(57)【要約】  改変された組換え重合酵素を含む組成物が、改変された重合酵素をコードする核酸分子と共に提供される。いくつかの態様では、そのような重合酵素を使用して核酸分子を合成する、または核酸鋳型をシークエンシングする方法が提供される。
2020501573.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表１から選択される第１の重合酵素に基づく組換え重合酵素であって、前記第１の重合酵素の少なくとも１つのアミノ酸セグメントが、表１から選択される第２の重合酵素に由来する対応するアミノ酸セグメントで置き換えられており、前記第１および第２の重合酵素は互いに異なり、任意選択で、前記組換え重合酵素が、表１の前記第１および／または第２の重合酵素の配列に対して１つまたは複数のアミノ酸の挿入、欠失、または置換をさらに含む、組換え重合酵素。
【請求項２】
前記第１の重合酵素が、Φ２９ポリメラーゼ（配列番号１）であり、前記第２の重合酵素が、配列番号２から１９のいずれか１つから選択される、請求項１に記載の組換え重合酵素。
【請求項３】
前記第１の重合酵素の少なくとも１から３個の追加のアミノ酸セグメントが、表１の１つまたは複数の重合酵素に由来する対応するアミノ酸セグメントで置き換えられており、表１の前記１つまたは複数の重合酵素が前記第１の重合酵素と異なり、任意選択で、前記対応するアミノ酸セグメントのうちの１つまたは複数が、表１内のそれらの配列に対して１つまたは複数のアミノ酸の挿入、欠失、または置換を含む、請求項１または２に記載の組換え重合酵素。
【請求項４】
前記セグメントのうちの１つまたは複数が、表１の重合酵素のドメインを含む、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の組換え重合酵素。
【請求項５】
前記アミノ酸セグメントのうちの１つまたは複数が、表１の重合酵素のドメインの一部分を含む、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の組換え重合酵素。
【請求項６】
前記アミノ酸セグメントのうちの１つまたは複数が、表１の重合酵素内の前記ドメインまたはその一部分に隣接する１つまたは複数のアミノ酸を含む、請求項４または５に記載の組換え重合酵素。
【請求項７】
少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失、または置換が、表１の異なる天然の重合酵素中に見出されるアミノ酸の挿入、欠失、または置換に対応する、請求項１乃至６のいずれか一項に記載の組換え重合酵素。
【請求項８】
少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失、または置換が、表１の天然の重合酵素中に見出されないアミノ酸の挿入、欠失、または置換に対応する、請求項１乃至７のいずれか一項に記載の組換え重合酵素。
【請求項９】
前記１つまたは複数の対応するアミノ酸セグメントが、Ｍ２Ｙポリメラーゼに由来するアミノ酸１から５１、Ｅ．フェシウムポリメラーゼに由来するアミノ酸２７１から３７５、Ｅ．フェシウムポリメラーゼに由来するアミノ酸７２から８９、および／またはＥ．フェシウムポリメラーゼに由来するアミノ酸４４５から４４９からなる群から選択される、請求項１乃至８のいずれか一項に記載の組換え重合酵素。
【請求項１０】
少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失、または置換が、Φ２９ポリメラーゼ内の位置：Ｍ８、Ｖ５１、Ｎ６２、Ｉ７１、Ｌ１０７、Ｋ１３１、Ｋ１３５、Ｌ１４２、Ｇ１９７、Ｙ２２４、Ｅ２３９、Ｖ２５０、Ｌ２５３、Ｙ２８１、Ｉ２８８、Ｔ３０１、Ｒ３０６、Ｒ３０８、Ｄ３２５、Ｄ３４１、Ｋ３５４、Ｔ３６８、Ｅ３７５、Ａ４３７、Ａ４４４、Ｅ４６６、Ｄ４７６、Ａ４８４、Ｅ５０８、Ｄ５１０、Ｋ５１２、Ｅ５１５、Ｋ５３９、Ｄ５７０、およびＴ５７１から選択される位置に対応する位置にある、請求項１乃至９のいずれか一項に記載の組換え重合酵素。
【請求項１１】
Ｍ８Ｒ、Ｖ５１Ａ、Ｎ６２Ｄ、Ｉ７１Ｖ、Ｌ１０７Ｉ、Ｋ１３１Ｅ、Ｋ１３５Ｑ、Ｌ１４２Ｋ、Ｇ１９７Ｄ、Ｙ２２４Ｋ、Ｅ２３９Ｇ、Ｖ２５０Ａ、Ｖ２５０Ｉ、Ｌ２５３Ａ、Ｌ２５３Ｈ、Ｙ２８１Ｈ、Ｉ２８８Ｌ、Ｔ３０１Ｃ、Ｒ３０６Ｑ、Ｒ３０８Ｌ、Ｄ３２５Ｅ、Ｄ３４１Ｅ、Ｋ３５４Ｒ、Ｔ３６８Ｆ、Ｅ３７５Ｙ、Ａ４３７Ｇ、Ａ４４４Ｔ、Ｅ４６６Ｋ、Ｄ４７６Ｈ、Ａ４８４Ｅ、Ｅ５０８Ｒ、Ｄ５１０Ｋ、Ｄ５１０Ｒ、Ｋ５１２Ｙ、Ｅ５１５Ｑ、Ｋ５３９Ｅ、Ｄ５７０Ｓ、およびＴ５７１Ｖから選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、請求項１０に記載の組換え重合酵素。
【請求項１２】
配列番号１におけるＩ７１、Ｌ１０７、Ｋ１３５、Ｌ１４２、Ｇ１９７、Ｙ２２４、Ｅ２３９、Ｖ２５０、Ｌ２５３、Ｅ３７５、Ａ４３７、Ａ４４４、Ｅ４６６、Ｄ４７６、Ａ４８４、Ｅ５０８、Ｄ５１０、Ｋ５１２、Ｅ５１５、Ｋ５３９、Ｄ５７０、およびＴ５７１に対応する位置において１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、請求項１乃至１１のいずれか一項に記載の組換え重合酵素。
【請求項１３】
前記１つまたは複数のアミノ酸置換が、配列番号１におけるＩ７１Ｖ、Ｌ１０７Ｉ、Ｋ１３５Ｑ、Ｌ１４２Ｋ、Ｇ１９７Ｖ、Ｙ２２４Ｋ、Ｅ２３９Ｇ、Ｖ２５０Ｉ、Ｌ２５３Ａ、Ｅ３７５Ｙ、Ａ４３７Ｇ、Ａ４４４Ｖ、Ｅ４６６Ｋ、Ｄ４７６Ｈ、Ａ４８４Ｅ、Ｅ５０８Ｒ、Ｄ５１０Ｒ、Ｋ５１２Ｙ、Ｅ５１５Ｑ、Ｋ５３９Ｅ、Ｄ５７０Ｓ、およびＴ５７１Ｖから選択される、請求項１２に記載の組換え重合酵素。
【請求項１４】
配列番号１におけるＫ１３１、Ｋ１３５、Ｌ１４２、Ｙ１４８、Ｙ２２４、Ｅ２３９、Ｖ２５０、Ｌ２５３、Ｒ３０６、Ｒ３０８、Ｅ３７５、Ａ４３７、Ｅ４６６、Ｄ４７６、Ａ４８４、Ｅ５０８、Ｄ５１０、Ｋ５１２、Ｅ５１５、Ｋ５３９、Ｄ５７０、およびＴ５７１に対応する位置において１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、請求項１乃至１３のいずれか一項に記載の組換え重合酵素。
【請求項１５】
前記１つまたは複数のアミノ酸置換が、配列番号１におけるＫ１３１Ｅ、Ｋ１３５Ｑ、Ｌ１４２Ｋ、Ｙ１４８Ｉ、Ｙ２２４Ｋ、Ｅ２３９Ｇ、Ｖ２５０Ａ、Ｖ２５０Ｉ、Ｌ２５３Ａ、Ｌ２５３Ｈ、Ｒ３０６Ｑ、Ｒ３０８Ｌ、Ｅ３７５Ｙ、Ａ４３７Ｇ、Ｅ４６６Ｋ、Ｄ４７６Ｈ、Ａ４８４Ｅ、Ｅ５０８Ｒ、Ｄ５１０Ｋ、Ｄ５１０Ｒ、Ｋ５１２Ｙ、Ｅ５１５Ｑ、Ｋ５３９Ｅ、Ｄ５７０Ｅ、Ｄ５７０Ｓ、およびＴ５７１Ｖから選択される、請求項１４に記載の組換え重合酵素。
【請求項１６】
前記１つまたは複数のアミノ酸置換が、配列番号１におけるＫ１３１Ｅ、Ｌ１４２Ｋ、Ｙ１４８Ｉ、Ｙ２２４Ｋ、Ｅ２３９Ｇ、Ｖ２５０Ａ、Ｌ２５３Ｈ、Ｅ３７５Ｙ、Ａ４３７Ｇ、Ａ４８４Ｅ、Ｅ５０８Ｒ、Ｄ５１０Ｋ、Ｋ５１２Ｙ、Ｅ５１５Ｑ、およびＤ５７０Ｅから選択される、請求項４に記載の組換え重合酵素。
【請求項１７】
置換したセグメントの少なくとも１つまたは複数が、エキソヌクレアーゼ領域、パーム領域、ＴＰＲ１領域、フィンガー領域、ＴＰＲ２領域、サム領域、またはそれらのうちのいずれか１つの一部分を含み、任意選択で１つまたは複数の隣接するアミノ酸を含む、請求項１乃至１６のいずれか一項に記載の組換え重合酵素。
【請求項１８】
表１のアミノ酸配列と少なくとも６０％、６０から７０％、７０から８０％、または少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有し、表２から５の１つまたは複数のアミノ酸改変を含む組換え重合酵素。
【請求項１９】
前記１つまたは複数のアミノ酸改変は、少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含む、請求項１８に記載の組換え重合酵素。
【請求項２０】
前記１つまたは複数のアミノ酸改変は、少なくとも１つのドメイン置換を含む、請求項１８に記載の組換え重合酵素。
【請求項２１】
前記１つまたは複数のアミノ酸改変は、少なくとも１つのドメイン置換および少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含む、請求項１８に記載の組換え重合酵素。
【請求項２２】
表２から選択される配列を有する、請求項１８に記載の組換え重合酵素。
【請求項２３】
表３から選択される配列を有する、請求項１８に記載の組換え重合酵素。
【請求項２４】
精製タグをさらに含む、請求項１乃至２３のいずれか一項に記載の組換え重合酵素。
【請求項２５】
前記精製タグが、Ｃ末端タグである、請求項２４に記載の組換え重合酵素。
【請求項２６】
前記精製タグが、Ｎ末端タグである、請求項２４の組換え重合酵素。
【請求項２７】
前記精製タグが、Ｈｉｓタグである、請求項２４、２５、または２６に記載の組換え重合酵素。
【請求項２８】
カップリング基をさらに含む、請求項１乃至２７のいずれか一項に記載の組換え重合酵素。
【請求項２９】
前記カップリング基が、前記組換え重合酵素のＣ末端に連結している、請求項２８に記載の組換え重合酵素。
【請求項３０】
前記カップリング基が、組換え重合酵素のＮ末端に連結している、請求項２８に記載の組換え重合酵素。
【請求項３１】
前記カップリング基が、ビオチン化配列である、請求項２８、２９、または３０に記載の組換え重合酵素。
【請求項３２】
Ｈｉｓタグおよびビオチン化配列を含む、請求項１乃至３１のいずれか一項に記載の組換え重合酵素。
【請求項３３】
表面上に固定化されている、請求項１８に記載の組換え重合酵素。
【請求項３４】
前記表面がナノアパーチャを含む、請求項３３に記載の組換え重合酵素。
【請求項３５】
請求項１８に記載の組換え重合酵素をコードする単離された核酸分子。
【請求項３６】
請求項１８に記載の組換え重合酵素を含む組成物。
【請求項３７】
請求項１８に記載の組換え重合酵素をシークエンシング反応混合物と接触させる工程を含む、核酸をシークエンシングする方法。
【請求項３８】
表１のアミノ酸配列と少なくとも６０％、６０から７０％、７０から８０％、または少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有し、表１または表２の異なる重合酵素に由来するエキソヌクレアーゼ領域と少なくとも６０％、６０から７０％、７０から８０％、または少なくとも８０％同一であるエキソヌクレアーゼ領域を含む組換え重合酵素。
【請求項３９】
表１のアミノ酸配列と少なくとも６０％、６０から７０％、７０から８０％、または少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有し、表１または表２の異なる重合酵素に由来するパーム領域と少なくとも６０％、６０から７０％、７０から８０％、または少なくとも８０％同一であるパーム領域を含む組換え重合酵素。
【請求項４０】
表１のアミノ酸配列と少なくとも６０％、６０から７０％、７０から８０％、または少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有し、表１または表２の異なる重合酵素に由来するＴＰＲ１領域と少なくとも６０％、６０から７０％、７０から８０％、または少なくとも８０％同一であるＴＰＲ１領域を含む組換え重合酵素。
【請求項４１】
表１のアミノ酸配列と少なくとも６０％、６０から７０％、７０から８０％、または少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有し、表１または表２の異なる重合酵素に由来するフィンガー領域と少なくとも６０％、６０から７０％、７０から８０％、または少なくとも８０％同一であるフィンガー領域を含む組換え重合酵素。
【請求項４２】
表１のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有し、表１または表２の異なる重合酵素に由来するＴＰＲ２領域と少なくとも８０％同一であるＴＰＲ２領域を含む組換え重合酵素。
【請求項４３】
表１のアミノ酸配列と少なくとも６０％、６０から７０％、７０から８０％、または少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有し、表１または表２の異なる重合酵素に由来するサム領域と少なくとも６０％、６０から７０％、７０から８０％、または少なくとも８０％同一であるサム領域を含む組換え重合酵素。
【請求項４４】
表１のアミノ酸配列と少なくとも６０％、６０から７０％、７０から８０％、または少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有し、請求項１乃至４３のいずれか一項に記載の２つ以上の領域を含む組換え重合酵素。
【請求項４５】
請求項１乃至４４のいずれか一項に記載の１つまたは複数のポリメラーゼを使用して、シークエンシング反応を実施する工程を含むシークエンシング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、概して、生物学的および／または化学的試料をシークエンシング分析するための方法および組成物を対象とする。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡポリメラーゼは、全生物のゲノムの複製にとって必要不可欠なヌクレオチド重合酵素である。複製および修復期間中にゲノムの完全性を維持するその役割に加えて、ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡクローニング、突然変異誘発、およびシークエンシングといったｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＤＮＡ操作において幅広く使用されている。処理能力、忠実性、および基質ヌクレオチド選択性といった固有の性質は酵素間で異なるものの、鋳型ＤＮＡに基づき相補鎖を合成するＤＮＡポリメラーゼの基本的な能力は保存されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本出願は、概して、生物学的および／または化学的試料をシークエンシング分析するための方法および組成物を対象とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本願明細書に開示する技術の態様は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの重合反応を実行するのに使用され得る改変された重合酵素（例えば、ポリメラーゼ）と関連する。いくつかの態様では、本願明細書に記載するポリメラーゼは、シークエンシング反応（例えば、核酸のシークエンシング）における使用に適する。いくつかの態様では、本開示は、１つまたは複数の改変を有する組換えポリメラーゼを提供する。いくつかの実施形態では、本開示の組換えポリメラーゼは、アミノ酸突然変異またはドメイン置換のうちの少なくとも１つを含む。
【０００５】
いくつかの態様では、本開示は、天然のポリメラーゼ（例えば、表１から選択される）に基づき、１つまたは複数のアミノ酸突然変異および／またはセグメント置換を含むアミノ酸配列を有する改変された重合酵素（例えば、核酸重合酵素または核酸ポリメラーゼ）を提供する。いくつかの実施形態では、改変された重合酵素は、１つまたは複数のセグメントの置換（例えば、ポリメラーゼの１つまたは複数のセグメントは、異なるポリメラーゼに由来する１つまたは複数の対応するセグメントで置き換えられている）、１つもしくは複数のアミノ酸の付加、欠失、および／または置換、またはその組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、セグメントは、ポリメラーゼの定義された領域（例えば、構造的または機能的ドメインもしくはサブドメイン）またはその一部分を含み、任意選択で１つまたは複数の隣接するアミノ酸を含む（例えば、表１の天然のポリメラーゼ内の領域またはその一部分のいずれかの側にある、例えば１〜５０、１〜４０、１〜３０、１〜２０、５〜１０、５〜２５個、またはこれらの範囲内の任意の整数のアミノ酸）。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸の挿入、欠失、または置換は、１つまたは複数の位置における２つの天然のポリメラーゼの間の天然の差異に対応する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸の挿入、欠失、または置換は、新しい非天然の変化である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換である（例えば、１つのアミノ酸は、類似した性質を有する、例えば類似した荷電性、極性、疎水性、親水性、および／または類似したその他の性質、例えば類似したサイズ等を有する別のアミノ酸で置き換えられている）。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は非保存的アミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸の挿入、欠失、または置換は、異なるポリメラーゼに由来する１つまたは複数の交換したセグメント、および／またはオリジナルのポリメラーゼのセグメントを含む、改変されたポリメラーゼ内の任意の位置（複数可）にあり得る。
【０００６】
したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、表１から選択されるアミノ酸配列を有し（または表１から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、８０〜９０％、９０〜９５％、９５〜９９％、またはそれより高いアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有し）、表２、表３、表４、または表５に由来する１つまたは複数のアミノ酸改変を含む組換え重合酵素を提供する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸改変は、少なくとも１つのアミノ酸突然変異（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、または２５個以上のアミノ酸突然変異）を含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸改変は、少なくとも１個かつ最大５個のアミノ酸突然変異、少なくとも１個かつ最大１０個のアミノ酸突然変異、少なくとも１個かつ最大１５個のアミノ酸突然変異、少なくとも１個かつ最大２５個のアミノ酸突然変異、少なくとも１個かつ最大５０個のアミノ酸突然変異、または少なくとも１個かつ最大１００個のアミノ酸突然変異を含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸改変は、少なくとも１つのドメイン置換（例えば、ドメイン全体の置換、またはドメインもしくはドメインの一部分を包含するセグメントの置換）を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのドメイン置換は、エキソヌクレアーゼドメイン置換およびポリメラーゼドメイン置換のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、エキソヌクレアーゼドメイン置換は、エキソヌクレアーゼループ置換を含む。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼドメイン置換は、パーム（ｐａｌｍ）サブドメイン置換、ＴＰＲ１サブドメイン置換、フィンガー（ｆｉｎｇｅｒ）サブドメイン置換、ＴＰＲ２サブドメイン置換、またはサム（ｔｈｕｍｂ）サブドメイン置換のいずれか１つを含む（例えば、ポリメラーゼ全体、パーム、ＴＰＲ１、フィンガー、ＴＰＲ２、もしくはサムのドメインもしくはサブドメイン、またはそのいずれか１つの一部分の置換、任意選択で１つまたは複数の隣接するアミノ酸を含む）。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸改変は、少なくとも１つのドメイン置換、および少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸突然変異は、アミノ酸の挿入、欠失、または置換であり得る。
【０００７】
いくつかの実施形態では、本開示の組換え重合酵素は、表２から選択される配列を有する。いくつかの実施形態では、本開示は、表３から選択される配列を有する組換え重合酵素を提供する。
【０００８】
いくつかの実施形態では、組換え重合酵素は、精製タグをさらに含む。いくつかの実施形態では、精製タグは、重合酵素配列内の領域に対して共有結合している。いくつかの実施形態では、精製タグは、重合酵素配列の末端に共有結合している。いくつかの実施形態では、精製タグはＣ末端タグである。いくつかの実施形態では、精製タグはＮ末端タグである。いくつかの実施形態では、精製タグは、Ｈｉｓタグ（例えば、反復したヒスチジン残基の配列、例えばヘキサヒスチジン配列等）である。
【０００９】
いくつかの実施形態では、組換え重合酵素は、カップリング基をさらに含む。いくつかの実施形態では、カップリング基は、重合酵素配列内のある領域に連結している。いくつかの実施形態では、カップリング基は、重合酵素の末端に連結している。いくつかの実施形態では、カップリング基は、組換え重合酵素のＣ末端に連結している。いくつかの実施形態では、カップリング基は、組換え重合酵素のＮ末端に連結している。いくつかの実施形態では、カップリング基は、ビオチン化配列である。いくつかの実施形態では、組換え重合酵素は、直接繋がった、またはペプチドリンカー（例えば、長さ５〜１５個以上のアミノ酸）により分離した精製タグ（例えば、Ｈｉｓタグ）とカップリング基（例えば、ビオチン化配列）とを含む（例えば、そのＣ末端において）。
【００１０】
いくつかの実施形態では、組換え重合酵素は表面上に固定化されている。いくつかの実施形態では、表面は、組換え重合酵素と結合するように構成されたカップリング基を含む。いくつかの実施形態では、表面は、ナノアパーチャ（ｎａｎｏａｐｅｒｔｕｒｅ）を含む。いくつかの実施形態では、表面は、試料ウェルの底部表面を含む。いくつかの実施形態では、試料ウェルは、表面（例えば、チップまたは集積化デバイスの表面）上の複数の試料ウェルの間に配置される。いくつかの実施形態では、複数の試料ウェルのそれぞれは、組換え重合酵素を受け入れるように構成される。いくつかの実施形態では、組換え重合酵素を含む複数の試料ウェルのそれぞれは、単一分子シークエンシング反応を実行する能力を有する。
【００１１】
いくつかの態様では、本開示は、本願明細書に記載する組換え重合酵素をコードする単離された核酸分子を提供する。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子はＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子はＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子はウイルスベクターを含む。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は発現ベクターを含む。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子はプラスミドを含む。いくつかの実施形態では、単離された核酸は、プロモーター（例えば、誘導性プロモーター）を含む。いくつかの実施形態では、単離された核酸は、組換え重合酵素を発現する能力を有する宿主細胞内にある。いくつかの実施形態では、組換え重合酵素は、宿主細胞から（例として、例えば、バイオリアクター内での増殖および誘導性プロモーターの誘発後の宿主細胞調製物から）単離される。
【００１２】
いくつかの態様では、本開示は、本出願に記載する組換え重合酵素を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、核酸をシークエンシングする方法において使用される。いくつかの実施形態では、組成物は、シークエンシング反応混合物をさらに含む。いくつかの実施形態では、シークエンシング反応混合物には、ヌクレオシドポリリン酸（例えば、２つ以上のリン酸基を含むヌクレオシド、例えばヌクレオチドまたはヌクレオシド六リン酸等）、シークエンシングされる鋳型核酸、相補鎖合成のための起点として機能する核酸プライマー、二価の金属イオン、緩衝液成分、および塩のうちの１つまたは複数が含まれ得る。いくつかの実施形態では、ヌクレオシドポリリン酸は検出可能部分（例えば、発光標識）を含む。
【００１３】
いくつかの態様では、本開示は、本出願に記載する組換え重合酵素をシークエンシング反応混合物と接触させることにより、核酸をシークエンシングする方法を提供する。いくつかの実施形態では、シークエンシング反応混合物には、ヌクレオシドポリリン酸（例えば、２つ以上のリン酸基を含むヌクレオシド、例えばヌクレオチドまたはヌクレオシド六リン酸等）、シークエンシングされる鋳型核酸、相補鎖合成のための起点として機能する核酸プライマー、二価の金属イオン、緩衝液成分、および塩のうちの１つまたは複数が含まれ得る。いくつかの実施形態では、ヌクレオシドポリリン酸は発光標識を含む。いくつかの実施形態では、方法は、鋳型核酸に対して相補的な成長過程にある鎖において、１つまたは複数のヌクレオシドポリリン酸の組み込みを検出する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、検出する工程は、組み込み事象に関与する発光標識されたヌクレオシドポリリン酸の１つまたは複数の発光上の性質（例えば、寿命、強度、光子到達時間、量子収率）を測定する工程を含む。
【００１４】
いくつかの態様では、本開示は、表１のいずれか１つの組換え重合酵素のエキソヌクレアーゼ領域またはその一部分（および任意選択でその片側または両側において隣接するアミノ酸）を含むセグメントを含む組換え重合酵素を提供する。いくつかの態様では、本開示は、表１のいずれか１つの組換え重合酵素のパーム領域またはその一部分（および任意選択でその片側または両側において隣接するアミノ酸）を含むセグメントを含む組換え重合酵素を提供する。いくつかの態様では、本開示は、表１のいずれか１つの組換え重合酵素のＴＰＲ１領域またはその一部分（および任意選択でその片側または両側において隣接するアミノ酸）を含むセグメントを含む組換え重合酵素を提供する。いくつかの態様では、本開示は、表１のいずれか１つの組換え重合酵素のフィンガー領域またはその一部分（および任意選択でその片側または両側において隣接するアミノ酸）を含むセグメントを含む組換え重合酵素を提供する。いくつかの態様では、本開示は、表１のいずれか１つの組換え重合酵素のＴＰＲ２領域またはその一部分（および任意選択でその片側または両側において隣接するアミノ酸）を含むセグメントを含む組換え重合酵素を提供する。いくつかの態様では、本開示は、表１のいずれか１つの組換え重合酵素のサム領域またはその一部分（および任意選択でその片側または両側において隣接するアミノ酸）を含むセグメントを含む組換え重合酵素を提供する。いくつかの態様では、本開示は、本願明細書に記載する２つ以上のセグメントを含む組換え重合酵素を提供する。
【００１５】
したがって、いくつかの実施形態では、組換え重合酵素は、異なる重合酵素に由来する（例えば、異なる種に由来する）１つまたは複数のアミノ酸セグメントを含むキメラ酵素である。いくつかの実施形態では、キメラポリメラーゼは、１つまたは複数のセグメントが異なる重合酵素に由来するセグメント（複数可）で置き換えられた第１の重合酵素に由来するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、異なる重合酵素に由来する１つまたは複数のセグメントは、Ｍ２Ｙポリメラーゼに由来するアミノ酸１〜５１を含むセグメント、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）ポリメラーゼに由来するアミノ酸２７１〜３７５を含むセグメント、Ｅ．フェシウムポリメラーゼに由来するアミノ酸７２〜８９を含むセグメント、および／またはＥ．フェシウムポリメラーゼに由来するアミノ酸４４５〜４４９を含むセグメントであり得る。いくつかの実施形態では、Ｍ２Ｙポリメラーゼに由来する１〜５１セグメントは、対応する天然のポリメラーゼセグメント（例えば、Φ２９ポリメラーゼのアミノ酸１〜５４）と置き換わる。いくつかの実施形態では、Ｅ．フェシウムポリメラーゼに由来する２７１〜３７５セグメントは、対応する天然のポリメラーゼセグメント（例えば、Φ２９ポリメラーゼのアミノ酸２６０〜３５９）と置き換わる。いくつかの実施形態では、Ｅ．フェシウムポリメラーゼに由来する７２〜８９セグメントは、対応する天然のポリメラーゼセグメント（例えば、Φ２９ポリメラーゼのアミノ酸７５〜９１）と置き換わる。いくつかの実施形態では、Ｅ．フェシウムポリメラーゼに由来する４４５〜４４９セグメントは、対応する天然のポリメラーゼセグメント（例えば、Φ２９ポリメラーゼのアミノ酸４２９〜４３３）と置き換わる。
【００１６】
いくつかの実施形態では、組換え重合酵素は、Φ２９２９における下記の置換：Ｍ８Ｒ、Ｖ５１Ａ、Ｎ６２Ｄ、Ｉ７１Ｖ、Ｌ１０７Ｉ、Ｋ１３１Ｅ、Ｋ１３５Ｑ、Ｌ１４２Ｋ、Ｇ１９７Ｄ、Ｙ２２４Ｋ、Ｅ２３９Ｇ、Ｖ２５０Ａ／Ｉ、Ｌ２５３Ａ／Ｈ、Ｙ２８１Ｈ、Ｉ２８８Ｌ、Ｔ３０１Ｃ、Ｒ３０６Ｑ、Ｒ３０８Ｌ、Ｄ３２５Ｅ、Ｄ３４１Ｅ、Ｋ３５４Ｒ、Ｔ３６８Ｆ、Ｅ３７５Ｙ、Ａ４３７Ｇ、Ａ４４４Ｔ、Ｅ４６６Ｋ、Ｄ４７６Ｈ、Ａ４８４Ｅ、Ｅ５０８Ｒ、Ｄ５１０Ｋ／Ｒ、Ｋ５１２Ｙ、Ｅ５１５Ｑ、Ｋ５３９Ｅ、Ｄ５７０Ｓ、およびＴ５７１Ｖに対応する１つまたは複数の置換を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態では、改変されたポリメラーゼは、本願明細書に記載するセグメントの置換、ならびに／またはアミノ酸の挿入、欠失、および／もしくは置換のうちの１つもしくは複数を含み、ならびに１つまたは複数の（例えば、１〜５、５〜１０、１０〜２５、２５〜５０、５０〜７５、７５〜１００、１００〜１２５、１２５〜１５０個の）追加のアミノ酸の挿入、欠失、および／または置換（例えば、保存的または非保存的アミノ酸置換）も含む。したがって、いくつかの実施形態では、表２または表３の改変されたポリメラーゼには、１つまたは複数の追加の（例えば、１〜５、５〜１０、１０〜２５、２５〜５０、５０〜７５、７５〜１００、１００〜１２５、１２５〜１５０個の）追加のアミノ酸の挿入、欠失、および／または置換（例えば、保存的または非保存的アミノ酸置換）が含まれ得る。
【００１８】
これらおよびその他の態様は、下記の詳細な説明においてよりに記載されており、ならびに非限定的な図面および実施例により例示される。
当業者は、本明細書に記載される図は、例示目的に限定されるものと理解する。いくつかの事例に、本発明の様々な態様が、本発明の理解を容易にするために、誇張されるかまたは拡張されて示されることもあることが理解されるべきである。図面では、似通った参照記号は、様々な図を通して、似通った特色、機能的に類似のおよび／または構造的に類似の要素を一般的に指す。図面は、必ずしも一定縮尺ではなくて、むしろ教示の原理を例示することに強調を置いている。図面は、本発明の教示の範囲を、いかなる意味でも限定することを意図されない。
【００１９】
図面と共に検討すれば、本発明の特色および長所は、下記の詳細な説明からより明らかになるであろう。
図面を参照して実施形態を説明する際に、方向の参照（「上」、「下」、「上部」、「下部」、「左」、「右」、「水平」、「垂直」、等）が使用され得る。そのような参照は、読者が正しい配向で図面を認識するのに役立つように意図されているに過ぎない。これらの方向の参照は、具体的なデバイスの好ましいまたは唯一の配向を記載することを意図していない。デバイスは、他の配向で具体化することもできる。
【００２０】
詳細な説明から明らかなように、図（例えば、図１〜７）に描かれた例および本出願全体にわたる例示の目的のためのさらなる記載は、非限定的実施形態について記載しており、いくつかの場合には、例示をより明確にする目的で、あるプロセスを簡易化するかまたは特色もしくは工程を省略していることもある。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】単一分子プロセスをモニタリングするための非限定的な方法におけるシグナルの読み取りに関連する重合反応の進行を示す概略図。
【図２】Φ２９ポリメラーゼ、ならびに該ポリメラーゼのドメインおよびサブドメインの構造を描いた非限定的な図。
【図３】ポリペプチド鎖のドメインおよびサブドメイン内の突然変異の部位と共に、選択された突然変異バリアントを描いた非限定的な例の図。
【図４】ポリペプチド鎖中に異なるドメインおよびサブドメインが置換されている選択されたキメラポリメラーゼバリアントを描いた非限定的な例の図。
【図５Ａ】Φ２９ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼドメイン内のループ領域を描いた非限定的な図。
【図５Ｂ】Φ２９ポリメラーゼと非限定的なセットのその他のポリメラーゼについて、それらのエキソヌクレアーゼ領域間の配列相同性アライメントを描いた図。
【図６】１つまたは複数の部位特異的突然変異を含む、キメラポリメラーゼバリアントの非限定的な一般的な例を描いた図。
【図７】大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で発現されたポリメラーゼの純度を評価するために実行されたＳＤＳ−ＰＡＧＥの画像を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本開示の態様は、改変された重合酵素およびその組成物と関連する。いくつかの態様では、本開示は、改変された組換え重合酵素および酵素を含む組成物を使用する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの重合反応を実行するのに使用され得る改変された組換え重合酵素および組成物を提供する。いくつかの態様では、本願明細書に記載する重合酵素は、改変された組換え核酸ポリメラーゼ、例えば、改変された組換えＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、本開示により提供される改変された組換えＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡの操作（例えば、ＤＮＡのシークエンシング）と関連するｉｎ  ｖｉｔｒｏでの反応に使用され得る。
【００２３】
いくつかのその他の態様の中でもとりわけ、本開示は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの重合反応を実行するのに使用され得る改変された重合酵素（例えば、ポリメラーゼ）を提供する。いくつかの実施形態では、本願明細書に記載するポリメラーゼは、シークエンシング反応を実行するのに、個別であってもまた組み合わせであっても有用である１つまたは複数の改変を含む。いくつかの実施形態では、本願明細書に記載する改変のうちの１つまたは複数は、シークエンシング反応を実行するのに役立つ１つまたは複数の性質、例えば、ポリメラーゼ処理能力、忠実性（例えば、正確性）、基質（例えば、ヌクレオシドポリリン酸）結合親和力、基質の利用（例えば、ヌクレオシドポリリン酸が鋳型鎖に対して相補的な成長過程にある鎖に組み込まれる速度）、ポリメラーゼと改変された基質（例えば、標識されたヌクレオシドポリリン酸）との相互作用、またはいくつかのその組み合わせ等の特性を有するポリメラーゼを生成するのに利用可能である。いくつかの実施形態では、改変のうちの１つまたは複数は、ポリメラーゼのプルーフリーディング能力を最低限に抑えるまたは取り除く。例えば、いくつかの実施形態では、ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性の喪失をもたらす１つまたは複数の改変を、ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼドメインに加えることができる。
【００２４】
いくつかの態様では、本出願は、単一分子核酸シークエンシング技術にとって有利である変化した生化学的性質を有する改変されたポリメラーゼに関連する。いくつかの実施形態では、本願明細書に記載するバリアントポリメラーゼは、単一分子シークエンシング反応においてシグナルの読み取りの改善を実現するように改変されている。図１は、リアルタイムのシグナルの読み取りに関連してシークエンシング反応の進行を示す事例的図を提供する。理論に束縛されることは望まないが、いくつかの単一分子核酸シークエンシング反応がスキーム１００に基づき進行するものと考えられる。
【００２５】
反応の開始時において（パネルＩ）、ポリメラーゼ（破線）は観察領域内に閉じ込められ、鋳型鎖およびプライマー鎖に結合する。示す通り、異なる種類のヌクレオチド（例えば、Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｃ、Ｕ）が、それぞれ異なる種類の検出可能な標識を有しており、同一の反応混合物中に存在する。ポリメラーゼが発光標識されたヌクレオチドと会合すると（パネルＩＩ）、標識はある期間観察領域内に閉じ込められる。例えば、組み込み事象期間において、この期間は、標識にとって観察領域内のその存在を検出および識別するのに十分な量のエネルギーを受け取り、および／または放出するのに十分であり得る。シグナルの読み取り１０２に関連してスキーム１００のパネルＩおよびＩＩにより示されるように、組み込み事象は、パルス幅（ｐｗ）に対応する期間、シグナルパルスと関連付けることができる。
【００２６】
いくつかの実施形態では、組み込み事象と関連付けられる個々のシグナルパルスは、様々な条件、例えば組み込まれるヌクレオチドの種類または特定の時点におけるポリメラーゼの活性等により影響を受け得るものと認められるべきである。いくつかの実施形態では、個々のシグナルパルスは、約１０ミリ秒〜約１０秒の間の個々のパルス幅を有し得る。したがって、いくつかの実施形態では、個々のパルス幅は平均化されて比較するためのパラメーターを提供し得る。本願明細書で使用する場合、いくつかの実施形態では、「パルス幅」とは、複数の個々のシグナルパルスの平均値に対応する数値を指し、個々のシグナルパルスのそれぞれは個々のパルス幅を有する。
【００２７】
いくつかの実施形態では、本出願の改変された重合酵素は、約１０ミリ秒〜約１０秒の間のパルス幅を生成する。いくつかの実施形態では、パルス幅は、少なくとも１０ミリ秒〜最大１０秒、少なくとも１０ミリ秒〜最大５秒、少なくとも１０ミリ秒〜最大１秒、または約１０ミリ秒〜約１秒の間である。いくつかの実施形態では、パルス幅は、約１０〜約５００ミリ秒の間、約１０〜約２００ミリ秒の間、約１０〜約１００ミリ秒の間、約１０〜約５０ミリ秒の間、約５０ミリ秒〜約１秒の間、約５０〜約５００ミリ秒の間、約５０〜約２００ミリ秒の間、約５０〜約１００ミリ秒の間、約１００ミリ秒〜約１秒の間、約１００〜約５００ミリ秒の間、約１００〜約２００ミリ秒の間、約２００ミリ秒〜約１秒の間、約２００〜約５００ミリ秒の間、または約５００ミリ秒〜約１秒の間である。
【００２８】
成長過程にある鎖中へのヌクレオチドの組み込みおよび発光標識の切断の後に、標識は照光域（ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ  ｖｏｌｕｍｅ）の外側に拡散し、観察領域内ではもはや検出可能でなくなる（パネルＩＩＩ）。パネルＩＩＩにおいてやはり示すように、組み込み事象後、ポリメラーゼは、それが後続する発光標識されたヌクレオチドと会合する能力を有するように鋳型鎖に沿って進行する。パネルＩからパネルＩＩに向かう進行と類似して、シグナルトレース１０２内のパネルＩＩＩからパネルＩＶに向かう進行に対応するシグナルの強度は、相対的に低い強度レベルから会合事象を示唆するシグナルパルスまで増加する。シグナルトレース１０２において、組み込み事象と後続する会合事象の間の期間は、パルス間距離（ｉｐｄ）と関連づけることができる。
【００２９】
パルス幅に関して上記において詳記したように、いくつかの実施形態では、第１のシグナルパルスと第２のシグナルパルスの間の期間と関連付けられる個々のパルス間距離は、様々な条件、例えば特定の時点におけるポリメラーゼの活性または処理能力等により影響を受け得る。いくつかの実施形態では、個々のパルス間距離は、約１０ミリ秒〜約１分の間またはそれより長い（例えば、約１〜約６０秒の間、約１〜約３０秒の間、約１〜約２０秒の間、約１〜約１０秒の間、または約１秒未満の）期間に対応する。したがって、いくつかの実施形態では、個々のパルス間距離は、比較するためのパラメーターを提供するために平均化され得る。本願明細書で使用する場合、いくつかの実施形態では、「パルス間距離」とは、複数の個々のパルス間距離の平均値に対応する数値を指す。
【００３０】
いくつかの実施形態では、本出願の改変された重合酵素は、約１０ミリ秒〜約１０秒の間のパルス間距離を生成する。いくつかの実施形態では、パルス間距離は、少なくとも１０ミリ秒〜最大１０秒、少なくとも１０ミリ秒〜最大５秒、少なくとも１０ミリ秒〜最大１秒、または約１０ミリ秒〜約１秒の間である。いくつかの実施形態では、パルス間距離は、約１０〜約５００ミリ秒の間、約１０〜約２００ミリ秒の間、約１０〜約１００ミリ秒の間、約１０〜約５０ミリ秒の間、約５０ミリ秒〜約１秒の間、約５０〜約５００ミリ秒の間、約５０〜約２００ミリ秒の間、約５０〜約１００ミリ秒の間、約１００ミリ秒〜約１秒の間、約１００〜約５００ミリ秒の間、約１００〜約２００ミリ秒の間、約２００ミリ秒〜約１秒の間、約２００〜約５００ミリ秒の間、または約５００ミリ秒〜約１秒の間である。
【００３１】
パルス幅および／またはパルス間距離の特性が、いくつかの実施形態では、固有の発光標識を識別するのに使用可能である。いくつかの実施形態では、発光標識されたヌクレオチドの会合を示唆する一連のパルス幅を観察して、鋳型鎖のヌクレオチド配列を決定することにより、本開示の改変されたポリメラーゼは、シークエンシング反応において使用可能である。いくつかの実施形態では、このプロセス内のアーチファクトが、不正確なシークエンシング情報を誘発する可能性がある。例えば、パネルＶは、組み込み事象が生じないにもかかわらず、シグナルパルスを生じさせるのに十分な期間、発光標識されたヌクレオチドが観察領域内に閉じ込められるという結合−放出事象について示す。
【００３２】
パネルＶに示すように、パネルＩＶにおいて組み込みが検出された後に、開裂した発光標識が観測可能領域（ｉ）の外側に拡散する。発光標識されたさらなるヌクレオチドは、観測可能領域内のポリメラーゼと会合して検出可能なシグナル（ｉｉ）を生じさせる。成長過程にある鎖に組み込まれるのではなく、発光標識されたヌクレオチドはポリメラーゼから解離し、そして反応混合物中に再び拡散する（ｉｉｉ）。したがって、その後、同一種類のヌクレオチドの組み込みに成功した後（図示せず）、パネルＶに対応するシグナルパルスは、シークエンシング情報読み取りにおいてみかけの挿入を引き起こす。したがって、いくつかの実施形態では、本出願の改変されたポリメラーゼは、これらおよびその他のそのようなアーチファクト事象から真正な組み込み事象を見分けるのに十分な長さのパルス幅を有する。いくつかの実施形態では、本出願の改変されたポリメラーゼは、基質がポリメラーゼ活性部位から早期に放出される確率を減少させる１つまたは複数の改変を有する。いくつかの実施形態では、本出願の改変されたポリメラーゼは、基質がポリメラーゼ活性部位と会合したら基質が組み込まれる確率を増加させる１つまたは複数の改変を有する。
【００３３】
いくつかの実施形態では、本開示により提供される改変されたポリメラーゼは、１つまたは複数の改変（例えば、表２〜５に例示する、またはその２つ以上の組み合わせ）を有する、表１に規定する野生型ポリメラーゼ配列（配列番号１〜１９）に基づくポリメラーゼ配列を含む。
【００３４】
【表１−１】
2020501573.tif 000003
【００３５】
【表１−２】
2020501573.tif 000004
【００３６】
【表１−３】
2020501573.tif 000005
【００３７】
【表１−４】
2020501573.tif 000006
【００３８】
【表１−５】
2020501573.tif 000007
【００３９】
いくつかの実施形態では、野生型ポリメラーゼ配列（例えば、表１に規定するような）は、組換えバリアントポリメラーゼを生成するために、１つまたは複数の改変を設けることができる大部分のポリメラーゼ配列を提供する。本願明細書で使用する場合、改変されたポリメラーゼの「大部分のポリメラーゼ配列」または「大部分の配列」とは、改変されたポリメラーゼ配列内で支配的な野生型ポリメラーゼ配列を指す（例えば、改変されたポリメラーゼ配列内のアミノ酸の少なくとも５０％が、大部分の配列内のアミノ酸に対応する）。いくつかの実施形態では、改変されたポリメラーゼ配列は、１つまたは複数のアミノ酸突然変異をさらに含む大部分の配列を含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸突然変異は、相同的タンパク質内の位置に対応する位置にあるアミノ酸を含む。例えば、いくつかの実施形態では、改変されたポリメラーゼは、Φ２９ポリメラーゼ（配列番号１）内のＡ４８４に対応する位置において突然変異を含む。その他のポリメラーゼ内のＡ４８４に対応するアミノ酸は、相同性アライメントを含む当技術分野において公知の任意の方法により決定可能である。この分析法の非限定的な例として、相同性アライメントを、表１において報告されたいくつかのポリメラーゼを用いて実行し、そしてΦ２９ポリメラーゼ内のＡ４８４は、Ｍ２Ｙ内のＡ４８１、バチルスファージＶＭＹ２２内のＡ４９２、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）内のＫ５００、およびヒツジキンバエ（Ｌｕｃｉｌｉａ  ｃｕｐｒｉｎａ）内のＫ８２７に対応することが確認された。したがって、相同性アライメントおよび類似した当技術分野において公知の方法が、本願明細書に記載する改変された残基の位置に対応するその他のポリメラーゼ内のアミノ酸を識別するのに使用され得る。したがって、本開示の改変は、本願明細書に記載するポリメラーゼ（例えば、表１にリスト化するポリメラーゼ）に限定されるように意図するものではなく、また公知の技術を使用する任意の重合酵素に対してまで拡張され得るものと認められるべきである。
【００４０】
いくつかの実施形態では、改変されたポリメラーゼは、表１にリスト化するポリメラーゼのうちの１つまたは複数（例えば、配列番号１、配列番号５、または表１にリスト化するその他の配列）に対して少なくとも２５％のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、改変されたポリメラーゼは、表１にリスト化するポリメラーゼのうちの１つまたは複数（例えば、表１にリスト化する配列番号１、配列番号５、またはその他の配列）に対して２５〜５０％、５０〜６０％、６０〜７０％、７０〜８０％、８０〜９０％、９０〜９５％、もしくは９５〜９９％、またはそれより高いアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、そのような改変されたポリメラーゼは、異なる改変されたポリメラーゼ構成の文脈において記載されるアミノ酸突然変異および／もしくはドメイン置換、ならびに／または本出願に提供される例のうちの１つもしくは複数を含む。
【００４１】
いくつかの実施形態では、異なるポリメラーゼに由来する１つまたは複数のセグメントまたは領域は、本出願に記載する特定の配列に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するものとして記載される。そのような領域は、所定の配列（例えば、表１の天然のポリメラーゼ内の対応するセグメントまたは領域）に対して、例えば８０〜９０％、９０〜９５％、９５〜９９％、または１００％の配列同一性を有し得る。また、代替的実施形態では、そのようなセグメント領域は、所定の配列（例えば、表１の天然のポリメラーゼ内の対応するセグメントまたは領域）に対してより低い配列同一性（例えば、５０〜６０％、６０〜７０％、または７０〜８０％のアミノ酸配列同一性）を有し得る。
【００４２】
２つ以上のアミノ酸配列を比較するために、第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列の間の「配列同一性」の割合（％）（本願明細書では「アミノ酸同一性」とも呼ばれる）は、［第２のアミノ酸配列内の対応する位置にあるアミノ酸残基と同一である、第１のアミノ酸配列内のアミノ酸残基の数］を、［第１のアミノ酸配列内のアミノ酸残基の合計数］により割り算し、そして［１００％］を掛け算することにより計算され得るが、第１のアミノ酸配列と比較して、第２のアミノ酸配列内のアミノ酸残基の各欠失、挿入、置換、または付加は、単一のアミノ酸残基（位置）における相違として、すなわち本願明細書で定義するような「アミノ酸の相違」としてみなされる。あるいは、２つのアミノ酸配列の間の配列同一性の程度は、公知のコンピューターアルゴリズムを使用して（例えば、スミスおよびウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ）（１９７０）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２ｃのローカルホモロジーアルゴリズムにより、ニードルマンおよびブンシュ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９７０）４８：４４３のホモロジーアライメントアルゴリズムにより、ピアソンおよびリップマン（Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ）．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９８）８５：２４４４の類似検索法により、もしくはＢｌａｓｔ、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａとして利用可能なアルゴリズム、またはその他の配列アラインメントアルゴリズムのコンピュータ化された実施により）、および、例えば、標準設定を使用して計算され得る。通常、本願明細書でこれまでに概説した計算方法に基づき、２つのアミノ酸配列の間の「配列同一性」の割合（％）を決定するために、最大のアミノ酸残基の数を有するアミノ酸配列が「第１の」アミノ酸配列として採用され、そして他方のアミノ酸配列が「第２の」アミノ酸配列として採用される。
【００４３】
付加的または二者択一的に、２つ以上の配列が配列間の同一性について評価され得る。２つ以上の核酸またはアミノ酸の配列の文脈において、用語「同一の（ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）」または「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」割合（％）とは、同一である２つ以上の配列またはサブ配列を指す。下記の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用して、またはマニュアルアライメントおよび目視検査により測定されるように、比較ウィンドウまたは指定された領域において最大の対応性が得られるように比較およびアライメントしたときに、所定の領域においてまたは配列全体において、２つの配列が、所定の割合（％）の同一のアミノ酸残基またはヌクレオチド（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、または９９．９％同一）を有する場合、２つの配列は「実質的に同一」である。任意選択で、同一性は、少なくとも長さ約２５、５０、７５、または１００個のアミノ酸である領域において、またはより好ましくは長さ１００〜１５０、２００個もしくはそれを超えるアミノ酸である領域において存在する。
【００４４】
付加的または二者択一的に、２つ以上の配列が、配列間のアライメントについて評価され得る。２つ以上の核酸またはアミノ酸の配列の文脈において、用語「アライメント」、または「アライメント」の割合（％）とは、２つ以上の同一である配列またはサブ配列を指す。下記の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用して、またはマニュアルアライメントおよび目視検査により測定されるように、比較ウィンドウまたは指定された領域において最大の対応性が得られるように比較およびアライメントしたときに、所定の領域においてまたは配列全体において、２つの配列が、所定の割合（％）の同一のアミノ酸残基またはヌクレオチド（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、または９９．９％同一）を有する場合、２つの配列は「実質的にアライメントされ」ている。任意選択で、アライメントは、少なくとも長さ約２５、５０、７５、または１００個のアミノ酸である領域において、またはより好ましくは長さ１００〜１５０、２００個もしくはそれを超えるアミノ酸である領域において存在する。
【００４５】
いくつかの実施形態では、改変されたポリメラーゼは、Φ２９ポリメラーゼ内のＫ１３１、Ｋ１３５、Ｌ１４２、Ｙ１４８、Ｙ２２４、Ｅ２３９、Ｖ２５０、Ｌ２５３、Ｒ３０６、Ｒ３０８、Ｅ３７５、Ａ４３７、Ｅ４６６、Ｄ４７６、Ａ４８４、Ｅ５０８、Ｄ５１０、Ｋ５１２、Ｅ５１５、Ｋ５３９、Ｄ５７０、およびＴ５７１に対応する位置において、１つまたは複数の（例えば、２個以上、５個以上、１０個以上、１５個以上、２０個以上、例えばすべての）アミノ酸突然変異を含む。例えば、いくつかの実施形態では、改変されたポリメラーゼがΦ２９ポリメラーゼの大部分の配列を含む場合、改変されたポリメラーゼは、本願明細書でこれまでにリスト化された位置において１つまたは複数の突然変異を含む。いくつかの実施形態では、改変されたポリメラーゼがΦ２９ポリメラーゼの大部分の配列を含まない場合、改変されたポリメラーゼは、例えば、相同性アライメントまたはその他の当技術分野において公知の方法により決定されるような、上記リスト化された位置に対応する１つまたは複数のアミノ酸を含む。
【００４６】
いくつかの実施形態では、改変されたポリメラーゼは、Φ２９ポリメラーゼ内のＹ１４８、Ｙ２２６、Ｖ２５０、Ｎ２５１、Ｔ３６８、Ｅ３７５、Ｋ３７９、Ｑ３８０、Ａ４３７、Ｐ４７７、Ｋ４７８、およびＡ４８４に対応する１つまたは複数の位置において突然変異を含む。いくつかの実施形態では、本開示の改変されたポリメラーゼは、Ｙ１４８、Ｙ２２６、Ｖ２５０、Ｎ２５１、Ｔ３６８、Ｅ３７５、Ｋ３７９、Ｑ３８０、Ａ４３７、Ｐ４７７、Ｋ４７８、およびＡ４８４のうちの１つまたは複数において突然変異を含む改変されたΦ２９ポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、改変されたポリメラーゼは、Ｙ１４８Ｉ、Ｙ２２６Ｆ、Ｖ２５０Ａ、Ｎ２５１Ｒ、Ｔ３６８Ｆ、Ｅ３７５Ｋ、Ｋ３７９Ｒ、Ｑ３８０Ｒ、Ａ４３７Ｇ、Ｐ４７７Ｄ、Ｋ４７８Ｄ、およびＡ４８４Ｃのうちの１つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、改変されたポリメラーゼは、Ｙ１４８Ｉ、Ｙ２２６Ｆ、Ｖ２５０Ａ、Ｎ２５１Ｒ、Ｔ３６８Ｆ、Ｅ３７５Ｋ、Ｋ３７９Ｒ、Ｑ３８０Ｒ、Ａ４３７Ｇ、Ｐ４７７Ｄ、Ｋ４７８Ｄ、およびＡ４８４Ｓのうちの１つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、改変されたポリメラーゼは、Ｙ１４８Ｉ、Ｙ２２６Ｆ、Ｖ２５０Ａ、Ｎ２５１Ｒ、Ｔ３６８Ｆ、Ｅ３７５Ｋ、Ｋ３７９Ｒ、Ｑ３８０Ｒ、Ａ４３７Ｇ、Ｐ４７７Ｄ、Ｋ４７８Ｄ、およびＡ４８４Ｔのうちの１つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、改変されたポリメラーゼは、Ｙ１４８Ｉ、Ｙ２２６Ｆ、Ｖ２５０Ａ、Ｎ２５１Ｒ、Ｔ３６８Ｆ、Ｅ３７５Ｋ、Ｋ３７９Ｒ、Ｑ３８０Ｒ、Ａ４３７Ｇ、Ｐ４７７Ｄ、Ｋ４７８Ｄ、およびＡ４８４Ｑのうちの１つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、改変されたポリメラーゼは、Ｙ１４８Ｉ、Ｙ２２６Ｆ、Ｖ２５０Ａ、Ｎ２５１Ｒ、Ｔ３６８Ｆ、Ｅ３７５Ｋ、Ｋ３７９Ｒ、Ｑ３８０Ｒ、Ａ４３７Ｇ、Ｐ４７７Ｄ、Ｋ４７８Ｄ、およびＡ４８４Ｎのうちの１つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、改変されたポリメラーゼは、Ｙ１４８Ｉ、Ｙ２２６Ｆ、Ｖ２５０Ａ、Ｎ２５１Ｒ、Ｔ３６８Ｆ、Ｅ３７５Ｋ、Ｋ３７９Ｒ、Ｑ３８０Ｒ、Ａ４３７Ｇ、Ｐ４７７Ｄ、Ｋ４７８Ｄ、およびＡ４８４Ｅのうちの１つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、改変されたポリメラーゼは、Ｙ１４８Ｉ、Ｙ２２６Ｆ、Ｖ２５０Ａ、Ｎ２５１Ｒ、Ｔ３６８Ｆ、Ｅ３７５Ｋ、Ｋ３７９Ｒ、Ｑ３８０Ｒ、Ａ４３７Ｇ、Ｐ４７７Ｄ、Ｋ４７８Ｄ、およびＡ４８４Ｄのうちの１つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、改変されたポリメラーゼは、Ｙ１４８Ｉ、Ｙ２２６Ｆ、Ｖ２５０Ａ、Ｎ２５１Ｒ、Ｔ３６８Ｆ、Ｅ３７５Ｋ、Ｋ３７９Ｒ、Ｑ３８０Ｒ、Ａ４３７Ｇ、Ｐ４７７Ｄ、Ｋ４７８Ｄ、およびＡ４８４Ｋのうちの１つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、改変されたポリメラーゼは、Ｙ１４８Ｉ、Ｙ２２６Ｆ、Ｖ２５０Ａ、Ｎ２５１Ｒ、Ｔ３６８Ｆ、Ｅ３７５Ｋ、Ｋ３７９Ｒ、Ｑ３８０Ｒ、Ａ４３７Ｇ、Ｐ４７７Ｄ、Ｋ４７８Ｄ、およびＡ４８４Ｒのうちの１つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、改変されたポリメラーゼは、Ｙ１４８Ｉ、Ｙ２２６Ｆ、Ｖ２５０Ａ、Ｎ２５１Ｒ、Ｔ３６８Ｆ、Ｅ３７５Ｋ、Ｋ３７９Ｒ、Ｑ３８０Ｒ、Ａ４３７Ｇ、Ｐ４７７��、Ｋ４７８Ｄ、およびＡ４８４Ｈのうちの１つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、改変されたポリメラーゼは、Ｙ１４８Ｉ、Ｙ２２６Ｆ、Ｖ２５０Ａ、Ｎ２５１Ｒ、Ｔ３６８Ｆ、Ｅ３７５Ｋ、Ｋ３７９Ｒ、Ｑ３８０Ｒ、Ａ４３７Ｇ、Ｐ４７７Ｄ、Ｋ４７８Ｄ、およびＡ４８４Ｙのうちの１つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、改変されたポリメラーゼは、Ｙ１４８Ｉ、Ｙ２２６Ｆ、Ｖ２５０Ａ、Ｎ２５１Ｒ、Ｔ３６８Ｆ、Ｅ３７５Ｋ、Ｋ３７９Ｒ、Ｑ３８０Ｒ、Ａ４３７Ｇ、Ｐ４７７Ｄ、Ｋ４７８Ｄ、およびＡ４８４Ｘのうちの１つまたは複数を含み、ただしＸは本願明細書に記載するように非天然アミノ酸に該当する。本願明細書で使用する場合、１つまたは複数とは、２個以上、４個以上、６個以上、８個以上、１０個以上、１２個以上であり得、例えばリスト化されているアミノ酸置換のすべてであり得る。
【００４７】
いくつかの実施形態では、改変されたポリメラーゼは、Φ２９ポリメラーゼ内のＭ８、Ｖ５１、Ｎ６２、Ｉ７１、Ｌ１０７、Ｋ１３１、Ｋ１３５、Ｌ１４２、Ｇ１９７、Ｙ２２４、Ｅ２３９、Ｖ２５０、Ｌ２５３、Ｙ２８１、Ｉ２８８、Ｔ３０１、Ｒ３０６、Ｒ３０８、Ｄ３２５、Ｄ３４１、Ｋ３５４、Ｔ３６８、Ｅ３７５、Ａ４３７、Ａ４４４、Ｅ４６６、Ｄ４７６、Ａ４８４、Ｅ５０８、Ｄ５１０、Ｋ５１２、Ｅ５１５、Ｋ５３９、Ｄ５７０、およびＴ５７１に対応する１つまたは複数の位置において（例えば、１〜３５箇所の位置、または間の任意の整数、例えば、２箇所以上、５箇所以上、１０箇所以上、１５箇所以上、２０箇所以上、例えばすべてにおいて）突然変異を含む。いくつかの実施形態では、改変されたポリメラーゼは、Φ２９ポリメラーゼ内のＭ８、Ｖ５１、Ｎ６２、Ｉ７１、Ｌ１０７、Ｋ１３１、Ｋ１３５、Ｌ１４２、Ｇ１９７、Ｙ２２４、Ｅ２３９、Ｖ２５０、Ｌ２５３、Ｙ２８１、Ｉ２８８、Ｔ３０１、Ｒ３０６、Ｒ３０８、Ｄ３２５、Ｄ３４１、Ｋ３５４、Ｔ３６８、Ｅ３７５、Ａ４３７、Ａ４４４、Ｅ４６６、Ｄ４７６、Ａ４８４、Ｅ５０８、Ｄ５１０、Ｋ５１２、Ｅ５１５、Ｋ５３９、Ｄ５７０、およびＴ５７１のうちの１つまたは複数において突然変異を含む改変されたΦ２９ポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、改変されたポリメラーゼは、下記の突然変異Ｍ８Ｒ、Ｖ５１Ａ、Ｎ６２Ｄ、Ｉ７１Ｖ、Ｌ１０７Ｉ、Ｋ１３１Ｅ、Ｋ１３５Ｑ、Ｌ１４２Ｋ、Ｇ１９７Ｄ、Ｙ２２４Ｋ、Ｅ２３９Ｇ、Ｖ２５０Ａ、Ｖ２５０Ｉ、Ｌ２５３Ａ、Ｌ２５３Ｈ、Ｙ２８１Ｈ、Ｉ２８８Ｌ、Ｔ３０１Ｃ、Ｒ３０６Ｑ、Ｒ３０８Ｌ、Ｄ３２５Ｅ、Ｄ３４１Ｅ、Ｋ３５４Ｒ、Ｔ３６８Ｆ、Ｅ３７５Ｙ、Ａ４３７Ｇ、Ａ４４４Ｔ、Ｅ４６６Ｋ、Ｄ４７６Ｈ、Ａ４８４Ｅ、Ｅ５０８Ｒ、Ｄ５１０Ｋ、Ｄ５１０Ｒ、Ｋ５１２Ｙ、Ｅ５１５Ｑ、Ｋ５３９Ｅ、Ｄ５７０Ｓ、およびＴ５７１Ｖのうちの１つまたは複数（例えば、１〜３５個または間の任意の整数、例えば、２個以上、５個以上、１０個以上、１５個以上、２０個以上、例えばすべて）を含む。
【００４８】
いくつかの実施形態では、改変されたポリメラーゼは、Φ２９ポリメラーゼ内のＫ１３５、Ｌ１４２、Ｙ２２４、Ｅ２３９、Ｖ２５０、Ｌ２５３、Ｅ３７５、Ａ４３７、Ｅ４６６、Ｄ４７６、Ａ４８４、Ｅ５０８、Ｄ５１０、Ｋ５１２、Ｅ５１５、Ｋ５３９、Ｄ５７０、およびＴ５７１に対応する１つまたは複数の位置において（例えば、１〜１８箇所の位置または間の任意の整数、例えば、２箇所以上、５箇所以上、１０箇所以上、１５箇所以上、例えばすべてにおいて）突然変異を含む。いくつかの実施形態では、本開示の改変されたポリメラーゼは、Ｋ１３５、Ｌ１４２、Ｙ２２４、Ｅ２３９、Ｖ２５０、Ｌ２５３、Ｅ３７５、Ａ４３７、Ｅ４６６、Ｄ４７６、Ａ４８４、Ｅ５０８、Ｄ５１０、Ｋ５１２、Ｅ５１５、Ｋ５３９、Ｄ５７０、およびＴ５７１のうちの１つまたは複数において突然変異を含む改変されたΦ２９ポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、改変されたポリメラーゼは、Ｋ１３５Ｑ、Ｌ１４２Ｋ、Ｙ２２４Ｋ、Ｅ２３９Ｇ、Ｖ２５０Ｉ、Ｌ２５３Ａ、Ｅ３７５Ｙ、Ａ４３７Ｇ、Ｅ４６６Ｋ、Ｄ４７６Ｈ、Ａ４８４Ｅ、Ｅ５０８Ｒ、Ｄ５１０Ｒ、Ｋ５１２Ｙ、Ｅ５１５Ｑ、Ｋ５３９Ｅ、Ｄ５７０Ｓ、およびＴ５７１Ｖのうちの１つまたは複数（例えば、１〜１８個または間の任意の整数、例えば、２個以上、５個以上、１０個以上、１５個以上、例えばすべて）を含む。
【００４９】
いくつかの実施形態では、本出願の改変されたポリメラーゼは、ＴＰＲ１領域の置換を含む。例えば、いくつかの実施形態では、改変されたポリメラーゼは、Φ２９ポリメラーゼ（配列番号１）内のＳ２６０〜Ｌ３５９に対応するＴＰＲ１領域の代わりに、Ｅ．フェシウムに由来するＴＰＲ１領域（例えば、配列番号５内のＶ２７１〜Ｍ３７５）を含む。
【００５０】
いくつかの実施形態では、本出願の改変されたポリメラーゼは、エキソヌクレアーゼ領域内に１つまたは複数の置換を含む。例えば、いくつかの実施形態では、改変されたポリメラーゼは、Φ２９ポリメラーゼ（配列番号１）内のＭ１〜Ｖ５４に対応するアミノ酸の代わりに、Ｍ２Ｙに由来するエキソヌクレアーゼ領域の一部分（例えば、配列番号２内のＭ１〜Ｉ５１）を含む。いくつかの実施形態では、改変されたポリメラーゼは、Φ２９ポリメラーゼ（配列番号１）内のＥ７５〜Ｎ９１に対応するアミノ酸の代わりに、Ｅ．フェシウムに由来するエキソヌクレアーゼ領域の一部分（例えば、配列番号５内のＦ７２〜Ｓ８９）を含む。いくつかの実施形態では、改変されたポリメラーゼは、Φ２９ポリメラーゼ内のＭ１〜Ｖ５４およびＥ７５〜Ｎ９１にそれぞれ対応するアミノ酸の代わりに、Ｍ２Ｙに由来するエキソヌクレアーゼ領域の一部分およびＥ．フェシウムに由来するエキソヌクレアーゼ領域の一部分を含む。
【００５１】
いくつかの実施形態では、本出願の改変されたポリメラーゼは、改変されたパーム領域を含む。例えば、いくつかの実施形態では、改変されたポリメラーゼは、Φ２９ポリメラーゼ（配列番号１）内のＭ４２９〜Ｉ４３３に対応するアミノ酸の代わりに、Ｅ．フェシウムに由来するパーム領域の一部分（例えば、配列番号５内のＬ４４５〜Ｖ４４９）を含む。いくつかの実施形態では、改変されたポリメラーゼは、Φ２９ポリメラーゼ内のＡ４４４に対応する位置においてアラニンからチミンへの突然変異（例えば、Ａ４４４Ｔ）を含む。いくつかの実施形態では、改変されたポリメラーゼは、Φ２９ポリメラーゼ内に、Ｅ．フェシウムに由来するパーム領域の一部分、およびＡ４４４Ｔに対応するアミノ酸突然変異を含む。
【００５２】
いくつかの実施形態では、改変されたポリメラーゼは、Φ２９ポリメラーゼ内のＧ１９７、Ｉ７１、およびＬ１０７に対応する１つまたは複数の位置（例えば、１、２、または３箇所）において、突然変異を含む。いくつかの実施形態では、本開示の改変されたポリメラーゼは、Ｇ１９７、Ｉ７１、およびＬ１０７のうちの１つまたは複数（例えば、１、２、または３箇所）において突然変異を含む改変されたΦ２９ポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、改変されたポリメラーゼは、Ｇ１９７Ｄ、１７ＩＶ、およびＬ１０７Ｉのうちの１つまたは複数（例えば、１、２、または３個）を含む。
【００５３】
いくつかの実施形態では、本出願の改変されたポリメラーゼは、ポリメラーゼの１つまたは複数の領域またはセグメント（例えば、ドメインまたはその一部分、任意選択で隣接するアミノ酸を含む）において１つまたは複数のアミノ酸突然変異を含む。いくつかの実施形態では、改変されたポリメラーゼは、エキソヌクレアーゼ領域、パーム領域、ＴＰＲ１領域、フィンガー領域、ＴＰＲ２領域、およびサム領域のうちの１つまたは複数において、１つまたは複数のアミノ酸突然変異を含む。
【００５４】
いくつかの実施形態では、改変されたポリメラーゼは、エキソヌクレアーゼ領域（例えば、エキソヌクレアーゼ領域のエキソヌクレアーゼループ）内の１つまたは複数の位置において突然変異を含む。いくつかの実施形態では、Φ２９ポリメラーゼの大部分の配列を有する改変されたポリメラーゼは、エキソヌクレアーゼ領域内の１つまたは複数の位置において突然変異を含む。例えば、いくつかの実施形態では、本開示の改変されたポリメラーゼは、Φ２９ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ領域内に位置するＥ７５、Ｒ７６、Ｓ８２、Ａ８３、Ｄ８４、Ｇ８５、Ｌ８６、Ｐ８７、Ｎ８８、Ｙ９０、およびＮ９１のうちの１つまたは複数において突然変異を含む改変されたΦ２９ポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、改変されたポリメラーゼは、Φ２９ポリメラーゼ内のＥ７５、Ｒ７６、Ｓ８２、Ａ８３、Ｄ８４、Ｇ８５、Ｌ８６、Ｐ８７、Ｎ８８、Ｙ９０、およびＮ９１に対応する位置において、１つまたは複数のアミノ酸突然変異を含む。したがって、いくつかの実施形態では、改変されたポリメラーゼがΦ２９ポリメラーゼの大部分の配列を含まない場合、改変されたポリメラーゼは、例えば、相同性アライメントまたはその他の当技術分野において公知の方法により決定されるような、上記リスト化された位置に対応する１つまたは複数のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、改変されたポリメラーゼは、Ｅ７５Ｆ、Ｒ７６Ｋ、Ｓ８２Ｃ、Ａ８３Ｋ、Ｄ８４Ｅ、Ｇ８５Ａ、Ｌ８６Ｋ、Ｐ８７Ｅ、Ｎ８８Ｒ、Ｙ９０Ｆ、およびＮ９１Ｓのうちの１つまたは複数を含む。したがって、いくつかの実施形態では、エキソヌクレアーゼドメインまたはその一部分を含むセグメントは、異なるポリメラーゼに由来する対応するエキソヌクレアーゼドメインについて交換されている。例えば、いくつかの実施形態では、１つのポリメラーゼのエキソヌクレアーゼドメインのループおよび隣接するアミノ酸を含むセグメントは、別のポリメラーゼに由来する対応するセグメントで置き換えられている。例えば、いくつかの実施形態では、Φ２９のＥ７５〜Ｎ９１セグメントは、Ｅ．フェシウムに由来する対応するＦ７２〜Ｓ８９セグメントで置き換えられている。いくつかの実施形態では、エキソヌクレアーゼループを含むセグメントを交換すれば、ポリメラーゼのパルス間距離を低下させることができる。
【００５５】
いくつかの実施形態では、改変されたポリメラーゼは、ＴＰＲ１領域内の１つまたは複数の位置において突然変異を含む。例えば、いくつかの実施形態では、改変されたポリメラーゼは、Φ２９ポリメラーゼ内のＹ２８１、Ｉ２８８、Ｔ３０１、Ｄ３２５、Ｄ３４１、およびＫ３５４に対応する１つまたは複数の位置（例えば、１、２、３、４、５、または６箇所）において突然変異を含む。いくつかの実施形態では、本開示の改変されたポリメラーゼは、Ｙ２８１、Ｉ２８８、Ｔ３０１、Ｄ３２５、Ｄ３４１、およびＫ３５４のうちの１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、または６箇所）において突然変異を含む改変されたΦ２９ポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、Ｙ２８１、Ｉ２８８、Ｔ３０１、Ｄ３２５、Ｄ３４１、およびＫ３５４のうちの１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、または６箇所）に位置するアミノ酸は、その他のポリメラーゼ（例えば、Ｍ２Ｙ、ヒツジキンバエ、バチルス株、例えばＧＡ−１）内の対応する位置のアミノ酸に変化している。いくつかの実施形態では、改変されたポリメラーゼは、Ｙ２８１Ｈ、Ｉ２８８Ｌ、Ｔ３０１Ｃ、Ｄ３２５Ｅ、Ｄ３４１Ｅ、およびＫ３５４Ｒのうちの１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、または６個）を含む。いくつかの実施形態では、Φ２９ポリメラーゼ内のＹ２８１、Ｉ２８８、Ｔ３０１、Ｄ３２５、Ｄ３４１、およびＫ３５４に対応する１つまたは複数の位置（例えば、１、２、３、４、５、または６箇所）の突然変異は、組み込み速度が増加している（例えば、単一分子シークエンシング反応において）。
【００５６】
いくつかの実施形態では、改変されたポリメラーゼは、パーム領域内の１つまたは複数の位置において突然変異を含む。例えば、いくつかの実施形態では、改変されたポリメラーゼは、Φ２９ポリメラーゼ内のＭ４２９、Ｇ４３０、Ｖ４３１、Ｉ４３３、およびＡ４４４に対応する１つまたは複数の位置（例えば、１、２、３、４、または５箇所）において突然変異を含む。いくつかの実施形態では、本開示の改変されたポリメラーゼは、Ｍ４２９、Ｇ４３０、Ｖ４３１、Ｉ４３３、およびＡ４４４のうちの１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、または５箇所）において突然変異を含む、改変されたΦ２９ポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、Ｍ４２９、Ｇ４３０、Ｖ４３１、Ｉ４３３、およびＡ４４４のうちの１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、または５箇所）に位置するアミノ酸は、その他のポリメラーゼ（例えば、Ｍ２Ｙ、ヒツジキンバエ、バチルス株、例えばＧＡ−１）内の対応する位置のアミノ酸に変化している。いくつかの実施形態では、改変されたポリメラーゼは、Ｍ４２９Ｌ、Ｇ４３０Ａ、Ｖ４３１Ｓ、Ｉ４３３Ｖ、およびＡ４４４Ｔのうちの１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、または５個）を含む。いくつかの実施形態では、Φ２９ポリメラーゼ内のＭ４２９、Ｇ４３０、Ｖ４３１、Ｉ４３３、およびＡ４４４に対応する１つまたは複数の位置（例えば、１、２、３、４、または５箇所）における突然変異は、正確性が増加している（例えば、単一分子シークエンシング反応において）。
【００５７】
いくつかの実施形態では、改変されたポリメラーゼは、パーム領域内の１つまたは複数の位置において、およびエキソヌクレアーゼ領域内の１つまたは複数の位置において突然変異を含む。例えば、いくつかの実施形態では、改変されたポリメラーゼは、Φ２９ポリメラーゼ内のＧ１９７、Ｍ８、およびＶ５１に対応する１つまたは複数の位置（例えば、１、２、または３箇所）において突然変異を含む。いくつかの実施形態では、本開示の改変されたポリメラーゼは、Ｇ１９７、Ｍ８、およびＶ５１のうちの１つまたは複数（例えば、１、２、または３箇所）において突然変異を含む改変されたΦ２９ポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、改変されたポリメラーゼは、Ｇ１９７Ｄ、Ｍ８Ｒ、およびＶ５１Ａのうちの１つまたは複数（例えば、１、２、または３個）を含む。いくつかの実施形態では、Φ２９ポリメラーゼ内のＧ１９７、Ｍ８、およびＶ５１に対応する１つまたは複数の位置（例えば、１、２、または３箇所）における突然変異は、生産収率、熱安定性を改善し、および／またはローディング（例えば、アレイの試料ウェル中へのローディング）の効率を改善することができる。
【００５８】
いくつかの実施形態では、改変されたポリメラーゼは、パーム領域内の１つまたは複数の位置において、およびサム領域内の１つまたは複数の位置において突然変異を含む。例えば、いくつかの実施形態では、改変されたポリメラーゼは、Φ２９ポリメラーゼ内のＥ４６６、Ｄ４７６、Ｋ５３９、Ｄ５７０、およびＴ５７１に対応する１つまたは複数の位置（例えば、１、２、３、４、または５箇所）において突然変異を含む。いくつかの実施形態では、本開示の改変されたポリメラーゼは、Ｅ４６６、Ｄ４７６、Ｋ５３９、Ｄ５７０、およびＴ５７１のうちの１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、または５箇所）において突然変異を含む改変されたΦ２９ポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、改変されたポリメラーゼは、Ｅ４６６Ｋ、Ｄ４７６Ｈ、Ｋ５３９Ｅ、Ｄ５７０Ｓ、およびＴ５７１Ｖのうちの１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、または５個）を含む。
【００５９】
いくつかの実施形態では、改変されたポリメラーゼは、Ｍ２Ｙポリメラーゼ内のＮ５９、Ｙ１４５、Ｖ２４７、Ｌ２５０、Ｅ３７２、Ａ４８１、およびＫ５０９に対応する位置において、１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、または７個）のアミノ酸突然変異を含む。例えば、いくつかの実施形態では、改変されたポリメラーゼがＭ２Ｙポリメラーゼの大部分の配列を含む場合、改変されたポリメラーゼは、本願明細書でこれまでにリスト化された位置において１つまたは複数の突然変異を含む。いくつかの実施形態では、改変されたポリメラーゼがＭ２Ｙポリメラーゼの大部分の配列を含まない場合、改変されたポリメラーゼは、例えば、相同性アライメントまたはその他の当技術分野において公知の方法により決定されるような、上記リスト化した位置に対応する１つまたは複数のアミノ酸突然変異を含む。
【００６０】
いくつかの実施形態では、改変されたポリメラーゼは、野生型ポリメラーゼ（例えば、表１に規定するような）の１つまたは複数のセグメント（例えば、ドメインまたはその一部分、任意選択で隣接するアミノ酸を含む）を含む。いくつかの実施形態では、エンテロコッカス・フェシウムポリメラーゼの１つまたは複数のセグメント（例えば、ドメインまたはその一部分、任意選択で隣接するアミノ酸を含む）（例えば、配列番号５の１つまたは複数のセグメント）は、配列番号１〜４および６〜１９のいずれかの１つまたは複数のセグメントと置換可能である。いくつかの実施形態では、エンテロコッカス・フェシウムポリメラーゼの１つまたは複数のセグメント（例えば、ドメインまたはその一部分、任意選択で隣接するアミノ酸を含む）は、Φ２９ポリメラーゼの１つまたは複数のセグメントと置換可能である。いくつかの実施形態では、エンテロコッカス・フェシウムポリメラーゼの１つまたは複数のセグメント（例えば、ドメインまたはその一部分、任意選択で隣接するアミノ酸を含む）は、Ｍ２Ｙポリメラーゼの１つまたは複数のセグメントと置換可能である。いくつかの実施形態では、エンテロコッカス・フェシウムポリメラーゼの１つまたは複数のセグメント（例えば、ドメインまたはその一部分、任意選択で隣接するアミノ酸を含む）は、Φ２９ポリメラーゼおよび／またはＭ２Ｙポリメラーゼの１つまたは複数のセグメントと置換可能である。いくつかの実施形態では、エンテロコッカス・フェシウムポリメラーゼの１つまたは複数のセグメント（例えば、ドメインまたはその一部分、任意選択で隣接するアミノ酸を含む）（例えば、配列番号５のドメイン、または例えば１つもしくは複数のアミノ酸置換を含有するその改変された形態）は、本願明細書に記載するバリアントポリメラーゼの（例えば、表２にリスト化するバリアントポリメラーゼ、または表２で示すまたは表３〜５に記載する１つもしくは複数のアミノ酸置換もしくはその他のドメイン置換を含有するバリアントポリメラーゼの）１つまたは複数のセグメントと置換可能である。
【００６１】
いくつかの実施形態では、改変されたポリメラーゼの大部分の配列は、例として上記リスト化するポリメラーゼ内の位置に対応する１つまたは複数の相同的アミノ酸を含まない。そのような事例では、いくつかの実施形態では、改変されたポリメラーゼは、１つまたは複数の突然変異を含まない。しかし、いくつかの実施形態では、望ましいアミノ酸配列を本願明細書に記載するポリメラーゼ配列と比較したときに、周辺の相同的残基が識別可能である場合、突然変異したアミノ酸は、周辺の相同的残基に基づき推測されるポリメラーゼ内の部位における挿入として、改変されたポリメラーゼ中に含まれる。突然変異したポリメラーゼバリアントを本願明細書に記載する実施形態に基づき工学的に作出したが、これを表２にリスト化する（配列番号２０〜９６）。
【００６２】
【表２−１】
2020501573.tif 000008
【００６３】
【表２−２】
2020501573.tif 000009
【００６４】
【表２−３】
2020501573.tif 000010
【００６５】
【表２−４】
2020501573.tif 000011
【００６６】
【表２−５】
2020501573.tif 000012
【００６７】
【表２−６】
2020501573.tif 000013
【００６８】
【表２−７】
2020501573.tif 000014
【００６９】
【表２−８】
2020501573.tif 000015
【００７０】
【表２−９】
2020501573.tif 000016
【００７１】
【表２−１０】
2020501573.tif 000017
【００７２】
【表２−１１】
2020501573.tif 000018
【００７３】
【表２−１２】
2020501573.tif 000019
【００７４】
【表２−１３】
2020501573.tif 000020
【００７５】
【表２−１４】
2020501573.tif 000021
【００７６】
【表２−１５】
2020501573.tif 000022
【００７７】
いくつかの実施形態では、アミノ酸は、ポリメラーゼの構造および／または機能に基づき改変するために選択される。例えば、図２は、Φ２９ポリメラーゼ２００のカートーンイラストレーションを描いている。折りたたまれた三次元構造は、オーバーレイ２０２に対応する別個のドメインおよびサブドメイン：Ｎ末端エキソヌクレアーゼドメイン（１）およびパームサブドメインを含有するＣ末端ポリメラーゼドメイン（２）、末端タンパク質領域１サブドメイン（ＴＰＲ１）（３）、フィンガーサブドメイン（４）、ＴＰＲ２サブドメイン（５）、およびサムサブドメイン（６）を含む。これらのドメインおよびサブドメインは、Ｎ末端からＣ末端の向きでポリペプチドコンストラクト２０４に基づくポリペプチド鎖のエリアに対してマッピングする。示す通り、野生型Φ２９ポリメラーゼのＮ末端エキソヌクレアーゼドメイン（１）は、残基１〜１８９にわたり延在し、またＣ末端ポリメラーゼドメインは、残基１９０〜５７５にわたり延在する。野生型Φ２９ポリメラーゼのＣ末端ポリメラーゼドメイン内で、パームサブドメイン（２）は残基１９０〜２６０および４２７〜５３０にわたり延在し、ＴＰＲ１サブドメイン（３）は残基２６１〜３５８にわたり延在し、フィンガーサブドメイン（４）は残基３５９〜３９４にわたり延在し、ＴＰＲ２サブドメイン（５）は残基３９５〜４２６にわたり延在し、サムサブドメイン（６）は残基５３１〜５７５にわたり延在する。本出願に記載する異なるポリメラーゼの等価なセグメント（例えば、ドメインまたはその一部分、任意選択で隣接するアミノ酸を含む）は、相互に置換してキメラポリメラーゼを生成することができる。例えば、１つのポリメラーゼ（例えば、表１に示す野生型配列を有する、または表２に例示する、もしくは表３〜５に記載する１つもしくは複数の突然変異を有する）に由来するエキソヌクレアーゼドメイン、パームサブドメイン、ＴＰＲ１サブドメイン、１つまたは複数のフィンガーサブドメイン、ＴＰＲ２サブドメイン、および／またはサムサブドメインのうちの１つまたは複数は、別のポリメラーゼ（例えば、表１に示す野生型配列を有する、または表２に例示する、もしくは表３〜５に記載する１つまたは複数の突然変異を有する）内の対応するドメインと置換可能である。いくつかの実施形態では、これらのドメインのうちの１つまたは複数の一部分を含み、任意選択で１つまたは複数の隣接するアミノ酸を含むセグメントが置換可能である。
【００７８】
いくつかの実施形態では、改変されたポリメラーゼは、大部分のポリメラーゼ配列としてΦ２９ポリメラーゼ以外の配列を含む。そのような実施形態では、大部分のポリメラーゼ配列は、Φ２９ポリメラーゼ２００と対比して類推され得る（例えば、相同性アライメント、計算論的モデリング、構造解析、または任意の適する方法に基づき）１つまたは複数の領域を含む。本願明細書で使用する場合、ポリメラーゼの「領域」とは、ポリメラーゼ酵素の別個のドメインまたはサブドメインを指す。例えば、いくつかの実施形態では、ポリメラーゼの領域とは、Ｎ末端エキソヌクレアーゼドメインまたはＣ末端ポリメラーゼドメインを指す。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼの領域とは、パームサブドメイン、ＴＰＲ１サブドメイン、フィンガーサブドメイン、ＴＰＲ２サブドメイン、またはサムサブドメインを指す。したがって、いくつかの実施形態では、ポリメラーゼの領域とは、所与のドメインまたはサブドメインを含むすべてのアミノ酸を指す。いくつかの実施形態では、改変されたポリメラーゼは、大部分のポリメラーゼ配列の１つまたは複数の領域に対する改変を含む。いくつかの実施形態では、改変されたポリメラーゼは、大部分のポリメラーゼ配列の１つまたは複数の一部分に対する改変を含む。本願明細書で使用する場合、「ポリメラーゼの一部分」とは、ポリメラーゼ配列内の２つ以上の連続した残基のストレッチを指す。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼ配列の一部分とは、単一のポリメラーゼドメインまたは単一のポリメラーゼサブドメイン内の２つ以上の連続したアミノ酸を指す。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼ配列の一部分とは、１つを上回るポリメラーゼドメインおよび／またはサブドメインにわたり延在する２つ以上の連続したアミノ酸を指す。したがって、いくつかの実施形態では、ポリメラーゼ配列の一部分は、ポリメラーゼ配列内の連続したアミノ酸の任意のストレッチである。いくつかの実施形態では、一部分とは、例えば、ポリメラーゼ領域またはドメインの一部分を構成する５〜１０個の連続したアミノ酸、１０〜２５個の連続したアミノ酸、２５〜５０個の連続したアミノ酸、５０〜７５個の連続したアミノ酸、７５〜１００個の連続したアミノ酸、またはその他の数の連続したアミノ酸を指す。
【００７９】
いくつかの実施形態では、改変されたポリメラーゼは、図２に一般的に描かれているドメインおよび／またはサブドメインのうちの１つまたは複数において１つまたは複数の単点突然変異を含む。例えば、図３は、表２の選択された突然変異バリアントを、各ポリペプチド鎖内の突然変異の部位（矢印でおよその位置を示す）と共に描いている。ポリペプチド鎖は、Ｍ２ＹおよびＭ２Ｙ突然変異バリアントＨＯ１６（無地）、ヒツジキンバエおよびヒツジキンバエ突然変異バリアントＨ０１８（点描）、エンテロコッカス・フェシウムおよびエンテロコッカス・フェシウム突然変異バリアントＨ０２０（破線）、ならびにバチルスファージＶＭＹ２２およびバチルスファージＶＭＹ２２突然変異バリアントＨ０２２（斜線）について示される。ただし、本願明細書に記載するようなその他のセグメント交換および／またはアミノ酸突然変異を含むキメラも使用可能である。
【００８０】
いくつかの実施形態では、本願明細書に記載する１つまたは複数の単点（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｉｔｅ）突然変異の改変に付加して、またはそれに替えて、大部分のポリメラーゼ配列内のアミノ酸（例えば、２つ以上の連続したアミノ酸）のストレッチが改変される。いくつかの実施形態では、アミノ酸のストレッチは、異なるポリメラーゼ配列の一部分に対応するアミノ酸のストレッチである。例えば、いくつかの実施形態では、大部分ポリメラーゼ配列のドメイン／サブドメイン（またはその中の一部分）は、異なるポリメラーゼ配列の対応するドメイン／サブドメイン（またはその中の一部分）と交換される。そのような実施形態では、ポリメラーゼは、キメラポリメラーゼ、キメラポリメラーゼバリアント、またはキメラと呼ばれる。キメラポリメラーゼを、本願明細書に記載する実施形態に基づき工学的に作出したが、それを表３にリスト化する（配列番号９７〜５１６）。
【００８１】
【表３−１】
2020501573.tif 000023
【００８２】
【表３−２】
2020501573.tif 000024
【００８３】
【表３−３】
2020501573.tif 000025
【００８４】
【表３−４】
2020501573.tif 000026
【００８５】
【表３−５】
2020501573.tif 000027
【００８６】
【表３−６】
2020501573.tif 000028
【００８７】
【表３−７】
2020501573.tif 000029
【００８８】
【表３−８】
2020501573.tif 000030
【００８９】
【表３−９】
2020501573.tif 000031
【００９０】
【表３−１０】
2020501573.tif 000032
【００９１】
【表３−１１】
2020501573.tif 000033
【００９２】
【表３−１２】
2020501573.tif 000034
【００９３】
【表３−１３】
2020501573.tif 000035
【００９４】
【表３−１４】
2020501573.tif 000036
【００９５】
【表３−１５】
2020501573.tif 000037
【００９６】
【表３−１６】
2020501573.tif 000038
【００９７】
【表３−１７】
2020501573.tif 000039
【００９８】
【表３−１８】
2020501573.tif 000040
【００９９】
【表３−１９】
2020501573.tif 000041
【０１００】
【表３−２０】
2020501573.tif 000042
【０１０１】
【表３−２１】
2020501573.tif 000043
【０１０２】
【表３−２２】
2020501573.tif 000044
【０１０３】
【表３−２３】
2020501573.tif 000045
【０１０４】
【表３−２４】
2020501573.tif 000046
【０１０５】
【表３−２５】
2020501573.tif 000047
【０１０６】
【表３−２６】
2020501573.tif 000048
【０１０７】
【表３−２７】
2020501573.tif 000049
【０１０８】
【表３−２８】
2020501573.tif 000050
【０１０９】
【表３−２９】
2020501573.tif 000051
【０１１０】
【表３−３０】
2020501573.tif 000052
【０１１１】
【表３−３１】
2020501573.tif 000053
【０１１２】
【表３−３２】
2020501573.tif 000054
【０１１３】
【表３−３３】
2020501573.tif 000055
【０１１４】
【表３−３４】
2020501573.tif 000056
【０１１５】
【表３−３５】
2020501573.tif 000057
【０１１６】
【表３−３６】
2020501573.tif 000058
【０１１７】
【表３−３７】
2020501573.tif 000059
【０１１８】
【表３−３８】
2020501573.tif 000060
【０１１９】
【表３−３９】
2020501573.tif 000061
【０１２０】
【表３−４０】
2020501573.tif 000062
【０１２１】
【表３−４１】
2020501573.tif 000063
【０１２２】
【表３−４２】
2020501573.tif 000064
【０１２３】
【表３−４３】
2020501573.tif 000065
【０１２４】
【表３−４４】
2020501573.tif 000066
【０１２５】
【表３−４５】
2020501573.tif 000067
【０１２６】
【表３−４６】
2020501573.tif 000068
【０１２７】
【表３−４７】
2020501573.tif 000069
【０１２８】
【表３−４８】
2020501573.tif 000070
【０１２９】
【表３−４９】
2020501573.tif 000071
【０１３０】
【表３−５０】
2020501573.tif 000072
【０１３１】
【表３−５１】
2020501573.tif 000073
【０１３２】
【表３−５２】
2020501573.tif 000074
【０１３３】
【表３−５３】
2020501573.tif 000075
【０１３４】
【表３−５４】
2020501573.tif 000076
【０１３５】
【表３−５５】
2020501573.tif 000077
【０１３６】
【表３−５６】
2020501573.tif 000078
【０１３７】
【表３−５７】
2020501573.tif 000079
【０１３８】
【表３−５８】
2020501573.tif 000080
【０１３９】
【表３−５９】
2020501573.tif 000081
【０１４０】
【表３−６０】
2020501573.tif 000082
【０１４１】
【表３−６１】
2020501573.tif 000083
【０１４２】
【表３−６２】
2020501573.tif 000084
【０１４３】
【表３−６３】
2020501573.tif 000085
【０１４４】
【表３−６４】
2020501573.tif 000086
【０１４５】
【表３−６５】
2020501573.tif 000087
【０１４６】
【表３−６６】
2020501573.tif 000088
【０１４７】
【表３−６７】
2020501573.tif 000089
【０１４８】
【表３−６８】
2020501573.tif 000090
【０１４９】
【表３−６９】
2020501573.tif 000091
【０１５０】
【表３−７０】
2020501573.tif 000092
【０１５１】
【表３−７１】
2020501573.tif 000093
【０１５２】
【表３−７２】
2020501573.tif 000094
【０１５３】
【表３−７３】
2020501573.tif 000095
【０１５４】
【表３−７４】
2020501573.tif 000096
【０１５５】
【表３−７５】
2020501573.tif 000097
【０１５６】
【表３−７６】
2020501573.tif 000098
【０１５７】
【表３−７７】
2020501573.tif 000099
【０１５８】
【表３−７８】
2020501573.tif 000100
【０１５９】
【表３−７９】
2020501573.tif 000101
【０１６０】
【表３−８０】
2020501573.tif 000102
【０１６１】
【表３−８１】
2020501573.tif 000103
【０１６２】
いくつかの実施形態では、本開示の改変された組換えポリメラーゼ酵素は表３から選択される。いくつかの実施形態では、キメラポリメラーゼバリアント（例えば、表３にリスト化するような）は、大部分のポリメラーゼ配列であって、その領域または一部分が異なるポリメラーゼ配列の対応する領域または一部分と置換されている大部分のポリメラーゼ配列を含む。いくつかの実施形態では、大部分のポリメラーゼ配列内の領域（例えば、ドメインおよび／またはサブドメイン）を含む残基のすべてが、異なるポリメラーゼ配列内の対応する領域を含む残基のすべてと置換される。いくつかの実施形態では、大部分のポリメラーゼ配列内の領域を含む残基の少なくとも一部分が、異なるポリメラーゼ配列内の対応する領域を含む残基の少なくとも一部分と置換される。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、大部分の配列内の単一のサブドメインのみが、異なる配列の対応するサブドメインと置換される。例えば、図４は、表３から選択されるキメラポリメラーゼバリアントを描いている。６つの選択されたバリアントが、ポリペプチド内でアミノ末端からカルボキシ末端の方向で一般的に生ずるように、いくつかのサブドメインを含むポリペプチド鎖として示されている。図４のポリペプチド鎖のそれぞれは、Ｍ２Ｙポリメラーゼ（配列番号２、無地）の１つまたは複数の対応するドメインおよび／またはサブドメイン、あるいはヒツジキンバエの１つまたは複数の対応するドメインおよび／またはサブドメイン（配列番号３、点描）と置換した１つまたは複数のドメインおよび／またはサブドメイン、ならびに／あるいは１つまたは複数の隣接するアミノ酸と共に、Ｑ００１のポリメラーゼの大部分の配列（黒地に白点）を含む。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、キメラポリメラーゼバリアントは、異なるポリメラーゼ配列から置換したエキソヌクレアーゼドメインを有する大部分のポリメラーゼ配列を含む。図４に示すように、Ｃ０１７は、Ｍ２Ｙポリメラーゼ配列（例えば、配列番号２に規定する）から置換したエキソヌクレアーゼドメインを含むキメラポリメラーゼバリアントである。同様に、Ｃ０２０は、ヒツジキンバエポリメラーゼ配列（例えば、配列番号３に規定するような）から置換したエキソヌクレアーゼドメインを含む。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼのプルーフリーディング能力が望ましくない（例えば、シークエンシング反応において）場合、改変されたポリメラーゼバリアント内のエキソヌクレアーゼドメインの改変または入れ替えが有用であり得る。しかし、付加的および代替的なドメインおよび／またはサブドメインの置換は、本開示の改変された組換えポリメラーゼについて検討されるものと認められるべきである。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、キメラポリメラーゼバリアントは、異なるポリメラーゼ配列から置換されたエキソヌクレアーゼループを有する大部分のポリメラーゼ配列を含む。本願明細書で使用する場合、いくつかの実施形態では、「エキソヌクレアーゼループ」とは、エキソヌクレアーゼドメイン内でループ領域を形成する連続したアミノ酸のストレッチを指す。例えば、図５Ａは、全体透視図５００およびズームした透視図５０２においてΦ２９ポリメラーゼのカートーンイラストレーションを描いている。ズームした透視図５０２は全体透視図５００内に示す四角で囲んだエリアのクローズアップビューであり、Φ２９ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼドメイン内のループ領域を示す。選択されたループ残基を、残基Ｎ７７からＮ８８にわたり延在するエキソヌクレアーゼループを形成する連続したアミノ酸のストレッチと共に、ズームした透視図５０２において棒状で示す。エキソヌクレアーゼドメインのこの領域の進化的保存分析から、ループおよびいくつかの隣接する残基の保存が比較的不十分であることが判明した。図５Ｂは、Φ２９ポリメラーゼおよび表１から選択される非限定的な一連のその他のポリメラーゼにおいて、それらのエキソヌクレアーゼ領域間の相同性アライメント５０４を描いている。Φ２９ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼループＮ７７〜Ｎ８８およびその他のポリメラーゼ内の対応するエキソヌクレアーゼループについて示すループ相同性アライメント５０６も描いている。
【０１６６】
Φ２９ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼループＮ７７〜Ｎ８８に対応する領域内では保存性が比較的低いことを示す相同性分析に基づき、ポリメラーゼバリアントの望ましい生化学性質（例えば、シークエンシング反応での使用にとって望ましい）について調査する際の変動要因が提供された。したがって、いくつかの実施形態では、キメラポリメラーゼバリアントは、異なるポリメラーゼ配列から置換したエキソヌクレアーゼループを有する大部分のポリメラーゼ配列を含み、その場合、「エキソヌクレアーゼループ」は、Φ２９ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼループＮ７７〜Ｎ８８と相同である（例えば、図５Ｂ内のループ相同性アライメント４０６により示す通り）。
【０１６７】
図５Ｂ内のアライメントの例により示す通り、配列相同性分析は、Φ２９ポリメラーゼのＮ７７〜Ｎ８８と相同であるエキソヌクレアーゼループ配列を識別するのに使用可能である。例としておよび非限定的に、ループ相同性アライメント５０６は、Ｍ２Ｙ（Ｈ７４〜Ｎ８５）、ヒツジキンバエ（Ｎ６４〜Ｇ７６）、Ｅ．フェシウム（Ｎ７４〜Ｒ８６）、バチルスＧＡ−１（Ｎ７４〜Ｋ８８）、バチルスＶＭＹ２２（Ｋ８０〜Ｋ９１）、放線菌ＡＶ−１（Ｈ９３〜Ｋ１０５）、ジャガイモシストセンチュウ（Ｐｏｔａｔｏ  ｃｙｓｔ  ｎｅｍａｔｏｄｅ）（Ｌ８６〜Ｋ９９）、イベリアン・リンクスの腸（Ｄ７３〜Ｒ８７）、カンジダツス（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ）（Ｎ８５〜Ｎ９８）、エゲルテラ属（Ｖ７３〜Ｋ８８）に関する相同的エキソヌクレアーゼループ配列を示す。したがって、いくつかの実施形態では、置換されたエキソヌクレアーゼループは、Φ２９ポリメラーゼのＮ７７〜Ｎ８８に対して相同性の領域内に約１２〜約１６個の間のアミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態では、置換されたエキソヌクレアーゼループは、Φ２９ポリメラーゼのＮ７７〜Ｎ８８に対して相同性の領域内に約１０個から最大２０個の間のアミノ酸、約５個から最大１５個の間のアミノ酸、約５個から最大２０個の間のアミノ酸、または約５個から２５個以上の間のアミノ酸を含む。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、本出願の改変されたポリメラーゼは、Φ２９ポリメラーゼのＮ７７〜Ｎ８８に対して相同性のエキソヌクレアーゼループを含むエキソヌクレアーゼドメインの領域内に１つまたは複数のアミノ酸突然変異を含む。例えば、いくつかの実施形態では、本開示の改変されたポリメラーゼは、Φ２９ポリメラーゼ内のＥ７５、Ｒ７６、Ｓ８２、Ａ８３、Ｄ８４、Ｇ８５、Ｌ８６、Ｐ８７、Ｎ８８、Ｙ９０、およびＮ９１のうちの１つまたは複数において突然変異を含む改変されたΦ２９ポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、改変されたポリメラーゼは、Ｅ７５Ｆ、Ｒ７６Ｋ、Ｓ８２Ｃ、Ａ８３Ｋ、Ｄ８４Ｅ、Ｇ８５Ａ、Ｌ８６Ｋ、Ｐ８７Ｅ、Ｎ８８Ｒ、Ｙ９０Ｆ、およびＮ９１Ｓのうちの１つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、改変されたポリメラーゼは、Φ２９ポリメラーゼ内のＥ７５、Ｒ７６、Ｓ８２、Ａ８３、Ｄ８４、Ｇ８５、Ｌ８６、Ｐ８７、Ｎ８８、Ｙ９０、およびＮ９１に対応する位置において１つまたは複数のアミノ酸突然変異を含む。例えば、いくつかの実施形態では、改変されたポリメラーゼがΦ２９ポリメラーゼの大部分の配列を含まない場合、改変されたポリメラーゼは、例えば、相同性アライメントまたはその他の当技術分野において公知の方法により決定されるような、上記リスト化した位置に対応する１つまたは複数のアミノ酸を含む。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、キメラポリメラーゼバリアントは、異なるポリメラーゼ配列から置換したＴＰＲ１サブドメインを有する大部分のポリメラーゼ配列を含む。例えば、Ｃ０１８は、Ｍ２Ｙポリメラーゼ配列から置換したＴＰＲ１サブドメインを含むキメラポリメラーゼである。同様に、Ｃ０２１は、ヒツジキンバエポリメラーゼから置換したＴＰＲ１サブドメインを含む。いくつかの実施形態では、キメラポリメラーゼバリアントは、異なるポリメラーゼ配列から置換したパームサブドメインを有する大部分のポリメラーゼ配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラポリメラーゼバリアントは、異なるポリメラーゼ配列から置換したフィンガーサブドメインを有する大部分のポリメラーゼ配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラポリメラーゼバリアントは、異なるポリメラーゼ配列から置換したＴＰＲ２サブドメインを有する大部分のポリメラーゼ配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラポリメラーゼバリアントは、異なるポリメラーゼ配列から置換したサムサブドメインを有する大部分のポリメラーゼ配列を含む。本願明細書に記載するように、改変された組換えポリメラーゼは、２つ以上のドメインおよび／またはサブドメインの置換を含むキメラポリメラーゼバリアントを含む。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、大部分の配列内の２つの領域（例えば、ドメイン／サブドメイン）は、異なる配列の２つの対応する領域（例えば、対応するドメイン／サブドメイン）と置換している。例えば、図４に示すように、Ｃ０１９は、Ｍ２Ｙポリメラーゼ配列の対応するエキソヌクレアーゼドメインおよびＴＰＲ１サブドメインと置換したエキソヌクレアーゼドメインおよびＴＰＲ１サブドメインを含むキメラポリメラーゼである。同様に、Ｃ０２２は、ヒツジキンバエポリメラーゼの対応するエキソヌクレアーゼドメインおよびＴＰＲ１サブドメインと置換したエキソヌクレアーゼドメインおよびＴＰＲ１サブドメインを含む。いくつかの実施形態では、本願明細書に記載する改変されたポリメラーゼとの追加のドメインおよび／またはサブドメインの置換について検討される。例えば、いくつかの実施形態では、大部分の配列内の２個を超える（例えば、３、４、５、または６個の）領域（例えば、ドメイン／サブドメイン）が、異なる配列の２個を超える（例えば、３、４、５、または６個の）対応する領域と置換している。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、キメラポリメラーゼバリアントの大部分のポリメラーゼ配列が、表１〜３内の配列から選択される。いくつかの実施形態では、大部分のポリメラーゼ配列は、表１〜３から選択される異なるポリメラーゼ配列から置換した１つまたは複数の領域および／または一部分を含む。例えば、表４は、表３に由来する選択されたキメラポリメラーゼバリアントの概要を提供し、そして大部分のポリメラーゼ配列を、そのそれぞれについて置換した領域（複数可）／一部分（複数可）の説明および置換の根拠となる配列と共にリスト化する。
【０１７２】
【表４−１】
2020501573.tif 000104
【０１７３】
【表４−２】
2020501573.tif 000105
【０１７４】
【表４−３】
2020501573.tif 000106
【０１７５】
【表４−４】
2020501573.tif 000107
【０１７６】
しかし、例えば本願明細書のいくつかの表のうちの１つまたは複数に記載および例示するようなその他のキメラも使用可能であり、および／またはさらに改変可能である。
いくつかの実施形態では、キメラポリメラーゼバリアントは、１つまたは複数の部位特異的突然変異をさらに含み得る。したがって、いくつかの実施形態では、本願明細書に記載する１つまたは複数の突然変異のいずれか（例えば、表２内の各配列に含まれる１つまたは複数の突然変異のいずれか）は、本開示において検討されるキメラポリメラーゼのいずれかに適用され得る（例えば、上に記載および表３にリスト化するように）。図６は、１つまたは複数の突然変異を含むキメラポリメラーゼバリアントを一般的に描いている。例えば、突然変異体キメラポリメラーゼ６０２は、置換したＭ２Ｙエキソヌクレアーゼドメインおよび置換したドメイン内の突然変異を有するΦ２９ポリメラーゼの大部分の配列を含む。いくつかの実施形態では、突然変異体キメラポリメラーゼは、２つ以上の異なるポリメラーゼ配列に対応する領域と置換した２つ以上の領域を有する大部分の配列を含む。例えば、突然変異体キメラポリメラーゼ６０４は、置換したエンテロコッカス・フェシウムポリメラーゼのＴＰＲ１サブドメインおよび置換したＭ２ＹポリメラーゼのＴＰＲ２サブドメインを有するΦ２９ポリメラーゼの大部分の配列を含み、ポリメラーゼ配列内の様々な位置において部位特異的突然変異が生じている。いくつかの実施形態では、突然変異体キメラポリメラーゼは、異なるポリメラーゼに対応する領域と置換した２つ以上の領域を有する大部分の配列を含む。例えば、突然変異体キメラポリメラーゼ６０６は、置換したエンテロコッカス・フェシウムポリメラーゼのＴＰＲ１、ＴＰＲ２、およびサムサブドメインを有するΦ２９ポリメラーゼの大部分の配列を含み、ポリメラーゼ配列内の様々な位置において部位特異的突然変異が生じている。
【０１７７】
表５は、表３に由来する選択されたキメラポリメラーゼバリアントの概要を提供し、同表は、大部分のポリメラーゼ配列を、そのそれぞれについて特定のバリアントに対して設けられたアミノ酸突然変異の説明と共に提供する。
【０１７８】
【表５】
2020501573.tif 000108
【０１７９】
しかし、その他のアミノ酸突然変異も本願明細書に記載する１つまたは複数のキメラのポリメラーゼに組込み可能である。例えば、１つまたは複数のアミノ酸変化は、Φ２９ポリメラーゼ配列を参照しながら、位置Ｍ８、Ｖ５１、Ｎ６２、Ｉ７１、Ｌ１０７、および／もしくはＫ１３１のうちの１つもしくは複数、ならびに／または位置Ｋ１３５、Ｌ１４２、Ｇ１９７、Ｙ２２４、Ｅ２３９、Ｖ２５０、Ｌ２５３、Ｙ２８１、Ｉ２８８、Ｔ３０１、Ｒ３０６、Ｒ３０８、Ｄ３２５、Ｄ３４１、Ｋ３５４、Ｔ３６８、Ｅ３７５、Ａ４３７、Ａ４４４、Ｅ４６６、Ｄ４７６、Ａ４８４、Ｅ５０８、Ｄ５１０、Ｋ５１２、Ｅ５１５、Ｋ５３９、Ｄ５７０、およびＴ５７１のうちの１つもしくは複数において組み込み可能である。例えば、いくつかの実施形態では、キメラポリメラーゼもまた、下記のアミノ酸置換：Ｍ８Ｒ、Ｖ５１Ａ、Ｎ６２Ｄ、Ｉ７１Ｖ、Ｌ１０７Ｉ、および／もしくはＫ１３１Ｅのうちの１つもしくは複数、ならびに／または下記のアミノ酸置換：Ｋ１３５Ｑ、Ｌ１４２Ｋ、Ｇ１９７Ｄ、Ｙ２２４Ｋ、Ｅ２３９Ｇ、Ｖ２５０Ａ、Ｖ２５０Ｉ、Ｌ２５３Ａ、Ｌ２５３Ｈ、Ｙ２８１Ｈ、Ｉ２８８Ｌ、Ｔ３０１Ｃ、Ｒ３０６Ｑ、Ｒ３０８Ｌ、Ｄ３２５Ｅ、Ｄ３４１Ｅ、Ｋ３５４Ｒ、Ｔ３６８Ｆ、Ｅ３７５Ｙ、Ａ４３７Ｇ、Ａ４４４Ｔ、Ｅ４６６Ｋ、Ｄ４７６Ｈ、Ａ４８４Ｅ、Ｅ５０８Ｒ、Ｄ５１０Ｋ、Ｄ５１０Ｒ、Ｋ５１２Ｙ、Ｅ５１５Ｑ、Ｋ５３９Ｅ、Ｄ５７０Ｓ、および／もしくはＴ５７１Ｖのうちの１つもしくは複数を含み得る。
【０１８０】
用語「ポリメラーゼ」および「重合酵素」は、本願明細書で使用する場合、重合反応を触媒する能力を有する任意の酵素を一般的に指す。ポリメラーゼの例として、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、耐熱性ポリメラーゼ、野生型ポリメラーゼ、改変されたポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼ、φ２９（ファイ２９）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｔｌｉポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、Ｐｗｏポリメラーゼ、ＶＥＮＴ（登録商標）ポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ  ＶＥＮＴ（商標）ポリメラーゼ、Ｅｘ  ＴＡＱ（商標）ポリメラーゼ、ＬＡ  ＴＡＱ（商標）ポリメラーゼ、Ｓｓｏポリメラーゼ、Ｐｏｃポリメラーゼ、Ｐａｂポリメラーゼ、Ｍｔｈポリメラーゼ、ＥＳ４ポリメラーゼ、Ｔｒｕポリメラーゼ、Ｔａｃポリメラーゼ、Ｔｎｅポリメラーゼ、Ｔｍａポリメラーゼ、Ｔｃａポリメラーゼ、Ｔｉｈポリメラーゼ、Ｔｆｉポリメラーゼ、ＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｂｒポリメラーゼ、Ｔｆｌポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、ＰＦＵＴＵＲＢＯ（登録商標）ポリメラーゼ、ＰＹＲＯＢＥＳＴ（登録商標）ポリメラーゼ、Ｐｗｏポリメラーゼ、ＫＯＤポリメラーゼ、Ｂｓｔポリメラーゼ、Ｓａｃポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗ断片、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ、ならびにそのバリアント、改変された生成物および誘導体が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、単一サブユニットポリメラーゼである。ポリメラーゼの追加の例として、Ｍ２Ｙポリメラーゼ、ヒツジキンバエポリメラーゼ、エンテロコッカス・フェシウムポリメラーゼ、バチルスファージＶＭＹ２２ポリメラーゼ、バチルスファージＧＡ−１ポリメラーゼ、放線菌ファージＡＶ−１ポリメラーゼ、カンジダツスモラン細菌ポリメラーゼ、バチルスファージＭＧ−Ｂ１ポリメラーゼ、エゲルテラ属ポリメラーゼ、ストレプトコッカスファージＣＰ−７ポリメラーゼ、バクテロイデス属ポリメラーゼ、クラミジア・トラコマティスポリメラーゼ、およびグロボデラ・パリダポリメラーゼが挙げられる。ＤＮＡポリメラーゼの非限定的な例およびその性質は、とりわけ、ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，コーンバーグおよびベイカー、Ｗ．Ｈ．フリーマン（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｂａｋｅｒ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ），Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９１）に詳記されている。そのような配列の非限定的な例は表１に見出され得る（配列番号１〜１９）。
【０１８１】
標的核酸と相補的なｄＮＴＰの核酸塩基間で塩基対が形成されると、ポリメラーゼは、新規に合成された鎖の３’ヒドロキシル末端とｄＮＴＰのα−リン酸の間でホスホジエステル結合を形成することによりｄＮＴＰを新規に合成された核酸鎖に組み込む。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、高い処理能力を有するポリメラーゼである。ただし、いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、処理能力が低下しているポリメラーゼである。ポリメラーゼの処理能力とは、核酸鋳型を放出することなく、ｄＮＴＰを核酸鋳型内に連続的に組み込むポリメラーゼの能力を一般的に指す。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性、および／または３’−５’エキソヌクレアーゼが低いポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは対応する野生型ポリメラーゼと比較して、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性および／または３’−５’活性が低下するように改変されている（例えば、アミノ酸置換により）。ＤＮＡポリメラーゼのさらなる非限定的な例として、９°ＮＭ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（ニューイングランドバイオラボ社（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ））、およびクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）エキソポリメラーゼのＰ６８０Ｇ突然変異体（ツスケら（Ｔｕｓｋｅ  ｅｔ．ａｌ．）（２０００）  ＪＢＣ  ２７５（３１）：２３７５９−２３７６８）が挙げられる。いくつかの実施形態では、処理能力が低下しているポリメラーゼは、ヌクレオチドリピートの１つまたは複数のストレッチ（例えば、同一種類の２つ以上の連続した塩基）を含有するシークエンシング用鋳型に対して正確性の増加を実現する。
【０１８３】
核酸ポリメラーゼの処理能力、エキソヌクレアーゼ活性、異なる種類の核酸に対する相対的親和性、またはその他の性質は、対応する野生型ポリメラーゼと比較して、突然変異またはその他の改変を導入することにより、当業者によって増加させたり、また低下させたりすることができる。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、改変されたポリメラーゼは、１つまたは複数の非天然アミノ酸置換を含む。本願明細書で使用する場合、「非天然アミノ酸」は、２０種類の遺伝子コードされる下記のα−アミノ酸：アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン以外のあらゆるアミノ酸、改変されたアミノ酸、またはアミノ酸類似体を指す。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、上記２０種類のα−アミノ酸以外の天然の化合物を含み得る。非天然アミノ酸および非天然アミノ酸をタンパク質配列に組み込む方法は、例えばその内容を本願明細書に援用する米国特許第７，０４５，３３７号に記載されるように、当技術分野において公知である。
【０１８５】
本願明細書に記載するように、ポリメラーゼおよび／またはポリメラーゼ配列が、共通する祖先のタンパク質またはタンパク質配列から、自然にまたは人工的に派生していれば、ポリメラーゼおよび／またはポリメラーゼ配列は「相同」である。同様に、核酸および／または核酸配列が、共通する祖先の核酸または核酸配列から自然にまたは人工的に派生していれば、核酸および／または核酸配列は「相同」である。例えば、あらゆる天然の核酸は、任意の利用可能な突然変異誘発法により、ポリペプチド内の所与の位置において自然に発生しないアミノ酸をコードする少なくとも１つの特別なコドンを含むように改変され得る。発現すると、この突然変異が誘発された核酸は、１つまたは複数の突然変異したアミノ酸を含むポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、相同性は、２つ以上の核酸またはタンパク質（またはその配列）の間の配列類似性から一般的に推測される。相同性を立証するのに有用である配列間の類似性の正確な割合（％）は、問題とする核酸およびタンパク質によって異なるが、しかしどんなに低くとも２５％の配列類似性が相同性を立証するのに通常使用される。より高いレベルの配列類似性、例えば、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％以上が、相同性を立証するのにやはり使用可能である。配列類似性の割合（％）を決定する方法は、当技術分野において周知されている。いくつかの実施形態では、類似性は、例えばＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＮアルゴリズムを含む、上記アルゴリズム等のアルゴリズムを使用して、例えばデフォルトパラメーターを使用して決定可能である。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、本開示のポリメラーゼを発現させるために、ポリメラーゼをコードするＤＮＡが、コードされるポリメラーゼが転写上および翻訳上の制御配列と作動的に連結するように、１つまたは複数の発現ベクターに挿入される（例えば、その内容を本願明細書に援用する米国特許第６，９１４，１２８号を参照）。この文脈において、用語「作動的に連結した」とは、ベクター内の転写上および翻訳上の制御配列が、ポリメラーゼの転写および翻訳を制御するというそれらの意図された機能を働かせるように、ポリメラーゼをコードする配列がベクター中にライゲートされることを意味するように意図されている。使用される発現宿主細胞に適合するように、発現ベクターおよび発現制御配列が選択される。ポリメラーゼをコードする配列は、標準法により発現ベクターに挿入される（例えば、ポリメラーゼをコードする配列上の相補的制限部位とベクターのライゲーション、または制限部位が存在しない場合には平滑末端ライゲーション）。
【０１８７】
改変されたポリメラーゼの発現では、改変されたポリメラーゼをコードする発現ベクターが、標準技法により宿主細胞にトランスフェクトされ得る。様々な形態の用語「トランスフェクション」は、外因性ＤＮＡの原核生物または真核生物の宿主細胞への導入で一般的に使用される多種多様な技法、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム沈殿法、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション法等を包含するように意図されている。本開示のポリメラーゼ発現用の適する宿主細胞は、原核生物、酵母菌、またはより高等な真核細胞を含む。
【０１８８】
この目的のための適する原核生物として、真正細菌、例えばグラム陰性またはグラム陽性微生物等、例としてエンテロバクター科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、例えば大腸菌属等、例として大腸菌、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エルウイニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、例として、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラシア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、例としてセラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、および赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ならびにバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｉ）、例えば枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）等、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、例えば緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）等、およびストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）が挙げられる。原核生物に付加して、真核生物病原菌、例えば糸状菌または酵母菌等が、クローニングまたはポリペプチドをコードするベクター用の発現宿主として適する。サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、または一般的なパン酵母が、下等の真核生物宿主微生物のなかでも最も一般的に使用されている。ただし、いくつかのその他の属、種、および系統、例えばシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）；クリベロミセス属宿主、例えばＫ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｋ．フラギリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）、Ｋ．ブルガリカス（Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、Ｋ．ウィケラミイ（Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ）、Ｋ．ワルティ（Ｋ．ｗａｌｔｉｉ）、Ｋ．ドロソフィラルム（Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）、Ｋ．テルモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、およびＫ．マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）等；ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）；カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）；トリコデルマ・リーシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ）；ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）；シュワニオミセス属（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）、例えばシュワニオミセス・オキシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）等；および糸状菌、例えばニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、およびアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）宿主、例えばＡ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）およびＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）等が一般的に入手可能であり、また本願明細書において有用である。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、宿主細胞が、ポリメラーゼを産生するように上記発現またはクローニングベクターを用いて変換され、そしてプロモーターの誘発、形質転換体の選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅を目的として適宜改変された従来型の栄養培地内で培養される。ポリメラーゼを生成するのに使用される宿主細胞は、様々な培地内で培養され得る。市販の培地、例えばＨａｍ’ｓ  Ｆ１０（商標）（シグマ社（Ｓｉｇｍａ））、Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（商標）（ＭＥＭ）、（シグマ社（Ｓｉｇｍａ））、ＲＰＭＩ−１６４０（シグマ社（Ｓｉｇｍａ））、およびＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（商標）（ＤＭＥＭ）（シグマ社（Ｓｉｇｍａ））等が、宿主細胞を培養するのに適する。培養条件、例えば温度、ｐＨ等は、発現用に選択された宿主細胞でこれまでに使用されている条件であり、また当業者にとって明白である。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、ポリメラーゼバリアントが細胞膜周辺腔内に細胞内産生可能であり、または細胞の培地中に直接分泌可能である。ポリメラーゼバリアントが細胞内産生されるような複数の実施形態では、宿主細胞または溶解した細胞のような微粒子デブリ（例えば、ホモジナイゼーションに起因する）は、遠心分離法または限外濾過法を含む、ただしこれらに限定されない様々な手段により除去可能である。ポリメラーゼが培地中に分泌される場合、そのような発現系からの上清は市販のタンパク質濃縮フィルターを使用して最初に濃縮可能であるが、次にこれに対して、アフィニティークロマトグラフィー（タンパク質アフィニティークロマトグラフィー等）、イオン交換クロマトグラフィー（陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー等）、および疎水性相互作用クロマトグラフィーといった、ただしこれらに限定されない１つまたは複数の追加の精製技法を実施することができる。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、本出願の態様は、生体試料のアッセイ法と関連する方法で使用可能である。典型的な実施形態では、本願明細書で提供される方法は、試料中の１つもしくは複数の核酸もしくはポリペプチドの配列を決定し、および／または試料中の１つもしくは複数の核酸もしくはポリペプチドバリアント（例えば、目的とする遺伝子内の１つまたは複数の突然変異）の有無を決定するのに使用される技法において有用である。いくつかの実施形態では、核酸配列情報を提供するため、または診断上、予後上、および／または治療上の目的で、目的とする１つまたは複数の核酸の有無を決定するために、患者試料（例えば、ヒト患者試料）上でテストが実施可能である。いくつかの例では、診断テストには、例えば対象の生体試料中の無細胞ＤＮＡ分子および／または発現産物（例えば、ＲＮＡ）をシークエンシングすることにより、対象の生体試料中の核酸分子をシークエンシングすることが含まれ得る。例えば、本開示は、それぞれの内容を本願明細書に援用する同時係属中の米国特許出願第１４／５４３，８６５号、同第１４／５４３，８６７号、同第１４／５４３，８８８号、同第１４／８２１，６５６号、同第１４／８２１，６８６号、同第１４／８２１，６８８号、同第１５／１６１，０６７号、同第１５／１６１，０８８号、同第１５／１６１，１２５号、同第１５／２５５，２４５号、同第１５／２５５，３０３号、同第１５／２５５，６２４号、同第１５／２６１，６９７号、同第１５／２６１，７２４号、同第６２／２８９，０１９号、同第６２／２９６，５４６号、同第６２／３１０，３９８号、同第６２／３３９，７９０号、同第６２／３４３，９９７号、同第６２／３４４，１２３号、および同第６２／４２６，１４４号に記載されている技術において有利に利用され得る方法および組成物を提供する。
【０１９２】
本出願のいくつかの態様は、生物学的ポリマー、例えば核酸およびタンパク質等をシークエンシングする能力を有する技法において有用である。いくつかの実施形態では、本出願に記載されている方法および組成物は、核酸またはタンパク質中に組み込まれる一連のヌクレオチドまたはアミノ酸モノマーを識別する技術（例えば、一連の標識されたヌクレオチドまたはアミノ酸モノマーの組み込みについて、そのタイムコースを検出することによる）において使用可能である。いくつかの実施形態では、本出願に記載されている方法および組成物は、重合酵素により合成される鋳型依存性核酸シークエンシング反応生成物に組み込まれる一連のヌクレオチドを識別する技法に組込み可能である。
【０１９３】
シークエンシング期間中に、重合酵素は、標的核酸分子（例えば、シークエンシング用鋳型の核酸分子）のプライミング位置にカップリングする（例えば、連結する）ことができる。プライミング位置は、標的核酸分子の一部分に対して相補的なプライマーを含み得る。代替案として、プライミング位置は、標的核酸分子の二本鎖セグメント内に提供されるギャップまたはニックである。ギャップまたはニックは、長さが０から少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、または４０個のヌクレオチドであり得る。ニックは、二本鎖配列の一方の鎖に切れ目を設けることができ、この切れ目は重合酵素、例えば鎖置換型ポリメラーゼ酵素等に対してプライミング位置を提供し得る。
【０１９４】
場合によっては、シークエンシングプライマーが、固体支持体に対して固定化されても、またされなくてもよい標的核酸分子に対してアニーリングされ得る。固体支持体は、例えば、核酸のシークエンシングで使用される集積化デバイス上の試料ウェルを含み得る。いくつかの実施形態では、シークエンシングプライマーは、固体支持体に固定化可能であり、また標的核酸分子のハイブリダイゼーションも標的核酸分子を固体支持体に固定化する。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは固体支持体に固定化され、そして可溶性プライマーおよび標的核酸がポリメラーゼと接触する。ただし、いくつかの実施形態では、ポリメラーゼ、標的核酸、およびプライマーを含む複合体が溶液中で形成され、そして該複合体は固体支持体に固定化される（例えば、ポリメラーゼ、プライマー、および／または標的核酸の固定化により）。いくつかの実施形態では、試料ウェル中の成分のいずれも、固体支持体に固定化されない。例えば、いくつかの実施形態では、ポリメラーゼ、標的核酸、およびプライマーを含む複合体が溶液中で形成され、そして該複合体は固体支持体に固定化されない。
【０１９５】
適切な条件下では、アニーリングされたプライマー／標的核酸と接触しているポリメラーゼ酵素が、１つまたは複数のヌクレオチドをプライマー上に付加するまたは組み込むことができ、そしてヌクレオチドは、５’→３’方向、鋳型依存的にプライマーに付加され得る。プライマー上へのそのようなヌクレオチドの組み込み（例えば、ポリメラーゼの作用による）は、プライマー伸長反応と一般的に呼ばれる場合がある。各ヌクレオチドは、核酸伸長反応期間中に検出および識別可能であり（例えば、その発光寿命および／またはその他の特性に基づき）、ならびに伸長したプライマー、したがって新規合成された核酸分子の配列に組み込まれた各ヌクレオチドを決定するのに使用可能である検出可能なタグと関連付けることができる。新規合成された核酸分子の配列相補性により、標的核酸分子の配列も決定可能である。場合によっては、標的核酸分子に対するシークエンシングプライマーのアニーリング、およびシークエンシングプライマーへのヌクレオチドの組み込みは、類似した反応条件（例えば、同一のまたは類似した反応温度）、または異なる反応条件（例えば、異なる反応温度）において生じ得る。いくつかの実施形態では、合成法によるシークエンシングには、標的核酸分子の集団（例えば、標的核酸のコピー）の存在、および／または標的核酸の集団を実現するために標的核酸を増幅させる工程が含まれ得る。ただし、いくつかの実施形態では、合成によるシークエンシングが、評価対象となる各反応内の単一分子の配列を決定するのに使用される（および核酸増幅法は、シークエンシング用の標的鋳型を調製することを必要としない）。いくつかの実施形態では、本出願の態様に基づき、複数の単一分子シークエンシング反応が並行して実施される（例えば、単一の集積化デバイス上で）。例えば、いくつかの実施形態では、複数の単一分子シークエンシング反応が、集積化デバイス上の別個の反応チャンバー内でそれぞれ実施される。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、本開示の重合酵素は、きわめて小体積の試料ウェル内で実行される単一分子シークエンシング反応において有用である。例えば、試料ウェルの体積は、いくつかの実施において約１０−２１リットル〜約１０−１５リットルの間であり得る。試料ウェルは小さい体積を有するので、単一の試料事象（例えば、単一の分子事象）の検出が実現可能である。いくつかの実施形態では、表面（例えば、試料ウェルの表面）は、本願明細書に記載するポリメラーゼを受け入れるように構成される。いくつかの実施形態では、試料ウェルはポリメラーゼを受け入れ、同ポリメラーゼは試料ウェルの表面、例えば底部表面等の上に配置され得る。いくつかの実施形態では、試料ウェルは集積化デバイス内に形成され、該試料ウェルの底部表面は、それが形成される集積化デバイスの表面より遠位側にある。
【０１９７】
特定の実施形態では、本願明細書に記載する技法は、重合酵素およびその複合体と関連し、それらは試料ウェルに添加され得る。いくつかの実施形態では、本願明細書に記載する重合酵素は、試料ウェルの標的体積（例えば、反応体積）内に閉じ込められ得る。いくつかの実施形態では、標的体積は、試料ウェル内の領域である。１つまたは複数の重合酵素が底部表面上に固定化される複数の実施形態では、１つまたは複数の重合酵素（例えば、重合酵素およびその複合体）の連結を可能にするように、底部表面を官能化するのが望ましい場合もある。いくつかの実施形態では、底部表面は、カップリング基を含む材料を用いて官能化される。例えば、カップリング基は、化学的部分、例えばアミン基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、スルフヒドリル基、金属、キレート剤等を含み得る。あるいは、底部表面には、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、レクチン、ＳＮＡＰ−ｔａｇ（商標）、または基質等の特異的結合要素、したがって、会合性または結合性ペプチドまたはタンパク質、抗体または抗体断片、核酸または核酸類似物等が含まれ得る。付加的または二者択一的に、カップリング基は、目的とする分子（例えば、重合酵素またはその複合体）とカップリングまたは結合するのに使用される追加の基をカップリングさせるのに使用することができ、これには、場合によって化学官能基および特異的結合要素の両方が含まれ得る。例として、カップリング基、例えばビオチンが基質表面上に積層され、そして所定のエリア内で選択的に活性化され得る。中間結合剤、例えばストレプトアビジンが、次に第１のカップリング基とカップリングし得る。目的とする分子（例えば、重合酵素またはその複合体）は、この特別な例ではビオチン化されており、次にストレプトアビジンとカップリングする。いくつかの実施形態では、本願明細書に記載する重合酵素は、ポリメラーゼを表面（例えば、試料ウェルの表面）に固定化するカップリング基との相互作用を形成する能力を有するカップリング部分をさらに含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、重合酵素は、アビジンタンパク質に結合する能力を有するＮ末端またはＣ末端ビオチン化配列を含む。いくつかの実施形態では、ビオチン化配列はリンカー配列をさらに含む。例えば、いくつかの実施形態では、Ｃ末端リンカー／ビオチン化配列は、アミノ酸配列ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＬＮＤＦＦＥＡＱＫＩＥＷＨΕ（配列番号５１７）を含む。
【０１９８】
実施例１．改変されたポリメラーゼの発現および評価
組換えポリメラーゼバリアントを大腸菌内で発現させ、Ｈｉｓスピンカラムを使用してスケール培養物１５０ｍＬから精製した。タンパク質純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとその後のクマシーブルー染色により分析した（図７）。緩衝液交換およびタンパク質濃縮の後、組換えバリアントを、ｄＮＴＰの存在下、トラップチェイスを用いて、３０℃で３０分間、活性および処理能力について評価した。キメラポリメラーゼバリアントＣ０１７およびＣ０２０は、トラップの存在下、活性、処理能力、および合成の長さを示した。シークエンシング反応におけるポリメラーゼの適切性を評価するために、バリアントポリメラーゼによるｄＮＴＰ類似物の利用を測定した。相同的突然変異バリアントおよびキメラポリメラーゼバリアントのいずれにも、ｄＮ６Ｐの利用が認められた。単一分子シークエンシングから得られた結果を下記の表６に示す。
【０１９９】
【表６−１】
2020501573.tif 000109
【０２００】
【表６−２】
2020501573.tif 000110
【０２０１】
同等物および範囲
いくつかの発明的実施形態を、本願明細書に記載および例示してきたが、当業者は、機能を実施するための、ならびに／あるいは本願明細書に記載する結果および／または１つもしくは複数の長所を取得するための様々なその他の手段および／または構造について容易に思いつくであろうが、そのような変更および／または改変のそれぞれは、本願明細書に記載する発明的実施形態の範囲内にあるとみなされる。より一般的には、当業者は、本願明細書に記載するすべてのパラメーター、寸法、材料、および構成は典型的なものとして意図されており、実際のパラメーター、寸法、材料、および／または構成は特定の用途または発明の教示が使用される用途に依存することを容易に認めるであろう。当業者は、ルーチン的な実験を超える実験を用いなくても、本願明細書に記載する具体的な発明的実施形態と同等の多くの実施形態を認識し、または確認することができるであろう。したがって、上記実施形態は例示目的に限定して提示されており、また別途、特別に記載および特許請求されない限り、添付の特許請求の範囲およびその同等物の範囲内で、発明的実施形態は実践可能であるものと理解されるべきである。本開示の発明的実施形態は、本願明細書に記載する個々の特色、システム、物品、材料、キット、および／または方法それぞれを対象とする。さらに、２つ以上のそのような特性、システム、物品、材料、キット、および／または方法の任意の組み合わせは、そのような特性、システム、物品、材料、キット、および／または方法が相互に矛盾しなければ、本開示の発明の範囲内に含まれる。
【０２０２】
すべての定義は、本願明細書で定義されおよび使用される通りであり、辞書の定義、援用する文書の定義、および／または定義された用語の通常の意味に対して制御上優先するものと理解すべきである。
【０２０３】
本願明細書に開示するすべての参考資料、特許、および特許出願は、そのそれぞれについて引用された主題に関して援用され、場合によっては文書全体を包含し得る。
不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本願明細書および特許請求の範囲において使用する場合、明確に反示されない限り、「少なくとも１つ」を意味するものと理解すべきである。
【０２０４】
慣用句「および／または」は、本願明細書および特許請求の範囲において使用する場合、そのように結びつけられた複数の要素の「いずれかまたは両方」、すなわち、ある場合には結合的に存在し、またその他の場合には非結合的に存在する要素を意味するものと理解されるべきである。「および／または」を用いてリスト化される複数の要素は、同様に、すなわちそのように結びつけられた複数の要素の「１つまたは複数」として解釈すべきである。「および／または」の句より特に識別される要素以外のその他の要素が、特に識別された要素と関連するまたは関連しないに関わらず任意選択で存在する可能性がある。したがって、非限定的な例として、「Ａおよび／またはＢ」との記載は、非制限的言語、例えば「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等と連携して使用される場合、１つの実施形態ではＡのみ（任意選択でＢ以外の要素を含む）；別の実施形態ではＢのみ（任意選択でＡ以外の要素を含む）；なおも別の実施形態ではＡとＢの両方（任意選択でその他の要素を含む）等を意味し得る。
【０２０５】
本願明細書および特許請求の範囲において使用する場合、「または（ｏｒ）」は、上記で定義したような「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」と同一の意味を有するものと理解すべきである。例えば、リスト内で品目を分離する際に、「または」あるいは「および／または」は包括的である、すなわちいくつかの要素または要素のリストの少なくとも１つ（ただし２つ以上も含む）、および任意選択で追加のリスト化されない品目の包括であると解釈されるものとする。明確に反示される用語に限り、例えば「〜のうちの１つのみ（ｏｎｌｙ  ｏｎｅ  ｏｆ）」または「〜のうちのまさに１つ（ｅｘａｃｔｌｙ  ｏｎｅ  ｏｆ）」等、あるいは特許請求の範囲で使用される際の「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｏｆ）」は、いくつかの要素または要素のリストのうちのまさに１つの要素の包括を指す。一般的に、用語「または（ｏｒ）」は、本願明細書で使用する場合、排他性の用語、例えば「いずれか（ｅｉｔｈｅｒ）」、「〜のうちの１つ（ｏｎｅ  ｏｆ）」、「〜のうちの１つのみ（ｏｎｌｙ  ｏｎｅ  ｏｆ）」、または「〜のうちのまさに１つ（ｅｘａｃｔｌｙ  ｏｎｅ  ｏｆ）」等が先行する場合に限り、排他的な代替的用語（すなわち、「一方または他方、ただし両方ではない（ｏｎｅ  ｏｒ  ｔｈｅ  ｏｔｈｅｒ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｂｏｔｈ）」）を示すと解釈するものとする。「〜から本質的になる（Ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、特許請求の範囲で使用されるとき、特許法の分野で使用されるその通常の意味を有するものとする。
【０２０６】
本願明細書および特許請求の範囲において使用する場合、１つまたは複数の要素のリストを参照する際の慣用句「少なくとも１つ」とは、要素のリスト内の任意の１つまたは複数の要素から選択される少なくとも１つの要素を意味するものと理解すべきであるが、しかし要素のリスト内に特にリスト化されているあらゆる要素それぞれの少なくとも１つを必ずしも含む必要はなく、また要素のリスト内の要素の任意の組み合わせを排除するものでもない。この定義は、慣用句「少なくとも１つ」が指す要素のリスト内で特に識別された要素以外の要素が、そのような特に識別された要素に関連する、しないに関わらず任意選択で存在し得ることも可能にする。したがって、非限定的な例として、「ＡおよびＢのうちの少なくとも１つ」（または同じく「ＡまたはＢのうちの少なくとも１つ」、または同じく「Ａおよび／またはＢのうちの少なくとも１つ」）とは、１つの実施形態では、Ａは少なくとも１つであり、任意選択で２つ以上を含み、Ｂは存在しない（任意選択でＢ以外の要素を含む）こと；別の実施形態では、Ｂは少なくとも１つであり、任意選択で２つ以上を含み、Ａは存在しない（任意選択でＡ以外の要素を含む）こと；さらに別の実施形態では、Ａは少なくとも１つであり、任意選択で２つ以上を含み、Ｂは少なくとも１つであり、任意選択で２つ以上を含む（任意選択でその他の要素を含む）こと等を指す。
【０２０７】
明確に反示されない限り、２つ以上の工程または行為が含まれる本願で特許請求された任意の方法において、方法の工程または行為の順序は、該方法の工程または行為が列挙された順序に必ずしも限定されないものと、やはり理解されるべきである。
【０２０８】
特許請求の範囲、ならびに上記明細書において、すべての移行句、例えば「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「〜を担持する（ｃａｒｒｙｉｎｇ）」、「〜を有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「〜を含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「〜を伴う（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、「〜を保持する（ｈｏｌｄｉｎｇ）」、「〜から構成される（ｃｏｍｐｏｓｅｄ  ｏｆ）」等は非制限的である、すなわち、〜を含むが、これらに限定されない、を意味するものと理解される。移行句「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」および「〜から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」に限り、特許審査手順の米国特許オフィスマニュアル（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｏｆｆｉｃｅ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｅｘａｍｉｎｉｎｇ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）、セクション２１１１．０３に規定するように、それぞれ限定的または半限定的な移行句であるものとする。非制限的な移行句（例えば、「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」）を使用する本文書に記載されている実施形態も、代替的実施形態においては、非制限的移行句により記載される特色「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」および「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」ものとやはりみなされるものと認められるべきである。例えば、開示が「ＡおよびＢを含む組成物」と記載する場合、該開示は、代替的実施形態、「ＡおよびＢからなる組成物」および「ＡおよびＢから本質的になる組成物」についても検討の対象とする。
【図１】
2020501573.tif 000111
【図２】
2020501573.tif 000112
【図３】
2020501573.tif 000113
【図４】
2020501573.tif 000114
【図５Ａ】
2020501573.tif 000115
【図５Ｂ】
2020501573.tif 000116
【図６】
2020501573.tif 000117
【図７】
2020501573.tif 000118
【配列表】
2020501573000001.app
【国際調査報告】
2020501573.tif 000119
2020501573.tif 000120
2020501573.tif 000121
2020501573.tif 000122
2020501573.tif 000123