(57)【要約】  本開示は、ポリアデニル化（ポリＡ）テールの分野に関する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡは、目的のタンパク質をコードするヌクレオチドに対して３’に位置するポリＡテールをコードし、前記ポリＡテールは、１個以上の非アデニンヌクレオチドを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的のタンパク質をコードするヌクレオチドに対して３’に位置するポリアデニル化（ポリＡ）テールをコードするヌクレオチドを含むＤＮＡであって、前記ポリＡテールが、少なくとも８個の連続するアデニン（Ａ）ヌクレオチドの第１のホモポリマー配列と、１個以上の非アデニン（Ａ）ヌクレオチドを含む中断配列と、を含む、ＤＮＡ。
【請求項２】
前記ポリＡテールが、少なくとも連続するアデニン（Ａ）ヌクレオチドの第２のホモポリマー配列をさらに含む、請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項３】
前記ポリＡテールが、少なくとも８個の連続するアデニン（Ａ）ヌクレオチドの３個以上のホモポリマー配列を含む、請求項１または２に記載のＤＮＡ。
【請求項４】
前記第１および／または以降のホモポリマー配列が、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、または４０個の連続するアデニンヌクレオチドを含む、請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項５】
前記１個以上の非アデニンヌクレオチドが、アデニンヌクレオチドのみを含有する類似または同じ長さの３’テールを含むＤＮＡにおいて起こる損失と比較して、ＤＮＡ複製中の１個以上のアデニンヌクレオチドの損失を防止する、請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項６】
前記１個以上の非アデニンヌクレオチドが、ポリ（Ａ）結合タンパク質が一続きの連続するアデニンヌクレオチドに結合することができるように、前記連続するアデニンヌクレオチドを中断するように配置される、請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項７】
前記ポリＡテールが、少なくとも５０個の総アデニンヌクレオチドを含む、請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項８】
前記ポリＡテールが、４０〜１０００個、４０〜９００個、４０〜８００個、４０〜７００個、４０〜６００個、４０〜５００個、４０〜４００個、４０〜３００個、４０〜２００個、または４０〜１００個の総アデニンヌクレオチドを含む、請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項９】
前記ポリＡテールが９５〜１００個の総アデニンヌクレオチドを含む、請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項１０】
前記ポリＡテールが、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、または９７個の総アデニンヌクレオチドを含むかまたは含有する、請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項１１】
前記ポリＡテールが、９６または９７個の総アデニンヌクレオチドを含むかまたは含有する、請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項１２】
前記１個以上の中断配列が、１個の非アデニンヌクレオチド、または１個の連続する一続きの２〜１０個の非アデニンヌクレオチドを含むかまたは含有する、請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項１３】
前記１個以上の中断配列が、１個の非アデニンヌクレオチド、または２個以上の非アデニンヌクレオチドを包含する１個の連続する一続きの２〜１０個のヌクレオチドを含むかまたは含有する、請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項１４】
前記非アデニンヌクレオチド（複数可）が、少なくとも８、９、１０、１１、または１２個の連続するアデニンヌクレオチドの後に位置する、請求項１２または１３に記載のＤＮＡ。
【請求項１５】
前記１個以上の非アデニンヌクレオチドが、少なくとも８〜５０個の連続するアデニンヌクレオチドの後に位置する、請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項１６】
前記１個以上の非アデニンヌクレオチドが、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０個の連続するアデニンヌクレオチドの後に位置する、請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項１７】
前記中断配列が、トリヌクレオチド、ジヌクレオチド、またはモノヌクレオチドの中断配列である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のＤＮＡ。
【請求項１８】
前記ポリＡテールが、８〜５０個の連続するアデニンヌクレオチドごとに、１個の非アデニンヌクレオチド、または１個の連続する一続きの２〜１０個の非アデニンヌクレオチドを含むかまたは含有する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のＤＮＡ。
【請求項１９】
前記ポリＡテールが、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０個の連続するアデニンヌクレオチドごとに、１個の非アデニンヌクレオチド、または１個の連続する一続きの２〜１０個の非アデニンヌクレオチドを含むかまたは含有する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のＤＮＡ。
【請求項２０】
前記ポリＡテールが、８〜５０個の連続するアデニンヌクレオチドごとに、１、２、３、４、または５個の連続する非アデニンヌクレオチドを含むかまたは含有する、請求項１〜１９のいずれかに記載のＤＮＡ。
【請求項２１】
前記ポリＡテールが、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０個の連続するアデニンヌクレオチドごとに、１、２、３、４、または５個の連続する非アデニンヌクレオチドを含むかまたは含有する、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のＤＮＡ。
【請求項２２】
前記ポリＡテールが、２個以上の非アデニンヌクレオチドまたは２個以上の連続する一続きの２〜１０個の非アデニンヌクレオチドを含むかまたは含有する、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のＤＮＡ。
【請求項２３】
前記２個以上の非アデニンヌクレオチドまたは２個以上の連続する一続きの２〜１０個の非アデニンヌクレオチドが、前記ポリＡテール内で不規則的に離間している、請求項１〜２２のいずれかに記載のＤＮＡ。
【請求項２４】
前記ポリＡテールが、１２個の連続するアデニンヌクレオチドごとに、１個の非アデニンヌクレオチド、または２、３、４、もしくは５個の連続する非アデニンヌクレオチドを含むかまたは含有する、請求項１〜２３のいずれかに記載のＤＮＡ。
【請求項２５】
前記ポリＡテールが、１６個の連続アデニンヌクレオチドごとに、１個の非アデニンヌクレオチド、または２、３、４、もしくは５個の連続する非アデニンヌクレオチドを含むかまたは含有する、請求項１〜２４のいずれかに記載のＤＮＡ。
【請求項２６】
前記ポリＡテールが、２５個の連続するアデニンヌクレオチドごとに、１個の非アデニンヌクレオチド、または２、３、４、もしくは５個の連続する非アデニンヌクレオチドを含むかまたは含有する、請求項１〜２５のいずれかに記載のＤＮＡ。
【請求項２７】
前記ポリＡテールが、３０個の連続するアデニンヌクレオチドごとに、１個の非アデニンヌクレオチド、または２、３、４、もしくは５個の連続する非アデニンヌクレオチドを含むかまたは含有する、請求項１〜２６のいずれかに記載のＤＮＡ。
【請求項２８】
前記ポリＡテールが、３９個の連続するアデニンヌクレオチドごとに、１個の非アデニンヌクレオチド、または２、３、４、もしくは５個の連続する非アデニンヌクレオチドを含むかまたは含有する、請求項１〜２７のいずれかに記載のＤＮＡ。
【請求項２９】
前記非アデニンヌクレオチドが、グアニン、シトシン、またはチミンである、請求項１〜２８のいずれかに記載のＤＮＡ。
【請求項３０】
前記非アデニンヌクレオチドが、グアニンヌクレオチドである、請求項２９に記載のＤＮＡ。
【請求項３１】
前記非アデニンヌクレオチドが、シトシンヌクレオチドである、請求項２９に記載のＤＮＡ。
【請求項３２】
前記非アデニンヌクレオチドが、チミンヌクレオチドである、請求項２９に記載のＤＮＡ。
【請求項３３】
ａ．グアニンおよびチミンヌクレオチド、
ｂ．グアニンおよびシトシンヌクレオチド、
ｃ．チミンおよびシトシンヌクレオチド、または
ｄ．グアニン、チミンおよびシトシンヌクレオチドから選択される、２個以上の非アデニンヌクレオチドを含む、請求項２９に記載のＤＮＡ。
【請求項３４】
前記非アデニンヌクレオチドが、グアニン、シトシン、およびチミンから選択される１個の非アデニンヌクレオチドからなる、請求項１〜３３のいずれかに記載のＤＮＡ。
【請求項３５】
前記非アデニンヌクレオチドが、グアニン、シトシン、およびチミンのうちの１個以上から選択される２個の非アデニンヌクレオチドを含む、請求項１〜３４のいずれかに記載のＤＮＡ。
【請求項３６】
前記非アデニンヌクレオチドが、グアニン、シトシン、およびチミンのうちの１個以上から選択される３個の非アデニンヌクレオチドを含む、請求項１〜３５のいずれかに記載のＤＮＡ。
【請求項３７】
前記アデニンヌクレオチドが、アデノシン一リン酸である、請求項１〜３６のいずれかに記載のＤＮＡ。
【請求項３８】
前記タンパク質が、治療用タンパク質である、請求項１〜３７のいずれかに記載のＤＮＡ。
【請求項３９】
前記タンパク質が、サイトカインまたはケモカインである、請求項３８に記載のＤＮＡ。
【請求項４０】
前記タンパク質が、増殖因子である、請求項３８に記載のＤＮＡ。
【請求項４１】
前記タンパク質が、Ｃａｓ９または修飾Ｃａｓ９である、請求項３８に記載のＤＮＡ。
【請求項４２】
請求項１〜４１のいずれか一項に記載のＤＮＡによりコードされるｍＲＮＡ。
【請求項４３】
前記ＤＮＡがベクター内にある、請求項１〜４２のいずれかに記載のＤＮＡ。
【請求項４４】
前記ベクターが宿主細胞内にある、請求項４３に記載のＤＮＡ。
【請求項４５】
前記１個以上の非アデニンヌクレオチドが、アデニンヌクレオチドのみを含有する類似または同じ長さのポリＡテールをコードするヌクレオチドを含むＤＮＡにおいて起こる損失と比較して、宿主細胞の増殖中のベクター内のポリＡテールをコードするヌクレオチドの損失を防止する、請求項４３に記載のＤＮＡ。
【請求項４６】
請求項４３に記載のＤＮＡベクターからｍＲＮＡを産生する方法であって、
ａ．前記ポリＡテールの下流の前記ベクターを直線化することと、
ｂ．前記直線化されたベクターを変性させることと、
ｃ．グアニン、シトシン、ウラシル、およびアデニンヌクレオチドの存在下で、前記変性ＤＮＡをＲＮＡポリメラーゼと接触させることと、を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、安定化されたメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）および安定化されたｍＲＮＡをコードするＤＮＡの分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリアデニル化は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の３’末端に複数のアデニンヌクレオチドを付加して、ポリＡテールを形成するプロセスである。ポリＡテールは、他の塩基が配列を中断することなく、アデノシン一リン酸などの複数の反復アデニンヌクレオチドで構成されている。ポリＡテールは、ｍＲＮＡの核外輸送、翻訳、および安定性にとって重要である。自然界では、ｍＲＮＡはＤＮＡから生成されるため、ターミナルトランスフェラーゼはｍＲＮＡの３’末端にアデニンヌクレオチドを付加する。この酵素プロセスは、エクスビボでｍＲＮＡを生成する際に適用できるが、プロセスを制御するのは難しく、長さの異なるポリＡテールが生じる。プラスミドのポリＡテールをコードすることにより、ポリＡテールの不均一性を減らすことができる。ただし、不均一性が排除されるわけではなく、プラスミドの潜在的な不安定性などの追加の欠点もある。
【０００３】
ポリＡテールは、ポリＡ結合タンパク質の結合部位として機能する。ポリＡ結合タンパク質は、ｍＲＮＡの核からの輸送、翻訳、およびｍＲＮＡの分解の抑制に役立つ。核からの輸送がない場合、ｍＲＮＡは通常、エキソソームによって分解される。ポリＡ結合タンパク質は、翻訳に必要なタンパク質を補充する。
【０００４】
現在、ｍＲＮＡは治療用分子として、例えばさまざまな病気や障害の治療に使用されている。ｍＲＮＡは、対象の細胞が細胞内でｍＲＮＡによってコードされるタンパク質を産生するように、タンパク質の代わりに対象に送達される。これらおよび他の目的のために、ｍＲＮＡは、しばしばプラスミドに含有されるＤＮＡ鋳型からの転写により調製され得る。ｍＲＮＡの産生中、ポリＡテールは、プラスミドからの転写後に酵素的にｍＲＮＡに付加され得るか、プラスミド自体にコード化され得る。ポリＡテールがプラスミドにコードされている場合、ポリＡテールはプラスミドＤＮＡ複製のサイクルで短くなる（すなわち、アデニンヌクレオチドを失う）場合があり、結果として生じるＤＮＡおよび後続のｍＲＮＡ集団に大きな変動をもたらす可能性がある。したがって、当該技術分野においてＤＮＡ複製中にポリＡアデニンヌクレオチドをコードするヌクレオチドの漸進的損失に対して安定で抵抗性のあるポリＡテールをコードするプラスミドの設計に対する必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００５】
本明細書では、目的のタンパク質をコードするヌクレオチドに対して３’に位置する連続するアデニンヌクレオチドを含むポリアデニル化（ポリＡ）テールをコードするＤＮＡ、およびそのポリＡテールを含むｍＲＮＡであって、ポリＡテールが非アデニンヌクレオチド「アンカー」を挿入することにより安定化される、ＤＮＡ、およびｍＲＮＡ、が開示されている。
【０００６】
本明細書で使用する「ポリＡテール」という用語は、ｍＲＮＡ分子上のポリＡテール、またはＤＮＡプラスミド内のポリＡテールをコードする配列を指す。ポリＡテールは、プラスミド内の相補的なＤＮＡ配列によってコードされていてもよい。ＤＮＡ配列内の反復チミン（Ｔ）ヌクレオチドの配列、例えば、ホモポリマーＴ配列は、ｍＲＮＡのポリＡテールをコードし得る。２個以上の連続するアデノシン（例えば、アデノシンまたはデオキシアデノシン）、チミジン、または他のヌクレオチドは、ホモポリマーと呼ばれる。天然のポリＡテールは、長く連続するホモポリマーＡ配列で構成されている。
【０００７】
本明細書に開示される非アデニンヌクレオチドアンカーは、規則的または不規則的に間隔を空けてポリＡテールを中断し、ポリＡテールをコードするＤＮＡならびにＤＮＡから生成されるｍＲＮＡを安定化する。例示的な非アデニンヌクレオチドアンカーを表４に提供する。例えば、アンカー配列は、ポリＡテール内の２個のアデニンヌクレオチドホモポリマー配列に隣接している。
【０００８】
いくつかの実施形態では、目的のタンパク質をコードするヌクレオチドに対して３’に位置するポリアデニル化（ポリＡ）テールをコードするヌクレオチドを含むＤＮＡ組成物であって、ポリＡテールは少なくとも８個の連続するアデニン（Ａ）ヌクレオチドを含み、かつ１個以上の非アデニン（Ａ）ヌクレオチドが包含される。
【０００９】
いくつかの実施形態では、ポリＡテールは、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、または９０個の連続するアデニンヌクレオチドを含む。
【００１０】
場合によっては、１個以上の非アデニンヌクレオチドは、アデニンヌクレオチドのみを含有する類似または同じ長さの３’テールを含むＤＮＡにおいて起こる損失と比較して、ＤＮＡ複製中の１個以上のアデニンヌクレオチドの損失を防止する。
【００１１】
いくつかの実施形態では、１個以上の非アデニンヌクレオチドは、ポリ（Ａ）結合タンパク質が一続きの連続するアデニンヌクレオチドに結合できるように、連続するアデニンヌクレオチドを中断するように配置される。
【００１２】
いくつかの実施形態では、ポリＡテールは、少なくとも５０個の総アデニンヌクレオチドを含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、ポリＡテールは、４０〜５００個の総アデニンヌクレオチドを含む。
【００１４】
場合によっては、ポリＡテールは９５〜１００個の総アデニンヌクレオチドを含む。
【００１５】
いくつかの実施形態では、ポリＡテールは、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、または９７個の総アデニンヌクレオチドを含むかまたは含有する。
【００１６】
いくつかの実施形態では、ポリＡテールは、９６または９７個の総アデニンヌクレオチドを含むかまたは含有する。
【００１７】
いくつかの実施形態では、ポリＡテールは、１個の非アデニンヌクレオチドまたは１個の連続する一続きの２〜１０個の非アデニンヌクレオチドを、含むかまたは含有する。
【００１８】
いくつかの実施形態では、非アデニンヌクレオチドは、少なくとも８、９、１０、１１、または１２個の連続するアデニンヌクレオチドの後に位置する。
【００１９】
場合によっては、１個以上の非アデニンヌクレオチドは、少なくとも８〜５０個の連続するアデニンヌクレオチドの後に位置する。
【００２０】
いくつかの実施形態では、１個以上の非アデニンヌクレオチドは、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０個の連続するアデニンヌクレオチドの後に位置する。
【００２１】
いくつかの実施形態では、ポリＡテールは、８〜５０個の連続するアデニンヌクレオチドごとに、１個の非アデニンヌクレオチド、または１個の連続する一続きの２〜１０個のヌクレオチドを含むかまたは含有する。いくつかの実施形態において、ポリＡテールは、８〜５０個の連続するアデニンヌクレオチドごとに、１個の非アデニンヌクレオチド、または少なくとも２個の非アデニンヌクレオチドを含む１個の連続する一続きの２〜１０個のヌクレオチド、を含むかまたは含有する。いくつかの実施形態において、ポリＡテールは、ポリＡテールの長さに沿って任意の場所に不規則的に離間された、１個以上の非アデニンヌクレオチドまたは１個以上の連続する一続きの２〜１０個の非アデニンヌクレオチドを有し、このポリＡテールの長さに沿って任意の場所には、少なくとも８個の連続するアデニンがある。例えば、ポリＡテールは、長さ７０〜１０００ヌクレオチドで、１個以上の一続きの少なくとも８個の連続するアデニンがある限り、長さに沿って不規則に離間された（単一のまたはグループ化された）任意の数の非アデニンを有することができる。
【００２２】
場合によっては、ポリＡテールは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０個の連続するアデニンヌクレオチドごとに、１個の非アデニンヌクレオチド、または１個の連続する一続きの２〜１０個のヌクレオチドを含むかまたは含有する。
【００２３】
場合によっては、ポリＡテールは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０個の連続するアデニンヌクレオチドごとに、１個の非アデニンヌクレオチドか、または少なくとも２個の非アデニンヌクレオチドを含む１個の連続する一続きの２〜１０個のヌクレオチドを含むかまたは含有する。
【００２４】
いくつかの実施形態では、ポリＡテールは、８〜５０個の連続するアデニンヌクレオチドごとに、１、２、３、４、または５個の連続する非アデニンヌクレオチドを含むかまたは含有する。
【００２５】
場合によっては、ポリＡテールは８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０個の連続するアデニンヌクレオチドごとに、１、２、３、４、または５個の連続する非アデニンヌクレオチドを含むかまたは含有する。
【００２６】
いくつかの実施形態では、ポリＡテールは、ポリＡテール内で不規則的に離間された中断配列として、２個以上の非アデニンヌクレオチドまたは２個以上の連続する一続きの２〜１０個のヌクレオチドを含むかまたは含有する。
【００２７】
いくつかの実施形態では、ポリＡテールは、ポリＡテール内に不規則的に離間された２個以上の非アデニンヌクレオチドまたは２個以上の少なくとも２個の非アデニンヌクレオチドを含む連続する一続きの２〜１０個のヌクレオチドを含むかまたは含有する。
【００２８】
いくつかの例において、ポリＡテールは、１２個の連続するアデニンヌクレオチドごとに、１個の非アデニンヌクレオチド、または、２、３、４、もしくは５個の連続する非アデニンヌクレオチドを含むかまたは含有する。
【００２９】
いくつかの実施形態では、ポリＡテールは、１６個の連続するアデニンヌクレオチドごとに、１個の非アデニンヌクレオチド、または２、３、４、もしくは５個の連続する非アデニンヌクレオチドを含むかまたは含有する。
【００３０】
いくつかの実施形態では、ポリＡテールは、２５個の連続するアデニンヌクレオチドごとに、１個の非アデニンヌクレオチドまたは２、３、４、もしくは５個の連続する非アデニンヌクレオチドを含むかまたは含有する。
【００３１】
いくつかの例において、ポリＡテールは、３０個の連続するアデニンヌクレオチドごとに、１個の非アデニンヌクレオチド、または２、３、４、もしくは５個の連続する非アデニンヌクレオチドを含むかまたは含有する。
【００３２】
いくつかの実施形態において、ポリＡテールは、３９個の連続するアデニンヌクレオチドごとに、１個の非アデニンヌクレオチドまたは２、３、４、もしくは５個の連続する非アデニンヌクレオチドを含むかまたは含有する。
【００３３】
いくつかの実施形態では、非アデニンヌクレオチドはグアニン、シトシン、またはチミンである。場合によっては、非アデニンヌクレオチドはグアニンヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、非アデニンヌクレオチドはシトシンヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、非アデニンヌクレオチドはチミンヌクレオチドである。
【００３４】
いくつかの場合、２個以上の非アデニンヌクレオチドが存在する場合、非アデニンヌクレオチドは、ａ）グアニンおよびチミンヌクレオチド、ｂ）グアニンおよびシトシンヌクレオチド、ｃ）チミンおよびシトシンヌクレオチド、またはｄ）グアニン、チミンおよびシトシンヌクレオチド、から選択されてもよい。
【００３５】
いくつかの実施形態では、非アデニンヌクレオチドは、グアニン、シトシン、およびチミンから選択される１個の非アデニンヌクレオチドからなる。
【００３６】
場合によっては、非アデニンヌクレオチドは、グアニン、シトシン、およびチミンのうちの１個以上から選択される２個の非アデニンヌクレオチドを含む。
【００３７】
いくつかの実施形態では、非アデニンヌクレオチドは、グアニン、シトシン、およびチミンのうちの１個以上から選択される３個の非アデニンヌクレオチドを含む。
【００３８】
アデニンヌクレオチドは、アデノシン一リン酸であり得る。
【００３９】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質は治療用タンパク質である。場合によっては、タンパク質はサイトカイン、ケモカイン、増殖因子、Ｃａｓ９または修飾Ｃａｓ９である。
【００４０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＤＮＡのいずれかによってコードされるｍＲＮＡが含まれる。
【００４１】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡはベクター内にある。ベクターは、昆虫、細菌、または哺乳動物（例えば、ヒト）細胞を含む宿主細胞内にあってもよい。
【００４２】
いくつかの実施形態では、１個以上の非アデニンヌクレオチドが、アデニンヌクレオチドのみを含有する類似または同じ長さのポリＡテールをコードするヌクレオチドを含むＤＮＡにおいて起こる損失と比較して、宿主細胞の増殖中にベクター内のポリＡテールをコードするヌクレオチドの損失を防止する。
【００４３】
本明細書に記載のＤＮＡベクターのいずれかからｍＲＮＡを産生する方法が包含され、ポリＡテールの下流のベクターを直線化することと、直線化されたベクターを変性させることと、グアニン、シトシン、ウラシル、およびアデニンヌクレオチドの存在下で、変性ＤＮＡをＲＮＡポリメラーゼと接触させることと、を含む。
【００４４】
いくつかの実施形態では、本開示は、目的のタンパク質をコードするヌクレオチドに対して３’に位置するポリアデニル化（ポリＡ）テールをコードするヌクレオチドを含むＤＮＡを含み、ポリＡテールは少なくとも８個の連続するアデニン（Ａ）ヌクレオチドの第１のホモポリマー配列と、１個以上の非アデニン（Ａ）ヌクレオチドを含む中断配列と、を含む。いくつかのそのような実施形態では、ポリＡテールは、少なくとも連続するアデニン（Ａ）ヌクレオチドの第２のホモポリマー配列をさらに含む。一部の実施形態では、ポリＡテールは、少なくとも８個の連続するアデニン（Ａ）ヌクレオチドの３個以上のホモポリマー配列を含む。いくつかの実施形態では、第１および／または以降のホモポリマー配列は、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、または４０個の連続するアデニンヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、１個以上の非アデニンヌクレオチドは、アデニンヌクレオチドのみを含有する類似または同じ長さの３’テールを含むＤＮＡにおいて起こる損失と比較して、ＤＮＡ複製中の１個以上のアデニンヌクレオチドの損失を防止する。いくつかの実施形態では、１個以上の非アデニンヌクレオチドは、ポリ（Ａ）結合タンパク質が一続きの連続するアデニンヌクレオチドに結合できるように、連続するアデニンヌクレオチドを中断するように配置される。一部の実施形態では、ポリＡテールは、少なくとも５０個の総アデニンヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリＡテールは、４０〜１０００個、４０〜９００個、４０〜８００個、４０〜７００個、４０〜６００個、４０〜５００個、４０〜４００個、４０〜３００個、４０〜２００個、または４０〜１００個の総アデニンヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリＡテールは９５〜１００個の総アデニンヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリＡテールは、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、または９７個の総アデニンヌクレオチドを含むかまたは含有する。いくつかの実施形態では、ポリＡテールは、９６または９７個の総アデニンヌクレオチドを含むかまたは含有する。いくつかの実施形態では、１個以上の中断配列は、１個の非アデニンヌクレオチドまたは１個の連続する一続きの２〜１０個の非アデニンヌクレオチドを含むかまたは含有する。いくつかの実施形態では、１個以上の中断配列は、１個の非アデニンヌクレオチドまたは２個以上の非アデニンヌクレオチドを包含する１個の連続する一続きの２〜１０個のヌクレオチドを含むかまたは含有する。いくつかの実施形態では、非アデニンヌクレオチド（複数可）は、少なくとも８、９、１０、１１、または１２個の連続するアデニンヌクレオチドの後に位置する。いくつかの実施形態では、１個以上の非アデニンヌクレオチドは、少なくとも８〜５０個の連続するアデニンヌクレオチドの後に位置する。いくつかの実施形態では、１個以上の非アデニンヌクレオチドは、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０個の連続するアデニンヌクレオチドの後に位置する。
【００４５】
いくつかの実施形態では、前の段落で説明したように、中断配列は、トリヌクレオチド、ジヌクレオチドまたはモノヌクレオチドの中断配列である。いくつかのこのような実施形態では、ポリＡテールは、８〜５０個の連続するアデニンヌクレオチドごとに、１個の非アデニンヌクレオチド、または１個の連続する一続きの２〜１０個の非アデニンヌクレオチドを含むかまたは含有する。いくつかの実施形態では、ポリＡテールは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０個の連続するアデニンヌクレオチドごとに、１個の非アデニンヌクレオチド、または１個の連続する一続きの２〜１０個の非アデニンヌクレオチドを含むかまたは含有する。いくつかの実施形態では、ポリＡテールは、８〜５０個の連続するアデニンヌクレオチドごとに、１、２、３、４、または５個の連続する非アデニンヌクレオチドを含むかまたは含有する。いくつかの実施形態では、ポリＡテールは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０個の連続するアデニンヌクレオチドごとに、１、２、３、４、または５個の連続する非アデニンヌクレオチドを含むかまたは含有する。いくつかの実施形態では、ポリＡテールは、２個以上の非アデニンヌクレオチドまたは２個以上の連続する一続きの２〜１０個の非アデニンヌクレオチドを含むかまたは含有する。いくつかの実施形態では、２個以上の非アデニンヌクレオチドまたは２個以上の連続する一続きの２〜１０個の非アデニンヌクレオチドは、ポリＡテール内で不規則的に離間している。いくつかの実施形態では、ポリＡテールは、１２個の連続するアデニンヌクレオチドごとに、１個の非アデニンヌクレオチド、または２、３、４、もしくは５個の連続する非アデニンヌクレオチドを含むかまたは含有する。いくつかの実施形態では、ポリＡテールは、１６個の連続するアデニンヌクレオチドごとに、１個の非アデニンヌクレオチド、または２、３、４、もしくは５個の連続する非アデニンヌクレオチドを含むかまたは含有する。いくつかの実施形態では、ポリＡテールは、２５個の連続するアデニンヌクレオチドごとに、１個の非アデニンヌクレオチドまたは２、３、４、もしくは５個の連続する非アデニンヌクレオチドを含むかまたは含有する。いくつかの実施形態では、ポリＡテールは、３０個の連続するアデニンヌクレオチドごとに、１個の非アデニンヌクレオチドまたは２、３、４、もしくは５個の連続する非アデニンヌクレオチドを含むかまたは含有する。いくつかの実施形態において、ポリＡテールは、３９個の連続するアデニンヌクレオチドごとに、１個の非アデニンヌクレオチドまたは２、３、４、もしくは５個の連続する非アデニンヌクレオチドを含むかまたは含有する。いくつかの実施形態では、非アデニンヌクレオチドは、グアニン、シトシン、またはチミンである。いくつかの実施形態では、非アデニンヌクレオチドは、グアニンヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、非アデニンヌクレオチドは、シトシンヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、非アデニンヌクレオチドは、チミンヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡは、（ａ）グアニンおよびチミンヌクレオチド、（ｂ）グアニンおよびシトシンヌクレオチド、（ｃ）チミンおよびシトシンヌクレオチド、または（ｄ）グアニン、チミン、およびシトシンヌクレオチド、から選択される２個以上の非アデニンヌクレオチドを含む。上記のいくつかの実施形態では、非アデニンヌクレオチドは、グアニン、シトシン、およびチミンから選択される１個の非アデニンヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態では、非アデニンヌクレオチドは、グアニン、シトシン、およびチミンのうちの１個以上から選択される２個の非アデニンヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、非アデニンヌクレオチドは、グアニン、シトシン、およびチミンのうちの１個以上から選択される３個の非アデニンヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、アデニンヌクレオチドはアデノシン一リン酸である。いくつかの実施形態では、タンパク質は治療用タンパク質である。いくつかの実施形態では、タンパク質はサイトカインまたはケモカインである。いくつかの実施形態では、タンパク質は増殖因子である。いくつかの実施形態では、タンパク質はＣａｓ９または修飾Ｃａｓ９である。
【００４６】
本開示はまた、前の段落に記載されているＤＮＡによりコードされるｍＲＮＡも包含する。
【００４７】
いくつかの実施形態では、前述の段落に記載されたＤＮＡは、ベクター内に含まれてもよい。いくつかの実施形態では、ベクターは宿主細胞内に含まれる。ＤＮＡがベクター内にある場合、いくつかの実施形態では、１個以上の非アデニンヌクレオチドは、アデニンヌクレオチドのみを含有する類似または同じ長さのポリＡテールをコードするヌクレオチド含むＤＮＡにおいて起こる損失と比較して、宿主細胞の増殖中のベクター内のポリＡテールをコードするヌクレオチドの損失を防止する。
【００４８】
本開示は、本明細書に記載のＤＮＡベクターからｍＲＮＡを産生する方法であって、（ａ）ポリＡテールの下流のベクターを直線化することと、（ｂ）直線化されたベクターを変性させることと、（ｃ）グアニン、シトシン、ウラシル、およびアデニンヌクレオチドの存在下で、変性ＤＮＡをＲＮＡポリメラーゼと接触させることと、を含む、方法も包含する。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】は、増殖のラウンドにわたり長さが減少するアデノシンのみを含有するポリＡテールをエンコードする配列を示す。各クローンは、クローンをコードするプラスミドを発現する宿主細胞の増殖／精製の連続するラウンドによって生成されたＤＮＡを指す。
【図２】２個の増殖継代にわたって非アデニンヌクレオチドを含むポリＡテールのサイズの保持を示す。
【図３】アデノシンのみを含有するポリＡテールを有するＣａｓ９  ｍＲＮＡまたは非アデニンヌクレオチドを含むポリＡテールを有するＣａｓ９  ｍＲＮＡ、およびＳＥＡＰを標的とするシングルガイドＲＮＡ（配列番号８）を使用するＣａｓ９  ｍＲＮＡアッセイで測定された分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レベルを示す。
【図４】アデノシンのみを含有するポリＡテールを有するＣａｓ９  ｍＲＮＡまたは非アデニンヌクレオチドを含むポリＡテールを有するＣａｓ９  ｍＲＮＡ、およびＳＥＡＰを標的とするシングルガイドＲＮＡ（配列番号８）を使用し、２４時間のインキュベーションして、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡアッセイで測定したＳＥＡＰ阻害率を示す。
【図５】アデノシンのみを含有するポリＡテールを有するＣａｓ９  ｍＲＮＡまたは非アデニンヌクレオチドを含むポリＡテールを有するＣａｓ９  ｍＲＮＡ、およびＳＥＡＰを標的とするシングルガイドＲＮＡ（配列番号８）を使用し、４８時間インキュベーションして、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡアッセイで測定したＳＥＡＰ阻害率を示す。
【図６】対照の形質転換および保存溶液（ＴＳＳ）緩衝液の投与、または配列番号９のシングルガイドＲＮＡ（マウスＴＴＲ遺伝子を標的とする）と、配列番号６（ＨｉＣａｓ９  ｍＲＮＡ）もしくは配列番号７（中断されたポリＡ  ｍＲＮＡ）によりコードされるｍＲＮＡのいずれかと、を配合した液体ナノ粒子（ＬＮＰ）の投与の７日後のマウスの血清トランスサイレチン（ＴＴＲ）レベルを示す。
【図７】アデノシンのみを含有するポリＡテールを有するＣａｓ９  ｍＲＮＡ、または非アデニンヌクレオチドを含むポリＡテールを有するＣａｓ９  ｍＲＮＡ、およびＳＥＡＰを標的とするシングルガイドＲＮＡ（配列番号８）を使用し、４８時間インキュベーションして、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡアッセイで測定されたＳＥＡＰ阻害率を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
本明細書に開示されるのは、目的のタンパク質をコードするヌクレオチドに対して３’に位置するポリアデニル化テールをコードするＤＮＡであり、ポリＡテールは１個以上の非アデニンヌクレオチドを含む。ＤＮＡ複製中、１個以上の非アデニンヌクレオチドを含むポリＡテールをコードするＤＮＡは、アデニンヌクレオチドのみから構成されるポリＡテールと比較して、ポリＡテール内のアデニンヌクレオチドの漸進的損失が少ないことを示し得る。したがって、１個以上の非アデニンヌクレオチドを含むポリＡテールをコードするＤＮＡを含むプラスミドが提供される。そのようなＤＮＡによってコードされるｍＲＮＡも含まれる。ＤＮＡとＲＮＡの両方は、非中断のポリＡテールを含む同様の分子よりも、アデニンヌクレオチドの進行性の損失に対してより大きな安定性を示し得る。
【００５１】
目的のタンパク質は、任意の天然または非天然タンパク質であり得る。本明細書で使用する「タンパク質」とは、連続するアミノ酸の任意の配列を指す。そのようなものとして、タンパク質は、天然に存在するタンパク質の完全なアミノ酸配列を含むタンパク質を指し得る。さらに、タンパク質は、全長タンパク質の断片を含むアミノ酸配列を指し得る。タンパク質は、天然に存在する配列、１つ以上の修飾を伴う天然に存在する配列、または自然界には存在しない人工的な配列であってよい。
【００５２】
目的のタンパク質は、対象において治療に使用してもよく、またはこのタンパク質は生化学反応で使用してもよい。治療用タンパク質には、例えば、とりわけ増殖因子、ワクチンまたは免疫腫瘍学の抗原、および酵素が含まれる。治療用タンパク質は、天然に存在するものまたは修飾されるものであってよい。特定の状況では、修飾タンパク質は融合タンパク質であってよい。
【００５３】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡによるタンパク質の発現は、疾患の治療として使用するためのものである。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡによるタンパク質の発現は、癌免疫療法、感染症に対するワクチン接種、Ｉ型アレルギーに対する寛容性を誘導するため、代替療法として、または再生医療として使用するためのものである（Ｓｅｒｇｅｅｖａ  ＯＶ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｍｏｓｃｏｗ）８１（７）：７０９−７２２（２０１６）参照）。
【００５４】
いくつかの実施形態では、自己樹状細胞は、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）をコードするｍＲＮＡにより、エクスビボでトランスフェクトされて転移性前立腺癌を有する対象のＴ細胞免疫応答を調節する。
【００５５】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは予防ワクチンである。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは１個以上の抗原タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、抗原タンパク質（複数可）はウイルスタンパク質である。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは体の細胞に抗原タンパク質を産生および発現させる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、危険または疾患なしに、または個体間で広がることなく、抗原タンパク質の発現を引き起こす。いくつかの実施形態では、抗原タンパク質の発現は、対象の免疫系に抗体を産生させる。いくつかの実施形態では、これらの抗体は、ウイルスを中和し、ウイルスへの曝露後の将来の感染を防ぐことができる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは感染症の予防ワクチンである。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、インフルエンザ、チクングニア熱、ジカ、サイトメガロウイルス、ヒトメタニューモウイルス（ＨＭＰＶ）、またはパラインフルエンザウイルス３型（ＰＩＶ３）に対する予防ワクチンである。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡはインフルエンザＨ１０またはＨ７サブタイプに対する予防ワクチンである。
【００５６】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは個別化癌ワクチンである。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、癌を有する対象の免疫系を刺激して、癌細胞を認識し、応答を開始する。いくつかの実施形態では、この応答は個々の患者の癌または腫瘍に合わせて調整される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、患者の特定の新抗原（患者の癌または腫瘍に存在する突然変異を有する独特のタンパク質）をコード化する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは患者の特定の新抗原の発現を引き起こす。いくつかの実施形態では、新抗原の発現は、患者において特定の免疫応答を誘発して、癌細胞を認識し破壊する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは個別化癌ワクチンとして有用である。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、抗ＰＤ−１療法などの１個以上のチェックポイント阻害剤抗体とともに個別化癌ワクチンとして有用である。
【００５７】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは腫瘍内免疫腫瘍学に有用である。いくつかの実施形態では、腫瘍へのｍＲＮＡの注入は、オフターゲット効果を低減し、かつ／または全身投与と比較してより強力であり得る。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、ＣＤ１３４のリガンドであるＯＸ４０Ｌ（ＣＤ２５２）の発現を引き起こす。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）などのサイトカインの発現を引き起こす。
【００５８】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、局所療法のためにタンパク質の発現を引き起こす。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、より多くの血管の作成および局所組織における血液供給の改善を引き起こす。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）の発現を引き起こす。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ−Ａの発現は局所的かつ一過性である。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ−Ａの局所および一過性発現は、心不全または心臓発作後、糖尿病性創傷治癒、または他の虚血性血管疾患の治療に有用である。
【００５９】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは補充療法のためのタンパク質の発現を引き起こす。いくつかの実施形態では、タンパク質は肺サーファクタントタンパク質Ｂである。
【００６０】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、クラス２  ＣＲＩＳＰＲ関連Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９／Ｃｓｎ１（Ｃａｓ９）などのＲＮＡガイド型ヌクレアーゼの発現を引き起こす。例示的なＣａｓ９配列はＵｎｉＰｒｏｔ  Ｑ９９ＺＷ２である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、修飾されたＣａｓ９または別の機能性タンパク質またはペプチドに融合したＣａｓ９タンパク質である。不活性な１個の触媒ドメインであるＲｕｖＣまたはＨＮＨのいずれかを有するＣａｓ９の修飾バージョンは、「ニッカーゼ」と呼ばれる。いくつかの実施形態では、組成物および方法はニッカーゼを含む。いくつかの実施形態では、組成物および方法は、標的ＤＮＡの二本鎖切断ではなくニックを誘導するニッカーゼＣａｓ９を含む。
【００６１】
いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、１個の機能的ヌクレアーゼドメインのみを含有するように修飾されてもよい。例えば、Ｃａｓタンパク質は、核酸切断活性を低下させるために、ヌクレアーゼドメインの１つが変異または完全または部分的に欠失するように修飾されてもよい。いくつかの実施形態では、活性が低下したＲｕｖＣドメインを有するニッカーゼＣａｓが使用される。いくつかの実施形態では、不活性ＲｕｖＣドメインを有するニッカーゼＣａｓが使用される。いくつかの実施形態では、活性が低下したＨＮＨドメインを有するニッカーゼＣａｓが使用される。いくつかの実施形態では、不活性ＨＮＨドメインを有するニッカーゼＣａｓが使用される。
【００６２】
いくつかの実施形態では、キメラＣａｓタンパク質はＤＮＡによってコードされ、タンパク質の１個のドメインまたは領域は異なるタンパク質の一部で置き換えられる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼドメインは、Ｆｏｋ１などの異なるヌクレアーゼ由来のドメインで置き換えられてもよい。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は修飾されたヌクレアーゼであってもよい。
【００６３】
Ｉ．非アデニンヌクレオチドを含むポリＡテールをコードするＤＮＡ
本明細書で使用する場合、「ポリＡテール」とは、ｍＲＮＡの３’末端にアデノシンまたは他のアデニンヌクレオチドを含む配列を指す。天然のポリＡテールはアデニンヌクレオチドのみで構成される場合があるが、本発明の「ポリＡテール」は１個以上の非アデニンヌクレオチド「アンカー」により安定化される。いくつかの実施形態では、ポリＡテールは、少なくとも８個の連続するアデニンヌクレオチドと、非アデニンヌクレオチドを含む１個以上の中断配列とを含む。言い換えれば、本発明のポリＡテールは、少なくとも８個の連続するアデニンを含むが、中断またはアンカー配列内に１個以上の非アデニンヌクレオチドも含む。本明細書に開示される中断配列は、規則的または不規則に間隔を空けてポリＡテールを中断し、ポリＡテールをコードするＤＮＡならびにＤＮＡから生成されるｍＲＮＡを安定化する。例示的な中断配列を表４に提供する。
【００６４】
本明細書で使用される「非アデニンヌクレオチド」は、アデニンを含まない任意の天然または非天然ヌクレオチドを指す。グアニン、チミン、およびシトシンヌクレオチドは、非アデニンヌクレオチドの例である。
【００６５】
天然のポリＡテールは、ＤＮＡからｍＲＮＡへの転写後に開始されるポリアデニル化プロセスで追加される。しかし、分子生物学の手法では、ポリＡテールは、目的のタンパク質をコードするプラスミド内のＤＮＡの部分によってコードされることがよくある。この場合、ポリＡテールのサイズ（すなわち、ポリＡテールに含まれるアデニンヌクレオチドの数）は、これらの連続するアデニンヌクレオチドをコードするプラスミド内のＤＮＡヌクレオチドの数に直接依存している。
【００６６】
ポリＡテールをコードするＤＮＡヌクレオチドの数は、例えば宿主細胞でのプラスミドの増殖中のＤＮＡ複製中に徐々に減少する場合がある。プラスミド内の連続するアデニンをコードするヌクレオチドの数が減少すると、完全長のポリＡテールをコードするプラスミドの収量が低下し、結果としてポリＡテールが短いｍＲＮＡの安定性が低下し、かつ／または分解が増加する場合がある。例えば、４０個の連続するアデニンヌクレオチドのポリＡテールを有するｍＲＮＡは、９０個以上のヌクレオチドのポリＡテールを有するｍＲＮＡよりも安定性が低いと予想されるかもしれない。安定性が低いとは、ｍＲＮＡがより迅速に分解される場合があることを意味し、その結果、標的タンパク質の発現は、ポリＡテールが短いｍＲＮＡから減少する。そのため、宿主細胞内でのＤＮＡ複製の複数のラウンドにわたってＤＮＡプラスミド内のポリＡテールの長さを維持することは有益である。さらに、ポリＡテールは翻訳に重要である場合があり、より長いポリＡテールを維持すると、ｍＲＮＡからのタンパク質発現が結果として改善される場合がある。
【００６７】
目的のタンパク質をコードするヌクレオチドに対して３’に位置するポリＡテールに１個以上の非アデニンヌクレオチドを含めると、アデニンヌクレオチドのみを含有する類似または同じ長さの３’ポリＡテールを含むＤＮＡにおいて起こる損失と比較して、ＤＮＡ複製中の１個以上のアデニンヌクレオチドの損失を防止し得る。より長いポリＡテールの存在はまた、ｍＲＮＡからのタンパク質翻訳の効率を改善する場合がある。
【００６８】
Ａ．アデニンヌクレオチド
本発明のポリＡテール中の連続するアデニンヌクレオチドの数は、ポリＡ結合タンパク質が連続するアデノシンに結合できるように設計されている。本明細書で使用する「ポリ−Ａ結合タンパク質」、「ポリＡ結合タンパク質」、または「ポリアデニレート結合タンパク質」とは、ｍＲＮＡのポリＡテールに結合するタンパク質を指す。ポリＡ結合タンパク質は、翻訳開始を調節するように機能する場合がある。ポリＡテールに結合することにより、ポリＡ結合タンパク質はＺＣＣＨＣ６／ＺＣＣＨＣ１１によるウリジル化からそれらを保護し、ｍＲＮＡの安定性に寄与する。ポリＡ結合タンパク質は、細胞質と核の間を往復する非翻訳ｍＲＮＡを含有する細胞質メッセンジャーリボ核タンパク質（ｍＲＮＰ）顆粒に局在している可能性がある。例示的なポリＡ結合タンパク質はＰＡＢＰＣ１である（Ｕｎｉｐｒｏｔ参照番号：Ｐ１１９４０）。本発明のＤＮＡは、ｍＲＮＡに転写されると、１個以上のポリＡ結合タンパク質がポリＡテールを結合する能力を保持するように、十分な連続するアデニンヌクレオチドをコードし得る。この機能的な数の連続するアデニンヌクレオチドの後に、中断非アデニンヌクレオチドアンカーが配置される。
【００６９】
いくつかの実施形態では、１個以上の非アデニンヌクレオチドは、ポリＡ結合タンパク質が連続する一続きのアデニンヌクレオチドに結合できるように、連続するアデニンヌクレオチド（すなわち、アデニンヌクレオチドホモポリマーまたは「ホモポリマーＡ」）を中断するように配置される。いくつかの実施形態では、ポリＡテールは、少なくとも８個の連続するアデニンヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも８個の連続するアデニンヌクレオチドは、８、９、１０、１１、および／または１２個の連続するヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ポリＡテールは、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、および／または４０個の連続するアデニンヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ポリＡテールは、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、および／または９０個の連続するアデニンヌクレオチドを含む。例えば、ポリＡ  ＲＮＡ配列のホモポリマーは、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、または４０個の連続するアデノシンヌクレオチドを含んでもよい。例えば、ポリＡテールをコードするプラスミド配列のホモポリマーは、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、または４０個の連続するチミジンヌクレオチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ポリＡテールは、異なる長さの２個以上のホモポリマーＡ配列を含み、例えば、ポリＡテールの中断配列は不規則的に離間されている。いくつかの実施形態では、ポリＡテールは、規則的に離間された中断配列と、同じ長さの２個以上のホモポリマーとを含む。
【００７０】
いくつかの実施形態では、ポリＡテールは、少なくとも８個の連続するアデニンヌクレオチドの第１ホモポリマー配列、少なくとも５個の連続するアデニンヌクレオチドの第２ホモポリマー配列、および１個以上の非アデニンヌクレオチドを含むアンカーを含む。
【００７１】
いくつかの実施形態では、ポリＡテールは、１個以上のセットの８〜５０個の連続するアデニンヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリＡテールは、１個以上のセットの８〜１００個の連続するアデニンヌクレオチドを含む。複数のセットの連続するアデニンヌクレオチド、すなわち複数のホモポリマー配列を有するポリＡテールの場合、各セットのアデニンヌクレオチドは同じ長さである必要はない。
【００７２】
連続するアデニンヌクレオチドの数に加えて、ポリＡテールは総アデニンヌクレオチドの数によっても特徴付けられ得る。総アデニンヌクレオチドの数は、単にポリＡテールのすべてのアデニンヌクレオチドの合計である。したがって、アデニンヌクレオチドの連続または非連続グループの異なるグループのすべてのアデニンヌクレオチドは、ポリＡテールの総アデニンヌクレオチドの数に含まれることになる。
【００７３】
いくつかの実施形態では、ポリＡテールは、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００、１００〜１１０、１１０〜１２０、１２０〜１３０、１３０〜１４０、１４０〜１５０、１５０〜１６０、１６０〜１７０、１７０〜１８０、１８０〜１９０、１９０〜２００、２００〜２１０、２１０〜２２０、２２０〜２３０、２３０〜２４０、２４０〜２５０、２５０〜２６０、２６０〜２７０、２７０〜２８０、２８０〜２９０、２９０〜３００、３００〜３１０、３１０〜３２０、３２０〜３３０、３３０〜３４０、３４０〜３５０、３５０〜３６０、３６０〜３７０、３７０〜３８０、３８０〜３９０、３９０〜４００、４００〜４１０、４１０〜４２０、４２０〜４３０、４３０〜４４０、４４０〜４５０、４５０〜４６０、４６０〜４７０、４７０〜４８０、４８０〜４９０、４９０〜５００、５００〜５１０、５１０〜５２０、５２０〜５３０、５３０〜５４０、５４０〜５５０、５５０〜５６０、５６０〜５７０、５７０〜５８０、５８０〜５９０、または５９０〜６００個の総アデニンヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリＡテールは、少なくとも８、９、１０、１２、２５、３０、５０ヌクレオチド長の１個以上のホモポリマーＡ配列を含む。
【００７４】
いくつかの実施形態では、ポリＡテールは、４０〜１０００、４０〜９００、４０〜８００、４０〜７００、４０〜６００、４０〜５００、４０〜４００、４０〜３００、４０〜２００、または４０〜１００個の総アデニンヌクレオチドを含む。
【００７５】
いくつかの実施形態では、ポリＡテールは、少なくとも４０個の総アデニンヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリＡテールは、少なくとも５０個の総アデニンヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリＡテールは、少なくとも４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、または３００個のアデニンヌクレオチドを含む。
【００７６】
いくつかの実施形態では、ポリＡテールは、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、または９７個の総アデニンヌクレオチドを含むかまたは含有する。いくつかの実施形態では、ポリＡテールは、９６または９７個の総アデニンヌクレオチドを含むかまたは含有する。
【００７７】
いくつかの実施形態では、アデニンヌクレオチドはアデノシン一リン酸である。ヌクレオチドは修飾されていてもよい。
【００７８】
Ｂ．非アデニンヌクレオチドを含む中断配列
本発明の非アデニンヌクレオチドは、グアニン、シトシン、またはチミンなどの天然または非天然ヌクレオチドを含むかまたはそれからなってもよい。ヌクレオチドは修飾されていてもよい。
【００７９】
いくつかの実施形態では、ポリＡテールは、そうでなければアデニンヌクレオチドのみから構成されるポリＡテールに１個の非アデニンヌクレオチドを含む。１個の非アデニンヌクレオチドは、アデニンヌクレオチドの配列を中断し得る。１個の非アデニンヌクレオチドは、グアニン、シトシン、およびチミンから選択されてもよい。いくつかの実施形態では、１個の非アデニンヌクレオチドはグアニンヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、１個の非アデニンヌクレオチドはシトシンヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、１個の非アデニンヌクレオチドはチミンヌクレオチドである。中断配列は、モノヌクレオチド、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド配列であり得る。中断配列は、１、２、３、４、５個、またはそれ以上の非アデニンヌクレオチドを含んでもよく、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれ以上の長さのヌクレオチドであってもよい。
【００８０】
いくつかの実施形態において、単一の非アデニンヌクレオチドは、連続するアデニンヌクレオチドのセットまたはグループを中断し得る。１個の非アデニンヌクレオチドは、ポリＡ結合タンパク質が連続する一続きのアデニンヌクレオチドに結合できるような方法で、連続するアデニンヌクレオチドを中断するように配置されてもよい。
【００８１】
いくつかの実施形態では、ポリＡテールに２個以上の非アデニンヌクレオチドが存在する。２個以上の非アデニンヌクレオチドは、ポリＡ結合タンパク質が連続する一続きのアデニンヌクレオチドに結合できるような方法で、連続するアデニンヌクレオチドを中断するように配置され得る。いくつかの実施形態では、非アデニンヌクレオチドは、ポリＡ結合タンパク質の結合を可能にするのに十分である、各一連の連続するアデニンヌクレオチドにおけるアデニンヌクレオチドの数で、連続するアデニンヌクレオチドの２個以上のセットの間に散在している。
【００８２】
非アデニンヌクレオチドは、２個以上の非アデニンヌクレオチドの一続き内にあってもよい。非アデニンヌクレオチドは、１個以上の非アデニンヌクレオチドを含む２〜１０個の連続するヌクレオチドの一続き内にあってもよい。非アデニンヌクレオチドは、連続するアデニンヌクレオチド、例えば２個以上のホモポリマーＡ配列の２個以上のセットの間に散在する中断配列にあってもよい。いくつかの実施形態では、連続する非アデニンヌクレオチドの数は、１、２、３、４、または５個であり得る。いくつかの実施形態では、連続する一続きの２〜１０個の非アデニンヌクレオチドが存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも２個の非アデニンヌクレオチドを含む連続する一続きの２〜１０個のヌクレオチドが存在する。
【００８３】
連続する非アデニンヌクレオチドは、同じヌクレオチドの２個以上であってもよく、または連続する非アデニンヌクレオチドは互いに異なっていてもよい。例えば、非アデニンヌクレオチドは、２個以上のグアニン、シトシン、またはチミンヌクレオチドであり得る。非アデニンヌクレオチドは、グアニンおよびチミンヌクレオチド、グアニンおよびシトシンヌクレオチド、チミンおよびシトシンヌクレオチド、またはグアニン、チミンおよびシトシンヌクレオチドでもあり得る。非アデニンヌクレオチドは、グアニン、シトシン、およびチミンの１個以上から選択される２個の非アデニンヌクレオチドを含んでもよい。非アデニンヌクレオチドは、グアニン、シトシン、およびチミンの１個以上から選択される３個の非アデニンヌクレオチドを含んでもよい。非アデニンヌクレオチドは、グアニン、シトシン、およびチミンの１個以上から選択される４個以上の非アデニンヌクレオチドを含んでもよい。ポリＡテールは、規則的または不規則な間隔で非アデニンヌクレオチド間にアデニンヌクレオチドを含んでもよい。例えば、ポリＡテールにはパターンを有すると見ることができ、パターンは規則的または不規則的である。パターンの鍵となるのは、長さに沿ってどこかに少なくとも８個の連続するアデニンが存在する限り、ポリＡテールのどこかに１個以上の非アデニンヌクレオチドが存在することである。いくつかの実施形態では、アデニンヌクレオチドが、８個以上のアデニンの後のどこかで１個以上の非アデニンヌクレオチドにより「中断」されるところで、ポリＡは、長さに沿ったどこかに少なくとも８個の連続するアデニンヌクレオチドの一続きを含み得る。中断配列は、１個の非アデニンヌクレオチド、または任意選択的に少なくとも２個の非アデニンヌクレオチドを含む、２〜１０個の連続するヌクレオチドであり得る。少なくとも２個の非アデニンヌクレオチドを含むヌクレオチドの各１つまたは連続する一続きの後に、１個以上のアデニンが続き、任意選択的に１個以上の非アデニンヌクレオチドが続き、任意選択的に１個以上のアデニンヌクレオチドが続き、同様にしてポリＡテールの終わりまで続く。アデニンヌクレオチド／非アデニンヌクレオチドのこのパターンは、規則的または不規則な間隔で繰り返され得る。あるいは、ポリＡの全長に沿って少なくとも２個の非アデニンヌクレオチドを任意選択で含む、１個のみのまたは１個の連続する一続きの２〜１０個のヌクレオチドが存在する場合など、パターンがない場合がある。
【００８４】
ＩＩ．ポリＡテールのアデニンおよび非アデニンヌクレオチドの例示的なパターン
本発明のポリＡテールは、連続するアデニンヌクレオチドおよび１個以上の非アデニンヌクレオチドなどの多数の異なるパターンの中断配列を含むかまたはそれからなってもよい。
【００８５】
ポリＡテールは、１個または一連の連続するアデニンヌクレオチドで始まり、その後に非アデニンヌクレオチドが続いていてもよい。一連のアデニンヌクレオチドで始まるポリＡテールとは、ポリＡテールの５’末端が、１個または一連の連続するアデニンヌクレオチドと連続するアデニンヌクレオチドの後にくる１個以上の非アデニンヌクレオチドとで構成されることを意味する。「後」とは、非アデニンヌクレオチドが一連の連続するアデニンヌクレオチドに対して３’であることを意味する。
【００８６】
いくつかの実施形態では、ポリＡテールの５’末端は、一連の連続するアデニンヌクレオチドと、それに続く１個以上の非アデニンヌクレオチド（複数可）から構成されてもよい。いくつかの実施形態では、１個以上の非アデニンヌクレオチド（複数可）は、少なくとも８、９、１０、１１、または１２個の連続するアデニンヌクレオチドの後に位置する。いくつかの実施形態では、１個以上の非アデニンヌクレオチドは、少なくとも８〜５０個の連続するアデニンヌクレオチドの後に位置する。いくつかの実施形態では、１個以上の非アデニンヌクレオチドは、少なくとも８〜１００個の連続するアデニンヌクレオチドの後に位置する。いくつかの実施形態では、非アデニンヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、または７個のアデニンヌクレオチドの後にあり、その後に少なくとも８個の連続するアデニンヌクレオチドが続く。
【００８７】
いくつかの実施形態では、ポリＡテールの５’末端は、１〜８個のアデニンヌクレオチドと、それに続く１個以上の非アデニンヌクレオチド（複数可）から構成される。そのような実施形態では、非アデニンヌクレオチド（複数可）の後にさらにアデニンヌクレオチドが続く。１個以上の非アデニンヌクレオチドに続くアデニンヌクレオチドは、別の非アデニンヌクレオチドの前に少なくとも８個のアデニンヌクレオチドを含む。
【００８８】
ポリＡテールを開始する連続するアデニンヌクレオチドのグループのサイズの範囲はさまざまであり得る。いくつかの実施形態では、ポリＡテールの５’末端は、１、２、３  ４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００個の連続するアデニンヌクレオチドから構成される。第１の非アデニンヌクレオチドが１〜７個のアデニンヌクレオチドの後に入る場合、ポリＡテールはさらに、非アデニンヌクレオチドの後に一続きの少なくとも８個のアデニンヌクレオチドを含む。
【００８９】
いくつかの実施形態では、１個以上の非アデニンヌクレオチドは、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０個の連続するアデニンヌクレオチドの後に位置する。
【００９０】
ポリＡテールは、３’末端で一続きの非アデニンヌクレオチドで終わってもよい。ポリＡテールの３’末端の非アデニンヌクレオチドの数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の非アデニンヌクレオチドであってよい。あるいは、ポリＡテールの３’末端は、１個以上のアデニンヌクレオチドで構成されていてもよい。
【００９１】
本発明のポリＡテールは、連続するアデニンヌクレオチドの１個の配列と、それに続く１個以上の非アデニンヌクレオチドと、任意選択的に、それに続く追加のアデニンヌクレオチドとを含むことができる。本発明のポリＡテールはまた、１個以上の非アデニンヌクレオチドにより中断された連続するアデニンヌクレオチドの２個以上の配列も含み得る。連続するアデニンヌクレオチドの配列は、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０個の連続するアデニンヌクレオチドであってよい。中断配列中の非アデニンヌクレオチドの数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の非アデニンヌクレオチドであってよい。
【００９２】
本発明のポリＡテールはまた、非アデニンヌクレオチドが中断または散在している２個以上の一連の連続するアデニンヌクレオチドを含んでもよい。中断配列の長さは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のヌクレオチドであってよい。中断配列の長さは、１〜３、１〜５、１〜１０、２〜１０、２〜８、２〜６、または２〜５個のヌクレオチドであってよい。本発明のポリＡテールは、連続するアデニンヌクレオチドの２個以上のセットと、連続するアデニンヌクレオチドの各セットの間に、１個の非アデニンヌクレオチド、または２個以上の連続する一続きの２〜１０個の非アデニンヌクレオチドを含む中断配列と、を含み得る。本発明のポリ−Ａテールは、連続するアデニンヌクレオチドの２個以上のセットと、連続するアデニンヌクレオチドの各セット間に、１個の非アデニンヌクレオチド、または少なくとも２個の非アデニンヌクレオチドを含む２個以上の連続する一続きの２〜１０個のヌクレオチドと、を含み得る。本発明のポリＡテールは、それぞれが１個以上の非アデニンヌクレオチドを含む、連続するアデニンヌクレオチドの２個以上のセットと１個以上の中断配列とを含み得る。セットはそれぞれ、同じ数または異なる数のアデニンヌクレオチドを含んでもよい。連続するアデニンヌクレオチドの複数のセットを伴う実施形態では、連続するアデニンヌクレオチドの各セットは、ポリＡ結合タンパク質の結合を可能にするのに十分な長さであり得る。
【００９３】
いくつかの実施形態において、１個以上の非アデニンヌクレオチドは、ポリＡテールと規則的な間隔で位置する中断配列である。規則的な間隔とは、連続するアデニンヌクレオチドのセット数の後に非アデニンヌクレオチドが繰り返しの様式で続くことを意味する。
【００９４】
いくつかの実施形態では、１個以上の非アデニンヌクレオチドは、ポリＡテールと不規則な間隔で位置する。不規則な間隔とは、連続するアデニンヌクレオチドのセット数の後に非アデニンヌクレオチドが続き、その後に最初のセットとは異なる数のアデニンを含む連続するアデニンヌクレオチドの別のセットが続くことを意味する。
【００９５】
いくつかの実施形態では、ポリＡテールは８〜５０個の連続するアデニンヌクレオチドごとに、１個の非アデニンヌクレオチド、または１個の連続する一続きの２〜１０個のヌクレオチド非アデニンヌクレオチドを含むかまたは含有する。いくつかの実施形態では、ポリＡテールは８〜５０個の連続するアデニンヌクレオチドごとに、１個の非アデニンヌクレオチド、または１個の連続する一続きの２〜１０個の非アデニンヌクレオチドを含むかまたは含有する。いくつかの実施形態では、ポリＡテールは８〜１００個の連続するアデニンヌクレオチドごとに、１個の非アデニンヌクレオチド、または１個の連続する一続きの２〜１０個のヌクレオチド非アデニンヌクレオチドを含むかまたは含有する。いくつかの実施形態では、ポリＡテールは８〜１００個の連続するアデニンヌクレオチドごとに、１個の非アデニンヌクレオチド、または１個の連続する一続きの２〜１０個の非アデニンヌクレオチドを含むかまたは含有する。
【００９６】
いくつかの実施形態では、ポリＡテールは８〜５０個の連続するアデニンヌクレオチドごとに、１個の非アデニンヌクレオチド、または少なくとも２個の非アデニンヌクレオチドを含む１個の連続する一続きの２〜１０個のヌクレオチドを含むかまたは含有する。いくつかの実施形態では、ポリＡテールは８〜５０個の連続するアデニンヌクレオチドごとに、１個の非アデニンヌクレオチド、または少なくとも２個の非アデニンヌクレオチドを含む１個の連続する一続きの２〜１０個のヌクレオチドを含むかまたは含有する。いくつかの実施形態では、ポリＡテールは８〜１００個の連続するアデニンヌクレオチドごとに、１個の非アデニンヌクレオチド、または少なくとも２個の非アデニンヌクレオチドを含む１個の連続する一続きの２〜１０個のヌクレオチドを含むかまたは含有する。いくつかの実施形態では、ポリＡテールは８〜１００個の連続するアデニンヌクレオチドごとに、１個の非アデニンヌクレオチド、または少なくとも２個の非アデニンヌクレオチドを含む１個の連続する一続きの２〜１０個のヌクレオチドを含むかまたは含有する。
【００９７】
いくつかの実施形態では、ポリＡテールは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０個の連続するアデニンヌクレオチドごとに、１個の非アデニンヌクレオチド、または非アデニンヌクレオチドを含む１個の連続する一続きの２〜１０個のヌクレオチドを含むかまたは含有する。
【００９８】
いくつかの実施形態では、ポリＡテールは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０個の連続するアデニンヌクレオチドごとに、１個の非アデニンヌクレオチド、または少なくとも２個の非アデニンヌクレオチドを含む１個の連続する一続きの２〜１０ヌクレオチドを含むかまたは含有する。
【００９９】
いくつかの実施形態では、非アデニンヌクレオチドの数は、１、２、３、４、または５個の連続する非アデニンヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態では、連続するアデニンヌクレオチドの数は、８〜５０個のアデニンヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態では、ポリＡテールは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０個の連続するアデニンヌクレオチドごとに１、２、３、４、または５個の連続する非アデニンヌクレオチドを含むかまたは含有する。
【０１００】
ポリＡテールの連続するアデニンヌクレオチドの数は、１２、１６、２５、３０、または３９個である。連続するアデニンヌクレオチドの数はまた３９個を超えてもよい。いくつかの実施形態では、ポリＡテールは、１２個の連続するアデニンヌクレオチドごとに、１、２、３、４、または５個の連続する非アデニンヌクレオチドを含むかまたは含有する。いくつかの実施形態では、ポリＡテールは、１６個の連続するアデニンヌクレオチドごとに１、２、３、４、または５個の連続する非アデニンヌクレオチドを含むかまたは含有する。いくつかの実施形態では、ポリＡテールは、２５個の連続するアデニンヌクレオチドごとに、１、２、３、４、または５個の連続する非アデニンヌクレオチドを含むかまたは含有する。いくつかの実施形態では、ポリＡテールは、３０個の連続するアデニンヌクレオチドごとに、１、２、３、４、または５個の連続する非アデニンヌクレオチドを含むかまたは含有する。いくつかの実施形態では、ポリＡテールは、３９個の連続するアデニンヌクレオチドごとに、１、２、３、４、または５個の連続する非アデニンヌクレオチドを含むかまたは含有する。連続する非アデニンヌクレオチドの数はまた５個より大きくてもよい。
【０１０１】
例示的なトリヌクレオチド中断配列には、ＧＣＧ、ＣＣＧ、ＧＴＧ、ＴＧＧ、ＣＧＧ、ＧＧＴ、ＴＡＴ、ＣＡＴ、ＣＧＴ、ＣＴＣ、ＧＡＴ、ＣＣＴ、ＴＧＴ、ＣＧＣ、ＣＡＣ、ＴＧＣ、ＴＣＧ、ＴＣＴ、ＣＣＣ、ＧＡＣ、ＴＡＧ、ＧＴＴ、ＣＴＧ、およびＴＴＴが含まれる。６３個の可能なトリヌクレオチド中断配列、および末端Ａを省く３６個のトリヌクレオチド中断配列がある。いくつかの実施形態では、ポリＡテールは、ＴＧＧ、ＣＧＧ、ＧＧＴ、ＴＡＴ、ＣＡＴ、ＣＧＴ、ＣＴＣ、ＧＡＴ、ＣＣＴ、ＴＧＴ、ＣＧＣ、ＣＡＣ、ＴＧＣ、ＴＣＧ、ＴＣＴ、ＣＣＣ、ＧＡＣ、ＴＡＧ、ＧＴＴ、ＣＴＧ、およびＴＴＴから選択される１個以上のトリヌクレオチド中断配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリＡテールは、ポリＡテールをコードする配列内またはポリＡテール内の３個以上のヌクレオチド間のハイブリダイゼーションおよびアニーリングを最小限に抑えるように設計された複数の中断配列を含む。特定の実施形態では、３個以上のヌクレオチド間のアニーリングを最小限に抑える中断配列は、末端Ａを省く３４個のトリヌクレオチド中断配列から選択される。いくつかの実施形態では、３個以上のヌクレオチド間のアニーリングを最小限に抑える中断配列は、ＴＧＧ、ＣＧＧ、ＧＧＴ、ＴＡＴ、ＣＡＴ、ＣＧＴ、ＣＴＣ、ＧＡＴ、ＣＣＴ、ＴＧＴ、ＣＧＣ、ＣＡＣ、ＴＧＣ、ＴＣＧ、ＴＣＴ、ＣＣＣ、ＧＡＣ、ＴＡＧ、ＧＴＴ、ＣＴＧ、およびＴＴＴから選択される。いくつかの実施形態、例えば配列番号１８では、ポリＡテールは、ＴＧＧ、ＣＧＧ、ＧＧＴ、ＴＡＴ、ＣＡＴ、ＣＧＴ、ＣＴＣ、ＧＡＴ、ＣＣＴ、ＴＧＴ、ＣＧＣ、ＣＡＣ、ＴＧＣ、ＴＣＧ、ＴＣＴ、ＣＣＣ、ＧＡＣ、ＴＡＧ、ＧＴＴ、ＣＴＧ、ＴＴＴ、およびＣＧから選択されるジヌクレオチドおよび／またはトリヌクレオチド中断配列を含む。特定の実施形態では、ポリＡテールは、ＧＣＧ、ＣＣＧ、およびＧＴＧから選択されるトリヌクレオチド中断配列を含む。例示的なジヌクレオチド中断配列には、ＣＧ、ＧＣ、ＣＣ、ＧＧ、ＴＴ、ＣＴ、ＴＣ、ＧＴ、およびＴＧが含まれる。１５個の可能なジヌクレオチド中断配列と、末端Ａを含まない９個のジヌクレオチドがある。モノヌクレオチド中断配列はＣ、Ｇ、およびＴとすることができる。上記の任意のヌクレオチド配列に関して、ＲＮＡ配列（ｍＲＮＡなど）に言及する場合、ＤＮＡ配列とは対照的に、ＴはＵに置き換えられることに注意されたい。
【０１０２】
当業者は、連続するアデニンヌクレオチドと１個以上の非アデニンヌクレオチドとを有するポリＡテールをコードするＤＮＡの多くの異なるパターンを設計することができるだろう。少なくとも８個の連続するアデニンヌクレオチドと１個以上のアデニンヌクレオチドとを含むいくつかの例示的なポリＡテールを、例えば、配列番号１〜５、１０、１１、および１８に提示する。
【０１０３】
ＩＩＩ．使用方法
本発明のＤＮＡは、ＤＮＡによりコードされるｍＲＮＡの産生に使用され得る。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは本発明のＤＮＡによってコードされる。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、本発明のＤＮＡはｍＲＮＡの産生のために調製される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡはベクター内にある。いくつかの実施形態では、ベクターは宿主細胞内にある。いくつかの実施形態では、本発明のＤＮＡによりコードされるｍＲＮＡは、ＤＮＡによりコードされる目的のタンパク質を翻訳するために使用される。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、１個以上の非アデニンヌクレオチドは、アデニンヌクレオチドのみを含有する類似または同じ長さの３’テールを含むＤＮＡで起こる損失と比較して、ＤＮＡ複製中の１個以上のアデニンヌクレオチドの損失を防止する。ＤＮＡの複製は、ＤＮＡ精製のためのプラスミドの増殖に必要なステップである。したがって、少なくとも８個の連続するアデニンヌクレオチドと１個以上の非アデニンヌクレオチドとを含むポリＡテールをコードする本発明のＤＮＡを含むプラスミドは、アデニンヌクレオチドのみから構成されるポリＡテールをコードするプラスミドと比較して、プラスミドのもう１回の増殖のラウンドおよび精製にわたって改善された安定性を示し得る。
【０１０６】
少なくとも８個の連続するアデニンヌクレオチドと１個以上の非アデニンヌクレオチドとを含むポリＡテールをコードする配列を含む本発明のＤＮＡを含むプラスミドは、連続するアデニンヌクレオチドのみから構成されるポリＡテールをコードする配列を含むＤＮＡを含むプラスミドと比較して、宿主細胞内で成長した場合により高い安定性を有し得る。ＤＮＡ配列を有するプラスミドを発現する宿主細胞の増殖中、連続するアデニンヌクレオチドと１個以上の非アデニンヌクレオチドを含むポリＡテールをコードするＤＮＡ配列は、アデニンヌクレオチドのみから構成されるポリＡテールと比較して、ポリＡテールをコードするＤＮＡの長さの減少に耐性があり得る。いくつかの実施形態では、１個以上の非アデニンヌクレオチドを含むポリＡテールをコードするＤＮＡを含むプラスミドは、アデニンヌクレオチドのみを含むポリＡテールをコードするＤＮＡを含むプラスミドと比較して、宿主細胞の増殖中のアデニンの損失を防止する。
【０１０７】
当業者に知られているベクターを増殖および精製する任意の手段を、プラスミドをコードする宿主細胞の増殖に使用してもよい。ベクターの増殖と精製のプロセスは、プラスミド調製とも呼ぶことができる。プラスミド精製の標準的なステップには、細菌培養の増殖、細菌の収穫と溶解、およびプラスミドＤＮＡの精製が含まれる。プラスミドＤＮＡを精製するための多くのキットがさまざまなメーカーから入手できる。プラスミド調製のステップは、ミニプレパレーション（２０〜４０μｇまたは５０〜１００μｇのプラスミドＤＮＡの予想収量）、ミディプレパレーション（１００〜３５０μｇのプラスミドＤＮＡの予想収量）、マキシプレパレーション（５００〜８５０μｇのプラスミドＤＮＡの予想収量）、メガプレパレーション（１．５〜２．５ｍｇのプラスミドＤＮＡの予想収量）、またはギガプレパレーション（７．５〜１０ｍｇのプラスミドＤＮＡ予想収量）であってよい。治療用ｍＲＮＡ産生のために、プラスミドは１００ｍｇ、１ｇ、１０ｇ、またはそれ以上の規模で産生され得る。本明細書に記載の非アデニンヌクレオチドを有するポリＡテールをコードするプラスミドの安定性および複製効率の増加は、そのような規模で作製されたプラスミドの一貫性および効率を改善し得る。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、本発明のＤＮＡベクターからｍＲＮＡを産生する方法が包含される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡベクターからｍＲＮＡを産生する方法は、ポリＡテールの下流でベクターを直線化することと、直線化されたベクトルを変性することと、グアニン、シトシン、ウラシル、アデニンなどのＲＮＡヌクレオチド、またはとりわけプソイドウリジン、Ｎ−１−メチルプソイドウリジン、メトキシウリジンなどのこうしたヌクレオチドの化学修飾バージョンの存在下で変性されたＤＮＡをＲＮＡポリメラーゼと接触させることと、を含む。ヌクレオチド残基の塩基、糖、骨格修飾などの修飾残基は、ｍＲＮＡ、ポリヌクレオチド、および本明細書に記載の方法で使用することができる。
【０１０９】
この説明および例示的な実施形態は、限定として解釈されるべきではない。本明細書および添付の特許請求の目的のために、特に明記しない限り、本明細書および特許請求の範囲で使用される量、パーセンテージ、または割合、および他の数値を表すすべての数字は、どの場合においても用語「約」によって、まだそのように修正されていない範囲で修正されていると理解されるべきである。したがって、そうでないことが示されない限り、以下の明細書および添付の特許請求の範囲に示される数値パラメータは、得ようとする所望の特性に応じて変化し得る近似値である。非常に少なくとも、および均等論の適用を特許請求の範囲に限定する試みとしてではなく、各数値パラメータは、報告された有効数字の数を考慮して、通常の丸め手法を適用することにより、少なくとも解釈されるべきである。
【０１１０】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」、および任意の単語の単数形の使用は、明示的かつ明確に１個の指示対象に限定されない限り、複数の指示対象を含めることに留意されたい。本明細書で使用される「含める（ｉｎｃｌｕｄｅ）」という用語およびその文法上の変形は、リスト内のアイテムの列挙が、リストされたアイテムに置換または追加できる他の同様のアイテムを除外しないように、非限定的であることを意図している。
【０１１１】
配列の説明
この表は、本明細書で参照される特定の配列のリストを提供する。下の表のＤＮＡ配列のＲＮＡバージョンを参照する場合、ＴはＵに置き換えられることをここでも留意されたい。下の表のＲＮＡ配列のＤＮＡバージョンを参照する場合、ＵはＴに置き換えられる。
【表１】
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【０１１２】
ホスホロチオエート（ＰＳ）連結または結合とは、ホスホジエステル連結、例えばヌクレオチド塩基間の結合での１個の非架橋リン酸塩酸素を硫黄が置換する結合を指す。ホスホロチオエートを使用してオリゴヌクレオチドを生成する場合、修飾オリゴヌクレオチドはＳ−オリゴとも呼ばれ得る。
【０１１３】
ＰＳ修飾を示すために「＊」が使用され得る。本出願では、用語Ａ＊、Ｃ＊、Ｕ＊、またはＧ＊を使用して、ＰＳ結合を用いて次の（例えば３’）ヌクレオチドに連結されているヌクレオチドを示し得る。
【０１１４】
本出願では、２’−Ｏ−Ｍｅで置換され、ＰＳ結合で次の（例えば３’）ヌクレオチドに連結されているヌクレオチドを示すために、用語「ｍＡ＊」、「ｍＣ＊」、「ｍＵ＊」、または「ｍＧ＊」が使用され得る。
【実施例】
【０１１５】
以下の実施例は、特定の開示された実施形態を例示するために提供され、本開示の範囲を決して限定するものとして解釈されるべきではない。
【０１１６】
実施例１−ポリＡコーディングのための安定したプラスミドの設計と安定性
非アデニンヌクレオチドを含むポリＡテールが設計された。連続するアデニンヌクレオチドと非アデニンヌクレオチド（例えば、中断配列）を有するこれらのポリＡテールをコードするプラスミドの安定性を、アデニンヌクレオチドのみで構成されるポリＡテールと比較した。
【０１１７】
アデノシンのみで構成されるｍＲＮＡポリＡテールのアデノシン数の損失の問題点は、表２で強調されている。９６個のアデノシンのポリＡテールを含有する配列をｐＵＣ５７プラスミド（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）に挿入し、Ｅ．ｃｏｌｉへと形質転換させた。細胞をＬＢ−Ａｍｐプレートに播種し、３０℃または３７℃のいずれかで一晩インキュベートした。８個のコロニーを採取し、ＬＢ−Ａｍｐ培地を有する９６ウェルプレートに接種し、３０℃または３７℃で一晩増殖させた（Ｄａｙ１）。Ｄａｙ１の培養からの試料を新鮮なＬＢ−Ａｍｐ培地に加え、３０℃または３７℃でさらに２日間培養した（Ｄａｙ２）。ＤＮＡをＤａｙ１およびＤａｙ２の培養物から精製し、配列決定して、プラスミドのポリＡテール長を決定した。例示的な結果を以下の表２および図１に示す。
【表２】
2020532961.tif 000038
【０１１８】
多くのコロニーについて、各ラウンドの増殖はポリＡテール内のアデノシン数の減少と関連しており、１ラウンドのみが２ラウンドの複製を通じて９０個を超えるアデノシンを維持していた。さらに、細菌コロニーのサイズは、プラスミドからのポリＡテール長の損失と相関しており（すなわち、より大きなコロニーがポリＡ長の損失に対応）、より長いポリＡテールをコードする配列がプラスミド産生中の細菌の増殖を阻害する場合があることを示唆している。Ｅ．ｃｏｌｉのコロニーから精製されたＤＮＡは、プラスミドＤＮＡを保有する個々のＥ．ｃｏｌｉからのＤＮＡの集団を表す。したがって、表２に示されている値（および本明細書で説明されている同様の値）は、集団の平均ポリＡ長を表す。さらに、ＰＣＲおよびポリＡなどの長い繰り返しの配列決定中に、ポリメラーゼがスリップすることがあり、その結果、配列が実際の配列よりわずかに短いように見える。したがって、９５個のアデノシンを示す結果については、プラスミドが１個のアデノシンを失ったかどうか、またはＰＣＲアーティファクトであるかどうかは不明である。ただし、大幅な損失は、ＰＣＲ増幅および配列決定中のポリメラーゼスリッページのアーティファクトによるものではない。
【０１１９】
別の実験では、配列番号１のポリＡテールを含有するｐＵＣ５７プラスミドでＥ．ｃｏｌｉを形質転換し、ＬＢ−Ａｍｐプレートに播種した。８個のクローンを２ラウンドの増殖で培養し、ポリＡテールをコードする配列の維持を試験した。１個のクローンの代表的なデータを図２に示す。配列番号１のポリＡテールでは、それをコードするプラスミドの２ラウンドの増殖にわたってテールのサイズに変化は見られなかった。ミニプレップ（Ｍｉｎｉｐｒｅｐ）１は増殖の第１のラウンドを指し、一方でミニプレップ２は増殖の第２のラウンドを指す。ミニプレップは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｐｕｒｅｌｉｎｋ  Ｑｕｉｃｋ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを使用して実行された。
【０１２０】
追加の非アデノシンパターン（配列番号３）を有するポリＡテールをコードするプラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉでの複製に耐える能力について試験した。配列番号３のポリＡテールを含有する配列をｐＵＣ１９プラスミド（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）に挿入し、Ｅ．ｃｏｌｉへと形質転換させた。細胞をＬＢ−Ｋａｎプレートに播種し、３０℃または３７℃のいずれかで一晩インキュベートした。８個のコロニーを採取し、ＬＢ−Ｋａｎ培地を有する９６ウェルプレートに接種し、３０℃または３７℃で一晩増殖させた（Ｄａｙ１）。Ｄａｙ１の培養からの試料を新鮮なＬＢ−Ｋａｎ培地に加え、３０℃または３７℃でさらに２日間培養した（Ｄａｙ２）。ＤＮＡをＤａｙ１およびＤａｙ２の培養物から精製し、配列決定して、プラスミドのポリＡテール長を決定した。配列決定された８個のＤａｙ１の培養物のうち、６個は一続きの２５、２４、２４および２４個のアデノシンを維持し、１２個のＤａｙ２の培養物のうち、９個は一続きの２５、２４、２４および２４個のアデノシンを維持し、アデノシンのみの配列と比較してポリＡ保持の改善を実証した。
【０１２１】
これらのデータは、非アデニンヌクレオチドを含むポリＡテールをコードするＤＮＡが、アデノシンのみを含有するポリＡテールをコードするＤＮＡと比較して、複数ラウンドのプラスミド増殖および精製にわたって安定性を改善したことを示している。
【０１２２】
実施例２−非アデニンヌクレオチドを含むポリＡテールを有する構築物の活性
実験を実施して、非アデニンヌクレオチドを含むポリＡテール（中断配列）を有するｍＲＮＡの有効性と、アデノシンのみを含有するポリＡテールを有するｍＲＮＡの有効性に差があるかどうかを判定した。Ｃａｓ９タンパク質をコードするｍＲＮＡが、分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）をコードするレポータープラスミド、ならびにＳＥＡＰを標的とするガイドＲＮＡを有するＨＥＫ−２９３細胞にエレクトロポレーションによってトランスフェクトされるモデルシステムを使用した。ｍＲＮＡからのＣａｓ９タンパク質の発現が成功すると、ＳＥＡＰ標的配列が切断され、ＳＥＡＰの産生の減少を反映した色の変化が起こる。ＳＥＡＰ  ＨＥＫ−Ｂｌｕｅレポーター試薬は、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎから入手した。Ｔ７プロモーターを含有し、アデノシンのみのポリＡテールを有するＣａｓ９  ｍＲＮＡをコードする配列（１００個のアデノシンヌクレオチドを有するように設計されているが、配列決定により９７個のアデノシンヌクレオチドを有すると示された）（配列番号６）、またはＴ７プロモーターを含み、配列番号１のポリＡテールを有するＣａｓ９  ｍＲＮＡをコードする配列（配列番号７）を、ｐＵＣ５７プラスミド（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）にクローニングした。ｍＲＮＡは、各ｍＲＮＡをコードする直線化されたプラスミドからのインビトロ転写により産生された。
【０１２３】
図３は、０．００５〜５０ｎＭの濃度での、およびＳＥＡＰを標的とする１μＭのシングルガイドＲＮＡ（配列番号８）でのＨＥＫ−Ｂｌｕｅ細胞アッセイにおける、アデノシンのみのポリＡまたは配列番号１のポリＡを有するＣａｓ９  ｍＲＮＡの滴定を示す。
【０１２４】
ＨＥＫ−Ｂｌｕｅの結果は、どちらのポリＡテールを有するｍＲＮＡの効果が用量反応曲線全体で類似していたことを示している。ｍＲＮＡの濃度が高いと、ベースラインの青色がＳＥＡＰ発現を示しているため、ピンクへの色の変化から明らかなように、ＳＥＡＰレポーター遺伝子の発現が減少した。したがって、非アデニンヌクレオチドを含むポリＡテールは、アデノシンのみを含有するポリＡテールと比較して、Ｃａｓ９構築物の発現および機能の有効性を変化させなかった。
【０１２５】
配列番号６のＣａｓ９  ｍＲＮＡの発現によって付与される編集の有効性も、配列番号７のＣａｓ９  ｍＲＮＡと比較した（すなわち、アデノシンのみのポリＡテールを配列番号１のポリＡテールと比較した）。これらの実験では、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ細胞はエレクトロポレーションによりｓｇＲＮＡ（配列番号８）と２個の異なるｍＲＮＡでトランスフェクトされた。
【０１２６】
図４は、２４時間のインキュベーション後の両方の構築物のＳＥＡＰ阻害率を示している。アデノシンのみを含有するポリＡテールと非アデニンヌクレオチドを含むポリＡテールを有するｍＲＮＡのＳＥＡＰ編集のＥＣ５０は、それぞれ０．０５０と０．０５４で類似していた。
【０１２７】
図５は、４８時間のインキュベーション後の両方の構築物のＳＥＡＰ阻害率を示している。アデノシンのみを含有するポリＡテールと非アデニンヌクレオチドを含むポリＡテールを有するｍＲＮＡのＳＥＡＰ編集のＥＣ５０は、それぞれ０．０８６と０．０８２で類似していた。
【０１２８】
インビボでのｍＲＮＡの発現と活性も確認された。配列番号６（ＨｉＣａｓ９  ｍＲＮＡ）および配列番号７（中断されたポリＡ  ｍＲＮＡ）のＣａｓ９  ｍＲＮＡは、配列番号９のシングルガイドＲＮＡ（マウスＴＴＲ遺伝子を標的とする）と１：１の重量比で脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中に配合され、１ｍｇ／ｋｇまたは０．５ｍｇ／ｋｇの総ＲＮＡで静脈内投与により、ＣＤ−１雌マウス（ｎ＝５）に投与した。投与後７日目に動物から血液を採取し、ＥＬＩＳＡによりＴＴＲタンパク質の血清レベルを測定した。手短にいえば、総ＴＴＲ血清レベルは、マウスプレアルブミン（トランスサイレチン）ＥＬＩＳＡキット（Ａｖｉｖａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｃａｔ．ＯＫＩＡ００１１１）を使用して決定した。キットの試薬と対照は、製造元のプロトコルに従って調製した。プレートをＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５プレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度で読み取った。血清ＴＴＲレベルは、標準曲線からの４パラメータのロジスティック曲線適合を使用して、ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏソフトウェアバージョン６．４．２によって計算した。アッセイ希釈のために最終血清値を調整した。
【０１２９】
図６は、投与後７日の両方のポリＡ構築物について、血清ＴＴＲノックダウン（ＴＴＲ遺伝子の編集率を表す）の同等レベルを示す。血清ＴＴＲノックダウンの結果は、７日目に採取したマウスの肝臓のＴＴＲ遺伝子座の配列決定によって確認された。アデノシンのみのポリＡ  ｍＲＮＡを受け取ったマウスは、０．５および１ｍｇ／ｋｇの総ＲＮＡでそれぞれ６１．７４％および６９．８４％の編集を示したが、非アデノシンヌクレオチドを含有するポリＡ  ｍＲＮＡを受け取ったマウスは、０．５および１ｍｇ／ｋｇの総ＲＮＡで６３．１４％および７０．８２％の編集を示した。
【０１３０】
したがって、非アデニンヌクレオチドを含むポリＡテールを有するＣａｓ９  ｍＲＮＡの発現は、アデノシンのみを含有するポリＡテールを有するＣａｓ９  ｍＲＮＡと比較して同様の編集効果をもたらした。
【０１３１】
実施例３−追加の中断配列を含むポリＡテールを有する構築物の活性
実験を実施して、非アデニンヌクレオチドを含むポリＡテールを有するｍＲＮＡの有効性と、実施例２のようにアデノシンヌクレオチドのみを含有するポリＡテールを有するｍＲＮＡの有効性を決定した。Ｔ７プロモーターを含有し、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号１０、または配列番号１１を含む中断されたポリＡテールを有するＣａｓ９  ｍＲＮＡをコードする配列は、ポリＡ配列を組み込むためのプライマーを使用したＰＣＲ増幅により作成された。ｍＲＮＡは、これらのＰＣＲ産物からのインビトロ転写によって産生された。配列番号１８のｍＲＮＡは、ｍＲＮＡをコードする直線化されたプラスミドからのインビトロ転写により産生された。
【０１３２】
図７は、０．０２〜６ｎＭの濃度でのおよびＳＥＡＰを標的とする１μＭのシングルガイドＲＮＡ（配列番号８）でのＨＥＫ−Ｂｌｕｅ細胞アッセイにおける、アデノシンのみのポリＡ［１００ＰＡ］または配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号１０、もしくは配列番号１１のポリＡを有するＣａｓ９  ｍＲＮＡの滴定を示す。具体的には、図７は、４８時間のインキュベーション後の構築物のＳＥＡＰ阻害率を示し、ＥＣ５０値を以下の表３に示す。すべての構築物が活性である。
【表３】
2020532961.tif 000039
【０１３３】
実施例４−中断配列を使用した長いポリＡのクローニング
３００ヌクレオチド長のポリＡテール、配列番号１８［３００ｐａ］は、表４（以下）からの１２個の中断配列および１２個の連続するアデノシンの１３個の繰り返しを含んで設計された。配列番号Ｔ１８のアンカーシーケンスは、ポリＡテールの約３００ｎｔ内のトリヌクレオチド中断配列間のハイブリダイゼーションと自己アニーリングを最小限に抑えるように設計された。以下の表４は、中断シーケンス間のアニーリングを最小化する中断シーケンスを示し、この実験で使用したアンカーを含む。
【０１３４】
配列番号１８をクローニングするため、ＰｏｌｙＡ−１（配列番号１２）、ＰｏｌｙＡ−２（配列番号１３）、ＰｏｌｙＡ−３（配列番号１４）、およびＰｏｌｙＡ−４（配列番号１５）の各配列が、ｐＵＣ５７ミニベクター（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）で作成される。ｐＡ１−２プラスミドは、配列番号１２をＢｃｌ１１ａプライマーで増幅し、ＰＣＲ産物を制限酵素ＸｈｏＩおよびＡｃｌＩで消化し、制限断片をＸｈｏＩおよびＢｓｔＢＩで消化した配列番号１３を含むｐＡ２プラスミドに連結することにより作成される。ｐＡ３−４プラスミドは、配列番号１４を増幅し、それをプラスミドｐＡ４上の同じ制限部位に連結する、同じ方法で作成される。ｐＡ１−４プラスミド（配列番号１８を含む）は、ｐＡ３−４からの配列番号１７の配列を増幅し、ＰＣＲ断片をＢｂｓＩおよびＸｂａＩ制限酵素で消化し、制限断片をＢｂｓＩおよびＸｂａＩ制限酵素で消化されたｐｏｌｙＡ  １−２（配列番号１６）構築物にクローニングすることにより組み立てられる。ｐＡ１−２およびｐＡ３−４への挿入物は、プライマー（配列番号２０および２１）として［ｐＵＣ−Ｍ  ｓｅｑ２フォワードプライマーおよびｐＵＣ−Ｍ  ｓｅｑリバースプライマー］を使用して両方向からサンガーシーケンシングにより評価される。
【０１３５】
得られた配列番号１８（３００ＰＡ）ポリＡ配列は、ベクターをコードするタンパク質の同じ部位にクローニングするために、ＸｈｏＩおよびＸｂａＩでｐＡ１−４を消化することにより切除される。すべてのステップは標準的な条件の下で実行される。
【表４】
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【図１】
2020532961.tif 000041
【図２】
2020532961.tif 000042
【図３】
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【図４】
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【図５】
2020532961.tif 000045
【図６】
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【図７】
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【配列表】
2020532961000001.app
【国際調査報告】
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2020532961.tif 000049
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