(57)【要約】  チップの表面にドナー細胞を置き、様々なプラスミド、他のトランスフェクションベクター、及びそれらの組み合わせをチップ上の緩衝液に追加し、チップ表面上に置かれた細胞とチップ表面下のプラスミド／ベクター緩衝液の全体にパルス電界を印加し、トランスフェクトされた細胞によって分泌された細胞外小胞（ＥＶ）を採取することにより、機能性核酸及び他の生体分子のハイコピーを含む治療用のＥＶを大量に生産する。チップ表面は、該表面に形成された三次元（３Ｄ）ナノチャネルエレクトロポレーション（ＮＥＰ）バイオチップを有し、大量のドナー細胞を処理し得る。緩衝液は、プラスミド及び他のトランスフェクションベクターを受容するのに適している。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
機能性核酸及び他の生体分子のハイコピーを含む、多数の治療用の細胞外小胞（ＥＶ）を生産する方法であって、
チップの表面であって、その上に形成された三次元（３Ｄ）のナノチャネルエレクトロポレーション（ＮＥＰ）バイオチップを有する該表面にドナー細胞を置くステップ、
チップ上の緩衝液に様々なプラスミド、他のトランスフェクションベクター及びそれらの組み合わせを添加するステップ、
チップの表面に置かれた細胞及びチップの表面下のプラスミド／ベクター緩衝溶液の全体にパルス電界を印加することにより、結果として細胞を強く刺激して非エンドサイトーシスでプラスミド／ベクターを細胞内に送達するステップ、及び
トランスフェクトされた細胞によって分泌されたＥＶを採取するステップを含む、方法。
【請求項２】
ナノチャネルの直径は５０〜９００ｎｍである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
プラスミド及びベクターはｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及び他のＲＮＡを転写し、トランスフェクトされた細胞内でのタンパク質及び他の生体分子の翻訳をもたらす、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
トランスフェクトされた細胞によって分泌されたＥＶが、転写されたｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及び他のＲＮＡ、並びに翻訳されたタンパク質及び他の生体分子を含む、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
トランスフェクトされた細胞内での小胞形成及びエキソサイトーシスを促進する、熱ショックタンパク質及び他のタンパク質の発現を増加させる手段が手順に追加され、該手段は細胞の熱ショック処理、又は培養細胞への熱ショックタンパク質の添加を含む、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
トランスフェクトされた細胞内でのエクソソーム形成を促進するタンパク質の発現を増加させる手段が手順に追加され、該手段はＣＤ６３、ＣＤ９及び他のＤＮＡプラスミドのコトランスフェクションを含む、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ＲＮＡ／タンパク質標的の共局在化及びＥＶ分泌を促進するために、多種のＤＮＡプラスミド及び他のベクターが、トランスフェクトされた細胞に逐次的に送達される、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ＤＮＡプラスミド、他のトランスフェクションベクター、ＲＮＡ、タンパク質／ペプチド、小分子薬等の外因性生体分子が、ＮＥＰによるドナー細胞の逐次的なトランスフェクションによって細胞内の小胞内でカプセル化され、治療用のＥＶとして分泌される、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ＮＥＰに加えて、ドナー細胞に強い刺激を与え、高速ＲＮＡ転写及びタンパク質翻訳のためのＥＶ分泌及び非エンドサイトーシスでのプラスミド／ベクター送達を促進する、他の細胞トランスフェクション法が、同様の効力を有する治療用のＥＶを産生する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
他の細胞トランスフェクション法が、遺伝子銃、及びマイクロ又はナノインジェクションを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
プラスミド及び／又は他のベクターはナノ又はミクロンサイズの金又は他の固体の粒子に係留され、それらの粒子は遺伝子銃を使用して空気圧力下でドナー細胞に注入され、強い細胞刺激及び非エンドサイトーシスのプラスミド／ベクター送達を引き起こす、請求項８から１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
プラスミド及び／又は他のベクターはナノ又はミクロンサイズのチップアレイに係留され、ドナー細胞はそれらのチップによって引き抜かれ、強い細胞刺激及びドナー細胞への非エンドサイトーシスのプラスミド／ベクター送達を引き起こす、請求項８から１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
三次元（３Ｄ）のナノチャネルエレクトロポレーション（ＮＥＰ）バイオチップ、及びその上に形成された受容用の緩衝液であって、プラスミド及び他のトランスフェクションベクターを受容するのに適した緩衝液、を有するチップを含む、機能性核酸及び他の生体分子のハイコピーを含む多数の治療用の細胞外小胞（ＥＶ）を生産するためのデバイス。
【請求項１４】
請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法でトランスフェクトされた細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ドナー細胞へＤＮＡプラスミド及び他のベクターを非エンドサイトーシス送達することによる、機能性メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、タンパク質、及び他の生体分子を含む治療用の細胞外小胞（ＥＶ）、特にエクソソームを生産する方法であって、ＤＮＡプラスミド／ベクターの非エンドサイトーシス送達が細胞質内でのＲＮＡの高速転写とタンパク質の翻訳をもたらす間に、送達によって引き起こされる強い刺激によってドナー細胞に細胞内で多数の小胞を生産し、ＥＶとしてドナー細胞から分泌される前に、それらの機能性生体分子を内因的に小胞にカプセル化させることによる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
エクソソーム、マイクロベシクル及び他の小胞を含む細胞外小胞（ＥＶ）は、多数の細胞型によって分泌される。人体において、１ｍＬの血液中に＞１０Ｅ１２個のＥＶがあり、またそれらはさまざまな体液中にも存在する。エクソソームはナノベシクル（４０〜１５０ｎｍ）である一方、マイクロベシクルのサイズは＜１００ｎｍから＞１μｍまで様々である。それらには、コーディングＲＮＡ及び非コーディングＲＮＡの両方及びそれらの断片、ＤＮＡ断片、タンパク質、並びにその他の細胞関連生体分子が含まれる。ＥＶ及びその生体分子含有量は、疾患診断のバイオマーカーとして提案されている。さらに、それらは腫瘍の微小環境及び循環における細胞間コミュニケーションにおいて、主要な役割を果たす。
【０００３】
機能性ＲＮＡ及びタンパク質を搭載したＥＶは、治療用途の薬物及び薬物担体としても提案されている。特定の核酸及び／又はタンパク質をｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで標的の組織又は細胞型に送達するには、内因性又は外因性のいずれかの治療用のカーゴと共にＥＶを生産し得る方法が必要である。
【０００４】
近年、従来のバルクエレクトロポレーション（ＢＥＰ）による外因性の低干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）及びｓｈＲＮＡのプラスミドの既存のエクソソームへの後挿入が開発された。それらの治療機能は、癌及び非癌疾患のいくつかのマウスモデルで成功裏に実証されているが、このアプローチは多くの制限に直面している。第一に、ＤＮＡプラスミド、ｍＲＮＡ、タンパク質等の大きな生体分子をナノサイズのエクソソームに後挿入することは非効率的である。第二に、ＢＥＰによって発生した強い電場は、多くのエクソソームを破壊し、治療用のエクソソームの収率の低下をもたらすだろう。さらに、ｍＲＮＡやタンパク質等の多くの大きな生体分子は、体外で合成するのが難しく、高価である。
【０００５】
ドナー細胞にＤＮＡプラスミド又は他のベクターをトランスフェクトして、治療用のＲＮＡ及びタンパク質標的を内在的に含む、多数のエクソソーム又は他のＥＶを産生する新しい方法を開発することができれば、非常に望ましいだろう。
【０００６】
先行の米国特許出願第１４／２８２６３０号では、我々はＤＮＡプラスミド又はその他の荷電粒子及び分子を非エンドサイトーシスに、良好な投与量制御で個々の細胞に送達できるナノチャネルエレクトロポレーション（ＮＥＰ）バイオチップを開発した。上記特許ではＮＥＰが、前述の後挿入の方法では達成できない、機能的ｍＲＮＡ及びマイクロＲＮＡ標的のハイコピーを含む、多数の治療用のエクソソームを生成できることを示す。適切な細胞刺激及び高速のプラスミド／ベクター送達を提供することができれば、ＮＥＰに加えて、遺伝子銃、マイクロ／ナノインジェクション等の他の非エンドサイトーシス送達法でも、同様のパフォーマンスを達成できる可能性がある。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、多数の小胞及び転写されたＲＮＡ、並びに翻訳されたタンパク質等がトランスフェクトされた細胞内で形成されるように、ＤＮＡプラスミド及び他のベクターを強力な細胞刺激によって非エンドサイトーシスでドナー細胞に送達し得る新規の概念及び方法の開発に関する。細胞は、治療機能を備えた特定のＲＮＡ及びタンパク質標的を含む多くの細胞外小胞（ＥＶ）を分泌するだろう。
【０００８】
上記の設計概念を実証するために、多くのドナー細胞を事前に指定されたＤＮＡプラスミドでトランスフェクトして、非トランスフェクトドナー細胞から分泌されるＥＶよりも最大で数千倍多い、無傷のｍＲＮＡ及びｍｉＲのターゲットのハイコピーを含むエクソソームを含む１０〜１００倍以上のＥＶを分泌し得る三次元（３Ｄ）ＮＥＰバイオチップを作製する。
【０００９】
本発明のいくつかの態様は、機能性核酸及び他の生体分子のハイコピーを含む、多数の治療用の細胞外小胞（ＥＶ）を生成する方法によって達成される。このような方法は、
チップの表面であって、その上に形成された三次元（３Ｄ）のナノチャネルエレクトロポレーション（ＮＥＰ）バイオチップを有する該表面にドナー細胞を置くステップ；
チップ上の緩衝液に様々なプラスミド、他のトランスフェクションベクター及びそれらの組み合わせを添加するステップ；
チップ表面上に置かれた細胞及びチップの表面下のプラスミド／ベクター緩衝液の全体にパルス電界を印加することにより、結果として細胞を強く刺激して非エンドサイトーシスでプラスミド／ベクターを細胞に送達するステップ；及び
トランスフェクトされた細胞によって分泌されたＥＶを採取するステップを含む。
【００１０】
これらの方法のいくつかでは、ナノチャネルの直径は５０〜９００ｎｍの間である。
【００１１】
これらの方法のいくつかでは、プラスミド及びベクターはｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及び他のＲＮＡを転写し、トランスフェクトされた細胞内でのタンパク質及び他の生体分子の翻訳をもたらす。
【００１２】
本発明の方法におけるいくつかの実施形態において、トランスフェクトされた細胞によって分泌されたＥＶが、転写されたｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及び他のＲＮＡ、並びに翻訳されたタンパク質及び他の生体分子を含む。
【００１３】
本発明の方法におけるいくつかの実施形態において、トランスフェクトされた細胞内での小胞形成及びエキソサイトーシスを促進し得るように、熱ショックタンパク質及び他のタンパク質の発現を増加させる手段が手順に追加され、該手段は細胞の熱ショック処理、又は培養細胞への熱ショックタンパク質の添加を含む。
【００１４】
いくつかの実施形態では、トランスフェクトされた細胞内でのエクソソーム形成を促進するタンパク質の発現を増加させる手段が手順に追加され、該手段はＣＤ６３、ＣＤ９及び他のＤＮＡプラスミドのコトランスフェクションを含む。
【００１５】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ／タンパク質標的の共局在化及びＥＶ分泌を促進するために、多種のＤＮＡプラスミド及び他のベクターがトランスフェクトされた細胞に逐次的に送達される。
【００１６】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡプラスミド、他のトランスフェクションベクター、ＲＮＡ、タンパク質／ペプチド、小分子薬等の外因性生体分子は、ＮＥＰによるドナー細胞の逐次的なトランスフェクションによって細胞内の小胞内でカプセル化され、治療用のＥＶとして分泌される。これらの形態の一部では、ＮＥＰに加えて、ドナー細胞に強い刺激を与え、高速ＲＮＡ転写及びタンパク質翻訳のためのＥＶ分泌及び非エンドサイトーシスでのプラスミド／ベクター送達を促進する、他の細胞トランスフェクション法を使用して、同様の効果を持つ治療用のＥＶを生成する。さらにこれらの形態では、他の細胞トランスフェクション法に、遺伝子銃、及びマイクロ又はナノインジェクションが含まれる。
【００１７】
いくつかの実施形態では、プラスミド及び／又は他のベクターはナノ又はミクロンサイズの金又は他の固体の粒子に係留され、それらの粒子は遺伝子銃を使用して空気圧力下でドナー細胞に注入され、強い細胞刺激及び非エンドサイトーシスのプラスミド／ベクター送達を引き起こす。
【００１８】
いくつかの実施形態では、プラスミド及び／又は他のベクターは、ナノサイズ又はミクロンサイズのチップアレイに係留され、ドナー細胞はこれらのチップによって引き抜かれ、強い細胞刺激及びドナー細胞内への非エンドサイトーシスのプラスミド／ベクター送達を引き起こす。
【００１９】
本発明の他の態様は、三次元（３Ｄ）のナノチャネルエレクトロポレーション（ＮＥＰ）バイオチップ、及びその上に形成された受容用の緩衝液であって、プラスミド及び他のトランスフェクションベクターを受容するのに適した緩衝液、を有するチップを含む、機能性核酸及び他の生体分子のハイコピーを含む多数の治療用の細胞外小胞（ＥＶ）を生産するためのデバイスによって達成される。
【００２０】
本発明の他の態様は、上述の方法のいずれかによりトランスフェクトされた細胞を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
本開示の多くの態様は、以下の図面を参照してより理解することができる。図面の構成要素は必ずしも縮尺通りではなく、代わりに本開示の原理を明確に描写することに重点が置かれている。
【図１】ドナー細胞トランスフェクション用の３Ｄナノチャネルエレクトロポレーション（ＮＥＰ）バイオチップの概略図である。
【図２Ａ】ＹＯＹＯ−１で蛍光標識した、神経関連遺伝子であるＡｃｈａｅｔｅ−Ｓｃｕｔｅ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｌｉｋｅ−１（Ａｓｃｌ１）のＤＮＡプラスミドを使用した、トランスフェクション後１時間のＢＥＰ及びＮＥＰベースの細胞トランスフェクションの比較を示す。
【図２Ｂ】ＹＯＹＯ−１で蛍光標識した、神経関連遺伝子であるＡｃｈａｅｔｅ−Ｓｃｕｔｅ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｌｉｋｅ−１（Ａｓｃｌ１）のＤＮＡプラスミドを使用した、トランスフェクション後１時間のＢＥＰ及びＮＥＰベースの細胞トランスフェクションの比較を示す。
【図３】ＤＮＡプラスミドを含む又は含まないＮＥＰ細胞トランスフェクションが、トランスフェクトされたマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）細胞からのＥＶ分泌を著しく刺激し、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏ）及びＢＥＰベースの細胞トランスフェクションよりもはるかに優れた性能を有することを示す。Ｃｔｒｌは、トランスフェクトされていないＭＥＦ細胞を表す。ＮＥＰは、ＤＮＡプラスミドによるＮＥＰ細胞トランスフェクションを表す。ＮＥＰ−ＰＢＳは、ＰＢＳバッファー（緩衝液）のみによるＮＥＰ細胞トランスフェクションを表す。使用するＤＮＡプラスミドは、重量比２／１／１のＡｃｈａｅｔｅ−Ｓｃｕｔｅ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｌｉｋｅ−１（Ａｓｃｌ１）、Ｐｏｕ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｃｌａｓｓ  ３  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ２（Ｐｏｕ３ｆ２又はＢｒｎ２）及びＭｙｅｌｉｎ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  １  Ｌｉｋｅ（Ｍｙｔ１ｌ）である。これらのＤＮＡプラスミドの混合物は、ドナー細胞を誘導ニューロン（ｉＮ）に再プログラムすることが知られている。
【図４】ＮＥＰでトランスフェクトされたＭＥＦ細胞からのＥＶ分泌における、ヒートショックプロテイン７０（ＨＳＰ７０）の阻害剤及びヒートショックプロテイン９０（ＨＳＰ９０）の阻害剤の効果を示す。ＮＥＰトランスフェクション後、細胞培養物をＨＳＰ７０阻害剤（ＶＥＲ  １５５００８、５０μＭ）、ＨＳＰ９０阻害剤（ＮＶＰ−ＨＳＰ９０、１μＭ）、又はそれらの混合物を含む新鮮な培地に交換した。トランスフェクション後２４時間で培地を採取し、動的光散乱（ＤＬＳ）ゴニオメトリーによりＥＶの数を検出した。
【図５】ＭＥＦ細胞からのＥＶ分泌における、ＣＤ６３のＤＮＡプラスミドのＮＥＰトランスフェクションの効果を示す。ＮＥＰによってＣＤ６３プラスミドの有無にかかわらず細胞をトランスフェクトした。細胞培養培地を採取し、４時間毎に新鮮な培地と交換した。ＥＶの数はＤＬＳゴニオメトリーによって検出した。
【図６】細胞トランスフェクションの２４時間後に採取されたＮＥＰ有り又は無しのＥＶの、ＤＬＳによって測定されたサイズ分布を示す。
【図７】諸手法を用いてＡｓｃｌ１／Ｂｒｎ２／Ｍｙｔ１ｌのＤＮＡプラスミドを２／１／１の比率でトランスフェクトしたＭＥＦ細胞からの、ｑＲＴ−ＰＣＲによって測定された、トランスフェクション後２４時間のＥＶのＡｓｃｌ１のｍＲＮＡ発現を示す。
【図８】諸手法を用いてＡｓｃｌ１／Ｂｒｎ２／Ｍｙｔ１ｌのＤＮＡプラスミドを２／１／１の比率でトランスフェクトしたＭＥＦ細胞からの、ｑＲＴ−ＰＣＲによって測定された、トランスフェクション後２４時間のＥＶのＢｒｎ２のｍＲＮＡ発現を示す。
【図９】諸手法を用いてＡｓｃｌ１／Ｂｒｎ２／Ｍｙｔ１ｌのＤＮＡプラスミドを２／１／１の比率でトランスフェクトしたＭＥＦ細胞から、ｑＲＴ−ＰＣＲによって測定された、トランスフェクション後２４時間のＥＶのＭｙｔ１ｌのｍＲＮＡ発現を示す。
【図１０】ＮＥＰによって得たＥＶのみが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳によって測定された機能的ｍＲＮＡを含むことを示す。
【図１１】ＮＥＰからのＥＶ−ｍＲＮＡが、マイクロベシクル内ではなくエクソソーム内に存在することを示す。
【図１２】ＮＥＰ細胞トランスフェクションからの、マイクロベシクル−ＲＮＡではなくエクソソーム−ｍＲＮＡがタンパク質を翻訳し得ることを示す。
【図１３】ＮＥＰでトランスフェクトしたＭＥＦ細胞からのＥＶ−ｍＲＮＡの分泌プロファイルを示す。
【図１４】パッチクランプによる活動電位検出が、Ａｓｃｌ１／Ｂｒｎ２／Ｍｙｔ１ｌのｍＲＮＡを含むＮＥＰから得たＥＶを１日おきにトランスフェクトしたＭＥＦ細胞は、２４日後に機能的な誘導ニューロン（ｉＮ）に再プログラミングされ得ることを示す。
【図１５】諸手法を用いて、ｍｉＲ−１２８のＤＮＡプラスミドをトランスフェクトしたＭＥＦ細胞から、ｑＲＴ−ＰＣＲによって測定された、トランスフェクション後２４時間のＥＶとしてのｍｉＲ−１２８発現を示す。
【図１６Ａ】ＭＥＦ細胞へのＤＮＡプラスミドのＮＥＰトランスフェクションによるｍｉＲ−１２８を含む分泌されたＥＶと、事前採取されたｍｉＲ−１２８をＢＥＰ後挿入によって装填した既存のＥＶとの比較である。
【図１６Ｂ】ＭＥＦ細胞へのＤＮＡプラスミドのＮＥＰトランスフェクションによるｍｉＲ−１２８を含む分泌されたＥＶと、事前採取されたｍｉＲ−１２８をＢＥＰ後挿入によって装填した既存のＥＶとの比較である。
【図１６Ｃ】ＭＥＦ細胞へのＤＮＡプラスミドのＮＥＰトランスフェクションによるｍｉＲ−１２８を含む分泌されたＥＶと、事前採取されたｍｉＲ−１２８をＢＥＰ後挿入によって装填した既存のＥＶとの比較である。
【図１６Ｄ】ＭＥＦ細胞へのＤＮＡプラスミドのＮＥＰトランスフェクションによるｍｉＲ−１２８を含む分泌されたＥＶと、事前採取されたｍｉＲ−１２８をＢＥＰ後挿入によって装填した既存のＥＶとの比較である。
【図１６Ｅ】ＭＥＦ細胞へのＤＮＡプラスミドのＮＥＰトランスフェクションによるｍｉＲ−１２８を含む分泌されたＥＶと、事前採取されたｍｉＲ−１２８をＢＥＰ後挿入によって装填した既存のＥＶとの比較である。
【図１７Ａ】ＭＥＦ細胞へのＤＮＡプラスミドのＮＥＰトランスフェクションによるＢｒｎ２のｍＲＮＡを含む分泌されたＥＶと、事前採取されたＢｒｎ２のｍＲＮＡをＢＥＰ後挿入によって装填した既存のＥＶとの比較である。
【図１７Ｂ】ＭＥＦ細胞へのＤＮＡプラスミドのＮＥＰトランスフェクションによるＢｒｎ２のｍＲＮＡを含む分泌されたＥＶと、事前採取されたＢｒｎ２のｍＲＮＡをＢＥＰ後挿入によって装填した既存のＥＶとの比較である。
【図１７Ｃ】ＭＥＦ細胞へのＤＮＡプラスミドのＮＥＰトランスフェクションによるＢｒｎ２のｍＲＮＡを含む分泌されたＥＶと、事前採取されたＢｒｎ２のｍＲＮＡをＢＥＰ後挿入によって装填した既存のＥＶとの比較である。
【図１８】逐次的なＮＥＰによる同じＥＶ内でのｍＲＮＡの共局在の増加を示す。ＮＥＰトランスフェクションの場合、Ａｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、及びＭｙｔ１ｌプラスミドを前述のように同時にトランスフェクトした。逐次的なＮＥＰでは、Ｍｙｔ１ｌプラスミドを最初にトランスフェクトし、Ｂｒｎ２プラスミドを４時間後にトランスフェクトし、Ａｓｃｌ１プラスミドをＢｒｎ２のトランスフェクションの４時間後にトランスフェクトした。Ｍｙｔ１ｌトランスフェクションの２４時間後、ＴＬＮアッセイのために培地を採取した。等量のＦＡＭ−Ａｓｃｌ１、Ｃｙ３−Ｂｒｎ２、及びＣｙ５−Ｍｙｔ１ｌそれぞれのＭＢが、ＥＶ−ｍＲＮＡ検出用の係留されたリポプレックスナノ粒子内にカプセル化された。黄色の矢印：３つのｍＲＮＡを含むＥＶ。青い矢印：２つのｍＲＮＡを含むＥＶ。ピンクの矢印：１つのｍＲＮＡを含むＥＶ。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
実施例１：３Ｄ  ＮＥＰバイオチップの概略図と、異なるトランスフェクション法を用いたＥＶ分泌及びＥＶのｍＲＮＡ含有量の比較。
図１は、チップ表面にドナー細胞の単一層が置かれた３Ｄ  ＮＥＰバイオチップの概略図を示す。細胞を一晩インキュベートした後、ＰＢＳバッファー中に事前に装填したＤＮＡプラスミドを、ナノチャネル全体に２２０Ｖの電界を用いて、ナノチャネルを介して個々のドナー細胞に注入した。電圧レベル、パルス数、パルス長等の様々なエレクトロポレーションの条件を選択し得る。
【００２３】
ＹＯＹＯ−１で蛍光標識された、Ａｃｈａｅｔｅ−Ｓｃｕｔｅ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｌｉｋｅ−１（Ａｓｃｌ１）のＤＮＡプラスミドを用い、図２Ａ及び図２Ｂは蛍光顕微鏡を使用して画像化した、４８８ｎｍの波長下でのＢＥＰ又はＮＥＰによるトランスフェクションの１時間後のトランスフェクトされた細胞を示す。蛍光強度は、ＮＩＳソフトウェアによって算出した。これら２つのグループの蛍光強度の比較は、棒グラフで示す。結果として、メーカーが推奨する最良の条件でのＢＥＰは、ＭＥＦ細胞への５回の１０ミリ秒パルスで２２０ＶのＮＥＰよりも、ほぼ３倍多くのプラスミドを送達できることを示している。しかし、ほとんどのプラスミドはＢＥＰトランスフェクションの１時間後もまだ細胞表面近くにあったが、それに対し同時刻にＮＥＰによって注入されたプラスミドはすでに細胞質内に均一に拡散していた。これは、ＢＥＰベースの細胞トランスフェクションが主にエレクトロポレーションを介したエンドサイトーシスに依存しているのに対し、ＮＥＰベースの細胞トランスフェクションは非エンドサイトーシスであることを意味する。
【００２４】
図３では、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏ）、ＢＥＰ、又はＮＥＰのいずれかによって、同じＡｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、及びＭｙｔ１ｌのＤＮＡプラスミドを２／１／１の重量比でトランスフェクトした、同じ数のＭＥＦ細胞（５Ｅ６個の細胞）から分泌されたＥＶの数を比較する。全てのＥＶは、トランスフェクション後２４時間で細胞培養培地から採取され、合計のＥＶ数はＮａｎｏＳｉｇｈｔ（登録商標）によって測定した。ＢＥＰの場合、トランスフェクション電圧は１回の３０ミリ秒パルスで１２５０Ｖであった。ＮＥＰの場合、トランスフェクション電圧は５回の１０ミリ秒パルスで２２０Ｖであった。使用したプラスミドの濃度は、Ａｓｃｌ１／Ｂｒｎ２／Ｍｙｔ１ｌ＝２００／１００／１００ｎｇ／μｌであった。リポフェクタミンのトランスフェクションでは、５μｇのプラスミド混合物（Ａｓｃｌ１／Ｂｒｎ２／Ｍｙｔ１ｌ＝２／１／１）をメーカーの説明書に従って使用した。ＥＶは、１５００ｇで１０分間の単純な遠心分離により、細胞培養培地から採取した。結果は、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏ）ベースの細胞トランスフェクションはＥＶ分泌を変化させなかったことを示す。ＥＶ濃度は、トランスフェクションの有無に関わらず約２Ｅ９個／ｍｌであった。おそらくは、ナノ粒子キャリアによる遅いプラスミドのエンドサイトーシスプロセスは、トランスフェクトされた細胞をあまり刺激しなかったらしく、その結果、ＥＶ分泌にほとんど変化はなかった。それに比べて、ＢＥＰベースの細胞トランスフェクションでは、ＥＶ分泌が６Ｅ９個／ｍｌ近くまで増加した。ＮＥＰ細胞のトランスフェクションによっては、プラスミドの添加の有無にかかわらず、ＥＶ分泌が１．３Ｅ１１個／ｍｌを超える大幅な増加が観察された。これは、トランスフェクトされた細胞が、ＢＥＰによっては多少刺激されたが、ＮＥＰによっては非常に刺激され、後者の場合でＥＶの非常に有意な増加をもたらすことを意味する。
【００２５】
エレクトロポレーション中、印加された電場によって引き起こされるジュール加熱は、細胞温度を一時的に上昇させ、トランスフェクトされた細胞に熱ショックを引き起こす可能性がある。熱ショックは、細胞内の熱ショックタンパク質（ヒートショックプロテイン）の増加によって引き起こされるシャペロン媒介オートファジーにより、ＥＶの細胞分泌を増加させる可能性があることが知られている（８−１０）。実際に、ＮＥＰは実質上、トランスフェクトしたＭＥＦ細胞において非トランスフェクトしたＭＥＦ細胞（Ｃｔｒｌ）よりも、ヒートショックプロテイン７０（ＨＳＰ７０）の発現を１３．８倍、ヒートショックプロテイン９０（ＨＳＰ）の発現を４．２倍双方とも増加させることがわかった。エレクトロポレーション後に細胞培養培地にＨＳＰ阻害剤を添加すると、ＥＶ分泌が抑制される可能性がある。図４は、ＨＳＰ７０阻害剤（ＶＥＲ  １５５００８、５０μＭ）、ＨＳＰ９０阻害剤（ＮＶＰ−ＨＳＰ９９０、１μＭ）、及びそれらの混合物を含む、ＮＥＰでトランスフェクトしたＭＥＦ細胞のＥＶ分泌の５０％、４０％、７０％の減少をそれぞれ示す。ここでは、ＮＥＰトランスフェクションの直後に、細胞培養をＨＳＰ７０阻害剤（ＶＥＲ  １５５００８）、ＨＳＰ９０阻害剤（ＮＶＰ−ＨＳＰ９９０）、又はそれらの混合物を含む新鮮な培地に置き換えた。トランスフェクション後２４時間で培地を採取し、動的光散乱（ＤＬＳ）ゴニオメトリーによりＥＶ数を検出した。これらの結果は、熱ショックタンパク質の発現を増加し得る細胞刺激がＥＶ分泌を促進するであろうことを意味する。
【００２６】
同様に、細胞における後期エンドソーム多胞体（ＭＶＢ）形成に必要なタンパク質の増加は、エクソソーム分泌を促進する可能性もある。図５は、ＭＥＦ細胞からのＥＶ分泌に対するＣＤ６３のＤＮＡプラスミドのＮＥＰトランスフェクションの効果を示す。ＮＥＰにより、ＣＤ６３のＤＮＡプラスミドの有無にかかわらず細胞をトランスフェクトした。細胞培養培地を採取し、４時間ごとに新鮮な培地と交換した。ＥＶ数はＤＬＳゴニオメトリーによって検出した。結果は、いずれの場合もＮＥＰトランスフェクション後の最初の１６時間においては同様のＥＶ分泌プロファイルを示す。しかしながら、ＣＤ６３のＤＮＡプラスミドによるＮＥＰトランスフェクションでは１６〜４４時間後に、より多くのＥＶが分泌された。ＣＤ６３のタンパク質は、エクソソーム分泌の前駆体である、エンドソーム膜のテトラスパニン濃縮マイクロドメインへの再編成に不可欠である。
【００２７】
図６は、ＭＥＦ細胞（ｃｔｒｌ）及びＮＥＰトランスフェクトされたＭＥＦ細胞について、ＤＬＳゴニオメトリーにより測定したＥＶのサイズ分布を示している。ＮＥＰ刺激は、より大きなＥＶ（主にマイクロベシクル）の分布をあまり変化させなかったが、大きさが４０〜１１０ｎｍの範囲内のエクソソームの分泌を大幅に増加させた。
【００２８】
図８〜９は、Ａｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、及びＭｙｔ１ｌのＤＮＡプラスミドのＮＥＰ細胞トランスフェクションから分泌されたＥＶには、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を使用して測定された、大量の対応するＡｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、及びＭｙｔ１ｌのｍＲＮＡ又はそれらの断片を含むことを示す。ＥＶの数と同様に、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏ）ベースの細胞トランスフェクションはｍＲＮＡ発現をあまり変化させなかったが、それに対してＢＥＰベースの細胞トランスフェクションはｍＲＮＡ発現を数倍増加させることができた。これに対して、ＮＥＰベースの細胞トランスフェクションでは、結果として標的のｍＲＮＡが数千倍に増加した。ここでは、同量の全ＲＮＡを得た後に、メーカーの説明書に従ってｑＲＴ−ＰＣＲにより逆転写を行った。
【００２９】
図１０は、いくつかのＥＶのｍＲＮＡがＡｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、及びＭｙｔｌ１タンパク質を翻訳し得るものであったため、それらが無傷かつ機能的であることを示す。ここでは、各トランスフェクション法からの同量の全ＲＮＡ（１μｇ）を、ウサギ網状赤血球ライセートシステム（プロメガ株式会社）を使用して、メーカーの説明書に従ってｉｎ  ｖｉｔｒｏタンパク質翻訳に適用した。サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ウェスタンブロッティングのプロットに示すように、タンパク質を種々の抗体で検出した。
【００３０】
採取された全ＥＶについて、より大きなマイクロベシクルは、１０，０００ｇで３０分間の超遠心分離により選別した。上清をさらに１００，０００ｇで２時間遠心分離して、より小さいエクソソームを採取した。上述したこれら２つの部分から全ＲＮＡを採取した。全ｍＲＮＡ濃度はＮａｎｏｄｒｏｐ（登録商標）で測定すると共に、Ａｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、及びＭｙｔ１ｌのｍＲＮＡのＡＢＭ発現はｑＲＴ−ＰＣＲで測定した。図１１は、エクソソーム内の方がマイクロベシクル内よりも２倍以上のＲＮＡがあったことを示すが、ほとんどのＡｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、及びＭｙｔ１ｌのｍＲＮＡはエクソソーム内に存在した。図１２は、機能的なＡｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、及びＭｙｔ１ｌのｍＲＮＡがエクソソーム内にも存在し、それらのエクソソームは典型的なエクソソームタンパク質マーカーである、ＣＤ９、ＣＤ６３、及びＴｓｇ１０１を持っていることを示す。それに比べて、より大きなマイクロベシクルは、典型的なタンパク質マーカーであるＡｒｆ６を持っている。
【００３１】
図１３は、Ａｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、及びＭｙｔｌ１のＤＮＡプラスミドによるＮＥＰトランスフェクション後の時間の関数としてのＥＶ分泌量及び含有量プロファイルを示す。Ａｓｃｌ１プラスミドは３つの中で最小（７ｋｂｐ）であり、Ｍｙｔ１ｌプラスミドは最大（９ｋｂｐ）で、Ｂｒｎ２プラスミドは中間（８ｋｂｐ）であった。指示された時点で細胞培養培地中のＥＶを採取し、培養培地を新鮮な培地と交換した。ＥＶ数はＤＬＳゴニオメトリーによって検出し、ＥＶのｍＲＮＡ発現は前述のようにｑＲＴ−ＰＣＲによって検出した。結果として、トランスフェクション後４時間以内にＥＶ分泌の急速な増加を示し、８時間でピークに達すると共に、２４時間以上の継続的なＥＶ分泌をもたらした。Ａｓｃｌ１及びＢｒｎ２のｍＲＮＡを含むＥＶも、ＥＶ分泌のプロファイルとよく一致するプロファイルであり、トランスフェクション後４時間以内に現れた。Ｍｙｔ１ｌのｍＲＮＡを含むＥＶは後に現れたが、２４時間以内に現れた。これは、ＥＶ分泌時間とｍＲＮＡ転写時間を細胞内で一致させる必要があることを意味し、ＮＥＰベースの細胞トランスフェクションによって達成し得るものである。
【００３２】
内因性ｍＲＮＡを含むＮＥＰ産生ＥＶが治療機能を有することを実証するために、ＭＥＦ細胞をそれらのＥＶで１日おきに、１００，０００細胞あたり１μｇの全ＥＶ  ＲＮＡ濃度で処理した。数日後、処理したＭＥＦ細胞はニューロン様の形態を明らかにし始め、２４日目に、処理した細胞は図１４に示すように、誘導活動電位を受ける能力によって示される電気生理学的活性を示した。それに比べて、ＮＥＰトランスフェクトしたＭＥＦ細胞も２１日目に同様の電気生理学的活性を示した。セルは、活動電位に発火させるために必要な電位依存性の電流を提示した。脱分極電圧シミュレーションに応答して、過渡的な内向き電流と持続的な外向き電流の両方が観察された。２０ｐＡの電流注入に対する一般的な応答を図１４に示すが、これは、細胞が脱分極電流に応答して活動電位に発火したことを示す。
【００３３】
全細胞パッチクランプ記録を使用して、興奮性を測定した。１１５ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、３ｍＭのＣａＣｌ２、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、及び１０ｍＭのグルコース（ｐＨ７．４）を含む細胞浴溶液で細胞を連続的に灌流した。ガラス電極（３〜４ＭΩ）に、１１５ｍＭのグルコン酸Ｋ、１０ｍＭのＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、４ｍＭのＮａＣｌ、０．５ｍＭのエチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２（ｐＨ７．３）を含むピペット溶液を充填した。全細胞にアクセスした後、セルのパッチ抵抗は１００ＭＯｈｍを超え、直列抵抗は４０〜５０％補正された。データは、Ａｘｏｐａｔｃｈ  ２００Ｂ増幅器、Ｄｉｇｉｄａｔａ  １３２２Ａデジタイザー、及びＣｌａｍｐｅｘ  ９ソフトウェア（モレキュラーデバイス株式会社，サニーベール，カリフォルニア州）を使用して採取した。電位依存性電流の分析では、基底保持電位は−７０ｍＶで、細胞は−１２０ｍＶから８０ｍＶまで１０ｍＶ刻みで４００ミリ秒介入した。電位依存性ナトリウムチャネルの活動による過渡的な内向き電流は、測定したピーク振幅から分離した。電圧依存性カリウム電流を反映した持続的なプラトー電流は、電流のプラトー相における電圧ステップの最後の５０ミリ秒の平均として測定した。活動電位誘導は、電流クランプを使用して測定した。電流は０ｐＡに保持し、その後２０ｐＡ間隔で１秒間介入した。
【００３４】
実施例２：異なるトランスフェクション法を用いたＥＶのマイクロＲＮＡの含有量。
より広範な治療適用性を実証するために、我々は細胞内のマイクロＲＮＡ標的を転写するＤＮＡプラスミドでＭＥＦ細胞をトランスフェクトした。図１５は、諸手法で（ｍｉＲ−１２８プラスミドを）トランスフェクションした後、２４時間で細胞培養培地から採取したＥＶにおけるＥＶのｍｉＲ−１２８発現を示す。メーカーの説明書に従って全ＲＮＡを取得した。前述の手順を使用したｑＲＴ−ＰＣＲによるｍｉＲ−１２８検出には、同量の全ＲＮＡ（３０ｎｇ）を使用した。ここでも、ＮＥＦベースのトランスフェクションは、ＢＥＰ又はリポフェクタミンベースの細胞トランスフェクションでは達成できない、多量のｍｉＲ−１２８（４，５００倍以上の増加）を含むＥＶを生成することができた。
【００３５】
実施例３：ＭＥＦ細胞へのＤＮＡプラスミドのＮＥＰトランスフェクションによる内因性ＲＮＡを含むＥＶと、事前に採取されたＲＮＡをＢＥＰ後挿入により装填した既存のＥＶとの比較。
ここで我々は、ＮＥＰベースの細胞トランスフェクション及び、いくつかの研究者によって使用されたＢＥＰの後挿入アプローチを使用して、治療用のＥＶの生産効果を比較した。前者については、前述の手順に従って、ｍｉＲ−１２８プラスミドをＮＥＰによってＭＥＦ細胞にＣＤ６３−ＧＦＰプラスミドと共にコトランスフェクトして、ｍｉＲ−１２８を含むＥＶを生成した。後者については、ＮＥＰの２４時間後にＣＤ６３−ＧＦＰプラスミドをトランスフェクトしたＭＥＦ細胞からブランクＥＶを最初に回収した。並行して、ＮＥＰによるトランスフェクションの２４時間後にｍｉＲ−１２８プラスミドをトランスフェクトしたＭＥＦ細胞からｍｉＲ−１２８を採取した。採取したｍｉＲ−１２８（１μｇ）をブランクＥＶ（１０Ｅ６個）と混合し、他の研究者が用いた条件に従ってＢＥＰ（１２５０Ｖ、３０ミリ秒）でエレクトロポレーションした。２つのアプローチからのＥＶは、全反射照明蛍光（ＴＩＲＦ）顕微鏡で係留リポプレックスナノ粒子（ＴＬＮ）バイオチップを使用してテストした。図１６Ａは、ＴＬＮ−ＴＩＲＦアッセイの概略図を示す（２、１１）。簡潔に説明すると、ＲＮＡ標的のモレキュラービーコン（ＭＢ）が設計され、カチオン性リポソームナノ粒子にカプセル化される。これらのカチオン性リポプレックスナノ粒子は、スライドガラス上に係留され、電気的静的相互作用により負に帯電したＥＶを捕捉して、より大きなナノスケール複合体を形成することができる。このリポプレックスとＥＶの融合により、バイオチップのインターフェース近くのナノスケール制限内でＲＮＡとＭＢが混合される。ＴＩＲＦ顕微鏡は、単一の生体分子を検出することができ、係留されたリポソームナノ粒子が位置する界面付近で３００ｎｍ未満の信号を測定する。
【００３６】
図１６Ｂは、捕捉されたＥＶの代表的なＴＬＮ−ＴＩＲＦ画像を示す。緑色の蛍光はＣＤ６３−ＧＦＰを含むＥＶからのもので、赤色の蛍光は捕捉されたＥＶ内のｍｉＲ−１２８分子とＣｙ５−ｍｉＲ−１２８のＭＢの混成からのものである。ＮＥＰの手法は、ＢＥＰ後挿入の手法よりもｍｉＲ−１２８のハイコピーを含むＥＶをより多く生成できることは明らかである。図１６Ｃ〜Ｅは、これら２つの手法の定量的比較を示す。どちらの手法もｍｉＲ−１２８を含むＥＶを生成できるが（捕捉されたＥＶ全体の約８０％）、ＥＶ中のＥＶ  ｍｉＲ−１２８の濃度（約３倍のＭＢ蛍光強度）は、ＢＥＰベースのマイクロＲＮＡ後挿入よりもＮＥＰベースの直接的な細胞トランスフェクションの方がはるかに高くなる。さらに、ＢＥＰの後挿入は、ブランクＥＶのほぼ半分を破壊する傾向があり、治療用のＥＶの極めて低い収率に繋がる。
【００３７】
同様の比較を、ｍｉＲ−１２８と同じ手法を使用して、はるかに大きなＲＮＡである、Ｂｒｎ２のｍＲＮＡ（Ｂｒｎ２のｍＲＮＡが６２７２塩基に対してｍｉＲ−１２８が２１塩基）についても実施した。図１７Ａ〜Ｃは、ＮＥＰの手法がＢｒｎ２のｍＲＮＡを含む、７０％を超えるＥＶを生成することができたことを示しているが、一方でごくわずかな既存のＥＶのみがＢＥＰの後挿入の手法によって同じｍＲＮＡを装填することができた。ＮＥＰで生成されたＥＶ中のＢｒｎ２のｍＲＮＡの濃度は高く、一方でＢＥＰの後挿入で生成されたＥＶ中のＢｒｎ２のｍＲＮＡの濃度は非常に低い。
【００３８】
実施例４：ＤＮＡプラスミドのＭＥＦ細胞への逐次的なＮＥＰトランスフェクションによって分泌された同じＥＶ中に共局在する多種のｍＲＮＡの改良。
図１３は、プラスミドのサイズの違い又は他の理由により、多種のＤＮＡプラスミドが同時に細胞に送達されたとしても、異なるｍＲＮＡ標的が、トランスフェクトされた細胞において異なる時間及び速度で転写され得るものであったことを示す。これは、１つ又は少数のｍＲＮＡ標的のみを含む個々のＥＶをもたらす可能性がある。より良い治療効果を得るには、より多く又は全てのｍＲＮＡターゲットを同じ分泌ＥＶ内にカプセル化できると役立つであろう。転写時間に基づいてＮＥＰを用いて各ＤＮＡプラスミドをＭＥＦ細胞に逐次的に送達することにより、図１８は、ｉＮの再プログラミングに必要な、Ａｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、及びＭｙｔ１ｌの３つのｍＲＮＡ全てを含む分泌ＥＶを大幅に増加することができた（＞５０％対＜２５％）ことを示す。ＮＥＰトランスフェクションの場合、Ａｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、及びＭｙｔ１ｌプラスミドを前述のように同時にトランスフェクションした。逐次的なＮＥＰの場合、Ｍｙｔ１ｌプラスミドを最初にトランスフェクションし、Ｂｒｎ２プラスミドを４時間後にトランスフェクションし、Ａｓｃｌ１プラスミドをＢｒｎ２トランスフェクションの４時間後にトランスフェクションした。Ｍｙｔ１ｌのトランスフェクションの２４時間後、ＴＬＮアッセイのために培地を採取した。等量のＭＢであるＦＡＭ−Ａｓｃｌ１、Ｃｙ３−Ｂｒｎ２、及びＣｙ５−Ｍｙｔ１ｌが、ＥＶのｍＲＮＡ検出用の係留されたリポプレックスナノ粒子にカプセル化された。図では、黄色の矢印は３つ全てのｍＲＮＡを含むＥＶ、青い矢印は２つのｍＲＮＡを含むＥＶ、ピンクの矢印は１つのｍＲＮＡのみを含むＥＶを意味する。
【００３９】
本発明をその好ましい実施形態に関連して説明したが、本明細書を読めば、それの様々な改良が当業者にとって明らかであろうことを理解されたい。したがって、本明細書に開示された本発明は、添付の特許請求の範囲内にあるこのような改良を網羅することを意図していることを理解されたい。
【００４０】
図面の補足説明
図１：ドナー細胞トランスフェクション用の３Ｄナノチャネルエレクトロポレーション（ＮＥＰ）バイオチップの概略図。
図２：トランスフェクション後１時間の、ＹＯＹＯ−１で蛍光標識したＤＮＡプラスミド送達の効果における、ＢＥＰ及びＮＥＰの比較。Ａ．ＢＥＰ及びＮＥＰの代表的な細胞画像。Ｂ．これら２つの場合の蛍光強度の比較。
図３：ＤＮＡプラスミドを含む又は含まないＮＥＰ細胞トランスフェクションが、トランスフェクトされたマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）細胞からのＥＶ分泌を著しく刺激し、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏ）及びＢＥＰベースの細胞トランスフェクションよりもはるかに優れた性能を有する。Ｃｔｒｌは、トランスフェクトされていないＭＥＦ細胞を表す。ＮＥＰは、ＤＮＡプラスミドによるＮＥＰ細胞トランスフェクションを表す。ＮＥＰ−ＰＢＳは、ＰＢＳバッファー（緩衝液）のみによるＮＥＰ細胞トランスフェクションを表す。使用するＤＮＡプラスミドは、重量比２／１／１のＡｃｈａｅｔｅ−Ｓｃｕｔｅ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｌｉｋｅ−１（Ａｓｃｌ１）、Ｐｏｕ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｃｌａｓｓ  ３  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ２（Ｐｏｕ３ｆ２又はＢｒｎ２）及びＭｙｅｌｉｎ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  １  Ｌｉｋｅ（Ｍｙｔ１ｌ）である。これらのＤＮＡプラスミドの混合物は、ドナー細胞を誘導ニューロン（ｉＮ）に再プログラムすることが知られている。同数のＭＥＦ細胞を諸手法によりＤＮＡプラスミドでトランスフェクトし、トランスフェクション後２４時間で細胞培養培地を採取した。ＥＶ数はＮａｎｏＳｉｇｈｔ（登録商標）によって測定した。ＢＥＰの場合、トランスフェクション電圧は１２５０Ｖであった。ＮＥＰの場合、トランスフェクション電圧は５回の１０ミリ秒パルスで２２０Ｖであった。
【００４１】
図４：ＮＥＰでトランスフェクトしたＭＥＦ細胞からのＥＶ分泌における、ヒートショックプロテイン７０（ＨＳＰ７０）及びヒートショックプロテイン９０（ＨＳＰ９０）の阻害剤の効果。ＮＥＰトランスフェクション後、細胞培養物をＨＳＰ７０阻害剤（ＶＥＲ  １５５００８、５０μＭ）、ＨＳＰ９０阻害剤（ＮＶＰ−ＨＳＰ９０、１μＭ）、又はそれらの混合物を含む新鮮な培地に交換した。トランスフェクション後２４時間で培地を採取し、動的光散乱（ＤＬＳ）ゴニオメトリーによりＥＶの数を検出した。
図５：ＭＥＦ細胞からのＥＶ分泌における、ＣＤ６３のＤＮＡプラスミドのＮＥＰトランスフェクションの効果。ＮＥＰによってＣＤ６３プラスミドの有無にかかわらず細胞をトランスフェクトした。細胞培養培地を採取し、４時間毎に新鮮な培地と交換した。ＥＶの数はＤＬＳゴニオメトリーによって検出した。
図６：細胞トランスフェクションの２４時間後に採取されたＮＥＰ有り又は無しのＥＶの、ＤＬＳによって測定されたサイズ分布。細胞培養培地はＮＥＰトランスフェクション後２４時間で採取し、細胞破片は１５００ｇで１０分間の遠心分離によって除去した。上清中のＥＶはＤＬＳによって検出した。
図７：諸手法を用いてＡｓｃｌ１／Ｂｒｎ２／Ｍｙｔ１ｌのＤＮＡプラスミドを２／１／１の比率でトランスフェクトしたＭＥＦ細胞からの、ｑＲＴ−ＰＣＲによって測定した、トランスフェクション後２４時間のＥＶのＡｓｃｌ１のｍＲＮＡ発現。全ＲＮＡを得た後、メーカーの説明書に従って逆転写を行った。ｑＲＴ−ＰＣＲによるＡｓｃｌ１の検出には同量の全ＲＮＡ（２０ｎｇ）を用いた。
【００４２】
図８：諸手法を用いてＡｓｃｌ１／Ｂｒｎ２／Ｍｙｔ１ｌのＤＮＡプラスミドを２／１／１の比率でトランスフェクトしたＭＥＦ細胞からの、ｑＲＴ−ＰＣＲによって測定した、トランスフェクション後２４時間のＥＶのＢｒｎ２のｍＲＮＡ発現。全ＲＮＡを得た後、メーカーの説明書に従って逆転写を行った。ｑＲＴ−ＰＣＲによるＢｒｎ２の検出には同量の全ＲＮＡ（２０ｎｇ）を用いた。
図９：諸手法を用いてＡｓｃｌ１／Ｂｒｎ２／Ｍｙｔ１ｌのＤＮＡプラスミドを２／１／１の比率でトランスフェクトしたＭＥＦ細胞からの、ｑＲＴ−ＰＣＲによって測定した、トランスフェクション後２４時間のＥＶのＭｙｔ１ｌのｍＲＮＡ発現。全ＲＮＡを得た後、メーカーの説明書に従って逆転写を行った。ｑＲＴ−ＰＣＲによるＭｙｔ１ｌの検出には同量の全ＲＮＡ（２０ｎｇ）を用いた。
図１０：ＮＥＰによって得たＥＶのみが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳によって測定された機能的ｍＲＮＡを含んでいた。各トランスフェクション法からの同量の全ＲＮＡ（１μｇ）を、メーカーの説明書に従ってｉｎ  ｖｉｔｒｏタンパク質翻訳に用いた。サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、タンパク質を抗体で検出した。
図１１：ＮＥＰからのＥＶ−ｍＲＮＡが、マイクロベシクル内ではなくエクソソーム内に存在する。ＥＶは、１５００ｇで１０分間の単純な遠心分離により、細胞培養培地から採取した。マイクロベシクルは、１０，０００ｇで３０分間の超遠心分離により採取した。上清をさらに１００，０００ｇで２時間遠心分離して、エクソソームを採取した。これら２つの部分から全ＲＮＡを採取し、全ｍＲＮＡ濃度はＮａｎｏｄｒｏｐ（登録商標）で測定した。ＥＶのｍＲＮＡ発現はｑＲＴ−ＰＣＲで測定した。
図１２：ＮＥＰ細胞トランスフェクションからの、マイクロベシクル−ＲＮＡではなくエクソソーム−ｍＲＮＡがタンパク質を翻訳し得る。ＥＶは、１５００ｇで１０分間の単純な遠心分離により、細胞培養培地から採取した。マイクロベシクルは、１０，０００ｇで３０分間の超遠心分離により採取した。上清をさらに１００，０００ｇで２時間遠心分離して、エクソソームを採取した。上述したこれら２つの部分から全ＲＮＡを採取し、１μｇの全ＲＮＡをｉｎ  ｖｉｔｒｏタンパク質翻訳に用いた。サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、タンパク質、エクソソーム及びマイクロベシクルのマーカーをウェスタンブロッティングで検出した。
図１３：ＮＥＰでトランスフェクトしたＭＥＦ細胞からのＥＶ−ｍＲＮＡの分泌プロファイル。ＮＥＰによりＭＥＦ細胞をＤＮＡプラスミドでトランスフェクトした。指示された時点で細胞培養培地中のＥＶを採取し、培養培地を新鮮な培地と交換した。ＥＶの数はＤＬＳゴニオメトリーによって検出した。ｍＲＮＡ発現はｑＲＴ−ＰＣＲで測定した。
【００４３】
図１４：パッチクランプによる活動電位検出が、Ａｓｃｌ１／Ｂｒｎ２／Ｍｙｔ１ｌのｍＲＮＡを含むＮＥＰから得たＥＶを１日おきにトランスフェクトしたＭＥＦ細胞は、２４日後に機能的な誘導ニューロン（ｉＮ）にリプログラミングされ得ることを示す。ＮＥＰトランスフェクトしたＭＥＦ細胞は２１日後にｉＮにリプログラミングされた。
図１５：諸手法を用いて、ｍｉＲ−１２８のＤＮＡプラスミドをトランスフェクトしたＭＥＦ細胞から、ｑＲＴ−ＰＣＲによって測定した、トランスフェクション後２４時間のＥＶとしてのｍｉＲ−１２８発現。諸手法で（ｍｉＲ−１２８プラスミドを）トランスフェクションした後、２４時間で細胞培養培地からＥＶを採取した。メーカーの説明書に従って全ＲＮＡを得た。ｑＲＴ−ＰＣＲによるｍｉＲ−１２８検出には、同量の全ＲＮＡ（３０ｎｇ）を使用した。
図１６：ＭＥＦ細胞へのＤＮＡプラスミドのＮＥＰトランスフェクションによるｍｉＲ−１２８を含む分泌されたＥＶと、事前採取したｍｉＲ−１２８をＢＥＰ後挿入によって装填した既存のＥＶとの比較。
図１７：ＭＥＦ細胞へのＤＮＡプラスミドのＮＥＰトランスフェクションによるＢｒｎ２のｍＲＮＡを含む分泌されたＥＶと、事前採取したＢｒｎ２のｍＲＮＡをＢＥＰ後挿入によって装填した既存のＥＶとの比較。
図１８：逐次的なＮＥＰによる同じＥＶ内でのｍＲＮＡの共局在の増加。ＮＥＰトランスフェクションの場合、Ａｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、及びＭｙｔ１ｌプラスミドを前述のように同時にトランスフェクトした。逐次的なＮＥＰでは、Ｍｙｔ１ｌプラスミドを最初にトランスフェクトし、Ｂｒｎ２プラスミドを４時間後にトランスフェクトし、Ａｓｃｌ１プラスミドをＢｒｎ２のトランスフェクションの４時間後にトランスフェクトした。Ｍｙｔ１ｌトランスフェクションの２４時間後、ＴＬＮアッセイのために培地を採取した。等量のＦＡＭ−Ａｓｃｌ１、Ｃｙ３−Ｂｒｎ２、及びＣｙ５−Ｍｙｔ１ｌそれぞれのＭＢを、ＥＶ−ｍＲＮＡ検出用の係留されたリポプレックスナノ粒子内にカプセルした。黄色の矢印：３つのｍＲＮＡを含むＥＶ。青い矢印：２つのｍＲＮＡを含むＥＶ。ピンクの矢印：１つのｍＲＮＡを含むＥＶ。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１６Ｅ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８】
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【国際調査報告】
2020529210.tif 000028
2020529210.tif 000029