挙げられる。
【００９０】
「治療する」および「予防する」という用語、ならびにそれから生じる用語は、本明細書の用法では、必ずしも１００％または完全な治療または予防を暗示しない。むしろ、当業者が潜在的利益または治療効果を有すると認識する、様々な程度の治療または予防がある。この点において、本発明の方法は、哺乳類における病状の任意の量の任意のレベルの治療または予防を提供し得る。さらに、本発明の方法によって提供される治療または予防は、例えば、治療または予防されるがんなどの１つまたは複数の病状または病状の症状の治療または予防を含み得る。例えば、治療または予防としては、腫瘍退縮の促進が挙げられる。また、本明細書の目的のために、「予防」は、病状または症状またはその病状の発生を遅延させるることを包含し得る。
【００９１】
本発明はまた、少なくとも１つの化学療法剤および／または放射線療法と組み合わせて、本明細書のＴＣＲ、核酸、または宿主細胞を投与するステップを含んでなる、がんを治療する方法にも関する。
【００９２】
本発明のもう一つの態様は、サンプルを前記ＴＡＡペプチドに特異的に結合する抗原認識コンストラクトと、またはＴＡＡペプチド／ＭＨＣ複合体と、接触させるステップと、前記抗原認識コンストラクトと前記ＴＡＡペプチドの間の結合、またはＴＡＡペプチド／ＭＨＣ複合体に対する結合を検出するステップとを含んでなる、対象または患者から得られたものなどの（生物学的）サンプル中で、ＴＡＡタンパク質、またはＭＨＣとＴＡＡタンパク質（ＴＡＡのタンパク質エピトープ）との複合体を検出する方法にさらに関する。いくつかの実施形態では、抗原認識コンストラクトはＴＣＲもしくは抗体、または類似したコンストラクト、または好ましくは本明細書に記載の発明による抗原認識コンストラクトである。いくつかの実施形態では、（生物学的）サンプルは、腫瘍またはがん（本明細書の他の箇所で記載されるものの１つなど）のサンプル、例えば、腫瘍またはがん細胞を含んでなるサンプルである。
【００９３】
ａ）細胞を前記対象から単離するステップと；
ｂ）細胞を本発明の抗原認識コンストラクトをコードする少なくとも１つのベクターで形質転換して、形質転換細胞を生成するステップと；
ｃ）形質転換細胞を増殖させて、複数の形質転換細胞を生成するステップと；
ｄ）複数の形質転換細胞を前記対象に投与するステップと
を含んでなる、それを必要とする対象においてがんを治療する方法もまた提供される。
【００９４】
ａ）細胞を健常ドナーから単離するステップと；
ｂ）細胞を本発明の抗原認識コンストラクトをコードするベクターで形質転換して、形質転換細胞を生成するステップと；
ｃ）形質転換細胞を増殖させて、複数の形質転換細胞を生成するステップと；
ｄ）複数の形質転換細胞を前記対象に投与するステップと
を含んでなる、それを必要とする対象においてがんを治療する方法もまた提供される。
【００９５】
それを必要とする対象においてがんを治療する方法もまた提供され、本明細書のいずれかのＴＣＲ、本明細書の核酸、本明細書の発現ベクター、本明細書の宿主細胞または本明細書の医薬組成物が、少なくとも２４時間隔てられた少なくとも２回の投与によって投与される。
【００９６】
それを必要とする対象においてがんを治療する方法もまた提供され、本明細書のいずれかのＴＣＲ、本明細書の核酸、本明細書の発現ベクター、本明細書の宿主細胞または本明細書の医薬組成物が、数日間、数週間または数ヶ月にわたって対象に投与される。
【００９７】
それを必要とする対象においてがんを治療する方法もまた提供され、本明細書のいずれかのＴＣＲ、本明細書の核酸、本明細書の発現ベクター、本明細書の宿主細胞または本明細書の医薬組成物が、局所注入によって投与される。好ましくは、局所注入は、注入ポンプおよび／またはカテーテルシステムによって投与される。より好ましくは、前記局所注入は、固形腫瘍、固形腫瘍に栄養供給する血管、および／または固形腫瘍を周囲の領域への注入である。
【００９８】
それを必要とする対象においてがんを治療する方法もまた提供され、本明細書のＴＣＲ、本明細書の核酸、本明細書の発現ベクター、本明細書の宿主細胞または本明細書の医薬組成物は、１用量当たり約１０４〜約１０１０個の細胞の用量で投与される。
【００９９】
ａ）生物学的サンプルを本明細書の抗原認識コンストラクト（例えば、ＴＣＴ）に接触させるステップと；
ｂ）抗原認識コンストラクト（例えば、ＴＣＲ）の生物学的サンプルへの結合を検出するステップと
を含んでなる、生物学的サンプルにおいてがんを検出する方法もまた提供される。
【０１００】
いくつかの実施形態では、がんを検出する方法は、生体外、生体内または原位置で実施される。
【０１０１】
哺乳類において病状の存在を検出する方法もまた提供される。方法は、（ｉ）哺乳類由来の１つまたは複数の細胞を含んでなるサンプルを、本発明のＴＣＲ（およびそれらの機能的変異型）、ポリペプチド、タンパク質、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞集団、抗体、またはその抗原結合部分、または本明細書に記載される医薬組成物のいずれかに接触させ、それによって複合体を形成し、複合体を検出するステップを含んでなり、複合体の検出は、哺乳類における病状の存在の指標となり、病状は、ＴＡＡ発現悪性腫瘍などのがんである。
【０１０２】
哺乳類における病状を検出する本発明の方法に関して、細胞サンプルは、全細胞、その溶解産物、または例えば、核もしくは細胞質画分、全タンパク質画分、または核酸画分などのホールセル溶解産物の画分を含んでなる、サンプルであり得る。
【０１０３】
本発明の検出法の目的のために、接触は哺乳類に関して生体外または生体内で行われ得る。好ましくは、接触は生体外である。
【０１０４】
また、複合体の検出は、当該技術分野で公知の多数の様式を通じて行い得る。例えば、本明細書に記載される、本発明の抗原認識コンストラクト（およびそれらの機能的変異型）、ポリペプチド、タンパク質、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞集団、または抗体またはＴＣＲ、またはその抗原結合部分は、例えば、放射性同位体、フルオロフォア（例えば、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ））、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、および元素粒子（例えば、金粒子）などの検出可能な標識で標識され得る。
【０１０５】
宿主細胞または細胞集団が投与される本発明の方法の目的のために、細胞は哺乳類にとって同種異系または自己由来の細胞であり得る。好ましくは、細胞は哺乳類に対して自己由来である。
【０１０６】
本発明のＴＣＲ材料の前述の医療用途に関して、治療および／または診断されるがんは、急性リンパ球性がん、急性骨髄性白血病、肺胞横紋筋肉腫、骨がん、脳がん、乳がん、肛門がん、肛門管または直腸がん、眼のがん、肝内胆管がん、関節がん、頸部がん、胆嚢または胸膜がん、鼻がん、鼻腔がん、中耳がん、口腔がん、膣がん、外陰部がん、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性がん、結腸がん、食道がん、子宮頸がん、消化管カルチノイド腫瘍、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、腎臓がん、喉頭がん、肝臓がん、肺がん、悪性中皮腫、黒色腫、多発性骨髄腫、鼻咽頭がん、非ホジキンリンパ腫、口腔咽頭がん、卵巣がん、陰茎がん、膵臓がん、腹膜がん、大網腸間膜がん、咽頭がん、前立腺がん、直腸がん、腎臓がん、皮膚がん、小腸がん、軟部組織がん、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、子宮がん、尿管がん、および膀胱がんのいずれかなどの任意のがんであり得る。好ましいがんは、子宮頸部、口腔咽頭、肛門、肛門管、肛門直腸、膣、外陰部、または陰茎のがんである。特に好ましいがんは、結腸がん、直腸がん、胃腸または胃がんなどのＴＡＡ陽性がんである。
【０１０７】
一般に、本発明は、本発明によって開示されるような抗原認識コンストラクト、核酸、ベクター、医薬組成物および／または宿主細胞を投与するステップを含んでなる、腫瘍または腫瘍疾患に罹患している対象を治療する方法を提供する。好ましくは、対象は、このような治療を必要とする対象である。好ましい実施形態では対象は、ＴＡＡ陽性の腫瘍または腫瘍疾患に罹患している哺乳類対象、好ましくはヒト患者である。
【０１０８】
本明細書の開示を考慮すると、本発明は以下の事項にさらに関するものであることが理解されるであろう：
項目１：配列番号３、９、１５、２１、２７、および３３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有する、少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）３を含んでなる抗原認識コンストラクト。
【０１０９】
項目２：前記抗原認識コンストラクトが、本発明の抗原ペプチドのＴＡＡに特異的におよび／または選択的に結合できる、項目１に記載の抗原認識コンストラクト。
【０１１０】
項目３：抗原認識コンストラクトが、抗体、またはその誘導体もしくは断片、またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、またはその誘導体もしくは断片である、項目１または２に記載の抗原認識コンストラクト。
【０１１１】
項目４：前記抗原認識コンストラクトがＴＡＡ抗原ペプチドを提示するヒト白血球抗原（ＨＬＡ）に結合し、前記ＨＬＡが任意選択的にＡ２型である、項目１〜３のいずれか一項に記載の抗原認識コンストラクト。
【０１１２】
項目５：コンストラクトが、配列番号４９、および５０〜５７から選択されるアミノ酸配列を含んでなり、またはそれからなるエピトープに特異的におよび／または選択的に結合する、項目１〜４のいずれか１項に記載の抗原認識コンストラクト。
【０１１３】
項目６：コンストラクトがα／β−ＴＣＲまたはその断片もしくは誘導体であり、またはコンストラクトがγ／δ−ＴＣＲまたはその断片もしくは誘導体である、項目１〜５のいずれか一項に記載の抗原認識コンストラクト。
【０１１４】
項目７：コンストラクトがヒト起源であり、ＴＡＡ抗原ペプチドを特異的におよび／または選択的に認識することを特徴とする、項目１〜６のいずれか一項に記載の抗原認識コンストラクト。
【０１１５】
項目８：前記抗原認識コンストラクトが、対象において免疫応答を誘導でき、任意選択的に、免疫応答がインターフェロン（ＩＦＮ）γレベルの増加によって特徴付けられる、項目１〜７のいずれか一項に記載の抗原認識コンストラクト。
【０１１６】
項目９：ＴＣＲαまたはγ鎖；および／またはＴＣＲβおよびδ鎖を含んでなり、ＴＣＲαまたはγ鎖が、配列番号３、１５、および２７から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するＣＤＲ３を含んでなり、および／またはＴＣＲβまたはδ鎖が、配列番号９、２１、および３３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するＣＤＲ３を含んでなる、項目１〜８のいずれか１項に記載の抗原認識コンストラクト。
【０１１７】
項目１０：ＴＣＲαまたはγ鎖が、配列番号１、１３、および２５から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するＣＤＲ１；および／または配列番号２、１４、および２６から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するＣＤＲ２をさらに含んでなる、項目９に記載の抗原認識コンストラクト。
【０１１８】
項目１１：ＴＣＲβまたはδ鎖が、配列番号７、１９、および３１から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するＣＤＲ１；および／または配列番号８、２０、および３２から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するＣＤＲ２をさらに含んでなる、項目９または１０に記載の抗原認識コンストラクト。
【０１１９】
項目１２：配列番号４、１０、１６、２２、２８、および３４から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するＴＣＲ可変鎖領域を含んでなる、項目１〜１１のいずれかに記載の抗原認識コンストラクト。
【０１２０】
項目１３：コンストラクトが、ヒト化、キメラ化および／またはマウス化されている、項目１〜１２のいずれか一項に記載の抗原認識コンストラクト。
【０１２１】
項目１４：ＴＣＲ結合断片を含んでなり、前記結合断片が、任意選択的に、配列番号１、２、３、または７、８、９または１３、１４、１５、または１９、２０、２１、または２５、２６、２７または３１、３２、３３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１〜ＣＤＲ３配列から選択されるＣＤＲ１〜ＣＤＲ３を含んでなる、項目１〜１３のいずれか一項に記載の抗原認識コンストラクト。
【０１２２】
項目１５：コンストラクトが、少なくとも１つのＴＣＲα鎖および１つのＴＣＲβ鎖配列から構成されるＴＣＲまたはその断片であり、前記ＴＣＲα鎖配列が、配列番号１〜３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１〜ＣＤＲ３配列を含んでなり、前記ＴＣＲβ鎖配列が、配列番号７〜９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１〜ＣＤＲ３配列を含んでなり；または前記ＴＣＲα鎖配列が、配列番号１３〜１５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１〜ＣＤＲ３配列を含んでなり、前記ＴＣＲβ鎖配列が、配列番号１９〜２１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１〜ＣＤＲ３配列を含んでなり；または前記ＴＣＲα鎖配列が、配列番号２５〜２７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１〜ＣＤＲ３配列を含んでなり、前記ＴＣＲβ鎖配列が、配列番号３１〜３３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１〜ＣＤＲ３配列を含んでなる、項目１〜１４のいずれか一項に記載の抗原認識コンストラクト。
【０１２３】
項目１６：コンストラクトが、少なくとも１つのＴＣＲα鎖および１つのＴＣＲβ鎖配列からなるＴＣＲまたはその断片であり、前記ＴＣＲα鎖配列が、配列番号４のアミノ酸配列を有する可変領域配列を含んでなり、前記ＴＣＲβ鎖配列が、配列番号１０のアミノ酸配列を有する可変領域配列を含んでなり、または前記ＴＣＲα鎖配列が、配列番号１６のアミノ酸配列を有する可変領域配列を含んでなり、前記ＴＣＲβ鎖配列が、配列番号２２のアミノ酸配列を有する可変領域配列を含んでなり、または前記ＴＣＲα鎖配列が、配列番号２８のアミノ酸配列を有する可変領域配列を含んでなり、前記ＴＣＲβ鎖配列が、配列番号３４のアミノ酸配列を有する可変領域配列を含んでなる、項目１〜１５のいずれか一項に記載の抗原認識コンストラクト。
【０１２４】
項目１７：コンストラクトが、配列番号５、１１、１７、２３、２９および３５から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、および１００％の配列同一性を有するＴＣＲ定常領域をさらに含んでなる、ＴＣＲまたはその断片であり；好ましくはＴＣＲが、少なくとも１つのＴＣＲαおよび１つのＴＣＲβ鎖配列から構成され、ＴＣＲα鎖配列が、配列番号５、１７、および２９から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する定常領域を含んでなる、項目１〜１６のいずれか一項に記載の抗原認識コンストラクト。
【０１２５】
項目１８：配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する第１のＴＣＲ鎖と、配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する第２のＴＣＲ鎖とを含んでなる、項目１〜１７のいずれか一項に記載の抗原認識コンストラクト。
【０１２６】
項目１９：配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する第１のＴＣＲ鎖と、配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する第２のＴＣＲ鎖とを含んでなる、項目１〜１７のいずれか一項に記載の抗原認識コンストラクト。
【０１２７】
項目２０：配列番号３０のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する第１のＴＣＲ鎖と、配列番号３６のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する第２のＴＣＲ鎖とを含んでなる、項目１〜１７のいずれか一項に記載の抗原認識コンストラクト。
【０１２８】
項目２１：項目１〜２０のいずれか一項に記載の抗原認識コンストラクトをコードする核酸。
【０１２９】
項目２２：項目２１に記載の核酸を含んでなるベクター。
【０１３０】
項目２３：項目１〜２０のいずれか一項に記載の抗原認識コンストラクト、または項目２１に記載の核酸または、または項目２２に記載のベクターを含んでなる、宿主細胞。
【０１３１】
項目２４：細胞が、リンパ球、好ましくはＴリンパ球またはＴリンパ球前駆体、より好ましくはＣＤ４またはＣＤ８陽性Ｔ細胞である、項目２３に記載の宿主細胞。
【０１３２】
項目２５：項目１〜２０のいずれか一項に記載の抗原認識コンストラクト、または項目２１に記載の核酸、または項目２２に記載のベクター、または項目２３または２４に記載の宿主細胞、および薬学的に許容可能な担体、安定剤および／または賦形剤を含んでなる、医薬組成物。
【０１３３】
項目２６：医療で使用するための、項目１〜２０のいずれか一項に記載の抗原認識コンストラクト、または項目２１に記載の核酸、または項目２２に記載のベクター、または項目２３もしくは２４に記載の宿主細胞、または項目２５に記載の医薬組成物。
【０１３４】
項目２７：悪性または良性の腫瘍疾患を含んでなる増殖性疾患の診断、予防および／または治療における使用のための、項目２６に記載の使用のための抗原認識コンストラクト、または核酸、またはベクター、または宿主細胞、または医薬組成物。
【０１３５】
項目２８：腫瘍疾患が、腫瘍疾患の腫瘍細胞内のＴＡＡの発現によって特徴付けられる、項目２７に記載の使用のための抗原認識コンストラクト、または核酸、またはベクター、または宿主細胞、または医薬組成物。
【０１３６】
項目２９：医学における使用が、任意選択的に養子細胞移入を含んでなる免疫療法における使用であり、免疫療法が、養子自己または異種Ｔ細胞療法を含んでなる、項目２６〜２８のいずれか一項に記載の使用のための抗原認識コンストラクト、または核酸、またはベクター、または宿主細胞、または医薬組成物。
【０１３７】
項目３０：ａ．適切な宿主細胞を提供するステップと、
ｂ．項目１〜２０のいずれか一項に記載の抗原認識コンストラクトをコードするコード配列を含んでなる遺伝子コンストラクトを提供するステップと、
ｃ．前記遺伝子コンストラクトを前記適切な宿主細胞に導入するステップと、
ｄ．前記適切な宿主細胞によって前記遺伝子コンストラクトを発現させるステップと
を含んでなる、細胞株を発現するＴＡＡ特異的抗原認識コンストラクトを製造する方法。
【０１３８】
項目３１：前記抗原認識コンストラクトの細胞表面提示をさらに含んでなる、項目３０に記載の方法。
【０１３９】
項目３２：遺伝子コンストラクトが、前記コード配列と作動可能に連結されたプロモーター配列を含んでなる発現コンストラクトである、項目３０または３１に記載の方法。
【０１４０】
項目３３：前記抗原認識コンストラクトが、哺乳類起源、好ましくはヒト起源である、項目３０〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【０１４１】
項目３４：前記適切な宿主細胞が、任意選択的にヒト細胞またはヒＴリンパ球から選択される哺乳類細胞である、項目３０〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【０１４２】
項目３５：前記抗原認識コンストラクトが修飾ＴＣＲであり、前記修飾が、標識を含んでなる機能ドメインの付加、または膜アンカードメインを含んでなる代替ドメインの付加を含んでなる、項目３０〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【０１４３】
項目３６：前記抗原認識コンストラクトがα／βＴＣＲ、γ／δＴＣＲ、または一本鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ）である、項目３５に記載の方法。
【０１４４】
項目３７：前記遺伝子コンストラクトが、レトロウイルス形質移入によって前記適切な宿主細胞に導入される、項目３０〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【０１４５】
項目３８：適切な宿主細胞からの抗原認識コンストラクトの単離および精製と、任意選択的に、Ｔ細胞内の抗原認識コンストラクトの再構成とをさらに含んでなる、項目３０〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【０１４６】
項目３９：上記の項目のいずれか一項に記載のＴＣＲ、核酸または発現ベクター、宿主細胞、および／または医薬組成物をそれを必要とする対象に投与するステップを含んでなる、がんを治療する方法。
【０１４７】
項目４０：ＴＣＲが宿主細胞の表面で発現される、項目３９に記載の方法。
【０１４８】
項目４１：宿主細胞が、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体からなる群から選択される、項目４０に記載の方法。
【０１４９】
項目４２：Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体が自己由来である、項目４１に記載の方法。
【０１５０】
項目４３：Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体が同種異系である、項目４２に記載の方法。
【０１５１】
項目４４：ＴＣＲが治療効果のある薬剤にコンジュゲートされている、項目４３に記載の方法。
【０１５２】
項目４５：治療効果のある薬剤が、放射性核種、化学療法剤、および毒素からなる群から選択される、項目４４に記載の方法。
【０１５３】
項目４６：がんが、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、腎細胞、脳がん、胃がん、結腸直腸がん、肝細胞がん、頭頸部がん、膵臓がん、前立腺がん、白血病、乳がん、メルケル細胞がん、黒色腫、卵巣がん、膀胱がん、子宮がん、胆嚢および胆管がん、食道がん、またはそれらの組み合わせである、項目３９〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【０１５４】
項目４７：少なくとも１つの化学療法剤を対象に投与することをさらに含んでなる、項目３９〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【０１５５】
項目４８：放射線療法を対象に施すステップをさらに含んでなる、項目４６〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【０１５６】
項目４９：
ａ）細胞を前記対象から単離するステップと；
ｂ）細胞を上記の項目のいずれか一項に記載のＴＣＲをコードするベクターで形質転換して形質転換細胞を生成するステップと；
ｃ）形質転換細胞を増殖させて、複数の形質転換細胞を生成するステップと；
ｄ）複数の形質転換細胞を前記対象に投与するステップと
を含んでなる、それを必要とする対象においてがんを治療する方法。
【０１５７】
項目５０：細胞がＴ細胞またはＴ細胞前駆体から選択される、項目４９に記載の方法。
【０１５８】
項目５１：
ａ）細胞を健常ドナーから単離するステップと；
ｂ）細胞を上記の項目のいずれか一項に記載のＴＣＲをコードするベクターで形質転換して形質転換細胞を生成するステップと；
ｃ）形質転換細胞を増殖させて、複数の形質転換細胞を生成するステップと；
ｄ）複数の形質転換細胞を前記対象に投与するステップと
を含んでなる、それを必要とする対象においてがんを治療する方法。
【０１５９】
項目５２：細胞がＴ細胞またはＴ細胞前駆体から選択される、項目５１に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【０１６０】
添付の図面および配列を参照しながら、本発明を以下の実施例においてさらに説明するが、それでもなおそれらに限定されるものではない。本発明の目的で、本明細書で引用される全ての参考文献は、その内容全体が参照により援用される。図面および配列において：
【図１】ＤＣＡＦ４Ｌ２−００１ペプチド（配列番号４９）、または配列番号１（配列番号５０〜５８）の１〜９位における様々なＤＣＡＦ４Ｌ２−００１アラニン置換変異型、または対照ペプチドＮＹＥＳＯ１−００１（配列番号６９）が負荷されたＴ２標的細胞との同時インキュベーション後における、ＴＣＲ  Ｒ３６Ｐ３Ｆ９（表１）のα鎖およびβ鎖ＲＮＡで電気穿孔されたＣＤ８＋Ｔ細胞からのＩＦＮγ放出である。ＩＦＮγ放出データは、２人の異なる健常ドナーに由来するＣＤ８＋Ｔ細胞を用いて得られた。ＲＮＡ電気穿孔ＣＤ８＋Ｔ細胞単独、または未負荷標的細胞との同時インキュベーションが、対照の役割を果たした。
【図２】ＤＣＡＦ４Ｌ２−００１ペプチド（配列番号４９）、または配列番号１（配列番号５０〜５８）の１〜９位における様々なＤＣＡＦ４Ｌ２−００１アラニン置換変異型、または対照ペプチドＮＹＥＳＯ１−００１（配列番号６９）が負荷されたＴ２標的細胞との同時インキュベーション後における、ＴＣＲ  Ｒ５２Ｐ２Ｇ１１（表１）のα鎖およびβ鎖ＲＮＡで電気穿孔されたＣＤ８＋Ｔ細胞からのＩＦＮγ放出である。ＩＦＮγ放出データは、２人の異なる健常ドナーに由来するＣＤ８＋Ｔ細胞を用いて得られた。ＲＮＡ電気穿孔ＣＤ８＋Ｔ細胞単独、または未負荷標的細胞との同時インキュベーションが、対照の役割を果たした。
【図３】ＤＣＡＦ４Ｌ２−００１ペプチド（配列番号４９）、または配列番号１（配列番号５０〜５８）の１〜９位における様々なＤＣＡＦ４Ｌ２−００１アラニン置換変異型、または対照ペプチドＮＹＥＳＯ１−００１（配列番号６９）が負荷されたＴ２標的細胞との同時インキュベーション後における、ＴＣＲ  Ｒ５３Ｐ２Ａ９（表１）のα鎖およびβ鎖ＲＮＡで電気穿孔されたＣＤ８＋Ｔ細胞からのＩＦＮγ放出である。ＩＦＮγ放出データは、２人の異なる健常ドナーに由来するＣＤ８＋Ｔ細胞を用いて得られた。ＲＮＡ電気穿孔ＣＤ８＋Ｔ細胞単独、または未負荷標的細胞との同時インキュベーションが、対照の役割を果たした。
【図４】標的細胞ＤＣＡＦ４Ｌ２−００１ペプチド（配列番号４９）、または同種であるが無関係のペプチドＧＲＢ１４−００２（配列番号５９）、ＳＮＲ−００４（配列番号６０）、ＷＲＮ−００２（配列番号６１）、ＭＵＣ−００９（配列番号６２）、ＧＳＴＡ４−００１（配列番号６３）、ＰＦＮ１−００１（配列番号６４）、ＶＰＳ３９−００１（配列番号６５）、ＡＨＲ−００２（配列番号６６）、ＫＣＭ−００１（配列番号６７）またはＶＰＳ５１−００１（配列番号６８）または対照ペプチドＮＹＥＳＯ１−００１（配列番号６９）が負荷されたＴ２標的細胞との同時インキュベーション後における、ＴＣＲ  Ｒ３６Ｐ３Ｆ９のα鎖およびβ鎖ＲＮＡで電気穿孔されたＣＤ８＋Ｔ細胞からのＩＦＮγ放出である。ＩＦＮγ放出データは、２人の異なる健常ドナーに由来するＣＤ８＋Ｔ細胞を用いて得られた。ＲＮＡ電気穿孔ＣＤ８＋Ｔ細胞単独、または未負荷標的細胞との同時インキュベーションが、対照の役割を果たした。
【図５】標的細胞ＤＣＡＦ４Ｌ２−００１ペプチド（配列番号４９）、または同種であるが無関係のペプチドＧＲＢ１４−００２（配列番号５９）、ＳＮＲ−００４（配列番号６０）、ＷＲＮ−００２（配列番号６１）、ＭＵＣ−００９（配列番号６２）、ＧＳＴＡ４−００１（配列番号６３）、ＰＦＮ１−００１（配列番号６４）、ＶＰＳ３９−００１（配列番号６５）、ＡＨＲ−００２（配列番号６６）、ＫＣＭ−００１（配列番号６７）またはＶＰＳ５１−００１（配列番号６８）または対照ペプチドＮＹＥＳＯ１−００１（配列番号６９）が負荷されたＴ２標的細胞との同時インキュベーション後における、ＴＣＲ  Ｒ５２Ｐ２Ｇ１１のα鎖およびβ鎖ＲＮＡで電気穿孔されたＣＤ８＋Ｔ細胞からのＩＦＮγ放出である。ＩＦＮγ放出データは、２人の異なる健常ドナーに由来するＣＤ８＋Ｔ細胞を用いて得られた。ＲＮＡ電気穿孔ＣＤ８＋Ｔ細胞単独、または未負荷標的細胞との同時インキュベーションが、対照の役割を果たした。
【図６】標的細胞ＤＣＡＦ４Ｌ２−００１ペプチド（配列番号４９）、または同種であるが無関係のペプチドＧＲＢ１４−００２（配列番号５９）、ＳＮＲ−００４（配列番号６０）、ＷＲＮ−００２（配列番号６１）、ＭＵＣ−００９（配列番号６２）、ＧＳＴＡ４−００１（配列番号６３）、ＰＦＮ１−００１（配列番号６４）、ＶＰＳ３９−００１（配列番号６５）、ＡＨＲ−００２（配列番号６６）、ＫＣＭ−００１（配列番号６７）またはＶＰＳ５１−００１（配列番号６８）または対照ペプチドＮＹＥＳＯ１−００１（配列番号６９）が負荷されたＴ２標的細胞との同時インキュベーション後における、ＴＣＲ  Ｒ５３Ｐ２Ａ９のα鎖およびβ鎖ＲＮＡで電気穿孔されたＣＤ８＋Ｔ細胞からのＩＦＮγ放出である。ＩＦＮγ放出データは、２人の異なる健常ドナーに由来するＣＤ８＋Ｔ細胞を用いて得られた。ＲＮＡ電気穿孔ＣＤ８＋Ｔ細胞単独、または未負荷標的細胞との同時インキュベーションが、対照の役割を果たした。
【図７】それぞれＴＣＲ  Ｒ５２Ｐ２Ｇ１１およびＴＣＲ  Ｒ５３Ｐ２Ａ９のα鎖およびβ鎖ＲＮＡで電気穿孔された、ＣＤ８＋Ｔ細胞のＨＬＡ−Ａ＊０２／ＤＣＡＦ４Ｌ２−００１四量体またはＨＬＡ−Ａ＊０２／ＮＹＥＳＯ１−００１四量体染色である。ＨＬＡ−Ａ＊０２／ＮＹＥＳＯ１−００１複合体に特異的に結合する１Ｇ４  ＴＣＲのＲＮＡで電気穿孔されたＣＤ８＋Ｔ細胞、および模擬電気穿孔されたＣＤ８＋Ｔ細胞が、対照の役割を果たした。
【図８】１０μＭ〜１０ｐＭの様々なペプチド負荷濃度における、ＤＣＡＦ４Ｌ２−００１ペプチド（配列番号４９）が負荷されたＴ２標的細胞との同時インキュベーション後における、ＴＣＲ  Ｒ５２Ｐ２Ｇ１１（表１）のα鎖およびβ鎖ＲＮＡで電気穿孔されたＣＤ８＋Ｔ細胞からのＩＦＮγ放出である。ＩＦＮγ放出データは、２人の異なる健常ドナーに由来するＣＤ８＋Ｔ細胞を用いて得られた。ＲＮＡ電気穿孔ＣＤ８＋Ｔ細胞単独、または未負荷標的細胞との同時インキュベーションが、対照の役割を果たした。ドナー１（ＴＣＲＡ−０００６）は左のＹ軸上に、ドナー２（ＴＣＲＡ−０００７）は右のＹ軸上にそれぞれ示される。
【図９】１０μＭ〜１０ｐＭの様々なペプチド負荷濃度における、標的細胞ＤＣＡＦ４Ｌ２−００１ペプチド（配列番号４９）が負荷されたＴ２標的細胞との同時インキュベーション後における、ＴＣＲ  Ｒ５３Ｐ２Ａ９（表１）のα鎖およびβ鎖ＲＮＡで電気穿孔されたＣＤ８＋Ｔ細胞からのＩＦＮγ放出である。ＩＦＮγ放出データは、２人の異なる健常ドナーに由来するＣＤ８＋Ｔ細胞を用いて得られた。ＲＮＡ電気穿孔ＣＤ８＋Ｔ細胞単独、または未負荷標的細胞との同時インキュベーションが、対照の役割を果たした。ドナー１（ＴＣＲＡ−０００６）は左のＹ軸上に、ドナー２（ＴＣＲＡ−０００７）は右のＹ軸上にそれぞれ示される。
【図１０】１０μＭ〜１０ｐＭの様々なペプチド負荷濃度における、ＤＣＡＦ４Ｌ２−００１ペプチド（配列番号４９）が負荷されたＴ２標的細胞との同時インキュベーション後における、ＴＣＲ  Ｒ３６Ｐ３Ｆ９（表１）のα鎖およびβ鎖ＲＮＡで電気穿孔されたＣＤ８＋Ｔ細胞からのＩＦＮγ放出である。ＲＮＡ電気穿孔ＣＤ８＋Ｔ細胞単独、または未負荷標的細胞との同時インキュベーションが、対照の役割を果たした。
【図１１】ＤＣＡＦ４Ｌ２−００１ペプチド（配列番号４９）、または配列番号１（配列番号７０〜７８）の１〜９位における様々なＤＣＡＦ４Ｌ２−００１スレオニン置換変異型、または対照ペプチドＮＹＥＳＯ１−００１（配列番号６９）が負荷されたＴ２標的細胞との同時インキュベーション後における、ＴＣＲ  Ｒ５２Ｐ２Ｇ１１（表１）のα鎖およびβ鎖ＲＮＡで電気穿孔されたＣＤ８＋Ｔ細胞からのＩＦＮγ放出である。ＩＦＮγ放出データは、２人の異なる健常ドナーに由来するＣＤ８＋Ｔ細胞を用いて得られた。ＲＮＡ電気穿孔ＣＤ８＋Ｔ細胞単独、または未負荷標的細胞との同時インキュベーションが、対照の役割を果たした。
【図１２】ＤＣＡＦ４Ｌ２−００１ペプチド（配列番号４９）、または配列番号１（配列番号７０〜７８）の１〜９位における様々なＤＣＡＦ４Ｌ２−００１スレオニン置換変異型、または対照ペプチドＮＹＥＳＯ１−００１（配列番号６９）が負荷されたＴ２標的細胞との同時インキュベーション後における、ＴＣＲ  Ｒ５３Ｐ２Ａ９（表１）のα鎖およびβ鎖ＲＮＡで電気穿孔されたＣＤ８＋Ｔ細胞からのＩＦＮγ放出である。ＩＦＮγ放出データは、２人の異なる健常ドナーに由来するＣＤ８＋Ｔ細胞を用いて得られた。ＲＮＡ電気穿孔ＣＤ８＋Ｔ細胞単独、または未負荷標的細胞との同時インキュベーションが、対照の役割を果たした。
【図１３】ＤＣＡＦ４Ｌ２−発現Ａ３７５細胞（Ｂ、Ｄ、Ｆ）における内在性にプロセスされ提示されたＤＣＡＦ４Ｌ２−００１のＴＣＲ媒介認識を評価するための、ＴＣＲ  Ｒ５２Ｐ２Ｇ１１またはＴＣＲ  Ｒ５３Ｐ２Ａ９のα鎖およびβ鎖を含有する異なるコンストラクトによるレンチウイルス形質導入後における、腫瘍増殖（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）およびＴ細胞のＩＦＮγ放出（Ｅ、Ｆ）に対する効果である。標的陰性Ａ３７５細胞が、対照の役割を果たした（Ａ、Ｃ、Ｅ）。２人のドナーからのデータ、１４１５４０（Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ）および１０５（Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ）が示される。
【０１６１】
表1:本発明のＴＣＲ配列
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【０１６２】
表2:本発明のペプチド配列および関連配列
【表２】
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【０１６３】
実施例
【０１６４】
背景
それぞれ、腫瘍特異的ＴＣＲ−αおよびＴＣＲ−β鎖をコードする３つのＤＣＡＦ４Ｌ２−００１特異的ＴＣＲ（Ｒ３６Ｐ３Ｆ９、Ｒ５２Ｐ２Ｇ１１、およびＲ５３Ｐ２Ａ９、表１を参照されたい）を健常ドナーのＴ細胞から単離し、増幅した。健常ドナーに由来する細胞は、以前記載された方法に従って生体外で刺激し（Ｗａｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｎｏｖ  １５；１７１（１０）：４９７４−８）、ＨＬＡ−Ａ＊０２多量体を用いて標的特異的細胞を単細胞ソートし、次に引き続くＴＣＲ単離のために使用した。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ  ｆｏｕｒｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋに記載されるように、標準法によって５’ＲＡＣＥを通じてＴＣＲ配列を単離した。ＴＣＲ  Ｒ３６Ｐ３Ｆ９、ＴＣＲ  Ｒ５２Ｐ２Ｇ１１、およびＴＣＲ  Ｒ５３Ｐ２Ａ９のαおよびβ可変領域を配列決定し、さらなる機能特性解析のために、発現コンストラクトを遺伝子合成によって作製した。Ｒ３６Ｐ３Ｆ９はＨＬＡ−Ａ＊０２陽性ドナーに由来し、Ｒ５２Ｐ２Ｇ１１およびＲ５３Ｐ２Ａ９はＨＬＡ−Ａ＊０２陰性ドナーに由来する（アロ反応性設定）。
【０１６５】
目的のＴＣＲを例えば、ｍＲＮＡ電気穿孔またはレンチウイルス形質導入による形質導入によって、ヒトＴ細胞で発現させた。レンチウイルス形質導入のために、ＰＢＭＣを解凍し、一晩休ませ、次に固定化抗体を用いて活性化した。活性化細胞をＤＣＡＦ４Ｌ２特異的ＴＣＲをコードするレンチウイルスベクターを用いて形質導入し、そしてサイトカインの存在下で増殖させた。Ｔ細胞を収集し、遠心分離によって濃縮し、次に凍結保存した。
【０１６６】
異なるペプチドを負荷したＴ２細胞などの異なる標的細胞との共培養後におけるＩＦＮ−γ放出について、Ｔ細胞を評価した。ＴＣＲ  Ｒ５２Ｐ２Ｇ１１およびＴＣＲ  Ｒ５３Ｐ２Ａ９を発現するＣＤ８＋Ｔ細胞の効力は、非修飾Ａ３７５細胞と比較して、例えば、Ｔ細胞活性化研究（ＩＦＮγ放出）によって、またはＤＣＡＦ４Ｌ２形質導入Ａ３７５腫瘍細胞株を標的細胞として用いる死滅アッセイによって判定した。
【０１６７】
実施例１：Ｔ細胞受容体Ｒ３６Ｐ３Ｆ９
ＴＣＲ  Ｒ３６Ｐ３Ｆ９（配列番号１〜１２）は、ＨＬＡ−Ａ＊０２を提示するＤＣＡＦ４Ｌ２−００１に対して拘束されている（図４参照）。
【０１６８】
Ｒ３６Ｐ３Ｆ９は、ＤＣＡＦ４Ｌ２−００１ペプチドまたはＤＣＡＦ４Ｌ２−００１のアラニン置換変異型のどちらかが負荷されたＨＬＡ−Ａ＊０２＋標的細胞との同時インキュベーションに際して、このＴＣＲ放出ＩＦＮγを再発現するヒト初代ＣＤ８＋Ｔ細胞としてＤＣＡＦ４Ｌ２−００１を特異的に認識する（図１）。ＴＣＲ  Ｒ３６Ｐ３Ｆ９はＤＣＡＦ４Ｌ２−００１を特異的に認識するが、ＤＣＡＦ４Ｌ２−００１との高度な配列類似性を示す異なるペプチドは認識しない（図４）。ＮＹＥＳＯ１−００１ペプチドを陰性対照として使用する。
【０１６９】
Ｒ３６Ｐ３Ｆ９の標的ペプチド滴定分析（図１０）は、３．６ｎＭの範囲のＥＣ５０を示した。
【０１７０】
実施例２：Ｔ細胞受容体Ｒ５２Ｐ２Ｇ１１
ＴＣＲ  Ｒ５２Ｐ２Ｇ１１（配列番号１３〜２４）は、ＨＬＡ−Ａ＊０２を提示するＤＣＡＦ４Ｌ２−００１に対して拘束されている（図５参照）。
【０１７１】
Ｒ５２Ｐ２Ｇ１１は、ＤＣＡＦ４Ｌ２−１１ペプチドまたはＤＣＡＦ４Ｌ２−００１のアラニンおよびスレオニン置換変異型のどちらかが負荷されたＨＬＡ−Ａ＊０２＋標的細胞との同時インキュベーションに際して、このＴＣＲ放出ＩＦＮγを再発現するヒト初代ＣＤ８＋Ｔ細胞としてＤＣＡＦ４Ｌ２−００１を特異的に認識する（図２および１１）。ＴＣＲ  Ｒ５２Ｐ２Ｇ１１は、ＤＣＡＦ４Ｌ２−００１を特異的に認識するが、ＤＣＡＦ４Ｌ２−００１との高度な配列類似性を示す異なるペプチドは認識しない（図５）。ＮＹＥＳＯ１−００１ペプチドを陰性対照として使用する。
【０１７２】
Ｒ５２Ｐ２Ｇ１１の再発現は、ヒト初代ＣＤ８＋Ｔ細胞においてＨＬＡ−Ａ＊０２／ＤＣＡＦ４Ｌ２−００１四量体の選択的結合をもたらすが、ＨＬＡ−Ａ＊０２／ＮＹＥＳＯ１−００１四量体の結合はもたらさない（図７）。ＮＹＥＳＯ１−００１特異的ＴＣＲ１Ｇ４の再発現および模擬発現を対照として使用する。
【０１７３】
Ｒ５２Ｐ２Ｇ１１の標的ペプチド滴定分析（図８）は、約８．５ｎＭの範囲のＥＣ５０を示した。
【０１７４】
ヒト初代ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＲ５２Ｐ２Ｇ１１の再発現は、ＤＣＡＦ４Ｌ２形質導入Ａ３７５腫瘍細胞株の選択的認識をもたらすが、非修飾Ａ３７５細胞ではもたらさない（図１３）。非形質導入Ｔ細胞を対象として使用した。ＨＬＡ−Ａ＊０２およびＤＣＡＦ４Ｌ２−００１を発現する細胞株との共培養時におけるＴ細胞活性化は、ＴＣＲ  Ｒ５２Ｐ２Ｇ１１による内在性に提示された標的ｐＨＬＡの認識を反映する（図１３）。
【０１７５】
実施例３：Ｔ細胞受容体Ｒ５３Ｐ２Ａ９
ＴＣＲ  Ｒ５３Ｐ２Ａ９（配列番号２５〜３６）は、ＨＬＡ−Ａ＊０２を提示するＤＣＡＦ４Ｌ２−００１に対して拘束されている（図６参照）。
【０１７６】
Ｒ５３Ｐ２Ａ９は、ＤＣＡＦ４Ｌ２−００１ペプチドまたはＤＣＡＦ４Ｌ２−００１のアラニンおよびスレオニン置換変異型のどちらかが負荷されたＨＬＡ−Ａ＊０２＋標的細胞との同時インキュベーションに際して、このＴＣＲ放出ＩＦＮγを再発現するヒト初代ＣＤ８＋Ｔ細胞としてＤＣＡＦ４Ｌ２−００１を特異的に認識する（図３および１２）。ＴＣＲ  Ｒ５３Ｐ２Ａ９はＤＣＡＦ４Ｌ２−００１を特異的に認識するが、ＤＣＡＦ４Ｌ２−００１との高度な配列類似性を示す異なるペプチドは認識しない（図６）。ＮＹＥＳＯ１−００１ペプチドを陰性対照として使用する。
【０１７７】
Ｒ５３Ｐ２Ａ９の再発現は、ヒト初代ＣＤ８＋Ｔ細胞においてＨＬＡ−Ａ＊０２／ＤＣＡＦ４Ｌ２−００１四量体の選択的結合をもたらすが、ＨＬＡ−Ａ＊０２／ＮＹＥＳＯ１−００１四量体の結合はもたらさない（図７）。ＮＹＥＳＯ１−００１特異的ＴＣＲ１Ｇ４の再発現および模擬発現を対照として使用する。
【０１７８】
Ｒ５３Ｐ２Ａ９の標的ペプチド滴定分析（図９）は、約１１．８ｎＭの範囲のＥＣ５０を示した。
【０１７９】
ヒト初代ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＲ５３Ｐ２Ａ９の再発現は、ＤＣＡＦ４Ｌ２形質導入Ａ３７５腫瘍細胞株の選択的認識をもたらすが、非修飾Ａ３７５細胞ではもたらさない（図１３）。非形質導入細胞を対象として使用した。ＨＬＡ−Ａ＊０２およびＤＣＡＦ４Ｌ２−００１を発現する細胞株との共培養時におけるＴ細胞活性化は、ＴＣＲ  Ｒ５３Ｐ２Ａ９による内在性にプロセスされた標的ｐＨＬＡの認識を反映する（図１３）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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