(57)【要約】  本発明は、機械的な分離を使用した組織の破壊に適合させたデバイス、及び前記目的のための前記デバイスの使用に関する。デバイスは、ねじ山を有する細長いシャフト、及び少なくとも１つの孔を有する非可動ケーシングを含む。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織の破壊に使用するためのデバイスであって、少なくとも１つの連続又は不連続のねじ山が取り付けられた又は一体化された細長いシャフトの形状の第１の可動部材と、前記シャフトに嵌合するように適合されたケーシング形状の第２の非可動部材であって、前記シャフトの縦軸と整列し、組織接触端部から離間した端部においてより幅広である少なくとも１つの細長い開口部を有する第２の非可動部材とを含むデバイス。
【請求項２】
前記可動部材が、モーター及びローターを備える、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
前記可動部材が、ハンドル又はマウンティングを含み、それを介して前記デバイスを操作中に保持できる、請求項１又は２に記載のデバイス。
【請求項４】
前記シャフトの下方部分又は下半分が、第１のねじ山を備えている、請求項１から３のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項５】
前記シャフトの上方部分又は上半分が、ねじ山を備えている、請求項１から４のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項６】
少なくとも２つのねじ山が、前記シャフトの下方部分又は下半分に少なくとも１つ、及び前記シャフトの上方部分又は上半分に少なくとも１つ備えられ、それぞれのねじ山の回転方向が、他方と逆である、請求項１から５のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項７】
１つ又は複数の前記ねじ山が、連続している、請求項１から６のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項８】
１つ又は複数の前記ねじ山が、不連続である、請求項１から７のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項９】
前記ねじ山の角度配置が、水平面から測定した場合、２０°〜８８°又は４０°〜８０°又は４０°〜５０°を含む範囲から選択される、請求項１から８のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１０】
前記ねじ山の深さが、前記ケーシングの直径の４０％又は３０％未満である、請求項１から９のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１１】
前記ケーシングが、複数の開口部を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１２】
ケーシングの円周当たり２〜１２個の開口部がある、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項１３】
４．５ｃｍのケーシング当たり４個の開口部がある、請求項１１又は１２に記載のデバイス。
【請求項１４】
前記開口部が、前記ケーシングの周りに均一に間隔を開けて配置される、請求項１１から１３のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１５】
前記開口部が、スリットを含み、前記スリットのサイズが、前記デバイスの前記組織接触端部から離れた端部で拡張している、請求項１から１４のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１６】
前記開口部が、不連続のスリットを含み、前記スリットのサイズが、前記組織接触端部から離れた端部で拡張している、請求項１から１５のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１７】
前記開口部の前記拡張した部分が、少なくとも部分的な円形の形状を形成する、請求項１５又は１６に記載のデバイス。
【請求項１８】
前記開口部の前記拡張した部分が、第１の前記ねじ山の上方端部と並んでいるか、又は前記第１の又は下方のねじ山と第３の又は上方のねじ山との間の接合部と並んでいる、請求項１５から１７のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１９】
前記細長いシャフトの下方領域又は組織接触領域が、取り付けられた又は合体したいかなるねじ山も含まず、前記シャフト又はケーシングの下方端部又は組織接触端部が、使用時に前記細長いシャフトが自由に回転するが横方向の制限を受けるように拘束部材をさらに含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項２０】
組織を破壊するための方法であって、請求項１から１９のいずれか一項に記載のデバイス及び選択された組織サンプルの使用を含み、前記組織サンプルの構成部分が機械的に分離される、方法。
【請求項２１】
前記組織が、添加剤含有又は非含有の生体適合性の流体中に懸濁されており、前記添加剤は、これらに限定されないが、単独の、又は組み合わされた、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、スクロース、アルブミン、アミノ酸、ピルビン酸塩を含む、生体適合性の／臨床的に承認された賦形剤／試薬である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記デバイスが、毎分１００〜１０，０００回転の範囲内の速度で回転する、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２３】
回転の持続時間が、１０秒〜１０分の範囲である、請求項２０から２２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、機械的な抽出を使用した、サンプルからの組織の破壊に適合させたデバイス、及び前記目的のための前記デバイスの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
今日利用可能な多くの細胞療法は、特定の組織型（組織タイプ）、例えば幹細胞の使用を必要とする。これらの細胞は多数の技術で使用されているが、個別化（パーソナライズ）又は再生医療において特に重要である。これらの細胞を使用するには、典型的には、細胞より大きなサンプルもしくは臓器又は臓器の一部からの細胞を単離することを必要とする。従来、組織は酵素消化を使用して単離されてきたが、それは、遅く侵襲性であり識別不能な場合がある。例えば、コラゲナーゼ又は他の分散酵素を使用して細胞外マトリックスを破壊し、続いて遠心分離して抽出物の成分を分離することが公知である。しかしながら、細胞外マトリックスを破壊しながらも標的組織を無傷で十分機能的に保持するのに適した量を使用するようにコラゲナーゼ量を調整することは、科学というより熟練の技に近く、処置する組織の年齢に加えてその構造的な成分及びそれらの成分の相対量の影響を受ける。さらに、経時的に、さらにはバッチ間でも、分散酵素の活性が低下することから、酵素消化が実行されるごとに活性酵素の慎重な事前調整を行う必要があることが問題をさらに複雑化する。これら全ての不確定要素のために、しばしば消化の結果がばらつくことは驚くべきことではない。
【０００３】
細胞は、多数の組織型から単離することができ、いくつか例を挙げれば、ランゲルハンス島細胞は膵臓から、筋細胞は心臓から、幹細胞は骨髄、口腔粘膜及び脂肪組織から単離することができる。しかしながら、単離された細胞型がそれらの固有の機能性を確実に保持することが必要であり、幹細胞の場合では、骨、軟骨、筋肉、神経、内分泌、上皮及び内皮などの複数の組織型を増殖及び発生させる能力である。さらに、幹細胞又は前駆細胞の供給源は、誘導された多能性幹細胞を作り出すのにも使用される。
【０００４】
当然のことながら、細胞の単離が成功すれば機能的な抽出物が生じるはずであるから、細胞をダメージから保護する単離方法が好ましい。この目的を達成するために、本発明者らは、本明細書において、機能的な細胞型、特に幹細胞又は前駆細胞の単離において好ましい機械的な抽出の形態を報告する。
【発明の概要】
【０００５】
したがって、本発明の第１の態様によれば、組織の破壊に使用するためのデバイスであって、少なくとも１つの連続又は不連続のらせん状のリボン／ねじ山が取り付けられた又は一体化した細長いシャフトの形状の第１の可動部材と、前記シャフトに嵌合するように適合されたケーシング形状であり、前記シャフトの縦軸と整列し、組織接触端部から離間した端部においてより幅広である少なくとも１つの細長い孔を有する第２の非可動部材とを備えるデバイスが提供される。
【０００６】
本発明の好ましい実施形態において、前記可動部材は、モーターを含み、理想的には、ローターを含む。より好ましくは、前記可動部材は、ハンドル又はマウンティングを含み、それを介して前記デバイスを操作中に保持可能とされる。
【０００７】
さらに好ましくは、１以上の前記リボン／ねじ山、すなわち第１及び第２のリボン／ねじ山が与えられ、それらは前記ケーシングの反対の部分から開始され、通常それらは、前記ケーシングの直径を考慮して１８０°離れて設置され、前記シャフトの下方部分に沿って同じ方向に流れる(run)が、いくつかの実施形態においては、２つのリボン／ねじ山は、前記シャフトの異なる位置から開始してもよいし、実際に異なる位置で終端してもよい。
【０００８】
らせん状のリボンとして本明細書で言及される構成部材は、規則的に間隔を開けて設置されたロッド手段によって中央のシャフトに連結されており、例えば、本発明者らは、現状において、ねじ山が９０°回転するごとに１つの連結ロッドを用いているが、一部の立体配置に関して他の間隔が好ましい場合がある。ねじ山として本明細書で言及される構成部材は、典型的には、シャフトの構造に形成するか又は切削してもよい。
【０００９】
さらなる実施形態において、第３のリボン／ねじ山は、前記シャフトの上方部分に備えられ、その回転方向は、他の第１及び／又は第２のリボン／ねじ山の方向と逆である。したがって、理想的には、前記デバイスの使用に関して、前記シャフトの下方部分又は下半分に、少なくとも１つの第１のねじのリボン／ねじ山、一部の実施形態において第２のねじのリボン／ねじ山が備えられ、第３のねじのリボン／ねじ山が備えられる例では、それは、前記シャフトの上方部分又は上半分に取り付けられるか又は形成される。
【００１０】
したがって、本発明者らの好ましい配置において、本発明者らは３つのらせん状のリボン又はねじ山を有し、２つの下方のリボン又はねじ山は同じ方向に流れるが、１８０°離れて開始されており、１つの上のリボン又はねじ山は逆方向に流れる。
【００１１】
より理想的には、前記リボン又はねじ山は連続しており、したがって第１又は第２のリボン／ねじ山は、第１の方向に連続して又は途切れずに回転し、第３のリボン／ねじ山は、第２の方向に連続して又は途切れずに回転する。
【００１２】
さらにより好ましくは、ねじのリボン／ねじ山の角度配置は、水平面から測定した場合、２０°〜８８°の範囲である。好ましい角度配置は４０°〜８０°の範囲内であり、より好ましくは、角度配置は５０°〜６０°の範囲内である。
【００１３】
一層有利には、リボン／ねじ山の深さは、ケーシングの直径の４０％未満であり、より好ましくはケーシングの直径の３０％未満である。
【００１４】
さらにより好ましくは、前記ケーシングは、複数の開口部を備える。典型的には、これらに限定されないが、ケーシングの円周当たり２〜１２個、より一層理想的には、ケーシングのおよそ４ｃｍ当たり４個の開口部であるが、当業者であれば、開口部の数は必要条件に従って変更が可能であることを認識すると予想され、さらに理想的には、前記開口部は、前記ケーシングの周りに均一に間隔を開けて配置される。
【００１５】
好ましい実施形態において、前記孔開口部はスリットを含み、前記スリットのサイズは、前記組織接触端部から離れた端部で拡張しており、理想的には部分的な円形の形状を形成する。
【００１６】
しかしながら、他の実施形態において、前記開口部は不連続のスリットを含み、前記スリットのサイズは、前記組織接触端部から離れた前記端部で拡張している。
【００１７】
好ましくは、前記開口部の拡張した部分は、前記第１及び／又は第２のねじ山の上方端部と整列しているか、又は前記第１のねじ山と第３のねじ山との間の接合部と整列している。
【００１８】
より好ましくは、前記モーター及び／又はローターはケーシング内に設置される。
【００１９】
特に好ましい実施形態において、細長いシャフトの下方領域又は組織接触領域は、いかなる取り付けられた又は合体したねじ山も含まず、係合部材、典型的にはブラケットが、前記シャフト又は前記ケーシングのいずれかの上に設けられ、そのため細長いシャフトは自由に回転するが、前記ブラケットによって相対的に横方向の制限を受け、それにより組織解離プロセス中にデバイスの第２の非可動部材に対する第１の可動部材のアライメントが維持される。最も理想的には、ケーシングの下方端部又は組織接触端部は、細長いシャフトの縦軸と並んでいるか又はそれと同軸であり、細長いシャフトの末端領域に順応するように設計される開口部を有するブラケットを含む。この実施形態において、組織解離プロセスの再現性及びデバイスの性能が改善される。代替の実施形態において、細長いシャフトの前記下方領域又は組織接触領域は、いかなる取り付けられた又は合体したねじ山も含まず、ブラケット又はスカート部材が、それとケーシングとの間に隙間が備えられるように同じサイズ及び形状で備えられ、そのため細長いシャフトは自由に回転するが、前記ブラケット又はスカート部材と前記ケーシングとの間に備えられた隙間によって相対的に横方向の制限を受ける。
【００２０】
使用時に、デバイスを、手で又は従来のマウンティングの使用によって安定的に保持し、ローターを作動させてシャフトを回転させると、その１つ又は複数のねじ山が、組織の連結を破壊する撹拌器になる。さらに、穴の開いた外部ケーシングを使用することによって、前記第１の及び／又は第２のリボン／ねじ山に沿って移動又は上昇する破壊された組織が、前記１つ又は複数の孔を介して、理想的にはそれらの拡張した端部で前記デバイスから確実に排出される。前記第１及び／又は第２のリボン／ねじ山に対して逆方向に回転し、前記開口部の拡張した部分又はその近傍で終端する第３の任意選択の上方のリボン／ねじ山を使用することによって、破壊された組織は、前記シャフトの全長に沿って移動するのではなく、典型的には前記開口部の拡張した部分と並んでいる２つの反対に巻かれた第１／第３のねじ山が出会う出口の方に確実に方向付けられる。
【００２１】
本発明の第２の態様によれば、組織を破壊するための方法であって、上記デバイス及び選択された組織サンプルの使用を含み、前記組織サンプルの構成部分が機械的に分離される方法が提供される。
【００２２】
好ましい方法において、前記組織は、添加剤含有又は非含有の生体適合性の流体（例えば生理食塩水、カルシウム及びマグネシウム含有又は非含有のハンクス平衡塩溶液、カルシウム及びマグネシウム含有又は非含有のリン酸緩衝塩溶液、リンゲル液、乳酸リンゲル液、ハルトマン液）中に懸濁されており、上記添加剤は、これらに限定されないが、得られる生きた無傷細胞の数を増加させるための、単独又は組み合わされた、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、スクロース、アルブミン、アミノ酸、ピルビン酸塩を含む、生体適合性の／臨床的に承認された賦形剤／試薬である。
【００２３】
好ましい方法において、前記デバイスの回転速度は、毎分１００〜１０，０００回転の範囲である。さらに、回転の持続時間は、１０秒〜１０分の範囲である。
【００２４】
以下に記載される特許請求の範囲及び前述の発明の説明において、言語表現又は必然的な意味合いのために文脈上他の意味に理解すべき場合を除き、文言「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化形は、包括的な意味に用いられる。すなわち、述べられた特徴の存在を明示するが、本発明の様々な実施形態において、さらなる特徴の存在又は追加を除外するものではない。
【００２５】
本発明の各態様の好ましい特徴は、他の態様のいずれかに関して記載された通りであってもよい。
【００２６】
本発明の他の特徴は、以下の実施例から明らかになるであろう。一般的に言えば、本発明は、本明細書（添付の特許請求の範囲及び図面を含む）で開示された特徴のあらゆる新規のもの、又はあらゆる新規の組合せに及ぶ。したがって、本発明の特定の態様、実施形態又は実施例と共に記載される特徴、整数、特性、化合物又は化学的部分は、それと矛盾しない限り、本明細書に記載される他のあらゆる態様、実施形態又は実施例にも適用可能であると解される。
【００２７】
さらに、特に明示しない限り、本明細書で開示されたいずれの特徴も、同じ又は類似の目的を果たす代替の特徴で置き換えることができる。
【００２８】
ここで本発明の実施形態を、以下の図面を参照しながら単なる一例として記載する。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本発明に係る第１の可動部材の側面図である。
【図２】本発明に係る第１の可動部材の斜めから見た側面図である。
【図３】本発明に係る第１及び第２のねじ山を有する第１の可動部材の底面図である。
【図４】本発明の好ましい実施形態に係る第１、第２及び第３のねじ山を有する第１の可動部材の側面図であり、第１（下）及び第２（下）のねじ山の回転方向は、第３のねじ山の回転方向と逆である。
【図５】図４に示される第１の可動部材の斜めから見た側面図である。
【図６】本発明の一実施形態に係る第２の非可動部材即ちケーシングの斜めからみた側面図である。
【図７】図６に示されるケーシングの直立状態の側面図である。
【図８】図６及び図７に示されるケーシングの底面図及び上面図である。
【図９】本発明の好ましい実施形態に係る第１、第２及び第３のねじ山を有する第１の可動部材の側面図であり、第１（下）及び第２（下）のねじ山の回転方向は、第３（上）のねじ山の回転方向と逆であり、細長いシャフトの下方領域即ち組織接触末端領域は、取り付けられた又は一体化されたねじ山を含まない。
【図１０】図９に示される第１の可動部材と組み合わせて使用するために適合されたケーシングの直立状態の側面図であり、ケーシングの下方端部即ち組織接触端部は、細長いシャフトの縦軸と整列しているか又は同軸であり、細長いシャフトの末端領域に順応するように設計された開口部を有するブラケットをさらに含む。
【図１１】図１０に示されるケーシングの斜めから見た側面図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
まず、図１を参照すると、デバイスの分解図が示され、内部の可動部材が外部のケーシングから取り外されている。中央のシャフトは、取り付け又は一体化がされた少なくとも１つの第１のらせん状のリボンを備え、当該リボンは前記シャフトの一部に沿って巻き付いている。理想的には、前記リボンは、前記シャフトの長さのおよそ半分を構成する下方部分に沿って巻き付いている。ねじ山は、製造中に、交差支柱(cross-strut)／ロッド(rod)を使用して前記シャフトに連結又は一体化される。支柱は、規則的に間隔を開けて設置され、例えば本発明者らは、現状においては、リボンが９０°回転するごとに１つの連結支柱(connecting-strut)／ロッドを用いている。らせんの角度配置は、水平面から測定した場合、２０°〜８８°の範囲であり、理想的には４０°〜８０°又は５０°〜６０°である。らせん状のリボンの溝の深さは、後述される外部の静止したケーシングの直径の４０％未満、理想的には３０°未満である。ある特定の実施形態においては、下方の第２のらせん状リボンを備え、このリボンは、理想的には前記第１のらせん状のリボンから１８０°離れて設置される。すなわち、このリボンは前記第１のらせん状リボンに対して、前記ケーシングの反対側から開始されて同じ方向に流れる(run)。
【００３１】
本明細書でらせん状リボンと称される構成部材は、中央シャフトに形成されるねじ山の形態をとっていてもよい。
【００３２】
図４において、同様に中央シャフトに取り付け又は一体化がされる第３のらせん状リボンを備える任意選択の特徴が示される。このリボンも前記シャフトの一部に沿って巻き付いており、理想的には、このリボンは、前記シャフトの長さのおよそ半分を構成する上方部分に沿って巻き付いている。このらせん状のリボンも、製造中に、交差支柱／ロッドを使用して前記シャフトに連結又は一体化される。第３の即ち上方のらせん状リボンの回転方向は、第１の即ち下方のらせん状リボンの方向と逆である。さらに、第３の即ち上方のらせん状リボンの周回数は、下方のらせん状リボンの周回数より少ない傾向がある。なぜなら、下方のらせん状のリボンは、主として破壊機能を実行するのに対し、上方のらせん状リボンは、切断された組織が適切な場所で前記デバイスから確実に排出されるように方向付けする機能を実行するからである。
【００３３】
したがって、本発明の好ましい配置においては、３つのらせん状リボン又はねじ山を有し、２つの下方のリボン又はねじ山は同じ方向に流れるが１８０°離れて開始されており、１つの上方のリボン又はねじ山は逆方向に流れる。
【００３４】
図５では、２つのリボンが、連結された又は連続するものとして示されているが（それらの形は周回数によって決まる）、２つのリボンは連結されていなくてもよいし不連続であってもよい。
【００３５】
図６において、外部ケーシングが示されているが、これはデバイスの分解図であって、内部のシャフトから外部の非可動部材が取り外されている。
【００３６】
ケーシングは、可動部材の周りに嵌合するような大きさと形状を有する中空円柱（円筒）を備える。その下方端部は、第１／第２の下方のねじ山に嵌合しており、少なくとも１つの、典型的には複数の開口部(opening)又はスリットを有し、これらは、ケーシングの下方端部から間隔を開けて配置されていてもよいし又は隣接していてもよい。示される実施形態において、開口部(aperture)は、ケーシングの下方端部から間隔を開けて配置されている。開口部は、ケーシングの縦軸又はケーシングが嵌合するシャフトと整列するスリットであり、通常、ケーシングの円周軸(cercumference axis)の周りに均一に分布する。典型的には、開口部(hole)の数は、ケーシング円周当たり２〜１２個の範囲であり、示される実施形態においては、ケーシング円周の４ｃｍ当たりに４個である。
【００３７】
図示されていないが、ケーシング内にはローター(roter)が設置され、それは可動部材と作動可能に接続され、ステーター(stator)内でのローターの回転を可能にする電源と接続される。
【００３８】
図９において、上述された特徴を有する本発明のさらなる実施形態が示されるが、この実施形態において、細長いシャフトは、ねじ山がない領域、即ちねじ山がまったくない中央シャフトで終端している。さらに、図１０及び１１に示されるこの実施形態に対応するケーシングは、上述の特徴を有することに加えて、多数の（この実施形態では３つの）中央の開口部と相互連結する伸長部を含む端部ブラケットも有する。この開口部は、細長いシャフトの縦軸と整列しているか又はそれと同軸であり、前記ケーシングに関して細長いシャフトが回転できるが許容される横方向の動き量を制限するように隙間が備えられる方式と同様にして順応する大きさと形状を有する。この特徴は、伸長するブラケットを使用して例示したが、ケーシングに関して回転シャフトの横方向の動きの程度を限定するために他の従来の手段を採用することができる。
【００３９】
使用時に、可動部材をケーシングに挿入し、ローターを作動させて、シャフトを回転させる。任意選択で緩衝溶液中に懸濁された組織サンプルと接触すると、この回転の動きによって組織が破壊され、その断片／成分が、第１／第２のねじ山に沿って開口部の拡張部分に向かって移動し、拡張部分から放出される。上方の反対方向に巻かれた戻り方向のねじ山の存在によって、破壊された組織が出口開口部より上方に移動しないようにされている。典型的には、前記デバイスの回転速度は、毎分１００〜１０，０００回転の範囲である。さらに、回転の持続時間は、１０秒〜１０分の範囲である。
【実施例】
【００４０】
実施例１
ここで、脂肪組織から幹細胞を得るためのデバイスの使用を単なる例示として記載する。
【００４１】
脂肪組織解離(dissociation)のためのデバイス／撹拌器の使用
１．解離する脂肪組織を含有する容器中に、ケーシング／ステーター及びローター／シャフトを置く。
ａ．生きた無傷細胞を含む間質血管画分（ＳＶＦ）が得られるように、デバイス／撹拌器によって脂肪組織を機械的に解離する。
【００４２】
流体及び添加剤の説明
１．使用される流体は、これらに限定されないが、生理食塩水、カルシウム及びマグネシウム含有又は非含有のハンクス平衡塩溶液、カルシウム及びマグネシウム含有又は非含有のリン酸緩衝塩溶液、リンゲル液、乳酸リンゲル液、又はハルトマン液を含む生体適合性の流体である。
ａ．脂肪組織を解離する容器に流体を添加する。
ｂ．添加する流体の体積は、容器中の解離する脂肪組織の体積の１０％〜２００％である。
２．流体は添加剤を含有していてもよく、添加剤は、これらに限定されないが、単独の又は組み合わされた、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、スクロース、グルコース、アルブミン、アミノ酸、ピルビン酸塩を含む、生体適合性の／臨床的に承認された賦形剤／試薬である。
３．流体は、哺乳類細胞の生存率を維持する。
４．添加剤は、得られた生きた無傷の間質血管画分の細胞数の増加及び／又は細胞が培養される場合はこれらの細胞増殖の増加を促進する。
【００４３】
脂肪組織及び脂肪組織の貯蔵の説明
脂肪組織は、以下の形態で得られ、解離の前に貯蔵することができる。
１．吸引脂肪組織又は細かく刻まれた断片として。
２．脂肪組織は、解離の前に０時間〜７２時間貯蔵することができる。
ａ．貯蔵温度は、４℃〜１８℃の範囲である。
ｂ．脂肪組織の貯蔵は、上述したような添加剤含有又は非含有の流体と共にでもよいし、又はそうでなくてもよい。
【００４４】
解離プロセスの説明
１．貯蔵される場合、さらに外観が固体の場合、脂肪組織を、解離の前に、室温もしくは３７℃で、又は脂肪組織が半固体の外観に戻るまで融解する。
２．解離のために、融解させた脂肪組織を容器中に置く。
３．添加剤含有又は非含有の流体を、容器中の融解させた脂肪組織に添加する。
ａ．添加される流体の体積は、容器中の脂肪組織の体積の１０％〜２００％である。
４．脂肪組織及び流体を含有する容器内に、ケーシング／ステーター及びシャフト／ローターを置く。
５．ステーターを回転させて又は回転させないでローターを回転させることによって、組織を解離する。
ａ．回転速度は、毎分１００〜１０，０００回転の範囲である。
ｂ．回転の持続時間は、１０秒〜１０分の範囲である。
【００４５】
ＳＶＦ分離、低温保存、及び細胞培養の説明
上述したように解離した後、以下の逐次工程を実行することによって、脂肪細胞及び油性物質からＳＶＦを分離する。
１．解離した脂肪組織を、５０〜１０００倍（５０×〜１０００×）の相対遠心力（ＲＣＦ）で遠心分離して、解離した脂肪組織を、油性物質及び脂肪組織の層、ならびにＳＶＦを含有する水性層に分離する。
ａ．ＳＶＦは、水性層中で、細胞ペレットの形態であってもよいし、又はそうでなくてもよい。
２．水性層及びＳＶＦから、油性物質及び脂肪組織の層を分離する。
３．ＳＶＦが細胞ペレットの形態である場合、ＳＶＦを穏やかに水性層中に再懸濁して、細胞懸濁液を得る。
４．細胞懸濁液を、４０〜２５０μｍの孔径を有するフィルターに通過させてろ過する。
５．ろ過した細胞懸濁液を５０×〜１０００×ＲＣＦで遠心分離して、ＳＶＦを細胞ペレットとして得る。
６．流体の大部分を除去して、ＳＶＦペレット及び少量の流体のみを残す。
ａ．流体メニスカスの底部は、細胞ペレットの上部から５ｍｍに近いかそれ未満であるべきである。
７．ＳＶＦを、穏やかな振盪又は軽く叩くことによって残りの流体に再懸濁して、濃縮した細胞懸濁液を得る。
８．この工程及びそこに含まれる手順は、任意選択であり、省いてもよい。
ｉ．実質的な赤血球（ＲＢＣ）は、任意選択で、１００ｃｃの脂肪組織からのＳＶＦ量に対して０．５ｍｌ〜１０ｍｌでＲＢＣ溶解溶液を添加することによって除去してもよい。
ｉｉ．ＲＢＣ溶解溶液の体積の１〜１０倍である生体適合性の流体の体積は、ＲＢＣ溶解溶液添加の１０秒〜６０秒以内に添加される。
ｉｉｉ．細胞懸濁液を５０×〜１０００×ＲＣＦで遠心分離して、ＳＶＦを細胞ペレットとして得る。
ｉｖ．工程６の場合のように、流体の大部分を除去して、ＳＶＦペレット及び少量の流体のみを残す。
ｖ．ＳＶＦを、穏やかな振盪によって残りの流体に再懸濁する。
９．ＳＶＦを培養するために、濃縮した細胞懸濁液に、培養培地（例えば、１５％ＦＢＳ、１×ＮＥＡＡ、５ｎｇ／ｍｌの塩基性ＦＧＦ、及び１００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ、又は適切な市販の培地）を添加する。プレーティングする前に、血球計算器又は自動細胞計数器を用いて、生存可能な細胞を数えることができる。
ａ．適切な容器に細胞を添加し、標準的な３７℃、５％ＣＯ２の加湿したインキュベーター中でインキュベートする。
ｂ．次の日、培養培地を除去し、接着細胞を穏やかに緩衝液（例えばＨＢＳＳ）で洗浄し、新鮮な培養培地で培養する。
ｃ．培養培地は、必要に応じて変更され、細胞増殖及び形態は、顕微鏡下で観察される。
１０．ＳＶＦを低温保存するために、濃縮した細胞懸濁液に低温保存培地（例えば、５０％ＦＢＳ及び１０％ＤＭＳＯを含有するＤＭＥＭ、又は適切な市販の低温保存液）を添加する前に、血球計算器又は自動細胞計数器を用いて、生存可能な細胞をまず数えることができる。低温保存培地を添加して、凍結に望ましい細胞密度（例えば、１〜２×１０６／ｍｌ）で細胞を得て、細胞を穏やかに再懸濁する。
ａ．細胞懸濁液を適切な容器（例えば１ｍｌクライオチューブ）に等分し、凍結速度を制御しながら−８０℃で凍結する。
ｂ．速度制御された凍結の後、長期間貯蔵のために、容器を液体窒素に移してもよい。
１１．臨床的な適用のために、生存可能な細胞を、血球計数器又は自動細胞計数器を用いてまず数えてもよい。数えた後、細胞懸濁液を適切な臨床用の流体で望ましい細胞濃度に希釈する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年4月11日(2018.4.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織の破壊に使用するためのデバイスであって、少なくとも１つの連続又は不連続のねじ山が取り付けられた又は一体化された細長いシャフトの形状の第１の可動部材と、前記シャフトに嵌合するように適合されたケーシング形状の第２の非可動部材であって、前記シャフトの縦軸と整列し、組織接触端部から離間した端部においてより幅広である少なくとも１つの細長い開口部を有する第２の非可動部材とを含み、
前記ねじ山の少なくとも１つが前記シャフトの下方部分または下半分に設けられた第１のねじ山であり、前記ねじ山の少なくとも１つが前記シャフトの上方部分または上半分に設けられた第２のねじ山であり、前記第１のねじ山の回転方向が、前記第２のねじ山の回転方向と逆である、デバイス。
【請求項２】
前記可動部分が、モーターおよびローターを含む、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
前記可動部分が、ハンドルまたはマウンティングを含み、それを介して前記デバイスを操作中に保持できる、請求項１または２に記載のデバイス。
【請求項４】
１つまたは複数の前記ねじ山が、連続している、請求項１から３のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項５】
１つまたは複数の前記ねじ山が、不連続である、請求項１から４のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項６】
前記ねじ山の角度配置が、水平面から測定した場合、２０°〜８８°または４０°〜８０°または４０°〜５０°を含む範囲から選択される、請求項１から５のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項７】
前記ねじ山の深さが、前記ケーシングの直径の４０％または３０％未満である、請求項１から６のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項８】
前記ケーシングが、複数の開口部を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項９】
ケーシングの円周当たり２〜１２個の開口部がある、請求項８に記載のデバイス。
【請求項１０】
４．５ｃｍのケーシング当たり４個の孔がある、請求項８または９に記載のデバイス。
【請求項１１】
前記開口部が、前記ケーシングの周りに均一に間隔を開けて配置される、請求項８から１０のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１２】
前記開口部が、スリットを含み、前記スリットのサイズが、前記デバイスの前記組織接触端部から離れた端部で拡張している、請求項１から１１のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１３】
前記開口部が、不連続のスリットを含み、前記スリットのサイズが、前記組織接触端部から離れた端部で拡張している、請求項１から１２のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１４】
前記開口部の前記拡張した部分が、少なくとも部分的な円形の形状を形成する、請求項１２または１３に記載のデバイス。
【請求項１５】
前記開口部の前記拡張した部分が、第１の前記ねじ山の上方端部と並んでいるか、または前記第１のまたは下方のねじ山と第３のまたは上方のねじ山との間の接合部と並んでいる、請求項１２から１４のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１６】
前記細長いシャフトの下方領域または組織接触領域が、取り付けられたまたは合体したいかなるねじ山も含まず、前記シャフトまたはケーシングの下方端部または組織接触端部が、使用時に前記細長いシャフトが自由に回転するが横方向の制限を受けるように拘束部材をさらに含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１７】
組織を破壊するための方法であって、請求項１から１６のいずれか一項に記載のデバイスおよび選択された組織サンプルの使用を含み、前記組織サンプルの構成部分が機械的に分離される、方法。
【請求項１８】
前記組織が、添加剤含有または非含有の生体適合性の流体中に懸濁されており、前記添加剤は、これらに限定されないが、単独の、または組み合わされた、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、スクロース、アルブミン、アミノ酸、ピルビン酸塩を含む、生体適合性の／臨床的に承認された賦形剤／試薬である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記デバイスが、毎分１００〜１０，０００回転の範囲内の速度で回転する、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
回転の持続時間が、１０秒〜１０分の範囲である、請求項１７から１９のいずれか一項に記載の方法。
【国際調査報告】
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