(57)【要約】  本発明は治療、特に皮膚科の分野に関する。本発明者らは、本明細書において、それを必要とする対象において皮膚色素脱失障害を予防、処置、又は軽減するための使用のための活性分子としてマトリックスメタロプロテイナーゼ−９（ＭＭＰ９）のインヒビターを初めて同定し、そのようなインヒビターを含む組成物及びキット、ならびにそれらの使用を記載する。本発明者らはさらに、色素脱失障害を予防、処置、又は軽減するための適切な医薬活性分子をスクリーニングするための方法、ならびにＭＭＰ９のインヒビターを含む色素脱失障害処置の有効性を評価するため又はそのような処置に曝露された対象において色素脱失障害の経過をモニターするための方法を記載する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
それを必要とする対象において色素脱失障害を予防、処置、又は軽減するための使用のためのマトリックスメタロプロテイナーゼ−９（ＭＭＰ９）のインヒビター。
【請求項２】
インヒビターが、メラニン形成細胞を表皮の基底膜に安定化させる、請求項１記載の使用のためのインヒビター。
【請求項３】
インヒビターが、抗体、アプタマー、スピーゲルマー、阻害性核酸配列、２−［［（４−フェノキシフェニル）スルホニル］メチル］−チイラン、２−（Ｎ−ベンジル−４−メトキシフェニルスルホンアミド）−５−（（ジエチルアミノ）メチル）−Ｎ−ヒドロキシ−３−メチルベンズアミド、及びＮ−｛２−［（２−メトキシフェニル）アミノ］−４’−メチル−４，５’−ビ−１，３−チアゾール−２’−イル｝アセトアミドより選択される、請求項１又は２記載の使用のためのインヒビター。
【請求項４】
インヒビターが、配列番号２、３、もしくは４の配列を含むか又はそれらからなる重鎖可変領域、及び／又は配列番号５の配列を含むか又はそれらからなる軽鎖を含む抗ＭＭＰ９抗体、ＧＳ−５７４５（アンデカリキシマブ）及びＣＡＬＹ−００１からなる群より選択される、請求項３記載の使用のためのインヒビター。
【請求項５】
色素脱失障害が、炎症性皮膚疾患に付随する、請求項１〜４のいずれか一項記載の使用のためのインヒビター。
【請求項６】
炎症性皮膚疾患が、白斑、乾癬、アトピー性皮膚炎、強皮症、ハイポメラノース及び白毛症より選択される、請求項５記載の使用のためのインヒビター。
【請求項７】
色素脱失障害又は炎症性皮膚疾患が、白斑である、請求項１〜６のいずれか一項記載の使用のためのインヒビター。
【請求項８】
組成物が、それを必要とする対象において色素脱失障害を予防、処置、又は軽減するため、特にそれ必要とする対象において色素脱失を予防、処置、又は軽減するため、或いは色素脱失した皮膚を再着色するための使用のための、ＭＭＰ９のインヒビターを含む医薬組成物。
【請求項９】
組成物が、単独で、又は光線療法との、もしくはヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）インヒビター及びカルシニューリンインヒビターより選択される薬物との組み合わせにおいて使用される、請求項８記載の医薬組成物。
【請求項１０】
方法が、ＭＭＰ９発現又は機能を阻害する、ＭＭＰ９及びヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）の両方の発現又は機能、特にＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＴＹＫ２及びそれらの任意の組み合わせより選択されるＪＡＫの発現又は機能を阻害してメラニン産生及び／又はメラニン細胞機能を誘導する、Ｅ−カドヘリンを切断する、可溶性Ｅ−カドヘリン発現を増加させる、Ｅ−カドヘリンの細胞質内再分布を増加させる、膜結合Ｅ−カドヘリンを再局在化させる、並びに／或いはメラニン細胞を表皮の基底膜に安定化させるテスト分子の能力を評価する工程を含み、前記能力は、テスト分子が、それを必要とする対象において、色素脱失障害を予防、処置、又は軽減するために適切な医薬活性分子であることを示す、それを必要とする対象において色素脱失障害を予防、処置、又は軽減するために適切なインビトロ又はエクスビボの医薬活性分子をスクリーニングするための方法。
【請求項１１】
方法が、ｔ０で対象から採取した第１の生物学的サンプル中の可溶性Ｅ−カドヘリンの発現を、ｔ０で前記対象から採取した第２の生物学的サンプル中の可溶性Ｅ−カドヘリンの発現と比較する工程を含み、ｔ１はｔ０よりも後であり、ｔ１で採取したサンプル中の可溶性Ｅ−カドヘリンの発現の増加は、前記対象における色素脱失障害の進行の指標であり、ｔ１で採取されたサンプル中の可溶性Ｅ−カドヘリンの発現の減少は、前記対象における色素脱失障害の後退の指標である、対象において色素脱失障害を処置するためのＭＭＰ９のインヒビターを含む処置の有効性を評価するための方法。
【請求項１２】
その任意の処置の前に色素脱失障害を有すると同定された対象からの第１の生物学的サンプル中の可溶性Ｅ−カドヘリンの発現を、色素脱失障害を処置するための薬物又は組成物に曝露された同じ対象の第２の生物学的サンプル中の可溶性Ｅ−カドヘリンの発現と比較することを含み、第２の生物学的サンプル中の可溶性Ｅ−カドヘリンの発現における減少は、色素脱失障害を処置又は減弱するための薬物又は組成物の有効性の指標であり、第２の生物学的サンプル中の可溶性Ｅ−カドヘリンの発現における増加又は発現の調節の非存在は、色素脱失障害を処置又は減弱するための薬物又は組成物の無効性の指標である、ＭＭＰ９のインヒビターを含む処置に曝露された対象における色素脱失障害の経過をインビトロ又はインビボでモニターするための方法。
【請求項１３】
対象がヒトである、請求項１〜７のいずれか一項記載の使用のためのインヒビター、請求項８もしくは９のいずれかに記載の使用のための医薬組成物、請求項１０記載のスクリーニングのための方法、或いはＭＭＰ９のインヒビターを含む処置の効率を評価するため、又は請求項１１もしくは１２に記載の対象における色素脱失障害の経過をインビトロ又はエクスビボでモニターするための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は治療の分野、特に皮膚科に関する。本発明者らは本明細書において、それを必要とする対象において、皮膚色素脱失障害、典型的には皮膚色素脱失を予防、処置、又は軽減するための使用のための活性分子としてマトリックスメタロプロテイナーゼ−９（ＭＭＰ９）のインヒビターを初めて同定し、そのようなインヒビターを含む組成物及びキットならびにそれらの使用を記載する。本発明者らはさらに、色素脱失障害、典型的には皮膚色素脱失を予防、処置、又は軽減するために適切な医薬活性分子をスクリーニングするための方法、ならびにＭＭＰ９のインヒビターを含む色素脱失障害の処置の有効性を評価するための又はそのような処置に曝露された対象において色素脱失障害の経過をモニターするための方法を記載する。
【０００２】
背景
白斑は最も一般的な皮膚色素脱失障害である。白斑の推定有病率は、世界人口の約０．５％から１％である。男女とも等しく罹患し、肌のタイプ又は人種に従った発生率における明らかな差はない。それは、表皮メラニン細胞、色素産生細胞の喪失から生じる対称性及び両側性の白斑により臨床的に特徴付けられる。
【０００３】
いくつかの機構（遺伝的素因、環境要因（例えば摩擦など）、代謝変化、ならびに変化した炎症反応及び免疫反応を含む）が、メラニン細胞の消失を説明するために関係づけられてきた。白斑は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方を含む自己免疫成分に付随する皮膚の後天性慢性色素脱失障害として記載されている。しかし、エフェクターメモリーＴ（ＴＥＭ）細胞サブセットの表現型及び寄与は、疾患のモデルにおける広範な分析の欠如のため、今日まで不明確で議論の余地が残ったままである。
【０００４】
いくつかの炎症性皮膚疾患／皮膚炎（例えば乾癬、アトピー性皮膚炎、強皮症、典型的には皮膚強皮症、ハイポメラノース（ｈｙｐｏｍｅｌａｎｏｓｅ）、及び白毛症など）は、他の症状の中でも、色素脱失に導く、又はそれに付随する。
【０００５】
白斑は特に、重度の社会的及び心理的影響を伴う非難される疾患である。純粋に美的なものとしてしばしば見られるが、この障害は実際に、時には他の慢性疾患（例えば、うつ病など）と同等の、生活の質の重大な障害に関与している。さらに、白斑を伴う患者はしばしば、他の慢性炎症性疾患（例えば自己免疫性甲状腺炎、関節リウマチ、及び炎症性腸疾患など）を呈する。しかし、その有病率及び影響にもかかわらず、具体的な根治的介入はこれまで報告されていない。今日まで、色素脱失に対する処置の有効性は実証されていない。また、色素脱失又は皮膚の色素再沈着、好ましくは根治的な皮膚色素再沈着の遮断を可能にする処置はない。現在の処置は全体的に限られた有効性を有しており、局所用ステロイド又はカルシニューリンインヒビター、全身用ステロイド、及び／又はＵＶ光を含み（Cochrane Database Syst Rev. 2015 Feb 24;(2):CD003263. doi: 10.1002/14651858.CD003263.pub5. Interventions for vitiligo. Whitton ME1, Pinart M, Batchelor J, Leonardi-Bee J, Gonzales U, Jiyad Z, Eleftheriadou V, Ezzedine K., and JAMA. 2016 Oct 25;316(16):1708-1709. doi: 10.1001/jama.2016.12399. Interventions for Vitiligo. Ezzedine K1, Whitton M2, Pinart M3.）、それらの全てが潜在的な長期的副作用を有する。
【０００６】
発明の簡単な説明
本発明者らは本明細書において、色素脱失障害に特に関与する治療標的としてマトリックスメタロプロテイナーゼ−９（ＭＭＰ９）を同定し、それを必要とする対象における、色素脱失障害を予防又は処置するための使用のための／色素脱失障害、特に皮膚の色素脱失を誘導する障害、典型的には皮膚色素脱失の予防又は処置における使用のための活性分子としてのそのインヒビターを初めて記載する。
【０００７】
本明細書に記載する目的は、このように、それを必要とする対象における、色素脱失障害を予防、処置、又は軽減するための使用のための／色素脱失障害、典型的には皮膚色素脱失の予防、処置、又は軽減における使用のためのマトリックスメタロプロテイナーゼ−９（ＭＭＰ９）のインヒビター、又はそのようなインヒビターを含む組成物もしくはキットに関する。組成物及びキットは、好ましくは、医薬的に許容可能な賦形剤、担体、又は支持体を一緒に伴うＭＭＰ９のインヒビターを含む。
【０００８】
本発明者らはさらに、目的の新規薬物を同定し、医薬組成物、特に色素脱失を予防することが可能な、例えば表皮メラニン細胞の喪失を予防する及び／又はメラニン細胞を表皮の基底膜に安定化させることが可能な組成物を調製するための調節分子のスクリーニングのための方法を記載する。本明細書に記載する特定の方法は、それを必要とする対象において、色素脱失障害、典型的には皮膚色素脱失を予防、処置、又は軽減するために適切な医薬活性分子を典型的にはインビトロ又はエクスビボでスクリーニングするための方法であり、それにおいて、方法は、ＭＭＰ９発現又は機能を阻害する、ＭＭＰ９及びヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）の両方の発現又は機能、特にＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＴＹＫ２、及びそれらの任意の組み合わせより選択されるＪＡＫの発現又は機能を阻害してメラニン産生及び／又はメラニン細胞機能を誘導する、Ｅ−カドヘリンを切断する、可溶性Ｅ−カドヘリン発現を増加させる、Ｅ−カドヘリンの細胞質内再分布を増加させる、膜結合Ｅ−カドヘリンを再局在化させる、並びに／或いはメラニン細胞を表皮の基底膜に安定化させるテスト分子の能力を評価する工程を含み、前記能力は、テスト分子が、それを必要とする対象において、色素脱失障害、典型的には皮膚色素脱失を予防、処置、又は軽減するために適切な医薬活性分子であることを示す。
【０００９】
また、本明細書に記載するのは、対象において、色素脱失障害、典型的には皮膚色素脱失を処置するためのＭＭＰ９のインヒビターを含む処置の有効性を評価するための方法であり、それにおいて、方法は、ｔ０で対象から採取した第１の生物学的サンプル中の可溶性Ｅ−カドヘリンの発現を、ｔ０で前記対象から採取した第２の生物学的サンプル中の可溶性Ｅ−カドヘリンの発現と典型的にはインビトロ又はエクスビボで比較する工程を含み、ｔ１はｔ０よりも後であり、ｔ１で採取したサンプル中の可溶性Ｅ−カドヘリンの発現の増加は、前記対象における色素脱失障害の進行の指標であり、ｔ１で採取されたサンプル中の可溶性Ｅ−カドヘリンの発現の減少は、前記対象における色素脱失障害の後退の指標である。
【００１０】
本明細書においてさらに記載するのは、モニターするための、典型的にはＭＭＰ９のインヒビターを含む処置に曝露された対象における色素脱失障害、典型的には皮膚色素脱失の経過をインビトロ又はインビボでモニターするための方法であって、その任意の処置の前に色素脱失障害を有すると同定された対象からの第１の生物学的サンプル中の可溶性Ｅ−カドヘリンの発現を、色素脱失障害を処置するための薬物又は組成物に曝露された同じ対象の第２の生物学的サンプル中の可溶性Ｅ−カドヘリンの発現と比較することを含み、第２の生物学的サンプル中の可溶性Ｅ−カドヘリンの発現における減少は、色素脱失障害を処置又は減弱するための薬物又は組成物の有効性の指標であり、第２の生物学的サンプル中の可溶性Ｅ−カドヘリンの発現における増加又は発現の調節の非存在は、色素脱失障害を処置又は減弱するための薬物又は組成物の無効性の指標である。
【００１１】
発明の詳細な説明
皮膚は、生物とその環境の間の保護的境界面を提供する大きく複雑な組織である。表皮はその外表面を形成し、主にケラチノサイトと呼ばれる特殊化された上皮細胞の複数の層で構成されている。メラニン細胞は、表皮の最下層に位置するメラニン産生細胞であり、メラニン（主に皮膚の色に関与する色素）の産生に関与する。皮膚は、多くの異なる原因（微生物、化学物質、行動、物理的損傷、加齢、紫外線照射、癌、自己免疫疾患又は炎症性疾患を含む）により損傷されうる。
【００１２】
表皮メラニン細胞の喪失及び／又は表皮メラニン細胞の機能的異常の検出（例えば表皮の基底膜へのメラニン細胞接着の異常、メラノサイトの増殖異常、炎症性タンパク質分泌の増加、メラニンの異常、及び／又はケラチノサイトへのメラノソーム移行など）は、皮膚色素脱失に関連する障害の病原性の特徴である。白斑は最も一般的な色素脱失疾患であり、メラニン細胞の完全な喪失に付随する。白斑の開始に関与する要因は大部分が未知のままであるが、しかし、遺伝的素因及び環境的誘因（例えば摩擦など）を含む可能性が高い。しかし、メラニン細胞の喪失に導く機構は依然として議論中である。いくつかの理論が提案されてきた。メラニン細胞の変性及び／又は増殖の障害に導く白斑におけるメラニン細胞固有の異常は、この疾患がメラニン細胞の一次欠陥に起因しうるとの仮説を支持する。しかし、他の観察は、特に白斑の慢性期及び進行期における自己免疫系の役割を強く支持する。ゲノムワイド関連試験は、白斑感受性遺伝子座の９０％が免疫系の構成要素をコードすることを示した。さらに、白斑はしばしば自己免疫疾患に関連付けられ、自然免疫細胞及び適応免疫細胞の両方が患者の罹患皮膚において見出される。メラニン細胞の喪失は、メラニン細胞特異的な細胞傷害性免疫反応を通じた（主にＣＤ８＋細胞を通じた）細胞破壊、及び／又はメラニン細胞流出（ｍｅｌａｎｏｃｙｔｏｒｒｈａｇｙ）とも呼ばれる欠陥接着系を通じたメラニン細胞の剥離からもたらされうる。Ｅ−カドヘリンは、表皮におけるヒトメラニン細胞接着の主要な媒介物質であり、白斑患者のメラニン細胞膜にわたって存在しないか又は不連続に分布していることが最近示された。そのような変化は、表皮の基底層からのメラニン細胞の剥離及びそれに続くそれらの喪失に関与する。
【００１３】
Ｅ−カドヘリンはカルシウム依存性Ｉ型１回膜貫通糖タンパク質であり、上皮細胞中の接着接合部及び側底膜に局在するカドヘリンスーパーファミリーのメンバーである。細胞外部分は、カルシウムイオンを結合して硬化した直鎖状分子を形成する５つの細胞外カドヘリンドメインリピートを含む。細胞質ドメインは、カテニン及び種々のアクチン結合タンパク質と相互作用し、アクチン細胞骨格及び細胞内シグナル伝達経路の調節のために重要なカドヘリン−カテニン複合体を固着する。Ｅ−カドヘリンの切断は、マトリックスメタロプロテイナーゼＭＭＰ（ＭＭＰ３、ＭＭＰ７、ＭＭＰ９、及びＭＴ１−ＭＭＰ）、Ａ−デインテグリン及びメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭ１０及びＡＤＡＭ１５）、プラスミン及びカリクレイン７を含むいくつかのプロテアーゼにより誘導され、成熟１２０kDa  Ｅ−ｃａｄを、細胞外Ｎ末端８０kDAフラグメント及び細胞内Ｃ末端３８kDaフラグメントに変換する。
【００１４】
本発明者らは、本明細書において、皮膚色素脱失障害に特に関与する治療標的としてＭＭＰ９を記載し、それを必要とする対象において、色素脱失障害、特に皮膚の色素脱失を誘導する障害、典型的には皮膚色素脱失を予防、処置、又は軽減するための使用のための活性分子として、そのインヒビターを初めて有利に同定する。
【００１５】
本記載の実験部分において、本発明者らは、進行性白斑においてＴＮＦα及びＩＦＮγを発現する皮膚炎症性Ｔ細胞の浸潤、ならびに増加したマトリックスメタロプロテイナーゼ−９（ＭＭＰ９）発現を通じたメラニン細胞喪失におけるＴＮＦα及びＩＦＮγの関与を実証しており、それはＥ−カドヘリンの機能不全及び可溶性Ｅ−カドヘリンの放出に導きうる。本発明者らは特に、ＴＮＦβがメラニン細胞におけるＭＭＰ９遺伝子の発現を上方制御し、この効果はまた、ＩＦＮγの存在において驚くほど増強されることを示した。また、本発明者らは、ＴＮＦβがケラチノサイトにおいてＭＭＰ９遺伝子の発現を上方制御することを示した。
【００１６】
マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）ファミリーは、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）のリモデリング及び種々の生物活性分子の機能的調節に広く関与する少なくとも２３の構造的に関連した可溶性又は膜結合亜鉛依存性エンドペプチダーゼからなる。全てのＭＭＰは、ＭＭＰを不活性形態に維持するプロドメイン及び幅広い細胞外マトリックス成分に作用する触媒ドメインを含むプロトタイプ構造を持つ。
【００１７】
マトリックスメタロペプチダーゼ９（ＭＭＰ−９）は、９２kDa  ＩＶ型コラゲナーゼ、９２kDaゼラチナーゼ又はゼラチナーゼＢ（ＧＥＬＢ）としても公知であり、細胞外マトリックスの分解に関与する亜鉛−メタロプロテイナーゼファミリーに属する酵素の一種であるマトリキシンである。ヒトにおいて、ＭＭＰ９遺伝子は、シグナルペプチド、プロペプチド、フィブロネクチンＩＩ型ドメインの３つの挿入リピートを伴う触媒ドメイン、続くＣ末端ヘモペキシン様ドメインをコードする。
【００１８】
ＭＭＰファミリーのタンパク質は、正常な生理学的プロセス（例えば胚発生、生殖、血管形成、骨発生、創傷治癒、細胞遊走、学習及び記憶など）、ならびに病理学的プロセス（例えば関節炎、脳内出血、及び転移など）における細胞外マトリックスの破壊に関与する。大半のＭＭＰは、細胞外プロテイナーゼにより切断された場合に活性化される不活性プロタンパク質として分泌される。この遺伝子によりコードされる酵素は、ＩＶ型及びＶ型コラーゲンならびに他の細胞外マトリックスタンパク質を分解する。
【００１９】
本発明者らは現在、色素脱失障害における、特に炎症に付随する色素脱失障害における、典型的には皮膚色素脱失障害におけるＭＭＰ９の役割を明らかにし、それを必要とする対象において色素脱失障害、典型的には皮膚色素脱失を予防、処置、又は軽減するための、或いはそれを必要とする対象においてそのような色素脱失障害を予防、処置、又は軽減するための医薬組成物、典型的には皮膚科組成物の調製のためのＭＭＰ９のインヒビターの使用を初めて記載する。
【００２０】
それを必要とする対象において色素脱失障害を予防、処置、又は軽減するための使用のためのマトリックスメタロプロテイナーゼ−９（ＭＭＰ９）のインヒビターを本明細書において有利に記載する。このＭＭＰ９のインヒビターは、ＭＭＰ９の直接的なインヒビターである。用語「直接的なインヒビター」は、インヒビターがＭＭＰ９に直接作用する（その阻害作用を発揮する）こと、又は言い換えれば、インヒビターが中間の異なる化合物を介してＭＭＰ９に作用しないことを示す。
【００２１】
好ましい態様では、ＭＭＰ９インヒビターは、任意のＭＭＰ２インヒビターの非存在における本発明の状況において使用する。
【００２２】
本発明の状況において、ＭＭＰ９インヒビターは典型的にはＭＭＰ９の生物学的活性を減少又は中和する。以前に示したように、このＭＭＰ９のインヒビターはＭＭＰ９の直接的なインヒビターである。これは、インヒビターが典型的にはＭＭＰ９の生物学的活性を直接的に減少又は中和すること、又は言い換えると、ＭＭＰ９が減少又は中和した生物学的活性が中間体化合物、例えばＰＫＣα及び／又はＥＲＫリン酸化或いはＮＦ−κＢ及び／又はＡＰ−１活性化を阻害又は低下させる化合物など（「ＭＭＰ９の間接的なインヒビター」）の作用の結果ではないことを意味する。特定の態様では、ＭＭＰ９インヒビターはピペリン（ＰＩＰ）ではない。
【００２３】
ＭＭＰ９インヒビターは特に、メラニン細胞を表皮の基底膜に安定化させる。言い換えれば、前記インヒビターのおかげで、色素脱失障害（例えば白斑など）に典型的なメラニン細胞喪失は、有意に低下するか又はもはや観察されないかのいずれかである。
【００２４】
ＭＭＰ９インヒビターは、典型的には、「剥離した」メラニン細胞、即ち、表皮の基底層から及び／又は近接／隣接するケラチノサイトから剥離したメラニン細胞の数を有意に低下させる。ＭＭＰ９のインヒビターに暴露された／それを用いて処置された典型的な皮膚において、「剥離した」メラニン細胞は、存在するメラニン細胞の少数、即ち、存在するメラニン細胞の５０％未満、例えば４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、又は１％未満を表す。
【００２５】
メラニン細胞の数は簡単に計数することができ、基底層から剥離したメラニン細胞の割合は、当業者により従来の顕微鏡法及び当技術分野のマーキング／標識方法を使用して簡単に決定することができる。
【００２６】
そのようなインヒビターを使用することは、また、死んだ（又はアポトーシスの）メラニン細胞、特に罹患した色素脱失皮膚において典型的に観察される破壊されたメラニン細胞のパーセンテージを有意に減少させることができる。
【００２７】
そのようなインヒビターを使用することはまた、皮膚色素脱失を処置し、典型的には及び好ましくは皮膚の色素再沈着を促す。メラニン（皮膚の着色に関与するメラニン細胞により産生される色素）の濃度の増加は、当業者により簡単に観察及び測定されることができる（Luna, L. G., ed. (1968) in Manual of the Histologic Staining Methods of the AFIP (McGraw-Hill, New York), pp. 104-105.; Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 Oct 19;101(42):15076-81. Epub 2004 Oct 11. Melanin acts as a potent UVB photosensitizer to cause an atypical mode of cell death in murine skin. Takeuchi S1, Zhang W, Wakamatsu K, Ito S, Hearing VJ, Kraemer KH, Brash DE.）。
【００２８】
好ましくは、ＭＭＰ９のインヒビターは、また、ケラチノサイト接触及び細胞接着を強化することにより皮膚バリアを安定化させる。
【００２９】
ＭＭＰ９インヒビターの医薬的作用は、対象の生物学的皮膚サンプル（生検）中でのｉ）メラニン細胞マスター転写因子（ＭＩＴＦ）、チロシナーゼ（ＴＹＲ）、カドヘリン−１（Ｅ−カドヘリン（ＣＤＨ１）としても公知である）、ドーパクロムトートメラーゼ（ＤＣＴ）、チロシナーゼ関連タンパク質１（ＴＲＰ１）、結合組織成長因子（ＣＣＮ２）、腎芽細胞腫過剰発現（ＣＣＮ３）、ならびにジスコイジンドメイン受容体ファミリー、メンバー１（ＤＤＲ１）遺伝子及び／又はタンパク質の、好ましくはＤＣＴ遺伝子又はタンパク質の発現の増加により、ｉｉ）Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカイン受容体３（ＣＸＣＲ３）リガンド、例えばＣ−Ｘ−Ｃモチーフケモカインリガンド９（ＣＸＣＬ９）及びＣ−Ｘ−Ｃモチーフケモカインリガンド１０（ＣＸＣＬ１０）などの発現の減少により、或いはｉｉ）インターロイキン−６（ＩＬ６）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、特にＴＮＦα、ならびに細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）遺伝子及び／又はタンパク質の発現の減少又は阻害によりさらに確認することができる。
【００３０】
本明細書中の上で同定したタンパク質又は遺伝子の発現の評価は、免疫組織化学／免疫蛍光法及びリアルタイムＰＣＲにより、それぞれ当業者により簡単に実施されることができる。ケモカインレベルはまた、無細胞上清中のＥＬＩＳＡにより評価することができる。
【００３１】
目的のＭＭＰ９インヒビターの例は、ＭＭＰ９に対して向けられた抗体、ＭＭＰ９に対して向けられたアプタマー又はシュピーゲルマー、ＭＭＰ９に対して向けられた阻害性核酸配列、及びＭＭＰ９に対して向けられた小分子である。
【００３２】
特定の実施形態では、ＭＭＰ９インヒビターは抗ＭＭＰ９抗体である。抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体、最も好ましくはモノクローナル抗体でありうる。それは種々のクラス（例、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭなど）でありうる。抗体は、種々の動物起源、又はヒトもしくはヒト化又は合成もしくは組換え体でありうる。さらに、用語「抗体」はまた、それらのフラグメント及び誘導体、特に実質的に同じ抗原特異性を有する前記モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体のフラグメント及び誘導体を含む。抗体フラグメントは、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’２、ＣＤＲなどを含む。誘導体は、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多機能抗体、一本鎖抗体（ＳｃＦｖ）などを含む。これらは、従来の方法（動物の免疫化及び血清（ポリクローナル）又は脾臓細胞（適当な細胞株との融合によりハイブリドーマを産生するため）の採取を含む）に従って産生されうる。
【００３３】
種々の種（マウス、げっ歯類、霊長類、ウマ、ブタ、ウサギ、家禽などを含む）からポリクローナル抗体を産生する方法は当業者に周知である。簡単には、抗原をアジュバント（例、フロイトのアジュバント）と組み合わせ、典型的には皮下注射により動物に投与する。反復注射を実施することができる。血液サンプルを採取し、免疫グロブリン又は血清を分離する。
【００３４】
上に列挙するような種々の種からモノクローナル抗体を産生する方法は、例えば、Harlow et al., 1988において又はKohler et al.1975において見出すことができ、参照により本明細書中に組み入れる。簡単には、これらの方法は、動物を抗原で免疫化することを含み、続いて脾臓細胞を回収し、これを次に不死化細胞（例えば骨髄腫細胞など）と融合させる。結果として得られたハイブリドーマはモノクローナル抗体を産生し、限界希釈により選択して個々のクローンを単離することができる。抗体はまた、例えばWard et al. (Nature 341 (1989) 544)に開示されるように、免疫グロブリンのコンビナトリアルライブラリーの選択により産生してもよい。
【００３５】
組換え抗体、又はそのフラグメントもしくは誘導体は、当技術分野においてそれ自体が公知の方法により、例えば、宿主細胞中での組換えにより、抗体の重鎖又は軽鎖をコードするヌクレオチド配列の発現及び／又は分泌を可能にする１つ又は複数のベクターを用いて形質転換することにより産生してもよい。ベクターは一般的に、プロモーター、翻訳開始シグナル、及び終結シグナル、ならびに適切な転写調節領域を含む。それは宿主細胞中で安定に維持され、場合により翻訳されたタンパク質の分泌のための特定のシグナルを持ってもよい。これらの異なる成分は、使用される宿主細胞に従って当業者により選択され、最適化される。
【００３６】
好ましい実施形態では、抗ＭＭＰ９抗体、そのフラグメント又は誘導体は、ヒトＭＭＰ９タンパク質（配列番号１）に結合する抗体、そのフラグメント又は誘導体である。そのような抗体の具体的な例はモノクローナル抗体を含む。好ましい実施形態では、抗ＭＭＰ９抗体、そのフラグメント又は誘導体は、ＭＭＰ９に選択的に結合する、即ち、典型的には異なるＭＭＰには結合しない抗体、そのフラグメント又は誘導体である。
【００３７】
他の抗体が、ＭＭＰ９タンパク質に対して見出される又は生成され、本発明において使用されうる。しかし、ＭＭＰ９中に存在するエピトープに結合し、前記結合がヒトＭＭＰ９タンパク質により少なくとも部分的に置換されている抗体、ならびに同じ抗原特異性を有するそのような抗体のフラグメント又は誘導体の使用が特に好ましいことに留意すべきである。
【００３８】
特定の実施形態では、ＭＭＰ９抗体は、ＷＯ２０１６／０２３９７２、ＷＯ２０１２／０２７７２１、ＷＯ２０１３／１３００７８、及びＷＯ２０１６／０２３９７９に開示されているものより選択する。好ましくは、ＭＭＰ９抗体は、配列番号２、３、もしくは４の配列を含む重鎖可変領域及び／又は配列番号５の配列を含む軽鎖を含む。
【００３９】
特定の実施形態では、ＭＭＰ９インヒビターは抗ＭＭＰ９アプタマーである。アプタマーは、所望の標的化合物又は分子に特異的に結合する特性を有し、多様な二次元及び三次元構造を形成するための十分な能力、ならびに単量体又は重合体を問わず、ファンデルワールス、水素結合、及び静電気結合を介した高い親和性を伴い、実質的に任意の化合物とリガンドとして作用する（特異的な結合対を形成する）ように（Pendergrast P.S. et al., 2005）、それらの単量体内で利用可能な十分な化学的多用途性を有する非コード一本鎖核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）である。任意のサイズ又は組成の分子が標的として役立ちうる。
【００４０】
アプタマーは、モノクローナル抗体及び単鎖抗体の親和性及び小型ペプチドのそれと類似した製造上の簡単さの両方を具体化する。動物試験では、類似の組成のアプタマー及び化合物が十分に許容され、低又は無免疫原性を示し、このように治療用化合物として反復投与のために適切であることが示されている（Floege et al., Am. J. Pathol. 1999, 154:169-179; Ostendorf et al., J. Clin. Invest. 1999, 104:913-923）。
【００４１】
アプタマーは、指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化（ＳＥＬＥＸ）プロセスを使用して同定されている［Tuerk C. and Gold L. (1990) Science 249: 505-510; Ellington AD ans Szostak JW. (1990) Nature 346: 818-822］。オリゴヌクレオチドのプール（１０１３〜１０１５の異なる配列）を標的と混合し、標的に連結されたものだけを選択する。これらのアプタマーを次に増幅し、以下のサイクルにおいて使用する。５〜１５の増幅工程の後、高親和性アプタマーを得る（Rimmelle M., 2003; Chauveau F. and al, 2006）。この技術は現在ロボット化されている。
【００４２】
ペプチドアプタマーは、２つのハイブリッド方法によりコンビナトリアルライブラリーより選択されるプラットフォームタンパク質（例えば大腸菌チオレドキシンＡなど）により呈される立体構造的に制約された抗体可変領域からなる（Colas et al., Nature, 1996,380, 548-50）。
【００４３】
特定の実施形態では、ＭＭＰ９アプタマーは、ＷＯ２０１５／１０１６３７に開示されているものより選択する。
【００４４】
ＭＭＰ９インヒビターはまた、抗ＭＭＰ９シュピーゲルマーでありうる。シュピーゲルマーは、例えばＷＯ９８／０８８５６において開示されている。それらはアプタマーと類似の分子である。しかし、シュピーゲルマーは、アプタマーとは対照的に、Ｄ−ヌクレオチドではなく、Ｌ−ヌクレオチドから完全に又は大部分がなる。その他の点では、特にシュピーゲルマーの可能な長さに関しては、アプタマーに関連して概説したのと同じことがシュピーゲルマーにも適用される。
【００４５】
別の特定の実施形態では、ＭＭＰ９に対して向けられた阻害性核酸配列は、本発明の状況においてＭＭＰ９インヒビターとして使用され、干渉ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、及びＭＭＰ９に対して向けられたスプライシング部位を遮断するオリゴヌクレオチドより選択する。
【００４６】
用語「干渉ＲＮＡ」は、標的タンパク質の発現を下方制御することが可能である任意のＲＮＡを意味する。それは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、及び低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子を包含する。ＲＮＡ干渉は、ｄｓＲＮＡが翻訳後レベルで標的遺伝子の発現を特異的に抑制する現象を指す。通常の条件では、ＲＮＡ干渉は数千塩基対の長さの二本鎖ＲＮＡ分子（ｄｓＲＮＡ）により開始される。インビボでは、細胞中に導入されたｄｓＲＮＡは、ｓｉＲＮＡと呼ばれる短いｄｓＲＮＡ分子の混合物に切断される。切断を触媒する酵素であるＤｉｃｅｒは、ＲＮａｓｅ  ＩＩＩドメインを含むエンドＲＮａｓｅである（Bernstein et al., 2001）。哺乳動物細胞において、Ｄｉｃｅｒにより産生されるｓｉＲＮＡは２１〜２３ｂｐの長さであり、１９又は２０ヌクレオチドの二本鎖配列、２ヌクレオチドの３’オーバーハング、及び５’−三リン酸末端を伴う（Elbashir et al., 2001 a; Elbashir et al., 2001 b; Zamore et al., 2000）。多数の特許及び特許出願で、一般的な用語において、遺伝子発現を阻害するためのｓｉＲＮＡ分子の使用が記載されている（例えば、ＷＯ  ９９／３２６１９、ＵＳ  ２００４００５３８７６、ＵＳ  ２００４０１０２４０８、及びＷＯ  ２００４／００７７１８）。
【００４７】
ＭＭＰ９のｍＲＮＡの配列は公知であり、当業者は、翻訳を阻害することが可能なオリゴヌクレオチドを設計することが可能である。あるいは、当業者は、ｓｈＲＮＡのベクター（例えば、カタログ参照ＴＲ３１１４３６）及びOrigene societyにより販売されているｓｉＲＮＡ（例えば、カタログ参照ＳＲ３２０９９７）のような市販のオリゴヌクレオチドを使用してもよい。ＭＭＰ９に対して向けられた干渉ＲＮＡもまた、Novus Biologicals society（カタログ参照：Ｈ００００４３１８−Ｒ０１）により販売されている。
【００４８】
「発現を下方制御する」により、例えば、遺伝子発現の３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％の減少を意味する。
【００４９】
アンチセンス核酸、又はアンチセンスＲＮＡは、ＭＭＰ９をコードするセンス核酸の全部又は一部に相補的、例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に相補的、又はｍＲＮＡ配列に相補的でありうるが、標的ｍＲＮＡの翻訳に干渉すると考えられる。好ましくは、アンチセンス核酸は、ＭＭＰ９をコードする標的ｍＲＮＡに相補的なＲＮＡ分子である。
【００５０】
別の特定の実施形態では、ＭＭＰ９インヒビターはＭＭＰ９に対して向けられた小分子である。小分子は特に、１０００Ｄａ未満の分子量を伴う有機小分子を指す。小分子及び他の薬物候補は、例えば、コンビナトリアルライブラリー及び天然産物ライブラリーから、及び当業者に公知の方法を使用して容易に得ることができる。さらに、固相に付着した又は溶液中のアミノ酸の全ての可能な組み合わせからなるランダムペプチドライブラリーもまた、インヒビターとして作用するペプチドを同定するために使用されうる。好ましい小分子は、２−［［（４−フェノキシフェニル）スルホニル］メチル］−チイラン（ＳＢ３ＣＴ、ＣＡＳ  ２９２６０５−１４−２）、２−（Ｎ−ベンジル−４−メトキシフェニルスルホンアミド）−５−（（ジエチルアミノ）メチル）−Ｎ−ヒドロキシ−３−メチルベンズアミド（ａｂ  １４２１８０、ＣＡＳ  １１７７７４９−５８−４）及びＮ−｛２−［（２−メトキシフェニル）アミノ］−４’−メチル−４，５’−ビ−１，３−チアゾール−２’−イル｝アセトアミドからなる群より、例えば、２−［［（４−フェノキシフェニル）スルホニル］メチル］−チイラン（ＳＢ３ＣＴ、ＣＡＳ  ２９２６０５−１４−２）、２−（Ｎ−ベンジル−４−メトキシフェニルスルホンアミド）−５−（（ジエチルアミノ）メチル）−Ｎ−ヒドロキシ−３−メチルベンズアミド（ａｂ  １４２１８０、ＣＡＳ  １１７７７４９−５８−４）からなる群より選択する。
【００５１】
好ましくは、ＭＭＰ９インヒビターは、「剥離した」メラニン細胞の数を減少させる、又は抑制し（「メラニン細胞の喪失」）、言い換えれば、表皮の基底膜へメラニン細胞を安定化させる。
【００５２】
本発明の状況において使用可能な好ましいＭＭＰ９インヒビターは、抗ＭＭＰ９抗体（例えば配列番号２、３、又は４の配列を含む、又はそれからなる重鎖可変領域及び／又は配列番号５の配列を含む、又はそれからなる軽鎖を含む抗ＭＭＰ９抗体など）、及び小分子（例えば２−［［（４−フェノキシフェニル）スルホニル］メチル］−チイラン、２−（Ｎ−ベンジル−４−メトキシフェニルスルホンアミド）−５−（（ジエチルアミノ）メチル）−Ｎ−ヒドロキシ−３−メチルベンズアミド又はＮ−｛２−［（２−メトキシフェニル）アミノ］−４’−メチル−４，５’−ビ−１，３−チアゾール−２’−イル｝アセトアミドより選択する。
【００５３】
本発明の状況において使用可能な他の好ましいＭＭＰ９インヒビターは、抗ＭＭＰ９モノクローナル抗体ＧＳ−５７４５（アンデカリキシマブ）及びＣＡＬＹ−００１である。
【００５４】
色素脱失障害、又は皮膚色素脱失は、炎症性皮膚疾患、色素脱失障害、又は皮膚色素脱失に関連付けることができ、典型的には炎症性皮膚疾患の症状である。
【００５５】
本発明の状況において、色素脱失障害又は炎症性皮膚疾患は、典型的には白斑、乾癬、アトピー性皮膚炎、強皮症、典型的には全身性硬化症、好ましくは皮膚強皮症、ハイポメラノース（ｈｙｐｏｍｅｌａｎｏｓｅ）、及び白毛症より選択する。
【００５６】
好ましい実施形態では、色素脱失障害は白斑である。
【００５７】
好ましくは、色素脱失障害、疾患、又は機能不全状態は、遺伝的又は感染起源の色素脱失障害、疾患、又は機能不全状態ではない。
【００５８】
乾癬は慢性炎症性多系統疾患で、主に皮膚及び関節の症状を伴い、人口の約２％が罹患している。罹患者のほぼ９０％が尋常性乾癬を有する。乾癬の主な症状は、皮膚の慢性的な炎症である。それは、痛みを伴う又はしばしばひどく掻痒でありうる外観、鱗屑、及び紅斑性のプラークにより特徴付けられる。乾癬は、患者の一生の間に増大して衰退する慢性疾患である。尋常性乾癬は最も一般的な形態であり、患者の約８０％〜９０％が罹患する。尋常性乾癬は、サイズが１cmから数センチメートルまで変動する、明確な、はっきりと区別される紅斑性のプラークとして現れる。患者は、ほんのわずかなプラークからほぼ体表面全体を覆う多数の病変までの範囲に及ぶ病変を有しうる。乾癬において発症した炎症反応は、同じ範囲に従って皮膚色素脱失に導きうる。この症状は、白斑と同じように患者の生活の質を変化させ、うつ病性障害又は社会的離脱に導く非美的な症状である。さらに、自然発生の白斑は乾癬に関連付けられうる。
【００５９】
アトピー性皮膚炎（ＡＤ）は、西欧諸国の成人人口の約２％〜５％に罹患する慢性の再発性炎症性皮膚疾患である。この疾患は、複雑な組み合わせの病原性の影響、複数の感受性遺伝子、環境的誘因、及び表皮バリアの破壊を含む。臨床的には、ＡＤは皮膚機能の障害を招き、激しく煩わしい痒みを伴い、かなりの睡眠の喪失及び通常は疾患の重症度に付随する不良な生活の質に導く。アトピー性皮膚炎において発症する炎症反応は、同じ範囲に従って皮膚色素脱失に導きうる。この症状は、白斑と同じように患者の生活の質を変化させ、非美的な症状はうつ病性障害又は社会的離脱に導く。さらに、自然発症の白斑はアトピー性皮膚炎に関連付けられうる。
【００６０】
強皮症は炎症性疾患である。疾患の２つの形態がある：ｉ）限局性強皮症（「モルフェア」と呼ぶ）は、内部病変を伴わない硬化した皮膚の孤立斑、及びｉｉ）皮膚病変（本明細書では一般的に「皮膚強皮症」として特定する）の範囲に基づく２つのサブグループを含む全身性強皮症（「全身性硬化症」とも呼ぶ）：サブグループはびまん性皮膚強皮症及び限局性皮膚強皮症である。全身性硬化症は、腎臓、心臓、肺、及び胃腸管を含む進行性の内臓器官の欠損と関連付けることができる。皮膚の症状は、進行性の皮膚のこわばり及び硬結ならびに顕著な皮膚の色素性変化（色素沈着過剰及び色素沈着低下の両方）である。それらの皮膚症状は、乾癬や白斑で考察されているように、患者の生活の質の大きな変化に関与する。
【００６１】
好ましい実施形態では、炎症性皮膚疾患は白斑である。
【００６２】
乾癬、ＡＤ、又は強皮症の状況において観察される皮膚色素脱失は、対象が乾癬、ＡＤ、又は強皮症について（成功裏に）処置されていたとしても残る／存続しうる。本発明のＭＭＰ９インヒビターは、典型的にはそのような色素脱失を処置又は軽減するために使用され、好ましくは皮膚の色素再沈着、さらにより好ましくは根治的な皮膚の色素再沈着を可能にする、又は促す。
【００６３】
本発明の状況において、「対象」は動物、典型的には哺乳動物である。哺乳動物の例は、ヒト及び非ヒト動物、例えば、限定しないが、家畜動物（例、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウサギ、ネコ、イヌ、及びウマ）、非ヒト霊長類（例えばサルなど）、及びげっ歯類（例、マウス及びラット）を含む。「対象」は、好ましくは、その男女、年齢、人種、又は性別を問わず、ヒトである。
【００６４】
特定の実施形態では、対象は、患者、即ち、皮膚色素脱失、色素脱失障害、本明細書で特定する疾患もしくは機能不全状態及び／又は炎症性皮膚疾患（典型的には色素脱失障害に導く又はそれに既に付随する）に罹患している、又は罹患していると診断もしくは特定された患者である。
【００６５】
別の特定の実施形態では、対象は、そのような色素脱失障害、疾患、又は機能不全状態を「発症するリスクがある」、特に色素脱失障害、典型的には皮膚色素脱失を発症するリスクがあると考えられる健康な対象又は見かけ上健康な対象であり、それにおいてこれを予防しなければならない。
【００６６】
さらなる特定の実施形態では、対象は、瘢痕、創傷、切り傷、もしくは切開を有する、又は皮膚移植を受けた対象である。
【００６７】
特に、本発明は、本明細書で先に特定した色素脱失障害、疾患、又は機能障害状態、典型的には皮膚色素脱失を予防、処置、又は軽減するための組成物を調製するための、本明細書に記載するＭＭＰ９インヒビターの使用に関する。
【００６８】
また、本明細書に記載するのは、このように、組成物、典型的には医薬組成物、特に皮膚科組成物であって、それにおいて組成物は、本明細書に記載するＭＭＰ９のインヒビターを、好ましくは治療的に効果的な量で含む。
【００６９】
ＭＭＰ９インヒビターの「治療的に効果的な量」は、本明細書に記載する対象、特に哺乳動物、好ましくはヒトの、本明細書に定義する処置を可能にする量である。
【００７０】
ＭＭＰ９インヒビター又はそのようなインヒビターを含む医薬組成物の用量は、処置される対象に依存して当業者により調整されうるが、種々の因子／条件（対象の年齢、体重、一般的な健康状態、性別、及び食事を含む）に依存する。用量はまた、投与経路、追加の生物学的に活性な化合物の任意の存在（本明細書中に開示する通り）などに依存して変動するであろう。
【００７１】
好ましくは、組成物はＭＭＰ２インヒビターを含まない。
【００７２】
選択は、ＭＭＰ９インヒビターの本明細書で上に記載する効果の１つ、好ましくはいくつか、さらにより好ましくは全てを産生するために効果的な用量、好ましくは本質的に毒性を起こすことなく色素再沈着を産生するために効果的な用量の決定を含む。例えば、所望の治療的な効果を達成するために要求されるレベルよりも低いレベルで産物の用量を開始し、所望の効果が達成されるまで投与量を徐々に増加させることは、当業者には周知である。本発明の産物の１日の総使用量は、健全な医学的判断の範囲内で主治医により決められることが理解されよう。本明細書で下に示す用量は、当業者／医師により簡単に適合されうる例である。
【００７３】
対象が哺乳動物、好ましくはヒトである場合、医薬組成物は典型的には体重１kg当たり約０．１〜１５０mgのＭＭＰ９インヒビター、好ましくは体重当たり約０．１〜５０mg、さらにより好ましくは体重当たり１〜５０mg、例えば体重当たり０．２５０mg〜２０mg（典型的には持続注入の状況で）を含む。
【００７４】
医薬組成物は、また、体重１kg当たり０．１〜１５０mgのＪＡＫインヒビターを含むことができる。
【００７５】
本明細書に記載するＭＭＰ９インヒビターと同様に、そのような組成物は、典型的には、それを必要とする対象における色素脱失障害の予防、処置、又は軽減のための、特にそれを必要とする対象における色素脱失の予防、処置、又は軽減のための、或いは色素脱失皮膚の再色素化のための使用のためである。
【００７６】
特定の態様では、記載するＭＭＰ９インヒビター、又はそのようなインヒビターを含む組成物は、瘢痕又は皮膚移植の美的外観を改善するための使用のためである。そのような状況では、組成物は化粧品組成物として考えることができる。
【００７７】
特定の実施形態では、本発明の医薬組成物は、いくつかの異なるＭＭＰ９のインヒビター、例えば少なくとも２つ又は３つの異なるＭＭＰ９のインヒビターを含む。
【００７８】
本明細書に記載するＭＭＰ９インヒビターは、単独で、或いはｉ）異なるＭＭＰ９インヒビター、ｉｉ）ＭＭＰ９インヒビターではない異なるＭＭＰインヒビター、例えばＭＭＰ２のインヒビター（それは本発明の好ましい実施形態ではないが）、ＭＭＰ３、ＭＭＰ７、ＭＴ１−ＭＭＰ、ＡＤＡＭ１０、もしくはＡＤＡＭ１５との、ｉｉｉ）光線療法との、又はｉｖ）ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）インヒビター、ＰＤＥ４インヒビター、ビタミンＤ誘導体、カルシニューリンインヒビター、コルチコステロイド、メトトレキセート、ヒドロキシクロロキン、抗ＴＮＦ、抗ＩＬ−１７、抗ＩＬ−２３、抗ｐ４０、抗ＣＸＣＲ３、抗ＣＸＣＬ９、抗ＣＸＣＬ１０、ＣＴＬＡ４Ｉｇ、プラスミン及びカリカレイン７、ＷＮＴアゴニスト、もしくはＧＳＫ３β（グリコーゲンシンターゼキナーゼ３ベータ）アンタゴニストより選択される薬物との組み合わせにおいて使用することができる。
【００７９】
特定の態様では、本明細書に記載するＭＭＰ９インヒビターは、ＷＮＴアゴニスト、ＧＳＫ３βアンタゴニスト、カルシニューリンインヒビター、メトトレキサート、ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）インヒビター、コルチコステロイド、又は光線療法との組み合わせにおいて使用することができる。
【００８０】
別の特定の態様では、本明細書に記載するＭＭＰ９インヒビターは、カルシニューリンインヒビター、ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）インヒビター、又は光線療法との組み合わせにおいて使用することができる。
【００８１】
別の特定の実施形態では、本発明の医薬組成物は、このように、少なくとも１つのＭＭＰ９インヒビターに加えて、ＪＡＫインヒビター、ビタミンＤ誘導体、カルシニューリンインヒビター、及びコルチコステロイドより選択される薬物を含む。
【００８２】
ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）は、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路を介してサイトカイン媒介性シグナルを伝達する細胞内の非受容体型チロシンキナーゼのファミリーである。ＪＡＫは、２つのほぼ同一のリン酸転移ドメインを持つ。一方のドメインはキナーゼ活性を示し、他方のドメインは第１のドメインのキナーゼ活性を負に調節する。
【００８３】
好ましい実施形態では、ＪＡＫインヒビターは、ＪＡＫ１インヒビター（例えばルキソリチニブ又はトファシチニブなど）、ＪＡＫ２インヒビター（例えばルキソリチニブなど）、ＪＡＫ３インヒビター（例えばトファシチニブなど）、ＴＹＫ２インヒビター、及びそれらの任意の組み合わせより選択する。
【００８４】
好ましい実施形態では、ビタミンＤ誘導体は局所カルシポトリオールであり、コルチコステロイドは、局所ステロイド（例えば、クロベタゾールプロピオネート、ベタメタゾンジプロピオネート、ベタメタゾンバレレート、ヒドロコルチゾンアセポネート、ジフルプレドネート、フルチカゾン、デソニド）又は全身性ステロイド（例えば、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾン、デキサメタゾン）であり、カルシニューリンインヒビターは、好ましくは、局所カルシニューリンインヒビター（例えば、タクロリムス又はピメクロリムス）である。
【００８５】
典型的な実施形態では、本発明の医薬組成物は、ＭＭＰ９のインヒビターに加えて、医薬的に許容可能な賦形剤、溶媒、担体、又は支持体を含む。用語「医薬的に許容可能な」は、動物における、特にヒトにおける使用のために連邦政府又は州政府の規制当局により承認されていること、又は米国薬局方、又はヨーロッパ薬局方、又は他の一般的に認められている薬局方に収載されていることを意味する。
【００８６】
本発明の状況において使用可能な医薬的に許容可能な賦形剤、溶媒、担体、又は支持体は、例えば、場合により安定化剤（例えばアイソジェニックアルブミン又は他の任意の安定化タンパク質、グリセロールなど）、及びまたアジュバント（例えばポリブレン又はＤＥＡＥデキストランなど）と組み合わせた生理食塩水、等張緩衝液（例えばマンニトール２０％など）である。
【００８７】
本明細書にさらに記載するのは、それを必要とする対象において、色素脱失障害、疾患、又は機能不全状態、例えば本明細書に記載するものの１つなど、典型的には皮膚色素脱失を予防、処置、又は軽減するための方法であって、単独で、又は本明細書に記載する異なる薬物との組み合わせにおいてＭＭＰ９のインヒビターに、もしくは本明細書に記載するそのようなインヒビターを含む組成物に対象を曝露する工程を含む。
【００８８】
用語「処置」又は「処置する」は、処置されている対象の自然な経過を変える試みにおける治療的介入を指し、予防的（予防）又は根治的な目的のために実施することができる。処置の望ましい効果は、障害、疾患、又は機能不全状態の発生又は再発を予防すること、症状の減弱又は軽減、障害、疾患、又は機能不全状態の任意の直接的又は間接的な病理学的結果の減少、障害、疾患、又は機能不全状態の進行の速度を減少させること、及び病状の寛解又は緩和を含むが、これらに限定しない。好ましい実施形態では、本発明の組成物及び方法を使用して、色素脱失障害、疾患、又は機能不全状態の発症を遅らせる、その進行を遅らせる、又は色素脱失障害を治癒させる、典型的には、好ましくは根治的な色素再沈着により、色素脱失した皮膚又は皮膚領域を色素再沈着させる。
【００８９】
本発明に従った典型的なＭＭＰ９インヒビター（治療用又は予防用ＭＭＰ９インヒビター）、又はそのようなインヒビターを含む本明細書に記載する組成物は、特に血流中の注射（全身注射）、例えば静脈内又は動脈内注射などによる、皮膚又は皮下（即ち、局所）投与による、筋肉内投与による、経口（経口的）又は直腸投与による、及び／又は経鼻投与による、本明細書に記載する対象、特に哺乳動物、好ましくはヒトへの曝露又は投与に適合する。
【００９０】
好ましい実施形態では、組成物は局所（皮膚又は皮下）投与用に製剤化する。そのような組成物は典型的には皮膚科組成物と考えられる。
【００９１】
組成物は、当業者に公知の方法に従って有利に製剤化されるであろう。
【００９２】
経口又は舌下経路で投与する場合、組成物は、例えば、被覆又は非被覆錠剤、ゼラチンカプセル、粉末、ペレット、懸濁液又は経口溶液の形態である。直腸経路により投与する場合、組成物は、例えば座薬の形態である。経口又は直腸投与のためのそのような形態の１つは、即時放出を用いるか、又は長期もしくは遅延放出を用いることができる。鼻腔内経路により投与する場合、組成物は、例えばエアロゾル又はスプレーの形態である。
【００９３】
以前に示したように、好ましい組成物は皮膚への局所適用のために有利に製剤化されるであろう。好ましくは、本発明において使用する組成物は、エマルジョン、クリーム、ローションタイプ、ゲル、又は溶液の形態である。組成物は、多かれ少なかれ液体でありうるが、膏薬、エマルジョン、クリーム、ミルク、軟膏、含浸パッド、合成洗剤、溶液、ゲル、スプレー又はエアロゾル、泡、懸濁液、ローション又はスティックの形態でもよい。
【００９４】
例えば、組成物は、場合によりゲル化された、油性溶液、場合によりローション型の二相分散液、水相中での脂肪相の分散により得られるエマルション（Ｏ／Ｗ）又はその逆（Ｗ／Ｏ）、或いは三重エマルジョン（Ｗ／Ｏ／Ｗ又はＯ／Ｗ／Ｏ）又はイオン及び／又は非イオン型の小胞分散液であってもよい。この局所用組成物は、無水形態中、水性形態中、又はエマルジョンの形態中でありうる。これらの組成物は通常の方法に従って調製する。好ましくは、水相中での脂肪相の分散により得られるエマルジョンの形態の組成物（Ｏ／Ｗ）を使用する。
【００９５】
種々のプロトコールを、ＭＭＰ９インヒビターの及び本明細書に記載する他の任意の追加分子、化合物、又は薬物の曝露／投与、例えば同時又は連続曝露／投与、単回投与又は反復投与などのために使用してもよく、それは当業者により調整されうる。
【００９６】
本発明者らは、また、本明細書において、対象における色素脱失障害、疾患、又は機能不全、典型的には皮膚色素脱失を処置するためのＭＭＰ９のインヒビターを含む処置の有効性を評価するための方法を提供する。この方法は、ｔ０で対象から採取した第１の生物学的サンプル中の可溶性Ｅ−カドヘリン、ＭＭＰ９、ＣＸＣＬ９、及びＣＸＣＬ１０のいずれか、好ましくはＥ−カドヘリン又はＭＭＰ９の発現を、ｔ１で前記対象から採取した第２の生物学的サンプル中の可溶性Ｅ−カドヘリン、ＭＭＰ９、ＣＸＣＬ９、及びＣＸＣＬ１０、好ましくはＥ−カドヘリン又はＭＭＰ９の発現と比較する工程を含み、ｔ１で採取されたサンプル中のＥ−カドヘリン、ＭＭＰ９、ＣＸＣＬ９、及びＣＸＣＬ１０のいずれかの発現の増加は、前記対象における、色素脱失障害の進行の、典型的には皮膚色素脱失の進行の指標であり、ｔ１で採取されたサンプル中の可溶性Ｅ−カドヘリン、ＭＭＰ９、ＣＸＣＬ９、及びＣＸＣＬ１０の発現の減少は、前記対象における、色素脱失障害の退行の、典型的には皮膚色素脱失の退行の又は皮膚の色素再沈着の進行の指標である。好ましくは、生物学的サンプルは血清サンプルである（図９参照）。
【００９７】
対象における色素脱失障害を処置するためのＭＭＰ９のインヒビターを含む処置の有効性を評価するための特定の方法は、ＶＥＴＦ（Vitiligo European Task Force-Pigment Cell Res. 2007 Feb;20(1):27-35. The definition and assessment of vitiligo: a consensus report of the Vitiligo European Task Force. Taieb A1, Picardo M; VETF Members）及び／又はＶＥＳ（Vitiligo Extent Score）スコア（Van Geel et al., J. Invest Dermatol. 2016）もしくはＶＡＳＩ（Vitiligo Area Severity Index-Arch Dermatol. 2004 Jun; 140(6):677-83. Parametric modeling of narrowband UV-B phototherapy for vitiligo using a novel quantitative tool: the Vitiligo Area Scoring Index. Hamzavi I1, Jain H, Mc Lean D, Shapiro J, Zeng H, Lui H）を使用して対象の色素脱失を臨床的に評価する追加の工程を含む。
【００９８】
本発明者らはさらに本明細書において、ＭＭＰ９のインヒビターを含む処置に曝露された対象において、インビトロ又はエクスビボで色素脱失障害、疾患、又は機能不全、典型的には皮膚色素脱失の経過をモニターするための方法を提供する。この方法は、その任意の処置の前に色素脱失障害、疾患、又は機能障害を有すると特定された、又は有すると疑われた対象からの第１の生物学的サンプル中の可溶性Ｅ−カドヘリンの発現を、色素脱失障害、疾患、又は機能障害を処置するための薬物又は組成物に曝露された同じ対象の第２の生物学的サンプル中の可溶性Ｅ−カドヘリンの発現と比較することを含み、第２の生物学的サンプル中の可溶性Ｅ−カドヘリンの発現における減少は、色素脱失障害、疾患、又は機能障害、典型的には皮膚色素脱失を処置又は軽減するための薬物又は組成物の有効性の指標であり、第２の生物学的サンプル中の可溶性Ｅ−カドヘリンの発現における増加又は発現の調節の非存在は、色素脱失障害、疾患、又は機能障害、典型的には皮膚色素脱失を処置又は軽減するための薬物又は組成物の無効性の指標である。
【００９９】
可溶性Ｅ−カドヘリンの発現の検出及び測定は、当技術分野の従来の方法、例えばＥＬＩＳＡ（例えば、R&Dシステムズを参照のこと）などを使用して実施することができる。
【０１００】
また本明細書に記載するのは、それを必要とする対象において、色素脱失障害を予防、処置、又は軽減するために、典型的には皮膚色素脱失を予防、処置、又は軽減するために、或いは皮膚の色素再沈着を可能にする又は促すために適切な医薬活性分子をスクリーニングするための、典型的にはインビトロ又はエクスビボでスクリーニングするための方法である。この方法は、ＭＭＰ９発現又は機能を阻害する、ＭＭＰ９及びヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）の両方の発現又は機能、特にＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＴＹＫ２、及びそれらの任意の組み合わせより選択されるＪＡＫの発現又は機能を阻害してメラニン産生及び／又はメラニン細胞機能を誘導する、Ｅ−カドヘリンを切断する、可溶性Ｅ−カドヘリン発現を増加させる、Ｅ−カドヘリンの細胞質内再分布を増加させる、膜結合Ｅ−カドヘリンを再局在化させる、並びに／或いはメラニン細胞を表皮の基底膜に安定化させるテスト分子の能力を評価する工程を含み、前記能力は、テスト分子が、それを必要とする対象において、色素脱失障害を予防、処置、又は軽減するための、典型的には皮膚色素脱失を予防、処置、又は軽減するための、或いは皮膚の色素再沈着を可能にする又は促すための適切な医薬活性分子であることを示す。
【０１０１】
スクリーニング方法は、典型的には色素脱失障害（例えば白斑など）の細胞モデルで、典型的には細胞三次元モデルで実施する。
【０１０２】
テスト分子の潜在的な治療効果を評価するために、表皮内のメラニン細胞の局在化を評価することができ、典型的には表皮、特に基底層に存在する剥離したメラニン細胞及び付着したメラニン細胞をそれぞれ定量化し、ＴＮＦα及びＩＦＮγだけが存在する条件（色素脱失の陽性対照）と比較することができる。可溶性Ｅ−カドヘリンレベル及び／又は膜結合Ｅ−カドヘリン発現の評価／定量化ならびに／或いはメラニン含量の定量化も評価し、陽性対照と比較することができる。皮膚サンプル中のＥ−カドヘリン発現は、免疫蛍光、免疫組織化学、又はウエスタンブロットにより古典的に評価する。可溶性Ｅ−カドヘリンレベルは、ＥＬＩＳＡにより古典的に決定する。
【０１０３】
そのような方法は、化合物の自動化ハイスループットスクリーニングに適応可能である。
【０１０４】
候補（テスト）薬理学的分子／薬剤は、例えば、コンビナトリアルペプチドライブラリー、コンビナトリアル化合物ライブラリー、及び天然産物ライブラリーから由来することができる。一般的に、スクリーニング方法は、ＭＭＰ９の発現又は活性を減少又は阻害する分子又は化合物についてアッセイすることを含む。テストすることができる分子は、このように、好ましくは、例えば、モノクローナル抗体、アプタマー、スピーゲルマー、阻害性核酸配列、小分子より選択する。特定の例において、これらの分子はＭＭＰ９に対して向けられる。そのようなアッセイのための便利な試薬は当技術分野において公知である。
【０１０５】
典型的には、複数のアッセイ混合物を異なる薬剤濃度を用いて並行して実行し、種々の濃度への異なる反応を得る。典型的には、これらの濃度の１つは陰性対照として、即ち、薬剤のゼロ濃度で又はアッセイ検出限界未満の薬剤の濃度で役立つ。
【０１０６】
色素脱失障害、典型的には皮膚色素脱失を予防、処置、又は軽減するための組成物の調製のための、記載するスクリーニング方法を用いて同定されたＭＭＰ９の発現又は活性を減少又は阻害する分子又は化合物の使用も本明細書に記載する。
【０１０７】
本発明はまた、本明細書において上に記載する方法及び使用を実施するために適切なキットに関する。
【０１０８】
本発明は特に、少なくとも１つのＭＭＰ９のインヒビター又はそのようなインヒビターを含む組成物、及び本明細書において上に記載するような少なくとも１つの追加の薬物、例えばＪＡＫインヒビターを含むキットを提供する。このキットは、キット中に目的の産物があるのと同じ数の異なる（場合により滅菌）容器を含むことができる。
【０１０９】
典型的には、キットはまた、開示された方法及び使用に従って本明細書に記載するＭＭＰ９インヒビター又は組成物を使用するための説明書、例えば特定の色素脱失障害、例えば皮膚色素脱失を予防又は処置するための有効量の投与についての情報を含む。
【０１１０】
特に本明細書において開示するのは、色素脱失障害、疾患、又は機能不全状態、例えば本明細書に記載するものの１つなど、典型的には白斑又は皮膚色素脱失を予防、処置、又は軽減するための、そのような脱色障害、疾患、又は機能不全状態の病因を試験するための、色素沈着／色素脱失機構を試験するため、又はＭＭＰ９と相互作用しうる化合物の治療的及び／又は調節的性質を評価するための本明細書に記載する産物のいずれかの使用である。「ＭＭＰ９モジュレーター」は、ＭＭＰ９の発現又は機能を調節（活性化又は阻害）する、好ましくは阻害する任意の分子を指す。
【０１１１】
続く実施例及びそれらの対応する図面は、本発明の範囲を限定することなく本発明を例証する。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】進行性白斑におけるＴＮＦα及びＩＦＮγを発現する皮膚炎症性Ｔ細胞の顕著な浸潤。Ｔ細胞を、進行性白斑（ｎ＝１０）又は安定性白斑（ｎ＝６）を伴う患者の病変周囲皮膚から単離した。結果を健常対照と比較した（ｎ＝６）。フローサイトメトリーによる、ＩＦＮγ、ＴＮＦβ、又はＩＦＮγ／ＴＮＦβ産生皮膚浸潤ＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞の分析。各々の記号は１つの標本を表す。平均値±標準誤差を、マンホイットニー検定を使用して示す（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。
【図２】ＴＮＦα及びＩＦＮγ：メラニン細胞の阻害に関与する２つの主要なサイトカイン。Ａ−Ｂ．正常ヒト表皮メラニン細胞の初代培養物を、示したサイトカインの存在又は非存在において２４時間にわたり刺激した（ＩＬ−１７、ＩＬ−１β、ＴＮＦβ、ＩＦＮγ：２０ng/ml；ＴＧＦβ：５ng/ml）。示した遺伝子発現のリアルタイム分析。結果を、対照培養物（刺激なし）を下回る減少倍数として表す。ＧＡＰＤＨをハウスキーピング遺伝子として使用した。データは３つの独立した実験を代表する。
【図３】炎症反応及び色素脱失におけるＴＮＦα及びＩＦＮγの関与。Ａ−Ｂ．正常なヒト表皮メラニン細胞の初代培養物を、２０ng/mlのＴＮＦα及び／又はＩＦＮγの存在又は非存在において２４時間（Ａ）又は４８時間（Ｂ）にわたり刺激した。Ａ．示した遺伝子発現のリアルタイム分析。結果を、上方制御された遺伝子については対照培養物（刺激なし）を上回る増加倍数（上方パネル）、又は下方制御された遺伝子については対照培養物を下回る減少倍数（下方パネル）として表現する。ＧＡＰＤＨをハウスキーピング遺伝子として使用した。Ｂ．ＥＬＩＳＡによる無細胞上清中のＣＸＣＬ９及びＣＸＣＬ１０分泌の測定。
【図４】炎症反応及びメラニン細胞の喪失におけるＴＮＦα及びＩＦＮγの関与。Ａ−Ｂ．正常ヒト表皮メラニン細胞（Ａ）又はケラチノサイト（Ｂ）の初代培養物を、２０ng/mlのＴＮＦα及び／又はＩＦＮγの存在又は非存在において示した時間にわたり刺激した。ＣＤＨ１遺伝子発現のリアルタイム分析。ＧＡＰＤＨをハウスキーピング遺伝子として使用した。Ｃ．健常対照（ｎ＝２０）又は進行性（ｎ＝４０）もしくは安定性（ｎ＝４０）白斑を伴う患者からの血清中の可溶性Ｅ−カドヘリンレベルの評価。データは３回（Ａ〜Ｄ）又は２回（Ｅ）の独立した実験を代表している。Ｄ．２０ng/mlのＴＮＦα及び／又はＩＦＮγの存在又は非存在において２４時間にわたり処理したメラニン細胞中のＭＭＰ９遺伝子発現のリアルタイム分析。ＧＡＰＤＨをハウスキーピング遺伝子として使用した。Ｅ．メラニン細胞を含む再構成ヒト表皮を、２０ng/mlのＴＮＦα及びＩＦＮγの存在又は非存在において２４時間にわたり刺激した。メラン−Ａ（赤色）及びＥ−カドヘリン（緑色）発現の免疫蛍光顕微鏡分析（倍率４００倍）。Ｅ．健常な皮膚、安定性又は進行性白斑を伴う患者の病変周囲の皮膚、及び病変のある乾癬性（ｐｓｏｓｉａｔｉｃ）皮膚におけるメラン−Ａ（赤色）及びＥ−カドヘリン（緑色）の発現の免疫蛍光顕微鏡分析（倍率４００倍）。白い矢印は、表皮の基底層から剥離しているメラニン細胞を示す。
【図５】ＴＮＦα及びＩＦＮγ誘導性メラニン細胞の喪失はＭＭＰ９を通じて媒介される。メラニン細胞を含む再構成ヒト表皮を、１０μMのＭＭＰ９インヒビターａｂ１４２１８０又はＳＢ−ＣＴの存在又は非存在において、２０ng/mlのＴＮＦα及びＩＦＮγを伴い又は伴わずに２４時間にわたり刺激した。メラン−Ａ（赤色）及びＥ−カドヘリン（緑色）発現の免疫蛍光顕微鏡分析（倍率４００倍）。白い矢印は、表皮の基底層から剥離しているメラニン細胞を示す。
【図６】メラニン細胞の喪失におけるＴＮＦα及びＩＦＮγの関与。メラニン細胞の初代培養物を２０ng/mlのＴＮＦα及びＩＦＮγの存在又は非存在において刺激した。２４時間の刺激後での示した遺伝子の発現の定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用した分析。ＧＡＰＤＨをコードする遺伝子を対照遺伝子として使用する。結果は、サイトカインの非存在における刺激細胞と対照細胞の間での発現比［３つの異なるサンプルで実施した３つの実験の平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）］を示す。本発明者らは、メラニン細胞機能、メラニン形成、及びメラニン細胞接着に関与するタンパク質をコードする遺伝子の阻害におけるＴＮＦα及びＩＦＮγカクテルの相乗効果を観察した。
【図７】メラニン細胞の喪失におけるＴＮＦα及びＩＦＮγの関与。メラニン細胞を含む再構成ヒト表皮を、２０ng/mlのＴＮＦα及びＩＦＮγの存在又は非存在において刺激した。２４時間の刺激後でのＤＣＴ遺伝子発現の定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用した分析。ＧＡＰＤＨ及びβ−グルクロニダーゼをコードする遺伝子をコントロール遺伝子として使用する。結果は、刺激された表皮とサイトカインを伴わない対照表皮の間での発現比［２つの異なるサンプルで実施した２つの実験の平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）］を示す。本発明者らは、ＴＮＦαの存在においてＤＣＴ遺伝子阻害を観察した。この効果は、ＩＦＮγの添加により改変されない。
【図８】細胞死はメラニン細胞の喪失に関与する主要な機構ではない。（Ａ−Ｂ）．メラニン細胞を含む再構成ヒト表皮を、２０ng/mlのＴＮＦα及びＩＦＮγの存在又は非存在において２４時間にわたり刺激した。免疫蛍光法を使用したメラン−Ａ発現の分析（赤色はメラニン細胞を明らかにする）及びＴＵＮＥＬ技術を使用したアポトーシス細胞の検出（緑色）（２つの異なるサンプルで実施した２つの実験の代表的な結果）。結果は、ＴＮＦα及び／又はＩＦＮγがメラニン細胞のアポトーシスに対する効果を有さないことを示す。ケラチノサイトに対するＴＮＦαのわずかなアポトーシス促進効果が観察される。（Ｂ）健常な皮膚（対照）、安定性又は進行性の白斑を伴う患者の病変周囲の皮膚、乾癬又はループスを伴う患者の病変皮膚における免疫蛍光法を使用したメラン−Ａ発現の分析（赤色はメラニン細胞を明らかにする）及びＴＵＮＥＬ技術を使用したアポトーシス細胞の検出（緑色）（倍率４００倍）。ＴＥＮはアポトーシスについての陽性対照である。結果は、白斑患者（安定性又は活動性疾患を伴う）において、剥離したメラニン細胞はアポトーシスに入らず、メラニン細胞の死がそれらの喪失に関与する主要な機構ではないことを強調している。
【図９】白斑患者の血清中のＭＭＰ９及び可溶性Ｅ−カドヘリンレベル。（Ａ〜Ｂ）可溶性Ｅ−カドヘリン（Ａ）及びＭＭＰ９（Ｂ）のレベルを、白斑（安定性及び進行性）又は乾癬を伴う患者の血清中及び健常対照の血清中でＥＬＩＳＡにより決定した。（Ｃ）ＭＭＰ９の血清レベルは、白斑患者における可溶性Ｅ−ｃａｄの血清レベルと相関していた（スピアマン検定Ｐ＜０．０５）。本発明者らは、健常対照と比較し、活動性及び安定性白斑患者の血清中の可溶性Ｅ−カドヘリン及びＭＭＰ９レベルの有意な増加を示す。ＭＭＰ９のレベルは、活動性疾患を伴う白斑患者において有意に高かった。また、正の相関が、白斑患者におけるＭＭＰ９と可溶性Ｅ−カドヘリンレベルの間に観察された。
【図１０】白斑患者の血清中のＭＭＰ９レベルと体表面積との相関。（Ａ）ＭＭＰ９のレベルを、白斑（安定性及び進行性）を伴う患者の血清中のＥＬＩＳＡにより決定し、関与する体表面積（ＢＳＡ）に基づいて分類した（＜１０％又は＞１０％）（マンホイットニー検定を使用し、Ｐ＜０．０５）。（Ｂ）ＭＭＰ９の血清レベルは体表面積と相関していた（スピアマン検定Ｐ＜０．０５）。正の相関が、ＭＭＰ９レベルと白斑患者に関与する体表面積の間に観察される。
【図１１】白斑患者の血清中の活性ＭＭＰ９のレベル。活性ＭＭＰ９のレベルは、健常対照（ｎ＝１２）又は活動性白斑を伴う患者（ｎ＝１２）の血清中でＦｌｕｏｒｏｋｉｎｅ  Ｅヒト活性ＭＭＰ９キットを使用することにより決定した。サンプルをＡＭＰＡ（酢酸ｐ−アミノフェニル水銀）の添加を用いて活性化した（マンホイットニー検定を使用し、Ｐ＜０．０５）。活性ＭＭＰ９の発現増加を活動性白斑患者からの血清中で観察する。
【図１２】皮膚中及びＲＨＰＥ  ３Ｄモデル中でのＭＭＰ９遺伝子発現。（Ａ）ＭＭＰ９遺伝子発現を、白斑患者の健常対照皮膚（ｎ＝６）ならびに非病変（ＮＬ）、病変（Ｌ）、及び病変周囲（ＰＬ）の皮膚（ｎ＝６）においてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより評価した。平均値＋ＳＥＭを示す。（Ｂ）再構築したヒト色素表皮を、ＴＮＦα及びＩＦＮγの存在又は非存在において２４時間にわたり処理した。ＭＭＰ９遺伝子発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより決定した（マンホイットニー検定を使用し、Ｐ＜０．０１）。ＭＭＰ９遺伝子の発現増加は、非罹患個体からの健常皮膚と比較し、白斑患者の病変、病変周囲、及び非病変皮膚の両方において観察される。また、ＴＮＦα及びＩＦＮγ誘導性ＭＭＰ９遺伝子発現を、ＲＮＰＥ  ３Ｄモデルを使用して示す。
【図１３】ＭＭＰ９インヒビターａｂ１４２１８０又はＳＢ−ＣＴの存在又は非存在におけるＴＮＦα及びＩＦＮγを伴う又は伴わないＲＨＰＥの処理。再構築したヒト色素表皮を、１μM及び１０μMのＭＭＰ９インヒビターａｂ１４２１８０又はＳＢ−ＣＴの存在又は非存在において、１０ng/mlのＴＮＦα及びＩＦＮγを伴い又は伴わずに２４時間にわたり処理した。（Ａ）ＭＭＰ９遺伝子発現のリアルタイムＰＣＲ分析。結果を、対照培養物を上回る増加倍数として表す。ＧＡＰＤＨをハウスキーピング遺伝子として使用した。（Ｂ）無細胞上清中のＥＬＩＳＡによるＭＭＰ９レベルの測定。これらの結果は、ＭＭＰ９阻害がＴＮＦαとＩＦＮγの組み合わせにより誘導されるＭＭＰ９産生を低下させることを示す。
【０１１３】
実施例
１／白斑における皮膚浸潤性Ｔ細胞によるＴＮＦα及びＩＦＮγの分泌増加。
本発明者らは、炎症性サイトカイン、特にＴＮＦα及びＩＦＮγ（疾患の発症に潜在的に関与するとして以前に同定された２つのサイトカイン）を産生する傾向を分析するために、安定性又は進行性疾患を伴う白斑患者の病変周囲皮膚からＴ細胞を抽出した（Boniface et al. G. Ital. Dermatol. Venereol 2016において概説されている）。結果を、健常個人から得られたものと比較した（図１）。それらは、活動性疾患を伴う白斑患者の皮膚から抽出されたＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞が、高レベルの１型関連サイトカインＩＦＮγ及びＴＮＦα（また、Ｔ細胞サブセットの大半により分泌されることが公知である）を産生することを示し、メラニン細胞の喪失におけるそれらの関与を示唆する。
【０１１４】
２／ＴＮＦ及びＩＦＮγ：メラニン細胞阻害に関与する２つの主要サイトカイン。
本発明者らは次に、メラニン細胞機能に関与する遺伝子、例えば小眼球症関連転写因子（ＭＩＴＦ、メラニン細胞マスター転写因子）及びチロシナーゼ（メラニン形成に関与するＴＹＲ）など、ならびにＥ−カドヘリンコード遺伝子（ＣＤＨ１）（メラニン細胞のケラチノサイト及び表皮基底膜への接着に重要なタンパク質）の発現に対する炎症誘発性又は抗炎症性サイトカインの生物学的活性を評価した。より正確には、本発明者らは、ヒト表皮メラニン細胞の初代培養に対するＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ−１７、ＩＬ−１β、及びＴＧＦβの単独又は組み合わせの効果を評価した（図２）。ＩＦＮγ又はＴＮＦβは、メラニン細胞の分化、機能、メラニン合成、及びメラニン細胞の接着に関与する遺伝子の発現を阻害した（図２Ａ）；ＴＧＦβはまた、弱いレベルではあるがメラニン細胞機能を下方制御することができたのに対し、ＩＬ−１７及びＩＬ−１βは効果が全くないか又はほとんどなかった。驚くべきことに、５つのサイトカインの組み合わせは、試験した遺伝子の頑強な阻害をもたらした。本発明者らは、より具体的には、メラニン細胞機能及び接着性を阻害する最も強力なサイトカインとしてＴＮＦα及びＩＦＮγを同定した（図２Ｂ）。
【０１１５】
３／ＴＮＦα及びＩＦＮγは、メラニン細胞に相乗的に作用して色素沈着を阻害し、炎症メディエーターを誘導する。
本発明者らは、メラニン細胞機能を改変するために協調して作用するＴＮＦα及びＩＦＮγの能力を評価した。図３及び図６に示すように、ＴＮＦα及びＩＦＮγは相乗作用し、色素沈着シグナル伝達に関与する遺伝子、例えばＭＩＴＦ、メラニン細胞マスター転写因子、チロシナーゼ（ＴＹＲ）、及びドーパクロムトートメラーゼ（ＤＣＴ）などの発現を下方制御した。ＴＮＦα及びＩＦＮγはまた、相乗作用し、ＩＬ−６、ＴＮＦα、及び細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）を含むメラニン細胞中の炎症性遺伝子の発現を上方制御し、それらはまたＣＸＣＲ３リガンドであるＣＸＣＬ９及びＣＸＣＬ１０の産生を誘導した  図３Ｂ）。これらの結果は、メラニン細胞が１型関連サイトカインの影響下で炎症性細胞になりうるが、白斑において観察される炎症反応を増幅しうることを初めて明らかにする。
【０１１６】
４／ＴＮＦα及びＩＦＮγは、Ｅ−カドヘリン変化及びＭＭＰ９の誘導を通じてメラニン細胞の剥離を誘導する。
本発明者らは、ＴＮＦα及びＩＦＮγが相乗効果を有し、メラニン細胞中のＣＤＨ１転写物の発現を下方制御するが（図４Ａ）、ケラチノサイト中ではしないことを示した（図４Ｂ）。そのような効果は興味深く、なぜなら、ヒトメラニン細胞接着の主要な媒介物質であるＥ−カドヘリンが白斑患者のメラニン細胞膜全体に不連続に分布していることが最近示されたためである（Wagner et al. J Invest Dermatol. 2015）。Ｅ−カドヘリンは、２つの形態で存在する膜貫通タンパク質である：全長Ｅ−カドヘリン及び可溶性Ｅ−カドヘリン（David et al. Cancer Res 2012）。可溶性形態は、自己免疫疾患を伴う患者の血清中で上方制御されることが示されている（Jin et al. J Rheumatol 2013; Matsuoyoshi et al. Br J Dermatol 1995）。本発明者らは、白斑患者の血清中の可溶性Ｅ−カドヘリンのレベルを決定した。図４Ｃに示すように、可溶性Ｅ−カドヘリンのレベルは、健常対照と比較し、白斑患者において有意に高かった。また、そのようなレベルは疾患活動性と相関する傾向があり、可溶性Ｅ−カドヘリンのレベルが疾患活動性のマーカーとして使用することができることを示す。いくつかの酵素が全長Ｅ−ｃａｄｈを切断し、その可溶性形態の放出に導くことができる（マトリックスメタロプロテイナーゼＭＭＰ９（別名ゼラチナーゼ）を含む）（Symowicz et al. Cancer Res 2007）。本発明者らは、総ＭＭＰ９レベル及び活性ＭＭＰ９レベルの両方が、健常対照よりも白斑を伴う患者の血清において有意に高いことを示した（図８及び１１）。ＭＭＰ９レベルは、安定性白斑と比較し、活動性疾患を伴う患者において有意に高かった。驚くべきことに、彼らは、白斑患者においてＭＭＰ９と可溶性Ｅ−カドヘリンレベルの間に正の相関を観察した。白斑患者に関与するＭＭＰ９レベルと体表面積の間の正の相関もまた観察された（図１０）。彼らはまた、非罹患個体からの健常皮膚と比較し、白斑患者の病変、病変周囲、及び非病変皮膚の両方においてＭＭＰ９遺伝子の増加した発現を示した（図１２Ａ）。重要なことに、本発明者らは、ＴＮＦβがメラニン細胞におけるＭＭＰ９遺伝子の発現を上方制御することを示した（図４Ｄ）；そのような効果は、ＩＦＮγの存在において増強された。これらの結果は、ＭＭＰ９が白斑中の可溶性Ｅ−カドヘリンの上方制御に関与しうることを示唆する。
【０１１７】
次に、メラニン細胞接着に対するＴＮＦα及びＩＦＮγの生物学的活性をより良く特徴付けるために、本発明者らは、メラニン細胞及びケラチノサイトの両方を含む色素脱失のインビトロ３Ｄ細胞モデルを使用した。驚くべきことに、彼らは、ＴＮＦα及びＩＦＮγの複合活性が、少なくとも部分的にＥ−カドヘリン発現の変化（図４Ｅ）及びＭＭＰ９遺伝子発現の上方制御（図１２Ｂ）を通じて媒介されるモデル基底層からのメラニン細胞剥離を誘導することを示した。メラニン形成関連遺伝子であるＤＣＴにおける減少も観察された（図７）。そのような表現型は、白斑病患者（安定性又は進行性疾患）の病変周囲皮膚において観察されるものと明らかに似ており、そこではメラニン細胞が表皮の基底層から剥離している（図４Ｆ）。興味深いことに、そのような現象は乾癬においても観察され（図４Ｆ）、メラニン細胞接着の欠損が乾癬のような他の皮膚炎症状態に拡大されうることを強調する。さらに、本発明者らは、ＴＮＦα及びＩＦＮγが、単独で又は組み合わせにおいて、メラニン細胞のアポトーシスに対してほとんど又は全く効果がないことを示した（図８Ａ）。これらのデータは、メラニン細胞が白斑患者の病変周囲皮膚においてアポトーシスを受けないという観察と一致しており（図８Ｂ）、メラニン細胞の剥離が白斑におけるメラニン細胞の喪失に関与する主な機構であることを強調する。
【０１１８】
まとめると、これらの結果は非常に興味深く、メラニン細胞の喪失に導く新たな機構を同定し、ＴＮＦα及びＩＦＮγの重大な役割を伴う。また、この色素脱失のインビトロモデルは、白斑患者において、ならびに炎症性皮膚疾患に関連する色素脱失障害を伴う患者において新たな治療標的をテストするために有利に使用することができる。
【０１１９】
５／ＭＭＰ９阻害は、表皮の基底膜へのメラニン細胞の安定化を通じてＴＮＦα及びＩＦＮγ誘導性色素脱失を予防する。
上で考察するように、ＴＮＦβ及びＩＦＮγはメラニン細胞においてＭＭＰ９遺伝子発現を誘導する。本発明者らは、２つの商業的に利用可能な合成ＭＭＰ９インヒビター、ＳＢ３ＣＴ（非選択的ＭＭＰ２及びＭＭＰ３インヒビター）及び選択的ＭＭＰ９インヒビター（ａｂ１４２１８０）を使用し、そのような阻害が色素脱失に対するＴＮＦβ及びＩＦＮγの効果を阻害しうるか否かを評価した。メラニン細胞を含むインビトロで再構築されたヒト表皮を、２つの異なるＭＭＰ９インヒビターの存在又は非存在においてこれら２つのサイトカインを用いて２４時間にわたり刺激した（図５）。ＴＮＦα及びＩＦＮγの組み合わせは、メラニン細胞の剥離及びＥ−カドヘリン阻害を誘導した。重要なことに、そのような効果はＭＭＰ９インヒビターの存在において強く阻害された。なぜなら、ＭＭＰ９阻害は表皮の基底膜へのメラニン細胞の安定化に導き（図５）、ＩＦＮγ及びＴＮＦαの両方の組み合わせにより誘導されたＭＭＰ９発現を遺伝子及びタンパク質の両方のレベルで低下させたからである（図１３）。これらの結果は、メラニン細胞接着に対するＩＦＮγ及びＴＮＦαの効果がＭＭＰ９を通じて媒介されることを実証した最初のものである。
【０１２０】
まとめると、これらの結果は、ＭＭＰ９を阻害することが、白斑におけるメラニン細胞の喪失を予防するだけでなく、また、皮膚炎症性障害（例えば乾癬、アトピー性皮膚炎、強皮症、又はハイポメラノース（ｈｙｐｏｍｅｌａｎｏｓｅ）など）においても起こる色素脱失においても魅力的で新規な戦略を表すとの概念を支持する。
【０１２１】
６／再構築された色素脱失メラニン化表皮モデルの調製方法の例。
色素性表皮（ＲＨＥｍ）は、正常人のケラチノサイト（ＮＨＥＫ）から及び正常人のメラニン細胞（ＮＨＥＭ）から再構築する。
【０１２２】
１．ＲＨＥｍ処置
１０日間の再構築後（Ｄ１０）、再構築されたヒト色素性表皮（ＲＨＥｍ）を、ヒドロコルチゾンを伴わない２mlの培養培地中の６ウェルプレート（ＮＵＮＣ参照番号１４０６７５）に入れ、それに１０ng/mlのインターフェロン（ＩＦＮ）−γ（R&Dシステムズ）及び１０ng/mlの「腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α」（R&Dシステムズ）を加える。サイトカインを伴わない対照条件を実施する。各々の実験条件を二通り又は三通りに実施する。
【０１２３】
ヒドロコルチゾンを伴わない培地の組成：以下を添加した完全EpiLife（登録商標）培地（cascade biologics（登録商標）基本培地参照Ｍ−ＥＰＩ−５００−ＣＡ＋添加剤参照Ｓ  ００１  Ｋ、その中でＩＧＦ−１及びヒドロコルチゾンアリコートは使用されていない）：
−５μg/mlのウシインスリン（Sigma Aldrich I1882）
−５０μg/mlのビタミンＣ（Sigma Aldrich A4403）
−３ng/mlのケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）（Millipore GF008）
−１．５mMのＣａＣｌ２（Sigma Aldrich C7902）。
【０１２４】
２４時間のインキュベーション期間後、再構成された表皮を含むインサートを、プライヤーを用いて回収し、インサート下の残留液を除去するためにタオルの上に置き、次に再構成された表皮を、メスを用いて支持体から切除し、ホルムアルデヒド溶液中に入れ、脱水前にパラフィン中に包埋した。
【０１２５】
２．メラニン細胞剥離の分析
パラフィン含有物の５μM切片を、免疫蛍光法による標識化のためにスライド上に載せて、以下のプロトコールに従ってメラン−Ａ及びＥ−カドヘリンを明らかにする：
１−脱パラフィン
スライドを７０℃のホットプレート上に置く。          １０分間
連続キシレン浴                                      ３×５分間
２−脱水
エタノール１００°                                  １分間
エタノール１００°                                  １分間
エタノール９５°                                    １分間
エタノール７０°                                    １分間
エタノール５０°                                    １分間
蒸留水                                              １分間
ＰＢＳ又はＴＢＳ                                    ５分間
３−抗原のアクセシビリティ
デブロッキングチャンバー装置BIOCARE Medicalの使用
スライドをｐＨ  ８の装置に入れる。
プログラムを起動させる（９８℃−２０分）。
冷却温度（６０〜７０℃）に等しい温度で、ＴＢＳ（Ｔｒｉｓ緩衝食塩水）０．１％Ｔｗｅｅｎで洗浄する。
室温に戻す
４−ＴＢＳ  ０．１％Ｔｗｅｅｎで洗浄する。          ３×５分間
５−疎水性ペンを用いて堆積領域を区切る。
６−１／１００希釈の一次抗ＭＥＬＡＮＡＡ抗体（１）及び１／１００希釈の抗Ｅ−ＣＡＤＨＥＲＩＮ抗体（２）を緩衝液（３）中に入れる。
４℃で一晩インキュベートする。
７−翌日：ＴＢＳ  ０．１％Ｔｗｅｅｎで洗浄する。    ３×５分間
緩衝液（３）中の１／１００希釈の二次抗体Ａ５５５（４）＋緩衝液（３）中の１／１００希釈のＡ  ４８８（５）を入れる。                  ６０分間
８−ＴＢＳ  ０．１％Ｔｗｅｅｎで洗浄する。          ３×５分間
【０１２６】
遮光して「ＤＡＰＩ」（６）を伴うミディアムアセンブリでスライドを組み立てる。
（１）：DAKO Melan-AクローンA103アイソタイプIgG1、カッパ（参照：Ｍ  ７１９６）
（３）：バックグラウンド低減成分を伴うDAKO Antibody Diluent（参照：Ｓ３０２２）
（２）：Abcamウサギ抗Ｅ−カドヘリン抗体（参照：ａｂ  １５１４８）
（４）：Invitrogen Alexa 555ヤギ抗マウスＩｇＧ（参照：Ａ２１４２２）
（５）：Invitrogen Alexa 488ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（参照：Ａ２１４４１）又はNovus（参照：ＮＢＰ  １−７２９４４）
（６）：ＤＡＰＩを伴うMolecular Probes Prolong退色防止金試薬（参照：Ｐ３６９３５）
次に、メラニン細胞の剥離の分析のために蛍光顕微鏡を用いて読む。
【０１２７】
結論：本発明者らは、それを必要とする対象において、色素脱失障害、典型的には炎症に関連する色素脱失障害を予防、処置、又は軽減するための使用のための活性分子としてマトリックスメタロプロテイナーゼ−９（ＭＭＰ９）のインヒビターを同定する。そのような分子は、白斑、白血球症、乾癬、アトピー性皮膚炎、強皮症、及びハイポメラノース（ｈｙｐｏｍｅｌａｎｏｓｅ）を予防、処置、又は軽減するために特に興味深い。
【０１２８】
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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