(57)【要約】  本発明は一般的に、個体におけるイズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）欠損および／またはムコ多糖症ＩＩ型（ＭＰＳ  ＩＩ）の処置、管理、進行の遅延、または発達の正常化に用いるためのポリペプチドまたは核酸に関し、このポリペプチドはアポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥＩＩ）の縦列反復に係留されたイズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）を含むか、またはこの核酸はアポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥＩＩ）遺伝子配列の縦列反復に係留されたイズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）遺伝子配列を含む。加えて本発明は、治療に用いるためにこうした核酸によって形質導入された造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）遺伝子配列と、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥＩＩ）遺伝子配列の反復とを含む、核酸。
【請求項２】
前記ＩＤＳ配列と前記ＡｐｏＥＩＩ配列との間に位置する介在リンカー配列をさらに含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
前記ＩＤＳ配列は野生型ＩＤＳ配列のコドン最適化配列を含む、請求項１または２に記載の核酸。
【請求項４】
前記ＡｐｏＥＩＩ配列の前記反復は縦列反復の形である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項５】
前記ＩＤＳ配列は、配列番号１もしくは配列番号２による配列、またはその少なくとも９０％の相同性を有する誘導体配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項６】
前記ＡｐｏＥＩＩ配列は、配列番号３またはその少なくとも９５％の相同性を有する誘導体配列による１つまたはそれ以上の配列を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項７】
前記介在リンカー配列は、配列番号４による配列、またはその少なくとも９５％の相同性を有する誘導体配列を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項８】
前記核酸は遺伝子治療ベクターに組み込まれる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項９】
前記ベクターはレンチウイルスベクターである、請求項８に記載の核酸。
【請求項１０】
前記核酸は、１つまたはそれ以上の造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）に形質導入される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項１１】
イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）欠損に起因し得る疾患または状態の処置、管理、進行の遅延、または発達の正常化に用いるための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項１２】
前記疾患または状態は、ムコ多糖症ＩＩ型（ＭＰＳ  ＩＩ）またはハンター症候群を含む、請求項１１に記載の核酸。
【請求項１３】
ａ）イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）を含む第１の部分と、
ｂ）アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥＩＩ）の反復を含む第２の部分とを含む、組成物。
【請求項１４】
前記アポリポタンパク質ＡｐｏＥＩＩの反復は縦列反復の形である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記第１および第２の部分は、それらの間に位置する介在リンカー部分を有する、請求項１３または１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記第１の部分のアミノ酸配列は、配列番号５による配列、またはその少なくとも９０％の相同性を有する誘導体配列を含む、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記第２の部分のアミノ酸配列は、配列番号７またはその少なくとも９５％の相同性を有する誘導体配列による１つまたはそれ以上の配列を含む、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記介在リンカー部分のアミノ酸配列は、配列番号８による配列、またはその少なくとも９５％の相同性を有する誘導体配列を含む、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）欠損に起因し得る疾患または状態の処置、管理、進行の遅延、または発達の正常化に用いるための、請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記疾患または状態は、ムコ多糖症ＩＩ型（ＭＰＳ  ＩＩ）またはハンター症候群を含む、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
個体におけるイズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）欠損および／またはムコ多糖症ＩＩ型（ＭＰＳ  ＩＩ）の処置、管理、進行の遅延、または発達の正常化に用いるための造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）であって、前記ＨＳＰＣは患者から除去され、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の核酸によってエクスビボで形質導入され、前記形質導入されたＨＳＰＣは前記個体に投与される、造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）。
【請求項２２】
タンパク質の欠損の結果もたらされる状態である個体における血液脳関門を横断して脳に欠損イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）タンパク質を送達するための方法であって、組成物は、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥＩＩ）遺伝子配列の縦列反復に係留された前記欠損タンパク質をコードする遺伝子配列を含むウイルスベクターを含み、前記ベクターは造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）の集団によってエクスビボで形質導入され、前記形質導入されたＨＳＰＣは前記個体に投与され、そこで前記形質導入されたＨＳＰＣは前記血液脳関門を横断するために十分な、より高い生理学的レベルの前記欠損タンパク質を発現する、方法。
【請求項２３】
ベクターは、前記欠損タンパク質をコードする遺伝子配列と、前記アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥＩＩ）遺伝子配列の前記縦列反復との間に、可動性リンカーに対する配列を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＡｐｏＥＩＩ縦列反復遺伝子配列は、配列番号３による配列、またはその最大９５％の相同性を有する変異体配列を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記可動性リンカー配列は、配列番号４による配列、またはその最大９５％の相同性を有する変異体配列を含む、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＨＳＰＣは自己のものである、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）遺伝子配列およびアポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥＩＩ）遺伝子配列の反復を含む核酸と、１つまたはそれ以上の造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）との組み合わせであって、前記核酸は前記ＨＳＰＣに形質導入できる、組み合わせ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ムコ多糖症（ＭＰＳ：ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｉｓ）ＩＩ型の処置のための幹細胞遺伝子治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
ムコ多糖症ＩＩ型（ＭＰＳ  ＩＩ、ＯＭＩＭ＃３０９９００）またはハンター症候群は、小児科のＸ連鎖リソソーム貯蔵障害であり、その原因はＩＤＳ遺伝子の突然変異によってイズロン酸−２−スルファターゼ酵素（ＥＣ  ３．１．６．１３）の欠損がもたらされることである。このＩＤＳ酵素の不足は、次いでヘパラン硫酸（ＨＳ：ｈｅｐａｒａｎ  ｓｕｌｐｈａｔｅ）およびデルマタン硫酸の両方の異化反応に影響し、その後すべての細胞のリソソームコンパートメントにそれらの調節されない蓄積がもたらされる（非特許文献１）。ＭＰＳ  ＩＩは出生男性１００，０００人当り１．３人が発症し（非特許文献２〜４）、歴史的に軽症型または重症型のいずれかに分類されてきた。しかし近年、ほとんどの臨床的展望は、症状の重症度に依存して２つの極値の間の連続体を記述している（非特許文献４）。ＭＰＳ  ＩＩは慢性かつ進行性の多系統疾患であり、たとえば脳、心臓、骨格、および関節などの多数の器官に影響する。より軽症型のＭＰＳ  ＩＩの臨床症状は重度の骨格異常を含み、それらは多発性骨形成不全、低身長、関節硬直、および肝脾腫として公知であり、心臓呼吸性の症状を伴う（非特許文献４、５）。重症型ＭＰＳ  ＩＩは付加的に進行性神経変性を特徴とし、その後閉塞性気道疾患および心不全によって１０代の年齢で死に至る（非特許文献４、６、７）。
【０００３】
酵素補充療法（ＥＲＴ：Ｅｎｚｙｍｅ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｔｈｅｒａｐｙ）は、外来性の補充酵素を静脈内に送達し、マンノース−６−リン酸受容体を用いる細胞によって内部移行させるものであり、疾患の重症度にかかわらずＭＰＳ  ＩＩ患者の身体症状を処置するために用いられてきた（非特許文献８、９）。しかし、血流中を循環する酵素は血液脳関門（ＢＢＢ：ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ）によってＣＮＳへの到達を妨げられ、３分の２のＭＰＳ  ＩＩ患者に対する治療上の利益がかなり低減して、認知的に影響される。さらに、補充酵素に対する重度のアナフィラキシー反応（非特許文献９、１０）、および酵素に対する中和抗体（非特許文献１１）が報告されており、これらは処置の有効性を減少させるおそれがある（非特許文献１２）。
【０００４】
ＭＰＳ  ＩＩにおける神経症状を処置するために特異的に設計されて認可された治療法は現在存在しないが、多様な戦略が開発されている。特に遺伝子治療は、ＭＰＳ  ＩＩなどの単一遺伝子疾患に対する魅力的な治療の可能性である。第２世代レンチウイルスベクター（ＬＶ：ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ）を用いた幹細胞遺伝子治療（非特許文献１３）、およびＣＮＳへのさまざまなアデノ随伴ベクター（ＡＡＶ：ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｅｃｔｏｒｓ）の直接注入（非特許文献５、１４、１５）によって、有望な結果が得られている。しかし、マウスの脳からヒトの脳へのスケールアップが主要なハードルであり、治療ベクターの脳組織全体への適切な分配も同様である。
【０００５】
同種幹細胞移植は、ＭＰＳ  Ｉハーラーにおける神経症状を処置するために推奨されている（非特許文献１６〜１８）が、ＭＰＳ  ＩＩのＣＮＳの処置においては可変性が高く、主に拒絶反応および移植片対宿主病によってもたらされる高い罹患率および死亡率に関連付けられる（非特許文献１９、２０）。同種移植片から送達される酵素のレベルは、末梢器官における主要な貯蔵材料を除去するためには十分であるが、脳においては低すぎるのかもしれず、したがって完全な神経補正に対する制限因子であることが示唆されている（非特許文献２１、２２）。実際に、ＬＶ形質導入した造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ：ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ）ならびにそれらの後代における超生理学的酵素レベルは、異染性白質ジストロフィー、ＭＰＳ  Ｉ、およびＭＰＳ  ＩＩＩＡにおける神経疾患の徴候を補正することが示されている（非特許文献２１、２３〜２５）。これは、隣接細胞を交差補正するためにリソソーム酵素を合成および分泌する、遺伝子改変ドナーＨＳＰＣに由来する細胞によるレシピエントのマクロファージおよびミクログリア集団の再構成をもたらす（非特許文献２２）。さらに、骨髄系前駆細胞に由来する補正されたミクログリア細胞もＣＮＳミクログリアのターンオーバーに著しく寄与する可能性があるが、成人ＣＮＳにおけるそれらの維持および再生に関する議論が存在する。
【０００６】
ＣＮＳを処置するための幹細胞遺伝子治療アプローチの有効性の程度は、ＨＳＣおよびそれらの後代で産生されて分泌される酵素のレベルに大きく依拠すると考えられる（非特許文献２２、２３）。一般的に、血流には高レベルの酵素が見出されるが、ＢＢＢの高密度の微小血管系によって、ＣＮＳに入ることが妨げられる（非特許文献２６）。
【０００７】
ＣＮＳの関与する疾患の神経病理の処置における主要なハードルは、ＢＢＢをバイパスすることである。こうした戦略の１つは、たとえばトランスフェリン受容体（ＴｆＲ：ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）および低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ：ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）などのＢＢＢ表面に位置する受容体を利用する、経細胞輸送として公知のプロセスを介してＣＮＳに移動させるために、タンパク質を標的にすることである（非特許文献２７）。ＬＤＬＲファミリーは、アリポタンパク質（Ａｐｏ：ａｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）複合体に結合してそれらをリソソームに対する標的とする細胞表面受容体である（非特許文献２８）。Ａｐｏ複合体はＢＢＢの表面でＬＤＬＲに結合し、ニューロンおよびアストロサイトへの取り込みの前に放出される前に反管腔側に経細胞輸送される（非特許文献２９）。多数の研究では、ＬＤＬＲ結合ドメインペプチドと目的の酵素とを融合することによってこの最小限の侵襲性の技術を利用しており、動物モデルにおいてこれらのキメラコンストラクトがＢＢＢを横断する効率的な送達を示している（非特許文献２９〜３３）。
【０００８】
本発明者らはこの技術を利用して、第３世代レンチウイルスベクターにおいてＣ末端におけるインバリアント可動性リンカーによってヒトアリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ：ａｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅ）の受容体結合ドメインを縦列反復としてＩＤＳ遺伝子に融合することによって、ＭＰＳ  ＩＩにおける脳病理および認知機能低下を効率的に処置することを探求した。これによって、エクスビボで補正されたＨＳＰＣが、移植された動物においてＢＢＢを優先的にバイパスし得る超生理学的レベルのＩＤＳ酵素を発現することによって、血流から脳実質に到達する酵素のレベルを増加させることが可能になる。
【０００９】
本発明の目的は、ＭＰＳＩＩに対する上に提案された治療に関連する問題の１つ以上を克服することである。ＭＰＳＩＩに対する効果的な処置を提供することも、本発明の目的である。こうした処置は、投与が比較的容易であり、かつ低い毒性学的プロファイルを有することが理想的であろう。こうした処置が、血液脳関門を横断する必要のある処置の投与に関する問題を克服または回避できることも望ましいだろう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｎｅｕｆｅｌｄ  ＥＦ，Ｍｕｅｎｚｅｒ  Ｊ．Ｔｈｅ  Ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｅｓ．Ｉｎ：ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，ｅｄｉｔｏｒ．Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ２００１．ｐ．３４２１−５２
【非特許文献２】Ｂａｅｈｎｅｒ  Ｆ，Ｓｃｈｍｉｅｄｅｓｋａｍｐ  Ｃ，Ｋｒｕｍｍｅｎａｕｅｒ  Ｆ，Ｍｉｅｂａｃｈ  Ｅ，Ｂａｊｂｏｕｊ  Ｍ，Ｗｈｙｂｒａ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ  ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ  ｒａｔｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｅｓ  ｉｎ  Ｇｅｒｍａｎｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ．２００５；２８（６）：１０１１−７
【非特許文献３】Ｐｏｏｒｔｈｕｉｓ  ＢＪ，Ｗｅｖｅｒｓ  ＲＡ，Ｋｌｅｉｊｅｒ  ＷＪ，Ｇｒｏｅｎｅｒ  ＪＥ，ｄｅ  Ｊｏｎｇ  ＪＧ，ｖａｎ  Ｗｅｅｌｙ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｏｆ  ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ．Ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ．１９９９；１０５（１−２）：１５１−６．Ｅｐｕｂ  １９９９／０９／１０
【非特許文献４】Ｗｒａｉｔｈ  ＪＥ，Ｓｃａｒｐａ  Ｍ，Ｂｅｃｋ  Ｍ，Ｂｏｄａｍｅｒ  ＯＡ，Ｄｅ  Ｍｅｉｒｌｅｉｒ  Ｌ，Ｇｕｆｆｏｎ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｉｓ  ｔｙｐｅ  ＩＩ（Ｈｕｎｔｅｒ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）：ａ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ａｎｄ  ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｒａ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍｅ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ．２００８；１６７（３）：２６７−７７．Ｅｐｕｂ  ２００７／１１／２７
【非特許文献５】Ｃａｒｄｏｎｅ  Ｍ，Ｐｏｌｉｔｏ  ＶＡ，Ｐｅｐｅ  Ｓ，Ｍａｎｎ  Ｌ，Ｄ’Ａｚｚｏ  Ａ，Ａｕｒｉｃｃｈｉｏ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｎｔｅｒ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＭＰＳＩＩ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｂｙ  ＡＡＶ２／８−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｈｕｍａｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２００６；１５（７）：１２２５−３６．Ｅｐｕｂ  ２００６／０３／０１
【非特許文献６】Ｍｅｉｋｌｅ  ＰＪ，Ｈｏｐｗｏｏｄ  ＪＪ，Ｃｌａｇｕｅ  ＡＥ，Ｃａｒｅｙ  ＷＦ．Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ｏｆ  ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．Ｊａｍａ．１９９９；２８１（３）：２４９−５４．Ｅｐｕｂ  １９９９／０１／２６
【非特許文献７】Ｈｏｌｔ  ＪＢ，Ｐｏｅ  ＭＤ，Ｅｓｃｏｌａｒ  ＭＬ．Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  Ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｉｓ  Ｔｙｐｅ  ＩＩ．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ．２０１１；１２７（５）：Ｅ１２５８−Ｅ６５
【非特許文献８】Ｅｎｇ  Ｃ，Ｍｕｅｎｚｅｒ  Ｊ，Ｗｒａｉｔｈ  Ｅ，Ｂｅｃｋ  Ｍ，Ｇｉｕｇｌｉａｎｉ  Ｒ，Ｈａｒｍａｔｚ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｂｅｎｅｆｉｔ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍｅ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｔｈｅｒａｐｙ（ＥＲＴ）  ｉｎ  ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｉｓ  ＩＩ（ＭＰＳ  ＩＩ，Ｈｕｎｔｅｒ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．２００７；９２（４）：Ｓ１８−Ｓ
【非特許文献９】Ｍｕｅｎｚｅｒ  Ｊ，Ｗｒａｉｔｈ  ＪＥ，Ｂｅｃｋ  Ｍ，Ｇｉｕｇｌｉａｎｉ  Ｒ，Ｈａｒｍａｔｚ  Ｐ，Ｅｎｇ  ＣＭ，ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｐｈａｓｅ  ＩＩ／ＩＩＩ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍｅ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ｉｄｕｒｓｕｌｆａｓｅ  ｉｎ  ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｉｓ  ＩＩ（Ｈｕｎｔｅｒ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２００６；８（８）：４６５−７３
【非特許文献１０】Ｍｕｅｎｚｅｒ  Ｊ，Ｂｅｃｋ  Ｍ，Ｅｎｇ  ＣＭ，Ｇｉｕｇｌｉａｎｉ  Ｒ，Ｈａｒｍａｔｚ  Ｐ，Ｍａｒｔｉｎ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ，ｏｐｅｎ−ｌａｂｅｌｅｄ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｉｄｕｒｓｕｌｆａｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｕｎｔｅｒ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１１；１３（２）：９５−１０１
【非特許文献１１】Ｓｃａｒｐａ  Ｍ，Ａｌｍａｓｓｙ  Ｚ，Ｂｅｃｋ  Ｍ，Ｂｏｄａｍｅｒ  Ｏ，Ｂｒｕｃｅ  ＩＡ，Ｄｅ  Ｍｅｉｒｌｅｉｒ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｉｓ  ｔｙｐｅ  ＩＩ：Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｍｕｌｔｉｄｉｓｃｉｐｌｉｎａｒｙ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｒａｒｅ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｏｒｐｈａｎｅｔ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｒａｒｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．２０１１；６：７２．Ｅｐｕｂ  ２０１１／１１／０９
【非特許文献１２】Ｂｒｏｏｋｓ  ＤＡ，Ｋａｋａｖａｎｏｓ  Ｒ，Ｈｏｐｗｏｏｄ  ＪＪ．Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｅｎｚｙｍｅ−ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ．Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２００３；９（１０）：４５０−３．Ｅｐｕｂ  ２００３／１０／１５
【非特許文献１３】Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉ  Ｔ，Ｓｈｉｍａｄａ  Ｙ，Ａｋｉｙａｍａ  Ｋ，Ｈｉｇｕｃｈｉ  Ｔ，Ｆｕｋｕｄａ  Ｔ，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｃｏｒｒｅｃｔｓ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｉｎ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｉｓ  Ｔｙｐｅ  ＩＩ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２０１５．Ｅｐｕｂ  ２０１５／０３／１３
【非特許文献１４】Ｈｉｎｄｅｒｅｒ  Ｃ，Ｋａｔｚ  Ｎ，Ｌｏｕｂｏｕｔｉｎ  ＪＰ，Ｂｅｌｌ  Ｐ，Ｙｕ  Ｈ，Ｎａｙａｌ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ａｎ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ  ｉｎｔｏ  ＣＳＦ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｉｓ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｍｉｃｅ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２０１６．Ｅｐｕｂ  ２０１６／０８／１２
【非特許文献１５】Ｍｏｔａｓ  Ｓ，Ｈａｕｒｉｇｏｔ  Ｖ，Ｇａｒｃｉａ  Ｍ，Ｍａｒｃｏ  Ｓ，Ｒｉｂｅｒａ  Ａ，Ｒｏｃａ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．ＣＮＳ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃ  ａｎｄ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｉｓ  ｔｙｐｅ  ＩＩ（Ｈｕｎｔｅｒ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）．ＪＣＩ  Ｉｎｓｉｇｈｔ．２０１６；１（９）
【非特許文献１６】Ａｌｄｅｎｈｏｖｅｎ  Ｍ，Ｊｏｎｅｓ  ＳＡ，Ｂｏｎｎｅｙ  Ｄ，Ｂｏｒｒｉｌｌ  ＲＥ，Ｃｏｕｓｓｏｎｓ  Ｍ，Ｍｅｒｃｅｒ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｉｓ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｉｓ  ｓａｆｅ  ａｎｄ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ：ｒｅｓｕｌｔｓ  ａｆｔｅｒ  ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ．Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  ｍａｒｒｏｗ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ：ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．２０１５；２１（６）：１１０６−９．Ｅｐｕｂ  ２０１５／０２／２５
【非特許文献１７】Ａｌｄｅｎｈｏｖｅｎ  Ｍ，Ｗｙｎｎ  ＲＦ，Ｏｒｃｈａｒｄ  ＰＪ，Ｏ’Ｍｅａｒａ  Ａ，Ｖｅｙｓ  Ｐ，Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｏｆ  Ｈｕｒｌｅｒ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ａｆｔｅｒ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ：ａｎ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ  ｓｔｕｄｙ．Ｂｌｏｏｄ．２０１５；１２５（１３）：２１６４−７２．Ｅｐｕｂ  ２０１５／０１／２８
【非特許文献１８】Ｂｏｅｌｅｎｓ  ＪＪ，Ａｌｄｅｎｈｏｖｅｎ  Ｍ，Ｐｕｒｔｉｌｌ  Ｄ，Ｒｕｇｇｅｒｉ  Ａ，Ｄｅｆｏｒ  Ｔ，Ｗｙｎｎ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｏｕｔｃｏｍｅｓ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｓｏｕｒｃｅｓ  ｉｎ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｒｌｅｒ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ａｆｔｅｒ  ｍｙｅｌｏａｂｌａｔｉｖｅ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ．Ｂｌｏｏｄ．２０１３；１２１（１９）：３９８１−７．Ｅｐｕｂ  ２０１３／０３／１６
【非特許文献１９】Ｇｕｆｆｏｎ  Ｎ，Ｂｅｒｔｒａｎｄ  Ｙ，Ｆｏｒｅｓｔ  Ｉ，Ｆｏｕｉｌｈｏｕｘ  Ａ，Ｆｒｏｉｓｓａｒｔ  Ｒ．Ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｎｔｅｒ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ｏｕｔｃｏｍｅ  ａｆｔｅｒ  ７  ｔｏ  １７  ｙｅａｒｓ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ．２００９；１５４（５）：７３３−７．Ｅｐｕｂ  ２００９／０１／２７
【非特許文献２０】Ｖｅｌｌｏｄｉ  Ａ，Ｙｏｕｎｇ  Ｅ，Ｃｏｏｐｅｒ  Ａ，Ｌｉｄｃｈｉ  Ｖ，Ｗｉｎｃｈｅｓｔｅｒ  Ｂ，Ｗｒａｉｔｈ  ＪＥ．Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｆｏｌｌｏｗ−ｕｐ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｈｕｎｔｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ．１９９９；２２：６３８−４８
【非特許文献２１】Ｖｉｓｉｇａｌｌｉ  Ｉ，Ｄｅｌａｉ  Ｓ，Ｐｏｌｉｔｉ  ＬＳ，Ｄｉ  Ｄｏｍｅｎｉｃｏ  Ｃ，Ｃｅｒｒｉ  Ｆ，Ｍｒａｋ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ａｕｇｍｅｎｔｓ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕｌｌｙ  ｃｏｒｒｅｃｔｓ  ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｉｓ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ．Ｂｌｏｏｄ．２０１０；１１６（２４）：５１３０−９．Ｅｐｕｂ  ２０１０／０９／１８
【非特許文献２２】Ｂｉｆｆｉ  Ａ，Ｖｉｓｉｇａｌｌｉ  Ｉ．Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ：Ｅｘｐｅｃｔｅｄ  Ｂｅｎｅｆｉｔｓ  ａｎｄ  Ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｇ．２０１３：１２７−３８
【非特許文献２３】Ｂｉｆｆｉ  Ａ，Ｄｅ  Ｐａｌｍａ  Ｍ，Ｑｕａｔｔｒｉｎｉ  Ａ，Ｄｅｌ  Ｃａｒｒｏ  Ｕ，Ａｍａｄｉｏ  Ｓ，Ｖｉｓｉｇａｌｌｉ  Ｉ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｔａｃｈｒｏｍａｔｉｃ  ｌｅｕｋｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｂｙ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．２００４；１１３（８）：１１１８−２９．Ｅｐｕｂ  ２００４／０４／１６
【非特許文献２４】Ｌａｎｇｆｏｒｄ−Ｓｍｉｔｈ  Ａ，Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ  ＦＬ，Ｌａｎｇｆｏｒｄ−Ｓｍｉｔｈ  ＫＪ，Ｈｏｌｌｅｙ  ＲＪ，Ｓｅｒｇｉｊｅｎｋｏ  Ａ，Ｈｏｗｅ  ＳＪ，ｅｔ  ａｌ．Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｃｏｒｒｅｃｔｓ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｂｅｈａｖｉｏｒ  ｉｎ  ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｉｓ  ＩＩＩＡ  ｍｉｃｅ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ．２０１２；２０（８）：１６１０−２１．Ｅｐｕｂ  ２０１２／０５／０２
【非特許文献２５】Ｓｅｒｇｉｊｅｎｋｏ  Ａ，Ｌａｎｇｆｏｒｄ−Ｓｍｉｔｈ  Ａ，Ｌｉａｏ  ＡＹ，Ｐｉｃｋｆｏｒｄ  ＣＥ，ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ  Ｊ，Ｎｏｗｉｎｓｋｉ  Ｇ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｙｅｌｏｉｄ／Ｍｉｃｒｏｇｌｉａｌ  ｄｒｉｖｅｎ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｃｏｒｒｅｃｔｓ  ａ  ｎｅｕｒｏｎｏｐａｔｈｉｃ  ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ．２０１３；２１（１０）：１９３８−４９．Ｅｐｕｂ  ２０１３／０６／１２
【非特許文献２６】Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ  ＷＭ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２００５；３０（１）：５７−７０．Ｅｐｕｂ  ２００５／０４／０５
【非特許文献２７】Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ  ＷＭ．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｎｅｕｒｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｇｅｎｔｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ．Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．２００２；５９（１）：３５−４０．Ｅｐｕｂ  ２００２／０１／１６
【非特許文献２８】Ｂｏｒｅｎ  Ｊ，Ｌｅｅ  Ｉ，Ｚｈｕ  Ｗ，Ａｒｎｏｌｄ  Ｋ，Ｔａｙｌｏｒ  Ｓ，Ｉｎｎｅｒａｒｉｔｙ  ＴＬ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｏｗ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ  ｉｎ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂ１００  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｃａｒｂｏｘｙｌ  ｔｅｒｍｉｎｕｓ  ｉｎ  ｆａｍｉｌｉａｌ  ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ａｐｏ−Ｂ１００．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．１９９８；１０１（５）：１０８４−９３．Ｅｐｕｂ  １９９８／０４／１６
【非特許文献２９】Ｓｏｒｒｅｎｔｉｎｏ  ＮＣ，Ｄ’Ｏｒｓｉ  Ｌ，Ｓａｍｂｒｉ  Ｉ，Ｎｕｓｃｏ  Ｅ，Ｍｏｎａｃｏ  Ｃ，Ｓｐａｍｐａｎａｔｏ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｈｉｇｈｌｙ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｓｕｌｐｈａｍｉｄａｓｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｔｏ  ｃｒｏｓｓ  ｔｈｅ  ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｃｏｒｒｅｃｔｓ  ｂｒａｉｎ  ｌｅｓｉｏｎｓ  ｏｆ  ｍｉｃｅ  ｗｉｔｈ  ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｅｓ  ｔｙｐｅ  ＩＩＩＡ．Ｅｍｂｏ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．２０１３；５（５）：６７５−９０．Ｅｐｕｂ  ２０１３／０４／１０
【非特許文献３０】Ｓｐｅｎｃｅｒ  Ｂ，Ｖｅｒｍａ  Ｉ，Ｄｅｓｐｌａｔｓ  Ｐ，Ｍｏｒｖｉｎｓｋｉ  Ｄ，Ｒｏｃｋｅｎｓｔｅｉｎ  Ｅ，Ａｄａｍｅ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｂｒａｉｎ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｒｅｓｔｏｒｅｓ  ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２０１４；２８９（２５）：１７９１７−３１．Ｅｐｕｂ  ２０１４／０５／１６
【非特許文献３１】Ｓｐｅｎｃｅｒ  ＢＪ，Ｖｅｒｍａ  ＩＭ．Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｃｒｏｓｓ  ｔｈｅ  ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２００７；１０４（１８）：７５９４−９．Ｅｐｕｂ  ２００７／０４／２８
【非特許文献３２】Ｂｏｃｋｅｎｈｏｆｆ  Ａ，Ｃｒａｍｅｒ  Ｓ，Ｗｏｌｔｅ  Ｐ，Ｋｎｉｅｌｉｎｇ  Ｓ，Ｗｏｈｌｅｎｂｅｒｇ  Ｃ，Ｇｉｅｓｅｌｍａｎｎ  Ｖ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｆｉｖｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｂｒａｉｎ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ｅｎｚｙｍｅ  ａｒｙｌｓｕｌｆａｔａｓｅ  Ａ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ：ｔｈｅ  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．２０１４；３４（９）：３１２２−９．Ｅｐｕｂ  ２０１４／０２／２８
【非特許文献３３】Ｗａｎｇ  Ｄ，Ｅｌ−Ａｍｏｕｒｉ  ＳＳ，Ｄａｉ  Ｍ，Ｋｕａｎ  ＣＹ，Ｈｕｉ  ＤＹ，Ｂｒａｄｙ  ＲＯ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａ  ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ｅｎｚｙｍｅ  ｗｉｔｈ  ａ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  ｏｆ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ａｐｏＥ  ｅｎａｂｌｅｓ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ａｃｒｏｓｓ  ｔｈｅ  ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２０１３；１１０（８）：２９９９−３００４．Ｅｐｕｂ  ２０１３／０２／０６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の態様によると、イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ：ｉｄｕｒｏｎａｔｅ−２−ｓｕｌｆａｔａｓｅ）遺伝子配列と、アポリポタンパク質（Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）Ｅ（ＡｐｏＥＩＩ）遺伝子配列の反復、またはＡｐｏＥＩＩ遺伝子配列の一部の反復とを含む核酸が提供される。
【００１２】
この核酸は、ＩＤＳ配列とＡｐｏＥＩＩ配列との間に位置する介在リンカー配列をさらに含んでもよい。
【００１３】
ＩＤＳ配列は、野生型ＩＤＳ配列のコドン最適化配列であってもよい。
【００１４】
ＡｐｏＥＩＩ配列の反復は、縦列反復の形であってもよい。ＡｐｏＥＩＩ配列の反復は、ＩＤＳ配列の上流および／または下流であってもよい。
【００１５】
ＩＤＳ配列は、配列番号１もしくは配列番号２による配列、またはその少なくとも９０％の相同性を有する誘導体配列を含んでもよい。その配列が誘導体配列であるとき、好ましくはその配列は少なくとも９３％の相同性を有する。さらにより好ましくは、その配列は、配列番号１または配列番号２と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の相同性を有する誘導体配列であってもよい。
【００１６】
ＡｐｏＥＩＩ配列は、配列番号３またはその少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の相同性を有する誘導体配列による１つ以上の配列を含んでもよい。
【００１７】
介在リンカー配列は、配列番号４による配列、またはその少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の相同性を有する誘導体配列を含んでもよい。
【００１８】
本発明の別の態様によると、個体における酵素の血漿レベルまたは血漿における安定性の増加に用いるための核酸が提供され、この核酸は酵素遺伝子配列と、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥＩＩ）遺伝子配列の反復とを含む。
【００１９】
この核酸は、酵素配列とＡｐｏＥＩＩ配列との間に位置する介在リンカー配列をさらに含んでもよい。
【００２０】
酵素配列は、酵素配列のコドン最適化配列であってもよい。
【００２１】
ＡｐｏＥＩＩ配列の反復は、縦列反復の形であってもよい。ＡｐｏＥＩＩ配列の反復は、酵素配列の上流および／または下流であってもよい。
【００２２】
ＡｐｏＥＩＩ配列は、配列番号３またはその少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の相同性を有する誘導体配列による１つ以上の配列を含んでもよい。
【００２３】
介在リンカー配列は、配列番号４による配列、またはその少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の相同性を有する誘導体配列を含んでもよい。
【００２４】
酵素は、リソソーム貯蔵疾患である個体において欠損しているか、または低血漿レベルにて存在する酵素であってもよい。リソソーム貯蔵疾患は、ムコ多糖症ＩＩ型（ＭＰＳ  ＩＩ）を含んでもよい。
【００２５】
核酸はＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、またはＰＮＡであってもよく、組み換えまたは合成のものであってもよい。核酸は一本鎖であっても、二本鎖であってもよい。核酸配列は、たとえば制限消化、連結、ゲル電気泳動（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓに記載されるものなど）を含む標準的な分子クローニング技術などを用いるクローニングによって導出されてもよい。核酸配列は、ＰＣＲ技術を用いて単離または増幅されてもよい。こうした技術は、増幅されるべき核酸配列の配列に基づくプライマーを使用してもよい。提供される配列情報によって、当業者は利用可能なクローニング技術を用いて、細胞への形質導入のために好適な核酸配列またはベクターを生成できる。
【００２６】
コドン最適化ＩＤＳ核酸配列は、発現または活性の増強を可能にするように、多数のやり方で最適化されてもよい。たとえば、ヒト細胞において最も一般的なコドンを選択すること、ならびに／または後で形成されるｍＲＮＡにおいて生じ得る１つもしくはそれ以上の二次構造およびヘアピンを低減させること、ならびに／またはＡＴＧ開始点にコザック配列を挿入することなどによって、配列が最適化されていてもよい。
【００２７】
好ましくは、核酸配列は発現ベクターとともに、その中に、またはその一部として提供される。好ましくは、核酸配列は遺伝子治療ベクターとしてとして提供されてもよく、それは好ましくは後で発現のために哺乳動物の体に戻される造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）へのエクスビボ形質導入のために好適なものである。ベクターは、ウイルス性または非ウイルス性（例、プラスミド）であってもよい。ウイルスベクターは、レンチウイルス、アデノウイルス、突然変異形を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ：ａｄｅｎｏａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ）、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ＭＭＬＶ、ＧａＬＶ、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ：Ｓｉｍｉａｎ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｖｉｒｕｓ）、ＨＩＶ、ポックスウイルス、およびＳＶ４０に由来するものを含む。ウイルスベクターは好ましくは複製欠損であるが、ウイルスベクターは複製欠損、複製可能、または条件的であってもよいことが想定される。ウイルスベクターは通常、標的神経細胞のゲノムに組み込まれずに染色体外の状態で存続してもよい。好ましいウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。ウイルスベクターは、任意の非必須配列を除去するために改変されてもよく、これらの非必須配列は当業者に明らかになるだろう。
【００２８】
ウイルスベクターは、細胞に入る能力を有する。しかし、たとえばプラスミドなどの非ウイルス性ベクターは、標的細胞による自身の取り込みを促進するための薬剤と複合体を形成してもよい。こうした薬剤は、ポリカチオン剤を含む。代替的に、たとえばリポソームに基づく送達系などの送達系が用いられてもよい。
【００２９】
本発明において用いるためのベクターは、好ましくはインビボもしくはエクスビボまたはインビトロで用いるために好適であり、かつ好ましくはヒトに用いるために好適である。最も好ましくは、ベクターはエクスビボで造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）に形質導入するために好適である。
【００３０】
ベクターは、好ましくは核酸の発現を指示するための１つ以上の制御配列を含むこととなる。制御配列は、ＩＤＳおよびＡｐｏＥＩＩ核酸配列に動作可能にリンクされたプロモーター、エンハンサー、転写終結シグナル、ポリアデニル化配列、複製起点、核酸制限部位、および相同組み換え部位を含んでもよい。加えてベクターは、たとえば成長系（たとえばバクテリア細胞など）または標的細胞におけるベクターの発現を判定するための選択可能マーカーを含んでもよい。
【００３１】
「動作可能にリンクされる」とは、核酸配列が自身に動作可能にリンクされた配列と機能的に関連して、互いの発現または機能に影響するような方式でリンクされることを意味する。たとえば、プロモーターに動作可能にリンクされた核酸配列は、そのプロモーターに影響される発現パターンを有することとなる。
【００３２】
本発明の態様によると、個体におけるイズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）欠損および／またはムコ多糖症ＩＩ型（ＭＰＳ  ＩＩ）の処置、管理、進行の遅延、または発達の正常化に用いるための造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）が提供され、このＨＳＰＣは患者から除去され、本明細書において上述された核酸によってエクスビボで形質導入され、形質導入されたＨＳＰＣは個体に投与される。
【００３３】
本発明の関連する態様によると、個体におけるイズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）欠損および／またはムコ多糖症ＩＩ型（ＭＰＳ  ＩＩ）の処置、管理、進行の遅延、または発達の正常化の方法に用いるため、あるいはそれを行うための造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）が提供され、このＨＳＰＣは患者から除去されて、本明細書において上述された核酸によってエクスビボで形質導入されており、形質導入されたＨＳＰＣは個体に投与される。
【００３４】
本発明の関連する態様によると、個体におけるイズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）欠損および／またはムコ多糖症ＩＩ型（ＭＰＳ  ＩＩ）の処置、管理、進行の遅延、または発達の正常化の方法に用いるための造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）が提供され、この方法は、前記イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）欠損を有し、かつ／またはイズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）レベルの上昇を必要とする個体を識別するステップと、その個体からＨＳＰＣの一部分を除去するステップと、そのＨＳＰＣを本明細書において上述された核酸によってエクスビボで形質導入するステップと、形質導入されたＨＳＰＣの治療上有効な量を個体に投与するステップとを含む。
【００３５】
関連する発明によると、イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）欠損に起因し得る疾患または状態の処置、管理、進行の遅延、または発達の正常化のための薬物の製造に用いるための造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）が提供され、このＨＳＰＣは患者から除去されて、本明細書において上述された核酸によってエクスビボで形質導入されており、形質導入されたＨＳＰＣは、患者への投与のための薬物に形成される。
【００３６】
上記のＨＳＰＣの態様は、好ましくは自己ＨＳＰＣを使用する（最初に患者または個体から除去されている）が、同種ＨＳＰＣも使用されてもよく、したがって患者または個体からＨＳＰＣを除去して、エクスビボで形質導入してから患者または個体に投与する必要がなくなる。同種ＨＳＰＣは、臍帯血に由来していてもよい。
【００３７】
本発明の態様によると、
ａ）イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）を含む第１の部分と、
ｂ）アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥＩＩ）の反復を含む第２の部分とを含む組成物が提供される。
【００３８】
ＡｐｏＥＩＩの反復は、縦列反復の形であってもよい。第２の部分は、第１の部分の上流および／または下流であってもよい。
【００３９】
第１および第２の部分は、それらの間に位置する介在リンカー部分を有してもよい。
【００４０】
第１の部分のアミノ酸配列は、配列番号５による配列、またはその少なくとも９０％の相同性を有する誘導体配列を含んでもよい。その配列が誘導体配列であるとき、好ましくはその配列は少なくとも９３％の相同性を有する。さらにより好ましくは、その配列は、配列番号５と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の相同性を有する誘導体配列であってもよい。
【００４１】
第２の部分のアミノ酸配列は、配列番号７またはその少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の相同性を有する誘導体配列による１つ以上の配列を含んでもよい。
【００４２】
介在リンカー部分のアミノ酸配列は、配列番号８による配列、またはその少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の相同性を有する誘導体配列を含んでもよい。
【００４３】
本発明のさらなる態様によると、酵素の血漿レベルまたは血漿における安定性を増加させるための組成物が提供され、この組成物は、
ａ）酵素を含む第１の部分と、
ｂ）アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥＩＩ）の反復を含む第２の部分とを含む。
【００４４】
ＡｐｏＥＩＩの反復は、縦列反復の形であってもよい。第２の部分は、第１の部分の上流および／または下流であってもよい。
【００４５】
第１および第２の部分は、それらの間に位置する介在リンカー部分を有してもよい。
【００４６】
有利なことに、これらの部分は酵素の血漿における活性を増加させ得ることを発明者らは見出し、これは酵素に対するリンカーを介したＡｐｏＥＩＩの縦列反復を含むことによって、酵素の安定性および循環時間、分泌または細胞への取り込みが変化する可能性を示唆する。
【００４７】
本発明のさらなる態様においては、配列番号１またはその少なくとも９５％の相同性を有する誘導体配列による核酸を含む組成物が提供される。
【００４８】
この組成物は、配列番号１の少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の相同性を有する誘導体配列を含んでもよい。
【００４９】
この組成物は、個体におけるイズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）欠損および／またはムコ多糖症ＩＩ型（ＭＰＳ  ＩＩ）の処置、管理、進行の遅延、または発達の正常化に用いるためのものであってもよい。
【００５０】
本発明の別の態様においては、個体におけるイズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）欠損および／またはムコ多糖症ＩＩ型（ＭＰＳ  ＩＩ）の処置、管理、進行の遅延、または発達の正常化に用いるためのポリペプチドまたは核酸が提供され、このポリペプチドはアポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥＩＩ）の縦列反復に係留されたイズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）を含むか、またはこの核酸はアポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥＩＩ）遺伝子配列の縦列反復に係留されたイズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）遺伝子配列を含む。
【００５１】
ポリペプチドまたは核酸は、リンカーまたはリンカー配列によって係留されてもよい。
【００５２】
ＡｐｏＥＩＩの縦列反復は、ＩＤＳの上流および／または下流であってもよい。
【００５３】
ＩＤＳ遺伝子配列は、野生型ＩＤＳ遺伝子配列のコドン最適化配列であってもよい。
【００５４】
ＩＤＳは、配列番号５によるアミノ酸配列、またはその少なくとも９０％の相同性を有する誘導体配列を含んでもよい。その配列が誘導体配列であるとき、好ましくはその配列は少なくとも９３％の相同性を有する。さらにより好ましくは、その配列は配列番号５と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の相同性を有する誘導体配列であってもよい。
【００５５】
ＩＤＳ遺伝子配列は、配列番号１もしくは配列番号２による配列、またはその少なくとも９０％の相同性を有する誘導体配列を含んでもよい。その配列が誘導体配列であるとき、好ましくはその配列は少なくとも９３％の相同性を有する。さらにより好ましくは、その配列は、配列番号１または配列番号２と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の相同性を有する誘導体配列であってもよい。
【００５６】
アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥＩＩ）の縦列反復は、配列番号７によるアミノ酸配列、またはその少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の相同性を有する誘導体配列を含んでもよい。アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥＩＩ）遺伝子配列の縦列反復は、配列番号３によるアミノ酸配列、またはその少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の相同性を有する誘導体配列を含んでもよい。
【００５７】
リンカーは、配列番号８によるアミノ酸配列、またはその少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の相同性を有する誘導体配列を含んでもよい。
【００５８】
リンカー配列は、配列番号４による配列、またはその少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の相同性を有する誘導体配列を含んでもよい。
【００５９】
ポリペプチドまたは核酸は、好適なペプチドまたは核酸送達媒体またはベクターに関連付けられるか、あるいはそれに組み込まれてもよい。
【００６０】
「遺伝子配列」という用語は、一般的に発現されて必要なタンパク質となり得る核酸配列を包含することが意図されており、それはゲノム配列、およびｃＤＮＡを含む１つ以上の非コード構成要素（たとえばイントロンなど）が存在しない配列を含む。
【００６１】
上記態様のすべてにおいて、組成物、核酸、ベクター、ポリペプチド、ならびに造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）は、リソソーム貯蔵疾患の処置、管理、進行の遅延、または発達の正常化に用いるためのものであってもよい。代替的または付加的に、組成物、核酸、ベクター、ポリペプチド、ならびに造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）は、リソソーム貯蔵疾患の処置、管理、進行の遅延、または発達の正常化の方法に用いられてもよい。代替的または付加的に、組成物、核酸、ベクター、ポリペプチド、ならびに造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）は、リソソーム貯蔵疾患の処置、管理、進行の遅延、または発達の正常化の方法に用いられてもよく、この方法は、前記リソソーム貯蔵疾患を有し、かつ／または酵素レベルの上昇を必要とする個体を識別するステップと、前記個体に治療上有効な量の組成物、核酸、ベクター、またはポリペプチドを投与するステップとを含む。なおさらに代替的または付加的に、組成物、核酸、ベクター、ポリペプチド、ならびに造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）は、リソソーム貯蔵疾患の処置、管理、進行の遅延、または発達の正常化のための薬物の製造に用いるためのものであってもよい。
【００６２】
特に、上記態様のすべてにおいて、組成物、核酸、ベクター、ポリペプチド、ならびに造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）は、イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）欠損に起因し得る疾患または状態の処置、管理、進行の遅延、または発達の正常化に用いるためのものであってもよい。代替的または付加的に、組成物、核酸、ベクター、ポリペプチド、ならびに造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）は、イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）欠損に起因し得る疾患または状態の処置、管理、進行の遅延、または発達の正常化の方法に用いられてもよい。代替的または付加的に、組成物、核酸、ベクター、ポリペプチド、ならびに造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）は、イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）欠損に起因し得る疾患または状態の処置、管理、進行の遅延、または発達の正常化の方法に用いられてもよく、この方法は、前記イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）欠損を有し、かつ／またはイズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）レベルの上昇を必要とする個体を識別するステップと、前記個体に治療上有効な量の組成物、核酸、ベクター、またはポリペプチドを投与するステップとを含む。なおさらに代替的または付加的に、組成物、核酸、ベクター、ポリペプチド、ならびに造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）は、イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）欠損に起因し得る疾患または状態の処置、管理、進行の遅延、または発達の正常化のための薬物の製造に用いるためのものであってもよい。イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）欠損に起因し得る疾患または状態は、ムコ多糖症ＩＩ型（ＭＰＳ  ＩＩ）またはハンター症候群を含むだろう。
【００６３】
組成物、核酸、ベクター、およびポリペプチドは液体または固体であってもよく、たとえば粉末、ゲル、またはペーストなどであってもよい。好ましくは、組成物、核酸、ベクター、ポリペプチド、ならびに造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）は液体であり、好ましくは注射可能な液体である。こうした注射可能な液体は、好ましくは静脈内および頭蓋内投与に好適となる。
【００６４】
本発明の先行態様の組成物、核酸、ベクター、およびポリペプチドは、さらに薬学的に許容できる賦形剤、アジュバント、希釈剤、または担体を含んで、調合物を提供してもよい。
【００６５】
「薬学的に許容できる」には、調合物が無菌でありかつ発熱物質を含まないことが含まれる。好適な医薬担体は、薬学の技術分野において周知である。担体（単数または複数）は、本発明の薬剤と適合可能であり、かつ自身のレシピエントに対して有害でないという意味で「許容できる」必要がある。通常、担体は無菌かつ発熱物質を含まない水または食塩水となるが、他の許容できる担体が用いられてもよい。
【００６６】
ヒトの治療において、本発明（単数または複数）の調合物は単独で投与され得るが、一般的には意図される投与経路および標準的な医薬診療に関して選択された好適な医薬賦形剤希釈剤または担体との混合物において投与されることとなる。
【００６７】
加えて、本発明（単数または複数）の調合物は非経口的に、たとえば静脈内、動脈内、腹腔内、くも膜下腔内、脳室内、胸骨内、頭蓋内、筋肉内、または皮下などに投与されてもよいし、それらは注入技術によって投与されてもよい。それらの調合物は無菌水溶液の形で最良に用いられ、この無菌水溶液は、たとえば溶液を血液と等張にするために十分な塩またはグルコースなどの他の物質を含有してもよい。もし必要であれば、水溶液は好適に（好ましくはｐＨ３から９に）緩衝されるべきである。無菌条件下での好適な非経口調合物の調製は、当業者に周知の標準的な製薬技術によって容易に達成される。
【００６８】
非経口投与のために好適な調合物は、抗酸化剤と、緩衝剤と、静菌剤と、調合物を意図されるレシピエントの血液と等張にする溶質とを含有し得る水性および非水性の無菌注射溶液；ならびに懸濁剤と増粘剤とを含み得る水性および非水性の無菌懸濁物を含む。調合物は、単位用量または複数用量の容器、たとえば密封アンプルおよびバイアルなどにおいて提供されてもよく、使用の直前にたとえば注射用水などの無菌液体担体の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）の状態で保存されてもよい。前に記載される種類の無菌粉末、顆粒、および錠剤から、即時の注射溶液および懸濁物が調製されてもよい。
【００６９】
本発明の別の態様によると、タンパク質の欠損の結果もたらされる状態である個体における血液脳関門を横断して脳に欠損タンパク質を送達するための方法が提供され、組成物は、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥＩＩ）遺伝子配列の縦列反復に係留された欠損タンパク質をコードする遺伝子配列を含むウイルスベクターを含み、このベクターは造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）の集団によってエクスビボで形質導入され、形質導入されたＨＳＰＣは個体に投与され、そこで形質導入されたＨＳＰＣは血液脳関門を横断するために十分である十分なレベルの欠損タンパク質を発現する。
【００７０】
ベクターは、欠損タンパク質をコードする遺伝子配列と、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥＩＩ）遺伝子配列の縦列反復との間に、インバリアント可動性リンカーに対する配列を含んでもよい。
【００７１】
欠損タンパク質は酵素を含んでもよい。酵素は、リソソーム貯蔵疾患酵素であってもよい。好ましくは、酵素はイズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）を含む。
【００７２】
この方法において、ＡｐｏＥＩＩ縦列反復遺伝子配列は、配列番号３による配列、またはその最大９５％、最大９６％、最大９７％、最大９８％、もしくは最大９９％の相同性を有する変異体配列を含んでもよく、一方でインバリアント可動性リンカー配列は、配列番号４による配列、またはその最大９５％、最大９６％、最大９７％、最大９８％、もしくは最大９９％の相同性を有する変異体配列を含んでもよい。
【００７３】
本発明のさらに別の態様によると、リソソーム貯蔵疾患の処置に用いるための組成物が提供され、この組成物は欠損タンパク質をコードする遺伝子配列を含むウイルスベクターを含み、この遺伝子配列はリソソーム貯蔵疾患に関係しており、かつアポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥＩＩ）遺伝子配列の縦列反復に係留される。
【００７４】
ベクターは好ましくは、造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）の集団によってエクスビボで形質導入され、形質導入されたＨＳＰＣは、リソソーム貯蔵疾患である個体に投与される。
【００７５】
ベクターは、欠損タンパク質をコードする遺伝子配列と、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥＩＩ）遺伝子配列の縦列反復との間に、インバリアント可動性リンカーに対する配列を含んでもよい。
【００７６】
欠損タンパク質は酵素を含んでもよい。酵素は、リソソーム貯蔵疾患酵素であってもよい。好ましくは、酵素はイズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）を含む。
【００７７】
ＡｐｏＥＩＩ縦列反復遺伝子配列は、配列番号３による配列、またはその最大９５％、最大９６％、最大９７％、最大９８％、もしくは最大９９％の相同性を有する変異体配列を含んでもよく、一方でインバリアント可動性リンカー配列は、配列番号４による配列、またはその最大９５％、最大９６％、最大９７％、最大９８％、もしくは最大９９％の相同性を有する変異体配列を含んでもよい。
【００７８】
本発明の別の態様によると、イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）遺伝子配列およびアポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥＩＩ）遺伝子配列の反復を含む核酸と、１つ以上の造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）との組み合わせが提供され、この核酸はＨＳＰＣに形質導入できる。
【００７９】
ＨＳＰＣは好ましくは自己のものとなり、すなわち形質導入されたＨＳＰＣが投与されるべき個体に由来する。代替的に、ＨＳＰＣは同種のものであってもよく、すなわち形質導入されたＨＳＰＣが投与されるべき個体とは異なる個体に由来する。
【００８０】
この組み合わせは、本明細書において前の態様に関して上述された核酸を含んでもよく、同様に本明細書において上述されたベクターに組み込まれてもよい。
【００８１】
別の態様において、イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）欠損に起因し得る疾患または状態の処置、管理、進行の遅延、または発達の正常化に用いるための薬物を調製する方法が提供され、この方法は、
（ａ）１つ以上のＨＳＰＣを提供するステップと、
（ｂ）アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥＩＩ）配列の縦列反復に係留されたＩＤＳをコードする配列を含むウイルスベクターを提供するステップと、
（ｃ）遺伝子配列によるＨＳＰＣの形質導入を可能にするために有効な条件下でＨＳＰＣとウイルスベクターとを組み合わせるステップとを含み、形質導入されたＨＳＰＣはＩＤＳを発現する。
【００８２】
好ましくは、ベクターはレンチウイルスベクターを含み、ＩＤＳをコードする配列はリンカーによってアポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥＩＩ）遺伝子配列の縦列反復に係留される。
【００８３】
さらなる態様において、造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）において、欠損タンパク質および／またはより高いレベルのタンパク質を発現させる方法が提供され、この方法は、
（ａ）１つ以上のＨＳＰＣを提供するステップと、
（ｂ）アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥＩＩ）配列の縦列反復に係留されたタンパク質をコードする配列を含むウイルスベクターを提供するステップと、
（ｃ）その配列によるＨＳＰＣの形質導入を可能にするために有効な条件下でＨＳＰＣとウイルスベクターとを組み合わせるステップとを含む。
【００８４】
好ましくは、ベクターはレンチウイルスベクターを含み、タンパク質をコードする配列はリンカーによってアポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥＩＩ）遺伝子配列の縦列反復に係留される。
【００８５】
驚くべきことに、かつ有利なことに、本発明者らは、第３世代レンチウイルスベクターにおいてＣ末端におけるインバリアント可動性リンカーによってヒトアリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）の受容体結合ドメインを縦列反復としてＩＤＳ遺伝子に融合することによって、それらがＭＰＳ  ＩＩにおける脳病理および認知機能低下を効率的に処置することを示すことに成功した。これによって、エクスビボで補正されたＨＳＰＣが、移植された動物においてＢＢＢを優先的にバイパスし得る超生理学的レベルのＩＤＳ酵素を発現することによって、血流から脳実質に到達する酵素のレベルを増加させることが可能になる。
【００８６】
本明細書における「ａ」または「ａｎ」への言及は、その範囲内に単数形および複数形の両方、すなわち１つ以上を含む。
【００８７】
別様に述べられない限り、各態様の特徴は、必要な変更を加えて本発明の他の態様にも適用される。
【００８８】
この明細書の記載および請求項の全体にわたって、「含む」および「含有する」という言葉およびそれらの変形は、「含むがそれ（ら）に限定されない」ことを意味し、それらの言葉は他の部分、付加物、構成要素、整数、またはステップを除外することを意図しない（除外しない）。この明細書の記載および特許請求の範囲の全体にわたって、状況が別様を要求しない限り、単数形は複数形を包含する。特に不定冠詞が用いられるところで、状況が別様を要求しない限り、この明細書は単一性と同様に複数性を予期するものと理解されるべきである。
【００８９】
本発明の特定の態様、実施形態、または実施例とともに記載される特徴、整数、特性、化合物、化学的な部分または基は、不適合性でない限り、本明細書に記載される任意のその他の態様、実施形態、または実施例に適用可能であることが理解されるべきである。この明細書（任意の添付の特許請求の範囲、要約書、および図面を含む）において開示されるすべての特徴、および／または開示される任意の方法またはプロセスのすべてのステップは、こうした特徴および／またはステップの少なくともいくつかが互いに排他的であるような組み合わせ以外は、任意の組み合わせで組み合わされてもよい。本発明は、任意の前述の実施形態の詳細に制限されない。本発明は、この明細書（任意の添付の特許請求の範囲、要約書、および図面を含む）において開示される特徴の任意の新規のものもしくは任意の新規の組み合わせ、または開示される任意の方法もしくはプロセスのステップの任意の新規のものもしくは任意の新規の組み合わせに及ぶ。
【００９０】
本発明の詳細な説明
ここで添付の図面を参照して、例として本発明の態様および実施形態を示すこととする。当業者にはさらなる態様および実施形態が明らかになるだろう。この本文において言及したすべての文書は、本明細書において引用により援用される。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１−１】インビトロにおける新規の血液脳関門横断ＩＤＳ酵素の生成および確認を示す図である。（ａ）コドン最適化ヒトＩＤＳ遺伝子、またはヒトＩＤＳ遺伝子に続く可動性リンカーおよび縦列反復としてのＡｐｏＥＩＩペプチド配列をコードするｐＣＣＬレンチウイルスベクターを示す概略的表示である。どちらのレンチウイルスベクターも、ヒトＣＤ１１ｂプロモーターによって駆動される。（ｂ）ＩＤＳ遺伝子のＣ末端に付加されたインバリアントリンカーおよびＡｐｏＥＩＩ縦列反復の概略的表示および配列である。（ｃ）ＬＶ．ＩＤＳまたはＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩのいずれかの２μｇプラスミドＤＮＡによる２４時間のトランスフェクション後のヒトミクログリア細胞株（ＣＨＭＥ３）において、トランスフェクションの４８時間後に測定した細胞内ＩＤＳ酵素活性を示すグラフである。ｎ＝３。（ｄ）ＬＶ．ＩＤＳまたはＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩのいずれかの２μｇプラスミドＤＮＡによって２４時間トランスフェクトしたヒトミクログリア細胞（ＣＨＭＥ３）において、トランスフェクションの４８時間後に測定した分泌ＩＤＳ酵素活性。ｎ＝３一方向ＡＮＯＶＡ、＊＊＝ｐ＜０．０１  ｖｓ．非トランスフェクト。
【図１−２】インビトロにおける新規の血液脳関門横断ＩＤＳ酵素の生成および確認を示す図である。（Ｅ）２４時間後のＩＤＳまたはＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩの培地からｂＥＮＤ．３細胞への取り込み、ｎ＝３ウェル／条件。（Ｆ）４時間の７．５ｍＭ  Ｍ６Ｐまたは５０μｇ／ｍｌのヒト組み換えａｐｏＥによるブロッキングの２４時間後の、Ｍ６ＰＲまたはＬＤＬＲを通じたＩＤＳまたはＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩの受容体介在性の取り込み、ｎ＝３ウェル／条件。データを平均±ＳＥＭとして示す、二方向ＡＮＯＶＡ、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１比較をブラケットによって示す。
【図２−１】ＬＶ．ＩＤＳおよびＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩは脳特異的ＩＤＳ活性を改善し、末梢器官において超生理学的レベルの活性ＩＤＳを発現することを示す図である。（ａ）幹細胞遺伝子治療の戦略の概略的表示である。ブスルファン条件付けした６〜８週齢のＭＰＳ  ＩＩマウスに、ＬＶ．ＩＤＳまたはＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩでＭＯＩ１００にて形質導入した４ｘ１０５ｌｉｎ−ＨＳＣ、または１ｘ１０７の全骨髄細胞を移植した。（ｂ）ベクターのコピー数を示すグラフ、および（ｃ）ＩＤＳ酵素活性を示すグラフは、移植におけるコロニー形成単位アッセイから形質導入ＨＳＣにおいて測定した。（ｄ）ＷＢＣにおけるドナーキメラ化を示すグラフは、すべての移植マウスにおける移植４週間後のフローサイトメトリーによって測定した。
【図２−２】ＬＶ．ＩＤＳおよびＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩは脳特異的ＩＤＳ活性を改善し、末梢器官において超生理学的レベルの活性ＩＤＳを発現することを示す図である。（ｅ）ベクターのコピー数を示すグラフは、対照および処置マウス（ｎ＝６）から８月齢に取ったＢＭ、ＷＢＣ／血漿、脾臓、および脳を含む器官において測定した。
【図２−３】ＬＶ．ＩＤＳおよびＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩは脳特異的ＩＤＳ活性を改善し、末梢器官において超生理学的レベルの活性ＩＤＳを発現することを示す図である。（ｆ）ＩＤＳ酵素活性を示すグラフは、対照および処置マウス（ｎ＝６）から８月齢に取ったＢＭを含む器官において測定した。（ｇ）骨髄（ｎ＝６）における個々のマウスのＶＣＮと酵素活性との相関を示すグラフである。
【図２−４】ＬＶ．ＩＤＳおよびＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩは脳特異的ＩＤＳ活性を改善し、末梢器官において超生理学的レベルの活性ＩＤＳを発現することを示す図である。（ｆ）ＩＤＳ酵素活性を示すグラフは、対照および処置マウス（ｎ＝６）から８月齢に取ったＷＢＣ／血漿を含む器官において測定した。（ｇ）ＷＢＣ／血漿（ｎ＝６）における個々のマウスのＶＣＮと酵素活性との相関を示すグラフである。
【図２−５】ＬＶ．ＩＤＳおよびＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩは脳特異的ＩＤＳ活性を改善し、末梢器官において超生理学的レベルの活性ＩＤＳを発現することを示す図である。（ｆ）ＩＤＳ酵素活性を示すグラフは、対照および処置マウス（ｎ＝６）から８月齢に取った脾臓を含む器官において測定した。（ｇ）脾臓（ｎ＝６）における個々のマウスのＶＣＮと酵素活性との相関を示すグラフである。
【図２−６】ＬＶ．ＩＤＳおよびＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩは脳特異的ＩＤＳ活性を改善し、末梢器官において超生理学的レベルの活性ＩＤＳを発現することを示す図である。（ｆ）ＩＤＳ酵素活性を示すグラフは、対照および処置マウス（ｎ＝６）から８月齢に取った脳を含む器官において測定した。（ｇ）脳（ｎ＝６）における個々のマウスのＶＣＮと酵素活性との相関を示すグラフである。
【図２−７】ＬＶ．ＩＤＳおよびＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩは脳特異的ＩＤＳ活性を改善し、末梢器官において超生理学的レベルの活性ＩＤＳを発現することを示す図である。（Ｉ）ＩＤＳ酵素活性を示すグラフは、８月齢に取った対照からの心臓において測定した。（Ｍ）血漿ＩＤＳ酵素活性とＥＬＩＳＡによって測定したＩＤＳタンパク質との相関。
【図２−８】ＬＶ．ＩＤＳおよびＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩは脳特異的ＩＤＳ活性を改善し、末梢器官において超生理学的レベルの活性ＩＤＳを発現することを示す図である。リソソーム酵素β−ヘキソサミニダーゼ活性のレベルを８月齢マウスの（Ｎ）血漿、（Ｏ）脾臓、および（Ｐ）脳において分析した。データを平均±ＳＥＭとして示す、一方向ＡＮＯＶＡ、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１  ｖｓ．ＭＰＳＩＩ、他の比較をブラケットによって示す。
【図３】ＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩはＭＰＳ  ＩＩマウスの認知異常を補正し、すべての移植は協調およびバランスを回復させることを示す図である。（ａ）Ｙ迷路テストの概略的表示である。マウスを中央に置き、１０分間自由に探索させる。（ｂ）Ｙ迷路における自発的交替を示すグラフは、８月齢の対照および処置マウスにおいて測定した。（ｃ）合計進入数を示すグラフは、自発運動活性の代理尺度として記録した。（ｄ）加速ロータロッドを表す。（ｅ）８月齢の対照および処置マウスを示すグラフは、最大３００秒間（４〜４ｒｐｍ、３００秒）にわたって加速ロータロッドにおいて３回試験した。
【図４−１】ＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩは８月齢のマウスにおける神経炎症に関連するサイトカインを正常化することを示す図である。（ａ）〜（ｃ）ＭＩＰ−１α、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１α、およびＲＡＮＴＥＳを測定するサイトカインビーズアレイを示すグラフは、フローサイトメトリーを用いて８月齢のマウスの全脳可溶化物に対して行った（ｎ＝６）。
【図４−２】ＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩは８月齢のマウスにおける神経炎症に関連するサイトカインを正常化することを示す図である。（ａ）〜（ｃ）ＭＩＰ−１α、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１α、およびＲＡＮＴＥＳを測定するサイトカインビーズアレイを示すグラフは、フローサイトメトリーを用いて８月齢のマウスの全脳可溶化物に対して行った（ｎ＝６）。
【図４−３】ＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩは８月齢のマウスにおける神経炎症に関連するサイトカインを正常化することを示す図である。（ｅ）合計ＨＳの合計相対量を示すグラフである。（ｆ）脳サンプルから分析した対照および処置マウス（ｎ＝６）からのＨＳの組成的二糖分析。
【図４−４】ＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩは８月齢のマウスにおける神経炎症に関連するサイトカインを正常化することを示す図である。（ｇ）活性化ミクログリアを識別するための、イソレクチンＢ４（ＩＬＢ４：ｉｓｏｌｅｃｔｉｎ  Ｂ４）で染色した運動皮質（Ｍ２）および線条体の３０μｍ切片の代表的画像、４０ｘ。（ｈ）皮質および（ｉ）線条体のマウス当り４つの３０μｍ切片のＩＬＢ４陽性細胞数をカウントした（ブレグマから約０．２６ｍｍから−１．９４ｍｍ）、ｎ＝３／群。スケールバー：５０μｍ。データを平均±ＳＥＭとして示す、一方向ＡＮＯＶＡ、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．００１  ｖｓ．ＭＰＳＩＩ、他の比較をブラケットによって示す。
【図５−１】ＷＴ−ＨＳＣＴ、ＬＶ．ＩＤＳ、およびＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩはＭＰＳ  ＩＩマウスにおける全体的骨格異常を正常化することを示す図である。（ａ）８月齢における対照および処置ＭＰＳ  ＩＩマウス頭蓋のＸ線画像である。（ｂ）頬骨弓の幅を示すグラフ。（ｃ）上腕骨の幅を示すグラフ。（ｄ）大腿骨の幅を示すグラフは、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ｎ＝５〜１１）を用いて分析した。
【図５−２】ＷＴ−ＨＳＣＴ、ＬＶ．ＩＤＳ、およびＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩはＭＰＳ  ＩＩマウスにおける全体的骨格異常を正常化することを示す図である。（Ｅ）ＭＣＰ−１、（Ｆ）ＭＩＰ−１α、および（Ｇ）ＲＡＮＴＥＳを測定するサイトカインビーズアレイは、フローサイトメトリーを用いて８月齢のマウスの肝臓可溶化物に対して行った、ｎ＝４〜６。対照および処置ＭＰＳ  ＩＩ動物の心臓における（Ｈ）Ｎｐｐｂおよび（Ｉ）Ｍｙｈ７の遺伝子発現（ＷＴ  ｎ＝３、ＭＰＳ  ＩＩ  ｎ＝４、ＷＴ−ＨＳＣＴ、ＬＶ．ＩＤＳおよびＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩ  ｎ＝６）。（Ｊ）血漿においてＩＤＳ特異的ＩｇＧ抗体価を測定した。（Ｋ）ＥＬＩＳＡによって血漿サンプルにおけるＩＤＳに対する合計ＩｇＧ抗体を定めた（Ｐｏｓ．対照ｎ＝１、ｎｅｇ．対照ｎ＝６、ＬＶ．ＩＤＳ／ＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩ  ｎ＝６）。データを平均±ＳＥＭとして示す、一方向ＡＮＯＶＡ、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１  ｖｓ．ＭＰＳＩＩ。
【図６−１】ＬＶ．ＩＤＳではなくＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩを用いると、脳におけるヘパラン硫酸の主要蓄積およびその硫酸化パターン形成が完全に正常化してＷＴレベルになることを示す図である。（Ａ）ＨＳの合計相対量、ならびに（Ｂ）対照および処置マウスからのＨＳの組成的二糖分析は脳サンプルから分析した、ｎ＝６／群。
【図６−２】ＬＶ．ＩＤＳではなくＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩを用いると、脳におけるヘパラン硫酸の初期蓄積およびその硫酸化パターン形成が全体的に正常化してＷＴレベルになることを示す図である。（Ｃ）ＮｅｕＮ（ニューロン核（ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｎｕｃｌｅｉ）；緑色）およびＬＡＭＰ２（リソソームコンパートメント；赤色）で染色した、対照および処置マウスからの運動皮質（Ｍ２）、尾状核被殻（どちらもブレグマから約−０．４６ｍｍ）、海馬（ＣＡ３）、および扁桃体（どちらもブレグマから約−１．２２ｍｍ）の３０μｍ脳切片の代表的画像、ｎ＝６／群、４０ｘ、バックグラウンドを低減するためにすべての画像において非線形調整を等しく行った。ガンマ０．７２、入力レベル０−１９０。スケールバー：５０μｍ。データを平均±ＳＥＭとして示す、一方向ＡＮＯＶＡ、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１  ｖｓ．ＭＰＳＩＩ、他の比較をブラケットによって示す。
【図７−１】ＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩは８月齢のＭＰＳ  ＩＩマウスにおけるアストログリオーシスを正常化することを示す図である。（Ａ）ＧＦＡＰ（グリア線維酸性タンパク質（ｇｌｉａｌ  ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  ａｃｉｄｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）；緑色）およびＬＡＭＰ２（リソソームコンパートメント；赤色）で染色した、対照および処置マウスからの運動皮質（Ｍ２、ブレグマから約−０．４６ｍｍ）、尾状核被殻（ブレグマから約−０．４６ｍｍ）、海馬（ＣＡ３）、および扁桃体（どちらもブレグマから約−１．２２ｍｍ）の３０μｍ脳切片の代表的画像、ｎ＝６／群、４０ｘ、バックグラウンドを低減するためにすべての画像において非線形調整を等しく行った。ガンマ０．７２、入力レベル０−１９０。スケールバー：５０μｍ。
【図７−２】ＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩは８月齢のＭＰＳ  ＩＩマウスにおけるアストログリオーシスを正常化することを示す図である。８月齢のＭＰＳ  ＩＩマウスの（Ｂ）皮質および（Ｃ）扁桃体におけるＧＦＡＰ免疫蛍光を定量化した、ｎ＝３／群、ＡＵ：任意単位（ａｒｂｉｔｒａｒｙ  ｕｎｉｔｓ）。データを平均±ＳＥＭとして示す、一方向ＡＮＯＶＡ、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１  ｖｓ．ＭＰＳＩＩ、他の比較をブラケットによって示す。
【図８】ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩがＭＰＳ  ＩＩマウスにおける認知表現型を補正することを可能にする、ＭＰＳ  ＩＩマウスにおけるＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩ酵素の作用の提案される機構を示す概略図である。ＡｐｏＥＩＩ残基はＩＤＳが血漿においてより長く活性であり続けることを可能にし、より長い循環時間およびより高確率のＣＮＳへの横断をもたらし、一方で非改変ＩＤＳは迅速に分解されて不活性形になる。脳内で、骨髄に由来する補正されたミクログリアがＩＤＳまたはＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩを類似のレベルで分泌するが、ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩの取り込みの方が効率的であり、改善された安定性で結合し、主要貯蔵および神経炎症のより良好な補正をもたらす。
【図９−１】複数の機構を介した血漿安定性の増加および脳内皮細胞による取り込みの増強を示すグラフおよび免疫蛍光染色画像を示す図である。（Ａ）１２ｎｇの合計ＩＤＳ酵素を注射したＭＰＳ  ＩＩマウスにおいて注射後１、１０、および３０分に測定したＩＤＳタンパク質の血漿クリアランス、ｎ＝２／群。（Ｂ）血漿ＩＤＳ酵素活性とＥＬＩＳＡによって測定したＩＤＳタンパク質との相関。（Ｃ）ＦＩＴＣ−デキストランのｂＥＮＤ．３細胞への取り込み。（Ｄ、Ｅ）ｂＥＮＤ．３細胞におけるＬＤＬＲ（Ｄ）またはＬＲＰ１（Ｅ）に対する免疫蛍光染色。
【図９−２】複数の機構を介した血漿安定性の増加および脳内皮細胞による取り込みの増強を示すグラフおよび免疫蛍光染色画像を示す図である。（Ｆ）単層培養で２４時間増殖させたｂＥＮＤ．３細胞の増殖培地に加えたＣＨＭＥ３細胞によって産生されたＩＤＳまたはＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩの取り込み。ｎ＝２独立実験、３ウェル／条件。（Ｇ）ｔｒａｎｓｗｅｌｌ培養で２４時間増殖させたｂＥＮＤ．３細胞の増殖培地に加えたＣＨＭＥ３細胞によって産生されたＩＤＳまたはＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩの取り込み。ｎ＝３独立実験、２ウェル／条件。（Ｈ）ＧからのｂＥＮＤ．３細胞の基底層に対する経細胞輸送のパーセンテージ。（Ｉ）細胞層のヘパリナーゼ処理または酵素添加前の１時間の７．５ｍＭ  Ｍ６Ｐもしくは５０μｇ／ｍｌのヒト組み換えＡｐｏＥによるブロッキングに続く、２４時間後のＩＤＳまたはＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩの受容体介在性の取り込み。ｎ＝３ウェル／条件。データは平均±ＳＥＭ、一方向ＡＮＯＶＡまたは適切なときにＴ検定、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１  ｖｓ．ＭＰＳ  ＩＩ。
【実施例】
【００９２】
実施例１
コドン最適化ＩＤＳを含有するベクターの造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）での形質導入を行うための実験を行い、その後マウスモデルにおいてこれらの細胞のＩＤＳ発現をテストし、特に血液脳関門を通過するＩＤＳの量を評価した。
【００９３】
発現ベクター
コドン最適化ＩＤＳ  ｃＤＮＡ（ｃｏＩＤＳ）（配列番号１）を形成するようにヒトＩＤＳ  ｃＤＮＡ（配列番号２）を適合させて、ＧｅｎｅＡｒｔ技術（サーモフィッシャー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ペーズリー（Ｐａｉｓｌｅｙ）、ＵＫ）を用いて合成し、Ｇａｔｅｗａｙクローニングを用いて第３世代ＬＶ  ｐＣＣＬ．ｓｉｎ．ｃＰＰＴ．ｈＣＤ１１ｂ．ｃｃｄＢ．ｗｐｒｅにクローニングしてｐＣＣＬ．ｓｉｎ．ｃＰＰＴ．ｈＣＤ１１ｂ．ＩＤＳ．ｗｐｒｅ）を作製した。ＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳリンカー（配列番号８）を提供するように長いインバリアントリンカーｃＤＮＡ配列（配列番号４）を用いて、縦列反復（ＬＲＫＬＲＫＲＬＬＬＲＫＬＲＫＲＬＬ）（配列番号７）としての脳標的ペプチド配列ＡｐｏＥＩＩのｃＤＮＡ配列（配列番号３）を含有する付加的なベクターを、コドン最適化ヒトＩＤＳ  ｃＤＮＡの下流に挿入した（非特許文献３２）。プラスミドをコドン最適化し、ＧｅｎｅＡｒｔ技術を用いて合成して、前に記載されるとおりに第３世代レンチウイルスバックボーンにクローニングした。ヒトＩＤＳ  ｃＤＮＡ（配列番号２）に対するアミノ酸配列を配列番号６として参照し、ここでｃｏＩＤＳ  ｃＤＮＡ（配列番号１）に対するアミノ酸配列を配列番号５として参照する。ヒトＩＤＳ  ｃＤＮＡおよびｃｏＩＤＳ  ｃＤＮＡの両方に対する結果として得られるアミノ酸配列は同じである。
【００９４】
トランスフェクションおよび交差補正
７．５ｍＭの高力価直鎖ポリエチレンイミン（ｐＨ７．４、ＭＷ４０，０００、ポリサイエンス社（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．）、ウォリントン（Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ）、ＰＡ、ＵＳＡ）および１５０ｍＭ  ＮａＣｌを用いて、ヒトミクログリア細胞（ＣＨＭＥ３）を、２μｇのプラスミドＣＤ１１ｂ．ＩＤＳまたはＣＤ１１ｂ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩ  ＤＮＡによってトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、ＲＩＰＡ緩衝剤（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８）中に細胞を収集し、振とう機上で４℃にて３０分間インキュベートした後、１４，０００ｒｐｍ、４℃にて２０分間遠心分離した。細胞可溶化物を収集し、−８０℃にて保存した。トランスフェクションの４８時間後に培地上清を収集し、１，０００ｒｐｍ、４℃にて１０分間遠心分離して細胞片を除去し、−８０℃にて保存した。
【００９５】
ＬＶ産生および滴定
ｐＭＤ２Ｇ、ｐΔ８．９１ｇａｇ／ｐｏｌ、ＬＶプラスミド（非特許文献２４、非特許文献２５、３４、３５）、および７．５ｍＭポリエチレンイミン（４０ｋＤａ、ポリサイエンス、ウォリントン、ＰＡ、ＵＳＡ）（３６）によるＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションによって、ＬＶを産生した（非特許文献２５）。４℃にて２１，１９１ｇで１５０分間遠心分離することによってレンチウイルスベクター粒子を濃縮し、調合物緩衝剤（ＰＢＳ、１ｍｇ／ｍｌヒト血清アルブミン、５μｇ／ｍｌプロタミン硫酸塩、４０ｍｇ／ｍｌラクトース、ｐＨ７．２）に再懸濁した。ＥＬ４マウスリンパ腫細胞（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ−３９；ＡＴＣＣ、マナッサス（Ｍａｎａｓｓａｓ）、ＶＡ、ＵＳＡ）を濃縮ＬＶの３つの希釈物によって形質導入し、７２時間後に収集した。ＧｅｎＥｌｕｔｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（シグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、プール（Ｐｏｏｌｅ）、ＵＫ）を用いて、ゲノムＤＮＡを抽出した。２コピー２組み込みコピー／細胞のｐＨＲｓｉｎ．ＳＦＦＶ．ｅＧＦＰ．ａｔｔ．ｗｐｒｅ（ＡＬＳ  ＥＬ４  ｅＧＦＰ２．２）を含有するＥＬ４細胞株クローンからのゲノムＤＮＡの希釈物によって生成された標準曲線を用いて、定量的ＰＣＲによって細胞当りの組み込まれたウイルスゲノムの数を定めた（非特許文献２４）。前に記載されるとおりにｗｐｒｅに対するプライマーおよびプローブのセット（ＴＡＭＲＡ）を使用し（非特許文献２４、２５）、げっ歯類ｇａｐｄｈ（ＶＩＣ）（アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ペーズリー、ＵＫ）に対して標準化した。
【００９６】
マウスおよび移植手順
Ｘ連鎖アレルに対するヘテロ接合性のメスをジョゼフ・ミュンツァー（Ｊｏｓｅｐｈ  Ｍｕｅｎｚｅｒ）教授（ノースカロライナ大学チャペルヒル校（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ  ａｔ  Ｃｈａｐｅｌ  Ｈｉｌｌ）、ＮＣ、ＵＳＡ）から得て、野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊのオス（エンヴィーゴ（Ｅｎｖｉｇｏ）、アルコンベリー（Ａｌｃｏｎｂｕｒｙ）、ＵＫ）と繁殖させて、野生型のオスおよびメス、ならびに罹患したヘミ接合性のオスおよびキャリアのメスを得た。前に記載されるとおりにドナーおよびレシピエント細胞を区別するために、ＰＥＰ３ＣＤ４５．１コンジェニックバックグラウンド（Ｂ６．ＳＪＬ−ＰｔｐｒｃａＰｅｐｃｂ／ＢｏｙＪ）にＭＰＳＩＩを戻し交配した（非特許文献２４）。全体を通じて、ＷＴ同腹仔を対照として用いた。
【００９７】
ＭＰＳＩＩマウスからの全骨髄単核細胞を大腿骨および脛骨から単離し、ｍｕｒｉｎｅ  ｌｉｎｅａｇｅ  ｃｅｌｌ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎキット（ミルテニーバイオテク（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）、ビズリー（Ｂｉｓｌｅｙ）、ＵＫ）を用いて製造者の指示に従って系統枯渇させた。２％ウシ血清アルブミンを含有するＸ−Ｖｉｖｏ−１０培地（バイオウィッタカー（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ））中に細胞を１ｘ１０６細胞／ｍｌにて再懸濁し、１００ｎｇ／ｍｌマウス幹細胞因子、１００ｎｇ／ｍｌマウスｆｍｓ様チロシンキナーゼ−３、および１０ｎｇ／ｍｌ組み換えマウスインターロイキン３（ペプロテック（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、ロッキーヒル（Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ）、ＮＪ、ＵＳＡ）を用いて３時間刺激した後に、感染効率１００にてレンチウイルスベクターによって２０〜２４時間形質導入した。
【００９８】
個別に通気したケージに収容した６〜８週齢のマウスに対し、腹腔内注射による５日量（２５ｍｇ／ｋｇ／日）の１２５ｍｇ／ｋｇブスルファン（Ｂｕｓｉｌｖｅｘ；ピエールファーブル（Ｐｉｅｒｒｅ  Ｆａｂｒｅ）、カストル（Ｃａｓｔｒｅｓ）、フランス（Ｆｒａｎｃｅ））を用いて骨髄破壊した。骨髄破壊の前に、マウスに酸性化した水（ｐＨ２．８）、照射した食物、およびマッシュを与えた。ブスルファンの最後の注射を受けてから２４時間以内に、外側尾静脈を通じてマウスに３〜４ｘ１０５の系統枯渇し形質導入した造血幹細胞を注射した。野生型移植（ＷＴ−ＨＳＣＴ）に対して、マウスは１〜２ｘ１０７の非形質導入全骨髄細胞を受けた。
【００９９】
フローサイトメトリーを用いたキメラ化分析
移植の４週間後に、末梢血においてドナー造血幹細胞の生着を評価した。細胞をＴｏＰｒｏ３ヨウ化物（サーモフィッシャーサイエンティフィック（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ペーズリー、ＵＫ）の５％溶液中で抗マウスＣＤ４５．１−ＰＥ（ドナーＨＳＣ）、ＣＤ４５．２−ＦＩＴＣ（レシピエントＨＳＣ）、ＣＤ３−Ｐｅ−Ｃｙ５（Ｔ細胞）、ＣＤ１９−ＡＰＣ−Ｃｙ７（Ｂ細胞）、およびＣＤ１１ｂ−Ｐｅ−Ｃｙ７（マクロファージ／ミクログリア）（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、オックスフォード（Ｏｘｆｏｒｄ）、ＵＫ）によって染色し、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ）において分析した。
【０１００】
サンプル処理
８月齢において、マウスに麻酔をして３７℃リン酸緩衝食塩水による経心腔的灌流を行って器官から血液を除去した。１つの脳半球を４％パラホルムアルデヒド中で２４時間固定し、３０％ショ糖、２ｍｍｏｌ／ｌ  ＭｇＣｌ２／リン酸緩衝食塩水溶液に４８時間移した後に、−８０℃で凍結した。脳、脾臓、心臓、腎臓、筋肉、および肝臓の小片をドライアイス上で急速凍結し、−８０℃にて保存した。ＩＤＳ酵素活性アッセイに対して、均質化緩衝剤（０．５ｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ、０．０２ｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、ｐＨ７〜７．５）中でサンプルをホモジナイズおよび超音波処理した後に、４℃にて１４，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。１つの脛骨および大腿骨を１ｍｌの２％ＦＢＳ／ＰＢＳで洗浄し、７０μｍフィルターを用いてろ過し、赤血球溶解緩衝剤（１５０ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭ  ＫＨＣＯ３、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２〜７．４）を用いて溶解することによって、骨髄サンプルを収集した。上清を収集し、−８０℃にて保存した。ＧｅｎＥｌｕｔｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを用いて、器官ＶＣＮ分析に用いるゲノムＤＮＡを抽出した。
【０１０１】
ＩＤＳ酵素活性
前に記載されるとおりに蛍光基質ＭＵ−αＩｄｏＡ−２Ｓ（カルボシンス（Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ）、コンプトン（Ｃｏｍｐｔｏｎ）、ＵＫ）および第２のステップの基質としてのラロニダーゼ（Ａｌｄｕｒａｚｙｍｅ、ジェンザイム（Ｇｅｎｚｙｍｅ））を用いた２ステッププロトコルにおいて、ＩＤＳ酵素活性を測定した（３７）。出発材料の量は、ＢＣＡアッセイ（サーモフィッシャー）を用いて血漿に対して２０μｇの総タンパク質、肝臓、脾臓および骨髄に対して４０μｇ、脳に対して６０μｇに標準化した。
【０１０２】
精製グリコサミノグリカンの調製
前に記載されるとおりに、可溶性脳フラクションを収集して処理した（３８）。簡単にいうと、脳組織を機械的にホモジナイズして３ｍｌ  ＰＢＳ中で３７℃にて４時間Ｐｒｏｎａｓｅ処理（１ｍｇ／組織）した。各サンプルに３０μｌのＴｒｉｔｏｎＸ１００を加えて１％の最終濃度にし、室温にて１時間インキュベートした後に、１ｍｇのＰｒｏｎａｓｅの２度目の添加を３７℃にて４時間行った。予め平衡化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌカラムにサンプルをロードし、カラムを５０ｍｌの０．２５Ｍ  ＮａＣｌ／２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ（ｐＨ７）で洗浄することによってヒアルロナンを除去した。５ｍｌの１．５Ｍ  ＮａＣｌ／２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ（ｐＨ７）によってＧＡＧを溶出し、ＰＤ１０カラム（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、ＧＥヘルスケア（Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））を用いて脱塩して凍結乾燥した。
【０１０３】
ＨＳおよびＤＳのヘパリナーゼ消化に続くＡＭＡＣ標識分析
１００μｌの０．１Ｍ酢酸ナトリウムおよび０．１Ｍ酢酸カルシウム（ｐＨ７）中で、各５ｍＩＵのヘパリナーゼＩ、ＩＩ、およびＩＩＩ（生化学工業（Ｓｅｉｋａｇａｋｕ）、東京（Ｔｏｋｙｏ）、日本（Ｊａｐａｎ））を用いてＨＳ鎖を消化した。結果として得られる二糖類を凍結乾燥し、２０μｌの０．１Ｍ  ２−アミノアクリドン（ＡＭＡＣ：２−ａｍｉｎｏａｃｒｉｄｏｎｅ）の８５％Ｍｅ２ＳＯ／１５％酢酸（ｖ／ｖ）溶液に再溶解し、室温にて２０分間インキュベートした。各サンプルに２０μｌのＮａＢＨ３ＣＮを加え、室温にて一晩インキュベートした。Ｚｏｒｂａｘ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＸＤＢ−Ｃ１８カラム（２．１ｘ５００ｍｍ、３．５μｍ）（アジレントテクノロジー（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ストックポート（Ｓｔｏｃｋｐｏｒｔ）、ＵＫ）を用いた逆相高速液体クロマトグラフィーによって、ＡＭＡＣ標識した二糖類を分離した。
【０１０４】
サイトメトリックビーズアレイ（ＣＢＡ：Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  ｂｅａｄ  ａｒｒａｙ）
ＢＤサイトメトリックビーズアレイ（ＣＢＡ）フレックスセット（Ｆｌｅｘ  Ｓｅｔ）キット（ＢＤバイオサイエンス（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、オックスフォード、ＵＫ）を用いて、８月齢の全脳抽出物（ｎ＝６／群）におけるＩＬ−１α、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、およびＲＡＮＴＥＳのレベルを測定した（４０）。ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ）において分析を行った。ＦＳＣ  ｖｓ  ＳＳＣプロットを用いてシングレットビーズ集団の識別を行い、ＡＰＣおよびＡＰＣ−Ｃｙ７を用いて各個々のサイトカインビーズを分離し、ＰＥを用いてサイトカインレベルを測定した。ＦＣＡＰ  Ａｒｒａｙソフトウェア（ＢＤ）を用いて、結果をエクスポートして分析した。ＢＣＡアッセイを用いて脳タンパク質濃度を得て、各サンプルに対するタンパク質レベルに対してサイトカインレベルを標準化した。
【０１０５】
行動分析
ロータロッド
わずかな変更を伴う前の記載のとおりに３２週齢における運動協調性およびバランスを評価するために、ロータロッドテストを用いた（４１）。オスのマウス（ＷＴ、ｎ＝１６、ＭＵＴ、ｎ＝１２、処置群ｎ＝１２〜１６）を、ロータロッド（ウゴバジレ（Ｕｇｏ  Ｂａｓｉｌｅ）、ヴァレーゼ（Ｖａｒｅｓｅ）、イタリア（Ｉｔａｌｙ））における３回の訓練試験（４ｒｐｍで１２０秒、４ｒｐｍで３００秒、４〜４０ｒｐｍで３００秒）にわたって訓練し、各セッションの間に３０分の間隔を置いた。訓練の２４時間後に３回のテスト試験を行った。テスト試験に対しては、ロータロッドを４〜４０ｒｐｍの加速する速度で３００秒間回転させ、各試験の間に５分間静止した。すべての訓練およびテスト試験に対して落下までの時間を記録し、落下までの時間を合計試験時間のパーセンテージとして算出した。
【０１０６】
自発的交替
自発的交替テスト（４１、４２）を用いて、３２週齢のすべてのマウスの空間的作業記憶を評価した。３つの同一のアームからなるＹ迷路における単一の１０分間の試験において、自発的交替を評価した。テストマウスを３つのアームの中央に置き、自由に探索させた。重複する３つ組のセットにおいて３つのアームに連続的に進入することを、自発的交替と記述した。その効果を、交替パーセント＝［交替回数／（合計アーム進入数−２）］ｘ１００として算出した。
【０１０７】
生マウスのＸ線イメージング
イソフルランを用いて対照および処置マウスを麻酔し、高感度の裏面入射型裏面照射型４ＭＰ、１６ビット、デジタルＣＣＤカメラで適合させたブルカー（Ｂｒｕｋｅｒ）ＩｎＶｉｖｏ  Ｘｔｒｅｍｅシステムを用いて、放射線透過写真を撮影した（４５ｋｅＶ）。個々の骨の幅に対して、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いてＸ線画像を分析した。
【０１０８】
統計
ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ７ソフトウェア（ラホヤ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて、統計分析を行った。個々の群比較に対して、両側パラメトリックの対応のないｔ検定を適用し、有意性をｐ＜０．０５に設定した。多群分析に対して一方向ＡＮＯＶＡを行い、その後チューキー多重比較検定を行った。
【０１０９】
血液脳関門を標的とするＩＤＳ酵素の開発およびインビトロ確認
実験の際に発明者らは、受容体介在性の経細胞輸送を介して、ＬＤＬＲの使用を通じて効率的にＢＢＢを横断できる新規のＭＰＳ  ＩＩ特異的スルファターゼ酵素の開発を探求した。ヒトＩＤＳ単独、または縦列反復としてのヒトＡｐｏＥ受容体結合領域にリンクされたヒトＩＤＳをコードする新規のレンチウイルスベクターを、ヒト骨髄特異的ＣＤ１１ｂプロモーターの下に構築した（図１ａに示す）。
【０１１０】
ＩＤＳ遺伝子のＣ末端にインバリアント可動性リンカーを加えた後に、ヒトＡｐｏＥの受容体結合部分のコドン最適化配列を縦列反復として加えることによって、このスルファターゼを改変した（図１ｂに示す）。通常、リンカーおよびペプチドの付加によってタンパク質の折り畳みが変わり、酵素活性に有害な影響を与える可能性がある。
【０１１１】
本発明のコンストラクトがなおもＩＤＳの過剰発現および分泌を可能にすることを検証するために、ヒトミクログリア細胞株（ＣＨＭＥ３）をＬＶ．ＩＤＳまたはＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩのいずれかを発現するプラスミドＤＮＡによってトランスフェクトした。ＬＶ．ＩＤＳおよびＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩによって、それぞれ２６倍および２４倍の細胞活性の増加を観察した（図１ｃに示す）。より重要なことに、トランスフェクションの７２時間後に分泌ＩＤＳ活性の８４倍および８１倍の増加を検出した（図１ｄ）。このことは特に、Ｃ末端の改変がインビトロにおける改変ＩＤＳ酵素の分泌または発現に負の影響を与えないことを示す。２４時間後にマウス内皮ｂＥＮＤ．３細胞におけるＩＤＳに対するＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩの取り込みの有意な増加を検出し（図１Ｅ、図１Ｆ）、これは排他的ではないが主にＭ６Ｐ受容体を介するものであった（図１Ｆ）。
【０１１２】
ＬＶ．ＩＤＳおよびＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩの介在する幹細胞遺伝子治療は、脳におけるＩＤＳ酵素活性を改善し、末梢器官において超生理学的レベルの活性ＩＤＳを発現する
ＩＤＳまたはＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩを発現するＬＶ．ＩＤＳまたはＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩのいずれかで形質導入したＭＰＳ  ＩＩドナーからの４ｘ１０５の系統枯渇した造血幹細胞（ＨＳＣ）を、１６匹のブスルファン条件付けした６〜８週齢のＭＰＳ  ＩＩマウスレシピエントに移植した（図２ａに示す）。同種幹細胞移植と同等に、改変していない全骨髄細胞も、完全に骨髄破壊したＭＰＳ  ＩＩレシピエントに注射しており、これを以後ＷＴ−ＨＳＣＴと呼ぶ。
【０１１３】
移植前に、コロニー形成単位（ＣＦＵ：ｃｏｌｏｎｙ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ）アッセイから単離した系統枯渇したＨＳＣ（ｌｉｎ−ＨＳＣ：ｌｉｎｅａｇｅ−ｄｅｐｌｅｔｅｄ  ＨＳＣ）において、ＩＤＳ活性およびベクターコピー数（ＶＣＮ：ｖｅｃｔｏｒ  ｃｏｐｙ  ｎｕｍｂｅｒ）を測定した。この実験は、ＬＶ．ＩＤＳおよびＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩで形質導入したＨＳＣにおける平均ベクターコピー数が３．１および３．８であること（図２ｂに示す）、ならびにＩＤＳ酵素の過剰発現がそれぞれＷＴの１２４倍および１５２倍であること（図２ｃに示す）を示した。これらのデータは、造血細胞におけるベクターゲノム組み込み数と、酵素過剰発現との正の相関を示す。移植の４週間後の末梢ＷＢＣのフローサイトメトリー分析は、ＭＰＳ  ＩＩレシピエントへの形質導入細胞の完全な生着を示し、８０〜１００％のドナーＣＤ４５．１＋細胞を達成した（図２ｄに示す）。
【０１１４】
ＭＰＳ  ＩＩにおけるこの新規の遺伝子治療の治療有効性を評価するために、各群からの６匹の動物を８月齢で屠殺して、中枢および末梢器官の生化学的分析を行った。全ＢＭ、ＷＢＣ、脾臓、および脳においてベクター組み込みを検出し、ＷＢＣにおけるＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩ処置マウスのみが有意に低い平均を有した（図２ｅに示す）。少数の動物は、評価されたすべての器官において一貫してより低いＶＣＮを示したが、別の移植手順において改変ＨＳＣを受取った。ＬＶ．ＩＤＳおよびＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩ処置群の両方に対するＢＭ、血漿、および脾臓において、超生理学的レベルのＩＤＳを観察した。脳におけるＩＤＳ酵素活性レベルも未処置ＭＰＳ  ＩＩ動物に比べて上昇しており、それはＷＴ脳における通常のＩＤＳ活性の１．５％から８％に相当する。ＷＴ−ＨＳＣＴ移植はＢＭ、血漿、および脾臓のみにおいてＷＴに相当するＩＤＳレベルを回復させたが、脳においては未処置ＭＰＳ  ＩＩ動物に比べて顕著なＩＤＳ活性の増加を検出しなかった。
【０１１５】
有利なことに、ＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩ処置動物の血漿のＩＤＳ活性は、ＬＶ．ＩＤＳ処置群よりも３倍高く、これは酵素の安定性および循環時間、分泌または細胞への取り込みが変わった可能性を示唆する（図２ｆに示す）。さらに、ＶＣＮとＩＤＳ酵素活性レベルとの正の相関は、ＩＤＳ遺伝子のゲノム組み込みの増加によって酵素の過剰発現が駆動されていることをさらに示唆する（図２ｇ）。しかし、血漿におけるＷＢＣ  ＶＣＮとＩＤＳ活性との相関は、ＬＶ．ＩＤＳ群とＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩ群とで有意差を示し、ここではＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩ  ＷＢＣにおける低ＶＣＮの結果もたらされるＩＤＳレベルがどのＬＶ．ＩＤＳ処置マウスよりも高く、これは酵素の産生、取り込み、または分泌の機構の相違を示唆している。加えて、ＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩ処置動物の血漿におけるより高いＩＤＳレベルは、脳におけるより高いＩＤＳ酵素レベルをもたらさず、脳における酵素レベルは両方のＬＶ処置群において同等である（図２ｆに示す）。血漿における注射した酵素のクリアランス速度は、ＩＤＳ群とＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩ群とで類似であった（図２Ｊ）。ＢＭ、脾臓、脳、肺、肝臓、および心臓におけるＶＣＮとＩＤＳ酵素活性レベルとの正の相関は、ＩＤＳおよびＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩの両方に対してほぼ同等の活性／ＶＣＮを伴って観察しており、これはＩＤＳ遺伝子のゲノム組み込みの増加によって酵素の過剰発現が駆動されていることを示唆する（図２Ｋ）。
【０１１６】
血漿におけるＬＶ．ＩＤＳにおける２．５６単位／ＶＣＮに比べて、ＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩにおいては１５．４１単位／ＶＣＮの酵素活性の値を検出しており、これはＡｐｏＥＩＩ残基の融合によって血漿におけるＩＤＳ酵素活性が有意に増加することを示唆する。ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩにおける酵素活性のこの増加は、血漿におけるＩＤＳタンパク質に対するＩＤＳ酵素活性の比較によってさらに示され、ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩはＩＤＳタンパク質の単位当りの活性がより高いことを示している（図２Ｍ）。
【０１１７】
リソソームの恒常性
ＭＰＳ  ＩＩにおけるリソソームの機能障害および主要貯蔵材料の制御されない蓄積は、リソソームの調節およびその後の恒常性に大きな影響を有すると考えられる。重要なことに、神経変性はリソソーム機能障害およびオートファジー障害に関連する。たとえばＭＰＳ  ＩＩなどの疾患状態において、内在性リソソーム酵素は、別のリソソーム酵素の欠損を補償できる。未処置ＭＰＳ  ＩＩ動物の血漿（ＷＴの２倍）、脾臓（ＷＴの１．５３倍）、および脳（ＷＴの２倍）において、リソソームヒドロラーゼβ−ヘキソサミニダーゼのレベル上昇を検出した（図２Ｎ〜Ｐ）。β−ヘキソサミニダーゼの血漿、脾臓、および脳レベルは、ＬＶ．ＩＤＳおよびＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩ処置群の両方においてＷＴレベルまで完全に正常化した（図２Ｎ〜Ｐ）。ＷＴ−ＨＳＣＴは血漿および脾臓におけるβ−ヘキソサミニダーゼレベルを正常化し（図２Ｎ、図２Ｏ）、脳におけるレベルをＷＴレベルまでの完全な正常化は達成せずに回復させた（図２Ｐ）。
【０１１８】
ヘパラン硫酸の蓄積をＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩは完全に正常化するがＬＶ．ＩＤＳは正常化しない
脳サンプルからＨＳおよびＣＳ／ＤＳグリコサミノグリカンを精製し、逆相ＨＰＬＣによって分析および定量化した。ＭＰＳＩＩマウスおよびＷＴ−ＨＳＣＴで処置したマウスの脳において、合計ＨＳの６倍の増加を検出した（図６Ａ）。ＬＶ．ＩＤＳで処置したマウスは、脳における合計ＨＳ蓄積がＷＴレベルの約３倍までの減少を示した。最も重要なことに、ＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩ処置マウスは、脳ＨＳレベルのＷＴレベルまでの完全な正常化、およびＬＶ．ＩＤＳと比較して有意に低いレベルのＨＳを示した（図６Ａ）。
【０１１９】
ＭＰＳ  ＩＩマウスにおけるＨＳ組成分析は、脳ＨＳの３１．１％が完全に硫酸化したＵＡ（２Ｓ）−ＧｌｃＮＳ（６Ｓ）からなることを示し、これに比べて対照ＷＴマウスでは１２．３％であった（図６Ｂ）。ＷＴマウスにおいて、これらは一般的に鎖に沿って他の硫酸化二糖とクラスタを形成し、ＭＰＳ  ＩＩマウスにおいてはＨＳ鎖全体に沿って硫酸化が有意に増加する。この傾向を、ＷＴ−ＨＳＣＴ、ＬＶ．ＩＤＳ、および最も効果的にＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩによって逆転した。同様に、ＵＡ（２Ｓ）−ＧｌｃＮＳはＷＴマウスにおける１６．８％からＭＰＳＩＩマウスにおける３１．１％に増加することを観察し、これはＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩ群のみにおいて１８．４％まで完全に補正されて減少した。
【０１２０】
加えて、合計脳ＣＳ／ＤＳレベルがＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩマウスにおいてＭＰＳ  ＩＩと比べて有意に低減することを観察した（補足図２Ａ）が、ＷＴとＭＰＳ  ＩＩマウスとの有意差は検出できなかった。ＵＡ（２Ｓ）−ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）はＷＴマウスにおける１．０３％からＭＰＳ  ＩＩマウスにおける６．５％に増加することを検出し、これはＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩ群において完全な補正が得られた。
【０１２１】
ＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩは脳全体にわたるニューロンのリソソーム蓄積を補正する
次いで、８月齢（移植の６ヵ月後）の移植ＭＰＳ  ＩＩマウスの脳におけるＩＤＳ酵素レベルの増加が、ニューロン（ＮｅｕＮ）におけるリソソーム拡大および基質蓄積に与える影響を、リソソームマーカーＬＡＭＰ２を用いて定めた。ＷＴ動物は、運動皮質（層Ｖ／ＶＩ）においてＮｅｕＮと部分的にしか共存しない弱い点状の核周囲ＬＡＭＰ２染色を示した。未処置ＭＰＳ  ＩＩ動物およびＷＴ−ＨＳＣＴ処置動物は、運動皮質、尾状核被殻、海馬、および扁桃体においてＮｅｕＮおよびＬＡＭＰ２の強い共存染色を示し、ニューロンまたは衛星グリア細胞における重いリソソーム負荷を示唆した（図６Ｃ）。大脳皮質、尾状核被殻、および扁桃体におけるＬＶ．ＩＤＳの介在する改善、ならびに海馬において充血したリソソームコンパートメントがなおもみられることは、脳に検出されるＨＳのレベルに強く相関する主要基質蓄積の単なる部分的な補正のみを示唆する（図６Ａ、図６Ｂ）。ＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩは皮質、尾状核被殻、および海馬における増加したＬＡＭＰ２染色を完全に正常化し、扁桃体におけるリソソーム負荷の量をかなり低減した（図６Ｃ）。
【０１２２】
ＭＰＳ  ＩＩマウスにおいてＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩは神経炎症を完全に正常化するのに対し、ＬＶ．ＩＤＳは改善を仲介する
アストロサイトはＭＰＳ障害における強い神経炎症反応に介在することが見出されており、これは反応性のグリオーシス、アストログリオーシス、および炎症性サイトカインのレベル増加につながる。対照および処置ＭＰＳ  ＩＩマウスの脳冠状切片を、アストロサイトのマーカーＧＦＡＰ（グリア線維関連タンパク質；緑色）およびＬＡＭＰ２（赤色）で染色した。未処置ＭＰＳ  ＩＩにおいてはＷＴマウスよりも顕著に多いＧＦＡＰ染色を皮質、尾状核被殻、および扁桃体において観察し、これは広範囲のアストログリオーシスを示した（図７Ａ）。加えて、未処置およびＷＴ−ＨＳＣＴマウスの尾状核被殻、海馬、および扁桃体においてＧＦＡＰおよびＬＡＭＰ２の強い共存を観察し（図７Ａ）、ニューロンに加えてアストロサイトにおける顕著なリソソーム基質蓄積を示唆した（図６Ｃ）。ＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩはアストログリオーシスを完全に抑制して、皮質、尾状核被殻、海馬、および扁桃体におけるＬＡＭＰ２染色を減少させてＷＴレベルに戻すことができ、このことは基質貯蔵および炎症性サイトカインの減少と相関した（図６Ａ、図６Ｂ、図６Ａ〜Ｄ）。同様に、ＬＶ．ＩＤＳは皮質、尾状核被殻、および扁桃体に存在する反応性アストロサイトの数を減少させた。
【０１２３】
ＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩはＭＰＳ  ＩＩマウスにおける認知異常ならびに協調およびバランスを完全に補正する
ＭＰＳ  ＩＩマウスモデルにおけるＣＮＳおよび骨格の表現型がＬＶ．ＩＤＳまたはＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩ改変ＨＳＣによって回復し得るかどうかを理解するために、各群のすべての処置動物に対して移植６ヵ月後に相当する８月齢において認知および感覚運動性能の機能研究を行った。１０分間のＹ迷路テストを用いて空間的作業記憶の認知的評価を評価し、このＹ迷路テストはマウスが最近探索したアームよりも新規のアームを探索することを生得的に好むことを利用したものである（図３ａに示す）。
【０１２４】
神経認知評価は、ＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩ処置マウスにおける自発的交替の完全な正常化を示したが、ＬＶ．ＩＤＳ処置群またはＷＴ−ＨＳＣＴ群においては示さなかった（図３ｂ）。このことは、ＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩを用いてＭＰＳ  ＩＩマウスモデルにおいてみられた認知機能障害の完全な補正を示唆するだけでなく、進行性のＭＰＳ  ＩＩ疾患に関連するさらなる認知衰退の防止も示す。興味深いことに、ＷＴ−ＨＳＣＴはＭＰＳ  ＩＩに関連する認知症状に正の影響を有さず、これはＷＴ−ＨＳＣＴがＭＰＳ  ＩＩの脳の処置に好適ではない可能性をさらに強調する。Ｙ迷路の異なるアームへの合計進入数を、全体の活動性の代理尺度として用いることもできる。すべてのテスト群の間に合計進入数の差は検出されず、これはＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩ処置動物における認知症状の真の表現型の救済を示唆した（図３ｃに示す）。
【０１２５】
対照および処置マウスに対して、げっ歯類の運動障害における感覚運動の協調およびバランスに対するよく確立されたテストであるロータロッドのテストも行った（図３ｄに示す）。前に記載されるとおり、８月齢のＭＰＳＩＩマウスは加速するロッドにおける能力の低減を示した。ＷＴ−ＨＳＣＴを含むすべての移植処置は、これを完全に救済した（図３ｅに示す）。
【０１２６】
ＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩは神経炎症性サイトカインを正常化するが、ＬＶ．ＩＤＳは正常化しない
８月齢の対照および処置マウスの全脳抽出物からの慢性神経炎症に関連する多数の炎症性サイトカインを定量化するために、サイトメトリックビーズアレイ（ＣＢＡ）を用いた。本発明者らは最初に、未処置ＭＰＳ  ＩＩ動物におけるマクロファージ炎症性タンパク質（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＭＩＰ−１α／ＣＣＬ３）、インターロイキン１α（ＩＬ−１α：ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  １α）タンパク質、ＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）、および単球走化性タンパク質（ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＭＣＰ−１／ＣＣＬ２）の有意な増加を識別した（図４ａ、図４ｂ、図４ｃ、図４ｄに示す）。ＭＩＰ−１α、ＩＬ−１α、およびＲＡＮＴＥＳタンパク質レベルをＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩは正常化し、ＬＶ．ＩＤＳは部分的にのみ正常化し、ＭＣＰ−１レベルはすべての群において上昇したままだった（図４ｂに示す）。
【０１２７】
加えて本発明者らは、未処理ＭＰＳ  ＩＩマウスの皮質および線条体において、イソレクチンＢ４（ＩＬＢ４）陽性細胞のそれぞれ３０倍および２５倍の増加を観察し（図４Ｅ、図４Ｆ、図４Ｇ）、これはミクログリアの広範囲の活性化およびその後の神経炎症を示唆する。興味深いことに、ＷＴ−ＨＳＣＴおよびＬＶ．ＩＤＳはどちらもＩＬＢ４染色を皮質においてＷＴレベルのそれぞれ１４倍および１２倍に低減し（図４Ｆ）、線条体においてＷＴ染色の１５倍および１３倍に低減した（図４Ｇ）。最も重要なことに、ＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩは皮質および線条体の両方において活性化したミクログリアの数を完全に正常化でき（図４Ｆ、図４Ｇ）、このことは前に観察した神経炎症サイトカインの低減およびＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩにおけるアストロサイト増加の完全な抑止と強く相関する。
【０１２８】
このことは全体として、ＭＰＳ  ＩＩにおける神経炎症性サイトカインおよびケモカインの放出、反応性アストログリオーシス、およびミクログリアの活性化をＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩは完全に抑止でき、ＬＶ．ＩＤＳは部分的にのみ抑止できることを示唆する。
【０１２９】
ヘパラン硫酸の蓄積をＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩは完全に正常化するがＬＶ．ＩＤＳは正常化しない
対照および処置ＭＰＳ  ＩＩマウスの脳からＨＳ  ＧＡＧを精製し、細菌ヘパリナーゼ酵素を用いて脱重合して個々のＨＳ二糖にした後、ＡＭＡＣを用いて個々の二糖の還元末端の蛍光タグ付けを行った。逆相ＨＰＬＣ分離を用いて、各ＨＳ二糖の個別の寄与および硫酸化パターンを定量化および決定した。
【０１３０】
ＨＰＬＣ分析は、ＷＴ、未処置ＭＰＳ  ＩＩ、およびすべての処置群の合計ＨＳの相対的レベルの算出を可能にする（図４ｅに示す）。ＭＰＳＩＩマウスおよびＷＴ−ＨＳＣＴで処置したマウスの脳において、合計ＨＳの６倍の増加を検出した（ｐ＜０．０００１）。興味深いことに、ＬＶ．ＩＤＳで処置したマウスは、脳における合計ＨＳ蓄積がＷＴレベルの約３倍までの減少を示した。最も重要なことに、ＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩ処置マウスは、脳ＨＳレベルのＷＴレベルまでの完全な正常化を示した（図４ｅに示す）。
【０１３１】
ＨＳ組成分析は、未処理ＭＰＳ  ＩＩ脳における三硫酸化二糖ＵＡ（２Ｓ）−ＧｌｃＮＳ（６Ｓ）の有意な増加、およびＵＡ（２Ｓ）−ＧｌｃＮＳの増加を示した（図４ｆに示す）。この傾向をＷＴ−ＨＳＣＴおよびＬＶ．ＩＤＳは部分的に逆転させたが、ＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩ群だけがＷＴレベルまで戻す完全な補正を得た。
【０１３２】
一硫酸化ＨＳ二糖は著しく異なる傾向を示し、ＵＡ−ＧｌｃＮＳの未処置ＭＰＳ  ＩＩおよびＷＴ−ＨＳＣＴ処置レベルはＷＴ脳よりも低かった（図４ｆに示す）。ＬＶ．ＩＤＳ処置はこれを部分的に改善したが、ＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩ群のみがこれを完全に補正した。
【０１３３】
ＭＰＳ  ＩＩマウスにおけるすべての移植戦略が骨格病理を寛解させる
ＭＰＳ  ＩＩマウスモデルにおける骨格症状の程度に対する強固なデータを得るために、対照および処置マウスに対する完全麻酔下の全身Ｘ線を行った。ＩｍａｇｅＪイメージングソフトウェアを用いて、頬骨弓ならびに四肢長管骨（上腕骨および大腿骨）の幅を測定した。
【０１３４】
未処置ＭＰＳ  ＩＩ動物において有意に増加する頬骨弓の幅は、ＷＴ−ＨＳＣＴを含むすべての移植群においてＷＴの寸法まで低減した（図５ａ、図５ｂに示す）。上腕骨の幅はＷＴ−ＨＳＣＴおよびＬＶ．ＩＤＳ群において有意に低減したが、ＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩ処置動物のみが完全な補正を得た（図５ｃに示す）。さらに、すべての処置動物における大腿骨の幅は、ＷＴ動物と比べて有意差を示さず、顕著な骨格の救済を示唆した。
【０１３５】
ＷＴ、ＬＶ．ＩＤＳまたはＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩ改変ＨＳＣの移植後に末梢炎症が抑止される
８月齢のＭＰＳ  ＩＩマウスの肝臓においてＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、およびＲＡＮＴＥＳのレベルの上昇を検出し、それをＷＴ−ＨＳＣＴ、ＬＶ．ＩＤＳまたはＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩ処置が完全に抑止した（図５Ｅ〜５Ｇ）。これらのデータは、ＷＴ−ＨＳＣＴ、ＬＶ．ＩＤＳ、およびＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩがＭＰＳ  ＩＩマウスにおける慢性的末梢炎症を完全に補正するために十分な量の末梢酵素を産生することを示唆する。
【０１３６】
ＷＴ−ＨＳＣＴ、ＬＶ．ＩＤＳ、およびＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩ群において、心不全マーカーＮｐｐｂおよびＭｙｈ７の遺伝子発現が正常化する
ＭＰＳ  ＩＩマウスモデルにおける心不全のリスクがより高いことの指標となり得る、心筋症および心臓病理に関連する２つのマーカーであるＮｐｐｂおよびＭｙｈ７の発現を調査した。心室から分泌されて筋細胞の伸展および血圧を調節する脳ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ：ｂｒａｉｎ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ）をコードするＮｐｐｂの発現は、ＭＰＳ  ＩＩにおいてＷＴオスマウスよりも約１６倍高いことを見出した（図５Ｈ）。ＷＴ−ＨＳＣＴ、ＬＶ．ＩＤＳ、およびＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩ群において、Ｎｐｐｂ発現はＷＴレベルまで完全に安定化した（図５Ｈ）。主に胎仔の心臓において見出され、心筋およびＩ型筋線維の主要構成要素としてのミオシン重鎖ベータをコードするＭｙｈ７の発現は、未処置ＭＰＳ  ＩＩ動物において上昇した。ＷＴ−ＨＳＣＴ、ＬＶ．ＩＤＳ、およびＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩ群におけるＭｙｈ７発現は、ＷＴ発現と類似であった（図５Ｉ）。
【０１３７】
ＬＶ．ＩＤＳおよびＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩ形質導入ＨＳＣの移植に続くＩＤＳの過剰発現は、ヒトＩＤＳに対する免疫応答をもたらさない
遺伝子改変細胞は移植後のヒトＩＤＳに対する耐性を仲介できたかどうかを調べるために、本発明者らは、完全な骨髄破壊的条件付けの後に、どちらもヒトＩＤＳを過剰発現するＬＶ．ＩＤＳまたはＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩ移植のいずれかを受けたマウスの血漿のヒトＩＤＳに対するＩｇＧ抗体を分析した。ＬＶ．ＩＤＳおよびＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩ群における全体のＩＤＳ特異的ＩｇＧ力価は正常範囲にとどまり、酵素に対する免疫応答に寄与しなかった（図５Ｊ）。
【０１３８】
ＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩ処置は複数の機構を通じて作用する
ＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩ処置マウスの血漿における酵素活性の増加およびＶＣＮ当りの酵素活性の増加の観察（図２ｆ、図２ｊ）の後、本発明者らは酵素の循環時間が増加したのではないかという仮説を立てた。等価レベルのＩＤＳおよびＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩ酵素をＭＰＳ  ＩＩマウスに注射して、ＥＬＩＳＡによってタンパク質レベルをモニタした（図９Ａ）。興味深いことに、酵素クリアランス速度は、分解または器官への取り込みのいずれによるものであっても、ＩＤＳおよびＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩ群において類似であり、両方の群において３０分以内に効果的に除去された。
【０１３９】
次に、ＡｐｏＥＩＩ残基の付加によって酵素の立体構造が変化して、分解に対する付加的な保護を与えたかもしれないという仮説を立てて、合計ＩＤＳタンパク質と比較した血漿における活性酵素のレベルをＥＬＩＳＡによって比較および測定した。血漿において、ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩはＩＤＳタンパク質の単位当りの活性がより高いことを示した（図９Ｂ）。このことは、天然ＩＤＳ酵素の活性部位は血漿中で迅速に分解するのに対し、ＡｐｏＥＩＩ付加は保護的であってインビボにおける酵素活性を効果的に延長することを示唆し得る。
【０１４０】
ＢＢＢ内皮細胞株ｂＥＮＤ．３を用いて、内皮細胞による酵素取り込みに何らかの差があるかどうかを定めた。これらの細胞はｔｒａｎｓｗｅｌｌに有効なＢＢＢ層を産生し（図９Ｃ）、ＬＤＬＲおよびＬＤＬＲ関連タンパク質１（ＬＲＰ１：ＬＤＬＲ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １）受容体の両方を発現する（図９Ｄ、図９Ｅ）。各酵素がＨＳＣＧＴ産生酵素のものと類似のＭ６Ｐ状態を有することを確認するために、本発明者らは、ＣＨＭＥ３ヒトミクログリア細胞のトランスフェクションの後に培地に分泌されたＩＤＳおよびＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩ酵素を用い、ＥＬＩＳＡによって標準化した。単層培養において、本発明者らはＩＤＳ対ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩのｂＥＮＤ．３細胞への取り込みを比較し、ＡｐｏＥＩＩペプチドの付加による細胞取り込みの４．７倍の増加を識別した（図９Ｆ）。ＢＢＢを擬態するためのｔｒａｎｓｗｅｌｌにおけるｂＥＮＤ．３内皮細胞の極性化細胞層を横断するＩＤＳまたはＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩの取り込みおよび経細胞輸送を、次いで比較した。細胞を単層において成長させたときと同様に、取り込みの２．６倍の増加が明らかであり、それとともにｔｒａｎｓｗｅｌｌの基底外側への経細胞輸送の１．５倍の増加が明らかであった（図９Ｇ、図９Ｈ）。
【０１４１】
加えて、ＡｐｏＥを用いたＡｐｏＥ依存性受容体の遮断、またはＭ６Ｐを用いたＭ６Ｐ受容体の封鎖（図９Ｉ）は、ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩが優先的かつ予想外にＭ６Ｐ受容体を介して取り込まれることを明らかにしたが、ＡｐｏＥペプチドによる遮断もＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩの取り込みを約３０％有意に阻害した。ＡｐｏＥＩＩペプチド配列はＨＳ部位もコードしており、このＨＳ部位はＬＤＬＲおよびＬＲＰ１を含む受容体へのＡｐｏＥの受容体／リガンド結合のための共受容体として必要とされる（Ｊｉら、１９９３）。ＡｐｏＥペプチドによる結果と同様に、細胞のヘパリナーゼ前処理もＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩ取り込みの約３０％の低減をもたらしており、ＡｐｏＥ／ＨＳも取り込みおよびｂＥＮＤ３細胞を横断する経細胞輸送に重要である可能性を示唆した。
【０１４２】
考察
リンカーおよびＡｐｏＥＩＩペプチドの付加は、インビトロにおけるＩＤＳ酵素の発現、産生、または分泌を変えなかったが、類似のベクターコピー数に対するＬＶ．ＩＤＳおよびＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩベクターの両方を用いて形質導入したＨＳＣにおいて超生理学的レベルのＩＤＳ酵素を産生した。すべての移植動物においてブスルファンを用いた完全な骨髄破壊的条件付けを用いて、ＣＤ４５．１＋ドナー細胞（＞８０％）の完全な生着を得て、移植時の下流インビトロ分化アッセイにおける有意差はなかった（データは示さず）。
【０１４３】
驚くべきことに、ＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩ群における血漿のＩＤＳ酵素活性レベルは、たとえＷＢＣにおいてより低いＶＣＮであってもＬＶ．ＩＤＳより約３倍高かった。このことは、ＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩ群におけるコピー当りのより高い酵素活性につながり、ＡｐｏＥＩＩ残基は自身の立体構造を変えることによって活性を安定化または改善することを示唆し、酵素不活性化に対する保護効果を提供するが血漿におけるクリアランスに対しては提供しないことを示す（図８）。ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩは非改変ＩＤＳよりもｂＥＮＤ．３細胞への取り込みが高いことを検出しており、これには主にＭ６ＰＲが介在すると考えられた。ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩ融合酵素に用いたａｐｏＥの受容体結合部分（残基１４２〜１４７）は、内皮細胞表面に豊富にあり、かつＭＰＳ  ＩＩにはさらにより豊富にあるＵＡ（２Ｓ）−ＧｌｃＮＳ（６Ｓ）の４反復で構成される八糖ＨＳフラグメントと高親和性結合複合体を形成できる。ＨＳは通常多くの受容体リガンド相互作用における共受容体の役割をし、ＡｐｏＥＩＩを通じたＨＳプロテオグリカン（ＨＳＰＧ：ＨＳ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ）への結合の増加は、ＬＤＬＲ、ＬＤＬＲ関連タンパク質１（ＬＲＰ１）、Ｍ６Ｐを通じた細胞取り込み、またはａｐｏＥ−ＨＳＰＧ複合体の直接の取り込みによる細胞取り込みの増加に介在し得る。
【０１４４】
ＬＶ．ＩＤＳ群とＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩ群とで類似の量の脳内酵素活性を検出したが、ＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩのみにおいてニューロンおよびアストロサイトからのＬＡＭＰ２のクリアランス改善を伴う完全な補正を検出した。これに対する説明の１つは、ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩを用いた方が間質空間からの酵素取り込みが効率的なのかもしれず、それによって同じ全体レベルを維持しながら非改変ＩＤＳよりもかなり効果的に常在脳細胞を補正するのではないかというものである（図８）。
【０１４５】
ＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩ処置動物において、主要貯蔵上昇の完全な補正と、神経炎症において大きな役割を果たす硫酸化パターン形成の全体的正常化とを観察した。脳における主要ＨＳ貯蔵の部分的補正は、認知行動を補正するには不十分である。ＭＰＳ  ＩＩにおけるＨＳの蓄積は、神経炎症および神経変性の悪化を引き起こす第１のシグナルの１つを提供し得ると考えられる。硫酸化パターン形成は細胞機能およびＨＳ結合恒常性にも重要な役割を果たす。なぜなら、６−Ｏ−および２−Ｏ−硫酸化ＨＳは線維芽細胞増殖因子およびストロマ細胞由来因子１（ＣＸＣＬ１２）のシグナル伝達のために必須だからである。実際に、ＭＰＳ  Ｉにおける異常な過剰ＨＳは、ＣＸＣＬ１２の隔離を介した制限条件下でのＨＳＣの移動を低減させることが示された（４２）。この研究の状況において、疾患動物の脳組織内に硫酸化二糖が増加することは、ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩ酵素の細胞取り込みの改善を促進することによって、疾患細胞を酵素の標的とすることを増強し得る。
【０１４６】
ＡｐｏＥ／ＨＳに基づく機構およびＭ６Ｐ受容体の両方を介して、ｂＥＮＤ．３細胞におけるＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩのＩＤＳよりも有意に増加した取り込みを観察した。複数の標的化機構を使用することによって、酵素欠損細胞に対するより効率的な標的化を身体全体にわたって、およびＢＢＢを横断して仲介できた。ここで用いたＡｐｏＥの受容体結合部分は、内皮細胞表面に豊富にあり、かつＭＰＳ  ＩＩにはさらにより豊富にあるＵＡ（２Ｓ）−ＧｌｃＮＳ（６Ｓ）の４反復で構成される八糖ＨＳフラグメントと高親和性結合複合体を形成できる。この研究の状況において、疾患動物の脳組織内に硫酸化二糖が増加することは、ＡｐｏＥＩＩペプチドのＨＳ結合モチーフを介してＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩ酵素の細胞取り込みの改善を促進することによって、疾患細胞を酵素の標的とすることを増強し得る。ＨＳは通常多くの受容体リガンド相互作用における共受容体の役割をし、ＡｐｏＥＩＩを通じたＨＳプロテオグリカンへの結合の増加は、ＬＤＬＲ、ＬＲＰ１、Ｍ６Ｐを通じた細胞取り込み、またはＡｐｏＥ−ＨＳＰＧ複合体の直接の取り込みによる細胞取り込みの増加に介在し得る。血漿安定性の改善と、ＢＢＢ取り込みおよび経細胞輸送の増加とを一緒にすることで、脳酵素量の有意差の不在下でＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩによってみられる脳内のＨＳおよびＤＳ貯蔵ならびにいくつかのその他の神経病理の正常化を説明できる。ＩＧＦＩＩ受容体に向けられたペプチドを介してＭ６Ｐの代替的エピトープを標的とするＧＩＬＴタグに結合した酵素を用いて、ＭＰＳ  ＩＩＩＢおよびポンぺ病における類似の酵素活性に対する取り込み、クリアランス、および細胞結合の増加の類似の効果がみられた。この研究は、天然ＩＤＳに対する顕著な変化なしにＳＧＳＨ．ＡｐｏＢによる脳酵素活性の少しの増加を示した。
【０１４７】
神経炎症はＬＳＤにおいて一般的に報告されており、これはさまざまな未分解分子の蓄積によって引き起こされると考えられ、これらの分子は協調的に神経炎症性の環境を活性化および永続化して、疾患自体を悪化させるおそれがある。ＭＰＳ  ＩＩマウスは脳において強い炎症反応を誘発し、それはＭＩＰ−１α、ＩＬ−１α、ＲＡＮＴＥＳ、およびＭＣＰ−１のレベル上昇を伴う。ＭＩＰ−１α、ＩＬ−１α、およびＲＡＮＴＥＳレベルはＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩ群において完全に正常化し、ＬＶ．ＩＤＳ処置マウスにおいては部分的な減少のみであった。興味深いことに、ＭＰＳ  ＩＩおよびすべてのブスルファン条件付けマウスにおいてはＭＣＰ−１レベルが上昇したままであった。本発明者らが前に示したとおり、ブスルファン条件付けは脳におけるＭＣＰ−１レベルの長期的増加をもたらし、これはＣＮＳに対する細胞遊出の主要なメディエータであり、かつ長期的な遊出効果を発揮する。静脈内注射したブスルファンの約２０％がＢＢＢを横断でき、さらにより強力な移動促進性ＭＣＰ−１応答を駆動し、これが最終的にＭＰＳ  ＩＩマウスにおいてドナー由来白血球がＢＢＢを横断してＣＮＳに入る遊出を促進して、酵素を脳実質に輸送する付加的な手段を提供してもよい。
【０１４８】
ミクログリアの活性化およびアストロサイト増加は、ＭＰＳ障害においてこの研究を含め一般的に報告されている。本発明者らはＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩマウスの皮質、尾状核被殻、海馬、および扁桃体におけるＧＦＡＰおよびＬＡＭＰ２染色の完全な抑止を観察し、ＬＶ．ＩＤＳ群の同じ範囲においては部分的な補正しか観察しなかった。さらに、ＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩ処置マウスの皮質および線条体において活性化ミクログリアの完全な正常化を観察し、ＬＶ．ＩＤＳにおいてはわずか５０％の低減であった。ＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩ処置は、ＣＳＦへの直接のＡＡＶ９−ＩＤＳ注射を用いて報告されたアストログリオーシスおよびミクログリア活性化の補正に匹敵する（非特許文献１５）。ＭＰＳ  ＩＩマウスの肝臓において末梢炎症を検出し、これはＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、およびＲＡＮＴＥＳのレベルの明確な上昇を伴い、かつすべての移植によって抑止され、同種移植によって得られる末梢ＩＤＳ酵素レベルは末梢における炎症の低減を仲介し得ることを示した。
【０１４９】
探索行動および空間的作業記憶の感受性かつ広く受容されるパラダイムとして、Ｙ迷路はＭＰＳ  ＩＩマウスにおける身体障害の可能性を説明するものであり、これは異なる身体能力によって無効化され得るバーンズ迷路とは異なる。ＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩ群において、認知障害の完全な行動補正を観察し、それとともに協調およびバランスの正常化を観察した。本発明者らは、認知の改善が以下の要素の組み合わせから生じるのではないかという仮説を立てている。すなわち、ＨＳの主要貯蔵の低減とともに、慢性神経炎症、アストログリオーシス、およびミクログリア活性化の完全な抑止であり、これらはすべてＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩ処置動物のみにおいて観察した。協調およびバランスの救済は、中枢または末梢の救済のいずれか、またはそれらの組み合わせに起因し得る。最も重要なことに、このことは、ＭＰＳ  ＩＩマウスにおける神経認知の態様の完全な補正を提供するためにＩＤＳ酵素に脳を標的とさせるためには、ＡｐｏＥ縦列ペプチドの付加が絶対に必要であることをさらに強調している。
【０１５０】
本発明者らなどは、ＭＰＳ  ＩＩ患者にみられる骨形成不全に関連する、ＭＰＳ  ＩＩマウスモデルにおけるたとえば頭蓋顔面骨構造および大腿骨の拡大）などの進行性の骨格異常を報告していた。わずかな酵素が軟骨または骨病変を標的とするため、イデュルスルファーゼを用いたＥＲＴは関節の疼痛、硬直、または運動範囲に限られた利益しか示さなかったが、より早期の処置は利益を提供できた。本発明者らの研究においては、ＷＴ−ＨＳＣＴを含むすべての移植動物において頬骨弓、上腕骨、および大腿骨の幅が有意に低減しており、これは骨格表現型がまだ軽度である早い時点で処置されれば、いくらかのレベルの酵素が骨組織に侵入し得ることを示唆した。これは肝臓に向けられたＡＡＶ２／８ＴＢＧ−ＩＤＳ遺伝子治療と部分的に比較可能であり、この遺伝子治療においても頭蓋顔面奇形が補正された。重要なことに、早い時点からの骨格および関節への酵素の持続的利用能が臨床的改善のために必要であると考えられる。
【０１５１】
ＭＰＳ  ＩＩにおける心臓合併症の範囲は進行性心臓弁病理、左室肥大、壁厚の増加から全身性高血圧症にわたり、まだ処置が困難な複合心臓表現型をもたらす（４９）。多量の因子が転写因子、共調節因子、およびマイクロＲＮＡの活性化を引き起こすことができ、それらが心臓遺伝子発現を変更することとなる。加えてＨＳ  ＧＡＧは、ＭＰＳ  ＩＩマウスにおいてＰｔｃｈ１、ＦｏｘＭ１、およびＢｍｐ４とともにダウンレギュレートされる、心臓個体発生および心臓再生に関与するソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ：Ｓｏｎｉｃ  Ｈｅｄｇｅｈｏｇ）を部分的に調節する。ＭＰＳ  ＩＩＩＢマウスにおける心不全に以前関係付けられた２つの遺伝子ＮｐｐｂおよびＭｙｈ７の発現は、それぞれＷＴレベルの最大１８倍および９倍に上昇し、ＭＰＳ  ＩＩマウスにおける心臓遺伝子および心臓経路の顕著な調節解除を示唆し、それはすべての移植によって救済される。よって、末梢におけるＩＤＳ酵素の持続的送達は、部分的にでも心臓組織に利益を与えて正常な心臓遺伝子発現を回復できる。全体として、内在性または超生理学的レベルのＩＤＳ酵素を発現するＨＳＣを移植することによって、心不全に関与する心臓遺伝子の発現をＷＴレベルまで調節できること、およびこのことがＭＰＳ  ＩＩ患者における心臓呼吸系の表現型の処置における重要なステップであり得ることが初めて示された。
【０１５２】
たとえばＥＲＴなどの免疫学的に外来性のタンパク質および酵素は、治療有効性を減少させ得る阻害抗体の放出を引き起こし得るが、ＨＳＣＴ後の分子および細胞のキメラ化はドナー特異的抗原に対する耐性を誘導できる。ＬＶ．ＩＤＳおよびＬＶ．ＩＤＳ．ＡｐｏＥＩＩ処置マウスの血漿においてヒト組み換えＩＤＳに対するＩｇＧ抗体は検出されず、中和抗体に起因し得る有害な症状は識別されなかった。全体として、このことは造血幹細胞遺伝子治療（ＨＳＣＧＴ：ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ）が耐性を誘導できること、および産生されるどちらの酵素も免疫系によってよく許容されることを強く示す。最後に、ＡｐｏＥＩＩペプチド残基の付加は、非改変ＩＤＳと比べて免疫感受性の増加を生じない。
【０１５３】
顕著なことに、ヒトＩＤＳへのａｐｏＥ縦列反復の付加は、ＭＰＳ  ＩＩマウスモデルにおける神経炎症、神経変性、および認知行動の完全な補正を可能にし、これはおそらく取り込みの増加および酵素安定化機構の組み合わせによるものである。過去の遺伝子治療アプローチは、ＬＳＤの疾患モデルにおける脳病理を補正するための、たとえばＡｐｏＢおよびＡｐｏＥなどの他のＡｐｏ複合体の受容体結合ドメインとのＢＢＢ融合酵素の治療可能性、およびＭＰＳ障害に対するそれらの有望な臨床的使用を強調していた。この研究は、ＭＰＳ  ＩＩマウスにおける神経、骨格、炎症、および行動の表現型を完全に補正するためのＨＳＣＧＴとＡｐｏＥＩＩ融合酵素との併用を強調する最初の研究である。これらの実験は、ＭＰＳ  ＩＩ患者の処置に対するＡｐｏＥＩＩ改変酵素を用いたＨＳＣＧＴの適合性を示している。
【０１５４】
前述の実施形態は、請求項によって提供される保護の範囲を限定することは意図されておらず、本発明をいかに実現し得るかという例を説明することが意図されている。
【０１５５】
配列リスト
配列番号１（ｃｏＩＤＳ  ＤＮＡ配列）
atgcctccac ctagaactgg aagaggcctg ctgtggctgg gcctggtgct gtctagtgtg     60
tgtgtggccc tgggcagcga gacacaggcc aacagcacaa ccgacgccct gaacgtgctg    120
ctgatcatcg tggacgacct gaggcctagc ctgggctgct acggcgataa gctcgtgcgg    180
agccccaaca tcgatcagct ggcctctcac agcctgctgt tccagaacgc attcgcacag    240
caggcagtgt gcgcccccag cagagtgtct ttcctgaccg gcagaaggcc cgacaccacc    300
cggctgtacg acttcaacag ctactggcgg gtgcacgccg gcaacttcag caccatcccc    360
cagtacttca aagaaaacgg ctacgtgacc atgagcgtgg gcaaggtgtt ccaccccggc    420
atcagctcca accacaccga cgacagcccc tacagctggt ccttcccacc ctaccacccc    480
agcagcgaga agtacgagaa caccaagacc tgcagaggcc ccgacggcga gctgcatgcc    540
aatctgctgt gccccgtgga cgtgctggat gtgcctgagg gaaccctgcc cgacaagcag    600
tctaccgagc aggccattca gctgctggaa aagatgaaga ccagcgccag ccccttcttc    660
ctggccgtgg gctatcacaa gccccacatc cctttcagat accccaaaga gttccagaag    720
ctgtaccccc tggaaaacat caccctggcc cccgatcctg aggtgccaga tggactgcct    780
cccgtggcct acaacccctg gatggacatc cggcagcgcg aggatgtgca ggccctgaat    840
atcagcgtgc cctacggccc catccccgtg gatttccagc ggaagatccg gcagagctac    900
ttcgccagcg tgtcctacct ggacacccaa gtgggcagac tgctgagcgc cctggacgat    960
ctgcagctgg ccaactccac catcattgcc ttcaccagcg accacggctg ggccctggga   1020
gaacatggcg agtgggccaa gtacagcaac ttcgacgtgg ccacccacgt gcccctgatc   1080
ttctacgtgc caggcagaac cgccagcctg cctgaggctg gcgagaagct gttcccttac   1140
ctggacccct tcgacagcgc ctcccagctg atggaacctg gcagacagag catggacctg   1200
gtggaactgg tgtccctgtt ccccacactg gccggactgg ctggactgca ggtgccccct   1260
agatgtcccg tgcctagctt tcacgtggaa ctgtgcagag agggcaagaa cctgctgaag   1320
cacttccggt tccgggacct ggaagaagat ccctacctgc ccggcaaccc cagagagctg   1380
atcgcctaca gccagtaccc cagacccagc gacatccctc agtggaacag cgacaagccc   1440
agcctgaagg acatcaagat catgggctac agcatccgga ccatcgacta ccggtacacc   1500
gtgtgggtgg gattcaaccc cgacgagttc ctggccaatt tctccgacat ccacgccggg   1560
gagctgtact tcgtggacag cgatcccctg caggaccaca acatgtacaa cgacagccag   1620
ggcggcgacc tgttccagct gctgatgccc                                    1650
配列番号２（野生型ＩＤＳ  ＤＮＡ配列）
atgccgccac cccggaccgg ccgaggcctt ctctggctgg gtctggttct gagctccgtc     60
tgcgtcgccc tcggatccga aacgcaggcc aactcgacca cagatgctct gaacgttctt    120
ctcatcatcg tggatgacct gcgcccctcc ctgggctgtt atggggataa gctggtgagg    180
tccccaaata ttgaccaact ggcatcccac agcctcctct tccagaatgc ctttgcgcag    240
caagcagtgt gcgccccgag ccgcgtttct ttcctcactg gcaggagacc tgacaccacc    300
cgcctgtacg acttcaactc ctactggagg gtgcacgctg gaaacttctc caccatcccc    360
cagtacttca aggagaatgg ctatgtgacc atgtcggtgg gaaaagtctt tcaccctggg    420
atatcttcta accataccga tgattctccg tatagctggt cttttccacc ttatcatcct    480
tcctctgaga agtatgaaaa cactaagaca tgtcgagggc cagatggaga actccatgcc    540
aacctgcttt gccctgtgga tgtgctggat gttcccgagg gcaccttgcc tgacaaacag    600
agcactgagc aagccataca gttgttggaa aagatgaaaa cgtcagccag tcctttcttc    660
ctggccgttg ggtatcataa gccacacatc cccttcagat accccaagga atttcagaag    720
ttgtatccct tggagaacat caccctggcc cccgatcccg aggtccctga tggcctaccc    780
cctgtggcct acaacccctg gatggacatc aggcaacggg aagacgtcca agccttaaac    840
atcagtgtgc cgtatggtcc aattcctgtg gactttcagc ggaaaatccg ccagagctac    900
tttgcctctg tgtcatattt ggatacacag gtcggccgcc tcttgagtgc tttggacgat    960
cttcagctgg ccaacagcac catcattgca tttacctcgg atcatgggtg ggctctaggt   1020
gaacatggag aatgggccaa atacagcaat tttgatgttg ctacccatgt tcccctgata   1080
ttctatgttc ctggaaggac ggcttcactt ccggaggcag gcgagaagct tttcccttac   1140
ctcgaccctt ttgattccgc ctcacagttg atggagccag gcaggcaatc catggacctt   1200
gtggaacttg tgtctctttt tcccacgctg gctggacttg caggactgca ggttccacct   1260
cgctgccccg ttccttcatt tcacgttgag ctgtgcagag aaggcaagaa ccttctgaag   1320
cattttcgat tccgtgactt ggaagaggat ccgtacctcc ctggtaatcc ccgtgaactg   1380
attgcctata gccagtatcc ccggccttca gacatccctc agtggaattc tgacaagccg   1440
agtttaaaag atataaagat catgggctat tccatacgca ccatagacta taggtatact   1500
gtgtgggttg gcttcaatcc tgatgaattt ctagctaact tttctgacat ccatgcaggg   1560
gaactgtatt ttgtggattc tgacccattg caggatcaca atatgtataa tgattcccaa   1620
ggtggagatc ttttccagtt gttgatgcct                                    1650
配列番号３（ＡｐｏＥ縦列反復（ＡｐｏＥＩＩ）ＤＮＡ配列）
ctgagaaagc tgcggaagcg gctgctgctg aggaagctga gaaaaagact gctg           54
配列番号４（リンカーＤＮＡ配列）
ctgggagggg gaggatctgg cggaggcgga agtggcggcg gaggatcagg gggcggaggc     60
tct                                                                   63
配列番号５（ｃｏＩＤＳアミノ酸配列）
MPPPRTGRGL LWLGLVLSSV CVALGSETQA NSTTDALNVL LIIVDDLRPS LGCYGDKLVR     60
SPNIDQLASH SLLFQNAFAQ QAVCAPSRVS FLTGRRPDTT RLYDFNSYWR VHAGNFSTIP    120
QYFKENGYVT MSVGKVFHPG ISSNHTDDSP YSWSFPPYHP SSEKYENTKT CRGPDGELHA    180
NLLCPVDVLD VPEGTLPDKQ STEQAIQLLE KMKTSASPFF LAVGYHKPHI PFRYPKEFQK    240
LYPLENITLA PDPEVPDGLP PVAYNPWMDI RQREDVQALN ISVPYGPIPV DFQRKIRQSY    300
FASVSYLDTQ VGRLLSALDD LQLANSTIIA FTSDHGWALG EHGEWAKYSN FDVATHVPLI    360
FYVPGRTASL PEAGEKLFPY LDPFDSASQL MEPGRQSMDL VELVSLFPTL AGLAGLQVPP    420
RCPVPSFHVE LCREGKNLLK HFRFRDLEED PYLPGNPREL IAYSQYPRPS DIPQWNSDKP    480
SLKDIKIMGY SIRTIDYRYT VWVGFNPDEF LANFSDIHAG ELYFVDSDPL QDHNMYNDSQ    540
GGDLFQLLMP                                                           550
配列番号６（野生型ＩＤＳアミノ酸配列）
MPPPRTGRGL LWLGLVLSSV CVALGSETQA NSTTDALNVL LIIVDDLRPS LGCYGDKLVR     60
SPNIDQLASH SLLFQNAFAQ QAVCAPSRVS FLTGRRPDTT RLYDFNSYWR VHAGNFSTIP    120
QYFKENGYVT MSVGKVFHPG ISSNHTDDSP YSWSFPPYHP SSEKYENTKT CRGPDGELHA    180
NLLCPVDVLD VPEGTLPDKQ STEQAIQLLE KMKTSASPFF LAVGYHKPHI PFRYPKEFQK    240
LYPLENITLA PDPEVPDGLP PVAYNPWMDI RQREDVQALN ISVPYGPIPV DFQRKIRQSY    300
FASVSYLDTQ VGRLLSALDD LQLANSTIIA FTSDHGWALG EHGEWAKYSN FDVATHVPLI    360
FYVPGRTASL PEAGEKLFPY LDPFDSASQL MEPGRQSMDL VELVSLFPTL AGLAGLQVPP    420
RCPVPSFHVE LCREGKNLLK HFRFRDLEED PYLPGNPREL IAYSQYPRPS DIPQWNSDKP    480
SLKDIKIMGY SIRTIDYRYT VWVGFNPDEF LANFSDIHAG ELYFVDSDPL QDHNMYNDSQ    540
GGDLFQLLMP                                                           550
配列番号７（ＡｐｏＥ縦列反復（ＡｐｏＥＩＩ）アミノ酸配列）
LRKLRKRLLL RKLRKRLL                                                   18
配列番号８（リンカーアミノ酸配列）
LGGGGSGGGG SGGGGSGGGG S                                               21
【０１５６】
参考文献
1. Neufeld EF, Muenzer J. The Mucopolysaccharidoses. In: McGraw-Hill, editor. Lysosomal Disorders2001. p. 3421-52.
2. Baehner F, Schmiedeskamp C, Krummenauer F, Miebach E, Bajbouj M, Whybra C, et al. Cumulative incidence rates of the mucopolysaccharidoses in Germany. Journal of inherited metabolic disease. 2005;28(6):1011-7.
3. Poorthuis BJ, Wevers RA, Kleijer WJ, Groener JE, de Jong JG, van Weely S, et al. The frequency of lysosomal storage diseases in The Netherlands. Human genetics. 1999;105(1-2):151-6. Epub 1999/09/10.
4. Wraith JE, Scarpa M, Beck M, Bodamer OA, De Meirleir L, Guffon N, et al. Mucopolysaccharidosis type II (Hunter syndrome): a clinical review and recommendations for treatment in the era of enzyme replacement therapy. European journal of pediatrics. 2008;167(3):267-77. Epub 2007/11/27.
5. Cardone M, Polito VA, Pepe S, Mann L, D’Azzo A, Auricchio A, et al. Correction of Hunter syndrome in the MPSII mouse model by AAV2/8-mediated gene delivery. Human molecular genetics. 2006;15(7):1225-36. Epub 2006/03/01.
6. Meikle PJ, Hopwood JJ, Clague AE, Carey WF. Prevalence of lysosomal storage disorders. Jama. 1999;281(3):249-54. Epub 1999/01/26.
7. Holt JB, Poe MD, Escolar ML. Natural Progression of Neurological Disease in Mucopolysaccharidosis Type II. Pediatrics. 2011;127(5):E1258-E65.
8. Eng C, Muenzer J, Wraith E, Beck M, Giugliani R, Harmatz P, et al. Clinical benefit of enzyme replacement therapy (ERT) in mucopolysaccharidosis II (MPS II, Hunter syndrome). Molecular genetics and metabolism. 2007;92(4):S18-S.
9. Muenzer J, Wraith JE, Beck M, Giugliani R, Harmatz P, Eng CM, et al. A phase II/III clinical study of enzyme replacement therapy with idursulfase in mucopolysaccharidosis II (Hunter syndrome). Genetics in Medicine. 2006;8(8):465-73.
10. Muenzer J, Beck M, Eng CM, Giugliani R, Harmatz P, Martin R, et al. Long-term, open-labeled extension study of idursulfase in the treatment of Hunter syndrome. Genetics in Medicine. 2011;13(2):95-101.
11. Scarpa M, Almassy Z, Beck M, Bodamer O, Bruce IA, De Meirleir L, et al. Mucopolysaccharidosis type II: European recommendations for the diagnosis and multidisciplinary management of a rare disease. Orphanet journal of rare diseases. 2011;6:72. Epub 2011/11/09.
12. Brooks DA, Kakavanos R, Hopwood JJ. Significance of immune response to enzyme-replacement therapy for patients with a lysosomal storage disorder. Trends in molecular medicine. 2003;9(10):450-3. Epub 2003/10/15.
13. Wakabayashi T, Shimada Y, Akiyama K, Higuchi T, Fukuda T, Kobayashi H, et al. Hematopoietic Stem Cell Gene Therapy Corrects Neuropathic Phenotype in Murine Model of Mucopolysaccharidosis Type II. Hum Gene Ther. 2015. Epub 2015/03/13.
14. Hinderer C, Katz N, Louboutin JP, Bell P, Yu H, Nayal M, et al. Delivery of an adeno-associated virus vector into CSF attenuates central nervous system disease in mucopolysaccharidosis type II mice. Hum Gene Ther. 2016. Epub 2016/08/12.
15. Motas S, Haurigot V, Garcia M, Marco S, Ribera A, Roca C, et al. CNS-directed gene therapy for the treatment of neurologic and somatic mucopolysaccharidosis type II (Hunter syndrome). JCI Insight. 2016;1(9).
16. Aldenhoven M, Jones SA, Bonney D, Borrill RE, Coussons M, Mercer J, et al. Hematopoietic cell transplantation for mucopolysaccharidosis patients is safe and effective: results after implementation of international guidelines. Biology of blood and marrow transplantation : journal of the American Society for Blood and Marrow Transplantation. 2015;21(6):1106-9. Epub 2015/02/25.
17. Aldenhoven M, Wynn RF, Orchard PJ, O’Meara A, Veys P, Fischer A, et al. Long-term outcome of Hurler syndrome patients after hematopoietic cell transplantation: an international multicenter study. Blood. 2015;125(13):2164-72. Epub 2015/01/28.
18. Boelens JJ, Aldenhoven M, Purtill D, Ruggeri A, Defor T, Wynn R, et al. Outcomes of transplantation using various hematopoietic cell sources in children with Hurler syndrome after myeloablative conditioning. Blood. 2013;121(19):3981-7. Epub 2013/03/16.
19. Guffon N, Bertrand Y, Forest I, Fouilhoux A, Froissart R. Bone marrow transplantation in children with Hunter syndrome: outcome after 7 to 17 years. The Journal of pediatrics. 2009;154(5):733-7. Epub 2009/01/27.
20. Vellodi A, Young E, Cooper A, Lidchi V, Winchester B, Wraith JE. Long-term follow-up following bone marrow transplantation for Hunter disease. Journal of inherited metabolic disease. 1999;22:638-48.
21. Visigalli I, Delai S, Politi LS, Di Domenico C, Cerri F, Mrak E, et al. Gene therapy augments the efficacy of hematopoietic cell transplantation and fully corrects mucopolysaccharidosis type I phenotype in the mouse model. Blood. 2010;116(24):5130-9. Epub 2010/09/18.
22. Biffi A, Visigalli I. Hematopoietic Stem Cell Gene Therapy for Lysosomal Storage Disorders: Expected Benefits and Limitations. Stem Cells Biol Reg. 2013:127-38.
23. Biffi A, De Palma M, Quattrini A, Del Carro U, Amadio S, Visigalli I, et al. Correction of metachromatic leukodystrophy in the mouse model by transplantation of genetically modified hematopoietic stem cells. The Journal of clinical investigation. 2004;113(8):1118-29. Epub 2004/04/16.
24. Langford-Smith A, Wilkinson FL, Langford-Smith KJ, Holley RJ, Sergijenko A, Howe SJ, et al. Hematopoietic stem cell and gene therapy corrects primary neuropathology and behavior in mucopolysaccharidosis IIIA mice. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 2012;20(8):1610-21. Epub 2012/05/02.
25. Sergijenko A, Langford-Smith A, Liao AY, Pickford CE, McDermott J, Nowinski G, et al. Myeloid/Microglial driven autologous hematopoietic stem cell gene therapy corrects a neuronopathic lysosomal disease. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 2013;21(10):1938-49. Epub 2013/06/12.
26. Pardridge WM. Molecular biology of the blood-brain barrier. Molecular biotechnology. 2005;30(1):57-70. Epub 2005/04/05.
27. Pardridge WM. Targeting neurotherapeutic agents through the blood-brain barrier. Archives of neurology. 2002;59(1):35-40. Epub 2002/01/16.
28. Boren J, Lee I, Zhu W, Arnold K, Taylor S, Innerarity TL. Identification of the low density lipoprotein receptor-binding site in apolipoprotein B100 and the modulation of its binding activity by the carboxyl terminus in familial defective apo-B100. The Journal of clinical investigation. 1998;101(5):1084-93. Epub 1998/04/16.
29. Sorrentino NC, D’Orsi L, Sambri I, Nusco E, Monaco C, Spampanato C, et al. A highly secreted sulphamidase engineered to cross the blood-brain barrier corrects brain lesions of mice with mucopolysaccharidoses type IIIA. Embo Mol Med. 2013;5(5):675-90. Epub 2013/04/10.
30. Spencer B, Verma I, Desplats P, Morvinski D, Rockenstein E, Adame A, et al. A neuroprotective brain-penetrating endopeptidase fusion protein ameliorates Alzheimer disease pathology and restores neurogenesis. The Journal of biological chemistry. 2014;289(25):17917-31. Epub 2014/05/16.
31. Spencer BJ, Verma IM. Targeted delivery of proteins across the blood-brain barrier. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007;104(18):7594-9. Epub 2007/04/28.
32. Bockenhoff A, Cramer S, Wolte P, Knieling S, Wohlenberg C, Gieselmann V, et al. Comparison of five peptide vectors for improved brain delivery of the lysosomal enzyme arylsulfatase A. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 2014;34(9):3122-9. Epub 2014/02/28.
33. Wang D, El-Amouri SS, Dai M, Kuan CY, Hui DY, Brady RO, et al. Engineering a lysosomal enzyme with a derivative of receptor-binding domain of apoE enables delivery across the blood-brain barrier. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110(8):2999-3004. Epub 2013/02/06.
34. Bigger BW, Siapati EK, Mistry A, Waddington SN, Nivsarkar MS, Jacobs L, et al. Permanent partial phenotypic correction and tolerance in a mouse model of hemophilia B by stem cell gene delivery of human factor IX. Gene therapy. 2006;13(2):117-26.
35. Siapati EK, Bigger BW, Miskin J, Chipchase D, Parsley KL, Mitrophanous K, et al. Comparison of HIV- and EIAV-based vectors on their efficiency in transducing murine and human hematopoietic repopulating cells. Molecular Therapy. 2005;12(3):537-46.
36. Kuroda H, Kutner RH, Bazan NG, Reiser J. Simplified lentivirus vector production in protein-free media using polyethylenimine-mediated transfection. J Virol Methods. 2009;157(2):113-21.
37. Lu JZ, Hui EK, Boado RJ, Pardridge WM. Genetic engineering of a bifunctional IgG fusion protein with iduronate-2-sulfatase. Bioconjugate chemistry. 2010;21(1):151-6. Epub 2009/12/17.
38. Holley RJ, Deligny A, Wei W, Watson HA, Ninonuevo MR, Dagalv A, et al. Mucopolysaccharidosis Type I, Unique Structure of Accumulated Heparan Sulfate and Increased N-Sulfotransferase Activity in Mice Lacking alpha-L-iduronidase. Journal of Biological Chemistry. 2011;286(43):37515-24.
39. Nolan T, Hands RE, Bustin SA. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nature protocols. 2006;1(3):1559-82.
40. Wilkinson FL, Holley RJ, Langford-Smith KJ, Badrinath S, Liao A, Langford-Smith A, et al. Neuropathology in mouse models of mucopolysaccharidosis type I, IIIA and IIIB. PloS one. 2012;7(4):e35787. Epub 2012/05/05.
41. Jiang L, O’Leary C, Kim HA, Parish CL, Massalas J, Waddington JL, et al. Motor and behavioral phenotype in conditional mutants with targeted ablation of cortical D1 dopamine receptor-expressing cells. Neurobiology of disease. 2015;76:137-58. Epub 2015/02/17.
42. O’Tuathaigh CMP, Babovic D, O’Sullivan GJ, Clifford JJ, Tighe O, Croke DT, et al. Phenotypic characterization of spatial cognition and social behavior in mice with ‘knockout’ of the schizophrenia risk gene neuregulin 1. Neuroscience.2007;147(1):18-27.
【図１−１】
2020506714.tif 000002
【図１−２】
2020506714.tif 000003
【図２−１】
2020506714.tif 000004
【図２−２】
2020506714.tif 000005
【図２−３】
2020506714.tif 000006
【図２−４】
2020506714.tif 000007
【図２−５】
2020506714.tif 000008
【図２−６】
2020506714.tif 000009
【図２−７】
2020506714.tif 000010
【図２−８】
2020506714.tif 000011
【図３】
2020506714.tif 000012
【図４−１】
2020506714.tif 000013
【図４−２】
2020506714.tif 000014
【図４−３】
2020506714.tif 000015
【図４−４】
2020506714.tif 000016
【図５−１】
2020506714.tif 000017
【図５−２】
2020506714.tif 000018
【図６−１】
2020506714.tif 000019
【図６−２】
2020506714.tif 000020
【図７−１】
2020506714.tif 000021
【図７−２】
2020506714.tif 000022
【図８】
2020506714.tif 000023
【図９−１】
2020506714.tif 000024
【図９−２】
2020506714.tif 000025
【配列表】
2020506714000001.app
【国際調査報告】
2020506714.tif 000026
2020506714.tif 000027
2020506714.tif 000028