(57)【要約】  本技術は、概して人工多能性幹細胞（iPSC）の発生に関する。具体的な特徴では、本技術は、概して非多能性細胞（例えば老齢体細胞）からiPSCを発生させる方法に関し、ここで、前記iPSCは、改善されたゲノム安定性、改善されたDNA損傷応答、増大したZSCAN10発現、低下したGSS発現、および/または増大した再プログラミング効率を特徴とする。
2020532290.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の非多能性細胞から人工多能性幹細胞（iPSC）を作製する方法であって、当該iPSCが、増大したゲノム安定性、増大したDNA損傷応答、増大したZSCAN10発現、および低下したグルタチオンシンターゼ（GSS）発現の1つ以上を特徴とし、非多能性細胞の再プログラミング開始前、再プログラミング中、および/または再プログラミング後にグルタチオンまたはその誘導体の有効量で処理した非多能性細胞をiPSCの作製を可能にする条件下で培養する工程を含み、それによって、同様な条件下で増殖させた未処理コントロール非多能性細胞から作製したiPSCと比較して、増大したゲノム安定性、増大したDNA損傷応答、増大したZSCAN10発現、および低下したGSS発現の1つ以上を有するiPSCを作製する、前記方法。
【請求項２】
さらにまた、グルタチオンまたはその誘導体による処理のための非多能性細胞を同定する工程を含む、請求項1に記載の方法であって、処理のために同定される非多能性細胞が、未処理コントロール非多能性細胞で観察される細胞内活性酸素種（ROS）レベルと対比して、上昇した細胞内ROSレベルを処理前に発現し、当該上昇した細胞内ROSレベルにより、非多能性細胞をグルタチオンまたはその誘導体による処理のための非多能性細胞として同定し、上昇した細胞内ROSレベルの欠如により非多能性細胞をグルタチオンまたはその誘導体による処理のための非多能性細胞として同定しない、前記方法。
【請求項３】
グルタチオンまたはその誘導体で処理した非多能性細胞の再プログラミング効率が、未処理コントロール非多能性細胞と対比して増大した、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
グルタチオンまたはその誘導体による処理が、非多能性細胞のiPSCへの再プログラミング効率を、未処理コントロール非多能性細胞と対比して少なくとも10倍増加させる、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
グルタチオンまたはその誘導体による処理が、iPSCのZSCAN10発現レベルを胚性幹細胞（ESC）の対応する発現レベルの約50％以上に回復させる、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
哺乳動物の非多能性細胞が体細胞である、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
体細胞が老齢体細胞である、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
体細胞が胚期由来の体細胞である、請求項6に記載の方法。
【請求項９】
体細胞が、若齢体細胞で観察される細胞内ROSレベルと対比して増大した発現をする、請求項6に記載の方法。
【請求項１０】
体細胞がiPSCを発生させることができない、請求項6に記載の方法。
【請求項１１】
体細胞が、線維芽細胞、血液由来細胞、眼組織由来細胞、上皮細胞、骨細胞、軟骨細胞、ニューロン、筋肉細胞、肝臓の細胞、腸の細胞、脾臓細胞、成人幹細胞、および成人幹細胞由来前駆細胞から成る群から選択される、請求項6に記載の方法。
【請求項１２】
哺乳動物の非多能性細胞が前駆細胞である、請求項1に記載の方法。
【請求項１３】
請求項1に記載の方法によって作製される人工多能性幹細胞（iPSC）であって、グルタチオンまたはその誘導体で処理した非多能性細胞から作製されたiPSCが、同様な条件下で増殖させた未処理コントロール非多能性細胞から作製されたiPSCと比較して、増大したゲノム安定性、増大したDNA損傷応答、増大したiPSC再プログラミング効率、増大したZSCAN10発現、および低下したGSS発現の1つ以上を特徴とする、前記人工多能性幹細胞。
【請求項１４】
iPSCが、同様な条件下で増殖させた未処理コントロール非多能性細胞から作製されたiPSCと比較して、増大したゲノム安定性を特徴とする、請求項1に記載の方法によって作製されるiPSC。
【請求項１５】
iPSCが、同様な条件下で増殖させた未処理コントロール非多能性細胞から作製されたiPSCと比較して、増大したDNA損傷応答を特徴とする、請求項1に記載の方法によって作製されるiPSC。
【請求項１６】
iPSCが、同様な条件下で増殖させた未処理コントロール非多能性細胞から作製されたiPSCと比較して、増大したZSCAN10発現を特徴とする、請求項1に記載の方法によって作製されるiPSC。
【請求項１７】
iPSCが、同様な条件下で増殖させた未処理コントロール非多能性細胞から作製されたiPSCと比較して、低下したGSS発現を特徴とする、請求項1に記載の方法によって作製されるiPSC。
【請求項１８】
iPSCが、同様な条件下で増殖させた未処理コントロール非多能性細胞から作製されたiPSCと比較して、増大したiPSC再プログラミング効率を特徴とする、請求項1に記載の方法によって作製されるiPSC。
【請求項１９】
グルタチオンが還元型グルタチオンエチルエステルである、請求項1に記載の方法。
【請求項２０】
老齢体細胞から誘導される、増大したゲノム安定性、増大したDNA損傷応答、増大したZSCAN10発現、および低下したグルタチオンシンターゼ（GSS）発現の1つ以上を有する人工多能性幹細胞（A-iPSC）を作製する方法であって、老齢体細胞の再プログラミング開始前、再プログラミング中、および/または再プログラミング後にグルタチオンまたはその誘導体の有効量で処理された老齢体細胞をA-iPSCの作製を可能にする条件下で培養する工程を含み、それによって、同様な条件下で増殖させた未処理コントロール老齢体細胞から作製されたA-iPSCで観察されるものと比較して、および/または若齢iPSC（Y-iPSC）またはESCで観察されるものに匹敵する、増大したゲノム安定性、増大したDNA損傷応答、増大したiPSC再プログラミング効率、増大したZSCAN10発現、および低下したGSS発現の1つ以上を有するA-iPSCを作製する、前記方法。
【請求項２１】
さらにまた、グルタチオンまたはその誘導体による処理のための老齢体細胞を同定する工程を含む請求項20に記載の方法であって、処理のために同定される老齢体細胞が、未処理コントロール老齢体細胞、若齢体細胞、およびESCの1つ以上と対比して、上昇した細胞内活性酸素種（ROS）レベルを処理前に発現し、当該上昇した細胞内ROSレベルにより老齢体細胞をグルタチオンまたはその誘導体による処理のための老齢体細胞として同定し、上昇した細胞内ROSレベルの欠如により老齢体細胞をグルタチオンまたはその誘導体による処理のための老齢体細胞として同定しない、前記方法。
【請求項２２】
グルタチオンまたはその誘導体で処理した老齢体細胞から作製されたA-iPSCが、同様な条件下で増殖させた未処理コントロール老齢体細胞から作製されたA-iPSCと比較して、および/または若齢iPSC（Y-iPSC）またはESCで観察されるものに匹敵する、増大したゲノム安定性、増大したDNA損傷応答、増大したiPSC再プログラミング効率、増大したZSCAN10発現、および低下したグルタチオンシンターゼ（GSS）発現の1つ以上を特徴とする、請求項20に記載の方法によって作製されるA-iPSC。
【請求項２３】
A-iPSCが、同様な条件下で増殖させた未処理コントロール老齢体細胞から作製されたA-iPSCと比較して、および/または若齢iPSC（Y-iPSC）またはESCで観察されるものに匹敵する、増大したゲノム安定性を特徴とする、請求項20に記載の方法によって作製されるA-iPSC。
【請求項２４】
A-iPSCが、同様な条件下で増殖させた未処理コントロール老齢体細胞から作製されたA-iPSCと比較して、および/または若齢iPSC（Y-iPSC）またはESCで観察されるものに匹敵する、増大したDNA損傷応答を特徴とする、請求項20に記載の方法によって作製されるA-iPSC。
【請求項２５】
A-iPSCが、同様な条件下で増殖させた未処理コントロール老齢体細胞から作製されたA-iPSCと比較して、および/または若齢iPSC（Y-iPSC）またはESCで観察されるものに匹敵する、増大したiPSC再プログラミング効率を特徴とする、請求項20に記載の方法によって作製されるA-iPSC。
【請求項２６】
A-iPSCが、同様な条件下で増殖させた未処理コントロール老齢体細胞から作製されたA-iPSCと比較して、および/または若齢iPSC（Y-iPSC）またはESCで観察されるものに匹敵する、増大したZSCAN10発現を特徴とする、請求項20に記載の方法によって作製されるA-iPSC。
【請求項２７】
A-iPSCが、同様な条件下で増殖させた未処理コントロール老齢体細胞から作製されたA-iPSCと比較して、および/または若齢iPSC（Y-iPSC）またはESCで観察されるものに匹敵する、低下したグルタチオンシンターゼ（GSS）発現を特徴とする、請求項20に記載の方法によって作製されるA-iPSC。
【請求項２８】
グルタチオンが還元型グルタチオンエチルエステルである、請求項20に記載の方法。
【請求項２９】
ゲノム安定性、誘導効率および再プログラミング品質を改善するために胚盤胞、単為生殖ES細胞、核移植ES細胞からの胚性肝細胞誘導体を含む多能性幹細胞の作製方法であって、前記方法が、胚の再プログラミング開始前および/または再プログラミング中にグルタチオンまたはその誘導体の有効量で処理した胚をES細胞、単為生殖ES細胞、核移植ES細胞からの作製を可能にする条件下で培養して多能性幹細胞の再プログラミング中に酸化ストレス（ROS）媒介阻害性作用を最小限にする工程を含み、それによって、同様な条件下で増殖させた未処理コントロール細胞から作製された多能性幹細胞と比較して、改善されたゲノム安定性、改善されたDNA損傷応答、増大した多能性遺伝子発現（ZSCAN10発現を含む）を有する再プログラミング品質、および低下したGSS発現の1つ以上を有する多能性幹細胞を作製する、前記方法。
【請求項３０】
以下の工程を含む幹細胞療法のための方法：
（a）対象動物から非多能性細胞を単離する工程；
（b）請求項1に記載の方法によってiPSCを作製する工程；
（c）当該iPSCをex vivoで分化細胞に分化させる工程；および
（d）当該分化細胞を対象動物に投与する工程。
【請求項３１】
以下の工程を含む幹細胞療法のための方法：
（a）対象動物から老齢体細胞を単離する工程；
（b）請求項20に記載の方法によってA-iPSCを作製する工程；
（c）当該A-iPSCをex vivoで分化細胞に分化させる工程；および
（d）当該分化細胞を対象動物に投与する工程。
【請求項３２】
処理のために同定される非多能性細胞の上昇した細胞内ROSレベルが、未処理コントロール非多能性細胞で観察されるものと対比して、増大したレベルを提示する1つ以上の代謝物を含む代謝プロフィールによって同定される、請求項2に記載の方法。
【請求項３３】
増大したレベルを提示する1つ以上の代謝物が、アデノシン、シチジン、キサンチン、およびシチジン3’一リン酸（3’-CMP）から成る群から選択される、請求項32に記載の方法。
【請求項３４】
処理のために同定される非多能性細胞の上昇した細胞内ROSレベルが、未処理コントロール非多能性細胞で観察されるものと対比して、ST6GALNAC6、IGFBP5、PDGFD、SURF4、BOC、ADGRD1、MPDU1、RPS4Y1、MME、SET、DOK1、COLEC12、HOXC10、SULF2、ADAMTSL1、ELN、MGRN1、COL15A1、ZEB1、SFRP1、CLDN11、LGALS3BP、CHI3L1、SPG21、PI16、およびMCFD2から成る群から選択される1つ以上の遺伝子の増大した遺伝子発現レベルによって同定される、請求項2に記載の方法。
【請求項３５】
処理のために同定される非多能性細胞の1つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルが、未処理コントロール非多能性細胞で観察されるものと対比して約2倍から約5倍増加する、請求項34に記載の方法。
【請求項３６】
処理のために同定される非多能性細胞の1つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルが、未処理コントロール非多能性細胞で観察されるものと対比して約5倍増加する、請求項34に記載の方法。
【請求項３７】
処理のために同定される非多能性細胞の上昇した細胞内ROSレベルが、未処理コントロール非多能性細胞で観察されるものと対比して、増大した細胞内G-四重鎖（G4）DNA構造形成によって同定される、請求項2に記載の方法。
【請求項３８】
処理のために同定される非多能性細胞のG4 DNA構造形成が、未処理コントロール非多能性細胞で観察されるものと対比して約2倍増加する、請求項37に記載の方法。
【請求項３９】
処理のために同定される非多能性細胞の上昇した細胞内ROSレベルが、未処理コントロール非多能性細胞で観察されるものと対比して、増大した8-oxo-グアニン（oxoG）形成によって同定される、請求項2に記載の方法。
【請求項４０】
処理のために同定される非多能性細胞のoxoG形成が、未処理コントロール非多能性細胞で観察されるものと対比して約2倍から約3倍増加する、請求項39に記載の方法。
【請求項４１】
処理のために同定される老齢体細胞の上昇した細胞内ROSレベルが、未処理コントロール老齢体細胞、若齢体細胞、およびESCの1つ以上で観察されるものと対比してレベルの増大を示す1つ以上の代謝物を含む代謝プロフィールによって同定される、請求項21に記載の方法。
【請求項４２】
レベルの増大を示す1つ以上の代謝物が、アデノシン、シチジン、キサンチン、およびシチジン3’一リン酸（3’-CMP）から成る群から選択される、請求項41に記載の方法。
【請求項４３】
処理のために同定される老齢体細胞の上昇した細胞内ROSレベルが、未処理コントロール老齢体細胞、若齢体細胞、およびESCの1つ以上で観察されるものと対比して、ST6GALNAC6、IGFBP5、PDGFD、SURF4、BOC、ADGRD1、MPDU1、RPS4Y1、MME、SET、DOK1、COLEC12、HOXC10、SULF2、ADAMTSL1、ELN、MGRN1、COL15A1、ZEB1、SFRP1、CLDN11、LGALS3BP、CHI3L1、SPG21、PI16、およびMCFD2から成る群から選択される1つ以上の遺伝子の増大した遺伝子発現レベルによって同定される、請求項21に記載の方法。
【請求項４４】
処理のために同定される老齢体細胞の1つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルが、未処理コントロール老齢体細胞、若齢体細胞、およびESCの1つ以上で観察されるものと対比して約2倍から約5倍増加する、請求項43に記載の方法。
【請求項４５】
処理のために同定される老齢体細胞の1つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルが、未処理コントロール老齢体細胞、若齢体細胞、およびESCの1つ以上で観察されるものと対比して約5倍増加する、請求項43に記載の方法。
【請求項４６】
処理のために同定される老齢体細胞の上昇した細胞内ROSレベルが、未処理コントロール老齢体細胞、若齢体細胞、およびESCの1つ以上で観察されるものと対比して、増大した細胞内G-四重鎖（G4）DNA構造形成によって同定される、請求項21に記載の方法。
【請求項４７】
処理のために同定される老齢体細胞のG4 DNA構造形成が、未処理コントロール老齢体細胞、若齢体細胞、およびESCの1つ以上で観察されるものと対比して約2倍増加する、請求項46に記載の方法。
【請求項４８】
処理のために同定される老齢体細胞の上昇した細胞内ROSレベルが、未処理コントロール老齢体細胞、若齢体細胞、およびESCの1つ以上で観察されるものと対比して、増大した8-oxo-グアニン（oxoG）形成によって同定される、請求項21に記載の方法。
【請求項４９】
処理のために同定される老齢体細胞のoxoG形成が、未処理コントロール老齢体細胞、若齢体細胞、およびESCの1つ以上で観察されるものと対比して約2倍から約3倍増加する、請求項48に記載の方法。
【請求項５０】
さらにまた、グルタチオンまたはその誘導体による処理のための、胚盤胞、単為生殖ES細胞、または核移植ES細胞からの胚性肝細胞誘導体を同定する工程を含む請求項29に記載の方法であって、処理のために同定される胚盤胞、単為生殖ES細胞、または核移植ES細胞からの胚性肝細胞誘導体が、胚盤胞、単為生殖ES細胞、または核移植ES細胞からの未処理コントロール胚性肝細胞誘導体の1つ以上と対比して、上昇した活性酸素種（ROS）レベルを処理前に発現し、当該上昇した細胞内ROSレベルにより、グルタチオンまたはその誘導体による処理のための胚盤胞、単為生殖ES細胞、または核移植ES細胞からの胚性肝細胞誘導体を同定し、上昇した細胞内ROSレベルの欠如によりグルタチオンまたはその誘導体による処理のための胚盤胞、単為生殖ES細胞、または核移植ES細胞からの胚性肝細胞誘導体を同定しない、前記方法。
【請求項５１】
処理のために同定される胚盤胞、単為生殖ES細胞、または核移植ES細胞からの胚性肝細胞誘導体の上昇した細胞内ROSレベルが、胚盤胞、単為生殖ES細胞、または核移植ES細胞からの未処理コントロール胚性肝細胞誘導体の1つ以上で観察されるものと対比して、レベルの増大を示す1つ以上の代謝物を含む代謝プロフィールによって同定される、請求項50に記載の方法。
【請求項５２】
レベルの増大を示す1つ以上の代謝物が、アデノシン、シチジン、キサンチン、およびシチジン3’一リン酸（3’-CMP）から成る群から選択される、請求項51に記載の方法。
【請求項５３】
処理のために同定される胚盤胞、単為生殖ES細胞、または核移植ES細胞からの胚性肝細胞誘導体の上昇した細胞内ROSレベルが、胚盤胞、単為生殖ES細胞、または核移植ES細胞からの未処理コントロール胚性肝細胞誘導体の1つ以上で観察されるものと対比して、ST6GALNAC6、IGFBP5、PDGFD、SURF4、BOC、ADGRD1、MPDU1、RPS4Y1、MME、SET、DOK1、COLEC12、HOXC10、SULF2、ADAMTSL1、ELN、MGRN1、COL15A1、ZEB1、SFRP1、CLDN11、LGALS3BP、CHI3L1、SPG21、PI16、およびMCFD2から成る群から選択される1つ以上の遺伝子の増大した遺伝子発現レベルによって同定される、請求項51に記載の方法。
【請求項５４】
処理のために同定される胚盤胞、単為生殖ES細胞、または核移植ES細胞からの胚性肝細胞誘導体の1つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルが、胚盤胞、単為生殖ES細胞、または核移植ES細胞からの未処理コントロール胚性肝細胞誘導体の1つ以上で観察されるものと対比して約2倍から約5倍増加する、請求項53に記載の方法。
【請求項５５】
処理のために同定される胚盤胞、単為生殖ES細胞、または核移植ES細胞からの胚性肝細胞誘導体の1つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルが、胚盤胞、単為生殖ES細胞、または核移植ES細胞からの未処理コントロール胚性肝細胞誘導体の1つ以上で観察されるものと対比して約5倍増加する、請求項53に記載の方法。
【請求項５６】
処理のために同定される胚盤胞、単為生殖ES細胞、または核移植ES細胞からの胚性肝細胞誘導体の上昇した細胞内ROSレベルが、胚盤胞、単為生殖ES細胞、または核移植ES細胞からの未処理コントロール胚性肝細胞誘導体の1つ以上で観察されるものと対比して、増大した細胞内G-4重鎖（G4）DNA構造形成によって同定される、請求項51に記載の方法。
【請求項５７】
処理のために同定される胚盤胞、単為生殖ES細胞、または核移植ES細胞からの胚性肝細胞誘導体のG4 DNA構造形成が、胚盤胞、単為生殖ES細胞、または核移植ES細胞からの未処理コントロール胚性肝細胞誘導体の1つ以上で観察されるものと対比して約2倍増加する、請求項56に記載の方法。
【請求項５８】
処理のために同定される胚盤胞、単為生殖ES細胞、または核移植ES細胞からの胚性肝細胞誘導体体の上昇した細胞内ROSレベルが、胚盤胞、単為生殖ES細胞、または核移植ES細胞からの未処理コントロール胚性肝細胞誘導体の1つ以上で観察されるものと対比して、増大した8-oxo-グアニン（oxoG）形成によって同定される、請求項51に記載の方法。
【請求項５９】
処理のために同定される胚盤胞、単為生殖ES細胞、または核移植ES細胞からの胚性肝細胞誘導体のoxoG形成が、胚盤胞、単為生殖ES細胞、または核移植ES細胞からの未処理コントロール胚性肝細胞誘導体の1つ以上で観察されるものと対比して約2倍から約3倍増加する、請求項58に記載の方法。
【請求項６０】
以下の工程を含む幹細胞療法のための方法：
（a）対象動物から非多能性細胞を単離する工程；
（b）請求項2−12、19または32−40のいずれか1項に記載の方法によってiPSCを作製する工程；
（c）当該A-iPSCをex vivoで分化細胞に分化させる工程；および
（d）当該分化細胞を対象動物に投与する工程。
【請求項６１】
以下の工程を含む幹細胞療法のための方法：
（a）対象動物から老齢体細胞を単離する工程；
（b）請求項21、28または41−49のいずれか1項に記載の方法によってA-iPSCを作製する工程；
（c）当該A-iPSCをex vivoで分化細胞に分化させる工程；および
（d）当該分化細胞を対象動物に投与する工程。
【請求項６２】
還元型グルタチオンエチルエステル、再プログラミング因子、および複数の非多能性細胞を再プログラミングするための指示を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互引用）本出願は、米国仮特許出願No. 62/531,672（2017年7月12日出願）（その全内容は参照によって本明細書に含まれる）の優先権を主張する。
（連邦政府助成研究に関する記載）本発明は、国立衛生研究所が提供するAG043531により政府の支援を受けて達成された。当該政府は本発明に一定の権利を有する。
（技術分野）
本明細書では、人工多能性幹細胞（iPSC）の発生に関係する方法が開示される。本技術は、一般的には、非多能性細胞（例えば老化体細胞）からiPSCを発生させる方法に関し、当該iPSCは、改善されたゲノム安定性、改善されたDNA損傷応答、増大したZSCAN10発現、低下したグルタチオンシンターゼ（GSS）発現、および/または増大した再プログラミング効率を特徴とする。
【背景技術】
【０００２】
以下の記述は読み手の理解を助けるために提供される。提供される情報または引用される文献のいずれも先行技術を容認するものではない。
人工多能性幹細胞（iPSC）は、患者自身の体細胞を用いて組織適合性移植可能組織を発生させるために非常に大きな潜在能力を有する。高齢患者は変性疾患を罹患しやすくiPSC系療法の恩恵を受けるが、基礎研究および臨床研究の両方が、老齢ドナー組織から発生させたiPSC（A-iPSC）のミトコンドリアおよびゲノムの変異または不安定性を報告している。臨床試験では、老齢黄斑変性（AMD）の治療のために、自己iPSCから分化させた網膜色素上皮（RPE）の移植が2例報告された。A-iPSC由来RPEは1人の患者では疾患の進行を停止させるのに成功したが、第二の患者への移植はiPSCのゲノム異常のために中断された。したがって、A-iPSCにおけるゲノム不安定性に至るメカニズムの同定およびそれらメカニズムを修正する方法の開発は、高齢患者および老齢表現型を特徴とする患者でiPSC系療法を臨床使用するために必須である（老齢表現型は、ライフスタイル（例えば喫煙、過剰アルコール摂取）および/または老齢プロセスから生じ得る）。
【発明の概要】
【０００３】
ある特徴では、本開示は、哺乳動物の非多能性細胞から人工多能性幹細胞（iPSC）を作製する方法を提供し、ここで、当該iPSCは、増大したゲノム安定性、増大したDNA損傷応答、増大したZSCAN10発現、および低下したグルタチオンシンターゼ（GSS）発現の1つ以上を特徴とし、前記方法は、非多能性細胞の再プログラミング開始前、再プログラミング中、および/または再プログラミング後にグルタチオンまたはその誘導体の有効量で処理した非多能性細胞をiPSCの作製を可能にする条件下で培養し、それによって、同様な条件下で増殖させた未処理コントロール非多能性細胞から作製したiPSCと比較して、増大したゲノム安定性、増大したDNA損傷応答、増大したZSCAN10発現、および低下したGSS発現の1つ以上を有するiPSCを作製する工程を含む。
いくつかの実施態様では、当該方法はさらにまた、グルタチオンまたはその誘導体による処理のための非多能性細胞を同定する工程を含み、ここで、処理のために同定される非多能性細胞は、未処理コントロール非多能性細胞で観察される細胞内活性酸素種（ROS）レベルと対比して上昇した細胞内ROSレベルを処理前に発現し、ここで、上昇した細胞内ROSレベルにより、非多能性細胞をグルタチオンまたはその誘導体による処理のための非多能性細胞として同定し、上昇した細胞内ROSレベルの欠如により非多能性細胞をグルタチオンまたはその誘導体による処理のための非多能性細胞として同定しない。
【０００４】
いくつかの実施態様では、グルタチオンまたはその誘導体で処理した非多能性細胞の再プログラミング効率は、未処理コントロール非多能性細胞と対比して増大する。
いくつかの実施態様では、グルタチオンまたはその誘導体による処理は、非多能性細胞のiPSCへの再プログラミング効率を、未処理コントロール非多能性細胞と対比して少なくとも10倍増加させる。
いくつかの実施態様では、グルタチオンまたはその誘導体による処理は、iPSCのZSCAN10発現レベルを、胚性幹細胞（ESC）の対応する発現レベルの約50％以上に回復させる。
いくつかの実施態様では、哺乳動物の非多能性細胞は体細胞である。いくつかの実施態様では、体細胞は老齢体細胞である。いくつかの実施態様では、体細胞は胚期由来の体細胞である。
いくつかの実施態様では、体細胞は、若齢体細胞で観察されるものと対比して増大した細胞内ROSレベルを発現する。
いくつかの実施態様では、体細胞は、線維芽細胞、血液由来細胞、眼組織由来細胞、上皮細胞、骨細胞、軟骨細胞、ニューロン、筋肉細胞、肝臓の細胞、腸の細胞、脾臓細胞、成人幹細胞、および成人幹細胞に由来する前駆細胞（progenitor cell）から成る群から選択される。いくつかの実施態様では、哺乳動物の非多能性細胞は前駆細胞である。
【０００５】
ある特徴では、本開示は、哺乳動物の非多能性細胞から人工多能性幹細胞（iPSC）を作製する方法によって作られたiPSCを提供し、ここで、当該iPSCは、増大したゲノム安定性、増大したDNA損傷応答、増大したZSCAN10発現、および低下したグルタチオンシンターゼ（GSS）発現の1つ以上を特徴とし、前記方法は、非多能性細胞の再プログラミング開始前、再プログラミング中、および/または再プログラミング後にグルタチオンまたはその誘導体の有効量で処理した非多能性細胞を、iPSCの作製を可能にする条件下で培養する工程を含み、グルタチオンまたはその誘導体の有効量で処理した非多能性細胞から作製されたiPSCは、同様な条件下で増殖させた未処理コントロール非多能性細胞から作製されたiPSCと比較して、増大したゲノム安定性、増大したDNA損傷応答、増大したZSCAN10発現、および低下したGSS発現の1つ以上を特徴とする。
いくつかの実施態様では、当該iPSCは、同様な条件下で増殖させた未処理コントロール非多能性細胞から作製されたiPSCと比較して、増大したゲノム安定性を特徴とする。
いくつかの実施態様では、当該iPSCは、同様な条件下で増殖させた未処理コントロール非多能性細胞から作製されたiPSCと比較して、増大したDNA損傷応答を特徴とする。
いくつかの実施態様では、当該iPSCは、同様な条件下で増殖させた未処理コントロール非多能性細胞から作製されたiPSCと比較して、増大したZSCAN10発現を特徴とする。
いくつかの実施態様では、当該iPSCは、同様な条件下で増殖させた未処理コントロール非多能性細胞から作製されたiPSCと比較して、低下したGSS発現を特徴とする。
いくつかの実施態様では、当該iPSCは、同様な条件下で増殖させた未処理コントロール非多能性細胞から作製されたiPSCと比較して、増大したiPSC再プログラミング効率を特徴とする。
いくつかの実施態様では、グルタチオンは還元型グルタチオンエチルエステルである。
【０００６】
ある特徴では、本開示は、増大したゲノム安定性、増大したDNA損傷応答、増大したZSCAN10発現、および低下したグルタチオンシンターゼ（GSS）発現の1つ以上を有する、老齢体細胞から誘導される人工多能性幹細胞（A-iPSC）を作製する方法を提供し、前記方法は、老齢体細胞の再プログラミング開始前、再プログラミング中、および/または再プログラミング後にグルタチオンまたはその誘導体の有効量で処理された老齢体細胞をA-iPSCの作製を可能にする条件下で培養し、それによって、同様な条件下で増殖させた未処理コントロール老齢体細胞から作製されたA-iPSCで観察されるものと比較して、および/または若齢iPSC（Y-iPSC）またはESCで観察されるものに匹敵する、増大したゲノム安定性、増大したDNA損傷応答、増大したiPSC再プログラミング効率、増大したZSCAN10発現、および低下したGSS発現の1つ以上を有するA-iPSCを作製する工程を含む。
いくつかの実施態様では、当該方法はさらにまた、グルタチオンまたはその誘導体による処理のために老齢体細胞を同定する工程を含み、ここで、処理のために同定される老齢体細胞は、未処理コントロール老齢体細胞、若齢体細胞、およびESCの1つ以上と対比して上昇した細胞内活性酸素種（ROS）レベルを処理前に発現し、ここで、上昇した細胞内ROSレベルにより老齢体細胞をグルタチオンまたはその誘導体による処理のための老齢体細胞として同定し、上昇した細胞内ROSレベルの欠如により老齢細胞をグルタチオンまたはその誘導体による処理のための老齢体細胞として同定しない。
【０００７】
ある特徴では、本開示は、増大したゲノム安定性、増大したDNA損傷応答、増大したiPSC再プログラミング効率、増大したZSCAN10発現、および低下したグルタチオンシンターゼ（GSS）発現の1つ以上を有するA-iPSCを作製する方法によって作られたA-iPSCを提供し、前記方法は、老齢体細胞の再プログラミング開始前、再プログラミング中、および/または再プログラミング後にグルタチオンまたはその誘導体の有効量で処理した老齢体細胞を、A-iPSCの作製を可能にする条件下で培養する工程を含み、ここで、グルタチオンまたはその誘導体で処理した老齢体細胞から作製されたA-iPSCは、同様な条件下で増殖させた未処理コントロール老齢体細胞から作製されたA-iPSCで観察されるものと比較して、および/または若齢iPSC（Y-iPSC）またはESCで観察されるものに匹敵する、増大したゲノム安定性、増大したDNA損傷応答、増大したiPSC再プログラミング効率、増大したZSCAN10発現、および低下したGSS発現の1つ以上を特徴とする。
いくつかの実施態様では、当該A-iPSCは、同様な条件下で増殖させた未処理コントロール老齢体細胞から作製されたA-iPSCと比較して、および/または若齢iPSC（Y-iPSC）またはESCで観察されるものに匹敵する、増大したゲノム安定性を特徴とする。
いくつかの実施態様では、当該A-iPSCは、同様な条件下で増殖させた未処理コントロール老齢体細胞から作製されたA-iPSCと比較して、および/または若齢iPSC（Y-iPSC）またはESCで観察されるものに匹敵する、増大したDNA損傷応答を特徴とする。
いくつかの実施態様では、当該A-iPSCは、同様な条件下で増殖させた未処理コントロール老齢体細胞から作製されたA-iPSCと比較して、および/または若齢iPSC（Y-iPSC）またはESCで観察されるものに匹敵する、増大したiPSC再プログラミング効率を特徴とする。
いくつかの実施態様では、当該A-iPSCは、同様な条件下で増殖させた未処理コントロール老齢体細胞から作製されたA-iPSCと比較して、および/または若齢iPSC（Y-iPSC）またはESCで観察されるものに匹敵する、増大したZSCAN10発現を特徴とする。
いくつかの実施態様では、当該A-iPSCは、同様な条件下で増殖させた未処理コントロール老齢体細胞から作製されたA-iPSCと比較して、および/または若齢iPSC（Y-iPSC）またはESCで観察されるものに匹敵する、低下したグルタチオンシンターゼ（GSS）発現を特徴とする。
いくつかの実施態様では、グルタチオンは還元型グルタチオンエチルエステルである。
【０００８】
ある特徴では、本開示は、ゲノム安定性、誘導効率、および再プログラミング品質を改善するために胚盤胞、単為生殖ES細胞、核移植ES細胞から胚性幹細胞誘導体を含む多能性幹細胞の作製方法を提供し、前記方法は、胚の再プログラミング開始前および/または再プログラミング中にグルタチオンまたはその誘導体の有効量で処理した胚をES細胞、単為生殖ES細胞、核移植ES細胞からの作製を可能にする条件下で培養して多能性幹細胞の再プログラミング中に酸化ストレス（ROS）によって媒介される阻害性作用を最小限にし、それによって、同様な条件下で増殖させた未処理コントロール細胞から作製された多能性幹細胞と比較して、改善されたゲノム安定性、改善されたDNA損傷応答、増大した多能性遺伝子発現（ZSCAN10発現を含む）を有する再プログラミング品質、および低下したGSS発現の1つ以上を有する多能性幹細胞を作製する工程を含む。
ある特徴では、本開示は幹細胞療法のための方法を提供し、前記方法は以下の工程を含む：（a）対象動物から非多能性細胞を単離する工程；（b）哺乳動物の非多能性細胞からiPSCを作製する方法によってiPSCを作製する工程、ここで、前記iPSCは、増大したゲノム安定性、増大したDNA損傷応答、増大したZSCAN10発現、および低下したグルタチオンシンターゼ（GSS）発現の1つ以上を特徴とし、前記iPSCを作製する方法は、非多能性細胞の再プログラミング開始前、再プログラミング中、および/または再プログラミング後にグルタチオンまたはその誘導体の有効量で処理した非多能性細胞をiPSCの作製を可能にする条件下で培養する工程を含み、グルタチオンまたはその誘導体で処理した非多能性細胞から作製されたiPSCは、同様な条件下で増殖させた未処理コントロール非多能性細胞から作製されたiPSCと比較して、増大したゲノム安定性、増大したDNA損傷応答、増大したiPSC再プログラミング効率、増大したZSCAN10発現、および低下したGSS発現の1つ以上を特徴とする；（c）当該iPSCをex vivoで分化細胞に分化させる工程；および（d）当該分化細胞を対象動物に投与する工程。
【０００９】
ある特徴では、本開示は幹細胞療法のための方法を提供し、前記方法は以下の工程を含む：（a）対象動物から老齢体細胞を単離する工程；（b）増大したゲノム安定性、増大したDNA損傷応答、増大したiPSC再プログラミング効率、増大したZSCAN10発現、および低下したグルタチオンシンターゼ（GSS）発現の1つ以上を有するA-iPSCを作製する方法によってA-iPSCを作製する工程、ここで、前記方法は、老齢体細胞の再プログラミング開始前、再プログラミング中、および/または再プログラミング後にグルタチオンまたはその誘導体の有効量で処理した老齢体細胞をA-iPSCの作製を可能にする条件下で培養する工程を含み、グルタチオンまたはその誘導体で処理した老齢体細胞から作製されたA-iPSCは、同様な条件下で増殖させた未処理コントロール老齢体細胞から作製されたA-iPSCで観察されるものと比較して、および/または若齢iPSC（Y-iPSC）またはESCで観察されるものに匹敵する、増大したゲノム安定性、増大したDNA損傷応答、増大したiPSC再プログラミング効率、増大したZSCAN10発現、および低下したGSS発現の1つ以上を特徴とする；（c）当該A-iPSCをex vivoで分化細胞に分化させる工程；および（d）当該分化細胞を対象動物に投与する工程。
いくつかの実施態様では、処理のために同定される非多能性細胞の上昇した細胞内ROSレベルは、未処理コントロール非多能性細胞で観察されるものと対比して、レベルの増大を示す1つ以上の代謝物を含む代謝プロフィールによって同定される。
いくつかの実施態様では、レベルの増大を示す1つ以上の代謝物は、アデノシン、シチジン、キサンチン、およびシチジン3’一リン酸（3’-CMP）から成る群から選択される。
いくつかの実施態様では、処理のために同定される非多能性細胞の上昇した細胞内ROSレベルは、未処理コントロール非多能性細胞で観察されるものと対比して、ST6GALNAC6、IGFBP5、PDGFD、SURF4、BOC、ADGRD1、MPDU1、RPS4Y1、MME、SET、DOK1、COLEC12、HOXC10、SULF2、ADAMTSL1、ELN、MGRN1、COL15A1、ZEB1、SFRP1、CLDN11、LGALS3BP、CHI3L1、SPG21、PI16、およびMCFD2から成る群から選択される1つ以上の遺伝子の増大した遺伝子発現レベルによって同定される。
【００１０】
いくつかの実施態様では、処理のために同定される非多能性細胞の1つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルは、未処理コントロール非多能性細胞で観察されるものと対比して約2倍から約5倍増大する。
いくつかの実施態様では、処理のために同定される非多能性細胞の1つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルは、未処理コントロール非多能性細胞で観察されるものと対比して約5倍増大する。
いくつかの実施態様では、処理のために同定される非多能性細胞の上昇した細胞内ROSレベルは、未処理コントロール非多能性細胞で観察されるものと対比して、増大した細胞内G-四重鎖（G4）DNA構造形成によって同定される。
いくつかの実施態様では、処理のために同定される非多能性細胞のG4 DNA構造形成は、未処理コントロール非多能性細胞で観察されるものと対比して約2倍増大する。
いくつかの実施態様では、処理のために同定される非多能性細胞の上昇した細胞内ROSレベルは、未処理コントロール非多能性細胞で観察されるものと対比して、増大した8-oxo-グアニン（oxoG）形成によって同定される。
いくつかの実施態様では、処理のために同定される非多能性細胞のoxoG形成は、未処理コントロール非多能性細胞で観察されるものと対比して約2倍から約3倍増加する。
いくつかの実施態様では、処理のために同定される老齢体細胞の上昇した細胞内ROSレベルは、未処理コントロール老齢体細胞、若齢体細胞およびESCの1つ以上で観察されるものと対比して、レベルの増大を示す1つ以上の代謝物を含む代謝プロフィールによって同定される。
いくつかの実施態様では、レベルの増大を示す1つ以上の代謝物は、アデノシン、シチジン、キサンチン、およびシチジン3’一リン酸（3’-CMP）から成る群から選択される。
いくつかの実施態様では、処理のために同定される老齢体細胞の上昇した細胞内ROSレベルは、未処理コントロール老齢体細胞、若齢体細胞、およびESCの1つ以上で観察されるものと対比して、ST6GALNAC6、IGFBP5、PDGFD、SURF4、BOC、ADGRD1、MPDU1、RPS4Y1、MME、SET、DOK1、COLEC12、HOXC10、SULF2、ADAMTSL1、ELN、MGRN1、COL15A1、ZEB1、SFRP1、CLDN11、LGALS3BP、CHI3L1、SPG21、PI16、およびMCFD2から成る群から選択される1つ以上の遺伝子の増大した遺伝子発現レベルによって同定される。
【００１１】
いくつかの実施態様では、処理のために同定される老齢体細胞の1つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルは、未処理コントロール老齢体細胞、若齢体細胞、およびESCの1つ以上で観察されるものと対比して約2倍から約5倍増加する。
いくつかの実施態様では、処理のために同定される老齢体細胞の1つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルは、未処理コントロール老齢体細胞、若齢体細胞、およびESCの1つ以上で観察されるものと対比して約5倍増加する。
いくつかの実施態様では、処理のために同定される老齢体細胞の上昇した細胞内ROSレベルは、未処理コントロール老齢体細胞、若齢体細胞、およびESCの1つ以上で観察されるものと対比して、増大した細胞内G-四重鎖（G4）DNA構造形成によって同定される。
いくつかの実施態様では、処理のために同定される老齢体細胞のG4 DNA構造形成は、未処理コントロール老齢体細胞、若齢体細胞、およびESCの1つ以上で観察されるものと対比して約2倍増加する。
いくつかの実施態様では、処理のために同定される老齢体細胞の上昇した細胞内ROSレベルは、未処理コントロール老齢体細胞、若齢体細胞、およびESCの1つ以上で観察されるものと対比して、増大した8-oxo-グアニン（oxoG）形成によって同定される。
いくつかの実施態様では、処理のために同定される老齢体細胞のoxoG形成は、未処理コントロール老齢体細胞、若齢体細胞、およびESCの1つ以上で観察されるものと対比して約2倍から約3倍増加する。
【００１２】
いくつかの実施態様では、当該方法はさらにまた、グルタチオンまたはその誘導体による処理のために、胚盤胞、単為生殖ES細胞、または核移植ES細胞からの胚性肝細胞誘導体を同定する工程を含み、ここで、処理のために同定される胚盤胞、単為生殖ES細胞、または核移植ES細胞からの胚性肝細胞誘導体は、胚盤胞、単為生殖ES細胞、または核移植ES細胞からの未処理コントロール胚性肝細胞誘導体の1つ以上と対比して、上昇した活性酸素種（ROS）レベルを処理前に発現し、ここで、上昇した細胞内ROSレベルにより、グルタチオンまたはその誘導体による処理のための胚盤胞、単為生殖ES細胞、または核移植ES細胞からの胚性肝細胞誘導体を同定し、上昇した細胞内ROSレベルの欠如によりグルタチオンまたはその誘導体による処理のための胚盤胞、単為生殖ES細胞、または核移植ES細胞からの胚性肝細胞誘導体として同定しない。
いくつかの実施態様では、処理のために同定される胚盤胞、単為生殖ES細胞、または核移植ES細胞からの胚性肝細胞誘導体の上昇した細胞内ROSレベルは、胚盤胞、単為生殖ES細胞、または核移植ES細胞からの未処理コントロール胚性肝細胞誘導体の1つ以上で観察されるものと対比して、レベルの増大を示す1つ以上の代謝物を含む代謝プロフィールによって同定される。
いくつかの実施態様では、レベルの増大を示す1つ以上の代謝物は、アデノシン、シチジン、キサンチン、およびシチジン3’一リン酸（3’-CMP）から成る群から選択される。
いくつかの実施態様では、処理のために同定される胚盤胞、単為生殖ES細胞、または核移植ES細胞からの胚性肝細胞誘導体の上昇した細胞内ROSレベルは、胚盤胞、単為生殖ES細胞、または核移植ES細胞からの未処理コントロール胚性肝細胞誘導体の1つ以上で観察されるものと対比して、ST6GALNAC6、IGFBP5、PDGFD、SURF4、BOC、ADGRD1、MPDU1、RPS4Y1、MME、SET、DOK1、COLEC12、HOXC10、SULF2、ADAMTSL1、ELN、MGRN1、COL15A1、ZEB1、SFRP1、CLDN11、LGALS3BP、CHI3L1、SPG21、PI16、およびMCFD2から成る群から選択される1つ以上の遺伝子の増大した遺伝子発現レベルによって同定される。
【００１３】
いくつかの実施態様では、処理のために同定される胚盤胞、単為生殖ES細胞、または核移植ES細胞からの胚性肝細胞誘導体の1つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルは、胚盤胞、単為生殖ES細胞、または核移植ES細胞からの未処理コントロール胚性肝細胞誘導体の1つ以上で観察されるものと対比して約2倍から約5倍増加する。
いくつかの実施態様では、処理のために同定される胚盤胞、単為生殖ES細胞、または核移植ES細胞からの胚性肝細胞誘導体の1つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルは、胚盤胞、単為生殖ES細胞、または核移植ES細胞からの未処理コントロール胚性肝細胞誘導体の1つ以上で観察されるものと対比して約5倍増大する。
いくつかの実施態様では、処理のために同定される胚盤胞、単為生殖ES細胞、または核移植ES細胞からの胚性肝細胞誘導体の上昇した細胞内ROSレベルは、胚盤胞、単為生殖ES細胞、または核移植ES細胞からの未処理コントロール胚性肝細胞誘導体の1つ以上で観察されるものと対比して、増大した細胞内G-4重鎖（G4）DNA構造形成によって同定される。
いくつかの実施態様では、処理のために同定される胚盤胞、単為生殖ES細胞、または核移植ES細胞からの胚性肝細胞誘導体のG4 DNA構造形成は、胚盤胞、単為生殖ES細胞、または核移植ES細胞からの未処理コントロール胚性肝細胞誘導体の1つ以上で観察されるものと対比して約2倍増加する。
いくつかの実施態様では、処理のために同定される胚盤胞、単為生殖ES細胞、または核移植ES細胞からの胚性肝細胞誘導体の上昇した細胞内ROSレベルは、胚盤胞、単為生殖ES細胞、または核移植ES細胞からの未処理コントロール胚性肝細胞誘導体の1つ以上で観察されるものと対比して、増大した8-oxo-グアニン（oxoG）形成によって同定される。
いくつかの実施態様では、処理のために同定される胚盤胞、単為生殖ES細胞、または核移植ES細胞からの胚性肝細胞誘導体のoxoG形成は、胚盤胞、単為生殖ES細胞、または核移植ES細胞からの未処理コントロール胚性肝細胞誘導体の1つ以上で観察されるものと対比して約2倍から約3倍増加する。
【００１４】
ある特徴では、本開示は幹細胞療法のための方法を提供し、前記方法は以下の工程を含む：（a）対象動物から非多能性細胞を単離する工程；（b）哺乳動物の非多能性細胞からiPSCを作製する方法によってiPSCを作製する工程、ここで、前記iPSCは、増大したゲノム安定性、増大したDNA損傷応答、増大したZSCAN10発現、および低下したグルタチオンシンターゼ（GSS）発現の1つ以上を特徴とし、前記iPSCを作製する方法は、非多能性細胞の再プログラミング開始前、再プログラミング中、および/または再プログラミング後にグルタチオンまたはその誘導体の有効量で処理した非多能性細胞をiPSCの作製を可能にする条件下で培養する工程を含み、ここで、グルタチオンまたはその誘導体で処理された非多能性細胞から作製されたiPSCは、同様な条件下で増殖させた未処理コントロール非多能性細胞から作製したiPSCと比較して、増大したゲノム安定性、増大したDNA損傷応答、増大したiPSC再プログラミング効率、増大したZSCAN10発現、および低下したGSS発現の1つ以上を特徴とし、ここで、処理のために同定される非多能性細胞は、未処理コントロール非多能性細胞で観察されるものと対比して処理前に上昇した活性酸素種（ROS）レベルを発現し、当該上昇した細胞内ROSレベルにより非多能性細胞をグルタチオンまたはその誘導体による処理のための非多能性細胞として同定し、上昇した細胞内ROSレベルの欠如により非多能性細胞をグルタチオンまたはその誘導体による処理のための非多能性細胞として同定しない；（c）当該iPSCをex vivoで分化細胞に分化させる工程；および（d）当該分化細胞を対象動物に投与する工程。
いくつかの実施態様では、処理のために同定される非多能性細胞の上昇した細胞内ROSレベルは、未処理コントロール非多能性細胞で観察されるものと対比して増大したレベルを示す1つ以上の代謝物を含む代謝プロフィールによって同定される。
いくつかの実施態様では、レベルの増大を示す1つ以上の代謝物は、アデノシン、シチジン、キサンチン、およびシチジン3’一リン酸（3’-CMP）から成る群から選択される。
【００１５】
いくつかの実施態様では、処理のために同定される非多能性細胞の上昇した細胞内ROSレベルは、未処理コントロール非多能性細胞で観察されるものと対比して、ST6GALNAC6、IGFBP5、PDGFD、SURF4、BOC、ADGRD1、MPDU1、RPS4Y1、MME、SET、DOK1、COLEC12、HOXC10、SULF2、ADAMTSL1、ELN、MGRN1、COL15A1、ZEB1、SFRP1、CLDN11、LGALS3BP、CHI3L1、SPG21、PI16、およびMCFD2から成る群から選択される1つ以上の遺伝子の増大した遺伝子発現レベルによって同定される。
いくつかの実施態様では、処理のために同定される非多能性細胞の1つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルは、未処理コントロール非多能性細胞で観察されるものと対比して約2倍から約5倍増加する。
いくつかの実施態様では、処理のために同定される非多能性細胞の1つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルは、未処理コントロール非多能性細胞で観察されるものと対比して約5倍増加する。
いくつかの実施態様では、処理のために同定される非多能性細胞の上昇した細胞内ROSレベルは、未処理コントロール非多能性細胞で観察されるものと対比して、増大した細胞内G-四重鎖（G4）DNA構造形成によって同定される。
いくつかの実施態様では、処理のために同定される非多能性細胞のG4 DNA構造形成は、未処理コントロール非多能性細胞で観察されるものと対比して約2倍増加する。
いくつかの実施態様では、処理のために同定される非多能性細胞の上昇した細胞内ROSレベルは、未処理コントロール非多能性細胞で観察されるものと対比して、増大した8-oxo-グアニン（oxoG）形成によって同定される。
いくつかの実施態様では、処理のために同定される非多能性細胞のoxoG形成は、未処理コントロール非多能性細胞で観察されるものと対比して約2倍から約3倍増加する。
【００１６】
ある特徴では、本開示は幹細胞療法のための方法を提供し、前記方法は以下の工程を含む：（a）対象動物から老齢体細胞を単離する工程；（b）増大したゲノム安定性、増大したDNA損傷応答、増大したiPSC再プログラミング効率、増大したZSCAN10発現、および低下したグルタチオンシンターゼ（GSS）発現の1つ以上を有するA-iPSCを作製する方法によってiPSCを作製する工程、ここで、前記方法は、老齢体細胞の再プログラミング開始前、再プログラミング中、および/または再プログラミング後にグルタチオンまたはその誘導体の有効量で処理した老齢体細胞をA-iPSCの作製を可能にする条件下で培養する工程を含み、ここで、グルタチオンまたはその誘導体で処理された老齢体細胞から作製されたA-iPSCは、同様な条件下で増殖させた未処理コントロール老齢体細胞から作製されたA-iPSCで観察されるものと比較して、および/または若齢iPSC（Y-iPSC）またはESCで観察されるものに匹敵する、増大したゲノム安定性、増大したDNA損傷応答、増大したiPSC再プログラミング効率、増大したZSCAN10発現、および低下したGSS発現の1つ以上を特徴とし、ここで、処理のために同定される老齢体細胞は、未処理コントロール老齢体細胞、若齢体細胞およびESCの1つ以上と対比して処理前に上昇した細胞内活性酸素種（ROS）レベルを発現し、当該上昇細胞内ROSレベルによりグルタチオンまたはその誘導体による処理のための老齢体細胞が同定され、上昇した細胞内ROSレベルの欠如により老齢体細胞をグルタチオンまたはその誘導体による処理のための老齢体細胞として同定しない；（c）当該A-iPSCをex vivoで分化細胞に分化させる工程；および（d）当該分化細胞を対象動物に投与する工程。
【００１７】
いくつかの実施態様では、処理のために同定される老齢体細胞の上昇した細胞内ROSレベルは、未処理コントロール老齢体細胞、若齢体細胞およびESCの1つ以上で観察されるものと対比してレベルの増大を示す1つ以上の代謝物を含む代謝プロフィールによって同定される。
いくつかの実施態様では、レベルの増大を示す1つ以上の代謝物は、アデノシン、シチジン、キサンチン、およびシチジン3’一リン酸（3’-CMP）から成る群から選択される。
いくつかの実施態様では、処理のために同定される老齢体細胞の上昇した細胞内ROSレベルは、未処理コントロール老齢体細胞、若齢体細胞およびESCの1つ以上で観察されるものと対比して、ST6GALNAC6、IGFBP5、PDGFD、SURF4、BOC、ADGRD1、MPDU1、RPS4Y1、MME、SET、DOK1、COLEC12、HOXC10、SULF2、ADAMTSL1、ELN、MGRN1、COL15A1、ZEB1、SFRP1、CLDN11、LGALS3BP、CHI3L1、SPG21、PI16、およびMCFD2から成る群から選択される1つ以上の遺伝子の増大した遺伝子発現レベルによって同定される。
いくつかの実施態様では、処理のために同定される老齢体細胞の1つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルは、未処理コントロール老齢体細胞、若齢体細胞およびESCの1つ以上で観察されるものと対比して約2倍から約5倍増加する。
いくつかの実施態様では、処理のために同定される老齢体細胞の1つ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルは、未処理コントロール老齢体細胞、若齢体細胞およびESCの1つ以上で観察されるものと対比して約5倍増加する。
いくつかの実施態様では、処理のために同定される老齢体細胞の上昇した細胞内ROSレベルは、未処理コントロール老齢体細胞、若齢体細胞およびESCの1つ以上で観察されるものと対比して、増大した細胞内G-四重鎖（G4）DNA構造形成によって同定される。
いくつかの実施態様では、処理のために同定される老齢体細胞のG4 DNA構造形成は、未処理コントロール老齢体細胞、若齢体細胞およびESCの1つ以上で観察されるものと対比して約2倍増加する。
いくつかの実施態様では、処理のために同定される老齢体細胞の上昇した細胞内ROSレベルは、未処理コントロール老齢体細胞、若齢体細胞およびESCの1つ以上で観察されるものと対比して、増大した8-oxo-グアニン（oxoG）形成によって同定される。
いくつかの実施態様では、処理のために同定される老齢体細胞のoxoG形成は、未処理コントロール老齢体細胞、若齢体細胞およびESCの1つ以上で観察されるものと対比して約2倍から約3倍増加する。
ある特徴では、本開示は、還元型グルタチオンエチルエステル、再プログラミング因子、および複数の非多能性細胞を再プログラミングするための指示を含むキットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】Y-iPSCと比較したマウスA-iPSCの損なわれたゲノム完全性とDNA損傷応答および一過性ZSCAN10発現後の回復（A）各A-iPSCにおける細胞遺伝学解析によって認められた染色体異常の数、およびZSCAN発現による回復。エラーバーは、グループごとに解析した独立クローンの平均の標準誤差を示す。解析した中期の総数は各グループで示されている。統計的有意性は両側ｔ検定によって決定した。（B）ESC、Y-iPSC、A-iPSC、およびA-iPSC-ZSCAN10のin situ 細胞死アッセイは、フレオマイシン処理（2時間、30μg/mL）の終了から15時間後に実施した。A-iPSCは、ESC、Y-iPSCおよびA-iPSC-ZSCAN10と比較して細胞死について少ない染色細胞を示す。陰性コントロールは、酵素反応非存在下で染料処理したY-iPSCである。核はDAPIで染色した。スケールバーは100μmを示す。（C）フレオマイシン処理後のDNA断片化アッセイによるアポトーシス応答の画像解析による定量。エラーバーは、技術的反復実験および生物学的反復実験の平均の標準誤差を示す。生物学的反復実験の正確な数は各グループの下に示されている。統計的有意性は独立両側ｔ検定によって決定した。（D）フレオマイシン処理（2時間、30μg/mL）後にイムノブロットによってモニターしたA-iPSCにおける低下ATMリン酸化（pATM）およびZSCAN10発現時のATM活性化の回復。赤線は、両方のイムノブロットで内部コントロールとしてローディングされた同じESCサンプルを示す。（E）フレオマイシン処理（2時間、30μg/mL）後のA-iPSCにおける低いγ-H2AX（リン酸化H2AX）およびZSCAN10発現によるγ-H2AXシグナルの回復を示す免疫組織化学。（F）免疫染色によって定量した、γ-H2AX陽性細胞：DAPI染色核比。γ-H2AX点状巣を示す細胞のみを数えた。数えた独立コロニーの数は各グループで示されている。エラーバーは、独立コロニーの平均の標準誤差を示す。統計的有意性は独立両側ｔ検定によって決定した。（G）γ-H2AXのイムノブロット解析は免疫組織化学所見を裏付ける。（H）独立3クローンにおける、フレオマイシン処理（2時間、30μg/mL）後のA-iPSCにおける損なわれたp53 DNA損傷応答およびZSCAN10の一過性発現による回復を示すイムノブロットである。赤線は、両方のイムノブロットで内部コントロールとしてローディングされた同じESCサンプルを示す。
【図２】Y-iPSCおよびESCと比較したマウスA-iPSCのDNA損傷応答およびゲノム安定性におけるZSCAN10機能の評価（A）老齢組織ドナーから発生させたA-ntESCおよびA-iPSCの弁別的DNA損傷応答を示すpATMイムノブロット。A-ntESCの3つの独立クローンは、フレオマイシン処理後に正常なDNA損傷応答を示す。（B）A-iPSCにおけるZSCAN10発現の貧弱な活性化およびZSCAN10の一過性発現による完全な活性化を示す、ZSCAN10 mRNAレベルのQ-PCR。内因性ZSCAN10レベルはβ-アクチンに対して正規化した。エラーバーは、各サンプルグループで3つの独立クローンを用いた2つの技術的反復実験の平均の標準誤差を示す。統計的有意性は両側ｔ検定によって決定した。（C）フレオマイシン処理（2時間、30μg/mL）後の3つの独立クローンにおけるZSCAN10 shRNA発現を有するY-iPSCの損なわれたATM/H2AX/p53 DNA損傷応答を示すイムノブロット。（D）放射線照射後のATM/H2AX/p53-媒介DNA損傷応答。A-iPSCを除き、ESCおよびY-iPSCは放射線照射後にpATM/γ-H2AX/p53レベルの増加を示す。A-iPSCにおいては、放射線照射に対するATM/H2AX/p53応答はZSCAN10の一過性発現によって回復する。（E）A-iPSCのより高い変異率の概算およびZSCAN10による回復。変異頻度は、6-チオグアニンによって媒介される負の選別の存在下におけるHPRTプロモーター活性の不活化によって概算した。エラーバーは、各サンプルグループで4つの独立クローンを用いた3つの生物学的反復実験の平均の標準誤差を示す。統計的有意性は両側ｔ検定によって決定した。
【図３】マウスA-iPSCのROS-グルタチオン恒常性失調および過剰活性化GSSの低下を介するZSCAN10発現による回復（A−B）A-iPSCにおけるZSCAN10発現は、多能性遺伝子の発現に影響を与え、A-iPSCの遺伝子発現プロフィールをY-iPSCのプロフィールにより類似させる。生物学的反復実験（nは2以上）として各体細胞および多能性細胞について独立クローンを用い、老齢および若齢線維芽細胞（A-SC、Y-SC）、ESC、Y-iPSC、A-iPSC、およびA-iPSC-ZSCAN10の全ゲノム発現プロフィールを解析に加えた（A）。全ゲノム発現プロフィールを用いた主成分分析（PCA）（B）。ヒートマップは、サンプルの階層クラスタリングおよびピアソン相関係数によって測定したペアワイズ遺伝子発現類似性を示す。（C）GSS mRNAレベルのA-iPSCにおける過剰発現およびZSCAN10発現によるダウンレギュレーションを示すQ-PCR。エラーバーは、各サンプルグループで3つの独立クローンを用いた2つの技術的反復実験の平均の標準誤差を示す。統計的有意性は両側ｔ検定によって決定した。（D）A-iPSCにおける上昇グルタチオンによる過剰酸化能およびZSCAN10発現による回復。全グルタチオンレベルを測定して最大酸化能力を決定した。A-iPSCにおけるグルタチオンの過剰酸化能は、ZSCAN10の一過性発現によって、ESCおよびY-iPSCのレベルに対して正規化した。平均±標準偏差は、各条件の各サンプルグループで2つの独立クローンを用い4つの生物学的反復実験についてプロットされた。グルタチオン分析はグルタチオン蛍光分析アッセイを用いて実施した。統計的有意性は両側ｔ検定によって決定した。（E）ESC、ntESC、Y-iPSC、A-iPSC-ZSCAN10、およびA-iPSCのROSスカベンジャー活性。細胞内ROSアッセイキット（DCFDAアッセイ）を用いて、H2O2スカベンジャー活性を測定した。A-iPSCは強いH2O2スカベンジャー活性を示し、TBHP（tert-ブチル過酸化水素；H2O2の安定化学形、3時間）による処理に対しては低下した応答を有する。前記応答はZSCAN10発現によって回復する。平均±標準偏差は、各条件の各サンプルグループで2つの独立クローンを用い3つの生物学的反復実験についてプロットされた。統計的有意性は両側ｔ検定によって決定した。（F）画像定量によるGSS shRNAを発現するA-iPSおよびY-iPSC-GSSのアポトーシスアッセイ。低いアポトーシス応答（DNA断片化アッセイ）がフレオマイシン処理（2時間、30μg/mL）から15時間後にA-iPSで認められ、GSSダウンレギュレーションによりA-iPSで回復する。Y-iPSCでのGSSの一過性発現もまたアポトーシス応答を低下させる。エラーバーは、各サンプルグループで2つの独立クローンを用いた3つの生物学的反復実験の平均の標準誤差を示す。統計的有意性は両側ｔ検定によって決定した。（G）A-iPSの3つの独立クローンにおけるGSSのshRNA媒介ノックダウンによるフレオマイシン処理後のDNA損傷応答の回復を示すpATMのイムノブロット。（H）GSS cDNAのレンチウイルス発現は、フレオマイシン処理後のY-iPSCの3つの独立クローンにおいてDNA損傷応答を損なうことを示すpATM/γ-H2AX/p53のイムノブロット。
【図４】ヒトA-hiPSCのDNA損傷応答およびゲノム完全性に対するZSCAN10機能の評価（A）既知の異常な細胞遺伝学シグネチャーを有する3つの移入A-hiPSCクローンを用いてpATMおよびβ-アクチンタンパク質のレベルを示すイムノブロット。（B）ZSCAN10のQ-PCR。エラーバーは、A-iPSC-JAおよびA-iPSC-LSのサンプルの2つの技術的反復実験および3つの生物学的反復実験を除いて、各サンプルグループで3つの独立クローンを用いた2つの技術的反復実験の平均の標準誤差を示す。統計的有意性は両側ｔ検定によって決定した。（C）GSSのQ-PCR。エラーバーは、A-iPSC-JAおよびA-iPSC-LSのサンプルの2つの技術的反復実験および3つの生物学的反復実験を除いて、各サンプルグループで3つの独立クローンを用いた2つの技術的反復実験の平均の標準誤差を示す。統計的有意性は両側ｔ検定によって決定した。（D）A-hiPSCの5つの独立クローン、Y-hiPSCの5つの独立クローン、およびZSCAN10を発現するA-hiPSCの5つのクローンにおけるpATMおよびβ-アクチンのレベルを示すイムノブロット。（E）フレオマイシン処理（2時間、30μg/mL）後の3つの独立クローンにおける、ZSCAN10 shRNA発現を有するY-hiPSCの損なわれたATM DNA損傷応答を示すイムノブロット。（F）4つの独立クローンでZSCAN10 shRNA発現を有するY-hiPSCのコピー数プロファイリング分析。
【図５】ZSCAN10およびGSSの脱調節によって引き起こされるヒトA-hiPSCのDNA損傷応答障害並びにZSCAN10発現による回復（A）A-hiPSCにおける上昇グルタチオンによる過剰な酸化能およびZSCAN10発現による回復。全グルタチオンレベルを測定して最大酸化能を決定した。A-hiPSCにおけるグルタチオンの過剰酸化能は、ZSCAN10の一過性発現によるhESCおよびY-hiPSCのレベルに対して正規化する。グルタチオン分析はグルタチオン蛍光分析アッセイを用いて実施する。平均±標準偏差は、各条件の各サンプルグループで2つの独立クローンを用い3つの生物学的反復実験についてプロットされる。統計的有意性は両側ｔ検定によって決定した。（B）hESC、Y-hiPSC、A-hiPSC、およびA-hiPSC-ZSCAN10のROSスカベンジャー活性。細胞内ROSアッセイキット（DCFDAアッセイ）を用いて、H2O2スカベンジャー活性を測定した。A-hiPSCは強いH2O2スカベンジャー活性を示し、TBHP（tert-ブチル過酸化水素；H2O2の安定化学形、3時間）による処理に対しては低下した応答を有する。前記応答はZSCAN10発現によって回復する。平均±標準偏差は、各条件の各サンプルグループで4つの生物学的反復実験についてプロットされる。統計的有意性は両側ｔ検定によって決定した。（C）GSSのshRNA媒介ノックダウンを有するA-hiPSCの3つの独立クローンにおけるフレオマイシン処理後のDNA損傷応答の回復を示すpATMのイムノブロット。（D）GSS cDNAのレンチウイルス発現は、フレオマイシン処理後のY-hiPSCの3つの独立クローンでDNA損傷応答を障害することを示すpATMのイムノブロット。（E−G）ヒトiPSCのコピー数プロファイリング分析。模式図は、7つの再構成A-hiPSC、4つの非再構成A-hiPSC、およびA-hiPSCが遺伝学的に制御された設定にある5つの非再構成A-hiPSC-ZSCAN10を示す。10の非再構成Y-hiPSC（異なる組織ドナーから発生させた）もまた加えられた。A-hiPSC（n＝11（7/11）、p＝0.64）、A-hiPSC（n＝5（0/5）、p*＝6.3E-3）およびY-hiPSC（n＝10（0/10）、p*＜4E-5）。カッコ内の数字は検出された再構成を示し、pおよびp*は、それぞれ、二項分布を用い系統効果の非存在下で非再構成検出の観察される尤度および概算される尤度である。
【図６】A-iPSにおけるゲノム不安定性を引き起す原因としての高い体細胞ROSおよびA-iPS再プログラミング初期段階におけるグルタチオン処理による回復（A）MitoSOX染色によって測定した体細胞ROS。ミトコンドリア超酸化物インジケーター、MitoSOX RED染料（ThermoFisher, M36008）を用いて体細胞ROSを測定した。（B）画像基準定量（ImageJソフトウェア）を用いたMitoSOX染色レベルの定量。エラーバーは独立コロニーの平均の標準誤差を示す。統計的有意性は独立両側ｔ検定によって決定した。（C）グルタチオンの安定形（還元型グルタチオンエチルエステルの3mM、CAT #G-275-500（GoldBio））を用いた、再プログラミングウイルス感染1日前から再プログラミングウイルス感染10日後の例示的A-iPSC再プログラミングの模式図。（D）グルタチオンで処理したヒトA-hiPSCのコピー数プロファイリング分析。模式図は、グルタチオンで処理されていない11クローンに由来する7つの再構成A-iPSCと比較した、グルタチオンで処理した10の非再構成A-iPSCを示す。（E）グルタチオン処理A-iPSCは、フレオマイシン処理後に生物学的独立クローンでDNA損傷応答が障害されることを示すpATMのイムノブロット。
【図７】A-iPSでゲノム不安定性を引き起す発端としての組織ドナー間におけるより高い体細胞ROSおよびA-iPS再プログラミング初期段階のグルタチオン処理による回復（A−B）MitoSOX染色によって測定した体細胞ROS。ミトコンドリア超酸化物インジケーター、MitoSOX RED染料（ThermoFisher, M36008）を用いて、B6CBAマウス由来若齢体細胞（Y-SC）およびB6129とB6CBAマウス由来老齢体細胞（A-SC）（A）、並びにMRC5ドナー由来ヒト若齢体細胞（Y-SC）およびLSとAG4ドナー由来ヒト老齢体細胞（A-SC）（B）から体細胞ROSを測定した。培養液中のグルタチオンの安定形（還元型グルタチオンエチルエステルの3mM、CAT #G-275-500（GoldBio））で3日間処理したAG4ドナー由来A-SCにおける体細胞ROSの低下レベル（A-SC-AG4-グルタチオン）（B）。スケールバーは100μmを示す。（C−D）図７Aおよび7Bのサンプルの画像基準定量（ImageJソフトウェア）を用いた、MitoSOX染色（ROS）レベルの定量。エラーバーは、独立コロニー（n＝10）の平均の標準誤差を示す。統計的有意性は独立両側ｔ検定によって決定した。（E−F）マウスおよびヒトドナーに由来する図S6AおよびS6Bのドナー体細胞の再プログラミングiPSCの代表的表現型。図7Bおよび7Dの還元型グルタチオンエチルエステル処理によってROSが低下したA-SC-AG4体細胞を調べた。（G）グルタチオン処理されたA-iPSCはフレオマイシン処理後に生物学的独立クローンでDNA損傷応答を回復することを示すpATMのイムノブロット。A-iPSCは、再プログラミング初期段階前および初期段階中に（再プログラミングウイルス感染1日前から再プログラミングウイルス感染後10日）、3mMの還元型グルタチオンエチルエステル処理で発生させた。（H）10クローンのグルタチオン処理ヒトA-hiPSCのコピー数プロファイリング分析。（上段パネル）。模式図は、図5Eのグルタチオン処理されていない11クローンに由来する7つの再構成A-iPSC（下段パネル）と比較した、グルタチオン処理された10の非再構成A-iPSCを示す。A-hiPSC（n＝11（7/11）、p＝0.64）およびA-hiPSC-グルタチオン（n＝10（0/10）、p*＜4E-5)。p値は、それぞれ、二項分布を用い系統効果の非存在下で非再構成検出の観察される尤度（p）および概算される尤度（p*）である。（I）ZSCAN10のQ-PCR。エラーバーは、図7Gの各サンプルグループで独立クローンを用いた2つの技術的反復実験の平均の標準誤差を示す。統計的有意性は両側ｔ検定によって決定した。（J）GSSのQ-PCR。エラーバーは、図7Gの各サンプルグループで独立クローンを用いた2つの技術的反復実験の平均の標準誤差を示す。統計的有意性は両側ｔ検定によって決定した。
【図８】A-iPSCの10の独立クローンにおけるフレオマイシン処理後のBSO（0.5mM）媒介GSS阻害によるDNA損傷応答の回復を示す、pATMのイムノブロット。
【図９Ａ−９Ｃ】図9Aは、老齢体細胞（A-SC（AG4））および若齢体細胞（Y-SC（MRC5））間におけるHT12 Illuminaマイクロアレー遺伝子発現分析を示す。図9Bは、老齢体細胞（AG4）および若齢体細胞（MRC5）間で弁別的に発現される遺伝子を列挙する。図9Cは、分子機能を基準にして老齢体細胞および若齢体細胞間で弁別的に発現される遺伝子を分ける円グラフである。1つの遺伝子（PRDX2）は酸化還元調節に必要とされることが見出された（GO:0016209）。
【図１０】図10は、AG4細胞、および本技術の方法にしたがって還元型グルタチオンエチルエステルで処理したAG4細胞の再プログラミング効率を比較する表である。
【図１１】図11は、ヒト集団間の酸化ストレスの変動およびG-四重鎖DNA構造の酸化ストレス制御を示す。体細胞（異なるヒト組織ドナーに由来する線維芽細胞；80−100歳）の基礎酸化ストレスレベルは、MitoSOX RED染色によって測定した。
【図１２Ａ−１２Ｂ】図12は上位50の弁別的代謝物の代謝プロファイリング分析を示す。高い、中間および低い酸化ストレスを有する老齢ヒトドナーから11の皮膚線維芽細胞をランダムに選択した。正（図12A）および負（図12B）の加熱エレクトロスプレーイオン化の両方を用いて、全サンプルを質量分析法に基づく分析で解析した。
【図１３Ａ−１３Ｂ】図13は、ヒト集団間の酸化ストレスの変動、およびG-四重鎖DNA構造の酸化ストレス制御を示す。図13Aは、より高いROSを有する線維芽細胞のより高いG4 IHC染色およびより低いROSを有する線維芽細胞のより低いG4 IHC染色を示す。図13BはG4 IHC染色の定量を示す。
【図１４Ａ−１４Ｂ】図14は、ヒト集団間の酸化ストレスの変動、およびG-四重鎖DNA構造の酸化ストレス制御を示す。図14Aは、グルタチオンで処理しROSを低下させた後の線維芽細胞のより低いG4 IHC染色を示す。統計的有意性は両側ｔ検定によって決定した。図14Bは、BSOで処理しROSを増加させた後の線維芽細胞のより高いG4 IHC染色を示す。統計的有意性は両側ｔ検定によって決定した。
【図１５Ａ−１５Ｂ】図15は、エンハンサー領域におけるG4プロファイリングシグネチャーを示す。高いおよび低い酸化ストレスを有する体細胞を用いて、比較G4抗体依拠ChIP-seqを実施した。酸化ストレスの上昇は、エンハンサー領域におけるG4マーカーの顕著な減少と結びついている。図15Aは、高い酸化ストレスを有するサンプル、およびGSH（3mM、4時間）による酸化ストレス低下処理を実施した高酸化ストレスの体細胞を示す。図15Bは、低い酸化ストレスを有するサンプル、およびBOS（0.5mM、4時間）による酸化ストレス上昇処理を実施した低酸化ストレスの体細胞を示す。
【図１６Ａ−１６Ｂ】図16は、特異的抗体を用いたIHCに依る8-oxo-グアニン（oxoG）定量を示す。図16Aは、低ROSに対して高ROSおけるA-SCの高いoxoG IHC染色を示す。図16Bは、複数の反復実験を用いた3つの独立クローンにおけるImageJソフトウェアによるoxoG IHC染色の定量を示す。統計的有意性は両側ｔ検定によって決定した。
【図１７Ａ−１７Ｂ】図17Aは多能性遺伝子におけるG4構造の位置を要約した表である。図は配列番号:19−26を出現順に開示する。図17Bは、多能性遺伝子OCT4、KLF4、ZSCAN10、LIN28A、SOX2、CMYC、NANOG、およびヒトESの遺伝子LIN28Bについて、種々の濃度のG4構造安定化剤PYRIDOSTATINによる72時間後の定量的PCRを示す。
【図１８】図18は、GEE/BOS処理によって影響を受けなかったROS上流の27の潜在的遺伝子を要約した表である。
【図１９Ａ−１９Ｂ】図19Aは、高いROSを有するコントロール線維芽細胞およびshCHI3で処理した高いROSを有する線維芽細胞のMitoSOX Red染色を示す。図19Bは、MitoSOX Red染色の定量を示す。
【図２０Ａ−２０Ｂ】図20は放射線/化学療法耐性発達の提唱モデルを示す。図20Aは、上昇したグルタチオンが、酸化ストレスに関連する体細胞の後成的マーカーの阻害性機能を克服するメカニズムを示す（前記マーカーは、iPSCまたは腫瘍始原細胞（放射線/化学療法耐性およびより高い腫瘍原性を有する）の発生をもたらす）。図20Bは、高ROSおよび低ROS線維芽細胞とメラノーマオルガノイドとの混合、その後のメラノーマ癌進行、グルタチオン上昇並びにin vitroおよびin vivoの放射線/化学療法剤耐性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本技術が実質的に理解されるように、本技術のある種の特徴、様式、実施態様、変型および特色が様々に詳細なレベルで下記に記載されることは理解されよう。
I．定義
本明細書で用いられる一定の用語の定義を下記に提供する。特段の規定がなければ、本明細書で用いられる全ての技術用語および学術用語は、本発明が属する業界の業者が一般的に理解する意味と同じ意味を有する。
本明細書および添付の特許請求の範囲で用いられるように、単数形“a”、“an”および“the”は、内容が明瞭にそうでないことを示していないかぎり複数の対応語も含む。例えば、“a cell”は2つ以上の細胞の組合せを含むというようなことである。
本明細書で用いられるように、“約”という用語は、測定で生じ得る当業者には明瞭な実験誤差の範囲を包含する。
【００２０】
本明細書で用いられるように、“老齢体細胞”（A-SCと略記）という用語は、老齢ドナー（例えば1.4年齢以上のマウスまたは50歳以上の人間）から単離されるか、または老齢ドナーから単離された体細胞と同等なプロフィール（例えば基礎ROSレベル、DNA損傷応答、ゲノム安定性、ZSCAN10発現レベル、GSS発現レベル）を示す体細胞を指す。老齢体細胞は、老齢ドナーから単離されるか、または老齢ドナーから単離された体細胞と同等なプロフィールを示す体細胞を含み、老齢体細胞は、多能性幹細胞再プログラミングに対する高い細胞内ROSレベルの阻害性作用のためにiPSCを発生させることができない。“老齢人工多能性幹細胞”（A-iPSCと略記）という用語は、老齢ドナーから単離された非多能性細胞（例えば体細胞）から誘導される、または老齢ドナーから単離された非多能性細胞（例えば体細胞）から誘導されたiPSCと同等なプロフィール（例えば基礎ROSレベル、DNA損傷応答、ゲノム安定性、ZSCAN10発現レベル、GSS発現レベル）を示すiPSCを指す。
本明細書で用いられるように、“染色体構造異常”という用語は、染色体の正常な構造における任意の変化を指す。染色体構造異常には、重複、欠失、転座、逆位および挿入が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
本明細書で用いられるように、“DNA損傷応答”という用語は、刺激の結果として（運動、分泌、酵素産生、遺伝子発現などに関して）細胞の状態または活性に変化を生じる任意のプロセスを指し、環境性傷害または代謝時のエラーによるDNAの損傷の指標である。
本明細書で用いられるように、“分化させる”または“分化した”という用語は、所与の細胞系統内のより明言的な（“分化した”）位置を取得する細胞を指す。
【００２１】
本明細書で用いられるように、化合物の“有効量”または“治療的に有効な量”は、疾患または異常の生理学的作用が最低限緩和される組成物、化合物、または薬剤レベルを指すか、または再プログラミングiPSCで1つ以上の所望の成果をもたらす量を指し、前記成果には、本技術の組成物、化合物、または薬剤と接触させなかった再プログラミングiPSCと対比して、増大した非多能性細胞のiPSCへの再プログラミング効率、改善するゲノム安定性、改善するDNA損傷応答、増大したZSCAN10発現、および低下したグルタチオンシンターゼ（GSS）発現が含まれるが、ただしこれらに限定されない。例えば、ある化合物（例えばグルタチオンまたはBSO）を、再プログラミングiPSCで1つ以上の所望の成果をもたらす量で細胞または細胞培養にデリバリーすることができ、前記成果には、グルタチオンまたはBSOと接触させなかった再プログラミングiPSCと対比して、増大した非多能性細胞のiPSCへの再プログラミング効率、改善するゲノム安定性、改善するDNA損傷応答、増大したZSCAN10発現、および低下したグルタチオンシンターゼ（GSS）発現が含まれるが、ただしこれらに限定されない。治療的に有効な量は、1回以上の投与で与えることができる（例えば非多能性細胞のiPSCへの再プログラミング開始前、再プログラミング中、再プログラミング後、および/または本明細書に記載するiPSC培養プロトコルの間ずっと）。治療的に有効な量を構成する化合物の量は、化合物、疾患およびその重篤度、並びに治療される対象動物の一般的健康状態、年齢、性別、体重および薬剤耐性に応じて変動するが、当業者は規定通りに決定することができる。例えば、本明細書に記載するように、薬剤（例えば還元型グルタチオンエチルエステル）の有効量は変動し、当業者は、例えば対象動物から得られた非多能性細胞（例えば体細胞）の標的集団で観察される条件（例えば細胞内活性酸素種（ROS）のレベル）に応じて調整することができる。
【００２２】
本明細書で用いられるように、“ゲノムの不安定性”（または“ゲノム不安定性”もしくは“遺伝学的不安定性”）は、構造的染色体変異（例えば欠失、増幅、転座）の増加、数量的な染色体異数性、または細胞系統内でのDNA配列の変異を指す。
本明細書で用いられるように、“グルタチオン”は、グルタチオン誘導体およびグルタチオンの安定化形、例えば還元型グルタチオンエチルエステル（“GSH”または“GEE”）を包含する。
本明細書で用いられるように、“人工多能性幹細胞”（iPSC）という用語は当業界で周知の意味を有し、胚性幹細胞（ESC）の特性と同様な特性を有する細胞を指し、分化した非多能性細胞、典型的には成人体細胞を再プログラミングすることによって人工的に誘導される未分化細胞を包含する。
本明細書で用いられるように、“発癌潜在性”という用語は、宿主に移植した後で細胞が当該宿主で悪性腫瘍を発生させる可能性を意味する。前記用語は、例えば人工多能性幹細胞（iPSC）、並びに分化時および動物または人間への移植時に悪性腫瘍を発生させるそれらの子孫に適用される。表現型上の特徴（例えばゲノムの不安定性および障害されるDNA損傷応答）は、iPSCが老齢ドナーから誘導されたか否かにかかわりなく上昇した発癌潜在性を示す。
【００２３】
本明細書で用いられるように、“多能性幹細胞”（PSC）という用語は、持続的に自己更新することができ、適切な条件下ではいくつかの異なる細胞タイプの子孫を産出できる細胞を指す。PSCは、三胚葉（内胚葉、中胚葉および外胚葉）の各々から派生する子孫を産出することができ、標準的な従来の試験にしたがえば、例えば適切な宿主で奇形腫を形成する能力、または三胚葉全ての組織タイプを代表するマーカーについて染色できる細胞に培養で分化させる能力を有する。PSCの定義に含まれるものは、多様なタイプの胚性細胞（例えば胚性幹細胞（ESC））とともに、非多能性細胞（例えば成人体細胞）から再プログラミングされた人工多能性幹細胞（iPSC）である。
そうでないことが明白に要求される場合を除き、PSCは、PSCの表現型上の特徴を保有する初代組織および樹立系統、並びに三胚葉の各々の子孫を産出する能力をなお有するそのような系統の派生物を含むことは当業者には理解されるであろう。PSC培養は、集団内の実質的な割合の幹細胞およびそれらの派生物が、それらを胚または成人由来の分化細胞から明瞭に区別する未分化細胞の形態学的特徴を示すとき、“未分化”または“実質的に未分化”と記載される。未分化PSCは当業者には容易に認識され、二次元顕微鏡像では典型的には高い核/細胞質比および顕著な核正体とともに出現する。集団内の未分化細胞コロニーはしばしば近隣の分化細胞によって取り囲まれることは理解される。
本明細書で用いられるように、疾患または症状を“予防する”（prevention, prevent, preventing）とは、統計的サンプルで、未処理コントロールサンプルと対比して処理サンプルで異常または症状の出現を減少させるか、または未処理コントロールサンプルと対比して異常または症状の1つ以上の症候の開始を遅らせる1つ以上の化合物を指す。
【００２４】
本明細書で用いられるように、“再プログラミング”という用語および文法的等価物は、部分的または最終的に分化している体細胞の分化状態を変化させるかまたは逆行させるプロセスを指す。体細胞の再プログラミングは、体細胞の分化状態の部分的または完全な逆行であり得る。いくつかの実施態様では、再プログラミングは、体細胞が人工多能性幹細胞に再プログラミングされるときに完了する。しかしながら、再プログラミングは、部分的（例えば任意のより低度の分化状態（less differentiated state）への逆行）、例えば最終分化細胞のより低度の分化状態の細胞、例えば複能性（multipotent）細胞への逆行であり得る。
本明細書で用いられるように、“再プログラミング効率”は、体細胞またはドナーインプット細胞につき発生したiPSCコロニーの数を指す。例えば、再プログラミング効率は、再プログラミング因子の完全セットを与えられたドナー細胞数と発生した再プログラミングコロニー数との間の比率によって提供できる。
本明細書で用いられるように、“再プログラミング因子”という用語は、分子、例えば転写因子を指し、前記は、細胞に接触するとき（例えば細胞によって発現される、細胞を形質転換して発現される、外因的に細胞に提供されるなど）、単独でまたは他の分子と組み合わされて再プログラミングを引起す（例えば体細胞を多能性状態の細胞に再プログラミングする）。例示すれば（制限のためではなく）、再プログラミング因子には、Oct3タンパク質、Oct4タンパク質、Myo-D-Oct4（M3O）タンパク質、Sox1タンパク質、Sox2タンパク質、Sox3タンパク質、Sox15タンパク質、Klf1タンパク質、Klf2タンパク質、Klf3タンパク質、Klf4タンパク質、Klf5タンパク質、c-Mycタンパク質、L-Mycタンパク質、N-Mycタンパク質、Nanogタンパク質、Lin28Aタンパク質、Tertタンパク質、Utf1タンパク質、Aicdaタンパク質、Glis1、Sall4、Esrrb、Tet1、Tet2、Zfp42、Prdm14、Nr5a2、Gata6、Sox7、Pax1、Gata4、Gata3、cEBPa、HNF4a、GMNN、SNAIL、Grb2、Trim71、並びに前記の生物学的活性フラグメント、アナログ、変種およびファミリーメンバーが含まれるが、ただしこれらに限定されない。いくつかの実施態様では、再プログラミング因子は、Oct4、Sox2、Klf4およびc-Myc（山中再プログラミング因子としても知られている）を含む。いくつかの実施態様では、NanogおよびLin28がKlf4およびc-Mycの代用となり、esrrbがKlf4の代用となり、SV40 LT（T）がKlf4、c-Myc、Lin28およびNanogの代用となり、BIX-01294がSox2およびOct4の代用となり、VPAがKlf4およびc-Mycの代用となる。
【００２５】
本明細書で用いられるように、“体細胞”という用語は、多能性幹細胞または生殖細胞以外の任意の細胞を指す。いくつかの実施態様では、当該細胞は、任意のタイプの体細胞で任意の起源（人間または動物から誘導される細胞を含む）であり得る。例示すれば（制限のためではなく）、体細胞には線維芽細胞、上皮細胞、骨細胞、軟骨細胞、ニューロン、筋肉細胞、肝臓性細胞（hepatic cell）、腸細胞、脾臓細胞、および成人幹細胞（造血幹細胞、血管内皮幹細胞、心臓幹細胞、筋肉由来幹細胞、間葉系幹細胞、上皮幹細胞、脂肪由来幹細胞、腸幹細胞、神経幹細胞、生殖系列幹細胞および肝臓性幹細胞を含むが、ただし前記に限定されない）が含まれ得る。
本明細書で用いられるように、“対象動物”、“個体”または“患者”という用語は個々の生物、脊椎動物、哺乳動物または人間であり得る。
本明細書で用いられる“治療”（treating、treat、treated、treatment）は、対象動物（例えば人間）における本明細書に記載する疾患または異常の治療をカバーし、以下が含まれる：（i）疾患または異常の抑制、すなわちその進展を停止させる；（ii）疾患または異常の緩和、すなわち異常の軽減を引起す；（iii）異常の進行の遅延；および/または（iv）疾患または異常の1つ以上の症候の抑制、緩和、または進行遅延。細胞、細胞培養、組織および組織培養の関係では、本明細書で用いられる“治療”（treating、treat、treated、treatment）という用語は、細胞、細胞培養、組織または組織培養と薬剤（例えば還元型グルタチオンエチルエステル）との接触をカバーし、さらに薬剤で処理された細胞、細胞培養、組織および組織培養を指す。
本明細書に記載の医療上の疾患または症状の多様な態様の治療または予防が“実質的”を意味することを意図していることもまた理解されるべきである。実質的治療または予防には、完全な治療または予防だけでなく完全に達しない治療または予防も含まれ、その場合には生物学的または医療的に相応の結果が達成される。
本明細書で用いられるように、“若齢体細胞”（Y-SCと略記）という用語は、若齢ドナー（例えば5日齢以下のマウスまたは16歳以下の人間）から単離されるか、または若齢ドナーから単離された体細胞と同等なプロフィール（例えば基礎ROSレベル、DNA損傷応答、ゲノム安定性、ZSCAN10発現レベル、GSS発現レベル）を示す体細胞を指す。“若齢人工多能性幹細胞”（Y-iPSCと略記）という用語は、若齢ドナーから単離された非多能性細胞（例えば体細胞）から誘導される、または若齢ドナーから単離された非多能性細胞（例えば体細胞）から誘導されたiPSCと同等なプロフィール（例えば基礎ROSレベル、DNA損傷応答、ゲノム安定性、ZSCAN10発現レベル、GSS発現レベル）を示すiPSCを指す。
【００２６】
II．iPSCを発生させる方法
A．総論
ある特徴では、本開示は、非多能性細胞から人工多能性幹細胞（iPSC）を作製する方法を提供する。いくつかの実施態様では、当該方法は、ゲノム安定iPSCを作製するために、再プログラミングの開始前、再プログラミング中、および/または再プログラミングに続いてグルタチオンの有効量とともに非多能性細胞を培養する工程を含む。いくつかの実施態様では、本技術の方法は、コントロールの未処理非多能性細胞から発生させたiPSCで観察されるものと比較して増大したゲノム安定性、増大したDNA損傷応答、増大したZSCAN10、低下したGSS発現、および/または増大した再プログラミング効率の1つ以上を特徴とするiPSCを作製する工程を含む。いくつかの実施態様では、本技術の方法は、非多能性細胞（例えば老齢体細胞）の再プログラミングを可能にする（そうでなければ、非多能性細胞は再プログラミングに抵抗性であり、および/または発生させる場合でも低効率でiPSCを発生させる）。
別の特徴では、本開示は、iPSCおよびこれらのiPSCから分化した体細胞を提供する。例えば、iPSCは、老齢プロフィールを示すドナー由来の体細胞から作製され（A-iPSC）、組織適合性移植可能組織の作製に用いることができる。前記老齢プロフィールは、老齢プロセスおよび/または老齢表現型を促進するライフスタイル要因（例えば喫煙、過剰なアルコール摂取）から生じ得る。
再プログラミング方法の開発の進展および追加の再プログラミング因子（例えば下記に記載するZSCAN10）の同定にもかかわらず、臨床的および研究環境でのiPSC技術の潜在的応用は、相対的に低いiPSC発生効率、外因性核酸導入の要求、およびA-iPSCのゲノム不安定性（A-iPSCで上昇する発癌潜在性に寄与し得る）によって阻まれている。
【００２７】
本方法の1つの利点は、外因性核酸の添加またはiPSC再プログラミングに典型的に用いられる因子（例えば山中因子Oct4、Sox2、Klf4およびc-Myc）によって導入される遺伝的改変を超えるものを要求することなく、iPSCを非多能性細胞（例えば体細胞）から作製し得るということである。追加の核酸のトランスフェクションを要求することなく細胞（例えば老齢組織に由来するもの）を再プログラミングする能力は、臨床環境では特に有利である。加えて、誘導iPSCのゲノム安定性を予測するバイオマーカーの使用は、本明細書に記載する方法にしたがって臨床医がグルタチオン処理のための非多能性細胞を同定する際に役立つ。例えば、コントロール老齢体細胞、若齢体細胞、または胚性幹細胞（ESC）で観察される細胞内活性酸素種（ROS）レベルと対比して、非多能性細胞（例えば老齢体細胞）で観察される増大したROSレベルを用いて、グルタチオンによる処理のための非多能性細胞を同定することができる。いくつかの実施態様では、コントロール老齢体細胞、若齢体細胞、またはESCで観察されるものと対比して、非多能性細胞（例えば老齢体細胞）で観察されるZSCAN10および/またはGSS発現レベルを用いて、グルタチオンによる処理のための非多能性細胞を同定することができる。したがって、GSSおよび/またはZSCAN10の遺伝子発現レベルは、再プログラミングiPSCのゲノム安定性を予測するバイオマーカーとして役立ち得る。加えて、バイオマーカー（例えば、ゲノム安定A-iPSCを発生させる多能性細胞で観察されるものと対比して、ゲノム不安定A-iPSCを発生させる非多能性細胞で増大したPrdx2発現）もまた、グルタチオン処理のための非多能性細胞の同定に用いることができる。したがって、本技術の方法の別の利点は、バイオマーカー（例えば細胞内ROSレベル、ZSCAN10/GSS発現レベル、およびPrdx2発現レベル）は、A-iPSCの臨床的品質の査定のために追加の試験を減らし或いは排除するであろう。例えば、非多能性細胞（例えば老齢体細胞）の特徴を基準にして、再プログラミングプロトコルを要望に合わせて調節し（例えばグルタチオン処理とともにまたはグルタチオン処理を実施せずに標準的な山中因子を用いる）、効率を高めてゲノム安定iPSCを作製することができる。
【００２８】
B．A-iPSCは損なわれたゲノム完全性を示し、Y-iPSCおよびESCと比較してアポトーシスおよびDNA損傷応答に欠陥がある
以前に記載されたように、Y-iPSC（E17.5胚から5日齢新生仔のマウス皮膚線維芽細胞を使用）およびA-iPSC（1.5年齢成獣マウスの皮膚線維芽細胞を使用）を発生させた（Takahashi & Yamanaka, Cell 126(4):663-676, 2006）。最低限12のiPSCクローンをランダムに選択し、マウスおよびヒトiPSCの特徴付けのために以前に用いられた一連の一般的多能性試験を実施した。前記試験は、奇形腫/キメラ分析および多能性遺伝子発現分析を含んでいた。これらのクローンのQ-PCR分析を実施し、再プログラミング因子のサイレンシングを確認した。全クローンで多能性試験一式を実施したが、図1Aに示すように、細胞遺伝学解析は、Y-iPSC（n＝120）と比較して、A-iPSC（n＝130）でより多数の染色体構造異常を明らかにした。
A-iPSCは、Y-iPSCまたはESCと比較して、操作性ストレス（例えば継代および融解）後により良好な生存を示した。図1Bおよび1Cに示すように、in situ細胞死アッセイは、Y-iPSC（n＝12）およびESCコントロール（n＝4）がフレオマイシン（より高い潜在能力を有するブレオマイシンの構造的アナログ）による処理の後で有意なレベルのアポトーシスを示すことを明らかにした。対照的に、A-iPSC（n＝13）は、Y-iPSCまたはESCと比較してフレオマイシンに対して貧弱なアポトーシス応答を示した。これは、A-iPSCにおけるDNA損傷に対するアポトーシス応答の不完全さは遺伝的異常を有する、より多数の細胞を生じ、損傷細胞の除去における不完全さを反映することを示した。
図1D−1Gに示すように、Y-iPSCまたはESCと比較して、A-iPSCは一貫してATM-H2AX-p53経路の貧弱な活性化を提示し、DNA損傷応答に必要な正常な細胞メカニズムがA-iPSCでは弱体化し、異常なゲノム内容を有する細胞の除去の失敗に至ることを示している。A-iPSCにおける貧弱なDNA損傷応答は、延長した組織培養（19継代まで）の間に持続することが示された。2つの追加の組織タイプ（肺臓および骨髄）から発生させたA-iPSCもまた、DNA損傷応答で同様な不完全さを提示することが示された。
【００２９】
C．ZSCAN10はマウスA-iPSCのDNA損傷応答およびゲノム安定性を回復させる
核移植は、患者特異的多能性幹細胞（ntESC）を作製するためのまた別の再プログラミング方法である。除核卵母細胞に老齢組織ドナー由来の核を挿入することによってマウスntESCを発生させA-ntESCを作製した。図2Aに示すように、A-ntESCは、A-iPSCと相違して、正常な細胞遺伝学シグネチャーを有する正常なDNA損傷応答を示した。卵母細胞は、iPSCを発生させるために用いられた4つの山中因子に加えておそらく他の再プログラミング因子を含むので、追加の多能性因子（除核卵母細胞に存在するが老齢体細胞には存在しない）が正常なDNA損傷応答に要求されるのかもしれない。そのような因子はまたY-iPSCおよびESCにも存在するかもしれない。なぜならばY-iPSCおよびESCは正常なDNA損傷応答を有するからである。
ZSCAN10（ESCで特異的に発現される公知のジンクフィンガー転写因子）が同定された。ZSCAN10は、SOX2、OCT4およびNANOGを有する転写調節ネットワークに組み込まれた部分である。線維芽細胞の低速度撮影画像化実験は、ZSCAN10が再プログラミングの6日目から検出可能で、iPSCコロニーが形成されるときに強く発現されることを示した。
【００３０】
加えて、図2Bに示すように、内因性ZSCAN10発現は、Y-iPSCおよびESCで高いがA-iPSCでは低い。A-iPSCでの5日目から14日目までの再プログラミング中のドキシサイクリン誘導性プロモーターによるZSCAN10の発現（A-iPSC-ZSCAN10）は、内因性ZSCAN10発現をY-iPSCおよびESCのそれと同様なレベルまで増加させ（図2B）、発現は15継代まで安定であることが示された。図1Aに示すように、A-iPSC-ZSCAN10（n＝150）は、Y-iPSCおよびESCで認められる頻度と比較して、少ない数の染色体構造異常を有する。A-iPSC-ZSCAN10クローンはまた、アポトーシス（図1B、1C）とDNA損傷応答（図1D−1G）の回復を示した。この回復は、A-iPSCと比較してA-iPSC-ZSCAN10の遅いDNA損傷応答、遅い増殖速度または弁別的テロメア長によるものではなかった。逆に、図2Cに示すように、Y-iPSCにおける再プログラミング中のshRNAによるZSCAN10のダウンレギュレーションは、DNA損傷応答を障害することが示された。
Y-iPSCおよびA-iPSC-ZSCAN10クローンの大半が、A-iPSCと比較して高いアポトーシス応答を示すが、2つの外れ値クローンはアポトーシス応答の回復を示さず（図1C）、染色体異常を有することが見出された（データは示されていない）。これらの外れ値クローンは低いZSCAN10発現および不完全なDNA損傷応答を有し（データは示されていない）、ZSCAN10が、DNA損傷応答でアポトーシス誘発を介するゲノム安定性における正の調節因子であることの更なる支持を提供した。A-iPSCの不完全なDNA損傷応答およびZSCAN10によるその回復はまた、他のDNA損傷薬剤（例えば放射線）に暴露したiPSCで確認された（図2D）。
アポトーシスを介してDNA損傷を受けたA-iPSCを除去できないことは、Y-iPSCまたはESCと比較したA-iPSCでのゲノム変異の蓄積をもたらす。図2Eに示すように、HPRT変異アッセイ（HPRTプロモーター活性の変異原性破壊を測定する）によって評価したとき、ESCおよびY-iPSCと対比して、A-iPSCはもっとも高い変異原性を有し、前記はZSCAN10発現によって回復した。
【００３１】
D．ZSCAN10は、過剰活性化GSSの低下を介してマウスA-iPSCのROS-グルタチオン恒常性を回復させる
A-iPSCの再プログラミング中に、多能性転写因子としてZSCAN10を一過性に発現させることは、全体的な多能性転写調節ネットワークをY-iPSCのものと類似させることが示された（図３A、３B）。A-iPSCのDNA損傷応答の欠陥に関与するZSCAN10標的を同定するために、ESCのChIP-on-Chip解析で以前に報告されたものに基づくZSCAN10標的プロモーター結合領域を、以下のリストを用いて相互に照らし合わせた：（1）Y-iPSC/ESCおよびA-iPSCで弁別的に発現される遺伝子、（2）A-iPSC-ZSCAN10と比較して変化したA-iPSCでの発現を示す遺伝子、および（3）DNA損傷応答およびゲノム安定性で公知の機能を有する遺伝子。得られた遺伝子を、ヒトA-iPSC、ESC、Y-iPSCおよびA-iPSC-ZSCAN10におけるそれらの発現パターンをQ-PCRによって確認することによってさらに絞り込んだ。この厳格な多段工程解析によってグルタチオンシンターゼ（GSS）が同定された。GSSは過剰に高いレベルでA-iPSCで発現されるが、ZSCAN10発現に際してY-iPSCまたはESCで認められるレベルまでA-iPSCにおいてダウンレギュレートされた（図3C）。逆に、Y-iPSCにおけるshRNAによるZSCAN10のダウンレギュレーションは上昇したGSS発現をもたらし、GSS発現のサプレッサーとしてのZSCAN10の役割を支持した。ChIP-Q-PCRは、GSSプロモーターに対するZSCAN10結合活性はGSS発現を抑制することを確認した（図3C）。
A-iPSCは、Y-iPSCまたはESCと対比して、過剰レベルのグルタチオン（図３D）および上昇したROSスカベンジャー活性（図3E）を有する。A-iPSCのROSレベルはDNA損傷薬剤による処理によって増加し（図3E）、このことは直接的なDNA損傷およびゲノム不安定性を引起すために十分であるかもしれないが、一方、過剰なグルタチオンによるROSの不適切なスカベンジングはDNA損傷応答を誘発するために必要なROS細胞内ストレスシグナルを制限し、それは順繰りにアポトーシスを低下させ、更なる遺伝子傷害性ストレスへのA-iPSC暴露を増加させて、変異の蓄積および他のゲノム変化を生じさせる。ZSCAN10発現に際して、グルタチオンおよびROSスカベンジャー活性は、Y-iPSCおよびESCで認められるものと同等なレベルに正常化された（図3D、3E）。加えて、再プログラミングA-iPSCにおけるGSSのshRNAノックダウン（データは示されていない）は、グルタチオンレベルおよびROSスカベンジャー活性を低下させ（データは示されていない）、アポトーシスを増加させ（図3F）、DNA損傷応答を回復させた（図3G）。DNA損傷応答はまた、GSSの薬理学的阻害剤、L-ブチオニン-スルホキシミン（BSO）によるA-iPSCの処理によって回復した（データは示されていない）。逆に、Y-iPSCにおけるGSSの過剰発現（データは示されていない）は、グルタチオンおよびROSスカベンジャー活性を増加させ（データは示されていない）、アポトーシスを低下させ（図3F）、DNA損傷応答を鈍化させた（図3H）。
【００３２】
E．ZSCA10は過剰なGSSによって引き起こされるヒトA-hiPSCのDNA損傷応答を回復させる
マウスA-iPSCで観察された表現型と一致して、A-hiPSC-JAおよびA-hiPSC-AG4は、貧弱なDNA損傷応答（図4A）、低レベルのZSCAN10（図4B）、高レベルのGSS（図4C）およびゲノム不安定性を示した（例えば以下を参照されたい：Prigione, et al. PloS one 6(11):e27352, 2011）。しかしながら、A-hiPSC-LSはこれらの老齢表現型を示さず、正常なDNA損傷応答、正常なZSCAN10/GSS発現（図4A−4C）、およびゲノム安定性を有した（例えば以下を参照されたい：Miller, et al. Cell Stem Cell 13(6):691-705, 2013）。ヒト組織ドナー間において同様なクローン変動が最近の臨床試験で記載された（Garber, Nature Biotechnology 33(9):890-891, 2015；Coughlan, New Sci. 227(3033):9, 2015）。当該試験では、治療は、第一の患者から発生させたA-hiPSCを用いて有意なゲノム不安定性を生じることなく上首尾で進行したが、第二の患者から発生させたA-hiPSCではゲノム不安定性が発見されたときに試験は停止された。異なる遺伝的背景を有するマウスから誘導したA-iPSCで同様な変動性が観察された。B6CBAマウスのA-iPSCと比較して、B6129マウスではより多くのA-iPSCクローンがゲノム安定性を示し、正常なDNA損傷応答、より高いZSCAN10発現、およびより低いGSS発現（データは示されていない）を提示した（図1、2B、3C）。まとめれば、これらの観察は、A-iPSCにおける老齢表現型に寄与するメカニズムが明らかにされるても、遺伝的多型性およびライフスタイルにおける相違は、マウスおよびヒトモデルの両方で加齢およびiPSC再プログラミにおけるその生物学的影響の点で重大な役割を果たすという着想を強調する。
【００３３】
ROSおよびグルタチオン恒常性を維持するメカニズムの異種間保存を、貧弱なDNA損傷応答を有することが確認されたAG4線維芽細胞を用いて解析した。ドキシサイクリン系を用いヒトZSCAN10発現の存在下および非存在下でA-hiPSCを発生させた。各A-hiPSCクローンで一連の多能性試験を実施して、線維芽細胞から誘導したhESCおよびY-hiPSCと比較した。我々がマウスA-iPSCで観察したように、内因性ZSCAN10発現は、Y-hiPSCまたはhESCよりもA-hiPSCで有意に低かった（図4B）。A-hiPSCは、Y-hiPSCまたはhESCと比較して、鈍化したDNA損傷応答（pATM；図4D）およびフレオマイシンに対するより貧弱なアポトーシス応答（データは示されていない）を示した。A-hiPSCにおける貧弱なDNA損傷応答は、多様な再プログラミングベクター系（例えばMYCのないレンチウイルス再プログラミングおよび組込みフリーエピソームベクター系）を用いて確認され（データは示されていない）、A-hiPSCの観察された表現型は、再プログラミングベクター系またはウイルスベクター組込みによって引き起こされないことを示した。老齢マウスドナーの再プログラミングと同様に、A-hiPSCの再プログラミング5日目から15日目の間のZSCAN10の一過性発現（A-hiPSC-ZSCAN10）は、Y-hiPSCおよびhESCのそれと同様なレベルに内因性ZSCAN10発現を持続的に増加させた（図4B）。増大したZSCAN10発現は、A-hiPSCのDNA損傷応答（図4D）およびアポトーシスの不完全さ（データは示されていない）を回復させた。さらに、マウスのデータと一致して、A-hiPSCは、より高レベルのGSSを発現し（図4C）、前記はZSCAN10の増大した発現によって正常化された（図4C）。反対に、Y-hiPSCにおけるZSCAN10のshRNAノックダウンにより、DNA損傷応答（図4E）およびゲノム安定性（図4F）が損なわれた。加えて、以前に報告された二次再プログラミング系から発生させたhiPSCのZSCAN10のshRNAノックダウンは、DNA損傷応答（データは示されていない）を障害した（前記再プログラミング系では、H1 hESC誘導線維芽細胞は前もって組み込まれたドキシサイクリン誘導性再プログラミングレンチウイルスによってhiPSC（Y-hiPSCと同等）へ再プログラミングされた）。ChIP-Q-PCRは、ZSCAN10がヒトGSSプロモーターのZSCAN10 DNA結合モチーフに直接結合し（データは示されていない）、GSS発現を抑制することを確認した（図4C）。
我々がマウスで観察したように、A-hiPSCは、Y-hiPSCまたはhESCと対比して、過剰レベルのグルタチオン（図5A）および上昇したROSスカベンジャー活性（図5B）を有した。ZSCAN10発現に際して、グルタチオンおよびROSスカベンジャー活性は、Y-hiPSCまたはhESCで認められるものと同等なレベルに正常化された（図5A、5B）。A-hiPSCにおけるGSSのshRNAノックダウンはDNA損傷応答を回復させ（図5C）、一方、Y-hiPSCのGSS過剰発現はDNA損傷応答を鈍化させた（図5D）。まとめると、これらのデータは、ZSCAN10がGSSレベルおよびROS/グルタチオン恒常性を正常化し、さらに2つのマウスおよび5つのヒト細胞株の両方でDMA損傷応答を回復させる調節メカニズムの進化上の保存を確認した。
【００３４】
F．ZSCAN10はヒトA-hiPSCでゲノムの完全性を維持する
A-hiPSCクローンの染色体構造異常（例えば転座、重複および欠失）をDNA配列決定に基づくコピー数変動解析および核型分析の組合せによって精査し、ゲノム安定性におけるZSCAN10の影響を確認した。11の独立A-hiPSCクローンに由来する7つのA-hiPSCクローンが8つの領域に細胞遺伝学異常を示し（図5E）、一方、5つのA-hiPSC-ZSCAN10および10のY-iPSCは異常を示さなかった（図5F、5G）。我々はまた、性染色体異数性を1つのA-hiPSCで、トリソミー12を1つのA-iPSC-ZSCAN10クローンで見出した。それらは、多能性幹細胞培養では通常的な染色体変異であり、A-iPSC特異的再プログラミングによってではなくin vitro拡張によって導入された可能性が高い。
ランダムに選択したA-hiPSCのサブセット（正常な細胞遺伝学シグネチャーを有する3クローンおよび細胞遺伝学変異を有する5クローン）、およびZSCAN10発現を有するA-hiPSC（4クローン）で、参照ゲノム配列として体細胞を用い全エキソーム配列決定分析を実施し、変異率がA-hiPSCで変化するか否かを探った。2つの優勢な非同義点変異および2つの同義変異が明らかにされた（データは示されていない）。細胞遺伝学および点変異解析は、全てのA-hiPSCクローンが細胞遺伝学異常または非同義点変異を有することを明示し、それらはA-hiPSC-ZSCAN10クローンでは観察されなかった。A-iPSCを発生させるために用いられた線維芽細胞で通常的細胞遺伝学異常が存在しないことは、核型分析（20クローンをスクリーニング）、染色体ペインティング（100クローンをスクリーニング）、および全エキソーム配列決定（80Xカバレッジ）によって確認された。A-hiPSCの独立クローンにおける再発細胞学異常または点変異は、iPSC再プログラミング中に誘発されるかまたは再プログラミング前に低頻度で存在するかもしれず、前記は、選択的再プログラミングまたは増殖利点を老齢細胞に提供しよう。しかしながら、ZSCAN10発現はゲノム変異の選択性利点を低下させた。マウスおよびヒトモデルの両方で（図1A、2E、5E、5F）、再プログラミング中のA-hiPSCにおけるZSCAN10発現は、ゲノム安定性を有するA-hiPSCを入手する可能性を増加させた。このヒトデータは、ゲノム不安定性に対するZSCAN10の作用は進化において保存されることを確認し、ZSCAN10はA-hiPSCでゲノム安定性を回復させマウスモデルで認められたものを繰返した。
ZSCANファミリーの別のメンバー、ZSCAN4は、Y-iPSCのゲノム完全性の維持に役立ち、ZSCAN10と協調してゲノムの保護で機能し得る。
【００３５】
G．A-hiPSCのゲノム不安定性の発端としての体細胞ROSおよびグルタチオン処理による回復
A-iPSCにおける貧弱なDNA損傷応答およびゲノム不安定性の主要な駆動因子並びにいくつかのA-iPSCがより深刻な老齢表現型を示す理由は今も明らかではない。細胞のROSレベル（MitoSOX染色によって検出される）は、ヒトAG4対LS体細胞およびB6CBA対B6129マウスで貧弱なDNA損傷応答/ゲノム不安定性に関し相関性を有する（図6A−6B）。下記で述べるように、グルタチオン処理（グルタチオン安定化形、3mMの還元型グルタチオンエチルエステル、CAT #G-275-500（GoldBio））の影響を、10のヒトAG4線維芽細胞クローン（より高レベルのMitoSOX染色を示す）でA-hiPSC再プログラミングの前および再プログラミングの最初の10日の間調べた（図6C）。図6に示すように、未処理A-hiPSC（図5E）と比較して、本明細書に開示する方法によるグルタチオン処理はMitoSOXレベルを低下させ、DNA損傷応答を保護し（図6E）、ゲノム安定性を維持する（図6D）。
加えて、本明細書に開示する方法はまた、同様な条件下で増殖させた未処理コントロール老齢体細胞から作製したA-iPSCで観察されるものと比較して、および/またはY-iPSCまたはESCで観察されるものに匹敵する、増大したゲノム安定性（図7H）、増大したDNA損傷応答（図7G）、増大したZSCAN10発現レベル（図7I）、および低下したGSS発現レベル（図7J）を有するA-hiPSCを生じることができる。
【００３６】
H．iPSCへ再プログラミングするための細胞の供給源
本明細書に開示する方法によってiPSCに再プログラミングすることができる非多能性細胞（例えば体細胞）のタイプおよび齢には制限がなく、任意の種類の体細胞を用いることができる。いくつかの実施態様では、成熟体細胞を用いることができる。いくつかの実施態様では、体細胞は胚期由来である。いくつかの実施態様では、体細胞は老齢体細胞である。いくつかの実施態様では、体細胞はiPSCを生じることができない。例示すれば（制限ではなく）、体細胞は、初代細胞（非不朽化細胞）、例えば動物から新しく単離されたものであり得るか、または細胞株（不朽化細胞）から誘導され得る。いくつかの実施態様では、体細胞は哺乳動物細胞（例えばヒト細胞またはマウス細胞）である。例示すれば（限定ではなく）、体細胞は、周知の方法によって、種々の器官（例えば皮膚、眼、肺臓、肝臓、胃、腸、心臓、生殖器官、膀胱、腎臓、尿道および他の泌尿器）から、または一般的には生きた体細胞を含む任意の器官もしくは組織から、または血液細胞から入手することができる。本明細書に開示する方法のいくつかの実施態様では、血液および/または骨髄から単離される細胞が用いられ、前記には、例えば内皮細胞、リンパ球、骨髄系細胞、白血球、間葉系幹細胞、および造血幹細胞が含まれるが、ただしそれらに限定されない。本明細書に開示する方法のいくつかの実施態様では、間葉系幹細胞が用いられる。本明細書で用いられる体細胞という用語はまた成人幹細胞を含むことが意図される。
【００３７】
i．上昇した細胞内ROSレベルを明示するバイオマーカー
いくつかの実施態様では、非多能性細胞（例えば体細胞）は、ドナー非多能性幹細胞（例えば体細胞）で、酸化ストレス関連（すなわち上昇した細胞内ROSレベル）バイオマーカーの検出に基づいてグルタチオンまたはその誘導体による処理のために選別される。いくつかの実施態様では、非多能性細胞（例えば体細胞）は、A-iPSCおよび腫瘍創始細胞（TIC）で老齢表現型を生じる非多能性細胞で、追加の酸化ストレス関連バイオマーカーの検出に基づいてグルタチオンまたはその誘導体による処理のために選別される。例えば、これらのマーカーは、体細胞ドナーから発生させたiPSCまたは老齢個体のTICで、低下した再プログラミング効率、上昇した腫瘍原性、および/または放射線/化学療法耐性の発達を予測することができる。いくつかの実施態様では、本技術は、老齢ドナーに由来する体細胞のバイオマーカーに基づいてA-iPSCのゲノム不安定性を特徴付け、再プログラミングプロトコルを要望に合わせて調節し（例えばグルタチオン処理とともにまたはグルタチオン処理を実施せずに標準的な山中因子を用いて体細胞を再プログラミングする）、増大したゲノム安定性、増大したDNA損傷応答、増大したZSCAN10発現、および低下したグルタチオンシンターゼ（GSS）発現の1つ以上を特徴とするiPSCを作製する方法に関する。
ROS
いくつかの実施態様では、非多能性細胞（例えば体細胞）は、非多能性細胞のサンプルにおいて細胞内ROSの発現レベルに基づいて、グルタチオンによる処理のために選別される。例えば、いくつかの実施態様では、老齢体細胞は、未処理コントロール老齢体細胞、若齢体細胞およびESCの1つ以上と対比して処理に先だって上昇した細胞内ROSレベルに基づいて、本技術の方法によるグルタチオンまたはその誘導体による処理のために選別され、ここで、上昇した細胞内ROSレベルにより、老齢体細胞をグルタチオンまたはその誘導体による処理のための老齢体細胞が同定され、上昇した細胞内ROSレベルの欠如により老齢細胞をROSまたはその誘導体による処理のための老齢体細胞として同定しない。
【００３８】
Prdx2
いくつかの実施態様では、非多能性細胞（例えば体細胞）は、バイオマーカー（例えばPrdx2）の発現レベルに基づいてグルタチオンまたはその誘導体による処理のために選別される。例えば、いくつかの実施態様では、老齢体細胞は、Prdx2発現レベルに基づいて本技術の方法によるグルタチオンまたはその誘導体による処理のために選別される。Prdx2は、老齢体細胞および若齢体細胞間のマイクロアレー遺伝子発現解析の結果に基づいてバイオマーカーとして同定された（図9A）。図9Aに示すマイクロアレー解析の結果は、老齢体細胞株（AG4）と若齢体細胞株（MRC5）との間で255の弁別的発現遺伝子を明らかにした（図9B）。255の弁別的発現遺伝子の中で、1つの遺伝子、Prdx2は、細胞のレドックス調節（GO:0016209）で必要とされることが見出された（図9C）。Prdx2レベルは、AG4線維芽細胞よりもMRC5線維芽細胞で10倍高いことが見出された。
いくつかの実施態様では、細胞は意図される治療薬のために再プログラミングされ、対象患者から誘導される（すなわち自己由来）。体細胞は、健康なまたは病気の対象動物から誘導することができる。体細胞は、若齢ドナー（Y-SC）（例えば5日齢以下のマウスまたは16歳以下の人間）から誘導されるか、または若齢ドナーから単離された細胞に匹敵するプロフィール（例えば基礎ROSレベル、DNA損傷応答、ゲノム安定性、ZSCAN10発現レベル、GSS発現レベル）を示すことができる。“若齢人工多能性幹細胞”（Y-iPSCと略記）という用語は、若齢ドナーから単離された非多能性細胞（例えば体細胞）から誘導したiPSC、または若齢ドナーから単離された非多能性細胞（例えば体細胞）から誘導したiPSCに匹敵するプロフィール（例えば基礎ROSレベル、DNA損傷応答、ゲノム安定性、ZSCAN10発現レベル、GSS発現レベル）を示すiPSCを指す。いくつかの実施態様では、体細胞は、老齢ドナー（例えば1.4年齢以上のマウスまたは50歳以上の人間）から誘導されるか（A-SC）、または老齢ドナーから単離した体細胞に匹敵するプロフィール（例えば基礎ROSレベル、DNA損傷応答、ゲノム安定性、ZSCAN10発現レベル、GSS発現レベル）を示す。“老齢人工多能性幹細胞”（A-iPSCと略記）という用語は、老齢ドナーから単離された非多能性細胞（例えば体細胞）から誘導したiPSC、または老齢ドナーから単離された非多能性細胞（例えば体細胞）から誘導したiPSCに匹敵するプロフィール（例えば基礎ROSレベル、DNA損傷応答、ゲノム安定性、ZSCAN10発現レベル、GSS発現レベル）を示すiPSCを指す。
【００３９】
代謝プロファイリング（メタボローム解析）
いくつかの実施態様では、非多能性細胞（例えば体細胞）は、代謝プロフィールに基づいて、グルタチオンまたはその誘導体による処理のために選別される。本明細書に記載する代謝プロファイリング分析の結果は、老齢ドナーに由来する細胞（例えば体細胞性線維芽細胞）は細胞内ROSレベルに基づいて別個のプロフィールを有することを提示する（図12Aおよび12B）。高ROSドナー細胞のメタボロームを低ROSドナー細胞と比較する代謝プロファイリング分析の結果は有意に変化する41の代謝物を明らかにし、その内の4つの特徴が決定された。高ROSコントロール体細胞の代謝プロフィールと類似する代謝プロフィールを示すドナー体細胞を、グルタチオン処理のために選別することができる。いくつかの例では、ドナー体細胞の代謝プロフィールの測定は、細胞内ROSレベルを直接測定するよりも安定的である上昇ROSレベル検出方法を提供する。
G4DNA構造形成および8-oxo-グアニン（oxoG）形成
いくつかの実施態様では、非多能性細胞（例えば体細胞）は、高ROSコントロール体細胞で見出されるものと対比した8-oxo-グアニン（oxoG）レベルおよびグアニン四重鎖（G4）構造形成レベルに基づいて、グルタチオンまたはその誘導体による処理のために選別される。G4およびoxoGは、ROSによって誘導される直接的な化学的変化の2つの例である。グアニンはROSの主要な酸化標的であり、前記はoxoGを発生させる。oxoGは、遺伝子発現を阻害する三次元G4構造をプロモーター領域で安定化させる。G4構造は、いくつかの多能性遺伝子（SOX2、CMYC、NANOGおよびその他を含む）の調節領域に位置する（図17Aおよび17B）。
本明細書に記載するように、G4構造形成（図13A、13B、15Aおよび15B）およびoxoG形成（図16Aおよび16B）は、低ROS細胞と対比して高ROS細胞で上昇する。したがって、ROSに起因するDNA損傷を検出する評価ツールとして、G4構造形成および/またはoxoG形成を用いることができる。いくつかの例では、ドナー体細胞におけるG4構造形成および/またはoxoG形成の測定は、細胞内ROSレベルを直接測定するよりも安定な、ROS起因DNA損傷検出方法を提供する。
【００４０】
トランスクリプトーム解析
いくつかの実施態様では、非多能性細胞（例えば体細胞）は、トランスクリプトームプロフィールに基づいて処理のために選別される。本明細書に記載するトランスクリプトーム解析の結果は、ROS形成の上流調節因子として機能する一枠の遺伝子が、老齢ドナー由来の体細胞で変化した遺伝子発現を提示することを示す（図18）。
いくつかの実施態様では、本技術は、ROS生成を正の態様で調節する1つ以上の遺伝子の発現を抑制することによって細胞内ROSレベルを低下させる方法に関する。ROS生成は、正の態様でROS生成を調節する遺伝子生成物をコードする内因性標的遺伝子を、当分野で一般的に知られている多数の方法で当該標的遺伝子配列を用いて抑制することによって、再プログラミング中に体細胞で低下させることができる。前記方法には、RNAi（siRNA、shRNA）技術、ミクロRNA、およびCRISPR-Casが含まれるが、ただしこれらに限定されない。したがって、本技術は、正の態様でROS生成を調節する遺伝子生成物をコードする遺伝子抑制することによって細胞内ROSレベルを低下させる方法を提供し、前記生成物は、例えばST6GALNAC6、IGFBP5、PDGFD、SURF4、BOC、ADGRD1、MPDU1、RPS4Y1、MME、SET、DOK1、COLEC12、HOXC10、SULF2、ADAMTSL1、ELN、MGRN1、COL15A1、ZEB1、SFRP1、CLDN11、LGALS3BP、CHI3L1、SPG21、PI16、およびMCFD2である。ROS生成を正の態様で調節する遺伝子生成物をコードする1つ以上の遺伝子の抑制はROSレベルの更なる低下をもたらし得る。いくつかの実施態様では、低ROS細胞と比較して、発現レベルが高ROS細胞で少なくとも2倍から5倍アップレギュレートされることが判明するとき、1つ以上の遺伝子がダウンレギュレーションのために標的とされる。いくつかの実施態様では、低ROS細胞と比較して、発現レベルが高ROS細胞で少なくとも5倍アップレギュレートされることが判明するとき、1つ以上の遺伝子がダウンレギュレーションのために標的とされる。
ヒト体細胞を入手する方法は当業界で周知であり、前記は例えば以下に記載される：Schantz and Ng, 2004, A Manual for Primary Human Cell Culture（World Scientific Publishing Co., Pte, Ltd.）。いくつかの実施態様では、体細胞を入手する方法は、細胞性サンプルを例えば生検によって入手することを含む（例えば皮膚サンプル）。
いくつかの実施態様では、本技術の方法は、卵母細胞（老齢卵母細胞を含む）をグルタチオンまたはその誘導体で処理することに関する。いくつかの実施態様では、処理された卵母細胞をin vitro受精（IVF）の適用に用いることができ、IVFの成功率を改善することができる。いくつかの実施態様では、処理された卵母細胞は、in vitro胚の産出の効率および胚の品質を増加させる。いくつかの実施態様では、卵母細胞は、卵母細胞内の上昇したROSレベルに基づいて、グルタチオンまたはその誘導体による処理のために選別される。
【００４１】
I．本技術の薬剤
いくつかの実施態様では、本技術の方法は、グルタチオンまたはその誘導体で非多能性細胞を処理してiPSCを作製する工程を含む。いくつかの実施態様では、グルタチオンは、還元型グルタチオンエチルエステル（グルタチオンの安定化形）である。
いくつかの実施態様では、本技術の方法は、L-ブチオニン-スルホキシミン（BSO）またはその誘導体で処理してiPSCを発生させる工程を含む（図8）。
J．投与方法および有効な投薬量
細胞または組織を本技術の薬剤と接触させるために当業者に知られている任意の方法を利用できる。いくつかの実施態様では、薬剤はグルタチオンまたはその誘導体である。いくつかの実施態様では、薬剤は還元型グルタチオンエチルエステルである。いくつかの実施態様では、薬剤はL-ブチオニン-スルホキシミン（BSO）またはその誘導体である。
ドナー細胞または組織サンプルに対応して用いることができる用量および投薬レジメンは、細胞または組織サンプルで観察される細胞内ROSレベルに左右され得る。有効量は、前臨床試験および臨床試験中に、当業者に馴染みの深い方法によって決定され得る。いくつかの実施態様では、ドナー細胞または組織サンプルは、0.01から10mMの還元型グルタチオンエチルエステルと接触される。いくつかの実施態様では、ドナー細胞または組織サンプルは、0.1mMの還元型グルタチオンエチルエステルと接触される。いくつかの実施態様では、ドナー細胞または組織サンプルは、0.5mMの還元型グルタチオンエチルエステルと接触される。いくつかの実施態様では、ドナー細胞または組織サンプルは、1mMの還元型グルタチオンエチルエステルと接触される。いくつかの実施態様では、ドナー細胞または組織サンプルは、2mMの還元型グルタチオンエチルエステルと接触される。いくつかの実施態様では、ドナー細胞または組織サンプルは、3mMの還元型グルタチオンエチルエステルと接触される。いくつかの実施態様では、ドナー細胞または組織サンプルは、4mMの還元型グルタチオンエチルエステルと接触される。いくつかの実施態様では、ドナー細胞または組織サンプルは、5mMの還元型グルタチオンエチルエステルと接触される。いくつかの実施態様では、ドナー細胞または組織サンプルは、6mMの還元型グルタチオンエチルエステルと接触される。いくつかの実施態様では、ドナー細胞または組織サンプルは、7mMの還元型グルタチオンエチルエステルと接触される。いくつかの実施態様では、ドナー細胞または組織サンプルは、8mMの還元型グルタチオンエチルエステルと接触される。いくつかの実施態様では、ドナー細胞または組織サンプルは、9mMの還元型グルタチオンエチルエステルと接触される。いくつかの実施態様では、ドナー細胞または組織サンプルは、10mMの還元型グルタチオンエチルエステルと接触される。
【００４２】
いくつかの実施態様では、ドナー細胞または組織サンプルは、0.01から10mMのL-ブチオニン-スルホキシミン（BSO）と接触される。いくつかの実施態様では、ドナー細胞または組織サンプルは0.1mMのBSOと接触される。いくつかの実施態様では、ドナー細胞または組織サンプルは0.5mMのBSOと接触される。いくつかの実施態様では、ドナー細胞または組織サンプルは1mMのBSOと接触される。いくつかの実施態様では、ドナー細胞または組織サンプルは2mMのBSOと接触される。いくつかの実施態様では、ドナー細胞または組織サンプルは3mMのBSOと接触される。いくつかの実施態様では、ドナー細胞または組織サンプルは4mMのBSOと接触される。いくつかの実施態様では、ドナー細胞または組織サンプルは5mMのBSOと接触される。いくつかの実施態様では、ドナー細胞または組織サンプルは6mMのBSOと接触される。いくつかの実施態様では、ドナー細胞または組織サンプルは7mMのBSOと接触される。いくつかの実施態様では、ドナー細胞または組織サンプルは8mMのBSOと接触される。いくつかの実施態様では、ドナー細胞または組織サンプルは9mMのBSOと接触される。いくつかの実施態様では、ドナー細胞または組織サンプルは10mMのBSOまたはそれより多いBSOと接触される。
再プログラム因子の形質導入日を0日目（再プログラミング開始）と考えれば、いくつかの実施態様では、投薬レジメンは、-1日目から10日目にグルタチオンでドナー細胞または組織サンプルを処理する工程を含む。いくつかの実施態様では、投薬レジメンは、-10日目から0日目、-9日目から0日目、-8日目から0日目、-7日目から0日目、-6日目から0日目、-5日目から0日目、-4日目から0日目、-3日目から0日目、-2日目から0日目、-1日目から0日目、0日目から1日目、0日目から2日目、0日目から3日目、0日目から4日目、0日目から5日目、0日目から6日目、0日目から7日目、0日目から8日目、0日目から9日目、0日目から10日目、または-10日目から10日目の間で任意の間隔によりグルタチオンでドナー細胞を処理する工程を含む。
【００４３】
K．治療的応用
以下の考察は単に例示として提示され、限定を意図しない。
いくつかの実施態様では、本明細書に記載の方法によって発生させたiPSCは多様な応用および治療的有用性を有する。いくつかの実施態様では、本明細書に開示する方法は、治療的応用（患者への移植を含む）のために適切なiPSC発生に関する。いくつかの実施態様では、本技術の方法は、ゲノム安定性およびDNA損傷修復シグナルが提示されるにつれて低下した発癌潜在性を有するiPSCを産出する。
理論に拘束されないが、癌幹細胞（CSC、または腫瘍創始細胞（TIC））は機構的類似性を多能性幹細胞と共有するので、TICにおける同様なレドックス不均衡は放射線/化学療法耐性腫瘍の発達をもたらすと考えられる。したがって、いくつかの実施態様では、本明細書に記載するバイオマーカーは、体細胞ドナーから発生させたiPSCまたは個体のTICでより高い腫瘍原性および放射線/化学療法耐性の発達を予測することができ、それによってグルタチオンまたはその誘導体による処理のためにそれらの細胞を同定できる。
L．キット
非多能性細胞からiPSCを発生させるためのキットもまた本明細書で開示される。いくつかの実施態様では、キットは、還元型グルタチオンエチルエステル、再プログラミング因子、および複数の非多能性細胞（例えば老齢ドナー由来の体細胞）を再プログラミングしてA-hiPSCを発生させるための指示を含む。
【００４４】
実験例
本技術はさらにまた以下の例によって例証されるが、いずれの態様においても限定と解されるべきではない。
材料と方法
細胞培養：ESCおよびiPSCは、10％ FBSおよび1,000U/mLのLIP（ESGRO(商標)白血病阻害因子（Leukemia Inhibitory Factor（LIF））、1000，000ユニット/1mL）を含むESC培地で培養した。ESCを発生させるために、確立された方法を用いた(例えば以下を参照されたい：Kim, et al. Nature 467:285-290, 2010)。体細胞のiPSC再プログラミングのためには、Oct4、Sox2、Klf4およびc-Mycを発現するレトロウイルスを導入した。誘導性再プログラミング因子を含む体細胞のために、培地に2μg/mLのドキシサイクリン(MP Biomedicals、ドキシサイクリンヒクラート)を補充した。DNAおよびRNA単離のために、ESCまたはiPSCをトリプシン処理し、新しい組織培養ディッシュに30分間再プレートしてフィーダー細胞を除去し、非付着性細胞浮遊液から核酸を抽出した。
マウスY-iPSC、マウスA-iPSC、ヒトY-iPSCおよびヒトA-iPSCの作製：皮膚線維芽細胞（106）をB6CBAおよびB6129マウスの5日齢の尾の先端皮膚および1.4年齢の尾の先端皮膚から収集し、pMX-mOCT4、pMX-SOX2、pMX-mKLF4,2およびpEYK-mMYC3から作製したレトロウイルスに各ウイルス上清0.5mLを用いて6ウェルディッシュで感染させた（各ウェルにつき合計2mL、2500rpmでRTで90分間遠心分離（BenchTop Centrifuge, BeckmanCoulter, Allegra-6R））。細胞を3mMの還元型グルタチオンエチルエステルと再プログラミング前および再プログラミング初期段階の間接触させた（再プログラミングウイルス感染の1日前から再プログラミングウイルス感染後10日）。
ヒトA-iPSCの作製のためには、105の皮膚線維芽細胞、例えばMRC5から若齢体細胞（Y-SC)並びにLSおよびAG4ドナー（80歳から100歳）から老齢体細胞（A-SC）を、hOCT4、hSOX2、hKLF4およびhMYCをコードする4シストロン性SFG-SV2ベクターから作製したレトロウイルスに、各ウイルス上清0.5mLを用いて（各ウェルにつき合計2mL）6ウェルディッシュで感染させ、2500rpmでRTで90分間遠心分離した（BenchTop Centrifuge, BeckmanCoulter, Allegra-6R））。細胞を3mMの還元型グルタチオンエチルエステルと再プログラミング前および再プログラミング初期段階の間接触させた（再プログラミングウイルス感染の1日前から再プログラミングウイルス感染後10日）。
【００４５】
定量リアルタイムPCT(Q-PCR)分析：遺伝子（ZSCAN10、GSS）の発現レベルをパワーSYBRグリーンPCRマスターミックス（Power SYBR Green PCR mastermix（Applied Biosystems））を用いて定量した。M-MuLV逆転写酵素系（New England Biolabs）を用いて、全RNA（1μg）を20μLの体積で逆転写し、得られたcDNAを合計200μLの体積に希釈した。前記の合成cDNA溶液の10μLを分析に用いた。多能性遺伝子について、各反応を25μLの体積でパワーSYBRグリーンPCRマスターミックス（Applied Biosystems）を用い実施した。条件は以下のようにプログラムした：95°Cで10分の初期変性；その後95°Cで30秒、55°Cで1分、および72°Cで1分の40サイクル；続いて95°Cで1分、55°Cで30秒、および95°Cで30秒。全てのサンプルを重複させ、Mx3005リーダー（Stratagene）を用いてPCR反応を実施した（Mx3005リーダーは各PCRサイクル中に合成されたシグナルの量を検出することができる）。mRNAの相対量をMxProプログラム（Strategene）を用いて決定した。PCR生成物量をβ-アクチンの発現レベルのパーセンテージに対して正規化した。
薬剤処理：フレオマイシン（Sigma）を2時間30μg/mLで添加した。特段の指示がなければ、フレオマイシン処理後30分で細胞を分析のために処理した。3分間ESC培地で回復させた後、細胞を収集し以下の実験のために処理した。延長期間におけるDNA損傷応答を検出するためには、細胞にはフレオマイシン処理後の回復のために6時間与え、H2AX免疫染色のために処理した。DNA断片化アッセイでは、回復のために細胞に15時間与えた。変異誘導潜在性をチェックするためには、細胞をフレオマイシン30μg/mLで2時間処理し、各処理後に1継代培養した。
イムノブロット分析：処理細胞および未処理細胞（1ｘ105細胞）を2時間のフレオマイシン処理（30μg/mL）から30分後に収集した。タンパク質を採集するために、100−200mLのRIPA緩衝液（50 mMトリス-HCL（pH7.4）、150 mM NaCl、1％NP40、0.25％デオキシコール酸ナトリウム、1mM PMSF、プロテアーゼ阻害剤カクテルおよびホスファターゼ阻害剤カクテル）を浮遊細胞ペレットおよび残りの付着細胞に添加した。氷上でサンプルをインキュベートし（10分）、遠心分離した（14,000g、10分、4°C）。BCAタンパク質アッセイキット（Pierce）を用いてタンパク質濃度を決定した。RIPA緩衝液（3000μg/mL）を用いてサンプルを同じ濃度に調整し、レムリ（Laemmli）サンプル緩衝液（Biorad）およびβ-メルカプトエタノール（Sigma）を加えて95°Cで5分間加熱し、4−15％のMini Protean TGX SDS-PAGEゲル（Biorad）にローディングした。湿式電気的転写方法（0.2Mグリシン、25mMトリス、および20％メタノール）を用いて、SDS-PAGEゲルのサンプルを0.2mm PVDF膜に100V（1時間）で移した。前記の膜をPBS-T中の5％ GSAで封鎖し（4°Cで1時間）、続いて一次抗体、抗H2AX（Millipore, 05-636）（1：1000）、抗p53（Leic Biosystems, P53-CM5P）（1：1000）、抗ホスホ-ATM（Pierce, MAI-2020）（1：1000）または抗β-アクチン（Cell Signaling #4967）（1：5000）とともに封鎖溶液（Tween-20（1：1000）を含むリン酸緩衝液（PBS-T）中の5％BSA）でインキュベートした。一次抗体とのインキュベーション後、ペルオキシダーゼで標識された二次抗体を添加する前に膜をPBS-Tで3回洗浄した。二次抗体（1：10,000）は業者（Cell Signaling）から得た。
【００４６】
コピー数プロファイリング分析：コピー数プロファイリング分析は公表されたプロトコルにしたがって実施した（Baslan et al., Genome Research 25:1-11, 2015）。
活性酸素種（ROS）分析：ミトコンドリアによる超酸化物の生成は、MitoSOXTM Red試薬（M36008, Thermofisher scientific）を用い蛍光顕微鏡法で可視化することができる。MitoSoxTM Red試薬は生細胞に浸透し、そこで選択的にミトコンドリアを標的にする。前記試薬は超酸化物によって急速に酸化されるが、他の活性酸素種（ROS）および活性窒素種（RNS）では酸化されない。酸化生成物は核酸との結合時に高度に蛍光性である。蛍光顕微鏡法を用いてこの蛍光を可視化し、画像化ソフトウェア（Image J）を用いて種々の細胞株の染色を定量した。
BSO処理：再プログラミング5日目の終わりに開始して、BSO-A-iPSCを500μMのL-ブチオニン-スルホキシミン（BSO, Sigma, B2515）の存在下で発生させた。再プログラミングのプロセスの終了からコロニーの採取後を通してずっと処理を続けた。
MitoSox Red染色：MitoSox Red染色（生細胞画像化のためのMitoSoxTM Redミトコンドリア超酸化物インジケーター*、M36008, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA）を業者（Molecular Probes/Thermo Scientific）のプロトコルにしたがって実施した。略記すれば、MitoSoxTM試薬のストック溶液（5mM（HBSS/Ca/Mgまたは適切な緩衝液で調製））を希釈して、5μMのMitoSoxTM試薬作業溶液を作成した。5μMのMitoSoxTM試薬作業溶液の1.0−2.0mLを適用して、カバースリップに付着した細胞を被覆した。細胞を37°Cで10分間インキュベートし、光から防御した。画像化の前に細胞を洗浄した。
【００４７】
メタボローム解析：メタボローム解析はフロリダ大学の施設（Southeast Center for Integrated Metabolomics（SECIM））で実施した。略記すれば、非標的設定液体クロマトグラフィー-質量分析全メタボローム解析（untargeted liquid chromatography-mass spectrometry global metabolomics analysis）を、低および高ROS（活性酸素種）としてグループ分けした老齢ドナー（80−100歳の間の年齢）由来ヒト線維芽細胞で実施した。合計11のサンプル（高ROS（n＝5）および低ROS（n＝6）を含む）を解析した。提供された全てのサンプルを、サンプルのタンパク質含有量に対して予め正規化し標準的細胞抽出手順にしたがって抽出した。Dionex UHPLC（Dionex, Sunnyvale, CA）およびオートサンプラーを備えたテルモQ-イグザクティブオリブトラップ質量分析計（Thermo Q-Exactive Oribtrap mass spectrometer（ThermoFisher Scientific））で、全メタボロームプロファイリングを実施した。陽性および陰性の両方の加熱エレクトロスプレーイオン化（分離注入としてm/z 200で35,000の質量分解能を有する）で全てのサンプルを解析した。分離はACE 18-pfp 100ｘ2.1mm、2μmカラム（Advanced Chromatography Technologies Ltd, Aberdeen, Scotland）で、移動相A 0.1％ギ酸水および移動相B アセトニトリルを用いて達成した。流速は350μL/分で25°Cのカラム温度を用いた。陰イオンモードで解析されるイオンのために4μLをカラムに注入し、陽イオンモードで解析されるイオンのために2μLをカラムに注入した。陽イオンおよび陰イオンモードの解析データを別々に統計分析に付した。合計1,006の特徴が陽イオンモードから検出され、692の特徴が陰イオンモードで検出された。その後のデータ解析は全て各サンプルの代謝物の合計に対して正規化した。MZmine（freeware）を用いて特徴を同定し、デアイソトープし、特徴をアラインメントし、ギャップ充填を実施して最初のアラインメントアルゴリズムで見逃した可能性がある任意の特徴を充填した。
【００４８】
G4および8-オキソグアノシン免疫染色：細胞を3.7％ホルムアルデヒドで20分間室温で固定し、リン酸緩衝食塩水（PBS）で洗浄した。続いて、PBS中の0.1% Triton X-100でサンプルを20分間透過性にし、さらにPBS-T中の3％ウシ血清アルブミン（BSA）で1時間封鎖し、続いて一次抗体とともに室温で2時間または4°Cで一晩インキュベートした。抗DNA G四重鎖（G4）抗体、クローン1H6（MABE1126, EMD Millipore, Burlington, MA）をDNA G-四重鎖の検出に用い、さらに抗8ヒドロキシグアノシンAB（N45.1）AB48508（Abcam（Cambridge, United Kingdom））を用いた。一次抗体は1：250および1：50希釈でそれぞれ用いた。Alexa 568結合ヤギ抗マウスIgM（A-21124）を業者から得た（Molecular Probes（Eugene, OR））。二次抗体は1：1000希釈で用いた。核を4’,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI, Sigma, St. Louis, MO）で染色した。画像定量はImage J（NIH, Bethesda, MD）で実施し、核領域で平均蛍光強度を定量した。
GSHおよびBSO処理、タイムコース実験：高ROS線維芽細胞を、還元型グルタチオンエチルエステル（3mM、GEE（Gold Biotechnology Inc., St. Louis, MO））を培地に添加することによって処理した。処理した高ROS線維芽細胞を続いて固定し、多数の時点における染色のために処理した。低ROS線維芽細胞を培地へのL-ブチオニン-スルホキシミン（500μM、BSO(Sigma, St. Louis, MO)）により処理した。処理した低ROS線維芽細胞を続いて固定し、多数の時点における染色のために処理した。
G4構造のためのCHIP-SEQ：クロマチン免疫沈澱（ChIP）を公表されたプロトコルにしたがって実施した（以下を参照されたい：Carey, M.F., et al., Chromatin Immunoprecipitation (ChIP), cold spring harb protoc, CSH Press, 2009）。抗DNA G四重鎖（G4）抗体、クローン1H6（MABE1126, EMD Millipore, Burlington, MA）をDNA G-四重鎖の検出に用いた。
レンチウイルス生成：293T細胞を5ｘ106細胞で150mmディッシュに一晩、DMEM（10％FBSおよびペニシリン/ストレプトマイシン補充）を用いて播種した。リン酸カルシウム細胞トランスフェクション（CalPhosTM Mammalian Transfection Kit, Takara Bio Inc., Kusata Shiga Prefecture, Japan）を用いて、前記細胞に1.0ｘのSMARTベクター誘導性ヒトCHI3L1 hEF1a-TurboRFP shRNA（Dharmacon Inc., Lafayette, CO）をトランスフェクトした。トランスフェクションから48時間後に、レンチウイルスを含む培養液を収集し、細胞屑を遠心分離で除去した。上清を0.45μmのフィルターでろ過し、45Tiローター（Beckman Coulter, Pasadena, CA）で33,000rpmの超遠心分離（4°Cで90分）によりウイルスをペレット化した。レンチウイルス粒子をDMEM培養液に再懸濁して-80°Cで保存した。
【００４９】
定量的リアルタイムPCR（Q-PCR）分析：Q-PCRにより遺伝子の発現レベルを定量した。M-MuLV逆転写酵素系（New England Biolabs, Ipswich, MA）を用いて、全RNA（1μg）を20μLの体積で逆転写し、得られたcDNAを合計200μLの体積に希釈した。前記の合成cDNA溶液の10μLを分析に用いた。各反応を25μLの体積でパワーSYBRグリーンPCRマスターミックス（Applied Biosystems, Foster City, CA）を用いて実施した。条件を以下のようにプログラムした：95°Cで10分の初期変性、その後で95°Cで30秒、55°Cで1分、および72°Cで1分の40サイクル、95°Cで1分、55°Cで30秒、および95°Cで30秒。全てのサンプルを重複させ、Mx3005リーダー（Stratagene, San Diego, CA）を用いてPCR反応を実施した（Mx3005リーダーは各PCRサイクル中に合成されたシグナルの量を検出することができる）。mRNAの相対量をMxProプログラム（Strategene）を用いて決定した。PCR生成物量をGAPDHの発現レベルのパーセンテージに対して正規化した。PCR生成物はまた1.2％アガロースゲル上で臭化エチジウム染色後に評価した。cDNA増幅に用いたプライマーは以下であった：
hGAPDH：CACCGTCAAGGCTGAGAACG（配列番号:1）およびGCCCCACTTGATTTTGGAGG（配列番号:2）、
hZSCAN10：CCTTACTCTCAGGAGCGCAG（配列番号:3）およびTGTGCCAGAGAATAAGGCGT（配列番号:4）、
hOCT4：CCTCACTTCACTGCACTGTA（配列番号:5）およびCAGGTTTTCTTTCCCTAGCT（配列番号:6）、
hSOX2：CCCAGCAGACTTCACATGT（配列番号:7）およびCCTCCCATTTCCCTCGTTTT（配列番号:8）、
hMYC：TGCCTCAAATTGGACTTTGG（配列番号:9）およびGATTGAAATTCTGTGTAACTGC（配列番号:10）、
hKLF4：GATGAACTGACCAGGCACTA（配列番号:11）およびGTGGGTCATATCCACTGTCT（配列番号:12）、
hLIN28A：CGGCCAAAAGGAAAGAGCAT（配列番号13）およびGCTTGCATTCCTTGGCATGAT（配列番号:14）、
LIN28B：GAGAGGGAAGCCCCTTGGAT（配列番号:15）およびACTGGTTCTCCTTCTTTTAGGCT（配列番号:16）、
hNanog：CAGCCCCGATTCTTCCACCAGTCCC（配列番号:17）およびCGGAAGATTCCCAGTCGGGTTCACC（配列番号:18）。
PDS処理：G四重鎖DNA安定化薬ピリドスタチン（Apex Biotechnology Co., Taiwan）を、培養液中で10μMの作業濃度で各実験に提示する時間適用した。
【実施例１】
【００５０】
グルタチオンはA-iPSCでゲノム安定性を回復させる
細胞内ROSレベル（MitoSOX染色により検出）は、B6CBAマウスの若齢ドナー体細胞（Y-SC）およびB6129マウスの老齢ドナー体細胞（A-SC）で低かったが、B6CBAマウスのA-SCでは高かった（図7A）。この異なる組織ドナー間における変動性はまたヒト体細胞で観察され、MRC5のY-SCおよびLSドナーのA-SCで細胞内ROSレベルは低かったが、AG4ドナーのA-SCでは高かった（図7B）。細胞内ROSの定量（図7C、7D）は、マウスおよびヒトの多様なドナー体細胞の細胞内ROSレベルの変動性を確認した。興味深いことに、異なる組織ドナー間の細胞内ROSレベルは、再プログラミングiPSCで貧弱なDNA損傷応答/ゲノム不安定性と高い相関性を有した（B6CBAマウスのY-SC/B1629マウスのA-SCから発生させたiPSCに対するB6CBAマウスのA-SCから発生させたiPSC（図7E））。MRC5ドナーのヒトY-SC/LSドナーのヒトA-SC対AG4ドナーのヒトA-SCでもまた、再プログラミングiPSCにおいて細胞内ROSレベルと貧弱なDNA損傷応答/ゲノム不安定性との間で強い関係が示される（図7F）。
再プログラミングA-iPSCのDNA損傷応答/ゲノム不安定性の回復における細胞内ROS低下の直接的影響を試験するために、グルタチオンの安定化形（還元型グルタチオンエチルエステル）を用いて細胞内ROSレベルを低下させた。AG4ドナー由来A-SCの還元型グルタチオンエチルエステル処理は、細胞内ROSレベルを低下させる（図7B、７D）。
A-hiPSC再プログラミング前およびその最初の10日間のヒトAG4線維芽細胞クローン（高レベルのMitoSOX染色を示す）における還元型グルタチオンエチルエステル処理の影響を調べた。結果は、処理はDNA損傷応答を保護し（図7G）、未処理A-hiPSC（下段パネル、図7H）と比較して統計的有意差で（p＝0.00005）ゲノム安定性（上段パネル、図7H）を維持することを示す。加えて、A-iPSCのZSCAN10レベルは還元型グルタチオンエチルエステル処理により上昇し（図7I）、グルタチオン処理はまた、iPSC再プログラミング中の後成的変化および多能性遺伝子発現に影響することを示す。A-iPSCのGSSレベルは還元型グルタチオンエチルエステル処理により低下した（図7J）。
ヒトAG4線維芽細胞の再プログラミング効率に対する還元型グルタチオンエチルエステル処理の影響もまた調べた。AG4線維芽細胞のコントロールグループ（AG4）および還元型グルタチオンエチルエステル-AG4線維芽細胞の処理グループ（AG4-GSH）（各グループ100,000細胞）を培養し、本明細書に方法にしたがって再プログラミングした。21日目に、iPSCコロニーを数え、再プログラミング因子の完全セットを付与されたドナー細胞数と発生した再プログラミングコロニー数との比によって再プログラミング効率を決定した。図10に示す結果は、老齢体細胞の還元型グルタチオンエチルエステルによる処理は再プログラミング効率を約10倍増加させることを提示した。
したがって、これらの結果は、再プログラミン開始前、再プログラミン中、および/または再プログラミン後の老齢体細胞の還元型グルタチオンエチルエステルによる処理は、同様な条件下で増殖させた未処理コントロール老齢体細胞から作製されるA-iPSCで観察されるものと比較して、および/または若齢iPSC（Y-iPSC）またはESCで観察されるものに匹敵する、増大したゲノム安定性、増大したDNA損傷応答、増大した再プログラミング効率、増大したZSCAN10発現レベル、および低下したGSS発現レベルを有するA-iPSCを産出することを示す。
【実施例２】
【００５１】
BSOはA-iPSCのDNA損傷応答を回復させる
以前に記載されたように（例えば以下を参照されたい：Ji, et al. Experimental & Molecular Medicine 42:175-186, 2010）、再プログラミング5日目の終わりに開始して、BSO-A-iPSCを500μMのL-ブチオニン-スルホキシミン（BSO, Sigma, B2515）の存在下で作製した。pATMのイムノブロットは、GSSのBSO（0.5mM）媒介阻害を有するA-iPSCの10の独立クローンにおけるフレオマイシン処理後のDNA損傷応答の回復を示す（図8）。したがって、これらの結果は、再プログラミン開始前、再プログラミン中、および/または再プログラミン後の老齢体細胞のBSOによる処理は、同様な条件下で増殖させた未処理コントロールから作製されるA-iPSCで観察されるものと比較して、および/またはESCで観察されるものに匹敵する、増大したDNA損傷応答を有するA-iPSCを産出することを示す。
【実施例３】
【００５２】
RNA-Seqによる高および低ROSを有する体細胞の後成的および発現調節状況
遺伝子発現解析は、ROS調節経路の上流および下流の両方で標的である弁別的に調節される遺伝子を明らかにした。GEE（3mMで4時間、ROS/G4を低下させる)、BSO（0.5mMで4時間、ROS/G4を増加させる）、およびピリドスタチン（PDS：G4構造安定化剤、10μMで4時間、G4を増加させる）を用いて、細胞内ROSレベルを改変させる最適条件もまた開発した。これらのツールを用いて、体細胞のROS/G4レベルを調整した。GEEによる高ROS体細胞の処理、またはBSOによる低ROS体細胞の処理は、ROSの下流経路を標的とするであろう。続いて、GEEまたはBSO処理されない高および低ROS体細胞間で弁別的に調節される遺伝子を比較することによって、下流の調節経路を上流の調節経路から区別した（すなわち、高および低ROSを有する体細胞間で弁別的に調節される全ての遺伝子からGEEおよびBSO処理によって調節される下流の標的を差し引けば、ROS調節経路の潜在的な上流標的が同定されるであろう）。2つの高ROSおよび2つの低ROSドナー体細胞をGEE/BSOで処理し解析した。高/低ROS線維芽細胞間で弁別的に（5倍を超えて）発現される遺伝子（102遺伝子）で、ROSの下流標的（GEE/BSO処理により75の遺伝子が弁別的に発現）およびROS上流の潜在的遺伝子（27の遺伝子はGEE/BSO処理により影響されなかった（図18）が明示された。ROS上流の調節遺伝子（例えばPI16、CHI3L1およびZEB1）はROS発生に必要であると報告されたので、shRNAによるROSの有意な低下（図19）は、癌予防ツールとしてROS誘発加齢メカニズムの克服のために貴重な標的であることに気付かされた。
【実施例４】
【００５３】
ドナー体細胞のROSレベルを同定するコンビナトリアルアプローチ
本技術の方法による処理のために選別される非多能性ドナー細胞（例えば体細胞）を一連の技術によって解析し、ドナー細胞の酸化関連バイオマーカーを同定する（前記バイオマーカーは、体細胞ドナーから発生するiPSCの低下した再プログラミング効率、上昇した腫瘍原性、および/または放射線/化学療法耐性の発達を予測することができる）。上昇した酸化ストレスプロフィールを有すると同定し得るドナー体細胞を、グルタチオンまたはその誘導体による処理のため選別することができる。ドナー体細胞をメタボロームプロファイリング解析に付し、メタボロームプロフィールシグネチャーに基づいて細胞内ROSレベルを決定する。加えて或いはまた別に、代謝分析に続いて、非多能性ドナー細胞（例えば体細胞）をRNA-Seqを用いて解析し、調節性ROS経路の上流および下流の両方で遺伝子発現プロフィールを決定する。ROSの上流で上昇した遺伝子発現プロフィールを有すると同定し得るドナー体細胞を、グルタチオンまたはその誘導体による処理のために選別することができる。加えて或いはまた別に、公知の免疫組織化学分析を用いて核内酸化ストレスが解析されるであろう。略記すれば、非多能性ドナー細胞（例えば体細胞）が8-oxo-グアノシン抗体で染色されるであろう（前記は、ROS高レベルのため核内の酸化DNAと結合するであろう）。ドナー細胞の染色に続いて、細胞は画像化され、ROSの相対的レベルを決定するためにコントロール細胞と比較されるであろう。上昇したROSレベルを有すると同定し得るドナー体細胞をグルタチオンまたはその誘導体による処理のために選別することができる。加えて或いはまた別に、非多能性ドナー細胞（例えば体細胞）はまた、CHIP-Seqを抗G4抗体とともに用いて内因性G4 DNAレベルについて分析されるであろう。図15に示すように、上昇レベルのROSを有するドナー細胞は上昇レベルのG4 DNAを有するはずである。上昇レベルのROSを有すると同定し得るドナー体細胞をグルタチオンまたはその誘導体による処理のため選別することができる。
【実施例５】
【００５４】
代謝プロファイリング解析は別個のROS関連プロフィールを明らかにする
図12Aおよび12Bに示す代謝プロファイリング解析の結果は、老齢ドナー由来の細胞（例えば体細胞）は、細胞内ROSレベルに基づいて別個の代謝プロフィールを有することを提示する。高ROSドナー細胞（n＝5）のメタボロームを低ROSドナー細胞（n＝6）と比較する代謝プロファイリング解析の結果は、有意に変化した41の代謝物を明らかにし、その内の4つの特徴を決定した。プロファイリング解析の結果はさらに表1および2でも要約される。高ROSドナー細胞（n＝5）のメタボロームで同定された各代謝物の平均レベルを低ROSドナー細胞（n＝6）のメタボロームで同定された各代謝物と分けることによって倍率変化を計算した。特徴付けられた代謝物の未加工質量分析データは表3および4で提供される。全体として、上記で述べたように、合計1006の特徴が陽イオンモードで検出され、692の特徴が陰イオンモードで検出された。高ROSおよび低ROSドナー細胞の同定されたが特徴付けられていない特性は、公知のライブラリーを検索し、代謝物についてフィルター処理し、さらに標準物を流して代謝物の正体を確認することによって明らかにすることができる。高ROSコントロール体細胞の代謝プロフィールと同様なプロフィールを提示するドナー体細胞をグルタチオン処理のために選別することができる。高ROSコントロール体細胞の代謝プロフィールと同様なプロフィールを提示する、グルタチオンまたはその誘導体による処理のために選別される高ROSドナー体細胞は、同様な条件下で増殖させた未処理コントロール体細胞から作製されたiPSCと比較して、増大したゲノム安定性、増大したDNA損傷応答、増大したZSCAN10発現、および低下したグルタチオンシンターゼ（GSS）発現の1つ以上の特徴を有するiPSCを発生させるであろう。したがって、これらの結果は、ドナー体細胞の代謝プロフィールは、iPSC再プログラミングの前、その最中、および/またはその後で処理される細胞を同定する、上昇した細胞内ROSレベルのためのバイオマーカーとして役立ち得ることを示すであろう。
【００５５】
表1：Volcano Plotによって分析した0.05未満のp値を有する有意な代謝物の数
2020532290.tif 000003
表2：陽および陰モードデータセットにおけるVolcano Plotの有意な公知代謝物
2020532290.tif 000004
表3：メタボローム解析のための質量分析データ（陽イオンモード）
2020532290.tif 000005
2020532290.tif 000006
2020532290.tif 000007
【００５６】
表3：メタボローム解析のための質量分析データ（陰イオンモード）
2020532290.tif 000008
2020532290.tif 000009
2020532290.tif 000010
【実施例６】
【００５７】
G4構造形成および/またはoxoG形成は細胞内ROSレベルのバイオマーカーとして役立つ
図13Aおよび13Bに示すように、G4 DNA構造の形成は細胞内ROSレベルと正に相関する。図15Aに示すように、高ROSレベルを有する細胞の還元型グルタチオンエチルエステル（GSH）による処理は、G4 DNA構造の形成を低下させる。図16および16Bに示すように、oxoG形成もまた細胞内ROSレベルと正に相関する。したがって、これらの結果は、ドナー体細胞のG4 DNA構造形成および/またはoxoG形成レベルは、上昇した細胞内ROSレベルのためのバイオマーカーとして役立ち、iPSC再プログラミングの前、最中、おまその後の処理のために細胞を同定できることを示している。
【実施例７】
【００５８】
トランスクリプトーム解析は細胞内ROSレベル調製のための遺伝子標的を明らかにする
トランスクリプトーム解析は、高ROSおよび低ROS線維芽細胞間で弁別的に（5倍を超えて）発現される多数の遺伝子を明らかにした。図18に示す26の遺伝子がROS上流の潜在的遺伝子として同定された。
図19Aおよび19Bで示すように、これらの遺伝子の1つ、CHI3L1を標的とするshRNA感染は、未処理高ROS線維芽細胞と対比して、処理された高ROS線維芽細胞でROSの有意な低下を提示する。
したがって、これらの結果は、細胞内ROSの調整に関係があるとされる標的遺伝子は、同様な条件下で増殖させた未処理コントロール体細胞と比較して、増大したゲノム安定性、増大したDNA損傷応答、増大したZSCAN10発現、および低下したグルタチオンシンターゼ（GSS）発現の1つ以上を特徴とするiPSCを発生させる方法で有用であり得ることを提示する。加えて、これらの結果は、弁別的に発現される遺伝子の1つ以上で変化する発現レベルを示すドナー細胞は、再プログラミングの前、最中またはその後でグルタチオンまたはその誘導体による処理のための候補としての細胞を同定し得ることを提示する。
【００５９】
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【００６０】
本技術は、本明細書で記載した特定の実施態様に関して限定されるべきではなく、それら実施態様は、本技術の個々の特徴の単一の例示を目的とする。当業者には明白であるように、本技術の趣旨および範囲を外れることなく、本技術の多くの改変および変型が実施され得る。本明細書に列挙したものに加えて、本技術の範囲内の機能的に等価な方法および装置は前述の記載から当業者には明白であろう。そのような改変および変型は添付の特許請求の範囲内であることが意図される。本技術は、添付の特許請求の範囲が権利を有する完全な範囲の等価物とともに当該特許請求の範囲によってのみ制限されるべきである。本技術は、特定の方法、試薬、化合物、組成物、または生物学的な系に制限されるべきではなく、当然それらは変動し得ることは理解されるべきである。本明細書で用いられる用語は特定の実施態様を説明するためのものであり、制限することを意図しないこともまた理解されるべきである。
加えて、本開示の特色または特徴がマーカッシュグループに関して記載されている場合、当該開示はまた、それによってマーカッシュグループのメンバーの個々のメンバーまたはサブグループに関して記載されていることは当業者には理解されよう。
当業者には理解されるように、あらゆる目的のために、特に記述の提供に関して、本明細書に開示される全ての範囲はまた、任意のおよび全ての可能な部分範囲およびその部分範囲の組合せを包含する。列挙されるいずれの範囲も、十分に説明されて同じ範囲を少なくとも同じ半分、1/3、1/4、1/5、1/10などに分解することが可能であることは容易に理解されよう。非限定的な例として、本明細書で考察される各範囲は、下方の3/1、真ん中の1/3、上方の1/3などに容易に分解することができる。当業者にはまた理解されるように、例えば、“まで”、“少なくとも”、“を超える”、“未満”などの言葉はいずれも列挙された数を含み、さらに上記で考察したように続いて部分範囲に分解することができる範囲を指す。最後に、当業者には理解されるように、範囲は個々のメンバーの各々を含む。したがって、例えば1−3つの細胞を含むグループは、1、2または3つの細胞を含むグループを指す。同様に、1−5つの細胞を含むグループは、1、2、3、4または5つの細胞を含むグループを指し、以下同様である。
本明細書で参照または引用した全ての特許、特許出願、仮特許出願、および公開物は、参照によってその全体（全ての図および表を含む）が本明細書に、本出願の明快な教示と一致する範囲まで含まれる。
他の実施態様は以下の特許請求の範囲で示される。
【図１】
2020532290.tif 000011
【図２】
2020532290.tif 000012
【図３】
2020532290.tif 000013
【図４】
2020532290.tif 000014
【図５】
2020532290.tif 000015
【図６】
2020532290.tif 000016
【図７】
2020532290.tif 000017
【図８】
2020532290.tif 000018
【図９Ａ】
2020532290.tif 000019
【図９Ｂ】
2020532290.tif 000020
【図９Ｃ】
2020532290.tif 000021
【図１０】
2020532290.tif 000022
【図１１】
2020532290.tif 000023
【図１２Ａ】
2020532290.tif 000024
【図１２Ｂ】
2020532290.tif 000025
【図１３Ａ】
2020532290.tif 000026
【図１３Ｂ】
2020532290.tif 000027
【図１４Ａ】
2020532290.tif 000028
【図１４Ｂ】
2020532290.tif 000029
【図１５Ａ】
2020532290.tif 000030
【図１５Ｂ】
2020532290.tif 000031
【図１６Ａ】
2020532290.tif 000032
【図１６Ｂ】
2020532290.tif 000033
【図１７Ａ】
2020532290.tif 000034
【図１７Ｂ】
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【図１８】
2020532290.tif 000036
【図１９Ａ】
2020532290.tif 000037
【図１９Ｂ】
2020532290.tif 000038
【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
2020532290.tif 000040
【配列表】
2020532290000001.app
【国際調査報告】
2020532290.tif 000041
2020532290.tif 000042