(57)【要約】Ｅ．ｃｏｌｉ宿主株におけるペリプラズムを標的とする組換えタンパク質の改善された産生のための方法が本発明で提供される。改善された組換えタンパク質の産生能力を有するＥ．ｃｏｌｉ宿主株もまた提供される。いくつかの実施形態では、内因性Ｅ．ｃｏｌｉホスホリパーゼを組換えタンパク質と同時発現させることを含む、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてペリプラズムを標的とする組換えタンパク質の放出を達成するための方法が提供される。いくつかの関連する実施形態では、組換えタンパク質およびホスホリパーゼの誘導後にＥ．ｃｏｌｉ宿主株は抽出緩衝液と接触される。【選択図】図１
2020532322.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞のペリプラズムから組換えポリペプチドを抽出する方法であって、前記宿主細胞は、発現制御配列に作動可能に連結された前記組換えポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列、および発現制御配列に作動可能に連結されたＥ．ｃｏｌｉホスホリパーゼをコードする第２のヌクレオチド配列を含み、前記方法は、
（ａ）前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞における前記組換えポリペプチドおよび前記ホスホリパーゼの同時発現を可能にする条件下で、培地中で前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞を培養することと、
（ｂ）必要に応じて、発現された組換えポリペプチドおよび発現されたホスホリパーゼを含む前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞を、キレート剤を含む抽出緩衝液と接触させることと、
（ｂ）必要に応じて、前記培地から前記組換えポリペプチドを収集することと、含む、方法。
【請求項２】
（ａ）前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主における前記組換えポリペプチドおよび前記ホスホリパーゼの同時発現を可能にする条件下で、培地中で前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞を培養することと、
（ｂ）前記発現された組換えポリペプチドおよび前記発現されたホスホリパーゼを含む前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞を、キレート剤を含む抽出緩衝液と接触させることと、を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組換えポリペプチドが、ＣＲＭ１９７、プロテインＤおよびエキソプロテインＡから選択されるキャリアタンパク質である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ホスホリパーゼが、ＧｌｐＱ、ＹｂａＣ、ＯｍｐＬＡ、ＰｌｄＢ、およびＴｅｓＡから選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ホスホリパーゼが、配列番号１〜５として示されるアミノ酸配列のいずれか１つに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるか、または同一である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ホスホリパーゼがｐｌｄＡであり、配列番号４として示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるか、または同一である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞が、前記第１のヌクレオチド配列および／または前記第２のヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記発現制御配列の一方または両方が誘導性プロモーターを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記発現制御配列の両方が誘導性プロモーターを含み、前記誘導性プロモーターが異なる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記発現制御配列の両方が誘導性プロモーターを含み、前記誘導性プロモーターが同じである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１のヌクレオチド配列が、前記組換えポリペプチドの前記ペリプラズムへの移動を方向付けるシグナル配列に融合した組換えポリペプチドをコードする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記組換えポリペプチドを前記ペリプラズムに方向付ける前記配列が、ＯｍｐＡ、ＭａｌＥ、ＨｄｅＡ、ＯｐｐＡ、ＨｄｅＢ、ＧｌｎＨ、ＭｇｌＢ、ａｇｐ、ＯｍｐＣ、ＲｂｓＢ、ＦｋｐＡまたはＹｔｆＱシグナル配列から、より好ましくは、ＯｍｐＡ、ＯｍｐＦ、またはＹｔｆＱシグナル配列から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１２】
前記工程（ｂ）の抽出緩衝液が、１〜１０ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、好ましくは３ｍＭ〜７ｍＭのＥＤＴＡ、より好ましくは約５ｍＭのＥＤＴＡを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記抽出緩衝液が、５０〜２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、好ましくは１００ｍＭ〜２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、より好ましくは約１５０ｍＭ  Ｔｒｉｓを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記抽出緩衝液が、６．５〜９、好ましくは７〜８、より好ましくは約７．７５〜８のｐＨを有する、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
工程（ｂ）が、前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞を抽出緩衝液中で少なくとも１時間かつ２４時間未満、好ましくは少なくとも６時間かつ２４時間未満、２０℃〜３０℃、好ましくは約２５℃の温度でインキュベートすることを含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
工程（ｂ）が振盪することを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞が野生型株、好ましくは野生型Ｋ−１２またはＢ株である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞が、その天然の親株のゲノムよりも約２％〜約３０％小さくなるように遺伝子操作されるゲノムを有する縮小ゲノム株である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞の前記天然の親株がＫ−１２またはＢ株である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株ＭＧ１６５５の少なくとも以下の遺伝子、ｂ０２４５〜ｂ０３０１、ｂ０３０３〜ｂ０３１０、ｂ１３３６〜ｂ１４１１、ｂ４４２６〜ｂ４４２７、ｂ２４４１〜ｂ２４５０、ｂ２６２２〜ｂ２６５４、ｂ２６５７〜ｂ２６６０、ｂ４４６２、ｂ１９９４〜ｂ２００８、ｂ４４３５、ｂ３３２２〜ｂ３３３８、ｂ２３４９〜ｂ２３６３、ｂ１５３９〜ｂ１５７９、ｂ４２６９〜ｂ４３２０、ｂ２９６８〜ｂ２９７２、ｂ２９７５〜ｂ２９７７、ｂ２９７９〜ｂ２９８７、ｂ４４６６〜４４６８、ｂ１１３７〜ｂ１１７２、ｂ０５３７〜ｂ０５６５、ｂ００１６〜ｂ００２２、ｂ４４１２〜ｂ４４１３、ｂ０５７７〜ｂ０５８２、ｂ４４１５、ｂ２３８９〜ｂ２３９０、ｂ２３９２〜ｂ２３９５、ｂ０３５８〜ｂ０３６８、ｂ０３７０〜ｂ０３８０、ｂ２８５６〜ｂ２８６３、ｂ３０４２〜ｂ３０４８、ｂ０６５６、ｂ１３２５〜ｂ１３３３、ｂ２０３０〜ｂ２０６２、ｂ２１９０〜ｂ２１９２、ｂ３２１５〜ｂ３２１９、ｂ３５０４〜ｂ３５０５、ｂ１０７０〜ｂ１０８３、ｂ１８７８〜ｂ１８９４、ｂ１９１７〜ｂ１９５０、ｂ４３２４〜ｂ４３４２、ｂ４３４５〜ｂ４３５８、ｂ４４８６、ｂ０４９７〜ｂ０５０２、ｂ０７００〜ｂ０７０６、ｂ１４５６〜ｂ１４６２、ｂ３４８１〜ｂ３４８４、ｂ３５９２〜ｂ３５９６、ｂ０９８１〜ｂ０９８８、ｂ１０２１〜ｂ１０２９、ｂ２０８０〜ｂ２０９６、ｂ４４３８、ｂ３４４０〜ｂ３４４５、ｂ４４５１、ｂ３５５６〜ｂ３５５８、ｂ４４５５、ｂ１７８６、ｂ０１５０〜ｂ０１５３およびｂ２９４５を欠いているか、または異なるＫ−１２もしくはＢ株の対応する遺伝子を欠いている、減少ゲノム株である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株ＭＧ１６５５の少なくとも以下の遺伝子、ｂ０２４５〜ｂ０３０１、ｂ０３０３〜ｂ０３１０、ｂ１３３６〜ｂ１４１１、ｂ４４２６〜ｂ４４２７、ｂ２４４１〜ｂ２４５０、ｂ２６２２〜ｂ２６５４、ｂ２６５７〜ｂ２６６０、ｂ４４６２、ｂ１９９４〜ｂ２００８、ｂ４４３５、ｂ３３２２〜ｂ３３３８、ｂ２３４９〜ｂ２３６３、ｂ１５３９〜ｂ１５７９、ｂ４２６９〜ｂ４３２０、ｂ２９６８〜ｂ２９７２、ｂ２９７５〜ｂ２９７７、ｂ２９７９〜ｂ２９８７、ｂ４４６６〜４４６８、ｂ１１３７〜ｂ１１７２、ｂ０５３７〜ｂ０５６５、ｂ００１６〜ｂ００２２、ｂ４４１２〜ｂ４４１３、ｂ０５７７〜ｂ０５８２、ｂ４４１５、ｂ２３８９〜ｂ２３９０、ｂ２３９２〜ｂ２３９５、ｂ０３５８〜ｂ０３６８、ｂ０３７０〜ｂ０３８０、ｂ２８５６〜ｂ２８６３、ｂ３０４２〜ｂ３０４８、ｂ０６５６、ｂ１３２５〜ｂ１３３３、ｂ２０３０〜ｂ２０６２、ｂ２１９０〜ｂ２１９２、ｂ３２１５〜ｂ３２１９、ｂ３５０４〜ｂ３５０５、ｂ１０７０〜ｂ１０８３、ｂ１８７８〜ｂ１８９４、ｂ１９１７〜ｂ１９５０、ｂ４３２４〜ｂ４３４２、ｂ４３４５〜ｂ４３５８、ｂ４４８６、ｂ０４９７〜ｂ０５０２、ｂ０７００〜ｂ０７０６、ｂ１４５６〜ｂ１４６２、ｂ３４８１〜ｂ３４８４、ｂ３５９２〜ｂ３５９６、ｂ０９８１〜ｂ０９８８、ｂ１０２１〜ｂ１０２９、ｂ２０８０〜ｂ２０９６、ｂ４４３８、ｂ３４４０〜ｂ３４４５、ｂ４４５１、ｂ３５５６〜ｂ３５５８、ｂ４４５５、ｂ１７８６、ｂ０１５０〜ｂ０１５３、ｂ２９４５、ｂ２４８１〜ｂ２４９２、ｂ２２１９〜ｂ２２３０、ｂ４５００、ｂ３７０７〜ｂ３７２３、ｂ０６４４〜ｂ０６５０、ｂ４０７９〜４０９０、ｂ４４８７、ｂ４０９２〜ｂ４１０６、ｂ０７３０〜ｂ０７３２、ｂ３５７２〜ｂ３５８７、ｂ１６５３、ｂ２７３５〜ｂ２７４０、ｂ２４０５〜ｂ２４０７、ｂ３８９６〜ｂ３９００、ｂ１２０２、ｂ４２６３〜ｂ４２６８、ｂ０６１１、ｂ２３６４〜ｂ２３６６、ｂ０８３９、ｂ０４８８〜ｂ０５００、およびｂ０５０２、または異なるＫ−１２もしくはＢ株の対応する遺伝子を欠いている減少ゲノム株である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞が機能的ｒｅｃＡ遺伝子を欠いている、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞が機能的ｄｉｎＢ遺伝子を欠いている、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞の前記天然の親がＫ−１２株であり、前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞が、以下の改変、（ｉ）オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を増強するためのｒｐｈ遺伝子の欠失、（ｉｉ）活性アセトヒドロキシ酸シンターゼＩＩ産生を回復するためのｉｌｖＧ遺伝子のネイティブ−２フレームシフト変異の修正、および（ｉｉｉ）ｉｃｌＲ遺伝子およびａｒｐＡ遺伝子のすべてまたは一部の欠失、を含む、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞が、以下の毒素抗毒素遺伝子、ｙａｆＱ、ｄｉｎＪ、ｈｈａ、ｔｏｍＢ、ｇｎｓＡ、ｙｍｃＥ、ｙｏｅＢ、ｙｅｆＭ、ｍａｚＦ、ｍａｚＥ、ｍａｚＧ、ｃｐｔＡ／ｙｇｆＸ、ｃｐｔＢ／ｓｄｈＥ、ｍｑｓＲ、ｍｑｓＡ、ｈｉｇＢ、ｈｉｇＡ、ｙｈａＶ、ｐｒｌＦ、ｌｄｒＤ、ｒｄｌＤ、ｉｓｔＲ−２、ｔｉｓＢ、ｃｈｐＢ、ｃｈｐＳ、ｒａｔＡ、ｒａｔＢ、ｌｄｒＡ、ｒｄｌＡ、ｌｄｒＢ、ｒｄｌＢ、ｌｄｒＣ、ｒｄｌＣ、ｈｏｋＢ、ｓｏｋＢ、ｓｉｂＡ、ｉｂｓＡ、ｓｉｂＢ、ｉｂｓＢ、ｏｈｓＣ、ｓｈｏＢ、ｓｉｂＣ、ｉｂｓＣ、ｓｉｂＤ、ｓｉｂＥ、ｉｂｓＤ、ｉｂｓＥ、ｄｉｎＱ、ａｇｒＡ、ａｇｒＢ、ｇｈｏＴ、ｇｈｏＳ、ｙｆｅＣ、ｙｆｅＤ、ｆｉｃ、ｙｈｆＧ、ｙｈｊＪ、ｙｈｊＭ、ｙｈｊＮ、ｙｊｊＪ、ｅｃｎＡ、およびｅｃｎＢを欠いており、かつ必要に応じて、ｈｉｐＡおよびｈｉｐＢを欠いている、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞が機能的ｒｎｃ遺伝子を欠いており、好ましくは、前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主がｒｎｃ遺伝子の完全または部分的欠失を含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記組換えポリペプチドの少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％が前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞の前記ペリプラズムから抽出される、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞が連続発酵モードで、好ましくは少なくとも１４日間、少なくとも３０日間、またはそれ以上の期間培養され、好ましくは、それによって、１日あたり１リットルあたり少なくとも１グラム、少なくとも２グラム、少なくとも３グラムまたはそれ以上の前記組換えタンパク質が産生される、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
４．４１Ｍｂ〜２．７８Ｍｂのゲノムを有し、以下の毒素抗毒素遺伝子、ｙａｆＱ、ｄｉｎＪ、ｈｈａ、ｔｏｍＢ、ｇｎｓＡ、ｙｍｃＥ、ｙｏｅＢ、ｙｅｆＭ、ｍａｚＦ、ｍａｚＥ、ｍａｚＧ、ｃｐｔＡ／ｙｇｆＸ、ｃｐｔＢ／ｓｄｈＥ、ｍｑｓＲ、ｍｑｓＡ、ｈｉｇＢ、ｈｉｇＡ、ｙｈａＶ、ｐｒｌＦ、ｌｄｒＤ、ｒｄｌＤ、ｉｓｔＲ−２、ｔｉｓＢ、ｃｈｐＢ、ｃｈｐＳ、ｒａｔＡ、ｒａｔＢ、ｌｄｒＡ、ｒｄｌＡ、ｌｄｒＢ、ｒｄｌＢ、ｌｄｒＣ、ｒｄｌＣ、ｈｏｋＢ、ｓｏｋＢ、ｓｉｂＡ、ｉｂｓＡ、ｓｉｂＢ、ｉｂｓＢ、ｏｈｓＣ、ｓｈｏＢ、ｓｉｂＣ、ｉｂｓＣ、ｓｉｂＤ、ｓｉｂＥ、ｉｂｓＤ、ｉｂｓＥ、ｄｉｎＱ、ａｇｒＡ、ａｇｒＢ、ｇｈｏＴ、ｇｈｏＳ、ｙｆｅＣ、ｙｆｅＤ、ｆｉｃ、ｙｈｆＧ、ｙｈｊＪ、ｙｈｊＭ、ｙｈｊＮ、ｙｊｊＪ、ｅｃｎＡ、およびｅｃｎＢを欠いており、かつ／または機能的ｒｎｃ遺伝子を欠いている、天然には存在しないＥ．ｃｏｌｉ細菌。
【請求項３０】
前記ｒｎｃ遺伝子の完全または部分的欠失を含む、請求項２９に記載の細菌。
【請求項３１】
前記細菌が、ＩＳ１、ＩＳ２、ＩＳ３、ＩＳ５、ＩＳ１５０およびＩＳ１８６挿入配列のすべてをさらに欠く、請求項２９または３０に記載の細菌。
【請求項３２】
前記細菌がｄｉｎＢ遺伝子の欠失をさらに含む、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項３３】
前記細菌がｒｅｃＡ遺伝子の欠失をさらに含む、請求項２９〜３２のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項３４】
前記細菌の親株がＫ−１２またはＢ株である、請求項２９〜３３のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項３５】
前記細菌の前記親株がＫ−１２株である、請求項３４に記載の細菌。
【請求項３６】
細前記菌が、以下の改変、（ｉ）オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を増強するためのｒｐｈ遺伝子の欠失、（ｉｉ）活性アセトヒドロキシ酸シンターゼＩＩ産生を回復するためのｉｌｖＧ遺伝子のネイティブ−２フレームシフト変異の修正、および（ｉｉｉ）ｉｃｌＲ遺伝子およびａｒｐＡ遺伝子のすべてまたは一部の欠失、のうちの１つ以上、及び好ましくはすべてを含む、請求項３５に記載の細菌。
【請求項３７】
前記細菌の前記親株がＫ−１２またはＢ株である、請求項２９〜３６のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項３８】
前記細菌の前記親株がＫ１２株ＭＧ１６５５である、請求項３７に記載の細菌。
【請求項３９】
前記細菌が前記Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株ＭＧ１６５５の少なくとも以下の遺伝子、ｂ０２４５〜ｂ０３０１、ｂ０３０３〜ｂ０３１０、ｂ１３３６〜ｂ１４１１、ｂ４４２６〜ｂ４４２７、ｂ２４４１〜ｂ２４５０、ｂ２６２２〜ｂ２６５４、ｂ２６５７〜ｂ２６６０、ｂ４４６２、ｂ１９９４〜ｂ２００８、ｂ４４３５、ｂ３３２２〜ｂ３３３８、ｂ２３４９〜ｂ２３６３、ｂ１５３９〜ｂ１５７９、ｂ４２６９〜ｂ４３２０、ｂ２９６８〜ｂ２９７２、ｂ２９７５〜ｂ２９７７、ｂ２９７９〜ｂ２９８７、ｂ４４６６〜４４６８、ｂ１１３７〜ｂ１１７２、ｂ０５３７〜ｂ０５６５、ｂ００１６〜ｂ００２２、ｂ４４１２〜ｂ４４１３、ｂ０５７７〜ｂ０５８２、ｂ４４１５、ｂ２３８９〜ｂ２３９０、ｂ２３９２〜ｂ２３９５、ｂ０３５８〜ｂ０３６８、ｂ０３７０〜ｂ０３８０、ｂ２８５６〜ｂ２８６３、ｂ３０４２〜ｂ３０４８、ｂ０６５６、ｂ１３２５〜ｂ１３３３、ｂ２０３０〜ｂ２０６２、ｂ２１９０〜ｂ２１９２、ｂ３２１５〜ｂ３２１９、ｂ３５０４〜ｂ３５０５、ｂ１０７０〜ｂ１０８３、ｂ１８７８〜ｂ１８９４、ｂ１９１７〜ｂ１９５０、ｂ４３２４〜ｂ４３４２、ｂ４３４５〜ｂ４３５８、ｂ４４８６、ｂ０４９７〜ｂ０５０２、ｂ０７００〜ｂ０７０６、ｂ１４５６〜ｂ１４６２、ｂ３４８１〜ｂ３４８４、ｂ３５９２〜ｂ３５９６、ｂ０９８１〜ｂ０９８８、ｂ１０２１〜ｂ１０２９、ｂ２０８０〜ｂ２０９６、ｂ４４３８、ｂ３４４０〜ｂ３４４５、ｂ４４５１、ｂ３５５６〜ｂ３５５８、ｂ４４５５、ｂ１７８６、ｂ０１５０〜ｂ０１５３およびｂ２９４５を欠いているか、または異なるＫ−１２もしくはＢ株の対応する遺伝子を欠いている、請求項２９〜３８のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項４０】
前記細菌が前記Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株ＭＧ１６５５の少なくとも以下の遺伝子、ｂ０２４５〜ｂ０３０１、ｂ０３０３〜ｂ０３１０、ｂ１３３６〜ｂ１４１１、ｂ４４２６〜ｂ４４２７、ｂ２４４１〜ｂ２４５０、ｂ２６２２〜ｂ２６５４、ｂ２６５７〜ｂ２６６０、ｂ４４６２、ｂ１９９４〜ｂ２００８、ｂ４４３５、ｂ３３２２〜ｂ３３３８、ｂ２３４９〜ｂ２３６３、ｂ１５３９〜ｂ１５７９、ｂ４２６９〜ｂ４３２０、ｂ２９６８〜ｂ２９７２、ｂ２９７５〜ｂ２９７７、ｂ２９７９〜ｂ２９８７、ｂ４４６６〜４４６８、ｂ１１３７〜ｂ１１７２、ｂ０５３７〜ｂ０５６５、ｂ００１６〜ｂ００２２、ｂ４４１２〜ｂ４４１３、ｂ０５７７〜ｂ０５８２、ｂ４４１５、ｂ２３８９〜ｂ２３９０、ｂ２３９２〜ｂ２３９５、ｂ０３５８〜ｂ０３６８、ｂ０３７０〜ｂ０３８０、ｂ２８５６〜ｂ２８６３、ｂ３０４２〜ｂ３０４８、ｂ０６５６、ｂ１３２５〜ｂ１３３３、ｂ２０３０〜ｂ２０６２、ｂ２１９０〜ｂ２１９２、ｂ３２１５〜ｂ３２１９、ｂ３５０４〜ｂ３５０５、ｂ１０７０〜ｂ１０８３、ｂ１８７８〜ｂ１８９４、ｂ１９１７〜ｂ１９５０、ｂ４３２４〜ｂ４３４２、ｂ４３４５〜ｂ４３５８、ｂ４４８６、ｂ０４９７〜ｂ０５０２、ｂ０７００〜ｂ０７０６、ｂ１４５６〜ｂ１４６２、ｂ３４８１〜ｂ３４８４、ｂ３５９２〜ｂ３５９６、ｂ０９８１〜ｂ０９８８、ｂ１０２１〜ｂ１０２９、ｂ２０８０〜ｂ２０９６、ｂ４４３８、ｂ３４４０〜ｂ３４４５、ｂ４４５１、ｂ３５５６〜ｂ３５５８、ｂ４４５５、ｂ１７８６、ｂ０１５０〜ｂ０１５３、ｂ２９４５、ｂ２４８１〜ｂ２４９２、ｂ２２１９〜ｂ２２３０、ｂ４５００、ｂ３７０７〜ｂ３７２３、ｂ０６４４〜ｂ０６５０、ｂ４０７９〜４０９０、ｂ４４８７、ｂ４０９２〜ｂ４１０６、ｂ０７３０〜ｂ０７３２、ｂ３５７２〜ｂ３５８７、ｂ１６５３、ｂ２７３５〜ｂ２７４０、ｂ２４０５〜ｂ２４０７、ｂ３８９６〜ｂ３９００、ｂ１２０２、ｂ４２６３〜ｂ４２６８、ｂ０６１１、ｂ２３６４〜ｂ２３６６、ｂ０８３９、ｂ０４８８〜ｂ０５００、およびｂ０５０２を欠いているか、または異なるＫ−１２もしくはＢ株の対応する遺伝子を欠いている、請求項２９〜３９のいずれか一項に記載の細菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年９月５日に出願された米国仮特許出願第６２／５５４４４３号の利益を主張し、その全開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
単鎖抗体、単鎖フラグメント、および多糖類およびハプテンのためのキャリアとして好適なものなどの産生することが困難なタンパク質の発現および回収を増強するための方法および組成物が提供される。
【背景技術】
【０００３】
ＦＤＡが承認した組換え治療用タンパク質の３０パーセントはＥ．ｃｏｌｉの中で作られており、これらには、キャリアタンパク質、単鎖抗体、および単鎖抗体フラグメントなどの重要なワクチン成分が含まれている。しかし、Ｅ．ｃｏｌｉから組換えタンパク質を生産する標準的な方法は、何十年もの間変わっていない。従来の流加バッチ発酵槽は、標的を含む細菌をますます大きなバッチで培養するために使用され、次いで、これは、タンパク質精製のしばしば複雑で骨の折れる作業の前に大量の均質化に供せられる。このプロセスは費用がかかり、時間がかかり、そして困難かつ広範な精製手順を必要とすることがしばしばであり、収率の損失を生じる。
【０００４】
ジフテリア毒素の変異体非毒性型である、交差反応性物質１９７（ＣＲＭ１９７）は、さまざまな成功した複合ワクチンにおいて使用されている承認されたキャリアタンパク質である。しかし、その製造に伴う問題により、ＣＲＭ１９７の需要は供給を超えている。元々の宿主であるＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅは低レベルのＣＲＭ１９７（０．１〜０．２ｇ／Ｌ）を生成し、バイオセーフティレベル２の施設を必要とする。野生型毒素へのＣＲＭ１９７の潜在的な復帰は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓやほとんどのＥ．ｃｏｌｉ株などの代替宿主において問題のままであり、残留ＣＲＭ１９７毒性はこれらの宿主に著しい生理学的ストレスを引き起こし、生産を制限する。さらに、ほとんどのＥ．ｃｏｌｉ宿主では、ＣＲＭ１９７は不溶性の形で蓄積し（封入体に凝集する）、収率をさらに減少させ、下流の精製工程を複雑にする。発酵のために好まれる多くのＥ．ｃｏｌｉ株は、１）発現ベクターに影響を与える可能性があるか、または２）宿主を破壊する可能性があり、両方の場合において、バッチモードにおいては迅速かつ全体的な生産の損失をもたらし、および拡張連続発酵プロセスにおいてＥ．ｃｏｌｉ宿主の使用を不可能にする。
【０００５】
Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  の非アシル化プロテインＤ（ＰＤ）であるＣＲＭ１９７、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのキャリアタンパク質エキソプロテインＡ（ＥＰＡ）、ならびに単鎖抗体、単鎖抗体フラグメントｓｃＦａｂ  ＹＭＦ１０、単鎖抗体可変フラグメントｓｃＦｖ  ７５１２７などの生産することが困難なキャリアタンパク質の重要性に起因して、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞からこのようなタンパク質を産生および精製するための改善されかつ費用対効果の高い方法についての必要性が存在している。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
いくつかの実施形態では、内因性Ｅ．ｃｏｌｉホスホリパーゼを組換えタンパク質と同時発現させることを含む、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてペリプラズムを標的とする組換えタンパク質の放出を達成するための方法が提供される。いくつかの関連する実施形態では、組換えタンパク質およびホスホリパーゼの誘導後にＥ．ｃｏｌｉ宿主株は抽出緩衝液と接触される。
【０００７】
いくつかの実施形態では、目的の組換えタンパク質のペリプラズムへの移入を方向付けるシグナル配列に融合された、目的の組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を保有する組換え（例えば、縮小ゲノム）Ｅ．ｃｏｌｉ株の発酵を含む対象とする組換えタンパク質を産生する方法が提供され、前記ヌクレオチド配列は発現制御配列に作動可能に連結され、Ｅ．ｃｏｌｉ株は目的の組換えタンパク質と１つ以上のＥ．ｃｏｌｉホスホリパーゼを同時発現する。例示的なペリプラズム標的化シグナルには、米国特許出願公開第２０１７／００７３３７９号の段落［００５５］〜［００５９］に記載されているものが含まれ、その全開示が参照により本明細書に組み込まれる。ＣＲＭ１９７をペリプラズムに方向付けることができる代表的なシグナル配列は、ＵＳ２０１７／００７３３７９の段落［００５７］の最後に列挙され、好ましくは、ＯｍｐＡ、ＭａｌＥ、ＨｄｅＡ、ＯｐｐＡ、ＨｄｅＢ、ＧｌｎＨ、ＭｇｌＢ、ａｇｐ、ＯｍｐＣ、ＲｂｓＢ、ＦｋｐＡ、またはＹｔｆＱシグナル配列から選択され、より好ましくは、ＯｍｐＡ、ＯｍｐＦ、またはＹｔｆＱシグナル配列から選択される。いくつかの好ましい態様において、ＹｔｆＱシグナル配列は、ＰＤ、ＥＰＡまたはＣＲＭ１９７をペリプラズムに方向付ける。いくつかの好ましい態様において、ＯｍｐＡシグナル配列は、単鎖抗体フラグメントｓｃＦａｂ  ＹＭＦ１０、単鎖抗体可変フラグメントｓｃＦｖ  ７５１２７をペリプラズムに方向付ける。
【０００８】
本明細書に記載の方法に従って、任意のＥ．ｃｏｌｉホスホリパーゼを、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主内で目的のタンパク質とともに同時発現させることができる。一実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉ株は、グリセロホスホリルジエステルホスホジエステラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸セグメントを含む（ｇｌｐＱ；ｂ２２３９；ＧｅｎＢａｎｋ  Ｒｅｆ．Ｎｏ．ＮＰ＿４１６７４２．１；配列番号１）。別の実施形態では、Ｅ．ｃｏｌｉ株は、Ａｅｓをコードするヌクレオチド配列を含む核酸セグメントを含む（ｙｂａＣ；ｂ０４７６；ＧｅｎＢａｎｋ  Ｒｅｆ．Ｎｏ．ＮＰ＿４１５００９．１；配列番号２）。別の実施形態では、Ｅ．ｃｏｌｉ株は、リゾホスホリパーゼＬ２をコードするヌクレオチド配列を含む核酸セグメントを含む（ｐｌｄＢ；ｂ３８２５；ＧｅｎＢａｎｋ  Ｒｅｆ．Ｎｏ．ＹＰ＿０２６２６６．１；配列番号３）。好ましい実施形態では、Ｅ．ｃｏｌｉ株は、ＯｍｐＬＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸セグメントを含む（ｐｌｄＡ；ｂ３８２１；ＧｅｎＢａｎｋ  Ｒｅｆ．ＮＯ．ＮＰ＿４１８２６５．１；配列番号４）。
【０００９】
「同時発現」とは、目的のタンパク質およびホスホリパーゼの発現が少なくとも重複するように、目的の組換えタンパク質およびホスホリパーゼの発現が調整されることを意味する。いくつかの好ましい態様において、目的の組換えタンパク質の発現およびホスホリパーゼの発現は、１つ以上の誘導性プロモーターの制御下（例えば、同じまたは別個の発現ベクター上）にある。いくつかの局面において、目的の組換えタンパク質およびホスホリパーゼの発現は、同じ誘導性プロモーターの制御下（例えば、同じまたは別個の発現ベクター上）にある。目的のタンパク質の発現およびホスホリパーゼの発現をほぼ同時に誘導するか、目的のタンパク質をホスホリパーゼの前に誘導するか、またはホスホリパーゼを目的のタンパク質の前に誘導することができる。いくつかの好ましい実施形態では、目的のタンパク質は、ホスホリパーゼの誘導の前（例えば、１時間前〜６時間前）に誘導される。好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉホスホリパーゼは、ホスホリパーゼの内因性レベルと比較して過剰発現され、組換えにより産生される（例えば、発現制御配列に作動可能に連結されたホスホリパーゼをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターをＥ．ｃｏｌｉに導入することにより、または内因性ホスホリパーゼをコードする遺伝子のプロモーターを操作することによる）。あるいは、内因性ホスホリパーゼ遺伝子が操作されて、ホスホリパーゼを過剰発現させてもよい。本明細書に記載される方法に従って、任意のＥ．ｃｏｌｉホスホリパーゼは、目的の組換えタンパク質とともに同時発現させることができる。いくつかの好ましい実施形態では、Ｅ．ｃｏｌｉホスホリパーゼはＯｍｐＬＡである。
【００１０】
好ましい実施形態において、目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列およびホスホリパーゼをコードするヌクレオチド配列は、同じ構築物（例えば発現ベクター）に存在し、同じ誘導性プロモーターの制御下にあるか、異なる誘導性プロモーターの制御下にある。他の実施形態において、目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸セグメントおよびＥ．ｃｏｌｉホスホリパーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸セグメントは、別々の構築物上にあり、同じ誘導性プロモーターの制御下にあってもよく、そうでなくてもよい。
【００１１】
いくつかの態様では、（ｉ）（ａ）発現制御配列に作動可能に連結された、ペリプラズムに目的のタンパク質を標的化する配列に融合された目的の組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および（ｂ）発現制御配列に作動可能に連結されたＥ．ｃｏｌｉホスホリパーゼをコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を保有する組換え（例えば、縮小ゲノム）Ｅ．ｃｏｌｉ株を発酵すること、（ｉｉ）目的の組換えタンパク質およびホスホリパーゼの発現を誘導すること、および（ｉｉｉ）組換えＥ．ｃｏｌｉ株を抽出緩衝液と接触させることにより、目的のタンパク質をペリプラズムから培地に抽出することを含む、目的の組換えタンパク質を産生するための方法が提供される。
【００１２】
いくつかの実施形態では、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、目的のタンパク質の少なくとも９５％または少なくとも９８％が、これらの方法に従ってペリプラズムから放出される。
【００１３】
好ましい実施形態では、抽出緩衝液は、約７〜９のｐＨ値の緩衝剤（例えばＴｒｉｓ）およびキレート剤（例えばＥＤＴＡ）を含む。いくつかの実施形態において、キレート剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレンジアミン、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ、Ｎ、Ｎ´、Ｎ´−四酢酸（ＢＡＰＴＡ）、エチレンジアミン−Ｎ、Ｎ´−二コハク酸（ＥＤＤＳ）、エチレンジアミンテトラ（メチレンホスホン酸）（ＥＤＴＭＰ）およびジエチレントリアミンペンタ（メチレンホスホン酸）（ＤＴＰＭＰ）からなる群より選択される。好ましい実施形態では、キレート剤はＥＤＴＡである。特に好ましい実施形態では、抽出緩衝液は、約７〜約９のｐＨ、好ましくは、約ｐＨ７．７５の、５０ｍＭ〜２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、好ましくは約１５０ｍＭ  Ｔｒｉｓおよび２ｍＭ〜１０ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）好ましくは約５ｍＭのＥＤＴＡを含む。一部の実施形態では、目的のタンパク質のペリプラズムから培地への抽出は、組換えＥ．ｃｏｌｉを抽出緩衝液と少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも６時間、少なくとも８時間、少なくとも１０時間、少なくとも１２時間、少なくとも１３時間、少なくとも１４時間、少なくとも１５時間、少なくとも１６時間、少なくとも１８時間、少なくとも２０時間、少なくとも２４時間以上またはその間の任意の範囲（例えば、１０〜２０時間の間または１２〜１６時間の間）、接触させることにより達成される。好ましくは、組換えＥ．ｃｏｌｉを抽出緩衝液と少なくとも２時間かつ２４時間以内、より好ましくは少なくとも６時間かつ２４時間以内接触させる。好ましくは、接触工程は２０〜３０℃、より好ましくは約２５℃で行われる。
【００１４】
いくつかの実施形態では、この方法はバッチ発酵を含む。他の実施形態では、この方法は流加バッチ発酵を含む。好ましい実施形態では、この方法は連続発酵を含む。特に好ましい実施形態では、この方法は、縮小ゲノム株Ｅ．ｃｏｌｉの連続発酵を含む。約５％〜約３０％のゲノム欠失を含む縮小ゲノムＥ．ｃｏｌｉは、少なくとも７日間以上、少なくとも１４日間以上、少なくとも２１日間以上、少なくとも３０日間以上、少なくとも４５日間以上、少なくとも６０日間以上、少なくとも１８０日間以上、少なくとも２４０日間以上、さらには少なくとも３６０日間以上、またはその間の任意の範囲、連続して発酵することができる。対照的に、一般に発酵に使用されるＥ．ｃｏｌｉ株は、連続製造における使用を不可能にするストレス誘導システムに供せられる。いくつかの実施形態では、連続発酵方法は、誘導相から種培養の成長を分離する２容器ケモスタット戦略を含む。簡単に説明すると、新しく成長した細胞が、誘導されていないシード容器（バイオリアクター１）から生産容器（バイオリアクター２）に供給され、そこで誘導剤が加えられ、生成物合成が開始される。定常状態のケモスタットは、誘導のために健康な細胞の生産容器への供給を提供する非誘導種子容器を備え、生産容器への導入まで、種子細胞の成長がストレスフリーであることを保証する。例示的な連続発酵装置には、図１７に例解される装置および米国特許公開第２０１８／０８７０１８号に記載される装置が含まれ、その内容は参照により本明細書に組み込まれるが、任意の好適な連続発酵方法および装置が使用されて本明細書に記載される方法を実施してもよい。
【００１５】
ペリプラズム標的化シグナルに融合し、ホスホリパーゼを同時発現する目的のタンパク質をコードする核酸セグメントを含む縮小ゲノムＥ．ｃｏｌｉ株は、７日間以上、１４日間以上、３０日間以上、４５日間以上、６０日間以上、１８０日間以上、２４０日間以上、または３６０日間以上さえ、連続的に発酵させることができる。好ましい実施形態において、ＣＲＭ１９７、ＰＤおよびＥＰＡから選択されるキャリアタンパク質をコードし、ホスホリパーゼを同時発現する核酸セグメントを含む縮小ゲノムＥ．ｃｏｌｉ株は、少なくとも５〜６５日間（またはその間の任意の範囲）、連続的に発酵され、それにより、連続発酵の間に培地中に少なくとも１〜９グラム／リットル／日のキャリアタンパク質の収率が得られる。Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞は連続発酵プロセスの間に無傷のままであり、培地は細胞溶解から生じる細胞タンパク質および核酸を混入することが実質的にないため、キャリアタンパク質は培地から直接精製することができる。
【００１６】
他の実施形態では、単鎖抗体断片ｓｃＦａｂ  ＹＭＦ１０、単鎖抗体可変断片ｓｃＦｖ  ７５１２７、共役キャリアタンパク質ＣＲＭ１９７、ＰＤ、およびＥＰＡなどの組換えタンパク質を産生することが困難な発言の増強のために特に重要であり、発酵からのこれらのタンパク質の回収を容易にする、改善された特性を有する遺伝子改変されたＥ．ｃｏｌｉ株が提供される。
【００１７】
いくつかの実施形態では、１つ以上の毒素抗毒素（ＴＡ）遺伝子の欠失を含むＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２またはＢ株が提供される。いくつかの態様において、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２またはＢ株は、１つ以上のＴＡ遺伝子の染色体欠失を含む。他の実施形態では、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２またはＢ株は、プラスミドからの１つ以上のＴＡ遺伝子の欠失を含む。好ましい実施形態では、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２またはＢ株は染色体またはプラスミドＴＡ遺伝子を含まない。いくつかの実施形態では、野生型Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２またはＢ株は、１つ以上のＴＡ遺伝子を欠失するように改変される。他の実施形態では、縮小ゲノムＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２またはＢ株（例えば、その天然の親Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株のゲノムよりも約５％〜約３０％小さくなるように遺伝子改変されたＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株またはＢ株）は、１つ以上のＴＡ遺伝子を欠失するように改変される。
【００１８】
Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２またはＢ株から欠失されたＴＡ遺伝子は、１型（例えば、ｌｄｒＡ、ｒｄｌＡ、ｌｄｒＢ、ｒｄｌＢ、ｌｄｒＣ、ｒｄｌＣ、ｌｄｒＤ、ｒｄｌＤ、ｈｏｋＢ、ｓｏｋＢ、ｓｉｂＡ、ｉｂｓＡ、ｓｉｂＢ、ｉｂｓＢ、ｏｈｓＣ、ｓｈｏＢ、ｓｉｂＣ、ｉｂｓＣ、ｓｉｂＤ、ｉｂｓＤ、ｄｉｎＱ、ａｇｒＡ、ａｇｒＢ、ｙｈｊＪ、ｙｈｊＭ、ｙｈｊＮ、ｉｓｔＲ−２、ｔｉｓＢ）、２型（ＹａｆＱ、ｄｉｎＪ、ｈｈａ、ｔｏｍＢ、ｇｎｓＡ、ｙｍｃＥ、ｙｏｅＢ、ｙｅｆＦ、ｙｅｆＭ、ｍａｚＦ、ｍａｚＥ、ｍａｚＧ、ｃｐｔＡ／ｙｇｆＸ、ｃｐｔＢ／ｓｄｈＥ、ｍｑｓＲ、ｍｑｓＡ、ｈｉｇＢ、ｈｉｇＡ、ｙｈａＶ、ｐｒｌＦ、ｌｄｒＤ、ｒｄｌＤ、ｉｓｔｒ−２、ｔｉｓＢ、ｃｈｐＢ、ｃｈｐＳ、ｒａｔＡ、ｒａｔＢ、ｅｃｎＡ、ｅｃｎＢ）、４型（ｃｂｔＡ、ｃｂｅＡ）、および／または５型（ｅｇｇｈｏＴ、ｇｈｏＳ）ＴＡ遺伝子であり得る。
【００１９】
いくつかの実施形態では、以下のＴＡ遺伝子の１つ以上、好ましくはすべてがＥ．ｃｏｌｉ株から欠失される：ＹａｆＱ、ｄｉｎＪ、ｈｈａ、ｔｏｍＢ、ｇｎｓＡ、ｙｍｃＥ、ｙｏｅＢ、ｙｅｆＭ、ｍａｚＦ、ｍａｚＥ、ｍａｚＧ、ｃｐｔＡ／ｙｇｆＸ、ｃｐｔＢ／ｓｄｈＥ、ｍｑｓＲ、ｍｑｓＡ、ｈｉｇＢ、ｈｉｇＡ、ｙｈａＶ、ｐｒｌＦ、ｌｄｒＤ、ｒｄｌＤ、ｉｓｔＲ−２、ｔｉｓＢ、ｃｈｐＢ、ｃｈｐＳ、ｒａｔＡ、ｒａｔＢ、ｌｄｒＡ、ｒｄｌＡ、ｌｄｒＢ、ｒｄｌＢ、ｌｄｒＣ、ｒｄｌＣ、ｈｏｋＢ、ｓｏｋＢ、ｓｉｂＡ、ｉｂｓＡ、ｓｉｂＢ、ｉｂｓＢ、ｏｈｓＣ、ｓｈｏＢ、ｓｉｂＣ、ｉｂｓＣ、ｓｉｂＤ、ｓｉｂＥ、ｉｂｓＤ、ｉｂｓＥ、ｄｉｎＱ、ａｇｒＡ、ａｇｒＢ、ｇｈｏＴ、ｇｈｏＳ、ｙｆｅＣ、ｙｆｅＤ、ｆｉｃ、ｙｈｆＧ、ｙｈｊＪ、ｙｈｊＭ、ｙｈｊＮ、ｙｊｊＪ、ｅｃｎＡ、および／またはｅｃｎＢ。いくつかの実施形態では、ｈｉｐＡおよび／またはｈｉｐＢが欠失される。
【００２０】
別の実施形態において、以下の表１に列挙される１つ以上のＴＡ遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ株から欠失される。好ましい実施形態では、表１に列挙されるすべてのＩＩ型ＴＡ遺伝子が欠失される。特に好ましい実施形態では、表１に列挙されるすべてのＴＡ遺伝子が欠失される。
【表１−１】
2020532322.tif 000003
【表１−２】
2020532322.tif 000004
【００２１】
他の実施形態では、ｒｎｃ（ｂ２５６７）遺伝子（リボヌクレアーゼＩＩＩをコードする）の発現を低減または排除するように遺伝的に改変されたＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２またはＢ株が提供される。好ましくは、ｒｎｃ遺伝子産物の発現は、ｒｎｃ遺伝子の部分的または完全な欠失により低減または排除される。いくつかの実施形態において、野生型Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２またはＢ株は、ｒｎｃ遺伝子の発現を低減または排除するように改変される。好ましい実施形態では、縮小ゲノムＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株（例えば、その天然の親Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株のゲノムよりも約２％または約５％〜約２２％または約３０％小さくなるように遺伝子改変されたＥ．ｃｏｌｉ株）は、ｒｎｃ遺伝子の発現を低減または排除するように改変される。
【００２２】
いくつかの実施形態では、ｒｎｃ遺伝子の部分的または完全な欠失を含み、表１に列挙されたＴＡ遺伝子の１つ以上、好ましくはすべての欠失を含むＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２またはＢ株が提供される。好ましい実施形態では、ｒｎｃ遺伝子の部分的または完全な欠失を含み、表１に列挙されたＴＡ遺伝子の１つ以上、好ましくはすべての欠失を含む縮小ゲノムＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株が提供される。
【００２３】
他の実施形態では、ｒｎｃ遺伝子の部分的または完全な欠失を含み、および／または表１に列挙されたＴＡ遺伝子の１つ以上、および好ましくはすべての欠失を含み、さらに以下の改変、（ａ）オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性の増強、（ｂ）活性アセトヒドロキシ酸シンターゼＩＩの産生、ならびに（ｃ）ｉｃｌＲ遺伝子およびａｒｐＡ遺伝子の発現の低下を含むＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株が提供される。
【００２４】
関連する実施形態では、ｒｎｃ遺伝子の部分的または完全な欠失を含み、および／または表１に列挙されたＴＡ遺伝子の１つ以上の対、および好ましくはすべてのＴＡ遺伝子の対の欠失を含み、および／または以下の改変、（ａ）オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性の増強、（ｂ）活性アセトヒドロキシ酸シンターゼＩＩの産生、ならびに（ｃ）ｉｃｌＲ遺伝子およびａｒｐＡ遺伝子の発現の低下を含み、ならびに、その内容が参照により本明細書に組み込まれるＷＩＰＯ公開第２０１３／０５９５９５号に記載されているように、非機能的ｄｉｎＢを含む（ｂ０２３１、ＭＧ１６５５ゲノム上の座標２５０８９８−２５１９５３）遺伝子を含み、および選択的に非機能的ｐｏｌＢ（ｂ００６０、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２  ＭＧ１６５５ゲノム上の座標６３４２９−６５７８０）および／またはｕｍｕＤＣ遺伝子（ｂ１１８３−ｂ１１８４、ＭＧ１６５５ゲノム上の座標１２２９９９０−１２３１６６７）を含む、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株が提供される。好ましくは、（これらの）遺伝子は、完全または部分的な欠失により不活性化される。
【００２５】
いくつかの態様において、その天然の親株のゲノムよりも約２％または約５％〜約２２％または約３０％小さくなるように遺伝子操作されるゲノムを有する縮小ゲノムＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２またはＢ株が提供され、縮小ゲノムＥ．ｃｏｌｉは、本明細書に記載の１つ以上の欠失または修飾を含み、挿入配列を含まない。
【００２６】
縮小ゲノム細菌は、細菌の天然の親株から選択された遺伝子を欠失させることにより産生され得るか、または例えば、事前に選択された遺伝子のアセンブリとして完全に合成され得る。本明細書における議論から容易に明らかなように、縮小ゲノム細菌は、比較される天然の親株において見出され、特定の必須遺伝子を共有する遺伝子の完全な相補物よりも少ない。
【００２７】
本発明の改変されたＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２またはＢ株を利用して目的のポリペプチドを産生する方法もまた提供され、ここで目的の可溶性ポリペプチドはペリプラズムを標的とし、および／または発酵培地に分泌される。一実施形態において、ポリペプチドは、発現制御配列に作動可能に連結されたポリペプチドをコードする核酸を含む改変Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２またはＢ株を、ポリペプチドを発現するために好適な条件下で培養することにより産生される。一態様では、核酸は異種タンパク質をコードする。関連する局面において、タンパク質は、本明細書に記載の改変を含まないＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２またはＢ株におけるよりも高いレベルで、本発明の改変Ｅ．ｃｏｌｉ株において産生される。さらに別の態様では、タンパク質産生は、同じ増殖条件下でそのような改変細胞が達成することができる多い細胞数により、本明細書に記載の改変を含まないＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２またはＢ株よりも高いレベルで増加する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるような、発現制御配列に作動可能に連結され、選択的にＥ．ｃｏｌｉホスホリパーゼを同時発現する、ペリプラズムシグナルペプチドに融合された目的タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を保有する、改変Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２またはＢ株は、連続発酵に供せられ、それにより、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも５、少なくとも７、さらには少なくとも１０グラム／リットル／日の収率が、少なくとも１日間、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも７日間、少なくとも１４日間、少なくとも３０日間、少なくとも６０日間、少なくとも９０日間、少なくとも１２０日間、または少なくとも３６５日間さえの期間の間、ペリプラズムから（例えば、ホスホリパーゼは同時発現されない場合）および／または培地から（ホスホリパーゼが同時発現される場合）直接得られる。
【００２８】
本発明の改変されたＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２またはＢ株を利用して異種核酸（例えば、プラスミドなどのベクター）を増幅するための方法もまた提供される。一実施形態において、核酸は、好適な栄養条件下で異種核酸を含む改変Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２またはＢ株を培養し、それによって核酸を増幅することにより産生される。さらに別の態様では、核酸産生は、同じ増殖条件下でそのような改変細胞が達成することができるより多くの細胞数により、本明細書に記載の改変を含まないＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２またはＢ株よりも高いレベルで増加する。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】振盪フラスコ培養におけるキャリアタンパク質の抽出。ＣＲＭ１９７、プロテインＤおよびＥＰＡのペリプラズム収率（左パネル）を、抽出緩衝液（１５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．７５、５ｍＭ  ＥＤＴＡ）を使用して得られた収率（右パネル）と比較した。簡単に言えば、それぞれの場合において、分泌シグナル（例えば、ＹｔｆＱ）に融合されたキャリアタンパク質をコードする発現プラスミドを保有する縮小ゲノムＥ．ｃｏｌｉ株を振盪フラスコ培養に供し、一旦宿主細胞が飽和に達するとキャリアタンパク質が誘導された。Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡ抽出緩衝液とともに６時間インキュベートした後の各キャリアタンパク質のペリプラズム収率の割合を示す。各々の場合における３回の実験からのタンパク質収率を示す。
【図２】ＳＧ６９  ｍｅｔａ  ｌｐｐ株は、ＥＰＡを培地に放出することができ、これは精製を容易にする。ＥＰＡの発現と放出を示す連続発酵。ペリプラズムＥＰＡ（暗）は、誘導後３週間まで蓄積しないことに注目のこと。培地中のＥＰＡ量は明で示される。Ａに最適な線（薄い明と中程度）は４次である。挿入図は、ＥＰＡに対するポリクローナル抗体を使用してキャピラリーウェスタンによって分析された１日６バッチ（２０〜２５日目、Ｄ２０−Ｄ２５と表示）の培地中のＥＰＡである。各例の重複レーンは、１：１０および１：１００希釈に対応する。
【図３】連続発酵中にプロテインＤが培地に放出される。ペリプラズムを標的としたＰＤを発現したＳＧ６９ｍｅｔａ株（別名ＭＤＳ６９ｍｅｔａ）を使用して、３つの別々の連続発酵（図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ）を実施した。誘導（１００μＭＩＰＴＧ）は、図３Ａおよび図３Ｂの１日目および図３Ｃの０日目であった。Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌａｂｃｈｉｐキャピラリータンパク質電気泳動を使用して、ペリプラズムＰＤ（暗）および放出ＰＤ（明）値を１日２回測定した。ペリプラズムＰＤ値（ｇ／Ｌ／日）は、ＯＤ６００の測定値に基づいている（ＡＣの平均ＯＤは、それぞれ２２４、２２０、２１４であった）。放出されたＰＤ（光）は、培地から直接測定された。図３Ｂの挿入図は、示された日以内に放出されたＰＤの増加を示す（キャリパー分析、パネル上部）。キャピラリーウェスタン分析（Ｗｅｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｉｍｐｌ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）（図３Ｂの下部パネル）は、培地サンプル中のＰＤの存在を確認した。機器の直線範囲内にある測定値を得るために、ウェスタンサンプルは希釈されていることに注目のこと。図３Ｂおよび３Ｃ（非常に明）の最良適合線は、４  次多項式である。
【図４】質量分析を用いたＰＤ配列の検証。推定ＰＤに対応する発酵培地からの非常に濃縮されたバンドを４−１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥスラブゲルから切除し、トリプシン消化またはキモトリプシン消化の後に質量分析を行った。カバレッジは＞  ９９％であった。
【図５Ａ】ｐｌｄＡの発現後の振盪フラスコ培養からのキャリアタンパク質の抽出。ＹｔｆＱ分泌シグナル（ＩＰＴＧ誘導性プロモーターの制御下）およびｐｌｄＡ（ドキシサイクリン（ＤＯＸ）誘導性プロモーターの制御下）に融合したキャリアタンパク質をコードするプラスミドを保有する宿主株ＳＧ６９ｍｅｔａの培養物がキャリアタンパク質発現についてＩＰＴＧを用いて誘導され、４時間後にｐｌｄＡ発現が誘導され（示された濃度のＤＯＸ）、培養物は１６時間インキュベートされた。２  ＯＤの培養液をペリプラズム分離（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  ａｎ  Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）に供し、一方１．５  ｍｌを１５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ  ７．７５、５  ｍＭ  ＥＤＴＡにし、２５℃で２４時間振盪抽出した。抽出値は、抽出および遠心分離後の中間上清からのものである。
【図５Ｂ】ｐｌｄＡの発現後の振盪フラスコ培養からのキャリアタンパク質の抽出。ＹｔｆＱ分泌シグナル（ＩＰＴＧ誘導性プロモーターの制御下）およびｐｌｄＡ（ドキシサイクリン（ＤＯＸ）誘導性プロモーターの制御下）に融合したキャリアタンパク質をコードするプラスミドを保有する宿主株ＳＧ６９ｍｅｔａの培養物がキャリアタンパク質発現についてＩＰＴＧを用いて誘導され、４時間後にｐｌｄＡ発現が誘導され（示された濃度のＤＯＸ）、培養物は１６時間インキュベートされた。２  ＯＤの培養液をペリプラズム分離（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  ａｎ  Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）に供し、一方１．５  ｍｌを１５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ  ７．７５、５  ｍＭ  ＥＤＴＡにし、２５℃で２４時間振盪抽出した。抽出値は、抽出および遠心分離後の中間上清からのものである。
【図５Ｃ】ｐｌｄＡの発現後の振盪フラスコ培養からのキャリアタンパク質の抽出。ＹｔｆＱ分泌シグナル（ＩＰＴＧ誘導性プロモーターの制御下）およびｐｌｄＡ（ドキシサイクリン（ＤＯＸ）誘導性プロモーターの制御下）に融合したキャリアタンパク質をコードするプラスミドを保有する宿主株ＳＧ６９ｍｅｔａの培養物がキャリアタンパク質発現についてＩＰＴＧを用いて誘導され、４時間後にｐｌｄＡ発現が誘導され（示された濃度のＤＯＸ）、培養物は１６時間インキュベートされた。２  ＯＤの培養液をペリプラズム分離（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  ａｎ  Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）に供し、一方１．５  ｍｌを１５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ  ７．７５、５  ｍＭ  ＥＤＴＡにし、２５℃で２４時間振盪抽出した。抽出値は、抽出および遠心分離後の中間上清からのものである。
【図６Ａ】本発明の実施形態を示す。図６Ａ：ＣＲＭ１９７  ＯＲＦのＣ末端とｐｌｄＡ  ＯＲＦの間の介在接合部の配列を示す。パートＡ：ＣＲＭ１９７  ＯＲＦの終止コドンのすぐ後に、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）およびｐｌｄＡ  ＯＲＦが続く。強度の異なる２つの代表的なリボソーム結合部位が示される。文献および他のバイシストロン性構造体に伴う以前の経験に基づいて、ＲＢＳの修飾を使用して、下流のｐｌｄＡ  ＯＲＦの翻訳頻度を増加または減少させることができる。パートＢ：ＭＤＳ６９ｍｅｔａ（別名Ｔ６９ｍｅｔａ）のゲノムを改変して、内因性ゲノムｐｌｄＡのＤＯＸ誘導を可能にした。ｔｅｔリプレッサーおよびＴ５ＤＥ２０−デュアルｔｅｔＯプロモーター／オペレーターは、ネイティブｐｌｄＡ遺伝子およびそのネイティブプロモーターの上流に挿入された。この株のｐｌｄＡ遺伝子は、その内在性プロモーターおよび導入されたプロモーターから誘導することができる。図６Ｂ：ゲノムからのＰｌｄＡの発現は、Ｔｒｉｓ  ／  ＥＤＴＡによるＣＲＭ１９７抽出を強化したが、ペリプラズムにあるものの１００％抽出を生じることはできなかった。本発明者らはまた、（ｉ）ＯｍｐＬＡ発現が誘導因子ドキシサイクリンによって用量依存性様式で制御され、ＣＲＭ１９７発現が誘導因子ＩＰＴＧによって制御された、ｐＳＸ２−ｙｔｆＱ−ＣＲＭ１９７と互換性のあるプラスミド上のｔｅｔ−オペレーター／  ｔｅｔ−リプレッサー制御プロモーターの制御下に、ｐｌｄＡ  ＯＲＦを配置することにより、および（ｉｉ）ＣＲＭ１９７をｔｅｔ−Ｏｐｅｒａｔｏｒ  ／  ｔｅｔ−ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ制御プロモーターの下に配置し、ｐｌｄＡ発現をＩＴＰＧ誘導性プロモーターの下に配置することにより、良好な結果を達成した。
【図６Ｂ】本発明の実施形態を示す。図６Ａ：ＣＲＭ１９７  ＯＲＦのＣ末端とｐｌｄＡ  ＯＲＦの間の介在接合部の配列を示す。パートＡ：ＣＲＭ１９７  ＯＲＦの終止コドンのすぐ後に、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）およびｐｌｄＡ  ＯＲＦが続く。強度の異なる２つの代表的なリボソーム結合部位が示される。文献および他のバイシストロン性構造体に伴う以前の経験に基づいて、ＲＢＳの修飾を使用して、下流のｐｌｄＡ  ＯＲＦの翻訳頻度を増加または減少させることができる。パートＢ：ＭＤＳ６９ｍｅｔａ（別名Ｔ６９ｍｅｔａ）のゲノムを改変して、内因性ゲノムｐｌｄＡのＤＯＸ誘導を可能にした。ｔｅｔリプレッサーおよびＴ５ＤＥ２０−デュアルｔｅｔＯプロモーター／オペレーターは、ネイティブｐｌｄＡ遺伝子およびそのネイティブプロモーターの上流に挿入された。この株のｐｌｄＡ遺伝子は、その内在性プロモーターおよび導入されたプロモーターから誘導することができる。図６Ｂ：ゲノムからのＰｌｄＡの発現は、Ｔｒｉｓ  ／  ＥＤＴＡによるＣＲＭ１９７抽出を強化したが、ペリプラズムにあるものの１００％抽出を生じることはできなかった。本発明者らはまた、（ｉ）ＯｍｐＬＡ発現が誘導因子ドキシサイクリンによって用量依存性様式で制御され、ＣＲＭ１９７発現が誘導因子ＩＰＴＧによって制御された、ｐＳＸ２−ｙｔｆＱ−ＣＲＭ１９７と互換性のあるプラスミド上のｔｅｔ−オペレーター／  ｔｅｔ−リプレッサー制御プロモーターの制御下に、ｐｌｄＡ  ＯＲＦを配置することにより、および（ｉｉ）ＣＲＭ１９７をｔｅｔ−Ｏｐｅｒａｔｏｒ  ／  ｔｅｔ−ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ制御プロモーターの下に配置し、ｐｌｄＡ発現をＩＴＰＧ誘導性プロモーターの下に配置することにより、良好な結果を達成した。
【図７】ＹｔｆＱ分泌シグナル（ＩＰＴＧ誘導性プロモーターの制御下にある）に融合したＣＲＭ１９７をコードし、ドキシサイクリン誘導性プロモーターの制御下でＯｍｐＬＡをコードしている、単一プラスミド発現ベクターを保有する縮小ゲノムＥ．  ｃｏｌｉ株Ｔ６９  Ｍｅｔａ  ｒｅｃＡ（別名ＭＤＳ６９ｍｅｔａ  ｒｅｃＡ）の培地への組換えＣＲＭ９１７の放出に対するホスホリパーゼ（ＰｌｄＡが例示される）の同時発現の効果を例解する。振盪フラスコ培養において宿主細胞が一旦飽和に達すると、ＣＲＭ１９７およびＯｍｐＬＡが発現し、Ｔｒｉｓ  ／  ＥＤＴＡとの２時間または一晩のインキュベーション後に培地およびペリプラズム中の可溶性ＣＲＭ１９７の収率が評価された。Ｔ６９（別名ＭＤＳ６９）は、ＭＤＳ４２のすべての欠失および２７の追加の欠失を含む複数欠失株である。Ｔ６９  Ｍｅｔａ  ｒｅｃＡ（別名ＭＤＳ６９ｍｅｔａ  ｒｅｃＡ）は、ＭＤＳ６９の欠失を含み、ネイティブｒｐｈおよびｉｌｖＧフレームシフト変異の修正、ｉｃｌＲ遺伝子およびａｒｐＡ遺伝子の欠失、ならびにｒｅｃＡ遺伝子の欠失も含む。
【図８】ＹｔｆＱ分泌シグナル（ＩＰＴＧ誘導性プロモーターの制御下にある）に融合したｒＥＰＡをコードし、ドキシサイクリン誘導性プロモーターの制御下でＯｍｐＬＡをコードする単一のプラスミド発現ベクターを保有する縮小ゲノムＥ．ｃｏｌｉ株Ｔ６９  Ｍｅｔａ  ｒｅｃＡ（別名ＭＤＳ６９ｍｅｔａ  ｒｅｃＡ）の培地への組換えエキソプロテインＡ（ｒＥＰＡ）の放出に対するホスホリパーゼ（ＯｍｐＬＡが例示される）の同時発現の効果を例解する。振盪フラスコ培養で一旦宿主細胞が飽和に達すると、ｒＥＰＡおよびＯｍｐＬＡが誘導され、Ｔｒｉｓ  ／  ＥＤＴＡとの２時間または一晩のインキュベーション後に培地およびペリプラズム中の可溶性ｒＥＰＡの収率が評価された。
【図９】ＹｔｆＱ分泌シグナル（ＩＰＴＧ誘導性プロモーターの制御下にある）と融合したＰＤをコードし、ドキシサイクリン誘導性プロモーターの制御下にあるＯｍｐＬＡをコードする単一のプラスミド発現ベクターを保有する縮小ゲノムＥ．ｃｏｌｉ株Ｔ６９  Ｍｅｔａ  ｒｅｃＡ（別名ＭＤＳ６９ｍｅｔａ  ｒｅｃＡ）の培地への組換えプロテインＤ（ＰＤ）の放出に対するホスホリパーゼ（ＯｍｐＬＡが例示される）の同時発現の効果を例解する。振盪フラスコ培養で一旦宿主細胞が飽和に達すると、ＰＤおよびＯｍｐＬＡが誘導され、Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡとの２時間、６時間または一晩のインキュベーション後に培地およびペリプラズムの可溶性ＰＤの収率が評価された。
【図１０Ａ】ＹｔｆＱ分泌シグナル（ＩＰＴＧ誘導性プロモーターの制御下にある）に融合したＣＲＭ１９７（図１０Ａ）、プロテインＤ（図１０Ｂ）またはｒＥＰＡ（図１０Ｃ）のいずれかをコードし、そして単一のテトラサイクリンオペレーター（ｔｅｔＯ）ドキシサイクリン誘導性プロモーターの制御下にあるＯｍｐＬＡをコードする、単一のプラスミド発現ベクターを保有するＴ６９  Ｍｅｔａ  ｒｅｃＡ（別名ＭＤＳ６９ｍｅｔａ  ｒｅｃＡ）株における基底内因性（１０Ａレーン４〜６のＳＧ７７６６  ２ｎｄ  ０−１００ｎｍ  ＤＯＸ左パネル）および基底内因性＋非誘導（ＳＧ９０４０レーン４）ＯｍｐＬＡレベル（ＤＯＸの非存在下での培地へのキャリアタンパク質の放出により測定）を、ＩＰＴＧ誘導性プロモーターの制御下にあるＹｔｆＱ分泌シグナルに融合したＣＲＭ１９７（図１０Ａ）、プロテインＤ（図１０Ｂ）、またはｒＥＰＡ（図１０Ｃ）のみをコードする単一のプラスミド発現ベクター（すなわち、このベクターにはＯｍｐＬＡをコードする配列はない）を保有するＴ６９  ｍｅｔａ  ｒｅｃＡ（別名ＭＤＳ６９ｍｅｔａ  ｒｅｃＡ）株と比較して例解する。ホスホリパーゼの同時発現は、培地中のキャリアタンパク質の放出を有意に増加させ、最高の誘導因子濃度のｒＥＰＡおよびＣＲＭ１９７では約５倍、最高の誘導因子濃でのＰＤでは約３倍であった。
【図１０Ｂ】ＹｔｆＱ分泌シグナル（ＩＰＴＧ誘導性プロモーターの制御下にある）に融合したＣＲＭ１９７（図１０Ａ）、プロテインＤ（図１０Ｂ）またはｒＥＰＡ（図１０Ｃ）のいずれかをコードし、そして単一のテトラサイクリンオペレーター（ｔｅｔＯ）ドキシサイクリン誘導性プロモーターの制御下にあるＯｍｐＬＡをコードする、単一のプラスミド発現ベクターを保有するＴ６９  Ｍｅｔａ  ｒｅｃＡ（別名ＭＤＳ６９ｍｅｔａ  ｒｅｃＡ）株における基底内因性（１０Ａレーン４〜６のＳＧ７７６６  ２ｎｄ  ０−１００ｎｍ  ＤＯＸ左パネル）および基底内因性＋非誘導（ＳＧ９０４０レーン４）ＯｍｐＬＡレベル（ＤＯＸの非存在下での培地へのキャリアタンパク質の放出により測定）を、ＩＰＴＧ誘導性プロモーターの制御下にあるＹｔｆＱ分泌シグナルに融合したＣＲＭ１９７（図１０Ａ）、プロテインＤ（図１０Ｂ）、またはｒＥＰＡ（図１０Ｃ）のみをコードする単一のプラスミド発現ベクター（すなわち、このベクターにはＯｍｐＬＡをコードする配列はない）を保有するＴ６９  ｍｅｔａ  ｒｅｃＡ（別名ＭＤＳ６９ｍｅｔａ  ｒｅｃＡ）株と比較して例解する。ホスホリパーゼの同時発現は、培地中のキャリアタンパク質の放出を有意に増加させ、最高の誘導因子濃度のｒＥＰＡおよびＣＲＭ１９７では約５倍、最高の誘導因子濃でのＰＤでは約３倍であった。
【図１０Ｃ】ＹｔｆＱ分泌シグナル（ＩＰＴＧ誘導性プロモーターの制御下にある）に融合したＣＲＭ１９７（図１０Ａ）、プロテインＤ（図１０Ｂ）またはｒＥＰＡ（図１０Ｃ）のいずれかをコードし、そして単一のテトラサイクリンオペレーター（ｔｅｔＯ）ドキシサイクリン誘導性プロモーターの制御下にあるＯｍｐＬＡをコードする、単一のプラスミド発現ベクターを保有するＴ６９  Ｍｅｔａ  ｒｅｃＡ（別名ＭＤＳ６９ｍｅｔａ  ｒｅｃＡ）株における基底内因性（１０Ａレーン４〜６のＳＧ７７６６  ２ｎｄ  ０−１００ｎｍ  ＤＯＸ左パネル）および基底内因性＋非誘導（ＳＧ９０４０レーン４）ＯｍｐＬＡレベル（ＤＯＸの非存在下での培地へのキャリアタンパク質の放出により測定）を、ＩＰＴＧ誘導性プロモーターの制御下にあるＹｔｆＱ分泌シグナルに融合したＣＲＭ１９７（図１０Ａ）、プロテインＤ（図１０Ｂ）、またはｒＥＰＡ（図１０Ｃ）のみをコードする単一のプラスミド発現ベクター（すなわち、このベクターにはＯｍｐＬＡをコードする配列はない）を保有するＴ６９  ｍｅｔａ  ｒｅｃＡ（別名ＭＤＳ６９ｍｅｔａ  ｒｅｃＡ）株と比較して例解する。ホスホリパーゼの同時発現は、培地中のキャリアタンパク質の放出を有意に増加させ、最高の誘導因子濃度のｒＥＰＡおよびＣＲＭ１９７では約５倍、最高の誘導因子濃でのＰＤでは約３倍であった。
【図１１】デュアルｔｅｔオペレーターを含むドキシサイクリン誘導性プロモーターの制御下でのＩＰＴＧ誘導性プロモーターおよびｐｌｄＡの制御下でのＣＲＭ１９７をコードする配列を含む単一の発現プラスミドを保有するＴ６９  Ｍｅｔａ  ｒｅｃＡ  （別名ＭＤＳ６９ｍｅｔａ  ｒｅｃＡ）宿主細胞におけるＲＭ１９７  および  ＯｍｐＬＡの発現の誘導後、ペリプラズムにおけるＣＲＭ１９７の収率と２５℃でのＴｒｉｓ  ／  ＥＤＴＡ抽出を例解する。ＤＯＸの非存在下、２５℃のＴｒｉｓ  ／  ＥＤＴＡ抽出において、ＣＲＭ１９７はほとんど現れないが、これはｐｌｄＡが誘導される場合に著しく増加する。ＣＲＭ１９７のペリプラズム収率は、ｐｌｄＡ遺伝子発現によって影響を受けない。
【図１２Ａ】図１２Ａは、（ｉ）ドキシサイクリン誘導性プロモーターの制御下にあるＹｔｆＱ分泌シグナルに融合されたＣＲＭ１９７をコードする発現プラスミドを保有するか、またはＣＲＭ１９７とｐｌｄＡ  ｏｒｆｓの間に２つのリボソーム結合部位（図６参照）のいずれかを備えたＣＲＭ１９７−ｙｔｆＱとｐｌｄＡ（コドン最適化）をコードする二シストロン性発現プラスミドを保有する、Ｔ６９  Ｍｅｔａ  Ｔｏｘ  ／  Ａｔｏｘ  ＬｏｗＭｕｔ  ｒｅｃＡ株（別名ＭＤＳ６９ｍｅｔａ  Ｔ  ／  Ａ  ＬｏｗＭｕｔ  ｒｅｃＡ）のペリプラズムにおけるＣＲＭ１９７収率（リゾチームを用いたＥｐｉｃｅｎｔｒｅペリプラズム調製法）を示す。図１２Ｂは、図１２Ａと同じ培養であるが、リゾチームを有するＥｐｉｃｅｎｔｅｒ  Ｐｅｒｉ  ｐｒｅｐの代わりに、誘導培養１  ｍｌを２５℃で一晩の振盪に供した（Ｔｒｉｓ  ／  ＥＤＴＡ処理なし）。ＯｍｐＬＡの存在下では、２５℃で振盪すると、約５倍以上の標的タンパク質がペリプラズムから培地に入る（ＯｍｐＬＡおよびＴｒｉｓ  ／  ＥＤＴＡ処理を用いて培地に抽出された標的タンパク質の総量のまだ５０％に過ぎない）。図１２Ｃは、ｐｌｄＡ発現の誘導ならびにＴｒｉｓ  ／  ＥＤＴＡによる抽出および２５℃での振盪後の培地でのＣＲＭ１９７収率を例解する。一番左のパネルは、ペリプラズムから培地に抽出される標的が非常に少ないことを示す。一方、右の２つのパネルは、左のパネルに比べて培地に平均５倍多く産生されている。右側の２つのパネルには、図１２Ｂの同じ２つのパネルよりも平均で２倍多く抽出されたＣＲＭ１９７がある。図１２Ｄは、ｐｌｄＡの発現および４℃で２日間の誘導培養のサンプル１ｍｌのインキュベーションを示す。４℃（Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡなし）対２５℃（Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡなし）でのインキュベーションでは、ペリプラズムから培地への標的の「漏れ」は改善されない。
【図１２Ｂ】図１２Ａは、（ｉ）ドキシサイクリン誘導性プロモーターの制御下にあるＹｔｆＱ分泌シグナルに融合されたＣＲＭ１９７をコードする発現プラスミドを保有するか、またはＣＲＭ１９７とｐｌｄＡ  ｏｒｆｓの間に２つのリボソーム結合部位（図６参照）のいずれかを備えたＣＲＭ１９７−ｙｔｆＱとｐｌｄＡ（コドン最適化）をコードする二シストロン性発現プラスミドを保有する、Ｔ６９  Ｍｅｔａ  Ｔｏｘ  ／  Ａｔｏｘ  ＬｏｗＭｕｔ  ｒｅｃＡ株（別名ＭＤＳ６９ｍｅｔａ  Ｔ  ／  Ａ  ＬｏｗＭｕｔ  ｒｅｃＡ）のペリプラズムにおけるＣＲＭ１９７収率（リゾチームを用いたＥｐｉｃｅｎｔｒｅペリプラズム調製法）を示す。図１２Ｂは、図１２Ａと同じ培養であるが、リゾチームを有するＥｐｉｃｅｎｔｅｒ  Ｐｅｒｉ  ｐｒｅｐの代わりに、誘導培養１  ｍｌを２５℃で一晩の振盪に供した（Ｔｒｉｓ  ／  ＥＤＴＡ処理なし）。ＯｍｐＬＡの存在下では、２５℃で振盪すると、約５倍以上の標的タンパク質がペリプラズムから培地に入る（ＯｍｐＬＡおよびＴｒｉｓ  ／  ＥＤＴＡ処理を用いて培地に抽出された標的タンパク質の総量のまだ５０％に過ぎない）。図１２Ｃは、ｐｌｄＡ発現の誘導ならびにＴｒｉｓ  ／  ＥＤＴＡによる抽出および２５℃での振盪後の培地でのＣＲＭ１９７収率を例解する。一番左のパネルは、ペリプラズムから培地に抽出される標的が非常に少ないことを示す。一方、右の２つのパネルは、左のパネルに比べて培地に平均５倍多く産生されている。右側の２つのパネルには、図１２Ｂの同じ２つのパネルよりも平均で２倍多く抽出されたＣＲＭ１９７がある。図１２Ｄは、ｐｌｄＡの発現および４℃で２日間の誘導培養のサンプル１ｍｌのインキュベーションを示す。４℃（Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡなし）対２５℃（Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡなし）でのインキュベーションでは、ペリプラズムから培地への標的の「漏れ」は改善されない。
【図１２Ｃ】図１２Ａは、（ｉ）ドキシサイクリン誘導性プロモーターの制御下にあるＹｔｆＱ分泌シグナルに融合されたＣＲＭ１９７をコードする発現プラスミドを保有するか、またはＣＲＭ１９７とｐｌｄＡ  ｏｒｆｓの間に２つのリボソーム結合部位（図６参照）のいずれかを備えたＣＲＭ１９７−ｙｔｆＱとｐｌｄＡ（コドン最適化）をコードする二シストロン性発現プラスミドを保有する、Ｔ６９  Ｍｅｔａ  Ｔｏｘ  ／  Ａｔｏｘ  ＬｏｗＭｕｔ  ｒｅｃＡ株（別名ＭＤＳ６９ｍｅｔａ  Ｔ  ／  Ａ  ＬｏｗＭｕｔ  ｒｅｃＡ）のペリプラズムにおけるＣＲＭ１９７収率（リゾチームを用いたＥｐｉｃｅｎｔｒｅペリプラズム調製法）を示す。図１２Ｂは、図１２Ａと同じ培養であるが、リゾチームを有するＥｐｉｃｅｎｔｅｒ  Ｐｅｒｉ  ｐｒｅｐの代わりに、誘導培養１  ｍｌを２５℃で一晩の振盪に供した（Ｔｒｉｓ  ／  ＥＤＴＡ処理なし）。ＯｍｐＬＡの存在下では、２５℃で振盪すると、約５倍以上の標的タンパク質がペリプラズムから培地に入る（ＯｍｐＬＡおよびＴｒｉｓ  ／  ＥＤＴＡ処理を用いて培地に抽出された標的タンパク質の総量のまだ５０％に過ぎない）。図１２Ｃは、ｐｌｄＡ発現の誘導ならびにＴｒｉｓ  ／  ＥＤＴＡによる抽出および２５℃での振盪後の培地でのＣＲＭ１９７収率を例解する。一番左のパネルは、ペリプラズムから培地に抽出される標的が非常に少ないことを示す。一方、右の２つのパネルは、左のパネルに比べて培地に平均５倍多く産生されている。右側の２つのパネルには、図１２Ｂの同じ２つのパネルよりも平均で２倍多く抽出されたＣＲＭ１９７がある。図１２Ｄは、ｐｌｄＡの発現および４℃で２日間の誘導培養のサンプル１ｍｌのインキュベーションを示す。４℃（Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡなし）対２５℃（Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡなし）でのインキュベーションでは、ペリプラズムから培地への標的の「漏れ」は改善されない。
【図１２Ｄ】図１２Ａは、（ｉ）ドキシサイクリン誘導性プロモーターの制御下にあるＹｔｆＱ分泌シグナルに融合されたＣＲＭ１９７をコードする発現プラスミドを保有するか、またはＣＲＭ１９７とｐｌｄＡ  ｏｒｆｓの間に２つのリボソーム結合部位（図６参照）のいずれかを備えたＣＲＭ１９７−ｙｔｆＱとｐｌｄＡ（コドン最適化）をコードする二シストロン性発現プラスミドを保有する、Ｔ６９  Ｍｅｔａ  Ｔｏｘ  ／  Ａｔｏｘ  ＬｏｗＭｕｔ  ｒｅｃＡ株（別名ＭＤＳ６９ｍｅｔａ  Ｔ  ／  Ａ  ＬｏｗＭｕｔ  ｒｅｃＡ）のペリプラズムにおけるＣＲＭ１９７収率（リゾチームを用いたＥｐｉｃｅｎｔｒｅペリプラズム調製法）を示す。図１２Ｂは、図１２Ａと同じ培養であるが、リゾチームを有するＥｐｉｃｅｎｔｅｒ  Ｐｅｒｉ  ｐｒｅｐの代わりに、誘導培養１  ｍｌを２５℃で一晩の振盪に供した（Ｔｒｉｓ  ／  ＥＤＴＡ処理なし）。ＯｍｐＬＡの存在下では、２５℃で振盪すると、約５倍以上の標的タンパク質がペリプラズムから培地に入る（ＯｍｐＬＡおよびＴｒｉｓ  ／  ＥＤＴＡ処理を用いて培地に抽出された標的タンパク質の総量のまだ５０％に過ぎない）。図１２Ｃは、ｐｌｄＡ発現の誘導ならびにＴｒｉｓ  ／  ＥＤＴＡによる抽出および２５℃での振盪後の培地でのＣＲＭ１９７収率を例解する。一番左のパネルは、ペリプラズムから培地に抽出される標的が非常に少ないことを示す。一方、右の２つのパネルは、左のパネルに比べて培地に平均５倍多く産生されている。右側の２つのパネルには、図１２Ｂの同じ２つのパネルよりも平均で２倍多く抽出されたＣＲＭ１９７がある。図１２Ｄは、ｐｌｄＡの発現および４℃で２日間の誘導培養のサンプル１ｍｌのインキュベーションを示す。４℃（Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡなし）対２５℃（Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡなし）でのインキュベーションでは、ペリプラズムから培地への標的の「漏れ」は改善されない。
【図１３】いくつかのＥ．ｃｏｌｉ株からのＣＲＭ１９７のペリプラズム産生の比較を例解する。
【図１４】ＲＮａｓｅ  ＩＩＩおよび毒素／抗毒素遺伝子が欠失された株におけるＣＲＭ１９７のペリプラズム収率を、これらの遺伝子を含む親株と比較して例解する。
【図１５】同じ発現プラスミドを保有する通常使用される発酵宿主におけるＣＲＭ１９７の産生と比較して、ペリプラズム発現シグナル配列に融合したＣＲＭ１９７をコードする発現ベクターを保有する縮小ゲノムＥ．  ｃｏｌｉ株（ＳＧ６９メタ別名ＭＤＳ６９ｍｅｔａ）の長期連続培養の間のＣＲＭ１９７の産生を例解する。１リットルあたり１日あたり４〜６グラムの間のＣＲＭ１９７を生成する発酵が示されている。データ点は、ＣＲＭ１９７標準曲線を使用してＣＲＭ１９７発現値に変換されたＷｅｓキャピラリー電気泳動化学発光免疫測定シグナルである。ＣＲＭ１９７の認識は、抗ＣＲＭ１９７ポリクローナル抗血清およびＨＲＰ−ルシフェラーゼ化学発光によるものであった。
【図１６】ＩＰＴＧ誘導性プロモーターの制御下でＣＲＭ１９７をコードする配列とドキシサイクリン誘導性プロモーターの制御下でｐｌｄＡを含む単一発現プラスミドを含むＳＧ６９ｍｅｔａ株の拡張連続発酵（別名連続フロー発酵またはＣフロー）を例解する。Ｃａｌｉｐｅｒ  ＬａｂｃｈｉｐおよびＷｅｓ（キャピラリーウェスタン）分析で決定されるように、Ｃフローは、平均で１ｇ／Ｌ／日産生した。左パネルは、１）Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡで処理し、２５℃で振盪したか、または２）ｐｌｄＡ遺伝子の発現を誘導するためにＤＯＸで処理し、その後、Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡで１６時間抽出した、ＣＲＭ１９７発現のＩＰＴＧ誘導後１０日間の生産タンクからの発酵液のキャリパー分析を示す。キャリパーの結果のグラフ表示は、右側のパネルに表示される。
【図１７】例示的な連続発酵装置の例を例解する。２つのケモスタットバイオリアクターにおける細菌培養は、高い細胞密度（約２００ＯＤ６００）で行われる。バイオリアクター２における標的遺伝子発現の誘導に続いて、生成物を含む細胞を１リットル／日の速度（または使用する発酵容器のサイズに応じた速度）で収集する。誘導されていないバイオリアクター１からの「シード」培養物がバイオリアクター２に移され、生成物の収集の間に除去された細胞が補充されることに注目のこと。誘導因子（ＩＰＴＧが例示される）をバイオリアクター２のフィードに添加することにより、誘導因子濃度が維持される。
【図１８】ドキシサイクリン誘導性プロモーターの制御下にあるＹｔｆＱ分泌シグナルに融合したＣＲＭ１９７をコードする発現プラスミドを保持する、Ｔ６９  Ｍｅｔａ  ｒｅｃＡ（別名ＭＤＳ６９ｍｅｔａ  ｒｅｃＡ）、Ｔ６９  Ｍｅｔａ  ｒｅｃＡ  Ｔ／ＡＴ（別名ＭＤＳ６９ｍｅｔａ  Ｔ／Ａ  ｒｅｃＡ）、およびＴ６９  Ｍｅｔａ  ｒｅｃＡ  Ｔ／ＡＴ  ＬｏｗＭｕｔ（別名ＭＤＳ６９ｍｅｔａ  Ｔ／Ａ  ＬｏｗＭｕｔ  ｒｅｃＡ）宿主細胞におけるＣＲＭ１９７のペリプラズム収率を比較する。毒素／抗毒素遺伝子の欠失は、ペリプラズムにおけるＣＲＭ１９７の収率を著しく増強する。
【図１９Ａ】一本鎖可変フラグメントｓｃＦｖ  ７５１２７（Ｆｒｉｔｚ  Ｓｃｈａｕｍｂｕｒｇ，Ｌｙｔｉｃ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩにより提供）（図１９Ａ）およびＯｍｐＬＡ発現後の振盪フラスコ培養からの一本鎖抗体ｓｃＦａｂ  ＹＭＦ１０（図１９Ｂ）の抽出を例解する。図１９Ａ：デュアルｓｃＦｖ、ｐｌｄＡ二シストロン発現プラスミド構築物を含む縮小ゲノムＥ．  ｃｏｌｉ株ＳＧ６９ｍｅｔａ（別名Ｔ６９  Ｍｅｔａ  ａｋａ  ＭＤＳ６９ｍｅｔａ）におけるｓｃＦｖおよびｐｌｄＡ発現の誘導後のｓｃＦｖ  ７５１２７のペリプラズムおよび抽出収率が示される。図１９Ｂ：デュアルｓｃＦａｂ、ｐｌｄＡ二シストロン発現プラスミド構築物を含む縮小ゲノムＥ．ｃｏｌｉ株ＳＧ６９ｍｅｔａ（別名Ｔ６９  Ｍｅｔａ  ａｋａ  ＭＤＳ６９ｍｅｔａ）におけるｓｃＦｖおよびＯｍｐＬＡ発現の誘導後のｓｃＦａｂ  ＹＭＦ１０のペリプラズムおよび抽出収率が示される。
【図１９Ｂ】一本鎖可変フラグメントｓｃＦｖ  ７５１２７（Ｆｒｉｔｚ  Ｓｃｈａｕｍｂｕｒｇ，Ｌｙｔｉｃ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩにより提供）（図１９Ａ）およびＯｍｐＬＡ発現後の振盪フラスコ培養からの一本鎖抗体ｓｃＦａｂ  ＹＭＦ１０（図１９Ｂ）の抽出を例解する。図１９Ａ：デュアルｓｃＦｖ、ｐｌｄＡ二シストロン発現プラスミド構築物を含む縮小ゲノムＥ．  ｃｏｌｉ株ＳＧ６９ｍｅｔａ（別名Ｔ６９  Ｍｅｔａ  ａｋａ  ＭＤＳ６９ｍｅｔａ）におけるｓｃＦｖおよびｐｌｄＡ発現の誘導後のｓｃＦｖ  ７５１２７のペリプラズムおよび抽出収率が示される。図１９Ｂ：デュアルｓｃＦａｂ、ｐｌｄＡ二シストロン発現プラスミド構築物を含む縮小ゲノムＥ．ｃｏｌｉ株ＳＧ６９ｍｅｔａ（別名Ｔ６９  Ｍｅｔａ  ａｋａ  ＭＤＳ６９ｍｅｔａ）におけるｓｃＦｖおよびＯｍｐＬＡ発現の誘導後のｓｃＦａｂ  ＹＭＦ１０のペリプラズムおよび抽出収率が示される。
【図２０Ａ】ＩＰＴＧ誘導性プロモーターの制御下にあるＯｍｐＡ分泌シグナルおよびＤＯＸ誘導性プロモーターの制御下にあるｐｌｄＡに融合したｓｃＦｖをコードする発現プラスミドを保有する、ＭＤＳ６９ｍｅｔａ  ｒｅｃＡ（別名Ｔ６９  Ｍｅｔａ  ｒｅｃＡ）およびＭＤＳ６９ｍｅｔａ  Ｔ／ＡＴ  ＬｏｗＭｕｔ  ＲｅｃＡ（別名Ｔ６９  Ｍｅｔａ  Ｔ／ＡＴ  ＬｏｗＭｕｔ  ｒｅｃＡ）株におけるｓｃＦｖ  ７５１２７のペリプラズム（図２０Ａ）および抽出収率（図２０Ｂ）を例解し、ｓｃＦｖ発現が誘導され、４時間後にｐｌｄＡの発現が誘導され、そして誘導が一晩続けられ、その時点で細胞が２５℃で一晩Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡ抽出緩衝液（上記）と接触された。
【図２０Ｂ】ＩＰＴＧ誘導性プロモーターの制御下にあるＯｍｐＡ分泌シグナルおよびＤＯＸ誘導性プロモーターの制御下にあるｐｌｄＡに融合したｓｃＦｖをコードする発現プラスミドを保有する、ＭＤＳ６９ｍｅｔａ  ｒｅｃＡ（別名Ｔ６９  Ｍｅｔａ  ｒｅｃＡ）およびＭＤＳ６９ｍｅｔａ  Ｔ／ＡＴ  ＬｏｗＭｕｔ  ＲｅｃＡ（別名Ｔ６９  Ｍｅｔａ  Ｔ／ＡＴ  ＬｏｗＭｕｔ  ｒｅｃＡ）株におけるｓｃＦｖ  ７５１２７のペリプラズム（図２０Ａ）および抽出収率（図２０Ｂ）を例解し、ｓｃＦｖ発現が誘導され、４時間後にｐｌｄＡの発現が誘導され、そして誘導が一晩続けられ、その時点で細胞が２５℃で一晩Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡ抽出緩衝液（上記）と接触された。
【図２１Ａ】ＩＰＴＧ誘導性プロモーターの制御下にあるＯｍｐＡ分泌シグナルおよびＤＯＸ誘導性プロモーターの制御下にあるｐｌｄＡに融合したｓｃＦａｂをコードする発現プラスミドを保有する、ＭＤＳ６９ｍｅｔａ  ｒｅｃＡ（別名Ｔ６９  Ｍｅｔａ  ｒｅｃＡ）およびＭＤＳ６９ｍｅｔａ  Ｔ／ＡＴ  ＬｏｗＭｕｔ  ＲｅｃＡ（別名Ｔ６９  Ｍｅｔａ  Ｔ／ＡＴ  ＬｏｗＭｕｔ  ｒｅｃＡ）株におけるｓｃＦａｂ  ＹＭＦ１０のペリプラズム（図２１Ａ）および抽出収率（図２１Ｂ）を例解し、ｓｃＦａｂ発現が誘導され、４時間後にｐｌｄＡの発現が誘導され、そして誘導が一晩続けられ、その時点で細胞が２５℃で一晩Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡ抽出緩衝液（上記）と接触された。
【図２１Ｂ】ＩＰＴＧ誘導性プロモーターの制御下にあるＯｍｐＡ分泌シグナルおよびＤＯＸ誘導性プロモーターの制御下にあるｐｌｄＡに融合したｓｃＦａｂをコードする発現プラスミドを保有する、ＭＤＳ６９ｍｅｔａ  ｒｅｃＡ（別名Ｔ６９  Ｍｅｔａ  ｒｅｃＡ）およびＭＤＳ６９ｍｅｔａ  Ｔ／ＡＴ  ＬｏｗＭｕｔ  ＲｅｃＡ（別名Ｔ６９  Ｍｅｔａ  Ｔ／ＡＴ  ＬｏｗＭｕｔ  ｒｅｃＡ）株におけるｓｃＦａｂ  ＹＭＦ１０のペリプラズム（図２１Ａ）および抽出収率（図２１Ｂ）を例解し、ｓｃＦａｂ発現が誘導され、４時間後にｐｌｄＡの発現が誘導され、そして誘導が一晩続けられ、その時点で細胞が２５℃で一晩Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡ抽出緩衝液（上記）と接触された。
【図２２】ＭＤＳ６９ｍｅｔａ  Ｔ／ＡＴ  ＬｏｗＭｕｔ  ｒｅｃＡおよびＭＤＳ６９ｍｅｔａ株におけるＴｒｉｓ／ＥＤＴＡ抽出後のＣＲＭ１９７およびＣＲＭ１９７のペリプラズム収率を例解する。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明者らは、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞の細胞周辺質に送達された、内因性Ｅ．ｃｏｌｉホスホリパーゼを同時発現する、単鎖抗体フラグメントｓｃＦａｂ  ＹＭＦ１０、単鎖抗体可変フラグメントｓｃＦｖ  ７５１２７、ＣＲＭ１９７、プロテインＤおよびＥＰＡを含むがこれらに限定されない組換え治療用タンパク質が、発酵中に培地に直接抽出でき、生産時間と労力を削減し、これらのタンパク質の精製を大幅に簡素化し、そして生産コストが劇的に削減することを発見した。
【００３１】
本明細書に記載される方法および組成物の使用は、ＣＲＭ１９７および他のキャリアタンパク質に関連するいくつかの標準的な製造上の課題を克服でき、これらの課題には（１）もともとのＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ宿主におけるＣＲＭ１９７（０．１〜０．２ｇ／Ｌ）の低いレベル、（２）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓや多くのＥ．ｃｏｌｉ株などの代替宿主におけるＣＲＭ１９７の野生型毒素への潜在的な復帰、（３）ＣＲＭ１９７の高生産率下での発酵宿主における生理的ストレス、（４）ほとんどのＥ．ｃｏｌｉ宿主における不溶性形態でのＣＲＭ１９７の蓄積、収率の低下、および顕著に複雑な下流の精製工程、（５）潜在的なプロファージもしくは挿入要素の活性化、または毒素／抗毒素ホメオスタシスの破壊、および細胞溶解を誘発し、連続製造におけるこれらの株の使用を損なう可能性がある他の突然変異生成するＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞におけるストレス誘導システムが挙げられる。
【００３２】
本明細書に記載の縮小ゲノムＥ．ｃｏｌｉ株および方法を使用して、本発明者らは、ＣＲＭ１９７、ＰＤ、およびＥＰＡなどのペリプラズムを標的とするタンパク質が継続的に産生され、高収率で（１日あたり１リットルあたり３ｇ以上）容易な精製のために細胞から直接培地に抽出され、これは、連続発酵中に少なくとも３０日間、さらには少なくとも６５日間以上さえもの期間、維持することができることを発見および検証した。対照的に、従来のＥ．ｃｏｌｉ株は、同じ条件下で数日間よりも多く生産を維持することができない。
【００３３】
ＣＲＭ１９７は、遺伝的に非毒性型のジフテリア毒素（ＤＴ）である。ＣＲＭ１９７における単一塩基変化（５２位のグルタミン酸からグリシンへ）は、Ａ鎖のＡＤＰリボシル化活性を無効にして、毒性を弱める。ＣＲＭ１９７は非毒性であるが、ジフテリア毒素と免疫学的に区別できない。ＣＲＭ１９７は、多糖類およびハプテンのキャリアとして機能し、いくつかの複合ワクチンにおいてそれらを免疫原性にする。
【００３４】
ＰＤは、グラム陰性細菌Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａの表面上に露出した免疫グロブリンＤ結合膜リポタンパク質である。このタンパク質は、エステル結合とアミド結合の両方のパルミテートのシステイン残基への共有結合により修飾された１８残基長のシグナル配列を有する前駆体として合成され、これはシグナル配列の切断後に成熟タンパク質のアミノ末端になる。システイン残基を欠く変異プロテインＤはアシル化されていない。非アシル化プロテインＤ分子は、Ｅ．ｃｏｌｉの細胞膜周辺腔に局在する。親水性プロテインＤ分子は、多糖およびハプテンのキャリアとして機能し、それらを複合ワクチン中で免疫原性にする。
【００３５】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来のキャリアタンパク質ＥＰＡは、ＣＲＭ１９７と同じ様式でＴ細胞を活性化する。ＣＲＭ１９７は、世界で最も売れているワクチンであるＰｒｅｖｎａｒ−１３を含む非常に多くの複合ワクチンの中で使用されているため、一部のワクチン製造業者は、エピトープ抑制を回避するためにそれを使用することを選択した。ＥＰＡは、ニコチン依存を緩和することが示されてきたニコチンワクチンＮｉｃＶＡＸ中で使用されている（Ｅｓｔｅｒｌｉｓ  Ｉ，Ｈａｎｎｅｓｔａｄ  ＪＯ，Ｐｅｒｋｉｎｓ  Ｅ，Ｂｏｉｓ  Ｆ，Ｄ´Ｓｏｕｚａ  ＤＣ，Ｔｙｎｄａｌｅ  ＲＦ，Ｓｅｉｂｙｌ  ＪＰ，Ｈａｔｓｕｋａｍｉ  ＤＭ，Ｃｏｓｇｒｏｖｅ  ＫＰ，Ｏ´Ｍａｌｌｅｙ  ＳＳ．Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ａ  ｎｉｃｏｔｉｎｅ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｏｎ  ｎｉｃｏｔｉｎｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｂｅｔａ２＊−ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｓｍｏｋｅｒｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ．２０１３；１７０（４）：３９９−４０７．ｄｏｉ：．１１７６／ａｐｐｉ．ａｊｐ．２０１２．１２０６０７９３．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２３４２９７２５；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ３７３８０００．）ＥＰＡを使用する抗マラリア抱合体ワクチンは開発に成功しており、臨床試験に入っている。
【００３６】
本発明者らは、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞において目的のペリプラズム標的タンパク質とＥ．ｃｏｌｉホスホリパーゼを同時発現させることが、適切な緩衝液を用いて目的タンパク質のほぼすべてを培地に抽出することができるシステムを提供することを発見した。好ましい実施形態では、ホスホリパーゼは、ＧｌｐＱ、ＹｂａＣ、ＰｌｄＡ、ＰｌｄＢおよびＴｅｓＡからなる群より選択される。これらの例示的なホスホジエステラーゼについて以下で議論する。
【００３７】
グリセロホスホリルジエステルホスホジエステラーゼ（ＧｌｐＱ）は、グリセロホスホジエステル、ｓｎ−グリセロール−３−リン酸（Ｇ３Ｐ）またはグリセロールなどの使用可能な形態に分解された後、リン脂質およびトリグリセリドのグリセロール部分の利用に関与する。ＧｌｐＱは、グリセロホスホジエステルのｓｎ−グリセロール３−リン酸（グリセロール−Ｐ）とアルコールへの加水分解を触媒する。次に、グリセロール−Ｐは、グリセロール−ＰトランスポーターであるＧｌｐＴによって細胞に輸送される。ペリプラズムＧｌｐＱは基質のグリセロホスホ部分に特異的であるが、アルコールはいくつかの長鎖および中鎖アルコールのいずれか１つであり得る。これは、広範でさまざまなグリセロホスホジエステルをｇｌｐエンコードされた異化システムに導く能力を細胞に与える。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法における使用のためのＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞、好ましくは縮小ゲノムＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、配列番号１のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列またはその配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含む核酸セグメントを含む。
【００３８】
Ａｅｓ（ｙｂａＣ遺伝子によってコードされる）は、短い（長さが８未満の）アシル鎖を持つ基質を優先して、脂肪酸のｐ−ニトロフェニルエステルの加水分解を触媒する。Ａｅｓはリパーゼおよびエステラーゼと構造的な類似性を有し、ホルモン感受性リパーゼ（ＨＳＬ）タンパク質ファミリーに属する。酵素は単量体またはホモ二量体のいずれかであってもよく、それは結晶化され、結晶構造が解決された。変性剤で誘導される酵素のアンフォールディングが研究されており、より高い熱安定性を持つ変異体が単離されてきた。触媒トライアドは、ｓｅｒ１６５、ａｓｐ２６２、およびｈｉｓ２９２を含むと予測され、部位特異的突然変異誘発は、これらの残基が触媒活性に必要であることを確認した。さらに、ａｓｐ１６４は構造的に重要であると考えられている。ｌ９７およびｌ２０９の点突然変異は、それぞれｋｃａｔを増加させ、ｋｍを減少させることにより、酵素活性を増加させる。ａｅｓの過剰発現は、野生型と比較してｐ−ニトロフェニルアセテートの加水分解の増加を生じる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法の使用のためのＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞、好ましくは縮小ゲノムＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、配列番号２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列またはその配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含む核酸セグメントを含む。
【００３９】
Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２遺伝子ｐｌｄＡは、外膜ホスホリパーゼＡ（ＯｍｐＬＡ）タンパク質をコードする。精製されたＯｍｐＬＡは複数の脂肪分解活性を示し、リン脂質、リゾホスフォリン脂質、ジグリセリド、およびモノグリセリドに対して活性があるが、インビボでは予想される基質は細胞外皮のリン脂質である。ＯｍｐＬＡの二量体化は、ホスホリパーゼ活性に必要である。酵素と基質のアシル側鎖との間の相互作用は、二量体化の主な安定化因子である。ｐｌｄＡは構成的に発現されるが、ＯｍｐＬＡ活性は通常の条件下では検出されず、外膜の完全性を妨げる条件によって誘導される。ＯｍｐＬＡはバクテリオシン放出に関係している。コリシン産生プラスミドを含むＥ．ｃｏｌｉ株において、溶解およびバクテリオシン放出の前にＯｍｐＬＡの活性が増加し、ホスファチジルエタノールアミン（主要な細菌外膜リン脂質）が分解された。Ｅ．ｃｏｌｉ  ｐｌｄＡ変異体を産生するコリシンにおいて、コリシンは細胞質に保持される。いくつかの好ましい実施形態では、本明細書に記載の方法における使用のためのＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞、好ましくは縮小ゲノムＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、配列番号４のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列またはその配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含む核酸セグメントを含む。
【００４０】
リゾホスホリパーゼＬ２（ＰｌｄＢ）は、リゾリン脂質の残りのアシル基への結合を加水分解する。最も効果的な基質は、２−アシルグリセロホスホエタノールアミンおよび２−アシルグリセロホスホコリンであり、各化合物の１アシルバージョンは、加水分解の効率がいくぶん劣る。加えて、ＰｌｄＢはアシル基を特定のリゾリン脂質からホスファチジルグリセロールに転移させてアシルホスファチジルグリセロールを生成することができる。ＰｌｄＢは明らかなシグナル配列または膜貫通ドメインを含まず、内膜の細胞質側に関連すると考えられている。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法で使用するためのＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞、好ましくは縮小ゲノムＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、配列番号３のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列またはその配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含む核酸セグメントを含む。
【００４１】
ＴＡＰ複合体（ＴｅｓＡ）は、チオエステラーゼ、アリールエステラーゼ、リゾホスホリパーゼ、およびプロテアーゼ活性を実行する広範な特異性のエステラーゼである。細胞内でのその正確な機能は不明であり、潜在的に遊離脂肪酸の生成またはエステル結合を含む化合物の回収に関与する可能性がある。ＴｅｓＡ（ｐｌｄＣ；ｂ０４９４；ＧｅｎＢａｎｋ  Ｒｅｆ．Ｎｏ．ＮＰ＿４１６７４２．１；配列番号５）は、チオエステラーゼ、アリールエステラーゼ、リゾホスホリパーゼとして作用することができ、プロテアーゼ活性が制限されている多機能エステラーゼである。それは非常に広範囲のアシルＣｏＡ分子に対するチオエステラーゼとして作用するが、パルミチル、パルミトレイル、およびシスーバクセニルエステルに対して最も高い活性を有する、炭素数が１０より多い脂肪アシルチオエステルに特異的であると報告されてきた。ＴｅｓＡの実際のインビボでの役割は不明である。ペリプラズムにおけるその局在は、脂肪アシルＣｏＡ分子へのアクセスをほぼ不可能にする。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法における使用のためのＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞、好ましくは縮小ゲノムＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、配列番号５のポリペプチドまたはその配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である配列を含む核酸セグメントを含む。
【００４２】
本明細書に記載の方法は、目的のタンパク質の任意のＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞への抽出を可能にする。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法によるＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞は、野生型Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢまたはＫ１２株である。
【００４３】
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、本明細書に記載の方法および組成物による組換えＥ．ｃｏｌｉ宿主株は、縮小ゲノム細菌である。本明細書で使用される「縮小ゲノム」細菌とは、そのゲノム（例えば、タンパク質をコードする遺伝子、ＲＮＡをコードする遺伝子）の約１％〜約７５％が欠失した細菌、例えば、ゲノムの約２％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、または約６０％が欠失した細菌を意味する。一実施形態では、本発明の実施において使用される縮小ゲノム細菌は、好ましくは少なくとも２パーセント（２％）〜最大３０パーセント（３０％）（それらの間の任意の数を含む）まで、天然の親株のゲノムよりも小さい、遺伝子操作されたゲノムを有する。好ましくは、ゲノムは、天然の親株のゲノムよりも少なくとも２パーセント（２％）〜最大２５パーセント（２５％）まで小さい。ゲノムは約２パーセント（２％）、５パーセント（５％）、８パーセント（８％）、１４パーセント（１４％）、２２パーセント（２２％）、２５パーセント（２５％）、３０パーセント（３０％）またはそれ以上（その間の任意の数を含む）、ネイティブの親株のゲノムよりも小さい。あるいは、ゲノムは、天然の親株のゲノムよりも１０％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満、または３０％未満小さくなるように操作されてもよい。縮小ゲノム細菌は、４．５５Ｍｂ（２％）〜３．２５Ｍｂ（３０％）、４．４１Ｍｂ（５％）〜３．６２Ｍｂ（２２％）、４．４１Ｍｂ〜３．２５Ｍｂ、または４．４１Ｍｂ〜２．７８Ｍｂであるゲノムを有する可能性がある。「天然の親株」という用語は、科学界によって一般に理解されるように、株系統の樹立を表すことが、自然界または天然の環境で見出され、そのゲノム上で一連の欠失を行ってより小さなゲノムを有する細菌株を生成することができる細菌株を意味する。天然の親株はまた、操作された株がそれに対して比較される株をいい、操作された株は、天然の親株の完全な相補物よりも少ない。一連の欠失後にゲノムが小さくなる割合は、「すべての欠失後に欠失された塩基対の総数」を「すべての欠失前のゲノム内の塩基対の総数」で除算し、その後、１００を掛けることによって計算される。同様に、ゲノムが天然の親株よりも小さい割合は、より小さなゲノムを有する株のヌクレオチドの総数を（それが産生されたプロセスに関係なく）ネイティブな親株のヌクレオチドの総数で除算し、その後、１００を掛けることによって計算される。
【００４４】
一実施形態では、「縮小ゲノム」細菌とは、上記量のゲノムの除去が、最小培地で増殖する生物の能力に許容できないほど影響を及ぼさない細菌を意味する。２つ以上の遺伝子の除去が、本文脈における最小培地で成長する生物の能力に「許容できないほど影響する」かどうかは、特定の用途に依存し、容易に評価される。例えば、増殖率の３０％の低下は、ある用途では許容されるが、別の用途では許容されない場合がある。さらに、ゲノムからＤＮＡ配列を欠失することの悪影響は、培養条件の変更などの手段によって軽減される可能性がある。そのような措置は、さもなければ許容できない悪影響を許容することができる悪影響に変える可能性がある。一実施形態では、増殖速度は親株とほぼ同じである。しかし、親株の増殖速度よりも約５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％〜約５０％低い増殖速度は本発明の範囲内にある。より具体的には、本発明の細菌の倍加時間は、約１５分〜約３時間の範囲であり得る。好適な縮小ゲノム細菌の非限定的な例、およびＥ．ｃｏｌｉなどの細菌からゲノムＤＮＡを累積的に欠失する方法は、米国特許第６，９８９，２６５号、同第７，３０３，９０６号、同第８，１１９，３６５号、同第８，０３９，２４３号、同第８，１７８，３３９号、同第８，７６５，４０８号および同第９，９０２，９６５号にそれぞれ開示されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。
【００４５】
縮小されたゲノム細菌の文脈における親Ｅ．ｃｏｌｉ株は、任意のＥ．ｃｏｌｉ株であり得る。いくつかの好ましい実施形態では、親Ｅ．ｃｏｌｉ株はＫ−１２株（例えばＭＧ１６５５（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ０００９６．３）、Ｗ３１１０（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＰ００９０４８．１）、ＤＨ１０Ｂ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＰ０００９４８．１）、ＤＨ１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＰ００１６３７．１）、またはＢＷ２９５２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＰ００１３９６．１）である。他の実施形態では、親Ｅ．ｃｏｌｉ株はＢ株（例えば、ＢＬＲ（ＤＥ３）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＰ０２０３６８．１）、ＲＥＬ６０６（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＰ０００８１９．１）、ＢＬ２１（ＤＥ３）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＰ００１５０９．３）である。
【００４６】
一態様において、親Ｅ．ｃｏｌｉ株は、米国特許第８，１７８，３３９号の表２−２０に列挙された遺伝子の１つ以上を欠くＫ−１２株またはＢ株であり、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【００４７】
いくつかの好ましい実施形態では、本明細書に記載の縮小ゲノムＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２株またはＢ株は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株ＭＧ１６５５（Ｂｌａｔｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７：１４５３−７４およびＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ０００９６．３に示される名称に基づいて「ｂ」番号で識別される）の少なくとも以下の遺伝子、ｂ０２４５−ｂ０３０１、ｂ０３０３−ｂ０３１０、ｂ１３３６−ｂ１４１１、ｂ４４２６−ｂ４４２７、ｂ２４４１−ｂ２４５０、ｂ２６２２−ｂ２６５４、ｂ２６５７−ｂ２６６０、ｂ４４６２、ｂ１９９４−ｂ２００８、ｂ４４３５、ｂ３３２２−ｂ３３３８、ｂ２３４９−ｂ２３６３、ｂ１５３９−ｂ１５７９、ｂ４２６９−ｂ４３２０、ｂ２９６８−ｂ２９７２、ｂ２９７５−ｂ２９７７、ｂ２９７９−ｂ２９８７、ｂ４４６６−４４６８、ｂ１１３７−ｂ１１７２、ｂ０５３７−ｂ０５６５、ｂ００１６−ｂ００２２、ｂ４４１２−ｂ４４１３、ｂ０５７７−ｂ０５８２、ｂ４４１５、ｂ２３８９−ｂ２３９０、ｂ２３９２−ｂ２３９５、ｂ０３５８−ｂ０３６８、ｂ０３７０−ｂ０３８０、ｂ２８５６−ｂ２８６３、ｂ３０４２−ｂ３０４８、ｂ０６５６、ｂ１３２５−ｂ１３３３、ｂ２０３０−ｂ２０６２、ｂ２１９０−ｂ２１９２、ｂ３２１５−ｂ３２１９、ｂ３５０４−ｂ３５０５、ｂ１０７０−ｂ１０８３、ｂ１８７８−ｂ１８９４、ｂ１９１７−ｂ１９５０、ｂ４３２４−ｂ４３４２、ｂ４３４５−ｂ４３５８、ｂ４４８６、ｂ０４９７−ｂ０５０２、ｂ０７００−ｂ０７０６、ｂ１４５６−ｂ１４６２、ｂ３４８１−ｂ３４８４、ｂ３５９２−ｂ３５９６、ｂ０９８１−ｂ０９８８、ｂ１０２１−ｂ１０２９、ｂ２０８０−ｂ２０９６、ｂ４４３８、ｂ３４４０−ｂ３４４５、ｂ４４５１、ｂ３５５６−ｂ３５５８、ｂ４４５５、ｂ１７８６、ｂ０１５０−ｂ０１５３およびｂ２９４５を欠き（例えば、その欠失を含む）、または異なるＫ−１２またはＢ株に対応する遺伝子を欠いている。これらは、複数の欠失株ＭＤＳ４２を作製するために親株ＭＧ１６５５から欠失された遺伝子である。
【００４８】
他の好ましい実施形態では、本明細書に記載の縮小ゲノムＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２株またはＢ株は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株ＭＧ１６５５の少なくとも以下の遺伝子、ｂ０２４５−ｂ０３０１、ｂ０３０３−ｂ０３１０、ｂ１３３６−ｂ１４１１、ｂ４４２６−ｂ４４２７、ｂ２４４１−ｂ２４５０、ｂ２６２２−ｂ２６５４、ｂ２６５７−ｂ２６６０、ｂ４４６２、ｂ１９９４−ｂ２００８、ｂ４４３５、ｂ３３２２−ｂ３３３８、ｂ２３４９−ｂ２３６３、ｂ１５３９−ｂ１５７９、ｂ４２６９−ｂ４３２０、ｂ２９６８−ｂ２９７２、ｂ２９７５−ｂ２９７７、ｂ２９７９−ｂ２９８７、ｂ４４６６−４４６８、ｂ１１３７−ｂ１１７２、ｂ０５３７−ｂ０５６５、ｂ００１６−ｂ００２２、ｂ４４１２−ｂ４４１３、ｂ０５７７−ｂ０５８２、ｂ４４１５、ｂ２３８９−ｂ２３９０、ｂ２３９２−ｂ２３９５、ｂ０３５８−ｂ０３６８、ｂ０３７０−ｂ０３８０、ｂ２８５６−ｂ２８６３、ｂ３０４２−ｂ３０４８、ｂ０６５６、ｂ１３２５−ｂ１３３３、ｂ２０３０−ｂ２０６２、ｂ２１９０−ｂ２１９２、ｂ３２１５−ｂ３２１９、ｂ３５０４−ｂ３５０５、ｂ１０７０−ｂ１０８３、ｂ１８７８−ｂ１８９４、ｂ１９１７−ｂ１９５０、ｂ４３２４−ｂ４３４２、ｂ４３４５−ｂ４３５８、ｂ４４８６、ｂ０４９７−ｂ０５０２、ｂ０７００−ｂ０７０６、ｂ１４５６−ｂ１４６２、ｂ３４８１−ｂ３４８４、ｂ３５９２−ｂ３５９６、ｂ０９８１−ｂ０９８８、ｂ１０２１−ｂ１０２９、ｂ２０８０−ｂ２０９６、ｂ４４３８、ｂ３４４０−ｂ３４４５、ｂ４４５１、ｂ３５５６−ｂ３５５８、ｂ４４５５、ｂ１７８６、ｂ０１５０−ｂ０１５３、ｂ２９４５、ｂ２４８１−ｂ２４９２、ｂ２２１９−ｂ２２３０、ｂ４５００、ｂ３７０７−ｂ３７２３、ｂ０６４４−ｂ０６５０、ｂ４０７９−４０９０、ｂ４４８７、ｂ４０９２−ｂ４１０６、ｂ０７３０−ｂ０７３２、ｂ３５７２−ｂ３５８７、ｂ１６５３、ｂ２７３５−ｂ２７４０、ｂ２４０５−ｂ２４０７、ｂ３８９６−ｂ３９００、ｂ１２０２、ｂ４２６３−ｂ４２６８、ｂ０６１１、ｂ２３６４−ｂ２３６６、ｂ０８３９、ｂ０４８８−ｂ０５００、およびｂ０５０２を欠き（例えば、欠失を含む）、または異なるＫ−１２またはＢ株の対応する遺伝子を欠いている。これらは、複数の欠失株ＭＤＳ６９（別名Ｔ６９、別名ＳＧ６９）を作製するために親株ＭＧ１６５５から欠失された遺伝子である。
【００４９】
本明細書に記載の方法における使用のための組換え細菌は、機能的ｒｅｃＡ遺伝子を含んでもよく（ｂ２６９９）、または機能的ｒｅｃＡ遺伝子を欠いてもよい（ｂ２６９９）。例えば、ＭＤＳ４２またはＭＤＳ６９（別名Ｔ６９またはＳＧ６９）などの縮小ゲノムＥ．ｃｏｌｉ株は、改変Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株からの遺伝子の完全なまたは部分的な欠失によるｂ２６９９の不活化によって改変することができる。
【００５０】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法における使用のための縮小ゲノムＥ．ｃｏｌｉは、以下の欠失／修飾のうちの１つ以上を含む：（ｉ）表１の１つ以上の毒素−抗毒素遺伝子の欠失（ｉｉ）ＲＮＡｓｅ  ＩＩＩをコードするｒｎｃ遺伝子の部分的なまたは完全な欠失（ｉｉｉ）ｄｉｎＢの欠失（ｉｖ）次の修飾：（ａ）オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性の増強（ｂ）活性アセトヒドロキシ酸シンターゼＩＩの産生、および（ｃ）ｉｃｌＲ遺伝子およびａｒｐＡ遺伝子の発現低下ならびに（ｖ）ｒｅｃＡ遺伝子の欠失。関連する実施形態では、本明細書に記載の方法における使用のための縮小ゲノムＥ．ｃｏｌｉは、親Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２株ＭＧ１６５５に基づいており、ＭＤＳ４２またはＭＤＳ６９の欠失（別名Ｔ６９またはＳＧ６９）および上記に列挙された１つ以上の欠失／修飾を含む。
【実施例】
【００５１】
以下の実施例は、本発明の範囲を説明するものである。実施例の特定の要素は説明目的のためのみであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。当業者は、等価な方法を開発し、本発明の範囲内にある比較し得る材料を利用することができる。
【００５２】
以下の例で使用される株は以下の通りである。
【００５３】
「ＭＤＳ６９」株（別名ＳＧ６９またはＴ６９）は、縮小ゲノムＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２株であり、そのネイティブ親はＭＧ１６５５であり、ＭＧ１６５５の以下の遺伝子を欠いている：ｂ０２４５−ｂ０３０１、ｂ０３０３−ｂ０３１０、ｂ１３３６−ｂ１４１１、ｂ４４２６−ｂ４４２７、ｂ２４４１−ｂ２４５０、ｂ２６２２−ｂ２６５４、ｂ２６５７−ｂ２６６０、ｂ４４６２、ｂ１９９４−ｂ２００８、ｂ４４３５、ｂ３３２２−ｂ３３３８、ｂ２３４９−ｂ２３６３、ｂ１５３９−ｂ１５７９、ｂ４２６９−ｂ４３２０、ｂ２９６８−ｂ２９７２、ｂ２９７５−ｂ２９７７、ｂ２９７９−ｂ２９８７、ｂ４４６６−４４６８、ｂ１１３７−ｂ１１７２、ｂ０５３７−ｂ０５６５、ｂ００１６−ｂ００２２、ｂ４４１２−ｂ４４１３、ｂ０５７７−ｂ０５８２、ｂ４４１５、ｂ２３８９−ｂ２３９０、ｂ２３９２−ｂ２３９５、ｂ０３５８−ｂ０３６８、ｂ０３７０−ｂ０３８０、ｂ２８５６−ｂ２８６３、ｂ３０４２−ｂ３０４８、ｂ０６５６、ｂ１３２５−ｂ１３３３、ｂ２０３０−ｂ２０６２、ｂ２１９０−ｂ２１９２、ｂ３２１５−ｂ３２１９、ｂ３５０４−ｂ３５０５、ｂ１０７０−ｂ１０８３、ｂ１８７８−ｂ１８９４、ｂ１９１７−ｂ１９５０、ｂ４３２４−ｂ４３４２、ｂ４３４５−ｂ４３５８、ｂ４４８６、ｂ０４９７−ｂ０５０２、ｂ０７００−ｂ０７０６、ｂ１４５６−ｂ１４６２、ｂ３４８１−ｂ３４８４、ｂ３５９２−ｂ３５９６、ｂ０９８１−ｂ０９８８、ｂ１０２１−ｂ１０２９、ｂ２０８０−ｂ２０９６、ｂ４４３８、ｂ３４４０−ｂ３４４５、ｂ４４５１、ｂ３５５６−ｂ３５５８、ｂ４４５５、ｂ１７８６、ｂ０１５０−ｂ０１５３、ｂ２９４５、ｂ２４８１−ｂ２４９２、ｂ２２１９−ｂ２２３０、ｂ４５００、ｂ３７０７−ｂ３７２３、ｂ０６４４−ｂ０６５０、ｂ４０７９−４０９０、ｂ４４８７、ｂ４０９２−ｂ４１０６、ｂ０７３０−ｂ０７３２、ｂ３５７２−ｂ３５８７、ｂ１６５３、ｂ２７３５−ｂ２７４０、ｂ２４０５−ｂ２４０７、ｂ３８９６−ｂ３９００、ｂ１２０２、ｂ４２６３−ｂ４２６８、ｂ０６１１、ｂ２３６４−ｂ２３６６、ｂ０８３９、ｂ０４８８−ｂ０５００、およびｂ０５０２。
【００５４】
「ＭＤＳ６９ｍｅｔａ」株（別名ＳＧ６９ｍｅｔａまたはＴ６９ｍｅｔａ）は、ＭＤＳ６９株について上記の遺伝子を欠いており、さらに以下の（ｍｅｔａ）修飾を含む：ネイティブｒｐｈおよびｉｌｖＧフレームシフト変異の修正ならびにｉｃｌＲ遺伝子およびａｒｐＡ遺伝子の欠失。
【００５５】
「ＭＤＳ６９ｍｅｔａ  ｒｅｃＡ」株（別名ＳＧ６９ｍｅｔａ  ｒｅｃＡまたはＴ６９ｍｅｔａ  ｒｅｃＡ）は遺伝子を欠いており、ＭＤＳ６９ｍｅｔａ株について上記の改変を含み、さらにｒｅｃＡ遺伝子の欠失を含む。
【００５６】
「ＭＤＳ６９ｍｅｔａ  Ｔ／Ａ  ｒｅｃＡ」（別名ＳＧ６９ｍｅｔａ  Ｔ／Ａ  ｒｅｃＡまたはＴ６９ｍｅｔａ  Ｔ／Ａ  ｒｅｃＡ）株は遺伝子を欠いており、ＭＤＳ６９ｍｅｔａ  ｒｅｃＡ株について上記の改変を含み、さらに以下の毒素／抗毒素遺伝子を欠く：ＹａｆＱ、ｄｉｎＪ、ｈｈａ、ｔｏｍＢ、ｇｎｓＡ、ｙｍｃＥ、ｙｏｅＢ、ｙｅｆＭ、ｍａｚＦ、ｍａｚＥ、ｍａｚＧ、ｃｐｔＡ／ｙｇｆＸ、ｃｐｔＢ／ｓｄｈＥ、ｍｑｓＲ、ｍｑｓＡ、ｈｉｇＢ、ｈｉｇＡ、ｙｈａＶ、ｐｒｌＦ、ｌｄｒＤ、ｒｄｌＤ、ｉｓｔｒ−２、ｔｉｓＢ、ｃｈｐＢ、ｃｈｐＳ、ｒａｔＡ、ｒａｔＢ、ｌｄｒＡ、ｒｄｌＡ、ｌｄｒＢ、ｒｄｌＢ、ｌｄｒＣ、ｒｄｌＣ、ｈｏｋＢ、ｓｏｋＢ、ｓｉｂＡ、ｉｂｓＡ、ｓｉｂＢ、ｉｂｓＢ、ｏｈｓＣ、ｓｈｏＢ、ｓｉｂＣ、ｉｂｓＣ、ｓｉｂＤ、ｓｉｂＥ、ｉｂｓＡ、ｉｂｓＤ、ｉｂｓＥ、ａｇｒＢ、ｇｈｏＴ、ｇｈｏＳ、ｙｆｅＣ、ｙｆｅＤ、ｆｉｃ、ｙｈｆＧ、ｙｈｊＪ、ｙｈｊＭ、ｙｈｊＮ、ｙｊｊＪ、ｅｃｎＡ、およびｅｃｎＢ。
【００５７】
「ＭＤＳ６９ｍｅｔａ  Ｔ／Ａ  ＬｏｗＭｕｔ  ｒｅｃＡ」株（別名ＳＧ６９ｍｅｔａ  Ｔ／Ａ  ＬｏｗＭｕｔ  ｒｅｃＡまたはＴ６９ｍｅｔａ  Ｔ／Ａ  ＬｏｗＭｕｔ  ｒｅｃＡ）は遺伝子を欠いており、ＭＤＳ６９ｍｅｔａ  Ｔ／Ａ  ｒｅｃＡ株について記載された修飾を含み、さらにｄｉｎＢの欠失を含む。
【００５８】
上記のすべてのＭＤＳ株は挿入配列を含まない。
【００５９】
実施例１
縮小ゲノム株における組換えキャリアタンパク質の緩衝液抽出
Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズムから組換えタンパク質を抽出する方法は、小規模で一般的である。しかし、実験室規模のペリプラズム単離法は、浸透圧、および、工業規模では簡単または安価に使用できない高価な酵素または有機溶媒を使用する。本発明者は、拡張可能であるペリプラズム抽出のための経済的な方法を開発するためにかなりの時間と労力を費やした。
【００６０】
多数の緩衝液システム、界面活性剤、および酵素を組み合わせて試験した後、Ｅ．ｃｏｌｉ株（縮小ゲノムＥ．ｃｏｌｉ株が例示されている）のペリプラズムから組換えタンパク質を抽出することができるＴｒｉｓ−ＨＣｌおよびＥＤＴＡ（最終条件＝１５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．７５、５ｍＭ  ＥＤＴＡ）を含む抽出緩衝液を特定した。標準的なＥｐｉｃｃｅｎｔｅｒペリプラズム分離法と比較して、この緩衝液はＣＲＭ１９７、プロテインＤ、およびＥＰＡの２５％、５９％、および４９％をそれぞれ抽出することができた（図１を参照）。
【００６１】
実施例２
ムレインリポタンパク質遺伝子の欠失
抽出緩衝液での結果は有望であったが、抽出量を高めるための遺伝子的方法が、異なるクラスのタンパク質間の抽出成功の不一致を考慮して調査された。
【００６２】
最初に、ムレインリポタンパク質（ｌｐｐ）をコードする遺伝子をＥ．ｃｏｌｉ株ＭＤＳ６９ｍｅｔａ（別名ＳＧ６９ｍｅｔａ別名Ｔ６９ｍｅｔａ）から除去して、株ＭＤＳｍｅｔａΔｌｐｐ（別名ＳＧ６９ｍｅｔａΔｌｐｐ、別名Ｔ６９ｍｅｔａΔｌｐｐ）を作製した。ＭＤＳ６９ｍｅｔａ株は、親のＫ−１２株ＭＧ１６５５に基づく還元ゲノムＥ．ｃｏｌｉ株であり、ＭＧ１６５５と比較して以下の欠失を含む：ｂ０２４５−ｂ０３０１、ｂ０３０３−ｂ０３１０、ｂ１３３６−ｂ１４１１、ｂ４４２６−ｂ４４２７、ｂ２４４１−ｂ２４５０、ｂ２６２２−ｂ２６５４、ｂ２６５７−ｂ２６６０、ｂ４４６２、ｂ１９９４−ｂ２００８、ｂ４４３５、ｂ３３２２−ｂ３３３８、ｂ２３４９−ｂ２３６３、ｂ１５３９−ｂ１５７９、ｂ４２６９−ｂ４３２０、ｂ２９６８−ｂ２９７２、ｂ２９７５−ｂ２９７７、ｂ２９７９−ｂ２９８７、ｂ４４６６−４４６８、ｂ１１３７−ｂ１１７２、ｂ０５３７−ｂ０５６５、ｂ００１６−ｂ００２２、ｂ４４１２−ｂ４４１３、ｂ０５７７−ｂ０５８２、ｂ４４１５、ｂ２３８９−ｂ２３９０、ｂ２３９２−ｂ２３９５、ｂ０３５８−ｂ０３６８、ｂ０３７０−ｂ０３８０、ｂ２８５６−ｂ２８６３、ｂ３０４２−ｂ３０４８、ｂ０６５６、ｂ１３２５−ｂ１３３３、ｂ２０３０−ｂ２０６２、ｂ２１９０−ｂ２１９２、ｂ３２１５−ｂ３２１９、ｂ３５０４−ｂ３５０５、ｂ１０７０−ｂ１０８３、ｂ１８７８−ｂ１８９４、ｂ１９１７−ｂ１９５０、ｂ４３２４−ｂ４３４２、ｂ４３４５−ｂ４３５８、ｂ４４８６、ｂ０４９７−ｂ０５０２、ｂ０７００−ｂ０７０６、ｂ１４５６−ｂ１４６２、ｂ３４８１−ｂ３４８４、ｂ３５９２−ｂ３５９６、ｂ０９８１−ｂ０９８８、ｂ１０２１−ｂ１０２９、ｂ２０８０−ｂ２０９６、ｂ４４３８、ｂ３４４０−ｂ３４４５、ｂ４４５１、ｂ３５５６−ｂ３５５８、ｂ４４５５、ｂ１７８６、ｂ０１５０−ｂ０１５３、ｂ２９４５、ｂ０３１５−ｂ０３３１、ｂ０３３３−ｂ０３４１、ｂ０３４６−ｂ０３５４、ｂ２４８１−ｂ２４９２、ｂ２２１９−ｂ２２３０、ｂ４５００、ｂ３７０７−ｂ３７２３、ｂ０６４４−ｂ０６５０、ｂ４０７９−４０９０、ｂ４４８７、ｂ４０９２−ｂ４１０６、ｂ０７３０−ｂ０７３２、ｂ３５７２−ｂ３５８７、ｂ１６５３、ｂ２７３５−ｂ２７４０、ｂ２４０５−ｂ２４０７、ｂ３８９６−ｂ３９００、ｂ１２０２、ｂ４２６３−ｂ４２６８、ｂ０６１１、ｂ２３６４−ｂ２３６６、ｂ０８３９、ｂ０４８８−ｂ０５００、およびｂ０５０２（ＭＤＳ６９（別名ＳＧ６９またはＴ６９）を作製するためにＭＧ１６５５から欠失された遺伝子）、およびさらに、以下の（ｍｅｔａ）修飾を含む：ネイティブｒｐｈおよびｉｌｖＧフレームシフト変異の修正、ｉｃｌＲ遺伝子およびａｒｐＡ遺伝子の欠失、ならびにｒｅｃＡ遺伝子の欠失。Ｌｐｐ（Ｂｒａｕｎのリポタンパク質）は、ペリプラズムの細胞骨格様ペプチドグリカン層を細胞外皮に固定する主要な外膜タンパク質であり、ＬＰＰの不活性化はペリプラズムからのタンパク質の放出を増強することが見出されている。しかし、ＭＤＳ６９ｍｅｔａΔｌｐｐ株はペリプラズムからタンパク質を放出する能力が制限されていることがわかり、長時間発���の間、溶解に感受性であった。さらに、抽出緩衝液は、連続発酵中、ＭＤＳ６９ｍｅｔａΔｌｐｐ株（別名ＳＧ６９ｍｅｔａΔｌｐｐ、別名Ｔ６９ｍｅｔａΔｌｐｐ）からの組換えタンパク質の放出を引き起こしたり、増強したりはしなかった。それにもかかわらず、組換えタンパク質のある程度の放出が観察された。図２は、キャリアタンパク質ＥＰＡ（ペリプラズム発現配列に融合）をＭＤＳ６９ｍｅｔａΔｌｐｐ株（別名Ｔ６９ｍｅｔａΔｌｐｐ、図２ではＳＧ６９ｍｅｔａΔｌｐｐと示す）で発現させた連続発酵実験を示す。一旦発現が開始されると、ＥＰＡは培地に放出された（図２）。しかし、最初の３週間は発現が低く、シードおよび生成培養物は細胞溶解に感受性であることがわかった。より一貫した増殖を促進するために一旦条件が変更されると、ＥＰＡのレベルはいくらか安定し、培養培地はＥＰＡ精製のために収集された。生成は約３５日間続いたが、主に細胞溶解量の変化により、この期間中に発現の変動を観察した。例えば、細胞密度は、図２に記載される発酵を通して比較的低かった（ＯＤ６００の値が、ＭＤＳ６９ｍｅｔａ、別名Ｔ６９ｍｅｔａおよびＳＧ６９ｍｅｔａを使用した発酵の２２０〜２７０のＯＤ６００値と比較して、  ９０〜１５０であった）。
【００６３】
培地中のＥＰＡの識別は、最初にＣａｌｉｐｅｒ  Ｌａｂｃｈｉｐを使用して決定した（図２）。しかし、ＥＰＡは標準のＳＤＳ  ＰＡＧＥと比較してキャピラリー電気泳動上でより遅く移動し、それゆえにＥＰＡ特異的ポリクローナル抗体を用いるキャピラリーウェスタンを使用して同一性を確認した（図２の挿入図）。最後に、ＭＳに供した部分精製ＥＰＡは、修飾またはアミノ酸の位置の間違いなしで予測タンパク質を明確に識別した（９９％カバレッジ）（図４）。
【００６４】
図２の挿入図は、１リットルの連続した６回の毎日の収集の培地中でのＥＰＡの濃度を示す。精製プロセス全体が大幅に簡素化され、単一のクロマトグラフィー精製工程の後、ＥＰＡが＞９０％まで精製され、これは、タンパク質精製の最初の工程として培養培地中に放出された組換えタンパク質を使用する利点を再度示し、培養培地中にタンパク質を抽出するための方法を開発することの価値を実証する。
【００６５】
ＭＤＳ６９ｍｅｔａΔｌｐｐ（別名Ｔ６９ｍｅｔａΔｌｐｐおよびＳＧ６９ｍｅｔａΔｌｐｐ）は、ＭＤＳ６９ｍｅｔａ（別名Ｔ６９ｍｅｔａおよびＳＧ６９ｍｅｔａ）と比較すると一貫してより多くのＥＰＡを放出したが、外膜の大幅な改変に起因する溶解へのその感受性が、放出されたキャリアタンパク質の商業生産への応用を制限する可能性が高い。例えば、ＭＤＳ６９ｍｅｔａΔｌｐｐは連続発酵（Ｃ−Ｆｌｏｗ）でキャリアタンパク質ＣＲＭ１９７を発現したが、ＭＤＳ６９ｍｅｔａΔｌｐｐを使用した培養培地へのＣＲＭ１９７の放出は観察されなかった。しかし、通常レベルのＬｐｐでＭＤＳ６９ｍｅｔａを使用した連続発酵実験において、培地への中程度の量のＣＲＭ１９７の断続的な放出が観察された。
【００６６】
実施例３
ＯｍｐＬＡ処理との同時発現は、組換えタンパク質の抽出を生じる
本発明者らは、保護された分類不能なＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ抗原および肺炎球菌コンジュゲートワクチンのキャリアタンパク質であるＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのプロテインＤ（ＰＤ）が、Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡ抽出なしで、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＭＤＳ６９ｍｅｔａ（別名ＳＧ６９ｍｅｔａ別名Ｔ６９ｍｅｔａ）の連続発酵中に適量で培地に放出され、ＣＲＭ１９７およびＥＰＡよりも効果的にペリプラズムから除去されたことを観察した。図３Ａ〜Ｃは、３つのＰＤを例解し、細菌細胞ペリプラズムで高レベルのＰＤが観察された後、培養培地へのＰＤ放出の一時的なスパイクが起こった連続発酵を例解する。培地内のＰＤのレベルは１リットルあたり１０グラムと同程度まで高く、放出された組換えタンパク質のレベルが高いことに注目のこと。培地内のインタクトなＰＤは、抗ＰＤ抗体を使用したＣａｌｉｐｅｒ  ＬａｂＣｈｉｐ、キャピラリーウェスタン（図３Ｂの挿入図）、およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動（図示せず）によって確認した。放出は、細胞タンパク質の増加が培地中で観察されず、細胞溶解から生じる物質（すなわち、核酸）の増加の証拠もなかったため、広範な細胞溶解の結果であるとは思われなかった。さらに、クロマトグラフィーの前にほとんど前処理することなく、ＰＤを培地から容易に精製した（以下を参照）。
【００６７】
ＰＤの放出は、ペリプラズムＰＤ濃度とパラレルではなかった。図３Ｃに示されている発酵の後半でＰＤの発現が増加しても、培地中のＰＤのレベルの増強は生じなかった。すなわち、ＰＤのペリプラズムレベルは、図３Ｃの２５日目〜３０日目まで増加したが、培地中のＰＤレベルはそれほど増加しなかった。この期間の間の培地中のＰＤの非存在は、２８日目からの培地サンプルに「スパイク」された以前の発酵から部分精製ＰＤが２５℃で２４時間インキュベーション後もインタクトなままであったため、ＰＤ分解の結果ではなかった。
【００６８】
ＰＤの同一性を確認するために、Ｃ−Ｆｌｏｗ図１Ｂの培地中の推定ＰＤを、４〜１２％アクリルアミドゲル上で汚染タンパク質から分離し、ゲルから切り出して質量分析（ＭＳ）に供した。図４に示すように、ＭＳは切除されたバンドをＰＤとして同定した。ＰＤ精製のために培養培地を使用することの利点を例解する切除領域において、汚染タンパク質は明らかではなかった（以下を参照）。ＰＤの完全なＮ末端（末端システインを除く）が予測どおりに同定され、全体的なカバレッジは９９％を超えていた。アシル化などの翻訳後修飾は、予想どおり明らかではなかった。
【００６９】
ＰＤの放出の原因であるメカニズムを特定するために、いくつかの培養条件が改変された。テストされた１つのパラメーター、誘導物質濃度の増加は、ペリプラズム中のＰＤを増強し、培地へのＰＤの移動の増加を促進すると仮定された。ペリプラズム中のＰＤ量の増加は、試験した最高の誘導因子濃度（３００μＭ  ＩＰＴＧ）まで観察されたが、培養培地中ではＰＤはほとんどまたはまったく明らかではなかった。ストレスである事象がＰＤ放出を引き起こしたか否かを判断するために、本発明者らは、Ｃ−ＦｌｏｗにおけるＰＤ発現の間の温度の上昇とｐＨの低下の両方を調べた。発酵条件のどちらの変化もＰＤの培地への放出を生じなかった。
【００７０】
ペリプラズムにおけるプロテインＤの存在は、その内因性グリセロホスホジエステラーゼ活性により外細胞膜を変化させると仮定された。しかし、プロテインＤとＣＲＭ１９７またはＥＰＡの同時誘導は、振盪フラスコ培養におけるＣＲＭ１９７またはＥＰＡの放出または抽出のいずれにも影響しなかった。
【００７１】
培養培地へのＰＤの放出のトリガーはまだ特定されていないが、放出されたＰＤを含む連続発酵（別名Ｃ−Ｆｌｏｗ）サンプルを使用して、ＰＤの簡単な精製方法が開発された。高レベルのＰＤ（図３Ｂの２１日目に約１０ｇ／Ｌ）を含む培地サンプルを使用して、純度９５％を達成するために２回のクロマトグラフィー工程のみを必要とする精製スキームを開発した。ＰＤの精製の容易さは、培地中の高いＰＤの割合（５８％）に直接起因していた。精製プロトコルの単純さを考えると、記載された方法は、組換えタンパク質のための連続エンドツーエンド製造プロセスの自動化に非常に適している。
【００７２】
次に、本発明者らは、振盪フラスコ培養を使用してペリプラズムからのより完全な抽出を促進すると予測した一連の酵素を調べた。Ｅ．ｃｏｌｉ外膜ホスホリパーゼＡ（ＯｍｐＬＡ）酵素（ｐｌｄＡ遺伝子によってコードされる）は、振盪フラスコ培養において３つすべてのキャリアタンパク質の抽出を増強することが見出された。（図５Ａ〜Ｃ）。他のいくつかのＥ．ｃｏｌｉホスホリパーゼもテストした。ＧｌｐＱ、ＰｌｄＢ、およびＴｅｓＡもまた、ＯｍｐＬＡよりも程度は低いものの、キャリアタンパク質の抽出を増強することが見出された。
【００７３】
これらの振盪フラスコ培養実験において、ｐｌｄａ遺伝子が各キャリアタンパク質（二シストロン性構築物）の下流に配置され、個別の制御下に置かれるように各発現プラスミドが改変された（すなわち、各キャリアタンパク質はＩＰＴＧによって誘導され、ｐｌｄＡ発現はドキシサイクリン（ＤＯＸ）によって誘導された）。次に、プラスミドは、配列が確認され、ＭＤＳ６９ｍｅｔａ（別名ＳＧ６９ｍｅｔａ、別名Ｔ６９ｍｅｔａ）にサブクローニングされた。強固なキャリアタンパク質発現レベルを確立するために、組換えキャリアタンパク質の誘導の４時間後にｐｌｄＡ発現が誘導された。各キャリアタンパク質の１６時間抽出後の結果を図５Ａ〜Ｃに示す。それぞれの場合において、抽出されたキャリアタンパク質の量は、Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒプロトコルに基づき、ペリプラズム中に存在する量と等しいか、それを超えていた。上記の実験と一致して、培養の間に中程度のレベルのプロテインＤが細胞から「漏出」したため、ペリプラズムと比較して、抽出後の培地中には、より高レベルのプロテインＤが存在した。ＯｍｐＬＡレベルを達成するために必要なＤＯＸはほとんどなく、これは、各キャリアタンパク質を完全な抽出を生じ、このことは、商業化のスケールアップの重要な特徴である。
【００７４】
ペリプラズム中における３つの組換えキャリアタンパク質（エキソプロテインＡ（ｒＥＰＡ）、プロテインＤ（ＰＤ）およびＣＲＭ１９７）の産生および培地への分泌を、ＭＤＳ６９ｍｅｔを作製するために作製された欠失を含み（上記）、いくつかの発現戦略を使用してｒｅｃＡの欠失も含む、縮小ゲノムＥ．ｃｏｌｉ宿主株ＭＤＳ６９ｍｅｔａ  ｒｅｃＡ（別名Ｔ６９ｍｅｔａ  ｒｅｃＡまたはＳＧ６９ｍｅｔａ  ｒｅｃＡ）を用いる振盪フラスコ培養中で調べた。
【００７５】
それぞれの場合の宿主細胞は、ＩＰＴＧ誘導性プロモーターの制御下にあるＹｔｆＱ分泌シグナルに融合したＥＰＡ、ＰＤまたはＣＲＭ１９７をコードする配列を含み、さらにドキシサイクリン（ＤＯＸ）誘導性プロモーターの制御下にあるＯｍｐｌＡをコードする配列を含む、単一発現プラスミド構築物でトランスフェクトした。
【００７６】
−８０℃で保存した宿主細胞のストック培養物を解凍し、１０ｍＬの規定培地（０．２％グルコースおよび５０μｇ／ｍｌカナマイシンを補充したＫｏｒｚ培地）に接種するために使用した。前培養物を一晩増殖させ、同じ初期細胞密度で振盪フラスコに接種するために使用した。細胞が飽和に達すると、標的遺伝子（ＥＰＡ、ＰＤまたはＣＲＭ１９７）は、５０μＭＩＰＴＧ（ＥＰＡおよびＣＲＭ１９７）または１００μＭＩＰＴＧ（ＰＤ）（非常に遅い誘導）で誘導され、約４時間後に０〜１００ｎＭ  ＤＯＸでｐｌｄＡ発現が誘導され、誘導は２５℃で一晩継続させた。増殖速度および最終細胞密度は、株間で同等であった。
【００７７】
翌朝、１３３５μｌの培養液を収集し、濃縮ＴｒｉｓおよびＥＤＴＡ（最終条件＝１．５ｍｌ、１５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．７５、５ｍＭ  ＥＤＴＡ）を含む数本の２ｍｌチューブに入れた。次に、チューブを２時間インキュベート（２５℃で振盪）し、その後、収率を評価するか、または２時間（２５℃で振盪）、その後、一晩（２５℃）インキュベート、その後、収率を評価した。ＰＤについては、チューブをまた２時間インキュベートし（２５℃で振盪）、その後２５℃で６時間インキュベートした。
【００７８】
２時間、６時間、または一晩振盪した後、チューブを４０００ｘｇで１５分間遠心分離し、５００μｌの上清を除去し、ＹＭ１０スピンフィルターに適用し、１３０００ｘｇで３０分間遠心分離した。保持液（培地を表す）を、Ｋｏｒｚ／０．２％グルコース  Ｋａｎ（２５μｇ／ｍｌ）／Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡで０．０２  ＯＤ／μｌの等価物に希釈した。ペリプラズム収率を評価するために、培養の別のアリコートで中心点ペリプレップを実施し、最終濃度＝０．２  ＯＤ  μｌであった。すべてのサンプルはキャリパーチップ上で分析した。
【００７９】
図７〜９から見ることができるように、ｐｌｄＡ遺伝子の同時発現は、各キャリアタンパク質のほぼ１００％の抽出が培地に生じ、この方法が任意の特定の組換えタンパク質に限定されないことが確認された。Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡを用いる一晩抽出は、２時間抽出よりもかなり多くの標的タンパク質を放出し、６時間および一晩抽出の間にほぼすべてのタンパク質が培地に抽出された（ペリプラズム収率を抽出収率に対して比較する−それらが同じ場合、すべてのタンパク質が抽出されている）。
【００８０】
１つの奇妙な観察は、ｐｌｄＡの発現が誘導されなかった培養物（０  ＤＯＸ）中においてさえ、これらの延長された抽出時間でキャリアタンパク質の一部が放出されるという事実であった。ｐｌｄＡ発現を制御するプロモーターは、ＧＦＰを用いた以前の実験に基づいて、いくつかの非誘導のベース活性を有することが知られている。したがって、ｐｌｄＡベースのプラスミドを保有する株において、ｐｌｄＡの発現レベルは野生型よりも高い可能性があり得ると想定された。その仮定をテストするために、組換えキャリアタンパク質のみをコードする発現ベクターで形質転換したＭＤＳ６９ｍｅｔａ  ｒｅｃＡ株からの標的のＴｒｉｓ／ＥＤＴＡ抽出を、組換えキャリアタンパク質およびＯｍｐＬＡをコードする発現ベクターと比較した。ＩＰＴＧを用いてすべての株を標的に対して誘導し、０、１０、または１００ｎＭ  ＤＯＸで処理した後、Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡ抽出緩衝液で一晩抽出した。結果は、ｐｌｄＡ発現の誘導の非存在下でさえ、ｐｌｄＡベースのプラスミドを保有する株から有意に多くの標的が抽出されることを実証しており、非誘導状態でのＯｍｐＬＡの漏出性のベース発現を示す。図１０Ａ〜Ｃを参照。この手順を使用して、培地中の２〜３ｇ／ＬのＣＲＭ１９７の収率が得られた。
【００８１】
ＯｍｐＬＡの漏出性発現は単一のｔｅｔオペレーターを用いて観察されたため（上記キャリアタンパク質実験におけるように）、以下の実験ではｐｌｄＡはデュアルｔｅｔオペレーターの制御下に置かれた。ＭＤＳ６９ｍｅｔａ  ｒｅｃＡ宿主細胞は、ＩＰＴＧ誘導性プロモーターの制御下にあるＹｔｆＱ分泌シグナルに融合したＥＰＡ、ＰＤまたはＣＲＭ１９７をコードする配列を含み、デュアルｔｅｔオペレーターによって制御されるＯｍｐＬＡをコードする配列をさらに含む、単一発現プラスミド構築物でトランスフェクトした。
【００８２】
−８０℃で保存した宿主細胞のストック培養物を解凍し、１０ｍＬの規定培地（Ｋｏｒｚ／０．２％グルコース／カナマイシン（２５μｇ／ｍｌ））を接種するために使用した。前培養物を一晩増殖させ、同じ初期細胞密度で振盪フラスコに接種するために使用した。一旦細胞が飽和に達すると、１００μＭＩＰＴＧ（ＥＰＡおよびＣＲＭ１９７）または２００μＭＩＰＴＧ（ＰＤ）（非常に遅い誘導）で標的遺伝子（ＥＰＡ、ＰＤまたはＣＲＭ１９７）が誘導され、約４時間後に、０、１２．５、２５、５０、７５、または１００ｎＭ  ＤＯＸでｐｌｄＡ発現が誘導され、２５℃で一晩誘導を続けた。増殖速度および最終細胞密度は、株間で同等であった。
【００８３】
翌朝、１３３５μｌの培養液を収集し、濃縮ＴｒｉｓおよびＥＤＴＡ（最終条件＝１．５ｍｌ、１５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．７５、５ｍＭ  ＥＤＴＡ）を含む何本か１．５ｍｌチューブに入れた。次に、チューブを６時間（２５℃で振盪）または一晩インキュベートし、その後、収率を評価した。
【００８４】
６時間または一晩振盪した後、チューブを４０００ｘｇで１５分間遠心分離し、５００μｌの上清を除去してＹＭ１０スピンフィルターに適用し、１３０００ｘｇで３０分間遠心分離した。保持液（培地を表す）を、Ｋｏｒｚ／０．２％グルコース／Ｋａｎ（２５μｇ／ｍｌ）／Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡで０．０２  ＯＤ／μｌの等価物に希釈した。ペリプラズム収率を評価するために、Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ  Ｐｅｒｉ−Ｐｒｅｐを培養の別のアリコートで実施し、最終濃度＝０．２  ＯＤ／μｌにした。すべてのサンプルはキャリパーチップ上で分析した。
【００８５】
ＣＲＭ１９７のデータを図１１に示す。ｐｌｄＡ遺伝子の発現を誘導するためにＤＯＸが追加されない限り、Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡ抽出によってＣＲＭ１９７はほとんど放出されない。これは、単一ｔｅｔＯ構築物で得られた以前の結果とまったく対照的である（上記の図１０Ａ）。これらの場合において、ｐｌｄＡの非誘導ベース発現に起因するＤＯＸによるｐｌｄＡ遺伝子発現の誘導の非存在下では、一晩のＴｒｉｓ／ＥＤＴＡ抽出後、通常、キャリアタンパク質の５０％以上が放出された。ＰＤおよびＥＰＡについても同様の結果が観察された（データ示さず）。したがって、誘導されたｐｌｄＡ発現の非存在下でのキャリアタンパク質のＴｒｉｓ／ＥＤＴＡ抽出は、ｐｌｄＡの発現が漏れやすい（例えば、単一のｔｅｔＯ）プロモーターによって制御され、誘導されていないバックグラウンドＯｍｐＬＡに起因する場合にのみ観察される。
【００８６】
前に見たように、ＰＤの固有のリパーゼ活性に起因して、ＣＲＭ１９７およびＥＰＡと比較して、ＤＯＸ（これはＯｍｐＬＡを誘導する）の非存在下でより多くのＰＤが放出され、これはデュアルｔｅｔＯ−ｐｌｄＡ構築物についてもまた当てはまる。しかし、デュアルｔｅｔＯ−ＰＬＤＡ構築物を使用する場合、単一のｔｅｔＯ−ＰＬＤＡ構築物で１／２以上（データ示さず）と比較して、ＰＤの１／６のみが、ＰＬＤＡ発現の誘導の非存在下で放出される。
【００８７】
非誘導状態における標的キャリアタンパク質およびＯｍｐＬＡの発現を最小限にすることは、潜在的な選択バイアスを回避するための連続発酵のために有益である。
【００８８】
上記の単一プラスミド／２プロモーター構築物は、培地中で２〜３ｇ／ＬのＣＲＭ１９７の収率をもたらしたが、しかし、これらの構築物はプラスミド二量体を形成する傾向があることが見出された。したがって、ＲＢＳ（リボソーム結合部位）−ｐｌｄＡインサートがＤＯＸ誘導性プロモーターの制御下でＣＲＭ１９７のすぐ下流に配置された二シストロン性メッセージアプローチをテストした。この構築物において、ＣＲＭ１９７とＯｍｐＬＡの両方の発現がＤＯＸによって誘導される。上記の手順でこの構築物を利用することは、ペリプラズム調製物に基づいて４〜５ｇ／ＬおよびＴｒｉｓ／ＥＤＴＡ抽出物に基づいて４ｇ／Ｌを生じた（データ示さず）。
【００８９】
一部の実験においては、二シストロン性ＣＲＭ１９７−ＲＢＳ−ｐｌｄＡ構築物を改変して、野生型ｐｌｄＡをコドン変更ｐｌｄＡに置き換え、染色体統合の機会を大幅に減らした。同時に、３つの異なるＲＢＳ配列をテストして、ＣＲＭ１９７とＯｍｐＬＡの同時発現を最適化してＣＲＭ１９７の収率を改善することができるか否かを判断した。
【００９０】
実施例４
ＣＲＭ１９７誘導因子濃度の最適化およびＭＤＳ６９ｍｅｔａ  Ｔ／Ａ  ＬｏｗＭｕｔ  ｒｅｃＡ細胞の培地へのＣＲＭ１９７放出の拡張分析
以前の実験では、ＣＲＭ１９７の放出をモニターするための培地サンプルは、一晩の誘導期間後に採取された。一晩誘導培養のアリコートから培地サンプルを採取し、次にこれをＴｒｉｓ／ＥＤＴＡ抽出サンプルと並行してインキュベートすることにより（２５℃で振盪しながら再度一晩インキュベートする）、より良好な対照サンプルが生成される。
【００９１】
以前の実験は、最適なＣＲＭ１９７発現は、５０〜２５０ｎＭのドキシサイクリン濃度範囲で達成されたが、５００ｎｍ以上では低下し始めたことを示した。
【００９２】
次の実験は、１００、２５０、４００ｎＭ  ＤＯＸによる誘導をテストし、改善された対照を使用して培地へのＣＲＭ１９７の放出を分析した。
【００９３】
簡単に説明すると、（ｉ）ドキシサイクリンプロモーターの制御下にあるＹｔｆＱ分泌シグナルに融合したＣＲＭ１９７または（ｉｉ）同じドキシサイクリンプロモーターの制御下にあるＹｔｆＱ分泌シグナルおよびコドン最適化されたｐｌｄＡ配列に融合したＣＲＭ１９７をコードする発現プラスミドを保有するＭＤＳ６９ｍｅｔａ  Ｔ／ＡＴ  ＬｏｗＭｕｔ  ｒｅｃＡ宿主細胞（ＣＲＭ１９７とｐｌｄＡ  ＯＲＦＳの間のＲＢＳに関してのみ異なる２つの別々の構築物を使用、図６Ａを参照）が、１００、２５０または４００ｎＭ  ＤＯＸ（培地＝Ｋｏｒｚ／０．２％グルコース／Ｋａｎ）を用いて誘導された。ペリプラズム収率を評価するために、２ＯＤに対して等価な培養物のアリコートに対して、Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ  Ｐｅｒｉ−Ｐｒｅｐを実施し、調製物の最終濃度を２ＯＤ／μｌに対して等価にした。培地中のＣＲＭ１９７の収率を決定するために、１３３５μｌの誘導培養物を濃縮ＴｒｉｓおよびＥＤＴＡを含む１．５ｍｌチューブに入れ（最終条件＝１．５ｍｌ、１５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．７５、５ｍＭ  ＥＤＴＡ）、すべてのサンプルを２５℃で一晩振盪した。上清は、ｃｆｇによって４０００ｘｇで１５分間収集した。５００μｌの上清を除去し、ＹＭ１０スピンフィルターに適用し、１３０００ｘｇで３０分間ｃｆｇを行った。保持液を、Ｋｏｒｚ／０．２％グルコース／Ｋａｎ（２５μｇ／ｍｌ）／Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡを用いて０．０２ＯＤ／μｌと等価に希釈した。
【００９４】
培地対照１：１ｍｌの誘導培養物を１．５ｍｌチューブに入れ、Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡ抽出と並行して２５℃で一晩振盪した。
【００９５】
培地対照２：１ｍｌの誘導培養液を１．５ｍｌチューブに入れ、４℃で２日間保存した。
【００９６】
両方の培地サンプルからの上清を収集し、Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡ抽出物と同じ手順に従って処理した。０．０２  ＯＤ／μｌへの最終希釈は、Ｋｏｒｚ／０．２％グルコース／Ｋａｎ（２５μｇ／ｍｌ）／Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡを用いて実施した。
【００９７】
これらの株からのＹｔｆＱ−ＣＲＭ１９７の最適な誘導のために使用するＤＯＸの最大濃度は４００ｎＭである（図１２Ｃを参照）。
【００９８】
誘導培養物の４℃での保存は、振盪しながら２５℃でインキュベートするよりも、培地へのＣＲＭ１９７の大幅に少ない放出をもたらした（図１２Ｂと１２Ｄを比較）。ＯｍｐＬＡ同時発現株において発現したＣＲＭ１９７の約５０％は、単に抽出緩衝液の非存在下で振盪しながら２５℃でインキュベートすることによって放出することができる（図１２Ｂ）。抽出緩衝液を用いると、ＣＲＭ１９７のほぼ１００％を放出することができる。
【００９９】
これらのデータは、本明細書に記載の方法に従って非常に良好な結果で多種多様な構成を使用してホスホリパーゼと目的のタンパク質を同時発現することができるが、目的のタンパク質の発現と目的のタンパク質の培地への抽出の両方に関して最適な結果が、ＲＢＳ（および同じプロモーター、この場合はＤＯＸ誘導性プロモーターの制御下にある）によって分離された目的のタンパク質とホスホリパーゼをコードする二シストロン性構築物を使用して達成され、実質的に１００％目的のタンパク質を培地に抽出したことを実証する。さらに、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）の強度は、発現されるＯｍｐＬＡの量と直接相関することが見出された（ＲＢＳの強度の違いによりｐｌｄＡ遺伝子が異なるレベルで発現されることを実証する図１２Ａの右の２つのパネルを参照）。
【０１００】
実施例５  野生型Ｅ．ｃｏｌｉ株およびＲＮａｓｅ  ＩＩＩ＋毒素／抗毒素遺伝子欠失を有するＥ．ｃｏｌｉ株におけるＣＲＭ１９７ペリプラズム収率
ＣＲＭ１９７のペリプラズム収率は、ＣＲＭ１９７をペリプラズムに方向付けるためのＯｍｐＦまたはＹｔｆＱ分泌シグナルを使用して、ＭＧ１６５５株（本明細書に記載の複数欠失株Ｅ．ｃｏｌｉの天然の親株）、野生型Ｋ１２株Ｗ３１１０およびＢＬ２１ＤＥ３株（ファージ欠失ありおよびなし）を含むいくつかのＥ．ｃｏｌｉ株で測定された。
【０１０１】
図１３は、以下の株、（１）ＢＬ２１ＤＥ３（２）ファージ欠失を伴うＢＬ２１ＤＥ３（３）ＭＧ１６５５および（４）Ｗ３１１０におけるＣＲＭ１９７のペリプラズム産生を実証する。手短に言えば、発現プラスミドを保持する各株を、ＯＤ６００が後期誘導（０．３  ＯＤ６００）または超後期誘導（１．５〜２．０  ＯＤ６００）のために十分になるまで２５℃で増殖させた。後期誘導のために、培養の２０ｍｌアリコートを１２５ｍｌバッフル付きエルレンマイヤーフラスコに取り出し、ＯｍｐＦ−ＣＲＭ１９７構築物には２５μＭＩＰＴＧ、ＹｔｆＱ−ＣＲＭ１９７構築物には５０μＭＩＰＴＧを用いて誘導した。非常に遅い誘導のために、培養物の２０ｍｌアリコートを１２５ｍｌのバッフル付きエルレンマイヤーフラスコに取り出し、ｏｍｐＦ−ＣＲＭ１９７構築物には２５〜２００μＭＩＰＴＧ、ＹｔｆＱ−ＣＲＭ１９７構築物には５００−４００μＭＩＰＴＧを用いて誘導した。すべての誘導は２５℃で２０時間増殖させた後、２  ＯＤの培養物を収集し、Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ  Ｐｅｒｉｐｌａｓｔｉｎｇ法を使用してペリプラズムおよびスフェロプラスト画分を調製した。
【０１０２】
Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｂ株ＢＬ２１ＤＥ３におけるＣＲＭ１９７の発現は、ファージを欠失させることによって大幅に改善された。ＯｍｐＦまたはＹｔｆＱ分泌シグナルを利用した場合でも、同様の結果が得られた。
【０１０３】
ＣＲＭ１９７のペリプラズム収率は、（ｉ）ＲＮＡを標的とする毒素−抗毒素遺伝子を欠失させること、および（ｉｉ）ＲＮＡｓｅ  ＩＩＩを欠失することにより、ｍＲＮＡ転写産物の量を増やすように設計された縮小ゲノムＥ  ｃｏｌｉ株において評価された。Ｔ６９ｍｅｔａ  Ｔｏｘ／Ａｎｔｉｔｏｘ  ＲＮａｓｅ  ＩＩＩ株におけるＣＲＭ１９７産生（ＭＤＳ６９の欠失、ＲＮａｓｅ  ＩＩＩの部分的（不活性化）欠失、およびＲＮＡを標的とする毒素−抗毒素遺伝子の欠失を含む）をＴ６９ｍｅｔａ株におけるＣＲＭ１９７産生と比較した。
【０１０４】
図１４に例解するように、ＲＮＡ標的化毒素／抗毒素遺伝子とＲＮａｓｅ  ＩＩＩの組み合わせ欠失は、ＯｍｐＦまたはＹｔｆＱシグナル配列を使用してＣＲＭ１９７をペリプラズムに誘導したか否かに関わらず、ＣＲＭ１９７のペリプラズム収率を顕著に増加した（ＳＧ７７５５株の２．６ｇ／Ｌと比較した、ＳＧ７１２８株およびＳＧ８００株における収率３．５および３．３ｇ／Ｌ）。毒素−抗毒素遺伝子およびＲＮａｓｅ  ＩＩＩの欠失を含むＥ．ｃｏｌｉ株において、組換えタンパク質の収率の相加的および相乗的でさえある増加が得られる可能性がある。シャペロンｐｓｐＡの同時発現はＣＲＭ１９７の収率を増加させず、おそらくシャペロンの産生への細胞機構の転換により、収率を低下させる傾向さえあった。
【０１０５】
結果を以下の表２に要約する。
【表２】
2020532322.tif 000005
【０１０６】
実施例６
キャリアタンパク質の産生および培地への抽出のための連続発酵システム
減少したゲノムＥ．ｃｏｌｉ株は、連続発酵培養（連続フローまたは「Ｃ−Ｆｌｏｗ」）で６０日間以上連続増殖およびタンパク質産生を維持することができる。従来のＥ．ｃｏｌｉ産生株ＢＬ２１、ＭＧ１６５５およびＢＬＲを用いても不可能である３０日間を超える（３週間を示している）期間にわたって４〜５ｇ／リットル／日の（ペリプラズム）収率でのＣＲＭ１９７の連続的な増殖および産生を例解する、図１５を参照のこと、ここでは、約１ｇ／Ｌの収率が最初に得られ（これは徐々に減少する）、非産生変異体が培養を引き継ぐため、数日間よりも長い期間連続発酵は維持できない。
【０１０７】
振盪フラスコ培養における組換えタンパク質の緩衝液抽出が、連続発酵中に達成される高い細菌細胞密度までスケール変更可能であるかどうかを判断するために、ＩＰＴＧ誘導性プロモーターの制御下にあるＣＲＭ１９７およびドキシサイクリン誘導性プロモーターの制御下にあるｐｌｄＡをコードする配列を含む単一発現プラスミドを含むＳＧ６９ｍｅｔａ（別名ＭＤＳ６９ｍｅｔａ  ａｋａ  Ｔ６９ｍｅｔａ）を使用した拡張発酵が、上記の振盪フラスコ培養実験で使用される。２週間の期間にわたるＣＲＭ１９７の発現を示す拡張発酵を図１６に示す。ＣＲＭ１９７の発現は平均１ｇ／Ｌ／日であり、発酵は２００の比較的一貫した高密度ＯＤ６００を維持した。高密度連続発酵発酵物に対して行われた抽出実験は、ＣＲＭ１９７の９０％回収を生じた（図１６のパネルＡおよびＢを参照）。示されている実験において、１００ｍｌの未希釈発酵液が１リットルのバッチ収集容器から採取された。次に、ドキシサイクリンを１００ｍｌの発酵アリコートに加え、サンプルを２５℃で撹拌しながら振盪チェストインキュベーターで４時間インキュベートした。抽出緩衝液を添加し（発酵物の１／１０体積に等しい）、サンプルをさらに１６時間インキュベートした。ＤＯＸ誘導の非存在下でのＴｒｉｓ／ＥＤＴＡ抽出は、ペリプラズムに存在するＣＲＭ１９７の約半分の抽出を生じたが（ｏｍｐＬＡの非誘導発現に起因する）、Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡと組み合わせたＤＯＸ誘導は、ＣＲＭ１９７の９０％の抽出を生じた。これらの結果は、本明細書に記載の抽出方法が高密度連続発酵に適応可能であることを実証する。
【０１０８】
本明細書に記載されるような、ペリプラズムシグナル配列およびＥ．ｃｏｌｉホスホリパーゼ（単一のプロモーターまたは個別のプロモーターによって調節されるキャリアタンパク質およびホスホリパーゼを伴う）に融合された縮小ゲノムＥ．ｃｏｌｉ株（極度に高密度まで増殖することができる）の連続発酵は、コードされたタンパク質の長期的な高収率産生および単純な緩衝液を用いた標的タンパク質の培地への完全な抽出を可能にし、下流の処理（例えば、精製）工程を大幅に簡素化する。
【０１０９】
重要なことに、ＣＲＭ１９７および他のキャリアタンパク質の産生は、ＢＬ２１およびＢＬＲなどの市販のＥ．ｃｏｌｉＢ株においては実現可能ではなく、本明細書に記載の縮小ゲノムＥ．ｃｏｌｉ株の親株であるＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２株ＭＧ１６５５においても実現可能ではない。これらの株を使用すると、７日間より長い連続発酵は不可能であり、ＣＲＭ１９７の産生は約１ｇ／Ｌ／日〜約０ｇ／Ｌ／日まで急速に低下する。本明細書に記載の縮小ゲノムＥ．ｃｏｌｉ株を使用すると、最大６５日間の連続発酵の実行が達成され、ＰＤの一貫した産生が約９ｇ／Ｌ／日で、最大３０日間でＣＲＭ１９７が約４〜５ｇ／Ｌ／日で一貫して産生され、リパーゼの同時発現を用いて可能である培地からの精製が大幅な改善を伴った。連続フローを３６５日間以上の連続生産に拡張することに制限はないようである。
【０１１０】
選択的な下流処理
連続培養（別名連続フローまたは「Ｃ−Ｆｌｏｗ」）は、発酵上清からインタクトな細胞または破片を除去するための連続的な自動清澄化のための下流培養清澄化プロセスを含んでもよく、クロマトグラフィープロセスを連続培養の流量と同時リンクさせることにより、清澄化された上清から所望の産物の容易な精製のための、小型化された低コストクロマトグラフィーシステムを含んでもよい。
【０１１１】
本明細書に記載の組成物および方法を使用して産生されたＣＲＭ１９７は、一貫性が高く、純度９８％までで、メチル化、アセチル化、グルコノイル化またはリン酸化を含まず、エンドトキシンレベルが極度に低い（＜２５ＥＵ／ｍｇ）。市販ワクチンの用量あたりのＣＲＭ１９７の量は１２〜６５ｕｇの範囲であることを考慮すると、潜在的なエンドトキシン汚染は、標準ワクチンの用量あたり０．５ＥＵ未満であり、多糖類ワクチンの業界標準である＜１０ＥＵ／用量を大きく下回る。
【０１１２】
実施例７
毒素−抗毒素遺伝子の欠失は、キャリアタンパク質の生産を大幅に改善する
Ｅ．ｃｏｌｉにおけるキャリアタンパク質の産生に対する毒素抗毒素遺伝子の欠失の影響を評価した。以下の毒素−抗毒素遺伝子をいくつかのＭＤＳ  Ｅ．ｃｏｌｉ株から欠失させて、対応するＭＤＳ  Ｔ／Ａ株を作製した：ＹａｆＱ、ｄｉｎＪ、ｈｈａ、ｔｏｍＢ、ｇｎｓＡ、ｙｍｃＥ、ｙｏｅＢ、ｙｅｆＭ、ｍａｚＦ、ｍａｚＥ、ｍａｚＧ、ｃｐｔＡ／ｙｇｆＸ、ｃｐｔＢ／ｓｄｈＥ、ｍｑｓＲ、ｍｑｓＡ、ｈｉｇＢ、ｈｉｇＡ、ｙｈａＶ、ｐｒｌＦ、ｌｄｒＤ、ｒｄｌＤ、ｉｓｔｒ−２、ｔｉｓＢ、ｃｈｐＢ、ｃｈｐＳ、ｒａｔＡ、ｒａｔＢ、ｌｄｒＡ、ｒｄｌＡ、ｌｄｒＢ、ｒｄｌＢ、ｌｄｒＣ、ｒｄｌＣ、ｈｏｋＢ、ｓｏｋＢ、ｓｉｂＡ、ｉｂｓＡ、ｓｉｂＢ、ｉｂｓＢ、ｏｈｓＣ、ｓｈｏＢ、ｓｉｂＣ、ｉｂｓＣ、ｓｉｂＤ、ｓｉｂＥ、ｉｂｓＤ、ｉｂｓＥ、ｄｉｎＱ、ａｇｒＡ、ａｇｒＢ、ｇｈｏＴ、ｇｈｏＳ、ｙｆｅＣ、ｙｆｅＤ、ｆｉｃ、ｙｈｆＧ、ｙｈｊＪ、ｙｈｊＭ、ｙｈｊＮ、ｙｊｊＪ、ｅｃｎＡ、およびｅｃｎＢ。
【０１１３】
ＣＲＭ１９７、ＥＰＡ、およびＰＤの産生は、ＭＤＳ６９ｍｅｔａ  ｒｅｃ  Ａ（毒素−抗毒素遺伝子を含む）において、および毒素−抗毒素遺伝子が欠失された、派生株ＭＤＳ６９ｍｅｔａ  Ｔ／Ａ  ｒｅｃＡおよびＭＤＳ６９ｍｅｔａ  Ｔ／Ａ  ＬｏｗＭｕｔ  ｒｅｃＡにおいて評価された。
【０１１４】
ＩＰＴＧ誘導性またはドキシサイクリン誘導性プロモーターの制御下にあるＹｔｆＱ分泌シグナルに融合したＣＲＭ１９７、ＥＰＡまたはＰＤをコードする発現プラスミドを保有する各宿主株において、ＣＲＭ１９７、ＰＤおよびＥＰＡのペリプラズム収率を評価した。
【０１１５】
ＩＰＴＧ誘導を伴うＣＲＭ１９７については、各株からの３つのコロニーを使用して、別々のフラスコに２５ｍｌ  Ｋｏｒ／０．２％グルコース／Ｋａｎ（２５μｇ／ｍｌ）で、３７℃で接種した。２５ｍｌの接種材料を使用して、その後の１００ｍｌの培養物を５００ｍｌのバッフル付きＥフラスコ中にＯＤ６００＝０．２５になるように接種した。すべての培養物を２５℃で次のおよそのＯＤ６００（修正）まで増殖させ、ＭＤＳ６９ｍｅｔａ  ｒｅｃＡについて２．８（下の表３のＳＧ７７６６）、ＭＤＳ６９ｍｅｔａ  Ｔ／Ａ  ＬｏｗＭｕｔ  ｒｅｃＡについて３．０（下の表３のＳＧ８０８１）であった。その後、２０ｍｌのアリコートを取り出し、１２５ｍｌのバッフル付きＥフラスコに入れ、２５μＭ、５０μＭ、１００μＭまたは２００μＭ  ＩＰＴＧで誘導し、培養物を２５℃で一晩振盪した。２５℃で１６〜２０時間のインキュベーション後、ｃｆｇによって２  ＯＤの培養物を収集し（７５００ｘｇで１０分）、ＥｐｉＣｅｎｔｒｅペリプラズム調製法により２  ＯＤから３連でペリプラズムを単離した（４０００ｘｇで１５分）。すべてのサンプルは最終濃度０．０２  ＯＤ／μｌであり、同じ分析で同じキャリパーチップで分析した。
【０１１６】
以下の表３から見ることができるように、毒素−抗毒素遺伝子が欠失された株においてはＣＲＭ１９７の産生が著しく増加した（ＣＲＭ１９７で約３８％増加）。
【表３】
2020532322.tif 000006
【０１１７】
ＩＰＴＧ誘導を用いるＥＰＡおよびＰＤについては、各株からの３つのコロニーを使用して、別々のフラスコに、３７℃で２５ｍｌ  Ｋｏｒ／０．２％グルコース／Ｋａｎを接種した。２５ｍｌの接種材料を使用して、その後の１００ｍｌの培養物を５００ｍｌのバッフル付きＥフラスコ中にＯＤ６００＝０．２５になるように接種した。すべての培養物を２５℃で飽和、ＯＤ６００ｍ（修正）まで増殖させた：ＭＤＳ６９ｍｅｔａ  ｒｅｃＡでは２．９、ＭＤＳ６９ｍｅｔａ  Ｔ／Ａ  ＬｏｗＭｕｔ  ｒｅｃＡでは３．２。その後、２０  ｍｌのアリコートを取り出し、１２５ｍｌのバッフル付きＥフラスコに入れ、２５μＭ、５０μＭ、１００μＭまたは２００μＭ  ＩＰＴＧで、２５℃で一晩誘導した。２５℃での１６〜２０時間インキュベート後、遠心分離（７５００ｘｇで１０分）で２ＯＤの培養物を収集し、ＥｐｉＣｅｎｔｒｅペリプラズム調製法により２ＯＤ（４０００ｘｇで１５分）からペリプラズムの内容物を３連で分離した。すべてのサンプルは最終濃度０．０２  ＯＤ／μｌであり、同じ分析で同じキャリパーチップで分析した。
【０１１８】
以下の表４から見ることができるように、ＰＤの産生は、毒素−抗毒素遺伝子が欠失された株において有意に増加した（ＰＤの約２５％増加）。
【表４】
2020532322.tif 000007
【０１１９】
次に、デュアルｔｅｔＯオペレーター／ｔｅｔリプレッサーの制御下でｙｔｆＱシグナル配列に融合したＣＲＭ１９７をコードする発現プラスミドを保有する３株のＣＲＭ１９７のペリプラズム収率を評価した（オペレーターの２つのコピーであるがｔｅｔリプレッサーの１つのコピーのみ）：（ｉ）ＭＤＳ６９ｍｅｔａ  ＲｅｃＡ（別名Ｔ６９  Ｍｅｔａ  ｒｅｃＡ  別名ＳＧ６９  Ｍｅｔａ  ｒｅｃＡ）（ｉｉ）ＭＤＳ６９ｍｅｔａ  Ｔ／Ａ  ｒｅｃＡ（別名Ｔ６９  Ｍｅｔａ  Ｔｏｘ／Ａｔｏｘ  ｒｅｃＡ  別名ＳＧ６９  Ｍｅｔａ  Ｔｏｘ／Ａｔｏｘ  ｒｅｃＡ）および（ｉｉｉ）ＭＤＳ６９ｍｅｔａ  Ｔ／Ａ  ＬｏｗＭｕｔ  ｒｅｃＡ（別名Ｔ６９  Ｍｅｔａ  Ｔｏｘ／Ａｔｏｘ  ＬｏｗＭｕｔ  ｒｅｃＡ（別名ＳＧ６９  Ｍｅｔａ  Ｔｏｘ／Ａｔｏｘ  ＬｏｗＭｕｔ  ｒｅｃＡ）。
【０１２０】
各株の３つのコロニーを使用して、別々のフラスコに２５ｍｌ  Ｋｏｒ  ／０．２％グルコース／Ｋａｎ（２５μｇ／ｍｌ）を３７℃で接種した。２５ｍｌの接種材料を使用して、その後の１００ｍｌの培養物を５００ｍｌのバッフル付きＥフラスコ中にＯＤ６００＝０．２５になるように接種した。すべての培養物を２５℃で飽和状態まで増殖させた。次に、２０ｍｌのアリコートを取り出し、１２５ｍｌのバッフル付きＥフラスコに入れ、５０または１００ｎＭ  ＤＯＸを用いて２５℃で一晩誘導した。２５℃での１６〜２０時間のインキュベート後、遠心分離（７５００ｘｇで１０分）で２ＯＤの培養物を収集し、ＥｐｉＣｅｎｔｒｅペリプラズム調製法により２ＯＤ（４０００ｘｇで１５分）からペリプラズムタンパク質を３連で分離した。すべてのサンプルは最終濃度０．０２  ＯＤ／μｌであり、同じ分析で同じキャリパーチップで分析した。
【０１２１】
毒素／抗毒素遺伝子の欠失は、ペリプラズムにおけるＣＲＭ１９７の収率を有意に増強した（３．９ｇ／Ｌ〜５．１ｇ／Ｌ、以下の表５、図１８も参照）。
【表５】
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【０１２２】
これらの結果は、毒素−抗毒素遺伝子が欠失しているＥ．ｃｏｌｉ株の利点を実証している。これらの利点は、特定のＥ．ｃｏｌｉ株に限定されるものではないようである。
【０１２３】
実施例８
ＯｍｐＬＡ同時発現は、組換え抗体の完全な抽出を促進する。
次に、関連する組換えタンパク質の抽出を拡大して、一本鎖抗体（ｓｃＦａｂ  ＹＭＦ１０）および一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ  ７５１２７、Ｆｒｉｔｚ  Ｓｃｈａｕｍｂｕｒｇから恵与、Ｌｙｔｉｃ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を含めた。両方の標的は、関連性の高い組換え治療用タンパク質を表している。簡単に説明すると、ＩＰＴＧ制御下にあるＯｍｐＡペリプラズムシグナル配列に融合するいずれかの抗体をコードし、デュアルｔｅｔＯ  ＤＯＸ誘導性プロモーターの制御下にあるＯｍｐＬＡをコードする、発現プラスミドを保有するＭＤＳ６９ｍｅｔａ  ＲｅｃＡ（別名Ｔ６９  Ｍｅｔａ  ＲｅｃＡ、別名ＳＧ６９ｍｅｔａ  ＲｅｃＡ）が誘導され（誘導が非常に遅い）、１００μＭＩＰＴＧを用いて、４時間後に０、５０または１００  ｎＭ  ＤＯＸを用いてｐｌｄＡを誘導する。一晩の誘導後、１３３５ｍｌの培養液を濃縮ＴｒｉｓおよびＥＤＴＡ（最終濃度＝１．５ｍｌ、１５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．７５、５ｍＭ  ＥＤＴＡ）を含む２ｍｌチューブに入れ、振盪しながら２５℃で一晩インキュベートした。ペリプラズムについては、Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ  Ｐｅｒｉ−Ｐｒｅｐを培養の別のアリコートで実施し、最終濃度＝０．０２  ＯＤ／μｌであった。すべてのサンプルはキャリパーチップ上で分析した。
【０１２４】
ｓｃＦｖの高レベルの発現とその後のペリプラズム送達が観察された（ｓｃＦｖは、ペリプラズムに適切な折り畳みを提供するシャペロンタンパク質ｓｋｐと同時発現された）。抽出後の培養培地中には大量のｓｃＦｖ  ７５１２７が存在し（図１９Ａ）、そのレベルはペリプラズムで観察されたレベルよりもはるかに高かった。ｓｃＦｖ  ７５１２７のペリプラズム収率および抽出収率を例解する図２０Ａおよび２０Ｂもまた参照。これらの結果は、大量のキャリアタンパク質を産生する発現および抽出方法が、単鎖抗体についても同様に機能することを確認する。
【０１２５】
単鎖抗体ｓｃＦａｂ  ＹＭＦ１０の発現と抽出もまた調べた。ｓｃＦａｂ  ＹＭＦ１０は、従来のＥ．ｃｏｌｉ発現株の分解に対して非常に感受性が高く、ＭＤＳ６９ｍｅｔａ（別名ＳＧ６９ｍｅｔａ、別名Ｔ６９ｍｅｔａ）中でゆっくりとした分解を受けることが見出された。分解の問題を解消するために、ＳＧ６９ｍｅｔａと比較して追加のプロテアーゼが除去されたＳＧ６９発現株が利用された。ｓｃＦａｂ  ＹＭＦ１０（およびシャペロン、ｓｋｐ）の安定した発現は、このプロテアーゼが減少した株において達成された（図１９Ｂ）。ｓｃＦａｂ  ＹＭＦ１０のペリプラズム収率および抽出収率を例解する図２１Ａおよび２１Ｂも参照。ｓｃＦｖと同様に、抽出されたサンプル中では、Ｅｃｃｅｎｔｅｒペリプラズム分離サンプルよりも多量のｓｃＦａｂ  ＹＭＦ１０が明らかであった。少量のｓｃＦａｂが抽出前の培地に存在しており（図１９Ｂの緑色の三角形）、このことは、この不一致を説明することができる。これらの結果は、本明細書に記載されている新規抽出方法と縮小ゲノムＥ．ｃｏｌｉの両方の汎用性を強調する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
2020532322.tif 000013
【図５Ｂ】
2020532322.tif 000014
【図５Ｃ】
2020532322.tif 000015
【図６Ａ】
2020532322.tif 000016
【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３】
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【図１４】
2020532322.tif 000030
【図１５】
2020532322.tif 000031
【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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