(57)【要約】  本発明は、ＰＤ−Ｌ１をコードする発現カセットを含むＤＮＡ分子の少なくとも１コピーを含むサルモネラの弱毒株に関する。具体的には、本発明は、がんの治療に使用するためのサルモネラの弱毒株に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＤ−Ｌ１をコードする発現カセットを含むＤＮＡ分子の少なくとも１コピーを含むサルモネラの弱毒株。
【請求項２】
請求項１に記載のサルモネラの弱毒株であって、ここで
（ａ）前記サルモネラの弱毒株は、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）種である；
（ｂ）前記サルモネラの弱毒株は、サルモネラ・チフィＴｙ２１ａ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ）である；
（ｃ）前記発現カセットは、真核生物発現カセットである；および／または
（ｄ）前期発現カセットは、一つのＣＭＶプロモーターを含む、
である、サルモネラの弱毒化株。
【請求項３】
ＰＤ−Ｌ１は、配列番号１において示されているアミノ酸配列を有するＰＤ−Ｌ１、およびそれと少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質、
ならびに配列番号２において示されているアミノ酸配列を有するＰＤ−Ｌ１、およびそれと少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質、
ならびに配列番号１３において示されているアミノ酸配列を有するＰＤ−Ｌ１、およびそれと少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質、
からなる群から選択され、
特にここで、ＰＤ−Ｌ１は配列番号１、配列番号２、または配列番号１３において示されているアミノ酸配列を有する、
請求項１または２に記載のサルモネラの弱毒株。
【請求項４】
ＰＤ−Ｌ１が、配列番号３、配列番号４、または配列番号１４において示されている核酸配列によってコードされている、請求項３に記載のサルモネラの弱毒化株。
【請求項５】
前記ＤＮＡ分子は、カナマイシン抗生物質耐性遺伝子、ｐＭＢ１  ｏｒｉ、および一つのＣＭＶプロモーターをさらに含み、特にここで、前記ＤＮＡ分子は、配列番号５において示されているＤＮＡ配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のサルモネラの弱毒株。
【請求項６】
薬剤としての使用のための、請求項１〜５のいずれか一項に記載のサルモネラの弱毒株。
【請求項７】
がんの治療における使用のための、請求項６に記載の使用のためのサルモネラの弱毒株。
【請求項８】
がん免疫療法における使用のための、請求項７に記載の使用のためのサルモネラの弱毒株。
【請求項９】
前記がんの治療は、化学療法、放射線療法または生物学的がん療法をさらに含み、特にここで前記サルモネラの弱毒株は、当該化学療法または当該放射線療法または当該生物学的がん療法の前、間および／または後、より具体的には当該化学療法または当該放射線療法または当該生物学的がん療法の前および間に投与される、請求項７または８に記載の使用のためのサルモネラの弱毒株。
【請求項１０】
前記生物学的がん療法は、特に腫瘍抗原、および／または腫瘍間質抗原をコードする、さらなる発現カセットを含むさらなるＤＮＡ分子の少なくとも１コピーを含むサルモネラの少なくとも一つのさらなる弱毒株から選択される、腫瘍抗原、および／または腫瘍間質抗原をコードする少なくとも一つのさらなるＤＮＡワクチンの投与を含み、
特にここで、前記サルモネラの少なくとも一つのさらなる弱毒株は、さらなる真核生物の発現カセットを含むサルモネラ・チフィＴｙ２１ａ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ）である、請求項９に記載の使用のためのサルモネラの弱毒株。
【請求項１１】
前記少なくとも一つのさらなるＤＮＡワクチンによってコードされる前記腫瘍抗原は、ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ＣＥＡ、ＣＭＶ  ｐｐ６５、からなる群から選択される、
および／または、前記少なくとも一つのさらなるＤＮＡワクチンによってコードされる前記腫瘍間質抗原は、ＶＥＧＦＲ−２、またはヒト線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）である、
請求項１０に記載の使用のためのサルモネラの弱毒株。
【請求項１２】
前記少なくとも一つのさらなるＤＮＡワクチンによってコードされる前記腫瘍抗原は、
配列番号６において示されているアミノ酸配列を有するウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）、およびそれと少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質、
配列番号７において示されているアミノ酸配列を有するメソテリン（ＭＳＬＮ）、およびそれと少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質、
配列番号８において示されているアミノ酸配列を有するＣＥＡ、およびそれと少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質、
配列番号９において示されているアミノ酸配列を有するＣＭＶ  ｐｐ６５、およびそれと少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質、
配列番号１０において示されているアミノ酸配列を有するＣＭＶ  ｐｐ６５、およびそれと少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質、および
配列番号１１において示されているアミノ酸配列を有するＣＭＶ  ｐｐ６５、およびそれと少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質、
からなる群から選択される、ならびに
前記少なくとも一つのさらなるＤＮＡワクチンによってコードされる前記腫瘍間質抗原は、
配列番号１２において示されているアミノ酸配列を有するＶＥＧＦＲ−２、およびそれと少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質、およびヒト線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）である、
請求項１１に記載の使用のためのサルモネラの弱毒株。
【請求項１３】
前記サルモネラの弱毒株は、経口投与される、請求項６〜１２のいずれか一項に記載の使用のためのサルモネラの弱毒株。
【請求項１４】
前記がんは、リンパ腫、白血病、骨髄腫、肺がん、特に非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、黒色腫、腎細胞がん、卵巣がん、神経膠芽腫、メルケル細胞がん、膀胱がん、頭頸部がん、結腸直腸がん、食道がん（ｅｓｏｐｈａｇｉａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、子宮頸がん、胃がん、肝細胞がん、前立腺がん、乳がん、膵臓がん、および甲状腺がんから選択される、請求項７〜１３のいずれか一項に記載の使用のためのサルモネラの弱毒株。
【請求項１５】
前記サルモネラの弱毒株の単回投与量は、約１０5〜約１０11、具体的には約１０6〜約１０10、より具体的には約１０6〜約１０9、より具体的には約１０6〜約１０8、最も具体的には約１０6〜約１０7コロニー形成単位（ＣＦＵ）を含む、請求項６〜１４のいずれか一項に記載の使用のためのサルモネラの弱毒株。
【請求項１６】
ＰＤ−Ｌ１の発現パターン、および／または患者のＰＤ−Ｌ１に対する前免疫応答を評価する工程を含む、個別化がん免疫療法で使用するためのものである、請求項８〜１５のいずれか一項に記載の使用のためのサルモネラの弱毒株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＤ−Ｌ１をコードする発現カセットを含むＤＮＡ分子の少なくとも１コピーを含むサルモネラの弱毒株に関する。具体的には、本発明は、がんの治療における使用のための上記サルモネラの弱毒株に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫系の重要な特徴は、「自己」、および「異物（ｆｏｒｅｉｇｎ）」を区別する能力である。この目的のために、免疫系は「チェックポイント」−免疫応答を開始するために活性化（または不活性化）される必要がある、特定の免疫細胞上の分子−を使用する。
【０００３】
主に、免疫系は、新生細胞を認識、および破壊する。Ｔ細胞は、抗がん免疫の主要なエフェクターであると思われる。しかし、多くの腫瘍は、その生存を高めるために免疫系を回避する機構を発達させている。免疫調節タンパク質、たとえばチェックポイントタンパク質、およびそのリガンドは、免疫の抑制、および抗がん免疫反応の耐性誘導に重要な役割を果たす。
【０００４】
プログラム細胞死タンパク質１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  １；ＰＤ−１）は、Ｔ細胞の表面で発現され、そして同種抗原に対するＴ細胞の機能的沈黙を維持する阻害シグナルを伝達する。そのリガンドＰＤ−Ｌ１は、通常、炎症性微小環境における抗原提示細胞、胎盤細胞、および非造血細胞に発現している。ＰＤ−Ｌ１は、免疫抑制性骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）に発現していることが報告されている。さらに、ＰＤ−Ｌ１は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達軸を使用して宿主の免疫系から逃れる様々なタイプのがん細胞の表面に広範囲に発現している。がん細胞によるＰＤ−Ｌ１の発現は、病期および患者の予後不良と相関することが示された。
【０００５】
ＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１への結合を阻害することにより機能する、いくつかのモノクローナル抗ＰＤ−１および抗ＰＤ−Ｌ１抗体を評価する臨床試験において、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達経路を標的とする可能性が実証されている。これらの抗体は、既存の抗がん免疫反応を引き起こし、または強化するように設計されている。様々な固形腫瘍および血液悪性腫瘍におけるオプジーボ（ニボルマブ、抗ＰＤ−１抗体）、様々な固形腫瘍および血液悪性腫瘍におけるペンブロリズマブ（キートルーダ、抗ＰＤ−１抗体）、化学療法による寛解後のＡＭＬにおける樹状細胞ワクチンと併用するＣＴ−０１１（抗ＰＤ−１）、およびＣＬＬの再発、難治性または高リスクの未治療患者におけるリツキシマブと併用するリリルマブ（抗ＫＩＲ）のような、様々な薬剤が現在、患者の臨床試験で調査されている。
【０００６】
最近になってやっと、ＰＤ−Ｌ１特異的Ｔ細胞の存在が説明された（ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ）。
【０００７】
国際公開第２０１３／０５６７１６号は、ＨＬＡ（ヒト白血球抗原）−Ａ２制限ＰＤ−Ｌ１ペプチドワクチンを開示している。
【０００８】
国際公開第２０１４／００５６８３号は、がん免疫療法、特に膵臓がんの治療における使用のためのＶＥＧＦ受容体タンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子を含むサルモネラの弱毒化変異株を開示している。
【０００９】
国際公開第２０１６／２０２４５９号は、ＶＥＧＦ受容体タンパク質およびチェックポイント阻害薬抗体をコードする組換えＤＮＡ分子を含むサルモネラの弱毒化変異株の併用投与を含むがん治療アプローチを開示している。
【００１０】
発明者の知る限り、ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞を直接標的とするＰＤ−Ｌ１特異的細胞毒性免疫細胞を誘導する目的でＰＤ−Ｌ１を標的とする細菌ＤＮＡワクチンは報告されていない。さらに、ＰＤ−Ｌ１を標的とする口腔がんワクチンは説明されて（ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ）いない。
【００１１】
発明の目的
従来技術を考慮して、本発明の目的は、がん治療を標的とする新規の安全かつ効率的なＰＤ−Ｌ１を提供することである。このような新規の治療アプローチは、がん患者の治療選択肢を改善するための大きな利点を提供するであろう。
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、全長ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメインを含む短縮型ＰＤ−Ｌ１のいずれかをコードする組換えＤＮＡ構築物を運ぶサルモネラベースのＤＮＡ送達媒体は、播種性同系ＦＢＬ−３赤白血病を有するＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて高い抗腫瘍効果を示すという驚くべき発見に基づいている。
【００１３】
したがって、第一の態様では、本発明は、ＰＤ−Ｌ１をコードする発現カセットを含むＤＮＡ分子の少なくとも１コピーを含むサルモネラの弱毒株に関する。
【００１４】
特定の実施形態では、サルモネラの弱毒株は、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）種である。具体的には、サルモネラの弱毒株は、サルモネラ・チフィＴｙ２１ａ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ）である。
【００１５】
特定の実施形態では、発現カセットは真核生物発現カセットである。具体的には、発現カセットはＣＭＶプロモーターを含む。
【００１６】
特定の実施形態では、ＰＤ-Ｌ１は、全長ＰＤ−Ｌ１、およびＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメインを含む短縮型ＰＤ−Ｌ１からなる群から選択される。短縮型ＰＤ−Ｌ１は、配列番号１３のアミノ酸１９〜２３８のアミノ酸配列、配列番号１３のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列を含んでもよく、または配列番号１３のアミノ酸１９〜２３８、配列番号１３、または配列番号２と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。特定の実施形態では、ＰＤ−Ｌ１は、配列番号１において示されているアミノ酸配列を有するＰＤ−Ｌ１、および当該ＰＤ−Ｌ１と少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質からなる群から選択される。特定の他の実施形態では、ＰＤ−Ｌ１は、配列番号２において示されているアミノ酸配列を有するＰＤ−Ｌ１、および当該ＰＤ−Ｌ１と少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質からなる群から選択される。特定の他の実施形態では、ＰＤ−Ｌ１は、配列番号１３において示されているアミノ酸配列を有するＰＤ−Ｌ１、および当該ＰＤ−Ｌ１と少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質からなる群から選択される。特定の他の実施形態では、ＰＤ-Ｌ１は、配列番号１３のアミノ酸１９〜２３８のアミノ酸配列を有するＰＤ-Ｌ１、および当該ＰＤ−Ｌ１と少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質からなる群から選択される。具体的には、ＰＤ−Ｌ１は、配列番号１、配列番号２、または配列番号１３において示されているアミノ酸配列を有し、好ましくは、ＰＤ−Ｌ１は、配列番号１３のアミノ酸１９〜２３８のアミノ酸配列を含む。一つの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１は、少なくともシグナル伝達ペプチドを伴うまたは伴わない細胞外ドメインを含む。
【００１７】
特定の実施形態では、ＰＤ−Ｌ１は、配列番号３、配列番号４または配列番号１４において示されている核酸配列によってコードされる。
【００１８】
特定の実施形態では、ＤＮＡ分子は、カナマイシン抗生物質耐性遺伝子、ｐＭＢ１  ｏｒｉ、およびＣＭＶプロモーターをさらに含む。具体的には、ＤＮＡ分子は、配列番号５において示されているＤＮＡ配列をさらに含む。
【００１９】
第二の態様では、本発明は、薬剤としての使用のための本発明によるサルモネラの弱毒株に関する。
【００２０】
特定の実施形態では、サルモネラの弱毒株は、がんの治療における使用のためのものである。
【００２１】
特定の実施形態では、サルモネラの弱毒株は、がん免疫療法における使用のためのものである。
【００２２】
特定の実施形態では、がんの治療は化学療法、放射線療法または生物学的がん療法をさらに含む。具体的には、サルモネラの弱毒株は、化学療法または放射線療法または生物学的がん療法の前、間および／または後に投与される。より具体的には、サルモネラの弱毒株は、化学療法または放射線療法または生物学的がん療法の前および間に投与される。
【００２３】
特定の実施形態では、生物学的がん療法は、腫瘍抗原、および／または腫瘍間質抗原をコードする、少なくとも一つのさらなるＤＮＡワクチンの投与を含む。特定の実施形態では、少なくとも一つのさらなるＤＮＡワクチンは、腫瘍抗原、および／または腫瘍間質抗原をコードする発現カセットを含む、ＤＮＡ分子の少なくとも１コピーを含むサルモネラの少なくとも一つの弱毒株から選択される。これは、腫瘍抗原をコードする発現カセットを含むＤＮＡ分子の少なくとも１コピーを含む少なくとも一つのさらなるＤＮＡワクチン、および／または腫瘍間質抗原をコードする発現カセットを含むＤＮＡ分子の少なくとも１コピーを含む少なくとも一つのさらなるＤＮＡワクチンを包含する。具体的には、上記サルモネラの少なくとも一つのさらなる弱毒株は、真核生物の発現カセットを含むサルモネラ・チフィＴｙ２１ａ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ）である。
【００２４】
一つの実施形態では、上記腫瘍抗原は、ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、およびＣＭＶ  ｐｐ６５から選択される。特定の実施形態では、上記少なくとも一つのさらなるＤＮＡワクチンによってコードされる上記腫瘍抗原は、配列番号６において示されているアミノ酸配列を有するウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）、およびそれと少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質、配列番号７において示されているアミノ酸配列を有するメソテリン（ＭＳＬＮ）、およびそれと少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質、配列番号８において示されているアミノ酸配列を有するＣＥＡ、およびそれと少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質、配列番号９において示されているアミノ酸配列を有するＣＭＶ  ｐｐ６５、およびそれと少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質、配列番号１０において示されているアミノ酸配列を有するＣＭＶ  ｐｐ６５、およびそれと少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質、および配列番号１１において示されているアミノ酸配列を有するＣＭＶ  ｐｐ６５、およびそれと少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質、からなる群から選択される。具体的には、ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）は配列番号６において示されているアミノ酸配列を有し、メソテリン（ＭＳＬＮ）は配列番号７において示されているアミノ酸配列を有し、ＣＥＡは配列番号８において示されているアミノ酸配列を有し、そしてＣＭＶ  ｐｐ６５は配列番号９、配列番号１０、または配列番号１１において示されているアミノ酸配列を有する。一つの実施形態では、上記腫瘍間質抗原は、ＶＥＧＦＲ−２、またはヒト線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、好ましくはＶＥＧＦＲ−２である。具体的には、上記少なくとも一つのさらなるＤＮＡワクチンによってコードされる上記腫瘍間質抗原は、配列番号１２において示されているアミノ酸配列を有するＶＥＧＦＲ−２、およびそれと少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質、およびヒト線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）からなる群から選択される。具体的には、ＶＥＧＦＲ−２は、配列番号１２において示されているアミノ酸配列を有する。
【００２５】
特定の実施形態では、サルモネラの弱毒株は、経口投与される。
【００２６】
特定の実施形態では、がんは、リンパ腫、白血病、骨髄腫、肺がん、特に非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、黒色腫、腎細胞がん、卵巣がん、神経膠芽腫、メルケル細胞がん、膀胱がん、頭頸部がん、結腸直腸がん、食道がん（ｅｓｏｐｈａｇｉａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、子宮頸がん、胃がん、肝細胞がん、前立腺がん、乳がん、膵臓がん、および甲状腺がんから選択される。
【００２７】
特定の実施形態では、サルモネラの弱毒株の単回投与量は、約１０5〜約１０11、具体的には約１０6〜約１０10、より具体的には約１０6〜約１０9、より具体的には約１０6〜約１０8、最も具体的には約１０6〜約１０7コロニー形成単位（ＣＦＵ）を含む。
【００２８】
特定の実施形態では、サルモネラの弱毒株は、ＰＤ−Ｌ１の発現パターン、および／または患者のＰＤ−Ｌ１に対する前免疫応答を評価する工程を含む、個別化がん免疫療法で使用するためのものである。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、プラスミドｐＶＡＸ１０．ＰＤ−Ｌ１ｈに含まれるＰＤ−Ｌ１  ｃＤＮＡによりコードされる、全長ヒトＰＤ−Ｌ１のアミノ酸配列（配列番号１）である。
【図２】図２は、プラスミドｐＶＡＸ１０．ＰＤ−Ｌ１ｈａに含まれるＰＤ−Ｌ１  ｃＤＮＡによりコードされる、シグナル伝達ペプチド（ＭＲＩＦＡＶＦＩＦＭＴＹＷＨＬＬＮＡ）を欠失している短縮型ヒトＰＤ−Ｌ１のアミノ酸配列（配列番号１）である。
【図３】図３は、プラスミドｐＶＡＸ１０．ＰＤ−Ｌ１ｈに含まれ、そして配列番号１の全長ヒトＰＤ−Ｌ１のアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号３）である。
【図４】図４は、プラスミドｐＶＡＸ１０．ＰＤ−Ｌ１ｈａに含まれ、そして配列番号２の短縮型ヒトＰＤ−Ｌ１のアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号４）である。
【図５】図５は、空の発現ベクターｐＶＡＸ１０に含まれる核酸配列である（制限部位ＮｈｅＩとＸｈｏＩとの間に位置するマルチクローニングサイトの部分を含まない発現ベクターｐＶＡＸ１０の配列（配列番号５））。
【図６】図６は、プラスミドｐＶＡＸ１０．ｈＷＴ１に含まれるＷＴ１  ｃＤＮＡによりコードされる、ヒトＷＴ１のアミノ酸配列（配列番号６）である。
【図７】図５は、プラスミドｐＶＡＸ１０．ｈＭＳＬＮに含まれるＭＳＬＮ  ｃＤＮＡによりコードされる、ヒトＭＳＬＮのアミノ酸配列（配列番号７）である。
【図８】図８は、プラスミドｐＶＡＸ１０．ｈＣＥＡに含まれるＣＥＡ  ｃＤＮＡによりコードされる、ヒトＣＥＡのアミノ酸配列（配列番号８）である。
【図９】図９は、プラスミドｐＶＡＸ１０．ＣＭＶｐｐ６５＿１に含まれるＣＭＶ  ｐｐ６５  ｃＤＮＡによりコードされる、ＣＭＶ  ｐｐ６５のアミノ酸配列（配列番号９）である。
【図１０】図１０は、プラスミドｐＶＡＸ１０．ＣＭＶｐｐ６５＿２に含まれるＣＭＶ  ｐｐ６５  ｃＤＮＡによりコードされる、ＣＭＶ  ｐｐ６５のアミノ酸配列（配列番号１０）である。
【図１１】図１１は、プラスミドｐＶＡＸ１０．ＣＭＶｐｐ６５＿３に含まれるＣＭＶ  ｐｐ６５  ｃＤＮＡによりコードされる、ＣＭＶ  ｐｐ６５のアミノ酸配列（配列番号１１）である。
【図１２】図１２は、プラスミドｐＶＡＸ１０．ＶＲ２−１に含まれるＶＥＧＦＲ−２  ｃＤＮＡによりコードされるＶＥＧＦＲ−２のアミノ酸配列（配列番号１２）である。
【図１３】図１３は、細胞外ドメイン（アミノ酸１９〜２３８）およびシグナル伝達ペプチド（アミノ酸１〜１８）を含む、短縮型ヒトＰＤ−Ｌ１のアミノ酸配列（配列番号１３）である。
【図１４】図１４は、配列番号１３の短縮型ヒトＰＤ−Ｌ１をコードする塩基配列（配列番号１４）である。
【図１５】図１５は、播種同系ＦＢＬ−３赤白血病を保有するＣ５７ＢＬ／６マウスの生存に対する、ＶＸＭ１０ｍおよびＶＸＭ１０ｍａの予防的投与の効果である。マウスに（Ａ）空のベクター（１．６×１０8ＣＦＵ）；（Ｂ）ＶＸＭ１０ｍ（１．８×１０8ＣＦＵ）；（Ｃ）ＶＸＭ１０ｍ（１．０×１０10ＣＦＵ）；（Ｄ）ＶＸＭ１０ｍａ（３．６×１０8ＣＦＵ）；または（Ｅ）ＶＸＭ１０ｍａ（１．０×１０10ＣＦＵ）を接種した。垂直矢印は、腫瘍接種を示す。
【図１６】図１６は、ＦＢＬ−３細胞による再負荷後のＣ５７ＢＬ／６マウスの長期生存に対する、ＶＸＭ１０ｍおよびＶＸＭ１０ｍａの予防的投与の効果である。マウスに以下のように接種および処理した。（Ａ）空のベクター（１．６×１０8ＣＦＵ）；（Ｂ）未処理（コントロールの再負荷）；（Ｃ）ＶＸＭ１０ｍ（１．８×１０8ＣＦＵ）；（Ｄ）ＶＸＭ１０ｍ（１．０×１０10ＣＦＵ）；（Ｅ）ＶＸＭ１０ｍａ（３．６×１０8ＣＦＵ）；または（Ｆ）ＶＸＭ１０ｍａ（１．０×１０10ＣＦＵ）。垂直矢印は、腫瘍接種を示す。
【図１７】図１７は、播種同系ＦＢＬ−３赤白血病を保有するＣ５７ＢＬ／６マウスの生存に対する、ＶＸＭ１０ｍおよびＶＸＭ１０ｍａの治療的投与の効果である。Ａ）ＦＢＬ−３モデルにおける、ＶＸＭ１０ｍおよびＶＸＭ１０ｍａの治療的ワクチン接種のスケジュール。Ｂ）マウスに（Ａ）空のベクター（１．０×１０9ＣＦＵ）；（Ｂ）ＶＸＭ１０ｍ（１．０×１０9ＣＦＵ）；または（Ｃ）ＶＸＭ１０ｍａ（１．０×１０9ＣＦＵ）を接種した。垂直矢印は、腫瘍接種を示す。
【図１８】図１８は、（Ａ）実験設計、および（Ｂ）ＶＸＭ１０  １０8ＣＦＵ（四角）、ＶＸＭ１０  １０10ＣＦＵ（丸）、ＶＸＭ１０ａ  １０8ＣＦＵ（三角、下向き）、ＶＸＭ１０ａ  １０10ＣＦＵ（三角、上向き）、ネガティブコントロール（長方形）の最終ワクチン接種の７９日後に収集された（ワクチン接種スケジュール：ｄ１、ｄ３、ｄ５、ｄ７、ｄ１４、ｄ２１、ＦＢＬ−３負荷ｄ２０）、播種同系ＦＢＬ−３赤白血病を保有するＣ５７ＢＬ／６マウスの結成における抗ＰＤ−Ｌ１応答である。破線は、ネガティブコントロール群の値から得られたカットオフ値（９５％信頼）を表す。ポジティブコントロール群（十字）のＣＦＡ／ＩＦＡによる免疫には可溶性組換えマウスＰＤ−Ｌ１を使用した。
【図１９】図１９は、６日間の刺激後にＥＬＩＳＡによって培養上清で測定されるように（ｎ＝５）、（Ａ）実験設計、および（Ｂ）空のベクター（丸）、ＶＸＭ１０（四角）、またはＶＸＭ１０ａ（三角）で免疫し、そしてＰＤ−Ｌ１由来の５つのペプチドのプールで刺激したマウスから分離した脾細胞によって分泌されるＩＦＮγ（白抜き記号）およびＴＮＦα（黒抜き記号）のレベルである。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
発明の詳細な説明
第一の態様では、本発明は、ＰＤ−Ｌ１をコードする発現カセットを含むＤＮＡ分子の少なくとも１コピーを含むサルモネラの弱毒株に関する。
【００３１】
本発明による生弱毒サルモネラ株は、ＰＤ−Ｌ１をコードする組換えＤＮＡ分子を安定して保持する。それは、この組換えＤＮＡ分子の経口送達の媒体として使用できる。
【００３２】
本発明の文脈において、用語「弱毒化された」は、親細菌株と比較して毒性が低下した細菌株を指し、弱毒化変異を含まない。弱毒化された細菌株は、好ましくは毒性を失っているが、防御免疫を誘導する能力を保持している。弱毒化は、毒性、調節、および代謝遺伝子を含む様々な遺伝子の削除により達成できる。弱毒化された細菌は、自然にみられるか、またはたとえば新しい培地や細胞培養への適応によって実験室で人工的に産生されるか、または組換えＤＮＡ技術によって産生される。本発明によるサルモネラの弱毒株の約１０11ＣＦＵの投与は、好ましくは対象の５％未満、より好ましくは１％未満、最も好ましくは１パーミル未満でサルモネラ症を引き起こす。
【００３３】
本発明の文脈において、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含むが、それに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ，  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」ことを意味する。この用語は、指定された特徴、要素、整数、工程、または要素の存在を明示するためにオープンエンドであることを意図しているが、一つまたは複数の他の特徴、要素、整数、工程、要素、またはそれらの群の存在または追加を排除するものではない。したがって、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、より制限的な用語「からなる」、および「から本質的になる」を含む。一つの実施形態では本願全体にわたり、そして特に特許請求の範囲内で使用される、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、用語「からなる」で置き換えてもよい。
【００３４】
ＰＤ-Ｌ１をコードする発現カセットを含むＤＮＡ分子は、好適には組換えＤＮＡ分子、すなわち、好ましくは異なる起源のＤＮＡ断片から構成される改変ＤＮＡ構築物である。ＤＮＡ分子は、線状核酸、または好ましくは、発現ベクタープラスミドにＰＤ−Ｌ１をコードするオープンリーディングフレームを導入することにより生成される環状ＤＮＡプラスミドであってもよい。好適な発現ベクタープラスミドは、たとえば、それに限定されない、ｐＶＡＸ１TM（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）またはｐｃＤＮＡTM３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）、またはそれらに由来する発現ベクタープラスミドである。発現ベクタープラスミドは、高コピー起源、たとえばｐＵＣ  ｏｒｉ、または低コピー起源、たとえばｐＭＢ１  ｏｒｉを含んでもよい。
【００３５】
本発明の文脈において、用語「発現カセット」は、その発現を制御する調節配列の制御下にある少なくとも一つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む核酸ユニットを指す。発現カセットは、好ましくは、標的細胞において組換えタンパク質、たとえばＰＤ−Ｌ１をコードする含まれたオープンリーディングフレームの転写を媒介することができる。発現カセットは、通常は、プロモーター、少なくとも一つのオープンリーディングフレーム、および転写終結シグナルを含む。
【００３６】
特定の実施形態では、サルモネラの弱毒株は、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）種である。サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）の弱毒化派生物は、Ｓ．エンテリカ（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ）株は免疫化の粘膜経路を介して、すなわち経口または経鼻的に潜在的に送達でき、非経口投与と比較して単純性と安全性の利点を提供するため、哺乳類免疫系に異種抗原を送達するための魅力的な媒体である。さらに、サルモネラ株は、全身および粘膜区画の両方のレベルで強い液性および細胞性免疫応答を誘発する。バッチ調製のコストは低く、生細菌ワクチンの製剤は非常に安定している。弱毒化は、毒性、調節、および代謝遺伝子を含む様々な遺伝子の削除によって達成できる。
【００３７】
ａｒｏ変異によって弱毒化されたいくつかのサルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）株は、動物モデルにおける異種抗原の安全かつ効果的な送達媒体であることが示されている。
【００３８】
特定の実施形態では、サルモネラの弱毒株は、サルモネラ・チフィＴｙ２１ａ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ）である。Ｓ．チフィＴｙ２１ａ（Ｓ．ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ）の弱毒生菌株は、Ｖｉｖｏｔｉｆ（登録商標）（Ｂｅｒｎａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｌｔｄ．，  ａ  Ｃｒｕｃｅｌｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄにより製造される）としても知られているＴｙｐｈｏｒａｌ  Ｌ（登録商標）の活性成分である。それは現在、唯一認可されている、腸チフスに対する経口生ワクチンである。このワクチンは、広範に試験されており、患者に対する毒性ならびに第三者への感染に関して安全であることが示されている（Ｗａｈｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  １９８２，  １４５：２９２−２９５）。当該ワクチンは、４０を超える国々で認可されており、腸チフスに対する予防ワクチン投与のために、何千人もの小児を含む、数百万人の個人に対して使われてきた。それは比類のない安全実績を有する。Ｓ．チフィＴｙ２１ａ（Ｓ．ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ）が全身的に血流に入ることができるということを示すデータはない。したがって、弱毒生Ｓ．チフィＴｙ２１ａ（Ｓ．ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ）ワクチン株は、安全かつ耐用性良好である一方で、腸内の免疫系の特異的標的化を可能にする。Ｔｙｐｈｏｒａｌ  Ｌ（登録商標）の販売許可番号は、１９９６年１２月１６日付のＰＬ  １５７４７／０００１である。ワクチンの一回分の用量は、少なくとも２×１０9コロニー形成単位の生（ｖｉａｂｌｅ）Ｓ．チフィＴｙ２１ａ（Ｓ．ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ）および少なくとも５×１０9個の非生（ｎｏｎ−ｖｉａｂｌｅ）Ｓ．チフィＴｙ２１ａ（Ｓ．ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ）を含む。
【００３９】
この忍容性の高い、腸チフスに対する経口生ワクチンは、野生型の病原性細菌単離株Ｓ．チフィＴｙ２（Ｓ．ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２）の化学的変異誘発によって得られた。そしてｇａｌＥ遺伝子に、ガラクトースの代謝不能につながる機能欠失変異を有する。当該弱毒細菌株はまた、硫酸塩を硫化物に還元することもできず、それが当該弱毒細菌株と野生型のＳ．チフィＴｙ２（Ｓ．ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２）を差別化する。その血清学的特性に関しては、サルモネラ・チフィＴｙ２１ａ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ）株は、細菌外膜の多糖であるＯ９抗原を含み、そして、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の特徴的成分であるＯ５抗原を欠く。この血清学的特性は、バッチリリースのための同定試験のパネルにそれぞれの試験を含むことについて、理論的根拠を裏付ける。
【００４０】
特定の実施形態では、発現カセットは真核生物発現カセットである。具体的には、発現カセットはＣＭＶプロモーターを含む。本発明の文脈において、用語「真核生物発現カセット」は、真核細胞内でオープンリーディングフレームの発現を可能にする発現カセットを指す。十分な免疫応答を引き起こすのに必要な異種抗原の量は、細菌に対しては有毒でありえ、そして細胞死、過剰な弱毒化または異種抗原の発現の欠失を引き起こしうることが示されている。細菌ベクター内では発現されず、標的細胞内でのみ発現される真核生物発現カセットを用いることで、この毒性問題を克服しうる。そして、典型的に発現されたタンパク質は真核生物の糖鎖付加パターンを示す。
【００４１】
真核生物発現カセットは、真核細胞内でオープンリーディングフレームの発現を制御することができる調節配列、好ましくは一つのプロモーターおよび一つのポリアデニル化シグナルを含む。本発明のサルモネラの弱毒株に含まれる組換えＤＮＡ分子に包含されるプロモーターおよびポリアデニル化シグナルは、好ましくは免疫化されるべき対象の細胞内で機能的であるよう選択される。特にヒト用のＤＮＡワクチンの製造に好適なプロモーターの例は、以下のものを含むが、これらに限定されない：強力なＣＭＶ前初期プロモーターのようなサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のプロモーター、サルウイルス４０（ＳＶ４０）由来のプロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）由来のプロモーター、ＨＩＶ長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーターのようなヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）由来のプロモーター、モロニーウイルス由来のプロモーター、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）由来のプロモーター、およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）由来のプロモーター、ＣＭＶ初期エンハンサー配列から構成される合成ＣＡＧプロモーター、トリβアクチン遺伝子のプロモーター、第一エキソンおよび第一イントロン、およびウサギβグロビン遺伝子のスプライス受容部位、ならびに、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチンおよびヒトメタロチオネインのような、ヒト遺伝子由来のプロモーター。特定の実施形態では、真核生物発現カセットは、ＣＭＶプロモーターを含む。本発明の文脈において、用語「ＣＭＶプロモーター」は、強力な前初期サイトメガロウイルスプロモーターを指す。
【００４２】
特にヒト用ＤＮＡワクチンの製造のために好適なポリアデニル化シグナルの例は、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化部位、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、およびＬＴＲポリアデニル化シグナルを含むが、これらに限定されない。特定の実施形態では、本発明のサルモネラの弱毒株に含まれる組換えＤＮＡ分子に含まれる真核生物発現カセットは、ＢＧＨポリアデニル化部位を含む。
【００４３】
プロモーターおよびポリアデニル化シグナルのような、異種遺伝子の発現に必要な調節因子に加え、他の配列もまた組換えＤＮＡ分子に含まれうる。このような追加の配列は、エンハンサーを含む。エンハンサーは、たとえば、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチンのエンハンサー、ならびに、ＣＭＶ、ＲＳＶ、およびＥＢＶ等由来のウイルスエンハンサーであってもよい。
【００４４】
調節配列およびコドンは一般に種依存的であるので、タンパク質産生を最大化するために、調節配列およびコドンは、好ましくは、免疫化されるべき種において有効であるよう選択される。当業者は、所与の対象種において機能的な組換えＤＮＡ分子を作製することができる。
【００４５】
一つの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１は、全長ＰＤ−Ｌ１、およびＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメインを含む短縮型ＰＤ−Ｌ１からなる群から選択される。短縮型ＰＤ−Ｌ１は、配列番号１３のアミノ酸１９〜２３８のアミノ酸配列、配列番号１３のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列を含んでもよく、または配列番号１３のアミノ酸１９〜２３８、配列番号１３、または配列番号２と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。特定の実施形態では、ＰＤ−Ｌ１は、配列番号１において示されているアミノ酸配列を有するＰＤ−Ｌ１、および当該ＰＤ−Ｌ１と少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質からなる群から選択される。特定の他の実施形態では、ＰＤ−Ｌ１は、配列番号２において示されているアミノ酸配列を有するＰＤ−Ｌ１、および当該ＰＤ−Ｌ１と少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質からなる群から選択される。特定のさらに他の実施形態では、ＰＤ−Ｌ１は、配列番号１３において示されているアミノ酸配列を有するＰＤ−Ｌ１、および当該ＰＤ−Ｌ１と少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質からなる群から選択される。特定の他の実施形態では、ＰＤ-Ｌ１は、配列番号１３のアミノ酸１９〜２３８のアミノ酸配列を有するＰＤ-Ｌ１、および当該ＰＤ−Ｌ１と少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質からなる群から選択される。具体的には、ＰＤ−Ｌ１は、配列番号１、配列番号２、または配列番号１３において示されているアミノ酸配列を有し、好ましくは、ＰＤ−Ｌ１は、配列番号１３のアミノ酸１９〜２３８のアミノ酸配列を含む。一つの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１は、少なくともシグナル伝達ペプチドを伴うまたは伴わない細胞外ドメインを含む。
【００４６】
この文脈において、用語「約（ａｂｏｕｔ）」または「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、所与の値または範囲の８０％〜１２０％以内、あるいは９０％〜１１０％以内、を指し、９５％〜１０５％以内を含む。
【００４７】
本発明の文脈において、「所与のタンパク質配列、たとえば、配列番号１、２または１３において示されているアミノ酸配列を有するＰＤ−Ｌ１、と少なくとも約８０％の配列同一性を有するタンパク質」は、上記比較タンパク質、たとえば、配列番号１、２または１３のアミノ酸配列を有するＰＤ−Ｌ１と、アミノ酸配列、および／または、そのアミノ酸配列をコードする核酸配列において異なりうるタンパク質、を指す。そのタンパク質は、天然由来、たとえば野生型タンパク質の変異型、たとえば野生型ＰＤ−Ｌ１の変異型、または、異種のホモログ、または、改変タンパク質、たとえば改変ＰＤ−Ｌ１であってもよい。コドンの使用頻度は種間で異なることが知られている。したがって、対象の細胞において異種性のタンパク質を発現する際は、標的細胞のコドン使用頻度に核酸配列を適合させることが必要であるか、あるいは少なくとも有用でありうる。所与のタンパク質の誘導体を設計および構築する方法は、当業者に周知である。
【００４８】
所与のタンパク質、たとえば、配列番号１、２または１３において示されているアミノ酸配列を有するＰＤ−Ｌ１、と少なくとも約８０％の配列同一性を有するタンパク質は、当該比較タンパク質、たとえば、配列番号１、２または１３のアミノ酸配列を有するＰＤ−Ｌ１、と比べて一つまたは複数のアミノ酸の、付加、欠失、および／または、置換を含む、一つまたは複数の変異を含んでもよい。同じことは、配列番号１３のアミノ酸１９〜２３８のアミノ酸配列を有するＰＤ−Ｌ１にも当てはまる。一つまたは複数のアミノ酸の付加、欠失、および／または置換を含む、一つまたは複数の変異は、配列番号１、２、１３のアミノ酸配列、または配列番号１３のアミノ酸１９〜２３８のアミノ酸配列に１０個未満、９個未満、８個未満、７個未満、６個未満、５個未満、４個未満、３個未満、２個未満、または１個の変異を包含する。本発明の教示によれば、上記欠失、付加および／または、置換されたアミノ酸は、連続するアミノ酸であってもよく、あるいは、比較タンパク質、たとえば、配列番号１、２、１３において示されている、または配列番号１３のアミノ酸１９〜２３８のアミノ酸配列を有するＰＤ−Ｌ１、と少なくとも約８０％の配列同一性を有するタンパク質の全長にわたり散在していてもよい。本発明の教示によれば、上記比較タンパク質とのアミノ酸配列同一性が少なくとも約８０％である限り、任意の個数のアミノ酸が付加、欠失、および／または置換されてもよい。好ましくは、変異タンパク質は免疫原性である。好ましくは、所与の比較タンパク質、たとえば、配列番号１、２、１３において示されている、または配列番号１３のアミノ酸１９〜２３８のアミノ酸配列を有するＰＤ−Ｌ１、と少なくとも約８０％の配列同一性を有するタンパク質の免疫原性は、上記比較タンパク質、たとえば、配列番号１、２、１３において示されている、または配列番号１３のアミノ酸１９〜２３８のアミノ酸配列を有するＰＤ−Ｌ１の、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、あるいは１％未満少なくなっている。免疫原性は、たとえばＥＬＩＳＡ法によって測定してもよい。タンパク質ホモログを設計および構築するための方法、およびそのようなホモログの免疫原性について試験する方法は、当業者に周知である。特定の実施形態では、比較タンパク質、たとえば、配列番号１、２、１３の、または配列番号１３のアミノ酸１９〜２３８のアミノ酸配列を有するＰＤ−Ｌ１、との配列同一性は、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、あるいは最も具体的には、少なくとも約９５％である。親タンパク質と、親配列に対して欠失、付加、および／または置換を有するその誘導体との比較を含む、配列同一性を決定するための方法およびアルゴリズムは、当業者にはよく知られている。ＤＮＡレベルでは、所与の比較タンパク質、たとえば、配列番号１、２、１３において示されている、または配列番号１３のアミノ酸１９〜２３８のアミノ酸配列を有するＰＤ−Ｌ１、と少なくとも約８０％の配列同一性を有するタンパク質をコードする塩基配列は、遺伝子コードの縮重のために、より大きな程度で異なっていてもよい。
【００４９】
特定の実施形態では、ＰＤ−Ｌ１は、配列番号３、配列番号４または配列番号１４において示されている核酸配列によってコードされる。
【００５０】
特定の実施形態では、ＤＮＡ分子は、カナマイシン抗生物質耐性遺伝子、ｐＭＢ１  ｏｒｉ、およびＣＭＶプロモーターを含む。特定の実施形態では、組換えＤＮＡ分子は、市販のｐＶＡＸ１TM発現プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）由来である。この発現ベクターは、高コピーｐＵＣ複製起点を、ｐＢＲ３２２の低コピーｐＭＢ１複製起点に置き換えることで改変された。低コピー改変は、代謝負担を低減し、そして構築物をより安定にするために行われた。作製された発現ベクターの骨格は、ｐＶＡＸ１０と名付けられた。
【００５１】
特定の実施形態では、ＤＮＡ分子は、配列番号５（ベクター骨格  ｐＶＡＸ１０）において示されているＤＮＡ配列をさらに含む。
【００５２】
配列番号１のアミノ酸配列を有するヒトＰＤ−Ｌ１をコードするＯＲＦを発現ベクター骨格にＮｈｅＩ／ＸｈｏＩを介して挿入すると、発現プラスミドｐＶＡＸ１０．Ｌ１ｈが得られた。発現プラスミドｐＶＡＸ１０．ＰＤ−Ｌ１ｈを含む弱毒サルモネラ株Ｔｙ２１ａを含むＤＮＡワクチンは、ＶＸＭ１０ｈと名付けられる。配列番号２のアミノ酸配列を有するヒトＰＤ−Ｌ１をコードするＯＲＦを発現ベクター骨格にＮｈｅＩ／ＸｈｏＩを介して挿入すると、発現プラスミドｐＶＡＸ１０．Ｌ１ｈａが得られた。発現プラスミドｐＶＡＸ１０．ＰＤ−Ｌ１ｈａを含む弱毒サルモネラ株Ｔｙ２１ａを含むＤＮＡワクチンは、ＶＸＭ１０ｈａと名付けられる。配列番号１３のアミノ酸配列を有するヒトＰＤ−Ｌ１をコードするＯＲＦを発現ベクター骨格にＮｈｅＩ／ＸｈｏＩを介して挿入すると、発現プラスミドｐＶＡＸ１０．Ｌ１ｈｂが得られた。発現プラスミドｐＶＡＸ１０．ＰＤ−Ｌ１ｈｂを含む弱毒サルモネラ株Ｔｙ２１ａを含むＤＮＡワクチンは、ＶＸＭ１０ｈｂと名付けられる。
【００５３】
ＰＤ−Ｌ１をコードするサルモネラの弱毒株は、医薬組成物で提供されてもよい。医薬組成物は、溶液、懸濁液、腸溶カプセル剤、凍結乾燥粉末、または意図する用途に好適な他の任意の形態の形態であってもよい。
【００５４】
医薬組成物は、一つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤をさらに含んでもよい。
【００５５】
本発明の文脈において、用語「賦形剤」は、医薬品の有効成分とともに製剤化される天然または合成物質を指す。好適な賦形剤は、固結防止剤（ａｎｔｉａｄｈｅｒｅｎｔｓ）、結合剤、コーティング剤、崩壊剤、香味剤、着色剤、滑沢剤、滑剤、吸着剤、保存剤および甘味料を含む。
【００５６】
本発明の文脈において、用語「薬学的に許容される」は、生理的に許容され、そして、哺乳類（例：ヒト）に投与したときに、通常は有害反応を引き起こさない、医薬組成物の分子性物質、および他の成分を指す。用語「薬学的に許容される」はまた、哺乳類、そしてより具体的にはヒトへの使用のために、連邦政府または州政府の規制当局によって承認された、または、米国薬局方もしくは他の一般に認められた薬局方に記載されている、ということも意味しうる。
【００５７】
特定の実施形態では、医薬組成物は飲用溶液として提供される。この実施形態は患者コンプライアンスの向上という利点を提供し、そして迅速で、実行可能かつ手ごろな価格の集団予防接種プログラムを可能にする。
【００５８】
具体的には、好適な飲用溶液は、胃酸を少なくともある程度まで中和する、すなわち胃液のｐＨをｐＨ７に近づける、手段を含む。特定の実施形態では、飲用溶液は、本発明によるサルモネラの弱毒株を、好適な緩衝液、好ましくは、胃酸を少なくともある程度まで中和する緩衝液、好ましくは、２．６ｇの炭酸水素ナトリウム、１．７ｇのＬ−アスコルビン酸、０．２ｇのラクトース一水和物および１００ｍｌの飲用水を含む緩衝液に、懸濁させることによって得られる緩衝懸濁液である。
【００５９】
第二の態様では、本発明は、薬剤としての使用のための本発明によるサルモネラの弱毒株に関する。
【００６０】
特定の実施形態では、サルモネラの弱毒株は、がんの治療における使用のためのものである。
【００６１】
特定の実施形態では、サルモネラの弱毒株は、ワクチンとしての使用のためのものである。
【００６２】
特定の実施形態では、サルモネラの弱毒株は、がん免疫療法における使用のためのものである。
【００６３】
理論に縛られることを望むわけではないが、ＰＤ−Ｌ１リガンドのＰＤ−１への結合の阻害により、チェックポイント阻害を媒介する、モノクローナル抗ＰＤ−１抗体および抗ＰＤ−Ｌ１抗体とは対照的に、本発明によるサルモネラの弱毒株は、ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞の破壊につながるＰＤ−Ｌ１特異的Ｔ細胞の応答を引き起こすと考えられている。さらに、特にプラスミドｐＶＡＸ１０．Ｌ１ｈｂの使用の場合のように、ヒトＰＤ−Ｌ１（配列番号１３）の細胞外ドメインのみを使用する場合、発現されているＰＤ−Ｌ１ベースのタンパク質産物が分泌され、そして本発明によるアプローチの治療効果をさらに支持しうる抗ＰＤ−Ｌ１抗体反応をもたらしうる。シグナルペプチドを欠く短縮型ヒトＰＤ−Ｌ１、たとえばプラスミドｐＶＡＸ１０．Ｌ１ｈａの使用の場合のように、配列番号２のアミノ酸配列、および配列番号１３のアミノ酸１９〜２３８（ＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメインに対応する）のアミノ酸配列を含む短縮型ヒトＰＤ−Ｌ１を使用した理論に縛られることなく、発現されているＰＤ−Ｌ１ベースのタンパク質産物は細胞質に蓄積する可能性があり、そしてＰＤ−Ｌ１に対する細胞毒性Ｔ細胞応答の増強を引き起こす可能性があり、本発明によるアプローチの治療効果をさらに裏付ける可能性がある。したがって、一つの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１はシグナル伝達ペプチドを含むまたは含まないＰＤ−Ｌ１の少なくとも細胞外ドメインを含む。
【００６４】
本発明によれば、弱毒サルモネラ株は、標的細胞への上記組換えＤＮＡ分子の送達のためのＰＤ−Ｌ１をコードする発現カセットを含む組換えＤＮＡ分子の細菌担体として機能する。異種抗原、たとえばＰＤ−Ｌ１をコードするＤＮＡ分子を含むそのような送達ベクターは、ＤＮＡワクチンと呼ばれる。
【００６５】
本発明の文脈において、用語「ワクチン」は、投与で対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）において免疫応答を引き起こすことができる薬剤を指す。ワクチンは、好ましくは、疾病を予防し、寛解させ、あるいは治療することができる。
【００６６】
遺伝的免疫化は、従来法のワクチン投与より有利でありうる。標的ＤＮＡは、かなりの長期間にわたって検出することができ、それゆえ抗原デポー（ｄｅｐｏｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｇｅｎ）として機能する。いくつかのプラスミド中の配列モチーフは、ＧｐＣアイランドのように、免疫刺激性であり、そして、ＬＰＳおよび他の細菌成分による免疫刺激によって促進されたアジュバントとして機能しうる。
【００６７】
弱毒生サルモネラベクターは、リポ多糖類（ＬＰＳ）のような独自の免疫調節因子をｉｎ  ｓｉｔｕで産生し、そのことがマイクロカプセル化のような他の形態での投与を上回る利点となりうる。また、本発明による粘膜ワクチンは、リンパ管内作用機序を有し、それは有益であることが判明している。本発明による弱毒化ワクチンの摂取後に、腸内のパイエル板のマクロファージおよび他の細胞は、改変細菌によって侵入される。当該細菌は、これらの食細胞に取り込まれる。弱毒化変異によって、Ｓ．チフィＴｙ２１（Ｓ．ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１）株の細菌は、これらの食細胞にとどまることはできず、この時点で死滅する。組換えＤＮＡ分子は、放出され、引き続いて食細胞性免疫細胞の細胞基質内に、特異的輸送システムまたはエンドソームの漏出のいずれかを介して移送される。最後に、組換えＤＮＡ分子は核に入り、そこで転写され、食細胞の細胞基質内で大量のＰＤ−Ｌ１の発現を引き起こす。そして潜在的に、特にＰＤ−Ｌ１ベースのタンパク質産物の分泌にプラスミドｐＶＡＸ１０．ＰＤ−Ｌ１ｈｂを使用する場合のように、特にヒトＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメイン（例：配列番号１３）のみを使用する場合。感染した細胞はアポトーシスを起こし、ＰＤ−Ｌ１抗原が負荷され、そして腸の免疫システムによって取り込まれて処理される。細菌感染の危険信号はこの過程において強いアジュバントとして機能し、全身および粘膜区画の両方のレベルにおいて、強い標的抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞および抗体反応をもたらす。免疫応答はワクチン投与後およそ１０日でピークに達する。抗キャリア反応の欠如は、多数回にわたり同じワクチン投与で追加免疫をすることを許容する。さらに、ＰＤ−Ｌ１ベースのタンパク質産物の分泌は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体応答をもたらす可能性があり、これは、本発明によるアプローチの治療効果をさらに裏付ける可能性がある。
【００６８】
特定の実施形態では、がんの治療法は、化学療法、放射線療法、または生物学的がん療法をさらに含む。具体的には、サルモネラの弱毒株は、化学療法または放射線療法または生物学的がん療法の前に、その間に、および／またはその後に投与される。より具体的には、サルモネラの弱毒株は、化学療法または放射線療法または生物学的がん療法の前およびその間に投与される。がんの治癒のためには、がん幹細胞の完全な根絶が不可欠である。最大の効果を得るには、異なる治療アプローチの組み合わせが有益でありうる。
【００６９】
本発明の文脈において、用語「生物学的がん療法」は、細菌およびウイルスを含む生物、生物由来の物質、またはそのような物質の実験室生産型の使用を含むがん療法を指す。がんに対するいくつかの生物学的療法は、がん細胞に抗するために身体の免疫システムを刺激することを目的とする（いわゆる生物学的がん免疫療法）。生物学的がん療法アプローチは、腫瘍抗原および腫瘍間質抗原の、たとえばサルモネラベースのＤＮＡワクチン、具体的には、Ｓ．チフィＴｙ２１ａ（Ｓ．ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ）ベースのＤＮＡワクチンによる送達、治療用抗体の薬としての送達、免疫刺激性サイトカインの投与、および改変されたＴ細胞を含む免疫細胞の投与、を含む。治療用抗体は、腫瘍抗原または腫瘍間質抗原を標的とする抗体を含む。
【００７０】
特定の実施形態では、生物学的がん療法は、腫瘍抗原、および／または腫瘍間質抗原をコードする少なくとも一つのさらなるＤＮＡワクチンの投与を含む。特定の実施形態では、上記少なくとも一つのさらなるＤＮＡワクチンは、腫瘍抗原、および／または腫瘍間質抗原をコードする発現カセットを含むＤＮＡ分子の少なくとも１コピーを含む、少なくとも一つのさらなるサルモネラの弱毒株から選択される。具体的には、上記少なくとも一つのさらなるサルモネラの弱毒株は、真核生物発現カセットを含むサルモネラ・チフィＴｙ２１ａ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ）である。
【００７１】
一つの実施形態では、上記腫瘍抗原は、ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ＣＥＡ、およびＣＭＶ  ｐｐ６５から選択される。特定の実施形態では、少なくとも一つのさらなるＤＮＡワクチンによってコードされる上記腫瘍抗原は、配列番号６において示されているアミノ酸配列を有するウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）、および当該ＷＴ１と少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質、配列番号７において示されているアミノ酸配列を有するメソテリン（ＭＳＬＮ）、および当該ＭＳＬＮと少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質、配列番号８において示されているアミノ酸配列を有するＣＥＡ、および当該ＣＥＡと少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質、配列番号９において示されているアミノ酸配列を有するＣＭＶ  ｐｐ６５、および当該ＣＭＶ  ｐｐ６５と少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質、配列番号１０において示されているアミノ酸配列を有するＣＭＶ  ｐｐ６５、および当該ＣＭＶ  ｐｐ６５と少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質、および配列番号１１において示されているアミノ酸配列を有するＣＭＶ  ｐｐ６５、および当該ＣＭＶ  ｐｐ６５と少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質、からなる群から選択される。具体的には、ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）は配列番号６において示されているアミノ酸配列を有し、メソテリン（ＭＳＬＮ）は配列番号７において示されているアミノ酸配列を有し、ＣＥＡは配列番号８において示されているアミノ酸配列を有し、ＣＭＶ  ｐｐ６５は配列番号９、配列番号１０、または配列番号１１において示されているアミノ酸配列を有する。一つの実施形態では、上記腫瘍間質抗原は、ＶＥＧＦＲ−２またはＦＡＰであり、好ましくはＶＥＧＦＲ−２である。具体的には、上記少なくとも一つのさらなるＤＮＡワクチンにコードされている上記腫瘍間質抗原は、配列番号１２において示されているアミノ酸配列を有するＶＥＧＦＲ−２、およびそれと少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質、ならびにヒト線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）からなる群から選択される。具体的には、ＶＥＧＦＲ−２は、配列番号１２において示されているアミノ酸配列を有する。
【００７２】
特定の実施形態では、ＰＤ−Ｌ１をコードするサルモネラの弱毒株は、腫瘍抗原、および／または腫瘍間質抗原をコードする少なくとも一つのさらなるＤＮＡワクチンの前に、同時に、および／またはその後に投与される。
【００７３】
本発明の文脈において、用語「同時に」は、ＰＤ−Ｌ１をコードするサルモネラの弱毒株、および腫瘍抗原および／または腫瘍間質抗原をコードする少なくとも一つのさらなるＤＮＡワクチンを、同日に、より具体的には１２時間以内に、より具体的には２時間以内に投与することを指す。
【００７４】
特定の実施形態では、ＰＤ−Ｌ１をコードするサルモネラの弱毒株、および腫瘍抗原および／または腫瘍間質抗原をコードする少なくとも一つのさらなるＤＮＡワクチンの投与は、連続１２週間以内に、より具体的には連続８週間以内に、より具体的には連続３〜６週間以内に行われる。ＰＤ−Ｌ１をコードするサルモネラの弱毒株、および腫瘍抗原および／または腫瘍間質抗原をコードする少なくとも一つのさらなるＤＮＡワクチンの投与は、同じ経路または異なる経路を介して投与してよい。たとえば、具体的には少なくとも一つのさらなるＤＮＡワクチンがサルモネラのさらなる弱毒株である場合、経口投与されてもよい。
【００７５】
サルモネラのさらなる弱毒株の単回投与量は、約１０5〜約１０11、具体的には約１０6〜約１０10、より具体的には約１０6〜約１０9、より具体的には約１０6〜約１０8、最も具体的には約１０6〜約１０7コロニー形成単位（ＣＦＵ）を含む。
【００７６】
本発明のサルモネラの弱毒変異株と組み合わせて使用する化学療法の薬剤は、たとえば、以下のものでもよい：ゲムシタビン、アミホスチン（エチオール）、カバジタキセル、カルボプラチン、オキサリプラチン、シスプラチン、カペシタビン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、ドセタキセル、メクロレタミン、ストレプトゾシン、シクロホスファミド、ニムスチン（ＡＣＮＵ）、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ドキソルビシンリポ（ドキシル）、フォリン酸、ゲムシタビン（ジェムザール）、ダウノルビシン、ダウノルビシンリポ（ダウノキソーム）、エピルビシン、プロカルバジン、ケトコナゾール、マイトマイシン、シタラビン、エトポシド、メトトレキサート、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、パクリタキセル（タキソール）、ドセタキセル（タキソテール）、ペメトレキセド（ｐｅｒｍｅｔｒｅｘｅｄ）、アルデスロイキン、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、クラドリビン、カンプトテシン、ＣＰＴ−１１、１０−ヒドロキシ−７−エチルカンプトテシン（ＳＮ３８）、ダカルバジン、フロクスウリジン、フルダラビン、ヒドロキシウレア、イホスファミド、イダルビシン、メスナ、インターフェロンα、インターフェロンβ、イリノテカン、ミトキサントロン、トポテカン、ロイプロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、オキサリプラチン、プリカマイシン、ミトタン、ペグアスパラガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、クロラムブシル、テモゾロミド、およびそれらの組み合わせ。
【００７７】
本発明による、最も好適な化学療法薬剤は、カバジタキセル、カルボプラチン、オキサリプラチン、シスプラチン、シクロホスファミド、ドセタキセル、エトポシド、ゲムシタビン、ドキソルビシン、ロムスチン、パクリタキセル（タキソール）、イリノテカン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、フォリン酸、５−フルオロウラシル、ブレオマイシン、およびテモゾロミドであり、特にゲムシタビンである。
【００７８】
特定の実施形態では、サルモネラの弱毒株は経口投与される。経口投与は、非経口投与よりも、より簡便、より安全、そして、より快適である。しかしながら、ＰＤ−Ｌ１をコードするサルモネラの弱毒株はまた、他の任意の好適な経路によっても投与されうることも留意すべきである。好ましくは、治療上有効な用量が患者に投与され、そしてこの用量は、特定用途、悪性腫瘍の種類、患者の体重、年齢、性別および健康状態、投与方法、ならびに製剤形態等に依存する。投与は、必要に応じ、単回投与または複数回投与であってもよい。
【００７９】
特定の実施形態では、がんは、リンパ腫、白血病、骨髄腫、肺がん、特に非小細胞肺がん、黒色腫、腎細胞がん、卵巣がん、神経膠芽腫、メルケル細胞がん、膀胱がん、頭頚部がん、大腸がん、食道がん（ｅｓｏｐｈａｇｉａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、子宮頸がん、胃がん、肝細胞がん、前立腺がん、乳がん、膵臓がん、および甲状腺がん、から選択される。
【００８０】
ＰＤ−Ｌ１をコードするサルモネラの弱毒株は、比較的低用量で驚くほど効果的である。 低用量の生細菌ワクチンの投与により、排泄のリスクを最小化し、したがって第三者への感染を最小化する。
【００８１】
特定の実施形態では、サルモネラの弱毒株の単回投与量は、約１０5〜約１０11、具体的には約１０6〜約１０10、より具体的には約１０6〜約１０9、より具体的には約１０6〜約１０8、最も具体的には約１０6〜約１０7コロニー形成単位（ＣＦＵ）を含む。
【００８２】
この文脈において、用語「約（ａｂｏｕｔ）」または「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、所与の値または範囲の３倍以内、あるいは２倍以内（１．５倍以内を含む）を指す。
【００８３】
特定の実施形態では、サルモネラの弱毒株は、患者のＰＤ−Ｌ１発現パターンおよび／またはＰＤ−Ｌ１に対する免疫前応答を評価する工程を含む、個別化がん免疫療法における使用のためのものである。患者のＰＤ−Ｌ１発現および／または、ＰＤ−Ｌ１に対する免疫前反応は、最初の工程で、たとえばコンパニオン診断によって評価してもよい。ｍＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルのいずれかで標的遺伝子、たとえばＰＤ−Ｌ１の発現を評価する方法は、当業者に周知である。たとえば、免疫組織化学染色、フローサイトメトリー法もしくはＲＮＡ塩基配列決定法、または標識を用いる代替法を、腫瘍における標的発現レベルを同定するのに使用してもよい。同様に、所与のタンパク質、たとえばＰＤ−Ｌ１に対する患者の免疫前反応を評価する方法は、当業者に周知である。患者の既存のＰＤ−Ｌ１特異的Ｔ細胞プールは、たとえばＥＬＩＳｐｏｔまたはマルチマーＦＡＣＳ解析によって検出することができる。高い腫瘍特異的ＰＤ−Ｌ１発現および／または、ＰＤ−Ｌ１に対する免疫前反応の発生は、ＰＤ−Ｌ１をコードするサルモネラの弱毒株を用いる治療法に対して順調に反応することについての患者の素因の予後指標となる。
【００８４】
ＰＤ−Ｌ１をコードするサルモネラの弱毒株は、溶液、懸濁液、凍結乾燥物、腸溶カプセル剤、または任意の他の好適な剤型で提供されてもよい。一般的に、サルモネラの弱毒株は、飲用溶液として処方される。この実施形態は、患者コンプライアンスの向上という利点を提供する。好ましくは、飲用溶液は、胃酸を少なくともある程度まで中和する、すなわち胃液のｐＨをｐＨ７に近づける、手段を含む。好ましくは、飲用溶液は、ＰＤ−Ｌ１をコードするサルモネラの弱毒株を含む、緩衝懸濁液である。特定の実施形態では、緩衝懸濁液は、好ましくは２．６ｇの炭酸水素ナトリウム、１．７ｇのＬ−アスコルビン酸、０．２ｇのラクトース一水和物および１００ｍｌの飲用水を含む、好適な緩衝液に、サルモネラの弱毒株を懸濁することによって得られる。
【００８５】
抗生物質または抗炎症剤による治療を含むことは、起こりうる副作用の発生に応じて好都合でありうる。
【００８６】
ヒスタミン、ロイコトリエンまたはサイトカインを介する過敏症反応に似た有害事象が発生した場合、発熱、アナフィラキシー、血圧不安定、気管支けいれん、および呼吸困難に対する治療選択肢が有用である。望ましくないＴ細胞由来の自己攻撃性の場合の治療選択肢は、幹細胞移植後に適用される、急性および慢性の移植片対宿主病における標準治療のスキームから得られる。シクロスポリンおよびグルココルチコイドは、治療選択肢として提示される。
【００８７】
全身性のサルモネラ・チフィＴｙ２１ａ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２１ａ）型の感染という望ましくない状況の場合、たとえば、シプロフロキサシンまたはオフロキサシンを含むフルオロキノロンを用いた、適切な抗生物質療法が推奨される。消化管の細菌感染症は、リファキシミン等のそれぞれの薬剤で治療される必要がある。
【００８８】
特定の実施形態では、がん免疫療法は、ＰＤ−Ｌ１をコードするサルモネラの弱毒株、または、当該サルモネラの弱毒株を含む医薬組成物の、単回または複数回投与を含む。投与の単回投与量は同じであっても異なってもよい。具体的には、がん免疫療法は、ＰＤ−Ｌ１をコードするサルモネラの弱毒株の、１、２、３、４、５、または６回の投与を含み、好ましくは、ここで複数回の投与は、３〜６か月連続で行われる。
【実施例】
【００８９】
実施例１：播種同系ＦＢＬ−３赤白血病を保有するＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるＶＸＭ１０ｍの抗腫瘍活性の評価
この研究の目的は、播種同系ＦＢＬ−３赤白血病を保有するＣ５７ＢＬ／６マウスにおける、２種類のサルモネラベースのＰＤ−Ｌ１  ＤＮＡワクチンの抗腫瘍効果を調査することであった。ＶＸＭ１０ｍは、全長ネズミネイティブＰＤ−Ｌ１（配列番号１７の塩基配列を有する）をコードする発現プラスミドｐＶＡＸ１０で形質転換された、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ａｒｏＡ株ＳＬ７２０である。ＶＸＭ１０ｍａは、短縮型ネズミＰＤ−Ｌ１（配列番号１８の塩基配列を有する）、より具体的には１７アミノ酸残基を切断したＮ末端をコードする発現プラスミドｐＶＡＸ１０で形質転換された、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ａｒｏＡ株ＳＬ７２０である。
【００９０】
治療は１日目（Ｄ１）と見なされた無作為化日に開始した。３０匹の４〜６週齢の健康なオスのＣ５７ＢＬ／６マウスを、体重に応じてランダムに６匹ずつの５群に分けた。処理群への動物の割り当てを表１に要約する。統計的検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定）を実行し、群間の均一性を検定した（データは示していない）。
【００９１】
【表１】
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【００９２】
群１は、空ベクターコントロール（ＶＸＭ０ｍ＿ｅｍｐｔｙ；外因性発現プラスミドを有さないＳ．チフィムリウム（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）細菌ベクターコントロール）で処理された。群２〜５は、二つの異なる単回投与で、ＶＸＭ１０ｍまたはＶＸＭ１０ｍａで処理された。
【００９３】
ＶＸＭ０ｍ＿ｅｍｐｔｙ、ＶＸＭ１０ｍ、およびＶＸＭ１０ｍａは、強制経口投与（ｏｒａｌ  ｇａｖａｇｅ）によって（ｐｅｒ  ｏｓ、ｐｏ）、適用（ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）ごとに最終容量１００μｌで投与された。動物群に関係なく、各動物に経口で（ｐｏ）投与前適用バッファー（ｐｒｅ−ｄｏｓｅ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）を投与し、投与（ｄｏｓｉｎｇ）前に胃内の酸を中和した（１００μｌ／動物／適用）。このバッファーは、２．６ｇの炭酸水素ナトリウム、１．７ｇのＬ−アスコルビン酸、０．２ｇのラクトース一水和物を１００ｍｌの飲用水に溶解させて生成され、そしてＶＸＭ０ｍ＿ｅｍｐｔｙ、ＶＸＭ１０ｍ、およびＶＸＭ１０ｍａの適用前３０分以内に適用された。
【００９４】
プライムワクチン接種（ｐｒｉｍｅ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ）は１日目に開始され、２日ごとに４回の投与で構成された（１、３、５、７日目）。プライムワクチン接種の後に、１４日目および２１日目に２回のブーストワクチン接種（ｂｏｏｓｔ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ）が行われた。
【００９５】
２０日目に５００μｌのＲＰＭＩ  １６４０中の５．０×１０6個のＦＢＬ−３細胞の腹腔内投与（Ｉ．Ｐ．  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）によってすべての動物において腫瘍が誘発された。ＦＢＬ−３は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに由来するフレンド白血病ウイルス誘発白血病細胞株である。この細胞株は、免疫系によって認識できるユニークな腫瘍特異的移植抗原を発現する。同系マウスをＦＢＬ−３腫瘍細胞で予備刺激すると、その後の生腫瘍負荷が今後拒絶される。ＦＢＬ−３は免疫原性であるが、生ＦＢＬ−３腫瘍細胞を無感作の同系マウスに注入すると腫瘍が成長し、ＦＢＬ−３腫瘍細胞は免疫認識および破壊を回避する機構を保有することが示唆される。注目すべきことに、ＰＤ−Ｌ１はＦＢＬ−３細胞株で高度に発現されることが示された。
【００９６】
動物の体重、生存率、および動物の行動は、研究を通じてモニターされた。
【００９７】
試験動物の生存は、図１５のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットに表示される。
【００９８】
実施例２：ＦＢＬ−３細胞による再負荷後のＣ５７ＢＬ／６マウスの長期生存におけるＶＸＭ１０ｍ、およびＶＸＭ１０ｍａの投与の効果
この研究の目的は、再負荷後の播種同系ＦＢＬ−３赤白血病を保有するＣ５７ＢＬ／６マウスにおける、２種類のサルモネラベースのＰＤ−Ｌ１  ＤＮＡワクチンの抗腫瘍効果の長期効果を調査することであった。
【００９９】
実施例１の研究を継続し、マウスに１００日目に二回目の腫瘍誘発用量を投与した。実験の開始から研究に存在したが、最初の腫瘍誘発を受けなかった、ワクチン未接種のコントロール動物（ｎ＝１０）は、腫瘍再負荷のコントロールとして含まれていた。再負荷は群２〜５（表１を参照）のすべての動物、およびワクチン未接種のコントロール動物において、１００日目に５００μｌのＲＰＭＩ  １６４０中の５．０×１０6個のＦＢＬ−３細胞の腹腔内投与（Ｉ．Ｐ．  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）によって腫瘍誘発によって行われた。
【０１００】
動物の体重、生存率、および動物の行動は、継続的にモニターされた。治療期間中、コントロール群と比較した場合、ＶＸＭ１０ｍ、およびＶＸＭ１０ｍａの投与により、白血病に対する強力な記憶Ｔ細胞応答が生成され、ＦＢＬ−３細胞による再負荷後も１００％の長期生存マウスが生じた。ワクチン接種に関連した毒性、または体重減少は、研究を通じて観察されなかった。試験動物の生存率は図１６のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットに表示される。
【０１０１】
実施例３：播種同系ＦＢＬ−３赤白血病を保有するＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるＶＸＭ１０ｍ、およびＶＸＭ１０ｍａの治療的抗腫瘍活性の評価
この研究の目的は、播種同系ＦＢＬ−３赤白血病を保有するＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて、治療的に投与されるＶＸＭ１０ｍ、およびＶＸＭ１０ｍａの抗腫瘍効果を調査することであった。
【０１０２】
０日目に５００μｌのＲＰＭＩ  １６４０中の５．０×１０6個のＦＢＬ−３細胞の腹腔内投与（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  （ｉ．ｐ．）  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）によってすべての動物において腫瘍が誘発された。
【０１０３】
治療は１日目（Ｄ１、腫瘍注入後）と見なされた無作為化日に開始した。治療群では、１６匹の４〜６週齢の健康なオスのＣ５７ＢＬ／６マウスを、体重に応じてランダムに８匹ずつの２群に分けた。統計的検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定）を実行し、群間の均一性を検定した（データは示していない）。
【０１０４】
ＶＸＭ０ｍ＿ｅｍｐｔｙ、ＶＸＭ１０ｍ、およびＶＸＭ１０ｍａは、強制経口投与（ｏｒａｌ  ｇａｖａｇｅ）によって（ｐｅｒ  ｏｓ、ｐｏ）、最終容量１００μｌ中の１．０×１０9ＣＦＵで投与された。
【０１０５】
８匹のマウスの群１は、空ベクターコントロール（ＶＸＭ０ｍ＿ｅｍｐｔｙ；外因性発現プラスミドを有さないＳ．チフィムリウム（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）細菌ベクターコントロール）で処理された。群２〜５は、二つの異なる単回投与で、ＶＸＭ１０ｍまたはＶＸＭ１０ｍａで処理された。８匹のマウスの他の群は、ＶＸＭ１０ｍ、またはＶＸＭ１０ｍａで処理され、１、３、５、７日目に４回のプライム処理がされ、１４日目および２１日目に週に１回のブースト処理がされた（図１７Ａ）。
【０１０６】
動物の体重、生存率、および動物の行動は、プライム−ブースト期間中、および免疫応答のピーク時、すなわち研究０日目から２８日目まで週３回、そしてその後研究終了まで週２回モニターされた。
【０１０７】
治療期間中、コントロール群と比較した場合、ＶＸＭ１０ｍ、およびＶＸＭ１０ｍａの経口投与は、ＦＢＬ−３白血病モデルで強力な抗腫瘍効果をもたらし、白血病負荷の８０日後に生存動物が１００％であった（図１７Ｂ）。ワクチン接種に関連した毒性、または体重減少は、研究を通じて観察されなかった。空ベクターの投与は抗がん効果を示さなかった。
【０１０８】
実施例４：播種同系ＦＢＬ−３赤白血病を保有するＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるＶＸＭ１０ｍ、およびＶＸＭ１０ｍａによるワクチン接種後の抗ＰＤ−Ｌ１抗体応答の評価
この研究の目的は、播種同系ＦＢＬ−３赤白血病を保有するＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて、１、３、５、および７日目、ならびに１４、２１日目のブーストで１０8ＣＦＵおよび１０10ＣＦＵで投与されたＶＸＭ１０ｍおよびＶＸＭ１０ｍａに対する抗ＰＤ−Ｌ１応答を調査することであった。２０日目に５．０×１０6個のＦＢＬ−３細胞の腹腔内投与（Ｉ．Ｐ．  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）によってすべての動物において腫瘍が誘発された。ワクチン接種および腫瘍誘発は基本的に実施例１に記載のとおりに行った。可溶性組換えマウスＰＤ−Ｌ１をポジティブコントロール群においてＣＦＡ／ＩＦＡによる免疫に使用した。
【０１０９】
２１日目の最終ワクチン接種の７９日後に、ＶＸＭ１０ｍまたはＶＸＭ１０ｍａのいずれかをワクチン接種した動物の血清中でＥＬＩＳＡによって全身抗体反応を評価した（図１８Ａ）。抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＶＸＭ１０ｍおよびＶＸＭ１０ｍａを接種した数匹の動物で検出され、そして反応は最高用量投与群においてより顕著であり、動物の５０％（６匹中３匹）が、カットオフ値を超えるシグナル対バックグラウンド比を示した（図１８Ｂ）。
【０１１０】
実施例５：Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＶＸＭ１０ｍ、およびＶＸＭ１０ｍａによるワクチン接種後のＰＤ−Ｌ１に対するＴ細胞応答の評価
この研究の目的は、１日おき（１、３、５、および７日目）に、ＶＸＭ１０ｍ、ＶＸＭ１０ｍａ、または空ベクターコントロールのいずれかの１０10ＣＦＵで経口経路によって４回免疫した健康なＣ５７ＢＬ／６マウス（群あたりｎ＝５）のＰＤ−Ｌ１エピトープに対して誘導されるＴ細胞応答を調査することであった（図１９Ａ）。
【０１１１】
最後の免疫化の１０日後（１７日目）に、マウスＰＤ−Ｌ１に由来する５つの免疫原性ペプチドのプールを使用して、脾細胞（ｓｐｅｎｏｃｙｔｅ）のｅｘ  ｖｉｖｏ再刺激を行った。培養上清の内容物は、６日間のｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激後にＥＬＩＳＡによってＩＦＮγおよびＴＮＦαの存在について試験された。
【０１１２】
ＴＮＦαのレベル、および比較的程度は低いがＩＦＮγのレベルは、ＶＸＭ１０ａでワクチン接種され、そしてＰＤ−Ｌ１ペプチドで刺激された動物に由来する脾細胞（ｓｐｅｎｏｃｙｔｅ）の上清で有意に増加した（図１９Ｂ）。これらのデータは、ＶＸＭ１０ａによる免疫がＰＤ−Ｌ１に特異的なＴ細胞のプールを誘発したことを裏付けている。
【０１１３】
実施例６：播種同系ＦＢＬ−３赤白血病を保有するＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるＶＸＭ１０ｍｂの抗腫瘍活性の評価
この研究の目的は、播種同系ＦＢＬ−３赤白血病を保有するＣ５７ＢＬ／６マウスにおける３番目のサルモネラベースのＰＤ−Ｌ１  ＤＮＡワクチンの抗腫瘍効果の長期効果を調査することである。ＶＸＭ１０ｍｂは、短縮型マウスＰＤ−Ｌ１、より具体的にはＮ末端シグナル伝達ペプチドを含む細胞外ドメイン（アミノ酸配列の配列番号１５；塩基配列の配列番号１６）をコードする発現プラスミドｐＶＡＸ１０で形質転換したサルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ａｒｏＡ株ＳＬ７２０である。実験は、基本的に実施例１および実施例２に記載されているように行われる。
【０１１４】
実施例７：播種同系ＦＢＬ−３赤白血病を保有するＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるＶＸＭ１０ｍｂの治療的抗腫瘍活性の評価
この研究の目的は、播種同系ＦＢＬ−３赤白血病を保有するＣ５７ＢＬ／６マウスに治療的に投与されたＶＸＭ１０ｍｂの抗腫瘍効果を調査することである。実験は、基本的に実施例３に記載されているように行う。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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