(57)【要約】本発明は、配列番号７に示されるヌクレオチド配列を有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの最適化フィターゼ遺伝子と、配列番号１２に示されるヌクレオチド配列を有するシグナルペプチドと、を使用することによって、糸状菌においてフィターゼを発現させるための方法を開示する。
2020511995.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糸状菌においてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのフィターゼまたはその変異体の分泌発現を増進するためのシグナルペプチドであって、前記シグナルペプチドが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅのＴＡＫＡアミラーゼに由来するものであり、配列番号１３に示されるアミノ酸配列を有する、前記シグナルペプチド。
【請求項２】
配列番号１２に示されるヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載の、糸状菌においてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのフィターゼまたはその変異体の分泌発現を増進するためのシグナルペプチド。
【請求項３】
前記糸状菌が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒから選択される、請求項１または請求項２に記載の、糸状菌においてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのフィターゼまたはその変異体の分泌発現を増進するためのシグナルペプチド。
【請求項４】
前記Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのフィターゼが、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する、請求項３に記載の、糸状菌においてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのフィターゼまたはその変異体の分泌発現を増進するためのシグナルペプチド。
【請求項５】
前記Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのフィターゼの変異体が、配列番号１５または配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有する、請求項３に記載の、糸状菌においてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのフィターゼまたはその変異体の分泌発現を増進するためのシグナルペプチド。
【請求項６】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのフィターゼまたはその変異体をコードするコドン最適化遺伝子であって、前記コドン最適化遺伝子が、配列番号７に示されるヌクレオチド配列を有するか、または配列番号７に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の相同性を有し、かつフィターゼ活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する、前記コドン最適化遺伝子。
【請求項７】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのフィターゼまたはその変異成熟ペプチドをコードするコドン最適化ＤＮＡ配列であって、前記コドン最適化ＤＮＡ配列が、配列番号８に示されるヌクレオチド配列を有するか、または配列番号８に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の相同性を有し、かつフィターゼ活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する、前記コドン最適化ＤＮＡ配列。
【請求項８】
糸状菌においてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのフィターゼまたはその変異体の分泌発現を増進するための方法であって、前記方法が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅのＴＡＫＡアミラーゼのシグナルペプチドを、前記Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのフィターゼまたはその変異成熟ペプチドをコードするＤＮＡ配列に連結すること、及び前記配列を含む発現カセットを、発現のための糸状菌に挿入すること、を含み、前記Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅのＴＡＫＡアミラーゼのシグナルペプチドのヌクレオチド配列が、配列番号１２に示されるものである、前記方法。
【請求項９】
前記Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅのＴＡＫＡアミラーゼのシグナルペプチドが、配列番号１３に示されるアミノ酸配列を有する、請求項８に記載の、糸状菌においてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのフィターゼまたはその変異体の分泌発現を増進するための方法。
【請求項１０】
前記糸状菌が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒから選択される、請求項８に記載の、糸状菌においてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのフィターゼまたはその変異体の分泌発現を増進するための方法。
【請求項１１】
前記Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのフィターゼが、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有し、前記Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのフィターゼの変異体が、配列番号１５または配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有する、請求項８に記載の、糸状菌においてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのフィターゼまたはその変異体の分泌発現を増進するための方法。
【請求項１２】
前記Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのフィターゼまたはその変異成熟ペプチドをコードする前記ＤＮＡ配列が、コドンが最適化されたものではない、請求項８に記載の、糸状菌においてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのフィターゼまたはその変異体の分泌発現を増進するための方法。
【請求項１３】
前記Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのフィターゼまたはその変異成熟ペプチドをコードする前記ＤＮＡ配列が、コドン最適化ＤＮＡ配列であり、配列番号８に示されるヌクレオチド配列を有するか、または配列番号８に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の相同性を有するヌクレオチド配列を有する、請求項８に記載の、糸状菌においてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのフィターゼまたはその変異体の分泌発現を増進するための方法。
【請求項１４】
前記Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのフィターゼまたはその変異成熟ペプチドをコードする前記コドン最適化ＤＮＡ配列が、配列番号１４に示されるものである、請求項１３に記載の、糸状菌においてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのフィターゼまたはその変異体の分泌発現を増進するための方法。
【請求項１５】
前記Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのフィターゼまたはその変異成熟ペプチドをコードする前記コドン最適化ＤＮＡ配列が、配列番号１６に示されるものである、請求項１３に記載の、糸状菌においてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのフィターゼまたはその変異体の分泌発現を増進するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子工学の分野に関すると共に、グラム陰性細菌に由来するフィターゼ（特にＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのフィターゼ）を糸状菌（特にＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）において高効率で発現させることに関する。
【背景技術】
【０００２】
フィターゼ（すなわち、ミオイノシトール六リン酸ホスホヒドロラーゼ）は、オルトリン酸モノエステルホスホヒドロラーゼであり、オルトリン酸モノエステルホスホヒドロラーゼは、フィチン酸を加水分解することで低分子化イノシトールリン酸誘導体及び無機リン酸の生成を触媒する。場合によっては、フィチン酸は、加水分解を受けて遊離のイノシトールに変換され得る。フィチン酸は、作物（穀物、マメ、及び油料作物など）の種子に最も豊富に含まれており、最大で１％〜３％の量で存在し、植物におけるリンの総含有量の６０％〜８０％を占める。しかしながら、フィチン酸中のリンは、直接的に吸収及び利用できないものであり、消化管において加水分解を受けて無機リン酸に変換される必要がある。単胃動物（例えば、ブタ、ニワトリ、アヒル、及びガチョウなど）は、フィターゼを有していないため、フィチン酸中のリンの利用度が低いことが研究によって示されている。また、フィチン酸は、電気陰性度が高いことから、二価陽イオンまたは三価陽イオン（Ｃａ２＋、Ｚｎ２＋、及びＦｅ２＋＋など）と共に不溶性の塩を形成し、これによって小腸におけるミネラルの吸収が妨げられる。フィチン酸は、タンパク質、アミノ酸、及び脂肪酸と複合体を形成し、これによってもフィチン酸の吸収及び利用に影響が及ぶ。フィチン酸は、ペプシン、キモトリプシン、トリプシン、及び他のものに結合して消化酵素の活性も低減する。したがって、単胃動物のための飼料にフィターゼを添加することで、飼料におけるリンの利用度を向上させ、動物の排泄物中のリン含有量を低減し、タンパク質及び飼料のエネルギー利用率を向上させることができる。
【０００３】
市販のフィターゼは、主に、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ（ＵＳ５４３６１５６に記載されるようなもの）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（ＵＳ７４３２０９８に記載されるようなもの）、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｅｎｕｓ（ＵＳ２０１００２６１２５９に記載のＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｂｒａａｋｉｉ株など）、及びＢｒｕｃｅｌｌａ（ＵＳ８１４３０４６に記載のＢｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａの１種など）などに由来する。こうしたフィターゼは、その起源が異なることから、酸及び熱に対する抵抗性が異なる。Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  Ａｇｒｉｃ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．２０１５，６３（３）：９４３−５０）は、市販のフィターゼの能力を比較し、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのフィターゼの能力が最も高いことを示した。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの市販フィターゼ製品は、すべて酵母（分裂酵母及びＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓなど）において発現されており、中国市場に存在するフィターゼ製品のほとんどがＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓによって生産される。フィターゼが使用される分野が主に飼料及び食品の分野であることに加えて、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるタンパク質の発現時には、タンパク質発現を誘導するための炭素源としてＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓがメタノールを使用する必要があるため、原料としてのメタノールを市販のフィターゼから完全に除去することは困難であり、それによって潜在的な安全上の危険が生じる。さらに、メタノールは、可燃性かつ爆発性の性質を有することから、輸送及び生産の間、特別な安全保護が必要であり、このことによって生産コストの上昇を招いている。さらに、生産環境にかかる要件が厳しくなる上に、生産従事者には、ある特定の潜在的危険性がつきまとう。したがって、食品及び飼料の添加物の生産にＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓを使用することは好ましくない。糸状菌は、有用な製品（酵素など）を生産するための細胞工場としてよく知られている。その中で、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉ
ｇｅｒ及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅは、それらが「一般に安全と認められる（Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ  Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  Ａｓ  Ｓａｆｅ）（ＧＲＡＳ）」特性を有することから、発現宿主として広く使用される。発酵プロセス中に毒性物質が全く生じない上に、発酵のための原料は、すべて穀類及びその副産物（大豆ミール、コーンシロップなど）である。したがって、酵素を生産するための産業では、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅが、より好ましい。グラム陰性細菌に由来するフィターゼを発現させるためにＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒを使用することは困難であることが研究によって明らかとなっている。例えば、ＵＳ２０１００２６１２５９では、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｂｒａａｋｉｉ（グラム陰性細菌）のフィターゼを発現させるためにＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、及び酵母を使用することについて記載されている。この結果では、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ及び酵母ではフィターゼが十分に分泌及び発現し得るが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒではフィターゼがほとんど発現し得ないことが示されている。上記のように、グラム陰性細菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）に由来するフィターゼ及びその変異体は優れた特性を有しており、したがって、ＧＲＡＳであるＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒにおける発現が期待される。
【発明の概要】
【０００４】
本発明の目的は、糸状菌においてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのフィターゼまたはその変異体の分泌発現を増進するシグナルペプチドを提供することである。
【０００５】
本発明の別の目的は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのフィターゼまたはその変異体をコードするコドン最適化遺伝子を提供することである。
【０００６】
本発明の別の目的は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのフィターゼまたはその変異成熟ペプチドをコードするコドン最適化ＤＮＡ配列を提供することである。
【０００７】
本発明のさらなる目的は、糸状菌においてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのフィターゼまたはその変異体の分泌発現を増進するための方法を提供することである。
【０００８】
本発明のこれらの目的は、下記の技術的解決法を介して達成することができる：
【０００９】
１つの態様では、本発明は、糸状菌においてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのフィターゼまたはその変異体の分泌発現を増進するためのシグナルペプチドを提供し、シグナルペプチドは、配列番号１３に示されるアミノ酸配列を有する、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ｏｒｙｚａｅのＴＡＫＡアミラーゼのシグナルペプチドから選択される。
【００１０】
本発明の１つの実施形態では、シグナルペプチドのヌクレオチド配列は、配列番号１２に示されるものである。
【００１１】
本発明の１つの実施形態では、糸状菌は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒから選択される。
【００１２】
本発明の１つの実施形態では、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのフィターゼは、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する。
【００１３】
本発明の別の実施形態では、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのフィターゼの変異体は、配列番号１５または配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有する。
【００１４】
別の態様では、本発明は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのフィターゼまたはその
変異体をコードするコドン最適化遺伝子を提供し、当該コドン最適化遺伝子は、配列番号７に示されるヌクレオチド配列を有するか、または配列番号７に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の相同性を有し、かつフィターゼ活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。
【００１５】
本発明の１つの実施形態では、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのフィターゼは、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する。
【００１６】
本発明の別の実施形態では、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのフィターゼの変異体は、配列番号１５または配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有する。
【００１７】
さらに別の態様では、本発明は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのフィターゼまたはその変異成熟ペプチドをコードするコドン最適化ＤＮＡ配列を提供し、当該コドン最適化ＤＮＡ配列は、配列番号８に示されるヌクレオチド配列を有するか、または配列番号８に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の相同性を有し、かつフィターゼ活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。
【００１８】
本発明の１つの実施形態では、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのフィターゼまたはその変異成熟ペプチドをコードするコドン最適化ＤＮＡ配列は、配列番号１４に示されるものである。
【００１９】
本発明の別の実施形態では、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのフィターゼまたはその変異成熟ペプチドをコードするコドン最適化ＤＮＡ配列は、配列番号１６に示されるものである。
【００２０】
さらに別の態様では、本発明は、糸状菌においてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのフィターゼまたはその変異体の分泌発現を増進するための方法を提供する。この方法は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅのＴＡＫＡアミラーゼのシグナルペプチドを、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのフィターゼまたはその変異成熟ペプチドをコードするＤＮＡ配列に連結すること、及び当該配列を含む発現カセットを、発現のための糸状菌に挿入すること、を含み、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅのＴＡＫＡアミラーゼのヌクレオチド配列は、配列番号１２に示されるものである。
【００２１】
本発明の１つの実施形態では、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅのＴＡＫＡアミラーゼのアミノ酸配列は、配列番号１３に示されるものである。
【００２２】
本発明の１つの実施形態では、糸状菌は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒから選択される。
【００２３】
本発明の１つの実施形態では、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのフィターゼは、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有し、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのフィターゼの変異体は、配列番号１５または配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有する。
【００２４】
本発明の１つの実施形態では、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのフィターゼまたはその変異成熟ペプチドをコードするＤＮＡ配列は、コドンが最適化されたものではない。
【００２５】
本発明の別の実施形態では、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのフィターゼまたはその変異成熟ペプチドをコードするＤＮＡ配列は、コドンが最適化されたものである。
【００２６】
本発明の別の実施形態では、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのフィターゼまたはその変異成熟ペプチドをコードするコドン最適化ＤＮＡ配列は、配列番号８に示されるヌクレオチド配列を有するか、または配列番号８に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の相同性を有し、かつフィターゼ活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。
【００２７】
本発明の好ましい実施形態では、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのフィターゼまたはその変異成熟ペプチドをコードするコドン最適化ＤＮＡ配列は、配列番号１４に示されるものである。
【００２８】
本発明の好ましい実施形態では、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのフィターゼまたはその変異成熟ペプチドをコードするコドン最適化ＤＮＡ配列は、配列番号１６に示されるものである。
【００２９】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのフィターゼをコードする遺伝子を含む発現カセット、組換え発現ベクター、組換え株、トランスジェニック細胞株、または組換え株も提供される。
【００３０】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのフィターゼの発現カセットを構築するためには、特定のプロモーター、ターミネーター、シグナルペプチド配列、及び制御配列（例えば、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、及び同様のもの）が必要である。
【００３１】
プロモーターは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒに由来する内在性プロモーター（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒに由来するグリコシラーゼ遺伝子プロモーター、中性アミラーゼ遺伝子プロモーター、酸性アミラーゼ遺伝子プロモーター、及びα−グルコシダーゼ遺伝子プロモーターなど）、または外来性プロモーター（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅに由来する中性アミラーゼ遺伝子プロモーター、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅに由来するグリコシラーゼ遺伝子プロモーターなど）、またはプロモーター変異体（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒの中性アミラーゼ遺伝子プロモーター変異体など）であり得る。本発明では、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒのグリコシラーゼ遺伝子プロモーター、またはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒの中性アミラーゼ遺伝子プロモーター変異体が好ましい。
【００３２】
プロモーターの３’末端には制御配列を連結することができ、こうした制御配列は、例えば、適切なリーダー配列（５’ＵＴＲ）（すなわち、宿主細胞における翻訳に重要なｍＲＮＡの非翻訳領域）（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅの中性アミラーゼのリーダー配列及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓのトリオース−リン酸イソメラーゼのリーダー配列など）である。
【００３３】
特定のタンパク質の分泌発現にはシグナルペプチド配列が必要であり、本発明では、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのフィターゼ向けのものとして、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅのＴＡＫＡアミラーゼのシグナルペプチドが好ましい。
【００３４】
ターミネーターは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒのグリコシラーゼ遺伝子、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅのＴＡＫＡアミラーゼ遺伝子、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓのアントラニル酸シンターゼ遺伝子、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒアルファ−グルコシダーゼ遺伝子、及びＦｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍのトリプシン様プロテアーゼ遺伝子から得られるものが好ましい。
【００３５】
プロモーター、制御配列、シグナルペプチド配列、及びターミネーターに特定の遺伝子を連結することで発現カセットが形成される。発現カセットは、通常の方法によってＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒのゲノムに挿入することができ、ゲノムに無作為に挿入するか、または１つもしくは複数の遺伝子座に組込むことができる。任意選択の遺伝子座には、ｇｌａ（グリコシラーゼ）、ａｍｙａ（中性アミラーゼ）、ａｍｙｂ（中性アミラーゼ）、ａａ（酸性アミラーゼ）、ａｇｄａ（アルファグルコシダーゼ）、及びａｇｄｂ（アルファグルコシダーゼ）が含まれる。
【００３６】
発現カセットは、好ましくは、１つまたは複数の選択可能マーカーと連結することができ、こうした選択可能マーカーによって、形質転換、遺伝子導入、及び形質導入されている細胞または株を簡単に選択することが可能になる。選択可能マーカーは、殺生物性またはウイルス抵抗性、重金属に対する抵抗性、栄養要求株に対する原栄養性、及び同様のものが、その産物によって付与される遺伝子である。糸状菌宿主細胞のための選択可能マーカーには、限定はされないが、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｙｇ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸還元酵素）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニリルトランスフェラーゼ）、及びｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、ならびにそれらの同等物が含まれる。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ細胞において使用するには、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅのａｍｄＳ及びｈｙｇが好ましい。
【００３７】
発現カセットは、好ましくは、１つまたは複数の対抗選択可能マーカー（負選択マーカー）に連結される。糸状菌宿主細胞のための選択可能マーカーには、限定はされないが、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ）、及びｈｓｖＴＫ（単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ）が含まれる。
【００３８】
組換え発現ベクターは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのフィターゼ遺伝子または当該遺伝子を含む発現カセットを発現ベクターに挿入することによって得られる。
【００３９】
組換え株は、組換え発現ベクターを目的の宿主株に導入することによって得られ、目的の宿主株は、好ましくは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒである。
【００４０】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのフィターゼの発現レベルの向上においてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのフィターゼ遺伝子を使用することが示される。
【００４１】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのフィターゼの発現レベルの向上において発現カセット、組換え発現ベクター、及び組換え株を使用することも示される。
【００４２】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのフィターゼを生産するための方法が提供され、この方法は、トランスジェニック組換え株の発酵及び培養によってＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉのフィターゼを得ることを含む。
【００４３】
本発明では、ＤＮＡ断片をＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒに導入するための方法は、当該技術分野の通常の方法である。
【００４４】
コドン最適化は、利用頻度が低いコドンまたは希少なコドンの代わりに好ましいコドンを使用することによって遺伝子を再設計することを指す。コドン最適化の詳細な説明については、Ｊｏｓｈｕａ  Ｂ．Ｐｌｏｔｋｉｎ  ａｎｄ  Ｇｒｚｅｇｏｒｚ  Ｋｕｄｌａの
文献（Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ．２０１１；１２（１）：３２−４２．）を参照のこと。コドン最適化は、異種発現系において広く使用されている。
【００４５】
本発明の有利な効果：
本発明者らは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのフィターゼまたはその変異体をコードする遺伝子については、コドンを最適化した後に人工遺伝子を合成し、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅのＴＡＫＡアミラーゼのシグナルペプチドと連結した後に、構築した発現カセットを、発現のためのＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒに導入することが好ましい。このようにして、分泌及び発現したフィターゼを培養上清に大量に得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】ｐＨｐｈｔｋプラスミドのマッピングである。
【図２】ｐＧｌａ−Ｐｈｙ−Ｐｈｙプラスミドのマッピングである。
【図３】ｐＧｌａ−Ｇｌａ−Ｐｈｙプラスミドのマッピングである。
【図４】ｐＧｌａ−Ａｍｙ−Ｐｈｙプラスミドのマッピングである。
【図５】ｐＧｌａ−Ｐｈｙ−ＰｈｙＯＰＴプラスミドのマッピングである。
【図６】ｐＧｌａ−Ｇｌａ−ＰｈｙＯＰＴプラスミドのマッピングである。
【図７】ｐＧｌａ−Ａｍｙ−ＰｈｙＯＰＴプラスミドのマッピングである。
【図８】ｐＧｌａ−Ａｍｙ−ＰｈｙＭ１プラスミドのマッピングである。
【図９】ｐＧｌａ−Ａｍｙ−ＰｈｙＭ２プラスミドのマッピングである。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
実施例１：ｐＨｐｈｔｋプラスミドの構築
プラスミドは、下記の３つの部分を含み、Ｎａｎｊｉｎｇ  Ｋｉｎｇｓｒａｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．によって構築されたものであり、このプラスミドのマッピングは図１に示される。
（１）ｐＵＣ５７プラスミドをＸｂａＩ−ＰｃｉＩで二重消化することによって得られた２３０５ｂｐの断片、
（２）配列番号１８に示される配列を有するｈｐｈ遺伝子発現カセット、及び
（３）配列番号１９に示される配列を有するＨＳＶ−ｔｋ発現カセット。
【００４８】
実施例２：さまざまなシグナルペプチドによってガイドされるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのフィターゼが組込まれたプラスミドの構築
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのフィターゼの発現カセットを、発現のためのＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒのグリコシラーゼ遺伝子座に組込み、ここでは、グリコシラーゼのプロモーター及びグリコシラーゼのターミネーターを使用した。ｐＧｌａ−Ｐｈｙ−Ｐｈｙプラスミド、ｐＧｌａ−Ｇｌａ−Ｐｈｙプラスミド、及びｐＧｌａ−Ａｍｙ−Ｐｈｙプラスミドをそれぞれ構築した。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの野生型フィターゼ成熟ペプチドをコードするＤＮＡ配列Ｐｈｙ（配列番号３）に対してさまざまなシグナルペプチド配列（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのフィターゼのシグナルペプチド（配列番号５）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒのグリコシラーゼのシグナルペプチド（配列番号１０）、及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅのＴＡＫＡアミラーゼのシグナルペプチド（配列番号１２）を含む）をそれぞれ連結した後、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒのグリコシラーゼ遺伝子の置換に使用した。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ８７３９に由来するフィターゼ成熟ペプチドをコードするＤＮＡ配列Ｐｈｙ（配列番号３）は、Ｎａｎｊｉｎｇ  Ｋｉｎｇｓｒａｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈ
Ｃｏ．，Ｌｔｄ．によって合成されたものであり、ＰｈｙシグナルペプチドのＤＮＡ配列は、Ｎａｎｊｉｎｇ  Ｋｉｎｇｓｒａｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．によって合成されたものであり、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒのグリコシラーゼのシグナ
ルペプチド（配列番号１０）及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅのＴＡＫＡアミラーゼのシグナルペプチド（配列番号１２）は、プライマーを使用してＰＣＲによってＰｈｙ配列に導入した。組込みプラスミドは、下記のように構築した。ベクター−Ｆプライマー及びベクター−ＲプライマーによってｐＨｐｈｔｋプラスミドを直鎖化した。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒのゲノム（受入番号ＣＩＣＣ２４６２としてＣｈｉｎａ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手したもの）をテンプレートとして使用し、Ｇｌａ−５’−Ｆ及びＧｌａ−５’−ＲならびにＧｌａ−３’−Ｆ及びＧｌａ−３’−Ｒをそれぞれ使用することで、グリコシラーゼ遺伝子の５’隣接配列及び３’隣接配列を増幅し、その際、それぞれの断片の長さを２０００ｂｐとした。Ｐｈｙ−Ｐｈｙ−Ｆ及びＰｈｙ−Ｐｈｙ−Ｒを使用してＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの野生型フィターゼ配列Ｐｈｙ（配列番号１）を増幅した。直鎖化したｐＨｐｈｔｋベクター、グリコシラーゼ遺伝子の５’隣接断片及び３’隣接断片、ならびにＰｈｙ断片をＧｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  Ｋｉｔ（Ｅ２６１１，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）によって組換えることで、組込みプラスミドであるｐＧｌａ−ＰｅｐＷＴを得た。この組込みプラスミドの配列は、シークエンシングによって確認した。このプラスミドのマッピングは、図２に示される。Ｇｌａ−Ｐｈｙ−Ｆ及びＰｈｙ−Ｐｈｙ−Ｒをプライマーとして使用し、Ｐｈｙ断片（配列番号１）をテンプレートとし使用することで、ＰＣＲ増幅によってＧｌａ−Ｐｈｙ断片を得た。この断片には、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒのグリコシラーゼのシグナルペプチド配列が導入されている。直鎖化したｐＨｐｈｔｋベクター、グリコシラーゼ遺伝子の５’隣接断片及び３’隣接断片、ならびにＧｌａ−Ｐｈｙ断片をＧｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  Ｋｉｔによって組換えることで、組込みプラスミドであるｐＧｌａ−Ｇｌａ−Ｐｈｙを得た。この組込みプラスミドの配列は、シークエンシングによって確認した。このプラスミドのマッピングは、図３に示される。アミラーゼ−Ｐｈｙ−Ｆ及びＰｈｙ−Ｐｈｙ−Ｒをプライマーとして使用し、Ｐｈｙ断片（配列番号１）をテンプレートとして使用することで、ＰＣＲ増幅によってアミラーゼ−Ｐｈｙ断片を得た。この断片には、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅのＴＡＫＡアミラーゼのシグナルペプチド配列が導入されている。直鎖化したｐＨｐｈｔｋベクター、グリコシラーゼ遺伝子の５’隣接断片及び３’隣接断片、ならびにアミラーゼ−Ｐｈｙ断片をＧｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  Ｋｉｔによって組換えることで、組込みプラスミドであるｐＧｌａ−Ａｍｙ−Ｐｈｙを得た。この組込みプラスミドの配列は、シークエンシングによって確認した。このプラスミドのマッピングは、図４に示される。グリコシラーゼ遺伝子の５’末端隣接ＤＮＡ配列（２ｋｂ）は、配列番号２０に示され、３’末端隣接ＤＮＡ配列（２ｋｂ）は、配列番号２１に示される。Ｐｈｙ−Ｐｈｙ、Ｇｌａ−Ｐｈｙ、及びＡｍｙ−Ｐｈｙは、それぞれ配列番号２２、配列番号２３、及び配列番号２４に示される。
関連プライマー配列は、以下に記載される：
【表１】
2020511995.tif 000003
【００４９】
実施例３：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのコドン最適化フィターゼ組込みプラスミドの構築
ｐＧｌａ−Ｐｈｙ−ＰｈｙＯＰＴプラスミド、ｐＧｌａ−Ｇｌａ−ＰｈｙＯＰＴプラスミド、及びｐＧｌａ−Ａｍｙ−ＰｈｙＯＰＴプラスミドをそれぞれ構築した。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのコドン最適化フィターゼ配列ＰｈｙＯＰＴ（配列番号８）に対してさまざまなシグナルペプチド配列（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのフィターゼのシグナルペプチド、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒのグリコシラーゼのシグナルペプチド、及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅのＴＡＫＡアミラーゼのシグナルペプチドを含む）をそれぞれ連結した後、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒのグリコシラーゼ遺伝子の置換に使用した。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ８７３９に由来するフィターゼ配列のコドンを最適化して配列番号８に示される配列とした。この配列は、Ｎａｎｊｉｎｇ  Ｋｉｎｇｓｒａｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄによって合成されたものである。同様に、Ｐｈｙシグナルペプチドを最適化して配列番号９に示される配列とした。組込みプラスミドは、下記のように構築した。ベクター−Ｆプライマー及びベクター−ＲプライマーによってｐＨｐｈｔｋプラスミドを直鎖化した。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒのゲノム（受入番号ＣＩＣＣ２４６２としてＣｈｉｎａ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能なもの）をテンプレートとして使用し、Ｇｌａ−５’−Ｆ及びＧｌａ−５’−ＲならびにＧｌａ−３’−Ｆ及びＧｌａ−３’−Ｒをそれぞれ使用することで、グリコシラーゼ遺伝子の５’隣接配列及び３’隣接配列を増幅し、その際、それぞれの断片の長さを２０００ｂｐとした。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの最適化フィターゼ配列ＰｈｙＯＰＴを、Ｐｈｙ−ＰｈｙＯＰＴ−Ｆ及びＰｈｙ−ＰｈｙＯＰＴ−Ｒ（当該プライマーには、最適化Ｐｈｙシグナルペプチド配列が導入されている）を使用して増幅した。直鎖化したｐＨｐｈｔｋベクター、グリコシラーゼ遺伝子の５’隣接断片及び３’隣接断片、ならびにＰｈｙ断片をＧｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  Ｋｉｔ（Ｅ２６１１，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）によって組換えることで、組込みプラスミドであるｐＧｌａ−Ｐｈｙ−ＰｈｙＯＰＴを得た。この組込みプラスミドの配列は、シークエンシングによって確認した。このプラスミドのマッピングは、図５に示される。Ｇｌａ−ＰｈｙＯＰＴ−Ｆ及びＰｈｙ−ＰｈｙＯＰＴ−Ｒをプライマーとして使用し、ＰｈｙＯＰＴ断片をテンプレートとして使用することで、ＰＣＲ増幅によってＧｌａ−ＰｈｙＯＰＴ断片を得た。この断片には、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌ
ｕｓ  ｎｉｇｅｒのグリコシラーゼのシグナルペプチド配列が導入されている。直鎖化したｐＨｐｈｔｋベクター、グリコシラーゼ遺伝子の５’隣接断片及び３’隣接断片、ならびにＧｌａ−ＰｈｙＯＰＴ断片をＧｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  Ｋｉｔによって組換えることで、組込みプラスミドであるｐＧｌａ−Ｇｌａ−Ｐｈｙを得た。この組込みプラスミドの配列は、シークエンシングによって確認した。このプラスミドのマッピングは、図６に示される。アミラーゼ−ＰｈｙＯＰＴ−Ｆ及びＰｈｙ−ＰｈｙＯＰＴ−Ｒをプライマーとして使用し、ＰｈｙＯＰＴ断片をテンプレートとして使用することで、ＰＣＲ増幅によってアミラーゼ−ＰｈｙＯＰＴ断片を得た。この断片には、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅのＴＡＫＡアミラーゼのシグナルペプチド配列が導入されている。直鎖化したｐＨｐｈｔｋベクター、グリコシラーゼ遺伝子の５’隣接断片及び３’隣接断片、ならびにアミラーゼ−ＰｈｙＯＰＴ断片をＧｉｂｓｏｎ
Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  Ｋｉｔによって組換えることで、組込みプラスミドであるｐＧｌａ−アミラーゼ−ＰｈｙＯＰＴを得た。この組込みプラスミドの配列は、シークエンシングによって確認した。このプラスミドのマッピングは、図７に示される。グリコシラーゼ遺伝子の５’末端隣接ＤＮＡ配列（２ｋｂ）は、配列番号２０に示され、３’末端隣接ＤＮＡ配列（２ｋｂ）は、配列番号２１に示される。Ｐｈｙ−ＰｈｙＯＰＴ発現カセット、Ｇｌａ−ＰｈｙＯＰＴ発現カセット、及びＡｍｙ−ＰｈｙＯＰＴ発現カセットの配列は、それぞれ配列番号２５、配列番号２６、及び配列番号２７に示される。
関連プライマー配列は、以下に記載される：
【表２】
2020511995.tif 000004
【００５０】
実施例４：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのコドン最適化フィターゼ変異体組込みプラスミドの構築
ＵＳ７４３２０９８では、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのフィターゼ変異体であるＮＯＶ９Ｘが、良好な耐熱性を有しており、飼料の分野において使用する上で、より適したものであることが記載されている。ＮＯＶ９Ｘは、本発明のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉのフィターゼと比較して、アミノ酸変異を９つ有する。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅのＴＡＫＡアミラーゼシグナルのガイド下でＮＯＶ９Ｘが効率的に発現し得るかどうかを検証するために、ＰｈｙＯＰＴに１７塩基の変異を導入してＮＯＶ９ＸのＤＮＡ配列を得た。このＤＮＡ配列は、配列番号１４に示される。ＮＯＶ９Ｘは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのフィターゼ成熟ペプチドのコドン最適化ＤＮＡ配列（配
列番号８）に対して９８．６％の配列同一性を有する。ＮＯＶ９Ｘは、Ｎａｎｊｉｎｇ  Ｋｉｎｇｓｒａｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．によって合成されたものであり、ＮＯＶ９Ｘによってコードされる成熟ペプチド配列は、配列番号１５に示される。４３塩基の変異をＮＯＶ９Ｘにさらに導入してＮＯＶ９ＸＭを形成させた。ＮＯＶ９ＸＭは、配列番号１６に示されており、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのフィターゼ成熟ペプチドをコードするコドン最適化ＤＮＡ配列（配列番号８）に対して９５．９％の配列同一性を有する。ＮＯＶ９ＸＭは、Ｎａｎｊｉｎｇ  Ｋｉｎｇｓｒａｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．によって合成されたものであり、ＮＯＶ９ＸＭによってコードされる成熟ペプチド配列は、配列番号１７に示される。ｐＧｌａ−Ａｍｙ−ＰｈｙＭ１プラスミド及びｐＧｌａ−Ａｍｙ−ＰｈｙＭ２プラスミドを構築することで、Ａｍｙ−ＮＯＶ９Ｘ及びＡｍｙ−ＮＯＶ９ＸＭをＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒのグリコシラーゼ遺伝子座にそれぞれ組込んだ。組込みプラスミドは、下記のように構築した。ベクター−Ｆプライマー及びベクター−ＲプライマーによってｐＨｐｈｔｋプラスミドを直鎖化した。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒのゲノム（受入番号ＣＩＣＣ２４６２としてＣｈｉｎａ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手したもの）をテンプレートとして使用し、Ｇｌａ−５’−Ｆ及びＧｌａ−５’−ＲならびにＧｌａ−３’−Ｆ及びＧｌａ−３’−Ｒをそれぞれ使用することで、グリコシラーゼ遺伝子の５’隣接配列及び３’隣接配列を増幅し、その際、それぞれの断片の長さを２０００ｂｐとした。アミラーゼ−ＰｈｙＯＰＴ−Ｆ及びＰｈｙ−ＰｈｙＯＰＴ−Ｒをプライマーとして使用し、ＮＯＶ９Ｘ断片及びＮＯＶ９ＸＭ断片をテンプレートとしてそれぞれ使用することで、ＰＣＲ増幅によってアミラーゼ−ＰｈｙＭ１断片及びアミラーゼ−ＰｈｙＭ２断片を得た。これら２つの断片には、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅのＴＡＫＡアミラーゼのシグナルペプチド配列が導入されている。直鎖化したｐＨｐｈｔｋベクター、グリコシラーゼ遺伝子の５’隣接断片及び３’隣接断片、ならびにアミラーゼ−ＰｈｙＭ１断片をＧｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  Ｋｉｔによって組換えることで、組込みプラスミドであるｐＧｌａ−アミラーゼ−ＰｈｙＭ１を得た。この組込みプラスミドの配列は、シークエンシングによって確認した。このプラスミドのマッピングは、図８に示される。直鎖化したｐＨｐｈｔｋベクター、グリコシラーゼ遺伝子の５’隣接断片及び３’隣接断片、ならびにアミラーゼ−ＰｈｙＭ２断片をＧｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  Ｋｉｔによって組換えることで、組込みプラスミドであるｐＧｌａ−アミラーゼ−ＰｈｙＭ２を得た。この組込みプラスミドの配列は、シークエンシングによって確認した。このプラスミドのマッピングは、図９に示される。グリコシラーゼ遺伝子の５’末端隣接ＤＮＡ配列（２ｋｂ）は、配列番号２０に示され、３’末端隣接ＤＮＡ配列（２ｋｂ）は、配列番号２１に示される。Ａｍｙ−ＰｈｙＭ１発現カセット及びＡｍｙ−ＰｈｙＭ２発現カセットは、それぞれ配列番号２８及び配列番号２９に示される。
関連プライマー配列は、以下に記載される：
【表３】
2020511995.tif 000005
【００５１】
実施例５：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒへのそれぞれの発現カセットの組込み
この実施例では、ＡＮＤ４Ｌを出発株とした。ＡＮＤ４Ｌは、ＣＩＣＣ２４６２株に由来するグリコシラーゼ遺伝子、真菌アミラーゼ遺伝子、及び酸性アミラーゼ遺伝子をノックアウトすることによって得た。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒの遺伝子をノックアウト／ノックインする方法は、ＣＮ１０３９３７７６６ＡまたはＣＮ１０４９６２５９４Ａの実施例に開示される技術的方法を参照することによって実施できる。この実施例でのグリコシラーゼ遺伝子座へのＰｈｙＰｈｙＯＰＴ及びＰｈｙＭの組込みは、ＣＮ１０４９６２５９４Ａの実施例に示されるものと同一の様式で達成し、すなわち、Ｄｅｌｍａｓ
ｅｔ  ａｌ．（Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１４，８０（１１）：３４８４−７）によって記載される方法によって達成した。具体的には、ｇｌａの５’隣接配列及び３’隣接配列、選択可能マーカー、リバース選択可能マーカー（または負選択可能マーカー）、及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの複製配列を含む環状ＤＮＡベクター（すなわち、実施例１〜４に記載のプラスミド）が使用される。この環状ベクターをＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒに導入し、組換え株をフォワード選択によって得た。ノックアウト／ノックイン株は、リバース選択可能マーカーによって得た。
【００５２】
プロトプラストの形質転換を使用することで、ｐＧｌａ−Ｐｈｙ−Ｐｈｙ、ｐＧｌａ−Ｇｌａ−Ｐｈｙ、ｐＧｌａ−Ａｍｙ−Ｐｈｙ、ｐＧｌａ−Ｐｈｙ−ＰｈｙＯＰＴ、ｐＧｌａ−Ｇｌａ−ＰｈｙＯＰＴ、ｐＧｌａ−Ａｍｙ−ＰｈｙＯＰＴ、ｐＧｌａ−Ａｍｙ−ＰｈｙＭ１、及びｐＧｌａ−Ａｍｙ−ＰｈｙＭ２を別々に導入した。具体的な段階は、以下ように実施した。
【００５３】
プロトプラストの調製：栄養素含有量の高いＴＺ液体培地（牛肉エキス粉末（０．８％）、酵母エキス（０．２％）、ペプトン（０．５％）、ＮａＣｌ（０．２％）、及びスクロース（３％）を含む（ｐＨ５．８））においてＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒの菌糸体を培養した。ｍｉｒａ−ｃｌｏｔｈ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）によって液体培地から菌糸体をろ過分離し、０．７ＭのＮａＣｌ（ｐＨ５．８）で洗浄した。菌糸体の水分を切り、セルラーゼ（Ｓｉｇｍａ）を１％、ヘリカーゼ（Ｓｉｇｍａ）を１％、及び溶壁酵素（ｌｙｗａｌｌｚｙｍｅ）（Ｓｉｇｍａ）を０．２％含む酵素加水分解緩衝液（ｐＨ５．８）に菌糸体を移し、酵素による加水分解を３０℃、６５ｒｐｍで３時間実施した。次に、プロトプラストを含む酵素加水分解緩衝液を氷上に置き、４層のレンズペーパーに通してろ過した。得られたろ液を４℃で１０分間、３０００ｒｐｍで穏やかに遠心分離し、上清を捨てた。チューブの壁に付着したプロトプラストをＳＴＣ緩衝液（Ｄ−ソルビトール（１Ｍ）、ＣａＣｌ２（５０ｍＭ）、トリス（１０ｍＭ）を含む（ｐＨ７．５））で１回洗浄し、最終的に、適量のＳＴＣ緩衝液に再浮遊させた。
【００５４】
環状プラスミドであるｐＧｌａ−Ｐｈｙ−Ｐｈｙ、ｐＧｌａ−Ｇｌａ−Ｐｈｙ、ｐＧｌａ−Ａｍｙ−Ｐｈｙ、ｐＧｌａ−Ｐｈｙ−ＰｈｙＯＰＴ、ｐＧｌａ−Ｇｌａ−ＰｈｙＯＰＴ、ｐＧｌａ−Ａｍｙ−ＰｈｙＯＰＴ、ｐＧｌａ−Ａｍｙ−ＰｈｙＭ１、及びｐＧｌａ−Ａｍｙ−ＰｈｙＭ２を、１００μｌのプロトプラスト浮遊液にそれぞれ１０μｌ（濃度：１００ｎｇ／μｌ）添加し、均一化するまで混合した後、室温で２５分間静置した。次に、総体積９００μｌのＰＥＧ溶液を３回添加し、均一化するまで混合した後、室温で２５分間静置した。この溶液を、室温で１０分間、３０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を捨て、チューブの壁に付着したプロトプラストを１ｍｌのＳＴＣ緩衝液に再浮遊させた。この浮遊液を、約４５℃に事前冷却したＴＢ３培地（酵母エキス（０．３％）、酸加水分解カゼイン（０．３％）、スクロース（２０％）、及び寒天（０．７％）を含む）と混合し、平板を形成させた。固化させた後、プレートを静置し、３４℃のインキュベーターにおいて培養した。２４時間後、３００ｎｇ／μｌのハイグロマイシンを含むＴＢ３固体培地（寒天を１％含むものであり、残りの成分は、上記のものと同一である）の平板層を上記プレートの上にさらに形成させ、このプレートを、３４℃のインキュベーターにおいて４〜５日さらにインキュベートした。上層の培地から増殖した形質転換体を、組込みが生じた形質転換体であると見なした。いくつかの組込み形質転換体を無作為にピッキングし、３００ｎｇ／μｌのハイグロマイシンを含むＴＢ３固体培地でそれぞれ継代培養した。３４℃の一定温度で３日間インキュベートした後、菌糸体を収集し、液体窒素において凍結した後、粉砕した。その後、組込み形質転換体のゲノムＤＮＡを真菌ゲノム抽出キット（Ｈａｎｇｚｈｏｕ  Ｂｏｒｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）で抽出した。最終的に、組込み形質転換体のゲノムＤＮＡをＰＣＲによって同定し、その際、Ｐｅｐ−５ｔｅｓｔ−Ｆ及びＰｅｐ−５ｔｅｓｔ−ＲならびにＰｅｐ−３ｔｅｓｔ−Ｆ及びＰｅｐ−３ｔｅｓｔ−Ｒを同定用プライマーとした。ＰＣＲ産物をシークエンシングし、グリコシラーゼ遺伝子座への組込みが生じていることを確認した。
関連プライマー配列は、以下に記載される：
【表４】
2020511995.tif 000006
【００５５】
陽性であることが確認された形質転換体の適量の粉砕菌糸体をピッキングし、１ｍｌの滅菌水を含む遠心チューブに入れ、ボルテックスして菌糸体浮遊液を形成させた。１００μｌを取り、１０μＭの５−Ｆ２ｄＵ（５−フルオロ−２−デオキシウリジン、製造業者：Ｓｉｇｍａ）を含むＴＢ３固体プレートに塗り広げ、３４℃の一定温度で４〜５日間インキュベートした。ノックアウト形質転換体を増殖させた。形質転換体であれば、１０μＭの５−Ｆ２ｄＵを含むプレートで２世代を経た後（これによって不純な形質転換体が阻止される）、３００ｎｇ／μｌのハイグロマイシンを含むプレートで増殖できないはずである。次に、ノックアウト形質転換体のゲノムＤＮＡをＰＣＲによって同定し、その際、プライマー配列及びゲノム抽出方法は、上記のものと同一のものとした。Ｐｅｐ−５ｔｅｓｔ−Ｆ及びＰｅｐ−３ｔｅｓｔ−Ｒを使用してＰＣＲによって同定すると、陽性の形質転換体産物は５．５ｋｂであり、陰性の形質転換体は６．３ｋｂであることが示された。陽性の質転換体について、ＰＣＲ産物をシークエンシングによって確認することで、ＡＮＤ４Ｌ−Ｐｈｙ−Ｐｈｙ株、ＡＮＤ４Ｌ−Ｇｌａ−Ｐｈｙ株、ＡＮＤ４Ｌ−Ａｍｙ−Ｐｈｙ株、ＡＮＤ４Ｌ−Ｐｈｙ−ＰｈｙＯＰＴ株、ＡＮＤ４Ｌ−Ｇｌａ−ＰｈｙＯＰＴ株、Ａ
ＮＤ４Ｌ−Ａｍｙ−ＰｈｙＯＰＴ株、ＡＮＤ４Ｌ−Ａｍｙ−ＰｈｙＭ１株、及びＡＮＤ４Ｌ−Ａｍｙ−ＰｈｙＭ２株を得た。
【００５６】
実施例６：株の振とうフラスコ発酵
実施例５において得られたＡＮＤ４Ｌ−Ｐｈｙ−Ｐｈｙ株、ＡＮＤ４Ｌ−Ｇｌａ−Ｐｈｙ株、ＡＮＤ４Ｌ−Ａｍｙ−Ｐｈｙ株、ＡＮＤ４Ｌ−Ｐｈｙ−ＰｈｙＯＰＴ株、ＡＮＤ４Ｌ−Ｇｌａ−ＰｈｙＯＰＴ株、ＡＮＤ４Ｌ−Ａｍｙ−ＰｈｙＯＰＴ株、ＡＮＤ４Ｌ−Ａｍｙ−ＰｈｙＭ１株、及びＡＮＤ４Ｌ−Ａｍｙ−ＰｈｙＭ２株を、５０ｍｌのＹＰＧ培地（酵母エキス（２ｇ／Ｌ）、ペプトン（２ｇ／Ｌ）、及びグルコース（１０％）を含む）を含む振とうフラスコにそれぞれ播種し、３４℃、２２０ｒｐｍで６日間培養した。上清を、変性条件のポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供した。それぞれの株の発現の詳細については、表１を参照のこと。
【表５】
2020511995.tif 000007
【００５７】
表１から確認できるように、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのフィターゼまたはその変異体をコードするＤＮＡのコドン最適化後、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅのＴＡＫＡアミラーゼのシグナルペプチドのガイド下では、上清の発現レベルは良好であり、他のシグナルペプチド配列の存在下では、タンパク質発現は全く生じていない。最適化を実施していない配列については、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅのＴＡＫＡアミラーゼのシグナルペプチドのガイド下においても、発現レベルは非常に低く、このことは、ＤＮＡ配列の最適化もまた、発現に非常に重要であることを証明するものである。最適化された配列に対して１７の変異及び５０の変異を導入した後にもまた、良好な発現をそれぞれが達成することができる。
【図１】
2020511995.tif 000008
【図２】
2020511995.tif 000009
【図３】
2020511995.tif 000010
【図４】
2020511995.tif 000011
【図５】
2020511995.tif 000012
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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