(57)【要約】  本発明は、(i)抗CRISPR(Acr)ポリペプチドをコードする配列および(ii)miRNA標的配列を含むポリヌクレオチドならびにそれと関連するベクターおよび宿主細胞に関する。本発明はさらに、(I)(i)抗CRISPR(Acr)ポリペプチドをコードする配列および(ii)RNA干渉(RNAi)標的配列を含む第1のポリヌクレオチド；ならびにCasヌクレアーゼもしくはCasヌクレアーゼをコードする発現可能な遺伝子を含む第2のポリヌクレオチド；(II)(i)抗CRISPR(Acr)ポリペプチドをコードする配列および(ii)RNA干渉(RNAi)標的配列を含む第1のポリヌクレオチドであって、Casヌクレアーゼの第1の断片をコードする発現可能な遺伝子をさらに含む第1のポリヌクレオチド、ならびにCasヌクレアーゼの第2の断片をコードする発現可能な遺伝子を含む第2のポリヌクレオチドであって、前記Casヌクレアーゼの前記第1および第2の断片が活性なCasヌクレアーゼを一緒になって再構成する、第１および第2のポリヌクレオチド；または(III)(i)抗CRISPR(Acr)ポリペプチドをコードする配列、(ii)RNA干渉(RNAi)標的配列、および(iii)Casヌクレアーゼをコードする配列を含む第1のポリヌクレオチド；ならびに阻害的RNA、好ましくは、前記RNAi標的配列にハイブリダイズするsiRNAもしくはmiRNA、より好ましくは、前記RNAi標的配列にハイブリダイズするsiRNAをコードする発現可能な遺伝子を含む第2のポリヌクレオチドを含むキットに関する。さらに、本発明は、前記手段と関連する方法および使用に関する。【選択図】  図１
2020532962.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(i)抗CRISPR(Acr)ポリペプチドをコードする配列及び(ii)miRNA標的配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記miRNAが組織特異的及び/又は細胞型特異的miRNAである、請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
同じmiRNAと本質的に相補的な少なくとも2つのmiRNA標的配列、より好ましくは、miRNAの同じ核酸配列と本質的に相補的である少なくとも2つの標的配列を含む、請求項１又は２記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
少なくとも2つの非同一のmiRNA標的配列、より好ましくは、互いに80％未満、さらにより好ましくは、70％未満、最も好ましくは、60％未満同一である少なくとも2つのmiRNA標的配列を含む、請求項１〜３のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
Acrポリペプチドをコードする前記配列が、前記miRNA標的配列、好ましくは、前記発現可能な核酸配列に含まれる全てのmiRNA標的配列の上流に位置する、請求項１〜４のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記AcrポリペプチドがAcrIIA4ポリペプチドである、請求項１〜５のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
Acrポリペプチドをコードする前記配列が、
a)配列番号２１の核酸配列；
b)配列番号２１の配列と少なくとも70％同一である核酸配列；
c)配列番号２０のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列；又は
d)配列番号２０の配列と少なくとも70％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列
を含む、請求項１〜６のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
CRISPR関連(Cas)ヌクレアーゼの少なくとも断片をコードする核酸配列をさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか１項記載のポリヌクレオチド及び/又は請求項９記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１１】
医学における使用のため、好ましくは、遺伝的疾患、神経変性疾患、がん、及び/又は感染症の処置における使用のための、請求項１〜８のいずれか１項記載のポリヌクレオチド及び/又は請求項９記載のベクター及び/又は請求項１０記載の宿主細胞。
【請求項１２】
(I)(i)抗CRISPR(Acr)ポリペプチドをコードする配列及び(ii)RNA干渉(RNAi)標的配列を含む第１のポリヌクレオチド；並びにCasヌクレアーゼ、又はCasヌクレアーゼをコードする発現可能な遺伝子を含む第２のポリヌクレオチド；
(II)(i)抗CRISPR(Acr)ポリペプチドをコードする配列及び(ii)RNA干渉(RNAi)標的配列を含む第１のポリヌクレオチドであって、Casヌクレアーゼの第１の断片をコードする発現可能な遺伝子をさらに含む前記第１のポリヌクレオチド、並びにCasヌクレアーゼの第２の断片をコードする発現可能な遺伝子を含む第２のポリヌクレオチドであって、前記Casヌクレアーゼの前記第１及び第２の断片は、一緒になって活性なCasヌクレアーゼを再構成する、前記第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチド；又は
(III)(i)抗CRISPR(Acr)ポリペプチドをコードする配列、(ii)RNA干渉(RNAi)標的配列、及び(iii)Casヌクレアーゼをコードする配列を含む第１のポリヌクレオチド；並びに阻害的RNA、好ましくは、前記RNAi標的配列にハイブリダイズするsiRNA若しくはshRNA若しくはmiRNA、より好ましくは、前記RNAi標的配列にハイブリダイズするsiRNAをコードする発現可能な遺伝子を含む第２のポリヌクレオチド
を含む、キット。
【請求項１３】
前記キットが、少なくとも1つのガイドRNA(gRNA)をコードするポリヌクレオチドを含み、好ましくは、少なくとも1つのgRNAをコードする前記ポリヌクレオチドが、第１又は第２のポリヌクレオチドであり、より好ましくは、第２のポリヌクレオチドである、請求項１２記載のキット。
【請求項１４】
宿主細胞を遺伝的に改変するための方法であって、
a1)前記宿主細胞を、請求項１〜８のいずれか１項記載のポリヌクレオチドと；請求項９記載のベクターと；及び/又は請求項１０記載の宿主細胞と接触させ；且つ、さらに、前記宿主細胞を、Casヌクレアーゼ活性及びgRNAと接触させること；又は
a2)前記宿主細胞を、請求項１２又は１３記載のキットに含まれる成分と接触させること；
並びに
b)それによって、前記宿主細胞を遺伝的に改変すること
を含む、前記方法。
【請求項１５】
宿主細胞を遺伝的に改変するための、請求項１〜８のいずれか１項記載のポリヌクレオチド；請求項９記載のベクター；請求項１０記載の宿主細胞；及び/又は請求項１２若しくは１３記載のキットの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、(i)抗CRISPR(Acr)ポリペプチドをコードする配列および(ii)miRNA標的配列を含むポリヌクレオチドならびにそれと関連するベクターおよび宿主細胞に関する。本発明はさらに、(I)(i)抗CRISPR(Acr)ポリペプチドをコードする配列および(ii)RNA干渉(RNAi)標的配列を含む第1のポリヌクレオチド；ならびにCasヌクレアーゼもしくはCasヌクレアーゼをコードする発現可能な遺伝子を含む第2のポリヌクレオチド；(II)(i)抗CRISPR(Acr)ポリペプチドをコードする配列および(ii)RNA干渉(RNAi)標的配列を含む第1のポリヌクレオチドであって、Casヌクレアーゼの第1の断片をコードする発現可能な遺伝子をさらに含む第1のポリヌクレオチド、ならびにCasヌクレアーゼの第2の断片をコードする発現可能な遺伝子を含む第2のポリヌクレオチドであって、前記Casヌクレアーゼの前記第1および第2の断片が活性なCasヌクレアーゼを一緒になって再構成する、第１および第2のポリヌクレオチド；または(III)(i)抗CRISPR(Acr)ポリペプチドをコードする配列、(ii)RNA干渉(RNAi)標的配列、および(iii)Casヌクレアーゼをコードする配列を含む第1のポリヌクレオチド；ならびに阻害的RNA、好ましくは、前記RNAi標的配列にハイブリダイズするsiRNAもしくはmiRNA、より好ましくは、前記RNAi標的配列にハイブリダイズするsiRNAをコードする発現可能な遺伝子を含む第2のポリヌクレオチドを含むキットに関する。さらに、本発明は、前記手段と関連する方法および使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌および古細菌におけるCRISPR(クラスター化された規則的な配置の短い回文配列リピート)系は、外来の侵入核酸の特異的分解を媒介する(Barrangouら、2007; Bhayaら、2011; TernsおよびTerns, 2011; Wiedenheftら、2012)。それらは、特異的な、配列相補的DNA遺伝子座における二本鎖切断を誘導するように短いガイドRNA(gRNA)によってプログラミングすることができるCRISPR関連(Cas)ヌクレアーゼを含む(Jinekら、2012)。多様なCRISPR-Cas系が哺乳動物細胞および動物におけるゲノム工学のために採用されており、最も突出しているものは、Streptococcus pyogenes由来のCRISPR-Cas9系(SpyCas9)である(Congら、2013; Jinekら、2013; Maliら、2013)。CRISPR-Cas9系はまた、胚性幹細胞(Wangら、2013)ならびに動物におけるゲノム編集のために上手く適用されてきた。例えば、SpyCas9を安定に発現し、かくして、in vivoでの遺伝子ノックアウトのスクリーニングを可能にするトランスジェニックマウスが報告された(Plattら、2014)。あるいは、例えば、水力学的プラスミドDNA注入(Yinら、2014)またはアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター(Senisら、2014；Ranら、2015)による、Casタンパク質およびgRNA成分の一過的かつ効率的なin vivoでの送達も達成されている。驚くことではないが、CRISPR-Casに基づくヒト遺伝子療法の可能性は、非常に高いと考えられ、遺伝的疾患の処置のためのさらに多数の前臨床試験を動機付ける(SchmidtおよびGrimm、2015; Daiら、2016; Xueら、2016)。
【０００３】
しかしながら、いくつかの課題が、特に、多細胞系における基礎または応用研究のためのCRISPR-Cas系の直接的な適用を依然として妨げている。1つは、Casヌクレアーゼの不十分な特異性、したがって、非標的遺伝子座の意図しない編集のリスクである (Fuら、2013; Hsuら、2013; Choら、2014; Wangら、2015; Zhangら、2015)。オンターゲット特異性が改善された、操作されたCasバリアント(Kleinstiverら、2016; Slaymakerら、2016)を用いることによって、またはCasヌクレアーゼを適時に活性化/脱活性化することによって、この問題の解決が試みられた。後者は、化学物質(Zetscheら、2015b; Majiら、2017)もしくは光(Hemphillら、2015; Nihongakiら、2015a; Nihongakiら、2015b; PolsteinおよびGersbach、2015)などの外因性トリガーを用いた制御を可能にするCasバリアントを使用することによって、またはCRISPR-Cas活性化を制御する合成遺伝子回路(Kianiら、2014; Petrisら、2017)を使用することによって、達成することができる。
【０００４】
第2の、大きなハードルは、理想的には、CRISPR-Cas成分の全身投与後であっても、CRISPR-Casの、所望の標的組織または細胞への高度に特異的な送達および/またはその中でのその活性化(単独の)の必要性である。(治療)目的の標的組織は、例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィー処置の場合の骨格筋、HIV治療の場合のヘルパーT細胞、ハンチントン病もしくはアルツハイマー病の場合の脳、肝臓、膵臓、腫瘍、またはヒト体内の任意の他のあり得る臓器/組織であってよい。組織特異的CRISPR-Cas活性化に関する重要な考慮すべき事柄は、送達の様式である。AAVベクターは、細胞、動物または患者へのCRISPR-Casの送達のための第1選択と考えられることが多い(Senisら、2014; SchmidtおよびGrimm、2015)。これらのものは、パルボウイルス科に属する小さい、一本鎖の非病原性DNAウイルスである。ex vivoまたはin vivoでの遺伝子送達に関するそれらの効力および安全性の他に、AAVは、動物またはヒトにおける全身ベクター投与後に組織標的化ならびに形質導入効能をモジュレートする可能性のため、他の(ウイルス)送達系よりも有益である。これは、AAVベクターを「偽型化」することによって、すなわち、導入遺伝子を担持するゲノムを、異なる天然の、または操作されたAAVキャプシド中にパッケージングすることによって達成することができる(Kay、2011において概説されている)。
【０００５】
偽型化/操作されたAAVベクターを含む、現行の送達系はいずれも、絶対的にストリンジェントではないため、依然として、標的化の特異性は、多くのCRISPR適用に関する大きな関心である。また、いくつかの(組織学的に)密接に関連する組織(例えば、特定の型のニューロン；周囲の健康な組織を除く腫瘍；ある特定の筋肉型、例えば、心臓を除く骨格筋)の1つへの特異的送達は、特に困難であり、現行の送達戦略を用いてはほぼ不可能である。したがって、オフターゲット組織における望ましくないCRISPR-Cas活性化のリスク、結果として、ヒトにおける遺伝子療法を含むin vivoでのCRISPR-Cas適用中の望ましくない副作用のリスクは、依然として大きな関心事である。したがって、組織特異的様式でCRISPR-Cas活性を制御するためのさらなる層が、非常に望ましく、緊急に必要である。
【０００６】
内因性マイクロRNA(miRNA)シグネチャーを用いて、異なる細胞型および組織間を効率的に識別することができる。マイクロRNAは、哺乳動物遺伝子発現の調節において重要な役割を果たす小さい非コードRNAである。1000種を超えるmiRNAがヒトにおいて記載されており(例えば、www.mirbase.orgを参照)、その一部は、選択された細胞型もしくは組織中で主に、もしくは専ら(同時に)存在するか、またはがんなどの疾患を含む特定の条件下で脱調節される。内因性miRNAシグネチャーに基づくいくつかの組織特異的導入遺伝子発現戦略が存在する(Xieら、2011; GeislerおよびFechner、2016)。それらは一般的には、導入遺伝子の3'UTR(非翻訳領域)に典型的に組み込まれるmiRNA結合部位を用いる。次いで、導入遺伝子発現のRNA干渉(RNAi)媒介性ノックダウンが、対応するmiRNAまたはmiRNAセットを発現する組織/細胞型内で特異的に起こる。これは、内因性miRNAによる導入遺伝子発現の負の調節、かくして、意図しない(オフターゲット)組織からの導入遺伝子「除去」をもたらす。内因性miRNAによる導入遺伝子発現の正の調節(「miR-ON」)も達成された(Amendolaら、2013)。この場合、導入遺伝子を駆動するプロモーターを阻害する転写リプレッサーは、再度、miRNA結合部位をその3'UTRに埋め込むことによって、miRNAの調節下に置かれる。次いで、リプレッサーのマイクロRNA誘導性ノックダウンは、前記miRNAを発現する組織内で特異的に導入遺伝子発現を放出する(WO 2007/000668 A2)。さらに、2つの最近の研究により、送達されるCas9遺伝子の3'UTRにmiRNA標的部位を組み込むことによって、オフターゲット細胞中でのCRISPR-SpyCas9活性の低下の成功が示された(Senisら、2014; Hirosawaら、2017)。後者の研究はまた、組織特異的なCas-ONスイッチを創出した。この目的のために、翻訳リプレッサーL7Aeを、miRNA制御下に置き、L7Ae結合モチーフ(Kターン)を担持するmRNAからCas9を発現させた。しかしながら、報告された構成にあるCas-ONスイッチは、非常に漏れやすく、したがって、ex vivoもしくはin vivoでの研究ならびに治療適用にとって大きな利益をもたらす可能性は低い。
【発明の概要】
【０００７】
かくして、細胞および/または組織特異的様式でのCasヌクレアーゼ活性を提供するための改善された手段および方法が当業界で必要である。この問題は、本明細書に開示される手段および方法によって解決される。
【０００８】
したがって、本発明は、(i)抗CRISPR(Acr)ポリペプチドをコードする配列および(ii)RNA干渉(RNAi)標的配列を含むポリヌクレオチドに関する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】内因性miRNAによって調節される抗CRISPRタンパク質を使用するCRISPR-Cas9の細胞および組織特異的活性化を示す図である。(A)関連するオフターゲット細胞/組織中ではなく、目的の標的細胞/組織中で非常に豊富なmiRNAのための結合部位を、acr導入遺伝子の3'UTRに埋め込む。AcrとCRISPR-Cas成分との同時送達の際に(CasおよびガイドRNA；ベクタースキーム、上部分)、AcrのノックダウンおよびCas活性の同時的放出が、意図される標的組織内でのみ起こる(下部分)。(B)任意のmiRNA結合部位を、BsmBI制限部位を介して本発明者らのAcr発現ベクター(クローニング足場、配列番号49)中に容易に導入することができる。全ての実験において、miR-122標的部位を担持するAcr構築物(下部分、配列番号50)を、長さが同一の「空の」足場を担持するベクター(上部分)と比較した。miR-122標的部位は、配列番号40を有する。
【図２】Cas9媒介性リポーター切断の肝細胞特異的活性化を示す図である。(A)使用した構築物の略図。AcrIIA4ベクターは、3'UTR内に2x miR-122結合部位を担持するか、または担持しない(対照として)。ルシフェラーゼリポーターは、正規化のための構成的なRenilla発現カセットも担持する(略図中には示されない)。(B)Huh-7細胞(高い内因性miR-122レベル)またはHELA細胞(対照、内因性miR-122なし)に、Aにおける構築物を三重トランスフェクトした。トランスフェクトされたAcrIIA4のCas9構築物に対する比を示す。トランスフェクションの48時間後、ホタルおよびRenillaルシフェラーゼ活性を、二重ルシフェラーゼアッセイによって測定した。ホタルルシフェラーゼの光子数を、Renillaの光子数に対して正規化した。1、リポーターのみ(陰性対照)；2、リポーター+Cas9(陽性対照)；3、2x miR-122結合部位を有する、CMVプロモーターにより駆動されるAcrIIA4；4、miR-122結合部位がない、CMVプロモーターにより駆動されるAcrIIA4(「足場」)；5、2x miR-122結合部位を有する、EFSプロモーターにより駆動されるAcrIIA4；6、miR-122結合部位がない、EFSプロモーターにより駆動されるAcrIIA4(「足場」)；3〜6は全て、リポーター+Cas9も含有する；n.s.、有意でない。エラーバーは、3回の反復物の平均の標準誤差を示す。
【図３】Cas9の阻害および放出は、供給されるAcr用量に依存する。実験を、Huh-7細胞中で、および図2Bに記載のように実施したが、トランスフェクションの間のAcrIIA4のCas9構築物に対する比を、示されるように変化させた。1、リポーターのみ(陰性対照)；2、リポーター+Cas9(陽性対照)；3、2x miR-122結合部位を有する、CMVプロモーターにより駆動されるAcrIIA4；4、miR-122結合部位がない、CMVプロモーターにより駆動されるAcrIIA4(「足場」)；5、2x miR-122結合部位を有する、EF1αプロモーターにより駆動されるAcrIIA4；6、miR-122結合部位がない、EF1αプロモーターにより駆動されるAcrIIA4(「足場」)；3〜6は全て、リポーター+Cas9も含有する(図2A)。エラーバーは、3回の反復物の平均の標準誤差を示す。
【図４】Cas9とAcrIIA4送達のカップリングが、緊密なmiR依存的Cas調節をもたらすことを示す図である。(A)実験の概説および使用される構築物の略図。SpyCas9を、2つの別々の断片(CasNおよびCasC)に分割し、スプリット-インテイン(それぞれ、N-インテインおよびC-インテイン)に融合した。両方のCas-インテイン部分の同時送達は、活性な、完全長Cas9の再集合をもたらす。AcrIIA4は、CasCベクター上に位置し、3'UTR内に2x miR-122結合部位を担持するか、または担持しない(足場)。ルシフェラーゼリポーターをコードするベクターは、正規化のための構成的なRenilla発現カセットも担持する(略図中には示されない)。(B)Huh-7細胞(高い内因性miR-122レベル)またはHELA細胞(対照、内因性miR-122なし)に、等モル量でAにおける構築物を三重トランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、ホタルおよびRenillaルシフェラーゼ活性を、二重ルシフェラーゼアッセイによって測定した。ホタルルシフェラーゼの光子数を、Renillaの光子数に対して正規化した。1、リポーターのみ(陰性対照)；2、リポーター+完全長Cas9(陽性対照)；3、リポーター+Cas9N+Cas9C(Acrカセットを含まない；陽性対照)；4〜6、Cas9N+Cas9C(以下に特定される)+リポーター；4、2x miR-122結合部位を有する、CMVプロモーターにより駆動されるAcrIIA4；5、miR-122結合部位がない、CMVプロモーターにより駆動されるAcrIIA4(「足場」)；6、2x miR-122結合部位を有する、EFSプロモーターにより駆動されるAcrIIA4；7、miR-122結合部位がない、EFSプロモーターにより駆動されるAcrIIA4(「足場」)；n.s.、有意でない。破線は、Cas9の非存在下でのリポーター活性を示す。エラーバーは、3回の反復物の平均の標準誤差を示す。
【図５】オフターゲット細胞中でのCas9阻害は、CasN:CasCベクター比とは無関係である。Hu-7細胞(高い内因性miR-122レベル)またはHELA細胞(対照、内因性miR-122なし)に、CasN-N-インテインおよびCasC-C-インテイン構築物(2x miR-122標的部位と共にCMVプロモーターにより駆動されるacrを担持する)ならびに対応するルシフェラーゼ切断リポーターを同時トランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、ホタルおよびRenillaルシフェラーゼ活性を、二重ルシフェラーゼアッセイによって測定した。ホタルルシフェラーゼの光子数を、Renillaの光子数に対して正規化した。1、リポーターのみ(陰性対照)；2、リポーター+完全長Cas9(陽性対照)；3、リポーター+Cas9N+Cas9C(Acrカセットを含まない；陽性対照)；4、示された比で同時トランスフェクトされたCas9N+Cas9C。破線は、Cas9の非存在下でのリポーター活性を示す。エラーバーは、3回の反復物の平均の標準誤差を示す。
【図６】dCas9-VP64による遺伝子発現のmiR-122依存的誘導を示す図である。(A)実験の概説および使用される構築物の略図。AcrIIA4ベクターは、その3'UTR内に2x miR-122結合部位を担持するか、または担持しない(対照として)。(B)Huh-7細胞(高い内因性miR-122レベル)に、Aにおける構築物ならびに構成的Renillaルシフェラーゼ発現ベクター(Aにおけるベクター略図には示されない)を同時トランスフェクトした。トランスフェクトされたAcrIIA4のCas9構築物に対する比を示す。トランスフェクションの48時間後、ホタルおよびRenillaルシフェラーゼ活性を、二重ルシフェラーゼアッセイによって測定した。ホタルルシフェラーゼの光子数を、Renillaの光子数に対して正規化した。1、リポーターのみ(陰性対照)；2、リポーター+dCas9-VP64(陽性対照)；3、2x miR-122結合部位を有するCMVプロモーターにより駆動されるAcrIIA4；4、miR-122結合部位がない、CMVプロモーターにより駆動されるAcrIIA4(「足場」)；3〜4は、リポーター+dCas9-VP64も含有する；エラーバーは、3回の反復物の平均の標準誤差を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下で使用される場合、用語「有する(have)」、「含む(comprise)」または「含む(include)」またはその任意の文法的変形は、非排他的様式で使用される。かくして、これらの用語は、これらの用語によって導入される特徴の他に、本文に完全に記載されたさらなる特徴が存在しない状況と、1つ以上のさらなる特徴が存在する状況との両方を指してもよい。例として、「AがBを有する(A has B)」、「AがBを含む(A comprises B)」および「AがBを含む(A includes B)」という表現は、Bの他に、Aの中に他の要素が存在しない状況(すなわち、Aが単独かつ排他的に、Bからなる状況)と、Bの他に、要素C、要素CおよびDまたはさらなる要素などの、1つ以上のさらなる要素がAの中に完全に存在する状況との両方を指してもよい。含まれるものとして本明細書で定義される任意の成分が、好ましくは、ただし書きまたは負の限定によって特許請求される発明から明示的に排除されてもよいことが理解されるであろう。
【００１１】
さらに、以下で使用される用語「好ましくは」、「より好ましくは」、「最も好ましくは」、「特に」、「より特に」、「具体的に」、「より具体的に」または類似の用語は、さらなる可能性を制限することなく、任意選択の特徴と共に使用される。かくして、これらの用語によって導入される特徴は、任意選択の特徴であり、特許請求の範囲を決して制限することを意図するものではない。本発明は、当業者であれば認識できるように、代替的な特徴を使用することによって実施することができる。同様に、「本発明の実施形態において」または類似の表現によって導入される特徴は、本発明のさらなる特徴に関するいかなる制限もない、本発明の範囲に関するいかなる制限もない、およびそのような方法で導入される特徴を、本発明の他の任意選択の特徴または非任意選択の特徴と組み合わせる可能性に関するいかなる制限もない、任意選択の特徴であることが意図される。
【００１２】
さらに、別途指摘されない場合、用語「約」は、関連する分野における一般的に許容される技術的正確性を有する示された値に関し、好ましくは、示された値±20%、より好ましくは±10%、最も好ましくは±5%に関する。さらに、用語「本質的に」は、示された結果または使用に対する影響を有する偏差が存在しないこと、すなわち、示された結果の、潜在的な偏差が±20%、より好ましくは±10%、最も好ましくは±5%を超えた逸脱を引き起こさないことを示す。かくして、「から本質的になる」とは、特定された成分を含むが、不純物として存在する材料、成分を提供するために用いられるプロセスの結果として存在する避けられない材料、および本発明の技術的効果を達成する以外の目的で添加される成分を除く他の成分を含まないことを意味する。例えば、語句「から本質的になる」を用いて定義される組成物は、任意の公知の許容し得る添加剤、賦形剤、希釈剤、担体などを包含する。好ましくは、セットの成分から本質的になる組成物は、5重量%未満、より好ましくは、3重量%未満、さらにより好ましくは、1重量%未満、最も好ましくは、0.1重量%未満の非特定成分を含むであろう。核酸配列の文脈では、用語「本質的に同一」は、少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも98%、最も好ましくは少なくとも99%の同一性%値を示す。理解されるように、本質的に同一という用語は、100%の同一性を含む。前記のことは、変更すべきところは変更して、用語「本質的に相補的」にも適用される。
【００１３】
本明細書で使用される用語「ポリヌクレオチド」とは、線状または環状の核酸分子を指す。この用語は、一本鎖ならびに部分的または完全に二本鎖のポリヌクレオチドを包含する。好ましくは、ポリヌクレオチドは、RNAまたはcDNAを含むDNAである。さらに、グリコシル化もしくはメチル化ポリヌクレオチドなどの天然に存在する改変ポリヌクレオチドまたはビオチン化ポリヌクレオチドなどの人工的に改変された誘導体を含む、化学的に改変されたポリヌクレオチドも含まれる。本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは、単離されたポリヌクレオチド(すなわち、その天然の状況から単離された)として、または遺伝的に改変された形態で提供されるものとする。
【００１４】
本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは、少なくとも1つの異種配列を含む、すなわち、少なくとも2つの異なる種に由来する配列を含む。好ましくは、2つの異なる種に由来する前記配列は、Acrポリペプチドをコードする配列およびRNAi標的配列である。また好ましくは、ポリヌクレオチドは、哺乳動物、好ましくは、ヒトの細胞に対して少なくとも1つの異種配列を含む、すなわち、哺乳動物、好ましくは、ヒトの細胞中に存在することが知られていない、または存在しない少なくとも1つの核酸配列を含む。好ましくは、哺乳動物細胞に対する前記異種配列は、少なくともAcrポリペプチドをコードする配列である。また好ましくは、ポリヌクレオチドは、哺乳動物細胞中に含まれる配列と相同な少なくとも1つの配列を含む；前記相同配列は、好ましくは、RNAi標的配列であり、より好ましくは、本明細書の他の箇所で特定されるmiRNA標的配列である。
【００１５】
本発明のポリヌクレオチドは、両方とも本明細書の他の箇所で特定される、(i)Acrポリペプチドをコードする、および(ii)RNA干渉(RNAi)標的配列を含む活性を有する；かくして、本明細書で言及される場合、ポリヌクレオチドは、(i)許容状態の宿主細胞中で機能的Acrポリペプチドの産生を引き起こす、および(ii)本明細書の以下で特定されるRNAiにとって必要とされる因子の存在下で、分解される、および/もしくは翻訳的に阻害される(ポリヌクレオチドがRNAである場合)、または前記ポリヌクレオチドから発現されるRNAの分解および/もしくは翻訳阻害を引き起こす(ポリヌクレオチドが、例えば、DNAである場合)活性を有する。好ましくは、RNAi標的配列は、Acrポリペプチドをコードする配列中に含まれない；かくして、好ましくは、ポリヌクレオチドは、5'-RNAi標的配列-Acrポリペプチドをコードする配列-3'、または5'-RNAi標的配列-Acrポリペプチドをコードする配列-RNAi標的配列-3'、または5'-Acrポリペプチドをコードする配列-RNAi標的配列-3'の順序で前記エレメントを含む；より好ましくは、順序は、5'-Acrポリペプチドをコードする配列-RNAi標的配列-3'である。好ましくは、ポリヌクレオチドは、好ましくは、配列番号20のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、配列番号21の核酸配列を含み、好ましくは、配列番号40〜43からなる一覧から選択される、RNAi標的配列、好ましくは、miRNA標的配列を含む。
【００１６】
本明細書で使用される用語、ポリヌクレオチドは、好ましくは、具体的に示されるポリヌクレオチドのバリアントを含む。より好ましくは、ポリヌクレオチドの用語は、示される特定のポリヌクレオチドに関する。本明細書で使用される用語「ポリヌクレオチドバリアント」は、少なくとも1つのヌクレオチド置換、付加および/または欠失によって、配列を上記の特定の核酸配列から誘導することができることを特徴とする核酸配列を含む、本発明に関するポリヌクレオチドのバリアントに関し、ここで、ポリヌクレオチドバリアントは、特定のポリヌクレオチドについて特定された活性を有するべきである。かくして、本発明に従って言及されるポリヌクレオチドバリアントは、少なくとも1つのヌクレオチド置換、欠失および/または付加に起因して異なる核酸配列を有するべきである。好ましくは、前記ポリヌクレオチドバリアントは、特定のポリヌクレオチドまたはその機能的サブ配列、例えば、Acrポリペプチドをコードする配列のオルトログ、パラログまたは別のホモログを含む。また好ましくは、前記ポリヌクレオチドバリアントは、特定のポリヌクレオチドまたはその機能的サブ配列、特に、Acrポリペプチドをコードする配列の天然に存在する対立遺伝子を含む。ポリヌクレオチドバリアントの文脈では、本明細書で使用される用語「機能的サブ配列」は、その少なくとも1つの活性を媒介する本発明のポリヌクレオチドの部分配列に関する；かくして、好ましくは、機能的サブ配列という用語は、(i)許容状態の宿主細胞中での機能的なAcrポリペプチドの産生を引き起こす部分配列、または(ii)分解および/もしくは翻訳阻害される部分配列(部分配列がRNA中に含まれる場合)もしくはRNA媒介性分解にとって必要とされる因子の存在下で、前記ポリヌクレオチド(ポリヌクレオチドが、例えば、DNAである場合)から発現されるRNAの分解および/もしくは翻訳阻害を引き起こす部分配列に関する。ポリヌクレオチドバリアントはまた、好ましくは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、上記の特定のポリヌクレオチドまたはその機能的サブ配列にハイブリダイズすることができる核酸配列を含むポリヌクレオチドも包含する。これらのストリンジェントな条件は、当業者には公知であり、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6に見出すことができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好ましい例は、約45℃での6x塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(=SSC)、次いで、50〜65℃での0.2xSSC、0.1%SDS中での1回以上の洗浄ステップにおけるハイブリダイゼーション条件である。当業者であれば、これらのハイブリダイゼーション条件が、核酸の型に応じて、および例えば、有機溶媒が存在する場合、バッファーの温度および濃度に関して、異なることを知っている。例えば、「標準的なハイブリダイゼーション条件」下では、温度は、核酸の型に応じて、0.1x〜5xSSC(pH7.2)の濃度を有する水性バッファー中、42℃〜58℃で異なる。有機溶媒、例えば、50%ホルムアミドが上記バッファー中に存在する場合、標準条件下での温度は、約42℃である。DNA:RNAハイブリッドのためのハイブリダイゼーション条件は、好ましくは、例えば、0.1xSSCおよび20℃〜45℃、好ましくは、30℃〜45℃である。DNA:RNAハイブリッドのためのハイブリダイゼーション条件は、好ましくは、例えば、0.1xSSCおよび30℃〜55℃、好ましくは、45℃〜55℃である。上記のハイブリダイゼーション温度は、例えば、ホルムアミドの非存在下で、約100bp(=塩基対)の長さおよび50%のG+C含量を有する核酸について決定される。当業者であれば、上記の教科書、または以下の教科書：Sambrookら、「Molecular Cloning」、Cold Spring Harbor Laboratory, 1989; HamesおよびHiggins (Ed.) 1985、「Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach」、IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (Ed.) 1991、「Essential Molecular Biology: A Practical Approach」、IRL Press at Oxford University Press, Oxfordなどの教科書に言及することによって必要とされるハイブリダイゼーション条件を決定する方法を知っている。あるいは、ポリヌクレオチドバリアントは、混合オリゴヌクレオチドプライマーに基づくDNAの増幅、すなわち、本発明のポリペプチドの保存されたドメインに対する縮重プライマーの使用などのPCRに基づく技術によって得られる。ポリペプチドの保存されたドメインを、本発明のポリヌクレオチドの核酸配列またはポリペプチドのアミノ酸配列と、他の生物の配列との配列比較によって同定することができる。鋳型として、細菌、菌類、植物、または好ましくは、動物に由来するDNAまたはcDNAを用いることができる。さらに、バリアントは、具体的に示される核酸配列またはその機能的サブ配列と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%または少なくとも99%同一である核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む。さらに、具体的に示されるアミノ酸配列と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%または少なくとも99%同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドも包含される。同一性パーセント値は、好ましくは、アミノ酸または核酸配列領域全体にわたって算出される。様々なアルゴリズムに基づく一連のプログラムが、異なる配列を比較するために当業者に利用可能である。これに関連して、NeedlemanおよびWunschまたはSmithおよびWatermanのアルゴリズムが、特に信頼できる結果を与える。配列アラインメントを実行するために、GCGソフトウェアパケット (Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711 (1991))の一部である、プログラムPileUp(J. Mol. Evolution., 25, 351-360, 1987、Higginsら、CABIOS, 5 1989: 151-153)またはプログラムGapおよびBestFit [NeedlemanおよびWunsch (J. Mol. Biol. 48; 443-453 (1970))ならびにSmithおよびWaterman (Adv. Appl. Math. 2; 482-489 (1981))]を使用すべきである。パーセント(%)で上記された配列同一性値は、好ましくは、別途特定されない限り、常に配列アラインメントのための標準設定として使用されるべきである、以下の設定：ギャップ重量：50、長さ重量：3、平均マッチ：10.000および平均ミスマッチ：0.000を用いて、配列領域全体にわたってGAPプログラムを使用して決定すべきである。
【００１７】
具体的に示された核酸配列のいずれかの断片を含むポリヌクレオチドであって、示された活性または複数の活性を保持する前記ポリヌクレオチドもまた、本発明のポリヌクレオチドバリアントとして包含される。本明細書で意味する断片は、好ましくは、特定の核酸配列のいずれか1つの少なくとも100個、好ましくは、少なくとも200個、より好ましくは、少なくとも250個の連続するヌクレオチドを含むか、または特定のアミノ酸配列のいずれか1つの少なくとも50個、好ましくは、少なくとも60個、より好ましくは、少なくとも75個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸配列をコードする。
【００１８】
本発明のポリヌクレオチドは、上記の核酸配列からなる、から本質的になる、またはそれらを含む。かくして、それらは、同様にさらなる核酸配列を含有してもよい。具体的には、本発明のポリヌクレオチドは、融合タンパク質の一方のパートナーが、本明細書に記載される核酸配列によってコードされるAcrポリペプチドである融合タンパク質をコードしてもよい。そのような融合タンパク質は、追加の部分として、発現をモニタリングするためのポリペプチド(例えば、緑色、黄色、青色もしくは赤色蛍光タンパク質、アルカリホスファターゼなど)または検出マーカーとして、もしくは精製のための補助手段として役立ち得るいわゆる「タグ」を含んでもよい。様々な目的のためのタグが当業界で周知であり、本明細書の他の箇所に記載される。好ましくは、ポリヌクレオチドは、核局在化配列(NLS)に融合されたAcrポリペプチドをコードする。好ましくは、ポリヌクレオチドは、Casヌクレアーゼをコードする核酸配列を含まない；より好ましくは、ポリヌクレオチドは、好ましくは、本明細書の他の箇所で特定される、Casヌクレアーゼの少なくとも断片をコードする核酸配列をさらに含む。
【００１９】
好ましくは、ポリヌクレオチドは、RNAである。より好ましくは、ポリヌクレオチドは、Acrポリペプチドをコードする前記配列および前記RNAi標的配列を含む連続するRNAとして発現可能な核酸配列を含むDNAである。好ましくは、ポリヌクレオチドがDNAである場合、ポリヌクレオチドは、原核生物または真核生物、好ましくは、真核宿主細胞またはその単離された画分中での発現を可能にする発現制御配列に機能し得る形で連結される。前記ポリヌクレオチドの発現は、好ましくは、翻訳可能なmRNAへの、ポリヌクレオチドの転写を含む。真核細胞、好ましくは、哺乳動物細胞中での発現を確保する調節エレメントは、当業界で周知である。それらは、好ましくは、転写の開始を確保する調節配列と、必要に応じて、転写の終結および転写物の安定化を確保するポリAシグナルを含む。さらなる調節エレメントは、転写ならびに翻訳エンハンサーを含んでもよい。真核宿主細胞中での発現を許容する調節エレメントの例は、酵母におけるAOX1もしくはGAL1プロモーターまたは哺乳動物および他の動物細胞におけるSMVP、U6、H1、7SK、CMV、EFS、SV40もしくはRSVプロモーター(ラウス肉腫ウイルス)、CMVエンハンサー、SV40エンハンサーもしくはグロビンイントロンである。さらに、誘導性または細胞型特異的発現制御配列を、本発明のポリヌクレオチドに含ませてもよい。誘導性発現制御配列は、tetもしくはlacオペレーター配列または熱ショックもしくは他の環境因子によって誘導される配列を含んでもよい。安定な発現制御配列は、当業界で周知である。転写の開始を担うエレメントの他に、そのような調節エレメントはまた、ポリヌクレオチドの下流に、SV40-ポリA部位またはtk-ポリA部位などの転写終結シグナルを含んでもよい。
【００２０】
「クラスター化された規則的な配置の短い回文配列リピート」または「CRISPR」系は、上記のように、当業者には公知である。本明細書で使用される用語「gRNA」は、crRNA/tracrRNAハイブリッドおよびCas CRISPR系のcrRNA-tracrRNA融合RNA、ならびにCPF1 CRISPR系のガイドRNAを含む。より好ましくは、gRNAという用語は、Cas CRISPR系のcrRNA-tracrRNA融合RNA、ならびにCPF1 CRISPR系のガイドRNAに関する。最も好ましくは、gRNAという用語は、Cas CRISPR系のcrRNA-tracrRNA融合RNAに関する。好ましくは、gRNAは、標的配列と相補的な少なくとも15ヌクレオチド、好ましくは、少なくとも18ヌクレオチド、より好ましくは、少なくとも20ヌクレオチドを含む。本明細書で使用される用語「相補的」は、別途注記されない場合、少なくとも90%、より好ましくは、少なくとも95%、さらにより好ましくは、99%の相補性に関する。最も好ましくは、相補性は、上記数のヌクレオチドにわたる100%の相補性に関する。さらに、好ましくは、本発明のgRNAは、Cpf1エンドヌクレアーゼの結合を媒介するヌクレオチド配列をさらに含むか、または好ましくは、Cas CRISPR系、より好ましくは、Cas9 CRISPR系のtracrRNA配列を含む。好ましくは、gRNAは、構造5’-標的化配列-活性化配列-3'を含み、より好ましくは、gRNAは、構造5’-標的化配列-リンカーループ-活性化配列-3’(ここで、前記リンカーループは、10〜30塩基対、より好ましくは、15〜25塩基対を含むステムループを含む)を含む。
【００２１】
本明細書で使用される用語「CRISPR関連エンドヌクレアーゼ」および「Casヌクレアーゼ」は、両方とも同等に、原理的には、当業界で公知である、本明細書で特定されるgRNAを認識する、エンドヌクレアーゼ、好ましくは、エンド-DNaseに関する。好ましくは、Casヌクレアーゼは、II型CRISPRエンドヌクレアーゼである。好ましくは、Casヌクレアーゼは、PrevoellaおよびFrancisellaエンドヌクレアーゼに由来するCRISPRエンドヌクレアーゼ、すなわち、Cpf1エンドヌクレアーゼである。より好ましくは、CRISPRエンドヌクレアーゼは、Cas9エンドヌクレアーゼである。好ましくは、Cas9ヌクレアーゼは、Staphylococcus aureusに由来するCas9エンドヌクレアーゼであるか、またはStreptococcus pyogenesに由来するCas9エンドヌクレアーゼであり、より好ましくは、Streptococcus pyogenesに由来するCas9エンドヌクレアーゼである。好ましくは、Casヌクレアーゼは、好ましくは、配列番号37に示される核酸配列によってコードされる、配列番号36に示されるアミノ酸配列を有する。本明細書で使用される用語「Casヌクレアーゼの断片」は、それ自体、ヌクレアーゼとして触媒的に活性ではないが、前記断片と、それ自体、同様に触媒的に活性ではない第2の断片とを接触させることによって、触媒的に活性なヌクレアーゼを形成するように再構成することができるCasヌクレアーゼのポリペプチド断片に関する。かくして、本明細書で言及される、Casヌクレアーゼの断片は、再構成可能な断片である。上記定義に対応するCasヌクレアーゼの断片の組合せの例は、本明細書の実施例に示される。好ましくは、Cas活性の再構成は、2つの断片間の結合を媒介する補助ペプチド配列へのCasポリペプチドの2つの非同一の断片の融合によって達成される。より好ましくは、実施例に示されるように、Cas活性の再構成は、2つの断片間のトランスタンパク質スプライシングを媒介する補助ペプチド配列への2つの非同一の断片の融合によって、例えば、2つのCas断片を融合して、インテイン配列、好ましくは、それぞれ、配列番号25および配列番号33の配列を含む核酸配列によってコードされる、好ましくは、配列番号24および配列番号32の配列を含むアミノ酸配列を分割することによって、達成される。したがって、Casヌクレアーゼの断片は、好ましくは、配列番号23を含むポリヌクレオチドによってコードされる配列番号22および/または好ましくは、配列番号31を含むポリヌクレオチドによってコードされる配列番号30のアミノ酸配列を有する。
【００２２】
用語「抗CRISPRポリペプチド」および「Acrポリペプチド」は、当業者には公知であり、同等に、少なくとも1つのCasヌクレアーゼ、好ましくは、Cas9ヌクレアーゼを阻害する活性を有するポリペプチドに関する。Acrポリペプチドは、例えば、Pawlukら(2016), Cell 167(7): 1829から、およびRauchら(2017), Cell 168(1-2): 150から当業界で公知である。Casヌクレアーゼを阻害するポリペプチドの阻害活性を、好ましくは、図2の実施例において本明細書で特定される、疑われるAcrポリペプチドの存在下で前記Casヌクレアーゼの活性を決定することによって決定することができる。好ましくは、少なくとも1つのCasヌクレアーゼの活性が、上記で特定されたアッセイにおいて少なくとも50%阻害される場合、ポリペプチドはAcrポリペプチドとして同定される。より好ましくは、少なくとも1つのCas9ヌクレアーゼ、より好ましくは、Streptococcus pyogenesに由来するCas9エンドヌクレアーゼの活性が、上記で特定されたアッセイにおいて少なくとも50%阻害される場合、ポリペプチドはAcrポリペプチドとして同定される。しかしながら、当業者によって理解されるように、目的のポリペプチドが目的の別のCasヌクレアーゼのためのAcrポリペプチドであるかどうかを確立することも、当業者の能力の範囲内にある。また理解されるように、好ましくは、本発明のAcrポリペプチドは、それが使用を意図されるCasヌクレアーゼを阻害するように選択される。かくして、例えば、Streptococcus pyogenesに由来するCas9エンドヌクレアーゼは、遺伝的改変のために使用されることが意図され、それと接触される細胞の少なくとも一部において阻害され、Listeria monocytogenesプロファージのAcrポリペプチドを用いることができる。かくして、好ましくは、Acrポリペプチドは、Listeria monocytogenesプロファージのAcrポリペプチドであり、より好ましくは、AcrIIA2またはAcrIIA4ポリペプチド、最も好ましくは、AcrIIA4ポリペプチドである。好ましくは、Acrポリペプチドは、より好ましくは、配列番号21に示される配列を含む、好ましくは、それからなる核酸配列によってコードされる、配列番号20に示されるアミノ酸配列を含む、好ましくは、それからなる。
【００２３】
用語「RNA干渉」(RNAi)は、当業者には公知であり、二本鎖RNA(dsRNA)分子が、RNA誘導性サイレンシング複合体(RISC)によって媒介される、二本鎖RNAと相補的な配列を含む遺伝子の発現を阻害する、特に、哺乳動物細胞および高等植物細胞を含む、多くの高等細胞の内因性の生物学的プロセスに関する。理論によって束縛されることを望むものではないが、RNAiは、mRNAを標的化することによって目的の遺伝子の発現をサイレンシングするために一般的に使用される。簡単に述べると、細胞中でのRNAiのプロセスは、リボヌクレアーゼによって切断されるdsRNAによって開始され、かくして、干渉RNAを生成する。干渉RNAは、別の細胞内酵素複合体に結合し、それによって、干渉RNA配列と十分に相補的であるどんなmRNA分子でも標的化するように活性化される。複合体の機能は、1つの干渉RNA鎖と、標的mRNAとの塩基対相互作用によって相同なmRNA分子を標的化することである。この結合の効果は、干渉RNAと標的との類似性の程度に大きく依存する：不完全な相補性(少なくとも1個の塩基ミスマッチ)が存在する場合、効果は、主に翻訳阻害、すなわち、標的mRNAの翻訳の防止である；完全な相補性(ミスマッチがない)が存在する場合、効果は主に、標的mRNAの分解である。次いで、mRNAは、siRNAの3’末端から約12ヌクレオチド切断され、分解される。このように、特定のmRNAを標的化し、翻訳阻害および/または分解することによって、標的化されたmRNAからのタンパク質発現の喪失をもたらすことができる。また、当業者には公知であるように、RNAiを、サイレンシングRNA(siRNA)を提供するように切断される、外因性(異種)dsRNA分子によって引き起こすか、またはマイクロRNA(miRNA)を提供するように切断される、内因性dsRNA分子によって開始させることができる。両経路とも、dsRNAとその標的との相同性の程度に応じて、標的化されたRNAの翻訳抑制および/または分解を誘導し得る、RISCに収束する。当業者であれば理解できるように、RNAiを引き起こす外因性dsRNAを、例えば、短いヘアピンRNA(shRNA)であってもよい、dsRNAのトランスフェクションによってそのまま細胞に提供するか、またはそのようなdsRNAを形成するRNAを発現させることによって提供することができる。かくして、別途注記しない限り、siRNAという用語は、shRNAを含む。
【００２４】
したがって、本明細書で使用される用語「RNAi標的配列」は、RNA干渉を誘導するdsRNA(干渉RNA)に特異的にハイブリダイズする核酸配列に関する。かくして、RNAi標的配列は、少なくとも1つのRNAi誘導分子(干渉RNA)と本質的に相補的である配列である。好ましくは、RNAi標的配列は、miRNA標的配列またはsiRNA標的配列であり、好ましくは、miRNA標的配列である。かくして、好ましくは、本発明は、(i)抗CRISPR(Acr)ポリペプチドをコードする配列および(ii)miRNA標的配列含むポリヌクレオチドに関する。
【００２５】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも2つのRNAi標的配列を含む。理解されるように、2つのRNAi標的配列は、本質的に同一であってよいか、または異なってもよい。かくして、第1の場合、少なくとも2つのRNAi標的配列は、同じ干渉RNAと本質的に相補的であり、好ましくは、干渉RNAの同じ核酸配列と本質的に相補的である。より好ましくは、そのような場合、少なくとも2つのRNAi標的配列は、同じmiRNAと100%相補的であり、好ましくは、干渉RNAの同じ核酸配列と100%相補的である。第2の場合、少なくとも2つのRNAi標的配列は、本質的に同一ではなく、より好ましくは、互いに80%未満、さらにより好ましくは70%未満、最も好ましくは、60%未満同一である。かくして、好ましくは、少なくとも2つのRNAi標的配列が異なる場合、それらは、本質的には、2つの異なる干渉RNAと好ましくは100%相補的である。当業者であれば理解できるように、本発明のポリヌクレオチドはまた、2つより多いRNAi標的配列、例えば、3つの本質的に同一のRNAi標的配列、または2つの本質的に同一の標的配列と、他の2つ、もしくは同様の集まりと非同一の1つのRNAi標的配列とを含んでもよい。
【００２６】
また、当業者であれば理解できるように、本発明のポリヌクレオチドはまた、異なる型のRNAi標的配列、例えば、1つのsiRNA標的部位と、1つのmiRNA標的部位；または2つがmiRNA標的部位(本質的に同一であっても、なくてもよい)および1つのsiRNA標的部位である3つのRNAi標的部位を含んでもよい。好ましくは、ポリヌクレオチドは、少なくとも1つのmiRNA標的部位、より好ましくは、少なくとも2つのmiRNA標的部位、さらにより好ましくは、少なくとも2つの本質的に同一のmiRNA標的部位を含む。本発明によれば、miRNA標的部位の含有は、好ましくは、1つ以上の特定の組織および/または細胞型中でのCasヌクレアーゼ活性を確保するために使用され、siRNA標的部位の含有は、Casヌクレアーゼ活性の外部的誘導を可能にするために使用される。
【００２７】
本明細書で使用される用語「干渉RNA」は、RNA干渉を誘導するRNA分子に関する；本明細書の他の箇所で詳述されるように、干渉RNAは、少なくとも部分的に二本鎖RNA分子である；それに応じて、干渉一本鎖RNA(ss-iRNA)という用語は、細胞サイレンシング成分および誘導RNA干渉によって干渉RNAから誘導される一本鎖RNAに関する。干渉RNAという用語は、好ましくは、2つの相補鎖および逆平行核酸鎖を含む二本鎖構造を有するRNAを指す。干渉RNAの二本鎖部分の全てのヌクレオチドが完全なワトソン・クリック塩基対を示す必要はない；2つのRNA鎖は、実質的に相補的であってもよい。干渉RNAの二本鎖部分を形成するRNA鎖は、同じか、または異なる数のヌクレオチドを有してもよく、塩基対の最大数は、RNAの短い方の鎖におけるヌクレオチドの数である。好ましくは、干渉RNAの二本鎖領域は、200ヌクレオチド長以下、より好ましくは、100ヌクレオチド長未満、さらにより好ましくは、50ヌクレオチド長未満、最も好ましくは、19〜23ヌクレオチド長である。続いて、干渉RNAは、リボヌクレアーゼ酵素によって、短い干渉RNA(siRNA)またはマイクロ(miRNA)に分解される。干渉RNAまたはss-iRNAの相補的領域は、標的RNAへの十分なハイブリダイゼーションを可能にし、かくして、RNAiを媒介する。哺乳動物細胞中では、ss-iRNAは、約20〜25ヌクレオチド長である。ss-iRNA配列は、相補的塩基対相互作用によってss-iRNAと標的RNAとを一緒にするために十分な長さのものである必要がある。ss-iRNAの長さは、好ましくは、標的RNAと安定に相互作用するのに十分な長さのもの；具体的には、10〜30ヌクレオチドである；より具体的には、10〜30ヌクレオチドの任意の整数、最も好ましくは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29または30である。「安定に相互作用する」とは、好ましくは、生理的条件下で標的中の相補的ヌクレオチドと水素結合を形成することによる、ss-iRNAと、標的核酸との相互作用を意味する。好ましくは、ss-iRNAとRNA標的との相補性は、少なくとも80%、より好ましくは、少なくとも90%、さらにより好ましくは、少なくとも95%、さらにより好ましくは、少なくとも98%である。最も好ましくは、ss-iRNAとRNA標的との相補性は、100%である。好ましくは、前記相補性は、最も高い相補性の値を提供する少なくとも20ヌクレオチドの伸長物にわたって算出され、より好ましくは、ss-iRNAの全長にわたって算出される。C.elegans、Drosophila、植物、および哺乳動物を含む生物における遺伝子をサイレンシングするためのRNAiの使用に関する方法は、当業界で公知である(例えば、WO 0129058; WO 09932619; およびElbashir (2001), Nature 411: 494-498 を参照されたい)。
【００２８】
好ましくは、干渉RNAは、siRNAである。狭い意味で、siRNAという用語は、dsRNA前駆体から切断され、遺伝子サイレンシングを媒介するタンパク質複合体に組み込まれた短い、一本鎖RNA分子に関する；しかしながら、より広い意味では、この用語は、上記の意味と、一本鎖siRNAが切断される前駆体dsRNAについてと両方で使用される；後者のより広い定義は、本明細書で使用される定義である；区別のために、狭い意味でのsiRNAは、一本鎖siRNAと呼ばれる。かくして、本明細書で使用される用語「siRNA」とは、本発明のRNAi標的配列と少なくとも部分的に本質的に相補的であり、RNA干渉(RNAi)により遺伝子発現を減少させるか、または無効化する外因性dsRNAを指す。本明細書で使用される用語「外因性RNA」は、細胞の外部を起源とするRNAに関する；疑いを避けるために、この用語は、そのまま細胞中に導入されるRNAを含むが、異なるポリヌクレオチド、特に、DNAを細胞に導入して、前記RNAの発現を引き起こしたRNAも含む。適切なsiRNAの構造およびそれらを提供するための方法は、当業界で周知である。好ましくは、siRNAは、好ましくは、「ループ」配列が介在する逆方向反復であって、好ましくは、上記で特定された長さおよび相補性を有する、RNAi標的配列と本質的に相補的である配列を含む、前記逆方向反復配列を含むRNAである。
【００２９】
より好ましくは、干渉RNAは、マイクロRNA(miRNA)である。上記と同様、miRNAという用語は、miRNA前駆体から切断され、遺伝子サイレンシングを媒介するタンパク質複合体に組み込まれた短い、一本鎖RNA分子に関する；しかしながら、より広い意味では、この用語は、上記の意味と、一本鎖miRNAが切断される前駆体miRNAについてと両方で使用される；後者のより広い定義は、本明細書で使用される定義である；区別のために、狭い意味でのmiRNAは、一本鎖miRNAと呼ばれる。かくして、本明細書で使用される用語「miRNA」とは、本発明のRNAi標的配列と少なくとも部分的に本質的に相補的であり、RNA干渉(RNAi)により遺伝子発現を減少させるか、または無効化する内因性RNAを指す。本明細書で使用される用語「内因性RNA」は、細胞自体を起源とするRNAに関する；好ましくは、miRNAは、細胞のゲノムから転写される核酸である。好ましくは、miRNAは、多くても5つの組織および/または細胞型、より好ましくは、多くても4つの組織および/または細胞型、さらにより好ましくは、多くても3つの組織および/または細胞型、さらにより好ましくは、多くても2つの組織および/または細胞型において発現されるmiRNAである；最も好ましくは、miRNAの発現は、組織および/または細胞型特異的である。組織および細胞型における発現の特異性は、多くのmiRNAについて公知であり、公共データベースから誘導することができる。さらに、miRNAの組織および/または細胞型特異性を決定するための方法は、当業界で、例えば、Landgrafら((2007), Cell 129(7):1401、Guoら(2014), Scientific Reports 4, doi:10.1038/srep05150; Babakら(2004), RNA 10:1813; Liuら (2011), J Biomed Sci Eng 4(19): 666; Ludwigら(2016), NAR 44(8):3865; およびBakerら(2017) JASN, doi: 10.1681/ASN.2016121280)から公知である。好ましくは、miRNAは、哺乳動物、より好ましくは、ヒトmiRNAである；例えば、データベースmiRBase (www.mirbase.org), release 21, lists 296 high-confidence human miRNA。より好ましくは、miRNAは、ヒトmiRNA miR-1(配列番号44)、miR-206(配列番号45)、miR-208a(配列番号46)、miR-122(配列番号47)、およびmiR-142(配列番号48)から選択される。
【００３０】
有利には、Casヌクレアーゼの活性を、Acr遺伝子を発現させることによって細胞中で阻害することができるが、この阻害を、miRNA依存的分解シグナルがAcrをコードするmRNA中に組み込まれる場合に細胞型特異的様式で軽減できるということが、本発明の基礎にある研究において見出された。理解されるように、miRNA標的配列、例えば、2種以上の細胞型において発現されるmiRNAを適切に選択することによって、または2種以上のmiRNAの標的配列を含有させることによって、2種以上の細胞型および/または組織における阻害の放出が可能である。さらに、細胞型特異的送達手段を用いたsiRNA標的部位のみを含むポリヌクレオチドを提供することによって、また、第2の送達手段によりsiRNAをさらに提供することによって、Casヌクレアーゼ活性の二重特異性を達成することができる；すなわち、第1の送達手段が細胞表面上の第1の受容体に特異的であり、第2の送達手段が第2の受容体に特異的である場合、Casヌクレアーゼの活性化は、両方の受容体を有する細胞中でのみ起こるであろう。Casヌクレアーゼの阻害は、翻訳後に起こることがさらに有利である。したがって、小さいAcr(AcrIIA4の場合、87アミノ酸)の転写および翻訳は、長いCas(1,000アミノ酸を超える)と比較して速く、より効率的であるため、任意の時点でCas活性を効率的に抑制することができる。さらに、現行のmiR-ON/Cas-ON戦略とは対照的に、本発明の系は、リプレッサー依存的プロモーターバリアントまたは導入遺伝子のUTR(非翻訳領域)内のリプレッサーにより標的とされ得る調節エレメントなどの、Cas導入遺伝子自体の中で必要とされる特異的調節エレメントとは無関係である。
【００３１】
上記の定義は、変更すべきところは変更して、以下にも適用される。以下でさらに為されるさらなる定義および説明も、変更すべきところは変更して、本明細書に記載の全ての実施形態に適用される。
【００３２】
本発明はさらに、本発明によるポリヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００３３】
本明細書で使用される用語「ベクター」は、ポリヌクレオチドを細胞中に送達する、および/または安定に維持する、および/または増殖させるのに必要とされる構造決定因子であって、必要に応じて、自己増殖する実体、例えば、ウイルスの外殻のエレメントを含む前記構造決定因子を含むポリヌクレオチドに関する。この用語は、好ましくは、ファージ、プラスミド、およびウイルスベクターならびに細菌または酵母人工染色体などの人工染色体を包含する。かくして、ベクターは、RNAまたはDNAであるか、またはそれを含んでもよい。さらに、この用語はまた、標的化構築物のゲノムDNAへの無作為または部位特異的な組込みを可能にする標的化構築物に関する。そのような標的構築物は、好ましくは、以下で詳細に説明される相同または非相同組換えにとって十分な長さのDNAを含む。本発明のポリヌクレオチドを包含するベクターは、好ましくは、宿主中での増殖および/または選択のための選択マーカーをさらに含む。ベクターを、当業界で周知の様々な技術によって宿主細胞中に送達することができる。例えば、プラスミドベクターを、リン酸カルシウム沈殿もしくは塩化ルビジウム沈殿などの沈殿中に、または荷電した脂質との複合体、もしくはフラーレンなどの炭素に基づくクラスター中の複合体中に導入することができる。あるいは、プラスミドベクターを、熱ショックまたはエレクトロポレーション技術によって導入することができる。ベクターがウイルスである場合、それを、宿主細胞への適用の前に、適切なパッケージング細胞系を使用してin vitroでパッケージングすることができる。レトロウイルスベクターは、複製可能または複製欠損であってもよい。後者の場合、ウイルス増殖は一般に、補完宿主/細胞中でのみ起こるであろう。好ましくは、ベクターは、アデノ随伴ウイルス、好ましくは、非複製可能アデノ随伴ウイルスである。標的化された送達、すなわち、高い特異性での1つ以上の細胞集団または組織へのポリヌクレオチドまたはベクターの送達を、目的の細胞および/もしくは組織に対する天然の向性を有してもよい、またはそれに対して再度標的化することができるウイルスベクターによって達成することができる；しかしながら、非ウイルス標的化方法も、例えば、Harrisら(2010), Biomaterials 31(5): 998から、当業者には公知である。
【００３４】
好ましくは、本発明のベクター中、ポリヌクレオチドは、上記で特定された発現制御配列に機能し得る形で連結される。これに関連して、Okayama-Berg cDNA発現ベクターpcDV1 (Pharmacia)、pBluescript (Stratagene)、pCDM8、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3 (ThermoFisher)またはpSPORT1 (Invitrogen)などの好適な発現ベクターが、当業界で公知である。同様の発現制御ベクターは、レトロウイルスなどのRNAベクターについても公知である。好ましくは、ベクターは、発現ベクターおよび遺伝子導入または標的化ベクターである。レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、またはウシパピローマウイルスなどのウイルスから誘導される発現ベクターを、標的細胞集団への本発明のポリヌクレオチドまたはベクターの送達のために使用することができる。当業者には周知である方法を使用して、組換えウイルスベクターを構築することができる；例えば、Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y.およびAusubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1994)に記載された技術を参照されたい。
【００３５】
本発明はまた、本発明によるポリヌクレオチドおよび/または本発明によるベクターを含む宿主細胞に関する。
【００３６】
本明細書で使用される用語「宿主細胞」は、本発明のポリヌクレオチドおよび/またはベクターを受け取る、および必要に応じて、維持する、および/または増殖させることができる任意の細胞に関する。好ましくは、細胞は、細菌細胞、より好ましくは、当業界で公知の一般的な実験細菌株の細胞、最も好ましくは、Escherichia株、特に、E.coli株である。また好ましくは、宿主細胞は、真核細胞、好ましくは、植物もしくは酵母細胞、例えば、パン酵母株の細胞であるか、または動物細胞である。より好ましくは、宿主細胞は、昆虫細胞または哺乳動物細胞、特に、マウスまたはラット細胞である。さらにより好ましくは、宿主細胞は、哺乳動物細胞であり、最も好ましくは、ヒト細胞である。本明細書で使用される用語「許容状態の宿主細胞」は、経路にとって一般的であるRNA干渉が起こるのに必要とされる全ての成分を含む本明細書で特定される宿主細胞に関する；許容状態の宿主細胞中で、RNA干渉は、標的RNAと干渉RNAとが提供される場合に起こると予想される。好ましくは、許容状態の宿主細胞は、植物もしくは酵母細胞、例えば、パン酵母株の細胞であるか、または動物細胞である。より好ましくは、許容状態の宿主細胞は、昆虫細胞または哺乳動物細胞、特に、マウスまたはラット細胞である。さらにより好ましくは、許容状態の宿主細胞は、哺乳動物細胞であり、最も好ましくは、ヒト細胞である。
【００３７】
本発明はさらに、医学における使用のための、本発明によるポリヌクレオチドおよび/または本発明によるベクターおよび/または本発明による宿主細胞に関する。
【００３８】
本発明はさらに、遺伝的疾患、神経変性疾患、がん、および/または感染症の処置および/または防止における使用のための、本発明によるポリヌクレオチドおよび/または本発明によるベクターおよび/または本発明による宿主細胞に関する。
【００３９】
本発明の手段および方法は、原理的には、細胞、好ましくは、特定の細胞型の遺伝的改変が有益と考えられるありとあらゆる疾患の処置および/または防止において使用可能である。そのことは、特に、遺伝的疾患、神経変性疾患、がん、および感染症にも当てはまる。本明細書で使用される用語「遺伝的改変」は、好ましくは、核DNA、オルガネラDNA(ミトコンドリアDNAまたはプラスチドDNA)を含むが、遊離核酸としての、または宿主細胞のDNAに共有的に接続された、感染性因子に由来する核酸も含む、所与の時点で宿主細胞中に含まれる任意の種類の核酸の改変を含む。好ましくは、遺伝的改変は、宿主細胞の核に存在する、核酸、好ましくは、DNAの改変である。
【００４０】
用語「処置」とは、本明細書に記載の疾患もしくは障害またはそれに伴う症状の有意な程度での改善を指す。本明細書で使用される前記処置は、本明細書に記載の疾患または障害に関する健康の完全な回復も含む。本発明に従って使用される処置は、処置される全ての対象において有効でなくてもよいことが理解されるべきである。しかしながら、この用語は、好ましくは、本明細書に記載の疾患または障害に罹患している対象の統計的に有意な部分を上手く処置できることを必要とするべきである。当業者であれば、ある部分が統計的に有意であるかどうかを、様々な周知の統計評価手段、例えば、信頼区間の決定、p値の決定、Studentのt検定、Mann-Whitney検定などを使用してさっさと決定することができる。好ましい信頼区間は、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%である。p値は、好ましくは、0.1、0.05、0.01、0.005、または0.0001である。好ましくは、処置は、所与のコホートまたは集団の対象の少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、または少なくとも90%について有効であるべきである。
【００４１】
用語「防止すること」とは、対象においてある特定の期間にわたって本明細書に記載の疾患または障害に関して健康を保持することを指す。前記期間は、対象の様々な個別の因子および特定の防止的処置に依存することが理解されるであろう。防止は、本発明に記載の化合物を用いて処置される全ての対象において有効でなくてもよいことが理解されるべきである。しかしながら、この用語は、好ましくは、コホートまたは集団の対象の統計的に有意な部分が、本明細書に記載の疾患または障害またはそれに伴う症状への罹患から有効に防止されることを必要とする。好ましくは、通常、すなわち、本発明に記載の防止手段を用いずに、本明細書に記載の疾患または障害を発症するであろう対象のコホートまたは集団が、これに関連して想定される。当業者であれば、ある部分が統計的に有意であるかどうかを、本明細書の他の箇所で考察される様々な周知の統計評価手段を使用してさっさと決定することができる。
【００４２】
本明細書で使用される用語「遺伝的疾患」は、個体のゲノム中の1つ以上の改変、好ましくは、突然変異と因果関係がある疾患に関する。かくして、好ましくは、遺伝的疾患は、1つ以上のエピジェネティック変化と因果関係があり、より好ましくは、1つ以上の遺伝子突然変異と因果関係がある。理解されるように、遺伝的疾患の症状は、1つ以上の特定の組織および/または細胞型における突然変異遺伝子の発現および/または遺伝子産物の正常な機能を提供する遺伝子の発現の欠如によって引き起こされることが多い。かくして、突然変異が疾患に寄与する細胞のみを、Cas活性によって遺伝的に改変することが好ましい。好ましくは、遺伝的疾患は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ハンチントン病、血友病A/B、嚢胞性線維症、ミオチュブラーミオパチー、糖原病、または鎌状赤血球貧血であり、その原因および症状は、医学の教科書から当業者には公知である。
【００４３】
用語「神経変性疾患」は、個体の末梢および/または中枢神経系におけるニューロンの構造および/または機能の進行的喪失によって引き起こされる疾患に関する。好ましくは、神経変性疾患は、運動ニューロンの神経変性疾患および/または中枢神経系の神経変性疾患である。好ましくは、神経変性疾患は、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、パーキンソン病、または脊髄小脳失調、好ましくは脊髄小脳失調1型(SCA１)である。理解されるように、多くの神経変性疾患は、遺伝的疾患である。
【００４４】
用語「がん」は、原理的には、当業者によって理解され、体細胞群による未制御の増殖を特徴とする(「がん細胞」)、ヒトを含む、動物の疾患に関する。この未制御の増殖は、周囲の組織への侵入およびその破壊ならびにおそらく体内の他の位置へのがん細胞の拡散と同時に起こってもよい。好ましくは、がんという用語には、再発も含まれる。かくして、好ましくは、がんは、非固形がん、例えば、白血病であるか、または固形がんの腫瘍、転移、もしくはその再発である。当業者には公知のように、がん細胞は、特に、がん遺伝子または腫瘍抑制遺伝子中に突然変異を蓄積し、遺伝的改変による補正に適していてもよい。さらに、本発明の手段および方法を使用して、具体的には、がん細胞中での、例えば、アポトーシスによって、細胞死を誘導することができる。好ましくは、がんの処置は、対象における腫瘍および/またはがん細胞量を減少させることである。当業者によって理解されるように、例えば、がんの処置の有効性は、例えば、がんのステージおよびがんの種類を含む、様々な因子に依存する。
【００４５】
用語「感染症」は、原理的には、当業者によって理解される。好ましくは、本明細書で使用されるこの用語は、感染性因子の複製サイクルが、感染性因子のゲノムが許容状態の宿主細胞中に存在する少なくとも1つのステージを含む感染症に関する。かくして、感染症は、好ましくは、ウイルス感染であり、好ましくは、免疫不全ウイルス感染、ヘルペスウイルス感染、パピローマウイルス感染、またはB型肝炎ウイルス感染である。
【００４６】
本発明はさらに、
(I)(i)抗CRISPR(Acr)ポリペプチドをコードする配列および(ii)RNA干渉(RNAi)標的配列を含む第1のポリヌクレオチド；ならびにCasヌクレアーゼまたはCasヌクレアーゼをコードする発現可能な遺伝子を含む第2のポリヌクレオチド；
(II)(i)抗CRISPR(Acr)ポリペプチドをコードする配列および(ii)RNA干渉(RNAi)標的配列を含む第1のポリヌクレオチドであって、Casヌクレアーゼの第1の断片をコードする発現可能な遺伝子をさらに含む前記第1のポリヌクレオチド；ならびにCasヌクレアーゼの第2の断片をコードする発現可能な遺伝子を含む第2のポリヌクレオチドであって、前記Casヌクレアーゼの前記第1および第2の断片が活性なCasヌクレアーゼを一緒になって再構成する、第1および第2のポリヌクレオチド；または
(III)(i)抗CRISPR(Acr)ポリペプチドをコードする配列、(ii)RNA干渉(RNAi)標的配列、および(iii)Casヌクレアーゼをコードする配列を含む第1のポリヌクレオチド；ならびに阻害的RNA、好ましくは、前記RNAi標的配列にハイブリダイズするsiRNAもしくはmiRNA、より好ましくは、前記RNAi標的配列にハイブリダイズするsiRNAをコードする発現可能な遺伝子を含む第2のポリヌクレオチド
を含む、キットに関する。
【００４７】
本明細書で使用される用語「キット」とは、一緒にパッケージングされていても、またはされていなくてもよい、本発明の上記化合物、手段または試薬の集合を指す。キットの成分は、別々のバイアルによって含まれていてもよいか(すなわち、別々の部品のキットとして)、または単一のバイアル中に提供してもよい。さらに、本発明のキットは、好ましくは、上記の方法を実行するために使用されることが理解されるべきである。実施形態においては、全ての成分が、上記の方法を実行するために即時使用可能な様式で提供されることが想定される。さらに、キットは、実施形態においては、前記方法を実行するための指示書を含有する。指示書を、紙の形態または電子的形態のユーザーズマニュアルによって提供することができる。さらに、マニュアルは、本発明のキットを使用して上記方法を実行する場合に得られる結果を解釈するための指示書を含んでもよい。好ましくは、キットに含まれる第1のポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドである。また好ましくは、必要に応じて、キットのポリヌクレオチドによって含まれるCasヌクレアーゼまたはその断片をコードする核酸配列の発現は、細胞型特異的プロモーターによって駆動される。また好ましくは、キットは、少なくとも1つのガイドRNA(gRNA)をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。好ましくは、少なくとも1つのgRNAをコードするポリヌクレオチドは、第1または第2のポリヌクレオチドであり、より好ましくは、第2のポリヌクレオチドである。上記から理解されるように、ポリヌクレオチドを含むキットの記載は、好ましくは、変更すべきところは変更して、対応するベクターを含むキットに関する。
【００４８】
好ましくは、キットは、それが含むポリヌクレオチドのための少なくとも1つの送達手段を含み、用語「送達手段」は、キットのポリヌクレオチドを、宿主細胞、好ましくは、許容状態の宿主細胞の内部に進入させるのに好適な任意の手段に関する。好適な送達手段は、当業界で公知であり、特に、トランスフェクション試薬、パッケージング手段などを含む。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、送達手段、例えば、ウイルス粒子中に予めパッケージングされる。上記で特定されたように、当業者であれば、細胞受容体に対する異なる特異性を提供する送達手段を知っている。したがって、好ましくは、キットの第1のポリヌクレオチドは、許容状態の宿主細胞の第1の受容体を標的とする第1の送達手段中にパッケージングされ、前記第2のポリヌクレオチドは、前記許容状態の宿主細胞の第2の受容体を標的とする第2の送達手段中にパッケージングされる。好ましくは、第1および第2の送達手段は、非同一であり、少なくともそれらが優先的に標的とする細胞受容体において異なる。また好ましくは、第1の受容体と第2の受容体は、非同一であり、両方とも、接近可能な様式で、好ましくは、標的細胞の表面上に存在する。
【００４９】
第1の実施形態においては、キットは、(i)抗CRISPR(Acr)ポリペプチドをコードする配列および(ii)RNA干渉(RNAi)標的配列を含む第1のポリヌクレオチド；ならびにCasヌクレアーゼをコードする発現可能な遺伝子を含む第2のポリヌクレオチドを含む。したがって、第1および第2のポリヌクレオチドを宿主細胞中に同時に送達することによって、Cas活性は、阻害されるが、しかしながら、細胞が第1のポリヌクレオチドのRNAi標的配列に対応するmiRNAを発現する場合に、または第1のポリヌクレオチドのRNAi標的配列に対応するsiRNAもしくはshRNAをさらに送達することによって、活性化することができる。かくして、好ましくは、第1の実施形態においては、キットは、細胞型もしくは組織特異的Cas活性化、または誘導性Cas活性化のためのものである。
【００５０】
第2の実施形態においては、キットは、(i)抗CRISPR(Acr)ポリペプチドをコードする配列および(ii)RNA干渉(RNAi)標的配列を含む第1のポリヌクレオチドであって、Casヌクレアーゼの第1の断片をコードする発現可能な遺伝子をさらに含む前記第1のポリヌクレオチド；ならびにCasヌクレアーゼの第2の断片をコードする発現可能な遺伝子を含む第2のポリヌクレオチドであって、前記Casヌクレアーゼの前記第1および第2の断片が、活性なCasヌクレアーゼを一緒になって再構成する、第1および第2のポリヌクレオチドを含む。理解されるように、キットのポリヌクレオチドから発現されるCasヌクレアーゼの断片は、非活性であるが、しかしながら、上記で特定されたように、活性なCasヌクレアーゼを一緒になって生成する。したがって、第1および第2のポリヌクレオチドを宿主細胞中に同時に送達することによって、Cas活性は再構成されるが、しかしながら、Acrポリペプチドによって阻害される；かくして、Cas活性を、キットの第1の実施形態について上で詳述されたように活性化することができる。理解されるように、第1および第2のポリペプチドが、2つの非同一の細胞受容体を標的とする送達手段によって送達される場合、Casヌクレアーゼ活性の送達の特異性を、さらに増大させることができる。
【００５１】
第3の実施形態においては、キットは、(i)抗CRISPR(Acr)ポリペプチドをコードする配列、(ii)RNA干渉(RNAi)標的配列、および(iii)Casヌクレアーゼをコードする配列を含む第1のポリヌクレオチド；ならびに阻害的RNA、好ましくは、前記RNAi標的配列にハイブリダイズするsiRNAまたはshRNAまたはmiRNA、より好ましくは、前記RNAi標的配列にハイブリダイズするsiRNAをコードする発現可能な遺伝子を含む第2のポリヌクレオチドを含む。理解されるように、第1および第2のポリペプチドが、2つの非同一の細胞受容体を標的とする送達手段によって送達される場合、Casヌクレアーゼの活性化を、第1と第2の両方の受容体を担持する細胞に限定することができる。
【００５２】
本発明はさらに、宿主細胞を遺伝的に改変するための方法であって、
a1)前記宿主細胞を、本発明によるポリヌクレオチドと；本発明によるベクターと；および/または本発明による宿主細胞と接触させるステップ；さらに、前記宿主細胞を、Casヌクレアーゼ活性およびgRNAと接触させるステップ；または
a2)前記宿主細胞を、本発明によるキットに含まれる成分およびgRNAと接触させるステップ；
ならびに
b)それによって、前記宿主細胞を遺伝的に改変するステップ
を含む、方法に関する。
【００５３】
本発明の宿主細胞を遺伝的に改変するための方法は、好ましくは、in vitroでの方法である。しかしながら、実施形態においては、方法は、in vivoで適用することもできる。さらに、方法は、上に明示的に記載されたものに加えたステップを含んでもよい。例えば、さらなるステップは、例えば、ステップa1)および/もしくはa2)のための、宿主細胞、好ましくは、許容状態の宿主細胞を提供すること、またはステップb)において適切な時間にわたって前記細胞をインキュベートすることに関するものであってもよい。さらに、前記ステップの1つ以上を、自動化された装備によって実施することができる。
【００５４】
用語「遺伝的に改変すること」は、原理的には、当業者によって理解され、少なくとも1つの改変を、宿主細胞の核酸中に導入することに関し、前記改変は、少なくとも1つの遺伝子の発現の変化を引き起こす。かくして、遺伝的に改変することは、好ましくは、例えば、Jurkowskiら(2015), Clin Epigenetics 7(1):18に開示されたように、少なくとも1つの突然変異を導入すること、ならびに少なくとも1つのエピジェネティックな改変を導入することを含む。好ましくは、遺伝的に改変することは、少なくとも1つの突然変異を、核酸、好ましくは、DNA、より好ましくは、宿主細胞のゲノム中に導入することである。好ましくは、前記突然変異は、Casヌクレアーゼ活性によるゲノムの一部の欠失および/または前記細胞のゲノム中の元の配列と比較して少なくとも1つの突然変異を含む核酸配列の導入である。かくして、より好ましくは、遺伝的に改変することは、遺伝子またはその一部を、その改変されたバージョンに交換することである。最も好ましくは、遺伝的に改変することは、遺伝子の非機能的なコピーを、その機能的なコピーに交換することである。
【００５５】
本発明の方法に関連して使用される用語「接触させること」は、当業者によって理解される。好ましくは、この用語は、本発明の少なくとも1つのポリヌクレオチド、ベクター、および/または宿主細胞を、宿主細胞、好ましくは、許容状態の宿主細胞との物理的な接触に持って行くこと、例えば、試料と化合物とを相互作用させることに関する。好ましくは、接触は、好ましくは、送達手段による、宿主細胞の内部への、本発明の少なくとも1つのポリヌクレオチドの送達を含む。
【００５６】
本発明はまた、遺伝的疾患、神経変性疾患、がん、および/または感染症を、それに罹患している患者において処置するための方法であって、
a1)宿主細胞を、本発明によるポリヌクレオチドと；本発明によるベクターと；および/または本発明による宿主細胞と接触させるステップ；さらに、前記宿主細胞を、Casヌクレアーゼ活性およびgRNAと接触させるステップ；または
a2)前記宿主細胞を、本発明によるキットに含まれる成分およびgRNAと接触させるステップ；ならびに
b)それによって、前記対象における遺伝的疾患、神経変性疾患、がん、および/または感染症を処置するステップ
を含む方法に関する。
【００５７】
本発明の対象を処置するための方法は、好ましくは、in vivoでの方法である。しかしながら、実施形態においては、方法は、in vitroで適用することもできる。さらに、方法は、上に明示的に記載されたものに加えたステップを含んでもよい。例えば、さらなるステップは、例えば、ステップa1)および/もしくはa2)のための、宿主細胞、好ましくは、許容状態の宿主細胞の試料を提供すること、またはステップb)において適切な時間にわたって前記細胞をインキュベートすることに関するものであってもよい。さらに、前記ステップの1つ以上を、自動化された装備によって実施することができる。
【００５８】
本発明によれば、キットのポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、および/または成分は、好ましくは、許容状態の宿主細胞を含む対象の試料、例えば、血液試料に投与され、前記試料またはそれに由来する細胞は、それらが遺伝的に改変された後に前記対象に再度投与される。より好ましくは、キットのポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、および/または成分は、直接的に、例えば、静脈内注射または局所適用によって、対象に投与される。
【００５９】
かくして、好ましくは、本発明のキットのポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、および/または成分は、医薬組成物として提供される。本明細書で使用される用語「医薬組成物」は、本発明の化合物と、必要に応じて、1つ以上の製薬上許容し得る担体とを含む。本発明の化合物を、製薬上許容し得る塩として製剤化することができる。許容し得る塩は、酢酸塩、メチルエステル、HCl、硫酸塩、塩化物などを含む。医薬組成物は、好ましくは、局所的または全身的に投与される。薬物投与のために従来使用される好適な投与経路は、経口、静脈内、または非経口投与ならびに吸入である。しかしながら、化合物の性質および作用様式に応じて、同様に医薬組成物を他の経路によって投与することができる。例えば、ポリヌクレオチド化合物を、上記で特定されたような、ウイルスベクターまたはウイルスまたはリポソームを使用することによって遺伝子療法手法において投与することができる。さらに、化合物を、一般的な医薬組成物中で、またはキット部品の形態で提供することができる別の医薬組成物として、他の薬物と共に投与することができる。化合物は、好ましくは、従来の手順に従って薬物と標準的な医薬担体とを混合することによって調製された従来の剤形で投与される。これらの手順は、必要に応じて、成分を、所望の調製物と混合すること、顆粒化すること、および圧縮すること、または溶解することを含んでもよい。製薬上許容し得る担体または希釈剤の形態および特徴は、混合しようとする活性成分の量、投与経路および他の周知の変数によって決定付けられることが理解されるであろう。
【００６０】
担体は、製剤の他の成分と適合し、そのレシピエントにとって有害ではないという意味で許容し得るものでなければならない。用いられる医薬担体は、例えば、固体、ゲルまたは液体であってもよい。固体担体の例は、ラクトース、白土、スクロース、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸などである。液体担体の例は、リン酸緩衝生理食塩溶液、シロップ、ピーナッツ油およびオリーブ油などの油、水、エマルジョン、様々な型の湿潤剤、滅菌溶液などである。同様に、担体または希釈剤は、単独で、またはワックスと共に、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどの、当業界で周知の時間遅延材料を含んでもよい。前記好適な担体は、上記のもの、および当業界で周知の他のものを含み、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvaniaを参照されたい。
【００６１】
希釈剤は、組合せの生物活性に影響しないように選択される。そのような希釈剤の例は、蒸留水、生理食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液、およびハンクス溶液である。さらに、医薬組成物または製剤はまた、他の担体、アジュバント、または非毒性、非治療的、非免疫原性の安定剤などを含んでもよい。
【００６２】
治療有効用量とは、本明細書に記載の疾患または状態に伴う症状を防止する、改善する、または処置する本発明の医薬組成物中で使用される化合物の量を指す。そのような化合物の治療効能および毒性を、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手順、例えば、ED50(集団の50%において治療有効な用量)およびLD50(集団の50%にとって致死的な用量)によって決定することができる。治療効果と毒性効果との用量比は、治療指数であり、それをLD50/ED50比として表すことができる。
【００６３】
用量レジメンは、主治医および他の臨床因子によって、好ましくは、上記方法のいずれか1つに従って決定されるであろう。医学界では周知のように、任意の1人の患者のための投薬量は、患者の大きさ、体表面積、年齢、投与しようとする特定の化合物、性別、投与の時間および経路、全体的な健康、ならびに同時に投与される他の薬物を含む、多くの因子に依存する。進行を、定期的評価によってモニタリングすることができる。典型的な用量は、例えば、1〜1000μgの範囲にあってよい；しかしながら、特に上記の因子を考慮すれば、この例示的範囲より下または上の用量も想定される。一般に、医薬組成物の規則的投与としてのレジメンは、1日あたり1μg〜10mg単位の範囲にあるべきである。レジメンが連続輸注である場合、それはまた、それぞれ、1μg〜10mg単位/キログラム体重/分の範囲にあるべきである。進行を、定期的評価によってモニタリングすることができる。しかしながら、対象および投与様式に応じて、物質投与の量は、約0.01mg/kg体重〜約10mg/kg体重を提供するために広範囲にわたって変化してもよい。ウイルスベクター、特に、アデノ随伴ウイルスベクターを投与する場合、好ましい用量は、5x1011〜2x1013ウイルス粒子またはウイルスゲノム/kg体重である；理解されるように、これらの例示的用量を、上記の因子に加えて、ウイルスの型、標的臓器などのさらなる因子に応じて改変してもよい。
【００６４】
本明細書に記載の医薬組成物および製剤は、本明細書に記載の疾患または状態を処置または改善または防止するために、少なくとも1回投与される。しかしながら、前記医薬組成物を、1回より多く、例えば、1日1〜4回から、非限定的な日数まで投与してもよい。
【００６５】
特定の医薬組成物は、製薬業界で周知の様式で調製され、製薬上許容し得る担体または賦形剤と混合した、またはそうでなければ結合した、少なくとも1つの上記活性化合物を含む。これらの特定の医薬組成物を作製するために、活性化合物を、通常、担体もしくは希釈剤と混合するか、またはカプセル、小袋、カシェ、紙または他の好適な容器もしくはビヒクルに同封または封入する。得られる製剤は、投与様式に、すなわち、錠剤、カプセル、坐剤、溶液、懸濁液などの形態に採用されるべきである。投薬量の推奨は、考慮されるレシピエントに応じて用量調整を予測するために処方者または使用者への指示書中に示されるべきである。
【００６６】
さらに、本発明は、宿主細胞を遺伝的に改変するための、本発明によるポリヌクレオチド；本発明によるベクター；本発明による宿主細胞；および/または本発明によるキットの使用に関する。
【００６７】
また、本発明は、遺伝的疾患、神経変性疾患、がん、および/または感染症を処置するための薬剤の製造のための、本発明によるポリヌクレオチド；本発明によるベクター；本発明による宿主細胞；および/または本発明によるキットの使用に関する。
【００６８】
上記を考慮すると、以下の実施形態が特に想定される。
【００６９】
1.(i)抗CRISPR(Acr)ポリペプチドをコードする配列および(ii)RNA干渉(RNAi)標的配列を含むポリヌクレオチド。
【００７０】
2.前記AcrポリペプチドがAcrIIA4ポリペプチドである、実施形態1に記載のポリヌクレオチド。
【００７１】
3.Acrポリペプチドをコードする前記配列が、
a)配列番号21の核酸配列；
b)配列番号21の配列と少なくとも70%同一である核酸配列；
c)配列番号20のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列；または 
d)配列番号20の配列と少なくとも70%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列
を含む、実施形態1または2に記載のポリヌクレオチド。
【００７２】
4.前記RNAi標的配列が、miRNA標的配列またはsiRNA標的配列であり、好ましくは、miRNA標的配列である、実施形態1〜3のいずれか1つに記載のポリヌクレオチド。
【００７３】
5.少なくとも2つのRNAi標的配列、好ましくは、少なくとも2つの非同一のRNAi標的配列、より好ましくは、互いに80%未満、さらにより好ましくは、70%未満、最も好ましくは、60%未満同一である少なくとも2つのRNAi標的配列を含む、実施形態1〜4のいずれか1つに記載のポリヌクレオチド。
【００７４】
6.少なくとも2つのRNAi標的配列、好ましくは、同じmiRNAと本質的に相補的な少なくとも2つのmiRNA標的配列、より好ましくは、miRNAの同じ核酸配列と本質的に相補的である少なくとも2つの標的配列を含む、実施形態1〜5のいずれか1つに記載のポリヌクレオチド。
【００７５】
7.前記miRNAが組織特異的および/または細胞型特異的miRNAである、実施形態1〜6のいずれか1つに記載のポリヌクレオチド。
【００７６】
8.前記miRNAが、ヒトmiRNA miR-1、miR-206、miR-208a、miR-122、およびmiR-142から選択される、実施形態1〜7のいずれか1つに記載のポリヌクレオチド。
【００７７】
9.前記発現可能な核酸配列の転写を引き起こす少なくとも1つのプロモーターをさらに含む、実施形態1〜8のいずれか1つに記載のポリヌクレオチド。
【００７８】
10.前記プロモーターが、構成的プロモーターである、実施形態1〜9のいずれか1つに記載のポリヌクレオチド。
【００７９】
11.配列番号21の核酸配列および配列番号40〜43の少なくとも1つを含む、実施形態1〜10のいずれか1つに記載のポリヌクレオチド。
【００８０】
12.Acrポリペプチドをコードする前記配列が、前記RNAi標的配列、好ましくは、前記発現可能な核酸配列に含まれる全てのRNAi標的配列の上流に位置する、実施形態1〜11のいずれか1つに記載のポリヌクレオチド。
【００８１】
13.RNAである、実施形態1〜12のいずれか1つに記載のポリヌクレオチド。
【００８２】
14.Acrポリペプチドをコードする前記配列および前記RNAi標的配列を含む連続するRNAとして発現可能な核酸配列を含むDNAである、実施形態1〜13のいずれか1つに記載のポリヌクレオチド。
【００８３】
15.CRISPR関連(Cas)ヌクレアーゼをコードする核酸配列を含まない、実施形態1〜14のいずれか1つに記載のポリヌクレオチド。
【００８４】
16.CRISPR関連(Cas)ヌクレアーゼの少なくとも断片をコードする核酸配列をさらに含む、実施形態1〜14のいずれか1つに記載のポリヌクレオチド。
【００８５】
17.実施形態1〜16のいずれか1つに記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【００８６】
18.アデノ随伴ウイルスベクターである、実施形態17に記載のベクター。
【００８７】
19.実施形態1〜16のいずれか1つに記載のポリヌクレオチドおよび/または実施形態17もしくは18に記載のベクターを含む宿主細胞。
【００８８】
20.医学における使用のための、実施形態1〜16のいずれか1つに記載のポリヌクレオチドおよび/または実施形態17もしくは18に記載のベクターおよび/または実施形態19に記載の宿主細胞。
【００８９】
21.遺伝的疾患、神経変性疾患、がん、および/または感染症の処置における使用のための、実施形態1〜16のいずれか1つに記載のポリヌクレオチドおよび/または実施形態17もしくは18に記載のベクターおよび/または実施形態19に記載の宿主細胞。
【００９０】
22.前記遺伝的疾患が、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ハンチントン病、血友病A/B、嚢胞性線維症、ミオチュブラーミオパチー、糖原病、もしくは鎌状赤血球貧血である；前記神経変性疾患が、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、パーキンソン病、もしくは脊髄小脳失調1型(SCA1)である；前記がんが、肝細胞癌、膵がん、骨肉腫、白血病もしくは結腸直腸がんである；および/または前記感染症が、ヒト免疫不全ウイルス感染、ヘルペスウイルス感染、パピローマウイルス感染、もしくはB型肝炎ウイルス感染である、実施形態21に記載の使用のためのポリヌクレオチド、ベクター、および/または宿主細胞。
【００９１】
23.(I)(i)抗CRISPR(Acr)ポリペプチドをコードする配列および(ii)RNA干渉(RNAi)標的配列を含む第1のポリヌクレオチド；ならびにCasヌクレアーゼもしくはCasヌクレアーゼをコードする発現可能な遺伝子を含む第2のポリヌクレオチド；
(II)(i)抗CRISPR(Acr)ポリペプチドをコードする配列および(ii)RNA干渉(RNAi)標的配列を含む第1のポリヌクレオチドであって、Casヌクレアーゼの第1の断片をコードする発現可能な遺伝子をさらに含む前記第1のポリヌクレオチド、ならびにCasヌクレアーゼの第2の断片をコードする発現可能な遺伝子を含む第2のポリヌクレオチドであって、前記Casヌクレアーゼの前記第1および第2の断片が、活性なCasヌクレアーゼを一緒になって再構成する、第1および第2のポリヌクレオチド；または
(III)(i)抗CRISPR(Acr)ポリペプチドをコードする配列、(ii)RNA干渉(RNAi)標的配列、および(iii)Casヌクレアーゼをコードする配列を含む第1のポリヌクレオチド；ならびに阻害的RNA、好ましくは、前記RNAi標的配列にハイブリダイズするsiRNA、shRNAもしくはmiRNA、より好ましくは、前記RNA媒介性分解標的配列にハイブリダイズするsiRNAもしくはshRNAをコードする発現可能な遺伝子を含む第2のポリヌクレオチド
を含む、キット。
【００９２】
24.前記Casヌクレアーゼまたはその断片の発現が、細胞型特異的または組織特異的プロモーターによって駆動される、実施形態23に記載のキット。
【００９３】
25.第1のポリペプチドによってコードされるAcrポリペプチドが、Listeria monocytogenesのAcrIIA4であり、前記Casヌクレアーゼまたはその断片が、Streptococcus pyogenesのCas9ヌクレアーゼである、実施形態23または24に記載のキット。
【００９４】
26.前記キットが、少なくとも1つのガイドRNA(gRNA)をコードするポリヌクレオチドを含み、好ましくは、少なくとも1つのgRNAをコードする前記ポリヌクレオチドが、第1または第2のポリヌクレオチドであり、より好ましくは、第2のポリヌクレオチドである、実施形態23〜25のいずれか1つに記載のキット。
【００９５】
27.前記第1のポリヌクレオチドが、許容状態の宿主細胞の第1の受容体を標的とする第1の送達手段中にパッケージングされ、前記第2のポリヌクレオチドが、前記許容状態の宿主細胞の第2の受容体を標的とする第2の送達手段中にパッケージングされる、実施形態23〜26のいずれか1つに記載のキット。
【００９６】
28.前記第1および第2の受容体が非同一である、実施形態27に記載のキット。
【００９７】
29.前記第1および第2の送達手段が非同一である、実施形態27または28に記載のキット。
【００９８】
30.前記第1のポリヌクレオチドが、実施形態1〜16のいずれか1つに記載のポリヌクレオチドである、実施形態23〜29のいずれか1つに記載のキット。
【００９９】
31.宿主細胞を遺伝的に改変するための方法であって、
a1)前記宿主細胞を、実施形態1〜16のいずれか1つに記載のポリヌクレオチドと；実施形態17もしくは18に記載のベクターと；および/または実施形態19に記載の宿主細胞と接触させるステップ；さらに、前記宿主細胞を、Casヌクレアーゼ活性およびgRNAと接触させるステップ；または
a2)前記宿主細胞を、実施形態23〜30のいずれか1つに記載のキットに含まれる成分と接触させるステップ；
ならびに
b)それによって、前記宿主細胞を遺伝的に改変するステップ
を含む、方法。
【０１００】
32.遺伝的疾患、神経変性疾患、がん、および/または感染症を、それに罹患している患者において処置するための方法であって、
a1)宿主細胞を、実施形態1〜16のいずれか1つに記載のポリヌクレオチドと；実施形態17もしくは18に記載のベクターと；および/または実施形態19に記載の宿主細胞と接触させるステップ；さらに、前記宿主細胞を、Casヌクレアーゼ活性およびgRNAと接触させるステップ；または
a2)前記宿主細胞を、実施形態23〜30のいずれか1つに記載のキットに含まれる成分と接触させるステップ；
ならびに
b)それによって、前記対象における遺伝的疾患、神経変性疾患、がん、および/または感染症を処置するステップ
を含む方法。
【０１０１】
33.宿主細胞を遺伝的に改変するための、実施形態1〜16のいずれか1つに記載のポリヌクレオチド；実施形態17もしくは18に記載のベクター；実施形態19に記載の宿主細胞；および/または実施形態23〜30のいずれか1つに記載のキットの使用。
【０１０２】
34.遺伝的疾患、神経変性疾患、がん、および/または感染症を処置するための薬剤の製造のための、実施形態1〜16のいずれか1つに記載のポリヌクレオチド；実施形態17もしくは18に記載のベクター；実施形態19に記載の宿主細胞；および/または実施形態23〜30のいずれか1つに記載のキットの使用。
【０１０３】
本明細書で引用される全ての参考文献は、それらの全開示内容および本明細書に具体的に記載される開示内容に関して、参照により本明細書に組み込まれるものとする。
(実施例)
以下の実施例は、単に本発明を例示するものである。それらは、何であれ、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【実施例１】
【０１０４】
方法
1.1 プラスミド
pAAV-SMVP-Cas9N (Addgene #80930)およびpAAV-SMVP-Cas9C (Addgene #80931)は、George Churchからの贈り物であった。本明細書で使用されるさらなるベクターは、配列番号3〜19を有する(Nihongakiら、(2015), Chem Biol. 22(2):169-74; Konermanら(2015), Nature 517(7536):583-8を参照)。
【０１０５】
1.2 細胞培養物
ヒト子宮頸部腺癌細胞(HELA)およびヒト肝癌細胞(Huh-7)を、加湿組織培養インキュベーター中、37℃および5%CO2で維持した。細胞を、75cm2のフラスコ(STARLAB)(表1)中で培養し、2〜3日毎に継代した。
【０１０６】
【表１】
2020532962.tif 000003
【０１０７】
1.3 細胞の播種および一過的トランスフェクション
実験のために、細胞を透明な、組織培養処理された96ウェルプレート(STARLAB)に播種した(ウェルあたり6,000個の細胞および100μlの培地中)。トランスフェクションを、播種の12〜16時間後に行った。Lipofectamine(商標)3000(Invitrogen)を、製造業者のプロトコールに従って全てのトランスフェクションについて使用した。
【０１０８】
触媒的に活性なCas9を含む実験のために、20ngのCas9発現ベクターおよび20ngのルシフェラーゼ切断リポーターを同時トランスフェクトした(量はウェルあたりのものである)。miR-122標的部位を含む、または含まないAcrIIA4発現ベクターを、図面の凡例に示されるように、トランスフェクション中に1:1〜1:80のAcrIIA4:Cas9比で添加した。
【０１０９】
Split Cas9構築物を含む実験のために、そうでなければ図面の凡例に示されない場合、それぞれ20ngの、ルシフェラーゼ切断リポーター、CasN-N-インテインおよびCasC-C-インテイン構築物を同時トランスフェクトした。
【０１１０】
dCas9-VP64を含む実験のために、それぞれ20ngのdCas9-VP64ベクター、TetOガイドRNAベクターならびにTetO依存的ホタルルシフェラーゼリポーターを、1ngのpRL-TK(Promega；Renillaルシフェラーゼをコードする)と共に同時トランスフェクトした。miR-122標的部位を含む、または含まないAcrIIA4発現ベクターを、図面の凡例に示されるように、トランスフェクション中に3:1〜1:20のAcrIIA4:dCas9-VP64比で添加した。
【０１１１】
ウェルあたりにトランスフェクトされたDNAの総量は、100ngであったか、またはdCas9-VP64実験の場合、101ngであった。必要に応じて、不活性なDNAの入れ物にDNAをいっぱいに満たした。トランスフェクションの6時間後、培地を交換した。
【０１１２】
1.4 ルシフェラーゼアッセイ
トランスフェクションの48時間後、ホタルおよびRenillaルシフェラーゼ活性を、製造業者の推奨に従ってDual Luciferase(登録商標)Reporter Assay System (Promega)を用いて決定した。簡単に述べると、培地を吸引し、細胞を100μlのPBSで洗浄した。30μlの供給された溶解バッファーを各ウェルに添加し、室温、450rpmで30分間、プレートを振とうした。次いで、10μlの溶解物を白色の96ウェルプレート(greiner bio-one)に移し、自動注入器を装備したGloMax(登録商標)96 Microplate Luminometer (Promega) を用いて発光を測定した。第1に、35μlのルシフェラーゼアッセイ試薬IIを添加することによって、ホタルルシフェラーゼシグナルを測定した。第2に、反応をクエンチし、35μlのStop & Glo(登録商標)試薬を添加することによって、Renillaルシフェラーゼ反応を同時に開始させた。シグナル統合時間は、10s、次いで、2sの遅延であった。データ分析のために、ホタルの値を、Renillaの値で除算した。データは、平均±3回の実験反復物の平均の標準誤差である。
【実施例２】
【０１１３】
結果
本発明者らは、可変的AcrIIA4駆動性プロモーター(サイトメガロウイルスプロモーター、CMV；伸長因子アルファプロモーター、EF-1α；EF-1α短縮プロモーター、EFS)を有するモジュラーAcrIIA4発現構築物ならびに任意のmiRNA標的部位の単純な挿入のためのモジュラー3'UTRのセットを生成した(図1A)。次いで、本発明者らは、miR-122のための2つの標的部位のコンカテマーを、本発明者らのAcrIIA4構築物に導入し、miRNAは、任意の他の細胞型ではなく、肝細胞中で特異的に発現された(図1B)。
【０１１４】
SpyCas9および対応するgRNAと一緒に肝細胞中に同時送達した場合、AcrIIA4の強力なノックダウン、したがって、Cas9活性の放出を期待することができる(図1A)。任意の他の細胞型では、すなわち、miR-122の非存在下では、AcrIIA4は、高度に発現されたままであるべきであり、したがって、Cas9活性を効率的に抑制する。本発明者らの仮説を試験するために、本発明者らは、大量のmiR-122を発現する肝細胞癌細胞系であるHuh-7、ならびにHELA細胞(対照として、miR-122を発現しない子宮頸癌細胞系)に、様々なAcrIIA4をコードするベクター、SpyCas9発現ベクター、およびルシフェラーゼに基づく切断リポーターを同時トランスフェクトして、Cas9触媒活性をモニタリングした(図2A)。
【０１１５】
AcrIIA4をコードするベクターは、AcrIIA4発現を駆動するプロモーター(CMVまたはEFS)、ならびにAcrIIA4遺伝子の3’UTR内の2つのmiR-122結合部位の存在または非存在において異なっていた。予想通り、miR-122結合部位を担持しないAcrIIA4ベクターは、Huh-7ならびにHELA細胞の両方においてCas9活性を強力に阻害した(図2B)。対照的に、miR-122標的部位を担持するAcrIIA4構築物については、本発明者らは、HELA細胞ではなく、Huh-7細胞においてのみ、Cas9活性の強力な放出(すなわち、強力なルシフェラーゼノックダウン)を観察したが、これは、Cas9のmiR-122依存的活性化の成功を示している(図2B)。
【０１１６】
次に、本発明者らは、Huh-7細胞における実験を繰り返し、今回は、AcrIIA4の量を滴定することによって、トランスフェクトされたAcrIIA4:Cas9構築物の比を1:1〜1:80の間で変化させた。AcrIIA4を駆動するプロモーターとして、本発明者らは、CMVまたはEF1α(非短縮型)のいずれかを用いた。AcrIIA4によるCas9の阻害は、用量依存的であった(図3)。中間のAcr:Cas比では、Cas9活性の強力な放出(リポーターノックダウンにおいて最大8倍の増加)が、Huh-7においてのみ、また、acr 3’UTR内のmiR-122結合部位の存在下で観察された。対照的に、非常に高いAcrIIA4:Cas9トランスフェクション比は、おそらく、内因性RNAi成分(例えば、RNA誘導性サイレンシング複合体(RISC)の触媒サブユニットであるArgonaute-2(Ago-2))の飽和または大部分の内因性miR-122の隔離に起因して、acr遺伝子中のmiR-122結合部位の存在下でも、効率的なCas9阻害をもたらした。他方、低いAcrIIA4:Cas9比は、AcrIIA4ベクター上にmiR-122結合部位が存在しない場合であっても、顕著なCas9活性をもたらした。AcrIIA4は競合的インヒビターとして作用し、したがって、効率的に機能するためには、そのCas9標的と比較して過剰に提供される必要があるため、これは予想されることである(Dongら、2017; Shinら、2017; YangおよびPatel、2017)。
【０１１７】
上記実験において、AcrおよびCas9発現カセットは、異なるベクター上に位置していた(図2A)。送達時のAcr:Cas9ベクター比、したがって、標的細胞内での対応するAcr:Cas9発現比は、強く変化する可能性があるため、これは次善的であり得る。これは、ある特定の確率で起こる非常に低いAcr:Cas9比のため、望ましくない漏出をもたらし得る(図3を参照)。この問題に対処するために、本発明者らは、Cas9活性と、存在するacr導入遺伝子の量とを直接結びつける戦略を考案した。本発明者らの戦略は、Harvard UniversityのGeorge Churchのグループによって報告されたSpyCas9-AAVベクター設計に基づくものである(Chewら、2016)。それらの設計においては、SpyCas9を、2つの別々の小片(CasNおよびCasC)に分割し、Rhodothermus marinus由来スプリット-インテイン配列に融合した。CasN-N-インテインおよびCasC-C-インテイン構築物は、それ自体、完全に不活性である。しかしながら、同時送達の際に、インテイン媒介性タンパク質トランススプライシングは、活性な、完全長のCas9の再構成をもたらす。
【０１１８】
本発明者らは、この設計を採用し、U6プロモーターにより駆動されるガイドRNA発現カセットを、報告されたCasN-N-インテインAAVベクター(Addgene #80930)中に、およびAcrIIA4発現カセット(2x miR-122結合部位を含む、または含まない)を、対応するCasC-C-インテインAAVベクター(Addgene #80931)中に挿入した(図4A)。ここで、細胞が十分な量のCasNならびにAcrをコードするCasCベクターの両方を受容する場合にのみ、SpyCas9の効率的な再集合が可能であるはずであり、それによって、Cas9活性を、AcrIIA4媒介性Cas調節と緊密に関連付ける。本発明者らの戦略を検証するために、本発明者らは再度、Huh-7またはHELA細胞に、Cas9触媒活性を示す本発明者らのホタルルシフェラーゼ切断リポーターと共にこれらのスプリット-SpyCas9ベクターを同時トランスフェクトした。予想通り、本発明者らは、Cas9触媒活性の強力なmiR-122依存的レスキューを観察した(図4B)。重要なことに、miR-122結合部位の非存在下では、漏出(Cas9活性)はあまり観察されなかったが、これは、AcrによるCas9の厳密な調節を示唆している。
【０１１９】
次に、本発明者らはこの実験を繰り返し、今回は、1:20〜20:1の比で互いに対して2x miR-122標的部位を有するCMVプロモーターにより駆動されるacrを同時にコードするCasN-N-インテインおよびCasC-C-インテインベクターを滴定した。本発明者らは、1:4〜4:1のCasN:CasC比について、強力なルシフェラーゼリポーターノックダウン、すなわち、Cas9触媒活性の強力なmiR-122依存的レスキューを観察した(図5)。より高い、またはより低いCasN:Cas9比は、おそらく、2つの必要なスプリットCas9断片のうちの1つの発現が低いため、Cas9活性の顕著な低下をもたらした。顕著には、HELA細胞において、全ての試験したCasN:CasC比についてCas9は不活性のままであったが、もう一度、オフターゲット細胞中でのAcrIIA4発現とCas9再集合との関連付けの成功を示している(図5)。
【０１２０】
AcrIIA4は、細菌細胞中で触媒的に不活性な(d)SpyCas9を効率的に阻害することが示されているが(Rauchら、2017)、これは、AcrIIA4を、実質的に任意のdCas9に基づく手段、例えば、dCas9に基づく転写調節因子またはエピジェネティック改変因子の細胞型または組織特異的制御のために使用することができることを示唆している(Maederら、2013; Hiltonら、2015)。同時に、AcrIIA4発現を制御するための内因性miRNAシグネチャーを使用することによって、細胞型または組織特異的様式で任意のdCas9に基づく手段を活性化することができる。この考えを検証するために、本発明者らは再度、dCas9-VP64トランス活性化因子、テトラサイクリン(tet)オペレーター標的化gRNA発現構築物、ならびに最小プロモーター、次いで、tetオペレーターリピートから駆動される対応するホタルルシフェラーゼリポーターを同時にトランスフェクトしたAcrIIA4ベクター(2x miR-122結合部位または空の足場を含む)の量を滴定した(図6A)。
【０１２１】
本発明者らは、足場AcrIIA4対照ベクターを使用する場合ではなく、miR-122標的部位を担持するAcrIIA4構築物と組み合わせたdCas9-VP64を使用する場合にのみ、顕著なルシフェラーゼリポーター活性化を観察したが、これは、dCas9-VP64リポータートランス活性化の効率的なmiR-122媒介性レスキューを示している(図6B)。miR-122標的部位の非存在下での阻害およびmiRNA標的部位の存在下でのdCas9-VP64活性の放出もまた用量依存的であった。非常に低いAcrIIA4:dCas9-VP64トランスフェクション比では、ルシフェラーゼリポーターは、acr 3’UTR中のmiR-122標的部位の存在または非存在とは無関係に活性であった。高いAcrIIA4:dCas9-VP64比では、miR-122媒介性AcrIIA4ノックダウン時のリポーター活性化は、依然として強力であったが、不完全であった。これは、触媒的に活性なCas9を用いる本発明者らの実験と一致しており(図3と図6Bを比較されたい)、もう一度、AcrIIA4:Cas9発現比が、本発明者らのCasON手法を用いる場合に考慮すべき重要なパラメーターであることを示している。
【０１２２】
引用文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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