(57)【要約】  抗生物質薬剤に対する細菌の感受性又は耐性を決定するための方法が提供される。一実施形態において、この方法は、抗菌剤の存在下又は非存在下で細菌を培養して、一次培養物を生成することを含み、一次培養物は、次に、形質転換ファージの存在下又は非存在下で培養される。組み換えファージは、細菌に特異的であり、異種マーカー（例えば、ＲＮＡ又はタンパク質などの検出可能な産物として発現可能な核酸）を含む。抗菌剤に対する細菌の感受性又は耐性は、異種マーカーの存在又は非存在について培養物をアッセイすることによって決定され得、比較用培養物におけるマーカーのレベル又は活性と比較した、この培養物におけるマーカーのレベル又は活性の低下は、細菌が抗生物質薬剤に対して感受性であることを示す。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の細菌種の同定のための方法であって、
異種タンパク質マーカーを発現するように形質転換された組み換えバクテリオファージとともに試料をインキュベートして、形質転換された培養物を形成することと、
前記異種タンパク質マーカーの存在又は非存在について前記形質転換された培養物をアッセイすることと、を含み、前記マーカーの存在が前記細菌種の存在を示す、方法。
【請求項２】
前記バクテリオファージが、溶解性バクテリオファージ、溶原性バクテリオファージ、及び繊維状バクテリオファージからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記溶解性バクテリオファージが、Ｔ４、Ｔ７、Ｔ３、及びＭＳ２からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記溶原性バクテリオファージが、λファージである、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記繊維状バクテリオファージが、ｆ１、ｆｄ、及びＭ１３からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記マーカーが、前記細菌中の核酸又はタンパク質中で発現可能である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記マーカーが、抗原、酵素、抗体又はそのフラグメント、及びアプタマー、又はそれらの組合せからなる群から選択されるポリペプチド中で発現可能である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記タンパク質マーカーが、検出可能な標識を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記タンパク質マーカーが、蛍光アッセイ、化学発光アッセイ、酵素アッセイ、ゲル電気泳動、イムノアッセイ、及びリガンド結合アッセイから選択されるアッセイを用いて検出される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記タンパク質マーカーが、側方流動イムノアッセイを用いて検出される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記インキュベートすることが、抗菌剤の存在下でインキュベートすることをさらに含み、前記異種タンパク質マーカーの発現が、前記抗菌剤に対する細菌の耐性を示す、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
試料中の細菌種の同時の同定及び抗菌剤に対するその感受性の決定のための方法であって、
（ａ）試料を抗菌剤とともに培養して、一次培養物を生成することと、
（ｂ）前記一次培養物を、細菌種に特異的であり、かつ異種マーカーを発現するように操作された形質転換ファージとともに培養することと、
（ｃ）前記マーカーの存在又は非存在を検出することと、を含み、前記マーカーの存在が、前記試料中の前記細菌種の存在及び前記抗菌剤に対するその耐性を示す、方法。
【請求項１３】
試料中の細菌種の同時の同定及び抗菌剤に対するその感受性の決定のための方法であって、
（ａ）試料のアリコートを、抗菌剤とともに及び抗菌剤を用いずに培養して、一次培養物の組を生成することと、
（ｂ）一次培養物の前記組の一部を、細菌種に特異的であり、かつ異種マーカーを発現するように操作された形質転換ファージとともに又はそれを用いずに培養し、それによって、複数の形質転換二次培養物を生成することであって、第１の形質転換二次培養物が、抗菌剤とともに培養された形質転換細菌を含み、第２の形質転換二次培養物が、前記抗菌剤とともに培養されていない形質転換細菌を含むことと、
（ｃ）前記異種マーカーの存在又は非存在を検出することと、を含み、前記マーカーの存在が、前記試料中の前記細菌種の存在及び前記抗菌剤に対するその耐性を示す、方法。
【請求項１４】
試験抗菌剤に対する細菌の感受性を決定するための方法であって、
（ａ）抗菌剤の存在下及び非存在下で細菌を培養して、一次培養物を生成することと、
（ｂ）前記細菌に特異的であり、かつマーカーを含む形質転換ファージの存在下及び非存在下で一次培養物を培養し、それによって、複数の形質転換二次培養物を生成することであって、第１の形質転換二次培養物が、前記試験抗菌剤で処理された形質転換細菌を含み、第２の形質転換二次培養物が、前記抗菌剤で処理されていない形質転換細菌を含むことと、
（ｃ）前記第１及び第２の形質転換二次培養物のそれぞれにおける前記マーカーのレベル又は活性を検出し、それによって、前記抗菌剤に対する前記細菌の感受性を検出することと、を含む方法。
【請求項１５】
前記第２の形質転換二次培養物における前記マーカーのレベル又は活性と比較した、前記第１の形質転換二次培養物における前記マーカーのレベル又は活性の低下は、前記細菌が前記試験抗菌剤に感受性であることを示す、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記第２の形質転換二次培養物（対照）における前記マーカーのレベル又は活性と比較した、前記第１の形質転換二次培養物における前記マーカーのレベル又は活性の均一性又は増加は、前記細菌が、前記試験抗菌剤に感受性でないか又は前記試験抗菌剤に耐性であることを示す、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記細菌が、グラム陽性菌又はグラム陰性菌からなる群から選択される、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記細菌が、アシネトバクター・バウマニ（Acinetobacter baumannii）、炭疽菌（Bacillus anthracis）、セレウス菌（Bacillus cereus）、百日咳菌（Bordetella pertussis）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）、ブルセラ・アボルツス（Brucella aborus）、イヌ流産菌（Brucella canis）、マルタ熱菌（Brucella melitensis）、ブタ流産菌（Brucella suis）、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）、クラミジア肺炎菌（Chlamydia pneumoniae）、オウム病クラミジア（Chlamydia psittaci）、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）、ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）、クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）、破傷風菌（Clostridium tetani）、ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）、エンテロバクター属（Enterobacter sp.）、大便レンサ球菌（Enterococcus faecalis）、バンコマイシン耐性大便レンサ球菌（Enterococcus faecalis）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、大腸菌（Escherichia coli）、腸管毒素原性大腸菌（Escherichia coli）（ＥＴＥＣ）、腸内病原性大腸菌（Escherichia coli）、大腸菌（E.coli）Ｏ１５７：Ｈ７、野兎病菌（Francisella tularensis）、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、ピロリ菌（Helicobacter pylori）、肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）、レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）、レプトスピラ・インタロガンス（Leptospira interrogans）、リステリア菌（Listeria monocytogenes）、らい菌（Mycobacterium leprae）、ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、マイコプラズマ肺炎菌（Mycoplasma pneumoniae）、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、プロテウス属（Proteus）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、リケッチア・リケッチイ（Rickettsia rickettsii）、チフス菌（Salmonella typhi）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、ソンネ赤痢菌（Shigella sonnei）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermis）、スタフィロコッカス・サプロフィティクス（Staphylococcus saprophyticus）、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）（ＭＲＳＡ）、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）（ＶＳＡ）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Streptococcus agalactiae）、肺炎レンサ球菌（Streptococcus pneumoniae）、化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）、梅毒トレポネーマ（Treponema pallidum）、コレラ菌（Vibrio cholerae）、及びペスト菌（Yersinia pestis）又はそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記細菌が、炭疽菌（Bacillus anthracis）、枯草菌（Bacillus subtilis）、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）、大腸菌（Escherichia coli）、ラクトバチルス・デルブルエッキイ（Lactobacillus delbrueckii）、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、乳酸レンサ球菌（Lactococcus lactis）、リステリア菌（Listeria monocytogenes）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、シュードモナス・シリンガエ（Pseudomonas syringae）、クレブシエラ属（Klebsiella）、サルモネラ属（Salmonella）、シゲラ属（Shigella）、及び黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）からなる群から選択される、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
ＤＮＡ、ＲＮＡ又はそれらの組合せからなる群から選択される核酸である二次マーカーを検出することによって、検出結果を確認することをさらに含む、請求項１４〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記二次核酸マーカーのレベルが、ゲル電気泳動、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）又はそれらの組合せを用いて検出される、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
[0001]  本出願は、２０１６年１２月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／４４０，９７１号の利益を主張するものであり、この仮特許は、全体が参照により本明細書に援用される。
【０００２】
[0002]  本明細書に記載される主題は、試験薬剤に対する細菌の感受性を決定するための方法、及び標的細菌種が１つ以上の抗菌剤に耐性であるかどうかを決定するための方法に関する。さらなる実施形態は、新しい試験化合物を、それらの抗菌又はプロバイオティック活性についてスクリーニングするための方法であって、食品及び環境試料を含む生体試料におけるこのような薬剤の存在を同定することを含む方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
[0003]  抗生物質ペニシリンの最初の実用化以来、多くの他の抗菌剤が、開発されており、抗菌治療は、現代医学の進歩及び平均寿命の延長に大いに貢献してきた。しかしながら、病原性細菌は、抗菌剤の大部分に対する耐性を獲得しており、それによって、抗菌治療の全般的な有効性が損なわれる一方、新たな公衆衛生問題も生じている。特に、β−ラクタム系抗菌剤への耐性を示すメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）（ＭＲＳＡ）は、高度耐性病原菌である。それは、年間約９４，０００人の新たな入院に直接関連しており、米国だけで年間約１９，０００人の死亡をもたらしている（Voss et al.,International Journal of Antimicrobial Agents,5:101-106,1995；McGeer et al.,LPTP Newsletter,190:1-4,1996；CDC MRSA tracking）。一つには、動物の畜産及び病院における抗生物質の使用の増加により、多剤耐性菌の新種も驚くべき速度で出現している。例えば、ＭＲＳＡ感染のためにバンコマイシンで治療されている患者においてバンコマイシン中間黄色ブドウ球菌（S.aureus）（ＶＩＳＡ）感染の報告があった（Hiramatsu et al.,J Antimicrob Chemother,40(1),135-6,1997；Perichon et al.,Antimicrob Agents Chemother.,53(11):4580-7,2009）。実際に、いくつかの菌株は、市販の薬剤の事実上全てに耐性を有するようになった。悪評の高い事例は、ＭＲＳＡのＭｕ５０菌株であり、これは、アミノグリコシド、マクロライド、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、及びリンコサミドに対しても耐性である（Hiramatsu et al.、上掲）。イソニアジド及びリファンピシンに耐性である多剤耐性ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）も同定されている（Dalton et al.,Lancet,380:1406-17,2012）。
【０００４】
[0004]  食品媒介細菌性疾患（特に、薬剤耐性菌によって引き起こされるもの）は、ヒトの健康にとって重大な脅威となる。大腸菌（E.coli）について野菜サラダ、生卵表面、生の鶏肉、低温殺菌処理されていない牛乳、及び生肉を含む１５０の食品試料を分析する微生物学的研究は、薬剤耐性大腸菌（E.coli）分離株の最も高いパーセンテージが、生の鶏肉（２３．３％）において検出され、続いて、野菜サラダ（２０％）、生肉（１３．３％）、生卵表面（１０％）及び低温殺菌処理されていない牛乳（６．７％）の順であったことを示した。薬剤耐性大腸菌（E.coli）の全発生率は、１４．７％であった（Rasheed et al.,Rev Inst Med Trop Sao Paulo,56(4):341-346,2014）。この研究はさらに、薬剤耐性遺伝子を他の種、例えば、クレブシエラ属（Klebsiella sp.）に移動する薬剤耐性大腸菌（E.coli）の能力によってもたらされる脅威を強調している。
【０００５】
[0005]  増加する科学的証拠は、細菌が、現在使用されている５つの主要な分類の抗菌薬から防護する防御系をいかに進化させているかを指摘している。これらの薬剤は、大きくβ−ラクタム、β−ラクタマーゼ阻害剤、セファロスポリン、キノロン、アミノグリコシド、テトラサイクリン／グリシルサイクリン及びポリミキシンとして分類される。特に、単独で使用される場合の、各薬剤の制限が、以下に概説される。
【０００６】
[0006]  β−ラクタムは、グラム陰性菌感染の主な治療である広域スペクトル薬剤の大分類である。β−ラクタム系薬剤のサブクラスは、狭域スペクトル（ペニシリン）から広域スペクトル（カルバペネム）にわたる。グラム陰性菌は、β−ラクタム耐性へのいくつかの経路を発達させた。おそらく、最も懸念される機構は、β−ラクタム系抗生物質を破壊する酵素であるβ−ラクタマーゼの進化を含む。ある種のβ−ラクタマーゼが、狭域スペクトル薬剤を破壊する（例えば、ペニシリンに対してのみ活性）一方、より新しいβ−ラクタマーゼ（例えば、カルバペネム耐性腸内細菌科（Enterobacteriaceae）又はＣＲＥに見られるカルバペネマーゼ）は、全てのβ−ラクタム系抗生物質を失活させることが可能である。
【０００７】
[0007]  β−ラクタマーゼ阻害剤は、β−ラクタム系抗生物質を破壊する限られた能力を有するβ−ラクタマーゼを有するグラム陰性菌に対してまだ有効である。基質拡張型セファロスポリン及びカルバペネムに耐性である細菌は、通常、これらの薬剤にも同様に耐性である。開発中の新しいβ−ラクタマーゼ阻害剤複合薬は、ＣＲＥに見られるものなどの最も強力なβ−ラクタマーゼからの耐性の全てではないがいくらかを克服する可能性を有する。
【０００８】
[0008]  基質拡張型セファロスポリンは、過去２０年間にわたって重篤なグラム陰性菌感染症の治療の礎となってきた。耐性グラム陰性菌感染は、社会に広がっている。耐性により、多くの場合、カルバペネムが依然として唯一の有効な抗菌剤である。
【０００９】
[0009]  フルオロキノロンは、経口投与されることが多い広域スペクトル抗生物質であり、入院患者及び外来患者の両方において使用するのに便利である。しかしながら、患者集団における使用の増加とともに、薬剤耐性株が急速に進化して、薬剤の効果をなくしている。使用の増加は、クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）の耐性高病原性株によって引き起こされる感染の増加にも関連している。
【００１０】
[0010]  アミノグリコシドは、グラム陰性菌によって引き起こされる感染の治療のために、β−ラクタム系薬剤と併用されることが多い。高まる耐性の懸念にもかかわらず、これらの薬剤は、重篤感染症に対する最終手段としての重要な治療選択肢であり続けている。しかしながら、それらは、耐性及び長引く副作用の懸念のため、臨床医によって単独で使用されることは仮にあるとしても稀である。
【００１１】
[0011]  テトラサイクリンは、重篤なグラム陰性菌感染症の第一治療選択肢ではないが；他の薬剤の種類の有効性が限られる場合、テトラサイクリンは、重篤な感染症を治療するための選択肢と考えられる。グリシルサイクリン（すなわち、チゲサイクリン）は、多剤耐性グラム陰性菌感染の治療のために考えられることが多い。チゲサイクリンは、体内で均一に分配されない薬剤であるため、感染部位に応じて他の薬剤と組み合わせて使用されることが多い。比較的稀ではあるが、チゲサイクリンに耐性である菌株の発生が報告されている。
【００１２】
[0012]  ポリミキシンは、毒性の懸念のために人気が落ちたより古い種類である。現在、ポリミキシンは、多剤耐性グラム陰性菌感染の治療のための「最終手段」の薬剤として使用されることが多い。これらは、ジェネリック医薬品であるため、薬量測定及び有効性についての最新データが限られている。さらに、高度耐性株の検出に関するいくらかのデータがあるが、限られている。
【００１３】
[0013]  細菌の薬剤耐性株の数の急増を考えると、細菌、特に、ＥＳＫＡＰＥグループに属する細菌（エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）、アシネトバクター・バウマニ（Acinetobacter baumannii）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）及びエンテロバクター属（Enterobacter）種）の臨床及び非臨床分離株の両方を同定し、核型分析するための新たな効率的な方法に対する差し迫った必要性がある（Boucher et al.,Clinical Infections,48:1-12,2009）。迅速で正確な病原体同定も、感染症（生命に関わるおそれのあるものを含む）に、医師が適切に対応し、対処するのを可能にするために必要とされる。現在、病原体同定は、固体培地（寒天ベースのプレート）における培養、続いて、さらなる一連の、特定の細菌産物の培養物中での複製又は精製を通常必要とする診断分析を必要とする。よくても、微生物同定は何日も要し、その間、さらなるレベルのバイオセーフティ封じ込めが、病原体の全体的な分類に応じて必要とされ得る。この生物学的な、増殖に基づくアッセイの第二世代バージョンは、細菌集団が肉眼で見えるのに十分な密度に達するのを待たずに、細菌を増殖させることによって産生される代謝産物を測定するための放射分析（例えば、Becton Dickinson’s BACTEC（商標））又は比色分析／蛍光分析（例えば、Becton Dickinson’s MGIT（商標）及びBiomerieux’s BACT ALERT（登録商標））デバイスを用いることによって、微生物同定並びに耐性試験の両方の検出時間を速める。しかしながら、これらのアッセイシステムは、しばしば汚染問題に直面し、それによって、再処理の必要性を増加させ、不必要な遅延をもたらす（Tortoli et al.,J.Clin. Microbiol.,40:607-610,2002）。
【００１４】
[0014]  薬剤耐性細菌の生物学的検出を速めるためのより最近の手法は、抗菌剤が分離株に与える影響を調べるのにバクテリオファージを使用することに焦点を当てている（Schofield et al.,Bacteriophage,2(2):105-283,2012及び国際公開第０８／１２４１１９号）。ファージは、細菌を感染させ、複製するための宿主の細胞生合成機構を乗っ取るのに使用され、それによって、臨床材料中の特定の細菌株の存在を同定するための手段として働く。様々な方法が、ファージの検出に用いられ得る。ある方法は、核酸増幅の使用に依存する（米国特許出願公開第２０１４−０２５６６６４号及び国際公開第１２／１５８５０２号）。この方法では、結核菌（M.tuberculosis）の薬剤感受性が、マイコバクテリオファージＤ２９  ＤＮＡのリアルタイムＰＣＲ産物を分析することによってスクリーニングされる。
【００１５】
[0015]  関連する方法は、二次培養物を、ファージ担持細菌に感染させ、二次培養物の増殖特性を分析することに依存する。この方法は、典型的に、薬剤耐性結核菌（M.tuberculosis）を同定するのに使用される。この間接的な検出方法に基づいた例示的な市販のキットは、商標FASTPLAQUE-RESPONSE（商標）でBiotec,Inc.（Suffolk,UK）によって販売されている（Mole et al.,J Med Microbiol.,56(Pt 10):1334-9,2007；Albert et al.,J Appl Microbiol.,103(4):892-9,2007）。また、このキットには、マイコバクテリオファージＤ２９が提供されるが、Ｄ２９  ＤＮＡの直接ＰＣＲ分析と対照的に、この方法は、細菌を感染させなかったファージを除去するための殺ウイルス剤を使用することによって偽陽性を最小限に抑えようとする。感染したマイコバクテリウムについてスクリーニングした後、ファージ感染した結核菌（M.tuberculosis）は、高速複製スメグマ菌（M.smegmatis）と組み合わせられ、次に、混合物が、寒天皿上で平板培養される。このアッセイシステムは、スメグマ菌（M.smegmatis）が、Ｄ２９によって効率的に交差感染され、各プラークがＤ２９によって最初に感染された結核菌（M.tuberculosis）細胞を表すように、スメグマ菌（M.smegmatis）細菌叢上に明瞭で視認できるプラークを形成するという原理に基づいている。したがって、このアッセイは、結核菌（M.tuberculosis）の小さいプール中のＤ２９複製を定量的に測定する。このアッセイは、正確で迅速な試験ではあるが、過度に複雑であり、寒天プレート上のプラーク形成によるウイルス増殖の分析が熟練技術者によって実験室中で行われなければならないため、リソースの少ない環境で使用するには扱いにくい。さらに、このアッセイに利用可能な二次的な急速増殖細菌の数は限られており、アッセイは、多数の標的細菌種をスクリーニングするためにカスタマイズも修正もできない。
【００１６】
[0016]  同様に、例えば、操作されたマイコバクテリオファージＴＭ４を用いた、元のルシフェラーゼレポーターアッセイ（ＬＲＡ）における変化も、検出の感度に関して制限される。Piuri et al.,PLoS One,2009;4(3):e4870を参照されたい（この文献では、フルオロファージ（フルオロマイコバクテリオファージ）が、感染の１６時間後に結核菌（M.tuberculosis）細胞の５０％のみを検出することができた）。また、このアッセイは、小さい試料において発現される蛍光又は発光マーカーの検出を含むため、アッセイは、分析され得る試料のタイプに関して制限される。
【００１７】
[0017]  要約すると、薬剤耐性細菌を同定する現在の手法は、例えば、細菌が有する耐性のタイプに基づいた、多種多様な細菌（その混合物を含む）の表現型分析のための効率的で有効な手段に対する現在の必要性を満たすことができない。したがって、抗菌剤に対する特定の細菌株の感受性をスクリーニングするのに有用なアッセイシステムに対する差し迫った必要性がある。このようなアッセイ技術は、コレラ、髄膜炎、肺炎などの多くのヒト及び動物疾患の診断、治療及び管理と有効に組み合わされ得る。このようなシステム及びアッセイは、工業的に有用な微生物、例えば、大腸菌（E.coli）、Ｒ．ユートロファ（R.eutropha）、Ｓ．カルノスス（S.carnosus）などの増殖を補うのに使用され得るプロバイオティクスのスクリーニングにも使用され得る。
【発明の概要】
【００１８】
[0018]  したがって、現在利用可能な技術によって提供される選択的な微生物（例えば、細菌）検出のための、低コストの、より効率的な、より特異的な、より迅速な、より入手しやすい、適合性がより良好な方法及び装置を提供することが目的である。したがって、抗生物質に対する細菌の耐性を決定するため、及び微生物種の同定のための方法が提供される。本方法は、バクテリオファージの、それらの対応する宿主細菌に対する固有の特異性を利用する。一実施形態において、感染を引き起こす細菌種の同定、及び同定された細菌種の、抗菌剤又は抗生物質薬剤に対する感受性の同時の決定を提供する方法が提供される。
【００１９】
[0019]  上記によれば、実施形態は、組み換えバクテリオファージ、このような組み換えバクテリオファージを構築及び生成するための方法、並びに標的細菌を検出し、及び／又は標的細菌が耐性である薬剤又は抗生物質を決定するための、このような組み換えバクテリオファージの使用のための方法を提供する。この組成物及び方法はまた、実験室レベル又は工業規模での、酵素、ホルモン、抗体、核酸、糖、及び他の生体分子の生合成に有用な新たなプロバイオティック薬剤をスクリーニングするように構成され得る。
【００２０】
[0020]  一実施形態によれば、例えば、標的化された生菌における特定の分子、例えば、タンパク質などのマーカーの存在を調べることによって、特定のタイプの細菌を検出することが可能な生成物、キット、及び方法である。薬剤耐性株が同定されたら、本方法は、例えば、薬剤耐性機構のための分子基盤、例えば、遺伝子突然変異、遺伝子重複、形質転換、抗生物質分解などを同定するための他の技術と組み合わされ得る。イムノアッセイによって検出可能な、異種ペプチド／タンパク質マーカーの遺伝子を含む組み換えファージの本発明に係る利用は、上記の目的を達成する。
【００２１】
[0021]  一実施形態において、試料中の細菌種を同定するための方法が提供される。本方法は、試料、又は試料のアリコートを、異種タンパク質マーカーを発現するように形質転換されたバクテリオファージとともに培養又はインキュベートして、形質転換された培養物を形成し、異種タンパク質マーカーの存在又は非存在について形質転換された培養物をアッセイすることを含む。マーカーの存在は、細菌種の存在を示す。一実施形態において、アッセイは、側方流動イムノアッセイを用いて行われる。
【００２２】
[0022]  一実施形態において、バクテリオファージは、溶解性バクテリオファージ、溶原性バクテリオファージ、及び繊維状バクテリオファージからなる群から選択される。
【００２３】
[0023]  別の実施形態において、溶解性バクテリオファージは、Ｔ４、Ｔ７、Ｔ３、及びＭＳ２からなる群から選択される。
【００２４】
[0024]  別の実施形態において、溶原性バクテリオファージは、λファージである。
【００２５】
[0025]  別の実施形態において、繊維状バクテリオファージは、ｆ１、ｆｄ、及びＭ１３からなる群から選択される。
【００２６】
[0026]  別の実施形態において、マーカーは、細菌中の核酸又はタンパク質中で発現可能である。
【００２７】
[0027]  別の実施形態において、マーカーは、抗原、酵素、抗体又はそのフラグメント、及びアプタマー、又はそれらの組合せからなる群から選択されるポリペプチド中で発現可能である。
【００２８】
[0028]  別の実施形態において、タンパク質マーカーは、検出可能な標識を含む。
【００２９】
[0029]  別の実施形態において、タンパク質マーカー又はマーカーにおける検出可能な標識は、蛍光アッセイ、化学発光アッセイ、酵素アッセイ、ゲル電気泳動、イムノアッセイ、及びリガンド結合アッセイから選択されるアッセイを用いて検出される。
【００３０】
[0030]  別の実施形態において、タンパク質マーカーにおける検出可能な標識は、側方流動イムノアッセイを用いて検出される。
【００３１】
[0031]  別の実施形態において、インキュベートすることは、抗菌剤の存在下でインキュベートすることをさらに含み、ここで、異種タンパク質マーカーの発現が、抗菌剤に対する細菌の耐性を示す。
【００３２】
[0032]  別の態様において、試料中の細菌種の同時の同定及び抗菌剤に対するその感受性の決定のための方法が提供される。本方法は、（ａ）試料又は試料のアリコートを、抗菌剤とともに培養して、一次培養物を生成することと；（ｂ）一次培養物を、細菌種に特異的であり、かつ異種マーカーを発現するように操作された形質転換ファージとともに培養することと；（ｃ）マーカーの存在又は非存在を検出することとを含み、ここで、マーカーの存在が、試料中の細菌種の存在及び抗菌剤に対するその耐性を示す。
【００３３】
[0033]  別の態様において、試料中の細菌種の同時の同定及び抗菌剤に対するその感受性の決定のための方法が提供される。本方法は、（ａ）試料のアリコートを、抗菌剤とともに及び抗菌剤を用いずに培養して、一次培養物の組を生成することと；（ｂ）一次培養物の前記組の一部を、細菌種に特異的であり、かつ異種マーカーを発現するように操作された形質転換ファージとともに又はそれを用いずに培養し、それによって、複数の形質転換二次培養物を生成することであって、第１の形質転換二次培養物が、抗菌剤とともに培養された形質転換細菌を含み、第２の形質転換二次培養物が、抗菌剤とともに培養されていない形質転換細菌を含むことと；（ｃ）異種マーカーの存在又は非存在を検出することと、を含み、ここで、マーカーの存在が、試料中の細菌種の存在及び抗菌剤に対するその耐性を示す。
【００３４】
[0034]  さらに別の態様において、試験抗菌剤に対する細菌の感受性を決定するための方法が提供される。本方法は、（ａ）細菌を、抗菌剤の存在下及び非存在下で培養して、一次培養物を生成することと；（ｂ）この細菌に特異的であり、かつマーカーを含む形質転換ファージの存在下及び非存在下で一次培養物を培養し、それによって、複数の形質転換二次培養物を生成することであって、第１の形質転換二次培養物が、試験抗菌剤で処理された形質転換細菌を含み、第２の形質転換二次培養物が、抗菌剤で処理されていない形質転換細菌を含むことと；（ｃ）前記第１及び第２の形質転換二次培養物のそれぞれにおける前記マーカーのレベル又は活性を検出し、それによって、前記抗菌剤に対する前記細菌の感受性を検出することと、を含む。
【００３５】
[0035]  一実施形態において、試験抗菌剤に対する細菌の感受性を決定するための方法が提供され、本方法は、（ａ）細菌を、抗菌剤の存在下及び／又は非存在下で培養して、複数の一次培養物を生成することと；（ｂ）（ａ）の一次培養物を、この細菌に特異的であり、かつマーカーを含む形質転換ファージの存在下又は非存在下で培養し、それによって、複数の二次培養物を生成することであって、第１の形質転換二次培養物が、試験抗菌剤で処理された形質転換細菌を含み、第２の形質転換二次培養物が、抗菌剤で処理されていない形質転換細菌を含むことと；（ｃ）第１及び第２の形質転換二次培養物のそれぞれにおけるマーカーのレベル又は活性を検出し、それによって、抗菌剤に対する細菌の感受性を決定することとを含む。この実施形態下で、工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は、連続的に又は非連続的に行われ得る。特定の実施形態において、工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は、連続的に行われる。
【００３６】
[0036]  関連する実施形態において、試験抗菌剤に対する細菌の感受性を決定するための方法が提供される。本方法は、（ａ）細菌を、抗菌剤の存在下及び／又は非存在下で培養して、複数の一次培養物を生成することと；（ｂ）（ａ）の一次培養物を、この細菌に特異的であり、かつマーカーを含む形質転換ファージの存在下又は非存在下で培養し、それによって、複数の二次培養物を生成することであって、第１の形質転換二次培養物が、試験抗菌剤で処理された形質転換細菌を含み、第２の形質転換二次培養物が、抗菌剤で処理されていない形質転換細菌を含むことと；（ｃ）第１及び第２の形質転換二次培養物のそれぞれにおけるマーカーのレベル又は活性を検出することと、を含み、ここで、第２の形質転換二次培養物（対照）におけるマーカーのレベル又は活性と比較した、第１の形質転換二次培養物におけるマーカーのレベル又は活性の低下は、細菌が試験抗菌剤に感受性であることを示す。
【００３７】
[0037]  別の関連する実施形態において、試験抗菌剤に対する細菌の感受性を決定するための方法が提供される。本方法は、（ａ）細菌を、抗菌剤の存在下及び／又は非存在下で培養して、複数の一次培養物を生成することと；（ｂ）（ａ）の一次培養物を、この細菌に特異的であり、かつマーカーを含む形質転換ファージの存在下又は非存在下で培養し、それによって、複数の二次培養物を生成することであって、第１の形質転換二次培養物が、試験抗菌剤で処理された形質転換細菌を含み、第２の形質転換二次培養物が、抗菌剤で処理されていない形質転換細菌を含むことと；（ｃ）第１及び第２の形質転換二次培養物のそれぞれにおけるマーカーのレベル又は活性を検出することと、を含み、ここで、第２の形質転換二次培養物（対照）におけるマーカーのレベル又は活性と比較した、第１の形質転換二次培養物におけるマーカーのレベル又は活性の均一性（例えば、変化なし）又は増加は、細菌が、試験抗菌剤に感受性でないか又は試験抗菌剤に耐性であることを示す。
【００３８】
[0038]  別の実施形態において、細菌に対する試験薬剤のプロバイオティック効果を決定するための方法が提供される。本方法は、（ａ）この薬剤の存在下及び／又は非存在下で細菌を培養して、複数の一次培養物を生成することと；（ｂ）（ａ）の一次培養物を、この細菌に特異的であり、かつマーカーを含む形質転換ファージの存在下又は非存在下で培養し、それによって、複数の二次培養物を生成することであって、第１の形質転換二次培養物が、試験薬剤で処理された形質転換細菌を含み、第２の形質転換二次培養物が、試験薬剤で処理されていない形質転換細菌を含むことと；（ｃ）第１及び第２の形質転換二次培養物のそれぞれにおけるマーカーのレベル又は活性を検出することと、を含み、ここで、第２の形質転換二次培養物（対照）におけるマーカーのレベル又は活性と比較した、第１の形質転換二次培養物におけるマーカーのレベル又は活性の増加は、試験薬剤が、プロバイオティック効果を有することを示す。
【００３９】
[0039]  別の実施形態において、試験抗菌剤に対するグラム陽性菌又はグラム陰性菌の感受性を決定するための方法が提供される。本方法は、（ａ）抗菌剤の存在下及び／又は非存在下で、グラム陽性菌又はグラム陰性菌を培養して、複数の一次培養物を生成することと；（ｂ）（ａ）の一次培養物を、グラム陽性菌又はグラム陰性菌に特異的であり、かつマーカーを含む形質転換ファージの存在下又は非存在下で培養し、それによって、複数の二次培養物を生成することであって、第１の形質転換二次培養物が、試験抗菌剤で処理された形質転換グラム陽性菌又はグラム陰性菌を含み、第２の形質転換二次培養物が、抗菌剤で処理されていない形質転換グラム陽性菌又はグラム陰性菌を含むことと；（ｃ）第１及び第２の形質転換二次培養物のそれぞれにおけるマーカーのレベル又は活性を検出し、それによって、抗菌剤に対するグラム陽性菌又はグラム陰性菌の感受性を決定することとを含む。
【００４０】
[0040]  一実施形態において、細菌は、アシネトバクター・バウマニ（Acinetobacter baumannii）、炭疽菌（Bacillus anthracis）、セレウス菌（Bacillus cereus）、百日咳菌（Bordetella pertussis）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）、ブルセラ・アボルツス（Brucella aborus）、イヌ流産菌（Brucella canis）、マルタ熱菌（Brucella melitensis）、ブタ流産菌（Brucella suis）、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）、クラミジア肺炎菌（Chlamydia pneumoniae）、オウム病クラミジア（Chlamydia psittaci）、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）、ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）、クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）、破傷風菌（Clostridium tetani）、ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）、エンテロバクター属（Enterobacter sp.）、大便レンサ球菌（Enterococcus faecalis）、バンコマイシン耐性大便レンサ球菌（Enterococcus faecalis）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、大腸菌（Escherichia coli）、腸管毒素原性大腸菌（Escherichia coli）（ＥＴＥＣ）、腸内病原性大腸菌（Escherichia coli）、大腸菌（E.coli）Ｏ１５７：Ｈ７、野兎病菌（Francisella tularensis）、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、ピロリ菌（Helicobacter pylori）、肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）、レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）、レプトスピラ・インタロガンス（Leptospira interrogans）、リステリア菌（Listeria monocytogenes）、らい菌（Mycobacterium leprae）、ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、マイコプラズマ肺炎菌（Mycoplasma pneumoniae）、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、プロテウス属（Proteus）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、リケッチア・リケッチイ（Rickettsia rickettsii）、チフス菌（Salmonella typhi）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、ソンネ赤痢菌（Shigella sonnei）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermis）、スタフィロコッカス・サプロフィティクス（Staphylococcus saprophyticus）、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）（ＭＲＳＡ）、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）（ＶＳＡ）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Streptococcus agalactiae）、肺炎レンサ球菌（Streptococcus pneumoniae）、化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）、梅毒トレポネーマ（Treponema pallidum）、コレラ菌（Vibrio cholerae）、及びペスト菌（Yersinia pestis）からなる群から選択される。
【００４１】
[0041]  別の実施形態において、細菌は、エンテロコッカス属（Enterococcus sp.）、エシェリキア属（Escherichia sp.）、スタフィロコッカス属（Staphylococcus sp.）、クレブシエラ属（Klebsiella sp.）、アシネトバクター属（Acinetobacter sp.）、シュードモナス属（Pseudomonas sp.）及びエンテロバクター属（Enterobacter sp.）からなる群から選択される。
【００４２】
[0042]  別の実施形態において、試験抗菌剤に対する、表１〜３のいずれか１つに列挙される細菌の感受性を決定するための方法であって、（ａ）表１〜３のいずれか１つに列挙される細菌を、抗菌剤の存在下又は非存在下で培養して、複数の一次培養物を生成することと；（ｂ）（ａ）の一次培養物を、この細菌に特異的であり、かつ異種マーカーの発現のための配列を含む、表１〜３のいずれか１つに列挙される形質転換ファージの存在下又は非存在下で培養し、それによって、複数の二次培養物を生成することであって、第１の形質転換二次培養物が、試験抗菌剤で処理された形質転換細菌を含み、第２の形質転換二次培養物が、抗菌剤で処理されていない形質転換細菌を含むことと；（ｃ）第１及び第２の形質転換二次培養物のそれぞれにおけるマーカーのレベル又は活性を検出し、それによって、抗菌剤に対する細菌の感受性を決定することとを含む方法が提供される。この実施形態の下で、細菌は、炭疽菌（Bacillus anthracis）、枯草菌（Bacillus subtilis）、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）、大腸菌（Escherichia coli）、ラクトバチルス・デルブルエッキイ（Lactobacillus delbrueckii）、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、乳酸レンサ球菌（Lactococcus lactis）、リステリア菌（Listeria monocytogenes）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、シュードモナス・シリンガエ（Pseudomonas syringae）、クレブシエラ属（Klebsiella）、サルモネラ属（Salmonella）、シゲラ属（Shigella）、及び黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）からなる群から選択され得る。
【００４３】
[0043]  別の実施形態において、試験抗菌剤に対する細菌の感受性を決定するための方法が提供される。本方法は、（ａ）細菌を、抗菌剤の存在下及び／又は非存在下で培養して、複数の一次培養物を生成することと；（ｂ）（ａ）の一次培養物を、この細菌に特異的であり、かつ異種マーカーを含む、形質転換組み換え又は遺伝子操作ファージの存在下又は非存在下で培養し、それによって、複数の二次培養物を生成することであって、第１の形質転換二次培養物が、試験抗菌剤で処理された形質転換細菌を含み、第２の形質転換二次培養物が、抗菌剤で処理されていない形質転換細菌を含むことと；（ｃ）第１及び第２の形質転換二次培養物のそれぞれにおけるマーカーのレベル又は活性を検出し、それによって、抗菌剤に対する細菌の感受性を決定することと、を含む。
【００４４】
[0044]  一実施形態において、組み換え又は遺伝子操作ファージは、（ａ）溶解性又は生産性ファージ；（ｂ）溶原性（temperate又はlysogenic）ファージ；及び（ｃ）繊維状ファージからなる群から選択され得る。
【００４５】
[0045]  特定の一実施形態において、組み換え又は遺伝子操作ファージは、Ｔ４、Ｔ７、Ｔ３、及びＭＳ２からなる群から選択される溶解性又は生産性ファージである。第２の特定の実施形態において、組み換え又は遺伝子操作ファージは、溶原性（temperate又はlysogenic）λファージである。第３の特定の実施形態において、組み換え又は遺伝子操作ファージは、ｆ１、ｆｄ、及びＭ１３からなる群から選択される繊維状ファージである。本方法は、様々なファージの組合せを用いて実施され得る。
【００４６】
[0046]  別の実施形態において、試験抗菌剤に対する細菌の感受性を決定するための方法が提供される。本方法は、（ａ）細菌を、抗菌剤の存在下及び／又は非存在下で培養して、複数の一次培養物を生成することと；（ｂ）（ａ）の一次培養物を、この細菌に特異的であり、かつ細菌細胞中の核酸又はポリペプチド産物中で発現可能なマーカーを含む形質転換ファージの存在下又は非存在下で培養し、それによって複数の二次培養物を生成することであって、第１の形質転換二次培養物が、試験抗菌剤で処理された形質転換細菌を含み、第２の形質転換二次培養物が、抗菌剤で処理されていない形質転換細菌を含むことと；（ｃ）第１及び第２の形質転換二次培養物のそれぞれにおけるマーカーのレベル又は活性を検出し、それによって、抗菌剤に対する細菌の感受性を決定することと、を含む。特定の実施形態において、マーカーは、抗原、酵素、抗体又はそのフラグメント、及びアプタマー、又はそれらの組合せからなる群から選択されるポリペプチド中で発現可能である。
【００４７】
[0047]  ある実施形態において、発現されるポリペプチドマーカーは、検出可能な標識を含み得る。他の実施形態において、ポリペプチドマーカーは、蛍光アッセイ、化学発光アッセイ、酵素アッセイ、ゲル電気泳動、イムノアッセイ、リガンド結合アッセイ、クロマトグラフアッセイ、分光法、又はそれらの組合せから選択されるアッセイを用いて検出され得る。特に、発現されるポリペプチドマーカーは、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）又は側方流動イムノアッセイを用いて検出される。特定の実施形態において、本方法は、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はそれらの組合せからなる群から選択される核酸である二次マーカーを検出することによって、検出結果を確認することをさらに含む。最初の検出が確認されるこのような実施形態において、二次核酸マーカーは、ゲル電気泳動、核酸増幅技術、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）又はそれらの組合せを用いて検出され得る。
【００４８】
[0048]  別の実施形態において、試験抗菌剤に対する細菌の感受性を決定するための方法であって、（ａ）抗菌剤の存在下又は非存在下で細菌を培養して、複数の一次培養物を生成することと；（ｂ）（ａ）の一次培養物を、この細菌に特異的であり、かつ（１）抗体に特異的に結合する抗原又は（２）反応を触媒する酵素である異種タンパク質をコードする核酸を含む形質転換ファージの存在下又は非存在下で培養し、それによって、複数の二次培養物を生成することであって、第１の形質転換二次培養物が、試験抗菌剤で処理された形質転換細菌を含み、第２の形質転換二次培養物が、抗菌剤で処理されていない形質転換細菌を含むことと；（ｃ）第１及び第２の形質転換二次培養物のそれぞれにおけるマーカーのレベル又は活性を検出し、それによって、抗菌剤に対する細菌の感受性を決定することとを含む方法が提供される。異種タンパク質が（１）抗体に特異的に結合する抗原である、この実施形態の下で、検出工程は、イムノアッセイを用いてタンパク質のレベルを検出することを含む。さらに、異種タンパク質が（２）反応を触媒する酵素であるこの実施形態の下で、検出工程は、酵素アッセイを用いてタンパク質の活性を検出することを含む。
【００４９】
[0049]  関連する実施形態において、標的細菌標本に対する抗菌活性について試験薬剤をスクリーニングするための方法であって、（ａ）標的細菌を、試験薬剤の存在下又は非存在下で培養して、複数の一次培養物を生成することと；（ｂ）（ａ）の一次培養物を、この細菌に特異的であり、かつマーカーを含む形質転換ファージの存在下又は非存在下で培養し、それによって、複数の二次培養物を生成することであって、第１の形質転換二次培養物が、試験薬剤で処理された形質転換細菌を含み、第２の形質転換二次培養物が、試験薬剤で処理されていない形質転換細菌を含むことと；（ｃ）第１及び第２の形質転換二次培養物のそれぞれにおけるマーカーのレベル又は活性を検出することとを含み、ここで、第２の形質転換二次培養物（対照）におけるマーカーのレベル又は活性と比較した、第１の形質転換二次培養物におけるマーカーのレベル又は活性の低下は、試験薬剤が抗菌活性を有することを示す方法が提供される。
【００５０】
[0050]  別の実施形態は、食品試料中の抗生物質薬剤の存在又は非存在を決定するための方法であって、（ａ）複数の細菌培養物中で食品試料を培養し、それによって、複数の一次培養物を生成することとであって、第１の培養物が、抗生物質に感受性である細菌を含み、第２の培養物が、抗生物質に耐性である細菌を含むことと；（ｂ）（ａ）の一次培養物を、この細菌に特異的であり、かつマーカーを含む形質転換ファージの存在下又は非存在下で培養し、それによって、複数の二次培養物を生成することであって、第１の形質転換二次培養物が、抗生物質薬剤に感受性である形質転換細菌を含み、第２の形質転換二次培養物が、抗生物質薬剤に耐性である形質転換細菌を含むことと；（ｃ）第１及び第２の形質転換二次培養物のそれぞれにおけるマーカーのレベル又は活性を検出することとを含み、ここで、第２の形質転換二次培養物（対照）におけるマーカーのレベル又は活性と比較した、第１の形質転換二次培養物におけるマーカーのレベル又は活性の低下は、食品試料が抗生物質薬剤を含むことを示す方法である。この実施形態の下で、感受性細菌及び耐性細菌は、同じ菌株に属する。さらに、耐性細菌は、抗菌剤に対する耐性を与える組み換え遺伝子を含む感受性細菌の突然変異体であり得る。
【００５１】
[0051]  別の実施形態は、標的細菌標本に対する抗菌剤の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を決定するための方法であって、（ａ）様々な濃度の抗菌剤の非存在下又は存在下で標的細菌を培養して、複数の一次培養物を生成することと；（ｂ）（ａ）の一次培養物を、この細菌に特異的であり、かつマーカーを含む形質転換ファージの存在下又は非存在下で培養し、それによって、複数の二次培養物を生成することであって、実験群が、様々な濃度の抗菌剤で処理された形質転換細菌を含み、対照群が、試験薬剤で処理されていない形質転換細菌を含むことと；（ｃ）実験群及び対照群のそれぞれにおけるマーカーのレベル又は活性を検出することと、を含み、抗菌剤が、対照群におけるマーカーの閾値レベル又は活性と比較して、マーカーのレベル又は活性を低下させることが可能である最小濃度が、ＭＩＣを示す方法に関する。関連する実施形態において、２つ以上の抗菌剤の相加的活性、超相加的活性、相乗的活性、又は拮抗活性を決定するための方法であって、上記に係る各抗菌剤の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を決定し、上記に係る各薬剤の最小発育阻止濃度を含む組合せの阻害効果を決定することと；組合せの阻害効果を、単一の薬剤の阻害効果と比較し、それによって、２つ以上の抗菌剤の相加的活性、超相加的活性、相乗的活性、又は拮抗活性を決定することとを含む方法が提供される。
【００５２】
[0052]  さらに別の実施形態は、必要とする対象の細菌性疾患の診断及び治療のための方法であって、（ａ）細菌を含む複数の対象試料を培養して、複数の一次細菌培養物を生成することと；（ｂ）（ａ）の一次培養物を、それぞれが、細菌に特異的であり、かつ独自のポリペプチドマーカーをコードする核酸を含む複数の形質転換ファージの存在下で培養し、それによって、複数の二次培養物を生成することと；（ｃ）免疫検出によって、二次培養物中の独自のポリペプチドマーカーを検出することと；（ｄ）マーカーの検出を細菌と相関させることと；（ｅ）細菌の存在を、細菌性疾患と相関させることと；（ｆ）任意選択的に、検出された細菌に特異的な抗生物質薬剤を対象に投与し、それによって、細菌性疾患を治療することと、を含む方法に関する。
【００５３】
図面の簡単な説明
[0053]  本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、添付の図面／表及び以下の説明に記載される。本発明の他の特徴、目的、及び利点は、図面／表及び詳細な説明、並びに特許請求の範囲から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】[0054]図１は、本明細書に記載される方法の一実施形態に係る例示的なワークフローを示す。
【図２】[0055]図２は、本明細書に記載される方法の別の実施形態に係る例示的なワークフローを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
[0056]  本明細書に記載される実施形態は、組み換えバクテリオファージを用いた、細菌感染性因子及び疾患の診断又は検出のための方法及びアッセイを提供する。本方法はまた、細菌感染性因子の検出、及びさらにこのような感染性因子の薬剤耐性を決定するのに好適である。さらに、本方法は、抗菌剤に対する感染性因子の感受性に関する情報を提供するのに使用される。
【００５６】
Ａ．感染性細菌
[0057]  基本的にあらゆる細菌が、検出可能であり、本方法及び組成物は、細菌の抗生物質感受性を決定するため、又は標的細菌に対する望ましい（例えば、抗菌若しくは細胞毒性）効果を発揮する候補抗生物質薬剤をスクリーニングするために使用され得る。
【００５７】
[0058]  一実施形態において、細菌は、グラム陰性菌である。典型的なグラム陰性菌としては、大腸菌（E.coli）、サルモネラ属（Salmonella）、シュードモナス属（Pseudomonas）、及びヘリコバクター属（Helicobacter）などのプロテオバクテリア、並びにシアノバクテリアが挙げられる。医薬に関連して分類される場合、グラム陰性菌としては、呼吸器系の障害を引き起こす緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）及びインフルエンザ菌（Hemophilus influenzae）、泌尿器系の障害を引き起こす大腸菌（Escherichia coli）及びプロテウス・ミラビリス（Proteus mirabilis）、並びに消化器系の障害を引き起こすピロリ菌（Helicobacter pylori）及びゲルトネル菌（Bacillus Gaertner）、並びにミクロコッカス属（micrococci）、例えば、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、モラクセラ・カタラーリス（Moraxella catarrhalis）、及び淋菌（Neisseria gonorrhea）が挙げられる。
【００５８】
[0059]  別の実施形態において、細菌は、グラム陽性菌である。「グラム陽性菌」とは、その細胞壁中にタイコ酸（例えば、リポタイコ酸及び／又は細胞壁タイコ酸）、又は機能的に同等の糖重合体（例えば、ラムノポリサッカライド（rhamnopolysaccharide）、タイクロン酸、アラビノガラクタン、リポマンナン、及びリポアラビノマンナン）を含有する１つ又は複数の細菌を意味する。機能的に同等の糖重合体の非限定的な例が、Weidenmaier et al.,Nature,6:276-287,2008に記載されている。機能的に同等の糖重合体のさらなる例が、当該技術分野において公知である。ある実施形態において、グラム陽性菌は、グラム染色方法（例えば、一般に、クリスタルバイオレットで染色する工程と、ヨウ素溶液で処理する工程と、アルコールで脱色する工程と、サフラニンで対比染色する工程とを含み、ここで、グラム陽性菌は、紫色の菌株を保持する）を用いて同定される。グラム陽性菌の非限定的な例が、本明細書に記載される。グラム陽性菌のさらなる例が、当該技術分野において公知である。グラム陽性菌を検出又は同定するための例示的な方法が、本明細書に記載される。グラム陽性菌を検出又は同定するためのさらなる方法が、当該技術分野において公知である。
【００５９】
[0060]  標的細菌としては、哺乳動物宿主（例えば、ウシ亜科動物、マウス、ウマ科動物、霊長類、ネコ科動物、イヌ科動物、及びヒト宿主）を感染させる病原性細菌が挙げられる。一実施形態において、細菌は、ヒト宿主を感染させ、及び／又はヒト宿主において疾患を引き起こす。このような病原性細菌の例としては、例えば、バクテロイデス属（Bacteroides）、クロストリジウム属（Clostridium）、ストレプトコッカス属（Streptococcus）、スタフィロコッカス属（Staphylococcus）、シュードモナス属（Pseudomonas）、ヘモフィルス属（Haemophilus）、レジオネラ属（Legionella）、マイコバクテリウム属（Mycobacterium）、エシェリキア属（Escherichia）、サルモネラ属（Salmonella）、シゲラ属（Shigella）、ビブリオ属（Vibrio）、又はリステリア属（Listeria）などの細菌種のメンバーが挙げられる。ヒト宿主において疾患を引き起こす病原性細菌のいくつかの臨床的に関連する例としては、限定はされないが、炭疽菌（Bacillus anthracis）、セレウス菌（Bacillus cereus）、百日咳菌（Bordetella pertussis）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）、ブルセラ・アボルツス（Brucella aborus）、イヌ流産菌（Brucella canis）、マルタ熱菌（Brucella melitensis）、ブタ流産菌（Brucella suis）、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）、クラミジア肺炎菌（Chlamydia pneumoniae）、オウム病クラミジア（Chlamydia psittaci）、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）、ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）、クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）、破傷風菌（Clostridium tetani）、ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）、大便レンサ球菌（Enterococcus faecalis）、バンコマイシン耐性大便レンサ球菌（Enterococcus faecalis）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、大腸菌（Escherichia coli）、腸管毒素原性大腸菌（Escherichia coli）（ＥＴＥＣ）、腸内病原性大腸菌（Escherichia coli）、大腸菌（E.coli）Ｏ１５７：Ｈ７、野兎病菌（Francisella tularensis）、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、ピロリ菌（Helicobacter pylori）、レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）、レプトスピラ・インタロガンス（Leptospira interrogans）、リステリア菌（Listeria monocytogenes）、らい菌（Mycobacterium leprae）、ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、マイコプラズマ肺炎菌（Mycoplasma pneumoniae）、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、プロテウス属（Proteus）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、リケッチア・リケッチイ（Rickettsia rickettsii）、チフス菌（Salmonella typhi）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、ソンネ赤痢菌（Shigella sonnei）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermis）、スタフィロコッカス・サプロフィティクス（Staphylococcus saprophyticus）、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）（ＭＲＳＡ）、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）（ＶＳＡ）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Streptococcus agalactiae）、肺炎レンサ球菌（Streptococcus pneumoniae）、化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）、梅毒トレポネーマ（Treponema pallidum）、コレラ菌（Vibrio cholerae）、及びペスト菌（Yersinia pestis）が挙げられる。
【００６０】
[0061]  別の実施形態において、感染性細菌は、クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）、カルバペネム耐性腸内細菌科（Enterobacteriaceae）（ＣＲ−クレブシエラ属（Klebsiella spp）；ＣＲ−大腸菌（E.coli））、及び淋菌（Neisseria gonorrhoeae）からなる群から選択される。別の実施形態において、感染性細菌は、多剤耐性アシネトバクター属（Acinetobacter）、薬剤耐性カンピロバクター属（Campylobacter）、基質拡張型β−ラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）産生腸内細菌科（enterobacteriaceae）、バンコマイシン耐性エンテロコッカス属（enterococcus）、多剤耐性緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、薬剤耐性非チフス性サルモネラ属（Salmonella）、薬剤耐性チフス菌（Salmonella enterica serovar Typhi）、薬剤耐性シゲラ属（Shigella）、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）（ＭＲＳＡ）、薬剤耐性肺炎レンサ球菌（Streptococcus pneumoniae）、及び薬剤耐性結核（Tuberculosis）からなる群から選択される。別の実施形態において、感染性細菌は、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、エリスロマイシン耐性Ａ群ストレプトコッカス属（Streptococcus）、クリンダマイシン耐性Ｂ群ストレプトコッカス属（Streptococcus）からなる群から選択される。
【００６１】
[0062]  特定の実施形態において、感染性因子は、宿主対象中で天然に見られる。別の実施形態において、感染性因子は、宿主対象の外部からの侵入種である。好ましくは、宿主は、哺乳動物、例えば、げっ歯類、ヒト、家畜動物、コンパニオンアニマル、又は飼い慣らされていない若しくは野生動物である。一実施形態において、対象は、げっ歯類、例えば、マウス、ラット、モルモットなどであり得る。別の実施形態において、対象は、家畜動物であり得る。好適な家畜動物の非限定的な例としては、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ラマ及びアルパカが挙げられる。さらに別の実施形態において、対象は、コンパニオンアニマルであり得る。コンパニオンアニマルの非限定的な例としては、イヌ、ネコ、ウサギ、及び鳥類などのペットが挙げられる。さらに別の実施形態において、対象は、動物園の動物であり得る。本明細書において使用される際、「動物園の動物」は、動物園で見られる動物を指す。このような動物としては、非ヒト霊長類、大型ネコ科動物、オオカミ、及びクマが挙げられる。例示的な実施形態において、対象は、ヒトである。
【００６２】
[0063]  本方法は、例えば、生体試料、研究試験試料、環境試料（天然の水体、池、地域社会の貯水池、レクリエーション水域、スイミングプール、渦巻、温水浴槽、温泉、親水公園、天然の真水、及び海洋表面の水など）及び工業試料（発酵性接種材料（乳酸菌（Lactobacteria）など）、化学試薬、培養培地、洗浄液から選択される水試料を含む水試料など）を含む様々な試料に含まれる感染性因子を分析するのに使用され得る。
【００６３】
[0064]  好ましくは、試料は、体液、例えば、痰、涙、唾液、汗、粘液、血清、精液、尿、便、嘔吐物、及び血液を含む生体試料である。試料は、例えば、脳脊髄液（ＣＳＦ）、血漿、血清、リンパ液、肺胞洗浄液、胸膜液などを含み得る。ある実施形態において、試料は、任意の公知のデバイス又は方法、例えば、スワブ、尿道カテーテル、吸引器、皮下注射器、細針生検、中空針生検、パンチ生検、代謝ケージ、及び注射器を用いて、対象から取得され得る。
【００６４】
[0065]  ある実施形態において、生体試料は、本明細書に記載される方法において使用するために処理される。非限定的な例として、痰又は気道表面液（ＡＳＦ）が、滅菌した標本バイアルなどの適切な容器中に収集される。試料は、例えば、約６０％の最終濃度になるまでアセトニトリル、約０．１％の最終濃度になるまでトリフルオロ酢酸を用いて、又はＮ−アセチルシステインを用いて可溶化される。
【００６５】
[0066]  特定の実施形態において、生体試料は、その中に含まれる細菌を培養するように操作され得る。「培養物」という用語は、液体媒体が使用される場合、培養される細胞、培養上清、それらの混合物、又は培養ろ液のいずれかを意味し；固体培地が使用される場合、「培養物」という用語は、細胞と細胞が増殖される培地との混合物を意味する。例えば、液体媒体が使用される場合、マーカーは、以下の手順によって培養物混合物から回収され得る。細菌の十分な増殖が達成された場合、培養物混合物は、抗生物質及び／又はファージによる処理に供される。このような下流のプロセスの間には、汚染物質を含まない粗細菌調製物を得るように、１つ以上の洗浄及び／又は分離工程（遠心分離若しくはろ過を含む）が介在し得る。マーカーは、細胞レベル（例えば、インサイチュ）で、又は培養物をさらなる処理に供した後に、検出又は分析され得る。例えば、マーカーが、サイトゾル中のタンパク質又はＤＮＡである場合、それらは、破砕又は超音波処理などの好適な方法を用いて細胞を破壊することによって抽出され得る。細胞は、細胞を破壊するように培養培地中での超音波処理に直接供されてもよく、粗酵素溶液が、処理された溶液から不溶物を除去することによって得られる。
【００６６】
[0067]  培養が固体培地上で行われる場合、マーカーは、以下の手順を用いて、まず、培養物を操作することによって分析され得る：水が、培養された細胞を含有する固体培地に加えられ、不溶物が、直ぐに、又は超音波処理などの好適な手段によって細胞を破壊した後、混合物から除去される。粗マーカー調製物が、独立して又は組み合わせて使用され得る、有機溶媒分別、硫酸アンモニウム分別、透析、等電沈殿及びカラムクロマトグラフィーなどの従来の精製技術によって、粗溶解物から単離され得る。マーカーのレベル又は活性は、従来の方法、例えば、抗原タンパク質マーカー用のイムノアッセイ、抗体様マーカー用のリガンド結合、酵素様マーカー用の酵素アッセイ、核酸ハイブリダイゼーション及び／又は核酸増幅などを用いて決定され得る。
【００６７】
[0068]  目的に応じて、細胞培養物は、慣例的な技術を用いて分析され得る。例えば、細菌は、対数期（ＭＳＳＡ  ＵＳＡ３００及びＭＲＳＡ  ＵＳＡ３００）まで培養さえ得、ピーク対数期ファージが、従来の技術、例えば、分光光度法を用いて検出され得る。対数期細菌の使用は、付着因子のより高い発現のために付着性である可能性がより高く、それらのペプチドグリカン層が、静止期細胞と比較して、あまり架橋せず、低粘度である可能性が高く、細胞が、より代謝的に活性であり、損傷に対するより迅速な応答を可能にするため、好ましいことがある。しかしながら、最適な条件は、菌株間で変化し得る。多くの場合、様々な菌株が、臨床環境において見られるため、この情報は、診断方法の有用性を評価するために重要である。本明細書において、菌株の変動性があることが想定されるが、細菌が、全ての菌株を試験するために単一のプロトコルの使用を可能にするのに十分に類似して挙動することが予測される。この予測は、細菌科（例えば、スタフィロコッカス属（staphylococci））が、遺伝的に互いにかなり類似しており、したがって類似の細胞構造を有する（これは、特定のファージに対するそれらの反応性の主な要素である）ことに基づいている。
【００６８】
[0069]  ある実施形態において、本方法及び組成物は、微生物、例えば、細菌の感受性の決定に有用である。本明細書において使用される際、「感受性」という用語は、細菌細胞が抗生物質によって影響される程度を指す。すなわち、細胞は、全く影響されないことがあり、細胞は、殺滅されずに減速若しくは停止された成長及び増殖を有することがあり、又は細胞は、殺滅されることがある。感受性は、細菌種又は菌株の集団が、抗生物質によって影響される程度も指す。この場合、集団の特定の感受性の高い細胞が、非常に感受性であり得、ごく低濃度の抗生物質によって殺滅され得、他の感受性の低い細胞が、減速された成長及び増殖を有し得る一方、他の細胞は、全く影響されないことがある。
【００６９】
[0070]  関連する実施形態において、本方法及び組成物は、抗菌剤又は抗生物質に対する微生物、例えば、細菌の耐性を同定するのに有用である。「抗生物質に対して耐性である」という用語は、本明細書において、特定の細菌株、多くの場合、突然変異株が、殺滅されないか、又はその菌株が由来する対応する野生型株と比較して有意に遅く殺滅されることを意味する。耐性はまた、突然変異株及び野生型株の改変された成長特性によって反映され得る。例えば、培養培地中の低濃度の抗生物質は、野生型株の成長を有意に防止するか又は低下させる一方、突然変異株の成長は影響されない。耐性株の表現型、例えば、改変された成長、細胞分裂、代謝、生物膜生成、病原性などが、例えば、測定されるパラメータの変化を評価するために同一の条件下で、成長する野生型株及び突然変異株について、慣例的な技術を用いて決定され得る。感受性株は、耐性の評価の参照標準（陽性対照）として使用され得る。
【００７０】
[0071]  一実施形態において、本方法は、抗生物質の存在下及び非存在下で、細菌試料を培養することによって行われる。培養培地又は発酵培地は、それぞれの菌株の要求を満たすように修正又は調整され得る。様々な微生物用の培養培地の説明が、米国微生物学会（American Society for Bacteriology）（Washington D.C.,USA,1981）の“Manual of Methods for General Bacteriology”に存在している。培養培地及び発酵培地又は培地という用語は、同義的である。
【００７１】
[0072]  その最も単純な意味で、培養培地は、任意選択的に、リン源、例えば、リン酸、リン酸カリウム又は他のリン酸塩と一緒に、少なくとも１つの炭素源（例えば、グルコース）及び少なくとも１つの窒素源（例えば、ニトレート）を含有する。好ましくは、培養培地は、細菌増殖のために緩衝される。培養培地は、塩、例えば、例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム及び鉄などの金属の塩化物又は硫酸塩、例えば、硫酸マグネシウム又は硫酸鉄などをさらに含んでもよく、これらは、増殖及び／又は代謝活性を促進する。最後に、アミノ酸、例えばホモセリン及びビタミン、例えばチアミン、ビオチン又はパントテン酸などの重要な増殖因子が、必要に応じて、培養培地に加えられ得る。米国特許第９，０７４，２２９号を参照されたい。
【００７２】
[0073]  細菌を含有する開始試料が、単一のバッチの形態で培養物に加えられ得、又は培養中に、好適な方法で、例えば、２〜４時間ごと若しくは１〜３時間ごとに、又は１、２、３、若しくは４時間ごとに供給され得る。
【００７３】
[0074]  培養物のｐＨは、好適な方法で、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア若しくはアンモニア水などの塩基性化合物、又はリン酸若しくは硫酸などの酸性化合物を用いることによって制御され得る。ｐＨは、一般に、６．０〜８．５、好ましくは、６．５〜８の値に調整される。発泡を制御するために、例えば、脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を用いることが可能である。細菌の安定性を維持するために、例えば、ＩＰＴＧなどの誘導剤などの好適な選択的物質を培地に加えることが可能である。発酵は、好ましくは、好気条件下で行われる。これらの条件を維持するために、酸素又は例えば空気などの酸素含有ガス混合物が、培養物中に導入される。バッチ又は流加プロセスにおいて、培養は、好ましくは、微生物の所望の密度の量に達するまで続けられる。検出は、分光光度的に行われる（吸収、蛍光）。この目的は、通常、２時間〜１６０時間以内に達成される。連続プロセスにおいて、より長い培養時間が可能である。微生物の活性が、微生物の発酵培地及び／又は細胞中の様々なマーカーの濃縮（蓄積）をもたらす。
【００７４】
[0075]  好適な発酵培地の例が、特に、米国特許第５，７７０，４０９号；同第５，２７５，９４０号；同第５，８２７，６９８号；同第５，７５６，３４５号；及び国際公開第２００７／０１２０７８号及び国際公開第２００９／０４３８０３号に見出される。
【００７５】
Ｂ．抗生物質
[0076]  上記の培養培地は、抗生物質が補充されるか又は補充されないことがある。本明細書において使用される際、「抗生物質」又は「抗菌剤」という用語は、微生物の増殖を阻害するか又は微生物を破壊する物質を指す。好ましくは、抗生物質は、感染性因子の病原性を抑制し、及び／又は感染症を治療するのに有用である。抗生物質は、微生物、例えば酵母又は真菌によって生成される天然形態が、後に構造的に修飾される半合成物質も指す。
【００７６】
[0077]  別の実施形態において、培養培地は、プロバイオティック物質が補充されるか又は補充されないことがある。本明細書において使用される際、「プロバイオティック」という用語は、微生物の成長若しくは代謝活性を促進する物質、例えば、微量栄養素、成長誘導物質、又は毒素除去物質を指す。
【００７７】
[0078]  好ましくは、抗生物質は、β−ラクタム（β−ラクタマーゼ阻害剤及びセファロスポリンを含む）、フルオロキノロン、アミノグリコシド、テトラサイクリン及び／又はグリシルサイクリン及び／又はポリミキシンからなる群から選択される。抗菌剤の任意の組合せ、例えば、少なくとも１つのβ−ラクタム及び少なくとも１つのフルオロキノロン；少なくとも１つのアミノグリコシド及び１つのセファロスポリン；任意選択的にアミノグリコシドと一緒に、少なくとも１つのβ−ラクタム及び１つのβ−ラクタマーゼ阻害剤なども試験され得る。
【００７８】
[0079]  本明細書において使用される際、「β−ラクタム」という用語は、その分子構造中にβ−ラクタム環を含む任意の抗生物質薬剤を指す。代表例としては、天然及び半合成ペニシリン及びペニシリン誘導体、クラブラン酸、カルバペネム、セファロスポリン、セファマイシン及びモノバクタムが挙げられる。これらの薬剤は、広く「β−ラクタマーゼ」と呼ばれる酵素によって代謝される。β−ラクタマーゼは、４つの分子クラス（Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ）に分かれている。クラスＡ酵素は、ペニシリンを選択的に加水分解し；クラスＢ酵素は、他のものより広い基質プロファイルを有する金属酵素を含み；クラスＣ酵素は、様々な抗生物質に対するグラム陰性菌の耐性に関与しており；クラスＤ酵素は、独特の基質プロファイルを示すセリンヒドロラーゼである。
【００７９】
[0080]  一般に、β−ラクタムは、それらのコア環構造にしたがって分類及びグループ分けされ、ここで、各グループは、異なるカテゴリーに分けられ得る。「ペナム」という用語は、ペニシリン抗生物質のメンバーのコア骨格、例えば、チアゾリジン環を含有するβ−ラクタムを表すのに使用される。ペニシリンは、狭域スペクトルペニシリン、例えば、ベンザチンペニシリン、ベンジルペニシリン（ペニシリンＧ）、フェノキシメチルペニシリン（ペニシリンＶ）、プロカインペニシリン及びオキサシリンを含み得る。狭域スペクトルペニシリナーゼ耐性ペニシリン、例えば、メチシリン、ジクロキサシリン及びフルクロキサシリン。狭域スペクトルβ−ラクタマーゼ耐性ペニシリンは、テモシリンを含み得る。中域スペクトルペニシリンは、例えば、アモキシシリン及びアンピシリンを含む。広域スペクトルペニシリンは、コ−アモキシクラブ（アモキシシリン＋クラブラン酸）を含む。最後に、ペニシリングループは、広域スペクトルペニシリン、例えば、アズロシリン、カルベニシリン、チカルシリン、メズロシリン及びピペラシリンも含む。合成ペニシリン誘導体は、例えば、ファロペネムを含む。
【００８０】
[0081]  ピロリジン環を含有するβ−ラクタムは、カルバペネムと命名される。カルバペネムグループは、ビアペネム、ドリペネム、エルタペネム、イミペネム、メロペネム、パニペネム及びＰＺ−６０１を含む。
【００８１】
[0082]  セファロスポリン及びセファマイシンは、セファレキシン、セファロチン、セファゾリン、セファクロル、セフロキシム、セファマンドール、セフォテタン、セフォキシチン、セフォタキシム、及びセフポドキシムを含む。グラム陽性菌に対して有効な第四世代セファロスポリンは、セフェピム及びセフピロムを含む。セファロスポリンクラスは、セファドロキシル、セフィキシム、セフプロジル、セファレキシン、セファロチン、セフロキシム、セファマンドール、セフェピム及びセフピロムをさらに含み得る。セファマイシンは、例えば、セフォキシチン、セフォテタン、セフメタゾール及びフロモキセフを含む。
【００８２】
[0083]  カルバセフェムの例は、ロラカルベフである。グラム陰性菌に対して有効であるモノバクタムは、例えば、チゲモナム、ノカルジシンＡ及びタブトキシンを含む。合成セフェムは、例えば、クラブラン酸及びオキサセフェム、例えば、モキサラクタム及びフロモキセフを含む。
【００８３】
[0084]  フルオロキノロンは、細菌ＤＮＡ複製にとって重要な酵素を阻害することによって作用する。その代表例としては、シプロフロキサシン、ガレノキサシン、ガチフロキサシン、ゲミフロキサシン、レボフロキサシン、及びモキシフロキサシンが挙げられる。
【００８４】
[0085]  アミノグリコシドは、ほとんどのグラム陰性好気性及び通性嫌気性細菌に対する殺菌作用を有する。代表例としては、例えば、カナマイシン、アミカシン、トブラマイシン、ジベカシン、ゲンタマイシン、シソマイシン、ネチルマイシン、ネオマイシンＢ、ネオマイシンＣ、ネオマイシンＥ（パロモマイシン）及びストレプトマイシン（合成誘導体クラリスロマイシン及びアジスロマイシンを含む）が挙げられる。
【００８５】
[0086]  テトラサイクリンは、オクタヒドロテトラセン−２−カルボキサミド骨格を有するポリケチドのサブクラスである。それらは、天然（例えば、テトラサイクリン、クロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、デメクロサイクリン）又は半構成（例えば、リメサイクリン、メクロサイクリン、メタサイクリン、ミノサイクリン、ロリテトラサイクリン）であり得る。グリシルサイクリン（例えば、ミノサイクリン／チゲサイクリン）は、テトラサイクリンから誘導される。
【００８６】
[0087]  ポリミキシンは、大腸菌（E.coli）及び緑膿菌（P.aeruginosa）などのグラム陰性菌に対して有効なポリペプチド抗生物質である。ポリミキシンＢ及びポリミキシンＥ（コリスチン）のみが、臨床的に使用される。
【００８７】
[0088]  本方法を実施する際、培地には、上記の抗生物質のうちの１つ以上が補充され得る。抗生物質の濃度は、抗生物質及び試験される菌株のタイプに応じて変化し得る。好ましくは、抗生物質の用量は、特定の菌株における特定の抗生物質の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）以上である。ＭＩＣを決定するための方法は、当該技術分野において公知である（Andrews et al.,J Antimicrob Chemother.,48 Suppl 1:5-16,2001を参照）。４つの菌株（大腸菌（E.coli）、黄色ブドウ球菌（S.aureus）、緑膿菌（P.aeruginosa）、及び大便レンサ球菌（Enterococcus faecalis））に対する約４０の抗菌剤についてのＭＩＣの代表的なチャートが、“Determination of minimum inhibitory concentrations(MICs)of  antibacterial agents by broth dilution”（European Society of Clinical Microbiology and Infection Diseases CMI,9,1-7,2003）と題された欧州抗微生物薬感受性試験委員会（ＥＵＣＡＳＴ）によって公表された報告書の表３に示されている。
【００８８】
[0089]  一般に、耐性株を同定又は検出するための抗生物質の濃度は、例えば、ベースラインＭＩＣの少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも３００倍又はさらには１０００倍増加され得る。これは、標的細菌及び細菌における抗生物質のＭＩＣが既知である場合に特に有効である。例えば、大腸菌（E.coli）については、ほとんどの抗生物質のＭＩＣは、約０．０１ｍｇ／Ｌ〜約１０ｍｇ／Ｌの範囲であり得るが；耐性株は、濃度が、例えば、ベースラインレベルの１０倍（すなわち、１ｌｏｇ倍）〜１０００倍（すなわち、３−ｌｏｇ倍）増加されるまで感受性でないことがある。これに関して、最終的な抗生物質濃度は、相応に調整され得る。
【００８９】
[0090]  あくまでも例示目的のために、アモキシシリンなどのβ−ラクタムに対する細菌の耐性を試験するために、以下の投与量が用いられ得、濃度は、約２ｍｇ／Ｌ〜約４０ｍｇ／Ｌ、特に、約５ｍｇ／Ｌ〜約２０ｍｇ／Ｌの範囲であり得る。米国特許第９，３４７，８８８号を参照されたい。一方、クロキサシリンに対する細菌の耐性の試験については、濃度は、約２５ｍｇ／Ｌ〜約３００ｍｇ／Ｌの範囲であり得る。カルバペネムについては、濃度は、０．０５〜３２ｍｇ／Ｌの範囲であり得る。これは、ファロペネムについては約２ｍｇ／Ｌ〜約３２ｍｇ／Ｌ、ドリペネムについては約０．０５ｍｇ／Ｌ〜約２ｍｇ／Ｌの範囲を含む（Woodman et al.,J Med Microbiol.,19(1):15-23,1983を参照）。セファロスポリンについては、濃度は、約１ｍｇ／Ｌ〜約２０ｍｇ／Ｌ、好ましくは、約４ｍｇ／Ｌ〜  約１６ｍｇ／Ｌの範囲であり得る（Waterworth,J Clin Pathol,35:1177-1180,1982を参照）。
【００９０】
[0091]  より特定的に、抗生物質は、０．１ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、６ｍｇ／ｍＬ、７ｍｇ／ｍＬ、８ｍｇ／ｍＬ、９ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、１１ｍｇ／ｍＬ、１２ｍｇ／ｍＬ、１３ｍｇ／ｍＬ、１４ｍｇ／ｍＬ、１５ｍｇ／ｍＬ、１６ｍｇ／ｍＬ、１７ｍｇ／ｍＬ、１８ｍｇ／ｍＬ、１９ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、２１ｍｇ／ｍＬ、２２ｍｇ／ｍＬ、２３ｍｇ／ｍＬ、２４ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬ、２６ｍｇ／ｍＬ、２７ｍｇ／ｍＬ、２８ｍｇ／ｍＬ、２９ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ、３１ｍｇ／ｍＬ、３２ｍｇ／ｍＬ、３３ｍｇ／ｍＬ、３４ｍｇ／ｍＬ、３５ｍｇ／ｍＬ、３６ｍｇ／ｍＬ、３７ｍｇ／ｍＬ、３８ｍｇ／ｍＬ、３９ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ、４１ｍｇ／ｍＬ、４２ｍｇ／ｍＬ、４３ｍｇ／ｍＬ  ４４ｍｇ／ｍＬ、４５ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、６０ｍｇ／ｍＬ、７０ｍｇ／ｍＬ、８０ｍｇ／ｍ、９０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ、１５０ｍｇ／ｍＬ、２００ｍｇ／ｍＬ、２５０ｍｇ／ｍＬ、３００ｍｇ／ｍＬ、４００ｍｇ／ｍＬ、５００ｍｇ／ｍＬ、又はそれ以上のいずれか１つの濃度で使用され得る。例えば、イミペネム及びエルタペネムは、５０、３０、２０、１５、１０、５及び１ｍｇ／ｍＬの濃度で使用され得る。投与量は、例えば、まず、野生型株についてのＭＩＣ（複合薬剤）を決定することによって、抗生物質の組合せの場合も同様に調整され得、耐性株を同定するために投与量を徐々に増加させる。
【００９１】
[0092]  細菌は、所定の期間、例えば、２時間〜１６０時間、特に、８時間〜２４時間、特に、１０時間〜１６時間にわたって、抗生物質の存在下又は非存在下で培養される。細菌は、バクテリオファージとの接触の前に、増殖期又は静止期にあり得る。増殖期は、細胞倍加によって特徴付けられる期間であり、この期間に、培養物中の細胞の数は、指数関数的に増殖する。静止期は、多くの場合、必須栄養素の枯渇又は老廃物の蓄積などの増殖制限因子のため、新たな細菌の増殖及び老化細胞の死の両方に起因する。好ましくは、細菌は、バクテリオファージの接種の前に、増殖期にある。細菌の増殖期を決定するための方法は、当該技術分野において公知である。Hall et al.,Mol Biol Evol.,31(1):232-8,2014を参照されたい。
【００９２】
[0093]  一実施形態において、細菌は、バクテリオファージを接種する前に、抗生物質で処理される。一次培養物は、接種の前に、任意選択的に、例えば、洗浄緩衝液で洗浄され得る。生存している培養物の密度に応じて、一次培養物又はその洗浄ペレット（一次培養物の遠心分離後に得られる）は、バクテリオファージを接種された新鮮な天然培地（又は抗生物質含有培地）中で再度増殖され得る。
【００９３】
[0094]  別の実施形態において、細菌は、抗生物質薬剤による処理と同時にバクテリオファージを接種される。この実施形態は、非溶解性ファージに特に適し得る。
【００９４】
Ｃ．ファージ
[0095]  本方法の実施形態は、宿主特異的バクテリオファージを用いる。本明細書において使用される際、「バクテリオファージ」という用語は、当該技術分野において理解されるその従来の意味（例えば、１つ以上の細菌を選択的に感染させるウイルス）を有する。多くのバクテリオファージは、細菌の特定の属又は種又は菌株に特異的である。「バクテリオファージ」という用語は、「ファージ」という用語と同義語である。「バクテリオファージ」としては、限定はされないが、以下のウイルス科のいずれかに属するバクテリオファージが挙げられる：コルチコウイルス科（Corticoviridae）、シストウイルス科（Cystoviridae）、イノウイルス科（Inoviridae）、レビウイルス科（Leviviridae）、ミクロウイルス科（Microviridae）、マイオウイルス科（Myoviridae）、ポドウイルス科（Podoviridae）、サイフォウイルス科（Siphoviridae）、又はテクティウイルス科（Tectiviridae）。バクテリオファージは、溶解性バクテリオファージ又は溶原性バクテリオファージ又は繊維状バクテリオファージであり得る。溶解性バクテリオファージは、溶原性経路に入らずに、溶解サイクルの完了によって溶解経路をたどるものである。溶解性バクテリオファージは、細胞膜の溶解、細胞の破壊、及び他の細胞を感染させることが可能な子孫バクテリオファージ粒子の放出をもたらすウイルス複製を行う。溶原性バクテリオファージは、溶原性経路に入ることが可能であるものであり、ここで、バクテリオファージは、その溶解サイクルの完了の前まで細胞のゲノムの休眠した受動的部分（passive part）になる。繊維状バクテリオファージは、長いフィラメントにパッケージングされる環状一本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）ゲノムを含む。これらのファージは、細菌を溶解させることによって再生せず；代わりに、それらは、宿主を殺滅せずに環境中に分泌される。
【００９５】
[0096]  一実施形態において、ファージは、溶解性又は生産性ファージ（例えば、Ｔ４、Ｔ７、Ｔ３、及びＭＳ２）である。別の実施形態において、ファージは、溶原性（temperate又はlysogenic）ファージ（例えば、λファージ）である。さらに別の実施形態において、ファージは、繊維状ファージ（例えば、ｆ１、ｆｄ、及びＭ１３）である。様々なファージの組合せも用いられ得る。ファージディスプレイ技術が、当該技術分野において公知である（例えば、米国特許第８，６８５，８９３号；米国特許第７，８１１，９７３号；及び米国特許出願公開第２００２−００４４９２２号）。好ましくは、ファージは、宿主細菌を形質転換することが可能である。本明細書において使用される際、「形質転換」という用語は、ＤＮＡが染色体外要素として又は染色体組み込みによって複製され得るような、宿主細胞中へのＤＮＡの導入を意味する。すなわち、形質転換は、細胞中に外来ＤＮＡを導入することによる遺伝子の合成的改変を指す。当該技術分野において認識されるように、ほとんどの細菌のＤＮＡは、細菌染色体と呼ばれる単一の環状分子及び１つ以上のプラスミドに含まれる。
【００９６】
[0097]  ファージは、天然ファージと異なる遺伝子のベクターとして働く操作ファージ又は組み換えバクテリオファージである。本明細書において使用される際、「組み換えファージ」又は「操作ファージ」という用語は、天然でない核酸配列を含むか、又は配列の２つの本来は別々のセグメントの人為的組合せによって作製された配列を有するものである。この人為的組合せは、例えば、遺伝子組み換え技術又はＤＮＡ転位の使用による、核酸の分離されたセグメントの化学合成又は人為的操作によって達成され得る。同様に、組み換えタンパク質は、組み換え核酸分子によってコードされるものである。組み換えバクテリオファージという用語は、レポーター又はインジケータ分子として働く異種タンパク質をコードする核酸を挿入することなどによる、核酸の挿入のみによって改変されたバクテリオファージを含む。
【００９７】
[0098]  特定の実施形態において、ファージは、精製ファージである。精製という用語は、絶対的な純度を必要とせず；相対的な用語として意図される。精製分子は、分子がその天然環境にあるより富化されたものであり、例えば、分子が、試料内の類似の分子の総含量の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９９％又はそれ以上を占める調製物である。例えば、組み換えファージの精製試料は、組み換えファージが、試料内の全バクテリオファージの少なくとも５０％を占めるものである。
【００９８】
[0099]  病原性細菌属及びそれらの公知の宿主特異的バクテリオファージの一覧が、以下の段落に示され、細菌−ファージ対の好ましいタイプが、表１〜３において提供される。同義語及び表記の変化形が、括弧内に示される。同音異義語は、現れるたびに繰り返される（例えば、Ｄ、Ｄ、ｄ）。無名のファージは、それらの属の横の「ＮＮ」によって示される。
【００９９】
[0100]  アクチノマイセス属（Actinomyces）の細菌は、以下のファージ：Ａｖ−１、Ａｖ−２、Ａｖ−３、ＢＦ３０７、ＣＴ１、ＣＴ２、ＣＴ３、ＣＴ４、ＣＴ６、ＣＴ７、ＣＴ８及び１２８１によって感染される。
【０１００】
[0101]  アエロモナス属（Aeromonas）の細菌は、以下のファージ：ＡＡ−１、Ａｅｈ２、Ｎ、ＰＭ１、ＴＰ４４６、３、４、１１、１３、２９、３１、３２、３７、４３、４３−１０Ｔ、５１、５４、５５Ｒ  １、５６、５６ＲＲ２、５７、５８、５９．１、６０、６３、Ａｅｈ１、Ｆ、ＰＭ２、１、２５、３１、４０ＲＲ２．８ｔ、（ｓｙｎ＝４４Ｒ）、（ｓｙｎ＝４４ＲＲ２．８ｔ）、６５、ＰＭ３、ＰＭ４、ＰＭ５及びＰＭ６によって感染される。
【０１０１】
[0102]  バチルス属（Bacillus）の細菌は、以下のファージ：Ａ、ａｉｚ１、Ａｌ−Ｋ−Ｉ、Ｂ、ＢＣＪＡ１、ＢＣ１、ＢＣ２、ＢＬＬ１、ＢＬ１、ＢＰ１４２、ＢＳＬ１、ＢＳＬ２、ＢＳ１、ＢＳ３、ＢＳ８、ＢＳ１５、ＢＳ１８、ＢＳ２２、ＢＳ２６、ＢＳ２８、ＢＳ３１、ＢＳ１０４、ＢＳ１０５、ＢＳ１０６、ＢＴＢ、Ｂ１７１５Ｖ１、Ｃ、ＣＫ−１、Ｃｏｌ１、Ｃｏｒ１、ＣＰ−５３、ＣＳ−１、ＣＳ１、Ｄ、Ｄ、Ｄ、Ｄ５、ｅｎｔ１、ＦＰ８、ＦＰ９、ＰＳ１、ＦＳ２、ＦＳ３、ＦＳ５、ＦＳ８、ＦＳ９、Ｇ、ＧＨ８、ＧＴ８、ＧＶ−１、ＧＶ−２、ＧＴ−４、ｇ３、ｇ１２、ｇ１３、ｇ１４、ｇ１６、ｇ１７、ｇ２１、ｇ２３、ｇ２４、ｇ２９、Ｈ２、ｋｅｎ１、ＫＫ−８８、Ｋｕｍ１、Ｋｙｕ１、Ｊ７Ｗ−１、ＬＰ５２、（ｓｙｎ＝ＬＰ−５２）、Ｌ７、Ｍｅｘ１、ＭＪ−１、ｍｏｒ２、ＭＰ−７、ＭＰ１０、ＭＰ１２、ＭＰ１４、ＭＰ１５、Ｎｅｏ１、Ｎｏ  ２、Ｎ５、Ｎ６Ｐ、ＰＢＣ１、ＰＢＬＡ、ＰＢＰ１、Ｐ２、Ｓ−ａ、ＳＦ２、ＳＦ６、Ｓｈａ１、Ｓｉｌ１、ＳＰＯ２、（ｓｙｎ＝ΦＳＰＰ１）、ＳＰβ、ＳＴＩ、ＳＴ１、ＳＵ−１１、ｔ、Ｔｂ１、Ｔｂ２、Ｔｂ５、Ｔｂ１０、Ｔｂ２６、Ｔｂ５１、Ｔｂ５３、Ｔｂ５５、Ｔｂ７７、Ｔｂ９７、Ｔｂ９９、Ｔｂ５６０、Ｔｂ５９５、Ｔｄ８、Ｔｄ６、Ｔｄ１５、Ｔｇ１、Ｔｇ４、Ｔｇ６、Ｔｇ７、Ｔｇ９、Ｔｇ１０、Ｔｇ１１、Ｔｇ１３、Ｔｇ１５、Ｔｇ２１、Ｔｉｎ１、Ｔｉｎ７、Ｔｉｎ８、Ｔｉｎ１３、Ｔｍ３、Ｔｏｃ１、Ｔｏｇ１、ｔｏｌ１、ＴＰ−１、ＴＰ−１０ｖｉｒ、ＴＰ−１５ｃ、ＴＰ−１６ｃ、ＴＰ−１７ｃ、ＴＰ−１９、ＴＰ３５、ＴＰ５１、ＴＰ−８４、Ｔｔ４、Ｔｔ６、タイプＡ、タイプＢ、タイプＣ、タイプＤ、タイプＥ、Ｔφ３、ＶＡ−９、Ｗ、ｗｘ２３、ｗｘ２６、Ｙｕｎ１、α、γ、ρ１１、φｍｅｄ−２、φＴ、φμ−４、φ３Ｔ、φ７５、φ１０５、（ｓｙｎ＝φ１０５）、１Ａ、１Ｂ、１−９７Ａ、１−９７Ｂ、２、２、３、３、３、５、１２、１４、２０、３０、３５、３６、３７、３８、４１Ｃ、５１、６３、６４、１３８Ｄ、Ｉ、ＩＩ、ＩＶ、ＮＮ−バチルス属（Bacillus）（１３）、ａｌｅ１、ＡＲ１、ＡＲ２、ＡＲ３、ＡＲ７、ＡＲ９、Ｂａｃｅ−１１、（ｓｙｎ＝１１）、Bastille、ＢＬ１、ＢＬ２、ＢＬ３、ＢＬ４、ＢＬ５、ＢＬ６、ＢＬ８、ＢＬ９、ＢＰ１２４、ＢＳ２８、ＢＳ８０、Ｃｈ、ＣＰ−５１、ＣＰ−５４、Ｄ−５、ｄａｒ１、ｄｅｎ１、ＤＰ−７、ｅｎｔ２、ＦｏＳ１、ＦｏＳ２、ＦＳ４、ＦＳ６、ＦＳ７、Ｇ、ｇａｌ１、γ、ＧＥ１、ＧＦ−２、ＧＳ１、ＧＴ−１、ＧＴ−２、ＧＴ−３、ＧＴ−４、ＧＴ−５、ＧＴ−６、ＧＴ−７、ＧＶ−６、ｇ１５、Ｉ９、Ｉ１０、ＩＳ１、Ｋ、ＭＰ９、ＭＰ１３、ＭＰ２１、ＭＰ２３、ＭＰ２４、ＭＰ２８、ＭＰ２９、ＭＰ３０、ＭＰ３２、ＭＰ３４、ＭＰ３６、ＭＰ３７、ＭＰ３９、ＭＰ４０、ＭＰ４１、ＭＰ４３、ＭＰ４４、ＭＰ４５、ＭＰ４７、ＭＰ５０、ＮＬＰ−１、Ｎｏ．１、Ｎ１７、Ｎ１９、ＰＢＳ１、ＰＫ１、ＰＭＢ１、ＰＭＢ１２、ＰＭＪ１、Ｓ、ＳＰＯ１、ＳＰ３、ＳＰ５、ＳＰ６、ＳＰ７、ＳＰ８、ＳＰ９、ＳＰ１０、ＳＰ−１５、ＳＰ５０、（ｓｙｎ＝ＳＰ−５０）、ＳＰ８２、ＳＳＴ、ｓｕｂ１、ＳＷ、Ｔｇ８、Ｔｇ１２、Ｔｇ１３、Ｔｇ��４、ｔｈｕ１、ｔｈｕ４、ｔｈｕ５、Ｔｉｎ４、Ｔｉｎ２３、ＴＰ−１３、ＴＰ３３、ＴＰ５０、ＴＳＰ−１、タイプＶ、タイプＶＩ、Ｖ、Ｖｘ、β２２、φｅ、φＮＲ２、φ２５、φ６３、１、１、２、２Ｃ、３ＮＴ、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１２、１７、１８、１９、２１、１３８、ＩＩＩ、４（Ｂ．メガテリウム（B.megaterium））、４（Ｂ．スファエリクス（B.sphaericus））、ＡＲ１３、ＢＰＰ−１０、ＢＳ３２、ＢＳ１０７、Ｂ１、Ｂ２、ＧＡ−Ｉ、ＧＰ−１０、ＧＶ−３、ＧＶ−５、ｇ８、ＭＰ２０、ＭＰ２７、ＭＰ４９、Ｎｆ、ＰＰ５、ＰＰ６、ＳＦ５、Ｔｇ１８、ＴＰ−１、Versailles、φ１５、φ２９、１−９７、８３７／ＩＶ、ＮＮ−バチルス属（Bacillus）（１）、Ｂａｔ１０、ＢＳＬ１０、ＢＳＬ１１、ＢＳ６、ＢＳ１１、ＢＳ１６、ＢＳ２３、ＢＳ１０１、ＢＳ１０２、ｇ１８、ｍｏｒ１、ＰＢＬ１、ＳＮ４５、ｔｈｕ２、ｔｈｕ３、Ｔｍ１、Ｔｍ２、ＴＰ−２０、ＴＰ２１、ＴＰ５２、タイプＦ、タイプＧ、タイプＩＶ、ＮＮ−バチルス属（Bacillus）（３）、ＢＬＥ、（ｓｙｎ＝θｃ）、ＢＳ２、ＢＳ４、ＢＳ５、ＢＳ７、Ｂ１０、Ｂ１２、ＢＳ２０、ＢＳ２１、Ｆ、ＭＪ−４、ＰＢＡ１２、ＡＰ５０、ＡＰ５０−０４、ＡＰ５０−１１、ＡＰ５０−２３、ＡＰ５０−２６、ＡＰ５０−２７及びＢａｍ３５によって感染される。以下のバチルス属（Bacillus）特異的ファージには、欠陥がある：ＤＬＰ１０７１６、ＤＬＰ−１１９４６、ＤＰＢ５、ＤＰＢ１２、ＤＰＢ２１、ＤＰＢ２２、ＤＰＢ２３、ＧＡ−２、Ｍ、Ｎｏ．１Ｍ、ＰＢＬＢ、ＰＢＳＨ、ＰＢＳＶ、ＰＢＳＷ、ＰＢＳＸ、ＰＢＳＹ、ＰＢＳＺ、ｐｈｉ、ＳＰα、タイプ１及びμ。
【０１０２】
[0103]  バクテロイデス属（Bacteriodes）の細菌は、以下のファージ：ａｄ１２、Ｂａｆ−４４、Ｂａｆ−４８Ｂ、Ｂａｆ−６４、Ｂｆ−１、Ｂｆ−５２、Ｂ４０−８、Ｆ１、β１、φＡ１、φＢｒ０１、φＢｒ０２、１１、６７．１、６７．３、６８．１、ＮＮ−バクテロイデス属（Bacteroides）（３）、Ｂｆ４２、Ｂｆ７１、及びＢＦ−４１によって感染される。
【０１０３】
[0104]  ボルデテラ属（Bordetella）の細菌は、以下のファージ：１３４及びＮＮ−ボルデテラ属（Bordetella）（３）によって感染される。
【０１０４】
[0105]  ボレリア属（Borrellia）の細菌は、以下のファージ：ＮＮ−ボレリア属（Borrelia）（１）及びＮＮ−ボレリア属（Borrelia）によって感染される。
【０１０５】
[0106]  ブルセラ属（Brucella）の細菌は、以下のファージ：Ａ４２２、Ｂｋ、（ｓｙｎ＝Ｂｅｒｋｅｌｅｙ）、ＢＭ２９、ＦＯ１、（ｓｙｎ＝ＦＯ１）、（ｓｙｎ＝ＦＱ１）、Ｄ、ＦＰ２、（ｓｙｎ＝ＦＰ２）、（ｓｙｎ＝ＦＤ２）、Ｆｚ、（ｓｙｎ＝Ｆｚ７５／１３）、（ｓｙｎ＝Ｆｉｒｅｎｚｅ  ７５／１３）、（ｓｙｎ＝Ｆｉ）、Ｆ１、（ｓｙｎ＝Ｆ１）、Ｆ１ｍ、（ｓｙｎ＝Ｆ１ｍ）、（ｓｙｎ＝Ｆｉｍ）、Ｆ１Ｕ、（ｓｙｎ＝Ｆ１Ｕ）、（ｓｙｎ＝ＦｉＵ）、Ｆ２、（ｓｙｎ＝Ｆ２）、Ｆ３、（ｓｙｎ＝Ｆ３）、Ｆ４、（ｓｙｎ＝Ｆ４）、Ｆ５、（ｓｙｎ＝Ｆ５）、Ｆ６、Ｆ７、（ｓｙｎ＝Ｆ７）、Ｆ２５、（ｓｙｎ＝Ｆ２５）、（ｓｙｎ＝ｆ２５）、Ｆ２５Ｕ、（ｓｙｎ＝Ｆ２５ｕ）、（ｓｙｎ＝Ｆ２５Ｕ）、（ｓｙｎ＝Ｆ２５Ｖ）、Ｆ４４、（ｓｙｎ＝Ｆ４４）、Ｆ４５、（ｓｙｎ＝Ｆ４５）、Ｆ４８、（ｓｙｎ＝Ｆ４８）、Ｉ、Ｉｍ、Ｍ、ＭＣ／７５、Ｍ５１、（ｓｙｎ＝Ｍ８５）、Ｐ、（ｓｙｎ＝Ｄ）、Ｓ７０８、Ｒ、Ｔｂ、（ｓｙｎ＝ＴＢ）、（ｓｙｎ＝Ｔｂｉｌｉｓｉ）、Ｗ、（ｓｙｎ＝Ｗｂ）、（ｓｙｎ＝Ｗｅｙｂｒｉｄｇｅ）、Ｘ、３、６、７、１０／１、（ｓｙｎ＝１０）、（ｓｙｎ＝Ｆ８）、（ｓｙｎ＝Ｆ８）、１２ｍ、２４／ＩＩ、（ｓｙｎ＝２４）、（ｓｙｎ＝Ｆ９）、（ｓｙｎ＝Ｆ９）、４５／ＩＩＩ、（ｓｙｎ＝４５）、７５、８４、２１２／ＸＶ、（ｓｙｎ＝２１２）、（ｓｙｎ＝Ｆ１０）、（ｓｙｎ＝Ｆ１０）、３７１／ＸＸＩＸ、（ｓｙｎ＝３７１）、（ｓｙｎ＝Ｆ１１）、（ｓｙｎ＝Ｐ１１）及び５１３によって感染される。
【０１０６】
[0107]  バークホルデリア属（Burkholderia）の細菌は、以下のファージ：ＣＰ７５によって感染される。
【０１０７】
[0108]  カンピロバクター属（Campylobacter）の細菌は、以下のファージ：Ｃタイプ、ＮＴＣＣ１２６６９、ＮＴＣＣ１２６７０、ＮＴＣＣ１２６７１、ＮＴＣＣ１２６７２、ＮＴＣＣ１２６７３、ＮＴＣＣ１２６７４、ＮＴＣＣ１２６７５、ＮＴＣＣ１２６７６、ＮＴＣＣ１２６７７、ＮＴＣＣ１２６７８、ＮＴＣＣ１２６７９、ＮＴＣＣ１２６８０、ＮＴＣＣ１２６８１、ＮＴＣＣ１２６８２、ＮＴＣＣ１２６８３、ＮＴＣＣ１２６８４、３２ｆ、１１１ｃ、１９１、Ｖｆｉ−６、（ｓｙｎ＝Ｖ１９）、Ｖｆｖ−３、Ｖ２、Ｖ３、Ｖ８、Ｖ１６、（ｓｙｎ＝Ｖｆｉ−１）、Ｖ１９、Ｖ２０（Ｖ４５）、Ｖ４５、（ｓｙｎ＝Ｖ−４５）及びＮＮ−カンピロバクター属（Campylobacter）（１）によって感染される。
【０１０８】
[0109]  クラミジア属（Chlamydia）の細菌は、以下のファージ：Ｃｈｐ１によって感染される。
【０１０９】
[0110]  クロストリジウム属（Clostridium）の細菌は、以下のファージ：ＣＡＫ１、ＣＡ５、Ｃａ７、ＣＥβ、（ｓｙｎ＝１Ｃ）、ＣＥγ、Ｃｌｄ１、ｃ−ｎ７１、ｃ−２０３  Ｔｏｘ−、ＤＥβ、（ｓｙｎ＝１Ｄ）、（ｓｙｎ＝１Ｄｔｏｘ＋）、ＨＭ３、ＫＭ１、ＫＴ、Ｍｓ、ＮＡ１、（ｓｙｎ＝Ｎａ１ｔｏｘ＋）、ＰＡ１３５０ｅ、Ｐｆo、ＰＬ７３、ＰＬ７８、ＰＬ８１、Ｐ１、Ｐ５０、Ｐ５７７１、Ｐ１９４０２、１Ｃｔｏｘ＋、２Ｃｔｏｘ−、２Ｄ、（ｓｙｎ＝２Ｄｔｏｘ＋）、３Ｃ、（ｓｙｎ＝３Ｃｔｏｘ＋）、４Ｃ、（ｓｙｎ＝４ｔｏｘ＋）、５６、ＩＩＩ−１、ＮＮ−クロストリジウム属（Clostridium）（６１）、ＮＢ１ｔｏｘ−α１、ＣＡ１、ＨＭＴ、ＨＭ２、ＰＦ１、Ｐ−２３、Ｐ−４６、Ｑ−０５、Ｑ−０６、Ｑ−１６、Ｑ−２１、Ｑ−２６、Ｑ−４０、Ｑ−４６、Ｓ１１１、ＳＡ０２、ＷＡ０１、ＷＡ０３、Ｗ１１１、Ｗ５２３、８０、Ｃ、ＣＡ２、ＣＡ３、ＣＰＴ１、ＣＰＴ４、ｃ１、ｃ４、ｃ５、ＨＭ７、Ｈ１１／Ａ１、Ｈ１８／Ａ１、Ｈ２２／Ｓ２３、Ｈ１５８／Ａ１、Ｋ２／Ａ１、Ｋ２１／Ｓ２３、ＭＬ、ＮＡ２ｔｏｘ−、Ｐｆ２、Ｐｆ３、Ｐｆ４、Ｓ９／Ｓ３、Ｓ４１／Ａ１、Ｓ４４／Ｓ２３、α２、４１、１１２／Ｓ２３、２１４／Ｓ２３、２３３／Ａ１、２３４／Ｓ２３、２３５／Ｓ２３、ＩＩ−１、ＩＩ−２、ＩＩ−３、ＮＮ−クロストリジウム属（Clostridium）（１２）、ＣＡ１、Ｆ１、Ｋ、Ｓ２、１、５及びＮＮ−クロストリジウム属（Clostridium）（８）によって感染される。
【０１１０】
[0111]  コリネバクテリウム属（Corynebacterium）の細菌は、以下のファージ：ＣＧＩ１（欠陥）、Ａ、Ａ２、Ａ３、Ａ１１０、Ａ１２８、Ａ１３３、Ａ１３７、Ａ１３９、Ａ１５５、Ａ１８２、Ｂ、ＢＦ、Ｂ１７、Ｂ１８、Ｂ５１、Ｂ２７１、Ｂ２７５、Ｂ２７６、Ｂ２７７、Ｂ２７９、Ｂ２８２、Ｃ、ｃａｐ１、ＣＣ１、ＣＧ１、ＣＧ２、ＣＧ３３、ＣＬ３１、Ｃｏｇ、（ｓｙｎ＝ＣＧ５）、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｈ−１、ｈｑ１、ｈｑ２、Ｉ１／Ｈ３３、Ｉ１／Ｈ３３、Ｊ、Ｋ、Ｋ、（ｓｙｎ＝Ｋｔｏｘ−）、Ｌ、Ｌ、（ｓｙｎ＝Ｌｔｏｘ＋）、Ｍ、ＭＣ−１、ＭＣ−２、ＭＣ−３、ＭＣ−４、ＭＬＭａ、Ｎ、Ｏ、ｏｖ１、ｏｖ２、ｏｖ３、Ｐ、Ｐ、Ｐ、ＲＰ６、ＲＳ２９、Ｓ、Ｔ、Ｕ、ＵＢ１、ｕｂ２、ＵＨ１、ＵＨ３、ｕｈ３、ｕｈ５、ｕｈ６、β、（ｓｙｎ＝βｔｏｘ＋）、βｌａｖ６４、βｖｉｒ、γ、（ｓｙｎ＝γｔｏｘ−）、γ１９、δ、（ｓｙｎ＝δｔｏｘ＋）、ρ、（ｓｙｎ＝ρｔｏｘ−）、φ９、φ９８４、ω、１Ａ、１／１１８０、２、２／１１８０、５／１１８０、５ａｄ／９７１７、７／４４６５、８／４４６５、８ａｄ／１０２６９、１０／９２５３、１３／９２５３、１５／３１４８、２１／９２５３、２８、２９、５５、２７４７、２８９３、４４９８及び５８４８によって感染される。
【０１１１】
[0112]  エンテロコッカス属（Enterococcus）の細菌は、以下のファージ：ＤＦ７８、Ｆ１、Ｆ２、１、２、４、１４、４１、８６７、Ｄ１、ＳＢ２４、２ＢＶ、１８２、２２５、Ｃ２、Ｃ２Ｆ、Ｅ３、Ｅ６２、ＤＳ９６、Ｈ２４、Ｍ３５、Ｐ３、Ｐ９、ＳＢ１０１、Ｓ２、２ＢＩＩ、５、１８２ａ、７０５、８７３、８８１、９４０、１０５１、１０５７、２１０９６Ｃ、ＮＮ−エンテロコッカス属（Enterococcus）（１）、ＰＥ１、Ｐ１、Ｆ３、Ｆ４、ＶＤ１３、１、２００、２３５及び３４１によって感染される。
【０１１２】
[0113]  エリジペロスリックス属（Erysipelothrix）の細菌は、以下のファージ：ＮＮ−エリジペロスリックス属（Erysipelothrix）（１）によって感染される。
【０１１３】
[0114]  エシェリキア属（Escherichia）の細菌は、以下のファージ：ＢＷ７３、Ｂ２７８、Ｄ６、Ｄ１０８、Ｅ、Ｅ１、Ｅ２４、Ｅ４１、ＦＩ−２、ＦＩ−４、ＦＩ−５、ＨＩ８Ａ、ＨＩ８Ｂ、ｉ、ＭＭ、Ｍｕ、（ｓｙｎ＝ｍｕ）、（ｓｙｎ＝Ｍｕ１）、（ｓｙｎ＝Ｍｕ−１）、（ｓｙｎ＝ＭＵ−１）、（ｓｙｎ＝ＭｕＩ）、（ｓｙｎ＝ｍｕ）、Ｏ２５、ＰｈＩ−５、Ｐｋ、ＰＳＰ３、Ｐ１、Ｐ１Ｄ、Ｐ２、Ｐ４（欠陥）、Ｓ１、Ｗφ、φＫ１３、φＲ７３（欠陥）、φ１、φ２、φ７、φ９２、ψ（欠陥）、７Ａ、８φ、９φ、１５（欠陥）、１８、２８−１、１８６、２９９、ＮＮ−エシェリキア属（Escherichia）（２）、ＡＢ４８、ＣＭ、Ｃ４、Ｃ１６、ＤＤ−ＶＩ、（ｓｙｎ＝Ｄｄ−Ｖｉ）、（ｓｙｎ＝ＤＤＶＩ）、（ｓｙｎ＝ＤＤＶｉ）、Ｅ４、Ｅ７、Ｅ２８、Ｆ１１、Ｆ１３、Ｈ、Ｈ１、Ｈ３、Ｈ８、Ｋ３、Ｍ、Ｎ、ＮＤ−２、ＮＤ−３、ＮＤ４、ＮＤ−５、ＮＤ６、ＮＤ−７、Ｏｘ−１、（ｓｙｎ＝ＯＸ１）、（ｓｙｎ＝１１Ｆ）、Ｏｘ−２、（ｓｙｎ＝Ｏｘ２）、（ｓｙｎ＝ＯＸ２）、Ｏｘ−３、Ｏｘ−４、Ｏｘ−Ｓ、（ｓｙｎ＝ＯＸ５）、Ｏｘ−６、（ｓｙｎ＝６６Ｆ）、（ｓｙｎ＝φ６６ｔ）、（ｓｙｎ＝φ６６ｔ−）、Ｏ１１１、ＰｈＩ−１、ＲＢ４２、ＲＢ４３、ＲＢ４９、ＲＢ６９、Ｓ、Ｓａｌ−１、Ｓａｌ−２、Ｓａｌ−３、Ｓａｌ−４、Ｓａｌ−５、Ｓａｌ−６、ＴＣ２３、ＴＣ４５、ＴｕＩＩ＊−６、（ｓｙｎ＝ＴｕＩＩ＊）、ＴｕＩＩ＊−２４、ＴｕＩＩ＊４６、ＴｕＩＩ＊−６０、Ｔ２、（ｓｙｎ＝γ）、（ｓｙｎ＝γ）、（ｓｙｎ＝ＰＣ）、（ｓｙｎ＝Ｐ．Ｃ．）、（ｓｙｎ＝Ｔ−２）、（ｓｙｎ＝Ｔ２）、（ｓｙｎ＝Ｐ４）、Ｔ４、（ｓｙｎ＝Ｔ−４）、（ｓｙｎ＝Ｔ４）、Ｔ６、Ｔ３５、α１、１、１Ａ、３、（ｓｙｎ＝Ａｃ３）、３Ａ、３Ｔ＋、（ｓｙｎ＝３）、（ｓｙｎ＝Ｍ１）、５φ、（ｓｙｎ＝φ５）、９２６６Ｑ、ＣＦＯ１０３、ＨＫ６２０、Ｊ、Ｋ、Ｋ１Ｆ、ｍ５９、ｎｏ．Ａ、ｎｏ．Ｅ、ｎｏ．３、ｎｏ．９、Ｎ４、ｓｄ、（ｓｙｎ＝Ｓｄ）、（ｓｙｎ＝ＳＤ）、（ｓｙｎ＝Ｓｄ）、（ｓｙｎ＝ｓｄ）、（ｓｙｎ＝ＳＤ）、（ｓｙｎ＝ＣＤ）、Ｔ３、（ｓｙｎ＝Ｔ−３）、（ｓｙｎ＝Ｔ３）、Ｔ７、（ｓｙｎ＝Ｔ−７）、（ｓｙｎ＝Ｔ７）、ＷＰＫ、Ｗ３１、ΔＨ、φＣ３８８８、φＫ３、φＫ７、φＫ１２、φＶ−１、Φ０４−ＣＦ、Φ０５、Φ０６、Φ０７、φ１、φ１．２、φ２０、φ９５、φ２６３、φ１０９２、φＩ、φＩＩ、（ｓｙｎ＝φＷ）、Ω８、１、３、７、８、２６、２７、２８−２、２９、３０、３１、３２、３８、３９、４２、９３３Ｗ、ＮＮ−エシェリキア属（Escherichia）（１）、Ｅｓｃ−７−１１、ＡＣ３０、ＣＶＸ−５、Ｃ１、ＤＤＵＰ、ＥＣ１、ＥＣ２、Ｅ２１、Ｅ２９、Ｆ１、Ｆ２６Ｓ、Ｆ２７Ｓ、Ｈｉ、ＨＫ０２２、ＨＫ９７、（ｓｙｎ＝ΦＨＫ９７）、ＨＫ１３９、ＨＫ２５３、ＨＫ２５６、Ｋ７、ＮＤ−１、ｎｏ．Ｄ、ＰＡ−２、ｑ、Ｓ２、Ｔ１、（ｓｙｎ＝α）、（ｓｙｎ＝Ｐ２８）、（ｓｙｎ＝Ｔ−１）、（ｓｙｎ＝Ｔ１）、Ｔ３Ｃ、Ｔ５、（ｓｙｎ＝Ｔ−５）、（ｓｙｎ＝Ｔ５）、ＵＣ−１、ｗ、β４、γ２、λ、（ｓｙｎ＝λ）、（ｓｙｎ＝Φλ）、ΦＤ３２６、φγ、Φ０６、Φ７、Φ１０、φ８０、χ、（ｓｙｎ＝χ１）、（ｓｙｎ＝φχ）、（ｓｙｎ＝φχ１）、��、４、４Ａ、６、８Ａ、１０２、１５０、１６８、１７４、３０００、ＡＣ６、ＡＣ７、ＡＣ２８、ＡＣ４３、ＡＣ５０、ＡＣ５７、ＡＣ８１、ＡＣ９５、ＨＫ２４３、Ｋ１０、ＺＧ／３Ａ、５、５Ａ、２１ＥＬ、Ｈ１９−ｆ及び９３３Ｈによって感染される。
【０１１４】
[0115]  フソバクテリウム属（Fusobacterium）の細菌は、以下のファージ：ＮＮ−フソバクテリウム属（Fusobacterium）（２）、ｆｖ８３−５５４／３、ｆｖ８８−５３１／２、２２７、ｆｖ２３７７、ｆｖ２５２７及びｆｖ８５０１によって感染される。
【０１１５】
[0116]  ヘモフィルス属（Haemophilus）の細菌は、以下のファージ：ＨＰ１（ヘモフィルス属（Haemophilus）ファージＨＰ１）、Ｓ２及びＮ３によって感染される。
【０１１６】
[0117]  ヘリコバクター属（Helicobacter）の細菌は、以下のファージ：ＨＰ１（ピロリ菌（Helicobacter pylori）ファージＨＰ１）及びＮＮ−ヘリコバクター属（Helicobacter）（１）によって感染される。
【０１１７】
[0118]  クレブシエラ属（Klebsiella）の細菌は、以下のファージ：ＡＩＯ−２、Ｋｌ４Ｂ、Ｋｌ６Ｂ、Ｋｌ９、（ｓｙｎ＝Ｋｌ９）、Ｋｌ１４、Ｋｌ１５、Ｋｌ２１、Ｋｌ２８、Ｋｌ２９、Ｋｌ３２、Ｋｌ３３、Ｋｌ３５、Ｋｌ１０６Ｂ、Ｋｌ１７１Ｂ、Ｋｌ１８１Ｂ、Ｋｌ８３２Ｂ、ＡＩＯ−１、ＡＯ−１、ＡＯ−２、ＡＯ−３、ＦＣ３−１０、Ｋ、Ｋｌ１、（ｓｙｎ＝Ｋｌ１）、Ｋｌ２、（ｓｙｎ＝Ｋ１２）、Ｋｌ３、（ｓｙｎ＝Ｋｌ３）、（ｓｙｎ＝Ｋ１７０／１１）、Ｋｌ４、（ｓｙｎ＝Ｋｌ４）、Ｋｌ５、（ｓｙｎ＝Ｋｌ５）、Ｋｌ６、（ｓｙｎ＝Ｋｌ６）、Ｋｌ７、（ｓｙｎ＝Ｋｌ７）、Ｋｌ８、（ｓｙｎ＝Ｋ１８）、Ｋｌ１９、（ｓｙｎ＝Ｋｌ９）、Ｋｌ２７、（ｓｙｎ＝Ｋ１２７）、Ｋｌ３１、（ｓｙｎ＝Ｋｌ３１）、Ｋｌ３５、Ｋｌ１７１Ｂ、ＩＩ、ＶＩ、ＩＸ、ＣＩ−１、Ｋｌ４Ｂ、Ｋｌ８、Ｋｌ１１、Ｋｌ１２、Ｋｌ１３、Ｋｌ１６、Ｋｌ１７、Ｋｌ１８、Ｋｌ２０、Ｋｌ２２、Ｋｌ２３、Ｋｌ２４、Ｋｌ２６、Ｋｌ３０、Ｋｌ３４、Ｋｌ１０６Ｂ、Ｋｌ１６５Ｂ、Ｋｌ３２８Ｂ、ＫＬＸＩ、Ｋ３２８、Ｐ５０４６、１１、３８０、ＩＩＩ、ＩＶ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＦＣ３−１１、Ｋｌ２Ｂ、（ｓｙｎ＝Ｋｌ２Ｂ）、Ｋｌ２５、（ｓｙｎ＝Ｋｌ２５）、Ｋｌ４２Ｂ、（ｓｙｎ＝Ｋｌ４２）、（ｓｙｎ＝Ｋｌ４２Ｂ）、Ｋｌ１８１Ｂ、（ｓｙｎ＝Ｋｌ１８１）、（ｓｙｎ＝Ｋｌ１８１Ｂ）、Ｋｌ７６５／１、（ｓｙｎ＝Ｋｌ７６５／１）、Ｋｌ８４２Ｂ、（ｓｙｎ＝Ｋｌ８３２Ｂ）、Ｋｌ９３７Ｂ、（ｓｙｎ＝Ｋｌ９３７Ｂ）、Ｌ１、φ２８、７、２３１、４８３、４９０、６３２及び８６４／１００によって感染される。
【０１１８】
[0119]  レプトスピラ属（Leptospira）の細菌は、以下のファージ：ＬＥ１、ＬＥ３、ＬＥ４及びＮＮ−レプトスピラ属（Leptospira）（１）によって感染される。
【０１１９】
[0120]  リステリア属（Listeria）の細菌は、以下のファージ：Ａ５１１、Ｏ１７６１、４２１１、４２８６、（ｓｙｎ＝ＢＯ５４）、Ａ００５、Ａ００６、Ａ０２０、Ａ５００、Ａ５０２、Ａ５１１、Ａ１１８、Ａ６２０、Ａ６４０、Ｂ０１２、Ｂ０２１、Ｂ０２４、Ｂ０２５、Ｂ０３５、Ｂ０５１、Ｂ０５３、Ｂ０５４、Ｂ０５５、Ｂ０５６、Ｂ１０１、Ｂ１１０、Ｂ５４５、Ｂ６０４、Ｂ６５３、Ｃ７０７、Ｄ４４１、ＨＳＯ４７、Ｈ１ＯＧ、Ｈ８／７３、Ｈ１９、Ｈ２１、Ｈ４３、Ｈ４６、Ｈ１０７、Ｈ１０８、Ｈ１０、Ｈ１６３／８４、Ｈ１３１２、Ｈ３４０、Ｈ３８７、Ｈ３９１／７３、Ｈ６８４／７４、Ｈ９２４Ａ、ＰＳＡ、Ｕ１５３、φＭＬＵＰ５、（ｓｙｎ＝Ｐ３５）、００２４１、００６１１、０２９７１Ａ、０２９７１Ｃ、５／４７６、５／９１１、５／９３９、５／１１３０２、５／１１６０５、５／１１７０４、１８４、５７５、６３３、６９９／６９４、７４４、９００、１０９０、１３１７、１４４４、１６５２、１８０６、１８０７、１９２１／９５９、１９２１／１１３６７、１９２１／１１５００、１９２１／１１５６６、１９２１／１２４６０、１９２１／１２５８２、１９６７、２３８９、２４２５、２６７１、２６８５、３２７４、３５５０、３５５１、３５５２、４２７６、４２７７、４２９２、４４７７、５３３７、５３４８／１１３６３、５３４８／１１６４６、５３４８／１２４３０、５３４８／１２４３４、１００７２、１１３５５Ｃ、１１７１１Ａ、１２０２９、１２９８１、１３４４１、９０６６６、９０８１６、９３２５３、９０７５１５、９１０７１６及びＮＮ−リステリア属（Listeria）（１５）によって感染される。
【０１２０】
[0121]  モルガネラ属（Morganella）の細菌は、以下のファージ：４７によって感染される。
【０１２１】
[0122]  マイコバクテリウム属（Mycobacterium）の細菌は、以下のファージ：Ｉ３、ＡＧ１、ＡＬ１、ＡＴＣＣ  １１７５９、Ａ２、Ｂ．Ｃ３、ＢＧ２、ＢＫ１、ＢＫ５、ブチリカム（butyricum）、Ｂ−１、Ｂ５、Ｂ７、Ｂ３０、Ｂ３５、Clark、Ｃ１、Ｃ２、ＤＮＡＩＩＩ、ＤＳＰ１、Ｄ４、Ｄ２９、ＧＳ４Ｅ、（ｓｙｎ＝ＧＳ４Ｅ）、ＧＳ７、（ｓｙｎ＝ＧＳ−７）、（ｓｙｎ＝ＧＳ７）、ＩＰα、ラクチコラ（lacticola）、Legendre、Leo、Ｌ５、（ｓｙｎ＝ΦＬ−５）、ＭＣ−１、ＭＣ−３、ＭＣ−４、ミネッティ（minetti）、ＭＴＰＨ１１、Ｍｘ４、ＭｙＦ３Ｐ／５９ａ、フレイ、（ｓｙｎ＝フレイ１）、フレイ４、Polonus II、ラビノヴィッチ（rabinovitschi）、スメグマチス（smegmatis）、ＴＭ４、ＴＭ９、ＴＭ１０、ＴＭ１２０、Ｙ７、Ｙ１０、φ６３０、１Ｂ、１Ｆ、１Ｈ、１／１、６７、１０６、１４３０、Ｂ１、（ｓｙｎ＝Ｂｏｌ）、Ｂ２４、Ｄ、Ｄ２９、Ｆ−Ｋ、Ｆ−Ｓ、ＨＰ、Polonus I、Roy、Ｒ１、（ｓｙｎ＝Ｒ１−Ｍｙｂ）、（ｓｙｎ＝Ｒ１）、１１、３１、４０、５０、１０３ａ、１０３ｂ、１２８、３１１１−Ｄ、３２１５−Ｄ及びＮＮ−マイコバクテリウム属（Mycobacterium）（１）によって感染される。
【０１２２】
[0123]  ナイセリア属（Neisseria）の細菌は、以下のファージ：グループＩ、グループＩＩ及びＮＰ１によって感染される。
【０１２３】
[0124]  ノカルディア属（Nocardia）の細菌は、以下のファージ：Ｐ８、ＮＪ−Ｌ、ＮＳ−８、Ｎ５及びＮＮ−ノカルディア属（Nocardia）（１）によって感染される。
【０１２４】
[0125]  プロテウス属（Proteus）の細菌は、以下のファージ：Ｐｍ５、１３ｖｉｒ、２／４４、４／５４５、６／１００４、１３／８０７、２０／８２６、５７、６７ｂ、７８、１０７／６９、１２１、９／０、２２／６０８、３０／６８０、Ｐｍ１、Ｐｍ３、Ｐｍ４、Ｐｍ６、Ｐｍ７、Ｐｍ９、Ｐｍ１０、Ｐｍ１１、Ｐｖ２、π１、φｍ、７／５４９、９Ｂ／２、１０Ａ／３１、１２／５５、１４、１５、１６／７８９、１７／９７１、１９Ａ／６５３、２３／５３２、２５／９０９、２６／２１９、２７／９５３、３２Ａ／９０９、３３／９７１、３４／１３、６５、５００６Ｍ、７４８０ｂ、ＶＩ、１３／３ａ、Clichy 12、π２６００、φχ７、１／１００４、５／７４２、９、１２、１４、２２、２４／８６０、２６００／Ｄ５２、Ｐｍ８及び２４／２５１４によって感染される。
【０１２５】
[0126]  プロビデンシア属（Providencia）の細菌は、以下のファージ：ＰＬ２５、ＰＬ２６、ＰＬ３７、９２１１／９２９５、９２１３／９２１１ｂ、９２４８、７／Ｒ４９、７４７６１３２２、７４７８／３２５、７４７９、７４８０、９０００／９４０２及び９２１３／９２１１ａによって感染される。
【０１２６】
[0127]  シュードモナス属（Pseudomonas）の細菌は、以下のファージ：Ｐｆ１、（ｓｙｎ＝Ｐｆ−１）、Ｐｆ２、Ｐｆ３、ＰＰ７、ＰＲＲ１、７ｓ、ＮＮ−シュードモナス属（Pseudomonas）（１）、ＡＩ−１、Ｍ−２、Ｂ１７、Ｂ８９、ＣＢ３、Ｃｏｌ  ２、Ｃｏｌ  １１、Ｃｏｌ  １８、Ｃｏｌ  ２１、Ｃ１５４、Ｃ１６３、Ｃ１６７、Ｃ２１２１、Ｅ７９、Ｆ８、ｇａ、ｇｂ、Ｈ２２、Ｋ１、Ｍ４、Ｎ２、Ｎｕ、ＰＢ−１、（ｓｙｎ＝ＰＢ１）、ｐｆ１６、ＰＭＮ１７、ＰＰ１、ＰＰ８、Ｐｓａ１、ＰｓＰ１、ＰｓＰ２、ＰｓＰ３、ＰｓＰ４、ＰｓＰ５、ＰＳ３、ＰＳ１７、ＰＴＢ８０、ＰＸ４、ＰＸ７、ＰＹＯ１、ＰＹＯ２、ＰＹＯ５、ＰＹＯ６、ＰＹＯ９、ＰＹＯ１０、ＰＹＯ１３、ＰＹＯ１４、ＰＹＯ１６、ＰＹＯ１８、ＰＹＯ１９、ＰＹＯ２０、ＰＹＯ２９、ＰＹＯ３２、ＰＹＯ３３、ＰＹＯ３５、ＰＹＯ３６、ＰＹＯ３７、ＰＹＯ３８、ＰＹＯ３９、ＰＹＯ４１、ＰＹＯ４２、ＰＹＯ４５、ＰＹＯ４７、ＰＹＯ４８、ＰＹＯ６４、ＰＹＯ６９、ＰＹＯ１０３、Ｐ１Ｋ、ＳＬＰ１、ＳＬ２、Ｓ２、ＵＮＬ−１、ｗｙ、Ｙａ１、Ｙａ４、Ｙａ１１、φＢＥ、φＣＴＸ、φＣ１７、φＫＺ、（ｓｙｎ＝ΦＫＺ）、φ−ＬＴ、Φｍｕ７８、φＮＺ、φＰＬＳ−１、φＳＴ−１、φＷ−１４、φ−２、１／７２、２／７９、３、３／ＤＯ、４／２３７、５／４０６、６Ｃ、６／６６６０、７、７ｖ、７／１８４、８／２８０、９／９５、１０／５０２、１１／ＤＥ、１２／１００、１２Ｓ、１６、２１、２４、２５Ｆ、２７、３１、４４、６８、７１、９５、１０９、１８８、３３７、３５２、１２１４、ＮＮ−シュードモナス属（Pseudomonas）（２３）、Ａ８５６、Ｂ２６、ＣＩ−１、ＣＩ−２、Ｃ５、Ｄ、ｇｈ−１、Ｆ１１６、ＨＦ、Ｈ９０、Ｋ５、Ｋ６、Ｋ１０４、Ｋ１０９、Ｋ１６６、Ｋ２６７、Ｎ４、Ｎ５、Ｏ６Ｎ−２５Ｐ、ＰＥ６９、Ｐｆ、ＰＰＮ２５、ＰＰＮ３５、ＰＰＮ８９、ＰＰＮ９１、ＰＰ２、ＰＰ３、ＰＰ４、ＰＰ６、ＰＰ７、ＰＰ８、ＰＰ５６、ＰＰ８７、ＰＰ１１４、ＰＰ２０６、ＰＰ２０７、ＰＰ３０６、ＰＰ６５１、Ｐｓｐ２３１ａ、Ｐｓｓｙ４０１、Ｐｓｓｙ９２２０、ｐｓ１、ＰＴＢ２、ＰＴＢ２０、ＰＴＢ４２、ＰＸ１、ＰＸ３、ＰＸ１０、ＰＸ１２、ＰＸ１４、ＰＹＯ７０、ＰＹＯ７１、Ｒ、ＳＨ６、ＳＨ１３３、ｔｆ、Ｙａ５、Ｙａ７、φＢＳ、ΦＫｆ７７、φ−ＭＣ、ΦｍｎＦ８２、φＰＬＳ２７、φＰＬＳ７４３、φＳ−１、１、２、２、３、４、５、６、７、７、８、９、１０、１１、１２、１２Ｂ、１３、１４、１５、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２０、２１、２１、２２、２３、２３、２４、２５、３１、５３、７３、１１９ｘ、１４５、１４７、１７０、２６７、２８４、３０８、５２５、ＮＮ−シュードモナス属（Pseudomonas）（５）、ａｆ、Ａ７、Ｂ３、Ｂ３３、Ｂ３９、ＢＩ−１、Ｃ２２、Ｄ３、Ｄ３７、Ｄ４０、Ｄ６２、Ｄ３１１２、Ｆ７、Ｆ１０、ｇ、ｇｄ、ｇｅ、ｇｆ、Ｈｗ１２、Ｊｂ１９、ＫＦ１、Ｌ°、ＯＸＮ−３２Ｐ、Ｏ６Ｎ−５２Ｐ、ＰＣＨ−１、ＰＣ１３−１、ＰＣ３５−１、ＰＨ２、ＰＨ５１、ＰＨ９３、ＰＨ１３２、ＰＭＷ、ＰＭ１３、ＰＭ５７、ＰＭ６１、ＰＭ６２、ＰＭ６３、ＰＭ６９、ＰＭ１０５、ＰＭ１１３、ＰＭ６８１、ＰＭ６８２、ＰＯ４、Ｐ��１、ＰＰ４、ＰＰ５、ＰＰ６４、ＰＰ６５、ＰＰ６６、ＰＰ７１、ＰＰ８６、ＰＰ８８、ＰＰ９２、ＰＰ４０１、ＰＰ７１１、ＰＰ８９１、Ｐｓｓｙ４１、Ｐｓｓｙ４２、Ｐｓｓｙ４０３、Ｐｓｓｙ４０４、Ｐｓｓｙ４２０、Ｐｓｓｙ９２３、ＰＳ４、ＰＳ−１０、Ｐｚ、ＳＤ１、ＳＬ１、ＳＬ３、ＳＬ５、ＳＭ、φＣ５、φＣ１１、φＣ１１−１、φＣ１３、φＣ１５、φＭＯ、φＸ、φ０４、φ１１、φ２４０、２、２Ｆ、５、７ｍ、１１、１３、１３／４４１、１４、２０、２４、４０、４５、４９、６１、７３、１４８、１６０、１９８、２１８、２２２、２３６、２４２、２４６、２４９、２５８、２６９、２９５、２９７、３０９、３１８、３４２、３５０、３５１、３５７−１、４００−１、ＮＮ−シュードモナス属（Pseudomonas）（６）、Ｇ１０、Ｍ６、Ｍ６ａ、Ｌ１、ＰＢ２、Ｐｓｓｙ１５、Ｐｓｓｙ４２１０、Ｐｓｓｙ４２２０、ＰＹＯ１２、ＰＹＯ３４、ＰＹＯ４９、ＰＹＯ５０、ＰＹＯ５１、ＰＹＯ５２、ＰＹＯ５３、ＰＹＯ５７、ＰＹＯ５９、ＰＹＯ２００、ＰＸ２、ＰＸ５、ＳＬ４、φ０３、φ０６及び１２１４によって感染される。
【０１２７】
[0128]  リケッチア属（Rickettsia）の細菌は、以下のファージ：ＮＮ−リケッチア属（Rickettsia）（１）によって感染される。
【０１２８】
[0129]  サルモネラ属（Salmonella）の細菌は、以下のファージ：ｂ、Beccles、ＣＴ、ｄ、Dundee、ｆ、Ｆｅｌｓ  ２、ＧＩ、ＧＩＩＩ、ＧＶＩ、ＧＶＩＩＩ、ｋ、Ｋ、ｉ、ｊ、Ｌ、Ｏ１、（ｓｙｎ＝Ｏ−１）、（ｓｙｎ＝Ｏ１）、（ｓｙｎ＝Ｏ−Ｉ）、（ｓｙｎ＝７）、Ｏ２、Ｏ３、Ｐ３、Ｐ９ａ、Ｐ１０、Ｓａｂ３、Ｓａｂ５、Ｓａｎ１５、Ｓａｎ１７、ＳＩ、Taunton、ＶｉＩ、（ｓｙｎ＝Ｖｉｌ）、９、ＮＮ−サルモネラ属（Salmonella）（１）、Ｎ−１、Ｎ−５、Ｎ−１０、Ｎ−１７、Ｎ−２２、１１、１２、１６−１９、２０．２、３６、４４９Ｃ／Ｃ１７８、９６６Ａ／Ｃ２５９、ａ、Ｂ．Ａ．Ｏ．Ｒ．、ｅ、Ｇ４、ＧＩＩＩ、Ｌ、ＬＰ７、Ｍ、ＭＧ４０、Ｎ−１８、ＰＳＡ６８、Ｐ４、Ｐ９ｃ、Ｐ２２、（ｓｙｎ＝Ｐ２２）、（ｓｙｎ＝ＰＬＴ２２）、（ｓｙｎ＝ＰＬＴ２２）、Ｐ２２ａ１、Ｐ２２−４、Ｐ２２−７、Ｐ２２−１１、ＳＮＴ−１、ＳＮＴ−２、ＳＰ６、ＶｉＩＩＩ、ＶｉＩＶ、ＶｉＶ、ＶｉＶＩ、ＶｉＶＩＩ、Worksop、ε１５、ε３４、１、３７、１（４０）、（ｓｙｎ＝φ１［４０］）、１、４２２、２、２．５、３ｂ、４、５、６、１４（１８）、８、１４（６，７）、１０、２７、２８Ｂ、３０、３１、３２、３３、３４、３６、３７、３９、１４１２、ＳＮＴ−３，７−１１、４０．３、ｃ、Ｃ２３６、Ｃ５５７、Ｃ６２５、Ｃ９６６Ｎ、ｇ、ＧＶ、Ｇ５、Ｇ１７３、ｈ、ＩＲＡ、Jersey、Ｍ７８、Ｐ２２−１、Ｐ２２−３、Ｐ２２−１２、Ｓａｂ１、Ｓａｂ２、Ｓａｂ２、Ｓａｂ４、Ｓａｎ１、Ｓａｎ２、Ｓａｎ３、Ｓａｎ４、Ｓａｎ６、Ｓａｎ７、Ｓａｎ８、Ｓａｎ９、Ｓａｎ１３、Ｓａｎ１４、Ｓａｎ１６、Ｓａｎ１８、Ｓａｎ１９、Ｓａｎ２０、Ｓａｎ２１、Ｓａｎ２２、Ｓａｎ２３、Ｓａｎ２４、Ｓａｎ２５、Ｓａｎ２６、ＳａｓＬ１、ＳａｓＬ２、ＳａｓＬ３、ＳａｓＬ４、ＳａｓＬ５、Ｓ１ＢＬ、ＳＩＩ、ＶｉＩＩ、φ１、１、２、３ａ、３ａＩ、１０１０、ＮＮ−サルモネラ属（Salmonella）（１）、Ｎ−４、ＳａｓＬ６及び２７によって感染される。
【０１２９】
[0130]  セラチア属（Serratia）の細菌は、以下のファージ：Ａ２Ｐ、ＰＳ２０、ＳＭＢ３、ＳＭＰ、ＳＭＰ５、ＳＭ２、Ｖ４０、Ｖ５６、κ、ＤＣＰ−３、（ＤＣＰ−６、３Ｍ、１０／１ａ、２０Ａ、３４ＣＣ、３４Ｈ、３８Ｔ、３４５Ｇ、３４５Ｐ、５０１Ｂ、ＳＭＢ２、ＳＭＰ２、ＢＣ、ＢＴ、ＣＷ２、ＣＷ３、ＣＷ４、ＣＷ５、Ｌ１２３２、Ｌ２２３２、Ｌ３４、Ｌ．２２８、ＳＬＰ、ＳＭＰＡ、Ｖ．４３、σ、φＣＷ１、ΦＣＰ６−１、ΦＣＰ６−２、ΦＣＰ６−５、３Ｔ、５、８、９Ｆ、１０／１、２０Ｅ、３２／６、３４Ｂ、３４ＣＴ、３４Ｐ、３７、４１、５６、５６Ｄ、５６Ｐ、６０Ｐ、６１／６、７４／６、７６／４、１０１／８９００、２２６、２２７、２２８、２２９Ｆ、２８６、２８９、２９０Ｆ、５１２、７６４ａ、２８４７／１０、２８４７／１０ａ、Ｌ．３５９及びＳＭＢ１によって感染される。
【０１３０】
[0131]  シゲラ属（Shigella）の細菌は、以下のファージ：Ｆｓａ、（ｓｙｎ＝ａ）、ＦＳＤ２ｄ、（ｓｙｎ＝Ｄ２ｄ）、（ｓｙｎ＝Ｗ２ｄ）、ＦＳＤ２Ｅ、（ｓｙｎ＝Ｗ２ｅ）、ｆｖ、Ｆ６、ｆ７．８、Ｈ−Ｓｈ、ＰＥ５、Ｐ９０、ＳｆＩＩ、Ｓｈ、ＳＨＩＩＩ、ＳＨＩＶ、（ｓｙｎ＝ＨＩＶ）、ＳＨＶＩ、（ｓｙｎ＝ＨＶＩ）、ＳＨＶＩＩＩ、（ｓｙｎ＝ＨＶＩＩＩ）、ＳＫγ６６、（ｓｙｎ＝γ  ６６）、（ｓｙｎ＝γ６６）、（ｓｙｎ＝γ６６ｂ）、ＳＫＩＩＩ、（ｓｙｎ＝ＳＩＩＩｂ）、（ｓｙｎ＝ＩＩＩ）、ＳＫＩＶ、（ｓｙｎ＝ＳＩＶａ）、（ｓｙｎ＝ＩＶ）、ＳＫＩＶａ、（ｓｙｎ＝ＳＩＶＡｎ）、（ｓｙｎ＝ＩＶＡ）、ＳＫＶＩ、（ｓｙｎ＝ＫＶＩ）、（ｓｙｎ＝ＳＶＩ）、（ｓｙｎ＝ＶＩ）、ＳＫＶＩＩＩ、（ｓｙｎ＝ＳＶＩＩＩ）、（ｓｙｎ＝ＶＩＩＩ）、ＳＫＶＩＩＩＡ、（ｓｙｎ＝ＳＶＩＩＩＡ）、（ｓｙｎ＝ＶＩＩＩＡ）、ＳＴＶＩ、ＳＴＩＸ、ＳＴＸＩ、ＳＴＸＩＩ、Ｓ６６、Ｗ２、（ｓｙｎ＝Ｄ２ｃ）、（ｓｙｎ＝Ｄ２０）、φＩ、φＩＶ１、３−ＳＯ−Ｒ、８３６８−ＳＯ−Ｒ、Ｆ７、（ｓｙｎ＝ＦＳ７）、（ｓｙｎ＝Ｋ２９）、Ｆ１０、（ｓｙｎ＝ＦＳ１０）、（ｓｙｎ＝Ｋ３１）、Ｉ１、（ｓｙｎ＝ａｌｆａ）、（ｓｙｎ＝ＦＳα）、（ｓｙｎ＝Ｋ１８）、（ｓｙｎ＝α）、Ｉ２、（ｓｙｎ＝ａ）、（ｓｙｎ＝Ｋ１９）、ＳＧ３５、（ｓｙｎ＝Ｇ３５）、（ｓｙｎ＝ＳＯ−３５／Ｇ）、ＳＧ５５、（ｓｙｎ＝ＳＯ−５５／Ｇ）、ＳＧ３２０１、（ｓｙｎ＝ＳＯ−３２０１／Ｇ）、ＳＨＩＩ、（ｓｙｎ＝ＨＩＩ）、ＳＨＶ、（ｓｙｎ＝ＳＨＶ）、ＳＨＸ、ＳＨＸ、ＳＫＩＩ、（ｓｙｎ＝Ｋ２）、（ｓｙｎ＝ＫＩＩ）、（ｓｙｎ＝ＳＩＩ）、（ｓｙｎ＝ＳｓＩＩ）、（ｓｙｎ＝ＩＩ）、ＳＫＩＶ、（ｓｙｎ＝ＳＩＶｂ）、（ｓｙｎ＝ＳｓＩＶ）、（ｓｙｎ＝ＩＶ）、ＳＫＩＶａ、（ｓｙｎ＝ＳＩＶａｂ）、（ｓｙｎ＝ＳｓＩＶａ）、（ｓｙｎ＝ＩＶａ）、ＳＫＶ、（ｓｙｎ＝Ｋ４）、（ｓｙｎ＝ＫＶ）、（ｓｙｎ＝ＳＶ）、（ｓｙｎ＝ＳｓＶ）、（ｓｙｎ＝Ｖ）、ＳＫＸ、（ｓｙｎ＝Ｋ９）、（ｓｙｎ＝ＫＸ）、（ｓｙｎ＝ＳＸ）、（ｓｙｎ＝ＳｓＸ）、（ｓｙｎ＝Ｘ）、ＳＴＶ、（ｓｙｎ＝Ｔ３５）、（ｓｙｎ＝３５−５０−Ｒ）、ＳＴＶＩＩＩ、（ｓｙｎ＝Ｔ８３４５）、（ｓｙｎ＝８３４５−ＳＯ−Ｓ−Ｒ）、Ｗ１、（ｓｙｎ＝Ｄ８）、（ｓｙｎ＝ＦＳＤ８）、Ｗ２ａ、（ｓｙｎ＝Ｄ２Ａ）、（ｓｙｎ＝ＦＳ２ａ）、ＤＤ−２、Ｓｆ６、ＦＳ１、（ｓｙｎ＝Ｆ１）、ＳＦ６、（ｓｙｎ＝Ｆ６）、ＳＧ４２、（ｓｙｎ＝ＳＯ−４２／Ｇ）、ＳＧ３２０３、（ｓｙｎ＝ＳＯ−３２０３／Ｇ）、ＳＫＦ１２、（ｓｙｎ＝ＳｓＦ１２）、（ｓｙｎ＝Ｆ１２）、（ｓｙｎ＝Ｆ１２）、ＳＴＩＩ、（ｓｙｎ＝１８８１−ＳＯ−Ｒ）、γ６６、（ｓｙｎ＝γ  ６６ａ）、（ｓｙｎ＝Ｓｓγ６６）、φ２、Ｂ１１、ＤＤＶＩＩ、（ｓｙｎ＝ＤＤ７）、ＦＳＤ２ｂ、（ｓｙｎ＝Ｗ２Ｂ）、ＦＳ２、（ｓｙｎ＝Ｆ２）、（ｓｙｎ＝Ｆ２）、ＦＳ４、（ｓｙｎ＝Ｆ４）、（ｓｙｎ＝Ｆ４）、ＦＳ５、（ｓｙｎ＝Ｆ５）、（ｓｙｎ＝Ｆ５）、ＦＳ９、（ｓｙｎ＝Ｆ９）、（ｓｙｎ＝Ｆ９）、Ｆ１１、Ｐ２−ＳＯ−Ｓ、ＳＧ３６、（ｓｙｎ＝ＳＯ−３６／Ｇ）、（ｓｙｎ＝Ｇ３６）、ＳＧ３２０４、（ｓｙｎ＝ＳＯ−３２０４／Ｇ）、���Ｇ３２４４、（ｓｙｎ＝ＳＯ−３２４４／Ｇ）、ＳＨＩ、（ｓｙｎ＝ＨＩ）、ＳＨＶＩＩ、（ｓｙｎ＝ＨＶＩＩ）、ＳＨＩＸ、（ｓｙｎ＝ＨＩＸ）、ＳＨＸＩ、ＳＨＸＩＩ、（ｓｙｎ＝ＨＸＩＩ）、ＳＫＩ、ＫＩ、（ｓｙｎ＝ＳＩ）、（ｓｙｎ＝ＳｓＩ）、ＳＫＶＩＩ、（ｓｙｎ＝ＫＶＩＩ）、（ｓｙｎ＝ＳＶＩＩ）、（ｓｙｎ＝ＳｓＶＩＩ）、ＳＫＩＸ、（ｓｙｎ＝ＫＩＸ）、（ｓｙｎ＝ＳＩＸ）、（ｓｙｎ＝ＳｓＩＸ）、ＳＫＸＩＩ、（ｓｙｎ＝ＫＸＩＩ）、（ｓｙｎ＝ＳＶＩＩ）、（ｓｙｎ＝ＳｓＸＩＩ）、ＳＴＩ、ＳＩＩＩ、ＳＴＩＩＩ、ＳＴＩＶ、ＳＴＶＩＩ、Ｓ７０、Ｓ２０６、Ｕ２−ＳＯ-Ｓ、３２１０−ＳＯ−Ｓ、３８５９−ＳＯ−Ｓ、４０２０−ＳＯ−Ｓ、φ３、φ５、φ７、φ８、φ９、φ１０、φ１１、φ１３、φ１４、φ１８、ＳＨＩＩＩ、（ｓｙｎ＝ＨＩＩＩ）、ＳＨＸＩ、（ｓｙｎ＝ＨＸＩ）及びＳＸＩ、（ｓｙｎ＝ＫＸＩ）、（ｓｙｎ＝ＳＸＩ）、（ｓｙｎ＝ＳｓＸＩ）、（ｓｙｎ＝ＸＩ）によって感染される。
【０１３１】
[0132]  スタフィロコッカス属（Staphylococcus）の細菌は、以下のファージ：Ａ、ＥＷ、Ｋ、Ｐｈ５、Ｐｈ９、Ｐｈ１０、Ｐｈ１３、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ８、Ｐ９、Ｐ１０、ＲＧ、ＳＢ−１、（ｓｙｎ＝Ｓｂ−１）、Ｓ３Ｋ、Ｔｗｏｒｔ、φＳＫ３１１、φ８１２、０６、４０、５８、１１９、１３０、１３１、２００、１６２３、ＳＴＣ１、（ｓｙｎ＝ｓｔｃ１）、ＳＴＣ２、（ｓｙｎ＝ｓｔｃ２）、４４ＡＨＪＤ、６８、ＡＣ１、ＡＣ２、Ａ６“Ｃ”、Ａ９“Ｃ”、ｂ５８１、ＣＡ−１、ＣＡ−２、ＣＡ−３、ＣＡ−４、ＣＡ−５、Ｄ１１、Ｌ３９×３５、Ｌ５４ａ、Ｍ４２、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ７、Ｎ８、Ｎ１０、Ｎ１１、Ｎ１２、Ｎ１３、Ｎ１４、Ｎ１６、Ｐｈ６、Ｐｈ１２、Ｐｈ１４、ＵＣ−１８、Ｕ４、Ｕ１５、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５、Ｘ２、Ｚ１、φＢ５−２、φＤ、ω、１１、（ｓｙｎ＝φ１１）、（ｓｙｎ＝Ｐ１１−Ｍ１５）、１５、２８、２８Ａ、２９、３１、３１Ｂ、３７、４２Ｄ、（ｓｙｎ＝Ｐ４２Ｄ）、４４Ａ、４８、５１、５２、５２Ａ、（ｓｙｎ＝Ｐ５２Ａ）、５２Ｂ、５３、５５、６９、７１、（ｓｙｎ＝Ｐ７１）、７１Ａ、７２、７５、７６、７７、７９、８０、８０ａ、８２、８２Ａ、８３Ａ、８４、８５、８６、８８、８８Ａ、８９、９０、９２、９５、９６、１０２、１０７、１０８、１１１、１２９−２６、１３０、１３０Ａ、１５５、１５７、１５７Ａ、１６５、１８７、２７５、２７５Ａ、２７５Ｂ、３５６、４５６、４５９、４７１、４７１Ａ、４８９、５８１、６７６、８９８、１１３９、１１５４Ａ、１２５９、１３１４、１３８０、１４０５、１５６３、２１４８、２６３８Ａ、２６３８Ｂ、２６３８Ｃ、２７３１、２７９２Ａ、２７９２Ｂ、２８１８、２８３５、２８４８Ａ、３６１９、５８４１、１２１００、ＡＣ３、Ａ８、Ａ１０、Ａ１３、ｂ５９４ｎ、Ｄ、Ｍ１２、Ｎ９、Ｎ１５、Ｐ５２、Ｐ８７、Ｓ１、Ｓ６、Ｚ４、φＲＥ、３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、６、７、１６、２１、４２Ｂ、４２Ｃ、４２Ｅ、４４、４７、４７Ａ、４７Ｃ、５１、５４、５４×１、７０、７３、７５、７８、８１、８２、８８、９３、９４、１０１、１０５、１１０、１１５、１２９／１６、１７４、５９４ｎ、１３６３／１４、２４６０及びＮＮ−スタフィロコッカス属（Staphylococcus）（１）によって感染される。
【０１３２】
[0133]  ストレプトコッカス属（Streptococcus）の細菌は、以下のファージ：ＥＪ−１、ＮＮ−ストレプトコッカス属（Streptococcus）（１）、ａ、Ｃｌ、ＦＬＯＴｈｓ、Ｈ３９、Ｃｐ−１、Ｃｐ−５、Ｃｐ−７、Ｃｐ−９、Ｃｐ−１０、ＡＴ２９８、Ａ５、ａ１０／Ｊ１、ａ１０／Ｊ２、ａ１０／Ｊ５、ａ１０／Ｊ９、Ａ２５、ＢＴ１１、ｂ６、ＣＡ１、ｃ２０−１、ｃ２０−２、ＤＰ−１、Ｄｐ−４、ＤＴ１、ＥＴ４２、ｅ１０、ＦＡ１０１、ＦＥＴｈｓ、ＦＫ、ＦＫＫ１０１、ＦＫＬ１０、ＦＫＰ７４、ＦＫ１１、ＦＬＯＴｈｓ、ＦＹ１０１、ｆ１、Ｆ１０、Ｆ２０１４０／７６、ｇ、ＧＴ−２３４、ＨＢ３、（ｓｙｎ＝ＨＢ−３）、ＨＢ−６２３、ＨＢ−７４６、Ｍ１０２、Ｏ１２０５、φＯ１２０５、ＰＳＴ、Ｐ０、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ５、Ｐ６、Ｐ８、Ｐ９、Ｐ９、Ｐ１２、Ｐ１３、Ｐ１４、Ｐ４９、Ｐ５０、Ｐ５１、Ｐ５２、Ｐ５３、Ｐ５４、Ｐ５５、Ｐ５６、Ｐ５７、Ｐ５８、Ｐ５９、Ｐ６４、Ｐ６７、Ｐ６９、Ｐ７１、Ｐ７３、Ｐ７５、Ｐ７６、Ｐ７７、Ｐ８２、Ｐ８３、Ｐ８８、ｓｃ、ｓｃｈ、ｓｆ、Ｓｆｉ１１、（ｓｙｎ＝ＳＦｉ１１）、（ｓｙｎ＝φＳＦｉ１１）、（ｓｙｎ＝ΦＳｆｉ１１）、（ｓｙｎ＝φＳｆｉ１１）、ｓｆｉ１９、（ｓｙｎ＝ＳＦｉ１９）、（ｓｙｎ＝φＳＦｉ１９）、（ｓｙｎ＝φＳｆｉ１９）、Ｓｆｉ２１、（ｓｙｎ＝ＳＦｉ２１）、（ｓｙｎ＝φＳＦｉ２１）、（ｓｙｎ＝φＳｆｉ２１）、ＳＴＧ、ＳＴＸ、ｓｔ２、ＳＴ２、ＳＴ４、Ｓ３、（ｓｙｎ＝φＳ３）、ｓ２６５、Φ１７、φ４２、Φ５７、φ８０、φ８１、φ８２、φ８３、φ８４、φ８５、φ８６、φ８７、φ８８、φ８９、φ９０、φ９１、φ９２、φ９３、φ９４、φ９５、φ９６、φ９７、φ９８、φ９９、φ１００、φ１０１、φ１０２、φ２２７、Φ７２０１、ω１、ω２、ω３、ω４、ω５、ω６、ω８、ω１０、１、６、９、１０Ｆ、１２／１２、１４、１７ＳＲ、１９Ｓ、２４、５０／３３、５０／３４、５５／１４、５５／１５、７０／３５、７０／３６、７１／ＳＴ１５、７１／４５、７１／４６、７４Ｆ、７９１３７、７９／３８、８０／Ｊ４、８０／Ｊ９、８０／ＳＴ１６、８０／１５、８０／４７、８０／４８、１０１、１０３／３９、１０３／４０、１２１／４１、１２１／４２、１２３／４３、１２３／４４、１２４／４４、３３７／ＳＴ１７及びＮＮ−ストレプトコッカス属（Streptococcus）（３４）によって感染される。
【０１３３】
[0134]  トレポネーマ属（Treponema）の細菌は、以下のファージ：ＮＮ−トレポネーマ属（Treponema）（１）によって感染される。
【０１３４】
[0135]  ビブリオ属（Vibrio）の細菌は、以下のファージ：ＣＴＸΦ、ｆｓ、（ｓｙｎ＝ｓ１）、ｆｓ２、１ｖｐｆｓ、Ｖｆ１２、Ｖｆ３３、ＶＰＩΦ、ＶＳＫ、ｖ６、４９３、ＣＰ−Ｔ１、ＥＴ２５、κ、Ｋ１３９、ＬａｂｏＩ，）ＸＮ−６９Ｐ、ＯＸＮ−８６、Ｏ６Ｎ−２１Ｐ、ＰＢ−１、Ｐ１４７、ｒｐ−１、ＳＥ３、ＶＡ−１、（ｓｙｎ＝ＶｃＡ−１）、ＶｃＡ−２、ＶｃＡ−１、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ７、ＶＰ８、ＶＰ９、ＶＰ１０、ＶＰ１７、ＶＰ１８、ＶＰ１９、Ｘ２９、（ｓｙｎ＝２９  ｄ’Ｈｅｒｅｌｌｅ）、１、ΦＨＡＷＩ−１、ΦＨＡＷＩ−２、ΦＨＡＷＩ−３、ΦＨＡＷＩ−４、ΦＨＡＷＩ−５、ΦＨＡＷＩ−６、ΦＨＡＷＩ−７、ΦＨＡＷＩ−８、ΦＨＡＷＩ−９、ΦＨＡＷＩ−１０、ΦＨＣ１−１、ΦＨＣｌ−２、ΦＨＣｌ−３、ΦＨＣ１−４、ΦＨＣ２−１、ΦＨＣ２−２、ΦＨＣ２−３、ΦＨＣ２−４、ΦＨＣ３−１、ΦＨＣ３−２、ΦＨＣ３−３、ΦＨＤ１Ｓ−１、ΦＨＤ１Ｓ−２、ΦＨＤ２Ｓ−１、ΦＨＤ２Ｓ−２、ΦＨＤ２Ｓ−３、ΦＨＤ２Ｓ−４、ΦＨＤ２Ｓ−５、ΦＨＤＯ−１、ΦＨＤＯ−２、ΦＨＤＯ−３、ΦＨＤＯ−４、ΦＨＤＯ−５、ΦＨＤＯ−６、ΦＫＬ−３３、ΦＫＬ−３４、ΦＫＬ−３５、ΦＫＬ−３６、ΦＫＷ１Ｈ−２、ΦＫＷＨ−３、ΦＫＷＨ−４、ΦＭＡＲＱ−１、ΦＭＡＲＱ−２、ΦＭＡＲＱ−３、ΦＭＯＡＴ−１、ΦＯ１３９、ΦＰＥＬ１Ａ−１、ΦＰＥＬ１Ａ−２、ΦＰＥＬ８Ａ−１、ΦＰＥＬ８Ａ−２、ΦＰＥＬ８Ａ−３、ΦＰＥＬ８Ｃ−１、ΦＰＥＬ８Ｃ−２、ΦＰＥＬ１３Ａ−１、ΦＰＥＬ−１３Ｂ−１、ΦＰＥＬ１３Ｂ３−２、ΦＰＥＬ１３Ｂ−３、ΦＰＥＬ１３Ｂ−４、ΦＰＥＬ１３Ｂ−５、ΦＰＥＬ１３Ｂ−６、ΦＰＥＬ１３Ｂ−７、ΦＰＥＬ１３Ｂ−８、ΦＰＥＬ１３Ｂ−９、ΦＰＥＬ１３Ｂ−１０、φＶＰ１４３、φＶＰ２５３、Φ１６、φ１３８、１−１１、５、１３、１４、１６、２４、３２、４９３、６２１４、７０５０、７２２７、ＩＩ、（ｓｙｎ＝グループ１１）、（ｓｙｎ＝φ２）、Ｖ、ＶＩＩＩ、ＮＮ−ビブリオ属（Vibrio）（１３）、ＫＶＰ２０、ＫＶＰ４０、ｎｔ−１、Ｏ６Ｎ−２２Ｐ、Ｐ６８、ｅ１、ｅ２、ｅ３、ｅ４、ｅ５、ＦＫ、Ｇ、Ｊ、Ｋ、ｎｔ−６、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｏ６Ｎ−３４Ｐ、ＯＸＮ−７２Ｐ、ＯＸＮ−８５Ｐ、ＯＸＮ−１００Ｐ、Ｐ、Ｐｈ−１、ＰＬ１６３／１０、Ｑ、Ｓ、Ｔ、φ９２、１−９、３７、５１、５７、７０Ａ−８、７２Ａ−４、７２Ａ−１０、１１０Ａ−４、３３３、４９９６、Ｉ、（ｓｙｎ＝グループＩ）、ＩＩＩ、（ｓｙｎ＝グループＩＩＩ）、ＶＩ、（ｓｙｎ＝Ａ−Ｓａｒａｔｏｖ）、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＮＮ−ビブリオ属（Vibrio）（６）、ｐＡ１、７、７−８、７０Ａ−２、７１Ａ−６、７２Ａ−５、７２Ａ−８、１０８Ａ−１０、１０９Ａ−６、１０９Ａ−８、１１０Ａ−１、１１０Ａ−５、１１０Ａ−７、ｈｖ−１、ＯＸＮ−５２Ｐ、Ｐ１３、Ｐ３８、Ｐ５３、Ｐ６５、Ｐ１０８、Ｐ１１１、ＴＰ１、ＶＰ３、ＶＰ６、ＶＰＩ２、ＶＰ１３、７０Ａ−３、７０Ａ−４、７０Ａ−１０、７２Ａ−１、１０８Ａ−３、１０９−Ｂ１、１１０Ａ−２、１４９、（ｓｙｎ＝φ１４９）、ＩＶ、（ｓｙｎ＝グループＩＶ）、ＮＮ−ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）（２２）、ＶＰ５、ＶＰ１１、ＶＰ１５、ＶＰ１６、α１、α２、α３ａ、３ｂ、３５３Ｂ及びＮＮ−ビブリオ属（Vibrio）（７）によって感染される。
【０１３５】
[0136]  エルシニア属（Yersinia）の細菌は、以下のファージ：Ｈ、Ｈ−１、Ｈ−２、Ｈ−３、Ｈ−４、Lucas 110、Lucas 303、Lucas 404、ＹｅｒＡ３、ＹｅｒＡ７、ＹｅｒＡ２０、ＹｅｒＡ４１、３／Ｍ６４−７６、５／Ｇ３９４−７６、６／Ｃ７５３−７６、８／Ｃ２３９−７６、９／Ｆ１８１６７、１７０１、１７１０、ＰＳＴ、１／Ｆ２８５２−７６、D’Herelle、ＥＶ、Ｈ、Kotljarova、ＰＴＢ、Ｒ、Ｙ、ＹｅｒＡ４１、φＹｅｒＯ３−１２、３、４／Ｃ１３２４−７６、７／Ｆ７８３−７６、９０３、１／Ｍ６１７６及びＹｅｒ２ＡＴによって感染される。
【０１３６】
[0137]  別の実施形態において、本方法は、上記のファージの少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ又はそれ以上の数の組合せを用いて実施される。当業者は、形質転換の効率が、用いられるファージの特定の組合せに応じて、操作、例えば、促進又は抑制され得ることを認識している。
【０１３７】
[0138]  特に、細菌種（及び対応する、宿主特異的バクテリオファージ）としては、アエロモナス・ハイドロフィラ（Aeromonas hydrophila）（ＰＭ２）、炭疽菌（Bacillus anthracis）（γ）、枯草菌（Bacillus subtilus）（ＳＰＰ１）、百日咳菌（Bordetella pertussis）（Pereversev et al.Zh Mikrobiol 5:54-57,1981を参照）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）（φＢＢ−１、Eggers et al.,J Bacteriol 183:4771-4778,2001を参照）、ウシ流産菌（Brucella abortus）（ＴＢ；２１２；３７１）、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）（φ４、φＣ）、ウェルシュ菌（Clostridium perfringes）（φ３６２６）、大便レンサ球菌（Enterococcus faecalis）（φＦＣ１）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）（ＥＮＢ６）、大腸菌（Escherichia coli）（Ｐ１；Ｔ１；Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５；Ｔ７、ＫＨ１、φＶ１０；λ；φ２０；ｍｕ）、肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）（６０；９２）、リステリア菌（Listeria monocytogenes）（Ａ５１１、Ａ１１８；２４３；Ｈ３８７；２３８９；２６７１；２６８５；４２１１）、らい菌（Mycobacterium leprae）（マイコバクテリオファージ、Ｌ５）、ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）（ＬＧ；ＤＳＧＡ）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）（Ｅ７９、Ｇ１０１；Ｂ３；ｐｐ．  ７）、サルモネラ・アナツム（Salmonella anatum）（Ｅ５）、サルモネラ・ボビスモルビフィカンス（Salmonella bovismorbificans）（９８）、サルモネラ・コレラスイス（Salmonella choleraesuis）（１０２）、腸炎菌（Salmonella enteritidis）（Ｌ；Ｐ２２；１０２；ＦＯ；ＩＲＡ；φ８）、サルモネラ・ニューイントン（Salmonella Newington）（Ｅ３４）、サルモネラ・ショトミュラー（Salmonella schottmulleri）（３１；１０２；Ｆ０；１４）、チフス菌（Salmonella typhi）（１６３；１７５；ＶｉＩ；ＶｉＶＩ；８；２３；２５；４６；１７５；Ｆ０）、セラチア・マルセッセンス（Serratia marcescens）（Ｓ２４ＶＡ）、志賀赤痢菌（Shigella dysenteriae）（φ８０；Ｐ２；２；３７）、フレキシネル赤痢菌（Shigella flexneri）（Ｓｆ６）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）（Ｋ；Ｐ１；Ｐ１４；ＵＣ１８；１５；１７；２９；４２Ｄ；４７；５２；５３；７９；８０；８１；８３Ａ；９２；Twort、φ１１）、肺炎レンサ球菌（Streptococcus pneumoniae）（Ｄｐ−１；Ｃｐ−１；ＨＢ−３；ＥＪ−１；ＭＭ１；ＶＯ１）、化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）（φＸ２４０；１Ａ；１Ｂ；Ｔ１２；１２／１２；１１３；１２０；１２４；Ｐ５８；Ｈ４４８９ａ）、コレラ菌（Vibrio cholerae）（１３８；１４５；１４９；１６３）、及びペスト菌（Yersinia pestis）（Ａ１１２２；Ｒ；Ｙ；Ｐ１）が挙げられる。さらなる情報が、米国特許出願公開第２００９−０１５５７６８号に提供されている。
【０１３８】
[0139]  特に、表１〜３は、特定の宿主特異的ファージ及びそれらが特異的な宿主（それらの作用を媒介する受容体を含む）の代表例を提供する。Bertozzi et al.,FEMS Microbiology Letters,363,1-11,2016も参照されたい。
【０１３９】
【表１】
2020513764.tif 000003
【０１４０】
【表２】
2020513764.tif 000004
【０１４１】
【表３】
2020513764.tif 000005
【０１４２】
【表４】
2020513764.tif 000006
【０１４３】
Ｄ．バクテリオファージパッケージング部位
[0140]  バクテリオファージパッケージング部位は、ビリオンへのゲノムパッケージングのためのファージゲノムにおける特定のＤＮＡ配列である。プラスミドは、プラスミドが形質導入粒子にパッケージングされるように、ファージパッケージング部位を含むように操作される。宿主特異的バクテリオファージ（及びそれらのパッケージング部位）としては、限定はされないが、ＳＰＰ１（ＳＰＰ１  ｐａｃ部位）、Ｐ１（Ｐ１  ｐａｃ部位）、Ｔ１（Ｔ１  ｐａｃ部位）、Ｔ７（Ｔ７コンカテマー接合部）、λ（ｃｏｓ部位）、ｍｕ（ｍｕ  ｐａｃ部位）、Ｐ２２（Ｐ２２  ｐａｃ部位）、φ８（φ８  ｐａｃ部位）、Ｓｆ６（Ｓｆ６  ｐａｃ部位）、１４９（１４９  ｐａｃ部位）、及びＡ１１２２（Ａ１１２２−コンカテマー接合部）が挙げられる。ほとんどのバクテリオファージについて、パッケージング部位は、ｐａｃ部位と呼ばれる。ある場合には、パッケージング部位は、コンカテマー接合部（例えばＴ７コンカテマー接合部）と呼ばれる。あらゆる場合に、パッケージング部位は、バクテリオファージゲノムにおける天然の隣接配列と異なる。
【０１４４】
[0141]  一部のバクテリオファージについては、パッケージング部位は、不明であり得る。こうした場合、ｐａｃ部位は、機能的バクテリオファージｐａｃ部位を含有するプラスミドがパッケージングされるという特性を利用することによって決定され得る。例えば、バクテリオファージλのパッケージングに必要なＤＮＡ配列は、λファージゲノムＤＮＡの小さい制限フラグメントを、プラスミドに組み込むことによって決定された（Hohn et al.,PNAS USA 80:7456-7460,1983）。インビボパッケージング菌株中への導入後に、パッケージング／形質導入の効率が、定量的に評価される。同様の手法を用いて、いくつかのバクテリオファージのｐａｃ部位が、決定されている：λ（Miwa et al.,Gene 20:267-279,1982）；Ｍｕ（Croenen et al.,Virology 144:520-522,1985）；ｆ１、ｆｄ、Ｍ１３、及びＩｋｅを含む繊維状バクテリオファージ（Russel et al.,J Virol.,63:3284-3295,1989）；Ｐ２２（Petri et al.,Gene 88:47-55,1990；Wu et al.,Mol.Microbiol 45:1631-1646,2002）；Ｔ７（Chung et al.,J Mol Biol 216:927-938,1990）、及びＴ３（Hashimoto et al.,Virology 187:788-795,1992）。
【０１４５】
[0142]  本方法の実施形態は、バクテリオファージパッケージング配列及びその機能的フラグメントを含む。ヌクレオチドフラグメントが、バクテリオファージカプシド中へのプラスミドＤＮＡのパッケージングを媒介し得る限り（パッケージングを媒介し、それによって、機能的形質導入粒子を生成するその能力によって判断される）、これらの核酸実施形態は、例えば、少なくとも９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、及び９００ヌクレオチド長であり得る。バクテリオファージパッケージング部位又はそのフラグメントを含む核酸が、プラスミドに組み込まれる。
【０１４６】
Ｅ．マーカー遺伝子構築物
[0143]  遺伝子技術が、細胞遺伝子発現をモニターするのに広く使用されている（Naylor et al.,Biochem Pharm 58:749-757,1990）。好ましくは、マーカー分子は、検出可能な産物、例えば、タンパク質又は酵素をコードする遺伝子である。特に好ましくは、マーカーは、ファージ又は細菌によって天然に発現されない分子である。例えば、マーカーは、異種真核性タンパク質、様々な細菌種のタンパク質、又はウイルスタンパク質であり得る。
【０１４７】
[0144]  一実施形態において、マーカーは、抗原、酵素、抗体又はそのフラグメント、及びアプタマーである。本明細書において使用される際の「抗原」という用語は、結合パートナー（例えば、抗体）への特異的結合を促進する１つ以上のエピトープ（線形エピトープ、立体配座エピトープ又はその両方）を含有する分子を指す。「抗原」という用語は、抗イディオタイプ抗体又はそのフラグメントなどの抗体、及び抗原又は抗原決定基（エピトープ）を模倣し得る合成ペプチドミモトープも指し得る。「抗原」という用語は、インビボで抗原又は抗原決定基を発現するオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドも指し得る。本明細書において使用される際、「エピトープ」という用語は、一般に、抗体又はＴ細胞受容体によって認識される抗原上の部位を指す。それは、タンパク質抗原に由来するか又はタンパク質抗原の一部としての短鎖ペプチドであり得る。しかしながら、この用語はまた、糖ペプチド及び炭水化物エピトープを有するペプチドを含むことが意図される。いくつかの異なるエピトープは、単一の抗原分子によって保有され得る。「エピトープ」という用語は、全生物を認識する応答を刺激するアミノ酸又は炭水化物の修飾配列も含む。
【０１４８】
[0145]  別の実施形態において、マーカーは、抗体である。「抗体」という用語は、全抗体分子及びさらにその抗原結合フラグメントの両方を含む。抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ並びに一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）などの抗体変異体を含む。好適な抗体フラグメントは、抗原結合部位を含有し、したがって、限定はされないが、Ｆｖ、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ）２フラグメントを含む。抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体であり得る。好ましい実施形態において、抗体は、モノクローナル抗体である。キメラ又は合成抗体も含まれる。特に好ましい実施形態において、抗体は、対象とする抗原に特異性を有して結合するｓｃＦｖである。「特異的結合」という用語は、他の非標的（「雑音」）を上回る特定の標的エピトープ（「信号」）への抗体の結合のレベルを指す。検出についての信号対雑音比が、少なくとも０．６倍、０．７倍、０．８倍、０．９倍、１倍（１００％の増加）、１．５倍、３倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、７０倍、１００倍、又はそれ以上である場合、特異的検出が達成される。抗体を調製し、特性評価するための手段は、当該技術分野において周知である（例えば、Lane et al.,“Antibodies:A Laboratory Manual”,Cold Spring Harbor Laboratory,1988を参照）。
【０１４９】
[0146]  さらに別の実施形態において、マーカーは、アプタマーである。本明細書において使用される際の「アプタマー」という用語は、特定の材料に関して高い特異性及び親和性を有する一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）又はＲＮＡを指す。免疫検出方法は、抗体試薬が製造するのに高価であることから、抗体試薬の制限のため、コストがかかり、かつ遅い。一方、アプタマーは、比較的単純な方法を用いて合成され、細胞、タンパク質及び小さい有機材料が、標的材料であり得るため、アプタマーを用いた新しい検出方法が開発され得、その特異性及び安定性は、開発された抗体と同等である。このような利点を考慮して、ＤＮＡアプタマーが、タンパク質マーカーの特異的検出に使用され得る。ポリペプチドへのその結合が特異的なアプタマーが、インビトロ発生法によって合成及び／又は同定され得ることが一般に認められている。インビトロ発生法を含む、アプタマーを調製し、特性評価するための手段が、当該技術分野において周知である（例えば米国特許第７，９３９，３１３号）。
【０１５０】
[0147]  本方法は、一つには、試料中の少なくとも１つのマーカー又はインジケータの存在（若しくは非存在）又はレベル（例えば、濃度）又は活性（例えば、酵素活性）を決定することを含む。「マーカー」又は「インジケータ」という用語は、それが本明細書において使用される際、ベクターが正確にトランスフェクト又は形質導入されていること、及びその配列が正確に発現されることの決定又は確認を可能にする、核酸（例えば、ｍＲＮＡ）、ペプチド又はタンパク質をコードするヌクレオチド配列を指す。マーカーは、ベクターを保有する細胞を選択するのに使用される、タンパク質をコードするヌクレオチド配列又は抗生物質耐性をコードする遺伝子であり得る。本明細書において使用される際、「少なくとも１つのマーカーの存在を検出する」という用語は、当業者に公知の任意の定量的又は定性的アッセイを用いて、対象とする各マーカーの存在を決定することを含む。ある場合には、特定の形質、変数、遺伝子型、及び／又は生化学的又は血清学的物質（例えば、タンパク質若しくは抗体）の存在又は非存在を決定する定性的アッセイが、対象とする各マーカーを検出するのに好適である。ある他の場合には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、抗体、又は活性の存在又は非存在を決定する定量的アッセイが、対象とする各マーカーを検出するのに好適である。本明細書において使用される際、「少なくとも１つのマーカーのレベルを検出する」という用語は、当業者に公知の任意の直接又は間接的な定量的アッセイを使用することによって、対象とする各マーカーのレベルを決定することを含む。ある場合には、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、抗体、又は活性の相対又は絶対量を決定する定量的アッセイが、対象とする各マーカーのレベルを検出するのに好適である。当業者は、マーカーのレベルを検出するのに有用な任意のアッセイが、マーカーの存在又は非存在を検出するのにも有用であることを理解するであろう。
【０１５１】
[0148]  ある実施形態において、マーカーは、例えば、その発光特性又は酵素反応を行うその能力によって、その存在を示し得るレポーター分子である。別の実施形態において、マーカーは、マーカーのレベル又は活性を示すレポーター分子に結合する。後者の場合、レポーターは、マーカータンパク質に結合する抗体又はリガンドであり得る。
【０１５２】
（ｉ）レポーター
[0149]  一実施形態において、レポーター分子は、検出可能なタンパク質の発現をコードする、レポーター遺伝子と呼ばれる遺伝子である。一般的に使用されるレポーター遺伝子としては、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、１３−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が挙げられる。一般に、レポーター遺伝子は、低いバックグラウンド活性及び遺伝子発現後の感知信号検出の利点を有する。例えば、遺伝子発現の非侵襲性マーカーとしてのルシフェラーゼ及びＧＦＰの開発は、感知電荷結合デバイス（ＣＣＤ）イメージングカメラ及び蛍光顕微鏡法を用いて検出の容易さと組み合わされて、単細胞レベルでさえ遺伝子発現についての時間的及び空間的情報を可能にした。
【０１５３】
[0150]  ルシフェラーゼ遺伝子及びレポーター遺伝子としてのそれらの使用の概説が、公知のルシフェラーゼ遺伝子、ｃＤＮＡ、タンパク質、並びにビブリオ・ハーベイ（Vibrio harveyi）（受託番号Ｍ１０９６１及びＡＡＡ８８６８５）、ビブリオ・ハーベイ（Vibrio harveyi）（受託番号Ｍ１０９６１及びＡＡＡ８８６８６）、ビブリオ・ハーベイ（Vibrio harveyi）（受託番号Ｍ２８８１５及びＡＡＡ２７５３１）、ビブリオ・フィッシェリ（Vibrio fischeri）（受託番号Ｘ０６７５８及びＣＡＡ２９９３１）ビブリオ・フィッシェリ（Vibrio fischeri）（受託番号Ｘ０６７９７及びＣＡＡ２９９３２）、ビブリオ・フィッシェリ（Vibrio fischeri）（受託番号ＡＦ１７０１０４（その変異体を含む））、フォトラブドゥス・ルミネセンス（Photorhabdus luminescens）（受託番号Ｍ６２９１７）、フォティヌス・ピラリス（Photinus pyralis）（Ｍ１５０７７及びＡＡＡ２９７９５）、ゲンジボタル（Luciola cruciate）（受託番号Ｍ２６１９４及びＡＡＡ２９１３５）、ウミホタル（Vargula hilgendorfii）（受託番号Ｅ０２７４９、Ｍ２５６６６、及びＡＡＡ３０３３２）、オワンクラゲ（Aequorea victoria）（受託番号Ｍ１６１０３、ＡＡＡ２７７１９、Ｍ１１３９４、ＡＡＡ２７７１６、Ｍ１６１０４、ＡＡＡ２７７１７、Ｍ１６１０５、ＡＡＡ２７７１８、Ｌ２９５７１、ＡＡＡ２７７２０、及びＥ０２３１９）；ヒオドシエビ（Oplophorus gracilorostris）（受託番号ＡＢ０３０２４６、ＢＡＢ１３７７６、ＡＢ０３０２４５及びＢＡＢ１３７７５）；レニラ・ムエレリ（Renilla muelleri）（受託番号ＡＹ０１５９８８及びＡＡＧ５４０９４）；及びウミシイタケ（Renilla reniformis）（受託番号Ｍ６３５０１及びＡＡＡ２９８０４）の対応するＧＥＮＢＡＮＫ受託番号の一覧を提供する。Greer et al.,Luminescence 17:43-74,2002を参照されたい）。Greerも、イメージングに有用な多数の構築物及びベクターを提供する（表２、ｐｐ  ４８−５２を参照）。これらのベクターは、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、大腸菌（E.coli）及び他の細菌における発現に好適である。公知のルシフェラーゼには、原核生物ルシフェラーゼ（Ｌｕｘ）、及び真核生物ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ、Ｒｕｃ及びそれらの調節タンパク質）があり、これらは両方とも、生細胞におけるルシフェラーゼ発現のイメージングに一般的に使用される。
【０１５４】
[0151]  別の実施形態において、レポーター分子は、細菌において発現されるβ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子を含む（Miller et al.,Experiments in Molecular Genetics,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.；Sambrook et al.,Molecular Cloning,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.）。細菌コロニーによって発現されるβ−ガラクトシダーゼ活性は、Ｘ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を含有する培地における青色着色によって検出される。クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）も、細菌中のレポーター遺伝子として使用するのに好適である。ＣＡＴは、細菌薬剤耐性遺伝子によってコードされる（Kondo et al.,J Bacteriol 88:1266-1276）。それは、その２つのヒドロキシル基の一方又は両方において薬剤をアセチル化することによって、クロラムフェニコールを不活性化する。典型的なＣＡＴアッセイにおいて、細胞抽出物が、１４Ｃ−又は３Ｈ−標識クロラムフェニコール及びｎ−ブチリル補酵素Ａを含有する反応混合物中でインキュベートされる。ＣＡＴは、補因子のｎ−ブチリル部分を、クロラムフェニコールに移動する。反応生成物は、キシレンで抽出され、ｎ−ブチリルクロラムフェニコールが、主に、キシレン相中に分離する一方、非修飾クロラムフェニコールは、主に、水性相に留まる。キシレン相中に分離する放射性標識クロラムフェニコールは、シンチレーションカウンターを用いて測定される。
【０１５５】
[0152]  大腸菌（E.coli）のｐｈｏＡによってコードされる細菌性アルカリホスファターゼは、それが細胞膜をわたって細胞周辺腔中に輸送された場合のみ、酵素的に活性である（Gibson et al.,Appl and Env Microbiol 68:928-932,2002）。この特性を活用して、細胞内部位の分子センサーとしてＰｈｏＡタンパク質を操作した。別の細菌性グラム陽性菌大便レンサ球菌（Enterococcus faecalis）に由来するアルカリホスファターゼ（ＰｈｏＺ）（Lee et al.,J Bacteriol 181:5790-5799,1999）は、グラム陽性菌中で高度に活性なレポーターとして開発された（Granok et al.,J Bacteriol 182:1529-1540,2000；Lee et al.,J Bacteriol 181:5790-5799,1999）。ＰｈｏＺのアルカリホスファターゼ活性は、ＰｈｏＡのものと同様に、細胞質からのその排出に依存する。アルカリホスファターゼアッセイにおいて、アルカリホスファターゼは、４−ニトロフェニルリン酸（４ＮＰＰ）などの基質を加水分解して、色原体（例えば４−ニトロフェノール、４ＮＰ）を生じる。
【０１５６】
[0153]  レポーター遺伝子は、より簡単な操作手順（例えば減少された精製又は細胞溶解）を可能にし、それらは、大規模な、ハイスループットスクリーニング測定に適合し、それらは、細菌系と適合する。レポーター遺伝子は、天然遺伝子、又は組み換えＤＮＡ技術若しくは突然変異誘発などの遺伝子操作によって産生されるもののいずれかであり得る。レポーター遺伝子は、コード領域及びプロモーターなどの任意の関連する発現配列、翻訳開始配列、及び調節配列を含む核酸セグメントである。
【０１５７】
（ｉｉ）細菌特異的プロモーター
[0154]  レポーター遺伝子は、典型的に、ＲＮＡの合成を制御及び指令するプロモーター配列に連結される。プロモーター配列が、様々な細菌種によって発現される多数の細菌遺伝子から選択され得ることが、当業者によって理解されよう。プロモーターの選択は、検出される標的細菌に基づいて行われる。大腸菌（E.coli）中の遺伝子の高レベルの発現を達成するための手法の概説については、Makrides et al.,Microbiol Rev 60:512-538,1996を参照されたい。大腸菌（E.coli）において有効な例示的なプロモーター配列は、Ｔ７プロモーターであるが、原核細胞において機能的な任意のプロモーター又はエンハンサーが使用され得る。有用なプロモーターとしては、限定はされないが、ｌａｃプロモーター（大腸菌（E.coli））、ｔｒｐプロモーター（大腸菌（E.coli））、ａｒａＢＡＤプロモーター（大腸菌（E.coli））、ｌａｃハイブリッドプロモーター、（大腸菌（E.coli））、ｔｒｃハイブリッドプロモーター（大腸菌（E.coli））、ＰＬ（Ｘ）、ＳＰ６、及びＴ７が挙げられる。
【０１５８】
[0155]  プロモーター配列は、標的病原性細菌中の検出可能なレベルの発現を達成するその能力に基づいて選択される。好ましい実施形態において、レポーター遺伝子は、好ましくは、検出される病原性細菌宿主から得られるプロモーターに連結される。構成的プロモーターは、生理的要求又は基質の濃度に関係なく、一定の速度でレポーターを発現する。あるいは、レポーター遺伝子発現のタイミングを制御するための誘導性プロモーターを使用することが有利であり得る。ｌａｃ及びｔｒｐオペロンなどの誘導性プロモーターについては、発現は、通常、抑制され、所望の時間に誘導され得る。ラクトースの非存在下で、ｌａｃプロモーターは、ｌａｃリプレッサータンパク質によって抑制される。誘導は、ｌａｃオペレーターへのリプレッサーの結合を防ぐ、ラクトース又はＩＰＴＧの添加によって達成され得る。同様に、ｌｉｐプロモーターは、ｔｒｐオペレーターに結合するトリプトファン−リプレッサー複合体によって負に調節される。ｔｒｐオペロンについては、遺伝子発現は、トリプトファンを除去するか、又はβ−インドールアクリル酸を加えることによって誘導され得る。
【０１５９】
（ｉｉｉ）細菌特異的な複製起点
[0156]  プラスミドにおいて使用される複製起点は、中程度のコピー数、例えばｐＢＲ３２２からのｃｏｌＥ１  ｏｒｉ（細胞当たり１５〜２０のコピー）若しくはＲ６Ｋプラスミド（細胞当たり１５〜２０のコピー）であってもよく、又はそれらは、多いコピー数、例えばｐＵＣ  ｏｒｉｓ（細胞当たり５００〜７００のコピー）、ｐＧＥＭ  ｏｒｉｓ（細胞当たり３００〜４００のコピー）、ｐＴＺ  ｏｒｉｓ（細胞当たり１０００超のコピー）若しくはｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ｏｒｉｓ（細胞当たり３００〜５００のコピー）であり得る。複製起点は、大腸菌（E.coli）中で、又は炭疽菌（Bacillis anthracis）若しくはペスト菌（Yershinia pestis）などの任意の他の原核生物種中で機能的であり得る。
【０１６０】
[0157]  プラスミド複製は、宿主酵素、並びにプラスミドでコードされる及びプラスミドで制御されるシス及びトランス決定因子に依存する。例えば、一部のプラスミドは、ほぼ全てのグラム陰性菌において認識され、かつ複製開始及び複製制御中に各宿主で正確に作用する決定因子を有する。他のプラスミドは、一部の細菌のみにおいてこの能力を有する（Kues et al.,Microbiol Rev 53:491-516,1989）。プラスミドは、３つの一般的機構、すなわち、シータタイプ（theta type）、鎖置換、及びローリングサークルによって複製される（Del Solar et al. Microbio and Molec Biol Rev 62:434-464,1998によって概説される）。
【０１６１】
[0158]  シータタイプ機構による複製では、複製起点は、（ｉ）プラスミドの自己複製を支持し得る最小のシス作用性領域、（ｉｉ）ＤＮＡ鎖が融解されて、複製プロセスを開始させる領域、又は（ｉｉｉ）リーディング鎖合成が開始する塩基として定義され得る。複製起点は、プラスミド及び／又は宿主でコードされるタンパク質の相互作用に必要な部位を含有する。シータタイプ複製を行うプラスミドは、ｐＰＳ１０、ＲＫ２（ｏｒｉＶを含有する）、ＲＰ４、Ｒ６Ｋ（ｏｒｉｙを含有する）、ＣｏｌＥ１及びＣｏＩＥ２も含む。ＣｏｌＥ１は、シータタイプ機構によって複製する小さい多コピープラスミドのクラスのプロトタイプである。Ｃ６１Ｅ１複製の起点は、約１ｋｂの領域にわたる（Del Solar et al.1998）。
【０１６２】
[0159]  鎖置換機構によるプラスミド複製の例は、ＩｎｃＱファミリーの広宿主域プラスミドであり、そのプロトタイプは、ＲＳＦ１０１０である。このファミリーのメンバーは、ＤＮＡ複製の開始のために、３つの、プラスミドでコードされるタンパク質を必要とする。これらのタンパク質は、複雑な起点領域における開始を促進し、複製は、鎖置換機構によっていずれかの方向に進行する。複製起点は、ＲＳＦ１１０複製タンパク質（ＲｅｐＡ、ＲｅｐＢ、及びＲｅｐＣ）が、第２のプラスミドによってトランスに供給される場合、二方向複製を支持することが可能な最小領域として定義されている。最小ｏｒｉ領域は、ＧＣリッチ区画（２８ｂｐ）及びＡＴリッチセグメント（３１ｂｐ）を含む、３つの同一の２０−ｂｐイテロン及び１７４ｂｐ領域を含む（Del Solar et al.1998）。
【０１６３】
[0160]  ローリングサークル（ＲＣ）機構による複製は、一方向性であり、リーディング鎖の合成及びラギング鎖の合成が結合されないため、非対称プロセスであると考えられる。ＲＣ複製の基礎となる分子機構についての研究は、主に、スタフィロコッカス属（staphylococcal）プラスミドｐＴ１８１、ｐＣ２２１、ｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４、並びにストレプトコッカス属（streptococcal）プラスミドｐＭＶ１５８及びそのＡｍｏｂ誘導体ｐＬＳ１を用いて行われている。ＲＣ複製を行う他のプラスミド又はファージとしては、限定はされないが、ｐＳ１９４、ｆｄ、φＸ１７４、ｐＥ１９４及びｐＦＸ２が挙げられる（Del Solar et al.1998）。
【０１６４】
[0161]  原核生物は、典型的に、単一の複製起点を有する、染色体ＤＮＡの環状分子を有する。例えば、大腸菌（E.coli）及び他の細菌の染色体複製起点は、ｏｎｉＣと呼ばれる。本方法は、種特異的プラスミドＤＮＡ（例えば、本明細書において上述されるＣｏｌＥ１、Ｒ１、ｐＴ１８１など）、バクテリオファージ（例えばφＸ１７４及びＭ１３）及び細菌染色体複製起点（例えばｏｒｉＣ）から同定された当該技術分野において公知の複製起点の使用を想定している。
【０１６５】
（ｉｖ）抗生物質耐性遺伝子
[0162]  形質導入粒子のプラスミドＤＮＡは、プラスミドの分子生物学クローニングを促進し、プラスミドによって形質転換される細菌の選択を可能にするために、任意選択的に抗生物質耐性遺伝子を有する。抗生物質耐性遺伝子は、当該技術分野において周知であり、限定はされないが、アンピシリン耐性（Ａｍｐｒ）、クロラムフェニコール耐性（Ｃｍｒ）、テトラサイクリン耐性（Ｔｅｔｒ）、カナマイシン耐性（Ｋａｎｒ）、ハイグロマイシン耐性（ｈｙｇ又はｈｐｈ遺伝子）、及びゼオマイシン（zeomycin）耐性（Ｚｅｏｒ）を含む。好ましくは、抗生物質耐性遺伝子は、耐性又は感受性が試験されている薬剤以外の（又はそれと異なる）薬剤の抗菌又は細胞毒性効果から細菌を保護する。別の実施形態において、抗生物質耐性遺伝子は、耐性又は感受性が試験されている薬剤と同じ薬剤の抗菌又は細胞毒性効果から細菌を保護する。
【０１６６】
Ｆ．形質導入粒子を作製する方法
[0163]  本方法において使用される形質導入粒子又は組み換えファージは、容易に認識可能な表現型に標的細菌を形質転換することが可能な遺伝子（以後、レポーター遺伝子と呼ばれる）を保有するように天然バクテリオファージを修飾することによって得られる。形質導入粒子は、細菌宿主が、検出可能に遺伝子機能を発現し得るように、標的細菌宿主中にレポーター遺伝子を特異的に導入することが可能でなければならない。多数のバクテリオファージが存在し、所望の宿主範囲及び対象とする遺伝子を保有し、形質導入するバクテリオファージの能力に基づいて、修飾のために選択され得る。特に、バクテリオファージは、レポーター遺伝子、関連するプロモーター領域、ファージパッケージング部位及び含まれ得る任意の他のＤＮＡ領域を収容するのに十分に大きくなければならない。修飾バクテリオファージは、通常、非修飾バクテリオファージの通常の宿主範囲特異性を保持するが、選択された標的細菌を同定する能力に影響を与えない限り、特異性のいくらかの変化が許容されるであろう。
【０１６７】
[0164]  修飾されるバクテリオファージは、溶原性又は毒性であり得、好ましくは溶原性である。バクテリオファージの修飾は、標的細菌宿主中にレポーター遺伝子を導入する能力を保持する形質導入粒子をもたらす。レポーター遺伝子は、プラスミド又は感染した宿主において持続及び発現される他の自己複製性エピソーム単位の一部である。
【０１６８】
[0165]  レポーター遺伝子の形質導入は、レポーター遺伝子の一過性発現（すなわち、細胞によって安定的に遺伝されないレポーター遺伝子からの発現）によって起こり得る。このような場合、バクテリオファージによって形質導入されるＤＮＡは、全試験期間を通して無傷で生存することはできない。しかしながら、ファージによって形質導入されるレポーター遺伝子の転写は、細菌が試験期間の終了までに機能的レポーター遺伝子を確実に組み立てるように、ＤＮＡが分解される前に十分に効率的である。したがって、細菌がファージＤＮＡを分解する場合でも、細菌は、アッセイによって検出され得る。
【０１６９】
[0166]  本方法に有用なバクテリオファージは、米国培養細胞系統保存機関（American Type Culture Collection）（P.O.Box 1549,Manassas、Va.,20108,USA）などの微生物保存機関から入手され得る。毒性バクテリオファージが、細菌を含まない溶解物として入手可能である一方、溶原性バクテリオファージは、一般に、感染した宿主細胞として入手可能である。任意の供給源から入手される野生型バクテリオファージは、対象とする検出可能な表現型を生成することが可能な所望のレポーター遺伝子を導入するために、従来の組み換えＤＮＡ技術によって修飾され得る。導入の前、対象とするレポーター遺伝子は、好適な遺伝子カセットにおけるプロモーター領域と組み合わされる。遺伝子カセットは、大腸菌（E.coli）などの好適な宿主において従来の組み換えＤＮＡ技術によって構築され得る。レポーター遺伝子及びプロモーター領域は両方とも、標的宿主の機能に合わせて選択されるべきであり、カセットは、インビトロ操作を容易にするために、抗生物質耐性、重金属耐性などの、第２のレポーター遺伝子を任意選択的に含み得る。
【０１７０】
[0167]  レポーター遺伝子（又は単一の遺伝子系でない場合、遺伝子）は、標的細菌宿主においてスクリーニング可能な表現型を発現することが可能である。本明細書において以後使用される際、スクリーニング可能な表現型という語句は、通常は混合培養物中で、全ての細胞が、成長し、再生している場合でも、この表現型を発現する細胞が、この表現型を発現しない他の細胞と区別されるのを可能にする特徴又は形質を意味することが意図される。すなわち、特徴又は形質の検出が行われ得る一方、感染した標的細胞が、表現型を発現しない、通常、増殖する生存非標的細菌の混合集団中に存在する。好ましくは、スクリーニング可能な表現型は、視覚的に検出可能な形質、すなわち、標的及び非標的細胞の混合集団において直接又は間接的に観察され得る形質を含む。表現型は、通常、選択可能でない、すなわち、特定の条件下で生存若しくは優先的成長を提供するもの（正の選択）又は特定の条件下で成長阻害若しくは殺滅を提供するものである。本方法では、試料中に存在する標的細菌が、試料中に存在し得る非標的細菌から分離されるか、又は非標的細菌と比べて富化される必要がなく、これは、標的細菌が存在する生細菌の一部のみを含む場合、形質が観察可能であるためである。
【０１７１】
[0168]  レポーター遺伝子は、それ自体でスクリーニング可能な表現型をコードすることができ、又は表現型をコードする複数の遺伝子系の一部であってもよく、ここで、他の遺伝子が、検出される宿主中に存在するか、又は検出される宿主に別々に導入される。例えば、形質導入粒子は、発現のために宿主中の相補的ｌａｃＺβ遺伝子又はｌａｃＺΔＭ１５欠失を必要とするｌａｃＺα遺伝子を保有し得る。
【０１７２】
[0169]  好適なスクリーニング可能な表現型は、生物発光、蛍光、酵素触媒色生成（例えば、酵素アルカリホスファターゼを用いる）などを含む。これらの表現型のそれぞれが、信号発生反応を完了させるのに必要な化学試薬を提供する従来の可視化技術によって観察され得る。好ましいのは、免疫検出の使用であり、より特定的には、異種酵素若しくはタンパク質を検出するための、又は共発現される分子が機能的発現系のインジケータとして働く酵素若しくはタンパク質と共発現される分子を検出するための側方流動イムノアッセイの使用である。
【０１７３】
[0170]  バクテリオファージについては、プラスミド又はカセットとの、ＤＮＡ構築物中のバクテリオファージパッケージング部位の結合によって、プラスミド又はレポーター遺伝子カセットをパッケージングすることが可能である。パッケージング部位は、バクテリオファージゲノムから得られ、レポーター遺伝子、プロモーター領域、及び任意選択的な第２のレポーターを保有するプラスミドにクローニングされ得る。次に、プラスミドは、好適な細菌宿主に移動され得る。次に、細菌宿主は、その宿主範囲の細菌中にプラスミドＤＮＡを挿入することが可能なバクテリオファージコート内にパッケージングされるプラスミド及び／又はマーカー遺伝子カセットを有する形質導入粒子を生成する。プラスミドは、プラスミド及びバクテリオファージの両方による好適な宿主の同時の感染によって、所望のバクテリオファージに転位される。宿主細胞が、インキュベートされ、形質導入粒子が収集される。ファージの一部が、プラスミドを保有している。形質導入粒子は、従来の技術によってファージから分離され得る。
【０１７４】
[0171]  宿主特異的バクテリオファージパッケージング部位は、バクテリオファージゲノム中でそれに隣接して天然に存在する配列から実質的に単離される。本明細書において使用される際、バクテリオファージパッケージング部位に関連する「実質的に単離される」という用語は、それらが天然環境にないことを意味する。すなわち、パッケージング部位は、自然界に見られる完全長のバクテリオファージゲノム核酸配列ではない。パッケージング部位は、制限エンドヌクレアーゼ酵素及びクローニング又はポリメラーゼ連鎖反応による増幅の使用などの実験技術によって、完全長バクテリオファージゲノム配列から単離され得る。パッケージング部位はまた、合成により生成され得る。
【０１７５】
[0172]  バクテリオファージパッケージング部位は、自然状態で通常はそれに結合される配列の全体若しくは一部；又は自然状態で存在するままの配列を含まないが、それに結合した異種配列を有する核酸フラグメントである。それは、ファージゲノムと切り離されたフラグメントである。
【０１７６】
[0173]  本明細書において使用される際、バクテリオファージパッケージング部位の文脈における「機能的同等物」という語句は、定性的に、野生型バクテリオファージパッケージング部位と同じ機能を果たすパッケージング部位を意味する。したがって、単離されたバクテリオファージパッケージング部位が、ＤＮＡのパッケージングを指令する場合、ＤＮＡフラグメントは、それがまた同じようにＤＮＡのパッケージングを指令する場合、機能的同等物である。フラグメントが本方法に係る機能的同等物であるために、定量的等価性は必要とされない。したがって、ヌクレオチド置換、欠失及び／又は付加を有するバクテリオファージパッケージング部位が、単離されたバクテリオファージパッケージング部位の機能的同等物であり得る。
【０１７７】
Ｇ．バクテリオファージを使用する方法
[0174]  上記の実施形態は、宿主細胞中への粒子の形質導入を可能にするために最小の構造要素を含む完全に無傷のファージ又はその変異体から構成される形質導入ファージ粒子を用いて実施され得る。ある場合には、生体試料を感染させ、改変及び表現型を直接観察することが可能であるが、他の場合には、試料中に存在する細菌の大量培養をまず調製するのが好ましいことがある。試料を取得し、（必要に応じて）大量培養を調製するための方法は、生体試料の性質に応じて変化し、様々な試料タイプを調製するための好適な技術が、Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology(8th ed.),Buchanan and Gibbons(eds.)Williams & Wilkens Co.,Baltimore(1974)；Manual of Methods for General Bacteriology,Gerhardt et al.(eds.),Am. Soc. Microbiology,Wash.(1981)；及びManual of Clinical Microbiology(8th ed.),Patrick,R et al.(eds.),Am. Soc. Microbiology,Washington(2003)などの標準的な微生物学及び細菌学の教科書に詳細に記載されている。
【０１７８】
[0175]  ファージ自体は、様々な形態で試料に加えられ得る。それは、乾燥状態で加えられ得る。ファージは、液体試薬混合物中に混合され、又は懸濁され得る。それは、試料が加えられるバイアル中で懸濁され得る。それはまた、任意の他の好適な形態を取り得る。試料に加えられるファージは、本明細書において「親ファージ」呼ばれることがある。バクテリオファージと接触されたら、試料は、ファージ曝露試料と呼ばれる。
【０１７９】
[0176]  ファージ曝露試料は、所定の時間にわたってインキュベートされ得る。インキュベーションは、曝露試料中に存在する場合、感染した標的細菌におけるファージマーカーの生成を可能にするのに十分な時間行われ得る。ファージ曝露試料は、標的細菌のファージ感染を誘導する条件にある。これは、様々な方法で達成され得る。例えば、親ファージは、試薬中に混合されてもよく、この試薬は、試料に加えられると、感染を誘導する試験試料をもたらす。試料は、ファージ感染を誘導する条件を確立するために多くの様々な方法で調製され得る。
【０１８０】
[0177]  試料中に標的細菌があると仮定すると、試験試料は、ファージマーカーを含有する。親ファージは、それ自体を標的細菌の細胞壁に結合させ、ウイルス核酸を注入して、感染した細菌を生成することによって、標的細菌を感染させる。次に、組み換えバクテリオファージマーカー遺伝子は、感染した細菌において多量に発現される。細菌が代謝的に活性である場合、例えば、増殖又は分割している場合、各子孫は、マーカー遺伝子のさらなるコピーを含有し（又はファージによって感染されている）、したがって、より大きいシグナルを生成する。対照的に、細菌が休眠状態であるか又は死亡している場合、より小さいシグナルが生成される。
【０１８１】
[0178]  マーカーは、複数の処理工程の実施によって分析され得る。一実施形態において、本方法は、細菌を溶解させることを含む。一実施形態において、微生物リゾチームが、バクテリオファージ曝露試料に加えられる。一実施形態において、溶解は、クロロホルムをバクテリオファージ曝露試料に加え、バクテリオファージ曝露試料を酸で処理し、又は他の方法でバクテリオファージ曝露試料を物理的に処理することを含む。
【０１８２】
[0179]  他の方法と対照的に、子孫ファージの生成、宿主の破壊、試験試料中への子孫ファージの放出、及びさらなる回数の細菌感染が必要とされない。さらに、多くの先行技術の方法が、無傷の子孫ファージを検出することに依存する一方、本開示の一実施形態は、細菌又はファージ若しくは細菌感染した宿主（ヒトなど）によって天然に発現されない、過剰発現されるマーカータンパク質の検出を含む。他の実施形態において、マーカー遺伝子の産物は、特定の表現型、例えば、抗生物質耐性又は向上した成長特性を与えることができ、これらは、機能的にスクリーニングされ得る。
【０１８３】
[0180]  一実施形態において、バクテリオファージマーカーは、試料中の標的細菌の存在の間接的な指標である。バクテリオファージマーカーが、親ファージの成分である場合、曝露試料中の親ファージの初期濃度は、生成されるバックグラウンドシグナルが、アッセイにおいて検出できないように制御され得る。したがって、標的細菌が試料中に存在しない場合、感染は起こらず、組み換えバクテリオファージマーカー遺伝子は発現されず、新たなバクテリオファージマーカーは合成されない。一実施形態において、陰性対照は、使用されるバクテリオファージがアッセイにおいてバックグラウンドシグナルを生成しないことを確認するために、標的細菌タイプを欠くことが知られている対照試料を用いて実施される。本開示の他の態様は、標的細菌を含む曝露試料から生じるシグナルから区別可能なバックグラウンドシグナルを同定するための陰性対照の使用を提供し得る。
【０１８４】
[0181]  特定の実施形態において、生体試料が調製されたら（大量培養の増量を伴う又は伴わずに）、感染を可能にするのに十分な時間（例えば、１５分間〜１２０分間）にわたって、撹拌を伴わずに、典型的に、細菌の急速な増殖を支持する温度（例えば、３５℃〜４０℃）で、細菌への粒子の結合及び遺伝物質の注入を促進する条件下で、それは、典型的に、形質導入粒子に曝される。感染の後、細胞は、レポーター遺伝子の発現及びレポーター遺伝子発現が後述されるように検出されるのを可能にするようにインキュベートされる。
【０１８５】
[0182]  本方法は、同種分離株、並びに例えば複数の種の細菌を含む異種細菌試料に適用可能である。「複数の」という用語は、２つ以上の単位、例えば、細菌の種を意味するが、個々の単位は、構造的に及び／又は機能的に異なる必要はない。特定の実施形態において、試料は、例えば、特定の集団に適合された特定の栄養培地を用いて、同種細菌集団を提供するようにスクリーニングされ得る。
【０１８６】
[0183]  形質導入細菌細胞の同種のコピーを生成することを意図された従来のファージ形質導入技術と対照的に、本方法は、形質導入細菌が何らかの方法で単離されることを必要としない。その代わりに、レポーター遺伝子又はその産物によって与えられる、スクリーニング可能な表現型、例えば、視覚的に観察可能な形質は、通常、増殖する生存非標的細菌が存在する場合、生体試料の選択されない部分において検出され得る。スクリーニングは、形質導入細菌を単離することが必要でないため、選択なしで行われ得る。
【０１８７】
[0184]  ある実施形態において、本方法は、マーカー核酸又はその産物の存在又は非存在について試料を分析することを含む。マーカー核酸又はその産物の検出のための好適な方法が、当該技術分野において公知であり、試料の性質に応じて、変化することができ、また変化することになる。
【０１８８】
[0185]  ある実施形態において、上記の抗生物質処理、ファージ形質転換及び検出工程を行うことによって、抗生物質に対する細菌の感受性又は耐性を決定するための方法が提供される。抗生物質処理及びファージ形質転換のこれらの工程は、任意の順序で又は同時に行われ得る。一実施形態において、抗生物質処理及びファージ形質転換の工程は、連続的に行われる。本明細書において使用される際の「連続的に」という用語は、工程が、順次、例えば、数分、数時間、数日又は数週間の１つ又は複数の間隔を空けて行われることを意味する。必要に応じて、工程は、規則的な反復周期で行われ得る。別の実施形態において、抗生物質処理及びファージ形質転換工程が、一緒に行われた後、決定工程が行われる。
【０１８９】
Ｈ．検出方法
[0186]  レポーター遺伝子又はその産物を検出するための方法は、間接的又は直接的方法であり得る。間接的検出は、試料中のレポーター遺伝子若しくはその産物を他の成分から分離し、又は試料中のレポーター遺伝子若しくはその産物を濃縮した後、精製若しくは濃縮された試料中のレポーター遺伝子若しくはその産物の検出を含み得る。レポーター遺伝子又はその産物は、遊離状態（例えば、ファージを含有する培地中で）又は結合形態（例えば、サイトゾル中で若しくはゲノム中に組み込まれて細菌の内部に含まれる）で検出され得る。ある場合には、レポーターは、細菌の表面で発現される分子であり、溶解を必要とせずにその検出を可能にする。他の実施形態において、レポーターは、上述されるように、酵素活性、例えば、ＣＡＴ活性又はＡＰ活性を有するタンパク質であり得る。このような場合、レポーター活性は、酵素的技術を用いて決定される。さらに別の実施形態において、レポーターは、公知の抗体又は公知のアプタマー若しくはタンパク質の結合パートナーに対する抗原性を示すタンパク質であり得る。
【０１９０】
[0187]  好ましい実施形態において、レポーター遺伝子又はその産物は、遺伝子のタンパク質産物又はタンパク質のフラグメント（例えば、抗体が特異的に結合する抗原決定基を含有するペプチド）の存在を検出することによって直接検出される。これに関して、抗体、アプタマー、又はレポータータンパク質若しくはそのフラグメントを認識する他の分子リガンドなどのエピトープ結合剤が、レポータータンパク質又はそのフラグメントを検出するのに使用され得る。例示的な実施形態において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、レポータータンパク質又はそのフラグメントの存在を検出するのに使用される。他の実施形態において、抗体は、レポータータンパク質の生合成活性から生成される産物を検出するのに使用され得、例えば、レポーターが、別のタンパク質に対する特異的活性を有するプロテアーゼである場合、第２のタンパク質の消化産物が検出される。
【０１９１】
[0188]  一実施形態において、レポータータンパク質又はそのフラグメントは、質量分析法を用いて検出される。特に、クロマトグラフ工程を、質量分析法工程と合わせた技術が使用され得る。一般的に言えば、レポータータンパク質又はそのフラグメントの存在が、液体クロマトグラフィー、続いて質量分析法を用いて決定され得る。
【０１９２】
[0189]  ある実施形態において、液体クロマトグラフィーは、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）である。ＨＰＬＣの非限定的な例としては、分配クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、置換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、生物親和性（bioaffinity）クロマトグラフィー、水性順相クロマトグラフィー又は超高速液体クロマトグラフィーが挙げられる。一実施形態において、液体クロマトグラフィーは、超高速液体クロマトグラフィーであり得る。
【０１９３】
[0190]  ある実施形態において、質量分析法は、コンスタントニュートラルロス質量分析法であり得る。他の実施形態において、質量分析法は、タンデム質量分析法（ＭＳ／ＭＳ）であり得る。異なる実施形態において、質量分析法は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）であり得る。特定の実施形態において、質量分析法は、エレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ）であり得る。
【０１９４】
[0191]  例示的な実施形態において、本方法は、液体クロマトグラフィー、続いてタンデム質量分析法を含む。特に例示的な実施形態において、本方法は、実施例に記載されるように、液体クロマトグラフィー、続いてタンデム質量分析法を含む。別の例示的な実施形態において、本方法は、液体クロマトグラフィー、続いてコンスタントニュートラルロス質量分析法を含む。特に例示的な実施形態において、本方法は、実施例に記載されるように、液体クロマトグラフィー、続いてコンスタントニュートラルロス質量分析法を含む。さらに別の例示的実施形態において、本方法は、液体クロマトグラフィー、続いてエレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ）を含む。
【０１９５】
[0192]  上記の実施形態のそれぞれにおいて、液体クロマトグラフィー、続いて質量分析法は、試料中のレポータータンパク質若しくはそのフラグメントの存在を決定するのに使用され得、又は液体クロマトグラフィー、続いて質量分析法は、試料中のレポータータンパク質若しくはそのフラグメントの存在及び量を決定するのに使用され得る。好ましい実施形態において、液体クロマトグラフィー、続いて質量分析法は、試料中のレポータータンパク質又はそのフラグメントの存在を決定するのに使用され得る。
【０１９６】
[0193]  一般に、レポータータンパク質又はそのフラグメントの存在又は量を評価する、エピトープ結合剤に基づく方法は、エピトープ結合剤とレポータータンパク質若しくはそのフラグメントとの間の複合体の形成を可能にするのに有効な条件下で、レポータータンパク質又はそのフラグメントを含む試料を、レポータータンパク質又はそのフラグメントに特異的なエピトープ結合剤と接触させることを含む。エピトープ結合剤に基づく方法は、溶液中に行ってもよく、又はエピトープ結合剤若しくは試料は、固体表面上に固定され得る。好適な表面の非限定的な例としては、マイクロタイタープレート、試験管、ビーズ、樹脂、及び他のポリマーが挙げられる。
【０１９７】
[0194]  当業者によって理解されるように、エピトープ結合剤は、多種多様な方法で基質に結合され得る。エピトープ結合剤は、まず合成され、その後、基質に結合されてもよく、又は基質上で直接合成されてもよい。基質及びエピトープ結合剤は、これら２つのその後の結合のために化学官能基で誘導体化され得る。例えば、基質は、アミノ基、カルボキシル基、オキソ基又はチオール基を含むがこれらに限定されない化学官能基で誘導体化され得る。これらの官能基下で、エピトープ結合剤は、官能基を用いて直接、又はリンカーを用いて間接的に結合され得る。
【０１９８】
[0195]  エピトープ結合剤はまた、非共有結合的に基質に結合され得る。例えば、結合をもたらすよう、ストレプトアビジンで共有結合的に被覆された表面に結合し得るビオチン化エピトープ結合剤が調製され得る。あるいは、エピトープ結合剤は、光重合及びフォトリソグラフィーなどの技術を用いて、表面上で合成され得る。エピトープ結合剤を固体表面に結合するさらなる方法及び基質上で生体分子を合成する方法が、すなわち、Affymetrix製のVLSIPS技術が、当該技術分野において周知である（例えば、米国特許第６，５６６，４９５号、及びRockett et al.,Xenobiotica 30(2):155-177,2000を参照）。
【０１９９】
[0196]  エピトープ結合剤とレポータータンパク質若しくはそのフラグメントとの間で複合体が形成されるのを可能にするために、個々の成分が、エピトープ結合剤が存在する任意の抗原に結合するのに十分に長い期間にわたって有効な条件下でインキュベートされる。この後、複合体は、非特異的結合を除去／低減するために洗浄されてもよく、複合体は、当該技術分野において周知の任意の方法によって検出され得る。エピトープ結合剤とレポータータンパク質若しくはそのフラグメントとの間の複合体を検出する方法は、一般に、標識又はマーカーの検出に基づいている。本明細書において使用される際の「標識」という用語は、エピトープ結合剤に結合される任意の基質、又は他の基質材料を指し、ここで、基質は、検出方法によって検出可能である。好適な標識の非限定的な例としては、発光分子、化学発光分子、蛍光色素、蛍光クエンチング剤、着色分子、放射性同位体、発光剤（scintillant）、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、抗体又はそのフラグメント、ポリヒスチジン、Ｎｉ２＋、Ｆｌａｇタグ、ｍｙｃタグ、重金属、及び酵素（アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、及びルシフェラーゼを含む）が挙げられる。このような方法は、当該技術分野において周知である。
【０２００】
[0197]  ある実施形態において、複合体は、イムノアッセイによって検出される。イムノアッセイは、いくつかの異なるフォーマットで実施され得る。一般的に言えば、イムノアッセイは、競合イムノアッセイ及び非競合イムノアッセイの２つのカテゴリーに分けられ得る。競合イムノアッセイにおいて、試料中の非標識被分析物は、抗体などのエピトープ結合剤に結合する標識被分析物と競合する。非結合被分析物は、洗い落とされ、結合被分析物が測定される。競合イムノアッセイの代替的な実施形態において、試料中の非標識被分析物は、抗体などの標識エピトープ結合剤を、固定された被分析物から変位させる。変位された抗体の量は、試料中の被分析物の量の指標として測定される。非競合イムノアッセイにおいて、抗体などのエピトープ結合剤が、標識され、被分析物は標識されない。非競合イムノアッセイは、１つの抗体（例えば、捕捉抗体が標識される）又は２つ以上の抗体（例えば、標識されていない少なくとも１つの捕捉抗体、及び標識された少なくとも１つの「キャッピング」若しくは検出抗体）を使用し得る。好適な標識は上述される。
【０２０１】
[0198]  ある実施形態において、エピトープ結合剤に基づく方法は、ＥＬＩＳＡである。他の実施形態において、エピトープ結合剤に基づく方法は、ラジオイムノアッセイである。さらに他の実施形態において、エピトープ結合剤に基づく方法は、免疫ブロット又はウエスタンブロットである。異なる実施形態において、エピトープ結合剤に基づく方法は、免疫組織化学（ＩＨＣ）である。代替的な実施形態において、エピトープ結合剤に基づく方法は、アレイである。異なる実施形態において、エピトープ結合剤に基づく方法は、側方流動アッセイである。側方流動アッセイは、試料中の標的分析物の存在（又は非存在）を検出することを意図されたデバイスであり得る。
【０２０２】
[0199]  細菌宿主を特異的に同定する能力を向上させるための第２の手法は、免疫吸着の使用を含む。抗血清又はモノクローナル抗体を含む固定抗体が、それらの細胞表面エピトープの同一性に基づいて細菌細胞を特異的に捕捉するのに用いられる。次に、細菌は、上述されるように、形質導入粒子を用いてさらに検出され得る。固相表面における特定の細菌種及び菌株の免疫吸着のための好適な材料及び方法が、Enterobacterial Surface Antigens:Methods for Molecular Characterization,Korhonen et al.(eds.),Elsevier Science Publishers,Amsterdam(1986)に記載されている。
【０２０３】
[0200]  別の実施形態において、レポータータンパク質又はそのフラグメントは、サイトメトリー技術を用いて検出され得る。培養された細菌のサイトメトリー測定を行うための方法が、他の場所（Martinez et al.,Cytometry(1982)3(2):129-33；Suller et al.,J Antimicrob Chemother(1997)40(1):77-83；及びRoth et al.,Appl Environ Microbiol(1997)63(6):2421-31）で報告されているが、それらは、ファージレポータータンパク質の検出を含まない。サイトメトリー検出方法は、グラム陽性菌及びグラム陰性菌の両方、例えば、大腸菌（Escherichia coli）（Martinez、上掲）、セレウス菌（Bacillus cereus）（Roth、上掲）、黄色ブドウ球菌（S.aureus）（Suller et al.,J Antimicrob Chemother(1997)40(1):77-83）、表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）（Cohen et al.,J Clin Microbiol(1989)27(6):1250-6）、化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）（Cohen、上掲）、肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）（Cohen、上掲）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）（Cohen、上掲）、Ｐ．  スタッツェリ（P. stutzeri）（Cohen、上掲）、プロテウス・ミラビリス（Proteus mirabilis）（Cohen、上掲）、及びエンテロバクター属（Enterobacter spp.）（Cohen、上掲）に適合され得る。
【０２０４】
[0201]  上記の実施形態において、本方法は、宿主特異的組み換え又は遺伝子操作ファージを用いる。例えば、ペスト菌（Yersinia pestis）を感染させることが可能な遺伝子組み換えされたφＡ１１２２が、ペスト菌（Yersinia pestis）の特異的検出に使用され得る。複数の標的細菌タイプを検出するために、各標的細菌タイプに特異的な１種のバクテリオファージが、単一の試験試料に、又は個別にそれらの複数の区分に加えられ得る。
【０２０５】
[0202]  図１は、本明細書に記載される方法の一実施形態に係る例示的なワークフローを示す。細菌を含む試料１０が得られる。上述されるように、試料は、対象、食品、環境などに由来し得る。試料は、必要又は所望に応じて、プロセシング又は処理され得る。試料のアリコートが、抗生物質の存在下で、インキュベート又は培養され（１２）、任意選択的に、試料のアリコートが、抗生物質の非存在下で、インキュベート又は培養される。同時に又は連続して、試料のアリコートは、試料中の細菌に特異的な組み換え又は遺伝子操作ファージとともに、インキュベート又は培養される（１２）。上述されるように、操作ファージは、異種マーカーを含む。次に、抗生物質及び操作ファージを伴うインキュベーションによって生成された培養物が、分析されて（１４）、マーカーの存在又は非存在が決定され（定量的又は定性的）、結果又はデータ１６が報告される。
【０２０６】
[0203]  図２は、本明細書に記載される方法の別の実施形態に係る例示的なワークフローを示す。細菌を含む試料２０が得られる。試料は、必要又は所望に応じて、プロセシング又は処理され得る。抗生物質を含む及び含まない流体培地を含む容器２２が準備される。試料２４のアリコートが、各容器に入れられ、混合される（２６）。次に、各容器は、所望の温度で所望の時間にわたってインキュベートされ、この実施形態において、各容器は、３５℃で２時間インキュベートされる（２８）。容器は、インキュベーション後に再度混合され得、次に、操作ファージが、容器中に導入され、混合され（３４）、次に、インキュベートされて（３６）、二次培養物を生成する。二次培養物のアリコートが、側方流動イムノアッセイデバイス（３８）に堆積され、次に、それが、異種マーカーの存在又は非存在について分析される（４０）（定量的又は定性的）。
【０２０７】
[0204]  細菌試料、細菌株又は菌株の混合物に対する有効性について候補抗生物質をスクリーニングするために本明細書に記載される方法及びアッセイを行うための図１及び２のワークフローは例示的なものである。一般に、本方法は、細菌試料を、試験抗生物質と接触させて、一次培養物を得て、試験抗生物質を含まないビヒクルと接触させて、対照一次培養物を得ることと；異種レポーター遺伝子の発現をコードする核酸配列を含む特定のバクテリオファージを、一次培養物及び対照一次培養物と接触させて、試験抗生物質で処理された細菌を含む第１の二次培養物、及び試験抗生物質で処理されていない細菌を含む第２の二次培養物を得ることと；第１及び第２の二次培養物中のレポーター遺伝子又はその産物のレベル又は活性を検出することとを含み、ここで、第２の二次培養物と比較した、第１の二次培養物中のレポーター遺伝子又はその産物のレベル又は活性の低下（又は非存在）が、試験化合物が抗生物質薬剤であることを示す。本方法はまた、複数の菌株に対する単一の試験抗生物質をスクリーニングするのに使用される。本方法はまた、抗生物質若しくは候補抗生物質の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）及び／又は臨床抗生物質化合物の有効性を決定するためのスクリーニングに使用される。
【０２０８】
[0205]  本明細書において使用される際、「最小発育阻止濃度」という用語は、微生物の可視の増殖を阻害する抗生物質の最低濃度を指す。この用語は、本明細書に記載される方法及びアッセイを用いて、細菌細胞死を起こすか又は細胞壁の修復を阻害する抗生物質の最低濃度も包含する。一実施形態において、本明細書に記載される方法及びアッセイは、細菌株に対する抗生物質又は候補抗生物質の最小発育阻止濃度の決定を可能にする。一実施形態において、抗生物質の最小発育阻止濃度は、抗生物質に曝されていない試料中若しくは異なる濃度の同じ抗生物質に曝された試料中の同じ細菌細胞と比較して、抗生物質に曝された試料中の細菌細胞の応答の調節（例えば、レポーター株の取り込み及び排出、形態の変化、代謝の変化など）を測定することによって決定され得る。
【０２０９】
[0206]  最小発育阻止濃度は、細菌細胞死を誘導し、及び／又は細菌媒介性疾患の少なくとも１つの症状を軽減するために対象に投与される抗生物質の最小有効用量を示す臨床的に関連する値である。臨床的に、最小発育阻止濃度を用いて、対象が投与される抗生物質の量を決定するだけでなく、使用される好ましい抗生物質も決定する。例えば、有効性決定及び臨床試験のための投与情報を可能にするために、候補抗生物質の最小発育阻止濃度も決定され得る。
【０２１０】
[0207]  本方法は、抗生物質及び他の殺菌剤に対する細菌の感受性の決定を可能にするため、患者の診断に有用である。形質導入粒子への曝露の前に、スクリーニングされる抗生物質又は殺菌剤とともに細菌の短時間のインキュベーションを行うことによって、細胞の代謝活性が停止され、表現型の変化が防止される。上述されるように、細菌の存在が、形質導入粒子を用いて最初に確認された後、このような試験は、有用であろう。次に、細菌感染に対して強力であると決定された生物質及び殺菌剤が、対象の治療に用いられ得る。有用な抗生物質及び殺菌剤のこのような迅速で早期の検出が、重篤な細菌感染を治療するのに非常に有益であり得る。
【０２１１】
[0208]  一実施形態において、診断方法は、細菌性疾患に罹患しているか又は細菌性疾患のリスクがあると疑われる対象の試料を、本明細書に記載される１つ以上の組み換えファージと接触させること；ファージによって発現されるマーカーの存在又は非存在を検出し、任意選択的に定量化することと；マーカーの存在を、細菌性疾患（例えば、黄色ブドウ球菌（S.aureus））の病原因子と相関させ、それによって、対象における細菌性疾患を診断することとを含み得る。「対象」とは、ヒト及び他の霊長類（チンパンジー及び他の類人猿及びサル種などの非ヒト霊長類を含む）；ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ及びウマなどの家畜；イヌ及びネコなどの飼い慣らされた哺乳動物；マウス、ラット及びモルモットなどのげっ歯類を含む実験動物；ニワトリ、シチメンチョウ及び他の家禽、カモ、ガチョウなどの、飼い慣らされた鳥、野生の鳥及び狩猟鳥を含む鳥類などを含むがこれらに限定されない脊索動物門（Chordata）の任意のメンバーを意味する。この用語は、成体及び新生個体の両方を包含する。
【０２１２】
[0209]  特定の実施形態において、細菌性疾患の確定診断が行われた後、対象は、標準的な手順を用いて、任意選択的に、治療され、管理され、インラインで追跡調査され得る。例えば、対象は、有効量の医薬品、例えば、抗生物質で治療され得る。本方法の趣旨では、薬剤の「有効量」は、対象における、病原因子、例えば、黄色ブドウ球菌（S.aureus）に対する応答を生成する量である。これに関して、咽頭炎に罹患している対象は、ペニシリンＧベンザチン及び／又はアモキシシリンで治療され得る。対象が、治療に応答しないことが判明した場合、病原因子が、上述される方法を用いて、抗生物質耐性について分析され得る。耐性株について確実な確認が行われた場合、対象は、第２の抗生物質薬剤若しくはより高い投与量の抗生物質薬剤、又は２つ以上の抗生物質薬剤の組合せで治療され得る。
【０２１３】
[0210]  同様に、本方法は、抗生物質、例えば、動物産物中の抗生物質残渣の存在を検出するのに有用である。この手法では、分析される材料の抽出物が、該当する抗生物質に感受性の細菌株の培養物に加えられ、混合物は、所与の量の抗生物質が存在する場合、菌株を殺滅するのに十分な所定の期間にわたってインキュベートされる。この時点で、菌株に特異的な形質導入粒子が加えられ、本明細書に記載されるアッセイが行われる。所与の量の抗生物質が存在する場合、細菌株の細胞は、死亡し、読み取りは陰性である（すなわち、ルシフェラーゼアッセイにおける発光の欠如）。所与の量の抗生物質が存在しないか又はＭＩＣ未満である場合、細菌は生存し、読み取りは陽性である（すなわち、発光）。
【０２１４】
[0211]  特定の実施形態において、ファージ特異性に基づいて形質導入粒子に対して予め感受性にされた細菌をアッセイするための手段が提供される。すなわち、第１の工程において、標的細菌は、対象とするバクテリオファージについての細胞特異的受容体を含有又は発現するように、例えば、形質転換によって修飾される。第２の工程において、修飾（又はタグ化）細菌が、それらがしたがうことになる試料環境中に導入されるか、又は混合される。試料環境は、屋外（例えば、土壌、空気又は水）；生きた宿主（例えば、植物、動物、昆虫）上；装置（例えば、製造、処理又は包装装置）上；及び臨床試料中を含む、細菌が存在する任意の設定であり得る。次に、本明細書に記載されるバクテリオファージアッセイは、導入された受容体に特異的なバクテリオファージを用いて行われ、タグ化細菌の存在が、モニター又は定量化され得る。
【０２１５】
[0212]  上記の実施形態は、以下の非限定的な例を考慮して、さらに説明される。
【実施例】
【０２１６】
[0213]  本明細書に記載される構造、材料、組成物、及び方法は、本発明の代表例であることが意図され、本発明の範囲は、実施例の範囲によって限定されないことが理解されるであろう。当業者は、本発明が、開示される構造、材料、組成物及び方法の変化を伴って実施され得、このような変化は、本発明の範囲内であると見なされることを認識する。
【０２１７】
実施例１
異種マーカーの発現のための組み換えバクテリオファージの構築
[0214]  この試験において、標的細胞又はファージベクター又は細菌感染した宿主によって天然に生成されない分子（マーカー）が調製され、続いて、イムノアッセイによる異種分子（マーカー）の特異的検出が行われる。マーカー分子は、例えば、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ）タグなどで任意選択的にタグ化されるペプチド又はタンパク質であり得る。
【０２１８】
[0215]  組み換えバクテリオファージの構築：組み換えプラスミドによって媒介される相同的組み換えを介してカプシドタンパク質（ｃｐｓ）をコードする核酸配列の下流のファージゲノムの強く発現される領域中に異種マーカーをコードするＤＮＡ配列を挿入することによって、組み換えバクテリオファージが構築される。ｃｐｓの上流に位置する強いプロモーターが、感染後にバクテリオファージゲノムの発現の過程で選択的に活性化され、対応するｍＲＮＡ転写産物の多くのコピーを生成する。組み換えバクテリオファージの構築は、好適な翻訳シグナルを有する、レポーターをコードする核酸の融合産物を用いて達成される（リボソーム結合部位、中間領域、開始コドン）。代表的な方法が、Loessner et al.,Appl. Environ. Microbiol.,62(4):1133-40,1996及び米国特許第５，８２４，４６８号に記載されている。
【０２１９】
[0216]  エレクトロコンピテント大腸菌（E.coli）Ｋ１株（ＡＴＣＣ株２３５０３）中へのプラスミドベクターの電気形質転換：Luria-Bertani（ＬＢ）ブロス中で、３７℃で０．８の光学密度（ＯＤ）まで増殖させることによって、菌株をエレクトロコンピテントにさせた後、１５％のグリセロールで数回洗浄する。電気形質転換は、Bio-Rad Labs（Hercules,CA）から入手可能なGENE PULSERを用いて行われる。
【０２２０】
[0217]  天然型バクテリオファージによる形質転換大腸菌（E.coli）Ｋ１株の感染：宿主細菌の感染の後、少なくとも少数の天然バクテリオファージが、プラスミド中のｌｕｘＡＢに隣接するカプシド配列の一部を用いて相同的組み換えを行い、したがって、ｌｕｘＡＢを移動して、組み換えファージを形成する。形質転換細菌は、ＬＢ−アンピシリン培地中で、３７℃で０．４のＯＤまで増殖される。バクテリオファージＫ１−５が、１０個の細菌当たり約１個のバクテリオファージの多重感染度（ＭＯＩ）で加えられ、溶解が起こるまでＯＤがモニターされる。溶解物は、０．４５ミクロンのニトロセルロース膜（Millipore Corp.（Bedford,MA）から入手可能）に通してろ過することによって収集される。
【０２２１】
[0218]  溶解物は、アンピシリンｍＬ当たり５０μｇで、ＬＢ固形寒天上で増殖する野生型大腸菌（E.coli）Ｋ１（ＡＴＣＣ  ２３５０３）上に平板培養され、プラーク形成され、レポーター活性についてプラークをアッセイすることによって、組み換えＫ１−５バクテリオファージについてスクリーニングされる。適切に組み込まれたレポーター遺伝子配列を含有する組み換えバクテリオファージが生成されたことの確認が、ファージゲノムをシークエンシングすることによって行われ得る。シークエンシングは、市販のシーケンサー（Commonwealth Biotechnologies,Richmond,VA）を用いて行われる。
【０２２２】
[0219]  最後に、発現されたマーカーが、イムノアッセイによって検出される。
【０２２３】
実施例２
ＤＮＡ転位を用いた組み換えバクテリオファージの生成
[0220]  異種レポーター核酸を含有するバクテリオファージが、Goryshin et al.,J. Biol. Chem.,273(13):7367-7374,1998に記載されるように、市販のEZ::TN（商標）トランスポゼースシステム（Epicenter Technologies,Madison,Wis.）を用いて構築される。次に、末端がＭＥ結合されたEZ::TN（商標）トランスポソームが、エレクトロコンピテント大腸菌（E.coli）Ｋ１株（ＡＴＣＣ株２３５０３）中に電気形質転換される。ＬＢ培地中で、３７℃で０．８の光学密度（ＯＤ）まで増殖させることによって、菌株をエレクトロコンピテントにさせた後、１５％のグリセロールで数回洗浄する。電気形質転換は、Bio-Rad Laboratories（Hercules,CA）から入手可能なBIORAD GENE PULSERを用いて行われる。
【０２２４】
[0221]  形質転換大腸菌（E.coli）Ｋ１株は、天然型Ｋ１−５バクテリオファージで感染される。形質転換細菌は、ＬＢ−アンピシリン培地中で、３７℃で０．４のＯＤまで増殖される。バクテリオファージＫ１−５は、１０個の細菌当たり約１個のバクテリオファージの多重感染度で加えられ、溶解が起こるまでＯＤがモニターされる。トランスポソーム−電気形質転換宿主細菌の感染の後、少なくとも少数の天然Ｋ１−５バクテリオファージが、ファージのプラーク形成能力に影響を与えない無害の位置で、ランダム転位によって異種レポーター遺伝子を受け入れる。溶解物は、０．４５ミクロンのニトロセルロース膜（Millipore Corp.（Bedford,MA）から入手可能）に通してろ過することによって収集される。
【０２２５】
[0222]  溶解物は、標準的な方法、例えば、レポータータンパク質に特異的に結合する抗体又はそのフラグメントを用いた、レポータータンパク質についてのイムノアッセイを用いて、レポーター遺伝子の産物の活性についてスクリーニングされる。一次抗体は、検出可能部分を含有する二次抗体を用いて検出され得る。
【０２２６】
実施例３
組み換えバクテリオファージを用いて対象から得られたスクリーニング試料
[0223]  細菌感染の症状（例えば、発熱、頭痛、腹痛、及び吐き気）を示す対象（例えば、ヒト患者）が同定され、以下の試料が、対象から採取される：０．０１ｍＬの脳脊髄液（ＣＳＦ）試料、１．０ｍＬの痰試料、及び１．０ｍＬの血液試料。各試料が、４．０ｍＬのＬＢブロスで希釈され、したがって、それぞれの試料中に存在する全ての細菌の増殖を促進し、３７℃で４時間インキュベートされる。インキュベーションの後、各試料が、９６ウェルプレートの３０ウェルに１００μＬのアリコートで分配される。血液試料のアリコートが、ウェル１〜３０に加えられ、ＣＳＦ試料のアリコートが、ウェル３１〜６０に加えられ、痰試料のアリコートが、ウェル６１〜９０に加えられる。ウェル９１〜９３は、陽性対照として働き、ウェル９４〜９６は、陰性対照として働く。
【０２２７】
[0224]  以下の５つの組み換えバクテリオファージが入手される：大腸菌（E.coli）Ｋ１細菌を感染させるＫ１−５：：ｌｕｘＡＢバクテリオファージ；エンテロコッカス属（enterococcus）細菌を感染させるＥＢＮ６：：ｌｕｘＡＢバクテリオファージ；スタフィロコッカス属（staphylococcus）細菌を感染させるＴｗｏｒｔ：：ｌｕｘＡＢバクテリオファージ；サルモネラ属（Salmonella）細菌を感染させるＳｐ６：：ｌｕｘＡＢバクテリオファージ；及びストレプトコッカス属（streptococcus）細菌を感染させるＲＺｈ：：ｌｕｘＡＢバクテリオファージ。ファージは、別の供給源から入手され、又は実施例１に記載されるプロトコルを用いて、インサイチュで操作される。
【０２２８】
[0225]  約３×１０８個のファージ／ｍＬに相当する組み換えバクテリオファージ懸濁液が、患者から採取された３つの試料のそれぞれに対応する３０ウェルの群の６つの個々のウェルに加えられる。システムは、異なる特異性のファージにわたる同じ異種マーカーの適用を含むため、ユニバーサル検出システムが開発される。微調整を加えて、このシステムは、マルチプレックス検出に適合され、例えば、複数の試料が、一緒に又は同時に処理される。このシステムは、特定の疾患の発病に関与する細菌病原体のコホートの同定に特に有用である。例えば、大腸菌（E.coli）、クレブシエラ属（Klebsiella）、エンテロバクター属（Enterobacter）、シュードモナス属（Pseudomonas）、スタフィロコッカス属（Staphylococcus）、プロテウス属（Proteus）などの、尿路感染症（ＵＴＩ）に関連する病原体は全て、マルチプレックスアレイフォーマットを用いて、同定及び特性評価され得る。
【０２２９】
実施例４
細菌試料の抗菌薬感受性又は耐性の決定
[0226]  生体試料が、４．０ｍＬのＬＢブロスで希釈され、３７℃で４時間インキュベートされて、試料に含まれる細菌の増殖を促進する。一次培養物が、以下の試験抗生物質のうちの１つが補充されたＬＢ培地を含むエッペンドルフチューブ中に等分される：アンピシリン（ペニシリンクラス）、イミペネム（β−ラクタム系抗生物質）、セフォキシチン（セファマイシンクラス）、シプロフロキサシン（フルオロキノロンクラス）、カナマイシン（アミノグリコシドクラス）及びテトラサイクリン（テトラサイクリンクラス）。抗生物質による処理の後、チューブが遠心分離され、細菌ペレットが洗浄され、レポーター遺伝子を含むファージ粒子を含むＬＢブロス中で再懸濁される。ファージ−細菌混合物が、細菌の形質転換及び二次培養物の生成を可能にする標準的な条件下で培養される。二次培養物は、遠心分離され、細菌ペレットが、溶解緩衝液で溶解される。レポーター遺伝子産物（異種タンパク質）の量又は活性が、標準的な技術、例えば、レポーター異種タンパク質の量を評価するためのＥＬＩＳＡ又はレポーター遺伝子産物（異種タンパク質）の活性を評価するための酵素アッセイを用いて評価される。実験は、シングル又はマルチプレックスフォーマットで行われ得る。
【０２３０】
[0227]  シングルアッセイ及びマルチプレックスアッセイの基本的な概要が、以下の表４．１に示される。予測される結果が、表４．２に示される。
【０２３１】
【表５】
2020513764.tif 000007
【０２３２】
【表６】
2020513764.tif 000008
【０２３３】
実施例５
抗菌薬感受性試験のための方法
[0228]  試験試料の複数のバッチが、増加するｌｏｇ濃度の同じ抗生物質、例えば、０．００ｍｇ／Ｌ（対照）、０．０１ｍｇ／Ｌ、０．０３ｍｇ／Ｌ、０．１０ｍｇ／Ｌ、０．３０ｍｇ／Ｌ、１．０ｍｇ／Ｌ、３．０ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ、３０ｍｇ／Ｌ、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンの最終濃度で処理されることを除いて、実施例４の基本的な実験の設置が保持される。アンピシリンの最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）曲線が、試験される個々の試験化合物のそれぞれについて細菌の各個々の種について確認される。互いに関連する種又は菌株が、例えば、抗生物質の５０％致死量（ＬＤ５０）及び／又は細菌のＭＩＣ値及びさらに増殖パラメータ、例えば、倍加時間に対する抗生物質の影響などに関して比較され得る。
【０２３４】
実施例６
バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）Ｃｒｙ１Ａｂ毒素の検出方法
[0229]  マーカータンパク質としてのバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）（Ｂｔ）のＣｒｙ１Ａｂタンパク質毒素の検出のための側方流動イムノアッセイが、溶解された大腸菌（E.coli）細胞からの精製タンパク質及びプラスミドでコードされるタンパク質の形態のＣｒｙ１Ａｂを検出するために、市販の抗体を用いて準備される。病原体を直接同定し、尿からその抗菌薬感受性（ＩＤ／ＡＳＴ）を確認するための本方法の能力が、評価され、抗菌薬感受性試験（ＡＳＴ）のために設計された米国臨床検査標準委員会（Clinical and Laboratory Standards Institute）（ＣＬＳＩ）の指針によって提供される標準的なプロトコルと比較される。
【０２３５】
[0230]  側方流動イムノアッセイが、市販の抗Ｂｔ  Ｃｒｙ１Ａｂウサギポリクローナル抗体及びマウスモノクローナル抗体（MyBioSource）を用いて準備される。側方流動イムノアッセイを用いたＣｒｙ１Ａｂの検出が、市販のＥＬＩＳＡキット（AMAR Immunodiagnostics、カタログ番号ＡＩＤ００７）を用いたＣｒｙ１Ａｂの検出と比較される。側方流動イムノアッセイは、マーカー特異的抗体の効率的なスクリーニングを可能にする一般的な捕捉及び検出試薬を有する。捕捉試薬は、支持膜上に固定された抗フルオレセインモノクローナル抗体から構成される。検出試薬は、ストレプトアビジン被覆ユウロピウムナノ粒子（ThermoFisher）である。マーカー特異的抗体は、市販の試薬、フルオレセインイソチオシアネート及びビオチン−ＮＨＳエステルを用いて、フルオレセイン及びビオチンで標識され、精製Ｂｔ  Ｃｒｙ１Ａｂタンパク質を用いて側方流動イムノアッセイフォーマットにおける組合せについて試験される。主要なイムノアッセイパラメータ−捕捉及び検出試薬の濃度、アッセイ緩衝液及び阻害薬の粗製、試料体積−が、MyBioSource製の精製Ｂｔ  Ｃｒｙ１Ａｂタンパク質（UniProt P0A370）を用いて最適化される。
【０２３６】
[0231]  Ｃｒｙ１Ａｂタンパク質発現ベクター（ｐＣｒｙ１Ａｂ−ＥＴ３０ａ）を保有する大腸菌（E.coli）細胞によって生成されるＣｒｙ１Ａｂタンパク質を検出する側方流動イムノアッセイの能力が評価される。試験システムが、精製Ｂｔ  Ｃｒｙ１Ａｂタンパク質（MyBioSource # MBS537737）を用いて校正され、検出限界が、精製タンパク質とともに標準曲線を用いて、［ブランク試料シグナル＋３ＳＤ］のシグナルに対応するＣｒｙ１Ａｂタンパク質の濃度として計算される。
【０２３７】
[0232]  大腸菌（E.coli）細胞中のＣｒｙ１Ａｂタンパク質発現、溶解された細胞からのその細胞外放出及び検出限界ＣＦＵ／ｍＬが評価される。Ｃｒｙ１Ａｂをコードする遺伝子が合成され（Epoch Life Sciences）、ｐＥＴ３０ａ（Novagen）中にサブクローニングされる。ｐＥＴ３０ａは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ１の転写制御下のタンパク質発現ベクターである。ｐＣｒｙ１Ａｂ−ＥＴ３０は、大腸菌（E.coli）Ｂへと形質転換され、Ｔ７ファージで感染される。Ｔ７感染は、（ＲＮＡポリメラーゼ１を供給することによって）Ｃｒｙ１Ａｂ発現を誘導し、感染の３０〜４５分後に、Ｃｒｙ１Ａｂを放出する細胞を溶解させる。ファージ誘導Ｃｒｙ１Ａｂ発現及び溶解された細胞からの放出の存在が、側方流動イムノアッセイを用いて検出される。検出能力は、一定の１０８ＰＦＵ／ｍＬで、１０２〜１０６ＣＦＵ／ｍＬの範囲の細胞の連続希釈を用いて評価される。ファージ感染した溶解された細胞のみが、上清中にＣｒｙ１Ａｂをもたらすため、Ｃｒｙ１Ａｂのファージ誘導プラスミドによる発現を用いたこの手法は、その後の実験の有用な基準を提供する。
【０２３８】
[0233]  他の実施形態：上記の実施例は、一般に若しくは具体的に記載される反応剤及び／又は上記の実施例において使用されるものについて本明細書の他の箇所に記載される操作条件を置き換えることによって同様に成功して繰り返され得る。
【０２３９】
実施例７
尿路感染症の検出方法
[0234]  存在する細菌を同定する尿路感染症の診断のための診断アッセイが、この実施例に記載される。このアッセイは、ｉ）標的細菌の認識及び異種タンパク質マーカーを発現する標的細菌を使用するための組み換えファージ、並びにｉｉ）異種タンパク質マーカーの検出のための側方流動イムノアッセイから構成され得る。このアッセイは、臨床試料、例えば、尿とともに使用することが想定され、臨床試料は、抗生物質及び組み換えファージを含有する試薬とともにインキュベートされて、混合物を形成し；インキュベーションの後、混合物は、側方流動イムノアッセイに適用されて、異種マーカーの存在又は非存在を決定する。抗生物質感受性株が、抗生物質によって阻害され、マーカーを発現せず、側方流動イムノアッセイがシグナルを生成しない一方（陰性の結果）、抗生物質耐性株は、マーカーを生成し、側方流動イムノアッセイにおいて検出可能なシグナルをもたらす（陽性の結果）。
【０２４０】
[0235]  異種タンパク質マーカーとしてヒスチジンタグ化ビオチン化ルシフェラーゼを発現する組み換えファージのモデルとして、ビオチン又はビオチン様部分（ストレプトアビジン結合タンパク質（ＳＢＰ）及びTwinStrep-tag（登録商標））を用いてＨｉｓタグ化ルシフェラーゼについての構築物を発現する組み換え大腸菌（E.coli）細胞を調製した。これらの６つの組み換え細胞株を、HM50NanoSBPHis、HM50NanoHisSBP、HM50HisTwinStrept、HM50TwinStreptHis、HM50HisBiotin、HM50BiotinHisと示した。溶解物を、Y-PER Plusタンパク質抽出試薬を用いて、各細胞株から調製した。
【０２４１】
[0236]  上流から下流の位置にニトロセルロース基質上に以下の領域を有する側方流動イムノアッセイを構築した：Ｈｉｓ−タグに対するマウス抗体及びストレプトアビジンで被覆されたユウロピウム粒子のそれぞれの捕捉及び検出試薬を含む試薬パッド；ヤギ抗体の陰性対照ライン、マウスＩｇＧに対するヤギ抗体の試験ライン、及びビオチン化ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の手順制御ラインから構成される試験領域；並びに吸収パッド。
【０２４２】
[0237]  細胞溶解物の希釈された抽出物を、側方流動イムノアッセイに設置し、試験領域のラインにおけるシグナルを、機器を用いて読み取った。検出可能なシグナルが、HM50BiotinHis、HM50HisBiotin及びHM50NanoHisSBPと示される細胞の溶解物から観察された。HM50HisBiotinを発現する細胞が、最も多い量の検出可能なｈｉｓ−ルシフェラーゼ−ビオチンシグナルを提供した。
【０２４３】
[0238]  上記の説明から、当業者は、方法の本質的特徴を容易に確認することができ、その趣旨及び範囲から逸脱せずに、様々な使用及び条件にそれを適合させるために様々な変形及び変更を行うことができる。
【０２４４】
[0239]  特に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様又は同等の方法及び材料が、本発明の実施又は試験に使用され得るが、好適な方法及び材料が、上記の段落において記載されている。さらに、材料、方法、及び例は、例示的なものに過ぎず、限定的であることは意図されていない。矛盾が生じた場合、定義を含む本明細書が優先される。
【０２４５】
[0240]  本明細書に引用される全ての米国特許及び公開若しくは非公開米国特許出願が、参照により援用される。全ての公開された外国特許及び特許出願が、参照により本明細書に援用される。本明細書に引用される全ての公開された参考文献、文書、原稿、科学文献が、参照により本明細書に援用される。科学データベース（例えば、ＮＣＢＩ、ＧＥＮＢＡＮＫ、ＥＢＩ）に関連する全ての識別子及び受託番号が、参照により本明細書に援用される。
【図１】
2020513764.tif 000009
【図２】
2020513764.tif 000010
【国際調査報告】
2020513764.tif 000011
2020513764.tif 000012
2020513764.tif 000013