(57)【要約】  本発明は、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含むインフルエンザウイルスペプチド、およびＢ細胞エピトープを含むインフルエンザウイルスペプチドを含むワクチン組成物であって、各ペプチドがナノ粒子と結合するワクチン組成物を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含むインフルエンザウイルスペプチドおよびＢ細胞エピトープを含むインフルエンザウイルスペプチドを含むワクチン組成物であって、各ペプチドがナノ粒子と結合する前記ワクチン組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の前記ワクチン組成物であって、前記ナノ粒子が金ナノ粒子、リン酸カルシウムナノ粒子またはケイ素ナノ粒子である前記ワクチン組成物。
【請求項３】
請求項１または２に記載の前記ワクチン組成物であって、前記のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含むインフルエンザウイルスペプチドおよび前記のＢ細胞エピトープを含むインフルエンザウイルスペプチドが同じナノ粒子と結合する前記ワクチン組成物。
【請求項４】
前述の請求項のうちいずれか１つに記載の前記ワクチン組成物であって、前記のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含むインフルエンザウイルスペプチドがリンカーを介して前記ナノ粒子と結合しかつ／または前記のＢ細胞エピトープを含むインフルエンザウイルスペプチドがリンカーを介して前記ナノ粒子と結合する前記ワクチン組成物。
【請求項５】
前述の請求項のうちいずれか１つに記載の前記ワクチン組成物であって、前記のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含むインフルエンザウイルスペプチドが配列番号１から２１に提示されるペプチドのうち１つ以上を含む前記ワクチン組成物。
【請求項６】
前述の請求項のうちいずれか１つに記載の前記ワクチン組成物であって、前記Ｂ細胞エピトープがインフルエンザマトリックス２タンパク質（Ｍ２ｅ）エピトープである前記ワクチン組成物。
【請求項７】
配列番号１から２１に提示されるＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープのうち１つ以上を含むインフルエンザウイルスペプチドを含むワクチン組成物であって、前記ペプチドがナノ粒子と結合する前記ワクチン組成物。
【請求項８】
請求項７に記載の前記ワクチン組成物であって、前記ナノ粒子が金ナノ粒子、リン酸カルシウムナノ粒子またはケイ素ナノ粒子である前記ワクチン組成物。
【請求項９】
請求項８に記載のワクチン組成物であって、前記のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含むインフルエンザウイルスペプチドがリンカーを介して前記ナノ粒子と結合する前記ワクチン組成物。
【請求項１０】
前述の請求項のうちいずれか１つに記載の前記ワクチン組成物であって、それぞれが異なるＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含む２つ以上のインフルエンザウイルスペプチドを含む前記ワクチン組成物。
【請求項１１】
請求項１０に記載の前記ワクチン組成物であって、前記の２つ以上のインフルエンザウイルスペプチドが前記の配列番号１から２１に提示されるペプチドのうち２つ以上である前記ワクチン組成物。
【請求項１２】
前述の請求項のうちいずれか１つに記載の前記ワクチン組成物であって、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含むインフルエンザウイルスペプチドをさらに含む前記ワクチン組成物。
【請求項１３】
請求項１２に記載のワクチン組成物であって、前記のＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含むインフルエンザウイルスペプチドがナノ粒子と結合する前記ワクチン組成物。
【請求項１４】
請求項１３に記載のワクチン組成物であって、前記のＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含むインフルエンザウイルスペプチドが結合するナノ粒子が金ナノ粒子、リン酸カルシウムナノ粒子、またはケイ素ナノ粒子である前記ワクチン組成物。
【請求項１５】
請求項１３または１４に記載のワクチン組成物であって、前記のＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含むインフルエンザウイルスペプチドがリンカーを介して前記ナノ粒子と結合する前記ワクチン組成物。
【請求項１６】
前述の請求項のうちいずれか１つに記載の前記ワクチン組成物であって、前記のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含むインフルエンザウイルスペプチドがＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープをさらに含む前記ワクチン組成物。
【請求項１７】
請求項１６に記載の前記ワクチン組成物であって、前記のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープおよびＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含むインフルエンザウイルスペプチドが配列番号２２から２７に提示するペプチドのうち１つ以上を含む前記ワクチン組成物。
【請求項１８】
前述の請求項のうちいずれか１つに記載の前記ワクチン組成物であって、それぞれが相異なるＨＬＡスーパータイプと相互作用するＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含む少なくとも２つのインフルエンザウイルスペプチドを含む前記ワクチン組成物。
【請求項１９】
前述の請求項のうちいずれか１つに記載の前記ワクチン組成物であって、少なくとも２つの相異なるＨＬＡスーパータイプと相互作用する少なくとも１つの免疫原性ペプチドを含む前記ワクチン組成物。
【請求項２０】
請求項１８または１９に記載の前記ワクチン組成物であって、前記の少なくとも２つの相異なるＨＬＡスーパータイプがＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ａ２４、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ８、ＨＬＡ−Ｂ２７、ＨＬＡ−Ｂ４４、ＨＬＡ−Ｂ５８およびＨＬＡ−Ｂ６２から選択される前記ワクチン組成物。
【請求項２１】
請求項２０に記載の前記ワクチン組成物であって、前記の少なくとの２つの相異なるＨＬＡスーパータイプがＨＡＬ−Ａ２およびＨＬＡ−Ａ２４である前記ワクチン組成物。
【請求項２２】
インフルエンザウイルス感染を予防または治療するための方法であって、インフルエンザウイルスに感染したか、またはこれに感染するリスクのある個人に前述の請求項のうちいずれか１つに記載の前記ワクチン組成物を投与することを含む方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の前記方法であって、前記インフルエンザウイルスが汎流行インフルエンザウイルスである前記方法。
【請求項２４】
個人におけるインフルエンザウイルス感染を予防または治療する方法における使用を目的とした請求項１から２１のうちいずれか１つに記載の前記ワクチン組成物。
【請求項２５】
請求項２４の記載に従った使用を目的とした前記ワクチン組成物であって、前記インフルエンザウイルスが汎流行インフルエンザウイルスである前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インフルエンザペプチドを含むワクチン組成物、およびインフルエンザウイルス感染の治療および予防のためのそのような組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザは重大な世界的衛生問題であり、毎年世界人口の最大２０％に感染し、全世界で最大５００万例の重症疾患および３００，０００例超の死亡を引き起こす。米国単独では、毎年推定３０，０００例超の死亡とほぼ３００，０００例の入院の原因がインフルエンザ感染とされる。新規の重症および再発の可能性のある季節疾患が最近出現したことに伴い、インフルエンザ誘発性肺炎の発生率を低下させる幅広い予防接種キャンペーンが、世界保健機構によって推進されている。インフルエンザの発生率を効果的に減少するには、継続的集中サーベイランス、現在利用できるインフルエンザワクチンの使用の増加、およびインフルエンザのシフトおよびドリフト株に対するより幅広い防御を提供することのできる代替的なワクチンおよび抗ウイルス薬が利用できることが必要となる。インフルエンザ予防接種キャンペーンが成功すれば、莫大な社会的および経済的影響を示すことができる。
【０００３】
インフルエンザに対する免疫応答は、先天性免疫および適応免疫の双方によって支配される。インフルエンザに対する先天性免疫応答は、初期のウイルス複製を制限するものの比較的非特異的である。インフルエンザウイルスの効率的なクリアランスには、体液性免疫および細胞媒介性免疫の双方を活性化する堅牢な適応免疫応答が必要である。分泌性ＩｇＡおよびＩｇＭ抗体によって媒介される体液性免疫が、初期感染の確立に対する防御を提供する一方で、ＩｇＧ抗体は確立された感染において新たに複製するウイルスを中和する。
【０００４】
従来のインフルエンザワクチンは、インフルエンザウイルスに対する体液性免疫を誘導することを目標とする。しかしこれらのワクチンは、抗原変動の発生により完全に防御的ではない。さらに、インフルエンザを防御する際には、Ｔ細胞応答が重要な役割を有しうると考えられる。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＩｇＧへのアイソタイプ切り替え、およびより親和性の高い抗体およびＣＴＬ記憶の生成において決定的な役割を果たす。ヒトにおいては、インフルエンザ予防接種後にヘマグルチニン（ＨＡ）特異性ＣＤ４＋Ｔ細胞が増殖し、ヘテロサブタイプインフルエンザ抗体応答の発生を促進する。ＣＤ８＋細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）はウイルスクリアランスを媒介し、インフルエンザＡ型ウイルスの相異なるサブタイプに対する交叉反応性応答を有することが示されている。このことは、高齢、インフルエンザの予防接種を受けている、または過去にインフルエンザに曝露している個人で比較的疾患が少ないことを説明しうる。
【０００５】
現在市販されているインフルエンザワクチンは毎年更新されている。それらの設計はＷＨＯの年間株勧告に基づき、インフルエンザシーズンまたは汎流行の開始前に製造される。現行のインフルエンザ用ワクチンは、ビリオン表面上のＨＡおよびノイラミニダーゼ（ＮＡ）糖タンパク質に対する防御的体液性免疫応答を誘導する。しかし、ウイルスＨＡおよびＮＡ糖タンパク質は頻繁かつ予測不可能な抗原シフト、および頻度はより低いが重症度がより高いドリフト変異に対する感受性が高く，これが抗原認識の消失をもたらす。このため、ヒト集団に感染する現行のウイルス血清型に適合する新規のワクチンを、頻繁に開発する必要がある。したがって、既存のインフルエンザワクチンは製造コストが高く、且つシーズン半ばに出現する新規株（２００９年Ｈ１Ｎ１ブタインフルエンザ、Ｎ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ９など）に対して防御しない可能性がある。さらに、これらのワクチンは抗体ベースでの防御を提供するよう設計され、体内よりウイルス感染細胞を消失させるのに重要なＴ細胞応答の誘導は、ほとんど考慮されていない。
【０００６】
数種類の四価ワクチン（２種類のインフルエンザＡ型および２種類のインフルエンザＢ型に対して防御）が、ＦＤＡより承認されている。これらのワクチンは従来のワクチンよりも幅広い防御を提供するものの、それらはシーズン半ばに出現する新規株に対して防御する可能性が未だに低く、且つ製造コストが高い。さらに四価ワクチンは、従来のインフルエンザワクチンと同様、体内からウイルス感染細胞を消失させるのに重要なＴ細胞応答を誘発するよう設計されていない。
【０００７】
したがって、全ての季節性インフルエンザ株および汎流行株に対する幅広い防御を、生涯ではなくても数年間提供する「汎用」インフルエンザワクチンが所望される。有効な汎用インフルエンザワクチンが開発されれば、将来的にインフルエンザ汎流行の恐れが低減され、且つ現在実施されているように、毎年季節性インフルエンザワクチンを開発および製造するよりも、費用対効果が高くなるであろう。
【０００８】
いくつかの汎用ウイルス製剤が開発中である。これらの汎用ワクチンは、その刺激する防御免疫応答の種類：１）Ｂ細胞応答（抗体）、２）Ｔ細胞応答、または３）Ｂ細胞およびＴ細胞の双方、によって幅広く特徴付けられる。Ｋａｎｅｋｉｙｏらは、複数のインフルエンザ株をカバーする高力価抗体応答を誘導するＨＡナノ粒子（フェリチンと融合したＨＡ）を生成した。このワクチンはまだ臨床試験に入っていない。ウイルスゲノム内で比較的維持されている４つのエピトープを標的とする、Ｔ細胞ベースのワクチンも開発中である。高度に維持されるＣＤ４エピトープに基づくＴ細胞ワクチンが第ＩＩ相攻撃試験で評価されており、汎流行株を含む多様なインフルエンザ株に対する防御応答が陽性であった。Ｂ細胞、ＣＤ４Ｔ細胞および９種類の異なるインフルエンザタンパク質に由来するＣＤ８Ｔ細胞維持エピトープを組み入れた、マルチメリック−００１と呼ばれる組換えポリエピトーブワクチンが、初期臨床試験で試験中である。核タンパク質（ＮＰ）およびアジュバントと結合したＢ細胞エピトープＭ２ｅからなる融合タンパク質ワクチンと、ＣｐＧと組み合わせた金ナノ粒子中のＭ２ｅペプチドも現在開発中である。上記のワクチンの大半は、臨床使用される際にしばしば副作用を誘発する多様なアジュバントと共に製剤化される。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、免疫応答を刺激する一方で、アジュバント含有ワクチンにしばしば随伴する有害な臨床効果を回避するインフルエンザワクチン組成物に関する。１つの態様においては、ワクチン組成物はインフルエンザウイルスに特異的な抗体の産生、およびインフルエンザウイルスに対するＴ細胞応答の双方を刺激する。体液性および細胞性応答の双方を刺激することで、ワクチンは自然状態でのウイルス感染に対する免疫応答を模倣することができる（図１）。ワクチン組成物は季節性および汎流行性インフルエンザ株の双方に対する防御を提供する可能性があり、たとえばワクチン組成物は汎用ワクチンとなりうる。
【００１０】
驚くべきことに、本発明者らは、たとえば金ナノ粒子などのナノ粒子を用いて、インフルエンザウイルスに特異的な抗体の産生、およびインフルエンザウイルスに対するＴ細胞応答の双方を刺激するよう設計されたワクチン組成物に対し、効率の良い応答を誘導しうることを確認している。ナノ粒子の使用によって、従来のアジュバントをワクチン組成物に含める必要がなくなった。したがって、個人がワクチン組成物の投与後に副作用を経験する可能性は低減される。
【００１１】
また本発明者らは、相異なるインフルエンザウイルス間で維持され、且つそれらのウイルスに感染した細胞上でＭＨＣによって提示される維持ペプチドを数多く同定している。そのような維持ペプチドをワクチン組成物に含めることで、季節性および汎流行性インフルエンザ株の双方に対する防御能を与えうる。相異なるＨＬＡスーパータイプと結合する多数の維持ペプチドをワクチン組成物に含めることにより、相異なるＨＬＡタイプを有する個人に対して有効なワクチンがもたらされる。
【００１２】
したがって本発明は、ナノ粒子と結合した１つ以上の免疫原性インフルエンザウイルスペプチドを含むワクチン組成物を提供する。
【００１３】
本発明はさらに以下を提供する：
−ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含むインフルエンザウイルスペプチド、およびＢ細胞エピトープを含むインフルエンザウイルスペプチドを含むワクチン組成物であって、各ペプチドがナノ粒子と結合するワクチン組成物；
配列番号１から１８に提示されるＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープのうち１つ以上を含むインフルエンザウイルスペプチドを含むワクチン組成物であって、ペプチドがナノ粒子と結合するワクチン組成物；
−インフルエンザウイルス感染を予防または治療する方法であって、インフルエンザウイルスに感染したか、またはこれに感染するリスクのある個人に本発明のワクチン組成物を投与することを含む方法；および
−個人のインフルエンザウイルス感染を予防または治療する方法における使用を目的とした本発明のワクチン組成物。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ウイルス感染によって生成される適応免疫応答を模倣するワクチン。
【図２−１】インフルエンザ特異的ペプチド配列の確認。
【図２−２】インフルエンザ特異的ペプチド配列の確認。
【図２−３】インフルエンザ特異的ペプチド配列の確認。
【図２−４】インフルエンザ特異的ペプチド配列の確認。
【図２−５】インフルエンザ特異的ペプチド配列の確認。
【図３】ヒトＰＢＭＣを用いてインビトロ生成されたエピトープ（Ｐ１〜Ｐ５）特異的ＣＴＬが、ペプチド装填（パネルＡ）標的細胞、および多様なインフルエンザウイルスに感染した（パネルＢ）標的細胞の双方を認識する。
【図４】ＨＬＡ  Ａ２トランスジェニックマウスにおいてインビボ生成されたエピトープ（Ｐ１〜Ｐ５）特異的ＣＴＬが、ペプチド装填（パネルＢ）標的細胞および多様なインフルエンザウイルスに感染した（パネルＣ）標的細胞の双方を認識する。
【図５】ＮＰ（ＮＰ１〜５）に組み入れられたエピトープが、ＨＬＡ  Ａ２トランスジェニックマウスにおいて多様なインフルエンザウイルス特異的ＣＴＬを活性化する。パネルＡおよびＢ：ＥＬＩＳｐｏｔ；パネルＣ：ＣＤ１０７発現。
【図６】Ｍ２ｅペプチド＋アジュバント（Ｐｅｐ６）またはＮＰないＭ２ｅペプチド（ＮＰ６）の接種によって、特異抗体応答が誘導される（パネルＡ）。アジュバントの無い遊離ペプチドは抗体応答なし（パネルＢ）。
【図７−１】Ｍ２ｅペプチド特異的抗血清が、インフルエンザウイルス感染細胞（ＰＲ８、Ｘ−３１、またはＪＡＰ（それぞれ緑、水色、赤）上のＭ２ｅエピトープと結合する。
【図７−２】Ｍ２ｅペプチド特異的抗血清が、インフルエンザウイルス感染細胞（ＰＲ８、Ｘ−３１、またはＪＡＰ（それぞれ緑、水色、赤）上のＭ２ｅエピトープと結合する。
【図８】抗Ｍ２ｅを介した感染の中和。上のパネルで用いた血清はペプチド接種マウスから分離され、下のパネルはＮＰ接種マウスから分離される。
【図９】インフルエンザウイルスに曝露した健常者における自然発生Ｍ２ｅ抗体応答。
【図１０】デング熱血清陽性者に由来するＰＢＭＣのデキストラマー分析による既存エピトープ特異的ＣＴＬの検出。
【図１１】血清陽性者のエピトープ特異的ＣＴＬがペプチド装填（ｐｅｐ）標的細胞およびデング熱ウイルス感染（ＤＶ２）標的細胞を認識する。
【図１２】より長いペプチド内に入れ子状に配置されたＣＤ８エピトープがプロセシングされ、ＡＰＣ上に提示される。上パネル、フローサイトメトリーで検出されたＳＩＩＮ：Ｋｂ複合体。下パネル、ハイブリドーマ分析におけるＳＩＩＮ特異的Ｔ細胞活性化。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（体液性および細胞性応答を刺激するワクチン組成物）
本発明は、ナノ粒子と結合した１つ以上の免疫原性インフルエンザウイルスペプチドを含むワクチン組成物を提供する。具体的には、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含むインフルエンザウイルスペプチド、およびＢ細胞エピトープを含むインフルエンザウイルスペプチドを含むワクチン組成物であって、各ペプチドがナノ粒子と結合しているワクチン組成物。
【００１６】
このワクチン組成物は、技術上既知である従来のインフルエンザワクチンを上回る数多くの長所を有する。重要な長所を本願に要約する。しかし、以下の考察でさらなる長所が明らかとなる。
【００１７】
第１に、本発明のワクチン組成物は、ＣＤ＋８Ｔ細胞エピトープを含むインフルエンザウイルスペプチド、およびＢ細胞エピトープを含むインフルエンザウイルスペプチドを有利に含む。したがってワクチン組成物は、インフルエンザウイルスに対する細胞性免疫応答および体液性免疫応答の双方を刺激することが可能である。上述のように、体液性免疫応答はインフルエンザウイルス感染に対する防御の最前線を提供する。具体的には、分泌性ＩｇＡおよびＩｇＭ抗体は、初期インフルエンザウイルス感染の確立に対し、たとえばウイルスが粘膜表面の上皮細胞と結合することを防止することによって防御する。その後、感染が確立しているときは、ＩｇＧ抗体が新たに複製されるウイルスを中和してウイルスの増殖を最小化する。したがって体液性応答は、インフルエンザウイルス感染の予防および治療において重要な役割を有する。しかし、細胞性応答、具体的にはＴ細胞応答もまた重要である。ＣＤ４＋Ｔ細胞はＩｇＧへのアイソタイプ切り替えを制御し、これにより複製ウイルスの中和を制御する。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、より親和性の高い抗体の生成および細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）記憶にも寄与する。ＣＤ８＋ＣＴＬ自体は、感染細胞に対するその細胞障害活性を介してウイルスクリアランスを媒介する。したがって、体液性および細胞性免疫の双方を刺激することにより、インフルエンザウイルス感染に対する有益な２方向からの攻撃が提供される。
【００１８】
第２に、ワクチン組成物中の各インフルエンザウイルスペプチドは、たとえば金ナノ粒子などのナノ粒子と結合する。以下により詳細に記述するように、ナノ粒子への結合によって、ワクチン組成物にアジュバントを含める必要性が低減または除外される。したがって、個人にワクチン組成物を接種する際に有害臨床事象を引き起こす可能性が低くなる。
【００１９】
（インフルエンザウイルスペプチド）
本発明のワクチン組成物は、１つ以上の免疫原性インフルエンザウイルスペプチドを含む。ワクチン組成物は約１から約５０種類のインフルエンザウイルスペプチド、たとえば約２から４０、３０から３０、４から２５、５から２０、６から１５、７、８、９または１０種類のインフルエンザペプチドを含みうる。ペプチドはそれぞれ１つ以上のエピトープを含み、それらはＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープおよび／またはＢ細胞エピトープでありうる。
【００２０】
１つの態様においては、ワクチン組成物は、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含むインフルエンザウイルスペプチドおよびＢ細胞エピトープを含むインフルエンザウイルスペプチドを含む。
【００２１】
インフルエンザウイルスペプチドは、１つ以上のインフルエンザウイルスが発現するペプチドである。インフルエンザウイルスは、周知のオルソミクソウイルス科ウイルスである。数百株のインフルエンザウイルスが存在し、それらが発現するＨＡおよびＮＡタンパク質に基づいてインフルエンザＡ型、インフルエンザＢ型またはインフルエンザＣ型の３つの主要カテゴリーに分類しうる。ワクチン組成物は複数のインフルエンザ株、たとえば１から２０００、１００から１９００、２００から１８００、３００から１７００、４００から１６００、５００から１５００、６００から１４００、７００から１３００、８００から１２００または９００から１１００インフルエンザ株などに由来するウイルスペプチドを含みうる。たとえば、ワクチン組成物はインフルエンザＡ型、インフルエンザＢ型、および／またはインフルエンザＣ型に由来する１つ以上のインフルエンザウイルスペプチドを含みうる。したがって、含まれるＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含むインフルエンザウイルスペプチドはインフルエンザＡ型、インフルエンザＢ型および／またはインフルエンザＣ型ウイルスによって発現されるペプチドとしうる。Ｂ細胞エピトープを含むインフルエンザウイルスペプチドは、インフルエンザＡ型、インフルエンザＢ型および／またはインフルエンザＣ型ウイルスによって発現されるペプチドとしうる。ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含むインフルエンザウイルスペプチド、およびＢ細胞エピトープを含むインフルエンザウイルスペプチドは、インフルエンザＡ型、インフルエンザＢ型および／またはインフルエンザＣ型などの同一のインフルエンザ株によって発現されるペプチドとしうる。またその代わりに、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含むインフルエンザウイルスペプチド、およびＢ細胞エピトープを含むインフルエンザウイルスペプチドは、異なるインフルエンザ株によって発現されるペプチドとしうる。
【００２２】
インフルエンザウイルスペプチドがインフルエンザＡ型ウイルスによって発現されるペプチドである場合、インフルエンザＡ型ウイルスは、たとえばＨ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｈ９またはＨ３Ｎ２でありうる。好ましくは、インフルエンザウイルスペプチドはＨ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｈ９およびＨ３Ｎ２インフルエンザＡ型ウイルスのうち２つ以上、たとえばＨ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２などによって発現される。インフルエンザウイルスペプチドはヒトインフルエンザウイルス、ブタインフルエンザウイルス、および／またはトリインフルエンザウイルスによって発現されるペプチドとしうる。インフルエンザウイルスは汎流行インフルエンザウイルスまたは潜在的汎流行インフルエンザウイルスとしうる。インフルエンザウイルスは人獣共通感染ウイルスとしうる。
【００２３】
インフルエンザウイルスペプチドは１つ以上のインフルエンザウイルスの表面上、または１つ以上のインフルエンザウイルスの細胞内に発現されるペプチドとしうる。ペプチドは構造的ペプチド、またはインフルエンザウイルスの代謝または複製に関与するペプチドなどの機能的ペプチドとしうる。好ましくは、ペプチドは内部ペプチドである。好ましくは、ペプチドは２つ以上の異なるインフルエンザ株間で維持される。
【００２４】
インフルエンザウイルスペプチドは任意の数のアミノ酸を含む可能性があり、すなわち任意の鎖長でありうる。典型的には、インフルエンザウイルスペプチドは長さが約８から約３０、３５または４０アミノ酸，たとえば長さが約９から約２９、約１０から約２８、約１１から約２７、約１２から約２６、約１３から約２５、約１３から約２４、約１４から約２３、約１５から約２２、約１６から約２１、約１７から約２０、または約１８から約２９アミノ酸などである。
【００２５】
インフルエンザウイルスペプチドは、たとえばタンパク質分解開裂などによって、ポリペプチドインフルエンザウイルス抗原から化学的に由来しうる。より典型的には、インフルエンザウイルスペプチドは技術上周知の方法を用いて合成しうる。
【００２６】
用語「ペプチド」は、アミノ酸残基がペプチド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）で連結された分子のみでなく、ペプチド結合が逆転した分子も含む。そのようなレトロインベルソペプチド模倣体は、たとえばＭｅｚｉｅｒｅ他（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９，３２３０−３２３７に記載されたものなどの、技術上既知である方法を用いて生成しうる。この手法は、骨格を包含するが側鎖の配向は包含しない変換を含むシュートペプチドを生成することを包含する。Ｍｅｚｉｅｒｅら（１９９７）は、少なくともＭＨＣクラスＩＩおよびＴヘルパー細胞応答に対し、これらのシュードペプチドが有用であることを示す。ＣＯ−ＮＨ結合の代わりにＮＨ−ＣＯ結合を含むレトロインバースペプチドの方が、タンパク質分解に対する抵抗性がはるかに強い。
【００２７】
同様に、アミノ酸残基の炭素原子間で適切な間隔を保持する適切なリンカー部分が用いられるならば、ペプチド結合はすべて省いてもよく；リンカー部分がペプチド結合とほぼ同じ電荷分布、およびほぼ同じ平面性を有するならば特に好ましい。細胞外タンパク分解消化に対する感受性の低減を促すために、ペプチドをそのＮ末端またはＣ末端で簡便にブロッキングしうることも評価される。たとえば、ペプチドのＮ末端アミノ基をカルボン酸と反応させることで保護し、またペプチドのＣ末端カルボキシル基をアミンと反応させることで保護しうる。他の修飾の例はグリコシル化およびリン酸化を含む。他の有望な修飾は、ＲまたはＫの側鎖上にある水素をメチレン基で置換しうることである（−ＮＨ２を−ＮＨ（Ｍｅ）または−Ｎ（Ｍｅ）２に修飾しうる）。
【００２８】
用語「ペプチド」は、インビボでペプチドの半減期を延長または短縮するペプチド変異体も含む。本発明にしたがって使用される、ペプチドの半減期を延長することの可能なアナログの例は、ペプチドのペプトイドアナログ、ペプチドのＤ−アミノ酸誘導体、およびペプチド−ペプトイドハイブリッドである。本発明にしたがって使用されるポリペプチド変異体のさらなる実施形態は、ポリペプチドのＤ−アミノ酸型を含む。Ｌ−アミノ酸ではなくＤ−アミノ酸を用いたポリペプチドの調製は、通常の代謝プロセスによるこうした物質のあらゆる望まれない分解を大きく低下させ、投与する必要のある物質の量をその投与頻度と共に低下させる。
【００２９】
（ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ）
本発明のワクチン組成物は、好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含むインフルエンザウイルスペプチドを含む。ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープは、（ｉ）クラスＩ  ＭＨＣ分子による提示および（ｉｉ）ＣＤ８＋Ｔ細胞上に存在するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）による認識が可能なペプチドである。好ましくは、ＴＣＲによる認識によってＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化がもたらされる。ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化は、増殖、サイトカイン産生および／または細胞障害効果の亢進をもたらしうる。
【００３０】
典型的には、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープは約９アミノ酸の長さである。しかしＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープはより短いこともあれば長いこともある。たとえば、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープはアミノ酸約８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５の長さでありうる。ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープはアミノ酸約８から１５、９から１４または１０から１２の長さでありうる。
【００３１】
ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含むインフルエンザウイルスペプチドは技術上既知である。ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを同定する方法は技術上既知である。エピトープマッピング法は、Ｘ線共結晶構造解析、アレイベースオリゴペプチドスキャニング（時にオーバーラッピングペプチドスキャンまたはペプスキャン分析と呼ばれる）、部位指向変異生成、高スループット変異生成マッピング、水素−重水素交換、架橋結合質量分析、ファージディスプレイおよび制限タンパク分解を含む。ＭＣＨモチーフ予測法も用いられる。
【００３２】
好ましくは、ワクチン組成物に含めることを目的としたＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを直接同定するために、インフルエンザウイルス感染細胞によって提示されるＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを同定することができる。これは単独でも、またはＭＣＨモチーフ予測法によって同定されたＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ候補の有用性を確認する目的でも用いることができる、効率的且つ論理的方法である。この方法を実施するために、細胞をインフルエンザウイルスに感染させ、約２４時間の間培養中で維持する。その後細胞を回収して洗う。次に、細胞を消化し、ＭＣＨ分子特異抗体を用いた免疫アフィニティクロマトグラフィでＭＣＨ／ペプチド複合体を分離する。ＭＨＣ分子から精製されたペプチドを、たとえばオフラインＨＰＬＣを用いてＣ−１８逆相（ＲＰ）カラムを用いて分画化する。ペプチド含有分画を回収し、真空乾燥し、質量分析で分析して分画の配列を同定する。その後、取得したスペクトルデータを、データベース化した全てのインフルエンザタンパク質と照合して検索し、インフルエンザウイルスと関連するペプチド配列を同定する。次に、同定された配列にしたがって合成ペプチドを生成し、質量分析に付して、ペプチド含有分画中のペプチドと同一であることを確認する。
【００３３】
この方法においては、任意の種類の細胞をインフルエンザウイルスに感染させることができる。細胞は抗原提示細胞でありうる。細胞はＨｅｐＧ２細胞などの肝癌細胞、ＪＹ細胞などのＥＢＶ形質転換リンパ芽球様Ｂ細胞、またはＴ２細胞などのリンパ芽球とすることができる。
【００３４】
同様に、目標とする任意のインフルエンザウイルスを用いて細胞を感染させることができる。たとえば、インフルエンザウイルスはインフルエンザＡ型、インフルエンザＢ型またはインフルエンザＣ型ウイルスとしうる。インフルエンザＡ型ウイルスは、たとえばＨ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｈ９またはＨ３Ｎ２としうる。
【００３５】
インフルエンザウイルス感染細胞によって提示されるＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの直接的な同定は、ＭＨＣモチーフ予測法と比較して有利である。免疫エピトープデータベース（ＩＥＤＢ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｅｄｂ．ｏｒｇ）は、機能的な方法ではなくモチーフ予測法によって生成され、ＭＨＣ結合スコアが高くＣＴＬ特性付けが制限された数多くの共有エピトープを含む、数百種類の予測ＨＬＡ特異的インフルエンザＴ細胞エピトープを含む。優位および準優位エピトープの双方がインフルエンザ感染細胞によって提示されるため、データベースを用いて自然に提示されるエピトープの順位を整理することは困難である。したがって、リストに挙げられたエピトープのうちいずれが、ワクチン組成物に含まれるときにＣＤ８＋Ｔ細胞応答を効率よく誘導すると期待できるかは、免疫エピトープデータベースのみからでは不明瞭である。上述の直接同定法は、エピトープの有用性を確認するための機構を提供する。
【００３６】
さらに、直接同定法を用いて、相異なるインフルエンザワクチンに感染した細胞が提示する維持ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを同定しうる。このようにして、汎用ワクチンに含めるのに適したＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを同定しうる。実施例に提示するように、本発明者らは、インフルエンザＡ型（Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２）とインフルエンザＢ型の間で維持されるＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを、直接的同定法を用いて同定した。同定された配列を表１に提示する。
【００３７】
【表１】
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【００３８】
また発明者らは、既知のペプチドＹＩＮＴＡＬＬＮＡ（Ｐ１；配列番号１９）、ＡＩＭＤＫＮＩＩＬ（Ｐ５；配列番号２０）およびＬＰＦＤＲＴＴＩＭ（配列番号２１）が、インフルエンザＡ型（Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２）とインフルエンザＢ型株の間で維持されるＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープであることも確認した。
【００３９】
したがって、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含むインフルエンザウイルスペプチドは配列番号１から２１のうち１つ以上を含みうる。たとえば、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含むインフルエンザウイルスペプチドは、配列番号１から２１のうち２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、１０以上、１５以上、または２０以上を任意の組み合わせで含みうる。ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含むインフルエンザウイルスペプチドは配列番号１から２１全てを含みうる。
【００４０】
同様に、ワクチン組成物は、それぞれが配列番号１から２１から選択される異なる配列を含むＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含む、１つ以上のインフルエンザウイルスペプチドを含みうる。たとえば、ワクチン組成物は、それぞれが配列番号１から２１から選択される相異なる配列を含むＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含む２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、１０以上、１５以上、または２０以上のインフルエンザウイルスペプチドを、任意の組み合わせで含みうる。ワクチン組成物は、たとえば、それぞれが配列番号１から２１から選択される相異なる配列を含むＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含む、２１のインフルエンザウイルスペプチドを含みうる。
【００４１】
（Ｂ細胞エピトープ）
本発明のワクチン組成物は、Ｂ細胞エピトープを含むインフルエンザウイルスペプチドを含みうる。Ｂ細胞エピトープは、Ｂ細胞上に存在する提示されるＢ細胞受容体（ＢＣＲ）による認識が可能なペプチドである。好ましくは、ＢＣＲによる認識によってＢ細胞の活性化および／または成熟がもたらされる。Ｂ細胞活性化は増殖、および／または抗体産生の亢進をもたらしうる。
【００４２】
Ｂ細胞エピトープを含むインフルエンザペプチドは技術上既知である。Ｂ細胞エピトープは線形ペプチド、すなわちインフルエンザウイルスタンパク質の特定領域の一次アミノ酸配列によって定義されるエピトープとしうる。またその代わりに、エピトープは高次構造エピトープ、すなわち天然インフルエンザタンパク質の高次構造によって定義されるエピトープとしうる。この場合、エピトープは連続的（すなわち抗体と相互作用するコンポーネントがタンパク質上で互いに隣接して連続的に位置する）であることも、非連続的（すなわち抗体と相互作用するコンポーネントがタンパク質上の異なる部分に位置し、折りたたまれた天然タンパク質構造において互いに近づく）であることもある。
【００４３】
典型的には、Ｂ細胞エピトープは長さが約５から２０アミノ酸、たとえば長さ６から１９、７から１８、８から１７、９から１６、１０から１５、１１から１４または１２から１３アミノ酸である。
【００４４】
Ｂ細胞エピトープを同定する方法も技術上既知である。たとえば、エピトープマッピング法を用いてＢ細胞エピトープを同定することができる。これらの方法は、既知のまたはモデル化したタンパク質の構造をアルゴリズムベースの手法に用いて表面エピトープを予測する構造的手法、およびタンパク質全体、タンパク質フラグメントまたはペプチドの抗体との結合を、たとえば酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）などを用いて定量化することのできる機能的手法を含む。競合的マッピング、抗原修飾またはタンパク質フラグメント化法も用いることができる。
【００４５】
Ｂ細胞エピトープは、たとえばインフルエンザマトリックス２タンパク質（Ｍ２ｅ）エピトープとしうる。Ｍ２ｅタンパク質の細胞外ドメインは、インフルエンザＡ型ウイルスの進化において維持された領域である。したがって、Ｍ２ｅＢ細胞エピトープを含むインフルエンザペプチドをワクチン組成物に含めることで、汎用的有用性の供与を促進しうる。
【００４６】
（汎用ワクチン組成物）
また本発明は、配列番号１から２１に提示されるＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープのうち１つ以上を含むインフルエンザウイルスペプチドを含むワクチン組成物であって、ペプチドがナノ粒子に結合されるワクチン組成物も提供する。
【００４７】
配列番号１から２１に提示されるＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープのうち１つ以上を含むインフルエンザウイルスペプチドを、ワクチン組成物に含めることは有利である。上記のように、配列番号１から２１に提示されるＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープは、相異なるインフルエンザウイルスに感染した細胞上でＭＨＣ分子によって提示される、維持ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープである。したがって、これらのエピトープのうちいずれかを含む組成物の接種によって生成する免疫応答は、そのエピトープを共有するあらゆるインフルエンザウイルスによる、その後の感染に対して防御しなければならない。換言すれば、ワクチン組成物には交叉サブタイプ効果が組み入れられており、すなわち汎用インフルエンザワクチン組成物である。そのような組成物は、インフルエンザ感染の新興または再出現株の著しい拡散を予防することも可能である。
【００４８】
さらに、本ワクチン組成物などの、インフルエンザウイルス感染細胞が提示するエピトープに基づくワクチン組成物は、ウイルスタンパク質サブユニットまたは予測エピトープモチーフに基づくワクチンよりも優れている。免疫系によるタンパク質プロセシングは、天然のウイルスエピトープを変化させる可能性がある。ワクチン組成物が感染細胞によって提示されると証明されたペプチドを基にすることにより、ペプチドはすでにタンパク質プロセシングを受けているので、この不確実性の元が取り除かれる。
【００４９】
また、インフルエンザウイルスペプチドを、たとえば金ナノ粒子などのナノ粒子と結合させることも有益である。以下により詳細に記述するように、ナノ粒子への結合によってワクチン組成物にアジュバントを含める必要性が低減または除外される。したがって、個人にワクチン組成物を接種する際に有害臨床事象を引き起こす可能性が低くなる。
【００５０】
（配列番号１から２１を含むインフルエンザペプチド）
ワクチン組成物は、配列番号１から２１に提示されるＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープのうち１つ以上を含むインフルエンザウイルスペプチドを含む。配列番号１から２１を含むインフルエンザペプチドは、体液性応答および細胞性応答を刺激するワクチン組成物と関連付けて上に詳述する。インフルエンザウイルスペプチドは、配列番号１から２１に提示するＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープのうち２つ以上、たとえば３つ以上、４つ以上、５つ以上、１０以上、１５以上、または２０以上を含みうる。この場合、インフルエンザウイルスペプチドは、配列番号１から２１に提示されるＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの任意の組み合わせを含みうる。インフルエンザウイルスペプチドは、配列番号１から２１に提示されるＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの全てを含みうる。
【００５１】
ワクチン組成物は、それぞれが異なるＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含む２つ以上のインフルエンザウイルスペプチドを含みうる。２つ以上のインフルエンザウイルスペプチドのそれぞれが、配列番号１から２１に提示されるＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープのうち異なる１つを含みうる。またその代わりに、２つ以上のインフルエンザウイルスペプチドのうち１つ以上が、配列番号１から２１に提示されないＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含みうる。ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープは技術上既知である。
【００５２】
（ナノ粒子）
ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含むインフルエンザウイルスペプチド、およびＢ細胞エピトープを含むインフルエンザウイルスペプチドを含むワクチン組成物と、配列番号１から２１に提示されるＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープのうち１つ以上を含むインフルエンザウイルスペプチドを含むワクチン組成物の双方において、各インフルエンザウイルスペプチドはナノ粒子と結合する。
【００５３】
前項に記載し、且つ以下の実施例で証明するように、インフルエンザウイルスペプチドをナノ粒子（金ナノ粒子など）に結合することによって、ワクチン組成物にアジュバントを含める必要性が低減または除外される。ナノ粒子は、インフルエンザウイルスペプチドに対する免疫応答の効率的な誘導を促進する、免疫「危険信号」を含みうる。ナノ粒子は、堅牢な免疫応答に必要とされる樹状細胞（ＤＣ）の活性化および成熟を誘導しうる。ナノ粒子は、抗原提示細胞などの細胞によるナノ粒子の取り込みを改善し、かつこれによるインフルエンザペプチドの取り込みを改善する非自己コンポーネントを含む。したがって、インフルエンザウイルスペプチドをナノ粒子に結合すると、抗原提示細胞がウイルス特異的Ｂ細胞および／またはＴ細胞を刺激する能力を促進しうる。またナノ粒子との結合により、皮下、皮内、経皮および経口／バッカル経路からのワクチン組成物の送達を促進し、従来のインフルエンザワクチンよりも大きな投与の柔軟性を提供する。
【００５４】
ナノ粒子は，リガンドの固定のための基質として用いることのできる、１から１００ナノメートル（ｎｍ）のサイズの粒子である。本発明のワクチン組成物においては、ナノ粒子は１から１００、２０から９０、３０から８０、４０から７０または５０から６０ｎｍの平均直径を有しうる。好ましくは、ナノ粒子は２０から４０ｎｍの平均直径を有する。２０から４０ｎｍの平均直径は、ナノ粒子のサイトゾルへの取り込みを促進する。平均直径は、透過電子顕微鏡などの技術上周知の技術を用いて測定することができる。
【００５５】
インフルエンザウイルスペプチドなどの抗原の送達に適したナノ粒子は、技術上既知である。そのようなナノ粒子を生成するための方法も既知である。
【００５６】
ナノ粒子は、たとえばポリマーナノ粒子、無機ナノ粒子、リポソーム、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、または自己組織化タンパク質などとしうる。ナノ粒子は、好ましくはリン酸カルシウムナノ粒子、ケイ素ナノ粒子または金ナノ粒子である。
【００５７】
ナノ粒子はポリマーナノ粒子としうる。ポリマーナノ粒子は、ポリ（ｄ，ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧ）、ポリ（ｄ，ｌ−乳酸−コグリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（ｇ−グルタミン酸）（ｇ−ＰＧＡ）ｍポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、またはポリスチレンなどの１つ以上の合成ポリマーを含みうる。ポリマーナノ粒子は、たとえばプルラン、アルギン酸、イヌリンまたはキトサンなどの多糖類などの１つ以上の天然ポリマーを含みうる。ポリマーナノ粒子の使用は、ナノ粒子に含まれうるポリマーの性質によって有利となりうる。たとえば、上に列挙した天然および合成ポリマーは、良好な生体適合性および生分解性、無毒性および／または所望の形状およびサイズに改造される能力を有しうる。ポリマーナノ粒子はハイドロゲルナノ粒子を形成しうる。ハイドロゲルナノ粒子はのナノサイズ親水性３次元ポリマーネットワークの一種である。ハイドロゲルナノ粒子は、自在なメッシュサイズ、多価コンジュゲーションのための大きな表面積、高い水分含有量、および高い抗原装填能力を含む好ましい性質を有する。ポリ（Ｌ−乳酸）（ＰＬＡ）、ＰＬＧＡ、ＰＥＧおよび多糖類などのポリマーは、ハイドロゲルナノ粒子を形成するのに特に適している。
【００５８】
ナノ粒子は無機ナノ粒子としうる。典型的には、無機ナノ粒子は堅牢な構造を有し且つ非生分解性である。しかし、無機ナノ粒子は生分解性としうる。無機ナノ粒子は、その中に抗原をカプセル化しうるシェルを含みうる。無機ナノ粒子は、そこに抗原を共有結合することのできるコアを含みうる。コアは金属を含みうる。たとえば、コアは金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）または銅（Ｃｕ）原子を含みうる。コアは、２種類以上の原子から形成されうる。たとえば、コアはＡｕ／Ａｇ、Ａｕ／Ｃｕ、Ａｕ／Ａｇ／Ｃｕ、Ａｕ／Ｐｔ、Ａｕ／ＰｄまたはＡｕ／Ａｇ／Ｃｕ／Ｐｄの合金などの合金を含みうる。コアはリン酸カルシウム（ＣａＰ）を含みうる。コアは、たとえばセレン化カドミウムなどの半導体材料を含みうる。
【００５９】
他の典型的な無機ナノ粒子は、カーボンナノ粒子およびシリカベースナノ粒子を含む。カーボンナノ粒子は良好な生体適合性を有し、且つ合成してナノチューブおよびメソポーラス球とすることができる。シリカベースナノ粒子（ＳｉＮＰ）は生体適合性であり、且つ調整可能な構造パラメーターで調製してその治療的用途に適合させることができる。
【００６０】
ナノ粒子は、ケイ素元素ナノ粒子などのケイ素ナノ粒子とすることができる。ナノ粒子はメソポーラスであることも、またはハニカム小孔構造を有することもある。好ましくは、ナノ粒子はハニカム小孔構造を有するケイ素元素粒子である。そのようなナノ粒子は技術上既知であり、ほぼ任意の装填、投与経路、標的および放出プロフィールに調節できる、調整および制御可能な薬剤装填、標的化および放出を提供する。たとえば、そのようなナノ粒子はその装填物のバイオアベイラビリティを高め、且つ／または経口投与した活性体の腸透過性および吸収を改善する。ナノ粒子は、その多孔性構造および大きな表面積によって、例外的に高い装填能力を有する。ナノ粒子は、その物理的特性に応じて、その装填物を数日間、数週間または数ヶ月間にわたって放出しうる。ケイ素は人体の天然元素であるので、ナノ粒子が免疫系からの反応を誘発する可能性はない。これは、ナノ粒子のインビボ安全性にとって有利である。
【００６１】
上記のＳｉＮＰのいずれも、生分解性または非生分解性としうる。生分解性ＳｉＮＰを溶解して、ケイ素の生体利用可能な形態であるオルトケイ酸（ｏｒｔｈｏｓｉｌｉｃ  ａｃｉｄ）としうる。オルトケイ酸は骨、結合組織、毛髪および肌の健康にとって有益であることが示されている。
【００６２】
ナノ粒子はリポソームとしうる。リポソームは、典型的には生分解性、無毒性リン脂質から形成され、且つ水性コアを伴う自己組織型リン脂質二重層シェルを含む。リポソームは、単一リン脂質二重層を含む単層小胞であることも、水の層で隔てられた数層の同心性リン脂質シェルを含む多層小胞であることもある。その結果、リポソームは親水性分子を水性コアに組み入れるよう、または疎水性分子をリン脂質二重層内に組み入れるよう調整することができる。リポソームは、送達を目的として抗原をコア内にカプセル化することができる。リポソームは、ウイルスエンベロープ糖タンパク質をシェルに組み入れてビロソームを形成しうる。当技術において数多くのリポソームベース製品が確立され、ヒトへの使用が承認される。
【００６３】
ナノ粒子は免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）としうる。ＩＳＣＯＭは、典型的にはコロイドサポニン含有ミセルによって形成される籠様粒子である。ＩＳＣＯＭはコレステロール、リン脂質（ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリンなど）およびサポニン（樹木Ｑｕｉｌｌａｉａ  ｓａｐｏｎａｒｉａに由来するＱｕｉｌ  Ａなど）を含みうる。ＩＳＣＯＭは、従来、単純ヘルペスウイルス１型、Ｂ型肝炎ウイルスまたはインフルエンザウイルスに由来するエンベロープタンパク質などの、ウイルスエンベロープタンパク質を捕捉するために使用されている。
【００６４】
ナノ粒子はウイルス様粒子（ＶＬＰ）としうる。ＶＬＰは感染性核酸を欠いた自己組織化ナノ粒子であり、生体適合性カプシドタンパク質の自己組織化によって形成される。ＶＬＰは、典型的には直径約２０から約１５０ｎｍ、たとえば約２０から約４０ｎｍ、約３０から約１４０ｎｍ、約４０から約１３０ｎｍ、約５０から約１２０ｎｍ、約６０から約１１０ｎｍ、約７０から約１００ｎｍ、または約８０から約９０ｎｍでありうる。ＶＬＰは、免疫系との相互作用に対して自然に最適化される、進化したウイルス構造の力を有利に活用する。自然に最適化されたナノ粒子のサイズおよび繰り返し構造の順序は、アジュバントの不在下でもＶＬＰが強力な免疫応答を誘導することを意味する。
【００６５】
ナノ粒子は自己組織化タンパク質でありうる。たとえば、ナノ粒子はフェリチンを含みうる。フェリチンは、自己組織化してほぼ球形の１０ｎｍ構造となることのできるタンパク質である。ナノ粒子は主要ヴォールトタンパク質（ＭＶＰ）を含みうる。９６ユニットのＭＶＰが自己組織化して、幅約４０ｎｍ長さ約７０ｎｍサイズの樽型ヴォールトナノ粒子となることができる。
【００６６】
ナノ粒子はリン酸カルシウム（ＣａＰ）ナノ粒子としうる。ＣａＰナノ粒子はＣａＰを１分子以上（２分子以上、１０分子以上、２０分子以上、５０分子以上、１００分子以上、２００分子以上、または５００分子以上など）含むコアを含みうる。ＣａＰナノ粒子およびその生成方法は技術上既知である。たとえば、ＣＡＰナノ粒子の安定したナノ懸濁液は、所定の比率のカルシウムとリン酸の無機塩溶液を連続的に混合することによって生成しうる。
【００６７】
ＣａＰナノ粒子は、約８０から約１００ｎｍ、たとえば約８２から約９８ｎｍ、約８４から約９６ｎｍ、約８６から約９４ｎｍ，または約８８から約９２ｎｍの平均粒径を有することができる。この粒径は、免疫細胞取り込みおよび免疫応答の点で、他のより大きな粒径より優れた成績をもたらしうる。粒径は、たとえば１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、１２ヶ月、１８ヶ月、２４ヶ月、３６ヶ月、または４８ヶ月にわたって測定するとき安定でありうる（すなわち著しい変化を示さない）。
【００６８】
ＣａＰナノ粒子は、ナノ粒子の表面に吸着されたか、または粒子の合成中にＣａＰと共沈殿した１つまたは複数の抗原と共製剤化することができる。たとえば、インフルエンザウイルスペプチドなどのペプチドは、ペプチドをＤＭＳＯに（たとえば約１０ｍｇ／ｍＬの濃度で）溶解し、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）（たとえば０．０９３ｍｏｌ／Ｌおよび超純水と共にＣａＰナノ粒子の懸濁液に添加し、約４時間（たとえば１時間、２時間、３時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間または１０時間）の間室温で混合することによって、ＣａＰナノ粒子と結合しうる。
【００６９】
ワクチン組成物は、約０．１５から約０．８％、たとえば０．２から約０．７５％、０．２５から約０．７％、０．３から約０．６％、０．３５から約０．６５％、０．４から約０．６％、または０．４５から約０．５５％のＣａＰナノ粒子を含みうる。好ましくは、ワクチン組成物はＣａＰナノ粒子を約０．３％含む。
【００７０】
ＣａＰナノ粒子は、骨や歯などのヒト硬組織とのその化学的類似性によって、高度な生体適合性を有する。したがって、有利なことに、ＣａＰナノ粒子は治療用途に用いるとき無毒性である。ＣａＰナノ粒子は、筋肉内、皮下、経口または吸入経路からの投与について安全である。ＣａＰナノ粒子は、商業的に合成する上で簡便でもある。さらに、ＣａＰナノ粒子は緩徐な抗原放出を伴い、これはナノ粒子と結合したインフルエンザペプチドに対する免疫応答の誘導を促進しうる。ＣａＰナノ粒子はアジュバントとしても、また薬剤送達担体としても用いうる。
【００７１】
ナノ粒子は金ナノ粒子としうる。金ナノ粒子は技術上既知であり、具体的には国際公開第２００２／３２４０４号、国際公開第２００６／０３７９７９号、国際公開第２００７／１２２３８８号、国際公開第２００７／０１５１０５および国際公開第２０１３／０３４７２６号に記載される。各インフルエンザウイルスペプチドと結合した金ナノ粒子は、国際公開第２００２／３２４０４号、国際公開第２００６／０３７９７９号、国際公開第２００７／１２２３８８号、国際公開第２００７／０１５１０５号、および国際公開第２０１３／０３４７２６のいずれかに記載された金ナノ粒子としうる。
【００７２】
金ナノ粒子は金（Ａｕ）原子を含むコアを含む。コアはＦｅ、ＣｕまたはＧｄ原子のうち１つ以上をさらに含みうる。コアは、Ａｕ／Ｆｅ、Ａｕ／Ｃｕ、Ａｕ／Ｇｄ、Ａｕ／Ｆｅ／Ｃｕ、Ａｕ／Ｆｅ／ＧｄまたはＡｕ／Ｆｅ／Ｃｕ／Ｇｄなどの金合金から形成されうる。コア内の原子の総数は１００から５００原子、たとえば１５０から４５０、２００から４００または２５０から３５０原子などとしうる。金ナノ粒子は１から１００、２０から９０、３０から８０、４０から７０または５０から６０ｎｍの平均直径を有しうる。好ましくは、金ナノ粒子は平均直径２０から４０ｎｍを有する。
【００７３】
インフルエンザウイルスペプチド以外の１つ以上のリガンドをナノ粒子と結合させてもよく、この粒子は上記のナノ粒子のいずれかの種類としうる。リガンドは、コアの表面を部分的に被覆することも完全に被覆することもある層またはコーティングである「コロナ」を形成しうる。コロナは、ナノ粒子コアを包囲するかまたは部分的に包囲する有機層と見なすことができる。コロナは、ナノ粒子のコアの不動態化を提供することもあれば、これに関与することもある。したがって一定の例においては、コロナはコアを安定化させる十分に完全なコーティング層としうる。コロナは、本発明のナノ粒子の水溶性などの溶解性を促進しうる。
【００７４】
ナノ粒子は少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、または少なくとも５０個のリガンドを含みうる。リガンドは１つ以上のペプチド、タンパク質ドメイン、核酸分子、脂質基、炭水化物基、陰イオン基、または陽イオン基、糖脂質および／または糖タンパク質を含みうる。炭水化物基は多糖類であることも、またはオリゴ糖類または単糖類（グルコースなど）であることもある。１つ以上のリガンドは非自己コンポーネントであってもよく、これは病原性コンポーネントと類似しているので、ナノ粒子が抗原提示細胞によって取り込まれる可能性を高める。たとえば、１つ以上のリガンドは炭水化物部分（細菌炭水化物部分など）、界面活性物質部分および／またはグルタチオン部分を含みうる。典型的なリガンドはグルコース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、グルタチオン、２’−チオエチル−β−Ｄ−グルコピラノシドおよび２’−チオエチル−グルコピラノシドを含む。好ましいリガンドは、糖ナノ粒子を形成する糖コンジュゲートを含む。
【００７５】
リガンドのコアとの結合はリンカーによって促進されうる。リンカーはチオール基、アルキル基、グリコール基またはペプチド基を含みうる。たとえば、リンカーはＣ２〜Ｃ１５アルキルおよび／またはＣ２〜Ｃ１５グリコールを含みうる。リンカーは、コアとの共有結合が可能であるイオウ含有基、アミノ含有基、リン酸含有基または酸素含有基を含みうる。またその代わりに、リガンドが、たとえばリガンドに含まれるイオウ含有基、アミノ含有基、リン酸含有基または酸素含有基を介してコアと直接結合してもよい。  
【００７６】
（ナノ粒子との結合）
インフルエンザウイルスペプチドは、ナノ粒子とそのＮ末端で結合しうる。典型的には、インフルエンザウイルスペプチドはナノ粒子のコアと結合するが、コロナまたはリガンドとの結合もまた可能である。
【００７７】
１つ以上のインフルエンザウイルスペプチドが、たとえばペプチド内のイオウ含有基、アミノ含有基、リン酸含有基または酸素含有基内の原子とナノ粒子またはそのコア内の原子との共有結合などにより、ナノ粒子と直接結合しうる。
【００７８】
リンカーを用いて、１つ以上のインフルエンザウイルスペプチドをナノ粒子と結合させうる。リンカーは、コア内の原子との共有結合が可能であるイオウ含有基、アミノ含有基、リン酸含有基または酸素含有基を含みうる。たとえば、リンカーはチオール基、アルキル基、グリコール基またはペプチド基を含みうる。
【００７９】
リンカーはペプチド部分と非ペプチド部分を含みうる。ペプチド部分は、Ｘ１はＡおよびＧから選択される１個のアミノ酸；Ｘ２はＡおよびＧから選択される１個のアミノ酸；且つＺ１はＹおよびＦから選択される配列Ｘ１Ｘ２Ｚ１を含みうる。ペプチド部分は配列ＡＡＹまたはＦＬＡＡＹを含みうる。リンカーのペプチド部分は、インフルエンザウイルスペプチドのＮ末端と結合しうる。リンカーの非ペプチド部分はＣ２〜Ｃ１５アルキルおよびＣ２〜Ｃ１５グリコール、たとえばチオエチル基またはチオプロピル基を含みうる。
【００８０】
リンカーは（ｉ）ＨＳ−（ＣＨ２）２−ＣＯＮＨ−ＡＡＹ；（ｉｉ）ＨＳ−（ＣＨ２）２−ＣＯＮＨ−ＬＡＡＹ；（ｉｉｉ）ＨＳ−（ＣＨ２）３−ＣＯＮＨ−ＡＡＹ；（ｉｖ）ＨＳ−（ＣＨ２）３−ＣＯＮＨ−  ＦＬＡＡＹ；（ｖ）ＨＳ−（ＣＨ２）１０−（ＣＨ２ＯＣＨ２）７−ＣＯＮＨ−ＡＡＹ；および（ｖｉ）ＨＳ−（ＣＨ２）１０−（ＣＨ２ＯＣＨ２）７−ＣＯＮＨ−ＦＬＡＡＹを含みうる。この場合、リンカーの非ペプチド部分のチオール基がリンカーをコアに結合させる。
【００８１】
インフルエンザウイルスをナノ粒子と結合させるのに適した他のリンカーは、技術上既知であり、当業者によって容易に同定および施行されうる。
【００８２】
ワクチン組成物がＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含むインフルエンザウイルスペプチド、およびＢ細胞エピトープを含むインフルエンザウイルスペプチドを含むとき、各インフルエンザペプチドは異なるナノ粒子と結合しうる。この場合、そこに各インフルエンザウイルスペプチドが結合するナノ粒子は同じ種類のナノ粒子でありうる。たとえば、各インフルエンザウイルスペプチドは金ナノ粒子と結合しうる。各インフルエンザウイルスペプチドはＣａＰナノ粒子と結合しうる。そこに各インフルエンザウイルスペプチドが結合するナノ粒子は、異なる種類のナノ粒子でありうる。たとえば、一方のインフルエンザウイルスペプチドが金ナノ粒子と結合し、他方のインフルエンザウイルスペプチドがＣａＰナノ粒子と結合することもありうる。しかし好ましくは、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含むインフルエンザウイルスペプチド、およびＢ細胞エピトープを含むインフルエンザウイルスペプチドは同じナノ粒子と結合する。たとえば、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含むインフルエンザウイルスペプチド、およびＢ細胞エピトープを含むインフルエンザウイルスペプチドは同じ金ナノ粒子と結合する。これにより、インフルエンザウイルス特異的細胞性応答、およびインフルエンザウイルス特異的体液性応答の双方を刺激することのできる、単一の粒子が提供される。
【００８３】
（ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ）
本発明のワクチン組成物は、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含むインフルエンザウイルスペプチドをさらに含みうる。ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは上に定義される。
【００８４】
ワクチン組成物は、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含むインフルエンザウイルスペプチドを２つ以上、たとえば３つ以上、４つ以上、５つ以上、１０以上、１５以上、または２０以上含みうる。そのようなペプチドは技術上既知である。
【００８５】
ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含むインフルエンザウイルスペプチドは、ＣＤ８＋細胞をコードするインフルエンザウイルスペプチド、およびＢ細胞エピトープをコードするインフルエンザウイルスペプチドとは異なるペプチドとしうる。ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含むインフルエンザウイルスペプチドは、ＣＤ８＋細胞をコードするインフルエンザウイルスペプチドと同じペプチドとしうる。すなわち、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含むインフルエンザウイルスペプチドがＣＤ４＋細胞エピトープをさらに含みうる。
【００８６】
ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含むインフルエンザウイルスペプチドがＣＤ４＋細胞エピトープを含む場合、ＣＤ８＋エピトープはＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ内に入れ子状に配置されうる。ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、典型的にはＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープよりも長い。したがって、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの一方または双方の末端を延長することにより、その配列がなおＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含む、さらに長いＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを得ることができる。したがって、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープはＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ、たとえば配列番号１から２１に提示され、そのＮ末端またはＣ末端が延長されたＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープなどを含みうる。ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープはそのＮ末端で１、２、３、４、または５アミノ酸延長しうる。ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープはそのＣ末端で１、２、３、４、または５アミノ酸延長しうる。好ましくは、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープはＮ末端で３アミノ酸、且つＣ末端で３アミノ酸延長される。しかし、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの各末端の延長アミノ酸数が同じである必要はない。
【００８７】
延長ペプチド内に入れ子状に配置されたＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープは、堅牢なＣＴＬ応答を生成することが可能である。延長ペプチド（ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ）はＴヘルパー媒介サイトカイン応答を誘導することが可能である。したがって、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープおよびＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含むインフルエンザウイルスペプチドをワクチン組成物に含めることで、ワクチン組成物が細胞障害性応答およびヘルパーＴ細胞応答の双方を誘導し、改善された抗インフルエンザ免疫を提供することを可能とする。
【００８８】
発明者らは、実施例に提示するように、配列番号１から２１に提示するＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープがその中に入れ子状に配置されたＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの候補を数多く同定している。これらは表２に提示する。
【００８９】
【表２】
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【００９０】
したがって、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープおよびＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含むインフルエンザウイルスペプチドは、配列番号２２から２７に提示するペプチドのうち１つ以上を含みうる。ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープおよびＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含むインフルエンザウイルスペプチドは、配列番号２２から２７に提示するペプチドのうち２つ以上、３つ以上、４つ以上または５つ以上を任意の組み合わせで含みうる。ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープおよびＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含むインフルエンザウイルスペプチドは、配列番号２２から２７に提示するペプチドの全てを含みうる。
【００９１】
ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含むインフルエンザウイルスはナノ粒子と結合させうる。ナノ粒子は金ナノ粒子としうる。ナノ粒子およびこれとの結合は上に記載されている。
【００９２】
（ＨＬＡスーパータイプとの相互作用）
ワクチン組成物は、それぞれが相異なるＨＬＡスーパータイプと相互作用するＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含む、少なくとも２つのインフルエンザウイルスペプチドを含みうる。ワクチン組成物にそのような複数のペプチドを含めることで、ワクチン組成物を投与した個人に対し、ワクチン組成物がＣＤ８＋Ｔ細胞応答をより高い割合で誘発することを可能とする。これは、複数のインフルエンザウイルスペプチドに含まれるＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープのうち１つと相互作用するＨＬＡスーパータイプの者全員に対して、ワクチン組成物がＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発できるはずであるからである。各ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープはＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ａ２４、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ８、ＨＬＡ−Ｂ２７、ＨＬＡ−Ｂ４４、ＨＬＡ−Ｂ５８またはＨＬＡ−Ｂ６２、または技術上既知である任意の他のＨＬＡスーパータイプと相互作用しうる。そのようなＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含むインフルエンザウイルスの、あらゆる組み合わせが可能である。
【００９３】
ワクチン組成物は、少なくとも２つの異なるＨＬＡスーパータイプと相互作用する、少なくとも１つの免疫原性ペプチドを含みうる。やはりこれにより、ワクチン組成物を投与した者に対し、ワクチン組成物がＤ８＋Ｔ細胞応答をより高い割合でＣ誘発することを可能とする。ワクチン組成物は、それぞれが少なくとも２つの相異なるＨＬＡサブタイプと相互作用する少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、少なくとも２つの、少なくとも１５の、または少なくとも２０の免疫原性ペプチドを含みうる。各免疫原性ペプチドは、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、少なくとも６つの、少なくとも７つの、少なくとも８つの、少なくとも９つのまたは少なくとも１０の異なるＨＬＡスーパータイプと相互作用しうる。各免疫原性ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ａ２４、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ８、ＨＬＡ−Ｂ２７、ＨＬＡ−Ｂ４４、ＨＬＡ−Ｂ５８またはＨＬＡ−Ｂ６２、または技術上既知である任意の他のＨＬＡスーパータイプのうち２つ以上の任意の組み合わせと相互作用しうる。好ましくは、ワクチン組成物はＨＬＡ−Ａ２およびＨＬＡ−２４と相互作用する免疫原性ペプチドを含む。この場合ワクチン組成物は、たとえば、配列番号３から５に提示されるペプチドのうち１つ以上を含むＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含むインフルエンザウイルスペプチドを含みうる。
【００９４】
（医薬品、方法および治療的使用）
本発明は、インフルエンザウイルス感染を予防または治療するための方法であって、インフルエンザウイルスに感染したか、またはこれに感染するリスクのある者に本発明のワクチン組成物を投与することを含む方法を提供する。また本発明は、個人におけるインフルエンザ感染を予防または治療する方法における使用を目的とした本発明のワクチン組成物も提供する。
【００９５】
インフルエンザウイルスはインフルエンザＡ型、インフルエンザＢ型および／またはインフルエンザＣ型ウイルスでありうる。インフルエンザＡ型ウイルスは、たとえばＨ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｈ９またはＨ３Ｎ２としうる。インフルエンザウイルスはヒトインフルエンザウイルス、ブタインフルエンザウイルス、またはトリインフルエンザウイルスとしうる。インフルエンザウイルスは汎流行インフルエンザウイルスまたは潜在的汎流行インフルエンザウイルスとしうる。
【００９６】
ワクチン組成物は医薬組成物として提供しうる。医薬組成物は、好ましくは医薬として許容できる担体または希釈液を含む。医薬組成物は任意の適切な方法によって製剤化しうる。標準的な医薬として許容できる担体および／または添加剤を用いた細胞の製剤化は、医薬技術において常用的な方法を用いて遂行しうる。製剤の厳密な性質は、投与しようとする細胞および所望の投与経路を含む数種類の因子に依存する。適切な製剤の種類は、『レミントン薬剤学第１９版』マック出版、米国東ペンシルバニアに完全に記載されている。
【００９７】
ワクチン組成物または医薬組成物は任意の経路によって投与しうる。適切な経路は静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、皮内、経皮および経口／バッカル経路を含むが、これに限定されない。
【００９８】
組成物は、生理学的に許容される担体または希釈液と共に調製される。典型的には、そのような組成物はペプチド結合ナノ粒子の液状懸濁液として調製される。ナノ粒子は、医薬品として許容でき且つ有効成分と適合する添加剤と混合しうる。適切な添加剤は、たとえば水、生理食塩水、デキストロース、グリセロールなど、およびその組み合わせと混合される。
【００９９】
さらに所望の場合、医薬組成物は、湿潤剤または乳化剤、および／またはｐＨ緩衝化剤などの少量の補助物質を含みうる。
【０１００】
ペプチド結合ナノ粒子は、投与製剤と適合する方法で投与され、そのような量で治療的に有効である。投与しようとする量は、治療しようとする対象、治療しようとする疾患、および対象の免疫系の能力に依存する。投与する必要のあるナノ粒子の正確な量は、臨床家の判断に依存し、また各対象に固有でありうる。
【０１０１】
任意の適切な数のナノ粒子を対象に投与しうる。たとえば、少なくとも、または約０．２×１０６、０．２５×１０６、０．５×１０６、１．５×１０６、４．０×１０６または５．０×１０６個／患者体重ｋｇのナノ粒子を投与しうる。たとえば、少なくともまたは約１０５、１０６、１０７、１０８、１０９個の細胞を投与しうる。目安として、投与しようとする本発明のナノ粒子の個数は１０５から１０９個、好ましくは１０６から１０８個としうる。
【０１０２】
開示された生成物の相異なる用途および方法は、技術上の特定のニーズに合わせて調整しうることが理解される。本願で用いる用語は本発明の具体的な実施形態を記述することのみを目的とし、制限することを意図していない。
【０１０３】
さらに、本明細書および付属の請求項に用いられるように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈より別段明示されない場合、複数の指示対象を含む。したがって、たとえば、「１つの車」への言及は「複数の車」を含み、「１個のＴ細胞」への言及は２つ以上のそのようなＴ細胞を含み、「１つのコンポーネント」への言及は２つ以上のそのようなコンポーネントを含むなどである。
【０１０４】
本願に引用する全ての出版物、特許および特許明細書は、上記であれ下記であれ、その全文を参照文献として本願に援用する。
【０１０５】
（本発明のさらなる実施形態）
１．配列番号１から１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのペプチドを含む医薬組成物中の分離オリゴペプチドまたはペプチドであって、前記オリゴペプチドまたはペプチドが８から約３０個のアミノ酸残基からなり、前記オリゴペプチドまたはペプチドがクラスＩ  ＭＨＣ分子と結合するかまたはクラスＩ  ＭＨＣ分子と結合してＴリンパ球応答を活性化するようプロセシングされることが可能であり、且つオリゴペプチドまたはペプチドが医薬として許容できる塩の形態にあるオリゴペプチドまたはペプチド。
２．第１項のオリゴペプチドであって、前記オリゴペプチドが少なくとも２つのエピトープペプチドを含むオリゴペプチド。
３．第１項のオリゴペプチドであって、前記オリゴペプチドが少なくとも３つのエピトープペプチドを含むオリゴペプチド。
４．第１項のオリゴペプチドであって、前記オリゴペプチドが少なくとも４つのエピトープペプチドを含むオリゴペプチド。
５．第１項のオリゴペプチドまたはペプチドであって、前記オリゴペプチドまたはペプチドが配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８と異なり前記の差異が１アミノ酸単位を越えないオリゴペプチドまたはペプチド。
６．第５項のオリゴペプチドまたはペプチドであって、前記１つのアミノ酸の差異が保存的アミノ酸の置換の結果であるオリゴペプチドまたはペプチド。
７．第５項のオリゴペプチドまたはペプチドであって、前記１つのアミノ酸の差異が１つの疎水性アミノ酸の他の疎水性アミノ酸による置換であるオリゴペプチドまたはペプチド。
８．第５項のオリゴペプチドまたはペプチドであって、前記のアミノ酸の差異が前記エピトープペプチドへの１つのアミノ酸の付加または欠失であるオリゴペプチドまたはペプチド。
９．（ａ）第１項のオリゴペプチドまたはペプチドをコードするポリヌクレオチド、および（ｂ）（ａ）の完全相補体からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含む医薬組成物中にあるポリヌクレオチドであって、ポリヌクレオチドが医薬として許容できる塩の形態にあるポリヌクレオチド。
１０．第９項のポリヌクレオチドであって、（ａ）のポリヌクレオチドがＤＮＡであるポリヌクレオチド。
１１．第９項のポリヌクレオチドであって、（ａ）のポリヌクレオチドがＲＮＡであるポリヌクレオチド。
１２．対象にインフルエンザ感染に対する予防接種および治療をするための方法であって、前記感染細胞が任意のクラスＩ  ＭＨＣ分子を発現し、クラスＩ  ＭＨＣと結合するかまたはクラスＩ  ＭＨＣ分子と結合するようプロセシングすることのできる組成物であって：配列番号１から１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むエピトープペプチドを、前記感染細胞にＣＴＬ応答を誘導するのに十分な量、且つ医薬として許容できる塩の形態で含む少なくとも１つのポリペプチド；または配列番号１から１８からなる群から選択されるアミノ酸配列との１アミノ酸の差異を有するエピトープペプチドを、前記感染細胞にＣＴＬ応答を誘導するのに十分な量、且つ医薬として許容できる塩の形態で含む少なくとも１つのポリペプチドを含む組成物を前記対象に投与することを含む方法。
１３．インフルエンザ感染した対象に予防接種および治療をするための方法であって、前記感染細胞が任意のクラスＩ  ＭＨＣ分子を発現し、前記方法が、クラスＩ  ＭＨＣと結合するかまたはクラスＩ  ＭＨＣ分子と結合するようプロセシングすることのできる組成物であって：配列番号１から１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのポリペプチドをコードする核酸配列を、前記感染細胞にＣＴＬ応答を誘導するのに十分な量、且つ医薬として許容できる塩の形態で含むポリヌクレオチド；または配列番号１から１８からなる群から選択されるアミノ酸配列との少なくとも１アミノ酸の差異を含むエピトープペプチドを、前記感染細胞にＣＴＬ応答を誘導するのに十分な量、且つ医薬品として許容できる塩の形態で含む少なくとも１つのポリペプチドを含む組成物を前記対象に投与することを含む方法。
１４．インフルエンザに感染した対象に由来するＴ細胞を用いて生体外で免疫応答を生成するための方法であって、前記方法が：配列番号１から１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み且つ医薬品として許容できる塩の形態にある少なくとも１つのポリペプチド；または配列番号１から１８からなる群から選択されるアミノ酸配列からの１アミノ酸の差異を含み且つ医薬品として許容できる塩の形態にある少なくとも１つのポリペプチドと前記Ｔ細胞が反応する、受動免疫療法における使用を目的としたＣＴＬ応答の生成を刺激することを含む方法。
１５．第１４項の方法であって、前記Ｔ細胞養子療法が自己由来またはＨＬＡ適合対象に由来する方法。
１６．インフルエンザに感染したかまたはインフルエンザおよび関連ウイルスに対する予防接種を受けた対象における免疫応答を評価または診断する方法であって、前記方法が：配列番号１から１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含みかつ医薬として許容できる塩の形態にある少なくとも１つのポリペプチド；または配列番号１から１８からなる群から選択されるアミノ酸配列からの１アミノ酸の差異を含み且つ医薬として許容できる塩の形態にある少なくとも１つのポリペプチドと前記Ｔ細胞が反応する、ＣＴＬ応答の生成を刺激することを含む方法。
１７．医薬品として許容できる塩の形態にある配列番号１から１８を用いてインフルエンザ感染に対してヒトを予防接種するための方法。
【０１０６】
以下の実施形態は本発明を例示する。
【実施例１】
【０１０７】
（序論）
インフルエンザは重大な世界的衛生問題であり、毎年世界人口の最大２０％に感染し、全世界で最大５００万例の重症疾患および３００，０００例超の死亡を引き起こす。米国単独では、毎年推定３０，０００例超の死亡とほぼ３００，０００例の入院が、インフルエンザ感染によるものとされる（１）。新規の重症および再発の可能性のある季節疾患が最近出現したことに伴い、インフルエンザ誘発性肺炎の発生率を低下させる幅広い予防接種キャンペーンが、世界保健機構によって推進されている。インフルエンザの発生率を効果的に減少するには、継続的集中サーベイランス、現在利用できるインフルエンザワクチンの使用の増加、およびインフルエンザのシフトおよびドリフト株に対するより幅広い防御を提供することのできる代替的なワクチンおよび抗ウイルス薬が利用できることが必要となる（１）。インフルエンザ予防接種キャンペーンが成功すれば、莫大な社会的および経済的影響を示すことができる（２）。
【０１０８】
（インフルエンザウイルスに対する免疫応答）
インフルエンザに対する免疫応答は、先天性免疫および適応免疫の双方によって支配される。インフルエンザに対する先天性免疫応答は、初期のウイルス複製を制限するものの比較的非特異的である（３）。インフルエンザウイルスの効率的なクリアランスには、体液性免疫および細胞媒介性免疫の双方を活性化する堅牢な適応免疫応答が必要である。分泌性ＩｇＡおよびＩｇＭ抗体によって媒介される体液性免疫は初期感染の確立に対する防御を提供する一方で、ＩｇＧ抗体は確立された感染において新たに複製するウイルスを中和する（４，５）。インフルエンザに対する体液性免疫を誘導することは現在の従来型インフルエンザワクチンの目標であるものの、抗原変異が発生するので、これらは完全な防御とならない（６）（７）。さらに、インフルエンザに対する防御にはＴ細胞応答が極めて重要であることが、データによって指摘されている。ＣＤ４＋Ｔ細胞はＩｇＧへのアイソタイプスイッチング、および親和性がより高い抗体（８）およびＣＴＬ記憶（９−１１）の生成において決定的な役割を果たす。ヒトにおいては、インフルエンザ予防接種（１２）後にＨＡ特異性ＣＤ４＋Ｔ細胞が増殖し、ヘテロサブタイプインフルエンザ抗体応答の発生を促進する（１３，１４）。ＣＤ８＋細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）はウイルスクリアランスを媒介し、また重要なことに、インフルエンザＡ型ウイルスの相異なるサブタイプ間で交叉反応性応答を有することが示されている（１５−１７）。このこと、高齢で、予防接種またはＨ１Ｎ１感染曝露を受けた可能性のある者の間で比較的疾患が少ないことを説明しうる。
【０１０９】
（インフルエンザウイルスワクチン開発の現状）
現在市販されているインフルエンザワクチンは毎年更新され、ＷＨＯの年間菌株勧告に基づいて設計され（１６，１８）、インフルエンザシーズンまたは汎流行の開始前に製造される。現行のインフルエンザ用ワクチンは、ビリオン表面のＨＡおよびＮＡ糖タンパク質に対する防御的体液性免疫応答を誘導する（７，１９，２０）。しかし、ウイルスＨＡおよびＮＡ糖タンパク質は頻繁かつ予測不可能な抗原シフト、および頻度はより低いが重症度がより高いドリフト変異に対する感受性が高く、これが抗体認識の消失をもたらし、ヒト集団に感染する現行のウイルス血清型と適合する新規ワクチンの頻繁な開発が必要となる（２１−２５）。さらに、これらのインフルエンザワクチンは製造コストが高く、シーズン途中に出現する可能性のある新規株（２００９年Ｈ１Ｎ１ブタインフルエンザ、Ｎ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ９など）に対して防御しなくなる。最も重要な点は、これらのワクチンは抗体ベースの防御が中心であり、体内から感染細胞を消失させるために不可欠であるＴ細胞応答の誘発は限定的であることである。
【０１１０】
現在、改良季節性インフルエンザワクチン３種類がＦＤＡによって承認されている。これらの四価ワクチンは、２種類のインフルエンザＡ型および２種類のインフルエンザＢ型をカバーする。（近年、インフルエンザシーズン中に２種類のインフルエンザＢ型ウイルスが共培養され、提供された三価ワクチンはこれらの株のうち１つに対して防御しなかった。）四価弱毒化生ワクチンＦｌｕＭｉｓｔは、限定的なタンパク合成（不活化ワクチンには存在しない）によって、免疫系に対してより多くの標的を提供しうる。ＦｌｕＭｉｓｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｆｌｕ／ｐｒｏｔｅｃｔ／ｖａｃｃｉｎｅ／ｖａｃｃｉｎｅｓ．ｈｔｍ）は、現在三価不活化ワクチンの代替品として販売されている。ＦｌｕａｒｉｘおよびＦｌｕＺｏｎｅは、現行の三価不活化ワクチンに類似した免疫応答を刺激する四価不活化ワクチンである。これらは２０１３〜２０１４年のインフルエンザシーズンに販売される予定である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ＢｉｏｌｏｇｉｃｓＢｌｏｏｄＶａｃｃｉｎｅｓ／Ｖａｃｃｉｎｅｓ／ＡｐｐｒｏｖｅｄＰｒｏｄｕｃｔｓ／ｕｃｍ２９５０５７．ｈｔｍ）。四価ワクチンによってカバーされるものの、これらは未だに季節的であり、三価ワクチンと同じ罠、すなわち製造時間と費用および感染細胞を除去する強力なＴ細胞応答およびシーズン半ばに発生する株に対する防御の不足に陥る。全てではないとしても、大半のインフルエンザ株に対する防御を提供する汎用ワクチンが必要であることが、容易に明らかとなる。
【０１１１】
今日まで、多数の汎用ウイルス製剤が開発中である。これらのワクチンは、刺激される防御免疫応答の種類：１）Ｂ細胞応答（抗体）、２）Ｔ細胞応答、または３）Ｂ細胞およびＴ細胞の双方、によって幅広く特徴付けることができる。Ｋａｎｅｋｉｙｏらは、複数のインフルエンザ株をカバーする力価がより高い抗体応答を誘導するＨＡナノ粒子（ヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質がフェリチンと融合する）を生成した（２６）。このワクチンはまだ臨床試験に入っていない。ウイルスゲノム内で比較的維持されている４つのエピトープを標的とするＴ細胞ベースのワクチン（２７）も開発中である。高度に維持されるＣＤ４エピトープに基づくＴ細胞ワクチンが、第ＩＩ相攻撃試験で評価されており、汎流行株を含む多様なインフルエンザ株に対する防御応答が陽性となっている（２８）。Ｂ細胞、ＣＤ４Ｔ細胞および９種類の相異なるインフルエンザタンパク質に由来するＣＤ８Ｔ細胞維持エピトープを組み入れた、マルチメリック−００１と呼ばれる組換えポリエピトーブワクチン（２９）が、初期臨床試験で試験中である。核タンパク質（ＮＰ）およびアジュバントと結合したＢ細胞エピトープＭ２ｅからなる融合タンパク質ワクチンと、ＣｐＧと組み合わせた金ナノ粒子中のＭ２ｅペプチド（３０）も現在開発中である。上述のワクチンの大半は、タンパク質またはペプチドとして、臨床的副作用を誘発する多様なアジュバントと共に製剤化される。対照的に、我々の完全合成汎用インフルエンザワクチン製剤は、アジュバント特性が組み入れられた金ナノ粒子ワクチン送達において製剤化され、新興株を含む多くのインフルエンザウイルス株に向けられた強力なＴ細胞およびＢ細胞免疫応答を刺激するよう設計された、維持ＣＤ４、ＣＤ８およびＢ細胞活性化エピトープのパネルからなる。
【０１１２】
（インフルエンザ感染に対する合成汎用ワクチンの概念）
理想的なワクチンは、それによって適応体液性および細胞性免疫記憶が生成される様態で、感染によって生成される自然免疫（図１）の模倣を試みなければならない（３１）。全種類のインフルエンザに作用する汎用ワクチンを開発するために、膨大な努力が払われている。
【０１１３】
目標は、全てのインフルエンザ季節株および汎流行株に対し、一生涯ではなくても数年間の防御を提供し、インフルエンザ予防接種を伝統的なワクチンにより近づけることである。有効な汎用インフルエンザワクチンが開発されれば、将来的なインフルエンザ汎流行の恐れが解消（または軽減）され、季節性インフルエンザワクチンを毎年開発および製造するよりも、費用対効果が高くなるであろう。そのような汎用型ワクチンは、株毎に変動しない維持ウイルスエピトープを必ず標的としなければならず、またより重要なこととして、感染細胞上のＭＨＣ分子によって提示されなければならない。最終的に、最も有望な汎用インフルエンザワクチンの候補は、Ｔ細胞およびＢ細胞免疫に対する抗原を組み合わせることで得られうる。動物モデルおよびヒト研究に基づき、活性合成ワクチンを製剤化するために可能な全てのＴ細胞およびＢ細胞リガンド（図１）を組み合わせることは合理的である。ワクチンが活性であるためには、サイトゾル取り込みが可能な範囲のサイズであり、標的抗原提示細胞に対する危険信号が組み入れられなければならない。これらの特性を有する新規の金糖ナノ粒子は、効率の良いワクチン応答を誘導することが示されている（３２，３３）金ナノ粒子に組み入れられた共有Ｔ細胞Ｂ細胞エピトープに基づく合成汎用ワクチンの開発が本願の焦点である。
【０１１４】
（技術革新）
この提案は２つの主要な新規の特徴を有する：（１）インフルエンザ感染の多数の株に対するＴヘルパー、細胞障害性Ｔ細胞および抗原応答を誘導する能力のある完全合成汎用ワクチンの開発、および（２）任意のサブユニットワクチンの強力なアジュバントとして作用する自然免疫および適応免疫刺激分子を備えた新規完全合成新規金糖ナノ粒子ワクチン送達プラットフォームの特性解析。提案されたワクチン手法は、既存のワクチンよりも優れた点がいくつか有するであろう。第１に、それは自然状態でプロセシングされて感染細胞上に提示される多数の維持ＭＨＣクラスＩ制限ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ（３４）、ＣＤ４エピトープ内に入れ子上に配置されたＣＤ８エピトープ、および多様なウイルスタンパク質に由来する抗体エピトープを有する。第２に、これらのエピトープは免疫「危険信号」を含む合成糖ナノ粒子の状態で送達される（３５，３６）。最後に、この２０〜４０ｎｍサイズの新規糖ナノ粒子は、他のナノ粒子と異なり、インフルエンザ特異的Ｔ細胞およびＢ細胞活性化エピトープの他に非自己コンポーネント（細菌炭水化物、ＧｌｃＮＡｃなど）を含み、抗原特異的Ｔ細胞および抗体応答を効率に活性化するよう病原体に似せているので、抗原提示細胞を標的とし、且つこれによって取り込まれる可能性がより高い。これらの糖ナノ粒子はＤＣ成熟／活性化を誘導し、またこれにより、特異的サブユニットワクチン応答が成功するのに不可欠な堅牢な免疫応答を誘導することも予測される。これらのナノ粒子は、皮内および皮下注射送達形態に加え、経皮および経口／バッカルを含む多様な送達経路に適用できる。
【０１１５】
この提案は、インフルエンザ感染の新興または再興株の重大な拡大を予防できる可能性のある、交叉サブタイプ効果が組み入れられた新興ワクチン戦略の前臨床開発を促進することも意図している。免疫原性コンセンサス配列エピトープを含む交叉サブタイプワクチンは、この目標を達成する可能性がある。増加するエビデンスによって、有効な汎用ワクチンは細胞媒介免疫および体液性免疫の双方の活性化を誘導するはずであることが示唆される。我々の仮説では、免疫系によるタンパク質プロセシングによって天然ウイルスエピトープが変化することがあるので、感染細胞によって提示された定義エピトープに基づくワクチンであれば、ウイルスタンパク質サブユニットまたはモチーフ予測エピトープベースのワクチンよりも遙かに優れているであろう。さらに、延長ペプチド内に入れ子状に配置されたＣＤ８エピトープが堅牢なＣＴＬ応答を生成するだけでなく、延長ペプチドもまた、インフルエンザ感染と戦う上で決定的に重要であるＴヘルパー媒介サイトカイン応答を誘導することができる（２８）。汎用抗体エピトープをこの合成ワクチン製剤に加えることにより、完全な防御のための免疫系の両輪が組み込まれる。
【０１１６】
我々の予備データで示されたように、感染細胞によって提示されるＴ細胞エピトープの直接的同定は、ワクチン用途のためのＴ細胞エピトープを同定するための効率的且つ論理的方法である。我々の分析により、ＭＨＣモチーフ予測法によって選択された少数のＴ細胞エピトープが確認された。免疫エピトープデータベース（ＩＥＤＢ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｅｄｂ．ｏｒｇ）は、ＭＨＣ結合スコアが高くＣＴＬ特性解析が限られた数多くの共有エピトープを含む、数百種類の予測ＨＬＡ特異的インフルエンザＴ細胞エピトープを含むので、ウイルス感染細胞によって提示されたワクチン用途エピトープを確認および使用することが決定的に重要である；。さらに、ＩＥＤＢデータベースは機能的方法でなくモチーフ予測法によって生成されているため、自然状態で提示されたエピトープの優性序列にしたがってソートすることは困難であろう。Ｔｈｏｍａｓら（３９）は、優性および準優性エピトープのいずれも感染細胞によって提示され、ＩＥＤＢデータベースを用いた場合それらをソートすることは難しいと思われることを、洗練された手法で証明した。モチーフ予測エピトープのもう１つの欠点は、最も多くの場合、寛容化している可能性のある感染者に由来するＣＴＬを用いて、機能的特異性によってスクリーニングされることである。
【０１１７】
標的化、免疫活性化および制御、完全合成、可変ナノ粒子ワクチン送達システムで製剤化されたＴ細胞（ＣＤ８およびＣＤ４）エピトープと抗体エピトープ（Ｍ２ｅ）の、これまでで初めての組み合わせにおいて、著しい技術革新が実現されることになる。ナノ粒子に組み入れられた、自然状態で感染細胞により提示される維持Ｔ細胞エピトープおよびＢ細胞エピトープの組み合わせを使用することが、ワクチン構成要素への小さな調節ではなく、ワクチン技術における大きな飛躍を表すことを我々は強調する。成功した場合、この方法は予防的および治療的ワクチンの製剤化する方法にパラダイムシフトをもたらす可能性がある。われわれの研究は、インフルエンザウイルス感染に対するＴ細胞媒介免疫応答の全般的な理解を進展させる上でも有用となる。この情報は、重篤で、場合によっては致死的なインフルエンザウイルス感染と戦い且つこれを予防するための、抗ウイルス剤および予防的および治療的汎用ワクチンの開発にとって決定的に重要である。
【０１１８】
（結果）
われわれは、感染細胞由来のＨＬＡ−Ａ２特異的維持エピトープのパネルを同定した。ＨＬＡ−Ａ２陽性健康ドナーから採取した末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を用いて、我々は選択したエピトープのＣＴＬ活性を特性解析し、インビトロ交叉反応性を立証した。
【０１１９】
（ＭＨＣクラスＩ提示インフルエンザエピトープの同定）
ＨＬＡ−Ａ２およびＢ７陽性ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞株ＪＹと、ＨＬＡ−Ａ２およびＡ２４陽性肝癌細胞株ＨｅｐＧ２、健常者由来のＨＬＡ−Ａ２陽性末梢血リンパ球から生成された樹状細胞（ＤＣ）をインフルエンザＡ型およびＢ型ウイルス株に感染させた（Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４）。ＪＹおよびＤＣの両者については、約１０ＨＡＵを１６〜２４時間用いるとき細胞感染が約５０％となり（４０）、インフルエンザ感染が最も成功することが（４１）、公表された研究で示されている。感染細胞は、感染性が５０％超を示した場合にＭＨＣペプチドの分離に用いた。細胞溶解産物を調製し、プロテインＡ／Ｇビーズ１ｍＬとコンジュゲート化したＷ６／３２（汎ＭＨＣクラスＩ特異性抗体）１ｍｇを用いて免疫沈殿法に２回付した。結合ＭＨＣ複合体をビーズより溶離し、Ｃ１８逆相（ＲＰ）カラムを用いてペプチド混合物を精製および分画化した。ペプチド分画をＬＣ−ＭＳ／ＭＳ系（ｎａｎｏＡｃｑｕｉｔｉＵＰＬＣ−ＬＴＱｏｒｂｉｔａｐ）に個別にインジェクトし、ＭＨＣペプチドを同定した。Ｂｉｏｗｏｒｋｓ／ｐｒｏｔｅｏｓｏｍｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いてＮＣＢＩインフルエンザデータベース内の生データを検索し、ＭＨＣペプチドおよびその対応するタンパク質を特定した。合成ペプチドを生成して検証および配列確認した。合成ペプチドを同一の衝突条件下で実験としてＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析に付し、そのＭＳ／ＭＳスペクトルをその合成アナログのスペクトルと比較してその配列を確認した。
【０１２０】
表３は、我々がインフルエンザウイルス感染細胞から同定したＭＨＣクラスＩ関連ペプチドを要約する。我々は、ＨＬＡ−Ａ２結合モチーフを有する７エピトープを同定し、その７エピトープのうち５つはＨＬＡ−Ａ２４交叉結合モチーフを有していた。さらに、我々はエピトープ含有ＨＬＡ−Ｂ７およびＢ４４モチーフ数種類を同定した。いずれのエピトープも、複数のインフルエンザ株間で維持されるタンパク質の領域に由来した。これらのペプチドを、合成ペプチドを用いた共溶離実験で確認した。興味深いことに、我々は過去に報告された３つのエピトープである、モチーフ予測および体外ＣＴＬ分析を用いて同定した２つのＨＬＡ−Ａ２特異的エピトープ（Ｐ１およびＰ５）（４２）、および汎流行Ｈ１Ｎ１−２００９およびＨ１Ｎ１−１９９８インフルエンザＡウイルス間で維持されることが示される１つのＨＡＬ−Ｂ７特異的エピトープ（表３のＬＰＦ）を同定した。
【０１２１】
【表３】
2020504179.tif 000005
インフルエンザウイルス感染細胞により提示されるＭＨＣクラスＩエピトープ
＊過去に報告されたエピトープ
【０１２２】
ＣＴＬ機能特性解析実験の前に、我々は５つのＨＬＡ−Ａ２特異的ペプチドＰ１−Ｐ５（表３）の確実性を、その合成ペプチドアナログを用いて確認した。図２に例示するように、実験的に同定されたペプチドのｍｓ／ｍｓスペクトル中のフラグメントイオンの大半は（図２：Ｐ１Ａ〜Ｐ５Ａ）、表示質量が示すように、その対応する合成ペプチドのスペクトル（図２：Ｐ１−Ｂ〜Ｐ５−Ｂ）と一致した（３４）。さらに、我々はｍｓ／ｍｓスペクトルを手作業で検証し、実験的に観察された全てのペプチドの同一性を確認した。Ｔ細胞エピトープをナノ粒子内に製剤化し、エピトープ特異的ＣＴＬの誘導および交叉反応性をインビトロ試験した。
【０１２３】
感染細胞によるこれらのエピトープの提示を検証するために、健常ＨＬＡ−Ａ２＋ドナーに由来するＰＢＭＣ、および同定されたエピトープに対応する合成ペプチドを用いて、５つのペプチドのそれぞれに特異的なＣＴＬを生成した。ＥＬＩＳｐｏｔ分析で抗原特異的ＩＦＮγ分泌を検出することにより、ＣＴＬ機能を測定した。図３Ａに例示するように、ＰＲ８感染ＪＹおよびＨｅｐＧ２細胞は、５種類のインフルエンザエピトープ特異的Ｔ細胞の全てを刺激した。さらに、多様なインフルエンザＡ株（Ｘ３１，Ｈ３Ｎ２およびＪＡＰ、Ｈ２Ｎ２）に感染したＨｅｐＧ２標的細胞を用いて他の株との交叉反応性を証明し、多様なインフルエンザ株感染細胞におけるこれらのエピトープの提示を示した（図３Ｂ）。
【０１２４】
これらのエピトープによって生成される免疫応答をさらにインビボで特性解析するために、我々はＨＬＡ−Ａ２＋形質転換マウスに前述の５種類のエピトープの混合物を接種した。接種は、アジュバントとしてのモンタニドＩＳＡ５１の存在下で、これらのペプチドを用いて遂行した（図４Ａ）。我々は、ＥＬＩＳｐｏｔ分析でマウスのＩＦＮγ分泌を測定することにより、インフルエンザ特異的Ｔ細胞応答を測定した。ペプチド１〜５を個別にパルス添加したＴ２細胞を用いて、我々は５つのペプチド全てに対する接種後の応答を観察した（図４Ｂ）。異なるインフルエンザ株に感染したＨｅｐＧ２およびＪＹ細胞を標的として用いるとき、これらのペプチドに特異的なインビボ生成ＣＴＬも同等に良好に刺激され（図４Ｃ）、多数のインフルエンザ感染においてこれらのエピトープがプロセシングされて提示されることが示された。また我々は、ＩＦＮγの放出に加えて、顆粒化エフェクターＣＴＬ上に存在する活性化マーカーＣＤ１０７ａについての、脾細胞に由来するＣＤ８＋Ｔ細胞の表現型の変化も測定した。図４Ｄに例示するように、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、感染した標的と共にインキュベートされると、非感染標的と比べて高いＣＤ１０７染色強度を示した。
【０１２５】
我々は、ＨＬＡ−Ａ２特異的エピトープ（ＮＰ１〜５）を組み入れた金ナノ粒子（ＮＰ）を生成し、インフルエンザマトリックス２タンパク質（Ｍ２ｅ）に由来する共有抗体エピトープ（ＮＰ６）と組み合わせた。我々は、ペプチド＋モンタニド５１またはＮＰ内のペプチドのいずれかを、ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスに接種し、ＥＬＩＳｐｏｔ（図５ＡおよびＢ）およびＣＤ１０７発現（図５Ｃ）を用いて、ＩＦＮγ放出によりＣＴＬ応答を評価した。ＮＰに組み入れられたペプチドは、アジュバント添加無しでインビボ抗ウイルスＣＴＬ応答を強力に活性化した。ＮＰ自体が、ペプチドを抗原提示細胞に送達することに加え、アジュバントとしても作用した。モンタニドアジュバントを含まないペプチドは、ＣＴＬ応答を誘発しなかった（データは示さず）。
【０１２６】
我々は、ＣＴＬ応答を特性分析することに加えて、インフルエンザマトリックス２タンパク質（Ｍ２ｅ）に由来する汎用抗体エピトープに対する抗体応答も評価した。我々は、この目的のために、Ｍ２（Ｍ２ｅ）のエクトドメインに由来するペプチド（Ｐ６またはＮＰ６）に加え、ＭＨＣＩペプチド（Ｐ１〜５）またはＧＮＰ内のペプチド（ＮＰ１〜５）をマウス群に接種した。ＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔ分析で測定したＴ細胞応答（図５ＡおよびＢ）およびＣＤ１０７のフローサイトメトリー分析（図５Ｃ）は、Ｔ細胞エピトープのみを接種した群（１〜５）か、Ｔ細胞エピトープとＭ２ｅペプチド（１〜６）を接種した群の間で同等であった。その後、接種マウスの末梢血から採取した血清を用いた標準的なＥＬＩＳＡにより、循環Ｍ２ｅ特異的抗体濃度を測定した。図６に例示するように、モンタニドアジュバントを含むＭ２ｅペプチド（Ｐｅｐ６）、またはＧＮＰ内のＭ２ｅペプチド（ＮＰ６）を接種したマウスは、堅牢でＭ２ｅ特異的なＩｇＧ応答を生成した（図６Ａ）。しかし、Ｍ２ｅペプチドをＭＨＣ１ペプチド（Ｐｅｐ１〜５またはＮＰ１〜５）と組み合わせた場合、Ｍ２ｅに対する抗体の力価はわずかに減少した。我々がＴ細胞応答で観察したところ、ペプチド＋モンタニドアジュバントとアジュバントを全く含まないＧＮＰの間に抗体応答の差はなかった。しかし、アジュバントを全く含まない遊離ペプチドとＮＰを比較したところ、我々はＮＰの方により大きな抗体応答を認めた（図６Ｂ）。まとめると、ＧＮＰに組み入れたＭＨＣＩおよび抗体エピトープは、臨床毒性を誘導するアジュバントを必要とするエピトープと比較して、堅牢なＣＴＬおよび抗体応答を共に生成することを、我々は証明する。
【０１２７】
次に、ＨｅｐＧ２およびＪＹ細胞を、我々がこれまで試験したインフルエンザウイルス３株全て（ＰＲＳ、Ｘ−３１、またはＪＡＰ）に感染させることにより、ペプチド＋モンタニドアジュバント（Ｐ１〜６、Ｐ６）およびＮＰ内のペプチド（ＮＰ１〜６，ＮＰ６）によって生成されるＭ２ｅ抗血清の、交叉反応に対する機能を特性解析した。我々は、フローサイトメトリーを用いて、ペプチド＋モンタニドまたはＮＰ接種マウスから採取したＭ２ｅ特異的抗血清で感染細胞を処理し、ＰＲ８、Ｘ−３１、またはＪＡＰ感染細胞に特異的な抗体の結合を証明し（それぞれ緑、水色および赤）、インフルエンザ感染細胞の様々な株においてこのエピトープが存在することを示した（図７）。
【０１２８】
最後に、ＰＲＳウイルスに感染したＨｅｐＧ２細胞に抗血清を添加することにより、これらの抗体の中和能力を測定した。ＭＨＣＩペプチド（Ｐ１〜５またはＮＰ１〜５）またはｐＭ２ｅペプチド（ｐＭ２ｅまたはＮＰ  Ｍ２ｅ）を接種したマウスから採取して１：５０希釈した血清の存在下で、ＨｅｐＧ２細胞に低用量ＰＲ８を１時間パルス添加した。同レベルの血清で一晩インキュベートした後に細胞を固定し、インフルエンザＮＰについて細胞内染色した。陽性細胞の百分率を示す。灰色で塗りつぶしたヒストグラムは非感染対照である。図８に例示するように、モンタニドアジュバントを含むＭ２ｅペプチド（図８Ａ）、またはＧＮＰ中のＭ２ｅペプチド（図８Ｂ）に由来する抗Ｍ２ｅ抗体を含む血清を用いた場合の感染レベルはより低く、Ｍ２ｅ特異的抗体の機能的能力を示した。
【０１２９】
（要約）
これらは、インフルエンザ感染細胞のＭＨＣクラスＩ関連ペプチド分析について報告された、これまでで初めての総括的研究である。重要なことに、全てのエピトープは異なるインフルエンザ株間で共有される。また興味深いことに、我々はすでに報告されたモチーフ予測されたエピトープも感染細胞上で少数同定した。また我々は、ＭＨＣＩエピトープ特性解析に関して、Ｍ２ｅ抗体エピトープに対する抗体の幅広い抗ウイルス活性も証明している。我々は、Ｔおよび抗体エピトープと共に製剤化した金ナノ粒子（ＧＮＰ）も生成し、インビトロおよびインビボ研究で抗ウイルスＴおよび抗体応答を特性解析した。我々が生成したデータは、汎用インフルエンザワクチンの開発、製剤化および特性解析に対して著しい影響を有することとなる。われわれの研究は、インフルエンザウイルス感染に対するＴ細胞媒介免疫応答の全般的な理解を進展させる上でも有用となる。この情報は、重篤で、場合によっては致死的なインフルエンザウイルス感染と戦い且つこれを予防するための、抗ウイルス剤および予防的および治療的汎用ワクチンの開発にとって決定的に重要である。
【０１３０】
（今後の研究）
我々は、季節予防接種を受けた個人において、これらのエピトープに特異的なＴ細胞およびＭ２ｅ抗体応答の頻度を評価し、インフルエンザ感染における内因性細胞媒介応答および体液性応答を評価することを提案する。我々は、この目標に沿って、インフルエンザ感染に曝露し、且つ季節予防接種を受けた一般集団におけるＭ２ｅ特異的抗体の存在を予備的に検討している。我々は、健常者１０名（男性５名および女性５名）から血清サンプルを入手した（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ＬＬＣ、マサチューセッツ州ブライトンより購入）。維持Ｍ２ｅエピトープに対する抗体の存在は、標準的なＥＬＩＳＡ分析を用いて評価した。
【０１３１】
血清サンプルの多様な希釈液をＭ２ｅペプチドコーティングしたＥＬＩＳＡウェルに適用し、抗ヒトＩｇＧ二次抗体およびＬｉｃｏｒ検出剤で処理した（３４）。相異なる４種類の希釈を用いた各個人の実際のＥＬＩＳＡウェルの画像を示す。図９に示すデータは、一部の個人が維持Ｍ２ｅエピトープに対する抗体を産生することを明示する。しかし、一部の個人の力価は非常に弱かった。インフルエンザ感染、またおそらくは季節予防接種がこの汎用抗体エピトープに対する内因的抗体応答を誘導するということは興味深い。この汎用エピトープを接種して堅牢な抗体応答を生成することで、有効な防御を誘導しうる。我々は、第ＩＩ相提案においてこの仮説を試験する計画である。
【０１３２】
我々は、汎用Ｂ細胞エピトープに対する抗体応答に加えて、我々が第Ｉ相提案において同定および特性解析したＭＨＣＩエピトープに特異的なＴ細胞の頻度を評価することも計画している。我々は、この作業を達成するために、特異的エピトープを有するＭＨＣ４量体またはデキストラマーを合成し、インフルエンザウイルスに曝露した個人、および季節性インフルエンザ予防接種を受けた個人に由来するＰＢＬをスクリーニングすることを提案する。我々は、デング熱ウイルス感染に由来するＴ細胞エピトープを用いたＭＨＣデキストラマー分析において、幅広い経験を有する。我々は、デキストラマーを含む３種類のＨＬＡ−Ａ２特異的Ｔ細胞エピトープを用いて、デング熱ウイルス血清陽性患者数名をスクリーニングしている。デキストラマーはＩｍｍｕｄｅｘ（バージニア州フェアファクス）によって合成した。全血よりＰＢＭＣを生成し、抗ＣＤ８抗体およびデキストラマーで染色した。染色した細胞をＧｕａｖａフローサイトメーターで分析し、Ｇｕａｖａｓｏｆｔ  ＩｎＣｙｔｅソフトウェアを用いて陽性百分率データを生成した。相異なる３つのエピトープ（ＮＩＱ、ＶＴＬ、ＫＬＡ）に特異的なデキストラマーデータを有する４例の患者を図１０に示す。全ての患者は、Ｔ細胞エピトープデキストラマーと特異的に結合する循環ＣＤ８＋Ｔ細胞を多少のレベル（０．５〜４％）で有していた。また我々は、インビトロ短時間培養においてこれらのＴ細胞を特異的ペプチドで刺激し、特異的ＣＴＬ応答データを得た（図１１）。デキストラマー染色ｐ１５１の高い染色率を示したデング熱血清陽性患者由来のＰＢＬを、培養内でペプチドにより７日間刺激した。活性化Ｔ細胞を、ＩＮＦγ産生の細胞内染色およびフローサイトメトリー分析によって、ＣＴＬ機能について評価した。図１１に示すように、ＣＴＬ活性は、個々のペプチド装填標的（ＮＩＱ  ｐｅｐ、ＫＬＡ  ｐｅｐ、ＶＴＬ  ｐｅｐ）およびデング熱ウイルス血清型２（ＤＶ２）感染標的（ＮＩＱ  ＤＶ２、ＫＬＡ  ＤＶ２、ＶＴＬ  ＤＶ２）に対して有意であった（０．７％〜１．１％）。デキストラマー分析データおよびＣＴＬ分析データは直接比較してはならないものの、デキストラマー陽性細胞が特異的エピトープによって再活性化されることが可能であり、且つＣＴＬがウイルス感染細胞を認識する機能を示すことは興味深い。
【０１３３】
我々は、ウイルス特異的ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞応答の両者の活性化を利用するために、内因性配列を含む延長１５量体ペプチド内に入れ子状に配置された、同定済ＣＤ８Ｔ細胞エピトープを合成することを提案する。これらのより長いペプチドは、ＣＤ４＋Ｔ細胞を刺激する可能性を有する。我々は、ＣＴＬ活性化を誘導するためのそのようなより長いペプチドの効果を評価するために、十分に特性解析されたモデルである卵白アルブミン由来ＣＤ８Ｔ細胞エピトープ（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）を試験した（４８）。我々は、ＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＱＬＥ  ＳＩＩＮＦＥＫＬ  ＴＥＷ）のＮ末端およびＣ末端の双方で隣接する３つの内因性ａａ残基を含めることにより延長ペプチドを合成し、より長いペプチドがプロセシングされてＴ細胞活性化のためのＣＤ８エピトープを提示することを評価した。
【０１３４】
図１２ＡおよびＢに示すように、延長ペプチドを含むモデル卵白アルブミンＨ２ＫｂエピトープがＡＰＣ（ＬＫｂ細胞）によってプロセシングおよび提示されるとき（図１２Ａ）、またＴ細胞認識および活性化が達成され（図１２Ｂ）、ＣＤ８エピトープが入れ子状に配置されたより長いペプチドがプロセシングされてＴ細胞を活性化することが可能であることが示された。ＥｘｔＳＩＩＮをパルス添加されたＬＫｂ細胞におけるＣＤ８エピトープの提示は、遊離ペプチド装填と比較して低かったものの（これはＥｘｔＳＩＩＮがインターナリゼーションおよびさらなるプロセシングを必要とすることから予測された）、Ｔ細胞の活性化はＥｘｔＳＩＩＮパルス添加ＡＰＣにおいて同等であり、これはより決定的である。これらのより長いペプチドが、抗インフルエンザワクチン応答に対する強力なＣＴＬおよびＢ細胞活性化に対し、インビボでヘルパーペプチドとしても作用することが推測される。
【０１３５】
（ナノ粒子送達の安全性の検証）
ＧＮＰワクチン組成物はヒトに対して試験されたことがないものの、健康ボランティアを対象としたインスリンペプチドの安全性および送達に関する第Ｉ相臨床試験において評価され、これまでのところ良好な安全性を示している。さらに、これまでのインビボおよびインビトロ安全性試験より、大型動物毒性試験において、粒子は非常に高い濃度でも安全であることが示される。ナノ粒子の個々のコンポーネントは全て合成されたものであり、個別に投与した場合に毒性を示していない。多様な癌細胞株、全血およびヒト頬粘膜を用いたインビトロ試験において、細胞増殖、サイトカイン放出および細胞毒性についてのＧＮＰ製剤の安全性が試験されており、有害作用は認められていない。多様なワクチンおよび転移腫瘍モデルを用いて、ナノ粒子ワクチン製剤を用いた毒性試験が実施されており、毒性は検出されていない。さらに、マウス脳ＧＬ２６１神経膠腫モデルを用いたＣＳＩＳインビボ撮像試験および網膜血管試験においても、毒性は認められなかった。マウスに対してナノ粒子を理論用量５．４ｍｇ／ｋｇで５日連続１日１回静脈投与するＧＬＰ毒性試験が実施され、尿、糞便排泄または脳、肝臓、腎臓、心臓、脾臓および肺を含む臓器に毒性の臨床徴候はみられなかった。
【０１３６】
（過去の研究の全般的結論）
本節に提示した研究は、多エピトープワクチン送達プラットフォームとしてのＧＮＰの多能性、およびウイルス感染の免疫分析における我々の強みを強調した。特に本試験と関係することは、ＭＨＣ関連ペプチド分析、Ｔ細胞エピトープ同定およびワクチン送達系におけるＴ細胞機能のためのエピトープの特性解析での我々の幅広い経験である（４９〜５２）。癌（５３，５４）およびインフルエンザ（３４）およびデング熱（５５）を含む感染症における我々の予備的な研究より、我々は提案したプロジェクトの達成に成功すると考えている。ワクチン送達プラットフォームおよびＴ細胞エピトープ同定の方法論が、他の感染症にも広範に適用されることは興味深い。
【０１３７】
（方法）
（ＣＴＬ頻度分析）
季節性インフルエンザワクチンを接種されたＨＬＡ−Ａ２またはＡ２４陽性健常者から採取したバフィーコートサンプルは、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ＬＬＣ（マサチューセッツ州ブライトン）から購入する。我々は６〜１０例の患者を評価することを提案する。ＡＨＬ−Ａ２およびＡ２４特異的ペプチドを有するペプチドＭＨＣ４量体（Ｐｒｏｉｍｍｕｎｅ）およびデキストラマー（Ｉｍｍｕｄｅｘ）構造体を入手する。標準的方法に従ってバフィーコートよりＰＢＭＣを精製する。ＰＢＭＣは、メーカーのプロトコルに従って４量体（５６）またはデキストラマー（５７）構造体により染色される。細胞は抗ＣＤ８抗体ＦＩＴＣコンジュゲートにより共染色する。染色した細胞をＧｕａｖａフローサイトメーター（ミリポア）で分析し、Ｇｕａｖａｓｏｆｔ  ＩｎＣｙｔｅソフトウェアを用いて陽性百分率データを生成した（図１０）。二重染色した細胞は総ＰＢＭＣ百分率として計数する。無関係の市販のＭＨＣ４量体またはデキストラマーを陰性対照として使用する。
【０１３８】
（記憶および未処理ＣＴＬの活性化）
未処理Ｔ細胞の活性化を目的として、ＨＬＡ−Ａ２またはＡ２４陽性健常ドナー由来の末梢血（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ、ＬＬＣ、マサチューセッツ州ブライトン）より購入）を入手する。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は、リンパ球分離媒体（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）を用い、標準的方法に従った分画遠心法を用いて精製する。ＰＢＭＣは、完全ＲＰＭＩ１６４０培地内で一晩平板培養する。非接着性細胞を除去し、保存する。完全培地内で、可塑性接着性細胞に、５０μｇ／ｍＬ合成ペプチドおよび１．５μｇ／ｍＬヒトβ２−ミクログロブリン（ＥＭＢ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州ギブスタウン）を２時間パルス添加する。その後、ＩＬ−７を５ｎｇ／ｍＬ、顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を２５ｎｇ／ｍＬおよびＩＬ−４を５０ｎｇ／ｍＬ添加した完全培地５ｍＬに、非接着性細胞を戻す（全てのサイトカインおよび成長因子はＰｅｐｒｏｔｅｃｈ、ニュージャージー州ロッキーヒルより購入した）。平板を、加湿インキュベーターにおいて５％ＣＯ２、３７℃で１２日間インキュベートする。ＩＬ−７を５ｎｇ／ｍＬおよびＩＬ−２を１０Ｕ／ｍＬ含有する完全培地内で、合成ペプチド１０μｇ／ｍＬおよびヒトβ２ミクログロブリン１．５μｇ／ｍＬをパルス添加した自己由来ＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞除去ＰＢＭＣにより、Ｔ細胞を１回５日間再刺激する。ＣＴＬ分析に用いる前に、再刺激を３回繰り返す。ペプチド装填Ｔ２細胞と、公表文献（３４）の記載にしたがって相異なるインフルエンザ株に感染させた標的細胞を用いて、ＣＴＬ分析を実施する。記憶Ｔ細胞を活性化するために、上記の方法でペプチドをパルス添加したＡＰＣで、ＣＴＬ分析前にＰＢＭＣを１回活性化する。
【０１３９】
ＣＬＴ活性化の指標として、抗原刺激したインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）およびグランザイムＢ放出を、それぞれのＥＬＩＳＰＯＴ分析で分析する（５８，５９）。ペプチドパルス添加Ｔ２細胞を、無関係なＨＬＡ−Ａ２ペプチドをパルス添加したＴ２細胞（１μｇ／ｍＬペプチドで３７℃、２時間）と共に、標的としてのインフルエンザ感染および非感染細胞と共に対照として用いる。さらに、多用なサイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＴＦＮ−α、グランザイムＢ）の分泌を、ＭａｇＰｉｘ  Ｌｕｍｉｎｅｘ技術（ミリポア）で評価する。ＣＬＴによる非特異的ＩＦＮ−γの誘導を刺激するため、ペプチドをパルス添加していないＴ２およびＰＨＡを含む適切な対照を、陰性および陽性対照として全ての分析に含める。
【０１４０】
（Ｍ２ｅ特異抗体応答）
季節性インフルエンザ予防接種を受けた健常者に由来する血清サンプルを用い、標準的ＥＬＩＳＡ技術を用いて、維持Ｍ２ｅエピトープ特異抗体の存在を分析する（図９）。さらに、血清サンプルを用いて、感染細胞上にあるＭ２ｅ抗体エピトープの認識を測定する。過去の報告に従い、ＨｅｐＧ２細胞をＰＲ８、Ｘ３１およびＪＡＰウイルスに感染させる（３４）。一晩インキュベートした後、１：５０希釈した血清サンプル、その後ＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ（インビトロジェン）二次抗体で細胞を染色する。サンプルは、ＧｕａｖａフローサイトメーターおよびＧｕａｖａＳｏｆｔ  Ｉｎｃｙｔｅソフトウェアを用いて分析する。
【０１４１】
（ＣＤ８を入れ子状に配置したより長いエピトープと共にＮＰを製剤化し、インビトロおよびインビボでＣＤ４およびＣＤ８応答の双方を特性解析する）
主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ制限ＣＤ８＋細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＬＴ）が誘発するような細胞媒介免疫（ＣＭＩ）は、インフルエンザウイルス感染の制御において中心的役割を果たす（６０〜６３）（６）。一次インフルエンザ感染によって生成されるＣＭＩは、ウイルスサブタイプ間で維持される内部ウイルスタンパク質に由来することの多い交叉反応性エピトープの認識により、血清学的に異なるウイルスに対して相当な防御を提供する（６４〜６６）。ウイルスクリアランスの媒介におけるＣＴＬの役割（６７，６８）に加えて重要なことは、ヒトのＣＤ８＋Ｔ細胞が、インフルエンザＡ型ウイルスの異なるサブタイプに対して交叉反応性急性応答（１５〜１７）および記憶応答（２５）を有すると示されたことである。マウスにおけるインフルエンザ感染試験より、ウイルスクリアランスは抗原特異的ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞によって媒介される一方で、メモリーＣＤ４＋Ｔ細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞およびＢ細胞記憶応答を維持する上で重要であることが明らかとなっている（６９）。最近、エフェクターＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の双方が、肺の炎症の抑制およびインターロイキン−１０の産生による過剰な組織障害の制限に関係づけられている（７０）。これまで遭遇していない株に対する、たとえば季節株でプライミングされたＣＤ４＋Ｔ細胞によるトリＨ５Ｎ１などに対する反応性を証明したインビトロ試験によって、ＣＤ４＋Ｔ細胞のための防御的役割の可能性が示唆されている（７１〜７４）。既存の防御抗体のない汎流行の状況においては、Ｔ細胞はヒトにおいて防御を媒介するかあるいはインフルエンザ関連疾患の重症度を制限しうる（７５）。既存のＴ細胞応答は、抗体が存在する状況に置いてインフルエンザの重症度を調節することが示されている（１５）。Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎらは、最近、攻撃株に対する体液性免疫が検出されていないヒトボランティアにおけるヒト攻撃モデルにおいて、インフルエンザゲノムの維持領域に由来する延長ＣＤ４活性化ペプチドを用い、インフルエンザの制限におけるＣＭＩの役割を検討し、幅広い防御スペクトルを証明した（２８）。興味深いことに、一部の例において、これらの延長ペプチドにＣＤ８＋Ｔ細胞応答を活性化する既報のＭＨＣクラスＩエピトープが入れ子状に配置されていた（２８，３４）。インフルエンザ感染に対する防御における、ＣＤ４およびＣＤ８陽性Ｔ細胞応答の両者の重要な役割に鑑みて、我々は、ＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化する可能性のある延長ペプチド内に同定済のＣＤ８Ｔ細胞エピトープが入れ子状に配置されたワクチンを製剤化することを提案する。我々は、この目標において、Ａ２およびＡ２４エピトープのＮ末端およびＣ末端の双方に、隣接する３つの内因性ａａ残基を含めることにより、延長ペプチドを合成する。これらの延長ペプチドは金ナノ粒子に製剤化され、ヒトＰＢＭＣを用いたインビトロ試験においてＣＤ４およびＣＤ８陽性Ｔ細胞応答の双方を、およびＡ２トランスジェニックマウスを用いたインビボ試験においてＣＴＬ応答を試験される。
【０１４２】
（エピトープを有するナノ粒子の調製）
ＣＤ８および延長ＣＤ４ペプチド（表４）の双方は、合成段階で、選択されたペプチドエピトープに近接するカテプシンＢ切断可能ペプチドに結合された混合脂肪族／ポリエチレンリンカーを含有するよう誘導される。ペプチドコンジュゲートは、一段階の自己会合化学反応によってナノ粒子に取り込まれ、これにより、既報にあるように、金金属コア約１．６ｎｍ、およびグルコースおよび２〜５炭素のスペーサーで修飾された混合リガンドコロナを有するナノ粒子が得られる（３５）。ペプチド混合物（それぞれ０．９４ｍｇ、０．３５μｍｏｌ）をＴＦＡ（２０μＬ）に溶解し、油が形成されるまでアルゴン気流下で溶液を濃縮する。ＭｅＯＨを添加し（１２５０μＬ）、反応物をボルテックスミキサーで２０秒間混合する。次に、Ｇｌｃ−リガンド（１．３４ｍｇ、５．６０μｍｏｌ）およびＧｌｃＮＨＡｃ−リガンド（１．２３ｍｇ、４．３７μｍｏｌ）をメタノール溶液に添加し、ＴＦＡ（２μＬ）でｐＨを２に調節する。ＨＡｕＣｌ４（３００μＬ、７．５μｍｏｌ）の水溶液を添加し、溶液をボルテックスミキサーで２０秒間混合する。５０μＬを分取してさらに金の含有量を試験する。ＮａＢＨ４の１Ｎ水溶液（１６５μＬ、１６５μｍｏｌ）を、残りの溶液に素早く振盪しながら数回に分けて添加する。生成する黒い懸濁液を振盪し、遠心分離してペレット化する。次に、ペレットを水に溶解して透析する。既報に従い（３５）、ナノクラスターの表面上にある各リガンドの比率を、初回混合液、形成されたＮＰおよび自己組織化プロセス後に回収した母液の１ＨＮＭＲスペクトルと比較することによって評価する。
【０１４３】
【表４】
2020504179.tif 000006
ＣＤ８エピトープおよび延長ＣＤ４エピトープ候補。ＣＤ８エピトープに対するＨＬＡ制限を示す。
【０１４４】
（エピトープ特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答のインビトロ評価）
我々は、ナノ粒子ワクチン製剤が特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答を活性化する能力を評価するよう提案する。ＰＢＭＣは、上述の方法でドナーから分離し、ＮＰワクチン製剤、または対照としての合成ペプチドのみのいずれかをパルス添加する。エピトープ特異的Ｔ細胞は、ＣＤ４またはＣＤ８抗体のいずれかでコンジュゲート化したビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、インビトロジェン）を用いたポジティブ選別によって精製し、ビーズより分離させ（ＤｅｔａｈＡＢｅａｄ、インビトロジェン）、下流の用途に用いる。用時精製したエピトープ特異的ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞を、該当するペプチドをパルス添加したか、または相異なるインフルエンザウイルス株（ＰＲ８、Ｘ３１、ＪＡＰ）に感染させた抗原提示細胞と共に一晩培養する。Ｔ細胞の活性化は３つの方法で評価する：１）ＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔ分析、２）ＭａｇＰｉｘ  Ｌｕｍｉｎｅｘ技術（ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、グランザイムＢ、ＩＬ−２）で検出するサイトカイン分泌および、３）ＣＤ８＋Ｔ細胞上の脱顆粒マーカーＣＤ１０７ａの発現を検出するフローサイトメトリー。いずれの実験においても、非感染および非パルス添加ＡＰＣをネガティブコントロールとして用いる。
【０１４５】
（予測される結果および技術的問題点）
我々は、ＮＰ製剤がペプチド単独よりも堅牢なＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導し、またこれらのＴ細胞が、相異なるインフルエンザウイルス株にそれぞれ感染した標的細胞を認識すると予測する。しかし我々は、延長ペプチドがＣＤ４Ｔ細胞を効率的に活性化しないことを観察する可能性もある。この場合、我々はペプチドの長さを延長してより多くの残基を組み入れるか、検証済のＣＤ４Ｔ細胞エピトープを製剤に直接添加することができる。我々は、インフルエンザウイルス関連を含めて、提案する技術について幅広い経験を有しているので、実験自体についての問題は予測していない。上述の技術のいずれかが、たとえば細胞数の問題などによって困難となった場合は、単一の培養内で活性化されたＣＤ４およびＣＤ８＋Ｔ細胞を同定するために、重用なサイトカイン（ＩＦＮ−ｇ、ＴＮＦ−α、グランザイムＢ）の内部レベルを評価するマルチパラメーターフローサイトメトリーを用いることができる。
【０１４６】
（エピトープ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答のインビボ評価）
ＨＬＡ−Ａ２およびＡ２４トランスジェニックマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ、ニューヨーク州ハドソン）試験は、Ｌａｍｐｉｒｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ペンシルバニア州パイパーズビル）に委託する。簡単に述べると、４〜８週齢の雌性マウスに対し、延長ペプチドを含有するワクチン製剤各１０μｇを、尾の付け根の皮内投与および側腹部皮下投与で２ヶ所に接種する。対照として、ＰＢＳまたはペプチド＋モンタニドアジュバントをマウスに接種する。全てのマウスにそれぞれ３回、０日目、１０日目、および３０日目に接種する。最終接種より７日後に脾臓を回収し、無菌つや消しガラススライドで挟んですりつぶし、０．４５μｍメッシュフィルターで濾過して単一細胞懸濁液を得る。単一細胞懸濁液を用いて、ネガティブセレクションによりＣＤ８＋Ｔ細胞を精製する。細胞は、上記のインビトロ分析の節に記載した終夜分析：ＥＬＩＳｐｏｔ、サイトカイン分泌、およびフローサイトメトリーに速やかに用いて脱顆粒を検出する。機能分析に加えて、目標１に記載したＭＨＣ−Ｉ  ４量体技術を用いてＣＤ８＋Ｔ細胞特異性を評価する。
【０１４７】
（予測される結果および技術的問題点）
我々は、接種マウスにおいてペプチド抗原特異的Ｔ細胞活性化をインビボで観察する予定である。さらに我々は、ＮＰ製剤を接種したマウスが、ペプチドパルス添加または感染ＡＰＣに応答して、ＰＢＳまたはペプチド＋モンタニド群と比較してより堅牢なＴ細胞応答を示すと予測する。ペプチドの一部がこれらのマウスの応答を誘導しないことを我々が観察した場合、追加の保存エピトープを直接的に追加することによってワクチン製剤を変更することができる。我々はＨＬＡ−Ａ２およびＨＬＡ−Ａ２４トランスジェニックモデルについて幅広い経験を有しているので、これらのトランスジェニックマウスモデル系を使用する際のいかなる問題も予想していない。
【０１４８】
（ＨＬＡ−Ａ２およびＡ２４トランスジェニックマウスを用いたウイルス攻撃モデルにおけるＮＰワクチン製剤のインビボ防御の評価）
（根拠）
ワクチンが有効であると見なされるためには、病原体が感染を確立することを完全に予防しない場合、疾患の期間および重症度の双方を必ず有意に低減しなければならない。インフルエンザウイルスのような多ウイルス株病原体に対するワクチンは、大半の株に対する幅広い防御を誘導することができれば、著しく改善される。我々は、この目標において、Ｔ細胞およびＢ細胞エピトープを含有するＮＰワクチン製剤をウイルス攻撃モデルにおいて直接試験し、このワクチンが異なる２つのインフルエンザ株に対して罹患率および死亡率を低減できるか判定する。我々はＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスモデルを用いて完全な試験を実施し、これが成功した場合、ＨＬＡ−Ａ２４トランスジェニックマウスモデルにおいて体重減少および致死攻撃試験を繰り返す。
【０１４９】
（方法）
我々は、ＮＰワクチン接種後のインビボ防御を評価するために、我々の共同研究者であるドレクセル大学のＰｅｔｅｒＫａｔｓｉｋｉｓ博士が確立したインフルエンザ攻撃モデルを用いる。ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ、ニューヨーク州ハドソン）系統を用いて、インフルエンザ特異的Ｔ細胞およびＢ細胞エピトープを含有するＮＰ配合ワクチンによって誘導される防御を評価する。簡単に述べると、我々は、雌性マウスを用いて、提案する３回接種スケジュール（０日目、１０日目および３０日目）を試験することを計画している。マウスに対し、ＮＰワクチン製剤１０μｇを、尾の付け根の皮内投与および側腹部の皮下投与で２ヶ所に接種する。対照として、アジュバント（モンタニドＩＳＡ５１）を含有するペプチドと含有しないペプチドも投与する。
【０１５０】
接種後、我々は数多くの重要な疑問点に対処する。ＮＰ接種は１）インフルエンザウイルス攻撃時に堅牢な二次ＣＴＬ応答を誘導するか、２）ウイルス負荷を低減またはウイルスクリアランスを促進するか、３）致死量以下のインフルエンザウイルス感染によって誘導される罹患から防御するか、および４）インフルエンザウイルス有毒株による致死的攻撃に対して防御するか？我々は、罹患率の試験を目的として、致死用量以下の感染性インフルエンザＡウイルスＰＲ８（Ｈ１Ｎ１，Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４）で、接種より４５日後に接種動物を攻撃する。マウスは鼻腔内感染させ、罹患率は体重およびウイルス誘導性肺病理の２つの手段で評価する。体重の変化は、ウイルス攻撃日から始めて１４日間にわたり１日１回マウスの体重を測定することでモニタリングする（７６，７７）。我々は、各群ｎ＝９匹の動物を用いる（検定力分析についての提言の脊椎動物の項を参照）。これらの頭数で、独立した３回の実験を実施する。予備データに基づき、感染後８〜１０日の野生種動物の体重減少を０日目と比較するとき、効果量は２０．４％である。接種マウスの５０％体重減少を推測する効果量は１０．２％である。そのような効果量の差（）（標準偏差（）約５．２％）は、α＝０．０５の検定力８０％（両側検定）で各群６匹の動物を必要とする。感染が必ずしも発生するとは限らず、あるいは動物は麻酔または感染で失われることがあるので、我々は各実験群につき９匹のマウスを用いて適切な動物数を確保している。
【０１５１】
ＰＲ８感染後、ウイルス誘導性の肺の炎症および病理を評価する。感染６日後および１０日後、マウスを屠殺して肺を回収する。肺は病理試験に用い、また一部の肺葉を用いてコラゲナーゼ＋ＤＮＡアーゼ消化単一細胞懸濁液を調製する。単一細胞懸濁液を用いて、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、ＤＣ、マクロファージおよび肺浸潤顆粒球の絶対数を定量する。さらに、細胞懸濁液をＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ８０／８６およびＭＨＣクラスＩＩについて染色し、フローサイトメトリーによりこれらの細胞の活性化プロフィールを検討する。我々はさらに肺の病理を評価する。肺のサイズ、外観および色調に基づく肉眼的病理変化、およびヘマトキシリンエオシン染色で評価する組織病理学的変化の双方を評価する。肺の病理により、我々は予防接種が肺の障害から防御するか否か評価することができる。肺の病理は、ＨＥ染色によって、および病理検査科の職員によって組織学的に評価する。罹患率の測定に加えて、感染３日目、６日目および１０日目にウイルスマトリックス遺伝子を増幅するリアルタイムＰＣＲによって肺のウイルス負荷を評価する。
【０１５２】
ワクチン効果の評価において重要なことは、ワクチンレジメ（ｒｅｇｉｍｅｎｔ）によって強力な二次応答が誘発されるか否かの判定である。我々のマルチエピトープＮＰ接種が堅牢な二次応答をもたらすか評価するため、我々はインフルエンザ感染後のＣＤ８＋Ｔ細胞応答および抗Ｍ２ｅ抗体応答を測定する。感染より３、６および１０日後に肺および脾臓を回収し、ペプチド装填ＭＨＣクラスＩ  ４量体およびペプチド刺激細胞内ＩＦＮγ株によってＣＤ８＋Ｔ細胞応答を測定する。回収時に血液を採取し、ＥＬＩＳＡで血清Ｍ２ｅ抗体を測定する。赤血球凝集抑制検査を用いて、血清中の中和抗インフルエンザ抗体を測定する。
【０１５３】
最後に、ＮＰワクチン製剤が幅広いインフルエンザウイルス、および致死量攻撃に対して防御できることを確実にするために、我々はマウスに対する病原性の高い株であるインフルエンザウイルスＡＥｑ／Ｌｏｎ（Ｈ７Ｎ７  Ａ／Ｅｑｕｉｎｅ／Ｌｏｎｄｏｎ／１４１６／７３）で致死量攻撃を実施する。ＰＲ８感染と同様、体重の病的状態を防御の読み取りとしてモニタリングする。両ウイルスモデルにおいて、鼻腔内攻撃後にＢ細胞およびＴ細胞応答を分析する。我々は、Ｅｑ／Ｌｏｎ感染による致死量攻撃試験に各群ｎ＝１５匹の動物を含めている（検定力分析についての提言の脊椎動物の項を参照）。α＝０．０５で検定力０．８および群比１についての接種群における生存確率０．６（６０％）および対照群０．１（１０％）の検定力分析には、総標本サイズ３０匹（各群１５匹）を必要とする。攻撃後、動物の臨床徴候を肉眼で１日２回視診してモニタリングする。動物は、以下の基準に合致するとき屠殺する：１）外来刺激に反応しない、２）１時間超の虚脱、３）努力呼吸、４）持続性振戦、または５）持続的うずくまり。全ての所見を記録する。体重が２５％超減少した動物は取り除き、生存分析では非生存として計数する。本試験の評価項目は死亡でない。（ＩＡＣＵＣは死亡を評価項目とすることを許可していない）。
【０１５４】
（目標４：毒性学および安全性試験）
（根拠）
空のナノ粒子およびインスリンペプチドを有するナノ粒子がヒト臨床試験において評価されているものの（予備試験）、何らかの抗原エピトープを有するＮＰのヒトにおける安全性は試験されていない。これらのエピトープはヒトＨＬＡ−Ａ２およびＡ２４分子に対して特異的であり且つヒト免疫応答に随伴する特異的生物学的機能を有するので、関連する動物モデルにおけるワクチン製剤の安全性を評価することも非常に重要である。上述のように、ＨＬＡトランスジェニックマウスモデルは、エピトープベースワクチン製剤の有効性のインビボ評価に幅広く用いられている。この目標において、我々はこれらのトランスジェニックマウスモデルを用いたナノ粒子の安全性を評価する。
【０１５５】
（方法）
ナノ粒子ワクチン製剤を、様々な用量（目標３のワクチン用量の１０倍まで）で５日連続皮内、皮下または静脈内投与する。投与体積は１００μＬ／匹とする。体重および飼料消費量を４８時間にわたってモニタリングする。尿および糞便サンプルを、試験期間中２４時間に渡り相異なる時点で採取し、各動物の尿および糞便の総量を採取して室温で秤量し、−８０±１０℃で保存する。事前に確立した時間に血液サンプルを採血し、ＥＤＴＡ  Ｋ３管に採取し、遠心分離（３５００ｒｐｍ、１０分間、４℃）するまで冷浴中に保存する。その後、採取した血清を−８０±１０℃で凍結する。採血後、動物を屠殺して以下の組織サンプルを採取する：脳、肝臓、腎臓、心臓、脾臓および肺。組織サンプルを秤量し、液体窒素でスナップ冷凍した後、−８０±１０℃で保存する。血液および組織サンプルの毒性分析を実施し、全てのデータの統計的有意性を分析する。採取した血液を用いて血液生化学分析を実施する。肝機能（アラニントランスアミナーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アルブミン、アルカリホスファターゼ、総ビリルビンおよび直接ビリルビン、および乳酸脱水素酵素）、腎機能（血中尿素窒素、クレアチニン、尿酸および総タンパク質）、および心機能（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼおよび乳酸脱水素酵素）のマーカーを評価する。さらに、アレルギー（好酸球、グロブリン、リンパ球および単球数）および血液疾患（ヘモグロビン、ヘマトクリット、赤血球数および白血球数）のマーカーパネルも試験に含める。また組織サンプルも、透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）により金粒子の蓄積について検討する（８２，８３）。
【０１５６】
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【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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