(57)【要約】  本発明は、生殖補助技術の分野、特に精子保存培地に関し、保存培地のための補助物質としてｍＴＯＲエンハンサー、特にｍＴＯＲ活性剤であるＭＨＹ１４８５を記載し、前記補充された培地は、受精能力（受精能獲得）及びＤＮＡの完全性を変えずに、代謝率を維持しながら、短期間の室温での保存中に精子の運動性及び生存率を向上させる。
2020529204.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｍＴＯＲの活性剤を含むことを特徴とする精子の品質及び機能増強組成物。
【請求項２】
前記ｍＴＯＲ活性剤が、ＭＨＹ１４８５であることを特徴とする、請求項１に記載の精子の品質及び機能増強組成物。
【請求項３】
ｍＴＯＲの活性剤を含むことを特徴とする精子保存培地用の精子の品質及び機能増強補助物質。
【請求項４】
前記ｍＴＯＲ活性剤が、ＭＨＹ１４８５であることを特徴とする、請求項３に記載の精子の品質及び機能増強補助物質。
【請求項５】
前記補助物質が、室温又は体温での保存に適することを特徴とする、請求項３又は４の何れか１項に記載の精子の品質及び機能増強補助物質。
【請求項６】
前記補助物質が、短期間の保存に適していることを特徴とする、請求項３〜５に記載の精子の品質及び機能増強補助物質。
【請求項７】
ｍＴＯＲの活性剤を含むことを特徴とする、精子の品質及び機能増強保存培地。
【請求項８】
前記ｍＴＯＲ活性剤が、ＭＨＹ１４８５であることを特徴とする、請求項７に記載の精子の品質及び機能増強保存培地。
【請求項９】
前記ＭＨＹ１４８５の量が、２μｇ／ｍＬであることを特徴とする、請求項８に記載の精子の品質及び機能増強保存培地。
【請求項１０】
前記保存培地が、室温又は体温での保存に適することを特徴とする、請求項７〜９の何れか１項に記載の精子の品質及び機能増強保存培地。
【請求項１１】
前記保存培地が、短期間の保存に適する、請求項７〜１０の何れか１項に記載の精子の品質及び機能増強保存培地。
【請求項１２】
ｍＴＯＲ活性剤が補充された保存培地において前記精子を堆積させることを特徴とする、保存中に精子の品質及び機能を増強させる方法。
【請求項１３】
前記ｍＴＯＲ活性が、ＭＨＹ１４８５であることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記保存培地における前記ＭＨＹ１４８５の量が、２μｇ／ｍＬであることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記精子が、室温又は体温で保存されることを特徴とする、請求項１２〜１４に記載の方法。
【請求項１６】
ｍＴＯＲ活性剤を補充された保存培地において精子を保存し、さらに生殖補助技術において前記保存された精子を使用することを含む精子細胞による受精の可能性を高める方法。
【請求項１７】
前記保存培地に、ＭＨＹ１４８５が補充されることを特徴とする、請求項１６に記載の受精の可能性を高める方法。
【請求項１８】
前記培地に加えられるＭＨＹ１４８５の量が、２μｇ／ｍＬであることを特徴とする、請求項１７に記載の受精の可能性を高める方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生殖補助技術の分野、特に精子の品質及び機能を高めるための精子保存培地に関する。
【背景技術】
【０００２】
先行技術
過去数十年において、生殖補助医療（ＡＲＴ）を求める人の数は増加している（Elder and Dale 2010）。男性の不妊症は、不妊症全体の症例の最大３０％を占めており、治療の選択枝は、主に精子の品質の改善技術に基づいているため（ＷＨＯ２０１０）、精子の品質は、体外受精（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ）（ＩＶＦ）検査室において非常に重要な要素である。男性の生殖生物学に関して、ＡＲＴ成功の重要な要因であるため、保存された精子の生存率を延ばすために多大な努力が費やされている（Jackson, Bormann et al . 2010）。精子の凍結保存及び冷蔵は非常に多く議論されており、短期間の室温／体温（ＲＴ）での精子の維持は、冷蔵環境での保存後の精子の生存率の急激な低下を避けるために効果的な代替案となり得ることが提案されている（Sato and Ishikawa 2004）。ＲＴでの精子の生存を維持することを目的とした、いくつかの保存培地が市販されている。しかしながら、ほとんどの場合、これらの培地に保存した後の精子の生存率は、理想からはほど遠い。精子細胞は外因性基質の供給に大きく依存しており、代謝率が高いためＲＯＳの量が増加するため、精子の保存に最適な組成の確立が、非常に重量である（Sato and Ishikawa 2004）。精子の生存率、形態代謝を向上させるために物質を使用する可能性は、男性の生殖治療における主要な工程になるだろう。
【０００３】
ラパマイシンの哺乳類上の標的（ｍＴＯＲ）は、いくつかの重要な細胞内の事象を制御する高度に保存された多機能セリン／スレオニンプロテインキナーゼである。しかしながら、ｍＴＯＲは、男性の生殖系全体でシグナルを統合及び媒介することが示唆されているが、精子形成におけるその証拠はない（Oliveira, Cheng et al. 2017）。体細胞の精巣細胞にて得られた発明者達の最初の結果は、ｍＴＯＲがヒトセルトリ細胞のグルコースの消費及びレドックスバランスを調節することを示した。従って、ｍＴＯＲは、精子形成の栄養的な補助において中心的や役割を果たすように考えられる（Jesus, Oliveira et al. 2016）
【０００４】
また、Ａｐａｒｉｃｉｏ達（Aparicio et al . (2016)）は、オートファジーに関連するタンパク質及び上流の制御因子がヒト精子に存在し、機能していることを示した。オートファジーの活性化／阻害（高濃度ｍＴＯＲ阻害剤であるラパマイシンの使用）後のミトコンドリアタンパク質発現の修飾は、運動性及び生存率等の精子機能を制御するマイトファジーと呼ばれるオートファジーの特殊な形態がアポトーシスと協力していることを示している可能性がある。しかしながら、代謝率を維持し、受精能力（受精能獲得）及びＤＮＡの完全性を変えずに、短期間の室温保存中に精子の運動性及び生存率を高めるために、市販の保存培地に低濃度のｍＴＯＲ活性剤ＭＨＹ１４８５を補充できるという事実は、これまで開示されていない。
【０００５】
従って、保存後の精子の品質を向上させるために利用可能な精子保存培地を改善することは、生殖補助医療を使用した不妊治療において長年必要とされてきた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】I. M. Aparicio, J. Espino, I. Bejarano, A. Gallardo-Soler, M. L. Campo and G. M. Salido (2016) . "Autophagy-related proteins are functionally active in human spermatozoa and may be involved in the regulation of cell survival and motility." Scientific Reports 6: 33647.
【非特許文献２】J. A. Pariente2, F. J. Peha4 & J. A. Tapial Elder, K. and B. Dale (2010) . In-vitro fertilization, Cambridge University Press.
【非特許文献３】Jackson, R. E., C. L. Bormann, P. A. Hassun, A. M. Rocha, E. L. Motta, P. C. Serafini and G. D. Smith (2010). "Effects of semen storage and separation techniques on sperm DNA fragmentation." Fertility and sterility 94(7) : 2626-2630.
【非特許文献４】Jesus, T. T., P. F. Oliveira, J. Silva, A. Barros, R. Ferreira, M. Sousa, C. Y. Cheng, B. M. Silva and M. G. Alves (2016) . "Mammalian target of rapamycin controls glucose consumption and redox balance in human Sertoli cells." Fertil. Steril. 105(3) : 825-833. e823.
【非特許文献５】Oliveira, P. F . , C. Cheng and M. G. Alves (2017) . "Emerging Role for Mammalian Target of Rapamycin in Male Fertility." Trends in Endocrinology & Metabolism: DOI : 10.1016/ . tern.2016.1012.1004.
【非特許文献６】Sato, M. and A. Ishikawa (2004) . "Room temperature storage of mouse epididymal spermatozoa: exploration of factors affecting sperm survival." Theriogenology 61(7-8) : 1455- 1469.
【非特許文献７】WHO (2010) . "WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen."
【発明の概要】
【０００７】
解決された技術的課題
以下に詳述するように、本発明は、生殖補助技術のための精子を保存する問題を対象としており、精子の品質及び機能を向上させる代替解決策を提案する。
【０００８】
本発明は、ｍＴＯＲ活性剤ＭＨＹ１４８５を保存培地の補助物質（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）として記載し、当該補充された培地は、代謝率を維持しながら、受精能力（受精能獲得）及びＤＮＡの完全性を変えずに、短期間の室温での保存中に精子の運動性及び生存率を向上させる。
【０００９】
従って、ｍＴＯＲ活性剤を使用すると、特定の精子の品質パラメーターが向上すると同時に、短期間のＲＴ保存中にその完全な状態及び品質が維持される。この発見は、室温／体温での精子の保存に大きな影響を与えるだけでなく、精子の生理機能の調節が極めて重要な他への応用にも大きな影響を与えるため、非常に重要である。本発明は、利用可能な精子保存培地を改善し、生殖補助技術を使用した不妊症の治療、及び室温／体温での保存後の精子の品質を向上させるために非常に重要である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
発明の詳細な説明
本発明は、ｍＴＯＲの活性剤を含むことを特徴とする精子品質及び機能増強組成物に関する。
【００１１】
好ましい実施形態において、ｍＴＯＲ活性剤は、ＭＨＹ１４８５である。
【００１２】
本発明はまた、ｍＴＯＲの活性剤を含むことを特徴とする精子保存培地用の精子の品質及び機能を強化する補助物質に関する。
【００１３】
好ましい実施形態において、ｍＴＯＲ活性剤は、ＭＨＹ１４８５である。
【００１４】
より好ましい実施形態において、補助物質は、室温又は体温での保存に適する。
【００１５】
他のより好ましい実施形態において、補助物質は、短期間の保存に適する。
【００１６】
本発明はまた、ｍＴＯＲの活性剤を含むことを特徴とする精子の品質及び機能を増強する保存培地に関する。
【００１７】
好ましい実施形態において、ｍＴＯＲ活性剤は、ＭＨＹ１４８５である。より好ましい実施形態において、保存培地中のＭＨＹ１４８５の量は、２μｇ／ｍＬである。
【００１８】
さらにより好ましい実施形態において、保存培地は、室温又は体温での保存に適する。他の好ましい実施形態において、保存培地は、短期間の保存に適する。
【００１９】
本発明はまた、ｍＴＯＲ活性剤が補充された保存培地における精子を堆積させることを特徴とする保存中の精子の品質及び機能を増強する方法に関する。
【００２０】
好ましい実施形態において、ｍＴＯＲ活性剤は、ＭＨＹ１４８５である。より好ましい実施形態において、保存培地に加えられるＭＨＹ１４８５の量は、２μｇ／ｍＬである。
【００２１】
より好ましい実施形態において、精子は、室温又は体温で保存される。
【００２２】
本発明はまた、ｍＴＯＲ活性剤が補充された保存培地に精子を保存し、さらに生殖補助技術で保存された精子を使用することを含む、精子細胞による受精の可能性を高める方法に関する。
【００２３】
好ましい実施形態において、保存培地にＭＨＹ１４８５が補充される。より好ましい実施形態において、培地に加えられるＭＨＹ１４８５の量は、２μｇ／ｍＬである。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】３７℃で１２０分間保存したヒトの精子の生存率。精子は、ｍＴＯＲ活性剤（ＭＨＹ１４８５）を補充しない、又は補充した精子調製培地（ORIGO, Malov, Denmark）に保存された。精子は、ネガティブコントロールとしてｍＴＯＲ阻害剤（ラパマイシン； Ｒａｐ）と共にインキュベートされた。生存率は、エオシン−ニグロシン染色法によって評価された。結果は、平均の標準誤差±の平均（ｎ＝１２）として表され； コントロールに対して有意な結果（ｐ＜０．０５）は、*として表される。
【図２】３７℃で１２０分間保存したヒトの精子の運動性。精子は、ｍＴＯＲ活性剤（ＭＨＹ１４８５）を補充しない、又は補充した精子調製培地（ORIGO, Malov, Denmark）に保存された。精子は、ネガティブコントロールとしてｍＴＯＲ阻害剤（ラパマイシン； Ｒａｐ）と共にインキュベートされた。結果は、エオシン−ニグロシン染色法によって評価された。結果は、平均の標準誤差±の平均（ｎ＝１２）として表され； コントロールに対して有意な結果（ｐ＜０．０５）は、*として表される。
【図３】３７℃で１２０分間保存したヒトの精子の代謝。精子は、ｍＴＯＲ活性剤（ＭＨＹ１４８５）を補充しない、又は補充した精子調製培地（ORIGO, Malov, Denmark）に保存された。精子は、ネガティブコントロールとしてｍＴＯＲ阻害剤（ラパマイシン； Ｒａｐ）と共にインキュベートされた。精子のグルコース消費及び乳酸の産生が、１Ｈ核磁気共鳴により評価された。結果は、平均の標準誤差±の平均（ｎ＝１２）として表され； コントロールに対して有意な結果（ｐ＜０．０５）は、*として表される。
【図４】３７℃で１２０分間保存したヒトの精子の受精能獲得。精子は、ｍＴＯＲ活性剤（ＭＨＹ１４８５）を補充しない、又は補充した精子調製培地（ORIGO, Malov, Denmark）に保存された。精子は、ネガティブコントロールとしてｍＴＯＲ阻害剤（ラパマイシン； Ｒａｐ）と共にインキュベートされた。精子受精能獲得は、精子受精能獲得培地（LifeGlobal Europe, Brussels, Belgium）で１８０分間インキュベートした後、精子のホスホチロシナーゼレベルを調べることにより評価された。結果は、平均の標準誤差±の平均（ｎ＝１２）として表され； コントロールに対して有意な結果（ｐ＜０．０５）は、*として表される。
【図５】３７℃で１２０分間保存した後のヒトＤＮＡの断片化。精子は、ｍＴＯＲ活性剤（ＭＨＹ１４８５）を補充しない、又は補充した精子調製培地（ORIGO, Malov, Denmark）に保存された。精子は、ネガティブコントロールとしてｍＴＯＲ阻害剤（ラパマイシン； Ｒａｐ）と共にインキュベートされた。Ｈａｌｏｓｐｅｒｍ Ｇ２キット（HALOTECH, Madrid, Spain）を使用してＤＮＡ断片が評価された。結果は、平均の標準誤差±の平均（ｎ＝１２）として表され； コントロールに対して有意な結果（ｐ＜０．０５）は、*として表される。
【図６】３７℃で１２０分間保存した後のタンパク質（カルボニル化）及び脂質（過酸化）に対するヒト精子の酸化ダメージ。精子は、ｍＴＯＲ活性剤（ＭＨＹ１４８５）を補充しない、又は補充した精子調製培地（ORIGO, Malov, Denmark）に保存された。精子は、ネガティブコントロールとしてｍＴＯＲ阻害剤（ラパマイシン； Ｒａｐ）と共にインキュベートされた。タンパク質のカルボニル化は、特定の＠ＤＮＰ抗体（SigmaAldrich, St. Louis, MO, US）の免疫ブロットにより評価された。脂質の過酸化は、特定の＠ＨＮＥ抗体（Merck Millipore, Temecula, USA）の免疫ブロットにより評価された。結果は、平均の標準誤差±の平均（ｎ＝１２）として表され； コントロールに対して有意な結果（ｐ＜０．０５）は、*として表される。
【実施例】
【００２５】
発明者達は、３７℃での精子保存中の添加剤としてｍＴＯＲ活性剤（ＭＨＹ１４８５）の使用を評価した。発明者達は、市販の精子保存培地（Sperm Preparation Medium（登録商標）; Origio, Malov, Denmark）にｍＴＯＲ活性剤（２μｇ／ｍＬの濃度）を加え、精子懸濁液（ｍＬ当たり２００万個の精子）をマイクロチューブ（５％ＣＯ２インキュベーター、３７℃）に最大１２０分間保存し、定期的な間隔（０、３０及び１２０分）でこれらの細胞に対する品質の重要なパラメーター及び酸化ダメージの程度を評価した。認定された胚発生学者の監督の下、世界保健機関のガイドラインに記載されている標準的な方法を使用して、重要な精子品質パラメーター、すなわち、精子の生存率及び運動性を評価した。また、精子のＤＮＡ（ＤＮＡ断片化）、タンパク質（タンパク質のカルボニル化）及び脂質（脂質過酸化）の参加的ダメージが評価された。Ｈａｌｏｓｐｅｒｍ（登録商標）キット（Halotech DNA SL, Madrid, Spain）を使用して精子の断片化が評価された。精子タンパク質のカルボニル化及び脂質過酸化は、２，４−ジニトロフェノール基及び抗−４−ヒドロキシノネナール基に対して特異的な抗体（ABCAM（登録商標）, Cambridge, USA）を使用して評価された（それぞれ）。精子の代謝変化は、ｚ勾配を備えた３ｍｍ関節検出プローブを備えたＶａｒｉａｎ ６００ ＭＨｚ分光計（Varian, Palo Alto, USA）を使用して、プロトン磁気共鳴法（１Ｈ−ＮＭＲ）によっても評価された。保存の最後に、市販の培地（Lifeglobal（登録商標）, Guilford, USA）にて細胞をインキュベートし、特異的抗体（ABCAM（登録商標）, Cambridge, USA）を使用して３−ニトロチロシンレベルを評価することにより、精子の受精能獲得が評価された。ｍＴＯＲ阻害剤（０．１μｇ／ｍＬの濃度のパラマイシン）が、ネガティブコントロールとして使用された。
【００２６】
３７℃での精子の保存は、３０分後直ぐに生存率の低下を引き起こした。ｍＴＯＲ活性剤の市販の保存培地への補充は、生存可能な精子の割合を、ゼロ時間と同じレベルに維持した（図１）。
【００２７】
加えて、保存中の精子の運動性は、次第に低下し、ｍＴＯＲ活性剤は精子の運動性を維持し（図２）、受精能を維持することができる。ヘキソースの消費及び乳酸の産生等、精子の代謝の基本的な側面を評価すると、３０分間の保存後に違いは観察されなかった（図３）。
【００２８】
ｍＴＯＲ活性剤は、精子の生存率及び受精能を維持する能力を有し（図４）、より高い運動性を維持するため、これらの結果は、１２０分間の精子保存を考慮する際に、より期待できる結果であった。１２０分間ｍＴＯＲ活性剤の存在下で保存されたこれらの精子において、グルコース消費は維持されたが、乳酸産生は、増加した。
【００２９】
注目に値するのは、精子の酸化ダメージが増加せず、治療後もＤＮＡは、完全に無傷のままであるということである（図５）。精子タンパク質の酸化ダメージ（タンパク質のカルボニル化）及び脂質の酸化ダメージ（脂質の過酸化）も、ｍＴＯＲ活性剤の存在下で１２０分間保存されたサンプルでは増加しなかった（図６）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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