(57)【要約】内部容積または内腔容積を有する基底膜構築物を作製するための組成物および方法が開示される。上記内部容積または内腔容積は、液体（例えば、血液）またはガス灌流のための脈管ネットワークの形態にあり得る。上記内部空間はまた、細胞（例えば、上皮細胞）を含み得る。基底膜構築物を含む組織および器官、ならびにその作製法がまた、開示される。いくつかの実施形態において、本発明は、基底膜によって裏打ちされた１または多数の三次元チャネルネットワークを含む足場の必要性に対処し、規定された厚みおよび組成の基底膜によって裏打ちされた三次元チャネルネットワークを生成するための新規な方法を提供する。この脈管構築物は、細胞ありまたはなしで支持材料の中に埋め込まれ得、より高レベルの機能を可能にするために上皮細胞裏打ちが再度生息させられ得る。
2020513987.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
内部容積を規定する薄膜を含む組成物であって、ここで該薄膜は、機能的基底膜材料を含む、組成物。
【請求項２】
前記内部容積は、上側および下側を有し、前記薄膜は、該上側を規定し、ポリマーまたはヒドロゲルは、該下側を規定する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記内部容積は、上側および下側を有し、前記薄膜は、該上側および該下側を規定する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記薄膜は、該薄膜を横切って、流体濾過、ガス拡散、電解質の分泌もしくは吸収、および／またはホルモンの拡散が可能である、請求項１〜３に記載の組成物。
【請求項５】
前記薄膜は、約０．１μＭ〜約１００μＭの厚みを有する、請求項１〜４に記載の組成物。
【請求項６】
前記薄膜は、約１０μＭまたはこれより薄い厚みを有する、請求項１〜４に記載の組成物。
【請求項７】
前記薄膜は、約１μＭまたはこれより薄い厚みを有する、請求項１〜４に記載の組成物。
【請求項８】
前記内部容積は、少なくとも１つのチャネルを含む、請求項１〜７に記載の組成物。
【請求項９】
前記少なくとも１つのチャネルは、直径が減少した分岐を有する分岐チャネルネットワークを含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記内部容積は、外部空間に接続される、請求項１〜９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記内部容積は、脈管チャネルネットワークを形成する、請求項１〜１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記脈管チャネルネットワークは、約０．０１ｍＬ〜約１０Ｌの容積を有する、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記機能的基底膜材料は、液化またはホモジナイズされた脱細胞化組織を含む、請求項１〜１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記機能的基底膜材料は、コラーゲン、ゼラチン、ヒドロゲル、ポリ乳酸、キトサン、または他の生体適合性材料もしくはこれらの材料の複合材を含む、請求項１〜１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記薄膜は、硬化されるか、架橋されるか、重合されるか、乾燥されるか、またはゲル化される、請求項１〜１４に記載の組成物。
【請求項１６】
三次元空間において多数の内部容積を規定する多数のフィルムを含む、請求項１〜１５に記載の組成物。
【請求項１７】
細胞足場をさらに含む、請求項１〜１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記内部容積の中に、および１またはこれより多くの薄膜の表面に付着した１またはこれより多くの細胞タイプをさらに含む、請求項１〜１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記１またはこれより多くの細胞タイプは、上皮細胞タイプを含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記１またはこれより多くの細胞タイプは、幹細胞または前駆細胞タイプを含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２１】
ヒト血管内皮細胞を含む第１の脈管ネットワークである第１の内部容積およびヒト腎上皮細胞を含む第２の脈管ネットワークである第２の内部容積を含み、ここで前記組成物は、患者の血液循環系に接続された場合に、血液透析が可能である、請求項１〜２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記組成物は、患者に移植される、請求項１〜２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記組成物は、覆い、または内方成長もしくは周りの組織との他の不安定化相互作用を防止するような他の囲いを含む、請求項１〜２２に記載の組成物。
【請求項２４】
ヒト血管内皮細胞を含む第１の脈管ネットワークである第１の内部容積およびヒト肺上皮細胞を含む第２の脈管ネットワークである第２の内部容積を含み、ここで前記組成物は、患者の血液循環系に接続した場合、ガス交換が可能である、請求項１〜２０に記載の組成物。
【請求項２５】
前記組成物の拡大および収縮を可能にする弾性線維をさらに含む、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記組成物は、前記患者に移植される、請求項２４〜２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記組成物は、覆い、または内方成長もしくは周りの組織との他の不安定化相互作用を防止するような他の囲いを含む、請求項２４〜２６に記載の組成物。
【請求項２８】
ａ．ヒト血管内皮細胞を含む第１の脈管ネットワークである第１の内部容積およびヒト腸上皮細胞を含む１またはこれより多くの内腔空間である第２の内部容積、ならびに
ｂ．該内部容積の外側の間質細胞および筋細胞であって、ここで前記組成物は、蠕動、および患者の血液循環系に接続した場合、前記患者の血液への栄養素吸収が可能である、間質細胞および筋細胞、
を含む、請求項１〜２０に記載の組成物。
【請求項２９】
ヒト血管内皮細胞を含む第１の脈管ネットワークである第１の内部容積およびヒト内分泌細胞を含む第２の脈管ネットワークである第２の内部容積を含み、ここで前記組成物は、患者の血液循環系に接続した場合、該患者の血液へとホルモンまたは他の物質を拡散することが可能である、請求項１〜２０に記載の組成物。
【請求項３０】
請求項１〜２９に記載の組成物を含む、組織または器官構築物。
【請求項３１】
基底膜構築物を作製するための方法であって、該方法は、
ａ．支持構造体または薄膜層上に１またはこれより多くの犠牲材料を含む犠牲構造体を生成する工程；
ｂ．機能的基底膜材料を含む薄膜層を、該犠牲構造体に付与する工程；
ｃ．工程（ａ）および次いで（ｂ）を、１またはこれより多くの回数、必要に応じて反復する工程；
ｄ．工程（ａ）、（ｂ）および必要に応じて（ｃ）の生成物を、犠牲材料または永久材料の中に必要に応じて埋め込む工程；ならびに
ｅ．該犠牲材料を除去して、１またはこれより多くの内部容積を提供し、それによって、基底膜構築物を作製する工程、
を包含する方法。
【請求項３２】
前記犠牲材料は、熱可逆性ゲル化特性を有する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記工程（ａ）の犠牲構造体は、押し出し、成形、ミリング、または付加プリンティングによって生成される、請求項３１〜３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記犠牲構造体は、少なくとも１つのチャネルを規定する容積を有する、請求項３１〜３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記少なくとも１つのチャネルは、直径が減少した分岐を有する分岐チャネルネットワークを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記犠牲構造体は、脈管チャネルネットワークまたは内腔空間を規定する容積を有する、請求項３１〜３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記脈管チャネルネットワークまたは内腔空間は、約１ｍＬ〜約１０Ｌの容積を規定する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記支持構造体は、細胞足場を含む、請求項３１〜３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記工程（ｂ）の薄膜は、化学的または物理的薄膜堆積、噴霧化、吹きつけ、電界紡糸、またはゲル化によって付与される、請求項３１〜３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記工程（ｂの）薄膜は、約０．１μＭ〜約１００μＭの厚みを有する、請求項３１〜３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記工程（ｂ）の薄膜は、約１０μＭまたはこれより薄い厚みを有する、請求項３１〜４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記工程（ｂ）の薄膜は、約１μＭまたはこれより薄い厚みを有する、請求項３１〜４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記薄膜は、工程（ｂ）を行った後に、硬化されるか、架橋されるか、重合されるか、乾燥されるか、またはゲル化される、請求項３１〜４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記機能的基底膜材料は、液化またはホモジナイズされた、脱細胞化組織、器官、または細胞外マトリクスを含む、請求項３１〜４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記機能的基底膜材料は、コラーゲン、ニトロセルロース、ゼラチン、ヒドロゲル、またはポリ乳酸を含む、請求項３１〜４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記工程（ｅ）の基底膜構築物は、各薄膜層の間に１またはこれより多くの内部容積を含む、請求項３１〜４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記工程（ｅ）の基底膜構築物は、交互になった薄膜層の間に１またはこれより多くの内部容積を含む、請求項３１〜４６に記載の方法。
【請求項４８】
工程（ｅ）は、前記犠牲材料を除去する前に、熱の印加によって、該犠牲材料を相変化または脱ゲル化に供する工程をさらに包含する、請求項３１〜４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記１またはこれより多くの内部容積に、１またはこれより多くの細胞タイプを生息させる工程という工程（ｆ）をさらに包含する、請求項３１〜４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記１またはこれより多くの細胞タイプは、上皮細胞タイプを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記構築物に、前記１またはこれより多くの内部容積に対して外側に細胞を生息させる工程という工程（ｇ）をさらに包含する、請求項３１〜５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記工程（ｅ）の基底膜構築物は、ヒト血管内皮細胞を含む第１の脈管ネットワークである第１の内部容積およびヒト腎上皮細胞を含む第２の脈管ネットワークである第２の内部容積を含み、ここで前記組成物は、患者の血液循環系に接続された場合に、血液透析が可能である、請求項３１〜５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記工程（ｅ）の基底膜構築物は、ヒト血管内皮細胞を含む第１の脈管ネットワークである第１の内部容積およびヒト肺上皮細胞を含む第２の脈管ネットワークである第２の内部容積を含み、ここで前記組成物は、患者の血液循環系に接続した場合、ガス交換が可能である、請求項３１〜５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記工程（ｅ）の基底膜構築物は、
ａ．ヒト血管内皮細胞を含む第１の脈管ネットワークである第１の内部容積およびヒト腸上皮細胞を含む１またはこれより多くの内腔空間である第２の内部容積、ならびに
ｂ．該内部容積の外側の間質細胞および筋細胞であって、ここで前記組成物は、蠕動、および患者の血液循環系に接続した場合、前記患者の血液への栄養素吸収が可能である、間質細胞および筋細胞、
を含む、請求項３１〜５１に記載の方法。
【請求項５５】
前記工程（ｅ）の基底膜構築物は、ヒト血管内皮細胞を含む第１の脈管ネットワークである第１の内部容積およびヒト内分泌細胞を含む第２の脈管ネットワークである第２の内部容積を含み、ここで前記組成物は、患者の血液循環系に接続した場合、該患者の血液へとホルモンまたは他の物質を拡散することが可能である、請求項３１〜５１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１６年１２月１６日に出願された米国仮出願番号第６２／４３５，１２１号、２０１７年１０月３日に出願された米国仮出願番号第６２／５６７，７４６号、および２０１７年１０月３日に出願された米国仮出願番号第６２／５６７，７４８号の利益を主張し、これら出願の内容は、それらの全体が参考として本明細書によって援用される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ヒトスケールの組織および器官移植片のバイオエンジニアリングは、細胞が定住してそれらの機能を果たすために三次元の状況を提供し、灌流可能な脈管系を供給して、それぞれの組織の代謝的要求を満たすマトリクスの生成を要求する。このようなマトリクスまたは足場は、他の技術の中でも、リソグラフィー、ステレオリソグラフィー、電界紡糸、光重合、および押し出しプリンティングを含む技術を使用して生成されてきた。今日まで、脈管チャネルネットワークの創出は、このプロセスにおける大きな制限要因であった。最も近年では、除去しやすいインクを使用する多方向３Ｄプリンティング（ｍｕｌｔｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ３Ｄ  ｐｒｉｎｔｉｎｇ）のような技術は、物質の固体ブロック内での三次元チャネルネットワークの生成を可能にしてきた。この技術は、固体組織（例えば、骨格筋、または軟骨）を生成するために適用され得る。
【０００３】
これらの例とは対照的に、１またはこれより多くの上皮構造を含む組織および器官（消化器系、内分泌系、神経系、リンパ系、外皮系、生殖系、呼吸器系、感覚系、泌尿器系、および循環系）は、流体の濾過（腎臓、眼、リンパ、脳）、ガスの拡散（肺）、電解質および他の分子の分泌および吸収（腎臓、腸、肝臓、腸組織）、ならびに１つの管腔もしくは区画から別の管腔もしくは区画へのホルモンの拡散（膵臓、下垂体、副腎）のような機能を可能にする薄い基底膜の存在に依存する。多くの場合には、この基底膜は、機能を可能にするために＜１μｍまたは＜１０μｍ厚でなければならない（腎臓、肺）。
【０００４】
現在、本発明者らは、このような基底膜によって裏打ちされた１または多数の三次元チャネルネットワークを含む足場を生成するために存在するいかなる技術も知らない。三次元付加プリンティング技術は、この点まで、生理学的に正確な脈管構造体を含む組織構築物の開発を妨げてきた分解能および材料の制約によって提示される顕著な限界を有する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の要旨
いくつかの実施形態において、本発明は、基底膜によって裏打ちされた１または多数の三次元チャネルネットワークを含む足場の必要性に対処し、規定された厚みおよび組成の基底膜によって裏打ちされた三次元チャネルネットワークを生成するための新規な方法を提供する。この脈管構築物は、細胞ありまたはなしで支持材料の中に埋め込まれ得、より高レベルの機能を可能にするために上皮細胞裏打ちが再度生息させられ得る。
【０００６】
本発明のいくつかの実施形態は、内部容積（例えば、内腔区画）を規定する１またはこれより多くの薄膜（ときおり、メンブレン、薄膜メンブレン、または薄膜メンブレン構成要素としても本明細書で言及される）を含む組成物（例えば、基底膜構築物、脈管化基底膜構築物、組織、器官）に関し、ここで上記１またはこれより多くの薄膜は、機能的基底膜材料を含む。いくつかの実施形態において、その内部容積は、上側および下側を有し、薄膜は、上記上側を規定し、ポリマーまたはヒドロゲルは、上記下側を規定する（例えば、上記内部容積は、上記薄膜と上記基底膜との間に挟まれる）。いくつかの実施形態において、薄膜は、上記上側および上記下側の両方を規定する（例えば、上記内部容積は、１または２つの薄膜の間に挟まれる）。
【０００７】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの薄膜は、上記薄膜を横断して、流体濾過、ガス拡散。電解質の分泌もしくは吸収、および／またはホルモンの拡散が可能である。例えば、薄膜は、血液透析、呼吸のための血液ガス交換；消化のための血液への栄養素の吸収、または内分泌機能のための血液へのホルモンの導入を行うために適切であり得る。
【０００８】
いくつかの実施形態において、上記１またはこれより多くの薄膜は、約０．１μＭ〜約１００μＭの、約０．１μＭ〜約１００μＭの、約０．５μＭ〜約５０μＭの、約１．０μＭ〜約４０μＭの、約５．０μＭ〜約３０μＭの、もしくは約１０μＭ〜約２０μＭの、またはこれらの間の任意の範囲の厚みを有する。いくつかの実施形態において、上記１またはこれより多くの薄膜は、約１０μＭまたはこれより薄い厚みを有する。いくつかの実施形態において、上記１またはこれより多くの薄膜は、約１μＭまたはこれより薄い厚みを有する。
【０００９】
いくつかの実施形態において、上記内部容積は、１またはこれより多くのチャネル（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、１００、２００、５００、７５０、１０００、２０００、１００００のチャネル）を含む。いくつかの実施形態において、上記少なくとも１つのチャネルは、直径が減少した１またはこれより多くの分岐（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、１００、２００、５００、７５０、１０００、２０００、１００００の分岐）を有する分岐チャネルネットワークを含む。いくつかの実施形態において、チャネル直径としては、約１０ｃｍ、１０ｍｍ、５ｍｍ、１ｍｍ、５００μｍ、５０μｍ、１０μｍ、５μｍ、３μｍ、１μｍ、０．５μｍ、０．１μｍ、０．０５μｍ、０．０２μｍ、または０．０１μｍが挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００１０】
いくつかの実施形態において、上記内部容積は、外部空間に接続される。例えば、上記内部容積は、上記内部容積を通じて（例えば、脈管ネットワークを形成する内部容積を通じて）血流を可能にする、患者の動脈に動作可能に接続され得るチャネルおよび患者の静脈に接続されるチャネルを有し得る。
【００１１】
いくつかの実施形態において、上記内部容積は、脈管チャネルネットワークを形成する。例えば、上記内部容積は、肺、腎臓、消化器またはヒト身体の他の組織における脈管ネットワークの構造を模倣し得る。いくつかの実施形態において、上記脈管チャネルネットワークは、約０．０１ｍＬ〜約１０Ｌの、約０．１ｍＬ〜約５Ｌの、約１ｍＬ〜約１Ｌの、約１０ｍＬ〜約０．５Ｌの、５０ｍＬ〜約２５０ｍＬの、もしくは約７５ｍＬ〜約１５０ｍＬの、またはこれらの間の任意の範囲の容積を有する。
【００１２】
いくつかの実施形態において、上記機能的基底膜材料は、脱細胞化組織を含む。いくつかの実施形態において、上記脱細胞化組織は、液化またはホモジナイズされている。いくつかの実施形態において、上記機能的基底膜材料は、コラーゲン、ゼラチン、ヒドロゲル、ポリ乳酸、キトサン、および／または他の生体適合性材料もしくはこれらの材料の複合材を含む。
【００１３】
いくつかの実施形態において、上記薄膜は、硬化されるか、架橋されるか、重合されるか、乾燥されるか、および／またはゲル化される。
【００１４】
いくつかの実施形態において、上記組成物は、三次元空間において多数の内部容積を規定する多数のフィルムを含む。例えば、上記組成物は、血液のための脈管ネットワークである第１の内部容積および薄膜によって第１の内部容積から分離された第２の内部容積を含み得る。
【００１５】
いくつかの実施形態において、上記組成物は、細胞足場をさらに含む。いくつかの実施形態において、上記細胞足場は、脱細胞化組織または器官に由来する。
【００１６】
いくつかの実施形態において、上記組成物は、上記内部容積の中に、および１またはこれより多くの薄膜の表面に付着した１またはこれより多くの細胞タイプをさらに含む。いくつかの実施形態において、上記１またはこれより多くの細胞タイプは、上皮細胞タイプを含む。「上皮細胞（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）」とは、中空器官を裏打ちする細胞、ならびに身体の腺および外表面を構成する細胞をいう。一般に、上皮細胞には４タイプあると考えられ得る：扁平上皮細胞、円柱上皮細胞、腺上皮細胞および移行上皮細胞。いくつかの実施形態において、上記上皮細胞タイプは、前立腺細胞、乳腺細胞、肝細胞、膵島細胞（β細胞を含む）、肺上皮細胞、腎臓細胞、膀胱細胞、胃上皮細胞、大腸および小腸の上皮細胞、尿道上皮細胞、精巣上皮細胞、卵巣上皮細胞、子宮頸部上皮細胞、甲状腺細胞、副甲状腺細胞、副腎細胞、胸腺細胞、胆嚢細胞、および下垂体細胞から選択される。
【００１７】
いくつかの実施形態において、上記組成物は、内部容積において、および１またはこれより多くの薄膜の表面に付着した１またはこれより多くの細胞タイプをさらに含む。いくつかの実施形態において、上記１またはこれより多くの細胞タイプは、幹細胞または前駆細胞タイプを含む。「幹細胞（ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）とは、最終分化していない細胞に言及し、生成、成熟、または別の方法で異なるタイプの細胞へと形質転換し得る。幹細胞は、全能性（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ）、多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）、多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）、少能性（ｏｌｉｇｉｐｏｔｅｎｔ）および単能性（ｕｎｉｐｏｔｅｎｔ）の幹細胞を含み得る。幹細胞の具体例としては、胚性幹細胞、胎児性幹細胞、成体幹細胞、および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）（例えば、米国出願公開番号２０１０／０１４４０３１、同２０１１／００７６６７８、同２０１１／００８８１０７、同２０１２／００２８８２１（これらは全て本明細書に参考として援用される））が挙げられる。
【００１８】
いくつかの実施形態において、上記組成物は、ヒト血管内皮細胞を含む第１の脈管ネットワークである第１の内部容積およびヒト腎上皮細胞を含む第２の脈管ネットワークである第２の内部容積を含み、ここで組成物は、患者の血液循環系に接続された場合に、血液透析が可能である。例えば、上記組成物は、患者の腎臓組織を補充するかまたは置き換えるために使用され得る。いくつかの実施形態において、上記組成物は、上記患者に移植される。いくつかの実施形態において、上記組成物は、上記患者に対して体外にある。
【００１９】
いくつかの実施形態において、上記組成物は、ヒト血管内皮細胞を含む第１の脈管ネットワークである第１の内部容積およびヒト肺上皮細胞を含む第２の脈管ネットワークである第２の内部容積を含み、ここで組成物は、患者の血液循環系に接続された場合に、ガス交換が可能である。例えば、上記組成物は、患者の肺組織を補充するかまたは置き換えるために使用され得る。いくつかの実施形態において、上記組成物は、上記組成物の拡大および収縮を可能にする弾性線維を含む。いくつかの実施形態において、上記組成物は、上記患者に移植される。いくつかの実施形態において、上記組成物は、上記患者に対して体外にある。
【００２０】
いくつかの実施形態において、上記組成物は、ヒト血管内皮細胞を含む第１の脈管ネットワークである第１の内部容積およびヒト腸上皮細胞を含む１またはこれより多くの内腔空間である第２の内部容積、ならびに内部容積の外側の間質細胞および筋細胞であって、ここで組成物は、蠕動、および患者の血液循環系に接続した場合、患者の血液への栄養素吸収が可能である、間質細胞および筋細胞、を含む。例えば、上記組成物は、患者の消化器の一部を補充するかまたは置き換えるために使用され得る。
【００２１】
いくつかの実施形態において、上記組成物は、ヒト血管内皮細胞を含む第１の脈管ネットワークである第１の内部容積およびヒト内分泌細胞を含む第２の脈管ネットワークである第２の内部容積を含み、ここで組成物は、患者の血液循環系に接続した場合、患者の血液へとホルモンまたは他の物質を拡散することが可能である。例えば、上記組成物は、患者の甲状腺、副甲状腺、副腎、胸腺、および／または下垂体組織を補充するかまたは置き換えるために使用され得る。
【００２２】
いくつかの実施形態において、上記組成物は、組織または器官構築物である。
【００２３】
本発明のいくつかの局面は、基底膜構築物を作製するための方法に方向付けられ、方法は、支持構造体または薄膜層上に１またはこれより多くの犠牲材料を含む犠牲構造体（本明細書において、チャネル構成要素またはチャネルネットワーク構成要素と呼ばれる場合もある）を生成する工程；機能的基底膜材料を含む薄膜層を、犠牲構造体に付与する工程；工程（ａ）および次いで（ｂ）を、１またはこれより多くの回数、必要に応じて反復する工程；工程（ａ）、（ｂ）および必要に応じて（ｃ）の生成物を、犠牲材料または永久材料の中に必要に応じて埋め込む工程；ならびに犠牲材料を除去して、１またはこれより多くの内部容積を提供し、それによって、基底膜構築物を作製する工程、を包含する。
【００２４】
ある実施形態において、上記犠牲材料は、熱可逆性ゲル化特性を有するか、または熱もしくは冷却の印加後に相変化を受け得る。任意の適切な材料は、これらが薄膜および／または永久材料の除去、分解、およびまたはこれらへの損傷なしに除去され得る場合、犠牲材料であり得る。いくつかの実施形態において、上記犠牲材料は、上記薄膜および／または永久材料が可溶性でない条件下で可溶性である。いくつかの実施形態において、上記犠牲材料は、上記薄膜および／または永久材料が消化可能でない条件下で、化学的にまたは酵素的に消化可能である。いくつかの実施形態において、上記犠牲材料は、ポリマーまたはヒドロゲルである。
【００２５】
ある実施形態において、上記工程（ａ）の犠牲構造体は、押し出し、成形、ミリング、または付加プリンティングによって生成される。上記犠牲構造体を生成するための方法は、限定されず、当該分野での任意の適切な方法を使用し得る。
【００２６】
いくつかの実施形態において、上記犠牲材料は、本明細書で記載されるとおりの内部空間（例えば、内腔空間）を規定する。いくつかの実施形態において、上記犠牲構造体は、少なくとも１つのチャネル（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、１００、２００、５００、７５０、１０００、２０００、１００００のチャネル）を規定する容積を有する。いくつかの実施形態において、上記少なくとも１つのチャネルは、直径が減少した分岐（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、１００、２００、５００、７５０、１０００、２０００、１００００の分岐）を有する分岐チャネルネットワークを含む。いくつかの実施形態において、チャネル直径としては、約１０ｃｍ、１０ｍｍ、５ｍｍ、１ｍｍ、５００μｍ、５０μｍ、１０μｍ、５μｍ、３μｍ、１μｍ、０．５μｍ、０．１μｍ、０．０５μｍ、０．０２μｍ、または０．０１μｍが挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００２７】
いくつかの実施形態において、上記犠牲構造体は、脈管チャネルネットワークまたは内腔空間を規定する容積を有する。いくつかの実施形態において、上記脈管チャネルネットワークまたは内腔空間は、約０．０１ｍＬ〜約１０Ｌの、約０．１ｍＬ〜約５Ｌの、約１ｍＬ〜約１Ｌの、約１０ｍＬ〜約０．５Ｌの、約５０ｍＬ〜約２５０ｍＬの、もしくは約７５ｍＬ〜約１５０ｍＬの、またはこれらの間の任意の範囲の容積を規定する。
【００２８】
いくつかの実施形態において、上記チャネルネットワークまたは内腔空間は、スタンピング、成形、または上記足場材料内の空白空間（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｓｐａｃｅ）もしくは上記足場材料のうちの一部を生成するであろう当該分野で公知の他の技術を通じて規定される。次いで、この空間は、薄膜メンブレンの追加によって包含されるかまたは分離される（図６）。
【００２９】
いくつかの実施形態において、上記チャネルネットワークまたは内腔空間は、薄膜メンブレンの選択的接着を通じて規定される。例えば、いくつかの実施形態において、２つの薄膜メンブレン片は重ねられ得、そして内部空間またはチャネルネットワークがその２つのメンブレンの間で形成されるようなパターンで、選択的に溶融、接着剤で接着、架橋、または別の方法で互いに接着され得る（図７）。
【００３０】
いくつかの実施形態において、上記支持構造体は、細胞足場を含む。いくつかの実施形態において、上記細胞足場は、脱細胞化組織または器官に由来する。
【００３１】
いくつかの実施形態において、上記工程（ｂ）の薄膜は、化学的または物理的な薄膜堆積、噴霧化、吹きつけ、電界紡糸、またはゲル化によって付与される。薄膜堆積の任意の適切な方法が使用され得、限定されない。
【００３２】
いくつかの実施形態において、上記工程（ｂ）の薄膜は、約０．１μＭ〜約１００μＭの、約０．１μＭ〜約１００μＭの、約０．５μＭ〜約５０μＭの、約１．０μＭ〜約４０μＭの、約５．０μＭ〜約３０μＭの、もしくは約１０μＭ〜約２０μＭの、またはこれらの間の任意の範囲の厚みを有する。いくつかの実施形態において、上記工程（ｂ）の薄膜は、約１０μＭまたはこれより薄い厚みを有する。いくつかの実施形態において、上記工程（ｂ）の薄膜は、約１μＭまたはこれより薄い厚みを有する。
【００３３】
いくつかの実施形態において、上記薄膜は、工程（ｂ）を行った後に、硬化されるか、部分的にもしくは完全に架橋されるか、重合されるか、乾燥されるか、またはゲル化される。硬化、架橋、重合、乾燥、またはゲル化の任意の適切な方法が使用され得、限定されない。
【００３４】
いくつかの実施形態において、上記機能的基底膜材料は、液化またはホモジナイズされた、脱細胞化組織、器官、または細胞外マトリクスを含む。いくつかの実施形態において、上記機能的基底膜材料は、コラーゲン、ニトロセルロース、ゼラチン、ヒドロゲル、またはポリ乳酸を含む。
【００３５】
いくつかの実施形態において、上記工程（ｅ）の基底膜構築物は、各薄膜層の間に１またはこれより多くの内部容積を含む。例えば、上記基底膜構築物は、例えば、３つの薄膜層および２つの内部容積を含み得、その薄膜層のうちの１つは、両方の内部容積に接している。いくつかの実施形態において、上記工程（ｅ）の基底膜構築物は、交互になった薄膜層の間に１またはこれより多くの内部容積を含む。例えば、上記基底膜構築物は、例えば、４つの薄膜層および２つの内部容積を含み得、各薄膜層は、ただ１つの内部容積と接触している。いくつかの実施形態において、上記基底膜構築物（ｂａｓｅｍｅｎｔ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）は、各薄膜層の間に１またはこれより多くの内部容積を有する部分、および交互になった薄膜層の間に１またはこれより多くの内部容積を有する部分を含む。いくつかの実施形態において、上記基底膜構築物は、１つの薄膜メンブレンおよび支持構造体を含み、上記薄膜メンブレンと支持構造体との間に１またはこれより多くの内部容積または内腔空間を有する。いくつかの実施形態において、上記基底膜構築物は、２つの薄膜メンブレンおよび上記薄膜メンブレンの間に１またはこれより多くの内部容積または内腔空間を含む。
【００３６】
いくつかの実施形態において、工程（ｅ）は、犠牲材料を除去する前に、熱の印加によって、犠牲材料を相変化または脱ゲル化に供する工程をさらに包含する。
【００３７】
いくつかの実施形態において、上記方法は、１またはこれより多くの内部容積に、１またはこれより多くの細胞タイプを生息させる工程という工程（ｆ）をさらに包含する。いくつかの実施形態において、上記１またはこれより多くの細胞タイプは、上皮細胞タイプを含む。いくつかの実施形態において、上記上皮細胞タイプは、前立腺細胞、乳腺細胞、肝細胞、膵島細胞（β細胞を含む）、肺上皮細胞、腎臓細胞、膀胱細胞、胃上皮細胞、大腸および小腸の上皮細胞、尿道上皮細胞、精巣上皮細胞、卵巣上皮細胞、子宮頸部上皮細胞、甲状腺細胞、副甲状腺細胞、副腎細胞、胸腺細胞、胆嚢細胞、および下垂体細胞から選択される。
【００３８】
いくつかの実施形態において、上記方法は、構築物に、１またはこれより多くの内部容積に対して外側に細胞を生息させる工程という工程（ｇ）をさらに包含する。  
【００３９】
いくつかの実施形態において、上記工程（ｅ）の基底膜構築物は、ヒト血管内皮細胞を含む第１の脈管ネットワークである第１の内部容積およびヒト腎上皮細胞を含む第２の脈管ネットワークである第２の内部容積を含み、ここで組成物は、患者の血液循環系に接続された場合に、血液透析が可能である。例えば、上記組成物は、患者の腎臓組織を補充するかまたは置き換えるために使用され得る。
【００４０】
いくつかの実施形態において、上記工程（ｅ）の基底膜構築物は、ヒト血管内皮細胞を含む第１の脈管ネットワークである第１の内部容積およびヒト肺上皮細胞を含む第２の脈管ネットワークである第２の内部容積を含み、ここで前記組成物は、患者の血液循環系に接続した場合、ガス交換が可能である。例えば、上記組成物は、患者の肺組織を補充するかまたは置き換えるために使用され得る。
【００４１】
いくつかの実施形態において、上記工程（ｅ）の基底膜構築物は、ヒト血管内皮細胞を含む第１の脈管ネットワークである第１の内部容積およびヒト腸上皮細胞を含む１またはこれより多くの内腔空間である第２の内部容積、ならびに内部容積の外側の間質細胞および筋細胞であって、ここで組成物は、蠕動、および患者の血液循環系に接続した場合、患者の血液への栄養素吸収が可能である、間質細胞および筋細胞、を含む。例えば、上記組成物は、患者の消化器の一部を補充するかまたは置き換えるために使用され得る。
【００４２】
いくつかの実施形態において、上記工程（ｅ）の基底膜構築物は、ヒト血管内皮細胞を含む第１の脈管ネットワークである第１の内部容積およびヒト内分泌細胞を含む第２の脈管ネットワークである第２の内部容積を含み、ここで前記組成物は、患者の血液循環系に接続した場合、該患者の血液へとホルモンまたは他の物質を拡散することが可能である。例えば、上記組成物は、患者の甲状腺、副甲状腺、副腎、胸腺、および／または下垂体組織を補充するかまたは置き換えるために使用され得る。
【００４３】
本発明のこれらのおよび他の特徴は、添付の図面と併せて以下の詳細な説明を参照することによって、より詳細に理解されるであろう。特許または出願書類は、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含有する。カラー図面を伴う本特許または特許出願公報のコピーは、申請して必要な料金を支払えば、特許庁によって提供されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１Ａ〜１Ｃは、メンブレンが独立型の構成要素（これは、次いで、上記足場へと組み込まれる）として作られる薄膜メンブレン足場アセンブリの構成要素ベースの方法を示す：Ａ）薄膜メンブレンが作られ、Ｂ）犠牲材料が上記メンブレン上に堆積されて、１またはこれより多くの側面上にチャネルネットワークを形成し、そしてＣ）上記メンブレンおよびチャネル構成要素が、足場材料の中に埋め込まれて、上記足場構築物を形成し得る。
【００４５】
【図２】図２Ａ〜２Ｃは、上記メンブレンが堆積されるか、またはチャネルネットワークもしくは他の足場構成要素上にまたはこれらとともに別の方法で作られる、薄膜メンブレン足場アセンブリの逐次的方法を示す：Ａ）犠牲材料が堆積されて、チャネルネットワークを形成し、Ｂ）薄膜メンブレンが堆積されるか、または上記チャネルネットワークとともに別の方法で作られ、そしてＣ）上記メンブレンおよびチャネル構成要素は、足場材料の中に埋め込まれて、上記構築物を形成する。
【００４６】
【図３】図３Ａ〜３Ｄは、上記メンブレンが堆積されるか、またはチャネルネットワークもしくは他の足場構成要素上にまたはこれらとともに別の方法で作られる、薄膜メンブレン足場アセンブリの交互になった方法を示し、このプロセスは、より大きなおよび／またはより複雑な足場を形成するために反復される：Ａ）薄膜メンブレンおよび犠牲材料が堆積されて、最初のチャネルネットワークを形成し、Ｂ）第２の薄膜メンブレン層が堆積され、Ｃ）さらなる犠牲材料層が堆積され、そしてＤ）上記プロセスは反復されて、より大きな足場を形成する。
【００４７】
【図４】図４Ａ〜４Ｃは、完成した足場構築物に対する細胞播種のための方法を示す：Ａ）無細胞足場を作り、Ｂ）除去しやすい物質を除去し、上記チャネルネットワークの空白空間を形成し、そしてＣ）多数の細胞集団を上記足場およびチャネルネットワークへと播種する。
【００４８】
【図５】図５Ａ〜５Ｃは、足場構築物の細胞化（ｃｅｌｌｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）のための代替の方法を示す：Ａ）上記細胞を埋め込むか、被包するか、または別の方法で上記足場を構築するために使用される材料に含め、Ｂ）上記足場が架橋されるか、培養されるか、または別の方法で安定化されるにつれて、上記細胞は、上記足場に付着し、そしてＣ）上記除去しやすい材料は、上記空白空間を裏打ちする細胞内容物を残して、上記チャネルネットワークから除去される。
【００４９】
【図６】図６Ａ〜６Ｃは、上記足場材料または上記足場材料のうちの一部の中に空白空間を生成するであろう、スタンピング、成形、または当該分野で公知の他の技術を通じて規定されるチャネルネットワークまたは内腔空間の構築のための代替の方法を示す：Ａ）上記足場材料が成形されて、上記チャネルネットワークまたは内腔空間の空白を作りだし、Ｂ）上記薄膜メンブレンは架橋されるか、または別の方法で上記足場材料に接着され、閉鎖したチャネルネットワークを作りだし、そしてＣ）第２の足場材料構成要素が成形され、上記構築物に追加されて、第２のチャネルネットワークを作り出す。このプロセスは、連続して反復され得る。
【００５０】
【図７】図７Ａ〜７Ｃは、薄膜メンブレンの選択的接着を通じて規定される、上記チャネルネットワークまたは内腔空間の構築のための代替の方法を示す：Ａ）２つの薄膜メンブレン片は、重ねられ得、Ｂ）上記メンブレンは、内部空間またはチャネルネットワークがその２つのメンブレンの間で形成されるようなパターンで、選択的に溶融、接着剤で接着、架橋、または別の方法で互いに接着され得、Ｃ）上記領域中で形成された内腔空間は、接着されたメンブレンを有しない。
【００５１】
【図８】図８は、薄膜メンブレン、足場、チャネルネットワーク、および薄膜メンブレン足場の構築のために本明細書で記載されるこれら技術を使用して作られる器官特異的構成の例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
発明の詳細な説明
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される発明は、天然の器官組織における基底膜と同じ機能（すなわち、濾過、拡散、吸収、および分泌）を行い得る器官足場内に生体模倣メンブレンを作り出すことによって、機能的器官組織構築物を操作するために必要とされる重要な構成要素に対処する。いくつかの実施形態において、本発明は、組織エンジニアリングのために、足場へと組み込まれ得る種々の組成および特性の生物学的薄膜メンブレンを構築するための方法を網羅する。これらの足場は、種々の材料組成のものであり得、流体、ガス、または他の材料を含むかまたは輸送することができる種々の構成の１またはこれより多くのチャネルネットワークを含み得る。これらのチャネルは、種々の組成の薄膜メンブレンに隣接するか、またはそのメンブレンで裏打ちされる。本発明のいくつかの実施形態の一般的概念は、図１に示される。具体的には、この実施形態において、その薄膜メンブレンは、区画、チャネル、またはチャネルネットワークおよび別の隣接する区画、チャネル、またはチャネルネットワークを、これら２つの区画、チャネル、またはチャネルネットワークの間の境界を規定して、部分的にまたは完全に包含する。このメンブレンおよびチャネル構成は、濾過、拡散、吸収、排泄、または他の生物学的機能を可能にする足場の機能的部分を含む。
【００５３】
いくつかの実施形態において、その薄膜メンブレン構成要素は、基材または表面上に生物学的材料のフィルムを作り出すために、吹きつけ、電界紡糸、薄膜堆積、または当該分野で公知の他の技術のような技術を使用して、製造され得る。いくつかの実施形態において、その足場において基底膜を含む薄膜は、別個の構成要素として構築され、その基材から除去される。その後、そのメンブレンは、次にさらに操作され得、その後、その区画、チャネル、またはチャネルネットワーク構成要素に沿って、その足場へと組み込まれる。いくつかの実施形態において、その薄膜メンブレンは、構築されるか、堆積されるか、またはチャネルネットワーク構成要素とともに別の方法で作られる。いくつかの実施形態において、その薄膜メンブレンは、具体的な構成の除去しやすい材料上に堆積され、これは、必要に応じてさらに埋め込まれ得るか、または別の方法で足場に組み込まれる。いくつかの実施形態において、その除去しやすい材料は、その除去しやすい材料に関する具体的な構成の薄膜メンブレン構成要素を生成する構築の間または後に、その足場から排出される。その薄膜メンブレン、チャネルネットワーク、および他の足場構成要素は、細胞なしで製造され得、細胞は、播種され得るか、被包され得るか、または足場全体の製作の間もしくは後の任意の時点で、これら構成要素のうちのいずれかもしくは全ての製造プロセスへと別の方法で組み込まれ得る。
【００５４】
いくつかの実施形態において、その薄膜メンブレンは、薄膜堆積に適切でかつ全体としてその足場内の区画の間の機械的実行可能性およびバリア完全性を維持することができる、任意の生物学的材料、合成材料、または複合材から構築され得る。この薄膜メンブレンは、そのメンブレンの機能、生体適合性、または他の品質を改善するためにデザインされた当該分野で公知の技術を使用して、製作の間に付与された孔、スリット、表面粗さ、または他の機能的特徴を含み得る。このメンブレンは、均一な、または０．０１μｍ〜１００μｍの範囲またはこれより大きな種々の厚みのものであり得る。
【００５５】
その足場内に含まれ、その薄膜メンブレンに隣接するチャネル区画またはネットワークは、所定のパターンまたは構成において堆積される、管腔空間を記載するために、型、フィラメント、押し出し、三次元プリンティング、または除去しやすい材料を含む以前に規定された種々の材料を使用する技術を使用して構築され得る。これらの材料は、分岐フローパターンおよび高い表面積を可能にするように、階層的パターンまたは構成において配置され得る。これらのチャネルネットワークは、その足場内で機能を生成または促進するように特異的様式でパターン化され得る。これらのチャネルネットワークは、相互に連結され得るかまたは別個であり得る。
【００５６】
その薄膜メンブレン構成要素の製造は、他の足場構成要素（例えば、チャネルネットワーク）の製造とは別個に起こってもよいし、その存在下で起こってもよいし、その製造とともに起こってもよい。その薄膜メンブレンの製造は、他の製造工程またはプロセスとともに、その足場の構築の間に逐次的様式で起こってもよい。そのメンブレン構成要素およびチャネルネットワーク構成要素は、完全な足場を形成するように逐次的に、または包括的な様式でアセンブルされ得、このプロセスの間に類似のまたは他の組成物の他の足場材料と組み合わされ得る。
【００５７】
その薄膜メンブレン構成要素は、薄膜に堆積され得、その後架橋、乾燥、ゲル化、硬化または別の方法で安定化されて、粘着性かつ機械的に安定な薄膜メンブレンを形成し得る、生物学的材料、合成材料、または複合材（例えば、コラーゲン、ゼラチン、他のヒドロゲル、セルロース、または他の材料から製造され得る。この薄膜は、増強された機能またはメカニクスを提供するためにさらなる処理または操作を受け得る。
【００５８】
そのチャネルネットワーク構成要素は、性質において除去しやすくてもそうでなくてもよく、溶解、液化、または別の方法でその足場から除去され得、チャネル区画またはネットワークを含む空白の管腔空間を作り出し得る材料から構築され得る。
【００５９】
その薄膜メンブレンまたはチャネルネットワーク構成要素によって包含されないその足場内のバルク材料は、これが、単一の粘着性の足場を形成するために、そのメンブレンと架橋され得るか、または別の方法で接着され得る限りにおいて、そのメンブレン構成要素と類似するかまたは似ていない組成の生物学的材料、合成材料、または複合材から構築され得る。
【００６０】
この足場は、インビトロ条件およびインビボ条件下で、機械的に、化学的に、および別の方法で安定であるように、適切な組成のものであり得る。この足場は、架橋され得るか、またはインビトロでの細胞培養およびインビボでの移植に適した温度で安定性を維持するように別の方法で質が変化される。
【００６１】
この足場は、細胞とともに構築され得るか、または細胞は、構築後に追加され得る。その足場は、その足場内の任意の位置において単一のまたは多数の細胞タイプを支持し得、これは、その細胞または足場位置に関する機能を増強するか、促進するか、または別の方法で提供してもよいし、しなくてもよい。そのメンブレン構成要素、チャネルネットワーク構成要素、およびバルク足場構成要素は、被包、生着、または当該分野で公知の他の手段を通じてそれらの構築物へと細胞を組み込み得る。その薄膜メンブレンおよび足場は、その足場の細胞リモデリング、再構築、および維持が起こるような材料から構築され得る。その細胞および足場相互作用は、薄膜メンブレン特徴、品質、または機能を改善または促進し得る。
【００６２】
その足場には、その薄膜メンブレン、チャネルネットワーク、およびバルク足場とともに、拡散、濾過、分泌、および吸収のような粘着性の、組織化された機能を提供し得る細胞が生息させられ得る。いくつかの実施形態において、この機能は、そのチャネルネットワークの内容物とともに、またはその内容物に依存して果たされ得、そのチャネルネットワークの内容物に対して物質的、化学的、生物学的、または他の質の変化を作製し得る。
【００６３】
本発明のいくつかの実施形態において、その足場およびメンブレンにグルコース、電解質、毒素、および他の分子の濾過、拡散、吸収および分泌が挙げられるが、これらに限定されない血液透析の機能を潜在的に提供し得る細胞タイプが生息させられる。その足場および薄膜メンブレンデバイスは、血液に対して以前に言及された機能を果たすために、その血液によって灌流されるチャネルネットワークを有し得る。その足場は、この機能を促進または増強するために、他の流体、例えば、透析液によって灌流されるさらなるチャネルネットワークを有していてもよいし、有していなくてもよい。本発明の実施形態は、体外様式で使用してもよいし、治療的適用のためにインビボでの血液透析移植片として患者に移植されてもよい。
【００６４】
本発明のいくつかの実施形態において、その足場および拡散、ガス交換、吸収および分泌が挙げられるが、これらに限定されない肺機能を潜在的に提供し得る細胞タイプが生息させられる。その足場および薄膜メンブレンデバイスは、血液に対して以前に言及された機能を果たすために、その血液によって灌流されるチャネルネットワークを有し得る。その足場は、この機能を促進または増強するために、他の流体またはガスによって灌流されるさらなるチャネルネットワークを有していてもよいし、有していなくてもよい。本発明の実施形態は、体外様式で使用してもよいし、治療的適用のためにインビボでのガス交換デバイスまたは肺組織移植片として患者に移植されてもよい。
【００６５】
本発明のいくつかの実施形態において、その足場およびメンブレンに、吸収および分泌が挙げられるが、これらに限定されない腸の機能を潜在的に提供し得る細胞タイプが生息させられる。その足場および薄膜メンブレンデバイスは、血液に対して以前に言及された機能を果たすために、その血液によって灌流されるチャネルネットワークを有し得る。その足場は、この機能を促進または増強するために、他の流体またはガスによって灌流されるさらなるチャネルネットワークを有していてもよいし、有していなくてもよい。本発明の実施形態は、治療的適用のためにインビボでの腸組織移植片として機能するように、患者に移植され得る。
【００６６】
本明細書で開示される発明のいくつかの実施形態において、その犠牲材料は、複雑性が増大しかつ直径が減少した分岐チャネルネットワークの形態で形づくられ得る。いくつかの実施形態において、チャネルネットワークの分岐は、その後合併して、漸減する数の直径の増大した流出（ｏｕｔｆｌｏｗ）分岐を形成する。いくつかの実施形態において、チャネルネットワークの分岐は、天然の灌流パターンを模倣する（例えば、単一の供給源から灌流され得る組織構築物内での拡散のために高い表面積を有する多数のチャネルを示し、その薄膜基底膜とともに機能的チャネル構成を可能にする）。本明細書で開示される方法は、多数のネットワーク、チャネル、ネットワークの層、またはサイズおよび機能において複雑にされ得る他の幾何形状および構成を可能にして、サイズおよび精巧化が増大した組織構築物を形成する。
【００６７】
本明細書で開示される発明のいくつかの実施形態において、チャネル直径は、その分与方法、材料特性、および／または他のパラメーターによって決定され得る。チャネル直径は、任意の適切な直径であり得る。いくつかの実施形態において、チャネル直径（例えば、プリントされた組織または足場におけるチャネル直径）としては、約１０ｃｍ、１０ｍｍ、５ｍｍ、１ｍｍ、５００μｍ、５０μｍ、１０μｍ、５μｍ、３μｍ、１μｍ、０．５μｍ、０．１μｍ、０．０５μｍ、０．０２μｍ、または０．０１μｍが挙げられ得るが、これらに限定されない。微細加工（ｍｉｃｒｏ−ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ）およびナノ加工（ｎａｎｏ−ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ）技術における顕著な進歩（例えば、２光子重合プリンター（ｔｗｏ  ｐｈｏｔｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｉｎｔｅｒ））が、０．０１〜１０μｍの解像度での構成を有する、犠牲材料構成要素またはヒドロゲルおよびポリマー足場のデザインおよび構築を可能にし得る。
【００６８】
本明細書で開示される発明のいくつかの実施形態は、熱可逆性ゲル化を伴う犠牲材料（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７ゲル（一般名ポロキサマー４０７）、ならびに薄膜基底膜および足場構成要素（ゼラチン、コラーゲン、キトサン、セルロース、ＰＬＡもしくは他のポリマーまたは生物学的材料、あるいは以前の例において記載されるようにアセンブルおよび架橋され得る複合材が挙げられるが、これらに限定されない材料からなる）からなる、組織または生物学的構築物を含む。
【００６９】
本明細書で開示される発明のいくつかの実施形態は、犠牲材料および基底膜、ならびに足場構成要素（ヒドロゲル（例えば、ゼラチン、ＰＬＡ、キトサン、ヒドロゲルの複合材または他のヒドロゲル材料）、ならびに種々の濃度および組成の複合材からなる）からなる組織または生物学的構築物の製作を含む。いくつかの実施形態において、そのヒドロゲル材料ならびに種々の濃度および組成の複合材を変動させると、所望の生物学的適用のための組織構築物を増強およびさらに専門化し得る機械的および生物学的特性の調整が可能になる。
【００７０】
本明細書で開示される発明のいくつかの実施形態は、ヒドロゲル、ポリマー、ならびに調整可能な機械的および生物学的特性を得るために、二価金属イオン除去、リガンド付着または当該分野で公知の他の技術のような技術を介して改変された材料の化合物を含む、組織または生物学的構築物、およびその製造方法を含む。
【００７１】
本明細書で開示される発明のいくつかの実施形態は、ヒドロゲル、ポリマー、ならびに調整可能な機械的および生物学的特性を得るために、増強する薬剤または化合物の添加を介して改変された材料の化合物を含む、組織または生物学的構築物、ならびにその製造方法を含む。技術の例としては、グリセリン、ソルビトール、プロピレングリコール、または他の可塑剤を、ゼラチンまたはゼラチン複合ヒドロゲルへと添加することが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７２】
本明細書で開示される発明のいくつかの実施形態は、基底膜材料および構築物のために支持マトリクスを提供するポリマーまたはヒドロゲル材料のようなさらなる材料の包含を伴う、組織または生物学的構築物、ならびにその製造方法を含む。このさらなる材料（例えば、ポリマーまたはヒドロゲル材料）は、その基底膜と類似の材料から構築され得るか、または補足的な（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）ヒドロゲルもしくはポリマーから構築され得る。
【００７３】
本明細書で開示される発明のいくつかの実施形態は、組織または生物学的構築物、およびその製造方法を含み、ここでその基底膜構成要素および／または足場構成要素は、ゼラチンもしくは他のヒドロゲルまたは種々の波長の紫外線を使用して光硬化可能であるように質を変化させた生体適合性材料（例えば、ゼラチンメタクリレート）から構築される。このような材料は、変動する濃度において、当該分野で公知の公開されたプロトコルまたは技術を使用して作られ得る。
【００７４】
本明細書で開示される発明のいくつかの実施形態は、組織または生物学的構築物、およびその製造方法を含み、ここでその基底膜構成要素および／または足場構成要素は、マルチステッププロセスにおいて印加される。このプロセスは、ポリマーまたはヒドロゲル材料を重合するか、ゲル化するか、硬化するか、または別の方法で固化するように作用する硬化溶液または化合物の付与の前または後のいずれかに、そのヒドロゲルまたはポリマー材料層を犠牲材料上に付与することからなり得る。いくつかの実施形態において、ゼラチンの付与およびその後の架橋溶液（例えば、グルタルアルデヒド、トランスグルタミナーゼ、または他の架橋酵素もしくは分子を含む溶液）の、約０．０１〜５ｇ／１０ｇ  ゼラチンの濃度での（が挙げられるが、これらに限定されない）付与。
【００７５】
本明細書で開示される発明のいくつかの実施形態は、組織または生物学的構築物、およびその製造方法を含み、ここでその基底膜材料の硬化溶液は、その犠牲材料内に含まれ、その基底膜材料は、その犠牲材料と接触した際に、硬化されるか、ゲル化されるか、または別の方法で固化される。この方法は、基底膜材料に（これはその犠牲材料に、噴霧されるか、吹きつけられるか、堆積されるか、または別の方法で付与される）、ならびに犠牲材料に（これは、プリントされるか、押し出されるか、または沈積することによって別の方法で基底膜材料に曝される）あてはまる。
【００７６】
本明細書で開示される発明のいくつかの実施形態は、組織または生物学的構築物、およびその製造方法を含み、ここでその組織または構築物の構築において使用されるヒドロゲルまたはポリマー材料のうちのいずれかまたは全ては、懸濁状態か、付着したか、または別の方法でその組織構築物のための細胞供給源を播種または送達するように被包された、細胞を含み得る。
【００７７】
本明細書で開示される発明のいくつかの実施形態は、細胞および組織成長を促進するために生物学的因子の被包または添加を伴うヒドロゲルおよびポリマーを含む、組織または生物学的構築物、およびその製造方法を含む。
【００７８】
本明細書で開示される発明のいくつかの実施形態は、組織または生物学的構築物、およびその製造方法を含み、ここでその基底膜は、パターン、多孔性、または他の物理的状態を、機能もしくは生体適合性もしくは他の品質を改善するように、そのメンブレンに付与する基材とともに製作される。
【００７９】
本明細書で開示される発明のいくつかの実施形態は、組織または生物学的構築物、およびその製造方法を含み、ここでその基底膜は、生物学的または化学的手段（例えば、増殖因子、リガンド、被包された細胞、または他の生物学的にもしくは生化学的に関連する構成要素の添加）を通じて、そのメンブレンを増強する基材または材料とともに製作される。
【００８０】
本明細書で開示される発明のいくつかの実施形態は、血液に関連する機能（例えば、濾過；拡散；吸収；グルコース、電解質、毒素、もしくは他の分子の分泌；ガス交換；吸収；および分泌）を行うために、その血液によって灌流されるチャネルネットワークを有する、足場または薄膜メンブレンデバイス、およびその製造方法を含む。いくつかの実施形態において、この足場または薄膜メンブレンデバイスは、その血液に関連する機能を促進または増強するために、他の流体またはガスによって灌流される、さらなるチャネルネットワークを有する。いくつかの実施形態において、その足場または薄膜メンブレンデバイスは、治療適用のために、患者に体外様式またはインビボ様式で機能を提供する。
【００８１】
本明細書で開示される発明のいくつかの実施形態は、血液透析機能（例えば、濾過、拡散、吸収、ならびに／またはグルコース、電解質、毒素、および他の分子の分泌）を提供し得る細胞タイプが生息させられている、足場およびメンブレン、ならびにその製造方法を含む。いくつかの実施形態において、その足場またはメンブレンは、体外様式で使用される。いくつかの実施形態において、その足場またはメンブレンは、治療適用のために、インビボ血液透析移植片として患者に移植される。
【００８２】
本明細書で開示される発明のいくつかの実施形態は、肺機能（例えば、拡散、ガス交換、吸収、および／または分泌）を提供し得る細胞タイプが生息させられている、足場およびメンブレン、ならびにその製造方法を含む。いくつかの実施形態において、その足場またはメンブレンは、体外様式で使用される。いくつかの実施形態において、その足場またはメンブレンは、治療適用のために、インビボガス交換デバイスまたは肺組織移植片として患者に移植される。
【００８３】
本明細書で開示される発明のいくつかの実施形態は、腸機能（例えば、吸収および／または分泌）を提供し得る細胞タイプが生息させられている、足場およびメンブレン、ならびにその製造方法を含む。いくつかの実施形態において、その足場またはメンブレンは、体外様式で使用される。いくつかの実施形態において、その足場またはメンブレンは、治療適用のために、インビボ腸組織移植片として機能するように患者に移植される。
【００８４】
当業者であれば、本発明は、目的を果たし、記載した目標および利点、ならびにその中の固有のものを得るように良好に適合されていることを容易に認識する。本明細書における記載および実施例の詳細は、特定の実施形態の代表的なものであり、例示的なものであり、本発明の範囲を限定するものとして意図しない。当業者であれば、その中の改変および他の使用を想到するであろう。これらの改変は、本発明の精神内に含有される。当業者であれば、本発明の範囲と精神から逸脱することなく、様々な置換および改変を本明細書に開示されている本発明に対して行い得ることは容易に明白であろう。
【００８５】
「ａ」および「ａｎ」という冠詞は、本明細書で使用される場合、明細書および請求項において、それとは反対に明らかに示さない限り、複数の参照対象を含むと理解すべきである。群の１つまたはそれを超えるメンバーの間に「または」を含む請求項または記載は、それとは反対に示さない限り、または他の点で状況から明らかでない限り、群メンバーの１つ、複数、またはすべてが、所定の生成物もしくはプロセスにおいて存在し、所定の生成物もしくはプロセスにおいて用いられ、または所定の生成物もしくはプロセスと他の点で関連性がある場合、満足されると考えられる。本発明は、群の正確に１つのメンバーが、所定の生成物もしくはプロセスにおいて存在し、所定の生成物もしくはプロセスにおいて用いられ、または所定の生成物もしくはプロセスと他の点で関連性がある実施形態を含む。本発明はまた、群メンバーの複数、またはすべてが所定の生成物もしくはプロセスにおいて存在し、所定の生成物もしくはプロセスにおいて用いられ、または所定の生成物もしくはプロセスと他の点で関連性がある実施形態を含む。さらに、本発明は、すべてのバリエーション、組み合わせ、および並べ替えを提供することを理解すべきであり、ここでは一覧表示した請求項の１つまたはそれよりも多くからの１つまたはそれを超える限度、要素、条項、記述用語などが、他に示さない限り、または矛盾もしくは不一致が生じることが当業者には明らかでない限り、同じ基本請求項（または、関連性があれば、任意の他の請求項）応じて別の請求項に導入される。本明細書に記載されるすべての実施形態は、適切な場合には、本発明のすべての異なる態様に適用可能であることが企図される。実施形態または態様のいずれかを、適切と認められるときは、１つまたはそれを超える他のこのような実施形態または態様と自由に合わせることができることも企図される。要素が一覧として、例えば、マーカッシュ群または同様のフォーマットで提示される場合、要素の各部分群がまた開示されており、任意の要素を群から除去し得ることを理解すべきである。一般に、本発明、または本発明の態様が、特定の要素、特徴などを含むと言及される場合、本発明の特定の実施形態または本発明の態様は、このような要素、特徴などからなり、またはこのような要素、特徴などから本質的になることを理解すべきである。簡潔さのために、これらの実施形態は、あらゆる場合において、本明細書で多くの言葉で具体的に記載してきたわけではない。特定の除外が明細書において記載されているかいないかにかかわらず、本発明の任意の実施形態または態様を明示的に請求項から除外し得ることも理解すべきである。例えば、任意の１つまたはそれを超える活性剤、添加物、成分、任意選択の薬剤、生物の種類、障害、対象、またはそれらの組み合わせを除外し得る。
【００８６】
請求項または記載が対象の組成物に関する場合、本明細書に開示される方法のいずれかによって対象の組成物を作製または使用する方法、および本明細書に開示される目的のいずれかのために対象の組成物を使用する方法は、他に示さない限り、または矛盾もしくは不一致が生じることが当業者には明らかでない限り、本発明の態様であることを理解すべきである。請求項または記載が方法に関する場合、例えば、方法を行うために有用な組成物を作製する方法、および方法によって生成される生成物が、他に示さない限り、または矛盾もしくは不一致が生じることが当業者には明らかでない限り、本発明の態様であることを理解すべきである。
【００８７】
本明細書で範囲が示される場合、本発明は、エンドポイントが含まれる実施形態、両方のエンドポイントが除外される実施形態、および１つのエンドポイントが含まれ、他のエンドポイントが除外される実施形態を含む。両方のエンドポイントは他に示さない限り含まれることを想定すべきである。さらに、他に示さない限り、または他の点で状況および当業者の理解から明らかでない限り、文脈によって明らかにそれ以外のことの指示がない限り、範囲として表される値は、範囲の下限の１０分の１まで、任意の特定の値、または異なる本発明の実施形態では記述した範囲内の部分範囲を想定することができることを理解すべきである。一連の数値が本明細書で記述される場合、本発明は、任意のその間にある値またはその一連の任意の２つの値によって定義される範囲にアナログ的に関する実施形態を含み、かつ最も低い値は、最小として受け取り得、最も大きな値は、最大として受け取り得ることも理解される。数値は、本明細書で使用される場合、百分率として表す値を含む。数値が「約」または「概ね」によって前置きされる本発明の任意の実施形態について、本発明は、正確な値が記述される実施形態を含む。数値が「約」または「概ね」によって前置きされない本発明の任意の実施形態について、本発明は、値が「約」または「概ね」によって前置きされる実施形態を含む。
【００８８】
本明細書で使用される場合、「Ａおよび／またはＢ」（ＡおよびＢは、異なる請求項用語である）は一般に、Ａ、Ｂの少なくとも１つ、またはＡおよびＢの両方を意味する。例えば、別の配列に対して相補的であり、および／または別の配列にハイブリダイズする１つの配列は、（ｉ）すべての条件下で他の配列に必ずしもハイブリダイズし得るわけではないけれど、他の配列に対して相補的な１つの配列、（ｉｉ）他の配列に対して完全に相補的であるわけではないけれど、他の配列にハイブリダイズする１つの配列、ならびに（ｉｉｉ）他の配列に対して相補的であり、かつ他の配列にハイブリダイズするものの両方である配列を含む。
【００８９】
「概ね」または「約」は一般に、特に明記しない限り、または他の点で状況から明らかでない限り（このような数が、可能な値の１００％を許容されないほどに超える場合を除いて）、いずれかの方向（その数超またはその数未満）で、１％の範囲内、またはいくつかの実施形態では、数の５％の範囲内、またはいくつかの実施形態では、数の１０％の範囲内に入る数を含む。それとは反対に明らかに示さない限り、複数の実行を含む本明細書における特許請求する任意の方法において、方法の実行の順序は、必ずしも方法の実行が記述される順序に限定されないが、本発明は、順序がこのように限定されている実施形態を含むことを理解すべきである。他に示さない限り、または状況から明らかでない限り、本明細書に記載される任意の生成物または組成物は、「単離されている」と考え得ることも理解すべきである。
【００９０】
本明細書で使用される場合、「含むこと」または「含む」という用語は、本発明にとって必須である組成物、方法、およびそれぞれのその構成要素に関して使用するが、不特定の要素を含むことは、必須であろうと、またはそうではなくても自由である。
【００９１】
本明細書で使用される場合、「から本質的になる」という用語は、所定の実施形態のために必要とされる要素を指す。この用語は、本発明のこの実施形態の基礎および新規または機能的特徴に物質的に影響を与えないさらなる要素の存在を可能とする。
【００９２】
「からなる」という用語は、実施形態のその記載において記述されないいずれの要素をも除いた、本明細書に記載される組成物、方法、およびそのそれぞれの構成要素を指す。
【実施例】
【００９３】
実施例１
【００９４】
本発明の一実施例において、薄膜基底膜足場が、以下のようにアセンブルされる：
【００９５】
工程１では、生体適合性基底膜材料またはこのような基底膜材料の組み合わせの薄膜を、物理的または化学的方法を使用する薄膜堆積のような当該分野で公知の技術を使用して、基材上に堆積させる。次いで、このメンブレンを、硬化するか、乾燥させるか、部分的にもしくは完全に架橋するか、または別の方法で固化し、その基材から除去して、均一な薄膜メンブレン構成要素を形成する。
【００９６】
工程２では、１またはこれより多くのチャネルネットワークの青写真を、１または多数の犠牲材料から構築し、その薄膜メンブレン構成要素の表面上に堆積し、薄膜メンブレンおよびチャネルネットワークを含む構成要素を形成した。これは、当該分野で公知の技術（押し出し、成形、ミリング、または付加プリンティングが挙げられるが、これらに限定されない）を使用して達成され得る。必要であれば、機械的支持材料を使用し得る。この材料は、同様に犠牲材料であってもよいし、そうでなくてもよい。
【００９７】
工程３では、１または多数の薄膜メンブレンおよびチャネル構成要素を、犠牲材料またはその薄膜メンブレン構成要素に永久的に架橋され得る永久マトリクス材料のいずれかの中に埋め込み得る。その材料は、細胞を含んでいてもよいし、そうでなくてもよく、弾性、引張り強さ、および色のような構築物の機械的特性を改変するために使用され得る。その材料はまた、さらなる機械的または生物学的機能を提供して、最初の構築物の機能を支援または増強し得る。
【００９８】
工程４では、その犠牲チャネル材料は、後ろ側の支持構造体ありもしくはなしの薄膜メンブレンによって裏打ちされた１もしくは多数のチャネルネットワークおよび／または空間を残して、除去される。
【００９９】
工程５では、そのチャネルネットワーク、区画、および／または管腔空間には、１または多数の上皮細胞タイプおよび／または内皮細胞タイプが再度生息させられ得る。
【０１００】
実施例２
【０１０１】
本発明の別の実施例では、薄膜基底膜足場が、以下のようにアセンブルされる：
【０１０２】
工程１では、１またはこれより多くのチャネルネットワークを含む構成要素を、１または多数の犠牲材料から生成する。これは、当該分野で公知の技術（押し出し、成形、ミリング、または付加プリンティングが挙げられるが、これらに限定されない）を使用して達成され得る。必要であれば、機械的支持材料または足場材料を使用し得る。この材料は、同様に犠牲材料であってもよいし、そうでなくてもよい。
【０１０３】
工程２では、この構成要素を、次いで、物理的または化学的方法を使用する薄膜堆積のような当該分野で公知の技術を使用して、生体適合性基底膜材料またはこのような基底膜材料の組み合わせの薄膜で部分的にもしくは完全に被覆する。
【０１０４】
工程１および工程２は、層化技術（犠牲材料、次に薄膜、次に犠牲材料などの交互になった堆積）において、または逐次的様式（犠牲材料、次に薄膜堆積）において達成され得る。
【０１０５】
工程３では、その得られた構築物を、犠牲材料またはそのメンブレン構成要素に永久的に架橋され得る永久マトリクス材料のいずれかの中に埋め込み得る。その得られた構築物を、１または多数の薄膜メンブレンおよびチャネル構築物に組み込み得る。その永久材料は、細胞を含んでいても、そうでなくてもよく、弾性、引張り強さ、および色のような構築物の機械的特性を改変するために使用され得る。その材料はまた、さらなる機械的または生物学的機能を提供して、最初の構築物の機能を支援または増強し得る。
【０１０６】
工程４では、その犠牲材料は、後ろの支持構造体ありまたはなしの薄い基底膜によって裏打ちされた１もしくは多数のチャネルネットワークおよび／または空間を残して、除去される。
【０１０７】
工程５では、そのチャネルネットワークおよび／または管腔空間には、１もしくは多数の上皮細胞タイプおよび／または内皮細胞タイプが再度生息させられ得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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