(57)【要約】  本発明は、Ｔ細胞前駆体を産生させるためのｉｎ  ｖｉｒｏにおける方法であって、ＴＮＦ−α、および／または芳香族炭化水素／ダイオキシン受容体の拮抗剤、特にはＳｔｅｍＲｅｇｅｎｉｎ  １（ＳＲ１）を含む培地において、Ｎｏｔｃｈリガンドおよび任意選択でフィブロネクチンフラグメントの存在下で、ＣＤ３４＋細胞を培養するステップを含む、方法に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔ細胞前駆体を産生させるためのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法であって、ＴＮＦ−αを含む培地において、固定したＮｏｔｃｈリガンドの存在下でＣＤ３４＋細胞を培養するステップを含む、方法。
【請求項２】
Ｔ細胞前駆体を産生させるためのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法であって、芳香族炭化水素／ダイオキシン受容体の拮抗剤、特にＳｔｅｍＲｅｇｅｎｉｎ  １（ＳＲ１）を含む培地において、固定したＮｏｔｃｈリガンドの存在下でＣＤ３４＋細胞を培養するステップを含む、方法。
【請求項３】
前記培養培地が、ＴＮＦ−αおよび芳香族炭化水素／ダイオキシン受容体の拮抗剤の両方を含む、請求項１または２に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法。
【請求項４】
ＴＮＦ−αおよび／または芳香族炭化水素／ダイオキシン受容体の拮抗剤が、培養の０日目から、前記培養培地に存在する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法。
【請求項５】
ＣＤ３４＋細胞が、成体のドナーから単離されている、請求項１〜４のいずれか１項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法。
【請求項６】
前記細胞を、最大１０日間、ＴＮＦ−αおよび／またはＳＲ１の存在下で培養する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法。
【請求項７】
前記細胞を、３〜７日間、ＴＮＦ−αおよび／または芳香族炭化水素／ダイオキシン受容体の拮抗剤の存在下で培養する、請求項１〜６のいずれか１項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法。
【請求項８】
ＴＮＦ−αおよび／または芳香族炭化水素／ダイオキシン受容体の拮抗剤を、３ｎｇ／ｍｌ以上の濃度で、前記培養培地に添加する、請求項１〜７のいずれか１項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法。
【請求項９】
Ｎｏｔｃｈリガンドが、ＩｇＧタンパク質、好ましくはＩｇＧ２タンパク質のＦｃ領域に融合した、デルタ様４リガンドの可溶性ドメインである、請求項１〜８のいずれか１項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法。
【請求項１０】
前記細胞を同様にフィブロネクチンフラグメントに曝露し、前記フラグメントが、ＲＧＤＳパターンおよびＣＳ−１パターン、ならびにヘパリン結合ドメインを含み、好ましくは培養容器の内面に固定されている、請求項１〜９のいずれか１項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法。
【請求項１１】
前記フィブロネクチンフラグメントがＲｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（登録商標）である、請求項１０に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法。
【請求項１２】
前記培養培地が、ＮｏｔｃｈリガンドにＣＤ３４＋細胞を曝露する少なくともある時点で、ＣＤ３４＋細胞のトランスフェクションまたは形質導入を目的とするベクターをも含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法。
【請求項１３】
前記培養培地が、インターロイキン７（ＩＬ−７）、ＳＣＦ（幹細胞因子）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、およびＦｌｔ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）からなる群から選択されるサイトカインまたは増殖因子のうちの少なくとも３つ、好ましくは４つ全てを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法。
【請求項１４】
Ｔ細胞前駆体を入手するための方法であって、
ａ．請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法を行うステップと、
ｂ．前記産生させたＴ細胞前駆体を精製するステップと、
ｃ．任意選択で、患者への注射用のパウチにおいて、前記Ｔ細胞前駆体を条件付けするステップと
を含む、方法。
【請求項１５】
ＣＤ７＋Ｔ細胞前駆体の集団であって、
この集団においてＣＤ３４−およびＣＤ１ａ−である細胞の割合が５０％超である、
集団。
【請求項１６】
請求項１５に記載のＴ細胞前駆体の集団を含む、静脈内注射用のパウチ。
【請求項１７】
形質転換したＴ細胞前駆体を入手するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法であって、
ａ．ＴＮＦ−αを含む培地において、固定したＮｏｔｃｈリガンドの存在下でＣＤ３４＋細胞を培養するステップと、
ｂ．前記細胞を、ＣＤ３４＋細胞のトランスフェクションまたは形質導入を目的とするベクターに曝露するステップと
を含む、方法。
【請求項１８】
改変したＴ細胞前駆体を入手するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法であって、
ａ．ＴＮＦ−αを含む培地において、固定したＮｏｔｃｈリガンドの存在下でＣＤ３４＋細胞を培養するステップと、
ｂ．前記細胞を、遺伝子編集に適切なエレメントを含むベクターまたは核酸配列に曝露するステップと
を含む、方法。
【請求項１９】
（ｉ）Ｎｏｔｃｈのリガンド、および任意選択でフィブロネクチンフラグメントを含むコーティング培地と、
（ｉｉ）ＣＤ３４＋細胞およびＴ細胞を培養するように適合させた培地と、
（ｉｉｉ）ＴＮＦ−α、ならびに好ましくはＳＣＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ−７からなる群から選択される３つまたは４つのサイトカインを含む前駆体増殖培地と
を含む、請求項１〜１４、１７、または１８のいずれか１項に記載の方法を行うためのキット。
【請求項２０】
（ｉ）Ｎｏｔｃｈのリガンド、および任意選択でフィブロネクチンフラグメントを含むコーティング培地と、
（ｉｉ）ＣＤ３４＋細胞およびＴ細胞を培養するように適合させた培地と、
（ｉｉｉ）芳香族炭化水素／ダイオキシン受容体の拮抗剤、ならびに好ましくはＳＣＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ−７からなる群から選択される３つまたは４つのサイトカインを含む前駆体増殖培地と
を含む、請求項１〜１４、１７、または１８のいずれか１項に記載の方法を行うためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞療法の分野、特には形質転換しているかまたはしていない造血性幹細胞グラフト、より具体的には当該グラフト移植後の免疫の再構成の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
前駆体および造血性幹細胞前駆体（ＨＳＰＣ）のグラフトは、最も重篤な遺伝性免疫不全、多くの悪性血液疾患、および多くの固形腫瘍にとって最良の治療選択肢とみなされている。
【０００３】
現在、ＨＬＡが部分的に不適合である同種移植の状況下では、あらかじめ条件付けされたレシピエントへ選別されたＣＤ３４＋ＨＳＰＣの漸増用量を注射することによって、移植片対宿主病（ＧＶＨ）を効果的に予防しながらのドナー移植が可能である。しかしながら、注射されたＣＤ３４＋細胞からの新規のＴリンパ球の分化は最低４ケ月の期間を必要とし、これらＴリンパ球は、その出現から数カ月間のみ、感染症に対する保護的な役割を果たすのに十分な数にある。
【０００４】
この免疫の再構成の遅さは、多くの感染性合併症、特にウイルス性の合併症をもたらすだけでなく、再発をももたらし、移植された患者の長期間の予後に影響を与えている。
【０００５】
さらに、他の治療プロトコルは、特定の遺伝性免疫不全の治療に有効であることが示されている、遺伝子療法の手法、すなわち形質導入したＨＳＰＣの自家グラフトを使用する。ＨＳＰＣ  ＣＤ３４＋の同種間の移植を超えるこの戦略の利点は、ＨＬＡ適合性のドナーが利用可能ではない場合の生存および罹患率の観点から、明白である。しかしながら、臨床治験は、重篤な感染症を有する一部の患者では、Ｔリンパ球のコンパートメントの再構成は遅く、循環性のＴリンパ球の正常なレベルに全く達していないことを示している。この特定の状況に関連する罹患率および死亡率は、重要である。
【０００６】
この種の移植に関連する高い罹患率および死亡率のため、移植後の免疫不全の期間を低減するための新規療法の開発が、完全に正当化される。
【０００７】
特に、Ｔリンパ球分化経路にすでに携わっている前駆体（Ｔ細胞前駆体）の投与によりＴリンパ球の産生を加速させることが重要である。
【０００８】
これらＴ細胞前駆体は、ＣＤ３４＋ＨＰＳＣの分化から得られ、特に、Ｔ細胞経路の分化のマーカーである、ＣＤ７＋マーカーを有する。またこの前駆体は、他のマーカーを有し得る。Ａｗｏｎｇら（Ｂｌｏｏｄ  ２００９；  １１４：  ９７２−９８２）は、以下のＴリンパ球の前駆体：ＥＴＰ（早期胸腺の前駆体：ｅａｒｌｙ  ｔｈｙｍｉｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）（複数のマーカー（ＣＤ３４＋／ＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＤ７＋）を有する））、ｐｒｏＴ１期の前駆細胞（ＣＤ７＋＋／ＣＤ５−）、ｐｒｏＴ２期の前駆細胞（ＣＤ７＋＋／ＣＤ５＋）、およびｐｒｅＴ期の細胞（ＣＤ７＋＋／ＣＤ５＋ＣＤ１ａ＋）を記載した。ＨＳＰＣは、Ｔ細胞発達経路にわたり、１つの期から他の期へと推移する際に、連続してこれらマーカーを獲得する。さらに、ヒトでは、ＣＤ１ａ抗原が、著しく未成熟な胸腺の前駆体から、Ｔ経路に明らかに携わっている前駆体までの推移を区別することが知られている（Ｃａｖａｚｚａｎａ−Ｃａｌｖｏ  ｅｔ  ａｌ，  ＭＥＤＥＣＩＮＥ／ＳＣＩＥＮＣＥＳ  ２００６；  ２２：  １５１−９）。
【０００９】
ＨＳＰＣの移植と併用したＴ細胞前駆体の移植は、成熟した機能的なＴリンパ球のコンパートメントの迅速な産生を可能にし、よって、免疫系の完全な再構成の前に一部の免疫から患者が利益を受けることを可能にすることにより、重篤な感染症のリスクの予防を支援する。
【００１０】
さらに、臍帯血細胞よりも成体の細胞を入手することが容易および安価であり、成体の細胞は同種移植においてより一般的に使用されているため、臍帯血細胞よりも成体の細胞を使用できることが重要である。
【００１１】
しかしながら、ヒトおよびマウスで得られた、文献で公開されているデータは、胎仔の造血性細胞（臍帯血を含む）と成体の細胞との間の本質的な違いを示している。これら差異は、生存、ＤＮＡ損傷を修復する能力、増殖の能力および分化能に関連している（たとえばＹｕａｎら（２０１２  Ｍａｒ  ９；  ３３５  （６０７３）：１１９５−２００）、これは成体の骨髄細胞は、様々な細胞種を産生する可能性において、胎仔の細胞よりも効果がないことを表す）：Ｌａｎｓｄｏｒｐら（Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９９３  Ｓｅｐ  １；  １７８  （３）：  ７８７−９１）；Ｓｚｉｌｖａｓｓｙら（Ｂｌｏｏｄ，  ２００１  Ｏｃｔ．  １，  ９８  （７）：  ２１０８−１５）、Ｆｒａｓｓｏｎｉら（Ｂｌｏｏｄ，  ２００３  Ａｕｇ．  １，  １０２  （３）：  １１３８−４１）、Ｌｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  １０６  （４）：  １４７９−８７）、Ｓｉｘら（Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２００７  Ｄｅｃ  ２４，  ２０４  （１３）：  ３０８５−９３）を参照）。
【００１２】
国際特許公開公報第２０１６／０５５３９６号は、固定したＮｏｔｃｈのリガンド（特に、ＩｇＧタンパク質のＦｃ領域に融合した、Ｄｅｌｔａ様リガンド（ｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ−ｌｉｇａｎｄ）の可溶性ドメイン）の存在下、ならびにＲＧＤＳ（配列番号３、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸−セリン）およびＣＳ−１ドメインと、ヘパリン結合ドメインとを含むフィブロネクチンのフラグメントの存在下（特にＲｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（登録商標）の存在下）で、ＣＤ３４＋細胞を培養することによりＴ細胞前駆体を産生させることが可能であることを記載している。使用されるＮｏｔｃｈリガンドは、ＤＬ４／Ｆｃと表され得る。
【００１３】
この文書が、固定したＮｏｔｃｈのリガンドとフィブロネクチンとの両方の存在がＴリンパ球前駆体（ＣＤ７＋細胞）の産生（ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）を増大させることを可能にすることを開示しており、これはすでに当該分野で改善されているが、国際特許公開公報第２０１６／０５５３９６号の図３に示されるように、ＣＤ７＋ＣＤ３４−細胞のパーセンテージは極めて低いままであることに、留意されたい。しかしながらより多量の前駆体を、それを必要とする患者に投与することを可能にするために、このパーセンテージを上げることに興味が集まっており、このパーセンテージを上げることが特に重要である。他方でまた、この細胞が、適切な免疫を提供できるよう早期の分化の段階のままであることも重要である。
【００１４】
Ｎｏｔｃｈタンパク質は、多数の環境シグナルに対する細胞応答を制御する膜貫通型受容体であることを想起されたい。哺乳類では、４種のＮｏｔｃｈ受容体（Ｎｏｔｃｈ１−４）および５種のリガンド（Ｄｅｌｔａ様−１、３、および４、Ｊａｇｇｅｄ１、Ｊａｇｇｅｄ２）が、述べられている（Ｗｅｉｎｍａｓｔｅｒ  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｇｅｎｅｔ  Ｄｅｖ  ２０００：  １０：  ３６３−３６９）。
【００１５】
Ｄｅｌｔａ様リガンド４は、
（ｉｉ）Ｄｅｌｔａ様リガンド４（ＤＬＬ４遺伝子の名称に対応）
（ｉｉｉ）Ｄｅｌｔａ様４またはＤｅｌｔａリガンド４（略語ＤＬ−４）
として表記することができる。
【００１６】
本願では、ＮｏｔｃｈのＤｅｌｔａ様１およびはＤｅｌｔａ様４のリガンドは、それぞれ、ＤＬ１およびＤＬ４、またはＤＬ−１およびＤＬ−４により表記され得る。リガンドＤＬ−１およびＤＬ−４の配列は、それぞれ配列番号１および配列番号２として明記されている。
【００１７】
Ｏｈｉｓｈｉら（ＢＬＯＯＤ，ｖｏｌ．  ９８，  ｎｏ．  ５，  ２００１，  ｐｐ  １４０２−１４０７）は、単球のマクロファージおよび樹状細胞への分化に関するＮｏｔｃｈシグナリングの作用に関するものである。この文書で開示された実験で使用した単球細胞は、ネガティブセレクションにより精製した末梢血の単球、またはＣＤ３４＋幹細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分化後に入手した単球のいずれかであった。よって、この文書で使用された細胞は、単球／マクロファージ／樹状細胞の分化経路に入り、ＣＤ３４マーカー（造血性幹細胞のマーカーである）を失い、ＣＤ１４マーカーを提示した。これら細胞は、Ｄｅｌｔａ−１の細胞外ドメインおよびＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α（ＣＤ３４＋細胞由来のＣＤ１ａ−ＣＤ１４＋細胞の樹状細胞への分化を誘導するために使用される）の存在下で、培養される。この文書は、ＮｏｔｃｈリガンドおよびＴＮＦ−αの存在下でＣＤ３４＋細胞を使用しておらず、Ｔ細胞前駆体（ＣＤ７＋Ｔリンパ球前駆体）の産生に関連していない。
【００１８】
ＳＨＵＫＬＡら（ＮＡＴＵＲＥ  ＭＥＴＨＯＤＳ，  ｖｏｌ．  １４，  ｎｏ．  ５，  ２０１７，  ５３１−５３８）および国際特許公開公報第２０１７／１７３５５１号は、幹細胞および／または前駆細胞から前駆Ｔ細胞を産生させるための方法であって、上記幹細胞および／または前駆細胞を、ＮｏｔｃｈリガンドのＤｅｌｔａ様４（ＤＬ４）およびＶＣＡＭ−１（ｖａｓｃｕｌａｒ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  １）に曝露するステップを含む、方法を開示する。
【００１９】
本願に記載される方法は、細胞の間質を使用せずに、ＣＤ３４＋幹細胞由来の、ＣＤ７＋Ｔリンパ球前駆体の産生および数の増加を可能にする（これは臨床的な状況で容易に想定することができない）。さらに本方法は、成体のドナーからもたらされるＣＤ３４＋細胞を用いて行う場合に特に適合している。
【００２０】
さらに、本明細書開示されるプロセスを介して得られる細胞は、Ｂｃｌ１１ｂマーカーを有しており、これは、Ｔ細胞の関与から固有に活性となる（ｓｗｉｔｃｈｅｄ  ｏｎ）重要な転写因子である（Ｋｕｅｈ  ｅｔ  ａｌ，  ２０１６，  Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２０１６  Ａｕｇ；１７（８）：９５６−６５．  ｄｏｉ：  １０．１０３８／ｎｉ．３５１４）。
【００２１】
また本発明者らは、本明細書中開示されるプロセスを介して得られる前駆体においてＴ細胞受容体の座位（ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、またはＴＣＲδのいずれか）の再編成（ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）がないことをも示した。
【００２２】
さらに、国際特許公開公報第２０１６／０５５３９６号に開示されるプロセスと比較して、本明細書中得られた前駆体に関して、アポトーシスマーカーの減少が示された。
【００２３】
まとめると、本明細書中開示されるプロセスは、幹細胞移植を受ける成体に効率的に使用するために十分多い数のＴ細胞前駆体を入手することを可能にする。
【００２４】
また本方法は、目的の遺伝子を含むベクターを本明細書中開示されるプロセス中のある時点で使用する場合に、遺伝子療法のため形質転換された（形質導入された）Ｔ細胞前駆体を入手するために使用することが可能であり得る。
【００２５】
本明細書中開示されるプロセスにより入手される細胞は、成体のＣＤ３４＋細胞で入手することができ、さらには臍帯血細胞がこのようなグラフトで使用される場合であっても、同種グラフトまたは自家グラフトで使用することができる。
【００２６】
本方法は、成体のＣＤ３４＋細胞で非常に効率的ではあるが、臍帯血のＣＤ３４＋細胞と共に用いることも可能であることに留意されたい。
【００２７】
よって、特定の実施形態では、本明細書中開示される方法は、Ｎｏｔｃｈリガンド、Ｄｅｌｔａ−４、Ｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（登録商標）、およびサイトカインの組み合わせに由来する固定した融合タンパク質を組み合わせたｉｎ  ｖｉｔｒｏの培養システムにおいて、ＨＳＰＣから産生させたＴ細胞前駆体の注入後に、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＴ細胞の産生を速める。
【００２８】
このシステムは、７日以内に、ヒトの胸腺のＴ細胞前駆体に表現型および分子に関して類似しているＴ細胞前駆体の産生を可能にする。さらに、これらＴ細胞前駆体は、ＨＳＰＣと比較して速い動態で、ヒトの成熟した多様なＴ細胞をマウスに生じさせることができる。
【００２９】
本明細書中記録された結果は、臍帯血（ＣＢ）および成体（成体のドナー由来の、固定した末梢血、ｍＰＢ）のＨＳＰＣの両方から得た。
【００３０】
本発明者らは、ＣＤ３４＋細胞からのＴ細胞前駆体の量を、可溶性のＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子α、Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０１３７５、ＲｅｆＳｅｑ  ＮＰ＿０００５８５、配列番号８）の存在下で、Ｎｏｔｃｈリガンドに上記ＣＤ３４＋細胞を曝露することにより、改善できることを示した。上記曝露は、前駆Ｔ細胞を産生させるために適した条件下で行われる。任意選択で、これら細胞はまた、ＲＤＧＳモチーフおよび／またはＣＳ−１モチーフ、ならびに任意選択でヘパリン結合ドメインを含むフィブロネクチンフラグメントに曝露される。好ましくは、上記フィブロネクチンフラグメントは、ＲＤＧＳモチーフ、ＣＳ−１モチーフ、およびヘパリン結合ドメインを含む。
【００３１】
ＴＮＦは、本来、安定したホモ三量体で構成された２２３アミノ酸長の膜貫通型タンパク質ＩＩ型として産生される。分泌された形態のヒトのＴＮＦ−αは、三角形のピラミッドの形状を取り、約１７ｋＤａの重さである。
【００３２】
国際特許公開公報第２０１６／０５５３９６号に開示されるように、フィブロネクチンフラグメントの代わりにＲＧＤＳペプチドおよび／またはＣＳ−１ペプチドを使用して本明細書中開示される方法を行うことが可能である。特に同じタンパク質に融合した、ＲＧＤＳペプチドおよびＣＳ−１ペプチドの併用が好ましい。よって、ＲＧＤＳペプチドおよび／またはＣＳ−１ペプチドは、それ自体が培養培地に存在してもよく、または培養培地中に存在するポリペプチドもしくはタンパク質の中に存在していてもよい。よって、培養培地が、ＲＧＤＳペプチドおよび／またはＣＳ−１ペプチド自体のみを含む場合、このようなペプチドが培養容器の内面に固定されていない場合、培養培地に「遊離した」ペプチドとしての当該ペプチドに関し得る。実際に、これらペプチドは、溶液中にあってもよく、またはＣＤ３４＋細胞が固定したＮｏｔｃｈリガンドに曝露される容器の内面に固定されていてもよい。
【００３３】
しかしながら、上述されるように、ＲＧＤＳパターンおよびＣＳ−１パターン、ならびにヘパリン結合ドメインを含むフィブロネクチンのフラグメントを使用することが好ましい。フィブロネクチンフラグメントは、溶液中に遊離していてもよく、または培養コンテナの内面に固定されていてもよい。
【００３４】
本プロセスは、細胞培養プレート（ペトリ皿、２４ウェルアレイなど）などのコンテナ、好ましくはその内面に固定したＮｏｔｃｈリガンドを伴うコンテナにおいて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて行われる。しかしながら、Ｎｏｔｃｈリガンドは、ビーズ（特にマイクロビーズ）の表面などの、培養培地に存在する他のいずれかの担体に固定され得る。Ｎｏｔｃｈリガンドの固定は、基本的に、ＣＤ３４＋細胞のＮｏｔｃｈ受容体の活性化を可能にするために、リガンドを安定化するように意図されている。
【００３５】
「Ｔ細胞前駆体」は、ＣＤ３４＋ＨＳＰＣ由来の、Ｔリンパ系経路への分化経路に関与するいずれかの細胞を表すことを意図している。よってこの細胞は、Ｔ細胞のリンパ球新生の間の最も早期のマーカーのうちの１つであることが知られている、ＣＤ７マーカーを発現することを特徴とする。Ｔリンパ系経路における分化の状態に応じて、Ｔ細胞前駆体は、ＣＤ３４マーカーを発現できる場合またはできない場合がある（分化の間のＣＤ３４の喪失）。このようなＴ細胞前駆体はまた、ＣＤ５マーカーを発現する場合または発現しない場合がある。
【００３６】
「Ｔ細胞前駆体」の中に、出生後の胸腺で見出され得る細胞、すなわちＥＴＰ（ＣＤ３４＋／ＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＤ７＋）、ｐｒｏＴ１細胞（ＣＤ３４＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ７＋＋ＣＤ５−ＣＤ１ａ−）、ｐｒｏＴ２細胞（ＣＤ３４＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ７＋＋ＣＤ５＋ＣＤ１ａ−）、およびｐｒｅＴ細胞（ＣＤ３４−ＣＤ７＋＋／ＣＤ５＋ＣＤ１ａ＋）がある。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の座は、高度に秩序ある方法で再編成する（ＴＣＲδ−ＴＣＲγ−ＴＣＲβ−ＴＣＲα）。特に、第１の機能的なＴＣＲ再編成は、ＣＤ３４−ＣＤ７＋＋／ＣＤ５＋ＣＤ１ａ＋のｐｒｅＴの細胞期で起こる（Ｄｉｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２００５；２０１：１７１５−１７２３）。Ｔ細胞前駆体は、最先端でよく知られている。これらは、特にＲｅｉｍａｎｎら（ＳＴＥＭ  ＣＥＬＬＳ  ２０１２；３０：１７７１−１７８０．）およびＡｗｏｎｇら（２００９，  ｏｐ．ｃｉｔ．）により引用されている。
【００３７】
用語「ＲＧＤＳペプチド」は、インテグリンＶＬＡ−５に結合できるように、ＲＧＤＳパターンを含むいずれかのペプチドまたはタンパク質を表すことが意図されている。このようなペプチドまたはタンパク質は、当該分野で知られており報告されている方法により、ＶＬＡ−５インテグリンに結合するその特性について試験することができる。ＲＧＤＳペプチドは、ＣＤ４９ｅ（α５）およびＣＤ２９（β１）から構成されるダイマーであるＶＬＡ−５（Ｖｅｒｙ  Ｌａｔｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ−５）に結合する。
【００３８】
ヘアピン結合ドメインは、当該分野で知られており、ヘアピンに結合する多くのタンパク質に存在する。これら配列は、一般に、ＸＢＢＸＢＸまたはＸＢＢＢＸＸＢＸである（Ｂ＝塩基性アミノ酸（ａｃｉｄｅ  ａｍｉｎｅ  ｂａｓｉｑｕｅ）；Ｘ＝ヒドロキシ基を有するアミノ酸（ａｃｉｄｅ  ａｍｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｑｕｅ）；Ｃａｒｄｉｎ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，  Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ．  １９８９；９：２１−３２、配列番号４および配列番号５）。
【００３９】
このようなヘアピン結合ドメインの存在は、ＣＤ３４＋細胞をウイルスベクター（特にレトロウイルスベクター）に曝露させて、それらを形質導入し、トランスジーンを発現するＴ細胞前駆体を入手する場合に特に好ましい。
【００４０】
ＣＳ−１ペプチドまたはＣＳ−１パターンは、Ｗａｙｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  １９８９，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １０９：  １３２１）により記載された２５アミノ酸のペプチド（ＤＥＬＰＱＬＶＴＬＰＨＰＮＬＨＧＰＥＩＬＤＶＰＳＴ、配列番号６）である。このＣＳ−１パターンは、ＶＬＡ−４（Ｖｅｒｙ  Ｌａｔｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ−４）受容体に結合する。この抗原は、ＣＤ４９ｄ（α４）およびＣＤ２９（β１）から構成される二量体のインテグリンである。
【００４１】
特定の実施形態では、フィブロネクチンフラグメントは、培養培地に存在するか、またはコンテナの内壁（特に底部）に固定されている。フィブロネクチンは、その天然の形態が１００ｎｍ長および４６０ｋＤａのＶ字型の大きな二量体である、タンパク質である。この２つのモノマーは、Ｃ末端で２つのジスルフィド架橋により結合している。用語「フィブロネクチン」または「フィブロネクチンフラグメント」は、天然のフィブロネクチンタンパク質（すなわち代替的なスプライシングにより産生されたいずれかのアイソフォーム）を意味することが理解されているが、同様に、このタンパク質のモノマー、またはこのタンパク質のフラグメント（しかし、ペプチドＲＧＤＳ、およびＣＳ−１ペプチド、およびヘアピン結合部位を含む）を意味することも理解されている。
【００４２】
本明細書中開示されるプロセスを行うことに特に適したフィブロネクチンは、Ｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（登録商標）である。このタンパク質は、ヒトのフィブロネクチンのフラグメントに対応しており（ＣＨ−２９６フラグメント、Ｋｉｍｉｚｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １９９１  Ａｕｇ．  １１０  （２）：２８４−９１，  Ｃｈｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２００１  Ｓｅｐ  １３０  （３）：３３１−４）、本方法の実施に好ましい３つの機能性ドメイン（ＲＧＤＳペプチドを含む細胞結合Ｃドメイン、ヘアピン結合ドメイン、およびＣＳ−１配列）を含む。このタンパク質は、特にＴａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．（Ｓｈｉｇａ，  Ｊａｐａｎ）により販売されている。
【００４３】
特定の実施形態では、フィブロネクチンフラグメントは、固定されている（すなわち、固体の担体に結合しており、（特定の成分が溶液中に見出され得る可能性はあるが）溶液中に遊離して存在してない）。この固体の担体は、好ましくは、本工程を行うコンテナの底壁である。しかしながら、同様に、ポリマーまたは磁気ビーズなどのビーズ（一般に１〜５μｍで構成された直径を有する）にフィブロネクチンフラグメントを結合させることを想定することも可能である。これらビーズに対するタンパク質またはペプチドの結合は、共有結合であってもよく、または共有結合でなくてもよい。タンパク質またはペプチドをビーズに付着させるための方法は、当該分野で知られている。また、フィブロネクチンフラグメントを、半固体の培地、たとえば寒天またはゲルに導入することも可能である。
【００４４】
フィブロネクチンフラグメントを担体（特に本工程を行うコンテナの底壁）に固定する場合、この固定もまた、共有結合であってもよく、または共有結合でなくてもよい。好ましい実施形態では、この固定は、フィブロネクチンフラグメントを、コンテナの底壁を構成するガラスまたはプラスチックに吸着させることにより、非共有結合的に行われる。
【００４５】
特定の実施形態では、上記でわかるように、ＣＤ３４＋細胞のＴ細胞前駆体への分化は、これら細胞に目的の遺伝子（または遺伝子編集のための系）を導入するため、ベクター（たとえば、ウイルスベクターまたは核酸フラグメント、たとえばプラスミドまたはプラスミドのＲＮＡ配列もしくはＤＮＡ配列など）によるＣＤ３４＋細胞の形質導入またはトランスフェクション（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ（商標）という、Ｌｏｎｚａにより開発された特定のエレクトロポレーションシステムを含む）と共に行われる。このことは、ＴＮＦ−αと共にＮｏｔｃｈリガンドおよびフィブロネクチンフラグメントに曝露される細胞が、ＴＮＦ−αと共にＮｏｔｃｈリガンドおよびフィブロネクチンフラグメントに曝露される時間の少なくとも一部の間、ウイルスの上清にも曝露されることを、意味している。
【００４６】
細胞の形質導入を行うための操作上の条件に関する国際特許公開公報第２０１６／０５５３９６号の教示は、本方法に明らかに適用可能であり、よって、本願に明らかに列挙されているとみなされる。
【００４７】
例の１つとして、特に、以下が挙げられる：
（ｉｖ）当該分野で知られており国際特許公開公報第２０１６／０５５３９６号に開示されている適切なサイトカインを伴う、ある時間（好ましくは４時間超、より好ましくは６時間超、または８時間もしくは１０時間超、かつ、３６時間未満、より好ましくは３０時間未満、または２４時間未満）の間の、Ｎｏｔｃｈリガンド、フィブロネクチンフラグメント、およびＴＮＦ−αへの細胞の曝露、ならびに、適切な期間（好ましくは４時間超、より好ましくは６時間超、８時間超、または１０時間超、かつ好ましくは３０時間未満、より好ましくは２４時間未満、より好ましくはおよそ１６時間）の間の、ウイルスの上清の添加。
（ｖ）国際特許公開公報第２０１６／０５５３９６号に教示されるように、必要に応じた第２の形質導入
（ｖｉ）トランスジーンが患者に存在していないかまたは欠損しているタンパク質を追加して治療上の利点をもたらすための、遺伝子療法のプロトコルにおける自家造血性幹細胞グラフトに関するこのプロトコルの使用。
（ｖｉｉ）利用可能なトランスジーン：免疫不全（特に重症複合型免疫不全ＳＣＩＤ、または左記ではないＣＩＤ）、ＨＩＶ、Ｘ連鎖副腎白質ジストロフィー、異常ヘモグロビン症、特にβサラセミア（ｔｈａｌａｓｓｅｍｙ）または鎌状赤血球症を訂正する遺伝子。また、トランスジーンとして、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、すなわち、操作したＣＡＲ−Ｔ細胞を介して癌細胞に対する免疫応答を誘発するために癌細胞が特異的に発現する細胞表面タンパク質を認識する細胞表面タンパク質をコードする遺伝子を、使用することができる。
（ｖｉｉｉ）特に当該分野で知られており記載されているレンチウイルスを使用した、細胞のゲノムの中へのトランスジーンの挿入を可能にするためのウイルスの上清の好ましい使用。
（ｉｘ）４時間〜３６時間の間、好ましくは６時間〜２４時間の間の、ＣＤ３４＋細胞のプレ活性化の後の細胞培養培地におけるウイルスベクターの導入。
（ｘ）４時間〜３０時間の間、好ましくは１２時間〜２４時間、より好ましくはおよそ１６時間の、ウイルスベクターへの細胞の曝露、ならびにウイルスベクターの除去（細胞の回収および洗浄、ならびにＮｏｔｃｈリガンド、フィブロネクチンフラグメント、およびＴＮＦ−αの存在下でのこれら細胞の再懸濁）。
【００４８】
上述のように、別の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、遺伝子編集を行うことを可能にするシステムに曝露される。ここで、このようなシステムは、当該分野において幅広く知られておりかつ記載されており、基本的に核酸の二本鎖切断修復（ｄｏｕｂｌｅ−ｂｒｅａｋ  ｒｅｐａｉｒ）に基づいている。このようなゲノム編集システムは、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥＮ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ−Ｌｉｋｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅ）、およびＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓヌクレアーゼからなる群から選択されるヌクレアーゼを使用し得る。ＣＤ３４＋細胞が、上述の要素、よってＴＮＦ−αの存在下で曝露される間に増殖するとの事実は、細胞の増殖を必要とするこれら遺伝子編集システムを使用することを可能にする。
【００４９】
特定の実施形態では、Ｎｏｔｃｈリガンドは、Ｄｅｌｔａ様１タンパク質（配列番号１）またはそのフラグメント（可溶性ドメイン）である。
【００５０】
別の好ましい実施形態では、Ｎｏｔｃｈリガンドは、Ｄｅｌｔａ様４タンパク質（配列番号２）である。
【００５１】
特定の実施形態では、上記Ｎｏｔｃｈリガンドは、ＩｇＧタンパク質のＦｃ領域に融合した天然のＮｏｔｃｈリガンドの可溶性ドメインを含む融合タンパク質である。当該分野で知られているように、Ｎｏｔｃｈリガンドの可溶性ドメインは、上記リガンドの細胞外部分を表す。Ｖａｒｎｕｍ−Ｆｉｎｎｅｙら（Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．，  ２０００  Ｄｅｃ；  １１３  Ｐｔ  ２３：４３１３−８）は、ＩｇＧ１のＦｃ部分を有するＤＬ−１の可溶性部分の融合タンパク質を記載していた。Ｒｅｉｍａｎｎら（同出典（ｏｐ  ｃｉｔ））は、ＩｇＧ２ｂ免疫グロブリンのＦｃフラグメントを有する、ＤＬ−４の可溶性部分（アミノ酸１〜５２６）の融合タンパク質を記載していた。よって、ＩｇＧタンパク質がＩｇＧ２である場合が好ましい。好ましい実施形態では、本明細書中開示される方法に使用されるＮｏｔｃｈリガンドの配列は、配列番号７である。Ｃ末端でヒトのＩｇＧ１のＦｃ領域に融合したヒトのＤＬＬ４（完全長のＤＬＬ４、寄託番号ＮＰ＿０６１９４７．１）の細胞外ドメイン（Ｍｅｔ１−Ｐｒｏ５２４）を含む市販の製品（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）は、ＤＬ４タンパク質であり、これもまた、本明細書の使用に適している。
【００５２】
本明細書中開示される方法の文脈で使用される培養培地は、ＣＤ３４＋細胞およびＴ細胞を培養することに適したいずれかの培地である。特に、α−ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ  １６４０培地、ＩＭＤＭ培地、ＢＭＥ培地、マッコイ５Ａ培地、ＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）培地、特にＳＦＩＩ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）培地またはＦｉｓｃｈｅｒの培地に言及がなされ得る。ＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）ＳＦＩＩ培地は、特にＩｓｃｏｖのＭＤＭ、ウシ血清アルブミン、組み換え型ヒトインスリン、ヒトのトランスフェリン（鉄飽和型）、２−メルカプトエタノールを含む。
【００５３】
本明細書中開示されるプロセスを行うことに適した好ましい培養培地は、Ｘ−ＶＩＶＯ（商標）培地（Ｌｏｎｚａ，  Ｂａｓｅｌ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）である。この培地は、特にＪｏｎｕｌｅｉｔら（Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  １９９７，  ２７，  １２，  ３１３５−４２）およびＬｕｆｔら（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  １９９８，  １６１，  ４，  １９４７−５３）により使用された。
【００５４】
好ましくは、基礎培地（すなわち、補充物質を添加することを必要とせず細胞の増殖を可能にする培地）が使用される。しかしながらここでは、好ましくは、血清、および／または増殖因子、およびサイトカインが添加されるであろう。
【００５５】
よって、好ましくは、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）またはウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、自家ヒト血清またはヒトのＡＢ血清が、基礎培養培地に添加される。好ましくは、この培地に、少なくとも１５％、より好ましくは少なくとも２０％の胎児血清が補充される。ＦＢＳは、本プロセスの実施に特に適している。特に、規定された（ｄｅｆｉｎｅｄ）ＦＢＳを使用することが好ましい。規定されたＦＢＳは、ウイルスの粒子の存在を回避するように解析およびろ過されている高品質の血清である。この規定されたＦＢＳは、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）のＨｙＣｌｏｎ（商標）のＤｅｆｉｎｅｄ  ＦＢＳ(定義されたウシ胎仔血清）などとして、多くの供給者により販売されている。
【００５６】
ＴＮＦ−αに加え、培養培地はまた、好ましくはサイトカインおよび増殖因子で補完される。これらサイトカインおよび増殖因子は、特に、ＳＣＦ（幹細胞因子）、トロンボポエチン（ＴＰＯ、また、ＭＧＤＦ（ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｆａｃｔｏｒ）とも呼ばれる）、Ｆｌｔ３リガンド（造血性の増殖因子である）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、インターロイキン７（ＩＬ−７）およびＳＣＦ（幹細胞因子）からなる群から選択される。特定の実施形態では、培養培地は、ＴＮＦ−αに加え、これらサイトカインまたは増殖因子のうち少なくとも３つ、好ましくは４つを含む。
【００５７】
好ましい実施形態では、特にウイルスベクターで形質導入されないＴ細胞前駆体の産生のために、少なくともまたは正確に３つのサイトカインが、添加される。好ましくは、これら３つのサイトカインは、インターロイキン７（ＩＬ−７）、ＳＣＦ（幹細胞因子）、およびＦｌｔ３リガンド（造血性増殖因子）である。
【００５８】
別の好ましい実施形態では、４つのサイトカイン、すなわち上述の３つのサイトカインとＴＰＯ（トロンボポエチン）とが添加される。
【００５９】
別の特定の実施形態では、特にウイルスベクターで形質導入されるＴ細胞前駆体の産生のために、サイトカインおよび増殖因子の性質が、本方法の実施の間に変動し得る。
【００６０】
よって、ＩＬ−３、ＩＬ−７、ＳＣＦ、ＴＰＯ、およびＦｌｔ３−Ｌは、ウイルスベクターの添加前に細胞をあらかじめ活性化（プレアクチベーション）するステップ、およびその後の、ベクターが除去された後にＩＬ−７、ＳＣＦ、ＴＰＯ、およびＦｌｔ３−Ｌのみで培地を補充するステップの際に、培地に使用され得る。
【００６１】
上述のサイトカインおよび増殖因子の混合物は、ＣＤ３４＋細胞のＴ細胞前駆体への分化を誘導するのに十分であり、一般に、培養培地は、実施例に記載されているようにＴ細胞前駆体の数を増やすことを可能にするＴＮＦ−αを除き、他のサイトカインまたは増殖因子を含まない。
【００６２】
本明細書中予測されるプロセスにおいて、Ｎｏｔｃｈリガンドの存在下、ＲＧＤＳモチーフを提示するタンパク質またはペプチド、およびＴＮＦαの存在下での、ＣＤ３４＋細胞の曝露の時間の合計は、一般に、好ましくは、３日超かつ１０日未満の時間の間行われる。
【００６３】
この曝露は、細胞が形質導入されるかどうかに応じて変動し得る。よって、３日間の曝露時間は、形質導入されなかった成体の幹細胞にとっては十分であり得るが、対して乳児性の幹細胞では、または形質導入が行われる場合では、一般に曝露時間はより長くなるであろう。
【００６４】
ＣＤ３４＋細胞は、骨髄穿刺（ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｐｕｎｃｔｕｒｅ）から、臍帯血から、または成体のドナー由来の末梢血から入手され、特にＧ−ＣＳＦまたは当該分野で知られている他の動員剤（ｍｏｂｉｌｉｚｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）で動員される。ＣＤ３４＋細胞を選別するための方法は、当該分野で知られている。特に、その表面でＣＤ３４を認識する抗体を有する磁気ビーズが、この目的のために使用され得る。
【００６５】
好ましくは、細胞培養容器は、ＣＤ３４＋細胞を曝露する前に、内面（好ましくは底面）にＮｏｔｃｈリガンドおよびフィブロネクチンフラグメントを固定することにより、調製される。Ｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（登録商標）または他のフィブロネクチンは、細胞培養ボックス（ペトリ皿または２４ウェルのボックス、またはその他）のプラスチックに自然に接着する。同様に、Ｎｏｔｃｈリガンドが、免疫グロブリンのＦｃフラグメントとの融合タンパク質として使用される場合、このＦｃフラグメントも、プラスチックに接着する。よってこのことは、適切なコーティングを得るためにこれら化合物の存在下にコンテナを数時間いれたままにすることで、十分に行われる。このような、Ｎｏｔｃｈリガンドおよびフィブロネクチンフラグメントで培養コンテナをコーティンするための方法は、国際特許公開公報第２０１６／０５５３９６号に詳細に開示されており、本明細書中開示される方法の実施に適切であり得る。
【００６６】
国際特許公開公報第２０１６／０５５３９６号によると、５μｇを使用する場合、およそ７５％のＤＬ−４がコンテナの表面に接着し、ここでの最適な用量は、１．２５μｇ／ｍｌ以上、好ましくは２．５〜５μｇ／ｍｌであることを想起されたい。
【００６７】
フィブロネクチンフラグメントに関しては、２５μｇ／ｍｌの濃度が、特に適切（特にＲｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（登録商標）を使用する場合）である。しかしながら他の濃度（上記より高いまたは低い）が使用され得る。
【００６８】
本明細書中開示されるプロセスの実施において、ＣＤ３４＋細胞は、培養容器において１０６〜１０７細胞／ｍｌ、特に１ｍｌあたりおよそ２×１０６個のＣＤ３４＋細胞から構成される濃度で、添加される。
【００６９】
細胞が形質導入されるかどうかに応じて、ＣＤ３４＋細胞のうちの１種は、２〜１０ｃｍ２のプレート（すなわち２４〜６ウェルのプレート）を使用し得る。２４ウェルのプレートを使用する場合、各ウェルに１０４〜１０６個のＣＤ３４＋細胞、好ましくはウェルあたり２×１０４〜４×１０５個のＣＤ３４＋細胞を添加する。６ウェルプレートを使用する場合、ウェルあたり８×１０４〜２×１０６個の細胞を添加する。
【００７０】
添加する細胞の量は、使用するコンテナによって、当業者により適切に調節される。
【００７１】
細胞は、ＴＮＦ−αを補充し、上述したように増殖因子およびサイトカインを選択的に補充した、ウェルの中の選択した基礎培地に配置される。
【００７２】
サイトカインまたは増殖因子の濃度は、２〜３００ｎｇ／ｍｌである。好ましくは、この濃度は、４０ｎｇ／ｍｌ超かつ３００ｎｇ／ｍｌまたは２００ｎｇ／ｍｌ未満、より好ましくは約１００ｎｇ／ｍｌである。
【００７３】
しかしながら、形質導入したＴ細胞前駆体を産生させることが望まれる場合、およびこの細胞をウイルスベクターに曝露する前にあらかじめ活性化する場合、より高い濃度（約３００〜４００ｎｇ／ｍｌ）が使用され得る。この実施形態では、ＳＣＦおよびＦｌｔ３−Ｌを、３００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で、ＴＰＯおよびＩＬ−７を、１００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度、ＩＬ―３を約４０ｎｇ／ｍｌで使用することができる。
【００７４】
ＴＮＦ−αは、好ましくは、５ｎｇ／ｍｌ以上の濃度で使用される。実際に、実施例に例示されるように、この低い濃度は、分化経路を改変することなくＴ細胞前駆体の増殖を得るのに十分である。
【００７５】
しかしながら、より高い濃度を使用することもできる。特に、ＴＮＦ−αの濃度は、３００ｎｇ／ｍｌまたは２００ｎｇ／ｍｌ程度に高い場合があり得る。適切な濃度は、およそ１００ｎｇ／ｍｌである。しかしながら、１０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、または５０ｎｇ／ｍｌなどの他の濃度も、同様に適切である。
【００７６】
よって本発明は、Ｔ細胞前駆体を産生させるためのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法であって、ＴＮＦ−αを含む適切な培地において、固定したＮｏｔｃｈリガンドおよび任意選択で上述のフィブロネクチンフラグメントの存在下で、ＣＤ３４＋細胞を培養するステップを含む、方法に関する。
【００７７】
よって本発明は、Ｔ細胞前駆体を増殖させるためのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法であって、ＴＮＦ−αを含む適切な培地において、固定したＮｏｔｃｈリガンドおよび任意選択で上述のフィブロネクチンフラグメントの存在下で、ＣＤ３４＋細胞を培養するステップを含む、方法に関する。
【００７８】
Ｔ細胞前駆体を増殖させることは、ＴＮＲ−αを使用しない場合よりも多くのＴ細胞前駆体が存在すること、および／またはコンテナに導入したＣＤ３４＋細胞の数よりも多くのＴ細胞前駆体が存在することを意味するように意図されている。
【００７９】
特に、上記の方法により入手したＴ細胞前駆体は、ＣＤ３４−／ＣＤ７＋／ＣＤ５−前駆体である。
【００８０】
一般的に、この細胞は、いずれも、ＣＤ１ａマーカーを有さない。
【００８１】
好ましい実施形態では、上記の方法により入手したＴ細胞前駆体は、ＣＤ３４−／ＣＤ７＋／ＣＤ１ａ−前駆体である。
【００８２】
このことは、本方法により入手されるＴ細胞前駆体の集団がＣＤ７マーカーを発現すること、およびこのマーカーを発現する細胞のうち８０％超が、フローサイトメトリーにより解析される際に、上記の表現型を有する
（ＣＤ３４およびＣＤ１ａ、または
ＣＤ３４およびＣＤ５、または
ＣＤ３４およびＣＤ１ａおよびＣＤ５
を発現しない）
ことを意味する。この表現型は、一般に、７日間の培養後に得られる。
【００８３】
表記されるように、ＣＤ３４＋細胞は、好ましくは臍帯血細胞ではない。しかしながら本方法は、臍帯血のＣＤ３４＋細胞を用いて使用されてもよく、臍帯血のＣＤ３４＋細胞に適用可能であり、これはまた、改善した結果をもたらす。
【００８４】
本方法は、特に、成体の患者から単離されたＣＤ３４＋細胞で行われる場合を対象としている（ｉｎｔｅｒｅｓｔｉｎｇ）。上記患者は、健常なドナー、またはある疾患を有するドナー、特にウイルス性の形質導入により細胞が訂正され得るドナーであり得る。
【００８５】
これら細胞は、３日超、好ましくは少なくとも５日超、より好ましくは少なくともまたは正確に６日間、最も好ましくは少なくともまたは正確に７日間、培養され得る。しかしながら、培養期間は、上記より長く持続する場合がある。
【００８６】
本明細書中開示される方法において、ＴＮＦ−αは、好ましくは、０日目から（すなわちＣＤ３４＋細胞の培養の開始時に）、培養培地に添加され、少なくとも３日間、好ましくは細胞を培養する全ての時間の間（すなわち好ましくは約７日間）、培養培地に存在し続ける。
【００８７】
本明細書中開示される方法を行う場合、ＴＮＦ−αをすでに含む培養培地に、ＳｔｅｍＲｅｇｅｎｉｎ  １（ＳＲ１、４−（２−（２−（ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル）−９−イソプロピル−９Ｈ−プリン−６−イルアミノ）エチル）フェノール、ＣＡＳ  １２２７６３３−４９−１０）をさらに添加することが可能である。
【００８８】
また本発明は、Ｔ細胞前駆体を入手するための方法であって、
ａ．上記に開示される方法を行うステップと、
ｂ．これにより入手される、産生させたＴ細胞前駆体を精製するステップと
を含む、方法に関する。
【００８９】
精製は、細胞を洗浄し、これを基礎培地に再懸濁することにより行われ得る。
【００９０】
また本方法は、患者へ注射するためのパウチでＴ細胞前駆体を条件付けするステップを含み得る。
【００９１】
この場合、これら細胞が、ａｌｂｕｎｏｒｍ（商標）（５％  ５０ｇ／Ｌ）（Ｏｃｔｏｐｈａｒｍａ，  Ｌｉｎｇｏｌｓｈｅｉｍ，  Ｆｒａｎｃｅ）などの５％のＨＳＡを含む生理食塩水溶液に再度条件付けされる場合が好ましい。
【００９２】
これら細胞はまた、当該分野で知られている方法により、凍結され得る。
【００９３】
また本発明は、Ｔ細胞前駆体（上述の方法により入手されやすいＴ細胞前駆体または上述の方法により入手されるＴ細胞前駆体）の集団を含む、静脈内注射用のパウチであって、この集団におけるＣＤ７＋細胞の割合が、８０％超、より好ましくは８５％超である、パウチに関する。
【００９４】
また本発明は、ＣＤ７＋Ｔ細胞前駆体（上述の方法により入手されやすいＣＤ７＋Ｔ細胞前駆体または上述の方法により入手されるＣＤ７＋Ｔ細胞前駆体）の集団を含む、静脈内注射用のパウチであって、この集団におけるＣＤ３４−およびＣＤ５−の細胞（ＣＤ７＋でありＣＤ３４−およびＣＤ５−である細胞）の割合が、８０％超、より好ましくは８５％超である、パウチに関する。
【００９５】
また本発明は、ＣＤ７＋Ｔ細胞前駆体（上述の方法により入手されやすいＣＤ７＋Ｔ細胞前駆体または上述の方法により入手されるＣＤ７＋Ｔ細胞前駆体）の集団を含む、静脈内注射用のパウチであって、この集団におけるＣＤ３４−細胞（ＣＤ＋７でありＣＤ３４−である細胞）の割合が、５０％超、より好ましくは６０％超である、パウチに関する。さらに、この集団における細胞の少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％が、ＣＤ１ａ−細胞である。
【００９６】
また本発明は、形質転換したＴ細胞前駆体を入手するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法であって、
ａ．ＴＮＦ−αを含む適切な培地において、固定したＮｏｔｃｈリガンドの存在下で、ＣＤ３４＋細胞を培養するステップと、
ｂ．ＣＤ３４＋細胞のトランスフェクションまたは形質導入を目的とするベクターに、上記細胞を曝露するステップと
を含む、方法に関する。
【００９７】
上記に開示されるように、細胞を洗浄し再度培養するステップの後に、形質転換したＴ細胞前駆体（これらゲノムと一体化したトランスジーンを発現）が、入手される。
【００９８】
また本発明は、改変したＴ細胞前駆体を入手するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法であって、
ａ．ＴＮＦ−αを含む培地において、固定したＮｏｔｃｈリガンドの存在下で、ＣＤ３４＋細胞を培養するステップと、
ｂ．少なくとも細胞培養の間の一部の期間の間、遺伝子編集に適切なエレメントを含むベクターまたは核酸配列に、上記細胞を曝露するステップと
を含む、方法に関する。
【００９９】
これにより、遺伝子編集により改変したＴ細胞前駆体が、可能性のある洗浄ステップおよび培養ステップの後に入手される。
【０１００】
また本発明は、免疫抑制された患者で使用するため、特に、数ケ月の間（少なくとも２ケ月、好ましくは少なくとも６ケ月）、この患者で免疫の再構成を可能にするためおよび／または上記患者の感染症に対する免疫保護を得るための、Ｔ細胞前駆体、特に本明細書中開示される方法により得られるＴ細胞前駆体に関する。
【０１０１】
特定の実施形態では、この患者は、免疫抑制された患者である。この不全の理由は、複数：遺伝性の免疫不全、白血病に関する化学療法、条件付け、幹細胞のみを含むグラフト、ＧＶＨ（移植片対宿主病）の防止のための移植後の治療、患者の年齢、および感染症などの合併症、であり得る。
【０１０２】
特に、患者は、造血性幹細胞の移植前の治療による自身の免疫細胞の減少により、免疫抑制され得る。この実施形態では、グラフトは、同種グラフト（この場合、Ｔ細胞前駆体は、部分的にＨＬＡが適合可能なドナーに由来するのが好ましい）、または自家グラフト（この場合、Ｔ細胞前駆体は、上記患者の遺伝子欠損を訂正することを可能にする遺伝子および／またはタンパク質を発現するために、ベクターにより選択的に形質転換されている）であり得る。
【０１０３】
Ｔ細胞前駆体は、好ましくは、ＣＤ７＋細胞の集団（すなわち、この集団の細胞の少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％が、ＣＤ７マーカーを発現する集団）である。この集団もまた、本発明の一部である。特にこれは、本明細書中開示される方法により入手されやすい。特定の実施形態では、これは、本明細書中開示される方法により入手される。
【０１０４】
より具体的には、Ｔ細胞前駆体は、好ましくは、ＣＤ７＋細胞の集団（すなわち、この集団における細胞の少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％がＣＤ７マーカーを発現する集団）であり、ここでは、この集団におけるＣＤ３４−およびＣＤ５−の細胞（ＣＤ７＋でありＣＤ３４−およびＣＤ５−である細胞）の割合が、８０％超、より好ましくは８５％超である。この集団もまた、本発明の一部である。特にこれは、本明細書中開示される方法により入手されやすい。特定の実施形態では、これは、本明細書中開示される方法により入手される。
【０１０５】
別の実施形態では、Ｔ細胞前駆体は、好ましくは、ＣＤ７＋の細胞の集団（すなわちこの集団の細胞の少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％が、ＣＤ７マーカーを発現する集団）である。この集団では、細胞の５０％超、より好ましくは６０％超が、ＣＤ３４マーカーを発現しない。この集団において、細胞の少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％が、ＣＤ１ａマーカーを発現しない。この集団におけるＣＤ７＋ＣＤ１ａ−細胞の割合は、好ましくは少なくとも８０％である。この集団もまた、本発明の一部である。特にこれは、本明細書中開示される方法により入手されやすい。特定の実施形態では、これは、本明細書中開示される方法により入手される。
【０１０６】
細胞が、表面のマーカー（ＣＤ７、ＣＤ３４、ＣＤ５、またはＣＤ１ａ）に対して陽性であるかどうかを決定するために、細胞を表面抗原に対する蛍光抗体でマークした後に、当該分野で知られているいずれかの方法、特にフローサイトメトリーを使用する。この原則は、集団の各細胞に関するシグナルが所定の強度で発せられ、当該シグナルが所定の閾値よりも高い場合に、細胞がこの抗原に関して陽性であるとみなされることである。
【０１０７】
ＣＤ３４では、ＨＰＳＣの集団からなる対照の集団（臍帯血または動員した末梢血から単離したものなど）が、適切な閾値を決定するために使用される。この細胞集団では、細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ７−ＣＤ５−、またはＣＤ３４＋ＣＤ７−ＣＤ１ａ−である。この対照を用いて、別の集団における細胞がこれら抗原に対して陽性であるかどうかを決定するために使用される、各抗原に関する閾値を決定することが可能である。
【０１０８】
この対照の集団は、一般に、およそ９０％のＣＤ３４＋ＣＤ７−ＣＤ５−またはＣＤ３４＋ＣＤ７−ＣＤ１ａ−の造血性幹細胞を含む。この閾値は、集団の細胞が９０／１０の割合で選別され得るシグナル強度レベルである。
【０１０９】
ＣＤ７（それぞれＣＤ５またはＣＤ１ａ）では、対照の集団は、当該分野で知られているいずれかの技術による末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の単離により、特にＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）などの密度勾配技術により、使用され、入手される。ＣＤ７（それぞれＣＤ５またはＣＤ１ａ）陽性細胞は、抗ＣＤ７（それぞれ抗ＣＤ５または抗ＣＤ１ａ）抗体を伴う磁気ビーズを使用するＭＡＣＳ（登録商標）技術（Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ，  Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）などの、当該分野で知られているいずれかの技術を使用して、単離される。この集団では、細胞は、基本的にＣＤ７＋（それぞれＣＤ５＋またはＣＤ１ａ＋）であり、この割合は約９０／１０であると考えられる。
【０１１０】
細胞が表面抗原に対して陽性であるかどうかを評価するための閾値は、この抗原に関する対照集団を使用して決定され、この対照集団の細胞の９０％超が高いシグナル強度を有する強度であり得る。
【０１１１】
結果的に、細胞は、ある抗原に関する強度シグナルが、上記のように決定される閾値よりも高い場合に、この抗原に関して陽性であるとみなされ、この抗原に関するシグナル強度が上記のように決定される閾値よりも低い場合に、当該抗原に関して陰性であるとみなされる。
【０１１２】
集団におけるＴ細胞前駆体の大部分がＣＤ１ａマーカーを発現しないとの事実は、このＣＤ１ａマーカーを発現する細胞が胸腺に達するためにはあまり効率的ではなく、よって、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける再増殖に関してＣＤ１ａ−細胞と同程度の効率であり得るため、好適であることが判明し得る。ＣＤ１ａ＋細胞の再構成の可能性は不確定であるため、よって、集団においてこのような細胞の量を少なくすることが好ましい。
【０１１３】
また本発明は、免疫抑制された患者を治療するため、特に、少なくとも一時的にこの患者において免疫の再構成を可能にする目的のための方法であって、上述したＴ細胞前駆体を上記患者に投与するステップを含む、方法に関する。
【０１１４】
また本発明は、ＴＮＦ−α（上述のＴＮＦ−α）の存在下で、Ｎｏｔｃｈリガンドと、好ましくはＲＧＤＳモチーフおよび／またはＣＳ１モチーフを有するタンパク質またはペプチド、特に上述のＡフィブロネクチンンフラグメントとに、ＣＤ３４＋細胞を上述の条件下で曝露することにより、当該前駆体を入手するステップを含み得る。
【０１１５】
特に、数ケ月（約６ケ月のオーダー）の間、感染症に関して保護的な役割を果たすことができる細胞を患者に提供することを可能にする、治療有効量、すなわち１ｋｇあたり１〜５×１０６個の前駆体のオーダーが、投与される。
【０１１６】
好ましくは、このＴ細胞前駆体の投与は、上記患者における造血性幹細胞の移植の直前、直後、または当該移植と同時に、行われる。上記からわかるように、注射された細胞は、上記患者の遺伝的欠損の訂正を可能にするように意図されたベクターにより、形質転換させることができる。
【０１１７】
別の実施形態では、Ｔ細胞前駆体は、造血性幹細胞移植を必要としない患者に注射される。実際に、免疫系を低減する化学療法を行うことを必要とせず、Ｔ細胞のみが冒されている一部の免疫不全、ＨＩＶ、または癌の患者を（ＣＡＲ−Ｔ細胞をもたらすように改変された前駆体を使用して）治療するために形質転換または形質導入されたＴ細胞前駆体を使用することが可能である。
【０１１８】
ＴＮＦ−αを伴い開示された本発明の教示はまた、プリン誘導体のＳｔｅｍＲｅｇｅｎｉｎ  １（ＳＲ１、Ｂｏｉｔａｎｏ  ｅｔ  ａｌ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２０１０  Ｓｅｐ  １０；３２９（５９９７）：１３４５−８に開示）を用いた場合にも適用可能であることに留意されたい。よって、ＳＲ１は、分化の開始時および細胞の増殖時（細胞の数の増加時）に、ＣＤ３４＋細胞からＴ細胞前駆体を入手するため、ＴＮＦ−αの代わりとなり得る（すなわち、ＴＮＦ−αの代わりに使用され得る）。ＳＲ１の濃度は、好ましくは７５０ｎＭ（３０ｎｇ／ｍｌ）の範囲にあるか、また、たとえば１５００Ｍもしくは２５００ｎＭ（１００ｎｇ／ｍｌ）もしくはさらには５０００ｎＭ（２００ｎｇ／ｍｌ）などのより高い濃度、または５００ｎＭ（２０ｎｇ／ｍｌ）などのより低い濃度も、想定され得る。単独で使用する場合、しかしながら特にはＴＮＦ−αと併用する場合、３ｎｇ／ｍｌまたは１０ｎｇ／ｍｌ程度の著しく上記よりも低い濃度が、使用され得る。適切な濃度はまた、３０ｎｇ／ｍｌまたは１００ｎｇ／ｍｌを含む。結果として、３ｎｇ／ｍｌ超または１０ｎｇ超であるいずれかの濃度が、ＣＤ３４＋細胞のＴ細胞前駆体への分化の増大に適切である。
【０１１９】
ＳＲ１は、芳香族炭化水素／ダイオキシン受容体（ＡｈＲ）のリガンド（拮抗剤）である。ＣＤ３４＋細胞のＴ細胞前駆体系列への分化を促進するために、他のＡｈＲ拮抗剤が、単独、またはＴＮＦ−αと併用して使用され得る。拮抗剤として、レスベラトロール、オメプラゾール、ルテオリン、αナフトフラボン、メキシレチン、トラニラスト、６，２’，４’−トリメトキシフラボン、ＣＨ  ２２３１９１（１−メチル−Ｎ−［２−メチル−４−［２−（２−メチルフェニル）ジアゼニル］フェニル−１Ｈ−ピラゾール−５−カルボキサミド、ＣＡＳ  ３０１３２６−２２−７）を例として挙げることができる。ＡｈＲ拮抗剤の量は、拮抗剤のＩＣ５０（ＳＲ１は１２７ｎＭのＩＣ５０を有し、対してＣＨ  ２２３１９１は、３０ｎＭのＩＣ５０を有する）、ならびに一部の製品が、高濃度で使用する場合（αナフトフラボンなど）または細胞の状況に応じて（オメプラゾールなど）、ＡｈＲに対してアゴニスト活性を有し得るという事実を考慮して、当業者によりケースバイケースで決定される。ＳＲ１およびＣＨ  ２２３１９１の間のＩＣ５０の差異の観点から、ＣＨ  ２２３１９１の有効な濃度は、本明細書中開示されるＳＲ１の有効濃度よりも著しく低いことが予想される。
【０１２０】
結果として、本発明はまた、以下に関する：
（ｉ）芳香族炭化水素／ダイオキシン受容体の拮抗剤、特にＳｔｅｍＲｅｇｅｎｉｎ  １（ＳＲ１）を含む培地において、固定したＮｏｔｃｈリガンドの存在下で、ＣＤ３４＋細胞を培養するステップを含む、Ｔ細胞前駆体を産生させるためのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法。
（ｉｉ）培養培地がＴＮＦ−αをさらに含む上記のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法。
（ｉｉｉ）芳香族炭化水素／ダイオキシン受容体の拮抗剤、特にＳＲ１が、培養の０日目から培養培地に存在する、上記のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法。
（ｉｖ）ＣＤ３４＋細胞が、成体のドナーまたは臍帯血から単離されている、上記のいずれかのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法。
（ｖ）細胞を、最大１０日間、芳香族炭化水素／ダイオキシン受容体の拮抗剤、特にＳＲ１の存在下で培養する、上記のいずれかのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法。
（ｖｉ）細胞を、３〜７日間、芳香族炭化水素／ダイオキシン受容体の拮抗剤、特にＳＲ１の存在下で培養する、上記のいずれかのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法。
（ｖｉｉ）芳香族炭化水素／ダイオキシン受容体の拮抗剤、特にＳＲ１を、１ｎｇ／ｍｌ〜３００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１ｎｇ／ｍｌ以上、または３ｎｇ／ｍｌ以上、または１０ｎｇ／ｍｌ以上、かつ好ましくは２００ｎｇ／ｍｌ未満、または１５０ｎｇ／ｍｌ未満、一般には３ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌの濃度で、培養培地に添加する、上記のいずれかのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法。
（ｖｉｉｉ）Ｎｏｔｃｈリガンドが、ＩｇＧタンパク質、好ましくはＩｇＧ２タンパク質のＦｃ領域に融合した、デルタ様４リガンドの可溶性ドメインである、上記のいずれかのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法。
（ｉｘ）細胞を、同様にフィブロネクチンフラグメントに曝露し、上記フラグメントが、ＲＧＤＳパターンおよびＣＳ−１パターン、ならびにヘパリン結合ドメインを含み、好ましくは培養容器の内面に固定されている、上記のいずれかのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法。
（ｘ）上記フィブロネクチンフラグメントが、上記に開示されるＲｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（登録商標）である、上記のいずれかのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法。
（ｘｉ）培養培地も、ＣＤ３４＋細胞のＮｏｔｃｈリガンドへの曝露の少なくともある時点で、ＣＤ３４＋細胞のトランスフェクションまたは形質導入を目的とするベクターを含む、上記のいずれかのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法。
（ｘｉｉ）培養培地が、インターロイキン７（ＩＬ−７）、ＳＣＦ（幹細胞因子）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、およびＦｌｔ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）からなる群から選択される、少なくとも３つ、好ましくは４つ全てのサイトカインまたは増殖因子を含む、上記のいずれかのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法。
（ｘｉｉｉ）Ｔ細胞前駆体を入手するための（ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける）方法であって、
ａ．上記のいずれかに記載の方法を行うステップと、
ｂ．産生させたＴ細胞前駆体を精製するステップと、
ｃ．任意選択で、患者に注射するためのパウチでＴ細胞前駆体を条件付けするステップと
を含む、方法。
（ｘｉｖ）形質転換したＴ細胞前駆体を入手するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法であって、
ａ．芳香族炭化水素／ダイオキシン受容体の拮抗剤、特にＳＲ１を含む培地において、固定したＮｏｔｃｈリガンドの存在下で、ＣＤ３４＋細胞を培養するステップと、
ｂ．ＣＤ３４＋細胞のトランスフェクションまたは形質導入を目的とするベクターに、上記細胞を曝露するステップと
を含む、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法。
（ｘｖ）改変したＴ細胞前駆体を入手するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法であって、
ａ．芳香族炭化水素／ダイオキシン受容体の拮抗剤、特にＳＲ１を含む培地において、固定したＮｏｔｃｈリガンドの存在下で、ＣＤ３４＋細胞を培養するステップと、
ｂ．遺伝子編集に適切なエレメントを含むベクターまたは核酸配列に、上記細胞を曝露するステップと
を含む、方法。
【０１２１】
また本発明は、以下を含む、上述のいずれかの方法を行うためのキットに関する：
（ｉ）Ｎｏｔｃｈのリガンド（特に、ＩｇＧタンパク質、特にＩｇＧ２タンパク質のＦｃ領域に融合したＤｅｌｔａ様リガンドの可溶性ドメイン）、および任意選択でフィブロネクチンフラグメントを含む、コーティング培地、
（ｉｉ）α−ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ  １６４０培地、ＩＭＤＭ培地、ＢＭＥ培地、マッコイ５Ａ培地、ＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）ＳＦＩＩ培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）培地、Ｘ−ＶＩＶＯ（商標）培地、またはＦｉｓｃｈｅの培地などの、ＣＤ３４＋細胞およびＴ細胞を培養（および／または増殖）するために適合させた培地
（ｉｉｉ）ＴＮＦ−α、ならびにＳＣＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ−７から特に選択される、好ましくは３つのサイトカインを含む、前駆体増殖培地。前駆体増殖培地は、ＴＮＦ−α、ならびに４つ全てのサイトカインのＳＣＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ−７を含む場合が好ましい。
【０１２２】
別の実施形態では、本発明は、上述したものと同じエレメント（ｉ）および（ｉｉ）と、芳香族炭化水素／ダイオキシン受容体の拮抗剤、特にはＳＲ１、およびＳＣＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ−７から特に選択される好ましくは３つのサイトカインを含む、前駆体増殖培地（ｉｉｉ）とを含む、キットに関する。前駆体増殖培地は、ＳＲ１と、４つ全てのサイトカインのＳＣＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ−７とを含む場合が好ましい。
【０１２３】
別の実施形態では、前駆体増殖培地（ｉｉｉ）は、ＴＮＦ−αと、芳香族炭化水素／ダイオキシン受容体の拮抗剤、特にはＳＲ１と、ＳＣＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ−７から特に選択される好ましくは３つのサイトカインとを含む。前駆体増殖培地は、ＴＮＦ−αと、ＳＲ１と、４つ全てのサイトカインのＳＣＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ−７とを含む場合が好ましい。
【０１２４】
このようなキットは、特に、本明細書中開示される方法を行うように適合および設計されている。
【０１２５】
コーティング培地（ｉ）は、最初に、培養容器の壁をコーティングするために使用される。
【０１２６】
次に、培地（ｉｉ）が、ＣＤ３４＋細胞（臍帯血、または、特には成体由来の動員した末梢血のいずれかから入手）を培養するために使用される。このような培地は、一般に好ましくは、１×の濃度で使用される（すなわち希釈を行わずに使用できる）。
【０１２７】
培地（ｉｉｉ）は、一般に、１０×希釈として提示される（すなわち、使用するために培地（ｉｉ）で希釈されなければならない）。次に、培地（ｉｉ）および（ｉｉｉ）から再構成された培地が、上記に開示されるように、ＣＤ３４＋細胞のＴ細胞系列のＴ細胞前駆体への分化を促進させるために使用される。
【０１２８】
また本発明は、その必要がある対象においてＴ細胞の数を増加させるための方法であって、本明細書中開示される方法により入手される前駆体Ｔ細胞の有効な数を上記対象に投与するステップを含む、方法に関する。
【０１２９】
また本発明は、Ｔ細胞の数を増加させる必要のある対象の治療に関して使用するための、本明細書中開示されるいずれかの方法により入手される前駆体Ｔ細胞に関する。
【０１３０】
特には、対象はヒトである。
【０１３１】
特には、投与される前駆体Ｔ細胞は、自己由来である。別の実施形態では、投与される前駆体Ｔ細胞は、同種である。
【０１３２】
特に、Ｔ細胞の数を増加させる必要のある対象は、リンパ球減少症、特には癌、ＨＩＶ感染、部分的な胸腺切除、自己免疫疾患、および／または臓器移植を引き起こすまたはもたらす病態を有する。
【図面の簡単な説明】
【０１３３】
【図１】培養から３日目（黒色のバー）および７日目（累加された灰黒色のバー）の、臍帯血（ＣＢ、図１Ａ）または動員した末梢血（ｍＰＢ、図１Ｂ）由来の、２００００個のＣＤ３４＋細胞から開始して入手した有核細胞数の合計。ＮＣ：補充なし；ＳＲ１：ＳｔｅｍＲｅｇｅｎｉｎ  １（７５０ｎＭ）の添加；ＴＮＦ−α：ＴＮＦ−α（１００ｎｇ／ｍｌ）の添加；＋（ａ）、（ｂ）、（ｃ）：補充物質を、培養の０〜３日目（ａ）、培養の０〜７日目（ｂ）、または培養の４〜７日目（ｃ）から添加する場合に観察される細胞の数。
【図２】臍帯血（ＣＢ、図２Ａ）または動員した末梢血（ｍＰＢ、図２Ｂ）由来の２００００個のＣＤ３４＋細胞から開始して、７日目に入手したＣＤ７＋Ｔ細胞前駆体の数。黒色のバー：ＣＤ３４＋ＣＤ７＋細胞；灰色のバー：ＣＤ３４−ＣＤ７＋細胞。（ａ）、（ｂ）、（ｃ）：補充物質を、培養の０〜３日目（ａ）、培養の０〜７日目（ｂ）、または培養の４〜７日目（ｃ）から添加する場合に観察される細胞の数。
【図３】Ｂｃｌ１１ｂの発現を、ＴＮＦ−αの存在下（灰色のバー）または非存在下（黒色のバー）で培養した、臍帯血（ＣＤ）または動員した末梢血（ｍＰＢ）由来のＣＤ３４＋細胞から開始して得られた、７日間の培養後に生存していた細胞で、解析した。
【図４】ＣＤ３４＋臍帯血細胞（ＣＢ、黒色のバー、左）または動員した末梢血（ｍＰＢ、灰色のバー、右）から開始して７日目に入手したＣＤ７＋細胞の数に及ぼす、ＴＮＦ−αおよびＮｏｔｃｈリガンドＤＬ４の併用作用（＋−はＤＬ４またはＴＮＦ−αの存在または非存在を意味する）。
【図５】ＴＮＦ−αの存在下（灰色のバー）または不存在下（黒色のバー）における、臍帯血（ＣＢ）または動員した末梢血（ｍＰＢ）由来のＣＤ３４＋細胞から開始して７日目に入手した骨髄系細胞の頻度（平均値±ＳＥＭ）。
【図６】臍帯血（ＣＢ、図６Ａ）または動員した末梢血（ｍＰＢ、図６Ｂ）由来のＣＤ３４＋細胞から開始して、ＴＮＦ−αの用量応答アッセイにおいて３日目から７日目に入手したＣＤ７＋細胞の総数。
【図７】臍帯血（ＣＢ、図７Ａ）または動員した末梢血（ｍＰＢ、図７Ｂ）由来のＣＤ３４＋細胞から開始した、ＴＮＦ−αの用量応答アッセイにおけるＣＤ３４−ＣＤ７＋細胞（灰色のバー）ｖｓＣＤ３４＋ＣＤ７＋細胞（黒色のバー）の割合。
【図８】細胞周期の異なる期における細胞の割合。Ａ．ＣＢ：臍帯血から分化した細胞；Ｂ：動員した末梢血細胞から分化した細胞。ＮＣ：補充なし；ＴＮＦ−α：ＴＮＦ−α（２０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で培養：ＳＲ１：ＳＲ１（３０ｎｇ／ｍｌ）の存在下での培養。
【図９】７日間の培養後の、様々な濃度のＴＮＦ−αおよび／またはＳＲ１の存在下での、臍帯血由来のＣＤ３４＋細胞から開始して培養したＣＤ５＋ＣＤ７＋細胞のパーセンテージ（Ａ）および総数（Ｂ）。
【発明を実施するための形態】
【０１３４】
実施例
実施例１−材料および方法
ヒトの細胞
血液バンク（ｂａｎｋｉｎｇ）の対象ではない臍帯血のサンプルは、小児の母親によるインフォームドコンセントの提供により、研究目的のために使用した。動員した末梢血（ｍＰＢ）のサンプルは、Ｇ−ＣＳＦの動員後に健常なドナーから回収した。サンプルは、ＣＤ３４＋細胞に関して直接的に濃度を高めた。インフォームドコンセントは、各ドナーから提供された（Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ，  Ｎｅｃｋｅｒ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，  Ｐａｒｉｓ）。
【０１３５】
ＮｏｔｃｈリガンドのＤＬ−４へのＣＤ３４＋前駆細胞の曝露
ヒトのＣＢのサンプルまたは動員した末梢血のサンプルに由来するＣＤ３４＋細胞を、組み換え型のヒトフィブロネクチン（ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ／Ｔａｋａｒａ）およびＤＬ−４（５μｇ／ｍｌ、ＰＸ’Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  Ｇｒｅｎｏｂｌｅ，  Ｆｒａｎｃｅ）でコーティングした２４ウェルプレートまたは６ウェルプレートで、培養した。コーティングは、３７℃で２時間行い、ＤＬ−４をコーティングしたウェルはその後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中２％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で、３７℃で３０分間ブロッキングし、ＰＢＳで洗浄した。ＮａＨＣＯ３（７，５％）（Ｇｉｂｃｏ，  ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、および２０％の規定された（ｄｅｆｉｎｅｄ）ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｉｌｌｋｉｒｃｈ，  Ｆｒａｎｃｅ）、ならびに組み換え型ヒトサイトカインのインターロイキン−７（ＩＬ−７）、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ−３）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、およびトロンボポエチン（ＴＰＯ）（全て１００ｎｇ／ｍｌであり、全てＰｅｐｒｏＴｅｃｈ  Ｉｎｃ，  Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，  ＮＪから購入）を補充したα−ＭＥＭ培地において、ＴＮＦ−α（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  ＵＳ）を伴うかまたは伴わずに、２×１０４細胞／ウェルまたは１×１０５細胞／ウェル（それぞれ２４ウェルプレートおよび６ウェルプレート）の濃度で、培養を開始した。３日間の培養後、細胞の半分を、新鮮な培地に置き換えた。培養した細胞を、それぞれ、ＤＬ−４上での培養から３日後および７日後に、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）により解析して、その後の解析からＣＤ３４−／ＣＤ７−骨髄細胞を除外した。
【０１３６】
ＯＰ９／ＤＬ１細胞でのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＴ細胞の分化アッセイ
天然のＣＤ３４＋ＣＢ細胞およびＤＬ−４への曝露により産生されたＴＮＦ−α誘導性Ｔ細胞前駆体の、Ｔリンパ系の潜在性を、以前に記載される通り（Ｓｉｘ  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ｍｏｌ  Ｄｉｓ．  ２０１１  Ｊｕｎ  １５；４７（１）：７２−８  ａｎｄ  Ｓｉｘ  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．  ２００７  Ｄｅｃ  ２４；２０４（１３）：３０８５−９３）、ＯＰ９／ＤＬ−１共培養において評価した。
【０１３７】
ＲＴ２プロファイラーアレイを使用した、定量的なリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応
７日間の培養後、ＣＤ７＋細胞を、ＡｒｉａＩＩで選別した。３日目由来および７日目由来の選別した細胞のフラクションの総ＲＮＡを、Ｒｎｅａｓｙ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，  Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ，  Ｆｒａｎｃｅ）を用いて単離した。ＲＴ２  Ｐｒｏｆｉｌｅｒ  ＰＣＲ  ａｒｒａｙを、ＲＴ２  Ｐｒｏｆｉｌｅｒ  ＰＣＲ  Ａｒｒａｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（ＳＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  ＭＤ）に詳述されるプロトコルにしたがい、行った。
【０１３８】
フローサイトメトリー解析およびセルソーティング
ヒトのＣＤ３４（ＡＣ１３６）、ＣＤ３（ＢＷ２６４／５６）、ＣＤ４５（５Ｂ１）に対するモノクローナル抗体は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入し、ＣＤ４（ＳＫ４）、ＣＤ７（Ｍ−Ｔ７０１）、ＣＤ２５（Ｍ−Ａ２５１）、７−アミノアクチノマイシンＤ（７ＡＡＤ）は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，  ＣＡ）製であった。抗ヒトＣＤ８（ＲＰＡＴ８）は、Ｓｏｎｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，  ＵＳＡ）製であった。抗ヒトＣｔｉｐ２（Ｂｃｌ１１ｂ）抗体は、Ａｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＵＫ）製であった。
【０１３９】
ヒトの細胞を染色し、Ｇａｌｌｉｏｓ  ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，  Ｋｒｅｆｅｌｄ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して解析した。異種間のレシピエント由来の細胞を、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ（登録商標）装置（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，  Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）で解析した。これらデータを、７ＡＡＤ陰性の生細胞に調節した後（ｇａｔｉｎｇ  ｏｎ）、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ，  Ａｓｈｌａｎｄ，  ＯＲ）を使用して解析した。
【０１４０】
細胞増殖アッセイ
細胞増殖アッセイのため、ＣＢ由来およびｍＰＢ由来のＣＤ３４＋細胞を、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）ＣＦＳＥキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）を使用して標識した後、ＤＬ−４およびＴＮＦ−α（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に培養した。細胞の染色の強度を、３日目から７日目まで、毎日、培養前に測定した。ＣＦＳＥ陽性細胞を、Ｇａｌｌｉｏｓ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）で解析した。
【０１４１】
細胞周期アッセイ
細胞周期解析のため、細胞を、室温で１５分間ＰｅｒＦｉｘ−ｎｃキット（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）のＦｉｘａｔｉｖｅ試薬（ｒｅａｇｅｎｔ）で固定し、浸透試薬（ｐｅｒｍｅａｂｌｉｚｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔ）を添加した後に、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）およびＫｉ６７−ＰＣ５（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で染色した。このデータを、７ＡＡＤ陰性の生細胞に調節した後（ｇａｔｉｎｇ  ｏｎ）、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（バージョン１０．２，  Ｔｒｅｅｓｔａｒ，  Ａｓｈｌａｎｄ，  ＯＲ）を使用して解析した。
【０１４２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて産生させた成体のＨＳＰＣ由来のＴ細胞前駆体のＮＳＧ新生仔への養子移入
動物を用いた全ての実験および手法は、仏国政府当局の動物実験に関する規則（Ｆｒｅｎｃｈ  Ｍｉｎｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ’ｓ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ａｎｉｍａｌ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ）に従い行った。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて産生させたヒトのＴ細胞前駆体のＮＳＧマウスへの注射は、高等教育・研究省（Ｍｉｎｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｈｉｇｈｅｒ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）により承認された（ＡＰＡＦＩＳ  ２１０１−２０１５０９０４１１４９５１７８ｖ４）。
【０１４３】
ＮＳＧ（ＮＯＤ−Ｓｃｉｄ（ＩＬ２Ｒｇｎｕｌｌ））マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＭＥから入手、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊａｘ．ｏｒｇ）を、特定の病原体のいない施設（ＳＰＦ：ｐａｔｈｏｇｅｎ−ｆｒｅｅ  ｆａｃｉｌｉｔｙ）で保存した。ＴＮＦα（３×１０５または１×１０６）を用いたかまたは用いなかった７日目のＤＬ−４培養物におけるｍＰＢのＣＤ３４＋ＨＳＰＣ由来の後代を、ＮＳＧ新生仔（生後０〜４日齢）に、肝臓内注射した。対照マウスには、３×１０５個の培養していないｍＰＢ  ＣＤ３４＋細胞または１００μｌのＰＢＳを注射した。
【０１４４】
ＮＳＧマウスの移植レベルの平均を、移植後４〜１２週間目に判定した。フローサイトメトリーによる解析を、大腿骨、胸腺、末梢血、および脾臓からすばやく回収した細胞で行った。細胞を、１×の赤血球溶解バッファー（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，  ＵＳ）で処理し、洗浄した後に、抗体により染色した。
【０１４５】
Ｔ細胞受容体の多様性の解析
ＴＣＲ遺伝子の再編成の解析を、二連で、２つの無関係に精製したサブセットで行った（平均を示す）。
【０１４６】
ＴＣＲ−δの定量化（Ｄδ２−Ｄδ３、Ｄδ２−Ｊδ１、およびＤδ３−Ｊδ１）を、プライマーおよびプローブの列挙したセットを用いて行った。
【０１４７】
以下を、Ｄδ２−Ｄδ３の再編成に使用した：
Ｄδ２、５’−ＣＡＡＧＧＡＡＡＧＧＧＡＡＡＡＡＧＧＡＡＧＡＡ−３’（配列番号９）；
Ｄδ３、５’−ＴＴＧＣＣＣＣＴＧＣＡＧＴＴＴＴＴＧＴＡＣ−３’（配列番号１０）；および
Ｄ’３プローブ、５’−ＡＴＡＣＧＣＡＣＡＧＴＧＣＴＡＣＡＡＡＡＣＣＴＡＣＡＧＡＧＡＣＣＴ−３’（配列番号１１）
【０１４８】
以下のプライマーおよびプローブを、Ｄδ２−Ｊδ１の再編成に使用した：
Ｄδ２、５’−ＡＧＣＧＧＧＴＧＧＴＧＡＴＧＧＣＡＡＡＧＴ−３’（配列番号１２）；
Ｊδ１、５’−ＴＴＡＧＡＴＧＧＡＧＧＡＴＧＣＣＴＴＡＡＣＣＴＴＡ−３’（配列番号１３）；および
Ｊδ１プローブ、５’−ＣＣＣＧＴＧＴＧＡＣＴＧＴＧＧＡＡＣＣＡＡＧＴＡＡＧＴＡＡＣＴＣ−３’（配列番号１４）
【０１４９】
以下を、Ｄδ３−Ｊδ１の再編成に使用した：
Ｄδ３、５’−ＧＡＣＴＴＧＧＡＧＡＡＡＡＣＡＴＣＴＧＧＴＴＣＴＧ−３’（配列番号１５）；
Ｊδ１プライマーおよびＪδ１プローブ
【０１５０】
マルチプレックスの蛍光ＰＣＲによるＴＣＲの再編成の解析を、キャピラリーシーケンシングのポリマーにおける蛍光色素で標識した一本鎖ＰＣＲ産物の分離により行い、自動化されたレーザスキャンを介して検出した。
【０１５１】
アポトーシスのアッセイ
細胞を、冷却したＰＢＳにより洗浄し、１ｍｌあたり１００万個の細胞の濃度で、結合バッファーに再懸濁した。５μｌのＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＰＥ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）および２ｕｌの７ＡＡＤを添加した後に、細胞を、暗室において室温で１５分間インキュベートした。その後、細胞を、５００μｌの結合バッファーで洗浄し、１００μｌの結合バッファーに再懸濁し、１時間以内に解析した。
【０１５２】
実施例２．Ｔ細胞前駆体の増殖および分化の改善
ＣＤ３４＋細胞をＤＬ−４と共に培養した場合に、図１は、細胞培養培地へのＴＮＦ−αの添加が、臍帯血（図１Ａ）またはＰＢ（図１Ｂ）のいずれかからもたらされるＣＤ３４＋細胞から開始した場合に、ＴＮＦ−αを伴わない培養と比較して、７日目に回収された細胞の総数を１０倍増加できることを示している。
【０１５３】
図２は、細胞培養培地へのＴＮＦ−αの添加が、臍帯血（図２Ａ）またはＰＢ（図Ｂ）のいずれかからもたらされるＣＤ３４＋細胞から開始した場合に、ＣＤ７＋細胞の数を２０〜４０倍増加できることを示している。この改善は、特に、ＣＤ３４−ＣＤ７＋細胞集団で著しい。
【０１５４】
実施例３．Ｔ細胞前駆体の表面マーカーの解析
７日間の培養後に得られた細胞の表面に存在する表面マーカーを、フローサイトメトリーにより決定した。
【表１】
2020513844.tif 000003
【０１５５】
【表２】
2020513844.tif 000004
【０１５６】
これら表は、ＴＮＦ−αの添加が、ＣＤ５＋細胞の割合を実際に増加させることなく、ＣＤ７＋細胞の割合の増加をもたらすことを示している。
【０１５７】
７日間の培養の後、ＨＳＰＣは、ＣＤ３４−ＣＤ７＋ＣＤ５−Ｔ細胞前駆体に分化する。
【０１５８】
１０日間の培養後に得られた細胞の表面に存在する表面マーカーもまた、フローサイトメトリーにより決定された。
ＣＤ１ａの発現は見いだされなかった（データ不図示）。
【０１５９】
表面マーカーの修飾の動態を試験し、培養培地におけるＴＮＦ−αの存在が、４日目から最大７日目までＣＤ７＋の割合を増大させることが見いだされた（データ不図示）。
【０１６０】
実施例４．Ｔ細胞受容体の再編成
ＤＬ−４Ｔ細胞前駆体は、７日間の培養後に、ＴＮＦ−αまたはＳＲ１を伴うかまたは伴わない場合であっても、ＴＣＲの再編成の兆候を全く呈さなかった（データ不図示）。
【０１６１】
再編成の具体的な解析を行った：
ＴＣＲδの再編成の結果
ＣＢ−ＮＣおよびＣＢ−ＳＲ１におけるＤδ２−Ｄδ３再編成の検出。他のＴＣＲδの再編成は検出されなかった。結果は、ＲＱ−ＰＣＲ定量化によるものであった。
【０１６２】
ＴＣＲγの再編成の結果
ＴＣＲγの再編成は、検出されなかった。
【０１６３】
ＴＣＲβの再編成の結果
ＴＣＲβの再編成の結果は検出されなかった
【０１６４】
実施例５：ＴＮＦ−α誘導性Ｔ細胞前駆体のＴの関与
Ｂｃｌ１１ｂは、Ｔ細胞の関与から固有に活性となる重要な転写因子であり、Ｔ細胞の分化に絶対に必要である。
【０１６５】
ＴＮＦ−αと共に培養したＴ細胞前駆体の細胞内染色は、臍帯血からもたらされるＣＤ３４＋細胞およびｍＰＢからもたらされるＣＤ３４＋細胞の両方で、Ｂｃｌ１１ｂの陽性発現を示した。図３は、ＴＮＦ−αが、Ｂｃｌ１１ｂ転写因子を発現する細胞の総計の割合を増大させることを示している。ＴＮＦ−αと共に培養した場合、細胞を発現するＢｃｌ１１ｂの割合は増大した。
【０１６６】
実施例６：他の系列に関する分化
他の系列に特異的な他の細胞表面マーカー（ＣＤ１４およびＣＤ３３）の存在を評価した。
【０１６７】
図５は、ＴＮＦ−αの存在下での培養がこのような細胞を検出できなくし、この割合は、ＣＤ３４＋細胞をＴＮＦ−αを用いずに培養した場合２２％未満であることを示している。
【０１６８】
実施例７：ＴＮＦ−αは、細胞のアポトーシスを低減する
アポトーシスマーカー（７ＡＡＤおよびＡｎｎｅｘｉｎ５）を試験した。
【表３】
2020513844.tif 000005
【０１６９】
この表は、ＴＮＦ−αの存在下の培養物が、アポトーシスマーカーの存在を低減することを示している。このことは、特にｍＰＢで明らかである。
【０１７０】
実施例８：ＴＮＦ−αの用量応答アッセイ
様々な用量のＴＮＦαを使用した。
【０１７１】
図６は、ＴＮＦαが、ＣＢ細胞（図６Ａ）またはｍＰＢ細胞（図６Ｂ）のいずれかで、濃度が１０ｎｇ／ｍｌ超の場合に、培養中にＣＤ７＋の細胞数を増加させ得ることを示している。
【０１７２】
用量応答の動態は、ＴＮＦ−αが、わずか４日間のＤＬ−４における培養後に、Ｔ細胞の分化を増大させることを示している。濃度１０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、および１００ｎｇ／ｍｌの間では、差異は存在しなかった（不図示）。
【０１７３】
有効な濃度の閾値を決定するために、より低い濃度（０．０１〜１０ｎｇ／ｍｌ
の解析を行った。
【０１７４】
Ｔ細胞の分化に及ぼすＣＢおよびｍＰＢでのＴＮＦ−αの作用（ＣＤ３４−ＣＤ７＋細胞のパーセンテージ）が、低い濃度では濃度依存的であることが見いだされた（図７）。ＣＤ７＋Ｔ細胞前駆体の総数は、５ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌで異なってはいなかった。
【０１７５】
実施例９：培養中の増殖解析
ＴＮＦ−αは、ＴＮＦ−αを用いない培養条件と比較して、ＤＬ−４培養の３日目から、ＣＤ３４＋ＣＤ７＋Ｔ細胞前駆体の増殖を増大させることが見いだされた（データ不図示）。
【０１７６】
実施例１０：ＴＮＦ−αとＮｏｔｃｈリガンドとの間の相乗作用
図４は、ＤＬ４を用いない場合に、ＣＢおよびｍＰＢが両方とも、ＣＤ７＋Ｔ細胞前駆体へ分化しなかったことを示している。さらにはＴＮＦ−αを用いた培地の補充は、これを回復することができなかった。
【０１７７】
ＴＮＦ−αおよびＮｏｔｃｈリガンドの両方が存在する場合、観察される作用は、著しく高い。よって、これら２つの化合物の間に相乗作用が存在することと、Ｔ細胞の分化に及ぼすＴＮＦ−αの作用が恐らくはＮｏｔｃｈに依存していることとが、想定される。
【０１７８】
実施例１１：ＴＮＦ−αの添加は、ＣＤ７＋前駆体の増殖を増大させる。
ＴＮＦ−αの存在下での７日間の培養の後、ＣＤ３４＋ＣＤ７−、ＣＤ３４＋ＣＤ７＋、およびＣＤ３４−ＣＤ７＋のサブセットを選別し、ＣＦＳＥ（カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル）で染色し、その後、８日目〜１０日目に、ＣＦＳＥ（細胞増殖のサロゲートマーカー）の希釈を行った。
【０１７９】
ＣＤ３４＋ＣＤ７＋細胞およびＣＤ３４−ＣＤ７＋細胞のみが、ＴＮＦ−αと共に培養した際に、増殖の増大を示した（データ不図示）。
【０１８０】
実施例１２：細胞周期の解析
細胞周期の解析を行った。ＴＮＦ−αの存在下で、ＣＢに由来するＣＤ７＋前駆体およびｍＰＢ由来のＣＤ７＋前駆体の両方で、Ｇ０期からより多くの細胞が放出されたことが観察された（図８）。
【０１８１】
実施例１３：ＳＲ１およびＴＮＦαの併用
ＳＲ１は、７日目のＣＤ５＋ＣＤ７＋細胞の存在により示されるように、Ｔ細胞の分化を加速させる。ＣＤ５＋ＣＤ７＋細胞数は、ＴＮＦ−αおよびＳＲ１の両方の存在により、増大する（図９）。
【０１８２】
実施例１４：ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるデータ
ＴＮＦ−αの存在下で誘導されるＴ細胞前駆体は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＴ系列の再構成を著しく速めることが可能である。
【０１８３】
実際に、移植から４週間後に、ＴＮＦ−αの存在下で産生させたｍＰＢ由来のＴ細胞前駆体を注射したレシピエントのマウスは、ＴＮＦ−αを用いずに産生させたｍＰＢ由来のＴ細胞前駆体を注射したマウスよりも大きい胸腺を有している。ＴＮＦ−αの存在下で誘導させたＴ細胞前駆体は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて４週間以内に、活性化したＴＣＲαβ細胞に分化することができる（データ不図示）。
【０１８４】
まとめると、ＤＬ−４培養システムにおける０日目からのＴＮＦ−αの添加は、７日目に、ｍＰＢのＨＳＰＣでは４０倍およびＣＢのＨＳＰＣでは２０倍のＴ細胞前駆体の増加（ＣＤ７の表面の発現により定義）をもたらす。
【０１８５】
ＣＢおよびｍＰＢから産生されたＣＤ７＋Ｔ細胞前駆体の両方は、ほとんどがＣＤ３４−であり、ＣＤ１ａ陰性であった。また細胞は、ほとんどがＣＤ５陰性であった。
【０１８６】
これらは、Ｔ細胞の関与およびさらにはＴ細胞の分化に重要な微調整（ｆｉｎｅ−ｔｕｒｎｉｎｇ）分子である、Ｂｃｌ１１ｂを発現した。
【０１８７】
これらは、Ｔ細胞受容体の再編成の兆候を全く呈さなかった。
【０１８８】
これらの表現型および分子の特徴は、ＴＮＦ−αを伴わずに得られたＣＤ３４−ＣＤ７＋Ｔ細胞前駆体のうちの１つと類似していた。
【０１８９】
ＴＮＦ−αの作用に関与する機構で、ＴＮＦ−αは、アポトーシスマーカーの発現を減少させ、培養中の細胞増殖を増大させる。またこれは、骨髄細胞の産生を阻害する。
【０１９０】
ＤＬ−４培養システムにおけるＴＮＦ−αの使用は、ヒトの成体および臍帯血のＨＳＰＣから産生されるＴ細胞前駆体の両方の量を高い度合まで増加させる。よってこのことは、成体のＨＳＰＣ由来の、多量のＴ細胞前駆体を入手する難しさを打開することが可能である。またこれは、将来の臨床試験で必要とされる開始時のＨＳＰＣの数、およびＧＭＰグレードの量、および必要とされる他の試薬を減少させ、よって、これらＴ細胞前駆体の生産の費用を下げることが可能である。
【図１】
2020513844.tif 000006
【図２】
2020513844.tif 000007
【図３】
2020513844.tif 000008
【図４】
2020513844.tif 000009
【図５】
2020513844.tif 000010
【図６】
2020513844.tif 000011
【図７】
2020513844.tif 000012
【図８】
2020513844.tif 000013
【図９】
2020513844.tif 000014
【手続補正書】
【提出日】令和1年11月5日(2019.11.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔ細胞前駆体を産生させるためのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法であって、ＴＮＦ−αおよび／または芳香族炭化水素／ダイオキシン受容体の拮抗剤、特にはＳｔｅｍＲｅｇｅｎｉｎ  １（ＳＲ１）を含む培地において、固定したＮｏｔｃｈリガンドの存在下でＣＤ３４＋細胞を培養するステップを含み、好ましくはＮｏｔｃｈリガンドが、培養容器の内面または前記培養培地に存在するビーズの表面に固定されている、方法。
【請求項２】
ＴＮＦ−αおよび／または芳香族炭化水素／ダイオキシン受容体の拮抗剤が、前記培養の０日目から、前記培養培地に存在しており、好ましくはＴＮＦ−αが、３ｎｇ／ｍｌ以上の濃度で存在しており、かつ／または芳香族炭化水素／ダイオキシン受容体の拮抗剤が、前記培養培地に３０ｎｇ／ｍｌ以上の濃度で存在している、請求項１に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法。
【請求項３】
前記ＣＤ３４＋細胞が、成体のドナーから単離されている、請求項１または２に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法。
【請求項４】
前記細胞を、最大１０日間、好ましくは３〜７日間、ＴＮＦ−αおよび／またはＳＲ１の存在下で培養する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法。
【請求項５】
Ｎｏｔｃｈリガンドが、ＩｇＧタンパク質、好ましくはＩｇＧ２タンパク質のＦｃ領域に融合した、デルタ様４リガンドの可溶性ドメインである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法。
【請求項６】
前記細胞を同様にフィブロネクチンフラグメントに曝露し、前記フラグメントが、ＲＧＤＳパターンおよびＣＳ−１パターン、ならびにヘパリン結合ドメインを含み、好ましくは前記培養容器の内面またはビーズに固定されており、好ましくは前記フィブロネクチンフラグメントが、Ｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（登録商標）である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法。
【請求項７】
前記培養培地が、ＮｏｔｃｈリガンドにＣＤ３４＋細胞を曝露する少なくともある時点で、ＣＤ３４＋細胞のトランスフェクションまたは形質導入を目的とするベクターをも含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法。
【請求項８】
ＣＤ３４＋細胞のトランスフェクションまたは形質導入を目的とするベクターが、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするトランスジーンである、請求項７に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法。
【請求項９】
Ｔ細胞前駆体を入手するための方法であって、
ａ．請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法を行うステップと、
ｂ．前記産生させたＴ細胞前駆体を精製するステップと、
ｃ．任意選択で、患者への注射用のパウチにおいて、前記Ｔ細胞前駆体を条件付けするステップと
を含む、方法。
【請求項１０】
形質転換したＴ細胞前駆体を入手するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法であって、
ａ．ＴＮＦ−αを含む培地において、固定したＮｏｔｃｈリガンドの存在下でＣＤ３４＋細胞を培養するステップと、
ｂ．前記細胞を、ＣＤ３４＋細胞のトランスフェクションまたは形質導入を目的とするベクターに曝露するステップと
を含む、方法。
【請求項１１】
改変したＴ細胞前駆体を入手するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法であって、
ａ．ＴＮＦ−αを含む培地において、固定したＮｏｔｃｈリガンドの存在下でＣＤ３４＋細胞を培養するステップと、
ｂ．前記細胞を、遺伝子編集に適切なエレメントを含むベクターまたは核酸配列に曝露するステップと
を含む、方法。
【請求項１２】
ＣＤ７＋Ｔ細胞前駆体の集団であって、
この集団においてＣＤ３４−およびＣＤ１ａ−であるか、またはＣＤ３４−およびＣＤ５−であるか、ＣＤ３４−およびＣＤ１ａ−およびＣＤ５−である細胞の割合が８０％超である、
集団。
【請求項１３】
ＣＡＲを発現する、請求項１２に記載のＣＤ７＋Ｔ細胞前駆体の集団。
【請求項１４】
請求項１２または１３に記載のＴ細胞前駆体の集団を含む、静脈内注射用のパウチ。
【請求項１５】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法を行うためのキットであって、
（ｉ）Ｎｏｔｃｈのリガンド、および任意選択でフィブロネクチンフラグメントを含むコーティング培地と、
（ｉｉ）ＣＤ３４＋細胞およびＴ細胞を培養するように適合させた培地と、
（ｉｉｉ）ＴＮＦ−α、ならびに／または芳香族炭化水素／ダイオキシン受容体の拮抗剤、ならびに好ましくはＳＣＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ−７からなる群から選択される３つまたは４つのサイトカインを含む前駆体増殖培地と
を含む、キット。
【請求項１６】
その必要がある対象においてＴ細胞の数を増加させるため、好ましくはリンパ球減少症を治療するため、より好ましくは、癌、ＨＩＶ感染、部分的な胸腺切除、自己免疫疾患、および／または臓器移植を治療するための、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法により得られる前駆体Ｔ細胞、または請求項１２もしくは１３に記載の前駆体Ｔ細胞。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2020513844000001.app
【国際調査報告】
2020513844.tif 000015
2020513844.tif 000016
2020513844.tif 000017
2020513844.tif 000018