(57)【要約】ここに開示するのは、トロゴサイトーシスに基づくTCRリガンド発見プラットフォームおよびそれを使用する方法、トロゴサイトーシスに基づくTCR発見プラットフォームおよびそれを使用する方法、およびトロゴサイトーシスに基づくリガンド発見プラットフォームおよびそれを使用する方法である。また、ここでは、トロゴサイトーシスに基づく発見プラットフォームを用いて生成する、分離した細胞、ヌクレオチド、配列、および配列データベースをも開示する。
2020529470.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原識別方法であって、以下のステップ：
a）一以上の抗原特異的T細胞受容体（TCR）発現性細胞集団を提供すること；
b）一以上の標的細胞集団を提供することであり、そこでは標的細胞集団は一以上の主要組織適合性複合体（MHC）対立遺伝子上で一以上の抗原ペプチドを提示すること；
c）一以上の抗原特異的TCR発現性細胞集団を一以上の標的細胞集団と接触させることであり、そこでは接触させることには、一以上の抗原特異的TCR発現性細胞集団の少なくとも一について一以上の標的細胞集団の少なくとも一を特異的に結合するのに十分な条件を提供することが含まれ、およびそこでは一以上の膜成分は、少なくとも一の抗原特異的TCR発現性細胞および少なくとも一の標的細胞間で結合の後に移されること；
d）次のものを分離すること、または分離したこと、
i）興味ある標的細胞であり、そこでは興味ある標的細胞には、接触させるステップ（c）の後に少なくとも一の抗原特異的TCR発現性細胞から移される一以上の膜成分が含まれるもの、および随意に
ii）興味あるTCR発現性細胞であり、そこでは興味あるTCR発現性細胞には、接触させるステップ（c）の後に少なくとも一の標的細胞から移される一以上の膜成分が含まれるもの；および
e）次のものを決定すること、または決定したこと、
i）興味ある標的細胞に関連する一以上の抗原ペプチドの配列、
ii）興味あるTCR発現性細胞に関連するTCRペプチドのTCR配列の少なくとも一部分、または
iii）興味ある標的細胞に関連する一以上の抗原ペプチドの配列および興味あるTCR発現性細胞に関連するTCRペプチドのTCR配列の少なくとも一部分
を含む、方法。
【請求項２】
抗原識別方法であって、以下のステップ：
a）抗原特異的TCRを発現する抗原特異的T細胞集団を提供すること；
b）複数の標的細胞集団を提供することであり、そこでは標的細胞集団は主要組織適合性複合体（MHC）対立遺伝子上で抗原ペプチドを提示すること；
c）抗原特異的T細胞集団を複数の標的細胞集団と接触させることであり、そこでは接触させることには、抗原特異的T細胞集団について複数の標的細胞集団の少なくとも一に特異的に結合するのに十分な条件を提供することが含まれ、およびそこでは一以上の膜成分は、抗原特異的T細胞および少なくとも一の標的細胞間で結合の後に移されること；
d）次の、
i）興味ある標的細胞
を分離すること、または分離したことであり、そこでは興味ある標的細胞には、接触させるステップ（c）の後に抗原特異的TCR発現性細胞から移される一以上の膜成分が含まれること；および
e）興味ある標的細胞に関連する一以上の抗原ペプチドの配列を決定すること、または決定したこと
を含み、
そこでは決定するステップ（e）には、興味ある標的細胞から一以上のポリヌクレオチドを精製すること、または精製したこと、および精製ポリヌクレオチドを鋳型として用いて生成される精製ポリヌクレオチドまたは任意のポリヌクレオチドを配列決定すること、または配列決定したことが含まれる、方法。
【請求項３】
抗原特異的TCR識別方法であって、次のステップ：
a）一以上の抗原特異的TCR発現性細胞集団を提供すること；
b）一以上の標的細胞集団を提供することであり、そこでは標的細胞集団は一以上の主要組織適合性複合体（MHC）対立遺伝子上で一以上の抗原ペプチドを提示すること；
c）一以上の抗原特異的TCR発現性細胞集団を一以上の標的細胞集団と接触させることであり、そこでは一以上の抗原特異的TCR発現性細胞集団の少なくとも一は一以上の標的細胞集団の少なくとも一に特異的に結合し、およびそこでは一以上の膜成分は少なくとも一の抗原特異的TCR発現性細胞および少なくとも一の標的細胞間で結合の後に移されること；
d）次のものを分離すること、または分離したこと、
i）興味あるTCR発現性細胞であり、そこでは興味あるTCR発現性細胞には、接触させるステップ（c）の後に少なくとも一の標的細胞から移される一以上の膜成分が含まれ、またはそこでは興味あるTCR発現性細胞は接触させるステップ（c）の後に少なくとも一の抗原特異的TCR発現性細胞から移される一以上の膜成分の損失を実証するもの、および随意に
ii）興味ある標的細胞であり、そこでは興味ある標的細胞には、接触させるステップ（c）の後に少なくとも一の抗原特異的TCR発現性細胞から移される一以上の膜成分が含まれるもの；および
e）次のものを決定すること、または決定したこと、
i）興味ある標的細胞に関連する一以上の抗原ペプチドの配列、
ii）興味あるTCR発現性細胞に関連するTCRペプチドをコードするTCR配列の少なくとも一部分、または
iii）興味ある標的細胞に関連する一以上の抗原ペプチドの配列および興味あるTCR発現性細胞に関連するTCRペプチドをコードするTCR配列の少なくとも一部分
を含む、方法。
【請求項４】
一以上の抗原特異的TCR発現性細胞集団には、不死化細胞系が含まれる、請求項1-3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
一以上の抗原特異的TCR発現性細胞集団には、一以上の抗原特異的T細胞集団が含まれる、請求項1-3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
一以上の抗原特異的T細胞集団は、次の：細胞傷害性T細胞（CTL）集団、CD8+T細胞集団、CD4+T細胞集団、プライマリT細胞集団、エクスビボ培養T細胞集団、腫瘍浸潤性T細胞集団、自己免疫性T細胞集団、病原体特異的T細胞集団、調節性T細胞集団、疲弊T細胞、メモリーT細胞集団、ナチュラルキラーT細胞集団、ガンマ-デルタ（γδ）T細胞集団、工学的に作り出されたT細胞集団、不死化T細胞系、およびそれらの組合せからなる群より選ばれる、請求項5の方法。
【請求項７】
一以上の抗原特異的T細胞集団の少なくとも一は対象から分離される、請求項5-6のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８】
対象はガンを有することが知られるか、または疑われる、請求項7の方法。
【請求項９】
一以上の抗原特異的TCR発現性細胞集団の少なくとも一はヒト細胞である、請求項1-8のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１０】
一以上の抗原特異的TCR発現性細胞集団の少なくとも一には、一以上の外因性TCRsが含まれ、随意にそこでは一以上の抗原特異的TCR発現性細胞集団は内因性TCRを発現しない、請求項1-9のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１】
一以上の外因性TCRsは一以上のTCRポリヌクレオチド配列によってコードされ、そこでは一以上のTCRポリヌクレオチド配列はプロモーターヌクレオチド配列に作動可能に連結される、請求項10の方法。
【請求項１２】
一以上の外因性TCRsには、TCRα鎖およびTCRβ鎖が含まれる、請求項11の方法。
【請求項１３】
一以上の外因性TCRsには、TCRγ鎖およびTCRδ鎖が含まれる、請求項11の方法。
【請求項１４】
外因性TCRの鎖は同じTCRポリヌクレオチド配列上でコードされる、請求項12または13の方法。
【請求項１５】
一以上のTCRポリヌクレオチド配列は、次の：ウイルスベクター、cDNA、プラスミド、線状二本鎖DNAベクター、線状一本鎖DNAベクター、および線状一本鎖RNAベクターからなる群より選ばれる、請求項11-14のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１６】
ウイルスベクターは一以上の抗原特異的TCR発現性細胞集団のゲノム中に組み込まれる、請求項15の方法。
【請求項１７】
一以上の外因性TCRsは腫瘍サンプルにおいて識別されるか、または識別されている、請求項10-16のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１８】
一以上の外因性TCRsは腫瘍サンプルにおいて頻度に基づいて選ばれる、請求項17の方法。
【請求項１９】
一以上の外因性TCRsは一以上の外因性TCRsを発現する細胞の表現型に基づいて選ばれる、請求項17または18の方法。
【請求項２０】
表現型は、次の：PD-1陽性、CD39陽性、CD137陽性、およびそれらの組合せからなる群より選ばれる、請求項19の方法。
【請求項２１】
一以上の抗原特異的TCR発現性細胞集団には、TCR共受容体が含まれる、請求項1-20のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２２】
TCR共受容体は、次の：CD3、CD4、CD8、またはそれらの組合せからなる群より選ばれる、請求項21の方法。
【請求項２３】
TCR共受容体はCD3である、請求項21の方法。
【請求項２４】
TCR共受容体は外因性TCR共受容体であり、随意にそこでは一以上の抗原特異的TCR発現性細胞集団は内因性TCR共受容体を発現しない、請求項21-23のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２５】
外因性TCR共受容体はTCR共受容体ポリヌクレオチド配列によってコードされ、そこでは共受容体ポリヌクレオチド配列はプロモーターヌクレオチド配列に作動可能に連結される、請求項24の方法。
【請求項２６】
TCR共受容体ポリヌクレオチド配列は、次の：ウイルスベクター、cDNA、プラスミド、線状二本鎖DNAベクター、線状一本鎖DNAベクター、および線状一本鎖RNAベクターからなる群より選ばれる、請求項25の方法。
【請求項２７】
ウイルスベクターは一以上の抗原特異的TCR発現性細胞集団のゲノム中に組み込まれる、請求項26の方法。
【請求項２８】
一以上の標的細胞集団には、不死化細胞系が含まれる、請求項1-27のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２９】
不死化細胞系はK562細胞系である、請求項28の方法。
【請求項３０】
一以上の標的細胞集団には、プロフェッショナル抗原提示細胞（APC）集団が含まれる、請求項1-28のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３１】
プロフェッショナルAPC集団は、次の：樹状細胞、マクロファージ、およびB細胞からなる群より選ばれる、請求項30の方法。
【請求項３２】
一以上のMHC対立遺伝子の少なくとも一には、外因性MHC対立遺伝子が含まれ、随意にそこでは一以上の標的細胞集団は内因性MHC対立遺伝子を発現しない、請求項1-31のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３３】
外因性MHC対立遺伝子は一以上のMHCポリヌクレオチド配列によってコードされ、そこでは一以上のMHCポリヌクレオチド配列はプロモーターヌクレオチド配列に作動可能に連結される、請求項32の方法。
【請求項３４】
一以上のMHCポリヌクレオチド配列は、次の：ウイルスベクター、cDNA、プラスミド、線状二本鎖DNAベクター、線状一本鎖DNAベクター、および線状一本鎖RNAベクターからなる群より選ばれる、請求項33の方法。
【請求項３５】
ウイルスベクターは一以上の標的細胞集団のゲノム中に組み込まれる、請求項34の方法。
【請求項３６】
一以上のMHC対立遺伝子の少なくとも一には、哺乳動物MHC対立遺伝子が含まれる、請求項1-35のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３７】
哺乳動物MHC対立遺伝子には、ヒトMHC対立遺伝子が含まれる、請求項36の方法。
【請求項３８】
一以上のMHC対立遺伝子の少なくとも一には、MHCクラスI分子が含まれる、請求項1-37のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３９】
MHCクラスI分子は、次の：HLA-A、HLA-B、およびHLA-Cからなる群より選ばれる、請求項38の方法。
【請求項４０】
一以上のMHC対立遺伝子の少なくとも一には、MHCクラスII分子が含まれる、請求項1-37のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４１】
MHCクラスII分子は、次の：HLA-DQおよびHLA-DRからなる群より選ばれるMHC分子とを含む、請求項40の方法。
【請求項４２】
一以上のMHC対立遺伝子の少なくとも一には、単鎖三量体（SCT）が含まれる、請求項1-41のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４３】
一以上のMHC対立遺伝子の少なくとも一には、対象のMHC対立遺伝子が含まれる、請求項1-42のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４４】
対象はガンを有することが知られるか、または疑われる、請求項43の方法。
【請求項４５】
一以上の抗原ペプチドの少なくとも一は、次の：腫瘍関連エピトープ、ネオエピトープ、腫瘍ネオエピトープ、ウイルスエピトープ、ホスホ-エピトープ、細菌エピトープ、微生物エピトープ、組織特異的自己エピトープ、自己エピトープ、およびそれらの組合せからなる群より選ばれる、請求項1-44のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４６】
一以上の抗原ペプチドには、ネオエピトープが含まれる、請求項1-44のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４７】
ネオエピトープは、一以上の体細胞変異を識別するために対象からの腫瘍、ウイルス、または細菌のシーケンシングデータを分析することによって選ばれる、請求項46の方法。
【請求項４８】
対象はガンを有することが知られるか、または疑われる、請求項47の方法。
【請求項４９】
分析することはインシリコ予測アルゴリズムを使用して実行される、請求項47または48の方法。
【請求項５０】
予測アルゴリズムには、対象のネオ抗原およびMHC対立遺伝子間の結合を予測するためにMHC結合性アルゴリズムが含まれる、請求項49の方法。
【請求項５１】
一以上のMHC対立遺伝子の少なくとも一は対象のMHC対立遺伝子である、請求項50の方法。
【請求項５２】
各々の一以上の抗原ペプチドには、健常サンプルから導き出される抗原ペプチドが含まれる、請求項1-44のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５３】
一以上の抗原ペプチドの少なくとも一はMHCクラスI分子上で提示される、請求項1-52のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５４】
MHCクラスI分子上で提示される一以上の抗原ペプチドの少なくとも一は、長さで7-15、7-10、8-9、7、8、9、10、11、12、13、14、または15のアミノ酸である、請求項53の方法。
【請求項５５】
MHCクラスI分子上で提示される一以上の抗原ペプチドの少なくとも一は長さで8-10の間のアミノ酸である、請求項53の方法。
【請求項５６】
一以上の抗原ペプチドの少なくとも一はMHCクラスII分子上で提示される、請求項1-55のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５７】
MHCクラスII分子上で提示される一以上の抗原ペプチドの少なくとも一は、長さで11-30、14-20、15-18、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30のアミノ酸である、請求項56の方法。
【請求項５８】
MHCクラスII分子上で提示される一以上の抗原ペプチドの少なくとも一は、長さで10および35の間、10および30の間、10および25の間、または10および20の間のアミノ酸である、請求項56の方法。
【請求項５９】
一以上の抗原ペプチドの少なくとも一には、外因性抗原ペプチドが含まれる、請求項1-58のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６０】
外因性抗原ペプチドは抗原ポリヌクレオチド配列によってコードされ、そこでは抗原ポリヌクレオチド配列はプロモーターヌクレオチド配列に作動可能に連結される、請求項59の方法。
【請求項６１】
抗原ポリヌクレオチド配列は、次の：ウイルスベクター、cDNA、プラスミド、線状二本鎖DNAベクター、線状一本鎖DNAベクター、および線状一本鎖RNAベクターからなる群より選ばれる、請求項60の方法。
【請求項６２】
ウイルスベクターは一以上の標的細胞集団のゲノム中に組み込まれる、請求項61の方法。
【請求項６３】
一以上の抗原ペプチドの少なくとも一は未処理ペプチド配列から導き出され、そこでは未処理ペプチド配列には、一以上の抗原ペプチドの少なくとも一が含まれる、請求項1-62のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６４】
未処理ペプチド配列は一以上の抗原ペプチドの少なくとも一を生産するために標的細胞によって処理される、請求項63の方法。
【請求項６５】
未処理ペプチド配列はプロテアソームを標的とする、請求項64の方法。
【請求項６６】
標的細胞は処理を増加させために操作されるか、または処理を増加させために刺激される、請求項64または65の方法。
【請求項６７】
未処理ペプチド配列は未処理抗原ポリヌクレオチド配列によってコードされ、そこでは未処理抗原ポリヌクレオチド配列はプロモーターヌクレオチド配列に作動可能に連結される、請求項63-66のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６８】
未処理抗原ポリヌクレオチド配列は、次の：ウイルスベクター、cDNA、プラスミド、線状二本鎖DNAベクター、線状一本鎖DNAベクター、および線状一本鎖RNAベクターからなる群より選ばれる、請求項67の方法。
【請求項６９】
ウイルスベクターは一以上の標的細胞集団のゲノム中に組み込まれる、請求項68の方法。
【請求項７０】
接触させることには、回転、反転、ボルテックス、振とう、インキュベーション、ピペッティング、混合、またはそれらの組合せが含まれる、請求項1-69のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７１】
接触させることは容器において実行される、請求項1-70のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７２】
容器は、次の：マルチウェルプレート、組織培養処理プレート、組織培養処理マルチウェルプレート、フラスコ、組織培養処理フラスコ、微小遠心管、培養管、試験管、丸底管、および円錐管からなる群より選ばれる、請求項71の方法。
【請求項７３】
一以上の膜成分の少なくとも一には、抗原特異的TCR発現性細胞膜成分が含まれる、請求項1-72のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７４】
抗原特異的TCR発現性細胞膜成分は、次の：TCR、TCR共受容体、CD3 TCR共受容体、CD4 TCR共受容体、およびCD8 TCR共受容体からなる群より選ばれる、請求項73の方法。
【請求項７５】
一以上の膜成分の少なくとも一には、標的細胞膜成分が含まれる、請求項1-74のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７６】
標的細胞膜成分には、MHC対立遺伝子が含まれる、請求項75の方法。
【請求項７７】
一以上の膜成分の少なくとも一には、外因性膜成分が含まれる、請求項1-76のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７８】
外因性膜成分は、次の：膜貫通タンパク質、膜関連タンパク質、表面受容体、蛍光分子、細胞表面タンパク質、糖、および脂質からなる群より選ばれる、請求項77の方法。
【請求項７９】
一以上の膜成分の少なくとも一には、標識膜成分が含まれる、請求項1-78のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８０】
標識膜成分には、ビオチン標識、蛍光標識、または反応性基が含まれる、請求項79の方法。
【請求項８１】
分離することには、興味ある標的細胞または一以上の移された膜成分が含まれる興味あるTCR発現性細胞を一以上の移された膜成分が含まれない標的細胞またはTCR発現性細胞から分けることが含まれる、請求項1-80のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８２】
分離することには、磁気分別が含まれる、請求項1-81のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８３】
磁気分別には、興味ある標的細胞または興味あるTCR発現性細胞を壁に対して磁石により捕捉すること、および壁に対して捕捉されない要素を除去することが含まれる、請求項82の方法。
【請求項８４】
分離するステップには、マイクロ流体デバイスを使用することが含まれる、請求項1-83のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８５】
マイクロ流体デバイスには、フローサイトメーターが含まれる、請求項84の方法。
【請求項８６】
分離するステップには、蛍光活性化細胞選別（FACS）が含まれる、請求項85の方法。
【請求項８７】
分離することには、一以上の膜成分を識別することが含まれる、請求項1-86のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８８】
識別することには、興味ある標的細胞または興味あるTCR発現性細胞を標識試薬と接触させることが含まれる、請求項87の方法。
【請求項８９】
標識試薬は、次の：抗体、反応性基が含まれる試薬、および脂質反応性試薬からなる群より選ばれる、請求項88の方法。
【請求項９０】
標識試薬は検出可能なマーカーにコンジュゲートされる、請求項88または89の方法。
【請求項９１】
検出可能なマーカーはフルオロフォアである、請求項90の方法。
【請求項９２】
決定ステップ（e）には、興味ある標的細胞または興味あるTCR発現性細胞から一以上のポリヌクレオチドを精製すること、または精製したことが含まれる、請求項1-91のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９３】
精製ポリヌクレオチドは、次の：ゲノムDNA、ベクターDNA、プラスミドDNA、mRNA、PCRによって増幅されたDNA、および逆転写によって生産されたcDNAからなる群より選ばれる、請求項92の方法。
【請求項９４】
一以上のポリヌクレオチドを精製すること、または精製したことには、一以上のポリヌクレオチドを単一細胞から精製すること、または精製したことが含まれる、請求項92-93のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９５】
決定するステップ（e）には、配列決定することが含まれる、請求項1-94のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９６】
配列決定することには、ポリヌクレオチドを配列決定することが含まれる、請求項95の方法。
【請求項９７】
配列決定することには、請求項92-93のいずれか1項に記載の精製ポリヌクレオチドを配列決定すること、または配列決定したこと、または請求項92-93のいずれか1項に記載の精製ポリヌクレオチドをテンプレートとして使用して生成される任意のポリヌクレオチドを配列決定すること、または配列決定したことが含まれる、請求項96の方法。
【請求項９８】
配列決定することには、次世代シーケンシングが含まれる、請求項96-97のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９９】
配列決定することには、単一細胞のシーケンシングが含まれる、請求項96-98のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１００】
決定するステップには、ネオ抗原またはネオ抗原特異的TCRを識別することがさらに含まれる、請求項1-99のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１０１】
一以上の膜成分には、一以上のオリゴヌクレオチドバーコードが含まれる、請求項1-100のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１０２】
一以上のオリゴヌクレオチドバーコードは一以上の膜成分に直接的にコンジュゲートされる、請求項101の方法。
【請求項１０３】
一以上のオリゴヌクレオチドバーコードは一以上の膜成分に間接的にコンジュゲートされる、請求項101の方法。
【請求項１０４】
一以上のオリゴヌクレオチドバーコードは標識試薬にコンジュゲートされる、請求項103の方法。
【請求項１０５】
標識試薬は、次の：抗体、反応性基が含まれる試薬、および脂質反応性試薬からなる群より選ばれる、請求項104の方法。
【請求項１０６】
決定するステップ（e）には、一以上のオリゴヌクレオチドバーコードの少なくとも一の配列を決定すること、または決定したことがさらに含まれる、請求項101-105のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１０７】
少なくとも一のオリゴヌクレオチドバーコードの配列は一以上の抗原特異的TCR発現性細胞集団の特異的TCRに特有である、請求項106の方法。
【請求項１０８】
一以上の抗原特異的TCR発現性細胞集団には、二以上の別個の抗原特異的TCR発現性細胞集団が含まれ、各別個の抗原特異的TCR発現性細胞集団には、特有のTCRおよび各特有のTCRの同一性に作動可能に関連する特有の、規定されたバーコード配列が含まれる、請求項107の組成物。
【請求項１０９】
少なくとも一のオリゴヌクレオチドバーコードの配列は、一以上の標的細胞集団の特異的標的細胞集団に特有である、請求項106の方法。
【請求項１１０】
特異的標的細胞集団は、特有の抗原ペプチド、特有のMHC対立遺伝子、または特有の抗原ペプチドおよびMHC対立遺伝子対を発現する、請求項109の組成物。
【請求項１１１】
一以上の標的細胞集団には、二以上の異なる標的細胞集団が含まれ、各別個の標的細胞には、各特有の抗原ペプチド、各特有のMHC対立遺伝子、または各特有の抗原ペプチドおよびMHC対立遺伝子対の同一性に作動可能に関連する特有の、規定されたバーコード配列が含まれる、請求項110の組成物。
【請求項１１２】
請求項1-107および109のいずれか1項に記載の方法によって生産される分離された興味ある標的細胞または興味あるTCR発現性細胞。
【請求項１１３】
請求項1-107および109のいずれか1項に記載の方法によって生産されるテンプレートとして精製されたポリヌクレオチドを使用して生成される精製されたポリヌクレオチド、または任意のポリヌクレオチド。
【請求項１１４】
請求項1-107および109のいずれか1項に記載の方法によって生産される一以上の配列が含まれるデータベース。
【請求項１１５】
一以上の配列には、請求項1-107および109のいずれか1項に記載の方法によって生産される一以上の配列決定されたポリヌクレオチドが含まれる、請求項114のデータベース。
【請求項１１６】
興味ある分離された標的細胞であって、そこでは次の：
i）一以上のT細胞膜関連成分であり、そこでは標的細胞は一以上のT細胞膜成分をコードする内因性ポリヌクレオチド配列を含まないもの；および
ii）一以上の主要組織適合性複合体（MHC）対立遺伝子であり、そこでは一以上の抗原ペプチドは一以上の主要組織適合性複合体（MHC）対立遺伝子上で提示されるもの
を含む、標的細胞。
【請求項１１７】
一以上の抗原ペプチドは一以上の抗原ポリヌクレオチド配列によってコードされる、請求項116の分離された標的細胞。
【請求項１１８】
リガンド識別にあたり、次のステップ：
a）一以上のリガンド特異的結合性分子発現性細胞集団を提供すること；
b）一以上の標的細胞集団を提供することであり、そこでは標的細胞集団は一以上のリガンド特異的結合性分子によって結合される能力がある一以上のリガンドを提示すること；
c）一以上のリガンド特異的結合性分子発現性細胞集団を一以上の標的細胞集団と接触させることであり、そこでは接触させることには、少なくとも一のリガンド特異的結合性分子発現性細胞について少なくとも一の標的細胞に特異的に結合するのに十分な条件を提供することが含まれ、およびそこでは一以上の膜成分はリガンド特異的結合性分子発現性細胞および標的細胞の間で結合の後に移されること；
d）次のものを分離すること、または分離したこと、
i）興味ある標的細胞であり、そこでは興味ある標的細胞には、接触させるステップ（c）の後にリガンド特異的結合性分子発現性細胞から移される一以上の膜成分が含まれるもの；および随意に
ii）興味あるリガンド特異的結合性分子発現性細胞であり、そこでは興味あるリガンド特異的結合性分子発現性細胞には、接触させるステップ（c）の後に標的細胞から移される一以上の膜成分が含まれるもの；および
e）次のものを決定すること、または決定したこと、
i）興味ある標的細胞に関連する一以上のリガンドをコードする配列の少なくとも一部分、または
ii）興味ある結合性分子リガンド特異的発現性細胞に関連する結合性分子ペプチドをコードする結合性分子配列の少なくとも一部分
を含む、方法。
【請求項１１９】
リガンド特異的結合性分子は、次の：免疫受容体、免疫グロブリン、抗体またはそのフラグメント、受容体、キメラ受容体、キメラ抗原受容体（CAR）、シグナル伝達受容体、細胞表面受容体、および膜貫通受容体からなる群より選ばれる、請求項118の方法。
【請求項１２０】
一以上のリガンドは、次の：抗原、表面抗原、エピトープ、非古典的MHC提示抗原、および受容体リガンドからなる群より選ばれる、請求項118または119の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、2017年7月25日付け出願の米国仮出願第62/536,828号の利益を主張し、それを参照によってその全体においてあらゆる目的についてここに組み込む。
連邦政府による資金提供を受けた研究または開発に関する声明
【０００２】
この発明は、the National Institutes of Health（米国国立衛生研究所）により与えられた助成番号CA199090の下で米国政府支援によりなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
シークエンスリスティング
【０００３】
本出願は、シークエンスリスティングを含み、それはEFS-ウェブを介して提出し、および参照によってその全体においてここに組み込む。前記ASCII（アスキー）コピーは、20XX年、XX月に作成し、名称XXXXXUS_sequencelisting.txt、サイズはX,XXX,XXXバイトである。
【背景技術】
【０００４】
T細胞は、標的細胞との直接的な、抗原特異的な接触を通して適応免疫を媒介する。各T細胞の抗原特異性はその特有なT細胞受容体（TCR）1によって定められ、それは標的細胞または抗原提示性細胞（APC）表面での主要組織適合性複合体（MHC）タンパク質分子上で提示される同族ペプチドリガンド（cognate peptide ligand）（エピトープ）に結合する。大抵、自己MHC上の自己リガンドを認識する新生T細胞（nascent T cells）は胸腺のネガティブ選択中に除去され（ablated）、感染細胞上で提示される外来性リガンド、ガン細胞で提示される変異自己リガンド（ネオエピトープ）、またはAPCs上で提示されるリガンドの様々なソースに結合する能力を有する成熟T細胞のレパートリーがもたらされる。このように、TCR抗原特異性は、B細胞が抗体を産生し、および成熟させるのを助け、生来のエフェクターを活性化し、自己に対する免疫寛容を維持し、および感染およびガン細胞を直接的に殺生するように、すべてを正確に標的とするマナーにおいてT細胞を向かわせる。TCRリガンドの発見は、病原体および腫瘍に対する適応（的）免疫反応、ならびに自己および食餌性抗原に対する不適切な反応を特徴付けるのに有用である2,3。この知識はまた、免疫反応を惹起し、増幅し、または弱める臨床的に有益な免疫療法（例は、TCR遺伝子移行およびワクチン）が抗原を標的にするのを可能にする4,5。例えば、外来または変異自己ペプチドリガンドを提示する感染またはガン性標的細胞は、提示されたエピトープを認識するTCRを発現する細胞傷害性T細胞によって殺生することができる。それゆえに、TCRリガンドの発見は、抗腫瘍免疫のターゲットを解明し、および標的化免疫療法を設計するための貴重なステップである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ローバストで、高スループットの、偏りのない（unbiased、不偏の）TCRリガンド発見技術について未だ満たされてないニーズがある。ペプチド-MHC（pMHC）多量体テクノロジーは、抗原の選定されたパネルに対するT細胞媒介性応答のモニタリングを可能にする6が、大抵は免疫応答に関係がある以前に特徴付けられた抗原ターゲットに向けられる偏りのある（biased、バイアスド）スクリーンに使用が制限される。目下、pMHC多量体を用いるスクリーニングは、偏りのない抗体リガンド発見プラットフォームの規模にはない7。ガンとの関連では、腫瘍特異的変異から生じる腫瘍ネオ抗原（腫瘍ネオアンチゲン）は、エクソームシーケンシング（エクソーム解析）を通して発見され、および次いでペプチド-MHC多量体またはネオ抗原が形質導入された抗原提示細胞を使用してT細胞を調べるために使用することができる8,9。しかしながら、腫瘍エクソームシーケンシングは変異エピトープにあまり焦点を当てない他の免疫応答に対処しない（例は、病原体特異的免疫、自己免疫）。
【０００６】
予め選定した抗原によるT細胞応答を調べることに代わるものは、その応答を媒介するTCRsを識別し、および次いで抗原ライブラリーを調べるためにこれらのTCRsを使用することである。興味ある免疫応答を媒介するTCRsは、その応答において表現型的に関係をもち10,11、またはその応答の部位にてクローンT細胞の間で豊富化される（例は、腫瘍反応性TCRsは腫瘍浸潤リンパ球の間で高頻度である）12,13T細胞をディープシーケンシングすることによって識別することができる。例えば、最近の研究では、酵母細胞表面に表示されるpMHCライブラリーをスクリーニングするために、オーファンTCR外部ドメイン（エクトドメイン）から導き出される可溶性の、蛍光を利用して標識した試薬を使用する不偏TCRリガンド発見法を説明する14。ただし、この方法では、テストする各MHC対立遺伝子および各リガンドの長さについて個別の酵母ライブラリーの構築、検証、およびスクリーニングが、典型的に、テストするTCRについてMHC制限の知識を伴わないで、ならびに可溶性TCR外部ドメインの生成も必要である。
【０００７】
トロゴサイトーシス（ギリシャ語から：trogo-、gnaw）は生物学的現象であり、それによって細胞はコンジュゲートする間に膜および膜関連タンパク質を共有する15。T細胞に結合するターゲット細胞によるT細胞膜タンパク質の抽出は報告されていない。それゆえ、抗原発見またはペアード抗原とTCRの発見のためのトロゴサイトーシスの使用は、本分野では説明されていない。
【０００８】
T細胞の抗原特異性とTCR遺伝子とのペアリングは情報価値があり、および有用である。例えば、T細胞サブセットが認識する抗原の知識は治療の設計を案内することができる。同様に、TCR遺伝子の知識は操作した細胞ベースの治療の設計を案内することができる。それゆえに、単一細胞レベルでのTCR抗原の特異性をスクリーニング分析する（screen analyze）能力は、本分野での重要なニーズを残したままである。しかしながら、偏りのないスクリーニングアプローチで、例えば、抗体リガンドスクリーニングにおいて採用されるものなどのようなものに近似する抗原特異的T細胞ペアリングについてのアプローチは、本分野において不存在である。それゆえ、TCR抗原識別について、および抗原特異的T細胞ペアリングについての優れたスクリーニングプラットフォームおよび方法は、本分野において必要なものである。
概略
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、結合性分子についてのリガンド、例えば、TCRsによって認識される抗原ペプチドなどのようなものを識別することができるトロゴサイトーシスに基づくシステムを見出した。トロゴサイトーシスに基づくシステムはまた抗原特異的結合性分子、例えば、抗原特異的TCRsなどのようなものも識別することができる。トロゴサイトーシスベースのシステムは、様々なスクリーニングアプリケーション向けにスケーラブル（自在に拡大縮小できるとも言う）で、およびカスタマイズ可能（好みに合わせて改造可能とも言う）である。かくして、ここに記載するトロゴサイトーシスに基づくシステムは、抗原発見の分野において、特に抗原特異的T細胞ペアリングの分野においていくつかの未解決の問題に対処する。
【００１０】
したがって、ここに開示するのは、抗原識別の方法であり、以下のステップ：a）一以上の抗原特異的T細胞受容体（TCR）発現性細胞集団を提供すこと；b）一以上の標的細胞集団を提供することであり、そこでは標的細胞集団は一以上の主要組織適合性複合体（MHC）対立遺伝子上で一以上の抗原ペプチドを提示すること；c）一以上の抗原特異的TCR発現性細胞集団を一以上の標的細胞集団と接触させることであり、そこでは接触させることには、一以上の抗原特異的TCR発現性細胞集団の少なくとも一について一以上の標的細胞集団の少なくとも一に特異的に結合するのに十分な条件を提供することが含まれ、およびそこでは一以上の膜成分は少なくとも一の抗原特異的TCR発現性細胞および少なくとも一の標的細胞の間で結合の後に移されること；d）次の、i）興味ある標的細胞であり、そこでは興味ある標的細胞には、接触させるステップ（c）の後に少なくとも一の抗原特異的TCR発現性細胞から移される一以上の膜成分が含まれるもの、および随意にii）興味あるTCR発現性細胞であり、そこでは興味あるTCR発現性細胞には、接触させるステップ（c）の後に少なくとも一の標的細胞から移される一以上の膜成分が含まれるもの、を分離すること、または分離したこと；およびe）次の、i）興味ある標的細胞に関連する一以上の抗原ペプチドの配列、ii）興味あるTCR発現性細胞に関連するTCRペプチドのTCR配列の少なくとも一部分、またはiii）興味ある標的細胞に関連する一以上の抗原ペプチドの配列および興味あるTCR発現性細胞に関連するTCRペプチドのTCR配列の少なくとも一部分、を決定すること、または決定したことを含む。
【００１１】
また、ここに開示するのは、抗原識別の方法であり、以下のステップ：a）抗原特異的TCRを発現する抗原特異的T細胞集団を提供すること；b）複数の標的細胞集団を提供することであり、そこでは標的細胞集団は主要組織適合性複合体（MHC）対立遺伝子上で抗原ペプチドを提示すること；c）抗原特異的T細胞集団を複数の標的細胞集団と接触させることであり、そこでは接触させることには、抗原特異的T細胞集団が複数の標的細胞集団の少なくとも一に特異的に結合するのに十分な条件を提供することが含まれ、およびそこでは一以上の膜成分は抗原特異的T細胞および少なくとも一の標的細胞の間で結合の後に移されること；d）次の、i）興味ある標的細胞を分離すること、または分離したことであり、そこでは興味ある標的細胞には、接触させるステップ（c）の後に抗原特異的TCR発現性細胞から移される一以上の膜成分が含まれること；およびe）興味ある標的細胞に関連する一以上の抗原ペプチドの配列を決定すること、または決定したことを含み、そこでは決定するステップ（e）には、興味ある標的細胞からの一以上のポリヌクレオチドを精製すること、または精製したこと、および精製ポリヌクレオチド、または精製ポリヌクレオチドを鋳型として使用して生成される任意のポリヌクレオチドを配列決定すること、または配列決定したことが含まれる。
【００１２】
また、ここで開示するのは、抗原特異的TCR識別の方法であり、以下のステップ：a）一以上の抗原特異的TCR発現性細胞集団を提供すること；b）一以上の標的細胞集団を提供することであり、そこでは標的細胞集団は一以上の主要組織適合性複合体（MHC）対立遺伝子上で一以上の抗原ペプチドを提示すること；c）一以上の抗原特異的TCR発現性細胞集団を一以上の標的細胞集団と接触させることであり、そこでは一以上の抗原特異的TCR発現性細胞集団の少なくとも一は一以上の標的細胞集団の少なくとも一に特異的に結合し、およびそこでは一以上の膜成分は少なくとも一の抗原特異的TCR発現性細胞および少なくとも一の標的細胞の間で結合の後に移されること；d）次の、i）興味あるTCR発現性細胞であり、そこでは興味あるTCR発現性細胞には、接触させるステップ（c）の後に少なくとも一の標的細胞から移される一以上の膜成分が含まれるもの、またはそこでは興味あるTCR発現性細胞は接触させるステップ（c）の後に少なくとも一の抗原特異的TCR発現性細胞から移される一以上の膜成分の損失を実証するもの、および随意にii）興味ある標的細胞であり、そこでは興味ある標的細胞には、接触させるステップ（c）の後に少なくとも一の抗原特異的TCR発現性細胞から移される一以上の膜成分が含まれるもの、を分離すること、または分離したこと；およびe）次の、i）興味ある標的細胞に関連する一以上の抗原ペプチドの配列、ii）興味あるTCR発現性細胞に関連するTCRペプチドをコードするTCR配列の少なくとも一部分、またはiii）興味ある標的細胞に関連する一以上の抗原ペプチドの配列、および興味あるTCR発現性細胞に関連するTCRペプチドをコードするTCR配列の少なくとも一部分、を決定すること、または決定したことを含む。
【００１３】
いくらかの態様において、一以上の抗原特異的TCR発現性細胞集団には、不死化細胞系が含まれる。いくらかの態様において、一以上の抗原特異的TCR発現性細胞集団には、一以上の抗原特異的T細胞集団が含まれる。いくらかの態様では、一以上の抗原特異的T細胞集団は、次の：細胞傷害性T細胞（CTL）集団、CD8+T細胞集団、CD4+T細胞集団、プライマリT細胞集団、エクスビボ培養されたT細胞集団、腫瘍浸潤性T細胞集団、自己免疫性T細胞集団、病原体特異的T細胞集団、調節性T細胞集団、疲弊T細胞、メモリーT細胞集団、ナチュラルキラーT細胞集団、ガンマデルタ（γδ）T細胞集団、工学的に作り出されたT細胞集団、不死化T細胞株、およびそれらの組合せからなる群より選ばれる。いくらかの態様では、一以上の抗原特異的T細胞集団の少なくとも一は対象から分離される。いくらかの態様においては、対象はガンを有することが知られるか、または疑われる。
【００１４】
いくらかの態様では、一以上の抗原特異的TCR発現性細胞集団の少なくとも一は、ヒト細胞である。
【００１５】
いくらかの態様では、一以上の抗原特異的TCR発現性細胞集団の少なくとも一は一以上の外因性TCRsを含み、随意にそこでは一以上の抗原特異的TCR発現性細胞集団は内因性TCRを発現しない。いくらかの態様では、一以上の外因性TCRsは一以上のTCRポリヌクレオチド配列によってコードされ、そこでは一以上のTCRポリヌクレオチド配列はプロモーターヌクレオチド配列に作動可能に連結される。いくらかの態様では、一以上の外因性TCRsには、TCRα鎖およびTCRβ鎖が含まれる。いくらかの態様では、一以上の外因性TCRsには、TCRγ鎖およびTCRδ鎖が含まれる。いくらかの態様では、外因性TCRの鎖は同じTCRポリヌクレオチド配列上でコードされる。いくらかの態様では、一以上のTCRポリヌクレオチド配列は、次の：ウイルスベクター、cDNA、プラスミド、線状二本鎖DNAベクター、線状一本鎖DNAベクター、および線状一本鎖RNAベクターからなる群より選ばれる。いくらかの態様では、ウイルスベクターは一以上の抗原特異的TCR発現性細胞集団のゲノム中に組み込まれる。いくらかの態様では、一以上の外因性TCRsは腫瘍サンプルにおいて識別されるか、または識別されている。いくらかの態様では、一以上の外因性TCRsは腫瘍サンプルにおいて頻度に基づいて選ばれる。いくらかの態様では、一以上の外因性TCRsは一以上の外因性TCRsを発現する細胞の表現型に基づいて選ばれる。いくらかの態様では、表現型は、次の：PD-1陽性、CD39陽性、CD137陽性、およびそれらの組合せからなる群より選ばれる。
【００１６】
いくらかの態様では、一以上の抗原特異的TCR発現性細胞集団には、TCR共受容体が含まれる。いくらかの態様では、TCR共受容体は、次の：CD3、CD4、CD8、またはそれらの組合せからなる群より選ばれる。いくらかの態様では、TCR共受容体はCD3である。いくらかの態様では、TCR共受容体は外因性TCR共受容体であり、随意にそこでは一以上の抗原特異的TCR発現性細胞集団は内因性TCR共受容体を発現しない。いくらかの態様では、外因性TCR共受容体はTCR共受容体ポリヌクレオチド配列によってコードされ、そこでは共受容体ポリヌクレオチド配列はプロモーターヌクレオチド配列に作動可能に連結される。いくらかの態様では、TCR共受容体ポリヌクレオチド配列は、次の：ウイルスベクター、cDNA、プラスミド、線状二本鎖DNAベクター、線状一本鎖DNAベクター、および線状一本鎖RNAベクターからなる群より選ばれる。いくらかの態様では、ウイルスベクターは一以上の抗原特異的TCR発現性細胞集団のゲノム中に組み込まれる。
【００１７】
いくらかの態様では、一以上の標的細胞集団には、不死化細胞系が含まれる。いくらかの態様では、不死化細胞系はK562細胞系である。いくらかの態様では、一以上の標的細胞集団には、プロフェッショナル抗原提示細胞（APC）集団が含まれる。いくらかの態様では、プロフェッショナルAPC集団は、次の：樹状細胞、マクロファージ、およびB細胞からなる群より選ばれる。
【００１８】
いくらかの態様では、一以上のMHC対立遺伝子の少なくとも一には、外因性MHC対立遺伝子が含まれ、随意にそこでは一以上の標的細胞集団は内因性MHC対立遺伝子を発現しない。いくらかの態様では、外因性MHC対立遺伝子は一以上のMHCポリヌクレオチド配列によってコードされ、そこでは一以上のMHCポリヌクレオチド配列はプロモーターヌクレオチド配列に作動可能に連結される。いくらかの態様では、一以上のMHCポリヌクレオチド配列は、次の：ウイルスベクター、cDNA、プラスミド、線状二本鎖DNAベクター、線状一本鎖DNAベクター、および線状一本鎖RNAベクターからなる群より選ばれる。いくらかの態様では、ウイルスベクターは一以上の標的細胞集団のゲノム中に組み込まれる。
【００１９】
いくらかの態様では、一以上のMHC対立遺伝子の少なくとも一には、哺乳動物MHC対立遺伝子が含まれる。いくらかの態様では、哺乳動物MHC対立遺伝子には、ヒトMHC対立遺伝子が含まれる。
【００２０】
いくらかの態様では、一以上のMHC対立遺伝子の少なくとも一には、MHCクラスI分子が含まれる。いくらかの態様では、MHCクラスI分子は、次の：HLA-A、HLA-B、およびHLA-Cからなる群より選ばれる。いくらかの態様では、一以上のMHC対立遺伝子の少なくとも一には、MHCクラスII分子が含まれる。いくらかの態様では、MHCクラスII分子は、次の：HLA-DQおよびHLA-DRからなる群より選ばれるMHC分子とを含む（comprises and MHC molecule）。
【００２１】
いくらかの態様では、一以上のMHC対立遺伝子の少なくとも一には、単鎖三量体（SCT）が含まれる。
【００２２】
いくらかの態様では、一以上のMHC対立遺伝子の少なくとも一には、対象のMHC対立遺伝子が含まれる。いくらかの態様では、対象はガンを有することが知られるか、または疑われる。
【００２３】
いくらかの態様では、一以上の抗原ペプチドの少なくとも一は、次の：腫瘍関連エピトープ、ネオエピトープ、腫瘍ネオエピトープ、ウイルスエピトープ、ホスホ-エピトープ、細菌エピトープ、微生物エピトープ、組織特異的自己エピトープ、自己エピトープ、およびそれらの組合せからなる群より選ばれる。いくらかの態様では、一以上の抗原ペプチドには、ネオエピトープが含まれる。いくらかの態様では、ネオエピトープは、一以上の体細胞変異を識別するために対象からの腫瘍、ウイルス、または細菌のシーケンシングデータを分析することによって選ばれる。いくらかの態様では、対象はガンを有することが知られるか、または疑われる。いくらかの態様では、分析することはインシリコ予測アルゴリズムを使用して実行される。いくらかの態様では、予測アルゴリズムには、対象のネオ抗原およびMHC対立遺伝子間の結合を予測するためにMHC結合性アルゴリズム（MHC binding algorithm）が含まれる。いくらかの態様では、一以上のMHC対立遺伝子の少なくとも一は対象のMHC対立遺伝子である。
【００２４】
いくらかの態様では、各々の一以上の抗原ペプチドには、健常サンプル（healthy sample）から導き出される抗原ペプチドが含まれる。
【００２５】
いくらかの態様では、一以上の抗原ペプチドの少なくとも一はMHCクラスI分子上で提示される。いくらかの態様では、MHCクラスI分子上で提示される一以上の抗原ペプチドの少なくとも一は、長さで7-15、7-10、8-9、7、8、9、10、11、12、13、14、または15のアミノ酸である。いくらかの態様では、MHCクラスI分子上で提示される一以上の抗原ペプチドの少なくとも一は長さで8-10の間のアミノ酸である。
【００２６】
いくらかの態様では、一以上の抗原ペプチドの少なくとも一はMHCクラスII分子上で提示される。いくらかの態様では、MHCクラスII分子上で提示される一以上の抗原ペプチドの少なくとも一は、長さで11-30、14-20、15-18、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30のアミノ酸である。いくらかの態様では、MHCクラスII分子上で提示される一以上の抗原ペプチドの少なくとも一は、長さで10および35の間、10および30の間、10および25の間、または10および20の間のアミノ酸である。
【００２７】
いくらかの態様では、一以上の抗原ペプチドの少なくとも一には、外因性抗原ペプチドが含まれる。いくらかの態様では、外因性抗原ペプチドは抗原ポリヌクレオチド配列によってコードされ、そこでは抗原ポリヌクレオチド配列はプロモーターヌクレオチド配列に作動可能に連結される。いくらかの態様では、抗原ポリヌクレオチド配列は、次の：ウイルスベクター、cDNA、プラスミド、線状二本鎖DNAベクター、線状一本鎖DNAベクター、および線状一本鎖RNAベクターからなる群より選ばれる。いくらかの態様では、ウイルスベクターは一以上の標的細胞集団のゲノム中に組み込まれる。
【００２８】
いくらかの態様では、一以上の抗原ペプチドの少なくとも一は未処理ペプチド配列から導き出され、そこでは未処理ペプチド配列には、一以上の抗原ペプチドの少なくとも一が含まれる。いくらかの態様では、未処理ペプチド配列は一以上の抗原ペプチドの少なくとも一を生産するために標的細胞によって処理される。いくらかの態様において、未処理ペプチド配列はプロテアソームを標的とする。いくらかの態様においては、標的細胞は処理を増加させために操作されるか、または処理を増加させために刺激される。いくらかの態様では、未処理ペプチド配列は未処理抗原ポリヌクレオチド配列によってコードされ、そこでは未処理抗原ポリヌクレオチド配列はプロモーターヌクレオチド配列に作動可能に連結される。いくらかの態様では、未処理抗原ポリヌクレオチド配列は、次の：ウイルスベクター、cDNA、プラスミド、線状二本鎖DNAベクター、線状一本鎖DNAベクター、および線状一本鎖RNAベクターからなる群より選ばれる。いくらかの態様では、ウイルスベクターは一以上の標的細胞集団のゲノム中に組み込まれる。
【００２９】
いくらかの態様では、接触させることには、回転、反転、ボルテックス、振とう、インキュベーション、ピペッティング、混合、またはそれらの組合せが含まれる。いくらかの態様では、接触させることは容器において実行される。いくらかの態様では、容器は、次の：マルチウェルプレート、組織培養処理プレート、組織培養処理マルチウェルプレート、フラスコ、組織培養処理フラスコ、微小遠心管、培養管、試験管、丸底管、および円錐管からなる群より選ばれる。
【００３０】
いくらかの態様では、一以上の膜成分の少なくとも一には、抗原特異的TCR発現性細胞膜成分が含まれる。いくらかの態様では、抗原特異的TCR発現性細胞膜成分は、次の：TCR、TCR共受容体、CD3 TCR共受容体、CD4 TCR共受容体、およびCD8 TCR共受容体からなる群より選ばれる。いくらかの態様では、一以上の膜成分の少なくとも一には、標的細胞膜成分が含まれる。いくらかの態様では、標的細胞膜成分には、MHC対立遺伝子が含まれる。
【００３１】
いくらかの態様では、一以上の膜成分の少なくとも一には、外因性膜成分が含まれる。いくらかの態様では、外因性膜成分は、次の：膜貫通タンパク質、膜関連タンパク質、表面受容体、蛍光分子、細胞表面タンパク質、糖、および脂質からなる群より選ばれる。
【００３２】
いくらかの態様では、一以上の膜成分の少なくとも一には、標識膜成分（labeled membrane component）が含まれる。いくらかの態様では、標識膜成分には、ビオチン標識、蛍光標識、または反応性基が含まれる。
【００３３】
いくらかの態様では、分離することには、一以上の移された膜成分が含まれる興味ある標的細胞またはTCR発現性細胞を一以上の移された膜成分が含まれない標的細胞またはTCR発現性細胞から分けることが含まれる。
【００３４】
いくらかの態様では、分離することには、磁気分別が含まれる。いくらかの態様では、磁気分別には、興味ある標的細胞または興味あるTCR発現性細胞を壁に対して磁石により捕捉すること、および壁に対して捕捉されない要素を除去することが含まれる。
【００３５】
いくらかの態様では、分離するステップには、マイクロ（微小）流体デバイスを使用することが含まれる。いくらかの態様では、マイクロ流体デバイスには、フローサイトメーターが含まれる。いくらかの態様では、分離するステップには、蛍光活性化細胞選別（FACS）が含まれる。
【００３６】
いくらかの態様では、分離することには、一以上の膜成分を識別することが含まれる。いくらかの態様では、識別することには、興味ある標的細胞または興味あるTCR発現性細胞を標識試薬（labeling reagent）と接触させることが含まれる。いくらかの態様では、標識試薬は、次の：抗体、反応性基が含まれる試薬、および脂質反応性試薬からなる群より選ばれる。いくらかの態様では、標識試薬は検出可能なマーカーにコンジュゲートされる。いくらかの態様では、検出可能なマーカーはフルオロフォアである。
【００３７】
いくらかの態様では、決定するステップ（e）には、興味ある標的細胞または興味あるTCR発現性細胞から一以上のポリヌクレオチドを精製すること、または精製したことが含まれる。いくらかの態様では、精製ポリヌクレオチドは、次の：ゲノムDNA、ベクターDNA、プラスミドDNA、mRNA、PCRによって増幅されたDNA、および逆転写によって生産されたcDNAからなる群より選ばれる。いくらかの態様では、一以上のポリヌクレオチドを精製すること、または精製したことには、一以上のポリヌクレオチドを単一細胞から精製すること、または精製したことが含まれる。
【００３８】
いくらかの態様では、決定するステップ（e）には、配列決定すること（シーケンシング、配列決定とも言う）が含まれる。いくらかの態様では、配列決定することには、ポリヌクレオチドを配列決定することが含まれる。いくらかの態様では、配列決定することには、ここに記載の任意の精製ポリヌクレオチドを配列決定すること、または配列決定したこと、またはここに記載の任意の精製ポリヌクレオチドをテンプレートとして使用して生成されるポリヌクレオチドを配列決定すること、または配列決定したことが含まれる。いくらかの態様では、配列決定することには、次世代シーケンシングが含まれる。いくらかの態様では、配列決定することには、単一細胞のシーケンシングが含まれる。
【００３９】
いくらかの態様では、決定するステップには、ネオ抗原またはネオ抗原特異的TCRを識別することがさらに含まれる。
【００４０】
いくらかの態様において、一以上の膜成分には、一以上のオリゴヌクレオチドバーコードが含まれる。いくらかの態様では、一以上のオリゴヌクレオチドバーコードは一以上の膜成分に直接的にコンジュゲートされる。いくらかの態様では、一以上のオリゴヌクレオチドバーコードは一以上の膜成分に間接的にコンジュゲートされる。いくらかの態様では、一以上のオリゴヌクレオチドバーコードは標識試薬にコンジュゲートされる。いくらかの態様では、標識試薬は、次の：抗体、反応性基が含まれる試薬、および脂質反応性試薬からなる群より選ばれる。いくらかの態様では、決定するステップ（e）には、一以上のオリゴヌクレオチドバーコードの少なくとも一の配列を決定すること、または決定したことがさらに含まれる。いくらかの態様では、少なくとも一のオリゴヌクレオチドバーコードの配列は一以上の抗原特異的TCR発現性細胞集団の特異的TCRに特有である。いくらかの態様では、一以上の抗原特異的TCR発現性細胞集団には、二以上の別個の抗原特異的TCR発現性細胞集団が含まれ、各別個の抗原特異的TCR発現性細胞集団には、特有のTCRおよび各特有のTCRの同一性に作動可能に関連する特有の、規定されたバーコード配列が含まれる。いくらかの態様では、少なくとも一のオリゴヌクレオチドバーコードの配列は、一以上の標的細胞集団の特異的標的細胞集団に特有である。いくらかの態様では、特異的標的細胞集団は、特有の抗原ペプチド、特有のMHC対立遺伝子、または特有の抗原ペプチドおよびMHC対立遺伝子対を発現する。いくらかの態様では、一以上の標的細胞集団には、二以上の異なる標的細胞集団が含まれ、各別個の標的細胞には、各特有の抗原ペプチド、各特有のMHC対立遺伝子、または各特有の抗原ペプチドおよびMHC対立遺伝子対の同一性に作動可能に関連する特有の、規定されたバーコード配列が含まれる。
【００４１】
ここに開示するのはまた、いずれかの上記方法によって生産される分離された興味ある標的細胞または興味あるTCR発現性細胞である。
【００４２】
ここに開示するのはまた、いずれかの上記方法によって生産されるテンプレートとして精製されたポリヌクレオチドを使用して生成される精製されたポリヌクレオチド、または任意のポリヌクレオチドである。
【００４３】
ここに開示するのはまた、いずれかの上記方法によって生産される一以上の配列が含まれるデータベースである。いくらかの態様では、一以上の配列には、いずれかの上記方法によって生産される一以上の配列決定されたポリヌクレオチドがまれる。
【００４４】
ここに開示するのはまた、興味ある分離された標的細胞であって、そこでは標的細胞には、次の：i）一以上のT細胞膜関連成分であり、そこでは標的細胞は一以上のT細胞膜成分をコードする内因性ポリヌクレオチド配列を含まないもの；およびii）一以上の主要組織適合性複合体（MHC）対立遺伝子であり、そこでは一以上の抗原ペプチドは一以上の主要組織適合性複合体（MHC）対立遺伝子上で提示されるものが含まれる。いくらかの態様では、一以上の抗原ペプチドは一以上の抗原ポリヌクレオチド配列によってコードされる。
【００４５】
ここに開示するのはまた、リガンド識別にあたり、次のステップ：a）一以上のリガンド特異的結合性分子発現性細胞集団を提供すること；b）一以上の標的細胞集団を提供することであり、そこでは標的細胞集団は一以上のリガンド特異的結合性分子によって結合される能力がある一以上のリガンドを提示すること；c）一以上のリガンド特異的結合性分子発現性細胞集団を一以上の標的細胞集団と接触させることであり、そこでは接触させることには、少なくとも一のリガンド特異的結合性分子発現性細胞について少なくとも一の標的細胞に特異的に結合するのに十分な条件を提供することが含まれ、およびそこでは一以上の膜成分はリガンド特異的結合性分子発現性細胞および標的細胞の間で結合の後に移されること；d）次の、i）興味ある標的細胞であり、そこでは興味ある標的細胞には、接触させるステップ（c）の後にリガンド特異的結合性分子発現性細胞から移される一以上の膜成分が含まれるもの；および随意にii）興味あるリガンド特異的結合性分子発現性細胞であり、そこでは興味あるリガンド特異的結合性分子発現性細胞には、接触させるステップ（c）の後に標的細胞から移される一以上の膜成分が含まれるもの、を分離すること、または分離したこと；およびe）次の、i）興味ある標的細胞に関連する一以上のリガンドをコードする配列の少なくとも一部分、またはii）興味ある結合性分子リガンド特異的発現性細胞に関連する結合性分子ペプチドをコードする結合性分子配列の少なくとも一部分、を決定すること、または決定したことを含む、方法である。いくらかの態様では、リガンド特異的結合性分子は、次の：免疫受容体、免疫グロブリン、抗体またはそのフラグメント、受容体、キメラ受容体、キメラ抗原受容体（CAR）、シグナル伝達受容体、細胞表面受容体、および膜貫通受容体からなる群より選ばれる。いくらかの態様では、一以上のリガンドは、次の：抗原、表面抗原、エピトープ、非古典的MHC提示抗原、および受容体リガンドからなる群より選ばれる。
図面のいくつかの観点の概略説明
【００４６】
本発明のこれらの、および他の特長、態様、および利益は、以下の説明、および添付図面で、次に示すものに関してさらに良好な理解となるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図1A-E。標的細胞のトロゴサイトーシスは抗原特異的である。（図1A）Jurkat（ジャーカット）およびK562細胞のフローサイトメトリーを介する解析。Jurkat T細胞およびK562細胞はそれぞれLNGFR+集団およびZsGreen（Zsグリーン）+集団をゲーティング（ゲート制御することなどとも言う）によって分解した。（図1B）HLA-A2/MART126-35（A27L）の単鎖三量体（SCT）を発現する同族MART1-K562標的細胞（ZsGreen+）またはHLA-A2/NYESO1157-165（C165V）のSCTを発現する非同族NYEOS1-K562標的細胞との共インキュベーションにおけるビオチン化F5-Jurkat T細胞上のNHS-ビオチンのレベル。F5-Jurkat T細胞上の表面タンパク質を1mg/ml NHS-ビオチンで標識し、および蛍光を利用して標識したストレプトアビジンを用いてビオチン化タンパク質のレベルを評価した。（図1C）Jurkat T細胞（LNGFR+）からK562標的細胞（ZsGreen+）へのビオチン化膜タンパク質の移行は、Jurkat対K562細胞の5：1の比率での共インキュベーション後、蛍光を利用して標識したストレプトアビジンを用いて評価した。（図1D）F5-Jurkat T細胞から同族のMART1-K562標的細胞（ZsGreen+）への、ただし非同族のNYESO1-K562標的細胞（ZsGreen+）へではない、細胞膜タンパク質、LNGFRおよびTCRの抗原特異的移動（5：1 J：K）。抗LNGFRおよび抗ヒトTCR（huTCR）抗体を用いてトロゴサイトーシスを評価した。（図1E）1G4-JurkatまたはF5-Jurkat T細胞（5：1 J：K）による共インキュベーション後のNYESO1-K562またはMART1-K562細胞のいずれかの代表的なフローサイトメトリープロットオーバーレイ。K562細胞（ZsGreen+HLA-A2+）はT細胞膜タンパク質、LNGFRおよびhuTCRの抗原特異的獲得を示し、およびJurkat細胞（ZsGreen-HLA-A2-）は膜タンパク質LNGFRおよびhuTCRの抗原特異的損失を示した。関連する集団を指し示す。
【図２Ａ】トロゴサイトーシスはCD8の存在によって滴定可能であり、および増強される。（図2A）異なる用量のMART1（ELAGIGILTV；上部）またはNYESO1（SLLMWITQV；底部）のヘテロクリティックペプチドがロードされたHLA-2発現性K562（A2-K562）細胞を伴うネズミ化したF5-Jurkatまたは1G4-Jurkat細胞のトロゴサイトーシス能力の比較は0ないし10uMに及ぶ（5：1 J：K）。SCT-K562細胞（eGFP+）は、抗muTCR抗体を用いてTCRの獲得について評価した。各条件について、左の列はF5-Jurkat細胞を表し、および右の列は1G4-Jurkat細胞を表す。
【図２Ｂ】異なるMART1（上部）またはNYESO1（底部）変種（バリアント、変異体などとも言う）がロードされたA2-K562細胞を伴うネズミ化F5-Jurkatまたは1G4-Jurkat細胞のトロゴサイトーシス能力の比較（5：1 J：K）。トロゴサイトーシス能力はTCR+eGFP+A2-K562細胞の割合によって評価した。各条件について、左の列はF5-Jurkat細胞を表し、および右の列は1G4-Jurkat細胞を表す。
【図２Ｃ】TCR+eGFP+SCT-K562の割合によって示すような、MART1-K562またはNYESO1-K562細胞を伴うCD8+またはCD8- F5-Jurkatまたは1G4-Jurkat細胞のトロゴサイトーシス能力の比較（5：1 J：K）。各条件について、左から右までの列はF5-Jurkat細胞、F5-CD8-Jurkat細胞、1G4-Jurkat細胞、および1G4-CD8-Jurkat細胞を表す。
【図３Ａ】標的細胞のトロゴサイトーシスは、10,000の非-抗原-発現性細胞において一つの同族抗原発現性標的細胞を識別するために十分に感受性である。（図3A）F5-Jurkat（上部）または1G4-Jurkat（底部）細胞のいずれかと共インキュベーションした1：10,000の同族NYESO1-K562（CD80-ZsGreen+）標的細胞対非同族A2-K562細胞（CD80+ZsGreen-）についての模式的および代表的なフロープロット（20,000：10,000：1 Jurkat：K562：SCT-K562）。NYESO1-K562細胞（HLA-A2+ZsGreen+）および非同族A2-K562細胞（HLA-A2+ZsGreen-）は、抗LNGFRおよび抗muTCR抗体を用いて、膜移行マーカー（membrane transfer markers）、LNGFRおよびTCRの獲得を分析するために別々にゲート制御した。非同族A2-K562細胞（グレイ）のオーバーレイは、同族対非同族K562細胞のトロゴサイトーシスの明確な比較を提供する。
【図３Ｂ】1G4-Jurkat（上部）またはF5-Jurkat（底部）細胞のいずれかと共インキュベーションした1：10,000の同族MART1-K562（CD80-ZsGreen+）標的細胞対非同族A2-K562細胞（CD80+ZsGreen-）の模式的およびフローサイトメトリーのプロット。この実験についてのフローサイトメトリーデータは（a）でのものと似せて分析した。
【図４Ａ】標的細胞のトロゴサイトーシスはパブリックなF5-および1G4 TCRについてのリガンドを検証する。12,055のエピトープを含むA2レトリクテッドライブラリー（retricted library）の関連で使用されるトロゴサイトーシスの概略図。免疫エピトープデータベース（Immune Epitope Database）（IEDB）からの様々な既知のT細胞エピトープを含むA2制限（A2-restricted）SCT DNAライブラリーを最初に生成した。次に、各細胞にDNAの一または二コピーだけが含まれるのを確実にするために、K562細胞に低MOIにてA2制限SCTライブラリーを形質導入した。次いで、F5-Jurkatまたは1G4 Jurkat細胞（E2-Crimson（クリムソン）+CD8+）をK562ライブラリー細胞と共インキュベーションし（2：1 J：K）、およびトロゴサイトーシス+（E2-Crimson-eGFP+TCR+）A2-SCT-K562細胞は、抗原検証のためのFACSを用いてデキストラマー染色、共インキュベーション、および次世代シーケンシング（NGS）によって選別した。
【図４Ｂ】F5-Jurkatまたは1G4-Jurkat（2：1 J：K）と共にインキュベーションしたF5-Jurkat培養物からのK562選別した細胞（左パネル）または1G4-Jurkat培養物からのK562選別した細胞（左パネル）の共インキュベーション検証後の、選別したトロゴサイトーシス+SCT-K562細胞の平均蛍光を表すヒストグラム。
【図４Ｃ】選別したトロゴサイトーシス+SCT-K562細胞による1G4 TCRまたはF5 TCRデキストラマー（dextramer）結合の代表的なフローサイトメトリープロット。F5-Jurkatまたは1G4-Jurkat細胞を伴う一または二ラウンドの共インキュベーションおよびFACSによる選定後のトロゴサイトーシス+SCT-K562は、蛍光標識F5 TCR（上部）および1G4 TCR（底部）デキストラマー染色を介して検証した。
【図４Ｄ】ディープシーケンシング解析による二ラウンドのトロゴサイトーシス選定後の豊富化ペプチドの検証。ランク平均は、豊富化ペプチドのランキングを表し、実験の三回の繰り返しから、すべてのペプチドの中の各ペプチドの存在量（abundance）に基づき算出した。
【図５Ａ】標的細胞のトロゴサイトーシスはネオ抗原特異的な、ペイシェント由来TCRについて同族リガンドを識別する。5,000のエピトープを含む腫瘍サンプルから導き出されるA2制限ネオエピトープライブラリーとの関連で使用される略図トロゴサイトーシス。A2制限ネオ抗原SCTライブラリーは、ペイシェントからのメラノーマのエクソームシーケンシングを介して識別された変異配列からHLA-A*02：01によって提示される予測ネオエイトペを用いて最初に生成した。次に、CD8+ Jurkat細胞（E2-Crimson+）を同じペイシェントからのネオエピトープ特異的TCR（neoTCR）により形質導入し、およびK562細胞をA2制限ネオエピトープライブラリーにより、各細胞が一または二のDNAのコピーだけを含むように低MOIにて形質導入した。次いで、これらの細胞を共インキュベーションし（2：1 J：K）、およびトロゴサイトーシス+（eGFP+ TCR+）A2制限SCT-K562細胞をNGSによるエピトープ識別および共インキュベーションおよび細胞傷害性アッセイによる検証のためにFACSを用いて選別した。
【図５Ｂ】ディープシーケンシング分析による二ラウンドのトロゴサイトーシス選定後の豊富化ペプチドの識別。ランク平均は、豊富化ペプチドのランキングを表し、すべてのペプチド中の各ペプチドの存在量に基づいて、実験の三回の繰り返しから算出した。
【図５Ｃ】ネオTCR-Jurkat細胞からUSP7mut-K562細胞（2：1 J：K）へのネオエピトープ特異的TCR転移を評価することによるトロゴサイトーシス試験を介するTCR-ネオ抗原対形成の検証を示すヒストグラム（左パネル）。ヒストグラムはTCR陽性細胞の割合として定量化した（右パネル）。各条件について、左のカラムはF5-Jurkat細胞を表し、および右のカラムはネオ12-Jurkat細胞を表す。
【図５Ｄ】インビトロでのUSP7mut-K562細胞に対するネオTCR-T細胞の細胞傷害性。ネオTCR-T細胞またはF5TCR-T細胞を異なるエフェクター対標的比にてUSP7mut-K562またはMART1-K562細胞と4時間共インキュベートし、およびUSP7mut-K562またはMART1-K562細胞に対する細胞傷害性を測定し、および％特異的溶解として提示した。
【図６Ａ】F5 TCRまたは1G4 TCRを発現するJurkat細胞およびHLA-A2/MART126-35（A27L）またはHLA-A2/NYESO1157-165（C165V）の単鎖三量体（SCT）を発現するK562細胞の確立。レトロウイルスベクターは、ヒトまたはネズミのいずれかのTCR定常領域が、LNGFRΔで、切断された細胞内ドメインと共に低親和性神経成長因子受容体を含む形質導入マーカーと一緒に運ばれるF5 TCRまたは1G4 TCR遺伝子をJurkat細胞に同時デリバリーした（co-delivered）。レンチウイルスベクターは、K562細胞への形質導入マーカーとしてZsGreenと共にMART1またはNYESO1ペプチドを含むSCTを同時デリバリーした。SCTsは、フレキシブルGSリンカーを介して、抗原ペプチド、β2-ミクログロブリン、およびHLA-A2ドメインの線形組成を伴う単一のポリペプチド鎖で構成される。
【図６Ｂ】赤/青の着色は、同族のTCR抗原対を指し示す。F5 TCR（赤）はMART1ペプチドを発現するSCTと対形成され、および1G4 TCR（青）はNYESO1ペプチドを発現するSCTと対形成する。
【図７Ａ】トロゴサイトーシスは多様なタンパク質移行によって追跡することができる。抗CD3および抗CD8抗体によって評価されるような、CD8発現性F5-Jurkatおよび1G4-Jurkat細胞からK562細胞（ZsGreen+）へのT細胞膜タンパク質、CD3およびCD8の抗原特異的移行（5：1 J：K）。
【図７Ｂ】抗HLA-A2抗体によって評価されるような、K562細胞からJurkat細胞（ZsGreen-）へのK562細胞膜タンパク質、HLA-A2の抗原特異的移行（5：1 J：K）。
【図７Ｃ】ドナー細胞からの膜タンパク質の付随する減少（Concomitant reduction）。K562細胞（ZsGreen+）はHLA-A2の抗原特異的損失を示し、その一方、抗HLA-A2、抗LNGFR、および抗マウスTCR（muTCR）抗体によって評価されるように、Jurkat細胞（ZsGreen-）はLNGFRおよびネズミ化TCRの抗原特異的損失を示した。
【図７Ｄ】ドナー細胞からの膜タンパク質の付随する減少（Concomitant reduction）。K562細胞（ZsGreen+）はHLA-A2の抗原特異的損失を示し、その一方、抗HLA-A2、抗LNGFR、および抗マウスTCR（muTCR）抗体によって評価されるように、Jurkat細胞（ZsGreen-）はLNGFRおよびネズミ化TCRの抗原特異的損失を示した。
【図８Ａ】図8。抗原特異的TCR移行は細胞同一性に関係なくドナー細胞からアクセプター細胞に起こる。ヒストグラムによる抗muTCR抗体で評価されるように、F5または1G4 TCR-K562細胞とMART1またはNYESO1 SCT-Jurkat細胞（ZsGreen+）の5：1比の共インキュベーション後のTCRの抗原特異的移行（左パネル）。ヒストグラムはTCR陽性細胞の割合として定量化した（右パネル）。各条件について、左のカラムはF5-K562細胞を表し、および右のカラムは1G4-K562細胞を表す。
【図８Ｂ】F5または1G4 TCR-K562とMART1またはNYESO1 SCT-K562（ZsGreen+）の5：1比の同じ細胞型の共インキュベーション後の、ヒストグラムによる抗muTCR抗体によって評価されるようなTCRの抗原特異的移行（左パネル）。ヒストグラムはTCR陽性細胞の割合として定量化した（右パネル）。各条件について、左のカラムはF5-K562細胞を表し、および右のカラムは1G4-K562細胞を表す。
【図８Ｃ】F5または1G4 TCR-JurkatとMART1またはNYESO1 SCT-Jurkat（ZsGreen+）の1：1比の共インキュベーション後、ヒストグラムによる抗muTCR抗体によって評価するようなTCRの抗原特異的移行（左パネル）。ヒストグラムはTCR陽性細胞の割合として定量化した（右パネル）。各条件について、左のカラムはF5-Jurkat細胞を表し、および右のカラムは1G4-Jurkat細胞を表す。
【図９Ａ】ペプチド投薬および変種に基づくトロゴサイトーシス能力の組織描写的視覚化（Histographic visualization）。0から10uMまでに及ぶ異なる用量の同族MART1ヘテロクリティックペプチドがロードされたA2-K562細胞を伴うネズミ化F5-Jurkat細胞のトロゴサイトーシス能力の比較（5：1 J：K）。トロゴサイトーシスはeGFP+TCR+A2-K562細胞の割合によって決定した。
【図９Ｂ】0から10uMまでに及ぶ異なる用量の非同族NYESO1がロードされたA2-K562細胞を伴うネズミ化F5-Jurkat細胞のeGFP+TCR+A2-K562細胞の割合によって評価されるようなトロゴサイトーシス能力の比較（5：1 J：K）。
【図９Ｃ】0から10uMまでに及ぶ異なる用量の同族NYESO1がロードされたA2-K562細胞を伴うネズミ化1G4-Jurkat細胞のeGFP+TCR+K562細胞の割合によって評価されるようなトロゴサイトーシス能力の比較（5：1 J：K）。
【図９Ｄ】0から10uMまでに及ぶ異なる用量の同族MART1がロードされたA2-K562細胞を伴うネズミ化1G4-Jurkat細胞のeGFP+TCR+K562の割合によって評価されるようなトロゴサイトーシス能力の比較（5：1 J：K）。
【図９Ｅ】異なるMART1変種がロードされたA2-K562細胞を伴うネズミ化F5-Jurkat細胞のeGFP+TCR+A2-K562細胞の割合によって決定されるトロゴサイトーシス能力の比較（5：1 J：K）。
【図９Ｆ】異なるMART1変種がロードされたA2-K562細胞を伴うネズミ化1G4-Jurkat細胞のeGFP+TCR+A2-K562細胞の割合によって決定されるトロゴサイトーシス能力の比較（5：1 J：K）。
【図９Ｇ】異なるNYESO1変種がロードされたA2-K562細胞を伴うネズミ化1G4-Jurkat細胞のeGFP+TCR+A2-K562細胞の割合によって決定されるトロゴサイトーシス能力の比較（5：1 J：K）。
【図９Ｈ】異なるNYESO1変種がロードされたA2-K562細胞を伴うネズミ化F5-Jurkat細胞のeGFP+TCR+A2-K562細胞の割合によって決定されるトロゴサイトーシス能力の比較（5：1 J：K）。
【図９Ｉ】MART1-K562またはNYESO1-K562細胞を伴うCD8+またはCD8-ネズミ化F5-Jurkat細胞のeGFP+TCR+SCT-K562細胞の割合によって決定されるトロゴサイトーシス能力の比較（5：1 J：K）。
【図９Ｊ】MART1-K562またはNYESO1-K562細胞を伴うCD8+またはCD8-ネズミ化1G4-Jurkat細胞のeGFP+TCR+SCT-K562細胞の割合によって決定されるトロゴサイトーシス能力の比較（5：1 J：K）。
【図１０Ａ】標的細胞のトロゴサイトーシスは同族抗原発現性標的細胞を非同族抗原発現性細胞から分解する。（図10A）実験の概略図。NYESO1-K562およびMART1-K562の1：1混合物は、F5-Jurkatまたは1G4-Jurkat細胞との共インキュベーション実験において用いた（10：1：1のJurkat：NYESO1-K562：MART1-K562）。トロゴサイトーシス+SCT-K562細胞（HLA-A2+ZsGreen+LNGFRhigh（LNGFR高などとも言う）TCRhigh）細胞は、抗原特異的トロゴサイトーシスを立証するために、さらにデキストラマー染色によって分析した。
【図１０Ｂ】1G4-Jurkat（上部）またはF5-Jurkat（底部）細胞のいずれかと共インキュベーションしたNYESO1-K562およびMART1-K562細胞の1：1混合物について代表的なフロープロット（10：1：1のJurkat：NYESO1-K562：MART1-K562）。混合したNYESO1-K562およびMART1-K562細胞（HLA-A2+ZsGreen+）は、トロゴサイトーシス+（TCR+LNGFR+）およびトロゴサイトーシス-（TCR-LNGFR-）集団について別々にゲート制御した。次いで、F5 TCRまたは1G4 TCRデキストラマー染色のいずれかを用いることによって、トロゴサイトーシス+およびトロゴサイトーシス-集団を抗原特異性について検証した。
【図１０Ｃ】トロゴサイトーシスが同族抗原発現性標的細胞を特異的に分解することができることを確認する三回の1：1のK562混合物実験の定量化。トロゴサイトーシス+NYESO1-K562細胞は同族の1G4 TCRデキストラマーについて陽性に染色された。各ゲーティング条件について、左のカラムは1G4-Jurkat細胞を表し、および右のカラムはF5-Jurkat細胞を表す。  詳細な記載
【発明を実施するための形態】
【００４８】
本発明の様々な実施形態の詳細を以下の説明に記載する。本発明の他の特長、目的、および利益は、説明および図面、ならびに請求の範囲から明らかであろう。
定義
【００４９】
請求の範囲および明細において用いる用語は、特に明記しない限り、以下に記載するように規定される。
【００５０】
ここで使用するように、「抗原特異的T細胞」または「抗原特異的TCR発現」細胞は、それらのT細胞受容体（TCRs）によって互いに区別される細胞に言及し、それらはMHCによって提示される同族の（cognate）抗原ペプチド（antigenic peptides、抗原性ペプチドなどとも言う）についてそれらの抗原特異性（また「エピトープ」とも呼ばれる）をそれらに与える。
【００５１】
本発明の実施形態には、同族T細胞と対合する能力がある組換え抗原-MHC複合体が含まれる。ここで使用する「抗原-MHC」、「抗原-MHC複合体」、「組換え抗原-MHC複合体」、「ペプチドMHC」、および「p/MHC」は、MHCの抗原結合溝（antigen binding groove）においてペプチドとの主要組織適合性複合体（major histocompatibility complex）に言及するために交換可能に使用する。
【００５２】
ここで用いるように、「抗原」には、ペイシェント特異的ネオ抗原を含めて任意の抗原が含まれる。「抗原ペプチド」は、MHC分子に結合し、およびTCR発現性細胞に対して提示される能力があるペプチドフラグメント（ペプチド断片とも言う）に言及する。「ネオ抗原（ネオアンチゲン、新生抗原、新抗原などとも言う）」は、ネオ抗原またはネオ抗原の提示をその対応する野生型抗原、例は、ポリペプチド配列における変異と区別させる少なくとも一の変動を有する抗原に言及し、違いは翻訳後修飾、または発現レベルでの違いである。「腫瘍ネオ抗原」は、腫瘍またはガンから、例は、ペイシェントの腫瘍から導き出されるネオ抗原に言及する。
【００５３】
ここで用いるように、「T細胞ペアード抗原MHC複合体（T cell paired antigen MHC complex、T細胞対合抗原MHC複合体などとも言う）」は、MHC分子によって提示される抗原ペプチドに結合するT細胞受容体を有するT細胞の複合体に言及する。
【００５４】
「インビボ（生体内とも言う）」という用語は生きた有機体において生じるプロセスに言及する。
【００５５】
ここで用いる「哺乳動物」という用語には、ヒトおよび非ヒトの双方が含まれ、および制限されないが、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ科動物、ネコ科動物、ネズミ科動物、ウシやそのような動物、ウマ科動物、およびブタやそのような動物が含まれる。
【００５６】
「十分な量」という用語は、望ましい効果を生成するのに十分な量、例は、細胞においてタンパク質凝集を調節するのに十分な量を意味する。
【００５７】
「治療上有効な量」という用語は疾患の徴候を改善するのに有効な量である。
【００５８】
本明細および添付の請求の範囲において使用されるように、単数形「a」、「an」、および「the」には、文脈から別なふうに明確に示されない限り、複数の指示対象を含むことに注目しなければならない。
【００５９】
特に明記せず、または別なふうに文脈から明らかでない限り、ここで用いる用語「約」は本技術において通常の許容範囲内、例えば、平均の2標準偏差内であると理解される。約は、規定値の10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、または0.01％内と理解することができる。文脈からそうでないことが明確でない限り、ここで提供するすべての数値は、約という用語によって修飾される。
イントロダクション
【００６０】
T細胞性免疫（T細胞媒介性免疫とも言う）は、細胞において死（不活化などとも言う）を誘導することが可能な抗原特異的細胞傷害性T細胞の活性化によって特徴付けられることができ、これらの細胞はそれらの表面での主要組織適合性複合体（MHC）において抗原を表示する。抗原がロードされたMHC複合体を表示するこれらの細胞には、ウイルス感染細胞、細胞内細菌を伴う細胞、タンパク質の細胞外供給源を内部移行または貪食した細胞、および腫瘍抗原を表示するガン細胞が含まれる。
【００６１】
T細胞性免疫プロセスを利用するために、例は、ペイシェント特異的ガン免疫療法について、初期ステップの一つは、ペイシェントの腫瘍特異的抗原（例は、ネオ抗原）の識別を含むことができる。刊行された文献とは異なり、抗原提示標的細胞は、ここで標的細胞（以下、ターゲット細胞とも言う）のトロゴサイトーシスとして命名するプロセスを通して相互作用性T細胞から膜および膜関連タンパク質を抽出することができる。抗原特異的ターゲット細胞のトロゴサイトーシスは複合的タンパク質（multiple-protein）の移行によって、およびドナー細胞からのタンパク質の損失によって追跡することができる。そのようなターゲット細胞のトロゴサイトーシスは、ペプチドMHC密度依存性であり、および各変種についてのTCRのそれぞれの認識能力に基づいて異なるペプチド変種を区別することが可能である。
【００６２】
ここに記載するのは、ターゲット細胞で、例えば、T細胞などのような、オーファンTCR形質導入細胞と同族のエピトープを提示する、例えば、MHC対立遺伝子発現性細胞などのようなものを選択的にマークするためにターゲット細胞のトロゴサイトーシス現象を活用するTCRリガンド発見プラットフォームであり、ターゲット細胞ライブラリーからの認識されたエピトープの分離が可能になる。また、ここで説明するのは、オーファンTCR形質導入細胞、例えば、T細胞などのようなものを選択的にマークするために、ターゲット細胞のトロゴサイトーシス現象を活用するTCR発見プラットフォームでもあり、それはTCR発現性細胞ライブラリーからのTCRの分離を可能にするターゲット細胞上の同族エピトープを認識する。
【００６３】
また、ここに記載するのは、リガンドおよびそれらの同族結合性分子を選択的にマークし、および識別するために、ターゲット細胞のトロゴサイトーシス現象を活用するリガンド発見プラットフォームである。
抗原識別の方法
【００６４】
ここでは、抗原識別にあたり、以下のステップ：a）一またはそれよりも多く（一以上とも言う）の抗原特異的T細胞受容体（TCR）発現性細胞集団を提供すること；b）一以上のターゲット細胞集団を提供することであり、そこではターゲット細胞集団は一以上の主要組織適合性複合体（MHC）対立遺伝子上で一以上の抗原ペプチドを提示すること；c）一以上の抗原特異的TCR発現性細胞集団を一以上のターゲット細胞集団と接触させることであり、そこでは接触させることには、一以上の抗原特異的TCR発現性細胞集団の少なくとも一について一以上のターゲット細胞集団の少なくとも一と特異的に結合するのに十分な条件を提供することが含まれ、およびそこでは一以上の膜成分は少なくとも一の抗原特異的TCR発現性細胞および少なくとも一のターゲット細胞の間で結合の後に移されること；d）次の、i）興味あるターゲット細胞であり、そこでは興味あるターゲット細胞には、接触させるステップ（c）の後に少なくとも一の抗原特異的TCR発現性細胞から移される一以上の膜成分が含まれるもの、および随意にii）興味あるTCR発現性細胞であり、そこでは興味あるTCR発現性細胞には、接触させるステップ（c）の後に少なくとも一のターゲット細胞から移される一以上の膜成分が含まれるものを分離すること、または分離したこと；およびe）次の、i）興味あるターゲット細胞に関連する一以上の抗原ペプチドの配列、ii）興味あるTCR発現性細胞に関連するTCRペプチドをコードするTCR配列の少なくとも一部分、またはiii）興味あるターゲット細胞に関連する一以上の抗原ペプチドの配列および興味あるTCR発現性細胞に関連するTCRペプチドをコードするTCR配列の少なくとも一部分を決定すること、または決定したことを含む方法を提供する。
抗原特異的TCR発現性細胞
【００６５】
抗原特異的TCR発現性細胞は一以上のTCRsを発現する任意の細胞に言及する。
【００６６】
ここで用いるように、「集団」は、クローン的に同一の、または実質同一の、細胞の群に言及する。集団は任意の数のクローン的に同一の細胞に言及することができる。例えば、集団は、一つの細胞、一つの細胞を超え、2の細胞、3の細胞、4の細胞、5の細胞、6の細胞、7の細胞、8の細胞、9の細胞、10の細胞、10を超える細胞、20を超える細胞、30を超える細胞、40を超える細胞、50を超える細胞、102を超える細胞、103を超える細胞、104を超える細胞、105を超える細胞、106を超える細胞、107を超える細胞、または108を超える細胞に言及することができる。一以上の抗原特異的TCR発現性細胞集団は、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれらより多くの抗原特異的TCR発現性細胞集団であることができる。一以上の抗原特異的TCR発現性細胞集団は、10を超え、20を超え、30を超え、40を超え、50を超え、102を超え、103を超え、104を超え、105を超え、106を超え、107を超え、または108を超える抗原特異的TCR発現性細胞集団であることができる。一以上のターゲット細胞集団は、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれらより多くのターゲット細胞集団であることができる。一以上のターゲット細胞集団は、10を超え、20を超え、30を超え、40を超え、50を超え、102を超え、103を超え、104を超え、105を超え、106を超え、107を超え、または108を超えるターゲット細胞集団であることができる。
【００６７】
抗原特異的TCR発現性細胞はT細胞であることができる。T細胞の例には、制限されないが、細胞傷害性T細胞（CTL）、CD8+T細胞、CD4+T細胞、プライマリT細胞（初代T細胞などとも言う）、エクスビボ（ex vivo、生体外などとも言う）培養T細胞、腫瘍浸潤性T細胞（tumor infiltrating T cell）、自己免疫性T細胞（autoimmune T cell）、病原体特異的T細胞、調節性T細胞（regulatory T cell、制御性T細胞などとも言う）、疲弊T細胞（exhausted T cell、消耗T細胞などとも言う）、メモリーT細胞（記憶T細胞などとも言う）集団、ナチュラルキラーT細胞（Natural Killer T cell）（NKT）集団、ガンマ-デルタ（γδ）T細胞集団、工学的に作り出されたT細胞（engineered T cell、改変T細胞などとも言う）、および不死化T細胞系が含まれる。ここでの方法について有用なT細胞の特定の例には、Jurkat（ジャーカット）不死化T細胞系（また「Jurkat」または「Jurkat細胞」とも称される）が含まれる。Jurkat細胞は、例えば、外因性タンパク質（例は、外因性TCRs）を発現するため、および/また興味ある特定の遺伝子を欠失するためになどで、工学的に作り出すことができ、およびここでの方法に有用なクローンまたはライブラリーを生成するために継代することが可能である。異なる望ましい特性を有する様々なJurkat細胞系が工学的に作り出されており、および例えば、American Type Culture Collection（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション）にて公的に利用可能である。T細胞は、ここに記載の方法を促進する特性を有するように工学的に作り出すことができる。例えば、T細胞は、特定の遺伝子、例えば、内因性TCR分子などのようなものを発現しないように工学的に作り出す（遺伝子工学的に作り出す、操作するなどとも言う）ことができ、またはT細胞は、外因性分子、例えば、TCRsまたは様々なT細胞共受容体などのようなものを発現するように操作することができる。細胞工学の方法には、制限されないが、一過性トランスフェクション（一過性導入などとも言う）、安定トランスフェクション、ウイルス形質導入（例は、レトロウイルスまたはレンチウイルス形質導入）、ヌクレアーゼベースの工学的アプローチ、エレクトロポレーション、および人工細胞（engineered cells）、例えば、T細胞などのようなものをもたらすその他の工学の方法（例は、操作されたT細胞を生産するために使用することができる動物または幹細胞の操作）が含まれる。ヌクレアーゼベースのアプローチには、制限されないが、クラスター化された規則的間隔の短いパリンドローム反復（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）（CRISPR）ファミリーヌクレアーゼ（例は、Cas9）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（Transcription activator-like effector nuclease）（TALEN）またはそれらの誘導体、亜鉛-フィンガーヌクレアーゼ（ZFN）またはその誘導体、およびホーミングエンドヌクレアーゼ（homing endonuclease）（HE）またはその誘導体が含まれるヌクレアーゼを使用することが含まれる。T細胞は、ネイティブTCR遺伝子座から発現されるその内因性TCRだけを発現することができる。
【００６８】
T細胞は、対象、例えば、ガンを有することが知られるか、または疑われる対象などのようなものから分離することができる。対象由来（また「ペイシェント由来」とも称される）T細胞は、ペイシェントの末梢血単核細胞（PBMCs）または腫瘍浸潤性リンパ球（TILs）から分離することができる。例えば、CD4+およびCD8+T細胞の双方は、CD4+またはCD8+細胞だけを分離するために、蛍光活性化細胞選別（fluorescence-activated cell sorting、蛍光活性化細胞分類、蛍光標識細胞分取などとも言う）（FACS）を使用して選別されたCD4+およびCD8+の単一陽性細胞の生存集団と共に抗CD4および抗CD8蛍光抗体を使用してPBMCsまたはTILSからラベル付けおよび選別することができる。他の選別方法、例えば、磁気選別などのようなものを使用することができる。対象由来のT細胞もまたペイシェントから間接的に分離すること、例えば、ペイシェントから分離されたT細胞またはT細胞前駆体のex vivo培養後にT細胞を分離することなどのようなものを行うことができる。T細胞を識別し、および分離するために様々なマーカーを使用することができる。マーカー類は、T細胞をより一層広範に分離するために、例えば、概してすべてのT細胞を分離するために、抗CD3蛍光抗体、次いでFACSを続けて使用することなどのようなもので使用することができる。特定のタイプまたはサブタイプのT細胞を分離するために他のマーカーを使用することができる。例えば、表現型マーカーは、T細胞のタイプまたはサブタイプを区別し、および分離するために使用することができ、例えば、活性化マーカーなどのようなもので、制限されないが、PD-1、CD39、およびCD137が含まれる。単一のマーカーを使用することも、または異なるマーカーの組合せを使用することもできる（例は、CD4/PD-1二重陽性T細胞）。本技術において熟練する者（当業者とも言う）は、分離するためにT細胞のタイプまたはサブタイプを定めることが可能であり、それらは興味ある抗原ペプチドのタイプまたはタイプ群を問い合わせるのに（for interrogating）有用である。
【００６９】
抗原特異的TCR発現性細胞はまた、T細胞に由来しない細胞でもあることができる。例えば、T細胞に由来しない細胞には、外因性TCRを発現するように操作された不死化細胞系が含まれる。ここに記載の方法に有用な不死化細胞系には、制限されないが、K562細胞、HEK293細胞およびその派生物、3T3細胞およびその派生物、チャイニーズハムスター卵巣（Chinese Hamster Ovary）（CHO）細胞およびその派生物、ヒーラ（HeLa）細胞およびその派生物が含まれる。不死化細胞は上記のように操作することができる。
【００７０】
抗原特異的TCR発現性細胞は、ヒトまたはヒト由来細胞、哺乳動物または哺乳動物由来細胞、ネズミ科動物またはネズミ科動物由来細胞、または脊椎動物または脊椎動物由来細胞であることができる。他の細胞および細胞発現性システム、例えば、ファージ、酵母、およびE. coli（エシェリキア・コリ、大腸菌などとも言う）発現システムなどのようなものを使用することができる。抗原特異的TCR発現性細胞は、細胞の種とは異なる種、例えば、ネズミ科動物由来のTCRを発現するように操作されたヒト細胞または逆もまた同じなどのようなものに由来するタンパク質を発現することができる。
【００７１】
抗原特異的TCR発現性細胞は外因性TCRを発現するために操作することができる。抗原特異的TCR発現性細胞は内因性TCRに加えて、または代わりに外因性TCRを発現することができ、例は、内因性TCRを発現するT細胞は、外因性TCRも発現するように操作することができる。外因性TCRはTCRポリヌクレオチド配列によってコードすることができ、そこでは一以上のTCRポリヌクレオチド配列はプロモーターヌクレオチド配列に作動可能に連結される。TCRsをコードすることができるポリヌクレオチドには、制限されないが、ウイルスベクター、cDNA、プラスミド、線状二本鎖（linear double-stranded）DNAベクター、線状一本鎖（linear single-stranded）DNAベクター、および線状一本鎖RNAベクターが含まれる。プロモーターヌクレオチド配列の例には、制限されないが、哺乳動物プロモーター、ヒトプロモーター、ウイルス（性）プロモーター、レトロウイルスまたはレンチウイルスからの長末端反復（long-terminal repeat、末端反復配列などとも言う）（LTR）由来のプロモーター、二以上のプロモーターの融合物、プロモーターの二以上の部分の融合物、MMLV LTRプロモーター、HIV LTRプロモーター、MCMV LTRプロモーター、EF1α、MND、CMV、SV40、PGK1、Ubc、ベータ-アクチン、CAG、小分子誘導性プロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター、小分子コンディショナルプロモーター（small molecule conditional promoters、小分子条件付きプロモーターなどとも言う）、Cre-LoxPコンディショナルプロモーターシステム、Flp-FRTコンディショナルプロモーターシステム、およびタモキシフェンコンディショナルプロモーターシステムが含まれる。外因性TCRsをコードすることができるポリヌクレオチドは、外因性TCRのPCR媒介増幅について有用なユニバーサルプライマー（universal primer、普遍的なプライマーなどとも言う）配列をもつことができ、および/またはNGSについて有用なアタッチングシーケンシングアダプター（attaching sequencing adaptors）、例は、ユニバーサルプライマー配列はTCRコード性ポリヌクレオチドの側面に位置することができる。
【００７２】
TCRは、TCRポリヌクレオチド配列から一過性に発現することができ、そこでTCRポリヌクレオチド配列は操作された細胞のゲノム中に組み込まれない。TCRは、操作した細胞のゲノム中に組み込まれるTCRポリヌクレオチド配列から発現させることができる。組み込まれるTCRポリヌクレオチド配列は規定した遺伝子座中に組み込むことができる。組み込むことができる規定されたゲノム遺伝子座の例には、制限されないが、コーディング領域、イントロン、T細胞受容体（TCR）-アルファ遺伝子座、TCR-ベータ遺伝子座、免疫チェックポイント遺伝子座（例は、PD-1、CTLA-4、BTLA、TIM3、LAG3、およびVISTA）が含まれる。規定された遺伝子座に組み込まれるTCRポリヌクレオチド配列は、規定される遺伝子座の内因性プロモーターヌクレオチド配列に作動可能に連結され、およびそれから発現することができるか、またはそれは、外因性プロモーター、例えば、上記のものなどのようなものに作動可能に連結され、およびそれから発現することができる。
【００７３】
抗原特異的TCR発現性細胞は単一TCRを発現することができる。抗原特異的TCR発現性細胞は一のTCRよりも多くを発現することができ、例えば、抗原特異的TCR発現性細胞は多様な（マルチプル、複合的などとも言う）TCRsを発現することができ、そこで各TCRは異なる特有の抗原に特異的である。抗原特異的TCR発現性細胞は、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれらよりも多くのTCRsを発現することができる。マルチプルTCRsは、例えば、TCR発現ライブラリーからのマルチプルTCRsなどのようなもののようにランダムであることもでき、またはマルチプルTCRsは合理的に選ぶこともでき、例えば、TCRsは対象またはペイシェントにおいて存在することが既知である。
【００７４】
抗原特異的TCR発現性細胞は抗原特異的TCR発現性細胞の集団において存在することができ、集団のメンバーは異なるTCRsまたはTCRsの組合せを発現する。一例において、対象またはペイシェントから分離したT細胞は概して、抗原特異的TCR発現性細胞の集団を含み、集団のメンバーは異なるTCRsを発現する。集団において異なるTCRsは、TCR発現ライブラリーからのマルチプルTCRsなどのようなもので、ランダムであることができる。集団において異なるTCRsを合理的に選ぶことができる。合理的な選定についての基準には、制限されないが、対象またはペイシェントに存在することが知られるTCRsの選定、対象またはペイシェントに一定の頻度で存在することが知られるTCRsの選定、および特定のT細胞集団（例は、ここに前述したT細胞集団のいずれか）によって発現されることが知られるTCRsまたは特定の表現型によって特徴付けられるT細胞、例えば、活性化T細胞（例は、PD-1+、CD39+、および/またはCD137+として特徴付けられるもの）または疲弊（exhausted）T細胞の選定が含まれる。集団内の潜在的な興味あるTCR配列を識別する方法は、本技術、例えば、発行された米国特許第8,507,205号、発行された米国特許第9,347,099号、発行された米国特許第9,506,119号、国際出願のWO2018075693号、Han（ハーン）ら2014、Briggs（ブリッグズ）ら2017、Gros（グロ）ら2014、Pricket（プリケット）ら2016、Linneman（リンネマン）ら2014、Pasetto（パセット）ら2014、および国際出願PCT/US18/21611において知られ、それらの各々は、すべての目的のために参照によって組み込まれる。
【００７５】
大抵、TCRは、「鎖」と称される二つの成分の相互作用によって形成されるヘテロ二量体性タンパク質である。古典的なT細胞は概して、アルファ-ベータ（αβ）T細胞であると考えられ、それはアルファ（α）鎖およびベータ（β）鎖を発現する。その本来の状況において（In its native context）、TCRα鎖およびTCRβ鎖は異なる遺伝子から発現される。外因性TCRが発現されるとき、それはTCRα鎖およびTCRβ鎖を別々にコードする二つのTCRポリヌクレオチド配列によってコードされることができるか、またはそれはTCRα鎖およびTCRβ鎖の双方をコードする単一TCRポリヌクレオチド配列によってコードされることができる。単一TCRポリヌクレオチド配列によりコードされるTCRα鎖およびTCRβ鎖は、例えば、TCR-アルファ：リンカー：TCR-ベータオリエンテーション（配向）またはTCR-ベータ：リンカー：TCR-アルファオリエンテーションにおいてリンカー配列によって分けることができる。一連の例において、リンカー配列は、別個のTCRαおよびTCRβポリペプチドを形成するために発現される連結TCRαおよびTCRβポリペプチドを処理することができるように、開裂可能なペプチド、例えば、フューリン開裂部位などのようなものをコードする。別の一連の例では、リンカー配列は、マルチシストロン発現（multicistronic expression）を可能にするヌクレオチド配列をコードし、それは、TCRαオープンリーディングフレームおよびTCRβオープンリーディングフレームの別個の翻訳であり、別個のTCRαおよびTCRβポリペプチド、例えば、IRESエレメントまたはリボソームスキッピングエレメントなどのようなものをもたらす（例は、T2A、E2A、P2A、F2A、または他の「自己開裂性」ペプチド）。
【００７６】
他のTCRsには、ガンマ-デルタ（γδ）T細胞からのものが含まれ、それらはガンマ（γ）鎖およびデルタ（δ）鎖を発現する。まだその上に他のTCRsには、ナチュラルキラーT細胞（NKT）からのものが含まれる。
【００７７】
抗原特異的TCR発現性細胞は、正しく操作された抗原特異的TCR発現性細胞を識別し、および/または分離するためにマーカー（群）（a marker(s)、（群）は複数もあり得ることを示す）、例えば、蛍光マーカー（例は、eGFP、E2-Crimson（クリムソン））、薬物選択マーカー（例は、ハイグロマイシン、ネオマイシン）、または表面発現マーカー（surface expressed marker）（例は、LNGFR）などのようなものを発現するように操作することができる。TCRの発現およびマーカーの発現を操作するための方法およびシステムは、同じか、または異なることができる。マーカーポリヌクレオチド配列は、TCRポリヌクレオチド配列と同じポリヌクレオチド、例えば、上記の開裂可能なペプチドまたはマルチシストロンシステムなどのようなものであることができる。マーカーポリヌクレオチド配列はTCRポリヌクレオチド配列とは別のポリヌクレオチドであることができる。
TCR共受容体
【００７８】
抗原特異的TCR発現性細胞は、T細胞共受容体、例えば、T細胞共受容体CD3、CD4、CD8、またはそれらの組合せなどのようなものを発現することができる。本技術において熟練する者に知られる任意の共受容体を使用することができる。
【００７９】
CD3は、TCR複合体を形成するためにTCRと関連することができる。CD3は、CD3δ、CD3ε、CD3γサブユニットを含むタンパク質の複合体、およびいくつかの関連では、例えば、活性なシグナル伝達TCR複合体、CD3ζサブユニットなどのようなものを総称的に言及する。
【００８０】
CD3と同様に、CD4およびCD8は、TCR複合体を形成するためにTCRと関連することができる。自然なT細胞の状況では、T細胞は大抵、CD4またはCD8のいずれかを発現する。理論によって縛られることは望まないが、CD4またはCD8の発現は、CD4およびMHCクラスIIまたはCD8およびMHCクラスIの間の特定の相互作用を通して、MHCクラスIIまたはMHCクラスI発現性細胞間での抗原特異的TCR発現性細胞の区別（antigen-specific TCR expressing cell discriminating）をそれぞれ促進する。CD4を発現するT細胞（また「CD4+T細胞」、「ヘルパーT細胞」、「Tヘルパー細胞」、または「TH細胞」とも称される）は、概して、MHCクラスIIを発現するプロフェッショナル抗原提示細胞（professional antigen presenting cells）と相互作用する。CD8を発現するT細胞（また「CD8+T細胞」、「細胞傷害性T細胞」、「キラーT細胞」、「TC細胞」、または「細胞傷害性Tリンパ球（CTLs）」とも称される）は大抵、MHCクラスIを発現する任意の有核細胞と相互作用する。
【００８１】
いくらかの例において、ここに記載の方法は、T細胞共受容体発現が必要なMHC提示抗原ペプチドのTCR認識をT細胞共受容体発現が必要ないものから区別するために使用することができる。
【００８２】
抗原特異的TCR発現性細胞は、内因性T細胞共受容体、例えば、T細胞などのようなものを発現することができる。抗原特異的TCR発現性細胞は、外因性T細胞共受容体を発現するように操作することができる。抗原特異的TCR発現性細胞は、内因性T細胞共受容体に加えて、またはその代わりに外因性T細胞共受容体を発現することができ、例は、内因性T細胞共受容体を発現するT細胞はまた外因性T細胞共受容体を発現するように操作することができる。外因性Ｔ細胞共受容体はT細胞共受容体ポリヌクレオチド配列によってコードされることができ、そこでは一以上のT細胞共受容体ポリヌクレオチド配列は、プロモーターヌクレオチド配列に作動可能に連結される。T細胞共受容体をコードすることができるポリヌクレオチドには、制限されないが、ウイルスベクター、cDNA、プラスミド、線状二本鎖DNAベクター、線状一本鎖DNAベクター、および線状一本鎖RNAベクターが含まれる。プロモーターヌクレオチド配列の例には、制限されないが、哺乳動物プロモーター、ヒトプロモーター、ウイルス（性）プロモーター、レトロウイルスまたはレンチウイルスからの長末端反復（LTR）由来のプロモーター、二以上のプロモーターの融合物、プロモーターの二以上の部分の融合物、MMLV LTRプロモーター、HIV LTRプロモーター、MCMV LTRプロモーター、EF1α、MND、CMV、SV40、PGK1、Ubc、ベータ-アクチン、CAG、小分子誘導性プロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター、小分子コンディショナルプロモーター、Cre-LoxPコンディショナルプロモーターシステム、Flp-FRTコンディショナルプロモーターシステム、およびタモキシフェンコンディショナルプロモーターシステムが含まれる。T細胞共受容体をコードすることができるポリヌクレオチドは、T細胞共受容体のPCR媒介増幅について有用なユニバーサルプライマー配列をもつことができ、および/またはNGSについて有用なアタッチングシーケンシングアダプター、例は、ユニバーサルプライマー配列は、ポリヌクレオチドをコードするT細胞共受容体に隣接することができる。
【００８３】
T細胞共受容体は、T細胞共受容体ポリヌクレオチド配列から一時的に発現することができ、そこで、T細胞共受容体ポリヌクレオチド配列は操作される細胞のゲノム中に組み込まれない。T細胞共受容体は、操作される細胞のゲノム中に組み込まれるT細胞共受容体ポリヌクレオチド配列から発現することができる。組み込まれるT細胞共受容体ポリヌクレオチド配列は、規定される遺伝子座において組み込むことができる。規定される遺伝子座に組み込まれるT細胞共受容体ポリヌクレオチド配列は、規定される遺伝子座の内因性プロモーターヌクレオチド配列に作動可能に連結され、およびそれから発現されか、または外因性プロモーター、例えば、上記のものなどのようなものに作動可能に連結され、およびそれから発現することができる。
【００８４】
T細胞共受容体を発現するように操作される抗原特異的TCR発現性細胞は、操作される能力がある任意の細胞であることができる。T細胞共受容体を発現するように操作される抗原特異的TCR発現性細胞はまた、外因性TCRを発現するように操作することもできる。TCRの発現およびT細胞共受容体の発現を操作するための方法およびシステムは同じか、または異なることができる。T細胞共受容体ポリヌクレオチド配列は、TCRポリヌクレオチド配列と同じポリヌクレオチド、例えば、上記の開裂可能なペプチドまたはマルチシストロンシステムなどのようなものであることができる。T細胞共受容体ポリヌクレオチド配列は、TCRポリヌクレオチド配列とは別個のポリヌクレオチドであることができる。
ターゲット細胞
【００８５】
ここで用いるように、「ターゲット（標的）細胞」は、抗原特異的TCR発現性細胞または結合性分子発現性細胞によって認識する能力がある任意の細胞に言及する。ターゲット細胞は、プライマリ細胞、エクスビボ培養細胞、腫瘍浸潤性細胞、自己免疫細胞、病原体感染細胞、ガンまたは腫瘍由来細胞（cancer or tumor derived cell）、および不死化細胞系であることができる。ここに記載の方法について有用な不死化細胞系には、制限されないが、K562細胞、HEK293細胞およびその派生物（例は、HEK293T細胞）、3T3細胞およびその派生物、Chinese Hamster Ovary（CHO）細胞およびその派生物、HeLa細胞とその派生物が含まれる。不死化細胞は上記のように操作することができる。
【００８６】
ターゲット細胞は、ヒトまたはヒト由来細胞、哺乳動物もしくは哺乳動物由来細胞、ネズミ科動物またはネズミ科動物由来細胞、または脊椎動物もしくは脊椎動物由来細胞であることができる。他の細胞および細胞発現性システム、例えば、ファージ、酵母、およびE. coli発現システムなどのようなものを使用することができる。ターゲット細胞は、細胞の種とは異なる種、例えば、ネズミ科動物由来のタンパク質を発現するように操作されたヒト細胞などのようなものに由来するタンパク質を発現することができ、または逆もまた同じである。
MHC対立遺伝子
【００８７】
TCRエピトープの識別に向けられる例では、ターゲット呼び出しは、エピトープおよびエピトープを提示する能力があるMHC分子（即ち、MHC対立遺伝子）を発現する任意の細胞であることができる。MHCを発現するために操作されたターゲット細胞は、操作される能力がある任意の細胞であることができる。
【００８８】
ターゲット細胞は、ターゲット細胞に対し内因性MHC分子上に、内因性または外因性のいずれかのエピトープを提示する細胞であることができる（即ち、ターゲット細胞によって天然に発現される）。内因性MHCクラスI分子を発現する細胞には、概して、すべての有核細胞が含まれる。内因性MHCクラスII分子を発現する細胞には、プロフェッショナル抗原提示細胞（APCs）、例えば、樹状細胞、マクロファージ、およびB細胞などのようなものが含まれる。
【００８９】
概して、MHCクラスI分子は、β2-ミクログロブリン（また、β2M、ベータ-2ミクログロブリン、またはB2Mとも称される）、およびMHCクラスI重鎖（また、アルファ鎖とも称される）で、α1、α2、およびα3ドメインが含まれるものを含むヘテロ二量体複合体である。それらの本来の状況では、β2MおよびMHCクラスI重鎖は異なる遺伝子によってコードされ、および別々のポリペプチドとして発現される。
【００９０】
概して、MHCクラスII分子はアルファ鎖（α鎖）およびベータ鎖（β鎖）を含むヘテロ二量体複合体である。アルファ鎖にはα1ドメインおよびα2ドメインが含まれ、その一方でベータ鎖にはβ1ドメインおよびβ2ドメインが含まれる。それらの本来の状況では、アルファ鎖およびベータ鎖は異なる遺伝子によってコードされ、および別々のポリペプチドとして発現される。
【００９１】
MHC分子は哺乳動物MHC対立遺伝子であることができ、制限されないが、ヒトMHC対立遺伝子（またHLAsとも称される）が含まれる。ヒト集団において普通に見出されるクラスI HLAsには、制限されないが、HLA-A、HLA-B、およびHLA-C対立遺伝子が含まれる。ヒト集団において普通に見出されるクラスI HLAsの特定のサブクラスには、制限されないが、HLA-A*02、24、01；HLA-B*35、44、51；DRB1*11、13、07が白人（コーカシアン）において、HLA-A*02、03、30；HLA-B*35、15、44；DRB1*13、11、03がアフリカ系ブラジル人において、およびHLA-A*24、02、26；HLA-B*40、51、52；DRB1*04、15、09がアジア人において含まれる。ヒト集団において普通に見出されるクラスII HLAsには、制限されないが、HLA-DQおよびHLA-DRが含まれる。ヒト集団において見出される普通の対立遺伝子は、Bardi（バルディ）らの（Rev Bras Hematol Hemoter.（Revista brasileira de hematologia e hemoterapia）2012；34(1)：25-30。）においてさらに説明される。
【００９２】
外因性MHC分子を発現するようにターゲット細胞を操作することができる。ターゲット細胞は、内因性MHC分子に加え、またはその代わりにMHC分子を発現することができ、例は、内因性MHCクラスII分子を発現するAPCはまた、外因性MHCクラスII分子も発現するために操作することができる。外因性MHC分子は、一以上のMHCポリヌクレオチド配列によってコードすることができ、そこでは一以上のMHCポリヌクレオチド配列は、プロモーターヌクレオチド配列に作動可能に連結される。MHC分子をコードすることができるポリヌクレオチドには、制限されないが、ウイルスベクター、cDNA、プラスミド、線状二本鎖DNAベクター、線状一本鎖DNAベクター、および線状一本鎖RNAベクターが含まれる。プロモーターヌクレオチド配列の例には、制限されないが、哺乳動物プロモーター、ヒトプロモーター、ウイルス（性）プロモーター、レトロウイルスまたはレンチウイルスからの長末端反復（LTR）由来プロモーター、二以上のプロモーターの融合物、プロモーターの二以上の部分の融合物、MMLV LTRプロモーター、HIV LTRプロモーター、MCMV LTRプロモーター、EF1α、MND、CMV、SV40、PGK1、Ubc、ベータ-アクチン、CAG、小分子誘導性プロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター、小分子コンディショナルプロモーター、Cre-LoxPコンディショナルプロモーターシステム、Flp-FRTコンディショナルプロモーターシステム、およびタモキシフェンコンディショナルプロモーターシステムが含まれる。外因性MHC分子をコードすることができるポリヌクレオチドは、外因性MHC分子のPCR媒介増幅について有用なユニバーサルプライマー配列を有することができ、および/またはNGSについて有用なアタッチングシーケンシングアダプター、例は、ユニバーサルプライマー配列は、ポリヌクレオチドをコードするMHC分子に隣接することができる。
【００９３】
MHC分子は、MHCポリヌクレオチド配列から一過性に発現することができ、そこで、MHCポリヌクレオチド配列は操作された細胞のゲノム中に組み込まれない。MHC分子は、操作された細胞のゲノムに組み込まれるMHCポリヌクレオチド配列から発現させることができる。組み込まれるMHCポリヌクレオチド配列は、規定される遺伝子座中に組み込まれることができる。規定される遺伝子座中に組み込まれるMHCポリヌクレオチド配列は、規定される遺伝子座の内因性プロモーターヌクレオチド配列に作動可能に連結され、および発現されることができ、またはそれは外因性プロモーター、例えば、上記のものなどのようなものに作動可能に連結し、および発現することができる。
【００９４】
ターゲット細胞は単一MHC分子を発現することができる。ターゲット細胞は一よりも多くのMHC分子を発現でき、例えば、ターゲット細胞はマルチプルMHC分子を発現でき、そこで、各MHC分子は異なるエピトープを提示する。ターゲット細胞は、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれらより多くのMHC分子を発現することができる。マルチプルMHC分子は、ランダムであることができ、例えば、MHC発現ライブラリーからのマルチプルMHC分子などのようなものであり、またはマルチプルMHC分子は合理的に選ばれることができる。例えば、合理的に選定するMHC分子は、対象またはペイシェントによって発現されることが知られるそれらの対立遺伝子であることができ、およびHLAタイピングを通して決定することができる。対象は、ガンを有することが知られ、または疑われることができ、およびT細胞またはTCRが分離され、または導き出される同じ対象であることもできる。特定の例として、抗原特異的TCR発現性細胞は、ペイシェント内で発現されると識別される一以上のTCRsを発現するように操作することができ、およびターゲット細胞は、ペイシェントに特異的な一以上のMHC対立遺伝子を発現するように操作することができる。ペイシェントから分離される細胞はまた、抗原特異的TCR発現性細胞および/またはターゲット細胞のために操作される細胞の代わりに使用することもできる。
【００９５】
ターゲット細胞は、ターゲット細胞の集団において異なるMHC分子またはMHC分子の組合せを発現する集団のメンバーと共に存在することができる。一例では、哺乳動物は（ヒトを含め）異なるMHC分子に対してヘテロ接合体である。それゆえ、概して、対象から分離される細胞は、それらのMHCレパートリーにおいて生来、多様である。例えば、ヒトは大抵、各々のHLA-A、HLA-B、およびHLA-CについてMHCクラスI重鎖の二つの異なる対立遺伝子をもち、それらの各々は六つの異なるMHCクラスI分子が概して細胞表面上に存在するように本来の状況で細胞において発現する。集団において異なるMHC分子はランダムであることができ、例えば、MHC発現ライブラリーからのマルチプルMHC分子などのようなものである。集団において異なるMHC分子を合理的に選ぶことができる。合理的選定のための基準には、制限されないが、上記で議論したように、対象またはペイシェントにおいて存在することが知られるMHC分子を選ぶことが含まれる。
【００９６】
MHC分子はコンディショナルリガンドにより発現されるMHCクラスI分子であることができる。MHCクラスI分子はペプチド（即ち、抗原ペプチド）の不存在下で不安定であるため、組換えMHCクラスI分子は開裂可能なペプチドにより発現し、それはUV光による照射により複合体から解離し、および崩壊する。しかし、開裂可能なペプチドのUV崩壊が「レスキューペプチド（rescue peptide）」の存在下で実行される場合、レスキューペプチドは、Toebes（トーベス）ら、2006、Nat. Med.（ネイチャー・メディシン）12：246-251およびBakker（ベイカー）ら、PNAS（プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ）、2008、105：3825-3830で、その双方の全体の内容はあらゆる目的のために参照によってここに組み込まれるものにおいて記載されるように、結合性溝（binding groove）においてUV照射ペプチドを難なく置き換えるであろう。この技術を使用すると、いくつかの組み立てられたMHCクラスI分子は、TCRsをスクリーニングするためのMHCクラスI抗原ライブラリを形成するために、候補抗原で、ネオ抗原が含まれるものと共にロードすることができる。
【００９７】
MHC分子は単鎖（single chain）三量体であることができる。単鎖三量体は、米国特許出願公開第2003/0003535号、米国特許出願公開第2009/0117153号、および米国特許出願公開第2008/0219947号においてより一層詳細に記載されており、これらの各々は参照によってあらゆる目的のためにその全体をここに組み込む。簡単に言うと、ここで使用するように、「単鎖三量体」は、抗原ペプチド、β2-ミクログロブリン、およびMHCクラスI重鎖で、α1、α2、およびα3ドメインが含まれるものを含む単一ポリペプチド融合物として発現される組換えMHC分子に言及する。一定の実施形態では、単鎖三量体は、米国特許出願公開第2009/0117153号および米国特許出願公開第2008/0219947号に記載されるように、ジスルフィドトラップを含むことができる。MHCクラスII分子の発現および単一ペプチドとして発現されるエピトープはまた、Ignatowicz（イグナトヴィッチ）らの（J Immunol.（ジャーナル・オブ・イムノロジー）1995 Apr 15；154（8）：3852-62）に記載され、あらゆる目的のために参照することによってその全体をここに組み込む。
【００９８】
使用することができるMHC分子のタイプの追加の説明は、米国特許出願公開第2017/0003288号において見出すことができる。候補抗原ペプチドを発現し、およびロードする組換えMHCクラスII分子は、Novak（ノヴァク）ら、1999、J. Clin Invest.（ザ・ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション）104：R63-R67において記載され、その全体の内容を参照によってここに組み込む。
抗原ペプチド
【００９９】
TCRエピトープの識別に向けられる例では、抗原ペプチド（またエピトープとも称される）は、MHC分子によって提示される能力がある任意のペプチドフラグメントであることができる。抗原ペプチドは、腫瘍関連エピトープ、ネオエピトープ、腫瘍ネオエピトープ、ウイルス（性）エピトープ（viral epitope）、ホスホ（リン酸化とも言う）エピトープ、細菌（性）エピトープ、微生物（性）エピトープ、組織特異的自己エピトープ、および自己エピトープであることができる。
【０１００】
ネオエピトープおよび/またはネオ抗原は、ガンを有することが知られ、または疑われる対象からのものであることができる。ペイシェントの推定ネオエピトープまたはネオ抗原（腫瘍または病原体）の識別について、インシリコ予測アルゴリズム（in silico predictive algorithm）プログラムを利用することができ、それは、推定上で発現したネオ抗原に対応する一以上の変異を識別するために、全ゲノム、全エクソーム、またはトランスクリプトームシーケンスデータを含め、腫瘍、ウイルス、または細菌のシーケンシングデータ（配列決定データ）を分析する。追加的に、ヒト白血球抗原（HLA）タイピングは、ペイシェントの腫瘍または血液サンプルから定めることができ、およびこのHLA情報は、Fritsch（フリッチェ）ら、2014、Cancer Immunol Res.（キャンサー・イムノロジー・リサーチ）、2：522-529によって検証されるように、MHC結合について予測アルゴリズムにおいて識別される推定上のネオ抗原ペプチド配列と一緒に利用することができ、それらの全体の内容を参照によってここに組み込む。ヒト集団において普通に見出されるHLAsはまた、ネオ抗原予測アルゴリズムにも含めることができ、例えば、HLA-A*02、24、01；HLA-B*35、44、51；DRB1*11、13、07が白人において、HLA-A*02、03、30；HLA-B*35、15、44；DRB1*13、11、03がアフリカ系ブラジル人において、およびHLA-A*24、02、26；HLA-B*40、51、52；DRB1*04、15、09がアジア人においてなどのようなものである。HLA対立遺伝子の特定のペアリングもまた使用することができる。ヒト集団において見出される普通の対立遺伝子は、Bardiら（Rev Bras Hematol Hemoter. 2012；34(1)：25-30）においてさらに説明される。
【０１０１】
ネオ抗原を識別する方法のさらなる例には、シーケンシングを質量分析およびMHC提示予測と組み合わせること（例は、米国特許出願公開第2017/0199961号）、およびシーケンシングをMHC結合親和性予測と組み合わせること（例は、発行された米国特許第9,115,402号）が含まれる。さらに、ネオ抗原特異的T細胞がペイシェントサンプルに存在するかどうかを識別するのに有用な方法は、例は、米国特許出願公開第2017/0003288号およびPCT/US17/59598号に記載されるように、ここに記載の方法と組み合わせて使用することができ、ここでそれらの全体を参照によって組み込む。これらの分析は、ペイシェントの候補ネオ抗原ペプチドのランク付けされたリストをもたらし、それは同族の抗原特異的T細胞のスクリーニングのための日常的な方法を使用して容易に合成することができる。
【０１０２】
抗原ペプチドは、概して健康であると考えられるサンプル、または特定の疾患、状態、または表現型を示さないことを特徴とするサンプルから導き出すことができる。健康サンプル由来の抗原ペプチドの使用は、コントロールサンプルから利益を得る方法、例えば、TCRによってバックグラウンドまたはオフターゲット/交差反応性結合を識別することから利益を得る方法などのようなものに役立つことができる。
【０１０３】
抗原ペプチドは、MHCクラスI分子によって提示される能力がある任意のペプチドであることができる。MHCクラスI分子によって提示されるペプチドは、長さが7-15、7-10、8-9、7、11、12、13、14、または15のアミノ酸であることができ、および典型的には8-10のアミノ酸（即ち、8、9、または10）の長さである。抗原ペプチドは、MHCクラスII分子によって提示される能力がある任意のペプチドであることができる。MHCクラスII分子によって提示されるペプチドは、11-30、14-20、15-18、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30のアミノ酸の長さであることができる。MHCクラスII分子によって提示されるペプチドは、長さが10および35の間、10および30の間、10および25の間、または10および20の間のアミノ酸であることができる。
【０１０４】
抗原ペプチドは、外因性抗原ペプチド、即ち、ターゲット細胞に提供される外因性ペプチドであることができる。外因性抗原ペプチドは、上記のUV開裂可能なペプチドシステムを使用して、ターゲット細胞上でMHC分子に提供することができる。外因性抗原ペプチドは、MHC分子に結合した他のペプチドを置換するのに十分な量において提供することができ、またペプチドパルシング（peptide pulsing）とも称される。外因性抗原ペプチドはまた、MHC分子と同じポリペプチドの一部分、例えば、ここで前述した単鎖三量体などのようなものをコードすることもできる。
【０１０５】
ターゲット細胞は、外因性抗原ペプチドを発現するように操作することができる。ターゲット細胞は、内在性抗原ペプチドに加え、またはその代わりに抗原ペプチドを発現することができ、例えば、内因性の自然な抗原ペプチドを発現するターゲット細胞は、抗原ペプチドの変異バージョン（例は、ネオエピトープ）も発現するように操作することができる。外因性抗原ペプチドは、一以上の抗原ポリヌクレオチド配列によってコードすることができ、そこでは一以上の抗原ポリヌクレオチド配列は、プロモーターヌクレオチド配列に作動可能に連結される。抗原ペプチドをコードすることができるポリヌクレオチドには、制限されないが、ウイルスベクター、cDNA、プラスミド、線状二本鎖DNAベクター、線状一本鎖DNAベクター、および線状一本鎖RNAベクターが含まれる。プロモーターヌクレオチド配列の例には、制限されないが、哺乳動物プロモーター、ヒトプロモーター、ウイルス性プロモーター、レトロウイルスまたはレンチウイルスからの長末端反復（LTR）由来のプロモーター、二以上のプロモーターの融合物、プロモーターの二以上の部分の融合物、MMLV LTRプロモーター、HIV LTRプロモーター、MCMV LTRプロモーター、EF1α、MND、CMV、SV40、PGK1、Ubc、ベータ-アクチン、CAG、小分子誘導性プロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター、小分子コンディショナルプロモーター、Cre-LoxPコンディショナルプロモーターシステム、Flp-FRTコンディショナルプロモーターシステム、およびタモキシフェンコンディショナルプロモーターシステムが含まれる。抗原ペプチドをコードすることができるポリヌクレオチドは、抗原ペプチドのPCR媒介増幅について有用なユニバーサルプライマー配列を有することができ、および/またはNGSについて有用なアタッチングシーケンシングアダプター、例は、ユニバーサルプライマー配列は、ポリペプチドをコードする抗原ペプチドに隣接することができる。
【０１０６】
外因性抗原ペプチドは抗原ポリヌクレオチド配列から一時的に発現することができ、そこで、抗原配列は操作される細胞のゲノム中に組み込まれない。抗原ペプチドは操作される細胞のゲノム中に組み込まれる抗原配列から発現することができる。組み込まれる抗原ポリヌクレオチド配列は規定される遺伝子座中に組み込むことができる。規定される遺伝子座中に組み込まれる抗原ポリヌクレオチド配列は、規定される遺伝子座の内因性プロモーターヌクレオチド配列に作動可能に連結され、およびそれから発現されることができ、またはそれは外因性プロモーター、例えば、上記のものなどのようなものに作動可能に連結し、およびそれから発現することができる。
【０１０７】
ターゲット細胞は単一抗原ペプチドを発現することができる。ターゲット細胞は一よりも多くの抗原ペプチドを発現することができ、例えば、ターゲット細胞はマルチプル抗原ペプチドを発現することができ、そこで各抗原ペプチドは異なるMHC分子に結合する。ターゲット細胞は、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれらよりも多くの抗原ペプチドを発現することができる。ターゲット細胞は、10を超える、20を超える、30を超える、40を超える、50を超える、102を超える、103を超える、104を超える、105を超える、106を超える、107を超える、または108を超える抗原ペプチド発現することができる。マルチプル抗原ペプチドはランダムであることができ、例えば、抗原ライブラリーからの複数の抗原ペプチドなどのようなものであるか、またはマルチプル抗原ペプチドは合理的に選ぶことができる。例えば、合理的に選ばれる抗原ペプチドは、対象またはペイシェントによって発現されることが知られ、または対象が有することを知られ、またはそれを疑われる特定の疾患、状態、または表現型に関連することが知られるそれらのエピトープまたは抗原であることができる。例えば、対象はガンを有することを知られ、またはそれを疑われることができる。対象および/またはガン特異的エピトープを予測するための方法は上述される。対象はまた、T細胞、TCR、および/またはMHC分子がそれから分離されるか、または由来する同じ対象であることもできる。特定の例として、抗原特異的TCR発現性細胞は、ペイシェント内で発現すると識別される一以上のTCRsを発現するように操作することができ、およびターゲット細胞は一以上の抗原ペプチド、および潜在的に一以上のMHC対立遺伝子で、ペイシェントに特異的なものを発現するように操作することができる。ペイシェントから分離された細胞は、抗原特異的TCR発現性細胞および/またはターゲット細胞のために操作される細胞の代わりに使用することもできる。
【０１０８】
ターゲット細胞は、ターゲット細胞の集団において、異なる抗原ペプチドまたは抗原ペプチドの組合せを発現する集団のメンバーと共に存在することができる。例えば、ターゲット細胞のライブラリーは、各ターゲット細胞集団が異なる抗原ペプチドを発現するように操作されることができる。集団において異なる抗原ペプチドはランダムであることができ、例えば、抗原発現ライブラリーからのマルチプル抗原ペプチドなどのようなものである。集団において異なる抗原ペプチドを合理的に選ぶことができる。合理的選定のための基準には、制限されないが、上記のように、対象またはペイシェントにおいて存在することが知られる抗原ペプチドを選定することが含まれる。
【０１０９】
抗原ペプチドは、腫瘍抗原、ネオ抗原、腫瘍ネオ抗原、ウイルス（性）抗原、ホスホ（リン酸化とも言う）抗原（phosphoantigen）、細菌（性）抗原、微生物（性）抗原、組織特異的自己抗原、および自己抗原から導き出すことができる。抗原ペプチドが導き出される抗原、即ち、未処理の抗原は、ターゲット細胞に提供され、およびターゲット細胞の内因性プロセシング経路に依存することができる。未処理の抗原を提供するために採用される方法は、標的化される望ましいプロセシング経路および/またはMHC分子に応じて選ぶことができる。例えば、MHCクラスI、MHCクラスII、または交差提示（クロスプレゼンテーション）での提示が望ましいかどうかに応じて、異なる方法を選ぶことができる。未処理の抗原はポリペプチドの形態においてターゲット細胞に提供される（即ち、それにデリバリーされる（送られるとも言う））ことができる。本技術において、未処理の抗原をデリバリーする多種多様な方法、例えば、エレクトロポレーション、細胞透過性ペプチド融合、タンパク質トランスフェクション、ナノ粒子デリバリー、および小胞媒介デリバリーなどのようなものが知られる。MHCクラスII提示経路へのデリバリーによく適した他の方法には、制限されないが、食作用についてAPCsによる未処理抗原の、または未処理抗原を発現する細胞の標的化、例えば、抗体ターゲティングおよび他の形態のオプソニン化などのようなものが含まれる。食作用経路（phagocytic pathway、食細胞経路などとも言う）へのターゲティングはまた、未処理の抗原を交差提示経路に対して標的化するためにも使用することができる。未処理の抗原はまた、未処理の抗原のエンコーディングポリヌクレオチド配列をデリバリーすることによって、ターゲット細胞に提供することもできる。未処理の抗原のエンコーディングポリヌクレオチド配列は、ここで前述した抗原のエンコーディングポリヌクレオチド配列の任意のもののフォーマット（形式とも言う）をとることができる。ポリヌクレオチド配列のデリバリーを通した未処理抗原のデリバリーは、未処理抗原が細胞内で発現されるため、未処理抗原をMHCクラスI提示経路に対して標的化するのに特に有用性をもつことができる。
【０１１０】
未処理抗原はまた、プロテアソーム経路、特にいくらかの場合においては免疫プロテアソーム、例えば、未処理抗原のユビキチン化を通してなどのようなものに対するターゲティングのために修飾することもできる。ターゲット細胞はまた、プロテアソーム活性を増加させるため、特にいくらかの場合において免疫プロテアソーム活性を増加させるため、例えば、インターフェロン-ガンマ（IFNγ）刺激を通してなどのようなもので刺激することもできる。
接触
【０１１１】
ここで使用するように「接触させること」は、抗原特異的TCR発現性細胞または結合性分子発現性細胞をターゲット細胞との相互作用のために近接させ、および十分な条件下にもっていく任意の方法に言及する。概して、接触させることには、トロゴサイトーシスが起こるのに十分な条件下、例えば、細胞培養環境などのようなものにおいて（例は、インキュベーターにおいて）、細胞を一緒にインキュベーションすることが含まれる。接触させることには、容器、例えば、マルチウェルプレートでのウェル、組織培養処理（tissue culture treated）プレート、組織培養処理マルチウェルプレート、フラスコ、組織培養処理フラスコ、微小遠心管（microcentrifuge tube、微量遠心管）、培養管、試験管、丸底管、または円錐管などのようなものにおいて細胞と一緒にインキュベーションすることが含まれる。接触させることには、細胞を一緒に混合すること、例えば、細胞を機械的に妨害することを通してなどのようなもので、それによりそれらが一緒に相互作用することを可能にされるようになり、例えば、回転、ピペッティング、反転、ボルテックス、または振とうを通してなどのようなものによるものを含むことができる。細胞は連続的に混合することができ、または一定期間混合してから、さらに処理されるまで邪魔されないようにすることもできる。
膜成分
【０１１２】
ここで用いるように、「膜成分」は細胞膜に関連する任意の分子に言及する。概して、膜成分はまた、細胞間の区別を許す任意の分子、例えば、大抵は抗原特異的TCR発現性細胞または結合性分子発現性細胞でターゲット細胞ではなく、または逆もまた同じであるものに関連する膜成分などのようなものにも言及する。
【０１１３】
膜成分は抗原特異的TCR発現性細胞または結合性分子発現性細胞に関連する膜成分、即ち、抗原特異的TCR発現性細胞または結合性分子発現性細胞からトロゴサイトーシス中にターゲット細胞に移される膜成分であることができる。抗原特異的TCR発現性細胞膜成分は、大抵、T細胞、例えば、TCR；TCR共受容体、CD3 TCR共受容体、CD4 TCR共受容体、CD8 TCR共受容体、またはT細胞上に概して見出される任意の他の成分などのようなものに関連する膜成分であることができる。
【０１１４】
膜成分はターゲット細胞に関連する膜成分、即ち、ターゲット細胞から抗原特異的TCR発現性細胞に移される膜成分またはトロゴサイトーシス中に発現する結合性分子であることができる。TCRエピトープの識別に向けられる例では、ターゲット細胞に関連する膜成分はMHC分子であることができる。
【０１１５】
細胞は、外因性膜成分、例えば、膜貫通タンパク質、膜関連タンパク質（membrane associated protein、膜結合タンパク質などとも言う）、表面受容体、蛍光分子、細胞表面タンパク質、糖、または脂質などのようなものを保有するように操作することができる。例えば、細胞は、細胞外ドメイン、例えば、形質導入またはトランスフェクションマーカーとして普通に使用されるタンパク質などのようなもの（例は、LNGFRΔ）を含むポリペプチドを発現するように操作することができる。細胞を操作するために使用する方法は、ここであらかじめ記載した任意のもの、例えば、ここであらかじめ記載したポリペプチドをコードするポリヌクレオチドシステムの任意のものを使用することなどであることができる。外因性膜成分は検出可能なマーカー、例えば、フルオロフォアなどのようなものを含むことができる（例は、GFPタグ付き膜成分）。外因性膜成分は、細胞内酵素を含むことができ（例は、ベータ-ラクタマーゼ）、およびシステムにおいて採用することができ、そこで膜成分を受ける細胞にはまた、トロゴサイトーシス後、移される細胞内酵素は基質を検出可能な分子に変換することができるように、酵素基質が含まれるであろう。外因性膜成分は転写因子を含むことができ、およびシステムにおいて採用されることができ、そこで膜成分を受ける細胞はまた、トロゴサイトーシス後、移される転写因子は放出され、および検出可能な分子の発現を促進する（即ち、レポーター遺伝子が活性化される）であろうように、転写因子を放出するための手段（例は、TEVプロテアーゼシステム）が含まれるであろう。外因性膜成分は細胞膜との相互作用を通して、即ち、膜貫通モチーフをもつことなしに関連することができる。
【０１１６】
膜成分もまた標識することができる。例えば、膜成分は検出可能な分子または反応性基によるトロゴサイトーシス反応においてインキュベーションに先立って標識することができる。反応性基によるラベリングは膜成分がトロゴサイトーシス後の検出可能なマーカー（例は、フルオロフォア）によってさらに標識化することができるように実行することができる。反応性基のペアには、制限されないが、ストレプトアビジン/ビオチンシステム、チオール基（例は、システイン）とマレイミド、アダマンタンとシクロデキストリン、アミノ基とカルボキシ基、およびアジド基とアルキニル基が含まれる。ラベリングは、特異的、例えば、反応性基またはフルオロフォア（蛍光色素分子、蛍光団などとも言う）コンジュゲート抗体により染色することなどであることができる。抗体は、本技術において熟練する者に知られる抗体フラグメントまたは抗体フォーマットを含むことができる。ラベリングは、非特異的または半特異的、例えば、反応性基またはフルオロフォアにコンジュゲートされるタンパク質反応性分子によるラベリングなどのようなものであることができる。ラベリングには、細胞膜を直接にラベリングすること、例えば、脂質反応性色素（例は、DiOC18(3)[ThermoFisher（サーモフィッシャー）]）によるラベリングなどのようなものを含むことができる。
【０１１７】
膜成分は、膜成分が概して関連する別の細胞からトロゴサイトーシスの間に興味ある細胞に移されることができ、その間に膜成分はその膜成分が概して関連する他の細胞から必然的に失われる。一よりも多くの膜成分は興味ある細胞に移されることができる。2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40よりも多く、または50よりも多くの膜成分を興味ある細胞に移すことができる。
分離
【０１１８】
ここで用いるように、「分離すること」は、細胞、細胞タイプ、または興味ある細胞の集団を細胞の他の集団から分けることに言及し、および大抵は他の細胞に対する興味ある細胞の豊富化を含む。ここに記載の任意の細胞、例えば、ターゲット細胞またはTCR発現性細胞などのようなもののいずれかを分離することができる。分離は、興味ある細胞の特性、例えば、別の細胞から移された（即ち、受け取った）膜成分を有するなどのようなものに基づいて、興味ある細胞を他の細胞から分けることに関与することができる。例えば、分離は、移された膜成分の識別（即ち、検出）に関与することができ、および移された膜成分の獲得または移された膜成分の損失のいずれかであることができる。移された膜成分、例えば、抗体、反応性基を含むマーカー、および脂質反応性マーカーなどのようなものを識別するために、様々なラベリング試薬を使用することができる。例えば、移された膜成分、検出可能なマーカー（例は、フルオロフォア）に直接コンジュゲートされる抗体、または別のラベリング試薬によって認識可能なもの（例は、フルオロフォアにコンジュゲートする二次抗体）を識別するために、膜成分について特異的な抗体を使用することができる。別の例では、移された膜成分を識別するために、機能性膜（functionalized membrane）成分について特異的な反応性基を含むマーカーを使用することでき、例えば、ビオチン化膜成分を識別するために蛍光ストレプトアビジンを使用することなどのようなものである。分離にはまた、興味ある細胞の他の特性の識別、例えば、細胞タイプ（例は、T細胞の識別）または活性化/シグナル伝達状態（例は、PD-1、CD39、CD137、またはサイトカイン産生の識別）などのようなものと並行して、移された膜成分を識別することが含まれる。
【０１１９】
興味ある細胞は、分離された細胞の集団が興味ある細胞だけを含み、または実質含むように分離することができる。興味ある細胞は、少なくとも1％、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、または少なくとも90％の分離された細胞の集団が興味ある細胞であるように分離することができる。興味ある細胞は、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、または少なくとも99.5％の分離された細胞の集団が興味ある細胞であるように分離することができる。興味のある細胞は約100％の分離された細胞の集団が興味ある細胞であるように分離することができる。興味ある細胞は約25％、約37％、約86％、または約95％の分離された細胞の集団が興味ある細胞であるように分離することができる。
【０１２０】
分離はマイクロ流体デバイスの使用に関係することができる。例えば、分離には、蛍光活性化細胞選別（FACS）が含まれ、そこでは、細胞は、興味ある細胞に関連する蛍光に基づいて分離、または「選別」される。細胞は、蛍光分子にコンジュゲートする抗体を用いて染色（即ち、接触または混合）することができる。細胞はまた、異なる蛍光分子にコンジュゲートする抗体のパネルを用いて染色することもできる。分離について有用な抗体は、興味ある細胞を他の細胞から区別する能力、例えば、あらかじめ膜成分を認識する抗体または特定の細胞タイプを認識する抗体などのようなものに基づいて選ぶことができる。細胞はまた、蛍光分子を発現するか、または発現するように操作することができる。細胞は、FACSによってバルク収集容器中に分けることができる（例は、興味あるあらゆる分離された細胞は同じ容器において収集される）。細胞はまた、FACSによって、個々の収集容器、例えば、マルチウェルプレートなどのようなものの中に分けることもできる。個々の収集容器は、シングルセル反応容器、例えば、シングルセルDropSeqアプリケーションにおいて形成されるものなどのようなものであることができる。
【０１２１】
分離は磁石の使用に関係することができる（即ち、磁気分離ステップ）。例えば、磁気ビーズまたはナノ粒子は、興味ある細胞を捕捉し、例えば、抗体をビーズまたはナノ粒子にコンジュゲートさせることなどのようなもののために、機能化することができる。いくらかの実施態様では、磁気ナノ粒子には、酸化鉄磁性体（磁性酸化鉄とも言う）が含まれる。磁気粒子の例には、制限されないが、DynabeadsTM（トレードマーク）（ダイナビーズ）（Thermo Fisher（サーモ・フィッシャー））が含まれる。磁気分離は、興味ある細胞を磁石により壁に対して捕捉すること、および壁に対して捕捉されない他の細胞または他の要素を除去することのステップを含むことができる。磁気分離には、カラムの使用、例えば、磁気活性化細胞選別（MACS）方法などのようなものが関与することができ、それは磁気特性に基づいて細胞を分けることができる。磁気分離には、磁気特性に基づいて細胞を分けることができるマイクロ流体デバイスの使用が関係することができる。磁気ナノ粒子は蛍光性であるか、またはフルオロフォアに直接または間接的に付着することができ、および磁気分離法はFACSと組み合わせて使用することができる（例は、FACSの前、後、または前および後）。
【０１２２】
分離はビーズ捕捉の使用に関係することができる。例えば、ビーズまたはナノ粒子は、興味ある細胞を捕捉する、例えば、抗体をビーズまたはナノ粒子にコンジュゲートさせることなどのようなもののために機能化することができる。ナノ粒子は、ポリスチレン粒子、表面、ビーズ、またはポリマーであることができる。ビーズの例には、制限されないが、アガロースビーズおよびセファロースビーズが含まれる。ビーズの捕捉には、細胞を分離するために、力、例えば、遠心分離または重力などのようなものを加えることができる。特定の実施形態では、粒子またはナノ粒子は蛍光性であるか、またはフルオロフォアに直接または間接的に付着することができ、および重力分離（gravity isolation）法はFACSと組み合わせて使用することができる（例は、FACSの前、後、または前および後）。磁性体の場合、ナノ粒子はFACSと組み合わせて磁気法を使用して分けた（例は、FACSの前、後、または前および後）。
シーケンシング
【０１２３】
ここに記載の興味あるポリペプチド配列のいずれか（例は、抗原ペプチドまたはTCRペプチド）を決定すること、例えば、興味あるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのシーケンシングなどのようなもののために、様々な配列決定方法を用いることができる。ポリヌクレオチドシーケンシング法には、制限されないが、Sanger（サンガー）シーケンシングおよび次世代シーケンシング（NGS）が含まれる。NGS法には、制限されないが、シーケンシング-バイ-シンセシス（sequencing-by-synthesis）プラットフォーム、Illumina/Solexa（イルミナ/ソレクサ）プラットフォーム（例は、HiSeqおよびMiSeq）、454パイロシーケンシングプラットフォーム（Roche（ロシュ））、およびSOLiDプラットフォーム（Applied BioSystems（アプライド・バイオシステムズ））が含まれる。
【０１２４】
配列の部分もまた決定することができ、例えば、TCRの一以上の可変ドメインまたは相補的決定領域を決定することなどのようなものである。
【０１２５】
ポリヌクレオチドシーケンシングに先立って、ここに記載の任意の興味あるポリヌクレオチド配列を精製すること、例は、興味ある細胞から抽出することができる。興味ある特定のポリヌクレオチド配列は、ゲノムDNA、ベクターDNA、プラスミドDNA、mRNA、PCRによって増幅されたDNA、および逆転写により生成されたcDNAであることができる。ポリヌクレオチドは、本分野においてよく知られる技術、例えば、フェノール-クロロホルム抽出、アガロースゲル分離、シリカカラムベースの精製、塩化セシウム、同様の精製方法、またはそれらの組合せなどのようなものを使用して精製することができる。特定の精製方法は、精製される特定の興味あるポリヌクレオチドに基づいて選ぶことができる。興味あるポリヌクレオチド配列はまた、シーケンシングに先立って精製およびさらに処理すること、例えば、PCR法による増幅化、バーコード化（barcoded）、シーケンシングアダプター（sequencing adaptors）による修飾化、逆転写化、またはシーケンシングのための調製において任意の他のプロセスなどのようなものもできる。さらに処理されたポリヌクレオチド配列もまた、追加ラウンドの精製を受けることもできる。
【０１２６】
シーケンシングに続いて、興味ある特定のポリヌクレオチド配列を識別するために、シーケンシング結果を分析することができる。
【０１２７】
興味あるポリペプチド配列を決定するのに有用な他の方法には、制限されないが、ペプチドシーケンシングおよび質量分析が含まれる。例えば、抗原ペプチドは、分離されたターゲット細胞上でMHC分子から溶出し、およびペプチド配列は質量分析によって決定することができる。
バーコーディング
【０１２８】
DNAバーコードは膜成分に直接または間接的にコンジュゲートすることができる。例えば、バーコードは膜成分に特異的な抗体にコンジュゲートすることができる。DNAオリゴを抗体にコンジュゲートさせるための方法および試薬は、そのような商業上のキット（例は、Solulink All-in-One Antibody-Oligonucleotide Conjugation Kit（ソルリンク・オール-イン-ワン抗体-オリゴヌクレオチド・コンジュゲーション・キット））が本技術において熟練する者に知られる。バーコードは、特定の細胞集団、例えば、特定のTCRを発現する細胞などのようなものに特異的であることができ、またはバーコードは、特定の細胞の混合物、例えば、特定の抗原ペプチドを発現する別の細胞と混合される特定のTCRを発現する細胞などのようなものに特異的であることができる。
【０１２９】
バーコードには概して、ランダムヌクレオチド配列が含まれる。ランダムヌクレオチド配列は、長さで6-20間、6-15間、6-12間、6-10間、または6-8間のヌクレオチドであることができる。ランダムヌクレオチド配列は、ユニバーサル配列、例えば、バーコードのPCR媒介増幅について有用なユニバーサルプライマー配列などのようなものの間に配置することができ、および/またはNGSについて有用なアタッチングシーケンシングアダプター、例は、ユニバーサルプライマー配列はDNAバーコードに隣接することができる。オリゴ（即ち、バーコード）は、形式：UPS1-NAANGGNAANGGNAAN-UPS2を取ることができ、そこでNはランダムなヌクレオチドを表す。ユニバーサルプライマー配列UPS1およびUPS2は近接するAAまたはGGジヌクレオチドを含むことはできない。
【０１３０】
抗体は、細胞表面上でタンパク質（例は、外因性タンパク質、例えば、CD8a、CD3e、TCR-ベータ、CD2などのようなもの、または内因性タンパク質、例えば、LNGFR、表面発現エピトープタグなどのようなもの）に対して向けられる商業上の抗体であることができる。
【０１３１】
バーコード化細胞（Barcoded cells）、例は、バーコード化抗体により標識された細胞は、プールすることができる。例えば、特定のTCRをそれぞれ発現する複数の細胞は、各特定のTCRに特有のDNAオリゴによりバーコード化し、および次いで抗原特異的TCR発現性細胞集団のライブラリーを形成するためにプールすることができる。抗原ペプチド発現性細胞（例は、ターゲット細胞）のライブラリーは、生じさせることができ、例えば、ユニーク抗原ペプチド（例は、抗原ペプチドライブラリーについて）、ユニークMHC対立遺伝子（例は、MHC対立遺伝子ライブラリーについて）、またはユニーク抗原ペプチドとMHC対立遺伝子対（MHC対立遺伝子ペアとも言う）（例は、MHC：エピトープペアライブラリーについて）に特有のDNAオリゴによりバーコード化される細胞などのようなものである。バーコード化細胞は、プールされたバーコード化細胞を含めて、他の細胞と混合し、およびトロゴサイトーシス反応において一緒にインキュベーションすることができる。例えば、バーコード化TCR発現性細胞のライブラリーは、抗原ペプチド発現性細胞のライブラリーと混合する（即ち、接触させる）ことができる。
【０１３２】
トロゴサイトーシス後、バーコード化膜タンパク質が含まれる興味ある細胞は、分離することができる。ここに記載の任意の分離方法を使用することができる。分離されるバーコード化細胞は、シーケンシングして、移された膜成分が由来する細胞（例は、特定のTCR発現性細胞）のアイデンティティ（同一性とも言う）、およびその後移された膜成分が由来する細胞によって発現されることが知られる任意のタンパク質または興味あるポリヌクレオチド（例は、TCRライブラリーから発現される特定のTCR）の同一性を決定するためにバーコード配列および使用される情報を決定することができる。ここに記載の任意のシーケンシング方法を使用することができる。さらに、バーコード配列を決定するために、興味ある他の配列、例えば、抗原ペプチド配列などのようなものを決定することができる。一例において、すべての特有のバーコードを分析して、母集団において存在するすべての特有のバーコードを決定する。TCRエピトープの識別に関する例では、分析は、集団内でのTCRsおよび/または抗原ペプチドの全体的な頻度を決定するために使用することができる。別の例では、特有のバーコードは、単一細胞に特有のすべてのユニークバーコードを決定するために、単一細胞のフォーマットにおいて分析され（例は、Drop-Seq（ドロップ-シーケンス）によって）、および一つのユニークバーコードまたは複数のユニークバーコードが含まれ得る（例は、一よりも多くの細胞が分離される細胞と相互作用した可能性がある）。TCRエピトープの識別に関する例では、分析を使用して、特定の抗原ペプチドとのTCR(s)の特定のペアリングを決定することができる。
リガンド識別の方法
【０１３３】
トロゴサイトーシス法は、TCRエピトープ識別を超えた様々な細胞ベースの結合相互作用に適用することができる。したがって、ここではまた、リガンド識別の方法も提供し、それには、以下のステップ：a）一以上のリガンド特異的結合性分子発現性細胞集団（one or more ligand-specific binding molecule expressing cell populations）を提供すること；b）一以上のターゲット細胞集団を提供することであり、そこでターゲット細胞集団は一以上のリガンド特異的結合性分子によって結合される能力がある一以上のリガンドを提示すること；c）一以上のリガンド特異的結合性分子発現性細胞集団を一以上のターゲット細胞集団と接触させることであり、そこで接触させることには、少なくとも一のリガンド特異的結合性分子発現性細胞について少なくとも一のターゲット細胞に特異的に結合するのに十分な条件を提供することが含まれ、およびそこで一以上の膜成分はリガンド特異的結合性分子発現性細胞およびターゲット細胞の間で結合の後に移ること；およびd）次のi）興味あるターゲット細胞であり、そこで興味あるターゲット細胞には、接触させるステップ（c）の後にリガンド特異的結合性分子発現性細胞から移される一以上の膜成分が含まれるもの；および随意にii）興味あるリガンド特異的結合性分子発現性細胞であり、そこで興味あるリガンド特異的結合性分子発現性細胞には、接触させるステップ（c）の後にターゲット細胞から移される一以上の膜成分が含まれるものを分離すること、または分離したこと、e）次のi）興味あるターゲット細胞に関連する一以上のリガンドをコードする配列の少なくとも一部分、またはii）結合性分子リガンド特異的発現性細胞に関連する結合性分子ペプチドをコードする結合性分子配列の少なくとも一部分を決定すること、または決定したことが含まれる。
【０１３４】
例えば、他の結合性相互作用には、制限されないが、結合性分子、例えば、免疫受容体、免疫グロブリン、抗体またはそのフラグメント、受容体、キメラ受容体、キメラ抗原受容体（CAR）、シグナル伝達受容体（signaling receptor）、細胞表面受容体、膜貫通受容体、またはアプタマーなどのようなものとのリガンド特異的相互作用が含まれる。抗体フラグメントまたは抗体フォーマットには、制限されないが、FabフラグメントおよびFab融合フォーマット、FvフラグメントおよびFv融合フォーマット、単鎖抗体フォーマット、scFvs、タンデムscFvs、単一可変ドメインフォーマット（例は、ラクダ科動物（camelid）VHH）、および本技術において熟練する者に既知の他の抗体フラグメントまたはフォーマットが含まれる。模範的な抗体および抗体フラグメントのフォーマットは、Brinkmann（ブリンクマン）らにおいて詳細に記載され（MABS（MAbs）, 2017, Vol. 9, No. 2, 182-212）、それが教示するすべてについて参照によりここに組み込む。したがって、結合性分子のリガンドの同一性、例えば、抗原、表面抗原、エピトープ、非古典的MHC提示抗原、および受容体リガンドの同一性などのようなものを決定することができる。興味ある結合性分子を発現する任意の細胞、例えば、膜結合抗体を発現するB細胞などのようなものを用いることができる。興味あるリガンド、例えば、抗体によって認識される抗原などのようなものを発現する任意の細胞を使用することができる。
【０１３５】
ここで前述した任意の様々な方法、技術、および態様は、リガンドおよび結合性分子の識別、例えば、細胞の操作、興味ある細胞の分離、ポリヌクレオチドの精製、ポリヌクレオチドのシーケンシング、およびペプチド配列の決定に有用なシステムおよび成分を説明するものなどのようなものに適用することができる。
本発明の組成物
【０１３６】
また、ここに提供するのは、興味ある分離されたターゲット細胞であり、そこでターゲット細胞には、i）一以上のT細胞膜関連成分であり、そこでターゲット細胞には、一以上のT細胞膜成分をコードする内因性ポリヌクレオチド配列が含まれないもの；およびii）一以上の主要組織適合性（遺伝子）複合体（MHC）対立遺伝子であり、そこで一以上の抗原ペプチドは一以上の主要組織適合性複合体（MHC）対立遺伝子上で提示されるものが含まれる。一以上の抗原ペプチドは、一以上の抗原ポリヌクレオチド配列によってコードされることができる。抗原ペプチドは、ここにあらかじめ記載した任意の抗原ペプチドであることができる。ターゲット細胞は、ここで前述した任意の細胞、例えば、前述した任意の操作した細胞などのようなものであることができる。T細胞膜関連成分は、ここで前述した任意の膜成分、例えば、T細胞に大抵関連する任意の膜成分またはここで前述した任意の外因性膜成分などのようなものであることができる。MHC対立遺伝子はここで前述した任意のMHC分子であることができる。
【０１３７】
ここで前述した任意の様々な方法、技術、および態様を応用することができ、例えば、細胞の操作および興味ある細胞の分離に有用なシステムおよび構成要素を説明するものなどのようなものである。
【０１３８】
ここではまた、分離した任意の興味あるターゲット細胞から精製したポリヌクレオチド配列も提供される。
【実施例】
【０１３９】
例1：方法
細胞系およびプライマリー細胞（初代細胞とも言う）
HEK-293T、Jurkat（ジャーカット）E6-1、およびK562細胞は、the American Type Culture Collection（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション）（Manassas（マナサス）、VA（米国バージニア州））から入手した。プライマリーヒトPBMCsは、UCLA AIDS Institute（UCLA AIDSインスティチュート、UCLAエイズ研究所）でのCFAR Virology Core Lab（CFARバイロロジー・コア・ラボ）から購入した。HEK-293T細胞は、10％（v/v）ウシ胎仔血清（FBS；Coming（コーニング）、NY（米国ニューヨーク州））および100U/mlペニシリン/ストレプトマイシン（Mediatech Inc.（メディアテック社）、Manassas、VA）により補充されたDulbecco's Modified Eagle Medium（ダルベッコ変法イーグル培地）（DMEM；Mediatech Inc.、Manassas、VA）において培養した。JurkatおよびK562細胞は、10％（v/v）FBS、10mM HEPES（Thermo Fisher、Waltham（ウォルサム）、MA（米国マサチューセッツ州））、50μMβ-メルカプトエタノール（Sigma-Aldrich（シグマ-アルドリッチ、St. Louis（セントルイス）、MO（米国ミズーリ州））、1×MEM NEAA（Thermo Fisher、Waltham、MA）、および1mMピルビン酸ナトリウム（Mediatech Inc.、Manassas、VA）により補充されたRPMI 1640培地（Mediatech Inc.、Manassas、VA）において培養した。すべての細胞は5％大気CO2により37℃にて培養した。
【０１４０】
転移性黒色腫を有するペイシェントは、HLA-A*02：01陽性であり、適切なベースライン生検ならびにオントリートメント生検（on-treatment biopsy）を有し、およびペンブロリズマブのフェーズ1試験に参加している間に客観的な腫瘍反応を示すことによって目下の分析のために選定した。ペイシェント＃1および＃2は、3週間毎に10mg/kgの単剤ペンブロリズマブを静脈内に受けた（10Q3W）。腫瘍の反応は12週目から評価し、最初の反応の4週間後に確認し、およびその後12週ごとに画像化した。反応は、Response Evaluation Criteria in Solid Tumors（固形腫瘍の応答評価基準）（RECIST）およびimmune-related response criteria（免疫関連応答基準）（irRC）の双方によって特徴付けた。腫瘍生検および末梢血細胞の収集と分析は、UCLA IRBs 11-001918および11-003066によって承認された。分析したペイシェントからの腫瘍生検は、ベースラインおよび治療の際に得られ、および一つのアリコートをすぐにホルマリンにおいて固定し、次いで病理学的分析のためにパラフィン包埋によって続け、第二のアリコートを遺伝子分析のために液体窒素において即時浸漬によってスナップ凍結し（snap frozen）、および第三のアリコートを滅菌条件下で刻んで新しくし、次いで液体窒素において凍結保存（cryopreservation、低温保存などとも言う）する前に単細胞懸濁物（s.c.s）を創り出すためにDNAse/コラゲナーゼの消化によって続けた。末梢血単核細胞（PBMCs）は、Ficoll-Paque（フィコール-パケ）密度勾配遠心分離によって新鮮な全血から調製し、および凍結保存した。腫瘍浸潤性リンパ球（TILs）は、抗CD3抗体（OKT3、50ng/mL、48時間暴露）およびIL-2（300IU/mL）を用いて凍結保存したs.c.sから拡大し（expanded from）、および2-4週間後に5×106細胞/mLにて再凍結保存した。TILsを解凍し、および使用の朝に45分間DNAseにより処理し、およびCD4（BV510、BioLegend（バイオレジェンド）、San Diego（サンディエゴ）、CA（米国カリフォルニア州））およびCD8+（BV605、BioLegend、San Diego、CA）に対する抗体により染色した。CD4およびCD8+単一陽性細胞の生きた（7AAD陰性）集団はFACS Cell Sorter（セル・ソーター）（BD Biosciences（バイオサイエンシーズ）、San Jose（サンホゼ）、CA）を使用して選別（ソート、ソーティングなどとも言う）した。
DNAコンストラクト（DNA構築物とも言う）
【０１４１】
MSGVベースのレトロウイルスベクター（TERTをコードするMSCVベクターはEugene Barsov lab（ユージーン・バーソフ・ラボ）からの親切な贈り物であり、TCR遺伝子クローニングを促進するために修飾された制限配列を有する）は、F5TCR、1G4TCR、またはヒトもしくはネズミTCR定常領域のいずれかを担うネオTCR遺伝子をコードし、フォーマットLNGFRΔ-P2A-TCRα-F2A-TCRβを有した。LNGFRΔは、切断された細胞内ドメインを有する低親和性神経成長因子受容体を含む形質導入マーカーであり、および表面染色によって検出可能である。MSGV-レトロウイルスベクターもまたCD8形質導入について使用した。レンチウイルスベクター（修飾pHAGE6バックボーンは、Richard Mulligan lab（リチャード・マリガン・ラボ）からの親切な贈り物であり、SCTおよびMHC遺伝子クローニングを促進するために修飾された制限配列を有する）は、ZsGreen/eGFPおよび抗原ペプチド（NY-ESO-1、SLLMWITQV、MART1、ELAGIGILTV、USP7mut、YLTHRVDVI）、β2-ミクログロブリン、および柔軟なGSリンカーを介したHLA-A2ドメインで構成されるペプチド-MHC単鎖三量体（SCT）をコードし、記載32のようにジスルフィドトラップ修飾により調製した。pHAGE6レンチウイルスベクターはまた、非SCTフォーマットにおいてHLA-A2遺伝子を形質導入するために、例は、A2-K562細胞について使用された。E2-Crimson（E2-クリムゾン）はレンチウイルスベクター中にサブクローニングした。CD3δ、CD3ε、CD3γ、およびCD3ζをコードするCD3融合遺伝子は、E2-Crimsonを共発現するレンチウイルスベクター中にサブクローニングした。
細胞系コンストラクション
【０１４２】
F5 TCR、1G4 TCR、ネオTCR、またはCD8をコードするレトロウイルスは、TransIT-293（Mirus Bio（ミルス・バイオ）、Madison（マディソン）WI（ウィスコンシン州））を製造元のプロトコルに従って使用したレトロウイルスベースのプラスミドおよびそれらのパッケージングベクター（pRD114およびpHIT60）の一過性トランスフェクションによってHEK-293T細胞において産生した。E2-Crimson、SCT、HLA-A2、またはCD3/E2-Crimsonをコードするレンチウイルスは、レンチウイルスベースのベクターおよびそれらのパッケージングベクター（psPAX2およびpMD2.G）の一過性トランスフェクションによってHEK-293T細胞において産生した。トランスフェクションの48時間後、ウイルスを収集し、0.45μmシリンジフィルターを通してろ過し、および感染のために使用した。JurkatまたはK562細胞に、2,500rpmおよび30℃で90分間、10μg/mLポリブレンを補充したウイルス上清をスピン感染させた。感染後3日目に、TCRhigh、TCRhigh E2-Crimson+、TCRhighCD8high、A2higheGFPhigh、またはA2highZsgreenhighK562（CD3-またはCD3+）またはJurkat細胞をフローサイトメトリーによってソートして指し示されるように派生細胞系を確立した。SCT-K562ライブラリー細胞については、eGFP+K562細胞をソートした。
T細胞活性化および形質導入
【０１４３】
T細胞を前述32のように刺激、形質導入、および培養した。初代ヒトT細胞を形質導入するために、T細胞培地（5％（v/v）ヒトAB血清および抗生物質（pen/strep）を補充したAIM-V培地）において1μg/mLの可溶性の抗CD28（クローンCD28.2、eBioscience（イーバイオサイエンス）、San Diego、CA）および300U/mL IL-2（Fisher Scientific（フィッシャー・サイエンティフィック）、Tustin（タスティン）、CA）の存在下で、1μg/mLの抗CD3（クローンOKT3、eBioscience、San Diego、CA）によりコーティングした24ウェルプレートにおいてPBMCs（2×106細胞/mL）を活性化した。活性化の48時間後、細胞は10μg/mLポリブレンにより補充したウイルス上清を用いて2,500rpmおよび30℃にて90分間スピン感染させた。スピン感染後、レトロウイルス上清を300U/mL IL-2および1μg/mL抗CD28を含む新鮮なT細胞培地により置き換えた。形質導入した初代T細胞を48時間培養し、および次いで細胞傷害性（細胞毒性とも言う）アッセイのために使用した。
表面ビオチンラベリング
【０１４４】
F5-Jurkat細胞を、新たに調製したビオチン溶液（滅菌PBS中1mg/mL、Thermo/Pierce EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin（サーモ/ピアスEZ-リンク・サルフォ-NHS-LC-ビオチン）100mg[21335]または8×1mgのNo-Weight（ノー-ウエイト）[21327]フォーマット）において1mL当たり1000万個の細胞にて再懸濁し、および室温で10分間インキュベーションした。細胞を1当量のFBSによりクエンチし、および4℃で10分間インキュベーションし、次いでFBSを補充した10mLのRPMI 1640培地により3回洗浄した。次いで、標識した細胞をコインキュベーション（co-incubation、同時インキュベーション、共インキュベーションなどとも言う）実験について使用した。
A2-K562細胞のペプチドローディング
【０１４５】
凍結乾燥ペプチド（Thermo Fisher、Waltham、MA）をDMSOにおいて10mMに再構成し、および次いで水において2mMのワーキングストックにさらに希釈した。ペプチドの5倍連続希釈は、80nMに達するまで50μMのスターティング溶液（195μL無血清培地（SFM）において5μLの2mMワーキングストック）を使用して実行した。ターゲットA2-K562細胞（50K合計、0.5×106細胞/mL）を、96ウェルUボトムプレートにおいて5×連続ペプチド希釈の25μLによりパルスし、および37℃にて2時間インキュベーションした。インキュベーション後、培地100μLを各ウェルに加え、および次いで1500rpmにて5分間遠心分離した。細胞ペレットを200μLの培地により一回洗浄し、および次いでコインキュベーション実験のために100μLの培地において再懸濁した。
コインキュベーションアッセイおよび細胞染色/ソーティング
【０１４６】
F5-Jurkat、1G4-Jurkat、MART1-K562、およびNYESO-K562を使用する実験のために、96ウェルU-ボトムプレートにおいて5：1のJurkat対K562の比率にてコインキュベーションをセットアップし（ウェルあたり300K細胞）、および37℃にて45分間コインキュベーションした。SCT-Jurkat細胞およびTCR-K562細胞に関係するコインキュベーション実験についての比率は、図面のテキストおよび説明において指し示す。次いで、コインキュベーションを1500rpmにて5分間遠心分離し、および培地を減圧によって吸引した。細胞ペレットを2mM EDTAを含む冷PBS溶液により再懸濁し、次いで遠心分離した。細胞を異なる抗体により4℃にて20分間染色し、二回洗浄し、および次いでMACSQuant Analyzer（MACSクアント・アナライザー）10（Miltenyi Biotec（ミルテニー・バイオテク）、Bergisch Gladbach（ベルギッシュ・グラッドバッハ）、Germany（ドイツ国））を使用してフローサイトメトリーによって分析した。表面マーカーの発現を検出するために以下の抗体：抗CD3-PE（クローンUHCT1）、抗CD8-BV510（クローンHIT8a）、抗TCRαβ-PacificBlue（パシフィックブルー）（クローンIP26）、抗TCRαβ-PE/Cy7（クローンIP26）、抗LNGFR-PE（クローンME20.4）、抗LNGFR-APC（クローンME20.4）、抗HLA-A2-PacificBlue（クローンBB7.2）、抗HLA-A2-BV510（クローンBB7.2）、および抗muTCRαβ-PE/Cy7（クローンH57-597）（すべてはBiolegend、San Diego、CAから）を使用した。
A2制限SCTおよびネオ抗原SCTライブラリーを用いるコインキュベーション実験
【０１４７】
F5-Jurkatまたは1G4-Jurkat細胞（E2-Crimson+）のA2-制限SCTライブラリー細胞（eGFP+）とのコインキュベーションについては、480万個のF5-Jurkatまたは1G4-Jurkat細胞は、A2-制限SCTライブラリーを発現する240万個のK562細胞と37℃にて45分間コインキュベーションした。前述のように細胞を染色し、およびTCRhigh染色にてゲーティング（ゲート制御とも言う）したFACSによって、トロゴサイトーシス+ターゲットK562細胞をソートした（K562-SCT細胞もまたeGFP+上でゲーティングし、およびJurkat-TCRはE2-Crimson+上でゲーティングした）。A2-制限ネオ抗原SCTライブラリーのコインキュベーションでは、200万のドナー細胞を100万のアクセプター細胞により37℃で45分間コインキュベーションした。A2-制限SCTライブラリーのコインキュベーションと同様に、FACSによるソーティングのために細胞を調製した。
SCT-K562細胞へのデキストラマーの結合
【０１４８】
F5 TCRまたは1G4 TCRデキストラマーは、蛍光を利用して標識するストレプトアビジン（Life Technologies（ライフ・テクノロジーズ）、Carlsbad（カールズバッド）、CA）を前述32のように使用することにより調製した。SCT形質導入K562細胞をTCRデキストラマーおよび7AAD（eBioscience、San Diego、CA）により室温で20分間染色した。染色細胞は、MACSQuant Analyzer 10（Miltenyi Biotec、Bergisch Gladbach、Germany）を使用したフローサイトメトリーによって分析した。
Calcein（カルセイン）AMを使用する初代ヒトT細胞による細胞傷害性アッセイ
【０１４９】
ターゲット細胞に対するエフェクターT細胞の細胞傷害性応答を測定するために、前述34のようにCalcein AM放出に基づく細胞傷害性アッセイを実行した。簡単に説明すると、1×106 SCT-K562ターゲット細胞を細胞培地（5μL/mL）において1mLのCalcein AM（Thermo Fisher、Waltham、MA）において再懸濁し、時々振とうしながら37℃にて1時間インキュベーションし、次いで残留色素を除去するために細胞培地により二回洗浄した。F5 TCRまたはneo（ネオ）TCRにより形質導入したエフェクターT細胞およびターゲットSCT細胞を、様々なエフェクター対ターゲット比（16：1、8：1、4：1、2：1、1：1、0.5：1、0：1）において96ウェルU-ボトムプレート上に播種し、および37℃で4時間コインキュベーションした。コインキュベーション後、無細胞上清を慎重に除去し、および蛍光プレートリーダー（励起フィルタ485nm、放出フィルタ530nm）を使用して分析した。特定の溶解の割合は、測定した光学密度に基づき、式[(テスト放出-自然放出)/(最大放出-自然放出)]×100を使用して算出した。自然放出ウェルにおいてターゲット細胞を培地単独によりインキュベーションし（0％溶解と考え）、および最大放出ウェルにおいてターゲット細胞を2％Triton（トライトン）X-100によりインキュベーションした（100％溶解と考える）。
エピトープ選定
【０１５０】
A2制限SCT cDNAライブラリーはImmune Epitope Database（免疫エピトープデータベース）（IEDB）からの約12,055のパブリックT細胞A2制限エピトープを含んだ。
【０１５１】
ネオ抗原SCT cDNAライブラリーは、黒色腫ペイシェントからの腫瘍物質のエクソーム/RNAシーケンシングによって無関係に識別されるおよそ3,000のユニークなネオ抗原、およびHLA-A*02：01による予測性ネオ抗原提示を含んだ。DNAおよびRNAの双方は、スナップ凍結腫瘍生検から同時に抽出した（Qiagen（キアゲン）AllPrep Kit（キット））。腫瘍および一致した正常な血液サンプルからのDNAは、UCLA Clinical Microarray Core（UCLAクリニカル・マイクロアレイ・コア）にて配列決定した（シーケンシングしたとも言う）。Nimblegen（ニンブルゲン）SeqCap EZ Human Exome Library（SeqCap EZヒューマン・エクソーム・ライブラリー）v3.0（Roche）を使用したエクソンキャプチャーの後、HiSeq 2000プラットフォーム（Illumina、San Diego、CA）上でペアードエンド（Paired-end）2×100bpシーケンシングを遂行したが、それは65Mbのゲノムを標的とする。シーケンシングでは、サンプルごとに60-100億回のリード（読み取りとも言う）が生じ、各標的化ベースは平均90-150回のリードによってカバーされる。BWA-memアルゴリズム（v0.7.9）を使用して、配列をUCSC hg19ヒトゲノムリファレンスに合わせた。前処理は、重複削除（duplicate removal）（Picard Tools（ピカール・ツールズ））、インデル・リアライメント（indel realignment、挿入欠失再編成などとも言う）、およびベース品質スコアリキャリブレーション（基本品質スコア再調整などとも言う）を含め、GATK Best Practices Workflow（GATKベストプラクティスワークフロー）v3に従った。体細胞変異は、MuTect（v1.1.7）36、Varscan2 Somatic（バリスキャン2ソマティック）（v2.3.6）37、およびGATK-HaplotypeCaller（GATK-ハプロタイプコーラー）（HC、v3.3）を使用して、35から修飾した方法により呼び出した。信頼性の高い変異だけを保持し、三つのプログラムのうち少なくとも二つによって識別されるものとして規定した。GATK-HCについて、体細胞変異は、腫瘍/正常ペア間の片側フィッシャー直接検定（one-sided Fisher's Exact Test）（P値カットオフ≦0.01）を使用して決定した。変異にはOncotator（オンコテーター）38によって注釈が付けられ、非同義変異（non-synonymous mutations）は、Nonsense（ナンセンス）、Missense（ミスセンス）、Splice_Site（スプライス部位）、またはNonstop Mutations（ノンストップ変異）に分類されるものであり、ならびにFrame_Shift（フレームシフト）、In_Frame（インフレーム）、またはStart_Codon（開始コドン）は挿入/欠失が変動する。HLAタイピングは、全体のエクソームシーケンシングデータからATHLATESによって実行した。RNAシーケンシングは、IlluminaTruSeq RNAサンプル調製キットを製造元の指示につき用いて調製した100-bpペアードエンドライブラリーでのIllumina HiSeq 2500プラットフォームを使用して実行した。リードはTopHat2 v2.0、39を用いてhg19にマッピングし、およびCufflinks v2.2.140プログラムおよびCuffNormを用いて定量化および正規化し、幾何学的正規化法を用いてライブラリーサイズ（マッピングされた100万フラグメントにつきエクソンのキロベース当りのフラグメント）によって正規化した発現テーブルを生成した。Biopythonおよびpysamパッケージを利用するカスタムPython（v2.7.3）スクリプトによって、変異を含むRNAリードを識別し、およびIntegrated Genomics Viewer（インテグレーテッド・ゲノミクス・ビュワー）（IGV）での目視検査によって検証した。HLA-A02：01へのペプチド結合予測は、9量体および10量体ペプチドについてnetMHC3.441によって各非同義アミノ酸変動変異（each nonsynonymous amino acid-altering mutation）の周りのスライディングウィンドウにおいて生成した。（ペプチド配列はEnsembl GRCh37リリース74から導き出した）。候補ペプチドは、1）RNA-seqによって識別される変異を含むリードを有するもの、2）RNA発現（FPKM>0）を有するが、識別された変異リードのないもの、および3）検出可能なRNA-seq発現を伴わない他のすべてによって入れ物に入れた（binned）。ペプチドは、各入れ物（bin）内のHLA結合親和性によってランク付けおよびソートした。
ライブラリー生成
【０１５２】
A2制限パブリックおよびネオエピトープをコードするオリゴプールを合成し（Twist Bioscience（ツイスト・バイオサイエンス）、San Francisco（サンフランシスコ）、CA）、およびプライマー5'-CAGGAGGGCTCGGCA-3'および5'-GATGAGCGGCCGCCGGACCCTCCGCATCC-3'を用いるPCR増幅についてのテンプレートとして使用し、次のプログラム：95℃にて2分間の初期変性ステップ、続いて95℃で20秒間、61℃で10秒間、および70℃で15秒間の6サイクル、次いで70℃にて1分間の最終伸長（final extension）、続いて4℃での保持を伴う。オリゴライブラリーのPCR増幅後、PCRアンプリコンをNotIにより消化し、次にBsmBI線状化（BsmBI linearized）レンチウイルスベクター中に挿入した（pCCLcバックボーンはDon Kohn lab（ドン・コーン・ラボ）からの親切な贈り物であり、SCTおよびMHC遺伝子クローニングを容易にするために修飾された制限配列を有し）、In-Fusion Cloning（イン-フュージョン・クローニング）によるGFP遺伝子の共発現を媒介したIRESを伴う。
PCR増幅およびディープシーケンシング
【０１５３】
ソートしたSCT-K562細胞のゲノムDNAは、PureLink Genomic DNA Mini Kit（ピュアリンク・ジェノミックDNAミニ・キット）（Invitrogen（インビトロゲン）、Carlsbad、CA）を使用して抽出し、およびMastercycler Pro（マスター・サイクラー・プロ）S PCRシステム（Eppendorf（エッペンドルフ）、Hamburg（ハンブルク）、Germany）でのバーコード化PCR増幅におけるテンプレートとして使用し、次のプログラム：95℃にて2分間の初期変性ステップ、続いて95℃で20秒間、66℃で10秒間、および70℃で15秒間の35サイクル、次いで70℃にて2分間の最終伸長、続いて4℃での保持を伴う。PCR増幅において使用するプライマーは次のとおりである：TruSeq-Univ-SCTfixed-Forward：5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGGCCTGCTTTGTTTGCC-3'、TruSeq-Read2-SCTfixed-Reverse：5'-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCTCCACCACCGCTACCTC-3'およびTruseq-Adapter-Index Reverse primer（Truseq-アダプター-インデックス・リバース・プライマー）。増幅したPCRは、製造元のプロトコルに従って、DNA Clean＆Concentrator-5 Kit（DNAクリーン＆コンセントレーター-5キット）（Zymo Research（ザイモ・リサーチ）、Irvine（アーヴィン）、CA）を用いて精製した。増幅したバーコード化DNAは、Bioanalyzer（バイオアナライザー）（Agilent Genomics（アジレント・ゲノミクス）、Santa Clara（サンタクララ）、CA）によって定量し、およびIllumina Genome Analyzer IIxシステム（Illumina、San Diego、CA）によってシーケンシングした。
例2：抗原特異的ターゲット細胞のトロゴサイトーシスはT細胞からAPCターゲット細胞に発生し、およびマルチプルなタンパク質移行によって追跡することができる
【０１５４】
興味あるオーファンTCRに反応するリガンドをロバストに（robustly）識別することができるトロゴサイトーシスに基づく細胞プラットフォームを記載する。同族TCR抗原ペアを発現する細胞系を確立した。Jurkat T細胞は、HLA-A2/MART126-35特異的F5 TCR遺伝子および形質導入マーカー（細胞内切断低親和性神経成長因子受容体（LNGFRΔ））をコ-デリバリーするレトロウイルスベクターにより形質導入した（図6a、b）。並行して、HLA-A2/MART126-35（A27L）の単鎖三量体（SCT）および形質導入マーカーとしてのZsGreenをコ-デリバリーするレンチウイルスベクターによりK562細胞を形質導入した（図6a、b）。A2/NYESO1157-165特異的1G4 TCRおよびA2/NYESO1157-165（C165V）SCTを有するK562細胞によりJurkat T細胞を形質導入して、同族のT細胞/ターゲット細胞系の第二のペアを確立した。抗原特異的相互作用によりT細胞膜成分がターゲット細胞に移行するかどうかをテストするために、我々はトロゴサイトーシスについてアッセイを修飾した18。標準アッセイは、NHS-ビオチンによりターゲット細胞上で表面タンパク質を標識すること、および次いで蛍光ストレプトアビジンを用いてターゲット細胞から反応性T細胞へのビオチン化膜タンパク質（即ち、膜成分）の移行を監視することを包含する。代わりに、ここでは、反応性T細胞からターゲット細胞への反対方向での膜成分の移行を監視した。T細胞表面タンパク質（即ち、膜成分）はNHS-ビオチンにより標識し、およびコインキュベーション中にターゲット細胞へのそれらの移行を監視した。コインキュベーション後、LNGFR+Jurkat T細胞およびZsGreen+K562を別々にゲーティングし（図1a）、および蛍光ストレプトアビジンにより表面のビオチン化を評価した。予想通り、NHSビオチンにより処理したJurkat T細胞はストレプトアビジンで強く染色されたが（図1b）、その一方でビオチン化Jurkat細胞によりコインキュベーションしなかったK562はストレプトアビジンについて陰性であった（図1c、左の二つのピーク）。ビオチン化F5-Jurkat細胞の非同族NYESO1-K562細胞によるコインキュベーションにより、ストレプトアビジン染色において＞30倍のシフトがもたらされ、ターゲット細胞への非特異的ビオチン移行が指し示された（図1c、右から二番目のピーク）。しかしながら、ビオチン化F5-Jurkat細胞の同族MART1-K562細胞によるコインキュベーションにより、この非特異的シフトを超えるさらに3.5倍のシフトがもたらされ、抗原特異的なターゲット細胞トロゴサイトーシスが実証された（demonstrating）（図1c、右ピーク）。興味深いことに、LNGFRおよびTCRの双方は、非ビオチン化膜成分の代表であり、またMART1-K562細胞をF5-Jurkat細胞によりコインキュベーションしたとき、同様の2-3倍のシフトを見せ、非同族のNYESO1-K562細胞とインキュベーションしたとき、LNGFRまたはTCRについての検出可能な非特異的シフトが伴われない（図1a、d）。T細胞タンパク質のターゲット細胞への移行を監視するために、抗体の単独を使用し、即ちJurkat T細胞をビオチン化しない別の実験を実行した。NYESO1-K562およびMART1-K562細胞の双方は、それらのそれぞれの同族のTCRを発現するJurkat T細胞と共にではあるが、非同族のTCRを発現するJurkat T細胞と共にではなくインキュベーションしたとき、LNGFRおよびTCR染色でのシフトを実証し、ターゲット細胞のトロゴサイトーシスの抗原特異性が確認された（図1e）。LNGFRおよびTCRに加えて、他の膜タンパク質の移行は、抗原依存的なマナーにおいてCD3およびCD8のJurkat細胞からK562細胞へのもの、およびHLA-A2のK562細胞からJurkat細胞へのものを含めて観察された（図7a、b）。さらに、ドナー細胞からのタンパク質の付随する減少が、K562細胞からのHLA-A2およびJurkat細胞からのTCRおよびLNGFRを含めて観察された（図7c、d）。それゆえ、トロゴサイトーシスは双方向であり、およびマスバランス（物質収支とも言う）が観察される。
【０１５５】
トロゴサイトーシスがドナー細胞/アクセプター細胞の同一性に依存するかどうかを定めるために、TCRまたはSCTのいずれかを発現するK562細胞系およびJurkat細胞系を生成し、およびすべてのペアリングの組合せを使用してコインキュベーション実験を実行した（SCT-Jurkatを伴うTCR-K562、SCT-K562を伴うTCR-K562、SCT-Jurkatを伴うTCR-Jurkat）。すべての細胞ペアリングについての抗原特異的TCR移行が観察され（図8a-c）、ターゲット細胞のトロゴサイトーシスがドナーおよびアクセプター細胞の同一性とは無関係に発生することが指し示される。
例3：トロゴサイトーシスは滴定可能であり、およびCD8共発現によって増強される
【０１５６】
ターゲット細胞上に提示されるpMHC複合体の密度は、TCR認識にとって重要である21。トロゴサイトーシスが定量的に滴定可能かどうかをテストするために、F5-Jurkatまたは1G4-Jurkat細胞を、0.016-10μMに及ぶMART1ヘテロクリティックペプチド（ELAGIGILTV）の異なる用量によりパルスしたHLA-A2発現性K562細胞（A2-K562）によりコインキュベーションした。トロゴサイトーシス+ターゲット細胞の数は、TCR陽性の割合について染色することによって定量化したように、A2-K562細胞上にパルスしたMART1ペプチドの用量と共に増加した（図2a、上部パネルおよび図9a）。F5 Jurkat細胞を非同族のNYESO1ヘテロクリティックペプチド（SLLMWITQV）でパルスしたA2-K562ターゲット細胞によりコインキュベーションしたとき、トロゴサイトーシス+ターゲット細胞の数に著しい増加はなかった（図2a、底部パネルおよび図9b）。同様に、1G4-Jurkat細胞によるコインキュベーション後、同族のNYESO1ヘテロクリティックペプチドの用量を増やしてパルスしたA2-K562ターゲット細胞についてだけ、トロゴサイトーシス+ターゲット細胞の数において増加があった（図2aおよび図9c、d）。これらのデータはターゲット細胞のトロゴサイトーシスがpMHC-密度-依存性であることを示唆する。
【０１５７】
F5 TCR-発現性T細胞は、異なるMART1ペプチド配列変種に対して異なる程度にまで応答する22。例えば、F5 TCRは、ヘテロクリティックELAペプチドにネイティブMART1 EAAペプチドよりも多く反応する。異なるMART1ペプチド変種がどの程度でトロゴサイトーシスを誘発するかを調べた。F5-Jurkatまたは1G4-Jurkat細胞を、同じ用量の異なるMART1ペプチド変種を用いてパルスしたA2-K562細胞によりコインキュベートした。F5-JurkatおよびELAペプチドでパルスしたA2-K562細胞の混合物において、ネイティブEAAペプチドまたは他のペプチド変種を用いてパルスしたA2-K562細胞によりコインキュベートしたF5-Jurkat細胞と比較して、トロゴサイトーシス+ターゲット細胞の割合での増加が観察された（図2b、上部パネルおよび図9e、f）。同様に、1G4-Jurkat細胞をヘテロクリティックNYESO1ペプチドを用いてパルスしたA2-K562細胞によりコインキュベートしたとき、ネイティブペプチドまたは他のペプチド変種を用いてパルスしたA2-K562細胞と比較して、トロゴサイトーシス+ターゲット細胞の割合において増加があった（図2b、底部パネルおよび図9g、h）。
【０１５８】
CD8の共発現は、MHC-Iに直接結合することによってTCR-pMHC相互作用のアビディティー（結合活性とも言う）を増大させ、より一層低い親和性のTCRsが関与することが可能になる23。CD8がトロゴサイトーシスを増強するかどうかを調べるため、CD8により形質導入したF5-Jurkatまたは1G4-Jurkat細胞をNYESO1-K562およびMART1-K562細胞によりインキュベートし、およびTCRのターゲットK562細胞への移行を測定した。CD8レトロウイルス形質導入はCD8aについて直接染色することによって評価した。CD8を共発現するように操作されるジャーカット細胞は、TCRだけを発現するものと比較して、〜（約とも言う）3倍だけトロゴサイトーシスを増加させた（図2cおよび図9i、j）。このように、結果は、ターゲット細胞のトロゴサイトーシスが、提示されたペプチドに対するTCRの反応性と相関し、およびCD8の共発現によっても増強されることを示唆する。
例4：ターゲット細胞のトロゴサイトーシスは同族エピトープ提示性ターゲット細胞の分離を可能にする
【０１５９】
前述の例では、単一のT細胞-ターゲット細胞ペアだけが存在し、即ち、一つのTCR発現性T細胞派生物が一つのエピトープ提示性K562派生物によりコインキュベートされるような条件下で、ターゲット細胞のトロゴサイトーシスアッセイを実行した。しかしながら、相互作用/活性化が単独で抗原特異的であり、およびいったん相互作用化/活性化されると、T細胞は続いて接触する任意の細胞に膜を移す可能性がある。活性化T細胞および非同族ターゲット細胞間の潜在的な相互作用により、ライブラリーアプリケーションが複雑になるであろうが、そこでは、希少な同族エピトープ提示性ターゲット細胞がはるかにより一層多くの非同族のエピトープ提示性細胞から選ばれるであろう。ターゲット細胞のトロゴサイトーシスが同族エピトープ提示性細胞の非同族エピトープ提示性細胞からの分離を可能にするかどうかを定めるために、1G4-JurkatまたはF5-Jurkat T細胞のいずれをもNYESO1-K562およびMART1-K562ターゲット細胞の1：1混合物によりコインキュベーションした。次いで、細胞混合物を可溶性1G4またはF5 TCRデキストラマーにより標識し、トロゴサイトーシスを受けるターゲット細胞の抗原組成の決定を可能にした（図10a）。NYESO1-K562およびMART1-K562ターゲット細胞の混合物を1G4-Jurkat細胞によりコインキュベーションしたとき、トロゴサイトーシス+ターゲット細胞（HLA-A2+ZsGreen+LNGFRhighTCRhigh）は、同族NYESO1-K562細胞について高度に豊富化された（95.1％）（図10b、c）。LNGFRおよびTCRの低い染色についてゲーティングされたトロゴサイトーシス-ターゲット細胞の中で、同族NYESO1-K562細胞（23.7％）を超える非同族MART1-K562細胞（70.8％）の付随した豊富化を観察した。同様に、F5-Jurkat細胞によるターゲット細胞混合物のコインキュベーションは、トロゴサイトーシス+ターゲット細胞の中でMART1-K562を（94.9％）に、およびトロゴサイトーシス-ターゲット細胞の中でNYESO1-K562を（76.3％対18.8％MART1-K562）に豊富化した。それゆえに、ターゲット細胞のトロゴサイトーシスはそれ自体が抗原特異的であり、および抗原発現性ターゲット細胞の抗原非発現性ターゲット細胞（non-antigen-expressing target cells）からの分解を可能にする。
【０１６０】
概念証明型ライブラリーシミュレーションを実施して、ライブラリースクリーニング適用のためのトロゴサイトーシスモニタリングの適用可能性を実証した。NYESO1-K562細胞（ZsGreenを発現）をCD80+HLA-A2+K562細胞（ZsGreenを発現しない）中に1：10,000で希釈した（CD80+HLA-A2+K562細胞はOwen Witte lab（オーエン・ヴィッテ・ラボ）からの親切な贈り物である）。希釈した混合物を1G4-JurkatまたはF5-Jurkat細胞のいずれかによりコインキュベーションし、およびCD80-ZsGreen+（NYESO1-K562）およびCD80+ZsGreen-（コントロール、HLA-A2+K562）のターゲット細胞の中でトロゴサイトーシスをモニターした（図3a）。双方のコインキュベーションにおいて、予想通り、NYESO1-K562細胞がすべてのターゲット細胞の〜0.01％を構成した。トロゴサイトーシス分析を実施し、および非同族コントロールF5-Jurkat細胞によりコインキュベーションしたNYESO1-K562（0.0％）および同族1G4-Jurkat細胞（70.8％）間のトロゴサイトーシス+NYESO1-K562ターゲット細胞（HLA-A2+ZsGreen+LNGFRhighTCRhigh）の割合において顕著な差が観察された。対照的に、最小限のトロゴサイトーシスだけが、いずれかのJurkat細胞タイプによるコインキュベーション後のコントロールCD80+HLA-A2+K562細胞について観察され（0.35％対0.33％）、潜在的にバックグラウンドレベルを反映する。コントロール細胞10,000個当たり一つのMART1-K562細胞を使用した追加実験を実施し、対応するK562-Jurkat細胞ペアについて同様の結果が与えられた：同族F5-Jurkatによるインキュベーションは、1G4-Jurkat細胞と比較してトロゴサイトーシス+MART1-K562細胞の増加した割合をもたらす（73.4％対1.6％）が、コントロール細胞では最小限のトロゴサイトーシスだけ（0.46％対0.41％）である（図3b）。それゆえ、ターゲット細胞のトロゴサイトーシスを使用して、同族抗原発現性ターゲット細胞を少なくとも1：10,000という低い比率にて検出することができる。
【０１６１】
リガンド発見のためのターゲット細胞トロゴサイトーシスについての適用は、リガンドの広範なライブラリーの関連においてさらに調べた。長さが8-12からのアミノ酸に及ぶImmune Epitope Database（免疫エピトープデータベース）（IEDB）からの12,055のパブリックT細胞エピトープを含むA2制限SCT cDNAライブラリーは生成され、F5および1G4 TCRs（それぞれMART1およびNYESO1）に特異的なエピトープが含まれた。K562細胞をA2制限SCTライブラリーにより形質導入し、および形質導入したターゲット細胞ライブラリーをF5-Jurkatまたは1G4-Jurkat細胞によりコインキュベーションした。トロゴサイトーシス+ターゲットK562細胞は、TCRhigh染色上でゲーティングした蛍光活性化細胞ソーティング（FACS）によってソートした（K562-SCT細胞もまたeGFP+上でゲーティングし、およびJurkat-TCRはE2-Crimson+上でゲーティングした）（図4a）。二ラウンドのトロゴサイトーシス+細胞のソーティングの後、そこで各ラウンドには、トロゴサイトーシスのコインキュベーションとそれに続くFACSソーティングの実行が含まれ、ソートしたK562細胞の特異性を検証するためにトロゴサイトーシス実験を実行した。続いて、F5-Jurkatコインキュベーション培養物から二回ソートしたK562細胞をF5-Jurkat細胞または1G4-Jurkat細胞のいずれかにより再度コインキュベーションした。ソートしたターゲット細胞は、1G4-Jurkat細胞と比較してF5-Jurkat細胞によりインキュベーションするとき、TCR染色によって測定されるように、増加したトロゴサイトーシスを実証し、F5-Jurkatと優先的に相互作用する細胞について豊富化されたソーティングが示唆される。（図4b、左パネル）。同様に、1G4-Jurkatコインキュベーション培養物から二回ソートしたK562細胞は、F5-Jurkat細胞と比較して1G4-Jurkat細胞とインキュベートするとき、TCR染色で測定されるように増加したトロゴサイトーシスを実証し、1G4-Jurkat細胞と優先的に相互作用する細胞について豊富化されたソーティングが示唆される。（図4b、右パネル）。さらに、F5-Jurkat細胞によるコインキュベーション後にソートするターゲットK562細胞は、F5 TCRデキストラマー染色について95％陽性であり（一ラウンドのソーティング後に37％から増加）（図4c、上部パネル）および1G4-Jurkat細胞によるコインキュベーション後にソートするターゲットK562細胞は、1G4 TCRデキストラマー染色について86％陽性であった（一ラウンドのソーティング後に25％から増加）（図4c、底部パネル）。対照的に、ソートした細胞は、両方のラウンドのソーティングについて非同族ペアリングにおいてデキストラマー染色について陰性であった（図4c）。これらの結果は、選定がTCR依存性であることを強く示唆し、および豊富化されたターゲット細胞での提示されるリガンドがそれぞれF5および1G4について同族リガンドに関連することを示唆した。ソートした集団によって提示されるリガンドの同一性を定めるために、各トロゴサイトーシス選定の第二ラウンドからのターゲット細胞は、豊富化されたエピトープを識別するためにIlluminaプラットフォームを使用して次世代シーケンシング（NGS）に供した。F5 Jurkatの共培養（co-culture、同時培養などとも言う）からソートしたトロゴサイトーシス+細胞によって提示される上部9の豊富化リガンドのうち8は、F5 TCRについて同族のネイティブおよびヘテロクリティックリガンド（EAAGIGILTVおよびELAGIGILTV）または密接に関連するリガンド（同族リガンドから≦3位置において異なる）であった。1G4-Jurkat共培養からソートしたトロゴサイトーシス+細胞によって提示される上部2のリガンドは、同様に1G4 TCRについての同族のネイティブおよびヘテロクリティックリガンド（SLLMWITQCおよびSLLMWITQV）であった（図4d）。これらのデータは、ターゲット細胞のトロゴサイトーシスがオーファンTCRsについての類似配列の同族リガンドおよび交差反応性リガンドを識別するためのプラットフォームを提供することを実証する。
例5：ターゲット細胞のトロゴサイトーシスはペイシェント由来のネオ抗原特異的TCRのリガンドを識別する
【０１６２】
ゲノミクスおよびプロテオミクスにおける最近の進歩は、支持的なバイオインフォマティクスおよびインシリコ（in silico、コンピューターシミュレーションによるなどとも言う）予測ツールとともに、ペイシェント由来の腫瘍からの変異ネオエピトープの迅速な識別を可能にした24,25。ターゲット細胞のトロゴサイトーシスがパブリックエピトープライブラリから同族TCRリガンドを正しく識別することを検証したので、ターゲット細胞のトロゴサイトーシスについてのアプリケーションをペイシェント特異的ネオエピトープのカスタムライブラリからの腫瘍浸潤性リンパ球（TIL）由来のオーファンTCRについてのネオエピトープリガンドの発見との関連でさらに検討した（図5a）。プライベート変異（Private mutations）は、転移性メラノーマを有するペイシェントからの腫瘍物質のエクソーム/RNAシーケンシングによって識別され、および変異によって生成される潜在的なネオエピトープリガンドはHLA-A*02：01による提示についてアルゴリズム的に予測された。以前の作業は、同じペイシェントから採取したTILsをスクリーニングしてネオエピトープ反応性TCRを分離するためにpMHCマルチマーパネルを使用した（示していない）。ネオエピトープSCT cDNAライブラリーが生成され、長さで8-12からのアミノ酸に及ぶ3,251のユニークなネオエピトープが含まれ、およびK562細胞中に形質導入され、ターゲットのネオエピトープターゲット細胞ライブラリーを生成する（to generate target a neoepitope target cell library）。K562ネオエピトープターゲット細胞ライブラリーは、ネオTCR形質導入Jurkat細胞（ネオTCR-Jurkat）によりコインキュベーションし、およびトロゴサイトーシス+ターゲット細胞について二ラウンドのソーティングを実行した。ソートしたターゲット細胞は、豊富化したネオエピトープを識別するためにNGSによって分析した。二ラウンドの選定後に豊富化した上部五のリガンドは、ユビキチン特異的ペプチダーゼ7（USP7）から導き出されるオーバーラッピング変異ペプチドであった（図5b）。ネオTCRが豊富化したネオエピトープを認識することを確認するため、すべての豊富化したヒットにおいて含まれるコア9-mer変異ペプチドYLYHRVDVI（mutUSP7-K562）をコードするSCTによりK562細胞を形質導入した。予想されるように、mutUSP7-K562のネオTCR-Jurkat細胞とのコインキュベーション後、非同族F5-Jurkat細胞とのものよりも増加した割合のトロゴサイトーシス+ターゲット細胞が観察され（図5c）、USP7変異エピトープYLYHRVDVIがネオTCRによって認識されることが実証される。ネオTCRによるUSP7変種エピトープの認識は、ネオTCRがネオエピトープ提示性ターゲット細胞の認識の際に細胞傷害性を誘導する能力を測定することによってさらに検証した。ネオTCRにより形質導入した初代T細胞は、mutUSP7-K562ターゲット細胞を抗原特異的およびエフェクター：ターゲット細胞比に依存的なマナーにおいてキルし（死滅させ）（図5d）、ターゲット細胞のトロゴサイトーシスを通して識別したUSP7mutエピトープをネオTCRが機能的に標的とすることが検証された。溶解パーセントの定量化を表Aにおいて示す。
【０１６３】
【表１】
2020529470.tif 000003
例6：ネオエピトープおよび同族TCRsを識別するための並行スクリーニング
【０１６４】
ペイシェント特異的ネオエピトープおよび同族TCRsを上記の方法を使用して識別する。
【０１６５】
ペイシェントの推定上のネオ抗原（腫瘍または病原体）の識別について、インシリコ予測アルゴリズムプログラムを利用し、それは推定上発現するネオ抗原に対応する体細胞変異を識別するために、腫瘍、ウイルス、または細菌シーケンシングデータを全体のゲノム、全体のエクソーム、またはトランスクリプトームシーケンシングデータを含めて分析する。さらに、ヒト白血球抗原（HLA）のタイピングは、ペイシェントの腫瘍または血液サンプルから定めることができ、およびこのHLA情報は、Fritschらの、2014、Cancer Immunol Res.（キャンサー・イムノロジー・リサーチ）、2:522-529で、その全体の内容は参照によってここに組み込まれるものによって検証されるように、MHC結合について予測アルゴリズムでの識別された推定上のネオ抗原ペプチド配列と一緒に利用することができる。ネオ抗原を識別するための方法の追加的な例には、シーケンシングを質量分析およびMHC提示予測と組み合わせること（例は、米国特許出願公開第2017/0199961号）、およびシーケンシングをMHC結合親和性予測と組み合わせること（例は、発行された米国特許第9,115,402号）が含まれる。さらに、ペイシェントサンプルにおいてネオ抗原特異的T細胞が存在するかどうかを識別するのに有用な方法は、ここに記載の方法と組み合わせて使用することができ、例は、参照することにより全体をここに組み込む米国特許出願公開第2017/0003288号およびPCT/US17/59598に記載のようである。これらの分析は、同族の抗原特異的T細胞のスクリーニングのための日常的な方法を使用して難なく合成することができるペイシェントの候補ネオ抗原ペプチドのランク付けされたリストをもたらす。
【０１６６】
潜在的なネオエピトープは、発現ベクター、例えば、以前に記載したSCTレトロウイルス発現ベクターなどのようなもの中にクローニングする。MHC発現細胞、例えば、単一のMHCを発現するように操作し、またはマルチプルのMHCs（例は、ペイシェントの各々のMHC対立遺伝子）を発現するように操作したk562細胞などのようなものは、ネオエピトープ発現ベクターにより形質導入またはトランスフェクトし、ネオエピトープ発現性ターゲット細胞ライブラリーを形成する。
【０１６７】
ターゲット細胞ライブラリーは、ペイシェントから導き出されるTCRsを発現する細胞、例えば、ペイシェントサンプルから直接分離された初代T細胞、またはペイシェントにおいて存在すると決定されたTCRsを発現するように操作された細胞によりコインキュベーションする。スクリーニングするペイシェント特異的TCRsを選定するための基準には、対象またはペイシェントにおいて存在することが知られるTCRsを含むことができ、対象またはペイシェントにおいて一定の頻度にて存在することが知られるTCRs、特定の表現型、例えば、活性化T細胞（例は、PD-1+、CD39+、および/またはCD137+として特徴付けられる）または疲弊したT細胞によって特徴付けられる特定のT細胞またはT細胞群によって発現されることが知られるTCRsを選定することである。集団内の興味ある潜在的なTCR配列を識別する方法は、本技術、例えば、発行された米国特許第8,507,205号、発行された米国特許第9,347,099号、発行された米国特許第9,506,119号、国際出願第WO2018075693号、Hanら2014、Briggsら2017年、Grosら2014、Pricketら2016年、Linnemanら2014、Pasettoら2014、および国際出願第PCT/US18/21611号において知られ、それらの各々は、あらゆる目的のために参照することによって組み込まれる。
【０１６８】
ターゲット細胞およびTCR発現性細胞のコインキュベーションに続いて、細胞は膜マーカーの移行に基づいてソートする。TCRsによって認識されるネオエピトープを発現するターゲット細胞はT細胞またはTCR発現性細胞に由来する膜マーカーの存在に基づいてソートする。追加的に、または代わりに、潜在的なネオエピトープを認識するTCRsを発現する細胞は、ターゲット細胞に由来する膜マーカーの存在に基づいてソートする。あるいはまた、興味あるターゲット細胞またはT細胞/TCR発現細胞は、それらのそれぞれの膜成分の損失に基づいてソートする。
【０１６９】
ソートしたターゲット細胞および/またはT細胞/TCR発現性細胞からのDNAまたはmRNAを分離し、および次世代シーケンシングによって配列決定し、およびネオエピトープおよび/またはTCRを識別する。
例7：膜成分の並行バーコーディング
【０１７０】
製造者の指示に従って商業上のキットを使用して、DNAバーコードを抗体にコンジュゲートさせる（Solulink All-in-One Antibody-Oligonucleotide Conjugation Kit）。簡単に説明すると、アミノ修飾DNAオリゴ（二つのユニバーサルプライマー部位によって隣接されるバーコードからなる）をスルホS-4FBにコンジュゲートし、それによってオリゴを4-FBによりデコレーティングする。並行して、抗体は二官能性HyNic-NHSエステルにコンジュゲートし、それによって抗体表面のLys残基をHyNic基によりデコレーティングする。次に、マルチウェルプレートの各ウェルにおいて、HyNic修飾抗体をユニークな4-FB修飾オリゴにより（または4-FB修飾オリゴのユニークなコンビナトリアルパネルにより）反応させ、ユニークな4-FBは各ウェルに特異的なオリゴを修飾した。
【０１７１】
オリゴ（即ち、バーコード）は、次の形態：UPS1-NAANGGNAANGGNAAN-UPS2を取り、そこでNはランダムヌクレオチドを代表する。ユニバーサルプライマー部位UPS1およびUPS2には、隣接するAAまたはGGは含まれない。
【０１７２】
抗体は、T細胞表面上のタンパク質（例は、内因性タンパク質、例えば、CD8a、CD3e、TCR-ベータ、CD2などのようなもの、または外因性タンパク質、例えば、LNGFR、表面発現エピトープタグなどのようなもの）に対して指向する商業上の抗体である。
【０１７３】
一連の実験において、HyNic-抗CD8a（クローンHIT8a）は96ウェルプレートの96ウェルにわたり分配され、および次に96のユニークな4-FBオリゴバーコード（または4-FBオリゴバーコードの96のユニークな組合せ）を96ウェルに追加し、結果として抗体および各オリゴの間に安定したビス-アリールヒドラゾン結合をもたらし、バーコード化した抗CD8抗体のパネルが生成される。
【０１７４】
次いで、興味深いオーファンTCRsのパネルからのオーファンTCRs（例は、TILsからの上部100の最も頻繁なTCRs、または腫瘍部位でCD39および/またはCD103および/またはPD-1を発現するT細胞に由来するTCRs）をバーコード抗体により標識する。96の異なるオーファンTCRsを発現するJurkat T細胞を96ウェル中に隔離し、各ウェルには、一つのオーファンTCRだけを発現する細胞が含まれる。上記で生成した96の一意にバーコード化した抗CD8a抗体を96のユニークなオーファンTCR発現性Jurkat細胞ウェルに加え、インキュベートして結合させ、および次いで洗浄して未結合のバーコード化抗体を除去する。
【０１７５】
洗浄ステップに続いて、一意にバーコード化した、オーファンTCR発現性T細胞を単一のプールにおいて組み合わせ、および次いでトロゴサイトーシス反応においてターゲット細胞のライブラリーによりインキュベーションする。T細胞からターゲット細胞ライブラリーの同族エピトープ発現性メンバーへの膜タンパク質の移行は、調べられるオーファンTCRsの一またはいくつかと相互作用するそれらのターゲット細胞の識別および分離を可能にする。具体的には、TCRhigh表現型を実証するトロゴサイトーシス+ターゲット細胞はFACSによってソートする。CD8はトロゴサイトーシス+ターゲット細胞に移行する膜タンパク質の中にある。それゆえに、ソートしたトロゴサイトーシス+ターゲット細胞はバーコード化抗CD8抗体を保有する。トロゴサイトーシス+ターゲット細胞はNGSによって分析され、標的細胞によってコードされるエピトープおよび抗CD8抗体に関連するバーコード化オリゴの双方を識別する。それゆえ、単一の実験において、腫瘍に反応するすべてのネオエピトープ反応性TCRsおよびその免疫応答を推進するエピトープが特定される。
【０１７６】
別の一連の実験において、トロゴサイトーシス+細胞を単一細胞としてソートし（またはバルクにおいてソートし、および次いで単一細胞Drop-seqによって分析し）、NGSによって分析し、抗腫瘍免疫を媒介するすべてのTCRs、免疫応答を推進するすべてのエピトープ、および追加的にTCR：エピトープ同族ペアが識別される（つまり、単一細胞からのバーコード（群）およびエピトープシーケンシング結果が一以上の同族TCR-エピトープペアを識別する）。
例8：ディスカッション
【０１７７】
ここで明らかにし、および提示するように、抗原提示性ターゲット細胞は、抗原特異的およびpMHC密度依存的マナーにおいて相互作用性T細胞から膜関連タンパク質を抽出する。この現象は、トロゴサイトーシスと呼ばれ、同族T細胞から抽出されたTCRs（および他の膜タンパク質）によりリガンド提示性ターゲット細胞をマーキングするためのプラットフォームを提供し、リガンドの発見を可能にすることがここで示された。本プラットフォームは、パブリックおよびネオエピトープ特異的TCRsの双方を使用して検証された。同族pMHCを提示するターゲット細胞はT細胞シナプスに関与し（TCR、CD3、およびCD8）またはLNGFRΔでないマルチプルのタンパク質のいずれかの移行によって識別することができた。それゆえに、本プラットフォームは、マルチプルの無関係な、商業上利用可能な試薬（即ち、抗体）を使用して検証された。トロゴサイトーシスプラットフォームを使用して識別した上部エピトープは、テストされるTCRについての生物学的ターゲットリガンドを確実に返した。トロゴサイトーシスプラットフォームはまた、エピトープの識別と並行してT細胞およびそれらのそれぞれのTCRsの識別を可能にする抗原特異的なマナーにおいてそれらの表面からTCRsを失うJurkat T細胞の難なく検出可能な、および分解可能な集団をも実証した。
【０１７８】
手短に言えば、トロゴサイトーシスに基づく方法は、感染症、腫瘍免疫学、自己免疫、および免疫療法の分野における基礎的およびトランスレーショナルリサーチ（translational research、橋渡し研究などとも言う）の重要な目標である、T細胞媒介免疫によって標的となるエピトープの迅速な識別を可能にする。
例9：他の実施態様
【０１７９】
好ましい実施態様および様々な代替実施態様を参照して本発明を個々に示し、および説明したが、本発明の精神および射程から離れることなくそこに形態および詳細において様々な変形を行うことができることを関連技術において熟練する者（当業者とも言う）は理解するであろう。
【０１８０】
本明細の本文内で引用したすべての参考資料、発行された特許および特許出願は、それらの全体においてすべての目的について、参照することによってここに組み込む。
参考資料
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
2020529470.tif 000026
【図８Ａ】
2020529470.tif 000027
【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
2020529470.tif 000030
【図９Ｂ】
2020529470.tif 000031
【図９Ｃ】
2020529470.tif 000032
【図９Ｄ】
2020529470.tif 000033
【図９Ｅ】
2020529470.tif 000034
【図９Ｆ】
2020529470.tif 000035
【図９Ｇ】
2020529470.tif 000036
【図９Ｈ】
2020529470.tif 000037
【図９Ｉ】
2020529470.tif 000038
【図９Ｊ】
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【図１０Ａ】
2020529470.tif 000040
【図１０Ｂ】
2020529470.tif 000041
【図１０Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2020529470.tif 000043
2020529470.tif 000044
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