(57)【要約】  本開示は、インスリンとグルカゴンとを対象に共投与することを含む治療方法、およびインスリンとグルカゴンとを含む合剤を提供する。
2020505429.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インスリンおよびグルカゴンを対象に共投与する工程を含む治療方法であって、前記インスリンおよびグルカゴンが、約１：１〜約６：１の間のインスリン：グルカゴンのモル比で共投与され、前記インスリンおよびグルカゴンが、同時に高血糖を治療または阻害し、かつ低血糖を阻害するのに治療的に有効な量で投与される、方法。
【請求項２】
前記対象が、前記インスリンおよびグルカゴンを共投与する前には高血糖である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記インスリンおよびグルカゴンを共投与する工程が、前記インスリンおよびグルカゴンを含む合剤を前記対象に投与する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記合剤が、約１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬの間の濃度のインスリン、および約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１ｍｇ／ｍＬの間の濃度のグルカゴンを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記合剤が、約３ｍｇ／ｍＬ〜約５ｍｇ／ｍＬの間の濃度のインスリン、および約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約０．８ｍｇ／ｍＬの間の濃度のグルカゴンを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記合剤が、１種または複数の非水性溶媒を含む溶媒を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記溶媒の約２０％〜約６０％（ｖ／ｖ）の間が、前記１種または複数の非水性溶媒からなる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも１種の非水性溶媒が、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記溶媒が、１種または複数の水性溶媒をさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記溶媒の約４０％（ｖ／ｖ）以下が、前記１種または複数の水性溶媒からなる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記溶媒の約１０％〜約４０％の間が、プロピレングリコール（ＰＧ）、グリセロール、またはＰＧとグリセロールとの組合せである、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
前記インスリンおよびグルカゴンの合剤が、注射としてまたは注入ポンプにおいて患者が取り扱う場合に十分な使用中の安定性を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項１３】
前記インスリンおよびグルカゴンを共投与する工程が、前記インスリンおよびグルカゴンを皮下投与する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記インスリンが、肝選択的インスリンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記インスリンおよびグルカゴンが、約１：１〜約５：１の間のインスリン：グルカゴンのモル比で共投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記インスリンおよびグルカゴンが、約３：１〜約６：１の間のインスリン：グルカゴンのモル比で共投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記インスリンおよびグルカゴンが、約３：１〜約５：１の間のインスリン：グルカゴンのモル比で共投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記インスリンおよびグルカゴンを共投与する工程が、前記インスリンを約０．２〜０．６ｍＵ／ｋｇ／分の基礎注入速度で投与する工程、および、前記グルカゴンを約１〜４ｎｇ／ｋｇ／分の基礎注入速度で投与する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記インスリンおよびグルカゴンを共投与する工程が、前記インスリンを約０．３〜０．５ｍＵ／ｋｇ／分の基礎注入速度で投与する工程を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記インスリンおよびグルカゴンを共投与する工程が、前記グルカゴンを約２〜３ｎｇ／ｋｇ／分の基礎注入速度で投与する工程を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記インスリンが、インスリンアナログを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記グルカゴンが、グルカゴンアナログを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記対象が、１型、２型、妊娠性、または他の形態の糖尿病を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記インスリンおよびグルカゴンが共投与される場合、前記対象が自律神経不全に関連する低血糖を示している、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
約１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬの間の濃度でインスリンを含み、かつ約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１ｍｇ／ｍＬの間の濃度でグルカゴンを含む合剤であって、インスリン：グルカゴンのモル比は、約１：１〜約６：１の間である、合剤。
【請求項２６】
前記インスリン：グルカゴンのモル比が、約１：１〜約５：１の間である、請求項２５に記載の合剤。
【請求項２７】
前記インスリン：グルカゴンのモル比が、約３：１〜約６：１の間である、請求項２５に記載の合剤。
【請求項２８】
前記インスリン：グルカゴンのモル比が、約３：１〜約５：１の間である、請求項２５に記載の合剤。
【請求項２９】
前記インスリンが、約３ｍｇ／ｍＬ〜約５ｍｇ／ｍＬの間の濃度であり、前記グルカゴンが、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約０．８ｍｇ／ｍＬの間の濃度である、請求項２５に記載の合剤。
【請求項３０】
１種または複数の水性溶媒および１種または複数の非水性溶媒を含む溶媒をさらに含む、請求項２５に記載の合剤。
【請求項３１】
前記溶媒の約２０％〜約６０％（ｖ／ｖ）の間が、１種または複数の非水性溶媒からなり、前記溶媒の約４０％（ｖ／ｖ）以下が、１種または複数の水性溶媒からなる、請求項３０に記載の合剤。
【請求項３２】
少なくとも１種の非水性溶媒が、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記溶媒の約１０％〜約４０％の間が、プロピレングリコール（ＰＧ）、グリセロール、またはＰＧとグリセロールとの組合せである、請求項３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年２月３日出願の米国仮特許出願第６２／４５４，６１３号の利益を主張するものであり、その内容はすべての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本開示は、糖尿病患者の治療、特にインスリンとグルカゴンとの共投与を含む治療のためのシステム、組成物および方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病患者の治療には、多くの場合、例えばシリンジによる注射またはインスリン送達ポンプを介したインスリンの送達が含まれる。低血糖は、Ｔ１ＤＭ患者が最も恐れている合併症である。低血糖を避けるためインスリンが過少量投与されるので、低血糖は、有効な治療に対する主な障壁である。結果として、多くの場合、現在の治療によって、望ましくない低血糖イベントおよび／または高血糖イベントを含む不適切な血糖制御がもたらされる。
血液グルコース変動および低血糖エピソードを低減しながら、糖尿病患者を治療するシステム、組成物、および方法が必要である。
【発明の概要】
【０００３】
本明細書に記載のシステム、デバイス、および方法の実施形態は、糖尿病患者の治療のためのシステム、デバイス、および方法と関連し得る。
いくつかの態様では、本開示は、インスリンとグルカゴンとを対象に共投与することを含む治療方法を提供し、インスリンとグルカゴンとを、インスリン：グルカゴンのモル比約１：１〜約６：１の間で共投与し、インスリンとグルカゴンとを、同時に、高血糖を治療または阻害するために、および低血糖を阻害するために、治療有効量で投与する。例えば、インスリンとグルカゴンとを、インスリン：グルカゴンのモル比約１：１〜約５：１の間で、約３：１〜約６：１の間で、または約３：１〜約５：１の間で共投与してもよい。対象は、インスリンとグルカゴンを共投与する前には高血糖であり得る。いくつかの実施形態では、インスリンとグルカゴンとの共投与は、インスリンとグルカゴンとを含む合剤を対象に投与することを含んでもよい。合剤は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬの間の濃度のインスリン、および約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１ｍｇ／ｍＬの間の濃度のグルカゴンを含んでもよい。例えば、合剤は、約３ｍｇ／ｍＬ〜約５ｍｇ／ｍＬの間の濃度のインスリン、および約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約０．８ｍｇ／ｍＬの間の濃度のグルカゴンを含んでもよい。合剤は、少なくとも１種の非水性溶媒（例えば、ジメチルスルホキシドおよび／またはＮ−メチルピロリドンなどの非プロトン性溶媒）を含む溶媒を含んでもよい。いくつかの実施形態では、溶媒の約２０％〜約６０％（ｖ／ｖ）が、１種または複数の非水性溶媒からなる。溶媒はさらに、１種または複数の水性溶媒を含んでもよい。いくつかの実施形態では、溶媒の約４０％（ｖ／ｖ）以下が、１種または複数の水性溶媒からなる。いくつかの実施形態では、溶媒の約１０％〜約４０％（ｖ／ｖ）は、プロピレングリコール（ＰＧ）、グリセロール、またはＰＧとグリセロールとの組合せである。インスリンとグルカゴンとの共投与は、インスリンとグルカゴンとを皮下投与することを含んでもよい。インスリンとグルカゴンとの共投与は、インスリンを約０．２〜０．６ｍＵ／ｋｇ／分の基礎注入速度で投与することおよびグルカゴンを約１〜４ｎｇ／ｋｇ／分の基礎注入速度で投与することを含んでもよい。例えば、インスリンは、約０．３〜０．５ｍＵ／ｋｇ／分の基礎注入速度で投与してもよく、および／またはグルカゴンは、約２〜３ｎｇ／ｋｇ／分の基礎注入速度で投与してもよい。
【０００４】
いくつかの態様では、本開示は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬの間の濃度のインスリン、および約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１ｍｇ／ｍＬの間の濃度のグルカゴンを含む合剤を提供し、インスリン：グルカゴンのモル比は、約１：１〜約６：１の間である。例えば、インスリン：グルカゴンのモル比は、約１：１〜約５：１の間、約３：１〜約６：１の間、または約３：１〜約５：１の間であってもよい。インスリンは、約３ｍｇ／ｍＬ〜約５ｍｇ／ｍＬの間の濃度であってもよく、グルカゴンは、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約０．８ｍｇ／ｍＬの間の濃度であってもよい。合剤は、１種または複数の水性溶媒および１種または複数の非水性溶媒（例えば、ＤＭＳＯおよび／またはＮＭＰなどの非プロトン性溶媒）を含む溶媒をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態では、溶媒の約２０％〜約６０％（ｖ／ｖ）が、１種または複数の非水性溶媒からなり得る。溶媒はさらに、１種または複数の水性溶媒を含んでもよい。いくつかの実施形態では、溶媒の約４０％（ｖ／ｖ）以下が、１種または複数の水性溶媒からなり得る。いくつかの実施形態では、溶媒の約１０％〜約４０％は、プロピレングリコール（ＰＧ）、グリセロール、またはＰＧとグリセロールとの組合せであり得る。
【０００５】
本明細書に記載される技術は、その属性および付随する利点とともに、代表的な実施形態が例により説明される添付の図面と併せて以下の詳細な説明を考慮して、最もよく認識および理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】本発明の概念と一致する、単一のリザーバを備えた単一のポンプデバイスを含む、組成物を患者に送達するためのシステムを示す。
【図１Ａ】本発明の概念と一致する、２つのリザーバを備えた単一のポンプデバイスを含む、組成物を患者に送達するためのシステムを示す。
【図１Ｂ】本発明の概念と一致する、２つのポンプデバイスを含む、組成物を患者に送達するためのシステムを示す。
【図２−１５】本発明の概念と一致する、出願人によって実施された哺乳動物試験からのデータを示す。
【図１６】本発明の概念と一致する、出願人によって実施された哺乳動物試験のプロトコルを示す。
【図１７−４６】本発明の概念と一致する、出願人によって実施された哺乳動物試験からのデータを示す。
【図４７−４８】本発明の概念と一致する、インスリンとグルカゴンとの合剤を使用した、出願人によって実施された哺乳動物試験からのデータを示す。
【図４９】本発明の概念と一致する、インスリン誘発性低血糖が現れた場合に、グルカゴンがグルコース産生を増加させかつ増加を維持する能力を評価するために、出願人によって実施された哺乳動物試験の実験タイムラインを示す。
【図５０−６０】本発明の概念と一致する、インスリン誘発性低血糖が現れた場合に、グルカゴンがグルコース産生を増加させかつ増加を維持する能力を評価するために、出願人によって実施された哺乳動物試験のデータを示す。
【図６１−６２】本発明の概念と一致する、基礎ホルモン補充を可能にし、有意な低血糖保護を提供する、インスリンとグルカゴンとの合剤の潜在力を評価するために出願人によって実施された哺乳動物試験からのデータを示す。
【図６３−６５】本発明の概念と一致する、インスリンとグルカゴンとの共注入が、正常血糖を維持しながら、２つのホルモンの基礎内因性分泌を補充する能力を評価するために、出願人によって実施された哺乳動物試験からのデータを示す。
【図６６−６７】本発明の概念と一致する、Ｉ／Ｇモル比４を維持しながら、インスリンおよびグルカゴンの基礎補充速度を減少させて、グルカゴンが正常血糖を維持するかどうかを判定するために出願人によって実施された哺乳類試験からのデータを示す。
【図６８−６９】本発明の概念と一致する、０．４ｍＵ／ｋｇ／分の速度でのインスリン注入および１．３８ｎｇ／ｋｇ／分の速度でのグルカゴン注入が、インスリンおよびグルカゴンの基礎分泌を効果的に補充して、インスリン誘発性低血糖を制限する能力を評価するために、出願人によって実施された哺乳動物試験からのデータを示す。
【図７０−７３】本発明の概念と一致する、２〜８℃で安定な注入ポンプで使用するための、インスリンとグルカゴンとの非水性合剤の開発を支援するために、出願人によって実施された哺乳動物試験からのデータを示す。
【図７４−７６】本発明の概念と一致する、別個の溶液としてのインスリンおよびグルカゴンと比較して、インスリンとグルカゴンとの合剤溶液の治療的価値を評価するために、出願人によって実施された哺乳動物試験からのデータを示す。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
ここで、本技術の本実施形態を詳細に参照し、その例を添付の図面に示す。同一かまたは同様の部分を指すために、図面全体を通じて同一の参照番号を使用する。
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」などの含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）の任意の形態）、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」（ならびに「持つ（ｈａｖｅ）」および「有する（ｈａｓ）」などの有する（ｈａｖｉｎｇ）の任意の形態）、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」などの含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）の任意の形態）または「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（ならびに「含む（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」および「含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」などの含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）の任意の形態）という単語は、本明細書で使用する場合、記載されている機能、整数、工程、操作、要素、および／または成分の存在を特定するが、１つまたは複数の他の機能、整数、工程、操作、要素、成分、および／またはそれらの群の存在または追加を排除するものではないと、理解されるであろう。
【０００８】
本明細書では、第１、第２、第３などの用語を使用して種々の制限、要素、成分、領域、層および／またはセクションを説明するが、これらの制限、要素、成分、領域、層および／またはセクションは、これらの用語によって限定されるべきではない。これらの用語は、ある制限、要素、成分、領域、層またはセクションを、別の制限、要素、成分、領域、層またはセクションと区別するためにのみ使用する。したがって、以下で論じる第１の制限、要素、成分、領域、層またはセクションは、本出願の教示から逸脱することなく、第２の制限、要素、成分、領域、層またはセクションと称することができる。
【０００９】
さらに、ある要素が別の要素「上に」ある、別の要素に「付着（ａｔｔａｃｈｅｄ）」、「接続（ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ）」または「結合（ｃｏｕｐｌｅｄ）」していると呼ばれるとき、それは直接他の要素上に（ｏｎ）もしくは他の要素上に（ａｂｏｖｅ）あり得るか、または他の要素に接続もしくは結合し得る、または１つもしくは複数の介在要素が存在し得る。対照的に、ある要素が別の要素「上に直接」ある、別の要素に「直接付着」、「直接接続」または「直接結合」していると呼ばれるとき、介在要素は存在しない。要素間の関係を説明するために使用する他の単語も同様に解釈するべきである（例えば、「間に」対「直接間に」、「隣接して」対「直接隣接して」など）。
【００１０】
第１の要素が第２の要素の「中に」、「上に」および／または「内」にあると呼ばれるとき、第１の要素は、第２の要素の内部空間内に、第２の要素の一部内に（例えば、第２要素の壁内に）配置し得る；第２の要素の外面および／または内面に配置し得る；およびこれらの１つまたは複数の組合せで配置し得ることが、さらに理解される。
本発明で使用する場合、「近接」という用語は、参照される構成要素に比較的近い場所、参照される構成要素の上の、中の、および／または内の場所、または他の場所を含むものとする。
【００１１】
「下に（ｂｅｎｅａｔｈ）」、「下部に（ｂｅｌｏｗ）」、「下方に（ｌｏｗｅｒ）」、「上部に（ａｂｏｖｅ）」、「上方に（ｕｐｐｅｒ）」などの空間的に相対的な用語は、例えば、図に示すように、ある要素および／または特徴の別の要素との関係を説明するために使用し得る。さらに、空間的に相対的な用語は、図に示されている向きに加えて、使用中および／または動作中のデバイスの異なる向きを包含することを意図していることもさらに理解されよう。例えば、図中のデバイスをひっくり返すと、他の要素または機能の「下に」および／または「下部」に示されている要素は、他の要素または機能の「上部」に方向付けられる。デバイスは、別の方法で方向付けることができ（例えば、９０度回転または他の方向付け）、本明細書で使用される空間的に相対的な記述子は、それに応じて解釈され得る。
【００１２】
本明細書で使用する「低減する」、「低減すること」、「低減」などの用語は、ゼロへの低減を含む、量の低減を含み得る。発生の可能性を低減させることは、発生の防止を含むものとする。
本明細書で使用する「および／または」という用語は、２つの明記された特徴または構成要素のそれぞれの、他方を伴うかまたは伴わない特定の開示と解釈し得る。例えば、「Ａおよび／またはＢ」は、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、ならびに（ｉｉｉ）ＡおよびＢのそれぞれの、あたかもそれぞれが本明細書に個別に記載されているかのような、特定の開示と解釈し得る。
【００１３】
本明細書で使用する「インスリン」という用語は、ホルモンインスリン、および／または１つまたは複数の任意のインスリンアナログ（例えば、当業者に既知の１つまたは複数のインスリンアナログ）、例えばＮＰＨインスリン、インスリンアスパルト、インスリングルリジン、インスリンリスプロ、および／または肝選択的インスリン（ｈｅｐａｔｏ−ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｉｎｓｕｌｉｎ）を含むものとする。
本明細書で使用する「グルカゴン」という用語は、ホルモングルカゴン、および／または１つもしくは複数のグルカゴンアナログ（例えば、当業者に既知の１つまたは複数のグルカゴンアナログ）、例えばダシグルカゴン（ＺＰ−４２０７、Ｚｅａｌａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓとしても知られる）、［Ａｓｐ２８］グルカゴン、［Ａｓｐ２８、Ｇｌｕ２９］グルカゴン、［Ａｓｐ２８、Ｇｌｕ２９］グルカゴン、および／またはグルカゴン−Ｃｅｘなどを含むものとする。
明確にするため、別個の実施形態との関係において記載されている本発明の特定の特徴は、単一の実施形態に組み合わせて提供し得ると理解されている。逆に、簡潔にするために、単一の実施形態との関係において記載されている本発明の種々の特徴は、別個にまたは任意の好適な部分的組合せで提供し得る。例えば、（独立または従属）請求項のいずれか１項に記載されているすべての特徴は、所与の方法で組み合わせることができると理解されよう。
【００１４】
インスリンおよびグルカゴンの両方を同時に、または少なくとも比較的同時に（本明細書では「同時に（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ）」または「同時に（ａｔ  ｔｈｅ  ｓａｍｅ  ｔｉｍｅ）」）送達することなどにより、糖尿病患者を治療するためのシステム、組成物および方法を、本明細書において提供する。例えば、同時送達には、０．１秒〜９０分の間の期間、０．１秒〜６０分の間の期間、または０．１秒〜３０分の間の期間内に発生する、いずれかの順序で送達される、第１の薬剤（例えばインスリン）量および第２の薬剤（例えばグルカゴン）量の連続送達が含まれる。
糖尿病患者の治療を改善するために、医原性低血糖のリスクを軽減するためにインスリンの修飾を実施することができる。低血糖に安全なインスリンを開発することにより、インスリン投与量を漸増することができ、そうすることで血漿グルコースの低値と高値を小さくすることができるであろう。血漿グルコースの変動がより調整されるということは、Ｔ１ＤＭ治療における非常に望ましい転帰であり、ＨｂＡ１ｃの改善および他の合併症の低減につながるはずである。グルカゴンおよびインスリンは、肝臓におけるグルコース代謝に相対立する影響を及ぼし、グルカゴン注射はインスリンの過剰投与に起因する低血糖を克服するために長い間使用されてきた。グルカゴンは、血漿グルコースレベルが低い場合に、第１のホルモン反応者であることが知られている。非糖尿病患者では、低血糖に反応して分泌されるグルカゴンは、グルコース産生を刺激し、それにより血漿グルコースの低下を制限する。１型真性糖尿病（Ｔ１ＤＭ）患者では、アルファ細胞が機能不全（グルカゴンの細胞源）であり、グルカゴンは低血糖に反応して上昇しないため、自律神経系により大きな負担をかけ、その結果、自律神経系自体が機能不全になり得る。
【００１５】
正常血糖／高血糖状態では、インスリン（Ｉ）は肝臓に対するグルカゴン（Ｇ）の作用を圧倒し（Steiner, et al, in Metabolism, 1990）、両方の注入速度が上昇すると、所定のＩ／Ｇモル比でインスリンがグルカゴンを支配するようになる。一方、グルカゴンは、低血糖状態ではインスリンとの競合において、はるかに有効である。本発明の概念のシステム、デバイス、および方法は、治療モダリティとして、インスリンとグルカゴンとを望ましいモル比で組み合わせて、インスリンが低血糖を誘発する程度を低下させながら、インスリンが高血糖を制御する能力を保持する。２つのペプチドホルモンの送達は、それらの個々の製剤の同時共投与によるか、ペプチドホルモンの合剤の投与によるものであり得る。このようにして、投与されたグルカゴンは、不完全なアルファ細胞反応を補って、自律神経系への要求を軽減する。この組合せは、グルコース耐性にほとんどまたはまったく影響を与えずに血糖降下作用の緩衝を提供する。出願人は、この望ましい治療結果を裏付けるために、インスリンとグルカゴンとの特定の比率を静脈内および皮下組織の両方に同時に送達する、以下に記載するインビボ実験を実施した。
【００１６】
ここで図１を参照して、本発明の概念と一致する、糖尿病患者を治療するためのシステムを示す。システム１０は、ポンプ１００および組成物２００を含む。ポンプ１００は、組成物２００を取り囲み、貯蔵し、供給し、および／またはそうでなければ提供する（本明細書で一般に「提供する」）ために使用することができるリザーバ１５０を含むことができ、このように組成物２００の持効的および／または断続的送達が可能になる。ポンプ１００は、ポンプ１００が、組成物２００を、皮下組織；筋肉；静脈；および／または動脈のうちの１つまたは複数に送達する場合など、組成物２００を１つまたは複数の患者の部位に送達するように構成することができる。組成物２００は、組成物２００が少なくともインスリン（例えば、インスリンおよび／またはインスリンアナログ、本明細書では「インスリン」）およびグルカゴン（例えば、別個の材料または合剤もしくはそうでなければ混合状態）を含む場合など、２つ以上の薬剤を含むことができる。組成物２００は、少なくとも２つの薬剤の合剤または他の混合物を含むことができる。あるいは、組成物２００は、第１の薬剤２０１ａ（例えば、少なくともインスリンを含む薬剤）と別個の第２の薬剤２０１ｂ（例えば、第１の薬剤と混合されていない少なくともグルカゴンを含む薬剤）とを含むことができる。システム１０によって患者に送達される第１の薬剤２０１ａの量と第２の薬剤２０１ｂの量との比率（例えば、インスリン／グルカゴンモル比、またはＩ／Ｇモル比）は、予め決定することができ、および／またはそうでなければ制御（例えば最大に、最小に、および／または範囲内に制御）することができ、これにより例えば、患者にとって望ましい治療的利益および／または有害事象の欠如を達成することができる。
【００１７】
ポンプ１００は、ポンプ１００が、組み込まれた針（例えば、皮下（ＳＱ）空間、腹腔内（ＩＰ）空間、静脈、または動脈などの体の部位に、皮膚を通って配置された針）；針（例えば、皮下空間、腹腔内空間、静脈、または動脈などの体の部位に皮膚を通って配置された針）を含む注入セット；および／またはカテーテル（例えば、皮下空間、腹腔内空間、静脈または動脈などの体の部位に皮膚を通って配置されたカテーテル）を含む流体送達要素１３０を含む場合など、患者の外部に配置されたポンプを含むことができる。あるいは、ポンプ１００は、流体送達要素１３０がカテーテル、例えば皮下組織に埋め込まれたカテーテルを含む場合など、埋め込み型ポンプを含むことができる。ポンプ１００は、針を介して患者の皮膚を通ってアクセス可能な補充ポートを含む埋め込み型ポンプを含むことができる。
ポンプ１００は、シリンジドライブ；蠕動型ポンプアセンブリ；ロータリーポンプ；バネ駆動ポンプ；およびこれらの１つまたは複数の組合せからなる群から選択されるポンピング機構１２０などの、１つまたは複数のポンピング機構を含むことができる。リザーバ１５０は、リザーバ１５０が１つまたは複数のシリンジおよび／またはチャンバー（例えば、圧縮可能なチャンバー）を含む場合など、単一または複数のリザーバを含むことができる。
【００１８】
いくつかの実施形態では、組成物２００は、インスリンとグルカゴンとの合剤を含み、例えばリザーバ１５０が合剤を提供する単一のリザーバを含む。組成物２００は、グルカゴンと肝選択的インスリンとの合剤を含むことができる。肝選択的インスリンは肝臓に焦点を合わせた作用を強化し、グルカゴンは低血糖状態で有効な競合相手である。筋肉へのグルコース取込に対する合剤形態の非肝選択的インスリンの影響がより顕著であるので、合剤化組成物２００における肝選択的インスリンの使用を、非肝選択的インスリンを含む合剤と比較して結果が改善するように構成することができる。
【００１９】
いくつかの実施形態では、組成物２００は、約６未満のＩ／Ｇモル比、例えば約５未満、約４未満、または約３未満のＩ／Ｇ比を有するインスリンおよびグルカゴンを含む。いくつかの実施形態では、組成物２００は、６未満であるが約１を超えるＩ／Ｇモル比、例えば約２を超えるまたは約３を超えるＩ／Ｇモル比を有するインスリンおよびグルカゴンを含む。いくつかの実施形態では、組成物２００は、以下に記載する出願人の試験において使用するおおよそのＩ／Ｇモル比を有するインスリンおよびグルカゴンを含む。いくつかの実施形態では、組成物２００は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬの間の濃度、例えば約３ｍｇ／ｍＬ〜約５ｍｇ／ｍＬの間の濃度のインスリンを含んでもよい。いくつかの実施形態では、組成物２００は、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１ｍｇ／ｍＬの間の濃度、例えば約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約０．８ｍｇ／ｍＬの間の濃度のグルカゴンを含んでもよい。いくつかの実施形態では、組成物２００は、以下に記載する出願人の試験において使用する濃度でインスリンおよびグルカゴンを含む。組成物２００は、同時に、高血糖を治療または阻害するために、および低血糖を阻害するために、治療有効量で対象に投与し得る。例えば、組成物を、インスリンを約０．２〜０．６ｍＵ／ｋｇ／分の間の基礎インスリン注入速度で投与し、グルカゴンを約１〜４ｎｇ／ｋｇ／分の間の基礎注入速度で投与するような方法で投与してもよい。いくつかの実施形態では、組成物を、インスリンを約０．３〜０．５ｍＵ／ｋｇ／分の間の基礎インスリン注入速度で投与し、グルカゴンを約２〜３ｎｇ／ｋｇ／分の間の基礎注入速度で投与するような方法で投与してもよい。我々のデータは、食事を埋め合わせるためにインスリン注入速度を上げた場合、Ｉ／Ｇモル比３が、高血糖の治療に関して負の結果がほとんどなく、低血糖保護を提供することを示している。Ｉ／Ｇ比が低いと食後の高血糖を増加させるグルカゴンレベルが得られ、一方、Ｉ／Ｇモル比が高いと低血糖保護が不十分になりすぎる場合があるため、最適なＩ／Ｇモル比は２〜６の間で変動する可能性がある。さらに、グルカゴンおよびインスリンアナログは、天然のヒトインスリンおよびグルカゴンと異なる効力を有することがあるため、インスリンアナログおよびグルカゴンアナログを使用するときの異なる効力を考慮して、最適比をさらに調整する必要がある。
【００２０】
組成物２００は、１種または複数の非水性溶媒および／または１種または複数の水性溶媒を含む溶媒をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態では、溶媒の約２０％〜約６０％（ｖ／ｖ）が、１種または複数の非水性溶媒からなり得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１種の非水性溶媒は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）を含むがこれらに限定されない非プロトン性溶媒であり得る。溶媒はさらに、１種または複数の水性溶媒を含んでもよい。いくつかの実施形態では、溶媒の約４０％（ｖ／ｖ）以下が、１種または複数の水性溶媒からなり得る。最後に、いくつかの実施形態では、溶媒の約１０％〜約４０％は、プロピレングリコール（ＰＧ）、グリセロール、またはＰＧとグリセロールとの組合せであり得る。
【００２１】
いくつかの実施形態では、ポンプ１００は、図１Ａに示すような二重リザーバを備えたポンプを含む。リザーバ１５０ａは、第１の薬剤２０１ａ（例えば、インスリン）を提供するように構成することができ、一方、リザーバ１５０ｂは、第２の薬剤２０１ｂ（例えば、グルカゴン）を提供するように構成することができる。これらの実施形態では、組成物２００は、薬剤２０１ａおよび別個の（混合していない）薬剤２０１ｂを一括して含む。薬剤２０１ａおよび２０１ｂは、単一のポンピング機構１２０による投入および送達の前に混合することができる。リザーバ１５０ａおよび１５０ｂにそれぞれ貯蔵された各薬剤２０１ａおよび２０１ｂの濃度は、（例えば、本明細書に記載のインスリン対グルカゴンの所定のモル比を送達するための）各薬剤の主要成分の比率を決定するものとする。あるいは、ポンプ１００は、２つのポンピング機構１２０（例えば、機構１２０ａおよび１２０ｂは図示しないが独立して制御可能な機構）を含むことができ、薬剤１５０ａ対１５０ｂの所望の送達比を、それらの相対濃度に関係なく達成するように、ポンピングの流量を構成することができる（例えば、プログラムすることができるかまたはプログラム可能である）。
【００２２】
いくつかの実施形態では、ポンプ１００は、図１Ｂに示されるような２つのポンプ、ポンプ１００ａおよび１００ｂを含む。ポンプ１００ａは、第１の薬剤２０１ａ（例えば、インスリン）を提供するように構成することができるリザーバ１５０ａを含む。ポンプ１００ｂは、第２の薬剤２０１ｂ（例えば、グルカゴン）を提供するように構成することができる第２のリザーバ１５０ｂを含むことができる。これらの実施形態では、組成物２００は、薬剤２０１ａおよび別個の（混合していない）薬剤２０１ｂを一括して含む。薬剤２０１ａ対薬剤２０１ｂの送達比は、２つの薬剤２０１ａおよび２０１ｂそれぞれの濃度、ならびに２つのポンプ１００ａおよび１００ｂそれぞれのプログラムされた流量の両方によって、（例えば、本明細書に記載の所定のインスリン対グルカゴンのモル比を送達するように）決定する。
【００２３】
組成物２００は、そのグルカゴンとインスリンとが協調して血液グルコースを厳密に調節するように構成し得る。インスリンは、血液から筋肉および脂肪組織へのグルコースの移動を促進し、肝臓によるグルコースの産生も阻害し、それによって血液グルコースレベルを低下させる。グルカゴンは肝臓のグルコース産生を刺激し、グルコースが血流に放出されて血液グルコースを上昇させる。糖尿病患者では、インスリンを分泌するベータ細胞とグルカゴンを分泌するアルファ細胞の両方に欠陥がある。この問題は、インスリン欠乏として現れ、グルコース利用の減少およびグルコース産生の増加をもたらす。同時に、グルカゴンの過剰もまた、グルコース産生の増加をもたらす。したがって、現在の治療アプローチがインスリンの分泌および作用を強化し、グルカゴンの分泌および作用を遮断することに焦点を合わせていることは驚くべきことではない。
【００２４】
糖尿病患者の有効な治療に対する主要な障壁の１つは、特に１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）患者における、正常なグルカゴン反応により低血糖に反応する能力の不備である。この不備により、Ｔ１Ｄの患者は、正常な（非糖尿病の）人よりも低血糖の影響を受けやすくなる。この欠陥の結果として、これらの患者の血液グルコースレベルは激しく変動し、著しい高血糖と低血糖の両方を示し、そのため、このような患者がインスリン治療のみによって血液グルコースレベルを適切に制御することは、非常に困難である。最近、閉ループインスリンポンプを使用している研究者は、高血液グルコース時にインスリンを、低血液グルコース時にグルカゴンを使用すると、低血糖と高血糖の両方の振幅を低下させることができるという結論に達した（例えば、New England Journal of Medicine, June 2014におけるＲｕｓｓｅｌらによる出版物、およびDiabetes, Obesity and Metabolism, 2013におけるＢａｋｈｔｉａｎらによる出版物に記載されているように）。リアルタイムグルコースセンサーおよび洗練されたアルゴリズムを使用して、閉ループシステムにおいてインスリンまたはグルカゴン注入のいずれかをトリガーしているにもかかわらず、血液グルコースのこのような変動を低減させて、低血糖エピソードを最小限に抑えるという重要な満たされない必要性がいまだに存在する。
【００２５】
組成物２００は、低血糖を最小限に抑えながら有益な治療効果を達成するための、インスリンの量とグルカゴンの量との間の特定の関係（例えば比率）を含む。組成物２００は、そのような比率を含むことができ、および／またはそうでなければ、高インスリン血症および／または高グルカゴン血症による合併症を回避するように構成することができる。いくつかの実施形態では、システム１０および組成物２００を、高インスリン血症またはインスリン送達の増加との関係において、低血糖リスクを防ぐことができる十分なグルカゴンを患者に提供するように構成する。システム１０は、約２ｎｇ／ｋｇ／分の速度で患者にグルカゴンを提供することができる。システム１０は、０．５ｎｇ／ｋｇ／分を超える、または０．７５ｎｇ／ｋｇ／分を超える速度でグルカゴンを提供することができ、これにより、インスリンレベルが上昇したときまたは注入速度が増加したときに、低血糖を防ぐことができる。代替的にまたは追加的に、システム１０は、２０ｎｇ／ｋｇ／分未満のグルカゴン注入速度を提供することができ、これにより過剰なグルカゴンによる代謝障害および／または心血管毒性のリスクの増加を回避することができる。いくつかの実施形態ではシステム１０および組成物２００は、前に定義されたグルカゴン注入のレベルに対して、グルコース恒常性を維持するように構成されたインスリンの注入速度を提供する。組成物２００は、１：１〜６：１の間のヒトインスリン：ヒトグルカゴンの比、例えば約１：１〜５：１の間の比、約３：１〜約６：１の間の比、または約３：１〜約５：１の間の比を含むことができ、これによりグルコース効果を低下させるだけでなく、低血糖のリスクを低下させる。いくつかの実施形態では、システム１０を、いかなる量のグルカゴンによっても克服できない過剰なインスリンの投与の可能性を低減させるように、３．２ｍＵ／ｋｇ／分未満のインスリン（例えば、ヒトインスリン）を投与するように構成してもよい。
【００２６】
いくつかの実施形態では、システム１０は、グルカゴンを、高インスリン血症の状態で、高グルカゴン血症からの毒性をもたらすことなく低血糖から保護するのに十分であるように構成される最小速度、例えば１０ｎｇ／ｋｇ／分を超える速度で、または皮下に送達することができる２０ｎｇ／ｋｇ／分で提供する。いくつかの実施形態では、組成物２００は、システム１０によって組成物２００を介して送達されるグルカゴンとの関係において、グルコース恒常性の改善を可能にするように構成された比率でインスリン：グルカゴンを含む。一定のモル比を含む組成物２００を投与することにより、インスリンがシステム１０によって（例えばポンプ１００を介して）ボーラス投与される場合でも、システム１０は低血糖からの保護を提供する。
【００２７】
出願人は、グルカゴンとインスリンとが相互作用して肝臓のグルコース産生を制御する方法が、現況の血漿グルコースレベルの影響を受けることを示す試験を実施した。例えば、正常血糖状態でインスリンとグルカゴンの両方のレベルをモル基準で４倍に上げると、グルカゴンの作用を支配するインスリンの作用が生じる。実際、グルカゴンの４倍の上昇が肝臓のグルコース産生を刺激する能力は、インスリンレベルも４倍に上昇する場合には８０％まで低下する。低血糖状態では逆のことが起こる。出願人は、低血糖状態では、正常血糖状態におけるよりも、また高インスリンレベルの存在下におけるよりも、低グルコースの存在下で、グルカゴンの効果が３倍高くなることを示した。低血糖は、肝臓におけるインスリンシグナル伝達を解除し、それによりグルカゴンがより良好に作用することが実証された。このグルカゴンの効果の改善によって、インスリンとグルカゴンとの共投与が治療上の利点を提供するという逆説的な可能性がもたらされる。
【００２８】
本明細書に記載の本発明の概念は、インスリンとグルカゴンとを、正しい割合で共投与するかまたは合剤にすることにより、Ｔ１Ｄ患者のより積極的かつ安全な治療が可能になり、血糖値の長期制御が強化されることを教示する。摂食中および血液グルコースの上昇中に、本発明の概念のシステム、組成物および方法は、２つが比例的に増加するインスリンおよびグルカゴンの食前用量を提供し、追加のインスリンの影響が追加のグルカゴンの影響を無効にする。一方、低血糖の期間中には、上昇したインスリンは肝臓での効果が低下し、追加グルカゴンがグルコース産生の増加を促し、それにより低血糖を制限し、交感神経系の活性化の必要性を低減させる。本発明の概念は、これらの血糖変動を制限するグルカゴンとインスリンとの共投与および／または合剤を提供し、それによりＨｂＡｌｃレベルを改善し、患者の糖尿病合併症を低減する。
本開示は、インスリンとグルカゴンとの定義された比率の共注入を使用して血液グルコースを制御すること；合剤化したインスリン  グルカゴン混合物を使用して血液グルコースを制御すること；インスリンとグルカゴンとの混合物を使用して低血糖関連自律神経不全（ＨＡＡＦ）を低減すること；インスリン  グルカゴン混合物を使用してインスリン媒介体重増加を防止すること；インスリン  グルカゴン混合物を使用して肝臓における脂肪蓄積を制限すること、を提供する。本発明の概念は、Ｔ１Ｄ患者の血糖変動性を安全に低減し、それにより、より積極的な治療が可能になり、このことはＨｂＡｌｃレベルの改善および合併症の低減を患者にもたらす。本明細書に記載されるように、本発明の概念のインスリンは、インスリン、インスリンのアナログ、および肝選択的インスリンなどの選択的に偏ったインスリンを含むことができる。
【００２９】
通常、インスリンおよびグルカゴンは肝門脈に分泌され、こうして肝臓は、他のどの組織よりも２〜３倍高いレベルにさらされる。一晩絶食した後、基礎Ｉ／Ｇモル分泌比は約１０であるが、低血糖または高血糖の状態ではそれぞれ低レベル（たとえば約０）から高レベル（たとえば約２４０）まで変化し得る。出願人の予備実験では、２つのホルモンを末梢に注入する場合、グルカゴン注入速度が１．６ｎｇ／ｋｇ／分のとき、通常の空腹時グルコース代謝を維持するために約３〜４のモル比が必要であることが示された。試験には、Ｉ／Ｇ比約２０および約４で組成物２００を送達することにより、インスリンの上昇が低血糖をもたらすか、または高血糖を防止する能力を調べることが含まれていた。
出願人は、高インスリンおよび高グルカゴンを共投与することの臨床的価値を裏付けるために、対象１、２、３および４と示された、４匹の意識のある対象（イヌ）のそれぞれについて、ペア試験（実験ＡおよびＢ）を行った。これらの試験結果を、図２〜１５に示す。対象１および２では、ソマトスタチンを送達して内因性インスリンおよびグルカゴンの分泌を阻害し、両ホルモンを脚静脈から注入することによって補充し、０分で膵臓内分泌部（endocrine pancreas）を制御した。グルカゴンは１．６ｎｇ／ｋｇ／分（通常の分泌速度の約３倍）で注入し、インスリンは正常血糖を維持するために必要に応じて注入した。対象１では２００〜２４０μＵ／ｋｇ／分を要したが、対象２では３４０〜３８０μＵ／ｋｇ／分を要した。対象１における実験Ａ（図２参照）の試験期間（１４０〜３２０分）中に、血漿インスリンおよびグルカゴンは４倍に上昇し、実験Ｂでは同じ対象におけるインスリンは４．８倍に上昇し、グルカゴンは１．６ｎｇ／ｋｇ／分を維持した。対象２において、実験Ｂではインスリンとグルカゴンの両方が５．３倍増加したのに対し、実験Ａでは、インスリンは５．８倍増加したが、グルカゴンは基礎を維持した（変化しなかった）。このようにして、グルカゴンの増加（対象１において基礎の４倍および対象２において基礎の５．３倍）のインスリン駆動低血糖に対する保護効果を評価した。
【００３０】
図３は、上記の実験の試験期間において明らかな血漿グルコース変動を示すデータを示す。追加グルカゴンは、１の対象の血漿グルコースの低下を遅らせる傾向があったが、最も重要なことは、両対象で血漿グルコースがほぼ６０ｍｇ／ｄＬにリバウンドしたことであった（図３に参照実験１Ａ、２Ｂを示す）。基礎グルカゴンの存在下で、インスリンの同一の上昇がもたらされた場合、実験１Ｂおよび２Ａでそれぞれ約４０ｍｇ／ｄＬおよび約５０ｍｇ／ｄＬの低血糖を持続させた。
図４は（１Ａおよび２Ｂに示すように）、正味肝グルコース放出（ＮＨＧＯ）に対するインスリンの阻害効果が、追加グルカゴンの存在によって明らかに鈍化したことを示すデータを示している。
【００３１】
図５は、肝臓内の血漿インスリンレベルが対象１における両実験で類似しており、対象２における血漿インスリンが実験ＢでＡよりわずかに高かったことを示すデータを示している。対象２におけるこの結果は、対象２における実験Ｂでの低血糖の程度が、この対象の血漿インスリンレベルが多少高くても低下したので、図３に示すデータがさらに顕著であることを示している。
図６は、血漿グルカゴンが、実験１Ｂおよび２Ａでは基礎のままであったが、実験１Ａおよび２Ｂでは（それぞれグルカゴン注入の４倍および５．３倍の増加により）上昇したことを確認するデータを示す。
図７は、グルコースが６０ｍｇ／ｄＬに戻ったときに、実験１Ａおよび２Ｂで血漿コルチゾールレベルが低下したことを示すデータを示す。データはまた、グルカゴンが上昇すると動脈血中血漿エピネフリン変動が減少したことを示しており（１Ａ、２Ｂ）、低血糖に対する交感神経系の反応が低下していることを示す。したがって、実験１Ａおよび２Ｂでの血漿ＦＦＡの上昇がはるかに小さいことから明らかなように、脂肪分解反応も低下した（図８を参照）。同様に、筋肉への交感神経ドライブは、グルカゴンの増加（１Ａ、２Ｂ）の存在下で排除され、結果として血中ラクテートレベルの増加ははるかに小さくなった。予想どおり、インスリン±グルカゴンの増加により、血中アラニンレベルが低下した（図９を参照）。
【００３２】
明らかに、グルカゴンおよびインスリンが比例して増加した場合（単独でインスリンが増加するのとは対照的に）、追加グルカゴンの存在によって、インスリンに起因する血糖降下反応が鈍化し、そうでなければ血糖値レベルを保護するために必要であった神経系の活性化が低下した。したがって、ＣＮＳ活性化の低下にもかかわらず、低血糖の改善が起こった。したがって、これらのデータは、本発明の概念を使用して、低血糖関連自律神経不全（ＨＡＡＦ）を低減できることを示唆している。
いくつかの実施形態では、本発明の概念のインスリンとグルカゴンとの合剤は、低血糖を制限するだけでなく、肝臓による食後のグルコース取込を有意に損なわない。この二重の利点は、２匹の対象（対象３および４）において実証された。対象１および２と同様に、ソマトスタチンを送達してインスリンおよびグルカゴンの分泌を阻害し、正常血糖を維持するために必要な、１．６ｎｇ／ｋｇ／分でのグルカゴン、およびインスリン（対象３では２９０μＵ／ｋｇ／分、対象４では２８０〜３５０μＵ／ｋｇ／分）の両方を、脚静脈に補充することによって、膵臓のクランプをもたらした（図２を参照）。１４０分で、インスリン注入速度を４倍もしくは６倍に増加させたが、グルカゴンは変化しないまま（３Ｂ、４Ａ）か、または４倍もしくは６倍に増加させた（３Ａ、４Ｂ）。同時に、脚静脈からグルコースを注入して、血糖値を２倍にした（約２００ｍｇ／ｄＬ）。
【００３３】
図１０は、４つの実験すべてにおいて血漿グルコースレベルが＞２００ｍｇ／ｄＬに上昇したことを示すデータを示している。図１１は、高インスリン血症と高血糖の複合刺激に反応して、肝臓が正味肝グルコース放出から正味肝グルコース取込（ＮＨＧＵ）に切り替わったことを示すデータを示している。追加グルカゴンは当初ＮＨＧＵの増加を幾分遅らせたが、実験の最後の１時間までにＮＨＧＵはそれほど差がなかった（追加グルカゴンの存在下または不存在下においてそれぞれ、対象３では２．８対３．１ｍｇ／ｋｇ／分；対象４では４．８対５．１ｍｇ／ｋｇ／分）。
【００３４】
図１２は、対象３において２つの実験で血漿インスリンの増加が等しく、対象４において基礎グルカゴンの存在下でインスリンが適度に高いことを示すデータを示し、インスリンを追加すると、ＮＨＧＵがさらに増加するはずであったので、これによりグルコースバランスデータがさらに印象的なものになっている。
図１３は、血漿グルカゴンが実際に実験３Ａおよび４Ｂで上昇したが、３Ｂおよび４Ａでは上昇しなかったことを示すデータを示している。
図１４は、脂肪分解の抑制が、血漿ＦＦＡとグリセロールの区別できない変化によって示されるように、４つの実験で同等であったことを示すデータを示す（グリセロールデータは示されていない）。同様に、血漿ラクテートの上昇も血中アラニンレベルの変化も、（図１４および１５に示すように）４つの実験で違いがなかった。
したがって、追加グルカゴンの存在は、高インスリン／高血糖状態で肝臓がグルコースを吸収して貯蔵する能力にほとんどまたは全く影響を与えなかった。したがって、これらのデータは、インスリンの上昇下でグルカゴンを上昇させると、高血糖状態で脂肪分解を阻害するか、または正味肝グルコース取込をもたらすインスリンの能力をそれほど鈍らせることはなく、インスリン誘発性低血糖を制限することを示す。
【００３５】
通常、インスリンおよびグルカゴンは肝門脈に分泌され、こうして肝臓は、他のどの組織よりも２〜３倍高いレベルにさらされる。一晩絶食した後、基礎Ｉ／Ｇモル分泌比は約１０であるが、低血糖または高血糖の存在、ならびにその他の要因によって広い範囲で変えることができる。予備実験では、末梢静脈のグルカゴン注入速度を１．６ｎｇ／ｋｇ／分（０．４５ｐｍｏｌ／ｋｇ／分；門脈への基礎分泌速度の３倍）に設定した。次いで、正常な空腹時グルコース代謝を維持するために、（１．６２ｐｍｏｌ／ｋｇ／分；Ｉ／Ｇモル比約３．７の）インスリンの末梢注入速度が必要であることが確立された。これを念頭に置いて、実験では、グルカゴンがインスリンに比例して増加した場合（Ｉ／Ｇモル比３〜５）に、または１．６ｎｇ／ｋｇ／分を維持した場合に、インスリン注入の増加が低血糖をもたらす能力を調べた（Ｉ／Ｇモル比１２〜２５）。
【００３６】
インスリンのみを上昇させてＩ／Ｇモル比を増加させるのではなく、インスリンとグルカゴンを同時に上昇させる（例えば、Ｉ／Ｇモル比を基礎値に維持する）と、インスリン誘発性低血糖が制限されるという仮説を試験するために、４匹の意識のある対象（イヌ）について、ペア試験を実施した。対象１、２および５では、ソマトスタチンを送達して、０分で膵臓内分泌部の制御を確立し、内因性インスリンおよびグルカゴンの分泌を阻害し、両ホルモンを各対象の脚静脈から注入することによって補充した。実験は、グルカゴンを１．６ｎｇ／ｋｇ／分（通常の分泌速度の約３倍）で注入することを含み、インスリンは正常血糖を維持するために必要に応じて注入した。対象１では２００〜２４０μＵ／ｋｇ／分を要し、対象２では３４０〜３８０μＵ／ｋｇ／分を要し、対象５では２２０〜３８０μＵ／ｋｇ／分を要した。対象１における実験Ａ（図１６）の試験期間（１４０〜３２０分）中に、血漿インスリンは４倍に上昇し、グルカゴンは４倍に上昇し、一方、実験Ｂでは、インスリンは４．８倍に上昇し、グルカゴンは１．６ｎｇ／ｋｇ／分を変わらず維持した。対象２において、実験Ｂではインスリンとグルカゴンの両方が５．３倍増加したのに対し、実験Ａでは、インスリンは５．８倍に増加したが、グルカゴンは基礎で維持された。対象５において、インスリンが実験Ａでは４倍、実験Ｂでは６．９倍に増加し、グルカゴンが実験Ａでは１．６ｎｇ／ｋｇ／分を維持し、実験Ｂでは６．９倍に増加した。このようにして、インスリン駆動低血糖に対するグルカゴンの増加の保護効果を評価した。対象６では、基礎クランプ期間はなかったが、試験期間（１４０〜３２０分）中にインスリン注入が５倍増加し、グルカゴン注入は１．６ｎｇ／ｋｇ／分を維持するか、または５倍に増加した。
【００３７】
図１７〜２４は、上記の８つの実験のデータを示す。図１７、１９、２１、および２３は、コントロール期間（斜線棒）、および実験期間の最後の２時間（白抜き棒）からのグルコースデータを示す。コントロール期間では、血漿グルコース、正味肝グルコース放出、インスリン、およびグルカゴンは、各対象における２つの実験で同等であった。対象１の実験期間（図１７）では、インスリンレベルは両方の実験で同等であったが、一方の場合にはグルカゴンは基礎（Ｉ／Ｇモル比１２）を維持し、他方の場合にはグルカゴンを増加させてＩ／Ｇモル比３を明確に維持した。インスリンに比例してグルカゴンを上昇させ、正味肝グルコース放出を刺激し、これにより血漿グルコースレベルの低下が実質的に減少した（約８ｍｇ／ｄＬ）。
図１７を参照して、対象１からのデータを示す。ソマトスタチンを注入して、実験期間中に膵臓内分泌部を不能にした。インスリンを、基礎速度（Ｉ／Ｇ比１２）または４×Ｂの速度（Ｉ／Ｇ比３）でのグルカゴンの注入とともに、４×基礎（Ｂ）分泌速度の速度で対象１の脚静脈に３時間注入した。インスリン誘発性グルコース低下は、追加グルカゴン（４２±１対５０±３ｍｇ／ｄＬの最下点）によるグルカゴン駆動肝グルコース産生の増加（２．８±０．２対１．９±０．２ｍｇ／ｋｇ／分）の結果として、減少した。データは、コントロール期間（斜線棒）および実験期間の最後の２時間（実線棒）からのものである。
【００３８】
図１９を参照して、対象２からのデータを示す。ソマトスタチンを注入して、実験期間中に膵臓内分泌部を不能にした。インスリンを、基礎速度（Ｉ／Ｇ比２５）または６×Ｂの速度（Ｉ／Ｇ比５）でのグルカゴンの注入とともに、６×基礎（Ｂ）分泌速度の速度で対象２の脚静脈に３時間注入した。インスリン誘発性グルコース低下は、追加グルカゴン（５２±１対５７±３ｍｇ／ｄＬの最下点）によるグルカゴン駆動肝グルコース産生の増加（２．３±０．２対４．６±１．４ｍｇ／ｋｇ／分）の結果として、減少した。データは、コントロール期間（斜線棒）および実験期間の最後の２時間（実線棒）からのものである。
【００３９】
図２１を参照して、対象５からのデータを示す。ソマトスタチンを注入して、実験期間中に膵臓内分泌部を不能にした。インスリンを、基礎速度（Ｉ／Ｇ比１９）または７×Ｂの速度（Ｉ／Ｇ比３）でのグルカゴンの注入とともに、７×基礎（Ｂ）分泌速度の速度で対象５の脚静脈に３時間注入した。インスリン誘発性グルコース低下は、追加グルカゴン（３９±１対４０±１ｍｇ／ｄＬの最下点）によるグルカゴン駆動肝グルコース産生の増加（０．７±０．２対１．４±０．２ｍｇ／ｋｇ／分）の結果として、減少した。データは、コントロール期間（斜線棒）および実験期間の最後の２時間（実線棒）からのものである。
【００４０】
図２３を参照して、対象６からのデータを示す。ソマトスタチンを注入して、実験期間中に膵臓内分泌部を不能にした。インスリンを、基礎速度（Ｉ／Ｇ比１９）または５×Ｂの速度（Ｉ／Ｇ比４）でのグルカゴンの注入とともに、５×基礎（Ｂ）分泌速度の速度で対象６の脚静脈に３時間注入した。インスリン誘発性グルコース低下は、追加グルカゴン（４５±２対４６±２ｍｇ／ｄＬの最下点）によって変化せず、正味肝グルコース産生は測定されなかった。データは、コントロール期間（斜線棒）および実験期間の最後の２時間（実線棒）からのものである。
【００４１】
図１８、２０、２２、および２４は、グルカゴンの上昇がインスリンの上昇を伴うと、血中のコルチゾールおよびエピネフリンが減少し、脂肪の脂肪分解反応が減少し、これにより筋肉のグリコーゲン分解反応が減少したことを示している。図１８は、グルカゴンの増加（Ｉ／Ｇモル比３）および／または血漿グルコースの低下の減少が、コルチゾール放出およびエピネフリン分泌に関連する低血糖の減少をもたらしたことを示すデータを示している。これにより、低血糖駆動の脂肪分解効果が低下し（ＮＥＦＡの増加の縮小）、筋肉のグリコーゲン分解の低血糖に関連する上昇が減少した（血中ラクテートの増加の縮小）。対象２（図１９および２０）では、低血糖保護がより少なく（５ｍｇ／ｄＬ）、交感神経系の反応の低下も対象１と比べてやや小さかったということを除いて、同じパターンが見られた。対象５（図２１および２２）では、低Ｉ／Ｇモル比による低血糖保護がほとんどなかった（約１ｍｇ／ｄＬ）が、なお、低血糖に対する交感神経系の反応の実質的低下があったということを除いて、同じパターンが見られた。同様に、対象６（図２３および２４）では、低血糖保護は最小限であったが、グルカゴンの上昇（すなわち、Ｉ／Ｇモル比が低い）の存在下では、低血糖に対する交感神経系の反応が劇的に減少した。
図１８を参照して、対象１からのデータを示す。ソマトスタチンを注入して、実験期間中に膵臓内分泌部を不能にした。（基礎グルカゴンを維持するのではなく）グルカゴン注入の比例上昇が存在する状態で、インスリン注入を増加させると、低血糖に対する自律神経系の反応が半分になり（Ｅｐｉ  １１３０±１２２対６６８±１００ｐｇ／ｍＬおよびコルチゾール８．０±０．９対４．６±１．３μｇ／ｄＬ）、その結果、脂肪分解の増加（ＮＥＦＡ；Δ８６５対Δ３８５μｍｏｌ／Ｌ）および筋肉グリコーゲン分解の増加（ラクテートΔ６６２対Δ６４μｍｏｌ／Ｌ）がはるかに小さくなった。データは、コントロール期間（斜線棒）および実験期間の最後の２時間（実線棒）からのものである。
【００４２】
ここで図２０を参照して、対象２からのデータを示す。ソマトスタチンを注入して、実験期間中に膵臓内分泌部を不能にした。（基礎グルカゴンを維持するのではなく）グルカゴン注入の比例上昇が存在する状態で、インスリン注入を増加させると、低血糖に対する自律神経系の反応が１／３まで減少し（Ｅｐｉ  ３３１８±５２３対２４４９±５４７ｐｇ／ｍＬおよびコルチゾール６．４±０．８対４．５±１．３μｇ／ｄＬ）、その結果、脂肪分解の増加（ＮＥＦＡ；Δ１２１対Δ９μｍｏｌ／Ｌ）および筋肉グリコーゲン分解の増加（ラクテートΔ１６９０対Δ１１６２μｍｏｌ／Ｌ）がはるかに小さくなった。データは、コントロール期間（斜線棒）および実験期間の最後の２時間（実線棒）からのものである。
ここで図２２を参照して、対象５からのデータを示す。ソマトスタチンを注入して、実験期間中に膵臓内分泌部を不能にした。（基礎グルカゴンを維持するのではなく）グルカゴン注入の比例上昇が存在する状態で、インスリン注入を増加させると、低血糖に対する自律神経系の反応が１／３まで減少し（Ｅｐｉ  １８４１±３９３対１２０７±３００ｐｇ／ｍＬおよびコルチゾール１０．５±０．８対８．８±１．２μｇ／ｄＬ）、その結果、脂肪分解の増加（ＮＥＦＡ；Δ２４２対Δ０μｍｏｌ／Ｌ）および筋肉グリコーゲン分解の増加（ラクテートΔ５７５対Δ２５３μｍｏｌ／Ｌ）がはるかに小さくなった。データは、コントロール期間（斜線棒）および実験期間の最後の２時間（実線棒）からのものである。
【００４３】
ここで図２４を参照して、対象６からのデータを示す。ソマトスタチンを注入して、実験期間中に膵臓内分泌部を不能にした。（基礎グルカゴンを維持するのではなく）グルカゴン注入の比例上昇が存在する状態で、インスリン注入を増加させると、低血糖に対する自律神経系の反応が半分になり（Ｅｐｉ  ３０６０±４５０対１３３４±１９５ｐｇ／ｍＬおよびコルチゾール９．３±１．２対４．８±１．４μｇ／ｄＬ）、その結果、脂肪分解の増加（ＮＥＦＡ；Δ１８２対Δ６８μｍｏｌ／Ｌ）および筋肉グリコーゲン分解の増加（ラクテートΔ３９６対Δ１０５μｍｏｌ／Ｌ）が減少した。データは、コントロール期間（斜線棒）および実験期間の最後の２時間（実線棒）からのものである。
【００４４】
全体として、これらのデータは、高インスリン血症が、比例的に変化したグルカゴンの存在下で生じると（低Ｉ／Ｇモル比の持続）、ほとんどのイヌ対象において低血糖の深度が低下し、重要なことに、すべての動物において血糖を防御するための交感神経系への依存性を低減することができることを示している。インスリンと並行してグルカゴンを上昇させると、インスリンに対する血糖降下反応が低下すると同時に、血糖を防御するための交感神経系への依存性が低減する。血漿グルコースが４０代の場合、血糖のわずかな違い（２〜５ｍｇ／ｄＬ）が、インスリン誘発性低血糖に対する拮抗ホルモン反応に劇的な影響を与える場合があることを強調しておくべきである。したがって、グルコースの低下の振幅のわずかな減少でさえ臨床的に重要である。
インスリン送達の増加に対して低いＩ／Ｇモル比を維持することによって低血糖および／またはそれに対する反応を防ぐ場合、そのことにより高血糖状態でインスリン作用が損なわれるかどうかに関して疑問が生じる。出願人は、２匹の対象（対象３と４）においてペア実験を実施した。プロトコル（図２５に示す）は、１４０分間のクランプ期間（上記の低血糖試験と同様）と、それに続く実験期間からなり、ここで、グルコースを約２１０ｎｇ／ｄＬでクランプし、インスリンを４〜５．７倍増加させ、一方グルカゴンは基礎を維持する（１．６ｎｇ／ｋｇ／分から変更なし）か、または増加させた（４または６倍）。
【００４５】
図２６および２７は、同様のデータを示し、正味肝グルコース取込、脂肪分解抑制およびラクテートレベルは、追加グルカゴンによって実質的に影響を受けなかったことを示している。したがって、低Ｉ／Ｇモル比（例えば３〜５）でのインスリンとグルカゴンとの共注入は、高血糖状態での肝臓のグルコース取込に有害な影響を与えることなく、低血糖を防ぐ。
ここで図２６を参照して、対象３からのデータを示す。実験期間中に、ソマトスタチンを注入して、膵臓内分泌部を不能にした。インスリンは、１×Ｂまたは４×Ｂグルカゴンとともに、４×基礎（Ｂ）の速度で３時間注入した。グルコースレベルは約２１０ｍｇ／ｄＬでクランプした。追加グルカゴン（それぞれ４×Ｂ対１×Ｂで、Ｉ／Ｇモル比を１６から４に変更した）は、正味肝グルコース放出（１．５±０．１ｍｇ／ｋｇ／分）から取込（２．４±０．２対３．０±０．２ｍｇ／ｋｇ／分）への切り替えにも、血漿ＮＥＦＡの抑制（５６７±３μｍｏｌ／Ｌから１１６±２１μｍｏｌ／Ｌまで対８９±１０μｍｏｌ／Ｌまで）にも、血中ラクテートの増加（５８２±５１μｍｏｌ／Ｌから１１４１±４０μｍｏｌ／Ｌまで対１０４０±６５μｍｏｌ／Ｌまで）にも、影響を与えなかった。データは、コントロール期間（斜線棒）および実験期間の最後の２時間（実線棒）からのものである。
【００４６】
ここで図２７を参照して、対象４からのデータを示す。実験期間中に、ソマトスタチンを注入して、膵臓内分泌部を不能にした。インスリンは、１×Ｂまたは６×Ｂグルカゴンとともに、６×基礎（Ｂ）の速度で３時間注入した。グルコースレベルは約２１０ｍｇ／ｄＬでクランプした。追加グルカゴン（それぞれ６×Ｂ対１×Ｂで、Ｉ／Ｇモル比を１６から４に変更した）は、正味肝グルコース放出（１．５２．４±０．２ｍｇ／ｋｇ／分）から取込（４．９±０．３対４．２±０．４ｍｇ／ｋｇ／分）への切り替えにも、血漿ＮＥＦＡの抑制（３７１±９４μｍｏｌ／Ｌから４７±１０μｍｏｌ／Ｌまで対４１±３μｍｏｌ／Ｌまで）にも、血中ラクテートの増加（８１９±１８２μｍｏｌ／Ｌから１０４０±７４μｍｏｌ／Ｌまで対８４５±３８μｍｏｌ／Ｌまで）にも、影響を与えなかった。データは、コントロール期間（斜線棒）および実験期間の最後の２時間（実線棒）からのものである。
【００４７】
図２８〜３４は、経時的にプロットした４匹の低血糖対象および２匹の高血糖対象（上記）からの平均データを示している。低血糖対象では、グルカゴンが比例して増加したか（Ｉ／Ｇモル比３〜５）、増加しなかった（Ｉ／Ｇモル比１２〜２５）にかかわらず、インスリンの増加（約５０μＵ／ｍｌ）が類似していた。グルカゴンは約１８０ｐｇ／ｍＬ増加したか、または有意な変化はなかった。
図２９は、上昇したグルカゴンの存在下で、血漿グルコースのインスリン誘発性低下の減少があったことを示すデータを示している。この減少は、正味肝グルコース放出の増加に関連しており、おそらくそれによってもたらされた。低血糖に対するエピネフリンおよびコルチゾールの反応は（図３０に示すように）、グルカゴンが上昇すると減少した。同様に、ＮＥＦＡ（脂肪分解）および血中ラクテート（筋肉グリコーゲン分解）の低血糖駆動上昇は、（図３１に示すように）追加グルカゴンの存在によって減少した。
【００４８】
図３２〜３４は、高血糖試験の経時的な平均データを示す。この場合も、グルカゴンが上昇したかどうかにかかわらず、同様にインスリンは上昇した。両プロトコルで、血漿グルコースレベルは約２１０ｍｇ／ｄＬでクランプした。インスリンおよびグルコースの上昇に反応して、肝臓は正味グルコース放出から取込に切り替わった。正味肝グルコース取込への移行は、グルカゴンが上昇した場合に、幾分よりゆっくり起こったが、実験期間の最後の９０分にわたって、正味肝グルコース取込に差はなかった。同様に、ＦＦＡ（脂肪分解）の低下およびラクテート（肝臓からのラクテートの漏出）の上昇はほぼ同一であった。したがって、低Ｉ／Ｇモル比を有する組成物２００は、高血糖状態で肝臓のグルコース取込を著しく損なうことなく低血糖から保護することができた。
【００４９】
出願人のさらなる試験には、インスリンとグルカゴンとの皮下共投与が含まれる。実験は、図１Ｂを参照して上述した注入ポンプ１００ａおよび１００ｂなどの２つの注入ポンプを使用して実施した。このタイプの最初の８つの実験（４匹の対象、対象７、８、９、および１０のそれぞれに２つ）のそれぞれは、コントロール期間（−３０〜０分）とそれに続く期間（０〜１８０分）からなり、対象にソマトスタチンを注入して膵臓内分泌部を阻害した。同時に、インスリン（０．３または０．４ｍＵ／ｋｇ／分）およびグルカゴン（１．６〜２．０ｎｇ／ｋｇ／分）の基礎注入を与えた。目標は、血漿グルコースレベルを基礎値でクランプすることであった。明らかに、ソマトスタチンは内因性インスリンおよびグルカゴンの分泌を迅速に阻害し、皮下注入によって適時に基礎ホルモンレベルを回復することはできなかった。血漿グルカゴンおよびインスリンの両レベルは、最初は低下し（１５分）、回復するのに１〜２時間かかった。別の対象（対象１１）における４つの追加実験では、ソマトスタチン注入の開始を６０分または９０分遅らせて、インスリンおよびグルカゴンの一時的な低下を防いだ。対象ごとに平均値は１〜２８μＵ／ｍＬの範囲であったが、０．４ｍＵ／ｋｇ／分のインスリン注入速度によって、基礎期間の終わりまでに１０〜１２μＵ／ｍＬの平均動脈血中血漿インスリンレベルが生じた。したがって、血漿インスリンの上昇の遅延に関する問題に加えて、皮下送達経路を使用する場合に明らかな固有の変動性が高かった。それにもかかわらず、０．４ｍＵ／ｋｇ／分（平均で）のインスリン注入速度は、基礎補充に適切であった。
【００５０】
基礎クランプ期間の後、インスリン注入速度の４倍の増加がもたらされたが、グルカゴンは４倍増加したか、または基礎を維持した。したがって、Ｉ／Ｇモル比は、対象７において３．８または１５．０のいずれか、対象８、９、１０ならびに１１ＡおよびＢにおいて４または１６、ならびに対象１１ＣおよびＤにおいて２．９および１１．５であった（図３５、３６）。実験計画における微妙な差異が生じたが、対象間のばらつきを考慮して、データは４匹の対象からのもので、そのうちの１匹（対象１５）は、２回試験した。血糖が４０ｍｇ／ｄＬを下回り、グルコースクランプが必要なため、グルコースレベルが有効なエンドポイントになるのを防ぐため、ある１匹の対象のデータは含まなかった。ベースライン期間の後、インスリン注入速度が増加し、血漿インスリンは両群において同様に、約４５μＵ／ｍＬまで上昇した（図３７）。明らかに、血漿グルカゴンレベルは、Ｉ／Ｇ比４の群ではほぼ１５０ｐｇ／ｍＬまで上昇したが、Ｉ／Ｇ比１６の群では変化しなかった（図３８）。その結果、両群において血漿グルコースが低下したが、Ｉ／Ｇモル比４の場合、低下は遅れ、かつ減少した（図３９）。ベースラインの差を調整し、拡大スケールでプロットした場合、血漿グルコースの低下は、Ｉ／Ｇモル比が低い群において約１０ｍｄＬ減少した（図４０）。本明細書に記載のＩＶ注入実験と同様に、より低いＩ／Ｇモル比は、低血糖に対するエピネフリンおよびコルチゾール反応の低下と関連していた（図４１；データは、低血糖期間の最後の１時間からの平均値）。
【００５１】
皮下ホルモン注入を使用したさらなる試験では、Ｉ／Ｇモル比４対１６を維持して、対象の脚静脈への１０ｍｇ／ｋｇ／分でのグルコースのＩＶ注入に反応する対象の能力に対する影響を調べた（図４２）。この場合も、実験は、コントロール期間（−３０〜０分）、基礎クランプ期間（０〜１５０分）、グルコース注入期間（１５０〜３６０分）からなっていた。ソマトスタチンを０分で注入開始して膵臓内分泌部を不能にし、インスリンおよびグルカゴンをそれぞれ０．４ｍＵ／ｋｇ／分および２ｎｇ／ｋｇ／分の速度で注入した（Ｉ／Ｇモル比４．１）。皮下低血糖試験の同じ期間に示されたように、基礎期間中に血漿グルコースがわずかに低下した（図４３）。１５０分で、グルコース注入を開始し、インスリン注入速度を４倍にし、一方、グルカゴン注入を４倍にするか、または基礎のままにしてＩ／Ｇモル比をそれぞれ４．１または１６．２にした。グルコース変動は、Ｉ／Ｇ比４の群においてわずかに高かったが、これは、１５０分のベースライン値の差に起因するものであり（図４３）、データをベースラインからの変化としてプロットした場合に（図４４）、追加グルカゴンの効果は全くなかった。図４５に見られるように、血漿インスリンの上昇は２つの群において同一であり、一方グルカゴンは、Ｉ／Ｇ比４の群では上昇したが、Ｉ／Ｇ比１６の群では上昇しなかった（図４６）。
【００５２】
出願人のさらなる試験には、インスリンとグルカゴンとの合剤を皮下投与することが含まれる。これらの実験からのデータは、図４７〜４８に示す。対象１２では、２つの実験（ＡおよびＢ）を実施した。実験Ａでは、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中のＩ／Ｇモル比１２のグルカゴンとインスリンとの合剤溶液を、試験日に皮下組織に配置されたカテーテルを介して、約２０マイクロリットル／時間（グルカゴン２．６ｎｇ／ｋｇ／分およびインスリン１．６ｍＵ／ｋｇ／分）の速度で注入した。注入期間中、血漿グルコースは約３０分でドリフトし始め、最終的には最後の１時間は約４４ｍｇ／ｄＬでプラトーになった（図４７を参照）。その後、２日目に、Ｉ／Ｇモル比３のＤＭＳＯ中の別のグルカゴンとインスリンの合剤溶液を使用して、試験を繰り返した。この合剤はまた、約２０マイクロリットル／時（グルカゴン１０．２ｎｇ／ｋｇ／分およびインスリン１．６ｍＵ／ｋｇ／分）で注入した。この場合、グルコースの初期上昇があり、その後、実験Ａで見られたのと同様に、１５０分で最小値まで低下した。しかし、その後、血漿グルコースレベルは約５６ｍｇ／ｄＬでプラトーを上昇させた（図４７を参照）。したがって、インスリンおよびグルカゴンの独立した皮下注入で発生したように、インスリンの上昇によってもたらされる低血糖の程度は、グルカゴンの同時上昇によって著しく低下した。血漿中のインスリンレベルは２つの実験で類似しており（最後の１時間は３５対３１μＵ／ｍＬ）、実験Ａではグルカゴンは低いままであり（６０ｐｇ／ｍｌ）、実験Ｂでは１２１ｐｇ／ｍｌに上昇した（図４８を参照）。これらのデータにより、２つの重要な原則が確立された。第一に、相溶性のある溶媒中でインスリンとグルカゴンとを合剤化することは明らかに可能であり、したがってこれらのペプチドホルモンを１つの溶液で共投与することができる。第二に、２つのホルモンに対する生物学的反応は、それらが独立して皮下に注入されるか、または合剤化された混合物として注入されるかにかかわらず類似している。両方の場合において、インスリン注入を４倍にし、グルカゴンを付随的に比例して上昇させると（Ｉ／Ｇモル比３）、インスリン誘発性低血糖が約１０〜１２ｍｇ／ｄＬまで減少した。この効果は、自律神経系の活性化の有意な低下に関連する可能性が非常に高い。
【００５３】
まとめると、本明細書に記載の試験によって、１つまたは複数の形態での皮下インスリンおよびグルカゴン送達に使用するための有効なＩ／Ｇモル比を確立した。これらの試験はまた、インスリンを上昇させながら低Ｉ／Ｇモル比を維持することにより、インスリンが高血糖に対処する能力を大幅に妨げることなく低血糖を防ぐことを示すＩＶ注入データを確認する。
【００５４】
ここで図４９〜６０を参照して、本発明の概念と一致する、出願人によって実施された試験の結果を示す。これらの試験では、インスリン誘発性低血糖が現れた場合に、グルカゴンがグルコース産生を増加させかつ増加を維持する能力を評価する。これらの試験の結果は、インスリン誘発性低血糖が現れた場合に、グルカゴンが有意かつ持続的なグルコース産生をもたらすことができることを示す。以下に記載のように、データは、グルカゴンが肝臓に対して時間依存的な効果ではなく二相性の効果を有することを示す。グルカゴンは、グルコースの急速なバーストをもたらし、その後、グルコース産生の第２相の延長が続く。このことは、インスリン誘発性低血糖の存在下で、グルカゴンが長時間（たとえば、少なくとも４時間）機能し続けることを示している。これらの試験は、体がグルカゴンのレベルの増加を認識しており、それに応じて、低血糖に対する体の交感神経系の反応を低下させることを示している。低血糖に対する交感神経系の反応の低下は、脳が血漿グルカゴンを感知することができ、血糖値の制御においてグルカゴンと交感神経系との間に相互関係があることを示唆している。脳はグルカゴンレベルを監視し、過剰グルカゴンが存在すると、所与の低血糖に対する交感神経系の反応を低下させる。これにより、グルコースのさらなる低下が可能になり、中枢神経系の反応がより大幅に増加し、それにより低血糖に対する保護が強化される。これらの試験は、本発明の概念のインスリンおよびグルカゴン合剤溶液が糖尿病患者に安全かつ有効な治療的価値を提供できることを実証している。
【００５５】
出願人は、本発明の概念のインスリンおよびグルカゴン合剤溶液の治療的価値を裏付けるために、８匹の意識のある対象（イヌ）のそれぞれについて試験を行った。８匹の対象を４匹の対象からなる２つの群に分け、第１の群を基礎グルカゴン群（Ｂａ  ＧＧＮ）、第２の群を高グルカゴン群（Ｈｉ  ＧＧＮ）と示した。この試験の結果を図４９〜６０に示す。
各イヌ対象は副腎摘出し、グルココルチコイドおよびミネラルコルチコイドで処置して、血液中のこれらのホルモンの基礎レベルを維持し、低血糖誘発性グルコース産生反応がエピネフリンではなくグルカゴンに起因することができるようにした。カテーテルを、血管内に配置して血液を（例えば、動脈、肝門脈）に供給し、肝臓から（例えば、肝静脈）血液を排出した。血流プローブを肝動脈および門脈の周囲に配置して、動静脈差（ＡＶ）法を使用して、正味肝グルコース放出（ＨＧＯ）を計算できるようにした。さらに、トレーサー法（３−３Ｈグルコースなど）を使用して、肝臓のグルコース産生（ＨＧＰ）を評価した。手術からの回復後、一晩絶食した後、意識状態の各対象において実験を行った。
【００５６】
図４９は、８匹の対象のそれぞれに用いた実験タイムラインを示す。トレーサー注入は−１４０分で開始し、１００分が平衡化された。−４０分〜０分のコントロール期間の後に、２７０分の試験期間が続いた。０分で、ソマトスタチン（ＳＲＩＦ）を注入して、膵臓内分泌部を不能にした。インスリンを０．８ｍＵ／ｋｇ／分で脚静脈に注入して、低血糖を発生させた。３０分で開始して、グルカゴンも１または８ｎｇ／ｋｇ／分で脚静脈に注入した（例えば、Ｂａ  ＧＧＮ対象の場合は１ｎｇ／ｋｇ／分で、Ｈｉ  ＧＧＮ対象の場合は８ｎｇ／ｋｇ／分で）。必要に応じてグルコースを注入して、２つの群のグルコース低下率を一致させ、どちらの群においても血漿グルコースレベルが４０ｍｇ／ｄＬを下回らないようにした。
【００５７】
図５０は、両群において動脈血中インスリンレベルが約１０μＵ／ｍＬから約４０μＵ／ｍＬに増加したことを示すデータを示している。
図５１は、Ｂａ  ＧＧＮ群では動脈血中グルカゴンレベルが基礎（例えば、約４５ｐｇ／ｍＬ）のままであったが、Ｈｉ  ＧＧＮ群では約２７０ｐｇ／ｍＬに増加したことを示すデータを示している。
図５２は、副腎摘出術および基礎ホルモン補充に起因する、両群で基礎のままのコルチゾール濃度（例えば、２．５μｇ／ｄＬ）を示すデータを示している。
図５３は、副腎摘出術および基礎ホルモン補充に起因する、両群で基礎のままのエピネフリン濃度（例えば、５０〜７５ｐｇ／ｍＬ）を示すデータを示している。
図５４は、両群について、実験の最後の２．５時間に動脈血中血漿グルコースが同等に減少し、同様のレベルでプラトーに達した（例えば、Ｂａ  ＧＧＮ群では４２ｍｇ／ｄＬ、およびＨｉ  ＧＧＮ群では４０ｍｇ／ｄＬ）ことを示すデータを示す。
図５５は、各群のグルコース曲線を一致させるのに必要なグルコース注入速度を示すデータを示している。Ｂａ  ＧＧＮ群の場合、グルコースは３０分で注入を開始し（例えば、グルカゴン注入と同時に）、最後の２．５時間は平均約２．８ｍｇ／ｋｇ／分で実験中に継続した。Ｈｉ  ＧＧＮ群の場合、グルコースは２時間から注入し、注入速度は約０．８ｍｇ／ｋｇ／分まで徐々に増加させた。
【００５８】
図５６は、正味肝グルコース放出を示すデータを示している。両群において、インスリンの増加とグルカゴンの減少の結果として、正味肝グルコース放出は０〜３０分にわたって減少した。３０分でグルカゴンを注入した後、Ｂａ  ＧＧＮ群の正味肝グルコース放出は約０．４ｍｇ／ｋｇ／分を維持した。３０分でグルカゴンを注入した後、Ｈｉ  ＧＧＮ群の正味肝グルコース放出は約７ｍｇ／ｋｇ／分に急速に増加し、その後約９０分の時間をかけて減少し、実験の最後の２．５時間で最終的に２．４ｍｇ／ｋｇ／分の平均速度に達した。このようなデータは、低血糖の存在下では、インスリンの上昇が継続して存在するにもかかわらず、グルカゴンの増加により約２〜２．５ｍｇ／ｋｇ／分のグルコース産生の増加が維持されることを示す。
図５７は、３−３Ｈグルコーストレーサーにより測定したグルコース産生データを示し、図５６を参照した上述のように、正味肝グルコースバランスデータを確認する。
図５８Ａは、両群において、低血糖により血漿ノルエピネフリンの増加が生じたことを示すデータを示している。このデータは、体全体の神経終末からのノルエピネフリンの溢出（例えば、交感神経系の緊張）を反映し、インスリン誘発性低血糖時に脂肪分解を刺激するシグナルを反映している。図５８Ｂは、Ｂａ  ＧＧＮ群における血漿ノルエピネフリンの増加がＨｉ  ＧＧＮ群の増加の２倍であったことを示すデータを示している。
【００５９】
図５９ＡおよびＢは、Ｈｉ  ＧＧＮ群では、Ｂａ  ＧＧＮ群と比較して、動脈血中グリセロールレベルを使用して評価した場合、低血糖により脂肪分解反応の低下が生じたことを示すデータを示している。低血糖に対する脂肪分解反応は、高グルカゴンの存在下で約６０％低下した。
図６０は、Ｈｉ  ＧＧＮ群では、動脈血中遊離脂肪酸レベルを使用して評価した場合、Ｂａ  ＧＧＮ群と比較して、低血糖により脂肪分解反応の低下が生じたことを示すデータを示している。
ここで図６１〜６２を参照して、本発明の概念と一致する、出願人によって実施された試験の結果を示す。これらの試験では、本発明の概念のインスリンとグルカゴンとの合剤の潜在力を評価して、合剤は、基礎ホルモン補充を可能にし、有意な低血糖保護を提供するように構成した。これらの試験結果は、最適化されたインスリン対グルカゴン（Ｉ／Ｇ）のモル比が１を超え１０未満であることを示す。以下に記載するように、インスリンを０．４ｍＵ／ｋｇ／分（±２０％）の速度で、グルカゴンを２．１ｎｇ／ｋｇ／分（±２０％）の速度で、Ｉ／Ｇモル比４で皮下共注入すると、血漿グルコースレベル偏位が極小で２つのホルモンの基礎分泌を補充することができる。これらの試験結果は、インスリンが４倍に増加する場合にＩ／Ｇモル比が維持されると、インスリン誘発性低血糖が有意に減少し、かつ中枢神経系活性化が明らかに低下することも示す。これらの試験は、様々なＩ／Ｇモル比のインスリンおよびグルカゴン合剤溶液の有効性をさらに調べるために、意識のあるイヌ対象で行った。
【００６０】
皮下注入インスリンの薬物動態（ＰＫ）および薬力学的（ＰＤ）特性をよりよく理解するために、予備実験を実施した。図６１は、本発明の概念と一致する、意識のあるイヌ対象における皮下インスリン注入に関するデータを示す。以下に記載するように、インスリン注入速度を４倍に増加させると、動脈血中インスリンレベルが約９０分の遅延時間で約４倍に増加することを示す。一晩絶食したイヌでは、ベースライン動脈血中血漿インスリンは、−３０分〜０分で７．１±０．７μＭ／ｍＬであった。インスリンを０．４ｍＵ／ｋｇ／分で９０分間皮下注入した後、動脈血中血漿インスリンは９．４±０．８μＵ／ｍＬに増加し、これは、内因的に放出されたインスリンと注入されたインスリンの両方を反映している。９０分で、ソマトスタチン注入を開始して、膵臓内分泌部を不能にした。内因性インスリン分泌は急速に停止し（Ｃ−ペプチドの減少によって示されるように）、内因性インスリン分泌に起因するインスリンは３０分以内に枯渇した。基礎ホルモン補充期間の最後の３０分間（例えば、１５０〜１８０分）、動脈血中インスリンは平均９．８±１．４μＵ／ｍＬであり、皮下注入のみに起因していた。したがって、インスリンを０．４ｍＵ／ｋｇ／分で皮下送達した場合、動脈血中インスリンはベースラインから約４０％増加した。この増加は、内因性インスリン分泌が末梢静脈インスリン送達によって補充されるときに、正常血糖を維持するために必要な動脈血中インスリンの増加に類似している。肝臓内のインスリンレベルは、ベースラインで約１７μＵ／ｍＬ（門脈への内因性インスリン放出のため−３０分〜０分）、および基礎ホルモン補充期間中（例えば、内因性の分泌が阻害されたとき）に７．８μＵ／ｍＬ、ほぼ５０％の減少であったと推定される。したがって、皮下インスリン注入速度０．４ｍＵ／ｋｇ／分により、ベータ細胞機能を欠く１型糖尿病のヒトへの皮下インスリン投与で通常見られる臨床状況を再現した。インスリンチャレンジ期間中にインスリン注入速度を４倍に増加させると、動脈血中インスリンレベルが９０分以内に３４．５±２．９μＵ／ｍＬに増加し、その後、最小限に増加し、最終的には３８．８±３．５μＵ／ｍＬに達した。これらのデータに基づいて、システムを「プライム」するために（すなわち、ソマトスタチン注入のない状態でのインスリン注入）、約９０分の皮下インスリン注入（２０μＬ／時間）が必要であると判断した。０．４ｍＵ／ｋｇ／分の速度での皮下インスリン注入により、基礎インスリン補充およびインスリン注入速度が４倍に増加し、動脈血中インスリンが４倍に増加する。
【００６１】
図６２は、意識のあるイヌ対象における皮下グルカゴン注入に関するデータを示す。以下に記載するように、グルカゴン注入速度を４倍に増加させると（Ｈｉ  ＧＧＮ群と呼ぶ）、動脈血中グルカゴンレベルが１〜２時間にわたって増加し、その後減少した。これらの実験では、Ｍｅｒｃｏｄｉａアッセイを使用してグルカゴンを測定し、その精度が向上しているため、血漿グルカゴンレベルは以前の試験におけるものよりも低いという点に留意すべきである。３匹のイヌ対象における動脈血中グルカゴンレベルのピーク上昇倍数は、それぞれ３．７、５．７、および６．８（ｘバー＝５．４）であった。一晩絶食したイヌでは（青色の点で示され、Ｂａ  ＧＧＮと呼ぶ）、ベースライン動脈血中血漿グルカゴンは−３０分〜０分で７．５±１．２ｐｇ／ｍＬであり、肝臓で約１５ｐｇ／ｍＬの予測レベルをもたらす（例えば、内因性のグルカゴンの門脈への分泌の結果として）。図６１に示すように、０分でのＳＱインスリン注入の開始と同時に、グルカゴンも２．１ｎｇ／ｋｇ／分の速度で皮下注入した。グルカゴンを９０分間皮下注入した後、動脈血中血漿グルカゴンは平均２１．５±４．０ｐｇ／ｍＬに増加し、これは、内因的に放出されたグルカゴンと注入されたグルカゴンの両方を反映している。ソマトスタチン注入の開始から３０分以内に、（例えば、内因性グルカゴン分泌を阻害するため）、動脈血中グルカゴンレベルは約１５．０±４．５ｐｇ／ｍＬに減少し、ベースライングルカゴン値の２倍に近いレベルを示した。したがって、２．１ｎｇ／ｋｇ／分の速度での注入による肝類洞内のグルカゴンのレベルは、そのベースライン値に近いと推定することができる。基礎グルカゴン注入速度が２．１ｎｇ／ｋｇ／分のままであるインスリンチャレンジ期間中、動脈血中グルカゴンレベルは３．５時間維持された。
【００６２】
ここで図６３〜６５を参照して、本発明の概念と一致する、出願人によって実施された試験の結果を示す。これらの試験では、最適な補充速度での本発明の概念のインスリンとグルカゴンとの共注入の能力を評価して、共注入を、正常血糖を維持しながら、２つのホルモンの基礎内因性分泌を補充するように構成した。
【００６３】
図６３ＡおよびＢは、本発明の概念のインスリンとグルカゴンとの共注入中のホルモン濃度に関するデータを示す。インスリンは０．４ｍＵ／ｋｇ／分の速度で注入し、グルカゴンは２．１ｎｇ／ｋｇ／分の速度で注入した。０〜１８０分のプライミングおよび基礎補充期間中、Ｉ／Ｇモル比は４であった。１８０分でのインスリンチャレンジ期間の開始時に、インスリン注入は４倍に増加して１．６ｍＵ／ｋｇ／分になり、一方、グルカゴンは４倍に増加して８．４ｎｇ／ｋｇ／分になったか、（Ｉ／Ｇモル比４、Ｈｉ  ＧＧＮ群と呼ぶ）または２．１ｎｇ／ｋｇ／分で基礎を維持した（Ｉ／Ｇモル比１６、Ｂａ  ＧＧＮ群と呼ぶ）。図６３Ａに示すように、両群の動脈血中インスリンレベルは非常に類似しており、インスリンチャレンジ期間中に約４倍に増加した。図６３Ｂに示すように、インスリンチャレンジ期間中、動脈血中グルカゴンレベルはＢａ  ＧＧＮ群では基礎のままであり、Ｈｉ  ＧＧＮ群では５倍超に増加した。
【００６４】
図６４Ａ〜Ｃは、本発明の概念のインスリンとグルカゴンとの共注入中のグルコース濃度に関するデータを示す。インスリンは０．４ｍＵ／ｋｇ／分の速度で注入し、グルカゴンは２．１ｎｇ／ｋｇ／分の速度で注入した。０〜１８０分のプライミングおよび基礎補充期間中、Ｉ／Ｇモル比は４であった。１８０分でのインスリンチャレンジ期間の開始時に、インスリン注入は４倍に増加して１．６ｍＵ／ｋｇ／分になり、一方、グルカゴンは４倍に増加して８．４ｎｇ／ｋｇ／分になったか、（Ｉ／Ｇモル比４、Ｈｉ  ＧＧＮ群と呼ぶ）または２．１ｎｇ／ｋｇ／分で基礎を維持した（Ｉ／Ｇモル比１６、Ｂａ  ＧＧＮ群と呼ぶ）。図６４Ａに示すように、血漿グルコースレベルは、１２０〜１８０分の基礎ホルモン補充期間中、約１００ｍｇ／ｄＬで安定であり、０．４ｍＵ／ｋｇ／分の速度での皮下インスリンの注入および２．１ｎｇ／ｋｇ／分の速度でのグルカゴンの注入により、内因性のインスリンおよびグルカゴンの分泌をうまく補充することができることを示す。しかし、グルカゴンがＩ／Ｇモル比１６で基礎のままであった場合、血漿グルコースレベルは９０分にわたって低下し、実験の最後の１時間で約４１ｍｇ／ｄＬでプラトーになった。図６４ＡおよびＢに示すように、Ｉ／Ｇモル比を４に維持すると、グルコースレベルははるかにゆっくりと低下し、実験の最後の１時間で平均約４６ｍｇ／ｄＬになった。図６４Ｃに示すように、Ｂａ  ＧＧＮ群では、グルコースを約０．８ｍｇ／ｋｇ／分の速度で注入して、血漿グルコースレベルが４０ｍｇ／ｄＬを下回るのを防いだ。Ｈｉ  ＧＧＮ群におけるグルコース注入とグルカゴンの時間依存性の（ピークからの）４４％減少の両方により、データは、グルカゴンによってもたらされる低血糖保護を過小評価した。それにもかかわらず、データは、追加グルカゴンの存在がインスリンの血糖降下作用を最小限に抑えることを示している。
【００６５】
図６５Ａ〜Ｄは、本発明の概念のインスリンとグルカゴンとの共注入中のエピネフリンおよびコルチゾール濃度に関するデータを示す。インスリンは１．６ｍＵ／ｋｇ／分の速度で注入した。グルカゴンは、基礎の４倍の速度の８．４ｎｇ／ｋｇ／分で注入したか（Ｉ／Ｇモル比４、Ｈｉ  ＧＧＮ群と呼ぶ）、または２．１ｎｇ／ｋｇ／分で基礎を維持した（Ｉ／Ｇモル比１６、Ｂａ  ＧＧＮ群と呼ぶ）。追加グルカゴンの存在下で、（例えば、中枢神経系の活性化から生じる）エピネフリンおよびコルチゾールのレベルの増加は、それぞれ約５０％および３０％減少した。さらに、中枢神経系の関与の減少にもかかわらず、血糖の改善が観察された。このことは、血糖をさらに防御するための中枢神経系の可用性が向上していることを示す。
【００６６】
ここで図６６および６７を参照して、本発明の概念と一致する、出願人によって実施された試験の結果を示す。これらの試験は、Ｉ／Ｇモル比を４に維持するがインスリンおよびグルカゴンの基礎補充率を低下させても、正常血糖が維持されるかどうかを判断するために実施した。インスリン感受性は個体間で異なり、すべての動物が同じ基礎補充率のインスリンおよびグルカゴンを必要とするわけではないことを考えると、これは重要である。
【００６７】
図６６ＡおよびＢは、本発明の概念のインスリンとグルカゴンとの共注入中のホルモン濃度に関するデータを示す。インスリンは０．３２ｍＵ／ｋｇ／分の速度で注入し、グルカゴンは１．６８ｎｇ／ｋｇ／分の速度で注入した。０〜１８０分のプライミングおよび基礎補充期間中、Ｉ／Ｇモル比は４であった。１８０分でのインスリンチャレンジ期間の開始時に、インスリン注入は４倍に増加して１．２８ｍＵ／ｋｇ／分になり、一方、グルカゴンは４倍に増加して６．７２ｎｇ／ｋｇ／分になったか（Ｉ／Ｇモル比４、Ｈｉ  ＧＧＮ群と呼ぶ）、または１．６８ｎｇ／ｋｇ／分で基礎を維持した（Ｉ／Ｇモル比１６、Ｂａ  ＧＧＮ群と呼ぶ）。図６６Ａに示すように、基礎ホルモン補充期間の最後の１時間のインスリンレベルは、平均わずか６μＵ／ｍＬであり、インスリン注入速度の低下と一致していた。図６６Ｂに示すように、基礎ホルモン補充期間の最後の１時間のグルカゴンレベルは、平均わずか約９ｐｇ／ｍＬであり、グルカゴン注入の減少と一致していた。
【００６８】
図６７ＡおよびＢは、本発明の概念のインスリンとグルカゴンとの共注入中のグルコース濃度に関するデータを示す。インスリンは０．３２ｍＵ／ｋｇ／分の速度で注入し、グルカゴンは１．６８ｎｇ／ｋｇ／分の速度で注入した。０〜１８０分のプライミングおよび基礎補充期間中、Ｉ／Ｇモル比は４であった。１８０分でのインスリンチャレンジ期間の開始時に、インスリン注入は４倍に増加して１．２８ｍＵ／ｋｇ／分になり、一方、グルカゴンは４倍に増加して６．７２ｎｇ／ｋｇ／分になったか（Ｉ／Ｇモル比４、Ｈｉ  ＧＧＮ群と呼ぶ）、または１．６８ｎｇ／ｋｇ／分で基礎を維持した（Ｉ／Ｇモル比１６、Ｂａ  ＧＧＮ群と呼ぶ）。図６７ＡおよびＢに示すように、基礎ホルモン補充期間中の血漿グルコースレベルは、図６４を参照して上述したものとほぼ同一であった。このデータは、インスリンおよびグルカゴンの両方の血漿レベルが低下したため、注入の減少の効果が互いに相殺されたことを示唆している。グルカゴンの上昇がない場合のインスリンの４倍の増加（たとえば、１．２８ｍＵ／ｋｇ／分）によって、血漿グルコースは、３９０分で最終レベルの３７ｍｇ／ｄＬまでゆっくりと減少した。付随するグルカゴンの４倍の増加によって、血漿グルコースは、３９０分で最終レベルの約５０ｍｇ／ｄＬまでゆっくりと減少した。したがって、Ｉ／Ｇモル比４での本発明の概念のインスリンとグルカゴンとの共投与は、所定の個体に必要なとき、インスリンおよびグルカゴンの絶対基礎補充率を適度に変更する（約２０％）場合でも、低血糖に対する保護を提供する。
【００６９】
ここで図６８および６９を参照して、本発明の概念と一致する、出願人によって実施された試験の結果を示す。これらの試験では、本発明の概念と一致する、０．４ｍＵ／ｋｇ／分の速度でのインスリン注入および１．３８ｎｇ／ｋｇ／分の速度でのグルカゴン注入（Ｉ／Ｇモル比６）の、インスリンおよびグルカゴンの基礎分泌を効果的に補充して、インスリン誘発性低血糖を制限する能力を評価する。
図６８ＡおよびＢは、本発明の概念のインスリンとグルカゴンとの共注入中のホルモン濃度に関するデータを示す。インスリンは０．４ｍＵ／ｋｇ／分の速度で注入し、グルカゴンは１．３８ｎｇ／ｋｇ／分の速度で注入した。０〜１８０分のプライミングおよび基礎補充期間中、Ｉ／Ｇモル比は６であった。１８０分でのインスリンチャレンジ期間の開始時に、インスリン注入は４倍に増加して１．６ｍＵ／ｋｇ／分になり、一方、グルカゴンは４倍に増加して５．５６ｎｇ／ｋｇ／分になったか（Ｉ／Ｇモル比６、Ｈｉ  ＧＧＮ群と呼ぶ）、または１．３９ｎｇ／ｋｇ／分で基礎を維持した（Ｉ／Ｇモル比２４、Ｂａ  ＧＧＮ群と呼ぶ）。図６８Ａに示すように、基礎ホルモン補充期間中、インスリンレベルは、上述の図６１を参照したものに類似していた。注入速度の４倍の増加に反応して発生したインスリンレベルの増加も、上述の図６１を参照したものに類似したレベルに近づいた。図６８Ｂに示すように、基礎ホルモン補充期間とグルカゴン注入速度が４倍に増加したときの両方における２．１ｎｇ／ｋｇ／分の注入速度と比較して、１．３８ｎｇ／ｋｇ／分の注入速度でグルカゴンレベルの増加は少なくなった。
【００７０】
図６９Ａ〜Ｄは、本発明の概念のインスリンとグルカゴンとの共注入中のグルコース濃度に関するデータを示す。インスリンは０．４ｍＵ／ｋｇ／分の速度で注入し、グルカゴンは１．３８ｎｇ／ｋｇ／分の速度で注入した。０〜１８０分のプライミングおよび基礎補充期間中、Ｉ／Ｇモル比は６であった。１８０分でのインスリンチャレンジ期間の開始時に、インスリン注入は４倍に増加して１．６ｍＵ／ｋｇ／分になり、一方、グルカゴンは４倍に増加して５．５２ｎｇ／ｋｇ／分になったか（Ｉ／Ｇモル比６、Ｈｉ  ＧＧＮ群と呼ぶ、）または１．３８ｎｇ／ｋｇ／分で基礎を維持した（Ｉ／Ｇモル比２４、Ｂａ  ＧＧＮ群と呼ぶ）。図６９Ａに示すように、Ｉ／Ｇモル比が６の場合、基礎ホルモン補充期間における血漿グルコースレベルは８０ｍｇ／ｄＬに低下した。図６９Ｂに示すように、グルコースを注入して、血漿グルコースレベルがさらに低下する（例えば、８０ｍｇ／ｄＬ未満）のを防いだ。図６９ＣおよびＤに示すように、基礎グルコース群においてわずかに多くのグルコースを注入しているにもかかわらず、インスリン誘発性低血糖からの保護は２ｍｇ／ｄＬであった。
【００７１】
ここで図７０〜７３を参照して、本発明の概念と一致する、出願人によって実施された試験の結果を示す。これらの試験は、ポンプシステムと適合性があり、２〜８℃で安定であり、撹拌条件下でも安定である、上記のシステム１０のポンプ１００などの注入ポンプで使用するための非水性共溶媒を含むインスリンとグルカゴンとの合剤の開発を支援するために実施した。課題には、非水性溶液合剤のインスリンとグルカゴンの、有機溶媒との溶解度、および注入ポンプ１００との合剤の適合性が含まれる。溶解度と安定性の向上を達成する目的で、２つのアプローチを用いた、すなわち、アセトン、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エタノール、酢酸エチル、グリセロール、メタノール、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、ポリエチレングリコール、およびプロピレングリコール（ＰＧ）などの純粋な有機溶媒、ならびに水溶液と混合した有機溶媒の溶液などの共溶媒、および添加剤を加えた主要な共溶媒混合物の付加。
これらの試験は、１〜１０ｍｇ／ｍＬの間のインスリンの目標濃度および０．１〜１．０ｍｇ／ｍＬの間のグルカゴンの目標濃度、より具体的には３〜５ｍｇ／ｍＬのインスリン濃度および０．１〜０．８ｍｇ／ｍＬのグルカゴン濃度で実施した。１０〜２０μＬ／時間の間のＵ−１００の基礎インスリン速度、および固定インスリン用量でのＩ／Ｇモル比３〜１６を想定した。
【００７２】
図７０および７０Ａ〜７０Ｃは、イヌ対象に投与したときのＤＭＳＯ中のインスリンとグルカゴンとの３つの合剤に関するデータを示している。合剤の濃度を測定するために、試料を０．０１Ｎ  ＨＣｌで希釈し、次いで逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）法で分析した。インスリンおよびグルカゴンの保持時間は、それぞれ１０．７分および１４．６分である。図７０に示すように、合剤ＡＢ−１６０００３−０１は、４．４８ｍｇ／ｍＬのインスリンと０．８３ｍｇ／ｍＬのグルカゴンとを含み、合剤ＡＢ−１６０００２−０１は、４．４８ｍｇ／ｍＬのインスリンと０．２１ｍｇ／ｍＬのグルカゴンとを含み、合剤ＡＢ−１６０００１−０１は、１．０８ｍｇ／ｍＬのインスリンと０．２１ｍｇ／ｍＬのグルカゴンとを含む。モル比は、合剤ＡＢ−１６０００３−０１およびＡＢ−１６０００１−０１の両方について３を含む。合剤ＡＢ−１６０００２−０１についてモル比は１２を含む。
【００７３】
１．０ｍｇ／ｍＬのインスリンと０．５ｍｇ／ｍＬのグルカゴンとを含むＤＭＳＯ中の合剤について、撹拌試験を実施した。一定分量の試料を、最長７日間３つの状態に置いた、すなわち、０ｒｐｍで５℃（コントロールとして）、５０ｒｐｍで２５℃、および５０ｒｐｍで３７℃。試料を０．０１Ｎ  ＨＣｌで希釈し、次いでＲＰ−ＨＰＬＣで分析した。活性成分（インスリンおよびグルカゴン）の回収率を計算し、以下の表に列挙した。インスリンとグルカゴンの両方は、７日間の撹拌後に良好な回収率を示した。
【００７４】
【表１】
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【００７５】
図７１ＡおよびＢは、本発明の概念と一致する、非水性溶媒中のインスリンおよびグルカゴンの溶解度にそれぞれ関連するデータを示す。上清中のインスリンおよびグルカゴンの濃度をＲＰ−ＨＰＬＣで分析した。ＤＭＳＯおよびＮＭＰの両方が、インスリン（例えば８ｍｇ／ｍＬを超える濃度）およびグルカゴン（例えば１ｍｇ／ｍＬを超える濃度）に対して良好な溶解度を示す。グリセロールおよびプロピレングリコールの両方が、グルカゴンに対しては良好な溶解度（例えば、２．５ｍｇ／ｍＬを超える濃度）を示すが、インスリンに対しては不十分な溶解度（例えば、２ｍｇ／ｍＬ未満の濃度）を示す。誘電率が２５〜７０の間の非水性溶媒、例えば、Ｎ−メチルピロリドン（３２）、メタノール（３３）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３７）、アセトニトリル（３８）、ジメチルアセトアミド（３８）、ＤＭＳＯ（４７）、炭酸プロピレン（６５）などの溶媒（括弧内に誘電率）は、グルカゴンに対して比較的高い溶解度を有する。
【００７６】
図７２ＡおよびＢは、本発明の概念と一致して、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）またはリン酸緩衝液（ＰＢ）、およびビタミンＥ  ＴＰＧＳと混合した非水性有機溶媒を含む共溶媒であって、非水性有機共溶媒が、この製剤の少なくとも６０％を構成していた共溶媒中のインスリンとグルカゴンとの合剤の溶解度に関するデータを示している。上清中のインスリンおよびグルカゴンの濃度をＲＰ−ＨＰＬＣで分析した。６０％の有機溶媒を含む溶液では、グルカゴンはＰＢへのより良好な溶解度を示した。図７２Ａに示すように、以下の共溶媒、すなわち、５％ビタミンＥ  ＴＰＧＳ；１０％ＤＭＳＯ；１０％ＮＭＰ；１０％ＰＧ；および１０％グリセロールのうちの少なくとも１つと混合して、７５〜９５％ＰＢＳを含むインスリンとグルカゴンとの合剤の溶解度を観察した。９５％ＰＢＳおよび５％ビタミンＥ  ＴＰＧＳと混合した場合、インスリンの個別のＤＳ溶解度は１．３８ｍｇ／ｍＬ、グルカゴンは０．２５ｍｇ／ｍＬであった。図７２Ｂに示すように、以下の共溶媒、すなわち４．５％ビタミンＥ  ＴＰＧＳ；３０％ＤＭＳＯ；３０％ＮＭＰ；３０％ＰＧ；３０％グリセロール、および１％エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のうちの少なくとも１つと混合して、３４．５〜３５．５％ＰＢを含む、本発明の概念のインスリンとグルカゴンとの合剤の溶解度を観察した。インスリンの目標濃度を、３４．５〜３５．５％ＰＢを含むすべての共溶媒で観察した。さらに、３４．５〜３５．５％ＰＢＳ、４．５％ビタミンＥ  ＴＰＧＳ、３０％ＤＭＳＯ、および３０％ＰＧを含む第１の共溶媒、ならびに３４．５〜３５．５％ＰＢＳ、４．５％ビタミンＥ  ＴＰＧＳ、３０％ＤＭＳＯ、および３０％グリセロールを含む第２の共溶媒において、グルカゴンの目標濃度を観察した。
【００７７】
図７３は、最大４０％の水性ＰＢ（ｐＨ７．８）と混合した非水性有機溶媒を含む共溶媒中のインスリンとグルカゴンとのそれぞれの溶解度に関するデータを示している。共溶媒は、本発明の概念と一致する、以下の有機溶媒、すなわち、ＮＭＰ；ＰＧ；グリセロール；およびＤＭＳＯうちの少なくとも１つを含み、共溶媒または共溶媒混合物がこの配合剤の少なくとも６０％を構成する。上清中のインスリンおよびグルカゴンの濃度をＲＰ−ＨＰＬＣで分析した。３０％以上の有機溶媒を含む溶液では、１００％ＰＢ中でのグルカゴンの溶解度（例えば、０．０２ｍｇ／ｍＬ未満）とは対照的に、グルカゴンはＰＢ中でより良好な溶解度（例えば、０．１〜０．３ｍｇ／ｍＬ）を示した。インスリンは、有機共溶媒が混合物の３０％を超える場合、試験したすべての共溶媒中で目標濃度を示した。
ここで図７４〜７６を参照して、本発明の概念と一致する、出願人によって実施された試験の結果を示す。これらの試験は、別個の溶液としてのインスリンおよびグルカゴンと比較して、インスリンとグルカゴンとの合剤溶液の治療的価値を評価するために、イヌ対象において実施した。
【００７８】
インスリンとグルカゴンとの合剤は、ＤＭＳＯ中のグルカゴンのストック溶液をＰＧおよびＰＢ（ｐＨ７．４）で希釈し、その後インスリンを添加することにより調製した。グルカゴンＤＭＳＯストック溶液は、グルカゴンを０．５５ｍｇ／ｍＬの濃度でＤＭＳＯ中に溶解させ、ＰＧで０．１２ｍｇ／ｍＬに希釈し、その後ＰＢ（例えば２０ｍＭ、ｐＨ７．４）で希釈して、４：２：４（グルカゴンＤＭＳＯストック溶液：ＰＧ：ＰＢ）の体積比で調製した。所望の量のインスリンをグルカゴン溶液に添加して（例えば、０．１２ｍｇ／ｍＬ）、０．８３ｍｇ／ｍＬのインスリン濃度を達成した。インスリン対グルカゴンのモル比は４である。最終の合剤は、透明かつ無色であることを観察した。
【００７９】
合剤中のインスリンおよびグルカゴンの濃度をＲＰ−ＨＰＬＣで分析した。合剤の試料を０．０１Ｎ  ＨＣｌで希釈した。希釈された合剤は、ダイオードアレイ検出器（ＤＡＤ）を備え、さらに５μｍのＺｏｒｂａｘ  ＳＢ−Ｃ８、流量１ｍＬ／分の４．６×２５０ｍｍカラム、２１４ｎｍの紫外線検出、および５０μｌの注入量を具備する、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣを使用して分析した。カラム温度は３０°Ｃに維持し、試料チャンバーは５°Ｃに維持した。移動相は、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水（移動相Ａ）中の０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）とアセトニトリル（移動相Ｂ）中の０．１％ＴＦＡとの組合せで構成した。移動相の組合せは、５分間、７０％イソクラティック移動相Ａで開始し、次いで、毎分０．５％の比率で移動相Ａが６０％に減少し、その後、より高いパーセンテージの移動相Ｂで５分間カラム洗浄を行った。
【００８０】
図７４は、別個の溶液としてのインスリンとグルカゴンとの共注入と比較した、合剤の注入中の血漿グルコースレベルに関するデータを示す。９０〜３９０分の期間中に、イヌ対象にソマトスタチンを投与して、膵臓内分泌部を不能にした。０〜１８０分の期間中に、インスリンを０．４ｍＵ／ｋｇ／分の速度で、グルカゴンを２．１ｎｇ／ｋｇ／分の速度で、別個の溶液として（Ｂａ  ＧＧＮ群と呼ぶ）、または合剤として（Ｈｉ  ＧＧＮ群と呼ぶ）基礎量で皮下注入した。１８０分で、Ｂａ  ＧＧＮおよびＨｉ  ＧＧＮ群の両方において、インスリン注入速度が１．６ｍＵ／ｋｇ／分に増加した。グルカゴン注入速度はＢａ  ＧＧＮ群では基礎を維持したが、Ｈｉ  ＧＧＮ群では８．４ｎｇ／ｋｇ／分に増加した。
９０〜１８０分の基礎ホルモン補充期間中、グルコースレベルは、Ｂａ  ＧＧＮ群において１００ｍｇ／ｄＬであった。グルコースレベルは、Ｈｉ  ＧＧＮ群において８０ｍｇ／ｄＬに近く、それにより、合剤におけるインスリン作用の優位性を示した。１８０〜３９０分のインスリンチャレンジ期間中、グルコースレベルは、Ｉ／Ｇモル比１６のＢａ  ＧＧＮ群で４１ｍｇ／ｄＬに減少した。Ｉ／Ｇモル比４を維持するためにグルカゴンレベルを４倍に増加すると（図７６に示すように）、Ｈｉ  ＧＧＮ群ではグルコースレベルがわずか５６ｍｇ／ｄＬに低下した。
【００８１】
図７５は、合剤中のインスリン、または別個の溶液としてのインスリンの注入中の、動脈血中インスリンレベルに関連するデータを示す。０〜１８０分のプライミングおよび基礎補充期間中に、インスリンを０．４ｍＵ／ｋｇ／分の速度で、単一溶液（Ｂａ  ＧＧＮ群と呼ぶ）として、またはグルカゴンとの合剤（Ｈｉ  ＧＧＮ群と呼ぶ）で皮下注入した。１８０〜３９０分のチャレンジ期間中、Ｂａ  ＧＧＮおよびＨｉ  ＧＧＮ両群において、インスリンを１．６ｍＵ／ｋｇ／分の速度で皮下注入し、前者はグルカゴンとの合剤中にあった。インスリンレベルは、両群で同様に増加した。
【００８２】
図７６は、別個の溶液としてのグルカゴンの注入と比較した、合剤の注入中の動脈血中グルカゴンレベルに関するデータを示す。Ｂａ  ＧＧＮ群において単一溶液として、０〜３９０分の実験全体で、グルカゴンを２．１ｎｇ／ｋｇ／分の速度で皮下注入した。グルカゴンは、Ｈｉ  ＧＧＮ群において最初の１８０分間、インスリンとの合剤で２．１ｎｇ／ｋｇ／分の速度で注入した。１８０〜３９０分のチャレンジ期間中、Ｈｉ  ＧＧＮ群において、インスリンとの合剤でグルカゴンを８．４ｎｇ／ｋｇ／分の速度で皮下注入した。グルカゴンレベルは約４倍に増加した。
図７５および７６に示す実験中に、０〜１８０分のプライミングおよび補充期間中、Ｉ／Ｇモル比は両群において４であった。１８０〜３９０分のインスリンチャレンジ期間中、Ｉ／Ｇモル比はＢａ  ＧＧＮ群において１６に増加し、Ｈｉ  ＧＧＮ群では４のままであった。
【００８３】
本開示の態様は、以下の条項に記載される本発明においてさらに具体化し得る。
第１項：インスリンとグルカゴンとを対象に共投与することを含む治療方法であって、インスリンとグルカゴンとを、インスリン：グルカゴンのモル比約１：１〜約６：１の間で共投与し、インスリンとグルカゴンとを、同時に、高血糖を治療または阻害するために、および低血糖を阻害するために、治療有効量で投与する方法。
第２項：対象が、インスリンとグルカゴンとを共投与する前には高血糖である、第１項の方法。
第３項：インスリンとグルカゴンとの共投与が、インスリンとグルカゴンとを含む合剤を対象に投与することを含む、第１項または第２項いずれかの方法。
第４項：合剤が、約１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬの間の濃度のインスリン、および約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１ｍｇ／ｍＬの間の濃度のグルカゴンを含む、第３項の方法。
第５項：合剤が、約３ｍｇ／ｍＬ〜約５ｍｇ／ｍＬの間の濃度のインスリン、および約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約０．８ｍｇ／ｍＬの間の濃度のグルカゴンを含む、第３項または第４項いずれかの方法。
【００８４】
第６項：合剤が、１種または複数の非水性溶媒を含む溶媒を含む、第３項から第５項までのいずれか１項の方法。
第７項：溶媒の約２０％〜約６０％（ｖ／ｖ）が、１種または複数の非水性溶媒からなる、第６項の方法。
第８項：少なくとも１種の非水性溶媒が、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）である、第６項または第７項のいずれかの方法。
第９項：溶媒がさらに、１種または複数の水性溶媒を含む、第６項から第８項までのいずれか１項の方法。
第１０項：溶媒の約４０％（ｖ／ｖ）以下が、１種または複数の水性溶媒からなる、第９項の方法。
【００８５】
第１１項：溶媒の約１０％〜約４０％（ｖ／ｖ）が、プロピレングリコール（ＰＧ）、グリセロール、またはＰＧとグリセロールとの組合せである、第６項から第１０項までのいずれか１項の方法。
第１２項：インスリンおよびグルカゴンの合剤が、注射としてまたは注入ポンプにおいて患者が取り扱う場合に十分な使用中の安定性を有する、第３項から第１０項までのいずれか１項の方法。
第１３項：インスリンとグルカゴンとの共投与が、インスリンとグルカゴンとを皮下投与することを含む、前記条項のいずれか１項の方法。
第１４項：インスリンが、肝選択的インスリンを含む、前記条項のいずれか１項の方法。
【００８６】
第１５項：インスリンとグルカゴンとを、インスリン：グルカゴンのモル比約１：１〜約５：１の間で共投与する、前記条項のいずれか１項の方法。
第１６項：インスリンとグルカゴンとを、インスリン：グルカゴンのモル比約３：１〜約６：１の間で共投与する、前記条項のいずれか１項の方法。
第１７項：インスリンとグルカゴンとを、インスリン：グルカゴンのモル比約３：１〜約５：１の間で共投与する、前記条項のいずれか１項の方法。
第１８項：インスリンとグルカゴンとの共投与が、インスリンを約０．２〜０．６ｍＵ／ｋｇ／分の基礎注入速度で投与することおよびグルカゴンを約１〜４ｎｇ／ｋｇ／分の基礎注入速度で投与することを含む、前記条項のいずれか１項の方法。
第１９項：インスリンとグルカゴンとの共投与が、インスリンを約０．３〜０．５ｍＵ／ｋｇ／分の基礎注入速度で投与することを含む、第１８項の方法。
【００８７】
第２０項：インスリンとグルカゴンとの共投与が、グルカゴンを約２〜３ｎｇ／ｋｇ／分の基礎注入速度で投与することを含む、第１８項または第１９項のいずれかの方法。
第２１項：インスリンが、インスリンアナログを含む、前記条項のいずれか１項の方法。
第２２項：グルカゴンが、グルカゴンアナログを含む、前記条項のいずれか１項の方法。
第２３項：対象が、１型、２型、妊娠性、または他の形態の糖尿病を有する、前記条項のいずれか１項の方法。
第２４項、ここではインスリンおよびグルカゴンを共投与する場合、対象が自律神経不全に関連する低血糖を示す。
【００８８】
第２５項：約１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬの間の濃度のインスリン、および約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１ｍｇ／ｍＬの間の濃度のグルカゴンを含む、合剤であって、インスリン：グルカゴンのモル比は、約１：１〜約６：１の間である、合剤。
第２６項：インスリン：グルカゴンのモル比が、約１：１〜約５：１の間である、第２５項の合剤。
第２７項：インスリン：グルカゴンのモル比が、約３：１〜約６：１の間である、第２５項または第２６項のいずれかの合剤。
第２８項：インスリン：グルカゴンのモル比が、約３：１〜約５：１の間である、第２５項から第２７項までのいずれか１項の合剤。
第２９項：インスリンが、約３ｍｇ／ｍＬ〜約５ｍｇ／ｍＬの間の濃度であり、グルカゴンが、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約０．８ｍｇ／ｍＬの間の濃度である、第２５項から第２８項までのいずれか１項の合剤。
【００８９】
第３０項：１種または複数の水性溶媒および１種または複数の非水性溶媒を含む溶媒をさらに含む、第２５項から第２９項までのいずれか１項の合剤。
第３１項：溶媒の約２０％〜約６０％（ｖ／ｖ）が、１種または複数の非水性溶媒からなり、溶媒の約４０％（ｖ／ｖ）以下が、１種または複数の水性溶媒からなる、第３０項の合剤。
第３２項：少なくとも１種の非水性溶媒が、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）である、第３０項または第３１項のいずれかの方法。
第３３項：溶媒の約１０％〜約４０％が、プロピレングリコール（ＰＧ）、グリセロール、またはＰＧとグリセロールとの組合せである、第３０項から第３２項までのいずれか１項の方法。
上述の実施形態は、例示的な例としてのみ機能すると理解されるべきであり、さらなる実施形態が想定される。任意のある実施形態に関して本明細書に記載された特徴は、単独で、または記載された他の特徴と組み合わせて使用してもよく、また、任意の他の実施形態の１つまたは複数の特徴と組み合わせて、または任意の他の実施形態を任意に組み合わせて使用してもよい。さらに、添付の特許請求の範囲に定義されている本発明の範囲から逸脱することなく、上記に記載されていない均等物および変更もまた使用してもよい。
【図１】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８Ａ】
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【図５８Ｂ】
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【図５９Ａ】
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【図５９Ｂ】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３Ａ−Ｂ】
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【図６４Ａ】
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【図６４Ｂ−Ｃ】
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【図６５Ａ−Ｂ】
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【図６５Ｃ−Ｄ】
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【図６６Ａ−Ｂ】
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【図６７Ａ】
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【図６７Ｂ】
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【図６８Ａ−Ｂ】
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【図６９Ａ】
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【図６９Ｂ】
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【図６９Ｃ】
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【図６９Ｄ】
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【図７０】
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【図７０Ａ−Ｃ】
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【図７１Ａ−Ｂ】
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【図７２Ａ】
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【図７２Ｂ】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５−７６】
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【国際調査報告】
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