(57)【要約】  本発明は、細胞標的結合部分（ＣＴＢＭ）を有する薬物コンジュゲート構築物においてペイロード（又は毒素）として有用な新規の天然産物由来のラトジャドンベースの化合物及び薬物コンジュゲートとの関連において有用なペイロードリンカー化合物を対象とする。本発明はさらに、上述のペイロード、ペイロードリンカー及び薬物コンジュゲートを含む新たなラトジャドン組成物、並びにがん、炎症性疾患及び感染性疾患などの病的状態を治療するためにこれらのペイロード、ペイロードリンカー及び薬物コンジュゲートを使用する方法に関する。【選択図】図２
2020529457.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
【化１】
2020529457.tif 000128
の化合物であって、
Ｒ1及びＲ2のうちの１つがＮＨＲ9であり、かつ、１つがＨ及びＯＨから選択され；
Ｒ3、Ｒ4及びＲ5が、Ｈ、ＣＨ3及びＣ2Ｈ5からなる群から互いに独立して選択され；
Ｒ6がＣＨ3又はＣ2Ｈ5であり；
Ｒ7及びＲ8が、Ｈ、ＣＨ3、Ｃ2Ｈ5、ｎ−Ｃ3Ｈ7、
【化２】
2020529457.tif 000129
からなる群から互いに独立して選択され；かつ
Ｒ9がＨである、
化合物。
【請求項２】
Ｒ1〜Ｒ8が請求項１に定義される通りであり；かつ
Ｒ9がＬ−ＲＭ＊であり、Ｌがリンカー、特に自壊性リンカーであり、ＲＭ＊がＲＭ及びＲＭ’から選択され、ＲＭが、標的化部分、特に標的結合性抗体又はその機能的断片と共有結合を形成することができる反応性部分であり、かつ、ＲＭ’が、保護基を有する部分ＲＭである、
式Ｉの化合物。
【請求項３】
Ｒ1〜Ｒ8が請求項１に定義される通りであり；かつ
Ｒ9がＬ−ＴＭであり、Ｌがリンカー、特に自壊性リンカーであり、かつ、ＴＭが標的化部分である、
式Ｉの化合物。
【請求項４】
Ｒ1がＯＨであり、かつ、Ｒ2がＮＨＲ9である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ2が１６Ｒ−ＮＨＲ9である、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ2が１６Ｓ−ＮＨＲ9である、請求項４に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ1がＮＨＲ9であり、かつ、Ｒ2がＯＨである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項８】
請求項２に記載の化合物を合成する方法であって、請求項１に記載の化合物を前記アミノ基Ｒ1又はＲ2を介して化合物Ｘ−Ｌ’−ＲＭ＊と反応させるステップを含み、
Ｘが、（ｉ）アミンと反応することができる、又は（ｉｉ）アミンにより置換されることができる基であり；かつ
Ｌ’がリンカーであり；
前記部分Ｘ−Ｌ’との前記アミノ基の前記反応が部分−ＮＨ−Ｌ−ＲＭ＊の形成を結果としてもたらす、
方法。
【請求項９】
ＲＭ＊がＲＭ’であり、前記方法が、前記部分ＲＭ’を脱保護してＲＭを結果としてもたらすことをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項２に記載の化合物を標的化部分と反応させるステップを含む、請求項３に記載の化合物を合成する方法。
【請求項１１】
請求項３に記載の化合物又は請求項１０に記載の方法により合成される化合物を含む、医薬組成物。
【請求項１２】
がんの治療において使用するための、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
がんの治療方法であって、請求項３に記載の化合物、又は請求項１１若しくは１２に記載の医薬組成物をそのような治療を必要とする患者に投与するステップを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞標的結合部分（ＣＴＢＭ）を有する薬物コンジュゲート構築物においてペイロード（又は毒素）として有用な新規の天然産物由来のラトジャドンベースの化合物及び薬物コンジュゲートとの関連において有用なペイロードリンカー化合物を対象とする。本発明はさらに、上述のペイロード、ペイロードリンカー及び薬物コンジュゲートを含む新たなラトジャドン組成物、並びにがん、炎症性疾患及び感染性疾患などの病的状態を治療するためにこれらのペイロード、ペイロードリンカー及び薬物コンジュゲートを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの種類のがんについて、古典的な化学療法が依然として唯一の効果的な治療形態である。化学療法は細胞傷害効果に基づいて機能し、毒素ががん細胞を殺傷することにより、腫瘍成長を停止させる。化学療法剤は主に、高レベルの細胞分裂活性を有する細胞を損傷して破壊する。しかしながら、これらの治療法は、悪性細胞を標的化及び破壊すると共に正常組織への望ましくない付随的毒性を最小化する必要性と長期にわたり奮闘してきた。そのような薬物は健常細胞にも損傷を与えるので、患者は重篤な副作用を患う。多数の高度に細胞傷害性の薬物は臨床的有用性が限られており、その理由は、該薬物は正常細胞及び悪性腫瘍細胞の両方に対して等しく侵攻性であるからである。健常組織は、細胞毒により重度に影響されることがある。これらの薬物は腫瘍細胞と正常細胞とを明示的に識別せず、副作用に繋がるので、薬物は多くの場合に最小レベルで投与され、効果的でないことがある。これが、腫瘍細胞を特異的に標的化するための方法を見出すことが重要である理由である。
【０００３】
薬物及び他の剤の標的細胞、組織及び腫瘍への送達を向上させて最大の有効性及び最小の毒性を達成することは、長年にわたりかなりの研究において焦点とされてきた。現代のがん療法はいまや、抗体のような大きな分子を使用してがんをより精密に標的化する。抗体は重要な、免疫系の天然に存在する部分であり、「侵入者」（例えば、ウイルス）の細胞表面に特異的に結合することによりそれを除去することができる大きな分子である。しかしながら、抗体は多くの場合に治癒的でないので、化学療法剤と組み合わせられる必要がある。
【０００４】
ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏの両方において、生物学的に活性の分子を細胞に輸送するための効果的な方法を開発する多くの試みが為されてきたが、いずれも完全に満足のいくものであるとは証明されていない。薬物のその細胞内標的との会合を最適化すると共に、例えば隣接する細胞への、薬物の細胞間再分布を最小化することは多くの場合に困難又は非効率的である。
【０００５】
細胞外被標的化キャリア−薬物コンジュゲート（ＥＤＣ）は、非特異的な細胞傷害性薬物及び特異的ＣＴＢＭの両方のこれらの制限を克服しようとするものである。ＥＤＣは、ＣＴＢＭ（目的の腫瘍を選択的に標的化するように設計された、抗体、小分子、抗体断片、抗体模倣物など（下記を参照））、毒性ペイロード（腫瘍を殺傷する細胞傷害性化合物）及びリンカー（抗体に毒性ペイロードを共役させるために使用される）という３つの鍵となる要素から構成され、新規の選択的ながん療法の開発のための大規模に研究される研究分野である。［１〜１０］。そのような細胞外標的化療法において、高度に細胞傷害性の薬物が、がん細胞の表面に過剰発現される特定のバイオマーカー［１１〜１３］に高い親和性を有するキャリア分子に細胞内切断可能なリンカーを介して取り付けられる。こうして薬物はそれらの細胞に選択的に送達されることができる。エンドサイトーシスを介した取込み後、リンカーは酵素切断され、細胞傷害性ペイロードが放出されてがん細胞を殺傷する。細胞毒への健常細胞の提示は著しく低減されるので、任意の全身性の従来の応用のためにはるかに強力な、非常に強力な細胞毒をそのようなアプローチにおいて利用することができ、最小有効量（ＭＥＤ）は有意に低減され、最大耐量（ＭＴＤ）は増加して、治療ウインドウの拡大に繋がる。そのようなＥＤＣのために利用することができる、目的の腫瘍を選択的に標的化するように設計されたキャリア分子は、抗体［１、３、９］、プロボディ、抗体断片、オクトレオチド［１４〜１７］、ゴナドトロピン［１８〜２２］又はアンチカリン［２３〜２５］のようながん細胞表面上の受容体に高い親和性を有するペプチド、及びがん細胞の増殖のために必須であり、かつ特定の高親和性受容体により取り込まれる葉酸［２６〜２９］、ビタミンＢ９のようなビタミンであり得る。例えば、ＡＤＣ（抗体薬物コンジュゲート）は、抗体（目的の腫瘍を選択的に標的化するように設計される）、毒性ペイロード（腫瘍を殺傷する細胞傷害性化合物）及びリンカー（抗体に毒性ペイロードを共役させるために使用される）という３つの鍵となる要素から構成される。そのような構築物の利益は、治療ウインドウの有意な向上であり、毒性ペイロードの半減期及び特異性を増加させ、オフターゲット効果及び毒性を低減させる。ＡＤＣの使用は、過去３０年にわたり大規模に研究されてきた（Moolten et al. (1972), J Natl. Cancer Inst. 49(4):1057-62、Chari et al., (2014) Angew. Chem. Int. Ed., 53:3796-3827;Jackson, (2016) Org. Process Res. Dev. 2016, 20:852-866）。２つのＡＤＣは既に承認及び市販されており、Kadcyla（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ）及びAdcetris（登録商標）（Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）は、それぞれ乳がん及び全身性未分化大細胞リンパ腫の治療について承認されている。いくつものさらなるＡＤＣが異なるがん種の治療のために臨床試験をされている［９］。さらには、いくつものペプチドコンジュゲートが、細胞外標的化療法における使用のために前臨床及び臨床評価中である。顕著なことに、これらのアプローチの大部分において利用される細胞傷害性ペイロードは、いずれも天然産物に由来し、作用モードにしたがって２つの群：１）抗有糸分裂性微小管結合剤、２）アルキル化又はインターカレーションによりＤＮＡ損傷を引き起こす剤に分類することができる。
【０００６】
すなわち、ＡＤＣにおいて使用されるペイロード（又は毒素）としては、ジフテリア毒素（Levy et al. (1975) Cancer Res. 35(5):1182-6）のような細菌毒素、リシン（ｒｉｃｉｎ）のような植物毒素、メイタンシノイド（欧州特許出願公開第１３９１２１３号明細書；Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623）、カリケアマイシン（Lode et al. (1998) Cancer Res. 58:2925-2928;Upeslacis et al., (1993) Cancer Res. 53, 3336-3342）、アウリスタチン（Sanderson et al. (2005) Clin. Cancer Res. 11:843-52）、ＳＮ−３８若しくはイリノテカンアナログ（Govidan et al. (2013) Mol. Cancer. Ther. 12:968-78、米国特許出願公開第２０１４／０２２７１８０Ａ１号明細書、Goldenberg et al. (2007), Clin. Cancer Res. 13, 5556s-5563s）、ピロロベンゾジアゼピン（米国特許出願公開第２０１１／０２５６１５７Ａ１号明細書、Kung Sutherland et al. Blood (2013) 122:1455-1463、Chari et al., (2009) Mol. Cancer Ther. 8, B126.）又はクリプトフィシン（ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｃｉｎｅｓ）（国際公開第２０１１／００１０５２Ａ１号パンフレット、Verma et al. (2015) Bioorg. Med. Chem. Lett. 25:864-8、米国特許出願公開第２０１２／０２２５０８９号明細書）のような小分子毒素が挙げられる。現在、現行で臨床評価されている全てのＡＤＣのうちの６０％より多くは、モノメチルアウリスタチンＥ及びＦ（ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦチューブリン阻害剤）に関する毒素を有する。ＭＭＡＥは、比較のための標準的なペイロードであると当業者は考えることができるであろう。
【０００７】
直接的又はリンカーを介したＣＴＢＭへの薬物の共役は様々な要因の考慮を伴い、該要因としては、薬物の共役のための化学基の素性及び位置、薬物放出の機序、薬物放出を提供する構造要素、並びに放出される遊離薬物への構造的修飾が挙げられる。加えて、薬物が抗体内部移行後に放出されるべき場合、薬物放出の機序は、コンジュゲートの細胞内トラフィッキングと調和しなければならない。したがって、多数の異なる薬物クラスがペイロードとして試みられてきたが、限られた有効性、選択性及び／又は安定性のため、抗体薬物コンジュゲートとして有効であると証明されたものはわずかな薬物クラスのみである（Tolcher et al. (2000) J Clin. Oncol. 18:4000、Laguzza et al (1989) J. Med. Chem. 32:548-555, Uadia P, (1984). Cancer Res. 44:4263-4266）。コンジュゲートとして適格であることに成功するためには、化合物はナノモル濃度より低いＩＣ50レベルで細胞傷害性のレベルを示すべきであることが判明している。（Casi and Neri, (2012) J. Control Release. 20;161(2):422-8.; Wu and Senter (2005) Nat. Biotechnol. 23(9):1137-46）。理想的なペイロードは多剤耐性機構（ＭＤＲ）を回避するべきである。ＭＤＲにさらされるＭＭＡＥの場合、一部の腫瘍は抵抗の機構を発生させることがある（Chen et al., 2015）。したがって、利用しやすい少数のペイロードは、広範ながん適応症に対して効果的でない。
【０００８】
このように、最初のＥＤＣの開発はがん療法のマイルストーンであったが、がんは極めて複雑な疾患であり、数多くの異なる起源の他に、様々なヒト組織における出現の形態を有し、遺伝学的にいずれの２つの腫瘍も同じでない。腫瘍のこの高い不均質性は多くの場合に、化学療法治療の推定上の成功の後にがんの再発を引き起こす［１３、３０〜３２］。さらには、確立された化学療法薬に応答しない腫瘍及び多剤耐性腫瘍は、依然としてがん療法における大問題である［３３、３４］。現行のＥＤＣの大部分は細胞傷害性の作用モードとしてチューブリン結合に依拠するので、未だ充分に治療できない特定のがん表現型に対処するためのＥＤＣの開発のための新たな作用モードを有する細胞傷害性ペイロードを研究する必要性が存在する。
【０００９】
ラトジャドンＡは、粘液細菌Ｓｏｒａｎｇｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍの培養物から単離された、ポリケチド天然産物ラトジャドン（図１を参照）の小クラスの最も豊富に存在するメンバーである［３５〜３７］。ラトジャドンは、いくつものがん細胞株の増殖阻害についてナノモル濃度未満のＩＣ50値を示す高度に強力な抗増殖剤であることが発見された［３７］。
【００１０】
ラトジャドンの抗増殖活性は、いくつものタンパク質の他にｍＲＮＡの細胞質への核外輸送に関与する進化的に高度に保存されたタンパク質であるＣｒｍ１の共有結合阻害に基づく［３７〜３９］。
【００１１】
核内輸送と核外輸送との関係は高い代謝に起因してがん細胞においてより高い核外輸送に有意に傾いていることが実証されている［４０］ことを考慮すると、また、Ｃｒｍ１の不活性化は、中心的細胞機能の大きな阻害［４１］、他の薬物へのがん細胞の感作［４２、４３］、そして細胞死に繋がるので、ラトジャドンは、これまで研究されていない作用モードを有する標的化された抗がん薬物の開発のために非常に興味深いものである。
【００１２】
ラトジャドンＡのいくつもの誘導体がKalesse及び共同研究者らによりｄｅ  ｎｏｖｏの全合成を通じて合成されており［４４、４５］、強力な細胞増殖阻害剤であると主張されている。しかしながら、Kalesse及び共同研究者らの全ての誘導体は、キャリア分子への選択的な共役のための適切な機能を欠いており、したがって、ＥＤＣの開発及び構築のために利用できず、このことが、このグループにより出願された全ての特許出願［４６〜４８］がやがて放棄又は取下げをされているようである理由を説明し得る。
【００１３】
加えて、構造的に関連する天然産物（図１を参照）であって、同じ機序によりＣｒｍ１を阻害するレプトマイシンＢのいくつもの誘導体［３９］がSanofi-Aventisの研究者らにより合成され、特許付与されている［４９〜５３］。これらの誘導体は、抗体−レプトマイシンコンジュゲートにおける細胞傷害性ペイロードとして使用されている［５１〜５３］。さらに、レプトマイシンＢのいくつもの誘導体がKosan Biosciencesの研究者らにより合成され、特許付与されている［５４］。これらの誘導体は、抗体−レプトマイシンコンジュゲートにおける細胞傷害性ペイロードとして使用されている［５５］。しかしながら、対応するＡＤＣは、いくつもの全身性の遅発性毒性を示した。レプトマイシンＢはラトジャドンＡに構造的に密接に関連するので、当業者は、ラトジャドン誘導体についても同様にそのような全身性の毒性を予期する可能性がある。
【００１４】
結論として、区別される作用モード、向上した選択性及び毒性プロファイル、並びにキャリア分子への選択的な共役のための適切な機能を有する新たなペイロードに対する臨床的な需要が依然として存在する。これら及び他の事項が本発明により対処される。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記の問題を解決するための重点的な研究の結果として、本発明者らは、がんに対する向上した有効性及び適切な効率的な共役を可能とする構造を有するラトジャドンＡの誘導体を発見した。このアプローチは、先行技術によりこれまで教示も示唆もされていない。
【００１６】
したがって、第１の態様では、本発明は、式Ｉ：
【化１】
2020529457.tif 000003
の化合物であって、
Ｒ1及びＲ2のうちの１つがＮＨＲ9であり、かつ、１つがＨ及びＯＨから選択され；
Ｒ3、Ｒ4及びＲ5が、Ｈ、ＣＨ3及びＣ2Ｈ5からなる群から互いに独立して選択され；
Ｒ6がＣＨ3又はＣ2Ｈ5であり；
Ｒ7及びＲ8が、Ｈ、ＣＨ3、Ｃ2Ｈ5、ｎ−Ｃ3Ｈ7、
【化２】
2020529457.tif 000004
からなる群から互いに独立して選択され；かつ
Ｒ9がＨである、
化合物に関する。
【００１７】
第２の態様では、本発明は、式Ｉの化合物であって、
Ｒ1〜Ｒ8が上記に定義される通りであり；かつ
Ｒ9がＬ−ＲＭ＊であり、Ｌがリンカー、特に自壊性リンカーであり、ＲＭ＊がＲＭ及びＲＭ’から選択され、ＲＭが、標的化部分、特に標的結合性抗体又はその機能的断片と共有結合を形成することができる反応性部分であり、かつ、ＲＭ’が、保護基を有する部分ＲＭである、
化合物に関する。
【００１８】
第３の態様では、本発明は、式Ｉの化合物であって、
Ｒ1〜Ｒ8が上記に定義される通りであり；かつ
Ｒ9がＬ−ＴＭであり、Ｌがリンカー、特に自壊性リンカーであり、かつ、ＴＭが標的化部分である、
化合物に関する。
【００１９】
第４の態様では、本発明は、本発明の毒性化合物−リンカー−反応性部分化合物を合成する方法であって、本発明の遊離の毒性化合物をアミノ基Ｒ1又はＲ2を介して化合物Ｘ−Ｌ’−ＲＭ＊と反応させるステップを含み、
Ｘが、（ｉ）アミンと反応することができる、又は（ｉｉ）アミンにより置換されることができる基であり；かつ
Ｌ’がリンカーであり；
部分Ｘ−Ｌ’との前記アミノ基の反応が部分−ＮＨ−Ｌ−ＲＭ＊の形成を結果としてもたらす、
方法に関する。
【００２０】
第５の態様では、本発明は、本発明の毒性化合物−リンカー−標的化部分化合物を合成する方法であって、本発明の毒性化合物−リンカー−反応性部分化合物を標的化部分と反応させるステップを含む、方法に関する。
【００２１】
第６の態様では、本発明は、本発明の毒性化合物−リンカー−標的化部分化合物又は本発明にしたがって合成される毒性化合物−リンカー−標的化部分化合物を含む医薬組成物に関する。
【００２２】
第７の態様では、本発明は、がんの治療において使用するための本発明の医薬組成物に関する。
【００２３】
第８の態様では、本発明は、がんの治療方法であって、本発明の毒性化合物−リンカー−標的化部分化合物又は本発明の医薬組成物をそのような治療を必要とする患者に投与するステップを含む、方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、ラトジャドン（ラトジャドンＡ：Ｒ1＝ＯＨ、Ｒ2＝ＣＨ3、Ｒ3＝ＣＨ3；ラトジャドンＢ：Ｒ1＝ＯＨ、Ｒ2＝Ｈ、Ｒ3＝ＣＨ3；ラトジャドンＣ：Ｒ1＝ＯＨ、Ｒ2＝Ｈ、Ｒ3＝ＣＨ2−ＣＨ3；ラトジャドンＤ：Ｒ1＝Ｈ、Ｒ2＝Ｈ、Ｒ3＝ＣＨ2−ＣＨ3）及び同じ構造種の他のＣＲＭ１阻害剤（カリースタチン（Ｃａｌｌｙｓｔａｔｉｎｅ）、レプトマイシンＢ、アンギノマイシンＡ）の構造を示す。
【００２５】
【図２】図２は、葉酸−ラトジャドンコンジュゲートの設計を示す。
【００２６】
【図３】図３は、モッシャー（Ｍｏｓｈｅｒ）アミド１８を介した１６−アミノ−ラトジャドンについてのＣ１６における絶対立体配置の決定を示す。
【００２７】
【図４】図４は、エクスポート阻害能力を決定するアッセイの結果を示す。
【図５】図５は、エクスポート阻害能力を決定するアッセイの結果を示す。
【００２８】
【図６−１】図６−１は、フローサイトメトリー実験の結果を示す。左欄：ドットプロットで示す、異なる葉酸−フルオレセインコンジュゲート（ＡＲ２８０＝ＦＡ−１ａ−ＦＩＴＣ、ＡＲ２８５＝ＦＡ−１０ｂ−ＦＩＴＣ、ＡＲ２８６＝ＦＡ−３ａ−ＦＩＴＣ、ＡＲ２８７＝ＦＡ−６ｂ−ＦＩＴＣ、ＡＲ２８８＝ＦＡ−３ｂ−ＦＩＴＣ、ＡＲ２８９＝ＦＡ−４ａ−（ＦＩＴＣ）２）で標識したＫＢ３．１細胞のフローサイトメトリー、（ＳＳＣ＝側方散乱、ＦＳＣ＝前方散乱）、右欄：細胞数当たりの蛍光強度。
【図６−２】図６−２は、フローサイトメトリー実験の結果を示す。左欄：ドットプロットで示す、異なる葉酸−フルオレセインコンジュゲート（ＡＲ２８０＝ＦＡ−１ａ−ＦＩＴＣ、ＡＲ２８５＝ＦＡ−１０ｂ−ＦＩＴＣ、ＡＲ２８６＝ＦＡ−３ａ−ＦＩＴＣ、ＡＲ２８７＝ＦＡ−６ｂ−ＦＩＴＣ、ＡＲ２８８＝ＦＡ−３ｂ−ＦＩＴＣ、ＡＲ２８９＝ＦＡ−４ａ−（ＦＩＴＣ）２）で標識したＫＢ３．１細胞のフローサイトメトリー、（ＳＳＣ＝側方散乱、ＦＳＣ＝前方散乱）、右欄：細胞数当たりの蛍光強度。
【００２９】
【図７】図７は、細胞数当たりの蛍光強度の棒グラフを示す（ＡＲ２８０＝ＦＡ−１ａ−ＦＩＴＣ、ＡＲ２８５＝ＦＡ−１０ｂ−ＦＩＴＣ、ＡＲ２８６＝ＦＡ−３ａ−ＦＩＴＣ、ＡＲ２８７＝ＦＡ−６ｂ−ＦＩＴＣ、ＡＲ２８８＝ＦＡ−３ｂ−ＦＩＴＣ、ＡＲ２８９＝ＦＡ−４ａ−（ＦＩＴＣ）2）。
【００３０】
【図８】図８は、２つの異なる時点における１０％の葉酸含有ＦＣＳを含む葉酸フリーＲＰＭＩ培地中の１μＭの異なる葉酸−フルオレセインコンジュゲートで処理したＫＢ３．１細胞の細胞イメージングの結果を示す（ＡＲ２８０＝ＦＡ−１ａ−ＦＩＴＣ、ＡＲ２８５＝ＦＡ−１０ｂ−ＦＩＴＣ、ＡＲ２８６＝ＦＡ−３ａ−ＦＩＴＣ、ＡＲ２８７＝ＦＡ−６ｂ−ＦＩＴＣ、ＡＲ２８８＝ＦＡ−３ｂ−ＦＩＴＣ、ＡＲ２８９＝ＦＡ−４ａ−（ＦＩＴＣ）2）。
【００３１】
【図９】図９は、異なる時点における異なる培地中の１μＭのＦＡ−１ａ−ＦＩＴＣ（ＡＲ２８０）で処理したＫＢ３．１細胞の細胞イメージングの結果を示す。ＲＰＭＩ＋／＋＝１０％の葉酸含有ＦＣＳを含む葉酸含有ＲＰＭＩ培地、ＲＰＭＩ＋／−＝１０％の透析した葉酸フリーＦＣＳを含む葉酸含有ＲＰＭＩ培地、ＲＰＭＩ−／＋＝１０％の葉酸含有ＦＣＳを含む葉酸フリーＲＰＭＩ培地、ＲＰＭＩ−／−＝１０％の透析した葉酸フリーＦＣＳを含む葉酸フリーＲＰＭＩ培地。
【００３２】
【図１０】図１０は、１０％の葉酸含有ＦＣＳを含む葉酸フリーＲＰＭＩ培地中の８．６μＭのＦＡ−１ａ−ＦＩＴＣ（ＡＲ２８０）で処理したＡ５４９細胞及び葉酸の存在及び非存在下でのＫＢ３．１細胞の細胞イメージングの結果を示す。
【００３３】
【図１１】図１１は、α−ストレプトアビジンプルダウン実験のゲルを示す。ビオチン−ＰＥＧ3−１６Ｓ−アミノラトジャドンの溶出液中のタンパク質バンドの同定。
【００３４】
【図１２】図１２は、標的同定のためのＬＣ−ＭＳプロテオームアプローチの結果を示す。
【００３５】
【図１３】図１３は、血漿安定性アッセイの結果を示す。
【図１４】図１４は、血漿安定性アッセイの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本発明を以下に詳細に記載する前に、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコール及び試薬は異なってもよいので、本発明はこれらに限定されないことが理解されるべきである。本明細書において使用される学術用語は、特定の実施形態を記載する目的のためのものに過ぎず、本発明の範囲を限定することは意図されず、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解されるべきである。別段の定義がなければ、本明細書において使用される全ての科学技術用語は、当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。
【００３７】
特に、本明細書において使用される用語は、「A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)」、Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. and Kolbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland）に記載されるように定義される。
【００３８】
本明細書及びそれに続く特許請求の範囲の全体を通じて、そうでないことを文脈が必要としなければ、「含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）並びに「含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）及び「含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）のような変形の語は、記載される整数、組成物又はステップ又は整数若しくはステップの群を含めることを含意し、任意の追加の整数、組成物又はステップ又は整数、組成物若しくはステップの群もまた任意選択で存在してもよく、これには、追加の整数、組成物又はステップ又は整数、組成物若しくはステップの群が存在しない実施形態が含まれることが理解される。そのような後者の実施形態では、「含む」という用語は、「からなる」と完全に重なり合うように使用される。
【００３９】
いくつもの文献が本明細書のテキストの全体を通じて参照される。本明細書において参照される各文献（全ての特許、特許出願、科学刊行物、製造者の仕様書、説明書、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号配列提出物などを含む）は、上掲のものであれ下記で挙げるものであれ、各々の特許法の下で可能な程度まで、参照により全体が本明細書に援用される。
【００４０】
本発明をこれよりさらに記載する。以下の記載において、発明の異なる態様がより詳細に定義される。そのように定義される各態様は、明らかにそうでないことを指し示さない限り、任意の他の１つ又は複数の態様と組み合わせることができる。特に、特定の関連性又は有益性があるものとして指し示される任意の特徴は、特定の関連性又は有益性があるものとして指し示される任意の他の１つ又は複数の特徴と組み合わせることができる。
【００４１】
本発明は、異なる有利な要素及び特徴の組合せに基づき、特に、ラトジャドンのアミノ置換誘導体は特に安定であると同時に、標的細胞中で高度に毒性であるという予想外の観察に基づく。
【００４２】
したがって、第１の態様では、本発明は、式Ｉ：
【化３】
2020529457.tif 000005
の化合物であって、
Ｒ1及びＲ2のうちの１つがＮＨＲ9であり、かつ、１つがＨ及びＯＨから選択され；
Ｒ3、Ｒ4及びＲ5が、Ｈ、ＣＨ3及びＣ2Ｈ5からなる群から互いに独立して選択され；
Ｒ6がＣＨ3又はＣ2Ｈ5であり；
Ｒ7及びＲ8が、Ｈ、ＣＨ3、Ｃ2Ｈ5、ｎ−Ｃ3Ｈ7、
【化４】
2020529457.tif 000006
からなる群から互いに独立して選択され；かつ
Ｒ9がＨである、
化合物に関する。
【００４３】
我々は、例えば、発酵手順若しくは化学合成により製造されたラトジャドンＡ［４５；７２］、ラトジャドンＢ又はＣ［３７；７２］、又は報告された手順［４４〜４８］にしたがって合成されるこれらの誘導体から開始する、新規のアミノ置換ラトジャドン誘導体、特にラトジャドンＡ誘導体の半合成のための手順を開発し、細胞外標的化薬物コンジュゲートにおける細胞傷害性ペイロードとしてのそれらの使用を実証した。
【００４４】
第２の態様では、本発明は、式Ｉの化合物であって、
Ｒ1〜Ｒ8が上記に定義される通りであり；かつ
Ｒ9がＬ−ＲＭ＊であり、Ｌがリンカー、特に自壊性リンカーであり、ＲＭ＊がＲＭ及びＲＭ’から選択され、ＲＭが、標的化部分、特に標的結合性抗体又はその機能的断片と共有結合を形成することができる反応性部分であり、かつ、ＲＭ’が、保護基を有する部分ＲＭである、
化合物に関する。
【００４５】
ラトジャドンの合成される誘導体は、生物学的に活性のキャリア分子への生体直交性又は直交性の連結を可能とする、ケトン、アミノ基、末端アルキン、シクロオクチン部分又は反応性ジスルフィドのような異なるＲＭ機能性を示す。したがって、これらの化合物は、がんの標的化療法のための新たな作用モードを有する細胞傷害性ペイロードとしてラトジャドン誘導体を使用する細胞外標的化薬物コンジュゲートの開発及び構築を可能とする。
【００４６】
本発明の文脈において、「保護基」という用語は、ＲＭに存在する官能基が、式Ｉの化合物を合成及び／又はさらに機能化するために使用される他の反応物と反応することを遮断するために前記官能基に取り付けられる基を指す。当業者は、官能基を保護するために必要とされる時に対応する官能基に取り付けることができ、かつその後、そのような保護がもはや必要とされない時に切断除去することができる、当該技術分野において利用可能な異なる保護基に充分に精通している。ＲＭに存在する官能基がアミノ基である特定の実施形態では、そのアミノ基は、Ｎ−アシル化試薬を使用することによりＮ保護されてもよい。したがって、そのような実施形態では、ＲＭ’は、保護基としてＮ−アシル基を有するアミノ基含有部分ＲＭである。特定の他の実施形態では、Ｎ保護にはＮ−アルキル化試薬が使用される。したがって、そのような実施形態では、ＲＭ’は、保護基としてＮ−アルキル基を有するアミノ基含有部分ＲＭである。
【００４７】
第３の態様では、本発明は、式Ｉの化合物であって、
Ｒ1〜Ｒ8が上記に定義される通りであり；かつ
Ｒ9がＬ−ＴＭであり、Ｌがリンカー、特に自壊性リンカーであり、かつ、ＴＭが標的化部分である、
化合物に関する。
【００４８】
葉酸−ラトジャドンコンジュゲート並びにキャリアペプチド−ホルモンゴナドリベリン及びゴセレリン（ｇｏｓｅｒｅｌｌｉｎ）の新規の誘導体とのラトジャドンのコンジュゲートの合成により細胞外標的化薬物コンジュゲートを開発及び構築するためのこの能力を我々は実証した（図２を参照）。同様に、これらの誘導体は、抗体−、プロボディ−又はナノボディ−ラトジャドンコンジュゲートにおいて使用することができる。
【００４９】
これらの最初の３態様の特定の実施形態では、Ｒ1及びＲ2のうちの１つはＮＨＲ9であり、かつ、１つはＯＨである。
【００５０】
特定の実施形態では、Ｒ1はＯＨであり、かつ、Ｒ2はＮＨＲ9である。
【００５１】
特定のそのような実施形態では、Ｒ2は１６Ｒ−ＮＨＲ9である。
【００５２】
他のそのような実施形態では、Ｒ2は１６Ｓ−ＮＨＲ9である。
【００５３】
特定の他の実施形態では、Ｒ1はＮＨＲ9であり、かつ、Ｒ2はＯＨである。
【００５４】
「標的化部分」（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｍｏｉｅｔｙ）又は「標的結合部分」という用語は、本明細書において使用される場合、標的分子又は標的エピトープに特異的に結合することができる任意の分子又は分子の部分を指す。本出願の文脈における好ましい標的結合部分は、（ｉ）抗体又はその抗原結合断片；（ｉｉ）抗体様タンパク質；及び（ｉｉｉ）核酸アプタマーである。本発明において使用するために好適な「標的結合部分」は、典型的に、４００００Ｄａ（４０ｋＤａ）又はより大きい分子量を有する。
【００５５】
本明細書において使用される場合、第１の化合物（例えば、抗体）は、該化合物が、１００μＭ又はそれ未満、特に５０μＭ又はそれ未満、特に３０μＭ又はそれ未満、特に２０μＭ又はそれ未満、特に１０μＭ又はそれ未満、特に５μＭ又はそれ未満、より特には１μＭ又はそれ未満、より特には９００ｎＭ又はそれ未満、より特には８００ｎＭ又はそれ未満、より特には７００ｎＭ又はそれ未満、より特には６００ｎＭ又はそれ未満、より特には５００ｎＭ又はそれ未満、より特には４００ｎＭ又はそれ未満、より特には３００ｎＭ又はそれ未満、より特には２００ｎＭ又はそれ未満、よりいっそう特には１００ｎＭ又はそれ未満、よりいっそう特には９０ｎＭ又はそれ未満、よりいっそう特には８０ｎＭ又はそれ未満、よりいっそう特には７０ｎＭ又はそれ未満、よりいっそう特には６０ｎＭ又はそれ未満、よりいっそう特には５０ｎＭ又はそれ未満、よりいっそう特には４０ｎＭ又はそれ未満、よりいっそう特には３０ｎＭ又はそれ未満、よりいっそう特には２０ｎＭ又はそれ未満、及びよりいっそう特には１０ｎＭ又はそれ未満の第２の化合物（例えば、標的タンパク質のような抗原）への解離定数ＫＤを有する場合に、前記第２の化合物に「特異的に結合する」と考えられる。
【００５６】
本出願の文脈において、「標的分子」及び「標的エピトープ」という用語はそれぞれ、標的結合部分が特異的に結合するそれぞれ抗原及び抗原のエピトープを指す。特に、標的分子は、腫瘍関連抗原、特に、非腫瘍細胞の表面と比較して増加した濃度及び／又は異なる立体配置で１つ又は複数の腫瘍細胞種の表面上に存在する抗原又はエピトープである。特に、前記抗原又はエピトープは、１つ又は複数の腫瘍細胞種の表面上に存在するが、非腫瘍細胞の表面上に存在しない。
【００５７】
「抗体又はその抗原結合断片」という用語は、本明細書において使用される場合、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分、すなわち、抗原に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子を指す。したがって、「その抗原結合断片」という用語は、少なくとも機能的な抗原結合ドメインを含む抗体の断片を指す。例えば、標的分子に特異的に結合するファージディスプレイなどの技術を通じて選択される免疫グロブリン様タンパク質も含まれる。本発明の免疫グロブリン分子は、任意の種類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラスの免疫グロブリン分子であってもよい。本発明において使用するために好適な「抗体及びその抗原結合断片」としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、一価抗体、二重特異的抗体、ヘテロコンジュゲート抗体、多重特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体（特に、ＣＤＲグラフト抗体）、脱免疫化抗体、又はキメラ抗体、単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ発現ライブラリーにより製造される断片、ダイアボディ又はテトラボディ（Holliger P. et al., Proc Natl Acad Sci USA. 90 (1993) 6444-8）、ナノボディ、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）、及び上記のいずれかのエピトープ結合断片が挙げられるがこれらに限定されない。
【００５８】
一部の実施形態では、抗原結合断片は、本発明のヒト抗原結合抗体断片であり、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｄｓＦｖ）及びＶＬ又はＶＨドメインのいずれかを含む断片が挙げられるがこれらに限定されない。単鎖抗体などの抗原結合抗体断片は、単独で又は以下：ヒンジ領域、ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインの全体若しくは部分と組み合わせて（１つ又は複数の）可変ドメインを含んでもよい。ヒンジ領域、ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインとの（１つ又は複数の）可変ドメインの任意の組合せも含む抗原結合断片もまた本発明に含まれる。
【００５９】
本発明において使用可能な抗体は、鳥及び哺乳動物などの任意の動物起源のものであってもよい。特に、抗体は、ヒト、齧歯動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、又はウサギ）、ニワトリ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ウシ、ウマ、ロバ、ネコ、又はイヌ起源のものである。抗体はヒト又はマウス起源のものであることが特に好ましい。本明細書において使用される場合、「ヒト抗体」としては、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体が挙げられ、ヒト免疫グロブリンライブラリーから単離される抗体、又は例えばKucherlapati & Jakobovitsにより米国特許第５，９３９，５９８号明細書に記載されるように、１つ若しくは複数のヒト免疫グロブリンについての動物トランスジェニックから単離され、内因性免疫グロブリンを発現しない抗体が挙げられる。
【００６０】
「抗体様タンパク質」という用語は、標的分子に特異的に結合するように（例えば、ループの突然変異生成により）操作されているタンパク質を指す。典型的に、そのような抗体様タンパク質は、タンパク質スキャフォールドに両末端において取り付けられる少なくとも１つの可変ペプチドループを含む。この二重の構造的制約は、抗体と同等のレベルまで抗体様タンパク質の結合親和性を大きく増加させる。可変ペプチドループの長さは、典型的に、１０〜２０アミノ酸からなる。スキャフォールドタンパク質は、良好な溶解特性を有する任意のタンパク質であってもよい。特に、スキャフォールドタンパク質は小さい球状タンパク質である。抗体様タンパク質としては、アフィボディ、アンチカリン、及び設計されたアンキリンリピートタンパク質が挙げられるがこれらに限定されない（総説についてBinz et al. (2005) Nat Biotechnol, 1257-68を参照）。抗体様タンパク質は突然変異体の大きいライブラリーに由来することができ、例えば、大きいファージディスプレイライブラリーからパニングすることができ、通常の抗体と同様に単離することができる。また、抗体様結合タンパク質は、球状タンパク質において表面に露出される残基のコンビナトリアル突然変異生成により得ることができる。
【００６１】
「核酸アプタマー」という用語は、標的分子への結合についての反復ラウンドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択又はＳＥＬＥＸ（ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ；指数関数的濃縮によるリガンドの体系的進化）を通じて操作された核酸分子を指す（総説についてBinz et al. (2005) Nat Biotechnol, 1257-68を参照）。核酸アプタマーはＤＮＡ又はＲＮＡ分子であってもよい。アプタマーは、修飾、例えば、２’−フッ素置換ピリミジンのような修飾ヌクレオチドを含有してもよい。
【００６２】
本発明の文脈における「リンカー」は、２つの成分を、それぞれをリンカーの１つの末端に取り付けて接続する構造物を指す。リンカーが結合である場合、抗体への毒性化合物の直接的な連結は、毒性化合物が細胞内でその分子標的と相互作用する能力を減少させることがある。特定の実施形態では、リンカーは、本発明の場合には抗体と毒性化合物との間のように、２成分間の距離を増加させ、これらの成分間の立体障害を軽減する。特定の実施形態では、リンカーは、その骨格中に１〜３０個の原子（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個の原子）の連続的な鎖を有し、すなわち、リンカーの長さは、毒性化合物部分と抗体との間の原子又は結合の数により測定される最短の接続として定義され、リンカー骨格の片側は毒性化合物と反応しており、他の側は抗体との反応のために利用可能であるか、又は反応している。本発明の文脈において、リンカーは、特に、任意選択で置換されている、Ｃ1~20−アルキレン、Ｃ1~20−ヘテロアルキレン、Ｃ2~20−アルケニレン、Ｃ2~20−ヘテロアルケニレン、Ｃ2~20−アルキニレン、Ｃ2~20−ヘテロアルキニレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、アラルキレン、又はヘテロアラルキレン基である。リンカーは、カルボキサミド、エステル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、尿素、チオ尿素、炭化水素部分及び同種のもののような１つ又は複数の構造要素を含有してもよい。リンカーはまた、これらの構造要素のうちの２つ又はそれより多くの組合せを含有してもよい。これらの構造要素のそれぞれは、１回より多く、例えば、２回、３回、４回、５回、又は６回、リンカーに存在してもよい。一部の実施形態では、リンカーはジスルフィド結合を含んでもよい。リンカーは、単一のステップ又は２つ若しくはそれより多くのその後のステップのいずれかにおいて毒性化合物及び抗体に取り付けられる必要があることが理解される。そのために、リンカーは、特に近位及び遠位末端において、２つの基を有し、これらの基は、（ｉ）連結される成分の１つに存在する基、特に、毒性化合物若しくは標的結合ペプチド上の活性化された基と共有結合を形成することができ、又は（ｉｉ）活性化されており若しくは活性化されることができ、それにより毒性化合物上の基と共有結合を形成する。したがって、化学基は、リンカーの遠位及び近位末端にあることが好ましく、これは、例えば、エステル、エーテル、ウレタン、ペプチド結合などのような連結反応の結果である。
【００６３】
特定の実施形態では、リンカーＬは、Ｃ、Ｏ、Ｎ及びＳから独立して選択される１〜２０個の原子、特に２〜１８個の原子、より特には５〜１６個の原子、よりいっそう特には６〜１５個の原子の直鎖状の鎖である。特定の実施形態では、直鎖状の鎖中の原子の少なくとも６０％はＣ原子である。特定の実施形態では、直鎖状の鎖中の原子は単結合により連結されている。
【００６４】
特定の実施形態では、リンカーＬは、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を含む、アルキレン、ヘテロアルキレン、アルケニレン、ヘテロアルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキニレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、アラルキレン、又はヘテロアラルキレン基であり、前記リンカーは任意選択で置換されている。
【００６５】
「アルキレン」という用語は、１〜２０個の炭素原子を有する二価の直鎖飽和炭化水素基、例えば、１〜１０個の炭素原子を有する基を指す。ある特定の実施形態では、アルキレン基は低級アルキレン基であってもよい。「低級アルキレン」という用語は、１〜６個の炭素原子、及びある特定の実施形態では、１〜５個又は１〜４個の炭素原子を有するアルキレン基を指す。アルキレン基の例としては、メチレン（−ＣＨ2−）、エチレン（−ＣＨ2−ＣＨ2−）、ｎ−プロピレン、ｎ−ブチレン、ｎ−ペンチレン、及びｎ−ヘキシレンが挙げられるがこれらに限定されない。
【００６６】
「アルケニレン」という用語は、２〜２０個の炭素原子を有する二価の直鎖基であって、炭素−炭素結合の少なくとも１つが二重結合であり、他の結合は単結合又はさらなる二重結合であってもよいものを指す。本明細書において「アルキニレン」という用語は、２〜２０個の炭素原子を有する基であって、炭素−炭素結合の少なくとも１つが三重結合であり、他の結合が、単結合、二重結合又はさらなる三重結合であってもよいものを指す。アルケニレン基の例としては、エテニレン（−ＣＨ＝ＣＨ−）、１−プロペニレン、２−プロペニレン、１−ブテニレン、２−ブテニレン、３−ブテニレン及び同種のものが挙げられる。アルキニレン基の例としては、エチニレン、１−プロピニレン、及び２−プロピニレンなどが挙げられる。
【００６７】
本明細書において使用される場合、「シクロアルキレン」は、任意の安定な単環系又は多環系の部分である二価の環であって、そのような環が３〜１２個の炭素原子を有するがヘテロ原子を有さず、かつ、そのような環が完全に飽和しているものを指すことが意図され、「シクロアルケニレン」という用語は、任意の安定な単環系又は多環系の部分である二価の環であって、そのような環が３〜１２個の炭素原子を有するがヘテロ原子を有さず、かつ、そのような環が少なくとも部分的に不飽和である（但し、任意のアリーレン環を除く）ものを指すことが意図される。シクロアルキレンの例としては、シクロプロピレン、シクロブチレン、シクロペンチレン、シクロヘキシレン、及びシクロへプチレンが挙げられるがこれらに限定されない。シクロアルケニレンの例としては、シクロペンテニレン及びシクロヘキセニレンが挙げられるがこれらに限定されない。
【００６８】
本明細書において使用される場合、「ヘテロシクロアルキレン」及び「ヘテロシクロアルケニレン」という用語は、任意の安定な単環式又は多環式の環系の部分である二価の環であって、そのような環が３〜約１２個の原子を有し、かつ、そのような環が、炭素原子並びに少なくとも１つのヘテロ原子、特に、Ｎ、Ｏ及びＳからなる群から独立して選択される少なくとも１つのヘテロ原子からなるものを指すことが意図され、ヘテロシクロアルキレンは、完全に飽和したそのような環を指し、ヘテロシクロアルケニレンは、少なくとも部分的に不飽和の環（但し、任意のアリーレン又はヘテロアリーレン環を除く）を指す。
【００６９】
「アリーレン」という用語は、任意の安定な単環系又は多環系の部分である二価の環又は環系であって、そのような環又は環系が３〜２０個の炭素原子を有するがヘテロ原子を有さず、環又は環系が、「４ｎ＋２」π電子則により定義される芳香族部分からなるものを意味することが意図され、例えばフェニレンである。
【００７０】
本明細書において使用される場合、「ヘテロアリーレン」という用語は、任意の安定な単環系又は多環系の部分である二価の環又は環系であって、そのような環又は環系が３〜２０個の原子を有し、環又は環系が、「４ｎ＋２」π電子則により定義される芳香族部分からなり、かつ炭素原子並びに１つ又は複数の窒素、硫黄、及び／又は酸素ヘテロ原子を含有するものを指す。
【００７１】
本発明の文脈において、「置換されている」という用語は、リンカーの骨格に存在する１つ又は複数の水素が、（１つ又は複数の）指し示される基から選択されるもので置換されており、但し、指し示される原子の通常の価数、又は置換される基の適切な原子の通常の価数を超えておらず、かつ、置換が安定な化合物を結果としてもたらすことを指し示すことが意図される。「任意選択で置換されている」という用語は、リンカーが、非置換であるか、又は、本明細書において定義されるような１つ又は複数の置換基で、本明細書において定義されるように置換されていることを意味することが意図される。置換基がケト（又はオキソ、すなわち、＝Ｏ）基である場合、リンカー骨格原子上のチオ又はイミノ基又は同種のもの、次に２つの水素が置換されている。例示的な置換基としては、例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、ヘテロアラルキル、アシル、アロイル、ヘテロアロイル、カルボキシル、アルコキシ、アリールオキシ、アシルオキシ、アロイルオキシ、ヘテロアロイルオキシ、アルコキシカルボニル、ハロゲン、（チオ）エステル、シアノ、ホスホリル、アミノ、イミノ、（チオ）アミド、スルフヒドリル、アルキルチオ、アシルチオ、スルホニル、スルフェート、スルホネート、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、アジド、ハロアルキル、例えば、ペルフルオロアルキル（例えば、トリフルオロメチル）、ハロアルコキシ、アルキルスルファニル、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルスルホニルアミノ、アリールスルホンアミノ（ａｒｙｌｓｕｌｆｏｎｏａｍｉｎｏ）、ホスホリル、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、アルキルカルボキシ、アルキルカルボキシアミド、オキソ、ヒドロキシ、メルカプト、アミノ（任意選択で、例えば、アルキル、アリール、又はヘテロアリールにより一又は二置換されている）、イミノ、カルボキサミド、カルバモイル（任意選択で、例えば、アルキル、アリール、又はヘテロアリールにより一又は二置換されている）、アミジノ、アミノスルホニル、アシルアミノ、アロイルアミノ、（チオ）ウレイド、（アリールチオ）ウレイド、アルキル（チオ）ウレイド、シクロアルキル（チオ）ウレイド、アリールオキシ、アラルコキシ、又は−Ｏ（ＣＨ2）n−ＯＨ、−Ｏ（ＣＨ2）n−ＮＨ2、−Ｏ（ＣＨ2）nＣＯＯＨ、−（ＣＨ2）nＣＯＯＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（ＣＨ2）nＲ、−（ＣＨ2）nＮ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、又は−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）2Ｒが挙げられ、ｎは１〜４から選択される整数であり、Ｒは、水素、−アルキル、−アルケニル、−アルキニル、−シクロアルキル、−シクロアルケニル、−（Ｃ連結ヘテロシクロアルキル）、−（Ｃ連結ヘテロシクロアルケニル）、−アリール、及び−ヘテロアリールから独立して選択され、複数の置換度が可能である。ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルキルなどのような置換基、又は−ＯＨ、−ＮＨＲなどのような官能基は、適切な場合、それ自体が置換されていてもよいことが当業者により理解されるであろう。適切な場合、置換される部分自体もまた、置換されていてもよいことも当業者に���り理解されるであろう。
【００７２】
特定の実施形態では、リンカーＬは、以下の部分：ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）、エーテル（−Ｏ−）、チオエーテル（−Ｓ−）、アミン（−ＮＨ−）、エステル（−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−又は−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−）、カルボキサミド（−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−又は−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）、ウレタン（−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−又は−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）、及び尿素部分（−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）のうちの１つから選択される部分を含む。
【００７３】
本発明の特定の実施形態では、リンカーＬは、リスト：アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、シクロアルキレン、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニレン、ヘテロアルキニレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、アラルキレン、及びヘテロアラルキレン基から選択されるｍ個の基を含み、各基は、任意選択で独立して置換されていてもよく、リンカーは、以下の部分：ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）、エーテル（−Ｏ−）、チオエーテル（−Ｓ−）、アミン（−ＮＨ−）、エステル（−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−又は−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−）、カルボキサミド（−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−又は−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）、ウレタン（−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−又は−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）、及び尿素部分（−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）のうちの１つから独立して選択されるｎ個の部分をさらに含み、ｍ＝ｎ＋１である。特定の実施形態では、ｍは２であり、かつｎは１であるか、又は、ｍは３であり、かつｎは２である。特定の実施形態では、リンカーは、２つ又は３つの非置換アルキレン基、及びそれぞれ１つ又は２つの、非置換アルキレン基を連結するジスルフィド、エーテル、チオエーテル、アミン、エステル、カルボキサミド、ウレタン又は尿素部分を含む。
【００７４】
特定の実施形態では、直鎖状の鎖中のＣ原子は、独立して、任意選択で置換されているメチレン基（−ＣＨ2−）の部分である。特定のそのような実施形態では、任意選択の置換基は、ハロゲン及びＣ1~6−アルキル、特にメチルから独立して選択される。
【００７５】
特定の実施形態では、リンカーＬは安定なリンカーである。
【００７６】
本発明の文脈において、「安定なリンカー」という用語は、（ｉ）酵素の存在下、及び（ｉｉ）細胞内の還元性環境において安定なリンカーを指す。
【００７７】
特定の実施形態では、安定なリンカーは、（ｉ）酵素切断可能な部分構造、及び／又は（ｉｉ）ジスルフィド基を含有しない。特定のそのような実施形態では、リンカーは、１２個までの原子、特に２〜１０個、より特には４〜９個、最も特には６〜８個の原子の長さを有する。
【００７８】
ある特定の実施形態では、リンカーは、切断可能なリンカーである。
【００７９】
本発明の文脈において、「切断可能なリンカー」という用語は、（ｉ）化学的切断により切断可能であるか、又は（ｉｉ）還元可能なリンカーであるリンカーを指す。
【００８０】
ある特定のそのような実施形態では、リンカーは、還元により切断可能である。本発明の文脈において、「還元により切断可能」という用語は、細胞内の還元性環境により内部移行後に標的結合部分に共役した毒素カーゴの細胞内放出を結果としてもたらす、細胞内の還元性環境中で切断できるリンカー、特に、ジスルフィド基を含有するリンカーを指す（Shen et al., (1985) J. Biol. Chem. 260:10905-10908を参照）。
【００８１】
ある特定のそのような実施形態では、リンカーは、ジスルフィド結合、特に−ＣＭｅ2−Ｓ−Ｓ−ＣＭｅ2−部分を含む。ある特定の他の実施形態では、リンカーは、ジスルフィド結合を介して標的化部分のチオール基に取り付けられる。
【００８２】
ある特定の他のそのような実施形態では、リンカーは、化学的切断により、特に、加水分解又はタンパク質加水分解により切断可能であり、特に、そのような化学的切断は酵素により触媒される。
【００８３】
本発明の文脈において、「化学的切断は酵素により触媒される」という用語は、酵素、特にカテプシンＢのようなリソソームペプチダーゼにより切断されて、内部移行後に標的化抗体に共役した毒素カーゴの細胞内放出を結果としてもたらすことができるリンカーを指す（Dubowchik et al., (2002) Bioconjug Chem. 13:855-69を参照）。特定の実施形態では、切断可能なリンカーは、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ｖａｌ−Ａｌａ、Ｐｈｅ−Ｃｉｔ及びＶａｌ−Ｃｉｔから選択されるジペプチド、特にＶａｌ−Ｃｉｔを含む。
【００８４】
ある特定のそのような実施形態では、リンカーはヒドラゾン基を含む。特定のそのような実施形態では、切断は、リソソーム中での加水分解により起こる。
【００８５】
ある特定の実施形態では、リンカーは自壊性リンカーである。
【００８６】
本発明の文脈において、「自壊性リンカー」という用語は、切断可能な結合を含むリンカーであって、切断後に断片化が起こり、断片化により、前記切断後に毒素に依然として取り付けられているリンカーの部分が除去されるものを指す。ある特定の実施形態では、リンカーは、−（切断可能な結合）−Ｘ−フェニル−ＣＨ2−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−の基を含み、カルボニル基が、本発明の化合物中のラトジャドン部分に取り付けられているアミノ基に取り付けられており、切断可能な結合の切断後に、遊離アミノ基−ＮＲ6Ｈ＝−ＮＨ2を有する本発明の化合物が放出される。特定のそのような実施形態では、自壊性リンカーは、切断可能なジペプチドと毒性ペイロードとの間のｐ−アミノベンジル（ＰＡＢ）スペーサーを含む。
【００８７】
特定のそのような実施形態では、切断可能なリンカーは、構造Ｌ1−Ｌ＊−Ｌ2を含み、Ｌ＊はｐ−アミノベンジルジペプチド部分であり、Ｌ1は、Ｌ＊を毒性ペイロードに接続するリンカーの部分であり、特に、Ｌ1は−ＮＨ−基を介してＬ＊に接続されており、かつ、Ｌ2は、Ｌ＊を標的結合部分に接続するリンカーの部分であり、特に、Ｌ2は−（ＣＨ2）m−部分（ｍは、１〜８、特に１〜５から選択される整数である。）を介して、又は−（ＣＨ2  ＣＨ2Ｏ）n−部分（ｎは、１〜３、特に１〜２から選択される整数である。）を介してＬ＊に接続されている。例えば、ジペプチドＶａｌ−Ａｌａを含む切断可能なリンカーの場合、Ｌ1−Ｌ＊−Ｌ2の構造は以下の通りである：
【化５】
2020529457.tif 000007
【００８８】
特定の他のそのような実施形態では、Ｌ＊はジペプチドＶａｌ−Ｌｙｓを含み、以下の構造：
【化６】
2020529457.tif 000008
を有する。
【００８９】
特定の実施形態では、リンカーＬ1は、Ｃ、Ｏ、Ｎ及びＳから独立して選択される１〜４個の原子、特に１〜３個の原子、より特には１〜２個の原子、よりいっそう特には１個のみの原子の直鎖状の鎖である。特定の実施形態では、直鎖状の鎖中の原子の少なくとも５０％はＣ原子である。特定の実施形態では、直鎖状の鎖中の原子は単結合により連結されている。
【００９０】
特定の実施形態では、Ｌ1は、本発明による毒性ペイロードの置換基Ｒ1又はＲ2の部分である−ＮＨ−基である。
【００９１】
第４の態様では、本発明は、本発明の毒性化合物−リンカー−反応性部分化合物を合成する方法であって、本発明による化合物をアミノ基Ｒ1又はＲ2を介して化合物Ｘ−Ｌ’−ＲＭ＊と反応させるステップを含み、
Ｘが、（ｉ）アミンと反応することができる、又は（ｉｉ）アミンにより置換されることができる基であり；かつ
Ｌ’がリンカーであり；
部分Ｘ−Ｌ’との前記アミノ基の反応が部分−ＮＨ−Ｌ−ＲＭ＊の形成を結果としてもたらす、
方法に関する。
【００９２】
ＲＭ＊がＲＭ’である特定の実施形態では、方法は、部分ＲＭ’を脱保護してＲＭを結果としてもたらすステップをさらに含む。
【００９３】
第５の態様では、本発明は、本発明の毒性化合物−リンカー−標的化部分化合物を合成する方法であって、本発明の毒性化合物−リンカー−反応性部分化合物を標的化部分と反応させるステップを含む、方法に関する。
【００９４】
式ＩのＲＭ＊がＲＭ’である特定の実施形態では、方法は、最初に部分ＲＭ’を脱保護してＲＭを結果としてもたらすステップをさらに含む。
【００９５】
標的化部分への共役は、標的化部分に存在する遊離アミノ基への毒素−Ｌ−ＲＭ構築物の連結を介して達成することができる。そのような場合、基ＲＭは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルのような活性化カルボン酸誘導体、又はイソチオシアネートのような活性化炭酸誘導体から選択することができる。
【００９６】
標的化部分への共役はさらに、標的化部分に存在する遊離チオール基への毒素−Ｌ−ＲＭ構築物の連結を介して達成することができる。そのような場合、基ＲＭは、ハロアセチル基；アクセプター置換アルケン（マイケル系）、特にマレイミド基又はプロペノイル基を含むＲＭ基（Badescu et al., (2014) Bioconjugate Chem. 25:460-469を参照）；脱離基Ｘにより３位で置換されているか又は３，４位で二置換されているマレイミド基、特に、Ｘが、Ｃｌ、Ｂｒ、及びアリール−Ｓ−から選択され、特にＰｈ−Ｓ−である該マレイミド基から選択することができる。
【００９７】
ある特定のそのような実施形態では、チオール基は、野生型標的化部分に存在する単一の、連結されていないシステイン残基の部分である。ある特定の他のそのような実施形態では、チオール基は、野生型標的化部分から生成された、特に組換え遺伝子操作により、例えば、野生型配列への挿入により、野生型標的化部分中の第１のシステイン残基とジスルフィド架橋を形成する第２のシステインを除去することにより、又は非システイン残基を置換することにより生成された、単一の、連結されていないシステイン残基の部分である。ある特定の他のそのような実施形態では、チオール基は、野生型標的化部分に存在する２つのシステインの間のジスルフィド結合の還元により生成される。
【００９８】
標的化部分への共役はさらに、標的化部分に存在する２つの遊離チオール基への毒素−Ｌ−ＲＭ構築物の連結を介して達成することができる。そのような場合、基ＲＭは、脱離基Ｘにより３，４位において二置換されているマレイミド基であってもよく、特に、Ｘが、Ｃｌ、Ｂｒ、及びアリール−Ｓ−から選択され、特にＰｈ−Ｓ−である該マレイミド基であってもよい。
【００９９】
ある特定のそのような実施形態では、２つのチオール基は、野生型標的化部分に存在する単一の、連結されていないシステイン残基の各部分である。ある特定の他のそのような実施形態では、チオール基は、野生型標的化部分から生成された、特に組換え遺伝子操作により、例えば、野生型配列への挿入により、野生型標的化部分中の第１のシステイン残基とジスルフィド架橋を形成する第２のシステインを除去することにより、又は非システイン残基を置換することにより生成された、２つの単一の、連結されていないシステイン残基の部分である。特定の実施形態では、２つのチオール基は、野生型標的化部分に存在する２つのシステインの間のジスルフィド結合の還元により生成される。二置換マレイミドとのそのような２つのチオール基の反応により、チオール基は架橋されて、元々存在するジスルフィド架橋を模倣する。
【０１００】
ある特定の他の実施形態では、遊離チオール基は、標的化部分に存在する遊離アミノ基のチオール化により、特に、２−イミノチオラン（Still et al., (1984) Can. J. Org. Chem. 62:586を参照）及び活性化アシルチオ酢酸誘導体（Ｘ−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ2−ＳＡｃｙｌ）、例えば、アセチルチオ酢酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルから選択されるチオール化試薬とのそのような遊離アミノ基の反応により生成することができる。
【０１０１】
標的化部分への共役はさらに、遺伝子操作により、例えば、ｐ−アセチルフェニルアラニンの導入及びその後のオキシムライゲーションにより導入される非天然アミノ酸への連結により達成することができる（Kazane et al., (2012) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 109:3731-3736を参照）。
【０１０２】
標的化部分への共役はさらに、標的化部分中のチロシン残基のフェニル環への環状ジアゾジカルボキサミドの連結により達成することができる（Ban et al., (2010) J Am. Chem. Soc. 13:1523-5を参照）。
【０１０３】
標的化部分への共役は、１，３−二極性付加環化（クリック化学）を介して達成することができる。
【０１０４】
ある特定のそのような実施形態では、標的化部分は二重又は三重結合を含み、かつ、毒素−Ｌ−ＲＭ構築物は１，３−双極子、特にアジド基を含む。ある特定のそのような実施形態では、標的化部分を最初にジベンゾシクロオクチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル又はアザジベンゾシクロオクチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応させる（例えば、Zhou et al., (2013) J Am Chem Soc. 135:12994-7を参照）。
【０１０５】
ある特定の他のそのような実施形態では、標的化部分は１，３−双極子、特にアジド基を含み、かつ、毒素−Ｌ−ＲＭ構築物は二重又は三重結合を含む。ある特定のそのような実施形態では、標的化部分は、酵素触媒反応によりアジド含有分子に最初に連結されるグリコシル化抗体である（商標名SiteClick；Zeglis et al., (2013) Bioconjug Chem. 24:1057-67を参照）。ある特定の他の実施形態では、アジド基は、非天然アミノ酸ｐ−アジド−フェニルアラニンを介して組み込まれる（Kazane et al., (2012) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 109:3731-3736を参照）。
【０１０６】
第６の態様では、本発明は、本発明の毒性化合物−リンカー−標的化部分化合物又は本発明にしたがって合成される毒性化合物−リンカー−標的化部分化合物を含む医薬組成物に関する。
【０１０７】
第７の態様では、本発明は、がんの治療において使用するための本発明の医薬組成物に関する。
【０１０８】
本明細書において使用される場合、疾患若しくは障害を「治療する」（ｔｒｅａｔ）、「治療する」（ｔｒｅａｔｉｎｇ）又は疾患若しくは障害の「治療」は、以下の１つ又は複数を達成することを意味する：（ａ）障害の重篤度の低減；（ｂ）治療されている（１つ又は複数の）障害に特徴的な症状の発生の制限又は予防；（ｃ）治療されている（１つ又は複数の）障害に特徴的な症状の悪化の阻害；（ｄ）以前に（１つ又は複数の）障害を有していた患者における（１つ又は複数の）障害の再発の制限又は予防；及び（ｅ）以前に（１つ又は複数の）障害の症状を示していた患者における症状の再発の制限又は予防。
【０１０９】
本明細書において使用される場合、治療は、本発明によるコンジュゲート又は医薬組成物を患者に投与することを含んでもよく、「投与すること」としては、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与の他に、ｅｘ  ｖｉｖｏの組織への直接的な投与、例えば静脈グラフトが挙げられる。
【０１１０】
特定の実施形態では、治療有効量の本発明のコンジュゲートが使用される。
【０１１１】
「治療有効量」は、意図する目的を達成するために充分な治療剤の量である。所与の治療剤の有効量は、剤の性質、投与経路、治療剤を与えられる動物のサイズ及び種、並びに投与の目的のような要因により変化する。各個々の症例における有効量は、当該技術分野において確立された方法にしたがって当業者により経験的に決定され得る。
【０１１２】
そして、１つ又は複数の薬学的に許容される希釈剤、担体、賦形剤、充填剤、結合剤、潤滑剤、滑剤、崩壊剤、吸着剤；及び／又は防腐剤をさらに含む。
【０１１３】
「薬学的に許容される」は、動物、より特にはヒトにおける使用について連邦若しくは州政府の規制機関により承認されているか、又は米国薬局方若しくは他の一般に認識される薬局方に列記されていることを意味する。
【０１１４】
特定の実施形態では、医薬組成物は、全身投与される医薬の形態で使用される。これには、特に注射可能液及び注入液を含む、非経口剤が含まれる。注射可能液は、アンプルの形態で、又はいわゆる使用準備済み（ｒｅａｄｙ−ｆｏｒ−ｕｓｅ）注射可能液、例えば、使用準備済み（ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｕｓｅ）シリンジ若しくは使い捨てシリンジとして、及びこれ以外に複数回採取のためのパンクチャラブルフラスコとして配合される。注射可能液の投与は、皮下（ｓ．ｃ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）又は皮内（ｉ．ｃ．）適用の形態であり得る。特に、結晶の懸濁液、溶液、ナノ粒子又は例えばヒドロゾルのようなコロイド分散系として好適な注射用配合物をそれぞれ製造することができる。
【０１１５】
注射用配合物はさらに濃縮物として製造することができ、濃縮物は、水性の等張希釈剤を用いて溶解又は分散させることができる。注入液はまた、等張溶液、脂肪エマルション、リポソーム配合物及びマイクロエマルションの形態で調製することができる。注射可能液と同様に、注入用配合物はまた、希釈するための濃縮物の形態で調製することができる。注射用配合物はまた、例えばミニポンプにより、入院療法及び外来療法の両方で永久的な注入液の形態で適用することができる。
【０１１６】
例えば、アルブミン、血漿、増量剤、表面活性物質、有機希釈剤、ｐＨ調整物質、複合体形成物質若しくはポリマー物質を、特に、タンパク質若しくはポリマーへの本発明の標的結合部分毒性化合物コンジュゲートの吸着に影響を及ぼす物質として、非経口薬物配合物に加えることができ、又はそれらを、注射器具若しくは包装材料、例えば、プラスチック若しくはガラスのような材料への本発明の標的結合部分毒性化合物コンジュゲートの吸着を低減させることを目的としても加えることができる。
【０１１７】
標的結合部分を含む本発明の毒性化合物（ペイロード）は、非経口剤中のマイクロ担体又はナノ粒子に結合していてもよく、例えば、ポリ（メタ）アクリレート、ポリラクテート、ポリグリコレート、ポリアミノ酸又はポリエーテルウレタンに基づく微分散された粒子に結合していてもよい。非経口配合物はまた、本発明のコンジュゲートがそれぞれ微分散、分散及び懸濁形態で導入される場合、例えば「複数単位原理」（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｕｎｉｔ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ）に基づいてデポー調製物として、又は、本発明のコンジュゲートがその後埋め込まれる配合物中、例えば、錠剤若しくは棒剤（ｒｏｄ）中に封入される場合、「単一単位原理」（ｓｉｎｇｌｅ  ｕｎｉｔ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ）に基づいて、若しくは医薬中の結晶の懸濁液として改変することができる。単一単位及び複数単位配合物でのこれらのインプラント又はデポー医薬は、多くの場合、いわゆる生分解性ポリマー、例えば、乳酸及びグリコール酸のポリエステル、ポリエーテルウレタン、ポリアミノ酸、ポリ（メタ）アクリレート又は多糖からなる。
【０１１８】
非経口剤として配合される本発明の医薬組成物の製造中に加えられる補助剤及び担体は、特に、滅菌水、ｐＨ値調整物質、例えば、有機又は無機の酸又は塩基の他にこれらの塩、ｐＨ値を調整するための緩衝化物質、等張化用の物質、例えば、塩化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、グルコース及びフルクトース、それぞれ界面活性剤（ｔｅｎｓｉｄｅｓ）及び界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ）、並びに乳化剤、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンの脂肪酸の部分エステル（例えば、Tween（登録商標））又は、例えば、ポリオキシエチレンの脂肪酸エステル（例えば、Cremophor（登録商標））、脂肪油、例えば、ピーナッツ油、大豆油又はヒマシ油、脂肪酸の合成エステル、例えば、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル及び中性油（例えば、Miglyol（登録商標）の他に、高分子補助剤、例えば、ゼラチン、デキストラン、ポリビニルピロリドン、有機溶媒の溶解度を増加させる添加物、例えば、プロピレングリコール、エタノール、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、プロピレングリコール又は複合体形成物質、例えば、クエン酸塩及び尿素、防腐剤、例えば、安息香酸ヒドロキシプロピルエステル及びメチルエステル、ベンジルアルコール、酸化防止剤、例えば、亜硫酸ナトリウム及び安定化剤、例えばＥＤＴＡである。
【０１１９】
懸濁液として本発明の医薬組成物を配合する場合、好ましい実施形態では、本発明のコンジュゲートの硬化を防止するための増粘剤、又は沈殿物の再懸濁を確実にするための界面活性剤及び多価電解質、並びに／又は、例えばＥＤＴＡのような複合体形成剤が加えられる。様々なポリマーとの活性成分の複合体を達成することもできる。そのようなポリマーの例は、ポリエチレングリコール、ポリスチレン、カルボキシメチルセルロース、Pluronics（登録商標）又はポリエチレングリコールソルビット脂肪酸エステルである。本発明のコンジュゲートはまた、例えばシクロデキストリンを用いた封入化合物の形態で液体配合物中に組み込むことができる。特定の実施形態では、分散剤をさらなる補助剤として加えることができる。凍結乾燥物の製造のために、マンニット、デキストラン、サッカロース、ヒトアルブミン、ラクトース、ＰＶＰ又は多様なゼラチンのようなスキャフォールド剤（ｓｃａｆｆｏｌｄｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ）を使用することができる。
【０１２０】
第８の態様では、本発明は、がんの治療方法であって、本発明の毒性化合物−リンカー−標的化部分化合物又は本発明の医薬組成物をそのような治療を必要とする患者に投与するステップを含む、方法に関する。
【実施例】
【０１２１】
本発明を実例を挙げて説明するために、以下の実施例を含める。しかしながら、これらの実施例は本発明を限定せず、本発明を実施する方法を示唆することのみを目的とすることが理解されるべきである。
【０１２２】
実施例１：毒素単位ＩＣＱＯ−１の生成及び合成
実験の詳細
概略の材料及び機器
別段の記載がなければ、全ての試薬は商用供給業者から購入し、さらなる精製なしに使用した。検査及び精製のために使用した全ての溶媒はＨＰＬＣグレードであった。水分感受性反応は、乾燥したガラス器具中アルゴン雰囲気下で行った。反応をＴＬＣ、ＬＣＭＳ又はＮＭＲによりモニターした。
【０１２３】
フラッシュクロマトグラフィーは、シリカゲル（Ｍｅｒｃｋ、Silicagel 60、１．１５１１１．１０００、１５〜４０μｍ）で満たした適切なガラスカラムを使用して手動で、又は、Ｂｕｃｈｉ社のReveleris（登録商標）Ｘ２フラッシュクロマトグラフィーシステム及び充填済みカートリッジ（Reveleris（登録商標）Flash Cartridges Silica 40μm）を使用して行った。
【０１２４】
Thermo Fisher Scientific Dionex Ultimate 3000 HPLC systemを使用して、Phenomenex Gemini C18 RP-column 00G-4436-NO、１０μｍ、１１０Ａ、２５０×１０．００ｍｍ（５ｍｌ／分）又はPhenomenex Gemini C18 RP-column 00G-4435-PO-AX、５μｍ、１１０Ａ、２５０×２１．２０ｍｍ（９ｍｌ／分）又はThermo Fisher Scientific BDS Hypersil C18 RP-column 28105-259370、５μｍ、２５０ｘ３０ｍｍ、（２５ｍｌ／分）又はMacherey-Nagel Nucleosil 100-7 VP C18 RP column 715691-1116949、２５０×４０ｍｍ（４５ｍｌ／分）で分取逆相高圧力液体クロマトグラフィー（分取ＨＰＬＣ  ＲＰ）を行った。溶出液、勾配及び添加物を括弧内に与える。生成物含有画分を合わせ、蒸留Ｈ2Ｏ（最小１：１／溶媒：Ｈ2Ｏ）で希釈し、冷凍及び凍結乾燥した。
【０１２５】
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、予めコーティングしたガラスプレート（Merck TLC Silicagel 60 F254、１．１５３４１．０００１、２．５ｘ７．５ｃｍ）上で行い、ＵＶ光（λ＝２５４ｎｍ［ＵＶ254］又はλ＝３６６ｎｍ［ＵＶ366］）下の観察、ヨウ素チャンバー中での展開プレートの処理又はＴＬＣ染色溶液（調製について以下のリストを参照）でプレートを処理した後の加熱により、成分を可視化した。使用した溶出液又は溶出液混合物を括弧中に報告する。
ＫＭｎＯ4染色溶液［ＫＭｎＯ4］：２００ｍＬのＨ2Ｏ中の１．５ｇのＫＭｎＯ4、１０ｇのＫ2ＣＯ3、及び１．２５ｍＬの１０％  ＮａＯＨ。
ＰＭＡ染色溶液［ＰＭＡ］：１００ｍＬの無水ＥｔＯＨ中の１０ｇのリンモリブデン酸。
ＣＡＭ染色溶液［ＣＡＭ］：１００ｍＬの１０％  Ｈ2ＳＯ4中の１ｇのＣｅ（ＩＶ）（ＳＯ4）2、２．５ｇの（ＮＨ4）6Ｍｏ4Ｏ7
アニスアルデヒド染色溶液［ＡＡ］：１３５ｍＬの無水ＥｔＯＨ、５ｍＬの濃Ｈ2ＳＯ4、１．５ｍＬのＨＯＡｃ及び３．７ｍＬのｐ−アニスアルデヒド。
ニンヒドリン染色溶液［ニンヒドリン］：１００ｍＬの無水ＥｔＯＨ及び３．０ｍＬのＨＯＡｃ中の１．５ｇのニンヒドリン。
バニリン染色溶液［Ｖａｎ］：２５０ｍＬの無水ＥｔＯＨ及び２．５ｍＬの濃Ｈ2ＳＯ4中の１５ｇのバニリン。
【０１２６】
分取薄層クロマトグラフィーは、予めコーティングしたガラスプレート（Merck TLC Silicagel 60 F254、１．０５７１５．０００１、２０ｘ２０ｃｍ、最大１０〜１５ｍｇ／プレート及びAnaltech Uniplate Silica gel GF Z51305-9、２０×２０ｃｍ×２ｍｍ、最大１００〜１５０ｍｇ／プレート）上で行った。使用した溶出液又は溶出液混合物及び展開数を括弧内に報告する。ＵＶ光（λ＝２５４又は３６６ｎｍ）下での観察により化合物を可視化した。化合物含有シリカゲル画分を外科用メスを用いてプレートから剥がし、小片に圧砕し、化合物を適切な溶剤混合物により溶出した。
【０１２７】
クライオプローブシステムを用いてBruker Avance III又はBruker Avance III HDでＮＭＲスペクトルを記録した。1Ｈ  ＮＭＲスペクトルは５００ＭＨｚ及び７００ＭＨｚにおいて記録した。13Ｃ  ＮＭＲスペクトルは１２６ＭＨｚ及び１７６ＭＨｚにおいて記録した。化学シフトを溶媒シグナルに対するｐｐｍとして報告する。多重度を以下の通りに指し示す：ｓ（シングレット）；ｂｓ（ブロードシングレット）；ｄ（ダブレット）；ｔ（トリプレット）；ｑ（カルテット）；ｍ（マルチプレット）；ｄｄ（ダブレットのダブレット）など。
【０１２８】
光学回転値をPerkin-Elmer 241 MCで決定し、ランバート−ベールの式により算出した。
【０１２９】
ＩＲスペクトルをＡＴＲ技術を用いてBruker ALPHA FT IR分光計で記録した。観察された吸収ピークの波数のみを与える。
【０１３０】
低分解能質量分析（ＬＲＭＳ）データは、電子スプレーイオン化（ＥＳＩ）（ＡＣＮ−Ｈ2Ｏ＋０．０５％のＴＦＡ）を伴うDAD検出器及びAPI 150 EX四重極型質量検出器を備えたAgilent 1100 HPLCシステム又は電子スプレーイオン化（ＥＳＩ）を伴うDAD検出器及びBruker amazonイオントラップ質量検出器を備えたDionex Ultimate 3000 HPLCシステムを使用して記録した。
【０１３１】
高分解能質量分析（ＨＲＭＳ）データは、電子スプレーイオン化（ＥＳＩ）を伴うDAD検出器及びBruker maXis HD QTOF質量検出器を備えたDionex Ultimate 3000 HPLCシステムを使用して記録した。
【０１３２】
発酵及びラトジャドンＡの単離
ラトジャドンＡ（１）  −  （Ｒ）−６−（（１Ｅ，３Ｚ，５Ｒ，７Ｅ，９Ｅ，１１Ｒ）−１１−ヒドロキシ−１１−（（２Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−４−ヒドロキシ−５−メチル−６−（（Ｅ）−プロパ−１−エン−１−イル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−３，５，７−トリメチルウンデカ−１，３，７，９−テトラエン−１−イル）−５，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−オンの単離
【化７】
2020529457.tif 000009
【０１３３】
発酵及びラトジャドンＡの単離は、報告された手順[35、36、56]にしたがって行うことができる。
【０１３４】
ラトジャドンＡ（１）：TCL (CH2Cl2:MeOH/95:5) Rf: 0.35 [UV254, CAM], IR (ATR) [cm-1]: 3417, 2962, 2921, 2871, 1715, 1653, 1625, 1451, 1438, 1380, 1344, 1295, 1245, 1149, 1121, 1056, 1011, 963, 916, 881, 814, 732, 660. 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ [ppm]: 6.88 (ddd, J = 9.7, 4.6, 3.9 Hz, 1H), 6.70 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 6.45 (ddd, J = 15.2, 10.9, 1.3 Hz, 1H), 6.09 - 5.99 (m, 1H), 5.76 (d, J = 11.0 Hz, 1H), 5.72 - 5.69 (m, 1H), 5.68 - 5.66 (m, 1H), 5.54 - 5.47 (m, 1H), 5.46 - 5.37 (m, 1H), 5.21 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 5.03 - 4.93 (m, 1H), 4.44 (d, J = 6.2 Hz, 1H), 4.32 (dd, J = 6.0, 2.8 Hz, 1H), 3.98 (q, J = 2.8 Hz, 1H), 3.85 (dt, J = 12.2, 2.8 Hz, 1H), 2.79 (dq, J = 9.6, 6.9 Hz, 1H), 2.50 - 2.39 (m, 2H), 1.98 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 1.86 (ddd, J = 14.9, 12.3, 2.9 Hz, 1H), 1.77 (d, J = 1.2 Hz, 3H), 1.70 (s, 6H), 1.70 - 1.68 (m, 2H), 1.65 - 1.58 (m, 2H), 1.43 - 1.34 (m, 1H), 0.90 (d, J = 6.6 Hz, 3H), 0.89 (d, J = 7.2 Hz, 3H). 13C-NMR (126 MHz, CDCl3) δ [ppm]: 164.34, 144.95, 139.55, 137.70, 130.81, 130.37, 129.45, 128.61, 128.51, 127.10, 126.08, 125.52, 121.84, 78.84, 74.97, 74.91, 74.57, 70.42, 47.97, 39.82, 30.74, 30.26, 26.98, 21.20, 20.60, 18.16, 17.29, 11.34. LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 479.2 [M+Na]+, 421.3 [M-H2O+H]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 479.277556, C28H40NaO5 [M+Na]+の計算値479.276795, err [ppm] 1.588.
【０１３５】
化合物の合成
ラトジャドンＡの誘導体化
１．１．１．１  １６−アミノ−ラトジャドンの合成
【化８】
2020529457.tif 000010
１６−オキソ−ラトジャドン（８）  −  （Ｒ）−６−（（Ｒ，１Ｅ，３Ｚ，７Ｅ，９Ｅ）−１１−（（２Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−４−ヒドロキシ−５−メチル−６−（（Ｅ）−プロパ−１−エン−１−イル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−３，５，７−トリメチル−１１−オキソウンデカ−１，３，７，９−テトラエン−１−イル）−５，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−オン、１９−オキソ−ラトジャドン（９）  −  （Ｒ）−６−（（１Ｅ，３Ｚ，５Ｒ，７Ｅ，９Ｅ，１１Ｒ）−１１−ヒドロキシ−３，５，７−トリメチル−１１−（（２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−５−メチル−４−オキソ−６−（（Ｅ）−プロパ−１−エン−１−イル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）ウンデカ−１，３，７，９−テトラエン−１−イル）−５，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−オン及び１６，１９−ジオキソ−ラトジャドン（１０）  −  （Ｒ）−６−（（Ｒ，１Ｅ，３Ｚ，７Ｅ，９Ｅ）−３，５，７−トリメチル−１１−（（２Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−５−メチル−４−オキソ−６−（（Ｅ）−プロパ−１−エン−１−イル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−１１−オキソウンデカ−１，３，７，９−テトラエン−１−イル）−５，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−オンの合成
【化９】
2020529457.tif 000011
【０１３６】
７５０μＬのＤＭＳＯ中の３３．７ｍｇ（０．１２０５ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ）のＩＢＸ1の溶液を２３℃で１６ｈの期間の期間にわたり滴下（シリンジポンプ）で７５０μＬのＤＭＳＯ中に溶解した５５ｍｇ（０．１０９５ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）のラトジャドンＡ  １の撹拌溶液に加えた（1ＩＢＸは、Santagostino及び共同研究者ら[68]の手順にしたがって２−ヨード安息香酸から新たに調製した。）。その後、混合物を２３℃でさらに２４ｈ撹拌した。反応をＨＰＬＣ−ＭＳによりモニターした。混合物をＣＨ2Ｃｌ2（１５ｍＬ）で希釈し、ＩＢＡが白色固体として沈殿し、セルロースフィルターを使用して濾過できるようになるまで３０分間撹拌した。濾液をＨ2Ｏ（３ｘ１５ｍＬ）で洗浄2し、無水Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥させ、減圧下で濃縮した（2生成物のクロマトグラフィー分離に強い負の影響を有するＤＭＳＯの跡形を取り除くことが重要である。）。残留物を分取薄層クロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ／９８：２、２ｘの展開）により精製して、薄黄色の固体泡として３４．５ｍｇ（０．０７６ｍｍｏｌ、６９％、７５％  ｂｒｓｍ）の１６−オキソラトジャドン８、薄黄色の固体泡として３．７ｍｇ（８．１μｍｏｌ、７％、８％  ｂｒｓｍ）の１９−オキソラトジャドン９、薄黄色の固体泡として６．９ｍｇ（１５．２μｍｏｌ、１４％、１５％  ｂｒｓｍ）の１６，１９−ジオキソラトジャドン１０及び４．０ｍｇ（８％）の再単離されたラトジャドンＡ  １を得た。反応は１０〜６００ｍｇのスケールで行い、類似の生成物分布及び収率を得た。
【０１３７】
１６−オキソ−ラトジャドン（８）：TCL (CH2Cl2:MeOH/98:2) Rf: 0.26 [UV254, CAM], IR (ATR) [cm-1]: 3456, 2970, 2922, 2883, 1723, 1682, 1620, 1581, 1451, 1437, 1380, 1362, 1307, 1247, 1218, 1126, 1084, 1056, 1013, 968, 914, 884, 783, 732, 700. 1H-NMR (700 MHz, CDCl3) δ [ppm]: 7.61 (dd, J = 15.1, 11.7 Hz, 1H), 6.88 (ddd, J = 9.8, 5.3, 3.1 Hz, 1H), 6.70 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 6.50 (d, J = 15.2 Hz, 1H), 6.04 (ddd, J = 9.8, 2.3, 1.3 Hz, 1H), 5.99 (d, J = 11.7 Hz, 1H), 5.77 - 5.70 (m, 1H), 5.73 - 5.67 (m, 1H), 5.50 (ddq, J = 15.4, 6.1, 1.6 Hz, 1H), 5.19 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 5.00 (dddd, J = 10.2, 6.3, 5.2, 1.1 Hz, 1H), 4.47 - 4.45 (m, 1H), 4.43 (dd, J = 11.1, 3.7 Hz, 1H), 4.01 (q, J = 2.7 Hz, 1H), 2.86 (ddq, J = 13.8, 9.7, 6.8 Hz, 1H), 2.51 - 2.39 (m, 2H), 2.10 (dd, J = 7.1, 2.2 Hz, 2H), 1.85 (d, J = 1.1 Hz, 3H), 1.78-1.73 (m, 2H), 1.77 (d, J = 1.2 Hz, 3H), 1.71 (dt, J = 6.5, 1.3 Hz, 3H), 1.68 (dtt, J = 6.7, 2.7, 1.5 Hz, 1H), 0.93 (d, J = 0.8 Hz, 3H), 0.92 (d, J = 1.5 Hz, 3H). 13C-NMR (176 MHz, CDCl3) δ [ppm]: 199.85, 164.29, 150.49, 144.94, 140.32, 138.65, 130.24, 130.13, 129.89, 127.14, 126.05, 125.99, 122.96, 121.84, 78.54, 75.09, 70.23, 48.47, 39.30, 30.87, 30.76, 30.23, 29.92, 21.26, 20.60, 18.17, 18.13, 11.44. LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 477.6 [M+Na]+, 455.2 [M-H2O+H]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 455.279347, C28H39O5 [M+H]+の計算値455.279201, err [ppm] - 0.321.
【０１３８】
１９−オキソ−ラトジャドン（９）：TCL (CH2Cl2:MeOH/98:2) Rf: 0.36 [UV254, CAM], IR (ATR) [cm-1]: 3450, 2970, 2923, 2857, 1713, 1653, 1452, 1419, 1380, 1353, 1302, 1245, 1140, 1093, 1030, 1014, 967, 915, 882, 815, 732, 653. 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ [ppm]: 6.90 (dt, J = 9.8, 4.2 Hz, 1H), 6.71 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 6.50 (ddd, J = 15.2, 11.0, 1.3 Hz, 1H), 6.07 (dt, J = 9.8, 1.8 Hz, 1H), 5.82 - 5.74 (m, 2H), 5.71 (dd, J = 15.6, 6.9 Hz, 1H), 5.54 - 5.41 (m, 2H), 5.23 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 5.04 - 4.95 (m, 1H), 4.46 (s, 1H), 4.19 (ddt, J = 6.1, 2.6, 1.1 Hz, 1H), 3.74 (dt, J = 11.8, 3.0 Hz, 1H), 2.85 - 2.76 (m, 1H), 2.75 (dd, J = 14.9, 11.9 Hz, 1H), 2.48 (ddd, J = 6.7, 3.8, 1.9 Hz, 2H), 2.39 (qdd, J = 7.0, 2.5, 1.1 Hz, 1H), 2.16 (ddd, J = 14.9, 2.9, 1.3 Hz, 1H), 2.02 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 1.80 (d, J = 1.2 Hz, 3H), 1.75 (ddd, J = 6.5, 1.6, 1.0 Hz, 3H), 1.73 (d, J = 1.1 Hz, 3H), 1.13 (d, J = 7.2 Hz, 3H), 0.93 (d, J = 6.6 Hz, 3H). 13C-NMR (126 MHz, CDCl3) δ [ppm]: 211.63, 164.07, 144.67, 139.22, 138.44, 130.73, 129.41, 129.36, 128.84, 127.42, 127.00, 125.67, 125.39, 121.70, 79.58, 79.33, 78.72, 73.88, 50.12, 47.86, 37.51, 30.52, 30.09, 21.03, 20.42, 17.94, 17.06, 11.13. LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 477.3 [M+Na]+, 455.4 [M+H]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 477.261253, C28H38NaO5 [M+Na]+の計算値477.261145, err [ppm] -0,225.
【０１３９】
１６，１９−ジオキソ−ラトジャドン（１０）：TCL (CH2Cl2:MeOH/98:2) Rf: 0.44 [UV254, CAM], IR (ATR) [cm-1]: 2968, 2923, 2855, 1717, 1684, 1620, 1582, 1451, 1419, 1381, 1333, 1305, 1245, 1186, 1148, 1100, 1059, 1013, 968, 932, 915, 883, 862, 814, 787, 732, 662. 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ [ppm]: 7.68 (dd, J = 15.1, 11.7 Hz, 1H), 6.89 (ddd, J = 9.7, 5.2, 3.2 Hz, 1H), 6.72 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 6.55 (d, J = 15.1 Hz, 1H), 6.09 - 6.01 (m, 2H), 5.86 - 5.77 (m, 1H), 5.72 (dd, J = 15.6, 6.3 Hz, 1H), 5.52 (ddd, J = 15.4, 6.0, 1.7 Hz, 1H), 5.22 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 5.06 - 4.97 (m, 1H), 4.27 - 4.22 (m, 2H), 2.88 (dtd, J = 13.7, 6.9, 3.3 Hz, 1H), 2.66 (dd, J = 15.0, 12.0 Hz, 1H), 2.52 - 2.40 (m, 4H), 2.14 (d, J = 7.3 Hz, 2H), 1.91 - 1.87 (m, 3H), 1.79 (d, J = 1.1 Hz, 3H), 1.76 (dt, J = 6.4, 1.2 Hz, 3H), 1.15 (d, J = 7.2 Hz, 3H), 0.95 (d, J = 6.6 Hz, 3H).13C-NMR (126 MHz, CDCl3) δ [ppm]: 209.87, 196.26, 164.03, 151.67, 144.70, 141.39, 138.36, 129.95, 129.09, 127.30, 126.07, 125.98, 122.31, 121.82, 84.92, 80.42, 80.20, 78.31, 50.21, 48.60, 39.92, 30.70, 30.19, 21.13, 20.52, 18.07, 18.00, 11.34. LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 475.2 [M+Na]+, 453.3 [M+H]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 453.263800, C28H37O5 [M+H]+の計算値47453.263600, err [ppm] - 0.7.
１６Ｒ−アミノ−ラトジャドン（１１）  −  （Ｒ）−６−（（１Ｅ，３Ｚ，５Ｒ，７Ｅ，９Ｅ，１１Ｒ）−１１−アミノ−１１−（（２Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−４−ヒドロキシ−５−メチル−６−（（Ｅ）−プロパ−１−エン−１−イル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−３，５，７−トリメチルウンデカ−１，３，７，９−テトラ−エン−１−イル）−５，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−オン、１６Ｓ−アミノ−ラトジャドン（１２）  −  （Ｒ）−６−（（１Ｅ，３Ｚ，５Ｒ，７Ｅ，９Ｅ，１１Ｓ）−１１−アミノ−１１−（（２Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−４−ヒドロキシ−５−メチル−６−（（Ｅ）−プロパ−１−エン−１−イル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−３，５，７−トリメチルウン−デカ−１，３，７，９−テトラエン−１−イル）−５，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−オン、化合物１３  −  メチル（５Ｒ，６Ｅ，８Ｚ，１０Ｒ，１２Ｅ，１４Ｅ，１６Ｒ）−３，１６−ジアミノ−５−ヒドロキシ−１６−（（２Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−４−ヒドロキシ−５−メチル−６−（（Ｅ）−プロパ−１−エン−１−イル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−８，１０，１２−トリメチルヘキサデカ−６，８，１２，１４−テトラエノエート及び化合物１４  −  メチル（５Ｒ，６Ｅ，８Ｚ，１０Ｒ，１２Ｅ，１４Ｅ，１６Ｓ）−３，１６−ジアミノ−５−ヒドロキシ−１６−（（２Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−４−ヒドロキシ−５−メチル−６−（（Ｅ）−プロパ−１−エン−１−イル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−８，１０，１２−トリメチルヘキサデカ−６，８，１２，１４−テトラエノエートの合成
【化１０】
2020529457.tif 000012
【０１４０】
３６．６ｍｇ（０．４７５ｍｍｏｌ、１０ｅｑ）の酢酸アンモニウムを２３℃で９５０μＬの乾燥ＭｅＯＨ中の２１．６ｍｇ（４７．５μｍｏｌ、１．０ｅｑ）の１６−オキソラトジャドン８の溶液に加えて３分間撹拌した後、５．９ｍｇ（９５．０μｍｏｌ、２．０ｅｑ）のシアノ水素化ホウ素ナトリウムを加え、混合物を２３℃で１４ｈ撹拌した。次に混合物を４０℃に２ｈ加熱した後、４００μＬのＡＣＮ：Ｈ2Ｏ＋ＴＦＡ／３０：７０＋０．０５％の添加により反応を停止させた。この混合物をＲＰ分取ＨＰＬＣ（Phenomenex Gemini C18 RP-column 00G-4435-PO-AX、５μｍ、１１０Ａ、２５０×２１．２０ｍｍ、流速：９ｍｌ／分、ＡＣＮ：Ｈ2Ｏ＋ＴＦＡ／１０：９０＋０．１％→９５：５＋０．１％、９０分）により直接精製して、凍結乾燥後に薄黄色の固体泡として６．９ｍｇ（１５．１μｍｏｌ、３２％、３４％  ｂｒｓｍ）の１６Ｒ−アミノ−ラトジャドン１１、薄黄色の固体泡として４．３ｍｇ（９．４μｍｏｌ、２０％、２１％  ｂｒｓｍ）の１６Ｓ−アミノラトジャドン１２、黄色の固体泡として１．５ｍｇ（３．３μｍｏｌ、７％、８％  ｂｒｓｍ）の化合物１３、黄色の固体泡として０．４ｍｇ（０．９μｍｏｌ、２％、２．４％  ｂｒｓｍ）の化合物１４及び１．６ｍｇ（７％）の再単離された１６−オキソラトジャドン８を得た。化合物１１及び１２は純粋な化合物として得られた一方、化合物１３及び１４は二ＴＦＡ塩として得られた。反応は１０〜１００ｍｇのスケールで行い、類似の生成物分布及び収率を得た。
【０１４１】
１６Ｒ−アミノ−ラトジャドン（１１）：IR (ATR) [cm-1]: 3403, 2961, 2923, 1674, 1522, 1452, 1436, 1382, 1345, 1253, 1201, 1160, 1134, 1058, 1014, 967, 918, 883, 816, 800, 722, 661. 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ [ppm]: 8.05 (s, 2H), 6.92 (dt, J = 9.7, 4.2 Hz, 1H), 6.64 (dd, J = 24.0, 15.5 Hz, 1H), 6.51 (dd, J = 15.1, 10.9 Hz, 1H), 6.03 (dt, J = 9.8, 1.7 Hz, 1H), 5.72 (d, J = 10.7 Hz, 1H), 5.70 - 5.61 (m, 2H), 5.58 (dd, J = 15.2, 9.2 Hz, 1H), 5.36 (ddt, J = 15.5, 3.9, 1.6 Hz, 1H), 5.20 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 5.02 - 4.90 (m, 1H), 4.38 (d, J = 5.1 Hz, 1H), 4.17 (d, J = 12.2 Hz, 1H), 3.96 - 3.91 (m, 1H), 3.80 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 2.78 (dt, J = 15.2, 8.3 Hz, 1H), 2.48 (ddd, J = 7.2, 3.8, 1.6 Hz, 2H), 2.00 (ddt, J = 22.4, 14.1, 6.7 Hz, 2H), 1.81 - 1.76 (m, 3H), 1.72 (s, 3H), 1.66 (d, J = 6.4 Hz, 3H), 1.69 - 1.53 (m, 2H), 1.40 (d, J = 14.0 Hz, 1H), 0.96 (d, J = 6.6 Hz, 3H), 0.81 (d, J = 7.1 Hz, 3H).13C-NMR (126 MHz, CDCl3) δ [ppm]: 164.94, 145.51, 140.31, 139.44, 134.67, 132.19, 129.79, 129.66, 126.71, 125.03, 124.99, 121.45, 120.81, 79.55, 74.77, 71.57, 69.49, 57.54, 47.51, 38.93, 30.57, 30.06, 28.99, 21.55, 20.41, 17.99, 17.48, 11.13. LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 456.3 [M+H]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 456.311233, C28H42NO4 [M+H]+の計算値456.310835, err [ppm] - 0.872.
【０１４２】
１６Ｓ−アミノ−ラトジャドン（１２）：IR (ATR) [cm-1]: 3342, 2956, 2925, 1675, 1522, 1436, 1382, 1305, 1254, 1202, 1180, 1136, 1056, 1017, 966, 912, 883, 800, 722, 651. 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ [ppm]: 8.07 (s, 2H), 6.98 - 6.87 (m, 1H), 6.69 (d, J = 15.5 Hz, 1H), 6.56 (dd, J = 15.0, 10.9 Hz, 1H), 6.04 (d, J = 9.8 Hz, 1H), 5.75 (d, J = 10.8 Hz, 1H), 5.68 (dd, J = 15.5, 7.7 Hz, 1H), 5.70 - 5.60 (m, 1H), 5.45 - 5.34 (m, 2H), 5.20 (d, J = 9.9 Hz, 1H), 5.02 - 4.91 (m, 1H), 4.41 (d, J = 5.5 Hz, 1H), 4.04 - 3.91 (m, 2H), 3.81 (s, 1H), 3.64 (t, J = 9.0 Hz, 1H), 2.80 (dh, J = 13.0, 6.3 Hz, 1H), 2.56 - 2.43 (m, 2H), 2.10 (dd, J = 13.8, 5.6 Hz, 1H), 1.90 (dd, J = 13.8, 8.7 Hz, 1H), 1.78 (s, 3H), 1.69 (s, 3H), 1.68 (d, J = 6.5 Hz, 3H), 1.67 - 1.64 (m, 1H), 1.57 (d, J = 14.0 Hz, 1H), 1.49 (t, J = 11.8 Hz, 1H), 0.96 (d, J = 6.5 Hz, 3H), 0.86 (d, J = 7.1 Hz, 3H). 13C-NMR (126MHz, CDCl3) δ [ppm]: 165.16, 145.67, 141.69, 139.23, 135.04, 132.47, 129.78, 129.55, 127.42, 124.94, 124.78, 121.42, 120.45, 79.55, 75.20, 71.61, 69.48, 59.36, 47.40, 39.25, 31.49, 30.22, 29.95, 21.44, 20.44, 18.07, 17.99, 11.16. LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 456.3 [M+H]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 456.310562, C28H42NO4 [M+H]+の計算値456.310835, err [ppm] 0.598.
【０１４３】
化合物１３：1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ [ppm]: 8.35 - 8.08 (m, 2H), 7.96 - 7.72 (m, 2H), 6.55 (dd, J = 15.0, 11.2 Hz, 1H), 6.21 (d, J = 15.3 Hz, 1H), 5.67 (dd, J = 15.3, 6.6 Hz, 1H), 5.57 (d, J = 11.0 Hz, 1H), 5.46 (ddd, J = 23.5, 15.2, 8.4 Hz, 2H), 5.38 (dd, J = 15.4, 4.5 Hz, 1H), 5.05 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 4.38 (d, J = 4.6 Hz, 1H), 4.26 (t, J = 10.0 Hz, 1H), 4.12 (d, J = 11.0 Hz, 1H), 3.95 (s, 1H), 3.77 (s, 2H), 3.71 (s, 3H), 2.87 - 2.78 (m, 1H), 2.69 (dd, J = 17.5, 5.0 Hz, 1H), 2.67 - 2.57 (m, 2H), 2.04 (d, J = 11.6 Hz, 1H), 2.02 - 1.93 (m, 1H), 1.87 - 1.79 (m, 1H), 1.78 (s, 3H), 1.74 (s, 3H), 1.69 (d, J = 6.1 Hz, 3H), 1.73 - 1.60 (m, 2H), 1.41 (s, 1H), 1.04 (d, J = 6.5 Hz, 3H), 0.83 (d, J = 7.1 Hz, 3H). 13C-NMR (126 MHz, CDCl3) δ [ppm]: 207.14, 171.48, 162.84, 162.47, 162.23, 161.97, 140.63, 137.42, 135.75, 130.88, 129.59, 129.44, 127.16, 125.32, 119.95, 74.90, 73.15, 71.35, 69.62, 62.95, 57.40, 52.49, 47.99, 39.08, 37.08, 31.24, 31.09, 29.85, 29.21, 22.65, 20.57, 17.98, 17.66, 11.16. LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 505.4 [M+H]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 505.363758, C28H42NO4 [M+H]+の計算値505.363599, err [ppm] -0.315.
【０１４４】
化合物１４：1H-NMR (700 MHz, CDCl3) δ [ppm]: 8.44 - 8.17 (m, 2H), 8.15 - 7.85 (m, 2H), 6.56 (dd, J = 15.0, 11.0 Hz, 1H), 6.38 (d, J = 15.4 Hz, 1H), 5.85 (d, J = 10.9 Hz, 1H), 5.66 (ddd, J = 15.5, 6.5, 1.2 Hz, 1H), 5.52 (dd, J = 15.4, 8.0 Hz, 1H), 5.42 - 5.38 (m, 1H), 5.37 (dd, J = 14.9, 9.3 Hz, 1H), 5.08 (d, J = 10.1 Hz, 1H), 4.43 (d, J = 6.1 Hz, 1H), 4.26 (s, 1H), 3.99 - 3.91 (m, 2H), 3.86 (s, 1H), 3.72 (s, 3H), 3.59 (t, J = 9.4 Hz, 1H), 2.79 - 2.71 (m, 2H), 2.65 (dd, J = 17.4, 5.0 Hz, 1H), 2.30 (d, J = 10.4 Hz, 1H), 2.02 - 1.94 (m, 1H), 1.73 (d, J = 1.1 Hz, 3H), 1.69 (s, 1H), 1.68 (s, 3H), 1.66 - 1.65 (m, 2H), 1.63 (s, 3H), 1.57 (d, J = 14.1 Hz, 1H), 1.48 (ddd, J = 14.3, 12.0, 2.7 Hz, 1H), 1.00 (d, J = 6.4 Hz, 3H), 0.87 (d, J = 7.2 Hz, 3H). 13C-NMR (176MHz, CDCl3) δ [ppm]: 207.11, 171.64, 162.76, 162.56, 162.35, 162.15, 143.94, 136.83, 135.91, 130.72, 130.21, 129.58, 129.26, 127.33, 124.62, 119.50, 75.04, 73.72, 71.63, 69.60, 52.54, 46.74, 39.47, 39.38, 36.96, 34.38, 31.09, 30.48, 29.86, 22.06, 20.38, 19.90, 17.97, 11.18. LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 505.4 [M+H]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 505.363803, C28H42NO4 [M+H]+の計算値505.363599, err [ppm] -0.404.
１．１．１．２  １６−アミノ−ラトジャドンのＣ１６における絶対立体配置の決定[57~59]
【化１１】
2020529457.tif 000013
モッシャーアミド１５  −  （Ｒ）−３，３，３−トリフルオロ−Ｎ−（（１Ｒ，２Ｅ，４Ｅ，７Ｒ，８Ｚ，１０Ｅ）−１−（（２Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−４−ヒドロキシ−５−メチル−６−（（Ｅ）−プロパ−１−エン−１−イル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−５，７，９−トリメチル−１１−（（Ｒ）−６−オキソ−３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）ウンデカ−２，４，８，１０−テトラエン−１−イル）−２−メトキシ−２−フェニルプロパンアミド、モッシャーアミド１６  −  （Ｓ）−３，３，３−トリフルオロ−Ｎ−（（１Ｒ，２Ｅ，４Ｅ，７Ｒ，８Ｚ，１０Ｅ）−１−（（２Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−４−ヒドロキシ−５−メチル−６−（（Ｅ）−プロパ−１−エン−１−イル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−５，７，９−トリメチル−１１−（（Ｒ）−６−オキソ−３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）ウンデカ−２，４，８，１０−テトラエン−１−イル）−２−メトキシ−２−フェニルプロパンアミド、モッシャーアミド１７  −  （Ｒ）−３，３，３−トリフルオロ−Ｎ−（（１Ｓ，２Ｅ，４Ｅ，７Ｒ，８Ｚ，１０Ｅ）−１−（（２Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−４−ヒドロキシ−５−メチル−６−（（Ｅ）−プロパ−１−エン−１−イル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−５，７，９−トリメチル−１１−（（Ｒ）−６−オキソ−３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）ウンデカ−２，４，８，１０−テトラエン−１−イル）−２−メトキシ−２−フェニルプロパンアミド及びモッシャーアミド１８  （Ｓ）−３，３，３−トリフルオロ−Ｎ−（（１Ｓ，２Ｅ，４Ｅ，７Ｒ，８Ｚ，１０Ｅ）−１−（（２Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−４−ヒドロキシ−５−メチル−６−（（Ｅ）−プロパ−１−エン−１−イル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−５，７，９−トリメチル−１１−（（Ｒ）−６−オキソ−３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）ウンデカ−２，４，８，１０−テトラエン−１−イル）−２−メトキシ−２−フェニルプロパンアミドの合成
【化１２】
2020529457.tif 000014
【０１４５】
１０μＬの乾燥ＣＨ2Ｃｌ2中の１．８５ｍｇ（７．８９６μｍｏｌ、１．２ｅｑ）の（Ｒ）−３，３，３−トリフルオロ−２−メトキシ−２−フェニルプロパン酸の溶液に１０μＬの乾燥ＴＨＦ中の０．９１ｍｇ（７．８９６μｍｏｌ、１．２ｅｑ）のＮ−ヒドロキシスクシンイミドの溶液及び１０μＬの乾燥ＣＨ2Ｃｌ2中の１．６３ｍｇ（７．８９６μｍｏｌ、１．２ｅｑ）のＤＣＣの溶液を加え、混合物を２３℃で１５ｈ撹拌した後、４．４μＬ（３９．５０μｍｏｌ、６．０ｅｑ）のＮＭＭ及び３ｍｇ（６．５８μｍｏｌ、１．０ｅｑ）の１６（Ｒ）−アミノ−ラトジャドン１１の溶液を加え、混合物をさらに３０ｈ撹拌した。反応混合物を２００μＬのＣＨ2Ｃｌ2で希釈し、分取薄層クロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ／９８：２、１ｘの展開）により直接的に精製して、黄色の固体泡として２．３ｍｇ（３．４２μｍｏｌ、５２％）のモッシャーアミド１５を得た。
【０１４６】
同様に、１６Ｓ−アミノ−ラトジャドン１２の存在下の反応によりモッシャーアミド１７を形成させ、それを黄色の固体泡として５２％（２．３ｍｇ）で単離した。
【０１４７】
化合物１５及び１７の両方は、不純物としてＤＣＵ及び微量のシリコングリースをわずかに含有した。
【０１４８】
モッシャーアミド１５：TCL (CH2Cl2:MeOH/98:2) Rf: 0.46 [UV254, CAM], IR (ATR) [cm-1]: 3421, 2961, 2924, 2854, 1722, 1693, 1625, 1506, 1451, 1380, 1260, 1164, 1080, 1056, 1015, 966, 918, 880, 802, 767, 735, 717, 698, 661. 19F-NMR (471 MHz, CDCl3) δ [ppm]: -68.80 (s, 3F). 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ [ppm]: 7.55 - 7.51 (m, 2H), 7.39 - 7.34 (m, 3H), 7.20 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 6.94 - 6.84 (m, 1H), 6.71 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 6.32 (ddd, J = 15.2, 10.9, 1.0 Hz, 1H), 6.06 (dt, J = 9.8, 1.8 Hz, 1H), 5.74 (d, J = 11.0 Hz, 1H), 5.70 (dd, J = 15.6, 6.5 Hz, 1H), 5.64 (ddd, J = 15.4, 6.5, 1.4 Hz, 1H), 5.57 (dd, J = 15.2, 7.6 Hz, 1H), 5.42 (ddd, J = 15.4, 5.7, 1.7 Hz, 1H), 5.22 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 5.05 - 4.93 (m, 1H), 4.53 (td, J = 8.1, 3.7 Hz, 1H), 4.37 (d, J = 5.5 Hz, 1H), 4.02 (s, 1H), 3.98 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 3.96 - 3.91 (m, 1H), 3.46 (d, J = 1.3 Hz, 3H), 2.80 (dq, J = 9.7, 7.0 Hz, 1H), 2.50 - 2.41 (m, 2H), 2.02 - 1.96 (m, 2H), 1.97 - 1.90 (m, 2H), 1.79 (d, J = 1.2 Hz, 3H), 1.71 (dt, J = 6.5, 1.4 Hz, 3H), 1.63 (d, J = 1.1 Hz, 3H), 1.60 - 1.57 (m, 1H), 0.92 (d, J = 6.6 Hz, 3H), 0.86 (d, J = 7.1 Hz, 3H). 13C-NMR (126 MHz, CDCl3) δ [ppm]: 165.29, 164.20, 144.87, 139.34, 137.84, 133.22, 130.39, 130.27, 130.25, 129.52, 129.41, 128.56, 127.78, 126.42, 125.91, 125.80, 125.59, 121.77, 78.55, 74.68, 74.05, 70.31, 55.22, 54.67, 53.58, 49.35, 47.96, 39.59, 34.12, 25.77, 25.10, 21.02, 20.54, 18.10, 17.11, 11.28. LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 672.9 [M+H]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 694.332582, C38H48F3NNaO6 [M+Na]+の計算値694.332594, err [ppm] 0.017.
【０１４９】
モッシャーアミド１７：TCL (CH2Cl2:MeOH/98:2) Rf: 0.41 [UV254, CAM], IR (ATR) [cm-1]: 3418, 2961, 2925, 2854, 1721, 1696, 1625, 1506, 1451, 1360, 1260, 1164, 1081, 1054, 1017, 965, 918, 877, 802, 767, 734, 718, 698, 668. 19F-NMR (471 MHz, CDCl3) δ [ppm]: -68.95 (s, 3F). 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ [ppm]: 7.60 (dd, J = 6.4, 3.0 Hz, 2H), 7.40 - 7.35 (m, 3H), 7.04 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 6.90 (ddd, J = 9.8, 4.5, 3.9 Hz, 1H), 6.67 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 6.43 (ddd, J = 15.2, 10.9, 1.2 Hz, 1H), 6.06 (dt, J = 9.8, 1.8 Hz, 1H), 5.74 (d, J = 10.8 Hz, 1H), 5.71 (dd, J = 15.8, 6.6 Hz, 1H), 5.61 (dd, J = 6.5, 1.3 Hz, 1H), 5.58 (dd, J = 6.5, 1.4 Hz, 1H), 5.36 (ddq, J = 15.3, 5.6, 1.4 Hz, 1H), 5.22 (d, J = 9.8 Hz, 1H), 5.04 - 4.95 (m, 1H), 4.42 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 4.35 (d, J = 5.8 Hz, 1H), 4.02 (s, 1H), 3.91 (dt, J = 12.1, 2.7 Hz, 1H), 3.86 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 3.47 (d, J = 1.3 Hz, 3H), 2.78 (dq, J = 9.7, 6.8 Hz, 1H), 2.47 (ddd, J = 7.1, 3.5, 1.6 Hz, 2H), 1.99 (d, J = 7.1 Hz, 2H), 1.93 (dt, J = 12.1, 3.8 Hz, 2H), 1.79 (d, J = 1.2 Hz, 3H), 1.70 (d, J = 1.2 Hz, 3H), 1.70 - 1.68 (m, 3H), 1.60 (dt, J = 13.1, 3.9 Hz, 1H), 0.93 (d, J = 6.6 Hz, 3H), 0.60 (d, J = 7.2 Hz, 3H). 13C-NMR (126 MHz, CDCl3) δ [ppm]: 165.79, 164.15, 144.74, 139.22, 137.41, 133.05, 130.53, 130.17, 129.35, 129.32, 128.73, 128.40, 128.10, 127.52, 126.20, 125.87, 125.34, 121.61, 78.76, 77.18, 74.39, 73.91, 70.19, 55.09, 54.58, 53.41, 49.19, 47.79, 39.21, 33.96, 25.61, 24.94, 20.98, 20.36, 17.95, 16.97, 10.67.LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 672.9 [M+H]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 694.332578, C38H48F3NNaO6 [M+Na]+の計算値694.332594, err [ppm] 0.022.
【０１５０】
LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 672.9 [M+H]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 694.332399, C38H48F3NNaO6 [M+Na]+の計算値694.332594, err [ppm] 0.280.
【化１３】
2020529457.tif 000015
【０１５１】
１０μＬの乾燥ＣＨ2Ｃｌ2中の１．８５ｍｇ（７．８９６μｍｏｌ、１．２ｅｑ）の（Ｓ）−３，３，３−トリフルオロ−２−メトキシ−２−フェニルプロパン酸の溶液に１０μＬの乾燥ＴＨＦ中の０．９１ｍｇ（７．８９６μｍｏｌ、１．２ｅｑ）のＮ−ヒドロキシスクシンイミドの溶液及び１０μＬの乾燥ＣＨ2Ｃｌ2中の１．６３ｍｇ（７．８９６μｍｏｌ、１．２ｅｑ）のＤＣＣの溶液を加え、混合物を２３℃で１５ｈ撹拌した後、４．４μＬ（３９．５０μｍｏｌ、６．０ｅｑ）のＮＭＭ及び３ｍｇ（６．５８μｍｏｌ、１．０ｅｑ）の１６（Ｒ）−アミノ−ラトジャドン１１の溶液を加え、混合物をさらに３０ｈ撹拌した。反応混合物を２００μＬのＣＨ2Ｃｌ2で希釈し、分取薄層クロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ／９８：２、１ｘの展開）により直接的に精製して、黄色の固体泡として２．２ｍｇ（３．２７μｍｏｌ、５０％）のモッシャーアミド１６を得た。
【０１５２】
同様に、１６Ｓ−アミノ−ラトジャドン１２の存在下の反応によりモッシャーアミド１８を形成させ、それを黄色の固体泡として５２％（２．３ｍｇ）で単離した。
【０１５３】
化合物１６及び１８の両方は、不純物としてＤＣＵ及び微量のシリコングリースをわずかに含有した。
【０１５４】
モッシャーアミド１６：TCL (CH2Cl2:MeOH/98:2) Rf: 0.42 [UV254, CAM], IR (ATR) [cm-1]: 3417, 2960, 2925, 2854, 1721, 1693, 1552, 1511, 1451, 1380, 1335, 1321, 1260, 1102, 1061, 1056, 1015, 966, 918, 880, 866, 801, 767, 734, 717, 698, 668. 19F-NMR (471 MHz, CDCl3) δ [ppm]: -69.05 (s, 3F). 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ [ppm]: 7.56 (dd, J = 6.1, 3.2 Hz, 1H), 7.39 (tt, J = 3.5, 2.3 Hz, 1H), 6.91 (ddd, J = 9.8, 5.1, 3.3 Hz, 1H), 6.72 (d, J = 15.7 Hz, 1H), 6.44 (ddd, J = 15.1, 10.9, 1.1 Hz, 1H), 6.06 (ddd, J = 9.8, 2.2, 1.4 Hz, 1H), 5.78 (d, J = 10.8 Hz, 1H), 5.71 (dd, J = 15.2, 6.5 Hz, 1H), 5.62 (dd, J = 6.5, 1.5 Hz, 1H), 5.59 (dd, J = 6.5, 1.5 Hz, 1H), 5.39 (ddq, J = 15.5, 5.1, 1.6 Hz, 1H), 5.22 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 5.02 (dt, J = 10.8, 5.4 Hz, 1H), 4.52 (td, J = 8.1, 4.0 Hz, 1H), 4.31 (d, J = 3.0 Hz, 1H), 4.02 (s, 1H), 3.96 (q, J = 2.6 Hz, 1H), 3.93 - 3.87 (m, 1H), 3.37 (d, J = 1.2 Hz, 3H), 2.81 (dq, J = 9.5, 6.9 Hz, 1H), 2.55 - 2.41 (m, 2H), 2.00 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 1.94 (dd, J = 12.6, 3.5 Hz, 2H), 1.79 (d, J = 1.2 Hz, 3H), 1.71 (d, J = 1.1 Hz, 3H), 1.70 (dt, J = 6.5, 1.4 Hz, 3H), 1.64 - 1.60 (m, 1H), 0.93 (d, J = 6.6 Hz, 3H), 0.85 (d, J = 7.1 Hz, 3H). 13C-NMR (126 MHz, CDCl3) δ [ppm]: 165.38, 164.24, 144.93, 139.29, 137.94, 132.68, 130.40, 130.30, 130.23, 129.52, 129.48, 128.65, 128.03, 126.22, 125.94, 125.61, 125.52, 121.75, 78.55, 74.46, 73.64, 70.29, 55.03, 54.92, 53.58, 49.35, 47.98, 39.51, 34.12, 25.77, 25.10, 21.11, 20.50, 18.10, 17.16, 11.26. LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 672.9 [M+H]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 694.332531, C38H48F3NNaO6 [M+Na]+の計算値694.332594, err [ppm] 0.090.
【０１５５】
モッシャーアミド１８：TCL (CH2Cl2:MeOH/98:2) Rf: 0.42 [UV254, CAM], IR (ATR) [cm-1]: 3419, 3328, 2926, 2852, 1722, 1654, 1624, 1577, 1534, 1503, 1450, 1380, 1343, 1260, 1245, 1164, 1104, 1088, 1056, 1020, 966, 917, 905, 892, 814, 801, 767, 733, 713, 697, 662. 19F-NMR (471 MHz, CDCl3) δ [ppm]: -68.80 (s, 3F). 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ [ppm]: 7.56 - 7.50 (m, 2H), 7.40 - 7.33 (m, 3H), 7.22 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.89 (dt, J = 9.8, 4.2 Hz, 1H), 6.68 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 6.33 (ddd, J = 15.1, 10.9, 1.2 Hz, 1H), 6.05 (dt, J = 9.8, 1.8 Hz, 1H), 5.72 (d, J = 12.1 Hz, 1H), 5.71 (dd, J = 14.7, 6.1 Hz, 1H), 5.65 (ddd, J = 15.4, 6.5, 1.3 Hz, 1H), 5.57 (dd, J = 15.3, 7.1 Hz, 1H), 5.43 (ddq, J = 15.5, 6.1, 1.6 Hz, 1H), 5.22 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 4.99 (q, J = 6.9 Hz, 1H), 4.48 - 4.41 (m, 1H), 4.41 (d, J = 6.1 Hz, 1H), 4.02 (s, 1H), 4.00 (s, 1H), 3.96 (dt, J = 12.2, 2.7 Hz, 1H), 3.45 (d, J = 1.3 Hz, 3H), 2.78 (dq, J = 9.9, 6.8 Hz, 1H), 2.49 - 2.43 (m, 2H), 1.98 (dd, J = 7.1, 4.4 Hz, 2H), 1.96 - 1.89 (m, 3H), 1.79 (d, J = 1.2 Hz, 3H), 1.70 (dt, J = 6.5, 1.3 Hz, 3H), 1.63 (d, J = 1.1 Hz, 3H), 0.92 (d, J = 9.0 Hz, 3H), 0.90 (d, J = 9.5 Hz, 3H). 13C-NMR (126 MHz, CDCl3) δ [ppm]: 165.95, 164.28, 144.90, 139.39, 137.47, 132.91, 130.69, 130.32, 129.56, 129.48, 128.83, 128.62, 128.39, 127.89, 126.55, 126.00, 125.53, 121.77, 78.91, 74.79, 73.95, 70.45, 55.31, 54.86, 53.58, 49.35, 47.93, 39.53, 34.12, 25.77, 25.10, 21.06, 20.54, 18.08, 17.11, 11.07.
【０１５６】
図３は、モッシャーアミド１８を介する１６位における配置の決定を示す。
１．１．１．３  短い非切断可能リンカーを介して取り付けられた末端アルキンを有する１６−アミノ−ラトジャドンの合成
【化１４】
2020529457.tif 000016
１６Ｒ−アミノ−ラトジャドンメチルカルバメート（１９）  −  メチル（（１Ｓ，２Ｅ，４Ｅ，７Ｒ，８Ｚ，１０Ｅ）−１−（（２Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−４−ヒドロキシ−５−メチル−６−（（Ｅ）−プロパ−１−エン−１−イル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−５，７，９−トリメチル−１１−（（Ｒ）−６−オキソ−３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）ウンデカ−２，４，８，１０−テトラエン−１−イル）カルバメート及び１６Ｓ−アミノ−ラトジャドンメチルカルバメート（２０）  −  メチル（（１Ｒ，２Ｅ，４Ｅ，７Ｒ，８Ｚ，１０Ｅ）−１−（（２Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−４−ヒドロキシ−５−メチル−６−（（Ｅ）−プロパ−１−エン−１−イル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−５，７，９−トリメチル−１１−（（Ｒ）−６−オキソ−３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）ウンデカ−２，４，８，１０−テトラエン−１−イル）カルバメートの合成
【化１５】
2020529457.tif 000017
【０１５７】
６６μＬの乾燥ＣＨ2Ｃｌ2中の１．５ｍｇ（３．２９μｍｏｌ、１．０ｅｑ）の１６Ｒ−アミノ−ラトジャドン１１の溶液に１．０μＬ（７．２４μｍｏｌ、２．２ｅｑ）のＥｔ3Ｎ及び０．２８μＬ（３．６２μｍｏｌ、１．１ｅｑ）のクロロギ酸メチル（乾燥ＣＨ2Ｃｌ2中のストック溶液）を加え、混合物を２３℃で３ｈ撹拌した。混合物を０．１ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2で希釈し、分取薄層クロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ／９８：２、１ｘの展開）により直接精製することにより、薄黄色の固体泡として０．９１ｍｇ（１．７５２μｍｏｌ、５４％）の化合物１９を得た。
【０１５８】
同様に、１６Ｓ−アミノ−ラトジャドン１２の存在下の反応により化合物２０を形成させ、それを薄黄色の固体泡として７４％（２．４ｍｇ）で単離した。
【０１５９】
１６Ｒ−アミノ−ラトジャドンメチルカルバメート（１９）：TCL (CH2Cl2:MeOH/98:2) Rf: 0.21 [UV254, CAM], LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 536.4 [M+H]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 536.298150, C38H48F3NNaO6 [M+Na]+の計算値536.298260, err [ppm] 0.205.
【０１６０】
１６Ｓ−アミノ−ラトジャドンメチルカルバメート（２０）：TCL (CH2Cl2:MeOH/98:2) Rf: 0.21 [UV254, CAM], LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 536.4 [M+Na]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 536.298223, C38H48F3NNaO6 [M+Na]+の計算値536.298260, err [ppm] 0.069.
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（２１）の合成3（3Galibert et al.[60]の手順にしたがって合成した。）
【化１６】
2020529457.tif 000018
【０１６１】
乾燥ＥｔＯＡｃ及び乾燥ジオキサンの６４ｍＬの１：１混合物中の５００ｍｇ（５．０９６ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）の３−ブチン酸（ｂｕｔｙｎｉｃ  ａｃｉｄ）及び５８７ｍｇ（５．０９６ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）のＮ−ヒドロキシスクシンイミドの溶液に０℃で１ポーションで１．０５１ｇ（５．０９６ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）のＤＣＣを加えた。混合物を０℃で５ｈ及び２３℃でさらに１５ｈ撹拌した後に濾過し、濾液を減圧下で濃縮した。残留物をＣＨ2Ｃｌ2／ペンタンから再結晶化して、白色の非晶性固体として８００ｍｇ（４．１００ｍｍｏｌ、８０％）の２１を得た。
【０１６２】
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（２１）：1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ [ppm]: 2.86 (dd, J = 8.2, 6.7 Hz, 2H), 2.82 (s, 4H), 2.60 (ddd, J = 8.6, 6.7, 2.7 Hz, 2H), 2.03 (t, J = 2.7 Hz, 1H).  13C-NMR (126 MHz, CDCl3) δ [ppm] 169.27, 167.39, 81.23, 70.43, 30.70, 25.97, 14.49.
化合物２２  −  Ｎ−（（１Ｒ，２Ｅ，４Ｅ，７Ｒ，８Ｚ，１０Ｅ）−１−（（２Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−４−ヒドロキシ−５−メチル−６−（（Ｅ）−プロパ−１−エン−１−イル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−５，７，９−トリメチル−１１−（（Ｒ）−６−オキソ−３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）ウンデカ−２，４，８，１０−テトラエン−１−イル）ペンタ−４−インアミドの合成
【化１７】
2020529457.tif 000019
【０１６３】
１６７μＬの乾燥ＣＨ2Ｃｌ2中の９．５ｍｇ（１６．６７μｍｏｌ、１．０ｅｑ）の１６Ｒ−アミノ−ラトジャドン１１の溶液に５．５μＬ（５０．０３μｍｏｌ、３．０ｅｑ）のＮＭＭ及び３．６ｍｇ（１８．３４μｍｏｌ、１．１ｅｑ）の４−ペンチン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル[60]を加え、混合物を２３℃で１．５ｈ撹拌した。混合物を０．２５ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2で希釈し、分取薄層クロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ／９８：２、１ｘの展開）により直接精製して、薄黄色の固体泡として５．８ｍｇ（１０．８２μｍｏｌ、６５％）の化合物２２を得た。
【０１６４】
化合物２２：TCL (CH2Cl2:MeOH/98:2) Rf: 0.12 [UV254, CAM], 1H-NMR (700 MHz, CDCl3) δ [ppm]: 6.91 (ddd, J = 9.7, 4.9, 3.6 Hz, 1H), 6.70 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 6.41 (d, J = 11.8 Hz, 1H), 6.39 (dd, J = 10.4, 3.8 Hz, 1H), 6.07 (dt, J = 9.8, 1.7 Hz, 1H), 5.76 (d, J = 10.9 Hz, 1H), 5.70 (dd, J = 15.4, 6.7 Hz, 1H), 5.69 - 5.63 (m, 1H), 5.61 (dd, J = 15.2, 8.0 Hz, 1H), 5.43 (ddt, J = 13.8, 5.9, 1.7 Hz, 1H), 5.22 (d, J = 9.7 Hz, 1H), 5.04 - 4.94 (m, 1H), 4.43 (td, J = 8.3, 3.5 Hz, 1H), 4.37 - 4.26 (m, 1H), 3.96 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 3.87 (dt, J = 12.4, 2.7 Hz, 1H), 2.80 (dq, J = 9.5, 6.9 Hz, 1H), 2.55 - 2.45 (m, 4H), 2.42 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.99 (dd, J = 7.0, 2.0 Hz, 2H), 1.97 (t, J = 2.6 Hz, 1H), 1.78 (d, J = 1.1 Hz, 3H), 1.72 (dt, J = 6.7, 1.3 Hz, 3H), 1.71 - 1.70 (m, 3H), 1.66 - 1.60 (m, 2H), 1.38 (d, J = 14.2 Hz, 1H), 0.93 (d, J = 6.6 Hz, 3H), 0.86 (d, J = 7.1 Hz, 3H). 13C-NMR (176 MHz, CDCl3) δ [ppm] 169.94, 164.26, 144.89, 139.46, 137.22, 130.88, 130.54, 130.02, 129.43, 126.74, 126.30, 126.18, 125.39, 121.77, 83.26, 78.79, 74.56, 74.28, 70.36, 69.43, 54.83, 47.88, 39.63, 35.63, 30.57, 30.54, 30.17, 21.15, 20.52, 18.06, 17.26, 15.07, 11.30. LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 536.9 [M+H]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 558.318041, C33H45NNaO5 [M+Na]+の計算値558.3189994, err [ppm] 1.707.
ブタ−３−イン−１−イル（４−ニトロフェニル）カーボネート（２３）の合成4（4合成はDommerholt et al.の手順に基づいた。）
【化１８】
2020529457.tif 000020
【０１６５】
７１ｍＬの乾燥ＣＨ2Ｃｌ2中の２００ｍｇ（２．８５３ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）のホモアリルアルコールの溶液に０．５８ｍＬ（７．１３４ｍｍｏｌ、２．５ｅｑ）のピリジン及び７１９ｍｇ（３．５６７ｍｍｏｌ、１．２５ｅｑ）のクロロギ酸パラ−ニトロフェニルを加え、混合物を２３℃で４０分間撹拌した。９０ｍＬの飽和ＮＨ4Ｃｌ溶液の添加により混合物をクエンチし、ＣＨ2Ｃｌ2（３ｘ９０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。残留物をシリカゲルを通じたフラッシュ−クロマトグラフィー（石油エーテル：ＥｔＯＡｃ／９５：５−９：１）により精製して、白色の非晶性固体として５７０ｍｇ（２．４２３ｍｍｏｌ、８５％）の２２を得た。
【０１６６】
ブタ−３−イン−１−イル（４−ニトロフェニル）カーボネート（２３）：TCL （石油エーテル：ＥｔＯＡｃ／９：１） Rf: 0.24 [UV254], 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ [ppm]: 8.55 - 7.98 (m, 2H), 7.48 - 7.32 (m, 2H), 4.40 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 2.68 (td, J = 6.7, 2.7 Hz, 2H), 2.08 (t, J = 2.7 Hz, 1H). 13C-NMR (126 MHz, CDCl3) δ [ppm] 155.55, 152.39, 145.62, 125.48, 121.89, 79.06, 70.81, 66.81, 19.13.
化合物２４  −  ブタ−３−イン−１−イル（（１Ｒ，２Ｅ，４Ｅ，７Ｒ，８Ｚ，１０Ｅ）−１−（（２Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−４−ヒドロキシ−５−メチル−６−（（Ｅ）−プロパ−１−エン−１−イル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−５，７，９−トリメチル−１１−（（Ｒ）−６−オキソ−３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）ウンデカ−２，４，８，１０−テトラエン−１−イル）カルバメートの合成
【化１９】
2020529457.tif 000021
【０１６７】
８８μＬの乾燥ＣＨ2Ｃｌ2中の４．０ｍｇ（８．７７μｍｏｌ、１．０ｅｑ）の１６Ｒ−アミノ−ラトジャドン１１の溶液に２．９μＬ（２６．３４μｍｏｌ、３．０ｅｑ）のＮＭＭ及び２．３ｍｇ（９．６５７μｍｏｌ、１．１ｅｑ）のブタ−３−イン−１−イル（４−ニトロフェニル）カーボネート２３を加え、混合物を２３℃で２４ｈ撹拌した。混合物を０．２５ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2で希釈し、分取薄層クロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ／９８：２、１ｘの展開）により直接精製して、薄黄色の固体泡として４．４ｍｇ（７．９０μｍｏｌ、９０％）の化合物２４を得た。
【０１６８】
化合物２４：TCL (CH2Cl2:MeOH/98:2) Rf: 0.15 [UV254, CAM], IR (ATR) [cm-1]: 3442, 3309, 3034, 2963, 2923, 1718, 1653, 1605, 1566, 1497, 1437, 1361, 1335, 1291, 1246, 1136, 1081,. 1056, 1013, 967, 937, 918, 883, 816, 776, 722, 683, 651.1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ [ppm]: 6.94 - 6.87 (m, 1H), 6.72 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 6.39 (dd, J = 15.1, 10.8 Hz, 1H), 6.07 (dt, J = 9.8, 1.8 Hz, 1H), 5.78 (d, J = 10.9 Hz, 1H), 5.76 - 5.67 (m, 1H), 5.66 (ddd, J = 15.4, 6.5, 1.4 Hz, 1H), 5.59 (dd, J = 15.1, 8.2 Hz, 1H), 5.49 - 5.36 (m, 2H), 5.23 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 5.09 - 4.97 (m, 1H), 4.35 (d, J = 5.5 Hz, 1H), 4.16 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 4.08 (s, 1H), 3.99 - 3.95 (m, 1H), 3.91 (dt, J = 12.3, 2.7 Hz, 1H), 3.49 (s, 1H), 2.88 - 2.70 (m, 1H), 2.55 - 2.45 (m, 4H), 2.10 - 1.94 (m, 3H), 1.79 (d, J = 1.2 Hz, 3H), 1.74 - 1.69 (m, 6H), 1.65 - 1.58 (m, 1H), 1.51 (s, 1H), 1.36 (d, J = 13.9 Hz, 1H), 0.92 (d, J = 6.6 Hz, 3H), 0.85 (d, J = 7.1 Hz, 3H). 13C-NMR (126 MHz, CDCl3) δ [ppm] 164.06, 155.38, 144.70, 139.28, 137.31, 130.35, 130.20, 129.71, 129.20, 126.75, 126.27, 125.93, 125.37, 121.61, 78.50, 74.34, 70.15, 69.70, 62.52, 56.81, 47.78, 39.51, 30.37, 30.22, 30.00, 20.88, 20.36, 19.39, 17.88, 16.99, 11.14. LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 552.4 [M+H]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 552.332090, C33H46NO6 [M+H]+の計算値552.331965, err [ppm] -0.228.
化合物２５  −  ブタ−３−イン−１−イル（（１Ｓ，２Ｅ，４Ｅ，７Ｒ，８Ｚ，１０Ｅ）−１−（（２Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−４−ヒドロキシ−５−メチル−６−（（Ｅ）−プロパ−１−エン−１−イル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−５，７，９−トリメチル−１１−（（Ｒ）−６−オキソ−３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）ウンデカ−２，４，８，１０−テトラエン−１−イル）カルバメートの合成
【化２０】
2020529457.tif 000022
【０１６９】
１１０μＬの乾燥ＣＨ2Ｃｌ2中の５．０ｍｇ（１０．９７μｍｏｌ、１．０ｅｑ）の１６Ｓ−アミノ−ラトジャドン１１の溶液に７．２μＬ（６５．８２μｍｏｌ、６．０ｅｑ）のＮＭＭ及び２．８４ｍｇ（１２．０７μｍｏｌ、１．１ｅｑ）のブタ−３−イン−１−イル（４−ニトロフェニル）カーボネート２３を加え、混合物を２３℃で２０ｈ撹拌した。混合物を０．２５ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2で希釈し、分取薄層クロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ／９８：２、１ｘの展開）により直接精製して、薄黄色の固体泡として４．４ｍｇ（７．９０μｍｏｌ、９０％）の化合物２５を得た。
【０１７０】
化合物２５：TCL (CH2Cl2:MeOH/98:2) Rf: 0.16 [UV254, CAM],1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ [ppm] 6.90 (dt, J = 9.7, 4.2 Hz, 1H), 6.67 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 6.38 (dd, J = 14.7, 11.1 Hz, 1H), 6.10 - 6.00 (m, 1H), 5.74 (d, J = 11.0 Hz, 1H), 5.72 - 5.68 (m, 1H), 5.65 (dd, J = 14.8, 7.2 Hz, 1H), 5.59 (dd, J = 15.2, 7.5 Hz, 1H), 5.40 (dd, J = 15.4, 4.0 Hz, 1H), 5.25 (s, 1H) 5.22 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 4.99 (q, J = 7.3 Hz, 1H), 4.39 (s, 1H), 4.23 - 4.12 (m, 2H), 4.05 (s, 1H), 4.02 - 3.96 (m, 1H), 3.88 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 2.77 (dt, J = 13.7, 6.9 Hz, 1H), 2.52 (td, J = 6.7, 2.6 Hz, 2H), 2.49 - 2.44 (m, 2H), 2.04 - 1.94 (m, 3H), 1.87 - 1.80 (m, 1H), 1.79 (s, 3H), 1.73 - 1.68 (m, 6H), 1.67 - 1.59 (m, 1H), 1.45 (d, J = 14.2 Hz, 1H), 0.92 (d, J = 6.6 Hz, 3H), 0.88 (d, J = 7.1 Hz, 3H). 13C-NMR (126 MHz, CDCl3) δ [ppm] 164.31, 156.17, 144.89, 139.45, 137.17, 130.76, 130.34, 129.52, 129.47, 128.28, 126.32, 126.16, 125.47, 121.78, 80.60, 78.96, 74.53, 74.09, 70.47, 69.85, 62.70, 56.99, 47.97, 39.58, 30.63, 30.58, 30.23, 21.12, 20.52, 19.56, 18.07, 17.13, 11.36.LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 552.4 [M+H]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 552.332174, C33H46NO6 [M+H]+の計算値552.331965, err [ppm] 0.038.
１．１．１．４  細胞内切断可能なＶａｌ−Ｃｉｔリンカーを介して取り付けられた末端アルキン及びシクロオクチンを有する１６−アミノ−ラトジャドンの合成
【化２１】
2020529457.tif 000023
Ｆｍｏｃ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＯＨ（２６）  −  （９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル（Ｓ）−（１−（（４−（ヒドロキシメチル）フェニル）アミノ）−１−オキソ−５−ウレイドペンタン−２−イル）カルバメートの合成[61]
【化２２】
2020529457.tif 000024
【０１７１】
アルゴン雰囲気下−４０℃で維持した２０ｍＬの乾燥ＴＨＦ中の１．０ｇ（２．５１６ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）のＦｍｏｃ−Ｃｉｔ−ＯＨの溶液に３０４μＬ（２．７６８ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ）のＮＭＭ及び３５８μＬ（２．７６８ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ）のイソ−クロロギ酸ブチルを加えた。混合物を−４０℃で３ｈ撹拌した後、さらに３３２μＬ（３．０１９ｍｍｏｌ、１．２ｅｑ）のＮＭＭ及び３７２ｍｇ（３．０１９ｍｍｏｌ、１．２ｅｑ）のパラ−アミノベンジルアルコールを加えた。混合物を−４０℃でさらに１ｈ撹拌した後、２０ｈの期間にわたり２３℃に温めた。反応混合物を減圧下で濃縮し、シリカゲルを通じたフラッシュクロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ／９５：５−９：１−８：２）により固体残留物を精製して、非晶性の薄黄色の固体として１．２６４ｇ（２．５１５ｍｍｏｌ、１００％）のＦｍｏｃ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＯＨ  ２６を得た。
【０１７２】
Ｆｍｏｃ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＯＨ（２６）5：TCL (CH2Cl2:MeOH/95:5) Rf: 0.10 [UV254, CAM], IR (ATR) [cm-1]: 3280, 3128, 3063, 2923, 2864, 1689, 1653, 1600, 1568, 1532, 1478, 1450, 1414, 1387, 1334, 1281, 12551, 1231, 1164, 1153, 1116, 1103, 1085, 1044, 1033, 1016, 989, 938, 823, 797, 778, 756, 737, 701, 674, 662, 640, 610. 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: 9.98 (s, 1H), 7.89 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.75 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 7.67 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.56 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.42 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 7.33 (q, J = 6.8 Hz, 2H), 7.24 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 5.99 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 5.43 (s, 2H), 5.10 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 4.43 (d, J = 5.6 Hz, 2H), 4.30 - 4.25 (m, 2H), 4.25 - 4.20 (m, 1H), 4.20 - 4.13 (m, 1H), 3.11 - 2.99 (m, 1H), 3.01 - 2.87 (m, 1H), 1.74 - 1.63 (m, 2H), 1.65 - 1.54 (m, 2H), 1.53 - 1.44 (m, 2H), 1.43 - 1.34 (m, 2H). 13C-NMR (126 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: 170.98, 158.90, 156.10, 143.88, 143.79, 140.70, 137.57, 137.39, 127.64, 127.64, 127.08, 127.06, 126.91, 125.36, 120.10, 120.10, 118.85, 66.05, 65.67, 62.60, 55.03, 54.95, 46.66, 46.07, 29.34, 26.93. LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 503.3[M+H]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 503.2294, の計算値503.2289 C28H31N4O5 [M+H]+, err [ppm] -1.00.（5得られた分析データは、以前に刊行されたデータ[61]と完全に一致した。）
Ｈ2Ｎ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＯＨ（２７）  −  （Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−アミノ−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−（４−（ヒドロキシメチル）フェニル）−５−ウレイドペンタンアミドの合成
【化２３】
2020529457.tif 000025
【０１７３】
３．９ｍＬの乾燥ＤＭＦ中の１００ｍｇ（０．１９９ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）のＦｍｏｃ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＯＨ  ２６の溶液に３１８μＬ（１．６ｍＬ／ｍｍｏｌの２６）のピペリジンを加え、混合物を２３℃で３ｈ撹拌した後（ＴＣＬ（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ／９：１）Ｒf：０．０５［Ｎｉｎ］）、混合物を１０ｍＬのトルエンで希釈し、減圧下で濃縮し、１０ｍＬのトルエンと３回共蒸発させた。未加工の固体Ｈ2Ｎ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＯＨを９００μＬの乾燥ＤＭＦに再溶解させ、１４２μＬ（０．７９５６ｍｍｏｌ、４．０ｅｑ）のＤｉＰＥＡと共に２３℃で９００μＬの乾燥ＤＭＦ中の１０１ｍｇ（０．１９９ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）のＦｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＰｆｐの溶液に加えた。混合物を２３℃で２４ｈ撹拌した後（ＴＣＬ（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ／８：２）Ｒf：０．１５［ＵＶ254、ＣＡＭ］）、３１８μＬ（１．６ｍＬ／ｍｍｏｌの２６）のピペリジンを加え、混合物を２３℃で１ｈ撹拌した。混合物を１０ｍＬのトルエンで希釈し、減圧下で濃縮し、１０ｍＬのトルエンと３回共蒸発させた。結果として得られた残留物をシリカゲルを通じたフラッシュクロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ／１：０−９５：５−９：１−８：２）により精製して、非晶性の薄黄色の固体として７０ｍｇ（０．１８５ｍｍｏｌ、９３％）のＨ2Ｎ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＯＨ  ２７を得た。
【０１７４】
Ｈ2Ｎ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＯＨ（２７）：TCL (CH2Cl2:MeOH/8:2) Rf: 0.05 [UV254, CAM], 1H-NMR (500 MHz, MeOD-d4) δ [ppm]: 7.54 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.30 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 4.56 (s, 2H), 4.58 - 4.51 (m, 1H), 3.27 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 3.21 (dt, J = 13.8, 7.0 Hz, 1H), 3.16 - 3.08 (m, 1H), 2.08 - 1.96 (m, 1H), 1.94 - 1.84 (m, 1H), 1.83 - 1.68 (m, 2H), 1.69 - 1.50 (m, 2H), 1.00 (d, J = 6.9 Hz, 3H), 0.94 (d, J = 6.8 Hz, 3H). 13C-NMR (126 MHz, MeOD-d4) δ [ppm]: 175.88, 172.35, 162.33, 138.74, 138.65, 128.60, 121.20, 64.82, 61.19, 54.83, 33.19, 30.68, 27.86, 19.68, 17.78. LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 380.3 [M+H]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 380.229231, C18H30N5O4 [M+H]+の計算値380.229231, err [ppm] -0.071.
ＢＣＮ−Ｏ（ＣＯ）Ｏ（４−ＮＯ2−Ｐｈ）（２８）  −  （（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）−ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イル）メチル（４−ニトロフェニル）カーボネートの合成
【化２４】
2020529457.tif 000026
【０１７５】
１６．６ｍＬの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２中の１００ｍｇ（０．６６６ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）の（（１Ｒ，８Ｓ，９Ｓ）−ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イル）メタノールの溶液に１３４μＬ（１．６６４ｍｍｏｌ、２．５ｅｑ）のピリジン及び１６８ｍｇ（０．８３１ｍｍｏｌ、１．２５ｅｑ）のクロロギ酸４−ニトロフェニルを加え、混合物を２３℃で２０分間攪拌した後、２０ｍＬの飽和塩化アンモニウム溶液の添加によりクエンチした。混合物をＣＨ2Ｃｌ2（３ｘ２０ｍＬ）で抽出し、合わせた有機層をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。残留物をシリカゲルを通じたフラッシュクロマトグラフィー（ＰＥ：ＥｔＯＡｃ／９５：５−９：１）により精製して、高粘性液として１９６ｍｇ（０．６２１５ｍｍｏｌ、９３％）の２８を得、それをゆっくり固化させて非晶性の白色固体を得た。
【０１７６】
ＢＣＮ−Ｏ（ＣＯ）Ｏ（４−ＮＯ2−Ｐｈ）（２８）：TCL (PE:EtOAc/9:1) Rf: 0.50 [UV254, CAM], IR (ATR) [cm-1]: 2918, 2852, 1760, 1616, 1595, 1523, 1492, 1470, 1440, 1354, 1340, 1323, 1247, 1203, 1164, 1139, 1108, 1056, 1027, 1013, 989, 944, 921, 859, 817, 776, 733, 703, 670, 628. 1H-NMR (700 MHz, CDCl3) δ [ppm]: 8.29 - 8.24 (m, 2H), 7.44 - 7.35 (m, 2H), 4.38 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 2.36 - 2.26 (m, 4H), 2.25 - 2.19 (m, 2H), 1.64 - 1.54 (m, 2H), 1.49 (p, J = 8.6 Hz, 1H), 1.09 - 0.99 (m, 2H). 13C-NMR (176 MHz, CDCl3) δ [ppm]: 155.73, 152.70, 145.49, 125.45, 121.91, 98.85, 68.16, 29.18, 21.50, 20.65, 17.38.
ＢＣＮ−Ｏ（ＣＯ）ＨＮ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＯＨ（２９）  −  （Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−アミノ−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−（４−（ヒドロキシメチル）フェニル）−５−ウレイドペンタンアミドの合成
【化２５】
2020529457.tif 000027
【０１７７】
２．６５ｍＬの乾燥ＤＭＦ中の１００ｍｇ（０．２６４ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）のＨ2Ｎ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＯＨ  ２７の溶液に８７μＬ（０．７９１ｍｍｏｌ、３．０ｅｑ）のＮＭＭ及び２．６５ｍＬの乾燥ＤＭＦ中の８７ｍｇ（０．２７７ｍｍｏｌ、１．０５ｅｑ）のＢＣＮ−Ｏ（ＣＯ）Ｏ（４−ＮＯ2−Ｐｈ）２８の溶液を加え、混合物を２３℃で２４ｈ撹拌した後、５０ｍＬの飽和塩化アンモニウム溶液の添加により反応を停止させた。混合物をＥｔＯＡｃ（３ｘ２０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させ、減圧下で濃縮し、１０ｍＬのトルエンと２回共蒸発させた。結果として得られた固体残留物をシリカゲルを通じたフラッシュクロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ／９５：５−９：１−８：２）により精製して、非晶性の白色固体として１３２ｍｇ（０．２３８ｍｍｏｌ、９０％）のＢＣＮ−Ｏ（ＣＯ）ＨＮ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＯＨ  ２９を得た。
【０１７８】
ＢＣＮ−Ｏ（ＣＯ）ＨＮ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＯＨ（２９）：TCL (CH2Cl2:MeOH/9:1) Rf: 0.21 [UV254, CAM], IR (ATR) [cm-1]: 3444, 3271, 2925, 2853, 2604, 2468, 1694, 1637, 1516, 1439, 1417, 1381, 1335, 1301, 1238, 1172, 1139, 1120, 1090, 1027, 911, 864, 825, 770, 734, 696, 670, 582, 554. 1H-NMR (500 MHz, MeOD-d4) δ [ppm]: 7.56 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.30 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 4.56 (s, 2H), 4.52 (dd, J = 8.9, 5.1 Hz, 1H), 4.17 (dd, J = 8.1, 1.5 Hz, 2H), 3.95 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 3.20 (dt, J = 13.8, 7.0 Hz, 1H), 3.11 (dt, J = 13.5, 6.7 Hz, 1H), 2.33 - 2.19 (m, 3H), 2.19 - 2.10 (m, 2H), 2.10 - 2.03 (m, 1H), 1.92 (td, J = 14.3, 6.1 Hz, 1H), 1.75 (ddp, J = 14.1, 9.7, 4.9 Hz, 1H), 1.58 (dtd, J = 16.1, 10.9, 9.8, 6.8 Hz, 4H), 1.40 (p, J = 8.4 Hz, 1H), 0.99 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.96 (d, J = 6.8 Hz, 2H). 13C-NMR (126 MHz, MeOD-d4) δ [ppm]: 174.50, 172.14, 162.31, 159.17, 138.74, 128.57, 121.20, 120.41, 99.47, 64.83, 64.15, 62.30, 54.87, 40.30, 31.83, 30.50, 30.13, 27.84, 21.92, 21.42, 19.79, 18.92, 18.66. LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 556.4 [M+H]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 556.313070, C29H42N5O6 [M+H]+の計算値556.312961, err [ppm] -0.197.
ＢＣＮ−Ｏ（ＣＯ）ＨＮ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＯ（ＣＯ）Ｏ（４−ＮＯ2−Ｐｈ）（３０）  −  （（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）−ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イル）メチル（（Ｓ）−３−メチル−１−（（（Ｓ）−１−（（４−（（（（４−ニトロフェノキシ）カルボニル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ）−１−オキソ−５−ウレイドペンタン−２−イル）アミノ）−１−オキソブタン−２−イル）カルバメートの合成
【化２６】
2020529457.tif 000028
【０１７９】
４２０μＬの乾燥ＤＭＦ中の７０ｍｇ（０．１２６ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）のＢＣＮ−Ｏ（ＣＯ）ＨＮ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＯＨ  ２９の溶液に３２μＬ（０．１８９ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）のＤｉＰＥＡ及び７７ｍｇ（０．２５２ｍｍｏｌ、２．０ｅｑ）のビス−４−ニトロフェニルカーボネートを加え、混合物を２３℃で１６ｈ撹拌した。反応混合物を３００μＬのＣＨ2Ｃｌ2で希釈し、シリカゲルを通じたフラッシュクロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ／９５：５）により直接精製して、非晶性の白色固体として７８．１ｍｇ（０．１０８ｍｍｏｌ、８６％）のＢＣＮ−Ｏ（ＣＯ）ＨＮ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＯ（ＣＯ）Ｏ（４−ＮＯ2−Ｐｈ）３０を得た。
【０１８０】
ＢＣＮ−Ｏ（ＣＯ）ＨＮ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＯ（ＣＯ）Ｏ（４−ＮＯ2−Ｐｈ）（３０）：TCL (CH2Cl2:MeOH/9:1) Rf: 0.62 [UV254], 1H-NMR (500 MHz, MeOD-d4) δ [ppm]: 8.33 - 8.26 (m, 2H), 7.68 - 7.60 (m, 2H), 7.50 - 7.43 (m, 2H), 7.43 (s, 2H), 5.26 (s, 2H), 4.54 (dt, J = 9.1, 3.9 Hz, 1H), 4.17 (dd, J = 8.1, 6.2 Hz, 2H), 3.95 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 3.20 (dq, J = 15.0, 8.1, 7.5 Hz, 1H), 3.11 (dt, J = 13.5, 6.6 Hz, 1H), ), 2.29 - 2.00 (m, 7H), 1.98 - 1.86 (m, 0H), 1.75 (dqd, J = 14.2, 9.3, 4.9 Hz, 1H), 1.67 - 1.49 (m, 4H), 1.39 (p, J = 8.6 Hz, 1H), 0.99 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.96 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.94 - 0.89 (m, 1H). 13C-NMR (126 MHz, MeOD-d4) δ [ppm]: 202.71, 200.46, 190.48, 187.35, 185.31, 182.15, 175.05, 168.38, 160.13, 158.69, 154.41, 151.45, 149.34, 127.64, 99.74, 92.31, 90.51, 83.05, 68.43, 59.97, 58.59, 58.31, 58.28, 56.02, 50.08, 49.57, 47.95, 47.07, 46.85.  LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 721.4 [M+H]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 721.3198819, C36H45N6O10 [M+H]+の計算値721.319168, err [ppm] -0.903.
ＢＣＮ−Ｏ（ＣＯ）ＨＮ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＯ（ＣＯ）ＮＨ−ラトジャ（３１）  −  （（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）−ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イル）メチル（（Ｓ）−１−（（（Ｓ）−１−（（４−（（（（（１Ｒ，２Ｅ，４Ｅ，７Ｒ，８Ｚ，１０Ｅ）−１−（（２Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−４−ヒドロキシ−５−メチル−６−（（Ｅ）−プロパ−１−エン−１−イル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−５，７，９−トリメチル−１１−（（Ｒ）−６−オキソ−３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）ウンデカ−２，４，８，１０−テトラエン−１−イル）カルバモイル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ）−１−オキソ−５−ウレイドペンタン−２−イル）アミノ）−３−メチル−１−オキソブタン−２−イル）カルバメートの合成
【化２７】
2020529457.tif 000029
【０１８１】
２３７μＬの乾燥ＤＭＦ中の１６．２ｍｇ（３５．４８μｍｏｌ、１．０ｅｑ）の１６Ｒ−アミノ−ラトジャドン１１の溶液に２３．４μＬ（０．２１２ｍｍｏｌ、６．０ｅｑ）のＮＭＭ及び２８．１ｍｇ（３９．０３μｍｏｌ、１．１ｅｑ）のＢＣＮ−Ｏ（ＣＯ）Ｏ（４−ＮＯ2−Ｐｈ）２８を加え、混合物を２３℃で２６ｈ撹拌した。反応混合物を１．０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、分取薄層クロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ／９５：５、３ｘの展開）により直接精製して、非晶性の白色固体として２８．０ｍｇ（２６．９９μｍｏｌ、７６％）のＢＣＮ−Ｏ（ＣＯ）ＨＮ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＯ（ＣＯ）ＮＨ−ラトジャ３１を得た。
【０１８２】
ＢＣＮ−Ｏ（ＣＯ）ＨＮ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＯ（ＣＯ）ＮＨ−ラトジャ（３１）：TCL (CH2Cl2:MeOH/95:5) Rf: 0.21 [UV254, CAM], IR (ATR) [cm-1]: 3316, 2963, 2927, 1697, 1657, 1609, 1517, 1451, 1415, 1381, 1311, 1248, 1141, 1057, 1018, 967, 912, 819, 777, 732, 656. 1H-NMR (700 MHz, CDCl3) δ [ppm] 9.24 (s, 1H), 7.57 - 7.47 (m, 2H), 7.24 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 6.91 (s, 1H), 6.71 (d, J = 15.4 Hz, 1H), 6.43 - 6.30 (m, 1H), 6.06 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 5.77 (d, J = 10.8 Hz, 1H), 5.69 (dd, J = 15.7, 6.8 Hz, 1H), 5.67 - 5.55 (m, 3H), 5.39 (dd, J = 15.4, 4.6 Hz, 1H), 5.23 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 5.01 (dq, J = 29.5, 13.4, 11.7 Hz, 3H), 4.69 (s, 1H), 4.33 (s, 1H), 4.20 - 4.12 (m, 1H), 4.08 (s, 2H), 3.92 (s, 1H), 3.88 (d, J = 11.7 Hz, 1H), 3.26 (s, 1H), 3.09 (s, 1H), 2.79 (s, 1H), 2.48 (d, J = 5.8 Hz, 2H), 2.30 - 2.13 (m, 7H), 2.13 - 2.06 (m, 1H), 2.03 - 1.94 (m, 2H), 1.92 - 1.83 (m, 1H), 1.78 (s, 3H), 1.72 - 1.58 (m, 10H), 1.51 (s, 4H), 1.40 - 1.27 (m, 3H), 0.95 (d, J = 5.9 Hz, 3H), 0.92 (d, J = 6.5 Hz, 9H), 0.83 (d, J = 7.1 Hz, 3H). 13C-NMR (176 MHz, CDCl3) δ [ppm]: 172.47, 170.40, 164.57, 161.98, 161.76, 160.52, 157.27, 155.96, 145.30, 139.64, 137.87, 137.40, 132.91, 130.83, 130.44, 129.74, 129.35, 128.91, 127.00, 126.31, 126.11, 125.39, 121.60, 120.20, 120.10, 98.96, 78.96, 74.54, 70.18, 66.37, 63.57, 60.67, 57.03, 53.02, 48.02, 39.48, 31.24, 30.50, 30.38, 30.18, 29.14, 21.55, 21.10, 20.51, 20.31, 19.45, 18.10, 18.05, 17.78, 17.07, 11.31. LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 1038.5 [M+H]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 1037.5958, C58H80N6O11 [M+H]+の計算値1037.5958, err [ppm] 0.0.
ホモプロパルギル−Ｏ（ＣＯ）ＨＮ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＯＨ（３２）  −  ブタ−３−イン−１−イル（（Ｓ）−１−（（（Ｓ）−１−（（４−（ヒドロキシメチル）フェニル）アミノ）−１−オキソ−５−ウレイドペンタン−２−イル）アミノ）−３−メチル−１−オキソブタン−２−イル）カルバメートの合成
【化２８】
2020529457.tif 000030
【０１８３】
１３ｍＬの乾燥ＤＭＦ中の４９５ｍｇ（１．３０４ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）のＨ2Ｎ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＯＨ  ２７の溶液に４３０μＬ（３．９１３ｍｍｏｌ、３．０ｅｑ）のＮＭＭ及び２．６５ｍＬの乾燥ＤＭＦ中の３１０ｍｇ（１．３１８ｍｍｏｌ、１．０１ｅｑ）のブタ−３−イン−１−イル（４−ニトロフェニル）カーボネート２３の溶液を加え、混合物を２３℃で１６ｈ撹拌した後、２２０ｍＬの飽和塩化アンモニウム溶液の添加により反応を停止させた。混合物をＥｔＯＡｃ（３ｘ２２０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させ、減圧下で濃縮し、６０ｍＬのトルエンと２回共蒸発させた。結果として得られた固体残留物をシリカゲルを通じたフラッシュクロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ／９５：５−８：２−１：１）により精製して、非晶性の白色固体としてとして４０９．２ｍｇ（０．８６１ｍｍｏｌ、６６％）のホモプロパルギル−Ｏ（ＣＯ）ＨＮ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＯＨ  ３２を得た。
【０１８４】
ホモプロパルギル−Ｏ（ＣＯ）ＨＮ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＯＨ（３２）：TCL (CH2Cl2:MeOH/9:1) Rf: 0.17 [UV254, CAM], IR (ATR) [cm-1]: 3267, 2960, 2925, 2871, 1690, 1639, 1602, 1535, 1465, 1445, 1415, 1386, 1339, 1295, 1248, 1184, 1136, 1117, 1094, 1075, 1035, 1015, 924, 823, 803, 774, 697, 661, 651, 606. 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: 9.96 (s, 1H), 8.06 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.54 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.23 (d, J = 8.6 Hz, 3H), 5.99 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 5.41 (s, 2H), 5.09 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 4.42 (d, J = 5.6 Hz, 3H), 4.43 - 4.36 (m, 1H), 4.08 - 3.96 (m, 3H), 3.89 (dd, J = 8.6, 7.0 Hz, 1H), 3.01 (dt, J = 13.0, 6.5 Hz, 1H), 2.94 (dq, J = 13.0, 6.4 Hz, 1H), 2.86 (t, J = 2.6 Hz, 1H), 2.47 (dt, J = 6.6, 3.4 Hz, 3H), 1.97 (dq, J = 13.5, 6.7 Hz, 1H), 1.77 - 1.63 (m, 1H), 1.58 (dtd, J = 13.5, 9.5, 4.8 Hz, 2H), 1.51 - 1.27 (m, 4H), 0.87 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.83 (d, J = 6.8 Hz, 3H). 13C-NMR (126 MHz, MeOD-d4) δ [ppm]: 171.13, 170.38, 158.85, 155.94, 137.50, 137.43, 126.92, 118.84, 81.16, 72.48, 62.58, 62.10, 60.07, 53.04, 39.52, 39.35, 39.19, 39.02, 38.57, 30.38, 29.50, 26.77, 19.19, 18.78, 18.18. LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 476.3 [M+H]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 476.250842, C23H34N5O6 [M+H]+の計算値476.250360, err [ppm] -1.012
ホモプロパルギル−Ｏ（ＣＯ）ＨＮ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＯ（ＣＯ）Ｏ（４−ＮＯ2−Ｐｈ）（３３）  −  ブタ−３−イン−１−イル（（Ｓ）−３−メチル−１−（（（Ｓ）−１−（（４−（（（（４−ニトロフェノキシ）カルボニル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ）−１−オキソ−５−ウレイドペンタン−２−イル）アミノ）−１−オキソブタン−２−イル）カルバメートの合成
【化２９】
2020529457.tif 000031
【０１８５】
３５０μＬの乾燥ＤＭＦ中の５０ｍｇ（０．１０５ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）のホモプロパルギル−Ｏ（ＣＯ）ＨＮ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＯＨ  ３２の溶液に２７μＬ（０．１５８ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）のＤｉＰＥＡ及び６３．５ｍｇ（０．２１０、２．０ｅｑ）のビス−４−ニトロフェニルカーボネートを加え、混合物を２３℃で６ｈ撹拌した。反応混合物を３００μＬのＣＨ2Ｃｌ2で希釈し、シリカゲルを通じたフラッシュクロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ／９５：５）により直接精製して、非晶性の薄黄色の固体として４３ｍｇ（０．０６７ｍｍｏｌ、６４％）のホモプロパルギル−Ｏ（ＣＯ）ＨＮ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＯ（ＣＯ）Ｏ（４−ＮＯ2−Ｐｈ）３３を得た。
【０１８６】
ホモプロパルギル−Ｏ（ＣＯ）ＨＮ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＯ（ＣＯ）Ｏ（４−ＮＯ2−Ｐｈ）（３３）：TCL (CH2Cl2:MeOH/95:5) Rf: 0.32 [UV254], 1H-NMR (700 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: 10.12 (s, 1H), 8.38 - 8.23 (m, 2H), 8.11 (dd, J = 15.3, 8.3 Hz, 1H), 7.64 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.59 - 7.50 (m, 2H), 7.41 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.24 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 5.97 (d, J = 5.1 Hz, 1H), 5.41 (s, 2H), 5.24 (s, 1H), 4.48 - 4.35 (m, 1H), 4.02 (tdd, J = 10.5, 6.6, 3.9 Hz, 2H), 3.92 - 3.85 (m, 1H), 3.03 (dq, J = 13.0, 6.6 Hz, 1H), 2.95 (dq, J = 12.9, 6.3 Hz, 1H), 2.86 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 2.30 - 2.09 (m, 1H), 1.97 (dq, J = 13.6, 6.8 Hz, 1H), 1.69 (dt, J = 15.3, 7.7 Hz, 1H), 1.58 (dd, J = 13.5, 4.8 Hz, 1H), 1.44 (ddd, J = 17.4, 12.6, 7.6 Hz, 2H), 1.35 (dd, J = 8.4, 4.7 Hz, 1H), 0.87 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.83 (d, J = 6.7 Hz, 3H). 13C-NMR (176 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: 171.17, 170.71, 158.84, 155.92, 155.26, 151.93, 145.15, 139.34, 129.47, 129.27, 126.16, 125.38, 122.60, 122.58, 119.00, 115.77, 98.93, 81.14, 72.46, 70.22, 67.60, 62.07, 60.00, 53.55, 53.10, 30.36, 29.36, 28.49, 26.77, 20.77, 19.91, 19.16, 18.76, 18.16, 18.06, 16.92, 16.72, 12.45. LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 641.7 [M+H]+.
ホモプロパルギル−Ｏ（ＣＯ）ＨＮ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＯ（ＣＯ）ＮＨ−ラトジャ（３４）  −  ブタ−３−イン−１−イル（（Ｓ）−１−（（（Ｓ）−１−（（４−（（（（（１Ｒ，２Ｅ，４Ｅ，７Ｒ，８Ｚ，１０Ｅ）−１−（（２Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−４−ヒドロキシ−５−メチル−６−（（Ｅ）−プロパ−１−エン−１−イル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−５，７，９−トリメチル−１１−（（Ｒ）−６−オキソ−３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）ウンデカ−２，４，８，１０−テトラエン−１−イル）カルバモイル）−オキシ）メチル）フェニル）アミノ）−１−オキソ−５−ウレイドペンタン−２−イル）アミノ）−３−メチル−１−オキソブタン−２−イル）カルバメートの合成
【化３０】
2020529457.tif 000032
【０１８７】
１２３μＬの乾燥ＤＭＦ中の７．０ｍｇ（１２．２８μｍｏｌ、１．０ｅｑ）の１６Ｒ−アミノ−ラトジャドン１１の溶液に８．１μＬ（７３．７μｍｏｌ、６．０ｅｑ）のＮＭＭ及び８．７ｍｇ（１３．５１μｍｏｌ、１．１ｅｑ）のホモプロパルギル−Ｏ（ＣＯ）Ｏ（４−ＮＯ2−Ｐｈ）３３を加え、混合物を２３℃で３０ｈ撹拌した。反応混合物を１．０ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2で希釈し、分取薄層クロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ：ＥｔＯＡｃ／９：１：１、２ｘの展開）により直接精製して、非晶性の白色固体として７．８ｍｇ（８．１０４μｍｏｌ、６６％）のホモプロパルギル−Ｏ（ＣＯ）ＨＮ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＯ（ＣＯ）ＮＨ−ラトジャ３４を得た。
【０１８８】
ホモプロパルギル−Ｏ（ＣＯ）ＨＮ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＯ（ＣＯ）ＮＨ−ラトジャ（３４）：TCL (CH2Cl2:MeOH/9:1) Rf: 0.49 [UV254, CAM], 1H-NMR (700 MHz, MeOD-d4) δ [ppm]  7.57 (dd, J = 8.8, 2.2 Hz, 2H), 7.36 - 7.25 (m, 2H), 7.02 (ddd, J = 9.8, 5.6, 2.8 Hz, 1H), 6.78 (d, J = 15.7 Hz, 1H), 6.37 (dd, J = 15.2, 10.8 Hz, 1H), 6.01 (ddd, J = 9.8, 2.5, 1.2 Hz, 1H), 5.77 (d, J = 10.9 Hz, 1H), 5.74 (dd, J = 15.6, 6.4 Hz, 1H), 5.67 (ddd, J = 15.4, 6.5, 1.5 Hz, 1H), 5.59 (dd, J = 15.2, 6.9 Hz, 1H), 5.42 (ddd, J = 15.4, 5.6, 1.7 Hz, 1H), 5.22 (d, J = 9.8 Hz, 1H), 5.10 - 5.06 (m, 1H), 5.05 (s, 2H), 4.51 (dd, J = 9.1, 5.2 Hz, 1H), 4.33 (ddt, J = 5.7, 2.8, 1.5 Hz, 1H), 4.18 - 4.08 (m, 3H), 3.96 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 3.86 (q, J = 3.0 Hz, 1H), 3.78 (dd, J = 12.4, 5.5 Hz, 1H), 3.23 - 3.16 (m, 1H), 3.11 (dt, J = 13.4, 6.7 Hz, 1H), 2.89 (dt, J = 16.0, 6.9 Hz, 1H), 2.57 - 2.53 (m, 0H), 2.52 (td, J = 6.7, 2.5 Hz, 3H), 2.45 (ddt, J = 18.5, 10.7, 2.7 Hz, 1H), 2.31 (t, J = 2.7 Hz, 1H), 2.11 - 2.03 (m, 2H), 1.99 (dd, J = 13.3, 8.1 Hz, 1H), 1.94 - 1.87 (m, 2H), 1.79 (d, J = 1.3 Hz, 2H), 1.78 - 1.74 (m, 1H), 1.71 (s, 2H), 1.69 (dt, J = 6.5, 1.5 Hz, 3H), 1.65 - 1.53 (m, 6H), 1.43 (d, J = 14.3 Hz, 1H), 0.98 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.95 (d, J = 6.9 Hz, 3H), 0.94 (d, J = 6.6 Hz, 3H), 0.90 (t, J = 7.1 Hz, 0H), 0.84 (d, J = 7.2 Hz, 3H). 13C-NMR (176 MHz, MeOD-d4) δ [ppm]: 13C NMR (176 MHz, MeOD) δ 174.33, 172.24, 166.71, 162.31, 158.58, 158.30, 147.99, 139.98, 139.32, 138.01, 134.36, 131.81, 131.25, 130.90, 129.51, 128.92, 127.27, 127.08, 126.87, 126.24, 123.27, 121.51, 121.09, 81.09, 80.04, 75.72, 71.07, 70.91, 67.06, 64.21, 62.15, 58.17, 54.94, 40.39, 31.92, 31.56, 30.92, 30.74, 30.46, 30.09, 29.53, 27.84, 21.72, 21.42, 20.60, 19.98, 19.77, 18.59, 18.07, 17.05, 11.55. LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 958.2 [M+H]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 957.532547, C52H72N6O11 [M+H]+の計算値957.533184, err [ppm] 0.662.
１．１．１．５  細胞内切断可能なジスルフィドリンカーを介して取り付けられた末端アルキン及びシクロオクチンを有する１６−アミノ−ラトジャドンの合成
【化３１】
2020529457.tif 000033
２−ＰｙＳＳ（ＣＨ2）2（ＣＯ）ＮＨ−ラトジャ（３５）  −  Ｎ−（（１Ｒ，２Ｅ，４Ｅ，７Ｒ，８Ｚ，１０Ｅ）−１−（（２Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−４−ヒドロキシ−５−メチル−６−（（Ｅ）−プロパ−１−エン−１−イル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−５，７，９−トリメチル−１１−（（Ｒ）−６−オキソ−３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）ウンデカ−２，４，８，１０−テトラエン−１−イル）−３−（ピリジン−２−イルジスルファネイル（ｙｌｄｉｓｕｌｆａｎｅｙｌ））プロパンアミドの合成
【化３２】
2020529457.tif 000034
【０１８９】
ＭｅＣＮ及びＰＢＳの１２６μＬの１：２混合物（１００ｍＭ、ｐＨ＝７．４５）中の２．４ｍｇ（４．２１５μｍｏｌ、１．０ｅｑ）の１６Ｒ−アミノ−ラトジャドン１１の溶液に１．５ｍｇ（４．６４μｍｏｌ、１．１ｅｑ）の３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを加え、混合物を２３℃で３．５ｈ撹拌した後、１ｍＬのＨ2Ｏで希釈し、ＣＨ2Ｃｌ2（３ｘ１．５ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。残留物を分取薄層クロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ／９５：５）により精製して、非晶性の白色固体として２．７ｍｇ（４．１３５μｍｏｌ、９８％）の２−ＰｙＳＳ（ＣＨ2）2（ＣＯ）ＮＨ−ラトジャ３５を得た。
【０１９０】
２−ＰｙＳＳ（ＣＨ2）2（ＣＯ）ＮＨ−ラトジャ（３５）：TCL (CH2Cl2:MeOH/95:5) Rf: 0.22 [UV254, CAM], 1H-NMR (500 MHz, ベンゼン-d6) δ [ppm] 8.33 (ddd, J = 4.8, 1.8, 0.9 Hz, 1H), 7.42 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 6.98 (ddd, J = 8.1, 7.5, 1.9 Hz, 1H), 6.83 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 6.72 (ddd, J = 15.2, 10.9, 1.0 Hz, 1H), 6.64 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 6.48 (ddd, J = 7.4, 4.8, 1.0 Hz, 1H), 5.99 (dd, J = 15.2, 7.3 Hz, 1H), 5.94 - 5.88 (m, 2H), 5.80 (ddd, J = 9.8, 2.5, 1.0 Hz, 1H), 5.73 - 5.62 (m, 1H), 5.52 - 5.42 (m, 2H), 5.12 (d, J = 9.7 Hz, 1H), 4.90 (td, J = 8.0, 4.1 Hz, 1H), 4.56 (d, J = 5.8 Hz, 1H), 4.45 - 4.36 (m, 1H), 4.07 (ddd, J = 12.3, 3.9, 2.4 Hz, 1H), 3.57 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 2.92 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.84 - 2.71 (m, 2H), 2.27 (td, J = 6.6, 3.2 Hz, 2H), 1.98 - 1.85 (m, 2H), 1.68 (d, J = 1.1 Hz, 3H), 1.68 - 1.67 (m, 3H), 1.57 (dt, J = 6.5, 1.2 Hz, 3H), 1.56 - 1.53 (m, 1H), 1.52 - 1.48 (m, 2H), 1.26 (d, J = 14.1 Hz, 2H), 0.91 (d, J = 6.6 Hz, 3H), 0.82 (d, J = 7.2 Hz, 3H). 13C-NMR (126 MHz, ベンゼン-d6) δ [ppm]: 169.79, 163.67, 161.09, 150.27, 144.23, 139.44, 137.10, 136.84, 131.75, 130.88, 130.33, 129.96, 127.34, 126.61, 126.20, 122.12, 120.86, 120.07, 78.44, 75.42, 75.28, 70.47, 55.59, 48.34, 40.07, 36.19, 35.80, 31.38, 31.18, 30.57, 30.19, 21.77, 20.86, 18.35, 17.66, 11.76. LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 653.9 [M+H]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 653.3077, C36H48N2O5S2 [M+H]+の計算値653.3077, err [ppm] 0.0.
２−ＰｙＳＳ（ＣＨ2）2ＮＨ2（３６）  −  ２−（ピリジン−２−イルジスルファネイル）エタン−１−アミン塩酸塩の合成6（6合成はＶｕ  ｅｔ  ａｌ．[70]の手順に基づいた。）
【化３３】
2020529457.tif 000035
【０１９１】
アルゴン雰囲気下５．３ｍＬの脱気した乾燥ＭｅＯＨ中の１．０ｇ（８．８０２ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）の２−アミノチオエタノール塩酸塩の溶液にシリンジポンプを使用して２３℃で１ｈの期間にわたり１０．６ｍＬの脱気した乾燥ＭｅＯＨ中の５．０ｇ（２２．６９５ｍｍｏｌ、２．５ｅｑ）の２，２’−ジピリジルジスルフィドの溶液を加えた。結果として得られた混合物を２３℃で２４ｈ撹拌した。氷冷したＥｔ2Ｏ（３００ｍＬ）を混合物に加えたところ、白色沈殿が形成され、これを回収し、氷冷したＥｔ2Ｏで洗浄し、ＨＶ中で乾燥して、白色固体として１．４７８ｇ（６．６３４ｍｍｏｌ、７５％）の３６を得た。
【０１９２】
２−ＰｙＳＳ（ＣＨ2）2ＮＨ2（３６）：1H-NMR (700 MHz, MeOD-d4) 8.54 (ddd, J = 4.9, 1.8, 0.9 Hz, 1H), 7.95 - 7.72 (m, 1H), 7.65 (dt, J = 8.1, 0.9 Hz, 1H), 7.31 (ddd, J = 7.4, 4.9, 1.0 Hz, 1H), 3.30 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 3.14 (t, J = 6.2 Hz, 2H). δ [ppm] 13C-NMR (176 MHz, MeOD-d4) δ [ppm]: 159.48, 150.91, 139.14, 123.30, 122.86, 38.72, 36.85. LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 187.3 [M+H]+.
２−ＰｙＳＳ（ＣＨ2）2ＮＨ−（ＣＯ）（ＣＨ2）2ＣＣＨ（３７）  −  Ｎ−（２−（ピリジン−２−イルジスルファネイル）エチル）ペンタ−４−インアミドの合成
【化３４】
2020529457.tif 000036
【０１９３】
１５．４ｍＬの乾燥ＣＨ2Ｃｌ2中の３００ｍｇ（１．５３７μｍｏｌ、１．０ｅｑ）の４−ペンチン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル[60]の溶液に８０３μＬ（４．６１１ｍｍｏｌ、３．０ｅｑ）のＤｉＰＥＡ及び３４２ｍｇ（１．５３７ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）の２−ＰｙＳＳ（ＣＨ2）2ＮＨ2  ３６を加え、混合物を２３℃で７ｈ撹拌した後、減圧下で濃縮し、結果として得られた残留物をシリカゲルを通じたフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ／３０：１−１５：１−１０：１）により精製して、薄黄色の非晶性固体として２７１．４ｍｇ（１．０１９ｍｍｏｌ、６６％）の３７を得た。
【０１９４】
２−ＰｙＳＳ（ＣＨ2）2ＮＨ−（ＣＯ）（ＣＨ2）2ＣＣＨ（３７）：TCL (EtOAc:MeOH/9:1) Rf: 0.77 [UV254, CAM], 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ [ppm] 8.54 - 8.44 (m, 1H), 7.60 (td, J = 7.9, 1.8 Hz, 1H), 7.49 (dt, J = 8.1, 0.9 Hz, 1H), 7.13 (ddd, J = 7.3, 4.9, 0.8 Hz, 1H), 3.56 (q, J = 5.9 Hz, 2H), 2.95 - 2.86 (m, 2H), 2.53 (tdd, J = 7.2, 2.6, 0.9 Hz, 2H), 2.45 - 2.38 (m, 2H), 1.98 (t, J = 2.6 Hz, 1H). 13C-NMR (126 MHz, CDCl3) δ [ppm]: 171.00, 159.25, 149.95, 137.12, 121.51, 121.36, 83.13, 69.42, 39.10, 37.40, 35.68, 15.07. LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 267.4 [M+H]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 267.062375, C12H15N2OS2 [M+H]+の計算値267.062032, err [ppm] -1.287.
ＨＯ2Ｃ（ＣＨ2）2ＳＳ（ＣＨ2）2ＮＨ−（ＣＯ）（ＣＨ2）2ＣＣＨ（３８）  −  ３−（（２−（ペンタ−４−インアミド）エチル）−ジスルファニル）プロパン酸の合成
【化３５】
2020529457.tif 000037
【０１９５】
アルゴン雰囲気下３．７５ｍＬの乾燥ＭｅＯＨ中の５０ｍｇ（０．１８７７ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）の２−ＰｙＳＳ（ＣＨ2）2ＮＨ−（ＣＯ）（ＣＨ2）2ＣＣＨ  ３７の溶液に１６．４μＬ（０．１８７７ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）の３−メルカプトプロピオン酸を加え、混合物を２３℃で１９ｈ撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、残留物を４００μＬのＭｅＯＨに溶解させ、分取ＨＰＬＣ（Phenomenex Gemini C18 RP-column 00G-4435-PO-AX、５μｍ、１１０Ａ、２５０×２１．２０ｍｍ（９ｍｌ／分）、ＡＣＮ：Ｈ2Ｏ＋ＴＦＡ／５：９５＋０．１％→９５：５＋０．１％、１５分）により精製して、凍結乾燥後に白色の非晶性固体として３７．３ｍｇ（０．１４２７ｍｍｏｌ、７６％）の３８を得た。
【０１９６】
ＨＯ2Ｃ（ＣＨ2）2ＳＳ（ＣＨ2）2ＮＨ−（ＣＯ）（ＣＨ2）2ＣＣＨ（３８）：TCL (EtOAc:MeOH/98:2 + 1% HOAc) Rf: 0.65 [CAM], 1H-NMR (500 MHz, MeOH-d4) 3.49 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 2.93 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 2.82 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 2.69 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 2.49 - 2.44 (m, 2H), 2.41 - 2.36 (m, 2H), 2.26 (t, J = 2.6 Hz, 1H). LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 262.4 [M+H]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 262.056032, C10H16NO3S2 [M+H]+の計算値262.056612, err [ppm] 2.213.
【０１９７】
ＨＣＣ（ＣＨ2）2（ＣＯ）−ＮＨ−（ＣＨ2）2ＳＳ（ＣＨ2）2（ＣＯ）−ＮＨ−ラトジャ（３９）  −  Ｎ−（２−（（３−（（（１Ｒ，２Ｅ，４Ｅ，７Ｒ，８Ｚ，１０Ｅ）−１−（（２Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−４−ヒドロキシ−５−メチル−６−（（Ｅ）−プロパ−１−エン−１−イル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−５，７，９−トリメチル−１１−（（Ｒ）−６−オキソ−３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）ウンデカ−２，４，８，１０−テトラエン−１−イル）アミノ）−３−オキソプロピル）ジスルファネイル）−エチル）ペンタ−４−インアミドの合成
【化３６】
2020529457.tif 000038
【０１９８】
１３１μＬの乾燥ＤＭＦ中の６．９ｍｇ（２６．３４６μｍｏｌ、１．０ｅｑ）のＨＯ2Ｃ（ＣＨ2）2ＳＳ（ＣＨ2）2ＮＨ−（ＣＯ）（ＣＨ2）2ＣＣＨ  ３８の溶液に１４．５μＬ（１３１．７３μｍｏｌ、５．０ｅｑ）のＮＭＭ及び７．９ｍｇ（２６．３４６μｍｏｌ、１．０ｅｑ）のＴＳＴＵを加えた。結果として得られた混合物を２３℃で３０分間攪拌した後、１３１μＬの乾燥ＤＭＦ中の１２．０ｍｇ（２６．３４６μｍｏｌ、１．０ｅｑ）の１６Ｒ−アミノ−ラトジャドン１１の溶液を加え、混合物を２３℃で１６ｈ撹拌した。混合物を２０ｍＬのＨ2Ｏに注ぎ、ＣＨ2Ｃｌ2（３ｘ１０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。残留物を分取薄層クロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ／９８：２）により精製して、薄黄色の非晶性固体として１２．０ｍｇ（１７．１２μｍｏｌ、６５％）の３９を得た。
【０１９９】
ＨＣＣ（ＣＨ2）2（ＣＯ）−ＮＨ−（ＣＨ2）2ＳＳ（ＣＨ2）2（ＣＯ）−ＮＨ−ラトジャ（３９）：TCL (CH2Cl2:MeOH/95:5) Rf: 0.69 [UV254, CAM], 1H-NMR (700 MHz, ベンゼン-d6) δ [ppm] 6.90 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 6.72 - 6.68 (m, 1H), 6.66 (d, J = 15.5 Hz, 1H), 6.42 (t, J = 5.9 Hz, 1H), 6.04 (dd, J = 15.2, 7.2 Hz, 1H), 5.95 (ddd, J = 9.8, 5.7, 2.7 Hz, 1H), 5.93 - 5.90 (m, 1H), 5.80 (ddd, J = 9.7, 2.6, 1.1 Hz, 1H), 5.77 (ddd, J = 15.4, 6.5, 1.5 Hz, 1H), 5.53 - 5.51 (m, 1H), 5.50 - 5.46 (m, 1H), 5.13 (dd, J = 9.9, 1.5 Hz, 1H), 4.90 (dddd, J = 8.8, 7.2, 4.5, 1.2 Hz, 1H), 4.64 (ddd, J = 5.7, 2.8, 1.5 Hz, 1H), 4.43 (dddd, J = 11.2, 7.2, 4.2, 1.1 Hz, 1H), 4.14 (ddd, J = 12.2, 4.7, 2.4 Hz, 1H), 3.75 (d, J = 2.9 Hz, 1H), 3.50 (dq, J = 13.9, 6.1 Hz, 1H), 3.46 - 3.40 (m, 1H), 2.95 - 2.85 (m, 2H), 2.82 (td, J = 9.1, 4.5 Hz, 1H), 2.72 - 2.63 (m, 2H), 2.53 - 2.44 (m, 3H), 2.41 - 2.31 (m, 2H), 2.27 - 2.22 (m, 2H), 1.98 (dd, J = 14.0, 5.5 Hz, 1H), 1.92 (dd, J = 14.0, 8.6 Hz, 1H), 1.86 (t, J = 2.7 Hz, 1H), 1.81 - 1.72 (m, 2H), 1.72 (d, J = 1.3 Hz, 3H), 1.71 (d, J = 1.3 Hz, 3H), 1.61 (dt, J = 6.5, 1.5 Hz, 3H), 1.58 - 1.54 (m, 2H), 1.52 - 1.48 (m, 1H), 0.93 (d, J = 6.6 Hz, 3H), 0.87 (d, J = 7.2 Hz, 3H). 13C-NMR (176 MHz, ベンゼン-d6) δ [ppm]: 171.08, 170.35, 163.75, 144.34, 139.48, 136.41, 131.59, 131.34, 129.93, 129.30, 128.69, 126.89, 126.04, 125.66, 121.63, 83.71, 78.54, 74.99, 74.95, 70.17, 69.60, 55.47, 47.93, 39.75, 38.90, 38.72, 36.61, 35.32, 35.07, 31.17, 30.84, 29.79, 21.59, 20.53, 18.06, 17.41, 15.18, 11.49. LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 699.9 [M+H]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 699.3490, C38H54N2O6S2 [M+H]+の計算値699.3496, err [ppm] -0.857.
１．１．１．６  短い非切断可能リンカーを介して取り付けられた末端アルキンを有する１９−アミノ−ラトジャドンの合成
【化３７】
2020529457.tif 000039
１９−アミノ−ラトジャドン（４０）  −  （６Ｒ）−６−（（１Ｅ，３Ｚ，５Ｒ，７Ｅ，９Ｅ，１１Ｒ）−１１−（（２Ｓ，５Ｓ，６Ｓ）−４−アミノ−５−メチル−６−（（Ｅ）−プロパ−１−エン−１−イル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−１１−ヒドロキシ−５，７−ジメチルウンデカ−１，３，７，９−テトラエン−１−イル）−５，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−オンの合成
【化３８】
2020529457.tif 000040
【０２００】
２．９ｍｇ（３９．５９５μｍｏｌ、２．０ｅｑ）の酢酸アンモニウムを２３℃で３９６μＬの乾燥ＭｅＯＨ中の９．０ｍｇ（１９．７９７μｍｏｌ、１．０ｅｑ）の１９−オキソラトジャドン９の溶液に加え、１５分間撹拌した後、２．５ｍｇ（３９．５９５μｍｏｌ、２．０ｅｑ）のシアノ水素化ホウ素ナトリウムを加え、混合物を２３℃で４ｈ撹拌した後、２００μＬのＡＣＮ：Ｈ2Ｏ＋ＴＦＡ／３０：７０＋０．０５％の添加により反応を停止させた。この混合物をＲＰ分取ＨＰＬＣ（Phenomenex Gemini C18 RP-column 00G-4435-PO-AX、５μｍ、１１０Ａ、２５０×２１．２０ｍｍ、流速：９ｍｌ／分、ＡＣＮ：Ｈ2Ｏ＋ＴＦＡ／１０：９０＋０．１％→９５：５＋０．１％、９０分）により直接精製して、凍結乾燥後に薄黄色の固体泡として６．９ｍｇ（１５．１μｍｏｌ、６８％）の１９−アミノ−ラトジャドン４０を２つのジアステレオ異性体の分離不可能な１：２混合物として得た。
【０２０１】
１９−アミノ−ラトジャドン（４０）：LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 456.3 [M+H]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 456.310615, C28H42NO4 [M+H]+の計算値456.310835, err [ppm] - 0.043.
化合物４１  −  ブタ−３−イン−１−イル（（２Ｓ，３Ｓ，６Ｓ）−６−（（１Ｓ，２Ｅ，４Ｅ，７Ｒ，８Ｚ，１０Ｅ）−１−ヒドロキシ−５，７，９−トリメチル−１１−（（Ｒ）−６−オキソ−３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）ウンデカ−２，４，８，１０−テトラエン−１−イル）−３−メチル−２−（（Ｅ）−プロパ−１−エン−１−イル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）カルバメートの合成
【化３９】
2020529457.tif 000041
【０２０２】
７０μＬの乾燥ＣＨ2Ｃｌ2中の４．０ｍｇ（７．０２μｍｏｌ、１．０ｅｑ）の１９−アミノ−ラトジャドン４０の溶液に２．３１μＬ（２１．０６μｍｏｌ、６．０ｅｑ）のＮＭＭ及び１．８２ｍｇ（７．７２μｍｏｌ、１．１ｅｑ）のブタ−３−イン−１−イル（４−ニトロフェニル）カーボネート２３を加え、混合物を２３℃で３６ｈ撹拌した。混合物を０．２５ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2で希釈し、分取薄層クロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ／９８：２、１ｘの展開）により直接精製して、薄黄色の固体泡として２．４ｍｇ（４．３５μｍｏｌ、６５％）の化合物４１を得た。
【０２０３】
化合物４１：TCL (CH2Cl2:MeOH/98:2) Rf: 0.21 [UV254, CAM], LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 552.9 [M+H]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 574.312547, C33H45NNaO6 [M+Na]+の計算値574.313909, err [ppm] 1.675.
Ｎ−プロパルギル−１９−アミノ−ラトジャドン（４２）  −  （６Ｒ）−６−（（１Ｅ，３Ｚ，５Ｒ，７Ｅ，９Ｅ，１１Ｒ）−１１−ヒドロキシ−３，５，７−トリメチル−１１−（（２Ｓ，５Ｓ，６Ｓ）−５−メチル−６−（（Ｅ）−プロパ−１−エン−１−イル）−４−（プロパ−２−イン−１−イルアミノ）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）ウンデカ−１，３，７，９−テトラエン−１−イル）−５，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−オンの合成
【化４０】
2020529457.tif 000042
【０２０４】
２．５４μＬ（３９．５９５μｍｏｌ、２．０ｅｑ）のプロパルギルアミン及び２．２μＬ（３９．５９５μｍｏｌ、２．０ｅｑ）の酢酸を２３℃で３９６μＬの乾燥ＭｅＯＨ中の９．０ｍｇ（１９．７９７μｍｏｌ、１．０ｅｑ）の１９−オキソラトジャドン９の溶液に加え、１５分間撹拌した後、２．５ｍｇ（３９．５９５μｍｏｌ、２．０ｅｑ）のシアノ水素化ホウ素ナトリウムを加え、混合物を２３℃で４ｈ撹拌した後、２００μＬのＡＣＮ：Ｈ2Ｏ＋ＴＦＡ／３０：７０＋０．０５％の添加により反応を停止させた。この混合物をＲＰ分取ＨＰＬＣ（Phenomenex Gemini C18 RP-column 00G-4435-PO-AX、５μｍ、１１０Ａ、２５０×２１．２０ｍｍ、流速：９ｍｌ／分、ＡＣＮ：Ｈ2Ｏ＋ＴＦＡ／１０：９０＋０．１％→９５：５＋０．１％、９０分）により直接精製して、凍結乾燥後に薄黄色の固体泡として９．７ｍｇ（１９．６４８μｍｏｌ、９９％）のＮ−プロパルギル−１９−アミノ−ラトジャドン４２を２つのジアステレオ異性体の分離不可能な１：２混合物として得た。
【０２０５】
Ｎ−プロパルギル−１９−アミノ−ラトジャドン（４２）：LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 494.7 [M+H]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 494.3268, C31H44NO4 [M+H]+の計算値494.3265, err [ppm] - 0.6.
適切なキャリア分子の合成
１．１．１．７  溶液中の葉酸誘導体の合成
【化４１】
2020529457.tif 000043
メチルＮ2−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ6−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−リジネート（４３）の合成
【化４２】
2020529457.tif 000044
【０２０６】
１０．７ｍＬの乾燥ＤＭＦ中の１．０ｇ（２．１３４ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）のＮ2−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ6−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−リジンの溶液に５９０ｍｇ（４．２６８ｍｍｏｌ、２．０ｅｑ）のＫ2ＣＯ3及び２００μＬ（３．２０１ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）のヨウ化メチルを加え、混合物を２３℃で３．５ｈ撹拌した。反応液をＥｔ2Ｏ（３０ｍＬ）で希釈し、混合物を飽和した水性ＮＨ4Ｃｌ溶液（２ｘ１５０ｍＬ）及びＨ2Ｏ（２ｘ５０ｍＬ）で洗浄した。有機層をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させ、減圧下で濃縮し、ＨＶ中で乾燥させて、薄黄色の固体として８８５ｍｇ（１．８３５ｍｍｏｌ、８６％）の４３を得た。
【０２０７】
Ｎ2−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ6−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−リジネート（４３）：TCL (CH2Cl2:MeOH/95:5) Rf: 0.90 [UV254], IR (ATR) [cm-1]: 3343, 2976, 2951, 2932, 2866, 1653, 1609, 1510, 1478, 1450, 1392, 1366, 1341, 1248, 1211, 1166, 1106, 1081, 1044, 1005, 909, 865, 780, 755, 728, 674, 646, 621. 1H-NMR (700 MHz, CDCl3) δ [ppm]: 7.74 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 7.62 - 7.55 (m, 2H), 7.38 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 7.29 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 5.42 (s, 1H), 4.58 (s, 1H), 4.38 (dt, J = 17.8, 8.6 Hz, 3H), 4.20 (t, J = 6.5 Hz, 1H), 3.73 (s, 3H), 3.09 (s, 2H), 1.83 (s, 1H), 1.68 (s, 1H), 1.41 (s, 9H), 1.52 - 1.29 (m, 5H). 13C-NMR (176 MHz, CDCl3) δ [ppm]: 173.04, 156.18, 156.09, 144.00, 143.85, 141.40, 127.80, 127.17, 125.20, 120.08, 79.26, 67.10, 53.82, 52.52, 47.27, 40.15, 32.22, 29.70, 28.53, 22.47. LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 483.2 [M+H]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 483.2493, C27H34N2O6 [M+H]+の計算値483.2490, err [ppm] -0.600.
メチルＮ2−（（Ｓ）−４−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−５−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−５−オキソペンタノイル）−Ｎ6−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−リジネート（４４）の合成
【化４３】
2020529457.tif 000045
【０２０８】
４．１ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2中の１００ｍｇ（０．２０７ｍｍｏｌ、１．２ｅｑ）のメチルＮ2−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ6−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−リジネート４３の溶液に３３２μＬ（１．６ｍＬ／ｍｍｏｌ）のピペリジンを加え、出発材料が消費されるまで混合物を２３℃で３ｈ撹拌した。混合物をトルエン（１０ｍＬ）で希釈し、濃縮し、減圧下トルエン（３ｘ１０ｍＬ）と共蒸発させた。遊離アミンを含有する残留物を１．２ｍＬの乾燥ＤＭＦに溶解させ、５７ｍＬ（０．５１７ｍｍｏｌ、３．０ｅｑ）のＮＭＭ、７４ｍｇ（０．１７２５ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）の（Ｓ）−４−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−５−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−５−オキソペンタン酸及び２８．２ｍｇ（０．２０７ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）のＨＯＡｔを加え、混合物を０℃に冷却した。３９．７ｍｇ（０．２０７ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）のＥＤＣＩを加え、混合物を２３℃で１２ｈ撹拌した後、５ｍＬのＨ2Ｏに注ぎ、ＥｔＯＡｃ（３ｘ１５ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。残留物をシリカゲルを通じたフラッシュクロマトグラフィー（ＰＥ：ＥｔＯＡｃ／８：２−１：１−０：１）により精製して、無色の非晶性固体として８０ｍｇ（０．１１９７ｍｍｏｌ、５８％）の４４を得た。
【０２０９】
メチルＮ2−（（Ｓ）−４−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−５−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−５−オキソペンタノイル）−Ｎ6−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−リジネート（４４）：TCL (PE:EtOAc/1:1) Rf: 0.16 [UV254], IR (ATR) [cm-1]: 3329, 2977, 2952, 2931, 2868, 171 1663, 1525, 1479, 1451, 1392, 1367, 1346, 1249, 1158, 1105, 1082, 1052, 912, 848, 760, 738, 647, 621, 591, 575, 526. 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ [ppm]: 7.77 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.61 (d, J = 7.3 Hz, 2H), 7.40 (td, J = 7.4, 2.9 Hz, 2H), 7.35 - 7.30 (m, 2H), 6.40 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 5.56 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 4.64 (s, 1H), 4.58 (q, J = 7.6 Hz, 1H), 4.48 - 4.35 (m, 2H), 4.23 (q, J = 7.7, 7.0 Hz, 2H), 3.72 (s, 3H), 3.09 (d, J = 5.7 Hz, 2H), 2.29 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.26 - 2.18 (m, 1H), 1.94 - 1.80 (m, 2H), 1.70 (q, J = 13.4 Hz, 1H), 1.47 (s, 9H), 1.42 (s, 9H), 1.52 - 1.28 (m, 3H), 0.94 - 0.75 (m, 2H).. 13C-NMR (126 MHz, CDCl3) δ [ppm]: 172.97, 171.86, 171.23, 156.50, 156.21, 144.06, 143.83, 141.47, 127.87, 127.23, 125.31, 125.25, 120.14, 120.12, 82.73, 79.24, 67.15, 53.97, 52.52, 52.23, 47.36, 40.16, 32.40, 32.04, 29.69, 29.16, 28.57, 28.15, 22.56. . LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 668.4 [M+H]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 668.354552, C36H50N3O9 [M+H]+の計算値668354157, err [ppm] -0.592
メチルＮ2−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ5−（（Ｓ）−６−（４−アジドベンズアミド）−１−メトキシ−１−オキソヘキサン−２−イル）−Ｌ−グルタミン（４５）の合成
【化４４】
2020529457.tif 000046
【０２１０】
２．９９ｍＬの乾燥ＣＨ2Ｃｌ2中の１００ｍｇ（０．１４９ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）のメチルＮ2−（（Ｓ）−４−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−５−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−５−オキソペンタノイル）−Ｎ6−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−リジネート４４の溶液に２３℃で３４４μＬ（４．４９２ｍｍｏｌ、３０ｅｑ）のＴＦＡを加え、出発材料が完全に消費されるまで混合物を２３℃で２２ｈ撹拌した。反応混合物をトルエン（２０ｍＬ）で希釈し、濃縮し、減圧下トルエン（３ｘ１０ｍＬ）と共蒸発させ、ＨＶ中で乾燥させた。遊離アミンを含有する残留物を８３μＬ（０．７４９ｍｍｏｌ、５．０ｅｑ）のＮＭＭと共に４９９μＬの乾燥ＤＭＦに溶解させ、４９９μＬの乾燥ＤＭＦ中の２６．９ｍｇ（０．１６５ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）の４−アジド安息香酸、８３μＬ（０．７４９ｍｍｏｌ、５．０ｅｑ）のＮＭＭ、２２．４ｍｇ（０．１６５ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）のＨＯＡｔ及び６２．６ｍｇ（０．１６５ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）のＨＡＴＵの予備活性化7させた溶液に加えた（7予備活性化のために混合物を２３℃で３０分間攪拌した。）。結果として得られた溶液を２３℃で３ｈ撹拌した後、トルエン（２０ｍＬ）で希釈し、濃縮し、減圧下トルエン（３ｘ２０ｍＬ）と共蒸発させた。残留物をシリカゲルを通じたフラッシュクロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ：ＨＯＡｃ／９５：４．７５：０．２５）により精製し、生成物含有画分を減圧下トルエンと共蒸発させ、ＨＶ中で乾燥させて、黄色の非晶性固体として８６ｍｇ（０．１３１ｍｍｏｌ、８８％）の４５を得た。
【０２１１】
メチルＮ2−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ5−（（Ｓ）−６−（４−アジドベンズアミド）−１−メトキシ−１−オキソヘキサン−２−イル）−Ｌ−グルタミン（４５）：TCL (PE:EtOAc/1:1) Rf: 0.16 [UV254], IR (ATR) [cm-1]: 3415, 2931, 2860, 2123, 1686, 1641, 1604, 1573, 1537, 1500, 1450, 1281, 1205, 1160, 1132, 1064, 1053, 992, 910, 840, 801, 761, 741, 724, 689, 647, 621. 1H-NMR (500 MHz, MeOD-d4) δ [ppm]: 7.85 - 7.79 (m, 1H), 7.78 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.66 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 7.38 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.30 (td, J = 7.5, 1.0 Hz, 1H), 7.14 - 7.05 (m, 1H), 4.39 (dd, J = 9.1, 5.0 Hz, 1H), 4.38 - 4.26 (m, 1H), 4.20 (t, J = 6.9 Hz, 1H), 4.11 (dd, J = 8.6, 4.6 Hz, 1H), 3.85 - 3.76 (m, 2H), 3.68 (s, 2H), 3.36 (t, J = 6.9 Hz, 1H), 3.01 (s, 2H), 2.32 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 2.17 (td, J = 13.0, 8.0 Hz, 1H), 1.97 - 1.81 (m, 2H), 1.72 (dtd, J = 14.2, 9.3, 5.7 Hz, 1H), 1.62 (dhept, J = 13.6, 6.9 Hz, 2H), 1.51 - 1.38 (m, 2H).. 13C-NMR (126 MHz, MeOD-d4) δ [ppm]: 177.07, 175.41, 174.25, 169.13, 158.42, 145.39, 145.20, 144.73, 142.55, 132.24, 130.14, 128.76, 128.17, 126.27, 126.24, 120.89, 119.95, 67.91, 65.84, 56.03, 55.09, 53.70, 52.64, 48.42, 44.67, 40.63, 33.15, 32.12, 29.95, 29.55, 24.28. LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 657.3 [M+H]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 657.267199, C34H36N6O8 [M+H]+の計算値657.266739, err [ppm] -0.700.
Ｆａ−Ｎ3−１  −  Ｎ2−（４−（（（２−アミノ−４−ヒドロキシプテリジン−６−イル）メチル）アミノ）ベンゾイル）−Ｎ5−（（Ｓ）−４−（（（Ｓ）−６−（４−アジドベンズアミド）−１−メトキシ−１−オキソヘキサン−２−イル）アミノ）−１−カルボキシ−４−オキソブチル）−Ｌ−グルタミンの合成
【化４５】
2020529457.tif 000047
【０２１２】
４５６μＬの乾燥ＤＭＦ中の６０ｍｇ（０．０９１ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）のメチルＮ2−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ5−（（Ｓ）−６−（４−アジドベンズアミド）−１−メトキシ−１−オキソヘキサン−２−イル）−Ｌ−グルタミン４５の溶液に１４６μＬ（１．６ｍＬ／ｍｍｏｌ）のジエチルアミンを加え、混合物を２３℃で２０ｈ撹拌した後、トルエン（２０ｍＬ）で希釈し、濃縮し、減圧下トルエン（３ｘ１０ｍＬ）と共蒸発させ、ＨＶ中で乾燥させて、遊離アミンを含有する残留物を得た。
【０２１３】
並行して、６３ｍｇ（０．５４８ｍｍｏｌ、６．０ｅｑ）のＮ−ヒドロキシスクシンイミド及び１１３ｍｇ（０．５４８ｍｍｏｌ、６．０ｅｑ）のＤＣＣを２．７ｍＬの乾燥ＤＭＳＯ中の２４２ｍｇ（０．５４８ｍｍｏｌ、６．０ｅｑ）の葉酸の溶液に加え、混合物を光排除下２３℃で２４ｈ撹拌して白色懸濁液中の対応するＦＡ−ＮＨＳエステルを形成させた。この懸濁液を次に濾過し、濾液を遊離アミンを含有する残留物（上記）に注いだ。９０μＬ（０．８２３ｍｍｏｌ、９．０ｅｑ）のＮＭＭを加え、混合物を２３℃で１４ｈ撹拌した。混合物を１．２ｍＬのＨ2Ｏで希釈し、Whatman（登録商標）フィルター（４５μｍ）に通して濾過し、ＲＰ分取ＨＰＬＣ（Phenomenex Gemini C18 RP-column 00G-4435-PO-AX、５μｍ、１１０Ａ、２５０×２１．２０ｍｍ、流速：９ｍｌ／分、ＡＣＮ：Ｈ2Ｏ＋ＴＦＡ／１０：９０＋０．１％→９５：５＋０．１％、６０分）で直接精製して、凍結乾燥後に濃黄色固体として３５．３ｍｇ（４１．１μｍｏｌ、４５％）のＦａ−Ｎ3−１を得た。
【０２１４】
Ｆａ−Ｎ3−１：LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 858.3 [M+H]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 858.327991, C38H44N13O11 [M+H]+の計算値858.327776, err [ppm] -0.25
メチルＮ2−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ６−（４−アジドベンゾイル）−Ｌ−リジネート（４６）の合成
【化４６】
2020529457.tif 000048
【０２１５】
１．２ｍＬの乾燥ＴＨＦ中の４０．５ｍｇ（０．２４８ｍｍｏｌ、１．２ｅｑ）の４−アジド安息香酸及び２９．８ｍｇ（０．２５８ｍｍｏｌ、１．２５ｅｑ）のＮ−ヒドロキシスクシンイミドの溶液に５３．４ｍｇ（０．２５８ｍｍｏｌ、１．２５ｅｑ）のＤＣＣを加え、混合物を２３℃で９ｈ撹拌して白色懸濁液中の対応する４−アジド安息香酸ＮＨＳエステルを形成させた。並行して、２３７μＬ（３．１０８ｍｍｏｌ、１５ｅｑ）のＴＦＡを４．２ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2中の１００ｍｇ（０．２０７ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）のメチルＮ2−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ6−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−リジネート４３の溶液に加え、出発材料が消費されるまで混合物を２３℃で３ｈ撹拌した。混合物をトルエン（２０ｍＬ）で希釈し、濃縮し、減圧下トルエン（３ｘ１０ｍＬ）と共蒸発させた。対応する遊離アミンを含有する残留物を０．９ｍＬの乾燥ＴＨＦに溶解させ、１３６．５μＬ（１．２４２ｍｍｏｌ、６．０ｅｑ）のＮＭＭを加え、４−アジド安息香酸ＮＨＳエステルを含有する懸濁液の濾液を加えた。結果として得られた混合物を２３℃で２０ｈ撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、残留物をシリカゲルを通じたフラッシュクロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ／１：０−９７．５：２．５）により精製して、非晶性の黄色固体として９８ｍｇ（０．１８６ｍｍｏｌ、９０％）の４６を得た。
【０２１６】
メチルＮ2−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ6−（４−アジドベンゾイル）−Ｌ−リジネート（４６）：1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ [ppm]: 7.78 - 7.74 (m, 4H), 7.56 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 7.40 (td, J = 7.4, 3.1 Hz, 2H), 7.32 - 7.26 (m, 2H), 6.95 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.36 (s, 1H), 5.54 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 4.43 - 4.34 (m, 2H), 4.30 (dd, J = 10.5, 7.3 Hz, 1H), 4.18 (t, J = 7.1 Hz, 1H), 3.75 (s, 3H), 3.44 (q, J = 6.4 Hz, 2H), 1.93 - 1.84 (m, 1H), 1.80 - 1.59 (m, 4H), 1.46 (dt, J = 16.3, 7.9 Hz, 2H), 1.32 - 1.24 (m, 1H). 13C-NMR (126 MHz, CDCl3) δ [ppm]: 173.02, 166.78, 156.30, 143.91, 143.75, 143.28, 141.40, 131.07, 128.82, 127.87, 127.19, 125.15, 120.14, 119.00, 67.22, 53.55, 52.63, 47.24, 39.71, 32.84, 32.54, 28.86, 25.22, 24.51, 22.62. LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 528.2 [M+H]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 528.224467, C29H30N5O5 [M+H]+の計算値528.224146, err [ppm] -0.608.
Ｆｍｏｃ−（Ａｓｐ（ＯｔＢｕ））3−ＯＨ（４７）  −  （５Ｓ，８Ｓ，１１Ｓ）−５，８，１１−トリス（２−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−２−オキソエチル）−１−（９Ｈ−フルオレン−９−イル）−３，６，９−トリオキソ−２−オキサ−４，７，１０−トリアザドデカン−１２−酸の合成
【化４７】
2020529457.tif 000049
【０２１７】
トリペプチドＦｍｏｃ−（Ａｓｐ（ＯｔＢｕ））3−ＯＨ  ４７の固相合成を、フリットガラスペプチド合成容器を使用してＲａｐｐ  ２−クロロトリチル樹脂（Rapp Polymere、Ｔｕｂｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ、０．９１ｍｍｏｌ／ｇ）上で１００μｍｏｌのスケールで手動で実行した。樹脂への第１のアミノ酸のローディングのために、４ｍＬの乾燥ＤＭＦ中の４１．２ｍｇ（１００μｍｏｌ、１．０ｅｑ）のＦｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ及び１１０μＬ（１．０ｍｍｏｌ、１０ｅｑ）のＮＭＭの溶液を樹脂と２３℃で２４ｈ振盪して反応させた。溶媒を樹脂から除去し、樹脂を４ｍＬの乾燥ＤＭＦ中の１ｍＬのＭｅＯＨ及び２２０μＬ（２．０ｍｍｏｌ、２０ｅｑ）のＮＭＭの溶液と２３℃で１ｈ振盪して反応させた。樹脂をＤＭＦ、ＣＨ2Ｃｌ2及びＤＭＦ（各３ｘ４ｍＬ、２分）で洗浄した。ＤＭＦ中のピペリジンの混合物（Ｐｉｐ：ＤＭＦ／１：４、３ｘ４ｍＬ、１０分）との樹脂の振盪しながらの繰返しの反応並びにＤＭＦ、ＣＨ2Ｃｌ2及びＤＭＦ（各３ｘ４ｍＬ、２分）での樹脂のその後の洗浄によりＦｍｏｃの切断を達成した。アミノ酸の連結は、２３℃で４ｈの連結時間で４ｍＬの乾燥ＤＭＦ中の８４．４ｍｇ（２００μｍｏｌ、２．０ｅｑ）のＦｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、２７．２（２００μｍｏｌ、２．０ｅｑ）のＨＯＡｔ、５５μＬ（６００μｍｏｌ、６．０ｅｑ）のＮＭＭ及び１６５ｍｇ（２００μｍｏｌ、２．０ｅｑ）のＨＡＴＵの予備活性化させた溶液を用いて振盪して行った。その後に樹脂をＤＭＦ、ＣＨ2Ｃｌ2及びＤＭＦ（各３ｘ４ｍＬ、２分）で洗浄した。樹脂からのトリペプチドの切断は、ＣＨ2Ｃｌ2：ＨＦＩＰ／４：１（３ｘ４ｍＬ、１０分）の混合物での樹脂の繰返しの処理により行った。合わせた切断溶液を減圧下で濃縮し、残留物をシリカゲルを通じたフラッシュクロマトグラフィー（ＰＥ：ＥｔＯＡｃ／８：２−１：１）により精製して、白色の非晶性固体としてＦｍｏｃ−（Ａｓｐ（ＯｔＢｕ））3−ＯＨ  ４７を得た。
【０２１８】
Ｆｍｏｃ−（Ａｓｐ（ＯｔＢｕ））3−ＯＨ（４７）：LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 776.3 [M+Na]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 776.3395 , C23H34N5NaO6 [M+Na]+の計算値776.3365, err [ppm] 3.86
（７Ｓ，１０Ｓ，１３Ｓ，１６Ｓ）−１６−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−１−（４−アジドフェニル）−１０，１３−ビス（カルボキシメチル）−７−（メトキシカルボニル）−１，９，１２，１５−テトラオキソ−２，８，１１，１４−テトラアザオクタデカン−１８−酸（４８）の合成
【化４８】
2020529457.tif 000050
【０２１９】
１．６ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２中の５３ｍｇ（９９．５μｍｏｌ、１．５ｅｑ）のメチルＮ2−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ６−（４−アジドベンゾイル）−Ｌ−リジネート４６の溶液に１５９μＬ（１．６ｍＬ／ｍｍｏｌ）のジエチルアミンを加え、混合物を２３℃で９ｈ撹拌した。混合物をトルエン（５ｍＬ）で希釈し、濃縮し、減圧下トルエン（３ｘ５ｍＬ）と共蒸発させ、ＨＶ中で乾燥させた。残留物を２０１μＬの乾燥ＤＭＦに溶解させ、結果として得られた溶液を５０ｍｇ（６０．３μｍｏｌ、１．０ｅｑ）のＦｍｏｃ−（Ａｓｐ（ＯｔＢｕ））3−ＯＨ  ４７、９．９ｍｇ（７２．５μｍｏｌ、１．２ｅｑ）のＨＯＡｔ、４３７μｌ（０．３９７ｍｍｏｌ、６．０ｅｑ）のＮＭＭ及び１３．９ｍｇ（７２．５μｍｏｌ、１．２ｅｑ）のＨＡＴＵの予備活性化8させた混合物に加え、混合物を２３℃で５．５ｈ撹拌した（8予備活性化のために混合物を２３℃で１５分間攪拌した）。混合物を５０ｍＬのＨ2Ｏに注ぎ、Ｅｔ2Ｏ（３ｘ２０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機抽出物をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。残留物をシリカゲルを通じたフラッシュクロマトグラフィー（ＰＥ：ＥｔＯＡｃ／９：１−７：３−１：１−０：１）により精製して、薄黄色の非晶性固体として３５．６ｍｇ（３４．１μｍｏｌ、５２％）の４８を得た。
【０２２０】
（７Ｓ，１０Ｓ，１３Ｓ，１６Ｓ）−１６−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−１−（４−アジドフェニル）−１０，１３−ビス（カルボキシ−メチル）−７−（メトキシカルボニル）−１，９，１２，１５−テトラオキソ−２，８，１１，１４−テトラアザオクタデカン−１８−酸（４８）：TCL (PE:EtOAc/1:1) Rf: 0.19 [UV254, Ninhydrin],  LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 895.3 [M+Na]+.
ＦＡ−Ｎ3−２  −  Ｎ2−（４−（（（２−アミノ−４−ヒドロキシプテリジン−６−イル）メチル）アミノ）ベンゾイル）−Ｎ5−（（Ｓ）−１−（（（Ｓ）−１−（（（Ｓ）−１−（（（Ｓ）−６−（４−アジドベンズアミド）−１−メトキシ−１−オキソヘキサン−２−イル）アミノ）−３−カルボキシ−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ）−３−カルボキシ−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ）−３−カルボキシ−１−オキソプロパン−２−イル）−Ｌ−グルタミンの合成
【化４９】
2020529457.tif 000051
【０２２１】
４６６μＬの乾燥ＣＨ2Ｃｌ2中の２０ｍｇ（０．０２３３ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）の（７Ｓ，１０Ｓ，１３Ｓ，１６Ｓ）−１６−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−１−（４−アジドフェニル）−１０，１３−ビス（カルボキシメチル）−７−（メトキシカルボニル）−１，９，１２，１５−テトラオキソ−２，８，１１，１４−テトラアザオクタデカン−１８−酸４８の溶液に８９μＬ（１．１６６ｍｍｏｌ、５０．０ｅｑ）のＴＦＡを加え、混合物を２３℃で２８ｈ撹拌した。反応液をトルエン（５ｍＬ）で希釈し、濃縮し、減圧下トルエン（３ｘ５ｍＬ）と共蒸発させた。結果として得られた残留物をＨＶ中で乾燥させ、４６６μＬのＣＨ2Ｃｌ2に再溶解させ、７５μＬ（３．２ｍＬ／ｍｍｏｌ）のジエチルアミンを加え、反応混合物を２３℃で２０ｈ撹拌した。混合物をトルエン（５ｍＬ）で希釈し、濃縮し、減圧下トルエン（３ｘ５ｍＬ）と共蒸発させた。未加工の（７Ｓ，１０Ｓ，１３Ｓ，１６Ｓ）−１６−アミノ−１−（４−アジドフェニル）−１０，１３−ビス（カルボキシメチル）−７−（メトキシカルボニル）−１，９，１２，１５−テトラオキソ−２，８，１１，１４−テトラアザオクタデカン−１８−酸を含有する結果として得られた残留物をＨＶ中で乾燥させた。
【０２２２】
並行して、１６ｍｇ（０．１３９８ｍｍｏｌ、６．０ｅｑ）のＮ−ヒドロキシスクシンイミド及び２９ｍｇ（０．１３９８ｍｍｏｌ、６．０ｅｑ）のＤＣＣを６９９μＬの乾燥ＤＭＳＯ中の６２ｍｇ（０．１３９８ｍｍｏｌ、６．０ｅｑ）の葉酸の溶液に加え、混合物を光排除下２３℃で２４ｈ撹拌して、白色懸濁液中の対応するＦＡ−ＮＨＳエステルを形成させた。この懸濁液を次に濾過し、濾液を（７Ｓ，１０Ｓ，１３Ｓ，１６Ｓ）−１６−アミノ−１−（４−アジドフェニル）−１０，１３−ビス（カルボキシメチル）−７−（メトキシカルボニル）−１，９，１２，１５−テトラオキソ−２，８，１１，１４−テトラアザオクタデカン−１８−酸を含有する残留物（上記）に注いだ。２３μＬ（０．２０９ｍｍｏｌ、９．０ｅｑ）のＮＭＭを加え、混合物を２３℃で２０ｈ撹拌した。混合物を６００μＬのＨ2Ｏ：ＡＣＮ／７０：３０＋０．０５％のＴＦＡで希釈し、Whatman（登録商標）フィルター（４５μｍ）に通して濾過し、ＲＰ分取ＨＰＬＣ（Phenomenex Gemini C18 RP-column 00G-4435-PO-AX、５μｍ、１１０Ａ、２５０×２１．２０ｍｍ、流速：９ｍｌ／分、ＡＣＮ：Ｈ2Ｏ＋ＴＦＡ／１０：９０＋０．１％→９５：５＋０．１％、６０分）で直接精製して、凍結乾燥後に濃黄色固体として８．０ｍｇ（７．４５μｍｏｌ、３２％）のＦＡ−Ｎ3−２を得た。
【０２２３】
Ｆａ−Ｎ3−２：LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 1074.4 [M+H]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 1074.36278, C45H51N15O17 [M+H]+の計算値1074.36601, err [ppm] -3.006.
１．１．１．８  固相合成による葉酸誘導体の合成
【化５０】
2020529457.tif 000052
Ｎ2−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ6−（４−アジドベンゾイル）−Ｌ−リジン（４９）の合成
【化５１】
2020529457.tif 000053
【０２２４】
６４ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2中の１．５ｇ（３．２０１ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）のＮ2−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ6−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−リジンの溶液に３．６８ｍＬ（４８．０２０ｍｍｏｌ、１５ｅｑ）のＴＦＡを加え、混合物を２３℃で３ｈ撹拌した。混合物をトルエン（２５ｍＬ）で希釈し、濃縮し、減圧下トルエン（２ｘ２５ｍＬ）と共蒸発させた。遊離アミンを含有する残留物をＨＶ中で乾燥させた。
【０２２５】
並行して、２７８μＬ（３．８４１ｍｍｏｌ、１．２ｅｑ）のチオニルクロリド及び２０μＬの乾燥ＤＭＦを０℃で１０．７ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2中の５２３ｍｇ（３．２０１ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）の４−アジド安息香酸の溶液に加え、混合物を２３℃で４ｈ撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、ＨＶ中で乾燥させた。残留物を２．６ｍＬの乾燥ジオキサンに再溶解させ、１３．３ｍＬのジオキサン中の遊離アミン（上記）及び１３．３ｍＬの水性２５ｗ％  Ｋ2ＣＯ3溶液の混合物に滴下で加えた。混合物を次に２３℃で４１ｈ撹拌した。混合物をｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（３ｘ２５ｍＬ）で洗浄し、水層を濃ＨＣｌでｐＨ＝２に酸性化させ、ＣＨＣｌ3（３ｘ２５ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。残留物をシリカゲルを通じたフラッシュクロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ／１：０−９５：５−９：１）により精製して、白色の非晶性固体として１．２１４ｇ（２．３６５ｍｍｏｌ、７４％）の４９を得た。
【０２２６】
Ｎ2−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ6−（４−アジドベンゾイル）−Ｌ−リジン（４９）：1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: 12.56 (s, 1H), 8.47 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 7.93 - 7.83 (m, 4H), 7.71 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.63 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.41 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.31 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 7.22 - 7.11 (m, 2H), 4.32 - 4.13 (m, 3H), 3.98 - 3.86 (m, 1H), 3.24 (q, J = 6.5 Hz, 2H), 1.79 - 1.69 (m, 1H), 1.64 (dtd, J = 14.2, 9.6, 5.2 Hz, 1H), 1.51 (dhept, J = 13.0, 6.7 Hz, 2H), 1.38 (dt, J = 15.8, 8.1 Hz, 2H). 13C-NMR (126 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: 173.96, 165.07, 156.13, 143.79, 142.03, 140.67, 131.19, 129.00, 127.60, 127.03, 125.24, 120.09, 118.79, 65.58, 53.74, 46.63, 30.45, 28.68, 23.16. LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 514.3 [M+H]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 514.2076, の計算値514.2085 C28H28N5O5 [M+H]+, err [ppm] -1.750.
１．１．１．８．１  ＦＡ−Ｎ3の固体支持合成の概略手順
【０２２７】
ＦＡ−Ｎ3−３−１１の固相合成は、フリットガラスペプチド合成容器及びＦｍｏｃ保護されたアミノ酸を使用してＲａｐｐ  ２−クロロトリチル樹脂（Rapp Polymere、Ｔｕｂｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ、１．０９ｍｍｏｌ／ｇ）上で２１８μｍｏｌのスケールで手動で実行した。アミノ酸の側鎖保護は以下の通りであった：Ｌｙｓ：Ｂｏｃ及びＡｓｐ：ＯｔＢｕ。さらに、Ｆｍｏｃ−アジドオルニチン、（Ｓ）−４−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−５−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−５−オキソペンタン酸及びＮ2−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）−Ｎ6−（４−アジドベンゾイル）−Ｌ−リジン４９を利用した。樹脂のローディングのために４ｍＬの乾燥ＤＭＦ中の第１のＦｍｏｃ保護されたアミノ酸（２１８μｍｏｌ、１．０ｅｑ）Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ及び４９７μＬ（４．３６ｍｍｏｌ、２０ｅｑ）のＮＭＭの溶液を樹脂と２３℃で２４ｈ振盪して反応させた。溶媒を樹脂から除去し、樹脂を４ｍＬの乾燥ＤＭＦ中の１ｍＬのＭｅＯＨ及び４９７μＬ（４．３６ｍｍｏｌ、２０ｅｑ）のＮＭＭの溶液と２３℃で１ｈ振盪して反応させた。樹脂をＤＭＦ、ＣＨ2Ｃｌ2及びＤＭＦ（各３ｘ４ｍＬ、２分）で洗浄した。ＤＭＦ中のピペリジンの混合物（Ｐｉｐ：ＤＭＦ／１：４、３ｘ５ｍＬ、１０分）との樹脂の振盪しながらの繰返しの反応並びにＤＭＦ、ＣＨ2Ｃｌ2及びＤＭＦ（各３ｘ４ｍＬ、２分）での樹脂のその後の洗浄によりＦｍｏｃの切断を達成した。アミノ酸の連結は、２３℃で４ｈの連結時間で４ｍＬの乾燥ＤＭＦ中のＦｍｏｃ保護されたアミノ酸（４３６μｍｏｌ、２．０ｅｑ）、５９ｍｇ（４３６μｍｏｌ、２．０ｅｑ）のＨＯＡｔ、１４４μＬ（１．３０８ｍｍｏｌ、６．０ｅｑ）のＮＭＭ及び１６６ｍｇ（４３６μｍｏｌ、２．０ｅｑ）のＨＡＴＵの予備活性化させた溶液を用いて振盪して行った。その後に樹脂をＤＭＦ、ＣＨ2Ｃｌ2及びＤＭＦ（各３ｘ４ｍＬ、２分）で洗浄した。Ｆｍｏｃの切断は、ＤＭＦ中のピペリジンの混合物（Ｐｉｐ：ＤＭＦ／１：４、３ｘ５ｍＬ、１０分）との樹脂の振盪しながらの繰返しの反応並びにＤＭＦ、ＣＨ2Ｃｌ2及びＤＭＦ（各３ｘ４ｍＬ、２分）での樹脂のその後の洗浄により達成した。
【０２２８】
最後のアミノ酸連結と並行した葉酸単位の取付けのために、１５０ｍｇ（１．３０８ｍｍｏｌ、６．０ｅｑ）のＮ−ヒドロキシスクシンイミド及び２７０ｍｇ（１．３０８ｍｍｏｌ、６．０ｅｑ）のＤＣＣを４ｍＬの乾燥ＤＭＳＯ中の５７７ｍｇ（１．３０８ｍｍｏｌ、６．０ｅｑ）の葉酸の溶液に加え、光排除下２３℃で２４ｈ撹拌した。結果として得られた懸濁液を、Whatman（登録商標）フィルター（４５μｍ）に通して遊離アミノ基を提示するペプチドロード樹脂（上記）に濾過し、光排除下２３℃で２４ｈ振盪して反応させた。樹脂をＤＭＦ、ＣＨ2Ｃｌ2、ＤＭＦ、ＣＨ2Ｃｌ2（各３ｘ４ｍＬ、２分）で洗浄し、集合した葉酸誘導体をＣＨ2Ｃｌ2：ＨＦＩＰの４：１混合物（３ｘ５ｍＬ、１０分）での繰返しの処理により樹脂から切断した。切断溶液を減圧下で濃縮し、残留物を２３℃でＴＦＡ：ＴＩＰＳ：Ｈ2Ｏ：ｎＰｒＳＨ／１００：３：３：３のアルゴン流脱気した混合物（２ｘ５ｍＬ、１ｈ）で処理した。氷冷したＥｔ2Ｏ（２０ｍＬ）で処理したところ黄色の沈殿が形成され、これを回収し、ＤＭＳＯ：Ｈ2Ｏ／１：３に再溶解させ、Whatman（登録商標）フィルター（４５μｍ）に通して濾過し、ＲＰ分取ＨＰＬＣ（Phenomenex Gemini C18 RP-column 00G-4435-PO-AX、５μｍ、１１０Ａ、２５０×２１．２０ｍｍ、流速：９ｍｌ／分、ＡＣＮ：Ｈ2Ｏ＋ＴＦＡ／１０：９０＋０．１％→９５：５＋０．１％、６０分）により精製して、凍結乾燥後に濃黄色の非晶性固体として対応するＦＡ−Ｎ3−３−１１を得た。
ＦＡ−Ｎ3−３  −  Ｎ2−（（Ｓ）−４−（４−（（（２−アミノ−４−ヒドロキシプテリジン−６−イル）メチル）アミノ）ベンズアミド）−４−カルボキシブタノイル）−Ｄ−アスパルチル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−アスパルチル−Ｎ6−（４−アジドベンゾイル）−Ｌ−リジン
【化５２】
2020529457.tif 000054
【０２２９】
概略手順Ａにしたがって、１１４ｍｇのＦＡ−Ｎ3−３を濃黄色の非晶性ＴＦＡ塩として得た。
【０２３０】
ＦＡ−Ｎ3−３：LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 1060.4 [M+H]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 530.678558, C44H51N15O17 [M+2H]2+の計算値530.678819, err [ppm] 0.491
ＦＡ−Ｎ3−４  −  Ｎ2−Ｎ2−（（Ｓ）−４−（４−（（（２−アミノ−４−ヒドロキシプテリジン−６−イル）メチル）アミノ）ベンズアミド）−４−カルボキシブタノイル）−Ｄ−アスパルチル−Ｄ−アスパルチル−Ｎ6−（４−アジドベンゾイル）−Ｌ−リジル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−アスパルチル−Ｎ6−（４−アジドベンゾイル）−Ｌ−リジン
【化５３】
2020529457.tif 000055
【０２３１】
概略手順Ａにしたがって、９０ｍｇのＦＡ−Ｎ3−４を濃黄色の非晶性ポリＴＦＡ塩として得た。
【０２３２】
ＦＡ−Ｎ3−４：LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 1448.7 [M+H]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 724.7536, の計算値724.7536 C61H71N21O22 [M+2H]2+, err [ppm] 0.00.
ＦＡ−Ｎ3−５  −  Ｎ2−（４−（（（２−アミノ−４−ヒドロキシプテリジン−６−イル）メチル）アミノ）ベンゾイル）−Ｎ５−（（Ｒ）−１−（（（Ｒ）−１−（（（Ｒ）−１−（（（Ｒ）−１−（（（Ｒ）−１−（（（Ｓ）−４−アジド−１−カルボキシブチル）アミノ）−３−カルボキシ−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ）−３−カルボキシ−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ）−３−カルボキシ−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ）−３−カルボキシ−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ）−３−カルボキシ−１−オキソプロパン−２−イル）−Ｌ−グルタミン
【化５４】
2020529457.tif 000056
【０２３３】
概略手順Ａにしたがって、８５ｍｇのＦＡ−Ｎ3−５を濃黄色の非晶性ＴＦＡ塩として得た。
【０２３４】
ＦＡ−Ｎ3−５：LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 1157.3 [M+H]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 579.179534, C44H54N16O22 [M+2H]2+の計算値579.179380, err [ppm] -0.266.
ＦＡ−Ｎ3−６  −  （３Ｓ，８Ｓ，１３Ｓ）−１−（４−（（（２−アミノ−４−ヒドロキシプテリジン−６−イル）メチル）アミノ）フェニル）−１９−（４−アジドフェニル）−１，６，１１，１９−テトラオキソ−２，７，１２，１８−テトラアザノナデカン−３，８，１３−トリカルボン酸
【化５５】
2020529457.tif 000057
【０２３５】
概略手順Ａにしたがって、６０ｍｇのＦＡ−Ｎ3−６を濃黄色の非晶性ＴＦＡ塩として得た。
【０２３６】
ＦＡ−Ｎ3−６：LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 844.3 [M+H]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 844.311777, C37H42N13O11 [M+H]+の計算値844.312126, err [ppm] 0.413
ＦＡ−Ｎ3−７  −  Ｎ2−（４−（（（２−アミノ−４−ヒドロキシプテリジン−６−イル）メチル）アミノ）ベンゾイル）−Ｎ5−（（Ｓ）−４−（（（Ｓ）−４−アジド−１−カルボキシブチル）アミノ）−１−カルボキシ−４−オキソブチル）−Ｌ−グルタミン
【化５６】
2020529457.tif 000058
【０２３７】
概略手順Ａにしたがって、５２ｍｇのＦＡ−Ｎ3−７を濃黄色の非晶性ＴＦＡ塩として得た。
【０２３８】
ＦＡ−Ｎ3−７：LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 711.3 [M+H]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 711.2589, C29H35N12O10 [M+H]+の計算値711.2594, err [ppm] 0.600.
ＦＡ−Ｎ3−８  −  Ｎ2−（（Ｓ）−４−（４−（（（２−アミノ−４−ヒドロキシプテリジン−６−イル）メチル）アミノ）ベンズアミド）−４−カルボキシブタノイル）−Ｎ6−（４−アジドベンゾイル）−Ｌ−リジル−Ｄ−リジン
【化５７】
2020529457.tif 000059
【０２３９】
概略手順Ａにしたがって、４９ｍｇのＦＡ−Ｎ3−８を濃黄色の非晶性ＴＦＡ塩として得た。
【０２４０】
ＦＡ−Ｎ3−８：LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 843.4 [M+H]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 843.364120, C38H47N14O9 [M+H]+の計算値843.364496, err [ppm] 0.445.
ＦＡ−Ｎ3−９  −（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−４−（４−（（（２−アミノ−４−ヒドロキシプテリジン−６−イル）メチル）アミノ）ベンズアミド）−４−カルボキシブタンアミド）−５−アジドペンタノイル）−Ｄ−リジン
【化５８】
2020529457.tif 000060
【０２４１】
概略手順Ａにしたがって、５３ｍｇのＦＡ−Ｎ3−９を濃黄色の非晶性ＴＦＡ塩として得た。
【０２４２】
ＦＡ−Ｎ3−９：LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 710.3 [M+H]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 710.311272, C30H40N13O8 [M+H]+の計算値710.311732, err [ppm] 0.647.
ＦＡ−Ｎ3−１０  −（（Ｓ）−２−（（Ｒ）−２−（（Ｒ）−２−（（Ｒ）−２−（（Ｓ）−４−（４−（（（２−アミノ−４−ヒドロキシプテリジン−６−イル）メチル）アミノ）ベンズアミド）−４−カルボキシブタンアミド）−３−カルボキシプロパンアミド）−３−カルボキシプロパンアミド）−３−カルボキシプロパンアミド）−５−アジドペンタノイル）−Ｄ−アスパルチル−Ｄ−アスパルチル−Ｄ−リジン
【化５９】
2020529457.tif 000061
【０２４３】
概略手順Ａにしたがって、９３ｍｇのＦＡ−Ｎ3−１０を濃黄色の非晶性ＴＦＡ塩として得た。
【０２４４】
ＦＡ−Ｎ3−１０：LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 1285.6 [M+H]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 643.226691, C50H66N18O23 [M+2H]2+の計算値643.226862, err [ppm] 0.265.
ＦＡ−Ｎ3−１１  −  Ｎ2−（４−（（（２−アミノ−４−ヒドロキシプテリジン−６−イル）メチル）アミノ）ベンゾイル）−Ｎ5−（（Ｒ）−１−（（（Ｒ）−１−（（（Ｓ）−５−アジド−１−（（（Ｒ）−１−（（（Ｒ）−１−（（（Ｓ）−５−アジド−１−（（（Ｒ）−１−（（（Ｒ）−１−（（（Ｓ）−４−アジド−１−カルボキシブチル）アミノ）−３−カルボキシ−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ）−３−カルボキシ−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ）−１−オキソペンタン−２−イル）アミノ）−３−カルボキシ−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ）−３−カルボキシ−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ）−１−オキソペンタン−２−イル）アミノ）−３−カルボキシ−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ）−３−カルボキシ−１−オキソプロパン−２−イル）−Ｌ−グルタミン
【化６０】
2020529457.tif 000062
【０２４５】
概略手順Ａにしたがって、５３ｍｇのＦＡ−Ｎ3−１１を濃黄色の非晶性ＴＦＡ塩として得た。
【０２４６】
ＦＡ−Ｎ3−１１：LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 1552.5 [M+H]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 776.762091, C58H75N25O27 [M+2H]2+の計算値776.762663, err [ppm] 0.736.
ＦＡ−ＳＨ−１  −  Ｎ2−（４−（（（２−アミノ−４−ヒドロキシプテリジン−６−イル）メチル）アミノ）ベンゾイル）−Ｎ5−（（Ｒ）−１−カルボキシ−２−メルカプトエチル）−Ｌ−グルタミンの合成
【化６１】
2020529457.tif 000063
【０２４７】
ＦＡ−ＳＨ−１の固相合成は、フリットガラスペプチド合成容器を使用してＲａｐｐ  ２−クロロトリチル樹脂（Rapp Polymere、Ｔｕｂｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ、１．２１ｍｍｏｌ／ｇ）上で４８４μｍｏｌのスケールで手動で実行した。樹脂のローディングのために７．５ｍＬの乾燥ＤＭＦ中の５６７ｍｇ（９６８μｍｏｌ、２．０ｅｑ）のＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ及び２．１２ｍＬ（１９．３６ｍｍｏｌ、２０ｅｑ）のＮＭＭの溶液を樹脂と２３℃で２４ｈ振盪して反応させた。溶媒を樹脂から除去し、樹脂を７．５ｍＬの乾燥ＤＭＦ中の１ｍＬのＭｅＯＨ及び２．１２ｍＬ（１９．３６ｍｍｏｌ、２０ｅｑ）のＮＭＭの溶液と２３℃で１ｈ振盪して反応させた。樹脂をＤＭＦ、ＣＨ2Ｃｌ2及びＤＭＦ（各３ｘ１０ｍＬ、２分）で洗浄した。ＤＭＦ中のピペリジンの混合物（Ｐｉｐ：ＤＭＦ／１：４、３ｘ１０ｍＬ、１０分）との樹脂の振盪しながらの繰返しの反応並びにＤＭＦ、ＣＨ2Ｃｌ2及びＤＭＦ（各３ｘ１０ｍＬ、２分）での樹脂のその後の洗浄によりＦｍｏｃの切断を達成した。
【０２４８】
並行して、２２０ｍｇ（１．９４ｍｍｏｌ、４．０ｅｑ）のＮ−ヒドロキシスクシンイミド及び４００ｍｇ（１．９４ｍｍｏｌ、４．０ｅｑ）のＤＣＣを７．５Ｍの乾燥ＤＭＳＯ中の８５３ｍｇ（１．９４ｍｍｏｌ、４．０ｅｑ）の葉酸の溶液に加え、光排除下２３℃で２４ｈ撹拌した。結果として得られた懸濁液をWhatman（登録商標）フィルター（４５μｍ）に通して遊離アミノ基を提示するＣｙｓロード樹脂（上記）に濾過し、光排除下２３℃で２４ｈ振盪して反応させた。樹脂をＤＭＦ、ＣＨ2Ｃｌ2、ＤＭＦ、ＣＨ2Ｃｌ2（各３ｘ１０ｍＬ、２分）で洗浄し、集合した葉酸誘導体を２３℃でＴＦＡ：ＴＩＰＳ：Ｈ2Ｏ：ｎＰｒＳＨ／１００：３：３：３のアルゴン流脱気した混合物（２ｘ５ｍＬ、１ｈ）での繰返しの処理により樹脂から切断した。氷冷したＥｔ2Ｏ（２０ｍＬ）で処理したところ黄色の沈殿が形成され、これを回収し、ＤＭＳＯ：Ｈ2Ｏ／１：３に再溶解させ、Whatman（登録商標）フィルター（４５μｍ）に通して濾過し、ＲＰ分取ＨＰＬＣ（Thermo Fisher Scientific BDS Hypersil C18 RP-column 28105-259370、５μｍ、２５０ｘ３０ｍｍ、流速：２５ｍｌ／分、ＡＣＮ：Ｈ2Ｏ＋ＴＦＡ／１０：９０＋０．１％→９５：５＋０．１％、６０分）により精製して、凍結乾燥後に濃黄色固体として１５５．０ｍｇ（２８５．６μｍｏｌ、５９％）のＦＡ−ＳＨを得た。
【０２４９】
ＦＡ−ＳＨ−１：LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 1086.5 [M+H]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 1086.441323, C22H24N8O7S [M+H]+の計算値1086.442337, err [ppm] -0.933.
１．１．１．９  ゴナドリベリン誘導体の合成
１．１．１．９．１  ゴナドリベリン誘導体の固体支持合成のための概略手順Ｂ
【化６２】
2020529457.tif 000064
【０２５０】
ペプチドの固相合成は、Ｒａｐｐ  Ｓ  ＲＡＭ樹脂（Rapp Polymere、Ｔｕｂｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ、０．８ｍｍｏｌ／ｇ）上でSyro Multiple Peptide Synthesizer（ＭｕｌｔｉＳｙｎＴｅｃｈ、Ｗｉｔｔｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて１５０μｍｏｌのスケールで実行した。５倍過剰のＦｍｏｃ保護されたアミノ酸：ＴＢＴＵ：ＤｉＰＥＡ／１：１：２及び２３℃で１ｈの連結時間を使用して、Ｆｍｏｃ保護されたアミノ酸を樹脂に連結させた。アミノ酸の側鎖保護は以下の通りであった：Ａｒｇ：Ｐｂｆ；Ｈｉｓ：Ｔｒｔ；Ｓｅｒ及びＴｙｒ：ｔ−Ｂｕ；Ｔｒｐ：Ｂｏｃ。２３℃で３ｈにわたるＴＦＡ：ＴＩＰＳ：Ｈ2Ｏ／９５：３：２（樹脂１ｇ当たり１０ｍＬ）での処理によりペプチドを樹脂から切断し、脱保護した。ｔ−ブチルメチルエーテルでの沈殿後、結果として得られた粗ペプチドを０．１％のＴＦＡを含有する水／アセトニトリル勾配を用いた分取（ｒｅｐａｒａｔｉｖｅ）ＨＰＬＣ（ＲＰ−１８）により精製し、分析的ＨＰＬＣ及びＭＡＬＤＩ−ＭＳにより特徴付けた。
ＬＨＲＨ  −  （Ｓ）−Ｎ−（２−アミノ−２−オキソエチル）−１−（（（Ｓ）−５−オキソピロリジン−２−カルボニル）−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−トリプトフィル−Ｌ−セリル−Ｌ−チロシルグリシル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−アルギニル）ピロリジン−２−カルボキサミドの合成
【化６３】
2020529457.tif 000065
【０２５１】
概略手順Ｂにしたがって、６８ｍｇのＬＨＲＨを白色の非晶性ＴＦＡ塩として得た。
【０２５２】
ＬＨＲＨ：LRMS (MALDI) [m/z]: 1182.5 [M+H]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 1182.5802, C55H76N17O13 [M+H]+の計算値1182.5803, err [ppm] 0.1.
Ｌ−Ｎ3−Ｏｒｎ−ＬＨＲＨ  −  （Ｓ）−１−（（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−３−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）−２−（（Ｓ）−５−オキソピロリジン−２−カルボキサミド）プロパンアミド）−３−（１Ｈ−インドール−３−イル）プロパンアミド）−３−ヒドロキシプロパンアミド）−３−（４−ヒドロキシフェニル）プロパンアミド）−５−アジドペンタノイル）−Ｌ−ロイシル−Ｌ−アルギニル）−Ｎ−（２−アミノ−２−オキソエチル）ピロリジン−２−カルボキサミドの合成
【化６４】
2020529457.tif 000066
【０２５３】
概略手順Ｂにしたがって、７８ｍｇのＬ−Ｎ3−Ｏｒｎ−ＬＨＲＨを白色の非晶性ＴＦＡ塩として得た。
【０２５４】
Ｌ−Ｎ3−Ｏｒｎ−ＬＨＲＨ：LRMS (MALDI) [m/z]: 1256.6 [M+H]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 633.3182, C58H82N20O13 [M+2H]2+の計算値633.3180, err [ppm] -0.300.
Ｄ−Ｎ3−Ｏｒｎ−ＬＨＲＨ  −  （Ｓ）−１−（（（Ｒ）−２−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−３−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）−２−（（Ｓ）−５−オキソピロリジン−２−カルボキサミド）プロパンアミド）−３−（１Ｈ−インドール−３−イル）プロパンアミド）−３−ヒドロキシプロパンアミド）−３−（４−ヒドロキシフェニル）プロパンアミド）−５−アジドペンタノイル）−Ｌ−ロイシル−Ｌ−アルギニル）−Ｎ−（２−アミノ−２−オキソエチル）ピロリジン−２−カルボキサミドの合成
【化６５】
2020529457.tif 000067
【０２５５】
概略手順Ｂにしたがって、７７ｍｇのＤ−Ｎ3−Ｏｒｎ−ＬＨＲＨを白色の非晶性ＴＦＡ塩として得た。
【０２５６】
Ｄ−Ｎ3−Ｏｒｎ−ＬＨＲＨ：LRMS (MALDI) [m/z]: 1265.7 [M+H]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 633.3182, C58H82N20O13 [M+2H]2+の計算値633.3180, err [ppm] -0.300.
Ｄ−Ｎ3−Ｏｒｎ−ゴセレリン  −  （Ｓ）−Ｎ−（（６Ｓ，９Ｓ，１２Ｒ，１５Ｓ，１８Ｓ，２１Ｓ，２４Ｓ）−２１−（（１Ｈ−インドール−３−イル）メチル）−１−アミノ−１２−（３−アジドプロピル）−６−（（Ｓ）−２−（２−カルバモイルヒドラジン−１−カルボニル）ピロリジン−１−カルボニル）−１５−（４−ヒドロキシベンジル）−１８−（ヒドロキシメチル）−２５−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）−１−イミノ−９−イソブチル−８，１１，１４，１７，２０，２３−ヘキサオキソ−２，７，１０，１３，１６，１９，２２−ヘプタアザペンタコサン−２４−イル）−５−オキソピロリジン−２−カルボキサミドの合成
【化６６】
2020529457.tif 000068
【０２５７】
Ｒａｐｐ  Ｓ  ＲＡＭ樹脂（１００μｍｏｌ、０．８ｍｍｏｌ／ｇ）を２３℃でＤＭＦ中の２０％のピペリジンで１０分間処理してＦｍｏｃ基を除去した後、ＤＭＦ（５ｘ５ｍＬ、２分）及びＤＣＭ（５ｘ５ｍＬ、２分）で洗浄した。乾燥ＤＣＭ（３ｍＬ）中の１６２ｍｇ（１．０ｍｍｏｌ、１０．０ｅｑ）のカルボニルジイミダゾールを加え、混合物を振盪しながら２３℃で３ｈインキュベートした後、ＤＣＭ（５ｘ５ｍＬ、２分）及びＤＭＦ（５ｘ５ｍＬ、２分）で洗浄した。樹脂を次に２３℃でＤＭＦ（５ｍＬ、約２Ｍ）中のヒドラジン9で１ｈ処理した10（9５ｍＬのヒドラジン−ＤＭＦ溶液は、５ｍＬのＤＭＦを加え、２０ｍｍＨｇ及び３７℃での３０分にわたるＴＨＦの蒸発によりＴＨＦ中の１０ｍＬの１Ｍヒドラジン溶液から調製した；10合成は、Verhelst et al.[71]の手順に類似して設計した。）。その後に樹脂をＤＭＦ（５ｘ５ｍＬ、２分）で洗浄し、概略手順Ｂに記載したようにペプチドをSyro Multiple Peptide Synthesizerで集合させ、切断し、精製し、特徴付けて、２０ｍｇのＤ−Ｎ3−Ｏｒｎ−ゴセレリンを得た。
【０２５８】
Ｄ−Ｎ3−Ｏｒｎ−ゴセレリン：LRMS (MALDI) [m/z]: 1266.8 [M+H]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 633.8156, C57H75N21O13 [M+ 2H]2+の計算値633.8156, err [ppm] 0.0.
イメージングプローブの合成
１．１．１．１０  クリック可能な蛍光染料の合成
【化６７】
2020529457.tif 000069
ＢＣＮ−ＦＴＩＣ  −  （（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）−ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イル）メチル（２−（３−（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５／６−イル）チオウレイド）エチル）カルバメートの合成
【化６８】
2020529457.tif 000070
【０２５９】
１．３ｍＬの乾燥ＤＭＦ中の５０ｍｇ（１２８μｍｏｌ、１．０ｅｑ）の５／６−フルオレセインチオイソシアネート（ＦＴＩＣ）の溶液に２０．５ｍｇ（１２８μｍｏｌ、１．０ｅｑ）のＮ−Ｂｏｃ−１，２−エチレンジアミンを加え、混合物を２３℃で１９ｈ撹拌した。反応混合物をトルエン（５ｍＬ）で希釈し、濃縮し、減圧下トルエン（４ｘ５ｍＬ）と共蒸発させた。残留物を１３０μＬのＴＦＡに入れ、２３℃で１．５ｈ撹拌した。混合物をトルエン（５ｍＬ）で希釈し、濃縮し、減圧下トルエン（３ｘ４ｍＬ）と共蒸発させ、残留物をＨＶ中で乾燥させた。残留物を次に１．３ｍＬの乾燥ＤＭＦに溶解させ、４３μＬ（３８４μｍｏｌ、３．０ｅｑ）のＮＭＭ及び４０ｍｇ（１２８μｍｏｌ、１．０ｅｑ）の２８を加え、混合物を２３℃で４８ｈ撹拌した。反応混合物をトルエン（５ｍＬ）で希釈し、濃縮し、減圧下トルエン（５ｘ５ｍＬ）と共蒸発させた。残留物を分取薄層クロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ／９：１）により精製して、濃橙色の非晶性固体として３６．６ｍｇ（５８．４９μｍｏｌ、４６％）のＢＣＮ−ＦＴＩＣを得た。
【０２６０】
ＢＣＮ−ＦＴＩＣ：TCL (CH2Cl2:MeOH/9:1) Rf: 0.35 [UV254, Vis],1H-NMR (500 MHz, MeOD-d4) δ [ppm]: 8.07 (s, 1H), 7.75 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.17 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 6.74 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.68 (d, J = 2.4 Hz, 2H), 6.55 (dd, J = 8.7, 2.4 Hz, 2H), 4.10 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 3.80 - 3.66 (m, 2H), 3.37 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 3.35 (s, 1H), 2.17 (dq, J = 32.4, 14.9, 14.3 Hz, 6H), 1.53 (q, J = 8.5 Hz, 2H), 1.34 (dt, J = 14.5, 7.3 Hz, 1H), 0.93 - 0.82 (m, 2H). 13C-NMR (126 MHz, MeOD-d4) δ [ppm]: 183.13, 171.18, 162.56, 159.80, 154.60, 141.86, 131.82, 130.55, 126.33, 120.97, 114.26, 111.85, 103.55, 99.50, 92.45, 66.78, 63.97, 55.78, 40.93, 30.15, 21.92, 21.40, 18.91. LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 626.2 [M+H]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 626.194754, C34H32N3O7S [M+H]+の計算値626.195548, err [ppm] 1.268.
ホモプロパルギル−ＦＴＩＣ  −  ブタ−３−イン−１−イル（２−（３−（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５／６−イル）チオウレイド）エチル）カルバメートの合成
【化６９】
2020529457.tif 000071
【０２６１】
１．３ｍＬの乾燥ＤＭＦ中の５０ｍｇ（１２８μｍｏｌ、１．０ｅｑ）の５／６−フルオレセインチオイソシアネート（ＦＴＩＣ）の溶液に２０．５ｍｇ（１２８μｍｏｌ、１．０ｅｑ）のＮ−Ｂｏｃ−１，２−エチレンジアミンを加え、混合物を２３℃で１９ｈ撹拌した。反応混合物をトルエン（５ｍＬ）で希釈し、濃縮し、減圧下トルエン（４ｘ５ｍＬ）と共蒸発させた。残留物を１３０μＬのＴＦＡに入れ、２３℃で１．５ｈ撹拌した。混合物をトルエン（５ｍＬ）で希釈し、濃縮し、減圧下トルエン（３ｘ４ｍＬ）と共蒸発させ、残留物をＨＶ中で乾燥させた。残留物を次に１．３ｍＬの乾燥ＤＭＦに溶解させ、４３μＬ（３８４μｍｏｌ、３．０ｅｑ）のＮＭＭ及び３０ｍｇ（１２８μｍｏｌ、１．０ｅｑ）の２３を加え、混合物を２３℃で４８ｈ撹拌した。反応混合物をトルエン（５ｍＬ）で希釈し、濃縮し、減圧下トルエン（５ｘ５ｍＬ）と共蒸発させた。残留物を分取薄層クロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ／９：１）により精製した後、ＲＰ分取ＨＰＬＣ（Phenomenex Gemini C18 RP-column 00G-4435-PO-AX、５μｍ、１１０Ａ、２５０×２１．２０ｍｍ、流速：９ｍｌ／分、ＡＣＮ：Ｈ2Ｏ／  ２０：９０→９５：５、４５分）により精製して、凍結乾燥後に濃橙色の非晶性固体として４３．６ｍｇ（８０．０μｍｏｌ、６３％）のホモプロパルギル−ＦＴＩＣを得た。
【０２６２】
ホモプロパルギル−ＦＴＩＣ：TCL (CH2Cl2:MeOH/9:1) Rf: 0.20 [UV254, Vis],1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: 8.13 (s, 1H), 7.80 - 7.66 (m, 1H), 7.17 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 6.73 - 6.63 (m, 4H), 6.55 (ddd, J = 8.7, 3.9, 2.4 Hz, 2H), 4.15 - 4.05 (m, 2H), 3.76 (d, J = 20.0 Hz, 2H), 3.38 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.81 (s, 10H), 2.48 (td, J = 6.8, 2.6 Hz, 1H). LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 546.1 [M+H]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 546.132346, C28H24N3O7S [M+H]+の計算値546.132948, err [ppm] 1.102.
ＢＣＮ−ＰＥＧ2−ＣＦ  −  （（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）−ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イル）メチル（２−（２−（２−（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５／６−カルボキサミド）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバメートの合成
【化７０】
2020529457.tif 000072
【０２６３】
１．２３ｍＬのＤＭＦ中の１０ｍｇ（３０．８μｍｏｌ、１．０ｅｑ）の（５／６）−カルボキシフルオレセインチオイソシアネートＮＨＳエステル及び１２．８μＬ（９２．４μｍｏｌ、３．０ｅｑ）のＮＭＭの溶液に１４．６ｍｇ（３０．８μｍｏｌ、１．０ｅｑ）の（（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）−ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イル）メチル（２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）エチル）カルバメートを加え、混合物を２３℃で１４ｈ撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、残留物をトルエン（２ｘ１０ｍＬ）と共蒸発させた。残留物を分取薄層クロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ／９：１）により精製して、白色の非晶性固体として１４．１ｍｇ（２０．６μｍｏｌ、６７％）のＢＣＮ−ＰＥＧ2−ＣＦを５／６異性体の混合物として得た。
【０２６４】
ＢＣＮ−ＰＥＧ2−ＣＦ：TCL (CH2Cl2:MeOH/9:1) Rf: 0.55 [UV254, Vis],1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 10.14 (s, 2H), 8.82 (dt, J = 68.1, 5.6 Hz, 1H), 8.46 - 8.20 (m, 1H), 8.19 - 8.05 (m, 1H), 7.73 - 7.35 (m, 1H), 7.07 (dt, J = 17.2, 5.6 Hz, 1H), 6.69 (dd, J = 3.7, 2.3 Hz, 2H), 6.59 (dd, J = 8.7, 1.7 Hz, 2H), 6.55 (ddd, J = 8.6, 6.0, 2.3 Hz, 2H), 4.01 (dd, J = 8.0, 3.3 Hz, 2H), 3.62 - 3.30 (m, 12H), 3.07 (dq, J = 23.0, 6.0 Hz, 2H), 2.21 (t, J = 13.1 Hz, 2H), 2.16 - 2.05 (m, 4H), 1.50 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 0.89 - 0.79 (m, 2H). 13C-NMR (126 MHz, MeOD-d4) δ [ppm]: 13C NMR (126 MHz, DMSO) δ 172.73, 168.01, 164.66, 164.54, 159.57, 156.38, 154.64, 151.79, 140.51, 136.12, 134.64, 129.22, 129.14, 128.17, 126.46, 124.84, 124.22, 123.27, 112.64, 109.12, 109.06, 102.22, 98.96, 83.24, 69.54, 69.50, 69.44, 69.39, 69.13, 69.06, 68.72, 68.59, 61.33, 54.90, 48.57, 28.55, 25.21, 20.82, 19.52, 17.62. . LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 683.3 [M+H]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 683.259012, C38H39N2O10 [M+H]+の計算値683.259922, err [ppm] 1.331.
ホモプロパルギル−ＣＦ  −  ３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソ−Ｎ−（プロパ−２−イン−１−イル）−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５−カルボキサミドの合成
【化７１】
2020529457.tif 000073
【０２６５】
８８７μＬの乾燥ＤＭＦ中の１０．５ｍｇ（２２．１８μｍｏｌ、１．０ｅｑ）の（５／６）−カルボキシフルオレセインチオイソシアネートＮＨＳエステル及び９．２μＬ（６６．５４μｍｏｌ、３．０ｅｑ）のトリエチルアミンの溶液に１．４６μＬ（２２．１８μｍｏｌ、１．０ｅｑ）のプロパルギルアミンを加え、混合物を２３℃で４ｈ撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、残留物をトルエン（２ｘ１０ｍＬ）と共蒸発させた。残留物を分取薄層クロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ／９５：５）により精製して、黄色の非晶性固体として６．６ｍｇ（１５．６μｍｏｌ、７２％）のホモプロパルギル−ＣＦを５／６異性体の混合物として得た。
【０２６６】
ホモプロパルギル−ＣＦ：TCL (CH2Cl2:MeOH/9:1) Rf: 0.56 [UV254, Vis],1H-NMR (700 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: PK-10.15 (s, 2H), 9.22 (dt, J = 109.3, 5.5 Hz, 1H), 8.49 - 8.22 (m, 1H), 8.20 - 8.06 (m, 1H), 7.71 - 7.34 (m, 1H), 6.69 (dd, J = 6.9, 2.4 Hz, 2H), 6.59 (dd, J = 8.7, 1.5 Hz, 2H), 6.56 (s, 2H), 4.11 (dd, J = 5.5, 2.5 Hz, 1H), 3.99 (dd, J = 5.5, 2.5 Hz, 1H), 3.17 - 3.16 (m, 1H). 13C-NMR (126 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: 164.21, 159.62, 151.84, 139.85, 129.47, 129.23, 129.17, 124.99, 124.35, 123.44, 122.40, 112.73, 109.03, 102.24, 80.69, 73.10, 48.58, 28.73. LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 414.2 [M+H]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 414.097870, C24H15NO6 [M+H]+の計算値414.097214, err [ppm] -1.585.
１．１．１．１１  葉酸−フルオレセインコンジュゲートの合成
【化７２】
2020529457.tif 000074
ＥＣ１７[62、63]  −  Ｎ2−（４−（（（２−アミノ−４−ヒドロキシプテリジン−６−イル）メチル）アミノ）ベンゾイル）−Ｎ5−（２−（３−（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５−イル）チオウレイド）エチル）−Ｌ−グルタミンの合成
【化７３】
2020529457.tif 000075
【０２６７】
１．１３ｍＬの乾燥ＤＭＳＯ中の１００ｍｇ（０．２２６５ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）の葉酸及び２６ｍｇ（０．２２６５ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）のＮ−ヒドロキシスクシンイミドの溶液に４７ｍｇ（０．２２６５ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）のＤＣＣを加え、混合物を２３℃で１５ｈ撹拌した後、６２μＬ（０．４５３ｍｍｏｌ、２．０ｅｑ）のトリエチルアミン及び７１μＬ（０．４５３ｍｍｏｌ、２．０ｅｑ）のＮ−Ｂｏｃ−１，２−エチレンジアミンを加え、混合物を２３℃で２４ｈ撹拌した。混合物を次にWhatman（登録商標）フィルター（４５μｍ）に通して濾過し、Ｈ2Ｏ：ＡＣＮ／７０：３０（５００μＬ）で希釈し、ＲＰ分取ＨＰＬＣ（Phenomenex Gemini C18 RP-column 00G-4435-PO-AX、５μｍ、１１０Ａ、２５０×２１．２０ｍｍ、流速：９ｍｌ／分、ＡＣＮ：Ｈ2Ｏ＋０．１％のＴＦＡ／１０：９０→９５：５、３５分）により直接精製して、凍結乾燥後に濃橙色の非晶性固体として８４．６ｍｇ（０．１６５ｍｍｏｌ、７３％）のＮ2−（４−（（（２−アミノ−４−ヒドロキシプテリジン−６−イル）メチル）アミノ）ベンゾイル）−Ｎ5−（２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）エチル）−Ｌ−グルタミンを得た。１６ｍｇ（２７．４μｍｏｌ、１．０ｅｑ）のこの化合物を１０９μＬのＴＦＡに溶解させ、２３℃で２ｈ撹拌した後、混合物を濃縮し、ＣＨ2Ｃｌ2（３ｘ２ｍＬ）と共蒸発させ、ＨＶ中で乾燥させた。残留物を１３７μＬの乾燥ＤＭＳＯに再溶解させ、２７．１μＬ（０．２４６ｍｍｏｌ、９．０ｅｑ）のＮＭＭ及び１０．７ｍｇ（２７．４μｍｏｌ、１．０ｅｑ）のＦＩＴＣを加え、混合物を２３℃で１．５ｈ撹拌した。反応混合物を１００μＬのＨ2Ｏで希釈し、ＲＰ分取ＨＰＬＣ（Phenomenex Gemini C18 RP-column 00G-4435-PO-AX、５μｍ、１１０Ａ、２５０×２１．２０ｍｍ、流速：９ｍｌ／分、ＡＣＮ：Ｈ2Ｏ＋０．１％のＴＦＡ／１０：９０→９５：５、３５分）により精製して、凍結乾燥後に濃橙色の非晶性固体として１７．９ｍｇ（２０．５５μｍｏｌ、７５％）のＥＣ１７を得た。
【０２６８】
ＥＣ１７：HRMS (ESI-IT) [m/z]: 873.2409, C42H37N10O10S [M+H]+の計算値873.2409, err [ppm] 0.0.
１．１．１．１１．１  銅フリーのクリック反応を介した葉酸−フルオレセインコンジュゲートの合成のための概略手順Ｃ
【０２６９】
対応するＦＡ−Ｎ3（１．１ｅｑ）をＤＭＳＯ（０．２Ｍ）に溶解させ、ＤＭＳＯ（０．２Ｍ）中のＢＣＮ−ＦＴＩＣ（１．０ｅｑ）の溶液を加え、ＬＣＭＳにより完全な変換がモニターされるまで混合物を光排除下２３℃で４〜２０ｈ撹拌した。反応混合物を１００μＬのＭｅＯＨで希釈し、Whatman（登録商標）フィルター（４５μｍ）に通して濾過し、ＲＰ分取ＨＰＬＣ（Phenomenex Gemini C18 RP-column 00G-4435-PO-AX、５μｍ、１１０Ａ、２５０×２１．２０ｍｍ、流速：９ｍｌ／分、ＡＣＮ：Ｈ2Ｏ＋０．１％のＴＦＡ／１０：９０→９５：５、４５分）により直接精製して、凍結乾燥後に濃橙色の非晶性固体として葉酸−フルオレセインコンジュゲートを得た。
ＦＡ−４ａ−（ＦＩＴＣ）2  −  Ｎ2−Ｎ2−（（Ｓ）−４−（４−（（（２−アミノ−４−ヒドロキシプテリジン−６−イル）メチル）アミノ）ベンズアミド）−４−カルボキシ−ブタノイル）−Ｄ−アスパルチル−Ｄ−アスパルチル−Ｎ6−（４−（２−（（５ａＲ，６Ｓ，６ａＳ）−６−（（（（２−（３−（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソ−ベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５−イル）チオウレイド）エチル）カルバモイル）オキシ）メチル）−５，５ａ，６，６ａ，７，８−ヘキサヒドロシクロ−プロパ［５，６］シクロオクタ［１，２−ｄ］［１，２，３］トリアゾール−１（４Ｈ）−イル））−ベンゾイル）−Ｌ−リジル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−アスパルチル−Ｎ6−（４−（２−（（５ａＲ，６Ｓ，６ａＳ）−６−（（（（２−（３−（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５−イル）チオ−ウレイド）エチル）カルバモイル）オキシ）メチル）−５，５ａ，６，６ａ，７，８−ヘキサヒドロシクロプロパ［５，６］シクロオクタ［１，２−ｄ］［１，２，３］トリアゾール−１（４Ｈ）−イル））−ベンゾイル）−Ｌ−リジン
【化７４】
2020529457.tif 000076
【０２７０】
ＦＡ−Ｎ3−４を概略手順Ｃに適用して、１．４ｍｇ（０．５１８μｍｏｌ、１７％）のＦＡ−４ａ−（ＦＩＴＣ）2を濃橙色固体として得た。
【０２７１】
ＦＡ−４ａ−（ＦＩＴＣ）2：LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 1350.4 [M+2H]2+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 898.61675, C129H128N27O36S2 [M-3H]3-の計算値898.61689, err [ppm] -0.155.
ＦＡ−３ａ−ＦＩＴＣ  −  Ｎ2−（（Ｓ）−４−（４−（（（２−アミノ−４−ヒドロキシプテリジン−６−イル）メチル）アミノ）ベンズアミド）−４−カルボキシブタノイル）−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−アスパルチル−Ｎ6−（４−（（５ａＲ，６Ｓ，６ａＳ）−６−（（（（２−（３−（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５−イル）チオウレイド）エチル）カルバモイル）オキシ）メチル）−５，５ａ，６，６ａ，７，８−ヘキサヒドロシクロプロパ［５，６］シクロオクタ［１，２−ｄ］［１，２，３］トリアゾール−１（４Ｈ）−イル）ベンゾイル）−Ｌ−リジン
【化７５】
2020529457.tif 000077
【０２７２】
ＦＡ−Ｎ3−３を概略手順Ｃに適用して、４．５ｍｇ（２．６６９μｍｏｌ、３０％）のＦＡ−３ａ−ＦＩＴＣを濃橙色固体として得た。
【０２７３】
ＦＡ−３ａ−ＦＩＴＣ：LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 1685.5 [M+H]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 841.25711, C78H78N18O24S [M-2H]2-の計算値841.25840, err [ppm] -1.53.
ＦＡ−１ａ−ＦＩＴＣ  −  Ｎ2−（４−（（（２−アミノ−４−ヒドロキシプテリジン−６−イル）メチル）アミノ）ベンゾイル）−Ｎ5−（（Ｓ）−１−カルボキシ−４−（（（Ｓ）−６−（４−（（５ａＳ，６Ｒ，６ａＲ）−６−（（（（２−（３−（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５−イル）チオウレイド）エチル）カルバモイル）オキシ）メチル）−５，５ａ，６，６ａ，７，８−ヘキサヒドロシクロプロパ［５，６］シクロオクタ［１，２−ｄ］［１，２，３］トリアゾール−１（４Ｈ）−イル）ベンズアミド）−１−メトキシ−１−オキソヘキサン−２−イル）アミノ）−４−オキソブチル）−Ｌ−グルタミン
【化７６】
2020529457.tif 000078
【０２７４】
ＦＡ−Ｎ3−１を概略手順Ｃに適用して、１．７ｍｇ（１．１４５μｍｏｌ、２５％）のＦＡ−１ａ−ＦＩＴＣを濃橙色固体として得た。
【０２７５】
ＦＡ−１ａ−ＦＩＴＣ：LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 1484.6 [M+H]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]:742.2617, の計算値742.2617 C72H76N16O18S [M+2H]2+, err [ppm] 0.0.
１．１．１．１１．２  銅媒介性のクリック反応を介した葉酸−フルオレセインコンジュゲートの合成のための概略手順Ｄ
【０２７６】
対応するＦＡ−Ｎ3（１．１ｅｑ）及びホモプロパルギル−ＦＴＩＣ（１．０ｅｑ）をＤＭＳＯ：Ｈ2Ｏ：ｔＢｕＯＨ／２：１：１（０．０２５Ｍ）の混合物に溶解させ、ＤｉＰＥＡ（６．０ｅｑ）、ＴＢＴＡ（０．１ｅｑ、ＤＭＳＯ中のストック溶液からの１０μＬ）、ＣｕＳＯ4（０．０５ｅｑ、Ｈ2Ｏ中のストック溶液からの１０μＬ）及びアスコルビン酸ナトリウム（０．５ｅｑ、Ｈ2Ｏ中のストック溶液からの１０μＬ）を加え、ＬＣＭＳにより完全な変換がモニターされるまで混合物を光排除下２３℃で４〜２４ｈ撹拌した。反応混合物を１００μＬのＭｅＯＨで希釈し、Whatman（登録商標）フィルター（４５μｍ）に通して濾過し、ＲＰ分取ＨＰＬＣ（Phenomenex Gemini C18 RP-column 00G-4435-PO-AX、５μｍ、１１０Ａ、２５０×２１．２０ｍｍ、流速：９ｍｌ／分、ＡＣＮ：Ｈ2Ｏ＋０．１％のＴＦＡ／１０：９０→９５：５、４５分）により直接精製して、凍結乾燥後に濃橙色の非晶性固体として葉酸−フルオレセインコンジュゲートを得た。
ＦＡ−９ｂ−ＦＩＴＣ  −  （（Ｓ）−２−（（Ｓ）−４−（４−（（（２−アミノ−４−ヒドロキシプテリジン−６−イル）メチル）アミノ）ベンズアミド）−４−カルボキシブタンアミド）−５−（４−（２−（（（２−（３−（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５−イル）チオウレイド）エチル）カルバモイル）オキシ）エチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）ペンタノイル）−Ｄ−リジン
【化７７】
2020529457.tif 000079
【０２７７】
ＦＡ−Ｎ3−９を概略手順Ｄに適用して、２．９ｍｇ（２．３６μｍｏｌ、６５％）のＦＡ−ＦＩＴＣ−９ｂを濃橙色固体として得た。
【０２７８】
ＦＡ−９ｂ−ＦＩＴＣ：LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 1256.3 [M+H]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 628.22296, C58H64N16O15S [M+2H]2+の計算値628.22234, err [ppm] 0.986.
ＦＡ−１１ｂ−（ＦＩＴＣ）3  −  Ｎ2−（４−（（（２−アミノ−４−ヒドロキシプテリジン−６−イル）メチル）アミノ）ベンゾイル）−Ｎ5−（（Ｒ）−３−カルボキシ−１−（（（Ｒ）−３−カルボキシ−１−（（（Ｓ）−１−（（（Ｒ）−３−カルボキシ−１−（（（Ｒ）−３−カルボキシ−１−（（（Ｓ）−１−（（（Ｒ）−３−カルボキシ−１−（（（Ｒ）−３−カルボキシ−１−（（（Ｓ）−１−カルボキシ−４−（２−（４−（２−（（（２−（３−（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５−イル）チオウレイド）エチル）カルバモイル）オキシ）エチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル））ブチル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ）−５−（２−（４−（２−（（（２−（３−（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５−イル）チオウレイド）エチル）カルバモイル）オキシ）エチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル））−１−オキソペンタン−２−イル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ）−５−（２−（４−（２−（（（２−（３−（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５−イル）チオウレイド）エチル）カルバモイル）オキシ）エチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル））−１−オキソペンタン−２−イル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）−Ｌ−グルタミン
【化７８】
2020529457.tif 000080
【０２７９】
ＦＡ−Ｎ3−１１を概略手順Ｄに適用して、３．０ｍｇ（０．９４μｍｏｌ、２５％）のＦＡ−１１ｂ−（ＦＩＴＣ）3を濃橙色固体として得た。
【０２８０】
ＦＡ−１１ｂ−（ＦＩＴＣ）3：LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 1064.32 [M+3H]3+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 1063.9719, C142H145N34O48S3 [M+3H]3+の計算値1063.9715, err [ppm] 0.376.
ＦＡ−８ｂ−ＦＩＴＣ  −  Ｎ2−（（Ｓ）−４−（４−（（（２−アミノ−４−ヒドロキシプテリジン−６−イル）メチル）アミノ）ベンズアミド）−４−カルボキシブタノイル）−Ｎ6−（４−（４−（２−（（（２−（３−（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５−イル）チオウレイド）エチル）カルバモイル）オキシ）エチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）ベンゾイル）−Ｌ−リジル−Ｄ−リジン
【化７９】
2020529457.tif 000081
【０２８１】
ＦＡ−Ｎ3−８を概略手順Ｄに適用して、１．７ｍｇ（１．２５μｍｏｌ、３４％）のＦＡ−８ｂ−ＦＩＴＣを濃橙色固体として得た。
【０２８２】
ＦＡ−８ｂ−ＦＩＴＣ：LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 694.6 [M+2H]2+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 694.7487, C66H71N17O16S [M+2H]2+の計算値694.7487, err [ppm] 0.0.
ＦＡ−１０ｂ−ＦＩＴＣ  −（（Ｓ）−２−（（Ｒ）−２−（（Ｒ）−２−（（Ｒ）−２−（（Ｓ）−４−（４−（（（２−アミノ−４−ヒドロキシプテリジン−６−イル）メチル）アミノ）ベンズアミド）−４−カルボキシブタンアミド）−３−カルボキシプロパンアミド）−３−カルボキシプロパンアミド）−３−カルボキシプロパンアミド）−５−（４−（２−（（（２−（３−（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５−イル）チオウレイド）エチル）カルバモイル）オキシ）エチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）ペンタノイル）−Ｄ−アスパルチル−Ｄ−アスパルチル−Ｄ−リジン
【化８０】
2020529457.tif 000082
【０２８３】
ＦＡ−Ｎ3−１０を概略手順Ｄに適用して、３．８ｍｇ（２．０８μｍｏｌ、５７％）のＦＡ−１０ｂ−ＦＩＴＣを濃橙色固体として得た。
【０２８４】
ＦＡ−１０ｂ−ＦＩＴＣ：LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 915.9 [M+2H]2+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 915.7897, C78H89N21O30S [M+2H]2+の計算値915.7897, err [ppm] 0.0.
ＦＡ−７ｂ−ＦＩＴＣ  −  Ｎ2−（４−（（（２−アミノ−４−ヒドロキシプテリジン−６−イル）メチル）アミノ）ベンゾイル）−Ｎ5−（（Ｓ）−１−カルボキシ−４−（（（Ｓ）−１−カルボキシ−４−（４−（２−（（（２−（３−（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５−イル）チオウレイド）エチル）カルバモイル）オキシ）エチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）ブチル）アミノ）−４−オキソブチル）−Ｌ−グルタミン
【化８１】
2020529457.tif 000083
【０２８５】
ＦＡ−Ｎ3−７を概略手順Ｄに適用して、３．８ｍｇ（２．０８μｍｏｌ、５７％）のＦＡ−ＦＩＴＣ−７ｂを濃橙色固体として得た。
【０２８６】
ＦＡ−７ｂ−ＦＩＴＣ：LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 915.8 [M+2H]2+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 1256.3869, C57H58N15O17S [M+H]+の計算値1256.3850, err [ppm] -1.5.
ＦＡ−６ｂ−ＦＩＴＣ  −（３Ｓ，８Ｓ，１３Ｓ）−１−（４−（（（２−アミノ−４−ヒドロキシプテリジン−６−イル）メチル）アミノ）フェニル）−１９−（４−（４−（（（２−（３−（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５−イル）チオウレイド）エチル）カルバモイル）オキシ）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）フェニル）−１，６，１１，１９−テトラオキソ−２，７，１２，１８−テトラアザノナデカン−３，８，１３−トリカルボン酸
【化８２】
2020529457.tif 000084
【０２８７】
ＦＡ−Ｎ3−６を概略手順Ｄに適用して、３．８ｍｇ（２．０８μｍｏｌ、５７％）のＦＡ−ＦＩＴＣ−６ｂを濃橙色固体として得た。
【０２８８】
ＦＡ−６ｂ−ＦＩＴＣ：LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 681.3 [M+2H]2+.
ＦＡ−３ｂ−ＦＩＴＣ  −  Ｎ2−（（Ｓ）−４−（４−（（（２−アミノ−４−ヒドロキシプテリジン−６−イル）メチル）アミノ）ベンズアミド）−４−カルボキシブタノイル）−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−アスパルチル−Ｎ6−（４−（４−（２−（（（２−（３−（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５−イル）チオウレイド）エチル）カルバモイル）オキシ）エチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）ベンゾイル）−Ｌ−リジン
【化８３】
2020529457.tif 000085
【０２８９】
ＦＡ−Ｎ3−３を概略手順Ｄに適用して、２．０ｍｇ（１．２４μｍｏｌ、５２％）のＦＡ−３ｂ−ＦＩＴＣを濃橙色固体として得た。
【０２９０】
ＦＡ−３ｂ−ＦＩＴＣ：LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 803.2 [M+2H]2+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 803.2417, C72H74N18O24S [M+2H]2+の計算値803.2417, err [ppm] 0.0.
ＦＡ−４ｂ−（ＦＩＴＣ）2  −  Ｎ2−Ｎ2−（（Ｓ）−４−（４−（（（２−アミノ−４−ヒドロキシプテリジン−６−イル）メチル）アミノ）ベンズアミド）−４−カルボキシブタノイル）−Ｄ−アスパルチル−Ｄ−アスパルチル−Ｎ6−（４−（２−（４−（２−（（（２−（３−（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５−イル）チオウレイド）エチル）カルバモイル）オキシ）エチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル））ベンゾイル）−Ｌ−リジル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−アスパルチル−Ｎ6−（４−フルオロベンゾイル）−Ｌ−リジン
【化８４】
2020529457.tif 000086
【０２９１】
ＦＡ−Ｎ3−４を概略手順Ｄに適用して、１．４ｍｇ（０．５５１μｍｏｌ、２７％）のＦＡ−４ｂ−（ＦＩＴＣ）2を濃橙色固体として得た。
【０２９２】
ＦＡ−４ｂ−（ＦＩＴＣ）2：LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 1270.3 [M+2H]2+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 1269.8793, の計算値1269.8792 C117H117N27O36S2 [M+H]+, err [ppm] -0.078.
１．１．１．１２  ゴナドリベリン−フルオレセインコンジュゲートの合成
Ｄ−Ｏｒｎ−ＬＨＲＨ−ＰＥＧ2−ＣＦ  −  （（５ａＲ，６Ｓ，６ａＳ）−１−（（３Ｓ，６Ｓ，９Ｓ，１２Ｓ，１５Ｒ）−３−（（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）メチル）−６−（（１Ｈ−インドール−３−イル）メチル）−１５−（（（Ｓ）−１−（（（Ｓ）−１−（（Ｓ）−２−（（２−アミノ−２−オキソエチル）カルバモイル）ピロリジン−１−イル）−５−グアニジノ−１−オキソペンタン−２−イル）アミノ）−４−メチル−１−オキソペンタン−２−イル）カルバモイル）−１２−（４−ヒドロキシベンジル）−９−（ヒドロキシメチル）−１，４，７，１０，１３−ペンタオキソ−１−（（Ｓ）−５−オキソピロリジン−２−イル）−２，５，８，１１，１４−ペンタアザオクタデカン−１８−イル）−１，４，５，５ａ，６，６ａ，７，８−オクタヒドロシクロプロパ［５，６］シクロオクタ［１，２−ｄ］［１，２，３］トリアゾール−６−イル）メチル（２−（２−（２−（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５−カルボキサミド）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバメートの合成
【化８５】
2020529457.tif 000087
【０２９３】
２７μＬの乾燥ＤＭＳＯ中の４ｍｇ（２．６７８μｍｏｌ、１．０ｅｑ）のＤ−Ｎ3−Ｏｒｎ−ＬＨＲＨの溶液に２７μＬの乾燥ＤＭＳＯ中の２．０ｍｇ（２．９４６μｍｏｌ、１．１ｅｑ）のＢＣＮ−ＰＥＧ2−ＣＦの溶液を加え、ＬＣＭＳにより完全な変換がモニターされるまで混合物を光排除下２３℃で１６ｈ撹拌した。反応混合物を１００μＬのＭｅＯＨで希釈し、ＲＰ分取ＨＰＬＣ（Phenomenex Gemini C18 RP-column 00G-4435-PO-AX、５μｍ、１１０Ａ、２５０×２１．２０ｍｍ、流速：９ｍｌ／分、ＡＣＮ：Ｈ2Ｏ＋０．１％のＴＦＡ／１０：９０→９５：５、４５分）により直接精製して、凍結乾燥後に黄色の非晶性固体として３．６ｍｇ（１．８４７μｍｏｌ、６９％）のＤ−Ｏｒｎ−ＬＨＲＨ−ＰＥＧ2−ＣＦを得た。
【０２９４】
Ｄ−Ｏｒｎ−ＬＨＲＨ−ＰＥＧ2−ＣＦ：HRMS (ESI-IT) [m/z]: 974.4443, C90H120N22O23 [M+2H]2+の計算値974.4443, err [ppm] 0.0.
Ｄ−Ｏｒｎ−ゴセレリン−ＰＥＧ2−ＣＦ：ＣＦ  −  （（５ａＲ，６Ｓ，６ａＳ）−１−（（３Ｓ，６Ｓ，９Ｓ，１２Ｓ，１５Ｒ）−３−（（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）メチル）−６−（（１Ｈ−インドール−３−イル）メチル）−１５−（（（Ｓ）−１−（（（Ｓ）−１−（（Ｓ）−２−（２−カルバモイルヒドラジン−１−カルボニル）ピロリジン−１−イル）−５−グアニジノ−１−オキソペンタン−２−イル）アミノ）−４−メチル−１−オキソペンタン−２−イル）カルバモイル）−１２−（４−ヒドロキシベンジル）−９−（ヒドロキシメチル）−１，４，７，１０，１３−ペンタオキソ−１−（（Ｓ）−５−オキソピロリジン−２−イル）−２，５，８，１１，１４−ペンタアザオクタデカン−１８−イル）−１，４，５，５ａ，６，６ａ，７，８−オクタヒドロシクロプロパ［５，６］シクロオクタ［１，２−ｄ］［１，２，３］トリアゾール−６−イル）メチル（２−（２−（２−（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５−カルボキサミド）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバメートの合成
【化８６】
2020529457.tif 000088
【０２９５】
２５μＬの乾燥ＤＭＳＯ中の４ｍｇ（２．４８７μｍｏｌ、１．０ｅｑ）のＤ−Ｏｒｎ−Ｎ3−ゴセレリンの溶液に２５μＬの乾燥ＤＭＳＯ中の１．９ｍｇ（２．７３５μｍｏｌ、１．１ｅｑ）のＢＣＮ−ＰＥＧ2−ＣＦの溶液を加え、ＬＣＭＳにより完全な変換がモニターされるまで混合物を光排除下２３℃で１６ｈ撹拌した。反応混合物を１００μＬのＭｅＯＨで希釈し、ＲＰ分取ＨＰＬＣ（Phenomenex Gemini C18 RP-column 00G-4435-PO-AX、５μｍ、１１０Ａ、２５０×２１．２０ｍｍ、流速：９ｍｌ／分、ＡＣＮ：Ｈ2Ｏ＋０．１％のＴＦＡ／１０：９０→９５：５、４５分）により直接精製して、凍結乾燥後に黄色の非晶性固体として３．４ｍｇ（１．７４４μｍｏｌ、７０％）のＤ−Ｏｒｎ−ゴセレリン−ＰＥＧ2−ＣＦを得た。
【０２９６】
Ｄ−Ｏｒｎ−ゴセレリン−ＰＥＧ2−ＣＦ：ＣＦ：HRMS (ESI-IT) [m/z]: 974.9419, C95H119N23O23 [M+2H]2+の計算値974.9419, err [ppm] 0.0.
Ｌ−Ｏｒｎ−ＬＨＲＨ−ＣＦ  −  （（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−３−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）−２−（（Ｓ）−５−オキソピロリジン−２−カルボキサミド）プロパンアミド）−３−（１Ｈ−インドール−３−イル）プロパンアミド）−３−ヒドロキシプロパンアミド）−３−（４−ヒドロキシフェニル）プロパンアミド）−５−（４−（（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５−カルボキサミド）メチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）ペンタノイル）−Ｌ−ロイシル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−プロリルグリシンの合成
【化８７】
2020529457.tif 000089
【０２９７】
ＤＭＳＯ：ｐＨ＝７リン酸緩衝液：ｔＢｕＯＨ／２：２：１（１３３μＬ）の混合物中の５．０ｍｇ（３．３４μｍｏｌ、１．０ｅｑ）のＬ−Ｎ3−Ｏｒｎ−ＬＨＲＨ及び１．５２ｍｇ（３．６８μｍｏｌ、１．１ｅｑ）のホモプロパルギル−ＣＦの溶液に０．４４３μｇ（０．８３５μｍｏｌ、０．２５ｅｑ、ＤＭＳＯ中のストック溶液からの１０μＬ）のＴＢＴＡ、５３μｇ（０．３３４μｍｏｌ、０．１ｅｑ、Ｈ2Ｏ中のストック溶液からの１０μＬ）のＣｕＳＯ4、１．４７ｍｇ（６．６８ｍｏｌ、２．０ｅｑ）の酢酸亜鉛及び６６１μｇ（３．３４μｍｏｌ、０．５ｅｑ、Ｈ2Ｏ中のストック溶液からの１０μＬ）のアスコルビン酸ナトリウムを加え、ＬＣＭＳにより完全な変換がモニターされるまで混合物を光排除下２３℃で２４ｈ撹拌した。反応混合物を１００μＬのＭｅＯＨで希釈し、ＲＰ分取ＨＰＬＣ（Phenomenex Gemini C18 RP-column 00G-4435-PO-AX、５μｍ、１１０Ａ、２５０×２１．２０ｍｍ、流速：９ｍｌ／分、ＡＣＮ：Ｈ2Ｏ＋０．１％のＴＦＡ／１０：９０→９５：５、４５分）により直接精製して、凍結乾燥後に濃黄色の非晶性固体として４．０ｍｇ（２．０９μｍｏｌ、６０％）のＬ−Ｏｒｎ−ＬＨＲＨ−ＣＦを得た。
【０２９８】
Ｌ−Ｏｒｎ−ＬＨＲＨ−ＣＦ：LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 840.4 [M+2H]2+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 560.5794, C82H97N10O20 [M+3H]3+の計算値560.5724, err [ppm] 12.487.
キャリア分子へのラトジャドン誘導体の共役
１．１．１．１３  ビオチン−ラトジャドンコンジュゲート
ビオチン−ＰＥＧ3−１６Ｓ−アミノラトジャドン  −  ２−（１−（１３−オキソ−１７−（（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）−２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）−３，６，９−トリオキサ−１２−アザヘプタデシル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）エチル（（１Ｓ，２Ｅ，４Ｅ，７Ｒ，８Ｚ，１０Ｅ）−１−（（２Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−４−ヒドロキシ−５−メチル−６−（（Ｅ）−プロパ−１−エン−１−イル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−５，７，９−トリメチル−１１−（（Ｒ）−６−オキソ−３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）ウンデカ−２，４，８，１０−テトラエン−１−イル）カルバメートの合成
【化８８】
2020529457.tif 000090
【０２９９】
ＤＭＳＯ：Ｈ2Ｏ：ｔＢｕＯＨ／２：１：１の混合物中の３．６ｍｇ（６．５３μｍｏｌ、１．０ｅｑ）の１６Ｓ−アミノラトジャドン誘導体２５及び３．２ｍｇ（７．１８μｍｏｌ、１．１ｅｑ）のＮ−（２−（２−（２−（２−アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）−５−（（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）−２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）ペンタンアミドの溶液に９．５μＬ（１９．６ｍｏｌ、３．０ｅｑ）のＤｉＰＥＡ、ＤＭＳＯ中のＴＢＴＡの１０μＬ（０．３４５ｍｇ、０．１ｅｑ）のストック溶液（３４．５ｍｇ／１ｍＬ）、Ｈ2Ｏ中のＣｕＳＯ4の１０μＬ（０．０５２ｍｇ、０．０５ｅｑ）のストック溶液（５．２ｍｇ／１ｍＬ）及びＨ2Ｏ中のアスコルビン酸ナトリウムの１０μＬ（０．６４６ｍｇ、０．１ｅｑ）のストック溶液（６４．６ｍｇ／１ｍＬ）を加えた。混合物を２３℃で２４ｈ撹拌した後、１００μＬ及び２００μＬのＤＭＳＯで希釈し、ＲＰ分取ＨＰＬＣ（Phenomenex Gemini C18 RP-column 00G-4435-PO-AX、５μｍ、１１０Ａ、２５０×２１．２０ｍｍ、流速：９ｍｌ／分、ＡＣＮ：Ｈ2Ｏ＋０．１％のＴＦＡ／１０：９０→９５：５、６０分）により精製して、凍結乾燥後に薄黄色の非晶性固体として２．５ｍｇ（２．５１μｍｏｌ、３９％）のビオチン−ＰＥＧ3−１６Ｓ−アミノラトジャドンを得た。
【０３００】
ビオチン−ＰＥＧ3~１６Ｓ−アミノラトジャドン：LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 996.5 [M+H]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 996.546028, C51H78N7O11S [M+H]+の計算値996.547454, err [ppm] -1.431
１．１．１．１４  葉酸−ラトジャドンコンジュゲート
１．１．１．１４．１  銅フリーのクリック反応を介した葉酸−ラトジャドンコンジュゲートの合成のための概略手順Ｅ
【０３０１】
対応するＦＡ−Ｎ3（１．１ｅｑ）をＤＭＳＯ（０．２Ｍ）に溶解させ、ＤＭＳＯ（０．２Ｍ）中のＢＣＮ−Ｏ（ＣＯ）ＨＮ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＯ（ＣＯ）ＮＨ−ラトジャ３１（１．０ｅｑ）の溶液を加え、ＬＣＭＳにより完全な変換がモニターされるまで混合物を光排除下２３℃で４〜２０ｈ撹拌した。反応混合物を１００μＬのＭｅＯＨで希釈し、Whatman（登録商標）フィルター（４５μｍ）に通して濾過し、ＲＰ分取ＨＰＬＣ（Phenomenex Gemini C18 RP-column 00G-4435-PO-AX、５μｍ、１１０Ａ、２５０×２１．２０ｍｍ、流速：９ｍｌ／分、ＡＣＮ：Ｈ2Ｏ＋０．１％のＴＦＡ／１０：９０→９５：５、４５分）により直接精製して、凍結乾燥後に黄色の非晶性固体として葉酸−ラトジャドンコンジュゲートを得た。
ＦＡ−１−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡ−１６Ｒ−アミノラトジャドン  −  Ｎ2−（４−（（（２−アミノ−４−オキソ−３，４−ジヒドロプテリジン−６−イル）メチル）アミノ）ベンゾイル）−Ｎ5−（（Ｓ）−１−カルボキシ−４−（（（Ｓ）−６−（４−（（５ａＲ，６Ｓ，６ａＳ）−６−（（（（（Ｓ）−１−（（（Ｓ）−１−（（４−（（（（（１Ｓ，２Ｅ，４Ｅ，７Ｒ，８Ｚ，１０Ｅ）−１−（（２Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−４−ヒドロキシ−５−メチル−６−（（Ｅ）−プロパ−１−エン−１−イル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−５，７−ジメチル−１１−（（Ｒ）−６−オキソ−３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）ドデカ−２，４，８，１０−テトラエン−１−イル）カルバモイル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ）−１−オキソ−５−ウレイドペンタン−２−イル）アミノ）−３−メチル−１−オキソブタン−２−イル）カルバモイル）オキシ）メチル）−５，５ａ，６，６ａ，７，８−ヘキサヒドロシクロプロパ［５，６］シクロオクタ［１，２−ｄ］［１，２，３］トリアゾール−１（４Ｈ）−イル）ベンズアミド）−１−メトキシ−１−オキソヘキサン−２−イル）アミノ）−４−オキソブチル）−Ｌ−グルタミン
【化８９】
2020529457.tif 000091
【０３０２】
ＦＡ−Ｎ3−１を概略手順Ｅに適用して、３．４ｍｇ（１７．４９μｍｏｌ、３９％）のＦＡ−１−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡ−１６Ｒ−アミノラトジャドンを黄色の非晶性固体として得た。
【０３０３】
ＦＡ−１−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡ−１６Ｒ−アミノラトジャドン：LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 1896.0 [M+H]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 948.46350, C96H125N19O22 [M+2H]2+の計算値948.46328, err [ppm] 0.231.
ＦＡ−２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡ−１６Ｒ−アミノラトジャドン  −  Ｎ2−（４−（（（２−アミノ−４−ヒドロキシプテリジン−６−イル）メチル）アミノ）ベンゾイル）−Ｎ5−（（Ｓ）−３−カルボキシ−１−（（（Ｓ）−３−カルボキシ−１−（（（Ｓ）−３−カルボキシ−１−（（（Ｓ）−６−（４−（（５ａＲ，６Ｓ，６ａＳ）−６−（（（（（Ｓ）−１−（（（Ｓ）−１−（（４−（（（（（１Ｓ，２Ｅ，４Ｅ，７Ｒ，８Ｚ，１０Ｅ）−１−（（２Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−４−ヒドロキシ−５−メチル−６−（（Ｅ）−プロパ−１−エン−１−イル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−５，７−ジメチル−１１−（（Ｒ）−６−オキソ−３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）ドデカ−２，４，８，１０−テトラエン−１−イル）カルバモイル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ）−１−オキソ−５−ウレイドペンタン−２−イル）アミノ）−３−メチル−１−オキソブタン−２−イル）カルバモイル）オキシ）メチル）−５，５ａ，６，６ａ，７，８−ヘキサヒドロシクロプロパ［５，６］シクロオクタ［１，２−ｄ］［１，２，３］トリアゾール−１（４Ｈ）−イル）ベンズアミド）−１−メトキシ−１−オキソヘキサン−２−イル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）−Ｌ−グルタミン
【化９０】
2020529457.tif 000092
【０３０４】
ＦＡ−Ｎ3−２を概略手順Ｅに適用して、１．７ｍｇ（０．８０５μｍｏｌ、２８％）のＦＡ−２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡ−１６Ｒ−アミノラトジャドンを黄色の非晶性固体として得た。
【０３０５】
ＦＡ−２−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡ−１６Ｒ−アミノラトジャドン：LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 2112.9 [M+H]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 1056.4847, C103H133N21O28 [M+2H]2+の計算値1056.4825, err [ppm] 2.082.
ＦＡ−３−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡ−１６Ｒ−アミノラトジャドン  −  Ｎ2−（（Ｓ）−４−（４−（（（２−アミノ−４−ヒドロキシプテリジン−６−イル）メチル）アミノ）ベンズアミド）−４−カルボキシブタノイル）−Ｄ−アスパルチル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−アスパルチル−Ｎ6−（４−（（５ａＲ，６Ｓ，６ａＳ）−６−（（（（（２Ｓ）−１−（（（２Ｓ）−１−（（４−（（（（（２Ｅ，４Ｅ，７Ｒ，８Ｚ，１０Ｅ）−１−（（２Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−４−ヒドロキシ−５−メチル−６−（（Ｅ）−プロパ−１−エン−１−イル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−５，７−ジメチル−１１−（（Ｒ）−６−オキソ−３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）ドデカ−２，４，８，１０−テトラエン−１−イル）カルバモイル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ）−１−オキソ−５−ウレイドペンタン−２−イル）アミノ）−３−メチル−１−オキソブタン−２−イル）カルバモイル）オキシ）メチル）−５，５ａ，６，６ａ，７，８−ヘキサヒドロシクロプロパ［５，６］シクロオクタ［１，２−ｄ］［１，２，３］トリアゾール−１（４Ｈ）−イル）ベンゾイル）−Ｌ−リジン
【化９１】
2020529457.tif 000093
【０３０６】
ＦＡ−Ｎ3−３を概略手順Ｅに適用して、３．３ｍｇ（１．５７３μｍｏｌ、５４％）のＦＡ−３−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡ−１６Ｒ−アミノラトジャドンを黄色の非晶性固体として得た。
【０３０７】
ＦＡ−３−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡ−１６Ｒ−アミノラトジャドン：LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 1049.8 [M+2H]2+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 1049.47480, C102H131N21O28 [M+2H]2+の計算値1049.47475, err [ppm] 0.047.
ＦＡ−４−（Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡ−１６Ｒ−アミノラトジャドン）2  −  Ｎ2−Ｎ2−（（Ｓ）−４−（４−（（（２−アミノ−４−ヒドロキシプテリジン−６−イル）メチル）アミノ）ベンズアミド）−４−カルボキシブタノイル）−Ｄ−アスパルチル−Ｄ−アスパルチル−Ｎ6−（４−（２−（（５ａＲ，６Ｓ，６ａＳ）−６−（（５Ｓ，８Ｓ）−１３−アミノ−８−（（４−（（（（（２Ｅ，４Ｅ，７Ｒ，８Ｚ，１０Ｅ）−１−（（２Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−４−ヒドロキシ−５−メチル−６−（（Ｅ）−プロパ−１−エン−１−イル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−５，７−ジメチル−１１−（（Ｒ）−６−オキソ−３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）ドデカ−２，４，８，１０−テトラエン−１−イル）カルバモイル）オキシ）メチル）フェニル）カルバモイル）−５−イソプロピル−３，６，１３−トリオキソ−２−オキサ−４，７，１２−トリアザトリデシル）−５，５ａ，６，６ａ，７，８−ヘキサヒドロシクロプロパ［５，６］シクロオクタ［１，２−ｄ］［１，２，３］トリアゾール−１（４Ｈ）−イル））ベンゾイル）−Ｌ−リジル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−アスパルチル−Ｎ6−（４−（２−（（５ａＲ，６Ｓ，６ａＳ）−６−（（５Ｓ，８Ｓ）−１３−アミノ−８−（（４−（（（（（２Ｅ，４Ｅ，７Ｒ，８Ｚ，１０Ｅ）−１−（（２Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−４−ヒドロキシ−５−メチル−６−（（Ｅ）−プロパ−１−エン−１−イル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−５，７−ジメチル−１１−（（Ｒ）−６−オキソ−３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）ドデカ−２，４，８，１０−テトラエン−１−イル）カルバモイル）オキシ）メチル）フェニル）カルバモイル）−５−イソプロピル−３，６，１３−トリオキソ−２−オキサ−４，７，１２−トリアザトリデシル）−５，５ａ，６，６ａ，７，８−ヘキサヒドロシクロプロパ［５，６］シクロオクタ［１，２−ｄ］［１，２，３］トリアゾール−１（４Ｈ）−イル））ベンゾイル）−Ｌ−リジン
【化９２】
2020529457.tif 000094
【０３０８】
ＦＡ−Ｎ3−４を概略手順Ｅ（修正：２．２ｅｑのＢＣＮ−Ｏ（ＣＯ）ＨＮ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＯ（ＣＯ）ＮＨ−ラトジャ３１）に適用して、２．９ｍｇ（０．８０μｍｏｌ、３６％）のＦＡ−４−（Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡ−１６Ｒ−アミノラトジャドン）2を黄色の非晶性固体として得た。
【０３０９】
ＦＡ−４−（Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡ−１６Ｒ−アミノラトジャドン）2：LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 1175.4 [M+3H]3+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 1174.89793, C177H232N33O44 [M+3H]3+の計算値1174.89827, err [ppm] -0.289.
ＦＡ−５−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡ−１６Ｒ−アミノラトジャドン  −  Ｎ2−（４−（（（２−アミノ−４−ヒドロキシプテリジン−６−イル）メチル）アミノ）−ベンゾイル）−Ｎ5−（（２Ｒ）−３−カルボキシ−１−（（（２Ｒ）−３−カルボキシ−１−（（（２Ｒ）−３−カルボキシ−１−（（（２Ｒ）−３−カルボキシ−１−（（（２Ｒ）−３−カルボキシ−１−（（（１Ｓ）−１−カルボキシ−４−（（５ａＲ，６Ｓ，６ａＳ）−６−（（（（（２Ｒ）−１−（（（２Ｒ）−１−（（４−（（（（（２Ｅ，４Ｅ，７Ｒ，８Ｚ，１０Ｅ）−１−（（２Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−４−ヒドロキシ−５−メチル−６−（（Ｅ）−プロパ−１−エン−１−イル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−５，７−ジメチル−１１−（（Ｒ）−６−オキソ−３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）ドデカ−２，４，８，１０−テトラエン−１−イル）カルバモイル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ）−１−オキソ−５−ウレイドペンタン−２−イル）アミノ）−３−メチル−１−オキソブタン−２−イル）カルバモイル）オキシ）メチル）−５，５ａ，６，６ａ，７，８−ヘキサヒドロシクロプロパ［５，６］シクロオクタ［１，２−ｄ］［１，２，３］トリアゾール−１（４Ｈ）−イル）ブチル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）−Ｌ−グルタミン
【化９３】
2020529457.tif 000095
【０３１０】
ＦＡ−Ｎ3−５を概略手順Ｅに適用して、３．９ｍｇ（１．７８μｍｏｌ、６１％）のＦＡ−５−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡ−１６Ｒ−アミノラトジャドンを黄色の非晶性固体として得た。
【０３１１】
ＦＡ−５−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡ−１６Ｒ−アミノラトジャドン：LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 1097.7 [M+2H]2+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 1097.97430, C102H134N22O33 [M+2H]2+の計算値1097.9753, err [ppm] -0.919
ＦＡ−６−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡ−１６Ｒ−アミノラトジャドン  −（３Ｓ，８Ｓ，１３Ｓ）−１−（４−（（（２−アミノ−４−ヒドロキシプテリジン−６−イル）メチル）アミノ）フェニル）−１９−（４−（（５ａＲ，６Ｓ，６ａＳ）−６−（（５Ｓ，８Ｓ）−１３−アミノ−８−（（４−（（（（（１Ｒ，２Ｅ，４Ｅ，７Ｒ，８Ｚ，１０Ｅ）−１−（（２Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−４−ヒドロキシ−５−メチル−６−（（Ｅ）−プロパ−１−エン−１−イル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−５，７，９−トリメチル−１１−（（Ｒ）−６−オキソ−３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）ウンデカ−２，４，８，１０−テトラエン−１−イル）カルバモイル）オキシ）メチル）フェニル）カルバモイル）−５−イソプロピル−３，６，１３−トリオキソ−２−オキサ−４，７，１２−トリアザトリデシル）−５，５ａ，６，６ａ，７，８−ヘキサヒドロシクロプロパ［５，６］シクロオクタ［１，２−ｄ］［１，２，３］トリアゾール−１（４Ｈ）−イル）フェニル）−１，６，１１，１９−テトラオキソ−２，７，１２，１８−テトラアザノナデカン−３，８，１３−トリカルボン酸
【化９４】
2020529457.tif 000096
【０３１２】
ＦＡ−Ｎ3−６を概略手順Ｅに適用して、２．２ｍｇ（１．１７μｍｏｌ、４９％）のＦＡ−６−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡ−１６Ｒ−アミノラトジャドンを黄色の非晶性固体として得た。
【０３１３】
ＦＡ−６−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡ−１６Ｒ−アミノラトジャドン：LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 1882.6 [M+H]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 940.9543, C95H123N19O22 [M+2H]2+の計算値940.9540, err [ppm] 0.318.
ＦＡ−７−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡ−１６Ｒ−アミノラトジャドン  −  Ｎ2−（４−（（（２−アミノ−４−ヒドロキシプテリジン−６−イル）メチル）アミノ）ベンゾイル）−Ｎ5−（（Ｓ）−１−カルボキシ−４−（（（Ｓ）−１−カルボキシ−４−（（５ａＲ，６Ｓ，６ａＳ）−６−（（（（（Ｓ）−１−（（（Ｓ）−１−（（４−（（（（（１Ｒ，２Ｅ，４Ｅ，７Ｒ，８Ｚ，１０Ｅ）−１−（（２Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−４−ヒドロキシ−５−メチル−６−（（Ｅ）−プロパ−１−エン−１−イル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−５，７，９−トリメチル−１１−（（Ｒ）−６−オキソ−３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）ウンデカ−２，４，８，１０−テトラエン−１−イル）カルバモイル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ）−１−オキソ−５−ウレイドペンタン−２−イル）アミノ）−３−メチル−１−オキソブタン−２−イル）カルバモイル）オキシ）メチル）−５，５ａ，６，６ａ，７，８−ヘキサヒドロシクロプロパ［５，６］シクロオクタ［１，２−ｄ］［１，２，３］トリアゾール−１（４Ｈ）−イル）ブチル）アミノ）−４−オキソブチル）−Ｌ−グルタミン
【化９５】
2020529457.tif 000097
【０３１４】
ＦＡ−Ｎ3−７を概略手順Ｅに適用して、１．１ｍｇ（０．６２９μｍｏｌ、２６％）のＦＡ−７−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡ−１６Ｒ−アミノラトジャドンを黄色の非晶性固体として得た。
【０３１５】
ＦＡ−７−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡ−１６Ｒ−アミノラトジャドン：LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 1748.6 [M+H]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 874.4274, C87H116N18O21 [M+2H]2+の計算値874.4276, err [ppm] -0.228.
ＦＡ−８−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡ−１６Ｒ−アミノラトジャドン  −  Ｎ2−（（Ｓ）−４−（４−（（（２−アミノ−４−ヒドロキシプテリジン−６−イル）メチル）アミノ）ベンズアミド）−４−カルボキシブタノイル）−Ｎ6−（４−（（５ａＲ，６Ｓ，６ａＳ）−６−（（（（（Ｓ）−１−（（（Ｓ）−１−（（４−（（（（（１Ｒ，２Ｅ，４Ｅ，７Ｒ，８Ｚ，１０Ｅ）−１−（（２Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−４−ヒドロキシ−５−メチル−６−（（Ｅ）−プロパ−１−エン−１−イル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−５，７，９−トリメチル−１１−（（Ｒ）−６−オキソ−３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）ウンデカ−２，４，８，１０−テトラエン−１−イル）カルバモイル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ）−１−オキソ−５−ウレイドペンタン−２−イル）アミノ）−３−メチル−１−オキソブタン−２−イル）カルバモイル）オキシ）メチル）−５，５ａ，６，６ａ，７，８−ヘキサヒドロシクロプロパ［５，６］シクロオクタ［１，２−ｄ］［１，２，３］トリアゾール−１（４Ｈ）−イル）ベンゾイル）−Ｌ−リジル−Ｄ−リジン
【化９６】
2020529457.tif 000098
【０３１６】
ＦＡ−Ｎ3−８を概略手順Ｅに適用して、１．３ｍｇ（０．６９１μｍｏｌ、３２％）のＦＡ−８−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡ−１６Ｒ−アミノラトジャドンを黄色の非晶性固体として得た。
【０３１７】
ＦＡ−８−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡ−１６Ｒ−アミノラトジャドン：LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 940.6 [M+2H]2+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 940.98325, C96H128N20O20 [M+2H]2+の計算値940.98163, err [ppm] 1.76.
ＦＡ−９−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡ−１６Ｒ−アミノラトジャドン  −（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−４−（４−（（（２−アミノ−４−ヒドロキシプテリジン−６−イル）メチル）アミノ）ベンズアミド）−４−カルボキシブタンアミド）−５−（（５ａＲ，６Ｓ，６ａＳ）−６−（（（（（Ｓ）−１−（（（Ｓ）−１−（（４−（（（（（１Ｒ，２Ｅ，４Ｅ，７Ｒ，８Ｚ，１０Ｅ）−１−（（２Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−４−ヒドロキシ−５−メチル−６−（（Ｅ）−プロパ−１−エン−１−イル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−５，７，９−トリメチル−１１−（（Ｒ）−６−オキソ−３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）ウンデカ−２，４，８，１０−テトラエン−１−イル）カルバモイル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ）−１−オキソ−５−ウレイドペンタン−２−イル）アミノ）−３−メチル−１−オキソブタン−２−イル）カルバモイル）オキシ）メチル）−５，５ａ，６，６ａ，７，８−ヘキサヒドロシクロプロパ［５，６］シクロオクタ［１，２−ｄ］［１，２，３］トリアゾール−１（４Ｈ）−イル）ペンタノイル）−Ｄ−リジン
【化９７】
2020529457.tif 000099
【０３１８】
ＦＡ−Ｎ3−９を概略手順Ｅに適用して、１．０ｍｇ（０．５７２μｍｏｌ、２６％）のＦＡ−９−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡ−１６Ｒ−アミノラトジャドンを黄色の非晶性固体として得た。
【０３１９】
ＦＡ−９−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡ−１６Ｒ−アミノラトジャドン：LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 1748.0 [M+H]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 873.9538, C88H121N19O19 [M+2H]2+の計算値873.9538, err [ppm] 0.0.
ＦＡ−１０−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡ−１６Ｒ−アミノラトジャドン  −（（Ｓ）−２−（（Ｒ）−２−（（Ｒ）−２−（（Ｒ）−２−（（Ｓ）−４−（４−（（（２−アミノ−４−ヒドロキシプテリジン−６−イル）メチル）アミノ）ベンズアミド）−４−カルボキシブタンアミド）−３−カルボキシプロパンアミド）−３−カルボキシプロパンアミド）−３−カルボキシプロパンアミド）−５−（（５ａＲ，６Ｓ，６ａＳ）−６−（（（（（Ｓ）−１−（（（Ｓ）−１−（（４−（（（（（１Ｒ，２Ｅ，４Ｅ，７Ｒ，８Ｚ，１０Ｅ）−１−（（２Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−４−ヒドロキシ−５−メチル−６−（（Ｅ）−プロパ−１−エン−１−イル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−５，７，９−トリメチル−１１−（（Ｒ）−６−オキソ−３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）ウンデカ−２，４，８，１０−テトラエン−１−イル）カルバモイル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ）−１−オキソ−５−ウレイドペンタン−２−イル）アミノ）−３−メチル−１−オキソブタン−２−イル）カルバモイル）オキシ）メチル）−５，５ａ，６，６ａ，７，８−ヘキサヒドロシクロプロパ［５，６］シクロオクタ［１，２−ｄ］［１，２，３］トリアゾール−１（４Ｈ）−イル）ペンタノイル）−Ｄ−アスパルチル−Ｄ−アスパルチル−Ｄ−リジン
【化９８】
2020529457.tif 000100
【０３２０】
ＦＡ−Ｎ3−１０を概略手順Ｅに適用して、１．８ｍｇ（０．７８μｍｏｌ、２４％）のＦＡ−１０−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡ−１６Ｒ−アミノラトジャドンを黄色の非晶性固体として得た。
【０３２１】
ＦＡ−１０−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡ−１６Ｒ−アミノラトジャドン：LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 1162.1 [M+H]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 775.01786, の計算値775.01762 C108H147N24O34 [M+3H]3+, err [ppm] 0.309.
ＦＡ−１１−（Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡ−１６Ｒ−アミノラトジャドン）3  −  Ｎ2−（４−（（（２−アミノ−４−ヒドロキシプテリジン−６−イル）メチル）アミノ）−ベンゾイル）−Ｎ5−（（Ｒ）−３−カルボキシ−１−（（（Ｒ）−３−カルボキシ−１−（（（Ｓ）−１−（（（Ｒ）−３−カルボキシ−１−（（（Ｒ）−３−カルボキシ−１−（（（Ｓ）−１−（（（Ｒ）−３−カルボキシ−１−（（（Ｒ）−３−カルボキシ−１−（（（Ｓ）−１−カルボキシ−４−（２−（（５ａＲ，６Ｓ，６ａＳ）−６−（（５Ｓ，８Ｓ）−１３−アミノ−８−（（４−（（（（（１Ｒ，２Ｅ，４Ｅ，７Ｒ，８Ｚ，１０Ｅ）−１−（（２Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−４−ヒドロキシ−５−メチル−６−（（Ｅ）−プロパ−１−エン−１−イル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−５，７，９−トリメチル−１１−（（Ｒ）−６−オキソ−３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）ウンデカ−２，４，８，１０−テトラエン−１−イル）カルバモイル）オキシ）メチル）フェニル）カルバモイル）−５−イソプロピル−３，６，１３−トリオキソ−２−オキサ−４，７，１２−トリアザトリデシル）−５，５ａ，６，６ａ，７，８−ヘキサヒドロシクロプロパ［５，６］シクロオクタ［１，２−ｄ］［１，２，３］トリアゾール−１（４Ｈ）−イル））ブチル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ）−５−（２−（（５ａＲ，６Ｓ，６ａＳ）−６−（（５Ｓ，８Ｓ）−１３−アミノ−８−（（４−（（（（（１Ｒ，２Ｅ，４Ｅ，７Ｒ，８Ｚ，１０Ｅ）−１−（（２Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−４−ヒドロキシ−５−メチル−６−（（Ｅ）−プロパ−１−エン−１−イル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−５，７，９−トリメチル−１１−（（Ｒ）−６−オキソ−３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）ウンデカ−２，４，８，１０−テトラエン−１−イル）カルバモイル）オキシ）メチル）フェニル）カルバモイル）−５−イソプロピル−３，６，１３−トリオキソ−２−オキサ−４，７，１２−トリアザトリデシル）−５，５ａ，６，６ａ，７，８−ヘキサヒドロシクロプロパ［５，６］シクロオクタ［１，２−ｄ］［１，２，３］トリアゾール−１（４Ｈ）−イル））−１−オキソペンタン−２−イル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ）−５−（２−（（５ａＲ，６Ｓ，６ａＳ）−６−（（５Ｓ，８Ｓ）−１３−アミノ−８−（（４−（（（（（１Ｒ，２Ｅ，４Ｅ，７Ｒ，８Ｚ，１０Ｅ）−１−（（２Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−４−ヒドロキシ−５−メチル−６−（（Ｅ）−プロパ−１−エン−１−イル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−５，７，９−トリメチル−１１−（（Ｒ）−６−オキソ−３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）ウンデカ−２，４，８，１０−テトラエン−１−イル）カルバモイル）オキシ）メチル）フェニル）カルバモイル）−５−イソプロピル−３，６，１３−トリオキソ−２−オキサ−４，７，１２−トリアザトリデシル）−５，５ａ，６，６ａ，７，８−ヘキサヒドロシクロプロパ［５，６］シクロオクタ［１，２−ｄ］［１，２��３］トリアゾール−１（４Ｈ）−イル））−１−オキソペンタン−２−イル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）−Ｌ−グルタミン
【化９９】
2020529457.tif 000101
【０３２２】
ＦＡ−Ｎ3−１１を概略手順Ｅ（修正  ３．３ｅｑのＢＣＮ−Ｏ（ＣＯ）ＨＮ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＯ（ＣＯ）ＮＨ−ラトジャ３１）に適用して、４．７ｍｇ（１．００７μｍｏｌ、５４％）のＦＡ−１１−（Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡ−１６Ｒ−アミノラトジャドン）3を黄色の非晶性固体として得た。
【０３２３】
ＦＡ−１１−（Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡ−１６Ｒ−アミノラトジャドン）3：LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 1555.5 [M+3H]3+.
１．１．１．１４．２  銅媒介性のクリック反応を介した葉酸−ラトジャドンコンジュゲートの合成のための概略手順Ｆ
【０３２４】
対応するＦＡ−Ｎ3（１．１ｅｑ）及び対応するラトジャドンペイロード（２２、２４又は４１）（１．０ｅｑ）をＤＭＳＯ：Ｈ2Ｏ：ｔＢｕＯＨ／２：１：１の混合物に溶解させ、ＤｉＰＥＡ（６．０ｅｑ）、ＴＢＴＡ（０．１ｅｑ、ＤＭＳＯ中のストック溶液からの１０μＬ）、ＣｕＳＯ4（０．０５ｅｑ、Ｈ2Ｏ中のストック溶液からの１０μＬ）及びアスコルビン酸ナトリウム（０．５ｅｑ、Ｈ2Ｏ中のストック溶液からの１０μＬ）を加え、ＬＣＭＳにより完全な変換がモニターされるまで混合物を光排除下２３℃で４〜２４ｈ撹拌した。反応混合物を１００μＬのＭｅＯＨで希釈し、Whatman（登録商標）フィルター（４５μｍ）に通して濾過し、ＲＰ分取ＨＰＬＣ（Phenomenex Gemini C18 RP-column 00G-4435-PO-AX、５μｍ、１１０Ａ、２５０×２１．２０ｍｍ、流速：９ｍｌ／分、ＡＣＮ：Ｈ2Ｏ＋０．１％のＴＦＡ／１０：９０→９５：５、４５分）により直接精製して、凍結乾燥後に黄色の非晶性固体として葉酸−ラトジャドンコンジュゲートを得た。
ＦＡ−３−１６Ｒ−アミノラトジャドン  −  Ｎ2−（（Ｓ）−４−（４−（（（２−アミノ−４−ヒドロキシプテリジン−６−イル）メチル）アミノ）ベンズアミド）−４−カルボキシブタノイル）−Ｄ−アスパルチル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−アスパルチル−Ｎ6−（４−（４−（２−（（（（１Ｒ，２Ｅ，４Ｅ，７Ｒ，８Ｚ，１０Ｅ）−１−（（２Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−４−ヒドロキシ−５−メチル−６−（（Ｅ）−プロパ−１−エン−１−イル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−５，７，９−トリメチル−１１−（（Ｒ）−６−オキソ−３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）ウンデカ−２，４，８，１０−テトラエン−１−イル）カルバモイル）オキシ）エチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）ベンゾイル）−Ｌ−リジン
【化１００】
2020529457.tif 000102
【０３２５】
ＦＡ−Ｎ3−３及び１６Ｒ−アミノラトジャドン誘導体２４を概略手順Ｆに適用して、２．７ｍｇ（１．５８μｍｏｌ、４２％）のＦＡ−３−１６Ｒ−アミノラトジャドンを黄色の非晶性固体として得た。
【０３２６】
ＦＡ−３−１６Ｒ−アミノラトジャドン：LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 1612.4 [M+H]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 806.3405, C77H96N16O23 [M+2H]2+の計算値806.3412, err [ppm] -0.639.
ＦＡ−３−１９−アミノラトジャドン  −  Ｎ2−（（Ｓ）−４−（４−（（（２−アミノ−４−ヒドロキシプテリジン−６−イル）メチル）アミノ）ベンズアミド）−４−カルボキシブタノイル）−Ｄ−アスパルチル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−アスパルチル−Ｎ6−（４−（４−（（（（２Ｓ，３Ｓ，６Ｓ）−６−（（１Ｒ，２Ｅ，４Ｅ，７Ｒ，８Ｚ，１０Ｅ）−１−ヒドロキシ−５，７，９−トリメチル−１１−（（Ｒ）−６−オキソ−３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）ウンデカ−２，４，８，１０−テトラエン−１−イル）−３−メチル−２−（（Ｅ）−プロパ−１−エン−１−イル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）アミノ）メチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）ベンゾイル）−Ｌ−リジン
【化１０１】
2020529457.tif 000103
【０３２７】
ＦＡ−Ｎ3−３及び１９−アミノラトジャドン誘導体４１を概略手順Ｆに適用して、１．２ｍｇ（０．７７μｍｏｌ、１０％）のＦＡ−３−１９−アミノラトジャドンを黄色の非晶性固体として得た。
【０３２８】
ＦＡ−３−１９−アミノラトジャドン：LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 777.8 [M+2H]2+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 777.3384, C75H94N16O21 [M+2H]2+の計算値777.3384, err [ppm] 0.0.
ＦＡ−３ｂ−１６Ｒ−アミノラトジャドン  −  Ｎ2−（（Ｓ）−４−（４−（（（２−アミノ−４−ヒドロキシプテリジン−６−イル）メチル）アミノ）ベンズアミド）−４−カルボキシブタノイル）−Ｄ−アスパルチル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−アスパルチル−Ｎ6−（４−（４−（３−（（（１Ｒ，２Ｅ，４Ｅ，７Ｒ，８Ｚ，１０Ｅ）−１−（（２Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−４−ヒドロキシ−５−メチル−６−（（Ｅ）−プロパ−１−エン−１−イル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−５，７，９−トリメチル−１１−（（Ｒ）−６−オキソ−３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）ウンデカ−２，４，８，１０−テトラエン−１−イル）アミノ）−３−オキソプロピル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）ベンゾイル）−Ｌ−リジン
【化１０２】
2020529457.tif 000104
【０３２９】
ＦＡ−Ｎ3−３及び１６Ｒ−アミノラトジャドン誘導体２２を概略手順Ｆに適用して、１．９ｍｇ（１．１９μｍｏｌ、１７％）のＦＡ−３ｂ−１６Ｒ−アミノラトジャドンを黄色の非晶性固体として得た。
【０３３０】
ＦＡ−３ｂ−１６Ｒ−アミノラトジャドン：LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 1596.7 [M+H]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 798.34173, C77H96N16O22 [M+H]+の計算値798.34370, err [ppm] -2.41
ＦＡ−５−１６Ｒ−アミノラトジャドン  −  Ｎ2−（４−（（（２−アミノ−４−ヒドロキシプテリジン−６−イル）メチル）アミノ）ベンゾイル）−Ｎ5−（（Ｒ）−３−カルボキシ−１−（（（Ｒ）−３−カルボキシ−１−（（（Ｒ）−３−カルボキシ−１−（（（Ｒ）−３−カルボキシ−１−（（（Ｒ）−３−カルボキシ−１−（（（Ｓ）−１−カルボキシ−４−（４−（２−（（（（１Ｒ，２Ｅ，４Ｅ，７Ｒ，８Ｚ，１０Ｅ）−１−（（２Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−４−ヒドロキシ−５−メチル−６−（（Ｅ）−プロパ−１−エン−１−イル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−５，７，９−トリメチル−１１−（（Ｒ）−６−オキソ−３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）ウンデカ−２，４，８，１０−テトラエン−１−イル）カルバモイル）オキシ）エチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）ブチル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）−Ｌ−グルタミン
【化１０３】
2020529457.tif 000105
【０３３１】
ＦＡ−Ｎ3−５及び１６Ｒ−アミノラトジャドン誘導体２４を概略手順Ｆに適用して、１．１ｍｇ（０．６８μｍｏｌ、１８％）のＦＡ−５−１６Ｒ−アミノラトジャドンを黄色の非晶性固体として得た。
【０３３２】
ＦＡ−５−１６Ｒ−アミノラトジャドン：LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 1709.9 [M+H]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 854.8417, C77H99N17O28 [M+2H]2+の計算値854.8417, err [ppm] 0.0.
ＦＡ−６−１６Ｒ−アミノラトジャドン  −（３Ｓ，８Ｓ，１３Ｓ）−１−（４−（（（２−アミノ−４−ヒドロキシプテリジン−６−イル）メチル）アミノ）フェニル）−１９−（４−（４−（２−（（（（１Ｒ，２Ｅ，４Ｅ，７Ｒ，８Ｚ，１０Ｅ）−１−（（２Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−４−ヒドロキシ−５−メチル−６−（（Ｅ）−プロパ−１−エン−１−イル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−５，７，９−トリメチル−１１−（（Ｒ）−６−オキソ−３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）ウンデカ−２，４，８，１０−テトラエン−１−イル）カルバモイル）オキシ）エチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）フェニル）−１，６，１１，１９−テトラオキソ−２，７，１２，１８−テトラアザノナデカン−３，８，１３−トリカルボン酸
【化１０４】
2020529457.tif 000106
【０３３３】
ＦＡ−Ｎ3−６及び１６Ｒ−アミノラトジャドン誘導体２４を概略手順Ｆに適用して、３．６ｍｇ（２．５８μｍｏｌ、６４％）のＦＡ−６−１６Ｒ−アミノラトジャドンを黄色の非晶性固体として得た。
【０３３４】
ＦＡ−６−１６Ｒ−アミノラトジャドン：LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 1396.3 [M+H]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 698.32208, C70H87N14O17 [M+2H]2+の計算値698.32204, err [ppm] 0.057
ＦＡ−７−１６Ｒ−アミノラトジャドン  −  Ｎ2−（４−（（（２−アミノ−４−ヒドロキシプテリジン−６−イル）メチル）アミノ）ベンゾイル）−Ｎ5−（（Ｓ）−１−カルボキシ−４−（（（Ｓ）−１−カルボキシ−４−（４−（２−（（（（１Ｒ，２Ｅ，４Ｅ，７Ｒ，８Ｚ，１０Ｅ）−１−（（２Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−４−ヒドロキシ−５−メチル−６−（（Ｅ）−プロパ−１−エン−１−イル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−５，７，９−トリメチル−１１−（（Ｒ）−６−オキソ−３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）ウンデカ−２，４，８，１０−テトラエン−１−イル）カルバモイル）オキシ）エチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）ブチル）アミノ）−４−オキソブチル）−Ｌ−グルタミン
【化１０５】
2020529457.tif 000107
【０３３５】
ＦＡ−Ｎ3−７及び１６Ｒ−アミノラトジャドン誘導体２４を概略手順Ｆに適用して、２．４ｍｇ（１．９０μｍｏｌ、４８％）のＦＡ−７−１６Ｒ−アミノラトジャドンを黄色の非晶性固体として得た。
【０３３６】
ＦＡ−７−１６Ｒ−アミノラトジャドン：LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 1263.8 [M+H]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 631.79626, C62H81N13O16 [M+2H]2+の計算値631.79566, err [ppm] -0.949
ＦＡ−８−１６Ｒ−アミノラトジャドン  −  Ｎ2−（（Ｓ）−４−（４−（（（２−アミノ−４−ヒドロキシプテリジン−６−イル）メチル）アミノ）ベンズアミド）−４−カルボキシブタノイル）−Ｎ6−（４−（４−（２−（（（（１Ｒ，２Ｅ，４Ｅ，７Ｒ，８Ｚ，１０Ｅ）−１−（（２Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−４−ヒドロキシ−５−メチル−６−（（Ｅ）−プロパ−１−エン−１−イル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−５，７，９−トリメチル−１１−（（Ｒ）−６−オキソ−３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）ウンデカ−２，４，８，１０−テトラエン−１−イル）カルバモイル）オキシ）エチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）ベンゾイル）−Ｌ−リジル−Ｄ−リジン
【化１０６】
2020529457.tif 000108
【０３３７】
ＦＡ−Ｎ3−８及び１６Ｒ−アミノラトジャドン誘導体２４を概略手順Ｆに適用して、１．４ｍｇ（１．００μｍｏｌ、２８％）のＦＡ−８−１６Ｒ−アミノラトジャドンを黄色の非晶性固体として得た。
【０３３８】
ＦＡ−８−１６Ｒ−アミノラトジャドン：LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 698.2 [M+2H]2+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 697.84802, の計算値697.84823 C23H34N5O6 [M+H]+, err [ppm] -0.288.
ＦＡ−９−１６Ｒ−アミノラトジャドン  −（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−４−（４−（（（２−アミノ−４−ヒドロキシプテリジン−６−イル）メチル）アミノ）ベンズアミド）−４−カルボキシブタンアミド）−５−（４−（２−（（（（１Ｒ，２Ｅ，４Ｅ，７Ｒ，８Ｚ，１０Ｅ）−１−（（２Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−４−ヒドロキシ−５−メチル−６−（（Ｅ）−プロパ−１−エン−１−イル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−５，７，９−トリメチル−１１−（（Ｒ）−６−オキソ−３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）ウンデカ−２，４，８，１０−テトラエン−１−イル）カルバモイル）オキシ）エチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）ペンタノイル）−Ｄ−リジン
【化１０７】
2020529457.tif 000109
【０３３９】
ＦＡ−Ｎ3−９及び１６Ｒ−アミノラトジャドン誘導体２４を概略手順Ｆに適用して、１．６ｍｇ（１．２６μｍｏｌ、３５％）のＦＡ−９−１６Ｒ−アミノラトジャドンを黄色の非晶性固体として得た。
【０３４０】
ＦＡ−９−１６Ｒ−アミノラトジャドン：LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 1261.9 [M+H]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 613.3218, C63H86N14O14 [M+H]+の計算値613.3218, err [ppm] 0.0.
ＦＡ−１０−１６Ｒ−アミノラトジャドン  −（（Ｓ）−２−（（Ｒ）−２−（（Ｒ）−２−（（Ｒ）−２−（（Ｓ）−４−（４−（（（２−アミノ−４−ヒドロキシプテリジン−６−イル）メチル）アミノ）ベンズアミド）−４−カルボキシブタンアミド）−３−カルボキシプロパンアミド）−３−カルボキシプロパンアミド）−３−カルボキシプロパンアミド）−５−（４−（２−（（（（１Ｒ，２Ｅ，４Ｅ，７Ｒ，８Ｚ，１０Ｅ）−１−（（２Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−４−ヒドロキシ−５−メチル−６−（（Ｅ）−プロパ−１−エン−１−イル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−５，７，９−トリメチル−１１−（（Ｒ）−６−オキソ−３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）ウンデカ−２，４，８，１０−テトラエン−１−イル）カルバモイル）オキシ）エチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）ペンタノイル）−Ｄ−アスパルチル−Ｄ−アスパルチル−Ｄ−リジン
【化１０８】
2020529457.tif 000110
【０３４１】
ＦＡ−Ｎ3−１０及び１６Ｒ−アミノラトジャドン誘導体２４を概略手順Ｆに適用して、２．５ｍｇ（１．３６μｍｏｌ、３４％）のＦＡ−１０−１６Ｒ−アミノラトジャドンを黄色の非晶性固体として得た。
【０３４２】
ＦＡ−１０−１６Ｒ−アミノラトジャドン：LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 919.8 [M+2H]2+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 918.89078, C83H111N19O29 [M+2H]2+の計算値918.88920, err [ppm] 1.719.
ＦＡ−ＳＳ−１６Ｒ−アミノラトジャドン  −  Ｎ2−（４−（（（２−アミノ−４−ヒドロキシプテリジン−６−イル）メチル）アミノ）ベンゾイル）−Ｎ5−（（Ｒ）−１−カルボキシ−２−（（３−（（（１Ｒ，２Ｅ，４Ｅ，７Ｒ，８Ｚ，１０Ｅ）−１−（（２Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−４−ヒドロキシ−５−メチル−６−（（Ｅ）−プロパ−１−エン−１−イル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−５，７，９−トリメチル−１１−（（Ｒ）−６−オキソ−３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）ウンデカ−２，４，８，１０−テトラエン−１−イル）アミノ）−３−オキソプロピル）ジスルファネイル）エチル）−Ｌ−グルタミンの合成
【化１０９】
2020529457.tif 000111
【０３４３】
アルゴン雰囲気下１．２２ｍＬのＡＣＮ中の２．６ｍｇ（４．７２μｍｏｌ、１．１ｅｑ）のＦＡ−ＳＨ−１の溶液に１．２２ｍｌのＰＢＳ緩衝液（ｐＨ＝７．４）中の２．８ｍｇ（４．２８μｍｏｌ、１．０ｅｑ）の２−ＰｙＳＳ（ＣＨ2）2（ＣＯ）ＮＨ−ラトジャ３５の溶液を加え、混合物を２３℃で４ｈ撹拌した。ＡＣＮを窒素流により除去し、５０μＬのＤＭＳＯを加えた。混合物をWhatman（登録商標）フィルター（４５μｍ）に通して濾過し、ＲＰ分取ＨＰＬＣ（Phenomenex Gemini C18 RP-column 00G-4435-PO-AX、５μｍ、１１０Ａ、２５０×２１．２０ｍｍ、流速：９ｍｌ／分、ＡＣＮ：Ｈ2Ｏ＋０．１％のＴＦＡ／１０：９０→９５：５、４５分）により直接精製して、凍結乾燥後に黄色の非晶性固体として１．５ｍｇ（１．３８μｍｏｌ、３２％）のＦＡ−ＳＳ−１６Ｒ−アミノラトジャドンを得た。
【０３４４】
ＦＡ−ＳＳ−１６Ｒ−アミノラトジャドン：LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 1086.5 [M+H]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 1086.44132, C53H68N9O12S2 [M+H]+の計算値1086.44233, err [ppm] -0.929
１．１．１．１５  ゴナドリベリン−ラトジャドンコンジュゲート
Ｌ−Ｏｒｎ−ＬＨＲＨ−１６Ｒ−アミノラトジャドン  −  ２−（１−（（３Ｓ，６Ｓ，９Ｓ，１２Ｓ，１５Ｓ）−３−（（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）メチル）−６−（（１Ｈ−インドール−３−イル）メチル）−１５−（（（Ｓ）−１−（（（Ｓ）−１−（（Ｓ）−２−（（２−アミノ−２−オキソエチル）カルバモイル）ピロリジン−１−イル）−５−グアニジノ−１−オキソペンタン−２−イル）アミノ）−４−メチル−１−オキソペンタン−２−イル）カルバモイル）−１２−（４−ヒドロキシベンジル）−９−（ヒドロキシメチル）−１，４，７，１０，１３−ペンタオキソ−１−（（Ｓ）−５−オキソピロリジン−２−イル）−２，５，８，１１，１４−ペンタアザオクタデカン−１８−イル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）エチル（（１Ｒ，２Ｅ，４Ｅ，７Ｒ，８Ｚ，１０Ｅ）−１−（（２Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−４−ヒドロキシ−５−メチル−６−（（Ｅ）−プロパ−１−エン−１−イル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−５，７，９−トリメチル−１１−（（Ｒ）−６−オキソ−３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）ウンデカ−２，４，８，１０−テトラエン−１−イル）カルバメートの合成
【化１１０】
2020529457.tif 000112
【０３４５】
ＤＭＳＯ：ｐＨ＝７リン酸緩衝液（１００ｎＭ）：ｔＢｕＯＨ／２：２：１（７２μＬ）の混合物中の５．４ｍｇ（３．６３μｍｏｌ、１．０ｅｑ）のＬ−Ｎ3−Ｏｒｎ−ＬＨＲＨ及び２．０ｍｇ（３．６３μｍｏｌ、１．０ｅｑ）の１６Ｒ−アミノラトジャドン誘導体２４の溶液に０．４８ｍｇ（０．９０６５μｍｏｌ、０．２５ｅｑ、ＤＭＳＯ中のストック溶液からの１０μＬ）のＴＢＴＡ、６６μｇ（０．３６３μｍｏｌ、０．１ｅｑ、Ｈ2Ｏ中のストック溶液からの１０μＬ）のＣｕＯＡｃ、２．３９ｍｇ（１０．８７５μｍｏｌ、３．０ｅｑ）の酢酸亜鉛及び７１８μｇ（３．６３μｍｏｌ、１．０ｅｑ、Ｈ2Ｏ中のストック溶液からの１０μＬ）のアスコルビン酸ナトリウムを加え、ＬＣＭＳにより完全な変換がモニターされるまで混合物を光排除下２３℃で１ｈ撹拌した。反応混合物を１００μＬのＭｅＯＨで希釈し、Whatman（登録商標）フィルター（４５μｍ）に通して濾過し、ＲＰ分取ＨＰＬＣ（Phenomenex Gemini C18 RP-column 00G-4435-PO-AX、５μｍ、１１０Ａ、２５０×２１．２０ｍｍ、流速：９ｍｌ／分、ＡＣＮ：Ｈ2Ｏ＋０．１％のＴＦＡ／１０：９０→９５：５、４５分）により直接精製して、凍結乾燥後に白色の非晶性固体として４．６ｍｇ（２．５３μｍｏｌ、７０％）のＬ−Ｏｒｎ−ＬＨＲＨ−１６Ｒ−アミノラトジャドンを得た。
【０３４６】
Ｌ−Ｏｒｎ−ＬＨＲＨ−１６Ｒ−アミノラトジャドン：LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 909.6 [M+H]+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 908.97884, C23H34N5O6 [M+H]+の計算値908.98031, err [ppm] -1.617.
Ｌ−Ｏｒｎ−ＬＨＲＨ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡ−１６Ｒ−アミノラトジャドン  −  ４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（（２−（１−（（３Ｓ，６Ｓ，９Ｓ，１２Ｓ，１５Ｓ）−３−（（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）メチル）−６−（（１Ｈ−インドール−３−イル）メチル）−１５−（（（Ｓ）−１−（（（Ｓ）−１−（（Ｓ）−２−（（２−アミノ−２−オキソエチル）カルバモイル）ピロリジン−１−イル）−５−グアニジノ−１−オキソペンタン−２−イル）アミノ）−４−メチル−１−オキソペンタン−２−イル）カルバモイル）−１２−（４−ヒドロキシベンジル）−９−（ヒドロキシメチル）−１，４，７，１０，１３−ペンタオキソ−１−（（Ｓ）−５−オキソピロリジン−２−イル）−２，５，８，１１，１４−ペンタアザオクタデカン−１８−イル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）エトキシ）カルボニル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジル（（１Ｒ，２Ｅ，４Ｅ，７Ｒ，８Ｚ，１０Ｅ）−１−（（２Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−４−ヒドロキシ−５−メチル−６−（（Ｅ）−プロパ−１−エン−１−イル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−５，７，９−トリメチル−１１−（（Ｒ）−６−オキソ−３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）ウンデカ−２，４，８，１０−テトラエン−１−イル）カルバメート
【化１１１】
2020529457.tif 000113
【０３４７】
ＤＭＳＯ：ｐＨ＝７リン酸緩衝液：ｔＢｕＯＨ／２：２：１（８０μＬ）の混合物中の２．９７ｍｇ（１．９９μｍｏｌ、１．０ｅｑ）のＬ−Ｎ3−Ｏｒｎ−ＬＨＲＨ及び２．０ｍｇ（２．０９μｍｏｌ、１．０５ｅｑ）のホモプロパルギル−Ｏ（ＣＯ）ＨＮ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＯ（ＣＯ）ＮＨ−ラトジャ３４の溶液に０．４４３μｇ（０．８３５μｍｏｌ、０．２５ｅｑ、ＤＭＳＯ中のストック溶液からの１０μＬ）のＴＢＴＡ、３６μｇ（０．１９９μｍｏｌ、０．１ｅｑ、Ｈ2Ｏ中のストック溶液からの１０μＬ）のＣｕＯＡｃ、１．３１ｍｇ（５．９７μｍｏｌ、３．０ｅｑ）の酢酸亜鉛及び３９４μｇ（１．９９μｍｏｌ、１．０ｅｑ、Ｈ2Ｏ中のストック溶液からの１０μＬ）のアスコルビン酸ナトリウムを加え、ＬＣＭＳにより完全な変換がモニターされるまで混合物を光排除下２３℃で２ｈ撹拌した。反応混合物を１００μＬのＭｅＯＨで希釈し、Whatman（登録商標）フィルター（４５μｍ）に通して濾過し、ＲＰ分取ＨＰＬＣ（Phenomenex Gemini C18 RP-column 00G-4435-PO-AX、５μｍ、１１０Ａ、２５０×２１．２０ｍｍ、流速：９ｍｌ／分、ＡＣＮ：Ｈ2Ｏ＋０．１％のＴＦＡ／１０：９０→９５：５、４５分）により直接精製して、凍結乾燥後に白色の非晶性固体として２．２ｍｇ（０．８９８μｍｏｌ、４５％）のＬ−Ｏｒｎ−ＬＨＲＨ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡ−１６Ｒ−アミノラトジャドンを得た。
【０３４８】
Ｌ−Ｏｒｎ−ＬＨＲＨ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡ−１６Ｒ−アミノラトジャドン：LRMS (ESI-Quad) [m/z]: 1112.3 [M+2H]2+, HRMS (ESI-IT) [m/z]: 112.0826, C110H154N26O24 [M+2H]2+の計算値1112.0827, err [ppm] -0.089.
Ｄ−Ｏｒｎ−ＬＨＲＨ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡ−１６Ｒ−アミノラトジャドン  −  ４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（（（（５ａＲ，６Ｓ，６ａＳ）−１−（（３Ｓ，６Ｓ，９Ｓ，１２Ｓ，１５Ｒ）−３−（（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）メチル）−６−（（１Ｈ−インドール−３−イル）メチル）−１５−（（（Ｓ）−１−（（（Ｓ）−１−（（Ｓ）−２−（（２−アミノ−２−オキソエチル）カルバモイル）ピロリジン−１−イル）−５−グアニジノ−１−オキソペンタン−２−イル）アミノ）−４−メチル−１−オキソペンタン−２−イル）カルバモイル）−１２−（４−ヒドロキシベンジル）−９−（ヒドロキシメチル）−１，４，７，１０，１３−ペンタオキソ−１−（（Ｓ）−５−オキソピロリジン−２−イル）−２，５，８，１１，１４−ペンタアザオクタデカン−１８−イル）−１，４，５，５ａ，６，６ａ，７，８−オクタヒドロシクロプロパ［５，６］シクロオクタ［１，２−ｄ］［１，２，３］トリアゾール−６−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジル（（１Ｒ，２Ｅ，４Ｅ，７Ｒ，８Ｚ，１０Ｅ）−１−（（２Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−４−ヒドロキシ−５−メチル−６−（（Ｅ）−プロパ−１−エン−１−イル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−５，７，９−トリメチル−１１−（（Ｒ）−６−オキソ−３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）ウンデカ−２，４，８，１０−テトラエン−１−イル）カルバメート
【化１１２】
2020529457.tif 000114
【０３４９】
５４μＬの乾燥ＤＭＳＯ中の４ｍｇ（２．６７８μｍｏｌ、１．０ｅｑ）のＤ−Ｎ3−Ｏｒｎ−ＬＨＲＨの溶液に５４μＬの乾燥ＤＭＳＯ中の３．０ｍｇ（２．９４６μｍｏｌ、１．１ｅｑ）のＢＣＮ−Ｏ（ＣＯ）ＨＮ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＯ（ＣＯ）ＮＨ−ラトジャ３１の溶液を加え、ＬＣＭＳにより完全な変換がモニターされるまで混合物を光排除下２３℃で２ｈ撹拌した。反応混合物を１００μＬのＭｅＯＨで希釈し、Whatman（登録商標）フィルター（４５μｍ）に通して濾過し、ＲＰ分取ＨＰＬＣ（Phenomenex Gemini C18 RP-column 00G-4435-PO-AX、５μｍ、１１０Ａ、２５０×２１．２０ｍｍ、流速：９ｍｌ／分、ＡＣＮ：Ｈ2Ｏ＋０．１％のＴＦＡ／１０：９０→９５：５、４５分）により直接精製して、凍結乾燥後に白色の非晶性固体として３．７ｍｇ（１．６μｍｏｌ、６０％）のＤ−Ｏｒｎ−ＬＨＲＨ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡ−１６Ｒ−アミノラトジャドンを得た。
【０３５０】
Ｄ−Ｏｒｎ−ＬＨＲＨ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡ−１６Ｒ−アミノラトジャドン：HRMS (ESI-IT) [m/z]: 2302.2203, C116H161N26O24 [M+H]+の計算値2302.2171, err [ppm] 1.389.
Ｄ−Ｏｒｎ−ゴセレリン−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡ−１６Ｒ−アミノラトジャドン  −  ４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（（（（５ａＲ，６Ｓ，６ａＳ）−１−（（３Ｓ，６Ｓ，９Ｓ，１２Ｓ，１５Ｒ）−３−（（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）メチル）−６−（（１Ｈ−インドール−３−イル）メチル）−１５−（（（Ｓ）−１−（（（Ｓ）−１−（（Ｓ）−２−（２−カルバモイルヒドラジン−１−カルボニル）ピロリジン−１−イル）−５−グアニジノ−１−オキソペンタン−２−イル）アミノ）−４−メチル−１−オキソペンタン−２−イル）カルバモイル）−１２−（４−ヒドロキシベンジル）−９−（ヒドロキシメチル）−１，４，７，１０，１３−ペンタオキソ−１−（（Ｓ）−５−オキソピロリジン−２−イル）−２，５，８，１１，１４−ペンタアザオクタデカン−１８−イル）−１，４，５，５ａ，６，６ａ，７，８−オクタヒドロシクロ−プロパ［５，６］シクロオクタ［１，２−ｄ］［１，２，３］トリアゾール−６−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジル（（１Ｒ，２Ｅ，４Ｅ，７Ｒ，８Ｚ，１０Ｅ）−１−（（２Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−４−ヒドロキシ−５−メチル−６−（（Ｅ）−プロパ−１−エン−１−イル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−５，７，９−トリメチル−１１−（（Ｒ）−６−オキソ−３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）ウンデカ−２，４，８，１０−テトラエン−１−イル）カルバメート
【化１１３】
2020529457.tif 000115
【０３５１】
２５μＬの乾燥ＤＭＳＯ中の４ｍｇ（２．４８７μｍｏｌ、１．０ｅｑ）のＤ−Ｎ3−Ｏｒｎ−ゴセレリンの溶液に２５μＬの乾燥ＤＭＳＯ中の２．８４ｍｇ（２．７３５μｍｏｌ、１．１ｅｑ）のＢＣＮ−Ｏ（ＣＯ）ＨＮ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＯ（ＣＯ）ＮＨ−ラトジャ３１の溶液を加え、ＬＣＭＳにより完全な変換がモニターされるまで混合物を光排除下２３℃で１６ｈ撹拌した。反応混合物を１００μＬのＭｅＯＨで希釈し、Whatman（登録商標）フィルター（４５μｍ）に通して濾過し、ＲＰ分取ＨＰＬＣ（Phenomenex Gemini C18 RP-column 00G-4435-PO-AX、５μｍ、１１０Ａ、２５０×２１．２０ｍｍ、流速：９ｍｌ／分、ＡＣＮ：Ｈ2Ｏ＋０．１％のＴＦＡ／１０：９０→９５：５、４５分）により直接精製して、凍結乾燥後に白色の非晶性固体として３．９ｍｇ（１．６９μｍｏｌ、６８％）のＤ−Ｏｒｎ−ゴセレリン−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡ−１６Ｒ−アミノラトジャドンを得た。
【０３５２】
Ｄ−Ｏｒｎ−ゴセレリン−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡ−１６Ｒ−アミノラトジャドン：HRMS (ESI-IT) [m/z]: 768.4090, C115H162N27O24 [M+3H]3+の計算値768.4090, err [ppm] 0.0.
【０３５３】
化合物の生物学的評価
細胞増殖アッセイ
表１に与える培地中３７℃及び１０％のＣＯ2で対応する細胞を培養した。試験化合物の段階希釈液６０μＬを９６ウェルプレートのウェル中の懸濁細胞（５０．０００／ｍＬ）１２０μＬに与えた。５日のインキュベーション後、ＭＴＴアッセイを使用して増殖阻害（ＩＣ50）を決定した。[64]
【表１】
2020529457.tif 000116
【表２−１】
2020529457.tif 000117
【表２−２】
2020529457.tif 000118
【表３】
2020529457.tif 000119
【表４】
2020529457.tif 000120
【０３５４】
葉酸フリー条件下の細胞増殖アッセイ
１０％のウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）を含む葉酸を含まないＲＭＰＩ培地（Ｇｉｂｃｏ）中３７℃及び１０％のＣＯ2でＫＢ  ３．１（ＤＳＭＺ  ＡＣＣ  １５８）細胞を培養した。１２０μＬの懸濁細胞（１００．０００／ｍＬ）を９６ウェルプレートのウェルに播種し、３７℃及び１０％のＣＯ2での２４ｈ後、培地を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄し、葉酸を含まないＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ）＋１０％の透析したウシ胎仔血清（Ｓｉｇｍａ）を細胞に加えた後、３７℃及び１０％のＣＯ2でのさらなる２４ｈ後、試験化合物の段階希釈液６０μＬを細胞に与えた。１、２及び５日のインキュベーション後、ＭＴＴアッセイを使用して増殖阻害（ＩＣ50）を決定した。[64]
【表５】
2020529457.tif 000121
【０３５５】
エクスポート阻害活性のモニタリング
化合物のエクスポート阻害能力を移行（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）バイオセンサーシステムを用いて評価した。この細胞アッセイは、核局在シグナル（ＳＶ４０−ＮＬＳ）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及び核外輸送シグナル（ＨＩＶ１−ＲｅｖＮＥＳ）からなる組換え発現される融合タンパク質に依存する。２つの輸送シグナル（ＮＬＳ／ＮＥＳ）に起因して、バイオセンサーは、核と細胞質との間で永久的に往復するが、比較的より強いＮＥＳに起因して主に細胞質に存在する。エクスポート阻害化合物は、ＧＦＰシグナルの核内蓄積を誘導する[65、66]。１０％のＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＵＳＡ）を添加した５％のグルタミンを含有するＤＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＵＳＡ）中でＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎにより推奨されるように細胞株を維持した。核外輸送阻害効果を定量化するために、蛍光移行バイオセンサーを安定に発現するＨｅＬａ細胞（ＨｅＬａRevBio）[67]を黒色９６ウェルマイクロ透明プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に播種した。翌日（Ｔｈｅｙ  ｎｅｘｔ  ｄａｙ）、適切な濃度範囲をカバーするように化合物を加えた。１ｈのインキュベーション後、細胞を４％のＰＦＡ中に１０分間固定し、ＰＢＳ中０．１％のTriton X100で５分間透過処理した。ＰＢＳでの洗浄後、核をHoechst H33342（３０分、１０μｇ／ｍｌ）で標識した。バイオセンサー依存性ＧＦＰシグナルの細胞内分布をハイコンテントイメージングシステムImageXpress MicroXLS（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＵＳＡ）を用いて定量的に評価した。移行促進応用モジュール（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＵＳＡ）を使用することにより、細胞質及び核内領域のＧＦＰ強度を定量化した。最終の読取り情報として、平均内部強度と平均外部強度との差異を算出した。４パラメーターロジスティック曲線回帰を用いるSigma Plot（Ｓｙｓｔａｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＧｍｂＨ、Ｅｒｋｒａｔｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して核外輸送阻害のＩＣ50を算出した。共焦点顕微鏡法のために、細胞を０．２×１０5細胞／ウェルの密度で８ウェル顕微鏡法チャンバー（Ｉｂｉｄｉ  ＧｍｂＨ、Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に播種した。翌日、化合物を１２５ｎＭの最終濃度で加えた。１ｈ後、ＵｌｔｒａＶＩＥＷ  ＶｏＸスピニングディスク（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＵＳ）を備えたECLIPSE Ti（Ｎｉｋｏｎ）、ＯＲＣＡ−Ｒ２カメラ（Ｈａｍ  Ｈａｍａｍａｔｓｕ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ、Ｊａｐａｎ）及びＶｏｌｏｃｉｔｙソフトウェア６．１．１（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＵＳ）で細胞をイメージングした（図４及び図５を参照）。
【表６】
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【０３５６】
フルオレセイン標識コンジュゲートを用いた細胞標識化の解析
１０％のＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＵＳＡ）を添加した５％のグルタミンを含有するＤＭＥＭ又はＲＰＭＩ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＵＳＡ）中でＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎにより推奨されるように全ての細胞株を維持した。フローサイトメトリー（ｆｌｏｗ  ｃｙｔｒｏｍｅｔｒｉｃ）解析のために、細胞をトリプシンにより剥離し、密度を２×１０6細胞／ｍｌに調整した。細胞懸濁液を１μＭの最終濃度の化合物と３７℃で３０分間インキュベートした後、ＰＢＳ中で２回の洗浄ステップを行った。フルオレセイン強度の解析のために、５２５／５０ｎｍバンドパスフィルターと組み合わせて４８８ｎｍレーザーと共にＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）ソフトウェアを含むLSRFortessa（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦＬＯＷＪＯ  ＬＬＣ、Ｏｒｅｇｏｎ、ＵＳ）を使用してデータを評価した（図６及び図７を参照）。
【０３５７】
共焦点顕微鏡法のために、細胞を０．２×１０5細胞／ウェルの密度で８ウェル顕微鏡法チャンバー（Ｉｂｉｄｉ  ＧｍｂＨ、Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に播種した。翌日、化合物を１μＭの最終濃度で加えた。指し示した時点の後に、ＵｌｔｒａＶＩＥＷ  ＶｏＸスピニングディスク（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＵＳ）を備えたＥＣＬＩＰＳＥ  Ｔｉ（Ｎｉｋｏｎ）、ＯＲＣＡ−Ｒ２カメラ（Ｈａｍ  Ｈａｍａｍａｔｓｕ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ、Ｊａｐａｎ）及びＶｏｌｏｃｉｔｙソフトウェア６．１．１（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＵＳ）で細胞をイメージングした（図８〜１０を参照）。
【０３５８】
ラトジャドン−ビオチンを用いたプルダウン
核外輸送受容体Ｃｒｍ１へのラトジャドンの結合を化学的プルダウンにおいて示した。ＨｅＬａ細胞を０．１μｇ／ｍｌの最終濃度のラトジャドン−ビオチン、ラトジャドン又は両方で５ｈ処理した。細胞をこすることにより剥離し、ＰＢＳ中で２回洗浄し、完全プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を添加したＭＰＥＲ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＵＳＡ）に溶解させた。氷上での５分のインキュベーション後、溶解液を遠心分離（２０分、１３０００ｒｐｍ、４℃）し、上清を高速ストレプトアビジンセファロース（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）と終夜４℃でインキュベートした。翌日、ビーズをＰＢＳで２回洗浄し、溶出緩衝液（Ｒｏｔｈ）に再懸濁し、９５℃に１０分間加熱した。ビオチン特異的抗体を用いてＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔで５％を試験した（図１１を参照）。タンパク質の同定のために溶出液をプロテオミクスプラットフォーム（J. Wissing）に与えた。図１２は、標的同定のためのＬＣ−ＭＳプロテオームアプローチの結果を示す。合計で７９のタンパク質が同定され、ＣＲＭ１は最も高い面積を有していた。
【０３５９】
血漿安定性アッセイ
ＦＡ−７−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡ−１６Ｒ−アミノラトジャドン（ＰＫ００８ａ）、ＦＡ−ＳＳ−１６Ｒ−アミノラトジャドン（ＰＫ０２６ａ）及びＦＡ−３ｂ−１６Ｒ−アミノラトジャドン（ＰＫ０５８ａ）をＤＭＳＯに溶解させ、２５μＭの最終濃度となるようにマウス血漿（ｐＨ７．４、３７℃）に加えた。加えて、プロカイン、プロポキシカイン及びプロカインアミド（ＤＭＳＯ中に溶解）を２５０μＭの最終濃度となるようにマウス血漿（ｐＨ７．４、３７℃）に加えた。プロカイン及びプロポキシカインは、マウス血漿中で不安定なことが公知であるので、陽性対照として働いた。プロカインアミドは、マウス血漿中で安定なことが公知であるので、陰性対照として働いた。試料を０分、１５分、３０分、６０分、９０分、１２０分、２４ｈ、４８ｈ及び７２ｈにわたり３７℃でインキュベートした。各時点において、内部標準を含有する２２．５μｌのメタノールを用いて２０００ｒｐｍの振盪インキュベーター（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）で５分間、７．５μｌの各々の試料を抽出した。次に試料を１３．０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、上清をＨＰＬＣガラスバイアルに移した。ダイオードアレイＵＶ検出器を備え、AB Sciex QTrap 6500質量分光計に連結されたAgilent 1290 HPLCシステムを使用するＨＰＬＣ−ＭＳを介して全ての試料を解析した。ＨＰＬＣ条件は以下の通りであった：カラム：Agilent Zorbax Eclipse Plus C18、５０ｘ２．１ｍｍ、１．８μｍ；温度：３０℃；注入体積：１μｌ；流速７００μｌ／分；溶媒Ａ：水＋０．１％のＨＣＯＯＨ；溶媒Ｂ：アセトニトリル＋０．１％のＨＣＯＯＨ；勾配：９９％のＡ（０分）、９９％〜０％のＡ（０．１分〜５．５０分）、０％のＡ（６．００分まで）、次に９９％のＡのポストラン（２分間）；ＵＶ検出１９０〜４００ｎｍ。質量分析条件は以下の通りであった：スキャンタイプ：Ｑ１  ＭＳ；スキャン速度：１０００Ｄａ／秒；スキャン開始：１００Ｄａ；スキャン停止：１０００Ｄａ。全ての化合物をポジティブスキャンモードで検出した。各化合物及び内部標準のピーク面積をMultiQuant 3.0ソフトウェア（ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ）を使用して解析した。以下のｍ／ｚサーチウインドウ（表７）を使用してピークを定量化した。各々の化合物のピーク面積を０分の時点での各々のピーク面積に対して正規化した：Ｂ／Ａ＊１００（Ａ：０分の時点での各々の化合物のピーク面積、Ｂ：各々の時点での各々の内部標準のピーク面積）。あらゆる実験は独立して少なくとも３回繰り返した（図１３及び図１４を参照）。
【表７】
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【０３６０】
参考文献：
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１２−５】
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【図１２−６】
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【図１２−７】
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【図１２−８】
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【図１２−９】
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【図１２−１０】
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【図１２−１１】
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【図１２−１２】
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【図１２−１３】
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【図１２−１４】
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【図１２−１５】
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【図１２−１６】
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【図１２−１７】
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【図１２−１８】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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