(57)【要約】本明細書では、エフェクタータンパク質、および対応する標的分子に結合するように設計された１種以上のガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ系；ＲＮＡ系マスキング構築物；および任意で試料中の標的ＲＮＡ分子を増幅する核酸増幅試薬を含む核酸検出システムが提供される。他の側面では、実施形態は、エフェクタータンパク質、およびトリガーＲＮＡに結合するように設計された１種以上のガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ系；ＲＮＡ系マスキング構築物；およびマスクされたＲＮＡポリメラーゼプロモーター結合部位またはマスクされたプライマー結合部位を含む１種以上の検出アプタマーを含むポリペプチド検出システムを提供する。態様によっては、前記システムを用いて試料中のウイルスを検出してもよい。
2020513815.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エフェクタータンパク質、および対応する標的分子に結合するように設計された１種以上のガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ系；および
ＲＮＡ系マスキング構築物を含み、
前記標的分子は１種以上のウイルス標的分子を含む、核酸検出システム。
【請求項２】
エフェクタータンパク質、およびトリガーＲＮＡに結合するように設計された１種以上のガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ系；
ＲＮＡ系マスキング構築物；および
マスクされたＲＮＡポリメラーゼプロモーター結合部位またはマスクされたプライマー結合部位を含む１種以上の検出アプタマーを含む、ポリペプチド検出システム。
【請求項３】
試料中のウイルスを検出する方法であって、
請求項１または２のＣＲＩＳＰＲ系を含む１つ以上の個別の容積に１つの試料または１組の試料を分配すること；
前記１種以上のガイドＲＮＡが前記１種以上の標的分子に結合することができる十分な条件で前記試料または前記１組の試料をインキュベートすること；
前記１種以上のガイドＲＮＡの前記１種以上の標的分子への結合により前記ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を活性化させること（ここで、前記ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を活性化させると、検出可能な陽性信号が生成されるように前記ＲＮＡ系マスキング構築物が修飾される）；および
前記検出可能な陽性信号を検出すること（ここで、前記検出可能な陽性信号の検出は前記試料中に１種以上のウイルスが存在することを示す）を含む、方法。
【請求項４】
前記試料は２種類以上のウイルスを含み、前記方法は前記２種類以上のウイルスを区別する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ガイドＲＮＡは前記１種以上のウイルスの一塩基多様体を検出する、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
前記ガイドＲＮＡは１つ以上の合成による不一致をさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記１つ以上のＣＲＩＳＰＲ系のガイドＲＮＡは、それぞれ１組のウイルス中のウイルスおよび／またはウイルス株を検出する汎用ウイルスガイドＲＮＡの組を含む、請求項３〜５の何れか一項に記載に記載の方法。
【請求項８】
前記ガイドＲＮＡは集合被覆法を用いて生成される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ウイルスを検出する方法であって、
請求項１または２の何れか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ系を試料に曝すこと；
前記１種以上のガイドＲＮＡを前記１種以上の微生物に特異的な標的ＲＮＡまたは１種以上のトリガーＲＮＡに結合させることで検出可能な陽性信号が生成されるようにＲＮＡエフェクタータンパク質を活性化すること；および
前記検出可能な陽性信号を検出すること（ここで、前記検出可能な陽性信号の検出は前記試料中に１種以上のウイルスが存在することを示す）を含む、方法。
【請求項１０】
前記ＣＲＩＳＰＲ系は基質の表面にあり、前記基質は前記試料に曝されている、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
同じまたは異なるＣＲＩＳＰＲ系が前記基質の複数の個別の位置に塗布される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
同じまたは異なるＣＲＩＳＰＲ系が前記基質の複数の個別の位置に塗布される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記基質は柔軟性材料の基質である、請求項１０〜１２の何れかに記載の方法。
【請求項１４】
前記柔軟性材料の基質は、紙の基質、布の基質、または柔軟性重合体の基質である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記異なるＣＲＩＳＰＲ系はそれぞれの位置で異なる微生物を検出する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記基質は、採取する流体に前記基質を一時的に浸す、試験する流体を前記基質に塗布する、あるいは試験する表面を前記基質と接触させることにより受動的に前記試料に曝される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記試料は生体試料または環境試料である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記環境試料は、食品試料、飲料試料、紙の表面、布の表面、金属の表面、木材の表面、プラスチックの表面、土壌試料、淡水試料、排水試料、生理食塩水試料、大気または他の気体試料に曝したもの、またはそれらの組合せから得られる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記生体試料は、組織試料、唾液、血液、血漿、血清、糞便、尿、唾液、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、腹水、胸水、血清腫、膿、あるいは皮膚または粘膜表面の拭い液から得られる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記環境試料または生体試料は生の試料であり、かつ／または前記１つ以上の標的分子は前記方法を適用する前に前記試料から精製または増幅されていない、請求項１７〜１９の何れか一項に記載に記載の方法。
【請求項２１】
ウイルス性疾患の大流行および／または進行を監視する方法であって、
請求項１または２のＣＲＩＳＰＲ系を試料に曝すこと；
検出可能な陽性信号が生成されるように非同義ウイルス変異を含む前記１つ以上の標的配列に前記１種以上のガイドＲＮＡを結合させることによりＲＮＡエフェクタータンパク質を活性化させること；および
前記検出可能な陽性信号を検出すること（ここで、前記検出可能な陽性信号の検出は、前記試料中に存在するウイルス株の種類を示す）を含む、方法。
【請求項２２】
前記ＣＲＩＳＰＲ系を曝すことは、１種以上のＣＲＩＳＰＲ系を１つ以上の個別の容積内に配置すること、および試料または試料の一部を前記１つ以上の個別の容積に加えることを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ウイルス抗原および／またはウイルスに特異的な抗体について試料を選別する方法であって、
請求項２のＣＲＩＳＰＲ系を試料に曝すこと（ここで、前記１種以上のアプタマーは１種以上のウイルス抗原または１種以上のウイルスに特異的な抗体に結合し、前記アプタマーは、前記１種以上のアプタマーが結合する前記１種以上のウイルス抗原または１種以上のウイルスに特異的な抗体を同定するバーコードをコードし、前記ガイドＲＮＡは前記バーコードを検出するように設計されている）；
前記１種以上のガイドＲＮＡを前記１種以上の微生物に特異的な標的ＲＮＡまたは１種以上のトリガーＲＮＡに結合させることで検出可能な陽性信号が生成されるように前記ＲＮＡエフェクタータンパク質を活性化すること；および
前記検出可能な陽性信号を検出すること（ここで、前記検出可能な陽性信号の検出は、前記試料中に１種以上のウイルス抗原または１種以上のウイルスに特異的な抗体が存在することを示す）を含む、方法。
【請求項２４】
前記ウイルスはＤＮＡウイルスである、請求項３〜２３の何れか一項に記載に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＤＮＡウイルスは、マイオウイルス科、ポドウイルス科、サイフォウイルス科、アロヘルペスウイルス科、ヘルペスウイルス科（ヒトヘルペスウイルス、および水痘帯状疱疹ウイルスを含む）、マロコヘルペスウイルス科、リポスリクスウイルス科，ルディウイルス科、アデノウイルス科、アンプラウイルス科、アスコウイルス科、アスファウイルス科（アフリカ豚コレラウイルスを含む）、バキュロウイルス科、シカウダウイルス科（Cicaudaviridae）、クラバウイルス科（Clavaviridae）、コルチコウイルス科（Corticoviridae）、フセロウイルス科、グロブロウイルス科、グッタウイルス科、ヒトロサウイルス科、イリドウイルス科、マセイレウイルス科（Maseilleviridae）、ミミウイルス科、ヌディウイルス科、ニマウイルス科、パンドラウイルス科、パピローマウイルス科、フィコドナウイルス科、プラズマウイルス科、ポリドナウイルス科、ポリオーマウイルス科（シミアンウイルス４０、ＪＣウイルス、ＢＫウイルスを含む）、ポックスウイルス科（牛痘および天然痘を含む）、スファエロリポウイルス科（Sphaerolipoviridae）、テクティウイルス科、ツリウイルス科（Turriviridae）、ディノドナウイルス（Dinodnavirus）、サルテロプロウイルス（Salterprovirus）、リジドウイルス（Rhizidovirus）、またはこれらの組合せである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ウイルス感染は二本鎖ＲＮＡウイルス、プラス鎖ＲＮＡウイルス、マイナス鎖ＲＮＡウイルス、レトロウイルス、またはこれらの組合せによって生じる、請求項３〜２３の何れか一項に記載に記載の方法。
【請求項２７】
前記ウイルスはコロナウイルス科ウイルス、ピコルナウイルス科ウイルス、カリシウイルス科ウイルス、フラビウイルス科ウイルス、トガウイルス科ウイルス、ボルナウイルス科、フィロウイルス科、パラミクソウイルス科、ニューモウイルス亜科、ラブドウイルス科、アレナウイルス科、ブニヤウイルス科、オルトミクソウイルス科、またはデルタウイルスである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ウイルスはコロナウイルス、ＳＡＲＳ、ポリオウイルス、ライノウイルス、Ａ型肝炎、ノーウォークウイルス、黄熱ウイルス、西ナイルウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、デング熱ウイルス、ジカウイルス、風疹ウイルス、ロスリバーウイルス、シンドビスウイルス、チクングニアウイルス、ボルナ病ウイルス、エボラウイルス、マールブルウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ニパウイルス、ヘンドラウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ヒト呼吸器多核体ウイルス、狂犬病ウイルス、ラッサウイルス、ハンタウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、インフルエンザ、またはＤ型肝炎ウイルスである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
試料中の１種以上の微生物を検出する方法であって、
試料を請求項１または２の何れかによる核酸検出システムに接触させること；および
前記接触させた試料を側流免疫クロマトグラフアッセイにかけることを含む、方法。
【請求項３０】
前記核酸検出システムは、第一の分子および第二の分子を含むＲＮＡ系マスキング構築物を含み、前記側流免疫クロマトグラフアッセイは、好ましくは横型フローストリップ表面の個別の検出部位で前記第一の分子および第二の分子を検出することを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記第一の分子および前記第二の分子は、前記第一または第二の分子を認識する抗体に結合し、かつ前記結合した分子を好ましくはサンドイッチ抗体により検出することで検出される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記横型フローストリップは、前記第一の分子に向けられた上流の第一の抗体、および前記第二の分子に向けられた下流の第二の抗体を含み、前記標的核酸が前記試料中に存在しない場合は未切断のＲＮＡ系マスキング構築物が前記第一の抗体と結合し、前記標的核酸が前記試料中に存在する場合は切断されたＲＮＡ系マスキング構築物が前記第一の抗体と前記第二の抗体の両方に結合する、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３３】
ウイルスを検出する方法であって、
試料を対象者から得ること（ここで、前記試料は尿、血清、血液、または唾液である）；
前記試料ＲＮＡを増幅すること；
前記試料を、エフェクタータンパク質、対応するウイルスに特異的な標的分子に結合するように設計された１種以上のガイドＲＮＡ、およびＲＮＡ系マスキング構築物と混合すること；
前記１種以上のガイドＲＮＡを前記１種以上のウイルスに特異的な標的分子に結合させることで前記ＲＮＡエフェクタータンパク質を活性化すること（ここで、前記ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を活性化させると、検出可能な陽性信号が生成されるように前記ＲＮＡ系マスキング構築物が修飾される）；および
前記信号を検出すること（ここで、前記信号の検出は前記ウイルスが存在することを示す）ことを含み、
前記方法は、前記試料からＲＮＡを抽出する工程を含まない、方法。
【請求項３４】
前記増幅工程は２時間、１時間、３０分間、２０分間、および１０分間からなる群より選択される継続時間である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記検出工程は３時間、２時間、１時間、３０分間、２０分間、および１０分間からなる群より選択される継続時間である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
検出に必要な試料の容積は１００μｌ〜１μｌである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記ウイルスはジカウイルスである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
前記試料は２種類以上のウイルスを含み、前記２種類以上のウイルスを区別する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＲＮＡ系マスキング構築物は、検出可能なリガンドおよびマスキング成分が付加されるＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項４０】
前記方法は、前記試料ＲＮＡを増幅する前にヌクレアーゼ不活性工程およびウイルス不活性工程をさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項４１】
前記ヌクレアーゼ不活性工程は３７℃〜５０℃の範囲の温度で行われる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記ヌクレアーゼ不活性工程は、５分間、１０分間、１５分間、および２０分間から選択される継続時間である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記ウイルス不活性工程は６４℃〜９５℃の範囲の温度で行われる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
前記ウイルス不活性工程は５分間である、請求項４０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本願は、２０１７年３月１５日に提出された米国特許仮出願第６２／４７１，９３１号、２０１７年４月１２日に提出された米国特許仮出願第６２／４８４，８５７号、２０１７年７月７日に提出された米国特許仮出願第６２／５３０，０８６号、２０１７年１０月５日に提出された米国特許仮出願第６２／５６８，３１５号、２０１７年１１月１７日に提出された米国特許仮出願第６２／５８８，１３８号、および２０１７年１２月８日に提出された米国特許仮出願第６２／５９６，７３５号に対する優先権を主張するものである。上に特定された出願の全内容は参照により本明細書に完全に組み込まれる。
連邦政府による資金提供を受けた研究に関する陳述
【０００２】
本発明は、国立衛生研究所による助成番号ＭＨ１００７０６、ＭＨ１１００４９、ＡＩ１１０８１８およびアメリカ国防脅威削減局による助成番号ＨＤＴＲＡ１−１４−１−０００６からの助成を受け、米国政府の支援によってなされた。米国政府は本発明に対して特定の権利を有する。
［技術分野］
【０００３】
本明細書で開示される主題は、一般に、クラスター化短鎖反復回文配列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats＝ＣＲＩＳＰＲ）エフェクター系の使用に関する高速診断法を目的とする。
【背景技術】
【０００４】
核酸は、生物学的情報の普遍的な特徴である。持ち運び可能な装置を用いて高感度かつ単塩基特異性により核酸を高速に検出する能力は、多くの疾患に対する診断および監視に革命を起こし、有益な疫学情報を提供し、一汎用性のある科学的道具として機能する可能性を有する。核酸を検出する方法は多数開発されている(Du et al., 2017; Green et al., 2014; Kumar et al., 2014; Pardee et al., 2014; Pardee et al., 2016; Urdea et al., 2006)が、感度、特異性、簡便さ、それに速度の間に妥協が必要という課題があることは否めない。例えば、定量ＰＣＲ法は高感度であるが、高価であり、複雑な装置に依存している。このため、その使用は研究室という環境で高度に訓練された操作者に限定される。他の方法、例えば、等温核酸増幅を持ち運び可能な装置と組み合わせる新規な方法(Du et al., 2017; Pardee et al., 2016)は、診療現場（ＰＯＣ）という設定で高い検出特異性を提供するが、感度が低いためその用途は幾分制限される。核酸診断法の様々な健康管理用途に対する適性は高まりつつあり、低コストで高特異性と高感度を提供する検出技術があれば臨床および基礎研究の場面で非常に有用である。
【発明の概要】
【０００５】
一側面では、本発明は、エフェクタータンパク質、および対応する標的分子に結合するように設計された１種以上のガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ系、ＲＮＡ系マスキング構築物、および任意であるが試料中の標的ＲＮＡ分子を増幅するための核酸増幅試薬を含む核酸検出システムを提供する。他の側面では、いくつかの実施形態は、エフェクタータンパク質およびトリガーＲＮＡに結合するように設計された１種以上のガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ系、ＲＮＡ系マスキング構築物、ならびにマスクされたＲＮＡポリメラーゼプロモーター結合部位またはマスクされたプライマー結合部位を含む１種以上の検出アプタマーを含むポリペプチド検出システムを提供する。
【０００６】
さらにいくつかの実施形態では、前記系は核酸増幅試薬をさらに含んでいてもよい。これら核酸増幅試薬は、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むプライマーを含んでいてもよい。特定の態様では、試料核酸を増幅してＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むＤＮＡ鋳型を得て、これにより転写により標的ＲＮＡ分子を生成してもよい。前記核酸はＤＮＡであってもよく、本明細書で記載する任意の方法で増幅されていてもよい。前記核酸はＲＮＡであってもよく、本明細書で記載する逆転写法で増幅されていてもよい。プライマー結合部位のマスキングを外す際にアプタマー配列を増幅してもよく、これにより増幅されたＤＮＡ生成物からトリガーＲＮＡが転写される。前記標的分子は標的ＤＮＡであってもよく、前記系は標的ＤＮＡに結合するプライマー、およびＲＮＡポリメラーゼプロモーターをさらに含んでいてもよい。
【０００７】
一例としての実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ系エフェクタータンパク質はＲＮＡ標的エフェクタータンパク質である。ＲＮＡ標的エフェクタータンパク質としては、例えば、Ｃ２ｃ２（現在ではＣａｓ１３ａとして知られている）、Ｃａｓ１３ｂ、およびＣａｓ１３ａが挙げられる。自明であるが、本明細書の用語「Ｃ２ｃ２」は、「Ｃａｓ１３ａ」と互いに言い換え可能である。別の例としての実施形態では、ＲＮＡ標的エフェクタータンパク質はＣ２ｃ２である。他の実施形態では、Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質は、レプトトリキア、リステリア、コリネバクター、サッテレーラ、レジオネラ、トレポネーマ、フィリファクター、ユウバクテリウム、ストレプトコッカス、乳酸桿菌、マイコプラズマ、バクテロイデス、フラビイボラ、フラボバクテリウム、スフェロケタ、アゾスピリルム、グルコナセトバクター、ナイセリア、ロゼブリア、パルビバクラム、スタフィロコッカス、ニトラチフラクター、マイコプラズマ、カンピロバクター、およびラクノスピラの属からなる群より選択される生物由来である。あるいはＣ２ｃ２エフェクタータンパク質は、レプトトリキア・シャーイイ、レプトトリキア・ウェイディイ、リステリア・シーリゲリ、クロストリジウム・アミノフィルム、カーノバクテリウム・ガリナルム、パルディバクター・プロピオニシゲネス、リステリア・ウェイヘンステファネンシスからなる群より選択される生物である。あるいはＣ２ｃ２エフェクタータンパク質はＬ．ウェイディイＦ０２７９またはＬ．ウェイディイＦ０２７９（Ｌｗ２）Ｃ２Ｃ２エフェクタータンパク質である。他の態様では、前記１種以上のガイドＲＮＡは、標的ＲＮＡまたはＤＮＡでの一塩基多型、転写物のスプライシング多様体、またはフレームシフト変異を検出するように設計されている。
【０００８】
他の実施形態では、前記１種以上のガイドＲＮＡは、疾患の状態の診断に用いられる１種以上の標的分子に結合するように設計されている。さらなる実施形態では、前記疾患の状態は、感染、臓器疾患、血液疾患、免疫系疾患、癌、脳および神経系疾患、内分泌腺疾患、妊娠または出産に関する疾患、遺伝疾患、または環境要因性疾患である。さらなる実施形態では、前記疾患の状態は癌、自己免疫疾患、または感染である。
【０００９】
さらなる実施形態では、前記１種以上のガイドＲＮＡは、癌に特異的な体細胞変異を含む１種以上の標的分子に結合するように設計されている。前記癌に特異的な変異は薬物耐性を付与してもよい。この薬物耐性変異は、イブルチニブ、エルロチニブ、イマチニブ、ゲフィチニブ、クリゾチニブ、トラスツズマブ、ベムラフェニブ、ＲＡＦ／ＭＥＫ、免疫チェックポイント阻害療法、または抗エストロゲン治療による治療によって誘導されてもよい。前記癌に特異的な変異は、プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）、アンドロゲン受容体（ＡＲ）、ブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）、上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＢＣＲ−Ａｂｌ、ｃ−ｋｉｔ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＨＥＲ２、ＥＭＬ４−ＡＬＫ、ＫＲＡＳ、ＡＬＫ、ＲＯＳ１、ＡＫＴ１、ＢＲＡＦ、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＮＲＡＳ、ＲＡＣ１、およびＥＳＲ１からなる群より選択されるタンパク質をコードする１個以上の遺伝子に存在してもよい。前記癌に特異的な変異は、以下の染色体バンド、６ｑ１６．１−ｑ２１、６ｑ２２．３１−ｑ２４．１、６ｑ２５．１−ｑ２６、７ｐ１１．２−ｑ１１．１、８ｐ２３．１、８ｐ１１．２３−ｐ１１．２１（ＩＤＯ１、ＩＤＯ２を含む）、９ｐ２４．２−ｐ２３（ＰＤＬ１、ＰＤＬ２を含む）、１０ｐ１５．３、１０ｐ１５．１−ｐ１３、１１ｐ１４．１、１２ｐ１３．３２−ｐ１３．２、１７ｐ１３．１（ＡＬＯＸ１２Ｂ、ＡＬＯＸ１５Ｂを含む）、および２２ｑ１１．１−ｑ１１．２１の何れかに影響を及ぼす染色体全体の事象を除き、ＣＡＳＰ８、Ｂ２Ｍ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＳＭＣ１Ａ、ＡＲＩＤ５Ｂ、ＴＥＴ２、ＡＬＰＫ２、ＣＯＬ５Ａ１、ＴＰ５３、ＤＮＥＲ、ＮＣＯＲ１、ＭＯＲＣ４、ＣＩＣ、ＩＲＦ６、ＭＹＯＣＤ、ＡＮＫＬＥ１、ＣＮＫＳＲ１、ＮＦ１、ＳＯＳ１、ＡＲＩＤ２、ＣＵＬ４Ｂ、ＤＤＸ３Ｘ、ＦＵＢＰ１、ＴＣＰ１１Ｌ２、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、またはＣ、ＣＳＮＫ２Ａ１、ＭＥＴ、ＡＳＸＬ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２、ＡＬＯＸ１２ＢおよびＡＬＯＸ１５Ｂ、からなる群より選択される遺伝子の変異またはコピー数増加であってもよい。
【００１０】
さらなる実施形態では、前記１種以上のガイドＲＮＡは、ヘテロ接合性の消失（ＬＯＨ）マーカーを含む１種以上の標的分子に結合するように設計されていてもよい。
【００１１】
さらなる実施形態では、前記１種以上のガイドＲＮＡは、一塩基多型（ＳＮＰ）を含む１種以上の標的分子に結合するように設計されていてもよい。前記疾患は心疾患であってもよく、前記標的分子はＶＫＯＲＣ１、ＣＹＰ２Ｃ９、およびＣＹＰ２Ｃ１９であってもよい。
【００１２】
さらなる実施形態では、前記疾患の状態は、妊娠または出産に関する疾患または遺伝疾患であってもよい。前記試料は血液試料または粘液試料であってもよい。前記疾患は、三染色体性１３、三染色体性１６、三染色体性１８、クラインフェルター症候群（４７、ＸＸＹ）、（４７、ＸＹＹ）および（４７、ＸＸＸ）、ターナー症候群、ダウン症候群（三染色体性２１）、嚢胞性線維症、ハンチントン病、βサラセミア、筋剛直性ジストロフィー、鎌状赤血球性貧血、ポルフィリン症、脆弱Ｘ症候群、ロバートソン型転座、アンジェルマン症候群、ディジョージ症候群、およびウォルフ・ヒルシュホーン症候群からなる群より選択されてもよい。
【００１３】
さらなる実施形態では、前記感染はウイルス、細菌、または真菌により引き起こされる、あるいは前記感染はウイルス感染である。特定の実施形態では、ウイルス感染は二本鎖ＲＮＡウイルス、プラス鎖ＲＮＡウイルス、マイナス鎖ＲＮＡウイルス、レトロウイルス、またはこれらの組み合わせにより引き起こされる。あるいは、ウイルス感染は、コロナウイルス科ウイルス、ピコルナウイルス科ウイルス、カリシウイルス科ウイルス、フラビウイルス科ウイルス、トガウイルス科ウイルス、ボルナウイルス科、フィロウイルス科、パラミクソウイルス科、ニューモウイルス亜科、ラブドウイルス科、アレナウイルス科、ブニヤウイルス科、オルトミクソウイルス科、またはデルタウイルス属により引き起こされる。あるいは、前記ウイルス感染は、コロナウイルス、ＳＡＲＳ、ポリオウイルス、ライノウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ノーウォークウイルス、黄熱ウイルス、西ナイルウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、デング熱ウイルス、ジカウイルス、風疹ウイルス、ロスリバーウイルス、シンドビスウイルス、チクングニアウイルス、ボルナ病ウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ニパウイルス、ヘンドラウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ヒト呼吸器多核体ウイルス、狂犬病ウイルス、ラッサウイルス、ハンタウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、インフルエンザ、またはＤ型肝炎ウイルスにより引き起こされる。
【００１４】
本発明の他の実施形態では、ＲＮＡ系マスキング構築物は、検出可能な陽性信号の生成を抑制する。あるいは、前記ＲＮＡ系マスキング構築物は、前記検出可能な陽性信号をマスキングすることにより検出可能な陽性信号の生成を抑制するか、その代わりに検出可能な陰性信号を生成する。あるいは、前記ＲＮＡ系マスキング構築物は、レポート構築物によってコードされた遺伝子産物の生成を抑制するサイレンシングＲＮＡを含み、前記遺伝子産物は発現すると検出可能な陽性信号を生成する。
【００１５】
さらなる実施形態では、前記ＲＮＡ系マスキング構築物は、前記検出可能な陰性信号を生成するリボザイムであり、前記検出可能な陽性信号は前記リボザイムが不活性化されると生成される。あるいは、前記リボザイムは基質を第一の色に変換し、前記リボザイムが不活性化されると前記基質は第二の色に変化する。
【００１６】
他の実施形態では、前記ＲＮＡ系マスキング因子はＲＮＡアプタマーである。あるいは、前記アプタマーは、基質に作用することで前記アプタマーから放出される際に検出可能な信号を生成する酵素を隔離する。あるいは、前記アプタマーは、前記アプタマーから放出されると結合して検出可能な信号を生成する１対の因子を隔離する。
【００１７】
他の態様では、前記ＲＮＡ系マスキング構築物は、検出可能なリガンドおよびマスキング成分が付加されたＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。他の態様では、前記検出可能なリガンドは蛍光色素分子であり、前記マスキング成分は消光分子であるか、これらに限定されないが、ＮＡＳＢＡ（核酸配列に基づく増幅）またはＲＰＡ試薬など、標的ＲＮＡ分子を増幅する試薬である。
【００１８】
他の側面では、本発明は、１つ以上の個別の容積を含む診断装置を提供し、前記１つ以上の個別の容積はそれぞれ、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質、対応する標的分子に結合するように設計された１種以上のガイドＲＮＡ、ＲＮＡ系マスキング構築物を含み、さらに核酸増幅試薬を含んでいてもよい。
【００１９】
他の側面では、本発明は１つ以上の個別の容積を含む診断装置し、各個別の容積はＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質、トリガーＲＮＡに結合するように設計された１種以上のガイドＲＮＡ、マスクされたＲＮＡポリメラーゼプロモーター結合部位またはマスクされたプライマー結合部位を含む１種以上の検出アプタマーを含み、さらに核酸増幅試薬を含んでいてもよい。
【００２０】
態様によっては、前記個別の容積は液滴である、個別の容積は固体基質に規定されている、マイクロウェルである、あるいは紙の基質のような基質に規定されたスポットである。
【００２１】
特定の他の例示的な実施形態では、前記核酸検出システムは、１種以上のウイルス標的を検出するように設計されて、抗ウイルス治療を組み合わせて用いられる。特定の例示的な実施形態では、前記抗ウイルス治療は、クラス２、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ系抗ウイルス系である。例えば、前記核酸検出システムは、適切な治療薬を選択するため、特定の患者に感染しているか所与の大流行で蔓延しているウイルス株の薬物耐性または感受性に対する抗ウイルス系と併用されてもよい。これは、治療の途中で発生する新規な変異、および治療耐性の発生に繋がることが分かっている変異を検知することができる診断システムを含む。本明細書で開示される実施形態のそのような診断システムを抗ウイルス治療に対するコンパニオン診断として用いて、適切な初期抗ウイルス治療を選択し、また発生する可能性のある耐性変異体に応答して抗ウイルス治療を修正してもよい。前記抗ウイルス系がクラス２、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ系抗ウイルス治療である例示的な実施形態では、本明細書で開示される実施形態の診断システムを用いてクラス２、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ系抗ウイルス治療によってエフェクタータンパク質を標的ウイルス因子核酸配列に向けるのに用いられるガイド配列を選択および／または修飾してもよい。
【００２２】
一態様では、前記ＲＮＡ標的エフェクタータンパク質は、Ｃ２ｃ２、Ｃａｓ１３ｂ、またはＣａｓ１３ｃなどのＣＲＩＳＰＲ、ＶＩ型ＲＮＡ標的エフェクタータンパク質である。特定の例示的な実施形態では、前記Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質は、レプトトリキア、リステリア、コリネバクター、サッテレーラ、レジオネラ、トレポネーマ、フィリファクター、ユウバクテリウム、ストレプトコッカス、乳酸桿菌、マイコプラズマ、バクテロイデス、フラビイボラ、フラボバクテリウム、スフェロケタ、アゾスピリルム、グルコナセトバクター、ナイセリア、ロゼブリア、パルビバクラム、スタフィロコッカス、ニトラチフラクター、マイコプラズマ、およびカンピロバクターからなる群より選択される生物由来である。あるいは、前記Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質は、レプトトリキア・シャーイイ、Ｌ．ウェイディイ、リステリア・シーリゲリ、ラクノスピラ科細菌、クロストリジウム・アミノフィルム、カーノバクテリウム・ガリナルム、パルディバクター・プロピオニシゲネス、リステリア・ウェイヘンステファネンシス、リステリア科細菌，およびロドバクター・カプスラータからなる群より選択される。あるいは、前記Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質はＬ．ウェイディイＦ０２７９またはＬ．ウェイディイＦ０２７９（Ｌｗ２）Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質である。他の態様では、前記１種以上のガイドＲＮＡは、疾患の状態の診断に用いられる１種以上の標的ＲＮＡ配列に結合するように設計されている。
【００２３】
特定の例示的な実施形態では、前記ＲＮＡ系マスキング構築物は、検出可能な陽性信号の生成を抑制する。あるいは、前記ＲＮＡ系マスキング構築物は、検出可能な陽性信号をマスキングすることで検出可能な陽性信号の生成を抑制するか、あるいは代わりに検出可能な陰性信号を生成する。あるいは、前記ＲＮＡ系マスキング構築物は、レポート構築物によりコードされる遺伝子産物の生成を抑制するサイレンシングＲＮＡを含み、前記遺伝子産物は発現すると前記検出可能な陽性信号を生成する。
【００２４】
他の例示的な実施形態では、前記ＲＮＡ系マスキング構築物は、検出可能な陰性信号を生成するリボザイムであり、前記リボザイムが不活性化されると前記検出可能な陽性信号が生成される。一例示的な実施形態では、前記リボザイムは基質を第一の色に変換し、前記基質は前記リボザイムが不活性化されると第二の色に変化する。他の例示的な実施形態では、前記ＲＮＡ系マスキング因子は酵素を隔離するアプタマーであり、前記酵素は、基質に作用することで前記アプタマーから放出される際に検出可能な信号を生成する。あるいは、前記アプタマーは、前記アプタマーから放出されると結合して検出可能な信号を生成する１対の因子を隔離する。
【００２５】
他の例示的な実施形態では、前記ＲＮＡ系マスキング構築物は、検出可能なリガンドオリゴヌクレオチドおよびマスキング成分が付加されたＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。特定の例示的な実施形態では、前記検出可能なリガンドは蛍光色素分子であり、前記マスキング成分は消光分子である。
【００２６】
他の側面では、本発明は、試料中の標的ＲＮＡを検出する方法を提供する。前記方法は、エフェクタータンパク質、１種以上のガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ系、ＲＮＡ系マスキング構築物を含む１つ以上の個別の容積に１つの試料または１組の試料を分配すること、前記１種以上のガイドＲＮＡが１種以上の標的分子に結合することができる十分な条件で前記試料または前記１組の試料をインキュベートすること、前記１種以上のガイドＲＮＡを前記１種以上の標的分子に結合させることで前記ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を活性化する（ここで、前記ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を活性化すると、前記ＲＮＡ系マスキング構築物が修飾されて検出可能な陽性信号が生成される）こと、および前記検出可能な陽性信号を検出する（ここで、前記検出可能な陽性信号の検出は前記試料中に１種以上の標的分子が存在することを示す）ことを含む。
【００２７】
他の側面では、本発明は、試料中のペプチドを検出する方法を提供する。前記方法は、ペプチド検出アプタマー、エフェクタータンパク質、１種以上のガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ系、ＲＮＡ系マスキング構築物を含む１組の個別の容積に１つの試料または１組の試料を分配する（ここで、前記ペプチド検出アプタマーはマスクされたＲＮＡポリメラーゼ部位を含み、１種以上の標的分子に結合するように構成されている）こと、前記ペプチド検出アプタマーが前記１種以上の標的分子に結合することができる十分な条件で前記１つの試料または１組の試料をインキュベートする（ここで、前記アプタマーが対応する標的分子に結合すると前記ＲＮＡポリメラーゼ結合部位に曝されて、トリガーＲＮＡのＲＮＡ合成が起こる）こと、前記１種以上のガイドＲＮＡの前記トリガーＲＮＡへの結合によりＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を活性化する（ここで、前記ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を活性化すると、前記ＲＮＡ系マスキング構築物が修飾されて、検出可能な陽性信号が生成される）こと、および前記検出可能な陽性信号を検出する（ここで、前記検出可能な陽性信号の検出は、試料中に１種以上の標的分子が存在することを示す）ことを含む。
【００２８】
特定の例示的な実施形態では、そのような方法は、前記試料ＲＮＡまたは前記トリガーＲＮＡを増幅することをさらに含む。他の実施形態では、ＲＮＡを増幅することは、ＮＡＳＢＡまたはＲＰＡによる増幅を含む。
【００２９】
特定の例示的な実施形態では、前記ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は、Ｃ２ｃ２またはＣａｓ１３ｂなどのＣＲＩＳＰＲ、ＶＩ型ＲＮＡ標的エフェクタータンパク質である。他の例示的な実施形態では、前記Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質は、レプトトリキア、リステリア、コリネバクター、サッテレーラ、レジオネラ、トレポネーマ、フィリファクター、ユウバクテリウム、ストレプトコッカス、乳酸桿菌、マイコプラズマ、バクテロイデス、フラビイボラ、フラボバクテリウム、スフェロケタ、アゾスピリルム、グルコナセトバクター、ナイセリア、ロゼブリア、パルビバクラム、スタフィロコッカス、ニトラチフラクター、マイコプラズマ、およびカンピロバクターからなる群より選択される生物由来である。あるいは、前記Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質は、レプトトリキア・シャーイイ、Ｌ．ウェイディイ、リステリア・シーリゲリ、ラクノスピラ科細菌、クロストリジウム・アミノフィルム、カーノバクテリウム・ガリナルム、パルディバクター・プロピオニシゲネス、リステリア・ウェイヘンステファネンシス、リステリア科細菌、およびロドバクター・カプスラータからなる群より選択される。特定の一実施形態では、前記Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質はＬ．ウェイディイＦ０２７９またはＬ．ウェイディイＦ０２７９（Ｌｗ２）Ｃ２Ｃ２エフェクタータンパク質である。
【００３０】
特定の例示的な実施形態では、前記１種以上のガイドＲＮＡは、疾患の状態の診断に用いられる１種以上の標的分子に結合するように設計されている。特定の他の例示的な実施形態では、前記疾患の状態は、感染、臓器疾患、血液疾患、免疫系疾患、癌、脳および神経系疾患、内分泌腺疾患、妊娠または出産に関する疾患、遺伝疾患、または環境要因性疾患、癌、真菌感染、細菌感染、寄生虫感染、またはウイルス感染である。
【００３１】
特定の例示的な実施形態では、前記ＲＮＡ系マスキング構築物は、検出可能な陽性信号の生成を抑制する。あるいは、前記ＲＮＡ系マスキング構築物は、前記検出可能な陽性信号をマスキングすることで検出可能な陽性信号の生成を抑制するか、代わりに検出可能な陰性信号を生成する。あるいは、前記ＲＮＡ系マスキング構築物は、レポート構築物によってコードされる遺伝子産物の生成を抑制するサイレンシングＲＮＡを含み、前記遺伝子産物が発現すると検出可能な陽性信号を生成する。あるいは、前記ＲＮＡ系マスキング構築物は前記検出可能な陰性信号を生成するリボザイムであり、前記検出可能な陽性信号は前記リボザイムが不活性化されると生成される。他の例示的な実施形態では、前記リボザイムは基質を第一の状態に変換し、前記基質は前記リボザイムが不活性化されると第二の状態に変わる。あるいは、前記ＲＮＡ系マスキング因子はアプタマーであり、前記アプタマーは酵素を隔離しており、前記酵素は基質に作用することで前記アプタマーから放出される際に検出可能な信号を生成する。あるいは、前記アプタマーは、前記アプタマーから放出されると結合して検出可能な信号を生成する１対の因子を隔離する。さらなる実施形態では、前記ＲＮＡ系マスキング構築物は、ＲＮＡオリゴヌクレオチド、前記ＲＮＡオリゴヌクレオチドの第一の端部に検出可能なリガンド、および前記ＲＮＡオリゴヌクレオチドの第二の端部にマスキング成分を含む。あるいは、前記検出可能なリガンドは蛍光色素分子であり、前記マスキング成分は消光分子である。
【００３２】
特定の例示的な実施形態では、本明細書で開示される方法、システム、および装置を胎児の小脳髄症に関連付けられるＳＮＰを検出するのに用いてもよい。本明細書で開示される実施形態を用いて検出されてもよい例示的な胎児小脳髄症変異はYuan et al. Science 10.1126/science.aam7120 (2017)に開示されている。
【００３３】
例示的な実施形態のこれらおよび他の側面、目的、特徴、および利点は、以下の図示された例示的な実施形態の詳細な記載を考慮すれば、一般の当業者には自明である。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】例示的なＣ２ｃ２系のＣＲＩＳＰＲエフェクター系の概略図である。
【００３５】
【図２】（Ａ）は、レプトトリキア・ウェイディイに由来するＣＲＩＳＰＲ／Ｃ２ｃ２座位の概略図である。ＬｗＣ２ｃ２およびＬｓｈＣ２ｃ２系に由来する代表的なｃｒＲＮＡ構造が示されている（配列番号１４２および１４３）。（Ｂ）はＣ２ｃ２活性に関する生体内細菌アッセイの概略図である。アンピシリン耐性プラスミドのβ−ラクタマーゼ遺伝子の上流にプロトスペーサーをクローニングする。Ｃ２ｃ２を発現している大腸菌に、この構築物を標的スペーサーまたは非標的スペーサーのいずれかと共に形質変換する。得られた形質転換体を計測して活性を定量する。（Ｃ）ＬｗＣ２ｃ２およびＬｓｈＣ２ｃ２の生体内活性の定量（ｎ＝２つの生物学的に同じ試料；棒は平均±標準誤差を示す）。（Ｄ）ＬｗＣ２ｃ２の最終サイズ排除ゲルろ過。（Ｅ）２段階精製したＬｗＣ２ｃ２をクマシーブルーで染色したアクリルアミドゲル。（Ｆ）異なるＰＦＳ標的に対するＬｗＣ２ｃ２の活性。スペーサーに隣接する可変３’ＰＦＳを持つ蛍光ＲＮＡに対してＬｗＣ２ｃ２を標的し、反応生成物を変性ゲル上で視覚化した。ＬｗＣ２ｃ２は、プロトスペーサー隣接部位（ＰＦＳ）Ｇに対してわずかに選好を示した。
【００３６】
【図３】１μｇ、１００ｎｇ、１０ｎｇ、および１ｎｇの標的を異なる４つの量のタンパク質／ｃｒＲＮＡと共に用いた異なる希釈（１：４、１：１６、１：３２、１：６４）での例示的なマスキング構築物の検出を示す。２の供給源のｃｒＲＮＡ、ｃｒＲＮＡなしの条件を用いて、技術的に同じ試料を２つ用意し、（９６＋４８）×２＝２８８反応で３時間に亘って５分間隔で測定した。
【図４】１μｇ、１００ｎｇ、１０ｎｇ、および１ｎｇの標的を異なる４つの量のタンパク質／ｃｒＲＮＡと共に用いた異なる希釈（１：４、１：１６、１：３２、１：６４）での例示的なマスキング構築物の検出を示す。２の供給源のｃｒＲＮＡ、ｃｒＲＮＡなしの条件を用いて、技術的に同じ試料を２つ用意し、（９６＋４８）×２＝２８８反応で３時間に亘って５分間隔で測定した。
【図５】１μｇ、１００ｎｇ、１０ｎｇ、および１ｎｇの標的を異なる４つの量のタンパク質／ｃｒＲＮＡと共に用いた異なる希釈（１：４、１：１６、１：３２、１：６４）での例示的なマスキング構築物の検出を示す。２の供給源のｃｒＲＮＡ、ｃｒＲＮＡなしの条件を用いて、技術的に同じ試料を２つ用意し、（９６＋４８）×２＝２８８反応で３時間に亘って５分間隔で測定した。
【図６】１μｇ、１００ｎｇ、１０ｎｇ、および１ｎｇの標的を異なる４つの量のタンパク質／ｃｒＲＮＡと共に用いた異なる希釈（１：４、１：１６、１：３２、１：６４）での例示的なマスキング構築物の検出を示す。２の供給源のｃｒＲＮＡ、ｃｒＲＮＡなしの条件を用いて、技術的に同じ試料を２つ用意し、（９６＋４８）×２＝２８８反応で３時間に亘って５分間隔で測定した。
【００３７】
【図７】特定の例示的な実施形態によるマスキング構築物およびＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を用いた例示的な検出スキームの概略図である。
【００３８】
【図８】異なる供給源のガイドＲＮＡを用いて標的を検出する際の蛍光の経時変化を示す１組のグラフである。
【００３９】
【図９】ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質の濃度を変えて異なる希釈率の標的ＲＮＡに対して正規化蛍光度を示すグラフである。
【００４０】
【図１０】ＮＡＳＢＡ増幅反応の一般的な工程を示す概略図である。
【００４１】
【図１１】異なる３組のプライマーと共にＮＡＳＢＡにより増幅し、消光蛍光プローブを用いたＣ２ｃ２副次（collateral）検出を行った核酸標的ｓｓＲＮＡ１の検出を示すグラフである（ｎ＝２つの技術的に同じ試料；バーは平均±標準誤差を示す）。
【００４２】
【図１２】レンチウイルスの標的ＲＮＡの存在を検出するのに用いてもよい副次効果を示すグラフである。
【００４３】
【図１３】副次効果とＮＡＳＢＡによりaM (= 10-18M)濃度で種を検出することができることを示すグラフである。
【００４４】
【図１４】副次効果とＮＡＳＢＡにより低濃度の試料を素早く区別することを示すグラフである。
【００４５】
【図１５】特定の時点での正規化蛍光度は試料の入力濃度を予測するしていることを示す図である。増幅せずに行ったＣａｓ１３ａ検出からの蛍光度測定は入力されたＲＮＡ濃度と相関する（ｎ＝２つの生物学的に同じ試料；バーは平均±標準誤差を示す）。
【００４６】
【図１６】ＲＰＡ反応の概略図であり、反応に関与する成分を示している。
【００４７】
【図１７】ＳＨＥＲＬＯＣＫ法(Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing＝特定高感度酵素レポーターアンロッキング)の概略図であり、ＲＰＡ工程またはＲＴ−ＲＰＡ工程の組み込みによりＤＮＡまたはＲＮＡ標的の両方の検出を示す。標的ＲＮＡを認識する際、副次効果によりＣ２ｃ２が切断レポーターを切断して蛍光を生成する。１分子の量のＲＮＡまたはＤＮＡをリコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）によりＤＮＡに増幅し、転写してＲＮＡを生成することができる。このＲＮＡをＣ２ｃ２により検出する。
【００４８】
【図１８】Ｃ２ｃ２副次検出により検出されたｓｓＲＮＡ標的（配列番号１４４および１４５）の概略図である。
【００４９】
【図１９】ＲＰＡを用いた１分子ＤＮＡ検出（すなわちＣ２ｃ２の付加は１５分以内）を示す１組のグラフである。
【００５０】
【図２０】Ｔ７ポリメラーゼをＲＰＡ反応に加えるとＤＮＡ検出に悪影響を及ぼすことを示す１組のグラフである。
【００５１】
【図２１】ポリメラーゼをＲＰＡ反応に加えるとＤＮＡ検出に悪影響を及ぼさないことを示す１組のグラフである。
【００５２】
【図２２】ＲＰＡ、Ｔ７による転写、およびＣ２ｃ２検出反応は互換性があり、同時にインキュベートした際に１分子検出を達成することを示すグラフである（ｎ＝２つの技術的に同じ試料；棒は平均±標準誤差を示す）。
【００５３】
【図２３】ＲＰＡ−ＲＮＡの短時間インキュベーションの有効性を示す１組のグラフである。
【００５４】
【図２４】Ｔ７ポリメラーゼ量を増やすとＲＰＡ−ＲＮＡに対する感度が高まることを示す１組のグラフである。
【００５５】
【図２５】１．５倍の酵素によるワンポット反応を用いたＲＰＡ−ＤＮＡ検出アッセイの結果を示す１組のグラフである。３０分という速度で１分子（２aM）検出が達成された。
【００５６】
【図２６】ＲＰＡ−ＤＮＡワンポット反応は入力濃度に対して蛍光度が定量的に減少することを示す１組のグラフである。近似曲線は、標的の入力濃度と出力される蛍光度との関係を示している。
【００５７】
【図２７】（Ａ）増幅なしのＲＮＡのＣ２ｃ２による検出は、５０ｆＭまでの濃度でｓｓＲＮＡ標的を検出することができ（ｎ＝２つの技術的に同じ試料；棒は平均±標準誤差を示す）、（Ｂ）ＲＰＡ−Ｃ２ｃ２反応は１分子ＤＮＡ検出が可能である（ｎ＝４つの技術的に同じ試料；棒は平均±標準誤差を示す）ことを示す１組のグラフである。
【００５８】
【図２８】特定の例示的な実施形態によって生成されたＣ２ｃ２信号は紙の基質で２０ｐＭの標的を検出することができることを示す１組のグラフである。
【００５９】
【図２９】特定のＲＮＡ分解酵素阻害剤が紙の背景信号を除去することができることを示すグラフである。
【００６０】
【図３０】特定の例示的な実施形態によるシステムを用いたガラス繊維基質での検出を示す１組のグラフである。
【００６１】
【図３１】以下のことを示す１組のグラフである。（Ａ）特定の例示的な実施形態によるジカＲＮＡ検出の概略を示す。レンチウイルスをＣ２ｃ２副次検出により標的したジカＲＮＡまたは相同なデング熱ＲＮＡ断片で包装した。４８時間後に媒体を採取して、熱溶解、ＲＴ−ＲＰＡ、およびＣ２ｃ２検出を行った。（Ｂ）ＲＴ−ＲＡＰ−Ｃ２ｃ２検出は、ジカレンチウイルス粒子の非常に高感度な検出が可能である（ｎ＝４つの技術的に同じ試料、両側スチューデントｔ検定；＊＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１；棒は平均±標準誤差を示す）。（Ｃ）特定の例示的な実施形態による、冷凍乾燥したＣ２ｃ２を用いた紙上でジカＲＮＡの検出の概略を示す。（Ｄ）この紙を用いたアッセイは、ジカレンチウイルス粒子を非常に高感度で検出することができる（ｎ＝４つの技術的に同じ試料、両側スチューデントｔ−検定；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１；＊＊、ｐ＜０．０１、棒は平均±標準誤差を示す）。
【００６２】
【図３２】以下のことを示す１組のグラフである。（Ａ）ヒト血清から単離されたジカＲＮＡを逆転写、ＲＮＡ分解酵素ＨによるＲＮＡの分解、ｃＤＮＡのＲＰＡ、およびＣ２ｃ２検出するための模式図。（Ｂ）Ｃ２ｃ２はヒトジカ血清試料を非常に高感度に検出することができる。示されているジカＲＮＡの濃度は定量ＰＣＲにより確認された（ｎ＝４つの技術的に同じ試料、両側スチューデントｔ−検定；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１；棒は平均±標準誤差を示す）。
【００６３】
【図３３】以下のことを示す１組のグラフである。（Ａ）冷凍乾燥Ｃ２ｃ２はフェムトモルという低濃度でｓｓＲＮＡ１を高感度で検出することができる。Ｃ２ｃ２は、紙の上で２００ｐＭの液体形態（Ｂ）または冷凍乾燥（Ｃ）のｓｓＲＮＡ１標的を高速に検出することができる。この反応は、溶液（Ｄ）（ｎ＝３）および冷凍乾燥形態（Ｅ）（ｎ＝３）の合成ジカＲＮＡ断片を高感度で検出することができる。（Ｆ）入力濃度と検出された蛍光度の有意な相関を示すヒトジカｃＤＮＡ検出の定量曲線である。（Ｇ）様々な量のヒト血清の存在下で行ったｓｓＲＮＡ１のＣ２ｃ２による検出（特に断りがなければ、ｎ＝２つの技術的に同じ試料；棒は平均±標準誤差を示す）。
【００６４】
【図３４】（Ａ）１組の汎用Ｖ３  ＲＰＡプライマーを用いて細菌ゲノム由来の16S rRNA遺伝子をＣ２ｃ２により検出する概要を示す。（Ｂ）特定の例示的な実施形態により行ったアッセイを用いて大腸菌または緑膿菌ｇＤＮＡを高感度かつ特異的に検出することができる（ｎ＝４つの技術的に同じ試料、両側スチューデントｔ−検定；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１；棒は平均±標準誤差を示す）。Ｅｃ、大腸菌；Ｋｐ、肺炎桿菌；Ｐａ、緑膿菌；Ｍｔ、ヒト型結核菌；Ｓａ、黄色スタフィロコッカス
【００６５】
【図３５】以下のことを示す１組のグラフである。（Ａ）肺炎桿菌の４つの異なる臨床単離物から２つの異なるカルバペネム耐性遺伝子（ＫＰＣおよびＮＤＭ−１）を検出する。（Ｂ）カルバペネム耐性遺伝子（部分Ａ）の検出は、ＫＰＣおよびＮＤＭ−１  ｃｒＲＮＡアッセイとの信号比として正規化されている（ｎ＝２つの技術的に同じ試料、両側スチューデントｔ−検定；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１；棒は平均±標準誤差を示す）。
【００６６】
【図３６】以下のことを示す１組のグラフである。（Ａ）Ｃ２ｃ２は１つの不一致に対しては高感度ではないが、追加の不一致を有するｃｒＲＮＡを充填した場合に標的の一塩基の違いを区別することができる。ｃｒＲＮＡの様々な位置に合成による不一致を含む１０個のスペーサーを有する１１個のｃｒＲＮＡを用いてｓｓＲＮＡ標的１〜３を検出した。不一致のスペーサーは、標的１の切断を低減しなかったが不一致のある標的２および３の切断を阻害した（配列番号１４６〜１５９）。（Ｂ）合成による不一致を有する単一塩基特異性スペーサーの合理的設計過程を示す概略図である。合成による不一致はＳＮＰまたは対象の塩基の近くに位置する（配列番号１６０〜１６４）。（Ｃ）切断した（２３ヌクレオチドの）ｃｒＲＮＡによるＣ２ｃ２検出を用いてＳＮＰ株を非常に特異的に検出することで、ジカアフリカ株のＲＮＡ標的とジカアメリカ株のＲＮＡ標的との１ヌクレオチドの違いを区別することができる（ｎ＝２つの技術的に同じ試料、片側スチューデントｔ−検定；＊、ｐ＜０．０５；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１；棒は平均±標準誤差を示す）。
【００６７】
【図３７】以下のことを示す１組のグラフである。（Ａ）検出に用いられるジカ株標的領域およびｃｒＲＮＡ配列（配列番号１６５〜１７０）を示す概略図である。標的のＳＮＰは赤色または青色で強調されており、ガイド配列の合成による不一致は赤色で示されている。（Ｂ）株のＳＮＰを高特異的に検出することで、ＳＨＥＲＬＯＣＫを用いてアフリカジカ株のＲＮＡ標的とアメリカジカ株のＲＮＡ標的を区別することができる（ｎ＝２つの技術的に同じ試料、両側スチューデントｔ−検定；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１；棒は平均±標準誤差を示す）（配列番号１７１〜１７６）。（Ｃ）検出に用いられるデング熱株の標的領域とｃｒＲＮＡ配列を示す概略図である。標的のＳＮＰは赤色または青色で強調されており、ガイド配列の合成による不一致は赤色で示されている。（Ｄ）株のＳＮＰを高特異的に検出することで、ＳＨＥＲＬＯＣＫを用いてデング熱株１のＲＮＡ標的とデング熱株３のＲＮＡ標的を区別することができる（ｎ＝２つの技術的に同じ試料、両側スチューデントｔ−検定；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１；棒は平均±標準誤差を示す）。（図３７）
【００６８】
【図３８】以下のことを示す１組のグラフである。（Ａ）Ｃ２ｃ２で検出したヒトＳＮＰの位置を示すサーコス(Circos)図。（Ｂ）特定の例示的な実施形態によって行ったアッセイはヒトＳＮＰを区別することができる。ＳＨＥＲＬＯＣＫは、ヒトゲノムの４つの異なるＳＮＰ部位で異なる４固体の遺伝子型を正確に同定することができる。各人の遺伝子型、およびアレルを感知するｃｒＲＮＡの同一性は各図の下に注釈として示されている（ｎ＝４つの技術的に同じ試料；両側スチューデントｔ−検定；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１；棒は平均±標準誤差を示す）。（Ｃ）特定の例示的な実施形態によるｃｆＤＮＡの検出過程（癌変異の循環無細胞ＤＮＡ検出など）を示す概略図である。（Ｄ）EGFR L858RおよびBRAF V600Eを検出するための例示的なｃｒＲＮＡ配列（配列番号１７７〜１８２）。循環無細胞ＤＮＡの癌変異についてアッセイした２つのゲノム座位の配列。これらの標的ゲノム配列では、ＳＮＰが青色で強調され、合成による不一致を持つ変異体／野生型感知ｃｒＲＮＡ配列が赤色で示されている。
【００６９】
【図３９】Ｃ２ｃ２が、EGFR L858R（Ｃ）またはBRAF V600E（Ｂ）低頻度アレルに由来する偽循環無細胞ＤＮＡ試料中の変異体低頻度アレルを検出することができることを示す１組のグラフである（ｎ＝４つの技術的に同じ試料、両側スチューデントｔ−検定；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１、＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１；棒は±標準誤差を示す）。
【００７０】
【図４０】以下のことを示す１組のグラフである。（Ａ）アッセイはｒｓ５０８２で遺伝子型を区別することができる（ｎ＝４つの技術的に同じ試料；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１；棒は平均±標準誤差を示す）。（Ｂ）このアッセイは、遠心分離、変性、かつ沸騰させた唾液に直接由来するｇＤＮＡのｒｓ６０１３３８での遺伝子型を区別することができる（ｎ＝３つの技術的に同じ試料；＊、ｐ＜０．０５；棒は平均±標準誤差を示す）。
【００７１】
【図４１】（Ａ）１つの不一致のみがｓｓＤＮＡ１と異なる標的の背景でｓｓＤＮＡ１に行った例示的な実施形態の概略を示す。（Ｂ）このアッセイは、不一致のある背景（１つの不一致のみによりｓｓＤＮＡと異なる標的）の存在下、ｓｓＤＮＡ１を一塩基特異的に検出する。様々な濃度の標的ＤＮＡを１つの不一致を有する過剰な背景ＤＮＡと混合して、アッセイにより検出した。
【００７２】
【図４２】異なる色素Ｃｙ５を持つマスキング構築物により有効な検出を行うことができることを示すグラフである。
【００７３】
【図４３】金ナノ粒子比色分析アッセイの概略図である。ＤＮＡリンカーとＲＮＡブリッジの組み合わせを用いて金ナノ粒子を凝集させる。ＲＮＡ分解酵素活性を加えると、ｓｓＲＮＡブリッジが切断されて、金ナノ粒子が放出され、赤色への特徴的な色変化が生じる。
【００７４】
【図４４】５２０ｎｍで分散したナノ粒子の色変化を検出する能力を示すグラフである。ナノ粒子は、図４３に示す例示的な実施形態に基づき、様々な濃度でＲＮＡ分解酵素Ａを付加して分散させた。
【００７５】
【図４５】ＲＮＡ分解酵素比色分析試験が定量的であることを示すグラフである。
【００７６】
【図４６】分散したナノ粒子の色変化は目視で検出可能であることを示すマイクロウェルプレートの画像である。
【００７７】
【図４７】比色分析の変化は紙の基質で見ることができることを示す画像である。ガラス繊維９３４−ＡＨ表面で、３７℃で１０分間試験を行った。
【００７８】
【図４８】特定の例示的な実施形態によるタンパク質または小分子を検出する高次構造切換アプタマーの概略図である。ＲＮＡ標的エフェクターの完全な標的としてライゲート生成物（Ｂ）を用いる。ＲＮＡ標的エフェクターはライゲートされていない入力物を検出することができない（配列番号２０２および４２４）。
【００７９】
【図４９】アプタマーに基づくライゲーションによりＲＰＡ検出可能な基質を作成することができることを示すゲル画像である。アプタマーを様々な濃度のトロンビンと共にインキュベートして、プローブにライゲートした。３分間のＲＰＡ反応にライゲート構築物を鋳型として用いた。５００ｎＭのトロンビンは、背景よりも非常に高い濃度の増幅された標的を含んでいた。
【００８０】
【図５０】選択されたＣ２ｃ２相同分子種のＨＥＰＮドメインのアミノ酸配列を示す（配列番号２０４〜２３３）。
【００８１】
【図５１】ＲＰＡ増幅を用いたＣａｓ１３ａによるＲＮＡの検出（ＳＨＥＲＬＯＣＫ）は、Ｃａｓ１３ａだけの場合に比べて約２aMまでの濃度でｓｓＲＮＡ標的を検出することができる（ｎ＝４つの技術的に同じ試料；棒は平均±標準誤差を示す）。
【００８２】
【図５２】Ｃａｓ１３ａによる検出を用いてウイルスおよび細菌性病原体を感知することができる。（Ａ）ヒト臨床試料から単離されたＺＩＫＶのＲＮＡのＳＨＥＲＬＯＣＫによる検出の概略である。（Ｂ）ＳＨＥＲＬＯＣＫは、ヒトＺＩＫＶ陽性血清（Ｓ）または尿（Ｕ）試料を非常に高感度に検出することができる。図示のＺＩＫＶのＲＮＡの近似濃度は、定量ＰＣＲにより決定された（ｎ＝４つの技術的に同じ試料、両側スチューデントｔ−検定；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１；棒は平均±標準誤差を示す；ｎ．ｄ．は「未検出」を示す）。
【００８３】
【図５３】プライマー組２（図１１）を用いたＮＡＳＢＡおよびＳＨＥＲＬＯＣＫによるｓｓＲＮＡ１の検出の比較（ｎ＝２つの技術的に同じ試料；棒は平均±標準誤差を示す）。
【００８４】
【図５４−１】ＲＰＡによる核酸増幅および１反応ＳＨＥＲＬＯＣＫ。（Ａ）図１Ｃで用いた希釈液について行ったｓｓＲＮＡ１のデジタル液滴ＰＣＲ定量。ｄｄＰＣＲの結果に基づく希釈液の調節濃度を上の棒グラフに示す。（Ｂ）図１Ｄに用いた希釈液について行ったｓｓＤＮＡ１のデジタル液滴ＰＣＲ定量。ｄｄＰＣＲの結果に基づく希釈液の調節濃度を上の棒グラフに示す。（Ｃ）ＲＰＡ、Ｔ７による転写、およびＣａｓ１３ａによる検出反応は互換性があり、同時にインキュベートした場合にＤＮＡ２の１分子検出を達成する（ｎ＝３つの技術的に同じ試料、両側スチューデントｔ−検定；ｎ．ｓ．は「有意ではない」を示す；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１；棒は平均±標準誤差を示す）。
【図５４−２】ＲＰＡによる核酸増幅および１反応ＳＨＥＲＬＯＣＫ。（Ａ）図１Ｃで用いた希釈液について行ったｓｓＲＮＡ１のデジタル液滴ＰＣＲ定量。ｄｄＰＣＲの結果に基づく希釈液の調節濃度を上の棒グラフに示す。（Ｂ）図１Ｄに用いた希釈液について行ったｓｓＤＮＡ１のデジタル液滴ＰＣＲ定量。ｄｄＰＣＲの結果に基づく希釈液の調節濃度を上の棒グラフに示す。（Ｃ）ＲＰＡ、Ｔ７による転写、およびＣａｓ１３ａによる検出反応は互換性があり、同時にインキュベートした場合にＤＮＡ２の１分子検出を達成する（ｎ＝３つの技術的に同じ試料、両側スチューデントｔ−検定；ｎ．ｓ．は「有意ではない」を示す；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１；棒は平均±標準誤差を示す）。
【００８５】
【図５５−１】ＳＨＥＲＬＯＣＫと他の高感度核酸検出ツールとの比較。（Ａ）デジタル液滴ＰＣＲによる１連のｓｓＤＮＡ１希釈液の検出分析（ｎ＝４つの技術的に同じ試料、両側スチューデントｔ−検定；ｎ．ｓ．は「有意ではない」を示す；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１；赤線は平均を示し、棒は平均±標準誤差を示す。試料は１０−１未満の測定コピー数／μＬのサンプルは図示せず）。（Ｂ）定量ＰＣＲによる１連のｓｓＤＮＡ１希釈液の検出分析（ｎ＝１６つの技術的に同じ試料、両側スチューデントｔ−検定；ｎ．ｓ．は「有意ではない」を示す；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１；赤線は平均を示し、棒は平均±標準誤差を示す。１０−１０未満の相対信号を持つ試料は図示せず）。（Ｃ）SYBR Green IIを用いたＲＰＡによる１連のｓｓＤＮＡ１希釈液の検出分析（ｎ＝４つの技術的に同じ試料、両側スチューデントｔ−検定；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；赤線は平均を示し、棒は平均±標準誤差を示す。１００未満の相対信号を持つ試料は図示せず）。（Ｄ）ＳＨＥＲＬＯＣＫによる１連のｓｓＤＮＡ１希釈液の検出分析（ｎ＝４つの技術的に同じ試料、両側スチューデントｔ−検定；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１；赤線は平均を示し、棒は平均±標準誤差を示す。１００未満の相対信号を持つ試料は図示せず）。（Ｅ）４つの検出方法について１連のｓｓＤＮＡ１希釈液の百分率変動係数。（Ｆ）４つの検出方法について６ｅ２、６ｅ１、６ｅ０、および６ｅ−１のｓｓＤＮＡ１希釈液の平均百分率変動係数（棒は平均±標準誤差を示す）。
【図５５−２】ＳＨＥＲＬＯＣＫと他の高感度核酸検出ツールとの比較。（Ａ）デジタル液滴ＰＣＲによる１連のｓｓＤＮＡ１希釈液の検出分析（ｎ＝４つの技術的に同じ試料、両側スチューデントｔ−検定；ｎ．ｓ．は「有意ではない」を示す；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１；赤線は平均を示し、棒は平均±標準誤差を示す。試料は１０−１未満の測定コピー数／μＬのサンプルは図示せず）。（Ｂ）定量ＰＣＲによる１連のｓｓＤＮＡ１希釈液の検出分析（ｎ＝１６つの技術的に同じ試料、両側スチューデントｔ−検定；ｎ．ｓ．は「有意ではない」を示す；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１；赤線は平均を示し、棒は平均±標準誤差を示す。１０−１０未満の相対信号を持つ試料は図示せず）。（Ｃ）SYBR Green IIを用いたＲＰＡによる１連のｓｓＤＮＡ１希釈液の検出分析（ｎ＝４つの技術的に同じ試料、両側スチューデントｔ−検定；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；赤線は平均を示し、棒は平均±標準誤差を示す。１００未満の相対信号を持つ試料は図示せず）。（Ｄ）ＳＨＥＲＬＯＣＫによる１連のｓｓＤＮＡ１希釈液の検出分析（ｎ＝４つの技術的に同じ試料、両側スチューデントｔ−検定；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１；赤線は平均を示し、棒は平均±標準誤差を示す。１００未満の相対信号を持つ試料は図示せず）。（Ｅ）４つの検出方法について１連のｓｓＤＮＡ１希釈液の百分率変動係数。（Ｆ）４つの検出方法について６ｅ２、６ｅ１、６ｅ０、および６ｅ−１のｓｓＤＮＡ１希釈液の平均百分率変動係数（棒は平均±標準誤差を示す）。
【図５５−３】ＳＨＥＲＬＯＣＫと他の高感度核酸検出ツールとの比較。（Ａ）デジタル液滴ＰＣＲによる１連のｓｓＤＮＡ１希釈液の検出分析（ｎ＝４つの技術的に同じ試料、両側スチューデントｔ−検定；ｎ．ｓ．は「有意ではない」を示す；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１；赤線は平均を示し、棒は平均±標準誤差を示す。試料は１０−１未満の測定コピー数／μＬのサンプルは図示せず）。（Ｂ）定量ＰＣＲによる１連のｓｓＤＮＡ１希釈液の検出分析（ｎ＝１６つの技術的に同じ試料、両側スチューデントｔ−検定；ｎ．ｓ．は「有意ではない」を示す；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１；赤線は平均を示し、棒は平均±標準誤差を示す。１０−１０未満の相対信号を持つ試料は図示せず）。（Ｃ）SYBR Green IIを用いたＲＰＡによる１連のｓｓＤＮＡ１希釈液の検出分析（ｎ＝４つの技術的に同じ試料、両側スチューデントｔ−検定；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；赤線は平均を示し、棒は平均±標準誤差を示す。１００未満の相対信号を持つ試料は図示せず）。（Ｄ）ＳＨＥＲＬＯＣＫによる１連のｓｓＤＮＡ１希釈液の検出分析（ｎ＝４つの技術的に同じ試料、両側スチューデントｔ−検定；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１；赤線は平均を示し、棒は平均±標準誤差を示す。１００未満の相対信号を持つ試料は図示せず）。（Ｅ）４つの検出方法について１連のｓｓＤＮＡ１希釈液の百分率変動係数。（Ｆ）４つの検出方法について６ｅ２、６ｅ１、６ｅ０、および６ｅ−１のｓｓＤＮＡ１希釈液の平均百分率変動係数（棒は平均±標準誤差を示す）。
【図５６】臨床細菌単離物のカルバペネム耐性の検出。肺炎桿菌の５つの臨床単離物に由来する２つの異なるカルバペネム耐性遺伝子（ＫＰＣおよびＮＤＭ−１）の検出と大腸菌対照（ｎ＝４つの技術的に同じ試料、両側スチューデントｔ−検定；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１；棒は平均±標準誤差を示す；ｎ．ｄ．は「未検出」を示す）。
【００８６】
【図５７−１】切断されたスペーサーに対するＬｗＣａｓ１３ａの感度と標的配列中の１つの不一致の解析。（Ａ）は（Ｂ）〜（Ｇ）で用いた切断されたスペーサーｃｒＲＮＡ配列（配列番号４２５〜４３６）である。また、赤色で示された一塩基対の違いを持つｓｓＲＮＡ１とｓｓＲＮＡ２の配列が示されている。合成による不一致を含むｃｒＲＮＡは、赤色の不一致の位置と共に示されている。（Ｂ）位置１〜７に合成による不一致を持つ２８ヌクレオチド（ｎｔ）のスペーサーｃｒＲＮＡのｓｓＲＮＡ１および２に対する副次切断活性（ｎ＝４つの技術的に同じ試料；棒は平均±標準誤差を示す）。（Ｃ）（Ｂ）で試験したｃｒＲＮＡの特異性比率。標的ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ１）副次切断の非標的ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ２）副次切断に対する比として特異性比率を算出する（ｎ＝４つの技術的に同じ試料；棒は平均±標準誤差を示す）。（Ｄ）位置１〜７に合成による不一致を有する２３ｎｔのスペーサーｃｒＲＮＡのｓｓＲＮＡ１および２に対する副次切断活性（ｎ＝４つの技術的に同じ試料；棒は平均±標準誤差を示す）。（Ｅ）（Ｄ）で試験したｃｒＲＮＡの特異性比率。標的ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ１）の副次切断の非標的ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ２）の副次切断に対する比として特異性比率を算出する（ｎ＝４つの技術的に同じ試料；棒は平均±標準誤差を示す）。（Ｆ）位置１〜７に合成による不一致を有する２０ｎｔのスペーサーｃｒＲＮＡのｓｓＲＮＡ１およびｓｓＲＮＡ２に対する副次切断活性（ｎ＝４つの技術的に同じ試料；棒は平均±標準誤差を示す）。（Ｇ）（Ｆ）で試験したｃｒＲＮＡの特異性比率。標的ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ１）の副次切断の非標的ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ２）の副次切断に対する比として特異性比率を算出する（ｎ＝４つの技術的に同じ試料；棒は平均±標準誤差を示す）。
【図５７−２】切断されたスペーサーに対するＬｗＣａｓ１３ａの感度と標的配列中の１つの不一致の解析。（Ａ）は（Ｂ）〜（Ｇ）で用いた切断されたスペーサーｃｒＲＮＡ配列（配列番号４２５〜４３６）である。また、赤色で示された一塩基対の違いを持つｓｓＲＮＡ１とｓｓＲＮＡ２の配列が示されている。合成による不一致を含むｃｒＲＮＡは、赤色の不一致の位置と共に示されている。（Ｂ）位置１〜７に合成による不一致を持つ２８ヌクレオチド（ｎｔ）のスペーサーｃｒＲＮＡのｓｓＲＮＡ１および２に対する副次切断活性（ｎ＝４つの技術的に同じ試料；棒は平均±標準誤差を示す）。（Ｃ）（Ｂ）で試験したｃｒＲＮＡの特異性比率。標的ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ１）副次切断の非標的ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ２）副次切断に対する比として特異性比率を算出する（ｎ＝４つの技術的に同じ試料；棒は平均±標準誤差を示す）。（Ｄ）位置１〜７に合成による不一致を有する２３ｎｔのスペーサーｃｒＲＮＡのｓｓＲＮＡ１および２に対する副次切断活性（ｎ＝４つの技術的に同じ試料；棒は平均±標準誤差を示す）。（Ｅ）（Ｄ）で試験したｃｒＲＮＡの特異性比率。標的ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ１）の副次切断の非標的ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ２）の副次切断に対する比として特異性比率を算出する（ｎ＝４つの技術的に同じ試料；棒は平均±標準誤差を示す）。（Ｆ）位置１〜７に合成による不一致を有する２０ｎｔのスペーサーｃｒＲＮＡのｓｓＲＮＡ１およびｓｓＲＮＡ２に対する副次切断活性（ｎ＝４つの技術的に同じ試料；棒は平均±標準誤差を示す）。（Ｇ）（Ｆ）で試験したｃｒＲＮＡの特異性比率。標的ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ１）の副次切断の非標的ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ２）の副次切断に対する比として特異性比率を算出する（ｎ＝４つの技術的に同じ試料；棒は平均±標準誤差を示す）。
【図５７−３】切断されたスペーサーに対するＬｗＣａｓ１３ａの感度と標的配列中の１つの不一致の解析。（Ａ）は（Ｂ）〜（Ｇ）で用いた切断されたスペーサーｃｒＲＮＡ配列（配列番号４２５〜４３６）である。また、赤色で示された一塩基対の違いを持つｓｓＲＮＡ１とｓｓＲＮＡ２の配列が示されている。合成による不一致を含むｃｒＲＮＡは、赤色の不一致の位置と共に示されている。（Ｂ）位置１〜７に合成による不一致を持つ２８ヌクレオチド（ｎｔ）のスペーサーｃｒＲＮＡのｓｓＲＮＡ１および２に対する副次切断活性（ｎ＝４つの技術的に同じ試料；棒は平均±標準誤差を示す）。（Ｃ）（Ｂ）で試験したｃｒＲＮＡの特異性比率。標的ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ１）副次切断の非標的ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ２）副次切断に対する比として特異性比率を算出する（ｎ＝４つの技術的に同じ試料；棒は平均±標準誤差を示す）。（Ｄ）位置１〜７に合成による不一致を有する２３ｎｔのスペーサーｃｒＲＮＡのｓｓＲＮＡ１および２に対する副次切断活性（ｎ＝４つの技術的に同じ試料；棒は平均±標準誤差を示す）。（Ｅ）（Ｄ）で試験したｃｒＲＮＡの特異性比率。標的ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ１）の副次切断の非標的ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ２）の副次切断に対する比として特異性比率を算出する（ｎ＝４つの技術的に同じ試料；棒は平均±標準誤差を示す）。（Ｆ）位置１〜７に合成による不一致を有する２０ｎｔのスペーサーｃｒＲＮＡのｓｓＲＮＡ１およびｓｓＲＮＡ２に対する副次切断活性（ｎ＝４つの技術的に同じ試料；棒は平均±標準誤差を示す）。（Ｇ）（Ｆ）で試験したｃｒＲＮＡの特異性比率。標的ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ１）の副次切断の非標的ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ２）の副次切断に対する比として特異性比率を算出する（ｎ＝４つの技術的に同じ試料；棒は平均±標準誤差を示す）。
【図５７−４】切断されたスペーサーに対するＬｗＣａｓ１３ａの感度と標的配列中の１つの不一致の解析。（Ａ）は（Ｂ）〜（Ｇ）で用いた切断されたスペーサーｃｒＲＮＡ配列（配列番号４２５〜４３６）である。また、赤色で示された一塩基対の違いを持つｓｓＲＮＡ１とｓｓＲＮＡ２の配列が示されている。合成による不一致を含むｃｒＲＮＡは、赤色の不一致の位置と共に示されている。（Ｂ）位置１〜７に合成による不一致を持つ２８ヌクレオチド（ｎｔ）のスペーサーｃｒＲＮＡのｓｓＲＮＡ１および２に対する副次切断活性（ｎ＝４つの技術的に同じ試料；棒は平均±標準誤差を示す）。（Ｃ）（Ｂ）で試験したｃｒＲＮＡの特異性比率。標的ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ１）副次切断の非標的ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ２）副次切断に対する比として特異性比率を算出する（ｎ＝４つの技術的に同じ試料；棒は平均±標準誤差を示す）。（Ｄ）位置１〜７に合成による不一致を有する２３ｎｔのスペーサーｃｒＲＮＡのｓｓＲＮＡ１および２に対する副次切断活性（ｎ＝４つの技術的に同じ試料；棒は平均±標準誤差を示す）。（Ｅ）（Ｄ）で試験したｃｒＲＮＡの特異性比率。標的ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ１）の副次切断の非標的ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ２）の副次切断に対する比として特異性比率を算出する（ｎ＝４つの技術的に同じ試料；棒は平均±標準誤差を示す）。（Ｆ）位置１〜７に合成による不一致を有する２０ｎｔのスペーサーｃｒＲＮＡのｓｓＲＮＡ１およびｓｓＲＮＡ２に対する副次切断活性（ｎ＝４つの技術的に同じ試料；棒は平均±標準誤差を示す）。（Ｇ）（Ｆ）で試験したｃｒＲＮＡの特異性比率。標的ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ１）の副次切断の非標的ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ２）の副次切断に対する比として特異性比率を算出する（ｎ＝４つの技術的に同じ試料；棒は平均±標準誤差を示す）。
【００８７】
【図５８−１】標的配列の変異に対する理想的な合成による不一致の位置の同定。（Ａ）理想的な合成による不一致の位置を評価してｓｓＲＮＡ１とｓｓＲＮＡ２との変異を検出するための配列（配列番号４３７〜４６２）。これら標的のそれぞれにおいて、赤色の位置に合成による不一致を有するｃｒＲＮＡを試験した。合成による不一致を有するｃｒＲＮＡの各組は、変異位置がスペーサーの配列に対してずれるように設計されている。スペーサーは、スペーサー内の位置３、４、５、および６で変異を評価するように設計されている。（Ｂ）様々な位置に合成による不一致を有するｃｒＲＮＡのｓｓＲＮＡ１および２に対する副次切断活性。スペーサー：標的二本鎖領域内の位置３、４、５、または６に変異を有する４組のｃｒＲＮＡが存在する（ｎ＝４つの技術的に同じ試料；棒は平均±標準誤差を示す）。（Ｃ）（Ｂ）で試験したｃｒＲＮＡの特異性比率。標的ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ１）の副次切断の非標的ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ２）の副次切断に対する比として特異性比率を算出する（ｎ＝４つの技術的に同じ試料；棒は平均±標準誤差を示す）。
【図５８−２】標的配列の変異に対する理想的な合成による不一致の位置の同定。（Ａ）理想的な合成による不一致の位置を評価してｓｓＲＮＡ１とｓｓＲＮＡ２との変異を検出するための配列（配列番号４３７〜４６２）。これら標的のそれぞれにおいて、赤色の位置に合成による不一致を有するｃｒＲＮＡを試験した。合成による不一致を有するｃｒＲＮＡの各組は、変異位置がスペーサーの配列に対してずれるように設計されている。スペーサーは、スペーサー内の位置３、４、５、および６で変異を評価するように設計されている。（Ｂ）様々な位置に合成による不一致を有するｃｒＲＮＡのｓｓＲＮＡ１および２に対する副次切断活性。スペーサー：標的二本鎖領域内の位置３、４、５、または６に変異を有する４組のｃｒＲＮＡが存在する（ｎ＝４つの技術的に同じ試料；棒は平均±標準誤差を示す）。（Ｃ）（Ｂ）で試験したｃｒＲＮＡの特異性比率。標的ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ１）の副次切断の非標的ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ２）の副次切断に対する比として特異性比率を算出する（ｎ＝４つの技術的に同じ試料；棒は平均±標準誤差を示す）。
【００８８】
【図５９】追加の座位でのＳＨＥＲＬＯＣＫによる遺伝子型決定および沸騰させた唾液からの直接遺伝子型決定。ＳＨＥＲＬＯＣＫにより、遠心分離、変性、かつ沸騰させた唾液から直接由来するゲノムＤＮＡのｒｓ６０１３３８のＳＮＰ部位で遺伝子型を区別することができる（ｎ＝４つの技術的に同じ試料、両側スチューデントｔ−検定；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊＊、ｐ＜０．００１；棒は平均±標準誤差を示す）。
【００８９】
【図６０−１】ヒトのＳＮＰの遺伝子型を正確に決定する合成遺伝子型決定基準の開発。（Ａ）ｒｓ６０１３３８のＳＮＰ部位でＳＨＥＲＬＯＣＫにより遺伝子型を決定し、４人のそれぞれについてＰＣＲで増幅した遺伝子型基準と比較した（ｎ＝４つの技術的に同じ試料；棒は平均±標準誤差を示す）。（Ｂ）ｒｓ４３６３６５７のＳＮＰ部位でＳＨＥＲＬＯＣＫにより遺伝子型を決定し、４人のそれぞれについてＰＣＲで増幅した遺伝子型基準と比較した（ｎ＝４つの技術的に同じ試料；棒は平均±標準誤差を示す）。（Ｃ）ｒｓ６０１３３８のＳＮＰ部位での各人のＳＨＥＲＬＯＣＫの結果と合成基準とで計算したｐ値のヒートマップ。アレルを感知するｃｒＲＮＡのそれぞれについてヒートマップを示す。カラーのヒートマップは、有意でないもの（ｐ＞０．０５）は赤色に、有意なもの（ｐ＜０．０５）は青色になるように目盛りが設けられている（ｎ＝４つの技術的に同じ試料、一元配置分散分析）。（Ｄ）ｒｓ４３６３６５７のＳＮＰ部位での各人のＳＨＥＲＬＯＣＫの結果と合成基準とで計算したｐ値のヒートマップ。アレルを感知するｃｒＲＮＡのそれぞれについてヒートマップを示す。カラーのヒートマップは、有意でないもの（ｐ＞０．０５）は赤色に、有意なもの（ｐ＜０．０５）は青色になるように目盛りが設けられている（ｎ＝４つの技術的に同じ試料、一元配置分散分析）。（Ｅ）ＳＨＥＲＬＯＣＫによる遺伝子型決定のｐ値のヒートマップを理解するための指針である。固体とアレル合成基準とのｐ値が０．０５より大きいｐ値に対応するアレルを選択することで容易に遺伝子型を決定することができる。赤色のブロックは、合成基準と固体のＳＨＥＲＬＯＣＫの結果との差が有意ではないものに対応し、従って遺伝子型陽性の結果に対応する。青色のブロックは、合成基準と固体のＳＨＥＲＬＯＣＫの結果との差が有意なものに対応し、従って遺伝子型陰性の結果に対応する。
【図６０−２】ヒトのＳＮＰの遺伝子型を正確に決定する合成遺伝子型決定基準の開発。（Ａ）ｒｓ６０１３３８のＳＮＰ部位でＳＨＥＲＬＯＣＫにより遺伝子型を決定し、４人のそれぞれについてＰＣＲで増幅した遺伝子型基準と比較した（ｎ＝４つの技術的に同じ試料；棒は平均±標準誤差を示す）。（Ｂ）ｒｓ４３６３６５７のＳＮＰ部位でＳＨＥＲＬＯＣＫにより遺伝子型を決定し、４人のそれぞれについてＰＣＲで増幅した遺伝子型基準と比較した（ｎ＝４つの技術的に同じ試料；棒は平均±標準誤差を示す）。（Ｃ）ｒｓ６０１３３８のＳＮＰ部位での各人のＳＨＥＲＬＯＣＫの結果と合成基準とで計算したｐ値のヒートマップ。アレルを感知するｃｒＲＮＡのそれぞれについてヒートマップを示す。カラーのヒートマップは、有意でないもの（ｐ＞０．０５）は赤色に、有意なもの（ｐ＜０．０５）は青色になるように目盛りが設けられている（ｎ＝４つの技術的に同じ試料、一元配置分散分析）。（Ｄ）ｒｓ４３６３６５７のＳＮＰ部位での各人のＳＨＥＲＬＯＣＫの結果と合成基準とで計算したｐ値のヒートマップ。アレルを感知するｃｒＲＮＡのそれぞれについてヒートマップを示す。カラーのヒートマップは、有意でないもの（ｐ＞０．０５）は赤色に、有意なもの（ｐ＜０．０５）は青色になるように目盛りが設けられている（ｎ＝４つの技術的に同じ試料、一元配置分散分析）。（Ｅ）ＳＨＥＲＬＯＣＫによる遺伝子型決定のｐ値のヒートマップを理解するための指針である。固体とアレル合成基準とのｐ値が０．０５より大きいｐ値に対応するアレルを選択することで容易に遺伝子型を決定することができる。赤色のブロックは、合成基準と固体のＳＨＥＲＬＯＣＫの結果との差が有意ではないものに対応し、従って遺伝子型陽性の結果に対応する。青色のブロックは、合成基準と固体のＳＨＥＲＬＯＣＫの結果との差が有意なものに対応し、従って遺伝子型陰性の結果に対応する。
【００９０】
【図６１】小さな画分の不一致のある背景標的としてのｓｓＤＮＡ１の検出。ヒトゲノムＤＮＡの背景で１連の希釈のｓｓＤＮＡ１をＳＨＥＲＬＯＣＫで検出した。なお、検出されたｓｓＤＮＡ１標的と背景ゲノムＤＮＡとの間には配列類似性はなかった（ｎ＝２つの技術的に同じ試料；棒は平均±標準誤差を示す）。
【００９１】
【図６２】ジカウイルス患者由来の尿（Ａ）または血清（Ｂ）試料を９５℃（尿）または６５℃（血清）で５分間、熱で不活性化した。一例示的な実施形態により、１マイクロリットルの不活性尿または血清を２時間のＲＰＡ反応の入力として用いて、その後で３時間のＣ２ｃ２／Ｃａｓ１３ａ検出反応を行った。エラーバーは、検出反応のｎ＝４つの技術的に同じ試料に基づいて１標準偏差（ＳＤ）を示している。
【００９２】
【図６３】ジカウイルス患者由来の尿試料を９５℃で５分間、熱で不活性化した。例示的な実施形態により、１マイクロリットルの不活性化尿を３０分間のＲＰＡ反応の入力として用いて、（Ａ）３時間または（Ｂ）１時間後にＣ２ｃ２／Ｃａｓ１３検出反応を行った。エラーバーは、検出反応のｎ＝４つの技術的に同じ試料に基づいて１ＳＤを示している。
【００９３】
【図６４】ジカウイルス患者由来の尿試料を９５℃で５分間、熱で不活性化した。１マイクロリットルの不活性化尿を２０分間のＲＰＡ反応の入力として用いて、その後で１時間のＣ２ｃ２／Ｃａｓ１３ａ検出反応を行った。健康なヒトの尿を陰性対照として用いた。エラーバーは、検出反応のｎ＝４つの技術的に同じ試料に基づいて１ＳＤを示している。
【００９４】
【図６５】ジカウイルス患者由来の尿試料を９５℃で５分間、熱で不活性化した。１マイクロリットルの不活性化尿を２０分間のＲＰＡ反応の入力として用いて、その後でガイドＲＮＡの存在下または非存在下で１時間のＣ２ｃ２／Ｃａｓ１３ａ検出反応を行った。ガイドなしの検出反応の平均蛍光値を、ガイドを含む検出反応から除去することでデータを正規化している。健康なヒトの尿を陰性対照として用いた。エラーバーは、検出反応のｎ＝４つの技術的に同じ試料に基づいて１ＳＤを示している。
【００９５】
【図６６】例示的な実施形態による４つの異なるガイドＲＮＡ設計を有する２つのマラリア特異的標的の検出を示す（配列番号４６３〜４７４）。
【００９６】
【図６７】分節ＬＣＭＶゲノムに沿った設計ガイドＲＮＡの位置を示す。ガイドRNA S1~S6はMCMV S RNAに相補性がある（そのうち、Ｓ１およびＳ６は、それぞれ５’非翻訳領域（untranslated region、ＵＴＲ）および３’非翻訳領域に結合している）。ガイドRNA L1~L6はMCMV L RNAに相補性がある（そのうち、Ｌ１およびＬ６は、それぞれ５’非翻訳領域および３’非翻訳領域に結合している）。すべてのガイドＲＮＡはコード鎖に結合する。
【００９７】
【図６８】Ｃａｓ１３ａおよびＬＣＭＶ特異的ガイドＲＮＡの発現により、細胞培養物中のＬＣＭＶ複製が増加する。Ａ）ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞に対してＣａｓ１３ａを発現しているプラスミドと、ＬＣＭＶを標的する一本鎖ガイドＲＮＡまたは非標的対照による形質移入を行った。形質移入の２４時間後、ＬＣＭＶで細胞を多重感染度５で感染させた。感染の４８時間後、培養物の上澄み中のウイルスＲＮＡにＲＴ−定量ＰＣＲを行い、ウイルス力価を測定した。Ｂ）ウイルス複製の阻害。空のベクター、非標的＃１および非標的＃２を陰性対照と見なす。Ｓ１〜Ｓ５およびＬ１〜Ｌ６はＬＣＭＶゲノムの様々な領域を標的する。エラーバーは、ｎ＝３〜６の生物学的に同じ試料に基づく１標準偏差を示している。
【００９８】
【図６９】ウイルス複製の阻害。ＬＣＭＶに感染させた哺乳類２９３ＦＴ細胞を示されたＣ２ｃ２およびガイドプラスミドで形質移入した。表は、１マイクロリットル当たりのゲノム当量としてＲＴ−定量ＰＣＲ値を表しており、棒は形質移入された各ガイドプラスミドを表す。空のベクター、非標的＃１および非標的＃２を陰性対照と見なす。Ｓ１〜Ｓ５およびＬ１〜Ｌ６はＬＣＭＶゲノムの様々な領域を標的する。エラーバーは、ｎ＝６の生物学的に同じ試料に基づく１標準偏差を示している。
【００９９】
【図７０】複数のガイドの組合せにより、ＬＣＭＶ複製のＣａｓ１３ａ媒介阻害が増加する。ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を、Ｃａｓ１３ａを発現しているプラスミドおよびＬＣＭＶを標的する１種以上のガイドＲＮＡまたは非標的対照で形質移入する。形質移入の２４時間後、多重感染度５でＬＣＭＶ感染を行い、感染の４８時間後に培養物上澄み中のウイルスＲＮＡをＲＴ−ｑＰＣＲしてウイルス力価を測定した。空のベクター、非標的＃１および非標的＃２を陰性対照と見なす。エラーバーは、ｎ＝６の生物学的に同じ試料に基づく１標準偏差を示している。[００１００]
【図７１】ウイルス複製を低減するガイドの画分。すべてのガイドについて、ＬＣＭＶ感染４８時間後の平均緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）蛍光度を３つの同じ試料から算出した。各ＬＣＭＶ標的ガイドの倍率変化を、対照ガイドとＬＣＭＶ標的ガイドを比べた平均蛍光の比として算出した。両側対応なし検定を用いてｐ値を算出した。標的ガイドは、ｐ値が０．０５以下、倍率変化（ＦＣ）が２以上の任意のガイドと見なす。この円グラフは、ＬＣＭＶの４種のタンパク質の非コード領域およびコード領域に対応する楔形により、表に示されたデータをプロットしている。残りのガイドは、ｐ値およびＦＣ閾値を満たさないＬＣＭＶ標的ガイドである。
【０１００】
【図７２】標的ガイドの標的効率分布。ｐ値の閾値０．０５を満たすガイドについて、（対照ガイドとＬＣＭＶ標的ガイドを比べた）ＧＦＰ蛍光の倍率変化の分布を示す。このグラフには示されていないが、８個のガイドはＧＦＰ蛍光度の低下が５０倍超であった（＊８個のガイドは５０倍超の低減を示した）。
【０１０１】
【図７３】対照（空のガイドベクター）に比べてＧＦＰの低減（すなわち、ＬＣＭＶ複製）を示すＬコード領域を標的するガイド（＃１０４）の代表的な画像（各ガイドについて３つの同じ試料）を示す。画像は、ＬＣＭＶ感染４８時間後に４倍の倍率で撮影された。倍率変化が２．７２、ｐ値が０．０４７であった。
【０１０２】
【図７４】ｐ値の閾値の０．０５および倍率変化の閾値の２を満たすすべてのガイドについて、感染４８時間後の対照ガイドとＬＣＭＶ標的ガイドを比べたＧＦＰ蛍光の倍率変化を示す。ｘ軸の各位置は、ＬＣＭＶの完全なゲノム画面で試験したガイドである。この閾値を満たさないガイドは１としてプロットした。背景ノイズ以下の蛍光を持つ任意のガイドの倍率変化は、観察された最大倍率変化として設定されている。
【０１０３】
【図７５】Ｃａｓ１３ａによる診断法は、ジカウイルスの核酸を高感度に検出することができる。ジカウイルスｃＤＮＡを健康なヒトの尿および水で連続希釈して、内因性ヒトＲＮＡ分解酵素を不活性化し、ＳＨＥＲＬＯＣＫ試験規約を用いてウイルスｃＤＮＡを定量した（ａ）。また、患者の尿または血清由来のいくつかのｃＤＮＡ試料を試験した（ｂ）。ガイドＲＮＡの組合せを用いてジカウイルス大流行時に異なる国から採取した患者の試料を区別した（ｃ）。エラーバーは１標準偏差を示す。略語：ＤＯＭ＝ドミニカ共和国、ＤＯＭＵＳＡ＝ドミニカ共和国・米国、ＨＮＤ＝ホンジュラス、ＵＳＡ＝米国。
【０１０４】
【図７６】特定の例示的な実施形態によるジカの１コピー検出を示すグラフである。
【０１０５】
【図７７−１】ジカウイルス特異的ＲＰＡプライマーおよびジカウイルス特異的ｃｒＲＮＡを用いたＳＨＥＲＬＯＣＫ法によるジカｃＤＮＡ（ａ）、ＲＮＡ（ｂ）、およびウイルス粒子（ｃ）の検出限界を示す。エラーバーは、３つの技術的に同じ試料の１標準偏差を示している。どの入力も、水または尿にヌクレアーゼを含まない水を加えたものではなかった。
【図７７−２】ジカウイルス特異的ＲＰＡプライマーおよびジカウイルス特異的ｃｒＲＮＡを用いたＳＨＥＲＬＯＣＫ法によるジカｃＤＮＡ（ａ）、ＲＮＡ（ｂ）、およびウイルス粒子（ｃ）の検出限界を示す。エラーバーは、３つの技術的に同じ試料の１標準偏差を示している。どの入力も、水または尿にヌクレアーゼを含まない水を加えたものではなかった。
【図７７−３】ジカウイルス特異的ＲＰＡプライマーおよびジカウイルス特異的ｃｒＲＮＡを用いたＳＨＥＲＬＯＣＫ法によるジカｃＤＮＡ（ａ）、ＲＮＡ（ｂ）、およびウイルス粒子（ｃ）の検出限界を示す。エラーバーは、３つの技術的に同じ試料の１標準偏差を示している。どの入力も、水または尿にヌクレアーゼを含まない水を加えたものではなかった。
【０１０６】
【図７８−１】パネルＡはウイルス試料中の一塩基変異を検出する概略図である。パネルＢは、ＳＨＥＲＬＯＣＫ法で試験した３つのＳＮＰのゲノム位置を示す概略図である。パネルＣは、２０１５年のジカウイルス大流行時に生じたＳＮＰをＳＮＰが生じた地域と共に表すグラフを示す。パネルＤは、１時間の変異体ｃＲＮＡと野生型ｃＲＮＡとの蛍光度の比を示す。パネルＥは、ｃｒＲＮＡのそれぞれに対する各試料について、図７８Ｄで示した蛍光度の比をｌｏｇ２に変換して示すヒートマップである。０より大きい値は変異多様体の存在を示している。パネルＦは、Ｓ１３９Ｎ多様体を持つデータを示すグラフである。濃い影付きの棒は、Ｓ１３９Ｎ標的ｃｒＲＮＡを検出反応に用いた場合に測定された蛍光度を示し、薄い影付きの棒は、Ｎ１３９Ｓ標的ｃｒＲＮＡを用いた場合に測定された蛍光度を示す。エラーバーは、３つの技術的に同じ試料について１ＳＤを示す。
【図７８−２】パネルＡはウイルス試料中の一塩基変異を検出する概略図である。パネルＢは、ＳＨＥＲＬＯＣＫ法で試験した３つのＳＮＰのゲノム位置を示す概略図である。パネルＣは、２０１５年のジカウイルス大流行時に生じたＳＮＰをＳＮＰが生じた地域と共に表すグラフを示す。パネルＤは、１時間の変異体ｃＲＮＡと野生型ｃＲＮＡとの蛍光度の比を示す。パネルＥは、ｃｒＲＮＡのそれぞれに対する各試料について、図７８Ｄで示した蛍光度の比をｌｏｇ２に変換して示すヒートマップである。０より大きい値は変異多様体の存在を示している。パネルＦは、Ｓ１３９Ｎ多様体を持つデータを示すグラフである。濃い影付きの棒は、Ｓ１３９Ｎ標的ｃｒＲＮＡを検出反応に用いた場合に測定された蛍光度を示し、薄い影付きの棒は、Ｎ１３９Ｓ標的ｃｒＲＮＡを用いた場合に測定された蛍光度を示す。エラーバーは、３つの技術的に同じ試料について１ＳＤを示す。
【図７８−３】パネルＡはウイルス試料中の一塩基変異を検出する概略図である。パネルＢは、ＳＨＥＲＬＯＣＫ法で試験した３つのＳＮＰのゲノム位置を示す概略図である。パネルＣは、２０１５年のジカウイルス大流行時に生じたＳＮＰをＳＮＰが生じた地域と共に表すグラフを示す。パネルＤは、１時間の変異体ｃＲＮＡと野生型ｃＲＮＡとの蛍光度の比を示す。パネルＥは、ｃｒＲＮＡのそれぞれに対する各試料について、図７８Ｄで示した蛍光度の比をｌｏｇ２に変換して示すヒートマップである。０より大きい値は変異多様体の存在を示している。パネルＦは、Ｓ１３９Ｎ多様体を持つデータを示すグラフである。濃い影付きの棒は、Ｓ１３９Ｎ標的ｃｒＲＮＡを検出反応に用いた場合に測定された蛍光度を示し、薄い影付きの棒は、Ｎ１３９Ｓ標的ｃｒＲＮＡを用いた場合に測定された蛍光度を示す。エラーバーは、３つの技術的に同じ試料について１ＳＤを示す。
【図７８−４】パネルＡはウイルス試料中の一塩基変異を検出する概略図である。パネルＢは、ＳＨＥＲＬＯＣＫ法で試験した３つのＳＮＰのゲノム位置を示す概略図である。パネルＣは、２０１５年のジカウイルス大流行時に生じたＳＮＰをＳＮＰが生じた地域と共に表すグラフを示す。パネルＤは、１時間の変異体ｃＲＮＡと野生型ｃＲＮＡとの蛍光度の比を示す。パネルＥは、ｃｒＲＮＡのそれぞれに対する各試料について、図７８Ｄで示した蛍光度の比をｌｏｇ２に変換して示すヒートマップである。０より大きい値は変異多様体の存在を示している。パネルＦは、Ｓ１３９Ｎ多様体を持つデータを示すグラフである。濃い影付きの棒は、Ｓ１３９Ｎ標的ｃｒＲＮＡを検出反応に用いた場合に測定された蛍光度を示し、薄い影付きの棒は、Ｎ１３９Ｓ標的ｃｒＲＮＡを用いた場合に測定された蛍光度を示す。エラーバーは、３つの技術的に同じ試料について１ＳＤを示す。
【０１０７】
【図７９−１】パネルＡは、多血清型デング熱ＳＨＥＲＬＯＣＫパネルがどのように作用するかを示す概略図である。パネルＢでは、ｘ軸の各目盛りは、ＳＨＥＲＬＯＣＫ反応の入力として用いられたｇブロック鋳型を示す。紫色のそれぞれの影は、血清型に特異的なｃｒＲＮＡを示す。エラーバーは、３つの技術的に同じ試料について１ＳＤを示す。パネルＣは、ｌｏｇ１０目盛りの蛍光度として（ｂ）でプロットされたバーの別の表示である。
【図７９−２】パネルＡは、多血清型デング熱ＳＨＥＲＬＯＣＫパネルがどのように作用するかを示す概略図である。パネルＢでは、ｘ軸の各目盛りは、ＳＨＥＲＬＯＣＫ反応の入力として用いられたｇブロック鋳型を示す。紫色のそれぞれの影は、血清型に特異的なｃｒＲＮＡを示す。エラーバーは、３つの技術的に同じ試料について１ＳＤを示す。パネルＣは、ｌｏｇ１０目盛りの蛍光度として（ｂ）でプロットされたバーの別の表示である。
【０１０８】
【図８０−１】パネルＡは、フラビウイルスのＳＨＥＲＬＯＣＫパネルがどのように作用するかを示す概略図である。パネルＢでは、ｘ軸の各目盛りはＳＨＥＲＬＯＣＫ反応の入力に用いられたｇブロック鋳型を示す。パネルＣでは、ｘ軸の各目盛りは、ＳＨＥＲＬＯＣＫ反応の入力として用いられて共感染を検出するＳＨＥＲＬＯＣＫの能力を模倣する２つのｇブロック鋳型を示す。交互に示されている白色のブロックと灰色のブロックでは、各棒は、各ブロックに保存されたZIKV crRNA、WNV crRNA、DENV crRNA、およびYFV crRNAの順で試験したガイドから得られた蛍光度である。パネルＢおよびＣでは、それぞれの色は、ウイルスに特異的なｃｒＲＮＡを示している。エラーバーは、３つの技術的に同じ試料について１ＳＤを示す。
【図８０−２】パネルＡは、フラビウイルスのＳＨＥＲＬＯＣＫパネルがどのように作用するかを示す概略図である。パネルＢでは、ｘ軸の各目盛りはＳＨＥＲＬＯＣＫ反応の入力に用いられたｇブロック鋳型を示す。パネルＣでは、ｘ軸の各目盛りは、ＳＨＥＲＬＯＣＫ反応の入力として用いられて共感染を検出するＳＨＥＲＬＯＣＫの能力を模倣する２つのｇブロック鋳型を示す。交互に示されている白色のブロックと灰色のブロックでは、各棒は、各ブロックに保存されたZIKV crRNA、WNV crRNA、DENV crRNA、およびYFV crRNAの順で試験したガイドから得られた蛍光度である。パネルＢおよびＣでは、それぞれの色は、ウイルスに特異的なｃｒＲＮＡを示している。エラーバーは、３つの技術的に同じ試料について１ＳＤを示す。
【０１０９】
【図８１】パネルＡおよびＢはそれぞれ、図８０Ｂおよび図８０Ｃの棒グラフに示した測定蛍光度の別の表示である。勾配は、３時間後のｌｏｇ１０目盛りの蛍光度である。
【０１１０】
【図８２Ａ−Ｃ】臨床試料および蚊の供給源由来の高感度ＺＩＫＶ検出。（Ａ）臨床試料に適用したＳＨＥＲＬＯＣＫの概略図である。臨床試料から核酸を抽出して、標的分子をリコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）により増幅する。ＲＰＡの前にＲＮＡ試料を逆転写（ＲＴ）する。ＲＰＡ生成物を（dsDNA RPA生成物の生体外転写について）T7 RNAポリメラーゼ、精製Ｃａｓ１３ａ、ｃｒＲＮＡ、および切断されると蛍光を発するＲＮＡレポーターを含む反応を用いて検出た。（Ｂ）２０１６年のＺＩＫＶ大流行時に採取した４０個の試料に対してＳＨＥＲＬＯＣＫを試験した。２０分のＲＰＡ反応および１時間のＣａｓ１３ａ検出によりｃＤＮＡにＳＨＥＲＬＯＣＫを行った。青色の破線は、ＺＩＫＶの有無に関する閾値を示している（詳細は「方法」を参照のこと）。（Ｃ）ＳＨＥＲＬＯＣＫの蛍光度と増幅産物ＰＣＲ収率との比較。（Ｂ）で示した４０個のZIKV cDNA試料に対してＳＨＥＲＬＯＣＫおよび増幅産物ＰＣＲを行った。増幅産物ＰＣＲ収率は、ＺＩＫＶゲノムのタイル（オーバーラップした配列）になっているプライマー供給源を用いる２つの個別の増幅反応の最少濃度（ｎｇ／μＬ）である。破線は、ＺＩＫＶの有無を決定する閾値を示す。青色はＳＨＥＲＬＯＣＫ、赤色は増幅産物ＰＣＲである。ベン図は、各方法についてこれらの閾値を満たす試料の数を示している。場合によっては、データ点がほとんど重なっており、括弧内の数字によって示されている。Ｎ．Ｄ．は「未検出」である。
【０１１１】
【図８３Ａ−Ｃ】尿からのZIKV cDNA、ＲＮＡ、および粒子の直接検出。（Ａ）ＳＨＥＲＬＯＣＫを用いた未処理の健康なヒトの尿（赤色）で希釈したZIKV cDNAの検出。（Ｂ）ＳＨＥＲＬＯＣＫを用いた未処理（赤色）または処理済み（青色）の健康なヒトの尿で希釈したZIKV RNAの検出。（Ｃ）ＳＨＥＲＬＯＣＫを用いたＰＢＳ（灰色）または未処理の健康なヒトの尿（赤色）で希釈したＺＩＫＶ粒子の検出。未希釈のウイルス保存液を黒色で示している。ほとんどの希釈試料および入力なしについて３時間の蛍光度を示す（はめ込み）。すべてのパネルにおいて、試料をＴＣＥＰ／ＥＤＴＡで処理して、加熱し、希釈直後にウイルスとＲＮＡ分解酵素の両方を不活性化した。熱処理の長さは、概略図に示されている。エラーバーは、３つの技術的に同じ試料について１ＳＤを示す。
【０１１２】
【図８４Ａ−Ｂ】ＳＨＥＲＬＯＣＫパネルはウイルス種および血清型を区別することができる。（Ａ） ＳＨＥＲＬＯＣＫを用いた４種の関連するフラビウイルスの検出。（Ｂ）棒グラフおよびヒートマップの両方にそれぞれのウイルスに対する各ｃｒＲＮＡの３時間後の標的に特異的な蛍光度を示す。（Ｃ）１つの試料中に２種のウイルス標的が存在する場合の３時間後の標的に特異的な蛍光度を示す。（Ｄ）ＳＨＥＲＬＯＣＫを用いたＤＥＮＶ血清型１〜４の検出。（Ｅ）ＤＥＮＶ血清型のそれぞれに対する血清型に特異的なｃｒＲＮＡの３時間後の標的に特異的な蛍光度を示す。標的に特異的な蛍光度は、入力なしのｃｒＲＮＡの蛍光度に対する各標的のｃｒＲＮＡに対する蛍光度である。すべてのパネルで、エラーバーは３つの技術的に同じ試料について１ＳＤを示す。
【図８４Ｃ】ＳＨＥＲＬＯＣＫパネルはウイルス種および血清型を区別することができる。（Ａ） ＳＨＥＲＬＯＣＫを用いた４種の関連するフラビウイルスの検出。（Ｂ）棒グラフおよびヒートマップの両方にそれぞれのウイルスに対する各ｃｒＲＮＡの３時間後の標的に特異的な蛍光度を示す。（Ｃ）１つの試料中に２種のウイルス標的が存在する場合の３時間後の標的に特異的な蛍光度を示す。（Ｄ）ＳＨＥＲＬＯＣＫを用いたＤＥＮＶ血清型１〜４の検出。（Ｅ）ＤＥＮＶ血清型のそれぞれに対する血清型に特異的なｃｒＲＮＡの３時間後の標的に特異的な蛍光度を示す。標的に特異的な蛍光度は、入力なしのｃｒＲＮＡの蛍光度に対する各標的のｃｒＲＮＡに対する蛍光度である。すべてのパネルで、エラーバーは３つの技術的に同じ試料について１ＳＤを示す。
【図８４Ｄ−Ｅ】ＳＨＥＲＬＯＣＫパネルはウイルス種および血清型を区別することができる。（Ａ） ＳＨＥＲＬＯＣＫを用いた４種の関連するフラビウイルスの検出。（Ｂ）棒グラフおよびヒートマップの両方にそれぞれのウイルスに対する各ｃｒＲＮＡの３時間後の標的に特異的な蛍光度を示す。（Ｃ）１つの試料中に２種のウイルス標的が存在する場合の３時間後の標的に特異的な蛍光度を示す。（Ｄ）ＳＨＥＲＬＯＣＫを用いたＤＥＮＶ血清型１〜４の検出。（Ｅ）ＤＥＮＶ血清型のそれぞれに対する血清型に特異的なｃｒＲＮＡの３時間後の標的に特異的な蛍光度を示す。標的に特異的な蛍光度は、入力なしのｃｒＲＮＡの蛍光度に対する各標的のｃｒＲＮＡに対する蛍光度である。すべてのパネルで、エラーバーは３つの技術的に同じ試料について１ＳＤを示す。
【０１１３】
【図８５Ａ−Ｂ】大流行に由来する適応および機能的ＺＩＫＶ変異の同定。（Ａ）ＳＨＥＲＬＯＣＫアッセイがどのようにＳＮＰ同定に対して設計されているかを示す概略図である。淡色を用いて祖先のｃｒＲＮＡを示し、濃色を用いて由来ｃｒＲＮＡを示す。（Ｂ）２０１６年のＺＩＫＶ大流行由来の３つのＳＮＰに対するＳＨＥＲＬＯＣＫアッセイ。本出願人は、ＳＮＰのそれぞれのゲノム位置と、その進化の関係を記載する簡略化した系統樹を示す。（Ｃ）合成標的を用いたＳＮＰ同定試験。３つの地域に特異的なＳＮＰのそれぞれについて、由来ｃｒＲＮＡ（濃色）および祖先ｃｒＲＮＡ（淡色）の蛍光値を示す。（Ｄ）２０１６年のＺＩＫＶ大流行に由来する試料中の地域に特異的なＳＮＰの同定。３つのＳＮＰ同定アッセイを用いて、ドミニカ共和国（ＤＯＭ）、米国（ＵＳＡ）、およびホンジュラス（ＨＮＤ）由来のｃＤＮＡ試料を評価した。本出願人は、各ＳＮＰと各試料について蛍光度の比（由来ｃｒＲＮＡの蛍光度を祖先ｃｒＲＮＡの蛍光で除したもの）を示す。（Ｅ）ヒートマップとして（Ｄ）のデータをｌｏｇ２に変換した表示である。（Ｆ）小頭症に関連したＺＩＫＶのＳＮＰの同定。（Ｃ）同様、濃色は由来ｃｒＲＮＡを示し、淡色は祖先ｃｒＲＮＡを示す。すべてのパネルで、エラーバーは３つの技術的に同じ試料について１ＳＤを示す。
【図８５Ｃ−Ｆ】大流行に由来する適応および機能的ＺＩＫＶ変異の同定。（Ａ）ＳＨＥＲＬＯＣＫアッセイがどのようにＳＮＰ同定に対して設計されているかを示す概略図である。淡色を用いて祖先のｃｒＲＮＡを示し、濃色を用いて由来ｃｒＲＮＡを示す。（Ｂ）２０１６年のＺＩＫＶ大流行由来の３つのＳＮＰに対するＳＨＥＲＬＯＣＫアッセイ。本出願人は、ＳＮＰのそれぞれのゲノム位置と、その進化の関係を記載する簡略化した系統樹を示す。（Ｃ）合成標的を用いたＳＮＰ同定試験。３つの地域に特異的なＳＮＰのそれぞれについて、由来ｃｒＲＮＡ（濃色）および祖先ｃｒＲＮＡ（淡色）の蛍光値を示す。（Ｄ）２０１６年のＺＩＫＶ大流行に由来する試料中の地域に特異的なＳＮＰの同定。３つのＳＮＰ同定アッセイを用いて、ドミニカ共和国（ＤＯＭ）、米国（ＵＳＡ）、およびホンジュラス（ＨＮＤ）由来のｃＤＮＡ試料を評価した。本出願人は、各ＳＮＰと各試料について蛍光度の比（由来ｃｒＲＮＡの蛍光度を祖先ｃｒＲＮＡの蛍光で除したもの）を示す。（Ｅ）ヒートマップとして（Ｄ）のデータをｌｏｇ２に変換した表示である。（Ｆ）小頭症に関連したＺＩＫＶのＳＮＰの同定。（Ｃ）同様、濃色は由来ｃｒＲＮＡを示し、淡色は祖先ｃｒＲＮＡを示す。すべてのパネルで、エラーバーは３つの技術的に同じ試料について１ＳＤを示す。
【０１１４】
【図８６】ＳＨＥＲＬＯＣＫは高感度でZIKV cDNAを検出することができる。本出願人は、ZIKV cDNAの連続希釈液について２０分のＲＰＡと１時間の検出を行った後のＳＨＥＲＬＯＣＫ蛍光値を示す。エラーバーは、３つの技術的に同じ試料について１ＳＤを示す。この実験では、ＲＮＡ分解酵素Alert v1 (IDT)をＲＮＡレポーターとして用いた。
【０１１５】
【図８７Ａ】（Ａ〜Ｄ）２０１６年のＺＩＫＶ大流行由来の４０個のｃＤＮＡ試料について１時間後のＳＨＥＲＬＯＣＫ蛍光度データ。試料名は、採取国、試料採取年、試料の名前、および試料の種類を示している。試料の種類は、ＰＬＡ：血漿試料、ＳＥＲ：血清試料、ＵＲＩ：尿試料、ＭＯＳ：蚊の供給源として示されている。採取国は、略語ＨＮＤ：ホンジュラス、ＤＯＭ：ドミニカ共和国、ＵＳＡ：米国で示されている。エラーバーは、３つの技術的に同じ試料について１ＳＤを示す。各プロットに示されている陽性対照（紫色）は培養したウイルス種保存液（ＰＥ２４３）である。陰性対照は橙色で示されている。
【図８７Ｂ】（Ａ〜Ｄ）２０１６年のＺＩＫＶ大流行由来の４０個のｃＤＮＡ試料について１時間後のＳＨＥＲＬＯＣＫ蛍光度データ。試料名は、採取国、試料採取年、試料の名前、および試料の種類を示している。試料の種類は、ＰＬＡ：血漿試料、ＳＥＲ：血清試料、ＵＲＩ：尿試料、ＭＯＳ：蚊の供給源として示されている。採取国は、略語ＨＮＤ：ホンジュラス、ＤＯＭ：ドミニカ共和国、ＵＳＡ：米国で示されている。エラーバーは、３つの技術的に同じ試料について１ＳＤを示す。各プロットに示されている陽性対照（紫色）は培養したウイルス種保存液（ＰＥ２４３）である。陰性対照は橙色で示されている。
【図８７Ｃ】（Ａ〜Ｄ）２０１６年のＺＩＫＶ大流行由来の４０個のｃＤＮＡ試料について１時間後のＳＨＥＲＬＯＣＫ蛍光度データ。試料名は、採取国、試料採取年、試料の名前、および試料の種類を示している。試料の種類は、ＰＬＡ：血漿試料、ＳＥＲ：血清試料、ＵＲＩ：尿試料、ＭＯＳ：蚊の供給源として示されている。採取国は、略語ＨＮＤ：ホンジュラス、ＤＯＭ：ドミニカ共和国、ＵＳＡ：米国で示されている。エラーバーは、３つの技術的に同じ試料について１ＳＤを示す。各プロットに示されている陽性対照（紫色）は培養したウイルス種保存液（ＰＥ２４３）である。陰性対照は橙色で示されている。
【図８７Ｄ】（Ａ〜Ｄ）２０１６年のＺＩＫＶ大流行由来の４０個のｃＤＮＡ試料について１時間後のＳＨＥＲＬＯＣＫ蛍光度データ。試料名は、採取国、試料採取年、試料の名前、および試料の種類を示している。試料の種類は、ＰＬＡ：血漿試料、ＳＥＲ：血清試料、ＵＲＩ：尿試料、ＭＯＳ：蚊の供給源として示されている。採取国は、略語ＨＮＤ：ホンジュラス、ＤＯＭ：ドミニカ共和国、ＵＳＡ：米国で示されている。エラーバーは、３つの技術的に同じ試料について１ＳＤを示す。各プロットに示されている陽性対照（紫色）は培養したウイルス種保存液（ＰＥ２４３）である。陰性対照は橙色で示されている。
【０１１６】
【図８８Ａ】増幅産物ＰＣＲプライマー供給源データおよび閾値化。（Ａ）各ｃＤＮＡ試料について、２つの増幅産物ＰＣＲプライマー供給源のそれぞれのｎｇ／μＬ濃度（Agilent tapestationで測定）の散布図。場合によってはデータ点がほとんど重なっており、それらは括弧内の数字によって示されている。Ｎ．Ｄ．は「未検出」である。陽性対照（紫色の十字）は培養したウイルス種保存液（ＰＥ２４３）であり、陰性対照（橙色の×）は１つの入力なし対照と、１提供者の４つの健康な尿試料を含む。（Ｂ）最近のジカ配列決定の成果(Metsky et al. 2017)に由来するゲノムのカバレッジに対する増幅産物ＰＣＲ収率（ｎｇ／μｌ）の散布図。増幅産物ＰＣＲ収率は、２つの増幅産物ＰＣＲ供給源の最低増幅産物ＤＮＡ濃度（Agilent tapestationにより測定）により規定される。ゲノムのカバレッジは１に対して正規化されている。配列決定ライブラリーの技術的に同じ試料を個別の円で示している。（Ｃ）本出願人は、精度（真陽性および偽陽性の和で除した真陽性）、再現率（感度）、および増幅産物ＰＣＲ収率の閾値を変化させるためのＦ０．５統計値を示す。Ｆ０．５統計値が最大になるように増幅産物ＰＣＲ収率の閾値を選択した。
【図８８Ｂ】増幅産物ＰＣＲプライマー供給源データおよび閾値化。（Ａ）各ｃＤＮＡ試料について、２つの増幅産物ＰＣＲプライマー供給源のそれぞれのｎｇ／μＬ濃度（Agilent tapestationで測定）の散布図。場合によってはデータ点がほとんど重なっており、それらは括弧内の数字によって示されている。Ｎ．Ｄ．は「未検出」である。陽性対照（紫色の十字）は培養したウイルス種保存液（ＰＥ２４３）であり、陰性対照（橙色の×）は１つの入力なし対照と、１提供者の４つの健康な尿試料を含む。（Ｂ）最近のジカ配列決定の成果(Metsky et al. 2017)に由来するゲノムのカバレッジに対する増幅産物ＰＣＲ収率（ｎｇ／μｌ）の散布図。増幅産物ＰＣＲ収率は、２つの増幅産物ＰＣＲ供給源の最低増幅産物ＤＮＡ濃度（Agilent tapestationにより測定）により規定される。ゲノムのカバレッジは１に対して正規化されている。配列決定ライブラリーの技術的に同じ試料を個別の円で示している。（Ｃ）本出願人は、精度（真陽性および偽陽性の和で除した真陽性）、再現率（感度）、および増幅産物ＰＣＲ収率の閾値を変化させるためのＦ０．５統計値を示す。Ｆ０．５統計値が最大になるように増幅産物ＰＣＲ収率の閾値を選択した。
【図８８Ｃ】増幅産物ＰＣＲプライマー供給源データおよび閾値化。（Ａ）各ｃＤＮＡ試料について、２つの増幅産物ＰＣＲプライマー供給源のそれぞれのｎｇ／μＬ濃度（Agilent tapestationで測定）の散布図。場合によってはデータ点がほとんど重なっており、それらは括弧内の数字によって示されている。Ｎ．Ｄ．は「未検出」である。陽性対照（紫色の十字）は培養したウイルス種保存液（ＰＥ２４３）であり、陰性対照（橙色の×）は１つの入力なし対照と、１提供者の４つの健康な尿試料を含む。（Ｂ）最近のジカ配列決定の成果(Metsky et al. 2017)に由来するゲノムのカバレッジに対する増幅産物ＰＣＲ収率（ｎｇ／μｌ）の散布図。増幅産物ＰＣＲ収率は、２つの増幅産物ＰＣＲ供給源の最低増幅産物ＤＮＡ濃度（Agilent tapestationにより測定）により規定される。ゲノムのカバレッジは１に対して正規化されている。配列決定ライブラリーの技術的に同じ試料を個別の円で示している。（Ｃ）本出願人は、精度（真陽性および偽陽性の和で除した真陽性）、再現率（感度）、および増幅産物ＰＣＲ収率の閾値を変化させるためのＦ０．５統計値を示す。Ｆ０．５統計値が最大になるように増幅産物ＰＣＲ収率の閾値を選択した。
【０１１７】
【図８９】熱および化学処理を用いたＲＮＡ分解酵素の不活性化。ＲＮＡ分解酵素Ａの１：４の連続希釈液（１μｇ／ｍｌ）または健康なヒトの尿を、最終濃度がそれぞれ１００ｍＭと１ｍＭのＴＣＥＰとＥＤＴＡで処理した。試料を９５℃で１０分間インキュベートして、ＲＮＡ分解酵素Alert v1 (IDT)を各試料に加え、蛍光度を監視してヌクレアーゼ活性を決定した。３７℃のインキュベーションの１時間後の蛍光値を示す。エラーバーは、３つの技術的に同じ試料について１ＳＤを示す。
【０１１８】
【図９０Ａ】（Ａ）尿の前処理によりＳＨＥＲＬＯＣＫで高感度なＲＮＡ検出を行うことができる。本出願人は、水で希釈したＲＮＡ（青色）および９５℃で１０分間１００ｍＭのＴＣＥＰと１ｍＭのＥＤＴＡで前処理した尿で希釈したＲＮＡ（薄紅色）を１時間検出した後の蛍光度データを示す。（Ｂ）担体のＲＮＡはＳＨＥＲＬＯＣＫ感度を向上させない。本出願人は、１００ｎｇの担体のＲＮＡの存在下または非存在下で部分的に不活性化した健康なヒトの尿でZIKV RNAを希釈した（詳細は「方法」の項を参照のこと）。（Ａ）同様、１時間の検出を用いた。エラーバーは、３つの技術的に同じ試料について１ＳＤを示す。
【図９０Ｂ】（Ａ）尿の前処理によりＳＨＥＲＬＯＣＫで高感度なＲＮＡ検出を行うことができる。本出願人は、水で希釈したＲＮＡ（青色）および９５℃で１０分間１００ｍＭのＴＣＥＰと１ｍＭのＥＤＴＡで前処理した尿で希釈したＲＮＡ（薄紅色）を１時間検出した後の蛍光度データを示す。（Ｂ）担体のＲＮＡはＳＨＥＲＬＯＣＫ感度を向上させない。本出願人は、１００ｎｇの担体のＲＮＡの存在下または非存在下で部分的に不活性化した健康なヒトの尿でZIKV RNAを希釈した（詳細は「方法」の項を参照のこと）。（Ａ）同様、１時間の検出を用いた。エラーバーは、３つの技術的に同じ試料について１ＳＤを示す。
【０１１９】
【図９１】低温でのＲＮＡ分解酵素の不活性化。本出願人は２工程の熱による不活性化試験規約で試験を行い、健康なヒトの尿を５０℃で２０分間、その後９５℃で５分間インキュベートした。５０℃の工程の後、９５℃の工程の前にＲＮＡを尿で希釈した。エラーバーは、３つの技術的に同じ試料について１ＳＤを示す。
【０１２０】
【図９２】フラビウイルスの経時変化を示すパネル。各パネルは、各フラビウイルス標的および入力なし対照に対するウイルス特異的なｃｒＲＮＡの背景補正済み蛍光度を示す。蛍光度は、５分間毎に蛍光度測定した３時間の経時変化を示している。エラーバーは、３つの技術的に同じ試料について１ＳＤを示す。
【０１２１】
【図９３】フラビウイルス共感染の経時変化を示す。パネル各パネルは、２種のフラビウイルス標的を含む試料に対するすべてのｃｒＲＮＡの背景補正済み蛍光度を示す。蛍光度は、５分間毎に蛍光度測定した３時間の経時変化を示している。また、各パネルは、入力なし対照に対する各ｃｒＲＮＡで観察された背景補正済み蛍光度を含む。エラーバーは、３つの技術的に同じ試料について１ＳＤを示す。
【０１２２】
【図９４】デング熱の経時変化のパネル。各パネルは、すべてのＤＥＮＶ血清型および入力なし対照に対するＤＥＮＶ血清型に特異的なｃｒＲＮＡの背景補正済み蛍光度を示す。蛍光度は、５分間毎に蛍光度測定した３時間の経時変化を示している。エラーバーは、３つの技術的に同じ試料について１ＳＤを示す。
【０１２３】
【図９５】ＳＮＰ設計予定。本出願人は、ＳＨＥＲＬＯＣＫによるＳＮＰ同定アッセイを設計、構築、および試験するのに必要な工程を示す。合計所要時間は１週間未満である。
【０１２４】
【図９６】別のｃｒＲＮＡ設計によるＺＩＫＶ小頭症関連ＳＮＰの識別。このＳＮＰはｃｒＲＮＡの７番目の位置にあり、このｃｒＲＮＡに導入された合成による不一致はない。濃色は由来ｃｒＲＮＡを示し、淡色は祖先ｃｒＲＮＡを示す。エラーバーは、３つの技術的に同じ試料について１ＳＤを示す。
【０１２５】
【図９７】ＳＨＥＲＬＯＣＫアッセイは、ＨＩＶ逆転写酵素における６つの薬物耐性変異を同定することができる。本出願人は、ＳＮＰ同定指標を示す。この指標は、由来鋳型の蛍光度の比を祖先の鋳型の蛍光度の比で除して算出される（詳細は「方法」の項を参照のこと）。祖先アレルと由来アレルを区別する能力がない場合はこの指標は１に等しく、２つのアレルを区別する能力が高ければ指標も高くなる。エラーバーは、３つの技術的に同じ試料について１ＳＤを示す。
【０１２６】
【図９８】ＳＨＥＲＬＯＣＫはＺＩＫＶ  ｃＤＮＡを高感度で検出することができることを示す図である。ＺＩＫＶ  ｃＤＮＡの連続希釈液を２０分間のＲＰＡ、１時間の検出を行った後のＳＨＥＲＬＯＣＫ蛍光値を示す。０．９aMの感度は、２aM＝１ｃｐ／μｌとして１コピー感度に相当し、２μｌの試料を入力として用いた。エラーバーは、３つの技術的に同じ試料について１ＳＤを示す。
【０１２７】
【図９９】患者試料および臨床単離物に由来するＺＩＫＶとＤＥＮＶの検出を示す。（Ａ）ＳＨＥＲＬＯＣＫの概略図。核酸を臨床試料から抽出し、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかを（ＲＴ−ＲＰＡまたＲＰＡ）入力として用いてＲＰＡにより標的を増幅する。T7 RNAポリメラーゼ、Ｃａｓ１３、標的特異的ｃｒＲＮＡ、および切断されると蛍光を発するＲＮＡレポーターを含む反応でＲＰＡ生成物を検出する。（Ｂ）２０１５年〜２０１６年のＺＩＫＶ大流行時に採取した３７個の患者試料に由来するｃＤＮＡおよび（Ｃ）AltonaRealStarジカウイルスＲＴ−ＰＣＲアッセイで１対１の比較をした１６個の患者試料に由来するｃＤＮＡについてＳＨＥＲＬＯＣＫで試験した。＋：ＺＩＫＶ種保存液ｃＤＮＡ（３×１０２ｃｐ／μｌ）、×：入力なし。（Ｄ）２４個のＤＥＮＶ陽性患者試料および臨床単離物由来のＲＮＡに行ったＳＨＥＲＬＯＣＫ。青色の破線は、ＺＩＫＶまたはＤＥＮＶの有無を示す閾値である（「方法」を参照のこと）。
【０１２８】
【図１００】ＳＨＥＲＬＯＣＫと他の核酸増幅試験の比較を示す。（Ａ）ＳＨＥＲＬＯＣＫとAltonaRealStarジカウイルスＲＴ−ＰＣＲアッセイの結果、（Ｂ）ＳＨＥＲＬＯＣＫとAltonaRealStarジカウイルスＲＴ−ＰＣＲアッセイ、Hologic Aptimaジカウイルスアッセイの結果を比較したベン図を示す。
【０１２９】
【図１０１】ＳＨＥＲＬＯＣＫおよび他の診断方法で標的したＺＩＫＶゲノムの領域の概略図である。ＰＣＲ増幅産物はＺＩＫＶゲノム全体のタイルになっているが、ＳＨＥＲＬＯＣＫ  ＺＩＫＶアッセイは短い増幅産物を有するＺＩＫＶゲノムの１つの領域のみを標的する。AltonaRealStar RT-PCRアッセイおよびHologic Aptima TMAアッセイもまた、ＺＩＫＶゲノムの個々の短い増幅産物を標的する（これら増幅産物の位置および大きさは独占所有権があるので概略図では示していない）。ＰＣＲプライマーによって増幅することができない非常に断片化されたＲＮＡ（生成物の長さが約４００ｎｔ）を含む臨床試料を有する可能性がある。逆に、約１２０ｎｔのＳＨＥＲＬＯＣＫ増幅産物を含まない部分ＺＩＫＶゲノムを含む臨床試料を有する可能性がある。
【０１３０】
【図１０２】４つのＤＥＮＶ血清型に由来するＲＮＡに対する汎デング熱ＳＨＥＲＬＯＣＫの検出限界を示すグラフである。（Ａ〜Ｄ）合成鋳型由来のDENV RNAの連続希釈液に２０分のＲＰＡおよび１時間の検出を行った後のＳＨＥＲＬＯＣＫの蛍光度値。１μｌの試料を入力として用いた。エラーバーは、３つの技術的に同じ試料について１ＳＤを示す。
【０１３１】
【図１０３】患者試料および臨床単離物に適用した汎デング熱ＳＨＥＲＬＯＣＫ汎デング熱ＳＨＥＲＬＯＣＫを示す。（Ａ）ＤＥＮＶ血清型によって示される２４個の試料および４つの保存液から抽出したＲＮＡの汎デング熱ＳＨＥＲＬＯＣＫ蛍光度。（Ｂ〜Ｄ）１時間Ｃａｓ１３検出した１４個のヒト血清試料（Ｂ）、１時間Ｃａｓ１３検出した１０個の培養臨床単離物（Ｃ）、および１時間Ｃａｓ１３検出した４つのＤＥＮＶ種保存液（Ｄ）から抽出したＲＮＡの汎デング熱ＳＨＥＲＬＯＣＫ蛍光度。
【０１３２】
【図１０４】ＨＵＤＳＯＮおよびＳＨＥＲＬＯＣＫによる体液中のＺＩＫＶとＤＥＮＶの直接検出。（Ａ）ＨＵＤＳＯＮおよびＳＨＥＲＬＯＣＫを用いた直接ウイルス検出の概略図。（Ｂ〜Ｃ）健康なヒト血清（桃色、Ｂ）または健康なヒト唾液（青色、Ｃ）で希釈した粒子中のZIKV RNAの検出。実験を一緒に行ったので、ＡおよびＢと同じＰＢＳ対照を用いた。（Ｄ）健康なヒトの尿（黄色）で希釈した粒子中のZIKV RNAの検出。黒色：未希釈のウイルス保存液。灰色：ＰＢＳでの希釈液。エラーバーは、３つの技術的に同じ試料について１ＳＤを示す。（Ｅ〜Ｆ）患者の血清（Ｅ）および唾液試料（Ｆ）から直接由来するDENV RNAの検出。（Ｇ）（Ｅ〜Ｆ）に示す試料に由来するＤＥＮＶの側流(lateral flow)検出。すべての試料は、加熱前にＴＣＥＰ／ＥＤＴＡで処理した。
【０１３３】
【図１０５】血液生成物に直接由来するZIKV cDNAのＳＨＥＲＬＯＣＫを用いた検出を示すグラフである。ZIKV cDNAは、健康なヒトの全血（赤色）、健康なヒトの血漿（紫色）、健康なヒト血清（桃色）、または水（灰色）で希釈した。希釈の直後に、体液を５０℃で５分間、次いで６４℃で５分間、１００ｍＭのＴＣＥＰと１ｍＭのＥＤＴＡで処理した。エラーバーは、３つの技術的に同じ試料について１ＳＤを示す。
【０１３４】
【図１０６】唾液から直接由来するZIKV cDNAのＳＨＥＲＬＯＣＫを用いた検出を示すグラフである。ZIKV cDNAは 健康なヒト唾液（青色）または水（灰色）で希釈した。希釈の直後に、体液を５０℃で５分間、次いで６４℃で５分間、１００ｍＭのＴＣＥＰと１ｍＭのＥＤＴＡで処理した。エラーバーは、３つの技術的に同じ試料について１ＳＤを示す。
【０１３５】
【図１０７】ＲＮＡ分解酵素による全血、血漿、および尿の急速な不活性化を示すグラフである。健康なヒトの全血、血漿、および尿を表示の通り希釈して５０℃で５分間１００ｍＭのＴＣＥＰと１ｍＭのＥＤＴＡで不活性化した。３７℃で１時間インキュベーションした後、ＲＮＡ分解酵素Alert v2 (Thermo)を用いて２Ｕ／μｌのMurine RNA分解酵素阻害剤(NEB)の存在下でＲＮＡ分解酵素の活性を測定した。各条件に対して２つの技術的に同じ試料（橙色および黒色の棒）が示されている。
【０１３６】
【図１０８】全血で希釈したジカウイルスの検出を示すグラフである。１時間の検出後、健康なヒトの全血（赤色）で希釈した粒子中のZIKV RNAを検出した。試料を１００ｍＭのＴＣＥＰと１ｍＭのＥＤＴＡと共に５０℃で５分間、次いで６４℃で５分間加熱した。実験を一緒に行ったので、図１０４Ａおよび図１０４Ｂと同じＰＢＳ対照を用いた。エラーバーは、３つの技術的に同じ試料について１ＳＤを示す。
【０１３７】
【図１０９】体温の熱による体液の不活性化を示すグラフである。健康なヒトの全血、血清、唾液、および尿を表示の通り希釈して、３７℃で２０分間１００ｍＭのＴＣＥＰと１ｍＭのＥＤＴＡで不活性化した。３７℃で１時間インキュベーションした後、ＲＮＡ分解酵素Alert v2 (Thermo)を用いて２Ｕ／μｌのMurine RNA分解酵素阻害剤(NEB)の存在下でＲＮＡ分解酵素の活性を測定した。各条件に対して２つの技術的に同じ試料（橙色および黒色の棒）が示されている。
【０１３８】
【図１１０】全血、血清、および唾液で希釈したデング熱ウイルスの検出を示すグラフである。検出の１時間後、健康なヒトの全血（赤色、Ａ）、血清（桃色、Ｂ）、または健康なヒトの唾液（青色、Ｃ）で希釈した粒子中のDENV RNAを検出した。試料を３７℃で２０分間、６４℃で５分間加熱して、１００ｍＭのＴＣＥＰと１ｍＭのＥＤＴＡで不活性化した。実験を一緒に行ったため、すべてのパネルで同じＰＢＳ対照を用いた。１ｍｌ当たりのフォーカス形成単位（ＦＦＵ／ｍｌ）でＤＥＮＶ滴定濃度が示されている。エラーバーは、３つの技術的に同じ試料について１ＳＤを示す。
【０１３９】
【図１１１】デング熱の臨床試料ＲＮＡ血清型の棒グラフを示す。（Ａ〜Ｄ）１つのＤＥＮＶ１試料（Ａ）、２つのＤＥＮＶ２試料およびＤＥＮＶ２とＤＥＮＶ３が存在する２つの試料（Ｂ）、４つのＤＥＮＶ３試料（Ｃ）、および３つのＤＥＮＶ４試料（Ｄ）に由来する抽出ＲＮＡで試験した血清型を区別するＳＨＥＲＬＯＣＫによるＤＥＮＶパネル。Ｃａｓ１３検出の３時間後の蛍光値が示されている。エラーバーは、３つの技術的に同じ試料について１ＳＤを示す。
【０１４０】
【図１１２】順応および機能的ＺＩＫＶ変異の同定を示す。（Ａ）ＳＮＰ同定のためのＳＨＥＲＬＯＣＫアッセイ。濃色：由来ｃｒＲＮＡ、淡色：祖先ｃｒＲＮＡ。（Ｂ〜Ｃ）２０１５年〜２０１６年のＺＩＫＶ大流行に由来する３つの地域に特異的なＳＮＰであり、ＳＮＰのゲノム位置と簡略化した系統樹を含む。これらのＳＮＰは合成標的（１０４ｃｐ／μｌ）およびウイルス種保存液ｃＤＮＡ（３×１０２ｃｐ／μｌ）を用いて試験した。（Ｄ〜Ｅ）ドミニカ共和国（ＤＯＭ）、米国（ＵＳＡ）、およびホンジュラス（ＨＮＤ）に由来するZIKV cDNA試料中の地域に特異的なＳＮＰの同定。各試料中のそれぞれのＳＮＰについて蛍光度の比（由来ｃｒＲＮＡの蛍光度を祖先ｃｒＲＮＡの蛍光度で除したもの）を棒グラフに示す（ヒートマップにはｌｏｇ２に変換したデータ）。（Ｆ）新規なＳＮＰについてＳＨＥＲＬＯＣＫアッセイを開発するための予定（さらなる詳細は図１１３を参照のこと）。（Ｇ〜Ｈ）蛍光度と比色検出による小頭症関連ＺＩＫＶ変異(PrM S139N)の同定。すべてのパネルで、エラーバーは３つの技術的に同じ試料について１ＳＤを示す。
【０１４１】
【図１１３】ＳＮＰの設計予定を示す。本出願人は、ＳＨＥＲＬＯＣＫによるＳＮＰ同定アッセイを設計、構築、および試験するのに必要な工程を示す。合計所要時間は１週間未満である。
【０１４２】
【図１１４】尿で希釈したジカウイルスの側流検出を視覚的な読み出しにより示す。尿で希釈したジカウイルスの側流検出を示す（図１０４Ｃ）。上部バンドは試験バンドであり、底部バンドは対照バンドである。弱いバンドは、１時間の検出後、ＰＢＳと尿の両方で希釈した１マイクロリットル当たり１０個のコピーで視覚化される。［発明の詳細な説明］  一般的な定義
【０１４３】
特に断りがなければ、本明細書で用いられる技術用語および科学用語は、本開示が関連する一般の当業者によって共通して理解されるのと同じ意味である。分子生物学の一般的な用語および技術用語の定義は以下に見つけられることがある：Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition（分子クローニング：実験マニュアル第２版） (1989) (Sambrook, Fritsch, and Maniatis); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th edition（分子クローニング：実験マニュアル第４版） (2012) (Green and brook); Current Protocols in Molecular Biology（分子生物学の現在のプロトコル） (1987) (F.M. Ausubel et al. eds.); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach （ＰＣＲ２：実践方法）(1995) (M.J. MacPherson, B.D. Hames, and G.R. Taylor eds.): Antibodies, A Laboraotry Manual（抗体、実験マニュアル） (1988) (Harlow and Lane, eds.): Antibodies A Laboraotry Manual, 2nd edition（抗体、実験マニュアル第２版） 2013 (E.A. Greenfield ed.); Animal Cell Culture（動物細胞の培養） (1987) (R.I. Freshney, ed.); Benjamin Lewin, Genes IX, published by Jones and Bartlet, 2008 (ISBN 0763752223); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology（分子生物学辞典）, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0632021829); Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference（分子生物学とバイオテクノロジー：総合的な卓上参考書）, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 9780471185710); Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed.（微生物学・分子生物学辞典第２版）, J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994), March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4th ed.（上級有機化学反応、機構、および構造第４版）, John Wiley & Sons (New York, N.Y. 1992); and Marten H. Hofker and Jan van Deursen, Transgenic Mouse Methods and Protocols, 2nd edition（遺伝子組換えマウス、方法とプロトコル第２版） (2011) 。
【０１４４】
本明細書で用いられるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈から明らかにそうでないことが示されていなければ、対象の単数と複数の両方を含む。
【０１４５】
用語「任意の」または「任意に」は、続いて記載された事象が起きても起こらなくてもよく、またその記載がその事象や状況が起こる場合と起こらない場合を含むことを意味する。
【０１４６】
端点による数値範囲の記述は、それぞれの範囲内に含まれるすべての数と画分、ならびに列挙された端点を含む。
【０１４７】
本明細書で用いられる「約」または「ほぼ」は、パラメータ、量、継続時間など、測定可能な値を述べる場合、その変形が開示される発明を実行するのに適切である限り、指定した値とその変形、例えば指定した値とその±１０％以下、±５％以下、±１％以下、および±０．１％以下の値を包含することを意味する。自明であるが、修飾語「約」または「ほぼ」が付いている値は、具体的に開示されることが好ましい。
【０１４８】
本明細書を通じて「１つの態様」、「一実施形態」、「一例示的な実施形態」への言及は、その実施形態に関連して記載された特定の特徴、構造、または特徴は本発明の少なくとも一態様に含まれることを意味する。従って、本明細書を通して様々な箇所で用いられる表現「１つの態様で」、「一実施形態で」、または「一例示的な実施形態」は、一見すると必ずしもすべて同じ実施形態を指しているわけではないが、そういう場合もある。さらに、当業者には本開示から自明であるが、１つ以上の実施形態において特定の特徴、構造、または特性を任意の好適な方法で組み合わせてもよい。さらに、本明細書で記載する実施形態によっては、他の実施形態に含まれるいくつかの特徴を含むが、他の特徴は含まず、異なる実施形態の特徴の組合せは本発明の範囲内にあることを意味する。例えば、添付の請求項において、主張した実施形態の何れかを任意の組合せで用いてもよい。
【０１４９】
本明細書で引用されたすべての出版物、出版された特許文献、および特許出願は、同程度に参照により本明細書に組み込まれるが、個々の出版物、出版された特許文献、または特許出願は参照により組み込まれるものとして具体的かつ個別に示された。
概説
【０１５０】
細菌のクラスター化短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）およびＣＲＩＳＰＲ関連（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ）順応免疫系は、Ｃａｓ９およびＣｐｆ１などのプログラム可能なエンドヌクレアーゼを含む(Shmakov et al., 2017; Zetsche et al., 2015)。Ｃａｓ９およびＣｐｆ１はいずれもＤＮＡを標的するが、近年、単体エフェクターであるＲＮＡ誘導ＲＮＡ分解酵素（Ｃ２ｃ２を含む）が発見され(Shmakov et al., 2015)、特性が明らかにされており(Abudayyeh et al., 2016; Smargon et al., 2017)、これによって特定のＲＮＡを感知する仕組みが提供されている。ＲＮＡ誘導ＲＮＡ分解酵素は、CRISPR RNA(crRNA)を用いて容易かつ簡便に再プログラムすることができ、標的ＲＮＡを切断することができる。ＤＮＡ標的のみを切断するＤＮＡエンドヌクレアーゼＣａｓ９およびＣｐｆ１とは異なり、Ｃ２ｃ２などのＲＮＡ誘導ＲＮＡ分解酵素は、そのＲＮＡ標的を切断した後も活性が残存し、付近の標的でないＲＮＡの「副次（collateral）」切断が生じる(Abudayyeh et al., 2016)。このｃｒＲＮＡにプログラムされた副次ＲＮＡ切断活性は、読み出しとして機能し得る生体内でのプログラム細胞死または生体外での非特異的ＲＮＡを誘導することにより、ＲＮＡ誘導ＲＮＡ分解酵素を用いて特定のＲＮＡの存在を検出する機会を提供する(Abudayyeh et al., 2016; East-Seletsky et al., 2016)。
【０１５１】
本明細書で開示される実施形態では、ＲＮＡ標的エフェクターを利用して、ＣＲＩＳＰＲに基づくaM感度での強固な診断が提供される。本明細書で開示される実施形態は、同等の感度でＤＮＡとＲＮＡの両方を検出することができ、一塩基対の違いに基づいて標的と非標的を区別することができる。また、本明細書で開示される実施形態は、配布の利便性と診療現場（ＰＯＣ）用途から冷凍乾燥形態で作製されてもよい。このような実施形態は、人間の健康において複数の状況（例えば、ウイルスの検出、細菌株の分類、高感度遺伝子型決定、および疾患に関連付けられる無細胞ＤＮＡの検出）で有用である。
【０１５２】
世界中の感染性微生物を診断するため、高速、高感度、低コストで、ユーザーが使いやすく、新たに同定される因子の検出に素早く順応できるアッセイが求められている。本明細書で開示される実施形態は、Ｃａｓ１３によるＳＨＥＲＬＯＣＫ装置は臨床試料および蚊の供給源中のジカウイルス（ＺＩＫＶ）を１コピー感度で検出することができ、２時間未満で尿から直接ＺＩＫＶを検出することができることを示す。本出願人はさらに、４種のフラビウイルスを同時に検出するアッセイ、デング熱ウイルスの血清型１〜４を区別するアッセイ、および地域に特異的な多様体を用いて２０１６年の大流行に由来するＺＩＫＶの株を区別するアッセイを開発した。最後に、本出願人は、その発表の１週間以内に胎児小頭症に関連付けられたＺＩＫＶ多様体を同定するアッセイを開発し、試験した。その結果、ＳＨＥＲＬＯＣＫは体液から直接由来するウイルスを検出し、複数の病原体ウイルスを区別することができ、臨床的に重要な表現型に関わる変異を同定できるように素早く更新することができることが判明した。
【０１５３】
一側面では、本明細書で開示される実施形態は、ＣＲＩＳＰＲ系、対応する標的分子に結合するように設計された１種以上のガイドＲＮＡ、マスキング構築物、および試料中の標的核酸分子を増幅する任意の増幅試薬を含む核酸検出システムに関する。特定の例示的な実施形態では、前記システムは１種以上の検出アプタマーをさらに含んでいてもよい。前記１種以上の検出アプタマーは、ＲＮＡポリメラーゼ部位またはプライマー結合部位を含んでいてもよい。前記１種以上の検出アプタマーは、１種以上の標的ポリペプチドに特異的に結合し、前記検出アプタマーが標的ペプチドに結合した場合にのみ前記ＲＮＡポリメラーゼ部位またはプライマー結合部位が露出するように構成されている。前記ＲＮＡポリメラーゼ部位の露出により、アプタマー配列を鋳型として用いてトリガーＲＮＡオリゴヌクレオチドを生成することが容易になる。従って、そのような実施形態では、前記１種以上のガイドＲＮＡは、１つのトリガーＲＮＡに結合するように構成されている。
【０１５４】
他の側面では、本明細書で開示される実施形態は複数の個別の容積を含む診断装置に関する。各個別の容積は、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質、対応する標的分子に結合するように設計された１種以上のガイドＲＮＡ、およびマスキング構築物を含む。特定の例示的な実施形態では、ＲＮＡ増幅試薬を前記個別の容積に予め充填してもよく、あるいは前記１つ以上の個別の容積はそれぞれに試料を加えるのと同時かその後に個別の容積に加えてもよい。前記装置は、マイクロ流体装置、装着可能な装置、または前記個別の容積が規定された柔軟性のある材料の基質を含む装置であってもよい。
【０１５５】
他の側面では、本明細書で開示される実施形態は、１つの試料または１組の試料を１組の個別の容積に分配することを含む、試料中の標的核酸を検出する方法に関する。前記１つ以上の個別の容積はそれぞれ、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質、１つの標的オリゴヌクレオチドに結合するように設計された１種以上のガイドＲＮＡ、およびマスキング構築物を含む。その後、前記１種以上のガイドＲＮＡが１種以上の標的分子に結合することができるのに十分な条件で前記１組の試料を維持する。次いで、前記１種以上のガイドＲＮＡが標的核酸に結合すると、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質が活性化される。一旦活性化されると、前記ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は、例えば、マスキング構築物を切断することによりマスキング構築物を不活性化して、検出可能な陽性信号からマスクが取れる、あるいは検出可能な陽性信号が放出または生成されるようにする。１個の個別の容積で検出可能な陽性信号が検出されるということは、前記標的分子が存在することを示す。
【０１５６】
さらに他の側面では、本明細書で開示される実施形態はポリペプチドを検出する方法に関する。前記ポリペプチドを検出する方法は、上記の標的核酸を検出する方法に類似している。しかしながら、ペプチド検出アプタマーも含まれている。前記ペプチド検出アプタマーは、上述のように機能して、標的ポリペプチドに結合した際にトリガーオリゴヌクレオチドの生成を容易にする。前記ガイドＲＮＡは、トリガーオリゴヌクレオチドを認識するように設計されて、これによってＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を活性化する。活性化されたＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質によってマスキング構築物が不活性化されると、検出可能な陽性信号からマスクが取れる、あるいは検出可能な陽性信号が放出または生成される。
ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質
【０１５７】
一般に、本明細書およびWO2014/093622 (PCT/US2013/074667)などの文献に用いられる用語「ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓまたはＣＲＩＳＰＲ系」は、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の発現に関与またはその活性に向けられる転写物およびその他の要素をまとめて言う。そのようなものとしては、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列、トランス活性化（ｔｒａｃｒＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡまたは活性部分ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒメイト配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系の文脈では「直列反復配列」およびｔｒａｃｒＲＮＡ処理した部分直列反復配列を包含する）、ガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系の文脈では「スペーサー」）、または本明細書で用いられる用語としての「ＲＮＡ」（例えば、ＣａｓをガイドするＲＮＡ（Ｃａｓ９、例えばCRISPR RNAおよびトランス活性化（ｔｒａｃｒ）ＲＮＡまたは一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）（キメラＲＮＡ）など）、あるいはＣＲＩＳＰＲ座位に由来する他の配列および転写物が挙げられる。一般に、ＣＲＩＳＰＲ系は、標的配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系の文脈ではプロトスペーサーとも言う）の部位でＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する要素により特徴付けられる。ＣＲＩＳＰＲタンパク質がＣ２ｃ２タンパク質である場合、ｔｒａｃｒＲＮＡは必要ない。Ｃ２ｃ２は以下に記載されており、引用によりその全内容を本明細書に組み込む：Abudayyeh et al. (2016) “C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector（C2c2は１成分のプログラム可能のRNA誘導RNA標的CRISPRエフェクターである）”; Science; DOI: 10.1126/science.aaf5573; and Shmakov et al. (2015) “Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR-Cas Systems（多様なクラス２のCRISPR-Cas系の発見と機能的特徴付け）”, Molecular Cell, DOI: dx.doi.org/10.1016/j.molcel.2015.10.008。Ｃａｓ１３ｂについては、Smargon et al. (2017) “Cas13b Is a Type VI-B CRISPR-Associated RNA-Guided RNases Differentially Regulated by Accessory Proteins Csx27 and Csx28（Cas13bはアクセサリータンパク質Csx27 and Csx28によって異なるように調節されるVI-B型CRISPR関連RNA誘導RNアーゼである）,” Molecular Cell. 65, 1-13; dx.doi.org/10.1016/j.molcel.2016.12.023に記載されており、その全内容を参照により本明細書に組み込む。
【０１５８】
特定の態様では、プロトスペーサー隣接モチーフ（protospacer adjacent motif = ＰＡＭ）あるいはＰＡＭ様モチーフは、本明細書で開示されるエフェクタータンパク質複合体の対象の標的座位への結合に関する。態様によっては、ＰＡＭは５’−ＰＡＭであってもよい（すなわち、プロトスペーサーの５’末端の上流に位置していてもよい）。他の実施形態では、ＰＡＭは、３’−ＰＡＭであってもよい（すなわち、プロトスペーサーの５’末端の下流に位置してもよい）。用語「ＰＡＭ」は用語「ＰＦＳ（protospacer flanking site又はprotospacer flanking sequence）＝プロトスペーサー結合配列」と互いに言い換え可能な場合がある。
【０１５９】
好ましい一態様では、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は３’−ＰＡＭを認識してもよい。特定の態様では、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は、５’Ｈ（ここでＨはＡ、Ｃ、またはＵ）である３’−ＰＡＭを認識してもよい。特定の態様では、エフェクタータンパク質は、レプトトリキア・シャーイイＣ２ｃ２ｐであってもよく、より好ましくはレプトトリキア・シャーイイDSM 19757 C2c2であり、３’−ＰＡＭは５’Ｈである。
【０１６０】
ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成の文脈で、「標的配列」は、ガイド配列と相補的であるように設計された配列を言う。ここで、標的配列とガイド配列のハイブリダイゼーションによりＣＲＩＳＰＲ複合体の形成が促進される。標的配列は、ＲＮＡポリヌクレオチドを含んでいてもよい。用語「標的ＲＮＡ」は、標的配列であるか、それを含むＲＮＡポリヌクレオチドを言う。換言すれば、標的ＲＮＡは、ｇＲＮＡの部分、すなわちガイド配列が相補性を有するように設計された、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を含む複合体とｇＲＮＡにより媒介されたエフェクター機能が向けられるＲＮＡポリヌクレオチドまたはＲＮＡポリヌクレオチドの部分であってもよい。態様によっては、標的配列は細胞の核または細胞質に位置している。
【０１６１】
ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質、特にＣ２ｃ２をコードする核酸分子は、最適化されたＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質であることが好ましい。この場合、コドン最適化配列の一例は、例えば、ヒトなどの真核生物で発現するのに最適化（すなわち、ヒトでの発現に最適化）された配列、あるいは本明細書で記載する他の真核生物、動物、または哺乳類で発現するのに最適化された配列である。例えば、WO2014/093622 (PCT/US2013/074667)のＳａＣａｓ９ヒトコドン最適化配列を参照のこと。これは好ましいが、自明であるように、他の例が可能であり、ヒト以外の宿主種に対するコドン最適化あるいは特定の臓器に対するコドン最適化が知られている。態様によっては、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質をコードする酵素コード配列は、特に、真核細胞などの細胞で発現するのに最適化されたコドンである。真核細胞は、植物あるいは哺乳類など、特定の生物に由来していてもよく、これらに限定されないが、ヒト、本明細書で記載されるヒトではない真核生物、動物、または哺乳類（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、家畜）、あるいはヒトではない哺乳類すなわち霊長類が含まれる。態様によっては、ヒトの生殖細胞系の遺伝的同一性を修正する、かつ／またはヒトまたは動物、およびそのような方法から得られる動物に何らかの実質的な医療的恩恵がないのに彼らを苦しめていると思われる動物の遺伝的同一性を修正する方法は除外されてもよい。一般に、コドン最適化は、天然の配列の少なくとも１個のコドン（例えば、約１個、２個、３個、４個、５個、１０個、１５個、２０個、２５個、５０個、またはそれ以上のコドン）を天然のアミノ酸配列を維持しつつ宿主細胞の遺伝子により頻繁または最も頻繁に用いられるコドンで置換することで対象の宿主細胞での発現を高めるために核酸配列を修飾する方法を言う。様々な種は、特定のアミノ酸の特定のコドンに対して特定のバイアスを示す。コドンバイアス（生物間でのコドンの使用の差）は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳効率と相関することが多い。この翻訳効率は、とりわけ、翻訳されるコドンの特性および特定の転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用しやすさに依存すると考えられている。一般に、細胞内での選択されたｔＲＮＡの有意性は、ペプチド合成で最も頻繁に用いられるコドンの反映である。従って、遺伝子を、コドン最適化に基づいて所与の生物での最適な遺伝子の発現に調節してもよい。コドン使用表は容易に入手可能であり、例えば「コドン使用データベース」（kazusa.orjp/codon/）で入手可能である。これらの表は様々なやり方で適応されていてもよい。Nakamura, Y., et al. “Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000” Nucl. Acids Res. 28:292 (2000)を参照のこと。特定の宿主細胞で発現させる特定の配列のコドン最適化のためのコンピューターアルゴリズム（例えば、Gene Forge (Aptagen、ペンシルベニア州ヤコバス）など）もまた入手可能である。態様によっては、Ｃａｓをコードする配列で１個以上のコドン（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、１０個、１５個、２０個、２５個、５０個、またはそれ以上のコドン、あるいはすべてのコドン）は、特定のアミノ酸に対して最も頻繁に用いられるコド���と対応している。
【０１６２】
特定の態様では、本明細書で記載する方法は、Ｃａｓ遺伝子導入細胞、特にＣ２ｃ２遺伝子導入細胞を準備することを含んでいてもよい。ここで、１種以上のガイドＲＮＡをコードする１種以上の核酸が、準備されるか、対象の１つ以上の遺伝子のプロモーターを含む調節要素により操作によって細胞に結合するように導入される。本明細書で用いられる用語「Ｃａｓ遺伝子導入細胞」は、Ｃａｓ遺伝子がゲノム的に組み込まれた真核細胞などの細胞を言う。細胞の性質、種類、または由来は本発明によって特に限定されない。また、Ｃａｓ遺伝子導入が細胞に導入される方法は様々であってもよく、当該分野で既知の任意の方法であってもよい。特定の態様では、Ｃａｓ遺伝子導入細胞は、単離細胞にＣａｓ導入遺伝子を導入することで得られる。特定の他の実施形態では、Ｃａｓ遺伝子導入細胞は、Ｃａｓ遺伝子導入生物から細胞を単離することで得られる。一例として、限定されるものではないが、本明細書で言うＣａｓ遺伝子導入細胞は、Ｃａｓノックイン真核生物などのＣａｓ遺伝子導入真核生物に由来していてもよい。WO2014/093622 (PCT/US13/74667)を参照のこと。その内容は参照により本明細書に組み込まれる。Sangamo BioSciences社に付与された、Ｒｏｓａ座位を標的するように向けられた米国特許公開第２０１２００１７２９０号および２０１１０２６５１９８号の方法を修正して本発明のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを用いてもよい。本発明のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを利用するために、Ｒｏｓａ座位の標的に関するCellectisに付与された米国特許公開第２０１３０２３６９４６号の方法を修正してもよい。さらなる例としては、Platt et. al. (Cell; 159(2):440-455 (2014))を参照のこと。この文献ではＣａｓ９ノックインマウスについて記述しており、その内容を参照により本明細書に組み込む。Ｃａｓ導入遺伝子はLox-Stop-polyA-Lox(LSL)カセットをさらに含んでいてもよく、これによりＣａｓの発現がＣｒｅリコンビナーゼにより誘導可能になる。あるいは、Ｃａｓ遺伝子導入細胞は、単離した細胞にＣａｓ導入遺伝子を導入して得てもよい。導入遺伝子の送達系は当該分野ではよく知られている。一例として、本明細書の他の箇所でも記載するように、例えば、ベクター（例えば、ＡＡＶ、アデノウイルス、レンチウイルス）および／または粒子および／またはナノ粒子送達により真核細胞にＣａｓ導入遺伝子を送達してもよい。
【０１６３】
当業者には自明であるが、Ｃａｓ遺伝子導入細胞など、本明細書で言及される細胞は、組み込みＣａｓ遺伝子を有することに加えてさらなるゲノム変化、またはＣａｓを標的座位に誘導することができるＲＮＡと結合した際のＣａｓの配列に特異的な作用から生じる変異をさらに含んでいてもよい。
【０１６４】
特定の側面では、本発明は、例えば、Ｃａｓおよび／またはＣａｓを標的座位に誘導することができるＲＮＡ（すなわち、ガイドＲＮＡ）を細胞に送達または導入するがこれら成分を（例えば原核細胞で）増殖するベクターを含む。本明細書で用いられる用語「ベクター」は、ある実体をある環境から別の環境に移動させるのを可能または容易にする道具である。ベクターは、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどのレプリコン（ＤＮＡ複製の単位）であり、他のＤＮＡ分節を挿入して、挿入した分節を複製してもよい。一般に、ベクターは、適切な制御要素と関連付けられると複製することができる。一般に、用語「ベクター」は、結合させた他の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。ベクターとしては、これらに限定されないが、一本鎖、二本鎖、または部分的二本鎖である核酸分子、１つ以上の遊離末端を含む核酸分子、遊離末端がない（例えば環状の）核酸分子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、あるいはその両方を含む核酸分子、および当該分野で知られているその他のポリヌクレオチドの変形が挙げられる。ベクターの１種に「プラスミド」がある。プラスミドは、環状の二本鎖ＤＮＡループを指し、標準的な分子クローニング技術により追加のＤＮＡ分節を挿入することができる。他の種類のベクターとしては、ウイルスベクターがある。この種類では、ウイルス（例えば、レトロウイルス、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠損アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス（adeno-associated viruses, AAVs））に包含するためにウイルス由来のＤＮＡまたはＲＮＡ配列が存在する。ウイルスベクターはまた、宿主細胞に形質移入するためのウイルスにより担持されたポリヌクレオチドを含む。特定のベクター（例えば、細菌性の複製起点を持つ細菌ベクターおよびエピソーム性哺乳類ベクター）は、導入された宿主細胞で自律複製することができる。他のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳類ベクター）は、宿主細胞に導入されると宿主細胞のゲノムに組み込まれ、これにより宿主ゲノムと共に複製される。また、特定のベクターは、操作によって結合させた遺伝子の発現を誘導することができる。そのようなベクターを本明細書では「発現ベクター」と言う。組換えＤＮＡ技術で一般に用いられる発現ベクターはプラスミドの形態を取ることが多い。
【０１６５】
組換え発現ベクターは、核酸の発現に好適な形態で本発明の核酸を含んでいてもよい。これは、組換え発現ベクターが１種以上の調節要素を含むということを意味する。発現に用いられる宿主細胞に基づいて上記調節要素を選択してもよい。上記調節要素は、発現する核酸配列に操作によって結合されている。組換え発現ベクター内で、「操作によって結合」は、（例えば、生体外翻訳系、またはベクターが宿主細胞に導入されている場合は宿主細胞で）対象のヌクレオチド配列が発現するようにヌクレオチド配列が調節要素に結合されていることを意味する。組換えおよびクローニング方法に関しては、米国特許出願第１０／８１５，７３０号（米国２００４−０１７１１５６Ａ１として２００４年９月２日に発行）に記載されており、それぞれの内容はすべて本明細書に参照により組み込まれる。従って、本明細書で開示される実施形態はまた、ＣＲＩＳＰＲエフェクター系を含む遺伝子導入細胞を含んでいてもよい。特定の例示的な実施形態では、遺伝子導入細胞は個別の容積として機能してもよい。換言すれば、マスキング構築物を含む試料を細胞、例えば、好適な送達小胞に送達してもよい。標的が送達小胞に存在していれば、ＣＲＩＳＰＲエフェクターが活性化されて検出可能な信号が生成される。
【０１６６】
ベクターは、例えば、プロモーターなどの調節要素を含んでいてもよい。ベクターは、Ｃａｓコード配列を含んでいてもよく、かつ／または単一もしくは可能性としては少なくとも３個、８個、１６個、３２個、４８個、または５０個のガイドＲＮＡ(例えば、ｓｇＲＮＡ）コード配列、例えば１〜２個、１〜３個、１〜４個、１〜５個、３〜６個、３〜７個、３〜８個、３〜９個、３〜１０個、３〜８個、３〜１６個、３〜３０個、３〜３２個、３〜４８個、３〜５０個のＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ）を含んでいてもよい。単一のベクターには、利点として、ＲＮＡが約１６個までの場合は各ＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ）に１個のプロモーターが存在する。単一のベクターが１７個以上のＲＮＡを提供する場合は、１個以上のプロモーターがそれらＲＮＡの２つ以上の発現を駆動してもよい。例えば、３２個のＲＮＡがある場合、各プロモーターは２個のＲＮＡの発現を駆動してもよく、４８個のＲＮＡがある場合、各プロモーターは３個のＲＮＡの発現を駆動してもよい。当業者であれば、単純な算術的な十分に確立されたクローニングプロトコル及び本開示の教示により、好適な例示的なベクター（例えば、ＡＡＶ）および好適なプロモーター（Ｕ６プロモーター）用のＲＮＡとして本発明を容易に実施することができる。例えば、ＡＡＶの包含限界は約４．７ｋｂである。単一のＵ６−ｇＲＮＡ（＋クローニング用制限部位）の長さは３６１ｂｐである。従って、当業者であれば、単一のベクターに約１２〜１６個、例えば、１３個のＵ６−ｇＲＮＡカセットを容易にはめ込むことができる。これは、ＴＡＬＥアセンブリに用いられるゴールデンゲート方法(genome-engineering.org/taleffectors/)などの任意の好適な手段によりアセンブルすることができる。また、当業者はタンデムガイド方法を用いて、約１．５倍Ｕ６−ｇＲＮＡの数を増加させる、例えば、１２〜１６個、例えば、１３個〜約１８〜２４個、例えば、約１９個のＵ６−ｇＲＮＡに増加させることができる。従って、当業者は、単一ベクター（例えば、ＡＡＶベクター）で約１８〜２４個、例えば、約１９個のプロモーターＲＮＡ（例えば、Ｕ６−ｇＲＮＡ）を容易に達成することができる。１個のベクターでのプロモーターおよびＲＮＡの数を増やすさらなる手段は、単一のプロモーター（例えば、Ｕ６）を用いて切断可能な配列によって分離されたＲＮＡアレイを発現させることである。１個のベクターでプロモーターＲＮＡの数を増やすさらなる手段は、コード配列または遺伝子のイントロンで切断可能な配列に分離されたプロモーターＲＮＡアレイを発現させることである。この場合、ポリメラーゼＩＩプロモーターの使用が有益である。ポリメラーゼＩＩプロモーターは、発現を増加させ、組織特異的なやり方で長鎖ＲＮＡを転写することができる（例えば、nar.oxfordjournals.org/content/34/7/e53.shortおよびnature.com/mt/journal/v16/n9/abs/mt2008144a.htmlを参照のこと）。好ましい一実施形態では、ＡＡＶは５０個までの遺伝子を標的するＵ６タンデムｇＲＮＡを包含していてもよい。従って、当該分野での知識および本開示の教示から、当業者であれば、特に、本明細書で記載された数のＲＮＡまたはガイドに対して必要以上の実験をせずに、１個以上のプロモーターの制御下にある、またはそれに操作または機能により結合した複数のＲＮＡまたはガイドを発現しているベクター（例えば、単一のベクター）を容易に作製して使用することができる。
【０１６７】
ガイドＲＮＡコード配列および／またはＣａｓコード配列は、機能または操作により調節要素に結合されていてもよく、これによって、調節要素は発現を駆動する。プロモーターは、構成的プロモーターおよび／または条件的プロモーターおよび／または誘導性プロモーターおよび／または組織特異的プロモーターであってもよい。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼ、pol I、pol II、pol III、Ｔ７、Ｕ６、Ｈ１、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸塩還元酵素プロモーター、β−アクチンプロモーター、ホスホグリセリンキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、およびＥＦ１αプロモーターからなる群より選択されてもよい。有用なプロモーターはプロモーターＵ６である。
【０１６８】
態様によっては、核酸標的系の１つ以上の要素は内因性CRISPR RNA標的系を含む特定の生物に由来している。特定の例示的な実施形態では、エフェクタータンパク質CRISPR RNA標的系は少なくとも１個のＨＥＰＮドメインを含む。そのようなものとしては、これに限定されないが、本明細書で記載するＨＥＰＮドメイン、当該分野で既知のＨＥＰＮドメイン、および共通配列モチーフと比較してＨＥＰＮドメインであると認識されるドメインが挙げられる。いくつかのそのようなドメインは本明細書で提供される。非限定的な一例では、共通配列は、本明細書で提供されるＣ２ｃ２またはＣａｓ１３ｂ相同分子種の配列に由来していてもよい。特定の例示的な実施形態では、エフェクタータンパク質は、単一のＨＥＰＮドメインを含む。特定の他の例示的な実施形態では、エフェクタータンパク質は２個のＨＥＰＮドメインを含む。
【０１６９】
一例示的な実施形態では、エフェクタータンパク質は、ＲｘｘｘｘＨモチーフ配列を含む１個以上のＨＥＰＮドメインを含む。限定されないが、ＲｘｘｘｘＨモチーフ配列は本明細書で記載するＨＥＰＮドメインまたは当該分野で既知のＨＥＰＮドメインに由来してもよい。ＲｘｘｘｘＨモチーフ配列は、２個以上のＨＥＰＮドメインの一部を組み合わせて作製したモチーフ配列をさらに含む。なお、共通配列は、以下に開示された相同分子種の配列に由来していてもよい：“Novel CRISPR Enzymes and Systems（新規なCRISPR酵素および系）”の名称の米国仮特許出願第６２／４３２，２４０号、２０１７年３月１５日に“Novel Type VI CRISPR Orthologs and Systems（新規なVI型CRISPR相同分子種および系）”の名称で提出された米国仮特許出願第６２／４７１，７１０号、および２０１７年４月１２日に“Novel Type VI CRISPR Orthologs and Systems（新規なVI型CRISPR相同分子種および系）”の名称で提出された米国仮特許出願（代理人案件番号４７６２７−０５−２１３３）。
【０１７０】
本発明の一実施形態では、ＨＥＰＮドメインは、Ｒ｛Ｎ／Ｈ／Ｋ｝Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｈの配列を含む少なくとも１個のＲｘｘｘｘＨモチーフを含む。本発明の一実施形態では、ＨＥＰＮドメインは、Ｒ｛Ｎ／Ｈ｝Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｈの配列を含むＲｘｘｘｘＨモチーフを含む。本発明の一実施形態では、ＨＥＰＮドメインは、Ｒ｛Ｎ／Ｋ｝Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｈの配列を含む。特定の態様では、Ｘ１はＲ、Ｓ、Ｄ、Ｅ、Ｑ、Ｎ、Ｇ、Ｙ、またはＨである。特定の態様では、Ｘ２はＩ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＬである。特定の態様では、Ｘ３はＬ，Ｆ、Ｎ、Ｙ、Ｖ、Ｉ、Ｓ、Ｄ、Ｅ、またはＡである。
【０１７１】
本発明によって用いられる追加のエフェクターは、これに限定されないが、例えば、ｃａｓ１遺伝子の始端から２０ｋｂでかつｃａｓ１遺伝子の終端から２０ｋｂの領域内など、そのｃａｓ１遺伝子との近接性により同定されてもよい。特定の態様では、エフェクタータンパク質は、少なくとも１個のＨＥＰＮドメインと少なくとも５００個のアミノ酸を含み、Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質は原核生物のゲノムのＣａｓ遺伝子またはＣＲＩＳＰＲ配列の上流または下流２０ｋｂ以内に天然に存在する。Ｃａｓタンパク質の非限定的な例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても知られている）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、これらの相同体または修飾バージョンが挙げられる。特定の例示的な実施形態では、Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質は、原核生物のゲノムのＣａｓ１遺伝子の上流または下流２０ｋｂ以内に天然に存在する。用語「相同分子種」（本明細書では「オルソログ」とも言う）および「相同体」（本明細書では「ホモログ」とも言う）は当該分野ではよく知られている。さらなる手引きとしては、本明細書で用いられるタンパク質の「相同体」は、相同体であるタンパク質と同じまたは類似の機能を果たす同種のタンパク質である。相同タンパク質は、構造的に関係していてもしていなくてもよいが、構造的に部分的にのみ関係している。タンパク質の「相同分子種」は、相同分子種であるタンパク質と同じまたは類似の機能を果たす異なる種のタンパク質である。相同分子種タンパク質は、構造的に関係していてもしていなくてもよく、あるいは構造的に部分的にのみ関係している。
【０１７２】
特定の実施形態では、ＶＩ型ＲＮＡ標的Ｃａｓ酵素はＣ２ｃ２である。他の例示的な実施形態では、ＶＩ型ＲＮＡ標的Ｃａｓ酵素はＣａｓ１３ｂである。特定の実施形態では、本明細書で言うＣ２ｃ２ＶＩ型タンパク質の相同体または相同分子種は、Ｃ２ｃ２（例えば、レプトトリキア・シャーイイＣ２ｃ２、ラクノスピラ科細菌MA2020 C2c2、ラクノスピラ科細菌NK4A179 C2c2、クロストリジウム・アミノフィルム（DSM 10710）Ｃ２ｃ２、カーノバクテリウム・ガリナルム（DSM 4847）Ｃ２ｃ２、パルディバクター・プロピオニシゲネス（ＷＢ４）Ｃ２ｃ２、リステリア・ウェイヘンステファネンシス（FSL R9-0317）Ｃ２ｃ２、リステリア科細菌（FSL M6-0635）Ｃ２ｃ２、リステリア・ニューヨーケンシス（FSL M6-0635）Ｃ２ｃ２、レプトトリキア・ウェイディイ（Ｆ０２７９）Ｃ２ｃ２、ロドバクター・カプスラータ（SB 1003）Ｃ２ｃ２、ロドバクター・カプスラータ（Ｒ１２１）Ｃ２ｃ２、ロドバクター・カプスラータ（ＤＥ４４２）Ｃ２ｃ２、レプトトリキア・ウェイディイ（Ｌｗ２）Ｃ２ｃ２、またはリステリア・シーリゲリＣ２ｃ２の何れかの野生型配列に基づく）のＶＩ型タンパク質と少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％の配列相同性または同一性を持つ。さらなる実施形態では、本明細書で言うＣ２ｃ２などのＶＩ型タンパク質の相同体または相同分子種は、野生型Ｃ２ｃ２（例えば、レプトトリキア・シャーイイＣ２ｃ２、ラクノスピラ科細菌MA2020 C2c2、ラクノスピラ科細菌NK4A179 C2c2、クロストリジウム・アミノフィルム（DSM 10710）Ｃ２ｃ２、カーノバクテリウム・ガリナルム（DSM 4847）Ｃ２ｃ２、パルディバクター・プロピオニシゲネス（ＷＢ４）Ｃ２ｃ２、リステリア・ウェイヘンステファネンシス（FSL R9-0317）Ｃ２ｃ２、リステリア科細菌（FSL M6-0635）Ｃ２ｃ２、リステリア・ニューヨーケンシス（FSL M6-0635）Ｃ２ｃ２、レプトトリキア・ウェイディイ（Ｆ０２７９）Ｃ２ｃ２、ロドバクター・カプスラータ（SB 1003）Ｃ２ｃ２、ロドバクター・カプスラータ（Ｒ１２１）Ｃ２ｃ２、ロドバクター・カプスラータ（ＤＥ４４２）Ｃ２ｃ２、レプトトリキア・ウェイディイ（Ｌｗ２）Ｃ２ｃ２、またはリステリア・シーリゲリＣ２ｃ２の何れかの野生型配列に基づく）と少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％の配列同一性を持つ。
【０１７３】
特定の他の例示的な実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ系エフェクタータンパク質は、Ｃ２ｃ２ヌクレアーゼである。Ｃ２ｃ２の活性は２個のＨＥＰＮドメインの存在に依存する場合がある。これらは、ＲＮＡ分解酵素ドメイン、すなわちヌクレアーゼ（特に、エンドヌクレアーゼ）切断ＲＮＡであることが示されている。Ｃ２ｃ２のＨＥＰＮはまた、ＤＮＡ、可能性としてはＤＮＡおよび／またはＲＮＡを標的してもよい。Ｃ２ｃ２のＨＥＰＮドメインが少なくともＲＮＡに結合して、その野生型形態でＲＮＡを切断することができることに基づくと、Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質はＲＮＡ分解酵素機能を持っていることが好ましい。C2c2 CRISPR系については、２０１６年６月１７日に提出された米国仮特許出願第６２／３５１，６６２号、および２０１６年８月１７日に提出された米国仮特許出願第６２／３７６，３７７号を参照のこと。また、２０１６年６月１７日に提出された米国仮特許出願第６２／３５１，８０３号を参照のこと。また、“Novel Crispr Enzymes and Systems（新規なCrispr酵素および系）”の名称で２０１６年１２月８日に提出された米国仮特許出願（Broad Institute番号１００３５．ＰＡ４および代理人案件番号４７６２７．０３．２１３３）も参照のこと。さらに、East-Seletsky et al. “Two distinct RNase activities of CRISPR-C2c2 enable guide-RNA processing and RNA detection（CRISPR-C2c2の２つの個別のRNアーゼ活性はガイドRNA処理とRNA検出を可能にする）” Nature doi:10/1038/nature19802 and Abudayyeh et al. “C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA targeting CRISPR effector（C2c2は１成分のプログラム可能のRNA誘導RNA標的CRISPRエフェクターである）” bioRxiv doi:10.1101/054742を参照のこと。
【０１７４】
ＣＲＩＳＰＲ系のＲＮＡ分解酵素機能が知られており、例えば、特定のＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系でｍＲＮＡ標的が報告されており(Hale et al., 2014, Genes Dev, vol. 28, 2432-2443; Hale et al., 2009, Cell, vol. 139, 945-956; Peng et al., 2015, Nucleic acids research, vol. 43, 406-417)、大きな有用性をもたらしている。スタフィロコッカス・エピデルミスＩＩＩ−Ａ型系では、標的に跨がる転写により標的ＤＮＡおよびその転写物が切断される。この切断はＣａｓ１０−Ｃｓｍリボ核タンパク質エフェクタータンパク質複合体内の独立した活性部位によって媒介される（Samai et al., 2015, Cell, vol. 151, 1164-1174を参照のこと）。従って、本発明のエフェクタータンパク質によるＲＮＡを標的する ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系、組成物、または方法が提供される。
【０１７５】
一実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、これらに限定されないが、レプトトリキア、リステリア、コリネバクター、サッテレーラ、レジオネラ、トレポネーマ、フィリファクター、ユウバクテリウム、ストレプトコッカス、乳酸桿菌、マイコプラズマ、バクテロイデス、フラビイボラ、フラボバクテリウム、スフェロケタ、アゾスピリルム、グルコナセトバクター、ナイセリア、ロゼブリア、パルビバクラム、スタフィロコッカス、ニトラチフラクター、マイコプラズマ、およびカンピロバクターを含む属の生物のＣ２ｃ２相同分子種であってもよい。そのような属の生物種は、本明細書で記載したものであってもよい。
【０１７６】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系酵素の相同分子種を同定するいくつかの方法は、対象のゲノムのｔｒａｃｒ配列を同定することを含んでいてもよい。ｔｒａｃｒ配列の同定は、データベースで直列反復配列またはｔｒａｃｒメイト配列を検索して、ＣＲＩＳＰＲ酵素を含むＣＲＩＳＰＲ領域を同定する以下の工程に関していてもよい。ＣＲＩＳＰＲ酵素に隣接するＣＲＩＳＰＲ領域の相同配列をセンス鎖方向およびアンチセンス鎖方向の両方で検索する。転写ターミネーターと二次構造を調べる。直列反復配列またはｔｒａｃｒメイト配列ではないが、可能性のあるｔｒａｃｒ配列として直列反復配列またはｔｒａｃｒメイト配列と５０％超の同一性を持つ任意の配列を同定する。可能性のあるｔｒａｃｒ配列を取り出して、それに関連付けられた転写ターミネーター配列を分析する。
【０１７７】
自明であるが、本明細書で記載する機能のいずれも、操作して、他の相同分子種に由来するＣＲＩＳＰＲ酵素（複数の相同分子種に由来する断片を含むキメラ酵素を含む）に入れてもよい。そのような相同分子種の例は本明細書の他の箇所で記載されている。従って、キメラ酵素は、これらに限定されないが、レプトトリキア、リステリア、コリネバクター、サッテレーラ、レジオネラ、トレポネーマ、フィリファクター、ユウバクテリウム、ストレプトコッカス、乳酸桿菌、マイコプラズマ、バクテロイデス、フラビイボラ、フラボバクテリウム、スフェロケタ、アゾスピリルム、グルコナセトバクター、ナイセリア、ロゼブリア、パルビバクラム、スタフィロコッカス、ニトラチフラクター、マイコプラズマ、およびカンピロバクターを含む生物のＣＲＩＳＰＲ酵素相同分子種の断片を含んでいてもよい。キメラ酵素は第一の断片と第二の断片を含んでいてもよく、これら断片は、本明細書で記載した属または種の生物のＣＲＩＳＰＲ酵素相同分子種であってもよい。好ましくは、これら断片は異なる種のＣＲＩＳＰＲ酵素相同分子種に由来する。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、本明細書で言うＣ２ｃ２タンパク質はまた、Ｃ２ｃ２の機能多様体、あるいはその相同体または相同分子種の機能多様体を包含する。本明細書で用いられるタンパク質の「機能多様体」は、タンパク質の活性を少なくとも部分的に保持するそのタンパク質の多様体を指す。機能多様体は、多型を含む変異体（挿入、欠失、または置換変異体であってもよい）を含んでいてもよい。機能多様体にはまた、そのようなタンパク質と別の通常は無関係な核酸、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドとの融合産物も含まれる。機能多様体は、天然に存在するものであってもよく、あるいは人工のものであってもよい。好ましい実施形態は、操作された、すなわち天然に存在しないＶＩ型ＲＮＡ標的エフェクタータンパク質を含んでいてもよい。
【０１７９】
一実施形態では、Ｃ２ｃ２あるいはその相同分子種または相同体をコードする１つまたは複数の核酸分子は、真核細胞での発現についてコドン最適化されていてもよい。真核生物は本明細書で記載されているものであってもよい。１つまたは複数の核酸分子は、操作されている、すなわち天然に存在しないものであってもよい。
【０１８０】
一実施形態では、Ｃ２ｃ２あるいはその相同分子種または相同体は、１つ以上の変異を含んでいてもよい（従って、それをコードする１つまたは複数の核酸分子は変異を持っていてもよい）。これらの変異は、人工的に導入された変異であってもよく、これらに限定されないが、触媒ドメインでの１つ以上の変異を含んでいてもよい。Ｃａｓ９酵素に対する触媒ドメインの例としては、これらに限定されないが、RuvC Iドメイン、RuvC IIドメイン、RuvC IIIドメイン、およびHNHドメインが挙げられる。
【０１８１】
一実施形態では、Ｃ２ｃ２あるいはその相同分子種または相同体は１つ以上の変異を含んでいてもよい。これらの変異は人工的に導入された変異であってもよく、これらに限定されないが、触媒ドメインでの１つ以上の変異を含んでいてもよい。Ｃａｓ酵素に対する触媒ドメインの例としては、これらに限定されないが、ＨＥＰＮドメインを含んでいてもよい。
【０１８２】
一実施形態では、Ｃ２ｃ２あるいはその相同分子種または相同体は、機能ドメインに融合または操作によって結合させた汎用核酸結合タンパク質として用いられてもよい。機能ドメインの例としては、これらに限定されないが、翻訳開始剤、翻訳活性化因子、翻訳抑制因子、ヌクレアーゼ、特にリボヌクレアーゼ、スプライソソーム、ビーズ、光誘導性／制御性ドメイン、または化学的誘導性／制御性ドメインを含んでいてもよい。
【０１８３】
特定の例示的な実施形態では、Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質は、レプトトリキア、リステリア、コリネバクター、サッテレーラ、レジオネラ、トレポネーマ、フィリファクター、ユウバクテリウム、ストレプトコッカス、乳酸桿菌、マイコプラズマ、バクテロイデス、フラビイボラ、フラボバクテリウム、スフェロケタ、アゾスピリルム、グルコナセトバクター、ナイセリア、ロゼブリア、パルビバクラム、スタフィロコッカス、ニトラチフラクター、マイコプラズマ、およびカンピロバクターからなる群より選択される生物に由来していてもよい。
【０１８４】
特定の態様では、エフェクタータンパク質はリステリアＣ２ｃ２ｐ種、好ましくはリステリア・シーリゲリＣ２ｃ２ｐ、より好ましくはリステリア・シーリゲリ血清型１／２ｂ株であってもよい。SLCC3954 C2c2pとｃｒＲＮＡ配列は、長さが４４〜４７ヌクレオチドであってもよく、２９ｎｔの５’末端直列反復配列（ＤＲ）と１５ｎｔ〜１８ｎｔのスペーサーを有する。
【０１８５】
特定の態様では、エフェクタータンパク質は、レプトトリキアＣ２ｃ２ｐ種、好ましくはレプトトリキア・シャーイイＣ２ｃ２ｐ、より好ましくはレプトトリキア・シャーイイDSM 19757 C2c2pであってもよい。また、ｃｒＲＮＡ配列は長さが４２〜５８ヌクレオチドであってもよく、少なくとも２４ｎｔの５’末端の直列反復配列、例えば、２４〜２８ｎｔの５’末端の直列反復配列（ＤＲ）と少なくとも１４ｎｔのスペーサー、例えば、１４ｎｔ〜２８ｎｔ、あるいは少なくとも１８ｎｔ、例えば、１９、２０、２１、２２ｎｔ、またはそれ以上、例えば、１８〜２８、１９〜２８、２０〜２８、２１〜２８、または２２〜２８ｎｔのスペーサーを有する。
【０１８６】
特定の例示的な実施形態では、エフェクタータンパク質はレプトトリキア属、レプトトリキア・ウェイディイＦ０２７９、またはリステリア属、好ましくはリステリア・ニューヨーケンシスFSL M6-0635であってもよい。
【０１８７】
特定の例示的な実施形態では、本発明のＣ２ｃ２エフェクタータンパク質は、限定されないが、以下の２１種の相同分子種（複数のＣＲＩＳＰＲ座位を含む）を含む：レプトトリキア・シャーイイ；レプトトリキア・ウェイディイ（Ｌｗ２）；リステリア・シーリゲリ；ラクノスピラ科細菌ＭＡ２０２０；ラクノスピラ科細菌ＮＫ４Ａ１７９；［クロストリジウム属］アミノフィラムDSM 10710；カーノバクテリウム・ガリナルムDSM 4847；カーノバクテリウム・ガリナルムDSM 4847（第二のＣＲＩＳＰＲ座位）；パルディバクター・プロピオニシゲネスＷＢ４；リステリア・ウェイヘンステファネンシスFSL R9-0317；リステリア科細菌FSL M6-0635；レプトトリキア・ウェイディイＦ０２７９；ロドバクター・カプスラータSB 1003；ロドバクター・カプスラータＲ１２１；ロドバクター・カプスラータＤＥ４４２；レプトトリキア・ブッカーリスＣ−１０１３−ｂ；ヘルビニックス・ヘミセルロシリィティカ；［ユウバクテリウム］レクターレ；ユーバクテリウム科細菌ＣＨＫＣＩ００４；ブラウティア・マルセイユＰ２３９８種；およびレプトトリキア・オーラルタクソン８７９種Ｆ０５５７株。さらに１２個の非限定的な例として、ラクノスピラ科細菌ＮＫ４Ａ１４４；クロロフレクサス・アグレガンス；デメキナ・アウランティアカ；タラソスピラＴＳＬ５−１種；シュードブチリビブリオＯＲ３７種；ブチリビブリオＹＡＢ３００１種；ブラウティア・マルセイユ−Ｐ２３９８；レプトトリキア・マルセイユ−Ｐ３００７種；バクテロイデス・イフアエ；ポリフィロモナス科細菌ＫＨ３ＣＰ３ＲＡ；リステリア・リパリア；およびインソリティスピリルム・ペレグリヌムがある。
【０１８８】
特定の態様では、本発明によるＣ２ｃ２タンパク質は、以下の表に示す相同分子種のうちの１つであるか、あるいはそれに由来する。あるいは、以下の表に示す相同分子種のうちの２つ以上のキメラタンパク質である。あるいは、以下の表に示す相同分子種のうちの１つの変異体または多様体（またはキメラ変異体あるいは多様体）である。上記Ｃ２ｃ２タンパク質は、本明細書の他の箇所で記載している、異種／機能ドメインと融合した、あるいはしていない死Ｃ２ｃ２、分割Ｃ２ｃ２、不安定化Ｃ２ｃ２を含む。
【０１８９】
特定の例示的な実施形態では、Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質は以下の表１から選択される（配列番号６００〜６１５も含まれる）。
【表１】
2020513815.tif 000003
2020513815.tif 000004
【０１９０】
上記の種の野生型タンパク質配列を以下の表２に示す。特定の態様では、Ｃ２ｃ２タンパク質をコードする核酸配列が提供される。
【表２】
2020513815.tif 000005
2020513815.tif 000006
【０１９１】
本発明の一実施形態では、レプトトリキア・シャーイイＣ２ｃ２、ラクノスピラ科細菌MA2020 C2c2、ラクノスピラ科細菌NK4A179 C2c2、クロストリジウム・アミノフィルム（DSM 10710）Ｃ２ｃ２、カーノバクテリウム・ガリナルム（DSM 4847）Ｃ２ｃ２、パルディバクター・プロピオニシゲネス（ＷＢ４）Ｃ２ｃ２、リステリア・ウェイヘンステファネンシス（FSL R9-0317）Ｃ２ｃ２、リステリア科細菌（FSL M6-0635）Ｃ２ｃ２，リステリア・ニューヨーケンシス（FSL M6-0635）Ｃ２ｃ２、レプトトリキア・ウェイディイ（Ｆ０２７９）Ｃ２ｃ２、ロドバクター・カプスラータ（SB 1003）Ｃ２ｃ２、ロドバクター・カプスラータ（Ｒ１２１）Ｃ２ｃ２、ロドバクター・カプスラータ（ＤＥ４４２）Ｃ２ｃ２、レプトトリキア・ウェイディイ（Ｌｗ２）Ｃ２ｃ２、またはリステリア・シーリゲリＣ２ｃ２の何れかの野生型配列に対して配列相同性が少なくとも８０％であるアミノ酸配列を含むエフェクタータンパク質が提供される。
【０１９２】
本発明の一実施形態では、エフェクタータンパク質は、ＶＩ型エフェクタータンパク質共通配列に対して配列相同性が少なくとも８０％であるアミノ酸配列を含む。そのような共通配列としては、これらに限定されないが、本明細書で記載する共通配列が挙げられる。本発明によれば、共通配列は複数のＣ２ｃ２相同分子種から生成されてもよい。共通配列は、保存されたアミノ酸残基およびモチーフの位置を決定するのを補助することができる。そのような共通配列としては、これらに限定されないが、Ｃ２ｃ２機能を媒介するＣ２ｃ２相同分子種中の触媒残基およびＨＥＰＮモチーフが挙げられる。そのような共通配列の１つは、Geneiousアライメントを用いて上記の３３個の相同分子種から生成された配列番号３２５である。
【０１９３】
他の非限定的な例では、共通配列の生成と保存された残基の同定を補助する配列アライメントツールとしてはMUSCLEアライメントツール(www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/)がある。例えば、MUSCLEを用いてレプトトリキア・ウェイディイＣ２ｃ２において、Ｃ２ｃ２相同分子種の中で保存された以下のアミノ酸位置を同定することができる：Ｋ２；Ｋ５；Ｖ６；Ｅ３０１；Ｌ３３１；Ｉ３３５；Ｎ３４１；Ｇ３５１；Ｋ３５２；Ｅ３７５；Ｌ３９２；Ｌ３９６；Ｄ４０３；Ｆ４４６；Ｉ４６６；Ｉ４７０；Ｒ４７４（ＨＥＰＮ）；Ｈ４７５；Ｈ４７９（ＨＥＰＮ）、Ｅ５０８；Ｐ５５６；Ｌ５６１；Ｉ５９５；Ｙ５９６；Ｆ６００；Ｙ６６９；Ｉ６７３；Ｆ６８１；Ｌ６８５；Ｙ７６１；Ｌ６７６；Ｌ７７９；Ｙ７８２；Ｌ８３６；Ｄ８４７；Ｙ８６３；Ｌ８６９；Ｉ８７２；Ｋ８７９；Ｉ９３３；Ｌ９５４；Ｉ９５８；Ｒ９６１；Ｙ９６５；Ｅ９７０；Ｒ９７１；Ｄ９７２；Ｒ１０４６（ＨＥＰＮ）、Ｈ１０５１（ＨＥＰＮ）、Ｙ１０７５；Ｄ１０７６；Ｋ１０７８；Ｋ１０８０；Ｉ１０８３；Ｉ１０９０。
【０１９４】
よく保存された残基を示すＨＥＰＮドメインの例示的な配列アライメントを図５０に示す。
【０１９５】
特定の例示的な実施形態では、ＲＮＡ標的エフェクタータンパク質は、Ｃａｓ１３ｂおよびグループ２９または３０のタンパク質などのＶＩ−Ｂ型エフェクタータンパク質である。特定の例示的な実施形態では、ＲＮＡ標的エフェクタータンパク質は１個以上のＨＥＰＮドメインを含む。特定の例示的な実施形態では、ＲＮＡ標的エフェクタータンパク質はＣ末端ＨＥＰＮドメイン、Ｎ末端ＨＥＰＮドメイン、またはこの両方を含む。本発明の文脈で用いられてもよいＶＩ−Ｂ型エフェクタータンパク質の例としては、以下を参照のこと。“Novel CRISPR Enzymes and Systems（新規なCRISPR酵素および系）”の名称で２０１６年１０月２１日に提出された米国特許出願第１５／３３１，７９２号、“Novel CRISPR Enzymes and Systems（新規なCRISPR酵素および系）”の名称で２０１６年１０月２１日に提出された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５８３０２号、Smargon et al. “Cas13b is a Type VI-B CRISPR-associated RNA-Guided RNase differentially regulated by accessory proteins Csx27 and Csx28（Cas13bはアクセサリータンパク質Csx27 and Csx28によって異なるように調節されるVI-B型CRISPR関連RNA誘導RNアーゼである）” Molecular Cell, 65, 1-13 (2017); dx.doi.org/10.1016/j.molcel.2016.12.023、および“Novel Cas13b Orthologues CRISPR Enzymes and System（新規なCas13b分子相同種CRISPR酵素および系）”の名称で２０１７年３月１５日に提出された米国特許仮特許出願。特定の実施形態では、Ｃａｓ１３ｂ酵素は、ベルゲイエラ・ズーヘルクム（Bergeyella zoohelcum）由来である。特定の他の例示的な実施形態では、エフェクタータンパク質は、表３に示す配列（配列番号４７９〜５６６も参照）の何れかに対して少なくとも８０％の配列相同性を持つアミノ酸配列である、あるいはそれを含む。
【表３】
2020513815.tif 000007
2020513815.tif 000008
2020513815.tif 000009
【０１９６】
特定の例示的な実施形態では、クラス２ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ系はＣａｓ１３ｃ系である。特定の例示的な実施形態では、Ｃａｓ１３ｃ相同分子種は以下の表４から選択される。この表は哺乳類細胞で発現するＣａｓ１３ｃ相同分子種を含む。
【表４】
2020513815.tif 000010
【０１９７】
特定の例示的な実施形態では、ＲＮＡ標的エフェクタータンパク質は２０１７年６月２６日に提出された米国特許仮特許出願第６２／５２５，１６５号および２０１７年８月１６日に提出された出願米国第２０１７／０４７１９３号に開示されるＣａｓ１３ｃエフェクタータンパク質である。Ｃａｓ１３ｃの野生型相同分子種の配列の例を以下の表５に示す。
【表５】
2020513815.tif 000011
ガイドＲＮＡ
【０１９８】
本明細書で用いられる用語「ｃｒＲＮＡ」、「ガイドＲＮＡ」、「一本鎖ガイドＲＮＡ」、「ｇＲＮＡ」は、標的核酸配列と十分な相補性を持つ任意のポリヌクレオチド配列を含み、標的核酸配列とハイブリダイズして、ｇＲＮＡとＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質とを含むＲＮＡ標的複合体の標的核酸配列への配列特異的結合を導くポリヌクレオチドを言う。一般に、ｇＲＮＡは、（ｉ）ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と複合体を形成することができ、（ｉｉ）標的ポリヌクレオチド配列と十分な相補性を持つ配列を含んで標的配列とハイブリダイズし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列への配列特異的結合を導く任意のポリヌクレオチド配列であってもよい。本明細書で用いられる用語「ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質と複合体を形成することができる」は、標的ＲＮＡに配列特異的に結合することができる複合体が形成されてその標的ＲＮＡに機能を及ぼすことができるようにＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質がｇＲＮＡに特異的に結合できるような構造をｇＲＮＡが有することを指す。ｇＲＮＡの構造的成分は直列反復配列およびガイド配列（すなわちスペーサー）を含んでいてもよい。標的ＲＮＡへの配列特異的結合は、ｇＲＮＡの一部である「ガイド配列」によって媒介される。ガイド配列は標的ＲＮＡと相補である。本発明の実施形態では、用語「ガイドＲＮＡ」すなわち標的座位にＣａｓを導くことができるＲＮＡは、WO2014/093622(PCT/US2013/074667)など上記の引用文献で用いられるのと同様に用いられる。本明細書で用いられる用語「ガイド配列はハイブリダイズすることができる」は、標的配列に十分な相補性を持ち、標的配列とハイブリダイズし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的ＲＮＡへの結合を媒介するｇＲＮＡの小部分を言う。一般に、ガイド配列は、標的ポリヌクレオチド配列と十分な相補性を持ち、標的配列とハイブリダイズして、ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列への配列特異的な結合を導く任意のポリヌクレオチド配列である。態様によっては、ガイド配列と対応する標的配列の相補性の程度は、好適なアライメントアルゴリズムを用いて最適なアライメントを行った場合、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％以上である。好適なアライメントは、配列を並べるための任意の好適なアルゴリズムを用いて決定してもよい。そのようなアルゴリズムの非限定的な例としては、Smith-Watermanアルゴリズム、Needleman-Wunschアルゴリズム、Burrows-Wheeler変換に基づくアルゴリズム（例えば、the Burrows Wheeler Aligner）、ClustalW, Clustal X, BLAT、Novoalign（Novocraft Technologies; novocraft.comで入手可能）、ELAND (Illumina,カリフォルニア州サンディエゴ）、SOAP（soap.genomics.org.cnで入手可能）、およびMaq（maq.sourceforge.netで入手可能）が挙げられる。
【０１９９】
特定の態様では、本明細書で提供されるＣＲＩＳＰＲ系は、ガイド配列を含むｃｒＲＮＡまたは類縁体ポリヌクレオチドを利用してもよい。ここで、ポリヌクレオチドはＲＮＡ、ＤＮＡ、またはＲＮＡとＤＮＡの混合物であり、かつ／または上記ポリヌクレオチドは１種以上のヌクレオチド類縁体を含む。この配列は、任意の構造を含んでいてもよい。そのような構造としては、これらに限定されないが、バルジ（二本鎖の一方で塩基が余った状態）、ヘアピン、またはステムループ構造など、天然ｃｒＲＮＡの構造が挙げられる。特定の態様では、ガイド配列を含むポリヌクレオチドは、第二のポリヌクレオチド配列と二本鎖を形成する。第二のポリヌクレオチド配列はＲＮＡ配列またはＤＮＡ配列であってもよい。
【０２００】
特定の態様では、化学修飾されたガイドＲＮＡが用いられる。ガイドＲＮＡの化学修飾の例としては、これらに限定されないが、１つ以上の末端ヌクレオチドへの２’−Ｏ−メチル（Ｍ）、３’−ホスホロチオ酸２’−Ｏ−メチル（ＭＳ）、または２’−Ｏ−メチル＝３’−チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）の組み込みが挙げられる。このような化学修飾されたガイドＲＮＡは、無修飾のガイドＲＮＡに比べて安定性と活性が高まっている場合があるが、標的特異性と非標的特異性は予測できない。（Hendel, 2015, Nat Biotechnol. 33(9):985-9, doi: 10.1038/nbt.3290（２０１５年６月２９日にオンラインで発表）を参照のこと）。化学修飾されたガイドＲＮＡは、これらに限定されないが、ホスホロチオ酸結合を有するＲＮＡ、およびリボース環の２’−炭素と４’−炭素との間にメチレン架橋を含む架橋型人工核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドをさらに含む。
【０２０１】
態様によっては、ガイド配列は、約５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５ヌクレオチドあるいはそれ以上の長さを有する。態様によっては、ガイド配列は、約７５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１２ヌクレオチド未満の長さを有する。ガイド配列は１０〜３０ヌクレオチド長であることが好ましい。ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列への配列特異的な結合を導くガイド配列の能力を任意の好適なアッセイにより評価してもよい。例えば、ＣＲＩＳＰＲ配列の成分をコードするベクターで形質移入するなど、試験対象のガイド配列を含むＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するのに十分なＣＲＩＳＰＲ系の成分を対応する標的配列を持つ宿主細胞に与えて、Surveyorアッセイなどで標的配列内での優先的な切断を評価してもよい。同様に、標的配列、ＣＲＩＳＰＲ複合体の成分（試験対象のガイド配列を含む）、および試験対象のガイド配列とは異なる対照ガイド配列を準備して、試験ガイド配列と対照ガイド配列の反応で標的配列での結合または切断速度を比較することで標的ＲＮＡの切断を試験管内で評価してもよい。他のアッセイも可能であり、当業者には自明である。
【０２０２】
ガイド配列、従って、核酸標的ガイドＲＮＡを、任意の標的核酸配列を標的するように選択してもよい。ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成という文脈で、「標的配列」は、ガイド配列が相補性を持つように設計された配列を指し、標的配列とガイド配列とのハイブリダイゼーションによりＣＲＩＳＰＲ複合体の形成が促進される。標的配列は、ＲＮＡポリヌクレオチドを含んでいてもよい。用語「標的ＲＮＡ」は、標的配列である、あるいはそれを含むＲＮＡポリヌクレオチドを指す。換言すれば、標的ＲＮＡは、ｇＲＮＡの一部分、すなわちガイド配列が相補性を持つように設計され、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質とｇＲＮＡを含む複合体によって媒介されるエフェクター機能が向けられるＲＮＡポリヌクレオチドまたはＲＮＡポリヌクレオチドの一部分であってもよい。態様によっては、標的配列は、細胞の核または細胞質に位置する。標的配列はＤＮＡであってもよい。標的配列は任意のＲＮＡ配列であってもよい。態様によっては、標的配列は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、前駆ｍＲＮＡ、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、および小細胞質ＲＮＡ（ｓｃＲＮＡ）からなる群より選択されるＲＮＡ分子内の配列であってもよい。好ましい態様によっては、標的配列は、ｍＲＮＡ、前駆ｍＲＮＡ、およびｒＲＮＡからなる群より選択されるＲＮＡ分子内の配列であってもよい。好ましい態様によっては、標的配列は、ｎｃＲＮＡおよびｌｎｃＲＮＡからなる群より選択されるＲＮＡ分子内の配列であってもよい。より好ましい態様によっては、標的配列はｍＲＮＡ分子または前駆ｍＲＮＡ分子内の配列であってもよい。
【０２０３】
態様によっては、核酸標的ガイドＲＮＡは、ＲＮＡ標的ガイドＲＮＡ内の二次構造度を低減するように選択されている。態様によっては、最適に折り畳まれると、核酸標的ガイドＲＮＡのヌクレオチドの約７５％、５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、１％以下が自己相補的塩基対の形成に参加する。最適な折り畳みは、任意の好適なポリヌクレオチド折り畳みアルゴリズムによって決定されてもよい。いくつかのプログラムは、最少ギブズ自由エネルギーを計算することに基づいている。そのようなアルゴリズムの一例は、Zuker and Stiegler (Nucleic Acids Res. 9 (1981), 133-148)に記載されたmFoldである。他の例示的な折り畳みアルゴリズムは、ウィーン大学Institute for Theoretical Chemistryで開発された重心構造予測アルゴリズムを用いるラインウェブサーバーRNAfoldである（例えば、A.R. Gruber et al., 2008, Cell 106(1): 23-24; and PA Carr and GM Church, 2009, Nature Biotechnology 27(12): 1151-62を参照のこと）。
【０２０４】
特定の態様では、ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡは、直列反復配列（ＤＲ）配列、およびガイド配列すなわちスペーサー配列を含む、それらから本質的になっている、あるいはそれらからなっていてもよい。特定の態様では、ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡは、ガイド配列すなわちスペーサー配列に融合または結合した直列反復配列を含む、それから本質的になっている、あるいはそれからなっていてもよい。特定の態様では、直列反復配列はガイド配列すなわちスペーサー配列の上流（すなわち、５’）に位置していてもよい。他の実施形態では、直列反復配列は、ガイド配列すなわちスペーサー配列の下流（すなわち、３’）に位置していてもよい。
【０２０５】
特定の態様では、ｃｒＲＮＡは、ステムループ、好ましくは単一のステムループを含む。特定の態様では、直列反復配列は、ステムループ、好ましくは単一のステムループを形成する。
【０２０６】
特定の態様では、ガイドＲＮＡのスペーサー長は１５〜３５ｎｔである。特定の態様では、ガイドＲＮＡのスペーサー長は、少なくとも１５ヌクレオチド、好ましくは少なくとも１８ｎｔ、例えば、少なくとも１９、２０、２１、２２ｎｔ、あるいはそれ以上である。特定の態様では、スペーサー長は１５〜１７ｎｔ、例えば、１５、１６、または１７ｎｔ、１７〜２０ｎｔ、例えば、１７、１８、１９、または２０ｎｔ、２０〜２４ｎｔ、例えば、２０、２１、２２、２３、または２４ｎｔ、２３〜２５ｎｔ、例えば、２３、２４、または２５ｎｔ、２４〜２７ｎｔ、例えば、２４、２５、２６、または２７ｎｔ、２７〜３０ｎｔ、例えば、２７、２８、２９、または３０ｎｔ、３０〜３５ｎｔ、例えば、３０、３１、３２、３３、３４、または３５ｎｔ、または３５ｎｔ以上である。
【０２０７】
特定の態様では、ガイドＲＮＡのスペーサー長は２８ヌクレオチド未満である。特定の態様では、ガイドＲＮＡのスペーサー長は少なくとも１８ヌクレオチドで、２８ヌクレオチド未満である。特定の態様では、ガイドＲＮＡのスペーサー長は１９〜２８ヌクレオチドである。特定の態様では、ガイドＲＮＡのスペーサー長は１９〜２５ヌクレオチドである。特定の態様では、ガイドＲＮＡのスペーサー長は２０ヌクレオチドである。特定の態様では、ガイドＲＮＡのスペーサー長は２３ヌクレオチドである。特定の態様では、ガイドＲＮＡのスペーサー長は２５ヌクレオチドである。
【０２０８】
従来のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系では、ガイド配列とその対応する標的配列との相補性の程度は、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％、あるいはそれ以上、または１００％であってもよい。ガイド、ＲＮＡ、またはｓｇＲＮＡは、長さが約５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５ヌクレオチドあるいはそれ以上であり得る。あるいは、ガイド、ＲＮＡ、またはｓｇＲＮＡは長さが約７５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１２ヌクレオチド以下であってもよい。しかしながら、本発明の側面は、例えば、低い相補性を持つ標的配列と相互作用するガイドを低減するなど、非標的の相互作用を低減するものである。実際、これらの例では、本発明は、標的配列と、８０％〜約約９５％の相補性、例えば、８３％〜８４％、８８〜８９％、または９４〜９５％の相補性を持つ非標的配列を区別する（例えば、１８ヌクレオチドの標的と、１つ、２つ、または３つの不一致を持つ１８ヌクレオチドの非標的を区別する）ことができるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系が得られる変異を含むことが示されている。従って、本発明の文脈で、ガイド配列とその対応する標的配列の相補性の程度は、９４．５％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．５％、９９．９％超、または１００％である。非標的は、配列とガイドの相補性が１００％、９９．９％、９９．５％、９９％、９９％、９８．５％、９８％、９７．５％、９７％、９６．５％、９６％、９５．５％、９５％、９４．５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、または８０％未満であり、好ましくは、非標的は、配列とガイドの相補性が１００％、９９．９％、９９．５％、９９％、９９％、９８．５％、９８％、９７．５％、９７％、９６．５％、９６％、９５．５％、９５％、９４．５％である。
【０２０９】
特定の態様では、不一致、例えば、スペーサー配列と標的配列の１つ以上の不一致（例えば、１つまたは２つの不一致）を導入することで、スペーサー／標的に沿った不一致の位置を含めて切断効率の調節を行うことができる。例えば、二重の不一致が中央寄り（すなわち、３’または５’ではない）にあると、切断効率はより影響を受ける。従って、スペーサーに沿った不一致位置を選択することで、切断効率を調節することができる。例えば、（例えば、細胞集団で）標的の１００％未満の切断が所望である場合、スペーサーと標的配列との１つ以上、例えば、好ましくは２つ不一致がスペーサー配列に導入されてもよい。不一致の位置のスペーサーに沿って中央寄りにあれば、切断割合は低くなる。
【０２１０】
特定の例示的な実施形態では、切断効率を用いて、例えば、一塩基多型（ＳＮＰ）、多様性、または（点）変異など１つのヌクレオチドが異なっている２つ以上の標的を区別することができる一本鎖ガイドを設計してもよい。ＣＲＩＳＰＲエフェクターは、ＳＮＰ（または他の一塩基多様性）に対する感度が低減されていて、特定のレベルの効率でＳＮＰ標的を続けて切断してもよい。従って、２つの標的あるいは１組の標的について、標的の１つ、すなわち標的ＳＮＰに相補なヌクレオチド配列を用いてガイドＲＮＡを設計してもよい。ガイドＲＮＡは、合成による不一致を持つようにさらに設計されている。本明細書で用いられる用語「合成による不一致」は、天然に存在するＳＮＰの上流または下流、最大５ヌクレオチド上流または下流、４、３、２、または１ヌクレオチド上流または下流、好ましくは最大３ヌクレオチド上流または下流、より好ましくは最大２ヌクレオチド上流または下流、最も好ましくは１ヌクレオチド上流または下流（すなわちＳＮＰに隣接して）導入した天然に存在しない不一致を言う。ＣＲＩＳＰＲエフェクターが標的ＳＮＰに結合すると、合成による不一致との１つの不一致のみが形成され、ＣＲＩＳＰＲエフェクターは引き続き活性化されており、検出可能な信号が生成される。ガイドＲＮＡが非標的ＳＮＰにハイブリダイズすると、ＳＮＰ由来の不一致と合成による不一致という２つの不一致が形成され、検出可能な信号は生成されない。従って、本明細書で開示される系は、１つの集団内でＳＮＰを区別するように設計されていてもよい。例えば、この系を用いて、１つのＳＮＰで異なっている病原体株を区別する、あるいは特定の疾患に特異的なＳＮＰを検出してもよい。そのようなＳＮＰとしては、これらに限定されないが、疾患関連ＳＮＰ、これらに限定されないが、癌関連ＳＮＰが挙げられる。
【０２１１】
特定の態様では、ガイドＲＮＡは、ＳＮＰが（５’末端から始めて）スペーサー配列の位置１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０に位置するように設計されている。特定の態様では、ガイドＲＮＡは、ＳＮＰが（５’末端から始めて）スペーサー配列の位置１、２、３、４、５、６、７、８、または９に位置するように設計されている。特定の態様では、ガイドＲＮＡは、ＳＮＰが（５’末端から始めて）スペーサー配列の位置２、３、４、５、６、または７に位置するように設計されている。特定の態様では、ガイドＲＮＡは、ＳＮＰが（５’末端から始めて）スペーサー配列の位置３、４、５、または６に位置するように設計されている。特定の態様では、ガイドＲＮＡは、ＳＮＰが（５’末端から始めて）スペーサー配列の位置３に位置するように設計されている。
【０２１２】
特定の態様では、ガイドＲＮＡは、不一致（例えば、合成による不一致、すなわちＳＮＰの他の別の変異）が（５’末端から始めて）スペーサー配列の位置１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０に位置するように設計されている。特定の態様では、ガイドＲＮＡは、不一致が（５’末端から始めて）スペーサー配列の位置１、２、３、４、５、６、７、８、または９に位置するように設計されている。特定の態様では、ガイドＲＮＡは、不一致が（５’末端から始めて）スペーサー配列の位置４、５、６、または７に位置するように設計されている。特定の態様では、ガイドＲＮＡは、不一致が（５’末端から始めて）スペーサー配列の位置５に位置するように設計されている。
【０２１３】
特定の態様では、ガイドＲＮＡは、不一致がＳＮＰの２ヌクレオチド上流に位置する（すなわち、１つのヌクレオチドがその間にある）ように設計されている。
【０２１４】
特定の態様では、ガイドＲＮＡは、不一致がＳＮＰの２ヌクレオチド下流に位置する（すなわち、１つのヌクレオチドがその間にある）ように設計されている。
【０２１５】
特定の態様では、ガイドＲＮＡは、不一致が（５’末端から始めて）スペーサー配列の位置５に位置し、ＳＮＰが（５’末端から始めて）スペーサー配列の位置３に位置するように設計されている。
【０２１６】
本明細書で記載する実施形態は、本明細書で記載するように、本明細書で記載したベクターを細胞に送達することを含む、真核細胞（生体外、すなわち単離された真核細胞）で１つ以上のヌクレオチド修飾を誘導することを理解するものである。変異は、１つまたは複数のガイドＲＮＡを介した細胞の各標的配列での１つ以上のヌクレオチドの導入、欠失、または置換を含んでいてもよい。変異は、１つまたは複数のガイドＲＮＡを介した前記細胞の各標的配列での１〜７５ヌクレオチドの導入、欠失、または置換を含んでいてもよい。変異は、１つまたは複数のガイドＲＮＡを介した前記細胞の各標的配列での１、５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、または７５ヌクレオチドの導入、欠失、または置換を含んでいてもよい。変異は、１つまたは複数のガイドＲＮＡを介した前記細胞の各標的配列での５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、または７５ヌクレオチドの導入、欠失、または置換を含んでいてもよい。変異は、１つまたは複数のガイドＲＮＡを介した前記細胞の各標的配列での１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、または７５ヌクレオチドの導入、欠失、または置換を含んでいる。変異は、１つまたは複数のガイドＲＮＡを介した前記細胞の各標的配列での２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、または７５ヌクレオチドの導入、欠失、または置換を含んでいてもよい。変異は、１つまたは複数のガイドＲＮＡを介した前記細胞の各標的配列での４０、４５、５０、７５、１００、２００、３００、４００、または５００ヌクレオチドの導入、欠失、または置換を含んでいてもよい。
【０２１７】
典型的には、内因性ＣＲＩＳＰＲ系の文脈では、ＣＲＩＳＰＲ複合体（標的配列にハイブリダイズして１種以上のＣａｓタンパク質と複合体を形成したガイド配列を含む）が形成されると、標的配列で、あるいはその付近（例えば、標的配列から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０個、またはそれ以上の数の塩基対内）で切断が生じるが、特にＲＮＡ標的の場合は、例えば、二次構造に依存する場合がある。
ＲＮＡ系マスキング構築物
【０２１８】
本明細書で用いられる用語「マスキング構築物」は、本明細書で記載する活性化されたＣＲＩＳＰＲ系エフェクタータンパク質によって切断され得るか、不活性化され得る分子を指す。用語「マスキング構築物」はまた、別の方法では「検出構築物」とも言われることがある。特定の例示的な実施形態では、マスキング構築物はＲＮＡ系マスキング構築物である。マスキング構築物は、検出可能な陽性信号の生成または検出を妨げる。検出可能な陽性信号は、当該分野で既知の光学、蛍光、化学発光体、電気化学、またはその他の検出方法を用いて検出することができる任意の信号であってもよい。マスキング構築物は、マスキング構築物が除去されるか、そうでなければ発現停止されるまでは、検出可能な陽性信号の生成を妨げる、あるいは検出可能な陽性信号の存在をマスクしていてもよい。用語「検出可能な陽性信号」は、マスキング構築物の存在下で検出可能な他の検出可能信号と区別するのに用いられる。例えば、特定の実施形態では、第一の信号は、マスキング因子が存在すると検出されてもよい（すなわち、検出可能な陰性信号）。第一の信号は、次いで、活性化されたＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質により標的分子が検出されてマスキング因子が切断または失活すると、第二の信号（例えば、検出可能な陽性信号）に変換される。
【０２１９】
特定の例示的な実施形態では、マスキング構築物は遺伝子産物の生成を抑制してもよい。遺伝子産物は、試料に付加されたレポーター構築物によりコードされてもよい。マスキング構築物は、例えば、ｓｈＲＨＮまたはｓｉＲＮＡなど、ＲＮＡ干渉経路に関与する干渉ＲＮＡであってもよい。マスキング構築物はまた、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含んでいてもよい。マスキング構築物が存在すると、遺伝子産物の発現を抑制する。遺伝子産物は、蛍光タンパク質であってもよく、あるいはマスキング構築物の存在に関して標識プローブまたは抗体により検出可能な他のＲＮＡ転写物またはタンパク質であってもよい。エフェクタータンパク質が活性化すると、マスキング構築物は切断あるいは発現停止されて遺伝子産物を検出可能な陽性信号として発現させ検出することができる。
【０２２０】
特定の例示的な実施形態では、マスキング構築物は陽性信号を生成するのに必要な１種以上の試薬を、このマスキング構築物から１種以上の試薬が放出されると検出可能な陽性信号が生成されるように、隔離していてもよい。１種以上の試薬は結合して、比色信号、化学発光信号、蛍光信号、または任意の他の検出可能な信号を生成してもよく、そのような目的に好適であると分かっている任意の試薬を含んでいてもよい。特定の例示的な実施形態では、１種以上の試薬は、１種以上の試薬と結合するＲＮＡアプタマーにより隔離されている。標的分子の検出時にエフェクタータンパク質が活性化されると、１種以上の試薬は放出される。特定の例示的な実施形態では、１種以上の試薬は、比色信号、化学発光信号、または蛍光信号などの検出可能な信号を容易に生成することができるタンパク質（例えば、酵素）である。このような試薬は、１種以上のＲＮＡアプタマーをタンパク質に結合させることでそのタンパク質が検出可能な信号を生成することができないように阻害または隔離するされている。本明細書で開示されるエフェクタータンパク質が活性化されると、ＲＮＡアプタマーは切断または分解されて、検出可能な信号を生成するタンパク質の能力を阻害できないようになる。特定の例示的な実施形態では、アプタマーはトロンビン阻害アプタマーである。特定の例示的な実施形態では、トロンビン阻害アプタマーは配列ＧＧＧＡＡＣＡＡＡＧＣＵＧＡＡＧＵＡＣＵＵＡＣＣＣ（配列番号：４１４）である。このアプタマーが切断されると、トロンビンが活性化されて、ペプチド比色基質または蛍光基質を切断する、特定の例示的な実施形態では、比色基質はトロンビンのペプチド基質に共有結合したパラニトロアニリド（ｐＮＡ）である。トロンビンによって切断されると、ｐＮＡが放出されて、黄色に変化し、容易に目で見えるようになる。特定の例示的な実施形態では、蛍光基質は、蛍光検出器を用いて検出することができる青色蛍光色素分子の７−アミノ−４−メチルクマリンである。上記の原則内で、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、β−ガラクトシダーゼ、または仔ウシアルカリホスファターゼ（ＣＡＰ）に対する阻害性アプタマーを用いてもよい。
【０２２１】
特定の態様では、ＲＮＡ分解酵素活性は、酵素阻害アプタマーの切断により比色分析から検出される。ＲＮＡ分解酵素活性を比色信号に変換する１つの可能性があるモードは、比色分析出力を生成することができる酵素の再活性化とＲＮＡアプタマーの切断とを結合させることである。ＲＮＡの切断がなければ、無傷のアプタマーが酵素標的に結合してその活性を阻害する。この読み出しシステムの利点は、酵素が追加の増幅工程を提供することである。副次活性（例えば、Ｃａｓ１３ａ副次活性）により一旦アプタマーから解放されると、比色分析酵素は継続して比色分析産物を生成し、信号を増大させる。
【０２２２】
特定の態様では、比色分析読み出しで酵素を阻害する既存のアプタマーが用いられる。トロンビン、タンパク質Ｃ、好中球エラスターゼ、およびスブチリシンなど、比色分析読み出しを持ついくつかのアプタマー／酵素対が存在する。これらプロテアーゼは、ｐＮＡに基づく比色基質を有しており、市販されている。特定の態様では、共通の比色分析酵素を標的する新規なアプタマーが用いられる。ＳＥＬＥＸなどの選択方法によって設計されたアプタマーを操作することにより強固な一般的な酵素（例えば、β−ガラクトシダーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、または仔ウシ腸アルカリホスファターゼ）を標的することができる。そのような方法により、ナノモル結合効率でアプタマーを素早く選択することがでる。またこのような方法は比色分析読み出しのためのさらなる酵素／アプタマー対の開発に用いることができる。
【０２２３】
特定の態様では、ＲＮＡ分解酵素活性は、ＲＮＡ結合阻害剤の切断により比色分析から検出される。多くの一般的な比色分析酵素は、競合性で可逆性の阻害剤を持っている。例えば、β−ガラクトシダーゼはガラクトースによって阻害され得る。これら阻害剤の多くは弱いものであるが、その効果は局所濃度が増加すると増加し得る。阻害剤の局所濃度とＲＮＡ分解酵素活性を結びつけることにより、比色分析酵素と阻害剤の対を操作によりＲＮＡ分解酵素センサーに導入することができる。小分子阻害剤に基づく比色分析ＲＮＡ分解酵素センサーは、３つの成分、すなわち、比色分析酵素、阻害剤、および阻害剤と酵素の両方に共有結合して阻害剤を酵素に結合させる架橋ＲＮＡを含む。未切断の構成では、小分子の局所濃度が高まることで酵素は阻害される。ＲＮＡが（例えばＣａｓ１３ａ副次切断により）切断されると、阻害剤が放出されて比色分析酵素が活性化される。
【０２２４】
特定の態様では、ＲＮＡ分解酵素活性は、グアニン四重鎖の形成および／または活性化により比色分析から検出される。ＤＮＡのグアニン四重鎖は、ヘム（鉄（ＩＩＩ）−プロトポルフィリンＩＸ）と結合して、ペルオキシダーゼ活性を持つＤＮＡ酵素を形成してもよい。ペルオキシダーゼ基質（例えば、ＡＢＴＳ：（２，２’−アジノビス［３−エチルベンゾチアゾライン−６−スルホン酸］二アンモニウム塩））と共に供給されると、グアニン四重鎖−ヘム複合体は過酸化水素の存在で基質を酸化させる。これにより溶液の色が緑色になる。ＤＮＡ配列を形成する例示的なグアニン四重鎖は、ＧＧＧＴＡＧＧＧＣＧＧＧＴＴＧＧＧＡ（配列番号：４１５）である。ＲＮＡ配列をこのＤＮＡアプタマーにハイブリダイズすることで、グアニン四重鎖構造の形成が限定される。ＲＮＡ分解酵素副次活性化（例えば、Ｃ２ｃ２−複合体副次活性化）の際には、ＲＮＡの固定が切断されて、グアニン四重鎖が形成され、ヘムが結合することができる。この方法は、特に色形成が酵素によるものであり、ＲＮＡ分解酵素活性化を超える追加の増幅があることを意味するので魅力的である。
【０２２５】
特定の例示的な実施形態では、マスキング構築物を個別の容積（さらに以下で規定される）内の固体基質に固定して、１つの試薬を隔離してもよい。例えば、試薬は、色素を含むビーズであってもよい。固定された試薬によって隔離されると、個々のビーズは検出可能な信号を生成できない程に分散されるが、マスキング構築物から放出されると、例えば凝集あるいは単に溶液濃度の上昇によって検出可能な信号を生成することができる。特定の例示的な実施形態では、固定されたマスキング因子は、標的分子が検出されると活性化したエフェクタータンパク質によって切断することができるＲＮＡ系アプタマーである。
【０２２６】
特定の他の例示的な実施形態では、マスキング構築物は、溶液中の固定された試薬に結合して、これにより溶液中で遊離している個別の標識された結合相手に結合する試薬の能力を阻害する。従って、試料に洗浄工程を行う際、標的分子の非存在下で標識された結合相手を試料から洗い流してもよい。しかしながら、エフェクタータンパク質が活性化されると、マスキング構築物は、試薬に結合するマスキング構築物の能力を阻害するのに十分な程度に切断され、これによって標識された結合相手は固定された試薬に結合することができる。従って、標識された結合相手は洗浄工程後に残留しており、これは試料中に標的分子が存在することを示す。特定の側面では、固定された試薬に結合するマスキング構築物は、ＲＮＡアプタマーである。固定された試薬はタンパク質であってもよく、標識された結合相手は標識抗体であってもよい。あるいは、固定された試薬はストレプトアビジンであり、標識された結合相手は標識ビオチンであってもよい。上記の実施形態で用いられる結合相手の標識は、当該分野で知られた任意の検出可能な標識であってもよい。また、上記の全体設計によって他の既知の結合相手を用いてもよい。
【０２２７】
特定の例示的な実施形態では、マスキング構築物はリボザイムを含んでいてもよい。リボザイムリボザイムは、触媒特性を持つＲＮＡ分子である。リボザイムは、天然に存在するものも人工的なものも、本明細書で開示されるエフェクタータンパク質によって標的されてもよいＲＮＡを含む、あるいはそれからなる。リボザイムは、検出可能な陰性信号を生成する、あるいは陽性対照信号の生成を阻害するかのいずれかの反応を触媒するように選択あるいは操作されていてもよい。活性化されたエフェクタータンパク質分子によってリボザイムが失活すると、反応は、陰性対照信号を生成するか、検出可能な陽性信号の生成を阻害するものを除去して、これによって検出可能な陽性信号の検出を可能にする。一例示的な実施形態では、リボザイムは、比色反応を触媒して、溶液が第一の色になるようにしてもよい。リボザイムが失活すると、溶液は第二の色になり、第二の色が検出可能な陽性信号である。リボザイムを用いてどのように比色反応を触媒するかの一例が、Zhao et al. “Signal amplification of glucosamine-6-phosphate based on ribozyme glmS（リボザイムglmSに基づくグルコサミン−６−ホスファートの信号増幅）,” Biosens Bioelectron. 2014; 16:337-42に記載されている。また、そのような系を修正して本明細書で開示される実施形態の文脈で作用させる例が示されている。あるいは、リボザイムは、存在する場合、例えばＲＮＡ転写物などの切断生成物を生成してもよい。従って、検出可能な陽性信号の検出は、リボザイムの非存在下でのみ生成された未切断ＲＮＡ転写物の検出を含んでいてもよい。
【０２２８】
一例示的な実施形態では、マスキング構築物は、溶液中に凝集しているか分散しているかによって色が変化する検出剤を含む。例えば、特定のナノ粒子（例えば、コロイド金）は、凝集体が分散粒子になるにつれてその色が目視で紫色から赤色に変化する。従って、特定の例示的な実施形態では、そのような検出剤は、１つ以上の架橋分子によって凝集体に担持されていてもよい。例えば、図４３を参照のこと。架橋分子の少なくとも一部はＲＮＡを含む。本明細書で開示されるエフェクタータンパク質が活性化されると、架橋分子のＲＮＡ一部が切断されて、検出剤が分散し、それに応じて色が変化する。例えば、図４５を参照のこと。特定の例示的な実施形態では、架橋分子はＲＮＡ分子である。特定の例示的な実施形態では、検出剤はコロイド金属である。コロイド金属材料は、液体、ヒドロゾル、または金属ゾルに分散された水不溶性金属粒子または金属化合物を含んでいてもよい。コロイド状金属は、周期表のＩＡ、ＩＢ、ＩＩＢ、およびＩＩＩＢ族金属、遷移金属、特にＶＩＩＩ族金属から選択されてもよい。好ましい金属は、金、銀、アルミニウム、ルテニウム、亜鉛、鉄、ニッケル、およびカルシウムが挙げられる。また、他の好適な金属は、以下の金属の様々な酸化状態の全てを含む：リチウム、ナトリウム、マグネシウム、カリウム、スカンジウム、チタン、バナジウム、クロム、マンガン、コバルト、銅、ガリウム、ストロンチウム、ニオブ、モリブデン、パラジウム、インジウム、スズ、タングステン、レニウム、白金、およびガドリニウム。これら金属は、適切な金属化合物から生成したイオン形態（例えば、Ａｌ３＋，Ｒｕ３＋、Ｚｎ２＋，Ｆｅ３＋、Ｎｉ２＋、およびＣａ２＋イオン）で提供されることが好ましい。
【０２２９】
ＲＮＡ架橋が活性化されたＣＲＩＳＰＲエフェクターによって切断されると、上記の色変化が観測される。特定の例示的な実施形態では、これら粒子はコロイド金属である。特定の他の例示的な実施形態では、コロイド金属はコロイド金である。特定の例示的な実施形態では、コロイドナノ粒子は１５ｎｍの金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）である。コロイド金ナノ粒子に固有の表面性により、溶液中に完全に分散されて目視で赤色に見える時の最大吸光度は５２０ｎｍで観察される。ＡｕＮＰが凝集すると、最大吸光度は赤色に変化して、色が濃くなり、最終的には濃い紫色凝集体として溶液から析出する。特定の例示的な実施形態では、ナノ粒子は、ナノ粒子の表面から延びるＤＮＡリンカーを含むように修飾されている。個々の粒子は、ＲＮＡの各末端をＤＮＡリンカーの少なくとも一部にハイブリダイズする一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）架橋によって互いに結合されている。従って、ナノ粒子は、結合粒子および凝集体のウェブを形成しており、濃い色の析出物として現れる。本明細書で開示されるＣＲＩＳＰＲエフェクターが活性化されると、ｓｓＲＮＡ架橋が切断されて、結合メッシュからＡｕＮＰが放出されて目視で赤色になる。ＤＮＡリンカーとＲＮＡ架橋配列の例を以下に示す。ＡｕＮＰに結合させる表面としてＤＮＡリンカーの末端のチオールリンカーを用いてもよい。結合の他の形態を用いてもよい。特定の例示的な実施形態では、各ＤＮＡリンカーに対して１つになるように、２つのＡｕＮＰ集団を生成してもよい。これは、適切な配向でｓｓＲＮＡ架橋が適切に結合するのを容易にするのを補助する。特定の例示的な実施形態では、第一のＤＮＡリンカーは３’末端に結合し、第二のＤＮＡリンカーは５’末端に結合している。
【表６】
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【０２３０】
態様によっては、核酸標的系の１つ以上の要素は、内因性CRISPR RNA標的系を含む特定の生物に由来する。特定の態様では、CRISPR RNA標的システムはユウバクテリウムおよびルミノコッカスに見られる。特定の態様では、エフェクタータンパク質は、標的されたＲＮＡ切断活性と副次ｓｓＲＮＡ切断活性を含む。特定の態様では、エフェクタータンパク質は２つのＨＥＰＮドメインを含む。特定の態様では、エフェクタータンパク質は、Ｃａｓ１３ａのＨｅｌｉｃａｌ−１ドメインの相手を欠いている。特定の態様では、エフェクタータンパク質は、上記の（大きさの中心値が９２８アミノ酸（ａａ））クラス２のＣＲＩＳＰＲエフェクターよりも小さい。この大きさの中心値は１９０ａａ（１７％）であってＣａｓ１３ｃの中心値より小さく、２００ａａ（１８％）超であってＣａｓ１３ｂの中心値よりも小さく、また３００ａａ（２６％）超であってＣａｓ１３ａの中心値よりも小さい。特定の態様では、エフェクタータンパク質には隣接配列（例えば、ＰＦＳ、ＰＡＭ）に関する要件がない。
【０２３１】
特定の態様では、エフェクタータンパク質座位構造は、補助タンパク質を含むＷＹＬドメインを含む（補助タンパク質は、これらドメインの由来が同定された群で保存された３つのアミノ酸の後ろに示されている。例えば、ＷＹＬドメインＩＰＲ０２６８８１を参照のこと）。特定の態様では、ＷＹＬドメイン補助タンパク質は、少なくとも１個のヘリックスターンヘリックス（ＨＴＨ）またはリボンヘリックスヘリックス（ＲＨＨ）ＤＮＡ結合ドメインを含む。特定の態様では、補助タンパク質を含むＷＹＬドメインは、ＲＮＡ標的エフェクタータンパク質の標的されたＲＮＡ切断活性と副次ｓｓＲＮＡ切断活性の両方を高める。特定の態様では、補助タンパク質を含むＷＹＬドメインは、Ｎ末端ＲＨＨドメインと、一次保存された疎水性残基のパターン（元のＷＹＬモチーフに対応する不変のチロシン−ロイシン二重項を含む）を含む。特定の態様では、補助タンパク質を含むＷＹＬドメインはＷＹＬ１である。ＷＹＬ１は、ルミノコッカスと一次的に関連付けられる１つのＷＹＬドメインタンパク質である。
【０２３２】
他の例示的な実施形態では、ＶＩ型ＲＮＡ標的Ｃａｓ酵素はＣａｓ１３ｄである。特定の態様では、Ｃａｓ１３ｄはユウバクテリウム・シラエウムDSM 15702 (EsCas13d)またはルミノコッカスN15.MGS-57種 (RspCas13d)（例えば、Yan et al., Cas13d Is a Compact RNA-Targeting Type VI CRISPR Effector Positively Modulated by a WYL-Domain-Containing Accessory Protein, Molecular Cell (2018), doi.org/10.1016/j.molcel.2018.02.028を参照のこと）。RspCas13dおよびEsCas13dには隣接配列（例えば、ＰＦＳ、ＰＡＭ）に関する要件がない。
【０２３３】
特定の他の例示的な実施形態では、マスキング構築物は、検出可能な標識および検出可能な標識のマスキング因子が付加されたＲＮＡオリゴヌクレオチドを含んでいてもよい。そのような検出可能な標識／マスキング因子対の例は、蛍光色素分子とその蛍光色素分子のクエンチャーである。蛍光色素分子と他の蛍光色素分子または非蛍光分子とで非蛍光複合体が形成された結果、蛍光色素分子の消光が生じ得る。この反応機構は、基底状態複合体形成、静的消光、または接触消光として知られている。従って、ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、接触消光が生じるよう蛍光色素分子とクエンチャーが十分に近接しているように設計されてもよい。蛍光色素分子とその関連したクエンチャーは当該分野で知られており、この目的のために一般の当業者によって選択されてもよい。蛍光色素分子／クエンチャー対の選択により蛍光色素分子が確実にマスキングされること以外は、特定の蛍光色素分子／クエンチャー対は本発明の文脈では重要ではない。本明細書で開示されるエフェクタータンパク質が活性化されると、ＲＮＡオリゴヌクレオチドは切断されて、接触消光効果を維持するのに必要な蛍光色素分子とクエンチャーの近接性を断ち切る。従って、蛍光色素分子の検出を用いて試料中の標的分子の存在を決定してもよい。
【０２３４】
特定の他の例示的な実施形態では、マスキング構築物は、１個以上の金属ナノ粒子（例えば、金ナノ粒子）が付加された１個以上のＲＮＡオリゴヌクレオチドを含んでいてもよい。態様によっては、マスキング構築物は、閉ループを形成する複数のＲＮＡオリゴヌクレオチドにより架橋された複数の金属ナノ粒子を含む。一態様では、マスキング構築物は、閉ループを形成する３個のＲＮＡオリゴヌクレオチドにより架橋された３個の金ナノ粒子を含む。態様によっては、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質によってＲＮＡオリゴヌクレオチドが切断されると、金属ナノ粒子により検出可能な信号が生成される。
【０２３５】
特定の他の例示的な実施形態では、マスキング構築物は、１個以上の量子ドットが付加された１個以上のＲＮＡオリゴヌクレオチドを含んでいてもよい。態様によっては、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質によってＲＮＡオリゴヌクレオチドが切断されると、量子ドットにより検出可能な信号が生成される。
【０２３６】
一例示的な実施形態では、マスキング構築物は量子ドットを含んでいてもよい。量子ドットは、その表面に複数のリンカー分子が付加されていてもよい。リンカー分子の少なくとも一部はＲＮＡを含む。量子ドットの消光が生じるようにクエンチャーを十分に近接して維持するように、リンカー分子はその一端が量子ドットに付加されており、リンカーの長さに沿って、あるいはその末端には１つ以上のクエンチャーが付加されている。リンカーは分岐していてもよい。上記のように、量子ドット／クエンチャー対によって蛍光色素分子が確実にマスキングされること以外は、量子ドット／クエンチャー対は重要でない。量子ドットおよびその関連するクエンチャーは、当該分野で知られており、この目的のために一般の当業者によって選択されてもよい。本明細書で開示されるエフェクタータンパク質が活性化されると、リンカー分子のＲＮＡ部分が切断されて、これにより消光効果を維持するのに必要な量子ドットと１つ以上のクエンチャーとの近接性を排除する。特定の例示的な実施形態では、量子ドットはストレプトアビジンと結合している。ＲＮＡはビオチンリンカーを介して付加されて、配列／５Ｂｉｏｓｇ／ＵＣＵＣＧＵＡＣＧＵＵＣ／３ＩＡｂＲＱＳｐ／（配列番号４１６）または／５Ｂｉｏｓｇ／ＵＣＵＣＧＵＡＣＧＵＵＣＵＣＵＣＧＵＡＣＧＵＵＣ／３ＩＡｂＲＱＳｐ／（配列番号４１７）（ここで／５Ｂｉｏｓｇ／はビオチンタグであり、／３ｌＡｂＲＱＳｐ／はIowa Blackクエンチャーである）と共に消光分子を動員する。本明細書で開示される活性化エフェクターにより切断されると、量子ドットは目に見える蛍光を発する。
【０２３７】
同様に、フェルスター共鳴エネルギー転移（Forster resonance energy transfer, ＦＲＥＴ）を用いて検出可能な陽性信号を生成してもよい。ＦＲＥＴは、エネルギーによって励起した蛍光色素分子（すなわち「供与体蛍光色素分子」）からの光子が他の分子（すなわち「受容体」）の電子のエネルギー状態をより高い振動レベルの励起した一重項状態まで上げる非放射性の過程である。供与体蛍光色素分子は、その蛍光色素分子に特徴的な蛍光を放出することなく基底状態に戻る。受容体は、他の蛍光色素分子または非蛍光分子であってもよい。受容体が蛍光色素分子である場合は、移動エネルギーはその蛍光色素分子に特徴的な蛍光として発せられる。受容体が非蛍光分子である場合は、吸収エネルギーが熱として失われる。従って、本明細書で開示される実施形態の文脈で、蛍光色素分子／クエンチャー対は、オリゴヌクレオチド分子に付加された供与体蛍光色素分子／受容体対と置き換えられる。無傷である場合、マスキング構築物は、受容体から発せられる蛍光あるいは熱として検出される第一の信号（検出可能な陰性信号）を生成する。本明細書で開示されるエフェクタータンパク質が活性化されると、ＲＮＡオリゴヌクレオチドは切断されて、ＦＲＥＴが阻害され、供与体蛍光色素分子の蛍光が（検出可能な陽性信号として）検出されるようになる。
【０２３８】
特定の例示的な実施形態では、マスキング構築物は、長いＲＮＡが短いヌクレオチドに切断されるのに応答してその吸光度が変化する挿入色素の使用を含む。そのような色素がいくつか存在する。例えば、ピロニン−ＹはＲＮＡと結合して、吸光度が５７２ｎｍの複合体を形成する。このＲＮＡが切断されると吸光度が失われて、色が変わる。メチレンブルーを同様に用いてもよい。メチレンブルーは、ＲＮＡが切断されると吸光度６８８ｎｍで変化する。従って、特定の例示的な実施形態では、マスキング構築物は、ＲＮＡ、および本明細書で開示されるエフェクタータンパク質によってＲＮＡが切断されると吸光度が変化する挿入色素複合体を含む。
増幅
【０２３９】
特定の例示的な実施形態では、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を活性化する前に標的ＲＮＡおよび／またはＤＮＡを増幅してもよい。任意の好適なＲＮＡまたはＤＮＡ増幅技術を用いてもよい。特定の例示的な実施形態では、ＲＮＡまたはＤＮＡ増幅は等温増幅である。特定の例示的な実施形態では、等温増幅は、核酸配列増幅（ＮＡＳＢＡ）、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）、ループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、またはニッキング酵素増幅反応（ＮＥＡＲ）であってもよい。特定の例示的な実施形態では、非等温増幅法を用いてもよく、これらに限定されないが、ＰＣＲ、多置換増幅（ＭＤＡ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、または分岐増幅法（ＲＡＭ）が挙げられる。
【０２４０】
特定の例示的な実施形態では、ＲＮＡまたはＤＮＡ増幅は、核酸配列増幅（ＮＡＳＢＡ）であり、配列に特異的な逆方向プライマーによる標的ＲＮＡの逆転写を開始してＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖を作製する。次いで、ＲＮＡ分解酵素Ｈを用いてＲＮＡ鋳型を分解し、プロモーター（例えば、Ｔ７プロモーター）を含む順方向プライマーを結合させて、相補鎖の伸長を開始し、二本鎖ＤＮＡ生成物を生成する。次いで、ＤＮＡ鋳型のＲＮＡポリメラーゼプロモーター媒介転写により、標的ＲＮＡ配列のコピーが作製される。重要なのは、ガイドＲＮＡによって新たな標的ＲＮＡのそれぞれを検出することができ、これにより、さらにアッセイの感度を高めることができることである。ガイドＲＮＡによって標的ＲＮＡが結合すると、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質が活性化されて、上で概略を示した方法が進行する。ＮＡＳＢＡ反応は、さらに穏やかな等温条件（例えば、約４１℃）で進行することができるという利点を有し、当該分野で、また臨床実験室から離れた場所で初期の直接検出に配置されるシステムおよび装置に好適になっている。
【０２４１】
特定の他の例示的な実施形態では、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）反応を用いて標的核酸を増幅してもよい。ＲＰＡ反応は、配列に特異的なプライマーを二本鎖ＤＮＡの相同性配列と対にすることができるリコンビナーゼを用いる。標的ＤＮＡが存在すると、ＤＮＡ増幅が開始され、熱サイクリングまたは化学融解など他の試料操作は必要ではない。ＲＰＡ増幅系全体は乾燥配合物として安定しており、冷蔵せずに安全に輸送することができる。ＲＰＡ反応はまた、３７〜４２℃の最適反応温度での等温条件で行ってもよい。配列に特異的なプライマーは、検出対象の標的核酸配列を含む配列を増幅するように設計されている。特定の例示的な実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（例えば、Ｔ７プロモーター）がプライマーの１つに付加されている。これにより、標的配列およびＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む増幅された二本鎖ＤＮＡ生成物が得られる。ＲＰＡ反応の後またはその最中にＲＮＡポリメラーゼを加えると、二本鎖ＤＮＡ鋳型からＲＮＡが生成される。次いで、増幅された標的ＲＮＡをＣＲＩＳＰＲエフェクター系により検出してもよい。このように、本明細書で開示される実施形態を用いて標的ＤＮＡを検出してもよい。ＲＰＡ反応を用いて標的ＲＮＡを増幅してもよい。標的ＲＮＡをまず逆転写酵素を用いてｃＤＮＡに変換し、第二の鎖ＤＮＡ合成を行う。この時、上で概略を示したＲＰＡ反応が進行する。
【０２４２】
従って、特定の例示的な実施形態では、本明細書で開示される系は増幅試薬を含んでいてもよい。核酸の増幅に有用な異なる成分または試薬は本明細書で記載されている。例えば、本明細書で記載する増幅試薬は、トリス緩衝液などの緩衝液を含んでいてもよい。トリス緩衝液を所望の応用または使用に適切な任意の濃度で用いてもよい。そのような濃度としては、これらに限定されないが、１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、１１ｍＭ、１２ｍＭ、１３ｍＭ、１４ｍＭ、１５ｍＭ、２５ｍＭ、５０ｍＭ、７５ｍＭ、１Ｍなどが挙げられる。当業者であれば、本発明と併用するトリスなどの緩衝液の適切な濃度を決定することができる。
【０２４３】
核酸断片の増幅を向上させるため、ＰＣＲなどの増幅反応に塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、または塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）などの塩を含めてもよい。塩の濃度は特定の反応および応用によって変化するが、実施形態によっては、特定の大きさの核酸断片は特定の塩濃度で最適な結果をもたらすことがある。所望の結果を得るため、大きな生成物は塩濃度を変更する、典型的には塩濃度を下げることが必要な場合がある。一方、小さい生成物の増幅では、塩濃度が高いほうがよりよい結果を得られる。当業者には自明であるが、塩の存在および／または濃度は、塩濃度の変化に沿って生物学的反応または化学反応の厳密さを変える場合があり、従って、本発明および本明細書で記載する反応に適切な条件をもたらす任意の塩を用いてもよい。
【０２４４】
生物学的反応または化学反応の他の成分は、細胞内の材料の分析のために細胞を壊して開けるすなわち溶解させるための細胞溶解成分を含んでいてもよい。細胞溶解成分は、これらに限定されないが、洗剤、上記の塩（例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、硫酸アンモニウム［（ＮＨ４）２ＳＯ４］、またはその他）を含む。本発明に適切であり得る洗剤は、トリトンＸ−１００、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホナート）、臭化エチルトリメチルアンモニウム、ノニルフェノキシポリエトキシルエタノール（ＮＰ−４０）を含んでいてもよい。洗剤の濃度は特定の応用によって変化してもよく、場合によっては反応に特異的であってもよい。増幅反応は本発明に適切な任意の濃度で用いられるｄＮＴＰおよび核酸プライマーを含んでいてもよい。そのような濃度としては、これらに限定されないが、１００ｎＭ、１５０ｎＭ、２００ｎＭ、２５０ｎＭ、３００ｎＭ、３５０ｎＭ、４００ｎＭ、４５０ｎＭ、５００ｎＭ、５５０ｎＭ、６００ｎＭ、６５０ｎＭ、７００ｎＭ、７５０ｎＭ、８００ｎＭ、８５０ｎＭ、９００ｎＭ、９５０ｎＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、１００ｍＭ、１５０ｍＭ、２００ｍＭ、２５０ｍＭ、３００ｍＭ、３５０ｍＭ、４００ｍＭ、４５０ｍＭ、５００ｍＭなどが挙げられる。同様に、本発明による有用なポリメラーゼは、当該分野で知られており本発明に有用な任意の特定のポリメラーゼあるいは汎用ポリメラーゼを用いてもよい。そのようなポリメラーゼとしてはＴａｑポリメラーゼ、Ｑ５ポリメラーゼなどが挙げられる。
【０２４５】
態様によっては、本明細書で記載する増幅試薬はホットスタート増幅に用いるのに適切な場合がある。ホットスタート増幅は、実施形態によっては、アダプター分子はオリゴの二量化を低減あるいは排除する、あるいはそうでなければ望ましくない増幅産物または人工物を防ぐ、あるいは所望の生成物の最適な増幅を得るのに有用である場合がある。増幅に用いる本明細書で記載する多くの成分はまた、ホットスタート増幅に用いてもよい。態様によっては、１種以上の適切な組成成分の代わりにホットスタート増幅に用いるのに適切な試薬または成分を用いてもよい。例えば、特定の温度または他の反応条件で所望の活性を示すポリメラーゼまたは他の試薬を用いてもよい。態様によっては、ホットスタート増幅に用いるように設計または最適化された試薬を用いてもよい。例えば、ポリメラーゼは、転位後あるいは特定の温度に達した後に活性化されてもよい。そのようなポリメラーゼは抗体系またはアプタマー系であってもよい。本明細書で記載するポリメラーゼは当該分野で知られている。そのような試薬の例としては、これらに限定されないが、ホットスタートポリメラーゼ、ホットスタートデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、および光ケージ化ｄＮＴＰを含んでいてもよい。そのような試薬は当該分野で知られており、入手可能である。当業者であれば、個々の試薬に適切な最適温度を決定することができる。
【０２４６】
特定の熱サイクル機構または装置を用いて核酸を増幅してもよく、また、単一の反応で行ってもよく、任意の所望の数の反応を同時に行うように大量に行ってもよい。態様によっては、マイクロ流体装置またはロボット装置を用いて増幅を行ってもよく、あるいは所望の増幅が達成されるように手動で温度を変化させて行ってもよい。態様によっては、最適化を行って特定の応用または材料に最適な反応条件を得てもよい。当業者には自明であるように、十分な増幅を得るための反応条件を最適化することができる。
【０２４７】
特定の態様では、本発明の方法またはシステムによるＤＮＡの検出は、検出の前に（増幅した）ＤＮＡをＲＮＡに転写する必要がある。
標的ＲＮＡ／ＤＮＡの濃縮
【０２４８】
特定の例示的な実施形態では、標的ＲＮＡまたはＤＮＡの検出または増幅の前にまず、標的ＲＮＡまたはＤＮＡを濃縮してもよい。特定の例示的な実施形態では、この濃縮はＣＲＩＳＰＲエフェクター系による標的核酸の結合により達成されてもよい。
【０２４９】
現在の標的に特異的な濃縮試験規約では、プローブでのハイブリダイゼーションの前に一本鎖核酸が必要である。様々な利点のうち、本実施形態はこの工程をなくして、直接二本鎖ＤＮＡ（二本鎖の一部あるいは全部）に標的することができる。また、本明細書で開示される実施形態は、酵素駆動による標的法であり、より速い動力学とより簡単なワークフローを提供して等温濃縮を可能にする。特定の例示的な実施形態では、濃縮は２０〜３７℃で生じる場合がある。特定の例示的な実施形態では、１回のアッセイで異なる標的核酸に対して１組のガイドＲＮＡを用いて、複数の標的の検出および／または１つの標的の中の複数の多様体の検出を行うことができる。
【０２５０】
特定の例示的な実施形態では、死ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を溶液中の標的核酸に結合させて、次いでその溶液から単離してもよい。例えば、死ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質に特異的に結合する抗体または他の分子（例えば、アプタマー）を用いて、標的核酸に結合した死ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を溶液から単離してもよい。
【０２５１】
他の例示的な実施形態では、死ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は固体基質に結合していてもよい。固定した基質は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを付加するのに適切であるか、そのように修飾された任意の材料を指す場合がある。可能性のある基質としては、これらに限定されないが、ガラスおよび修飾機能ガラス、プラスチック（アクリル、ポリスチレン、およびスチレンおよび他の材料の共重合体、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、テフロン（登録商標）等を含む）、多糖、ナイロン、ニトロセルロース、セラミック、樹脂、シリカ、ケイ素および修飾ケイ素を含むシリカ系材料、炭素、金属、無機ガラス、プラスチック、光学繊維束、および様々な他の重合体が挙げられる。態様によっては、固体の支持体は、規則的に並んだパターンで分子を固定するのに好適なパターン付き表面を含む。特定の実施形態では、パターン付き表面は、固体の支持体の露出層内またはそれに接した異なる領域の配列を言う。態様によっては、固体の支持体は、表面のウェルすなわち凹みの配列を含む。固体の支持体の組成および形状はその用途によって異なってもいてもよい。態様によっては、固体の支持体は、スライド、チップマイクロチップ、および／またはアレイなど平面構造である。従って、基質の表面は平面層の形態であってもよい。態様によっては、固体の支持体は、フローセルの１つ以上の表面を含む。本明細書で用いられる用語「フローセル」は、１つ以上の流体試薬が流れることができる固体表面を含むチャンバーを言う。本開示の方法で容易に用いることができるフローセルおよび関連する流体システムおよび検出装置の例は、例えば、以下に記載されている： Bentley et al. Nature 456:53-59 (2008), ＷＯ０４／０９１８４９７、米国第７，０５７，０２６号；ＷＯ９１／０６６７８；ＷＯ０７／１２３７４４；米国第７，３２９，４９２号；米国第７，２１１，４１４号；米国第７，３１５，０１９号；米国第７，４０５，２８１号、および米国第２００８／０１０８０８２号。態様によっては、固体の支持体またはその表面は、管または容器の内面あるいは外面など非平面である。態様によっては、固体の支持体は微小球またはビーズを含む。用語「微小球」、「ビーズ」、「粒子」は、固体基質という観点からは、様々な材料からなる小さい個別の粒子を意味する。様々な材料としては、これらに限定されないが、プラスチック、セラミック、ガラス、およびポリスチレンが挙げられる。特定の態様では、微小球は磁性微小球またはビーズである。これに代えて、あるいはこれに加えて、ビーズは多孔性であってもよい。ビーズ径は、ナノメートル（例えば、１００ｎｍ）からミリメートル（例えば、１ｍｍ）の範囲である。
【０２５２】
次いで、標的核酸を含む、あるいは含むと思われる試料を基質に曝して、結合している死ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質に標的核酸を結合させてもよい。次いで、非標的分子を洗い流してもよい。特定の例示的な実施形態では、その後、本明細書で開示される方法を用いたさらなる検出のために、標的核酸はＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質／ガイドＲＮＡ複合体から放出されてもよい。特定の例示的な実施形態では、標的核酸はまず、本明細書で記載するように増幅されてもよい。
【０２５３】
特定の例示的な実施形態では、ＣＲＩＳＰＲエフェクターを結合タグで標識してもよい。特定の例示的な実施形態では、ＣＲＩＳＰＲエフェクターは化学的にタグ付けされてもよい。例えば、ＣＲＩＳＰＲエフェクターは化学的にビオチン化されてもよい。他の例示的な実施形態では、融合をコードするさらなる配列をＣＲＩＳＰＲエフェクターに付加することにより融合を作製してもよい。そのような融合の一例はAviTag（登録商標）である。これは、非常に標的された酵素によって単一のビオチンを固有の１５アミノ酸ペプチドからなるタグに結合させるとい方法を用いている。特定の態様では、ＣＲＩＳＰＲエフェクターは、ＧＳＴ、Ｍｙｃ、ヘマグルチニン（ＨＡ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ｆｌａｇ、Ｈｉｓタグ、ＴＡＰタグ、およびＦｃタグなどのキャプチャータグで標識されていてもよいが、これらに限定されない。融合、化学タグ、またはキャプチャータグのいずれかの結合タグを用いて、ひとたび標的核酸に結合したらＣＲＩＳＰＲエフェクター系を破壊するか、または固体基質表面にＣＲＩＳＰＲエフェクター系を固定してもよい。
【０２５４】
特定の例示的な実施形態では、ガイドＲＮＡは結合タグで標識されていてもよい。特定の例示的な実施形態では、１つ以上のビオチン化ヌクレオチド（例えば、ビオチン化ウラシル）を組み込んだ生体外転写（ＩＶＴ）を用いてガイドＲＮＡ全体を標識してもよい。態様によっては、１つ以上のビオチン基をガイドＲＮＡの３’末端に付加するなど、ビオチンを化学的に、あるいは酵素によってガイドＲＮＡに付加してもよい。 結合が生じた後は、結合タグを用いて、例えば、ガイドＲＮＡ／標的核酸をストレプトアビジンで被覆した固体基質に曝すことによりガイドＲＮＡ／標的核酸複合体を破壊してもよい。
【０２５５】
従って、特定の例示的な実施形態では、操作された、すなわち天然に存在しないＣＲＩＳＰＲエフェクターを濃縮の目的で用いてもよい。一実施形態では、この修飾は、エフェクタータンパク質の１つ以上のアミノ酸残基の変異を含んでいてもよい。このような１つ以上の変異は、エフェクタータンパク質の１つ以上の触媒活性ドメインにあってもよい。エフェクタータンパク質は、１つ以上の変異がないエフェクタータンパク質と比較して、ヌクレアーゼ活性が低減あるいは消失していてもよい。エフェクタータンパク質は、対象の標的座位でのＲＮＡ鎖の切断を誘導しなくてもよい。好ましい一態様では、１つ以上の変異は２つの変異を含んでいてもよい。好ましい一態様では、前記１つ以上のアミノ酸残基は、Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質（例えば、操作された、すなわち天然に存在しないエフェクタータンパク質またはＣ２ｃ２）において修飾されている。特定の実施形態では、１つ以上の修飾された変異のあるアミノ酸残基は、Ｒ５９７、Ｈ６０２、Ｒ１２７８、およびＨ１２８３（Ｌｓｈ  Ｃ２ｃ２アミノ酸を基準として）（例えば、変異Ｒ５９７Ａ、Ｈ６０２Ａ、Ｒ１２７８Ａ、およびＨ１２８３Ａ）に対応するＣ２ｃ２の１つ以上のアミノ酸残基、またはＬｓｈ  Ｃ２ｃ２相同分子種の対応するアミノ酸残基である。
【０２５６】
特定の実施形態では、１つ以上の修飾された変異のあるアミノ酸残基は、Ｃ２ｃ２コンセンサス番号付けに従ってＫ２、Ｋ３９、Ｖ４０、Ｅ４７９、Ｌ５１４、Ｖ５１８、Ｎ５２４、Ｇ５３４、Ｋ５３５、Ｅ５８０、Ｌ５９７、Ｖ６０２、Ｄ６３０、Ｆ６７６、Ｌ７０９、Ｉ７１３、Ｒ７１７（ＨＥＰＮ）、Ｎ７１８、Ｈ７２２（ＨＥＰＮ）、Ｅ７７３、Ｐ８２３、Ｖ８２８、Ｉ８７９、Ｙ８８０、Ｆ８８４、Ｙ９９７、Ｌ１００１、Ｆ１００９、Ｌ１０１３、Ｙ１０９３、Ｌ１０９９、Ｌ１１１１、Ｙ１１１４、Ｌ１２０３、Ｄ１２２２、Ｙ１２４４、Ｌ１２５０、Ｌ１２５３、Ｋ１２６１、Ｉ１３３４、Ｌ１３５５、Ｌ１３５９、Ｒ１３６２、Ｙ１３６６、Ｅ１３７１、Ｒ１３７２、Ｄ１３７３、Ｒ１５０９（ＨＥＰＮ）、Ｈ１５１４（ＨＥＰＮ）、Ｙ１５４３、Ｄ１５４４、Ｋ１５４６、Ｋ１５４８、Ｖ１５５１、Ｉ１５５８に対応するＣ２ｃ２の１つ以上のアミノ酸残基である。特定の態様では、１つ以上の修飾された変異のあるアミノ酸残基は、Ｒ７１７およびＲ１５０９に対応するＣ２ｃ２の１つ以上のアミノ酸残基である。特定の態様では、１つ以上の修飾された変異のあるアミノ酸残基は、Ｋ２、Ｋ３９、Ｋ５３５、Ｋ１２６１、Ｒ１３６２、Ｒ１３７２、Ｋ１５４６、およびＫ１５４８に対応するＣ２ｃ２の１つ以上のアミノ酸残基である。特定の態様では、前記変異により、タンパク質の活性が変化または変性する。特定の態様では、前記変異により、特異性の低下など、タンパク質の活性が低下する。特定の態様では、前記変異により、タンパク質の触媒活性が失われる（すなわち、「死」Ｃ２ｃ２）。一実施形態では、前記アミノ酸残基は、Ｌｓｈアミノ酸残基、あるいは異なる種に由来するＣ２ｃ２タンパク質の対応するアミノ酸残基に対応する。これらの工程を容易にすることができる装置。
【０２５７】
また、上記の濃縮システムを用いて特定の核酸試料を枯渇させてもよい。例えば、ガイドＲＮＡは、非標的ＲＮＡに結合して、試料から非標的ＲＮＡを除去するように設計されていてもよい。一例示的な実施形態では、ガイドＲＮＡは、特定の核酸多様性を担持する核酸に結合するように設計されていてもよい。例えば、所与の試料で多様性のない核酸のコピー数が多いことが予測される場合がある。従って、本明細書で開示される実施形態を用いて試料から多様性のない核酸を除去し、検出ＣＲＩＳＰＲエフェクター系が所与の試料で標的多様体配列を検出することができる効率を高めてもよい。
タンパク質の検出
【０２５８】
本明細書で開示されるシステム、装置、および方法は、核酸の検出に加えて、特異的に構成されたポリペプチド検出アプタマーによりポリペプチド（または他の分子）の検出に採用されてもよい。ポリペプチド検出アプタマーは、上記のマスキング構築物アプタマーとは個別のものである。まず、アプタマーは、１種以上の標的分子に特異的に結合するように設計されている。一例示的な実施形態では、標的分子は標的ポリペプチドである。他の例示的な実施形態では、標的分子は、例えば、標的治療分子などの標的化学化合物である。所定の標的に対する特異性を持つアプタマーを設計および選択する方法（例えば、SELEX）は、当該分野で知られている。所定の標的に対する特異性に加えて、アプタマーはさらに、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター結合部位を組み込むように設計されている。特定の例示的な実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターはＴ７プロモーターである。標的に結合させる前に、ＲＮＡポリメラーゼ部位はＲＮＡポリメラーゼからは近づけない、あるいは認識できない。しかしながら、アプタマーは、標的に結合すると、アプタマーの構造は、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが露出するような高次構造変化を受ける。ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの下流にあるアプタマー配列は、ＲＮＡポリメラーゼによるトリガーＲＮＡオリゴヌクレオチドの生成の鋳型として作用する。従って、アプタマーの鋳型部分は、所定のアプタマーおよびその標的を同定するバーコードあるいは他の同定配列をさらに組み込んでいてもよい。上記のガイドＲＮＡは、次いでこれら特異的なトリガーオリゴヌクレオチド配列を認識するように設計されていてもよい。ガイドＲＮＡがトリガーオリゴヌクレオチドに結合すると、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質が活性化されて、上記のようにマスキング構築物が失活し、検出可能な陽性信号が生成される。
【０２５９】
従って、特定の例示的な実施形態では、本明細書で開示される方法は、１つの試料または１組の試料を１組の個別の容積に分配し（ここで、１つ以上の個別の容積はそれぞれペプチド検出アプタマー、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質、１種以上のガイドＲＮＡ、マスキング構築物を含む）、およびペプチド検出アプタマーが前記１種以上の標的分子に結合することができる十分な条件で１つの試料または１組の試料をインキュベートする追加の工程を含む。ここで、アプタマーが対応する標的に結合すると、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター結合部位が露出して、ＲＮＡポリメラーゼのＲＮＡポリメラーゼプロモーター結合部位への結合によりトリガーＲＮＡが合成される。
【０２６０】
他の例示的な実施形態では、アプタマーが標的ポリペプチドに結合すると、アプタマーの結合によりプライマー結合部位が露出してもよい。例えば、アプタマーはＲＰＡプライマー結合部位を露出させてもよい。従って、プライマーの付加または包含は、上で概略を示したＲＰＡ反応など増幅反応に供給される。
【０２６１】
特定の例示的な実施形態では、アプタマーは高次構造切換アプタマーであってもよく、対象の標的に結合すると、二次構造が変化して、一本鎖ＤＮＡの新しい領域が露出されてもよい。特定の例示的な実施形態では、これら一本鎖ＤＮＡの新しい領域をライゲーションの基質として用いて、アプタマーを伸長させ、本明細書で開示される実施形態を用いて特異的に検出することができる長いｓｓＤＮＡ分子を作製してもよい。アプタマーの設計はさらに、低エピトープ標的（例えば、グルコース）の検出用の三次複合体と組み合わせてもよい(Yang et al. 2015: http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acs.analchem.5b01634)。高次構造をシフトさせるアプタマーおよび対応するガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）の例を以下の表７に示す。
【表７】
2020513815.tif 000013
装置
【０２６２】
本明細書で記載するシステムは診断装置で具現化されてもよい。その中に複数の個別の容積を規定することができる装置の複数の基質および構成を用いてもよい。本明細書で用いられる用語「個別の容積」は、容器、入れ物などの個別の空間、あるいは標的分子の移行を防止および／または阻害するという特性によって規定することができる他の任意の規定された容積または空間を指す。例えば、壁（例えば、ウェル、管の壁）、あるいは不透過性または半透過性であってもよい液滴の表面などの物性によって規定された容積または空間、あるいは化学的な方法、拡散速度律速、電磁性による方法、光照射、または標的分子および指標となる核酸識別子（例えば、核酸バーコード）を含んでいてもよいこれらの任意の組合せなど、他の方法で規定された容量または空間である。「拡散速度律速」（例えば、拡散によって規定される容積）は、２つの平行な層流がある場合に拡散は標的分子が１つの流れからもう一方の流れへ移行するのを制限し、拡散は有効に空間または容積の規定を制限することができることから、特定の分子または反応にのみ利用可能な空間を意味する。「化学的な方法」で規定された容積または空間は、例えば、粒径など特定の標的分子の化学または分子特性からその標的分子のみが存在してもよい空間を意味する。例えば、ゲルビーズは、表面電荷、マトリックスの粒径、またはビーズ内部に侵入してもよい種の選択を可能にするビーズの他の物性などにより、特定の種がビーズに侵入することを排除するが、他の種は排除しない。「電磁性による方法」で規定された容積または空間は、標的分子またはその支持体の電磁特性（例えば、電荷あるいは磁気特性）を用いて、例えば、磁界内で磁性粒子を補足する、あるいは直接磁石で補足するなどにより空間内の特定の領域を規定することができる空間を意味する。「光学的に」規定された容積は、規定された空間または容積内の標的分子のみが標識されるように可視光、紫外光、赤外光、または他の波長の光で照射することで規定してもよい空間の任意の領域を意味する。壁がない、あるいは半透過性の個別容積を用いる１つの利点は、緩衝液、化学活性剤、または他の薬剤など試薬によっては、個別の容積を通過させてもよく、標的分子などの他の材料は個別の容積または空間内に維持してもよいということである。典型的には、個別の容積としては、標識を可能にする条件で指標となる核酸識別子で標的分子を標識するのに好適な流体培地（例えば、水溶液、油、緩衝液、および／または細胞の成長を補助することができる媒体）が挙げられる。開示される方法で有用な例示的な個別の容積または空間としては、液滴（例えば、マイクロ流体の液滴および／または乳化液滴）、ヒドロゲルビーズまたは他の重合体構造（例えば、二アクリル酸ポリエチレングリコールビーズまたはアガロースビーズ）、組織のスライド（例えば、化学的、光学的、または物理的方法で規定された特定の領域、容積、または空間を有する、固定ホルマリンパラフィン埋め込み組織のスライド）、とりわけ、規則的に並べられた配列、あるいは無作為パターンで試薬を管（例えば、遠心分離器管、マイクロ遠心分離管、試験管、キュベット、円錐管など）、瓶（例えば、ガラス瓶、プラスチック瓶、窯業瓶、三角フラスコ、シンチレーションバイアルなど）、ウェル（例えば、プレートのウェル）、プレート、ピペット、ピペットの先端に置くことにより規定された領域を持つ顕微鏡スライドが挙げられる。特定の態様では、区画は、油中水乳液中の水性液滴である。特定の実施形態では、正確あるいは均一な容積を必要とする本明細書で記載する用途、方法、またはシステムのいずれも、音響液体ディスペンサーを用いてもよい。
【０２６３】
特定の例示的な実施形態では、前記装置は、複数のスポットが規定されてもよい柔軟性材料の基質を含む。診断法およびバイオセンシングに用いるのに好適な柔軟性材料の基質は当該分野で知られている。柔軟性のある基質材料は、植物由来の繊維（例えば、セルロース繊維）でできていてもよいし、柔軟性重合体（例えば、柔軟性ポリエステルフィルムおよび他の種類の重合体）からできていてもよい。本明細書で記載するシステムの規定された各スポット内で個々のスポットに試薬を加える。各スポットは、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡの組が異なることを除いて同じ試薬を含んでいてもよく、あるいは該当する場合は一度に複数の標的を選別するための異なる検出アプタマーを含んでいてもよい。従って、本明細書のシステムおよび装置は、同じ標的または限定された数の標的の存在について複数の供給源（例えば、異なる個体に由来する複数の臨床試料）に由来する試料を選別できる、あるいは試料中の複数の異なる標的の存在について１つの試料の部分（または同じ供給源に由来する複数の試料）を選別することができる場合がある。特定の例示的な実施形態では、本明細書で記載するシステムの要素は、紙または布の基質に載せて冷凍乾燥されている。特定の例示的な装置で用いられてもよい柔軟性材料からなる基質の例は、Pardee et al. Cell. 2016, 165(5):1255-66、およびPardee et al. Cell. 2014, 159(4):950-54に開示されている。血液を含む体液と用いるのに好適な柔軟性材料からなる基質については、以下に開示されている：Shevkoplyasらに付与された国際特許出願公開第ＷＯ／２０１３／０７１３０１号（名称は“Paper based diagnostic test（紙による診断テスト）”）、Siegelらに付与された米国特許出願公開第２０１１／０１１１５１７号（名称は“Paper-based microfluidic systems（紙によるマイクロ流体系）”）、およびSiegel et al. and Shafiee et al. “Paper and Flexible Substrates as Materials for Biosensing Platforms to Detect Multiple Biotargets（複数のバイオ試料を検出するバイオセンシングプラットフォームのための紙および柔軟性基材）” Scientific Reports 5:8719 (2015)、さらに、装着可能な診断装置に用いるのが好適な材料を含む柔軟性材料については、“Flexible Substrate-Based Devices for Point-of-Care Diagnostics（医療現場診断のための柔軟性基材を元にした装置）” Cell 34(11):909-21 (2016)に開示されている。さらに、柔軟性材料は、ニトロセルロース、ポリカーボネート、メチルエチルセルロース、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリスチレン、またはガラスを含んでいてもよい（例えば、米国２０１２０２３８００８号を参照のこと）。特定の態様では、個別の容積は、これらに限定されないが、ワックス、フォトレジスト、または固体インクなどの疎水性表面により分離されている。
【０２６４】
態様によっては、装着者が特定の微生物または他の因子に対する暴露を知らされるようなセンサーまたは指示薬として働く線量計またはバッジが提供されてもよい。例えば、本明細書で記載するシステムを用いて特定の病原体を検出してもよい。同様に、上で開示されたアプタマーに基づく実施形態を用いて、ポリペプチドと特定のアプタマーが結合してもよい他の因子（例えば、化学薬剤）の両方を検出してもよい。そのような装置は、例えば、生物あるいは化学兵器剤の検出などのため、できるだけ速く可能性のある危険な微生物に対する暴露に関する情報を提供するため、兵士または他の軍関係者、臨床医、研究者、病院スタッフなどの視察に有用である場合がある。他の実施形態では、免疫力がない患者、火傷患者、化学療法を受けている患者、子ども、あるいは高齢者が危険な微生物または病原体に曝されないようにそのような視察用バッジを用いてもよい。
【０２６５】
本明細書で記載するシステムおよび装置を用いて分析されてもよい試料の供給源は、対象者の生体試料または環境試料を含む。環境試料は表面または流体を含んでいてもよい。生体試料は、これらに限定されないが、唾液、血液、血漿、血清、糞便、尿、唾液、粘液、リンパ液、滑液、髄液、脳脊髄液、皮膚または粘膜の拭い液、またはこれらの組合せを含んでいてもよい。一例示的な実施形態では、環境試料は固体表面（例えば、食品の準備に用いられる表面など）または他の影響を受けやすい組成物および材料から採取される。
【０２６６】
他の例示的な実施形態では、本明細書で記載するシステムの要素は、綿棒または布など、表面または試料流体を拭うのに用いられる使い捨ての基質に載せられていてもよい。例えば、このシステムを用いて、果実または野菜など食品の表面を拭うことで食品表面の病原体の存在を試験することができる。同様に、この使い捨ての基質を用いて、特定の微生物または因子の検出（例えば、安全性選別での使用）のために他の表面を拭ってもよい。この使い捨ての基質はまた、科学捜査の用途を持っていてもよい。この場合、ＣＲＩＳＰＲ系は、例えば、被疑者を同定するのに用いられるかもしれないDNA SNPの同定、あるいは試料中に存在する生物学的物質を決定する特定の組織または細胞マーカーを検出するように設計されている。同様に、この使い捨ての基質を用いて、患者由来の試料（例えば、口から唾液試料、あるいは皮膚から拭い液）を採集してもよい。他の実施形態では、肉製品の表面または内部の汚染物質を検出するため、肉製品から試料または拭い液を採取してもよい。
【０２６７】
食品、臨床、工業、およびその他の環境設定でほぼリアルタイムの微生物診断法が必要とされている（例えば、Lu TK, Bowers J, and Koeris MS., Trends Biotechnol. 2013 Jun;31(6):325-7を参照のこと）。特定の態様では、病原体に特異的なガイドＲＮＡを用いて食品が媒介する病原体（例えば、カンピロバクター・ジェジュニ、クロストリジウム・パーフリンゲンス、サルモネラ属、大腸菌、バシラス・セレウス、リステリア・モノサイトゲネス、赤痢菌属、黄色スタフィロコッカス、スタフィロコッカル・  エンテリティス、ストレプトコッカス、ビブリオ・コレレ、ビブリオ・パラヘモリティカス、ビブリオ・バルニフィカス、エルシニア・エンテロコリチカおよびエルシニア・シュードツベルクローシス、ブルセラ属、コリネバクテリウム・ウルセランス、コクシエラ・バーネッティイ、またはプレシオモナス・シゲロイデス）を素早く検出するのに本発明が用いられる。
【０２６８】
特定の態様では、前記装置はフローストリップ（flow strip、イムノクロマトの試験片のこと）である、あるいはそれを含む。例えば、横型フローストリップは、色によってＲＮＡ分解酵素（例えば、Ｃ２ｃ２）を検出することができる。ＲＮＡレポーターは、５’末端に付加された第一分子（例えば、ＦＩＴＣ）と３’末端に付加された第二分子（例えば、ビオチン）（あるいはこの逆）を持つように修飾されている。横型フローストリップは２つの捕獲ラインを持つように設計されており、抗第一分子（例えば、抗ＦＩＴＣ）抗体が第一のラインにハイブリダイズされ、抗第二分子（例えば、抗ビオチン）抗体が第二の下流ラインにハイブリダイズされている。ＳＨＥＲＬＯＣＫ反応液が条片を流れると、未切断のレポーターが第一の捕獲ラインで抗第一分子と結合し、切断されたレポーターが第二分子を放出して第二の捕獲ラインで第二分子と結合する。第二分子は、例えば、ナノ粒子（例えば、金ナノ粒子）に結合させた抗体を挟んで、第一または第二のラインで任意の第二分子に結合し、その結果強い出力／信号（例えば、色）が生成される。より多くのレポーターが切断されると、より多くの信号が第二の捕獲ラインに蓄積して、より少ない信号が第一のラインに現れる。特定の側面では、本発明は、核酸またはポリペプチドを検出する本明細書で記載するフォローストリップの使用に関する。特定の側面では、本発明は、例えば、（側方）フロー試験または（側方）フロー免疫クロマトグラフィアッセイにおいて、本明細書で規定したフローストリップで核酸またはポリペプチドを検出する方法に関する。
【０２６９】
特定の例示的な実施形態では、前記装置は、異なる液滴（すなわち、個別の容積）を生成および／または合流させるマイクロ流体装置である。例えば、選別する試料を含む第一の組の液滴を形成してもよく、本明細書で記載するシステムの要素を含む第二の組の液滴を形成してもよい。次いで、第一の組の液滴および第二の組の液滴を合流させて、合流させた液滴の組に対して本明細書で記載する診断方法を行う。本明細書で開示されるマイクロ流体装置は、シリコーン製チップであってもよく、様々な技術を用いて作製されてもよい。そのような技術としては、これらに限定されないが、熱浮き彫り加工、エラストマー成形、微小射出成、ＬＩＧＡ法（Lithographie, Galvanoformung, Abformung）、ソフトリソグラフィ、シリコン形成法、および関連する薄膜処理技術が挙げられる。マイクロ流体装置を作製するのに好適な材料は、これらに限定されないが、環状オレフィン共重合体（ＣＯＣ）、ポリカーボネート、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、およびポリアクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）が挙げられる。一態様では、ＰＤＭＳのソフトリソグラフィを用いてマイクロ流体装置を作製してもよい。例えば、フォトリソグラフィーを用いて、基質内に流れ溝、バルブ、フィルターの位置を規定する型を作製してもよい。基質材料を型に流し込んで固めて、押し型を作製する。次いで、押し型を固体の支持体、これに限定されないが、ガラスに貼り付ける。ＰＤＭＳなど重合体によっては疎水性であるので、タンパク質によってはそれを吸収して特定の生物学的過程を阻害することがあるので、受動化剤が必要な場合がある（Schoffner et al. Nucleic Acids Research, 1996, 24:375-379)。好適な受動化剤は当該分野で知られており、これらに限定されないが、シラン、パリレン、ｎ−ドデシル−ｂ−Ｄ−マルトシド（ＤＤＭ）、プルロニック、Ｔｗｅｅｎ−２０、他の類似の界面活性剤、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アルブミン、コラーゲン、ならびに他の類似のタンパク質およびペプチドが挙げられる。
【０２７０】
特定の例示的な実施形態では、システムおよび／または装置をフローサイトメトリーの読み出しに変換するのに用いてもよい。あるいは、１回の実験で１００万個の細胞に高感度な定量的測定を行って既存のフローによる方法（例えば、PrimeFlowアッセイ）を向上させるのに用いてもよい。特定の例示的な実施形態では、未重合のゲル単量体を含む液滴に細胞を入れて、次いで、それをフローサイトメトリーで分析するのに好適な単細胞液滴に入れてもよい。未重合のゲル単量体を含む液滴に蛍光検出可能な標識を含む検出構築物を入れてもよい。ゲル単量体を重合すると、液滴内にビーズが形成される。ゲル重合は遊離ラジカル形成によって行われるので、蛍光レポーターはゲルに共有結合される。この検出構築物をさらに修飾して、リンカー（例えば、アミン）を含ませてもよい。ゲル形成後にクエンチャーを加えて、リンカーを介してレポーター構築物に結合させてもよい。従って、クエンチャーはゲルに結合しておらず、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質によってレポーターが切断されると自由に拡散する。検出構築物とハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ阻害剤）増幅を結合させて、液滴の信号増幅を達成してもよい。ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドヘアピンをゲルに組み込んでもよく、このゲルはＲＮＡ分解酵素に高感度なドメインを持つヘアピンループを含んでいてもよい。ＲＮＡ分解酵素に高感度なドメインを持つヘアピンループ内の鎖置換の足掛かりを保護することで、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質によってヘアピンループが切断された後にＨＣＲ開始剤を選択的に脱保護してもよい。足掛かり配列を介した鎖置換によりＨＣＲ開始剤を脱保護した後、蛍光ＨＣＲ単量体を洗浄してゲルに入れ、阻害剤が脱保護された信号増幅を行うことができる。
【０２７１】
本発明の文脈で用いてもよいマイクロ流体装置の一例は、Hou et al. “Direct Dectection and drug-resistance profiling of bacteremias using inertial microfluidics（慣性マイクロ流体工学を用いた菌血の直接検出および薬剤耐性分析）” Lap Chip. 15(10):2297-2307 (2016)に記載されている。
【０２７２】
本明細書で記載するシステムはさらに、診療所設定の外で対象者の生体試料（例えば、体液）をアッセイして、医師がアクセスできる中央サーバーに遠隔地からアッセイの結果を報告する装着可能な医療用具に組み込まれていてもよい。この装置は血液を自己採取する能力を含んでいてもよく、例えば、そのような装置はPeetersらに付与された米国特許出願公開第２０１５／０３４２５０９号（名称は“Needle-free Blood Draw（針なし採血）”）およびAndrew Conradに付与された米国特許出願公開第２０１５／００６５８２１号（名称は“Nanoparticle Phoresis（ナノ粒子の便乗）”）に開示されている。
【０２７３】
特定の例示的な実施形態では、前記装置は、マクロプレートウェルなど、個々のウェルを含んでいてもよい。マクロプレートウェルのサイズは、標準の６、２４、９６、３８４、１５３６、３４５６、または９６００ウェルであってもよい。特定の例示的な実施形態では、本明細書で記載するシステムの要素は、分布および使用の前に冷凍乾燥され、ウェルの表面に塗布されていてもよい。
【０２７４】
本明細書で開示される装置はさらに、入口と出口、すなわち開口部を含んでいてもよく、これらは装置に／から流体を導入する／取り出すためにバルブ、管、溝、チャンバー、および注射器、および／またはポンプと連結されていてもよい。前記装置は、マイクロ流体装置内で流体の方向性のある動きを可能にする流体流アクチュエーターと連結されていてもよい。アクチュエーターの例としては、これらに限定されないが、注射器ポンプ、機械的に作動する再循環ポンプ、電気浸透ポンプ、球、ふいご、ダイアフラム、または流体を動かすことを意図した気泡が挙げられる。特定の例示的な実施形態では、前記装置は、共に作動して装置を通って流体を移動させるプログラム可能な弁により制御装置と連結されている。特定の例示的な実施形態では、前記装置は、以下でさらに詳細に記載する制御装置に連結されている。この装置は、装置の入口に挿入する金属ピンで留めた管によりフローアクチュエーター、制御装置、試料充填装置に連結されていてもよい。
【０２７５】
本明細書に示すように、システムの要素は冷凍乾燥すると安定する。従って、支持装置を必要としない実施形態もまた想起される。すなわち、前記システムは、本明細書で開示される反応液を支持する任意の表面または流体に塗布して、その表面または溶液から検出可能な陽性信号を検出してもよい。冷凍乾燥に加えて、前記システムはまた、ペレットの形態で安定して保存・使用してもよい。好適なペレット形態を形成するのに有用な重合体は当該分野で知られている。
【０２７６】
特定の態様では、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は前記装置の個別の容積のそれぞれと結合している。個別の容積はそれぞれ、異なる標的分子に対して特異的な異なるガイドＲＮＡを含んでいてもよい。特定の態様では、試料は、標的分子に対して特異的なガイドＲＮＡをそれぞれ含む２つ以上の個別の容積を含む固体基質に曝されていてもよい。何らかの理論に束縛されるわけではないが、各ガイドＲＮＡは試料からその標的分子を捕獲するので、試料を個別のアッセイに分割する必要がない。従って、有用な試料が保存されるかもしれない。エフェクタータンパク質は、親和性タグを含む融合タンパク質であってもよい。親和性タグは当該分野でよく知られている（例えば、ＨＡタグ、Ｍｙｃタグ，Ｆｌａｇタグ、Ｈｉｓタグ、ビオチン）。エフェクタータンパク質はビオチン分子に結合されていてもよく、個別の容積はストレプトアビジンを含んでいてもよい。他の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質はエフェクタータンパク質に特異的な抗体に結合している。ＣＲＩＳＰＲ酵素を結合する方法は上述した（例えば、米国２０１４０３５６８６７Ａ１号を参照のこと）。
【０２７７】
本明細書で開示される装置はまた、他の方法で試料する当該分野で既知の診療現場（ＰＯＣ）装置の要素を含んでいてもよい。例えば、St John and Price, “Existing and Emerging Technologies for Point-of-Care Testing（診療現場試験のための新旧技術）” (Clin Biochem Rev. 2014 Aug; 35(3): 155-167)を参照のこと。
【０２７８】
本発明を無線ラボオンチップ（lab-on-chip = LOC、微小遺伝子分析）診断センサーシステムと共に用いてもよい（例えば、米国特許第９，４７０，６９９号“Diagnostic radio frequency identification sensors and applications thereof（診断用無線識別センサーとその用途）”を参照のこと）。特定の態様では、本発明は無線装置（例えば、携帯電話、個人用デジタル補助装置（ＰＤＡ）、タブレット）によって制御されるＬＯＣで実行され、結果は前記装置に報告される。
【０２７９】
無線自動識別（radio frequency identification = ＲＦＩＤ）タグシステムは、ＲＦＩＤ読み取り器（質問器とも言う）によって受信されるデータを送信するＲＦＩＤタグを含む。典型的なＲＦＩＤシステムでは、個々の対象（例えば、店の商品）は、トランスポンダーを含む比較的小さいタグを備えている。トランスポンダーは、固有の電子的製品コードが付与されたメモリチップを持つ。ＲＦＩＤ読み取り器は、通信試験規約の使用によりタグ内のトランスポンダーを作動させる信号を発する。従って、ＲＦＩＤ読み取り器は、タグからデータを読み出し、タグにデータを書き込むことができる。また、ＲＦＩＤタグ読み取り器は、ＲＦＩＤタグシステムの用途に従ってデータを処理する。現在は、受動型および能動型のＲＦＩＤタグがある。受動型ＲＦＩＤタグは内部電源を含んでいないが、ＲＦＩＤ読み取り器から受信した無線周波数信号によって作動する。あるいは、能動型ＲＦＩＤタグは、能動型ＲＦＩＤタグを作動させることができる内部電源を含んでおり、送信範囲が広くメモリ容量が大きい。受動型タグを用いるか、能動型タグを用いるかは特定の用途によって決まる。
【０２８０】
ラボオンチップ技術は科学文献によく記載されており、複数のマイクロ流体溝、入力、または化学ウェルからなる。無線自動識別（ＲＦＩＤ）タグ技術を用いてウェル内の反応液を測定してもよい。ＲＦＩＤ電子チップからの導電性のリード線は試験ウェルのそれぞれと直接連結されていてもよいからである。アンテナは電子チップの他の層に、あるいは直接装置の背面にプリントまたは実装されている。さらに、リード線、アンテナ、および電子チップはＬＯＣチップに埋め込まれていてもよく、これにより電極または電子機器の短絡を防ぐことができる。ＬＯＣは複雑な試料の分離および分析を可能にし、この技術によって複雑または高価な読み取り器とは無関係にＬＯＣ試験を行うことができる。むしろ、簡単な無線装置（例えば、携帯電話やＰＤＡ）を用いてもよい。一態様では、無線装置はまたより複雑なＬＯＣ分析でマイクロ流体溝の分離および制御を制御する。一態様では、ＬＥＤおよび他の電子測定または感知装置はＬＯＣ−ＲＦＩＤチップに含まれる。何らかの理論に束縛されるわけではないが、この技術は使い捨てで、研究室の外で行われる分離および混合を必要とする複雑な試験を可能にする。
【０２８１】
好ましい態様では、ＬＯＣはマイクロ流体装置であってもよい。ＬＯＣは受動型チップであってもよく、前記チップは無線装置により作動され、制御される。特定の態様では、 ＬＯＣは、試薬を保持するマイクロ流体溝、および試料を導入する溝を含む。特定の態様では、無線装置からの信号は、ＬＯＣに動力を送達し、試料とアッセイ試薬の混合を作動させる。具体的には、本発明の場合、システムはマスキング因子、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質、および標的分子に特異的なガイドＲＮＡを含んでいてもよい。ＬＯＣが作動すると、マイクロ流体装置は試料とアッセイ試薬を混合してもよい。混合すると、センサーは信号を検出して、結果を無線装置に送信する。特定の態様では、脱マスク剤は導電性ＲＮＡ分子である。導電性ＲＮＡ分子は導電性材料に付加されていてもよい。導電性分子は導電性ナノ粒子、導電性タンパク質、タンパク質に付加された金属粒子、または導電性のラテックスあるいはその他のビーズであってもよい。特定の態様では、ＤＮＡまたはＲＮＡを用いる場合、導電性分子は対応するＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖に直接付加されていてもよい。導電性分子が放出されると、センサーで検出してもよい。アッセイは１工程の過程であってもよい。
【０２８２】
表面面積の導電率を測定することができるので、使い捨ての無線ＲＦＩＤ電子アッセイで正確な定量結果が可能である。さらに、試験面積は非常に小さいので、所定の面積でより多くの試験を行うことができ、従ってコストを節約することができる。特定の態様では、個別のセンサーはそれぞれ、センサーに固定した異なるＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質とガイドＲＮＡに関連付けられており、複数の標的分子を検出するのに用いられる。何らかの理論に束縛されるわけではないが、異なるセンサーの作動は無線装置によって区別されてもよい。
【０２８３】
本明細書で記載する導電性による方法に加えて、使い捨てＲＦＩＤアッセイ用の低基本コストの通信および動力プラットフォームとしてＲＦＩＤまたはブルートゥースに依存した他の方法を用いてもよい。例えば、光学手段を用いて所与の標的分子の存在およびその濃度を試験してもよい。特定の態様では、光学センサーは、蛍光マスキング因子の脱マスクを検出する。
【０２８４】
特定の態様では、本発明の装置は、持ち運び可能な携帯アッセイ診断読み取り装置を含む（例えば、Vashist et al., Commercial Smartphone-Based Devices and Smart Applications for Personalized Healthcare Monitoring and Management, Diagnostics 2014, 4(3), 104-128; mReader from Mobile Assay;およびHolomic Rapid Diagnostic Test Readerを参照のこと）。
【０２８５】
本明細書に示すように、特定の実施形態は、信号を読み出すためのより複雑な検出装置へのアクセスが限定され得るＰＯＣ状況および／または資源が乏しい環境で実施形態を用いる場合に、特定の付随する恩恵を持つ比色変化により検出が可能である。しかしながら、本明細書で開示される持ち運び可能な実施形態はまた、可視光の範囲外での信号を検出することができる携帯分光光度計と連結されていてもよい。本発明と組合せて用いてもよい携帯分光光度計装置の一例は、Das et al. “Ultra-portable, wireless smartphone spectrophotometer for rapid, non-destructive testing of fruit ripeness（果実の塾度を迅速に非破壊検査するための超小型無線スマートフォン分光光度計）.” Nature Scientific Reports. 2016, 6:32504, DOI: 10.1038/srep32504に記載されている。最後に、量子ドット系のマスキング構築物を用いる特定の実施形態では、量子ドットによってもたらされるほぼ完全な量子収率のおかげで携帯ＵＶ光装置あるいは他の好適な装置を用いると信号をうまく検出することがある。
例示的な方法およびアッセイ
【０２８６】
アッセイプラットフォームは低コストで適応性があるので、（ｉ）汎用ＲＮＡ／ＤＮＡ／タンパク質定量、（ｉｉ）ＲＮＡ／ＤＮＡおよびタンパク質の発現の高速多重複検出、および（ｉｉｉ）臨床および環境試料中の標的核酸、ペプチド、およびタンパク質の高感度検出を含む複数の用途に適している。また、本明細書で開示されるシステムは、細胞などの生物学的設定内で転写物を検出するのに用いられてもよい。本明細書で記載するＣＲＩＳＰＲエフェクターの非常に特異的な性質を仮定すると、生きた細胞内で転写物のアレル特異的発現または疾患に関連付けられた変異を追跡することが可能な場合がある。
【０２８７】
特定の例示的な実施形態では、１つの標的に特異的な１つのガイドＲＮＡは個別の容積に入れられている。次いで、各容積は同じ試料の異なる試料またはその一部を受容してもよい。特定の例示的な実施形態では、個別の標的に対する複数のガイドＲＮＡはそれぞれ、複数の標的が異なるウェルで選別されるように１つのウェルに入れられていてもよい。特定の例示的な実施形態で１つの容積内で複数のガイドＲＮＡを検出するために、異なる特異性を持った複数のエフェクタータンパク質を用いてもよい。例えば、異なる配列特異性を持つ異なる相同分子種を用いてもよい。例えば、ある相同分子種はＡを優先的に切断するが、他の相同分子種はＣ、Ｕ、またはＴを優先的に切断する。従って、１ヌクレオチド全体、または実質的にその一部を含むガイドＲＮＡをそれぞれ異なる蛍光色素分子と共に生成してもよい。このように４つの異なる標的を１つの個別の容積で選別してもよい。
【０２８８】
上で示したように、ＣＲＩＳＰＲエフェクター系は標的分子のアトモル濃度で検出することができる。例えば、図１３、図１４、図１９、図２２および以下に記載する実施例を参照のこと。前記システムの感度により、高速で高感度な検出が要求される複数の用途は本明細書で開示される実施形態から恩恵を得られる場合があり、本発明の範囲内で想起される。以下で例示的なアッセイおよび用途をさらに詳細に記載する。
微生物への応用
【０２８９】
特定の例示的な実施形態では、本明細書で開示されるシステム、装置、および方法は、試料（例えば、対象者から得た生体試料）中の１種以上の微生物因子の存在を検出することに関する。特定の例示的な実施形態では、微生物は細菌、真菌、酵母菌、原生動物、寄生虫、またはウイルスであってもよい。従って、本明細書で開示される方法は、微生物種の素早い同定、微生物タンパク質（抗原）、抗体、抗体遺伝子の存在の監視、特定の表現型（例えば、細菌耐性）の検出、疾患の進行および／または大流行の監視、および抗生物質の選別を必要とする他の方法と共に他の方法での用途（またはそれとの併用）に用いられてもよい。本明細書で開示される実施形態の高速で高感度な診断能、１ヌクレオチドの違いでの微生物種の検出、およびＰＯＣ装置としての展開能により、本明細書で開示される実施形態を用いて、適切な抗生物質または抗ウイルス剤の選択など治療計画を導いてもよい。本明細書で開示される実施形態を用いて、微生物汚染の存在について環境試料（空気、水、表面、食品など）を選別してもよい。
【０２９０】
微生物種（例えば、細菌、ウイルス、真菌、酵母菌、または寄生虫などの種）を同定する方法が開示されている。本明細書で開示される特定の実施形態は、１つの試料中、または複数の試料に亘って微生物種を同定および区別して多くの異なる微生物を認識することができる方法およびシステムを記載する。本発明の方法によって、生物学的試料または環境試料中で標的核酸配列の存在を検出することで試料中の病原体を検出し、１種以上の生物（例えば、細菌ウイルス、酵母菌、原生動物、および菌類、またはこれらの組合せ）のうちの２つ以上の種を区別することができる。試料から得られた陽性信号は、微生物が存在することを示している。本発明の方法およびシステムを用いて２種以上のエフェクタータンパク質を用いることで複数の微生物を同時に同定することができる。ここで、各エフェクタータンパク質は特異的な微生物標的配列を標的する。このように、任意の数の微生物を一度に検出することができる多レベル分析を特定の対象者に行ってもよい。態様によっては、１つ以上の微生物種を同定することができる１組のプローブを用いて複数の微生物を同時に検出してもよい。
【０２９１】
試料の多重分析により、試料の大規模検出が可能になり、分析にかかる時間とコストが低減される。しかしながら、多重分析は生体試料の有効性によって限定されることが多い。しかしながら、本発明によれば、複数のエフェクタータンパク質を１つの試料に加えて各マスキング構築物が個別のクエンチャー色素と結合するような、多重分析に対する代替え方法を行ってもよい。この場合、１つの試料で複数の検出を行うために陽性信号を各クエンチャー色素から個別に得てもよい。
【０２９２】
試料中の１種以上の生物のうち２つ以上の種を区別する方法が開示されている。前記方法はまた、試料中で１種以上の生物のうち１つ以上の種を検出するのに適している。
微生物の検出
【０２９３】
態様によっては、試料中で微生物を検出する方法が提供される。前記方法は、１つの試料または１組の試料を本明細書で記載するＣＲＩＳＰＲ系を含む１つ以上の個別の容積に分配すること；１種以上の微生物に特異的な標的に１種以上のガイドＲＮＡが結合するのに十分な条件で前記１つの試料または１組の試料をインキュベートすること；前記１種以上のガイドＲＮＡの１種以上の標的分子への結合によりＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を活性化させること（ここで、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を活性化させると、検出可能な陽性信号が生成されるようにＲＮＡ系マスキング構築物が修飾される）；および検出可能な陽性信号を検出すること（ここで、検出可能な陽性信号の検出は、試料中に１種以上の標的分子が存在することを示す）を含む。１種以上の標的分子は、２つ以上の微生物の種／株を互いに区別するのに用いてもよい標的ヌクレオチド配列を含むｍＲＮＡ、ｇＤＮＡ（コードまたは非コード）、ｔｒＲＮＡ、またはＲＮＡであってもよい。ガイドＲＮＡは標的配列を検出するように設計されてもよい。本明細書で開示される実施形態はまた、ガイドＲＮＡと標的ＲＮＡ配列のハイブリダイゼーションを向上させる特定の工程を用いてもよい。リボ核酸ハイブリダイゼーションを増強する方法がＷＯ２０１５／０８５１９４（名称は“Enhanced Methods of Ribonucleic Acid Hybridization（強化されたリボ核酸ハイブリダイゼーション法）”）に開示されており、その内容を参照により本明細書に組み込む。微生物に特異的な標的はＲＮＡまたはＤＮＡまたはタンパク質であってもよい。ＤＮＡなら、前記方法は、本明細書で記載するＲＮＡポリメラーゼプロモーターを導入するＤＮＡプライマーの使用をさらに含んでいてもよい。標的がタンパク質である場合、前記方法は本明細書で記載するタンパク質の検出に特異的なアプタマーおよび工程を用いる。
一塩基多様体の検出
【０２９４】
態様によっては、本明細書で記載する標的配列に特異的でそれに結合するガイドＲＮＡを用いて１つ以上の同定された標的配列を検出してもよい。本発明のシステムおよび方法は、異なる微生物種の中に存在する一塩基多型さえも区別することができ、従って、本発明による複数のガイドＲＮＡの使用は種を区別するのに用いられてもよい標的配列をさらに拡張または向上させてもよい。例えば、実施形態によっては、１種以上のガイドＲＮＡは、微生物を種、属、科、目、綱、門、界、表現型、またはこれらの組合せで区別してもよい。
ｒＲＮＡ配列に基づく検出
【０２９５】
特定の例示的な実施形態では、本明細書で開示される装置、システム、および方法を用いて試料中の複数の微生物種を区別してもよい。特定の例示的な実施形態では、同定は１６Ｓ、２３Ｓ、および５Ｓサブユニットを含むリボソームＲＮＡ配列に基づいていてもよい。関連するｒＲＮＡ配列を同定する方法は、米国特許出願公開第２０１７／００２９８７２号に開示されている。特定の例示的な実施形態では、１組のガイドＲＮＡは、各種または株に固有の可変領域によって各種を区別するように設計されていてもよい。ガイドＲＮＡはまた、属、科、目、綱、門、界、またはこれらの組合せで微生物を区別する標的ＲＮＡ遺伝子に対して設計されてもよい。増幅が用いられる特定の例示的な実施形態では、１組の増幅プライマーはリボソームＲＮＡ配列の隣接定常領域に対して設計され、ガイドＲＮＡは内部可変領域によって各種を区別するように設計されていてもよい。特定の例示的な実施形態では、プライマーおよびガイドＲＮＡはそれぞれ、１６Ｓサブユニットの保存された可変領域に対して設計されていてもよい。種または種の下位集合（例えば、ＲｅｃＡ遺伝子ファミリー、ＲＮＡポリメラーゼβサブユニット）に亘って固有に変化する他の遺伝子またはゲノム領域を用いてもよい。他の好適な系統発生マーカーおよびそれを同定する方法は、例えば、Wu et al. arXiv:1307.8690 [q-bio.GN]に記載されている。
【０２９６】
特定の例示的な実施形態では、方法または診断は、同時に複数の系統発生的および／または表現型レベルに亘って微生物を選別するように設計されてもよい。例えば、方法または診断は、複数のＣＲＩＳＰＲ系を異なるガイドＲＮＡと共に使用することを含んでいてもよい。第一の組のガイドＲＮＡは、例えば、マイコバクテリウム、グラム陽性およびグラム陰性細菌を区別してもよい。これらの一般的な綱はさらに下位分割されてもよい。例えば、グラム陰性細菌内で腸溶性のものと非腸溶性のものを区別するガイドＲＮＡを設計し、前記方法または診断で用いてもよい。第二の組のガイドＲＮＡを、属または種レベルで微生物を区別するように設計してもよい。従って、マトリックスが生成されて、所与の試料中で同定された、これら綱のうちの１つに入る細菌種の各属によりマイコバクテリウム、グラム陽性およびグラム陰性細菌（さらに腸溶性のものと非腸溶性のものに分割）をすべて同定してもよい。上記は、例えばこれらの目的のためだけである。他の微生物種を分類する他の手段もまた想起され、上記の一般的な構造に従う。
薬剤耐性のための選別
【０２９７】
特定の例示的な実施形態では、本明細書で開示される装置、システム、および方法を用いて対象の微生物遺伝子（例えば、抗生物質および／または抗ウイルス剤耐性遺伝子）を選別してもよい。ガイドＲＮＡは、対象の既知の遺伝子を区別するように設計されてもよい。臨床試料を含む試料は、次いで、そのような遺伝子の検出のための本明細書で開示される実施形態を用いて選別されてもよい。ＰＯＣで薬物耐性を選別する能力は、適切な治療計画を選択する上で多大な恩恵がある。特定の例示的な実施形態では、抗生物質耐性遺伝子は、ＫＰＣ、ＮＤＭ１、ＣＴＸ−Ｍ１５、ＯＸＡ−４８を含むカルバペネマーゼである。他の抗生物質耐性遺伝子は既知であり、例えば、Comprehensive Antibiotic Resistance Database（包括的抗生物質耐性データベース） (Jia et al. “CARD 2017: expansion and model-centric curation of the Comprehensive Antibiotic Resistance Database（包括的抗生物質耐性データベースの展開とモデルを中心とするキュレーション）.” Nucleic Acids Research, 45, D566-573)で見出せる場合がある。
【０２９８】
リバビリンは、複数のＲＮＡウイルスを攻撃する有効な抗ウイルス剤である。いくつかの臨床的に重要なウイルスはリバビリン耐性を発達させた。そのような例として、口蹄疫ウイルスdoi:10.1128/JVI.03594-13；ポリオウイルス (Pfeifer and Kirkegaard. PNAS, 100(12):7289-7294, 2003)；およびＣ型肝炎ウイルス (Pfeiffer and Kirkegaard, J. Virol. 79(4):2346-2355, 2005)。複数の他の耐性ＲＮＡウイルス（例えば、肝炎およびＨＩＶ）は既存の抗ウイルス薬物に対する耐性を発達させた：Ｂ型肝炎ウイルス（ラミブジン、テノホビル、エンテカビル）doi:10/1002/hep22900；Ｃ型肝炎ウイルス（テラプレビル、ＢＩＬＮ２０６１、ＩＴＭＮ−１９１、ＳＣｈ６、ボセプレビル、ＡＧ−０２１５４１、ＡＣＨ−８０６）doi:10.1002/hep.22549；およびＨＩＶ（多くの薬物耐性変異）hivb.standford.edu.。本明細書で開示される実施形態を用いてとりわけそのような多様体を検出してもよい。
【０２９９】
薬物耐性とは別に、本明細書で開示される実施形態で検出することができる臨床的に関連する変異が複数ある。例えば、ＬＣＭＶの耐性ウイルス急性感染（doi:10.1073/pnas.1019304108）、およびエボラの高まる感染力(Diehl et al. Cell. 2016, 167(4):1088-1098）が挙げられる。
【０３００】
本明細書の他の箇所で記載するように、密接に関連した微生物種（例えば、所与の標的配列で１ヌクレオチドの違いを持つ）は、ｇＲＮＡへの合成による不一致の導入によって区別してもよい。
集合被覆法
【０３０１】
特定の実施形態では、１組のガイドＲＮＡは、例えば、規定された組の微生物内ですべての微生物種を同定することができるように設計されている。このような方法は特定の例示的な実施形態で記載されており、本明細書で記載するガイドＲＮＡを生成する方法をＷＯ２０１７／０４０３１６（参照により本明細書に組み込まれる）で開示されている方法と比較してもよい。ＷＯ２０１７０４０３１６で記載されているように、集合被覆による解決は、標的配列全体または１組の標的配列（例えば１組のゲノム配列）を被覆するのに必要な最少の数の標的配列プローブまたはガイドＲＮＡを同定してもよい。従来、集合被覆法を用いて、典型的には２０〜５０塩基対の範囲でプライマーおよび／またはマイクロアレイプローブを同定していた。例えば、以下を参照のこと：Pearson et al., cs.virginia.edu/~robins/papers/primers_dam11_final.pdf., Jabado et al. Nucleic Acids Res. 2006 34(22):6605-11, Jabado et al. Nucleic Acids Res. 2008, 36(1):e3 doi10.1093/nar/gkm1106, Duitama et al. Nucleic Acids Res. 2009, 37(8):2483-2492, Phillippy et al. BMC Bioinformatics. 2009, 10:293 doi:10.1186/1471-2105-10-293。しかしながら、そのような方法は、一般に各プライマー／プローブをｋ−ｍｅｒとして処理して、正確な一致を検索する、あるいは接尾辞アレイを用いて不正確な一致を可能にすることに関与していた。また、これらの方法は、一般に、各入力配列のみが１つのプライマーまたはプローブと結合する必要があり、この配列に沿った結合位置が不適切であるようにプライマーまたはプローブを選択することによりハイブリダイゼーションを検出するのに二項法を取る。代替え方法は、標的ゲノムを分割して予め規定した窓に入れ、二項法で個別の入力配列として各窓を有効に処理してもよい。すなわち、これらの方法は、所与のプローブまたはガイドＲＮＡが各窓の内側に結合するかどうかを決定し、すべての窓がプローブまたはガイドＲＮＡの開始に結合していることを必要とする。これらの方法は、入力配列全体または予め規定した窓の入力配列のいずれかとして集合被覆問題における「ユニバース（データセット）」の各要素を効果的に処理し、各要素は、プローブまたはガイドＲＮＡの開始が要素内に結合していると「被覆された」と見なされる。異なるプローブまたはガイドＲＮＡの設計は所与の標的配列をカバーするが、これらの方法はこの設計に対して流動性を制限する。
【０３０２】
これに対して、本明細書で開示される実施形態は、長い、例えば、ハイブリッド選択配列決定に好適な７０ｂｐ〜２００ｂｐの範囲の長さを持つプローブまたはガイドＲＮＡを検出することに関する。また、ＷＯ２０１７／０４０３１６で開示される方法をここに応用して、大型および／または可変標的配列組のすべての種および／または株の配列の検出配列決定を同定し容易にすることができるプローブまたはガイドＲＮＡ組を規定することができる汎標的配列法を取ってもよい。例えば、本明細書で開示される方法を用いて、所与のウイルスのすべての多様体を、あるいは１回のアッセイでの複数の異なるウイルスを同定してもよい。さらに、本明細書で開示される方法は、標的配列のヌクレオチドとして集合被覆問題における「ユニバース」の各要素を処理して、プローブまたはガイドＲＮＡがその要素を含む標的ゲノムのある分節に結合している限り各要素は「被覆された」と見なされる。このような種類の集合被覆法は、従来の二項法に代わりに用いられてもよく、本明細書で開示される方法は、プローブまたはガイドＲＮＡを標的配列にどのようにハイブリダイズするかについてよりよいモデルである。所与のガイドＲＮＡ配列が所与の窓に結合しているか否かを尋ねるのみではなく、むしろ、これらの方法を用いて、プローブまたはガイドＲＮＡが１つまたは複数の標的配列に結合するハイブリダイゼーションパターンを検出してもよい。次いで、これらのハイブリダイゼーションパターンから、試料からの濃縮と任意およびすべての標的配列の配列決定の両方を行うことができる程度に前記組の標的配列を被覆するのに必要な最少の数のプローブまたはガイドＲＮＡを決定する。これらのハイブリダイゼーションパターンは、損失関数を最少にする特定のパラメータを規定することで決定されてもよく、これにより、各種でパラメータを変動させる（例えば、各種の多様性を反映させる）ように、また計算効率がいいように最少プローブまたガイドＲＮＡ組を同定することができる。計算効率は、従来プローブまたはガイドＲＮＡ設計の文脈で適用されていたような集合被覆による解決をそのまま適用しても達成することができない。
【０３０３】
複数の転写物の多さを検出する能力により、特定の表現型を示す固有の微生物の特徴を生成することが可能な場合がある。様々な機械学習技術を用いて、遺伝子の特徴を生成させてもよい。従って、ＣＲＩＳＰＲ系のガイドＲＮＡを用いて、特定の表現型を検出するために遺伝子の特徴によって規定された生体指標の相対量を同定および／または定量してもよい。特定の例示的な実施形態では、遺伝子の特徴は、抗生物質に対する感受性、抗生物質に対する耐性、またはこれらの組合せを示す。
【０３０４】
本発明の一側面では、方法は１種以上の病原体を検出することを含む。このように、個々の微生物による対象者の感染の区別を得てもよい。態様によっては、このような区別により、臨床医が特定の疾患（例えば、疾患の異なる多様体）を検出または診断することができる場合がある。病原体の配列は、病原体のゲノムまたはその断片であることが好ましい。前記方法は、病原体の進化を決定することをさらに含んでいてもよい。病原体の進化の決定は、病原体の変異、例えば、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド挿入、ヌクレオチド置換などの同定を含んでいてもよい。後者のうち、非同義置換、同義置換、および非コード置換がある。変異は発生時には非同義的であることが多い。前記方法は、上記のように分析した２つの病原体配列間での置換率を決定することをさらに含んでいてもよい。しかしながら、変異が有害であるか、あるいは適応可能であるかは機能分析を必要とし、非同義変異の率は、この流行の進行の継続が病原体の順応の機会を与え得ることを示唆しており、急速な封じ込めに対する要求が強調される。従って、前記方法は、ウイルス順応の危険性を評価することをさらに含んでいてもよく、非同義変異の数が決定される(Gire, et al., Science 345, 1369, 2014)。
微生物発生の監視
【０３０５】
態様によっては、本明細書で記載するＣＲＩＳＰＲ系またはその使用方法を用いて、病原体発生の進化を決定してもよい。この方法は、１人以上の対象者に由来する複数の試料に由来する１つ以上の標的配列を含んでいてもよい。ここで、前記標的配列は、大流行を引き起こす微生物由来の配列である。このような方法は、病原体の伝染パターンまたは病原体によって引き起こされる疾患の発生に関与する反応機構を決定することをさらに含んでいてもよい。
【０３０６】
病原体の伝染パターンは、病原体の天然の供給源からの継続した新しい感染または対象から対象への感染（例えば、ヒトからヒトへの感染）を含み、その後、天然の供給源からの単一感染または両方の混合となってもよい。一態様では、病原体の伝染は細菌またはウイルスの伝染であってもよく、そのような場合、標的配列微生物ゲノムまたはその断片であることが好ましい。一態様では、病原体の伝染パターンは病原体の伝染の初期パターン、すなわち病原体の大流行の始まりである。大流行の始まりで病原体の伝染パターンを決定することは、できるだけ早い時間で大流行を停止させる尤度を高め、これによって地域的および国際的流布の可能性を低減する。
【０３０７】
病原体の伝染パターンの決定は、本明細書で記載する方法による病原体配列を検出することを含んでいてもよい。病原体の伝染パターンの決定は、対象者間で共有された病原体配列の宿主内多様性を検出すること、および共有された病原体配列の宿主内多様性が時間的パターンを示すか否かを決定することをさらに含んでいてもよい。宿主内および宿主間多様性に見られるパターンは伝染および疫学について重要な洞察を与えてくれる(Gire, et al., 2014)。
【０３０８】
時間的パターンを示す対象者間で共有された宿主内多様性の検出は対象者（特にヒト）間の伝染の連鎖を示す。というのは、これは複数の供給源（重複感染）からの対象者感染、（変異を強化するための平衡淘汰があってもなくても）変異を繰り返し生じさせる試料の汚染、または伝染連鎖の初期の変異によって生じたわずかに異なるウイルス(Park, et al., Cell 161(7):1516-1526, 2015)によって説明することができるからである。対象者間で共有された宿主内多様性の検出は、共通の一塩基多型（ＳＮＰ）位置にある宿主内多様体の検出を含んでいてもよい。共通の（ＳＮＰ）位置にある宿主内多様体の陽性検出は、宿主内多様体の主な説明として重複感染および汚染を示している。重複感染および汚染は、宿主間多様体として現れるＳＮＰ頻度に基づいて分けることができる(Park, et al., 2015)。そうでなければ、重複感染および汚染は除外することができる。後者の場合、対象者間で共有された宿主内多様性の検出は、同義多様体および非同義多様体の頻度を評価し、同義多様体および非同義多様体の頻度を互いに比較することをさらに含んでいてもよい。非同義変異は、自然淘汰が生じるような微生物の生物学的変化となるようなタンパク質のアミノ酸の変化を起こす変異である。同義置換は、アミノ酸配列を変化させない。同義多様体および非同義多様体が同じ頻度であることは、宿主内多様体の進化が中立であることを示している。同義多様体および非同義多様体の頻度が異なっている場合、宿主内多様体は平衡淘汰によって維持されていると思われる。同義多様体および非同義多様体の頻度が低い場合は、変異の繰り返しを示している。同義多様体および非同義多様体の頻度が高い場合は、共伝染を示している(Park, et al., 2015)。
【０３０９】
エボラウイルス同様、ラッサウイルス（ＬＡＳＶ）は出血性の発熱を引き起こすことがあり、症例死亡率が非常に高い。Andersenらは、臨床試料および齧歯類供給源試料に由来するほぼ２００個のＬＡＳＶ配列のゲノムカタログを生成した(Andersen, et al., Cell Volume 162, Issue 4, p 738-750, 13 August 2015)。Andersenらは、２０１３年から２０１５年のＥＶＤ大流行はヒトからヒトへの伝染によって加速されたが、ＬＡＳＶ感染は主に供給源からヒト感染の結果であることを示している。Andersenらは、西アフリカ全体でのＬＡＳＶの広がりはこの移行がＬＡＳＶゲノムの豊富さ、死亡率、コドン適応、および翻訳効率の変化を伴っていることを解明した。前記方法は、第一の病原体配列を第二の病原体配列と系統発生的に比較すること、および第一の病原体配列と第二の病原体配列との系統発生的繋がりがあるか否かを決定することをさらに含んでいてもよい。第二の病原体配列は、初期の基準配列であってもよい。系統発生的な繋がりがある場合、前記方法は第一の病原体配列の第二の病原体配列に対する系統発生をつきとめることをさらに含んでいてもよい。これにより、第一の病原体配列の系統を構築することが可能である(Park, et al., 2015)。
【０３１０】
前記方法は、変異が有害であるか、あるいは適応可能であるかを決定することをさらに含んでいてもよい。有害な変異は、伝染によって損なわれたウイルスおよび行き止まりの感染を示しており、通常、個々の対象者にのみ存在する。１個体の対象者に固有の変異は系統樹の末端の枝に生じるものであるが、内側の枝の変異は複数の試料（すなわち、複数の対象者）に存在する変異である。高い非同義置換率は、系統樹の末端の枝に特有のものである(Park, et al., 2015)。
【０３１１】
系統樹の内側の枝では、有害な変異体を取り除く淘汰の機会が増加している。定義により、内側の枝は複数の子孫系統を発生させ、これによって適応コストを伴う変異が含まれにくくなっている。従って、低い非同義置換率は内側の枝を示している(Park, et al., 2015)。
【０３１２】
同義変異は、適応にあまり影響を及ぼさないと思われるが、内側の枝と末端の枝でより同等な頻度で生じる(Park, et al., 2015)。
【０３１３】
配列決定された標的配列（例えば、ウイルスゲノム）を分析することで、２０１４年のエボラ大流行などでの伝染性発症の重症度に関与する機構を発見することが可能である。例えば、Gireらは、２０１４年の大流行のゲノムとそれ以前の大流行に由来する２０個のゲノムすべてとを系統発生的に比較した。この比較から、２０１４年西アフリカウイルスは、過去１０年以内に中央アフリカから広まったと思われることが示唆されている。他のエボラウイルスゲノムからの分岐を用いて系統発生をつきとめることは問題があった（６、１３）。しかしながら、最も古い大流行の木をつきとめることにより、１年につき部位当たり８×１０−４の置換率と共に、試料の日付と根から先端までの距離との強い相関が明らかになった（１３）。これは、３つの最も直近の大流行の系統はすべて、ほぼ同時、２００４年頃に共通の祖先から分岐していることを示唆している。これは、各大流行は、天然の供給源における遺伝的に異なる同じウイルス集団に由来する独立した人獣共通感染事象を表しているという仮説を裏付けるものである。また、彼らは、２０１４年のＥＢＯＶ大流行は、天然の供給源に由来する単一の伝染によって引き起こされ、その後、大流行時にヒトからヒトへの伝染となったことを見出した。これらの結果はまた、シエラ・レオネでの伝染性発症は、同じ頃のギニア由来の遺伝的に異なる２つのウイルスの導入から生じていることを示唆している(Gire, et al., 2014)。
【０３１４】
また、特にヒトからヒトへの伝染と、この広がりの歴史を４００年遡ることによりどのようにラッサウイルスがその原点から広まったかを決定することが可能になった(Andersen, et al., Cell 162(4):738-50, 2015)。
【０３１５】
２０１３〜２０１５年のＥＢＯＶ大流行時に必要だった作業と大流行の現場で医療スタッフが直面した困難に関連して、より一般に、本発明の方法は配列決定を加速して、試料の採取から結果の入手までに必要な時間を短縮するように選択されたより少ないプローブを用いて配列決定を行うことを可能にする。さらに、キットおよびシステムは、国または世界の他の地域に試料を送る必要がなく、患者の診断が容易に行えるように野外で使用できるように設計されていてもよい。
【０３１６】
上記の任意の方法では、標的配列またはその断片の配列決定には上記の配列決定法のいずれを用いてもよい。さらに、標的配列またはその断片の配列決定は、ほぼリアルタイムの配列決定であってもよい。標的配列またはその断片の配列決定は、上記の方法に従って行われてもよい（実験手順：Matranga et al., 2014;およびGire, et al., 2014)。標的配列またはその断片の配列決定は、複数の標的配列の並行配列決定を含んでいてもよい。標的配列またはその断片の配列決定は、Illumina配列決定を含んでいてもよい。
【０３１７】
選択されたプローブのうちの１つ以上にハイブリダイズする標的配列またはその断片の分析は、同定分析であってもよく、選択されたプローブの標的配列またはその断片へのハイブリダイゼーションは、試料中に標的配列が存在することを示す。
【０３１８】
現在、一次診断法は患者の症状に基づいている。しかしながら、様々な疾患は同じ症状を共有している場合があり、診断法は統計学に多くを依存している。例えば、マラリアは風邪のような症状を誘発する：頭痛、発熱、震え、関節の痛み、嘔吐、溶血性貧血、黄疸、尿中ヘモグロビン、網膜損傷、および痙攣。これらの症状はまた、敗血症、胃腸炎、およびウイルス性疾患に共通している。後者の中で、エボラ出血熱は、発熱、喉の痛み、筋肉痛、頭痛、嘔吐、下痢、発疹、肝臓および腎臓の機能低下、内出血および外出血などの症状がある。
【０３１９】
例えば、熱帯アフリカで患者が医療部隊に現れると、基本診断法はマラリアと結論づける。というのは、アフリカのこの領域では統計的にマラリアが最も可能性がある疾患だからである。その結果、患者はマラリアの治療を受けるが、実際にはマラリアに罹ってない場合もあり、患者は正しい治療を受けられない。特に、患者が罹っている疾患が急速に進化する場合、正しい治療を受けられないことは生命を脅かす場合がある。医療スタッフが、患者に行った治療が有効ではないことに気づいて、正しい診断法に至り、患者に適切な治療を施す前に手遅れになりかねない。
【０３２０】
本発明の方法はこのような状況に対する解決法を提供する。実際、ガイドＲＮＡの数が劇的に減少するので、本発明の方法を単一チップ選択プローブで提供することができる。プローブは同時に複数の疾患（例えば、ウイルス感染）を診断できるように、それぞれが１つの疾患に特異的である複数の群に分割されている。本発明のおかげで、４種以上の疾患、好ましくは、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０疾患以上を同時に１つのチップで診断してもよい。疾患は好ましくは、所与の地理的領域の集団内で一般に発生する疾患である。選択されたプローブの各群は診断される疾患のうちの１つに特異的であるので、より正確な診断を行うことができ、従って患者に間違った治療を施す危険性が低減される。
【０３２１】
他の場合では、ウイルス感染などの疾患は何の症状もなく発生することがある、あるいは症状を引き起こしたが患者が医療スタッフを訪れる前に消えたという場合がある。そのような場合、患者は何の医療支援も求められず、医療スタッフを訪れた日に症状がないために診断は困難である。
【０３２２】
本発明はまた、疾患を診断し、病原体を同定し、生の未精製の試料中におけるｍＲＮＡなどの核酸の検出に基づいて治療を最適にする他の方法と共に用いられてもよい。
【０３２３】
本発明の方法はまた、このような状況に対処する強力な道具を提供する。実際、各群が所与の地域の集団内で最も一般的に発生する疾患に特異的である、選択されたガイドＲＮＡの複数の群が１つの診断法に含まれているので、医療スタッフは患者から採取した生体試料をチップに接触させるだけである。チップの読み取ると、患者が罹った疾患が判明する。
【０３２４】
場合によっては、患者は特定の症状の診断のために医療スタッフを訪れる。本発明の方法は、これらの症状を引き起こしている疾患を同定するだけでなく、同時に患者が気づいていない他の疾患を発症しているか否かを決定することができる。
【０３２５】
この情報は、大流行の機構を探す場合に最も重要なものである場合がある。実際、同じウイルスを持つ患者群は、対象者から対象者への伝染の繋がりを示唆する時間的パターンを示す。
【０３２６】
態様によっては、本明細書で記載するＣＲＩＳＰＲ系またはその使用方法を用いて、ウイルス性疾患を発症している患者の疾患転帰を予測してもよい。特定の実施形態では、ウイルス性疾患はラッサ熱を含んでいてもよいが、必ずしもこれに限定されない。ラッサ熱病に関連する特異的因子は、必ずしもこれに限定されないが、年齢、腎臓損傷の程度、および／または中枢神経系（ＣＮＳ）損傷を含んでいてもよい。
微生物性遺伝的摂動の選別
【０３２７】
特定の例示的な実施形態では、本明細書で開示されるＣＲＩＳＰＲ系を用いて微生物性遺伝的摂動を選別してもよい。このような方法は、例えば、微生物の経路および機能ネットワークを作成するのに有用である場合がある。微生物細胞は遺伝的に修飾されていて、異なる実験条件で選別されてもよい。上述のように、本明細書で開示される実施形態は、１つの試料中の複数の標的分子、あるいは多重法で１つの個別の容積中の１つの標的を選別してもよい。遺伝的に修飾された微生物は修飾されて、１つの特定の微生物細胞または微生物細胞の集団によって担持される特定の遺伝子改変を同定する核酸バーコード配列を含んでいてもよい。バーコードは、識別子として用いられるヌクレオチドの短い配列（（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはこれらの組合せ）である。核酸バーコードは、長さが４〜１００ヌクレオチドであり、一本鎖または二本鎖のいずれかであってもよい。バーコードで細胞を同定する方法は当該分野で知られている。従って、本明細書で記載するＣＲＩＳＰＲエフェクター系のガイドＲＮＡを用いてバーコードを検出してもよい。検出可能な陽性信号の検出は、試料中に特定の遺伝子改変が存在することを示している。本明細書で開示される方法を、試験した実験条件での遺伝子改変の効果を示す補足的な遺伝子型または表現型の読み出しを検出する他の方法と組み合わせてもよい。選別される遺伝子改変としては、これらに限定されないが、遺伝子ノックイン、遺伝子ノックアウト、逆位、転座、転位、１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、置換、変異、あるいはタンパク質の安定性または検出を変えるなど機能的な結果を持つエピトープをコードする核酸の付加などが挙げられる。同様に、本明細書で記載する方法を合成バイオロジーの応用に用いて、遺伝子調節要素と遺伝子の発現モジュールの特異的な配置の機能を選別してもよい。
【０３２８】
特定の例示的な実施形態では、これらの方法を用いてハイポモルフ（形質の発現が低下した対立遺伝子の変異）を選別してもよい。主要な細菌性機能性遺伝子の同定におけるハイポモルフの生成およびその使用、および新規な抗生物質治療法の同定が２０１６年１１月４日に提出されたＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６０７３０（名称は“Multiplex High-Resolution Detection of Micro-organism Strains, Related Kits, Diagnostic Methods and Screening Assays（微生物株の多重高解像度検出、関連キット、診断法、および選別アッセイ）”）に開示されており、その内容を参照により本明細書に組み込む。
【０３２９】
異なる実験条件は、微生物細胞を異なる化学薬剤、化学薬剤の組合せに曝すこと、化学薬剤または化学薬剤の組合せの異なる濃度、化学薬剤または化学薬剤の組合せに曝す異なる継続時間、異なる物理パラメータ、またはその両方を含んでいてもよい。特定の例示的な実施形態では、化学薬剤は抗生物質または抗ウイルス剤である。選別される異なる物理パラメータは、異なる温度、大気圧、大気圧および非大気圧での異なる気体濃度、異なるｐＨレベル、異なる培地組成、またはこれらの組合せを含んでいてもよい。
環境試料の選別
【０３３０】
また、本明細書で開示される方法を用いて、標的核酸またはポリペプチドの存在を検出することにより汚染物質について環境試料を選別してもよい。例えば、実施形態によっては、本発明は、微生物を検出する方法を提供する。前記方法は、本明細書で記載するＣＲＩＳＰＲ系を試料に曝すこと、および検出可能な陽性信号が生成されるように１種以上のガイドＲＮＡを１種以上の微生物に特異的な標的ＲＮＡまたは１種以上のトリガーＲＮＡに結合させることでＲＮＡエフェクタータンパク質を活性化させることを含む。陽性信号を検出してもよく、これは試料中に１種以上の微生物が存在することを示している。態様によっては、ＣＲＩＳＰＲ系は本明細書で記載する基質表面にあってもよく、基質は試料に曝されていてもよい。他の実施形態では、同じＣＲＩＳＰＲ系および／または異なるＣＲＩＳＰＲ系を基質の複数の個別の位置に塗布してもよい。さらなる実施形態では、異なるＣＲＩＳＰＲ系は各位置で異なる微生物を検出してもよい。上でさらに詳細に記載したように、基質は柔軟性材料の基質であってもよく、例えば、紙の基質、布の基質、または柔軟性重合体の基質が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３３１】
本発明によれば、基質は、採取した流体に基質を一時的に浸す、試験する流体を基質に塗布する、または試験する表面を基質と接触させることにより受動的に試料に曝されていてもよい試料を基質に導入する如何なる適切な方法を用いてもよい。
【０３３２】
本明細書で記載するように、本発明で使用する試料は、生物学的試料または環境試料、例えば、食品試料（新鮮な果実または野菜、肉）、飲料試料、紙の表面、布の表面、金属の表面、木材の表面、プラスチックの表面、土壌試料、淡水試料、排水試料、生理食塩水試料、大気または他の気体試料に曝したもの、またはそれらの組合せであってもよい。例えば、これらに限定されないが、金属、木材、プラスチック、ゴムなどを含む任意の材料からなる家庭用／商用／工業用表面を拭って、汚染物質について試験してもよい。環境目的および／またはヒト、動物、または植物の疾患試験の目的で病原性細菌または寄生虫、あるいは他の微生物の存在について土壌試料を試験してもよい。例えば、クリプトスポリジウム・パルブム、ランブル鞭毛虫、または他の微生物汚染の存在を検出するため、淡水試料、排水試料、生理食塩水試料などの水試料を清浄度および安全性および／または携帯性について評価してもよい。さらなる実施形態では、生体試料は、これらに限定されないが、組織試料、唾液、血液、血漿、血清、糞便、尿、唾液、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、腹水、胸水、血清腫、膿、あるいは皮膚または粘膜表面の拭い液を含む供給源から得てもよい。特定の実施形態によっては、環境試料または生体試料は生の試料であってもよく、かつ／または１種以上の標的分子は方法を適用する前に試料から精製または増幅されていてもよい。微生物の同定は有用であり、かつ／または任意の数の用途で必要であってもよい。従って、本発明によって、当業者によって適切と見なされた任意の供給源由来のいずれの種類の試料を用いてもよい。
【０３３３】
態様によっては、レストランまたは他の食品提供者で大腸菌などの細菌による食品汚染を調べること；食品表面；サルモネラ、カンピロバクター、または大腸菌などの病原体について水を検査すること；また製造者および規制者が肉の供給源の純度を決定するために食品の品質を調べること；レジオネラ菌などの病原体による空気汚染を同定すること；ペジオコックスおよび乳酸桿菌などの病原体でビールが汚染または腐敗したか否かを調べること；製造中の細菌または真菌でペースト状または非ペースト状のチーズの汚染。
【０３３４】
本発明による微生物は、病原性微生物または食品あるいは消費製品を腐敗させる微生物であってもよい。病原性微生物は、病原性、またはそうでなければヒト、動物、または植物にとって望ましくないものであってもよい。ヒトまたは動物目的では、微生物は疾患を引き起こす、あるいは病気をもたらすものであってもよい。本発明の動物または獣医的用途では、微生物に感染した動物を同定してもよい。例えば、本発明の方法およびシステムは、これらに限定されないが、犬伝染性気管気管支炎（kennel cough）、狂犬病ウイルス、およびイヌ糸状虫を含む病原体を持つペットを同定してもよい。他の実施形態では、繁殖目的で親子鑑別に本発明の方法およびシステムを用いてもよい。植物微生物は、植物の損傷または病気を引き起こして収率を低下させたり、色、味、稠度、匂いなどの性質を変えたりすることがある。食品または消費品の汚染目的で、微生物は食品または消費製品の味、匂い、色、稠度、または他の商業的特性に悪影響を及ぼすことがある。特定の例示的な実施形態では、微生物は細菌種である。細菌は、低温細菌、大腸菌、乳酸菌、または芽胞形成菌であってもよい。特定の例示的な実施形態では、細菌は疾患または病気、そうでなければ、望ましくない生成物や特徴を引き起こす任意の細菌種であってもよい。本発明による細菌はヒト、動物、または植物にとって病原性であってもよい。
試料の種類
【０３３５】
本明細書で開示される方法で用いられる適切な試料は、植物、動物、細菌などの生物またはその一部から得られた任意の従来の生体試料を含む。特定の実施形態では、生体試料は、ヒト対象者などの動物対象から得られる。生体試料は、任意の生きている生物から得た、あるいはそれから排泄あるいは分泌された任意の固体または流体試料である。そのような生物としてはこれらに限定されないが、単細胞生物（例えば、とりわけ、細菌、酵母菌、原生動物、およびアメーバ）、多細胞生物（例えば、植物または動物）が挙げられる。そのような試料としては、病状または疾患（例えば、病原性微生物（例えば、病原性細菌またはウイルス）による感染など）によって影響を受けている診断または調査対象の健康あるいは健康に見えるヒト対象または患者由来の試料が挙げられる。例えば、生体試料は、例えば、血液、血漿、血清、尿、糞便、唾液、粘液、リンパ液流体、滑液、胆汁、腹水、胸水、血清腫、唾液、脳脊髄液、房水または硝子体液、任意の体分泌液、浸出液、滲出液（例えば、膿瘍または任意の他の感染あるいは炎症部位から得た流体）、あるいは関節（例えば、正常な関節またはリウマチ性関節炎、変形性関節症、痛風、あるいは敗血症性関節炎などの疾患によって影響を受けた関節）から得た流体、あるいは皮膚または粘膜表面の拭い液から得た体液であってもよい。
【０３３６】
試料はまた、任意の臓器または組織から得た試料（腫瘍生検材料などの生検材料または解剖試料を含む）であってもよく、任意の細胞、組織、または臓器で条件付けられた細胞（一次細胞または培養細胞）あるいは培地を含んでいてもよい。例示的な試料は、これらに限定されないが、細胞、細胞溶菌液、血液塗抹標本、細胞遠心分離調製液、細胞塗抹標本、体液（例えば、血液、血漿、血清、唾液、唾液、尿、気管支肺胞洗浄液、精液など）、組織生検（例えば、腫瘍生検）、微細針吸引液、および／または組織切片（例えば、凍結組織切片および／またはパラフィン埋め込み組織切片）が挙げられる。他の例では、試料は循環腫瘍細胞（細胞表面マーカーによって同定することができる）を含む。特定の例では、試料は直接用いられる（例えば、生または冷凍で）、あるいは例えば、用いる前に（例えば、ホルマリンを用いて）固定する、かつ／またはワックスに埋め込むことにより（例えば、ホルマリン固定パラフィン埋め込み（ＦＦＰＥ）組織試料）操作されていてもよいよい。自明であるが、対象者から組織を得る任意の方法を用いてもよく、用いる方法の選択は、組織の種類、対象者の年齢、または医師に利用可能な手順など様々な因子に依存している。そのような試料を得るための標準的な技術は当該分野で利用可能である。例えば、Schluger et al., J. Exp. Med. 176:1327-33(1992); Bigby et al., Am. Rev. Respir. Dis. 133:515-18(1986); Kovacs et al., NEJM 318:589-93(1988); and Ognibene et al., Am. Rev. Respir. Dis. 129:929-32(1984)を参照のこと。
【０３３７】
他の実施形態では、試料は環境試料、例えば、水土壌、または工業的または医療的な表面などの表面であってもよい。態様によっては、米国特許公開第２０１３／０１９０１９６号で開示されている方法を、高い感度と特異性で生の細胞試料から核酸の特徴（具体的には、ＲＮＡ濃度）を直接検出するのに用いてもよい。ＢＬＡＳＴソフトウェアにより対象の病原体由来のコード配列を他の生物のすべてのコード配列と比較することで対象の各病原体に特異的な配列を同定または選択してもよい。
【０３３８】
本開示のいくつかの実施形態は、臨床血液試料をうまく画分する当該分野で既知の手順および方法の使用を含む。例えば、Han Wei Hou et al., Microfluidic Devices for Blood Fractionation（血液分画のためのマイクロ流体装置）, Micromachines 2011, 2, 319-343; Ali Asgar S. Bhagat et al., Dean Flow Fractionation (DFF) Isolation of Circulating Tumor Cells (CTCs) from Blood（血液からの循環腫瘍細胞のディーンフロー分画）, 15th International Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences, October 2-6, 2011, Seattle, WA;および国際特許公開第WO2011109762に記載された手順を参照のこと。これらの開示はその全内容を参照により本明細書に組み込む。血液試料は一般に培地で膨張させて、試験の目的に合わせて試料の寸法を大きくする。本発明の態様によっては、培地で膨張する必要なしに血液または他の生体試料を本明細書で記載する方法で用いてもよい。
【０３３９】
さらに、本開示のいくつかの実施形態は、らせん状のマイクロ溝を用いて全血から病原体をうまく単離する当該分野で既知の手順および方法の使用を含む。これらは、Han Wei Hou et al., Pathogen Isolation from Whole Blood Using Spiral Microchannel（らせん状マイクロチャネルを用いた全血からの病原体の単離）, Case No. 15995JR, Massachusetts Institute of Technology, manuscript in preparationに記載されており、その開示の全内容を参照により本明細書に組み込む。
【０３４０】
本明細書で開示される実施形態の感度が高まっているので、特定の例示的な実施形態では、アッセイおよび方法を生の試料、あるいは検出対象の標的分子がさらに試料から画分または精製されていない試料に対して実行してもよい。
例示的な微生物
【０３４１】
本明細書で開示される実施形態を用いて複数の異なる微生物を検出してもよい。本明細書で用いられる用語「微生物」は細菌、真菌、原生動物、寄生虫、およびウイルスを含む。
細菌
【０３４２】
以下に、本明細書で開示される実施形態を用いて検出されるかもしれない微生物の種類の例示的なリストを示す。特定の例示的な実施形態では、前記微生物は細菌である。開示される方法に従って検出することができる細菌の例としては、これらに限定されないが、とりわけ以下のいずれか１種以上（またはその任意の組合せ）が挙げられる：アシネトバクター・バウマニ、アクチノバチルス属、アクチノミセテス、アクチノマイセス属（例えば、アクチノマイセス・イスラエリおよびアクチノマイセス・ナエスルンディ）、アエロモナス属（例えば、アエロモナス・ヒドロフィラ、アエロモナス・ベロニ次亜属ソブリア（アエロモナス・ソブリア）、およびアエロモナス・カビアエ）、アナプラズマ・ファゴサイトフィルム、アナプラズマ・マルギナーレ、アルカリゲネス・キシロソキシダンス、アシネトバクター・バウマニ、アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンス、バシラス属（例えば、バシラス・アントラシス、バシラス・セレウス、枯草菌、バシラス・チューリンゲンシス、およびバチルス・ステアロサーモフィルス）、バクテロイデス属（例えば、バクテロイデス・フラギリス）、バルトネラ属（例えば、バルトネラ・バシリフォルミスおよびバルトネラ・ヘンセラエ）、ビフィドバクテリウム属、ボルデテラ属（例えば、ボルデテラ・ペルトゥシス、ボルデテラ・パラペルトゥシス、およびボルデテラ・ブロンキセプチカ）、ボレリア属（例えば、ボレリア・レカレンティス、およびボレリア・ブルグドルフェリ）、ブルセラ属（例えば、ブルセラ・アボルタス、ブルセラ・カニス、ブルセラ・メリテンシス、およびブルセラ・スイス）、ブルコルデリア属（例えば、ブルコルデリア・シュードマレイ、およびブルコルデリア・セパシア）、カンピロバクター属（例えば、カンピロバクター・ジェジュニ、カンピロバクター・コリ、カンピロバクター・ラリ、およびカンピロバクター・フェタス）、カプノサイトファーガ属、カルディオバクテリウム・ホミニス、クラミジア・トラコマチス、クラミドフィラ・ニューモニアエ、クラミドフィラ・シタッシ、シトロバクター属、コクシエラ・バーネッティイ、コリネバクテリウム属（例えば、コリネバクテリウム・ジフテリアエ、コリネバクテリウム・イエイケイウム、およびコリネバクテリウム）、クロストリジウム属（例えば、クロストリジウム・ペルフリンゲンス、クロストリジウム・ディフィシル、クロストリジウム・ボツリヌム、およびクロストリジウム・テタニ）、エイケネラ・コロデンス、エンテロバクター属（例えば、エンテロバクター・アエロゲネス、エンテロバクター・アグロメランス、エンテロバクター・クロアカ、および大腸菌（毒素原性大腸菌、侵入性大腸菌、病原性大腸菌、腸管出血性大腸菌、腸管凝集性大腸菌、および尿路病原性大腸菌などの日和見性大腸菌を含む）、エンテロコッカス属（例えば、エンテロコッカス・ファエカリスおよびエンテロコッカス・ファエキウム）、エールリキア属（例えば、エールリキア・シャフェンシア、およびエールリキア・カニス）、エピデルモフィトン・フロッコーサム、豚丹毒菌、ユウバクテリウム属，フランシセラ・ツラレンシス，フソバクテリウム・ヌクレアタム、ガードネレラ・バジナリス、ゲメラ・モルビロルム、ヘモフィルス属（例えば、インフルエンザ菌、軟性下疳菌、ヘモフィルス・エジプチウス、ヘモフィルス・パラインフルエンザエ、ヘモフィルス・ヘモリティクス、およびヘモフィルス・パラヘモリティクス）、ヘリコバクター属（例えば、ヘリコバクター・ピロリ、ヘリコバクター・シネディ、およびヘリコバクター・フェネリアエ）、キンゲラ・キンギイ、クレブシエラ属（例えば、肺炎桿菌、クレブシエラ・グラヌロマチス、およびクレブシエラ・オキシトカ）、乳酸桿菌属、リステリア・モノサイトゲネス、レプトスピラ・インテロガンス、レジオネラ・ニューモフィラ、レプトスピラ・インテロガンス、ペプトストレプトコッカス属、マンヘミア・ヘモリチカ、ミクロスポルム・カニス、モラクセラ・カタラーリス、モルガネラ属、モビルンカス属、ミクロコッカス属、マイコバクテリウム属（例えば、マイコバクテリウム・レプラエ、ヒト型結核菌、マイコバクテリウム・パラツベルクローシス、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ、マイコバクテリウム・アビウム、マイコバクテリウム・ボビス、およびマイコバクテリウム・マリヌム）、マイコプラズマ属（例えば、マイコプラズマ・ニューモニアエ、マイコプラズマ・ホミニス、およびマイコプラズマ・ゲニタリウム）、ノカルジア属（例えば、ノカルジア・アステロイデス、ノカルジア・シリアシゲオルギカ、およびノカルジア・ブラシリエンシス）、ナイセリア属（例えば、淋菌およびナイセリア・メニンギティディス）、パスツレラ・ムルトシダ、ピチロスポルム・オルビクラーレ（癜風菌）、プレシオモナス・シゲロイデス。プレボテラ属、ポルフィロモナス属、プレボテラ・メラニノゲニカ、プロテウス属（例えば、プロテウス・ブルガリス、およびプロテウス・ミラビリス）、プロビデンシア属（例えば、プロビデンシア・アルカリファシエンス、プロビデンシア・レットゲリ、およびプロビデンシア・スツアルティ）、緑膿菌、プロピオニバクテリウム・アクネス，ロドコッカス・エクイ、リケッチア属属（例えば、リケッチア・リケッチ、リケッチア・アカリ、およびリケッチア・プロワゼキ、オリエンティア・ツツガムシ（かつてはリケッチア・ツツガムシ）、およびリケッチア・ティフィ），ロドコッカス属、霊菌、ステノトロフォモナス・マルトフィラ、サルモネラ属（例えば、サモネラ・エンテリカ、サルモネラ・ティフィ、サルモネラ・パラティフィ、サルモネラ・エンテリティディス、サルモネラ・コレラスイス、およびネズミチフス菌）、セラチア属（例えば、セラチア・マルセサンスおよびセラチア・リクエファシエンス）、赤痢菌属（例えば、志賀赤痢菌、シゲラ・フレックスネリ、シゲラ・ボイディ、およびシゲラ・ソンネイ）、スタフィロコッカス属（例えば、黄色スタフィロコッカス、表皮スタフィロコッカス、スタフィロコッカス・ヘモリチカス、スタフィロコッカス・サプロフィチカス）、ストレプトコッカス属（例えば、肺炎レンサ球菌（例えば、クロラムフェニコール耐性血清型４肺炎レンサ球菌、スペクチノマイシン耐性血清型６Ｂ肺炎レンサ球菌、ストレプトマイシン耐性血清型９Ｖ肺炎レンサ球菌、エリスロマイシン耐性血清型１４肺炎レンサ球菌、オプトキン耐性血清型１４肺炎レンサ球菌、リファンピシン耐性血清型１８Ｃ肺炎レンサ球菌、テトラサイクリン耐性血清型１９Ｆ肺炎レンサ球菌、ペニシリン耐性血清型１９Ｆ肺炎レンサ球菌、およびトリメトプリム耐性血清型２３Ｆ肺炎レンサ球菌、クロラムフェニコール耐性血清型４肺炎レンサ球菌、スペクチノマイシン耐性血清型６Ｂ肺炎レンサ球菌、ストレプトマイシン耐性血清型９Ｖ肺炎レンサ球菌、オプトキン耐性血清型１４肺炎レンサ球菌、リファンピシン耐性血清型１８Ｃ肺炎レンサ球菌、ペニシリン耐性血清型１９Ｆ肺炎レンサ球菌、またはトリメトプリム耐性血清型２３Ｆ肺炎レンサ球菌）、ストレプトコッカス・アガラクチアエ、ストレプトコッカス・ムタンス、化膿レンサ球菌、Ａ群レンサ球菌、化膿レンサ球菌、Ｂ群レンサ球菌、ストレプトコッカス・アガラクチアエ、Ｃ群レンサ球菌、ストレプトコッカス・アンギノスス、ストレプトコッカス・エクイスミリス、Ｄ群レンサ球菌、ストレプトコッカス・ボビス、Ｆ群レンサ球菌、およびストレプトコッカス・アンギノススＧ群レンサ球菌）、スピリウム・ミヌス、ストレプトバチルス・モニリフォルミ、トレポネーマ属（例えば、トレポネーマ・カラテウム、トレポネーマ・ペテヌエ、梅毒トレポネーマ、およびトレポネーマ・エンデミカム、トリコフィトン・ルブルム、トリコフィトン・メンタグロフィテス、トロフェリマ・ホウィッペリ、ウレアプラズマ・ウレアリチクム、ベイロネラ属、ビブリオ属（例えば、ビブリオ・コレレ、ビブリオ・パラヘモリティカス、ビブリオ・バルニフィカス、ビブリオ・パラヘモリティクス、ビブリオ・バルニフィカス、ビブリオ・アルギノリティクス、ビブリオ・ミミクス、ビブリオ・ホリサエ、ビブリオ・フルビアリス、ビブリオ・メチニコフィイ、ビブリオ・ダムセラ、およびビブリオ・フルニシイ）、エルシニア属（例えば、エルシニア・エンテロコリチカ、ペスト菌、およびエルシニア・シュードツベルクローシス）、およびキサントモナス・マルトフィラ。
真菌
【０３４３】
特定の例示的な実施形態では、微生物は真菌または真菌属である。開示される方法によって検出され得る菌類の例としては、これらに限定されないが、以下のいずれか１種以上（またはその任意の組合せ）が挙げられる：アスペルギルス、ブラストミセス、カンジジアシス、コクシジオドミコシス、クリプトコックス・ネオフォルマンス、クリプトコックス・ガッティ種、ヒストプラズマ属（例えば、ヒストプラズマ・カプスラーツム）、ニューモシスチス属（例えば、ニューモシスチス・イロベチイ）、スタキボトリス（例えば、スタキボトリス・チャルタルム）、ムクロイムコシス、スポロトリックス、真菌性目感染白癬菌、エクセロヒルム、クラドスポリウム。
【０３４４】
特定の例示的な実施形態では、真菌は酵母菌である。開示される方法によって検出し得る酵母菌の例としては、これらに限定されないが、以下のいずれか１種以上（またはその任意の組合せ）が挙げられる：アスペルギルス属（例えば、アスペルギルス・フミガツス、アスペルギルス・フラブス、およびアスペルギルス・クラバツス）、クリプトコックス属（例えば、クリプトコックス・ネオフォルマンス、クリプトコックス・ガッティ、クリプトコックス・ラウレンチイ、およびクリプトコックス・アルビヅス）、ゲオトリチュム属、サッカロミセス属、ハンセヌラ属、カンジダ属（例えば、カンジダ・アルビカンス）、クルイベロミセス属、デバリオミセス属、ピキア属、またはこれらの組合せ。特定の例示的な実施形態では、菌類はカビである。カビの例としては、これらに限定されないが、アオカビ属、クラドスポリウム属、ビソクラミス属、またはこれらの組合せが挙げられる。
原生動物
【０３４５】
特定の例示的な実施形態では、微生物は原生動物である。開示される方法および装置によって検出され得る原生動物の例としては、これらに限定されないが、ユーグレノゾア、ヘテロロボセア、ジプロモナジダ、アメーボゾア、ブラストシスチス、およびアピコンプレクサのいずれか１種以上（またはその任意の組合せ）が挙げられる 。ユーグレノゾアの例としては、これらに限定されないが、トリパノソーマ・クルージ（シャーガス病）、トリパノソーマ・ブルセイガンビエンセ、トリパノソーマ・ブルセイロデシエンセ、レイシュマニア・ブラジリエンシス、レイシュマニア・インファンツム、レイシュマニア・メキシカナ、レイシュマニア・メジャー、レイシュマニア・トロピカ、およびレイシュマニア・ドノバニが挙げられる。ヘテロロボセアの例としては、これらに限定されないが、ネグレリア・フォーレリが挙げられる。ジプロモナジダの例としては、これらに限定されないが、ジアルディア・インテスチナリス（ジアルディア・ランブリア、ジアルディア・ドゥオデナリスドゥオデナリス）が挙げられる。アメーボゾアの例としてはこれらに限定されないが、アカンサモエバ・カステラニ、バラムチア・マンドリラリス、赤痢アメーバが挙げられる、ブラストシスチスの例としては、これらに限定されないが、ブラストシスチス・ホミニスが挙げられる。アピコンプレクサの例としては、これらに限定されないが、バベシア・ミクロチ、クリプトスポリジウム・パルブム、シクロスポラ・カイエタネンシス、プラスモジウム・ファルチパルム、プラスモジウム・ビバックス、プラスモジウム・オバーレ、プラスモジウム・マラリアエ、およびトキソプラズマ・ゴンディ、バベシア・ミクロチ、クリプトスポリジウ．ム・パルブム、シクロスポラ・カイエタネンシス、プラスモジウム・ファルチパルム、プラスモジウム・ビバックス、プラスモジウム・オバーレ、プラスモジウム・マラリアエ、およびトキソプラズマ・ゴンディが挙げられる。
寄生虫
【０３４６】
特定の例示的な実施形態では、微生物は寄生虫である。開示される方法によって検出され得る寄生虫としては、これらに限定されないが、オンコセルカ属およびプラスモジウム属のいずれか１種以上（またはその任意の組合せ）が挙げられる。
ウイルス
【０３４７】
特定の例示的な実施形態では、本明細書で開示されるシステム、装置、および方法は、試料中のウイルスを検出することに関する。本明細書で開示される実施形態を用いて、ウイルス感染（例えば、対象者または植物）を検出、あるいは一塩基多型により異なるウイルス株を含むウイルス株の決定を行ってもよい。ウイルスは、ＤＮＡウイルス、ＲＮＡウイルス、またはレトロウイルスであってもよい。本発明で有用なウイルスの非限定的な例としては、これらに限定されないが、以下のものを含む：エボラウイルス、麻疹ウイルス、ＳＡＲＳウイルス、チクングニアウイルス、肝炎ウイルス、マールブルグウイルス、黄熱ウイルス、ＭＥＲＳウイルス、デング熱ウイルス、ラッサ熱ウイルス、インフルエンザウイルス、ラブドウイルス、またはＨＩＶラブドウイルスが挙げられる。肝炎ウイルスは、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、またはＣ型肝炎ウイルスを含んでいてもよい。インフルエンザウイルスは、例えば、インフルエンザＡまたはインフルエンザＢを含んでいてもよい。ＨＩＶはＨＩＶ１またはＨＩＶ２を含んでいてもよい。特定の例示的な実施形態では、ウイルス配列は以下のものであってもよい：ヒト呼吸器多核体ウイルス、スーダンエボラウイルス、ブンディブギョウイルス、タイフォレストエボラウイルス、レストンエボラウイルス、アチモタウイルス、アエデスフラビウイルス、アグアカテウイルス、アカバネウイルス、アレチノフィドレプタレナウイルス（Alethinophid reptarenavirus）、オルパフアヨマンマレナウイルス（Allpahuayo mammarenavirus）、アマパリマレナウイルス（Amapari mmarenavirus）、アンデスウイルス、アポイウイルス、アラバンウイルス、アロアウイルス、アルムウォトウイルス、タイセイヨウサケパラミクソウイルス、オーストラリアコウモリ・リッサウイルス、鳥ボルナウイルス、鳥メタニューモウイルス、鳥パラミクソウイルス、ペンギンまたフォークランド島ウイルス、ＢＫポリオーマウイルス、バガザウイルス、バンナウイルス、コウモリヘペウイルス、コウモリサポウイルス、熊カノンマンマレナウイルス、ベイロンウイルス、ベータコロナウイルス、ベータパピローマウイルス１〜６、バーンヤウイルス、ボケローコウモリリッサウイルス、ボルナ病ウイルス、バーボンウイルス、ウシヘパシウイルス、ウシパラインフルエンザウイルス３、ウシ呼吸器多核体ウイルス、ブラゾランウイルス、ブニヤムウェラウイルス、カリシウイルス科ウイルス。カリフォルニア脳炎ウイルス、カンディルウイルス、犬ジステンパーウイルス、犬ニューモウイルス、セダーウイルス、細胞融合因子ウイルス、クジラモルビリウイルス、チャンディプラウイルス、朝陽ウイルス、チャパレマンマレナウイルス（Chapare mammarenavirus）、チクングニアウイルス、コロブスモンキーパピローマウイルス、コロラドダニ熱ウイルス、牛痘ウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、イエカフラビウイルス、クピキシ（Cupixi）マンマレナウイルス、デング熱ウイルス、ドブラバ−ベルグレドウイルス、ドンガン（Donggang）ウイルス、デュグベ（Dugbe）ウイルス、ドゥベンヘイジウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、エンテベコウモリウイルス、エンテロウイルスＡ〜Ｄ、ヨーロッパコウモリリッサウイルス１〜２���アイア（Eyach）ウイルス、ネコモルビリウイルス、フェルドランスパラミクソウイルス、フィッツロイ川ウイルス、フラビウイルス科ウイルス、フレクサルマンマレナウイルス、ＧＢウイルスＣ、ガイロ（Gairo）ウイルス、ゲミサーキュラーウイルス、ガチョウパラミクソウイルスＳＦ０２、グレートアイランドウイルス、グアナリトマンマレナウイルス、ハンタンウイルス、ハンタウイルスＺ１０、ハートランドウイルス、ヘンドラウイルス、Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｅ型肝炎ウイルス、デルタ肝炎ウイルス、ヒトボカウイルス、ヒトコロナウイルス、ヒト内因性レトロウイルスＫ、ヒト腸溶性コロナウイルス、ヒトゲンシャル関連環状ＤＮＡウイルス−１、ヒトヘルペスウイルス１〜８、ヒト免疫不全ウイルス１／２、ヒトマストアデノウイルスＡ〜Ｇ、ヒトパピローマウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス１〜４、ヒトパレコウイルス、ヒトピコビルナウイルス、ヒトスマコウイルス（smacovirus）、イコマリッサウイルス、イルヘウスウイルス、インフルエンザＡ〜Ｃ、イッピマンマレナウイルス、イルクーツウイルス、Ｊ−ウイルス、ＪＣポリオーマウイルス、日本脳炎ウイルス、ジュニンマンマレナウイルス、ＫＩポリオーマウイルス、カディピロウイルス、カミチ川（Kamiti River）ウイルス、ケドウゴウウイルス、クージャンウイルス、ココベラウイルス、キャサヌル森林病ウイルス、ラゴスコウモリウイルス、ランガットウイルス、ラッサマンマレナウイルス、ラティーノマンマレナウイルス、レオパーズヒルウイルス、遼寧（Liao ning）ウイルス、ユンガン（Ljungan）ウイルス、ルロビウ（Lloviu）ウイルス、跳躍病ウイルス、ルジョマンマレナウイルス、ルナマンマレナウイルス、ルンク（Lunk）ウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎マンマレナウイルス、リッサウイルスオゼルノエ、ＭＳＳＩ２＼．２２５ウイルス、マチュポマンマレナウイルス、ママストロウイルス１、マンザニラウイルス、マプエラウイルス、マールブルグウイルス、マヨロウイルス、麻疹ウイルス、メナングルウイルス、メルカデオウイルス、メルケル細胞ポリオーマウイルス、中東呼吸器症候群コロナウイルス、モバラマンマレナウイルス、モドクウイルス、モイジャン（Moijang）ウイルス、モコロウイルス、サル痘ウイルス、モンタナ筋炎白質脳炎（myotis leukoencephalitis）ウイルス、モペイアラッサウイルス再集合体２９、モペイアマンマレナウイルス、モロゴロウイルス、モスマンウイルス、ムンプスウイルス、マウス肺炎ウイルス、マリーバレー脳炎ウイルス、ナリバウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ニパウイルス、ノーウォークウイルス、ノルウェーラットヘパシウイルス、タヤウイルス、オニョンニョンウイルス、オリベロスマンマレナウイルス、オムスク出血熱ウイルス、オロプーシェウイルス、パラインフルエンザウイルス５、パラナマンマレナウイルス、パラマッタ川ウイルス、小反芻獣疫ウイルス、ピチャンデ（Pichande）マンマレナウイルス、ピコルナウイルス科ウイルス、ピリタルマンマレナウイルス、ピシヘペ（Piscihepe）ウイルスＡ、ブタパラインフルエンザウイルス１、ブタルブラウイルス、ポワサンウイルス、霊長類Ｔリンパ球向性ウイルス１〜２、霊長類エリスロパルボウイルス１、プンタトロウイルス、プーマラウイルス、カンビンウイルス、狂犬病ウイルス、ラズダンウイルス、爬虫類ボルナウイルス１、ライノウイルスＡ〜Ｂ、リフトバレー熱ウイルス、牛疫ウイルス、リオブラボーウイルス、齧歯類トルクテノウイルス、齧歯類ヘパシウイルス、ロスリバーウイルス、ロタウイルスＡ〜Ｉ，ロイヤルファームウイルス、風疹ウイルス、サビアマンマレナウイルス、サレムウイルス、サシチョウバエ熱ナポリウイルス、サシチョウバエ熱シチリアウイルス、サッポロウイルス、サシュペリウイルス、アザラシ（Seal）アネロウイルス、セムリキ森林ウイルス、センダイウイルス、ソウルウイルス、セピクウイルス、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス、血小板減少症症候群ウイルスを伴う高熱、シャモンダウイルス、シモニコウモリウイルス、シュニウイルス、シンブウイルス、シミアントルクテノウイルス、シミアンウイルス４０〜４１、シンノンブルウイルス、シンドビスウイルス、小アネロウイルス、スソガ（Sosuga）ウイルス、スペインヤギ脳炎ウイルス、スポンドウェニィウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、サンシャインウイルス、ＴＴＶ用ミニウイルス、タカリベマンマレナウイルス、タイラ（Taila）ウイルス、タマナコウモリウイルス、タミアミマンマレナウイルス、テンブスウイルス、トゴトウイルス、トッタパラヤンウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、チオマンウイルス、トガウイルス科ウイルス、トルクテノカニスウイルス、トルクテノドウロウコウリ（douroucouli）ウイルス、トルクテノフェリスウイルス、トルクテノディウイルス、トルクテノススウイルス、トルクテノタマリンウイルス、トルクテノウイルス、トルクテノアシカウイルス、ツホコウイルス、ツラウイルス、ツパイア・パラミクソウイルス、ウスツウイルス、ウークニエミウイルス、ワクシニアウイルス、天然痘ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、水疱性口内炎インディアナウイルス、ＷＵポリオーマウイルス、ウェッセルスブロンウイルス、ウェストコーカシアンコウモリウイルス、西ナイルウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、ホワイトウオーター・アロヨマンマレナウイルス、黄熱ウイルス、ヨコセウイルス、ヤグボグダノバクウイルス、ザイールエボラウイルス、ジカウイルス、またはジゴサッカロミセス・バイリウイルスＺウイルス配列。検出され得るＲＮＡウイルスの例は、以下のいずれか１つ以上（またはその任意の組合せ）を含む：コロナウイルス科ウイルス、ピコルナウイルス科ウイルス、カリシウイルス科ウイルス、フラビウイルス科ウイルス、トガウイルス科ウイルス、ボルナウイルス科、フィロウイルス科、パラミクソウイルス科、ニューモウイルス亜科、ラブドウイルス科、アレナウイルス科、ブニヤウイルス科、オルトミクソウイルス科、またはデルタウイルス。特定の例示的な実施形態では、ウイルスは、コロナウイルス、ＳＡＲＳ、ポリオウイルス、ライノウイルス、Ａ型肝炎、ノーウォークウイルス、黄熱ウイルス、西ナイルウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、デング熱ウイルス、ジカウイルス、風疹ウイルス、ロスリバーウイルス、シンドビスウイルス、チクングニアウイルス、ボルナ病ウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ニパウイルス、ヘンドラウイルス���ニューカッスル病ウイルス、ヒト呼吸器多核体ウイルス、狂犬病ウイルス、ラッサウイルス、ハンタウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、インフルエンザ、またはＤ型肝炎ウイルスである。
【０３４８】
特定の例示的な実施形態では、ウイルスは、以下を含む群から選択される植物ウイルスであってもよい：タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）、トマト黄化壊疽ウイルス（ＴＳＷＶ）、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）、ジャガイモウイルスＹ（ＰＶＹ）、レトロウイルスカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、ウメ輪紋ウイルス（ＰＰＶ）、ブロムモザイクウイルス（ＢＭＶ）、ジャガイモウイルスＸ（ＰＶＸ）、カンキツトリステザウイルス（ＣＴＶ）、オオムギ黄萎ウイルス（ＢＹＤＶ）、ジャガイモ葉巻ウイルス（ＰＬＲＶ）、トマト矮化病ウイルス（ＴＢＳＶ）、イネ矮化ウイルス（ＲＴＳＶ）、イネ黄斑紋ウイルス（ＲＹＭＶ）、イネ白葉病ウイルス（ＲＨＢＶ）、トウモロコシラヤドフィノウイルス（ＭＲＦＶ）、トウモロコシ矮小モザイクウイルス（ＭＤＭＶ）、サトウキビモザイクウイルス（ＳＣＭＶ）、サツマイモ斑紋モザイクウイルス（ＳＰＦＭＶ）、サツマイモ凹脈クロステロウイルス(sweet potato sunken vein closterovirus, SPSVV)、ブドウファンリーフウイルス（ＧＦＬＶ）、ブドウウイルスＡ（ＧＶＡ）、ブドウウイルスＢ（ＧＶＢ）、ブドウフレックウイルス（ＧＦｋＶ）、ブドウ葉巻随伴ウイルス−１、−２、および−３，（ＧＬＲａＶ−１、−２、および−３）、アラビスモザイクウイルス（ＡｒＭＶ）、またはブドウステムピッティング随伴ウイルス（ＲＳＰａＶ）。好ましい一態様では、標的ＲＮＡ分子は、前記病原体の一部であるか、または前記病原体のＤＮＡ分子から転写されている。例えば、標的配列はＲＮＡウイルスのゲノムに含まれていてもよい。前記病原体が前記植物に感染する、あるいはしている場合、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は、前記植物の病原体の標的ＲＮＡ分子を加水分解することがさらに好ましい。従って、ＣＲＩＳＰＲ系（またはその完成に必要な部分）が治療として感染が起こった後、または予防として感染が起こる前に適用される場合のいずれも、ＣＲＩＳＰＲ系は植物の病原体から標的ＲＮＡ分子を切断することができることが好ましい。
【０３４９】
特定の例示的な実施形態では、ウイルスはレトロウイルスであってもよい。本明細書で開示される実施形態を用いて検出され得るレトロウイルスの例としては、アルファレトロウイルス、ベータレトロウイルス、ガンマレトロウイルス、デルタレトロウイルス、イプシロンレトロウイルス、レンチウイルス、スプマウイルス属ウイルス、あるいはメタウイルス科、シュウドウイルス科、およびレトロウイルス科（ＨＩＶを含む）、ヘパドナウイルス科（Ｂ型肝炎ウイルスを含む）、およびカリモウイルス科（カリフラワーモザイクウイルスを含む）のウイルスの１種以上またはその任意の組合せが挙げられる。
【０３５０】
特定の例示的な実施形態では、ウイルスはＤＮＡウイルスである。本明細書で開示される実施形態を用いて検出され得るＤＮＡウイルスの例としては、マイオウイルス科、ポドウイルス科、サイフォウイルス科、アロヘルペスウイルス科、ヘルペスウイルス科（ヒトヘルペスウイルス、および水痘帯状疱疹ウイルスを含む）、マロコヘルペスウイルス科、リポスリクスウイルス科，ルディウイルス科、アデノウイルス科、アンプラウイルス、アスコウイルス科、アスファウイルス科（アフリカ豚コレラウイルスを含む）、バキュロウイルス科、シカウダウイルス科（Cicaudaviridae）、クラバウイルス科（Clavaviridae）、コルチコウイルス科（Corticoviridae）、フセロウイルス科、グロブロウイルス科、グッタウイルス科、ヒトロサウイルス科、イリドウイルス科、マセイレウイルス科（Maseilleviridae）、ミミウイルス科、ヌディウイルス科、ニマウイルス科、パンドラウイルス科、パピローマウイルス科、フィコドナウイルス科、プラズマウイルス科、ポリドナウイルス科、ポリオーマウイルス科（シミアンウイルス４０、ＪＣウイルス、ＢＫウイルスを含む）、ポックスウイルス科（牛痘および天然痘を含む）、スファエロリポウイルス科（Sphaerolipoviridae）、テクティウイルス科、ツリウイルス科（Turriviridae）、ディノドナウイルス（Dinodnavirus）、サルテロプロウイルス（Salterprovirus），リジドウイルス（Rhizidovirus）のうちの１種以上（またはその任意の組合）のウイルスが挙げられる。態様によっては、細菌感染していると疑われる対象者で種に特異的な細菌感染を診断する方法が記載される。前記方法は、細菌性リボソームリボ核酸を含む試料を対象者から得ること；前記試料を上記のプローブの１つ以上と接触させて、試料中にある細菌性リボソームリボ核酸配列とプローブのハイブリダイゼーションを検出することを含み、ハイブリダイゼーションの検出は、対象者が大腸菌、肺炎桿菌、緑膿菌、黄色スタフィロコッカス、アシネトバクター・バウマニ、カンジダ・アルビカンス、エンテロバクター・クロアカ、エンテロコッカス・ファエカリス、エンテロコッカス・ファエキウム、プロテウス・ミラビリス、スタフィロコッカス・アガラクチアエ、スタフィロコッカス・マルトフィラ、またはこれらの組合せに感染していることを示す。
【０３５１】
特定の例示的な実施形態では、ウイルスは以下の表８に示すウイルス、または示された属／科のウイルスである。
【表８】
2020513815.tif 000014
2020513815.tif 000015
2020513815.tif 000016
2020513815.tif 000017
2020513815.tif 000018
2020513815.tif 000019
2020513815.tif 000020
2020513815.tif 000021
【０３５２】
特定の態様では、ウイルスは以下の表に示すウイルスである。
【表８Ａ】
2020513815.tif 000022
【０３５３】
特定の態様では、ウイルスは以下の表９に示すウイルスである。
【表９】
2020513815.tif 000023
【０３５４】
特定の態様では、ウイルスは薬物耐性ウイルスである。例として、これらに限定されないが、ウイルスはリバビリン耐性ウイルスであってもよい。リバビリンは、複数のＲＮＡウイルスを攻撃する非常に有効な抗ウイルスである。以下は、リバビリン耐性を進化させたいくつかの重要なウイルスである。口蹄疫ウイルス：doi:10.1128/JVI.03594-13。ポリオウイルス: www.pnas.org/content/100/12/7289.full.pdf。Ｃ型肝炎ウイルス：jvi.asm.org/content/79/4/2346.full。肝炎およびＨＩＶウイルスなど、既存の抗ウイルス薬に耐性を進化させた複数の他の耐性ＲＮＡウイルス。Ｂ型肝炎ウイルス（ラミブジン、テノホビル、エンテカビル）： doi:10.1002/hep.22900。Ｃ型肝炎ウイルス（テラプレビル、ＢＩＬＮ２０６１、ＩＴＭＮ−１９１、ＳＣＨ６、ボセプレビル、ＡＧ−０２１５４１、ＡＣＨ−８０６）： doi:10.1002/hep.22549。ＨＩＶは多くの薬物耐性変異を持つ。さらなる情報についてはHIVdb.stanford.eduを参照のこと。薬物耐性の他に、本明細書で記載する本発明によるＣＲＩＳＰＲ系で標的することができる臨床に適切な変異が複数ある。例えば、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）の耐性対急性感染: doi:10.1073/pnas.1019304108；またはエボラの感染力の増強：http://doi.org/10.1016/j.cell.2016.10.014およびhttp://doi.org/10.1016/j.cell.2016.10.013。
マラリアの検出と監視
【０３５５】
マラリアは、プラスモジウム寄生虫によって引き起こされる蚊媒介病である。これらの寄生虫は、感染したメスのハマダラカに噛まれることで人々の間に広まっていく。プラスモジウム・ファルチパルム、プラスモジウム・ビバックス、プラスモジウム・オバーレ、プラスモジウム・マラリアエ、およびプラスモジウム・ノウレシという５つのプラスモジウム属がヒトのマラリアを引き越す。世界保健機関（ＷＨＯ）によれば、これらの中でもプラスモジウム・ファルチパルムとプラスモジウム・ビバックスが最も大きな脅威に関与する。Ｐ．ファルチパルムはアフリカ大陸で最も広まっているマラリア寄生虫で、地球上のマラリアに関連した死のほとんどに関与している。Ｐ．ビバックスは、サブサハラアフリカの外側のほとんどの国で優勢なマラリア寄生虫である。
【０３５６】
２０１５年、９１の国と地域でマラリアの伝染が発生した。最新のＷＨＯの見積もりによれば、２０１５年に２１２，０００，０００件のマラリア症例があり、死亡は４２９０００件であった。マラリアの伝染が広がった地域では、５歳以下の子どもが特に感染、発症、および死亡しやすく、マラリアによる総死亡数の３分の２（７０％）超がこの年齢群で起きていた。２０１０年〜２０１５年の間に５歳以下のマラリアによる死亡は世界で２９％減少した。しかしながら、マラリアは依然として５歳以下の子どもの主要な死亡原因であり、２分間ごとに一人の子どもの命を奪っている。
【０３５７】
ＷＨＯによって説明されるように、マラリアは急性の熱病である。免疫のない個体では、症状は感染性のある蚊に噛まれてから７日以上後に現れる。第一の症状である、発熱、頭痛、悪寒は中程度であることもあり、マラリアと認識しにくいが、２４時間以内に治療しなければＰ．ファルチパルムマラリアは重篤な病状に進行して死に至ることもある。
【０３５８】
重篤なマラリアに罹った子供は、以下の症状のうちの１つ以上を発症することが多い：ひどい貧血、代謝性アシドーシスに関連した呼吸困難、または脳マラリア。大人では多臓器合併症が見られることも多い。マラリアの流行地域では、人々は部分免疫を発達させていることもあり、無症状性感染を起こす。
【０３５９】
急速かつ効率的な診断試験の発達は公衆の健康に大きく関連する。実際、マラリアの早期診断と治療は、疾患を低減するだけでなく死亡を防ぐが、マラリア伝染を低減することにも寄与する。ＷＨＯの推奨によれば、治療を施す前にマラリアが疑われるすべての症例を寄生虫に基づく診断試験（特に高速診断試験）を用いて確認すべきである（２０１５年４月に公開された「ＷＨＯマラリア治療ガイドライン第三版」を参照のこと）。
【０３６０】
抗マラリア治療に対する耐性は、著しく治療方針を低下させる重要な健康問題である。実際、ＷＨＯのウェブサイトで報告されているように、Ｐ．ファルチパルムの前世代の医薬品（例えば、クロロキンおよびスルファドキシン／ピリメタミン（ＳＰ））に対する耐性は、１９５０年代および１９６０年代に広まり、マラリア制御の努力を損ない、子どもの生存に関する進歩を反転させた。従って、ＷＨＯは抗マラリア薬物耐性を常に監視することを推奨している。実際、正確な診断は、不適切な治療と抗マラリア医薬品の耐性の延長限度を回避する場合がある。
【０３６１】
２０１６年〜２０３０年のマラリアに対するＷＨＯ世界技術方策（２０１５年５月に世界保健総会で採択）の文脈では、すべてのマラリア流行国に対して技術的な枠組みが提供される。マラリアの制御と根絶に向かって協働するように地域および国のプログラムを導き支援することを意図している。この方策は野心的だが、達成可能な世界的目標が設定されている：
＊２０３０年までにマラリアの発生数を少なくとも９０％低減すること。
＊２０３０年までにマラリアの死亡率を少なくとも９０％低減させること。
＊２０３０年までに少なくとも３５カ国でマラリアを根絶すること。
＊マラリアのないすべての国でのマラリア再流行を防ぐこと。
【０３６２】
この方策は２年間に及ぶ広範囲の協議の結果であり、７０の加盟国から４００人以上の技術専門家の参加を含む。この方策は３つの主軸に基づく：
＊マラリアの予防、診断、および治療への普遍的手段を確実にすること；
＊根絶とマラリアのない状態の獲得に向かって努力を加速させること；および
＊マラリアの監視を核心部への介入に転換すること。
【０３６３】
プラスモジウムに対する治療は、キニーネまたはキニーネ誘導体などのアリールアミノアルコール類（例えば、クロロキン、アモジアキン、メフロキン、ピペラキン、ルメファントリン、プリマキン）；親油性ヒドロキシナフトキノン類縁体（例えば、アトバクオン）；抗葉酸塩薬物（例えば、スルファ薬物スルファドキシン、ダプソーン、およびピリメタミン）；プログアニル；アトバクオン／プログアニルの組合せ；アルテミシニン薬物）、およびこれらの組合せを含む。
【０３６４】
蚊媒介病原体の存在について診断に用いられる標的配列は、プラスモジウム、特にヒトに影響を及ぼすプラスモジウム属（例えば、プラスモジウム・ファルチパルム、プラスモジウム・ビバックス、プラスモジウム・オバーレ、プラスモジウム・マラリアエ、およびプラスモジウム・ノウレシ）の存在について診断に用いられる配列（これらのゲノム由来の配列を含む）を含む。
【０３６５】
プラスモジウム、特にヒトに影響を及ぼすプラスモジウム属（例えば、プラスモジウム・ファルチパルム、プラスモジウム・ビバックス、プラスモジウム・オバーレ、プラスモジウム・マラリアエ、およびプラスモジウム・ノウレシ）に対する治療の薬物耐性を監視するのに診断に用いられる標的配列。
【０３６６】
さらに、標的配列は、プラスモジウム寄生虫の重要な生物学的過程に関与するタンパク質をコードする標的分子／核酸分子を含む配列を含む。そのようなタンパク質としては、特に輸送タンパク質（例えば、薬物／代謝産物輸送ファミリー由来のタンパク質、基質転座に関与するＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）タンパク質（例えば、ＡＢＣトランスポーターＣサブファミリーまたはＮａ＋／Ｈ＋交換体、膜グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ））；葉酸塩経路に関与するタンパク質（例えば、ジヒドロプテロイン酸生成酵素、ジヒドロ葉酸塩還元酵素活性またはジヒドロ葉酸塩還元酵素−チミジル酸生成酵素）；およびミトコンドリア内膜に超えるプロトンの転移に関与するタンパク質、特にシトクロムｂ複合体が挙げられる。さらなる標的はまた、ヘムポリメラーゼをコードする１つまたは複数の遺伝子を含んでいてもよい。
【０３６７】
さらに、標的配列は、重要な生物学的過程に関与するタンパク質をコードする標的分子／核酸分子を含む。このようなタンパク質は、Ｐ．ファルチパルムクロロキン耐性輸送遺伝子（ｐｆｃｒｔ）、Ｐ．ファルチパルム多剤耐性トランスポーター１（ｐｆｍｄｒ１）、Ｐ．ファルチパルム多剤耐性関連タンパク質遺伝子（Ｐｆｍｒｐ）、Ｐ．ファルチパルムＮａ＋／Ｈ＋交換体遺伝子（ｐｆｎｈｅ）、Ｐ．ファルチパルム輸出タンパク質１をコードする遺伝子、Ｐ．ファルチパルムＣａ２＋輸送ＡＴＰアーゼ６（ｐｆａｔｐ６）；Ｐ．ファルチパルムジジヒドロプテロイン生成酵素（ｐｆｄｈｐｓ）、ジヒドロ葉酸塩還元酵素活性（ｐｆｄｈｐｒ）およびジヒドロ葉酸塩還元酵素−チミジル酸生成酵素（ｐｆｄｈｆｒ）遺伝子、シトクロムｂ遺伝子、ｇｔｐシクロヒドラーゼ、Ｋｅｌｃｈ１３（Ｋ１３）遺伝子、および他のプラスモジウム属の機能的異種遺伝子から選択されてもよい。
【０３６８】
多くの変異、特に単一点変異は、現在の治療の標的であり、特異的耐性表現型に関連付けられているタンパク質において同定されている。従って、本発明により、プラスモジウムなどの蚊媒介寄生虫の様々な耐性表現型を検出することができる。
【０３６９】
発明により、標的核酸／分子における１つ以上の変異、特に１つ以上の一塩基多型を検出することができる。従って、以下の変異のいずれか１つまたはその組合せを薬物耐性マーカーとして用いて、本発明によってその変異を検出してもよい。
【０３７０】
Ｐ．ファルチパルムＫ１３の単一点変異は、位置２５２、４４１、４４６、４４９、４５８、４９３、５３９、５４３、５５３、５６１、５６８、５７４、５７８、５８０、６７５、４７６、４６９、４８１、５２２、５３７、５３８、５７９、５８４、および７１９での単一点変異、特に変異Ｅ２５２Ｑ、Ｐ４４１Ｌ、Ｆ４４６Ｉ、Ｇ４４９Ａ、Ｎ４５８Ｙ、Ｙ４９３Ｈ、Ｒ５３９Ｔ、Ｉ５４３Ｔ、Ｐ５５３Ｌ、Ｒ５６１Ｈ、Ｖ５６８Ｇ、Ｐ５７４Ｌ、Ａ５７８Ｓ、Ｃ５８０Ｙ、Ａ６７５Ｖ、Ｍ４７６Ｉ；Ｃ４６９Ｙ；Ａ４８１Ｖ；Ｓ５２２Ｃ；Ｎ５３７Ｉ；Ｎ５３７Ｄ；Ｇ５３８Ｖ；Ｍ５７９Ｉ；Ｄ５８４Ｖ；およびＨ７１９Ｎを含む。これらの変異は、一般に、アルテミシニン薬物耐性表現型に関与する（アルテミシニンおよびアルテミシニン系併用療法耐性、２０１６年４月ＷＨＯ／ＨＴＭ／ＧＭＰ／２０１６．５）。
【０３７１】
Ｐ．ファルチパルムジヒドロ葉酸塩還元酵素(DHFR)(PfDHFR-TS, PFD0830w)では、重要な多型は、位置１０８、５１、５９、および１６４の変異、特にピリメタミンに対する耐性を調節する１０８Ｄ、１６４Ｌ、５１Ｉ、および５９Ｒを含む。他の多型もまた、スルファドキシンに対する耐性に関連付けられている４３７Ｇ、５８１Ｇ、５４０Ｅ、４３６Ａ、および６１３Ｓを含む。さらに観察されている変異は、Ｓｅｒ１０８Ａｓｎ、Ａｓｎ５１Ｉｌｅ、Ｃｙｓ５９Ａｒｇ、Ｉｌｅ１６４Ｌｅｕ、Ｃｙｓ５０Ａｒｇ、Ｉｌｅ１６４Ｌｅｕ、Ａｓｎ１８８Ｌｙｓ、Ｓｅｒ１８９ＡｒｇおよびＶａｌ２１３Ａｌａ、Ｓｅｒ１０８ＴｈｒおよびＡｌａ１６Ｖａｌを含む。変異Ｓｅｒ１０８Ａｓｎ、Ａｓｎ５１Ｉｌｅ、Ｃｙｓ５９Ａｒｇ、Ｉｌｅ１６４Ｌｅｕ、Ｃｙｓ５０Ａｒｇ、Ｉｌｅ１６４Ｌｅｕは特に、ピリメタミン系治療および／またはクロログアニン−ダプソーン併用療法耐性に関連付けられている。シクログアニル耐性は二重変異Ｓｅｒ１０８ＴｈｒおよびＡｌａ１６Ｖａｌに関連付けられているようである。ｄｈｆｒの増幅はまた、治療耐性、特にピリメタミン耐性に大きく関連する場合がある。
【０３７２】
Ｐ．ファルチパルムジジヒドロプテロイン生成酵素(DHPS)(PfDHPS, PF08_0095), 重要な多型は位置４３６、４３７、５８１および６１３での変異Ｓｅｒ４３６Ａｌａ／Ｐｈｅ、Ａｌａ４３７Ｇｌｙ、Ｌｙｓ５４０Ｇｌｕ、Ａｌａ５８１Ｇｌｙ、およびＡｌａ６１３Ｔｈｒ／Ｓｅｒを含む。位置５８１および／または６１３での多型は、スルファドキシン−ピリメタミン系治療に関連付けられている。
【０３７３】
Ｐ．ファルチパルムクロロキン耐性トランスポーター(PfCRT)では、位置７６の多型、特に変異Ｌｙｓ７６Ｔｈｒはクロロキンに対する耐性に関連付けられている。さらに、多型は、クロロキン耐性に関連付けられることがあるＣｙｓ７２Ｓｅｒ、Ｍｅｔ７４Ｉｌｅ、Ａｓｎ７５Ｇｌｕ、Ａｌａ２２０Ｓｅｒ、Ｇｌｎ２７１Ｇｌｕ、Ａｓｎ３２６Ｓｅｒ、Ｉｌｅ３５６Ｔｈｒ、およびＡｒｇ３７１Ｉｌｅを含む。ＰｆＣＲＴはまた、輸送活性あるいはタンパク質の特異性を調節することがある、残基Ｓ３３、Ｓ４１１およびＴ４１６でのリン酸化である。
【０３７４】
Ｐ．ファルチパルム多薬物耐性トランスポーター１(PfMDR1)(PFE1150w)では、位置８６、１８４、１０３４、１０４２での多型、特にＡｓｎ８６Ｔｙｒ、Ｔｙｒ１８４−Ｐｈｅ、Ｓｅｒ１０３４Ｃｙｓ、Ａｓｎ１０４２Ａｓｐ、およびＡｓｐ１２４６Ｔｙｒが同定されており、ルメファントリン、アルテミシニン、キニーネ、メフロキン、ハロファントリン、およびクロロキンに対する感受性に影響を及ぼすことが報告されている。また、ＰｆＭＤＲ１の増幅は、ルメファントリン、アルテミシニン、キニーネ、メフロキン、およびハロファントリンに対する感受性の低減と関連付けられており、ＰｆＭＤＲ１の脱増幅（deamplification）はクロロキン耐性を増加させる。また、ｐｆｍｄｒ１の増幅を検出してもよい。ＰｆＭＤＲ１のリン酸化反応状態もまた大きく関連している。
【０３７５】
Ｐ．ファルチパルム多薬物耐性関連タンパク質(PfMRP) (遺伝子基準PFA0590w)では、位置１９１および／または４３７（例えば、Ｙ１９１ＨおよびＡ４３７Ｓ）での多型が同定されており、クロロキン耐性表現型と関連付けられている。
【０３７６】
Ｐ．ファルチパルムＮＡ＋／Ｈ＋交換体(PfNHE) (ref PF13_0019)では、マイクロサテライトｍｓ４６７０でのＤＮＮＮＤの繰り返しの増加がキニーネ耐性に関するマーカーであってもよい。
【０３７７】
シトクロムｂｅ遺伝子(cytb, mal_mito_3)をコードするシトクロムｂタンパク質のユビキノール結合部位を変化させる変異はアトバクオン耐性と関連付けられている。位置２６、２６８、２７６、１３３、および２８０での変異、特にＴｙｒ２６Ａｓｎ、Ｔｙｒ２６８Ｓｅｒ、Ｍ１３３１、およびＧ２８０Ｄはアトバクオン耐性と関連づけられる場合がある。
【０３７８】
例えば、 P ．ビバックスでは、Pf MDR1の相同体であるＰｖＭＤＲ１の変異は、クロロキン耐性、特に位置９７６での多型、例えば変異Ｙ９７６Ｆと関連付けられている。
【０３７９】
上記の変異は、タンパク質配列の観点で規定されている。しかしながら、当業者は、ＳＮＰを含む対応する変異を決定して、核酸標的配列として同定することができる。
【０３８０】
例えば、以下の文献で記載されているように、他の同定された薬物耐性マーカーが当該分野で知られている：“Susceptibility of Plasmodium falciparum to antimalarial drugs（熱帯熱マラリア原虫の抗マラリア薬に対する感受性）(1996-2004)”; WHO; Artemisinin and artemisinin-based combination therapy resistance（アルテミシニンおよびアルテミシニンに基づく併用療法耐性）(April 2016 WHO/HTM/GMP/2016.5); “Drug-resistant malaria: molecular mechanisms and implications for public health（薬剤耐性マラリア：分子メカニズムと公衆衛生への影響）” FEBS Lett. 2011 Jun 6;585(11):1551-62. doi:10.1016/j.febslet.2011.04.042. Epub 2011 Apr 23. Review. PubMed PMID: 21530510。これらの全内容を参照により本明細書に組み込む。
【０３８１】
本発明によって検出され得るポリペプチドに対してして、本明細書で記載されるすべての遺伝子の遺伝子産物を標的として用いてもよい。これに対応して、そのようなポリペプチドを属の同定、分類、および／または薬物耐性の検出に用いてもよいことが想起される。
【０３８２】
特定の例示的な実施形態では、本明細書で開示されるシステム、装置、および方法は、例えば、対象者から得た生体試料などの試料中で１種以上の蚊媒介寄生虫を検出することに関する。特定の例示的な実施形態では、寄生虫は、以下の種、すなわちプラスモジウム・ファルチパルム、プラスモジウム・ビバックス、プラスモジウム・オバーレ、プラスモジウム・マラリアエ、またはプラスモジウム・ノウレシから選択されてもよい。従って、本明細書で開示される方法は、寄生虫種を素早く同定することが必要な寄生虫の存在および寄生虫形態（例えば、感染の様々な段階および寄生虫の生活環（例えば、外赤血球期、赤血球期、胞子形成期）であり、寄生虫形態は娘虫体、種虫、分裂体、生殖母体を含む）を監視する、特定の表現型（例えば、病原体の薬物耐性の検出、疾患の進行および／または大流行の監視、および治療（薬物）の選別を行う他の方法と共に他の方法（またはその組合せ）で用いられてもよい。さらに、マラリアの場合、噛まれて感染した後に長時間が経過していることがある。言い換えると、患者が症状を示さない長いインキュベーション期がある。同様に、予防的な治療は症状が現れるのを遅らせることがあり、長い無症状性期間が再発前に観察されることもある。そのような遅延により誤診断を引き起こしやすく、従って治療の有効性を損なうことがある。
【０３８３】
本明細書で開示される実施形態の高速かつ高感度な診断能、つまり、１ヌクレオチドの違いによる寄生虫の種類の検出およびＰＯＣ装置としての展開能により、本明細書で開示される実施形態を用いて治療計画（例えば、適切な治療過程の選択）を導いてもよい。また、本明細書で開示される実施形態を用いて寄生虫の存在および分類のために環境試料（蚊の集団など）を選別してもよい。また、実施形態を修飾して、蚊媒介寄生虫と他の蚊媒介病原体を同時に検出してもよい。場合によっては、マラリアおよび他の蚊媒介病原体はその初期に似たような症状を示すことがある。従って、感染の種類を素早く区別する能力は重要な治療決定を導く場合がある。マラリアと共に検出され得る他の蚊媒介病原体は、デング熱ウイルス、西ナイルウイルス、チクングニアウイルス、黄熱病ウイルス、フィラリアウイルス、日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ラクロス脳炎ウイルス、およびジカウイルスを含む。
【０３８４】
特定の例示的な実施形態では、本明細書で開示される装置、システム、および方法を用いて、試料中の複数の蚊媒介寄生虫種を区別してもよい。特定の例示的な実施形態では、同定は、１８Ｓ、１６Ｓ、２３Ｓ、および５Ｓサブユニットを含むリボソームＲＮＡ配列に基づいていてもよい。特定の例示的な実施形態では、同定は、ゲノム（例えば、ＣＹＴＢのようなミトコンドリアの遺伝子）の複数のコピーに存在する遺伝子配列に基づいていてもよい。特定の例示的な実施形態では、同定は、非常に発現および／または保存されたＧＡＰＤＨ、ヒストンＨ２Ｂ、エノラーゼ、またはＬＤＨなどである遺伝子の配列に基づいていてもよい。適切なｒＲＮＡ配列を同定する方法は米国特許出願公開第２０１７／００２９８７２号に開示されている。特定の例示的な実施形態では、１組のガイドＲＮＡは、種または株に固有な可変領域によってそれぞれの種を区別するように設計されていてもよい。ガイドＲＮＡはまた、属、科、目、綱、門、界、またはこれらの組合せで微生物を区別する標的ＲＮＡ遺伝子に対して設計されてもよい。増幅が用いられる特定の例示的な実施形態では、１組の増幅プライマーはリボソームＲＮＡ配列の隣接定常領域に対して設計され、ガイドＲＮＡは内部可変領域によって各種を区別するように設計されていてもよい。特定の例示的な実施形態では、プライマーおよびガイドＲＮＡはそれぞれ、１６Ｓサブユニットの保存された可変領域に対して設計されていてもよい。種または種の下位集合（例えば、ＲｅｃＡ遺伝子ファミリー、ＲＮＡポリメラーゼβサブユニット）に亘って固有に変化する他の遺伝子またはゲノム領域を用いてもよい。他の好適な系統発生マーカーおよびそれを同定する方法は、例えば、Wu et al. arXiv:1307.8690 [q-bio.GN]に記載されている。
【０３８５】
特定の例示的な実施形態では、種の同定は、ＣＹＴＢのようなミトコンドリアの遺伝子など、ゲノムの複数のコピーに存在する遺伝子に基づいていてもよい。特定の例示的な実施形態では、種の同定は、非常に発現および／または保存された遺伝子（例えば、ＧＡＰＤＨ、ヒストンＨ２Ｂ、エノラーゼ、またはＬＤＨ）に基づいて行われてもよい。
【０３８６】
特定の例示的な実施形態では、方法または診断は、複数の系統発生的量および／または表現型量に亘って同時に蚊媒介寄生虫を選別するように設計されている。例えば、前記方法または診断は、異なるガイドＲＮＡを持つ複数のＣＲＩＳＰＲ系の使用を含んでいてもよい。第一の組のガイドＲＮＡは、例えば、プラスモジウム・ファルチパルムとプラスモジウム・ビバックスを区別してもよい。これらの一般的な綱をさらに下位分割してもよい。例えば、ガイドＲＮＡを設計して、一般に、または特異的な薬物または薬物の組合せに関して薬物耐性株を区別する方法または診断で用いてもよい。第二の組のガイドＲＮＡは、種で微生物を区別するように設計されていてもよい。従って、すべての蚊媒介寄生虫の種または亜種を同定するマトリックスを作成して、薬物耐性によってさらに分割しもよい。上記は、単に例示目的である。蚊媒介寄生虫の他の種類を分類する他の手段もまた想起され、上記の一般構造に従う。
【０３８７】
特定の例示的な実施形態では、本明細書で開示される装置、システム、および方法を用いて、例えば、薬物耐性遺伝子など、対象の蚊媒介寄遺伝子を選別してもよい。ガイドＲＮＡは、既知の対象遺伝子を区別するように設計されていてもよい。従って、臨床試料を含む試料は、本明細書で開示される１種以上のそのような遺伝子を検出する実施形態を用いて選別されてもよい。ＰＯＣで薬物耐性を選別する能力は、適切な治療計画を選択する上で大きな利点となる。特定の例示的な実施形態では、薬物耐性遺伝子は、タンパク質をコードする遺伝子である。そのようなタンパク質としては、特に輸送タンパク質（例えば、薬物／代謝産物輸送ファミリー由来のタンパク質、基質転座に関与するＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）タンパク質（例えば、ＡＢＣトランスポーターＣサブファミリーまたはＮａ＋／Ｈ＋交換体））； 葉酸塩経路に関与するタンパク質（例えば、ジヒドロプテロイン酸生成酵素、ジヒドロ葉酸塩還元酵素活性またはジヒドロ葉酸塩還元酵素−チミジル酸生成酵素）；およびミトコンドリア内膜に亘るプロトンの転移に関与するタンパク質、特にシトクロムｂ複合体が挙げられる。さらなる標的はまた、ヘムポリメラーゼをコードする１つまたは複数の遺伝子を含んでいてもよい。特定の例示的な実施形態では、薬物耐性遺伝子は、Ｐ．ファルチパルムクロロキン耐性輸送遺伝子（ｐｆｃｒｔ）、Ｐ．ファルチパルム多剤耐性トランスポーター１（ｐｆｍｄｒ１）、Ｐ．ファルチパルム多剤耐性関連タンパク質遺伝子（Ｐｆｍｒｐ）、Ｐ．ファルチパルムＮａ＋／Ｈ＋交換体遺伝子（ｐｆｎｈｅ）、Ｐ．ファルチパルムＣａ２＋輸送ＡＴＰアーゼ６（ｐｆａｔｐ６）、Ｐ．ファルチパルムジジヒドロプテロイン生成酵素（ｐｆｄｈｐｓ）、ジヒドロ葉酸塩還元酵素活性（ｐｆｄｈｐｒ）およびジヒドロ葉酸塩還元酵素−チミジル酸生成酵素（ｐｆｄｈｆｒ）遺伝子、シトクロムｂ遺伝子、ｇｔｐシクロヒドラーゼ、Ｋｅｌｃｈ１３（Ｋ１３）遺伝子、および他のプラスモジウム属の機能的異種遺伝子から選択される。他の同定された薬物耐性マーカーは当該分野で知られており、例えば、以下に記載されている：“Susceptibility of Plasmodium falciparum to antimalarial drugs（抗マラリア薬に対するＰ．ファルチパルムの感受性） (1996-2004)”; WHO; Artemisinin and artemisinin-based combination therapy resistance（アルテミシニンおよびアルテミシニン系組合せ治療耐性） (April 2016 WHO/HTM/GMP/2016.5); “Drug-resistant malaria: molecular mechanisms and implications for public health（薬剤耐性マラリア分子機構および公衆衛生のための含意）” FEBS Lett. 2011 Jun 6;585(11):1551-62. doi:10.1016/j.febslet.2011.04.042.Epub 2011 Apr 23. Review. PubMed PMID: 21530510。その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０３８８】
態様によっては、本明細書で記載するＣＲＩＳＰＲ系、それを用いた検出システムまたは方法を用いて、蚊媒介寄生虫大流行の発生を決定してもよい。前記方法は、１つ以上の対象に由来する複数の試料から１種以上の標的配列を検出することを含んでいてもよい。ここで、前記標的配列は大流行を拡大あるいは引き起こす蚊媒介寄生虫に由来する配列である。そのような方法は、蚊媒介寄生虫パターンの伝染、または蚊媒介寄生虫によって引き起こされる疾患大流行に関与する機構を決定することをさらに含んでいてもよい。前記試料は１人以上のヒトに由来していてもよく、かつ／または１種以上の蚊に由来していてもよい。
【０３８９】
病原体の伝染パターンは、蚊媒介寄生虫の天然の供給源からの継続した新しい感染または他の伝染（例えば、蚊を介した）を含み、その後、天然の供給源からの単一感染または両方の混合となってもよい。一態様では、前記標的配列は、蚊媒介寄生虫ゲノムまたはその断片内の配列であることが好ましい。一態様では、蚊媒介寄生虫伝染のパターンは、蚊媒介寄生虫伝染の初期パターン、すなわち、蚊媒介寄生虫大流行の始まりである。大流行の始まりで蚊媒介寄生虫伝染のパターンを決定することは、できるだけ早い時間で大流行を停止させる尤度を高め、これによって地域的および国際的伝播の可能性を低減する。
【０３９０】
蚊媒介寄生虫伝染のパターンの決定は、本明細書で記載する方法による蚊媒介寄生虫配列を決定することを含んでいてもよい。病原体の伝染パターンの決定は、対象者で共有された蚊媒介寄生虫の配列の宿主内多様性を検出すること、および共有された宿主内多様性が時間的パターンを示すか否かを決定することをさらに含んでいてもよい。宿主内および宿主間多様性に見られるパターンは伝染および疫学について重要な洞察を与えてくれる(Gire, et al., 2014)。
【０３９１】
本明細書で開示される他の試料の種類に加えて、前記試料は１種以上の蚊に由来していてもよく、例えば、前記試料は蚊の唾液を含んでいてもよい。
バイオマーカーの検出
【０３９２】
特定の例示的な実施形態では、本明細書で開示されるシステム、装置、および方法は生体指標の検出に用いられてもよい。例えば、本明細書で開示されるシステム、装置、および方法は、ＳＮＰの検出および／または遺伝子型決定に用いられてもよい。本明細書で開示されるシステム、装置、および方法はまた、異常な遺伝子の発現によって特徴付けられた任意の疾患の状態または障害の検出に用いられてもよい。異常な遺伝子の発現は、発現した遺伝子、発現の位置、および発現量の異常を含む。他の疾患のうち、心臓血管、免疫異常、および癌に関連する複数の転写物またはタンパク質マーカーを検出してもよい。特定の例示的な実施形態では、本明細書で開示される実施形態を、肝線維症および拘束性拘束性／閉塞性肺疾患など溶解を含む疾患の無細胞ＤＮＡ検出に用いてもよい。特定の例示的な実施形態では、循環無細胞ＤＮＡの出産前試験用により高速で携帯性の高い検出に実施形態を用いてもよい。本明細書で開示される実施形態は、とりわけ、心臓血管の健康、脂質／代謝兆候、民族性同定、父系一致、ヒトの同定（例えば、犯罪データベースのＳＮＰ兆候と一致した被疑者）に関連付けられた異なるＳＮＰのパネルを選別するのに用いられてもよい。本明細書で開示される実施形態はまた、癌腫瘍に関連して放出される変異の無細胞ＤＮＡの検出に用いられてもよい。本明細書で開示される実施形態はまた、例えば、所与の肉製品において異なる動物源を素早く検出などにより肉の品質を検出するのに用いてもよい。本明細書で開示される実施形態はまた、遺伝子組換え生物（ＧＭＯ）またはＤＮＡに関連した遺伝子編集の検出に用いられてもよい。本明細書の他の箇所で記載されるように、密接に関連した遺伝子／アレルまたは生体指標（例えば、所与の標的配列における１ヌクレオチドのみの違いを有する）はｇＲＮＡに合成による不一致を導入することで区別されてもよい。
【０３９３】
一側面では、本発明は試料中の標的核酸を検出する方法に関する。前記方法は、
１つの試料または１組の試料を本明細書で記載する本発明によるＣＲＩＳＰＲ系を含む１つ以上の個別の容積に分配すること；
１種以上のガイドＲＮＡが１種以上の標的分子に結合することができる十分な条件で前記試料または前記１組の試料をインキュベートすること；
前記１種以上のガイドＲＮＡの１種以上の標的分子への結合によりＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を活性化させること（ここで、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を活性化させると、検出可能な陽性信号が生成されるようにＲＮＡ系マスキング構築物が修飾される）；および
検出可能な陽性信号を検出すること（ここで、検出可能な陽性信号の検出は、試料中に１種以上の標的分子が存在することを示す）を含む。
バイオマーカー試料の種類
【０３９４】
本明細書で記載するアッセイの感度は、様々な生体試料の種類（標的核酸が希釈されている、あるいは試料材料が限定されている試料の種類を含む）で標的核酸の検出によく適している。バイオマーカーの選別は、複数の試料の種類に対して行われてもよい。試料の種類は、これらに限定されないが、唾液、尿、血液、糞、唾液、および脳脊髄液を含む。また、本明細書で開示される実施形態を用いて遺伝子の上方および／または下方調節を検出してもよい。例えば、過剰発現している遺伝子のみがアッセイの検出限界閾値より高くなるように試料を連続希釈してもよい。
【０３９５】
特定の態様では、本発明は体液（例えば、、尿、血漿、血清、唾液、脳髄液）の試料を得る工程、およびＤＮＡを抽出する工程を提供する。検出対象の変異ヌクレオチド配列は大きい分子の画分でもよく、あるいは始めから個別の分子として存在していてもよい。
【０３９６】
特定の態様では、ＤＮＡは癌患者の血漿／血清から単離されている。新生物組織から単離されたＤＮＡ試料との比較のため、第二の試料を同じ患者の非新生物組織（例えば、リンパ球）から単離してもよい（対照）。非新生物組織は新生物組織と同じ種類のもの、あるいは異なる臓器源に由来するものであってもよい。特定の態様では、血液試料を採取して、すぐに血漿を遠心分離によって血液細胞から分離する。血清を濾過して、ＤＮＡを抽出するまで冷凍保存してもよい。
【０３９７】
特定の例示的な実施形態では、標的核酸は、生または未加工の試料（例えば、血液、血清、唾液、脳脊髄液、唾液、または尿）から直接検出される。特定の例示的な実施形態では、標的核酸は無細胞ＤＮＡである。
循環腫瘍細胞
【０３９８】
一態様では、循環細胞（例えば、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ））を本発明でアッセイしてもよい。本明細書で記載する方法の何れかで用いられる循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の単離を行ってもよい。特異的かつ高感度の検出と本発明で用いられてもよい循環細胞の捕捉を達成する例示的な技術は、(Mostert B, et al., Circulating tumor cells (CTCs): detection methods and their clinical relevance in breast cancer（循環腫瘍細胞（CTC）：乳がんにおける検出方法と臨床的関連性）. Cancer Treat Rev. 2009;35:463-474;およびTalasaz AH, et al., Isolating highly enriched populations of circulating epithelial cells and other rare cells from blood using a magnetic sweeper device（磁場掃引器を用いた血液からの非常に高濃度の循環上皮細胞およびその他の希な細胞の単離）. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009; 106:3970-3975)に記載されている。僅か１個のＣＴＣが１０５〜１０６個の末梢血単核球の背景で発見されることがある(Ross A A, et al., Detection and viability of tumor cells in peripheral blood stem cell collections from breast cancer patients using immunocytochemical and clonogenic assay techniques（免疫細胞化学およびクローン形成アッセイ技術を用いた乳癌患者からの末梢血幹細胞の採取における腫瘍細胞の検出と実行可能性）. Blood. 1993,82:2605-2610)。CellSearch（登録商標）プラットフォームは、抗体で被覆された免疫磁性ビーズを上皮細胞付着分子（ＥｐＣＡＭ）に対して用いてＥＰＣＡＭ発現上皮細胞を濃縮し、免疫染色してサイトケラチン染色の存在と白血球マーカーＣＤ４５の非存在を確認し、捕捉された赤色が上皮腫瘍細胞であることを確認する(Momburg F, et al., Immunohistochemical study of the expression of a Mr 34,000 human epithelium-specific surface glycoprotein in normal and malignant tissues（正常組織および悪性組織での34000人のヒト男性上皮特異的な表面糖タンパク質の発現についての免疫組織化学研究）. Cancer Res. 1987;47:2883-2891;およびAllard WJ, et al., Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant diseases（腫瘍細胞はすべての主要な癌の末梢血を循環しているが、非悪性疾患を持つ対象あるいは患者では循環していない）. Clin Cancer Res. 2004; 10:6897-6904)。捕捉された細胞の数は、病気が進行している乳癌癌患者、結腸直腸癌患者、および前立腺癌患者にとって予後の有意性があることが予め示された(Cohen SJ, et al., J Clin Oncol. 2008;26:3213-3221; Cristofanilli M, et al. N Engl J Med. 2004;351:781-791; Cristofanilli M, et al., J Clin Oncol. 2005;23: 1420-1430; and de Bono JS, et al. Clin Cancer Res. 2008; 14:6302-6309)。
【０３９９】
本発明はまた、ＣＴＣチップ技術でＣＴＣを単離することを提供する。ＣＴＣチップは、マイクロ流体ＣＴＣ捕捉装置であり、血液はＣＴＣが結合する抗ＥｐＣＡＭ抗体で被覆された数千個のマイクロポストを含むチャンバーを流れる(Nagrath S, et al. Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology（マイクロチップ技術による癌患者の希な循環腫瘍細胞の単離）. Nature. 2007;450: 1235-1239)。ＣＴＣチップは、CellSearch（登録商標）システムに比べてＣＴＣ計測量と純度を有意に増加させ(Maheswaran S, et al. Detection of mutations in EGFR in circulating lung-cancer cells（循環肺がん細胞のEGFRの変異の検出）, N Engl J Med. 2008;359:366-377)、両方のプラットフォームを下流の分子分析に用いてもよい。
無細胞クロマチン
【０４００】
特定の態様では、本発明によって無細胞クロマチン断片を単離して分析する。健康な個体および疾患の状態で苦しんでいる個体の血清中でヌクレオソームを検出してもよい(Stroun et al., Annals of the New York Academy of Sciences 906: 161-168(2000))。また、ヌクレオソームの血清濃度は、良性および悪性疾患（例えば、癌および自己免疫疾患）に罹っている患者でかなり高くなっている(Holdenrieder et al (2001) Int J Cancer 95, 1 14-120, Trejo-Becerril et al (2003) Int J Cancer 104, 663-668; Kuroi et al 1999 Breast Cancer 6, 361-364; Kuroi et al (2001) Int j Oncology 19, 143-148; Amoura et al (1997) Arth Rheum 40, 2217-2225; Williams et al (2001) J Rheumatol 28, 81-94)。何らかの理論に束縛されるわけではないが、腫瘍を患っている患者でヌクレオソームの濃度が高いのはアポトーシスに由来している。アポトーシスは増殖している腫瘍で自然に起こる。血液を循環するヌクレオソームは固有に修正されたヒストンを含む。例えば、米国特許公開第２００５／００６９９３１号（２００５年３月３１日）は、疾患の診断指示薬としての特異的なヒストンＮ末端修飾に向けられた抗体の使用に関する。この使用は、そのようなヒストン特異的抗体を用いて患者の血液または血清試料からヌクレオソームを単離して、診断／選別目的で付随するＤＮＡの精製および分析を容易にする。従って、本発明は、クロマチン結合ＤＮＡを用いて、例えば、腫瘍変異を検出および監視してもよい。修飾ヒストンに関連付けられたＤＮＡの同定は、疾患および先天性の欠陥の診断マーカーとして機能することができる。
【０４０１】
従って、他の実施形態では、単離されたクロマチン断片は循環クロマチン、好ましくは循環モノおよびオリゴヌクレオソームに由来する。単離されたクロマチン断片は生体試料に由来していてもよい。生体試料は、それを必要とする対象または患者に由来していてもよい。生体試料は血清、血漿、リンパ液、血液、血液画分、尿、滑液、髄液、唾液、循環腫瘍細胞、または粘液であってもよい。
無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）
【０４０２】
特定の態様では、本発明を用いて無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を検出してもよい。血漿または血清中の無細胞ＤＮＡは非侵襲性診断ツールとして用いられもよい。例えば、無細胞胎児のＤＮＡは、適合ＲｈＤ因子の試験、Ｘ連鎖潜性遺伝性疾患に関する性決定、一遺伝子障害試験、妊娠高血圧腎症の同定について研究および最適化されている。例えば、母親の血漿中の胎児の細胞画分のｃｆＤＮＡの配列決定は、胎児の染色体異数性に関連付けられるコピー数の変化を検出する信頼性の高い方法である。他の例として、癌患者から単離されたｃｆＤＮＡを用いて、治療の決定に関連する主要遺伝子の変異を検出する。
【０４０３】
特定の例示的な実施形態では、本開示は、患者試料から直接ｃｆＤＮＡを検出することを提供する。特定の他の例示的な実施形態では、本開示は標的ｃｆＤＮＡを検出する前に上で開示された濃縮に関する実施形態を用いてｃｆＤＮＡを濃縮することを提供する。
エキソソーム
【０４０４】
一態様では、本発明によりエキソソームをアッセイしてもよい。エキソソームは、ＲＮＡを含むことが示されている小さな細胞外小胞である。超遠心分離、ろ過、化学沈殿、サイズ排除クロマトグラフィー、およびマイクロ流体によるエキソソームの単離は当該分野で知られている。一態様では、エキソソーム生体指標を用いてエキソソームは精製される。生体試料由来のエキソソームの単離および精製は任意の既知の方法によって行ってもよい（例えばＷＯ２０１６１７２５９８Ａ１を参照のこと）。
ＳＮＰ検出および遺伝子型
【０４０５】
特定の態様では、本発明を用いて生体試料中の一塩基多型（ＳＮＰ）の存在を検出していてもよい。ＳＮＰは母性試験（例えば、性決定、胎児の欠陥）に関連していてもよい。これらは犯罪捜査に関連していてもよい。一態様では、犯罪捜査の被疑者は本発明によって同定されてもよい。何らかの理論に束縛されるわけではないが、核酸に基づく法医学的証拠は、試験する試料が限られていることがあるので、被疑者または被害者の遺伝子材料を検出するのに利用可能な最も高感度なアッセイを必要とすることがある。
【０４０６】
他の実施形態では、疾患に関連付けられたＳＮＰは本発明により包含される。疾患に関連付けられたＳＮＰは当該分野でよく知られており、当業者であれば、上記方法を用いて好適なガイドＲＮＡを設計することができる（例えば、www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar?term=human%5Borgn%5Dを参照のこと）。
【０４０７】
一側面では、本発明は、ＳＮＰ遺伝子型決定などの遺伝子型を決定する方法に関する。前記方法は、
１つの試料または１組の試料を本明細書で記載する本発明によるＣＲＩＳＰＲ系を含む１つ以上の個別の容積に分配すること；
前記１種以上のガイドＲＮＡが１種以上の標的分子に結合することができる十分な条件で前記試料または前記１組の試料をインキュベートすること；
前記１種以上のガイドＲＮＡの１種以上の標的分子への結合によりＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を活性化させること（ここで、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を活性化させると、検出可能な陽性信号が生成されるようにＲＮＡ系マスキング構築物が修飾される）；および
検出可能な陽性信号を検出すること（ここで、前記検出可能な陽性信号の検出は、試料中に特定の遺伝子型に固有の１種以上の標的分子が存在することを示す）を含む。
【０４０８】
特定の態様では、例えば、図６０の実施形態に示されるように、検出可能な信号は、（例えば、信号強度の比較により）１つ以上の基準信号、好ましくは合成基準信号と比較される。特定の態様では、基準は特定の遺伝子型である、あるいはそれに対応している。特定の態様では、基準は、特定のＳＮＰまたは他の（単一）ヌクレオチド多様性を含む。特定の態様では、基準は（ＰＣＲ増幅された）遺伝子型基準である。特定の態様では、基準はＤＮＡである、またはそれを含む。特定の態様では、基準はＲＮＡである、またはそれを含む。特定の態様では、基準は、ＤＮＡから転写されたＲＮＡである、またはそれを含む。特定の態様では、基準は、ＲＮＡから逆転写されたＤＮＡである、またはそれを含む。特定の態様では、検出可能な信号は、ＳＮＰまたは他の（単一）ヌクレオチド多様性など既知の遺伝子型にそれぞれ対応する１つ以上の基準と比較される。特定の態様では、検出可能な信号は１つ以上の基準信号と比較され、この比較は例えば、パラメトリックまたはノンパラメトリック統計分析（例えば、１元または２元配置分散分析など）による統計分析を含む。特定の態様では、検出可能な信号は１つ以上の基準信号と比較され、検出可能な信号が基準と（統計的に）大きく逸脱してない場合、遺伝子型は前記基準に対応する遺伝子型として決定される。
【０４０９】
他の実施形態では、本発明により、緊急薬理ゲノム学のための高速遺伝子型決定を可能にする。一態様では、一診療現場アッセイを用いて緊急治療室に運ばれた患者の遺伝子型を決定してもよい。患者は、血栓を持つと疑われる場合があり、救急医師は抗凝血剤の投与量を決定する必要がある。例示的な実施形態では、本発明は、ＶＫＯＲＣ１、ＣＹＰ２Ｃ９、およびＣＹＰ２Ｃ１９などのマーカーの遺伝子型決定に基づいて心筋梗塞または脳卒中の治療中に抗凝血剤の投与のための指針を提供してもよい。一態様では、抗凝血剤は抗凝血剤ワルファリンである(Holford, NH (December 1986). "Clinical Pharmacokinetics and Pharmacodynamics of Warfarin Understanding the Dose-Effect Relationship（投与量と効果の関係を理解するためのワルファリンの臨床薬物動態および薬理学）". Clinical Pharmacokinetics. Springer International Publishing. 11 (6): 483-504)。血栓に関連付けられた遺伝子は当該分野で知られている（例えば、米国２００６０１６６２３９Ａ１号; Litin SC, Gastineau DA (1995) "Current concepts in anticoagulant therapy（抗凝固治療における現在の概念）". Mayo Clin. Proc. 70 (3): 266-72; and Rusdiana et al., Responsiveness to low-dose warfarin associated with genetic variants of VKORC1, CYP2C9, CYP2C19, and CYP4F2 in an Indonesian population（インドネシア集団におけるVKORC1、CYP2C9、CYP2C19、およびCYP4F2の遺伝多様体と関連付けられる小投与量のワルファリンに対する応答性）. Eur J Clin Pharmacol. 2013 Mar;69(3):395-405)。具体的には、VKORC1 1639(または3673)一塩基多型では、共通の（「野生型」）ＧアレルがＡアレルで置換されている。Ａアレル（または「Ａハプロタイプ」）を持つ人々は、Ｇアレル（または「非Ａハプロタイプ」）を持つ人々よりもＶＫＯＲＣ１の産生が少ない。また、これら多様体の有病率は人種によって変動し、Ａアレルを持つのは白色人種の３７％、アフリカ系人種の１４％である。その最終結果は、血液凝固因子数の減少、従って血液凝固能の低下である。
【０４１０】
特定の例示的な実施形態では、患者のＳＮＰを検出するための遺伝子材料の利用可能性により、ＤＮＡまたはＲＮＡ試料を増幅せずにＳＮＰを検出することができる。遺伝子型決定の場合、試験される生体試料を容易に得ることができる。特定の例示的な実施形態では、本発明のインキュベーション時間を短くしてもよい。アッセイは、生じる酵素反応に必要な時間で行ってもよい。当業者であれば、５分間生化学反応（例えば、５分のライゲーション）を行ってもよい。本発明は、自動化ＤＮＡ抽出装置を用いて血液からＤＮＡを得てもよい。次いで、ＤＮＡを反応液に加えて、エフェクタータンパク質の標的分子を生成してもよい。標的分子の生成後すぐに、マスキング因子を切断して信号を検出してもよい。例示的な実施形態では、本発明により、薬物（例えば、抗凝血剤）を投与する前に遺伝子型を決定するＰＯＣ高速診断が可能になる。増幅工程が用いられる場合、すべての反応は１工程の過程で同じ反応で起こる。好ましい態様では、ＰＯＣアッセイは、１時間未満、好ましくは１０分、２０分、３０分、４０分、または５０分以内で行われてもよい。
【０４１１】
特定の態様では、本明細書で開示されるシステム、装置、および方法を用いて長い非コード領域ＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）の存在または発現量を検出してもよい。特定のｌｎｃＲＮＡの発現は疾患の状態および／または薬物耐性に関連付けられる。特に、特定のｌｎｃＲＮＡ（例えば、TCONS_00011252、NR_034078、TCONS_00010506、TCONS_00026344、TCONS_00015940、TCONS_00028298、TCONS_00026380、TCONS_0009861、TCONS_00026521、TCONS_00016127、NR_125939、NR_033834、TCONS_00021026、TCONS_00006579、NR_109890、および NR_026873）は癌治療に対する耐性、例えば、黒色腫（例えば、結節型黒色腫、悪性黒子、悪性黒子黒色腫、末端性黒子性黒色腫、表在拡大型黒色腫、粘膜黒色腫、ポリープ状黒色腫、線維形成性黒色腫、メラニン欠乏性黒色腫、および軟部組織黒色腫）を治療する１種以上のＢＲＡＦ阻害剤（例えば、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、ソラフェニブ、ＧＤＣ−０８７９、ＰＬＸ−４７２０、およびＬＧＸ８１８）に対する耐性と関連付けられる。本明細書で記載する様々な実施形態を用いてｌｎｃＲＮＡを検出すると、疾患の診断および／または治療の選択肢の選択を容易にすることがある。
【０４１２】
一態様では、特に、素早く治療を施すことが治療転帰に重要な場合、本発明はＤＮＡまたはＲＮＡ標的治療（例えば、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥ、ジンクフィンガータンパク質、ＲＮＡｉ）を導くことができる。
ＬＯＨの検出
【０４１３】
癌細胞は、正常細胞と比べて遺伝子材料（ＤＮＡ）の消失を被る。この遺伝子材料の欠失は「ヘテロ接合性の消失」（ＬＯＨ）と言われ、すべてではないとしてもほとんどすべての癌が被る。ヘテロ接合性の消失（ＬＯＨ）は、遺伝子全体および周囲の染色体領域での消失となる染色体全体の事象である。ヘテロ接合性の消失は癌に共通に出現し、消失領域で機能的腫瘍抑制遺伝子が存在しないことを示す場合がある。しかしながら、消失は沈黙している場合がある。というのは、染色体対の他方の染色体で１個の機能的遺伝子がまだ残っているからである。腫瘍抑制遺伝子の残りのコピーは、点変異によって不活性化されて、腫瘍抑制遺伝子の消失に繋がることがある。癌細胞由来の遺伝子材料の消失により、染色体の特定の座位での細胞生存率または細胞成長に不可欠な遺伝子の２つ以上のアレルの１つが選択可能に消失されてもよい。
【０４１４】
「ＬＯＨマーカー」はマイクロサテライト座位に由来するＤＮＡであり、正常細胞と比較して、欠失、変化、または増幅が癌あるいは他の疾患と関連付けられる。ＬＯＨマーカーはしばしば、腫瘍抑制遺伝子、または他の通常腫瘍に関連付けられる遺伝子に関連付けられる。
【０４１５】
用語「マイクロサテライト」は、ヒトゲノムに広く分配されているＤＮＡの短い反復配列を言う。マイクロサテライトは、２〜５ヌクレオチドの範囲の長さの縦列型反復（すなわち隣接）ＤＮＡモチーフ群であり、典型的には５〜５０回繰り返される。例えば、配列ＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡ（配列ＩＤ番号：４１８）は二ヌクレオチドマイクロサテライトであり、ＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣ（配列ＩＤ番号：４１９）は三ヌクレオチドマイクロサテライトである（ここで、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシン、Ｔはチミンである）。そのようなマイクロサテライトの反復長の体細胞変異は、腫瘍に固有の特徴を表していることが示されている。ガイドＲＮＡは、そのようなマイクロサテライトを検出するように設計されていてもよい。さらに、本発明を用いて、検出可能な信号の定量に基づいて反復長の変化、増幅および欠失を検出してもよい。特定のマイクロサテライトは、遺伝子の調節隣接領域またはイントロン領域に位置するか、あるいは遺伝子のコドンに直接位置する。そのような場合のマイクロサテライトの変異は、表現型の変化および疾患、特に脆弱性Ｘ症候群およびハンチントン病などのトリプレット（３個のヌクレオチドの組）リピート伸長病に繋がる場合がある。
【０４１６】
特定の染色体領域での頻繁なヘテロ接合性の消失（ＬＯＨ）は、多くの種類の悪性腫瘍で報告されている。特定の染色体領域でのアレル消失は、様々な悪性腫瘍で観察される最も共通した遺伝子変化であり、従って、マイクロサテライト分析を用いて体液由来の試料（例えば、肺癌では唾液、膀胱癌では尿）中の癌細胞のＤＮＡを検出している(Rouleau, et al. Nature 363, 515-521 (1993);およびLatif, et al. Science 260, 1317-1320 (1993))。また、可溶性ＤＮＡの濃度の著しい上昇が癌および他のいくつかの疾患を持つ個体の血漿中に見られるということが確率されている。これは、無細胞血清または血漿を用いてマイクロサテライトの異常により癌ＤＮＡを検出してもよいことを示している(Kamp, et al. Science 264, 436-440 (1994);およびSteck, et al. Nat Genet. 15(4), 356-362 (1997))。２つのグループは、小細胞肺癌または頭部および頸部癌を持つ限定された数の患者の血漿または血清中のマイクロサテライト変化を報告している(Hahn, et al. Science 271, 350-353 (1996);およびMiozzo, et al. Cancer Res. 56, 2285-2288 (1996))。腫瘍および黒色腫患者の血清でのヘテロ接合性の消失の検出はこれまでにも示されている（例えば、米国特許第６４６５１７７Ｂ１号）。
【０４１７】
従って、癌を患っている、あるいはその危険性がある対象者でＬＯＨマーカーを検出することは利点がある。本発明を用いて腫瘍細胞のＬＯＨを検出してもよい。一態様では、循環腫瘍細胞を生体試料として用いてもよい。好ましい態様では、血清または血漿から得た無細胞ＤＮＡを用いて、ＬＯＨを非侵襲的に検出および／または監視する。他の実施形態では、生体試料は本明細書で記載する任意の試料（例えば、膀胱癌では尿試料）であってもよい。何らかの理論に束縛されるわけではないが、本発明を用いて、任意の従来の方法と比べて向上した感度でＬＯＨマーカーを検出し、これによって変異事象の早期検出を行ってもよい。一態様では、体液中でＬＯＨが検出される。この場合、ＬＯＨの存在は癌の発生と関連付けられる。本明細書で記載する方法およびシステムは、癌に関連付けられた特定のアレルのＬＯＨを検出する非侵襲性で高速、かつ正確な方法を提供することで、ＰＣＲまたは組織生検材料などの従来の技術に比べて有意な利点を表している。従って、本発明は、危険性の高い集団を選別し、科学的予防、化学療法、免疫治療法、または他の治療を受けている危険性の高い患者を監視するのに用いてもよい方法およびシステムを提供する。
【０４１８】
本発明の方法は、血液などの体液からＤＮＡを抽出することのみを必要とするので、１人の患者で任意の時間、繰り返し行ってもよい。手術の前後、化学療法、放射線治療、遺伝子治療、または免疫治療法などの治療の前、最中、あるいは後、あるいは治療後に疾患の進行、安定性、または再発についてフォローアップ検査時に血液を採取して、ＬＯＨを監視してもよい。何らかの理論に束縛されるわけではないが、ＬＯＨマーカーは個々の患者の腫瘍に特異的であるので、本発明の方法を用いて、その患者に特異的なＬＯＨマーカーにより亜臨床的疾患の存在または再発を検出してもよい。前記方法はまた、腫瘍に特異的なＬＯＨマーカーを用いて複数の転移が存在するか否かを検出してもよい。
後成的修飾の検出
【０４１９】
癌または癌の進行を示すヒストン多様体、ＤＮＡ修飾、およびヒストン修飾を本発明で用いてもよい。例えば、米国特許公開第２０１４０２０６０１４号には、癌試料では健康な対象者に比べてヌクレオソームＨ２ＡＺ、マクロＨ２Ａ１．１、５−メチルシトシン、Ｐ−Ｈ２ＡＸ（Ｓｅｒ１３９）の量が上昇していることが記載されている。個体に癌細胞が存在すると、癌細胞のアポトーシスが増加した結果、血液中に無細胞ヌクレオソームが多く生成されることがある。一態様では、H2B Ser 14(P)など、アポトーシスに関連付けられたマークに対する抗体を用いて、アポトーシスによる新生物細胞から放出された単一ヌクレオソームを同定してもよい。従って、好ましくは、腫瘍細胞から生じたＤＮＡは、本発明によって高感度、高精度で分析されてもよい。
出生前選別
【０４２０】
特定の態様では、本発明の方法およびシステムは、出生前選別で用いられてもよい。特定の態様では、循環無細胞ＤＮＡは出生前選別方法で用いられる。特定の態様では、単一ヌクレオソームまたはオリゴヌクレオソームに関連付けられたＤＮＡを本発明で検出してもよい。好ましい態様では、単一ヌクレオソームまたはオリゴヌクレオソームで関連付けられたＤＮＡの検出は、出生前選別に用いられる。特定の態様では、無細胞クロマチン断片は出生前選別方法に用いられる。
【０４２１】
出生前診断または出生前選別は、生まれる前に胎児または胚の疾患あるいは状態を試験することを言う。この目的は、神経管欠損、ダウン症候群、染色体異常、遺伝性疾患、および他の病気（例えば、脊椎披裂、口蓋裂、テイ・サックス病、鎌状赤血球貧血、サラセミア、嚢胞性線維症、筋ジストロフィー、および脆弱Ｘ症候群）などの出生異常を検出することである。選別はまた、出生前性別鑑定に用いられてもよい。一般的な試験手順は羊水穿刺、項部透光性超音波を含む超音波検査、血清マーカー試験、または遺伝子選別を含む。場合によっては、試験は胎児を中絶するか否かを決定するために施されるが、医師および患者は危険度の高い妊娠を早期に診断して、新生児が適切な治療を受けられる専門病院で出産を計画することができるので有用であると見なしている。
【０４２２】
母親の血中に存在する胎児の細胞があること、これら細胞は出産前ＤＮＡ診断法用の胎児染色体の可能性のある供給源を表しているということが理解されている。また、胎児のＤＮＡは、母親の血液中の総ＤＮＡの約２〜１０％の範囲である。現在利用可能な出産前遺伝子試験は、一般的に侵襲性手順を含む。例えば、妊娠約１０〜１２週に妊婦に対して行われる絨毛膜絨毛採取（ＣＶＳ）および約１４〜１６週で行われる羊水穿刺はすべて、胎児の染色体異常試験用の試料を得るための侵襲性手順を含んでいる。これらの採取手順を経て得た胎児の細胞は、通常、細胞遺伝学的分析または蛍光その場ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）分析を用いて染色体異常について試験される。無細胞胎児のＤＮＡは、妊娠第６週という早期に妊婦の血漿および血清中に存在し、その濃度が妊娠中に上昇し、出産前にピークに達することが分かっている。これら細胞は妊娠の非常に早期に現れるので、正確な非侵襲性第一期検査の基礎をなし得る。何らかの理論に束縛されるわけではないが、本発明は、小量の胎児のＤＮＡを検出するこれまでにない感度を提供する。何らかの理論に束縛されるわけではないが、豊富な量の母親のＤＮＡは、一般に対象の胎児のＤＮＡと共に同時に回収され、従って胎児のＤＮＡの定量化および変異の検出での感度を低下させている。本発明は、アッセイの予期してなかった高感度によりそのような問題を克服する。
【０４２３】
Ｈ３クラスのヒストンは、主要型Ｈ３．１およびＨ３．２、置換型Ｈ３．３、および精巣特異的多様体Ｈ３ｔという４つの異なるタンパク質種からなる。Ｈ３．１とＨ３．２は密接に関連しているが、Ｓｅｒ９６でのみ異なっている。Ｈ３．１は少なくとも５アミノ酸位置でＨ３．３と異なっている。さらに、Ｈ３．１は、肝臓、腎臓、および心臓を含む大人の組織での存在と比べて胎児の肝臓に非常に豊富にある。大人のヒトの組織では、Ｈ３．３多様体はＨ３．１多様体よりも多いが、胎児の肝臓ではその反対である。本発明は、これらの違いを用いて、胎児の細胞と母親の細胞および／または胎児の核酸の両方を含む母親の生体試料中の胎児のヌクレオソームおよび胎児の核酸を検出してもよい。
【０４２４】
一態様では、胎児のヌクレオソームは血液から得てもよい。他の実施形態では、胎児のヌクレオソームは頸管粘液試料から得てもよい。特定の態様では、頸管粘液試料は、妊娠の第二期初期または第一期後期の妊婦を拭うまたは洗浄して得られる。試料をインキュベーターに入れて、粘液に捕捉されたＤＮＡを放出させてもよい。インキュベーターを３７℃に設定してもよい。試料を約１５〜３０分間揺らしてもよい。ＤＮＡを放出させる目的で粘液をムチナーゼでさらに溶解させてもよい。試料を化学処理や当該分野で既知の処理などの条件に曝して、アポトーシスを誘導し、胎児のヌクレオソームを放出させてもよい。従って、頸管粘液試料は、アポトーシスを誘導する因子によって処理されてもよく、これによって胎児のヌクレオソームが放出される。循環胎児ＤＮＡの濃縮については米国特許公開第２００７０２４３５４９号および２０１００２４００５４号を参照のこと。本発明は、少量の画分のヌクレオソームまたはＤＮＡのみが胎児由来のものである出生前選別に前記方法およびシステムを適用する際に特に利点がある。
【０４２５】
本発明による出産前選別は、これらに限定されないが、三染色体性１３、三染色体性１６、三染色体性１８、クラインフェルター症候群（４７、ＸＸＹ），（４７、ＸＹＹ）および（４７、ＸＸＸ）、ターナー症候群、ダウン症候群（三染色体性２１）、嚢胞性線維症、ハンチントン病、βサラセミア、筋剛直性ジストロフィー、鎌状赤血球性貧血、ポルフィリン症、脆弱Ｘ症候群、ロバートソン型転座、アンジェルマン症候群、ディジョージ症候群、およびウォルフ・ヒルシュホーン症候群を含む疾患用であってもよい。
【０４２６】
本発明のさらにいくつかの側面は、国立衛生研究所のウェブサイト（ウェブサイト：health.nih.gov/topic/Genetic Disorders）の見出し「遺伝子疾患」の下にさらに記載された広範囲の遺伝子疾患に関連付けられた欠陥を診断、予知、および／または治療することに関する。
癌および癌の薬剤耐性の検出
【０４２７】
特定の態様では、本発明を用いて、癌に関連付けられた遺伝子および変異を検出してもよい。特定の態様では、耐性に関連付けられた変異が検出される。治療中、腫瘍細胞のクロナール集団で耐性腫瘍細胞が増幅する、あるいは耐性変異が現れることがある（例えば、Burger JA, et al., Clonal evolution in patients with chronic lymphocytic leukaemia developing resistance to BTK inhibition（ＢＴＫ阻害耐性を発達させた慢性リンパ性白血病患者のクローン進化）. Nat Commun. 2016 May 20;7:11589; Landau DA, et al., Mutations driving CLL and their evolution in progression and relapse（ＣＬＬおよびその進行と再発における進化を駆動する変異）. Nature. 2015 Oct 22;526(7574):525-30; Landau DA, et al., Clonal evolution in hematological malignancies and therapeutic implications. Leukemia. 2014 Jan;28(1):34-43; and Landau DA, et al., Evolution and impact of subclonal mutations in chronic lymphocytic leukemia（慢性リンパ性白血病でのサブクロナール変異の進化と影響）. Cell. 2013 Feb 14;152(4):714-26を参照のこと）。従って、そのような変異を検出することは、非常に高感度なアッセイが必要であり、監視は生検材料の繰り返しが必要である。繰り返される生検は利便性が悪く、侵襲性でコストがかかる。耐性変異は、血液試料、または当該分野で知られた従来の方法を用いて他の非侵襲性的な方法で採取した生体試料（例えば、血液、唾液、尿）での検出が難しい場合がある。耐性変異は、化学療法、標的治療、または免疫治療法に対する耐性に関連付けられた変異を指す場合がある。
【０４２８】
特定の態様では、変異は個々の癌で起こり、癌の進行を検出するのに用いられてもよい。一態様では、腫瘍に対するＴ細胞細胞溶解活性に関する変異は、本発明によって特徴付けられており、検出してもよい（例えば、Rooney et al., Molecular and genetic properties of tumors associated with local immune cytolytic activity（局所免疫細胞溶解活性に関連付けられた腫瘍の分子的および遺伝子的特徴）, Cell. 2015 January 15; 160(1-2): 48-61）。個別治療は、これら変異の検出に基づいて開発されてもよい（例えば、ＷＯ２０１６１００９７５Ａ１を参照のこと）。特定の態様では、細胞溶解活性に関連付けられた癌に特異的な変異は、ＣＡＳＰ８、Ｂ２Ｍ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＳＭＣ１Ａ、ＡＲＩＤ５Ｂ、ＴＥＴ２、ＡＬＰＫ２、ＣＯＬ５Ａ１、ＴＰ５３、ＤＮＥＲ、ＮＣＯＲ１、ＭＯＲＣ４、ＣＩＣ、ＩＲＦ６、ＭＹＯＣＤ、ＡＮＫＬＥ１、ＣＮＫＳＲ１、ＮＦ１、ＳＯＳ１、ＡＲＩＤ２、ＣＵＬ４Ｂ、ＤＤＸ３Ｘ，ＦＵＢＰ１、ＴＣＰ１１Ｌ２、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、またはＣ、ＣＳＮＫ２Ａ１、ＭＥＴ、ＡＳＸＬ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２、ＡＬＯＸ１２Ｂ、およびＡＬＯＸ１５Ｂからなる群より選択される遺伝子の変異、または染色体全体の事象を除く、染色体バンド６ｑ１６．１−ｑ２１、６ｑ２２．３１−ｑ２４．１、６ｑ２５．１−ｑ２６、７ｐ１１．２−ｑ１１．１、８ｐ２３．１、８ｐ１１．２３−ｐ１１．２１（ＩＤＯ１、ＩＤＯ２を含む）、９ｐ２４．２−ｐ２３（ＰＤＬ１、ＰＤＬ２を含む）、１０ｐ１５．３、１０ｐ１５．１−ｐ１３、１１ｐ１４．１、１２ｐ１３．３２−ｐ１３．２、１７ｐ１３．１（ＡＬＯＸ１２Ｂ、ＡＬＯＸ１５Ｂを含む）、および２２ｑ１１．１−ｑ１１．２１の何れかに影響を及ぼすコピー数増加であってもよい。
【０４２９】
特定の態様では、治療の途中または完了後に本発明を用いて癌変異（例えば、耐性変異を検出する。本発明の感度により、治療中に生じたクロナール変異の非侵襲性検出が可能になり、疾患の再発を検出することができる。
【０４３０】
特定の例示的な実施形態では、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）のおよび／または異なるように発現したｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡの特徴の検出を用いて癌の進行を検出または監視し、かつ／または癌治療に対する薬物耐性を検出してもよい。一例として、Nadal et al. (Nature Scientific Reports, (2015) doi:10.1038/srep12464)にはｍＲＮＡの特徴が記載されており、これらを用いて非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を検出してもよい。
【０４３１】
特定の例示的な実施形態では、治療計画の決定に細胞のクロナール部分母集団に耐性変異が存在することを用いてもよい。他の実施形態では、共通の腫瘍変異に基づいて患者を治療する個別治療を施してもよい。特定の態様では、共通の変異は、治療に応答して発生して薬物耐性に繋がる。特定の態様では、本発明を用いて変異を獲得した細胞あるいはそのような薬物耐性変異を宿している細胞の増幅について患者を監視してもよい。
【０４３２】
様々な化学療法薬、特にチロシンキナーゼ阻害剤などの標的治療薬による治療は、治療の活性に抵抗する標的分子において新たな変異に繋がることが多い。例えば、これら変異によって影響を受けない第二世代の治療薬の開発、および複数の薬剤による治療（耐性変異の下流に作用するものを含む）など、この耐性を克服する複数の方策が評価されている。一例示的な実施形態では、ブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）を標的してＣＬＬおよび特定のリンパ腫に対して用いられる分子であるイブルチニブに対する共通の変異は、位置４８１（ＢＴＫ／Ｃ４８１Ｓ）でのシステインからセリンへの変化である。上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）のチロシンキナーゼドメインを標的するエルロチニブは一般に肺癌の治療に用いられるが、常に治療の後に耐性腫瘍が発達する。耐性クローンで見られる共通の変異は、位置７９０でのトレオニンからメチオニンへの変異である。
【０４３３】
癌患者の集団で共有された沈黙していない変異と本発明で検出され得る共通の耐性変異は当該分野で知られている（例えば、ＷＯ／２０１６／１８７５０８を参照のこと）。特定の態様では、薬物耐性変異はイブルチニブ、エルロチニブ、イマチニブ、ゲフィチニブ、クリゾチニブ、トラスツズマブ、ベムラフェニブ，ＲＡＦ／ＭＥＫ、免疫チェックポイント阻害療法、または抗エストロゲン治療での治療により誘導されることがある。特定の態様では、癌に特異的な変異は、プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１），アンドロゲン受容体（ＡＲ）、ブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）、上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＢＣＲ−Ａｂｌ、ｃ−キット、ＰＩＫ３ＣＡ、ＨＥＲ２、ＥＭＬ４−ＡＬＫ、ＫＲＡＳ、ＡＬＫ，ＲＯＳ１、ＡＫＴ１、ＢＲＡＦ、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＮＲＡＳ，ＲＡＣ１、およびＥＳＲ１からなる群より選択されるタンパク質をコードする１個以上の遺伝子に存在する。
【０４３４】
免疫チェックポイントは、免疫反応を遅らせ、かつ停止させ、免疫細胞の制御されていない活性から過剰な組織損傷を防ぐ阻害経路である。特定の態様では、標的される免疫チェックポイントは、プログラム死−１（ＰＤ−１またはＣＤ２７９）遺伝子（ＰＤＣＤ１）である。他の実施形態では、標的される免疫チェックポイントは細胞毒性Ｔリンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ−４）である。さらなる実施形態では、標的される免疫チェックポイントは、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ４  Ｉｇスーパーファミリー（例えば、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３、ＩＣＯＳ、ＰＤＬ１、またはＫＩＲ）のうちの他のものである。さらなる実施形態では、標的される免疫チェックポイントは、ＴＮＦＲスーパーファミリー（例えば、ＣＤ４０、ＯＸ４０，ＣＤ１３７、ＧＩＴＲ，ＣＤ２７、またはＴＩＭ−３）のうちの１つである。
【０４３５】
最近、腫瘍での遺伝子の発現およびそれらの微小環境が１細胞レベルで特徴付けられている（例えばTirosh, et al. Dissecting the multicellular ecosystem of metastatic melanoma by single cell RNA-seq（１細胞RNAシークセンシングによる転移性メラノーマの多細胞生態系の分析）. Science 352, 189-196, doi:10.1126/science.aad0501 (2016)); Tirosh et al., Single-cell RNA-seq supports a developmental hierarchy in human oligodendroglioma（１細胞RNA配列はヒトの乏突起膠腫の発達階層を支持する）. Nature. 2016 Nov 10;539(7628):309-313. doi : 10.1038/nature20123. Epub 2016 Nov 2; and 国際特許公報WO2017004153 A1を参照のこと）。特定の態様では、本発明を用いて遺伝子の特徴を検出してもよい。一態様では、腫瘍微小環境で補体遺伝子が監視または検出される。一態様では、ＭＩＴＦおよびＡＸＬプログラムが監視または検出される。一態様では、腫瘍に特異的な幹細胞または前駆細胞の特徴が検出される。そのような特徴は、免疫応答の状態および腫瘍の状態を示している。特定の態様では、増殖、治療に対する耐性、および免疫細胞の豊富さに関する腫瘍の状態が検出されてもよい。
【０４３６】
従って、特定の実施形態では、本発明は、腫瘍ＤＮＡなどの循環ＤＮＡ用、特に、疾患の再発または共通の耐性変異の発達を監視する低コストの高速多重癌検出パネルを提供する。
免疫治療の適用
【０４３７】
本明細書で開示される実施形態はまた、さらなる免疫治療法の文脈で有用な場合がある。例えば、実施形態によっては、対象者の免疫応答を診断、予期、および／または段階分けする方法は、第一の発現量、活性および／または１つ以上の生体指標の機能を検出すること、および検出量を対照量と比較することを含む。ここで、検出量と対照量の差は、対象者に免疫応答があることを示している。
【０４３８】
特定の態様では、本発明を用いて、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の機能障害または活性化を決定してもよい。既知の方法を用いてＴＩＬを単離してもよい。ＴＩＬを分析して、それらを養子細胞移入治療に用いるか否かを決定してもよい。また、対象者に投与する前にキメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）を機能障害または活性化の特徴について分析してもよい。機能障害および活性化Ｔ細胞の例示的な特徴が記載されている（例えば、Singer M, et al., A Distinct Gene Module for Dysfunction Uncoupled from Activation in Tumor-Infiltrating T Cells（腫瘍浸潤リンパ球における活性化から切り離された機能不全のための個別遺伝子モジュール）. Cell. 2016 Sep 8;166(6):1500-1511.e9. doi: 10.1016/j.cell.2016.08.052を参照のこと）。
【０４３９】
態様によっては、Ｃ２ｃ２を用いて免疫細胞、例えば、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋Ｔ細胞）の状態を評価してもよい。特に、例えば、１つ以上のＴ細胞の状態に関連付けられた遺伝子または遺伝子の特徴に基づいてＴ細胞活性化および／または機能障害を決定してもよい。このように、ｃ２ｃ２を用いて、１つ以上の部分母集団のＴ細胞の存在を決定してもよい。
【０４４０】
態様によっては、Ｃ２ｃ２を診断アッセイに用いてもよく、あるいは患者に免疫治療法または他の種類の治療を施すのが好適か否かを決定する方法として用いてもよい。例えば、遺伝子または生体指標特徴の検出は、ｃ２ｃ２によって行われて、患者が所与の治療に反応しているか否か、あるいはそれはＴ細胞機能障害によるものか否かを決定してもよい。そのような検出は、患者が受けられる最も適した治療の種類に関して有益である。例えば、患者が免疫治療法を受けるか否か。
【０４４１】
態様によっては、本明細書で開示されるシステムおよびアッセイにより、治療（例えば、養子細胞移入（ＡＣＴ）治療）に対する患者の応答が細胞機能障害によるものか、その場合、生体指標の特徴に亘って上方調節および下方調節の量によって問題を処理することができるか否か、臨床医が同定することができる。例えば、ＡＣＴを受けている患者が反応しない場合、ＡＣＴの一部として投与された細胞を本明細書で開示されるアッセイによりアッセイして、細胞活性化および／または機能障害状態と関連付けられることが分かっている生体指標の特徴の発現の相対量を決定してもよい。特定の阻害受容体または分子がＡＣＴ細胞で上方調節されている場合、患者をその受容体または分子の阻害剤で治療してもよい。特定の促進受容体または分子がＡＣＴ細胞で下方調節されている場合、患者をその受容体または分子の作動薬で治療してもよい。
【０４４２】
特定の例示的な実施形態では、本明細書で記載するシステム、方法、および装置を用いて、特定の細胞種、細胞表現型、または細胞の状態を同定する遺伝子の特徴を選別してもよい。同様に、圧縮センシングなどの方法を用いることで、本明細書で開示される実施形態を用いてトランスクリプトームを検出してもよい。いくつかの遺伝子の発現量が他の遺伝子の発現量を予測するように遺伝子発現データを高次に構造化する。遺伝子の発現データが高次に構造化されているという知見により、システムの自由度の数が小さくなると仮定することができる。これによって、相対的な遺伝子の豊富さの算出基礎が確実に疎になる。いくつかの生物学的に動機付けされた仮定をすることが可能であり、それによって遺伝子が相互作用していることについて何の特定の知識がなくてもアンダーサンプリングして、本出願人は非線形の相互作用関係を回復することができる。特に、本出願人が遺伝子の相互作用が低ランク、疎、またはこれらの組合せと仮定した場合、自由度の真の数が完全な組合せ拡張に対して小さい。これによって、本出願人は相対的小さい数の摂動を伴う完全な非線形ランドスケープを推測することができる。これら仮定によって、行列完成および圧縮センシングの分析理論を用いてアンダーサンプリングした組合せ摂動実験を設計してもよい。また、カーネル学習フレームワークを用いて、任意の個々の相互作用係数を直接学習せずに組合せ摂動の予測機能を構築することでアンダーサンプリングを採用してもよい。圧縮センシングは、包括的な遺伝子発現プロファイルを得るために検出対象の最少数の標的転写物を同定する方法を提供する。圧縮センシング法は、２０１６年１０月２７日に提出されたＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５９２３０号（“Systems and Methods for Determining Relative Abundances of Biomolecules（バイオ分子の相対量を決定するシステムおよび方法）”）に開示されており、その内容を参照により本明細書に組み込む。圧縮センシングなどの方法を用いて最少の転写物標的の組を同定する場合、対応する１組のガイドＲＮＡを設計して前記転写物を検出してもよい。従って、特定の例示的な実施形態では、細胞の遺伝子発現プロファイルを得る方法は、本明細書で開示される実施形態を用いて、１個の細胞または集団の細胞の遺伝子発現プロファイルを提供する最少の転写物の組を検出することを含む。
核酸がタグ付けされたものを検出する
【０４４３】
あるいは、本明細書で記載する実施形態を用いて核酸識別子を検出してもよい。核酸識別子は、特定の項目を同定するのに用いてもよい非コード領域核酸である。例示的な核酸識別子（例えば、ＤＮＡウォーターマーク（watermark））は、Heider and Barnekow. “DNA watermarks: A proof of concept（ＤＮＡウォーターマーク：概念の実証）” BMC Molecular Biology 9:40 (2008)に記載されている。また、核酸識別子は核酸バーコードであってもよい。核酸系バーコードは、関連付けられる分子（例えば、標的分子および／または標的核酸）の識別子として用いられるヌクレオチドの短い配列（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはこれらの組合せ）である。核酸バーコードは、長さが少なくとも、例えば、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ヌクレオチドであってもよく、一本鎖または二本鎖の形態であってもよい。１つ以上の核酸バーコードを標的分子および／または標的核酸に結合、すなわち「タグ付け」してもよい。この結合は、直接的（例えば、バーコードの標的分子への共有または非共有結合による結合）であってもよく、あるいは間接的（例えば、特定の結合因子（例えば抗体（あるいは他のタンパク質）など、追加の分子を介して）あるいはバーコード受容アダプター（または他の核酸分子）を介して）であってもよい。標的分子および／または標的核酸を組み合わせて（核酸バーコード鎖状中間体など）複数の核酸バーコードで標識してもよい。典型的には、核酸バーコードを用いて、特定の区画（例えば、個別の容積）に由来する、特定の物性（例えば、親和性、長さ、配列など）を持つ、あるいは特定の治療条件を被るものとして標的分子および／または標的核酸を同定する。標的分子および／または標的核酸は複数の核酸バーコードに関連付けられて、これらの特徴（およびそれ以上）のすべてについて情報を提供してもよい。核酸バーコードを生成する方法は、例えば、国際特許出願公開第ＷＯ／２０１４／０４７５６１に開示されている。
酵素
【０４４４】
本願は、ＲＮＡ切断および検出という異なる用途に特に好適な強固な活性を示すＣ２ｃ２の相同分子種をさらに提供する。これらの用途は本明細書で記載する用途を含むが、これらに限定されない。より特定には、試験された他のものよりも強い活性を持つことが示された相同分子種は、生物レプトトリキア・ウェイディイ（ＬｗＣ２ｃ２）から同定されたＣ２ｃ２相同分子種である。従って、本願は、対象の標的座位を修飾する方法を提供する。前記方法は、Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質、特に本明細書で記載されたように活性が高められたＣ２ｃ２エフェクタータンパク質、および１種以上の核酸成分を含む天然に存在しない、すなわち遺伝子操作された組成物を前記座位に送達することを含む。ここで、少なくとも前記１種以上の核酸成分は遺伝子操作されており、複合体を対象の標的に向ける。前記エフェクタータンパク質は前記１種以上の核酸成分と複合体を形成し、前記複合体は対象の標的座位に結合している。特定の実施形態では、対象の標的座位はＲＮＡを含む。本願は、ＲＮＡ配列に特異的な干渉、ＲＮＡ配列に特異的な遺伝子調節、ＲＮＡまたはＲＮＡ生成物、ｌｉｎｃＲＮＡ、非コード領域ＲＮＡ、核内ＲＮＡ、またはｍＲＮＡの選別、突然変異生成、蛍光その場ハイブリダイゼーション、あるいは繁殖における、活性が高められたＣｃ２エフェクタータンパク質の使用をさらに提供する。
【０４４５】
本明細書で開示される実施形態はまた、側流アッセイを用いて行われてもよい。そのようなアッセイは米国特許仮特許出願第６２／５６８，３０９；６２／６１０，１４４号および６２／６２３，５２９号、およびGootenberg et al. (Science doi:10.1126/science.aaq0179(2018))に開示されている。
【０４４６】
さらに、本発明の実施形態は、以下の番号付けした段落に記載される。
１．エフェクタータンパク質および対応する標的分子に結合するように設計された１種以上のガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ系；および
ＲＮＡ系マスキング構築物を含む、核酸検出システム。
２．エフェクタータンパク質、トリガーＲＮＡに結合するように設計された１種以上のガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ系；
ＲＮＡ系マスキング構築物；および
マスクされたＲＮＡポリメラーゼプロモーター結合部位またはマスクされたプライマー結合部位を含む１種以上の検出アプタマー含む、ポリペプチド検出システム。
３．核酸増幅試薬をさらに含む、段落１または２のシステム。
４．前記標的分子は標的ＤＮＡであり、前記システムは標的ＤＮＡに結合し、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むプライマーをさらに含む、段落１のシステム。
５．前記ＣＲＩＳＰＲ系エフェクタータンパク質はＲＮＡ標的エフェクタータンパク質である、段落１〜４の何れか一項に記載のシステム。
６．前記ＲＮＡ標的エフェクタータンパク質は１つ以上のＨＥＰＮドメインを含む、段落５のシステム。
７．前記１つ以上のＨＥＰＮドメインはＲｘｘｘｘＨモチーフ配列を含む、段落６のシステム。
８．前記ＲｘｘｘＨモチーフはＲ｛Ｎ／Ｈ／Ｋ］Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｈ配列を含む、段落７のシステム。
９．Ｘ１はＲ、Ｓ、Ｄ、Ｅ、Ｑ、Ｎ、Ｇ、またはＹであり、Ｘ２は独立してＩ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＬであり、Ｘ３は独立してＬ，Ｆ、Ｎ、Ｙ、Ｖ、Ｉ、Ｓ、Ｄ、Ｅ、またはＡである、段落８のシステム。
１０．前記ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ標的エフェクタータンパク質はＣ２ｃ２である、段落１〜９の何れか一項に記載のシステム。
１１．前記ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ標的エフェクタータンパク質はＣ２ｃ２である、段落６のシステム。
１２．前記Ｃ２ｃ２は２０ｋｂのＣａｓ１遺伝子である、段落１１のシステム。
１３．前記Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質は、レプトトリキア、リステリア、コリネバクター、サッテレーラ、レジオネラ、トレポネーマ、フィリファクター、ユウバクテリウム、ストレプトコッカス、乳酸桿菌、マイコプラズマ、バクテロイデス、フラビイボラ、フラボバクテリウム、スフェロケタ、アゾスピリルム、グルコナセトバクター、ナイセリア、ロゼブリア、パルビバクラム、スタフィロコッカス、ニトラチフラクター、マイコプラズマ、カンピロバクター、およびラクノスピラからなる群より選択される属の生物に由来する、段落１２のシステム。
１４．前記Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質は、レプトトリキア・シャーイイ；レプトトリキア・ウェイディイ（Ｌｗ２）；リステリア・シーリゲリ；ラクノスピラ科細菌ＭＡ２０２０；ラクノスピラ科細菌ＮＫ４Ａ１７９；［クロストリジウム属］アミノフィラムＤＳＭ  １０７１０；カーノバクテリウム・ガリナルムＤＳＭ  ４８４７；カーノバクテリウム・ガリナルムＤＳＭ  ４８４７（第二のＣＲＩＳＰＲ座位）；パルディバクター・プロピオニシゲネスＷＢ４；リステリア・ウェイヘンステファネンシスＦＳＬ  Ｒ９−０３１７；リステリア科細菌ＦＳＬ  Ｍ６−０６３５；レプトトリキア・ウェイディイＦ０２７９；ロドバクター・カプスラータＳＢ  １００３；ロドバクター・カプスラータＲ１２１；ロドバクター・カプスラータＤＥ４４２；レプトトリキア・ブッカーリスＣ−１０１３−ｂ；ヘルビニックス・ヘミセルロシリィティカ；［ユウバクテリウム］レクターレ；ユーバクテリウム科細菌ＣＨＫＣＩ００４；ブラウティア・マルセイユ−Ｐ２３９８種；およびレプトトリキア・オーラルタクソン８７９種Ｆ０５５７株からなる群より選択される生物由来である、段落１３のシステム。さらに１２個の非限定的な例として、ラクノスピラ科細菌ＮＫ４Ａ１４４；クロロフレクサス・アグレガンス；デメキナ・アウランティアカ；タラソスピラＴＳＬ５−１種；シュードブチリビブリオＯＲ３７種；ブチリビブリオＹＡＢ３００１種；ブラウティア・マルセイユ−Ｐ２３９８；レプトトリキア・マルセイユ−Ｐ３００７種；バクテロイデス・イフアエ；ポリフィロモナス科細菌ＫＨ３ＣＰ３ＲＡ；リステリア・リパリア；およびインソリティスピリルム・ペレグリヌムがある。
１５．前記Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質は、Ｌ．ウェイディイＦ０２７９またはＬ．ウェイディイＦ０２７９（Ｌｗ２）Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質である、段落１４のシステム。
１６．前記ＲＮＡ系マスキング構築物は検出可能な陽性信号の生成を抑制する、段落１〜１５の何れか一項に記載のシステム。
１７．前記ＲＮＡ系マスキング構築物は、前記検出可能な陽性信号をマスキングするか、あるいはその代わりに検出可能な陰性信号を生成することで検出可能な陽性信号の生成を抑制する、段落１６のシステム。
１８．前記ＲＮＡ系マスキング構築物は、レポート構築物によってコードされる遺伝子産物の生成を抑制するサイレンシングＲＮＡを含み、前記遺伝子産物は発現すると検出可能な陽性信号を生成する、段落１６のシステム。
１９．前記ＲＮＡ系マスキング構築物は、前記検出可能な陰性信号を生成するリボザイムであり、前記検出可能な陽性信号は前記リボザイムが失活すると生成される、段落１６のシステム。
２０．前記リボザイムは基質を第一の色に変換し、前記基質は前記リボザイムが失活すると第二の色に変わる、段落１９のシステム。
２１．前記ＲＮＡ系マスキング因子はＲＮＡアプタマーであり、かつ／またはＲＮＡ結合阻害剤である、段落１６のシステム。
２２．前記アプタマーまたはＲＮＡ結合阻害剤は酵素を隔離し、基質に作用することで前記酵素は前記アプタマーまたはＲＮＡ結合阻害剤から放出される際に検出可能な信号を生成する、段落２１のシステム。
２３．前記アプタマーは、酵素を阻害して、前記酵素が基質からの検出可能な信号の生成を触媒することを防ぐ阻害性アプタマーであり、前記ＲＮＡ結合阻害剤は酵素を阻害して、前記酵素が基質からの検出可能な信号の生成を触媒することを防ぐ、段落２１のシステム。
２４．前記酵素はトロンビン、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、または仔ウシアルカリホスファターゼである、段落２３のシステム。
２５．前記酵素はトロンビンであり、前記基質はトロンビンに対してペプチド基質に共有結合したパラニトロアニリドであるか、トロンビンに対してペプチド基質に共有結合した７−アミノ−４−メチルクマリンである、段落２４のシステム。
２６．前記アプタマーは、前記アプタマーから放出されると結合して検出可能な信号を生成する１対の因子を隔離する、段落２１のシステム。
２７．前記ＲＮＡ系マスキング構築物は、検出可能なリガンドおよびマスキング成分が付加されるＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む、段落１６のシステム。
２８．前記ＲＮＡ系マスキング構築物は架橋分子によって凝集体中で保持されるナノ粒子を含み、前記架橋分子の少なくとも一部はＲＮＡを含み、前記溶液は前記ナノ粒子が溶液中で分配されると色が変化する、段落１６のシステム。
２９．前記ナノ粒子はコロイド金属である、段落２８のシステム。
３０．前記コロイド金属はコロイド金である、段落２９のシステム。
３１．前記ＲＮＡ系マスキング構築物は、結合分子によって１つ以上の消光分子に結合されて量子ドットを含み、前記結合分子の少なくとも一部はＲＮＡを含む、段落１６のシステム。
３２．前記ＲＮＡ系マスキング構築物は、挿入剤と複合したＲＮＡを含み、前記挿入剤は前記ＲＮＡが切断されると吸光度が変化する、段落１６のシステム。
３３．前記挿入剤はピロニン−Ｙまたはメチレンブルーである、段落３２のシステム。
３４．前記検出可能なリガンドは蛍光色素分子であり、前記マスキング成分は消光分子である、段落１６のシステム。
３５．前記マスキング構築物は、グアニン四重鎖形成配列に結合するように設計されたＲＮＡオリゴヌクレオチドを含み、グアニン四重鎖構造は前記マスキング構築物が切断されると前記グアニン四重鎖形成配列によって形成され検出可能な陽性信号を生成する、段落１６のシステム。
３６．対応する標的分子に結合するように設計された前記１種以上のガイドＲＮＡは、合成による不一致を含む、段落１〜３５の何れか一項に記載のシステム。
３７．前記不一致は前記標的分子のＳＮＰまたは他の一塩基多様性の上流または下流にある、段落３６に記載のシステム。
３８．前記ガイドＲＮＡの合成による不一致または一塩基多様性は前記スペーサーの位置３、４、５、または６、好ましくは位置３にある、段落３６または３７の検出システム。
３９．前記ガイドＲＮＡの合成による不一致は、前記スペーサーの位置１、２、３、４、５、６、７、８、または９、好ましくは位置５にある、段落３６〜３８の何れか一項に記載の検出システム。
４０．前記合成による不一致は、前記ガイドＲＮＡのＳＮＰまたは他の一塩基多様性の１、２、３、４、または５ヌクレオチド、好ましくは２ヌクレオチド上流または下流にある、段落３６〜３９の何れか一項に記載の検出システム。
４１．前記ガイドＲＮＡは、野生型スペーサーに対して切断されたスペーサーを含む、段落３６〜４０の何れか一項に記載の検出システム。
４２．前記ガイドＲＮＡは、２８未満のヌクレオチド、好ましくは２０〜２７ヌクレオチド（その範囲の両端を含む）を含むスペーサーを含む、段落４１の検出システム。
４３．ガイドＲＮＡは、２０〜２５ヌクレオチドまたは２０〜２３ヌクレオチド、好ましくは２０または２３ヌクレオチドからなるスペーサーを含む、段落４２の検出システム。
４４．前記１種以上のガイドＲＮＡは、標的ＲＮＡまたはＤＮＡの一塩基多型を検出する、あるいはＲＮＡ転写物の多様体をスプライシングするように設計されている、段落１〜４３の何れか一項に記載の検出システム。
４５．試料中のウイルスを検出する方法であって、
段落１〜４４の何れか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ系を含む１つ以上の個別の容積に１つの試料または１組の試料を分配すること；
前記１種以上のガイドＲＮＡが１種以上の標的分子に結合することができる十分な条件で前記試料または前記１組の試料をインキュベートすること；
前記１種以上のガイドＲＮＡの１種以上の標的分子への結合によりＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を活性化させること（ここで、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を活性化させると、検出可能な陽性信号が生成されるようにＲＮＡ系マスキング構築物が修飾される）；および
前記検出可能な陽性信号を検出すること（ここで、前記検出可能な陽性信号の検出は前記試料中に１種以上のウイルスが存在することを示す）を含む、方法。
４６．前記試料は２種類以上のウイルスを含み、前記方法は前記２種類以上のウイルスを区別する、段落４５の方法。
４７．前記ガイドＲＮＡは前記１種以上のウイルスの一塩基多様体を検出する、段落４５または４６の方法。
４８．前記ガイドＲＮＡは、１つ以上の合成による不一致を含む、段落４７の方法。
４９．前記１つ以上のＣＲＩＳＰＲ系のガイドＲＮＡは、それぞれ１組のウイルス中のウイルスおよび／またはウイルス株を検出する汎用ウイルスガイドＲＮＡの組を含む、段落４５〜４７の何れか一項に記載の方法。
５０．前記ガイドＲＮＡは集合被覆法を用いて生成される、段落４９の方法。
５１．ウイルスを検出する方法であって、
段落１〜３６の何れか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ系を試料に曝すこと；
前記１種以上のガイドＲＮＡを前記１種以上の微生物に特異的な標的ＲＮＡまたは１種以上のトリガーＲＮＡに結合させることで検出可能な陽性信号が生成されるように前記ＲＮＡエフェクタータンパク質を活性化すること；および
前記検出可能な陽性信号を検出すること（ここで、前記検出可能な陽性信号の検出は前記試料中に１種以上のウイルスが存在することを示す）を含む、方法。
５２．前記ＣＲＩＳＰＲ系は基質の表面にあり、前記基質は前記試料に曝されている、段落５１の方法。
５３．同じまたは異なるＣＲＩＳＰＲ系が前記基質の複数の個別の位置に塗布される、段落５２の方法。
５４．同じまたは異なるＣＲＩＳＰＲ系が前記基質の複数の個別の位置に塗布される、段落５３の方法。
５５．前記基質は柔軟性材料の基質である、段落５２〜５４の何れか一項に記載の方法。
５６．前記柔軟性材料の基質は紙の基質、布の基質、または柔軟性重合体の基質である、段落５５の方法。
５７．前記異なるＣＲＩＳＰＲ系はそれぞれの位置で異なる微生物を検出する、段落５４の方法。
５８．前記基質は、採取する流体に前記基質を一時的に浸す、試験する流体を前記基質に塗布する、あるいは試験する表面を前記基質と接触させることにより受動的に前記試料に曝される、段落５５の方法。
５９．前記試料は生物学的試料または環境試料である、段落５８の方法。
６０．前記環境試料は、食品試料、飲料試料、紙の表面、布の表面、金属の表面、木材の表面、プラスチックの表面、土壌試料、淡水試料、排水試料、生理食塩水試料、大気または他の気体試料に曝したもの、またはそれらの組合せから得られる、段落５９の方法。
６１．前記生体試料は、組織試料、唾液、血液、血漿、血清、糞便、尿、唾液、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、腹水、胸水、血清腫、膿、あるいは皮膚または粘膜表面の拭い液から得られる、段落５９の方法。
６２．前記環境試料または生体試料は生の試料であり、かつ／または前記１種以上の標的分子は前記方法を適用する前に前記試料から精製または増幅されていない、段落５９〜６１の何れか一項に記載の方法。
６３．ウイルス性疾患の大流行および／または進行を監視する方法であって、
段落１〜３６の何れか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ系を試料に曝すこと；
検出可能な陽性信号が生成されるように非同義ウイルス変異を含む１種以上の標的分子に前記１種以上のガイドＲＮＡを結合させることによりＲＮＡエフェクタータンパク質を活性化させること；および
前記検出可能な陽性信号を検出すること（ここで、前記検出可能な陽性信号の検出は、前記試料中に存在するウイルスの種類を示す）を含む、方法。
６４．前記ＣＲＩＳＰＲ系を曝すことは、１種以上のＣＲＩＳＰＲ系を１つ以上の個別の容積内に配置すること、および試料または試料の一部を前記１つ以上の個別の容積に加えることを含む、段落６３の方法。
６５．ウイルス抗原および／またはウイルスに特異的な抗体について試料を選別する方法であって、
段落２〜３６の何れか一項のＣＲＩＳＰＲ系を試料に曝すこと（ここで、前記１種以上のアプタマーは１種以上のウイルス抗原または１種以上のウイルスに特異的な抗体に結合し、前記アプタマーは、前記１種以上のアプタマーが結合する前記１種以上のウイルス抗原または１種以上のウイルスに特異的な抗体を同定するバーコードをコードし、前記ガイドＲＮＡは前記バーコードを検出するように設計されている）；
前記１種以上のガイドＲＮＡを前記１種以上の微生物に特異的な標的ＲＮＡまたは１種以上のトリガーＲＮＡに結合させることで検出可能な陽性信号が生成されるように前記ＲＮＡエフェクタータンパク質を活性化すること；および
前記検出可能な陽性信号を検出すること（ここで、前記検出可能な陽性信号の検出は、前記試料中に１種以上のウイルス抗原または１種以上のウイルスに特異的な抗体が存在することを示す）ことを含む、方法。
６６．前記ウイルスはＤＮＡウイルスである、段落４５〜６５の何れか一項に記載の方法。
６７．前記ＤＮＡウイルスは、マイオウイルス科、ポドウイルス科、サイフォウイルス科、アロヘルペスウイルス科、ヘルペスウイルス科（ヒトヘルペスウイルス、および水痘帯状疱疹ウイルスを含む）、マロコヘルペスウイルス科、リポスリクスウイルス科，ルディウイルス科、アデノウイルス科、アンプラウイルス、アスコウイルス科、アスファウイルス科（アフリカ豚コレラウイルスを含む）、バキュロウイルス科、シカウダウイルス科（Cicaudaviridae）、クラバウイルス科（Clavaviridae）、コルチコウイルス科（Corticoviridae）、フセロウイルス科、ロブロウイルス科、グッタウイルス科、ヒトロサウイルス科、イリドウイルス科、マセイレウイルス科（Maseilleviridae）、ミミウイルス科、ヌディウイルス科、ニマウイルス科、パンドラウイルス科、パピローマウイルス科、フィコドナウイルス科、プラズマウイルス科、ポリドナウイルス科、ポリオーマウイルス科（シミアンウイルス４０、ＪＣウイルス、ＢＫウイルスを含む）、ポックスウイルス科（牛痘および天然痘を含む）、スファエロリポウイルス科（Sphaerolipoviridae）、テクティウイルス科、ツリウイルス科（Turriviridae）、ディノドナウイルス（Dinodnavirus）、サルテロプロウイルス（Salterprovirus）、リジドウイルス（Rhizidovirus）、またはこれらの組合せである、段落６６の方法。
６８．前記ウイルス感染は二本鎖ＲＮＡウイルス、プラス鎖ＲＮＡウイルス、マイナス鎖ＲＮＡウイルス、レトロウイルス、またはこれらの組合せによって生じる、段落４５〜６５の何れか一項に記載の方法。
６９．前記ウイルスはコロナウイルス科ウイルス、ピコルナウイルス科ウイルス、カリシウイルス科ウイルス、フラビウイルス科ウイルス、トガウイルス科ウイルス、ボルナウイルス科、フィロウイルス科、パラミクソウイルス科、ニューモウイルス亜科、ラブドウイルス科、アレナウイルス科、ブニヤウイルス科、オルトミクソウイルス科、またはデルタウイルスである、段落６８の方法。
７０．前記ウイルスはコロナウイルス、ＳＡＲＳ、ポリオウイルス、ライノウイルス、Ａ型肝炎、ノーウォークウイルス、黄熱ウイルス、西ナイルウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、デング熱ウイルス、ジカウイルス、風疹ウイルス、ロスリバーウイルス、シンドビスウイルス、チクングニアウイルス、ボルナ病ウイルス、エボラウイルス、マールブルウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ニパウイルス、ヘンドラウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ヒト呼吸器多核体ウイルス、狂犬病ウイルス、ラッサウイルス、ハンタウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、インフルエンザ、またはＤ型肝炎ウイルスである、段落６８の方法。
７１．試料中の１種以上の微生物を検出する方法であって、
試料を段落１〜４４の何れかによる核酸検出システムに接触させること；および
前記接触させた試料を側流免疫クロマトグラフアッセイにかけることを含む、方法。
７２．前記核酸検出システムは、第一の分子および第二の分子を含むＲＮＡ系マスキング構築物を含み、前記側流免疫クロマトグラフアッセイは、好ましくは横型フローストリップ表面の個別の検出部位で前記第一の分子および第二の分子を検出することを含む、段落７１による方法。
７３．前記第一の分子および前記第二の分子は、前記第一または第二の分子を認識する抗体に結合することで検出され、前記結合分子を好ましくはサンドイッチ抗体により検出する、段落７２による方法。
７４．前記横型フローストリップは、前記第一の分子に向けられた上流の第一の抗体、および前記第二の分子に向けられた下流の第二の抗体を含み、前記標的核酸が前記試料中に存在しない場合は未切断のＲＮＡ系マスキング構築物が前記第一の抗体と結合し、前記標的核酸が前記試料中に存在する場合は切断されたＲＮＡ系マスキング構築物が前記第一の抗体と前記第二の抗体に結合する、段落７２または７３による方法。
７５．ウイルスを検出する方法であって、
試料を対象者から得ること（ここで、前記試料は尿、血清、血液、または唾液である）；
前記試料ＲＮＡを増幅すること；
前記試料を、エフェクタータンパク質、対応するウイルスに特異的な標的分子に結合するように設計された１種以上のガイドＲＮＡ、およびＲＮＡ系マスキング構築物と混合すること；
前記１種以上のガイドＲＮＡを前記１種以上のウイルスに特異的な標的分子に結合させることで前記ＲＮＡエフェクタータンパク質を活性化すること（ここで、前記ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を活性化させると、検出可能な陽性信号が生成されるように前記ＲＮＡ系マスキング構築物が修飾される）；および
前記信号を検出すること（ここで、前記信号の検出は前記ウイルスが存在することを示す）ことを含み、
前記方法は、前記試料からＲＮＡを抽出する工程を含まない、方法。
７６．前記増幅工程は、２時間、１時間、３０分間、２０分間、および１０分間からなる群より選択される継続時間である、段落７５の方法。
７７．前記検出工程は、３時間、２時間、１時間、３０分間、２０分間、および１０分間からなる群より選択される継続時間である、段落７５の方法。
７８．検出に必要な試料の容積は１００μｌ〜１μｌである、段落７５の方法。
７９．前記ウイルスはジカウイルスである、段落７５の方法。
８０．前記試料は２種類以上のウイルスを含み、前記２種類以上のウイルスを区別する、段落７５の方法。
８１．前記ＲＮＡ系マスキング構築物は含む、段落７５の方法。
［実施例］
実施例１  一般試験規約
【０４４７】
ＤＮＡおよびＲＮＡに関するＣ２ｃ２診断試験を行う方法が２つある。この試験規約はまた、検出アプタマーの送達後にタンパク質検出多様体と共に用いてもよい。１つ目の方法は、増幅とＣ２ｃ２検出を別々に行う２工程の反応である。２つ目の方法はすべてを１つの反応で結合させ、これを２工程の反応と言う。なお、重要なのは、濃度の高い試料は増幅する必要がない場合があるということである。増幅を組み込まない個別のＣ２ｃ２試験規約を有するのは利点である。
【表１０】
2020513815.tif 000024
【０４４８】
反応緩衝液は４０ｍＭのトリスＨＣｌ、６０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ：７．３である。
【０４４９】
この反応を３７℃で２０分から３時間行う。励起：４８５ｎｍ／２０ｎｍ、発光：５２８ｎｍ／２０ｎｍで読み出す。始まりから２０分後に１分子感度の信号を検出してもよいが、もちろん、反応時間が長いほど感度は高くなる。
２工程反応：
【表１１】
2020513815.tif 000025
【０４５０】
この反応液を混合して、２本から３本の管の冷凍乾燥酵素混合物を再懸濁させる。この混合物に２８０ｍＭのＭｇＡｃを５μＬ添加して、反応を開始する。１０〜２０分、反応を行う。各反応液は２０μＬであるので、５回までの反応に十分な量である。
【表１２】
2020513815.tif 000026
【０４５１】
反応緩衝液は４０ｍＭのトリスＨＣｌ、６０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ：７．３である。
【０４５２】
２０分〜３時間これを行う。１分子感度で調べるための最低検出時間は約２０分である。長く反応を行うだけで感度を高められる。
【表１３】
2020513815.tif 000027
【０４５３】
参照したNEBキットは、HighScribe T7 High Yieldキットである。緩衝液を再懸濁するため１．５倍の濃度で用いる。３本の管の冷凍乾燥基質を５９μＬの緩衝液に再懸濁させて、上記の混合物中で用いる。各反応液は２０μＬであるので、５回の反応に十分な量である。この反応液で１分子感度は３０〜４０分で観測された。
実施例２  レプトトリキア・ウェイディイ由来のＣ２Ｃ２はＤＮＡとＲＮＡの非常に高感度で特異的な検出を媒介する
【０４５４】
高速かつ低コストの高感度核酸検出により、医療現場での病原体の検出、遺伝子型決定、疾患の監視を補助してもよい。ＲＮＡガイドＲＮＡ標的ＣＲＩＳＰＲエフェクターＣａｓ１３ａ（かつてはＣ２ｃ２として知られていた）は、標的を認識すると手当たり次第にＲＮＡ分解酵素活性（「副次効果」）を発揮する。Ｃａｓ１３ａのこの副次効果を等温増幅と組み合わせてＣＲＩＳＰＲ系診断（ＣＲＩＳＰＲ−Ｄｘ）を確立し、アトモル感度と１塩基の不一致による特異性でＤＮＡまたはＲＮＡの高速検出を提供する。このＣａｓ１３ａに基づく分子検出プラットフォームＳＨＥＲＬＯＣＫ（Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing＝特定高感度酵素レポーターアンロッキング）を用いてジカウイルスおよびデング熱ウイルスの特定の株を検出する、病原性細菌、遺伝子型ヒトＤＮＡを区別する、無細胞腫瘍ＤＮＡ変異を同定する。さらに、コールドチェーンに依存せず長期保存するためＳＨＥＲＬＯＣＫ反応試薬を凍結乾燥してもよく、野外での用途で容易に紙の表面で再構成してもよい。
【０４５５】
持ち運び可能なプラットフォームで高感度と１塩基の特異性で核酸を高速に検出する能力により、疾患の診断および監視、疫学的作業および一般の研究室での作業を補助してもよい。核酸を検出する方法は存在する（１−６）が、これらは感度、特異性、簡便さ、コスト、および速度の間で妥協がある。クラスター化短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）およびＣＲＩＳＰＲ関連（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ）適応免疫系は、ＣＲＩＳＰＲ系診断法（ＣＲＩＳＰＲ−Ｄｘ）の成果を上げるために用いてもよいプログラム可能なエンドヌクレアーゼを含む。Ｃａｓ酵素によってはＤＮＡを標的する（７、８）が、単体エフェクターＲＮＡ誘導ＲＮＡ分解酵素（例えば、Ｃａｓ１３ａ（かつてはＣ２ｃ２として知られていた）（８）はCRISPR RNA (crRNA)（９〜１１）で再プログラムして特異的ＲＮＡセンシングのためのプラットフォームを提供してもよい。ＲＮＡ標的を認識すると、活性化されたＣａｓ１３ａは近くの非標的ＲＮＡの「副次（collateral）」切断に従事する（１０）。このｃｒＲＮＡでプログラム化された副次切断活性によって、Ｃａｓ１３ａは、生体内でプログラム細胞死を誘発することにより（１０）、または生体外で標識ＲＮＡの非特異的な分解により（１０、１２）特異的なＲＮＡの存在を検出することができる。ここで、標的のリアルタイム検出を可能にする（図１７）核酸増幅および商業レポーターＲＮＡ（１２）の３Ｃａｓ１３ａ媒介副次切断に基づくアトモル感度での生体外核酸検出プラットフォームＳＨＥＲＬＯＣＫ（Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing＝特定高感度酵素レポーターアンロッキング）について記載する。

方法
Ｃ２ｃ２座位のクローニングおよび発現させるタンパク質
【０４５６】
細菌による生体内効率アッセイとして、レプトトリキア・ウェイディイＦ０２７９およびレプトトリキア・シャーイイ由来のＣ２ｃ２タンパク質を哺乳類の発現に対してコドン最適化された遺伝子として注文し（Genscript、中国江蘇省）、β−ラクタマーゼを標的する、あるいは標的しないスペーサーの何れかに隣接する対応する直列反復配列と共にｐＡＣＹＣ１８４主鎖にクローニングした。スペーサーの発現はＪ２３１１９プロモーターによって駆動された。
【０４５７】
タンパク質を精製するため、哺乳類コドン最適化Ｃ２ｃ２タンパク質をタンパク質精製様細菌性発現ベクターにクローニングした（６倍のHis/Twin Strep SUMO、Ilya Finkelsteinから寄贈されたｐＥＴ系発現ベクター）。
細菌による生体内Ｃ２ｃ２効率アッセイ
【０４５８】
ＬｗＣ２ｃ２およびＬｓｈＣ２ｃ２生体内効率プラスミドおよび上記のβ−ラクタマーゼプラスミド（Abudayyeh 2016）をそれぞれ９０ｎｇと２５ｎｇでNovaBlue Singles適格細胞（Millipore）に共形質転換した。形質転換後、細胞の希釈液をアンピシリンおよびクロラムフェニコールＬＢ寒天プレートに加えて、３７℃で一晩インキュベートした。翌日コロニーを数えた。
核酸標的およびｃｒＲＮＡの調製
【０４５９】
核酸標的をKAPA Hifi Hot Start (Kapa Biosystems)でＰＣＲ増幅し、ゲルを抽出し、MinEluteゲル抽出キット(Qiagen)を用いて精製した。HiScribe T7 Quick High Yield RNA合成キット(New England Biolabs)を用いて精製したｄｓＤＮＡを３０℃で一晩、Ｔ７ポリメラーゼと共にインキュベートし、ＲＮＡをMEGAclear Transcription Clean-upキット(Thermo Fisher)で精製した。
【０４６０】
ｃｒＲＮＡの調製のため、Ｔ７プロモーター配列を添付した構築物をＤＮＡとして注文した (Integrated DNA Technologies)。ｃｒＲＮＡ  ＤＮＡを短いＴ７プライマー（最終濃度：１０ｕＭ）にアニールし、HiScribe T7 Quick High Yield RNA合成キット(New England Biolabs)を用いてＴ７ポリメラーゼと共に３７℃で一晩インキュベートした。反応容積に対してビーズが２倍の比率でRNAXP洗浄ビーズ(Beckman Coulter)を用いて、さらに１．８倍のイソプロピルアルコール(Sigma)を補充してｃｒＲＮＡを精製した。
ＮＡＳＢＡ等温増幅
【０４６１】
[Pardee 2016]にＮＡＳＢＡ反応の詳細が記載されている。２０μＬの総反応容積に対して、６．７μＬの反応緩衝液(Life Sciences, NECB-24)、３．３μＬのヌクレオチド混合物(Life Sciences, NECN-24)、０．５μＬのヌクレアーゼを含まない水、０．４μＬの１２．５ＭのＮＡＳＢＡプライマー、０．１ｕＬのＲＮＡ分解酵素阻害剤(Roche, 03335402001)、および４μＬのＲＮＡ増幅産物（陰性対照の場合は水）を４℃で合わせて、６５℃で２分、４１℃で１０分インキュベートした。次いで、５μＬの酵素混合物(Life Sciences, NEC-1-24)を各反応液に加えて、反応混合物を４１℃で２時間インキュベートした。用いたＮＡＳＢＡプライマーは５’−ＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＡＡＴＡＴＧＧＡＴＴ−３’（配列番号１６）および５’−ＣＴＣＧＴＡＴＧＴＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴ−３’（配列番号１７）であった。下線部分はＴ７プロモーター配列を示している。
リコンビナーゼポリメラーゼ増幅
【０４６２】
NCBIプライマーブラスト(Ye et al., BMC Bioinformaics 13, 134(2012)を用いて、増幅産物の大きさ（１００〜１４０ｎｔ）、プライマー融解温度（５４℃〜６７℃）、およびプライマーの大きさ（３０〜３５ｎｔ）とした以外はデフォルトのパラメータを用いてＲＰＡ用プライマーを設計した。次いで、プライマーをＤＮＡとして注文した(Integrated DNA Technologies)。
【０４６３】
２８０ｍＭのＭｇＡｃを入力鋳型の前に加えたことを除いてＲＰＡおよびＲＴ−ＲＰＡ反応の実行はそれぞれ、TwistAmp（登録商標）BasicまたはTwistAmp（登録商標）BasicRT (TwistDx)で指示されたように行われた。特に断りがなければ、反応は１ｕＬの入力について３７℃で２時間行われた。
ＬｗＣ２ｃ２タンパク質の精製
【０４６４】
Ｃ２ｃ２細菌性発現ベクターをRosetta（登録商標）2(DE3) pLysS Singles適格細胞(Millipore)に形質変換した。１６ｍＬの開始培養物をTerrific Broth 4増殖培地（１２ｇ／Ｌのトリプトン、２４ｇ／Ｌの酵母菌抽出物、９．４ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ、２．２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、Sigma）（ＴＢ）で成長させて、を用いて４ＬのＴＢを接種した。このＴＢを吸光度ＯＤ６００が０．６となるまで３７℃、３００ＲＰＭでインキュベートした。この時、タンパク質の発現は、最終濃度５００ｕＭまでIPTG(Sigma)を補充することで誘導された。タンパク質を発現させるため、細胞を１６時間１８℃まで冷却した。次いで、細胞を４℃、５２００ｇで１５分間遠心分離した。細胞ペレットを採取して、後の精製用に−８０℃で保存した。
【０４６５】
タンパク質精製のすべての後続の工程を４℃で行った。細胞ペレットを破砕して、プロテアーゼ阻害剤(Complete Ultra EDTA-free tablets)、リゾチーム、およびベンゾナーゼを補充した溶解緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｈｃｌ、５００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ：８．０）に再懸濁し、振幅１００で１秒、２秒オフ、総超音波処理時間が１０分という条件で超音波処理した(Sonifier 450, Branson, Danbury, CT)。溶解物を４℃、１０，０００ｇで１時間遠心分離により洗浄し、上澄みをStericup ０．２２ミクロンフィルター(EMD Millipore)で濾過した。濾過した上澄みをStrepTactin Sepharose(GE)に加えて、１時間回転させながらインキュベートした。その後、タンパク質が結合したStrepTactin樹脂を溶解緩衝液中で３回洗浄した。この樹脂を２５０単位のSUMOプロテアーゼ(ThermoFisher)と共にSUMO消化緩衝液（３０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、０．１５％のＩｇｅｐａｌ（ＮＰ−４０）、ｐＨ：８．０）に再懸濁し、回転させながら４℃で一晩インキュベートした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシーブルー染色により消化を確認し、樹脂をスピンダウン（spinning down）してタンパク質溶出液を単離した。タンパク質を中高圧液体クロマトグラフィー（fast protein liquid chromatography, FPLC）(AKTA PURE, GE Healthcare Life Sciences)を介して５ｍＬのHiTrap SP HP陽イオン交換カラム(GE Healthcare Life Sciences)に充填し、１３０ｍＭ〜２ＭのＮａＣｌの塩勾配で溶出緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、５％のグリセロール、ｐＨ：８．０）中で溶出させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより得られた画分をＬｗＣ２ｃ２の存在について試験した。タンパク質を含む画分を溜めて、Ｓ２００緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ：７．０）中で遠心濾過装置により１ｍＬまで濃縮した。濃縮されたタンパク質をFPLCによりゲル濾過カラム(Superdex（登録商標）200 Increase 10/300 GL, GE Healthcare Life Sciences)に充填した。ゲル濾過から得られた画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、ＬｗＣ２ｃ２を含む画分を溜めて、緩衝液を保存緩衝液（６００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ：７．５）、５％のグリセロール、２ｍＭのＤＴＴ）に交換し、−８０℃で冷凍して保存した。
ＬｗＣ２ｃ２の副次検出
【０４６６】
特に断りがなければヌクレアーゼアッセイ緩衝液（４０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、６０ｍＭのＮａＣｌ、６ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ：７．３）中で４５ｎＭの精製ＬｗＣ２ｃ２、２２．５ｎＭのｃｒＲＮＡ、１２５ｎＭの基質レポーター(Thermo Scientific RNA分解酵素Alert v2)、２μＬのマウスＲＮＡ分解酵素阻害剤、１００ｎｇの背景総ＲＮＡ、および様々な量の入力核酸標的により検出アッセイを行った。入力がＲＰＡ反応由来のＴ７プロモーターを含む増幅ＤＮＡである場合、上記のＣ２ｃ２反応液を修正して１ｍＭのＡＴＰ、１ｍＭのＧＴＰ、１ｍＭのＵＴＰ、１ｍＭのＣＴＰ、および０．６μＬのＴ７ポリメラーゼ混合物（ＮＥＢ）を含めた。反応は、蛍光プレートリーダー(BioTek)で蛍光動力を５分ごとに測定しながら３７℃で（特に断りがなければ）１〜３時間進行させた。
【０４６７】
上記の反応条件をＲＰＡ増幅混合物に組み込んで、ＲＰＡ−ＤＮＡ増幅、Ｔ７ポリメラーゼによるＤＮＡのＲＮＡへの転換、およびＣ２ｃ２検出を組み合わせたワンポット反応を行った。手短に言うと、５０μＬのワンポットアッセイは、０．４８μＭの順方向プライマー、０．４８μＭの逆方向プライマー、１倍のＲＰＡ再水和緩衝液、様々な量のＤＮＡ入力、４５ｎＭのＬｗＣ２ｃ２組み換えタンパク質、２２．５ｎＭのｃｒＲＮＡ、２５０ｎｇの背景総ＲＮＡ、２００ｎＭの基質レポーター（ＲＮＡ分解酵素alert v2）、４ｕＬのＲＮＡ分解酵素阻害剤、２ｍＭのＡＴＰ、２ｍＭのＧＴＰ、２ｍＭのＵＴＰ、２ｍＭのＣＴＰ、１μＬのＴ７ポリメラーゼ混合物、５ｍＭのＭｇＣｌ２、および１４ｍＭのＭｇＡｃからなっていた。
TaqManプローブによる定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）分析
【０４６８】
ＳＨＥＲＬＯＣＫ定量法を他の確立された方法と比較するため、ｓｓＤＮＡ１の連続希釈液の定量ＰＣＲを行った。TaqManプローブおよびプライマー組（以下の配列）をｓｓＤＮＡ１に対して設計し、ＩＤＴで製造した。TaqManFast Advanced Master Mix (ThermoFisher)を用いてアッセイを行い、Roche LightCycler 480で測定した。
【表１４】
2020513815.tif 000028
ＳＹＢＲグリーンIIを用いたリアルタイムＲＰＡ
【０４６９】
ＳＨＥＲＬＯＣＫ定量法を他の確立された方法と比較するため、ｓｓＤＮＡ１の連続希釈液にＲＰＡを行った。リアルタイムでＤＮＡの蓄積を定量するため、上記の典型的なＲＰＡ反応混合物に１倍のSYBR Green II (ThermoFisher)を加えた。SYBR Green IIは核酸の量に相関する蛍光信号を提供する。反応は、蛍光プレートリーダー(BioTek)で蛍光動力を５分ごとに計測しながら、３７℃で１時間進行させた。
レンチウイルスの調製および処理
【０４７０】
これまで知られている方法に基づいてレンチウイルスを調製および処理した。手短に言うと、HeBS-CaCl2法を用いて、ジカまたはデング熱ＲＮＡ断片を含む１０μｇのｐＳＢ７００誘導体、７．５μｇのｐｓＰＡＸ２、および２．５μｇのｐＭＤ２．ＧをＨＥＫ２９３ＦＴ細胞(Life Technologies, R7007)に形質移入した。２８時間後に培地を変えて、ＤＭＥＭ に１０％のＦＢＳ、１％のペニシリン−ストレプトマイシン、および４ｍＭのGlutaMAX (ThermoFisher Scientific)を補充し、上澄みを０．４５μｍの注射器フィルターを用いて濾過した。ViralBindレンチウイルス精製キット(Cell Biolabs, VPK-104)およびLenti-X濃縮器(Clontech, 631231)を用いて、上澄みからレンチウイルスを精製して準備した。QuickTiter レンチウイルスキット(Cell Biolabs, VPK-112)を用いてウイルス濃度を定量した。ウイルス試料を７％のヒト血清(Sigma, H4522)に加えて２分間９５℃まで加熱し、ＲＰＡへの入力として用いた。
ジカヒト血清試料の単離およびｃＤＮＡ精製
【０４７１】
疑わしいジカ陽性ヒト血清または尿試料をAVL緩衝液(Qiagen)で不活性化し、QIAampウイルスＲＮＡミニキット(Qiagen)でＲＮＡを単離した。ランダムプライマー、ｄＮＴＰ、および試料ＲＮＡを混合することで単離されたＲＮＡをｃＤＮＡに変換し、７０℃で７分間熱変性した。次いで、変性したＲＮＡを２２〜２５℃で１０分、５０℃で４５分、５５℃で１５分、および８０℃で１０分インキュベートしてSuperscript III (Invitrogen)で逆転写した。次いで、ＲＮＡ分解酵素Ｈ(New England Biolabs)と共にｃＤＮＡを３７℃で２０分インキュベートして、ＲＮＡ：ｃＤＮＡハイブリッド中のＲＮＡを壊した。
ヒトの唾液からのゲノムＤＮＡ抽出
【０４７２】
協力者から２ｍＬの唾液を採取した。協力者は、採取の前３０分は食べ物または飲料を取ることが制限されていた。次いで、QIAamp（登録商標）ＤＮＡ血液ミニキット(Qiagen)を用いてキットの試験規約に推奨されるように試料を処理した。沸騰させた唾液試料に対して、４００μＬのリン酸緩衝生理食塩水(Sigma)を１００μＬの協力者の唾液に加えて、１８００ｇで５分間遠心分離した。上澄みを静かに注いで、９５℃で５分インキュベートする前にペレットを０．２％のトリトンＸ−１００(Sigma)でリン酸緩衝生理食塩水中に再懸濁させた。１μＬの試料をＲＰＡ反応への直接入力として用いた。
冷凍乾燥および紙への載置
【０４７３】
ガラス繊維のろ紙（ワットマン紙、１８２７−０２１）を９０分間オートクレーブ殺菌し（Consolidated Stills and Sterilizers、MKII）、５％のヌクレアーゼを含まないＢＳＡ (EMD Millipore, 126609-10GM)で一晩ブロックした。紙をヌクレアーゼを含まない水(Life technologies, AM9932)で１回洗浄した後、４％のRNAsecureTM (Life technologies, AM7006)で６０℃、２０分間インキュベートし、ヌクレアーゼを含まない水でさらに３回洗浄した。処理された紙を使用前にホットプレート(Cole-Parmer, IKA C-Mag HS7)に載せて８０℃で２０分乾燥させた。上で示したように１．８μＬのＣ２ｃ２反応混合物をディスク（２ｍｍ）に載せて、ディスクを黒色透明な底部の３８４ウェルプレート(Corning, 3544)に入れた。冷凍乾燥試験では、反応混合物ディスクを含むプレートを液体窒素で急速冷凍し、Pardee et al (2)に記載されているように一晩冷凍乾燥した。ＲＰＡ試料をヌクレアーゼを含まない水で１：１０に希釈し、１．８μＬの混合物を紙ディスクに充填して、プレートリーダー(BioTek Neo)を用いて３７℃でインキュベートした。
細菌ゲノムＤＮＡの抽出
【０４７４】
カルバペネム耐性腸内細菌科細菌（ＣＲＥ）検出を含む実験では、細菌性培養物を溶原培地（ＬＢ）で中期対数期まで成長させ、ペレット化してQiagen DNeasy BloodおよびTissue Kitを用いて、適切なものとしてグラム陰性またはグラム陽性細菌の何れかに関する製造者の試験規約を用いてｇＤＮＡ抽出と精製を行った。Qubit蛍光光度計でQuant-It dsDNAアッセイによりｇＤＮＡを定量して、その品質をNanodrop分光光度計で２００〜３００ｎｍの吸光度スペクトルにより評価した。
【０４７５】
大腸菌と緑膿菌を区別する実験では、細菌性培養物をルリア−ベルターニ（ＬＢ）ブロス中で初期静止期まで成長させた。持ち運び可能なPureLyse細菌ｇＤＮＡ抽出キット(Claremont BioSolutio)を用いて１．０ｍＬの大腸菌と緑膿菌を処理した。電池駆動の溶解カートリッジに３分間通す前に、１倍の結合緩衝液をこの細菌性培養物に加えた。１５０μＬの水で溶出する前に、０．５倍の結合緩衝液の水溶液を洗浄液として用いた。
デジタル液滴ＰＣＲ定量
【０４７６】
図１Ｃで用いられたｓｓＤＮＡ１およびｓｓＲＮＡ１基準希釈液の濃度を確認するため、デジタル液滴ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を行った。ＤＮＡの定量では、ｓｓＤＮＡ１配列を標的するように設計されたPrimeTime定量ＰＣＲプローブ／プライマーアッセイでプローブ用ｄｄＰＣＲスーパーミックス（ｄＵＴＰなし）を用いて液滴を作製した。ＲＮＡの定量では、ｓｓＲＮＡ１配列を標的するように設計されたPrimeTime定量ＰＣＲプローブ／プライマーアッセイでプローブ用１工程ＲＴ−ｄｄＰＣＲキットを用いて液滴を作製した。いずれの場合もＱＸ２００液滴生成器(BioRad)を用いて液滴を生成しＰＣＲに移した。キットの試験規約に記載されているように液滴に基づく増幅を熱サイクラーで行い、次いでＱＸ２００液滴リーダーで測定して核酸濃度を決定した。
ヒト遺伝子型決定用の合成基準
【０４７７】
ヒト試料の遺伝子型を正確に決定する基準を作製するため、ＳＮＰ標的の周囲にプライマーを設計して、２つのホモ接合性遺伝子型のそれぞれを表すヒトゲノムＤＮＡ由来の約２００ｂｐの領域を増幅した。次いで、ホモ接合性基準と１：１の比で混合してヘテロ接合基準を作製した。次いで、コレラの基準を当量ゲノム濃度（約０．５６ｆｇ／μＬ）まで希釈して、実際のヒト試料と共にＳＨＥＲＬＯＣＫの入力として用いた。
腫瘍変異体無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の検出
【０４７８】
実際の患者のｃｆＤＮＡ試料を模倣するｃｆＤＮＡ基準の模造物を商業ベンダー(Horizon Discovery Group)から購入した。これらの基準は、BRAF V600E変異体およびEGFR L858R変異体の両方に対して４つのアレル画分（１００％ＷＴ、および０．１％変異体、１％変異体、および５％変異体）として準備された。３μＬのこれら基準がＳＨＥＲＬＯＣＫの入力として準備された。
蛍光度データの分析
【０４７９】
背景ノイズを除去した蛍光度データを算出するため、試料の初期蛍光度を減じて異なる条件で比較できるようにした。背景条件（入力なしまたはｃｒＲＮＡなしの条件のいずれか）の蛍光度を試料から減じて背景ノイズを除去した蛍光度を生成した。
【０４８０】
各ガイドをガイド値の合計で除してＳＮＰまたは系統株の識別のためのガイド比率を算出し、試料間の全体的な多様性を調節した。ＳＮＰまたは系統株の識別のためのｃｒＲＮＡ比を以下のように算出して、試料間の全体的な多様性を調節した。
【数１】
2020513815.tif 000029
ここで、ＡｉおよびＢｉはそれぞれ、所与の個体についてアレルＡまたはアレルＢを感知するｃｒＲＮＡのｉ個の技術的に同じ試料に対するＳＨＥＲＬＯＣＫ強度値を指す。典型的にはｃｒＲＮＡにつき４つの技術的に同じ試料があるので、ｍおよびｎは４と等しく、分母は所与のＳＮＰ座位および個体に対してcrRNA SHERLOCK強度値の８個すべての合計に等しい。２個のｃｒＲＮＡがあるので、１つの個体に対するこれらｃｒＲＮＡのそれぞれのｃｒＲＮＡ比平均は常に２である。従って、ホモ接合性の理想的な場合では、陽性アレルｃｒＲＮＡに関する平均ｃｒＲＮＡ比は２であり、陰性アレルｃｒＲＮＡに関する平均ｃｒＲＮＡ比はゼロである。ヘテロ接合性の理想的な場合では、２つのｃｒＲＮＡのそれぞれの平均ｃｒＲＮＡ比は１である。
ＬｗＣａｓ１３ａ切断要件の特徴付け
【０４８１】
プロトスペーサー隣接部位（ＰＦＳ）は、Ｃａｓ１３ａによる強固なリボヌクレアーゼ活性を必要とする標的部位の近くに存在する特異的なモチーフである。ＰＦＳは、標的部位の３’末端に位置し、ＬｓｈＣａｓ１３ａに関してＨ（Ｇではなく）として発明者らのグループによりかつて特徴付けられていた（１）。このモチーフはプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と類似しているが、ＤＮＡ標的クラス２系に対する配列制限は機能的に異なっている。というのは、内因性系でのＣＲＩＳＰＲ座位の自己標的を防ぐことには関与していないからである。Ｃａｓ１３ａのさらなる構造的な研究は、Ｃａｓ１３ａ：ｃｒＲＮＡ標的複合体形成および切断活性についてＰＦＳの重要性を解明すると思われる。
【０４８２】
大腸菌由来の組み換えＬｗＣａｓ１３ａタンパク質（図２Ｄ〜図２Ｅ）を精製し、それぞれの可能性のあるプロトスペーサー隣接部位（ＰＦＳ）ヌクレオチド（Ａ、Ｕ、Ｃ、またはＧ）を持つ１７３ｎｔのｓｓＲＮＡを切断する能力をアッセイした（図２Ｆ）。ＬｓｈＣａｓ１３ａ同様、ＬｗＣａｓ１３ａはＡ、Ｕ、またはＣのＰＦＳを持つ標的を強固に切断することができるが、ＧのＰＦＳを持つｓｓＲＮＡに対する活性が小さい。ＧのＰＦＳを持つｓｓＲＮＡ１に対する活性が弱いことを観察したが、それでもＧのＰＦＳモチーフを持つ２つの標的について強固な検出を観察している（表３；rs601338 crRNAおよびジカ標的ｃｒＲＮＡ２）。それぞれの状況ではＨのＰＦＳは必要ではなく、多くの場合、ＧのＰＦＳにより強い切断すなわち副次活性が達成されると思われる。
リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）および他の等温増幅法についての考察
【０４８３】
リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）は、リコンビナーゼ、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）、および鎖置換ポリメラーゼの３つの主要な酵素からなる等温増幅技術である。これらの酵素がすべて３７℃付近の一定温度で作用するため、ＲＰＡは、温度調節を不要にすることで他の増幅法、特にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に存在する多くの技術的な困難を克服している。ＲＰＡでは、二本鎖鋳型の全体的な融解とプライマーのアニーリングに関して、生体内でのＤＮＡ複製および修復に触発された酵素による手法が温度循環と置き換わっている。リコンビナーゼ−プライマー複合体は、二本鎖ＤＮＡを走査して、相補部位での鎖交換を容易にする。鎖交換はＳＳＢによって安定化され、プライマーを結合したままにすることができる。リコンビナーゼの自発的な分解はＡＤＰ結合状態で起こり、医療現場および野外の設定では利用できない複雑な装置がなくても鎖置換ポリメラーゼはプライマーに侵入して伸長させ、増幅させることができる。この過程が３７〜４２℃の温度範囲で繰り返し循環することでＤＮＡの指数関数的増幅を行うことができる。公開されている元の配合物は、鎖置換ポリメラーゼとして枯草菌Pol I（Ｂｓｕ）、リコンビナーゼとしてT4 uvsX、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質としてT4 gp32を用いている（２）が、本研究で用いられたTwistDxによって販売されている現在の配合物にどのような成分が含まれているかは不明である。
【０４８４】
また、ＲＰＡにはいくつかの限定がある。
１）Ｃａｓ１３ａ検出は定量的である（図１５）が、リコンビナーゼが利用可能なすべてのＡＴＰを使ってしまうとすぐに飽和するためリアルタイムＲＰＡ定量は困難な場合がある。増幅を循環させることができるのでリアルタイムＰＣＲは定量的であるが、ＲＰＡは増幅率を厳しく管理する機構を持たない。例えば、利用可能なマグネシウムまたはプライマーの濃度を低下させる、反応温度を下げる、あるいは効率のないプライマーを設計するなど、何らかの調節をして増幅速度を低下させてもよい。図３１、図３２、および図５２など定量的ＳＨＥＲＬＯＣＫのいくつかの例を見たが、必ずしもこれに当てはまらず、鋳型に依存している。
２）ＲＰＡ効率はプライマー設計に敏感な場合がある。製造者は、典型的には、平均ＧＣ含有量（４０〜６０％）で効率的なリコンビナーゼ結合を確実にするために長いプライマーを設計すること、および非常に高感度なプライマー対を見つけるために１００プライマー対までを選別することを推奨する。本発明者らは、ＳＨＥＲＬＯＣＫについて、１分子感度でアトモル試験を達成するのに２つのプライマー対のみを設計しなければならないことを見出した。この強固さは、増幅産物の増幅での何らかの非効率性を相殺する構成的に活性なＣａｓ１３ａ副次活性による信号のさらなる増幅によるものと思われる。この品質は、特に図３４の細菌性病原体の同定にとって重要である。ＲＰＡには融解工程が含まれないので、細菌ゲノムの16S rRNA遺伝子部位など、非常に構造化された領域を増幅するには様々な問題があった。従って、プライマーの二次構造は１つの問題になり、増幅効率と感度を制限する。本明細書で開示される実施形態は、これらＲＰＡに特異的な問題にも関わらずＣａｓ１３ａからのさらなる信号増幅のために成功していると思われる。
３）効率的なＲＰＡのためには増幅配列の長さは短く（１００〜２００ｂｐ）なければならない。ほとんどの用途で、これは有意な問題ではなくおそらく利点ですらある（例えば、平均断片の大きさが１６０ｂｐであるｃｆＤＮＡ検出）。例えば、汎用プライマーが細菌の検出に望ましい場合、および識別するＳＮＰが広い領域に亘って広がっている場合など、増幅産物の長さが長いことが重要なことがある。
【０４８５】
ＳＨＥＲＬＯＣＫのモジュール性により任意の増幅技術、非等温法でさえもＴ７による転写およびＣａｓ１３ａ検出の前に用いることが可能になる。このモジュール性は、１つの反応でのＴ７工程とＣａｓ１３ａ工程の両立性によって可能になり、Ｔ７プロモーターを持つ任意の増幅されたＤＮＡ入力に対して検出を行うことができる。ＲＰＡを用いる前に、本発明者らの検出アッセイで核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）（３、４）を試みた（図１０）。しかしながら、ＮＡＳＢＡは、Ｃａｓ１３ａの感度を大きく向上させることはなかった（図１１および図５３）。検出の前に用いてもよい他の増幅技術としては、ＰＣＲ、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）（５）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）（６）、ヘリカーゼ依存増幅（ＨＤＡ）（７）、およびニッキング酵素増幅反応（ＮＥＡＲ）（８）が挙げられる。任意の等温技術と交換可能であることにより、ＳＨＥＲＬＯＣＫは何れか一つの増幅技術の特異的な限定を克服することができる。
遺伝子操作による不一致の設計
【０４８６】
本発明者らはこれまでに、標的：ｃｒＲＮＡ二本鎖に２つ以上の不一致があるとＬｓｈＣａｓ１３ａの標的切断は低下するが、１つの不一致では相対的に影響を受けないことを示し、ＬｗＣａｓ１３ａ副次切断についてそのような観察を確認した（図３６Ａ）。本発明者らは、１つの不一致のみがあるが故に標的の副次切断を維持しつつ、ｃｒＲＮＡスペーサー配列にさらなる変異を導入することでさらなる不一致（合計２つの不一致）を持つ標的に対する副次切断を不安定化すると仮定した。遺伝子操作で高められた特異性の可能性を試験するため、本発明者らは、ｓｓＲＮＡ１を標的する複数のｃｒＲＮＡを設計し、ｃｒＲＮＡの長さに亘る不一致を含めて標的副次切断を最適化し、１つの不一致で異なっている標的の副次切断を最少にした（図３６Ａ）。これら不一致はｓｓＲＮＡ１の副次切断を低下させなかったが、さらなる不一致を含む標的（ｓｓＲＮＡ２）に関する信号は有意に減少したことを観察した。ｓｓＲＮＡ１とｓｓＲＮＡ２を最もよく区別するように設計されたｃｒＲＮＡは、ｓｓＲＮＡ２の不一致に近い合成による不一致を含んでおり、実際にハイブリダイズされたＲＮＡに「（転写）バブル」または歪みを形成した。合成による不一致と標的に存在するさらなる不一致（すなわち二重の不一致）の協調によって生じた感度の消失は、連続または近接する二重の不一致に対するＬｓｈＣａｓ１３ａとＬｗＣａｓ１３ａの感度に一致し、１ヌクレオチドによる区別を可能にするｃｒＲＮＡの合理的設計の基礎を提供する（図３６Ｂ）。
【０４８７】
ＺＩＫＶおよびＤＥＮＶ株の不一致の検出では、本発明者らの完全な長さのｃｒＲＮＡは、２つの不一致を含んでいた（図３７Ａ、図３７Ｂ）。株間の配列の大きな相違により、２つのゲノム間で１ヌクレオチドの違いのみを持つ２８ｎｔの連続した区間を見つけることはできなかった。しかしながら、より短いｃｒＲＮＡは機能的であることを予測し、スペーサー配列に合成による１つの不一致と標的配列に１つのみの不一致を含む２つのＺＩＫＶ株の標的に対してより短い２３ｎｔのｃｒＲＮＡを設計した。これらのｃｒＲＮＡは、ＺＩＫＶのアフリカ株とアメリカ株を区別することができる（図３６Ｃ）。続く２３ｎｔおよび２０ｎｔのｃｒＲＮＡの試験から、スペーサー長が短くなると活性が低下するが、１つの不一致を区別する能力は維持または増強されることが示された（図５７Ａ〜図５７Ｇ）。合成による不一致が導入されて１ヌクレオチドの変異の識別をどのように容易にするかをより理解するため、３つの異なるスペーサー長、２８ｎｔ、２３ｎｔ、および２０ｎｔでスペーサーの最初の７つの位置に亘って合成による不一致をタイルにした（図５７Ａ） 。合成による不一致がスペーサーの位置５にある時、３つ目の位置に変異を持つ標的に対してＬｗＣａｓ１３ａは最大の特異性を示しており、標的活性レベルは低いもののより短いスペーサー長さで特異性が向上している（図５７Ｂ〜図５７Ｇ）。本発明者らはまた、標的の変異を位置３〜６に亘ってずらして、変異の周囲のスペーサーで合成による不一致をタイルした（図５８）。
合成基準を用いたＳＨＥＲＬＯＣＫによる遺伝子型決定
【０４８８】
ＳＮＰ座位のＰＣＲ増幅から作製された合成基準の評価により遺伝子型を正確に同定することができる（図６０Ａ、図６０Ｂ）。個体の試料と合成基準のＳＨＥＲＬＯＣＫによる結果のすべての比較を算出することで（分散分析）、ＳＨＥＲＬＯＣＫ検出強度と最も類似した合成基準を見つけることにより各個体の遺伝子型を同定することができる（図６０Ｃ、図６０Ｄ）。このＳＨＥＲＬＯＣＫ遺伝子型決定法は任意のＳＮＰ座位に一般化可能である（図６０Ｅ）。
ＳＨＥＲＬＯＣＫは、価格が手頃な適応可能なＣＲＩＳＰＲ−Ｄｘプラットフォームである
【０４８９】
ＳＨＥＲＬＯＣＫのコスト分析では、ｃｒＲＮＡの合成用ＤＮＡ鋳型、ＲＰＡに用いられるプライマー、共通の緩衝液（ＭｇＣｌ２、トリスＨＣｌ、グリセリン、ＮａＣｌ、ＤＴＴ）、ガラスマイクロ繊維ろ紙、およびRNAsecure試薬などの少額であると判定される試薬は省かれた。ＤＮＡ鋳型については、ＩＤＴからのultramer合成は、４０回の生体外転写反応（それぞれは約１０，０００反応を行うのに十分な量である）分の材料を約７０ドルで提供し、ｃｒＲＮＡ合成のコストに少額が加算される。ＲＰＡプライマーについては、３０ｎｔのＤＮＡプライマーの２５ｎｍｏｌｅのＩＤＴ合成は、約１０ドルで購入することができ、５０００回のＳＨＥＲＬＯＣＫ反応に適した材料を提供する。ガラスマイクロ繊維紙は０．５０／枚で入手可能であり、数百回のＳＨＥＲＬＯＣＫ反応に十分な量である。４％のRNAsecure試薬のコストは７．２０ドル／ｍＬであり、５００回の試験に十分な量である。
【０４９０】
また、紙によるアッセイを除きすべての実験で、０．０３６ドル／反応のコストで３８４ウェルプレートを用いた(Corning 3544)。このコストは少額であるので、全体のコスト分析には含めなかった。また、ＳＨＥＲＬＯＣＫ−ＰＯＣは、紙で容易に行えるので、プラスチック容器の使用を必要としない。本明細書に用いられるＳＨＥＲＬＯＣＫの読み出し方法は、フィルターセットまたは単色光分光器の何れかを備えたプレートリーダーであった。投資として、リーダーのコストは計算に含めなかった。というのは、より多くの反応をプレートリーダーで行うほどコストは低下することが予測され、少額になるからである。ＰＯＣ用途では、携帯分光光度計（９）または持ち運び可能な電子リーダー（４）など安価で持ち運び可能な代替えを用いた場合もあった。これらは装置のコストを２００ドル未満に低下させる。これらの持ち運び可能な解決法は嵩張る装置に比べると速度と読み出し易さが低下しているが、より広範囲に使用することができる。
結果
【０４９１】
本明細書で記載するアッセイおよびシステムは一般に、増幅および検出の２工程の過程を含んでいてもよい。第一の工程では、核酸試料、ＲＮＡまたはＤＮＡの何れかを、例えば等温増幅により増幅する。第二の工程では、増幅したＤＮＡをＲＮＡに転写して、次いでＣＲＩＳＰＲエフェクター（例えばＣ２ｃ２）および標的核酸配列の存在を検出するようにプログラムされたｃｒＲＮＡと共にインキュベートする。検出を可能にするため、消光された蛍光色素分子で標識したレポーターＲＮＡを反応液に加える。レポーターＲＮＡの副次切断により、蛍光色素分子の消光作用が失われて、核酸標的のリアルタイム検出が可能になる（図１７Ａ）。
【０４９２】
強固な信号検出を達成するため、Ｃ２ｃ２の相同分子種を生物レプトトリキア・ウェイディイ（ＬｗＣ２ｃ２）から同定して評価した。ＬｗＣ２ｃ２タンパク質の活性は、大腸菌の合成ＣＲＩＳＰＲ配列と共にこのタンパク質を発現させて、β−ラクタマーゼｍＲＮＡ内の標的部位を切断するようにプログラムすることで評価された。切断されるとアンピシリン選択下で細菌の死に繋がる（図２Ｂ）。ＬｓｈＣ２ｃ２座位よりもＬｗＣ２ｃ２座位を持つ大腸菌コロニーのほうが生存したものが少なかった。これは、ＬｗＣ２ｃ２相同分子種の切断活性がより高いことを示している（図２Ｃ）。次いで、ヒトコドン最適化ＬｗＣ２ｃ２タンパク質を大腸菌から精製し（図２Ｄ〜図２Ｅ）、異なるプロトスペーサー隣接部位（ＰＦＳ）ヌクレオチドにより１７３ｎｔのｓｓＲＮＡを切断する能力をアッセイした（図２Ｆ）。ＬｗＣ２ｃ２は、可能性のある４つのＰＦＳ標的のそれぞれを切断することができた。また、ＧのＰＦＳを持つｓｓＲＮＡでは活性がわずかに低くなっていた。
【０４９３】
ＬｗＣ２ｃ２ＲＮＡ分解酵素の副次活性のリアルタイム測定は、市販のＲＮＡ蛍光プレートリーダーを用いて測定された（図１７Ａ）。ＬｗＣ２ｃ２活性のベースライン感度を決定するため、ＬｗＣ２ｃ２をｓｓＲＮＡ標的１（ｓｓＲＮＡ１）、このｓｓＲＮＡ標的内の部位に相補であるｃｒＲＮＡ、およびＲＮＡセンサープローブと共にインキュベートした（図１８）。これにより約５０ｆＭの感度が得られた（図２７Ａ）。この感度は他の細菌の核酸検出技術(Pardee et al., 2014)よりも高いが、下位フェムトモルでの検出性能を要求する多くの診断用途には十分な高さではない(Barletta et al., 2004; Emmadi et al., 2011;Rissin et al., 2010; Song et al., 2013)。
【０４９４】
感度を高めるため、ＬｗＣ２ｃ２とのインキュベーションの前に等温増幅工程を付け加えた。核酸配列に基づく増幅(NASBA)(Compton, 1991; Pardee et al., 2016)など、従来用いられている等温増幅法とＬｗＣ２ｃ２媒介検出を連結することである程度まで感度が向上した（図１１）。代替えの等温増幅法であるリコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）(Piepenburg et al., 2006)を試験した。この方法を用いて２時間以下で指数関数的にＤＮＡを増幅させることができる。T7 RNAポリメラーゼプロモーターをＲＰＡプライマーに付加することで、増幅したＤＮＡを後続のＬｗＣ２ｃ２による検出用のＲＮＡに変換することができる（図１７）。従って、特定の例示的な実施形態では、前記アッセイは、ＲＰＡによる増幅、T7 RNAポリメラーゼによるＤＮＡのＲＮＡへの変換、および後続のＲＮＡの検出（消光されたレポーターから蛍光を切り離すＣ２ｃ２による）の組合せを含む。
【０４９５】
ｓｓＲＮＡ１の合成されたＤＮＡバージョンでこの例示的な方法を用いて、１反応あたり１〜１０分子の範囲でアトモル感度を達成することが可能であった（図２７Ｂ左）。検出の正確さを確かめるため、入力ＤＮＡの濃度をデジタル液滴ＰＣＲで定量して、最も低い検出可能標的濃度（２ａＭ）が１マイクロリットルあたり１分子の濃度であることを確認した。また、逆転写工程を追加して、ＲＰＡはＲＮＡを増幅してｄｓＤＮＡ形態にしてもよく、これによりｓｓＲＮＡ１でアトモル感度を達成することができる（図２７Ｂ右）。同様に、ＲＮＡ標的の濃度をデジタル液滴ＰＣＲによって確かめた。ＰＯＣ診断試験として機能するこの例示的な方法の実行可能性を評価するため、ＲＰＡ、Ｔ７ポリメラーゼ増幅、およびＬｗＣ２ｃ２検出のすべての成分の１反応で機能する能力を試験したところ、アッセイのワンポットバージョンでアトモル感度が観察された（図２２）。
アッセイは液体中または紙の表面で高感度なウイルス検出が可能である
【０４９６】
次に、アッセイが伝染病用途に有効であるか否かを決定した。伝染病用途では高感度が要求され、持ち運び可能な診断からの恩恵を受ける場合がある。モデルシステムでの検出を試験するため、ジカウイルスゲノムおよび関連するフラビウイルスデング熱のＲＮＡ断片を宿すレンチウイルス(Dejnirattisai et al., 2016)を作製して、ウイルス粒子の数を定量した（図３１Ａ）。模造ウイルスの量は２ａＭまで検出された。また同時に、ジカおよびデング熱ＲＮＡ断片を含むこれら代理ウイルスをはっきりと識別することが可能であった（図３１Ｂ）。配布のためのコールドチェーンへの依存をなくす目的で前記アッセイが冷凍乾燥と両立可能であるか否かを決定するため、反応成分を冷凍乾燥した。試料を用いて凍結乾燥された成分を再水和したところ、２０ｆＭのｓｓＲＮＡ１が検出された（図３３Ａ）。資源が乏しい設定およびＰＯＣ設定では容易に使用できるので紙の試験から恩恵を受ける場合があり、ガラス繊維紙表面でのＣ２ｃ２検出の活性も評価したところ、紙スポッティングＣ２ｃ２反応は標的を検出することが可能であることが観察された（図３３Ｂ）。冷凍乾燥と紙スポッティングを組合せると、Ｃ２ｃ２検出反応はｓｓＲＮＡ１を高感度で検出した（図３３Ｃ）。また、合成ジカウイルスＲＮＡ断片の検出について、溶液中のＬｗＣ２ｃ２と冷凍乾燥ＬｗＣ２ｃ２とで同程度の感度が観察された。これは、冷凍乾燥ＳＨＥＲＬＯＣＫの強固さと高速ＰＯＣジカウイルス診断の可能性を示している（図３３Ｄ〜図３３Ｅ）。この目標のため、アッセイのＰＯＣ多様体の可能性を試験して、ジカＲＮＡとデング熱ＲＮＡを区別する能力を決定した（図３１Ｃ）。紙スポッティングと冷凍乾燥が読み出しの絶対信号をわずかに低下させたものの、前記アッセイは、デング熱対照配列による模倣ウイルスの検出に比べて２０ａＭという低い濃度で模倣ジカウイルスを有意に検出した（図３１Ｄ）。
【０４９７】
ヒトのジカウイルスＲＮＡ量は、患者の唾液中に３×１０６コピー／ｍＬ（４．９ｆＭ）、患者の血清中に７．２×１０５コピー／ｍＬ（１．２ｆＭ）と低いことが報告されている(Barzon et al., 2016; Gourinat et al., 2015; Lanciotti et al., 2008)。得られた患者試料から、１．２５×１０３コピー／ｍＬ（２．１ａＭ）という低い濃度が観察された。前記アッセイが滴定量の少ない臨床単離物のジカウイルス検出を行うことが可能か否かを評価するため、ウイルスＲＮＡを患者から抽出して逆転写し、得られたｃＤＮＡをアッセイの入力として用いた（図３２Ａ）。ジカヒト血清試料の有意な検出は１．２５コピー数／ｕＬ（２．１ａＭ）の濃度まで観察された（図３２Ｂ）。さらに、患者試料からの信号はジカウイルスＲＮＡコピー数を予測可能であり、これを用いてウイルス量を予測した（図３１Ｆ）。核酸精製が利用できない疾患状況に対する広範な用途を試験するため、ヒト血清に加えたｓｓＲＮＡ１の検出を試験したところ、前記アッセイは２％未満の血清量で作動したことが分かった（図３３Ｇ）。
細菌性病原体の区別および遺伝子の区別
【０４９８】
前記アッセイを用いて細菌性病原体を区別することができるか否かを決定するため、最初の標的として16S V3領域を選択した。というのは、保存された隣接領域により保存されたＲＰＡプライマーを細菌種に亘って用いることことができ、可変内部領域によって種の区別が可能であるからである。病原性株と、単離された大腸菌ｇＤＮＡおよび緑膿菌ｇＤＮＡに対して可能性のある５つの標的ｃｒＲＮＡのパネルを設計した（図３４Ａ）。前記アッセイは、大腸菌ｇＤＮＡと緑膿菌ｇＤＮＡを区別することが可能であり、他の種のｃｒＲＮＡに対して低い背景信号を示した（図３４Ａ、図３４Ｂ）。
【０４９９】
また、前記アッセイを用いて対象の細菌性遺伝子（例えば、抗生物質耐性遺伝子）を高速で検出して区別することができる。カルバペネム耐性腸内細菌（ＣＲＥ）は新たに発生した大きな公衆衛生問題である(Gupta et al., 2011)。カルバペネム耐性遺伝子を検出するアッセイの能力と、この試験が異なるカルバペネム耐性遺伝子を区別することができるか否かを評価した。クレブシエラ肺炎を肺炎桿菌カルバペネマーゼ（ＫＰＣ）耐性遺伝子またはニューデリー・メタロベータラクタマーゼ（ＮＤＭ−１）耐性遺伝子を宿す臨床単離物から得て、これらの遺伝子を区別するｃｒＲＮＡを設計した。すべてのＣＲＥは、これら耐性遺伝子を欠く細菌に対して有意な信号を持っていた（図３５Ａ）。また、ＫＰＣ株とＮＤＭ−１株の耐性を有意に区別することができた（図３５Ｂ）。
ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ誘導ＲＮＡ分解酵素の１塩基による不一致の特異性
【０５００】
特定のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ誘導ＲＮＡ分解酵素相同分子種（例えば、ＬｓｈＣ２ｃ２）は、１塩基による不一致を区別するのは容易ではないことが示されている(Abudayyeh et al., 2016)。本明細書で示されたように、ＬｗＣ２ｃ２もこの特徴を共有している（図３７Ａ）。ＬｗＣ２ｃ２切断の特異性を高めるため、ｃｒＲＮＡ：標的二本鎖に合成による不一致を導入する系が開発された。この系は、不一致に対する総感度を高めて、１塩基による不一致に対する感度を可能にする。標的１に対して複数のｃｒＲＮＡを設計した。これらのｃｒＲＮＡはｃｒＲＮＡの長さに亘って不一致を含んで（図３７Ａ）標的の切断を最適にし、１つの不一致で異なっている標的の切断を最少にする。これらの不一致は、ｓｓＲＮＡ標的１の切断効率を低下させないが、さらなる不一致を含む標的（ｓｓＲＮＡ標的２）に対する信号を有意に減じた。標的１と標的２を最もよく区別した設計されたｃｒＲＮＡは、標的２の不一致に近い合成による不一致を含んでおり、実際に「バブル」を形成した。合成による不一致と標的に存在するさらなる不一致（すなわち二重の不一致）の協調によって生じた感度の消失は、連続または近接する二重の不一致に対するＬｓｈＣ２ｃ２の感度と一致し(Abudayyeh et al., 2016)、１ヌクレオチドによる区別を可能にするｃｒＲＮＡの合理的設計の型を提供する（図３７Ｂ）。
【０５０１】
Ｃ２ｃ２を遺伝子操作して１塩基による不一致を認識することができることが示されたので、この遺伝子操作された特異性を用いて密接に関係するウイルス病原体を区別することができるか否かを決定した。複数のｃｒＲＮＡを設計してジカウイルスのアフリカ株またはアメリカ株（図３７Ａ）およびデング熱ウイルスの株１または３（図３７Ｃ）を検出した。これらのｃｒＲＮＡは、スペーサー配列に合成による不一致を１つ含んでいて、標的株に結合すると合成による不一致により１つのバブルを形成した。しかしながら、合成による不一致スペーサーが非標的株に結合すると、合成による不一致とＳＮＰによる不一致によって２つのバブルが形成される。合成による不一致ｃｒＲＮＡは、非標的株よりも有意に大きい信号で対応する株を検出し、強固に株を区別することができた（図３７Ｂ、図３７Ｄ）。株間の有意な配列類似性により、真の１ヌクレオチドによる株の区別を示すために２つのゲノムで１ヌクレオチドの違いのみを持つ２８ｎｔの連続した区間を見つけることはできなかった。しかしながら、ＬｓｈＣ２ｃ２と共にある時、より短いｃｒＲＮＡは機能的である(Abudayyeh et al., 2016)ことを予測した。従って、より短い２３ｎｔのｃｒＲＮＡを、スペーサー配列に合成による不一致を、標的配列に１つのみの不一致を含む２つのジカ株の標的に対して設計した。これらのｃｒＲＮＡはジカのアフリカ株およびアメリカ株を高感度で区別することができた（図３６Ｃ）。
唾液から精製したＤＮＡを用いた高速遺伝子型決定
【０５０２】
ヒトの唾液からの高速遺伝子型決定は、緊急薬理ゲノム的状況または仮定での診断で有益な場合がある。遺伝子型決定について本明細書で開示される実施形態の可能性を示すため、５つの座位を選択して、２３ａｎｄＭｅ遺伝子型決定データを代表基準として用いてＣ２ｃ２検出を基準に従って評価した(Eriksson et al., 2010)（図３８Ａ）。５つの座位は、スタチンまたはアセトアミノフェンなど薬物に対する感度、ノロウイルス感受性、および心疾患の危険性を含む広範囲の機能的な関連に亘っている（表１５）。
【表１５】
2020513815.tif 000030
【０５０３】
４人のヒト対象者由来の唾液を採取して、簡単な市販キットを用いて１時間未満でゲノムＤＮＡを精製した。４人の対象者は、これら５つの座位に亘って異なる組の遺伝子型を持っており、遺伝子型決定についてアッセイを評価するのに十分に広い標本空間を提供した。これら５つのＳＮＰ座位のそれぞれについて、適切なプライマーを有するＲＰＡを用いて対象者のゲノムＤＮＡを増幅し、ＬｗＣ２ｃ２、および２つの可能性のあるアレルの一方を特異的に検出するように設計されたｃｒＲＮＡ対で検出した（図３８Ｂ）。前記アッセイは、非常に有意にアレルを区別し、ホモ接合性遺伝子型およびヘテロ接合性遺伝子型の両方を推測するのに十分特異的であった。検出の前に唾液に対してＤＮＡ抽出試験規約を行ったので、前記アッセイを試験して、さらに何らかの抽出をしなくても５分間９５℃まで加熱した唾液を用いることによってＰＯＣ遺伝子型決定により適したものにすることができるか否かを決定した。前記アッセイは、２人の患者の唾液を５分間加熱しただけで、その後で増幅およびＣ２ｃ２検出を行ったが、これらの患者の遺伝子型決定を正しく行うことができた（図４０Ｂ）。
低アレル画分のｃｆＤＮＡにおける癌性変異の検出
【０５０４】
前記アッセイは標的の１ヌクレオチドの違いに非常に特異的であるので、前記アッセイが循環無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の癌変異を検出するのに十分高感度であるか否かを決定するための試験を考案した。ｃｆＤＮＡ断片は野生型ｃｆＤＮＡ断片の小さな割合（０．１％〜５％）である(Bettegowda et al., 2014; Newman et al., 2014; Olmedillas Lopez et al., 2016; Qin et al., 2016)。ｃｆＤＮＡ分野での重要な課題は、これら変異を検出することである。というのは、典型的には、血液中の背景に観察される多量の変異していないＤＮＡを考えるとこれらの変異を発見するのは難しいからである(Bettegowda et al., 2014; Newman et al., 2014; Qin et al., 2016)。ＰＯＣでのｃｆＤＮＡ癌試験もまた、特に寛解の危険性がある患者について癌の存在の通常の選別に有用である場合がある。
【０５０５】
野生型の背景で変異体ＤＮＡを検出するアッセイの能力は、ｃｒＲＮＡ標的部位に１つの変異を持つｓｓＤＮＡ１の背景でｄｓＤＮＡ標的１を希釈することにより決定された（図４１Ａ〜図４１Ｂ）。ＬｗＣ２ｃ２は、背景ｄｓＤＮＡの０．１％という低い濃度のｄｓＤＮＡ１をｄｓＤＮＡ１のアトモル濃度以内で感知することができた。この結果は、背景変異体ｄｓＤＮＡ１のＬｗＣ２ｃ２切断が十分に低く、０．１％のアレル画分で標的ｄｓＤＮＡを強固に検出することができることを示している。０．１％未満の濃度では、背景活性は問題になると思われ、正しい標的の任意のさらに有意な検出を妨げる。
【０５０６】
前記アッセイは、臨床的に適切な範囲でアレル画分を持つ合成標的を感知することができたので、前記アッセイがｃｆＤＮＡの癌変異を検出することができるか否かを評価した。２つの異なる癌変異EGFR L858RおよびBRAF V600Eに対するＲＰＡプライマーを設計して、市販のｃｆＤＮＡ基準を、実際のヒトｃｆＤＮＡ試料に似せた５％、１％、および０．１％のアレル画分と共に用いて試験した。変異体アレルと野生型アレルを区別することができる１対のｃｒＲＮＡを用いて（図３８Ｃ）、変異体座位の両方について０．１％アレル画分の検出を達成した（図３９Ａ〜図３９Ｂ）
考察
【０５０７】
Ｃ２ｃ２の天然の特性を等温増幅および消光蛍光プローブと組み合わせることで、本明細書で開示されるアッセイおよびシステムは、用途が広く強固なＲＮＡおよびＤＮＡ検出方法であり、伝染病用途および高速遺伝子型決定を含む様々な高速診断に好適であることが分かった。本明細書で開示されるアッセイおよびシステムの主要な利点は、新規なＰＯＣ試験を０．６ドル／試験という低コストでわずか数日のうちに再設計および合成することができる点である。
【０５０８】
多くのヒトの疾患用途は１つの不一致を検出する能力を必要とするので、合理的な手法が開発されて、ｃｒＲＮＡのスペーサー配列に合成による１つの不一致を導入することで標的配列の１つの不一致に対して非常に特異的であるようにｃｒＲＮＡを遺伝子操作した。ＣＲＩＳＰＲエフェクターとの特異性を達成する他の手法は、数十のガイド設計に対する選別による方法に依存している(Chavez et al., 2016)。設計された不一致ｃｒＲＮＡを用いて、１つの不一致で異なっている部位のジカデング熱ウイルス株の識別、ヒトの唾液ｇＤＮＡ由来のＳＮＰの高速遺伝子型決定、およびｃｆＤＮＡ試料中の癌変異の検出が確認された。
【０５０９】
前記アッセイプラットフォームの低コストおよび適応性は、以下のものを含むさらなる用途に適している：（ｉ）特定の定量ＰＣＲアッセイ（例えば、Taqman）の置き換えでの汎用ＲＮＡ／ＤＮＡ定量経験、（ｉｉ）マイクロアレイに似た高速多重ＲＮＡ発現検出、および（ｉｉｉ）他の高感度検出用途（例えば、食品の他の供給源由来の核酸汚染の検出など）。また、Ｃ２ｃ２は、生物学的設定（例えば、細胞中）での転写物の検出に用いることが可能な場合もある。また、Ｃ２ｃ２検出の非常に特異的な性質から、転写物のアレル特異的発現あるいは生きた細胞での疾患に関連付けられた変異を追跡することも可能である。アプタマーの広い利用性により、アプタマーによるタンパク質の検出とＲＰＡのための謎の増幅部位の解明とを組み合わせて、その後でＣ２ｃ２検出を行うことでタンパク質を感知することも可能である。
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ａ／Ｃ２ｃ２による核酸検出：アトモル感度および一塩基特異性
【０５１０】
強固な信号検出を達成するため、レプトトリキア・ウェイディイ（ＬｗＣａｓ１３ａ）由来のＣａｓ１３ａの相同分子種を同定した。ＬｗＣａｓ１３ａは、レプトトリキア・シャーイイＣａｓ１３ａ（ＬｓｈＣａｓ１３ａ）に比べてより高いＲＮＡ誘導ＲＮＡ分解酵素活性を示す（１０）（図２、また「ＬｗＣａｓ１３ａ切断要件の特徴付け」を参照のこと）。ｓｓＲＮＡ標的１（ｓｓＲＮＡ１）、ｃｒＲＮＡ、およびレポーター（消光された蛍光ＲＮＡ）と共にインキュベートしたＬｗＣａｓ１３ａ（図１８）（１３）は、約５０ｆＭの検出感度を示した（図５１、図１５）。この感度は多くの診断用途に十分な高さではない（１２、１４〜１６）。従って、本発明者らは、Ｃａｓ１３ａによる検出を異なる等温増幅工程と組み合わせることを模索した（図１０、図１１、図５３、図１６）（１７、１８）。模索した方法の中で、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）が最も高い感度を示し（１８）、ＬｗＣａｓ１３ａによる後続の検出のために増幅したＤＮＡをＲＮＡに変換するＴ７による転写と組み合わせることができる（また、上記の「リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）および他の等温増幅法についての考察」を参照のこと）。ＲＰＡによる増幅、増幅したＤＮＡのＲＮＡへのT7 RNAポリメラーゼ転写、およびＳＨＥＲＬＯＣＫとしてのレポーター信号のＣａｓ１３ａ副次ＲＮＡ切断媒介放出による標的ＲＮＡの検出の組合せについて述べる。
【０５１１】
まず、ＲＮＡ（逆転写と組み合わせた場合）またはＤＮＡ標的の検出のためにＳＨＥＲＬＯＣＫの感度を決定した。本発明者らは、デジタル液滴ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）で確認したようにＲＮＡとＤＮＡの両方で１分子感度を達成した（図２７、図５１、図５４Ａ、図５４Ｂ）。すべてのＳＨＥＲＬＯＣＫ成分を１回の反応で合わせるとアトモル感度が維持された。これはこのプラットフォームの診療現場（ＰＯＣ）としての実行可能性を示している（図５４Ｃ）。ＳＨＥＲＬＯＣＫは、２つの確立された高感度核酸検出法であるｄｄＰＣＲおよび定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）と同程度の感度を持っているが、ＲＰＡのみでは低濃度の標的を検出するのに十分な感度ではなかった（図５５Ａ〜図５５Ｄ）。また、ＳＨＥＲＬＯＣＫは、同じ試料に対する変動係数によって測定されたようにｄｄＰＣＲ、定量ＰＣＲ、およびＲＰＡよりも変動が少ない（図５５Ｅ〜図５５Ｆ）。
【０５１２】
次いで、本発明者らは、ＳＨＥＲＬＯＣＫが高感度が要求される伝染病用途で有効であるか否かを調べた。ジカウイルス（ＺＩＫＶ）または関係するフラビウイルスデング熱（ＤＥＮＶ）の何れかのゲノム断片を宿すレンチウイルスを作製した（１９）（図３１Ａ）。ＳＨＥＲＬＯＣＫはウイルス粒子を２ａＭまで検出し、ＺＩＫＶとＤＥＮＶを区別することができた（図３１Ｂ）。野外でのＳＨＥＲＬＯＣＫの可能性のある使用を探求するため、まず、凍結乾燥され、次いで再水和されたＣａｓ１３ａｃｒＲＮＡ複合体（２０）が２０ｆＭの増幅していないｓｓＲＮＡ１を検出することができ（図３３Ａ）、その標的検出はガラス繊維紙の表面でも可能であった（図３３Ｂ）ことが示された。ＳＨＥＲＬＯＣＫの他の成分もまた冷凍乾燥に適応可能である。ＲＰＡは凍結乾燥された試薬として周囲温度で提供される。また、Ｔ７ポリメラーゼが冷凍乾燥を許容することはこれまでに示した（２）。冷凍乾燥と紙スポッティングの組合せで、Ｃａｓ１３ａ検出反応は、水性反応として相当高い感度でｓｓＲＮＡ１を検出した（図３３Ｃ〜図３３Ｅ）。紙スポッティングおよび冷凍乾燥は読み出しの絶対信号をわずかに低下させるが、ＳＨＥＲＬＯＣＫ（図３１Ｃ）は２０ａＭという低濃度で模倣ＺＩＫＶウイルスを容易に検出することができた（図３１Ｄ）。ＳＨＥＲＬＯＣＫはまた、滴定量が２×１０３コピー／ｍＬ（３．２ａＭ）と低い場合がある臨床単離物（血清、尿、または唾液）中のＺＩＫＶを検出することができる（２１）。定量ＰＣＲ（図３２Ｆおよび図５２Ｂ）で確認したように、患者の血清または尿試料から抽出してｃＤＮＡに逆転写したZIKV RNA（図３２Ｅおよび図５２Ａ）は１．２５×１０３コピー／ｍＬ（２．１ａＭ）の濃度で検出することができた。さらに、患者試料からの信号はZIKV RNAコピー数の予測可能であり、これを用いてウイルス量を予測することができた（図３３Ｆ）。核酸を精製せずに試料検出を模倣するため、ヒト血清に加えたｓｓＲＮＡ１の検出を測定し、Ｃａｓ１３ａが２％の血清を含む反応でＲＮＡを検出することができることが分かった（図３３Ｇ）。ＣＲＩＳＰＲ−ｄｘの他の重要な疫学用途は、細菌性病原体の同定および特定の細菌遺伝子の検出である。本発明者らは、16S rRNA遺伝子Ｖ３領域を標的した。この領域では、保存された隣接領域により、細菌種に亘って汎用ＲＰＡプライマーを用いることができ、可変内部領域によって種の区別をすることができる。異なる病原性株および大腸菌および緑膿菌から単離されたｇＤＮＡに対する５つの可能性のある標的ｃｒＲＮＡのパネル（図３４Ａ）で、ＳＨＥＲＬＯＣＫは株を正しく遺伝子型決定し、低い交差反応性を示した（図３４Ｂ）。また、ＳＨＥＲＬＯＣＫを用いて、２つの異なる耐性遺伝子肺炎桿菌カルバペネマーゼ（ＫＰＣ）およびニューデリー・メタロベータラクタマーゼ１（ＮＤＭ−１）で肺炎桿菌の臨床単離物の区別をすることができた（２２）（図５６）。
【０５１３】
ＳＨＥＲＬＯＣＫの特異性を高めるため、ＬｗＣａｓ１３ａが１塩基の不一致で異なっている標的を区別することができるｃｒＲＮＡ：標的二本鎖に合成による不一致を導入した（図３６Ａ、図３６Ｂ；また上記の「遺伝子操作による不一致の設計」を参照のこと）。本発明者らは、スペーサー配列に合成による不一致を持つ複数のｃｒＲＮＡを設計して、ＺＩＫＶのアフリカ株またはアメリカ株（図３７Ａ）およびＤＥＮＶの株１または３（図３７Ｃ）の何れかを検出した。合成による不一致ｃｒＲＮＡは、非標的株に比べて有意に高い信号で対応する株を検出し（両側スチューデントｔ−検定；ｐ＜０．０１）、１つの不一致に基づく強固な株の識別を可能にした（図３７Ｂ、図３７Ｄ、図３６Ｃ）。さらに、特徴付けから、Ｃａｓ１３ａ検出は、最大の特異性を達成しつつ、変異がスペーサーの位置３にあり、合成による不一致が位置５にある場合に標的の感度を維持することが明らかになった（図５７および図５８）。１塩基の違いを検出する能力は、高速なヒト遺伝子型決定にＳＨＥＲＬＯＣＫを用いる機会をもたらした。本発明者らは、健康に関連した１塩基多型（ＳＮＰ）の範囲に亘る５つの座位を選択し（表１）、これらＳＮＰで代表的な基準として２３ａｎｄＭｅ遺伝子型決定データを用いてＳＨＥＲＬＯＣＫ検出を評価した（２３）（図３８Ａ）。対象の座位に亘って異なる遺伝子型を持つ４人のヒト対象者から唾液を採取し、市販のカラム精製または５分間の直接加熱のいずれかでゲノムＤＮＡを抽出した（２０）。ＳＨＥＲＬＯＣＫは、非常に有意で十分な特異性でアレルを区別して、ホモ接合性遺伝子型とヘテロ接合性遺伝子型の両方を推測した（図３８Ｂ、図４０、図５９、図６０；また上記の「合成基準を用いたＳＨＥＲＬＯＣＫによる遺伝子型決定」を参照のこと）。最後には、ＳＨＥＲＬＯＣＫが無細胞（ｃｆ）ＤＮＡ断片中で頻度の低い癌変異を検出することができるか否かを決定することを調べた。これは、患者の血液中に野生型ＤＮＡが高濃度で存在するために困難である（２４〜２６）。まず、ＳＨＥＲＬＯＣＫはゲノムＤＮＡの背景で希釈されたアトモル濃度でｓｓＤＮＡ１を検出することができることが見出された（図６１）。次いで、ＳＨＥＲＬＯＣＫはまた、背景ＤＮＡの０．１％という低濃度で一塩基多型（ＳＮＰ）を含むアレルを検出することができることが見出された（図４１Ａ、図４１Ｂ）。次いで、ＳＨＥＲＬＯＣＫは、０．１％という低いアレル画分を持つ模造ｃｆＤＮＡ試料中で２つの異なる癌変異、EGFR L858RおよびBRAF V600Eを検出することができた（図３８、図３９）（２０）ことが示された。
【０５１４】
ＳＨＥＲＬＯＣＫプラットフォームは、以下のものを含むさらなる用途に適している：（ｉ）特定の定量ＰＣＲアッセイ（例えば、Taqman）に代わる汎用ＲＮＡ／ＤＮＡ定量、（ｉｉ）高速多重ＲＮＡ発現検出、および（ｉｉｉ）核酸汚染の検出など、他の高感度検出用途。また、Ｃａｓ１３ａは、生物学的設定内で転写物を検出すること、および転写物のアレル特異的発現および生きた細胞での疾患に関連付けられた変異を追跡することが可能であった。ＳＨＥＲＬＯＣＫは、用途が広く強固なＲＮＡおよびＤＮＡ検出方法であり、伝染病用途および高感度遺伝子型決定を含む高速診断に好適であることが示された。ＳＨＥＲＬＯＣＫの紙での試験は、０．６１ドル／試験という低コストでわずか数日のうちに高い信頼性でもって再設計および合成することができる（また、上記の「ＳＨＥＲＬＯＣＫは、価格が手頃な適応可能なＣＲＩＳＰＲ−Ｄｘプラットフォームである」を参照のこと）。というのは、ほとんどすべての試験されたｃｒＲＮＡは高感度および特異性を示したからである。これらの品質はＣＲＩＳＰＲ−Ｄｘの力を強調するものであり、生物学的分子の高速で強固で高感度な検出に新たな道を開く。
【表１６】
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【表１７】
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【表１８】
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【表１９】
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実施例３  Ｃ２ｃ２は感染を防ぎ、リンパ球性脈絡髄膜炎（ＬＣＭＶ）の複製を低下させる
【０５１５】
図６７に示すように、また以下の表２０に示すように、ＬＣＭＶゲノムの様々な領域に結合するようにガイドＲＮＡを設計した。
【表２０】
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【０５１６】
リポフェタミン２０００を用いて、核外搬出シグナルでｍｓｆＧＦＰに融合させたレプトトリキア・ウェイディイ（Ｌｗ）Ｃ２ｃ２／Ｃａｓ１３ａを発現しているプラスミドとガイドＲＮＡを発現しているプラスミドを２９３ＦＴ細胞に形質移入した。リポフェタミン−プラスミド混合物の添加と同時に２９３ＦＴ細胞を播種した。２４時間後、形質移入した２９３ＦＴ細胞をＬＣＭＶアームストロング株（多重感染度：５、１時間）に感染させた（ウイルス力価はベロ細胞によるフォーカス形成単位アッセイで決定された）。感染の１時間後、細胞をクエン酸塩緩衝液で洗浄して、細胞に感染せず感染培地に残留しているウイルスを破壊した。感染の４８時間後、ウイルスを含む上澄みを除去して、ヌクレアーゼを含まない水で１：１０に希釈し、ＬＣＭＶ  ＧＰに対するプライマーと共にＲＴ−定量ＰＣＲの入力として用いた。結果を図６８に示す。
【０５１７】
２９３ＦＴ細胞はＬＣＭＶ感染の１日前に播種されたので、感染は８０〜８５％の密集度で行われた。播種の２４時間後、２９３ＦＴ細胞をＬＣＭＶアームストロング株で感染させた（多重感染度：５、１時間）（ウイルス力価はベロ細胞によるフォーカス形成単位アッセイで決定された）。感染の１時間後、細胞をクエン酸塩緩衝液で洗浄して、細胞に感染せずに感染培地に残留しているウイルスを破壊した。２４時間後、リポフェタミン２０００を用いて、核外搬出シグナルでｍｓｆＧＦＰに融合させたLw C2c2/Cas13aを発現しているプラスミドと、ガイドＲＮＡを発現しているプラスミドを２９３ＦＴ細胞に形質移入した。感染の４８時間後、ウイルスを含む上澄みを除去して、ヌクレアーゼを含まない水で１：１０に希釈して、LCMV GPに対するプライマーと共にＲＴ−定量ＰＣＲの入力として用いた。結果を図６９に示す。
【０５１８】
リポフェタミン２０００を用いて、核外搬出シグナルでｍｓｆＧＦＰに融合させたLw C2c2/Cas13aを発現しているプラスミドと、ガイドＲＮＡを発現している１つまたは複数のプラスミドのいずれかを２９３ＦＴ細胞に形質移入した。リポフェタミン−プラスミド混合物の添加と同時に２９３ＦＴ細胞を播種した。１〜４個の異なるガイドＲＮＡと共に細胞を形質移入した。２４時間後、細胞をＬＣＭＶアームストロング株で感染させた（多重感染度：５、１時間）（ウイルス力価はベロ細胞によるフォーカス形成単位アッセイで決定された）。感染の１時間後、細胞をクエン酸塩緩衝液で洗浄して、細胞に感染せず感染培地に残留しているウイルスを破壊した。感染の４８時間後、ウイルスを含む上澄みを除去して、ヌクレアーゼを含まない水で１：１０に希釈し、LCMV GPに対するプライマーと共にＲＴ−定量ＰＣＲの入力として用いた。結果を図７０に示す。
【０５１９】
図６８〜図７０より明かであるが、ウイルスＲＮＡを標的するように設計されたＣＲＩＳＰＲ系は、特に複数のガイドＲＮＡを用いた場合、ウイルス複製、従ってウイルス量を低減させることができる。
実施例４  Ｃａｓ１３標的ガイドのためのＬＣＭＶの全ゲノム選別
【０５２０】
ゲノム規模の選別を行って最も効率的なガイドＲＮＡを特定した。２８３個のガイドＲＮＡをＬＣＭＶゲノムに亘ってコード鎖の５０ｎｔごと（２０７個のガイド）、および非コード鎖の１５０ｎｔごと（７６ガイド）にタイル積みした。
【０５２１】
ＬＣＭＶ選別設計および方法：ＬＣＭＶ複製を低減させるガイドの全ゲノム選別を行うため、ガイドをＬＣＭＶゲノムのＳ分節およびＬ分節の両方に亘ってタイル積みした。コード領域では、２８ｎｔのガイドをコード領域に沿って５０ｎｔごとに設計した。非コード領域では、ガイドを１５０ｎｔごとに設計した。ＬＣＭＶには４種のタンパク質（ＧＰＣ、ＮＰ（またはｄＮ）、Ｚ、およびＬ）に対して４つのコード領域があり、これら４種のタンパク質のそれぞれは自身の非コード領域を持つ。この方法では、合計２８３個のガイドを試験した。ＧＰＣ：非コード領域に１１個のガイド、コード領域に３２個のガイド；ＮＰ：非コード領域に１２個のガイド、コード領域に３５個のガイド；Ｚ：非コード領域に４個のガイド、コード領域に７個のガイド；Ｌ：非コード領域に４９個のガイド、コード領域に１３３個のガイド。それぞれのｇＲＮＡのスペーサー配列、ＬＣＭＶゲノム内の相対位置、およびＬＭＣＶ遺伝子を以下の表２１に示す。
【表２１】
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【０５２２】
選別を行うため、リポフェタミン２０００を用いて、ＢＦＰ蛍光と共にＣａｓ１３ａをコードするプラスミドおよび１つのガイドをコードするプラスミドと一緒にＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を逆形質移入した。また、１つの空ベクターおよび２つの非標的ガイドの３つの対照ガイドを形質移入した。形質移入の２４時間後、細胞を多重感染度１で１時間ＧＦＰ発現ＬＣＭＶに感染させた。次いで、ＧＦＰ蛍光度によって測定されたように、感染の４８時間後にウイルスの複製を測定した（逆形質移入の７２時間後）。ウイルス複製を低減するガイドの画分を図７１および以下の表２２に示す。ＧＦＰ蛍光度の倍率変化で測定されるように、ウイルスの低下量を図７２に示す。図７３は、ＧＦＰの低下を示す代表画像を示している。図７４から明かであるが、標的ガイドはＬＣＭＶゲノムに沿ってかたまっている。
【表２２】
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【表２３】
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実施例５  ジカｃＤＮＡ、ＲＮＡ、およびウイルス粒子の検出限界の決定
【０５２３】
ジカウイルス特異的ＲＰＡプライマーおよびジカウイルス特異的ｃｒＲＮＡによるＳＨＥＲＬＯＣＫ法を用いてジカｃＤＮＡ、ＲＮＡ、およびウイルス粒子の検出限界を決定した。
【０５２４】
ｃＤＮＡを検出するため、ウイルス種保存液由来のジカウイルスｃＤＮＡを水または尿で希釈した。熱不活性を行って臨床試料中のウイルス粒子の熱不活性処理を模倣し、ヒトの尿中に存在するＲＮＡを不活性化した。ＲＰＡを２０分行って、次いでＣａｓ１３ａ検出を行った。棒グラフに示す蛍光度は１時間後に測定したものである（図７７Ａ）。
【０５２５】
ＲＮＡを検出するため、ウイルス種保存液由来のジカウイルスＲＮＡを水、尿、または予め熱とＲＮＡ分解酵素で不活性化した尿で希釈した。熱処理前に、熱とＲＮＡ分解酵素で不活性化した健康な尿に対してＴＣＥＰ／ＥＤＴＡを加える。この処理は、ＲＮＡの分解を防止するためのＲＮＡ分解酵素の不活性の重要性を示すものである。ＲＴ−ＲＰＡを２０分行って、次いでＣａｓ１３ａ検出を行った。棒グラフに示される蛍光度は１時間後に測定したものである（図７７Ｂ）。
【０５２６】
ウイルス粒子を検出するため、細胞培養物の上澄みに由来するジカウイルス粒子をＰＢＳまたは尿で希釈した。次いで、ＴＣＥＰ／ＥＤＴＡと共に試料を熱とＲＮＡ分解酵素で不活性化し、２５分間熱処理した（５５℃で２０分、９５℃で５分）。この２工程の熱処理により、ウイルス粒子からＲＮＡを放出させる前に尿中のＲＮＡ分解酵素を不活性させることができる（ジカウイルス粒子は６５℃未満の温度で安定である）。ＲＮＡ分解酵素の不活性化後、９５℃の工程でウイルス粒子からＲＮＡを放出させる。ＲＴ−ＲＰＡを２０分行って、次いでＣａｓ１３ａ検出を行った。棒グラフに示す蛍光は１時間後に測定されたものである（図７７Ｃ）。
【０５２７】
ウイルス試料中の１ヌクレオチド多様体を以下のように検出した。試料は、変異体配列を標的するｃｒＲＮＡおよび野生型配列を標的するｃｒＲＮＡの両方で試験した。相対蛍光度を用いて存在するアレルを決定した（図７８Ａ）。
【０５２８】
図７８Ｂは、ＳＨＥＲＬＯＣＫ法で試験した３つのＳＮＰのゲノム位置を示す。簡略化した系統樹は、これらＳＮＰと２０１５年のジカウイルス大流行時に発生したＳＮＰとの関係を示している。
【０５２９】
図７８Ｃに示すグラフは、２０１５年のジカウイルス大流行時に発生した異なるＳＮＰと、ＳＮＰが発生した場所に対応している。各棒は、変異多様体または野生型多様体のいずれかに対応する配列を持つ合成ｇブロック、祖先の配列を持つ種保存液に由来するｃＤＮＡ（すなわち、変異のない多様体）、または入力なし（水）のいずれかを表している。各試料を２０分間のＲＰＡで増幅した。棒は検出反応の１時間後の蛍光を表す。濃い影の棒は、変異体ｃｒＲＮＡを検出反応に用いた場合に測定された蛍光度を表し、薄い影の棒は、野生型ｃｒＲＮＡを用いた時に測定された蛍光度を表す。
【０５３０】
ｃＤＮＡは３つの臨床試料に由来していた。２０１５年のジカ大流行のそれぞれの場所に関連付けられたもの、および祖先の配列を持つ種保存液に由来するｃＤＮＡ（変異のない多様体）を変異体ｃｒＲＮＡと野生型ｃｒＲＮＡで試験した。図７８Ｄに示すグラフは、１時間後の変異体ｃＲＮＡと野生型ｃＲＮＡの蛍光度の比を表す。比が１より大きいことは、変異体ｃｒＲＮＡの蛍光度が野生型ｃｒＲＮＡの蛍光度よりも高いことを示しており、従って、試験した試料中に変異多様体が存在することを示している。紫色はDOMUSA SNP、橙色はUSA SNP、緑色はHND SNPである。
【０５３１】
図７８Ｅのヒートマップは、ｃｒＲＮＡのそれぞれに対する各試料について、図７８Ｄで示した蛍光度の比をｌｏｇ２変換したものを示している。０より大きい値は変異多様体の存在を示している。
【０５３２】
Ｓ１３９Ｎは、最近のジカ大流行時に観察された小頭症の表現型において役割を担ったと近年同定された多様体である(Yuan, L. 2017. Science)。図７８Ｆの各棒は、Ｓ１３９Ｎ多様体またはＮ１３９Ｓ多様体に対応する配列を持つ合成ｇブロック、Ｓ１３９Ｎ多様体を持つ種保存液に由来するｃＤＮＡ、または入力なし（水）の何れかを表している。各試料を２０分間のＲＰＡで増幅した。棒は、検出反応の１時間後の蛍光を表している。濃い影の棒は、Ｓ１３９Ｎ標的ｃｒＲＮＡを検出反応に用いた時に測定された蛍光度を表し、薄い影の棒は、Ｎ１３９Ｓ標的ｃｒＲＮＡを用いた時に測定された蛍光度を表す。本発明者らは、小頭症にこの多様体が関連付けられるという発表の１週間以内にＲＰＡプライマーガイドを設計して、それらを試験することができた。これは、本発明の方法の速度／即時性を強調するものである。
実施例６  デング熱ウイルスのＳＨＥＲＬＯＣＫパネル
【０５３３】
多血清型デング熱ＳＨＥＲＬＯＣＫパネルが図７９Ａに示されている。デング熱に特異的な１組のＲＰＡプライマーをＲＰＡに用いる。次いで、ＲＰＡ反応液を４つの反応液に分けて（血清型に特異的なガイドが各反応液中にある）、デング熱ウイルスの４つの血清型を区別することができる。図７９Ｂでは、ｘ軸の各目盛りは、ＳＨＥＲＬＯＣＫ反応の入力として用いられたｇブロック鋳型を表す。各鋳型を１組のＲＰＡプライマーと共に増幅し、次いで、各ＲＰＡ反応液をｃｒＲＮＡのそれぞれ（DENV1 crRNA、DENV2 crRNA、DENV3 crRNA、およびDENV4 crRNA）に対して試験した。ＲＰＡ反応を２０分行った。棒グラフに示す蛍光度は３時間後に測定したものである。紫色の各影は血清型に特異的なｃｒＲＮＡを示している。この棒グラフの別の表示形態が図７９Ｃにｌｏｇ１０目盛りの蛍光度として示されている。
実施例７  様々なフラビウイルスのＳＨＥＲＬＯＣＫパネル
【０５３４】
図８０Ａは、フラビウイルスのＳＨＥＲＬＯＣＫパネルがどのように作用するかを示している。４つの異なる関係したフラビウイルスを増幅することができる１組のＲＰＡプライマーをＲＰＡに用いる。次いで、ＲＰＡ反応液を４つの反応液に分けて（ウイルスに特異的なガイドが各反応液にある）、ジカウイルス、西ナイルウイルス、デング熱ウイルス、および黄熱ウイルスの存在を区別することができる。図８０Ｂでは、ｘ軸の各目盛りはＳＨＥＲＬＯＣＫ反応の入力として用いられたｇブロック鋳型を表している。各鋳型を１組のＲＰＡプライマーと共に増幅し、次いで、ｃｒＲＮＡ（ZIKV crRNA、WNV crRNA、DENV crRNA、およびYFV crRNA）のそれぞれに対して各ＲＰＡ反応を試験した。ＲＰＡ反応を２０分行った。棒グラフに示した蛍光度は３時間後に測定したものである。各色は、ウイルスに特異的なｃｒＲＮＡを示している。図８０Ｃでは、ｘ軸の各目盛りは、共感染を検出するＳＨＥＲＬＯＣＫの能力を模倣するのにＳＨＥＲＬＯＣＫ反応の入力として用いられた２つのｇブロック鋳型を表す。各反応液を１組のＲＰＡプライマーと共に増幅し、次いで、ｃｒＲＮＡのそれぞれ（ZIKV crRNA、WNV crRNA、DENV crRNA、およびYFV crRNA）に対して各ＲＰＡ反応液を試験した。ＲＰＡ反応を２０分行った。棒グラフに示した蛍光度は３時間後に測定したものである。各色は、ウイルスに特異的なｃｒＲＮＡを示している。白色ブロックと灰色ブロックが交互になっており、各棒は、各ブロックに保存されたZIKV crRNA、WNV crRNA、DENV crRNA、およびYFV crRNAの順で試験したガイドから得られた蛍光度を表す。図８０Ｂおよび図８０Ｃの棒グラフで示した測定された蛍光度の別の表示形態がそれぞれ、図８１Ａおよび図８１Ｂに示されている。
実施例８  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ａによるウイルス診断
【０５３５】
本出願人らはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３検出プラットフォームＳＨＥＲＬＯＣＫを用いて尿から直接ジカウイルスを検出する、複数の病原性ウイルスを区別する、かつ臨床的に適切な適応変異を同定する。
【０５３６】
最近のウイルス大流行は、特に臨床実験室から離れた地域でウイルス感染を診断するという大きな課題を浮き彫りにした。ウイルス診断は、２０１６年のＺＩＫＶ大流行にはとりわけ困難であった。というのも、一部にはＺＩＫＶはヒトの試料中に少ない滴定量で維持され、一過性感染であるためである。既存の診断技術の限界の結果、ウイルスが何ヶ月も循環した後に初めての症例が臨床的に確認された(Metsky et al. 2017)。例えば、核酸の検出は非常に高感度で、素早く適応可能であるが、広範囲な試料操作および高価な機器が要求される。これに対して、抗原および抗体による試験は、高速で最低限の装置を必要とするが、感度が低く、開発するのに数ヶ月もかかる場合がある。理想的な診断は、核酸診断法の感度、特異性、および柔軟性と抗原による試験の低コストおよびスピードとを組み合わせることである。そのような診断法であれば出現しつつあるウイルス大流行を前にして速やかに開発・配備することができ、野外での疾患の監視に好適であろう。
【０５３７】
本明細書では、本出願人らはＣａｓ１３に基づいた核酸検出プラットフォームＳＨＥＲＬＯＣＫ（Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing＝特定高感度酵素レポーターアンロッキング）を用いてウイルス診断法を開発する（図８２Ａ）。ＲＮＡ誘導リボヌクレアーゼＣａｓ１３は、副次切断により信号を１，０００倍超増幅することができ、ｃｒＲＮＡ：標的対に基づいて特異性を高める。また、Ｃａｓ１３は、順応性の高いウイルス診断プラットフォームを可能にする。というのは、単にｃｒＲＮＡ配列を変更するだけで新しいウイルス病原体または変異を標的することができるからである。リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）を用いてＣａｓ１３ａを上流の等温増幅と対にすることで、高価な機器という要件なしでその感度をさらに高められる。ＳＨＥＲＬＯＣＫプラットフォームを用いて、本出願人らは体液から直接ウイルスを検出し、ウイルスパネルを作成して複数のウイルス種および株を区別し、臨床的に適切な変異を同定する診断法を開発する。
【０５３８】
本出願人らはまず、ＺＩＫＶ用のＳＨＥＲＬＯＣＫアッセイの感度を調べ(Gootenberg et al. 2017)、それがZIKV cDNAに対して１コピー（１ｃｐ）感度を持っていることを決定した（図８６）。本出願人らは、２０１６年のＺＩＫＶ大流行に由来する試料に由来する１組４０個のｃＤＮＡでＳＨＥＲＬＯＣＫの性能を評価した（図８２Ｂ、図８７）。これは、ＺＩＫＶを持つ患者由来の３７個の試料（１３個の血漿試料、１３個の血清試料、および１１個の尿試料）と蚊の供給源由来の３個の試料を含んでいた。本出願人らは、３７個の臨床試料のうち２５個（６８％）、３個の蚊の供給源のうち３個（１００％）からｃＤＮＡ中のＺＩＫＶを検出することができた。本出願人らは、これら４０個のｃＤＮＡ試料について、より多くの増幅産物を含むＰＣＲ法とＳＨＥＲＬＯＣＫ検出とを比較した。ＰＣＲ法では、ZIKV cDNAをタイルして、３５個の標的部位を含む２つの異なるＰＣＲプライマー供給源を用いて増幅する(Quick et al. 2017)（図８２Ｃ）。本出願人らは、Agilent Tapestationを用いてこれらの増幅産物ＰＣＲ生成物を定量し、ＺＩＫＶの有無（赤色の破線）を決定する閾値を選択して、ゲノム配列カバレッジによって測定される精度を最大にした（図８８、詳細は「方法」を参照のこと）。少なくとも１つの方法を用いて陽性だった３２個の試料のうち、２５個は７８％の一致率で両方の方法で陽性であった（ベン図を参照のこと）。増幅産物ＰＣＲによって全ゲノムをタイルしたにもかかわらず、また増幅産物ＰＣＲの入力容積（２．５μｌ）がＳＨＥＲＬＯＣＫ（１μｌ）よりも大きかったにもかかわらず、いずれの方法も同じ性能を持っていた。これらの結果は、ＳＨＥＲＬＯＣＫの感度と、臨床試料へうまく応用できることを示している。
【０５３９】
核酸抽出は時間がかかり、専門家の知識を必要とし、しばしば野外では実行可能ではない。従って、本出願人らは、抽出なしに尿から核酸を増幅して検出することができるＳＨＥＲＬＯＣＫ試験規約を開発した。本出願人らは、熱と化学還元の組合せを用いて、ウイルス粒子を溶解し、尿中に１μｇ／ｍｌ存在しているＲＮＡ分解酵素を不活性化した（図８９）(Weickmann and Glitz 1982)。本出願人らは、この処理した尿を希釈せずにＲＰＡへの入力として直接用いた。この方法は、尿で希釈したZIKV cDNAの１コピー検出を可能にした（図８３Ａ）。ZIKV RNAを未処理の尿で希釈すると、感度は３．６ｆＭ（１，８００ｃｐ／μｌ）まで低下したが、これはＲＮＡ分解酵素の分解によるものと思われる（図８３Ｂ）。処理した尿でZIKV RNAを希釈すると、水と同程度の高い感度（３６ａＭすなわち１８ｃｐ／μｌ、図９０）で検出することができた。当然、ZIKV RNAは、ＲＮＡを分解から守るウイルス粒子に包含されている。本出願人らは、２工程の熱不活性試験規約を開発した。まず、試料をＺＩＫＶ粒子の融解温度以下に加熱して、ＲＮＡ分解酵素を不活性化し、９５℃で５分間加熱してウイルス粒子を溶解して不活性化する（図９１）(Muller et al. 2016)。これにより、２時間未満で２０ａＭ（１０ｃｐ／μｌ）と感染性粒子からＺＩＫＶを高感度で検出することができた（図８３Ｃ）。尿中で６ａＭ（３ｃｐ／μｌ）の感度を達成するため、本出願人らは合計所要時間が４時間未満に対して３時間の検出工程を用いた（図８３Ｃ、はめ込み）。
【０５４０】
多くの遺伝的、抗原的に類似したフラビウイルスはアメリカおよびアフリカ内で共循環している。従って、本出願人らは、関連するウイルス種を検出してウイルス血清型を区別する診断パネルを開発することでＳＨＥＲＬＯＣＫを拡張した。実験室で開発されたプローブ設計アルゴリズムを用いて、本出願人らは、汎用フラビウイルスＲＰＡプライマー領域として機能するのに十分に保存されたＺＩＫＶ、デング熱ウイルス（ＤＥＮＶ）、西ナイルウイルス（ＷＮＶ）、および黄熱ウイルス（ＹＦＶ）内の領域を素早く同定することができる。このように、１対のＲＰＡプライマーは４種のウイルスの何れかを増幅することができ、種に特異的なｃｒＲＮＡは所与の試料中に存在する１種またはそれ以上のウイルスを検出することができる（図８４Ａ）。本出願人らは、汎用フラビウイルスＲＰＡプライマーを見出して、ウイルスに特異的なｃｒＲＮＡは、合成ＺＩＫＶ、ＤＥＮＶ、ＷＮＶ、およびＹＦＶ  ＤＮＡ標的の存在を０．２２％未満の交差反応性で非常に特異的に検出することができた（図８４Ｂ、図９２）。このアッセイはまた、すべての対の組合せのフラビウイルスの存在を検出することができる。これはこのアッセイの模造共感染を検出する能力を示している（図８４Ｃ、図９３）。関連するウイルスを特異的に検出することに加えて、本出願人らは、ＤＥＮＶに特異的なＲＰＡプライマーおよび血清型に特異的なｃｒＲＮＡを用いて異なるＤＥＮＶ血清型を区別するＳＨＥＲＬＯＣＫパネルを設計した（図８４Ｄ）。本出願人らは、３．２％未満の交差反応性でＤＥＮＶ血清型１〜４を区別することができた（図８４Ｅ、図９４）。従って、ＳＨＥＲＬＯＣＫは、ウイルスまたは血清型に特異的なＲＰＡプライマーを必要とせずに関連するウイルスまたは血清型を検出して区別するように拡張することができる。
【０５４１】
ＳＨＥＲＬＯＣＫは、野外配備可能な多様体の同定のために固有に準備される。一塩基多型（ＳＮＰ）同定は、典型的には、広範囲の試料処理を必要とする配列決定技術の使用を含み、野外に配備するのは難しい。ｃｒＲＮＡの３番目の位置にＳＮＰ、ｃｒＲＮＡの５番目の位置に合成による不一致を置いてＳＨＥＲＬＯＣＫをＳＮＰの同定に用いてもよい（図８５Ａ）(Gootenberg et al. 2017)。本出願人らは、２０１６年のＺＩＫＶ大流行に由来する３つの地域に特異的なＳＮＰのためのＳＨＥＲＬＯＣＫ診断法を設計した（図８５Ｂ）。本出願人らは、合成した標的および祖先のウイルス種保存液についてこれらアッセイのそれぞれの性能を立証した（図８５Ｃ）。試料の遺伝子型を決定するため、本出願人らは、由来ｃｒＲＮＡの蛍光度（図８５Ａ、濃い影の棒）と祖先ｃｒＲＮＡの蛍光度（図８５Ａ、薄い影の棒）の比を取る。この比は、ＳＮＰを含む試料では１より大きくなり、ＳＮＰを含まない試料では１より小さくなる。本出願人らは、ホンジュラスおよびドミニカ共和国の患者に由来するｃＤＮＡ試料と、米国由来の蚊の供給源に対してＳＮＰアッセイを試験した（図８５Ｄ）。本出願人らは、棒グラフ（図８５Ｄ）およびヒートマップ（図８５Ｅ）に示されるように期待された蛍光度の比を観察した。これらの結果は、ＳＨＥＲＬＯＣＫの１ヌクレオチドの特異性を強調するものである。
【０５４２】
最後に、本出願人らは、ＳＨＥＲＬＯＣＫを素早く適応して出現しつつある機能的変異を同定することができることを示した。胎児の小頭症に寄与するｐｒＭ（Ｓ１３９Ｎ）のＺＩＫＶ点変異を記載する報告(Yuan et al. 2017)が発表されて１週間以内に（図９５）、本出願人らは、核酸配列をＳ１３９Ｎ変異の有無で区別することができるＳＨＥＲＬＯＣＫ診断法の設計、注文、および試験に成功した（図８５Ｆ）。本出願人らは、１３９Ｓアレルと１３９Ｎアレルも区別することができる代替えのｃｒＲＮＡ設計（合成による不一致なし、位置７でのＳＮＰ）を試験した（図９６）。臨床的に適切な変異に対して新しいＳＨＥＲＬＯＣＫ診断法を容易に開発できることをさらに示すため、本出願人らは、ＨＩＶ逆転写酵素で最も一般的に観察される６個の薬物耐性変異についてのアッセイを１週間で開発した（図９７）。これらの開発は、ＳＨＥＲＬＯＣＫプラットフォームの適応性および特異性を強調するものである。
【０５４３】
本出願人らは、感度、スピード、使いやすさ、ウイルス診断パネルを多重化する能力、および臨床的に適切なＳＮＰの遺伝子型を決定する能力を含むウイルスＳＨＥＲＬＯＣＫ診断法の様々な有用な特徴を示した。短い所要時間と試料処理に対する低い要件により、近い将来ＳＨＥＲＬＯＣＫの野外検査が可能になるであろう。また、ＳＨＥＲＬＯＣＫ診断法は、出血熱、性感染症、および呼吸器疾患、ならびに出現しつつあるウイルス病原体を含む様々なウイルス性疾患に対して容易に開発される。
実施例８  方法
【０５４４】
臨床試料／倫理についての陳述。本研究に用いられた臨床試料は、la Plaza de la Salud（ドミニカ共和国サントドミンゴ）のInstitutional Review Boards/Ethics Review Committees、Florida Department of Health（フロリダ州タラハシー）、およびUniversidad Nacional Autonoma de Honduras（ホンジュラス、テグシガルパ）で評価および承認された臨床研究に由来している。マサチューセッツ工科大学（ＭＩＴ）のInstitutional Review Board/Ethics Review CommitteeおよびOffice of Research Subject Projection at the Broad Instituteは、上に示した機関によって採取された試料の使用を承認した。
【０５４５】
ＬｗＣａｓ１３ａおよびｃｒＲＮＡの作製ＬｗＣａｓ１３ａを記載の通り精製した (Gootenberg et al. 2017)。１倍のＴａｑ反応緩衝液（NEB）中の最終濃度を１０μＭとしてcrRNA DNA鋳型をＴ７プロモーターオリゴヌクレオチドにアニールした。これは、９５℃、５分間の変性を含み、次いで１分間に５℃で４℃まで下げてアニールした。HiScribe T7 High Yield RNA合成キット（ＮＥＢ）を用いてｃｒＲＮＡを生体外で転写した。短いＲＮＡ転写物について製造者の指示に従って容積を３０μｌまでスケールアップして転写を行った。反応液を３７℃で一晩インキュベートした。反応容積の２倍の比でRNAClean XPビーズ(Beckman Coulter)を用いて、さらに１．８倍のイソプロピルアルコールを補充し、転写物を精製した。
【０５４６】
試料の調製製造者の指示に従い、担体ＲＮＡを有するQIAamp Viral RNAミニキット(QIAGEN)を用いて、１４０μｌの入力材料からウイルスのＲＮＡを抽出した。試料を６０μｌで溶出し、−８０℃で保存した。
【０５４７】
既に公開されている方法(Matranga et al. 2014)を用いて、ｃＤＮＡを作製するため、５ｕＬの抽出したＲＮＡを一本鎖ｃＤＮＡに変換した。手短に言うと、SuperScript IIIおよびランダムヘキサマープライマーでＲＮＡを逆転写した。次いで、ＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖をＲＮＡ分解酵素Ｈで分解した。
【０５４８】
ＺＩＫＶ検出実験で１つの培養単離物ＺＩＫＶペルナンブコ（単離物ＰＥ２４３、ＫＸ１９７１９２．１）を陽性対照または祖先の配列の対照として用いた。ウイルスＲＮＡを種保存液試料から取り出した。
【０５４９】
ＴＣＥＰ／ＥＤＴＡを加えて試料を加熱することで尿試料のＲＮＡ分解酵素による不活性を行った。ＴＣＥＰおよびＥＤＴＡをそれぞれ、最終濃度１００ｍＭおよび１ｍＭで尿試料に加えた。２つの試験規約を用いた：９５℃で１０分間の１工程の不活性、あるいは５０℃で２０分間、次いで９５℃で５分間の２工程の不活性。熱サイクラー(Eppendorf MasterCycler)または乾燥熱ブロックを用いて不活性化を行った。
【０５５０】
ＲＰＡ反応およびプライマー設計ＲＰＡ反応でTwist-Dx RT-RPAキットを製造者の指示に従って用いた。プライマー濃度は４８０ｎＭであった。ＲＮＡを含む増幅反応ではMurine ＲＮＡ分解酵素阻害剤(NEB M3014L)を１マイクロリットルあたり２単位の最終濃度で用いた。
【０５５１】
ＺＩＫＶ検出では、最近の出版物(Gootenberg et al. 2017)に由来するＲＰＡプライマーRP819/RP821を用いた。フラビウイルスパネルではＲＰＡプライマーFLAVI-NS5fwd-1/FLAVI-NS5rev-1を用いた。デング熱ウイルスパネルではＲＰＡプライマーDENV-3UTRfwd-1/DENV-3UTRrev-1を用いた。地域に特異的なジカＳＮＰ検出ではＲＰＡプライマーDOMUSA-5249-fwd / DOMUSA-5249-rev (DOMUSA5249 SNP)、USA-935-fwd / USA-935-rev (USA935 SNP)、およびHND-2788-fwd / HND-2788-rev (HND2788 SNP)を用いた。小頭症に関連付けられたジカＳＮＰの検出では、ＲＰＡプライマーZIKV-mcep-fwdおよびZIKV-mcep-revを用いた。ＨＩＶ逆転写酵素の薬物耐性ＳＮＰの検出ではＲＰＡプライマーHIVRT-149F / HIVRT-348R(K65R、K103N、およびV106M SNP)、およびHIV-462F / HIVRT-601R(Y181C、M184V、およびG190A SNP)を用いた。
【０５５２】
Ｃａｓ１３ａ検出反応およびｃｒＲＮＡ設計１００ｎｇの代わりに２５ｎｇの背景ＲＮＡを用いた以外は上記の通り検出反応を行った(Gootenberg et al. 2017)。これにより、レポーターオリゴヌクレオチドの如何なる擬似切断も導入せずに反応速度を高められる。特に断りがなければ、ＲＮＡ分解酵素Alert v2(Thermo)をレポーターとして用いた。Biotekマイクロプレートリーダー(Synergy H4、Neo2、およびCytation 5)を検出反応の蛍光度を測定するのに用いた。４８５ｎｍの励起、５２０ｎｍの放出で単色光分光器を用いて、３時間まで５分ごとに読み取って蛍光動力学を監視した。異なる機械間の感度に有意な差は見られなかった。
【０５５３】
ＺＩＫＶ検出では、最近の出版物に由来するｃｒＲＮＡ「ジカ標的ｃｒＲＮＡ２」(Gootenberg et al. 2017)を用いた。フラビウイルスパネルでは、ｃｒＲＮＡのZIKV-NS5at9227(ZIKV)、DENV-NS5at9127(DENV)、WNV-NS5at9243(WNV)、およびYFV-NS5at9122(YFV)を用いた。デング熱ウイルスパネルでは、crRNAのD1-3UTRat10457(DENV1)、D2-3UTRat10433(DENV2)、D3-3UTRat10419(DENV3)、およびD4-3UTRat10366(DENV4)を用いた。地域に特異的なジカＳＮＰ検出では、ｃｒＲＮＡのDOMUSA-5249-祖先 / DOMUSA-5249由来(DOMUSA5249 SNP)、USA-935-祖先 /USA-935由来(USA935 SNP)、およびHND-2788-祖先 / HND-2788由来(HND2788 SNP)を用いた。小頭症に関連付けられたジカＳＮＰの検出では、ｃｒＲＮＡのZIKV-mcep-snp3syn5-祖先/ ZIKV-mcep-snp3syn5由来（図８５Ｆに示される設計）、およびｃｒＲＮＡのZIKV-mcep-snp7-祖先/ ZIKV-mcep-snp7由来（図９６に示される設計）を用いた。ＨＩＶ逆転写酵素の薬物耐性ＳＮＰの検出では、ｃｒＲＮＡのHIVRT-K65R-祖先 / HIVRT-K65R由来(K65R SNP)、crRNAs HIVRT-K103N-祖先 / HIVRT-K103N由来(K103N SNP)、crRNAs HIVRT-V016M-祖先 / HIVRT-V106M由来(V106M SNP)、crRNAs HIVRT-Y181C-祖先 / HIVRT-Y181C由来(Y181C SNP)、crRNAs HIVRT-M184V-祖先 / HIVRT-M184V由来(M184V SNP)、およびcrRNAs HIVRT-G190A-祖先 / HIVRT-G190A由来(G190A SNP)を用いた。
【０５５４】
データ分析最少の蛍光が観察された１０分後（図８２〜図８４）または２０分後（図８５）の蛍光度の値を減じて背景の補正を行った。フラビウイルスパネルとデング熱ウイルスパネルの両方で、背景を補正した蛍光度を標的に特異的な蛍光度に正規化した。標的に特異的な蛍光度は、各時点の所与のｃｒＲＮＡを持つ所与のＤＮＡ標的の背景補正済み蛍光度から減じた同じｃｒＲＮＡを持つ入力なし（水）対照の背景補正済み平均蛍光度である。
【０５５５】
２０１６年の大流行由来のＺＩＫＶ試料の分析では（図８２）、閾値を用いてＺＩＫＶの有無を決定した。１提供者からの健康なヒトの尿試料を４つと入力のない水対照を１つという５つの試料から背景を減じた蛍光度を用いてＳＨＥＲＬＯＣＫ蛍光度の閾値を決定した。つまり、これら５つの試料それぞれについて、本出願人らは、３つの技術的に同じ試料に亘って蛍光度の平均ｍｓおよび標準偏差σｓを取った。閾値は、５つの値の｛ｍｓ＋３σｓ｝の中心値に設定した。ゲノム組立体からの情報を用いて増幅産物ＰＣＲ収率の閾値を決定した。まず、２つの増幅産物ＰＣＲ供給源のそれぞれから最低濃度を取って各試料の増幅産物ＰＣＲ収率を算出した（図８７Ａ）。次いで、目的は、ゲノムの特定の標的部分ｒが試料（この場合は、本出願人らがＳＨＥＲＬＯＣＫで検出するＲＰＡ増幅産物）中に存在するか否かを決定することである。特定の標的部分ｒが試料ｓ中に存在する確率Ｐｒｓ（ｒ）は、試料ｓのｃＤＮＡから配列して組み立てたＺＩＫＶゲノムの画分として見積もられてもよい（ゲノムに亘る確率の計算は、部分ｒでゲノムのカバレッジがあるか否かを単に調べるのが好ましい。カバレッジがないことが特定の標的部分ｒが存在しないことを必ずしも示していないからである）。この分析のデータは、ＺＩＫＶ大流行の最近のゲノム配列決定研究に由来する個々の技術的に同じ試料に由来する(Metsky et al. 2017)。増幅産物ＰＣＲ収率とカバーされたゲノムの画分のプロットを図８７Ｂに示す。値Ｐｒｓ（ｒ）を用いて、閾値の各選択に対する精密度と呼び戻しを見積もってもよい。特に、特定の標的部分ｒを持たない試料の数の見積もりは、すべての試料のＰｒｓ（ｒ）の和である。同様に、増幅産物ＰＣＲ収率が所定の閾値を超える試料Ｐをｒが存在するものとして正しく標識化し、試料Ｐ中のＰｒｓ（ｒ）の和として見積もる。図８７Ｃは、閾値の各選択に対する精密度と呼び戻し、およびＦ０．５スコアを示す。Ｆ０．５スコアは、ＺＩＫＶの標的部分を持つ試料を正確に分類する閾値の能力を考慮した複合測定基準値である。増幅産物ＰＣＲ収率の閾値はＦ０．５スコアが最大になるように設定されている。
【０５５６】
ＳＮＰの同定では、祖先標的ｃｒＲＮＡおよび由来標的ｃｒＲＮＡを用いて背景を減じた蛍光度の値を算出した。本出願人らは、由来標的ｃｒＲＮＡの背景を減じた蛍光度の祖先標的ｃｒＲＮＡの背景を減じた蛍光度に対する比を取ってＳＮＰの有無を決定した。ＨＩＶのＳＮＰ（図９７）では、本出願人らは、ＳＮＰ同定指標を算出した。この指標は由来アレルの蛍光度の比を祖先アレルの蛍光度の比で除した比である。ＳＮＰ同定指標は、２つのアレル間に特徴的な力がなければ１に等しく、２つのアレルの蛍光度の比が異なるほど高くなる。
【０５５７】
ＺＩＫＶ検出実験ＰＥ２４３種保存液のｃＤＮＡを保存液濃度６．８×１０４ｃｐ／ｕｌで用いた。ｃＤＮＡを超純水(Life Technologies)または健康な尿(Lee Biosolutions)で１：１０に連続希釈した。４〜８μｌの各試料を不活性化して、１〜２μｌをＲＰＡ反応の入力として用いた。ＰＥ２４３種保存液のＲＮＡ２．７２×１０５ｃｐ／ｕｌで用いた。ｃＤＮＡを超純水(Life Technologies)または健康な尿(Lee Biosolutions)でＲＮＡを連続希釈した。４〜８μｌの各試料を不活性化して、１〜２μｌをＲＰＡ反応の入力として用いた。
【０５５８】
培養した単離物、株ＰＲＶＡＢＣ５９（ＫＵ５０１２１５）をウイルス粒子実験に用いた。ＰＲＶＡＢＣ５９は昆虫で培養した。非ヒト霊長類細胞株および元の保存液はATCC (ATCC VR-1843)から購入した。
【０５５９】
ウイルスのパネル実験フラビウイルスパネルおよびデング熱ウイルスパネルの両方で、合成により生成させたＤＮＡ鋳型を１０４コピー／μＬの濃度で入力として用いた。試験したｃｒＲＮＡのそれぞれの陰性対照として入力なし（水）対照を用いた。すべての実験で、ＲＰＡ反応のＭｇＡｃ濃度を２０ｍＭまで高めて、３つの技術的に同じ試料を用いた。
【０５６０】
フラビウイルスパネルでは、ＺＩＫＶ鋳型配列を(KX197192)、DENV(NC_001477.1)、ＷＮＶ(NC_09942.1)、およびYFV(AY968065.1)から生成させた。ＲＰＡ反応により、これらフラビウイルスのＮＳ５の一部を増幅する。
【０５６１】
デング熱ウイルスパネルでは、ＤＥＮＶ１鋳型配列を(KM204119.1)、DENV2(KM204118.1)、DENV3(KU050695.1)、DENV4(JQ822247.1)から生成させた。ＲＰＡ反応によりＤＥＮＶ１〜４の３’非翻訳領域の一部を増幅する。
【０５６２】
ＳＮＰ同定実験。祖先または由来アレルを持つ地域に特異的なＳＮＰの同定では、ＺＩＫＶゲノムの４００ｎｔ断片を含む合成鋳型を用いてＳＮＰ同定アッセイの性能を立証した。また、３つの国（米国、ホンジュラス、およびドミニカ共和国）に由来するＺＩＫＶ  ｃＤＮＡ試料を用いて蚊の供給源および臨床試料に対する性能を確認した。ＰＥ２４３種保存液ｃＤＮＡ（ＫＸ１９７１９２．１）を３００ｃｐ／μｌで外集団対照として用いた。また、入力なし（水）対照を用いた。小頭症に関連付けられたＳＮＰの同定実験では、祖先または由来のアレルを持つＺＩＫＶゲノムの４００ｎｔ断片を含む合成鋳型を１０４ｃｐ／μｌで用いて、ＰＥ２４３種保存液のｃＤＮＡを３００ｃｐ／μｌで用いた。ＨＩＶ薬物耐性ＳＮＰの同定実験では、祖先または由来のアレルを持つＨＩＶゲノムの４６８ｎｔ断片を含む合成鋳型を１０４ｃｐ／μｌで用いた。すべてのＳＮＰ同定実験で、３つの技術的に同じ試料を用いた。
実施例９  プログラム可能なＣａｓ１３に基づく抗ウイルス治療法およびコンパニオン診断法
【０５６３】
感染性疾患は我々の健康と安全を脅かすが、代表的な基準診断および治療はその有効性が限定されており、何十年も前の古い科学とシステムに基づいている。伝染病の大部分は診断と治療がなされず、大流行の診断には時間がかかりすぎる。核酸による診断法は１１種のウイルスにのみ承認されており、９種のウイルス性疾患のみがＦＤＡ承認抗ウイルス治療法によって対処することができる(De Clercq and Li, 2016)。これは、我々が診断および治療することができるのは、ヒトに感染すると分かっているウイルス病原体の１０％未満であるという意味である(Hulo et al., 2011)。さらに、ウイルスは治療に対して急速に耐性を進化させて、既存の抗ウイルス手段の有効性を限定的にすることがある。世界のどこでも感染症を素早く正確に診断し、既知または新規の感染による脅威を同定・追跡し、診断法によって知り得る抗ウイルス治療を開発することができる新たなツールを開発する緊急の必要性がある。
【０５６４】
本出願人らは、特異的なＲＮＡ配列を検出して切断するのに用いることができるCRISPR-Cas13系を近年発見し、伝染病に対するそれらの可能性のある用途を示した(Abudayyeh et al., 2016; Gootenberg et al., 2017)。Ｃａｓ１３は、病原体核酸などのＲＮＡ標的の認識時にリボヌクレアーゼ活性を示すＲＮＡ誘導ＲＮＡ標的ＣＲＩＳＰＲエフェクターである。ウイルスＲＮＡを直接標的するCRISPR-Cas13系をプログラムすることで、本出願人らは高度に多重化された抗ウイルス治療法およびウイルス診断法を開発することができる。従って、CRISPR-Cas13系はＲＮＡウイルスに適用するように準備されており、定量ＰＣＲ診断法およびｓｈＲＮＡ治療法に対するより特異的な代替えとなり得る。
【０５６５】
本明細書で、本出願人らは、ウイルス感染した患者の診断および治療の上記の欠点に対処する新たな方法を提供する。本出願人らは、Ｃａｓ１３に基づく系を用いて、ウイルスの脅威を無効にし、薬物耐性の進化を防ぐプログラム可能な治療法を開発する。また、本出願人らは、特異的な多型（例えば、薬物耐性変異）を含む特異的な病原体配列を同定する高速で高感度、低コストのコンパニオン診断法を作る。これにより、ウイルス複製を阻害する強力な適応性の方法が示され、新たな診断法および治療用途を開発するためのＣａｓ１３の重要性が強調される。より広くは、類似の手法は、Ｃａｓ１３に基づく系を感染因子を素早く同定し患者を治療するための新たな最先端ツールとして位置付けることができる。
【０５６６】
抗ウイルス薬物は最も新たに出現したウイルスに対しては存在しておらず、利用可能な直接作用する抗ウイルス剤（小分子、短鎖干渉ＲＮＡ、および抗体を含む）は典型的には、少数の高度に変異可能なウイルスタンパク質またはＲＮＡを標的する。これは問題である。というのは、ＲＮＡウイルスは急速に進化して、容易に既存の治療法に対する耐性を獲得することができるからである。Ｃａｓ１３に基づく系は、ウイルスＲＮＡを直接標的する、あるいは新規なウイルスまたは出現しつつある大流行の病原体を標的するように柔軟に適応可能で高度に多重化したプログラム可能な抗ウイルス治療法を提供する。Ｃａｓ１３に基づく治療法を、ウイルスに対して既存の抗ウイルス化合物が存在する場合はそのような抗ウイルス化合物と組合せて用いてもよい。これにより、特異的な薬物耐性変異の有病率を低減させることができる。おそらく最も重要なのは、ウイルスが特異的なＣａｓ１３ガイドＲＮＡ配列に対する耐性を発達させると、異なるガイドＲＮＡ配列に切り替える、または新たな変異を標的する新たなガイド配列を設計するのが容易なことである。このような方法は、Ｃａｓ１３に基づく治療法に対する耐性が広く展開することを防ぎ、現在の抗ウイルス治療法が直面する共通の課題に対処する。
【０５６７】
現在の代表的な基準による病原体診断法は、高価で時間がかかり、ウイルス感染を診断する十分な感度がないことが多い。ＲＴ−定量ＰＣＲなど、標準の分子増幅法は典型的には核酸抽出と高価な熱循環機器を必要とする。ＥＬＩＳＡなどの免疫アッセイは１つの標的のみを検出し、抗原的に類似の標的と交差反応することがあり、新たな出現しつつある脅威を処理するのに素早く開発または更新することができない。新規なＣＲＩＳＰＲ系プラットフォーム（ＳＨＥＲＬＯＣＫ）は、１分子検出感度および一塩基多型特異性でウイルス性疾患の診断を変えることができる(Gootenberg et al., 2017)。本出願人らは、ＳＨＥＲＬＯＣＫをコンパニオン診断としての使用に用いてＣａｓ１３に基づく治療法を知らせることができる。それをするため、本出願人らは、精製した核酸の代わりに直接の入力として臨床試料を用いる技術を採用することで高性能によって所要時間を１時間未満に下げることができる。さらに、本出願人らは、既知または予測される治療耐性変異を同定する特異的なＣａｓ１３に基づく治療法を開発する。これらの特徴により、Ｃａｓ１３に基づく治療法は治療での使用を補完することができる。
【０５６８】
治療法を開発Ｃａｓ１３に基づく系は、Ｃａｓ９で指摘されたように、可能性のある非標的効果に関する関心を高めることがある。Ｃａｓ９の多くの用途は、恒久性および遺伝性の変化をコードするＤＮＡで編集することができるその能力に関係している。これに対して、Ｃａｓ１３は異なる用途を持つ。というのはその標的であるＲＮＡとガイドに誘導された変化は遺伝性ではないからである。Ｃａｓ１３に誘導された変化は遺伝性ではないので、Ｃａｓ１３は、細胞内外のＲＮＡ分子を調節、検出、または画像処理するのに用いてもよい。これは、ウイルス性疾患を研究するツールとしてその強みを示すものである。
【０５６９】
本出願人らは、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）とインフルエンザという２つの哺乳類ウイルスの複製を効率的に阻害する１組のＣａｓ１３相同分子種および対応するガイドＲＮＡ配列を開発する。また、本出願人らはパイロット実験を行って、Ｃａｓ１３の送達法を試験し、Ｃａｓ１３の非標的活性の選別し、Ｃａｓ１３治療に応答したウイルスの進化およびガイドの耐性を研究する。本出願人らは、所要時間の短い向上した診断試験規約、インフルエンザを検出してインフルエンザＡ、Ｂ、およびＣを区別するためのアッセイの設計、および機器の不要な診断法のための側方流動アッセイを開発する。
【０５７０】
ＳＨＥＲＬＯＣＫ診断プラットフォームは、高速で、広スペクトルの野外配備可能な診断法として伝染病検査に革命をもたらす可能性がある。その技術的進歩および商業化の可能性の評価は、既存の一般的な診断法（例えば、免疫アッセイおよび核酸増幅法）の文脈に入れられている。従って、開発の段階でその性能測定基準（感度および特異性、結果が得られるまでの時間、１反応あたりのコスト、温度安定性、外因性装置要件、および使用と解釈の容易さを含む）を評価する。予め得られた結果は、ＳＨＥＲＬＯＣＫが既存のＦＤＡ承認病原体診断法に匹敵することを示唆している。
【０５７１】
この手法に関連する５つの主要な技術課題、すわなち、個々のガイドＲＮＡの有効性、ガイド耐性の進化、非標的ヌクレアーゼ活性、インフルエンザ複製の標的の容易さ、およびコンパニオンＣａｓ１３に基づく治療法の感度がある。
【０５７２】
第一の技術課題は、個々のガイドＲＮＡによりウイルスゲノムを標的する有効性を確実に高くすることである。プロモーターの強度によって決定される特定の速度でゲノムから作製されるメッセンジャーＲＮＡとは異なり、ウイルスゲノムは指数関数的に複製する。ウイルス複製を適切に阻害するためには、Ｃａｓ１３媒介切断活性は、新たなウイルスゲノムの合成速度に勝っていなければならない。本出願人らは２つの方法を採用して、この危険性を軽減し、有効性の高いゲノム切断を確実にすることができる。その２つの方法とは、Ｃａｓ１３相同分子種を選別してより高いヌクレアーゼ活性を持つ相同分子種を見つけること、およびウイルスゲノムを選別して最適なガイド配列を見つけることである。これらの結果を組み合わせてより高い標的効率を得てもよい。Ｃａｓ１３相同分子種のヌクレアーゼ活性を最適化して最適なガイド配列を選別することで、本出願人らは少なくとも１０倍までウイルス複製のノックダウンを達成することを計画する。複数のガイドを同時に組み合わせることで、本出願人らは少なくとも２０倍のウイルス複製のノックダウンを達成することを計画する。
【０５７３】
第二の技術課題は、ウイルスが、標的するガイドに対する耐性を発達させ得ることである。これは、標的部位の直接変異、あるいは標的切断の効果を補うゲノムの他の部分での変異の何れかにより起こり得る。ＲＮＡウイルスは、１世代につき１塩基あたり約１０−４個の置換という比較的高い変異率を持つことで知られている(Sanjuan et al., 2010)。ガイドＲＮＡは典型的にはウイルスゲノムの２８ヌクレオチドの領域を標的すると仮定すると、これは１つの標的領域で１つの変異が起きる確率は約３×１０−３であることを意味する。本出願人らは、これまでのＣａｓ１３の特徴付けから、１つの標的領域での２つの変異が標的切断を防ぐのに必要であることを知っている(Abudayyeh et al., 2016)。２つの変異が独立して起こると仮定すると、１つの領域で生じるガイド耐性の確率は約１０−５である。これらの計算は、ガイドを溜めることの重要性を示している。というのはガイドの供給源は耐性の進化の確率を倍数的にさらに低下させる（例えば、２個のガイドでは１０−１０、３個のガイドでは１０−１５）からである。ガイドを溜めることに加えて、本出願人らはＣａｓ１３による治療の前後でウイルス集団の配列決定を行って治療耐性の進化（存在する場合）をマップすることにより、この問題に特異的に対処する。
【０５７４】
第三の技術課題は、Ｃａｓ１３による非標的ヌクレアーゼ活性である。非標的ヌクレアーゼ活性は、動物モデルまたは患者での副作用を誘導することがあるため、懸念される。しかしながら、Ｃａｓ１３およびＣａｓ９による非標的切断の相対効果を区別することは重要である。Ｃａｓ９はＤＮＡを標的するので、任意の非標的切断事象は、影響を受けた細胞のゲノムに恒久的な変化をもたらす。しかしながら、Ｃａｓ１３はＲＮＡを標的するので、非標的切断は遺伝子の発現に対して一過性の効果のみを持つ。というのは、メッセンジャーＲＮＡの半減期は２４時間未満である傾向があるからである(Yang et al., 2003)。Ｃａｓ１３とＣａｓ９のこの対比にもかかわらず、本出願人らは、Ｃａｓ１３切断の有無で細胞のトランスクリプトームの配列決定を行い、Ｃａｓ１３の任意の非標的切断活性を測定することができる。具体的には、本出願人らは、配列決定により、ルシフェラーゼ転写物を標的するＣａｓ１３ガイドとｓｉＲＮＡの非標的効果を比較する。非標的効果がガイドに特異的であれば、本出願人らは最適な標的ガイドの非標的効果も評価する。本出願人らは、Ｃａｓ１３は、ｓｉＲＮＡの少なくとも１／２未満の非標的切断活性を持つと期待している。
【０５７５】
第四の技術課題は、インフルエンザＡを標的する能力である。ＬＣＭＶに比べて、インフルエンザＡは感染した細胞の核内でそのゲノムを複製し、そのゲノムはインフルエンザＡタンパク質に結合してリボ核タンパク質（ＲＮＰ）を形成する(Knipe and Howley, 2007)。本出願人らは、包括的な全ゲノム選別に進む前に、パイロット実験によりこれまでに公開されたｓｈＲＮＡ由来のいくつかのガイドによりインフルエンザＡの標的を最適化することができる(Wang et al., 2017; Huang et al., 2017; Stoppani et al., 2015; Xu et al., 2015; Wang et al., 2016; McMillen et al., 2016)。具体的には、本出願人らはＣａｓ１３の局所化を最適化（核対細胞質ゾル）して、プラスのセンスｍＲＮＡを標的するガイドの設計がより有効な方法であるか否かを区別することができる。というのはこのＲＮＡ種はＲＮＰから遊離して、より容易に標的され得るからである。これらの方法が目標とする標的効率を達成しない場合、本出願人らは、融合タンパク質の作製によりＣａｓ９の機能を変える方法同様、Ｃａｓ１３他のタンパク質と融合させてこれらＲＮＰを不安定にすることができる(Dominguez et al., 2016)。現在のインフルエンザに対する核酸標的法はｓｉＲＮＡを含んでおり、細胞培養モデルにおいて８０％〜９５％のノックダウンまたは少なくとも１／５のインフルエンザ複製の低減を示すと報告されている(Huang et al., 2017; Xu et al., 2015)。本出願人らは、インフルエンザを標的する１つまたは複数のガイドを用いてウイルス複製の低減を同程度かそれ以上、具体的には、５倍超に高めることができる。
【０５７６】
最終の技術課題は、コンパニオンＣａｓ１３による診断の感度である。これは、ウイルスが患者に広がる前に確実に検出されるために重要である。これは特に、治療耐性変異の文脈に関連する。治療耐性変異は、始めは低頻度で検出が難しいが、高頻度では検出しやすくなる。しかしながら、治療耐性変異が患者で高頻度になるまでに既に損傷が起こっている。より高感度であれば、高速Ｃａｓ１３診断でより素早い検出が可能になる。これらの理由から、本出願人らは、Ｃａｓ１３によるインフルエンザ診断に対して５０ａＭ（１マイクロリットルあたり２５コピー）という非常に厳密な閾値を設定した。この閾値は、鼻の拭い液中のインフルエンザＡ滴定量の中心値よりも実質的に低く、１マイクロリットルあたり１０４ＲＮＡコピーである(Ngaosuwankul et al., 2010)。
参考文献
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実施例１０  ウイルス性下痢疾患のＣａｓ１３ａ／Ｃ２ｃ２診断法の向上
【０５７７】
下痢疾患は毎年５０万件を越える死亡に関与し、その大部分は発展途上国の子どもである(Walker CL, Rudan I, Liu L, et al. Global burden of childhood pneumonia and diarrhoea（子どもの肺炎および下痢の世界的負担）. Lancet 2013;381:1405-16)。これらの疾患のうち、ロタウイルスは死亡率の主要な原因であり、ノロウイルスなどの他のウイルスは世界中で深刻な大流行を引き起こしている。これらの感染はしばしば診断がつかない、あるいは細菌と誤診断されて抗生物質による不適切な治療が行われ、患者の症状を悪化させ抗生物質耐性を促進する。この切迫した公衆衛生の課題に対処するため、ウイルス性下痢疾患の診断に高速で低コストの高感度試験が非常に必要である。
【０５７８】
本出願人らは、近年発見されたＲＮＡ誘導ＲＮＡ標的ヌクレアーゼＣａｓ１３ａ／Ｃ２ｃ２を用いて下痢疾患の診断法を作成することができる。診断は患者の治療において重要な最初の工程である。というのは、診断により医師は細菌感染とウイルス感染とを区別することができ、これによって治療計画に影響を及ぼすからである。ＳＨＥＲＬＯＣＫ（Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing＝特定高感度酵素レポーターアンロッキング）と言うＣＲＩＳＰＲ−Ｄｘプラットフォームはコールドチェーンに頼らず持ち運び可能な高感度かつ特異的な核酸検出ツールである。
【０５７９】
モデルとしてウイルス性下痢疾患を用いて、本出願人らは、ＳＨＥＲＬＯＣＫ技術に基づき高速で野外で用いることが可能な診断方法を作成することができる。多くの臨床設定で、診断が可能な場合でもウイルス性疾患の診断には４８時間以上かかる。合計アッセイ時間を１時間に短縮する、および蛍光による読み出しから比色分析出力に変えるなどを含むＳＨＥＲＬＯＣＫのいくつかの主要な技術的増強により、本出願人らは、簡単な熱ブロックを用いて実行し、臨床従事者が目視で分析することができる試験を作成することができる。これにより、高価で時間がかかり、試料の分解に繋がることもある集中型の検査実験室に試料を送る必要性を回避する。そのような遅延は特に地域的あるいは季節的な疾患大流行時には重要で、素早い公衆衛生応答により出現しつつある感染因子がさらに広がることを防ぐことができる。
【０５８０】
ヒトに感染して疾患を引き起こす約２２の既知のウイルス族が存在する。この数は継続する集団拡大により増加している(Woolhouse ME, Howey R, Gaunt E, Reilly L, Chase-Topping M, Savill N. Temporal trends in the discovery of human viruses（ヒトウイルスの発見の一時的傾向）. Proc Biol Sci 2008;275:2111-5)。これら疾患の多くは、患者の治療に重要な最初の工程である適切な診断法がない。ＲＴ−定量ＰＣＲおよびＥＬＩＳＡなど、現在の代表的な基準診断法は、専門化された装置を必要とし、コールドチェーンは時間がかかり、高い間接費を持つ。高速な抗原による診断法は開発が困難であることが証明されている。これらの限界により、低所得の設定および大流行時に特異的なウイルス病原体を検出するのに用いることができる高速で安価な高感度診断ツールに対して多大な必要性がある。本出願人らは、子どもの主要な死亡原因の１つである下痢性疾患のためのウイルス診断法を開発・向上させることができる。新たなＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３ａ／Ｃ２ｃ２系は、ＤＮＡまたはＲＮＡに由来する特異的なＲＮＡ配列を素早く認識して切断する能力を持ち(Abudayyeh OO, Gootenberg JS, Konermann S, et al. C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector（Ｃ２ｃ２は１成分のプログラム可能なＲＮＡ誘導ＲＮＡ標的ＣＲＩＳＰＲエフェクターである）. Science 2016;353:aaf5573)、それによりウイルス診断法のための最適な系となる。また、この系は特に大流行に適している。というのは数日のうちに新しい試験を設計して配備することができるからである。
【０５８１】
ＳＨＥＲＬＯＣＫの高感度と他の伝染病への適応を考慮すると、この検出プラットフォームは医療現場での診断を向上させ、下痢性ウイルス病原体のための高速で野外で配備可能な多重化試験を開発する理想的な候補である。この手法は、重篤な疾患の診断を向上させ、患者の治療を向上させ、抗生物質の不適切な使用を低減する。
【０５８２】
既存の診断方法の主要な限定因子の１つは患者の診察と実験室の結果との間の時間のずれである。ロタウイルスおよびノロウイルスなどのウイルスではそのような遅延は致命的な効果を持つ場合がある。Ｃａｓ１３ａ／Ｃ２ｃ２検出反応の速度を高め、核酸抽出を必要としない検出試験規約を開発するため、「リアルタイム」診断を達成してもよい。本出願人らは、試料の採取から結果までの所要時間を１時間未満とすることができる。
【０５８３】
ＲＴ−定量ＰＣＲなど、一般に用いられる核酸検出試験は、宿主材料（血清、尿、糞便）でＰＣＲ阻害剤による増幅の前に抽出が必要である。これは、抽出に時間がかかり、熟練した技術者を必要とするので有意な限定である。従って、試料は典型的には集中型の実験室で扱われ、すぐに処理されない。ＳＨＥＲＬＯＣＫで用いられる等温増幅法は宿主材料により阻害されず、試料調製試験規約は野外での高速ウイルス検出のために尿および糞便から直接増幅することができる。
【０５８４】
本出願人らは、配列の設計により、かつ検出反応液の組成を変更することで増幅スピードを最適化する 。これまでの研究から、等温増幅プライマーは様々な性能を持っていることが示されており、本出願人らは少なくとも１０個のプライマー対を選別して、向上した性能を持つものを同定する。本出願人らは、同様にガイド配列を最適化する。というのは、Ｃａｓ１３ａ／Ｃ２ｃ２は特定の配列モチーフを切断する選好性があることが示されているからである。本出願人らはまた、Ｔ７ポリメラーゼ濃度、ｒＮＴＰ濃度、背景ＲＮＡ濃度、およびマグネシウム濃度を最適化して検出のスピードをさらに高める。検出反応の現在の反復は、高感度の核酸検出を達成するには典型的には２時間かかるが、最適化により１時間未満、可能性としては３０分まで低下させることができる。
ウイルス性病原体の検出用の比色分析読み出しの開発
【０５８５】
臨床診断法に対する最大の限定因子の１つは、世界の多くの臨床設定で強固なインフラ構造がないことである。現在の診断法は、高価な機器と高度な技術訓練を必要とすることが多く、多くの診療所では電気などの基本的なインフラ構造が問題である。現在のＣａｓ１３ａ／Ｃ２ｃ２検出を蛍光出力から目視による色の変化に変えることで、本出願人らは、高価でエネルギーを消費する機器なしでどんな医療従事者でも実行することができる使い勝手のよい診断法を作成することができる。
【０５８６】
本出願人らは、比色検出に異なる２つの方法、無色の基質から色のついた生成物を生成する酵素レポーター（例えば、ｌａｃＺ、ペルオキシダーゼ、β−グルクロニダーゼ）、およびナノ粒子の集団を分解してナノ粒子が溶液に溶解する時に色を変化させることで直接ヌクレアーゼ活性を色の変化に変換することができる一本鎖ＲＮＡに結合した金ナノ粒子の塊を用いることができる。本出願人らは、これら２つの方法、特に紙表面での読み出しとしての性能を注意深く評価する。というのは、スピードと色変化の決定のしやすさは相殺されるためである。臨床試料を用いて最も性能のよい方法を試験して、特異的な核酸配列の存在について報告する能力をさらに立証する。
下痢性疾患に対するウイルス性病原体の多重診断の開発
【０５８７】
ロタウイルス、ノロウイルス、ノーウォークウイルス、サイトメガロウイルス、およびウイルス性肝炎を含む下痢を起こすウイルスは診断がつかないことが多い。これらのウイルス感染は、高い死亡率と病的状態に繋がり、しばしば、抗生物質などの薬物によって増強される。本出願人らは、下痢性感染がウイルス性であるか否かを決定して、患者の治療を知らせ、素早くウイルス大流行を検出し、不必要な抗生物質の使用を減らすのを助けることができる多重診断法を開発することができる。
【０５８８】
糞便、尿、および血液由来の臨床試料およびウイルス種保存液を用いて各病原体に対してＳＨＥＲＬＯＣＫを開発する。本出願人らは、複数の配列アライメントを用いて結合領域内のヌクレオチド多様性に相当するプライマー対とガイドを設計する。ウイルスのＲＮＡはリコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）反応を受ける。T7 RNAポリメラーゼを加えて増幅したＤＮＡをＲＮＡに転写する。本出願人らは、Ｃａｓ１３ａ、消光された蛍光レポーター、および評価用の比色分析系からなる新たな反応混合物に得られたＲＮＡを加える。
実施例１１  体液から直接ウイルス検出をするためのＨＵＤＳＯＮ試験規約の使用
【０５８９】
ＳＨＥＲＬＯＣＫが任意の文脈でのウイルス検出で勝るためには、患者試料からの直接検出することができる方法と視覚的な読み出しを組み合わせるべきである。本発明者らは、患者試料でＺＩＫＶおよびＤＥＮＶの検出でのＳＨＥＲＬＯＣＫの性能を試験し、ＨＵＤＳＯＮ(Heating Unextracted Diagnostic Samples to Obliterate Nucleases、未抽出の診断試料を加熱してヌクレアーゼを破壊する)を開発した。この方法は、比色分析読み出しにより体液から直接ＺＩＫＶおよびＤＥＮＶの高速かつ高感度な検出を可能にし、ＳＨＥＲＬＯＣＫｖ２の一部として最近示された(Gootenberg et al. Science doi:10.1126/science.aaq0179; 2018)。また、本発明者らは、複数のウイルス種および株を区別して、臨床的に適切な変異を同定するＳＨＥＲＬＯＣＫアッセイを設計した。
【０５９０】
患者の試料中でのＺＩＫＶおよびＤＥＮＶ  の検出により、ＳＨＥＲＬＯＣＫの感度とウイルス多様性の許容誤差について厳密な試験が提供される。本発明者らのZIKV SHERLOCKアッセイは種保存液のｃＤＮＡで試験した場合に１コピー（１ｃｐ／μｌ）感度を持っていた（図９８）。本発明者らは、２０１５年〜２０１６年のＺＩＫＶ大流行時に採取した試料に由来する４０個のｃＤＮＡの性能を評価した。そのうち、３７個はＺＩＫＶ感染が疑われる患者の試料に由来し、３個は蚊の供給源に由来するものであった（図８７、図９９Ｂ、および表２４）。これら患者由来の１６個の試料では、その感度と特異性を他の核酸増幅試験（市販のAltona RealstarジカウイルスＲＴ−ＰＣＲアッセイを含む）と比較することでＳＨＥＲＬＯＣＫを評価した（図８２Ｃ、図８８Ａ〜Ｃ、図９９Ｃ、図１００、図１０１、表２５、また「考察」を参照のこと）。Altonaアッセイで陽性とされた１０個の試料のうち、１０個すべてがＳＨＥＲＬＯＣＫで検出された（１００％の感度）。他の６個の試料は両方のアッセイで陰性であった（１００％の特異性、１００％の一致性）。本発明者らのＺＩＫＶアッセイは、健康な尿および水で試験した場合は偽陽性がなかった（図９９Ｂ）。次いで、ＺＩＫＶ感染に似た症状を持つ関連しているがより多様性のあるフラビウイルスであるＤＥＮＶを検出するＳＨＥＲＬＯＣＫの能力を立証した。すべての２４個のＲＴ−ＰＣＲ陽性DENV RNA試料は、検出の１時間後にＤＥＮＶ陽性であることが確認された（図９９Ｄ、図１０２、図１０３、および表２６）。ＳＨＥＲＬＯＣＫは、ＺＩＫＶおよびＤＥＮＶの患者の試料から抽出したウイルス核酸を高感度かつ特異的に検出する。
【表２４】
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【表２５】
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【表２６】
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【０５９１】
ＳＨＥＲＬＯＣＫは抽出された核酸の検出に優れているが、野外配備可能な高速診断試験は体液中のウイルス核酸を検出する抽出工程を必要としない。多くのウイルスはＺＩＫＶおよびＤＥＮＶを含む尿または唾液中に放出されており、採取は侵襲性ではない(Paz-Bailey et al. N. Engl. J. Med doi:10.1056/NEJMoa1613108 (2017); Andries et al. PLoS Negl. Trop. Dis. 9, e0004100 (2015))。ＳＨＥＲＬＯＣＫによってウイルス核酸を直接体液から検出するため、本発明者らは、熱および化学還元を用いてウイルス粒子を溶解し、体液中に観察される高濃度のＲＮＡ分解酵素を不活性化する方法ＨＵＤＳＯＮを開発した（図１０４Ａおよび図８９）(Weickmann et al. J. Biol. Chem. 257:8705-8710 (1982))。ＨＵＤＳＯＮで処理した尿または唾液は、続く増幅または検出を阻害することなく、希釈または精製せずに直接ＲＰＡ反応液に加えてもよい（血液生成物は加熱時に固化するのを避けるため、１：３に希釈された）。ＨＵＤＳＯＮおよびＳＨＥＲＬＯＣＫは、尿、全血、血漿、血清、または唾液に加えた遊離ＺＩＫＶ核酸を高感度で検出することができる（図８３Ａ、８３Ｂ、図９０Ａ、図１０５、および図１０６）。ウイルス核酸は感染性粒子内に封入されているが、臨床感染を模倣するため、本発明者らは感染性ＺＩＫＶ粒子を体液に加えた。ＨＵＤＳＯＮをＳＨＥＲＬＯＣＫと組み合わせると（図９１および図１０７）、全血（図１０８）または血清（図１０４Ｂ）で９０ａＭ（４５ｃｐ／μｌ）、唾液（図１０４Ｃ）で０．９ａＭ（約１ｃｐ／μｌ）、尿で２０ａＭ（１０ｃｐ／μｌ）という高感度で感染性粒子由来のＺＩＫＶ  ＲＮＡを検出することができた。蛍光および比色分析読み出しを含めて総所要時間は２時間未満であった（図１０４Ｄおよび図１１４）。ＨＵＤＳＯＮおよびＳＨＥＲＬＯＣＫの感度は、患者試料中で観察されたZIKV RNA濃度に相当するもので、１〜１，０００ｃｐ／μｌの範囲である(Faye et al. J. Clin. Virol. 43:96-101 (2008); Paz-Bailey et al. N. Engl. J. Med. Doi:10.1056/NEJMoa1613108 (2017))。ＨＵＤＳＯＮを汎DENV SHERLOCKアッセイと組み合わせると、全血、血清、および唾液中のＤＥＮＶを検出した（図１０９および図１１０）。８人の患者の血清試料のうちの８個（図１０４Ｅ）、試験された３人の患者の唾液試料のうちの３個（図１０４Ｆ）から直接ＤＥＮＶを検出した。血清よりもウイルス力価が低いにもかかわらず合計所要時間１時間未満で唾液から検出された(Andries et al. PLoS Negl. Trop. Dis. 9, e0004100 (2015))。本発明者らは、横型フローストリップを用いて比色分析読み出しによりＤＥＮＶを直接検出した（図１０４Ｇ）。これは、最小限の装置で体液から直接ＺＩＫＶまたはＤＥＮＶを検出することができるＨＵＤＳＯＮからＳＨＥＲＬＯＣＫという経路を示している。
【０５９２】
多くの遺伝的および抗原的に類似したフラビウイルスは共循環し、類似の症状を持つので、本発明者らは、関係したウイルス種および血清型を区別する診断パネルを開発した。本発明者らは、ＺＩＫＶゲノム、ＤＥＮＶゲノム、西ナイルウイルス（ＷＮＶ）ゲノム、および黄熱ウイルス（ＹＦＶ）ゲノム内の保存された領域を同定し、４種のウイルスのいずれか、および種に特異的なｃｒＲＮＡを増幅することができる汎用フラビウイルスＲＰＡプライマーを持つフラビウイルスパネルを設計した（図８４Ａ）。このパネルは、０．２２％未満の非標的蛍光で合成ＺＩＫＶ、ＤＥＮＶ、ＷＮＶ、およびＹＦＶ  ＤＮＡ標的を検出し（図８４Ｂ、図９２、また「方法」を参照のこと）、これら４種のウイルスのすべての対の組合せが存在することを確認した。これは模倣共感染を検出する能力を示している（図８４Ｂ、図８４Ｃ、および図９３）。本発明者らはまた、ＤＥＮＶに特異的なＲＰＡプライマーおよび血清型に特異的なｃｒＲＮＡを用いて３．２％の非標的蛍光度（図８４Ｄ、図７９Ｃ、および図９４）でＤＥＮＶ血清型１〜４を区別することができるパネルを設計した（図８４Ｄ）。低レベルの非標的蛍光度により、１００％の特異性で血清型を区別することができ、現在の血清型同定法の代替えを提供する(Waggoner et al. Microbiol. 51:3418-3420 (2013))。このＤＥＮＶパネルは、１２個のＲＴ−ＰＣＲ血清型患者試料または臨床単離物の血清型を確認し（図８４Ｄおよび図１１１）、２個の臨床単離物を混合感染と同定した。これは一般に観察される現象である(Requena-Castro et al. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 112:520-522 (2017))。従って、ＳＨＥＲＬＯＣＫは、１つの増幅反応を用いて関係するウイルスまたは血清型を区別するように拡張することができる。
【０５９３】
ＳＨＥＲＬＯＣＫは野外配備可能な多様体の同定のために固有に用意されている。これにより、微生物の脅威をリアルタイムに追跡することができる。一塩基多型（ＳＮＰ）の遺伝子型決定は、典型的にはＰＣＲおよび蛍光または質量分析検出の何れかを含み、高価な試料処理、高価な装置が必要であり、野外配備性が限定される(Kim et al. Annu. Rev. Biomed. Eng. 9:289-320 (2007)。ＳＨＥＲＬＯＣＫは、ｃｒＲＮＡのＳＮＰに近い位置に合成による不一致を配置することでＳＮＰを同定し、祖先に特異的および由来したものに特異的なｃｒＲＮＡで各標的を試験することができる(Gootenberg et al. Science 356:438-442 (2017)。本発明者らは、２０１５年〜２０１６年のＺＩＫＶ大流行に由来する３つの地域に特異的なＳＮＰの診断法を設計し（図１１２Ｂ）、合成標的、ウイルス種保存液、およびホンジュラス、ドミニカ共和国、および米国由来のｃＤＮＡ試料中のこれらＳＮＰを同定した図１１２Ｃ〜図Ｅ）。これらの結果は、ＳＨＥＲＬＯＣＫがＺＩＫＶ大流行由来の試料のＳＮＰを同定することができることを示しており、ＳＨＥＲＬＯＣＫの１ヌクレオチド特異性を強調するものである。
【０５９４】
ウイルス（例えば、ＺＩＫＶおよびＨＩＶ）について出現しつつある薬物耐性および他の臨床的に関連する変異を急速に同定することは大きな利便性がある。多様体の同定アッセイを素早く開発するため、近年胎児の小頭症と関連付けられたＰｒＭ領域（Ｓ１３９Ｎ）のＺＩＫＶの点変異を試験症例として用いた(Yuan et al. Science eaam7120 (2017)。報告が公開された１週間以内に（図１１２Ｆおよび図１１３）、本発明者らはＳ１３９Ｎ変異用の複数のＳＨＥＲＬＯＣＫアッセイを開発し（図９６および図１１２Ｇ）、視覚的な読み出しで２０１５年〜２０１６年のＺＩＫＶ大流行に由来する患者試料中の変異を同定することができた（図１１２Ｈ）。多くの臨床的に適切な変異のＳＨＥＲＬＯＣＫ診断法を開発する容易さをさらに示すため、本発明者らは、ＨＩＶ逆転写酵素に最も一般に観察される６つの薬物耐性変異のためのアッセイを１週間で設計および試験した(Rhee et al. Nucleic Acids Res. 31:298-303 (2003))（図９７）。これらの例は、ＳＨＥＲＬＯＣＫを用いてほとんどリアルタイムで臨床的に適切な多様体を監視することができることを強調するものである。
【０５９５】
ＨＵＤＳＯＮとＳＨＥＲＬＯＣＫを組み合わせて、本発明者らは、高性能かつ最小限の装置または試料処理要件で野外配備可能なウイルス診断プラットフォームを作成した。このプラットフォームは、高速抗原試験(Bosch et al. Sci. Transl. Med 9 (2017), doi:10.1126/scitrtanslmed.aan1589; Balmaseda et al. PNAS USA 114:8384-8389 (2017); Priyamvada et al. PNAS USA 113:7852-7857 (2016))と同程度のスピードおよび装置要件を持ち、増幅による核酸診断法と同程度に高感度かつ特異的である(Piepenburg et al. PLoS Biol. 4, e204 (2006)); Yu et al. Angew. Chem. Int. Ed Engl. 56, 992-996 (2017); Eboigbodin et al. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 86:369-371 (2016); Pardee et al. Cell 165:1255-1266 (2016); Chotiwan et al. Sci. Transl. Med. 9 (2017) doi:10.1126/scitranslmed.aag0538; Van Ness et al. PNAS 100:4504-4509 (2003))。さらに、この方法は、体液中に存在する実質的にどのウイルスをも検出するように容易に適応させることができ、多重化検出をスケールアップすることができ(Gootenberg et al. Science doi:10.1126/science.aaq0179 (2018))、コールドチェーンに頼らないようにするため上記試薬を冷凍乾燥してもよい(Gootenberg et al. Science 356:438-442 (2017))。Ｃａｓ１３による検出は、世界のほとんどどこでも実行することができてウイルス感染の有効な高速診断を可能にする、有望な次世代の診断方法である。
材料および方法
【０５９６】
臨床試料／倫理についての陳述。本研究に用いられた臨床試料は、la Plaza de la Salud（ドミニカ共和国サントドミンゴ）のInstitutional Review Boards/Ethics Review Committees、Florida Department of Health（フロリダ州タラハシー）、およびUniversidad Nacional Autonoma de Honduras（ホンジュラス、テグシガルパ）で評価および承認された臨床研究に由来している。マサチューセッツ工科大学（ＭＩＴ）のInstitutional Review Board/Ethics Review CommitteeおよびOffice of Research Subject Projection at the Broad Instituteは、上に示した機関によって採取された試料の使用を承認した。デングウイルス臨床試料については、The Broad Institute InstitutionalReview Board/EthicsReview Committeeがこれら試料の使用を承認した。
【０５９７】
ジカウイルス（ＺＩＫＶ）臨床試料は２０１５年〜２０１６年のＺＩＫＶ大流行時に採取され、共同機関でその共同機関に応じてHologic Aptima ＺＩＫＶアッセイあるいは公開されているＺIKV RT-PCRまたはＲＴ−定量ＰＣＲアッセイの何れかで試験した。核酸試験とその結果は表２４に報告されている。これらの採取した臨床試料から抽出したＲＮＡは、メタゲノムおよび標的配列決定、ならびにこれまで公開されたゲノムに対して準備された(Metsky et al. Nature 546:411-415 (2017))。これら４０個の調製液由来のｃＤＮＡを入力として用いてＳＨＥＲＬＯＣＫと増幅産物ＰＣＲの性能を比較した。AltonaRealStarジカウイルスRT-PCRキットを用いて、これら試料のうちの１６個から抽出したＲＮＡを試験した。このアッセイの詳細を以下に示す。試験した試料およびその結果は表２５に報告されている。
【０５９８】
デングウイルス（ＤＥＮＶ）に陽性と確認された患者の血清試料は、Broad Institute Viral Genomics InitiativeのＤＥＮＶの比較ゲノミクスから過剰であった。また、ＤＥＮＶ陽性と確認された患者の４つの血清試料および３つの一致する唾液試料をBoca Biolisticsから得た。DENV RT-PCR陽性ヒト血清試料から抽出したＲＮＡおよび臨床単離物はBroad Institute Viral Genomics InitiativeのＤＥＮＶの比較ゲノミクスより過剰であった。以下に概要を述べるＲＮＡ抽出試験規約に沿ってヒト血清をＣ６／３６細胞で培養して、細胞上澄みからＲＮＡを採取して、臨床単離物を準備した。
【０５９９】
ＬｗＣａｓ１３ａおよびｃｒＲＮＡの作製ＬｗＣａｓ１３ａを組織内(Gootenberg et al. Science 356:438-442 (2017))またはGenscriptによって精製した。１倍Ｔａｑ反応緩衝液（ＮＥＢ）中の最終濃度が１０μＭでcrRNA DNA鋳型をＴ７プロモーターオリゴヌクレオチドにアニールした。これは９５℃で５分間の変性を含み、次いで１分間に５℃で４℃まで下げてアニールした。HiScribe T7 High Yield RNA合成キット（ＮＥＢ）を用いてｃｒＲＮＡを生体外で転写した。短いＲＮＡ転写物について製造者の指示に従って容積を３０μｌまでスケールアップして転写を行った。反応液を３７℃で一晩インキュベートした。反応容積の２倍の比でRNAClean XPビーズ(Beckman Coulter)を用いて、さらに１．８倍のイソプロピルアルコールを補充し、転写物を精製した。いくつかのｃｒＲＮＡはIntegrated DNA Technologies (IDT)によって合成された。
【０６００】
試料の調製。製造者の指示に従い、担体ＲＮＡを有するQIAamp Viral RNAミニキット(QIAGEN)を用いて、１４０μｌの入力材料からウイルスのＲＮＡを抽出した。試料を６０μｌのヌクレアーゼを含まない水で溶出し、使用まで−８０℃で保存した。
【０６０１】
既に公開されている方法(Matranga et al. Genome Biol. 15:519 (2014))を用いて、ｃＤＮＡを作製するため、５μｌの抽出したＲＮＡを一本鎖ｃＤＮＡに変換した。手短に言うと、SuperScript III (Invitrogen) およびランダムヘキサマープライマーでＲＮＡを逆転写した。次いで、ＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖をＲＮＡ分解酵素Ｈで分解した。ｃＤＮＡを使用まで−２０℃で保存した。実験によっては（図９９Ｃおよび図１００）、ＲＮＡ分解酵素Ｈによる処理をせず、SuperScript IVを用いて５５℃で２０分逆転写を行った。
【０６０２】
ＺＩＫＶ検出実験で１つの培養単離物ＺＩＫＶペルナンブコ（単離物ＰＥ２４３、ＫＸ１９７１９２．１）を陽性対照または祖先の配列の対照として用いた。上記のＲＮＡ抽出方法を用いて、１４０μｌの種保存液試料からウイルスのＲＮＡを抽出した。
【０６０３】
ＴＣＥＰ／ＥＤＴＡの添加および試料の加熱により尿試料のＲＮＡ分解酵素による不活性を行った。ＴＣＥＰおよびＥＤＴＡをそれぞれ、最終濃度１００ｍＭおよび１ｍＭで尿試料に加えた。２つの試験規約を用いた：９５℃で１０分間の１工程の不活性、あるいは５０℃で２０分間、次いで９５℃で５分間の２工程の不活性。熱サイクラーまたは乾燥熱ブロックを用いて不活性化を行った。
【０６０４】
ＴＣＥＰ／ＥＤＴＡの添加および試料の加熱により全血、血漿、血清、および唾液試料中のジカウイルスのＲＮＡ分解酵素による不活性を行った。ＴＣＥＰおよびＥＤＴＡをそれぞれ、最終濃度１００ｍＭおよび１ｍＭで尿試料に加えた。５０℃で５分、次いで６４℃で５分（血液生成物または唾液）あるいは５０℃で２０分、次いで９５℃で５分（尿）の２工程の不活性化を用いた。熱サイクラーまたは乾燥熱ブロックを用いて不活性化を行った。
【０６０５】
ＴＣＥＰ／ＥＤＴＡの添加および試料の加熱により全血、血清、および唾液試料中のＤＥＮＶのＲＮＡ分解酵素による不活性を行った。ＴＣＥＰおよびＥＤＴＡをそれぞれ、最終濃度１００ｍＭおよび１ｍＭで尿試料に加えた。４２℃（あるいは実験によっては３７℃）で２０分間、次いで６４℃で５分間の２工程の不活性を用いた。熱サイクラーを用いて不活性化を行った。
【０６０６】
ＲＰＡ反応およびプライマー設計。ＲＰＡ反応でTwist-Dx RT-RPAキットを製造者の指示に従って用いた。プライマー濃度は４８０ｎＭであった。ＲＮＡを含む増幅反応ではMurine RNA分解酵素阻害剤(NEB M3014L) を１マイクロリットルあたり２単位の最終濃度で用いた。特に断りがなければ、すべてのＲＰＡ反応は２０分であった。
【０６０７】
ＺＩＫＶ検出では、最近の出版物(Gootenberg et al. Science 356:438-442 (2017))に由来するＲＰＡプライマーＲＰ８１９／ＲＰ８２１を用いた。汎用ＤＥＮＶ検出では、血清型に関わらず、公開されているＲＰＡプライマーDENV1-3-RPA-RP4/DENV1-3-RPA-FP13およびDENV4-RPA-RP2/DENV4-RPA-FP3の同量混合物を用いた(Abd El Wahed et al. PLoS One 10, e0129682 (2015))。フラビウイルスパネルではＲＰＡプライマーFLAVI-NS5fwd-1/FLAVI-NS5rev-1を用いた。血清型を区別するＤＥＮＶパネルでは、ＲＰＡプライマーDENV-3UTRfwd-1/DENV-3UTRrev-1を用いた。地域に特異的なジカＳＮＰ検出では、ＲＰＡプライマーDOMUSA-5249-fwd/DOMUSA-5249-rev (DOMUSA5249 SNP)、USA-935-fwd/USA-935-rev (USA935 SNP)、およびHND-2788-fwd/HND-2788-rev (HND2788 SNP)を用いた。小頭症に関連付けられたジカＳＮＰの検出では、ＲＰＡプライマーZIKV-mcep-fwdおよびZIKV-mcep-revを用いた。ＨＩＶ逆転写酵素の薬物耐性ＳＮＰの検出では、RPAプライマーHIVRT-149F/HIVRT-348R (K65R、K103N、およびV106M SNP)、およびHIV-462F/HIVRT-601R (Y181C、M184V、およびG190A SNP)を用いた。ＲＰＡプライマー名および配列の完全なリストは表２８を参照のこと。
【表２７】
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【表２８】
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【０６０８】
Ｃａｓ１３検出反応およびｃｒＲＮＡの設計。１反応あたりの背景ＲＮＡの入力を１００ｎｇから０〜２５ｎｇに減じた以外は上記のように検出反応を行った(Gootenberg et al. Science 356:438-442 (2017))。これにより、レポーターオリゴヌクレオチドの如何なる擬似切断も導入せずに反応速度を高められる。特に断りがなければ、ＲＮＡ分解酵素Alert v2 (Thermo)をレポーターとして用いた。Biotekマイクロプレートリーダー(Synergy H4、Neo2、およびCytation 5)を検出反応の蛍光度を測定するのに用いた。４８５ｎｍの励起、５２０ｎｍの放出で単色光分光器を用いて、３時間まで５分ごとに読み取って蛍光動力学を監視した。異なる機械間の感度に有意な差は見られなかった。従って、これらの機械を交換可能に用いた。報告された蛍光値は背景を減じたもの、あるいは鋳型に特異的な値である。報告された時点は、図面の注記に記載されている。
【０６０９】
ＺＩＫＶ検出では、最近の出版物に由来するｃｒＲＮＡ「ジカ標的ｃｒＲＮＡ２」(Gootenberg et al. Science 356:438-442 (2017))を用いた。汎用ＤＥＮＶ検出では、血清型に関わらず、３つのｃｒＲＮＡおよびD1-3UTRat10660、D2/3-3UTrat10635、D4-3UTRat10620の同量混合物を用いた。フラビウイルスパネルでは、ｃｒＲＮＡのZIKV-NS5at9227 (ZIKV)、DENV-NS5at9127 (DENV)、WNV-NS5at9243 (WNV)、およびYFV-NS5at9122 (YFV)を用いた。血清型を区別するＤＥＮＶパネルでは、ｃｒＲＮＡのD1-3UTRat10457 (DENV1)、D2-3UTRat10433 (DENV2)、D3-3UTRat10419(DENV3)、およびD4-3UTRat10366 (DENV4)を用いた。地域に特異的なジカＳＮＰ検出では、ｃｒＲＮＡのDOMUSA-5249-祖先/DOMUSA-5249由来(DOMUSA5249 SNP),USA-935-祖先/USA-935由来(USA935 SNP)、およびHND-2788-祖先/HND-2788由来(HND2788 SNP)を用いた。小頭症に関連付けられたジカＳＮＰの検出では、ｃｒＲＮＡのZIKV-mcep-snp3syn5-祖先/ZIKV-mcep-snp3syn5由来（図１１２Ｆに示す設計）、およびｃｒＲＮＡのZIKV-mcep-snp7-祖先/ZIKV-mcep-snp7由来（図１０５に示す設計）を用いた。ＨＩＶ逆転写酵素の薬物耐性ＳＮＰの検出では、ｃｒＲＮＡのHIVRT-K65R-祖先/HIVRT-K65R由来(K65R SNP)、HIVRT-K103N-祖先/HIVRT-K103N由来(K103N SNP)、HIVRT-V016M-祖先/HIVRT-V106M由来(V106M SNP)、HIVRT-Y181C-祖先/HIVRT-Y181C由来(Y181C SNP)、HIVRT-M184V-祖先/HIVRT-M184V由来(M184V SNP)、およびHIVRT-G190A-祖先/HIVRT-G190A由来(G190A SNP)を用いた。ｃｒＲＮＡ名およびスペーサー配列の完全なリストについては表２９を参照のこと。ｃｒＲＮＡ配列と二次構造の活性に及ぼす効果についてのさらなる考察は「考察」を参照のこと。
【表２９】
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【０６１０】
側流検出反応。あつらえたプローブオリゴヌクレオチド（ＬＦ−ポリＵ、配列については表３０を参照のこと）を用いて市販の検出ストリップ（Milenia Hybridetect 1, TwistDx、英国ケンブリッジ）により側流検出を達成した。Hybridetectアッセイ緩衝液でＣａｓ１３検出反応液を１：５に希釈し、ストリップを浸して室温で５分間インキュベートした。次いで、ストリップを取り出して、スマートフォンのカメラを用いて撮影した。
【表３０】
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【０６１１】
ＲＴ−ＰＣＲ実験。Lightcycler 96 RT-PCR装置(Roche)で製造者の仕様書に従って、AltonaRealStarジカウイルスＲＴ−ＰＣＲキット（RUOバージョン）を用いてＺＩＫＶ検出のＲＴ−ＰＣＲを行った。患者試料から抽出した１０μｌのZIKV RNAをＲＴ−ＰＣＲの入力として用いた。各試料に対して１μｌの内部対照（ＩＣ）を用いた。
【０６１２】
データ分析。最少の蛍光が観察された０分後（図９８、図９９Ｄ、図１０２、図１０３）、１０分後（図８４、図９９Ｂ〜図９９Ｃ、および図１０４）または２０分後（図１１２）の蛍光値を減じることにより背景を減じた。フラビウイルスパネルとＤＥＮＶパネルの両方で、背景ノイズを除去した蛍光度を標的に特異的な蛍光度に正規化した。標的に特異的な蛍光度は、各時点の所与のｃｒＲＮＡを持つ所与のＤＮＡ標的の背景減算済み蛍光度から減じた同じｃｒＲＮＡを持つ入力なし（水）対照の背景減算済み平均蛍光度である。
【０６１３】
２０１５年〜２０１６年の大流行に由来するＺＩＫＶ試料の分析（図９９Ｂ）から、閾値を用いてＺＩＫＶの有無を決定した。１提供者の健康なヒトの尿試料４個と入力なしの水対照１個という５つの陰性対照試料から背景ノイズを除去した蛍光度を用いてZIKV SHERLOCKの蛍光度閾値を決定した。つまり、これら５つの試料それぞれについて、本出願人らは、３つの技術的に同じ試料に亘って蛍光度の平均ｍｓおよび標準偏差σｓを取った。閾値は、５つの値の｛ｍｓ＋３σｓ｝の中心値と設定した。図１Ｃでは、１個の入力なし対照を用いて同じ計算｛ｍｓ＋３σｓ｝を行い、閾値を決定した。ゲノム組立体からの情報を用いて増幅産物ＰＣＲ収率の閾値を決定した。まず、２つの増幅産物ＰＣＲ供給原のそれぞれから最低濃度を取って各試料の増幅産物ＰＣＲ収率を算出した（図８７Ａ）。次いで、目的は、ゲノムの特定の標的部分ｒが試料（この場合は、本出願人らがＳＨＥＲＬＯＣＫで検出するＲＰＡ増幅産物）中に存在するか否かを最もよく予測する収率を決定することである。特定の標的部分ｒが試料ｓ中に存在する確率Ｐｒｓ（ｒ）、試料ｓのｃＤＮＡから配列して組み立てたＺＩＫＶゲノムの画分として見積もられてもよい（ゲノムに亘る確率の計算は、部分ｒでゲノムのカバレッジがあるか否かを単に調べるのが好ましい。カバレッジがないことが特定の標的部分ｒが存在しないことを必ずしも示していないからである）。この分析のデータは、ＺＩＫＶ大流行の最近のゲノム配列決定研究に由来する個々の技術的に同じ試料に由来する(Metsky et al. Nature 546:411-415 (2017))。増幅産物ＰＣＲ収率とカバーされたゲノムの画分のプロットを図８８Ｂに示す。値Ｐｒｓ（ｒ）を用いて、閾値の選択に対する精密度と呼び戻しを見積もってもよい。特に、特定の標的部分ｒを持たない試料の数の見積もりは、すべての試料のＰｒｓ（ｒ）の和である。同様に、増幅産物ＰＣＲ収率が所定の閾値を超える試料Ｐのうち、ｒが存在するものとして正しく標識化された数を試料Ｐ中のＰｒｓ（ｒ）の和として見積もる。図８７Ｃは、閾値の各選択に対する精密度と呼び戻し、およびＦ０．５スコアを示す。Ｆ０．５スコアは、ＺＩＫＶの標的部分を持つ試料を正確に分類する閾値の能力を考慮した複合測定基準値である。増幅産物ＰＣＲ収率の閾値はＦ０．５スコアが最大になるように設定されている。増幅産物ＰＣＲおよび他の方法と比べたＳＨＥＲＬＯＣＫの感度および特異性についてさらなる考察は「考察」を参照のこと。
【０６１４】
ＺＩＫＶアッセイを用いて上記のようにDENV SHERLOCKの蛍光閾値を算出した。８個の入力なし陰性対照から背景を減じた蛍光度を用いて閾値を決定した。これら８個のうちのそれぞれの入力なし対照ｓで本出願人らは、３つの技術的に同じ試料に亘って蛍光度の平均ｍｓおよび標準偏差σｓを取って、閾値を８個の値の｛ｍｓ＋３σｓ｝の中心値に設定した。
【０６１５】
多ウイルスまたは血清型パネルでは、パネルの他のｃｒＲＮＡに対して各標的の非標的蛍光度を算出した。これは、検出の３時間後の時点で（最大蛍光が観察された、あるいは信号が飽和した時）対応する標的：ｃｒＲＮＡ対で観察された標的に特異的な蛍光度に対する非一致型標的：ｃｒＲＮＡ対の標的に特異的な蛍光度の百分率を計算することで行った。文献で報告された非標的蛍光度は、所与のパネルの４つの標的について観察された最大のものであった。
【０６１６】
ＳＮＰの同定では、祖先標的ｃｒＲＮＡおよび由来標的ｃｒＲＮＡを用いて背景ノイズを除去した蛍光度の値を算出した。本発明者らは、祖先の背景を減じた蛍光度に対する由来の背景を減じた蛍光度の比を取ってＳＮＰの有無を決定した。HIV SNP（図１０６）に対してＳＮＰ同定指標を算出した。この指標は由来アレルの蛍光度の比を祖先アレルの蛍光度の比で除した比である。ＳＮＰ同定指標は、２つのアレル間に特徴的な力がなければ１に等しく、２つのアレルの蛍光度の比が異なるほど高くなる。ＳＨＥＲＬＯＣＫを用いて個々のＳＮＰの区別しやすさに影響を及ぼす因子についてさらなる考察は、「考察」を参照のこと。
【０６１７】
ＺＩＫＶおよびＤＥＮＶの検出実験。ＰＥ２４３（ＭＦ３５２１４１．１）種保存液のｃＤＮＡ を保存液濃度６．８×１０４ｃｐ／μｌで用いた。ｃＤＮＡを超純水(Life Technologies)または健康な尿(Lee Biosolutions)で１：１０に連続希釈した。４〜８μｌの各試料を不活性化し、１〜２μｌをＲＰＡ反応の入力として用いた。ＰＥ２４３種保存液のＲＮＡを２．７２×１０５ｃｐ／μｌで用いた。このウイルスは元々、２０１５年５月１３日に発疹を持った熱病患者から単離されたものであり、２０１６年にブラジルのFIOCRUZ Pernambuco研究所(E. Marques)およびMIT Gehrke研究所でベロ細胞継代が行われた。ＰＥ２４３はブラジルのジカ大流行由来に由来する最初の単離物の１つである(Donald et al. PLoS Negl. Trop. Dis. 10, e0005048 (2016)。ＲＮＡを超純水(Life Technologies)または 健康な尿(Lee Biosolutions)で１：１０に連続希釈した。４〜８μｌの各試料を不活性化し、１〜２μｌをＲＰＡ反応の入力として用いた。ＤＥＮＶ検出に１４ｍＭのＭｇＡｃ、ＺＩＫＶ検出に１７ｍＭのＭｇＡｃを用いた。
【０６１８】
プエルトリコ由来の培養単離物ＺＩＫＶ株ＰＲＶＡＢＣ５９（ＫＵ５０１２１５）(Donald et al. PLoS Negl. Trop. Dis. 10, e0005048 (2016); Lanciotti et al. Emerg. Infect. Dis. 22:933-935 (2016)) を米国BEI repositoryからcat number ATCC VR-1843としてを得て、ウイルスを健康な尿、唾液、全血、および血清試料に加えるのに用いられた。ＰＲＶＡＢＣ５９を昆虫および非ヒト霊長類細胞株で培養した、上記のようにウイルス保存液中で感染性粒子を駆動するためＨｕＨ−７ヒトヘパトーマ細胞を用いた(Lambeth et al. J. Clin. Microbiol. 43:3267-3272 (2005)。ウイルスを健康な唾液(Lee Biosolutions)、全血(Research Blood Components)、および血清(Millipore Sigma)で希釈するため、培養単離物ＤＥＮＶ２株New Guinea C (NGC)を用いた。
【０６１９】
ウイルスパネルの実験。フラビウイルスファミリー（ＺＩＫＶ、ＤＥＮＶ、ＷＮＶ、およびＹＦＶ）の４つの異なるウイルスの配列多様性を説明するため、本発明者らは、ＣＡＴＣＨ法（Compact Aggregation of Targets for Comprehensive Hybridization、包括的ハイブリダイゼーションのための標的の小型凝集）汎用フラビウイルスＲＰＡプライマー対に好適な保存された領域を検索するのに適用した。この方法の実施はＭＩＴライセンス下のGitHubで入手可能である(https://github.com/broadinstitute/catch)。この方法により、本発明者らは、ＮＳ５の保存された領域内でプライマー対の検索を絞ることができた。
【０６２０】
フラビウイルスパネルおよびＤＥＮＶパネルの最初の試験では、合成により生成させたＤＮＡ鋳型を入力として濃度の１０４コピー／μｌで用いた。試験したｃｒＲＮＡのそれぞれに対して入力なし（水）対照を陰性対照として用いた。すべてのパネル実験で３つの技術的に同じ試料を用いた。すべてのフラビウイルスパネル実験で、ＲＰＡ反応液のＭｇＡｃ濃度は２０ｍＭであり、すべてのＤＥＮＶパネル実験でＲＰＡ反応液のＭｇＡｃ濃度は１４ｍＭであった。
【０６２１】
フラビウイルスパネルの最初の試験で(KX197192)、DENV(NC_001477.1)、WNV(NC_09942.1)、およびYFV(AY968065.1)からＺＩＫＶ鋳型配列を生成させた。これらフラビウイルスに対してＲＰＡ反応により一部のＮＳ５を増幅する。
【０６２２】
ＤＥＮＶパネルの最初の試験では(KM204119.1)、DENV2(KM204118.1)、DENV3(KU050695.1)、DENV4(JQ822247.1)からＤＥＮＶ１合成鋳型配列を生成させた。ＲＰＡ反応により、ＤＥＮＶ１〜４の３’非翻訳領域の一部を増幅する。このＤＥＮＶパネルは、臨床試料および種保存液から抽出したＲＮＡに対して追加で試験された。
【０６２３】
ＳＮＰ同定試験。地域に特異的なＳＮＰの同定は、祖先または由来アレルを持つＺＩＫＶゲノムの４００ｎｔ断片を含む合成鋳型を用いてＳＮＰ同定アッセイの性能を立証した。また、３つの国（米国、ホンジュラス、およびドミニカ共和国）由来のＺＩＫＶ  ｃＤＮＡ試料を用いて蚊の供給原および臨床試料に対する性能を確認した。これらｃＤＮＡ試料に関するさらなる情報は表２４を参照のこと。ＰＥ２４３種保存液のｃＤＮＡ（ＫＸ１９７１９２．１）を３００ｃｐ／μｌで外集団対照として用いた。また、入力なし（水）対照を用いた。小頭症に関連付けられたＳＮＰ同定実験では、祖先アレルまたは由来アレルを持つＺＩＫＶゲノムの４００ｎｔ断片を含む合成鋳型を１０４ｃｐ／μｌで用いて、ＰＥ２４３種保存液のｃＤＮＡを３００ｃｐ／μｌで用いた。ＨＩＶ薬物耐性ＳＮＰ同定実験では、祖先アレルまたは由来アレルを持つＨＩＶゲノムの４６８ｎｔ断片を含む合成鋳型を１０４ｃｐ／μｌで用いた。合成鋳型の名前および配列の完全なリストは表３０を参照のこと。すべてのＳＮＰ同定実験で３つの技術的に同じ試料を用いた。
考察
【０６２４】
ＺＩＫＶ検出でのＳＨＥＲＬＯＣＫの感度および特異性の考察。本発明者らは、ＳＨＥＲＬＯＣＫが非常に高感度で特異的な核酸検出法であることを示した。ＺＩＫＶ検出はＳＨＥＲＬＯＣＫの感度についての主要な試験であった。というのは、主に、ＺＩＫＶの検出は低いウイルス力価と試料の分解により大変困難であるからである(Paz-Bailey et al. N. Engl. J. Med. Doi:10.1056NEJMoa1613108 (2017))。本発明者らは、２０１５年〜１６年のＺＩＫＶ大流行に由来する１組の試料（３７個の陽性と疑われる患者の試料と３個の蚊の供給原）をＳＨＥＲＬＯＣＫおよび増幅産物ＰＣＲの両方で試験して、所与の試料中でＺＩＫＶ核酸の有無を決定した。これら患者に由来する１６個の試料について本発明者らはＳＨＥＲＬＯＣＫを１）Hologic Aptima ＺＩＫＶアッセイおよび２）AltonaRealStarジカウイルスＲＴ−ＰＣＲアッセイの２つのＦＤＡ−ＥＵＡ−承認ＺＩＫＶ診断法と比較した。
【０６２５】
ＳＨＥＲＬＯＣＫとAltonaRealStarジカウイルスＲＴ−ＰＣＲアッセイを比較するため、本発明者らは、１組の１６個の患者試料について両方のアッセイを比較した。逆転写条件および入力容積（２０分の逆転写および１０μｌの入力）を同じになるようにして２つのアッセイを行った。逆転写反応条件によりｃＤＮＡをＲＮＡ入力から１：４で希釈する。従って、本発明者らがＳＨＥＲＬＯＣＫに用いるＲＮＡの量はAltonaキットで用いる量の１／４である。本発明者らは、これら２つの方法が同程度の感度であることを観察した。１６個の試料のうちの１０個はそれぞれの方法で陽性であり、全体の一致率は１００％であった（図９９Ｃおよび図１００）。
【０６２６】
次いで、本発明者らはＳＨＥＲＬＯＣＫおよびAltonaアッセイをHologic Aptimaジカウイルスアッセイと比較した。Hologic Aptimaジカウイルスアッセイはより多くの入力容積（５００μｌ超）を用いる。AltonaアッセイおよびＳＨＥＲＬＯＣＫの両方で陽性となった１０個の試料すべてはHologicアッセイで陽性であった（表２５）。３つの試料はHologicアッセイで陽性であったが、他の２つのアッセイでは陽性ではなかった。これはHologicアッセイの試料の入力容積が５０倍超大きいためであると思われる。つまり、ＳＨＥＲＬＯＣＫは、ＺＩＫＶ検出ではＲＴ−ＰＣＲアッセイと同等の感度を持ち、Hologicアッセイに対するその感度は入力容積に限定されている。
【０６２７】
増幅産物ＰＣＲデータを含むことの論拠は、部分的ゲノムが非常に一般的であったＺＩＫＶ大流行時に広いスケールでのゲノム配列決定を行った際の本発明者らの観察に基づいたものである(Metsky et al. Nature 546:411-415 (2017))。これは、ゲノム全体での比較基準が単一増幅産物法（例えばＲＴ−ＰＣＲ）よりも高い感度を提供することを示唆している。増幅産物ＰＣＲ法では、本発明者らは、Agilent tapestationを用いて増幅産物ＰＣＲ生成物を定量し、ＺＩＫＶの有無を決定するために２ｎｇ／μｌの閾値を選択した。この閾値は、増幅産物ＰＣＲ生成物のゲノム配列カバレッジによって測定されるように精度を最大にする（図１００、詳細は「方法」を参照のこと）。これら２つの方法が標的するＺＩＫＶゲノムの領域が異なっているにもかかわらず、両者は高い一致率（８２．５％）を示した（図８４Ｃおよび図８８Ａ〜図８８Ｃ）。増幅産物ＰＣＲ法はＺＩＫＶゲノム全体をタイル積みするが、ＳＨＥＲＬＯＣＫは、３００〜４００ｎｔのＰＣＲ増幅産物よりも短い１２８ｎｔの長さで１つの増幅産物のみを用いる（図１０１）。従って、非常に分解された試料（短いＲＮＡ断片を持つ）は、増幅産物ＰＣＲよりもＳＨＥＲＬＯＣＫによってより容易に検出される可能性がある。逆にＳＨＥＲＬＯＣＫ増幅産物自体は分解しているがゲノムの他の部分はそうではない場合、増幅産物ＰＣＲは試料中に存在するゲノムの残りの部分を検出する。
【０６２８】
ＳＨＥＲＬＯＣＫのこの感度を高い特異性と組み合わせる。本発明者らは、様々なＳＨＥＲＬＯＣＫアッセイを用いてＳＮＰ感度、血清型同定、および種レベルの特異性を示した。また、本発明者らは、健康な体液、水、場合によっては他のウイルス由来の核酸を含む多くの陰性対照を試験した。これらの結果に基づき、本発明者らは、ＳＨＥＲＬＯＣＫを用いると多くの偽陽性（もしあっても）を観察しないことを期待する。
【０６２９】
ＳＨＥＲＬＯＣＫ性能の変動性の原因。ＳＨＥＲＬＯＣＫのオリジナル論文の補足で論じたように、ＲＰＡ性能は非常に変動し、鋳型配列、増幅産物の長さ、および他の因子に依存する(Gootenberg et al. Science 356:438-442 (2017))。Ｃａｓ１３検出工程は、ＲＰＡ増幅産物の入力濃度により蛍光信号を１００倍〜１，０００倍超に増幅する。その結果、多様性が非常に大きくなければ、ＳＨＥＲＬＯＣＫはＲＰＡ増幅またはＣａｓ１３検出の何れかにおいて多様性に対してかなり強固である。
【０６３０】
多ウイルスおよび多血清型パネルを設計するため、本発明者らは、縮重したＲＰＡプライマーを用いて、関係するＲＮＡウイルスの顕著な配列多様性を捉えた。場合によっては、プライマーの縮重は、異なる標的について増幅効率を変動させ得る。一般に、これはＲＰＡ反応を最適化する（プライマーおよびマグネシウム濃度を調節するなど）ことで管理することができる。
【０６３１】
本発明者らは、ＲＰＡ多様性に加えて、スペーサーのＧＣ含有量、ポリＵのストレッチ、および二次構造のｃｒＲＮＡ性能に及ぼす効果によるＳＨＥＲＬＯＣＫのＣａｓ１３検出工程のいくつかの多様性を観察した。ｃｒＲＮＡによっては他のものよりも活性が高く、ｃｒＲＮＡによっては、標的の非存在でより活性を示す（すなわち、入力なし対照）。本発明者らはまた、ｃｒＲＮＡによっては、生体外転写後の他のｃｒＲＮＡよりも純度が低いことを観察した。しかしながら、精製後、ほとんどすべてのｃｒＲＮＡは活性が高くなる（スペーサーの大部分が自身と対をなし得る場合など、スペーサーの望ましくない二次構造による少数の例外がある）。
【０６３２】
フラビウイルスパネルでＺＩＫＶの蛍光度が低いのは（図８４Ｂ）上記の因子の組合せによる場合がある（本研究に用いた他のｃｒＲＮＡでも同様である）。
【０６３３】
ＳＨＥＲＬＯＣＫによるＳＮＰ識別に影響を及ぼす因子。異なるスペーサーＲＮＡ配列はＳＨＥＲＬＯＣＫの検出工程で異なるレベルの性能を持つことが観察された。これらの性能の違いに繋がる要因が論じられたが、またＳＮＰ検出に関係する含意がある。
【０６３４】
ＳＮＰ検出は、１つまたは２つのヌクレオチドで標的配列と異なっており、従って配列依存性の標的分子に対して異なる活性を持つ１対のｃｒＲＮＡに依存している。ｃｒＲＮＡと標的ＲＮＡとの２番目の不一致の存在が副次切断で観察され得る違いに繋がる場合、ＳＮＰ識別はうまくいく。従って、以下はＳＮＰ識別の成功を限定することがある。
●活性の高いｃｒＲＮＡでの１つのさらなる不一致は、強力な識別に対して十分に活性を低下させない場合があり、いくつかのｃｒＲＮＡで観察された。可能性のある解決としては、１）検出反応液に加える前にＲＰＡ生成物を希釈すること、あるいは２）低いｃｒＲＮＡ濃度を用いることが挙げられる。
●（鋳型の二次構造の変化により）ＲＰＡ時に１つのアレルが他のアレルよりも優先的に増幅される場合、これはＳＨＥＲＬＯＣＫの出力を偏らせる場合がある。本発明者らはこれを観察していないが、可能性がある。
●ＲＮＡの不安定な対合により、ｃｒＲＮＡによっては、ワトソン・クリック型塩基対合の非存在下で弱く結合することがある。これは、本発明者らのＡ＞ＧまたはＧ＞Ａ変異のいくつかで観察された（例えば、ＵＳＡ９３５）。ｃｒＲＮＡの「Ｕ」は由来または祖先ヌクレオチドの何れとも結合することができる。しかしながら、このシナリオでも２つのアレルを区別するのは容易である。というのは、Ｇ標的ｃｒＲＮＡは、Ａと対合しないＣヌクレオチドを含んでいるからである。
【０６３５】
これらの限定を考慮すると、低い活性を持つｃｒＲＮＡ（スペーサーを短くすることで達成することができる）がＳＮＰ検出により適しており、不安定な塩基対合はＳＨＥＲＬＯＣＫの信号に効果を及ぼす場合があるが、完全にはＳＮＰの同定を無効にしない。
＊＊＊
【０６３６】
本発明の範囲および精神を逸脱することなく本発明の上記方法、医薬組成物、およびキットの様々な修正および変形が当業者に自明である。本発明は特定の実施形態に関連して記載されたが、自明であるようにさらなる修正が可能であり、主張されるように本発明はそのような特定の実施形態に不当に限定されるものではない。実際、当業者には自明である本発明を実行するための上記の態様の様々な修正は、本発明の範囲内にあることが意図される。本願は、一般に、本発明の原則に従って、任意の多様性、使用、または本発明の適応を包含することを意図し、本発明が関連する当該分野で既知の慣例的な実践の範囲内であり、本明細書で上に述べた主要な特徴に適用し得る本開示からのそのような逸脱を含む。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４−１】
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【図５４−２】
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【図５５−１】
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【図５５−２】
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【図５５−３】
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【図５６】
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【図５７−１】
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【図５７−２】
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【図５７−３】
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【図５７−４】
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【図５８−１】
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【図５８−２】
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【図５９】
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【図６０−１】
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【図６０−２】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７−１】
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【図７７−２】
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【図７７−３】
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【図７８−１】
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【図７８−２】
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【図７８−３】
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【図７８−４】
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【図７９−１】
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【図７９−２】
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【図８０−１】
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【図８０−２】
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【図８１】
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【図８２Ａ−Ｃ】
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【図８３Ａ−Ｃ】
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【図８４Ａ−Ｂ】
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【図８４Ｃ】
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【図８４Ｄ−Ｅ】
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【図８５Ａ−Ｂ】
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【図８５Ｃ−Ｆ】
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【図８６】
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【図８７Ａ】
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【図８７Ｂ】
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【図８７Ｃ】
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【図８７Ｄ】
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【図８８Ａ】
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【図８８Ｂ】
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【図８８Ｃ】
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【図８９】
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【図９０Ａ】
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【図９０Ｂ】
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【図９１】
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【図９２】
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【図９３】
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【図９４】
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【図９５】
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【図９６】
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【図９７】
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【図９８】
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【図９９】
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【図１００】
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【図１０１】
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【図１０２】
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【図１０３】
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【図１０４】
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【図１０５】
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【図１０６】
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【図１０７】
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【図１０８】
2020513815.tif 000197
【図１０９】
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【図１１０】
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【図１１１】
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【図１１２】
2020513815.tif 000201
【図１１３】
2020513815.tif 000202
【図１１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2020513815.tif 000205
2020513815.tif 000206
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