(57)【要約】  本開示は、ＰＥＧ部分に直線的に結合されて多量体を形成する単量体結合ペプチドの多量体形態である式（Ｉ）の化合物に関する。当該多量体形態は、血管新生を刺激し、創傷治癒を促進する。また本開示は、局所投与または全身投与に好適な組成物を含む、上記多量体を含む医薬組成物も含む。【選択図】図１Ｂ
2020506223.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
【化１】
2020506223.tif 000020
［式中、
ｎは約２５〜約１００の整数であり、
各Ｘは独立してまたは同時に（Ｃ１−Ｃ２０）アルキレンまたは（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニレンであり、その各々は所望により１個以上のハロ、アミノ、ヒドロキシ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ６−Ｃ１０）アリールまたは（Ｃ５−Ｃ１０）ヘテロアリールにより置換され；
各Ｙは独立してまたは同時に（Ｃ１−Ｃ２０）アルキレンまたは（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニレンであり、その各々は所望により１個以上のハロ、アミノ、ヒドロキシ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ６−Ｃ１０）アリールまたは（Ｃ５−Ｃ１０）ヘテロアリールにより置換され；および
ＲはＴ７ペプチド（配列番号１）、ＧＡ３ペプチド（配列番号２）、Ｔ４ペプチド（配列番号３）、Ｔ６ペプチド（配列番号４）またはＴ８ペプチド（配列番号５）である］
の化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項２】
Ｔｉｅ２リン酸化を刺激する、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
ＭＡＰＫ、ＡＫＴおよびｅＮＯＳのリン酸化を刺激する、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
対象の創傷に局所的に適用された場合に前記対象において創傷治癒を刺激する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
ＲがＴ７ペプチド（配列番号１）である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
ｎが約４０〜約７０の整数である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
ｎが約４８〜約６５の整数である、請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
ｎが約５５である、請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
Ｘが独立してまたは同時に、（Ｃ１−Ｃ６）アルキレンまたは（Ｃ２−Ｃ６）アルケニレンである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｙが独立してまたは同時に、（Ｃ１−Ｃ６）アルキレンまたは（Ｃ２−Ｃ６）アルケニレンである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｙがチオグリコール酸、２−メルカプトプロピオン酸、４−メルカプトブタン酸、６−メルカプトヘキサン酸、８−メルカプトオクタン酸、１１−メルカプトウンデカン酸、１２−メルカプトドデカン酸、または１６−メルカプトヘキサデカン酸から誘導される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１２】
式（Ｉ）の化合物が
【化２】
2020506223.tif 000021
［式中、
ｎは約５０〜６０の間の整数または約５５であり；かつ
ＲはＨｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ（配列番号１）である］
またはその薬学的に許容される塩である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の化合物および薬理学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１４】
前記薬理学的に許容される担体が局所投与に好適である、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記薬理学的に許容される担体が全身投与に好適である、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
（ｉ）Ｔ７ペプチド（配列番号１）、ＧＡ３ペプチド（配列番号２）、Ｔ４ペプチド（配列番号３）、Ｔ６ペプチド（配列番号４）および／またはＴ８ペプチド（配列番号５）またはこれらのレトロインベルソペプチドであるペプチドを、式（ＩＩ）
【化３】
2020506223.tif 000022
のチオール化合物と反応させて式（ＩＩＩ）
【化４】
2020506223.tif 000023
の化合物またはその塩を得ること；
（ｉｉ）式（ＩＩＩ）の化合物を式（ＩＶ）
【化５】
2020506223.tif 000024
のＰＥＧ四量体と反応させて請求項１〜１２のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容される塩を得ること；
（ここで変数ｎ、ＸおよびＹは請求項１に記載のようであり、ＬＧは好適な脱離基でありかつＰＧはＨまたは好適な保護基である）
を含む、式（Ｉ）の化合物を製造する方法。
【請求項１７】
前記好適な脱離基がハロ、トシラートまたはメシラートである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ハロがブロモである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
好適な保護基がトリチルである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
その必要がある対象においてＴｉｅ２受容体を接触させるおよび活性化するための請求項１〜１２のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【請求項２１】
前記Ｔｉｅ２受容体の活性化が前記Ｔｉｅ２受容体のチロシン残基のリン酸化によって証明される、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
前記Ｔｉｅ２受容体の活性化がＭＡＰＫ、ＡＫＴまたはｅＮＯＳのリン酸化によって証明される、請求項２０に記載の使用。
【請求項２３】
その必要がある対象における部位で血管新生を刺激するための請求項１〜１２のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【請求項２４】
前記化合物が局所投与用に製剤化される、請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
前記化合物が全身投与用に製剤化される、請求項２３に記載の使用。
【請求項２６】
前記化合物によって刺激される血管新生が以下の特性：
ａ）血管周囲支持細胞のリクルートメント；
ｂ）さもなければ漏出性であろう血管の非漏出性；
ｃ）明瞭な分枝；および
ｄ）内皮細胞アポトーシスの阻害
の少なくとも１つにより特徴付けられる、請求項２３に記載の使用。
【請求項２７】
第２の血管新生剤の使用を更に含む、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２８】
前記第２の血管新生剤がＶＥＧＦである、請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
前記第２の血管新生剤がＰＤＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、組換えヒトエリスロポイエチン、ｂＦＧＦ、Ａｎｇ２阻害剤および胎盤増殖因子（ＰＬＧＦ）からなる群から選択される、請求項２７に記載の使用。
【請求項３０】
血管新生が再生組織の血管新生、虚血肢疾患、脳虚血、血管炎症状態、動脈硬化、虚血壊死、発毛刺激および勃起不全からなる群から選択される臨床的状況において刺激される、請求項２３〜２９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３１】
その必要がある対象における漏出性血管の部位で血管透過性を減少させるための請求項１〜１２のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【請求項３２】
血管透過性が脳卒中、黄斑部変性、黄斑浮腫、リンパ浮腫、血液網膜関門の破壊、血液脳関門の破壊、細菌により誘発された血管漏出および腫瘍血管系の正常化からなる群から選択される臨床的状況において減少される、請求項３１に記載の使用。
【請求項３３】
その必要がある対象において内皮細胞を保護するための請求項１〜１２のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【請求項３４】
内皮細胞が急性腎臓損傷などの腎臓損傷、腎臓線維症、脳卒中、黄斑部変性、血管性認知症および糖尿病合併症からなる群から選択される臨床的状況において保護される、請求項３３に記載の使用。
【請求項３５】
前記内皮細胞が肺損傷の臨床的状況において保護される、請求項３３に記載の使用。
【請求項３６】
その必要がある対象において創傷の治癒を刺激するための請求項１〜１２のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【請求項３７】
前記化合物が局所投与用に製剤化される、請求項３６に記載の使用。
【請求項３８】
前記化合物が全身投与用に製剤化される、請求項３６に記載の使用。
【請求項３９】
前記創傷が糖尿病性潰瘍である、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４０】
前記創傷が褥瘡性潰瘍、圧迫潰瘍、外科切開、外傷性組織損傷、火傷および皮膚移植部位からなる群より選択される、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４１】
その必要がある対象においてＣＦＵ−Ｇ細胞の増殖を阻害するための請求項１〜１２のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【請求項４２】
その必要がある対象において好酸球および／または好塩基球を減少させるための、請求項４１に記載の使用。
【請求項４３】
アトピー性皮膚炎、喘息またはアレルギー性鼻炎を処置するための、請求項４１または４２に記載の使用。
【請求項４４】
アトピー性皮膚炎を処置するための請求項４３に記載の使用。
【請求項４５】
その必要がある対象において好酸球および／または好塩基球に関連する病状を処置するための請求項４１に記載の使用。
【請求項４６】
前記好酸球および／または好塩基球に関連する病状が好酸球および／または好塩基球起源の白血病である、請求項４５に記載の使用。
【請求項４７】
前記好酸球および／または好塩基球に関連する病状が炎症性腸疾患である、請求項４５に記載の使用。
【請求項４８】
好酸球および／または好塩基球に関連する病状が寄生虫感染である、請求項４５に記載の使用。
【請求項４９】
エオタキシン、ＩＬ−１７、ＭＩＧ、ＩＬ１２／ＩＬ２３（ｐ４０）、ＩＬ−９、ＭＩＰ−１ａ、ＭＩＰ−１ｂ、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、およびＭＣＰ−１の少なくとも１つを含む炎症性サイトカインおよび／またはケモカインのレベルを低減するための、請求項４１に記載の使用。
【請求項５０】
前記炎症性サイトカインおよび／またはケモカインがエオタキシンを含む、請求項４９に記載の使用。
【請求項５１】
薬剤が局所的に、全身的に、鼻腔内にまたは吸入によって使用される、請求項４１〜５０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５２】
前記対象がヒトである、請求項２３〜５１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５３】
インフルエンザに感染したまたはインフルエンザに関連する細菌重複感染を有する動物を処置するための請求項１〜１２のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【請求項５４】
抗ウイルス剤の同時使用または順次使用を更に含む、請求項５３に記載の使用。
【請求項５５】
前記抗ウイルス剤がアマンタジン、リマンタジン、ザナミビル、ペラミビル、ビラミジン、リバビリンまたはオセルタミビルである、請求項５４に記載の使用。
【請求項５６】
前記動物がヒトでありかつ前記インフルエンザがヒトインフルエンザである、請求項５３〜５５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５７】
（ａ）請求項１〜１２のいずれか一項に記載の化合物および（ｂ）抗ウイルス剤を含む組成物。
【請求項５８】
インフルエンザに感染した動物または細胞を処置するためのおよび／またはインフルエンザに感染した細胞または動物において細菌重複感染を処置するためのキットであって、（ａ）請求項１〜１２のいずれか一項に記載の化合物、（ｂ）抗ウイルス剤および（ｃ）前記キットを使用するための使用説明書を含む、キット。
【請求項５９】
前記抗ウイルス剤がアマンタジン、リマンタジン、ザナミビル、ペラミビル、ビラミジン、リバビリンまたはオセルタミビルである、請求項５７または５８に記載の組成物またはキット。
【請求項６０】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の化合物が組み込まれる生体材料。
【請求項６１】
マトリゲル、代用皮膚および架橋グリコサミノグリカンヒドロゲルからなる群より選択される、請求項６０に記載の生体材料。
【請求項６２】
ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、組換えヒトエリスロポイエチン、ｂＦＧＦ、Ａｎｇ２阻害剤、および胎盤増殖因子（ＰＬＧＦ）からなる群より選択される第２の薬剤が組み込まれる、請求項６０または６１に記載の生体材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本非仮出願は、２０１７年１月１３日に出願の米国仮出願第６２／４４６，０３０号の優先権を主張し、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、バスキュロチド（ｖａｓｃｕｌｏｔｉｄｅ）と比較して改善された活性を有する薬剤、ならびにその方法および使用に関する。特に、本開示は、血管新生を刺激して糖尿病性創傷治癒および他の心血管適応症を処置するための、アレルギー疾患、喘息およびアトピー性皮膚炎を処置するための、およびインフルエンザを処置するための使用および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
いくつかの重要な分子プレイヤーが、血管恒常性の維持を調節すると同定されてきた。これらの内で最もよく知られているものの１つは、Ｔｉｅ２／アンギオポエチン（Ａｎｇ）シグナル伝達系である。この受容体型チロシンキナーゼ（Ｔｉｅ２）およびタンパク質増殖因子（Ａｎｇ）によるシステムは、２つの主な増殖因子Ａｎｇ１およびＡｎｇ２が血管内皮上に存在する同一の受容体を介してそれぞれ抗炎症応答または炎症誘発性応答を増加させるという点で、幾分独特である。ほとんどの受容体型チロシンキナーゼとは異なり、Ｔｉｅ２は正常で健常な内皮細胞において、Ａｎｇ１の作用を介して構成的に活性状態に維持される。この受容体は増殖および内皮細胞生存（ＭＡＰＫおよびＡＫＴ）、透過性（ＶＥ−カドヘリン）および細胞間相互作用（ＩＣＡＭおよびＶＣＡＭ）を調節する多数の細胞内経路を活性化すると見出されており、当該細胞内経路の全ては正常な生理機能において協調して機能して内皮細胞の静止状態を維持する。Ｔｉｅ２受容体のリン酸化によって特徴付けられるこの経路の活性化は、トランスドミナントシグナルとして機能し、ＶＥＧＦ、セロトニン、ブラジキニン、ヒスタミン、ＰＡＦ、トロンビン、ＬＰＳ、敗血症血清および炭疽毒素を含む種々の炎症性因子への曝露後の血管漏出の誘発に対抗する（Ｐａｒｉｋｈ  ＳＭ，Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ２０１３）。Ａｎｇ２レベルの急激な上昇は、多数の異なる傷害後の血管漏出、病的状態および死亡率をもたらすことが繰り返し示されている。研究は、Ａｎｇ１とＡｎｇ２の循環レベルの間のバランスが血管活性化の優位な根本的状態を定めることを実証した。この事実のため、この経路を調節することを目的とする手法は、治療適用を有し得る。
【０００４】
Ａｎｇｓの複雑な性質は、これまで精製および治療適用を妨げてきた。したがって、この経路を調節する代替的手法が広範囲に検討されてきた。２つの主な手法がこれまで説明されている。第１の、かつはるかにより一般的な手法は、拮抗リガンドであるＡｎｇ２を遮断することに焦点を合わせている。このクラスの治療薬は大まかに、Ａｎｇ２に対する遮断抗体またはペプチボディとして定義できる。第２のクラスのＴｉｅ２を標的とするモジュレーターは、Ａｎｇ１の解明された構造的特徴を取り入れている。すなわち、生物活性Ａｎｇ１は、少なくとも４つのサブユニットの多量体として天然に存在する。Ａｎｇ１サブユニットは、Ｔｉｅ２受容体に結合し、その際に隣接する受容体をクラスター化し、リン酸基転移を促進する配置に受容体を効率的に並置すると仮定される。Ｔｉｅ２受容体に対するＡｎｇ１のアゴニスト作用を模倣するために、隣接する受容体に結合し、かつそれらをクラスター化するいくつかの大型の組換え型タンパク質が設計されている（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００２；Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．２００４；Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１６；ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．８，９５７，０２２）。
【０００５】
バスキュロチド（親化合物バスキュロチド（ｐａｒｅｎｔａｌ  ｖａｓｃｕｌｏｔｉｄｅ）とも称される）は、Ａｎｇ１の作用を模倣する合理的に設計された完全合成化合物である。バスキュロチドの中心コアは、１０ｋＤａの狭分散性４分岐ポリエチレングリコールから構成される。高親和性Ｔｉｅ２結合ペプチド、特に（−ＣＨＨＨＲＨＳＦ−、配列番号６）の共有結合は、活性化されたマレイミド基およびアミノ末端システインの反応を通じて促進される。この構造は、Ｔｉｅ２受容体を結合し活性化するのに最適な立体構造であることが明らかにされた。親化合物バスキュロチドによるＴｉｅ２の直接的な活性化は、アトピー性疾患およびインフルエンザの前臨床モデルを含む、いくつかの異なるインビトロおよびインビボ研究において優位な抗血管漏出シグナルを発生させることが示されている（Ｂｏｕｒｄｅａｕ  Ａ，ｅｔ  ａｌ  ＢＭＣ  Ｒｅｓ  Ｎｏｔｅｓ  ２０１６  ａｎｄ  Ｓｕｇｉｙａｍａ  ＭＧ，ｅｔ  ａｌ  Ｓｃｉ  Ｒｅｐ  ２０１５）。
【０００６】
インフルエンザ誘発性の急性肺損傷またはより重篤かつ関連する診断である急性呼吸促迫症候群（ＡＬＩ／ＡＲＤＳ）は、毎年公衆に多大な犠牲を強要し、若者および高齢者に偏って影響を与える。病原体に媒介されるＡＬＩ／ＡＲＤＳの一般的な保存された特徴は、血管漏出の誘発である。感染に対する宿主応答（特に血管漏出）の処置における治療手段は、絶えず変異している病原体に特に狙いを定めた治療薬に見られる急速な耐性の発生を伴うべきではない。肺損傷の処置に対し認可された治療的に標的化された手段は、現在のところ存在しない。インフルエンザ誘発性のＡＬＩ／ＡＲＤＳを処置するためのバスキュロチドなどのＴｉｅ２作用薬の使用は、ワクチンおよび／または抗ウイルス薬の使用と区別されるある種の概念的特徴を提供しうる。例えば、現在のインフルエンザワクチン接種プログラムは系統の同一性に関連する事前知識を必要とする一方で、抗ウイルス剤に対する耐性は最近詳細に記述されている。加えて、新たな病原性系統または兵器化された生物に代表される脅威は、利用可能な治療薬を完全に無効にする可能性がある。したがって、病原体に対する宿主応答を処置する新規手法が早急に必要とされる。
【発明の概要】
【０００７】
親化合物バスキュロチドの化学分析は、得られたペプチドＰＥＧコンジュゲートが５および６員環産物の混合物を含有することを明らかにした（図１Ａ）。示される５員のスクシンイミド環は、システイン上のチオール基によるマレイミドの直接的なアルキル化により生じ、同様に示される６員のチアジン環は、システインリンカー上の遊離アミン基によるこの初期生成物の転位により生じる。これらの発見は、ペプチドが直鎖状のスルファン部分を介してＰＥＧに結合されて活性化ＰＥＧ四量体を形成する、より単純なバスキュロチド類縁体（Ｍｐａ−Ｂｒ）の開発をもたらした。一実施形態では、Ｍｐａ−Ｂｒは、システインのアキラル類似体である３−メルカプトプロピオン酸を有する、Ｎ末端のアミン側鎖がないＴ７ペプチドのブロモアセトアミドを含有する活性化ＰＥＧ四量体への結合によって調製される（図１Ｂ）。得られたペプチドＰＥＧコンジュゲートは、転位しやすい不安定な環状構造のない単一の産物を提供する。
【０００８】
よって本開示は、式（Ｉ）
【化１】
2020506223.tif 000003
［式中、
ｎは約２５〜約１００の整数であり、
各Ｘは独立してまたは同時に（Ｃ１−Ｃ２０）アルキレンまたは（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニレンであり、各々は所望により１個以上のハロ、アミノ、ヒドロキシ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ６−Ｃ１０）アリールまたは（Ｃ５−Ｃ１０）ヘテロアリールにより置換され；
各Ｙは独立してまたは同時に（Ｃ１−Ｃ２０）アルキレンまたは（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニレンであり、各々は所望により１個以上のハロ、アミノ、ヒドロキシ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ６−Ｃ１０）アリールまたは（Ｃ５−Ｃ１０）ヘテロアリールにより置換され；および、
ＲはＴ７ペプチド（配列番号１）、ＧＡ３ペプチド（配列番号２）、Ｔ４ペプチド（配列番号３）、Ｔ６ペプチド（配列番号４）および／もしくはＴ８ペプチド（配列番号５）またはこれらのレトロインベルソペプチドである］の化合物またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【０００９】
一実施形態では、本発明の化合物は、Ｔｉｅ２リン酸化；ＭＡＰＫ、ＡＫＴおよび／またはｅＮＯＳのリン酸化を刺激する；内皮細胞遊走を刺激する；内皮細胞からのＭＭＰ２放出および血清枯渇によって誘発されるアポトーシスからの内皮細胞の保護を刺激する；マトリゲルアッセイにおいてインビボで血管新生反応を刺激する；対象の創傷に局所的に適用された場合に対象の創傷治癒を刺激する；血管漏出を減少させる；アレルギー疾患を処置するおよび／またはインフルエンザを処置する。
【００１０】
一実施形態では、Ｒは、配列番号１に示すＴ７ペプチドである。
【００１１】
一実施形態では、本明細書で開示される化合物および薬理学的に許容される担体を含む医薬組成物が本明細書において提供される。一実施形態では、薬理学的に許容される担体は、局所投与に好適である。他の実施形態では、薬理学的に許容される担体は、全身投与に好適である。更に別の実施形態では、薬理学的に許容される担体は、鼻腔内投与に、吸入にまたは灌流液の成分として好適である。
【００１２】
本明細書において、
（ｉ）Ｔ７ペプチド（配列番号１）、ＧＡ３ペプチド（配列番号２）、Ｔ４ペプチド（配列番号３）、Ｔ６ペプチド（配列番号４）および／もしくはＴ８ペプチド（配列番号５）またはこれらのレトロインベルソペプチドであるペプチドを式（ＩＩ）
【化２】
2020506223.tif 000004
のチオール化合物と反応させて式（ＩＩＩ）
【化３】
2020506223.tif 000005
の化合物を得ること；
（ｉｉ）式（ＩＩＩ）の化合物を式（ＩＶ）
【化４】
2020506223.tif 000006
のＰＥＧ四量体と反応させて式（Ｉ）の化合物を得ること；
を含む、本明細書で開示される式（Ｉ）の化合物の製造方法もまた提供される（ここで、変数ｎ、ＸおよびＹは上で定義されるようであり、ＬＧは好適な脱離基であり、ＰＧはＨまたは好適な保護基である）。
【００１３】
本明細書において、Ｔｉｅ２受容体が活性化されるようにＴｉｅ２受容体を本明細書で開示される化合物と接触させることを含むＴｉｅ２受容体を活性化させる方法もまた提供される。一実施形態では、Ｔｉｅ２受容体の活性化は、Ｔｉｅ２受容体のチロシン残基、例えばヒトではチロシン９９２（Ｙ９９２）およびマウスではＹ９９０、のリン酸化によって、またはＭＡＰＫ、ＡＫＴまたはｅＮＯＳのリン酸化によって証明される。
【００１４】
また更に、本明細書で開示される化合物を、その必要がある対象に投与することを含む対象において血管新生を刺激する方法が提供される。
【００１５】
別の実施形態では、本発明の化合物によって刺激される血管新生は、以下の特性の少なくとも１つを特徴とする：
ａ）血管周囲支持細胞のリクルートメント；
ｂ）さもなければ漏出性であろう血管の非漏出性；
ｃ）明瞭な分枝；および、
ｄ）内皮細胞アポトーシスの阻害。
【００１６】
別の実施形態では、本発明の方法は、第２の血管新生剤を同時に、または順次投与することを更に含む。一実施形態では、第２の血管新生剤は、ＶＥＧＦである。別の実施形態では、第２の血管新生剤は、ＰＤＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、組換えヒトエリスロポイエチン、ｂＦＧＦ、Ａｎｇ２阻害剤、および胎盤増殖因子（ＰＬＧＦ）からなる群から選択される。
【００１７】
また更なる実施形態では、その必要がある対象は、再生組織の血管新生、虚血肢疾患、脳虚血、血管炎症状態、動脈硬化、虚血壊死、発毛刺激および勃起不全から選択される臨床状態を有する。
【００１８】
本明細書において、その必要がある対象における部位に本明細書で開示される化合物を投与することを含む漏出性血管の部位で血管透過性を減少させる方法もまた提供される。一実施形態では、対象は、脳卒中、黄斑部変性、黄斑浮腫、リンパ浮腫、血液網膜関門の破壊、血液脳関門の破壊、細菌により誘発された血管漏出または腫瘍血管系の正常化を有するまたは有したことがある。
【００１９】
また本明細書において、その必要がある対象に本明細書で開示される化合物を投与することを含む内皮細胞を保護する方法も提供される。一実施形態では、対象は、腎臓損傷もしくは腎臓線維症、脳卒中、血管性認知症、黄斑部変性または糖尿病合併症を有するかまたは有したことがある。別の実施形態では、対象は、肺損傷を有するかまたは有したことがある。
【００２０】
また更に、その必要がある対象における創傷に本明細書で開示される化合物を投与することを含む創傷治癒を刺激する方法が提供される。一実施形態では、本発明の化合物は、局所投与または全身投与される。一実施形態では、創傷は、糖尿病性潰瘍である。別の実施形態では、創傷は、褥瘡性潰瘍、圧迫潰瘍、外科切開、外傷性組織損傷、火傷または皮膚移植片である。
【００２１】
また更に、その必要がある対象に本明細書で開示される化合物を投与すること含むＣＦＵ−Ｇ細胞の増殖を阻害する方法が本明細書において提供される。一実施形態では、本発明の方法は、その必要がある対象において好酸球および／または好塩基球を減少させるため、アトピー性皮膚炎、喘息またはアレルギー性鼻炎を処置するため、またはその必要がある対象において好酸球および／または好塩基球に関連する病状を処置するためである。
【００２２】
一実施形態において、好酸球および／または好塩基球に関連する病状は、好酸球および／または好塩基球起源の白血病である。別の実施形態では、好酸球および／または好塩基球に関連する病状は、炎症性腸疾患である。更に別の実施形態では、好酸球および／または好塩基球に関連する病状は、寄生虫感染である。
【００２３】
別の実施形態では、ＣＦＵ−Ｇ細胞の増殖を阻害する方法は、エオタキシン、ＩＬ−１７、ＭＩＧ、ＩＬ１２／ＩＬ２３（ｐ４０）、ＩＬ−９、ＭＩＰ−１ａ、ＭＩＰ−１ｂ、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、およびＭＣＰ−１の少なくとも１つを含む炎症性サイトカインおよび／またはケモカインのレベルを低減するためである。一実施形態では、炎症性サイトカインおよび／またはケモカインは、エオタキシンを含む。
【００２４】
別の実施形態では、本発明の方法は、ヒスタミンによって誘発される血管漏出を阻害する。
【００２５】
また更に、その必要がある対象に本明細書で開示される化合物を投与することを含む、インフルエンザに感染した対象またはインフルエンザを伴う細菌重複感染を有する対象を処置する方法が本明細書において提供される。
【００２６】
一実施形態では、本発明の方法は、抗ウイルス剤を同時に、または順次投与することを更に含む。一実施形態では、抗ウイルス剤は、アマンタジン、リマンタジン、ザナミビル、ペラミビル、ビラミジン、リバビリンまたはオセルタミビルである。別の実施形態では、対象はヒトであり、インフルエンザはヒトインフルエンザである。
【００２７】
一実施形態では、本発明の化合物は、局所的に、全身的に、鼻腔内に、吸入によって、または灌流液として投与される。
【００２８】
また、（ａ）本明細書で開示される化合物および（ｂ）抗ウイルス剤を含む組成物も提供される。また更に、（ａ）本明細書で開示される化合物および（ｂ）血管新生剤を含む組成物が提供される。
【００２９】
更に、本明細書において開示されるようにＴｉｅ２を活性化させるための、および／または血管新生を刺激するためのキットであって、（ａ）本明細書で開示される化合物、（ｂ）第２の血管新生剤、および（ｃ）当該キットを使用するための使用説明書を含むキット、が提供される。
【００３０】
更に、インフルエンザに感染した対象を処置するための、および／またはインフルエンザに感染した対象の細菌重複感染を処置するためのキットであって、（ａ）本明細書で開示される化合物、（ｂ）抗ウイルス剤、および（ｃ）当該キットを使用するための使用説明書を含むキット、が提供される。
【００３１】
また更に、本明細書で開示される化合物が組み込まれる、生体材料が提供される。一実施形態では、生体材料は、マトリゲル、代用皮膚または架橋グリコサミノグリカンヒドロゲルである。別の実施形態では、第２の薬剤、例えば、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、組換えヒトエリスロポイエチン、ｂＦＧＦおよび胎盤増殖因子（ＰＬＧＦ）が生体材料に組み込まれる。
【００３２】
本開示の他の特徴および利点は、下記の詳細な説明によって明らかとなるであろう。しかし、詳細な説明および具体例は、本出願の実施形態を示すものであるが、例証のためにのみ提供するものと理解すべきであり、特許請求の範囲は、これらの実施形態によって限定されるべきでないが、全体として説明と一貫した最も広い解釈が与えられるべきである。
【００３３】
実施形態を、以下の図を参照して後述する：
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１Ａ】Ｎ末端にシステインを有するＴ７ペプチドを、マレイミドを含有する活性化ＰＥＧ四量体へ結合させることにより調製される、親化合物バスキュロチドの模式図を示す。得られるペプチドＰＥＧコンジュゲートは、５および６員環産物の混合物を含有する。示される５員のスクシンイミド環は、システイン上のチオール基によるマレイミドの直接的なアルキル化により生じ、同様に示される６員のチアジン環は、システインリンカー上の遊離アミン基によるこの初期生成物の転位により生じる。
【図１Ｂ】一実施形態において、システインのアキラル類似体である３−メルカプトプロピオン酸を有する、Ｎ末端のアミン側鎖がないＴ７ペプチドをブロモアセトアミドを含有する活性化ＰＥＧ四量体へと結合させることによって調製される、Ｍｐａ−Ｂｒの模式図を示す。
【図２Ａ−Ｄ】図２Ａはトリプトファン蛍光分光法を使用する溶液中の均一な組換え受容体集団（ヒトＴｉｅ２Ｆｃ）への親化合物バスキュロチド結合の検出を示す。図２Ｃはトリプトファン蛍光分光法を使用する溶液中の均一な組換え受容体集団（ヒトＴｉｅ２Ｆｃ）へのＭＰＡ−Ｂｒ結合の検出を示す。ヒトＴｉｅ２Ｆｃ受容体の増加する濃度のリガンド（Ａ，Ｃ）（○）とのインキュベーションまたはリガンド単独（□）のインキュベーションによる内部蛍光強度の増加および得られる結合曲線。試料は、２９５ｎｍの波長で励起された。図２Ｂは親化合物バスキュロチドのヒトＴｉｅ２Ｆｃへの特異的な飽和結合の曲線を示す。図２ＤはＭｐａ−ＢｒのヒトＴｉｅ２Ｆｃへの特異的な飽和結合の曲線を示す。非線形回帰（１サイト特異的結合）のために、親化合物バスキュロチド単独またはＭＰＡＢｒ単独の内部蛍光強度が全結合から差し引かれた。親化合物バスキュロチドおよびＭＰＡ−ＢｒのヒトＴｉｅ２Ｆｃへの正規化された特異的結合の得られたＫｄは、１０２．９ｎＭおよび２．６２３ｎＭである。
【図２Ｅ−Ｆ】図２Ｅは親化合物バスキュロチドのヒトＩｇＧＦｃとの結合曲線を示す。図２ＦはＭＰＡ−ＢｒのヒトＩｇＧＦｃとの結合曲線を示す。ヒトＩｇＧＦｃおよび親化合物バスキュロチドまたはヒトＩｇＧＦｃおよびＭＰＡ−Ｂｒで結合飽和は観察されない。
【図２Ｇ】様々な種の組換えＴｉｅ２ＦＣに対する親化合物バスキュロチドおよびＭＰＡ−Ｂｒの結合定数を示す表を示す。トリプトファン走査蛍光分光法を使用して、示された種の組換えＴｉｅ２Ｆｃ受容体に対する親化合物バスキュロチドおよびＭＰＡ−Ｂｒの結合定数を測定した。
【図３Ａ−Ｂ】図３Ａは親化合物バスキュロチドおよびＭＰＡ−ＢｒはＴｉｅ２受容体を活性化することを示す。漸増する用量の親化合物バスキュロチドおよびＭＰＡ−Ｂｒにより処理されたＨＵＶＥＣ細胞中のリン酸化されたＴｉｅ２。データは正規化平均±ＳＥＭ、無処理（ＮＴ）に対する一元配置分散分析、事後Ｈｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ多重比較、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１として表現される。見やすさのために、斜線により親化合物バスキュロチド処理とＭＰＡ−Ｂｒ処理が分離される。図３Ｂは親化合物バスキュロチドおよびＭＰＡ−Ｂｒは分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）を活性化することを示す。親化合物バスキュロチドおよびＭＰＡ−Ｂｒにより処理されたＨＵＶＥＣ細胞中のＭＡＰＫ（Ｅｒｋ２）のリン酸化。データは正規化平均±ＳＥＭ、無処理（ＮＴ）に対する一元配置分散分析、事後Ｈｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ多重比較、＊ｐ＜０．０５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１として表現される。
【図４Ａ】示された濃度の親化合物バスキュロチドおよびＭＰＡ−Ｂｒで処理されたＨＭＶＥＣｔｅｒｔ細胞（テロメラーゼによって不死化された）中のリン酸化されたＴｉｅ２を示す（データは、平均±ＳＥＭ、スチューデントｔ検定、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、内皮基本培地（ＥＢＭ）処理群に対する処理群として表現される）。
【図４Ｂ】示された濃度の親化合物バスキュロチドおよびＭＰＡ−Ｂｒで処理されたマウス初代肺微小血管内皮細胞中のリン酸化されたＴｉｅ２を示す（データは、平均±ＳＥＭ、一元配置分散分析、事後Ｈｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ検定、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＃ｐ＝０．０６、無処理群（ＮＴ）に対する処理群として表現される）。
【図５Ａ−Ｃ】図５Ａはラット糸球体に由来する初代培養内皮細胞を示す。図５Ｂはイヌ大動脈に由来する初代培養内皮細胞を示す。図５Ｃはカニクイザル糸球体に由来する初代培養内皮細胞を示す。細胞は、示される濃度のＭＰＡ−Ｂｒ（ｍＢｒ）により１５分間刺激された。リン酸化されたＴｉｅ２は、ＥＬＩＳＡにより定量化された。示されるデータは、総Ｔｉｅ２タンパク質レベルに正規化された場合のＴｉｅ２の相対的な活性化（ｐＴｉｅ２）を表す。ヒト組換えアンギオポエチン１（Ａｎｇ１）が、陽性対照として含まれた。データは、平均±ＳＥＭ、スチューデントｔ検定、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、無処理群（ＮＴ）に対する処理群として表現される。ラットについてｎ＝３、イヌについてｎ＝４およびカニクイザルについてｎ＝３。
【図６Ａ−Ｉ】親化合物ＶＴおよびＭＰＡ−ＢｒはＸ３１（Ｈ３Ｎ２）インフルエンザの接種後にマウスを保護することを示す。マウスを０日目に６４ＨＡＵのＸ３１に鼻腔内感染させた。示される用量の親化合物ＶＴまたはＭＰＡ−Ｂｒが、研究の間、感染の４８時間後に始めて２４時間毎に腹腔内投与（Ｉ．Ｐ．）された。生存率を１２日目まで毎日モニタリングした（図６Ａ）。感染の５日後（図６Ｂ）および６日後（図６Ｃ）に測定された最初の体重に対する割合。感染の５日後（図６Ｄ）および６日後（図６Ｅ）での動脈血酸素飽和度。感染の５日後（図６Ｆ）または６日後（図６Ｇ）に測定された体温。感染の５日後（図６Ｈ）および６日後（図６Ｉ）に測定された活動性スコア。生存統計は、マンテル・コックス・ログランク解析（Ｍａｎｔｅｌ  Ｃｏｘ  Ｌｏｇ  Ｒａｎｋ  ａｎａｌｙｓｉｓ）によって実行された（＊＊＊ｐ＜０．００１）。全ての他の統計的な測定値は、以下の通りであった：一元配置分散分析およびフィッシャー事後検定によるＰＢＳで処置されたＦｌｕに対する＃ｐ＜０．０５、一元配置分散分析およびダネット事後検定によるＰＢＳで処置されたＦｌｕに対する＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１および＊＊＊＊ｐ，０．０００１。
【図７Ａ−Ｂ】ゼロ時点で尾静脈注射により示される用量の親化合物ＶＴまたはＭＰＡ−Ｂｒを投与されたスプラーグドーリーラットを示す。血漿を、示される時点で収集してＥＬＩＳＡによる被検物質の循環レベルの定量化を行った。グラフは、循環ＭＰＡ−Ｂｒ（図７Ａ）および親化合物ＶＴ（図７Ｂ）の経時的な体循環からの消失を表す。表は、１２０ｕｇ／ｋｇ用量について算出されたクリアランス、排除、分布容積および終末相半減期値を列挙する。ＭＰＡ−Ｂｒを提供される１つの実験群は、３日間連続して一回の２４時間用量（反復投与（ＭＤ）  １２０ｕｇ／ｋｇ）を送達された。
【図８】皮膚へのヒスタミン曝露の１時間前に示される量の親化合物バスキュロチドまたはＭＰＡ−Ｂｒを（ＩＰにより）投与された、背部が剃毛された雄性ＦＶＢマウスを示す。尾静脈を介して送達されたエバンスブルー（ＥＢ）色素は、ヒスタミン曝露の直後に投与された。標準的な皮膚生検材料を、ヒスタミン曝露の３０分後に心臓灌流したマウスから取り出した。６２０ｎｍでの吸光度を使用して全ての投与群についてＥＢ色素の血管外漏出量を算出した。データを、ＥＢの平均量±ＳＥＭ、ＰＢＳ媒体対照に対する一元配置分散分析、事後ダネット多重比較、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１として表す。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
定義
本明細書で使用する場合、用語「（Ｃ１−Ｃｐ）アルキル」は、１〜「ｐ」個の炭素原子を含有する直鎖および／または分枝鎖の飽和アルキル基を意味し、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、２，２−ジメチルブチル、ｎ−ペンチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、４−メチルペンチル、ｎ−ヘキシルなどを含み（ｐの同一性に応じて）、ここで変数ｐはアルキル基の炭素原子の最大数を表わす整数である。
【００３６】
本明細書で使用する場合、用語「（Ｃ２−Ｃｐ）アルケニル」は、２〜「ｐ」個の炭素原子を含有する直鎖および／または分枝鎖の不飽和アルキル部分を意味し、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含み、エテニル、１−プロペニル、イソプロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、ｔ−ブテニル、１−ペンテニル、２−メチル−１−ペンテニル、３−メチル−１−ペンチル、４−メチル−１−ペンチル、１−ヘキセニル、２−ヘキセニルなどを含み（ｐの同一性に応じて）、ここで変数ｐはアルケニル基の炭素原子の最大数を表わす整数である。
【００３７】
用語「（Ｃ１−Ｃｐ）アルコキシ」は、それに結合される酸素原子を有する、上に定義されるアルキル基を意味する。本発明で使用する場合、当該用語は、それに結合される酸素原子を有し１〜「ｐ」個の炭素原子を含有する直鎖および／または分枝鎖の飽和アルキル基を意味し、エトキシ、メトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｓ−ブトキシ、イソブトキシ、ｔ−ブトキシ、２，２−ジメチルブトキシ、ｎ−ペントキシ、２−メチルペントキシ、３−メチルペントキシ、４−メチルペントキシ、ｎ−ヘキソキシなどを含み（ｐの同一性に応じて）、ここで変数ｐはアルコキシ基の炭素原子の最大数を表わす整数である。
【００３８】
本明細書で使用する場合、用語「アリール」は、少なくとも１個の芳香環、例えば、単環（例えばフェニル）または多重縮合環（例えばナフチル）を含有する環状基を指す。本開示の態様では、アリール基は、フェニル、ナフチル、インダニル、アントラセニル、１，２−ジヒドロナフチル、１，２，３，４−テトラヒドロナフチル、フルオレニル、インダニル、インデニルなどの６、９または１０個の原子を含有する。
【００３９】
本明細書で使用する場合、用語「ヘテロアリール」は、Ｎ、ＯおよびＳから選択される少なくとも１個のヘテロ原子および少なくとも１個の芳香環を有する芳香族環式または多環式系を指す。ヘテロアリール基の例としては、特に、フリル、チエニル、ピリジル、キノリニル、イソキノリニル、インドリル、イソインドリル、トリアゾリル、ピロリル、テトラゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル、カルバゾリル、ベンゾオキサゾリル、ピリミジニル、ベンズイミダゾリル、キノキサリニル、ベンゾチアゾリル、ナフチリジニル、イソオキサゾリル、イソチアゾリル、プリニルおよびキナゾリニルが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４０】
本明細書で使用する場合、用語「ハロ」は、ハロゲン原子を指し、フッ素（Ｆ）、塩素（Ｃｌ）、臭素（Ｂｒ）およびヨウ素（Ｉ）を含む。
【００４１】
上記の基のいずれかに付加される接尾辞「エン」は上記の基が二価であること、すなわち、２つの他の基の間に挿入されることを意味する。
【００４２】
本明細書で使用する場合、レトロインベルソペプチドは、ｄ−アミノ酸が逆順で置換えられたペプチドを指す。側鎖トポロジーは、元の分子（一次構造）を模倣し、したがって、結合を提供する。
【００４３】
本開示の化合物
一実施形態では、本発明の発明者らは、バスキュロチド（ＶＴ）を超える改善された活性を有する新規薬剤の部類を提供し、実施例における「Ｍｐａ−Ｂｒ」としての１つの新規薬剤に言及する。
【００４４】
したがって、本開示は、式（Ｉ）
【化５】
2020506223.tif 000007
［式中、
ｎは約２５〜約１００の整数であり、
各Ｘは独立してまたは同時に（Ｃ１−Ｃ２０）アルキレンまたは（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニレンであり、各々は所望により１個以上のハロ、アミノ、ヒドロキシ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ６−Ｃ１０）アリールまたは（Ｃ５−Ｃ１０）ヘテロアリールにより置換され；
各Ｙは独立してまたは同時に（Ｃ１−Ｃ２０）アルキレンまたは（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニレンであり、各々は所望により１個以上のハロ、アミノ、ヒドロキシ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ６−Ｃ１０）アリールまたは（Ｃ５−Ｃ１０）ヘテロアリールにより置換され；および、
ＲはＴ７ペプチド（配列番号１）、ＧＡ３ペプチド（配列番号２）、Ｔ４ペプチド（配列番号３）、Ｔ６ペプチド（配列番号４）またはＴ８ペプチド（配列番号５）またはこれらのレトロインベルソペプチドである］；
の化合物および／またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【００４５】
一実施形態では、ＲはＴ７ペプチドであり、当該Ｔ７ペプチドはアミノ酸配列：Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ（配列番号１）を含む。別の実施形態では、ＲはＧＡ３ペプチドであり、当該ＧＡ３ペプチドはアミノ酸配列：Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（配列番号２）を含む。別の実施形態では、ＲはＴ４ペプチドであり、当該Ｔ４ペプチドはアミノ酸配列：Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ（配列番号３）を含む。更に別の実施形態では、ＲはＴ６ペプチドであり、当該Ｔ６ペプチドはアミノ酸配列：Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ（配列番号４）を含む。更に別の実施形態では、ＲはＴ８ペプチドであり、当該Ｔ８ペプチドはアミノ酸配列：Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ（配列番号５）を含む。
【００４６】
Ｔ４、Ｔ６、Ｔ７およびＴ８は、Ｔｏｕｒｎａｉｒｅ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）  ＥＭＢＯ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ５：２６２−２６７に記載されるＴｉｅ２結合ペプチドＴ４、Ｔ６、Ｔ７およびＴ８である。ＧＡ３もまた、Ｗｕ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３１５：１００４−１０１０に記載されるＴｉｅ２結合ペプチドである。
【００４７】
一実施形態では、ｎは約４０〜約７０、または約４８〜約６５、または約５５の整数である。
【００４８】
別の実施形態では、Ｘは、独立して、または同時に（Ｃ１−Ｃ１０）アルキレンまたは（Ｃ２−Ｃ１０）アルケニレンである。別の実施形態では、Ｘは、独立して、または同時に、（Ｃ１−Ｃ６）アルキレンまたは（Ｃ２−Ｃ６）アルケニレンである。別の実施形態では、Ｘは、独立して、または同時に、（Ｃ１−Ｃ３）アルキレンである。別の実施形態では、Ｘは、メチレン（−ＣＨ２）である。他の実施形態では、任意の置換基は、１個以上のハロまたは（Ｃ１−Ｃ３）アルキルまたは（ＣＨ３）である。
【００４９】
他の実施形態では、Ｙは、独立して、または同時に、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキレンまたは（Ｃ２−Ｃ１０）アルケニレンである。他の実施形態では、Ｙは、独立して、または同時に、（Ｃ１−Ｃ６）アルキレンまたは（Ｃ２−Ｃ６）アルケニレンである。他の実施形態では、Ｙは、独立して、または同時に、（Ｃ１−Ｃ３）アルキレンである。他の実施形態では、Ｙは、エチレン（−ＣＨ２ＣＨ２−）である。他の実施形態では、Ｙは、チオグリコール酸、２−メルカプトプロピオン酸、４−メルカプトブタン酸、６−メルカプトヘキサン酸、８−メルカプトオクタン酸、１１−メルカプトウンデカン酸、１２−メルカプトドデカン酸または１６−メルカプトヘキサデカン酸から誘導される。
【００５０】
一実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、
【化６】
2020506223.tif 000008
［式中、
ｎは約５０〜６０の間の整数または約５５であり；
ＲはＨｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ（配列番号１）である］またはその薬学的に許容される塩である。
【００５１】
他の実施形態では、薬理学的に許容される塩は、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩またはＨＣｌ塩の形態などの酸付加塩である。他の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、酢酸塩または塩酸塩である、塩である。
【００５２】
他の実施形態では、本開示は、式（Ｉ）の化合物の四量体に加えて二量体および三量体も含む。一実施形態では、本開示は、式
【化７】
2020506223.tif 000009
［式中、
Ｗは独立してまたは同時にヒドロキシ置換（Ｃ１−Ｃ２０）アルキルまたはヒドロキシ置換（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニルであり、各々は所望により１個以上のハロ、アミノ、ヒドロキシ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ６−Ｃ１０）アリールまたは（Ｃ５−Ｃ１０）ヘテロアリールにより置換され；または
ＷはＸ−Ｓ−Ｙ−Ｃ（Ｏ）−Ｒである（ここでｎ、Ｘ、ＹおよびＲは上に定義されるようである）］を有する二量体、三量体および四量体化合物を含む。
【００５３】
一実施形態では、Ｗは、ヒドロキシ置換（Ｃ１−Ｃ１０）アルキルまたはヒドロキシ置換（Ｃ２−Ｃ１０）アルケニルである。別の実施形態では、Ｗは、ヒドロキシ置換（Ｃ１−Ｃ６）アルキルまたはヒドロキシ置換（Ｃ２−Ｃ６）アルケニルである。別の実施形態では、Ｗは、−ＣＨ２−ＯＨである。
【００５４】
一実施形態では、二量体は以下の構造
【化８】
2020506223.tif 000010
［式中、Ｗは独立してまたは同時にヒドロキシ置換（Ｃ１−Ｃ２０）アルキルまたはヒドロキシ置換（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニルであり、各々は所望により１個以上のハロ、アミノ、ヒドロキシ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ６−Ｃ１０）アリールまたは（Ｃ５−Ｃ１０）ヘテロアリールにより置換され、ｎ、Ｘ、ＹおよびＲは上に定義されるようである］を有する。
【００５５】
他の実施形態では、三量体は以下の構造
【化９】
2020506223.tif 000011
［式中、Ｗは独立してまたは同時にヒドロキシ置換（Ｃ１−Ｃ２０）アルキルまたはヒドロキシ置換（Ｃ２−Ｃ２０）アルケニルであり、各々は所望により１個以上のハロ、アミノ、ヒドロキシ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ６−Ｃ１０）アリールまたは（Ｃ５−Ｃ１０）ヘテロアリールにより置換され、ｎ、Ｘ、ＹおよびＲは上に定義されるようである］を有する。
【００５６】
他の実施形態では、四量体は式（Ｉ）の化合物である。
【００５７】
一実施形態では、本明細書で開示される化合物は、Ｔｉｅ２アゴニスト活性を示す。このＴｉｅ２アゴニスト活性は、当該技術分野において確立されているＴｉｅ２活性化の指標を使用して検出できる。例えば、本明細書で開示される化合物は、Ｔｉｅ２リン酸化を刺激できる（例えば、ヒトＴｉｅ２のアミノ酸残基Ｙ９９２などの、チロシン残基のリン酸化）。
【００５８】
したがって、一実施形態において、化合物はＴｉｅ２リン酸化を刺激する。
【００５９】
更に、本明細書で開示される化合物は、Ｔｉｅ２の下流シグナル伝達経路における分子のリン酸化、例えばＭＡＰＫ、ＡＫＴのリン酸化（例えば、ヒトＡＫＴのアミノ酸残基Ｓ４７３でのリン酸化）および／またはｅＮＯＳのリン酸化（例えば、ｅＮＯＳのアミノ酸残基Ｓ１１７７でのリン酸化）を刺激できる。特定のタンパク質のリン酸化を刺激する化合物の能力は、化合物で処理した細胞可溶化物のイムノブロットアッセイなどの、当該技術分野において周知の標準的な技術を使用して測定できる。
【００６０】
したがって、一実施形態において、本発明の化合物は、ＭＡＰＫ、ＡＫＴおよびｅＮＯＳのリン酸化を刺激する。
【００６１】
他の実施形態では、本明細書で開示される化合物は、内皮細胞に対する明白な効果を有する。例えば、本明細書で開示される化合物は、内皮細胞遊走の刺激、内皮細胞からのＭＭＰ２放出の刺激、および血清枯渇によって誘発されるアポトーシスからの内皮細胞の保護からなる群から選択される少なくとも１つの内皮細胞に対する効果を有してもよい。所望により、本明細書で開示される化合物は、内皮細胞に対するこれらの効果の少なくとも２つを有するかまたは内皮細胞に対するこれらの効果の３つ全てを有する。内皮細胞に対するこれらの効果のいずれかを有する化合物の能力は、細胞遊走を評価するボイデンチャンバーアッセイ、ＭＭＰ２放出を評価する酵素電気泳動アッセイまたは血清枯渇によって誘発されるアポトーシスを評価する細胞死ＥＬＩＳＡアッセイなどの、当技術分野において公知の分析法を使用して測定できる。
【００６２】
したがって、一実施形態において、本発明の化合物は、内皮細胞遊走を刺激し、内皮細胞からのＭＭＰ２放出および／または血清枯渇によって誘発されるアポトーシスからの内皮細胞の保護を刺激する。
【００６３】
一実施形態では、本明細書で開示される化合物は、インビトロまたはインビボでの血管新生アッセイにおいて測定されるように、血管新生に対する明白な効果を有する。このようなアッセイの１つはインビボでのマトリゲルアッセイであり、このアッセイでは増殖因子が減少したマトリゲルに本発明の化合物を混ぜ込み、試験動物に皮下注入する。一定期間（例えば、１４日）後に、試験動物を、血管の同定および定量化を容易にする薬剤（例えば、ＦＩＴＣ−レクチン）で処置でき、マトリゲルプラグを除去し血管新生反応について調べることができる。
【００６４】
したがって、一実施形態において、本明細書で開示される化合物は、マトリゲルアッセイにおいてインビボで血管新生反応を刺激する。
【００６５】
他の実施形態では、本明細書で開示される化合物は、対象の創傷に局所的に適用された場合に当該対象の創傷治癒を刺激できる。創傷治癒を刺激する化合物の能力は、創傷治癒障害を呈する糖尿病系統のマウスであるＢ６．Ｃｇ−ｍ（＋／＋）Ｌｅｐｒ（ｄＢ）／Ｊ（ｄＢ／ｄＢ）系統のマウスなどの、動物モデルにおいて評価できる。切除創傷をマウスに加えることができ、局所製剤に組み込まれた本発明の化合物を創傷に適用でき、創傷治癒を評価できる。一実施形態では、本明細書で開示される化合物は、閉創時間を早めることができ、かつ／またはコラーゲン沈着および新血管新生の増加を促進できる。
【００６６】
したがって、一実施形態において、本発明の化合物は、対象の創傷に局所的に適用された場合に当該対象において創傷治癒を刺激する。
【００６７】
一実施形態では、本明細書で開示される化合物のＰＥＧ分子の数は、所望により、約２１，５００ダルトン未満の分子量、約８，０００ダルトン〜約２１，５００のダルトンの分子量範囲、約１２，５００ダルトンの分子量、約１５，５００ダルトンの分子量または約１４，０００ダルトンの分子量をもたらす数である。
【００６８】
本明細書で開示される化合物および薬理学的に許容される担体を含む医薬組成物もまた、本明細書において提供される。
【００６９】
本明細書で使用する場合、「薬理学的に許容される担体」は、生理的適合性であるあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。所望により、当該担体は、局所投与に好適であるかまたは、（例えば、注射または注入による）静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、非経口投与、脊髄投与、または表皮投与に好適である。投与経路に応じて、本発明の活性化合物を材料でコーティングして当該化合物を不活性化し得る酸の作用および他の自然条件から当該化合物を保護してもよい。
【００７０】
薬理学的に許容される担体は、所望の投与経路に好適であるように選択できる。例えば、一実施形態において薬理学的に許容される担体は、局所投与に好適である。局所投与に好適な担体の非限定的な例は、ＩｎｔｒａＳｉｔｅ  Ｇｅｌ（Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｎｅｐｈｅｗから市販されている）である。他の実施形態では、薬理学的に許容される担体は、全身投与に好適である。全身投与（例えば、静脈内投与）に好適な担体の非限定的な例は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）である。
【００７１】
更に別の実施形態では、薬理学的に許容される担体は、鼻腔内投与に好適である。更に別の実施形態では、薬理学的に許容される担体は、吸入に好適である。更なる実施形態では、薬理学的に許容される担体は、灌流液の成分として好適である。
【００７２】
本発明の医薬組成物は、１種以上の薬理学的に許容される塩を含んでよい。「薬理学的に許容される塩」は、元の化合物の望ましい生物活性を保持し、なんらかの望ましくない毒物学的効果を付与しない塩を指す（例えば、Ｂｅｒｇｅ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９７７）  Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９を参照のこと）。このような塩の例は、酸付加塩および塩基付加塩を含む。酸付加塩としては、例えば、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸などの無毒性無機酸から誘導されるもの、ならびに例えば、脂肪族モノカルボン酸およびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸など（例えば、酢酸）の無毒性有機酸から誘導されるものが挙げられる。塩基付加塩としては、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどのようなアルカリ土類金属、ならびに、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどのような非毒性の有機アミンから誘導されるものが挙げられる。
【００７３】
また本発明の医薬組成物は、薬理学的に許容される抗酸化剤を含んでもよい。薬理学的に許容される抗酸化剤の例としては、以下が挙げられる：（１）例えば、アスコルビン酸、塩酸システイン、硫化水素ナトリウム、異性重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどの水溶性抗酸化剤；（２）例えば、アスコルビルパルミテート、ブチルヒドロキシアニゾール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロールなどの油溶性抗酸化剤；および（３）例えば、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などの金属キレート化剤。
【００７４】
本発明の医薬組成物に使用できる好適な水性および非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）およびこれらの好適な混合物、オリーブ油などの植物油ならびにオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが挙げられる。適切な流動度は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用により、また、分散液の場合には必要な粒子サイズの維持により、および界面活性物質の使用により、維持され得る。
【００７５】
これらの組成物はまた、例えば、防腐剤、湿潤剤、乳化剤および／または分散剤を含有してもよい。微生物の存在の防止は、滅菌手順、および各種の抗菌ならびに抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールおよびソルビン酸などの含有の両方によって確実にできる。本発明の組成物に例えば糖、塩化ナトリウムなどを含めることも望ましいかもしれない。加えて、注射可能な剤型の長期にわたる吸収を、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅らせる薬剤の含有によって引き起こしてもよい。
【００７６】
治療用組成物は、通常は、無菌でありかつ製造および保管条件下で安定でなければならない。滅菌注射用溶液は、上に列挙された成分の１つまたは組合せと共に適切な溶媒中に必要量で活性化合物を組み入れ、必要に応じて、その後に滅菌精密濾過することによって調製できる。本発明の組成物は、溶液、マイクロエマルション、リポソーム、または高薬物濃度に好適な他の規則構造として製剤化できる。担体は、溶剤または分散媒であってよく、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、およびこれらの適当な混合物を含む。適切な流動度は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用により、分散液の場合には必要な粒子サイズの維持により、および界面活性物質の使用により、維持できる。多くの場合に、等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを本発明の組成物中に含めることが好ましい。
【００７７】
単一剤形を製造するために担体材料と組み合わせることができる有効成分の量は、処置される対象および特定の投与様式によって異なるであろう。単一剤形を製造するために担体材料と組み合わせることができる有効成分の量は一般に、治療効果をもたらす本発明の組成物の量であろう。一般に、この量は１００パーセント中、薬理学的に許容される担体と組み合わせて、約０．０１パーセント〜約９９パーセントの有効成分、好ましくは約０．１パーセント〜約７０パーセントの有効成分、最も好ましくは約１パーセント〜約３０パーセントの有効成分の範囲である。
【００７８】
投与計画は、最適な望ましい応答（例えば、治療応答）をもたらすように調整される。例えば、単回ボーラス投与してよく、いくつかの分割量を経時的に投与してよく、または治療状況の緊急性により示唆されるように投与量を相対的に減少または増加させてもよい。非経口組成物は、投与の容易さおよび投与量の均一性のために単位剤形で製剤化できる。本明細書で使用する場合、単位剤形は、処置される対象のための単位投与量として適する物理的に分離した単位を指し；各単位は、必要な薬学的担体と共同して望ましい治療効果をもたらすように算出された所定量の活性化合物を含有する。単位剤形の規格は、（ａ）活性化合物に固有の特徴および達成されるべき特定の治療効果、および（ｂ）個体における感受性を処置するためのこのような活性化合物を配合する技術に固有の制限事項、によって決定され、かつそれらに直接的に依存する。
【００７９】
本明細書で開示される化合物の全身投与について、投与量は一般的に、約０．００００１〜１００ｍｇ／宿主体重ｋｇ、およびより通常には０．１〜１００μｇ／宿主体重ｋｇの範囲である。例えば、投与量は、０．１μｇ／ｋｇ体重、０．５μｇ／ｋｇ体重、５μｇ／ｋｇ体重、１０μｇ／ｋｇ体重、３０μｇ／ｋｇ体重、０．１ｍｇ／ｋｇ体重、０．３ｍｇ／ｋｇ体重、０．５ｍｇ／ｋｇ体重または１ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。局所投与について、例示的な投与量濃度は、約１ｎｇ／ｍｌ〜約１０ｎｇ／ｍｌである。
【００８０】
本発明の医薬組成物中の有効成分の実際の投与量レベルは、特定の患者、組成物および投与様式について、当該患者に有毒でなく、望ましい治療応答を達成するのに有効な有効成分の量を得られるように異なっていてよい。選択される投与量レベルは、使用される特定の組成物またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、使用されている特定の化合物の投与経路、投与時間、排出速度、処置期間、使用される特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬剤、化合物および／または材料、処置されている患者の年齢、性別、体重、状態、健康状態および既往歴、ならびに医術において公知の類似の因子を含む種々の薬物動態学的因子に依存する。当業者はかかる量を、対象のサイズ、対象の症状の重症度、および特定の組成物または選択される投与経路などの因子に基づいて決定できるであろう。
【００８１】
製造方法
また、
（ｉ）Ｔ７ペプチド（配列番号１）、ＧＡ３ペプチド（配列番号２）、Ｔ４ペプチド（配列番号３）、Ｔ６ペプチド（配列番号４）および／またはＴ８ペプチド（配列番号５）またはこれらのレトロインベルソペプチドであるペプチドを式（ＩＩ）
【化１０】
2020506223.tif 000012
のチオール化合物と反応させて式（ＩＩＩ）
【化１１】
2020506223.tif 000013
の化合物またはその塩を得ること；
（ｉｉ）式（ＩＩＩ）の化合物を式（ＩＶ）
【化１２】
2020506223.tif 000014
のＰＥＧ四量体と反応させて式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩を得ること；
を含む本明細書で開示される式（Ｉ）の化合物の製造方法も本明細書において提供される（ここで、変数ｎ、ＸおよびＹは上に定義されるようであり、ＬＧは好適な脱離基であり、ＰＧはＨまたは好適な保護基である）。
【００８２】
一実施形態では、好適な脱離基は、ハロ、トシラートまたはメシラートである。更なる実施形態では、脱離基は、ブロモである。
【００８３】
一実施形態では、好適な保護基は、トリチルである。
【００８４】
一実施形態では、式（ＩＩＩ）の化合物は、トリフルオロ酢酸塩、酢酸塩または塩酸塩などの酸付加塩である。
【００８５】
いくつかの実施形態では、ペプチド（Ｒ）をポリスチレン樹脂に最初に結合させる。別の実施形態では、当該ポリスチレン樹脂に結合された当該ペプチドを次いで、式（ＩＩ）のチオール化合物と反応させる。更なる実施形態では、式（ＩＩＩ）の化合物はポリスチレン樹脂に結合され、それは式（ＩＶ）の化合物と反応させられる前に切断される。
【００８６】
一実施形態では、式（ＩＩＩ）の化合物と式（ＩＶ）の化合物の間の反応は、約５〜約８、または約６〜約８、または約６〜約７の間のｐＨ、またはｐＨ６．５で実施される。
【００８７】
他の実施形態では、式（ＩＩＩ）のチオール化合物が、上記のような、かつ不飽和部分を更に含有する四量体ＰＥＧ分子と共にマイケル付加反応において求核試薬として使用される。例えば、式（ＩＩＩ）の化合物を、
【化１３】
2020506223.tif 000015
［式中、Ｔはアクリレート部分またはビニルスルホン部分などの不飽和部分である］などの四量体ＰＥＧ分子と反応させる。
【００８８】
他の実施形態では、アクリレート部分は、
【化１４】
2020506223.tif 000016
である。
【００８９】
他の実施形態では、ビニルスルホン部分は、
【化１５】
2020506223.tif 000017
である。
【００９０】
一実施形態では、式（ＩＩＩ）の化合物のチオール部分は、マイケル付加反応において求核試薬として作用して
【化１６】
2020506223.tif 000018
2020506223.tif 000019
［式中、ＲおよびＹは上記に定義されるようである］などの、本開示の更なる化合物を形成する。
【００９１】
方法および使用
Ｔｉｅ２活性化および血管新生の刺激
別の態様は、本明細書で開示される化合物の使用方法および使用に関する。本明細書において述べるように、本明細書で開示される化合物を使用して、インビトロまたはインビボのいずれかでＴｉｅ２受容体を活性化できる。したがって、一実施形態において、Ｔｉｅ２受容体を活性化するようにＴｉｅ２受容体を本明細書で開示される化合物と接触させることを含むＴｉｅ２受容体を活性化する方法が提供される。Ｔｉｅ２受容体を活性化するための本明細書で開示される化合物の使用もまた提供される。更に、Ｔｉｅ２受容体を活性化するための薬剤の調製における本明細書で開示される化合物の使用が提供される。また更に、Ｔｉｅ２受容体を活性化するのに使用するための本明細書で開示される化合物が提供される。
【００９２】
Ｔｉｅ２受容体の活性化は、各種のインビトロまたはインビボアッセイを含むがこれらに限定されない、当該技術分野において確立されているＴｉｅ２活性化の多数の考えられる指標のいずれかによって証明できる。一実施形態では、例えば、Ｔｉｅ２受容体の活性化は、Ｔｉｅ２受容体のチロシン残基、例えば、ヒトＴｉｅ２のチロシン９９２（Ｙ９９２）のリン酸化によって証明される。別の実施形態では、例えば、Ｔｉｅ２受容体の活性化は、ＭＡＰＫ、ＡＫＴまたはｅＮＯＳのリン酸化によって証明される。
【００９３】
本明細書で開示される化合物は、血管形成活性を有することが示されているバスキュロチドと比べて増大した応答の大きさおよび幅広い用量範囲を有することが示されたため（例えば、図３Ａ、Ｂ、４Ａ、Ｂ、５Ａ〜Ｃおよび８Ａを参照のこと）、その必要がある対象に本明細書で開示される化合物を投与することを含む対象において血管新生を刺激する方法もまた提供される。その必要がある対象における血管新生を刺激するための本明細書で開示される化合物の使用もまた提供される。更に、その必要がある対象において血管新生を刺激するための薬剤の調製における本明細書で開示される化合物の使用が提供される。また更に、その必要がある対象において血管新生を刺激するのに使用するための本明細書で開示される化合物が提供される。
【００９４】
一実施形態では、本発明の化合物によって刺激される血管新生は、以下の特性の少なくとも１つを特徴とする：
ａ）血管周囲支持細胞のリクルートメント；
ｂ）さもなければ漏出性であろう血管の非漏出性；
ｃ）明瞭な分枝；および、
ｄ）内皮細胞アポトーシスの阻害。
【００９５】
血管周囲支持細胞のリクルートメントは、平滑筋細胞のマーカーの検出によって、例えば、平滑筋アクチン１（Ｓｍａ１）、ＮＧ２またはデスミンに対する抗体による免疫染色によって実証できる。血管の非漏出性は、インビトロおよび／またはインビボでのアッセイを含む、当該技術分野において確立されている血管透過性アッセイを使用して評価できる。インビボでの血管透過性アッセイの非限定的な例は、エバンスブルーまたはＦＩＴＣアルブミンを使用するマイルスアッセイである。本明細書で使用する場合、血管は、当該血管の透過性の程度がＶＥＧＦ処理または他の血管炎症性メディエーター、例えばセロトニンまたはヒスタミンによる処理によってその発達が刺激された血管の透過性の程度より低い場合、「非漏出性である」とみなされる。明瞭な分枝は、例えば、新たに形成された血管のイメージングおよび特定の画像視野における血管の数およびリンパ節の数の定量によって実証できる。明瞭な分枝は、例えば、リンパ節の数に対する血管の数の比率が１．０：０．５、所望により１．０：０．７あるいは１．０：１．０である血管新生などの、血管の顕著な、かつ組織化された分枝形成により示される。更に、新生血管の流動態を、マイクロドップラー超音波を使用して評価できる。
【００９６】
血管新生を刺激する方法において、部位を本明細書で開示される化合物のみと接触させることができ、あるいは、部位を１種以上の追加の血管形成剤と接触させることができる。したがって、別の実施形態では、本発明の血管新生法は、対象における部位を第２の血管新生剤と接触させることを更に含む。本明細書で開示される化合物と組み合わせて使用できる追加の血管新生剤の非限定的な例としては、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、組換えヒトエリスロポイエチン、ｂＦＧＦおよび胎盤増殖因子（ＰＬＧＦ）が挙げられる。よって、一実施形態では、第２の血管新生剤は、ＶＥＧＦである。別の実施形態では、第２の血管新生剤は、ＰＤＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、組換えヒトエリスロポイエチン、ｂＦＧＦ、Ａｎｇ２阻害剤、および胎盤増殖因子（ＰＬＧＦ）からなる群から選択される。
【００９７】
血管新生を刺激する本明細書で開示される化合物の能力を考えれば、本明細書で開示される化合物を、血管新生の促進が望ましい種々の臨床的状況において使用できる。このような適応症の非限定的な例としては、再生組織の血管新生、虚血肢疾患、脳虚血、動脈硬化を含む血管炎症状態、虚血壊死、発毛刺激および勃起不全が挙げられる。
【００９８】
本明細書において、その必要がある対象における部位に本明細書で開示される化合物を投与することを含む漏出性血管の部位で血管透過性を減少させる方法もまた提供される。その必要がある対象における漏出性血管の部位での血管透過性を減少させるための本明細書で開示される化合物の使用もまた提供される。更に、その必要がある対象における漏出性血管の部位で血管透過性を減少させるための薬剤の調製における本明細書で開示される化合物の使用が提供される。また更に、その必要がある対象における漏出性血管の部位で血管透過性を減少させるのに使用するための本明細書で開示される化合物が提供される。
【００９９】
一実施形態では、対象は、脳卒中、黄斑部変性、黄斑浮腫、リンパ浮腫、血液網膜関門の破壊、血液脳関門の破壊、細菌により誘発された血管漏出を有するまたは有したことがある、または腫瘍血管系の正常化を必要とする。
【０１００】
バスキュロチドは以前に、例えば、内皮細胞のアポトーシスを阻害することにより、内皮細胞に対する防護効果を有することが示されている。腎血管系の内皮細胞を保護するＴｉｅ２作用薬の能力は、実験モデルでの腎臓線維症を改善すると報告されている（Ｋｉｍ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．（２００６）  Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．１７：２４７４−２４８３）。ＭＰＡ−Ｂｒは本明細書において、ＨＵＶＥＣ、ＨＭＶＥＣ中で、ならびに初代ラット、イヌおよびカニクイザルの内皮細胞中でＴｉｅ２リン酸化を引き起こすことが示された。ＶＴはごく最近、Ｔｈａｍｍ  Ｋら（２０１６）によって移植（マウスにおける）後の急性腎臓損傷を改善することが示された。これは、ＶＴを投与されたそれらのマウスにおける低減された移植関連腎臓線維症にも結びついた。Ｒｕｂｉｇ  Ｅら（２０１６）は、ＶＴが虚血−再灌流後の急性腎臓損傷の程度を低減することを示した。損傷の低減は、生存期間の延長、損傷した腎臓内の血流の改善、血管漏出の低減によって特徴付けられた。
【０１０１】
したがって、本明細書において、その必要がある対象に本明細書で開示される化合物を投与することを含む内皮細胞を保護する方法が提供される。また、その必要がある対象において内皮細胞を保護するための本明細書で開示される化合物の使用も提供される。更に、その必要がある対象において内皮細胞を保護するための薬剤の調製における本明細書で開示される化合物の使用が提供される。また更に、その必要がある対象において内皮細胞を保護するための本明細書で開示される化合物が提供される。
【０１０２】
かかる方法または使用は、種々の臨床的状況において使用でき、その非限定的な例としては肺損傷、腎臓損傷、腎臓線維症、脳卒中、血管性認知症、黄斑部変性および（例えば、腎臓、眼、皮膚および／または四肢における）糖尿病合併症が挙げられる。
【０１０３】
また更に、その必要がある対象において創傷に本明細書で開示される化合物を投与することを含む創傷の治癒を刺激する方法が提供される。その必要がある対象において創傷の治癒を刺激するための本明細書で開示される化合物の使用もまた提供される。更に、その必要がある対象において創傷の治癒を刺激するための薬剤の調製における本明細書で開示される化合物の使用が提供される。また更に、その必要がある対象において創傷の治癒を刺激するのに使用するための本明細書で開示される化合物が提供される。
【０１０４】
創傷治癒の刺激は、例えば、本発明の化合物の非存在下での創傷治癒と比較して加速された閉創時間、無処置と比較して増加された創傷部位での肉芽組織および／または無処置と比較して増強された創傷の新血管新生によって証明できる。
【０１０５】
一実施形態では、創傷の治癒を刺激する方法または使用は、糖尿病性潰瘍の処置において使用される。
【０１０６】
他の実施形態では、創傷の治癒を刺激する方法または使用は、褥瘡性潰瘍、圧迫潰瘍、外科切開部、外傷性組織損傷、火傷および皮膚移植部位を含むがこれらに限定されない、創傷を伴う種々の臨床的状況において使用できる。
【０１０７】
好酸球および／または塩基好性に関連する病態
ＭＰＡ−Ｂｒは、バスキュロチドと比較して改善した標的結合および薬物動態を有する化合物であり、これは以前にＣＦＵ−Ｇ細胞の増殖を阻害することが示されている。
【０１０８】
したがって、本明細書において、その必要がある対象に本明細書で開示される化合物を投与すること含むＣＦＵ−Ｇ細胞の増殖を阻害する方法が提供される。また本開示は、その必要がある動物または細胞においてＣＦＵ−Ｇ細胞の増殖を阻害するための本明細書で開示される化合物の使用も提供する。また、その必要がある動物または細胞においてＣＦＵ−Ｇ細胞の増殖を阻害するための薬剤の調製における本明細書で開示される化合物の使用も提供される。更に、その必要がある動物または細胞においてＣＦＵ−Ｇ細胞の増殖を阻害するのに使用するための本明細書で開示される化合物が提供される。
【０１０９】
本明細書で使用する場合、用語「ＣＦＵ−Ｇ」はコロニー形成単位顆粒球細胞を指し、顆粒球細胞は好酸球、好塩基球および好中球などの顆粒球を産生する一種の造血細胞である。本明細書で使用する場合、「増殖の阻害」は、未処理の対照と比較した顆粒球コロニー形成細胞数の少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％以上の減少を指す。
【０１１０】
ＭＰＡ−Ｂｒは、バスキュロチドと比較して改善された結合および薬物動態を有する化合物であり、これは以前に、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球または好中球のより全般的な免疫抑制を伴わずにアトピー性疾患の低減、循環好酸球および好塩基球の減少をもたらすことが示されている。したがって、本開示は、本明細書で開示される化合物を投与することを含む、その必要がある動物または細胞において好酸球および／または好塩基球を減少させる方法も提供する。また本開示は、その必要がある動物または細胞において好酸球および／または好塩基球を減少させるための本明細書で開示される化合物の使用も提供する。また、その必要がある動物または細胞において好酸球および／または好塩基球を減少させるための薬剤の調製における本明細書で開示される化合物の使用も提供される。更に、その必要がある動物または細胞において好酸球および／または好塩基球を減少させるのに使用するための本明細書で開示される化合物が提供される。
【０１１１】
本明細書で使用する場合、語句「好酸球および／または好塩基球を減少させる」は、対照と比較して少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％または８０％少ない好酸球および／または好塩基球が循環している、循環好酸球および／または好塩基球数の減少を指す。更に、好塩基球の減少は肥満細胞の減少をもたらし、したがって好塩基球の減少は肥満細胞の減少を含む。
【０１１２】
好酸球および好塩基球は、アレルギー応答に関係付けられている。更に、ＭＰＡ−Ｂｒは本明細書において、皮膚のヒスタミン曝露後の血管漏出を減弱することが示された。
【０１１３】
したがって、本開示は、本明細書で開示される化合物を投与することを含む、その必要がある動物または細胞においてアレルギー疾患またはアレルギー応答を処置する方法も提供する。本開示は、その必要がある動物または細胞においてアレルギー疾患またはアレルギー応答を処置するための本明細書で開示される化合物の使用も提供する。また、その必要がある動物または細胞においてアレルギー疾患またはアレルギー応答を処置するための薬剤の調製における本明細書で開示される化合物の使用も提供される。更に、その必要がある動物または細胞においてアレルギー疾患またはアレルギー応答を処置するのに使用するための本明細書で開示される化合物が提供される。
【０１１４】
本明細書で使用する場合、用語「処置または処置する」は、臨床結果を含む、有益であるかまたは望ましい結果を得るための取り組みを意味する。有益であるかまたは望ましい臨床結果としては、検出できるか検出できないかに関わらず、１つ以上の症状または病状の緩和または改善、疾患の程度の減少、疾患の安定化された（すなわち悪化しない）状態、疾患の蔓延の予防、疾患進行の遅延または緩徐化、病態の改善または緩和、および寛解（部分的または完全のいずれかである）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１５】
一実施形態では、アレルギー疾患またはアレルギー応答は、アトピー性疾患である。本明細書で使用する場合、用語「アトピー性疾患」は、アレルゲンと直接接触していない体の部分に影響を及ぼすアレルギー性過敏症を指し、動物の血清中ＩｇＥレベルの増加によって定義される。一実施形態では、アトピー性疾患は、アトピー性皮膚炎／湿疹、喘息、結膜炎、慢性副鼻腔炎、好酸球食道炎、食物アレルギーまたはアレルギー性鼻炎／枯草熱である。喘息、アレルギー性鼻炎およびアトピー性皮膚炎は、一般にアトピー性三徴候と称され、多くの場合、アトピー性皮膚炎が最初に顕在化し（Ｅｉｃｈｅｎｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．２００３）、一般に、喘息の発症および／またはアレルギー性鼻炎が後に続く。したがって、一実施形態では、アトピー性疾患は、アトピー性皮膚炎である。別の実施形態では、アトピー性疾患は、喘息である。
【０１１６】
別の実施形態では、本開示は、本明細書で開示される化合物を投与することを含む、その必要がある動物または細胞において好酸球および／または好塩基球に関連する病状を処置する方法も提供する。本開示は、その必要がある動物または細胞において好酸球および／または好塩基球に関連する病状を処置するための本明細書で開示される化合物の使用も提供する。また、その必要がある動物または細胞において好酸球および／または好塩基球に関連する病状を処置するための薬剤の調製における本明細書で開示される化合物の使用も提供される。更に、その必要がある動物または細胞において好酸球および／または好塩基球に関連する病状を処置するのに使用するための本明細書で開示される化合物が提供される。一実施形態では、好酸球および／または好塩基球に関連する病状は、骨髄異形成症候群である。別の実施形態では、好酸球および／または好塩基球に関連する病状は、好酸球および／または好塩基球起源の白血病、例えば、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、慢性好酸球性白血病、急性好酸球性白血病、好酸球増加を伴う慢性骨髄単球性白血病および急性好塩基球性白血病である。別の実施形態では、好酸球および／または好塩基球に関連する病状は、炎症性腸疾患である。更に別の実施形態では、好酸球および／または好塩基球に関連する病状は、寄生虫感染である。更に別の実施形態では、好酸球および／または好塩基球に関連する病状は、特発性好酸球増加症候群（ＨＥＳ）である。
【０１１７】
本開示は、本明細書で開示される化合物を投与することを含む、その必要がある動物または細胞において炎症性サイトカインおよび／またはケモカインレベルを減少させる方法もまた提供する。本開示は、その必要がある動物または細胞において炎症性サイトカインおよび／またはケモカインレベルを減少させるための本明細書で開示される化合物の使用もまた提供する。また、その必要がある動物または細胞において炎症性サイトカインおよび／またはケモカインレベルを減少させるための薬剤の調製における本明細書で開示される化合物の使用も提供される。更に、その必要がある動物または細胞における炎症性サイトカインおよび／またはケモカインレベルを減少させるのに使用するための本明細書で開示される化合物が提供される。一実施形態では、炎症性サイトカインおよび／またはケモカインレベルは、血清炎症性サイトカインおよび／またはケモカインレベルである。一実施形態では、炎症性サイトカインおよび／またはケモカインは、エオタキシン、ＩＬ−１７、ＭＩＧ、ＩＬ１２／ＩＬ２３（ｐ４０）、ＩＬ−９、ＭＩＰ−１ａ、ＭＩＰ−１ｂ、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、およびＭＣＰ−１の少なくとも１つを含む。別の実施形態では、炎症性サイトカインおよびケモカインは、ＩＬ−１７、ＭＩＧ、ＩＬ１２／ＩＬ２３（ｐ４０）、ＩＬ−９、ＭＩＰ−１ａ、ＭＩＰ−１ｂ、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、およびＭＣＰ−１を含む。更に別の実施形態では、炎症性サイトカインおよび／またはケモカインは、エオタキシンを含む。かかる方法および使用は、炎症性サイトカインおよび／またはケモカインの増加に関連する疾患および症状の処置における治療適用を有する。
【０１１８】
一実施形態では、本発明の方法および使用は、本明細書で開示される化合物と組み合わせた免疫調節剤またはコルチコステロイドの投与または使用を更に含む。
【０１１９】
インフルエンザ
ＭＰＡ−Ｂｒは、バスキュロチドのように、インフルエンザのマウスモデルでの病的状態および死亡率を改善することが示されているが、より低用量で効果がある。
【０１２０】
したがって、本明細書において、その必要がある対象に本明細書で開示される化合物を投与することを含むインフルエンザに感染した対象を処置する方法が提供される。また、インフルエンザに感染した対象を処置するための本明細書で開示される化合物の使用も提供される。更に、インフルエンザに感染した対象を処置するための薬剤の調製における本明細書で開示される化合物の使用が提供される。また更に、インフルエンザに感染した対象を処置するのに使用するための本明細書で開示する化合物が提供される。
【０１２１】
本開示は、本明細書で開示される化合物を投与することを含む、インフルエンザに感染した細胞または動物において肺内皮性漏出を減少させる方法も提供する。本開示は、インフルエンザに感染した細胞または動物において内皮性漏出を減少させるための本明細書で開示される化合物の使用も提供する。また、インフルエンザに感染した細胞または動物において内皮性漏出を減少させるための薬剤の調製における本明細書で開示される化合物の使用も提供される。更に、インフルエンザに感染した細胞または動物において内皮性漏出を減少させるのに使用するための本明細書で開示される化合物が提供される。
【０１２２】
本明細書で使用する場合、用語「インフルエンザ」は、オルソミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）のＲＮＡウイルスによって引き起こされる感染性疾患を指す。またインフルエンザという用語は、原発性ウイルス肺炎も指す。一実施形態では、インフルエンザは、ヒトインフルエンザウイルスによって引き起こされる疾患である。ヒトインフルエンザウイルスは、それらのヘマグルチニン分子中の特定の塩基性アミノ酸の欠如によって鳥インフルエンザウイルス（例えば、Ｈ５Ｎ１鳥インフルエンザ）と区別できる；この欠如は気道内に含まれるトリプシン様プロテアーゼに対する切断を限定する。したがって、ヒトインフルエンザは主に気道上皮に感染し、上皮の損傷、アポトーシスおよび落屑をもたらす（Ｋｕｉｋｅｎ  ａｎｄ  Ｔａｕｂｅｎｂｅｒｇｅｒ，２００８）。対照的に、鳥インフルエンザウイルスは、気道外で複製し、内皮細胞を標的にできる。ヒトインフルエンザウイルスはまた、ヒトインフルエンザウイルスがヒトからヒトへと伝播できるが鳥インフルエンザウイルスはヒトからヒトへと伝播できないことに基づいて鳥インフルエンザウイルスと区別できる。ヒトインフルエンザウイルスの非限定的な例としては、以下が挙げられる。：Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ２Ｎ２およびＨ１Ｎ２。
【０１２３】
本明細書で使用する場合、用語「肺内皮性漏出」は、関門完全性の消失または肺微小血管内皮の透過性の増加を指す。用語「肺内皮性漏出を減少させる」は、本明細書に記載される方法および使用によって処理されない対照と比較して少なくとも５、１０、１５、２５、５０、７５または１００％の肺内皮性漏出の減少を指す。一実施形態では、肺内皮性漏出は、デキストランなどのフルオレセイン標識された化合物の蛍光または経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）により測定される。用語「肺内皮性漏出を減少させる」は、本明細書に記載される方法および使用によって処理されない対照と比較して少なくとも５、１０、１５、２５、５０、７５または１００％の肺微小血管内皮の透過性の増加も指す。
【０１２４】
インフルエンザの低用量感染は、肺内皮を、細菌へのその後の曝露時に漏出増加しやすくさせ（プライミングとして公知の現象）、バスキュロチドはこのプライミングによって誘発された漏出を抑止できることが以前に示された。改善されたＴｉｅ２受容体結合を有し、かつインフルエンザのマウスモデルにおいて必要とされるより低い用量を有するＭＰＡ−Ｂｒは、同一のまたはより低い用量で同程度のまたは改善された活性を提供すると予想される。
【０１２５】
したがって、本開示は、本明細書で開示される化合物を投与することを含む、その必要がある動物または細胞においてインフルエンザを伴う細菌重複感染を処置する方法も提供する。また本開示は、その必要がある動物または細胞においてインフルエンザを伴う細菌重複感染を処置するための本明細書で開示される化合物の使用も提供する。また、その必要がある動物または細胞においてインフルエンザを伴う細菌重複感染を処置するための薬剤の調製における本明細書で開示される化合物の使用も提供される。更に、その必要がある動物または細胞においてインフルエンザを伴う細菌重複感染を処置するのに使用するための本明細書で開示される化合物が提供される。
【０１２６】
また本開示は、本明細書で開示される化合物を投与することを含む、インフルエンザを伴う細菌重複感染を有する動物または細胞において生存期間を延長させる方法および／または死亡率を減少させる方法も提供する。また本開示は、インフルエンザを伴う細菌重複感染を有する動物または細胞において生存期間を延長させるためのおよび／または死亡率を減少させるための本明細書で開示される化合物の使用も提供する。また、インフルエンザを伴う細菌重複感染を有する動物または細胞において生存期間を延長させるための薬剤および／または死亡率を減少させるための薬剤の調製における本明細書で開示される化合物の使用も提供される。更に、インフルエンザを伴う細菌重複感染を有する動物または細胞において生存期間を延長させるおよび／または死亡率を減少させるのに使用するための本明細書で開示される化合物が提供される。
【０１２７】
本開示は、本明細書で開示される化合物を投与することを含む、インフルエンザを伴う細菌重複感染を有する動物または細胞において肺内皮性漏出を減少させる方法も提供する。本開示は、インフルエンザを伴う細菌重複感染を有する動物または細胞において肺内皮性漏出を減少させるための本明細書で開示される化合物の使用も提供する。また、インフルエンザを伴う細菌重複感染を有する動物または細胞において肺内皮性漏出を減少させるための薬剤の調製における本明細書で開示される化合物の使用も提供される。更に、インフルエンザを伴う細菌重複感染を有する動物または細胞において肺内皮性漏出を減少させるのに使用するための本明細書で開示される化合物が提供される。
【０１２８】
本明細書で使用する場合、用語「細菌重複感染」は、低用量インフルエンザ感染を含む、インフルエンザ一次感染によって二次的に生じるかまたは、通常その後に生じる細菌感染を指す。細菌重複感染は、インフルエンザ感染後と同時にまたはその後に発生する肺炎と定義することもできる。一実施形態では、細菌重複感染の原因となる細菌は、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）または肺炎球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）などのグラム陽性菌である。理論に拘束されるものではないが、インフルエンザは肺内皮を予備刺激し、肺内皮を二次細菌感染が生じた場合に漏出に対してより感受性にすると考えられている。結果として、細菌重複感染は、さもなければ日常的なインフルエンザによる感染後に重篤な肺損傷を引き起こし得る。
【０１２９】
本明細書で使用する場合、「インフルエンザを伴う細菌重複感染」という表現は、一実施形態において、インフルエンザ感染と同時にまたは並行して発生する細菌重複感染を指す。別の実施形態では、「インフルエンザを伴う細菌重複感染」という表現は、インフルエンザ感染後に、またはそれに続いて発生する細菌重複感染を指す。
【０１３０】
抗ウイルス剤による現在の処置は、最初の感染開始と処置の間の時間がたつほど効果的でなく、このことは、患者は必ずしも症状が生じた直後に処置のために来院しないために問題である。抗ウイルス剤による処置の有効性の減少とは対照的に、バスキュロチドは、遅れて投与された場合であっても効果的であることが以前に実証されており、ＭＰＡ−Ｂｒも感染後４８時間遅れて投与された場合に効果を示した。
【０１３１】
したがって、一実施形態において、本明細書で開示される化合物は、感染の約２４時間後または少なくとも２４時間後に使用されるかまたは投与される。別の態様において、本明細書で開示される化合物は、感染の約４８時間後または少なくとも４８時間後に使用されるかまたは投与される。更に別の実施形態では、本明細書で開示される化合物は、感染の約７２時間後または少なくとも７２時間後に使用されるかまたは投与される。
【０１３２】
バスキュロチドによる処置はまた以前に、インフルエンザによる原発性ウイルス肺炎および急性肺損傷のマウスモデルにおいて抗ウイルス剤による処置の有効性を低下させず、生存期間を延長することも示された。ＭＰＡ−Ｂｒは、同一のまたはより低い用量で同程度のまたは改善した活性を有するであろうと予測される。したがって、本開示は、その必要がある動物または細胞に（ａ）本明細書で開示される化合物および（ｂ）抗ウイルス剤を投与することを含む、インフルエンザに感染した動物または細胞を処置する方法も提供する。また本開示は、インフルエンザに感染した動物または細胞を処置するための（ａ）本明細書で開示される化合物および（ｂ）抗ウイルス剤の使用も提供する。また、インフルエンザに感染した動物または細胞を処置するための薬剤の調製における（ａ）本明細書で開示される化合物および（ｂ）抗ウイルス剤の使用も提供される。更に、インフルエンザに感染した動物または細胞を処置するのに使用するための（ａ）本明細書で開示される化合物および（ｂ）抗ウイルス剤が提供される。
【０１３３】
本開示は、（ａ）本明細書で開示される化合物および（ｂ）抗ウイルス剤を投与することを含む、インフルエンザに感染した細胞または動物において生存期間を延長させる方法および／または死亡率を減少させる方法も提供する。本開示は、インフルエンザに感染した細胞または動物において生存期間を延長させるためおよび／または死亡率を減少させるための（ａ）本明細書で開示される化合物および（ｂ）抗ウイルス剤の使用も提供する。また、インフルエンザに感染した細胞または動物において生存期間を延長させるためおよび／または死亡率を減少させるための薬剤の調製における（ａ）本明細書で開示される化合物および（ｂ）抗ウイルス剤の使用も提供される。更に、インフルエンザに感染した細胞または動物において生存期間を延長させるためおよび／または死亡率を減少させるために使用するための（ａ）本明細書で開示される化合物および（ｂ）抗ウイルス剤が提供される。
【０１３４】
本開示は、（ａ）本明細書で開示される化合物および（ｂ）抗ウイルス剤を投与することを含む、インフルエンザに感染した細胞または動物において肺内皮性漏出を減少させる方法も提供する。本開示は、インフルエンザに感染した細胞または動物において肺内皮性漏出を減少させるための（ａ）本明細書で開示される化合物および（ｂ）抗ウイルス剤の使用も提供する。また、インフルエンザに感染した細胞または動物において肺内皮性漏出を減少させるための薬剤の調製における（ａ）本明細書で開示される化合物および（ｂ）抗ウイルス剤の使用も提供される。更に、インフルエンザに感染した細胞または動物において肺内皮性漏出を減少させるのに使用するための（ａ）本明細書で開示される化合物および（ｂ）抗ウイルス剤が提供される。
【０１３５】
本明細書で使用する場合、用語「抗ウイルス剤」は、インフルエンザウイルスによる感染などのウイルス感染を処置するために使用される薬剤を指す。一実施形態では、抗ウイルス剤は、ウイルスの複製能力を抑制する薬剤である。抗ウイルス剤の例としては、アマンタジン、リマンタジン、ザナミビル、ペラミビル、ビラミジン、リバビリンおよびオセルタミビル（別名タミフル（登録商標））が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３６】
本明細書で使用する場合、用語「処置または処置する」は、臨床結果を含む、有益であるかまたは望ましい結果を得るための手法を意味する。有益であるかまたは望ましい臨床結果としては、検出できるまたは検出できないかに関わらず、１つ以上の症状または病状の緩和または改善、疾患の程度の減少、疾患の安定化された（すなわち悪化しない）状態、疾患の蔓延の予防、疾患進行の遅延または緩徐化、病態の改善または緩和、および寛解（部分的または完全のいずれかである）が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用する場合、用語「処置または処置する」は、インフルエンザウイルス感染に続発する細菌重複感染を予防するまたは遅延することも含む。インフルエンザ処置の有益な結果の例としては、生存期間を延長させること、死亡率を減少させること、肺内皮性漏出を減少させること、体重減少を減少させることおよび／または低体温を予防することならびに動脈血酸素化を改善することが挙げられる。
【０１３７】
本明細書で使用する場合、用語「生存期間を延長させること」は、インフルエンザ感染および／またはインフルエンザを伴う細菌重複感染後の動物が生存する時間を増加させることを意味する。一実施形態では、用語「生存期間を延長させること」は、本明細書に記載される方法および使用で処置されない動物と比較して少なくとも５、１０、２５、５０、７５、１００、２００％のインフルエンザ感染後に動物が生存する時間の増加を指す。
【０１３８】
本明細書で使用する場合、用語「死亡率を減少させること」は、本明細書に記載される方法および使用で処置されない動物と比較した場合にインフルエンザおよび／またはインフルエンザを伴う細菌重複感染による動物または細胞の死亡率を低下させること意味する。一実施形態では、死亡率は、本明細書に記載される方法および使用で処置されない動物と比較した場合に少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５％低下される。
【０１３９】
用語「投与すること」は、インビトロまたはインビボでの動物へのまたは細胞への本明細書に記載される薬剤の投与を含む。
【０１４０】
本明細書で使用する場合、用語「対象」または「動物」は、ヒトを含む動物界の全てのメンバーを含む。
【０１４１】
用語「細胞」は、単一の細胞および複数の細胞または細胞集団を含む。細胞へ投与することは、インビトロ（またはエクスビボ）ならびにインビボで投与することを含む。
【０１４２】
本明細書で開示される化合物は、局所的に、全身的に、経口的に、鼻腔内に、または、吸入によって、を含む任意の好適な方法によって投与できる。
【０１４３】
抗ウイルス剤は、局所的に、全身的に、経口的に、鼻腔内に、または、吸入によって、を含むがこれらに限定されない任意の好適な方法で投与することもできる。
【０１４４】
本明細書で開示される化合物および抗ウイルス剤は、並行して（同時に）投与できる。別の実施形態では、本明細書で開示される化合物および抗ウイルス剤は、逐次的に投与できる。本明細書で開示される化合物は、抗ウイルス剤の前に投与されてよく、または抗ウイルス剤は本明細書で開示される化合物の前に投与されてよい。一実施形態では、本明細書で開示される化合物は、抗ウイルス剤の約２４時間後または少なくとも２４時間後に使用されるかまたは投与される。別の態様において、本明細書で開示される化合物は、抗ウイルス剤の約４８時間後または少なくとも４８時間後に使用されるかまたは投与される。更に別の実施形態では、本明細書で開示される化合物は、抗ウイルス剤の約７２時間後または少なくとも７２時間後に使用されるかまたは投与される。
【０１４５】
本明細書に記載される薬剤の「有効量」の投与は、望ましい結果を達成するのに必要な用量でかつ期間の間、効果的な量と定義される。本明細書で開示される化合物の有効量は、動物の病態、年齢、性別、および重量などの因子によって異なってよい。抗ウイルス剤の有効量は、動物の病態、年齢、性別、および重量などの因子によって異なってもよい。
【０１４６】
投与計画は、最適な治療応答を提供するように調整されてよい。例えば、いくつかに分割した用量を毎日投与でき、または用量を治療状況の要求により示唆されるとおりに相対的に減少することができる。投与様式（例えば、注射剤または局所適用によるインビボ、または培養物でのエクスビボ）もまた投与計画に影響を与えるであろう。
【０１４７】
本明細書に記載される方法および使用は、単独でのまたは本明細書で開示される化合物を含む医薬組成物の一部としての本明細書で開示される化合物の投与または使用を含む。
【０１４８】
一実施形態において、本明細書における方法および使用において使用するための本明細書で開示される化合物を含む医薬組成物は、本明細書で開示される抗ウイルス剤および／または第２の血管新生剤を更に含む。所望により、本発明の組成物は、薬理学的に許容される担体を更に含む。
【０１４９】
かかる医薬組成物は、病巣内用、静脈内用、表面用、直腸用、非経口用、局所用、吸入用、鼻腔内用または皮下用、皮内用、筋肉内用、髄腔内用、経腹膜用、経口用および脳内用であり得る。本発明の組成物は、液状、固形状または半固形状、例えば、丸剤、錠剤、クリーム、ゼラチンカプセル、カプセル、坐剤、軟ゼラチンカプセル剤、ゲル、膜、錠剤、溶剤または懸濁液であり得る。本発明の組成物は、灌流液形態でもあり得る。
【０１５０】
本発明の医薬組成物は、患者に投与できる薬理学的に許容される組成物の調製のためのそれ自体既知の方法によって、有効量の作用物質を薬理学的に許容される媒体と混合物中で組みを合わせるように調製できる。好適な媒体は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  （Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，ＵＳＡ  ２００３  −  ２０ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）および１９９９年に発行されたＴｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ：Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ  （ＵＳＰ２４、ＮＦ１９）に記載されている。
【０１５１】
これに基づき、本明細書に記載される使用および／または方法に使用するための医薬組成物は、１種以上の薬理学的に許容される媒体または希釈剤を伴い活性な化合物または物質を含み（しかし、これらに限定さない）、好適なｐＨを有する緩衝液および等張の生理液中に含有される。本発明の医薬組成物は、コルチコステロイドおよび免疫モジュレーターなどの他の薬剤を追加で含有できる。
【０１５２】
また、（ａ）本明細書で開示される化合物および（ｂ）本明細書で開示される抗ウイルス剤および／または第２の血管新生剤を含む組成物も提供される。所望により、本発明の組成物は、薬理学的に許容される担体を更に含む。
【０１５３】
更に、（ａ）本明細書で開示される化合物および（ｂ）本明細書で開示される第２の血管新生剤を含むキットが提供される。一実施形態では、本発明のキットは、容器を更に含む。別の実施形態では、本発明のキットは、その必要がある動物または細胞において血管新生を刺激するためおよび／または本明細書で開示される方法および使用を実施するための本発明のキットの使用のための使用説明書を含有する。
【０１５４】
更に、（ａ）本明細書で開示される化合物および（ｂ）本明細書において記載される抗ウイルス剤を含むキットが提供される。一実施形態では、本発明のキットは、容器を更に含む。別の実施形態では、本発明のキットは、その必要がある動物または細胞においてインフルエンザを処置するため、および／またはインフルエンザを有する動物において生存期間を延長させることおよび／または死亡率を減少させるためのキットを使用するための使用説明書を含有する。他の実施形態では、本発明のキットは、その必要がある動物または細胞においてインフルエンザを伴う細菌重複感染を処置するためのキットを使用するための使用説明書を含有する。更なる実施形態では、本発明のキットは、インフルエンザに罹患した動物において肺内皮性漏出を減少させるためのキットを使用するための使用説明書を提供する。
【０１５５】
本発明のキットの本明細書で開示される化合物および抗ウイルス剤または第２の血管新生剤は所望により、同時使用または順次使用のためである。本明細書で開示される化合物は、抗ウイルス剤／第２の血管新生剤の前の使用のためであってよく、または抗ウイルス剤／第２の血管新生剤は、本明細書で開示される化合物の前の使用のためであってよい。
【０１５６】
生体材料
本明細書で開示される化合物は、生体材料に組み込まれてよく、それは次いで対象における部位に移植されて、これにより、その部位で本発明の化合物の効果を提供する。マトリックスまたは足場を提供する生体材料が使用に好適である。本発明の化合物は、単独で、または１種以上の追加の薬剤、例えばＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、組換えヒトエリスロポイエチン、ｂＦＧＦおよび胎盤増殖因子（ＰＬＧＦ）と組み合わせて組み込むことができる。好適な生体材料の非限定的な例としては、マトリゲル、代用皮膚および架橋グリコサミノグリカンヒドロゲル（例えば、Ｒｉｌｅｙ，Ｃ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２００６）  Ｊ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２７：５９３５−５９４３に記載されているように）が挙げられる。したがって、別の態様は、その中に本明細書で開示される化合物が単独でまたは１種以上の追加の薬剤と組み合わせて組み込まれる、生体材料組成物に関する。生体材料を含むパッケージ化された材料も包含される。パッケージ化された材料を、生体材料の使用のために標識できる。
【０１５７】
上記の開示内容は、一般に本出願を記載する。以下の具体例を参照することにより、より完全な理解を得ることができる。これらの例は、単に例証の目的で記載され、本出願の範囲を限定することを意図しない。状況が好都合であることを示唆または示す場合、形式の変化および等価物への置換が考慮される。特定の用語が本明細書において使用されたが、そのような用語は制限の目的ではなく記述的意味に意図される。
【０１５８】
以下の非限定的な例は、本開示の事例である：
【０１５９】
実施例
結果
トリプトファン蛍光分光法を使用する均一な種特異的組換え受容体集団への親化合物バスキュロチドおよびＭＰＡ−Ｂｒの結合の検出。
アミノ酸のトリプトファン、チロシンおよびフェニルアラニンは、２８０ｎｍの波長で、および特にトリプトファンについては２９５ｎｍの波長で励起された場合に内部蛍光特性を示す。この発光スペクトルは、タンパク質構造の立体配座およびその溶媒に高度に依存する。構造的立体配座に関して、リガンドのその受容体への結合により生じるスペクトルの変化が、用量依存的結合を特徴付ける内在性マーカーとして使用されてきた。この目的のために、種特異的なＴｉｅ２Ｆｃタンパク質の内部蛍光特性および、親化合物バスキュロチドまたはＭＰＡ−Ｂｒが存在する場合の発光スペクトルの変化を利用して結合動態を特徴付けた。
【０１６０】
内部蛍光強度の用量依存的増加が、組換えヒトＴｉｅ２Ｆｃ受容体とリガンド親化合物バスキュロチドまたはＭＰＡ−Ｂｒのインキュベーションにより観察された（図２Ａ、Ｃ）。両方の場合において、蛍光強度は飽和可能であることが分かった。特異的シグナルは、受容体とリガンドの複合体からリガンド単独により生成される蛍光強度を引くことによって導き出された。非線形回帰（１サイト特異的結合）を使用して、ヒトＴｉｅ２Ｆｃへの親化合物バスキュロチドおよびＭＰＡ−Ｂｒの正規化された特異的結合について得られたＫｄは、１０２．９ｎＭおよび２．６２３ｎＭである（図２Ｂ、Ｄ）。同一の研究が、組み換えマウスＴｉｅ２Ｆｃに対する親化合物バスキュロチドおよびＭＰＡ−Ｂｒについて、ならびに組換えラットＴｉｅ２Ｆｃおよび組換えカニクイザルＴｉｅ２ＦｃとＭＰＡ−Ｂｒ単独について実行された（生データ非表示）。測定された解離定数（Ｋｄ）を図２Ｇに列挙する。
【０１６１】
組換えＴｉｅ２受容体がヒトＩｇＧ  Ｆｃとの融合タンパク質であることから、組換えヒトＩｇＧ  Ｆｃの親化合物バスキュロチドまたはＭＰＡ−Ｂｒを結合する能力が測定された。重要なことに、蛍光強度の用量依存的増加は、どちらのリガンドについても観察されなかった（図２Ｅ、Ｆ）。
【０１６２】
親化合物バスキュロチドおよびＭＰＡ−Ｂｒは、ＨＵＶＥＣにおいてＴｉｅ２およびＭＡＰＫのリン酸化を引き起こす。
親化合物バスキュロチドおよびＭＰＡ−ＢｒのＴｉｅ２活性化能をヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）で評価した。異なる用量の両方のリガンドで処理されたＨＵＶＥＣは、Ｔｉｅ２および下流のシグナル伝達分子であるＭＡＰＫの活性化の増加を示した（図３Ａ、Ｂ）。一般に、ＭＰＡ−Ｂｒは、親化合物バスキュロチドが示すよりも増加した応答の大きさおよびより低い濃度で始まるより広い用量範囲を示し、親化合物バスキュロチドの１０００ｎｇ／ｍｌでの単一の有意な応答のみと比較して１０〜１００ｎｇの用量でＴｉｅ２を有意に活性化した。親化合物バスキュロチドおよびＭＰＡ−Ｂｒによる処理は、両方ともＴｉｅ２受容体に対する特徴的なベル型の用量応答を示した。この種の用量応答は、Ｔｉｅ２リガンドについて以前に記述されており、この受容体型チロシンキナーゼの活性化に関連する一般的な特徴であるように思われる（Ｂｒｋｏｖｉｃ  Ａ，ｅｔ  ａｌ  ２００７，Ｓｔｕｒｎ  ＤＨ，ｅｔ  ａｌ  ２００５，Ｍｕｒｄｏｃｈ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ  ２００７，Ｇｒｕｂｅｒ  ＢＬ，ｅｔ  ａｌ  １９９５  ａｎｄ  Ｍａｌｉｂａ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ  ２００８）。親化合物バスキュロチドまたはＭＰＡ−ＢｒいずれかによるＨＵＶＥＣの刺激は、ＭＡＰＫの下流の活性化をもたらした。ヒト組換えＡｎｇ１をＴｉｅ２およびＭＡＰＫ活性化研究のための陽性対照として使用した。
【０１６３】
親化合物バスキュロチドおよびＭＰＡ−Ｂｒは、ＨＭＶＥＣｔｅｒｔにおいてＴｉｅ２リン酸化を引き起こす。
ＨＵＶＥＣについて上で詳述したものと類似のＴｉｅ２活性化研究を、テロメラーゼによって不死化されたヒト微小血管内皮細胞（皮膚由来）（ＨＭＶＥＣｔｅｒｔ）で完了した。異なる血管床に由来する内皮細胞または相対的な内径の血管は異なる振る舞いをすることが広く受け入れられており、したがって、ＨＭＶＥＣｔｅｒｔを利用した研究は異なる由来のヒト内皮細胞の比較を容易にした。示された濃度の親化合物バスキュロチドまたはＭＰＡ−ＢｒによるＨＭＶＥＣｔｅｒｔの刺激は、Ｔｉｅ２受容体の用量依存的活性化をもたらした（図３Ａ）。この場合もまた、用量応答はベル型であり、ＭＰＡ−Ｂｒは０．２ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で統計的に有意なアゴニスト活性を示した。親化合物バスキュロチドによる刺激後の活性化は、５倍高い濃度で明白になり、１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌの範囲であった。Ｔｉｅ２活性化の相対的な大きさは、親化合物バスキュロチド（〜２．６倍）またはヒト組換えＡｎｇ１（８００ｎｇ／ｍｌ）と比較して、ＭＰＡ−Ｂｒ（〜３．３倍）でより大きかった。ＨＵＶＥＣおよびＨＭＶＥＣｔｅｒｔの両方における親化合物バスキュロチドと比較したＭＰＡ−Ｂｒのアゴニスト力価の増加は、ヒトＴｉｅ２受容体に対して示される改善した結合特性の作用である可能性がある（図２Ｇを参照のこと）。
【０１６４】
親化合物バスキュロチドおよびＭＰＡ−Ｂｒは、ＭＬＭＶＥＣにおいてＴｉｅ２リン酸化を引き起こす。
本明細書において詳述されるいくつかの前臨床有効性研究は、試験種としてマウスを利用する。したがって、親化合物バスキュロチドおよびＭＰＡ−ＢｒのＴｉｅ２アゴニスト力価を詳細に評価するために、マウス初代肺微小血管内皮細胞（ＭＬＭＶＥＣ）を使用するインビトロ細胞培養系を使用した。親化合物バスキュロチドおよびＭＰＡ−Ｂｒは、濃度特異的なベル型の用量応答を示した。ＭＰＡ−Ｂｒにより媒介されるＴｉｅ２の活性化は、１０ｎｇ／ｍｌ〜５０００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で明らかであり、一方、親化合物バスキュロチドは、１００ｎｇ／ｍｌ〜５０００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度でＴｉｅ２の活性化を促進した。Ｔｉｅ２受容体の誘導の相対的な大きさは、親化合物バスキュロチドおよびＭＰＡ−Ｂｒで差が無かったが、Ｔｉｅ２の統計的に有意な活性化は、ＭＰＡ−Ｂｒについて親化合物バスキュロチドの場合より１０倍低い濃度で生じた。
【０１６５】
親化合物バスキュロチドおよびＭＰＡ−Ｂｒは、初代ラット、イヌおよびカニクイザルの内皮細胞においてＴｉｅ２リン酸化を引き起こす
ラット糸球体内皮細胞、イヌ大動脈内皮細胞およびカニクイザル糸球体内皮細胞の初代細胞培養物を、異なる濃度のＭＰＡ−Ｂｒにより刺激した。全ての場合で、これらの細胞培養アッセイはＭＰＡ−Ｂｒ依存的なＴｉｅ２活性化の増加を示した。用量応答は、ヒトおよびマウス内皮細胞の研究で認められた特徴的なベル型に似ており、０．２ｎｇ／ｍｌと５０ｎｇ／ｍｌの間に集中したＴｉｅ２受容体のリン酸化の統計的に有意な増加が見られた。全ての場合で、ヒト組換えＡｎｇ１は、ベースラインＴｉｅ２リン酸化の有意な増加（無処理（ＮＴ）と比較して）をもたらした。
【０１６６】
親化合物バスキュロチドおよびＭＰＡ−Ｂｒは、Ｘ３１（Ｈ３Ｎ２）インフルエンザへの曝露後の罹患率および死亡率を改善する
インフルエンザに感染させた（Ｈ３Ｎ２、６４ＨＡＵ／マウス）Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウスは、感染後の５〜７日間で体重減少を呈し致死効果で死に始めた（図６Ｂ、Ｃ）。１００ｎｇ／マウス／日で投与された親化合物バスキュロチドの有効性が以前に調べられ（Ｓｕｇｉｙａｍａ  ＭＧ  ｅｔ  ａｌ，２０１５）  、Ｃ５７Ｂｌ／６ＪマウスのＸ３１インフルエンザ感染後の生存率を向上する効果がないと分かった。親化合物バスキュロチド（５００ｎｇ、腹腔内に毎日（以前に最適であるとが明らかにされた））またはＭＰＡ−Ｂｒ（腹腔内に毎日、３１．２５ｎｇまたは２００ｎｇ）の投与は、感染マウスの全生存率を大幅に向上させた（ｐ＜０．００１）（図６Ａ）。加えて、親化合物バスキュロチドおよびＭＰＡ−Ｂｒは、肺酸素化（ＳｐＯ２）、体温調整および活動性スコア（図６Ｄ〜Ｉ）を有意に改善した。ＭＰＡ−Ｂｒが親化合物バスキュロチドに対する優位性を示したいくつかの尺度が存在した。その例としては具体的に、消耗からの保護（６日目、２００ｎｇ／日のＭＰＡ−Ｂｒ、図６Ｃ）および動脈血酸素化（６日目、２００ｎｇ／日のＭＰＡ−Ｂｒ、図６Ｅ）が挙げられる。３１．２５ｎｇ／マウス／日で送達されたＭＰＡ−Ｂｒは、１６倍の用量の減少を示した。全ての研究エンドポイントにおいて、３１．２５ｎｇ／マウス／日で送達されたＭＰＡ−Ｂｒは、親化合物バスキュロチドと同等の、またはより良好な効果を発揮した。これは、２００ｎｇ／マウス／日のＭＰＡ−Ｂｒの場合でも同様であり、親化合物バスキュロチドと比較して用量の２．５倍の減少を示した。
【０１６７】
雄性スプラーグドーリーラットにおける親化合物バスキュロチドおよびＭＰＡ−Ｂｒの薬物動態学的分析
示された量（ｕｇ／ｋｇ）の親化合物バスキュロチドおよびＭＰＡ−Ｂｒを、ボーラス注射により雄性スプラーグドーリーラットに静脈内投与した。連続的、経時的採血を実行し、血漿調整物を、親化合物バスキュロチドまたはＭＰＡ−Ｂｒを定量化するように専用に設計された登録商標の酵素結合免疫吸着測定法に供した。経時的な被検物質の定量化は、分布容積、クリアランス、および終末相半減期を含む薬物動態学的（ＰＫ）指標の算出を容易にした（図７Ａ、Ｂ）。１２０ｕｇ／ｋｇの投与量はこれらの研究において最大の検出感度を提供し、したがって、掲示されるＰＫ指標はこの特定の投与量レベルに関する。親化合物バスキュロチド（図７Ｂ）およびＭＰＡ−Ｂｒ（図７Ａ）は同程度の分布容積およびクリアランス率を示したが、ＭＰＡ−Ｂｒは親化合物バスキュロチドより顕著に長く循環した（３４分に対して６８分のｔ１／２）。ＭＰＡ−ＢｒのＰＫを、３日間連続して２４時間毎に１回、１２０ｕｇ／ｋｇの反復静脈内投与（ＭＤ）の設定で評価した。この特定の投与手法は単回の１２０ｕｇ／ｋｇのＩＶ投与と差が無く、毎日投与した場合に薬剤蓄積がないことを示唆した。
【０１６８】
親化合物バスキュロチドおよびＭＰＡ−Ｂｒは、皮膚のヒスタミン曝露後の血管漏出を減弱する
以前の研究は、ヒスタミンへの曝露後の血管漏出の誘導への対抗におけるＴｉｅ２の必須の役割を強調した。具体的には、Ｔｉｅ２の天然のアンタゴニストであるアンギオポエチン２を遺伝的に欠損するマウスは、ヒスタミン曝露の際の血管漏出応答を全く開始できない（Ｂｅｎｅｓｔ  ＡＶ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｌｏｓ  Ｏｎｅ，２０１３）。したがって、親化合物バスキュロチドおよびＭＰＡ−ＢｒなどのＴｉｅ２の特異的なアゴニストの投与は、ヒスタミンにより誘発された血管漏出を阻害すると仮定された。皮膚へのヒスタミン曝露の１時間前に親化合物バスキュロチドまたはＭＰＡ−Ｂｒの予防用量を与えられた雄性ＦＶＢマウスは、トレーサー色素エバンスブルーの血管外漏出により評価されるように、媒体で処置されたマウスより有意に少ない血管漏出を示した（図８Ａ）。重要なことに、５００ｎｇ／マウスの最適用量で送達された親化合物バスキュロチド投与は、等しい用量または４倍少ない用量（１２５ｎｇ／マウス）でのＭＰＡ−Ｂｒと比べてヒスタミンにより誘発された血管漏出の低減においてあまり効果がなかった。
【０１６９】
方法および材料：
バスキュロチド類縁体Ｍｐａ−Ｂｒを提供する３−メルカプトプロピオン酸（Ｍｐａ）リンカーによる四量体Ｔｉｅ２結合ペプチド（Ｔ７）の調製
概要：Ｍｐａ−Ｂｒのために実行される製造プロセスは、いくつかの工程を必要とした。第１段階において、Ｔ７ペプチドおよび３−メルカプトプロピオン酸（Ｍｐａ）により合成されるペプチドは、ＦＭＯＣ固相ペプチド合成法を使用して調製された。これは、Ｎ末端に３−メルカプトプロピオニルリンカーを有するＴ７ペプチドを含む、Ｍｐａ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−ＯＨを提供した（配列番号７）。これに続いて、終末産物の切断および脱保護、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製ならびに凍結乾燥法による凍結乾燥を行いＴＦＡ塩としてＭｐａ−Ｔ７ペプチドを単離した。第２の段階において、Ｍｐａ−ペプチドの（ブロモアセトアミド）４−ＰＥＧ１０Ｋとの結合を行い、続いて２段階のＰＥＧコンジュゲートの精製を行った。第１の精製工程は、ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラフィーを含み、これによりＭｐａ−ＢｒコンジュゲートのＴＦＡ塩を得た。この産物を、この段階で凍結乾燥法により単離するか、またはＴＦＡ対イオンを、イＴＦＡ塩中間体を単離することなくオン交換クロマトグラフ法により酢酸塩の形態に直接的に交換してもよい。この初期生成物を凍結乾燥して、Ｍｐａ−Ｂｒ酢酸塩を遊離流動固体として単離した。
【０１７０】
Ｍｐａ−Ｔ７ペプチドの製造
ステップ１：樹脂上構築
Ｔ７ペプチド配列を、ＣＳ  Ｂｉｏペプチド合成機を使用して４０ｇの樹脂投入しＷａｎｇポリスチレン樹脂（最初の官能基化は１．２ｍｍｏｌ／ｇ）上で構築した。Ｗａｎｇ樹脂に、ＤＭＦ中の８ｅｑのアミノ酸および４ｅｑのＤＩＣを使用してＦｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨを４時間ローディングした。Ｆｍｏｃローディング試験は、４５．４ｍｍｏｌスケールの合成に対応して０．８ｍｍｏｌ／ｇのローディングが達成されたことを示した。全てのアミノ酸はＤＩＣ／Ｏｘｙｍａ化学反応（３ｅｑ、１３６．２ｍｍｏｌ）を使用して単一カップリングされ、０．５ＭのＡｃ２Ｏ／ＤＭＦをキャップ形成に、２０％のピペリジン／ＤＭＦをＦｍｏｃ脱保護に使用した。試験切断を、Ｔ７ペプチド配列の完了後に実施し、ＲＰ−ＨＰＬＣ分析は、配列が７７．５％の組成物純度でうまく構築されたことを示した。
【０１７１】
樹脂に結合されたＴ７ペプチドへのＭｐａ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）の結合を、３ｅｑのＴｒｔ−Ｍｐａ−ＯＨを使用してＤＭＦ中３ｅｑのＤＩＣ／Ｏｘｙｍａの存在下で４時間実施した。樹脂を洗浄（ＤＭＦ、ＭｅＯＨおよびＭＴＢＥ）し真空乾燥器中で一晩乾燥した後、８９．１％の合成収率に相当する１２４．５ｇの最終樹脂が得られた（８４．５ｇの重量増加）。試験切断分析は、Ｍｐａ−Ｔ７ペプチドが７８．５％の粗製物純度で形成されたことを示した。ＥＳＩ−ＭＳ分析は、Ｍｐａペプチドが形成されたことを確認した（ＭＳ観測値＝１０４４．４）。
【０１７２】
ステップ２：切断および脱保護
樹脂に結合されたＭｐａ−Ｔ７ペプチドを、ＴＦＡ／ＴＩＳ／水／ＥＤＴ（９２．５：２．５：２．５：２．５）を含む切断溶液で３時間処理した。ペプチドを抗溶剤（ｉＰｒ２Ｏ）で沈殿させ、ペプチドを濾過によって単離して粗生成物を得た。樹脂に結合されたＭｐａ−Ｔ７ペプチドを切断して３８％の全体回収率および９１．８％の収率に相当する３１．５ｇの粗ペプチドを得た。粗生成物のＲＰ−ＨＰＬＣ分析は、粗製物純度が７０．５％であることを示した。
【０１７３】
ステップ３：精製
粗製Ｍｐａ−Ｔ７ペプチド（２４ｇ）を緩衝液Ａ（１５ｍＭのＴＥＡＰ）で希釈し、Ｌｕｎａ  Ｃ１８（３）  ＰＲＥＰ  ２５０×５０ｍｍ  Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘカラム上でのＲＰ−ＨＰＬＣを使用して５〜１０％の緩衝液Ｂ（２０％ＭｅＣＮ／水）の勾配および８８ｍＬ／分の流速で精製した。ＴＥＡＰ精製からの産物プールを合わせ、０．５％ＴＦＡ／水で５倍に希釈した。ペプチド溶液の半分を精製カラムに再ロードし、産物を０．５％のＴＦＡを含有する水／ＭｅＣＮ（１０％）で最初にオンカラム洗浄した後、緩衝液ＢをＭｅＣＮ中の０．１％ＴＦＡと置き換え、産物を、２０〜６０％のＢの勾配を適用することによって溶出した。この工程を残りのペプチド溶液で繰り返し、産物プールを合わせ、凍結乾燥して樹脂ローディング工程からの４３．７％の全体回収率に相当する１１．４ｇのＭｐａ−Ｔ７ペプチドをＴＦＡ塩として得た。最終分析は、６．７ｇの純ペプチド（２５．８％の収率）に相当する６１％のペプチド含量および９６．２％のＲＰ−ＨＰＬＣ純度を示した。
【０１７４】
Ｍｐａ−Ｂｒコンジュゲートの製造
ステップ１：コンジュゲーション
コンジュゲーション反応を、Ｍｐａ−Ｔ７ペプチドのＴＦＡ塩（２ｍｍｏｌ）および（ブロモアセトアミド）４−ＰＥＧ１０Ｋ（ＪｅｎＫｅｍ、米国）（０．４８ｍｍｏｌ）を０．１３ＭのＮａＣｌを含有するｐＨ８の１００ｍＭリン酸ナトリウム（二塩基性）緩衝液（１２０ｍｌ）中に溶解することによって実行した。反応溶液のｐＨがｐＨ６．５であることを確認し、反応混合物を３０℃にて２２時間撹拌した。反応の進行をＲＰ−ＨＰＬＣによりモニタリングし、完全にコンジュゲートされた産物への４アーム置換された四量体ブロモアセトアミドの約５８％の転換まで進行させた。反応の完了時に、粗製混合物は、それぞれ〜３０％の３アーム中間体および〜７％の２アーム中間体を含有した。少量の単一アーム産物が得られた。
【０１７５】
ステップ２：Ｍｐａ−ＢｒのＴＦＡ塩の精製
反応混合物を、緩衝液Ａ（水＋０．１％ＴＦＡ）で１：１に希釈し、精製を、１０〜７５％の緩衝液Ｂ（ＭｅＣＮ：水（６０：４０）＋０．１％のＴＦＡ）の勾配および４２ｍＬ／分の流速でＬｕｎａ  Ｃ１８（３）  ＰＲＥＰ  ２５０×３０ｍｍのカラムを用い１０ｍＬ画分を収集して実施した。この段階で凍結乾燥によって単離された産物は、ＲＰ−ＨＰＬＣによる約４５％の収率および＞９９％の純度でＭｐａ−Ｂｒ  ＴＦＡ塩を提供した。
【０１７６】
ステップ３：Ｍｐａ−Ｂｒの対イオン交換
ＴＦＡ対イオンを有するＭｐａ−Ｂｒコンジュゲートは、ろう状／粘着性の粘度を有する非晶質物質を生じる。物理的特性に取り組むために、塩交換を、ステップ２に記載されるように得られた、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製されたＭｐａ−Ｂｒ  ＴＦＡ塩画分から直接実行した。凍結乾燥の前に画分を合わせ（〜５００  ｍＬ）、水で１：１に希釈し、溶液をＲＰ−ＨＰＬＣカラム上へロードし、最初のカラム平衡化（１％ＡｃＯＨを含有する０．５ＭのＮＨ４ＯＡｃ）、試料のロードに続く交換プロセス（１％のＡｃＯＨを含有する０．５ＭのＮＨ４ＯＡｃ）、酢酸アンモニウム除去プロセス（１％のＡｃＯＨ（緩衝液Ａ）およびＭｅＣＮ（緩衝液Ｂ）、１０％Ｂ）、および溶出プロセス（１％のＡｃＯＨ（緩衝液Ａ）およびＭｅＣＮ（緩衝液Ｂ）、１０〜５０％Ｂ）を含むいくつかのプロセス後に１０ｍＬ画分を収集する、４２ｍＬ／分の流速でＬｕｎａ  Ｃ１８（３）  ＰＲＥＰ  ２５０×３０ｍｍのカラムを使用する酢酸塩交換プロセスに供した。産物をプールし、凍結乾燥してＭｐａ−Ｂｒ酢酸塩を自由流動結晶性固体として得た。分析はＲＰ−ＨＰＬＣによる１００％の純度を示し、４２．１％の全収率の完全に置換されたペプチドコンジュゲートであるＭｐａ−Ｂｒに相当した。イオンクロマトグラフィーによる残留臭素（Ｂｒ）コンジュゲートの分析は、４アームブロモアセトアミド−ＰＥＧ四量体の完全な置換を示す＜０．１％のＢｒを確認した。Ｍｐａ−Ｂｒ酢酸塩の更なる分析をＳＣＸクロマトグラフィーにより行い、Ｍｐａ−Ｂｒ酢酸塩の純度が９０．０％であることが分かった。
【０１７７】
トリプトファン蛍光分光法：
リガンドおよび受容体相互作用。２倍濃度の各リガンド（親化合物バスキュロチドおよびＭＰＡ−Ｂｒ）を２５μＬで調製し、２５μＬの２倍濃度のＴｉｅ２Ｆｃ受容体と混合して５０μＬの最終容量で１倍濃度のリガンドおよび受容体を作製した。リガンドの濃度は、受容体の結合飽和に達するのに十分なほど高くなければならない。試料を、１０ｎｍの規定読み取り間隔および読み取り前の５秒間の自動混合で励起波長２９５ｎｍ、３６０ｎｍでの開始発光波長スキャン、４５０ｎｍでの終了発光波長スキャンに設定したＳｐｅｃｔｒａＭａｘＭ２プレートリーダーにより室温にて読み取った。データを、ＳｏｆｔＭａｘを使用してコンパイルし、Ｐｒｉｓｍを使用して分析した。
【０１７８】
受容体およびリガンド。組換え受容体は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した（組換えヒトＴｉｅ−２Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、組み換えマウスＴｉｅ−２Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、組換え型ラットＴｉｅ２−ＦＣ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）および組換えカニクイザルＴｉｅ２−ＦＣ（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ））。リガンドは、Ｂａｃｈｅｍ（親化合物バスキュロチドおよびＭＰＡ−Ｂｒ）によって製造された。陰性対照のＩｇＧ−ＦＣは、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから供給された。受容体およびリガンドの両方を、ＤＰＢＳ（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ−ＨｙＣｌｏｎｅ）中に再懸濁した。
【０１７９】
Ｔｉｅ２リン酸化−ＨＵＶＥＣ：
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、製造者の推奨に従い２０％Ｏ２、５％ＣＯ２および３７℃の加湿したチャンバー内で「ＥＧＭ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｑｕｏｔｓ」（Ｌｏｎｚａ）を補足した完全内皮基本培地（ＥＢＭ）（Ｌｏｎｚａ）中にて１００ｍｍ組織培養プレートに播種した。９０％のコンフルエンスに到達した細胞を、完全ＥＢＭ培地中で特定の濃度の親化合物バスキュロチド、ＭＰＡ−Ｂｒまたはアンギオポエチン−１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で１５分間刺激した。１５分の刺激後、細胞を氷上に置き、氷冷ＰＢＳで二回洗浄した。細胞可溶化物を、ＩＣ１２溶解緩衝液（１％のＮＰ−４０、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ  ８．０）、１３７ｍＭのＮａＣｌ、１０％のＧｌｙｃｅｒｏｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭの活性化オルトバナジウム酸ナトリウム）中で使用のために調製した。ＢＣＡタンパク質濃度測定キットを製造者の使用説明書（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にしたがって使用して、各々の可溶化液のタンパク質濃度を測定した。試料を、製造者プロトコールにしたがいリン酸化されたＴｉｅ２および総Ｔｉｅ２レベルを測定するＥＬＩＳＡに供した。各々の試料からの２０μｇまたは５μｇのタンパク質を、それぞれリン酸化されたＴｉｅ２および総Ｔｉｅ２の読み取りのため２重にロードした。リン酸化されたＴｉｅ２：総Ｔｉｅ２の比率を、各々の試料について測定した。各々の実験において全ての処理群のＴｉｅ２リン酸化のレベルを次いで、無処置群（ＮＴ、完全ＥＢＭのみ）のＴｉｅ２リン酸化のレベルに正規化した。
【０１８０】
ＭＡＰＫリン酸化−ＨＵＶＥＣ：
ＨＵＶＥＣを上記のように培養した。可溶化液を調製した（１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、６Ｍの尿素、５ｍＭのＮａＦ、１００ｕＭのＰＭＳＦ、２５ｍＭのピロリン酸ナトリウム、１ｍＭのオルトバナジウム酸ナトリウム、ｐＨ７．２〜７．４、１ｘｃＯｍｐｌｅｔｅＴＭ  ｍｉｎｉ  ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅプロテアーゼ阻害剤）。ＢＣＡタンパク質濃度測定キットを製造者の使用説明書（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にしたがって使用して、各々の可溶化液のタンパク質濃度を測定した。試料を、製造者プロトコール（R&D  Systems） にしたがいリン酸化されたＭＡＰＫおよび総ＭＡＰＫレベルを測定するＥＬＩＳＡに供した。各々の試料からの２０μｇまたは１０μｇのタンパク質を、それぞれリン酸化されたＭＡＰＫおよび総ＭＡＰＫの読み取りのため２重にロードした。リン酸化されたＭＡＰＫ：総ＭＡＰＫの比率を、各々の試料について測定した。各々の実験において全ての処理群のＭＡＰＫリン酸化のレベルを次いで、無処置群（ＮＴ、完全ＥＢＭのみ）のＭＡＰＫリン酸化のレベルに正規化した。
【０１８１】
Ｔｉｅ２リン酸化−ＨＭＶＥＣｔｅｒｔ：
ヒトテロメラーゼ逆転写酵素／触媒サブユニット（ｔｅｒｔ）によって不死化されたヒト微小血管内皮細胞（皮膚由来）（Ｓｈａｏ  ａｎｄ  Ｇｕｏ（２００４））を、完全内皮基本培地−２（ＥＢＭ−２）（Ｌｏｎｚａ）中で１００ｍｍの組織培養プレートに播種し、２０％のＯ２、５％のＣＯ２および３７℃の加湿したチャンバー内で培養した。増殖培地は、１０％のウシ胎児血清、１Ｘペニシリン／ストレプトマイシン、１ｕｇ／ｍｌヒドロコルチゾンおよび１００ｎｇ／ｍｌのＥＧＦを補足したＥＢＭ−２から構成された。９０％のコンフルエンスに到達した細胞を、完全ＥＢＭ−２培地中で特定の濃度の親化合物バスキュロチド、ＭＰＡ−Ｂｒまたはアンギオポエチン−１で１５分間刺激した。１５分の刺激後、細胞を氷上に置き、氷冷ＰＢＳで二回洗浄した。細胞可溶化物を、ＩＣ１２溶解緩衝液（１％のＮＰ−４０、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ  ８．０）、１３７ｍＭのＮａＣｌ、１０％のＧｌｙｃｅｒｏｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭの活性化オルトバナジウム酸ナトリウム）中で使用のために調製した。ＢＣＡタンパク質濃度測定キットを使用して、各々の可溶化液のタンパク質濃度を測定した。試料を、ｐＹＴｉｅ２および総Ｔｉｅ２レベルを測定するＥＬＩＳＡに供した。各々の試料からの２０μｇのタンパク質を、各ウェルにロードし、各試料を２重に試験した。総Ｔｉｅ２に対する相対的なｐＴｉｅ２の比率を、各々の試料について測定した。各々の実験において各処理群のＴｉｅ２リン酸化のレベルを、ＥＢＭ処理群のＴｉｅ２リン酸化のレベルに正規化した。
【０１８２】
Ｔｉｅ２リン酸化−マウス初代肺微小血管内皮細胞
マウス初代肺内皮細胞（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）を、「ＥＧＭ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｑｕｏｔｓ」（Ｌｏｎｚａ）を補足した完全内皮基本培地（ＥＢＭ）（Ｌｏｎｚａ）中で１００ｍｍ組織培養プレートに播種した。９０％のコンフルエンスに到達した細胞を、完全ＥＢＭ培地中で特定の濃度の親化合物バスキュロチド、ＭＰＡ−Ｂｒまたはアンギオポエチン−１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で１５分間刺激した。１５分の刺激後、細胞を氷上に置き、氷冷ＰＢＳで二回洗浄した。細胞可溶化物を、ＩＣ１２溶解緩衝液（１％のＮＰ−４０、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ  ８．０）、１３７ｍＭのＮａＣｌ、１０％のＧｌｙｃｅｒｏｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭの活性化オルトバナジウム酸ナトリウム）中で使用のために調製した。ＢＣＡタンパク質濃度測定キットを製造者の使用説明書（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にしたがって使用して、各々の可溶化液のタンパク質濃度を測定した。試料を、製造者のプロトコールにしたがいリン酸化されたＴｉｅ２および総Ｔｉｅ２レベルを測定するＥＬＩＳＡに供した（マウスＴｉｅ２、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）。各々の試料からの５０μｇまたは５μｇのタンパク質を、それぞれリン酸化されたＴｉｅ２および総Ｔｉｅ２の読み取りのため３重にロードした。リン酸化されたＴｉｅ２：総Ｔｉｅ２の比率を、各々の試料について測定した。各々の実験において全ての処理群のＴｉｅ２リン酸化のレベルを次いで、無処理群（ＮＴ、完全ＥＢＭのみ）のＴｉｅ２リン酸化のレベルに正規化した。
【０１８３】
Ｔｉｅ２リン酸化−ラット初代糸球体内皮細胞：
ラット初代糸球体内皮細胞（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）を、２０％のＯ２、５％のＣＯ２および３７℃で加湿したチャンバー内にてＣｏｍｐｌｅｔｅ  Ｒａｔ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  ／ｗ  Ｋｉｔ（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）中で増殖させ、８０〜９０％の培養密度に達したら１：３で継代した。ラット腎臓糸球体内皮細胞におけるＭＰＡ−ＢｒによるＴｉｅ２の活性化を調べるために、９５〜１００％コンフルエントの細胞を、示された濃度の被検物質で１５分間血清添加培地中にて刺激した。ヒトＡｎｇ−１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を陽性対照として使用した。細胞可溶化物を、Ｈｕｍａｎ  ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｔｉｅ−２  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）において推奨される溶解緩衝液ＩＣ１２（上記で詳述）を使用して収集し、チロシンがリン酸化されたＴｉｅ２および総Ｔｉｅ２を、ラットＴｉｅ２への適用が確認された捕捉抗体を代用するＥＬＩＳＡ（Ｈｕｍａｎ  ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｔｉｅ２  ａｎｄ  ｔｏｔａｌ−Ｔｉｅ２  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔｓ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ））を使用して測定した。マウス抗Ｔｉｅ２抗体（ＢＤ  ＰｈａｒｍｉｎｇｅｎＴＭ）およびウサギＴＥＫポリクローナル抗体（ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ）を、それぞれｐＴｉｅ２および総Ｔｉｅ２のＥＬＩＳＡで捕捉抗体として使用した。各々の実験において全ての処理群のＴｉｅ２リン酸化のレベルを次いで、無処理群（ＮＴ、完全ラット内皮細胞媒体）のＴｉｅ２リン酸化のレベルに正規化した。
【０１８４】
Ｔｉｅ２リン酸化−イヌ初代大動脈内皮細胞：
イヌ初代大動脈内皮細胞（ＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｉｃｓ）を、２０％のＯ２、５％のＣＯ２および３７℃で加湿したチャンバー内でＣｏｍｐｌｅｔｅ  ｃａｎｉｎｅ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｍｅｄｉｕｍ  ／ｗ  ｋｉｔ（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）中で増殖させ、８０〜９０％の培養密度に達したら１：３で継代した。カニクイザル初代糸球体内皮細胞に対し実行したＴｉｅ２活性化研究を、ラット初代糸球体内皮細胞の研究について上で詳述された手法にしたがって実行した。
【０１８５】
Ｔｉｅ２リン酸化−カニクイザル初代糸球体内皮細胞：
カニクイザル初代糸球体内皮細胞（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）を、ＨＭＶＥＣｔｅｒｔについて上に掲示の詳細にしたがって培養した。カニクイザル初代糸球体内皮細胞に対し実行したＴｉｅ２活性化研究を、ラット初代糸球体内皮細胞の研究について上で詳述された手法にしたがって実行した。
【０１８６】
皮膚へのヒスタミン曝露：
１０週齢の雄性ＦＶＢマウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。マウスは、標準的な明暗周期の動物施設で飼育され、餌料および水を自由に摂取した。０日目にマウスをイソフルランで麻酔し、背部領域全体を電気カミソリで剃毛した。残りの体毛は、脱毛クリームの適用により除去した。残ったクリームを滅菌ガーゼおよび水で除去した。４日目に、マウスに２００ｕｌの腹腔内注射として媒体対照（滅菌ＰＢＳ）、親化合物バスキュロチドまたはＭＰＡ−Ｂｒのいずれかを投与した。ＰＢＳ／親化合物バスキュロチド／ＭＰＡ−Ｂｒの送達の１時間後に、マウスをイソフルラン麻酔下に置き、その時点で１００ｕｌの（滅菌ＰＢＳ中に含有される）１％エバンスブルー色素を、尾静脈を介して静脈内に送達した。エバンスブルー色素の投与直後、かつまだ麻酔下にある間に単回のＰＢＳ注射（背側、皮内、５０ｕｌ）および３回の等間隔のヒスタミン注射（背側、皮内、５０ｕｌ中に含有される１．２５ｕｇ）を適用した。皮内注射が完了したら、マウスを麻酔から回復させ、それらの収容ケージに２５分間戻した。
【０１８７】
経心臓灌流。２５分のヒスタミンへの曝露後に、マウスを適切な容量の２．５％アバチン（腹腔内注射による１００ｕｌ／１０ｇ体重）で麻酔下に置いた。深麻酔が生じたら、マウスを背臥位に配置して固定し、胸部を外科的に切開し、心臓を露出させ、２３ゲージ針を終端として接続したカテーテルを左心室に挿入した。カテーテルが確実に固定されたら、右心房に切れ目を入れ、２５ｍｌの冷ＰＢＳを１００ｍｍＨｇでカテーテルを介し送達して血管内の全てのエバンスブルー色素を流し出した。マウスを完全に灌流したら、背部皮膚を外科的に除去した。４つの１２ｍｍの皮膚生検材料を、標準的な皮膚パンチを使用して各々のマウスについて収集した（１ＰＢＳ、３ヒスタミン）。全ての場合で、ＰＢＳを投与された生検材料を、個々のマウスに対するベースライン対照として用いた。
【０１８８】
エバンスブルー色素血管外漏出の定量化。皮膚生検材料をラベル付けしたチューブに入れ、摂氏６０度のオーブンに１６時間置いて全ての水分を除去した。乾燥させた皮膚生検材料の重さを量り、１．５ｍｌのホルムアミドを含むチューブ中に置き、次いで、摂氏６０度のウオーターバスに７２時間置いた。７２時間後にチューブを５００ＲＣＦで遠心分離し、１００ｕｌの試料を６２０ｎｍおよび４０５ｎｍでの測定のために平底９６ウェルマイクロタイタープレートに取り出した。エバンスブルー色素血管外漏出の量（ｕｇ／ｇ皮膚）を算出できるように高いおよび低い実験データポイントを包含するエバンスブルー色素の検量線を構築した。
【０１８９】
インフルエンザ研究：
実験計画。１４週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを購入した（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。マウスは、標準的な明暗周期の動物施設で飼育され、餌料および水を自由に摂取した。全ての実験について、マウスを５％イソフルランで鎮静させ、ＰＢＳで８０ｕＬの最終容量に希釈されたインフルエンザウイルス（下記のウイルスのセクションを参照のこと）を鼻腔内感染させた。感染後に、マウスを体重が一致する対照群および投与群へと分離した；各々の実験処置群は、群あたり１０匹のマウスを使用し、マウスを６４ＨＡＵのインフルエンザウイルスに感染させ、これは７日目に１００％の死亡率を引き起こした。以下の群が含まれた：インフルエンザウイルスのみを投与されたマウス（Ｆｌｕ）、親化合物バスキュロチド（腹腔内注射による０．１ｍＬのＰＢＳ中の５００ｎｇ）またはＭＰＡ−Ｂｒ（腹腔内注射による０．１ｍＬのＰＢＳ中の２００ｎｇまたは３１．２５ｎｇ）も投与された感染マウス。親化合物バスキュロチドまたはＭＰＡ−Ｂｒによる処置は感染の４８時間後に開始され、研究の間２４時間毎に１回与えられた。対照のマウス（Ｆｌｕ）は、感染の４８時間後から開始して研究の間、毎日０．１ｍＬのＰＢＳの腹腔内注射が与えられた。
【０１９０】
ウイルス。インフルエンザＡウイルスＨＫｘ３１（Ｈ３Ｎ２）は、タニア・ワッツ博士から分与を受け、Ｓｚｒｅｔｔｅｒ，Ｋ．Ｊ．，Ｂａｌｉｓｈ，Ａ．Ｌ．＆  Ｋａｔｚ，Ｊ．Ｍ．，２００６にしたがって増殖された。培養液上清からのウイルス価を、ＭＤＣＫ（メイディン・ダービー・イヌ腎臓）細胞での標準的なプラーク形成アッセイを実行することによって、またはヒツジ赤血球の凝集を測定することによって決定した（ヘマグルチニン単位、ＨＡＵ）。
【０１９１】
パルス酸素測定。動脈血酸素飽和度を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ用の小型の首輪クリップのいずれかを使用して覚醒した（無麻酔の）マウスでＭｏｕｓｅ  Ｏｘ  Ｐｌｕｓ装置およびソフトウェア（Ｓｔａｒｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ペンシルベニア州オークモント）を使用して測定した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスについて、化学的脱毛クリームを使用して感染の数日前に首の付け根まわりの体毛を除去した。ＳＯ２測定について、マウスを、最大ＳＯ２の測定を記録する前にそれらのホームケージ内で数分間首輪クリップに順応させた。
【０１９２】
活動性スコアリングガイドライン
マウスを１日２回観察し、１日１回体重を量り、１〜５の活動性スコアを割り当てた。５のスコアが与えられるには、マウスは正常な活発かつ奇妙な行動を示す必要がある。すなわち、マウスは動き回り、ケージの端で直立する。４のスコアでは、マウスは活発というほどではない。すなわち、マウスは頻繁には立ち上がらず、ケージの隅にとどまるのを好む。３のスコアでは、マウスはより活発でなく、移動する時はしばしば止まって座る。すなわち、マウスは巣の隅にとどまる。２のスコアでは、マウスは触られた場合にだけ、短い距離のみ移動する。すなわち、マウスは好んで巣の隅に隠れる。最後に、１のスコアでは、マウスは瀕死である。５〜３の活動性スコアは、許容できるとみなされる。２の活動性スコアを有するマウスは綿密にモニタリングされ、活動性が２のスコアより減少した場合、それらは屠殺された。更に、３０％を超える体重減少を経験したマウスは、許容できる活動性スコアに関係なく安楽死させた。
【０１９３】
マイケル付加のための一般的な反応方法
活性化ＰＥＧ四量体（例えばビニルスルホンまたはアクリレート）（１１７〜１１８ｍｇ、１ｅｑｕｉｖ．）およびＭｐａ−ペプチド（１００ｍｇ、１．５ｅｑｕｉｖ．）を光から保護された５０ｍｌ丸底フラスコに添加し、ＰＢＳ（ｐＨ  ６．５＊、２０ｍｌ）を５ｍｇ／ｍｌの最終ペプチド濃度となるように添加した。反応物を室温にて撹拌し、ｐＨを、ｐＨメーターを使用して確認し、反応の経過を種々の時間間隔でＨＰＬＣによりモニタリングした。反応混合物を、精製前に以下の工程を使用してｐＨ３．５に酸性化した：
ステップ１  フラッシュＬＣ：
カラム：Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｈａｓｅ  Ｃ１８、Ｆｕｊｉ、２００Å、４０ｇカラム３０μｍ（カスタム包装）。
勾配プロフィール：６３分で１０〜１００％Ｂ
溶出剤：溶出剤Ａ＝水中の０．１％ＴＦＡ
溶出剤Ｂ＝６０％アセトニトリル、４０％水中の０．１％ＴＦＡ
検出：ＵＶ（λ＝２１０ｎｍ／２５４ｎｍ）
カラム温度：室温
流速：４０ｍｌ／ｍｉｎ
ステップ２  分取ＨＰＬＣ：
カラム：Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｈａｓｅ  Ｃ１８、Ｄａｉｓｏ  Ｂｉｏ  Ｃ１８、２００Å、１０μｍ  ２５ｍｍ×２５０ｍｍ（カスタム包装）  
勾配プロフィール：７７分で４５〜１００％Ｂ
溶出剤：溶出剤Ａ＝水中の３％アセトニトリル中の０．１％ＨＦＢＡ
溶出剤Ｂ＝６０％アセトニトリル、４０％水中の０．１％ＨＦＢＡ
検出：ＵＶ（λ＝２１０ｎｍ）
カラム温度：室温
流速：３０ｍｌ／ｍｉｎ
ステップ３  分取ＨＰＬＣ：
カラム：Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｈａｓｅ  Ｃ１８、Ｄａｉｓｏ  Ｂｉｏ  Ｃ１８、２００Å、１０μｍ  ２５ｍｍ×２５ｍｍ（カスタム包装）  
勾配プロフィール：８４分で４０〜１００％Ｂ
溶出剤：溶出剤Ａ＝水中の０．１％ＴＦＡ
溶出剤Ｂ＝６０％アセトニトリル、４０％水中の０．１％ＴＦＡ
【０１９４】
ビニルスルホン−ＰＥＧコンジュゲートの収量は４８ｍｇでありおよびアクリレート−ＰＥＧコンジュゲートの収量は１５．２ｍｇである（両方ともＴＦＡ塩として）。
【０１９５】
本開示は現在例として考えられるものに関して記載するが、本開示が本開示の例に限定されないことを理解すべきである。それとは反対に、本開示は、添付の特許請求の範囲内およびその趣旨内に含まれる、様々な変更および同価値のアレンジを含むことが意図される。
【０１９６】
全ての刊行物、特許および特許出願は、各個別の刊行物、特許および特許出願が参照により組み込まれるように個々にかつ具体的に示されているかのような程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。
参考文献
Ｂｅｒｇｅ  ＳＭ，  Ｂｉｇｈｌｅｙ  ＬＤ，  Ｍｏｎｋｈｏｕｓｅ  ＤＣ，  “  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｓａｌｔｓ”  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．  １９７７  Ｊａｎ；６６（１）：１−１９．
Ｂｏｕｒｄｅａｕ  Ａ，  Ｖａｎ  Ｓｌｙｋｅ  Ｐ，  Ｋｉｍ  Ｈ，  Ｃｒｕｚ  Ｍ，  Ｓｍｉｔｈ  Ｔ，  Ｄｕｍｏｎｔ  ＤＪ，  “  Ｖａｓｃｕｌｏｔｉｄｅ，  ａｎ  Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１  ｍｉｍｅｔｉｃ，  ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ  ｓｅｖｅｒａｌ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｔｏｐｉｃ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ−ｌｉｋｅ  ｄｉｓｅａｓｅ”  ＢＭＣ  Ｒｅｓ  Ｎｏｔｅｓ．  ２０１６  Ｍａｙ  ２８；９：２８９．
Ｂｒｋｏｖｉｃ  Ａ，  Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ  Ｍ，  Ｇｉｒａｒｄ  Ｄ，  Ｓｉｒｏｉｓ  ＭＧ，  “Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｎ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ  ａｒｅ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ＰＩ−３Ｋ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ”  Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ．  ２００７  Ａｐｒ；８１（４）：１０９３−１０１．
Ｃｈｏ  ＣＨ，  Ｋａｍｍｅｒｅｒ  ＲＡ，  Ｌｅｅ  ＨＪ，  Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ  ＭＯ，  Ｒｙｕ  ＹＳ，  Ｌｅｅ  ＳＨ，  Ｙａｓｕｎａｇａ  Ｋ，  Ｋｉｍ  ＫＴ，  Ｋｉｍ  Ｉ，  Ｃｈｏｉ  ＨＨ，  Ｋｉｍ  Ｗ，  Ｋｉｍ  ＳＨ，  Ｐａｒｋ  ＳＫ，  Ｌｅｅ  ＧＭ，  Ｋｏｈ  ＧＹ，  “ＣＯＭＰ−Ａｎｇ１：  ａ  ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１  ｖａｒｉａｎｔ  ｗｉｔｈ  ｎｏｎｌｅａｋｙ  ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ”  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ２００４  Ａｐｒ  １３；１０１（１５）：５５４７−５２．
Ｅｉｃｈｅｎｆｉｅｌｄ  ＬＦ，  Ｈａｎｉｆｉｎ  ＪＭ，  Ｂｅｃｋ  ＬＡ，  Ｌｅｍａｎｓｋｅ  ＲＦ  Ｊｒ，  Ｓａｍｐｓｏｎ  ＨＡ，  Ｗｅｉｓｓ  ＳＴ，  Ｌｅｕｎｇ  ＤＹ，  “Ａｔｏｐｉｃ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ  ａｎｄ  ａｓｔｈｍａ：  ｐａｒａｌｌｅｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ”  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ．  ２００３  Ｍａｒ；１１１（３）：６０８−１６．
Ｇｒｕｂｅｒ  ＢＬ，  Ｍａｒｃｈｅｓｅ  ＭＪ，  Ｋｅｗ  Ｒ，  “Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅ  ｍａｓｔ−ｃｅｌｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ”  Ｂｌｏｏｄ．  １９９５  Ｏｃｔ  １；８６（７）：２４８８−９３．
Ｋｉｍ  Ｗ，  Ｍｏｏｎ  ＳＯ，  Ｌｅｅ  ＳＹ，  Ｊａｎｇ  ＫＹ，  Ｃｈｏ  ＣＨ，  Ｋｏｈ  ＧＹ，  Ｃｈｏｉ  ＫＳ，  Ｙｏｏｎ  ＫＨ，  Ｓｕｎｇ  ＭＪ，  Ｋｉｍ  ＤＨ，  Ｌｅｅ  Ｓ，  Ｋａｎｇ  ＫＰ，  Ｐａｒｋ  ＳＫ，  “ＣＯＭＰ−ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１  ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ  ｒｅｎａｌ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｉｎ  ａ  ｕｎｉｌａｔｅｒａｌ  ｕｒｅｔｅｒａｌ  ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｍｏｄｅｌ”  Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ．  ２００６  Ｓｅｐ；１７（９）：２４７４−８３．
Ｋｕｉｋｅｎ  Ｔ，  Ｔａｕｂｅｎｂｅｒｇｅｒ  ＪＫ，  “Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｒｅｖｉｓｉｔｅｄ”  Ｖａｃｃｉｎｅ．  ２００８  Ｓｅｐ  １２；２６  Ｓｕｐｐｌ  ４：Ｄ５９−６６．
Ｍａｌｉｂａ  Ｒ，  Ｂｒｋｏｖｉｃ  Ａ，  Ｎｅａｇｏｅ  ＰＥ，  Ｖｉｌｌｅｎｅｕｖｅ  ＬＲ，  Ｓｉｒｏｉｓ  ＭＧ，  “Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｐ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ：  ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ”  Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ．  ２００８  Ｆｅｂ；８３（２）：３５２−６０．
Ｍｕｒｄｏｃｈ  Ｃ，  Ｔａｚｚｙｍａｎ  Ｓ，  Ｗｅｂｓｔｅｒ  Ｓ，  Ｌｅｗｉｓ  ＣＥ，  “Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｉｅ−２  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−２”  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００７  Ｊｕｎ  １；１７８（１１）：７４０５−１１．
Ｐａｒｉｋｈ  ＳＭ，  “Ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−Ｔｉｅ−２  ａｘｉｓ  ｉｎ  ｓｅｐｓｉｓ  ａｎｄ  ＡＲＤＳ”  Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ．  ２０１３  Ａｕｇ  １５；４（６）：５１７−２４．
Ｒｉｌｅｙ  ＣＭ，  Ｆｕｅｇｙ  ＰＷ，  Ｆｉｒｐｏ  ＭＡ，  Ｓｈｕ  ＸＺ，  Ｐｒｅｓｔｗｉｃｈ  ＧＤ，  Ｐｅａｔｔｉｅ  ＲＡ  “Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ｄｕａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｌｏａｄｅｄ  ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ  ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ  ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ”  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．  ２００６  Ｄｅｃ；２７（３５）：５９３５−４３．
Ｒｕｂｉｇ  Ｅ，  Ｓｔｙｐｍａｎｎ  Ｊ，  Ｖａｎ  Ｓｌｙｋｅ  Ｐ，  Ｄｕｍｏｎｔ  ＤＪ，  Ｓｐｉｅｋｅｒ  Ｔ，  Ｂｕｓｃｈｅｒ  Ｋ，  Ｒｅｕｔｅｒ  Ｓ，  Ｇｏｅｒｇｅ  Ｔ，  Ｐａｖｅｎｓｔａｄｔ  Ｈ１，  Ｋｕｍｐｅｒｓ  Ｐ，  “  Ｔｈｅ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｔｉｅ２  Ａｇｏｎｉｓｔ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｖａｓｃｕｌｏｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｃｔｓ  Ｒｅｎａｌ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｂａｒｒｉｅｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  Ｉｎ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｃｕｔｅ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｊｕｒｙ”  Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．  ２０１６  Ｆｅｂ  ２５；６：２２１１１．
Ｓｈａｏ  Ｒ，  Ｇｕｏ  Ｘ，  “Ｈｕｍａｎ  ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｕｍａｎ  ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ：  ａ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ”  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２００４  Ｓｅｐ  ３；３２１（４）：７８８−９４．
Ｓｔｕｒｎ  ＤＨ，  Ｆｅｉｓｔｒｉｔｚｅｒ  Ｃ，  Ｍｏｓｈｅｉｍｅｒ  ＢＡ，  Ｄｊａｎａｎｉ  Ａ，  Ｂｉｊｕｋｌｉｃ  Ｋ，  Ｐａｔｓｃｈ  ＪＲ，  Ｗｉｅｄｅｒｍａｎｎ  ＣＪ，  “Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ  ａｆｆｅｃｔｓ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ”  Ｍｉｃｒｏｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．  ２００５  Ｊｕｌ−Ａｕｇ；１２（５）：３９３−４０３．
Ｓｕｇｉｙａｍａ  ＭＧ，  Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ  ＳＭ，  Ｗａｎｇ  Ｃ，  Ｈｗａｎｇ  Ｄ，  Ｌｅｏｎｇ−Ｐｏｉ  Ｈ，  Ａｄｖａｎｉ  Ａ，  Ａｄｖａｎｉ  Ｓ，  Ｚｈａｎｇ  Ｈ，  Ｓｚａｓｚｉ  Ｋ，  Ｔａｂｕｃｈｉ  Ａ，  Ｋｕｅｂｌｅｒ  ＷＭ，  Ｖａｎ  Ｓｌｙｋｅ  Ｐ，  Ｄｕｍｏｎｔ  ＤＪ，  Ｌｅｅ  ＷＬ，  “Ｔｈｅ  Ｔｉｅ２−ａｇｏｎｉｓｔ  Ｖａｓｃｕｌｏｔｉｄｅ  ｒｅｓｃｕｅｓ  ｍｉｃｅ  ｆｒｏｍ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ”  Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．  ２０１５  Ｊｕｎ  ５；５：１１０３０．
Ｓｚｒｅｔｔｅｒ  ＫＪ，  Ｂａｌｉｓｈ  ＡＬ，  Ｋａｔｚ  ＪＭ，  “Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ：  ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ，  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｓｔｏｒａｇｅ”  Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２００６  Ｄｅｃ；  Ｃｈａｐｔｅｒ  １５：Ｕｎｉｔ  １５Ｇ．１．
Ｔｈａｍｍ  Ｋ，  Ｎｊａｕ  Ｆ，  Ｖａｎ  Ｓｌｙｋｅ  Ｐ，  Ｄｕｍｏｎｔ  ＤＪ，  Ｐａｒｋ  ＪＫ，  Ｈａｌｌｅｒ  Ｈ，  Ｄａｖｉｄ  Ｓ，  “Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｉｅ２  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｋｉｄｎｅｙ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ”  Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．  ２０１６  Ｓｅｐ  ２４；６（３）：５７３−８２．
Ｔｏｕｒｎａｉｒｅ  Ｒ，  Ｓｉｍｏｎ  ＭＰ，  ｌｅ  Ｎｏｂｌｅ  Ｆ，  Ｅｉｃｈｍａｎｎ  Ａ，  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｐ，  Ｐｏｕｙｓｓｅｇｕｒ  Ｊ，  “Ａ  ｓｈｏｒｔ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ，  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  Ｔｉｅ２  ｒｅｃｅｐｔｏｒ”  ＥＭＢＯ  Ｒｅｐ．  ２００４  Ｍａｒ；５（３）：２６２−７．
Ｖａｎ  Ｓｌｙｋｅ  Ｐ，  Ａｌａｍｉ  Ｊ，  Ｍａｒｔｉｎ  Ｄ，  Ｋｕｌｉｓｚｅｗｓｋｉ  Ｍ，  Ｌｅｏｎｇ−Ｐｏｉ  Ｈ，  Ｓｅｆｔｏｎ  ＭＶ，  Ｄｕｍｏｎｔ  Ｄ  “Ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ  ｂｙ  ａｎ  ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｉｍｅｔｉｃ”  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  Ｐａｒｔ  Ａ．  ２００９  Ｊｕｎ；１５（６）：１２６９−８０．
Ｗｕ  Ｘ，  Ｚｈａｏ  Ｒ，  Ｌｉ  Ｚ，  Ｙａｏ  Ｍ，  Ｗａｎｇ  Ｈ，  Ｈａｎ  Ｊ，  Ｑｕ  Ｓ，  Ｃｈｅｎ  Ｘ，  Ｑｉａｎ  Ｌ，  Ｓｕｎ  Ｙ，  Ｘｕ  Ｙ，  Ｇｕ  Ｊ，  “Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｍａｌｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｓ  ａ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｌｉｇａｎｄ  ｆｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  Ｔｉｅ２”  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２００４  Ｍａｒ  １９；３１５（４）：１００４−１０．
Ｚｈａｎｇ  ＺＧ，  Ｚｈａｎｇ  Ｌ，  Ｃｒｏｌｌ  ＳＤ，  Ｃｈｏｐｐ  Ｍ，  “Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｖｅｓｓｅｌ  ｌｅａｋａｇｅ  ａｎｄ  ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｌｅｓｉｏｎ  ｖｏｌｕｍｅ  ａｆｔｅｒ  ｆｏｃａｌ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｅｍｂｏｌｉｃ  ｉｓｃｈｅｍｉａ  ｉｎ  ｍｉｃｅ”  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．  ２００２；１１３（３）：６８３−７．
【図１Ａ】
2020506223.tif 000025
【図１Ｂ】
2020506223.tif 000026
【図２Ａ−Ｄ】
2020506223.tif 000027
【図２Ｅ−Ｇ】
2020506223.tif 000028
【図３Ａ−Ｂ】
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【図４Ａ】
2020506223.tif 000030
【図４Ｂ】
2020506223.tif 000031
【図５Ａ−Ｃ】
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【図６Ａ】
2020506223.tif 000033
【図６Ｂ−Ｅ】
2020506223.tif 000034
【図６Ｆ−Ｉ】
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【図７Ａ−Ｂ】
2020506223.tif 000036
【図８】
2020506223.tif 000037
【手続補正書】
【提出日】令和1年11月1日(2019.11.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2020506223000001.app
【国際調査報告】
2020506223.tif 000038
2020506223.tif 000039
2020506223.tif 000040
2020506223.tif 000041
2020506223.tif 000042