(57)【要約】  本明細書において特に、生物活性剤（例えば治療剤または診断剤）のインビボ送達に有用な組成物および方法が提供される。本明細書において提供される組成物は、カチオン性脂質、ヘルパー脂質および生体安定性強化剤を含み、それらが生物活性剤とともに脂質凝集体を形成し、生体分子標的化を必要とすることなく、例えば肺組織などへの生物活性剤の全身送達を可能とする。【選択図】図４Ａ
2020532546.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）約０．１８〜約０．３２の組成モル比であり、以下の式（Ｉ）の第一のカチオン性脂質であって、
【化１】
2020532546.tif 000018
（Ｉ）
式中、
Ｒ1およびＲ2は独立して、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、または置換もしくは非置換のヘテロアリールである；
Ｒ3およびＲ4は独立して、水素、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、または置換もしくは非置換のヘテロアリールである；
ｍは、１〜６の整数である；
Ｘa-は、アニオンである、第一のカチオン性脂質；
（ｉｉ）約０．２４〜約０．５１の組成モル比であり、以下の式（ＩＩ）の第二のカチオン性脂質であって、
【化２】
2020532546.tif 000019
（ＩＩ）
式中、
Ｒ5およびＲ8は独立して、水素、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、または置換もしくは非置換のヘテロアリールである；
Ｒ6およびＲ7は独立して、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、または置換もしくは非置換のヘテロアリールである；
ｎは、１〜６の整数である；および
Ｘb-は、アニオンである、第二のカチオン性脂質；
（ｉｉｉ）約０．２０〜約０．３２の組成モル比の第一のヘルパー脂質；
（ｉｖ）約０．０１〜約０．１４の組成モル比の第二のヘルパー脂質；および
（ｖ）約０．０１〜約０．０２の組成モル比の生体安定性強化剤、を含む組成物。
【請求項２】
ｍは、約１〜５の整数である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ｍは、約１〜４の整数である、請求項１〜２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４】
ｍは、約１〜３の整数である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
ｍは、１である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
ｍは、２である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
ｍは、３である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
ｍは、４である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
ｍは、５である、請求項１〜２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
ｍは、６である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
ｎは、約１〜５の整数である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
ｎは、約１〜４の整数である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
ｎは、約１〜３の整数である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
ｎは、１である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
ｎは、２である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
ｎは、３である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
ｎは、４である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
ｎは、５である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
ｎは、６である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記第一のカチオン性脂質が、約０．１８の組成モル比で存在する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記第一のカチオン性脂質が、約０．２３の組成モル比で存在する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記第一のカチオン性脂質が、約０．２４の組成モル比で存在する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記第一のカチオン性脂質が、約０．２５の組成モル比で存在する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２４】
前記第一のカチオン性脂質が、約０．２７の組成モル比で存在する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２５】
前記第一のカチオン性脂質が、約０．２８の組成モル比で存在する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２６】
前記第一のカチオン性脂質が、約０．３２の組成モル比で存在する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２７】
前記第一のカチオン性脂質が、以下の式：
【化３】
2020532546.tif 000020
（ＩＡ）を有し、
式中、
Ｘa-は、Ｃｌ-またはＣＨ3ＣＯＯ-である、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２８】
Ｘa-は、ＣＨ3ＣＯＯ-である、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２９】
前記第一のカチオン性脂質が、ジヒドロキシジミリスチルスペルミジンである、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
前記第二のカチオン性脂質が、約０．２４の組成モル比で存在する、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３１】
前記第二のカチオン性脂質が、約０．３８の組成モル比で存在する、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３２】
前記第二のカチオン性脂質が、約０．３９の組成モル比で存在する、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３３】
前記第二のカチオン性脂質が、約０．４０の組成モル比で存在する、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３４】
前記第二のカチオン性脂質が、約０．４５の組成モル比で存在する、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３５】
前記第二のカチオン性脂質が、約０．４７の組成モル比で存在する、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３６】
前記第二のカチオン性脂質が、約０．５１の組成モル比で存在する、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３７】
前記第二のカチオン性脂質が、以下の式：
【化４】
2020532546.tif 000021
（ＩＩＡ）を有し、
式中、
Ｘb-は、Ｃｌ-またはＣＨ3ＣＯＯ-である、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３８】
Ｘb-は、ＣＨ3ＣＯＯ-である、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３９】
前記第二のカチオン性脂質が、ヒドロキシジミリスチルスペルミジンである、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
前記第一のヘルパー脂質が、約０．２０の組成モル比で存在する、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４１】
前記第一のヘルパー脂質が、約０．２４の組成モル比で存在する、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４２】
前記第一のヘルパー脂質が、約０．２６の組成モル比で存在する、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４３】
前記第一のヘルパー脂質が、約０．３２の組成モル比で存在する、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４４】
前記第一のヘルパー脂質が、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である、請求項１〜４３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４５】
前記第二のヘルパー脂質が、約０．０１の組成モル比で存在する、請求項１〜４４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４６】
前記第二のヘルパー脂質が、約０．０５の組成モル比で存在する、請求項１〜４４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４７】
前記第二のヘルパー脂質が、約０．０８の組成モル比で存在する、請求項１〜４４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４８】
前記第二のヘルパー脂質が、約０．１０の組成モル比で存在する、請求項１〜４４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４９】
前記第二のヘルパー脂質が、約０．１４の組成モル比で存在する、請求項１〜４４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５０】
前記第二のヘルパー脂質が、コレステロールである、請求項１〜４９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５１】
前記生体安定性強化剤が、約０．０１の組成モル比で存在する、請求項１〜５０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５２】
前記生体安定性強化剤が、約０．０２の組成モル比で存在する、請求項１〜５０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５３】
前記生体安定性強化剤が、ポリエーテル化合物である、請求項１〜５２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５４】
前記生体安定性強化剤が、ＰＥＧ化リン脂質である、請求項１〜５２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５５】
前記生体安定性強化剤が、ポリエチレングリコールである、請求項１〜５３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５６】
前記生体安定性強化剤が、約７５０ｇ／ｍｏｌの分子量を有する、請求項１〜５３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５７】
前記生体安定性強化剤が、約２０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有する、請求項１〜５３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５８】
前記生体安定性強化剤が、約５０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有する、請求項１〜５３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５９】
前記生体安定性強化剤が、Ｃ１４ポリエチレングリコール７５０である、請求項１〜５３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６０】
前記生体安定性強化剤が、Ｃ１４ポリエチレングリコール２０００である、請求項１〜５３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６１】
前記生体安定性強化剤が、Ｃ１４ポリエチレングリコール５０００である、請求項１〜５３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６２】
（ｉ）約０．２４の組成モル比の第一のカチオン性脂質であって、前記第一のカチオン性脂質は、ジヒドロキシジミリスチルスペルミジンである、第一のカチオン性脂質；
（ｉｉ）約０．３８の組成モル比の第二のカチオン性脂質であって、前記第二のカチオン性脂質は、ヒドロキシジミリスチルスペルミジンである、第二のカチオン性脂質；
（ｉｉｉ）約０．３２の組成モル比の第一のヘルパー脂質であって、前記第一のヘルパー脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンである、第一のヘルパー脂質；
（ｉｖ）約０．０５の組成モル比の第二のヘルパー脂質であって、前記第二のヘルパー脂質は、コレステロールである、第二のヘルパー脂質；および
（ｖ）約０．０１の組成モル比の生体安定性強化剤であって、前記生体安定性強化剤は、Ｃ１４ポリエチレングリコール５０００である、生体安定性強化剤、を含む組成物。
【請求項６３】
（ｉ）約０．３２の組成モル比の第一のカチオン性脂質であって、前記第一のカチオン性脂質は、ジヒドロキシジミリスチルスペルミジンである、第一のカチオン性脂質；
（ｉｉ）約０．３９の組成モル比の第二のカチオン性脂質であって、前記第二のカチオン性脂質は、ヒドロキシジミリスチルスペルミジンである、第二のカチオン性脂質；
（ｉｉｉ）約０．２６の組成モル比の第一のヘルパー脂質であって、前記第一のヘルパー脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンである、第一のヘルパー脂質；
（ｉｖ）約０．０１の組成モル比の第二のヘルパー脂質であって、前記第二のヘルパー脂質は、コレステロールである、第二のヘルパー脂質；および
（ｖ）約０．０２の組成モル比の生体安定性強化剤であって、前記生体安定性強化剤は、Ｃ１４ポリエチレングリコール５０００である、生体安定性強化剤、を含む組成物。
【請求項６４】
（ｉ）約０．１８の組成モル比の第一のカチオン性脂質であって、前記第一のカチオン性脂質は、ジヒドロキシジミリスチルスペルミジンである、第一のカチオン性脂質；
（ｉｉ）約０．３８の組成モル比の第二のカチオン性脂質であって、前記第二のカチオン性脂質は、ヒドロキシジミリスチルスペルミジンである、第二のカチオン性脂質；
（ｉｉｉ）約０．３２の組成モル比の第一のヘルパー脂質であって、前記第一のヘルパー脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンである、第一のヘルパー脂質；
（ｉｖ）約０．１０の組成モル比の第二のヘルパー脂質であって、前記第二のヘルパー脂質は、コレステロールである、第二のヘルパー脂質；および
（ｖ）約０．０２の組成モル比の生体安定性強化剤であって、前記生体安定性強化剤は、Ｃ１４ポリエチレングリコール５０００である、生体安定性強化剤、を含む組成物。
【請求項６５】
（ｉ）約０．２３の組成モル比の第一のカチオン性脂質であって、前記第一のカチオン性脂質は、ジヒドロキシジミリスチルスペルミジンである、第一のカチオン性脂質；
（ｉｉ）約０．４５の組成モル比の第二のカチオン性脂質であって、前記第二のカチオン性脂質は、ヒドロキシジミリスチルスペルミジンである、第二のカチオン性脂質；
（ｉｉｉ）約０．２０の組成モル比の第一のヘルパー脂質であって、前記第一のヘルパー脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンである、第一のヘルパー脂質；
（ｉｖ）約０．１０の組成モル比の第二のヘルパー脂質であって、前記第二のヘルパー脂質は、コレステロールである、第二のヘルパー脂質；および
（ｖ）約０．０２の組成モル比の生体安定性強化剤であって、前記生体安定性強化剤は、Ｃ１４ポリエチレングリコール５０００である、生体安定性強化剤、を含む組成物。
【請求項６６】
（ｉ）約０．１８の組成モル比の第一のカチオン性脂質であって、前記第一のカチオン性脂質は、ジヒドロキシジミリスチルスペルミジンである、第一のカチオン性脂質；
（ｉｉ）約０．５１の組成モル比の第二のカチオン性脂質であって、前記第二のカチオン性脂質は、ヒドロキシジミリスチルスペルミジンである、第二のカチオン性脂質；
（ｉｉｉ）約０．２０の組成モル比の第一のヘルパー脂質であって、前記第一のヘルパー脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンである、第一のヘルパー脂質；
（ｉｖ）約０．１０の組成モル比の第二のヘルパー脂質であって、前記第二のヘルパー脂質は、コレステロールである、第二のヘルパー脂質；および
（ｖ）約０．０１の組成モル比の生体安定性強化剤であって、前記生体安定性強化剤は、Ｃ１４ポリエチレングリコール５０００である、生体安定性強化剤、を含む組成物。
【請求項６７】
（ｉ）約０．２７の組成モル比の第一のカチオン性脂質であって、前記第一のカチオン性脂質は、ジヒドロキシジミリスチルスペルミジンである、第一のカチオン性脂質；
（ｉｉ）約０．３８の組成モル比の第二のカチオン性脂質であって、前記第二のカチオン性脂質は、ヒドロキシジミリスチルスペルミジンである、第二のカチオン性脂質；
（ｉｉｉ）約０．３２の組成モル比の第一のヘルパー脂質であって、前記第一のヘルパー脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンである、第一のヘルパー脂質；
（ｉｖ）約０．０１の組成モル比の第二のヘルパー脂質であって、前記第二のヘルパー脂質は、コレステロールである、第二のヘルパー脂質；および
（ｖ）約０．０２の組成モル比の生体安定性強化剤であって、前記生体安定性強化剤は、Ｃ１４ポリエチレングリコール５０００である、生体安定性強化剤、を含む組成物。
【請求項６８】
（ｉ）約０．２５の組成モル比の第一のカチオン性脂質であって、前記第一のカチオン性脂質は、ジヒドロキシジミリスチルスペルミジンである、第一のカチオン性脂質；
（ｉｉ）約０．３８の組成モル比の第二のカチオン性脂質であって、前記第二のカチオン性脂質は、ヒドロキシジミリスチルスペルミジンである、第二のカチオン性脂質；
（ｉｉｉ）約０．２６の組成モル比の第一のヘルパー脂質であって、前記第一のヘルパー脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンである、第一のヘルパー脂質；
（ｉｖ）約０．１０の組成モル比の第二のヘルパー脂質であって、前記第二のヘルパー脂質は、コレステロールである、第二のヘルパー脂質；および
（ｖ）約０．０１の組成モル比の生体安定性強化剤であって、前記生体安定性強化剤は、Ｃ１４ポリエチレングリコール５０００である、生体安定性強化剤、を含む組成物。
【請求項６９】
（ｉ）約０．２８の組成モル比の第一のカチオン性脂質であって、前記第一のカチオン性脂質は、ジヒドロキシジミリスチルスペルミジンである、第一のカチオン性脂質；
（ｉｉ）約０．２４の組成モル比の第二のカチオン性脂質であって、前記第二のカチオン性脂質は、ヒドロキシジミリスチルスペルミジンである、第二のカチオン性脂質；
（ｉｉｉ）約０．３２の組成モル比の第一のヘルパー脂質であって、前記第一のヘルパー脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンである、第一のヘルパー脂質；
（ｉｖ）約０．１４の組成モル比の第二のヘルパー脂質であって、前記第二のヘルパー脂質は、コレステロールである、第二のヘルパー脂質；および
（ｖ）約０．０２の組成モル比の生体安定性強化剤であって、前記生体安定性強化剤は、Ｃ１４ポリエチレングリコール７５０である、生体安定性強化剤、を含む組成物。
【請求項７０】
（ｉ）約０．１８の組成モル比の第一のカチオン性脂質であって、前記第一のカチオン性脂質は、ジヒドロキシジミリスチルスペルミジンである、第一のカチオン性脂質；
（ｉｉ）約０．４７の組成モル比の第二のカチオン性脂質であって、前記第二のカチオン性脂質は、ヒドロキシジミリスチルスペルミジンである、第二のカチオン性脂質；
（ｉｉｉ）約０．３２の組成モル比の第一のヘルパー脂質であって、前記第一のヘルパー脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンである、第一のヘルパー脂質；
（ｉｖ）約０．０１の組成モル比の第二のヘルパー脂質であって、前記第二のヘルパー脂質は、コレステロールである、第二のヘルパー脂質；および
（ｖ）約０．０２の組成モル比の生体安定性強化剤であって、前記生体安定性強化剤は、Ｃ１４ポリエチレングリコール５０００である、生体安定性強化剤、を含む組成物。
【請求項７１】
（ｉ）約０．２４の組成モル比の第一のカチオン性脂質であって、前記第一のカチオン性脂質は、ジヒドロキシジミリスチルスペルミジンである、第一のカチオン性脂質；
（ｉｉ）約０．４０の組成モル比の第二のカチオン性脂質であって、前記第二のカチオン性脂質は、ヒドロキシジミリスチルスペルミジンである、第二のカチオン性脂質；
（ｉｉｉ）約０．２４の組成モル比の第一のヘルパー脂質であって、前記第一のヘルパー脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンである、第一のヘルパー脂質；
（ｉｖ）約０．１０の組成モル比の第二のヘルパー脂質であって、前記第二のヘルパー脂質は、コレステロールである、第二のヘルパー脂質；および
（ｖ）約０．０２の組成モル比の生体安定性強化剤であって、前記生体安定性強化剤は、Ｃ１４ポリエチレングリコール２０００である、生体安定性強化剤、を含む組成物。
【請求項７２】
（ｉ）約０．３２の組成モル比の第一のカチオン性脂質であって、前記第一のカチオン性脂質は、ジヒドロキシジミリスチルスペルミジンである、第一のカチオン性脂質；
（ｉｉ）約０．３８の組成モル比の第二のカチオン性脂質であって、前記第二のカチオン性脂質は、ヒドロキシジミリスチルスペルミジンである、第二のカチオン性脂質；
（ｉｉｉ）約０．２０の組成モル比の第一のヘルパー脂質であって、前記第一のヘルパー脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンである、第一のヘルパー脂質；
（ｉｖ）約０．０８の組成モル比の第二のヘルパー脂質であって、前記第二のヘルパー脂質は、コレステロールである、第二のヘルパー脂質；および
（ｖ）約０．０２の組成モル比の生体安定性強化剤であって、前記生体安定性強化剤は、Ｃ１４ポリエチレングリコール５０００である、生体安定性強化剤、を含む組成物。
【請求項７３】
生物活性剤をさらに含む、請求項１〜７２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７４】
前記生物活性剤が、治療剤または診断剤である、請求項７３に記載の組成物。
【請求項７５】
前記生物活性剤が、核酸、リボヌクレオタンパク質または低分子を含む、請求項７３または７４に記載の組成物。
【請求項７６】
前記核酸が、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはガイドＲＮＡである、請求項７５に記載の組成物。
【請求項７７】
前記生物活性剤が、核酸およびリボヌクレオタンパク質を含む、請求項７６に記載の組成物。
【請求項７８】
前記リボヌクレオタンパク質が、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）である、請求項７７に記載の組成物。
【請求項７９】
請求項１〜７８のいずれか１項に記載の組成物、および薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項８０】
請求項１〜７８のいずれか１項に記載の組成物を含む細胞。
【請求項８１】
前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項８０に記載の細胞。
【請求項８２】
前記細胞が、齧歯類細胞である、請求項８０に記載の細胞。
【請求項８３】
前記細胞が、マウス細胞である、請求項８０に記載の細胞。
【請求項８４】
前記細胞が、ラット細胞である、請求項８０に記載の細胞。
【請求項８５】
前記細胞が、ブタ細胞である、請求項８０に記載の細胞。
【請求項８６】
前記細胞が、イヌ細胞である、請求項８０に記載の細胞。
【請求項８７】
前記細胞が、霊長類細胞である、請求項８０に記載の細胞。
【請求項８８】
前記細胞が、上皮細胞である、請求項８０〜８７のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項８９】
前記細胞が、肺上皮細胞である、請求項８０〜８７のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項９０】
前記細胞が、内皮細胞である、請求項８０〜８７のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項９１】
前記細胞が、肺内皮細胞である、請求項８０〜８７のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項９２】
前記細胞が、生物体の一部を形成する、請求項８０〜９１のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項９３】
前記生物体が、ヒトである、請求項９２に記載の細胞。
【請求項９４】
生物活性剤を細胞に送達する方法であって、
（ｉ）請求項１〜７２のいずれか１項に記載の組成物と生物活性剤を混合し、それにより生物活性剤−脂質複合体を形成させる工程；
（ｉｉ）前記生物活性剤−脂質複合体と細胞を接触させ、それにより前記生物活性剤−脂質複合体を細胞に送達する工程、を含む、方法。
【請求項９５】
前記生物活性剤−脂質複合体が前記細胞内に入るのを許容することをさらに含む、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記生物活性剤が、治療剤または診断剤である、請求項９４または９５に記載の方法。
【請求項９７】
前記生物活性剤が、核酸、リボヌクレオタンパク質または低分子を含む、請求項９４〜９６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９８】
前記核酸が、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはガイドＲＮＡである、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
前記生物活性剤が、ガイドＲＮＡおよびリボヌクレオタンパク質を含む、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記リボヌクレオタンパク質が、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）である、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記リボヌクレオタンパク質が、前記ガイドＲＮＡに結合される、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０２】
前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項９４に記載の方法。
【請求項１０３】
前記細胞が、齧歯類細胞である、請求項９４に記載の方法。
【請求項１０４】
前記細胞が、マウス細胞である、請求項９４に記載の方法。
【請求項１０５】
前記細胞が、ラット細胞である、請求項９４に記載の方法。
【請求項１０６】
前記細胞が、ブタ細胞である、請求項９４に記載の方法。
【請求項１０７】
前記細胞が、イヌ細胞である、請求項９４に記載の方法。
【請求項１０８】
前記細胞が、霊長類細胞である、請求項９４に記載の方法。
【請求項１０９】
前記細胞が、上皮細胞である、請求項９４〜１０８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１０】
前記細胞が、肺上皮細胞である、請求項９４〜１０８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１１】
前記細胞が、内皮細胞である、請求項９４〜１０８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１２】
前記細胞が、肺内皮細胞である、請求項９４〜１０８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１３】
生物活性剤を対象の肺組織に送達する方法であって、
（ｉ）請求項１〜７２のいずれか１項に記載の組成物と生物活性剤を混合し、それにより生物活性剤−脂質複合体を形成させる工程；
（ｉｉ）前記生物活性剤−脂質複合体の有効量を対象に全身投与し、それにより前記生物活性剤−脂質複合体を対象の肺組織に送達させる工程、を含む、方法。
【請求項１１４】
対象の肺組織においてタンパク質を発現させる方法であって、
（ｉ）請求項１〜７２のいずれか１項に記載の組成物とｍＲＮＡを混合し、それによりｍＲＮＡ−脂質複合体を形成させる工程；
（ｉｉ）前記ｍＲＮＡ−脂質複合体の有効量を対象に投与する工程；および
（ｉｉｉ）前記ｍＲＮＡ−脂質複合体の前記ｍＲＮＡを前記対象の肺組織において発現させ、それにより対象の肺組織でタンパク質を発現させる工程、を含む、方法。
【請求項１１５】
その必要のある対象において肺疾患を治療する方法であって、生物活性剤の治療有効量および請求項１〜７２のいずれか１項に記載の組成物を対象に投与し、それにより前記対象において肺疾患を治療する工程、を含む、方法。
【請求項１１６】
前記組成物および前記生物活性剤が、前記投与の前に混合される、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
前記生物活性剤が、核酸、リボヌクレオタンパク質または低分子を含む、請求項１１５または１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
前記核酸が、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはガイドＲＮＡである、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
前記肺疾患が、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺癌、または嚢胞性線維症である、請求項１１５〜１１８のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
例えば治療用核酸などの搭載物の特定組織への送達には、送達ビヒクルとして機能する脂質ナノ粒子の表面上にリガンドまたは受容体を発現させることによる生体分子標的化を使用して従来、実施されていた。標準的な生体分子標的化技術を使用することなく、特定の臓器、組織または細胞型を標的とすることができる脂質ナノ粒子を設計することは非常に困難であった。脂質ナノ粒子に本来備わっている特性を操作することで、臓器、組織および細胞型特異的な標的化の手段が得られる。本明細書において、この課題および当分野の他のニーズを解消する組成物および方法が提供される。
【発明の概要】
【０００２】
ある態様において、（ｉ）約０．１８〜約０．３２の組成モル比であり、以下の式の第一のカチオン性脂質であって、
【化１】
2020532546.tif 000003
式中、Ｒ1およびＲ2は独立して、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、または置換もしくは非置換のヘテロアリールであり；Ｒ3およびＲ4は独立して、水素、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、または置換もしくは非置換のヘテロアリールであり；ｍは、１〜６の整数であり；Ｘa-は、アニオンである、第一のカチオン性脂質；（ｉｉ）約０．２４〜約０．５１の組成モル比であり、以下の式の第二のカチオン性脂質であって、
【化２】
2020532546.tif 000004
（ＩＩ）
式中、Ｒ5およびＲ8は独立して、水素、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、または置換もしくは非置換のヘテロアリールであり；Ｒ6およびＲ7は独立して、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、または置換もしくは非置換のヘテロアリールであり；ｎは、１〜６の整数であり；およびＸb-は、アニオンである、第二のカチオン性脂質；（ｉｉｉ）第一のヘルパー脂質；（ｉｖ）第二のヘルパー脂質；ならびに（ｖ）生体安定性強化剤（ｂｉｏｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、を含む組成物が提供される。
【０００３】
ある態様において、（ｉ）約０．１８〜約０．３２の組成モル比であり、以下の式の第一のカチオン性脂質であって、
【化３】
2020532546.tif 000005
式中、Ｒ1およびＲ2は独立して、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、または置換もしくは非置換のヘテロアリールであり；Ｒ3およびＲ4は独立して、水素、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、または置換もしくは非置換のヘテロアリールであり；ｍは、１〜６の整数であり；Ｘa-は、アニオンである、第一のカチオン性脂質；（ｉｉ）約０．２４〜約０．５１の組成モル比であり、以下の式の第二のカチオン性脂質であって、
【化４】
2020532546.tif 000006
（ＩＩ）
式中、Ｒ5およびＲ8は独立して、水素、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、または置換もしくは非置換のヘテロアリールであり；Ｒ6およびＲ7は独立して、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、または置換もしくは非置換のヘテロアリールであり；ｎは、１〜６の整数であり；およびＸb-は、アニオンである、第二のカチオン性脂質；（ｉｉｉ）約０．２０〜約０．３２の組成モル比の第一のヘルパー脂質；（ｉｖ）第二のヘルパー脂質；ならびに（ｖ）生体安定性強化剤、を含む組成物が提供される。
【０００４】
ある態様において、（ｉ）約０．１８〜約０．３２の組成モル比であり、以下の式の第一のカチオン性脂質であって、
【化５】
2020532546.tif 000007
式中、Ｒ1およびＲ2は独立して、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、または置換もしくは非置換のヘテロアリールであり；Ｒ3およびＲ4は独立して、水素、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、または置換もしくは非置換のヘテロアリールであり；ｍは、１〜６の整数であり；Ｘa-は、アニオンである、第一のカチオン性脂質；（ｉｉ）約０．２４〜約０．５１の組成モル比であり、以下の式の第二のカチオン性脂質であって、
【化６】
2020532546.tif 000008
（ＩＩ）
式中、Ｒ5およびＲ8は独立して、水素、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、または置換もしくは非置換のヘテロアリールであり；Ｒ6およびＲ7は独立して、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、または置換もしくは非置換のヘテロアリールであり；ｎは、１〜６の整数であり；およびＸb-は、アニオンである、第二のカチオン性脂質；（ｉｉｉ）約０．２０〜約０．３２の組成モル比の第一のヘルパー脂質；（ｉｖ）約０．０１〜約０．１４の組成モル比の第二のヘルパー脂質；ならびに（ｖ）生体安定性強化剤、を含む組成物が提供される。
【０００５】
ある態様において、（ｉ）約０．１８〜約０．３２の組成モル比であり、以下の式の第一のカチオン性脂質であって、
【化７】
2020532546.tif 000009
式中、Ｒ1およびＲ2は独立して、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、または置換もしくは非置換のヘテロアリールであり；Ｒ3およびＲ4は独立して、水素、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、または置換もしくは非置換のヘテロアリールであり；ｍは、１〜６の整数であり；Ｘa-は、アニオンである、第一のカチオン性脂質；（ｉｉ）約０．２４〜約０．５１の組成モル比であり、以下の式の第二のカチオン性脂質であって、
【化８】
2020532546.tif 000010
（ＩＩ）
式中、Ｒ5およびＲ8は独立して、水素、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、または置換もしくは非置換のヘテロアリールであり；Ｒ6およびＲ7は独立して、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、または置換もしくは非置換のヘテロアリールであり；ｎは、１〜６の整数であり；およびＸb-は、アニオンである、第二のカチオン性脂質；（ｉｉｉ）約０．２０〜約０．３２の組成モル比の第一のヘルパー脂質；（ｉｖ）約０．０１〜約０．１４の組成モル比の第二のヘルパー脂質；ならびに（ｖ）約０．０１〜約０．０２の組成モル比の生体安定性強化剤、を含む組成物が提供される。
【０００６】
ある態様において、（ｉ）約０．２４の組成モル比の第一のカチオン性脂質であって、当該第一のカチオン性脂質は、ジヒドロキシジミリスチルスペルミジンである、第一のカチオン性脂質；（ｉｉ）約０．３８の組成モル比の第二のカチオン性脂質であって、当該第二のカチオン性脂質は、ヒドロキシジミリスチルスペルミジンである、第二のカチオン性脂質；（ｉｉｉ）約０．３２の組成モル比の第一のヘルパー脂質であって、当該第一のヘルパー脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンである、第一のヘルパー脂質；（ｉｖ）約０．０５の組成モル比の第二のヘルパー脂質であって、当該第二のヘルパー脂質は、コレステロールである、第二のヘルパー脂質；および（ｖ）約０．０１の組成モル比の生体安定性強化剤であって、当該生体安定性強化剤は、Ｃ１４ポリエチレングリコール５０００である、生体安定性強化剤、を含む組成物が提供される。
【０００７】
ある態様において、（ｉ）約０．３２の組成モル比の第一のカチオン性脂質であって、当該第一のカチオン性脂質は、ジヒドロキシジミリスチルスペルミジンである、第一のカチオン性脂質；（ｉｉ）約０．３９の組成モル比の第二のカチオン性脂質であって、当該第二のカチオン性脂質は、ヒドロキシジミリスチルスペルミジンである、第二のカチオン性脂質；（ｉｉｉ）約０．２６の組成モル比の第一のヘルパー脂質であって、当該第一のヘルパー脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンである、第一のヘルパー脂質；（ｉｖ）約０．０１の組成モル比の第二のヘルパー脂質であって、当該第二のヘルパー脂質は、コレステロールである、第二のヘルパー脂質；および（ｖ）約０．０２の組成モル比の生体安定性強化剤であって、当該生体安定性強化剤は、Ｃ１４ポリエチレングリコール５０００である、生体安定性強化剤、を含む組成物が提供される。
【０００８】
ある態様において、（ｉ）約０．１８の組成モル比の第一のカチオン性脂質であって、当該第一のカチオン性脂質は、ジヒドロキシジミリスチルスペルミジンである、第一のカチオン性脂質；（ｉｉ）約０．３８の組成モル比の第二のカチオン性脂質であって、当該第二のカチオン性脂質は、ヒドロキシジミリスチルスペルミジンである、第二のカチオン性脂質；（ｉｉｉ）約０．３２の組成モル比の第一のヘルパー脂質であって、当該第一のヘルパー脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンである、第一のヘルパー脂質；（ｉｖ）約０．１０の組成モル比の第二のヘルパー脂質であって、当該第二のヘルパー脂質は、コレステロールである、第二のヘルパー脂質；および（ｖ）約０．０２の組成モル比の生体安定性強化剤であって、当該生体安定性強化剤は、Ｃ１４ポリエチレングリコール５０００である、生体安定性強化剤、を含む組成物が提供される。
【０００９】
ある態様において、（ｉ）約０．２３の組成モル比の第一のカチオン性脂質であって、当該第一のカチオン性脂質は、ジヒドロキシジミリスチルスペルミジンである、第一のカチオン性脂質；（ｉｉ）約０．４５の組成モル比の第二のカチオン性脂質であって、当該第二のカチオン性脂質は、ヒドロキシジミリスチルスペルミジンである、第二のカチオン性脂質；（ｉｉｉ）約０．２０の組成モル比の第一のヘルパー脂質であって、当該第一のヘルパー脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンである、第一のヘルパー脂質；（ｉｖ）約０．１０の組成モル比の第二のヘルパー脂質であって、当該第二のヘルパー脂質は、コレステロールである、第二のヘルパー脂質；および（ｖ）約０．０２の組成モル比の生体安定性強化剤であって、当該生体安定性強化剤は、Ｃ１４ポリエチレングリコール５０００である、生体安定性強化剤、を含む組成物が提供される。
【００１０】
ある態様において、（ｉ）約０．１８の組成モル比の第一のカチオン性脂質であって、当該第一のカチオン性脂質は、ジヒドロキシジミリスチルスペルミジンである、第一のカチオン性脂質；（ｉｉ）約０．５１の組成モル比の第二のカチオン性脂質であって、当該第二のカチオン性脂質は、ヒドロキシジミリスチルスペルミジンである、第二のカチオン性脂質；（ｉｉｉ）約０．２０の組成モル比の第一のヘルパー脂質であって、当該第一のヘルパー脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンである、第一のヘルパー脂質；（ｉｖ）約０．１０の組成モル比の第二のヘルパー脂質であって、当該第二のヘルパー脂質は、コレステロールである、第二のヘルパー脂質；および（ｖ）約０．０１の組成モル比の生体安定性強化剤であって、当該生体安定性強化剤は、Ｃ１４ポリエチレングリコール５０００である、生体安定性強化剤、を含む組成物が提供される。
【００１１】
ある態様において、（ｉ）約０．２７の組成モル比の第一のカチオン性脂質であって、当該第一のカチオン性脂質は、ジヒドロキシジミリスチルスペルミジンである、第一のカチオン性脂質；（ｉｉ）約０．３８の組成モル比の第二のカチオン性脂質であって、当該第二のカチオン性脂質は、ヒドロキシジミリスチルスペルミジンである、第二のカチオン性脂質；（ｉｉｉ）約０．３２の組成モル比の第一のヘルパー脂質であって、当該第一のヘルパー脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンである、第一のヘルパー脂質；（ｉｖ）約０．０１の組成モル比の第二のヘルパー脂質であって、当該第二のヘルパー脂質は、コレステロールである、第二のヘルパー脂質；および（ｖ）約０．０２の組成モル比の生体安定性強化剤であって、当該生体安定性強化剤は、Ｃ１４ポリエチレングリコール５０００である、生体安定性強化剤、を含む組成物が提供される。
【００１２】
ある態様において、（ｉ）約０．２５の組成モル比の第一のカチオン性脂質であって、当該第一のカチオン性脂質は、ジヒドロキシジミリスチルスペルミジンである、第一のカチオン性脂質；（ｉｉ）約０．３８の組成モル比の第二のカチオン性脂質であって、当該第二のカチオン性脂質は、ヒドロキシジミリスチルスペルミジンである第二のカチオン性脂質；（ｉｉｉ）約０．２６の組成モル比の第一のヘルパー脂質であって、当該第一のヘルパー脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンである、第一のヘルパー脂質；（ｉｖ）約０．１０の組成モル比の第二のヘルパー脂質であって、当該第二のヘルパー脂質は、コレステロールである、第二のヘルパー脂質；および（ｖ）約０．０１の組成モル比の生体安定性強化剤であって、当該生体安定性強化剤は、Ｃ１４ポリエチレングリコール５０００である、生体安定性強化剤、を含む組成物が提供される。
【００１３】
ある態様において、（ｉ）約０．２８の組成モル比の第一のカチオン性脂質であって、当該第一のカチオン性脂質は、ジヒドロキシジミリスチルスペルミジンである、第一のカチオン性脂質；（ｉｉ）約０．２４の組成モル比の第二のカチオン性脂質であって、当該第二のカチオン性脂質は、ヒドロキシジミリスチルスペルミジンである、第二のカチオン性脂質；（ｉｉｉ）約０．３２の組成モル比の第一のヘルパー脂質であって、当該第一のヘルパー脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンである、第一のヘルパー脂質；（ｉｖ）約０．１４の組成モル比の第二のヘルパー脂質であって、当該第二のヘルパー脂質は、コレステロールである、第二のヘルパー脂質；および（ｖ）約０．０２の組成モル比の生体安定性強化剤であって、当該生体安定性強化剤は、Ｃ１４ポリエチレングリコール７５０である、生体安定性強化剤、を含む組成物が提供される。
【００１４】
ある態様において、（ｉ）約０．１８の組成モル比の第一のカチオン性脂質であって、当該第一のカチオン性脂質は、ジヒドロキシジミリスチルスペルミジンである、第一のカチオン性脂質；（ｉｉ）約０．４７の組成モル比の第二のカチオン性脂質であって、当該第二のカチオン性脂質は、ヒドロキシジミリスチルスペルミジンである、第二のカチオン性脂質；（ｉｉｉ）約０．３２の組成モル比の第一のヘルパー脂質であって、当該第一のヘルパー脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンである、第一のヘルパー脂質；（ｉｖ）約０．０１の組成モル比の第二のヘルパー脂質であって、当該第二のヘルパー脂質は、コレステロールである、第二のヘルパー脂質；および（ｖ）約０．０２の組成モル比の生体安定性強化剤であって、当該生体安定性強化剤は、Ｃ１４ポリエチレングリコール５０００である、生体安定性強化剤、を含む組成物が提供される。
【００１５】
ある態様において、（ｉ）約０．２４の組成モル比の第一のカチオン性脂質であって、当該第一のカチオン性脂質は、ジヒドロキシジミリスチルスペルミジンである、第一のカチオン性脂質；（ｉｉ）約０．４０の組成モル比の第二のカチオン性脂質であって、当該第二のカチオン性脂質は、ヒドロキシジミリスチルスペルミジンである、第二のカチオン性脂質；（ｉｉｉ）約０．２４の組成モル比の第一のヘルパー脂質であって、当該第一のヘルパー脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンである、第一のヘルパー脂質；（ｉｖ）約０．１０の組成モル比の第二のヘルパー脂質であって、当該第二のヘルパー脂質は、コレステロールである、第二のヘルパー脂質；および（ｖ）約０．０２の組成モル比の生体安定性強化剤であって、当該生体安定性強化剤は、Ｃ１４ポリエチレングリコール２０００である、生体安定性強化剤、を含む組成物が提供される。
【００１６】
ある態様において、（ｉ）約０．３２の組成モル比の第一のカチオン性脂質であって、当該第一のカチオン性脂質は、ジヒドロキシジミリスチルスペルミジンである、第一のカチオン性脂質；（ｉｉ）約０．３８の組成モル比の第二のカチオン性脂質であって、当該第二のカチオン性脂質は、ヒドロキシジミリスチルスペルミジンである、第二のカチオン性脂質；（ｉｉｉ）約０．２０の組成モル比の第一のヘルパー脂質であって、当該第一のヘルパー脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンである、第一のヘルパー脂質；（ｉｖ）約０．０８の組成モル比の第二のヘルパー脂質であって、当該第二のヘルパー脂質は、コレステロールである、第二のヘルパー脂質；および（ｖ）約０．０２の組成モル比の生体安定性強化剤であって、当該生体安定性強化剤は、Ｃ１４ポリエチレングリコール５０００である、生体安定性強化剤、を含む組成物が提供される。
【００１７】
ある態様において、その実施形態を含む本明細書に提供される組成物と、薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物が提供される。
【００１８】
ある態様において、その実施形態を含む本明細書に提供される組成物を含む細胞が提供される。ある実施形態では、細胞は哺乳動物の細胞である。ある実施形態では、細胞はげっ歯類の細胞である。ある実施形態では、細胞はマウスの細胞である。ある実施形態では、細胞はラットの細胞である。ある実施形態では、細胞はブタの細胞である。ある実施形態では、細胞はイヌの細胞である。ある実施形態では、細胞は霊長類の細胞である。ある実施形態では、細胞は上皮細胞である。ある実施形態では、細胞は肺上皮細胞である。ある実施形態では、細胞は内皮細胞である。ある実施形態では、細胞は肺内皮細胞である。
【００１９】
ある態様において、細胞に生物活性剤を送達する方法が提供され、当該方法は、（ｉ）生物活性剤と、その実施形態を含む本明細書に提供される組成物を混合し、それにより生物活性剤−脂質複合体を形成させる工程；（ｉｉ）細胞と、当該生物活性剤−脂質複合体を接触させ、細胞に当該生物活性剤−脂質複合体を送達する工程、を含む。
【００２０】
別の態様において、対象の肺組織に生物活性剤を送達する方法が提供され、当該方法は、（ｉ）生物活性剤と、その実施形態を含む本明細書に記載される組成物を混合し、それにより生物活性剤−脂質複合体を形成させる工程；（ｉｉ）対象に当該生物活性剤−脂質複合体の有効量を全身投与し、それにより対象の肺組織に当該生物活性剤−脂質複合体を送達する工程、を含む。
【００２１】
別の態様において、対象の肺組織においてタンパク質を発現させる方法が提供され、当該方法は、（ｉ）ｍＲＮＡと、その実施形態を含む本明細書に記載される組成物を混合し、ｍＲＮＡ−脂質複合体を形成させる工程；（ｉｉ）対象に当該ｍＲＮＡ−脂質複合体の有効量を投与する工程；および（ｉｉｉ）対象の肺組織において当該ｍＲＮＡ−脂質複合体のｍＲＮＡを発現させ、それにより対象の肺組織においてタンパク質を発現させる工程、を含む。
【００２２】
ある態様において、その必要のある対象において肺疾患を治療する方法が提供され、当該方法は、生物活性剤の治療有効量と、その実施形態を含む本明細書に記載される組成物を対象に投与し、それにより当該対象において肺疾患を治療する工程、を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１Ａ】図１Ａ−１Ｃ。実験最適化の混合デザインに基づき、過去に開発されたプロトコールを使用してｍＲＮＡと複合体化された新たなＬＮＰ製剤が作製され（図１Ａ〜１Ｃ）、得られたＬＮＰを、ルシフェラーゼの読み取り結果を使用してインビボでの送達に関してスクリーニングした。その後は最も性能の良い製剤を使用して、組織特異的発現の最適化に関し、第二世代製剤をモデル化し、予想を行った。その後、これらの新たな製剤をインビボで検証し、最良のＬＮＰ製剤を特定した。図１Ａ。新規脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤の作製、インビボでの検証および最適化の方法に関する図。図１Ｂ。ＬＮＰ製剤とｍＲＮＡの複合体化およびインビボでの検証に含まれる工程の図。図１Ｃ。ＬＮＰ製剤とｍＲＮＡの複合体化およびインビボでの検証に含まれる工程の手順。
【図１Ｂ】同上。
【図１Ｃ】同上。
【図２】図２。ＬＮＰ検証に関するインビボルシフェラーゼアッセイのワークフロー。
【図３Ａ】図３Ａ−３Ｅ。ＬＮＰの全身送達により、様々な生体分布パターンが生じる。動物全身のインビボイメージングにより、臓器特異的な生体分布パターンが明らかとなった。図３Ａ動物全身のイメージングを通じて、ＬＮＰは脾臓に分布したことが示されている。図３Ｂ動物全身のイメージングを通じて、ＬＮＰは肺に分布したことが示されている。図３Ｃ−３Ｅは、単離された臓器組織の生体外イメージングで決定されたＬＮＰの生体分布パターンを示す。
【図３Ｂ】同上。
【図３Ｃ】同上。
【図３Ｄ】同上。
【図３Ｅ】同上。
【図４Ａ】図４Ａ−４Ｂ。性能最適化スクリーニング。図４Ａ。肺指向性送達：生体外定量。図４Ｂ。脾臓指向性送達：生体外定量。
【図４Ｂ】同上。
【図５Ａ】図５Ａ−５Ｃ。用量依存性タンパク質発現。図５Ａ。肺送達のインビボルシフェラーゼ発現。図５Ｂ。ｍＲＮＡ投与量の漸増（３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ）に応じた肺放射輝度は、注射後４時間（４ｈ）で定量された。図５Ｃ。肺指向性送達：インビボ定量。各投与量の漸増（３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ）に対する、経時的（時）なインビボ放射輝度が定量された。
【図５Ｂ】同上。
【図５Ｃ】同上。
【図６Ａ】図６Ａ−６Ｃ。タンパク質発現の経時変化。図６Ａ。生体外肺生体発光シグナル。図６Ｂ。インビボ生体発光シグナル。図６Ｃ。生体外肺ルシフェラーゼシグナルの定量。
【図６Ｂ】同上。
【図６Ｃ】同上。
【図７Ａ】図７Ａ−７Ｊ。毒性−サイトカインパネル。２つのｍＲＮＡ投与条件：低（１ｍｇ／ｋｇ）および高（３ｍｇ／ｋｇ）下での注射後２時間、４時間、２４時間、および４８時間後のマウス血清中の循環サイトカインレベルの定量。図７Ａ。ＩＬ５のレベル。図７Ｂ。ＩＬ４のレベル。図７Ｃ。ＩＬ２のレベル。図７Ｄ。ＩＬ１０のレベル。図７Ｅ。ＩＬ１ｂのレベル。図７Ｆ。ＩＬ６のレベル。図７Ｇ。ＩＦＮｇのレベル。図７Ｈ。ＧＭＣＳＦのレベル。図７Ｉ。ＩＬ１２のレベル。図７Ｊ。ＴＮＦａのレベル。
【図７Ｂ】同上。
【図７Ｃ】同上。
【図７Ｄ】同上。
【図７Ｅ】同上。
【図７Ｆ】同上。
【図７Ｇ】同上。
【図７Ｈ】同上。
【図７Ｉ】同上。
【図７Ｊ】同上。
【図８】図８Ａ−８Ｂ。Ｎ／Ｐ比率を変化させることで、ｍＲＮＡの送達および発現の調整が可能であり、それにより排他的な組織発現パターンがもたらされる。インビボでの動物全身のイメージング、および生体外の単離臓器のイメージングから、Ｎ／Ｐ比率を変化させることで、特定臓器からのタンパク質発現が消え、肺（図８Ａ）または脾臓（図８Ｂ）での特異的な発現がもたらされ得ることが示唆される。
【図９】図９。肺送達の定量的アッセイ：ルシフェラーゼアッセイ。
【図１０】図１０Ａ−１０Ｂ。低性能型製剤。比較用の基準として最良製剤を含む（図１０Ｂ）および含まない（図１０Ａ）、低性能製剤のルシフェラーゼ活性。
【図１１Ａ】図１１Ａ〜１１Ｆ。Ｊｅｔ  ＰＥＩ（登録商標）と、Ｂｒｕｃｅ  ＃３．１４。動物全身のインビボイメージングから、Ｂｒｕｃｅ  ＃３．１４脂質ナノ粒子製剤（図１１Ａ）は、Ｊｅｔ  ＰＥＩ（登録商標）（図１１Ｂ）と比較して特異的な生体分布パターンを有していることが示される。単離臓器組織の生体外イメージングからも、Ｂｒｕｃｅ  ＃３．１４脂質ナノ粒子製剤（図１１Ｃ）は、Ｊｅｔ  ＰＥＩ（登録商標）（図１１Ｄ）と比較して特異的な生体分布パターンを有していることが示される。図１１Ｅは、Ｂｒｕｃｅ  ＃３．１４脂質ナノ粒子製剤およびＪｅｔ  ＰＥＩ（登録商標）のフラックスを示す。Ｊｅｔ  ＰＥＩ（登録商標）群の２匹の動物が死亡した。図１１Ｆは、Ｂｒｕｃｅ  ＃３．１４脂質ナノ粒子製剤またはＪｅｔ  ＰＥＩ（登録商標）を用いた治療後の肺におけるフラックスを示す。
【図１１Ｂ】同上。
【図１１Ｃ】同上。
【図１１Ｄ】同上。
【図１１Ｅ】同上。
【図１１Ｆ】同上。
【図１２Ａ】図１２Ａ−１２Ｃ。製剤＃３．１０の治療。図１２Ａは、臓器全体の臓器フラックスルシフェラーゼ活性を示す。図１２Ｂは、動物全身のインビボ発光を示す。図１２Ｃは、単離臓器組織の生体外発光を示す。
【図１２Ｂ】同上。
【図１２Ｃ】同上。
【図１３Ａ】図１３Ａ−１３Ｃ。製剤＃３．１４の治療。図１３Ａは、臓器全体の臓器フラックスルシフェラーゼ活性を示す。図１３Ｂは、動物全身のインビボ発光を示す。図１３Ｃは、単離臓器組織の生体外発光を示す。
【図１３Ｂ】同上。
【図１３Ｃ】同上。
【図１４Ａ】図１４Ａ−１４Ｃ。製剤＃３．１９の治療。図１４Ａは、臓器全体の臓器フラックスルシフェラーゼ活性を示す。図１４Ｂは、動物全身のインビボ発光を示す。図１４Ｃは、単離臓器組織の生体外発光を示す。
【図１４Ｂ】同上。
【図１４Ｃ】同上。
【図１５Ａ】図１５Ａ−１５Ｃ。製剤＃３．２０の治療。図１５Ａは、臓器全体の臓器フラックスルシフェラーゼ活性を示す。図１５Ｂは、動物全身のインビボ発光を示す。図１５Ｃは、単離臓器組織の生体外発光を示す。
【図１５Ｂ】同上。
【図１５Ｃ】同上。
【図１６Ａ】図１６Ａ−１６Ｃ。製剤＃２．２の治療。図１６Ａは、臓器全体の臓器フラックスルシフェラーゼ活性を示す。図１６Ｂは、動物全身のインビボ発光を示す。図１６Ｃは、単離臓器組織の生体外発光を示す。
【図１６Ｂ】同上。
【図１６Ｃ】同上。
【図１７Ａ】図１７Ａ−１７Ｋ。Ｂｒｕｃｅ  ＃３．１４のインビボ／生体外の経時変化（３ｍｇ／kg）。４時間（図１７Ａ）、２４時間（図１７Ｂ）、４８時間（図１７Ｃ）、７２時間（図１７Ｄ）および９６時間（図１７Ｅ）での動物全身のインビボ発光。４時間（図１７Ｆ）、２４時間（図１７Ｇ）、４８時間（図１７Ｈ）、７２時間（図１７Ｉ）および９６時間（図１７Ｊ）での単離臓器組織の生体外発光。図１７Ｋは、経時的なカラム１に対する平均（総フラックス（ｐ／ｓ））を示す。
【図１７Ｂ】同上。
【図１７Ｃ】同上。
【図１７Ｄ】同上。
【図１７Ｅ】同上。
【図１７Ｆ】同上。
【図１７Ｇ】同上。
【図１７Ｈ】同上。
【図１７Ｉ】同上。
【図１７Ｊ】同上。
【図１７Ｋ】同上。
【図１８Ａ】図１８Ａ−１８Ｃ。ｍＲＮＡの投与量変化と、経時変化３．１４（３、１、０．５ｍｇ／ｋｇ）。４時間（図１８Ａ）、２４時間（図１８Ｂ）および４８時間（図１８Ｃ）での、各投与量変化に対する動物全身のインビボ発光。
【図１８Ｂ】同上。
【図１８Ｃ】同上。
【図１９】図１９。ワークフロー略図。
【図２０Ａ】図２０Ａ−２０Ｂ。試薬比較分析。実験デザイン−試薬：４種の異なる製剤（ＩＶＦ（登録商標）Ｌｕｎｇ、ＤＯＴＭＡ：ＤＯＰＥ、ＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥ、Ｊｅｔ  ＰＥＩ（登録商標））、送達経路：静脈内（全身）、搭載物質：Ｔｒｉｌｉｎｋ（登録商標）ホタルルシフェラーゼｍＲＮＡ。図２０Ａは、各製剤に対する肺放射輝度を図示する棒グラフを示す。図２０Ｂは、各製剤に対する動物全身のインビボ放射輝度を示す。
【図２０Ｂ】同上。
【図２１】図２１。ホタルルシフェラーゼをコードする様々なｍＲＮＡのインビボスクリーニング。ｍＲＮＡ発現動態は、ｍＲＮＡ最適化に応じて異なり得る。実験デザイン−試薬：Ｉｎｖｉｖｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）Ｌｕｎｇ、送達経路：静脈内（全身）、搭載物質：ホタルルシフェラーゼをコードする２種の異なるｍＲＮＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ（登録商標）および自社製品）。グラフは、使用された各搭載物質に対する肺放射輝度を示す。
【図２２】図２２。肺におけるｓｉＲＮＡノックダウン。チロシンキナーゼ受容体のＴｉｅ２は、Ｔｅｋとしても知られており、胎児期の脈管構造において重要な役割を果たし、成体の内皮細胞においても存続する。内皮細胞においてほぼ専属的に発現されている。ＬＮＰのＩＶ送達の４８時間後に単離された肺組織に対してノックダウン分析が実施された（ＩＶＦ  Ｒｘ  ｌｕｎｇ＋ｓｉＲＮＡ）（Ｎ＝４）。グラフは、Ｔｉｅ２残留の百分率を示す。
【図２３】図２３。ＬａｃＺ  Ｃｒｅ−レポーター株の図、およびＩＶＦ（登録商標）Ｌｕｎｇを使用したＣｒｅ  ｍＲＮＡ送達の結果の図。
【図２４Ａ】図２４Ａ−２４Ｄ。野生型マウスにおけるｌａｃ  Ｚ  ｍＲＮＡ送達。図２４Ａおよび２４Ｃは、ベータ−ガラクトシダーゼ染色を介したｌａｃＺ発現を示す。図２４Ｂおよび２４Ｄはそれぞれ、図２４Ａおよび２４Ｃにおいて丸で囲まれた領域の高倍率画像である。
【図２４Ｂ】同上。
【図２４Ｃ】同上。
【図２４Ｄ】同上。
【図２５Ａ】図２５Ａ−２５Ｂ。ｌａｃＺレポーターマウスにおけるＣｒｅ  ｍＲＮＡ送達。インビボにおけるＩｎｖｉｖｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）Ｌｕｎｇの送達。ｌａｃＺ発現検出用の免疫蛍光染色から、肺組織全体の発現が明らかとなり、細気管支構造が明白である。図２５Ａは、染色の１０倍拡大図を示す。図２５Ｂは、染色の２５倍拡大図を示す。
【図２５Ｂ】同上。
【図２６】図２６。Ｎ／Ｐ比率を示す図。Ｎ／Ｐ比率とは、核酸主鎖上のリン酸塩による負電荷に対する、カチオン性脂質上の窒素残基による正電荷を指す。高Ｎ／Ｐ＝ｍＲＮＡと比較して脂質量が多い。低Ｎ／Ｐ＝ｍＲＮＡと比較して脂質量が少ない。Ｎ／Ｐ比率は、脂質ナノ粒子の表面電荷に大きな影響を与える。脂質ナノ粒子の表面電荷は、トランスフェクション効率を規定し、生体分布に影響を与える。
【図２７Ａ】図２７Ａ−２７Ｋ。Ｎ／Ｐ比率は、生体分布パターンに影響を与える。動物全身のインビボイメージングおよび単離臓器組織の生体外イメージングから、生体分布に対するＮ／Ｐ比率（１０、８、６、４、２）の影響が示される。図２７Ａおよび２７Ｂは、Ｎ／Ｐ比率１０を示す。図２７Ｃおよび２７Ｄは、Ｎ／Ｐ比率８を示す。図２７Ｅおよび２７Ｆは、Ｎ／Ｐ比率６を示す。図２７Ｇおよび２７Ｈは、Ｎ／Ｐ比率４を示す。図２７Ｉおよび２７Ｊは、Ｎ／Ｐ比率２を示す。図２７Ｋは、Ｎ／Ｐ比率４の側面図を示す。
【図２７Ｂ】同上。
【図２７Ｃ】同上。
【図２７Ｄ】同上。
【図２７Ｅ】同上。
【図２７Ｆ】同上。
【図２７Ｇ】同上。
【図２７Ｈ】同上。
【図２７Ｉ】同上。
【図２７Ｊ】同上。
【図２７Ｋ】同上。
【図２８】図２８。製剤：Ｎ／Ｐ比率を変化させたＤＨＤＭＳ／ＤＯＰＥ。肺送達は認められず、Ｎ／Ｐ比率の変化は、肺分布に影響を与えなかった。単離臓器組織の生体外イメージング。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
定義
本明細書において使用される略語は、化学分野および生物分野内でのその慣例的な意味を有している。本明細書において記載される化学構造および化学式は、化学分野において公知の化学的価数に関する標準的な規則に従い構築される。
【００２５】
置換基が、慣例的な化学式により左から右に記載されて特定される場合、右から左に記載された構造から生じうる化学的に同一の置換基も等しく包含される。例えば、−ＣＨ2Ｏ−は、−ＯＣＨ2−と等しい。
【００２６】
それ自身、または別の置換基の一部としての「アルキル」という用語は、別段の記述がない限り、指定される炭素原子数を有する（すなわちＣ1−Ｃ10は１〜１０個の炭素を意味する）直鎖（すなわち非分枝）もしくは分枝鎖、またはそれらの組み合わせを意味し、完全に飽和していてもよく、一飽和または多飽和でもよく、そして二価ラジカルおよび多価ラジカルを含み得る。アルキルは、非環状鎖である。飽和炭化水素ラジカルの例としては限定されないが、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、（シクロヘキシル）メチル、例えばｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチルなどのホモログおよび異性体などの基が挙げられる。非飽和アルキル基は、１つもしくは複数の二重結合または三重結合を有する基である。非飽和アルキル基の例としては限定されないが、ビニル、２−プロぺニル、クロチル、２−イソペンテニル、２−（ブタジエニル）、２，４−ペンタジエニル、３−（１，４−ペンタジエニル）、エチニル、１−および３−プロピニル、３−ブチニル、ならびに高次のホモログおよび異性体が挙げられる。アルコキシは、酸素リンカー（−Ｏ−）を介して分子の残りの部分に結合したアルキルである。
【００２７】
それ自身または別の置換基の一部としての「アルキレン」という用語は、別段の記載がない限り、アルキルから誘導された二価ラジカルを意味する。例としては限定されないが、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−がある。典型的にはアルキル（またはアルキレン）基は、１〜２４個の炭素原子を有し、１０個以下の炭素原子を有する基が好ましい。「低級アルキル」または「低級アルキレン」は、Ｃ1−Ｃ8のアルキル基またはアルキレン基である。
【００２８】
それ自身、または別の用語と組み合わされた「ヘテロアルキル」という用語は、別段の記載がない限り、少なくとも１つの炭素原子と、Ｏ、Ｎ、Ｐ、ＳｉおよびＳからなる群から選択される少なくとも１つのヘテロ原子からなる安定的な直鎖もしくは分枝鎖またはそれらの組み合わせを意味し、この場合において窒素原子および硫黄原子は任意で酸化されてもよく、窒素ヘテロ原子は任意で四級化されてもよい。ヘテロ原子のＯ、Ｎ、Ｐ、ＳおよびＳｉは、ヘテロアルキル基の任意の内部の位置に配置されてもよく、またはアルキル基が分子の残りの部分に結合している位置に、配置されてもよい。ヘテロアルキルは、非環状鎖である。例としては限定されないが、以下が挙げられる：−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ3、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＨ3、−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｎ（ＣＨ3）−ＣＨ3、−ＣＨ2−Ｓ−ＣＨ2−ＣＨ3、−ＣＨ2−ＣＨ2、−Ｓ（Ｏ）−ＣＨ3、−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｓ（Ｏ）2−ＣＨ3、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｏ−ＣＨ3、−Ｓｉ（ＣＨ3）3、−ＣＨ2−ＣＨ＝Ｎ−ＯＣＨ3、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｎ（ＣＨ3）−ＣＨ3、−Ｏ−ＣＨ3、−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ3、および−ＣＮ。最大で２個のヘテロ原子が連続してもよく、例えば−ＣＨ2−ＮＨ−ＯＣＨ3がある。
【００２９】
同様に、それ自身または別の置換基の一部としての「ヘテロアルキレン」という用語は、別段の記載がない限り、ヘテロアルキルから誘導された二価ラジカルを意味し、限定されないが、−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｓ−ＣＨ2−ＣＨ2−および−ＣＨ2−Ｓ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＨ2−が例示される。ヘテロアルキレン基に関して、ヘテロ原子は、鎖の末端のいずれか、または両端を占有することができる（例えばアルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノなど）。さらにアルキレン結合基およびヘテロアルキレン結合基に関して、結合基の方向は、当該結合基の化学式が記載されている方向によって暗示されない。例えば、化学式−Ｃ（Ｏ）2Ｒ’−は、−Ｃ（Ｏ）2Ｒ’ −と−Ｒ’Ｃ（Ｏ）2−の両方を表す。上述のとおり、本明細書において使用される場合、ヘテロアルキル基は、例えば−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＯＲ’、−ＳＲ’および／または−ＳＯ2Ｒ’など、ヘテロ原子を介して分子の残りの部分に結合されている基を含む。「ヘテロアルキル」が列挙され、次いで例えば−ＮＲ’Ｒ’’などの具体的なヘテロアルキル基の列挙があった場合、ヘテロアルキルおよび−ＮＲ’Ｒ’’という用語は、冗長ではなく、相互排他的でもないことを理解されたい。むしろ具体的なヘテロアルキル基は、明白性を与えるために列挙されている。ゆえに「ヘテロアルキル」という用語は本明細書において、例えば−ＮＲ’Ｒ’’などの具体的なヘテロアルキル基を除外するとは解釈されないものとする。
【００３０】
それ自身または別の用語と組み合わされた「シクロアルキル」および「ヘテロシクロアルキル」という用語は、別段の記載がない限り、それぞれ「アルキル」および「ヘテロアルキル」の環状型を意味する。シクロアルキルおよびヘテロアルキルは、芳香族ではない。さらにヘテロシクロアルキルに関して、ヘテロ原子は、当該複素環が分子の残りの部分に結合している位置を占めることができる。シクロアルキルの例としては限定されないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、１−シクロヘキセニル、３−シクロヘキセニル、シクロヘプチルなどが挙げられる。ヘテロシクロアルキルの例としては限定されないが、１−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジル）、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−モルホリニル、３−モルホリニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニルなどが挙げられる。単独または別の置換基の一部としての「シクロアルキレン」および「ヘテロシクロアルキレン」とはそれぞれ、シクロアルキルおよびヘテロシクロアルキルから誘導された二価ラジカルを意味する。
【００３１】
それ自身または別の置換基の一部としての「ハロ」または「ハロゲン」という用語は、別段の記載がない限り、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、またはヨウ素原子を意味する。さらに例えば「ハロアルキル」などの用語は、モノハロアルキルおよびポリハロアルキルを含むことが意図される。例えば「ハロ（Ｃ1−Ｃ4）アルキル」という用語は限定されないが、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、２，２，２−トリフルオロエチル、４−クロロブチル、３−ブロモプロピルなどを含む。
【００３２】
「アシル」という用語は別段の記載がない限り、−Ｃ（Ｏ）Ｒを意味し、式中、Ｒは置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、または置換もしくは非置換のヘテロアリールである。
【００３３】
「アリール」という用語は、別段の記載がない限り、多非飽和の芳香族炭化水素置換基を意味し、単一の環または複数の環（好ましくは１〜３個の環）であってもよく、それら複数の環は縮合され（すなわち縮合環アリール）または共有結合される。縮合環アリールとは、縮合された複数の環を指し、この場合において当該縮合環のうちの少なくとも１つが、アリール環である。「ヘテロアリール」という用語は、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を含有するアリール基（または環）を指し、この場合において窒素原子および硫黄原子は任意で酸化され、窒素原子は任意で四級化される。ゆえに「ヘテロアリール」という用語は、縮合環のヘテロアリール基（すなわち、複数の環が縮合し、当該縮合環の少なくとも１つが、ヘテロ芳香族環である）を含む。５，６−縮合環ヘテロアリーレンとは、縮合した２つの環を指し、この場合において１つの環は５員であり、他方の環は６員であり、そしてこの場合において少なくとも１つの環は、ヘテロアリール環である。同様に、６，６−縮合環ヘテロアリーレンとは、縮合した２つの環を指し、この場合において１つの環は６員であり、他方の環は６員であり、そしてこの場合において少なくとも１つの環は、ヘテロアリール環である。そして６，５−縮合環ヘテロアリーレンとは、縮合した２つの環を指し、この場合において１つの環は６員であり、他方の環は５員であり、そしてこの場合において少なくとも１つの環は、ヘテロアリール環である。ヘテロアリール基は、炭素原子またはヘテロ原子を介して分枝の残りの部分に結合されてもよい。アリール基およびヘテロアリール基の非限定的な例としては、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、４−ビフェニル、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、２−フェニル−４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソキサゾリル、４−イソキサゾリル、５−イソキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ベンゾチアゾリル、プリニル、２−ベンズイミダゾリル、５−インドリル、１−イソキノリル、５−イソキノリル、２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、３−キノリル、および６−キノリルが挙げられる。上述のアリール環系およびヘテロアリール環系のそれぞれに対する置換基は、以下に記載される受容可能な置換基の群から選択される。単独または別の置換基の一部としての「アリーレン」および「ヘテロアリーレン」とはそれぞれ、アリールおよびヘテロアリールから誘導された二価ラジカルを意味する。
【００３４】
簡潔さを目的として、他の用語と組み合わされて使用されるときの「アリール」という用語（例えば、アリールオキシ、アリールチオキシ、アリールアルキル）は、上記の規定されるアリール環およびヘテロアリール環の両方を含む。ゆえに「アリールアルキル」という用語は、アリール基がアルキル基に結合しているラジカルを含むことが意図され、当該アルキル基（例えばベンジル、フェネチル、ピリジルメチルなど）は、炭素原子（例えばメチレン基）が、例えば酸素原子により置換されているアルキル基を含む（例えばフェノキシメチル、２−ピリジルオキシメチル、３−（１−ナフチルオキシ）プロピルなど）。
【００３５】
本明細書において使用される場合、「オキソ」という用語は、炭素に二重結合されている酸素を意味する。
【００３６】
本明細書において使用される場合、「アルキルスルホニル」という用語は、式−Ｓ（Ｏ2）−Ｒ’を有する部分を意味し、式中、Ｒ’は、上記に規定されるアルキル基である。Ｒ’は、特定の数の炭素を有し得る（例えば「Ｃ1−Ｃ4  アルキルスルホニル」）。
【００３７】
上記の用語のそれぞれ（例えば「アルキル」、「ヘテロアルキル」、「アリール」および「ヘテロアリール」）は、示されるラジカルの置換型および非置換型の両方を含む。
【００３８】
アルキルラジカルおよびヘテロアルキルラジカル（しばしば、アルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニルおよびヘテロシクロアルケニルとも呼称される基を含む）に対する置換基は、限定されないが、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ2Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）2Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’）＝ＮＲ’’’’’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）2Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）2ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲＳＯ2Ｒ’、−ＣＮおよび−ＮＯ2から選択される様々な基のうちの１つまたは複数であってもよく、数はゼロ〜（２ｍ’＋１）の範囲であり、式中、ｍ’は、かかるラジカル中の炭素原子の総数である。Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’はそれぞれ独立して、水素、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール（例えば１〜３個のハロゲンで置換されたアリール）、置換もしくは非置換のアルキル、アルコキシまたはチオアルコキシ基、またはアリールアルキル基を指すことが好ましい。本明細書に開示される化合物が複数のＲ基を含むとき、例えばＲ基のそれぞれは独立して、これら基の複数が存在するときに、各々Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’基であるとして選択される。Ｒ’およびＲ’’が同じ窒素原子に結合しているとき、それらは窒素原子とともに組み合わされて、４−、５−、６−または７−員の環を形成することができる。例えば−ＮＲ’Ｒ’’としては限定されないが、１−ピロリジニルおよび４−モルホリニルが挙げられる。置換基に関する上述の検討から、当業者であれば、「アルキル」という用語が、水素基以外の基に結合した炭素原子を含む基、例えばハロアルキル（例えば−ＣＦ3および−ＣＨ2ＣＦ3）およびアシル（例えば−Ｃ（Ｏ）ＣＨ3、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ3、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ2ＯＣＨ3など）を含むことが意図されることを理解するであろう。
【００３９】
アルキルラジカルに関して記載される置換基と同様に、アリール基およびヘテロアリール基に対する置換基も多様であり、例えば以下から選択される：−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ2Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）2Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’）＝ＮＲ’’’’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）2Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）2ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲＳＯ2Ｒ’、−ＣＮ、−ＮＯ2、−Ｒ’、−Ｎ3、−ＣＨ（Ｐｈ）2、フルオロ（Ｃ1−Ｃ4）アルコキシ、およびフルオロ（Ｃ1−Ｃ4）アルキル。数はゼロから、芳香族環系上の開放されている原子価の総数の範囲であり、式中、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’は好ましくは独立して水素、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のヘテロアルキル、置換または非置換のシクロアルキル、置換または非置換のヘテロシクロアルキル、置換または非置換のアリール、および置換または非置換のヘテロアリールから選択される。本明細書に開示される化合物が複数のＲ基を含むとき、例えばＲ基のそれぞれは独立して、これら基の複数が存在するときに、各々Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’基であるとして選択される。
【００４０】
２個以上の置換基が任意で組み合わされてアリール基、ヘテロアリール基、シクロアルキル基またはヘテロシクロアルキル基を形成してもよい。そうしたいわゆる環形成置換基は、典型的には環状基礎構造に結合して存在するが、必ずではない。ある実施形態では、環形成置換基は、基礎構造の隣接員に結合される。例えば２つの環形成置換基は、環状基礎構造の隣接員に結合され、縮合環構造を生成させる。別の実施形態では、環形成置換基は、基礎構造の１つの員に結合される。例えば２つの環形成置換基は、環状基礎構造の１つの員に結合され、スピロ環構造を生成させる。さらに別の実施形態では、環形成置換基は、基礎構造の非隣接員に結合される。
【００４１】
アリール環またはヘテロアリール環の隣接原子上の置換基のうちの２個が任意で、式−Ｔ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＲＲ’）q−Ｕ−の環を形成してもよく、式中、ＴおよびＵは独立して、−ＮＲ−、−Ｏ−、−ＣＲＲ’−または一重結合であり、ｑは０〜３の整数である。あるいはアリール環またはヘテロアリール環の隣接原子上の置換基のうちの２個が任意で、式−Ａ−（ＣＨ2）r−Ｂ−の置換基と置き換えられてもよく、式中、ＡおよびＢは独立して−ＣＲＲ’−、−Ｏ−、−ＮＲ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）2−、−Ｓ（Ｏ）2ＮＲ’ −または一重結合であり、そしてｒは１〜４の整数である。そのようにして形成された新たな環の一重結合のうちの１つは任意で二重結合と置き換えられてもよい。あるいはアリール環またはヘテロアリール環の隣接原子上の置換基のうちの２個が任意で、式−（ＣＲＲ’）s−Ｘ’−（Ｃ’’Ｒ’’’）d−の置換基と置き換えられてもよく、式中、ｓおよびｄは独立して０〜３の整数であり、Ｘ’は、−Ｏ−、−ＮＲ’−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）2−または−Ｓ（Ｏ）2ＮＲ’−である。置換基のＲ、Ｒ’、Ｒ’’およびＲ’’’は好ましくは独立して、水素、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のシクロアルキル、置換または非置換のヘテロシクロアルキル、置換または非置換のアリール、および置換または非置換のヘテロアリールから選択される。
【００４２】
本明細書において使用される場合、「ヘテロ原子」または「環ヘテロ原子」という用語は、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、硫黄（Ｓ）、リン（Ｐ）およびケイ素（Ｓｉ）を含むことが意図される。
【００４３】
本明細書において使用される場合、「置換基」は、以下の部分から選択される基を意味する：
（Ａ）−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＳＨ、−ＣＮ、−ＣＦ3、−ＮＯ2、オキソ、ハロゲン、非置換アルキル、非置換ヘテロアルキル、非置換シクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、非置換アリール、非置換ヘテロアリール、および
（Ｂ）以下から選択される置換基の少なくとも１つで置換されたアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールおよびヘテロアリール：
（ｉ）オキソ、−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＳＨ、−ＣＮ、−ＣＦ3、−ＮＯ2、ハロゲン、非置換アルキル、非置換ヘテロアルキル、非置換シクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、非置換アリール、非置換ヘテロアリール、および
（ｉｉ）以下から選択される置換基の少なくとも１つで置換されたアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールおよびヘテロアリール：
（ａ）オキソ、−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＳＨ、−ＣＮ、−ＣＦ3、−ＮＯ2、ハロゲン、非置換アルキル、非置換ヘテロアルキル、非置換シクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、非置換アリール、非置換ヘテロアリール、および
（ｂ）以下から選択される置換基の少なくとも１つで置換されたアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリール：オキソ、−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＳＨ、−ＣＮ、−ＣＦ3、−ＮＯ2、ハロゲン、非置換アルキル、非置換ヘテロアルキル、非置換シクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、非置換アリール、および非置換ヘテロアリール。
【００４４】
本明細書において使用される場合、「サイズ限定置換基（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｎｔ）」または「サイズ限定置換基（ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔ  ｇｒｏｕｐ）」とは、「置換基」に関して上述される置換基のすべてから選択される基を意味し、この場合において各置換または非置換のアルキルは、置換または非置換のＣ1−Ｃ20アルキルであり、各置換または非置換のヘテロアルキルは、置換または非置換の２〜２０員のヘテロアルキルであり、各置換または非置換のシクロアルキルは、置換または非置換のＣ4−Ｃ8シクロアルキルであり、そして各置換または非置換のヘテロシクロアルキルは、置換または非置換の４〜８員のヘテロシクロアルキルである。
【００４５】
本明細書において使用される場合、「低級置換基（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｎｔ）」または「低級置換基（ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔ  ｇｒｏｕｐ）」とは、「置換基」に関して上述される置換基のすべてから選択される基を意味し、この場合において各置換または非置換のアルキルは、置換または非置換のＣ1−Ｃ8アルキルであり、各置換または非置換のヘテロアルキルは、置換または非置換の２〜８員のヘテロアルキルであり、各置換または非置換のシクロアルキルは、置換または非置換のＣ5−Ｃ7シクロアルキルであり、そして各置換または非置換のヘテロシクロアルキルは、置換または非置換の５〜７員のヘテロシクロアルキルである。
【００４６】
一部の実施形態では、本明細書の化合物中に記載される各置換基は、少なくとも１つの置換基で置換される。より具体的には、一部の実施形態では、本明細書の化合物中に記載される各置換アルキル、置換ヘテロアルキル、置換シクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、置換アリール、置換ヘテロアリール、置換アルキレン、置換ヘテロアルキレン、置換シクロアルキレン、置換ヘテロシクロアルキレン、置換アリーレン、および／または置換ヘテロアリーレンは、少なくとも１つの置換基で置換される。他の実施形態では、これら基の少なくとも１つ、またはすべてが、少なくとも１つのサイズ限定置換基で置換される。他の実施形態では、これら基の少なくとも１つ、またはすべてが、少なくとも１つの低級置換基で置換される。
【００４７】
本明細書の化合物の他の実施形態では、各置換または非置換のアルキルは、置換または非置換のＣ1−Ｃ20アルキルであり、各置換または非置換のヘテロアルキルは、置換または非置換の２〜２０員のヘテロアルキルであり、各置換または非置換のシクロアルキルは、置換または非置換のＣ3−Ｃ8シクロアルキルであり、各置換または非置換のヘテロシクロアルキルは、置換または非置換の３〜８員のヘテロシクロアルキルであり、各置換または非置換のアリールは、置換または非置換のＣ6−Ｃ10アリールであり、および／または各置換または非置換のヘテロアリールは、置換または非置換の５〜１０員のヘテロアリールであり得る。本明細書の化合物の一部の実施形態では、各置換または非置換のアルキレンは、置換または非置換のＣ1−Ｃ20アルキレンであり、各置換または非置換のヘテロアルキレンは、置換または非置換の２〜２０員のヘテロアルキレンであり、各置換または非置換のシクロアルキレンは、置換または非置換のＣ3−Ｃ8シクロアルキレンであり、各置換または非置換のヘテロシクロアルキレンは、置換または非置換の３〜８員のヘテロシクロアルキレンであり、各置換または非置換のアリーレンは、置換または非置換のＣ6−Ｃ10アリーレンであり、および／または各置換または非置換のヘテロアリーレンは、置換または非置換の５〜１０員のヘテロアリーレンである。
【００４８】
一部の実施形態では、各置換または非置換のアルキルは、置換または非置換のＣ1−Ｃ8アルキルであり、各置換または非置換のヘテロアルキルは、置換または非置換の２〜８員のヘテロアルキルであり、各置換または非置換のシクロアルキルは、置換または非置換のＣ3−Ｃ7シクロアルキルであり、各置換または非置換のヘテロシクロアルキルは、置換または非置換の３〜７員のヘテロシクロアルキルであり、各置換または非置換のアリールは、置換または非置換のＣ6−Ｃ10アリールであり、および／または各置換または非置換のヘテロアリールは、置換または非置換の５〜９員のヘテロアリールである。一部の実施形態では、各置換または非置換のアルキレンは、置換または非置換のＣ1−Ｃ8アルキレンであり、各置換または非置換のヘテロアルキレンは、置換または非置換の２〜８員のヘテロアルキレンであり、各置換または非置換のシクロアルキレンは、置換または非置換のＣ3−Ｃ7シクロアルキレンであり、各置換または非置換のヘテロシクロアルキレンは、置換または非置換の３〜７員のヘテロシクロアルキレンであり、各置換または非置換のアリーレンは、置換または非置換のＣ6−Ｃ10アリーレンであり、および／または各置換または非置換のヘテロアリーレンは、置換または非置換の５〜９員のヘテロアリーレンである。一部の実施形態では、化合物は、本明細書に記載される化学種である。
【００４９】
本明細書において使用される場合、「ａ」または「ａｎ」という用語は、１つまたは複数を意味する。さらに本明細書において使用される場合、「ａ［ｎ］で置換された」という文言は、特定される基が、指名される置換基のいずれか、もしくはすべてのうちの１つまたは複数で置換され得ることを意味する。例えば、アルキル基またはヘテロアリール基などの基が、「非置換のＣ1−Ｃ20アルキル、または非置換の２〜２０員のヘテロアルキルで置換されている」場合、当該基は、１つもしくは複数の非置換のＣ1−Ｃ20アルキルおよび／または１つもしくは複数の非置換の２〜２０員のヘテロアルキルを含有し得る。さらに部分がＲ置換基で置換される場合、当該基は、「Ｒ置換された」と呼称され得る。部分がＲ置換された場合、当該部分は、少なくとも１つのＲ置換基で置換され、各Ｒ置換基は任意で異なっている。
【００５０】
本発明の化合物に関する記載は、当業者に公知の化学結合に関する原理に限定される。したがって基が、多くの置換基のうちの１つまたは複数により置換され得る場合、かかる置換基は、化学結合の原理に適合し、本質的に不安定ではない化合物が得られる、および／または当業者に大気条件下、例えば水性条件、中性条件、およびいくつかの公知の生理学的条件下で不安定である可能性があるとして公知である化合物を得られるよう選択される。例えばヘテロシクロアルキルまたはヘテロアリールは、当業者に公知の化学結合原理に従い、環ヘテロ原子を介して分子の残りの部分に結合し、それにより本質的に不安定な化合物となることを回避する。
【００５１】
別段の規定がない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、当業者によって普遍的に理解される意味と同じ意味を有する。例えば、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  １９９４）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ，Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ  １９８９）を参照のこと。本明細書に記載されるものと類似した、または均等な任意の方法、デバイスおよび材料を、本発明の実施に使用することができる。以下の定義は、本明細書においてしばしば使用される特定の用語の理解を促進するために提供されるものであり、本開示の範囲を限定することは意図されていない。
【００５２】
「核酸」という用語は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、および一本鎖型、二本鎖型または多鎖型のいずれかのそのポリマー、またはその相補物を指す。「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドの直線状の配列を指す。「ヌクレオチド」という用語は、典型的にはポリヌクレオチドの単一単位、すなわち単量体を指す。ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはその改変型であってもよい。本明細書において予期されるポリヌクレオチドの例としては、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡおよびｍＲＮＡを含む）、ならびに一本鎖および二本鎖のＤＮＡならびにＲＮＡの混合物を有するハイブリッド分子が挙げられる。核酸は、直線状または分枝状であってもよい。例えば核酸は、ヌクレオチドの直鎖であってもよく、または核酸は、分枝してもよく、それにより例えば当該核酸は、１つもしくは複数のヌクレオチドのアームまたは枝を含む。任意で分枝型核酸は、反復して分枝して、例えばデンドリマーなどの高次構造を形成する。
【００５３】
ホスホチオエート主鎖を伴う核酸を含む核酸は、１つまたは複数の反応部分を含んでもよい。本明細書において使用される場合、反応部分という用語は、別の分子と反応することができる、例えば共有結合、非共有結合または他の相互作用を介して核酸またはポリペプチドと反応することができる任意の基を含む。例としては、核酸は、共有結合、非共有結合または他の相互作用を介してタンパク質またはポリペプチド上のアミノ酸と反応するアミノ酸反応部分を含んでもよい。
【００５４】
この用語は、公知のヌクレオチドアナログまたは改変主鎖残基もしくは結合を含有する核酸も包含し、それらは合成、天然および非天然であり、参照核酸と類似した結合特性を有し、参照ヌクレオチドと類似した様式で代謝される。そうしたアナログの例としては限定されないが、例えばホスホロアミデート、ホスホロジアミデート、ホスホロチオエート（ホスホチオエートとしても知られる）、ホスホロジチオエート、ホスホノカルボン酸、ホスホノカルボン酸塩、ホスホノ酢酸、ホスホノギ酸、ホスホン酸メチル、ホスホン酸ホウ素、またはＯ−メチルホスホロアミデート結合（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと）を含むホスホロジエステル誘導体；ならびにペプチド核酸主鎖および結合が挙げられる。他のアナログ核酸としては、ポジティブ主鎖；非イオン性主鎖、修飾糖類および非リボース主鎖（例えばホスホロジアミデートモルホリノオリゴまたはロックド核酸（ＬＮＡ））を有するものが挙げられ、米国特許第５，２３５，０３３号および第５，０３４，５０６号ならびにＣｈａｐｔｅｒｓ  ６  ａｎｄ  ７，ＡＳＣ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ５８０，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓａｎｇｈｕｉ＆Ｃｏｏｋ，ｅｄｓに記載されるものが挙げられる。１つまたは複数の炭素環式糖類を含有する核酸も、核酸の１つの定義内に含まれる。リボース−リン酸塩主鎖の改変は、例えば生理学的環境下中でのかかる分子の安定性および半減期を増加させるため、またはバイオチップ上のプローブとして、などの様々な理由で行われ得る。天然核酸とアナログの混合物が作製されてもよい。あるいは異なる核酸アナログ、および天然核酸とアナログの混合物の混合物が作製されてもよい。ある実施形態では、ＤＮＡ中のヌクレオチド間結合は、ホスホジエステル、ホスホジエステル誘導体、またはそれら両方の組み合わせである。
【００５５】
本明細書において使用される場合、「約」という用語は、指定された値を含む値の範囲を意味し、当業者であれば、指定された値に合理的に類似するとみなすであろう。ある実施形態では、「約」という用語は、当分野に一般的に受容される測定尺度を使用した標準偏差の内を意味する。ある実施形態では、約とは、指定された値の±１０％にまで拡張する範囲を意味する。ある実施形態では、約とは、指定された値を意味する。
【００５６】
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は本明細書において相互交換可能に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指し、この場合において当該ポリマーは、アミノ酸から構成されない部分と複合体化される場合がある。当該用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工化学的模倣体であるアミノ酸ポリマーにも適用され、ならびに天然アミノ酸ポリマーおよび非天然アミノ酸ポリマーにも適用される。当該用語は、大環状ペプチド、非ペプチド機能を有して改変されたペプチド、ペプチド模倣体、ポリアミド、およびマクロラクタムにも適用される。「融合タンパク質」とは、組み換えにより単一部分として発現される２つ以上の別個のタンパク質配列をコードするキメラタンパク質を指す。
【００５７】
「ペプチジル」および「ペプチジル部分」という用語は、一価のペプチドを意味する。
【００５８】
「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と類似した様式で機能するアミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣体を指す。天然アミノ酸は、遺伝子コードによりコードされるアミノ酸、ならびに例えばヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸塩、およびＯ−ホスホセリンなどの後に改変されたアミノ酸である。アミノ酸アナログとは、天然アミノ酸と同じ基礎化学構造、すなわち水素、カルボキシル基、アミノ基およびＲ基に結合されるα炭素、を有する化合物を指し、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムが挙げられる。そのようなアナログは、改変Ｒ基を有し（例えばノルロイシン）、または改変ペプチド主鎖を有しているが、天然アミノ酸と同じ基礎化学構造を保持している。アミノ酸模倣体とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然のアミノ酸と類似した様式で機能する化合物を指す。「非天然アミノ酸」および「非自然アミノ酸」という用語は、アミノ酸アナログ、合成アミノ酸および自然界には存在しないアミノ酸模倣体を指す。
【００５９】
アミノ酸は、それらの一般的に知られている３文字の記号、またはＩＵＰＡＣ−ＩＢＬ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号のいずれかによって、本明細書において呼称される場合がある。同様にヌクレオチドも、それらの一般的に受け入れられている１文字コードにより呼称される場合がある。
【００６０】
アミノ酸またはヌクレオチド塩基の「位置」は、Ｎ末端（または５’末端）に対する位置に基づき、参照配列中の各アミノ酸（またはヌクレオチド塩基）を連続的に特定する数字により表される。最適アライメントの決定の際には欠失、挿入、切断、融合などを考慮しなければならず、そしてそれらによって、一般的に、Ｎ末端から単純に数を数えることにより決定された被験配列中のアミノ酸残基番号は、参照配列中の対応する位置の番号とは必ずしも一致しない。例えば、並置された参照配列と比較してバリアントが欠失を有してる場合、参照配列中の位置に対応するバリアント中のアミノ酸が、欠失部位では存在しない。並置された参照配列中に挿入が存在する場合、この挿入は、参照配列中の番号を割り当てられたアミノ酸位置には対応しない。切断または融合の場合、参照配列または並置配列のいずれかに、対応する配列中の任意のアミノ酸に対応しないアミノ酸の連続配列が存在し得る。
【００６１】
「〜を参照して番号を割り当てられた」または「〜に対応する」という用語は、所与のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列のナンバリングの文脈において使用された場合、所与のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列が参照配列と比較されたときの、指定の参照配列残基のナンバリングを指す。
【００６２】
「保存的改変バリアント」とは、アミノ酸配列と核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関しては、保存的改変バリアントとは、同一、または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を指し、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一の配列を指す。遺伝子コードの縮重があるために、多数の機能的に同一な核酸が、任意の所与のタンパク質をコードする。例えば、コドンのＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵはすべてアミノ酸のアラニンをコードする。ゆえにアラニンがコドンにより指定される位置ごとに、コドンは、コードされるポリペプチドを変化させることなく、記載の対応コドンのいずれかへと変化し得る。こうした核酸の多様性は、「サイレントな多様性」であり、保存的に改変された多様性の１種である。本明細書において、ポリペプチドをコードする各核酸配列は、当該核酸のすべての可能性のあるサイレントな多様性も記載するものとする。当業者であれば、核酸中の各コドン（ＡＵＧとＴＧＧを除く。ＡＵＧは通常、メチオニンに対する唯一のコドンであり、ＴＧＧは通常、トリプトファンに対する唯一のコドンである）を改変して、機能的に同一の分子を得ることができることを認識するであろう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸のサイレントな多様性の各々は、発現産生物に関して記載される各配列においては暗示されているが、実際的なプローブ配列に関しては異なる。
【００６３】
アミノ酸配列に関しては、当業者であれば、核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の配列に対する個々の置換、欠失または付加は、コードされる配列中の単一アミノ酸または数パーセントのアミノ酸を変化させ、付加させ、または欠失させるが、その変化が、化学的に類似したアミノ酸とのアミノ酸置換を生じさせる場合には、「保存的改変バリアント」であることを認識するであろう。保存的置換の表に機能的に類似したアミノ酸が提示されており、これは当分野に公知である。こうした保存的改変バリアントは、多型バリアント、種間ホモログおよび本発明のアレルに加えられるものであり、除外するものではない。
【００６４】
以下の８群は各々、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む。１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）。
【００６５】
「配列同一性の百分率」は、最適に並置された２つの配列を比較ウィンドウ上で比較することにより決定され、この場合において比較ウィンドウ中のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列の一部は、２配列の最適アライメントのために、参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して付加または欠失（すなわちギャップ）を含む場合がある。百分率は、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列中に存在する位置の数を決定して、合致位置数を出し、その合致位置数を比較ウィンドウ中の位置の総数で割り、その結果に１００を掛け、配列同一性の百分率を出すことにより算出される。
【００６６】
２つ以上の核酸またはポリペプチドの配列の文脈における「同一」または「同一性」百分率という用語は、比較ウィンドウ上で、または以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用して、もしくは手動のアライメントと目視検査により測定されたときに指定された領域で、比較され、最大対応のために並置されたときに、同一である２つ以上の配列もしくはサブ配列、または同一なアミノ酸残基もしくはヌクレオチドの指定百分率（すなわち、６０％の同一性、任意で、例えば本発明の全ポリペプチド配列または本発明のポリペプチドの個々のドメインの指定領域で６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性）を有する２つ以上の配列またはサブ配列を指す。そうした配列は、「実質的に同一」であるといわれる。この規定は、被験配列の相補配列も指す。任意で、同一性は、少なくとも約５０ヌクレオチドの長さの領域にわたって、より好ましくは１００〜５００または１００〜１０００以上のヌクレオチドの長さの領域にわたって存在する。
【００６７】
配列比較に関し、典型的には、１つの配列は、被験配列が比較される参照配列としての役割を果たす。配列比較アルゴリズムを使用する場合、被験配列および参照配列がコンピュータに入力され、必要に応じてサブ配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムのパラメータが指定される。デフォルトのプログラムパラメータを使用してもよく、または代替的なパラメータを指定してもよい。次に配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、参照配列と比較した、被験配列の配列同一性百分率を算出する。
【００６８】
本明細書において使用される場合、「比較ウィンドウ」には、例えば全長配列または２０〜６００、約５０〜約２００、もしくは約１００〜約１５０のアミノ酸またはヌクレオチドなどからなる群から選択される連続的な位置数のうちのいずれか１つのセグメントに対する参照を含み、その中で、配列は、２配列が最適に並置された後に、同数の連続的位置の参照配列に対して比較され得る。比較用の配列のアライメント方法は、当分野に公知である。比較用の最適な配列アライメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９７０）  Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２ｃの局所的ホモロジーアルゴリズムにより、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３のホモロジーアライメントアルゴリズムにより、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：２４４４による類似性に関する探索方法により、これらのコンピュータ実装アルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、ウィスコンシン州マジソンのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）により、または手動アライメントと目視検査（例えばＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５補足）を参照のこと）により、実施されてもよい。
【００６９】
配列同一性百分率および配列類似性の決定に適したアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、それらはそれぞれＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）  Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２、およびＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０に記載されている。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて公的に利用することができる。このアルゴリズムには最初に、データベース配列中の同じ長さのワードと並置されたときに、いくつかのポジティブ値の閾値スコアＴに合致する、または満たす、クエリ配列中の長さＷの短ワードを特定することにより、高スコアの配列ペア（ＨＳＰ）を特定することを含む。Ｔは、隣接ワードスコア閾値（ｎｅｉｔｈｂｏｒｈｏｏｄ  ｗｏｒｄ  ｓｃｏｒｅ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）と呼称される（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．、上記）。これらの初期隣接ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを発見するための探索を始める種としての役割を果たす。ワードヒットは、累積アライメントスコアが増加し得る限り、各探索に平行して両方向に伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列に関しては、パラメータＭ（合致残基のペアに対するリワードスコア；常に＞０である）とパラメータＮ（ミスマッチ残基のペナルティスコア；常に＜０である）を使用して算出される。アミノ酸配列に関しては、スコアリングマトリクスを使用して、累積スコアが算出される。ワードヒットの各方向への伸長は、以下のときに停止される：累積アライメントスコアが、その最大獲得値から量Ｘにまで下落したとき；累積スコアが、１つまたは複数のネガティブスコアリング残基アライメントの蓄積によってゼロ以下になったとき；またはいずれか配列末端に到達したとき。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ、ＴおよびＸは、アライメントの感受性とスピードを決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとしてワード長（Ｗ）を１１、期待値（Ｅ）を１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列に関しては、ＢＬＡＳＴＰは、デフォルトとしてワード長を３、期待値（Ｅ）を１０、そしてＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５を参照のこと）アライメント（Ｂ）を５０、期待値（Ｅ）を１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を使用する。
【００７０】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはさらに、２配列間の類似性の統計解析も実施する（例えば、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ    ９０：５８７３−５７８７を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提示される類似性の１つの尺度は、最小総計確率（Ｐ（Ｎ）：ｓｍａｌｌｅｓｔ  ｓｕｍ  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）であり、これは、２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の間の合致が偶然により生じる可能性の指標を提示する。例えば、被験核酸と参照核酸の比較における最小総計確率が、約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合、核酸は、参照配列に対し類似しているとみなされる。
【００７１】
以下に記載されるように、２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一である指標は、第一の核酸にコードされるポリペプチドが、第二の核酸によりコードされるポリペプチドに対して惹起された抗体と免疫交差反応することである。ゆえに典型的には、２ペプチドが保存的置換でのみ異なっている場合には、ポリペプチドは、第二のポリペプチドと実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一であることの別の指標は、その２つの分子またはその相補物が、以下に記載されるように、ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。２つの核酸配列が実質的に同一であることのさらに別の指標は、同じプライマーを使用して、配列を増幅できることである。
【００７２】
「接触すること」は、その率直で普通の意味に従い使用されており、少なくとも２つの別個の種（例えば生体分子を含む化合物または細胞）が充分に近接して、反応、相互作用または物理的に接触することが可能となるプロセスを指す。しかしながら、得られた反応産物は、添加された試薬間の反応から直接産生されてもよく、または反応混合物中に産生され得る、添加された試薬の１つまたは複数からの中間体から産生されてもよいことを認識されたい。ある実施形態では、接触することは、例えば、本明細書に記載のリボ核酸が、エンドヌクレアーゼおよびエンハンサーエレメントと相互作用することが可能になることを含む。
【００７３】
「対照」のサンプルまたは値とは、参照として役立つサンプル、通常は被験サンプルとの比較用の公知の参照として役立つサンプルを指す。例えば被験サンプルは、被験条件、例えば被験化合物の存在下から採取され、公知の条件、例えば被験化合物の非存在下（陰性対照）または公知化合物の存在下（陽性対照）からのサンプルと比較されてもよい。対照は、多くの検証または結果から集められた平均値を表すものであってもよい。当業者であれば、対照は、任意の数のパラメータの評価用に設計され得ることを認識するであろう。例えば対照は、薬理データ（例えば半減期）または治療測定値（例えば副作用比較）に基づき治療利益を比較するために考案されてもよい。当業者であれば、どの標準対照が、所与の状況において最も適しているか、そして標準対照値との比較に基づきデータを分析することができるかを理解するであろう。標準対照はさらに、データの有意性（例えば統計的有意性）の決定にも有益である。例えば所与のパラメータの値が、標準対照で広範に変化するものである場合、被験サンプルの多様性は有意とはみなされないであろう。
【００７４】
「標識」または「検出可能な部分」は、分光的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、化学的手段、または他の物理的手段により検出可能な組成物を指す。例えば有用な標識としては、32Ｐ、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（例えばＥＬＩＳＡにおいて普遍的に使用されている）、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテン、および例えば標的ペプチドと特異的に反応するペプチドまたは抗体内に放射性標識を組み込むことにより検出可能となりえるタンパク質もしくは他の実体が挙げられる。抗体と標識を複合体化するための、当分野に公知の適切な方法のいずれか、例えばＨｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １９９６，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏに記載される方法の使用などを採用してもよい。
【００７５】
「標識されたタンパク質またはポリペプチド」は、共有結合、リンカーもしくは化学結合を介して、または非共有結合、イオン結合、ファンデルワールス力を介して、静電的に、または水素結合のいずれかで標識に結合されたものであり、それによって、当該標識されたタンパク質またはポリペプチドの存在が、当該標識されたタンパク質またはポリペプチドに結合した標識の存在を検出することにより検出され得る。あるいは、高アフィニティ相互作用を使用した方法でも同じ結果を得ることができ、この方法では結合パートナーのペアのうちの一方が、例えばビオチンまたはストレプトアビジンなどの他方に結合する。
【００７６】
「生物サンプル」または「サンプル」とは、対象または患者から得られた、または誘導された物質を指す。生物サンプルには、組織学的な目的で採取された、例えば生検サンプル剖検サンプルなどの組織切片、および凍結切片が含まれる。こうしたサンプルとしては、体液、例えば血液または血液分画もしくは血液産物（例えば血清、血漿、血小板、赤血球など）、唾液、組織、培養細胞（例えば初代培養、外殖片および形質転換細胞）、糞便、尿、滑液、関節組織、滑膜組織、滑膜細胞、線維芽細胞様滑膜細胞、マクロファージ様滑膜細胞、免疫細胞、造血細胞、線維芽細胞、マクロファージ、Ｔ細胞などが挙げられる。生物サンプルは典型的には、例えばチンパンジーまたはヒトなどの霊長類；ウシ；イヌ；ネコ；齧歯類、例えばモルモット、ラット、マウス；ウサギなどの哺乳動物；または鳥類；爬虫類；または魚類などの真核生物から取得される。
【００７７】
本明細書において使用される場合、「細胞」とは、そのゲノムＤＮＡの保存または複製に充分な代謝機能または他の機能を実行する細胞を指す。細胞は、当分野に公知の方法により特定することができ、例えば損なわれていない膜の存在、特定の色素による染色、子孫物の生産能力、または配偶子の場合には第二の配偶子と組み合わせて活性のある子孫物を産生する能力などが挙げられる。細胞には、原核細胞と真核細胞が含まれ得る。原核細胞としては限定されないが細菌が挙げられる。真核細胞としては限定されないが、酵母細胞、ならびに植物から誘導された細胞、および例えば哺乳動物、昆虫（例えばヨトウ）などの動物から誘導された細胞、ならびにヒト細胞が挙げられる。
【００７８】
本明細書において使用される場合、遺伝子に関する「発現」または「発現した」という文言は、遺伝子の転写産物および／または翻訳産物を意味する。細胞中のＤＮＡ分子の発現レベルは、当該細胞内に存在する対応するｍＲＮＡの量、または当該細胞により産生されるＤＮＡによりコードされるタンパク質の量のいずれかを基礎として決定されてもよい（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，１８．１−１８．８８）。
【００７９】
トランスフェクトされた遺伝子の発現は、一過性に、または安定的に細胞において発生することができる。「一過性発現」の間では、トランスフェクトされた遺伝子は、細胞分裂中に娘細胞に移動しない。その発現は、トランスフェクトされた細胞に限定されており、遺伝子の発現は経時的に失われる。対照的に、トランスフェクトされた遺伝子の安定的発現は、トランスフェクトされた細胞に対し選択利益を付与する別の遺伝子と、当該遺伝子が、共トランスフェクトされたときに生じ得る。そのような選択利益は、細胞に対して提示される特定の毒素に対する抵抗性であってもよい。
【００８０】
「外因性」という用語は、所与の細胞または生物体の外を起源とする分子または物質（例えば核酸またはタンパク質）を指す。逆に、「内因性」という用語は、所与の細胞もしくは生物体に生来の、または所与の細胞もしくは生物体内を起源とする分子または物質を指す。
【００８１】
「細胞培養」は、生物体の外側に存在するインビトロ細胞集団である。細胞培養は、細胞バンクまたは動物から単離された初代細胞から確立されることができ、またはこれらの源から誘導され、長期間のインビトロ培養用に不死化された二次細胞から確立されることができる。
【００８２】
本発明の剤はしばしば、活性治療剤と、様々な他の薬学的に許容可能な成分を含む医薬組成物として投与される。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１５ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，１９８０）を参照のこと。好ましい剤型は、意図される投与様式および治療アプリケーションに依存する。組成物はさらに、望ましい製剤に応じて、薬学的に許容可能で非毒性の担体または希釈物質を含んでもよく、それらは動物またはヒトの投与用の医薬組成物を処方するために普遍的に使用されるビヒクルと規定される。希釈物質は、その併用剤の生物活性に影響を与えないように選択される。そうした希釈物質の例は、蒸留水、生理学的リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル溶液、ブドウ糖液、およびハンクス溶液である。さらに医薬組成物または製剤は、他の担体、アジュバントまたは非毒性で非治療的、非免疫原性の安定剤などを含んでもよい。
【００８３】
組成物は、治療処置または予防処置のために投与されることができる。治療アプリケーションにおいて、組成物は、疾患（例えば肺疾患）の罹患患者に、「治療有効投与量」で投与される。この用途に有効な量は、疾患の重大度、および患者の健康上の一般的状態に依存する。組成物の単回投与または複数回投与は、患者に必要とされる、および患者に忍容される用量ならびに頻度に応じて投与されてもよい。本発明の目的に対し、「患者」または「対象」には、ヒトおよび他の動物、特に哺乳動物の両方が含まれる。ゆえに当該方法は、ヒトの治療、獣医的応用の両方、および例えば齧歯類、イヌ科動物および霊長類動物のモデルを含む、実験動物モデルにおける研究用途のすべての状況に適用可能である。特定の実施形態では、対象または患者は、哺乳動物、好ましくは霊長類であり、最も好ましい実施形態では患者はヒトである。他の実施形態では、対象または患者は、哺乳動物、好ましくは齧歯類であり、最も好ましい実施形態ではマウスまたはラットである。
【００８４】
医薬組成物は、例えばタンパク質、例えばキトサンなどの多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸およびコポリマー（例えばラテックス官能化セファロース（ＴＭ）、アガロース、セルロースなど）、多量体型アミノ酸、アミノ酸コポリマー、ならびに脂質凝集体（例えば油滴またはリポソーム）などの大きくゆっくりと代謝される高分子を含んでもよい。さらにこれらの担体は、免疫刺激剤（すなわちアジュバント）として機能してもよい。
【００８５】
本明細書において提示される組成物は、単独または他の適切な成分と併用されて、エアロゾル製剤（すなわち霧状化され得る）へと作製され、吸入を介して投与されてもよい。エアロゾル製剤は、例えばジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの許容可能な加圧推進剤内に入れられてもよい。
【００８６】
例えば関節内（関節における）、静脈内、筋肉内、腫瘍内、皮内、腹腔内および皮下の経路などによる非経口投与に適した製剤としては、水性および非水性の等張滅菌注射溶液が挙げられ、それらは抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および目的のレシピエントの血液との等張性を製剤に付与する溶質を含んでもよく、そして水性および非水性の滅菌懸濁液も挙げられ、それらは懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤および保存剤を含んでもよい。本発明の実施において、組成物は、例えば静脈内点滴、腹腔内、膀胱内または髄腔内に投与されてもよい。非経口投与および静脈内投与が、好ましい投与方法である。化合物の製剤は、単位投与量または複数投与量で、例えばアンプルおよびバイアルなどの密閉容器に入っていてもよい。
【００８７】
注射用の溶液および懸濁液は、上述の滅菌粉末、顆粒および錠剤から調製されてもよい。
【００８８】
医薬調製物は、単位剤型であることが好ましい。そうした剤型では、製剤は、適切な量の活性成分を含有する単位用量へとさらに分割される。単位剤型は、パッケージ化された調製物であってもよく、そのパッケージは、個別量の調製物、例えばバイアルまたはアンプル中に粉末を含有する。組成物は、望ましい場合には他の適合性のある治療剤を含有してもよい。
【００８９】
併用投与は、別個の製剤または単一医薬製剤を使用した共投与、およびいずれかの順序での連続的投与が予期され、この場合において両方の（またはすべての）活性剤が、その生物活性を同時に発揮する期間があることが望ましい。
【００９０】
本明細書に提示される組成物の有効投与量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトであるか動物であるか、他に投与される医薬、そして処置が予防的であるか治療的であるか、を含む多くの様々な因子に応じて変化する。しかし当業者であればただちにガイダンスの肺障害の治療および予防に承認された組成物の用量から判断して、適切なおよび／または均等な投与量を認識するであろう。
【００９１】
「疾患」または「状態」という用語は、本明細書に提示される化合物、医薬組成物または方法で治療される状態、または治療されることができる患者または対象の健康状態を指す。ある実施形態では、疾患は、肺疾患（例えば肺癌、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症）である。
【００９２】
疾患（例えば肺疾患、肺癌、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症）と関連した物質または物質の活性または機能の文脈において、「関連した」または「〜と関連した」という用語は、当該物質または物質の活性または機能により（全体として、または部分的に）引き起こされたものであり、または当該疾患の症状は、当該物質または物質の活性または機能により（全体として、または部分的に）引き起こされる。
【００９３】
「トランスフェクション」、「形質導入」、「トランスフェクションすること」または「形質導入すること」という用語は相互交換可能に使用され、そして核酸分子および／またはタンパク質および／またはリボヌクレオタンパク質を、培養中の細胞に、またはインビボの組織に導入するプロセスとして規定される。核酸分子は、完全なタンパク質、リボヌクレオタンパク質またはその機能的部分をコードする配列であってもよい。典型的には、タンパク質、リボヌクレオタンパク質またはその機能的部分をコードする核酸は、当該タンパク質またはその機能的部分の発現に必要なエレメント（例えばプロモーター、転写開始部位など）を含む。トランスフェクションの非ウイルス的方法としては、細胞内に核酸分子を導入するための送達システムとしてウイルスＤＮＡまたはウイルス粒子を使用しない任意の適切な方法が挙げられる。非ウイルストランスフェクション法の例としては、リポソームトランスフェクションが挙げられる。「トランスフェクション」または「形質導入」という用語はさらに、外部環境から細胞内に核酸および／またはタンパク質を導入することを指す。トランスフェクションを介して核酸分子および／またはタンパク質および／またはリボヌクレオタンパク質は、細胞の内部に、または組織を構成する細胞内に送達される。核酸分子および／またはタンパク質および／またはリボヌクレオタンパク質の細胞または組織内へのトランスフェクションは、当該細胞の生物機能を改変する目的で実施されてもよい。あるいは核酸分子および／またはタンパク質および／またはリボヌクレオタンパク質のトランスフェクションは、細胞または組織へ検出可能な標識を送達し、細胞または組織の特定を促進する目的で実施されてもよい。例えば核酸（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ガイドＲＮＡ）および／またはリボヌクレオタンパク質（例えばＣＡＳ９）は、脂質介在型送達（例えばリポソームトランスフェクション）を介して細胞または組織内に導入され得る。あるいは核酸分子は、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはガイドＲＮＡであってもよい。一部の例において、核酸分子は、リボヌクレオタンパク質に結合されてもよい（例えばガイドＲＮＡに結合したＣａｓ９）。
【００９４】
本明細書に記載される特定のタンパク質に関して、指定されるタンパク質は、そのタンパク質の天然型、またはタンパク質転写因子活性を維持する（例えば天然タンパク質と比較して少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％以内）バリアントもしくはホモログのいずれかを含む。一部の実施形態では、バリアントまたはホモログは、天然型と比較して、配列全体または配列の一部（例えば５０、１００、１５０または２００個の連続的なアミノ酸部分）にわたって、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有している。他の実施形態では、タンパク質は、ＮＣＢＩ配列リファレンス番号により特定されるタンパク質である。他の実施形態では、タンパク質は、ＮＣＢＩ配列リファレンス番号により特定されるタンパク質またはその機能的断片もしくはホモログである。
【００９５】
ゆえに本明細書において言及される場合、「ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（ＣＲＩＳＰＲ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ９）」、「Ｃａｓ９」または「Ｃａｓ９タンパク質」には、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼの組み換え型もしくは天然型のいずれか、またはＣａｓ９エンドヌクレアーゼ酵素活性を（例えばＣａｓ９と比較して少なくとも５０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％以内）維持するそのバリアントもしくはホモログが含まれる。一部の態様では、バリアントまたはホモログは、天然型Ｃａｓ９タンパク質と比較して、配列全体または配列の一部（例えば５０、１００、１５０または２００個の連続的なアミノ酸部分）にわたって、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有している。ある実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔリファレンス番号Ｑ９９ＺＷ２により特定されるタンパク質に実質的に同一であるか、またはそれと実質的な同一性を有するバリアントもしくはホモログである。Ｃａｓ９とは、当分野において「ニッカーゼ（ｎｉｃｋａｓｅ）」としても知られているタンパク質を指す。ある実施形態では、Ｃａｓ９は、ＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ）核酸配列に結合する。ある実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ核酸配列は、原核細胞の核酸配列である。
【００９６】
本明細書において使用される場合、「脂質」という用語は、以下に詳述されるように、脂肪、ワックス、ステロイド、コレステロール、脂溶性ビタミン、モノグリセリド、ジグリセリド、リン脂質、スフィンゴ脂質、糖脂質、カチオン性脂質またはアニオン性脂質、誘導体化脂質などを含み得る脂質分子を指す。
【００９７】
適切なリン脂質としては限定されないが、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、およびホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジミリストイルホスファチジルセリン（ＤＭＰＳ）、ジステアロイルホスファチジルセリン（ＤＳＰＳ）、ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）、ジパルミトイルホスファチジルセリン（ＤＰＰＳ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル−  ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）およびジオレオイル−  ホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボン酸塩（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル−ホスファチジル−エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６−Ｏ−モノメチル  ＰＥ，１６−Ｏ−ジメチル  ＰＥ，１８−１−トランスＰＥ，１−ステアロイル−２−オレオイル−ホスファチジエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、１，２−ジエライドイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（トランスＤＯＰＥ）、およびカルジオリピンが挙げられる。一部の実施形態では、リン脂質はＤＯＰＥである。他の実施形態では、リン脂質はＤＳＰＣである。例えば卵ＰＣ、心抽出物、脳抽出物、肝抽出物および大豆ＰＣなどの脂質抽出物も本発明に有用である。一部の実施形態では、大豆ＰＣは、ヒドロ大豆ＰＣ（ＨＳＰＣ：Ｈｙｄｒｏ  Ｓｏｙ  ＰＣ）を含み得る。特定の実施形態では、脂質は、例えばＰＥＧ化脂質などの誘導体化脂質を含み得る。誘導体化脂質としては例えば、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００、コレステロール−ＰＥＧ２０００、ＤＳＰＥ−ポリグリセロール、または当分野に一般的に知られている他の誘導体が挙げられる。
【００９８】
本明細書において提示される「カチオン性脂質」とは、通常の、および慣習的な意味で、正味で正に荷電された脂質を指し、この電荷により脂質凝集体の形成が促進され得る。カチオン性脂質は、生理学的条件下で正電荷の官能基を含有する。カチオン性脂質としては限定されないが、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ−［１−（２，３，−ジテトラデシルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、Ｎ−［１−（２，３，ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩＥ）、３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）およびＮ，Ｎ−ジメチル−２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）が挙げられる。ある実施形態では、カチオン性脂質（例えば第一のカチオン性脂質、第二のカチオン性脂質）は、式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物である。ある実施形態では、第一のカチオン性脂質は、ジヒドロキシジミリスチルスペルミジン（ＤＨＤＭＳ）である。ある実施形態では、第二のカチオン性脂質は、ヒドロキシジミリスチルスペルミジン（ＨＤＭＳ）である。
【００９９】
脂質は、ミセル、単層膜および二重層膜を形成し得る。脂質は、リポソームまたは脂質凝集体へと自己アセンブリし得る。
【０１００】
「脂質凝集体」という用語は、複数の脂質または脂質型を含み、高次構造（例えば二次構造、三次構造または四次構造）を形成する脂質構造を指す。脂質凝集体の非限定的な例としては、リポソーム、単層小胞、多重膜小胞、ミセル、非晶質凝集体などが挙げられる。本発明の脂質凝集体は、カチオン性脂質、両性脂質、中性脂質、またはアニオン性脂質を含む任意の適切な脂質を含有し得る。ある実施形態では、脂質凝集体は、カチオン性脂質またはカチオン性脂質型を含む。ある実施形態では、脂質凝集体は、非カチオン性（例えば中性）脂質または非カチオン性脂質型と組み合わされたカチオン性脂質またはカチオン性脂質型を含む。ある実施形態では、脂質凝集体は、正味正電荷を有する。ある実施形態では、脂質凝集体は、カチオン性脂質と中性脂質を含む。ある実施形態では、カチオン性脂質は、参照によりすべての目的に対して本明細書に組み込まれる米国特許第８，７８５，２００号に記載されるカチオン性脂質である。
【０１０１】
ある実施形態では、脂質凝集体は、単一の脂質を含む。ある実施形態では、脂質凝集体は、複数の様々な脂質（例えば第一のカチオン性脂質、第二のカチオン性脂質、ヘルパー脂質）を含む。脂質凝集体が複数の様々な脂質を含む場合、脂質凝集体は脂質ブレンドを含んでもよい。本明細書に提示される場合、「脂質ブレンド」は、複数の脂質型の混合物である。ある実施形態では、脂質ブレンドは、第一の脂質型、第二の脂質型、または第三の脂質型を含む。第一、第二および第三の脂質型は独立して異なっていてもよい（例えばカチオン性脂質と非カチオン性脂質）。したがって当業者であれば、「脂質」および「脂質型」という用語は同じ意味を有し、相互交換可能に使用し得ることを即時に認識するであろう。
【０１０２】
ある実施形態では、本明細書に提示される脂質凝集体は、リポソームである。本明細書において使用される場合、「リポソーム」という用語は、脂質二重層に封入される任意の区画を包含する。リポソームという用語は、単層小胞を含み、単層小胞は、単一の脂質二重層から構成され、一般的に、約２０〜約４００ｎｍの範囲の直径を有する。リポソームはさらに、およそ１μｍ〜およそ１０μｍの範囲の直径の多重膜であってもよい。多重膜リポソームは、いくつか（２〜数百のいずれか）の単層小胞からなり、１つの単層小胞が他の単層小胞の中にサイズを小さくして形成され、水層により分離される同心のリン脂質スフィアの多重膜構造を生成する。あるいは多重膜リポソームは、大きなリポソームの内部の多くの小さな非同心脂質スフィアからなるものであってもよい。ある実施形態では、リポソームは、多重膜小胞（ＭＬＶ）、大型単層小胞（ＬＵＶ）、および小型単層小胞（ＳＵＶ）を含む。本発明のリポソームは、カチオン性脂質、両性脂質、中性脂質、またはアニオン性脂質を含む任意の適切な脂質を含有し得る。
【０１０３】
組成物
本明細書において特に、生物活性剤（例えば治療剤、生物活性剤または診断剤）のインビボ送達に有用な組成物および方法が提供される。その実施形態を含む本明細書において提供される組成物および方法は特に、対象の肺（例えば限定されないが肺内皮細胞、肺上皮細胞）への生物活性剤（例えば核酸分子、リボヌクレオタンパク質、低分子またはそれらの組み合わせ）の送達に使用されてもよい。本明細書において提供される組成物は、カチオン性脂質、ヘルパー脂質および生体安定性強化剤を含み、それらが生物活性剤とともに脂質凝集体を形成し、生体分子標的化を必要とすることなく、例えば肺組織などへの生物活性剤の全身送達を可能とする。
【０１０４】
ある態様において、以下を含む組成物が提供される：（ｉ）約０．１８〜約０．３２の組成モル比であり、以下の式の第一のカチオン性脂質であって、
【化９】
2020532546.tif 000011
（Ｉ）。
式（Ｉ）中、Ｒ1およびＲ2は独立して置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、または置換もしくは非置換のヘテロアリールである。Ｒ3およびＲ4は独立して、水素、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、または置換もしくは非置換のヘテロアリールである。ｍは、１〜６の整数である。Ｘa-はアニオンである、第一のカチオン性脂質、（ｉｉ）  約０．２４〜約０．５１の組成モル比であり、以下の式の第二のカチオン性脂質であって、
【化１０】
2020532546.tif 000012
（ＩＩ）。
式（ＩＩ）中、Ｒ5およびＲ8は独立して、水素、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、または置換もしくは非置換のヘテロアリールである。Ｒ6およびＲ7は独立して、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、または置換もしくは非置換のヘテロアリールである。ｎは、１〜６の整数である。Ｘb-は、アニオンである、第二のカチオン性脂質、（ｉｉｉ）  約０．２０〜約０．３２の組成モル比の第一のヘルパー脂質、（ｉｖ）約０．０１〜約０．１４の組成モル比の第二のヘルパー脂質、および（ｖ）約０．０１〜約０．０２の組成モル比の生体安定性強化剤。
【０１０５】
ある実施形態では、Ｒ1およびＲ2は独立して、置換または非置換のアルキルである。ある実施形態では、Ｒ1およびＲ2は独立して、非置換のアルキルである。Ｒ1およびＲ2は独立して、非置換のＣ1−Ｃ20アルキルである。ある実施形態では、Ｒ1およびＲ2は独立して、非置換のＣ5−Ｃ20アルキルである。ある実施形態では、Ｒ1およびＲ2は独立して、非置換のＣ10−Ｃ20アルキルである。ある実施形態では、Ｒ1およびＲ2は独立して、非置換のＣ12−Ｃ18アルキルである。ある実施形態では、Ｒ1およびＲ2は独立して、非置換のＣ14−Ｃ16アルキルである。ある実施形態では、Ｒ1は、非置換のＣ14アルキルである。ある実施形態では、Ｒ2は、非置換のＣ14アルキルである。ある実施形態では、Ｒ1は、非置換のＣ15アルキルである。ある実施形態では、Ｒ2は、非置換のＣ15アルキルである。ある実施形態では、Ｒ1は、非置換のＣ16アルキルである。ある実施形態では、Ｒ2は、非置換のＣ16アルキルである。ある実施形態では、Ｒ1は、−（ＣＨ2）13ＣＨ3である。ある実施形態では、Ｒ2は、−（ＣＨ2）13ＣＨ3である。
【０１０６】
ある実施形態では、Ｒ3およびＲ4は独立して、水素または置換もしくは非置換のアルキルである。ある実施形態では、Ｒ3およびＲ4は独立して、水素である。
【０１０７】
ある実施形態では、Ｒ5、Ｒ6およびＲ7は独立して、水素または置換もしくは非置換のアルキルである。ある実施形態では、Ｒ5、Ｒ6およびＲ7は独立して、水素または非置換のアルキルである。ある実施形態では、Ｒ5、Ｒ6およびＲ7は独立して、水素または非置換のＣ1−Ｃ20アルキルである。ある実施形態では、Ｒ5、Ｒ6およびＲ7は独立して、水素または非置換のＣ5−Ｃ20アルキルである。ある実施形態では、Ｒ5、Ｒ6およびＲ7は独立して、水素または非置換のＣ10−Ｃ20アルキルである。ある実施形態では、Ｒ5、Ｒ6およびＲ7は独立して、水素または非置換のＣ12−Ｃ18アルキルである。ある実施形態では、Ｒ5、Ｒ6およびＲ7は独立して、水素または非置換のＣ14−Ｃ16アルキルである。ある実施形態では、Ｒ5、Ｒ6およびＲ7は独立して、水素または非置換のＣ14アルキルである。ある実施形態では、Ｒ5、Ｒ6およびＲ7は独立して、水素または非置換のＣ15アルキルである。ある実施形態では、Ｒ5、Ｒ6およびＲ7は独立して、水素または非置換のＣ16アルキルである。ある実施形態では、Ｒ5は、非置換のＣ14アルキルである。ある実施形態では、Ｒ7は、非置換のＣ14アルキルである。ある実施形態では、Ｒ5は、−（ＣＨ2）13ＣＨ3である。ある実施形態では、Ｒ6は、水素である。ある実施形態では、Ｒ7は、−（ＣＨ2）13ＣＨ3である。
【０１０８】
ある実施形態では、Ｒ8は、水素または置換もしくは非置換のアルキルである。ある実施形態では、Ｒ8は、水素である。
【０１０９】
ある実施形態では、ｍは、約１〜６の整数である。ある実施形態では、ｍは、約１〜５の整数である。ある実施形態では、ｍは、約１〜４の整数である。ある実施形態では、ｍは、約１〜３の整数である。ある実施形態では、ｍは、１〜６の整数である。ある実施形態では、ｍは、１〜５の整数である。ある実施形態では、ｍは、１〜４の整数である。ある実施形態では、ｍは、１〜３の整数である。ある実施形態では、ｍは、１である。ある実施形態では、ｍは、２である。ある実施形態では、ｍは、３である。ある実施形態では、ｍは、４である。ある実施形態では、ｍは、５である。ある実施形態では、ｍは、６である。
【０１１０】
ある実施形態では、ｎは、約１〜６の整数である。ある実施形態では、ｎは、約１〜５の整数である。ある実施形態では、ｎは、約１〜４の整数である。ある実施形態では、ｎは、約１〜３の整数である。ある実施形態では、ｎは、１〜６の整数である。ある実施形態では、ｎは、１〜５の整数である。ある実施形態では、ｎは、１〜４の整数である。ある実施形態では、ｎは、１〜３の整数である。ある実施形態では、ｎは、１である。ある実施形態では、ｎは、２である。ある実施形態では、ｎは、３である。ある実施形態では、ｎは、４である。ある実施形態では、ｎは、５である。ある実施形態では、ｎは、６である。
【０１１１】
１つの実施形態では、Ｒ1は、−（ＣＨ2）13ＣＨ3、Ｒ2は、−（ＣＨ2）13ＣＨ3、Ｒ3は、水素、Ｒ4は、水素、ｍは４、そしてＸa-は、ＣＨ3ＣＯＯ-である。
【０１１２】
１つの実施形態では、Ｒ5は、−（ＣＨ2）13ＣＨ3、Ｒ6は、水素、Ｒ7は、−（ＣＨ2）13ＣＨ3、Ｒ8は、水素、ｎは４、そしてＸb-は、ＣＨ3ＣＯＯ-である。
【０１１３】
化合物（例えばカチオン性脂質、ヘルパー脂質、生体安定性強化剤など）の「組成モル比」という用語は、溶液中のすべての化合物の溶質モルの総数に対する、個々の化合物の溶質モル数の比率を指す。例えば溶質モルの総数が３３．８であり、個々の化合物（例えば第一のカチオン性脂質）の溶質モル数が８．１であれば、この個々の化合物の組成比は０．２４となる。ある実施形態では、溶質モルの総数は３３．８であり、単一化合物の溶質モル数は１０．８であると、この単一化合物の組成比は０．３２となる。
【０１１４】
本明細書に提供される組成物は、２つ以上のヘルパー脂質（例えば第一のヘルパー脂質、第二のヘルパー脂質など）を含む。本明細書において提供される「ヘルパー脂質」とは、当該ヘルパー脂質の非存在下と比較して、細胞への生物活性剤の送達を増加させることができる脂質を指す。ゆえに細胞への生物活性剤の送達効率は、当該ヘルパー脂質の非存在下の送達効率と比較して、ヘルパー脂質の存在下のほうが高い。細胞内への生物活性剤の送達は、例えば、細胞内への生物活性剤の取り込み（細胞膜を介した浸透）、細胞中での生物活性剤のエンドソーム放出、生物活性剤の安定性強化、および／または送達プロセスの間に脂質凝集体を形成する化合物などを含む。本発明に有用なヘルパー脂質としては限定されないが、レシチン；ホスホチジルエタノールアミン；ホスファチジルエタノールアミン、例えばＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）、ＤＰｈＰＥ（ジフィタノイルホスファチジルエタノールアミン）、ＤＰＰＥ（ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン）、ジパルミテオイルホスファチジルエタノールアミン、ＰＯＰＥ（パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン）およびジステアロイルホスファチジルエタノールアミン；ホスホチジルコリン；ホスファチジルコリン、例えばＤＯＰＣ（ジオレオイルホスフィジルコリン）、ＤＰＰＣ（ジパルミトイルホスファチジルコリン）  ＰＯＰＣ（パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン）およびジステアロイルホスファチジルコリン；ホスファチジルグリセロール；ホスファチジルグリセロール、例えばＤＯＰＧ（ジオレオイルホスファチジルグリセロール）、ＤＰＰＧ（ジパルミトイルホスファチジル−グリセロール）、およびジステアロイルホスファチジルグリセロール；ホスファチジルセリン；ホスファチジルセリン、例えばジオレオイル−  またはジパルミトイルホスファチジルセリン；ジホスファチジルグリセロール；脂肪酸エステル；グリセロールエステル；スフィンゴ脂質；カルドリピン；セレブロシド；およびセラミド；ならびにそれらの混合物が挙げられる。ヘルパー脂質としてはさらにコレステロールおよび他の３βＯＨ−ステロールが挙げられる。
【０１１５】
本明細書において提示される「生体安定性強化剤」は、当該化合物の非存在下と比較して、本明細書に提供される組成物（例えば生物活性剤を含有する脂質凝集体）の物理的および化学的な安定性を増加させることができる化合物である。対象に生体安定性強化剤を投与することで、本明細書に提供される化合物の生体分布が増加し得る。ある実施形態では、生体安定性強化剤は、ポリエーテル化合物である。ある実施形態では、生体安定性強化剤は、ＰＥＧ化リン脂質である。ある実施形態では、生体安定性強化剤は、ポリエチレングリコールである。
【０１１６】
ある実施形態では、第一のカチオン性脂質は、約０．１８の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第一のカチオン性脂質は、０．１８の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第一のカチオン性脂質は、約０．２３の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第一のカチオン性脂質は、０．２３の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第一のカチオン性脂質は、約０．２４の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第一のカチオン性脂質は、０．２４の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第一のカチオン性脂質は、約０．２５の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第一のカチオン性脂質は、０．２５の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第一のカチオン性脂質は、約０．２７の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第一のカチオン性脂質は、０．２７の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第一のカチオン性脂質は、約０．２８の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第一のカチオン性脂質は、０．２８の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第一のカチオン性脂質は、約０．３２の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第一のカチオン性脂質は、０．３２の組成モル比で存在する。
【０１１７】
ある実施形態では、第一のカチオン性脂質は、式：
【化１１】
2020532546.tif 000013
（ＩＡ）を有し、
式中、
Ｘa-は、Ｃｌ-またはＣＨ3ＣＯＯ-である。ある実施形態では、Ｘa-は、ＣＨ3ＣＯＯ-である。ある実施形態では、第一のカチオン性脂質は、ジヒドロキシジミリスチルスペルミジンである。
【０１１８】
ある実施形態では、第二のカチオン性脂質は、約０．２４の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第二のカチオン性脂質は、０．２４の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第二のカチオン性脂質は、約０．３８の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第二のカチオン性脂質は、０．３８の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第二のカチオン性脂質は、約０．３９の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第二のカチオン性脂質は、０．３９の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第二のカチオン性脂質は、約０．４０の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第二のカチオン性脂質は、０．４０の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第二のカチオン性脂質は、約０．４５の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第二のカチオン性脂質は、０．４５の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第二のカチオン性脂質は、約０．４７の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第二のカチオン性脂質は、０．４７の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第二のカチオン性脂質は、約０．５１の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第二のカチオン性脂質は、０．５１の組成モル比で存在する。
【０１１９】
ある実施形態では、第二のカチオン性脂質は、式：
【化１２】
2020532546.tif 000014
（ＩＩＡ）を有し、
式中、Ｘb-は、Ｃｌ-またはＣＨ3ＣＯＯ-である。ある実施形態では、Ｘb-は、ＣＨ3ＣＯＯ-である。ある実施形態では、第二のカチオン性脂質は、ヒドロキシジミリスチルスペルミジンである。
【０１２０】
ある実施形態では、第一のヘルパー脂質は、約０．２０の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第一のヘルパー脂質は、０．２０の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第一のヘルパー脂質は、約０．２４の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第一のヘルパー脂質は、０．２４の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第一のヘルパー脂質は、約０．２６の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第一のヘルパー脂質は、０．２６の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第一のヘルパー脂質は、約０．３２の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第一のヘルパー脂質は、０．３２の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第一のヘルパー脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である。
【０１２１】
ある実施形態では、第二のヘルパー脂質は、約０．０１の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第二のヘルパー脂質は、０．０１の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第二のヘルパー脂質は、約０．０５の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第二のヘルパー脂質は、０．０５の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第二のヘルパー脂質は、約０．０８の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第二のヘルパー脂質は、０．０８の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第二のヘルパー脂質は、約０．１０の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第二のヘルパー脂質は、０．１０の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第二のヘルパー脂質は、約０．１４の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第二のヘルパー脂質は、０．１４の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第二のヘルパー脂質は、コレステロールである。
【０１２２】
ある実施形態では、生体安定性強化剤は、約０．０１の組成モル比で存在する。ある実施形態では、生体安定性強化剤は、０．０１の組成モル比で存在する。ある実施形態では、生体安定性強化剤は、約０．０２の組成モル比で存在する。ある実施形態では、生体安定性強化剤は、０．０２の組成モル比で存在する。ある実施形態では、生体安定性強化剤は、ポリエーテル化合物である。ある実施形態では、生体安定性強化剤は、ＰＥＧ化リン脂質である。ある実施形態では、生体安定性強化剤は、ポリエチレングリコールである。
【０１２３】
ある実施形態では、生体安定性強化剤は、約７５０ｇ／ｍｏｌ〜約５０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有する。ある実施形態では、生体安定性強化剤は、約８００ｇ／ｍｏｌ〜約５０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有する。ある実施形態では、生体安定性強化剤は、約８５０ｇ／ｍｏｌ〜約５０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有する。ある実施形態では、生体安定性強化剤は、約９００ｇ／ｍｏｌ〜約５０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有する。ある実施形態では、生体安定性強化剤は、約９５０ｇ／ｍｏｌ〜約５０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有する。ある実施形態では、生体安定性強化剤は、約１０００ｇ／ｍｏｌ〜約５０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有する。ある実施形態では、生体安定性強化剤は、約１５００ｇ／ｍｏｌ〜約５０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有する。ある実施形態では、生体安定性強化剤は、約２０００ｇ／ｍｏｌ〜約５０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有する。ある実施形態では、生体安定性強化剤は、約２５００ｇ／ｍｏｌ〜約５０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有する。ある実施形態では、生体安定性強化剤は、約３０００ｇ／ｍｏｌ〜約５０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有する。ある実施形態では、生体安定性強化剤は、約３５００ｇ／ｍｏｌ〜約５０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有する。ある実施形態では、生体安定性強化剤は、約４０００ｇ／ｍｏｌ〜約５０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有する。ある実施形態では、生体安定性強化剤は、約４５００ｇ／ｍｏｌ〜約５０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有する。
【０１２４】
ある実施形態では、生体安定性強化剤は、約７５０ｇ／ｍｏｌの分子量を有する。ある実施形態では、生体安定性強化剤は、７５０ｇ／ｍｏｌの分子量を有する。ある実施形態では、生体安定性強化剤は、約２０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有する。ある実施形態では、生体安定性強化剤は、２０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有する。ある実施形態では、生体安定性強化剤は、約５０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有する。ある実施形態では、生体安定性強化剤は、５０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有する。
【０１２５】
ある実施形態では、生体安定性強化剤は、Ｃ１４ポリエチレングリコール７５０である。ある実施形態では、生体安定性強化剤は、Ｃ１４ポリエチレングリコール２０００である。ある実施形態では、生体安定性強化剤は、Ｃ１４ポリエチレングリコール５０００である。
【０１２６】
ある実施形態では、第一のカチオン性脂質は、約０．１８〜約０．３２、約０．１９〜約０．３２、約０．２０〜約０．３２、約０．２１〜約０．３２、約０．２２〜約０．３２、約０．２３〜約０．３２、約０．２４〜約０．３２、約０．２５〜約０．３２、約０．２６〜約０．３２、約０．２７〜約０．３２、約０．２８〜約０．３２、約０．２９〜約０．３２、または約０．３０〜約０．３２の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第一のカチオン性脂質は、０．１８〜０．３２、０．１９〜０．３２、０．２０〜０．３２、０．２１〜０．３２、０．２２〜０．３２、０．２３〜０．３２、０．２４〜０．３２、０．２５〜０．３２、０．２６〜０．３２、０．２７〜０．３２、０．２８〜０．３２、０．２９〜０．３２、または０．３０〜０．３２の組成モル比で存在する。
【０１２７】
ある実施形態では、第一のカチオン性脂質は、０．１８〜０．３２の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第一のカチオン性脂質は、０．１９〜０．３２の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第一のカチオン性脂質は、０．２０〜０．３２の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第一のカチオン性脂質は、０．２１〜０．３２の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第一のカチオン性脂質は、０．２２〜０．３２の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第一のカチオン性脂質は、０．２３〜０．３２の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第一のカチオン性脂質は、０．２４〜０．３２の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第一のカチオン性脂質は、０．２５〜０．３２の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第一のカチオン性脂質は、０．２６〜０．３２の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第一のカチオン性脂質は、０．２７〜０．３２の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第一のカチオン性脂質は、０．２８〜０．３２の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第一のカチオン性脂質は、０．２９〜０．３２の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第一のカチオン性脂質は、０．３０〜０．３２の組成モル比で存在する。
【０１２８】
ある実施形態では、第一のカチオン性脂質は、０．１８〜０．３１の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第一のカチオン性脂質は、０．１８〜０．３０の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第一のカチオン性脂質は、０．１８〜０．２９の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第一のカチオン性脂質は、０．１８〜０．２８の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第一のカチオン性脂質は、０．１８〜０．２７の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第一のカチオン性脂質は、０．１８〜０．２６の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第一のカチオン性脂質は、０．１８〜０．２５の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第一のカチオン性脂質は、０．１８〜０．２４の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第一のカチオン性脂質は、０．１８〜０．２３の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第一のカチオン性脂質は、０．１８〜０．２２の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第一のカチオン性脂質は、０．１８〜０．２１の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第一のカチオン性脂質は、０．１８〜０．２０の組成モル比で存在する。
【０１２９】
ある実施形態では、第一のカチオン性脂質は、０．１８、０．１９、０．２０、０．２１、０．２２、０．２３、０．２４、０．２５、０．２６、０．２７、０．２８、０．２９、０．３０、０．３１または０．３２の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第一のカチオン性脂質は、約０．１８、０．１９、０．２０、０．２１、０．２２、０．２３、０．２４、０．２５、０．２６、０．２７、０．２８、０．２９、０．３０、０．３１または０．３２の組成モル比で存在する。さらなる実施形態では、第二のカチオン性脂質は、約０．２４〜約０．５１の組成モル比で存在し、第一のヘルパー脂質は、約０．２０〜約０．３２の組成モル比で存在し、第二のヘルパー脂質は、約０．０１〜約０．１４の組成モル比で存在し、そして生体安定性強化剤は、約０．０１〜約０．０２の組成モル比で存在する。
【０１３０】
ある実施形態では、第二のカチオン性脂質は、約０．２４〜約０．５１、約０．２５〜約０．５１、約０．２６〜約０．５１、約０．２７〜約０．５１、約０．２８〜約０．５１、約０．２９〜約０．５１、約０．３０〜約０．５１、約０．３１〜約０．５１、約０．３２〜約０．５１、約０．３３〜約０．５１、約０．３４〜約０．５１、約０．３５〜約０．５１、約０．３６〜約０．５１、約０．３７〜約０．５１、約０．３８〜約０．５１、約０．３９〜約０．５１、約０．４０〜約０．５１、約０．４１〜約０．５１、約０．４２〜約０．５１、約０．４３〜約０．５１、約０．４４〜約０．５１、約０．４５〜約０．５１、約０．４６〜約０．５１、約０．４７〜約０．５１、約０．４８〜約０．５１、または約０．４９〜約０．５１の組成モル比で存在する。
【０１３１】
ある実施形態では、第二のカチオン性脂質は、０．２４〜０．５１、０．２５〜０．５１、０．２６〜０．５１、０．２７〜０．５１、０．２８〜０．５１、０．２９〜０．５１、０．３０〜０．５１、０．３１〜０．５１、０．３２〜０．５１、０．３３〜０．５１、０．３４〜０．５１、０．３５〜０．５１、０．３６〜０．５１、０．３７〜０．５１、０．３８〜０．５１、０．３９〜０．５１、０．４０〜０．５１、０．４１〜０．５１、０．４２〜０．５１、０．４３〜０．５１、０．４４〜０．５１、０．４５〜０．５１、０．４６〜０．５１、０．４７〜０．５１、０．４８〜０．５１、または０．４９〜０．５１の組成モル比で存在する。
【０１３２】
ある実施形態では、第二のカチオン性脂質は、約０．２４〜約０．５１、約０．２４〜約０．５０、約０．２４〜約０．４９、約０．２４〜約０．４８、約０．２４〜約０．４７、約０．２４〜約０．４６、約０．２４〜約０．４５、約０．２４〜約０．４４、約０．２４〜約０．４３、約０．２４〜約０．４２、約０．２４〜約０．４１、約０．２４〜約０．４０、約０．２４〜約０．３９、約０．２４〜約０．３８、約０．２４〜約０．３７、約０．２４〜約０．３６、約０．２４〜約０．３５、約０．２４〜約０．３４、約０．２４〜約０．３３、約０．２４〜約０．３２、約０．２４〜約０．３１、約０．２４〜約０．３０、約０．２４〜約０．２９、約０．２４〜約０．２８、約０．２４〜約０．２７、または約０．２４〜約０．２６の組成モル比で存在する。
【０１３３】
ある実施形態では、第二のカチオン性脂質は、０．２４〜０．５１、０．２４〜０．５０、０．２４〜０．４９、０．２４〜０．４８、０．２４〜０．４７、０．２４〜０．４６、０．２４〜０．４５、０．２４〜０．４４、０．２４〜０．４３、０．２４〜０．４２、０．２４〜０．４１、０．２４〜０．４０、０．２４〜０．３９、０．２４〜０．３８、０．２４〜０．３７、０．２４〜０．３６、０．２４〜０．３５、０．２４〜０．３４、０．２４〜０．３３、０．２４〜０．３２、０．２４〜０．３１、０．２４〜０．３０、０．２４〜０．２９、０．２４〜０．２８、０．２４〜０．２７、または０．２４〜０．２６の組成モル比で存在する。
【０１３４】
ある実施形態では、第二のカチオン性脂質は、０．２４〜０．５１の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第二のカチオン性脂質は、０．２５〜０．５１の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第二のカチオン性脂質は、０．２６〜０．５１の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第二のカチオン性脂質は、０．２７〜０．５１の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第二のカチオン性脂質は、０．２８〜０．５１の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第二のカチオン性脂質は、０．２９〜０．５１の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第二のカチオン性脂質は、０．３０〜０．５１の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第二のカチオン性脂質は、０．３１〜０．５１の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第二のカチオン性脂質は、０．３２〜０．５１の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第二のカチオン性脂質は、０．３３〜０．５１の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第二のカチオン性脂質は、０．３４〜０．５１の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第二のカチオン性脂質は、０．３５〜０．５１の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第二のカチオン性脂質は、０．３６〜０．５１の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第二のカチオン性脂質は、０．３７〜０．５１の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第二のカチオン性脂質は、０．３８〜０．５１の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第二のカチオン性脂質は、０．３９〜０．５１の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第二のカチオン性脂質は、０．４０〜０．５１の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第二のカチオン性脂質は、０．４１〜０．５１の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第二のカチオン性脂質は、０．４２〜０．５１の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第二のカチオン性脂質は、０．４３〜０．５１の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第二のカチオン性脂質は、０．４４〜０．５１の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第二のカチオン性脂質は、０．４５〜０．５１の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第二のカチオン性脂質は、０．４６〜０．５１の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第二のカチオン性脂質は、０．４７〜０．５１の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第二のカチオン性脂質は、０．４８〜０．５１の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第二のカチオン性脂質は、０．４９〜０．５１の組成モル比で存在する。
【０１３５】
ある実施形態では、第二のカチオン性脂質は、０．２４、０．２５、０．２６、０．２７、０．２８、０．２９、０．３０、０．３１、０．３２、０．３３、０．３４、０．３５、０．３６、０．３７、０．３８、０．３９、０．４０、０．４１、０．４２、０．４３、０．４４、０．４５、０．４６、０．４７、０．４８、０．４９、０．５０または０．５１の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第二のカチオン性脂質は、約０．２４、０．２５、０．２６、０．２７、０．２８、０．２９、０．３０、０．３１、０．３２、０．３３、０．３４、０．３５、０．３６、０．３７、０．３８、０．３９、０．４０、０．４１、０．４２、０．４３、０．４４、０．４５、０．４６、０．４７、０．４８、０．４９、０．５０または０．５１の組成モル比で存在する。さらなる実施形態では、第一のカチオン性脂質は、約０．１８〜約０．３２の組成モル比で存在し、第一のヘルパー脂質は、約０．２０〜約０．３２の組成モル比で存在し、第二のヘルパー脂質は、約０．０１〜約０．１４の組成モル比で存在し、そして生体安定性強化剤は、約０．０１〜約０．０２の組成モル比で存在する。
【０１３６】
ある実施形態では、第一のヘルパー脂質は、０．２０〜０．３２、０．２１〜０．３２、０．２２〜０．３２、０．２３〜０．３２、０．２４〜０．３２、０．２５〜０．３２、０．２６〜０．３２、０．２７〜０．３２、０．２８〜０．３２、０．２９〜０．３２、または０．３０〜０．３２の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第一のヘルパー脂質は、約０．２０〜約０．３２、約０．２１〜約０．３２、約０．２２〜約０．３２、約０．２３〜約０．３２、約０．２４〜約０．３２、約０．２５〜約０．３２、約０．２６〜約０．３２、約０．２７〜約０．３２、約０．２８〜約０．３２、約０．２９〜約０．３２、または約０．３０〜約０．３２の組成モル比で存在する。
【０１３７】
ある実施形態では、第一のヘルパー脂質は、０．２０〜０．３１、０．２０〜０．３０、０．２０〜０．２９、０．２０〜０．２８、０．２０〜０．２７、０．２０〜０．２６、０．２０〜０．２５、０．２０〜０．２４、０．２０〜０．２３、または０．２０〜０．２２の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第一のヘルパー脂質は、約０．２０〜約０．３１、約０．２０〜約０．３０、約０．２０〜約０．２９、約０．２０〜約０．２８、約０．２０〜約０．２７、約０．２０〜約０．２６、約０．２０〜約０．２５、約０．２０〜約０．２４、約０．２０〜約０．２３、または約０．２０〜約０．２２の組成モル比で存在する。
【０１３８】
ある実施形態では、第一のヘルパー脂質は、０．２０〜０．３１の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第一のヘルパー脂質は、０．２０〜０．３０の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第一のヘルパー脂質は、０．２０〜０．２９の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第一のヘルパー脂質は、０．２０〜０．２８の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第一のヘルパー脂質は、０．２０〜０．２７の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第一のヘルパー脂質は、０．２０〜０．２６の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第一のヘルパー脂質は、０．２０〜０．２５の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第一のヘルパー脂質は、０．２０〜０．２４の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第一のヘルパー脂質は、０．２０〜０．２３の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第一のヘルパー脂質は、０．２０〜０．２２の組成モル比で存在する。
【０１３９】
ある実施形態では、第一のヘルパー脂質は、０．２０から、０．２１、０．２２、０．２３、０．２４、０．２５、０．２６、０．２７、０．２８、０．２９、０．３０、０．３１または０．３２の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第一のヘルパー脂質は、約０．２０から、０．２１、０．２２、０．２３、０．２４、０．２５、０．２６、０．２７、０．２８、０．２９、０．３０、０．３１または０．３２の組成モル比で存在する。さらなる実施形態では、第一のカチオン性脂質は、約０．１８〜約０．３２の組成モル比で存在し、第二のカチオン性脂質は、約０．２４〜約０．５１の組成モル比で存在し、第二のヘルパー脂質は、約０．０１〜約０．１４の組成モル比で存在し、そして生体安定性強化剤は、約０．０１〜約０．０２の組成モル比で存在する。
【０１４０】
ある実施形態では、第二のヘルパー脂質は、０．０１〜０．１４、０．０１〜０．１３、０．０１〜０．１２、０．０１〜０．１１、０．０１〜０．１０、０．０１〜０．９、０．０１〜０．８、０．０１〜０．７、０．０１〜０．６、０．０１〜０．５、０．０１〜０．４、０．０１〜０．３、０．０１〜０．２、０．０１〜０．１、０．０１〜０．０９、０．０１〜０．０８、０．０１〜０．０７、０．０１〜０．０６、０．０１〜０．０５、０．０１〜０．０４、または０．０１〜０．０３の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第二のヘルパー脂質は、約０．０１〜約０．１４、約０．０１〜約０．１３、約０．０１〜約０．１２、約０．０１〜約０．１１、約０．０１〜約０．１０、約０．０１〜約０．９、約０．０１〜約０．８、約０．０１〜約０．７、約０．０１〜約０．６、約０．０１〜約０．５、約０．０１〜約０．４、約０．０１〜約０．３、約０．０１〜約０．２、約０．０１〜約０．１、約０．０１〜約０．０９、約０．０１〜約０．０８、約０．０１〜約０．０７、約０．０１〜約０．０６、約０．０１〜約０．０５、約０．０１〜約０．０４、または約０．０１〜約０．０３の組成モル比で存在する。
【０１４１】
ある実施形態では、第二のヘルパー脂質は、０．０２〜０．１４の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第二のヘルパー脂質は、０．０３〜０．１４の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第二のヘルパー脂質は、０．０４〜０．１４の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第二のヘルパー脂質は、０．０５〜０．１４の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第二のヘルパー脂質は、０．０６〜０．１４の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第二のヘルパー脂質は、０．０７〜０．１４の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第二のヘルパー脂質は、０．０８〜０．１４の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第二のヘルパー脂質は、０．０９〜０．１４の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第二のヘルパー脂質は、０．１〜０．１４の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第二のヘルパー脂質は、０．２〜０．１４の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第二のヘルパー脂質は、０．３〜０．１４の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第二のヘルパー脂質は、０．４〜０．１４の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第二のヘルパー脂質は、０．５〜０．１４の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第二のヘルパー脂質は、０．６〜０．１４の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第二のヘルパー脂質は、０．７〜０．１４の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第二のヘルパー脂質は、０．８〜０．１４の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第二のヘルパー脂質は、０．９〜０．１４の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第二のヘルパー脂質は、０．１〜０．１４の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第二のヘルパー脂質は、０．１１〜０．１４の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第二のヘルパー脂質は、０．１２〜０．１４の組成モル比で存在する。
【０１４２】
ある実施形態では、第二のヘルパー脂質は、０．０１から、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１０、０．１１、０．１２、０．１３、または０．１４の組成モル比で存在する。ある実施形態では、第二のヘルパー脂質は、約０．０１から、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１０、０．１１、０．１２、０．１３、または０．１４の組成モル比で存在する。さらなる実施形態では、第一のカチオン性脂質は、約０．１８〜約０．３２の組成モル比で存在し、第二のカチオン性脂質は、約０．２４〜約０．５１の組成モル比で存在し、第一のヘルパー脂質は、約０．２０〜約０．３２の組成モル比で存在し、そして生体安定性強化剤は、約０．０１〜約０．０２の組成モル比で存在する。
【０１４３】
ある実施形態では、生体安定性強化剤は、０．０１〜０．０２の組成モル比で存在する。ある実施形態では、生体安定性強化剤は、０．０１１〜０．０２の組成モル比で存在する。ある実施形態では、生体安定性強化剤は、０．０１２〜０．０２の組成モル比で存在する。ある実施形態では、生体安定性強化剤は、０．０１３〜０．０２の組成モル比で存在する。ある実施形態では、生体安定性強化剤は、０．０１４〜０．０２の組成モル比で存在する。ある実施形態では、生体安定性強化剤は、０．０１５〜０．０２の組成モル比で存在する。ある実施形態では、生体安定性強化剤は、０．０１６〜０．０２の組成モル比で存在する。ある実施形態では、生体安定性強化剤は、０．０１７〜０．０２の組成モル比で存在する。ある実施形態では、生体安定性強化剤は、０．０１８〜０．０２の組成モル比で存在する。
【０１４４】
ある実施形態では、生体安定性強化剤は、約０．０１〜約０．０２の組成モル比で存在する。ある実施形態では、生体安定性強化剤は、約０．０１１〜約０．０２の組成モル比で存在する。ある実施形態では、生体安定性強化剤は、約０．０１２〜約０．０２の組成モル比で存在する。ある実施形態では、生体安定性強化剤は、約０．０１３〜約０．０２の組成モル比で存在する。ある実施形態では、生体安定性強化剤は、約０．０１４〜約０．０２の組成モル比で存在する。ある実施形態では、生体安定性強化剤は、約０．０１５〜約０．０２の組成モル比で存在する。ある実施形態では、生体安定性強化剤は、約０．０１６〜約０．０２の組成モル比で存在する。ある実施形態では、生体安定性強化剤は、約０．０１７〜約０．０２の組成モル比で存在する。ある実施形態では、生体安定性強化剤は、約０．０１８〜約０．０２の組成モル比で存在する。
【０１４５】
ある実施形態では、生体安定性強化剤は、約０．０１〜約０．０１９の組成モル比で存在する。ある実施形態では、生体安定性強化剤は、約０．０１〜約０．０１８の組成モル比で存在する。ある実施形態では、生体安定性強化剤は、約０．０１〜約０．０１７の組成モル比で存在する。ある実施形態では、生体安定性強化剤は、約０．０１〜約０．０１６の組成モル比で存在する。ある実施形態では、生体安定性強化剤は、約０．０１〜約０．０１５の組成モル比で存在する。ある実施形態では、生体安定性強化剤は、約０．０１〜約０．０１４の組成モル比で存在する。ある実施形態では、生体安定性強化剤は、約０．０１〜約０．０１３の組成モル比で存在する。ある実施形態では、生体安定性強化剤は、約０．０１〜約０．０１２の組成モル比で存在する。
【０１４６】
ある実施形態では、生体安定性強化剤は、０．０１から、０．０１１、０．０１２、０．０１３、０．０１４、０．０１５、０．０１６、０．０１７、０．０１８、０．０１９または０．０２０の組成モル比で存在する。ある実施形態では、生体安定性強化剤は、約０．０１から、０．０１１、０．０１２、０．０１３、０．０１４、０．０１５、０．０１６、０．０１７、０．０１８、０．０１９または０．０２０の組成モル比で存在する。さらなる実施形態では、第一のカチオン性脂質は、約０．１８〜約０．３２の組成モル比で存在し、第二のカチオン性脂質は、約０．２４〜約０．５１の組成モル比で存在し、第一のヘルパー脂質は、約０．２０〜約０．３２の組成モル比で存在し、そして第二のヘルパー脂質は、約０．０１〜約０．１４の組成モル比で存在する。
【０１４７】
ある態様において、（ｉ）約０．２４の組成モル比の第一のカチオン性脂質であって、当該第一のカチオン性脂質は、ジヒドロキシジミリスチルスペルミジンである；（ｉｉ）約０．３８の組成モル比の第二のカチオン性脂質であって、当該第二のカチオン性脂質は、ヒドロキシジミリスチルスペルミジンである；（ｉｉｉ）約０．３２の組成モル比の第一のヘルパー脂質であって、当該第一のヘルパー脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンである；（ｉｖ）約０．０５の組成モル比の第二のヘルパー脂質であって、当該第二のヘルパー脂質は、コレステロールである；および（ｖ）約０．０１の組成モル比の生体安定性強化剤であって、当該生体安定性強化剤は、Ｃ１４ポリエチレングリコール５０００である、を含む組成物が提供される。
【０１４８】
ある態様において、（ｉ）約０．３２の組成モル比の第一のカチオン性脂質であって、当該第一のカチオン性脂質は、ジヒドロキシジミリスチルスペルミジンである、第一のカチオン性脂質；（ｉｉ）約０．３９の組成モル比の第二のカチオン性脂質であって、当該第二のカチオン性脂質は、ヒドロキシジミリスチルスペルミジンである、第二のカチオン性脂質；（ｉｉｉ）約０．２６の組成モル比の第一のヘルパー脂質であって、当該第一のヘルパー脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンである、第一のヘルパー脂質；（ｉｖ）約０．０１の組成モル比の第二のヘルパー脂質であって、当該第二のヘルパー脂質は、コレステロールである、第二のヘルパー脂質；および（ｖ）約０．０２の組成モル比の生体安定性強化剤であって、当該生体安定性強化剤は、Ｃ１４ポリエチレングリコール５０００である、生体安定性強化剤、を含む組成物が提供される。
【０１４９】
ある態様において、（ｉ）約０．１８の組成モル比の第一のカチオン性脂質であって、当該第一のカチオン性脂質は、ジヒドロキシジミリスチルスペルミジンである、第一のカチオン性脂質；（ｉｉ）約０．３８の組成モル比の第二のカチオン性脂質であって、当該第二のカチオン性脂質は、ヒドロキシジミリスチルスペルミジンである、第二のカチオン性脂質；（ｉｉｉ）約０．３２の組成モル比の第一のヘルパー脂質であって、当該第一のヘルパー脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンである、第一のヘルパー脂質；（ｉｖ）約０．１０の組成モル比の第二のヘルパー脂質であって、当該第二のヘルパー脂質は、コレステロールである、第二のヘルパー脂質；および（ｖ）約０．０２の組成モル比の生体安定性強化剤であって、当該生体安定性強化剤は、Ｃ１４ポリエチレングリコール５０００である、生体安定性強化剤、を含む組成物が提供される。
【０１５０】
ある態様において、（ｉ）約０．２３の組成モル比の第一のカチオン性脂質であって、当該第一のカチオン性脂質は、ジヒドロキシジミリスチルスペルミジンである、第一のカチオン性脂質；（ｉｉ）約０．４５の組成モル比の第二のカチオン性脂質であって、当該第二のカチオン性脂質は、ヒドロキシジミリスチルスペルミジンである、第二のカチオン性脂質；（ｉｉｉ）約０．２０の組成モル比の第一のヘルパー脂質であって、当該第一のヘルパー脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンである、第一のヘルパー脂質；（ｉｖ）約０．１０の組成モル比の第二のヘルパー脂質であって、当該第二のヘルパー脂質は、コレステロールである、第二のヘルパー脂質；および（ｖ）約０．０２の組成モル比の生体安定性強化剤であって、当該生体安定性強化剤は、Ｃ１４ポリエチレングリコール５０００である、生体安定性強化剤、を含む組成物が提供される。
【０１５１】
ある態様において、（ｉ）約０．１８の組成モル比の第一のカチオン性脂質であって、当該第一のカチオン性脂質は、ジヒドロキシジミリスチルスペルミジンである、第一のカチオン性脂質；（ｉｉ）約０．５１の組成モル比の第二のカチオン性脂質であって、当該第二のカチオン性脂質は、ヒドロキシジミリスチルスペルミジンである、第二のカチオン性脂質；（ｉｉｉ）約０．２０の組成モル比の第一のヘルパー脂質であって、当該第一のヘルパー脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンである、第一のヘルパー脂質；（ｉｖ）約０．１０の組成モル比の第二のヘルパー脂質であって、当該第二のヘルパー脂質は、コレステロールである、第二のヘルパー脂質；および（ｖ）約０．０１の組成モル比の生体安定性強化剤であって、当該生体安定性強化剤は、Ｃ１４ポリエチレングリコール５０００である、生体安定性強化剤、を含む組成物が提供される。
【０１５２】
ある態様において、（ｉ）約０．２７の組成モル比の第一のカチオン性脂質であって、当該第一のカチオン性脂質は、ジヒドロキシジミリスチルスペルミジンである、第一のカチオン性脂質；（ｉｉ）約０．３８の組成モル比の第二のカチオン性脂質であって、当該第二のカチオン性脂質は、ヒドロキシジミリスチルスペルミジンである、第二のカチオン性脂質；（ｉｉｉ）約０．３２の組成モル比の第一のヘルパー脂質であって、当該第一のヘルパー脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンである、第一のヘルパー脂質；（ｉｖ）約０．０１の組成モル比の第二のヘルパー脂質であって、当該第二のヘルパー脂質は、コレステロールである、第二のヘルパー脂質；および（ｖ）約０．０２の組成モル比の生体安定性強化剤であって、当該生体安定性強化剤は、Ｃ１４ポリエチレングリコール５０００である、生体安定性強化剤、を含む組成物が提供される。
【０１５３】
ある態様において、（ｉ）約０．２５の組成モル比の第一のカチオン性脂質であって、当該第一のカチオン性脂質は、ジヒドロキシジミリスチルスペルミジンである、第一のカチオン性脂質；（ｉｉ）約０．３８の組成モル比の第二のカチオン性脂質であって、当該第二のカチオン性脂質は、ヒドロキシジミリスチルスペルミジンである、第二のカチオン性脂質；（ｉｉｉ）約０．２６の組成モル比の第一のヘルパー脂質であって、当該第一のヘルパー脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンである、第一のヘルパー脂質；（ｉｖ）約０．１０の組成モル比の第二のヘルパー脂質であって、当該第二のヘルパー脂質は、コレステロールである、第二のヘルパー脂質；および（ｖ）約０．０１の組成モル比の生体安定性強化剤であって、当該生体安定性強化剤は、Ｃ１４ポリエチレングリコール５０００である、生体安定性強化剤、を含む組成物が提供される。
【０１５４】
ある態様において、（ｉ）約０．２８の組成モル比の第一のカチオン性脂質であって、当該第一のカチオン性脂質は、ジヒドロキシジミリスチルスペルミジンである、第一のカチオン性脂質；（ｉｉ）約０．２４の組成モル比の第二のカチオン性脂質であって、当該第二のカチオン性脂質は、ヒドロキシジミリスチルスペルミジンである、第二のカチオン性脂質；（ｉｉｉ）約０．３２の組成モル比の第一のヘルパー脂質であって、当該第一のヘルパー脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンである、第一のヘルパー脂質；（ｉｖ）約０．１４の組成モル比の第二のヘルパー脂質であって、当該第二のヘルパー脂質は、コレステロールである、第二のヘルパー脂質；および（ｖ）約０．０２の組成モル比の生体安定性強化剤であって、当該生体安定性強化剤は、Ｃ１４ポリエチレングリコール７５０である、生体安定性強化剤、を含む組成物が提供される。
【０１５５】
ある態様において、（ｉ）約０．１８の組成モル比の第一のカチオン性脂質であって、当該第一のカチオン性脂質は、ジヒドロキシジミリスチルスペルミジンである、第一のカチオン性脂質；（ｉｉ）約０．４７の組成モル比の第二のカチオン性脂質であって、当該第二のカチオン性脂質は、ヒドロキシジミリスチルスペルミジンである、第二のカチオン性脂質；（ｉｉｉ）約０．３２の組成モル比の第一のヘルパー脂質であって、当該第一のヘルパー脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンである、第一のヘルパー脂質；（ｉｖ）約０．０１の組成モル比の第二のヘルパー脂質であって、当該第二のヘルパー脂質は、コレステロールである、第二のヘルパー脂質；および（ｖ）約０．０２の組成モル比の生体安定性強化剤であって、当該生体安定性強化剤は、Ｃ１４ポリエチレングリコール５０００である、生体安定性強化剤、を含む組成物が提供される。
【０１５６】
ある態様において、（ｉ）約０．２４の組成モル比の第一のカチオン性脂質であって、当該第一のカチオン性脂質は、ジヒドロキシジミリスチルスペルミジンである、第一のカチオン性脂質；（ｉｉ）約０．４０の組成モル比の第二のカチオン性脂質であって、当該第二のカチオン性脂質は、ヒドロキシジミリスチルスペルミジンである、第二のカチオン性脂質；（ｉｉｉ）約０．２４の組成モル比の第一のヘルパー脂質であって、当該第一のヘルパー脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンである、第一のヘルパー脂質；（ｉｖ）約０．１０の組成モル比の第二のヘルパー脂質であって、当該第二のヘルパー脂質は、コレステロールである、第二のヘルパー脂質；および（ｖ）約０．０２の組成モル比の生体安定性強化剤であって、当該生体安定性強化剤は、Ｃ１４ポリエチレングリコール２０００である、生体安定性強化剤、を含む組成物が提供される。
【０１５７】
ある態様において、（ｉ）約０．３２の組成モル比の第一のカチオン性脂質であって、当該第一のカチオン性脂質は、ジヒドロキシジミリスチルスペルミジンである、第一のカチオン性脂質；（ｉｉ）約０．３８の組成モル比の第二のカチオン性脂質であって、当該第二のカチオン性脂質は、ヒドロキシジミリスチルスペルミジンである、第二のカチオン性脂質；（ｉｉｉ）約０．２０の組成モル比の第一のヘルパー脂質であって、当該第一のヘルパー脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンである、第一のヘルパー脂質；（ｉｖ）約０．０８の組成モル比の第二のヘルパー脂質であって、当該第二のヘルパー脂質は、コレステロールである、第二のヘルパー脂質；および（ｖ）約０．０２の組成モル比の生体安定性強化剤であって、当該生体安定性強化剤は、Ｃ１４ポリエチレングリコール５０００である、生体安定性強化剤、を含む組成物が提供される。
【０１５８】
ある実施形態では、その実施形態を含む本明細書において提供される組成物は、生物活性剤をさらに含む。本明細書に提供される「生物活性剤」とは、細胞、組織または生物体への投与時に、当該細胞、組織または生物体の生物機能に対する検出可能な効果を有する化合物を指す。ある実施形態では、検出可能な効果は、生物学的な効果である。ある実施形態では、検出可能な効果は、治療的な効果である。ある実施形態では、検出可能な効果は、診断的な効果である。生物活性剤は、その実施形態を含む本明細書に提供される組成物との脂質凝集体を形成することができる。ある実施形態では、生物活性剤は、被験化合物である。本明細書に提供される「被験化合物」は、生物機能に対するその効果が、対照化合物との比較で決定される化合物である。本明細書に提供される「対照化合物」とは、生物機能に対する公知の効果を有する化合物を指す。ある実施形態では、生物活性剤は、対照化合物である。ある実施形態では、生物活性剤は、治療剤または診断剤である。ある実施形態では、生物活性剤は、治療剤または診断剤である。ある実施形態では、生物活性剤は、治療剤である。ある実施形態では、生物活性剤は、診断剤である。ある実施形態では、生物活性剤は、核酸、リボヌクレオタンパク質または低分子を含む。ある実施形態では、生物活性剤は、核酸を含む。ある実施形態では、生物活性剤は、リボヌクレオタンパク質を含む。ある実施形態では、生物活性剤は、低分子を含む。ある実施形態では、核酸は、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはガイドＲＮＡである。ある実施形態では、核酸は、ｍＲＮＡである。ある実施形態では、核酸は、ｓｉＲＮＡである。ある実施形態では、核酸は、ｍｉＲＮＡである。ある実施形態では、核酸は、ガイドＲＮＡである。ある実施形態では、生物活性剤は、核酸およびリボヌクレオタンパク質を含む。ある実施形態では、リボヌクレオタンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）である。本明細書に提供される「ｍＲＮＡ」とは、１つもしくは複数のタンパク質またはポリペプチドをコードする１つまたは複数の発現可能な核酸配列、または他のＤＮＡ分子を含むリボ核酸分子を指す。
【０１５９】
医薬組成物
ある態様において、その実施形態を含む本明細書に提供される組成物と、薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物が提供される。
【０１６０】
本明細書に提供される治療有効量とは、意図される目的を達成するのに有効な量を指す。特定のアプリケーションに有効な実際の量は特に、治療される状態に依存する。疾患を治療する方法において投与される場合、本明細書に記載される医薬組成物は、所望される結果、例えば標的分子の活性の調節、および／または疾患症状（例えば肺疾患）の低下、消失、または進行の減速などを達成するのに有効な量の活性生物活性剤を含有する。本明細書に提供される組成物と脂質凝集体を形成する生物活性剤の治療有効量の決定は、特に本明細書に詳細に開示される内容を考慮することで、当業者の能力の範囲内にある。
【０１６１】
許容可能な担体、賦形剤または安定剤は、採用した用量および濃度でレシピエントに非毒性であり、例えば典型的にはｐＨ５．０〜８．０、最も多くはｐＨ６．０〜７．０のリン酸塩、クエン酸塩または酢酸塩などの緩衝剤；例えば等張にするための塩化ナトリウム、塩化カリウムなどの塩；抗酸化剤、保存剤、低分子量ポリペプチド、タンパク質、例えばポリソルベート８０などの親水性ポリマー、例えばグリシンなどのアミノ酸、炭水化物、キレート剤、糖類、および当業者に公知の他の標準的な成分（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １６th  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．１９８０）が挙げられる。
【０１６２】
その実施形態を含む本明細書に提供される組成物（例えば生物活性剤と複合体化された脂質凝集体）を含む医薬組成物は、当分野に公知の様々な方法により投与されることができる。投与経路および／または投与様式は、望まれる結果に応じて変化する。ある実施形態では、投与は、静脈内、筋肉内、腹腔内または皮下であるか、または標的部位に近接して投与される。薬学的に許容可能な賦形剤は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、非経口投与、脊髄投与または表皮投与に適していてもよい（例えば注射または点滴による）。
【０１６３】
その実施形態を含む本明細書に提供される組成物（例えば生物活性剤と複合体化された脂質凝集体）の医薬組成物は、当分野に公知であり、日常的に実施されている方法に従って調製されることができる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，２０th  ｅｄ．，２０００；ａｎｄ  Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７８を参照のこと。医薬組成物は、ＧＭＰ条件下で製造されることが好ましい。典型的には、その実施形態を含む本明細書に提供される組成物（例えば生物活性剤と複合体化された脂質凝集体）の治療有効投与量または有効投与量が、本発明の医薬組成物において採用される。その実施形態を含む本明細書に提供される組成物（例えば、生物活性剤と複合体化された脂質凝集体）は、当業者に公知の標準的な方法により薬学的に許容可能な剤型へと製剤化されることができる。投薬レジメンは、最適な望ましい応答（例えば治療応答）をもたらすように調整される。例えば単回ボーラスを投与してもよく、数回に分けられた投与量を経時的に投与してもよく、または治療状況の要件に示されるように投与量を相対的に減少または増加させてもよい。その実施形態を含む本明細書に提供される組成物（例えば生物活性剤と複合体化された脂質凝集体）を、他の治療法または治療剤と組み合わせて製剤化することが有利となる場合がある。投与の簡易性および用量の均一性のために、単位剤型で非経口組成物を製剤化することが有利となり得る。本明細書において使用される場合、単位剤型とは、治療される対象に対する単位形態の用量として適合された、物理的に別個の単位を指す。各単位は、所定量のその実施形態を含む本明細書に提供される組成物（例えば生物活性剤と複合体化された脂質凝集体）を含有し、必要とされる医薬賦形剤と共同して望ましい治療効果をもたらす。
【０１６４】
本発明の医薬組成物中の生物活性剤の実際の用量レベルは、特定の患者に毒性をもたらすことなく望ましい治療応答をもたらすために有効な活性成分の量、組成物および投与様式が得られるように変化し得る。選択された用量レベルは、採用された本発明の特定の組成物の活性、投与経路、投与時間、採用された特定の抗体の排出速度、治療期間、他の薬剤、採用された特定の組成物と併用して使用される化合物および／または物質、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、一般健康状態および既往歴、ならびに類似の因子をはじめとする様々な薬物動態因子に依存する。
【０１６５】
医師または獣医師は、医薬組成物中に採用された、その実施形態を含む本明細書に提供される組成物（例えば生物活性剤と複合体化された脂質凝集体）の投与を、所望される治療効果を達成するために必要とされるよりも少ないレベルで開始し、所望される効果が達成されるまで用量を徐々に増加させてもよい。概して、本明細書の組成物の有効投与量は、治療される具体的な疾患または状態、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトであるか動物であるか、他に投与される医薬、そして処置が予防的であるか治療的であるか、を含む多くの様々な因子に応じて変化する。治療用量は、安全性および有効性を最適化するために漸増させる必要がある。
【０１６６】
その実施形態を含む本明細書に提供される組成物（例えば生物活性剤と複合体化された脂質凝集体）は、複数のときに投与されてもよい。単回用量の間の間隔は、毎週、毎月または毎年であってもよい。さらに間隔は、患者において組成物の血液レベルを測定することにより示されるように、不規則であってもよい。用量と頻度は、患者における組成物の半減期に応じて変化する。用量と投与頻度は、治療が予防的であるか、または治療的であるかに応じて変化してもよい。予防的アプリケーションの場合、長期間にわたり比較的低い用量を、比較的に低頻度の間隔で投与する。一部の患者は、その生涯にわたり治療を受け続ける。治療アプリケーションの場合、疾患の進行が遅くなる、または停止するまで、そして好ましくは患者が疾患症状の部分的または完全な改善を示すまで、比較的短い間隔で比較的高い用量が必要とされる場合がある。その後、患者は予防的レジメンを投与されてもよい。
【０１６７】
細胞組成物
ある態様において、その実施形態を含む本明細書に提供される組成物を含む細胞が提供される。ある実施形態では、細胞は哺乳動物の細胞である。ある実施形態では、細胞はげっ歯類の細胞である。ある実施形態では、細胞はマウスの細胞である。ある実施形態では、細胞はラットの細胞である。ある実施形態では、細胞はブタの細胞である。ある実施形態では、細胞はイヌの細胞である。ある実施形態では、細胞は霊長類の細胞である。ある実施形態では、細胞はヒトの細胞である。ある実施形態では、細胞は上皮細胞である。ある実施形態では、細胞は肺上皮細胞である。ある実施形態では、細胞は内皮細胞である。ある実施形態では、細胞は肺内皮細胞である。ある実施形態では、細胞は、生物体の一部を形成する。ある実施形態では、生物体は、ヒトである。ある実施形態では、生物体は、ラットである。ある実施形態では、生物体は、マウスである。
【０１６８】
送達方法
ある態様において、細胞に生物活性剤を送達する方法が提供され、当該方法は、（ｉ）生物活性剤と、その実施形態を含む本明細書に提供される組成物を混合し、それにより生物活性剤−脂質複合体を形成させる工程；（ｉｉ）細胞と、当該生物活性剤−脂質複合体を接触させ、細胞に当該生物活性剤−脂質複合体を送達する工程、を含む。生物活性剤は、本明細書に記載される任意の生物活性剤（例えば核酸）であってもよい。本明細書に提示される生物活性剤−脂質複合体は、本明細書に記載される脂質凝集体である。
【０１６９】
ある実施形態では、その実施形態を含む本明細書に記載される方法は、生物活性剤−脂質複合体を細胞に入れさせることをさらに含む。ある実施形態では、生物活性剤は、治療剤または診断剤である。ある実施形態では、生物活性剤は、核酸、リボヌクレオタンパク質または低分子を含む。ある実施形態では、核酸は、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはガイドＲＮＡである。ある実施形態では、生物活性剤は、ガイドＲＮＡおよびリボヌクレオタンパク質を含む。ある実施形態では、リボヌクレオタンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）である。ある実施形態では、リボヌクレオタンパク質は、ガイドＲＮＡに結合される。
【０１７０】
ある実施形態では、細胞は哺乳動物の細胞である。ある実施形態では、細胞はげっ歯類の細胞である。ある実施形態では、細胞はマウスの細胞である。ある実施形態では、細胞はラットの細胞である。ある実施形態では、細胞はブタの細胞である。ある実施形態では、細胞はイヌの細胞である。ある実施形態では、細胞は霊長類の細胞である。ある実施形態では、細胞は上皮細胞である。ある実施形態では、細胞は肺上皮細胞である。ある実施形態では、細胞は内皮細胞である。ある実施形態では、細胞は肺内皮細胞である。
【０１７１】
別の態様において、対象の肺組織に生物活性剤を送達する方法が提供され、当該方法は、（ｉ）生物活性剤と、その実施形態を含む本明細書に記載される組成物を混合し、それにより生物活性剤−脂質複合体を形成させる工程；（ｉｉ）対象に当該生物活性剤−脂質複合体の有効量を全身投与し、それにより対象の肺組織に当該生物活性剤−脂質複合体を送達する工程、を含む。
【０１７２】
別の態様において、対象の肺組織においてタンパク質を発現させる方法が提供され、当該方法は、（ｉ）ｍＲＮＡと、その実施形態を含む本明細書に記載される組成物を混合し、ｍＲＮＡ−脂質複合体を形成させる工程；（ｉｉ）対象に当該ｍＲＮＡ−脂質複合体の有効量を投与する工程；および（ｉｉｉ）対象の肺組織において当該ｍＲＮＡ−脂質複合体のｍＲＮＡを発現させ、それにより対象の肺組織においてタンパク質を発現させる工程、を含む。
【０１７３】
治療方法
ある態様において、その必要のある対象において肺疾患を治療する方法が提供され、当該方法は、生物活性剤の治療有効量と、その実施形態を含む本明細書に記載される組成物を対象に投与し、それにより当該対象において肺疾患を治療する工程、を含む。
【０１７４】
ある実施形態では、組成物と生物活性剤は、投与前に混合される。ある実施形態では、生物活性剤は、核酸、リボヌクレオタンパク質または低分子を含む。ある実施形態では、核酸は、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはガイドＲＮＡである。
【０１７５】
ある実施形態では、肺疾患は、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺癌、または嚢胞性線維症である。ある実施形態では、肺疾患は、喘息である。ある実施形態では、肺疾患は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）である。ある実施形態では、肺疾患は、肺癌である。ある実施形態では、肺疾患は、嚢胞性線維症である。
【０１７６】
「肺の疾患」、「肺の障害」、「肺疾患」などの用語は本明細書において相互交換可能に使用される。この用語は、呼吸困難、咳、気道の不快感および炎症、粘液増加、ならびに／または肺線維症を特徴とする肺障害を広く指すために使用される。
【０１７７】
「投与量」および「用量」という用語は、本明細書において相互交換可能に使用される。投与量とは、各投与で個体に与えられる活性成分の量を指す。本発明に関し、概して投与量とは、肺疾患治療の量を指す。投与量は、所与の治療に関する通常の投与量範囲、投与頻度、個体の大きさと忍容性、状態の重大度、副作用リスク、および投与経路をはじめとする多くの因子に応じて変化する。当業者であれば、投与量は、上記の因子に応じて、または治療の進行に基づいて改変され得ることを認識するであろう。「剤型」という用語は、医薬品の特定の形式を指し、投与経路に依存する。例えば、吸入用などには剤型は噴霧用の液体の形態であってもよく、注射用などには生理食塩水であってもよい。
【０１７８】
本明細書において使用される場合、「治療」と「予防」という用語は、独立した用語であることは意図されない。治療とは、症状の発生の何らかの遅延、頻度の低下または重大度の低下、症状の改善、患者の快適性および／または呼吸機能の改善を指し得る。治療効果は、所与の治療を受けていない個体または個体群と比較されてもよく、または治療前もしくは治療停止後の同じ患者と比較されてもよい。
【０１７９】
本明細書において使用される場合（および当分野に広く理解されているように）、「治療すること」または「治療」には、対象の状態において有益な、または望ましい臨床結果を含む結果を得るための任意の方法も広く含む。有益な、または望ましい臨床結果には、限定されないが、部分的または総合的、そして検出可能または検出不可能な、１つもしくは複数の症状または状態の軽減または改善、疾患の程度の縮小、疾患状態の安定化（すなわち悪化しない）、疾患の伝染または拡散の予防、疾患進行の遅延または減速、疾患状態の改善または緩和、疾患再発の縮小、および寛解が挙げられる。言い換えると、本明細書において使用される場合、「治療」とは、疾患の任意の治癒、改善または予防を含む。治療は、疾患が発生しないように予防してもよく、疾患が広がることを阻害してもよく、疾患の症状（例えば目の痛み、光周囲にハローが見えること、目の充血、非常に高い眼内圧）を軽減してもよく、疾患の基礎となる原因を完全に、または部分的に除去してもよく、疾患の期間を短縮してもよく、またはこれらのことの組み合わせであってもよい。
【０１８０】
本明細書において使用される場合、「治療すること」および「治療」には、予防的治療も含まれる。治療方法は、対象に、活性剤の治療有効量を投与することを含む。投与工程は、単回投与からなるものであってもよく、または一連の投与を含むものであってもよい。治療期間の長さは、例えば状態の重大度、患者の年齢、活性剤の濃度、治療に使用される組成物の活性、またはそれらの組み合わせなどの様々な因子に依存する。また、治療または予防に使用される剤の有効な用量は、特定の治療レジメンまたは予防レジメンの経過上で増加または減少してもよいことも認識するであろう。用量の変化は、当分野に公知の標準的な診断アッセイの結果であり、明白となるであろう。一部の例では、慢性的な投与が必要とされ得る。例えば組成物は、患者を治療するのに充分な量および期間、対象に投与される。
【０１８１】
「予防」という用語は、患者において肺疾患の症状の発生が減少することを指す。上記に示されるように、予防は、完全（症状が検出できない）または部分的であってもよく、それにより、治療が行われない場合に発生し得る症状よりも少ない症状が観察される。
【０１８２】
本明細書において使用される場合、「治療有効量」という用語は、上述のように疾患を改善するのに充分な治療剤の量を指す。例えば、所与のパラメータに関し、治療有効量は、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、９０％もしくは少なくとも１００％の増加または減少を示す。治療有効性は、「〜倍」の増加または減少として表され得る。例えば治療有効量は、対照よりも少なくとも１．２倍、１．５倍、２倍、５倍またはそれ以上の効果を有し得る。
【０１８３】
「診断」という用語は、肺疾患が対象に存在することの相対的な確率を指す。同様に、「予後」という用語は、特定の将来的な転帰が、対象に発生し得る相対的な確率を指す。例えば本発明の背景下で、予後とは、個体が肺疾患を発症する可能性、または疾患のあり得る重大度（例えば症状の重大度、機能低下速度、生存率など）を指し得る。この用語は、医療診断分野の当業者により認識されるように、完全であることは意図されない。
【実施例】
【０１８４】
実施例１：ｍＲＮＡおよびｓｉＲＮＡの肺標的化インビボ送達用の新規脂質ナノ粒子
治療ツールとしての核酸利用の急速な拡大は、送達法の最適化と革新という課題を当該分野に課している。脂質ナノ粒子は、搭載物を細胞外酵素の分解から防ぎつつ細胞取り込みを促進する能力があるために、普遍的な送達ビヒクルとなっている。例えばｍＲＮＡなどのセンシティブな搭載物の臓器および組織特異的な送達は、治療機能性の調整に非常に重要である。こうした送達は、ナノ粒子表面上にリガンドまたは受容体を発現させることによる生体分子標的化を使用して普遍的に実施されている。しかしながらナノ粒子に固有の特性を操作することで、対象の特定臓器への送達位置の調整機会が得られる。
【０１８５】
出願人らは、インビボでの使用に特異的に最適化され、生体分子標的化を使用することなく、マウスの肺および脾臓を本質的に標的とし、核酸搭載物（ｍＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ）を送達するよう操作された新規脂質ナノ粒子を開発した。脂質ナノ粒子の開発は、多変数実験デザインモデリングを使用して実施された。これにより出願人らは、脂質製剤の成分と組成を理解し、最適化することができた。脂質ナノ粒子の特徴解析から、均一なサイズと、高い封入効率が示された。複数回のデザイン反復を行った後、生体分布を評価するインビボ機能性検査から、肺組織を排他的に標的とし、高いｍＲＮＡトランスフェクション効率を達成することができる新規製剤が特定された。化学的に改変されたルシフェラーゼコードｍＲＮＡのインビボ全身送達の後に、トランスフェクション効率が測定された。定量は、ＩＶＩＳイメージングシステムを使用して実施され、インビボおよび生体外の生体発光測定値を測定した。
【０１８６】
実施例２：ｍＲＮＡの肺標的化インビボ送達用の新規脂質ナノ粒子の開発
要約
治療ツールとしてのｍＲＮＡ利用の急速な拡大は、送達法の最適化と革新という課題を当該分野に課している。ＲＮＡを基にした治療法のアプリケーションが増え続けるにつれて、新規の技術を改善し、開発する必要性が並行して生じ、最前線の課題となっている。脂質ナノ粒子は、ｍＲＮＡを細胞外酵素の分解から防ぎつつ細胞取り込みを促進する能力があるために、普遍的なｍＲＮＡ用送達ビヒクルとなっている。臓器および組織特異的なｍＲＮＡの送達は、治療機能性の調整に非常に重要である。こうした送達は、ナノ粒子表面上にリガンドまたは受容体を発現させることによる生体分子標的化を使用して普遍的に実施されている。
【０１８７】
出願人らは、インビボでの使用に特異的に最適化され、生体分子標的化を使用することなく、マウスの肺および脾臓を本質的に標的とし、ｍＲＮＡを送達するよう操作された新規脂質ナノ粒子を開発した。脂質ナノ粒子の開発は、多変数実験デザインモデリングを使用して実施された。これにより出願人らは、脂質製剤の成分と組成を理解し、最適化することができた。脂質ナノ粒子の特徴解析から、均一なサイズと、高い封入効率が示された。複数回のデザイン反復を行った後、生体分布を評価するインビボ機能性検査から、肺組織を排他的に標的とし、高いｍＲＮＡトランスフェクション効率を達成することができる新規製剤が特定された。化学的に改変されたルシフェラーゼコードｍＲＮＡのインビボ全身送達の後に、トランスフェクション効率が測定された。定量は、ＩＶＩＳイメージングシステムを使用して実施され、インビボおよび生体外の生体発光測定値を測定した。肺特異的な発現レベルは、ｍＲＮＡの投与量を変えることにより調節され、単回投与後、多量のタンパク質発現が４８時間の経過にわたり維持された。この新規脂質ナノ粒子は、インビボで忍容性良好であり、定性的な総毒性はなく、マウス血清サンプルで実施された包括的サイトカインプロファイリングにより定量的に分析された。肺への排他的標的化を達成するためのさらなる生体分布の最適化が現在行われており、予備的データからは、電荷比率の変化が、肺への排他的な送達と発現を強化し、他の臓器での発現を激減させることが示されている。
【０１８８】
イントロダクション
ｍＲＮＡは不安定な性質であるため、送達フェーズ中の分解からの保護は、ｍＲＮＡ治療分野において克服するべき大きな課題である。出願人らは効率的な脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）システムを開発し、ｍＲＮＡを封入し、分解および血中クリアランスから保護することで、有効性を改善し、インビボ毒性を低下させた。出願人らによるＬＮＰシステムの最適化は、例えば静脈内送達を介した肺および脾臓などの臓器特異的取り込みパターンとともに送達効率を最大化した。
【０１８９】
材料と方法
実験最適化の混合デザインに基づき、新たなＬＮＰ製剤を作製し、図１Ａ〜１Ｃに示される既存の開発プロトコールを使用してｍＲＮＡと複合体化させた。得られたＬＮＰを、ルシフェラーゼの読み取り結果を使用してインビボ送達に対してスクリーニングした。その後は最も性能の良い製剤を使用して、組織特異的発現の最適化に関し、第二世代製剤をモデル化し、予想を行った。その後、これらの新たな製剤をインビボで検証し、最良のＬＮＰ製剤を特定した。
【０１９０】
ホタルルシフェラーゼｍＲＮＡを各ＬＮＰ製剤と複合体化し、静脈内注射した（図２）。４時間のインキュベーション後、ルシフェリン基質をＩＰ注射し、ルシフェラーゼ発現をインビボおよび生体外で、ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ  ＬＴにより測定した。生体発光（ｐ／秒／ｃｍ＾２／ｓｒ）を、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ（登録商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて定量した（図２）。
【０１９１】
結果
ＬＮＰの最初のパススクリーニングにより、製剤組成またはＮ／Ｐ比率の変化に基づいた臓器特異的送達パターンが明らかとなった。動物全身のインビボイメージングから、臓器特異的なパターンが示され（図３Ａ〜３Ｂ）、生体外解析により、生体分布パターンの詳細な評価が可能となった（図３Ｃ〜３Ｅ）。第一世代のＬＮＰから得られた性能データを使用して、ＤｏＥデザインを使用して発現を最適化し、脾臓および肺における発現の強化を主な焦点とした組織特異的な性能を最大化した。
【０１９２】
１００を超える新たなＬＮＰ製剤は、３世代にわたる最適化で性能に関してスクリーニングされた。スクリーニングに関して、ホタルルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡは、新たに設計された各製剤と複合体化され、静脈内注射された。ＩＶ注射の４時間後、ＢＡＬＢ／ｃマウスから単離された肺組織（図４Ａ）または単離された脾臓組織（図４Ｂ）における、生体発光シグナルの生体外定量をグラフに要約する。生体発光（ｐ／秒／ｃｍ＾２／ｓｒ）を、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ（登録商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して定量した。
【０１９３】
ｍＲＮＡの投与量漸増を行い、ルシフェラーゼ発現を読み取り結果として使用して、タンパク質発現を測定した。０時の時点でマウスに注射し、１２０時間（５日間）の経過にわたり画像撮影した。４時間でのインビボ画像、および対応する定量を図  ５Ａ−５Ｂに示す。ルシフェラーゼ活性の継続的測定は、同じマウスで、実験期間中繰り返された。生体外測定と比較して低い開始シグナル値をもたらす、動物全身のインビボイメージング法を使用して測定を行った。生体発光（ｐ／秒／ｃｍ＾２／ｓｒ）を、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ（登録商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して定量し、これを図５Ｃのグラフに要約する。
【０１９４】
ｍＲＮＡ投与量の最適化後、ルシフェラーゼ発現レベルの経時変化を測定し、性能を、肺組織の採取および９６時間の経過にわたる生体外測定を実施した後に測定した（図６Ａ〜６Ｃ）。マウスにＬＮＰを静脈内注射し、全身イメージングを各指定時点で実施して、その後、生体外測定を単離した肺組織で行った。
【０１９５】
２つのｍＲＮＡ投与条件：低（１ｍｇ／ｋｇ）および高（３ｍｇ／ｋｇ）下での注射後、２時間、４時間、２４時間、および４８時間後のマウス血清中の循環サイトカインレベルの定量（図７Ａ〜７Ｊ）。
【０１９６】
予備的結果から、ＬＮＰのＮ／Ｐ比を変化させることで、特定の臓器からタンパク質発現を消失させることができた。これにより、ｍＲＮＡの組織特異的な生体分布がもたらされた（図８Ａ〜８Ｂ）。
【０１９７】
結論
ＬＮＰ製剤は、実験デザインを基にした検証により、標的化肺送達に非常に良く最適化された。インビボ全身送達を通じて、肺組織で高い忠実度のルシフェラーゼ発現が実現された。一過性発現は、トランスフェクション後、４８時間持続した。発現の調節は、ｍＲＮＡの投与量を変えることで実現された。
【０１９８】
脾臓組織における発現も実現され、送達の特異性は、Ｎ／Ｐ比の変化を通して現在最適化している。現在進行中の、および将来的な研究としては以下が含まれる：対象の標的臓器内での特定の細胞型群のトランスフェクション効率の決定、全身送達後の単一臓器特異性の増大、ｍＲＮＡ複合体化前、および後のＬＮＰ製剤の安定性。
【０１９９】
実施例３：調製および複合体化。
製剤調製
個々の脂質成分のストック溶液を、１００％エタノール（ＥｔＯＨ）中、個々の脂質の溶解度に基づき適切な濃度で調製する。５０℃に加熱し、ＥｔＯＨ中で完全に脂質を溶解させる。ガラスバイアル中、表１に列記されるモル比に従い算出された体積で、５種すべての脂質成分をピペットを使用して混ぜ合わせる。混ぜ合わせた脂質を、２００ｎＭ  酢酸ナトリウムを使用して１：４体積の希釈比率で希釈する。パラフィンで蓋を密閉する。４℃で保存。
【０２００】
複合体化の調製
３ｍｇ／ｋｇの濃度で脂質濃縮物は送達される。ｍＲＮＡ濃縮物は１０：１希釈であり、それにより．３ｍｇ／ｍＬの総ｍＲＮＡが投与される。２つのねじ蓋のプラスチックサンプルチューブを「脂質」および「ｍＲＮＡ」とラベリングする。調製された脂質製剤１００μＬを、「脂質」とラベリングされたチューブに移す。２００μＬの複合体総量に必要なｍＲＮＡの量を算出する（６ｍｇ／ｍＬ）。酢酸ナトリウムを用いた１：４希釈の後の脂質製剤は２５％  ＥｔＯＨ溶液であるため、ｍＲＮＡは２５％  ＥｔＯＨ溶液に希釈される必要がある。２５μＬの１００％  ＥｔＯＨを、「ｍＲＮＡ」とラベリングされたチューブに加える。計算結果に従い、適切な量のｍＲＮＡを「ｍＲＮＡ」のチューブに加える。サンプル量を、滅菌ろ過水を使用して１００ｕＬまで増量する。ｍＲＮＡチューブの内容物を、脂質チューブに加えて、よく混ぜる。簡単にボルテックスする。５０℃で３０分間、複合体を加熱する。８〜１０ｋＤの分子量カットオフの透析カラムに複合体を移し、２時間、１００％  ＰＢＳ中で透析する。気密ねじ蓋サンプルチューブにサンプルを移し、直ちに使用するか、または使用するまで−２０℃に保存する。
【０２０１】
複合体投与
【０２０２】
凍結複合体を使用する場合、使用前に室温まで溶解させる。実験動物のケアと使用に関する組織ガイドラインに従い、複合体を、尾静脈注射を介してマウスに投与する。
【０２０３】
製剤の調製は以下のように実施された。個々の粉末脂質成分を、１００％  エタノール（ＥｔＯＨ）中に再懸濁した。ストック溶液は、以下の濃度で調製した：ＤＨＤＭＳ  ５０ｍｇ／ｍＬ、ＨＤＭＳ  １５ｍｇ／ｍＬ、コレステロール  ２５ｍｇ／ｍＬ、ＤＯＰＥ  ５０ｍｇ／ｍＬ、およびＣ１４  ＰＥＧ  ５０００（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ社、＃８８０２１０）  １００ｍｇ／ｍＬ。脂質溶液を、ヒートブロックを使用して５０℃に加熱し、製剤調製中は完全に溶解させた。
【０２０４】
５つの製剤成分をガラスねじ蓋のバイアル中で、所望のモル比と脂質のストック濃度に基づき算出された表１に列記される量でピペットを使用して混合した。５つすべての成分を適切な量でガラスバイアルに加えたら、１００％  ＥｔＯＨを使用して１００μＬまで体積を増量させた。その後、この量を、２００ｍＭ  酢酸ナトリウム溶液を使用して、１：４の比率で希釈した。得られた溶液は、トランスフェクション試薬として使用し、４℃で保存した。
【０２０５】
脂質／ｍＲＮＡ複合体の調製は、以下のように実施された。．３ｍｇ／ｍＬの最終標的濃度が、送達に望ましい濃度として、およびサンプル調製の計算の基礎として、選択された。２つのねじ蓋プラスチックサンプルチューブに、「脂質」および「ｍＲＮＡ」とラベリングした。１００μＬの調製済み脂質製剤を、「脂質」とラベリングされたチューブに移した。
【０２０６】
ｍＲＮＡ溶液の調製に関しては、２００μＬの総複合体量に必要なｍＲＮＡ量は、所望の．３ｍｇ／ｍＬの最終濃度に基づき、．６ｍｇ／ｍＬである。ｍＲＮＡ溶液の濃度に基づき、式（Ｃ１）（Ｖ１）＝（Ｃ２）（Ｖ２）を使用して必要量を算出する。式中、Ｃ１＝ｍＲＮＡのストック濃度。Ｖ１＝変数、Ｃ２＝．６ｍｇ／ｍＬの最終ｍＲＮＡ濃度。Ｖ２＝１００μＬの溶液量。ストックｍＲＮＡは氷上で溶解され、ｍＲＮＡ溶液は氷上で調製された。実験のために、ホタルルシフェラーゼｍＲＮＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ（登録商標）  ＃Ｌ−６１０７）を、２ｍｇ／ｍＬの濃度で購入した。所望の濃度を達成するために、出願人らは３０μＬのストックｍＲＮＡ溶液を使用した。２５％  ＥｔＯＨの濃度（脂質製剤は、２５％  ＥｔＯＨである）を維持するために、ｍＲＮＡは、２５％  ＥｔＯＨ中で調製される。ｍＲＮＡとラベリングされたチューブで、３０μＬの未希釈ｍＲＮＡ、２５μＬの１００％  ＥｔＯＨ、そして４５μＬのＵｌｔｒａｐｕｒｅ  ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ  ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  ｗａｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ社  ＃１０９７７−０１５）を混合した。
【０２０７】
両方のチューブが準備されたら、ｍＲＮＡチューブを、脂質チューブに加えて、よく混合した。簡単にチューブをボルテックスして、その後、３０分間、５０℃で加熱した。複合体化後、複合体を８〜１０ｋＤ分子量のカットオフの透析カラム（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｌａｂｓ社、Ｆｌｏａｔ−ａ−Ｌｙｚｅｒ  ｄｉａｌｙｓｉｓ  ｄｅｖｉｃｅ  ＃Ｇ２３５０３１）へと移し、１００％  ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社  ＰＢＳ  ＃  １００１００２３）中で２時間透析した。透析後、ねじ蓋プラスチックサンプルチューブにサンプルを移し、直ちに使用するか、または使用するまで−２０℃に保存する。
【０２０８】
複合体のインビボ投与は、以下のように実施された：凍結した複合体を使用する場合、使用前に室温まで溶解させる。新たに透析したサンプルを使用する場合には直ちに進める。２０グラムのマウスの使用には、２００μＬの注射量が許容される。それに応じて、より重い、またはより軽いマウスに対して量を調整する。尾静脈注射を実施するために、拘束装置を使用して動物を拘束する。温かい水槽、またはヒートランプを使用して、静脈の拡張と可視化を補助してもよい。アルコールを使用して尾を消毒する。静脈内に針を入れ、ゆっくりと静脈内に溶液を注入する（２０〜４０μＬ／秒）。針挿入と注射に成功したら、静脈から血液が消える。血液の消失が生じず、注射時に抵抗を感じた場合、針を取り出し、最初の注射部位に近い場所で繰り返す。複合体溶液を完全に注射した後、針を引き抜き、注射部位を優しく圧迫して、出血を止める。
【０２０９】
ルシフェラーゼｍＲＮＡ注射の３時間後に、５０μＬのルシフェリン基質をマウスにＩＰ注射し、１５分間インキュベートした。ルシフェラーゼ活性解析のために直ちに組織を採取した。実験のために、出願人らはＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ  ＬＴ  ｐｒｅ−ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社、＃ＩＶＩＳＬＭＬＴ）を利用して、個々の臓器中のルシフェラーゼ活性を測定した。Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ（登録商標）ソフトウェアを使用して、対象の特定領域からの生体発光を表すシグナルのフラックスを測定し、定量した。
【０２１０】
【表１】
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【０２１１】
【表２】
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【０２１２】
【表３】
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【０２１３】
実施例４：肺送達用の新規インビボプラットフォーム
図１９は、Ｉｎｖｉｖｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）Ｌｕｎｇ（ＩＶＦ（登録商標）Ｌｕｎｇ）の研究および開発のワークフローを示す。
【０２１４】
試薬比較解析は、４つの異なる製剤（ＩＶＦ（登録商標）Ｌｕｎｇ、ＤＯＴＭＡ：ＤＯＰＥ、ＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥおよびＪｅｔ  ＰＥＩ（登録商標））を使用して実施された。静脈内注射を介して動物に製剤の全身送達が施された。すべての製剤は、搭載物としてＴｒｉｌｉｎｋ（登録商標）ホタルルシフェラーゼｍＲＮＡを送達した。図  ２０Ａ−２０Ｂは、実験結果を示す。
【０２１５】
複数のｍＲＮＡ配列を検証して、ＩＶＦ（登録商標）Ｌｕｎｇを使用した臓器（すなわち肺）へのｍＲＮＡ送達を決定した。Ｔｒｉｌｉｎｋ（登録商標）から取得した、または自社で開発したホタルルシフェラーゼの送達を決定するために、臓器とマウスの生体発光イメージングを使用した。ｌａｃＺ（Ｔｒｉｌｉｎｋ（登録商標）から取得）の送達を決定するために、肺組織の組織検査を、ベータ−ガラクトシダーゼで染色することにより完了させた。ｌａｃＺ−レポーター株における、Ｃｒｅ（Ｔｒｉｌｉｎｋ（登録商標）から取得）の送達を決定するために、免疫蛍光染色を使用して、タンパク質発現を検出した。
【０２１６】
ｍＲＮＡ発現動態は、ｍＲＮＡの最適化に基づいて異なり得る。図２１は、Ｔｒｉｌｉｎｋ（登録商標）ホタルルシフェラーゼ、または自社で最適化したホタルルシフェラーゼのいずれかを含有するＩｎｖｉｖｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）Ｌｕｎｇの全身（静脈内）送達後の肺放射輝度を示す。
【０２１７】
ｌａｃＺ  ｍＲＮＡのＩＶＦ（登録商標）Ｌｕｎｇ送達、およびＣｒｅ  ｍＲＮＡのＩＶＦ（登録商標）Ｌｕｎｇ送達を評価するために、動物に複合体化されたＬＮＰを静脈内注射した。送達の４時間後に組織を採取し、直ちに凍結保存した。その後、単離された肺組織の凍結切片をベータ−ガラクトシダーゼで染色し、実験内容に応じて組織を解剖学的特性に関して対比染色し（図２４Ａ〜２４Ｄ）、またはｌａｃＺタンパク質発現の免疫蛍光検出に使用した（図２５Ａ〜２５Ｂ）。ｍＲＮＡの送達は、陽性ベータ−ガラクトシダーゼ染色と、免疫蛍光染色により確認された。レポーター株を使用して、気道への特異的送達が蛍光染色を用いて確認される。
【０２１８】
図２２は、ＩＶＦ（登録商標）Ｌｕｎｇが、肺だけではなく、内皮細胞へもｓｉＲＮＡを送達することを示しており、これはＴｉｅ２のノックダウンと内皮細胞特異的マーカーにより示されている。
【０２１９】
図  ２７Ａ−２７Ｋは、Ｎ／Ｐ比率（図２６を参照）が生体分布パターンに影響を与えることを示している。しかしＤＯＰＥで製剤化されたコア脂質（ＤＨＤＭＳ）を使用すると、肺送達は行われず、Ｎ／Ｐ比率を変化させても肺分布には影響がなかった（図２８）。
【０２２０】
参照文献
1. Kranz LM, Diken M, Haas H, Kreiter Set al. Systemic RNA delivery to dendritic cells exploits antiviral defense for cancer immunotherapy. Nature. 2016 Jun1;534(7607):396-401 
2. Azarmi S, Roa WH, Lobenberg R, Targeted delivery of nanoparticles for the treatment of lung diseases Adv Drug Deliv Rev, 2008 May 22;60(8):863-75
3. Scott McIvor, R. Therapeutic Delivery of mRNA: The Medium Is the Message. Molecular Therapy 19.5 (2011): 822 823. PMC. Web. 8 Nov. 2015.
4. Sahin, Ugur, Katalin Kariko, and Ozlem Tureci. “mRNA-based therapeutics [mdash] developing a new class of drugs.” Nature Reviews Drug Discovery(2014).
5. Kauffman, Kevin John, et al. “Optimization of Lipid Nanoparticle Formulations for mRNA Delivery in vivo with Fractional Factorial and Definitive Screening Designs.” Nano Letters (2015).
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図７Ｈ】
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【図７Ｉ】
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【図７Ｊ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１７Ｆ】
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【図１７Ｇ】
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【図１７Ｈ】
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【図１７Ｉ】
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【図１７Ｊ】
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【図１７Ｋ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２４Ｄ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２７Ｄ】
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【図２７Ｅ】
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【図２７Ｆ】
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【図２７Ｇ】
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【図２７Ｈ】
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【図２７Ｉ】
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【図２７Ｊ】
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【図２７Ｋ】
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【図２８】
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【国際調査報告】
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