(57)【要約】  本発明は、血小板濃縮物を病原体減少工程に付してエンベロープのないウイルスを破壊し、血小板濃縮物を活性化工程にかけて血小板に成長因子を放出させ、フィブリノーゲン枯渇体液血小板放出物を回収し、フィブリノーゲン枯渇流動性血小板を第２病原体濃度減少工程に供してエンベロープウイルスを破壊し、血小板放出物を滅菌濾過し、成長因子を含有する濾液を回収する、連続工程を含む、流動性哺乳動物血小板濃縮物から成長因子含有血小板放出物を調製する方法に関する。本発明の方法で得られた血小板放出物は、再生医療における、ならびに非治癒性創傷および耐性潰瘍の管理における多系統細胞の増殖を増強するための治療薬として使用され得る。第２適用は、細胞培養培地中のウシ胎児血清の代わりとしてである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
成長因子含有血小板放出物（ｒｅｌｅａｓａｔｅ）を流動性哺乳動物血小板濃縮物から調製する方法であって、
ａ．前記血小板濃縮物中に存在する微生物のＤＮＡおよびＲＮＡの両方を破壊する目的で、前記血小板濃縮物を第１病原体濃度減少工程に供し、
ｂ．前記血小板にその中に存在するアルファ顆粒および成長因子の少なくとも一部を放出させ、それによって流動性血小板放出物を提供する目的で、前記血小板濃縮物を、当該血小板濃縮物を活性化剤と接触させることによる活性化工程に供し、
ｃ．前記流動性血小板放出物をフィブリノーゲン濃度減少工程に供し、フィブリノーゲン枯渇流動性血小板放出物を回収し、
ｄ．前記フィブリノーゲン枯渇流動性血小板放出物をエンベロープウイルスを破壊する目的で第２病原体濃度減少工程に供し、
ｅ．前記血小板放出物を滅菌濾過する工程に供し、前記濾過工程から前記成長因子を含有する濾液を回収する、
連続工程を含む、方法。
【請求項２】
工程ｅで得られた前記成長因子を含む前記濾液は、凍結乾燥を受ける、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記活性化剤は、カルシウム塩、トロンビン、コラーゲン、トロンボキサンＡ２、およびアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）の群から選択される１つ以上の化合物を含む溶液、好ましくはトロンビン含有溶液である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１病原体濃度減少工程は、前記血小板濃縮物を光化学活性剤と共にインキュベートすること、および前記血小板濃縮物をＵＶ照射に曝露することを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ＵＶ照射は、ＵＶＡ照射、好ましくは１〜１０ＪＪ／ｃｍ２のエネルギー密度のＵＶＡ照射、より好ましくは３Ｊ／ｃｍ２のエネルギー密度のＵＶＡ照射である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記光化学活性剤は、ソラレン、特にアモトサレンまたはリボフラビンである、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
前記第２病原体濃度減少工程は、前記血小板放出物を溶媒および／または洗剤と共にインキュベートし、続いて前記溶媒および／または前記洗剤を除去し、溶媒および／または洗剤中の枯渇した前記血小板放出物を回収すること、を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記血小板濃縮物をインキュベートするための前記溶媒は、ジ−またはトリアルキルホスフェートの群から選択される、好ましくはトリ−ｎ−ブチルホスフェートである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記洗剤は、脂肪酸のポリオキシエチレン誘導体、無水ソルビトールの部分エステル、非イオン性洗剤、デオキシコール酸ナトリウムおよびスルホベタインのうちの１つ以上を含む群から選択され、好ましくはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、またはＴｗｅｅｎ  ８０である、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記溶媒および／または前記洗剤は、油抽出によって前記血小板放出物から除去される、請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記油抽出は、前記血小板濃縮物と前記溶媒および／または前記洗剤との混合物の総重量に基づき、２〜２０重量％、好ましくは５〜１５重量％、より好ましくは５〜１０重量％の範囲の量の油の存在下で行われる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記第２病原体濃度減少工程において、前記溶媒および／または前記洗剤を除去した後に、前記血小板放出物を遠心分離する少なくとも１つの工程をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
凍結乾燥の前に、前記濾液を個々の部分に分け、前記個々の部分がほぼ同数の前記放出物を含むように前記個々の部分の体積を調整する、請求項２〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記濾液は、１ｃｍ３当たり約２×１０５〜２×１０７個の前記放出物、好ましくは１ｃｍ３当たり約２×１０６個の前記放出物を含有する個々の部分に分割される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記濾液を凍結乾燥に供する前に、工程ｅで得られた前記濾液にヒトアルブミンを供給する、請求項２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記血小板濃縮物を前記活性化工程ｂに供する前に、前記血小板濃縮物を白血球不活性化工程に供する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記哺乳動物血小板濃縮物は、ヒト血小板またはウマ血小板由来の成長因子に富んでいる、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記哺乳動物血小板濃縮物は、異なる対象から生じる血小板濃縮物のプールを含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
再生医療に使用するための、特に、多系列細胞の増殖の促進、ならびに創傷治癒および潰瘍治癒の促進の群から選択される１つ以上の用途のための、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法で得られた成長因子含有血小板放出物。
【請求項２０】
幹細胞、線維芽細胞または樹状細胞から選択される１つ以上の細胞培養培地で使用するための、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法で得られる成長因子含有血小板放出物。
【請求項２１】
エアロゾル、処理流体、スプレー、ミスト、ローション、クリーム、軟膏、ゲル、ガム、包帯、皮膚パッチ、プラスターの群のうちの１つ以上から選択される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法で得られた成長因子含有血小板放出物を含有する製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、請求項１のプリアンブルに記載の、成長因子含有血小板放出物を哺乳動物血小板濃縮物から調製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物の血小板は重要な生理機能を持つ無数の生理活性物質を含んでいる。それらの中で、成長因子は、異なる細胞株増殖および組織再生の促進におけるそれらの役割のために特に興味深いものであり、それらは両方とも再生医療、創傷および潰瘍治癒において非常に重要である。
【０００３】
歯科、整形外科および再生医療で患者自身の多血小板血漿（ＰＲＰ）を使用するという概念は、すでに１９９０年代初頭に開発された。血小板は、患者自身の抗凝固処理された全血の遠心分離、またはＭｅｄｔｒｏｎｉｃのＭａｇｅｌｌａｎやＨａｒｖｅｓｔのＳｍａｒｔＰｒｅｐなどの特別な装置を使用することによって得られた。しかしながら、自己血小板のこの使用は貧血患者または大量に使用する必要があるまたは長期間にわたって危険にさらされる場合がある。自己ＰＲＰの最も重要な制限の１つは、血小板濃縮物を調製するための専用の機械または実験室に対する必要性である。それらを使用に適するようにするために、血小板は、すなわちそれらがそれらのアルファ顆粒の内容物を放出させるように活性化される。しかしながら、そうでなければそこに含まれる成長因子はそれらの生物活性のかなりの部分を失う危険性があるので、患者から分離した後数時間以内にＰＲＰを使用することが不可欠である。
【０００４】
血小板を保存するためのいくつかの技術が記載されている。ＤＭＳＯおよびトレハロースの添加は、血小板の保存を延長するための適切な方法の２つの例であり、両方とも凍結乾燥（フリーズドライ）に供されているか否かにかかわらずである。凍結乾燥プロセスと共に使用される抗凍結剤組成物は、保存に関して同様の結果をもたらした。無傷の血小板に対して保存料および／または凍結乾燥を単に使用するこれらのアプローチの不利な点は、タンパク質、受容体などが血小板表面または血小板内に保持されるという事実に関連する。例えば、いくつかの血小板膜受容体は、血小板活性化に応答して細胞外因子と結合するために、例えば血小板接着、凝集などのために無傷のままである。
【０００５】
したがって、創傷治癒、皮膚治療、肺組織などの体組織（体器官を含む）の障害の治療などを含む、血小板を多種多様な用途における有効な使用に適した調製物に変換することを可能にするであろう、より普遍的な方法を処理することは有益であろう。それによって、おそらく、そのような調製物と細胞外因子との望ましくない相互作用の危険性は最小限であるはずである。
【０００６】
特許文献１は、治療的使用または培養培地としての使用に適した組成物を調製する方法を開示しており、ここで血小板は濃縮され、血小板の膜を破壊するために溶解に供される。血小板の少なくとも３０％が溶解され得る。凍結乾燥血小板溶解物は、放出濃度の利用可能な成長因子、サイトカイン、およびケモカインも含む組成物中に形成される。特許文献１はまた、治療のために哺乳動物組織部位に凍結乾燥血小板溶解物を含む上記組成物を適用する工程を含む、哺乳動物組織を治療する方法を開示している。一例では、凍結乾燥血小板溶解物は、供給源血小板から調製され、供給源血小板の少なくとも３０％が溶解されて凍結乾燥血小板溶解物が形成される。しかしながら、溶解物はフィブリノーゲンが枯渇しておらず、そして特許文献１はウイルスまたは病原体感染の問題を認識せずその問題を解決していない。
【０００７】
特許文献２は、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）および血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）を枯渇させたウイルス不活性化成長因子含有血小板溶解物の調製方法を開示し、これは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでの細胞培養、ならびに骨芽細胞系列および／または軟骨細胞への幹細胞の増殖および／または分化の促進に適している。この方法は、血小板濃縮物を、５分〜６時間の間、ｐＨ約６．０〜約９．０、および２℃〜５０℃の温度で、０．２〜５ｖｏｌ．％の溶媒および／または洗剤に接触し、インキュベートし、溶媒および／または洗剤を油抽出によって除去して水性タンパク質相を得、溶媒／洗剤を除去するために、水性タンパク質相を木炭と共にインキュベートする、工程を含む。予備工程は、アフェレーシスまたは全血からのバフィーコート単離によって出発血小板濃縮物を調製することを含み得、それは新鮮で期限切れで貯蔵された液体または期限切れで貯蔵され氷結でのいずれかであり得る。好ましい態様において、血小板溶解物は成長因子ＴＧＦ−β、ＩＧＦ、ＥＧＦおよび／またはｂＦＧＦを含む。しかしながら、特許文献２に開示されている方法はいくつかの欠点を提示する。創傷治癒におけるように、再生医療における血小板溶解物の臨床使用のためには、すべての血小板由来因子、特にＰＤＧＦおよびＶＥＧＦの完全なカクテルが必要とされるので、血小板溶解物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏ細胞培養に適している可能性があるが、骨折治癒を含む再生医療目的における臨床応用には不十分な効果しかないと予想される。溶媒抽出はしばしば、元のボリュームに関してのみ１０〜１５ｖｏｌ．％の低い血小板収率を与える。特許文献２はフィブリノーゲン枯渇工程を含まず、凍結乾燥工程を含まない。溶媒／洗剤によるウイルスの不活性化は、エンベロープウイルスにのみ適用されますが、Ｈｅｐａｔｉｔｓ  ＡウイルスやＰａｒｏｖｉｒｕｓ  Ｂ１９などの非エンベロープウイルスの不活性化はできず、また、溶剤／洗剤処理はバクテリアや他の微生物のような他の潜在的な汚染物質を取り除かない。
【０００８】
特許文献３は、非破壊的培地中で患者の全血または血漿から成長因子を放出する方法を開示している。その方法から得られる成長因子は、組織成長および治癒を促進するための裂傷腱などの軟組織への注射のための、創傷治癒を促進するための表面創傷領域への局所適用に適している。別の方法では、成長因子は全血供給源から放出され、慣用の凍結乾燥により凍結乾燥される。凍結乾燥製品は、患者の創傷の治療のために、または外科的処置における使用のために、通常の生理食塩水によって再構成され得る。特許文献３は、最終生成物が凍結乾燥され得ることを開示しているが、凍結乾燥のみでは病原体を確実に除去するには不十分であることが証明されている。さらに、特許文献３の方法から得られる成長因子はフィブリノーゲン枯渇ではない。
【０００９】
他の既知の血小板放出成長因子には、Ｃａｍｂｉｕｍ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  Ｐｏｏｌｅｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｌａｔｅｌｅｔ  Ｌｙｓａｔｅによって開発されたものが含まれる。この製品はまだ市販品としては存在しておらず、フィブリノーゲンが枯渇していると言われているが、それが病原体／ウイルス減少処理を受けたという表示はない。
【００１０】
多数の論文が、ウシ胎児血清の代用としての血小板放出成長因子の役割について論じている。非特許文献１において概説が与えられている。
【００１１】
特許文献４は、幹細胞、線維芽細胞または樹状細胞の単離および／または増殖および／または増殖のための共アジュバントとして作用することができる血小板溶解物を調製する方法を開示している。この方法は、（ａ）少なくとも２人の対象から得られた全血試料の混合物からバフィーコート画分を単離する工程、（ｂ）単離されたバフィーコート画分を光化学剤および紫外線にさらして存在するあらゆる汚染剤を除去する工程、（ｃ）バフィーコート画分を少なくとも１回の凍結／解凍サイクルにかけて、そこに含まれる血小板の溶解を達成する工程、（ｄ）画分を遠心分離しそして液相を集める工程、を含む。このようにして得られた血小板溶解物は、幹細胞、特に間葉系、脂肪組織由来の間葉系幹細胞、線維芽細胞および樹状細胞の培養、増殖および／または増殖のための共アジュバントとして使用され得る。しかしながら、特許文献４に開示されている方法で得られた血小板溶解物は、フィブリノーゲンが枯渇しておらず、凍結／融解サイクルが成長因子の効率的な放出を引き起こすことができるかどうか、そして成長因子の活性が反復凍結／融解サイクルによって影響されるかどうかは疑問であり、この方法はただ１つの病原体除去工程を使用している。
【００１２】
市販の血小板溶解物、例えばＭａｃｏｐｈａｒｍａからのものが入手可能である。残念なことに、これらの溶解物は大量の凍結容量として利用可能になり、それは解凍後に少量のアリコートに縮小する必要があり、微生物汚染の危険性がある。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅによるヒト血小板溶解物、ＰＬＴＭａｘ、およびＺｅｎｂｉｏによって提供されるものもまた、大きな凍結容量でのみ利用可能であり、それらは研究目的のみを目的としており、ｅｘ  ｖｉｖｏでの治療的使用を目的としていない。
【００１３】
非特許文献２によると、血小板顆粒に貯蔵された成長因子およびサイトカインは、塩化カルシウム塩溶液の添加を用いた直接活性化により、フィブリン形成および血小板脱顆粒により、またはトロンビンを用いて放出され得る。血小板からの成長因子および他の生体分子の放出を誘導するための他の技術には、反復凍結／融解サイクル、超音波処理単独または凍結／融解サイクルとの組み合わせ、または脂質エンベロープウイルスも不活性化する溶媒／界面活性剤処理が含まれる。しかしながら、血小板を繰り返し凍結／融解サイクルに供することは成長因子に影響を与えると考えられる。感染性病原体の伝播の危険性は、確認的な供血を使用しないで、個々の供血の必須テストによって管理される。必須検査は、ＨＩＶ−１／ＨＩＶ−２、抗体、Ｂ型肝炎表面抗原、Ｃ型肝炎ウイルス抗体の検出に勧められる。
【００１４】
したがって、成長因子の最適収率を提供する血小板由来成長因子の調製方法が依然として必要とされ、それは、脂質エンベロープ、ならびに非エンベロープウイルスおよび細菌を含む病原体の存在に対する最小限の危険性を示す。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】国際公開第２０１３／１１３０２４号
【特許文献２】欧州特許第２３８９９４２号明細書
【特許文献３】米国特許第８７３４８５４号明細書
【特許文献４】欧州特許第２７５７８７９号明細書
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｐｌａｔｅｌｅｔ  Ｌｙｓａｔｅ  ａｓ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  ｉｎ  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｒｏｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，  Ｔｒａｎｓｆｕｓ  Ｍｅｄ  Ｈｅｍｏｔｈｅｒ  ２０１３；４０：３２６−３３５
【非特許文献２】Ｔ．Ｂｕｒｎｏｕｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ７６（２０１６）、３７１−３８７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
したがって、成長因子の最適収率を達成することを可能にする、哺乳動物血小板濃縮物からの血小板由来成長因子の調製方法を提供することが本発明の目的であり、これは、エンベロープを含む、またはエンベロープを含まないウイルス、バクテリア、真菌、およびその他の血液由来の微生物の存在に対する最小限のリスクを示す。
【００１８】
好ましい態様では、本発明の目的は、最も一般的な病原体のみならず既存の技術では不活性化できないかまたはほとんど不活性化できない病原体を含む病原体の不活性化が改善された血小板由来成長因子の調製方法を提供することである。
【００１９】
本発明の別の好ましい実施形態は、再生医療および創傷管理における使用に適した血小板放出物を提供することを目的とする。さらなる好ましい実施形態は、細胞培養培地中のウシ胎児血清の代わりとして使用することができる血小板放出物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
最適な収率の成長因子を提供する哺乳動物の血小板濃縮物から血小板由来成長因子を調製する方法であって、血小板由来成長因子が、脂質エンベロープウイルス、非エンベロープウイルス、バクテリア、および上記のその他の血液由来の病原体を含む病原体の存在に対して最小の危険性を示す、方法を提供するという課題は、請求項１の特徴部分の技術的特徴を示す方法により、本発明に従って解決され得る。
【００２１】
それに加えて、本発明の成長因子含有血小板溶解物（ｒｅｌｅａｓａｔｅ）を調製する方法は、
ａ．血小板濃縮物中に存在する、エンベロープウイルス、非エンベロープウイルス、または細菌、真菌などを含む微生物のＤＮＡおよびＲＮＡの両方を破壊する目的で、血小板濃縮物を第１病原体濃度減少工程に供し、
ｂ．血小板にその中に存在するアルファ顆粒および成長因子の少なくとも一部を放出させ、それによって流動性血小板放出物を提供する目的で、前記血小板濃縮物を、当該を活性化剤と接触させることによる活性化工程に供し、
ｃ．流動性血小板放出物をフィブリノーゲン濃度減少工程に供し、フィブリノーゲン枯渇流動性血小板放出物を回収し、この工程は、流動性血小板放出物中のフィブリノーゲンの濃度を低下させることを目的とし、
ｄ．フィブリノーゲン枯渇流動性血小板放出物をエンベロープウイルスを破壊する目的で第２確証的病原体濃度減少工程に供し、
ｅ．血小板放出物を滅菌濾過する工程に供し、成長因子を含有する濾液を回収する、連続工程を含む。
【００２２】
本発明の成長因子含有血小板溶解物を調製する方法は、下記（ａ）〜（ｅ）の連続工程を含む。
（ａ）血小板濃縮物を第１病原体濃度減少工程に供する工程。好ましい実施形態では、第１病原体濃度減少工程は、血小板濃縮物を光化学活性剤とインキュベートし、血小板濃縮物をＵＶ照射に曝露する工程を含む。この工程は、血小板濃縮物中に存在する微生物のＲＮＡおよび／またはＤＮＡの不活性化または破壊のために、減少した病原体含量を有する血小板濃縮物を得ることを可能にする。特に、血小板濃縮物は、エンベロープウイルスおよび非エンベロープウイルスの濃度が減少するという結果をもたらす。この第１工程はまた、血小板濃縮物中に含まれる他の血液由来の微生物を不活性化することも可能にする。
（ｂ）このように処理された血小板濃縮物を、血小板濃縮物を活性化剤と接触させることによる活性化工程に供し、血小板にそれらの内容物の少なくとも一部、特に、血小板中に存在するアルファ顆粒の少なくとも一部、ならびに成長因子を含むこれらのアルファ顆粒の内容物の少なくとも一部を放出させ、血小板放出物を提供する工程。血小板放出物は通常、活性化血小板の残留物および活性化工程で放出された血小板の内容物を含む流体組成物の形態をとるであろう。この活性化工程の結果として、上記生理的用量の成長因子およびサイトカインが、フィブリノーゲンに加えて、血小板から血小板濃縮物を含む組成物または溶液中に放出されるであろう。アルファ顆粒は通常、成長因子の大部分を含んでいるので、これは重要である。哺乳動物の血小板およびそれらの濃縮物の活性化は、生理的用量を超える成長因子、サイトカインおよびケモカインを含む、それらを血小板の破裂を誘導することができそして内容物の少なくとも一部を放出させることができる血小板活性化剤とそれらを接触させることによって達成することができる。適切な活性化剤は、カルシウム塩の水溶液、例えば塩化カルシウム、トロンビン、コラーゲン、トロンボキサンＡ２およびアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）を含む。トロンビンの添加は、血小板濃縮物の実質的に全含有量を含む巨大な血餅を形成させる。体温付近の温度、約３７℃で十分に長い時間、多くの場合３時間以上インキュベートすると、血餅は無視できるサイズに収縮し、捕捉された血小板内のすべての成長因子が発現する。したがって、本発明は、血漿中に懸濁された一定量の成長因子が放出されることを達成することができ、それは初期の血小板濃縮物の量とほぼ同一である。
（ｃ）流動性血小板放出物をフィブリノーゲン減少工程に供し、流体、フィブリノーゲン枯渇放出物を回収する工程。この工程は実際には、血小板から放出されたフィブリノーゲンと前の工程で添加された活性化剤との相互作用後に形成されたフィブリン血餅を単離して血小板の内容物を放出させる工程を含む。血小板（ＰＲＰ）が濃縮されている血漿が、例えば、腱、靭帯および関節を含む筋骨格系の損傷における、あるいは顔の若返りまたは他の任意の治療における病巣内注射としてさらに使用される場合、それは迷惑を引き起こす可能性がある半固体ゲルの形成を引き起こす可能性があるので、血小板の活性化の際に放出されるフィブリノーゲンを放出物からできるだけ多く取り除くことが賢明である。それにもかかわらず、血小板のフィブリノーゲン濃度は血漿のそれよりも低い。本発明の方法は、血小板放出物からフィブリノーゲンを単離し、さらなる使用のためにフィブリノーゲン枯渇血小板放出物を回収する工程を含む。
（ｄ）フィブリノーゲン枯渇血小板放出物を第２病原体濃度減少工程に供して、エンベロープウイルスを破壊または不活性化し、そして成長因子を含有する水性タンパク質相を回収する工程。この工程の主な目的は、脂質エンベロープＨＢＣ、ＨＣＶおよびＨＩＶエンベロープウイルスなどのエンベロープウイルスの除去を確認することである。２つの直交性病原体不活性化工程（工程ａおよび工程ｄ）の使用は、本発明で行われるように、特に重要であり、それにより、非エンベロープウイルスおよびエンベロープウイルスの両方の不活性化ならびにそれより大きい細菌などの微生物や原虫などの寄生虫の不活性化を達成することを可能にする。それと共に本発明の方法は、バイオ医薬品産業の血液由来製品の現代の規制の本質的な要求に応える。この工程は、細胞外因子との望ましくない相互作用の危険性が最小化され得ることを確実にする。
（ｅ）フィブリノーゲン枯渇血小板を、残っている固形物および細菌を除去し、液体または流体の濾液を含む成長因子を回収する目的で、滅菌濾過に供する工程。血小板は、哺乳動物の血液に由来するので、液体または流体の濾液は主に水系であるか、またはタンパク質相を含む水溶液である。
【００２３】
上記方法において、工程は記載された順序で連続して行われることが好ましい。
【００２４】
血小板濃縮物中に存在する非エンベロープウイルスの不活性化を達成することを可能にする第１工程ａに加えて、本発明の方法はまた、血小板濃縮物または血小板それ自体のいずれかに含まれ得る、エンベロープウイルス、一般に脂質エンベロープウイルスを不活性化するための工程も含む。これを達成するための好ましい方法は、放出物中に含まれる脂質膜を溶解し、その中に含まれる核酸を破壊する目的で、血小板放出物を溶媒および／または洗剤に供するか、血小板放出物を溶媒および／または洗剤と接触させ、その後、溶解した脂質膜を含有する溶媒および／または洗剤を除去するために好ましくは油で抽出する工程と、残っている全ての固体を除去するための濾過工程とが続く。抽出および濾過工程の存在のために、脂質エンベロープウイルスならびに細菌および原虫のような寄生虫のような他の病原体は不活性化され得、そして初期の血小板濃縮物中に含まれ得る血漿および血小板脂質は除去され得る。油抽出および濾過の工程段階は、血小板放出物を含有するウイルス性および細菌性の不活性化成長因子の容易で迅速かつ効率的な調製を可能にし、ここで、溶媒および洗剤の濃度は、非経口血液由来の治療用製品について規制当局によって承認された限度を満たしている。
【００２５】
本発明は、成長因子含有血小板放出物を調製するための方法を提供し、それにより、計り知れない因子による残留血液感染性疾患の伝播の危険性、特に、白血球除去を系統的に受けた血液製剤に由来する血小板製剤の場合の危険性を、最小限に抑えることができる。白血球除去は、すなわち、血液の自己殺菌能力がかなりの程度まで失われ、そしてしばしば完全に失われるという効果を有する。血漿は多種多様な病原体の生存または増殖に最適な培地を構成するため、これは重要である。
【００２６】
さらに、病原体不活性化処理の選択された組み合わせのために、本発明で得られる血小板由来成長因子の絶対的な安全性が保証され得る。したがって、ウイルスで不活性化された血小板由来成長因子の混合物を提供することができ、それは治療的処置、細胞療法または細胞培養における使用のために効率的に標準化され得る。ウイルス／病原体不活性化の２段階工程により、本発明の方法によって得られる製剤が、ｉｎ  ｖｉｖｏ適用のための臨床研究および間葉幹細胞増殖において安全に使用されるための要件が満たされる。結果として、関連する制限を伴う、患者に自己血小板を使用する必要性は、なくなる。さらに、自己血小板の使用を強制する代わりに、本発明は哺乳動物血液製剤のプールから得られる血小板放出物を使用する可能性を開き、これは、血小板濃縮物が由来する１つ以上の対象に由来し得る血液感染性疾患の伝播に対する危険性が最小限である、いくつかの対象に由来する。
【００２７】
本発明の方法は、ヒト血小板由来成長因子を調製するのに適しているだけでなく、動物血小板から、例えば同様の医療用途を有するウマ血小板からウマ由来成長因子を産生するために最小限の調整で使用され得る。再構成された凍結乾燥血小板由来成長因子は、細胞培養培地中および間葉幹細胞増殖中のウシ胎児血清の代替としてさらに使用され得る。
【００２８】
細菌汚染の危険性および止血のための機能的活性の喪失に部分的に起因して、血小板は通常５または７日間という限られた貯蔵寿命を有するという事実を考慮すると、定量的または機能的血小板減少症の矯正のために臨床的に静脈内に使用される場合、５または７日間を超える多数の血小板単位は通常毎年廃棄される。期限切れの血小板ストックを本発明の血小板放出物のような血小板由来製品の調製に使用することを可能にすることにおいて、本発明の方法は有望な経済的利益を明らかにする。
【００２９】
本発明はさらに、上記の順序でプロセス工程を実施することによって、得られる放出物の量を最大にすることを可能にする。Ｍｉｒａｓｏｌ（商標）システムなどの現代の技術は、収集された血小板体積を減少させる危険性を最小限に抑えながら、血小板除去療法によって収集された大量の血小板濃縮物を病原体不活性化に供することを可能にする。最初のウイルス不活性化が実施された後にのみ油抽出工程を実施することによって、病原体除去処理の結果として利用可能な放出物の量の損失または減少は最小限に抑えられ得る。
【００３０】
凍結融解サイクルの使用は避けられ得るので、本発明は、それによって得られた、アルブミンや免疫グロブリンなど、成長因子の主要タンパク質中の含有量、ならびにＴＧＦ−β１、ＥＧＦ、およびＩＧＦなどの血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）および血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）以外の放出物中の成長因子の濃度が悪影響を受けるであろうという危険性が最小限であるというさらなる利点を提示する。
【００３１】
好ましい実施形態では、本発明の方法で得られた成長因子含有血小板放出物は、実際の必要に応じて、水または食塩水を添加することによって単一工程で容易に再構成し得る小容量バイアル中で凍結乾燥され得る。それによって、容量は、それが１回の治療に十分な数の成長因子を含むように選択されることが好ましい。バイアル当たりの成長因子のバッチ内およびバッチ間濃度は、初期血小板数、すなわち、上記の連続した工程（ａ）〜（ｅ）に供される血小板の量に従って各バイアルに分配された放出成長因子の量を調節することによって標準化され得る。好ましい実施形態では、上記の工程（ｅ）で得られた液体濾液を個々の容量に分割し、ここでは、個々の容量は、それが１ｃｍ３当たり２×１０５〜２×１０７個の血小板、好ましくは１ｃｍ３当たり約２×１０６個の血小板に由来するように調整される。所望であれば、血小板放出物は、意図される用途に応じて、特定の成長因子セットについて濃縮されてもよい。各バイアルの成長因子の数を標準化することによって、所望の小さいアリコートの抽出を可能にするためにより大きいストックが受けなければならない繰り返しの解凍および凍結サイクルのために、汚染および活性の喪失の潜在的な危険性を伴うより大きなストック容量からより小さなアリコートを作製する必要性がなくなる。
【００３２】
上記において、用語「血小板濃縮物」は、血小板を含む、生物学的または人工的のいずれかの任意の流体を指す。そのような流体の非限定的な例は、ヒトまたは動物であり得る哺乳動物源に由来する様々な形態の全血、血漿、多血小板血漿、任意の培地中の濃縮血小板などを含む。流体は概して水系であろう。それによって、流体は自己由来のものでもよく、または、いくつかの異なる対象、例えば、血液バンクで日常的に調製される、特定の最小血小板含有量を有するアフェレーシスまたはバフィーコート由来の血小板濃縮物に由来する、同種流体のプールでもよい。通常製造は同種の既製品の標準化される。血小板濃縮物は概して、全血を用いるバフィーコート法、ＰＲＰ法、または貯蔵された個別に供与された血液部分から生じるアフェレーシス血小板を用いて調製され得る。後者の使用は、特に保存前の白血球除去にさらに供されるときに好ましい。さらに、５〜７日の貯蔵限界に達したために輸血することができない血小板濃縮物は、凍結し、貯蔵し、そして成長培地補助剤として使用され得る。
【００３３】
血小板濃縮物は、血漿中または血漿と添加剤溶液の混合物中に維持され得る。貯蔵寿命を延ばすために、血小板濃縮物は凍結した血小板濃縮物の大きなプールからなり得る。
【００３４】
用語「濃縮物」または「濃縮する」は、血漿、全血、またはそれが存在する他の液体の大部分からの血小板の分離を指し得るが、それは元の生成物、例えば全血または血漿を指し得る。遠心分離、分光分析、濾過、デカンテーション、重力沈降、または血小板含有流体から血小板を濃縮する他の方法が濃縮物の製造に使用され得る。血小板を濃縮する場合、血小板を血液、血漿、または他の流体の他の成分から分離する間の凝固を防ぐために、抗凝固剤（特に遠心分離または重力沈降用）を血小板の供給源と共に使用することが望ましい場合がある。用語「抗凝固剤」は、本開示の実施例に従って使用するために血小板を濃縮または収集するときに凝固を抑制する組成物を指す。抗凝血剤は概して、凝固因子合成の阻害剤、トロンビンの阻害剤、または抗血小板薬として利用可能である。肝臓における特定の凝固因子の産生を阻害する凝固因子合成の阻害剤には、ワルファリン（Ｃｏｕｍａｄｉｎ）などの組成物が含まれる。トロンビンの阻害剤は、トロンビンの活性を遮断することによって血液凝固を妨害し、そしてヘパリンおよびレピルジン（Ｒｅｆｌｕｄａｎ）のような組成物を含む。抗血小板薬は、血小板自体と相互作用し、アスピリン、チクロピジン（Ｔｉｃｌｉｄ）、クロピドグレル（Ｐｌａｖｉｘ）、チロフィバン（Ａｇｇｒａｓｔａｔ）、エプチフィバチド（Ｉｎｔｅｇｒｉｌｉｎ）などの薬を含む。
【００３５】
上記において、用語「血小板放出物」は、血小板濃縮物が活性化工程に供され、血小板によって放出された内容物が上記のように、特に上記の工程ｂで回収されるときに得られる組成物を指す。
【００３６】
上記において、「血小板濃縮物を活性化工程または活性化処理に供する」とは、それらの細胞膜を破壊することによって血小板を破壊して血小板がそれらの顆粒内容物、特に血小板に含まれるアルファ顆粒を放出することを達成することを意味する。活性化血小板は、その中に含まれる多種多様な化合物、例えば、タンパク質、細胞性微小胞、例えば、原形質膜由来微小粒子、エキソソーム、成長因子、例えばＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−βおよび他のサイトカインを放出し得る。これは、化学的に、機械的に、流体均質化または超音波処理によって、あるいは溶解によって行われ得る。しかしながら、本発明によれば、活性化は、血小板濃縮物を活性化剤と接触させることによって実施されるのが好ましい。なぜなら、これにより、血小板内容物の流動性血小板放出物への放出が最大になるからである。適切な溶解剤には、トロンビン、コラーゲン、トロンボキサンＡ２またはＡＤＰ、およびカルシウム塩溶液、またはそれらの２つ以上の混合物が含まれる。適切なカルシウム塩の例は塩化カルシウムである。しかしながら、当業者によって適切であると考えられる他の任意の溶解剤も同様に使用され得る。
【００３７】
機械的溶解は、例えば、凍結融解サイクルを使用して、血小板懸濁液を凍結し、次いで材料を室温より高い温度、例えば３０℃〜４５℃に融解することによって実施され得る。この方法は、氷の結晶が形成されるにつれて細胞を膨潤させて破壊し、続いて融解時に収縮させる。周期的な膨張および収縮は、最終的に血小板を破裂させる。凍結融解サイクルの数に応じて、血小板計数により、例えば少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％、または最大１００％までの細胞溶解度などの様々な程度の血小板細胞溶解を達成し得る。本発明の範囲内では、機械的溶解が考慮され得るが、放出物の品質損失が疑われるために、省かれることが好ましい。
【００３８】
本発明の範囲内において、「凍結乾燥血小板放出物」は、凍結乾燥血小板放出物の特定のタイプとしての「凍結乾燥血小板多血漿放出物」または「ＬＰＲＲＬ」を含むが、これらに限定されない。
【００３９】
本発明の範囲内にある「抗凝固剤」は、本発明に従って使用するために血小板を濃縮または収集するときに血餅を抑制する組成物である。抗凝血剤は概して、カルシウムイオン錯化剤／キレート剤、凝固因子合成の阻害剤、トロンビンの阻害剤、または抗血小板薬として入手可能である。肝臓における特定の凝固因子の産生を阻害する凝固因子合成の阻害剤には、ワルファリン（Ｃｏｕｍａｄｉｎ）などの組成物が含まれる。トロンビンの阻害剤には、ヘパリンおよびレピルジン（Ｒｅｆｌｕｄａｎ）などの組成物が含まれる。抗血小板薬は、血小板自体と相互作用し、アスピリン、チクロピジン（Ｔｉｃｌｉｄ）、クロピドグレル（Ｐｌａｖｉｘ）、チロフィバン（Ａｇｇｒａｓｔａｔ）、エプチフィバチド（Ｉｎｔｅｇｒｉｌｉｎ）などの薬を含む。
【００４０】
本発明の方法の工程ａにおいて行われるＵＶ照射は、好ましくは血小板放出物をＵＶＡ照射に曝露すること、好ましくは１〜１０Ｊ／ｃｍ２、より好ましくは約３Ｊ／ｃｍ２のエネルギー密度のＵＶＡ放射線に曝露することを含む。ＵＶ照射への曝露は、血小板放出物を光化学剤、特にソラレン、特にアモトサレン、またはリボフラビンとインキュベートした後に行うのが好ましい。
【００４１】
本発明の方法の工程ｄにおいて、血小板放出物を溶媒および／または洗剤と接触させて、エンベロープを有するウイルスまたは他の病原体の膜を溶解し、好ましくは、ジ−またはトリアルキルホスフェートの群から選択される血小板濃縮物をインキュベートするための溶媒が使用され、そして好ましくはトリ−ｎ−ブチルホスフェートである。本発明の方法の工程ｄにおいて使用するための適切な洗剤は、脂肪酸のポリオキシエチレン誘導体、無水ソルビトールの部分エステル、非イオン性洗剤、デオキシコール酸ナトリウムおよびスルホベタインの群から選択される洗剤を含み、好ましくは、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００またはＴｗｅｅｎ  ８０である。
【００４２】
溶媒および／または洗剤ならびにそれらに溶解した成分を除去するための次の抽出工程で使用される油の量は、広い範囲内で変え得るが、好ましくは、油の量は、血小板濃縮物と溶媒および／または洗剤との混合物の全容量に基づいて、２〜２０重量％、好ましくは５〜１５重量％、さらに好ましくは５〜１０重量％の範囲である。それによって、好ましくは医薬等級の油、例えばヒマシ油が使用される。抽出プロセスでは、典型的には一定量の油を血小板放出物に添加し、そして一定時間、典型的には３０、２０または１５分以下の間、血液ミキサー上で振盪する。その後、抽出が行われる容器は、上部油相および下部血小板放出物相を得るために、ある期間、例えば１０分以下またはそれ以上の間、逆位置に吊り下げられてもよく、これにより下相は重力によって上相から分離される。抽出効率に応じて、この工程を１回または２回以上繰り返すことができる。
【００４３】
本発明の方法は、抽出工程ｅの後に、血小板を油および水性タンパク質相から分離するための遠心分離の少なくとも１つの工程を含み得る。通常、血小板放出物は、好ましくは、上相にある油の残余物と重力により得られる下相にある血小板放出物とを分離するために、逆位置で、低温、典型的には１０℃未満、好ましくは５℃未満、典型的には約４℃で、遠心分離に供される。
【００４４】
本発明の方法は、濾過工程ｅの後に、血小板放出物の貯蔵寿命を延長するための凍結乾燥工程を含み得る。凍結乾燥に供される前に、工程ｅで得られた液体または流体の濾液をいくつかの容量に分けてもよく、各容量は、１ｃｍ３当たり所定量の血小板の放出物、例えば約２×１０５〜２×１０７個の血小板の放出物、より好ましくは１ｃｍ３当たり約２×１０６個の血小板の放出物を含むように調節され、任意の他の濃度の血小板は、当業者によって選択され得る。本発明の方法で得られた生成物は、貯蔵および再構成が容易であり、適切なアリコートにさらに分割する必要なく即時使用に適した合理的な量で凍結乾燥され、フィブリノーゲンが枯渇するという特徴を兼ね備えている。
【００４５】
好ましい実施形態では、成長因子の凍結保護を達成するために、凍結乾燥の前に、ヒトアルブミンは、工程ｅで得られた液体濾液に供給される。
【００４６】
本発明の範囲内において、「凍結乾燥」とは、血小板を保存するためにしばしば使用される凍結乾燥または脱水プロセスを指す。しかしながら、凍結乾燥はまた、最初の凍結融解または他の溶解技術が行われた後に血小板をさらに溶解するために、保存プロセスとしてだけでなくむしろ血小板を溶解するための処置としても使用され得る。言い換えれば、本開示の例によれば、本明細書に記載されるように放出物が形成された後、凍結乾燥は、成長因子、サイトカイン、ケモカイン、および血小板の表面内に最初に封入されているかまたは表面に結合している他の内容物を保存するというさらなる利点を提供するが、それは、血小板が本明細書中に記載されるように溶解されると、例えば凍結融解溶解されると放出される。この方法は典型的には、材料を凍結させ、周囲の圧力を下げて材料中の凍結水を固相から気相に直接昇華させることによって行われる。
【００４７】
所望であれば、血小板濃縮物は、血小板を活性化工程に供され、それらの内容物を放出させる前に、白血球除去工程に供され得る。白血球除去は、主に、赤血球および血小板の単位で存在する輸血された白血球に関連する望ましくない合併症の発生に対する危険性を減らすことを目的とする。
【００４８】
本発明の方法は、ヒトまたは動物の血小板、例えばウマの血小板であり得る哺乳動物の血小板濃縮物からの成長因子に富むフィブリノーゲン枯渇血小板放出物の調製を意図する。放出物は凍結乾燥してもしなくてもよい。
【００４９】
本発明の方法で得られた血小板放出物は、創傷、潰瘍、または火傷の治療に使用され得る。血小板放出物は、適用前に乾燥形態または再水和形態で、またはゲルとして適用され得る。あるいは、皮膚が創傷、潰瘍、または火傷によって損傷を受けていなくても、それは、老化、光損傷、病的または変性疾患などの結果として生じる他の種類の損傷を修復するために使用され得る。本発明の方法で得られる血小板放出物中の血小板の濃度は、広い範囲内で変え得るが、好ましくはその濃度は最大の効果を達成するためにできるだけ高い。
【００５０】
上記において、用語「創傷」は、皮膚に対する損傷ならびにより深い組織に対する損傷を含む、対象の任意の組織に対するあらゆる損傷を指す。それによって、創傷は偶然にまたは意図的に引き起こされ得るか、または病理学的状態、疾患状態または変性状態の正常な経過によって引き起こされ得る。例えば、損傷は怪我や手術の結果であり得る。傷害の非限定的な例は、潰瘍、火傷、骨折、穿刺、切り傷および擦り傷、裂傷、外科的切開、炎症、感染症などを含む。
【００５１】
血小板放出物は、液体、エアロゾル、スプレー、ミスト、ローション、クリーム、軟膏、ジェル、ガム、噴霧液滴または粉末、ディスペンシングボトル、予め浸した布地、注射器、包帯、パッチまたはプラスターなどの使用を含む、当業者に公知の投与方法を用いて投与され得る。好ましい実施形態では、本発明の方法で得られた血小板放出物は、創傷を治療するための緊急事態に使用するためのキット中に安定した形で保存され得る。血小板放出物は、必要に応じて直ちに使用するために再構成され得る。別の態様では、本発明は、本発明の方法で得られた成長因子含有血小板放出物を含有する、エアロゾル、トリートメント液、スプレー、ミスト、ローション、クリーム、軟膏、ゲル、ガム、包帯、パッチ、プラスターに関する。
【００５２】
本発明の方法で得られる血小板放出物は、増加した量の成長因子、サイトカイン、ケモカインを含み得る。放出物中に存在し得る成長因子および他の材料の例は、限定されることなく、ＰＤＧＦ、ＰＤＡＦ、ＶＥＧＦ、ＰＤＥＧＦ、ＰＦ−４、ＴＧＦ−Ｂ、ＦＧＦ−Ａ、ＦＧＦ−Ｂ、ＴＧＦ−Ａ、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、ＢＴＧ、ＴＳＰ、ｖＷＦ、ＰＡＩ−１、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＫＧＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＫＧＦ−２、フィブロペプチドＡ、フィブリノーゲン、アルブミン、オステオネクチン、グロアルファ、ビトロネクチン、フィブリンＤ−ダイマー、ファブター（ｆａｖｔｏｒ）Ｖ、アンチトロンビンＩＩＩ、ａ２マクログロブリン、血管新生因子、Ｆｇ−Ｄ、およびエラスターゼを含む。さらに詳しく、存在し得る、成長因子、サイトカインなどは、限定されることなく、ＬＩＦ、ＩＧＦＢＰ３などの抗癌性成長因子ＰＧ、オルロイコトリエンなどのエイコサノイド、ＩＬ−１  ＴＮＦアルファ、ＩＮＦ、ＴＮＦ−ａ、ＩＬ−６、ＩＬ−１（ａ／ｂ）、プロスタノイド代謝物、補完的成分、活性酸素中間体、アラキドン酸代謝物、凝固因子、硝酸塩、そしてケモカインを含む。ヒト由来の成長因子，ケモカイン、サイトカイン、およびホルモンは、アルファデフェンシン、アルファシヌクレイン、ベータシヌクレイン、４−１  ＢＢＬ、６Ｃｋｉｎｅ、酸性ＦＧＦ、アクチビンＡ、アクチビンＲ１ｂ、アンジオポイエチン２、Ｂ−ＤＮＦ、ＢＡＦＦ、ＢＣＡ−１、ＢＣＡ−１、ＢＤ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７、ＢＭＰＲＡ１、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＣＴＧＦ、ＣＴＩ＿Ａ−４Ｆｃ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、カルジオトロフィン−１、クリプト（Ｃｒｉｐｔｏ）、シスタチン（Ｃｙｓｔａｔｉｎ）Ｃ、Ｄｋｋ−１、ＥＧＦ  ＡＯＦ、ＥＧＦ、ＥＭＡＰ  ＩＩ、ＥＮＡ−７８、ＥＰＯ、エオタキシン、ＦＧＦ、塩基性ＡＯＦ、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−１６、ＦＧＦ  １７、ＦＧＦ  １８、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ４、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ８ｂ、ＦＧＦ９、Ｆｌｔ３、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＤＮＦ、ＧＭＣＳＦ、ＨＧＦ、ＨＧＨ、ＩＦＮアルファＡ、ＩＦＮアルファＡ／Ｄ、ＩＦＮアルファＤ、ＩＦＮアルファａ２ｂ、ＩＦＮ、ベータ１Ａ、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＧＦ１、ＩＧＦｉｌ、ＩＧＦＢＰ−４、ＩＧＦＢＰ６、ＩＬＩアルファ、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１５、ＩＬ１７、ＩＬ１７Ａ、ＩＬ１７Ｆ、ＩＬ１８、ＩＬ１９、ＩＬ２、ＩＬ２０、ＩＬ２１、ＩＬ２３、ＩＬ２８Ａ、ＩＬ２８Ｂ、ＩＬ２９、ＩＬ３、ＩＬ３１、ＩＬ３３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＴＡＣ、ＫＧＦ２、カリクレイン（Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ）１１、カリクレイン（Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ）４、カリクレイン（Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ）７、ＬＥＦＴＹ−Ａ、ＬＩＦ、レプチン（Ｌｅｐｔｉｎ）、ＭＣＳＦ、ＡＯＦ、ＭＣＳＦ、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ２、ＭＣＰ３、ＭＣＰ４、ＭＤＣ、ＭＩＧ、ＭＩＰ１アルファ、ＭＩＰ１ベータ、ＭＩＰ３アルファ、ＭＩＰ３ベータ、ＭＩＰ４、ＭＩＰ５、ミッドカイン、ＮＡＰ２、ＮＴ３、ＮＴ４、ニューロタクチン（Ｎｅｕｒｏｔａｃｔｉｎ）、ニュールツリン、オンコスタチン（Ｏｎｃｏｓｔａｔｉｎ）、オステオプロテグレリン、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＴＮ、ランク（Ｒａｎｋ）配位子、ランク（Ｒａｎｋ）受容体、ＲＡＮＴＥＳ＜ＳＣＦ、ＳＣＦＡＯＦ、ＳＤＦ−１アルファ、ＳＤＦ−１ベータ、ＣＤ４、ＣＤ４０Ｌ、ＴＮＦ−ＲＩ、ＴＮＦＲＩＩ、ＴＡＲＣ、ＴＥＣＫ、ＴＧＦアルファ、ＴＧＦ１ベータ１、ＴＧＦベータ２、ＴＧＦベータ３、ＴＮＦベータ／リンホトキシン、ＴＮＦ−アルファ、ＴＰＯ、ＴＲＡＩＬ、ＴＷＥＡＫ、およびＶＥＧＦを含み得る。
【００５３】
本発明の方法で得られる血小板放出物は、それが有意な価値があることが証明されている２つの主な徴候を有するが、それは他の徴候においても同様に使用され得る。第１適用は、再生医療ならびに非治癒性創傷および抵抗性潰瘍の管理における多系統細胞の増殖を増強するための治療薬としてのその使用である。これらの用途において、使用される成長因子を含有する血小板放出物は、ヒトまたはウマの血小板のいずれかから調製される。本発明の方法で得られた血小板放出物は、細胞培養培地、特に幹細胞、線維芽細胞または樹状細胞にも使用され得る。第２適用は、細胞培養培地中のウシ胎児血清の代わりとしてである。フィブリノーゲン枯渇血小板放出物は、ゲル形成の望ましくない影響を回避し、放出物を２段階の病原体／ウイルス減少に供することは製品の安全性を確実にする。結果として、自己血小板濃縮物はもはや必須ではなく、そして本発明の方法において使用される哺乳動物血小板濃縮物は、異なる哺乳動物対象に由来する血小板のプールを含み得る。
【００５４】
以下の実施例において本発明をさらに説明する。
【００５５】
実施例１．
初期の血小板数の３〜５倍の血小板数を有する多血小板濃縮物を得るために、ヒトをフェレシス装置（Ｈａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ  ＭＣＳ＋９０００ａ）に接続した。多血小板濃縮物をリボフラビンと共にインキュベートし、病原体低減の第１段階としてＭＩＲＡＳＯＬ（商標）システムによって紫外線を照射した。その後、滅菌トロンビンｂを５００単位／ｃｍ３の適切な濃度で添加して前記濃縮物中の血小板を活性化した。これにより、血小板顆粒からの生理的用量を超える成長因子およびサイトカインのその後の放出が生じた。さらに、活性化血小板は、トロンビンによって活性化されて不溶性血餅を形成するフィブリノーゲンのアルファ顆粒内容物を放出した。遠心分離すると、トロンビン処理血小板濃縮物は、その内容物が血小板顆粒から放出された成長因子の生理的用量を超える、溶解した血小板および不溶性フィブリン血餅の沈殿物から本質的になる透明な薄赤色液体または流体を含む上清に分離した。上清をさらなる調製工程のために新しい容器に移した。血小板放出物を、３１℃で１時間、溶媒および洗剤系（０．３％ＴＮＢＰｃおよび１％Ｔｗｅｅｎ  ２０ｄ）で処理した。この工程は、エンベロープウイルス（主にＨＢＣ、ＨＣＶ、およびＨＩＶ）を破壊し得る。溶媒および洗剤は、植物油抽出の３つの連続工程によって除去された後にそこにある。上部油相および重力によって上相から分離される下部血小板溶解相を得るために、滅菌ヒマシ油（総容量の７．５％）を血小板放出物に添加し、混合物を血液ミキサー上で１５分間振盪した後、容器を逆位置で１０分間吊るす。この工程をさらに２回繰り返した後、血小板放出物を４℃および１５００ｇで２０分間、逆位置で遠心分離して、上相の油の残留物および重力によって得られる下相の血小板放出物を分離する。
【００５６】
次いで、血小板放出物を無菌濾過の工程に供して細菌性汚染物質を確実に除去し、次いで液体または流体濾液をガラスバイアル中に所定容量（濃縮液の初期血小板数に応じて、１ｃｍ３当たり約１００万血小板に相当するように調整）で分注し、そして主として血小板由来成長因子からなるそのような濾液を凍結乾燥する。
【００５７】
実施例２．
実施例１で得られた血小板放出物を用いて達成した。
顔の若返り。顎、頬および鼻唇襞の女性の顔の両側に、２×１０６個の血小板由来の１つのバイアルを注射した。発赤、痛み、腫れを大幅に減らすことができた。再生効果は少なくとも６ヶ月間続く。
【００５８】
比較実験．
実施例２と同じ欠陥に悩まされている女性の顔の両側に、２×１０６個の自己血小板を含む容量を注射した。発赤、痛み、腫れは限られた範囲でしか減らすことができなかった。
【００５９】
実施例３．
実施例１で得られた血小板放出物を用いて達成した。
腰痛管理における疼痛緩和。２×１０６個の血小板から生じた２つのバイアルを背中の下部に注射した。痛みを大幅に軽減することができた。１週間後、１本のバイアルを注射することによって治療を繰り返した。再生効果は数ヶ月続いた。
【００６０】
実施例４．
実施例１で得られた血小板放出物をコラーゲンアルギン酸ナトリウムヒドロゲル創傷包帯に組み入れ、そして６ヶ月超にわたって治癒することができなかった糖尿病性潰瘍に適用した。数日以内に著しい創傷治癒を達成することができた。
【００６１】
実施例５．
今回はウマ血液を用いて、実施例１の方法に従って血小板放出物を調製した。２×１０６個の血小板からそれぞれ生じた２つのバイアルをウマの損傷した筋肉に注射した。一週間後に治療を繰り返した。筋肉は怪我を残すことなく治癒した。
【００６２】
（付記）
（付記１）
成長因子含有血小板放出物（ｒｅｌｅａｓａｔｅ）を流動性哺乳動物血小板濃縮物から調製する方法であって、
ａ．前記血小板濃縮物中に存在する微生物のＤＮＡおよびＲＮＡの両方を破壊する目的で、前記血小板濃縮物を第１病原体濃度減少工程に供し、
ｂ．前記血小板にその中に存在するアルファ顆粒および成長因子の少なくとも一部を放出させ、それによって流動性血小板放出物を提供する目的で、前記血小板濃縮物を、当該血小板濃縮物を活性化剤と接触させることによる活性化工程に供し、
ｃ．前記流動性血小板放出物をフィブリノーゲン濃度減少工程に供し、フィブリノーゲン枯渇流動性血小板放出物を回収し、
ｄ．前記フィブリノーゲン枯渇流動性血小板放出物をエンベロープウイルスを破壊する目的で第２病原体濃度減少工程に供し、
ｅ．前記血小板放出物を滅菌濾過する工程に供し、前記濾過工程から前記成長因子を含有する濾液を回収する、
連続工程を含む、方法。
【００６３】
（付記２）
工程ｅで得られた前記成長因子を含む前記濾液は、凍結乾燥を受ける、付記１に記載の方法。
【００６４】
（付記３）
前記活性化剤は、カルシウム塩、トロンビン、コラーゲン、トロンボキサンＡ２、およびアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）の群から選択される１つ以上の化合物を含む溶液、好ましくはトロンビン含有溶液である、付記１または２に記載の方法。
【００６５】
（付記４）
前記第１病原体濃度減少工程は、前記血小板濃縮物を光化学活性剤と共にインキュベートすること、および前記血小板濃縮物をＵＶ照射に曝露することを含む、付記１〜３のいずれか１つに記載の方法。
【００６６】
（付記５）
前記ＵＶ照射は、ＵＶＡ照射、好ましくは１〜１０ＪＪ／ｃｍ２のエネルギー密度のＵＶＡ照射、より好ましくは３Ｊ／ｃｍ２のエネルギー密度のＵＶＡ照射である、付記４に記載の方法。
【００６７】
（付記６）
前記光化学活性剤は、ソラレン、特にアモトサレンまたはリボフラビンである、付記４または５に記載の方法。
【００６８】
（付記７）
前記第２病原体濃度減少工程は、前記血小板放出物を溶媒および／または洗剤と共にインキュベートし、続いて前記溶媒および／または前記洗剤を除去し、溶媒および／または洗剤中の枯渇した前記血小板放出物を回収すること、を含む、付記１〜６のいずれか１つに記載の方法。
【００６９】
（付記８）
前記血小板濃縮物をインキュベートするための前記溶媒は、ジ−またはトリアルキルホスフェートの群から選択される、好ましくはトリ−ｎ−ブチルホスフェートである、付記７に記載の方法。
【００７０】
（付記９）
前記洗剤は、脂肪酸のポリオキシエチレン誘導体、無水ソルビトールの部分エステル、非イオン性洗剤、デオキシコール酸ナトリウムおよびスルホベタインのうちの１つ以上を含む群から選択され、好ましくはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、またはＴｗｅｅｎ  ８０である、付記７または８に記載の方法。
【００７１】
（付記１０）
前記溶媒および／または前記洗剤は、油抽出によって前記血小板放出物から除去される、付記７〜９のいずれか１つに記載の方法。
【００７２】
（付記１１）
前記油抽出は、前記血小板濃縮物と前記溶媒および／または前記洗剤との混合物の総重量に基づき、２〜２０重量％、好ましくは５〜１５重量％、より好ましくは５〜１０重量％の範囲の量の油の存在下で行われる、付記１０に記載の方法。
【００７３】
（付記１２）
前記第２病原体濃度減少工程において、前記溶媒および／または前記洗剤を除去した後に、前記血小板放出物を遠心分離する少なくとも１つの工程をさらに含む、付記１〜１１のいずれか１つに記載の方法。
【００７４】
（付記１３）
凍結乾燥の前に、前記濾液を個々の部分に分け、前記個々の部分がほぼ同数の前記放出物を含むように前記個々の部分の体積を調整する、付記２〜１２のいずれか１つに記載の方法。
【００７５】
（付記１４）
前記濾液は、１ｃｍ３当たり約２×１０５〜２×１０７個の前記放出物、好ましくは１ｃｍ３当たり約２×１０６個の前記放出物を含有する個々の部分に分割される、付記１３に記載の方法。
【００７６】
（付記１５）
前記濾液を凍結乾燥に供する前に、工程ｅで得られた前記濾液にヒトアルブミンを供給する、付記２〜１４のいずれか１つに記載の方法。
【００７７】
（付記１６）
前記血小板濃縮物を前記活性化工程ｂに供する前に、前記血小板濃縮物を白血球不活性化工程に供する、付記１〜１５のいずれか１つに記載の方法。
【００７８】
（付記１７）
前記哺乳動物血小板濃縮物は、ヒト血小板またはウマ血小板由来の成長因子に富んでいる、付記１〜１６のいずれか１つに記載の方法。
【００７９】
（付記１８）
前記哺乳動物血小板濃縮物は、異なる対象から生じる血小板濃縮物のプールを含む、付記１〜１７のいずれか１つに記載の方法。
【００８０】
（付記１９）
再生医療に使用するための、特に、多系列細胞の増殖の促進、ならびに創傷治癒および潰瘍治癒の促進の群から選択される１つ以上の用途のための、付記１〜１８のいずれか１つに記載の方法で得られた成長因子含有血小板放出物。
【００８１】
（付記２０）
幹細胞、線維芽細胞または樹状細胞から選択される１つ以上の細胞培養培地で使用するための、付記１〜１８のいずれか１つに記載の方法で得られる成長因子含有血小板放出物。
【００８２】
（付記２１）
エアロゾル、処理流体、スプレー、ミスト、ローション、クリーム、軟膏、ゲル、ガム、包帯、皮膚パッチ、プラスターの群のうちの１つ以上から選択される、付記１〜１８のいずれか１つに記載の方法で得られた成長因子含有血小板放出物を含有する製剤。
【手続補正書】
【提出日】平成30年9月24日(2018.9.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
成長因子含有血小板放出物（ｒｅｌｅａｓａｔｅ）を流動性哺乳動物血小板濃縮物から調製する方法であって、
ａ．前記血小板濃縮物中に存在する微生物のＤＮＡおよびＲＮＡの両方を破壊する目的で、前記血小板濃縮物を第１病原体濃度減少工程に供する工程と、
ｂ．前記血小板にその中に存在するアルファ顆粒および成長因子の少なくとも一部を放出させ、それによって流動性血小板放出物を提供する目的で、前記血小板濃縮物を、当該血小板濃縮物を活性化剤と接触させることによる活性化工程に供する工程と、
ｃ．前記流動性血小板放出物をフィブリノーゲン濃度減少工程に供し、フィブリノーゲン枯渇流動性血小板放出物を回収する工程と、
ｄ．前記フィブリノーゲン枯渇流動性血小板放出物をエンベロープウイルスを破壊する目的で第２病原体濃度減少工程に供する工程と、
ｅ．前記血小板放出物を滅菌濾過する工程に供し、前記濾過工程から前記成長因子を含有する濾液を回収する工程と、
ｆ．前記濾液を個々の部分に分ける工程であって、前記個々の部分がほぼ同数の血小板を含むように前記個々の部分の体積が調整される、工程と、
ｇ．このようにして得られた濾液の前記個々の部分を凍結乾燥に供する工程と、
を含む連続工程を含む、方法。
【請求項２】
前記活性化剤は、カルシウム塩、トロンビン、コラーゲン、トロンボキサンＡ２、およびアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）の群から選択される１つ以上の化合物を含む溶液、好ましくはトロンビン含有溶液である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１病原体濃度減少工程は、前記血小板濃縮物を光化学活性剤と共にインキュベートすること、および前記血小板濃縮物をＵＶ照射に曝露することを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＵＶ照射は、ＵＶＡ照射、好ましくは１〜１０ＪＪ／ｃｍ２のエネルギー密度のＵＶＡ照射、より好ましくは３Ｊ／ｃｍ２のエネルギー密度のＵＶＡ照射である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記光化学活性剤は、ソラレン、特にアモトサレンまたはリボフラビンである、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
前記第２病原体濃度減少工程は、前記血小板放出物を溶媒および／または洗剤と共にインキュベートし、続いて前記溶媒および／または前記洗剤を除去し、溶媒および／または洗剤中の枯渇した前記血小板放出物を回収すること、を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記血小板濃縮物をインキュベートするための前記溶媒は、ジ−またはトリアルキルホスフェートの群から選択される、好ましくはトリ−ｎ−ブチルホスフェートである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記洗剤は、脂肪酸のポリオキシエチレン誘導体、無水ソルビトールの部分エステル、非イオン性洗剤、デオキシコール酸ナトリウムおよびスルホベタインのうちの１つ以上を含む群から選択され、好ましくはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−４５、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、またはＴｗｅｅｎ  ８０である、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
前記溶媒および／または前記洗剤は、油抽出によって前記血小板放出物から除去される、請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記油抽出は、前記血小板濃縮物と前記溶媒および／または前記洗剤との混合物の総重量に基づき、２〜２０重量％、好ましくは５〜１５重量％、より好ましくは５〜１０重量％の範囲の量の油の存在下で行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記第２病原体濃度減少工程において、前記溶媒および／または前記洗剤を除去した後に、前記血小板放出物を遠心分離する少なくとも１つの工程をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記濾液は、１ｃｍ３当たり約２×１０５〜２×１０７個の前記放出物、好ましくは１ｃｍ３当たり約２×１０６個の前記放出物を含有する個々の部分に分割される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記濾液を凍結乾燥に供する前に、工程ｅで得られた前記濾液にヒトアルブミンを供給する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記血小板濃縮物を前記活性化工程ｂに供する前に、前記血小板濃縮物を白血球不活性化工程に供する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記哺乳動物血小板濃縮物は、ヒト血小板またはウマ血小板由来の成長因子に富んでいる、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記哺乳動物血小板濃縮物は、異なる対象から生じる血小板濃縮物のプールを含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
再生医療に使用するための、特に、多系列細胞の増殖の促進、ならびに創傷治癒および潰瘍治癒の促進の群から選択される１つ以上の用途のための、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法で得られた成長因子含有血小板放出物。
【請求項１８】
幹細胞、線維芽細胞または樹状細胞から選択される１つ以上の細胞培養培地で使用するための、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法で得られる成長因子含有血小板放出物。
【請求項１９】
エアロゾル、処理流体、スプレー、ミスト、ローション、クリーム、軟膏、ゲル、ガム、包帯、皮膚パッチ、プラスターの群のうちの１つ以上から選択される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法で得られた成長因子含有血小板放出物を含有する製剤。
【国際調査報告】
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