(57)【要約】  免疫系を有する対象における癌細胞を治療するための組成物は、少なくとも１つの変異を有するヤタポックスウイルス（Ｙａｔａｐｏｘｖｉｒｕｓ）属のウイルスを含む。一実施形態において、変異は結果的に、当該ウイルスによるＴＮＦ結合タンパク質の発現抑制を生じる。別の実施形態において、変異は結果的に、当該ウイルスによるチミジンキナーゼ（「ＴＫ」）の発現抑制を生じる。別の実施形態において、変異は、当該ウイルスに細菌フラジェリンを発現させる導入遺伝子を供給する。変異は、単一でまたは組み合わせで存在することができる。追加の態様は、癌細胞を本明細書に説明する組成物で治療する方法、および対象における癌細胞へ少なくとも１つの遺伝子を送達する方法を含む。【選択図】図１
2020504146.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における癌細胞へ少なくとも１つの遺伝子を送達する方法であって、
ヤタポックスウイルス（Ｙａｔａｐｏｘｖｉｒｕｓ）属のウイルスを変異させてインターロイキン２導入遺伝子を発現させることにより、前記ウイルスを改変することと、
前記改変されたヤタポックスウイルス属のウイルスを前記対象へ全身投与することと、を含む、方法。
【請求項２】
前記ウイルスがタナポックスウイルス（ｔａｎａｐｏｘｖｉｒｕｓ）（ＴＰＶ）であり、かつ変異が前記ＴＰＶの６６Ｒ遺伝子によってコードされるチミジンキナーゼの発現を抑制する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ウイルスがタナポックスウイルス（ＴＰＶ）であり、前記ウイルスが前記ＴＰＶのｍＩＬ−２遺伝子によってコードされるインターロイキン２導入遺伝子を発現するよう改変される、請求項１および２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
前記改変されたヤタポックスウイルス属のウイルスを前記対象へ全身投与することが、腫瘍の増殖を少なくとも２５％低減させる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記改変したヤタポックスウイルス属のウイルスを前記対象へ全身投与することが、腫瘍の増殖を少なくとも５０％低減させる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ウイルスがタナポックスウイルス（ＴＰＶ）であり、かつ変異が前記ＴＰＶの２Ｌ遺伝子によってコードされるＴＮＦ結合タンパク質の発現を抑制する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ウイルスにおける前記少なくとも１つの遺伝子をコードすることによって前記ウイルスを改変することをさらに含み、前記ウイルスが導入遺伝子をさらにコードして、前記対象の免疫系を活性化する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ウイルスにおける前記少なくとも１つの遺伝子をコードすることによって前記ウイルスを改変することをさらに含み、前記ウイルスが導入遺伝子をさらにコードして、前記癌細胞のアポトーシスを亢進する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ウイルスが導入遺伝子をコードして、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光レポーターを導入する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ウイルスが導入遺伝子をコードして、緑色蛍光タンパク質蛍光レポーターを導入する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記癌細胞が、皮膚癌細胞である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記癌細胞が、乳癌細胞である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記癌細胞が、大腸癌細胞である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも１つの変異を有するヤタポックスウイルス属のウイルスを含む、免疫系を有する対象における癌細胞を治療するための組成物であって、
前記少なくとも１つの変異が、挿入されたインターロイキン２導入遺伝子を含む、組成物。
【請求項１５】
前記ウイルスがタナポックスウイルス（ＴＰＶ）であり、前記少なくとも１つの変異が前記ＴＰＶの６６Ｒ遺伝子によってコードされるチミジンキナーゼ遺伝子の切除をさらに含む、請求項１４に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、対象における癌細胞を治療するための組成物、およびそのための方法に関する。
【発明の概要】
【０００２】
本開示の一態様は、免疫系を有する対象における癌細胞を治療するための組成物である。組成物は、少なくとも１つの変異を有するヤタポックスウイルス（Ｙａｔａｐｏｘｖｉｒｕｓ）属のウイルスを含む。少なくとも１つの変異は結果的に、そのウイルスによるＴＮＦ結合タンパク質の発現抑制を生じる。
【０００３】
本開示の別の態様は、ヤタポックスウイルス属のウイルスを含む、免疫系を有する対象における癌細胞を治療するための組成物であり、ウイルスは少なくとも１つの変異を有し、少なくとも１つの変異は結果的に、チミジンキナーゼ（「ＴＫ」）の発現抑制を生じ、ＭＨＣ−１軽鎖と結合することのできる構造を有するＴＮＦ結合タンパク質の発現抑制を生じ、ニューレグリン（「ＮＲＧ」）を模倣する１５Ｌコードタンパク質の発現抑制を生じ、および／またはＴ細胞増殖因子であるインターロイキン２（ＩＬ−２）の発現を生じる。
【０００４】
本開示の別の態様において、免疫系を有する対象における癌細胞を治療するための組成物は、細菌フラジェリンを発現する導入遺伝子をコードするポックスウイルスを含む。
【０００５】
本開示のさらに別の態様において、癌細胞を有する対象を治療する方法は、組成物を対象へ投与することを含み、組成物は、ウイルスによってＭＨＣ−１軽鎖と結合することのできる構造を有するＴＮＦ結合タンパク質の発現抑制を結果的に生じる少なくとも１つの変異を有するヤタポックスウイルス属のウイルス、チミジンキナーゼ（「ＴＫ」）の発現抑制を結果的に生じる少なくとも１つの変異を有するヤタポックスウイルス属のウイルス、ニューレグリン（「ＮＲＧ」）を模倣する１５Ｌコードタンパク質の発現抑制を結果的に生じる少なくとも１つの変異を有するヤタポックスウイルス属のウイルス、および／またはＴ細胞増殖因子であるインターロイキン２（ＩＬ−２）の発現を結果的に生じる少なくとも１つの変異を有するヤタポックスウイルス属のウイルスを含む。
【０００６】
本開示のさらに別の態様によると、少なくとも１つの遺伝子は、ヤタポックスウイルス属のウイルスを変異させて、ＭＨＣ−１軽鎖と結合することのできる構造を有するＴＮＦ結合タンパク質の発現を抑制し、チミジンキナーゼ（「ＴＫ」）の発現を抑制し、ニューレグリン（「ＮＲＧ」）を模倣する１５Ｌコードタンパク質の発現を抑制し、および／またはＴ細胞増殖因子であるインターロイキン２（ＩＬ−２）を発現させることによってウイルスを改変することによって、対象における癌細胞へ送達される。ウイルスは、ウイルスの少なくとも１つの遺伝子をコードすることによっても改変され、ウイルスにおいてコードされる少なくとも１つの遺伝子は、対象における癌細胞のアポトーシスを結果的に亢進させるか、または免疫応答を活性化する。改変されたウイルスは、対象へ投与される。
【０００７】
本明細書で説明する癌腫瘍を治療するための薬学的組成物および方法は、従来の治療方法を用いて経験され得る、またいくつかの症例においては従来の治療方法と併用され得る、重大な感染または副作用のリスクが制限された癌細胞の潜在的に有効な治療を可能にする。本明細書で説明する改変されたポックスウイルスは、改変されていないポックスウイルスと比較して高い癌選択性（ｏｎｃｏｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ）および高い癌致死性（ｏｎｃｏｌｅｔｈａｌｉｔｙ）を示す結果を呈しており、感染した対象における軽度のおよび自然治癒する熱性疾患のみを発症するなどの好ましいＯＶ特徴を維持すると予想される。
【０００８】
本デバイスのこれらおよび他の特長、利点、ならびに目的は、以下の明細書、特許請求の範囲、ならびに添付の図面を学ぶ際に、当業者によってさらに理解され認識されることになる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】発現させる導入遺伝子および蛍光レポーターを挿入するためのｐ２ＫＯ法によって変化した組換えタナポックスウイルス（ＴＰＶ）の一実施形態を説明する概略図である。
【図２Ａ】ＨＣＴ１１６細胞を異種移植した、およびビヒクルのみの対照液を用いて処置した無胸腺ヌードマウスの平均腫瘍量を説明するグラフである。
【図２Ｂ】ビヒクルのみの対照液と比較して、ＨＣＴ１１６細胞を異種移植した、および組換えＴＰＶの一実施形態を用いて処置した（ＴＰＶ／ｅｇｆｐ）無胸腺ヌードマウスの平均腫瘍量を説明するグラフである。
【図２Ｃ】ビヒクルのみの対照液と比較して、ＨＣＴ１１６細胞を異種移植した、および組換えＴＰＶの一実施形態を用いて処置した（ＴＰＶ−ｐ２ＫＯ／Δ６６Ｒ／ｍＭＣＰ−１）無胸腺ヌードマウスの平均腫瘍量を説明するグラフである。
【図２Ｄ】ビヒクルのみの対照液と比較して、ＨＣＴ１１６細胞を異種移植した、および組換えＴＰＶの一実施形態を用いて処置した（ＴＰＶ−ｐ２ＫＯ／Δ６６Ｒ／ｍＧＭ−ＣＳＦ）無胸腺ヌードマウスの平均腫瘍量を説明するグラフである。
【図２Ｅ】ビヒクルのみの対照液と比較して、ＨＣＴ１１６細胞を異種移植した、および組換えＴＰＶの一実施形態を用いて処置した（ＴＰＶ−ｐ２ＫＯ／Δ６６Ｒ／ｆｌｉＣ）無胸腺ヌードマウスの平均腫瘍量を説明するグラフである。
【図２Ｆ】ビヒクルのみの対照液と比較して、ＨＣＴ１１６細胞を異種移植した、および組換えＴＰＶの一実施形態を用いて処置した（ＴＰＶ−ｐ２ＫＯ／Δ６６Ｒ）無胸腺ヌードマウスの平均腫瘍量を説明するグラフである。
【図２Ｇ】ビヒクルのみの対照液と比較して、ＨＣＴ１１６細胞を異種移植した、および組換えＴＰＶの一実施形態を用いて処置した（ＴＰＶ−ｐ２ＫＯ／Δ２Ｌ）無胸腺ヌードマウスの平均腫瘍量を説明するグラフである。
【図２Ｈ】ビヒクルのみの対照液と比較して、ＨＣＴ１１６細胞を異種移植した、および組換えＴＰＶの一実施形態を用いて処置した（ＴＰＶ−ｐ２ＫＯ／Δ２Ｌ／Δ６６Ｒ／ｆｌｉＣ）無胸腺ヌードマウスの平均腫瘍量を説明するグラフである。
【図３】蛍光レポーターを発現するよう変化させた、組換えＴＰＶの一実施形態の感染によって作製した、２日間、４日間、および６日間でのウイルスプラークの一実施形態の図を含む。
【図４Ａ】ビヒクルのみの液と比較して、ＳＫ−ＭＥＬ−３細胞を異種移植した、および野生型ＴＰＶ（ｗｔＴＰＶ）で処置した無胸腺ヌードマウスの平均腫瘍量を説明するグラフである。
【図４Ｂ】ビヒクルのみの液と比較して、ＳＫ−ＭＥＬ−３細胞を異種移植した、および組換えＴＰＶの一実施形態（ＴＰＶ−ｐ２ＫＯ／Δ６６Ｒ）で処置した無胸腺ヌードマウスの平均腫瘍量を説明するグラフである。
【図４Ｃ】ビヒクルのみの液と比較して、ＳＫ−ＭＥＬ−３細胞を異種移植した、および組換えＴＰＶの一実施形態（ＴＰＶ−ｐ２ＫＯ／Δ１５Ｌ）で処置した無胸腺ヌードマウスの平均腫瘍量を説明するグラフである。
【図４Ｄ】ビヒクルのみの液と比較して、ＳＫ−ＭＥＬ−３細胞を異種移植した、および組換えＴＰＶの一実施形態（ＴＰＶ−ｐ２ＫＯ／Δ１５ＬΔ６６Ｒ）で処置した無胸腺ヌードマウスの平均腫瘍量を説明するグラフである。
【図４Ｅ】ビヒクルのみの液と比較して、ＳＫ−ＭＥＬ−３細胞を異種移植した、および組換えＴＰＶの一実施形態（ＴＰＶ−ｐ２ＫＯ／Δ６６Ｒ／ｍＩＬ−２）で処置した無胸腺ヌードマウスの平均腫瘍量を説明するグラフである。
【図５Ａ】ビヒクルのみの対照液と比較して、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を異種移植した、および野生型ＴＰＶ（ｗｔＴＰＶ）で処置した無胸腺ヌードマウスの平均腫瘍量を説明するグラフである。
【図５Ｂ】ビヒクルのみの液と比較して、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を異種移植した、および組換えＴＰＶの一実施形態（ＴＰＶ−ｐ２ＫＯ／Δ６６Ｒ／ｍＣＣＬ２）で処置した無胸腺ヌードマウスの平均腫瘍量を説明するグラフである。
【図５Ｃ】ビヒクルのみの液と比較して、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を異種移植した、および組換えＴＰＶの一実施形態（ＴＰＶ−ｐ２ＫＯ／Δ６６Ｒ）で処置した無胸腺ヌードマウスの平均腫瘍量を説明するグラフである。
【図５Ｄ】ビヒクルのみの液と比較して、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を異種移植した、および組換えＴＰＶの一実施形態（ＴＰＶ−ｐ２ＫＯ／Δ６６Ｒ／ｍＩＬ２）で処置した無胸腺ヌードマウスの平均腫瘍量を説明するグラフである。
【図５Ｅ】ビヒクルのみの液と比較して、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を異種移植した、および組換えＴＰＶの一実施形態（ＴＰＶ−ｐ２ＫＯ／Δ６６Ｒ／ｍＧＭＣＳＦ）で処置した無胸腺ヌードマウスの平均腫瘍量を説明するグラフである。
【図５Ｆ】ビヒクルのみの液と比較して、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を異種移植した、および組換えＴＰＶの一実施形態（ＴＰＶ−ｐ２ＫＯ／Δ２Ｌ）で処置した無胸腺ヌードマウスの平均腫瘍量を説明するグラフである。
【図５Ｇ】ビヒクルのみの液と比較して、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を異種移植した、および組換えＴＰＶの一実施形態（ＴＰＶ−ｐ２ＫＯ／Δ６６Ｒ／ＦｌｉＣ）で処置した無胸腺ヌードマウスの平均腫瘍量を説明するグラフである。
【図５Ｈ】ビヒクルのみの液と比較して、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を異種移植した、および組換えＴＰＶの一実施形態（ＴＰＶ−ｐ２ＫＯ／Δ６６Ｒ／Δ２Ｌ）で処置した無胸腺ヌードマウスの平均腫瘍量を説明するグラフである。
【図５Ｉ】ビヒクルのみの液と比較して、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を異種移植した、および組換えＴＰＶの一実施形態（ＴＰＶ−ｐ２ＫＯ／Δ６６Ｒ／Δ２Ｌ／ＦｌｉＣ）で処置した無胸腺ヌードマウスの平均腫瘍量を説明するグラフであり、ならびに
【図５Ｊ】ビヒクルのみの液と比較して、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を異種移植した、および組換えＴＰＶの一実施形態（ＴＰＶ−ｐ２ＫＯ／Δ１５Ｌ）で処置した無胸腺ヌードマウスの平均腫瘍量を説明するグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本明細書での説明目的のために、「上」、「下」、「右」、「左」、「後」、「前」、「縦」、「横」という用語およびこれらの派生語は、図１に方向付けられた組成物に関することになっている。しかしながら、相反して明らかに指定されていない限り、組成物が種々の代替的な方向付けを想定し得、方法が種々のステップの流れを含み得ることは、理解されるべきである。添付の図面に図示される、および後続の明細書において説明される具体的なデバイスおよび方法が、添付の特許請求の範囲に定義される本発明の概念の単に例示的な実施形態であることも理解されるべきである。この故、本明細書に開示する実施形態に関する具体的な寸法および他の物理的特徴は、特許請求の範囲が別段に明らかに述べていない限り、制限するものとみなすべきではない。
【００１１】
本明細書で使用する場合、「および／または」という用語は、２つ以上の項目のリストにおいて使用するとき、列挙した項目のいずれか１つがそれ自体によって採用されることができ、または列挙した項目の２つ以上のいずれかの組み合わせが採用されることができることを意味する。例えば、組成物が成分Ａ、Ｂ、および／またはＣを含有するものとして説明される場合、組成物は、Ａ単独、Ｂ単独、Ｃ単独、組み合わせでのＡおよびＢ、組み合わせでのＡおよびＣ、組み合わせでのＢおよびＣ、または組み合わせでのＡ、Ｂ、およびＣを含有することができる。
【００１２】
癌細胞および／または形質転換した細胞の感染についての何らかの好ましさが、ＶＡＣＶなどのいくつかのウイルスの腫瘍溶解性変異体において示されてきたが、タナポックスウイルス（「ＴＰＶ」）を含むがこれに限定されない、ヤタポックスウイルス属のウイルスなどの野生型ポックスウイルスは概して、高レベルの天然の癌特異性を有するとはみなされない。有意な天然の癌特異性を持たないウイルスにおいて、遺伝子操作は、癌細胞選択性を高めるよう採用されてきた。
【００１３】
高レベルの天然の癌特異性を必ずしも有するとは限らないが、ポックスウイルス、およびより具体的には、ヤタポックスウイルス属のポックスウイルスは、ＯＶとしての使用のための修飾に十分適させるいくつかの固有の質を有している。ポックスウイルスは、多量の付加された遺伝材料を収容することのできるウイルスゲノムを有しており、一連の攻撃能および防御能を内蔵している。ポックスウイルスゲノムは、宿主免疫監視から感染関連細胞表面エピトープを隠すことと、いくつかの宿主免疫応答および炎症応答の阻害および回避と、宿主サイトカインおよびサイトカイン受容体を模倣するウイルスコードペプチドによる細胞外環境からのシグナルの混乱とに対して充てられる種々の免疫調節タンパク質をコードする。ポックスウイルスは、２つの異なる種類の後代ウイルス粒子、すなわち成熟ウイルス粒子（ＭＶ）形態およびエンベロープウイルス粒子（ＥＶ）形態も産生する。ＭＶ形態のウイルスは、単一の脂質二重層内に閉じ込められており、細胞溶解によってのみ宿主細胞から放出される。ＥＶ形態は、おそらく宿主細胞トランスゴルジネットワークから第２の外膜を獲得した後、宿主細胞から活発に搬出され、感染細胞から搬出されるまでは包まれたビリオン（ｗｒａｐｐｅｄ  ｖｉｒｉｏｎ、ＷＶ）と称され、その後、ＥＶ形態と称される。ポックスウイルスＥＶ形態は、血流およびリンパネットワークを通じて輸送することによって、宿主内での異なる部位へポックスウイルスを伝播することに起因する、ウイルスの特化した形態である。ＥＶ形態は、この課題に十分適しており、その理由は、細胞外環境へ曝露された膜貫通タンパク質を６個のみ有しているからであるのに対し、ＭＶ形態についてはおよそ２０個有しているからである。より少数の曝露されたエピトープは、ＥＶ形態がＭＶ形態よりも中和免疫をより回避することができることを意味する。
【００１４】
さらに、ヤタポックスウイルス属のメンバーでありかつ野生型ポックスウイルスであるＴＰＶは、ＯＶを発生させる上で有益であるさらなる特徴を有しているので、ＯＶを発生させるためのヤタポックスウイルス属の好ましいメンバーにする。ＴＰＶに感染した人は、軽度のおよび自然治癒する熱性疾患のみを発症し、おそらくその理由は、ＴＰＶ感染が通常、身体の末梢領域に限定されるからである。アフリカの赤道付近における複数の地域（地方病性である）は別として、ヒトは、ＴＰＶに対して免疫学的に無感作である。さらに、ＴＰＶは、人から人へと伝染することが一度も観察されておらず、ＯＶにおける非常に望ましい安全性特徴である。
【００１５】
ヤタポックスウイルス属の試料を含む、ポックスウイルスの遺伝子操作された試料は、ＯＶとしての使用のために本明細書で開示されており、癌細胞を治療するための組成物において組み込まれ、癌細胞を治療する方法において使用されることになっている。組換えＴＰＶを組み込んでいるいくつかの好ましい実施形態を含むいくつかの好ましい実施形態も、本明細書で説明されている。
【００１６】
要約すると、後でさらに説明するように、本開示の一態様は、免疫系を有する対象における癌細胞を治療するための組成物である。一態様において、組成物は、少なくとも１つの変異を有するヤタポックスウイルス属のウイルスを含む。少なくとも１つの変異は結果的に、そのウイルスによるＴＮＦ結合タンパク質の発現抑制を生じる。本開示の別の態様は、ヤタポックスウイルス属のウイルスを含む、免疫系を有する対象における癌細胞を治療するための組成物であり、そのウイルスは、チミジンキナーゼ（「ＴＫ」）の発現抑制を生じる少なくとも１つの変異を有する。本開示の別の態様においては、ヤタポックスウイルス属のウイルスを含む、免疫系を有する対象における癌細胞を治療するための組成物であり、そのウイルスは、ニューレグリン（「ＮＲＧ」）を模倣する１５Ｌコードタンパク質の発現抑制を結果的に生じる少なくとも１つの変異を有する。本開示のさらに別の態様においては、ヤタポックスウイルス属のウイルスを含む、免疫系を有する対象における癌細胞を治療するための組成物であり、そのウイルスは、Ｔ細胞増殖因子であるインターロイキン２（ＩＬ−２）の発現を結果的に生じる少なくとも１つの変異を有する。別の態様において、その組成物は、細菌フラジェリンを発現する導入遺伝子をコードするポックスウイルスを含む。本明細書で使用する場合、「対象」という用語は、ヒトおよび動物の対象、好ましくは哺乳類対象を含む。
【００１７】
また後でより詳細に説明するように、癌細胞を有する対象を治療する方法は、組成物を対象へ投与することを含み、その組成物は、本明細書で説明するとおりである。例えば、一実施形態において、組成物は、ヤタポックスウイルス属のウイルスによってＴＮＦ結合タンパク質の発現抑制を結果的に生じる少なくとも１つの変異を有するヤタポックスウイルス属のウイルスを含む。別の実施形態において、組成物は、ヤタポックスウイルス属のウイルスを含み、そのウイルスは、ＴＫの発現抑制を結果的に生じる少なくとも１つの変異を有する。別の実施形態において、組成物は、ヤタポックスウイルス属のウイルスを含み、そのウイルスは、ニューレグリン（「ＮＲＧ」）を模倣する１５Ｌコードタンパク質の発現抑制を結果的に生じる少なくとも１つの変異を有する。別の実施形態において、組成物は、ヤタポックスウイルス属のウイルスを含み、そのウイルスは、Ｔ細胞増殖因子であるインターロイキン２（ＩＬ−２）の発現を結果的に生じる少なくとも１つの変異を有する。さらに別の実施形態において、組成物は、細菌フラジェリンを発現する導入遺伝子をコードするポックスウイルスを含む。これらの変異のうちのいずれかまたはすべては、組成物中に単独でまたはいずれかの組み合わせで存在することができる。さらに、組成物は、標的化した様式で癌細胞の群へ送達することができるか、または対象へ全身送達することができる。
【００１８】
本開示のさらに別の態様によると、後でより詳細に説明するように、少なくとも１つの遺伝子は、ヤタポックスウイルス属のウイルスを変異させて、ＭＨＣ−１軽鎖と結合することのできる構造を有するＴＮＦ結合タンパク質の発現を抑制し、チミジンキナーゼ（「ＴＫ」）の発現を抑制し、ニューレグリン（「ＮＲＧ」）を模倣する１５Ｌコードタンパク質の発現を抑制し、および／またはＴ細胞増殖因子であるインターロイキン２（ＩＬ−２）を発現させることによってウイルスを改変することによって、対象における癌細胞へ送達される。ウイルスは、ウイルスにおける少なくとも１つの遺伝子をコードすることによっても改変され、そのウイルスにおいてコードされる少なくとも１つの遺伝子は、対象における癌細胞のアポトーシスを結果的に亢進させるか、または免疫応答を活性化する。改変されたウイルスは、対象へ投与される。
【００１９】
ある特定の実施形態において、ポックスウイルスは、ＴＮＦ結合タンパク質とも本明細書で称される、ＴＮＦ結合活性を有する宿主範囲因子の発現を抑制するよう遺伝子改変される。抑制されたＴＮＦ結合タンパク質は、ＭＨＣ−１重鎖タンパク質と構造上類似しており、コードされたＴＮＦ結合タンパク質は、ＭＨＣ−１軽鎖と相互作用することができる。ＴＰＶにおいて、ＴＮＦ結合タンパク質は、２Ｌ遺伝子においてコードされる。２Ｌ遺伝子が欠失したかまたはさもなくば変異してＴＮＦ結合タンパク質の発現を抑制する組換えＴＰＶは、「２Ｌ欠失」または「Δ２Ｌ」と本明細書で時に称される。正常なポックスウイルス感染において、分泌型ＴＮＦ結合タンパク質は、感染した細胞と相互作用するよう存在するＴＮＦへ結合することおよびその量を有効に低減させることによって、宿主の炎症応答および抗ウイルス免疫応答を鈍化するよう作用する。このことは、ポックスウイルスにとって望ましい結果であるが、ポックスウイルスがＯＶとして使用されるとき、治療された腫瘍によって経験される炎症の量を低下させるよりもむしろ増大させることは有利であることがある。腫瘍がポックスウイルスとしての組換えＴＰＶを基にしてＯＶを用いて治療されるヒト対象において、組換えＴＰＶにおける２Ｌ遺伝子の切除は結果的に、（２Ｌ保持ＴＰＶを感染させた腫瘍と比較して）腫瘍部位でのＴＮＦ濃度の有効な上昇を生じることができる。ＴＮＦレベルの上昇は究極的には、腫瘍のクリアランスを増大させるよう作用することができる。２Ｌ遺伝子は、マウスＴＮＦではなくヒトＴＮＦへ結合することがすでに示されてきたので、本明細書で説明する組換えＴＰＶのいくつかにおける２Ｌ遺伝子の切除は、マウスの実験中の腫瘍クリアランスにおける有意な因子であるとは期待されていなかったが、霊長類およびヒトにおける腫瘍クリアランスのより有意な因子であると期待されている。２Ｌ遺伝子の切除は、本明細書で説明する場合、異種移植片がヒト癌細胞から作製された異種移植した無胸腺ヌードマウスにおいて使用する組換えＴＰＶの具体的な例において行われたが、その理由は、マウスでの検査が癌のウイルス療法のより関連性のある霊長類モデルにおけるポックスウイルスに基づくＯＶのさらなる検査に向けての重要なステップであるからである。
【００２０】
ある特定の実施形態において、ポックスウイルスの癌選択性は、チミジンキナーゼ（「ＴＫ」）の発現を抑制するようポックスウイルスを改変することによって亢進する。ＴＰＶにおいて、ＴＫコード遺伝子は、６６Ｒとして公知である。６６Ｒ遺伝子が欠失しているかさもなくば変異して、ＴＫの発現を抑制した組換えＴＰＶは、本明細書で「６６Ｒ欠失」または「Δ６６Ｒ」と時に称される。腫瘍細胞におけるＴＫ活性は、癌細胞の細胞内ＴＫ１の作用により、構成的に高い。このことは、ＴＫ活性のレベルが細胞周期のＳ期の間にピークに達し、他の期ではほぼ検出不可能である正常細胞とは対照的である。細胞内ＴＫ１は、ヌクレオチド合成におけるステップであるチミジンからチミジル酸への転化を触媒する。この理由のため、癌細胞は、細胞周期全体を通じてＴＫ１を発現し、結果として、細胞周期の全期で入手可能なチミジル酸の多量の細胞質プールを有する傾向にある。特にヤタポックスウイルス属のポックスウイルスにおけるＴＫコード遺伝子を抑制することによって、そのポックスウイルスは、ＴＫコード遺伝子が未処置のままであった場合よりも癌細胞選択性が大きい。６６Ｒ遺伝子の切除を、マウスがＴＰＶについての正常な動物宿主ではないが、本明細書で説明する異種移植した無胸腺ヌードマウスにおいて使用される組換えＴＰＶの具体例のうちのいくつかにおいて行った。本環境における６６Ｒ遺伝子の切除は、６６Ｒ遺伝子の切除が許容細胞（ヒト癌性腫瘍細胞など）において非複製ＴＰＶを結果的に生じなかったことを実証している。
【００２１】
いくつかの実施形態において、そのポックスウイルスは、ニューレグリン（「ＮＲＧ」）を模倣する１５Ｌコードタンパク質の発現を抑制するよう遺伝子改変される。その１５Ｌ遺伝子が欠失したかまたはさもなくば変異してニューレグリンを模倣するタンパク質の発現を抑制した組換えＴＰＶは、本明細書で「１５Ｌ欠失」もしくは「Δ１５Ｌ」と時に称される。１５Ｌコードタンパク質は、ニューレグリンを生物学的に模倣しており、表皮増殖因子（ＥＧＦ）として作用し得る。１５Ｌコードタンパク質および／またはＮＲＧは、黒色腫、乳癌、および前立腺癌などの多くの癌における治療耐性と関係しているＥｒｂＢ３およびＥｒｂＢ４についてのリガンドとして作用し得る。ＥｒｂＢ受容体へのリガンドの結合は、ホモ二量体またはヘテロ二量体の形成、および内在性キナーゼドメインの活性化をもたらす。これらの活性は順に、シグナル伝達カスケードを初発させ、究極的にはＤＮＡ合成および細胞増殖をもたらす。特にヤタポックスウイルス属のポックスウイルスにおけるＮＲＧを模倣する１５Ｌコードタンパク質の発現を抑制することによって、そのポックスウイルスは、未処置のままにした１５Ｌコード遺伝子と比較して、腫瘍の増殖を退縮させる能力を有している。その１５Ｌ遺伝子の切除を、組換えＴＰＶのいくつかの具体例において行い、マウスがＴＰＶについての正常な宿主ではないが、本明細書に説明する異種移植した無胸腺ヌードマウスにおいて使用した。組換えＴＰＶにおける１５Ｌ遺伝子の切除は、単独でまたは他の遺伝子改変との組み合わせのいずれかで、１５Ｌ遺伝子の切除がヌードマウスにおけるヒト黒色腫、乳房腫瘍、および結腸直腸腫瘍を退縮させることができることを実証する。
【００２２】
なおも他の実施形態において、ポックスウイルスは、Ｔ細胞増殖因子であるインターロイキン２（ＩＬ−２）を発現するよう遺伝子改変される。Ｔ細胞増殖因子であるインターロイキン２（ＩＬ−２）は、生得的免疫系および適応免疫系の両方におけるＴ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、およびマクロファージの活性化における決定的な役割を担っている。（ｍＩＬ−２）遺伝子が導入された組換えＴＰＶは、ポックスウイルスの抗腫瘍活性を亢進させ得、結果的に、野生型ＴＰＶよりも有意な黒色腫退縮を生じ得る。ＩＬ−２は、生得的免疫系および適応免疫系の両方において鍵となる役割を担っている多面的サイトカインである。ＩＬ−２は、Ｔ細胞によって分泌され、胸腺リンパ球の分化および発達を誘導して、エフェクターＴ細胞となる。ＩＬ−２は、記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞の生存を促進し、腫瘍細胞におけるＭＨＣ−ＩＩ発現を亢進することが示されてきた。黒色腫を治療する上で一貫した有効性を実証してきた養子Ｔ細胞移入療法において、ＩＬ−２は、インビトロでＴ細胞を増殖させた後に、そのＴ細胞を癌患者へ再注入するために使用されてきた。さらに、ＩＬ−２は、生得的免疫系を活性化する上での実質的な有効性を有する。ＩＬ−２がナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を活性化して、（リンホカイン活性化殺滅（ＬＡＫ）として公知の）細胞毒性機能の亢進を獲得することが実証されてきた。ＩＬ−２によって活性化されるＮＫ細胞は腫瘍細胞に対するペルホリンの親和性の亢進と共に、より広い範囲の腫瘍細胞を標的とすることが示されてきており、結果的により有意な細胞溶解を生じた。さらに、マクロファージは、ＩＬ−２によって活性化された後、より大きく、より顆粒状に、細胞毒性の亢進した癌細胞上で集合することが実証された。ＩＬ−２は、マクロファージを活性化して、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）およびフリーラジカルなどの他の細胞毒性分子を誘導することも示されてきた。特にヤタポックスウイルス属のポックスウイルスにおいてｍＩＬ−２遺伝子を付加および発現させることによって、そのポックスウイルスは、ポックスウイルスの抗腫瘍活性を亢進する能力を有しており、より有意な黒色腫退縮を結果的に生じる。マウスがＴＰＶについての正常な宿主ではないが、本明細書で説明する異種移植した無胸腺ヌードマウスにおいて使用される組換えＴＰＶのいくつかの具体例において、ｍＩＬ−２遺伝子の導入を行った。組換えＴＰＶにおけるｍＩＬ−２遺伝子の付加は、単独でまたは他の遺伝子改変との組み合わせのいずれかで、ｍＩＬ−２遺伝子の導入がヌードマウスにおけるヒト黒色腫、乳房腫瘍、および結腸直腸腫瘍における抗腫瘍活性を亢進することができることを実証している。
【００２３】
さらなる実施形態において、ポックスウイルスは、単球走化性タンパク質１（ｍＣＣＬ２）および／または顆粒球単球コロニー刺激因子（ｍＧＭＣＳＦ）などの他の免疫刺激タンパク質を発現するよう遺伝子改変され得る。単球走化性タンパク質１は、記憶Ｔ細胞（ＣＤ２９＋およびＣＤ４５ＲＯ＋）、Ｂ細胞、樹状細胞、単球、および／またはマクロファージについての強力な炎症性化学誘引物質として作用し得る。顆粒球単球コロニー刺激因子は、抗腫瘍細胞毒性リンパ球（ＣＴＬ）応答の誘導に向けて作用し得る。特にヤタポックスウイルス属のポックスウイルスにおけるｍＣＣＬ２および／またはｍＧＭＣＳＦ遺伝子を付加および発現させることによって、ポックスウイルスは、ポックスウイルス抗腫瘍活性を亢進する能力を有し、結果的により有意な腫瘍退縮を生じる。ｍＣＣＬ２および／またはｍＧＭＣＳＦ遺伝子の導入は、マウスがＴＰＶについての正常なホストではないが、本明細書で説明する異種移植した無胸腺ヌードマウスにおいて使用される組換えＴＰＶのいくつかの具体例において行った。組換えＴＰＶにおけるｍＣＣＬ２および／またはｍＧＭＣＳＦ遺伝子の付加は、単独でまたは本明細書で言及される他の遺伝子改変との組み合わせのいずれかで、ｍＣＣＬ２および／またはｍＧＭＣＳＦ遺伝子の導入がヌードマウスにおけるヒト黒色腫、乳房腫瘍、および結腸直腸腫瘍における抗腫瘍活性を亢進し得ることを実証する。
【００２４】
さらに、ポックスウイルスの癌致死性は、癌細胞のアポトーシスを亢進するために、または対象の免疫系を活性化するために、ポックスウイルスを導入遺伝子でコードすることによって亢進することができる。ポックスウイルスをコードするために使用することができる導入遺伝子の例としては、サイトカイン、ケモカイン、抗原提示ポリペプチド、または細菌抗原を発現する遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用する場合、サイトカインとは、免疫細胞を刺激すること、免疫細胞の増殖を促進すること、または特定の部位へ免疫細胞を方向付けることなど、免疫細胞または免疫系の調節作用を有するタンパク質またはポリペプチドを称する。ある特定の好ましい実施形態において、使用されるポックスウイルスは、顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージ走化性タンパク質１（ＣＣＬ２）（ＭＣＰ−１およびＭＣＦ−１とも称する）、または細菌フラジェリン（ＦｌｉＣ）（サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）におけるｆｌｉＣ遺伝子の産物）を備えた組換えＴＰＶである。マウスを用いて使用するために組換えＴＰＶを用いて実験するとき、これらの導入遺伝子のマウス（ｍ）バージョンを使用し、組換えＴＰＶ、すなわち、ｍＧＭ−ＣＳＦ、ｍＣＣＬ２、ｍＭＣＰ１、ｍＭＣＦ−１において関連していた。検査または治療が実施されることになっている対象についてのこれらの導入遺伝子の適切なまたは有効なバージョンを使用することが好ましい。
【００２５】
重合したフラジェリンは、本開示による使用のための細菌フラジェリンの主要成分である。本明細書で説明する具体的な実験に使用されるフラジェリンとは、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）遺伝子ｆｌｉＣの産物とした。ＦｌｉＣおよび他の細菌フラジェリンは、ｔｏｌｌ様受容体５（ＴＬＲ５）の同族リガンドであり、ＭｙＤ８８依存性細胞内シグナル伝達、究極的には、転写因子ＮＦκＢの活性化を介した哺乳類細胞における生得的免疫応答の強い活性化因子である。フラジェリンは、細菌病理発生における他の重要な役割を有する強力で多面的な毒性因子である。
【００２６】
先に説明したポックスウイルスの実施形態におけるゲノムの改変に加えて、蛍光レポーター導入遺伝子は、ポックスウイルスのゲノムへと任意に挿入される。培養細胞におけるウイルス感染の可視化は、蛍光レポーター導入遺伝子の包含によって大いに容易になり、それにより、本明細書で説明するポックスウイルス変異株を用いた研究を容易にする。好ましい蛍光レポーター導入遺伝子には、ｍＣｈｅｒｒｙ（励起／発光５８７ｎｍ／６１０ｎｍ）および増感型の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（励起／発光４７５ｎｍ／５０９ｎｍ）というレポーターが含まれる。
【００２７】
ポックスウイルスの好ましい実施形態には、先に説明した変異または挿入のいずれかまたはすべてを有する好ましくはヤタポックスウイルス属のウイルスが含まれ、変異および挿入は好ましくはｐ２ＫＯベクター法を用いて実施される。１つの好ましい実施形態において、ヤタポックスウイルス属のメンバーである組換えＴＰＶは、本明細書で使用するｐ２ＫＯ法によって変化し、その概略図は図１に示される。説明されるように、２つのワクシニアウイルス（ＶＡＣＶ）由来初期／後期合成プロモーターは、所望の発現させる導入遺伝子の発現を駆動して、ウイルス（例えば、ｍＧＭ−ＣＳＦ、ｍＣＣＬ２、ｍＭＣＰ１、ｍＭＣＦ−１、ｆｌｉＣ）および任意の蛍光レポーター導入遺伝子をコードするために使用される。図１に図示するｐ２ＫＯベクター法の実施形態には、ｐ２ＫＯ発現カセット（左右の隣接部、発現させる導入遺伝子または蛍光レポーター導入遺伝子を含む少なくとも１つの介在オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、および少なくとも１つのプロモーターを含む）をＴＰＶのウイルスゲノムへ、後でより詳細に説明するトランスフェクション／感染手順の間に相同組換え二重乗換え事象を経て転移させることが含まれる。この方法で、ｐ２ＫＯ発現カセットは、ＴＰＶのウイルスゲノムにおける特定地点へと、ウイルスゲノム隣接配列の使用によって誘導され、結果的に、組換えＴＰＶにおける所望の発現させる導入遺伝子と任意の蛍光レポーター導入遺伝子との同時発現と共に、所望の遺伝子（複数可）を標的とした切除を生じる。
【００２８】
図１に説明するようなＴＰＶｐ２ＫＯ発現カセットの実施形態において、複数のポックスウイルス初期／後期合成プロモーターは複数の導入遺伝子の発現を可能にした。ｐ２ＫＯ発現カセットは、標的遺伝子に由来するウイルスゲノム隣接配列の使用によってウイルスゲノムにおける特定地点への挿入を誘導し、結果的に、蛍光レポーター導入遺伝子と発現させる導入遺伝子との同時発現と共に、所望の遺伝子（複数可）を標的とした切除を生じて、ウイルスを備える。図１に示される実施形態において、蛍光レポーター導入遺伝子および発現させる導入遺伝子の両方が示されている。代替的な実施形態において、蛍光レポーター導入遺伝子または発現させる導入遺伝子のいずれかが、ウイルスゲノムへの挿入のためにｐ２ＫＯ発現カセット中に存在し得る。左右の隣接部は、複数対の独特な制限部位によって隣接されている。隣接領域は、５’−（左）隣接部上のＳａｃＩ制限部位とＮｏｔＩ制限部位の間で、および３’−（右）隣接部上のＥｃｏＲＩ制限部位とＨｉｎｄＩＩＩ制限部位の間でｐ２ＫＯベクターへとライゲートされる。発現することになっている遺伝子（複数可）（蛍光レポーター導入遺伝子および／または発現させる導入遺伝子）は、独特な５’−ＢａｍＨＩ制限部位および３’−ＸｍａＩ制限部位によって隣接されている。これらは、適切な制限部位によって隣接されるＰＣＲアンプリコンの単純で方向付けられたライゲーションを可能にする。
【００２９】
本明細書で説明する例についてのｐ２ＫＯ法において使用される関連プライマーを以下の表１に示す。各場合において、挿入された制限エンドヌクレアーゼ部位は、下線を付すことによって示される。適用可能な場合、順方向プライマーにおいて、開始コドンは灰色の陰影を付した太字で示され、逆方向プライマーにおいて、終止コドンは、灰色の陰影を付した太字で示される。本明細書で説明する例において使用される左右の隣接プライマーは、開始コドンも終止コドンも含んでいなかった。
表１  ｐ２ＫＯ切除／挿入ベクターを調製するために使用されるプライマー
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【００３０】
発現させる導入遺伝子の挿入部位についてのｐ２ＫＯ法の種々の実施形態において使用されるＯＲＦには、ｍＣＣＬ２導入遺伝子、ｍＧＭ−ＣＳＦ導入遺伝子、およびｆｌｉＣ導入遺伝子が含まれる。後に引用する例において使用されるｍＣＣＬ２導入遺伝子は、ＯＲＦ支持プラスミド（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄから入手可能）として購入したｍＣＣＬ２ｃＤＮＡクローンＯＲＦを用いて作製した。後に引用する例において使用されるｍＧＭ−ＣＳＦ導入遺伝子は、Ｇｒａｎｔ  ＭｃＦａｄｄｅｎ博士によって提供されたｍＧＭ−ＣＳＦのｃＤＮＡクローンＯＲＦを用いて作製した。ｍＣＣＬ２、ｍＧＭ−ＣＳＦおよびｆｌｉＣのＯＲＦをＰＣＲによってこれらのベクターから増幅し、増幅産物のそれぞれ５’末端および３’末端上にＢａｍＨＩ制限配列およびＸｍａｌ制限配列を付与した。ｍＣＣＬ２、ｍＧＭ−ＣＳＦ、およびｆｌｉＣのＯＲＦをｐ２ＫＯ切除／挿入ベクターへとライゲートした。
【００３１】
以下の表２に示すように、次の略記を、ｐ２ＫＯ法を用いて作製された組換えＴＰＶの種々の実施形態を説明するために、本明細書で使用する。ｐ２ＫＯ切除／挿入法が本明細書で説明されているが、ゲノムから遺伝子を切除することまたは導入遺伝子をゲノムへと挿入することについて公知のいずれかの方法が、本明細書で説明される組換えＴＰＶを形成するために使用されることができることは理解される。
表２  組換えＴＰＶ略記
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【００３２】
マウス宿主において組換えＴＰＶを検査するための適切な細胞株を選択するために、最小限に変化させた組換えＴＰＶ／ｅｇｆｐをヒト大腸癌細胞株のパネルに対して検査し、最良のウイルス複製を可能にする細胞株を選別し、それにより直接的なウイルス腫瘍細胞溶解の効果を最大限にした。ＴＰＶ／ｅｇｆｐ複製のために検査されたｈＣＲＣ細胞株には、ＨＣＴ１１６、ＣＯＬＯ２０５、ＳＷ１４６３およびＷｉＤｒが含まれていた。腫瘍細胞のウイルス性溶解は、いくつかの場合において腫瘍のクリアランスに重要であるが、ウイルス性細胞溶解は、腫瘍の生存およびクリアランスの際に影響する多くの因子のうちのたった１つに過ぎず、免疫細胞動員もある役割を担うことができる。ＨＣＴ１１６は、対照細胞株ＯＭＫよりも少数の後代ビリオンを生成するが、ＨＣＴ１１６は、検査されるｈＣＲＣ細胞株から最も多く産生された。さらに、多くのＯＶは、ＨＣＴ１１６で誘導される腫瘍において特徴づけられてきた。これらの理由のため、ＨＣＴ１１６は、インビボでの組換えＴＰＶの腫瘍溶解能をさらに特徴づけるために複数の実験に使用された。
【００３３】
組換えＴＰＶの種々の実施形態を査定するために、ＨＣＴ１１６細胞株を有する無胸腺ヌードマウスの背側面上への５×１０６個のＨＣＴ１１６細胞の皮下注射によって、その無胸腺ヌードマウスにおいて腫瘍を誘導した。腫瘍の大きさが７５ｍｍ３に到達したとき、そのマウスを対照群および実験群へと無作為に分け、各群５匹とした。ビヒクルのみ（ａ群）または組換えＴＰＶ（ｂ〜ｈ群）を１００μＬ含有する単回注射を（７５ｍｍ３の腫瘍量に到達した後の）０日後に投与し、その後、腫瘍量を３日間間隔で測定した。平均腫瘍量は、次式を用いて計算した。
平均腫瘍量＝（長さ）×（幅）×（高さ）×π／６    （１）
【００３４】
ＨＣＴ１１６誘導性腫瘍異種移植片は、組換えＴＰＶを用いた処置の間に予想したレベルまで量が増大しなかった。しかしながら、複数の二次腫瘍は、組換えＴＰＶを用いた処置を受けているマウスにおいて発症した。さらに、ＨＣＴ１１６同所性異種移植片モデルを含むいくつかのインビトロ試験において、ＨＣＴ１１６細胞は、非常に運動性があり侵襲性であると報告されてきた。
【００３５】
図２Ａは、５×１０６個のＨＣＴ１１６細胞を異種移植し、その後ビヒクルのみの対照液を用いて処置した無胸腺ヌードマウスにおいて３６日間のスパン（腫瘍量が７５ｍｍ３を超過したときに開始）にわたって観察された平均腫瘍発達を説明する。白色の丸で示される平均腫瘍量は、およそ１５日間まで増加し、その時点でその量は、その時間スパンの残りについておよそ１００ｍｍ３で安定した。平均の標準誤差はバーで示す（±１ＳＥＭ）。腫瘍の量の安定は、初発異種移植片において同数または類似の数のＨＣＴ１１６細胞を使用したときに、ヌードマウスにおける処置されていないＨＣＴ１１６腫瘍の量が同じ間隔にわたって漸増することを示したいくつかの先行研究とは対照的である。例えば、ＨＣＴ１１６誘導腫瘍はおよそ８日間の倍加時間を有していることが報告されてきた。また、ヌードマウスにおけるＨＣＴ１１６異種移植片に対するＯＶ治療薬としてのＶＡＣＶを検討した最近の研究は、図２Ａに説明される時間スパンと類似の時間間隔において４０００ｍｍ３までのＨＣＴ１１６腫瘍増殖を示した。
【００３６】
図２Ｂにおいて図示する実施形態において、黒色の正方形は、ＴＰＶ／ｅｇｆｐで処置したＢ群におけるマウスの平均腫瘍量と、対照Ａ群におけるマウスの平均腫瘍量とを説明する。バーは、対照Ａ群の腫瘍量およびＢ群の腫瘍量についての平均の標準誤差（±１ＳＥＭ）を説明する。
【００３７】
図２Ｃにおいて図示する実施形態において、黒色の正方形は、ＴＰＶ−ｐ２ＫＯ／Δ６６Ｒ／ｍＭＣＰ−１を用いて処置したＣ群のマウスの平均腫瘍量、および対照Ａ群のマウスの平均腫瘍量を説明する。バーは、対照Ａ群の腫瘍量およびＣ群の腫瘍量についての平均の標準誤差（±１ＳＥＭ）を説明する。
【００３８】
図２Ｄにおいて図示する実施形態において、黒色の正方形は、ＴＰＶ−ｐ２ＫＯ／Δ６６Ｒ／ｍＧＭ−ＣＳＦを用いて処置したＤ群のマウスの平均腫瘍量、および対照Ａ群のマウスの平均腫瘍量を説明する。バーは、対照Ａ群の腫瘍量およびＤ群の腫瘍量についての平均の標準誤差（±１ＳＥＭ）を説明する。
【００３９】
図２Ｅにおいて図示する実施形態において、黒色の正方形は、ＴＰＶ−ｐ２ＫＯ／Δ６６Ｒ／ｆｌｉＣを用いて処置したＥ群のマウスの平均腫瘍量、および対照Ａ群のマウスの平均腫瘍量を説明する。バーは、対照Ａ群の腫瘍量およびＥ群の腫瘍量についての平均の標準誤差（±１ＳＥＭ）を説明する。
【００４０】
図２Ｆにおいて図示する実施形態において、黒色の正方形は、ＴＰＶ−ｐ２ＫＯ／Δ６６Ｒを用いて処置したＦ群のマウスの平均腫瘍量、および対照Ａ群の平均腫瘍量を説明する。バーは、対照Ａ群の腫瘍量およびＦ群の腫瘍量についての平均の標準誤差（±１ＳＥＭ）を説明する。
【００４１】
図２Ｇにおいて図示する実施形態において、黒色の正方形は、ＴＰＶ−ｐ２ＫＯ／Δ２Ｌを用いて処置したＧ群のマウスの平均腫瘍量、および対照Ａ群のマウスの平均腫瘍量を説明する。バーは、対照Ａ群の腫瘍量およびＧ群の腫瘍量についての平均の標準誤差（±１ＳＥＭ）を説明する。
【００４２】
図２Ｈにおいて図示する実施形態において、黒色の正方形は、ＴＰＶ−ｐ２ＫＯ／Δ２Ｌ／Δ６６Ｒ／ｆｌｉＣを用いて処置したＨ群のマウスの平均腫瘍量、および対照Ａ群のマウスの平均腫瘍量を説明する。バーは、対照Ａ群の腫瘍量およびＨ群の腫瘍量についての平均の標準誤差（±１ＳＥＭ）を説明する。
【００４３】
図４Ａ〜図４Ｅに関して、黒色腫腫瘍モデルにおける腫瘍抑制における変異ウイルスの有効性をインビボで示す。黒色腫腫瘍は、６〜８週齢の無胸腺ヌードマウスにおいて、５×１０６個のＳＫ−ＭＥＬ−３細胞を背側面へと皮下注射することによって誘導した。腫瘍の大きさが４５±４．５ｍｍ３に到達したとき、マウスを、各群５匹のマウスを含有する対照群または実験群へと無作為に分けた（ｎ＝５）。実験群のマウスを５×１０６ｐｆｕのウイルスの腫瘍内注射で処置したのに対し、偽の群のマウスには媒体のみを腫瘍内注射した。腫瘍量は、デジタルカリパスを用いて毎日測定した。ここで示す各グラフにおいて、ｙ軸は腫瘍増殖の平均百分率（％）を表し、ｘ軸は時間（ウイルス治療処置後の日数）である。実験群はすべて、マウスを媒体注射のみで処置した偽の群と比較する。バーは、平均の標準誤差（±１ＳＥＭ）を示す。星印（＊）で示された地点は、対照から有意に低減した腫瘍増殖を指す（Ｐ≦０．０５）。星印は、有意性があった場合に３日ごとに標識した。
【００４４】
図４Ａにおいて図示する実施形態において、黒色のＸ’は、ｗｔＴＰＶを用いて処置したＡ群のマウスの腫瘍増殖の百分率、および対照Ａ群のマウスの平均腫瘍増殖を説明する。バーは、対照Ａ群の腫瘍増殖およびＡ群の腫瘍増殖についての平均の標準誤差（±１ＳＥＭ）を説明する。
【００４５】
図４Ｂにおいて図示する実施形態において、黒色の正方形は、ＴＰＶ／ｐ２ＫＯ／Δ６６Ｒで処置したＢ群のマウスの腫瘍増殖の百分率、および対照Ａ群のマウスの腫瘍増殖の百分率を説明する。バーは、対照Ａ群の腫瘍増殖およびＢ群の腫瘍増殖についての平均の標準誤差（±１ＳＥＭ）を説明する。
【００４６】
図４Ｃにおいて図示する実施形態において、黒色の正方形は、ＴＰＶ−ｐ２ＫＯ／Δ１５Ｌを用いて処置したＣ群のマウスの腫瘍増殖の百分率、および対照Ａ群のマウスの腫瘍増殖の百分率を説明する。バーは、対照Ａ群の腫瘍増殖およびＣ群の腫瘍増殖についての平均の標準誤差（±１ＳＥＭ）を説明する。
【００４７】
図４Ｄにおいて図示する実施形態において、黒色の正方形は、ＴＰＶ−ｐ２ＫＯ／Δ１５ＬΔ６６Ｒを用いて処置したＤ群のマウスの腫瘍増殖の百分率、および対照Ａ群のマウスの腫瘍増殖の百分率を説明する。バーは、対照Ａ群の腫瘍増殖およびＤ群の腫瘍増殖についての平均の標準誤差（±１ＳＥＭ）を説明する。
【００４８】
図４Ｅにおいて図示する実施形態において、黒色の正方形は、ＴＰＶ−ｐ２ＫＯ／Δ６６Ｒ／ｍＩＬ−２を用いて処置したＥ群のマウスの平均腫瘍量、および対照Ａ群のマウスの平均腫瘍量を説明する。バーは、対照Ａ群の腫瘍量およびＥ群の腫瘍量についての平均の標準誤差（±１ＳＥＭ）を説明する。
【００４９】
図５Ａ〜図５Ｊに関して、インビボでの黒色腫腫瘍モデルにおける腫瘍抑制における変異ウイルスの有効性である。６〜８週齢の無胸腺ヌードマウスにおいて、背側表面へ５×１０６個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を皮下注射することによって、黒色腫腫瘍を誘導した。腫瘍の大きさが４５±４．５ｍｍ３に到達したとき、マウスを、各群５匹のマウスを含有する対照群または実験群へと無作為に分けた（ｎ＝５）。実験群のマウスを５×１０６ｐｆｕのウイルスの腫瘍内注射で処置したのに対し、偽の群のマウスには媒体のみを腫瘍内注射した。腫瘍量は、デジタルカリパスを用いて毎日測定した。ここで示す各グラフにおいて、ｙ軸は腫瘍増殖の平均百分率（％）を表し、ｘ軸は時間（ウイルス治療処置後の日数）である。実験群はすべて、マウスを媒体注射のみで処置した偽の群と比較する。バーは、平均の標準誤差（±１ＳＥＭ）を示す。星印（＊）で示された地点は、対照から有意に低減した腫瘍増殖を指す（Ｐ≦０．０５）。星印は、有意性があった場合に３日ごとに標識した。
【００５０】
図５Ａにおいて図示する実施形態において、黒色の正方形は、ｗｔＴＰＶで処置したＡ群のマウスの平均腫瘍量、および対照Ａ群のマウスの平均腫瘍量を説明する。バーは、対照Ａ群の腫瘍量およびＡ群の腫瘍量についての平均の標準誤差（±１ＳＥＭ）を説明する。
【００５１】
図５Ｂにおいて図示する実施形態において、黒色の正方形は、ＴＰＶ−ｐ２ＫＯ／Δ６６Ｒ／ｍＣＣＬ２で処置したＢ群のマウスの平均腫瘍量、および対照Ａ群のマウスの平均腫瘍量を説明する。バーは、対照Ａ群の腫瘍量およびＢ群の腫瘍量についての平均の標準誤差（±１ＳＥＭ）を説明する。
【００５２】
図５Ｃにおいて図示する実施形態において、黒色の正方形は、ＴＰＶ−ｐ２ＫＯ／Δ６６Ｒを用いて処置したＣ群のマウスの平均腫瘍量、および対照Ａ群のマウスの平均腫瘍量を説明する。バーは、対照Ａ群の腫瘍量およびＣ群の腫瘍量についての平均の標準誤差（±１ＳＥＭ）を説明する。
【００５３】
図５Ｄにおいて図示する実施形態において、黒色の正方形は、ＴＰＶ−ｐ２ＫＯ／Δ６６Ｒ／ｍＩＬ２で処置したＤ群のマウスの平均腫瘍量、および対照Ａ群の平均腫瘍量を説明する。バーは、対照Ａ群の腫瘍量およびＤ群の腫瘍量についての平均の標準誤差（±１ＳＥＭ）を説明する。
【００５４】
図５Ｅにおいて図示する実施形態において、黒色の正方形は、ＴＰＶ−ｐ２ＫＯ／Δ６６Ｒ／ｍＧＭＣＳＦで処置したＥ群のマウスの平均腫瘍量、および対照Ａ群のマウスの平均腫瘍量を説明する。バーは、対照Ａ群の腫瘍量およびＥ群の腫瘍量についての平均の標準誤差（±１ＳＥＭ）を説明する。
【００５５】
図５Ｆにおいて図示する実施形態において、黒色の正方形は、ＴＰＶ−ｐ２ＫＯ／Δ２Ｌで処置したＦ群のマウスの平均腫瘍量、および対照Ａ群のマウスの平均腫瘍量を説明する。バーは、対照Ａ群の腫瘍量およびＦ群の腫瘍量についての平均の標準誤差（±１ＳＥＭ）を説明する。
【００５６】
図５Ｇにおいて図示する実施形態において、黒色の正方形は、ＴＰＶ−ｐ２ＫＯ／Δ６６Ｒ／ＦｌｉＣで処置したＧ群のマウスの平均腫瘍量、および対照Ａ群のマウスの平均腫瘍量を説明する。バーは、対照Ａ群の腫瘍量およびＧ群の腫瘍量についての平均の標準誤差（±１ＳＥＭ）を説明する。
【００５７】
図５Ｈにおいて図示する実施形態において、黒色の正方形は、ＴＰＶ−ｐ２ＫＯ／Δ６６Ｒ／Δ２Ｌで処置したＨ群のマウスの平均腫瘍量、および対照Ａ群のマウスの平均腫瘍量を説明する。バーは、対照Ａ群の腫瘍量およびＨ群の腫瘍量についての平均の標準誤差（±１ＳＥＭ）を説明する。
【００５８】
図５Ｉにおいて図示する実施形態において、黒色の正方形は、ＴＰＶ−ｐ２ＫＯ／Δ６６Ｒ／Δ２Ｌ／ＦｌｉＣで処置したＩ群のマウスの平均腫瘍量、および対照Ａ群のマウスの平均腫瘍量を説明する。バーは、対照Ａ群の腫瘍量およびＩ群の腫瘍量についての平均の標準誤差（±１ＳＥＭ）を説明する。
【００５９】
図５Ｊにおいて図示する実施形態において、黒色の正方形は、ＴＰＶ−ｐ２ＫＯ／Δ１５Ｌで処置したＪ群のマウスの平均腫瘍量、および対照Ａ群のマウスの平均腫瘍量を説明する。バーは、対照Ａ群の腫瘍量およびＪ群の腫瘍量についての平均の標準誤差（±１ＳＥＭ）を説明する。
【００６０】
本明細書での使用のための組換えＴＰＶの１つの特に好ましい実施形態は、二重ノックアウトバックグラウンド（Δ６６ＲおよびΔ２Ｌ）へｆｌｉＣ導入遺伝子を付加した組換えＴＰＶである。我々の結果は、ｆｌｉＣ導入遺伝子を発現した２Ｌおよび６６Ｒの両方について欠失した組換えＴＰＶが、ＨＣＴ１１６腫瘍異種移植の際に頑強で持続性のある治療効果を生じたことを実証する。本明細書での使用のための組換えＴＰＶの別の好ましい実施形態は、単一ノックアウトウイルス（Δ６６Ｒ）へｆｉｌＣ導入遺伝子を付加した組換えＴＰＶである。単一ノックアウト組換えＴＰＶ実施形態（ＴＰＶ−ｐ２ＫＯ／Δ６６ＲおよびＴＰＶ−ｐ２ＫＯ／Δ２Ｌ）はいずれも、腫瘍量の統計的に有意な低減を少なくとも２つの時点で示し、各場合において、観察された腫瘍量の有意な低減は、ウイルス治療接種の時点から時間的に離れていた。単一ノックアウト組換えＴＰＶはいずれも、これらのより後期の時点での効果に至る傾向があるようであった。実際、ＴＰＶ／ｅｇｆｐウイルスを除き、検査した組換えＴＰＶの実施形態はすべて、ある程度の腫瘍切除を生じるようであり、先に言及した組換えＴＰＶが好ましかった。Ｔ細胞依存性養子免疫応答は、ヌードマウスにおいて重度に損なわれたので、本明細書で説明する例は、生得的免疫応答が対象における腫瘍量を低減させることが潜在的にできることを実証しており、それゆえ生得的免疫応答活性化因子を備えた組換えＴＰＶが免疫不全症候群に罹患している対象において有用であると予想される。それゆえ、本発明者らは、生得的免疫応答の活性化因子を備えたＯＶも、免疫不全症候群に罹患している個体において有用であろうと結論付ける。
【００６１】
高度に保存された病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）として、フラジェリンは、サイトソル免疫監視に関与する検出因子の分子についての標的である。例えば、Ｎｏｄ様受容体ＮＣＬＲ４（Ｉｐａｆとしても公知）によるフラジェリンの検出は、Ｉｐａｆインフラマソームの活性化を誘起し、これが順に、マクロファージにおけるカスパーゼ１とサイトカインであるインターロイキン１β（ＩＬ−１β）の成熟化とを活性化する。ＯＶ感染の時間経過において生じたＦｌｉＣの予想される量は少ないと予想されるが、マウスにおいて、尾静脈注射によって投与される微量の細菌フラジェリン（≦５μｇ／個体）でさえ、サイトカインであるＴＮＦ、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、およびケモカインであるＭＩＰ−２（ＩＬ−８）の包括的な（すなわち、器官および血漿のいずれにもおける）上昇、ならびにＭＥＫ細胞内シグナル伝達経路の変化を生じる。哺乳類細胞におけるＦｌｉＣの作用はそれゆえ、ＴＬＲ系ＰＡＭＰ検出因子とは部分的に無関係であり、いまなお完全に説明されてはいない。しかしながら、本明細書で説明する結果に基づいて、ＦｌｉＣを発現する組換えＴＰＶによる生得的免疫応答の活性化は、未処置の生得的免疫応答を有するヌードマウスにおける腫瘍量の低減に寄与するようである。
【００６２】
表２、本明細書の説明、および図面において表されるように、ＴＰＶ組換え体の各々は、ｐ２ＫＯという名称を用いてまたはそれなしで表され得る。例えば、ＴＰＶ−ｐ２ＫＯ／Δ６６Ｒはまた、ＴＰＶ／Δ６６Ｒとして本明細書で等しく呼ばれ得る。切除／挿入について本明細書で説明するｐ２ＫＯ法は、制限しているものとは意味されず、ゲノムから遺伝子を切除することまたは導入遺伝子をゲノム内へ挿入することについて公知のいずれかの方法を使用して、ＴＰＶ組換え体を形成することができることは理解される。例および発明を実施するための形態において説明するように、本明細書に提供される遺伝子のいずれかが切除され得および／またはいずれかの順序でＴＰＶゲノムへ付加され得る。例えば、ポックスウイルス、特にヤタポックスウイルス属のポックスウイルスは、６６Ｒ、２Ｌ、および／または１５Ｌ遺伝子が欠失され得、さらに、また、例えば、ｍＧＭ−ＣＳＦ、ｍＭＣＰ−１、ｆｌｉＣ、ｍＩＬ−２、ｍＣＣＬ２、および／またはｍＧＭＣＳＦ導入遺伝子が付加され得る。本明細書に説明する遺伝子のいずれかの組み合わせは、切除され得および／または所望のＴＰＶ組換え体へ付加され得る。いくつかの実施形態において、皮膚癌または黒色腫は、ｗｔ−ＴＰＶ、ＴＰＶ／Δ６６Ｒ、ＴＰＶ／Δ６６Ｒ／ｍＧＭＣＳＦ、ＴＰＶ／Δ１５Ｌ、ＴＰＶ／Δ６６Ｒ／Δ１５、ＴＰＶ／Δ６６Ｒ／ｍＩＬ−２、および／またはこれらの組み合わせを用いて本明細書に説明するとおり治療され得る。他の実施形態において、乳癌は、ｗｔ−ＴＰＶ、ＴＰＶ／Δ６６Ｒ、ＴＰＶ／Δ２Ｌ、ＴＰＶ／Δ６６Ｒ／Δ２Ｌ、ＴＰＶ／Δ６６Ｒ／ＦｌｉＣ、ＴＰＶ／Δ６６Ｒ／Δ２Ｌ／ＦｌｉＣ、ＴＰＶ／Δ６６Ｒ／ｍＧＭＣＳＦ、ＴＰＶ／Δ６６Ｒ／ｍＣＣＬ２（ｍＭＣＰ１）、ＴＰＶ／Δ１５Ｌ、ＴＰＶ／Δ６６Ｒ／Δ１５、ＴＰＶ／Δ６６Ｒ／ｍＩＬ−２、および／またはこれらの組み合わせを用いて本明細書に説明するとおり治療され得る。
さらに他の実施形態において、大腸癌は、ＴＰＶ／Δ６６Ｒ、ＴＰＶ／Δ２Ｌ、ＴＰＶ／Δ６６Ｒ／Δ２Ｌ、ＴＰＶ／Δ６６Ｒ／ＦｌｉＣ、ＴＰＶ／Δ６６Ｒ／Δ２Ｌ／ＦｌｉＣ、ＴＰＶ／Δ６６Ｒ／ｍＧＭＣＳＦ、ＴＰＶ／Δ６６Ｒ／ｍＣＣＬ２（ｍＭＣＰ１）、および／またはこれらの組み合わせを用いて本明細書に説明するとおり治療され得る。
【００６３】
非限定的な実施形態のリスト
実施形態Ａは、少なくとも１つの変異を有するヤタポックスウイルス属のウイルスを含む、免疫系を有する対象における癌細胞を治療するための組成物であり、その少なくとも１つの変異は、そのウイルスによるＴＮＦ結合タンパク質の発現抑制を結果的に生じる。
【００６４】
ＴＮＦ結合タンパク質の発現を抑制するウイルスがＭＨＣ−１軽鎖へ結合することができる構造を有する、実施形態Ａの組成物。
【００６５】
ウイルスが細菌フラジェリンタンパク質を発現する導入遺伝子をコードするヤタポックスウイルスである、実施形態Ａまたは介在特徴のうちの１つ以上を有する実施形態Ａの組成物。
【００６６】
重合したフラジェリンタンパク質が細菌フラジェリンの主要成分である、実施形態Ａまたは介在特徴のうちの１つ以上を有する実施形態Ａの組成物。
【００６７】
導入遺伝子がネズミチフス菌遺伝子（「ｆｌｉＣ」）の産物である、実施形態Ａまたは介在特徴のうちの１つ以上を有する実施形態Ａの組成物。
【００６８】
ウイルスがタナポックスウイルス（ＴＰＶ）であり、少なくとも１つの変異が、ＴＰＶの２Ｌ遺伝子によってコードされるＴＮＦ結合タンパク質の発現を抑制する、実施形態Ａまたは介在特徴のうちの１つ以上を有する実施形態Ａの組成物。
【００６９】
ウイルスが第２の変異を有し、第２の変異が、ウイルスによるチミジンキナーゼの発現抑制を結果的に生じる、実施形態Ａまたは介在特徴のうちの１つ以上を有する実施形態Ａの組成物。
【００７０】
ウイルスがタナポックスウイルス（ＴＰＶ）であり、第２の変異が、ＴＰＶの６６Ｒ遺伝子によってコードされたチミジンキナーゼの発現を抑制する、実施形態Ａまたは介在特徴のうちの１つ以上を有する実施形態Ａの組成物。
【００７１】
ウイルスが癌細胞のアポトーシスを増大させるよう導入遺伝子をさらにコードする、実施形態Ａまたは介在特徴のうちの１つ以上を有する実施形態Ａの組成物。
【００７２】
ウイルスが、対象の免疫系を活性化するよう導入遺伝子をさらにコードする、実施形態Ａまたは介在特徴のうちの１つ以上を有する実施形態Ａの組成物。
【００７３】
ウイルスが、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光レポーターを導入するよう導入遺伝子をさらにコードする、実施形態Ａの組成物または介在特徴のうちの１つ以上を有する実施形態Ａの組成物。
【００７４】
ウイルスが、緑色蛍光タンパク質蛍光レポーターを導入するよう導入遺伝子をさらにコードする、実施形態Ａまたは介在特徴のうちの１つ以上を有する実施形態Ａの組成物。
【００７５】
実施形態Ｂは、少なくとも１つの変異を有するヤタポックスウイルス属のウイルスを含む、免疫系を有する対象における癌細胞を治療するための組成物であり、その少なくとも１つの変異は、チミジンキナーゼ（ＴＫ）の発現抑制を結果的に生じる。
【００７６】
ウイルスが、細菌フラジェリンタンパク質を発現する導入遺伝子をコードするポックスウイルスである、実施形態Ｂの組成物。
【００７７】
導入遺伝子が、ネズミチフス菌（「ｆｌｉＣ」）の産物である、実施形態Ｂまたは介在特徴のうちの１つ以上を有する実施形態Ｂの組成物。
【００７８】
ウイルスがタナポックスウイルス（ＴＰＶ）であり、少なくとも１つの変異がＴＰＶの６６Ｒ遺伝子によってコードされるチミジンキナーゼの発現を抑制する、実施形態Ｂまたは介在特徴のうちの１つ以上を有する実施形態Ｂの組成物。
【００７９】
ウイルスが第２の変異を有し、第２の変異が、ウイルスによるＴＮＦ結合タンパク質の発現抑制を結果的に生じる、実施形態Ｂまたは介在特徴のうちの１つ以上を有する実施形態Ｂの組成物。
【００８０】
ウイルスがタナポックスウイルス（ＴＰＶ）であり、第２の変異が、ＴＰＶの２Ｌ遺伝子によってコードされるＴＮＦ結合タンパク質の発現を抑制する、実施形態Ｂまたは介在特徴のうちの１つ以上を有する実施形態Ｂの組成物。
【００８１】
ＴＮＦ結合タンパク質の発現を抑制するウイルスが、ＭＨＣ−１軽鎖へ結合することができる構造を有する、実施形態Ｂまたは介在特徴のうちの１つ以上を有する実施形態Ｂの組成物。
【００８２】
ウイルスが、癌細胞のアポトーシスを亢進するよう導入遺伝子をさらにコードする、実施形態Ｂまたは介在特徴のうちの１つ以上を有する実施形態Ｂの組成物。
【００８３】
ウイルスが、対照の免疫系を活性化するよう導入遺伝子をさらにコードする、実施形態Ｂまたは介在特徴のうちの１つ以上を有する実施形態Ｂの組成物。
【００８４】
実施形態Ｃは、ＭＨＣ−１軽鎖へ結合することができる構造を有するＴＮＦ結合タンパク質の発現を抑制するようヤタポックスウイルス属のウイルスを変異させることによって、そのウイルスを改変することと、改変されたヤタポックスウイルス属のウイルスを対象へ全身投与することとを含む、対照における癌細胞へ少なくとも１つの遺伝子を送達する方法である。
【００８５】
少なくとも１つの遺伝子が、癌細胞のアポトーシス亢進を結果的に生じるか、または対象における免疫応答を活性化する、ウイルスにおける少なくとも１つの遺伝子をコードすることによってウイルスを改変することをさらに含む、実施形態Ｃの方法。
【００８６】
実験の詳細な説明：
米国培養細胞系統保存機関製のＯＭＫ（ヨザル腎）細胞、ＨＣＴ１１６、ＳＫ−ＭＥＬ−３、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＣＯＬＯ２０５、ＳＷ１４６３およびＷｉＤｒ細胞株を用いた（それぞれ、米国培養細胞系統保存機関製品名ＣＲＬ−１５５６、ＣＣＬ−２４７、ＣＣＬ−２２２、ＣＣＬ−２３４およびＣＣＬ−２１８として入手可能）。ＯＭＫ細胞は、本明細書で説明するウイルス増幅およびウイルス力価測定に使用した。その細胞株を、１０％（容積／容積）のウシ胎仔血清（Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓから入手可能）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能）および５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン硫酸塩（ＡＭＲＥＳＣＯから入手可能）を補充したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能）からなる完全増殖培地中で増殖させた。ウイルス感染後、ウシ胎仔血清の濃度が２％まで低減したこと以外は増殖培地と同一である維持培地中で細胞株の細胞単層を維持した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２雰囲気中でインキュベートした。細胞計数および細胞生存アッセイを、０．２％（重量／容積）トリパンブルーを用いて、改良されたＮｅｕｂａｕｅｒ血球計で実施した。ＳＫ−ＭＥＬ−３黒色腫細胞は、１５％ＦＢＳ含有ＭｃＣｏｙ５Ａ培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）からなる増殖培地中で培養した。血清非含有ＭｃＣｏｙ５Ａ培地は、黒色腫の増殖のための飢餓培地として用いた。
【００８７】
実験１：対照
野生型ＴＰＶ（ケニア株）は、Ｊｏｓｅｐｈ  Ｅｓｐｏｓｉｔｏ博士（Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ，ＵＳＡ所属）によって提供された。野生型ＴＰＶは、蛍光レポーターＥＧＦＰを発現する対照組換えＴＰＶ（他の遺伝子改変なし）を形成するよう、本明細書で説明するとおり改変した。簡潔には、２つの同一のワクシニアウイルス（ＶＡＣＶ）由来初期／後期合成プロモーターを使用して、ｐ２ＫＯ法を用いた対照組換えＴＰＶにおける蛍光レポーター遺伝子の発現を駆動した。ｐ２ＫＯ発現カセット（左右の隣接部、＋介在するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）およびプロモーターを含んでいる）を野生型ＴＰＶのウイルスゲノムへ、トランスフェクション／感染手順の間に相同組換え二重乗換え事象を経て転移させた。組換えのための隣接領域を５’−（左）隣接部上のＳａｃＩ制限部位とＮｏｔＩ制限部位の間で、および３’−（右）隣接部上のＥｃｏＲＩ制限部位とＨｉｎｄＩＩＩ制限部位の間で、ｐ２ＫＯベクターへとライゲートした。
【００８８】
実験２：トランスフェクション／感染手順
トランスフェクション／感染手順を使用して、これらの例となる実施形態において使用する組換えＴＰＶを作製した。簡潔には、トランスフェクション試薬のトランスフェクションプロトコルの製造元により、精製されたｐ２ＫＯベクター１μｇあたり１μｌの濃度のｊｅｔＰＲＩＭＥトランスフェクション試薬（ＰｏｌｙＰｌｕｓ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ＳＡから入手可能）を用いて、ＯＭＫ細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションのおよそ５時間後、ＯＭＫ単層に野生型ＴＰＶケニア株（非蛍光）の細胞１個当たり１プラーク形成単位（ｐｆｕ／個）を接種した。接種５日後、感染した単層を、氷上でゴム製細胞掻把装置を用いて掻把し、−８０℃での３周期の凍結解凍へ供し、４℃で１５秒間超音波処理し、連続希釈し、およそ９０％コンフルエンスの新鮮に播種したＯＭＫ単層上へ播種し、０．５％メチルセルロースを含有する維持培地と重ね合わせた。十分に分離された蛍光性プラークを拾い上げ、それぞれを少なくとも３回のプラーク精製へ供して、可視化していない野生型（非蛍光）プラークを含有するウイルス調製物を作製した。試料は培養物中で野生型プラークが見えない場合にのみ純粋とみなし、野生型ＴＰＶ  ＤＮＡはＰＣＲによって検出できなかった。
【００８９】
実験３：ウイルス導入遺伝子発現の確認
ＦｌｉＣ発現の確認は、ウェスタンブロットによって行った。ｍＣＣＬ２およびｍＧＭ−ＣＳＦ発現の確認は、Ｌｕｍｉｎｅｘ多重分析物サイトカイン検出アッセイ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍａｒｙｌａｎｄサイトカイン中枢研究室によって実施）によって行った。分析用の試料は、１０ｐｆｕ／個を用いたＴＰＶ−ｐ２ＫＯ／Δ６６Ｒ／ｍＣＣＬ２、ＴＰＶ−ｐ２ＫＯ／Δ６６Ｒ／ｍＧＭ−ＣＳＦ、およびＴＰＶ−ｐ２ＫＯ／Δ２Ｌ／Δ６６Ｒ／ｆｌｉＣを、６０ｍｍの組織培養皿（細胞増殖に利用可能な２２．１ｃｍ２の表面積を有する）中の半コンフルエントのＯＭＫ細胞単層に感染させることによって調製した。上清（３ｍｌ／皿）および細胞質抽出物を、感染後の示された時点で調製した。ＦｌｉＣ検出については、抽出した可溶化物をウェスタンブロットによって分析した。タンパク質をＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから入手可能）へ転移させ、１：２０００希釈（容積／容積）の抗ＦｌｉＣモノクローナル抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから入手可能）でプローブ処理した。５％（重量／容積）の粉乳をブロッキング剤として使用した。２次抗体は、１：２５００希釈で使用するセイヨウワサビペルオキシダーゼへ結合させたモノクローナル抗マウスＩｇＧ（Ａｂｃａｍから入手可能）とした。可視化は、ＥＣＬ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ／Ｐｉｅｒｃｅ）によってであった。ｐ２ＫＯベクターを含有するがｆｌｉＣ、ｍＧＭ−ＣＳＦ、またはｍＣＣＬ２インサートを含有していないＴＰＶ組換え体の実施形態は、対照として供した。
【００９０】
実験４：細胞密度の測定
４種類のヒト大腸癌細胞株およびＯＭＫ細胞対照を１２ウェルプレート（細胞株１種類当たり３ウェル）へ、翌日、細胞が９０％コンフルエンスに到達するように個別に接種した。各ウェル（細胞増殖について利用可能な３．８ｃｍ２の表面積を有する）をトリプシン処理し、計数し、トリパンブルー排除によって生存度をスコア化した。このことは、核細胞株について指定された数のウイルスｐｆｕ／個の実験が正確となることを確保するために行った。
【００９１】
ヒト黒色腫癌株については、細胞を３７℃、５％ＣＯ２雰囲気中でインキュベートした。細胞計数および生存度アッセイはすべて、改良型Ｎｅｕｂａｕｅｒ血球計および正常塩類溶液中の０．２％（ｗ／ｖ）トリパンブルーを用いて実施した。
【００９２】
ヒト乳癌株については、細胞を３７℃、５％ＣＯ２雰囲気中でインキュベートした。細胞計数および生存度アッセイはすべて、細胞増殖を測定するためのＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８を用いて実施した。このキットは、３Ｈ−チミジン組み込みについての置き換えである（ＣＣＫ−８、Ｄｏｊｉｎｄｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，３０Ｗｅｓｔ  Ｇｕｄｅ  Ｄｒ．，Ｓｕｉｔｅ２６０，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ２０８５０）。
【００９３】
実験５：ウイルス力価滴定
試料中に存在する生組換えＴＰＶビリオンの数をアッセイするために、プラークアッセイを用いた。簡潔には、ウイルス試料を氷上で１５秒間超音波処理し、維持培地中で連続希釈し、６ウェルプレート中でほぼコンフルエントなＯＭＫ単層へと接種した（試料の各希釈につきｎ＝３）。ウイルスを室温で穏やかに１時間揺らしながら吸着させておいた。次に、接種物を取り出し、各ウェルを１ｍｌの事前に加温しておいた維持培地で２回穏やかに洗浄した。洗浄後、２ｍｌの重層培地を添加し、感染したＯＭＫ単層を３７℃で１０日間インキュベートした。次に、重層培地を取り出し、単層を染色した（３７％ホルムアルデヒド中の０．１％クリスタルバイオレットを使用）。プレートを蒸留水で洗浄し、風乾させ、プラークを計数した。
【００９４】
実験６：動物
大腸癌株については、雄新生児無胸腺ヌード（Ｎｕｄｅ−Ｆｏｘｎ１ｎｕ／ｎｕ）マウス（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓを通じて入手可能）を４週齢で受領し、実験の開始前に１週間馴化させておいた。マウスを１２時間／１２時間の明暗周期の下で透明なポリカーボネートケージ中で個々に飼育した。食餌および水は自由に入手可能とした。動物飼育条件、操作および処置はすべて、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｍｉｃｈｉｇａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの施設実験動物委員会によって承認されたプロトコル（ＩＡＣＵＣプロトコル番号１３−０７−０１）に従って実施した。
【００９５】
乳癌株および黒色腫癌株については、雄無胸腺ヌードマウス（Ｃｒｌ：ＮＵ（ＮＣｒ）−Ｆｏｘｎ１ｎｕ）をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ社（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）から６〜８週齢で購入した。マウスは、病原体非含有動物施設において、食餌および水が入手可能な状態で個々に飼育した。動物飼育条件、操作および処置はすべて、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｍｉｃｈｉｇａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの施設実験動物委員会によって承認されたプロトコル（ＩＡＣＵＣプロトコル番号１３−０７−０１）に従って実施した。
【００９６】
実験７：ヌードマウスにおける腫瘍異種移植片についての細胞株の選択
無胸腺ヌードマウスにおけるインビボ試験を開始する前に、本発明者らは、ＴＰＶ／ｅｇｆｐを感染させたときに、ｈＣＲＣ細胞株が最高ウイルス産生度を有していると判定した。ＴＰＶ／ｅｇｆｐは、４つのｈＣＲＣ由来細胞株、すなわち、ＨＣＴ１１６、ＳＫ−ＭＥＬ−３、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＷｉＤｒ、ＳＷ１４６３およびＣＯＬＯ２０５における複製する能力についてアッセイした。ＯＭＫ細胞は、陽性対照として用いた。各細胞株を１２ウェル組織培養プレート（細胞増殖に利用可能な３．８ｃｍ２の表面積を有する）へと播種し、０．１ｐｆｕ／個のＴＰＶ／ｅｇｆｐを各ウェルへと接種した。可溶化物を感染後４日間収集し、プラークアッセイによってアッセイした。
【００９７】
実験８：腫瘍誘導および測定
腫瘍を無胸腺ヌードマウスにおいて、およそ第１腰椎を覆う背側面上への５×１０６個のＨＣＴ１１６細胞の皮下注射によって作製した。各注射に続いて、トリパンブルー排除による生存度の評価を行って、細胞が注射時および注射後に生存していることを確認した。いったん可視化すると、腫瘍を、デジタルカリパス（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈモデル６ＺＢＴＭＣＯ）を用いて、長軸（長さ）、短軸（幅）およびｚ次元（高さ）に沿って測定した。次に、腫瘍量を、本明細書に呈示する式１を用いて概算した。腫瘍の大きさの概算値が７５ｍｍ３に到達するかまたは上回ると、各動物を対照群（ａ群）または７つの実験群（ｂ群〜ｈ群）のうちの１つへと無作為に分けた。
【００９８】
実験９：ヌードマウスにおけるＨＣＴ１１６異種移植片のウイルス療法
各処置群は、５匹または６匹の腫瘍保持無胸腺ヌードマウスから構成された。腫瘍量がいったん７５ｍｍ３に到達したかまたはそれを超過したら、単回のウイルス治療注射を各腫瘍保持マウスへ投与した。ウイルス治療注射は、正常塩類溶液中に希釈した粗ＯＭＫ細胞可溶化液１００μｌ中に懸濁した５×１０６ｐｆｕの単回注射物として、腫瘍内に付与した。その後３日間間隔で各マウスの体重および腫瘍量を測定および記録した。データは、合計３９日間にわたって１３の時点について収集した。組換えＴＰＶ注射の投与によって生じる予期せぬ炎症または他の注射効果について制御するために、ビヒクル対照群を使用し、本明細書ではａ群として示した。この対照群は、ＨＣＴ１１６細胞を受けるが、偽の組換えＴＰＶ注射のみ（１００μｌのビヒクルのみ）を受ける動物からなった。この群は、「偽のウイルス療法群」またはＡ群と称する。実験群はすべて、組換えＴＰＶの治療有効性を評価するためにＡ群と比較した。
【００９９】
処置効果を評価するために、マン・ホイットニーＵ検定（時にウィルコクソン順位和検定と称する）を用いて各実験群を対照群と比較した。組換えＴＰＶを用いた処置は、群内での平均腫瘍量が偽注射対照と比較したときに有意に低減していた場合、有意な治療効果を生じたと判断した。ｐ＜０．０５有意性レベルを本試験中、使用した。
【０１００】
結果：ｐ２ＫＯポックスウイルス切除／挿入ベクター
ｐ２ＫＯポックスウイルス切除／挿入ベクターは、いずれかの所望のＴＰＶ遺伝子（複数可）を同時に切除し、切除した遺伝子（複数可）を、所望の発現した蛍光レポーターおよび／または所望の発現させる導入遺伝子と置き換えるための迅速で信頼可能な方法を提供するよう設計および構築された。培養細胞におけるウイルス感染の可視化は、蛍光レポーターであるｍＣｈｅｒｒｙおよびＥＧＦＰの包含によって大いに容易となった。２つの蛍光レポーターの使用で、ｆｌｉＣ挿入のある二重欠失した組換えＴＰＶ（ＴＰＶ−ｐ２ＫＯ／Δ２Ｌ／Δ６６Ｒ／ｆｌｉＣ）を同定および単離することができた。ＯＭＫ細胞単層上でのＴＰＶ−ｐ２ＫＯ／Δ２Ｌ／Δ６６Ｒ／ｆｌｉＣウイルスによる感染によって生じたウイルスプラークは図３に示されており、それぞれｍＣｈｅｒｒｙおよびＥＧＦＰと会合した鮮やかな橙赤色および緑色の同時発現を実証している。
【０１０１】
基本ベクター（すなわち、蛍光レポーターは有するが、発現することになっている任意の導入遺伝子は有していない）の全体的な配列は、Ｍ１３順方向プライマー結合配列と逆方向プライマー結合配列の間の領域のＰＣＲ増幅によって生じた増幅産物のＤＮＡ配列決定によって確認された。ｍＣＣＬ２、ｍＧＭ−ＣＳＦ、またはｆｌｉＣをコードするＯＲＦの挿入は、トランスフェクション／感染手順において使用される前の正確な配置および向きを確定するためにｐ２ＫＯベクターのＤＮＡ配列決定によって確認した。組換えＴＰＶは、２Ｌ、６６Ｒのいずれか、または両方について組換えウイルスＤＮＡをテンプレートとして用いるＰＣＲ産物のアガロースゲル分析によってノックアウトであると確認された。
【０１０２】
結果：トランスフェクション／感染
接種後４〜５日間までに、蛍光レポーターの発現は、ＯＭＫ細胞単層細胞単層において明白であり、野生型ＴＰＶ感染細胞のサイトソル区画におけるｐ２ＫＯベクターからの遺伝子発現を示した。ｐ２ＫＯベクターをトランスフェクトしたが、野生型ＴＰＶをその後接種していない対照培養物において、蛍光は観察されなかった。次に、ウイルス試料の純度を、さらなる使用の前に、組換えウイルスゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いるＰＣＲによって確認した。ウイルスＤＮＡ試料はすべて、いずれの組換えＴＰＶにおいても検出されないアンピシリン耐性遺伝子の存在についてプローブ処理した。このことは、組換えＴＰＶがすべて、単回乗換え事象よりもむしろ二重乗換え事象から結果的に生じたことを示す。
【０１０３】
結果：ウイルス導入遺伝子発現の確認
挿入したＯＲＦが、組換えＴＰＶ（ＴＰＶ−ｐ２ＫＯ／Δ６６Ｒ／ｍＣＣＬ２、ｐ２ＫＯ／Δ６６Ｒ／ｍＧＭ−ＣＳＦ、およびＴＰＶ−ｐ２ＫＯ／Δ２Ｌ／Δ６６Ｒ／ｆｌｉＣを含む）に感染した細胞において発現したことを実証するために、６０ｍｍ皿（２０ｃｍ２の増殖面積を有する）の中のＯＭＫ単層に関連する組換えＴＰＶを摂取して、細胞可溶化物および培養上清における導入遺伝子の発現について、すでに説明したとおりアッセイした。ＴＰＶ−ｐ２ＫＯ／Δ２Ｌ／Δ６６Ｒ／ｆｌｉＣを摂取したＯＭＫ細胞由来の可溶化物のウェスタンブロットを、モノクローナル抗ＦｌｉＣ抗体を用いてプローブ処理した。見かけの分子量が５０ｋＤａの単一のバンドを観察し、予想したとおり、ＦｌｉＣ陽性対照と同一であった。このバンドの強度は、感染３日後と６日後の間に漸増した。ＦｌｉＣ導入遺伝子は、偽の感染細胞においては検出されなかった。感染した細胞の可溶化物およびそれらの培養上清をアッセイして、ｍＣＣＬ２およびｍＧＭ−ＣＳＦの存在を判定した。導入遺伝子はいずれも非常に多く発現し、感染した細胞上清中で多量に存在した（４．９ｎｇ／ｍｌのｍＣＣＬ２、および１０．０ｎｇ／ｍｌ超のｍＧＭ−ＣＳＦ）。ｍＧＭ−ＣＳＦおよびｍＣＣＬ２はいずれも、感染細胞または対照非感染細胞の細胞質抽出物において弱く検出可能であるかまたは顕出不可能に過ぎず、ＴＰＶに感染した細胞においては、これらの導入遺伝子を発現していなかった。このデータは、ｍＣＣＬ２およびｍＧＭ−ＣＳＦのいずれもが、予期せぬことに、感染細胞から分泌されたのに対し、ＦｌｉＣは、これも予期せぬことに、感染細胞の細胞質内へと蓄積したことを示す。
【０１０４】
結果：細胞密度の測定
本試験において使用する各細胞株は、ほぼコンフルエンスでそのコンフルエント密度（個／ｃｍ２）が測定された。ＯＭＫ対照細胞株は、およそ１．０×１０５個／ｃｍ２のコンフルエント密度を有していた。大腸癌細胞株について測定した密度は、次のとおりであった。ＨＣＴ１１６は、およそ１．４×１０５個／ｃｍ２のコンフルエント密度を有しており、ＣＯＬＯ２０５は、およそ６．９×１０５個／ｃｍ２のコンフルエント密度を有しており、ＳＷ１４６３は、およそ４．５×１０５個／ｃｍ２のコンフルエント密度を有しており、ＷｉＤｒは、およそ２．５×１０５個／ｃｍ２のコンフルエント密度を有していた。これらの値は、これらの細胞株を接種するときに使用するｐｆｕの数を計算するために使用した。
【０１０５】
結果：ヌードマウスにおけるＨＣＴ１１６異種移植片のウイルス療法
無胸腺ヌードマウスにおけるインビボ試験を開始する前に、ＯＭＫ細胞は、先に説明したとおり、ＴＰＶ／ｅｇｆｐに感染したとき、最高ウイルス産生度のｈＣＲＣ細胞株であることがわかった。ＯＭＫ細胞は、最高の宿主細胞であり、およそ３×１０６個の後代ｐｆｕ／ウェルの産生を可能にした。検査したｈＣＲＣ細胞株のうち、ＨＣＴ１１６は、およそ７×１０５後代ｐｆｕ／ウェルの平均収量（ｎ＝３）で最も多量の後代のビリオンを生じた。本発明者らは、それゆえ、本試験のインビボの相についてＨＣＴ１１６を選択した。
【０１０６】
組換えＴＰＶの腫瘍溶解能を評価するために、腫瘍を無胸腺ヌードマウス（Ｎｕｄｅ−Ｆｏｘｎ１ｎｕ／ｎｕ）において誘導した。ＨＣＴ１１６細胞の生存度計数は、９９％超が注射時に生存していることを実証した。腫瘍は概して、ＨＣＴ１１６細胞の注射後１〜３週間以内に７５ｍｍ３に到達した。ＴＰＶ／Δ６６Ｒ（Ｆ群）、ＴＰＶ／Δ２Ｌ（Ｇ群）、およびＴＰＶ／Δ２Ｌ／Δ６６Ｒ／ｆｌｉＣ（Ｈ群）を用いた処置はすべて、偽注射対照と比較したとき、２つ以上の時点で腫瘍の大きさにおける有意な低減を生じた。ＴＰＶ／Δ２Ｌ処置した腫瘍（Ｇ群）は、２つの時点、すなわち処置３３日後（４７．６％の低減）および３６日後（６５．２％の低減）で偽注射腫瘍よりも有意に小さかった。ＴＰＶ／Δ６６Ｒで処置した腫瘍（Ｆ群）は、２つの時点、すなわち、処置２７日後（３４．９％の低減）および３６日後（５２％の低減）において、偽注射した腫瘍よりも有意に小さかった。ＴＰＶ／Δ２Ｌ／Δ６６Ｒ／ｆｌｉＣで処置した腫瘍（Ｈ群）は、頑強で耐久性のある治療効果を示し、６つの時点、すなわち、処置１５日後（５６．１％の低減）、２１日後（６２．０％の低減）、２４日後（６３．８％の低減）、２７日後（５９．５％の低減）、３３日後（５５．３％の低減）および３６日後（６９．６％の低減）において偽注射した腫瘍と比較するとき、量に有意な低減があった。
【０１０７】
結果：ヌードマウスにおけるＳＬ−ＭＥＬ−３異種移植片のウイルス療法
黒色腫腫瘍を無胸腺ヌードマウスにおいて、肩甲間部における背側面上に５×１０６個のＳＫ−ＭＥＬ−３を皮下注射することを介して誘導した。腫瘍量が４５±４．５ｍｍ３まで発達すると、マウスを４群へ無作為に分け、それぞれ、偽（媒体のみ）、ｗｔＴＰＶ、ＴＰＶΔ６６Ｒ、ＴＰＶΔ１５Ｌ、ＴＰＶΔ１５ＬΔ６６Ｒ、およびＴＰＶΔ６６Ｒ／ｍＩＬ−２の腫瘍内注射で処置した。図４Ａ〜図４Ｅに示されるように、ＴＰＶΔ６６Ｒ／ｍＩＬ−２で処置した動物における腫瘍の平均の大きさは、偽注射で処置したマウスにおけるそれよりも有意に小さかった。さらに、ＴＰＶΔ６６Ｒ／ｍＩＬ−２で処置したマウスの腫瘍量は、ｗｔＴＰＶまたはＴＰＶΔ６６Ｒで処置したマウスのそれよりも小さく、差は統計的に有意であった（Ｐ＜０．０５）。ＴＰＶΔ６６Ｒ／ｍＩＬ−２で処置した腫瘍の平均腫瘍量は、０日後の約４５ｍｍ３（処置当日）から３５日後の６４ｍｍ３まで増大したのに対し、偽の媒体注射で処置した腫瘍の平均腫瘍量は、０日後の４６ｍｍ３から３５日後の３１０ｍｍ３まで増大したｗｔＴＰＶで処置した腫瘍の平均腫瘍量は、０日後の４５ｍｍ３から３５日後の１５３ｍｍ３まで増大したのに対し、ＴＰＶΔ６６Ｒで処置した腫瘍の平均腫瘍量は、０日後の４５ｍｍ３から３５日後の１５５ｍｍ３まで増大した。インビトロでの試験によって示されるｗｔＴＰＶおよびＴＰＶΔ６６Ｒと比較したＴＰＶΔ６６Ｒ／ｍＩＬ−２の減衰した複製動態の点において、インビボでの結果は、直接的なウイルスの細胞溶解に加えて、腫瘍低減のために生得的免疫応答を誘起する上でのＩＬ−２の免疫刺激効果を強く示唆する。
【０１０８】
結果：ヌードマウスにおけるＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植片のウイルス療法
乳癌腫瘍を無胸腺ヌードマウスにおいて、５×１０６個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を肩甲間部における背側面上で皮下注射することを介して誘導した。腫瘍の大きさが４５±４．５ｍｍ３まで発達すると、マウスを４群へ無作為に分け、それぞれ、偽（媒体のみ）、ｗｔＴＰＶ、ＴＰＶ／Δ６６Ｒ／ｍＣＣＬ２（ｍＭＣＰ１）、ＴＰＶ／Δ６６Ｒ、ＴＰＶ／Δ６６Ｒ／ｍＩＬ−２、ＴＰＶ／Δ６６Ｒ／ｍＧＭＣＳＦ、ＴＰＶ／Δ２Ｌ、ＴＰＶ／Δ６６Ｒ／ＦｌｉＣ、ＴＰＶ／Δ６６Ｒ／Δ２Ｌ、ＴＰＶ／Δ６６Ｒ／Δ２Ｌ／ＦｌｉＣ、ＴＰＶ／Δ１５Ｌの腫瘍内注射で処置した。図５Ａ〜図５Ｊに示されるように、組換えＴＰＶで処置した動物における平均腫瘍量は、偽の注射を用いて処置したマウスにおけるそれよりも有意に小さかった。さらに、組換えＴＰＶで処置したマウスにおける腫瘍量は、ｗｔＴＰＶおよび偽の注射で処置したマウスにおけるそれよりも小さく、差は統計的に有意であった（Ｐ＜０．０５）。腫瘍の平均腫瘍量は、図５Ａ〜図５Ｊにおける組換えＴＰＶ変異体の各々について処置した。ＴＰＶ組換え体は、ヒト乳癌細胞において感染および複製することができたが、ＴＫ遺伝子の切除は、そのウイルスの複製能を低減させた。ＴＰＶ組換え体は、用量依存的な様式でヒト乳癌細胞の細胞生存度を有意に低減させ、有意な退縮がｈＴＮＢＣ（２Ｌ）、ＴＰＶ／Δ６６Ｒ／ｍＣＣＬ２（ｍＭＣＰ１）、およびＴＰＶ／Δ６６Ｒ／ｍＩＬ−２組換え体について観察された。インビトロ試験によって示される組換えＴＰＶの減衰した複製動態の点で、インビボの結果は、これらの組換えＴＰＶの免疫刺激効果が、直接的なウイルス細胞溶解に加えて、腫瘍低減について生得的な免疫応答を誘起することを強く示唆している。
【０１０９】
ヒト大腸癌細胞株を用いて初期検査を実施したが、本明細書で説明する薬学的ウイルス療法は、広範な範囲の癌を治療する上での使用について企図されている。本明細書で説明する薬学的組成物を用いて治療されることになっている癌の非限定的なリストには、基底細胞癌、癌腫、絨毛癌、神経膠腫、上皮内腫瘍、白血病、リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、黒色腫、骨髄腫、神経芽腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、ならびに胆道、膀胱、骨、脳、乳房、中枢神経系、子宮頸部、結腸直腸、結合組織、消化器系、子宮内膜細胞、食道、眼、胃、頭頸部、腎臓、咽頭、肝臓、肺、膵臓、前立腺、口腔、卵巣、呼吸器系、皮膚、胃、精巣、甲状腺、子宮、および尿路系の癌が含まれる。
【０１１０】
本明細書で説明する薬学的組成物は、治療有効量で投与されることになっている。本明細書で説明する場合の「治療有効量」という用語は、投与後に所望の治療結果を達成することが有効である薬剤の量を指す。治療有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重、薬剤の形態、ならびに個体において所望の応答を誘起するための剤形の能力などの因子によって患者ごとに変えることができる。治療有効量は、治療効果（例えば、癌細胞増殖の低減）について、いずれかの有害な副作用の存在と共に監視しながら、低く安全な用量で開始して、より多量の用量まで上昇させることによって決定され得る。薬学的組成物は、所望のウイルス治療効果を生じるポックスウイルス、ウイルス核酸、または発現ベクターを含み得る。
【０１１１】
薬学的組成物は、全身性または局所的治療有効量を提供するための、非経口、経口、腸内、頬側、局所、直腸、膣内、経粘膜、表皮、経皮、皮内、眼内、肺内、および皮下投与経路を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で公知のいずれかの適切な剤形または経路を介して投与することができる。薬剤は、特定の投与経路に適した製剤または調製物で対象へ投与されるであろう。薬学的剤形の投与に適した製剤には、限定されるものではないが、エアゾール、分散剤、エマルション、インプラント、リポソーム系製剤、点鼻薬、パッチ、散剤、液剤、スプレー剤、坐剤および懸濁剤が含まれ得る。製剤は単位剤形で呈され得、当該技術分野で公知のいずれかの方法によって調製され得る。これらの製剤または剤形を調製する方法には、本開示のポックスウイルスまたは核酸を、１つ以上の薬学的に許容され得る担体と組み合わせるステップを含み、安定化剤、保存剤、および薬物の細胞内取り込みを支援するトランスフェクション促進剤などだがこれらに限定されない助剤をさらに含み得る。適切な安定化剤は、アルブミン、ＥＤＴＡ、グリシンおよびグルタミン酸一ナトリウムを含み得るが、これらに限定されない。適切な保存剤には、抗生物質、ヒドロキシ安息香酸メチル、フェノール、２−フェノキシエタノール、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、およびチメロサルが含まれ得るが、これらに限定されない。
【０１１２】
薬学的組成物は、治療の必要のある対象の腫瘍部位で標的組織または器官内へと局所的に送達することができる。有効量の組成物は、対象の皮膚を経て、または露出した外科的な場の中に注射器を用いて腫瘍部位へ直接注射される。ある特定の実施形態において、薬学的組成物は、植え込み可能な投薬装置を用いて注射することができる。
【０１１３】
例示的な実施形態において示されおよび説明されるような組成物の要素の構築および配置が実例であるに過ぎないことが突起されることも重要である。本発明の数個の実施形態しか本開示において詳細に説明されてきていないが、本開示を再調査する当業者は、列挙された対象事項の新規の教示および利点から実質的に逸脱することなく、多くの変更が可能であることを容易に認識するであろう（例えば、種々の要素の大きさ、寸法、構造、形状および比率、パラメータの値、装着配置、材料の使用、色彩、向きなど）。例えば、一体となって形成されるよう示される要素は、複数の部分が一体となって形成され得るものとして示される複数の部分または要素から構築され得、インターフェイスの操作は、改定され得またはさもなくば変化し得、構造の長さもしくは幅および／またはシステムの部品または接続子または他の要素が変化し得、要素間に提供される調整位置の性質または数が変化し得る。システムの要素および／または組立て体は、幅広い種々の色彩、生地、および組み合わせのうちのいずれかにおいて、十分な強度または耐久性を提供する幅広い種々の材料のうちのいずれかから構築され得ることは特記されるべきである。したがって、このような変更はすべて、本発明の範囲内に含まれるよう企図される。他の置換、変更、変化、および省略は、本発明の趣旨から逸脱することなく、所望のおよび他の例示的な実施形態の設計、操作条件、および配置においてなされ得る。
【０１１４】
いずれかの説明された方法または説明された方法内のステップが、本デバイスの範囲内の構造を形成するために、他の開示された方法またはステップと組み合わされ得ることは理解されるであろう。本明細書に開示される例示的な構造および方法は、説明目的のためであり、制限するものとして解釈されることにはなっていない。
【０１１５】
変化および変更が上述の構造および方法について、本デバイスの概念から逸脱することなくなされることができることも理解されることになっており、さらに、このような概念は、後述の特許請求の範囲が言語によって明らかに別段に述べられていない限り、これらによって網羅されるよう企図されていることは理解されることになっている。
【０１１６】
上述の説明は、説明された実施形態のみのものとみなされる。本デバイスの変更は、当業者にとって、および本デバイスを作製または使用するものにとって生じるであろう。それゆえ、図面において示されるおよび先に説明した実施形態が単に説明目的のためであり、等価物の原理を含む特許法の原理によって解釈されるような後述の特許請求の範囲によって定義される本デバイスの範囲を制限するよう企図されるものではないことは理解される。
SEQUENCE LISTING
<160>  NUMBER OF SEQ ID NOS: 10    
<210>  SEQ ID NO 1
<211>  LENGTH: 1500
<212>  TYPE: DNA
<213>  ORGANISM: Bacterial Salmonella typhimurium
<220>  FEATURE:
<221>  NAME/KEY: Gene
<222>  LOCATION: (1)..(1500)
<223>  OTHER INFORMATION: Fli.C
<400>  SEQUENCE: 1
aaggaaaaga tcatggcaca agtcattaat acaaacagcc tgtcgctgtt gacccagaat       60
aacctgaaca aatcccagtc cgctctgggc accgctatcg agcgtctgtc ttccggtctg      120
cgtatcaaca gcgcgaaaga cgatgcggca ggtcaggcga ttgctaaccg ttttaccgcg      180
aacatcaaag gtctgactca ggcttcccgt aacgctaacg acggtatctc cattgcgcag      240
accactgaag gcgcgctgaa cgaaatcaac aacaacctgc agcgtgtgcg tgaactggcg      300
gttcagtctg ctaacagcac caactcccag tctgacctcg actccatcca ggctgaaatc      360
acccagcgcc tgaacgaaat cgaccgtgta tccggccaga ctcagttcaa cggcgtgaaa      420
gtcctggcgc aggacaacac cctgaccatc caggttggtg ccaacgacgg tgaaactatc      480
gatatcgatc tgaagcagat caactctcag accctgggtc tggatacgct gaatgtgcaa      540
caaaaatata aggtcagcga tacggctgca actgttacag gatatgccga tactacgatt      600
gctttagaca atagtacttt taaagcctcg gctactggtc ttggtggtac tgaccagaaa      660
attgatggcg atttaaaatt tgatgatacg actggaaaat attacgccaa agttaccgtt      720
acggggggaa ctggtaaaga tggctattat gaagtttccg ttgataagac gaacggtgag      780
gtgactcttg ctggcggtgc gacttccccg cttacaggtg gactacctgc gacagcaact      840
gaggatgtga aaaatgtaca agttgcaaat gctgatttga cagaggctaa agccgcattg      900
acagcagcag gtgttaccgg cacagcatct gttgttaaga tgtcttatac tgataataac      960
ggtaaaacta ttgatggtgg tttagcagtt aaggtaggcg atgattacta ttctgcaact     1020
caaaataaag atggttccat aagtattaat actacgaaat acactgcaga tgacggtaca     1080
tccaaaactg cactaaacaa actgggtggc gcagacggca aaaccgaagt tgtttctatt     1140
ggtggtaaaa cttacgctgc aagtaaagcc gaaggtcaca actttaaagc acagcctgat     1200
ctggcggaag cggctgctac aaccaccgaa aacccgctgc agaaaattga tgctgctttg     1260
gcacaggttg acacgttacg ttctgacctg ggtgcggtac agaaccgttt caactccgct     1320
attaccaacc tgggcaacac cgtaaacaac ctgacttctg cccgtagccg tatcgaagat     1380
tccgactacg cgaccgaagt ttccaacatg tctcgcgcgc agattctgca gcaggccggt     1440
acctccgttc tggcgcaggc gaaccaggtt ccgcaaaacg tcctctcttt actgcgttaa     1500
<210>  SEQ ID NO 2
<211>  LENGTH: 510
<212>  TYPE: DNA
<213>  ORGANISM: Athymic nude mouse
<220>  FEATURE: 
<221>  NAME/KEY: Gene
<222>  LOCATION: (1)..(510)
<223>  OTHER INFORMATION: mIL-2
<400>  SEQUENCE: 2
atgtacagca tgcagctcgc atcctgtgtc acattgacac ttgtgctcct tgtcaacagc       60
gcacccactt caagctccac ttcaagctct acagcggaag cacagcagca gcagcagcag      120
cagcagcagc agcagcagca cctggagcag ctgttgatgg acctacagga gctcctgagc      180
aggatggaga attacaggaa cctgaaactc cccaggatgc tcaccttcaa attttacttg      240
cccaagcagg ccacagaatt gaaagatctt cagtgcctag aagatgaact tggacctctg      300
cggcatgttc tggatttgac tcaaagcaaa agctttcaat tggaagatgc tgagaatttc      360
atcagcaata tcagagtaac tgttgtaaaa ctaaagggct ctgacaacac atttgagtgc      420
caattcgatg atgagtcagc aactgtggtg gactttctga ggagatggat agccttctgt      480
caaagcatca tctcaacaag ccctcaataa                                       510
<210>  SEQ ID NO 3
<211>  LENGTH: 426
<212>  TYPE: DNA
<213>  ORGANISM: Athymic nude mouse
<220>  FEATURE:
<221>  NAME/KEY: Gene
<222>  LOCATION: (1)..(426)
<223>  OTHER INFORMATION: mGM-CSF
<400>  SEQUENCE: 3
atgtggctgc agaatttact tttcctgggc attgtggtct acagcctctc agcacccacc       60
cgctcaccca tcactgtcac ccggccttgg aagcatgtag aggccatcaa agaagccctg      120
aacctcctgg atgacatgcc tgtcacgttg aatgaagagg tagaagtcgt ctctaacgag      180
ttctccttca agaagctaac atgtgtgcag acccgcctga agatattcga gcagggtcta      240
cggggcaatt tcaccaaact caagggcgcc ttgaacatga cagccagcta ctaccagaca      300
tactgccccc caactccgga aacggactgt gaaacacaag ttaccaccta tgcggatttc      360
atagacagcc ttaaaacctt tctgactgat atcccctttg aatgcaaaaa accaggccaa      420
aaatga                                                                 426
<210>  SEQ ID NO 4
<211>  LENGTH: 447
<212>  TYPE: DNA
<213>  ORGANISM: Athymic nude mouse
<220>  FEATURE: 
<221>  NAME/KEY: Gene
<222>  LOCATION: (1)..(447)
<223>  OTHER INFORMATION: mCCL-2
<400>  SEQUENCE: 4
atgcaggtcc ctgtcatgct tctgggcctg ctgttcacag ttgccggctg gagcatccac       60
gtgttggctc agccagatgc agttaacgcc ccactcacct gctgctactc attcaccagc      120
aagatgatcc caatgagtag gctggagagc tacaagagga tcaccagcag caggtgtccc      180
aaagaagctg tagtttttgt caccaagctc aagagagagg tctgtgctga ccccaagaag      240
gaatgggtcc agacatacat taaaaacctg gatcggaacc aaatgagatc agaacctaca      300
actttattta aaactgcatc tgccctaagg tcttcagcac ctttgaatgt gaagttgacc      360
cgtaaatctg aagctaatgc atccactacc ttttccacaa ccacctcaag cacttctgta      420
ggagtgacca gtgtgacagt gaactag                                          447
<210>  SEQ ID NO 5
<211>  LENGTH: 462
<212>  TYPE: DNA
<213>  ORGANISM: Homo sapiens
<220>  FEATURE:
<221>  NAME/KEY: Gene
<222>  LOCATION: (1)..(462)
<223>  OTHER INFORMATION: IL-2
<400>  SEQUENCE: 5
atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacaaacagt       60
gcacctactt caagttctac aaagaaaaca cagctacaac tggagcattt actgctggat      120
ttacagatga ttttgaatgg aattaataat tacaagaatc ccaaactcac caggatgctc      180
acatttaagt tttacatgcc caagaaggcc acagaactga aacatcttca gtgtctagaa      240
gaagaactca aacctctgga ggaagtgcta aatttagctc aaagcaaaaa ctttcactta      300
agacccaggg acttaatcag caatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggatctgaa      360
acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga      420
tggattacct tttgtcaaag catcatctca acactgactt ga                         462
<210>  SEQ ID NO 6
<211>  LENGTH: 435
<212>  TYPE: DNA
<213>  ORGANISM: Homo sapiens
<220>  FEATURE:
<221>  NAME/KEY: Gene
<222>  LOCATION: (1)..(435)
<223>  OTHER INFORMATION: GM-CSF
<400>  SEQUENCE: 6
atgtggctgc agagcctgct gctcttgggc actgtggcct gcagcatctc tgcacccgcc       60
cgctcgccca gccccagcac gcagccctgg gagcatgtga atgccatcca ggaggcccgg      120
cgtctcctga acctgagtag agacactgct gctgagatga atgaaacagt agaagtcatc      180
tcagaaatgt ttgacctcca ggagccgacc tgcctacaga cccgcctgga gctgtacaag      240
cagggcctgc ggggcagcct caccaagctc aagggcccct tgaccatgat ggccagccac      300
tacaagcagc actgccctcc aaccccggaa acttcctgtg caacccagat tatcaccttt      360
gaaagtttca aagagaacct gaaggacttt ctgcttgtca tcccctttga ctgctgggag      420
ccagtccagg agtga                                                       435
<210>  SEQ ID NO 7
<211>  LENGTH: 300
<212>  TYPE: DNA
<213>  ORGANISM: Homo sapiens
<220>  FEATURE:
<221>  NAME/KEY: Gene
<222>  LOCATION: (1)..(300)
<223>  OTHER INFORMATION: CCL-2
<400>  SEQUENCE: 7
atgaaagtct ctgccgccct tctgtgcctg ctgctcatag cagccacctt cattccccaa       60
gggctcgctc agccagatgc aatcaatgcc ccagtcacct gctgttataa cttcaccaat      120
aggaagatct cagtgcagag gctcgcgagc tatagaagaa tcaccagcag caagtgtccc      180
aaagaagctg tgatcttcaa gaccattgtg gccaaggaga tctgtgctga ccccaagcag      240
aagtgggttc aggattccat ggaccacctg gacaagcaaa cccaaactcc gaagacttga      300
<210>  SEQ ID NO 8
<211>  LENGTH: 552
<212>  TYPE: DNA
<213>  ORGANISM: Tanapoxvirus
<220>  FEATURE: 
<221>  NAME/KEY: Gene
<222>  LOCATION: (1)..(552)
<223>  OTHER INFORMATION: Thymidine kinase/66R
<400>  SEQUENCE: 8
atgacatcta aaagtggaca tatacagatt atattaggcc caatgttttc tggtaaaagt       60
acagaattaa ttagaatatt aaaacggtat caaattgcta ggtatacttg ctttgtaata      120
aaatactcaa aagatactag gtacggaaaa ggattagtaa cacacgataa taattcaata      180
cccgcaattc ctgttaactc actaagtgaa attaattgtg ataaaattaa agctgatgta      240
ataggaatag acgaaggaca attttttcca gatattgtag aattttgcga acgtatggca      300
aacgatggaa aaattgtaat agttgctgct ttagacggta catttttaag agagccattt      360
ggaaatattt taaaattaat accatgtgct gagtacgttt caaagcttac agccgtttgc      420
atgaattgtt ttaatagcgc atcgttttct aaacgaattg gagatgaaca agaaatagaa      480
gttataggag gcaaagacaa gtatcaatct gtatgtagaa aatgttactt taaattaaaa      540
ataaataatt ga                                                          552
<210>  SEQ ID NO 9
<211>  LENGTH: 1017
<212>  TYPE: DNA
<213>  ORGANISM: Tanapoxvirus
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atggataagt tactattatt tagcacaatt gtagcagttt gtaactgcat aactttaaaa       60
tataattata ctgttacgtt aaaagatgat gggttatacg atggagtatt ttacgatcat      120
tacaacgatc agttagtgac gaaaatatca tataaccatg aaactagaca cggaaacgta      180
aattttaggg ctgattggtt taatatttct aggagtcccc acacgccagg taacgattat      240
aactttaact tttggtattc tttaatgaaa gaaactttag aagaaattaa taaaaacgat      300
agcacaaaaa ctacttcgct ttcattaatc actgggtgtt atgaaacagg attattattt      360
ggtagttatg ggtatgtaga aacggccaac gggccgttgg ccagatacca tacaggagat      420
aaaaggttta cgaaaatgac acataaaggt tttcccaagg ttggaatgtt aactgtaaaa      480
aacactcttt ggaaagatgt aaaagcttat ttaggcggtt ttgaatatat gggatgttca      540
ttagctattt tagattacca aaaaatggct aaaggtaaaa taccaaaaga tacaacacct      600
acagtgaaag taacgggtaa tgagttagaa gatggtaaca tgactcttga atgcactgta      660
aattcatttt accctcctga cgtaattact aagtggatag aaagcgaaca ttttaaaggt      720
gaatataaat atgttaacgg aagatactat ccagaatggg ggagaaaatc caattatgag      780
ccaggagagc caggttttcc atggaatatc aaaaaagata aagatgcaaa tacatatagt      840
ttaacagatt tagtacgtac aacatcaaaa atgagtagtc aaccagtatg tgttgttttc      900
catgacactt tagaagcgca agtttatact tgttctgaag gatgcaatgg agagctatac      960
gatcacctat atagaaaaac agaagaaggg gaaggtgaag aggatgaaga agactga        1017
<210>  SEQ ID NO 10
<211>  LENGTH: 234
<212>  TYPE: DNA
<213>  ORGANISM: Tanapoxvirus
<220>  FEATURE: 
<221>  NAME/KEY: Gene
<222>  LOCATION: (1)..(234)
<223>  OTHER INFORMATION: 15L
<400>  SEQUENCE: 10
atgaaaaaca aatttatgtt ttttacttta tcatgtgcca ttttagcatt aaattgttta       60
ccgttgctac aaaatatgta cgtaatagag tgtgacacaa gtaacttttg tttaaatgga      120
gggacctgtt ttttaactaa acatgttcct tcgtattcta attttagttt aaaattttgt      180
ttgtgtaaaa ggcaatttaa cggaaaaagg tgtgaaaata aaatagtaaa ttaa            234
【図１】
2020504146.tif 000005
【図２Ａ】
2020504146.tif 000006
【図２Ｂ】
2020504146.tif 000007
【図２Ｃ】
2020504146.tif 000008
【図２Ｄ】
2020504146.tif 000009
【図２Ｅ】
2020504146.tif 000010
【図２Ｆ】
2020504146.tif 000011
【図２Ｇ】
2020504146.tif 000012
【図２Ｈ】
2020504146.tif 000013
【図３】
2020504146.tif 000014
【図４Ａ】
2020504146.tif 000015
【図４Ｂ】
2020504146.tif 000016
【図４Ｃ】
2020504146.tif 000017
【図４Ｄ】
2020504146.tif 000018
【図４Ｅ】
2020504146.tif 000019
【図５Ａ】
2020504146.tif 000020
【図５Ｂ】
2020504146.tif 000021
【図５Ｃ】
2020504146.tif 000022
【図５Ｄ】
2020504146.tif 000023
【図５Ｅ】
2020504146.tif 000024
【図５Ｆ】
2020504146.tif 000025
【図５Ｇ】
2020504146.tif 000026
【図５Ｈ】
2020504146.tif 000027
【図５Ｉ】
2020504146.tif 000028
【図５Ｊ】
2020504146.tif 000029
【国際調査報告】
2020504146.tif 000030
2020504146.tif 000031