(57)【要約】  機能性物質が塗工されたビーズは、そのビーズを捕捉または通過させる音響場にさらされる。ビーズは、強磁性物質を含んでも含まなくてもよい。ビーズは、ホストに対して生体適合性があってもよく、生分解性があってもよい。ビーズのサイズはある範囲にわたって変化してもよく、および／または、不均一または均一であってもよい。ビーズの組成は、高、中または低の音響コントラスト物質を含んでもよい。機能性物質の化学的性質は、既存のプロセスと互換性があってもよい。
2020513248.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分離プロセスにおいて使用する物質であって、
強磁性物質を含まないビーズと、
ターゲット生体物質を引き付けるための前記ビーズ上の機能性物質と、を備える物質。
【請求項２】
物質を分離するシステムであって、
音響場を生成するためのデバイスと、
複数のビーズと、を備え、前記複数のビーズはそれぞれ、前記ビーズに結合した生体物質を含み、前記音響場に存在するときに捕捉され、または、通過するシステム。
【請求項３】
物質を分離する方法であって、
機能性物質を複数のビーズに塗工することと、
前記機能性物質に対して親和性を有する生体物質に前記ビーズをさらし、前記生体物質を前記ビーズに結合させることと、
前記ビーズを音響場にさらして、前記ビーズを捕捉し、または、通過させることと、を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
生体物質の分離は様々な状況で適用されてきた。例えば、タンパク質を他の生体物質から分離するための分離技術は、多くの分析プロセスにおいて使用されている。
【発明の概要】
【０００２】
生体物質の分離は、流体チャンバ内に分散されて組換えタンパク質、モノクローナル抗体または細胞などの特定のターゲット物質と結合する機能性物質によって達成することができる。親和性タンパク質でコーティングされたマイクロキャリアなどの機能性物質は、音響定在波の節および腹で捕捉される。このアプローチにおいて、機能性物質は非接触で（例えば、機械的なチャネル、導管、ピンセットなどを使用しないで）捕捉される。
【図面の簡単な説明】
【０００３】
添付の図面を参照して、図面を以下でより詳細に説明する。
【０００４】
【図１】図１は、磁場において常磁性ビーズを使用する分離プロセスの図である。
【図２】図２は、音響場において音響ビーズを使用する分離プロセスの図である。
【図３】図３は、ビーズとＣＤ３＋Ｔ細胞複合体の画像である。
【図４】図４は、選択の特異性を実証するためのＣＤ３−Ｔ細胞を含まないビーズの画像である。
【図５】図５は、ストレプトアビジンとビオチンの共役結合体で利用可能な不均一なビーズの画像である。
【図６】図６は、均一なアガロースビーズの画像である。
【図７】図７は、ビーズを処理するための小型音響システムの写真である。
【図８】図８は、分離結果の写真である。
【図９】図９は、ビーズと共に使用することができる親和性技術の図である。
【図１０】図１０は、互いに複合体を形成するストレプトアビジン共役結合ビーズおよびビオチン共役結合ビーズの顕微鏡写真である。
【図１１】図１１は、互いに複合体を形成するストレプトアビジン共役結合ビーズおよびビオチン共役結合ビーズの顕微鏡写真である。
【図１２】図１２は、互いに複合体を形成するストレプトアビジン共役結合ビーズおよびビオチン共役結合ビーズの顕微鏡写真である。
【図１３】図１３は、赤血球、樹状細胞およびＴ細胞が同定された細胞懸濁液の顕微鏡写真である。
【図１４】図１４は、細胞の明視野像の顕微鏡写真である。
【図１５】図１５は、細胞に結合した抗ＣＤ４抗体の緑色蛍光の明視野像の顕微鏡写真である。
【図１６】図１６は、細胞の明視野像の顕微鏡写真である。
【図１７】図１７は、細胞に結合した抗ＣＤ４抗体のマゼンタ色蛍光の明視野像の顕微鏡写真である。
【図１８】図１８は、過剰なビーズと過剰な細胞とを含む環境におけるビーズ−細胞複合体の例を示す一連の顕微鏡写真である。
【図１９】図１９は、親和性結合のための活性化の化学反応の例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
タンパク質または細胞などの生物学的物質の親和性分離は、マイクロビーズなどの表面に共有結合したリガンド（配位子）を使用することによって達成される。このリガンドは、タンパク質または細胞がマイクロビーズ上のリガンドに結合するようにタンパク質または細胞と相互作用するものである。
【０００６】
リガンドは、生体分子とともに複合体を形成する物質である。タンパク質−リガンドの結合において、リガンドは通常、対象のタンパク質上のサイトに結合することによってシグナルを生成する分子であり、その結合は典型的にはターゲットタンパク質の評価に変化をもたらす。リガンドは、タンパク質物質に結合する小さな分子、イオンまたはタンパク質であってもよい。リガンドと結合相手との間の関係は、電荷、疎水性および分子構造の関数である。結合は、イオン結合、水素結合、ファンデルワールス力などの分子間力によって起こる。そのドッキングの会合は、実際には解離によって元に戻すことができる。リガンドとターゲット分子との間の測定できる程度の不可逆的な共有結合は、生物学的システムにおいて例外的である。
【０００７】
受容体に結合し、その受容体の機能を変えて生理学的応答を引き起こすことができるリガンドは、受容体に対するアゴニストと呼ばれる。受容体に結合したアゴニストは、どの程度の生理学的応答を引き起こすことができるかという観点と、生理学的応答を生じさせるために必要なアゴニストの濃度の観点の両方の観点から特徴付けることができる。高親和性のリガンド結合は、リガンド−結合サイトを最大限に占有して生理学的応答を引き起こすには比較的低濃度のリガンドで十分であることを意味する。Ｋｉレベルが低いほど、未結合のリガンドと受容性の抗原との間に化学反応が発生しやすい。低親和性の結合（高Ｋｉレベル）は、結合サイトを最大限に占有してリガンドに対する最大の生理学的応答が達成されるためには比較的高濃度のリガンドが必要とされることを意味する。二価のリガンドは、２つの連結したリガンドとしての分子からなり、科学的研究において受容体タイマーを検出したり、その性質を調べたりするために用いられる。
【０００８】
Ｔ細胞受容体またはＴＣＲは、Ｔ細胞またはＴリンパ球の表面上に見られる分子であり、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）の分子に結合したペプチドとしての抗原の断片を認識する役割を有する。ＴＣＲと抗原ペプチドとの間の結合は、比較的親和性が低く、変性的である。
【０００９】
図１を参照すると、ダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）の名称で販売されている鉄または強磁性ビーズなどの常磁性ビーズは、親和性抽出を達成するために使用されてきた。機能性物質でコーティングされた磁性ビーズは、磁場を用いてターゲット物質を複雑な混合物から分離できるように、複雑な混合物中の生物学的なターゲットに結合する。ビーズは、様々なターゲットに高い特異性で親和性結合するための分子を担持する。このビーズを複雑な混合物に注入し、培養してターゲットと結合させる。ビーズは、そのビーズに付着したターゲットと共に磁石によって抽出される。
【００１０】
例えばダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）のようなミクロサイズのビーズが利用可能であり、そのサイズは４．５μｍ程度である。また、例えばミルテニー（Ｍｙｌｔｅｎｙｉ）のようなナノサイズのビーズを使用してもよく、そのサイズは５０ｎｍ程度である。使用可能な親和性分子のいくつかとしては、抗体、アプタマー、オリゴヌクレオチド、受容体などが挙げられる。親和性結合のターゲットとしては、生体分子、細胞、エキソソーム、薬物などが挙げられる。
【００１１】
図２を参照すると、音響コントラストおよび親和性が高い化学的性質を有するビーズが図示されている。これらの音響ビーズは、機能性物質のコーティングまたは親和性結合用の組成物を有することに関して、磁性ビーズと全く同じ方法で使用することができる。音響ビーズは、音響場で複雑な混合物または流体から抽出されるように設計されている。音響ビーズは、磁性ビーズを使用する細胞製造、生化学、診断、センサーなどにおいて開発された全ての用途に直接使用することができる。
【００１２】
音響ビーズは、磁性ビーズで使用されるのと同じ表面および親和性の化学的性質を使用することができる。磁性ビーズから音響ビーズに容易に置き換えできるため、応用が簡易になるだけでなく、その応用の承認が簡易になるなど、多くの利点を有する。
【００１３】
音響ビーズは生体適合性を有してもよい。そのようなビーズは様々に異なるサイズで製造することができるので、傾斜場（ａｎｇｌｅｄ−ｆｉｅｌｄ）分別技術を用いて提供され得るような、サイズを区別する音響場におけるサイズに基づく連続的な分離が可能になる。音響ビーズは密閉型の音響ベースシステムと組み合わせることができ、この組み合わせにより、治療用細胞の製造の最初から最後まで連続したサイクルを行うことができる。この機能は、現存する親和性の化学的性質の使用をそのまま維持しながら音響ビーズに直接移すことができ、磁性ビーズによる抽出に代わる代替手段を提供する。音響ビーズは、分離工程における消耗品であってもよい。
【００１４】
一例では、患者の血液からＣＤ３＋Ｔ細胞を抽出するために、公表済みのメモリアル・スローンケタリングがんセンター（ＭＳＫＣＣ）プロトコルを使用して概念実証（Ｐｒｏｏｆ  ｏｆ  Ｃｏｎｃｅｐｔ）試験が行われた。この試験では、常磁性ビーズが使用され、磁場が音響場に置き換えられた。患者の血液からＣＤ３＋Ｔ細胞を抽出するプロセスは、ＣＡＲ（キメラ抗原受容体）Ｔ細胞の製造に不可欠な部分である。現在のプロセスは市販のＣＤ３ダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）に基づいている。この試験では、血液ではなく培養液で実験を行うなど、プロトコルの違いを最小限に抑えるための努力が払われた。ＣＡＲＴ細胞製造におけるいくつかの工程は培養液から行われるので、差異は減少したと考えられる。Ｔ細胞を「音響的に見えない」ようにするか、または音響場の影響を受けにくくするために、溶媒密度を高めた。ダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）のサイズが小さいと、細胞と同様の音響コントラストが得られるため、分離の許容誤差が小さくなる。試験では、ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）ＣＤ３＋およびＣＤ３−Ｔ細胞株を、典型的な例として用いた。ＣＤ３−細胞は、非特異的な捕捉に対応する対照として用いた。
【００１５】
ここで図３および図４を参照すると、前記試験の結果の画像が示されている。細胞懸濁液は、ＣＤ３＋細胞と結合するＣＤ３ダイナビーズと共に培養した。この混合物が音響システムを通過することで、（細胞を含むまたは含まない）磁性ビーズを捕捉した。集めた細胞は培養中でうまく増殖した。図３および図４の画像は、明視野像と蛍光像とを重ね合わせて得られる。ビーズはわずかに赤みを帯びた自己蛍光を有する黒色である。生きている細胞は蛍光赤色である。ビーズの直径は４．５ミクロンである。図３は、ビーズとＣＤ３＋Ｔ細胞複合体を示し、この技術の効率を実証している。図４は、ＣＤ３−Ｔ細胞が抽出されていないことを示し、この技術の特異性および選択性を実証している。
【００１６】
ここで図５および図６を参照すると、音響ビーズを用いた試験の結果が示されている。この試験では、アガロースビーズを音響ビーズとして使用した。これらのビーズは、いくつかの製造業者から市販されており、常磁性ではないか、または、鉄や強磁性体をほとんど含有していない。あるアガロースビーズでは、抗体が付着しやすくなるように表面が改変されている。それらはまた、治療のソルーションにとって重要な生体適合性物質で構成されている。図５は、ストレプトアビジンとビオチンの共役結合体で利用可能な、比較的安価で不均一（２０〜１５０μｍ）な市販のＡＢＴビーズを示している。図６は、セルモザイク（ＣｅｌｌＭｏｓａｉｃ）アガロースビーズを示している。これは比較的高価で均一（２０〜４０μｍ）になる傾向があり、オーダーによって任意に改変させて構成することができる。
【００１７】
音響ビーズは、多次元音響定在波などの音響場内に捕捉することができる。図７を参照すると、音響の応用のために開発された小型音響システムが示されており、このシステムは音響ビーズを捕捉するために使用される。前記システムをより小さいサイズにすることにより、大量の高価な試薬の必要性を減らすことができ、少量のサンプルの処理が可能になる。
【００１８】
図８を参照すると、音響システム内で捕捉されていない（左チューブ）および捕捉された（右）セルモザイク（ＣｅｌｌＭｏｓａｉｃ）アガロースビーズが示されている。音響システムの捕捉効率は９０％以上になる。
【００１９】
図９を参照すると、音響ビーズの活性化に対する柔軟なアプローチが示されている。このアプローチでは、ストレプトアビジン−ビオチン複合体を用いて抗体をアガロースビーズに結合させる。この複合体は生化学で広く使用されており、非常に安定している。共役結合ストレプトアビジンを有するアガロースビーズは、抗体−ビオチン共役結合体と同様に市販されている。
【００２０】
ストレプトアビジンビーズおよびビオチンビーズの機能性を評価した。図１０〜図１２を参照すると、予想通り、混合時に互いに複合体を形成するストレプトアビジン共役結合ビーズおよびビオチン共役結合ビーズが示されている。
【００２１】
懸濁液からＣＤ４＋およびＣＤ８＋（それぞれ「ヘルパー」Ｔ細胞および「キラー」Ｔ細胞）を独立して単離し、それらを効果的な治療の観点から所望の比率で混合することが望ましい場合がある。この目的のために、ＣＤ４受容体およびＣＤ８受容体に対する親和性を有する音響ビーズを提供することができる。一実施例を得るための試験は、マウスの脾臓から調製した細胞懸濁液を用いて行った。図１３を参照すると、赤血球、樹状細胞およびＴ細胞が同定されている。インビトロジェン除去キットを使用して、約２０００万（２０  ｍｉｌｌｉｏｎ（Ｍ））および１８００万（１８Ｍ）のＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞がそれぞれ４つの脾臓から単離された。両方の細胞株は増殖することができ、ＣＤ４およびＣＤ８のＴ細胞は両方とも約８．２〜８．６μｍである。
【００２２】
この試験では、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋の単離細胞を免疫学的に検証した。図１４および図１５を参照すると、ＣＤ４受容体の存在を確認できる。マウスの脾臓から精製した後に単離されたＣＤ４のＴ細胞の量を推定するために、アレクサ４８８抗ＣＤ４抗体が使用された。図１４は、焦点面内に細胞の小円を有する明視野像を示す。図１５は、細胞に結合した抗ＣＤ４抗体の蛍光を示す。図１６は、焦点面内に細胞の小円を有する明視野像を示す。図１７は、細胞に結合した抗ＣＤ４抗体の蛍光を示す。図１５及び図１７それぞれにおける緑及びマゼンタの互いに異なる色により、結果の多重分析、たとえばＣＤ４／ＣＤ８比分析ができる。
【００２３】
ここで図１８を参照すると、ストレプトアビジン共役結合アガロースビーズをビオチン共役結合の抗ＣＤ３抗体およびＣＤ３＋ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）Ｔ細胞と共に用いた試験の結果が示されている。ビーズと細胞の親和性の組み合わせが明確に図示されている。混合物から細胞を抽出するために、ビーズを音響場で分離することができる。
【００２４】
音響システムにおける音響親和性ビーズを使用した概念実証および性能の検証が示されている。開示された方法およびシステムでは、市販の試薬および現在利用可能な音響システムが使用できる。親和性は、任意のタイプの所望のＴ細胞またはマーカーをターゲットとすることができ、そのＴ細胞またはマーカーとしては、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋が挙げられる。音響ビーズは、高、中または低のコントラスト係数を有してもよく、このコントラスト係数は、例えばビーズが音響の節または腹に向かって促されるか、または、ビーズが音響場を通過するかなど、ビーズが音響場にどのように応答するかについて影響を及ぼし得るものである。
【００２５】
ビーズは、様々な物質および組み合わせから構成し、音響性能および生体適合性との最適な相性について開発できるようにしてもよい。ビーズは、分離、選別、または、分離プロセスにおいて有用な他の任意の機能のために、処理してもよい。調整された音響システムと共に使用されるとき、特別に設計された音響ビーズの性能は、常磁性ビーズの性能に匹敵するか、または、その常磁性ビーズの性能を超えることができる。
【００２６】
既存の化学物質を音響ビーズと共に使用し、更にサイズおよび構造の均一性の仕様と組み合わせて使用し、音響性能および分離性能に関して所望の結果が得られるようにしてもよい。ビーズは、音響効率を高めるために複合構造物から構成してもよい。音響システムは、熱管理とともに、常磁性ビーズ単独では不可能な結果を得るための流体工学の使用により、小さいサイズを管理できる柔軟性を有する。音響ビーズ及び単純化された処理それぞれの生体適合性および／または生分解性により、ＣＡＲＴ細胞の製造のための既存のハードウェアとの統合が可能になる。親和性音響ビーズは様々な環境で使用することができ、その環境としては、例えば、ターゲット細胞を混入した動物の血液およびマウスの脾臓抽出物などのモデル環境が挙げられる。音響ビーズは、このように既存のシステムと協働して使用してもよく、目的の用途向けに設計および製造してもよい。ビーズは、音響的に活性または不活性のコアを有してもよく、ビーズ自体は、高、中または低の音響コントラスト用に構成してもよい。ビーズのサイズは、分離性と親和性との組み合わせに対して構成してもよく、例えば、特定のサイズのビーズは特定の生体物質をターゲットとする機能性物質を含んでもよく、別のサイズのビーズは別の生体物質をターゲットとするように機能化されてもよく、それぞれのサイズのビーズは閉鎖系または流動系において同時にかつ連続的に分離できるようにしてもよい。ビーズは、狭い範囲または比較的広い範囲で均一なサイズ分布になるように設計してもよい。また、様々な親和性化学物質を使用してもよく、その親和性化学物質としてはストレプトアビジン−ビオチン複合体、免疫グロブリンまたはアプタマーが挙げられる。ビーズは製造容易性および／または保存期間のために設計してもよい。ビーズは、承認済みの化学物質を使用する既知のシステムに容易に統合できるように、承認済みの化学物質と共に使用してもよい。
【００２７】
図１９を参照すると、活性化の化学反応を例示する図が示されている。この図示された活性化の化学反応は、本明細書に記載された音響親和性ビーズに適用できる。
【００２８】
上述の方法、システム、および装置は例である。様々な構成は、必要に応じて様々な手順または構成要素を省略、置換、または追加してもよい。例えば、代替構成においては、方法は説明されたものとは異なる順序で実行されてもよく、様々なステップが追加、省略、または組み合わされてもよい。また、特定の構成に関して説明された特徴は、他の様々な構成において組み合わされてもよい。構成の異なる態様および要素は同様の方法で組み合わされてもよい。また、技術は進化しており、したがって、要素の多くは例であり、本開示または特許請求の範囲を限定するものではない。
【００２９】
例示的な構成（実施形態を含む）の完全な理解を提供するために、本明細書の説明において具体的な詳細が与えられる。しかしながら、構成はこれらの具体的な詳細なしで実施されてもよい。例えば、構成を不明瞭にすることを避けるために、不必要な詳細なしに、周知のプロセス、構造、および技術が示されている。この説明は例示的な構成のみを提供するものであり、特許請求の範囲、適用性または構成を限定するものではない。むしろ、前述の構成の説明は、説明された技法を実施するための説明を提供する。本開示の趣旨または範囲から逸脱することなく、要素の機能および配置に様々な変更を加えてもよい。
【００３０】
また、構成は、フロー図またはブロック図として示されるプロセスとして説明されてもよい。それぞれが動作を逐次プロセスとして説明することがあるが、動作の多くは並行してまたは同時に実行することができる。さらに、動作の順序は並べ替えられてもよい。プロセスは、図に含まれていない追加のステージまたは機能を有してもよい。
【００３１】
いくつかの構成例を説明してきたが、本開示の趣旨から逸脱することなく、様々な修正形態、代替構成、および等価物を使用してもよい。例えば、上記の要素は、より大きなシステムの構成要素としてもよく、その場合、他の構造またはプロセスが、本発明の適用より優先されるか、またはそうでなければ本発明の適用を修正してもよい。また、上記の要素が考慮される前、その間、またはその後に、いくつかの操作を行ってもよい。したがって、上記の説明は特許請求の範囲を限定するものではない。
【図１】
2020513248.tif 000003
【図２】
2020513248.tif 000004
【図３】
2020513248.tif 000005
【図４】
2020513248.tif 000006
【図５】
2020513248.tif 000007
【図６】
2020513248.tif 000008
【図７】
2020513248.tif 000009
【図８】
2020513248.tif 000010
【図９】
2020513248.tif 000011
【図１０】
2020513248.tif 000012
【図１１】
2020513248.tif 000013
【図１２】
2020513248.tif 000014
【図１３】
2020513248.tif 000015
【図１４】
2020513248.tif 000016
【図１５】
2020513248.tif 000017
【図１６】
2020513248.tif 000018
【図１７】
2020513248.tif 000019
【図１８】
2020513248.tif 000020
【図１９】
2020513248.tif 000021
【国際調査報告】
2020513248.tif 000022
2020513248.tif 000023
2020513248.tif 000024