(57)【要約】  本明細書は、真核細胞に発現される配列のライブラリから１つ以上の所望の特性を有するポリペプチド又はタンパク質を選択する方法を提供し、光重合によって細胞を被包し、被包された細胞を可溶化して、半透性マイクロカプセルを作製し、任意に細胞及び／又はマイクロカプセルを１つ以上の薬剤に接触させて目的のポリペプチド又はタンパク質の活性又は機能を検出することを促進し、並びに１つ以上の所望の特性を有する目的のポリペプチド又はタンパク質を選択することを含む。また、前述のポリペプチド又はタンパク質の選択に使用される真核細胞を被包する方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核細胞に発現される配列のライブラリから、１つ以上の所望の特性を有するポリペプチド又はタンパク質を選択する方法であって、
（ｉ）光重合によって前記細胞を被包すること、
（ｉｉ）前記被包された細胞を可溶化して、半透性マイクロカプセルを作製し、
（ｉｉｉ）任意に、前記細胞及び／又は前記マイクロカプセルを１つ以上の薬剤に接触させて、目的のポリペプチド又はタンパク質の活性又は機能の検出を促進し、そして
（ｉｖ）１つ以上の所望の特性を有する目的のポリペプチド又はタンパク質を選択すること、
を含む、方法。
【請求項２】
ステップ（ｉｉｉ）は、ステップ（ｉ）若しくはステップ（ｉｉ）の前、ステップ（ｉ）若しくはステップ（ｉｉ）と同時、又はステップ（ｉｉ）の後に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記接触は、同じ又は異なる薬剤との２つ以上の接触ステップを含み、少なくとも１つの接触ステップは、前記被包又は可溶化の前に行われ、少なくとも１つの接触ステップは、前記被包又は可溶化の後に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記真核細胞は昆虫細胞又は哺乳動物細胞である、請求項１〜３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記光重合がポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）系モノマーの光重合を含む、請求項１〜４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ＰＥＧ系モノマーがＰＥＧ−ジアクリレートである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記光開始剤が染料を含む、請求項１〜６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記染料がエオシン染料である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記エオシン染料がエオシンＹである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記光重合がアミン及び／又は促進剤の存在下で行われる、請求項１〜９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記アミンがトリエタノールアミンである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記促進剤が１−ビニル−２−ピロリジノンである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
光重合のための前記光開始剤系がエオシン染料、トリエタノールアミン及び１−ビニル−２−ピロリジノンを含む、請求項１〜１２の何れか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記被包ステップが
−  前記細胞を前記光開始剤、任意にエオシンＹで処理すること、
−  前記細胞を洗浄すること、
−  前記細胞を、アミン、任意にトリエタノールアミンの存在下で、光重合可能な残基、任意にＰＥＧ−ジアクリレートを含む溶液で処理すること、
−  前記細胞を、１−ビニル−２−ピロリジノン等の促進剤の存在下で、光源に暴露して、前記細胞を被包すること
を含む、請求項１〜１３の何れか一項に記載の方法。
【請求項１５】
さらに、前記選択ステップの前に、前記マイクロカプセルを１つ以上の環境条件に供する前記ステップを含む、請求項１〜１４の何れか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記１つ以上の環境条件が、洗剤処理、温度、化学的変性剤又はｐＨから選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記１つ以上の所望の特性が１つ以上の環境条件下で、安定性を含む、請求項１〜１６の何れか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記安定性は、洗浄剤安定性、熱安定性、化学安定性又はｐＨ安定性を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記可溶化ステップが前記被包された細胞を１つ以上の洗剤で処理することを含む、請求項１〜１８の何れか一項に記載の方法。
【請求項２０】
真核細胞に発現される配列のライブラリから、１つ以上の所望の特性を有するポリペプチド又はタンパク質を選択する方法において使用するための１つ以上の前記真核生物を被包する方法であって、前記被包が光重合を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、概して、細胞ベース核酸及びタンパク質のスクリーニング方法に使用するための真核細胞を被包する改善された方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
定向進化は、特定の特性でコードする核酸及び分子を生成するための強力なツールである。定向進化は、様々な産業上、治療及び調査用途についての改善された、変化した若しくは新規の特徴及び／又は機能を有する酵素及びその他のタンパク質の生成に使用される。例えば、タンパク質は、改善された又は変化した可溶性、ｐＨ安定性、熱安定性、洗浄剤安定性、屈曲特性、結合特徴、改善された性能及び／又は新規の機能性について選択され得る。
【０００３】
いくつかの技術及び方法が開発されており、配列の大きなライブラリのスクリーニング、並びにファージディスプレイ、細菌ディスプレイ、酵母ディスプレイ、リボソームディスプレイ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ区画化を含む所望の表現型について発現された配列の選択を促進した。ポリペプチド及びタンパク質の定向進化の特定の適用の技術の１つは、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ（ＣＨＥＳＳ）（Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｄｉｒｅｃｔ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ−ｓｔａｂｌｅ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｕｓｉｎｇ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、２０１３、４２５：６６２−６７７；Ｙｏｎｇ  ａｎｄ  Ｓｃｏｔｔ、Ｒａｐｉｄ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｗｉｔｈ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ（ＣＨＥＳＳ）．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ、２０１５、１１２：４３８−４４６を参照のこと）として知られる細胞ベースシステムであり、細菌細胞がキトサン及びアルギン酸等の反対電荷のポリマーの交互の層を使用して被包される。被包後、細胞は可溶し、ポリマーカプセルを小分子（リガンド及び検出可能なラベル等）の進入を可能にする半透性バリアとして残し、より大きいポリペプチド及びタンパク質の漏出を予防する。
【０００４】
発現された核酸配列のライブラリから配列を選択するときにＣＨＥＳＳを使用する方法は、国際公開第２０１３／１０４６８６号パンフレットに記載されており、その開示は、参照により本明細書にその全体が組み込まれる。そこに開示された方法は、細菌細胞への特別な適用である。しかしながら、細菌細胞は、通常、真核細胞において行われるタンパク質の翻訳後修飾を実施することができず、そのため、発現された真核生物、特にヒトのタンパク質のスクリーニング及び選択に限定的に使用される。さらに、本発明の発明者は、カチオン性多糖（キトサン等）及びアニオン性多糖（アルギン酸等）の交互の層を使用して、国際公開第２０１３／１０４６８６号パンフレットに記載され、示される細胞の被包方法が、真核細胞を被包することができないことを発見した。
【０００５】
国際公開第２０１３／１０４６８６号パンフレットに記載される細胞スクリーニング及び選択方法を促進し、拡張するために、真核細胞を被包する方法が必要である。
【発明の概要】
【０００６】
本開示の概要
本開示の第１態様に従って、真核細胞に発現される配列のライブラリから、１つ以上の所望の特性を有するポリペプチド又はタンパク質を選択する方法を提供し、
（ｉ）光重合によって細胞を被包すること、
（ｉｉ）被包された細胞を可溶化して、半透性マイクロカプセルを作製し、
（ｉｉｉ）任意に、細胞及び／又はマイクロカプセルを１つ以上の薬剤に接触させて、目的のポリペプチド又はタンパク質の活性又は機能の検出を促進し、そして
（ｉｖ）１つ以上の所望の特性を有する目的のポリペプチド又はタンパク質を選択すること、を含む。
【０００７】
一実施形態において、ステップ（ｉｉｉ）は、ステップ（ｉ）若しくはステップ（ｉｉ）の前、ステップ（ｉ）若しくはステップ（ｉｉ）と同時、又はステップ（ｉｉ）の後に行われる。
【０００８】
一実施形態において、接触は、同じ又は異なる薬剤との２つ以上の接触ステップを含み、少なくとも１つの接触ステップは、被包又は可溶の前に行われ、少なくとも１つの接触ステップは、被包又は可溶の後に行われる。
【０００９】
１つの例示的な実施形態において、接触は、目的のポリペプチド又はタンパク質に結合するリガンド又は基質にマイクロカプセルを接触させることを含み得る。
【００１０】
例示的な実施形態において、真核細胞は昆虫細胞又は哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞はヒト細胞であり得る。１つの例示的な実施形態において、ヒト細胞はヒト胚腎臓細胞である。
【００１１】
光重合は、ＰＥＧ−ジアクリレート等のポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）系モノマーの光重合を含み得る。光開始剤は、エオシン染料等の染料を含み得る。エオシン染料は、エオシンＹであり得る。光重合は、トリエタノールアミン等のアミン、及び／又は１−ビニル−２−ピロリジノン等の促進剤の存在下で行われ得る。例示的な実施形態において、光開始剤系は、エオシン染料、トリエタノールアミン及び１−ビニル−２−ピロリジノンを含む。
【００１２】
例示的な実施形態において、被包ステップは、
−  細胞を光開始剤、任意にエオシンＹで処理すること、
−  細胞を洗浄すること、
−  細胞を、アミン、任意にトリエタノールアミンの存在下で、光重合可能な残基、任意にＰＥＧ−ジアクリレートを含む溶液で処理すること、
−  細胞を、任意に１−ビニル−２−ピロリジノン等の促進剤の存在下で、可視光源に暴露して、細胞を被包することを含む。
【００１３】
方法は、さらに、選択ステップの前に、マイクロカプセルを１つ以上の環境条件に供するステップを含み得る。環境条件は、例えば、洗剤処理、温度、化学的変性剤又はｐＨを含み得る。所望の特性は、通常、１つ以上の環境条件下の安定性を含む。安定性は、洗浄剤安定性、熱安定性、化学安定性又はｐＨ安定性を含み得る。
【００１４】
可溶化ステップは、被包された細胞を１つ以上の洗剤で処理することを含み得る。
【００１５】
本開示の第２態様に従って、真核細胞に発現される配列のライブラリから、１つ以上の所望の特性を有するポリペプチド又はタンパク質を選択する方法において使用するための、１つ以上の真核生物を被包する方法を提供するものであり、ここで被包は光重合を含む。
【００１６】
例示的な実施形態において、真核細胞は昆虫細胞又は哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞はヒト細胞であり得る。１つの例示的な実施形態において、ヒト細胞はヒト胚腎臓細胞である。
【００１７】
光重合は、ＰＥＧ−ジアクリレート等のポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）系モノマーの光重合を含み得る。光開始剤は、エオシン染料等の染料を含み得る。エオシン染料は、エオシンＹであり得る。光重合は、トリエタノールアミン等のアミン、及び／又は１−ビニル−２−ピロリジノン等の促進剤の存在下で行われ得る。例示的な実施形態において、光開始剤系は、エオシン染料、トリエタノールアミン及び１−ビニル−２−ピロリジノンを含む。
【００１８】
例示的な実施形態において、被包ステップは、
−  細胞を光開始剤、任意にエオシンＹで処理すること、
−  細胞を洗浄すること、
−  細胞を、アミン、任意にトリエタノールアミンの存在下で、光重合可能な残基、任意にＰＥＧ−ジアクリレートを含む溶液で処理すること、
−  細胞を、任意に１−ビニル−２−ピロリジノン等の促進剤の存在下で、可視光源に暴露すること、
それにより細胞を被包すること、を含む。
【００１９】
図面の簡単な説明
本開示の実施形態は、以下の図を参照しながら、非限定的な例によってのみ本明細書に記載する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞の光学顕微鏡である。図１Ａは裸の（非被包の）ＨＥＫ細胞である。図１Ｂは約１００倍に希釈し、３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）で２４時間処理した図１Ａの裸のＨＥＫ細胞である。図１Ｃは本開示の実施形態に従って被包されたＨＥＫ細胞である。図１Ｄは約１００倍に希釈し、ＣＨＡＰＳで２４時間処理した図１Ｃの被包されたＨＥＫ細胞である。
【００２１】
【図２】裸の（非被包の）又は本開示の実施形態に従って被包された（ｅｎｃａｐｅｄ）ＧＦＰ発現ＨＥＫ細胞のフローサイトメトリー分析である。図２Ａは細胞濃度である。図２Ｂは可溶化（ＧＦＰの喪失）である。括弧内の数は、試料の細胞濃度を示す。
【００２２】
【図３】本開示の実施形態に従って被包されたＮＴＳ１発現ＨＥＫ細胞へのニューロテンシン結合のフローサイトメトリー分析結果である。図３Ａは洗浄剤のない場合である。図３Ｂはｎ−デシル−β−Ｄ−マルトピラノシド（ＤＭ）で、２５℃で２４時間処理した場合である。
【００２３】
【図４】裸の（非被包の）ＨＥＫ細胞、ドラゴン−グリーンで標識されたナノビーズでインキュベートした裸細胞、本開示の実施形態に従って被包された細胞、本開示の実施形態に従ってドラゴン−グリーンで標識されたナノビーズで共被包された細胞のフローサイトメトリーの分析結果である。
【００２４】
【図５】多くが凝集されたドラゴン−グリーンナノビーズの蛍光顕微鏡画像である。
【００２５】
【図６】メタノール固定されたＨＥＫ細胞の透過光及び蛍光顕微鏡画像である。図６Ａ及びＢは裸細胞である。図６Ｃ及びＤは、ドラゴン−グリーンで標識されたナノビーズでインキュベートされたが、被包されていない裸細胞である。図６Ｅ及びＦは、本開示の実施形態に従って被包された細胞である。図６Ｇ及びＨは、本開示の実施形態に従ってドラゴン−グリーンで標識されたナノビーズで共被包された細胞である。
【００２６】
【図７】本開示の実施形態に従って被包されたＨＥＫ細胞、本開示の実施形態に従ってドラゴン−グリーンで標識されたナノビーズで共被包されたＨＥＫ細胞、及び共被包され、続いて洗浄剤ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド（ＤＤＭ）で３時間処理されたＨＥＫ細胞のフローサイトメトリーの分析結果である。
【００２７】
【図８】本開示の実施形態に従ってドラゴン−グリーンで標識されたナノビーズで共被包され、洗浄剤（ＤＤＭ）で２４時間処理された、ＨＥＫ細胞の図８Ａは透過光顕微鏡画像及び図８Ｂは蛍光顕微鏡画像である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
詳細な説明
本明細書の全体にわたって、他に断りの無い限り、含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）という用語、又は「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」又は「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」等の変形例は、記述されるステップ、要素若しくは整数、又はステップ、要素若しくは整数の群を含むが、その他のステップ、要素若しくは整数、又はステップ、要素若しくは整数の群を除外しないことが理解される。したがって、本明細書の文脈において、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「本質的に含むが、必ずしも単独で含むわけではない」ことを意味する。
【００２９】
本明細書の文脈において、用語「約」は、当業者が同じ機能又は結果を達成する内容において、記載の値と等価であると理解する数の範囲を指すことが理解される。
【００３０】
本明細書の文脈において、用語「ａ」及び「ａｎ」は、物品の文法的対象物の１つ又は１つ以上（すなわち、少なくとも１つ）を指す。例えば、「１つの要素」は１つ要素又は１つ以上の要素を意味する。
【００３１】
用語「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって一緒に結合されるアミノ酸から作製されるポリマーを意味する。用語「タンパク質」は、ポリマー等を指すが、いくつかの例において、ポリペプチドは、タンパク質より短い（すなわち、少ないアミノ酸残基から構成される）場合もある。それにもかかわらず、用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書では同義に使用され得る。
【００３２】
本開示は、国際公開第２０１３／１０４６８６号パンフレットに記載され、示される選択方法及びこの方法を細菌細胞の被包に限定することで、本発明の発明者によって判断された欠点を克服する。真核生物のポリペプチド及びタンパク質、並びに所望の特性を有する真核生物のポリペプチド及びタンパク質の発現について、真核細胞のポリペプチド及びタンパク質を発現することが好ましい。そのため、国際公開第２０１３／１０４６８６号パンフレットに記載され、示される手段に従って、所望の特性を有するポリペプチド及びタンパク質の選択を可能にする真核細胞を被包する適切な方法が必要とされる。
【００３３】
したがって、本明細書に、真核細胞に発現される配列のライブラリから、１つ以上の所望の特性を有するポリペプチド又はタンパク質を選択する方法を提供し、
（ｉ）光重合によって細胞を被包すること、
（ｉｉ）被包された細胞を可溶化して、半透性マイクロカプセルを作製し、
（ｉｉｉ）任意に、細胞及び／又はマイクロカプセルを１つ以上の薬剤に接触させて、目的のポリペプチド又はタンパク質の活性又は機能の検出を促進し、
（ｉｖ）１つ以上の所望の特性を有する目的のポリペプチド又はタンパク質を選択すること含む。
【００３４】
また、本明細書に、真核細胞に発現される配列のライブラリから、１つ以上の所望の特性を有するポリペプチド又はタンパク質を選択する方法において使用するために、１つ以上の真核生物を被包する方法を提供し、被包は光重合を含む。
【００３５】
本開示の方法は、任意の真核細胞を使用して実施され得る。適切な真核細胞として、限定されないが、酵母細胞、原生動物細胞、藻類細胞若しくはその他の植物細胞、又は昆虫若しくは哺乳動物細胞等の動物細胞が挙げられる。細胞は、一次若しくは二次細胞培養物、又は不死化細胞株であってもよい。例示的な実施形態において、真核細胞は、昆虫細胞若しくは細胞株、又は哺乳動物細胞若しくは細胞株、任意にヒト細胞若しくは細胞株である。ヒト細胞又は細胞株は、例えば、胚性若しくは幹細胞又は細胞株であってもよい。しかし、当業者は、任意の真核細胞を使用してもよく、本開示の範囲が特定の適用のために選択される真核細胞の同一性又は起源によって限定されないことを理解する。
【００３６】
本開示に従って、真核細胞の被包は、光重合の手段による。当業者は、光重合の原理に慣れ親しんでおり（例えば、Ｂａｒｏｌｉ、Ｐｈｏｔｏｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ：ｉｓｓｕｅｓ  ａｎｄ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌｉｔｉｅｓ  ｉｎ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ、ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｊ  Ｃｈｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２００６、８１：４９１−４９９）、本開示の文脈において光重合の適用は、実験に負担をかけずに、充分に当業者の能力の範囲内にある。広義には、光重合は、重合化可能なモノマー（光重合可能な残基）、光開始剤及び光源を必要とする。本開示の文脈において、適切な光重合可能な残基、光開始剤及び光源を特定の適用に依存して使用してもよい。光源は、使用される光開始剤及び光重合可能な残基に依存して、例えば、ＵＶ光、可視光又は赤外線光を含み得る。
【００３７】
例えば、光重合可能な残基は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）の（ジ）メタクリル酸又は（ジ）アクリル酸誘導体及びその誘導体、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）及びその誘導体、ＰＥＧ−ポリスチレンコポリマー（ＰＥＧ）−（ＰＳＴ）、エチレングル−乳酸コポリマー（ｎＥＧｍＬＡ；ｎ及びｍは、それぞれＥＧ及びＬＡの繰り返し単位の数である）、エチレングリコール−乳酸−カプロラクトンコポリマー（ｎＥＧｍＬＡｚＣＬ）、ＰＬＡ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡ、ＰＬＡ−ｇ−ＰＶＡ、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−ε−カプロラクトン）、（ポリ）−無水物、ウレタン、デキストラン、コラーゲン、及びフマル酸ジエチル／ポリ（フマル酸プロピレン）から選択され得る。
【００３８】
例示的な実施形態において、光重合可能な残基は、ＰＥＧ−ジアクリレートである。ＰＥＧの分子量は、例えば、約１０００Ｄａ〜約３０，０００Ｄａ、約２０００Ｄａ〜約８０００Ｄａであり得る。例えば、ＰＥＧの分子量は、約１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、１０，０００、１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００、２０，０００、２１，０００、２２，０００、２３，０００、２４，０００、２５，０００、２６，０００、２７，０００、２８，０００、２９，０００、又は３０，０００Ｄａであり得る。例示的な実施形態において、ＰＥＧ−ジアクリレートは、約６０００Ｄａの分子量を有するＰＥＧ−ジアクリレート６Ｋである。ＰＥＧの分子量は、被包の効率及び／又はポリマーの厚みに影響し得る。当業者は、使用される細胞及び方法の特定の適用を含む様々な要因に依存して、通例の実験だけで、最適な分子量を特定することができる。
【００３９】
例えば、光開始剤は、エオシン（エオシンＹ等）、１−シクロヘキシルフェニルケトン、２，２−ジメトキシ−２−フェニルアセトフェノン（ＤＭＰＡ）、２−ヒドロキシ−１−［４−（ヒドロキシエトキシ）フェニル］−２−メチル−１−プロパノン又はカンファキノン／アミンから選択され得、アミンは、例えば、トリエチルアミン、トリエタノールアミン又はエチル４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ安息香酸である。
【００４０】
例示的な実施形態において、光開始剤は、エオシンＹ及び／又はトリエタノールアミン等の染料を含む。光開始剤系は、エオシンＹ及びトリエタノールアミンを含み得る。エオシンＹは、例えば、約５ｍＭ〜約５００μＭの濃度で使用され得る。例えば、エオシンＹの濃度は、約５ｍＭ、２０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、２５０ｍＭ、５００ｍＭ、７５０ｍＭ、１μＭ、５０μＭ、１００μＭ、１５０μＭ、２００μＭ、２５０μＭ、３００μＭ、３５０μＭ、４００μＭ、４５０μＭ又は５００μＭであってもよい。例示的な実施形態において、エオシンＹは、約１００μＭで使用される。エオシンＹの濃度は、被包の効率に影響し得る。当業者は、使用される細胞及び方法の特定の適用を含む様々な要因に依存して、通例の実験だけで、最適な濃度を特定することができる。
【００４１】
トリエタノールアミンは、例えば、約１００ｍＭ〜約５００ｍＭの濃度で使用され得る。例えば、トリエタノールアミンの濃度は、約１００ｍＭ、１２５ｍＭ、１５０ｍＭ、１７５ｍＭ、２００ｍＭ、２２５ｍＭ、２５０ｍＭ、２７５ｍＭ、３００ｍＭ、３２５ｍＭ、３５０ｍＭ、３７５ｍＭ、４００ｍＭ、４２５ｍＭ、４５０ｍＭ、４７５ｍＭ又は５００ｍＭであってもよい。例示的な実施形態において、トリエタノールアミンは、約２２５ｍＭの濃度で使用される。トリエタノールアミンの濃度は、被包の効率及び／又はポリマーの厚みに影響し得る。当業者は、使用される細胞及び方法の特定の適用を含む様々な要因に依存して、通例の実験だけで、最適な濃度を特定することができる。
【００４２】
光重合は、１−ビニル−２−ピロリジノン等の促進剤の存在下で実施され得る。１−ビニル−２−ピロリジノンは、例えば、約１５ｍＭ〜約１００ｍＭの濃度で使用され得る。例えば、１−ビニル−２−ピロリジノンの濃度は約１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、５５ｍＭ、６０ｍＭ、６５ｍＭ、７０ｍＭ、７５ｍＭ、８０ｍＭ、８５ｍＭ、９０ｍＭ、９５ｍＭ又は１００ｍＭであってもよい。例示的な実施形態において、１−ビニル−２−ピロリジノンは、約３７ｍＭの濃度で使用される。１−ビニル−２−ピロリジノンの分子量は、被包の効率及び／又はポリマーの厚みに影響し得る。当業者は、使用される細胞及び方法の特定の適用を含む様々な要因に依存して、通例の実験だけで、最適な濃度を特定することができる。
【００４３】
例示的な実施形態において、被包された細胞は、１−ビニル−２−ピロリジノンを促進剤として使用して、可視光を照射するときに、エオシンＹ及びトリエタノールアミンで開始することによって、ＰＥＧ−ジアクリレートプレポリマー溶液を光重合することによって形成される。このような実施形態において、ＰＥＧ−ジアクリレートの光重合について光開始剤系は、エオシン染料、トリエタノールアミン及び１−ビニル−２−ピロリジノンを含むと考えられ得る。特定の例示的な実施形態において、被包は、
−  細胞を光開始剤、任意にエオシンＹで処理すること、
−  細胞を洗浄すること、
−  細胞を、アミン、任意にトリエタノールアミンの存在下で、光重合可能な残基、任意にＰＥＧ−ジアクリレートを含む溶液で処理すること、
−  細胞を、任意に１−ビニル−２−ピロリジノン等の促進剤の存在下で、可視光源に暴露して、細胞を被包することを含む。
【００４４】
例示的な実施形態において、光重合による細胞を被包するプロセスは、被包指示薬で共被包することを含み、得られる被包層は、光重合されたポリマーと被包指示薬の両方を含む。被包指示薬を被包層に組み込むことによって、得られる細胞への被包の成功を指示薬を観察することによって検証することができ、被包及び非被包細胞の混合試料に被包された細胞を検出することができる。例示にすぎないが、被包指示薬は、標識されたナノビーズ、例えば、蛍光標識されたポリスチレンナノビーズを含み得る。細胞がナノビーズと共被包される場合、ナノビーズを被包層に組み込み、洗浄後であっても細胞に結合したままである。ナノビーズの蛍光の観察を使用して、細胞の被包が成功したかどうかを検証することができる。例示的な実施形態において、共被包は、光重合を行う前に、被包指示薬を光重合可能な残基に加えることによって行われる。
【００４５】
特定の実施形態において、真核細胞に発現される配列のライブラリから、１つ以上の所望の特性を有するポリペプチド又はタンパク質を選択する方法は、
−  光重合によって細胞を被包すること、
−  被包された細胞を可溶化して、半透性マイクロカプセルを作製し、
−  任意に、細胞及び／又はマイクロカプセルを１つ以上の薬剤に接触させて、目的のポリペプチド又はタンパク質の活性又は機能の検出を促進し、
−  １つ以上の所望の特性を有する目的のポリペプチド又はタンパク質を選択すること含み、光重合による細胞を被包するステップは、被包指示薬で細胞を共被包することを含む。
【００４６】
真核細胞に発現される配列のライブラリから、１つ以上の所望の特性を有するポリペプチド又はタンパク質を選択する方法は、前述の被包方法が適用され得、国際公開第２０１３／１０４６８６号パンフレットに記載され示されるように、適切なｃｅｌｌｕｌａｒ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ（ＣＨＥＳＳ）法であってもよく、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。したがって、ライブラリの構築、被包された細胞の可溶化、及び所望の特性を有する（例えば、リガンド又は目的のポリペプチド又はタンパク質に結合するその他の基質の検出によって）目的のポリペプチド又はタンパク質の選択に対する方法及びアプローチは、国際公開第２０１３／１０４６８６号パンフレットに記載され、本開示に等しく適用することができる。
【００４７】
広義には、元々考えられていたＣＨＥＳＳは、１）変異体タンパク質を細胞にコードし、細胞にタンパク質を発現する遺伝子ライブラリを形質転換し、２）細胞を被包し、３）細胞膜を洗剤で可溶化、又は透過性にし、４）タンパク質をリガンド（例えば、標識されたリガンド又は酵素基質）に接触させ、被包層は、タンパク質の変種及びそのコード遺伝子をカプセルに保持するが、リガンドをカプセルに入れ、機能的タンパク質に結合することができる半透性バリアとしての役割を有し、５）例えばＦＡＣによってカプセルを整列し、リガンドに強く結合する（すなわち活性を保持する）変異体を含むカプセルは、より強い検出可能なシグナルを表示し（例えば、より多くの標識されたリガンドを含む）、６）遺伝子を整列したカプセルから回収し、並びに７）さらなるラウンドの変異又は選択のために、コードされた／所望の変異体タンパク質を同定し、及び／又はテンプレートとして遺伝子を使用することを伴う。ＣＨＥＳＳは、元来、洗剤安定のＧタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）を同定するためのハイスループット法として設計された。しかし、可溶性又は膜結合された任意のタンパク質の定向進化に適用することができ、一体型膜タンパク質、イオンチャンネル、酵素、核受容体、転写因子、ＤＮＡ／ＲＮＡ結合タンパク質、抗体及びその断片（例えば、ダイアボディ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ジスルフィド安定Ｆｖ断片（ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）２、二重特異性ｄｓＦｖ（ｄｓＦｖ−ｄｓＦｖ’））、ジスルフィド安定ダイアボディ（ｄｓダイアボディ）、一本鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）、ＤＡＲＰｉｎ、ＦＡＢ、ナノボディ又は一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ））を含む。
【００４８】
本明細書に記載されるように、所望の特徴を有するポリペプチド又はタンパク質を選択する前に、本来のＣＨＥＳＳ法に考えられるように、被包及び可溶化によって作製されたマイクロカプセルを、リガンド又は目的のポリペプチド若しくはタンパク質に結合する基質に接触させ得る。しかし、本明細書に記載の被包及び選択方法の使用について、細菌細胞よりも真核細胞を使用する非常に有利な点は、機能的タンパク質の変異体を選択するその他の方法を、リガンド結合の他に、又は適切なリガンドが存在しない場合にリガンド結合の代わりに使用することができることである。これは、目的のタンパク質が、タンパク質の生理学作用に必要とされる重要な機構を保持する細胞に発現するためである。
【００４９】
したがって、本開示の方法は、細胞及び／又はマイクロカプセルを１つ以上の薬剤に接触させて、目的のポリペプチド又はタンパク質の活性又は機能の検出を容易にする任意の１つのステップ又は複数のステップを含む。１つ以上の薬剤は、以下の記載するように、ポリペプチド又はタンパク質の活性又は機能を容易に検出することができるリガンド、基質又はその他のバイオセンサーを含み得る。接触ステップ（１つ又は複数）は、被包ステップと可溶ステップの何れか又は両方の前、同時に、又は後に行われ得る。例示に過ぎないが、方法で使用する真核細胞は、蛍光タンパク質を発現するレポーター遺伝子を保持し得、細胞は、被包の前に適切なアゴニストで刺激され得、目的の機能的ポリペプチド又はタンパク質の存在下で、レポーター遺伝子を切り替え、細胞が蛍光タンパク質を発現する。複数の接触ステップを使用する場合、各ステップは、細胞又はマイクロカプセルを同じ又は異なる薬剤に接触させることを含み得、各ステップは、被包及び可溶化ステップについて同じ時間又は異なる時間に行われ得る。
【００５０】
当業者によって理解されるように、本開示は、目的のポリペプチド又はタンパク質の活性又は機能を検出するために、接触ステップは必要ではなく、それによって、１つ以上の所望の特性を有する目的のポリペプチド及びタンパク質の選択が容易になる。例えば、細胞は、目的のポリペプチド又はタンパク質の活性又は機能の検出を容易にするために必要とされるリガンド、基質又はその他のセンサーを自然に発現し、生成し、又は含む（又は、発現、生成又は含むために、本開示の方法を使用する前に、改変され、又は操作され得る）。例示に過ぎないが、真核細胞は、目的の機能的又は活性ポリペプチド又はタンパク質と相互作用することができる蛍光タンパク質とタンパク質又はポリペプチドの間に、融合タンパク質を発現するように設計され得る。このように、目的のポリペプチド又はタンパク質の活性又は機能は、外因性薬剤を加える必要がなく、検出又はモニタリングすることができる。前述のように、これは、ＣＨＥＳＳ並びに真核細胞の関連の選択及びスクリーニング方法を可能にする際に、本発明によって提供される主要な利点の１つを強調する。
【００５１】
目的のポリペプチド又はタンパク質に結合し、ＣＨＥＳＳ及び関連の方法の使用に適したリガンドは、当業者によって特定される。いくつかの例において、リガンドは、蛍光染料（例えば、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール、ジヒドロクロリド（ＤＡＰＩ）、５−又は６−カルボキシフルオセイン（５−ＦＡＭ及び６−ＦＡＭ）又はフルオレセイン等のキサンテン染料、５−又は６−カルボキシテトラメチルローダミン（５又は６−ＴＡＭＲＡ）等のローダミン染料及びシアニン染料）等の検出可能な標識を含む。その他の例では、リガンドは、酵素基質であり、タンパク質の変種（この実施形態では酵素である）の結合によって検出可能なシグナルを生成される。例えば、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム臭化物（ＭＴＴ）は、フマル酸還元酵素の変異体についてのリガンドとして使用することができ、この活性変異体は、ＭＴＴを不溶性、紫色のホルマザンに還元する。リガンドは、核酸分子、ペプチド又はタンパク質であり得、例えば、タンパク質の天然リガンド、並びに抗体及びその断片等の設計されたタンパク質リガンド（例えば、Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ（すなわちナノボディ））を含む。
【００５２】
あるいは又はさらに、機能的タンパク質の変種及び変異体の選択は、タンパク質の二量体化、その他の細胞タンパク質との相互作用、シグナル伝達経路の刺激、遺伝子転写の活性、キナーゼ活性、イオンチャンネルの活性、タンパク質変性の活性、タンパク質の内部移行、膜再編成、細胞酵素の活性、及びタンパク質輸送の活性等のタンパク質機能の蛍光読み出し情報に基づいてもよい。このような蛍光読み出し情報は、例えば、蛍光染料での染色又はレポーター染料、蛍光タンパク質融合タンパク質の組み換え発現、二分子蛍光相補性パートナー融合タンパク質、蛍光タンパク質融合タンパク質の組み換え発現によって得ることができ、蛍光タンパク質は、タンパク質間相互作用の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）検出の対、シグナルセンサーの組み換え発現（例えば、ｃＡＭＰについてのＣＡＭＹＥＬ  ＦＲＥＴセンサー、カルシウムについてのＧＣａＭＰ、電圧センサー）、又は蛍光タンパク質若しくは酵素を発現するレポーター遺伝子である。
【００５３】
例示に過ぎないが、ＧＰＣＲ変種又は変異体の同定及び選択について、ＦＲＥＴドナー／アクセプター蛍光タンパク質−ＧＰＣＲ融合タンパク質は、ＦＲＥＴドナー／アクセプター蛍光タンパク質−Ｇタンパク質と共発現し得、ＧＰＣＲとこれらのエフェクタータンパク質との相互作用は、ＦＲＥＴを使用して又は受容体の二量体化をモニタリングすることによってモニターされる（例えば、Ｐｆｌｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｅｉｄｎｅ（２００５）Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｙｎａｍｉｃ  Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｉｎ  ｌｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ３８５：６２５−６３７を参照のこと）。ある範囲の代替のバイオセンサーベースのラベリングアプローチは、当業者に周知であり、例えば、ＦＲＥＴベースのセンサー、生物発光共鳴エネルギー転移（ＢＲＥＴ）ベースのセンサー、及びランタニドベースのｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｔｉｍｅ  ｒｅｓｏｌｖｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（ＨＴＲＦ）センサーが挙げられる。適切なセンサーの非限定的な例は、例えば、Ｔａｉｎａｋａ等（２０１０）Ｄｅｓｉｇｎ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｏｆ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｓｅｎｓｏｒｓ  １０：１３５５−１３７６に記載されている。
【００５４】
例えば、細胞をカルシウム感知染料及びモニタリングされる受容体誘発性カルシウムシグナル伝達で標識し得、特定の遺伝子の受容体活性をレポーターアッセイを使用してモニタリングし得（例えば、Ｈｉｌｌ等（２００１）Ｒｅｐｏｒｔｅｒ−ｇｅｎｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １：５２６−５３２を参照のこと）、又はＣＡＭＹＥＬ等のＦＲＥＴベースのシグナル伝達センサーが共発現し得る（例えば、Ｍａｔｔｈｉｅｓｅｎ  ａｎｄ  Ｎｉｅｌｓｅｎ（２０１１）Ｃｙｃｌｉｃ  ＡＭＰ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｍｅａｓｕｒｅｄ  ｉｎ  ｔｗｏ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ＨＥＫ２９３  ｃｅｌｌｓ：ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ  Ｋ（Ｍ）ｉｓ  ｍｏｒｅ  ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  ｔｈａｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ６を参照のこと）。
【００５５】
タンパク質の変異体をコードする遺伝子ライブラリを当業者に周知の方法を使用して、細胞に調製、トランスフェクト又は形質導入することができる。例えば、本開示に従って真核細胞を形質導入する際に使用される適切なベクターとして、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルスベクターが挙げられる。適切なレトロウイルスベースのシステムの一例は、レトロウイルスベクター及び形質導入を含む。本開示に従って使用に適したいくつかのレンチウイルスベクター及び形質導入システムは、市販されており、当業者に周知である。小分子量タンパク質が目的のタンパク質である場合、そのタンパク質を他のオリゴペプチド又はタンパク質に対する融合物として作製して、より大きい構造（例えば、三重ＧＦＰタグ）を形成することができる。そのため、いくつかの実施形態において、遺伝子ライブラリは、融合タンパク質をコードする融合遺伝子を含む。
【００５６】
遺伝子の多様なライブラリ（すなわち、遺伝子多様化）を作製する方法は、当該技術分野で周知であり、他にも記載されている（例えば、Ｐａｃｋｅｒ  ａｎｄ  Ｌｉｕ（２０１５）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ  １６：３７９−３９３を参照のこと）。遺伝子多様化は、ランダム変異誘発、集束変異誘発又はその組み合わせを伴い得る。これらの方法として、限定されないが、化学的又は環境的変異誘発（例えば、亜硝酸、ＵＶ照射及び亜硫酸水素塩）、変異誘発株の使用（例えば、ＸＬ１−ｒｅｄ  Ｅ．ｃｏｌｉ）、エラープローンＰＣＲ、部位特異的飽和変異誘発、相同性組換え（例えば、ＤＮＡ混合、ファミリー混合、スタガードエクステンションプロセス（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ）（ＳｔＥＰ）、ランダムキメラジェネシス・オン・トランジエントテンプレート（ｒａｎｄｏｍ  ｃｈｉｍｅｒａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｎ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｔｅｍｐｌａｔｅｓ）（ＲＡＣＨＩＴＴ）、核酸交換及び除去技術（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ａｎｄ  ｅｘｃｉｓｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（ＮＥｘＴ）、遺伝性組み換え、アセンブリ・オブ・デザインドオリゴヌクレオチド（ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）（ＡＤＯ）及び合成混合）、並びに非相同性組み換え（例えば、インクレメンタルトランケーション・フォー・ハイブリッドエンザイム（ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ  ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃｒｅａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄ  ｅｎｚｙｍｅｓ）（ＩＴＣＨＹ）、シークエンスホモロジー−インデペンデントプロテインリコンビネーションｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）（ＳＨＩＰＲＥＣ）、非相同ランダム組み換え（ｎｏｎ−ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒａｎｄｏｍ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）（ＮＲＲ）、シークエンスインデペンデントサイトディレクテッドキメラジェネシス（ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｃｈｉｍｅｒａｇｅｎｅｓｉｓ）（ＳＩＳＤＣ）、オーバーラップエクステンションＰＣ）（Ｐａｃｋｅｒ  ａｎｄ  Ｌｉｕ（２０１５）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ  １６：３７９−３９３のレビューを参照のこと）が挙げられる。
【００５７】
可溶化ステップは、細胞壁又は外側の膜を破壊し、細胞内部を暴露し、被包ステップの最中に細胞に適用されるコーティング剤は、細胞の構造及び分子を保持して、次のステップでプローブされる。可溶化ステップは、被包ステップの最中に、細胞に被覆される層を破壊しない方法を使用してもよい。非限定的な例として、洗剤、パーフォリン、リゾチームによる処理、穏やかな超音波処理、高浸透圧性又は低浸透圧ショック、電気泳動、アルコール又はその他の有機溶媒による処理、凍結融解サイクル、カプセルの加熱及び沸騰、並びに圧力勾配が挙げられる。いくつかの特定の実施形態において、被包された細胞の膜を可溶化することは、被包された細胞を水溶液中の洗剤に暴露することを含む。
【００５８】
本開示の実施形態に従って、当業者に周知の方法を使用して、選択されたポリペプチド又はタンパク質をコードする配列を抽出し、カプセルから単離することができる。このように単離された配列をさらなる分析に供してもよく、例えば、細胞にサブクローニング及び再トランスフェクション、形質導入又は形質転換して、１つ以上のさらなるラウンドの選択又はスクリーニングを容易にすることを含み、本開示の主題の方法又は当該技術分野で周知の適切なその他の方法を使用する。このようなさらなるラウンドの選択又はスクリーニングの前に、配列を変異誘発し、又は改変し若しくは操作してもよい。
【００５９】
当業者は、広義に記載される本開示の趣旨又は範囲を逸脱することなく、多くの変形例及び／又は修正が本開示になされ得ることを理解する。本発明の実施形態は、したがって、全てに関して、例示であり、限定するものとして考えられるべきではない。
【００６０】
本開示は、さらに、以下の特定の例を参照することにより、より詳細に記載され、この例は、いかなる場合においても本開示の範囲を限定するものとして考えるべきではない。
【実施例】
【００６１】
実施例１−哺乳動物の被包
２２５ｍＭのトリエタノールアミン（ＴＥＡ、Ｓｉｇｍａ９０２７９）及び３７ｍＭの１−ビニル−２−ピロリジノン（ＶＰ、ＳｉｇｍａＶ３４０９）を有するｐＨ８のフェノールレッドを含まない完全ＤＭＥＭ培地に、２５％のＰＥＧジアクリレート６Ｋ（Ｓｉｇｍａ７０１９６３）を含むＰＥＧジアクリレート前駆体溶液を調製した。溶液を０．２２μｍのシリンジフィルターを使用してろ過滅菌し、１５分間のアルゴンによる通気によって酸素を除去した。
【００６２】
ＧＦＰ及びヒト胚腎臓細胞を発現し、安定したニューロテンシン受容体１（ＮＴＳ１）を安定的に発現するヒト胚腎臓（ＨＥＫ）２９３Ｔ細胞を１５００Ｇで２分間ペレット状にし、過剰な培地を取り除き、フェノールレッドを含まないＤＭＥＭ培地の１００μＭのエオシンＹ（ＥＹ、ＳｉｇｍａＥ４００９）で、ペレットを５分間染色した。染色したペレットをフェノールレッドを含まないＤＭＥＭ培地で３回洗浄し、２ｍｌのＰＥＧジアクリレート前駆体溶液に再懸濁した。細胞を２４ウェルプレートに分注し、ＰＯＬＡＲｓｔａｒ  Ｏｍｅｇａプレートリーダー（ＢＭＧ  ＬａｂＴｅｃｈ）を使用して、分光光度計モードで（ブロードに発光する波長）、プレートを振盪しながら、５８秒間照射した。被包された細胞をフェノールレッドを含まないＤＭＥＭ培地又はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄した。
【００６３】
図１に示されるように、１％の３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）の存在下でＨＥＫ細胞の光顕微鏡分析を行ったところ、被包された細胞の細胞構造及び統一性が２４時間後も保持され（図１Ｄ）、非被包の細胞は溶解した（図１Ｂ）ことを示す。１％のＣＨＡＰＳの存在又は非存在下で、ＧＦＰを発現する被包及び非被包ＨＥＫ細胞の共焦点顕微鏡分析は、同じ結果を明らかにした（データ示さず）。
【００６４】
実施例２−被包された細胞のフローサイトメトリー分析
ｅＧＦＰを安定的に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を実施例１に記載のように被包した。非被包及び被包細胞の試料をＰＢＳ又は１％のＣＨＡＰＳを有するＰＢＳに２２℃で２４時間インキュベートした。試料を、被包後最初に、又は２４時間の処理の後にフローサイトメトリーで分析した。少なくとも１０００個の単一の被包された細胞のＧＦＰ蛍光をモニタリングして（４８８ｎｍの励起、５３０ｎｍ±３０ｎｍの発光）、各カプセル内部に保持されるＧＦＰの量をモニタリングした。フローサイトメトリー分析は、被包によって、非被包細胞よりも、洗剤の存在下で細胞の喪失が有意に減少したことを示す（図２Ａ）。洗剤による処理は、細胞に「孔」を作製し、ＧＦＰを漏出することができる（図２Ｂ）。
【００６５】
さらなる受容体結合の試験のために、洗剤安定性ニューロテンシン受容体１（ＧＰＣＲ）を安定的に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（２０１３）Ｄｉｒｅｃｔ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ−ｓｔａｂｌｅ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｕｓｉｎｇ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２５：６６２−６７７を参照のこと）を実施例１と同様に被包し、ＰＢＳ又は２％のｎ−デシル−β−Ｄ−マルトピラノシド（ＤＭ）を含むＰＢＳで、２５℃で２４時間インキュベートした。また、１００ｎＭのフルオセイン標識ニューロテンシンペプチド（ＦＡＭ−ＮＴ８−１３）又は１００ｎＭのＦＡＭ−ＮＴ及び１０μＭの非標識ニューロテンシンペプチド（ＮＴ８−１３）を競合者として、試料を処理した。被包された細胞に結合する特定のペプチドをフローサイトメトリーで特定し、少なくとも１０００個の被包された単一細胞のフルオセイン蛍光（４８８ｎｍの励起、５３０ｎｍ±３０ｎｍの発光）をモニタリングした。この分析によって、生成されたシグナルが洗剤による受容体の変性によって減少したものの、ニューロテンシン結合能力が洗剤の存在下で保持されることを示した（図３Ｂ）。
【００６６】
実施例１及び２の本明細書に記載の実験は、光重合による哺乳動物細胞の被包が、Ｇタンパク質結合受容体に結合するリガンドを充分に検出することができる、２５℃で少なくとも２日間安定する洗剤安定性マイクロカプセルを生成することを示す。
【００６７】
実施例３−哺乳動物細胞のナノビーズ共被包
１０μｇ／ｍＬのドラゴン−グリーンで標識された直径２００ｎｍのポリスチレンビーズ（ナノビーズ）を、照射前に、実施例１に記載の得られたＰＥＧジアクリレート−ＨＥＫ２９３−Ｔ細胞の被包混合物に加えた。ドラゴン−グリーンのナノビーズはＢａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．から入手し、ドラゴン−グリーンは、最大５０１ｎｍの励起波長、及び最大５１０ｎｍの発光波長を有する染料である。混合物に照射し、被包された細胞を実施例１に記載のように洗浄した。被包されていないドラゴン−グリーンのナノビーズでインキュベートされた裸細胞、ナノビーズを含まない被包された細胞、及びナノビーズ共被包細胞の少なくとも５０００個の単一の裸細胞のドラゴン−グリーン蛍光をフローサイトメトリーを使用して評価した。フローサイトメトリーによって分析した試料を、メタノール処理で５分間固定し、透過光及び蛍光顕微鏡による分析のために、カバースリップに固定し、２０倍の対物レンズを使用して、全ての顕微鏡画像を同じ設定で得た。図５及び６の画像のスケールバーは、約５０μＭの長さを示す。
【００６８】
図４に示されるように、ドラゴン−グリーンナノビーズで共被包された細胞に結合したドラゴン−グリーン蛍光がフローサイトメトリーで観察された（「Ｅｎｃａｐｅｄ細胞＋ビーズ」）。ドラゴン−グリーンナノビーズ単独は、サイズが小さいことによって、フローサイトメトリーで観察することができなかった（データ示さず）。共被包された細胞とは対照的に、ドラゴン−グリーン蛍光は、被包のない１０μｇ／ｍＬのドラゴン−グリーンナノビーズでインキュベートされた裸細胞（「裸細胞＋ビーズ」）においても、裸（非被包）細胞（「裸細胞」）においても、ドラゴン−グリーンナノビーズを有さない被包された細胞（「被包された細胞」）においても観察されなかった。
【００６９】
乾燥し、凝集したドラゴン−グリーンナノビーズの蛍光を図５に示されるように、蛍光顕微鏡で観察した。ナノビーズは小さすぎるため、透過光モード下で溶解しない。図６は、細胞試料の透過光及び蛍光顕微鏡画像を示す。裸細胞（図６Ａ）、ドラゴン−グリーンナノビーズでインキュベートした裸細胞（図６Ｃ）、被包された細胞（図６Ｅ）及びドラゴン−グリーンビーズで共被包された細胞（図６Ｇ）は、透過光モード下で、同じサイズ（直径約１５μＭ）及び形状であった。裸細胞（図６Ｂ）又は被包された細胞（図６Ｆ）についてはドラゴン−グリーン蛍光が観察されなかったが、いくつかの不鮮明な蛍光は、点状のナノビーズ様蛍光ではないもののドラゴン−グリーンナノビーズでインキュベートした裸細胞に結合した（図６Ｄ）。強い、点状の蛍光は、ドラゴン−グリーンナノビーズで共被包された細胞の周囲で局所化した（図６Ｈ）。
【００７０】
これらの分析は、ナノビーズが、細胞の周囲の被包ＰＥＧ層に捕捉され、さらに洗浄した後も、ナノビーズが被包された細胞に結合したままであることを示す。したがって、蛍光ナノビーズで共被包することによって、混合した試料において順調な被包を検証し、順調に被包された細胞を検出することができる。
【００７１】
実施例４−ナノビーズ共被包後の洗剤の処理
実施例３で生成したように、ドラゴン−グリーンナノビーズで共被包された細胞を１％のｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド（ＤＤＭ）で、室温で３時間（フローサイトメトリー分析のために）処理し、（顕微鏡分析のために）２４時間処理した。ドラゴン−グリーンナノビーズで共被包された細胞、及び３時間洗剤で処理した共被包された細胞の少なくとも５０００個の単一の被包された細胞のドラゴン−グリーン蛍光をフローサイトメトリーによって評価した。洗剤で処理されたナノビーズ共被包細胞のメタノール固定によって、カプセルが溶解し（データ示さず）、そのため、洗剤で２４時間処理した試料を、固定することなくカバークリップに置き、透過光及び蛍光顕微鏡によって分析した。
【００７２】
図７に示されるように、ナノビーズ共被包細胞の洗剤処理によって、いくらかドラゴン−グリーン蛍光が減少し、これは、洗剤処理の後に、被包された細胞に結合したナノビーズの数の減少によるものと思われる。
【００７３】
図８Ａは、洗剤で処理した２４時間後の共被包細胞の透過光顕微鏡画像を示し、細胞様カプセルの集団を明らかにしている。これらの細胞様カプセルは、洗剤で処理しなかった共被包細胞に比べて蛍光は減少したものの、図８Ｂの蛍光顕微鏡画像に示されるように、ドラゴン−グリーン蛍光をいくらか示した（図６Ｈ）。
【００７４】
これらの結果は、ナノビーズとの共被包が、洗剤処理後に適切に形成されたカプセルの識別を可能にすることを示し、さらに、本明細書に記載の被包方法が洗剤抵抗性のカプセルを生み出すことを示している。
参考文献
Baroli, B. Photopolymerization of biomaterials: issues and potentialities in drug delivery, tissue engineering and cell encapsulation technologies, J Chem Technol Biotechnol, 81:491-499 (2006)
Hill, SJ. et al. Reporter-gene systems for the study of G-protein-coupled receptors. Curr Opin Pharmacol 1:526-532 (2001)
Matthiesen, K and Nielsen, J. Cyclic AMP control measured in two compartments in HEK293 cells: phosphodiesterase K(M) is more important than phosphodiesterase localization. PLoS One 6 (2011)
Packer, MS and Liu, DR. Methods for the directed evolution of proteins. Nat Rev Genet 16:379-393 (2015)
Pfleger, KD and Eidne, KA. Monitoring the formation of dynamic G-protein-coupled receptor-protein complexes in living cells. Biochem J 385:625-637 (2005).
Scott, DJ and Pluckthun, A. Direct molecular evolution of detergent-stable G protein-coupled receptors using polymer encapsulated cells. J. Mol. Biol. 425:662-677 (2013)
Tainaka, K et al. Design strategies of fluorescent biosensors based on macromolecule receptors. Sensors 10:1355-1376 (2010)
Yong, KJ and Scott, DJ. Rapid directed evolution of stabilized proteins with cellular high-throughput encapsulation solubilization and screening (CHESS), Biotechnol Bioeng 112:438-446 (2015)
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【国際調査報告】
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