(57)【要約】  本発明は、ａ）異種タンパク質生体分子を産生する細胞を培養し、ｂ）添加剤及び／又は添加剤の供給源を、（ｉ）細胞培養培地中に分泌される異種タンパク質生体分子の総収率を増加させる、及び／又は（ｉｉ）細胞培養培地中に分泌される異種タンパク質生体分子の比細胞生産性を増加させるのに十分な量で培養培地に添加する、タンパク質生体分子産生を増加させる方法に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質生体分子産生を増加させる方法であって、以下の工程を含む方法：
ａ）培養培地中でタンパク質生体分子を産生する細胞を培養する工程、
ｂ）（ｉ）前記細胞培養培地中に分泌される前記タンパク質生体分子の総収率を増加させる、及び／又は（ｉｉ）前記細胞培養培地中に分泌される前記タンパク質生体分子の比細胞生産性を増加させるのに十分な量の一酸化窒素及び／又は前記一酸化窒素の供給源を前記培養培地に供給する工程、
ｃ）ここで、工程ｂ）の前記増加は：
・前記タンパク質生体分子の製造のための規制上の承認のために確立された事前の一連の条件下での培養並びに／又は
・前記一酸化窒素及び／若しくは前記一酸化窒素の前記供給源を供給することを除いて、実質的に同じ条件下での培養
に対して測定される、方法。
【請求項２】
（ａ）前記一酸化窒素が気体一酸化窒素及び／又は一酸化窒素の化学源を含み、（ｂ）前記細胞が真核細胞であり、（ｃ）前記タンパク質生体分子が異種タンパク質生体分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記真核細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞であり、前記異種タンパク質生体分子がモノクローナル抗体である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記一酸化窒素が気体であり、前記バイオリアクターに供給される別の気体の体積の一部を置換する、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記バイオリアクターに供給される前記別の気体が、酸素ガス、窒素ガス及び／又は二酸化炭素ガスを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記一酸化窒素及び／又は一酸化窒素の前記供給源が、前記細胞培養培地中に分泌される前記モノクローナル抗体の総収率を増加させるのに十分な量で添加される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記一酸化窒素及び／又は一酸化窒素の前記供給源が、前記細胞培養培地中に分泌される前記モノクローナル抗体の比細胞生産性を増加させるのに十分な量で添加される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞培養培地に可溶性の前記一酸化窒素が、０．１〜１０ナノモルの濃度である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記一酸化窒素及び／又は一酸化窒素の前記供給源が、前記細胞培養培地中に分泌される前記モノクローナル抗体の比細胞生産性を増加させるのに十分な量で添加される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞培養培地に可溶性の前記一酸化窒素が、０．１〜１０ナノモルの濃度である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞培養培地に可溶性の前記一酸化窒素が、０．１〜１０ナノモルの濃度である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記一酸化窒素が、散布された気体中に２００〜４００ｐｐｍの一酸化窒素の濃度で前記散布された気体として前記細胞培養培地に供給される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
一酸化窒素ガスの供給源又は一酸化窒素を形成することができる化学物質の供給源を含むバイオリアクターであって、前記バイオリアクターは、前記一酸化窒素又は一酸化窒素を形成することができる化学物質を前記バイオリアクター内の細胞培養培地に提供するように構成及び適合される、バイオリアクター。
【請求項１４】
前記バイオリアクターが、細胞培養バッチ当たり、又は単一の実質的に連続した細胞培養生産ラン当たり、少なくとも１０００ｍｇ／Ｌの異種タンパク質生体分子の商業規模生産のために構成及び適合される、請求項１３に記載のバイオリアクター。
【請求項１５】
前記一酸化窒素ガス及び／又は一酸化窒素を形成することができる化学物質を前記バイオリアクター内の前記細胞培養培地に提供する工程を含む、請求項１３又は１４に記載のバイオリアクターの操作方法。
【請求項１６】
前記バイオリアクターが：
ａ）前記バイオリアクター内の前記細胞培養培地中の前記一酸化窒素レベルを測定するように構成及び適合された一酸化窒素センサ、
ｂ）一酸化窒素ガスインジェクタ及び／又は一酸化窒素の化学源の供給源に操作可能に接続された化学インジェクタ、並びに
ｃ）前記一酸化窒素センサへの通信リンクを有し、ｂ）の前記インジェクタに電子的に接続されたコンピュータであって、前記一酸化窒素センサの読み取り値を受け取り、前記インジェクタを調節して、前記細胞培養培地中の前記一酸化窒素濃度を所定の濃度範囲及び／又は設定点内に維持するように特にプログラムされたコンピュータ
をさらに含む、請求項１３又は１４に記載のバイオリアクター。
【請求項１７】
前記所定の濃度範囲が、前記細胞培養培地中に可溶化された０．１〜１０ナノモルの一酸化窒素である、請求項１６に記載のバイオリアクター。
【請求項１８】
前記一酸化窒素ガス及び／又は一酸化窒素を形成することができる化学物質を前記バイオリアクター内の前記細胞培養培地に提供する工程を含む、請求項１６に記載のバイオリアクターの操作方法。
【請求項１９】
ａ）異種タンパク質生体分子を分泌することができる真核細胞株、及び
ｂ）前記真核細胞によって分泌される異種タンパク質生体分子の量の増加を引き起こすことができ、引き起こすのに十分な量の一酸化窒素
を含む細胞培養培地。
【請求項２０】
前記一酸化窒素が、前記細胞培養培地と混合された一酸化窒素ガス及び前記細胞培養培地に溶解された一酸化窒素の１つ以上から選択される、請求項１９に記載の細胞培養培地。
【請求項２１】
前記真核細胞株がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株であり、前記異種タンパク質生体分子がモノクローナル抗体である、請求項１９又は２０に記載の細胞培養培地。
【請求項２２】
前記細胞培養培地に可溶性の前記一酸化窒素が、０．１〜１０ナノモルの一酸化窒素の濃度範囲内である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
異種タンパク質生体分子を分泌し、添加された一酸化窒素に応答して分泌タンパク質生体分子の量を増加させる細胞株をスクリーニングする方法であって、以下の工程を含む方法：
ａ）前記異種タンパク質生体分子を分泌する前記細胞株の細胞培養物を樹立する工程、
ｂ）前記細胞培養物に前記一酸化窒素を添加する工程、
ｃ）前記分泌された異種タンパク質生体分子の量を測定する工程、及び
ｄ）工程ｃ）で測定された前記量を、前記一酸化窒素の前記添加を欠く対照条件を表す分泌された異種タンパク質生体分子の量と比較する工程。
【請求項２４】
前記添加される一酸化窒素が、一酸化窒素ガス及び一酸化窒素を形成することができる化学物質の１つ以上から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞株がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株であり、前記異種タンパク質生体分子がモノクローナル抗体である、請求項２３又は２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、その主な焦点として、タンパク質含有生体分子、特に、培養物中の哺乳動物細胞によって産生されるモノクローナル抗体及び小生物活性ペプチドなどのタンパク質生物医薬品の細胞生産性及び細胞培養収率の増強に関する。
【背景技術】
【０００２】
組換えヒトインスリンは、１９８２年に初めて認可された生物製剤となった。Ｊｕｎｏｄ、Ｓｕｚａｎｎｅ  Ｗｈｉｔｅ．「Ｃｅｌｅｂｒａｔｉｎｇ  ａ  ｍｉｌｅｓｔｏｎｅ：ＦＤＡ’ｓ  ａｐｐｒｏｖａｌ  ｏｆ  ｆｉｒｓｔ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｐｒｏｄｕｃｔ．」Ｕｐｄａｔｅ（２００７）：４３−４４。生物製剤産業は、それ以来、多数の新しい生物製剤の追加により劇的に拡大し、血友病から癌までの多数の疾患に多くの必要とされる治療選択肢を提供してきた。２０１５年、米国ＦＤＡは、１３種類の新しい生物製剤を承認し、そのうち９種類が「第１級」治療薬に分類された。ＦＤＡ医薬品評価研究センター（ＦＤＡ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、“Ｎｏｖｅｌ  Ｄｒｕｇｓ  ２０１５  Ｓｕｍｍａｒｙ”，Ｊａｎｕａｒｙ  ２０１６．＜ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｄｏｗｎｌｏａｄｓ／Ｄｒｕｇｓ／ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔＡｐｐｒｏｖａｌＰｒｏｃｅｓｓ／ＤｒｕｇＩｎｎｏｖａｔｉｏｎ／ＵＣＭ４８１７０９．ｐｄｆ＞。
【０００３】
治療薬としての生物製剤の大きな期待は、数多くの現実的な課題に直面しており、その中で最も重要なのは、製造のコスト及び複雑さである。規制の枠組みも、必然的に、伝統的な小分子医薬とは異なる：
【０００４】
「多くの場合、複雑な生物学的生成物の臨床的に活性な成分の同一性を同定する能力は限られているので、そのような生成物は、しばしば、それらの製造プロセスによって定義される。製造プロセス、設備又は施設の変更は、生物学的生成物自体の変更をもたらす可能性があり、生成物の安全性、同一性、純度及び力価を実証するために追加の臨床試験を必要とすることがある。伝統的な薬物生成物は、通常、製造後に容易に分析される純粋な化学物質からなる。生物学的生成物の製造方法には大きな違いがあるので、製造は初期段階から政府機関により監視されて、最終製品が期待通りに得られることを確認する。」
米国ＦＤＡ、治療用生物製剤に関するよくある質問、＜ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／Ｄｒｕｇｓ／ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔＡｐｐｒｏｖａｌＰｒｏｃｅｓｓ／ＨｏｗＤｒｕｇｓａｒｅＤｅｖｅｌｏｐｅｄａｎｄＡｐｐｒｏｖｅｄ／ＡｐｐｒｏｖａｌＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＢｉｏｌｏｇｉｃＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｕｃｍ１１３５２２．ｈｔｍ＞。
【０００５】
従って、生物製剤の製造及び供給は、必要な患者への生物製剤の流れにおける重要な実際的な障害である。生物製剤の価格は、伝統的な小分子化学薬品に比べて相応に高い。結果として、生物製剤の費用便益分析は、アクセスに関する決定を行う際に重要になる。例えば、Ｊｏｅｎｓｕｕ，Ｊａａｎａ  Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．“Ｔｈｅ  ｃｏｓｔ−ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：ａ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｒｅｖｉｅｗ．”ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  １０．３  （２０１５）：ｅ０１１９６８３；Ｈｕｏｐｏｎｅｎ，Ｓａａｒａ，ａｎｄ  Ｍａｒｊａ  Ｂｌｏｍ．“Ａ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｏｓｔ−Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｂｏｗｅｌ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ．”ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  １０．１２（２０１５）：ｅ０１４５０８７を参照のこと。
【０００６】
米国連邦政府は、追加的な供給を奨励し、コストを下げるために、２０１０年の医療保険制度改革法（Ｐａｔｉｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｆｆｏｒｄａｂｌｅ  Ｃａｒｅ  Ａｃｔ）の一環として、２００９年の生物製剤価格競争・イノベーション法（Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  Ｐｒｉｃｅ  Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ  Ａｃｔ  ｏｆ  ２００９）を制定した。この新しい法律は、「バイオシミラー」、即ち市場承認を確保するためのジェネリック生物製剤の法的経路と義務を確立した。Ａｈｍｅｄ，Ｉｓｌａｈ，Ｂｅｎ  Ｋａｓｐａｒ，ａｎｄ  Ｕｍａ  Ｓｈａｒｍａ．“Ｂｉｏｓｉｍｉｌａｒｓ：ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｌｉｆｅ  ｃｙｃｌｅ  ａｎｄ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｔｒａｊｅｃｔｏｒｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ．”Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ３４．２（２０１２）：４００−４１９。欧州医薬品庁（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ  Ａｇｅｎｃｙ）は、最初のバイオシミラー承認により、バイオシミラー規制の世界的最前線にある。
【０００７】
供給を改善し、コストを低減する１つの手段は、現存する生物製剤製造からの生成物収率を増大させるための費用効果の高い手段によって生産性を改善することであろう。理想的には、これは、最小の資本経費で達成されるであろう。もちろん、結果として得られる生成物は、ＦＤＡ又は他の医薬品機関の規制（例えば、ＥＭＡ）の下で提案されたバイオシミラー又は「主要な」製造プロセス変化に類似した厳格な規制レビュー及び評価に耐えなければならない。
【０００８】
生物製剤の製造及びコストに対する厳しい商業的及び医療上の圧力のために、生物医薬品製造のための最新技術は、タンパク質生体分子製造のための細胞の作製及び培養における多くのパラメーターの広範囲にわたる多面的な最適化及び操作を含む。Ａｌｍｏ  ＳＣ，Ｌｏｖｅ  ＪＤ．Ｂｅｔｔｅｒ  ａｎｄ  ｆａｓｔｅｒ：ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ．２０１４；２６：３９−４３．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｂｉ．２０１４．０３．００６；Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ（２０１４）Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３９（Ｚｈｏｕ，Ｗ．ａｎｄ  Ｋａｎｔａｒｄｊｉｅｆｆ，Ａ．ｅｄｓ）。
【０００９】
多くの細胞培養プロセス操作が日常的に使用されている。Ａｂｕ−Ａｂｓｉ，Ｓｕｓａｎ，ｅｔ  ａｌ．“Ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｏｐｅｒａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．”Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，２０１３．３５−６８。例えば、培養パラメーター、化学薬剤及び遺伝子工学的アプローチは、全て、タンパク質生体分子収率を高めるために、細胞周期阻害を引き起こして比細胞生産性を増加させるために適用されてきた。Ｄｕ，Ｚｈｉｍｅｉ，ｅｔ  ａｌ．“Ｕｓｅ  ｏｆ  ａ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｔｏ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ＣＨＯ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ．”Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １１２．１（２０１５）：１４１−１５５。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
タンパク質生体分子産生を改善するための広範且つ継続的な努力にもかかわらず、さらなる改善のための新しい方法を見出すための強い商業的圧力及び医学的必要性が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、以下の非限定的な例示的な実施形態に関連して理解され得る：
第１の実施形態では、本発明は、以下の番号を付した文章によって部分的に説明することができる：
文章１．タンパク質生体分子産生を増加させる方法であって、以下の工程を含む方法：
ａ）タンパク質生体分子を産生する細胞を培養する工程、
ｂ）（ｉ）細胞培養培地中に分泌されるタンパク質生体分子の総収率を増加させる、及び／又は（ｉｉ）細胞培養培地中に分泌されるタンパク質生体分子の比細胞生産性を増加させるのに十分な量の添加剤、好ましくは一酸化窒素、及び／又は添加剤の供給源を培養培地に供給する工程、
ｃ）ここで、工程ｂ）の増加は：
・タンパク質生体分子の製造のための規制上の承認のために確立された事前の一連の条件下での培養
並びに／又は
・添加剤及び／若しくは添加剤の供給源を供給することを除いて、実質的に同じ条件下での培養
に対して測定される。
文章２．（ａ）添加剤が一酸化窒素及び／又は一酸化窒素の化学源であり、（ｂ）細胞が真核細胞であり、（ｃ）タンパク質生体分子が異種タンパク質生体分子である、文章１の方法。
文章３．真核細胞がＣＨＯ細胞であり、異種タンパク質生体分子がモノクローナル抗体である、文章１及び／又は２の方法。
文章４．一酸化窒素が気体であり、バイオリアクターに供給される別の気体の体積の一部を置換する、文章１、２、及び／又は３の方法。
文章５．バイオリアクターに供給される別のガスが、酸素ガス、窒素ガス及び／又は二酸化炭素ガスを含む、文章４の方法。
文章６．一酸化窒素及び／又は一酸化窒素の化学源が、細胞培養培地中に分泌されるモノクローナル抗体の総収率を増加させるのに十分な量で添加される、文章１、２、３、４、及び／又は５の方法。
文章７．一酸化窒素及び／又は一酸化窒素の化学源が、細胞培養培地中に分泌されるモノクローナル抗体の比細胞生産性を増加させるのに十分な量で添加される、文章１、２、３、４、５、及び／又は６の方法。
文章８．細胞培養培地に可溶性の一酸化窒素が、０．１〜１０ナノモルの濃度である、文章１、２、３、４、５、６及び／又は７の方法。
文章９．一酸化窒素が、散布された気体中に２００〜４００ｐｐｍの一酸化窒素の濃度で散布された気体として細胞培養培地に供給される、文章８の方法。
文章１０．真核細胞がＣＨＯ細胞であり、異種タンパク質生体分子がモノクローナル抗体である、文章１、２、３、４、５、６、７、８及び／又は９の方法。
文章１１．添加剤が一酸化炭素であり、（ｂ）細胞が真核細胞であり、（ｃ）タンパク質生体分子が異種タンパク質生体分子である、文章１の方法。
文章１２．真核細胞がＣＨＯ細胞であり、異種タンパク質生体分子がペプチド又はグリコペプチド生物製剤である、文章１１の方法。
文章１３．細胞培養培地中に分泌されるモノクローナル抗体の比細胞生産性を増加させるのに十分な量の一酸化炭素が添加される、文章１１及び／又は１２の方法。
文章１４．ＨＯ−１活性を誘導し、細胞内のカスパーゼ−３活性を阻害することができる少なくとも２つの追加の添加剤を培養培地に供給する工程をさらに含む、文章１３の方法。
文章１５．ＨＯ−１活性を誘導する添加剤が、クルクミン、コーヒー酸フェネチルエステル、レスベラトロール、ケルセチン、没食子酸エピガロカテキン、カルノソール、スルフォラファン、及びフマル酸ジメチルの１つ以上から選択される、文章１４の方法。
文章１６．カスパーゼ−３活性を阻害する添加剤が、キノリル−バリル−Ｏ−メチルアスパルチル−［−２，６−ジフルオロフェノキシ］−メチルケトン、Ｂｏｃ−Ｄ−ｆｍｋ及びＺ−ＶＡＤ−ｆｍｋの１つ以上から選択される、文章１４の方法。
文章１７．細胞内のグルタチオンレベルを増加させることができる添加剤を培養培地に供給する工程をさらに含む、文章１４の方法。
文章１８．細胞内のグルタチオンレベルを増加させることができる添加剤が、イソチオシアン酸ベンジル、β−ナフトフラボン、クマリン、α−アンゲリカラクトン、ジスルフィラム、インドール−３−カルビノール及びインドール−３−アセトニトリルスルホラファン並びにフマル酸ジメチルの１つ以上から選択される、文章１７の方法。
【００１２】
第２の実施形態では、本発明は、以下の番号を付した文章によって部分的に説明することができる：
文章１９．一酸化窒素ガスの供給源又は一酸化窒素を形成することができる化学物質の供給源を含むバイオリアクターであって、バイオリアクターは、一酸化窒素又は一酸化窒素を形成することができる化学物質をバイオリアクター内の細胞培養培地に提供するように構成及び適合される、バイオリアクター。
文章２０．バイオリアクターが、細胞培養バッチ当たり、又は単一の実質的に連続した細胞培養生産ラン当たり、少なくとも１０００ｍｇ／Ｌの異種タンパク質生体分子の商業規模生産のために構成及び適合される、文章１９のバイオリアクター。
文章２１．バイオリアクターが：
ａ）バイオリアクター内の細胞培養培地中の一酸化窒素レベルを測定するように構成及び適合された一酸化窒素センサ、
ｂ）一酸化窒素ガスインジェクタ及び／又は一酸化窒素の化学源の供給源に操作可能に接続された化学インジェクタ、並びに
ｃ）一酸化窒素センサへの通信リンクを有し、ｂ）のインジェクタに電子的に接続されたコンピュータであって、一酸化窒素センサの読み取り値を受け取り、インジェクタを調節して、細胞培養培地中の一酸化窒素濃度を所定の濃度範囲及び／又は設定点内に維持するように特にプログラムされたコンピュータ
をさらに含む、文章１９及び／又は２０のバイオリアクター。
文章２２．所定の濃度範囲が、細胞培養培地中に可溶化された０．１〜１０ナノモルの一酸化窒素である、文章２１のバイオリアクター。
文章２３．文章１９、２０、及び／又は２１のバイオリアクターを操作する方法であって、一酸化窒素ガス、及び／又は一酸化窒素を形成することができる化学物質を、文章１９、２０、及び／又は２１のバイオリアクター内の細胞培養培地に提供する工程を含む、方法。
【００１３】
第３の実施形態では、本発明は、以下の番号を付した文章によって部分的に説明することができる：
文章２４．
ａ）異種タンパク質生体分子を分泌することができる真核細胞株、及び
ｂ）真核細胞によって分泌される異種タンパク質生体分子の量の増加を引き起こすことができる添加剤
を含む細胞培養培地。
文章２５．添加剤が、細胞培養培地と混合された一酸化窒素ガス、細胞培養培地に溶解された一酸化窒素、及び一酸化炭素の１つ以上から選択される、文章２４の細胞培養培地。
文章２６．（ａ）添加剤が一酸化窒素であり、（ｂ）真核細胞株がＣＨＯ細胞株であり、（ｃ）異種タンパク質生体分子がモノクローナル抗体である、文章２４及び／又は２５の細胞培養培地。
文章２７．細胞培養培地に可溶性の一酸化窒素が、０．１〜１０ナノモルの一酸化窒素の濃度範囲内である、文章２４、２５、及び／又は２６の方法。
【００１４】
第４の実施形態では、本発明は、以下の番号を付した文章によって部分的に説明することができる：
文章２８．異種タンパク質生体分子を分泌し、添加剤に応答して分泌タンパク質生体分子の量を増加させる細胞株をスクリーニングする方法であって、以下の工程を含む方法：
ａ）異種タンパク質生体分子を分泌する細胞株の細胞培養物を樹立する工程、
ｂ）細胞培養物に添加剤を添加する工程、
ｃ）分泌された異種タンパク質生体分子の量を測定する工程、及び
ｄ）工程ｃ）で測定された量を、添加剤の添加を欠く対照条件を表す分泌された異種タンパク質生体分子の量と比較する工程。
文章２９．添加剤が、一酸化窒素ガス、一酸化窒素を形成することができる化学物質、及び一酸化炭素の１つ以上から選択される、文章２８の方法。
文章３０．（ａ）添加剤が、一酸化窒素ガス及び一酸化窒素を形成することができる化学物質の１つ以上から選択され、（ｂ）細胞株がＣＨＯ細胞株であり、（ｃ）異種タンパク質生体分子がモノクローナル抗体である、文章２８及び／又は２９の方法。
【００１５】
本発明は、培養される細胞によって産生されるタンパク質生体分子の正味の収率を増加させる細胞培養添加剤（又は添加剤、本明細書では一般的に「添加剤」と呼ばれる）の使用に関する。好ましい実施形態の群において、タンパク質生体分子は、添加剤で産生されたタンパク質生体分子が安全性、有効性、生物学的同等性などのための任意の適用可能な規制要件に従って、述語タンパク質生体分子の代わりになり得るように、同じ機能及び比活性レベルを保持する。
【００１６】
添加剤
「添加剤」は、細胞培養物中の細胞によって産生される生体分子の収率の正味の増加を生じる、細胞培養物に供給される化学物質又は化学物質の組み合わせである。
【００１７】
添加剤の作用機序の理論
添加剤は、培養培地における多様な反応に関与し、細胞損傷を与え、ストレスを誘発し得る活性酸素及び窒素種を生じる。細胞は、多くの解毒酵素及び細胞生存を支持する他の保護機構を活性化することによって、酸化ストレスに対抗する。転写因子Ｎｒｆ２（核因子赤血球関連因子２）は、このような酸化ストレス応答の活性化において重要な役割を果たす（Ｄｈａｋｓｈｉｎａｍｏｏｒｔｈｙ，Ｓ．ａｎｄ  Ｐｏｒｔｅｒ，Ａ．Ｇ．，２００４．Ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｇｅｎｅｓ  ｂｙ  Ｎｒｆ２  ｖｉａ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｃｏｕｎｔｅｒａｃｔｓ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｃｅｌｌｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７９（１９），ｐｐ．２００９６−２０１０７；Ｌｏｂｏｄａ，Ａ．，Ｄａｍｕｌｅｗｉｃｚ，Ｍ．，Ｐｙｚａ，Ｅ．，Ｊｏｚｋｏｗｉｃｚ，Ａ．ａｎｄ  Ｄｕｌａｋ，Ｊ．，２０１６．Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｎｒｆ２／ＨＯ−１  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅｓ：ａｎ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｉｌｙ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，７３（１７），ｐｐ．３２２１−３２４７）。基礎条件下では、Ｎｒｆ２は、Ｋｅａｐ１（Ｋｅｌｃｈ様ＥＣＨ関連タンパク質１）によって調節される短い半減期を有する。Ｋｅａｐ１内のシステインのチオール基は、求電子剤及びオキシダントのためのセンサとして作用する。活性酸素種の存在下で、Ｋｅａｐ１のシステイン残基は酸化され、コンホメーション変化をもたらし、これはＫｅａｐ１のＮｒｆ２への結合を妨げる。結果として、遊離Ｎｒｆ２は安定化され、核に移動し、そこで抗酸化剤応答に関与する遺伝子の発現を駆動する。
【００１８】
多くのＮｒｆ２標的は、グルタチオン代謝に関連する。細胞において、グルタチオンは、グルタチオン反応性種付加物を形成することによって活性酸素及び窒素種をクエンチすることができる（Ｌｕｐｅｒｃｈｉｏ，Ｓ．，Ｔａｍｉｒ，Ｓ．ａｎｄ  Ｔａｎｎｅｎｂａｕｍ，Ｓ．Ｒ．，１９９６．ＮＯ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ  ａｎｄ  ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  ｒｏｄｅｎｔ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２１（４），ｐｐ．５１３−５１９）。さらに、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）は、疎水性の求電子剤及び活性酸素種をグルタチオンと結合させる。これに沿って、増加した細胞内グルタチオンは、酸化ストレスの間に細胞により大きな抵抗性を提供することが示されている。Ｎｒｆ２は、グルタチオン生合成グルタミン酸システインリガーゼ（ＧＣＬ）、大きな触媒サブユニット（ＧＣＬｃ）及び小さな調節サブユニット（ＧＣＬｍ）を含むヘテロダイマーに関与する酵素の発現を制御する。細胞におけるグルタチオンホメオスタシスはまた、再循環及び細胞輸出などの他の因子によっても調節される。例えば、好気性呼吸は、２つのＧＳＨ分子をＧＳＳＧに変換することによってグルタチオンペルオキシダーゼによって代謝される過酸化水素の増加をもたらし得る。ＧＳＨは、グルタチオンレダクターゼの作用によって再循環させることができる。
【００１９】
Ｎｒｆ２は、ヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）、ＣＯ、鉄及びビリルビンへのヘム分解における律速酵素の発現を駆動する（Ｆｏｒｅｓｔｉ，Ｒ．ａｎｄ  Ｍｏｔｔｅｒｌｉｎｉ，Ｒ．，１９９９．Ｔｈｅ  ｈｅｍｅ  ｏｘｙｇｅｎａｓｅ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ．Ｆｒｅｅ  ｒａｄｉｃａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，３１（６），ｐｐ．４５９−４７５）。フリーヘムは、ホメオスタシス条件においてフリーラジカルの生成を触媒することができるので、このプロオキシダント特性は、ヘム基をタンパク質中に保持することによって制御される。しかしながら、酸化ストレス下では、タンパク質は、それらのヘム基を放出することができる。細胞は、ヘムを分解し、細胞死を回避するＨＯ−１の発現を誘導することによって応答する。ビリルビンも、強力なペルオキシルラジカルスカベンジャーとして作用し得る（Ｍｏｔｔｅｒｌｉｎｉ，Ｒ．，Ｆｏｒｅｓｔｉ，Ｒ．，Ｉｎｔａｇｌｉｅｔｔａ，Ｍ．ａｎｄ  Ｗｉｎｓｌｏｗ，Ｒ．Ｍ．，１９９６．ＮＯ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｍｅ  ｏｘｙｇｅｎａｓｅ：ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｃｙｔｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ  ｔｏ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ−Ｈｅａｒｔ  ａｎｄ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｏｒｙ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２７０（１），ｐｐ．Ｈ１０７−Ｈ１１４）。遊離鉄は、鉄を隔離し、Ｆｅｎｔｏｎ反応への遊離鉄の関与を制限する保護酵素であるフェリチンの誘導をもたらす。他の間接的効果は、増殖を阻害するＨＯ−１によって生成される低レベルの一酸化炭素から生じ得る。用量／応答曲線は細胞型に依存するが、１〜３０ｎＭ／ｓの範囲の低レベルの添加剤は、典型的にはＨＯ−１誘導に関連する（Ｂｏｕｔｏｎ，Ｃ．ａｎｄ  Ｄｅｍｐｌｅ，Ｂ．，２０００．Ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｍｅ  ｏｘｙｇｅｎａｓｅ−１  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍＲＮＡ  ａｎｄ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｄｉｒｅｃｔ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７５（４２），ｐｐ．３２６８８−３２６９３；Ｍａｒｑｕｉｓ，Ｊ．Ｃ．ａｎｄ  Ｄｅｍｐｌｅ，Ｂ．，１９９８．Ｃｏｍｐｌｅｘ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｓｕｂｌｅｔｈａｌ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｐｕｒｅ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ．Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，５８（１５），ｐｐ．３４３５−３４４０）。Ｎｒｆ２はまた、酸化ストレス誘導細胞阻害剤Ｏｓｇｉｎ１の特異的アイソフォームの発現を誘導し得る（Ｂｒｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｓ．，Ｍａｔｏｓ，Ｍ．Ｆ．，Ｒｉｃｈｔｅｒ，Ｋ．Ｅ．，Ｌｉ，Ｂ．ａｎｄ  Ｓｃａｎｎｅｖｉｎ，Ｒ．Ｈ．，２０１７．Ｔｈｅ  ＮＲＦ２  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｔａｒｇｅｔ，ＯＳＧＩＮ１，ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ  ｆｕｍａｒａｔｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｙｔｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，７，ｐ．ｓｒｅｐ４２０５４）。
【００２０】
添加剤の細胞保護効果には、「プログラム細胞死」又は「アポトーシス」と呼ばれる細胞死の形態の減少が含まれる。このタイプの細胞死は、典型的には、カスパーゼと呼ばれるプロテアーゼによって開始される。全てのカスパーゼは、活性に必須である酵素触媒部位に単一のシステインを含有する。カスパーゼ−３については、システイン１６３は酸化還元修飾を受けやすく、一酸化窒素の存在下で効率的にＳ−ニトロシル化することができる（Ｂｒｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｓ．，Ｍａｔｏｓ，Ｍ．Ｆ．，Ｒｉｃｈｔｅｒ，Ｋ．Ｅ．，Ｌｉ，Ｂ．ａｎｄ  Ｓｃａｎｎｅｖｉｎ，Ｒ．Ｈ．，２０１７．Ｔｈｅ  ＮＲＦ２  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｔａｒｇｅｔ，ＯＳＧＩＮ１，ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ  ｆｕｍａｒａｔｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｙｔｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，７，ｐ．ｓｒｅｐ４２０５４）。添加剤によるカスパーゼ活性の抑制は、いくつかの精製されたヒトカスパーゼを用いて実証されており、少なくとも部分的には、インビボ及びインビトロの両方の添加剤によるアポトーシスの阻害を説明することが示されている（Ｌｉ，Ｊ．，Ｂｉｌｌｉａｒ，Ｔ．Ｒ．，Ｔａｌａｎｉａｎ，Ｒ．Ｖ．ａｎｄ  Ｋｉｍ，Ｙ．Ｍ．，１９９７．Ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｓｅｖｅｎ  ｍｅｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃａｓｐａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｖｉａ  Ｓ−ｎｉｔｒｏｓｙｌａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２４０（２），ｐｐ．４１９−４２４）。
【００２１】
要するに、低濃度の添加剤は、長期間にわたり高い細胞生存率を提供し、生体分子の産生ブーストをもたらす。以下の実験によれば、亜硝酸塩、硝酸塩、二酸化窒素、又は一酸化炭素は、全体的な生体分子生産収率に対して中立又は負の効果を示し、これは一酸化窒素が細胞培養密度に対する負の影響を相殺するにもかかわらず、生体分子産生を特異的に増加させることを示す。培地中での一酸化窒素の制御された放出を提供する化学物質を用いた細胞のインキュベーションは、生存度の増大（ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）をもたらした。一酸化窒素は、グルタチオンを産生する酵素の活性の増大を介する上昇したグルタチオンによって相殺され得るか又はされ得ない、ミトコンドリアに対する酸化的損傷を引き起こすことが示されている。これは、増加した生体分子産生を生じるＨＯ−１メカニズムとは異なる一酸化窒素の二次効果である。それにもかかわらず、本発明において使用される細胞は、一酸化窒素が使用される添加剤である場合、細胞密度、生存率及びタンパク質生体分子収率の最適な増加のために、この様式で一酸化窒素に応答することが明らかに好ましい。
【００２２】
添加剤としての使用のための一酸化窒素の例としては、ａ）窒素又は他の不活性バランスガス中の適切な濃度の一酸化窒素ガス、ｂ）いくつかの公知のデバイス（例えば、Ｐｅｚｏｎｅ，Ｍａｔｔｈｅｗ  Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．“Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｄｉｏｘｉｄｅ  ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｖｅｎｔｉｌａｔｏｒ  ｃｉｒｃｕｉｔ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｕｎｉｆｏｒｍ  ＮＯ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｉｎｓｐｉｒａｔｉｏｎ．”Ｎｉｔｒｉｃ  Ｏｘｉｄｅ  ５８（２０１６）：４２−５０．）の１つによって連続的に生成される一酸化窒素ガス、及び／又はｃ）不活性バランスガス中の適切な濃度の二酸化炭素を伴う適切な濃度の一酸化窒素が挙げられる。特定の好ましい実施形態では、添加剤は、分子自体として提供される一酸化窒素、又は一酸化窒素になるか、若しくは一酸化窒素を生成するプロ分子である。一酸化窒素を提供するためのプロ分子の例としては、以下が挙げられる：
・ＤＥＴＡ−ＮＯ（ジエチレントリアミン−一酸化窒素付加物、ＣＡＳ  ＃  １４６７２４−９４−９）、３７℃、ｐＨ７．４で２０時間の半減期のｐＨ依存的な一次プロセスで自発的に解離して、親化合物１モル当たり２モルのＮＯを遊離するＮＯ供与体。
・β−Ｇａｌ−ＮＯ（ＣＡＳ  ＃３５７１９２−７７−９）、ｐＨ５．６で６分の半減期でβ−ガラクトシダーゼによる活性化後にＮＯを放出するＮＯ供与体。
・ＮＯＣ−５（ＣＡＳ  ＃１４６７２４−８２−５）、生理学的条件下で溶液中に２当量のＮＯを放出するＮＯ供与体。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）でのＮＯＣ−５の半減期は、２２℃で９３分である。
・ＤＥＡ−ＮＯ（ＣＡＳ  ＃３７２９６５−００−９）、３７℃、ｐＨ７．４で２分の半減期のｐＨ依存的な一次プロセスで自発的に解離して、親化合物１モル当たり１．５モルのＮＯを遊離するＮＯ供与体。
・ＤＰＴＡ−ＮＯ（ＣＡＳ  ＃１４６７２４−９５−０）、３７℃、ｐＨ７．４で３時間の半減期のｐＨ依存的な一次プロセスで自発的に解離して、親化合物１モル当たり２モルのＮＯを遊離するＮＯ供与体。
・ＭＡＨＭＡ  ＮＯＮＯａｔｅ（ＣＡＳ  ＃  １４６７２４−８６−９）、３７℃、ｐＨ７．４で１分の半減期の一次プロセスで自発的に解離して、親化合物１モル当たり２モルのＮＯを遊離するＮＯ供与体。
・ＰＡＰＡ  ＮＯＮＯａｔｅ（ＣＡＳ  ＃１４６６７２−５８−４）、３７℃、ｐＨ７．４で１５分の半減期の一次プロセスで自発的に解離して、親化合物１モル当たり２モルのＮＯを遊離するＮＯ供与体。
【００２３】
添加剤の共通の構造的及び／又は化学的特徴
一酸化窒素（「ＮＯ」）及び一酸化炭素（「ＣＯ」）は、両方とも、非酸素原子に結合した酸素原子を有する二原子分子である。両方とも、同等のレベルで水溶性である。Ｇｅｖａｎｔｍａｎ，Ｌ．Ｈ．“Ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｇａｓｅｓ  ｉｎ  ｗａｔｅｒ．”Ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ（ＮＯ）３０８．３．３４８（２０００）：１０−４。両方の分子は、ヘムオキシゲナーゼ−１媒介細胞機能に影響を及ぼす。例えば、Ｚｕｃｋｅｒｂｒａｕｎ  ＢＳ，Ｂｉｌｌｉａｒ  ＴＲ，Ｏｔｔｅｒｂｅｉｎ  ＳＬ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｒｂｏｎ  Ｍｏｎｏｘｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｌｉｖｅｒ  Ｆａｉｌｕｒｅ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｎｉｔｒｉｃ  Ｏｘｉｄｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｈｅｍｅ  Ｏｘｙｇｅｎａｓｅ  １．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２００３；１９８（１１）：１７０７−１７１６．ｄｏｉ：１０．１０８４／ｊｅｍ．２００３１００３；Ｗａｎｇ，Ｊｉｎｌｉｎｇ，ｅｔ  ａｌ．“Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ｗｉｔｈ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｍｅ  ｏｘｙｇｅｎａｓｅ−１．”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７８．４（２００３）：２３４１−２３４７を参照のこと（要約：「ＮＯ及びＣＯは、ある生理学的状況においてシグナル伝達分子として互いに補完し合い得る」）。
【００２４】
添加物に対する細胞応答及び添加物で培養した細胞の識別特性
タンパク質生体分子
タンパク質生体分子は、脂質、炭水化物又はリン酸塩などの様々な他の化学成分を有することもできるアミノ酸含有分子である。一般に、アミノ酸成分は、タンパク質生体分子の全体的な分子量の大部分である。タンパク質生体分子は、天然に存在する分子、翻訳されたアミノ酸配列若しくは抗体キメラに対して選択された変更を行うための遺伝子工学によるような天然分子の改変バージョン、又は例えばタンパク質結晶学誘導ペプチド工学アプローチに基づく完全に人工の分子であり得る。好ましいタンパク質生体分子は、一般にエリスロポエチン（ＥＰＯＧＥＮ（商標）；ＰＲＯＣＲＩＴ（商標））のようなペプチド、又はアダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ（商標））のようなモノクローナル抗体である医学的用途を有するものである。
【００２５】
細胞
添加剤に応答して増加された生体分子産生を生じる培養細胞は、真核細胞、一般にチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、マウス骨髄腫（ＮＳ０、Ｓｐ２／０）細胞、及びヒト胚性腎細胞（ＨＥＫ）などの哺乳動物細胞である。これらの細胞は、ヒトにおけるものに類似する複合タンパク質に翻訳後修飾を付加し、酸化ストレス応答を誘導する能力を共有する。
【００２６】
細胞培養
タンパク質生体分子を産生するための細胞は、バイオリアクター内の適切な液体培地中で培養される。Ｌｉ  Ｆ，Ｖｉｊａｙａｓａｎｋａｒａｎ  Ｎ，Ｓｈｅｎ  Ａ（Ｙｉｊｕａｎ），Ｋｉｓｓ  Ｒ，Ａｍａｎｕｌｌａｈ  Ａ．Ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  ｆｏｒ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．ｍＡｂｓ．２０１０；２（５）：４６６−４７７；Ｗａｎｇ，Ｄｉａｎｌｉａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．“Ｔｈｅ  ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ：ａ  ｐｏｗｅｒｆｕｌ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌ  ｃｅｌｌｓ．”Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６．５（２００５）：３９７−４０３；Ｂｕｔｌｅｒ，Ｍ．，ａｎｄ  Ａ．Ｍｅｎｅｓｅｓ−Ａｃｏｓｔａ．“Ｒｅｃｅｎｔ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ  ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．”Ａｐｐｌｉｅｄ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９６．４（２０１２）：８８５−８９４。大規模モノクローナル抗体生産のための最も一般的な形式は、温度、圧力、撹拌、ｐＨ及び溶存酸素制御、並びにｐＨ、溶存ＣＯ２のためのセンサシステムなどを有するステンレス鋼撹拌槽であるバイオリアクターである。最も一般的な培地／培養形式は、流加式である。Ｌｉ  Ｆ，Ｖｉｊａｙａｓａｎｋａｒａｎ  Ｎ，Ｓｈｅｎ  Ａ（Ｙｉｊｕａｎ），Ｋｉｓｓ  Ｒ，Ａｍａｎｕｌｌａｈ  Ａ．Ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  ｆｏｒ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．ｍＡｂｓ．２０１０；２（５）：４６６−４７７；Ｙａｎｇ  Ｊ−Ｄ，Ｌｕ  Ｃ，Ｓｔａｓｎｙ  Ｂ，Ｈｅｎｌｅｙ  Ｊ，Ｇｕｉｎｔｏ  Ｗ，Ｇｏｎｚａｌｅｚ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．Ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ  ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｓｃａｌｅ−ｕｐ  ｆｒｏｍ  ３  Ｌ  ｔｏ  ２，５００  Ｌ  ｓｃａｌｅ  ｆｏｒ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．２００７；９８：１４１−１５４。
【００２７】
潅流培養のためのＷＡＶＥ（商標）バイオリアクターなどの多くの他のバイオリアクター及び培地培養形式が、現在、タンパク質生体分子の大規模生産のために利用可能である。Ｃｌｉｎｃｋｅ，Ｍａｒｉｅ‐Ｆｒａｎｃｏｉｓｅ，ｅｔ  ａｌ．“Ｖｅｒｙ  ｈｉｇｈ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｂｙ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ  ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  ｆｌｏｗ  ｏｒ  ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  ｆｌｏｗ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ＷＡＶＥ  ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒＴＭ−ｐａｒｔ  ＩＩ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ．”Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ２９．３（２０１３）：７６８−７７７；Ｃｈｏｔｔｅａｕ，Ｖｅｒｏｎｉｑｕｅ，Ｙｅ  Ｚｈａｎｇ，ａｎｄ  Ｍａｒｉｅ−Ｆｒａｎｃｏｉｓｅ  Ｃｌｉｎｃｋｅ．“Ｖｅｒｙ  Ｈｉｇｈ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  ｉｎ  Ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ＣＨＯ  Ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ＡＴＦ，ＴＦＦ，Ｗａｖｅ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ，ａｎｄ／ｏｒ  ＣｅｌｌＴａｎｋ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ−Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．”Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ（２０１４）。
【００２８】
バイオリアクター培地への化学添加剤の使用
バイオリアクターは、原液濃縮物として種々の培地成分を添加するように設計されている。一般に、バイオリアクターは、導管によってバイオリアクターチャンバーに接続された培地供給システムを含む。培地供給システムは、供給源容器から追加の培地又はその成分を引き出し、これらを一般に自動制御下でバイオリアクターに供給する。ほとんどの場合、スケジュール、センサフィードバックループなどに基づいて、バイオリアクターに様々な成分を追加するためのプログラミングを伴うコンピュータ自動化が存在する。ｐＨ、グルコースレベル、及び他の能動的に管理されるパラメーターは、バイオリアクターへの様々な培地成分及び他の化学物質の追加によって調節される。バイオリアクター工学のこれらの面は、古く、確立された技術である。Ｔｅｌｌｉｎｇ，Ｒ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｃ．Ｊ．Ｓｔｏｎｅ．“Ａ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ａｕｔｏｍａｔｉｃ  ｐＨ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ａ  ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ−ＣＯ２  ｂｕｆｆｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｕｂｍｅｒｇｅｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ  ｃｅｌｌｓ．”Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ６．２（１９６４）：１４７−１５８；Ｖａｒｌｅｙ  Ｊ，Ｂｉｒｃｈ  Ｊ．Ｒｅａｃｔｏｒ  ｄｅｓｉｇｎ  ｆｏｒ  ｌａｒｇｅ  ｓｃａｌｅ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ａｎｉｍａｌ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１９９９；２９（３）：１７７−２０５．ｄｏｉ：１０．１０２３／Ａ：１００８００８０２１４８１；Ｍａｒｋｓ，Ｄａｖｉｄ  Ｍ．“Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ  ｄｅｓｉｇｎ  ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｌａｒｇｅ  ｓｃａｌｅ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ．”Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４２．１（２００３）：２１−３３。
【００２９】
本発明の性質及び目的をさらに理解するために、以下の詳細な説明を添付の図面と併せて参照するべきであり、添付の図面では、同様の要素には同じ又は類似の参照番号が与えられている：
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本明細書に記載の添加剤についての理論的作用機構を示す；
【図２】水素ガス又はキセノンガスに暴露されたＣＨＯ−ＨＢＳ細胞の培養物についての生存細胞密度曲線を示す；
【図３】水素ガス又はキセノンガスに暴露されたＣＨＯ−ＨＢＳ細胞の培養のためのモノクローナル抗体の力価を示す；
【図４】一酸化炭素（「ＣＯ」）ガスに暴露されたＣＨＯ−ＨＳＢ細胞のバッチ３Ｌ培養物の生存細胞密度を示す；
【図５】細胞培養散布ガス上で３００ｐｐｍで供給される一酸化窒素（「ＮＯ」）ガスに暴露されたＣＨＯ−ＨＳＢ細胞のバッチ３Ｌ培養物の生存細胞密度を示す；
【図６】図５の細胞培養物についての抗体力価を示す；
【図７】図５の細胞培養物について計算された比細胞生産性を示す；
【図８】図５〜７によって表される実験に使用される３Ｌバイオリアクターバッチ細胞培養形式に関する、散布ガス中及び細胞培養培地中のＮＯによって生成される主な化学反応／分解生成物を示す；
【図９】細胞培養培地に添加された硝酸ナトリウムの形態の硝酸塩に暴露された３Ｌバッチ細胞培養ＣＨＯ−ＨＳＢ細胞についての生存細胞密度を示す；
【図１０】硝酸塩に暴露された３Ｌバッチ細胞培養ＣＨＯ−ＨＳＢ細胞（図９と同じ培養物）についての抗体力価を示す；
【図１１】細胞培養散布ガス上で３００ｐｐｍで供給される一酸化窒素（「ＮＯ」）ガスに暴露されたＣＨＯ−ＨＳＢ細胞のバッチ３Ｌ培養物における亜硝酸塩の時間経過蓄積と、亜硝酸ナトリウム処理した３Ｌ細胞バッチ培養における亜硝酸塩のマッチング濃度プロファイルを示す；
【図１２】細胞培養培地に添加された亜硝酸ナトリウムの形態の亜硝酸塩に暴露された３Ｌバッチ細胞培養ＣＨＯ−ＨＳＢ細胞の生存細胞密度を示す；
【図１３】亜硝酸塩に暴露された３Ｌバッチ細胞培養ＣＨＯ−ＨＳＢ細胞（図１２と同じ培養物）についての抗体力価を示す；
【図１４】対照培養と亜硝酸塩処理培養と陽性対照の一酸化窒素処理振盪フラスコ培養（一酸化窒素の供給源としてＤＥＴＡ−ＮＯを使用）を比較した振盪フラスコ培養におけるＨＯ−１発現の正規化された発現プロファイルを示す；
【図１５】散布ガス中の二酸化窒素ガスに暴露されたＣＨＯ−ＨＳＢ細胞のバッチ３Ｌ培養物の生存細胞培養密度及び力価を示す；
【図１６】細胞培養散布ガス上で３００ｐｐｍで供給される一酸化窒素（「ＮＯ」）ガスに暴露されたＣＨＯ−ＨＳＢ細胞の３Ｌ培養物の、３時点（１日目、３日目及び５日目）での細胞のＲＮＡｓｅｑ分析からの差次的発現読み取りを示す；
【図１７】一酸化窒素暴露による調節されていない発現を有する遺伝子を示す表及びヒートマップである；
【図１８】細胞培養散布ガス上で３００ｐｐｍで供給されるＮＯガスに暴露されたＣＨＯ−ＨＳＢ細胞の３Ｌ培養物の細胞のＨＯ−１タンパク質レベルについてのウェスタンブロット分析及びベータアクチン正規化密度読み取りを示す；
【図１９】細胞培養散布ガス上で３００ｐｐｍで供給されるＮＯガスに暴露されたＣＨＯ−ＨＳＢ細胞の３Ｌ培養物の細胞のグルタチオンＳ−トランスフェラーゼｐ１タンパク質レベルについてのウェスタンブロット分析及びベータアクチン正規化密度読み取りを示す；
【図２０】ＣＨＯ−ＨＳＢ細胞の３Ｌ培養物±３００ｐｐｍで細胞培養散布ガス上で供給される一酸化窒素（「ＮＯ」）ガスについて蛍光強度により測定したカスパーゼ３活性を示す；
【図２１】細胞培養散布ガス上で３００ｐｐｍで供給されるＮＯガスに暴露されたＣＨＯ−ＨＳＢ細胞の３Ｌバッチ培養物からの代表的なデータと比較した、ＣＨＯ−ＨＳＢ細胞の３つのＤＥＴＡ−ＮＯ濃度（０．０９ｍＭ、０１８ｍＭ及び０．３６ｍＭ）振盪フラスコ培養物についての生存細胞密度を示す；
【図２２】図２１に示した細胞培養物からのＤＥＴＡ−ＮＯ振盪フラスコ実験及び比較３Ｌ  ＮＯ散布細胞培養データについての抗体力価を示す；
【図２３】振盪フラスコ培養物からのＤＥＴＡ−ＮＯ処理ＣＨＯ−ＨＳＢ細胞におけるＨＯ−１タンパク質発現のウェスタンブロット及びベータアクチン正規化密度測定値を示す；
【図２４】還元剤の非存在下（上部）又は存在下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した、８又は１０日目における対照バイオリアクター（レーン１〜３）又は３００ｐｐｍのＮＯを散布したバイオリアクター（レーン４〜６）から精製したＩｇＧを示す；
【図２５】二量体形態及び凝集体を強調した、培養１０日目における抗体のクロマトグラムを示す；
【図２６】未処理のＣＨＯ−ＨＢＳ細胞培養物から精製されたＩｇＧの典型的なグリカンプロファイルを示す。Ｇ０、Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ、Ｇ１Ｆ’、Ｇ２Ｆ及びクラスター１〜３は、ＨＰＬＣによって検出される異なるタイプのグリカンを指す。グリカンの主要なクラスはまた、着色された幾何学的記号で表される；
【図２７】対照及び３００ｐｐｍのＮＯを散布したバイオリアクターからのＩｇＧのグリカン構造の比較分析を示す。平均及び標準偏差を各サンプルについて示す（６日目及び８日目のサンプルについては、ｎ＝３；１０日目のサンプルについては、ｎ＝６）；
【図２８】ＣＤ１６ａ受容体を発現する細胞への抗体結合を、異なる濃度の抗体における蛍光標識細胞の百分率として示す；
【図２９】非常に高濃度の抗体に外挿された最大特異的結合を示す。平均値及び標準偏差を示し、培養８日目に収集した抗体については、ｎ＝３、１０日目に収集した抗体については、ｎ＝６である。Ｐ値は、片側ｔ検定を用いて計算した；
【図３０】対照リアクター（左）又はｐＨ５．８で３００ｐｐｍのＮＯを散布したリアクター（右）からのＩｇＧのイオン交換クロマトグラフィープロファイルを示す；
【図３１】バイオリアクター培養物への添加剤の気体添加又は化学的添加を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
試験した候補添加剤
以下の候補気体添加剤及び化学添加剤を、３Ｌ（２Ｌ作業容積）バイオリアクター内でバッチＣＨＯ細胞プロセスを使用してスクリーニングした。ＣＨＯ−ＨＢＳ細胞を、３〜３０×１０５細胞／ｍＬでベントされた平底三角フラスコ内のＣＤＭ４ＭＡｂ培地（ＨｙＣｌｏｎｅ  Ｌａｂａｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｌｏｇａｎ  Ｕｔａｈ；追加の０．５ｇ／Ｌポロキサマー１８８を補充した基本培地ｃａｔ＃  ＳＨ３０８０１．０２を含むカスタムパーツ）中で培養した。細胞を１４〜１６日間培養し、次いで、３〜４×１０５細胞／ｍＬで３Ｌセミバッチバイオリアクターに、２Ｌ作業容積で接種した。バイオリアクターシステムは、温度、ｐＨ、％ＣＯ２、％Ｏ２、散布速度、及び曝気速度をモニターし、制御した。バイオリアクターは、０．１ｖｖｍの散布速度、４０％  ＤＯ、及び７．１０のｐＨ値を維持した。ＣＯ２又は１Ｎ重炭酸ナトリウム溶液を添加することにより、ｐＨを制御した。さらに、１Ｍグルコースを添加し、３ｇ／Ｌ／日のグルコース消費速度を可能にするように毎日調整した。分析のために、各バイオリアクターを毎日サンプリングした（３〜４ｍＬ／日を除去）。気体添加剤は、以下の方法を用いてバイオリアクターに注入した：
・不活性ガス注入（キセノン）：バイオリアクターシステムは、各バイオリアクターに散布された酸素、二酸化炭素、空気、及び窒素の流量及び組成を制御した。混合物組成は、各リアクター内の溶存酸素及びｐＨレベルによって決定した。これらの４種のガスのハウスガスラインを濾過し、バイオリアクター質量流量制御システムに供給した。キセノンの効果は、窒素ハウスガスフィードをキセノンを含むシリンダーで置き換え、空気ガスフィードを各々２１％の酸素及び７９％のキセノンを含むシリンダーで置き換えることによって試験した。システムは、フィルム流量計を用いて各ガスのバイオリアクター質量流量コントローラー流量を１２ｓｌｐｈで測定し、次いでフィルム流量計及びバイオリアクターシステム上の流量が同じになるまでバイオリアクター窒素又は空気質量流量コントローラーのガス補正係数を調整することによって、置換ガスの流量を制御するために較正された。従って、キセノンは、実験中にガス流中の窒素を完全に置換し、その結果、２５〜７５％のキセノンがバイオリアクター内に散布された。これにより、ＣＨＯ細胞を最大量の不活性ガスで培養することができた。
・反応性ガス注入（一酸化窒素、一酸化炭素、又は水素）：バイオリアクターモジュールは、前述のように、酸素、空気、窒素、及び二酸化炭素ガスの組成及び流量を制御した。一酸化窒素、一酸化炭素、又は水素を含む反応性ガスを、ガス混合物がバイオリアクターに入る前に、Ｔ字管接続部を通してガス流に導入した。反応性ガス流速は、質量流量コントローラーを用いて制御し、バイオリアクター制御混合物の流速は、各リアクターへの全ガス流速を１２ｓｌｐｈに維持するように調整した。
【００３２】
キセノン及び水素（気体）
キセノン及び水素を用いた細胞培養散布の例示的な結果を、各々図２及び３に示す。観察された２つの主要なパラメーターは、生存細胞密度（ＶＣＤ）及び抗体力価であり、これらから細胞比生産性（ｑＰ）が得られる。これらの結果は、タンパク質生体分子産生又は細胞増殖に有意な影響を及ぼさない気体添加剤に典型的である。ＣＨＯ細胞培養に有意に影響を及ぼさなかった他の気体添加物には、アルゴン及びクリプトンが含まれた。
【００３３】
一酸化炭素（気体）
キセノン、アルゴン、クリプトン及び水素とは対照的に、一酸化炭素は、細胞増殖に顕著な影響を示した（図４）。散布ガス中の２．５％〜５％の一酸化炭素の閾値量を超えると、細胞増殖が影響を受けた。ＶＣＤは増殖期に抑制されるが、培養期間の終わりには、対照と比較してより高いＶＣＤを示す。経時的なＶＣＤの顕著な変化にもかかわらず、最終抗体力価はあまり影響を受けなかった。従って、計算されたｑＰは、対照よりも高かった。しかし、ｑＰに対するＶＣＤの正味の効果は、バイオリアクター内のバッチ細胞培養物において、全体的により低い収率を生じた。従って、一酸化炭素は、細胞によって産生されるタンパク質生体分子の量を増加させるように機能する添加剤であるが、培養物からの全体的な収率が低下する点まで細胞増殖を抑制するという望ましくない効果を有する。細胞培養バイオリアクターにおける一酸化炭素の効果を改善する１つの手段は、ｑＰ増加に対する増殖阻害効果の均衡を保つために、暴露期間を細胞培養増殖期の後期に始まるように制限することであろう。
【００３４】
後述する一酸化窒素（「ＮＯ」）とは対照的に、一酸化炭素（「ＣＯ」）に暴露された細胞は、ＨＯ−１のような酸化ストレス反応に関与する酵素の増加をもたらさなかった（図１）。この相違は、好ましい添加剤がＮＯであることを実証する。ＣＯはｑＰを増加させるが、ＨＯ−１の細胞保護誘導は欠如しており、全体のバッチ収率に関してＣＯの正の効果を打ち消すより低いＶＣＤをもたらす。ＣＯのさらなる利点は、他のＨＯ−１誘導補助添加剤の添加によって実現されるであろう。多くの化合物がＨＯ−１を誘導することが周知である。ＨＯ−１誘導化合物は、最先端の科学文献からの分子のクラスの既知の集合体である：
【００３５】
天然及び合成ＨＯ−１誘導化合物
ＨＯ誘導剤のサブクラスには、求電子性抗酸化化合物が含まれ、その多くは、ヒトの食餌中に見出される植物由来ポリフェノールである。これらの化合物は、Ｎｒｆ２系を活性化し、解毒関連タンパク質（例えば、ＨＯ−１、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼＡ２及びＮＡＤＰＨ：キノンオキシドレダクターゼ）をコードするいくつかのＮｒｆ２標的遺伝子の増強された発現をもたらす。２４７−２４８モデルシステムにおいてＨＯ−１を誘導できる天然化合物の中でも、植物由来化合物のクルクミン、１２−１４コーヒー酸フェネチルエステル、１３−１４レスベラトロール、１１ケルセチン、１５−１７没食子酸エピガロカテキン、１８−１９カルノソール、２４８スルフォラファン２４８及びその他が挙げられる。インビトロモデルシステムを用いてＨＯ−１を誘導する際のこれらの食事性化合物の有効性は、これらの化合物又は関連化合物が心血管疾患などのヒト状態のための医薬として使用され得るという仮説を導いた。２４９最近の研究は、ヒトにおける高用量経口クルクミン投与の有効性を評価した。２５０この研究は、吸収不良に起因して、経口クルクミンが投与後にヒト末梢血単核細胞においてＨＯ−１を誘導するのに効果がないと結論付けた。２５０ヒトにおいてＨＯ−１を誘導することができる安全で効果的な経口化合物を同定するためにさらなる研究が必要である。
【００３６】
食事性化合物に加えて、フマル酸ジメチル（ＤＭＦ）及び関連化合物を含む、Ｎｒｆ２／Ｋｅａｐ１軸を活性化することができるいくつかの医薬化合物が同定されている。２４８フマレートは、乾癬の治療に使用されているが、ＤＭＦは、多発性硬化症の第３相臨床試験において治療効果を示している。ＤＭＦの経口製剤（例えば、ＢＧ−１２、Ｔｅｃｆｉｄｅｒａ）は、米国、カナダ、ヨーロッパ及びオーストラリアにおいて多発性硬化症の治療における臨床使用が承認されている。２５１−２５２ＤＭＦ又はその下流代謝産物フマル酸モノメチルの作用機序は、Ｎｒｆ２安定化をもたらすＫｅａｐ１（Ｃｙｓ１５１）の重要なシステインチオール基の直接修飾を含む。２５３−２５４ＤＭＦは、ミクログリア細胞（ｍｉｃｒｏｇｌｉａ  ｃｅｌｌ）においてＨＯ−１の強力な誘導因子として作用し、この細胞タイプにおいて抗炎症作用を付えることができる。２４８ＤＭＦの適用は、慢性実験的自己免疫性脳脊髄炎のマウスモデルにおいて神経保護を与え、マクロファージ炎症を低減し、ＩＬ−１０産生を増加させることができる。２５３、２５５ＤＭＦはまた、ｐ２１のアップレギュレーションを含むＮｒｆ２依存性メカニズムにおいて、血管損傷のモデルにおいて内膜過形成を減少させた。Ｃｌｐ１．２５６ＤＭＦのようなＮｒｆ２誘導化合物の効果は、Ｎｒｆ２が多数のエフェクター酵素を調節するので、必ずしもＨＯ−１に特異的ではない。さらなる研究は、ヒト疾患の状況における酸化剤応答の安全且つ効果的な活性化のためのさらなるＮｒｆ２活性化化合物の開発につながり得る。
【００３７】
Ｒｙｔｅｒ，Ｓｔｅｆａｎ  Ｗ．，ａｎｄ  Ａｕｇｕｓｔｉｎｅ  ＭＫ  Ｃｈｏｉ．“Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｈｅｍｅ  ｏｘｙｇｅｎａｓｅ−１  ａｎｄ  ｃａｒｂｏｎ  ｍｏｎｏｘｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．”Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １６７．１（２０１６）：７−３４，ｐａｇｅｓ  １３−１４。細胞株はまた、構成的又は誘導性ＨＯ−１導入遺伝子で形質転換されて、添加剤としてのＣＯに応答して改善された収率を有する改変された細胞株を作製し得る。同書、１４ページ。
【００３８】
ＣＯのさらなる利点は、カスパーゼ−３阻害補助添加剤及び細胞内グルタチオン誘導補助添加剤の添加によっても実現される。多くの化合物はカスパーゼ−３を阻害することが周知である。カスパーゼ−３阻害化合物は、最先端の科学文献からの分子のクラスの公知の集合体である。例えばＥｋｅｒｔ，Ｐ．Ｇ．，Ｊ．Ｓｉｌｋｅ，ａｎｄ  Ｄ．Ｌ．Ｖａｕｘ．“Ｃａｓｐａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．”Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  ＆  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ６．１１（１９９９）；Ｋｅｏｎｉ，Ｃ．Ｌ．，＆  Ｂｒｏｗｎ，Ｔ．Ｌ．（２０１５）．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  Ｐａｎ  Ｃａｓｐａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ，ｉｎ  Ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ，８，１−７．ｈｔｔｐ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．４１３７／ＪＣＤ．Ｓ２３８４４を参照のこと。
【００３９】
一酸化窒素（気体）
一酸化窒素（ＮＯ）は、一般的に使用される哺乳動物細胞株、チャイニーズハムスター卵巣細胞などの真核細胞においてより高いｑＰを誘導するための別の添加剤である。図５〜７は、ＮＯ散布実験からの代表的な結果を示す。バッチ３Ｌバイオリアクター培養物において、種々の濃度のスクリーニングは、ガスフィード中の最適な気体ＮＯレベルが細胞培養物のＶＣＤプロファイルをシフトさせ、一酸化炭素と同様にｑＰを増大させることを実証した。しかしながら、ＮＯは、ＶＣＤ／ｑＰバランスが３Ｌバイオリアクターにおける実験バッチ培養物について、対照収率に対して１０％を超える、一般的には約２０％の正味培養収率増加を生じるという点で、この状況において、より良好な単一添加剤であることが示される。単一分子添加剤は、ＤｏＥ最適化の複雑さを低減すること、及び適用可能な規制承認のより高い実現可能性などの多くの理由のために好ましい。培養条件のさらなるＤｏＥ最適化（例えば、流加培養）は、全体的な抗体収率をさらに改善することが期待される。
【００４０】
一酸化窒素は、酸素ガスによる酸化に起因して、細胞培養培地又は散布ガス中でさえ安定ではない（図８）。従って、溶液中では、ＮＯを散布すると、化学物質の組み合わせが細胞培養培地中に送達される。
【００４１】
散布された細胞培養物
本発明者らは、細胞培養培地中の一酸化窒素及びその反応産物のレベルを、以下のように測定した：
ＮＯをＯ２、ＣＯ２及びＮ２と混合した後、バイオリアクターに送達する。この構成により、ＮＯはＯ２と反応し、ＮＯ２（２ＮＯ＋Ｏ２→２ＮＯ２）を生成した後、バイオリアクターに入ることができる。ＮＯ流速は、質量流量コントローラーで一定に維持されるが、Ｏ２流量は細胞による酸素要求量に従って変化し、バイオリアクターに入るＮＯ及びＮＯ２濃度の経時的な変動を生じる。
【００４２】
ＮＯ及びＮＯ２濃度を見積もるために、気体サンプルを入口管路から収集し、ＳＩＦＴ−ＭＳによって定量した。１２０〜２５０ｐｐｍの範囲のＮＯ濃度及び５０〜２００ｐｐｍの範囲のＮＯ２濃度が、試験中にバイオリアクターに送達されると結論付けられた。同様に、出口におけるＮＯ及びＮＯ２濃度を測定した。ＮＯは１２０〜２２０ｐｐｍの範囲である一方、ＮＯ２は５０〜１００ｐｐｍの範囲であることが見出された。
【００４３】
培養培地への窒素取り込みを特徴付けるために、亜硝酸塩又は硝酸塩の産生をモニターした。これらの２つの種は、４ＮＯ＋Ｏ２＋２Ｈ２Ｏ→４ＮＯ２−＋４Ｈ＋及び２ＮＯ２＋Ｈ２Ｏ→ＮＯ２−＋ＮＯ３−＋２Ｈ＋の反応に従って形成される。ＮＯ及びＮＯ２は、亜硝酸塩の式＝２３．１２×時間によって記述される、液状培地中で比較的線形の速度で移動した（図１１）。硝酸塩は５日目から検出され、培養終了時に１００ｍｇ／Ｌに近い値に達した。
【００４４】
培地中に溶解したＮＯの濃度を、間接的及び直接的の両方で測定した。生物システムにおけるその短い半減期に起因して、ＮＯ濃度は、一般に、亜硝酸塩及び硝酸塩に基づいて推定される。培地中のＮＯの直接測定を得るために、４つのバイオリアクターに３００、６００、９００又は１２００ｐｐｍのＮＯを２４時間散布した。培地中の亜硝酸塩濃度は、入口ガスの濃度と相関した。１２００ｐｐｍのＮＯを散布したリアクターでは、培地中で１２０ｎＭでＮＯが見出されたが、より低い流速では、ＮＯの濃度は、低ナノモル範囲であった。これらのデータは、３００ｐｐｍのＮＯを散布したバイオリアクターにおいて、細胞が低（０．１〜１０）ナノモル範囲のＮＯ濃度を経験することを示す。これらの値は、細胞応答について報告されている値よりも低い（Ｉｇｎａｒｒｏ，Ｌ．Ｊ．，１９９０．Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｏｆ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ．Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，３０（１），ｐｐ．５３５−５６０）。
【００４５】
振盪フラスコ内のＤＥＴＡ−ＮＯ
ポロキサマー−１８８を補充したＣＤＭ４ＭＡｂ培地中で細胞を増殖させた。フラスコを、３７℃及び５％  ＣＯ２の加湿インキュベーター中、１２５ｒｐｍで振盪機上でインキュベートした。ＤＥＴＡ−ＮＯを０．０１Ｍの水酸化ナトリウム溶液に０．２Ｍ濃度で溶解した。ＤＥＴＡ−ＮＯ溶液のアリコートを細胞培養物に毎日添加して、最終濃度０．０９、０．１８又は０．３６ｍＭ  ＤＥＴＡ−ＮＯに到達させた。水酸化ナトリウム溶液（０．０１Ｍ）を陰性対照として毎日添加した。０．０１〜１．０ｍＭ  ＤＥＴＡ−ＮＯは、低いｎＭ／ｓｅｃ範囲の速度でＮＯを放出する（Ｂｏｕｔｏｎ，Ｃ．ａｎｄ  Ｄｅｍｐｌｅ，Ｂ．，２０００．Ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｍｅ  ｏｘｙｇｅｎａｓｅ−１  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍＲＮＡ  ａｎｄ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｄｉｒｅｃｔ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７５（４２），ｐｐ．３２６８８−３２６９３）。
【００４６】
培地中の気体ＮＯからの３つの一次誘導体は、二酸化窒素、硝酸塩及び亜硝酸塩である（図８）。従って、本発明者らは、ＮＯ散布細胞培養物中のこれらの化学種の計算された濃度に基づいて、これらの各々を候補添加剤として試験した。
【００４７】
硝酸ナトリウム（溶解）：硝酸は、ＶＣＤ又は抗体力価に影響を及ぼさない（図９及び１０）。
【００４８】
亜硝酸ナトリウム（溶解）：亜硝酸塩は、培養後期にＶＣＤにせいぜいわずかな影響しか及ぼさず、抗体力価に有意な影響を及ぼさない（図１１〜１３）。一酸化窒素とは対照的に、亜硝酸塩は、陽性対照として一酸化窒素生成化学物質ＤＥＴＡ−ＮＯを使用する振盪フラスコ内の相対発現レベルに基づいて、ＨＯ−１などの酸化ストレス応答の遺伝子を活性化しない（図１４）。
【００４９】
二酸化窒素（気体）：一酸化窒素ガスを散布した細胞培養によって経験されるような匹敵する培地濃度を産生するように適合された二酸化窒素は、培養タイムラインを通してＶＣＤ及び抗体力価に対して強い負の効果を有する（図１５）。
【００５０】
二酸化窒素、硝酸塩、及び亜硝酸塩を用いたこれらの実験に基づいて、細胞培養培地のＮＯガス散布で見られたＶＣＤ及びｑＰ効果のための活性分子は、ＮＯ分子自体である。
【００５１】
一酸化窒素遺伝子発現プロファイリング
ＲＮＡ−ｓｅｑを用いて遺伝子発現プロファイルを捕捉した。Ｃｏｎｅｓａ  Ａ，Ｍａｄｒｉｇａｌ  Ｐ，Ｔａｒａｚｏｎａ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  ｂｅｓｔ  ｐｒａｃｔｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ＲＮＡ−ｓｅｑ  ｄａｔａ  ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．２０１６；１７：１３．ｄｏｉ：１０．１１８６／ｓ１３０５９−０１６−０８８１−８。ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）で抽出し、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて２６０ｎｍでの吸光度によって定量した。ＲＮＡ品質は、ＲＮＡ  ６０００  Ｎａｎｏ  Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ）及びＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて評価した。ＲＮＡを断片化し、市販のキット（ＴｒｕＳｅｑ  ＲＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ  ｖ２、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いてライブラリーを調製した。デラウェア大学のＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＆  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ＣｅｎｔｅｒのＨｉＳｅｑ  ２５００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）でＲＮＡをシークエンシングした。データは、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ、デラウェア大学のＣｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙで分析した。ＣＨＯ  ＤＧ４４株の特異的ゲノム配列は入手できなかったので、チャイニーズハムスターゲノム概要配列を参照として使用した。差次的発現（偽発見率＜０．００１）を有する遺伝子を、ＤＡＶＩＤ  ６．８（ｈｔｔｐｓ：／／ｄａｖｉｄ．ｎｃｉｆｃｒｆ．ｇｏｖ／）、ＳＴＲＩＮＧ  １０．０（ｈｔｔｐ：／／ｓｔｒｉｎｇ−ｄｂ．ｏｒｇ／）及びｉＰｒｏＸｐｒｅｓｓ（ｈｔｔｐ：／／ｐｉｒ．ｇｅｏｒｇｅｔｏｗｎ．ｅｄｕ／ｉｐｒｏｘｐｒｅｓｓ２／）を用いてさらに分析した。
【００５２】
３Ｌ細胞培養物の１日目、３日目及び５日目の細胞の例示的な転写プロファイルを、対照培養物と気体ＮＯ処理培養物との間で作製して、差次的遺伝子発現分析を行った（図１６）。差次的に発現される遺伝子は、ヘムオキシゲナーゼ１（「ＨＯ−１」）を含む酸化ストレス応答に関連する（図１７）。
【００５３】
ＮＯは細胞内分子を酸化し、それによって細胞内の抗酸化剤レベルを変化させ、膜機能不全、ＤＮＡ損傷、及びタンパク質の不活性化を潜在的にもたらす酸化ストレスをもたらすことができる。グルタチオン関連代謝は、酸化ストレスを生じる薬剤に対する細胞保護のための主要なメカニズムである。グルタチオンは、いくつかの異なるレベルで解毒に関与し、フリーラジカルを捕捉するか、過酸化物を還元するか、又は求電子化合物と結合することができる。遺伝子発現プロファイルは、ＮＯがグルタチオン関連酵素（Ｓ−トランスフェラーゼタンパク質、カタラーゼ、及び酸化抵抗性遺伝子）の発現を刺激することを示す（図１７）。さらに、ＮＯは、酸化ストレスによって誘導されるアポトーシス細胞死から細胞を保護するヘム−オキシゲナーゼ１の発現を誘導する。
【００５４】
ＨＯ−１及び種々のグルタチオン関連遺伝子の差次的転写は、ウェスタンブロット分析によって翻訳及びタンパク質レベルの増加と相関することが確認された（図１８〜１９）。発現及び翻訳は、対照とＮＯ処理３Ｌ細胞培養物との間のＶＣＤの分岐のタイミングに先行する。
【００５５】
生存率のＮＯ特異的延長は、カスパーゼ−３活性の減少と相関する（図２０）。同数の生存細胞を含むサンプルを用いて、ＥｎｚＣｈｅｃｋ  Ｃａｓｐａｓｅ−３  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ  ＃１（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、カスパーゼ−３活性をモニターした。全てのカスパーゼプロテアーゼは、活性に必須である酵素触媒部位に単一のシステインを含有する。チオールは酸化還元修飾に感受性であり、ＮＯの存在下で効率的にニトロシル化され得、カスパーゼ活性の減少を導く（Ｌｉ，Ｊ．，Ｂｉｌｌｉａｒ，Ｔ．Ｒ．，Ｔａｌａｎｉａｎ，Ｒ．Ｖ．ａｎｄ  Ｋｉｍ，Ｙ．Ｍ．，１９９７．Ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｓｅｖｅｎ  ｍｅｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃａｓｐａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｖｉａ  Ｓ−ｎｉｔｒｏｓｙｌａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２４０（２），ｐｐ．４１９−４２４）。従って、観察されたより低いカスパーゼ−３活性は、ニトロシルチオールの形成による触媒システイン残基の特異的遮断によるものであり得る。アポトーシスの阻害はまた、カスパーゼ−３について実証されているプロ酵素（不活性型）からの限定されたカスパーゼプロセシングと適合し得る（Ｍａｎｎｉｃｋ，Ｊ．Ｂ．，Ｈａｕｓｌａｄｅｎ，Ａ．，Ｌｉｕ，Ｌ．，Ｈｅｓｓ，Ｄ．Ｔ．，Ｚｅｎｇ，Ｍ．，Ｍｉａｏ，Ｑ．Ｘ．，Ｋａｎｅ，Ｌ．Ｓ．，Ｇｏｗ，Ａ．Ｊ．ａｎｄ  Ｓｔａｍｌｅｒ，Ｊ．Ｓ．，１９９９．Ｆａｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃａｓｐａｓｅ  ｄｅｎｉｔｒｏｓｙｌａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８４（５４１４），ｐｐ．６５１−６５４）。
【００５６】
一酸化窒素（化学物質）
気体ＮＯの効果は、振盪フラスコ内の細胞培養物にＮＯ放出化合物ＤＥＴＡ−ＮＯを毎日添加することによって部分的に再現された。細胞増殖及び生存率は、気体ＮＯと同様に、ＤＥＴＡ−ＮＯの添加で同様の傾向に従った。いずれの場合も、生存細胞数は、定常期では低かったが、培養後期では対照培養と比較して増加した。気体ＮＯに関しては、試験した高濃度のＤＥＴＡ−ＮＯとのインキュベーションも細胞死の増加をもたらした（図２１〜２２）。より低い試験用量のＤＥＴＡ−ＮＯとのインキュベーションも、ＨＯ−１アップレギュレーションで実証されたように、酸化ストレス反応を活性化した（図２３）。
【００５７】
試験した細胞及び生体分子
ＣＨＯ  ＨＢｓＡｂ  −  ＨＢＳ抗体産生ＣＨＯ（ＣＨＯ−ＨＢＳ）組換え細胞株をＫｏｒｅａ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙのＧ．Ｍ．Ｌｅｅ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手した。Ｋｉｍ，Ｓ．Ｊ．，Ｋｉｍ，Ｎ．Ｓ．，Ｒｙｕ，Ｃ．Ｊ，Ｈｏｎｇ，Ｈ．Ｊ，Ｌｅｅ，Ｇ．Ｍ．１９９８．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ＣＨＯ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｏｆ  Ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｇｅｎｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ａｂｓｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｐｒｅｓｓｕｒｅ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．５８，Ｎｏ．１，Ａｐｒｉｌ  ５，１９９８．Ｐａｇｅ  ７３−８４。
【００５８】
ＣＨＯ  ＥＰＯ  −  エリスロポエチン（ＥＰＯ）産生ＣＨＯ（ＣＨＯ−ＥＰＯ）組換え細胞株を、Ｋｏｒｅａ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙのＧ．Ｍ．Ｌｅｅ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手した。これは、ＥＰＯ産生のために改変されたＣＨＯ  ＨＢｓＡｂと同じ細胞株である。
【００５９】
ＣＨＯ−ＥＰＯ予言的実施例：
ＣＨＯ−ＥＰＯ細胞を、ＣＨＯ−ＨＢＳ実験と同様の条件下で３Ｌ細胞培養バイオリアクター内で培養し、標準条件を最適化して、比較対照としてのベースライン細胞培養力価を達成する。一酸化窒素ガスを評価して、ＶＣＤ及びＥＰＯの全体的な培養力価／収率に基づいて最適なガス濃度を同定する。ＣＨＯ−ＥＰＯ細胞は一酸化窒素に応答して、対照結果と比較してＥＰＯの収率を増加させる。
【００６０】
生体分子の完全性
抗体アセンブリ
還元剤の非存在下では、ＩｇＧのプールは、３つの構造：完全に組み立てられたＩｇＧ、１つの軽鎖を欠くＩｇＧ、及び２つの軽鎖を欠くＩｇＧからなる。３つの構造の割合の変化は、産生プロセス及びＩｇＧ分子の固有の特性に依存する。ＮＯは、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりＩｇＧ構造全体に影響を及ぼさないようであった（図２４）。還元剤の存在下では、３つの構造は、各々重鎖及び軽鎖に対応する約５２及び２６ｋＤａの２つの形態に崩壊した。対照と比較して、ＮＯ散布したリアクター内で産生された抗体間で大きな差異は検出されなかった。２５ｋＤａの見かけの分子量を有する副生成物を１０日目に検出した。軽鎖の分解産物であると思われるこれらの種は、ＮＯベースのプロセスから独立したＨＢＳ抗体の固有の特徴であると思われた。
【００６１】
抗原への結合
抗原に対する親和性は、Ｏｃｔｅｔ装置（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を用いて測定した。抗ＨＢＳ抗体は、最初に報告されたものに近い親和性値を示した。Ｒｙｕ，Ｃ．Ｊ．，Ｇｒｉｐｏｎ，Ｐ．，Ｐａｒｋ，Ｈ．Ｒ．，Ｐａｒｋ，Ｓ．Ｓ．，Ｋｉｍ，Ｙ．Ｋ．，Ｇｕｇｕｅｎ−Ｇｕｉｌｌｏｕｚｏ，Ｃ．，Ｙｏｏ，Ｏ．Ｊ．ａｎｄ  Ｈｏｎｇ，Ｈ．Ｊ．，１９９７。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ  ｂｙ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｈｅ  ｖｉｒａｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２（２），ｐｐ．２２６−２３３。３００ｐｐｍのＮＯを散布したリアクターから精製したＩｇＧは、抗原への結合の変化を示さなかった（表１）。ＮＯ処理リアクターから得られたサンプルは、対照培養物と比較して、１０日目に低いｋＯＦＦ及びＫＤ値を有したが、これらの差異は、統計的に有意ではなかった。解離定数は、８日目及び１０日目の両方のＩｇＧ生成物について、低いナノモル値であった。
【００６２】
【表１】
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【００６３】
安定性
ＩｇＧを、移動相としてリン酸緩衝生理食塩水を使用するＡｄｖａｎｃｅ  ＢｉｏＳＥＣ  ３００オングストロームカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いたサイズ排除液体クロマトグラフィーにより、それらの見かけの分子量に従って分離した。分離の質は、タンパク質標準（Ａｄｖａｎｃｅ  ＳＥＣ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔａｎｄａｒｄｓ、Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて評価した。ＩｇＧ単量体は、主要な種であると思われる。１つ又は２つの軽鎖を欠く不完全な抗体が見出された。二量体及び可溶性凝集体もまた、より低いレベルで検出された。対照リアクター及びＮＯ散布リアクターの両方において、凝集体及び不完全抗体のレベルは、同様の様式で培養時間にわたって増加するようである。
【００６４】
二量体及び凝集体に対応するピークは、ＮＯ処理ＩｇＧ及び対照ＩｇＧについて、培養１０日目に同等であった（図２５）。唯一の顕著な相違は、ＮＯを散布したリアクターからの抗体調製物中のＩｇＧ単量体に対応するピークの広がりである。この現象は、５日目に収集されたＩｇＧにおいて見られ、時間と共に増加するように見えた。
【００６５】
グリコシル化分析
グリカンを精製ＩｇＧから酵素的に放出させ、蛍光色素で標識し、親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＧｌｙｃｏＷｏｒｋｓ  ＲａｐｉＦｌｕｏｒ−ＭＳ  Ｎ−Ｇｌｙｃａｎ  Ｋｉｔ、Ｗａｔｅｒｓ）によって分離した。ＣＨＯ−ＨＢＳ細胞から精製されたＩｇＧのグリカンは、ＣＨＯ細胞内で発現されるタンパク質に関する文献で報告されている典型的なパターンと一致した。高い割合のＧ０Ｆ構造、続いてＧ１Ｆ及びＧ２Ｆを有するグリカンの不均一な集団が観察された（図２６）。
【００６６】
６、８及び１０日目に検出された主要なグリカン形態は、ＮＯ処理培養物及び対照の両方において、アガラクトシル化Ｇ０Ｆ形態、続いてモノガラクトシル化形態Ｇ１Ｆであった（図２７）。３００ｐｐｍ  ＮＯでＣＨＯ−ＨＢＳ細胞を処理した結果、フコシル化グリカンは、わずかに減少した。
【００６７】
Ｆｃ受容体への結合
ビオチン化Ｆｃ受容体（ＣＤ１６ａ、ＣＤ３２ａ又はＣＤ６４）に対する抗体の会合及び解離速度を、Ｏｃｔｅｔ機器（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）で測定した。ＩｇＧ／Ｆｃ受容体について得られたＫＤ値は、予想の範囲内であった（Ｇｉｌｌｉｓ，Ｃ．，Ｇｏｕｅｌ−Ｃｈｅｒｏｎ，Ａ．，Ｊｏｅｎｓｓｏｎ，Ｆ．ａｎｄ  Ｂｒｕｈｎｓ，Ｐ．，２０１４．Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＦｃγＲｓ  ｔｏ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｗｉｔｈ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ａｎｉｍａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，５，ｐ．２５４）。ＣＤ３２ａ及びＣＤ１６ａは、μＭ範囲で低〜中程度の結合速度を示したが、ＣＤ６４は高い親和性を有し、ＫＤ値はナノモル範囲であった（表２）。ＮＯで処理した細胞から得られた抗体は、対照と比較して、ＣＤ３２ａ及びＣＤ６４への区別できない結合、並びにヒトＣＤ１６ａへの増加した親和性を示した。
【００６８】
【表２】
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【００６９】
より生理学的な設定における親和性に関する情報を得るために、ＣＤ１６ａ受容体を発現するＣＨＯ細胞をＨＢＳ  ＩｇＧと共にインキュベートし、フローサイトメトリー用に処理した（Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ａ．，Ｌｉｕ，Ｚ．，Ｍａｋｗｅｃｈｅ，Ｓ．，Ｍａｓｋｅｌｌ，Ｋ．，Ｑｉ，Ｈ．ａｎｄ  Ｈａｌｅ，Ｇ．，２０１２．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｔｏ  ｍｅａｓｕｒｅ  ｔｈｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  Ｆｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）ｕｓｉｎｇ  ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ｋｉｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ，６３，ｐｐ．２３−２８）。蛍光細胞（陽性細胞）の数は、Ｆｃ受容体によって結合されたＩｇＧの量に比例する。ＮＯを散布したバイオリアクターから得られた抗体は、対照抗体と比較して、ＣＤ１６ａ受容体を発現する細胞へのより強い結合を示した（図２８及び２９）。１つの可能性は、観察されたフコシル化の減少がこの表現型を決定することである。アフコシル化抗体は、ＣＤ１６ａ受容体に対してより高い親和性を有することが知られている。
【００７０】
電荷分布の解析
抗体のイオン交換クロマトグラフィーを使用して、アスパラギン脱アミド化、アスパラギン酸異性化、ジスルフィド交換、ペプチド結合切断、及び酸化から生じる形態をモニターする。弱い正電荷を含有する固定相（ＢｉｏＭＡｂ  ＰＥＥＫ、Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用するイオン交換クロマトグラフィーによってＩｇＧを分離した。クロマトグラフィーは、塩勾配を増加させながらｐＨ５．８又はｐＨ７．０の水性緩衝液を用いて行った。対照と比較すると、ＮＯを散布したリアクター由来のＩｇＧのクロマトグラムは、異なったプロファイル（テイル）を有しているように見え、抗体表面上の正味電荷の変化を示唆した。イオン交換クロマトグラフィーをｐＨ５．８で実施した場合、ＩｇＧの正味電荷の変化は、より顕著であった（図３０）。
【００７１】
試験した細胞培養形式
３Ｌバイオリアクターバッチ培養形式は、上記に記載されている。一酸化窒素のさらなる試験は、流加培養を用いて行われる。バッチ培養とは異なる流加バッチ形式及びパラメーターは、３５ｇ／Ｌの市販のＣｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ５供給溶液１５０ｍＬの毎日の添加と、グルコース及びグルタミンの各々４ｇ／Ｌ及び２．２ｍＭの設定値への毎日の調整である。
【００７２】
流加バッチの予言的実施例：
ＣＨＯ−ＨＢＳ流加バッチ細胞培養は、細胞培養が上記の改変を用いて以前に行われたように行われる。一酸化窒素は、先の細胞培養実験で見られた結果と同様に、対照培養物よりも力価の相対的増加を誘導する。
【００７３】
上記のように、３Ｌバイオリアクター内の一酸化窒素を使用した結果は、振盪フラスコ内で部分的に再現された。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
本発明は、モノクローナル抗体などの治療用生物製剤の製造に少なくとも工業的に適用可能である。
【００７５】
本発明は、その特定の実施形態に関連して説明されてきたが、多くの代替、修正、及び変形が前述の説明に照らして当業者には明らかなことは明白である。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲の趣旨及び広い範囲内に入る、全てのそのような代替、修正、及び変形を包含することが意図される。本発明は、開示された要素を適切に含み、それらからなり、又は本質的にそれらからなり、開示されていない要素の非存在下で実施することができる。さらに、第１及び第２のような順序を参照する言語がある場合、例示的な意味で理解されるべきであり、限定的な意味ではない。例えば、当業者は、特定の工程を単一工程に組み合わせることができることを認識することができる。
【００７６】
単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうではないと指示しない限り、複数の指示対象を含む。
【００７７】
特許請求の範囲における「含む」は、その後に特定されるクレーム要素が非排他的なリストであることを意味する開放された移行用語である（即ち、他のものが追加的に含まれ、「含む」の範囲内に留まる）。本明細書で使用される「含む」は、本明細書で別段の指示がない限り、「から本質的になる」及び「からなる」というより限定された移行用語によって置き換えられてもよい。
【００７８】
特許請求の範囲における「提供する」は、何かを装備し、供給し、利用可能にし、又は準備することを意味すると定義される。この工程は、反対に、クレーム中に明示的な言語が存在しない場合には、どの行為者によっても実行することができる。
【００７９】
場合による、又は場合によりは、後述する事象又は状況が発生する可能性がある、又は発生しない可能性があることを意味する。説明は、事象又は状況が発生する場合と、それが発生しない場合とを含む。
【００８０】
範囲は、本明細書では、ほぼ１つの特定の値から、及び／又はほぼ別の特定の値までとして表すことができる。そのような範囲が表現される場合、別の実施形態は、１つの特定の値から、及び／又は他の特定の値まで、並びに前記範囲内の全ての組み合わせであることを理解するべきである。
【００８１】
本明細書で特定される全ての参考文献は、各々、それらの全体において、並びにそのために各々が引用される特定の情報について、参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
2020532310.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【国際調査報告】
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