(57)【要約】  本開示は、アミロイド形成の予防及びパーキンソン病等のシヌクレオパチーを含むアミロイド関連障害の治療に有用な化合物を提供する。
2020529432.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容可能な塩：
【化１】
2020529432.tif 000103
式中：
Ｌ１は結合又は−Ｎ（Ｒ５）（Ｃ＝Ｏ）−であり；
Ｌ２は−（Ｃ＝Ｏ）−又は−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−であり；
Ｇ１は−Ｎ（Ｒ５）２又はＲ６であり；
Ｇ２は−Ｈ、−Ｎ（Ｒ５）２又は−Ｎ（Ｒ５）（Ｒ６）であり；
Ｒ５は、それぞれ独立して、−Ｈ又はＣ１〜６アルキルであり；
Ｒ６は、ｎ個のＲ７で置換されたアリールであり；
Ｒ７は、それぞれ独立して、−Ｆ、−ＯＨ、又は−Ｏ（Ｃ１〜６アルキル）であり；
ｎは０、１、２、又は３である。
【請求項２】
式（Ｉ）が式（Ｉ−ａ）である、請求項１に記載の化合物：
【化２】
2020529432.tif 000104
【請求項３】
（ａ）前記化合物が少なくとも１つのＲ６の例を含む；及び／又は
（ｂ）前記化合物が少なくとも３つのＲ７の例を含む；及び／又は
（ｃ）前記化合物が以下の構造を持たない：
【化３】
2020529432.tif 000105
である場合、式中、
Ｇ１がＲ６であり；
Ｇ２が−ＮＨ２又は−Ｎ（Ｒ５）（Ｒ６）であり；
Ｒ５が−Ｈ又は−ＣＨ３であり；
Ｒ６が、ｎ個のＲ７の例で置換されたフェニルであり；
Ｒ７が、それぞれ独立して、−Ｆ、−ＯＨ、又は−ＯＣＨ３であり；
ｎが０、１、２、又は３である、請求項２に記載の化合物又は薬学的に許容可能な塩。
【請求項４】
Ｒ５が−ＣＨ３である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項５】
式（Ｉ）が式（Ｉ−ｂ）である、請求項１に記載の化合物：
【化４】
2020529432.tif 000106
【請求項６】
Ｇ１がＲ６である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項７】
Ｇ２が−ＮＨ２である、請求項１〜６のいずれか１項記載の化合物。
【請求項８】
Ｇ２が−Ｎ（Ｒ５）（Ｒ６）である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項９】
式（Ｉ−ｂ）が式（Ｉ−ｂ−１）又は式（Ｉ−ｂ−２）である、請求項５に記載の化合物：
【化５】
2020529432.tif 000107
【請求項１０】
各Ｒ７が、−ＯＨ及び−ＯＣＨ３から独立して選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１１】
３個〜５個のＲ７の例を有する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１２】
各Ｒ６が、以下から独立して選択される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の化合物：
【化６】
2020529432.tif 000108
【請求項１３】
各Ｒ６が、以下から独立して選択される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の化合物：
【化７】
2020529432.tif 000109
【請求項１４】
各Ｒ６が、以下から独立して選択される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の化合物：
【化８】
2020529432.tif 000110
【請求項１５】
表１の化合物から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物又はその薬学的に許容可能な塩。
【請求項１６】
以下から選択される、請求項１５に記載の化合物及びその薬学的に許容可能な塩：
【化９】
2020529432.tif 000111
【請求項１７】
式（ＩＩ）の化合物又はその薬学的に許容可能な塩：
【化１０】
2020529432.tif 000112
式中：
Ｌ１は結合であり；
Ｌ２は結合、−ＣＨ２−、−（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−、又は−ＮＲ２（Ｃ＝Ｏ）−であり；
Ｇ１は−Ｈ又はＲ３であり；
Ｇ２は−Ｈ、−Ｎ（Ｒ２）２、−Ｎ（Ｒ２）（Ｒ３）又はＲ３であり；
Ｒは−Ｈ又はＣ１〜６アルキルであり；
Ｒ１は−Ｆ、−ＯＨ、又は−Ｏ（Ｃ１〜６アルキル）であり；
Ｒ２は、それぞれ独立して、−Ｈ又はＣ１〜６アルキルであり；
Ｒ３は、ｎ個のＲ４の例で置換されたアリールであり；
Ｒ４は、それぞれ独立して、−Ｆ、−ＯＨ、又は−ＯＣＨ３であり；
ｎは、それぞれ０、１、２、３、又は４であり；
ｍは０、１、２、３、又は４である。
【請求項１８】
式中：
Ｌ１が結合であり；
Ｌ２が結合、−ＣＨ２−、−（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−、又は−ＮＲ２（Ｃ＝Ｏ）−であり；
Ｇ１が−Ｈ又はＲ３であり；
Ｇ２が−Ｎ（Ｒ２）（Ｒ３）又はＲ３であり；
ＲがＨ又は−ＣＨ３であり；
Ｒ１が−ＯＨ又は−ＯＣＨ３であり；
Ｒ２が−Ｈ又は−ＣＨ３であり；
Ｒ３が、ｍ個のＲ４の例で置換されたフェニルであり；
Ｒ４が、それぞれ独立して、−Ｆ、−ＯＨ、又は−ＯＣＨ３であり；
ｎが、それぞれ０、１、２、３、又は４であり；
ｍが０、１、２、３、又は４である、請求項１７に記載の化合物又はその薬学的に許容可能な塩。
【請求項１９】
（ａ）前記化合物が、少なくとも１つのＲ３の例を含む；及び／又は
（ｂ）ｍとｎの全ての例の合計が少なくとも３である；及び／又は
（ｃ）前記化合物が以下の構造を持たない：
請求項１７〜１８のいずれか１項に記載の化合物。
【化１１】
2020529432.tif 000113
【請求項２０】
式（ＩＩ）が式（ＩＩ−ａ）又は式（ＩＩ−ｂ）である、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の化合物。
【化１２】
2020529432.tif 000114
【請求項２１】
式（ＩＩ−ａ）が式（ＩＩ−ａ−１）又は式（ＩＩ−ａ−２）である、請求項２０に記載の化合物。
【化１３】
2020529432.tif 000115
【請求項２２】
式（ＩＩ−ｂ）が式（ＩＩ−ｂ−１）又は式（ＩＩ−ｂ−２）である、請求項２０に記載の化合物。
【化１４】
2020529432.tif 000116
【請求項２３】
ＲがＨである、請求項１７〜２２のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２４】
Ｒが−ＣＨ３である、請求項１７〜２２のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２５】
Ｒ２がＨである、請求項１７〜２２のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２６】
Ｒ２が−ＣＨ３である、請求項１７〜２２のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２７】
Ｒ４が、それぞれ個別に、−ＯＨ又は−ＯＣＨ３である、請求項１７〜２２のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２８】
ｎの全ての例の合計が１〜６である、請求項１７〜２７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２９】
ｍが１、２、又は３である、請求項１７〜２７のいずれか１項記載の化合物。
【請求項３０】
ｍ及びｎの全ての例の合計が３〜９である、請求項１７〜２７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項３１】
各Ｒ３が、以下から独立して選択される、請求項１７〜２７のいずれか１項に記載の化合物：
【化１５】
2020529432.tif 000117
【請求項３２】
各Ｒ３が、以下から独立して選択される、請求項１７〜２７のいずれか１項に記載の化合物：
【化１６】
2020529432.tif 000118
【請求項３３】
各Ｒ３が、以下から独立して選択される、請求項１７〜３２のいずれか１項に記載の化合物：
【化１７】
2020529432.tif 000119
【請求項３４】
表２の化合物から選択される、請求項１７〜３３のいずれか１項に記載の化合物又はその薬学的に許容可能な塩。
【請求項３５】
以下から選択される、請求項３４に記載の化合物及びその薬学的に許容可能な塩：
【化１８】
2020529432.tif 000120
【請求項３６】
請求項１〜３４のいずれか１項に記載の化合物又はその医薬的に許容される塩と、薬学的に許容可能な担体とを含む、医薬組成物。
【請求項３７】
前記化合物又は医薬組成物が経口投与用に製剤化される、請求項３６に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
前記化合物又は医薬組成物が注射による投与用に製剤化される、請求項３６に記載の医薬組成物。
【請求項３９】
前記注射が静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、脊髄内又は頭蓋内である、請求項３６に記載の医薬組成物。
【請求項４０】
前記医薬組成物が腸内送達用に製剤化されている、請求項３６に記載の医薬組成物。
【請求項４１】
前記医薬組成物が、被験体の下部腸又は結腸内での制御放出用に製剤化される、請求項３６に記載の医薬組成物。
【請求項４２】
前記医薬組成物が、被験体の中枢神経系への送達用に製剤化される、請求項３６に記載の医薬組成物。
【請求項４３】
前記医薬組成物が、被験体の全身循環の外側への送達用に製剤化される、請求項３６に記載の医薬組成物。
【請求項４４】
請求項１〜３４のいずれか１項に記載の化合物若しくはその薬学的に許容可能な塩又は請求項３６〜４３のいずれか１項に記載の医薬組成物を被験体に投与することを含む、それを必要とする被験体においてアミロイド形成を阻害する方法。
【請求項４５】
請求項１〜３４のいずれか１項に記載の化合物若しくはその薬学的に許容可能な塩又は請求項３６〜４３のいずれか１項に記載の医薬組成物を被験体に投与することを含む、それを必要とする被験体のアミロイド障害を予防又は治療する方法。
【請求項４６】
前記アミロイド障害が神経障害である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記アミロイド障害が、パーキンソン病（ＰＤ）、レビー小体型認知症、多系統萎縮症、α−シヌクレイノパチー、ＰＤ関連便秘、ＰＤ関連低血圧症、ハンチントン病、アレキサンダー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、又はアルツハイマー病である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記アミロイド障害が、腸ディスバイオシス、腸透過性亢進、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎又はクローン病である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記被験体が、嚥下障害、腸管運動性の低下、胃不全麻痺、便秘（慢性便秘及び慢性特発性便秘を含む）、小腸内細菌異常増殖（ＳＩＢＯ）、下痢、腹痛及び／又は腹痛発作、腹部膨満、鼓腸、唾液分泌過多（流涎症）、肛門直腸機能障害、排便協調障害、及び吐き気の１又は複数を含む胃腸症状を患っている、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
前記胃腸症状がパーキンソン病又はパーキンソニズムに関連する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記アミロイド障害が、腸内細菌アミロイド凝集体の存在又はレベルを検出することにより診断され得る、請求項４５〜５０のいずれか１項記載の方法。
【請求項５２】
前記凝集体が細菌のＣｓｇＡタンパク質を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記被験体の腸サンプル中のＣｓｇＡ等の細菌タンパク質又は細菌タンパク質を産生する微生物の存在又はレベルを検出することを更に含む、請求項４５〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記細菌タンパク質若しくは前記細菌タンパク質を産生する前記微生物の存在が腸サンプルで検出される場合、又は腸サンプル中の前記細菌タンパク質若しくは前記細菌タンパク質を産生する前記微生物のレベルが所定のレベル若しくは対照より大きい場合、前記被験体が前記予防又は治療を必要とすると選択される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
投与後の腸アミロイド凝集体の減少又は不在を判定することを更に含む、請求項４５〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
前記被験体が胃腸症状を示すと特定することを更に含む、請求項４５〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
アミロイド又はアミロイドの前駆体を、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の化合物又はその薬学的に許容可能な塩と接触させることを含む、アミロイド凝集体の形成を妨害及び／又は阻害する方法。
【請求項５８】
請求項１〜３４のいずれか１項に記載の化合物若しくはその薬学的に許容可能な塩又は請求項３６〜４３のいずれか１項に記載の医薬組成物を前記被験体に投与することを含む：
それを必要とする被験体においてアミロイド凝集体の形成を妨害する方法。
【請求項５９】
化合物又は医薬組成物を投与する前に、アミロイド凝集体の形成を妨害する化合物の利益を受ける被験体を選択すること、及び／又は投与後の被験体における前記アミロイド凝集体の形成の阻害を測定することを更に含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記選択が臨床的又は診断的評価による請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記アミロイド凝集体が１又は複数の哺乳類タンパク質を含む、請求項５７〜６０のいずれかに記載の方法。
【請求項６２】
前記哺乳類タンパク質が、α−シヌクレイン、タウ、アミロイド前駆体タンパク質由来のベータアミロイド、メジン、アポリポタンパク質ＡＩ、心房性ナトリウム利尿因子、ベータアミロイド、シスタチン、ＩＡＰＰ（アミリン）、ベータ−２ミクログロブリン、トランスサイレチン、ＰｒＰ、ゲルゾリン、リゾチーム、ハンチンチン、ケラトエピセリン、カルシトニン、プロラクチン、血清アミロイドＡ、ＳＯＤ１、及び免疫グロブリン軽鎖ＡＬから選択される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記アミロイド凝集体が、１又は複数の細菌タンパク質又は真菌タンパク質を含む、請求項５７〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
前記細菌タンパク質がＣｓｇＡである、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記アミロイド凝集体が、消化管、頭蓋洞、又は鼻腔内に存在する、請求項５７〜６４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６６】
前記アミロイド凝集体が、腸神経組織又は嗅球内に存在する、請求項５７〜６５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
投与の過程で腸内アミロイドレベル及び／又はアミロイド凝集を測定又は評価することを更に含む、請求項５８〜６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６８】
前記投与の過程に続いて腸内アミロイドレベル及び／又はアミロイド凝集を測定又は評価することを更に含む、請求項５８〜６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６９】
前記被験体の神経学的症状又は行動等の神経系の変化を測定又は評価することを更に含む、請求項５８〜６８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７０】
前記被験体の胃腸症状又は行動等の胃腸系の変化を測定又は評価することを更に含む、請求項５８〜６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７１】
前記胃腸症状が便秘を含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記化合物又は医薬組成物が、神経学的症状又は状態の出現前に投与される、請求項５８〜７１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７３】
前記神経学的症状又は状態が、無呼吸、低呼吸、運動緩慢、運動失調、振戦、筋肉の硬直、姿勢及びバランスの障害、自動運動の喪失、構音障害若しくは他の発話の変化、筆跡の変化、起立性低血圧、記憶障害、嚥下障害、失禁、睡眠障害、心不整脈、視覚障害、うつ病及び視覚、聴覚、嗅覚又は触覚性の幻覚を含む精神医学的問題、めまい、認知機能障害、ドーパミンレベルの変化、セロトニンレベルの変化、キヌレニンの変化、並びに／又はそれらの任意の組み合わせの１又は複数の症状を含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記化合物又は医薬組成物がカフェイン、ニコチン、テオフィリン、テオブロミン、キサンチン、メチルキサンチン、又はそれらの誘導体と同時投与される、請求項５８〜７３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７５】
α−シヌクレイン凝集の阻害剤を前記被験体に投与することを更に含む、請求項５８〜７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７６】
前記被験体が、臨床的又は診断的評価等により、パーキンソン病を発症するリスクがある、又は既にパーキンソン病に罹患していると特定又は選択された被験体である、請求項５８〜７５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７７】
前記被験体が、臨床的又は診断的評価等によって、レビー小体型認知症、偶発性レビー小体疾患、アルツハイマー病レビー小体亜型、多系統萎縮症、純粋自律神経失調症又は任意の組み合わせを発症するリスクがある又は既に罹患していると特定された者である、請求項５８〜７６のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、２０１７年８月４日に出願された米国仮特許出願第６２／５４１，５３６号に対して米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく優先権を主張し、その全内容は引用することで本明細書の一部をなす。
【０００２】
本開示は、アミロイド形成の阻害剤、特に微生物誘発性アミロイド形成の阻害剤と並んで、神経障害及びアミロイド蓄積に関連する他の障害を治療又は阻害するためにかかる阻害剤を使用する方法に関する。アミロイド形成を阻害又は促進する組成物を特定する方法も提供される。
【背景技術】
【０００３】
多くの神経変性疾患は、脳内のタンパク質の非定型的な凝集に関連しており、これは細胞死及び多くの神経障害の結果としての発現をもたらす。疾患特異性は、（ｉ）凝集に関与する特定のタンパク質、（ｉｉ）影響を受ける脳の特定の領域、及び（ｉｉｉ）影響を受ける特定の神経細胞型の結果であると考えられている。天然のヒトタンパク質α−シヌクレインの場合、このタンパク質の異常な凝集は、５０超の「α−シヌクレイノパチー」のいずれかを引き起こし、そのうちパーキンソン病が最も一般的で最も広く研究されている。パーキンソン病では、α−シヌクレインの凝集により、特定の神経細胞型、最も一般的には神経伝達物質ドーパミンを生成するレビー小体と呼ばれる大きな沈殿凝集体が蓄積する。十分なα−シヌクレイン凝集体が存在すると、神経細胞死が起こり、ドーパミンの産生が低下する。ドーパミンは動作を適切に制御するために必要であり、ドーパミン作動性ニューロンは一旦死滅すると置き換えられない。時間が経つにつれて、ドーパミンプールは、運動症状が進行し衰弱する時点まで不可逆的に減少する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
α−シヌクレインの最も病原性の形態、例えば、完全な無傷のレビー小体又はより小さなオリゴマーのα−シヌクレイン原線維が、疾患の進行及び病理学に最も関連しているかどうかは、まだわかっていない。α−シヌクレイン凝集を阻害する従来の医薬品及びバイオテクノロジーのアプローチは、疾患症状に最も関連するニューロン及び脳領域の凝集プロセスを攻撃することに焦点を合わせてきた。小分子アプローチ、抗体アプローチ及びワクチンアプローチは全て試みられており、パーキンソン病及び他のα−シヌクレイノパチーに対する介入として評価され続けている。重要なことに、これらの戦略の全ては現在、血液脳関門を通過して標的神経組織に到達する治療エンティティに依存している。血液脳関門を通過することは、神経変性疾患の薬物開発を妨げる最も重要な薬物動態上の課題の１つである。したがって、血液脳関門を通過することなく治療効果を提供する可能性を有するアミロイド形成の阻害剤、特にα−シヌクレイン凝集阻害剤が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
幾つかの実施形態では、組成物は、被験体の全身循環外への送達用に製剤化される。上記組成物は、例えば、腸内又は鼻腔内送達用に製剤化されてもよく、及び／又は上記組成物は、下部腸又は結腸内の制御放出用に更に製剤化されてもよい。前述の組成物は、腸溶コーティングカプセル剤、錠剤、ソフトゲル、噴霧乾燥粉末、ポリマーマトリクス、ヒドロゲル、腸溶コーティング固体、結晶性固体、非晶質固体、ガラス状固体、コーティング微粉化粒子、液体、噴霧液、エアロゾル、又はマイクロカプセルを含み得る。
【０００６】
本開示はさらに、アミロイド又はアミロイドの前駆体を本発明の１又は複数の化合物を含む組成物と接触させることを含む、アミロイド凝集体の形成を妨害する方法を提供する。
【０００７】
本開示は、本発明の化合物を含む組成物等の１又は複数のポリフェノール又はポリフェノール様化合物を含む組成物を被験体に投与することを含む、被験体においてアミロイド凝集体の形成を破壊する方法を更に提供する。任意に、上記被験体は、上記組成物の投与前にアミロイド凝集体の形成を妨害する分子の利益を受ける被験体として更に選択又は特定される。かかる選択又は特定を、上記組成物を投与する前に、臨床的又は診断的な評価により行うことができる。かかる選択された被験体は、パーキンソン病、レビー小体型認知症、偶発性レビー小体病、アルツハイマー病レビー小体亜型、多系統萎縮症若しくは純粋自律神経失調症、又はそれらの任意の組み合わせについて診断又は評価されたことがあり得る。任意に、組成物の投与前、投与中又は投与後に、上記被験体におけるアミロイド凝集体の形成の妨害又は阻害が測定又は評価される。
【０００８】
本開示はさらに、被験体のアミロイド障害を阻害、改善、その可能性を低減、その発症を遅延、治療又は予防する方法を提供する。本方法は、本明細書に記載されるように、本発明の化合物を含む組成物を被験体に投与することを含むことができる。任意に、被験体は、例えば、細菌タンパク質（ＣｓｇＡ等）の存在若しくはレベル、又は被験体の腸内サンプル中の細菌タンパク質を生成する微生物の存在若しくはレベルを検出することにより、上記組成物の投与前にアミロイド凝集体の形成を阻害又は妨害する分子の利益を受ける被験体として更に選択又は特定される。かかる選択又は特定を、上記組成物を投与する前に、臨床的又は診断的な評価により行うことができる。かかる選択された被験体は、パーキンソン病、レビー小体型認知症、偶発性レビー小体病、アルツハイマー病レビー小体亜型、多系統萎縮症若しくは純粋自律神経失調症、又はそれらの任意の組み合わせについて診断又は評価されたことがあり得る。任意に、組成物の投与前、投与中又は投与後に、上記被験体におけるアミロイド凝集体の形成の妨害又は阻害が測定又は評価される。
【０００９】
本明細書に記載の方法及び組成物による幾つかの実施形態では、前記アミロイド凝集体は、１又は複数の哺乳類アミロイド又はタンパク質等の哺乳類アミロイド前駆体、及び／又は１又は複数の細菌又は真菌タンパク質（例えば、ＣｓｇＡを含む組成物）を含み得る。本明細書に開示される方法及び組成物による幾つかの実施形態では、上記アミロイド凝集体は、消化管、腸神経組織、頭蓋洞、又は鼻腔（例えば、嗅球）内に存在し得る。
【００１０】
幾つかの実施形態では、本開示の方法は、被験体の神経学的症状、運動行動又は他の行動等、例えば、無呼吸、低呼吸、運動緩慢、運動失調、振戦、筋肉の硬直、姿勢及びバランスの障害、自動運動の喪失、構音障害又は他の発話の変化、筆跡の変化、起立性低血圧、記憶障害、嚥下障害、失禁、睡眠障害、心不整脈、視覚障害、うつ病及び／又は視覚、聴覚、嗅覚及び／又は触覚性の幻覚を含む精神医学的問題、めまい、認知機能障害、ドーパミンレベルの変化、セロトニンレベルの変化、キヌレニンの変化、又はそれらの任意の組み合わせを含み得る、被験体の神経系の変化を測定又は評価することを更に含む。
【００１１】
幾つかの実施形態では、本開示の方法は、嚥下障害、腸管運動性の低下、胃不全麻痺、便秘（慢性便秘及び慢性特発性便秘を含む）、小腸内細菌異常増殖（ＳＩＢＯ）、下痢、腹痛及び／又は腹痛発作、腹部膨満、鼓腸、吐き気、若しくは過敏性腸症候群（ＩＢＳ）の任意のその他の症状、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎、クローン病、腸管透過性亢進、腸管壁浸漏、腸管ディスバイオシス、唾液分泌過多（流涎症）、直腸肛門機能不全、排便協調障害、又はそれらの任意の組み合わせの１又は複数を含み得る、被験体の胃腸症状又は行動等の胃腸系の変化を測定又は評価することを更に含む。本明細書で使用される場合、ＩＢＳ及びＩＢＤという用語は、本開示に鑑みて当業者によって理解される慣習的で通常の意味を有する。かかる透過性亢進は、腸内膜の炎症及び／又は腸上皮の細胞間のタイトジャンクションの障害に起因する可能性があり、これにより、物質が管腔から周囲組織へと通過し、一部が腹腔及び／又は全身循環に入る可能性がある。腸管又は腸管腔からのこの物質の漏出のため、腸の透過性亢進は「腸管壁浸漏」又は「腸管壁浸漏症候群」と呼ばれることがある。
【００１２】
幾つかの実施形態では、本開示の組成物は、神経学的症状又は状態の出現の前又は後に被験体に投与され得る。幾つかの実施形態では、本開示の組成物は、アミロイド障害に関連する胃腸症状又は状態の出現の前又は後に被験体に投与され得る。幾つかの実施形態では、上記被験体は、臨床的又は診断的評価等によって、レビー小体型認知症、偶発性レビー小体疾患、アルツハイマー病レビー小体亜型、多系統萎縮症、純粋自律神経失調症又は任意の組み合わせを発症するリスクがある又は既に罹患していると特定された被験体として選択される。幾つかの実施形態では、上記被験体は、１８歳、１８歳〜３０歳、３０歳〜５０歳、５０歳〜６０歳、６０歳〜７０歳、又は７０歳より高齢である。幾つかの実施形態では、上記被験体は、臨床的又は診断的評価又は家族歴分析等によって、パーキンソン病を発症するリスクがあるか、既にパーキンソン病に罹患していると特定又は選択された被験体である。
【００１３】
本明細書に開示される組成物及び方法による幾つかの実施形態では、上記組成物は、カフェイン、ニコチン、テオフィリン、テオブロミン、キサンチン、メチルキサンチン、又はそれらの誘導体と同時投与され得る。幾つかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、α−シヌクレイン凝集の阻害剤を上記被験体に投与することを更に含む。幾つかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、上記被験体に、Ｌ−ドーパ、カルボドパ、レボドパ、ドロキシドパ、ラサギリン、塩酸アポモルフィン、ブロモクリプチン、ロチゴチン、プラミペキソール、ロピニロール、ベンゾトロピン、トリヘキシフェニジル、セレギリン、エンタカポン、トルカポン、アマンタジン、ピマバネルシン、リバスチグミン等、又はそれらの任意の組み合わせを投与することを更に含む。幾つかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、α−シヌクレイン凝集の阻害剤を上記被験体に投与することを更に含み、上記被験体にＬ−ＤＯＰＡ、カルボドパ、レボドパ、ドロキシドパ、ラサギリン、塩酸アポモルフィン、ブロモクリプチン、ロチゴチン、プラミペキソール、ロピニロール、ベンゾトロピン、トリヘキシフェニジル、セレギリン、エンタカポン、トルカポン、アマンタジン、ピマバネルシン、リバスチグミン等、又はそれらの任意の組み合わせを投与することを更に含む。幾つかの実施形態では、α−シヌクレイン凝集の阻害剤と、Ｌ−ドーパ、カルボドパ、レボドパ、ドロキシドパ、ラサギリン、アポモルフィン塩酸塩、ブロモクリプチン、ロチゴチン、プラミペキソール、ロピニロール、ベンゾトロピン、トリヘキシフェニジル、セレギリン、エンタカポン、トルバイン、トルカポン、トルカポン、リバスチグミン等は、同じ組成物で投与される。幾つかの実施形態では、α−シヌクレイン凝集の阻害剤と、Ｌ−ドーパ、カルボドパ、レボドパ、ドロキシドパ、ラサギリン、アポモルフィン塩酸塩、ブロモクリプチン、ロチゴチン、プラミペキソール、ロピニロール、ベンゾトロピン、トリヘキシフェニジル、セレギリン、エンタカポン、トルバイン、トルカポン、トルカポン、リバスチグミン等は、別々の組成物で投与される。幾つかの実施形態では、別個の組成物が同時に投与される。幾つかの実施形態では、別個の組成物が異なる時間に投与される。
【００１４】
幾つかの実施形態では、本明細書に開示される組成物及び方法のいずれかによる組成物は、医学用途向けである。幾つかの実施形態では、本明細書に開示される組成物及び方法のいずれかによる組成物は、本明細書に記載のアミロイド障害（表３のアミロイド障害等）の治療に使用するためのものである。幾つかの実施形態では、アミロイド障害は、パーキンソン病、レビー小体型認知症、偶発性レビー小体疾患、アルツハイマー病レビー小体亜型、多系統萎縮症、又は純粋自律神経失調症、又はこれらの２つ以上の任意の組み合わせからなる群から選択される。幾つかの実施形態では、本明細書に開示される組成物及び方法による組成物は、本明細書に記載のアミロイド障害（表３のアミロイド障害等）の治療用の医薬の調製に使用するためのものである。幾つかの実施形態では、アミロイド障害は、パーキンソン病、レビー小体型認知症、偶発性レビー小体疾患、アルツハイマー病レビー小体亜型、多系統萎縮症、又は純粋自律神経失調症、又はこれらの２つ以上の任意の組み合わせからなる群から選択される。幾つかの実施形態では、組成物は、本明細書に記載されるように、本発明の１又は複数の化合物を含む。幾つかの実施形態では、組成物は、例えば経口送達又は直腸送達を介した消化管への送達用に製剤化されるか、又は腸溶性コーティングと共に製剤化される。幾つかの実施形態では、組成物は、例えば脊髄内又は頭蓋内の送達を介した中枢神経系への送達のために製剤化されるか、又は血液脳関門を通過するように製剤化される。幾つかの実施形態では、組成物は、血液脳関門をバイパスするように製剤化される。かかる製剤は、例えば鼻腔内に投与され得る。かかる製剤はまた、嗅覚経路を介して投与され得る。
【００１５】
本開示は、微生物誘発性アミロイドの形成に影響を及ぼす組成物を特定する方法を提供する。幾つかのアプローチにおいて、上記方法は、上記組成物の存在下で、複数の濃度の微生物アミロイド若しくは微生物アミロイド前駆体を複数の濃度のα−シヌクレイン及び／又は他の哺乳類アミロイド若しくは哺乳類アミロイド前駆体と接触させること、上記の反応後のアミロイド形成を分析又は測定すること、並びに該分析又は測定を対照の分析又は測定と比較することを含み、上記対照は、上記組成物の不在下での上記反応後のアミロイド形成の分析又は測定を含む。本明細書に開示される幾つかの方法及び組成物では、上記微生物アミロイド又は微生物アミロイド前駆体はＣｓｇＡを含む。幾つかの実施形態では、本開示による方法はまた、接触工程中及び／又は測定前の撹拌を含む。
【００１６】
特定の実施形態では、複数の濃度の微生物アミロイド又は微生物アミロイド前駆体（例えば、ＣｓｇＡを含む組成物）と複数の濃度のα−シヌクレイン及び／又は他の哺乳類アミロイド又は哺乳類アミロイド前駆体との上記接触は、アミロイド形成の指標の存在下で行われる。幾つかのさらなる実施形態では、上記指標は、蛍光インジケータ、スピン標識インジケータ、酵素、抗体又は比色インジケータである。幾つかのさらなる実施形態では、上記指標はチオフラビンＴ（ＴｈＴ）である。上記アミロイド形成の指標が抗体である場合、本開示の方法は、該抗体が凝集したα−シヌクレイン及び／又は別の哺乳類アミロイド又は哺乳類アミロイド前駆体に対して特異性を有し得て、任意に蛍光標識、酵素、比色標識、スピン標識、金属イオン結合部分、核酸、多糖類、又はポリペプチドに複合化され得ることを提供する。本開示の方法による幾つかの態様では、ＣｓｇＡ、並びに上記α−シヌクレイン及び／又は他のかかる細菌アミロイド前駆体及び／又は哺乳類アミロイド／哺乳類アミロイド前駆体は、それぞれ別々に標識される。
【００１７】
本開示の方法による幾つか実施形態では、上記複数の濃度の微生物アミロイド又は微生物アミロイド前駆体（例えば、ＣｓｄＡを含む組成物）を、組成物の存在下で複数の濃度のα−シヌクレイン及び／又は他の哺乳動物アミロイド若しくは哺乳類アミロイド前駆体と接触させること、上記の反応後のアミロイド形成を分析又は測定すること；並びに上記分析又は測定を対照の分析又は測定と比較することは、アミロイド形成を変更若しくは調節する、又は変更若しくは調節が疑われる組成物を特定若しくは選択することを更に含む。幾つかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、アミロイド形成を低減又は増強する組成物を特定又は選択することを更に含む。幾つかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、さらに血液脳関門を通過しないアミロイド形成を低減又は増強する組成物を特定又は選択することを更に含む。これらの方法で特定された化合物を、アミロイド形成を変更する化合物（例えば、好ましくは血液脳関門を通過することなくアミロイド形成を減少させる化合物）を投与することで利益を受ける集団として特定又は選択された被験体に投与することができる。かかる選択された被験体は、パーキンソン病、レビー小体型認知症、偶発性レビー小体病、アルツハイマー病レビー小体亜型、多系統萎縮症若しくは純粋自律神経失調症、又はそれらの任意の組み合わせについて診断又は評価されたことがあり得る。
【００１８】
本開示による方法は、組成物の存在下又は不在下で、複数の濃度の微生物アミロイド又は微生物アミロイド前駆体を、複数の濃度のα−シヌクレイン及び／又は他の哺乳類アミロイド若しくは哺乳類アミロイド前駆体と接触させること；微生物誘発性アミロイドを生成すること；並びに微生物誘発性アミロイドを分析又は定量化することを含む、微生物誘発性アミロイドを作製する方法を更に企図する。幾つかのさらなる実施形態では、上記微生物アミロイド又は微生物アミロイド前駆体はＣｓｇＡを含む。幾つかのさらなる実施形態では、本開示による方法は、上記接触の又は測定前に撹拌を更に含む。幾つかのさらなる実施形態では、上記方法は、アミロイド形成の指標の存在下で実施される。幾つかのさらなる実施形態では、アミロイド形成の上記指標は、蛍光指標、スピン標識指標又は比色指標を含み得る。幾つかの実施形態では、上記指標は、上記指標がチオフラビンＴ（ＴｈＴ）である。幾つかの態様では、ＣｓｇＡ及びα−シヌクレイン、又は他のかかる細菌アミロイド／細菌アミロイド前駆体及び哺乳類アミロイド／哺乳類アミロイド前駆体はそれぞれ別々に標識される。幾つかの実施形態では、上記アミロイド形成は、内部蛍光、染料若しくは標識の蛍光、蛍光共鳴エネルギー移動、蛍光偏光、蛍光偏光移動、ＵＶ／Ｖｉｓ分光法、磁気共鳴、ラマン散乱、電子常磁性スピン共鳴、光学顕微鏡法、電子顕微鏡法、走査トンネル顕微鏡法、又は原子間力顕微鏡法により分析又は測定される。
【００１９】
本開示の方法による幾つかの実施形態では、上記組成物は、複数の濃度の微生物アミロイド又は微生物アミロイド前駆体（例えば、ＣｓｇＡを含む組成物）と、複数の濃度のα−シヌクレイン及び／又は化合物の混合物を含む他の哺乳類アミロイド若しくは哺乳類アミロイド前駆体との上記接触中に存在する。上記組成物は、組織、体液又はその抽出物を含み得る。幾つかの実施形態では、上記組成物は、糞便、尿、血液、髄液若しくは唾液、又はそれらの成分を含む。幾つかの実施形態では、組成物は、天然産物からの抽出物を含む。幾つかのさらなる実施形態では、天然産物は、ハーブ、植物性物質又は食材である。幾つかの実施形態では、上記天然産物は、真菌組織、マメ科植物、種子、ベリー、葉、果実、花、植物の根、植物の茎又は植物の樹皮である。幾つかの実施形態では、組成物は、１又は複数の細菌、細菌抽出物、溶解物、馴化培地、凍結乾燥細菌、凍結乾燥溶解物、凍結乾燥培地又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。幾つかの実施形態では、組成物は、１又は複数の微生物、微生物抽出物、溶解物、馴化培地、凍結乾燥微生物、凍結乾燥溶解物、凍結乾燥培地又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。幾つかの実施形態では、上記の方法は、アミロイド形成を増加又は減少させる組成物、好ましくは血液脳関門も通過しない化合物を特定又は選択することを更に含む。これらの方法で特定された化合物を、アミロイド形成を変更する化合物（例えば、好ましくは血液脳関門を通過することなくアミロイド形成を減少させる化合物）を投与することで利益を受ける集団として特定又は選択された被験体に投与することができる。かかる選択された被験体は、パーキンソン病、レビー小体型認知症、偶発性レビー小体病、アルツハイマー病レビー小体亜型、多系統萎縮症若しくは純粋自律神経失調症、又はそれらの任意の組み合わせについて診断又は評価されたことがあり得る。
【００２０】
幾つかの実施形態では、アミロイド形成の阻害剤は、腸の中枢神経系に全身的又は局所的に投与することを目的とし得る。例えば、哺乳類アミロイド又は哺乳類アミロイド前駆体タンパク質の凝集に対して有効な阻害剤は、本明細書に記載の１又は複数のアミロイド障害（例えば、表３の１又は複数の障害）の治療に有用であり得る。したがって、かかる実施形態では、アミロイド形成の阻害剤を含む組成物は、全身投与（例えば、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内）又は局所投与（例えば、迷走神経付近の局所注射、脊髄内注射又は頭蓋内注射）を含む非経口投与用に製剤化され得る。ＣＮＳへの送達には、阻害剤が血液脳関門を通過する必要がある。したがって、かかる実施形態では、阻害剤は、好ましくは脂溶性分子であるか、又は脂質溶解度を高めるように修飾され得るか、又は血液脳関門の通過を促進する化合物と同時投与され得る（例えば、国際公開第２０１４０７６６５５号Ａ１、国際公開第２０１２１５９０５２号Ａ２、国際公開第１９９２０１８５２９号Ａ１を参照されたい）。
【００２１】
本開示はまた、キットであって、該キットの１又は複数の容器に微生物アミロイド又は微生物アミロイド前駆体、並びにα−シヌクレイン及び／又は他の哺乳類アミロイド若しくは哺乳類アミロイド前駆体を含み、本開示の発明が実施され得るキットを企図する。幾つかの実施形態では、上記微生物アミロイド又は微生物アミロイド前駆体は、ＣｓｇＡを含む。
【００２２】
本開示は、本明細書に記載の本発明の化合物、又はその医薬的に許容される塩、又はその医薬組成物を被験体に投与することを含む、それを必要とする被験体のアミロイド形成を阻害する方法を提供する。
【００２３】
本開示は、本明細書に記載の本発明の化合物、又はその医薬的に許容される塩、又はその医薬組成物を被験体に投与することを含む、それを必要とする被験体においてアミロイド形成に関連する障害を予防又は治療する方法を提供する。
【００２４】
本開示は、本明細書に記載の本発明の化合物、又はその医薬的に許容される塩、又はその医薬組成物を被験体に投与することを含む、それを必要とする被験体においてアミロイド障害を予防又は治療する方法を提供する。
【００２５】
本開示の方法では、アミロイド障害又はアミロイド形成に関連する障害は神経障害であり得る。障害は、パーキンソン病（ＰＤ）、レビー小体型認知症、多系統萎縮症、α−シヌクレイノパシー、ＰＤ関連便秘、ＰＤ関連低血圧症、ハンチントン病、アレキサンダー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、又はアルツハイマー病である。障害は、腸ディスバイオシス、腸透過性亢進、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎、又はクローン病である。
【００２６】
被験体は、嚥下障害、腸管運動性の低下、胃不全麻痺、便秘（慢性便秘及び慢性特発性便秘を含む）、小腸内細菌異常増殖（ＳＩＢＯ）、下痢、腹痛及び／又は腹痛発作、腹部膨満、鼓腸、唾液分泌過多（流涎症）、肛門直腸機能障害、排便協調障害、及び吐き気の１又は複数を含む胃腸症状に苦しむ場合がある。胃腸症状は、パーキンソン病又はパーキンソニズムに関連している可能性がある。
【００２７】
特定の実施形態では、アミロイド障害は、腸内細菌アミロイド凝集体の存在又はレベルを検出することにより診断することができる。凝集体は、細菌のＣｓｇＡタンパク質を含み得る。特定の実施形態では、腸内細菌遺伝子及び遺伝子転写物の存在又はレベルを検出することにより、障害を診断することができる。
【００２８】
本開示の方法は、被験体の腸サンプル中の、ＣｓｇＡ等の細菌タンパク質、又は細菌タンパク質を産生する微生物の存在又はレベルを検出することを更に含み得る。特定の実施形態では、細菌タンパク質若しくは細菌タンパク質を産生する微生物の存在が腸サンプルで検出される場合、又は腸サンプル中の細菌タンパク質若しくは細菌タンパク質を産生する微生物のレベルが所定のレベル若しくは対照より大きい場合、被験体は上記の予防又は治療を必要であるものとして選択される。
【００２９】
本開示の方法は、投与後の腸アミロイド凝集体の減少又は不在を判断すること、又は胃腸症状を示すものとして被験体を特定することを更に含み得る。
【００３０】
本開示の方法は、試験した被験体において、アミロイド障害（例えば、パーキンソン病、レビー小体認知症、偶発性レビー小体疾患、アルツハイマー病レビー小体亜型、多系統萎縮症若しくは純粋自律神経失調症等の神経障害、又はそれらの任意の組み合わせ）を治療又は阻害する方法であって、複数の濃度の微生物アミロイド又は微生物アミロイド前駆体を、組成物の存在下又は不在下で上記試験した被験体に由来する生体サンプルから得ることができる、複数の濃度のα−シヌクレイン及び／又は他の哺乳類アミロイド若しくは哺乳類アミロイド前駆体と接触させること；アミロイドの形成を分析又は測定すること；並びに行われた分析又は測定を対照の分析又は測定と比較すること、ここで、該対照は上記組成物の不在下でアミロイドの形成を分析若しくは測定すること、又は健康な被験体若しくはアミロイドーシスを有する被験体（例えば、パーキンソン病、レビー小体病、レビー小体型認知症、偶発性レビー小体疾患、アルツハイマー病レビー小体亜型、多系統萎縮症若しくは純粋自律神経失調症、又はそれらの任意の組み合わせに罹患している被験体）によるアミロイドの量若しくは割合若しくは形成等の基準との比較を含み得て；上記組成物の存在下でのアミロイドの形成が、上記組成物の不在下でのアミロイドの形成と比較して増加する場合又は、アミロイドの量若しくは割合若しくは形成が、例えば、健康な被験体対照又はアミロイドーシスを有する対照被験体に由来するアミロイドの量、速度若しくは形成よりも、試験した被験体に由来するサンプルにおいて同じであるか多い場合、上記試験した被検者に、上記アミロイド障害を阻害又は治療するのに適した有効量の医薬組成物を投与することを含む、方法。これらの方法の幾つかのさらなる実施形態では、上記微生物アミロイド又は微生物アミロイド前駆体は、ＣｓｇＡを含む、本質的にそれからなる、又はそれからなる。
【００３１】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、アミロイド障害の治療又は阻害から利益を得る被験体として上記試験した被験体を特定又は選択することを更に含み、パーキンソン病、レビー小体型認知症、偶発性レビー小体病、アルツハイマー病レビー小体亜型、多系統萎縮症、純粋自律神経失調症、又はそれらの任意の組み合わせの１又は複数の症状を示すリスクにある被験体として上記被験体を特定又は選択することを更に含み得る。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１Ａ〜図１Ｏは、マウスのカーリー駆動性の病態生理が機能的なアミロイド形成を必要とすることを示す一連のグラフ及び画像である。図１Ａは、示される濃度のエピガロカテキン没食子酸塩（ＥＧＣＧ）での静置培養での４日間後の野生型大腸菌によるバイオフィルム増殖のクリスタルバイオレット染色を示すグラフである；光学密度（ＯＤ）によって評価されるデータ。図１Ｂは、ＥＧＣＧ（５０μＭ）の処理を伴う及び処理を伴わない、単独で又はＣｓｇＡ（２５：１モル比）の存在下でＳｙｎアミロイド形成の間チオフラビンＴ蛍光により測定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏでのαＳｙｎ凝集を示すグラフである。図１Ｃ〜図１Ｌは、５週齢〜６週齢で野生型Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）で単コロニー化され、水のみ（ビヒクル：Ｖｅｈ）又はＥＧＣＧ（＋ＥＧＣＧ）を自由飲水で与えた無菌のＴｈｙ１−αＳｙｎマウス（ＡＳＯ）の結果を示す。  図１Ｃは、ＲＮＡを糞塊から抽出し、大腸菌参照遺伝子ｒｒｓＡと比較した、ｑＲＴ−ＰＣＲにより定量化されたｃｓｇＡ発現を示すグラフである。図１Ｄ〜図１Ｈは、１５週齢〜１６週齢において、ビーム横断時間（図１Ｄ）、ポール降下時間（図１Ｅ）、鼻接着剤除去時間（図１Ｆ）、後肢抱擁スコア（図１Ｇ）、及びワイヤハングテスト（図１Ｈ）を定量化することによって行った運動機能の評価を示す。図１Ｉは、（図１Ｄ〜図１Ｈ）の試験から収集された運動スコアの主成分分析を示すグラフである。図１Ｊ〜図１Ｋは、免疫蛍光顕微鏡法で画像化された黒質のプロテイナーゼＫ耐性αＳｙｎ凝集体（白い矢印で注釈）を示す一連のグラフである。ビヒクル処理マウス（図１Ｊ）及びＥＧＣＧ処置マウス（図１Ｋ）を示す。ビヒクルで処理したコントロール（図１Ｊ）よりもＥＧＣＧで処理したマウス（図１Ｋ）では、プロテイナーゼＫ耐性αＳｙｎ凝集体の数が少なかった。図１Ｌ〜図１Ｍは、ドットブロットアッセイによる線条体（図１Ｌ）及び腹側中脳（図１Ｍ）における不溶性αＳｙｎ原線維の定量を示す。図１Ｎ〜図１Ｏは、Ｉｂａ１（ミクログリア）で染色された脳の薄切片、生成された３Ｄ細胞再構成、及び線条体（図１Ｎ）及び黒質（図１Ｏ）に存在するミクログリアから定量化された形態学的特徴を示す一連のグラフである。ｎ＝３（図１Ａ、１Ｂ、１Ｎ、１Ｏ）、ｎ＝８（図１Ｃ）、ｎ＝１０〜１１（図１Ｄ〜図１Ｉ）、ｎ＝４（図１Ｌ〜図１Ｍ）。点は個体を表し、バーは平均及び標準誤差を表す。図１ＡのＴｕｋｅｙ事後検定、図Ｃ〜Ｋの両側Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ、又は図１Ｌの両側ｔ検定による一元配置ＡＮＯＶＡで分析したデータ。図１Ａ〜図１Ｌの場合＊ｐ≦０．０５；＊＊ｐ≦０．０１；＊＊＊ｐ≦０．００１。運動データは、２つの独立したコホートから収集される。
【図２】図２Ａ〜図２Ｇは、カーリーが十分な細菌による単コロニー化が脳におけるαＳｙｎ依存性病変及び炎症反応の増加を誘導することを示す一連のグラフ及び画像である。無菌（ＧＦ）野生型（ＷＴ）又はＴｈｙ１−αＳｙｎ（ＡＳＯ）動物を、野生型のカーリーが十分な大腸菌（ＷＴ）又はカーリー欠損大腸菌（ΔｃｓｇＢＡＣ）のいずれかにより単コロニー化した。図２Ａは、ＥＬＩＳＡにより定量化された全脳溶解物中の総αＳｙｎを示すグラフである。図２Ｂは、ドットブロットアッセイによる線条体中の不溶性αＳｙｎ原線維の定量化を示すグラフである。図２Ｃ〜図２Ｄは、線条体からのＥＬＩＳＡによるＴＮＦα（図２Ｃ）及びＩＬ−６（図２Ｄ）の定量化を示す。図２Ｅ〜図２Ｇは、ＡＳＯマウスに由来する脳の薄切片を染色した結果を示巣す。切片をＩｂａ１（ミクログリア）で染色し、３Ｄ細胞再構成を生成し、線条体に存在するミクログリアの形態的特徴を定量化した。ｎ＝３（図２Ａ〜図２Ｂ）、ｎ＝６〜７（図２Ｃ、図２Ｄ）、ｎ＝４（図２Ｅ〜Ｇ）（直径は２０個〜４０個の細胞、又は分岐は５個〜７個の細胞から平均した）。点は個体を表し、バーは平均及び標準誤差を表す。図２Ａ〜図２ＤのＴｕｋｅｙ事後検定、又は図２Ｅ及び２Ｆの両側ｔ検定による一元配置分散分析で分析されたデータ。＊ｐ≦０．０５；＊＊ｐ≦０．０１；＊＊＊ｐ≦０．００１；＊＊＊＊ｐ≦０．０００１。  図２Ｈ〜図２Ｊは、ヒト糞便サンプル（図２Ｈ）、ＰＤ若しくは一致した対照に由来する微生物がコロニーを形成した野生型マウス（図２Ｉ）、又はＰＤを有する人若しくは一致した対照に由来する微生物がコロニーを形成したＴｈｙ１−αＳｙｎ（ＡＳＯ）マウス（図２Ｊ）におけるＣｓｇＡのレベルを示すマウス一連のグラフである。これらのデータと一致して、ＣｓｇＡはＰＤを有する人に由来する微生物が豊富であると予想されている。
【図３】図３Ａ〜図３Ｉは、腸カーリーが進行性のシヌクレイン依存性の病態生理を促進することを示す一連のグラフである。通常飼育されたＴｈｙ１−αＳｙｎ（ＡＳＯ）動物に、３０μｇの合成ＣｓｇＡヘキサマー（ＣｓｇＡ；Ｎ−ＱＹＧＧＮＮ−Ｃ）又は非アミロイド形成ペプチド（Ｎ１２２Ａ；Ｎ−ＱＹＧＧＮＡ−Ｃ）を腸内に注入した。図３Ａ〜図３Ｇについて、ビーム横断（図３Ａ）、ポール降下（図３Ｂ）、接着剤除去（図３Ｃ）、後肢抱擁スコア（図３Ｄ）、ワイヤハング（図３Ｅ）、糞便排出量（７０日目）（図３Ｆ）における注入後０日、７日、２１日、及び７０日に経時的に試験した運動及びＧＩ機能。図３Ｇは、図３Ａ〜図３Ｆの収集された運動スコアの主成分分析を示すグラフである。図３Ｈ〜図３Ｉは、ドットブロットアッセイによる線条体（図３Ｈ）及び腹側中脳（図３Ｉ）の不溶性αＳｙｎ原線維の定量化を示す。ｎ＝８（図３Ａ〜図３Ｇ）、ｎ＝４（図３Ｈ）。点は個体を表し、バーは平均及び標準誤差を表す。群間比較に対するＳｉｄａｋ事後検定と共に、二元配置ＡＮＯＶＡによって分析された時間経過が個々の時間点上に示され、括弧は治療間の有意性を示す。両側Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定によって分析されたデータ（図３Ｈ）。図３Ａ〜図３Ｉの場合、＊ｐ≦０．０５；＊＊ｐ≦０．０１；＊＊＊ｐ≦０．００１；＊＊＊＊ｐ≦０．０００１。
【図４】図４Ａ〜図４Ｃは、ヒト化動物における糞便中のアミロイド産生細菌の量を示す一連のグラフである。以前のコホート（ＥＮＡアクセッション：ＰＲＪＥＢ１７６９４）からのヒトサンプルをＰＩＣＲＵＳｔで分析し、各集団内でコードされたＣｓｇＡの量を推測した（図４Ａ）。野生型、カーリーが十分な大腸菌（ＷＴ）又はカーリー欠損大腸菌（ΔｃｓｇＢＡＣ）のいずれかで富化された健康なヒト由来の糞便微生物を受けたＴｈｙ１−αＳｙｎ（ＡＳＯ）マウスの糞塊を、糞便細菌ＤＮＡに存在する１６ｓ  ｒＲＮＡと比較したｒｒｓＡ量についてｑＰＣＲにより（図４Ｂ）、及び糞便細菌ＲＮＡ中のｒｒｓＡと比較したＣｓｇＡ発現についてｑＰＣＲ分析により（図４Ｃ）分析した。ｎ＝５（図４Ａ）、ｎ＝８（図４Ｂ〜図４Ｃ）。点は個体を表し、バーは平均及び標準誤差を表す。データを両側Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定によって分析した。＊＊＊ｐ≦０．００１。
【図５】図５Ａ〜図５Ｊは、本明細書の幾つかの実施形態による機能的アミロイド形成の阻害が進行性運動障害を抑制することを示す一連のグラフである。無菌のＴｈｙ１−αＳｙｎマウス（ＡＳＯ）を野生型Ｅ．コリにより単コロニー化し、水のみ（ビヒクル、Ｖｅｈ）で処理するか、又は飲料水中のＥＧＣＧを自由摂取（＋ＥＧＣＧ）させた。鼻粘着剤除去時間運動機能は、１０週齢、１２週齢及び１５週齢において、ビーム横断時間（図５Ａ）、ポール降下時間（図５Ｂ）、鼻接着剤除去時間（図５Ｃ）、後肢抱擁スコア（図５Ｄ）及びワイヤハングテスト（図５Ｅ）を定量化することにより評価した。図５Ｆは、図５Ａ〜図５Ｄから収集された運動スコアの主成分分析を示す。脳の薄切片をＩｂａ１（ミクログリア）で染色し、線条体（図５Ｇ〜図５Ｈ）及び黒質（図５Ｉ〜図５Ｊ）に存在するミクログリアの形態的特徴を定量化した。ｎ＝１０〜１１（図５Ａ〜図５Ｆ）、ｎ＝３（図５Ｇ〜図５Ｊ）（分岐について５個〜７個の細胞からの平均）。バーは平均誤差及び標準誤差を表す。群間比較に対するＳｉｄａｋ事後検定と共に、二元配置ＡＮＯＶＡによって分析された時間経過が個々の時間点上に示され、括弧は治療間の有意性を示す。両側ｔ検定で分析されたデータ（図５Ｇ〜図５Ｊ）。＊ｐ≦０．０５；＊＊ｐ≦０．０１；＊＊＊＊ｐ≦０．０００１。
【図６】図６Ａ〜図６Ｋは、本明細書の幾つかの実施形態による細菌性アミロイドタンパク質、ＣｓｇＡがａＳｙｎ線維化のシードとなることを示す一連のグラフである。精製されたαＳｙｎタンパク質及びＣｓｇＡタンパク質を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生物物理学的分析が実施した。図６Ａは、αＳｙｎアミロイド形成のみの間又はＣｓｇＡモノマーの存在下（２５：１モル比、黄色）での経時的なチオフラビンＴ蛍光により測定される凝集を示す。図６Ｂは、指数関数的線維化、遅滞期に達する時間を示す。図６Ｃ〜図６Ｈは、０時間（図６Ｃ〜図６Ｅ）及び凝集後６０時間（図６Ｆ〜図６Ｈ）でのαＳｙｎ単独（図６Ｃ、６Ｆ）若しくはＣｓｇＡ単独（図６Ｅ、図６Ｈ）、又は組み合わせ（図６Ｄ、６Ｇ）の一連の代表的な透過型電子顕微鏡写真である。図６Ｉ〜図６Ｋは、αＳｙｎ線維化の単独又は凝集後０時間、１２．５時間及び６０時間でのＣｓｇＡの存在下での円二色性分光分析を示す一連のグラフである。図６Ａ及び図６Ｂでは、ｎ＝３である。バーは平均誤差及び標準誤差を表す。データは、両側ｔ検定によって分析される。＊＊ｐ≦０．０１。データは２つの独立した試験の代表である。
【図７】図７Ａ〜図７Ｆは、ＣｓｇＡがシヌクレインの凝集及び過渡的相互作用による伝播を引き起こすことを示す一連のグラフ及び透過型電子顕微鏡画像である。図７Ａは、αＳｙｎアミロイド形成単独の間又はαＳｙｎ（図６Ａのように）へのＣｓｇＡモノマーの添加により以前に生成された５％シード又はαＳｙｎ単独存在下でのチオフラビンＴ蛍光を示すグラフである。図７Ｂ〜図７Ｆは、上記のシード及びシード自体の添加により生成された原線維構造の一連の透過電子顕微鏡写真である。図７Ｇは、ＣｓｇＡモノマー若しくはシード、又は陽性対照としてのＤＯＰＳ−ＤＯＰＧコレステロールのいずれかを添加した表面固定化αＳｙｎの表面プラズモン共鳴測定を示すグラフである。
【図８】幾つかの実施形態によるアミロイド凝集アッセイを示すグラフである。経時的なα−シヌクレインの凝集は、ＣｓｇＡの存在下及び不在下で、チオフラビンＴ（ＴｈＴ）蛍光によって測定される。
【図９】１０：１のＭＯＩで４時間、大腸菌Ｋ１２又はカーリー欠損株ΔｃｓｇＢＡＣで処理した腸内分泌（ＳＴＣ−１細胞株）細胞におけるα−シヌクレインのウエスタンブロットである。
【図１０】式（ＩＩ）の化合物を合成する方法を示す。
【図１１】式（ＩＩ）の化合物を合成する方法を示す。
【図１２】式（Ｉ）の化合物を合成する方法を示す。
【図１３】式（Ｉ）の化合物を合成する方法を示す。
【発明の詳細な説明】
【００３３】
神経変性疾患の症例の大部分は特発性であり、従来、かかる疾患のほとんどの病因を特定することは困難であった。新たな理論では、多くの神経変性疾患は脳又は中枢神経系（ＣＮＳ）ではなく、末梢から始まり、ゆっくりと進行する過程で長年にわたって徐々に脳に移行する。それでも、末梢の分子病因は研究の主題となっている。パーキンソン病の場合、多くは、現在パーキンソン病を定義しているステレオタイプの運動症状が出現する数十年前に多数の患者で便秘及び低血圧が起こることが知られている。したがって、理論に制限されることなく、α−シヌクレインの凝集は消化（ＧＩ）管及び嗅球で始まり、凝集したα−シヌクレインはプリオンのような増殖過程で徐々に脳に進行すると考えられている。より一般的にはブラーク（Ｂｒａａｋ）の仮説として知られているこのシナリオでは、これらの末梢組織に関与する分子メカニズムの分析は、パーキンソン病等のα−シヌクレイノパチー等のアミロイド障害を予防及び／又は治療するための非直感的で非従来的なアプローチにつながる可能性があると考えられている。
【００３４】
理論に制限されることなく、本明細書で企図される１つの分子メカニズムは、核形成するか、さもなければそれによって最終的にはレビー小体沈着、並びにパーキンソン病及び他のα−シヌクレイノパチーの臨床症状を引き起こす病理学的プロセスを開始するα−シヌクレイン凝集を導くシード因子として細菌アミロイドを関与させる。細菌のアミロイドは、分泌された細菌タンパク質の凝集形態であり、宿主細胞への細菌の付着とバイオフィルムの形成の両方で役割を果たすと考えられている。正しい環境で、及び凝集しやすい宿主タンパク質の存在下では、理論に制限されることなく、細菌のアミロイド自体がプリオンのような様式で宿主タンパク質凝集の直接的な構造テンプレートとして機能すると考えられている。細菌のアミロイド凝集を促進する原因となる細菌シャペロン機構は、宿主タンパク質を基質として使用することもでき、それにより宿主タンパク質のアミロイド構造への凝集を促進する。一旦凝集すると、宿主タンパク質の凝集は、長年にわたって腸神経系を介してプリオンのような様式で持続する。最終的に、これらの凝集体は脳組織に広がり、パーキンソン病の典型的な臨床症状をもたらす。この効果は、アルツハイマー病等の他のアミロイド駆動型疾患の発症にもつながる可能性があり、宿主タンパク質Ａ−ベータ及び／又はタウの凝集が関与している。これと一致して、現在公開されているヒトミクロビオームデータセットの分析により、パーキンソン病患者におけるＥ．コリ由来のカーリー関連ｃｓｇＡ遺伝子の発現増加が明らかとなり、ＰＤ患者に由来する糞便微生物の無菌（ＧＦ）野生型マウス又はＡＳＯマウスへの移植は、１６ｓ  ｒＲＮＡ配列のＰＩＣＲＵＳｔ帰属解析に基づいて、健康な対照に由来するマイクロバイオームと比較して、より多くのＣｓｇＡの存在量をもたらす（実施例７を参照されたい）。本明細書では、腸のアミロイド凝集体がパーキンソン病及び他のアミロイド障害に関連する症状を引き起こす可能性があり（実施例６〜実施例８を参照されたい）、アミロイド凝集体を阻害及び／又は破壊する化合物でこれらの動物を治療すると、パーキンソン病及び他のアミロイド障害に関連するこれらの症状を改善できることが示されている（実施例１０を参照されたい）。幾つかの実施形態では、アミロイド障害の阻害、改善、可能性の低減、発症の遅延、治療及び／又は予防のための方法は、本発明の化合物、例えば表１及び表２又は表４（下記）の化合物いずれかを含む組成物（例えば、医薬組成物）を投与することを含む。幾つかの実施形態では、組成物は、表４の任意の列の「＋＋＋」の化合物活性範囲によって特定される化合物からなる群から選択される１又は複数の化合物を含む又は本質的にそれらからなる。幾つかの実施形態では、組成物は、表４の任意の列の「＋＋」又は「＋＋＋」の化合物活性範囲によって特定される化合物のセットからなる群から選択される１又は複数の化合物を含む又は本質的にそれらからなる。幾つかの実施形態では、組成物は、表４の任意の列の「＋」、「＋＋」又は「＋＋＋」の化合物活性範囲によって特定される化合物のセットからなる群から選択される１又は複数の化合物を含む又は本質的にそれらからなる。幾つかの実施形態では、組成物は、表４の「αＳｙｎ」列の「＋＋＋」の化合物活性範囲によって特定される化合物からなる群から選択される１又は複数の化合物を含むか又は本質的にそれらからなる。幾つかの実施形態では、組成物は、表４の「αＳｙｎ」列の「＋＋」又は「＋＋＋」の化合物活性範囲によって特定される化合物のセットからなる群から選択される１又は複数の化合物を含む又は本質的にそれらからなる。幾つかの実施形態では、組成物は、表４の「αＳｙｎ」列の「＋」、「＋＋」又は「＋＋＋」の化合物活性範囲によって特定される化合物のセットからなる群から選択される１又は複数の化合物を含む又は本質的にそれらからなる。幾つかの実施形態では、組成物は、表４の「ＣｓｇＡシードαＳｙｎ（ＣｓｇＡ−ｓｅｅｄｅｄ  αＳｙｎ）」列の「＋＋＋」の化合物活性範囲によって特定される化合物からなる群から選択される１又は複数の化合物を含むか又は本質的にそれらからなる。幾つかの実施形態では、組成物は、表４の「ＣｓｇＡシードαＳｙｎ」列の「＋＋」又は「＋＋＋」の化合物活性範囲によって特定される化合物のセットからなる群から選択される１又は複数の化合物を含むか又は本質的にそれらからなる。幾つかの実施形態では、組成物は、表４の「ＣｓｇＡシードαＳｙｎ」列の「＋」、「＋＋」又は「＋＋＋」の化合物活性範囲によって特定される化合物のセットからなる群から選択される１又は複数の化合物を含むか又は本質的にそれらからなる。幾つかの実施形態では、組成物は、表４の「ＣｓｇＡ」列の「＋＋＋」の化合物活性範囲によって特定される化合物からなる群から選択される１又は複数の化合物を含むか又は本質的にそれらからなる。幾つかの実施形態では、組成物は、表４の「ＣｓｇＡ」列の「＋＋」又は「＋＋＋」の化合物活性範囲によって特定される化合物のセットからなる群から選択される１又は複数の化合物を含む又は本質的にそれらからなる。幾つかの実施形態では、組成物は、表４の「ＣｓｇＡ」列の「＋」、「＋＋」又は「＋＋＋」の化合物活性範囲によって特定される化合物のセットからなる群から選択される１又は複数の化合物を含む又は本質的にそれらからなる。幾つかの実施形態では、被験体は、糞便サンプル等の被験体の腸サンプル中の凝集物の存在及び／又はレベルを検出することにより、組成物を必要とするものとして選択される。陰性対照（例えば、健康な対照被験体、又はアミロイド障害がないことがわかっている対照被験体の糞便サンプル）よりも多い腸凝集物の存在又はレベルは、被験体が組成物を必要としていることを示す。
【００３５】
幾つかの実施形態では、被験体のサンプル中の腸凝集物の存在及び／又はレベルを検出することは、サンプル中の細菌タンパク質、例えばＣｓｇＡ等のカーリー関連タンパク質の存在及び／又はレベルを検出することを含む。幾つかの実施形態では、被験体のサンプル中の腸凝集物の存在及び／又はレベルを検出することは、サンプル中のアミロイド、例えばＣｓｇＡ等のカーリー関連タンパク質を産生する細菌のレベルを検出することを含む。例えば、細菌のアミロイドを直接検出することができ、又はサンプル内でアミロイドをコードする核酸を検出することもできることから、被験体の消化管にアミロイド産生細菌が存在することがわかる。アミロイド産生細菌の例には、Ｅ．コリ等のＣｓｇＡ産生腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）が含まれ得る。
【００３６】
アミロイドは、Ｅ．コリ及び他のプロテオバクテリア等の消化管微生物叢のメンバーによって消化管で産生される。これらの微生物アミロイドは、消化管内で接触している細胞と相互作用し、α−シヌクレインの発現及び／又はα−シヌクレインの凝集に影響を与える可能性がある。ＳＴＣ−１細胞株は、マウス小腸の腫瘍に由来し、天然の消化管内分泌細胞の多くの特徴を持っている（ＭｃＣａｒｔｈｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５），ＳＴＣ−１  Ｃｅｌｌｓ．Ｉｎ：Ｖｅｒｈｏｅｃｋｘ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ）Ｔｈｅ  Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ｂｉｏａｃｔｉｖｅｓ  ｏｎ  Ｈｅａｌｔｈ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｃｈａｍ．）。ＳＴＣ−１細胞によるα−シヌクレイン発現がウエスタンブロットによって決定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイでは、野生型ＣｓｇＡを発現するＥ．コリ株への曝露は、α−シヌクレイン発現の顕著な増加をもたらしたが、同質遺伝子変異体への曝露はＣｓｇＡが欠失されたα−シヌクレインレベルにはほとんど影響がなかった（図９及び実施例３３を参照されたい）。したがって、ＣｓｇＡがα−シヌクレインの発現に影響した正確なメカニズムは不明であるが、ＣｓｇＡは消化管の腸内分泌様細胞と相互作用し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでα−シヌクレインの過剰発現を引き起こし、病原性微生物アミロイドが、腸内分泌細胞又は消化管内の他の細胞に接触する場合に同様の効果が起こることを示唆する。通常、マウスのα−シヌクレインの凝集は観察されないが、ヒトα−シヌクレインの過剰発現は凝集を引き起こし、次いで細胞機能を損ない、プリオンのように消化管及び腸神経系の隣接細胞に伝播して、消化管機能に有害な影響を与える。これらの負の影響には、腸ディスバイオシス、腸透過性亢進、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎及び／又はクローン病の１又は複数が含まれる。これらの障害は、嚥下障害、腸管運動性の低下、胃不全麻痺、便秘（慢性便秘及び慢性特発性便秘を含む）、小腸細菌異常増殖（ＳＩＢＯ）、下痢（慢性下痢を含む）、腹痛及び／又は腹痛発作、腹部膨満、鼓腸及び吐き気を含む１又は複数の症状と関連し得る。場合によっては、アミロイド障害の神経学的症状と胃腸症状を関連付けることができる。例えば、パーキンソン病とパーキンソニズム（振戦、運動緩慢、硬直、及び姿勢の不安定性を特徴とする臨床症候群）では、ドーパミンのレベルが低下すると、ジスキネジアの神経学的症状及び慢性特発性便秘の胃腸症状を引き起こす可能性がある。したがって、本発明の方法を含む、腸管運動性を改善する治療は、腸管内のドーパミン吸収を改善し、それにより、運動障害を減少させることができる。したがって、便秘を管理する治療法（又は、より一般的には、腸ディスバイオシス又は腸透過性亢進）は、パーキンソン病の運動症状の進行を遅らせると同様に、パーキンソン病の症状を適切に制御する「オンタイム（ｏｎ−ｔｉｍｅ）」の期間を延長することができる。
【００３７】
Ｅ．コリのＣｓｇＡにｉｎ  ｖｉｔｒｏで反応するＳＴＣ−１細胞の能力と一致して、胃腸細胞は微生物アミロイドを感知して反応することが観察されている。例えば、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）ＣｓｇＡは、ＴＬＲ２／ＰＩ３Ｋ経路の活性化を介して、マウスの消化管透過性を調節することが示されている。さらに、Ｔｕｋｅｌは、米国特許第９，８１４，７５６号で、ＣｓｇＡ及び／又はＣｓｇＢバリアントの投与を介して胃腸の透過性を調節する方法を開示している。Ｔｕｋｅｌは、米国特許第９，８１４，７５６号において、（ｉ）１個〜５個のアミノ酸が置換、欠失、若しくは付加されている点で天然起源のＣｓｇＡポリペプチドとは異なるＣｓｇＡポリペプチドバリアント；（ｉｉ）１個〜５個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されている点で天然起源のＣｓｇＢポリペプチドとは異なるＣｓｇＢポリペプチドバリアント；又は（ｉｉｉ）上記ＣｓｇＡポリペプチドバリアントと上記ＣｓｇＢポリペプチドバリアントとの組み合わせ等のとりわけ上皮透過性低下活性を有する単離されたカーリー原線維を含む組成物を投与することにより小腸又は大腸の上皮の透過性を低下させることを開示している。したがって、微生物アミロイドが消化管細胞と相互作用する追加の機構が存在する可能性があるが、本明細書ではかかるメカニズムの少なくとも１つが企図される。
【００３８】
本開示は、アミロイド障害の治療、改善、又は予防のための方法及び組成物に関する。本明細書に開示されるのは、真核生物タンパク質α−シヌクレインの凝集及びアミロイド形成を促進する細菌アミロイドの能力を変える組成物及び方法である。上記変化には、微生物により誘発されたアミロイドの程度、形成速度、安定性及び／又は脱凝集速度の変化、又はそれらの任意の組み合わせが含まれ得る。本明細書でさらに開示されるのは、神経変性疾患の治療又は阻害に有用な組成物（例えば、本発明の化合物を含む）及び方法と並んで、神経変性疾患の進行の予防又は改善に有用な組成物及び方法である。本明細書でさらに開示されるのは、神経変性疾患に関連する消化管機能障害の治療又は阻害に有用な組成物及び方法である。本明細書にさらに開示されるのは、哺乳類アミロイド疾患の分子病因及び細菌アミロイド産生と哺乳類アミロイド産生との間の分子的リンクを研究する方法である。本開示の方法によれば、上記神経変性疾患及び／又は哺乳類アミロイド疾患は、パーキンソン病（ＰＤ）、レビー小体型認知症、多系統萎縮症、及び他の全てのα−シヌクレイノパチー、ＰＤ関連便秘、ＰＤ関連低血圧症、ハンチントン病、アレキサンダー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病及びアミロイドが関係している他の疾患の１又は複数を含み得る。幾つかの実施形態では、組成物は、本明細書に記載の本発明の化合物を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなる。本開示はさらに、宿主アミロイドタンパク質と細菌アミロイドタンパク質の両方の凝集及び脱凝集の評価を促進する方法に関する。本開示の方法は、これらのプロセスに影響を及ぼす薬物候補を特定するのにも有用である。
【００３９】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載の本発明の化合物を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなる組成物は、α−シヌクレイン凝集、ＣｓｇＡ又は他の微生物アミロイドによるα−シヌクレイン凝集のシーディング、及びｉｎ  ｖｉｖｏでα−シヌクレイン凝集のシードとなる可能性のある微生物アミロイドの形成の防止に有用であり、したがって、これらの化合物は、パーキンソン病及び／又は他のα−シヌクレイノパチーの予防又は治療に有用である可能性がある（例えば、実施例３２及び表３を参照されたい）と考えられる。
【００４０】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載の本発明の化合物を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなる組成物は、微生物アミロイドによるシーディングの有無にかかわらずα−シヌクレインの凝集を予防するのに有用であり、それにより微生物アミロイドとは独立したα−シヌクレイノパチーの予防又は治療に有益な可能性があると考えられる（実施例３２及び表３を参照されたい）。
【００４１】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載の本発明の化合物を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなる組成物は、微生物アミロイドによってシードされたα−シヌクレイン凝集を予防するのに有用であり、それにより、例えば消化管等、微生物のアミロイドが豊富に存在し得る部位（実施例３２及び表３を参照されたい）投薬された場合に治療上の利点を有すると考えられる。
【００４２】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載の本発明の化合物を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなる組成物は、パーキンソン病及び他のα−シヌクレイノパチーにおいて治療効果を有し得る。理論に制限されることなく、この利点は、これらの化合物のα−シヌクレイン及び／又は微生物アミロイドの凝集の阻害による可能性がある。さらに、２つ以上のタイプの凝集が阻害される化合物の場合、これらの阻害効果は相加的又は相乗的であり得ると考えられる（実施例３２及び表３を参照されたい）。
【００４３】
したがって、本明細書では、アミロイド障害、例えば、α−シヌクレイノパシー、パーキンソン病、レビー小体型認知症、偶発性レビー小体病、アルツハイマー病レビー小体亜型、多系統萎縮症、純粋自律神経失調症、又は列挙される２つ以上の項目の組み合わせ等の表４のいずれかのアミロイド障害（下記）の阻害、改善、可能性の低減、発症の遅延、治療及び／又は予防に有用な化合物（すなわち、本発明の化合物）が提供される。
【００４４】
本発明の化合物
一態様では、式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容可能な塩が本明細書で提供される。
【化１】
2020529432.tif 000003
【００４５】
式（Ｉ）、本明細書で提供される式（Ｉ）の実施形態、及びその薬学的に許容可能な塩は、以下のように定義される：
【００４６】
Ｌ１は、結合及び−Ｎ（Ｒ５）（Ｃ＝Ｏ）−から選択される２価の部分である。
【００４７】
Ｌ２は、−（Ｃ＝Ｏ）−及び−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−から選択される２価の部分である。
【００４８】
Ｇ１は、−Ｎ（Ｒ５）２及びＲ６から選択される１価の部分である。特定の実施形態では、Ｇ１は−ＮＨ２である。特定の実施形態では、Ｇ１は−ＮＨＲ５である。特定の実施形態では、Ｇ１は−Ｎ（Ｒ５）２である。特定の実施形態では、Ｇ１はＲ６である。
【００４９】
Ｇ２は、−Ｈ、−Ｎ（Ｒ５）２、及び−Ｎ（Ｒ５）（Ｒ６）から選択される１価の部分である。特定の実施形態では、Ｇ２は−Ｈである。特定の実施形態では、Ｇ２は−ＮＨ２である。特定の実施形態では、Ｇ２は−ＮＨＲ５である。特定の実施形態では、Ｇ２は−Ｎ（Ｒ５）２である。特定の実施形態では、Ｇ２は−ＮＨＲ６である。特定の実施形態では、Ｇ２は−Ｎ（Ｒ５）（Ｒ６）である。
【００５０】
各Ｒ５は、−Ｈ及びアルキルから独立して選択される１価の部分である。特定の実施形態では、Ｒ５は置換Ｃ１〜６アルキルである。特定の実施形態では、Ｒ５は非置換Ｃ１〜６アルキルである。特定の実施形態では、Ｒ５はメチルである。特定の実施形態では、Ｒ５は−Ｈである。
【００５１】
各Ｒ６は、ｎ個のＲ７で置換されたアリールである。各Ｒ６について、ｎは０、１、２、３又は４である。特定の実施形態では、ｎは０である。特定の実施形態では、ｎは１である。特定の実施形態では、ｎは２である。特定の実施形態では、ｎは３である。特定の実施形態では、ｎは４である。
【００５２】
各Ｒ７は、−Ｆ、−ＯＨ、及び−Ｏ（アルキル）から独立して選択される。特定の実施形態では、各Ｒ７は、−Ｆ、−ＯＨ、及び−ＯＣＨ３から独立して選択される。特定の実施形態では、各Ｒ７は、−ＯＨ及び−ＯＣＨ３から独立して選択される。特定の実施形態では、各Ｒ７は−ＯＨである。特定の実施形態では、各Ｒ７は−ＯＣＨ３である。
【００５３】
特定の実施形態では、式（Ｉ）は式（Ｉ−ａ）又はその薬学的に許容可能な塩である。
【化２】
2020529432.tif 000004
【００５４】
式（Ｉ−Ａ）の特定の実施形態では：
Ｇ１はＲ６であり；
Ｇ２は−ＮＨ２又は−Ｎ（Ｒ５）（Ｒ６）であり；
Ｒ５は−Ｈ又は−ＣＨ３であり；
Ｒ６は、ｎ個のＲ７の例で置換されたフェニルであり；
Ｒ７は、それぞれ独立して−Ｆ、−ＯＨ、又は−ＯＣＨ３であり；
ｎは０、１、２、３又は４である。
【００５５】
特定の実施形態では、式（Ｉ）は式（Ｉ−ｂ）又はその薬学的に許容可能な塩である。
【化３】
2020529432.tif 000005
【００５６】
特定の実施形態では、式（Ｉ−ｂ）は、式（Ｉ−ｂ−１）又は式（Ｉ−ｂ−２）又はその薬学的に許容可能な塩である。
【化４】
2020529432.tif 000006
【００５７】
特定の実施形態では、式（Ｉ）、（Ｉ−ａ）、（Ｉ−ｂ）、（Ｉ−ｂ−１）若しくは（Ｉ−ｂ−２）の化合物、又はその薬学的に許容可能な塩は、０個〜６個のＲ７を有する。特定の実施形態では、化合物は、１個〜６個のＲ７の例を有する。特定の実施形態では、化合物は、２個〜６個のＲ７の例を有する。特定の実施形態では、化合物は、３個〜６個のＲ７の例を有する。特定の実施形態では、化合物は、１個〜３個のＲ７の例を有する。特定の実施形態では、化合物は、２個〜４個のＲ７の例を有する。特定の実施形態では、化合物は、２つのＲ７の例を有する。特定の実施形態では、化合物は、３つのＲ７の例を有する。特定の実施形態では、化合物は、４つのＲ７の例を有する。特定の実施形態では、化合物は、５つのＲ７の例を有する。特定の実施形態では、化合物は、６つのＲ７の例を有する。
【００５８】
式（Ｉ）、（Ｉ−ａ）、（Ｉ−ｂ）、（Ｉ−ｂ−１）若しくは（Ｉ−ｂ−２）の化合物、又はその薬学的に許容可能な塩の特定の実施形態では、各Ｒ６は以下から独立して選択される：
【化５】
2020529432.tif 000007
【００５９】
式（Ｉ）、（Ｉ−ａ）、（Ｉ−ｂ）、（Ｉ−ｂ−１）若しくは（Ｉ−ｂ−２）の化合物、又はその薬学的に許容可能な塩の特定の実施形態では、各Ｒ６は以下から独立して選択される：
【化６】
2020529432.tif 000008
【００６０】
特定の実施形態では、式（Ｉ）、（Ｉ−ａ）、（Ｉ−ｂ）、（Ｉ−ｂ−１）又は（Ｉ−ｂ−２）の化合物が提供される：
（ａ）少なくとも１つＲ６の例を含む；及び／又は
（ｂ）少なくとも３つＲ７の例を含む；及び／又は
（ｃ）次の化合物のいずれでもない：
【化７】
2020529432.tif 000009
【００６１】
特定の実施形態では、式（Ｉ）、（Ｉ−ａ）、（Ｉ−ｂ）、（Ｉ−ｂ−１）、又は（Ｉ−ｂ−２）の化合物は、表１の化合物及びその薬学的に許容可能な塩から選択される。
【００６２】
【表１】
2020529432.tif 000010
2020529432.tif 000011
2020529432.tif 000012
2020529432.tif 000013
【００６３】
別の態様では、式（ＩＩ）の化合物又はその薬学的に許容可能な塩が本明細書で提供される。
【化８】
2020529432.tif 000014
【００６４】
式（ＩＩ）、本明細書で提供される式（ＩＩ）の実施形態、及びその薬学的に許容可能な塩は、以下の通り定義される。
【００６５】
Ｌ１は結合である。
【００６６】
Ｌ２は、結合、−ＣＨ２−、−（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−及び−ＮＲ２（Ｃ＝Ｏ）−から選択される２価の部分である。
【００６７】
Ｇ１は、−Ｈ及びＲ３から選択される１価の部分である。特定の実施形態では、Ｇ１は−Ｈである。特定の実施形態では、Ｇ１はＲ３である。
【００６８】
Ｇ２は、−Ｈ、−Ｎ（Ｒ２）２、−Ｎ（Ｒ２）（Ｒ３）及びＲ３から選択される１価の部分である。特定の実施形態では、Ｇ２は−Ｈである。特定の実施形態では、Ｇ２は−Ｎ（Ｒ２）２である。特定の実施形態では、Ｇ２は−ＮＨ２である。特定の実施形態では、Ｇ２は−Ｎ（Ｃ１〜６アルキル）２である。特定の実施形態では、Ｇ２は−Ｎ（Ｒ２）（Ｒ３）である。特定の実施形態では、Ｇ２はＲ３である。
【００６９】
Ｒは、−Ｈ及びアルキルから選択される１価の部分である。特定の実施形態では、Ｒは置換Ｃ１〜６アルキルである。特定の実施形態では、Ｒは非置換Ｃ１〜６アルキルである。特定の実施形態では、Ｒはメチルである。特定の実施形態では、Ｒは−Ｈである。
【００７０】
各Ｒ１は、−Ｆ、−ＯＨ及び−Ｏ（アルキル）から独立して選択される。特定の実施形態では、各Ｒ１は、−Ｆ、−ＯＨ及び−ＯＣＨ３から独立して選択される。特定の実施形態では、各Ｒ１は、−ＯＨ及び−ＯＣＨ３から独立して選択される。特定の実施形態では、各Ｒ１は−ＯＨである。特定の実施形態では、各Ｒ１は−ＯＣＨ３である。
【００７１】
各Ｒ２は、−Ｈ及びアルキルから独立して選択される１価の部分である。特定の実施形態では、Ｒ２は置換Ｃ１〜６アルキルである。特定の実施形態では、Ｒ２は非置換Ｃ１〜６アルキルである。特定の実施形態では、Ｒ２はメチルである。特定の実施形態では、Ｒ２は−Ｈである。
【００７２】
各Ｒ３は、ｎ個のＲ４の例で置換されたアリールである。各Ｒ３について、ｎは０、１、２、３、又は４である。特定の実施形態では、ｎは０である。特定の実施形態では、ｎは１である。特定の実施形態では、ｎは２である。特定の実施形態では、ｎは３である。特定の実施形態では、ｎは４である。
【００７３】
各Ｒ４は、−Ｆ、−ＯＨ、及び−Ｏ（アルキル）から独立して選択される。特定の実施形態では、各Ｒ４は、−Ｆ、−ＯＨ、及び−ＯＣＨ３から独立して選択される。特定の実施形態では、各Ｒ４は、−ＯＨ及び−ＯＣＨ３から独立して選択される。特定の実施形態では、各Ｒ４は−ＯＨである。特定の実施形態では、各Ｒ７は−ＯＣＨ３である。
【００７４】
ｍは０、１、２、３、又は４である。特定の実施形態では、ｍは０である。特定の実施形態では、ｍは１である。特定の実施形態では、ｍは２である。特定の実施形態では、ｍは３である。特定の実施形態では、ｍは４である。
【００７５】
特定の実施形態では、
Ｌ１は結合であり；
Ｌ２は結合、−ＣＨ２−、−（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−又は−ＮＲ２（Ｃ＝Ｏ）−；
Ｇ１は−Ｈ又はＲ３であり；
Ｇ２は−Ｎ（Ｒ２）（Ｒ３）又はＲ３であり；
ＲはＨ又は−ＣＨ３であり；
Ｒ１は−ＯＨ又は−ＯＣＨ３であり；
Ｒ２は−Ｈ又は−ＣＨ３であり；
Ｒ３はｍ個のＲ４の例で置換されたフェニルであり；
Ｒ４はそれぞれ独立して、−Ｆ、−ＯＨ又は−ＯＣＨ３であり；
ｎはそれぞれ、０、１、２、３又は４であり；
ｍは０、１、２、３又は４である。
【００７６】
特定の実施形態では、式（ＩＩ）は、式（ＩＩ−ａ）若しくは式（ＩＩ−ｂ）又はその薬学的に許容可能な塩である。
【化９】
2020529432.tif 000015
【００７７】
特定の実施形態では、式（ＩＩ−ａ）は式（ＩＩ−ａ−１）若しくは式（ＩＩ−ａ−２）又はその薬学的に許容可能な塩である。：
【化１０】
2020529432.tif 000016
【００７８】
特定の実施形態では、式（ＩＩ−ｂ）は、式（ＩＩ−ｂ−１）若しくは式（ＩＩ−ｂ−２）又はその薬学的に許容可能な塩である。
【化１１】
2020529432.tif 000017
【００７９】
特定の実施形態では、式（ＩＩ）、（ＩＩ−ａ）、（ＩＩ−ａ−１）、（ＩＩ−ａ−２）、（ＩＩ−ｂ）、（ＩＩ−ｂ−１）、（ＩＩ−ｂ−２）又はその薬学的に許容可能な塩は、０個〜６個のＲ４を有する。特定の実施形態では、化合物は、１個〜６個のＲ４の例を有する。特定の実施形態では、化合物は、２個〜６個のＲ４の例を有する。特定の実施形態では、化合物は、３個〜６個のＲ４の例を有する。特定の実施形態では、化合物は、１個〜３個のＲ４の例を有する。特定の実施形態では、化合物は、２個〜４個のＲ４の例を有する。特定の実施形態では、化合物は、２つのＲ４の例を有する。特定の実施形態では、化合物は、３つのＲ４の例を有する。特定の実施形態では、化合物は、４つのＲ４の例を有する。特定の実施形態では、化合物は５つのＲ４の例を有する。特定の実施形態では、化合物は、６つのＲ４の例を有する。
【００８０】
式（ＩＩ）、（ＩＩ−ａ）、（ＩＩ−ａ−１）、（ＩＩ−ａ−２）、（ＩＩ−ｂ）、（ＩＩ−ｂ−１）、（ＩＩ−ｂ−２）又はその薬学的に許容可能な塩、ｍ及びｎの全ての例の合計は０〜９である。特定の実施形態では、合計は１〜９である。特定の実施形態では、合計は２〜９である。特定の実施形態では、合計は３〜９である。特定の実施形態では、合計は４〜９である。特定の実施形態では、合計は５〜９である。特定の実施形態では、合計は６〜９である。特定の実施形態では、合計は１〜６である。特定の実施形態では、合計は２〜６である。特定の実施形態では、合計は３〜６である。特定の実施形態では、合計は１〜３である。特定の実施形態では、合計は２である。特定の実施形態では、合計は３である。特定の実施形態では、合計は４である。特定の実施形態では、合計は５である。特定の実施形態では、合計は６である。特定の実施形態では、合計は７である。特定の実施形態では、合計は８である。特定の実施形態では、合計は９である。
【００８１】
式（ＩＩ）、（ＩＩ−ａ）、（ＩＩ−ａ−１）、（ＩＩ−ａ−２）、（ＩＩ−ｂ）、（ＩＩ−ｂ−１）、（ＩＩ−ｂ−２）又はその薬学的に許容可能な塩、各Ｒ３は、以下から独立して選択される：
【化１２】
2020529432.tif 000018
【００８２】
式（ＩＩ）、（ＩＩ−ａ）、（ＩＩ−ａ−１）、（ＩＩ−ａ−２）、（ＩＩ−ｂ）、（ＩＩ−ｂ−１）、（ＩＩ−ｂ−２）又はその薬学的に許容可能な塩、各Ｒ３は、以下から独立して選択される：
【化１３】
2020529432.tif 000019
【００８３】
式（ＩＩ）、（ＩＩ−ａ）、（ＩＩ−ａ−１）、（ＩＩ−ａ−２）、（ＩＩ−ｂ）、（ＩＩ−ｂ−１）、又は（ＩＩ−ｂ−２）の特定の実施形態では、以下が提供される：
（ａ）化合物は、少なくとも１つのＲ３の例を含む；及び／又は
（ｂ）ｍ及びｎの全ての例の合計は少なくとも３であり；及び／又は
（ｃ）化合物は次の構造を持たない：
【化１４】
2020529432.tif 000020
【００８４】
特定の実施形態では、式（ＩＩ）、（ＩＩ−ａ）、（ＩＩ−ａ−１）、（ＩＩ−ａ−２）、（ＩＩ−ｂ）、（ＩＩ−ｂ−１）、又は（ＩＩ−ｂ−２）は、表２の化合物及びその薬学的に許容可能な塩から選択される。
【００８５】
【表２】
2020529432.tif 000021
2020529432.tif 000022
2020529432.tif 000023
2020529432.tif 000024
【００８６】
上記の化合物及びその薬学的に許容可能な塩は、まとめて本発明の化合物と称されることがある。
【００８７】
「アルキル」という用語は、１個〜１０個の炭素原子を有する直鎖又は分岐の飽和炭化水素基のラジカルを指す（「Ｃ１〜１０アルキル」）。幾つかの実施形態では、アルキル基は１個〜９個の炭素原子を有する（「Ｃ１〜９アルキル」）。幾つかの実施形態では、アルキル基は１個〜８個の炭素原子を有する（「Ｃ１〜８アルキル」）。幾つかの実施形態では、アルキル基は１個〜７個の炭素原子を有する（「Ｃ１〜７アルキル」）。幾つかの実施形態では、アルキル基は１個〜６個の炭素原子を有する（「Ｃ１〜６アルキル」）。幾つかの実施形態では、アルキル基は１個〜５個の炭素原子を有する（「Ｃ１〜５アルキル」）。幾つかの実施形態では、アルキル基は１個〜４個の炭素原子を有する（「Ｃ１〜４アルキル」）。幾つかの実施形態では、アルキル基は１個〜３個の炭素原子を有する（「Ｃ１〜３アルキル」）。幾つかの実施形態では、アルキル基は１個〜２個の炭素原子を有する（「Ｃ１〜２アルキル」）。幾つかの実施形態では、アルキル基は１個の炭素原子を有する（「Ｃ１アルキル」）。幾つかの実施形態では、アルキル基は２個〜６個の炭素原子を有する（「Ｃ２〜６アルキル」）。Ｃ１〜６アルキル基としては、メチル（Ｃ１）、エチル（Ｃ２）、プロピル（Ｃ３）（例えば、ｎ−プロピル、イソプロピル）、ブチル（Ｃ４）（例えば、ｎ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル）、ペンチル（Ｃ５）（例えば、ｎ−ペンチル、３−ペンタニル、アミル、ネオペンチル、３−メチル−２−ブタニル、三級アミル）、及びヘキシル（Ｃ６）（例えば、ｎ−ヘキシル）が挙げられる。アルキル基の追加の例としては、ｎ−ヘプチル（Ｃ７）、ｎ−オクチル（Ｃ８）等が挙げられる。特段の明示がない限り、アルキル基の各例は、独立して非置換（「非置換アルキル」）又は１若しくは複数の置換基（例えば、Ｆ等のハロゲン）で置換（「置換アルキル」）されている。特定の実施形態では、アルキル基は、非置換Ｃ１〜１０アルキル（非置換Ｃ１〜６アルキル、例えば−ＣＨ３（Ｍｅ）、非置換エチル（Ｅｔ）、非置換プロピル（Ｐｒ、例えば非置換ｎ−プロピル（ｎ−Ｐｒ）、非置換イソプロピル（ｉ−Ｐｒ））、非置換ブチル（Ｂｕ、例えば非置換ｎ−ブチル（ｎ−Ｂｕ）、非置換ｔｅｒｔ−ブチル（ｔｅｒｔ−Ｂｕ又はｔ−Ｂｕ）、非置換ｓｅｃ−ブチル（ｓｅｃ−Ｂｕ又はｓ−Ｂｕ）、非置換イソブチル（ｉ−Ｂｕ））である。特定の実施形態では、アルキル基は、置換Ｃ１〜１０アルキル（置換Ｃ１〜６アルキル、例えば、−ＣＨ２Ｆ、−ＣＨＦ２、−ＣＦ３又はベンジル（Ｂｎ）等）である。アルキル基は分岐していてもよく、又は分岐していなくてもよい。
【００８８】
「アリール」という用語は、芳香族環系で提供される６個〜１４個の炭素原子及びゼロヘテロ原子を有する単環式又は多環式（例えば、二環式又は三環式）４ｎ＋２芳香環系（例えば、環状配列で共有される６個、１０個又は１４個のπ電子を有する）のラジカル（「Ｃ６〜１４アリール」）を指す。幾つかの実施形態では、アリール基は６個の環炭素原子を有する（「Ｃ６アリール」；例えばフェニル）。幾つかの実施形態では、アリール基は、１０個の環炭素原子を有する（「Ｃ１０アリール」；例えば、１−ナフチル及び２−ナフチル等のナフチル）。幾つかの実施形態では、アリール基は、１４個の環炭素原子を有する（「Ｃ１４アリール」；例えば、アントラシル）。「アリール」には、上記で定義したアリール環が１又は複数のカルボシクリル基又はヘテロシクリル基と縮合している環系も含まれ、ラジカル又は結合点はアリール環上にあり、かかる場合、炭素原子の数は続いてアリール環系の炭素原子の数を指定する。特段の明示がない限り、アリール基の各例は独立して非置換（「非置換アリール」）であるか、又は１つ若しくは複数の置換基（例えば、−Ｆ、−ＯＨ又は−Ｏ（Ｃ１〜６アルキル）で置換（「置換アリール」）されている。特定の実施形態では、アリール基は非置換Ｃ６〜１４アリールである。特定の実施形態では、アリール基は置換Ｃ６〜１４アリールである。
【００８９】
「溶媒和物」は、本開示に鑑みて当業者によって理解される、慣習的で通常の意味を有する。「溶媒和物」は、溶媒及び活性医薬成分（又はＡＰＩ）、その代謝産物又は塩との相互作用によって形成される化合物を指す。適切な溶媒和物は、水和物を含む薬学的に許容可能な溶媒和物である。
【００９０】
「減少する」、「低減する」、「低減、「阻害する」又は「妨害する」はいずれも、統計額的に有意な量の減少を意味するため本明細書で使用される。幾つかの実施形態では、「低減する」、「低減」、「減少する」、「阻害する」又は「妨害する」は、通常、参照レベルと比較して少なくとも１０％の減少を意味し（例えば、所与の治療の不在）、例えば、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又はそれ以上の減少を含むことができる。「低減」又は「阻害」は、本明細書で使用される場合、参照レベルと比較した場合の完全な阻害又は低減を包含しない。「完全な阻害」とは、基準レベルと比較して１００％の阻害である。減少は、好ましくは、所定の障害のない個体の正常範囲内として許容されるレベルまで低下させることができる。
【００９１】
化合物（例えば、本発明の化合物）又はかかる化合物を含む組成物の「有効量」又は「有効用量」は、例えば、選択された投与形態、経路、及び／又はスケジュールに従って細胞又は生物に送達される場合、所望の生物学的及び／又は薬理学的効果を達成するのに十分な量を指す。「有効量」及び「治療有効量」という語句は、区別なく使用される。当業者によって理解される、有効な特定の化合物又は組成物の絶対量は、所望の生物学的又は薬理学的エンドポイント、送達される薬剤、標的組織等の要因に応じて異なり得る。当業者は、様々な実施形態において、「有効量」が単回投与で、又は複数回投与の使用を通じて被験体に投与され得ることを更に理解するであろう。
【００９２】
医薬組成物、製剤、投与及び投薬
別の態様において、本明細書で提供されるのは、本発明の化合物と薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物である。本明細書に記載の医薬組成物は、アミロイド形成の阻害に有用である。
【００９３】
特定の実施形態では、医薬組成物は、被験体の全身循環の外側への送達用に製剤化される。特定の実施形態では、医薬組成物は、被験体の中枢神経系への送達用に製剤化される。上記組成物は、例えば、腸内又は鼻腔内送達用に製剤化されてもよく、及び／又は上記組成物は、下部腸又は結腸内の制御放出用に更に製剤化されてもよい。前述の組成物は、腸溶コーティングカプセル剤、錠剤、ソフトゲル、噴霧乾燥粉末、ポリマーマトリクス、ヒドロゲル、腸溶コーティング固体、結晶性固体、非晶質固体、ガラス状固体、コーティング微粉化粒子、液体、噴霧液、エアロゾル、又はマイクロカプセルを含み得る。
【００９４】
特定の実施形態では、医薬組成物は経口投与用に製剤化される。特定の実施形態では、医薬組成物は、注射による投与用に製剤化される。注射は、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、脊髄内又は頭蓋内であり得る。
【００９５】
医薬組成物は、有効量の本発明の１又は複数の化合物である。有効量は、所望の生物学的及び／又は薬理学的効果の１又は複数、例えば、アミロイド凝集体の形成の妨害若しくは阻害、神経障害の若しくは神経障害の症状の治療若しくは予防、又は胃腸障害若しくは胃腸障害の症状の治療若しくは予防を達成するのに十分である。
【００９６】
「投与する」は、本開示に鑑みて当業者によって理解される、慣習的で通常の意味を有する。「投与する」は、被験体への医薬品、栄養補助食品又は組成物の提供を指し、医療専門家による投与及び自己投与が含まれるが、これらに限定されない。本明細書に開示される化合物又はその薬学的に許容可能な塩の投与は、経口、腹腔内又は直腸を含むがこれらに限定されない類似の有用性を提供する薬剤の許容される投与様式のいずれかによるものであり得る。経口投与は、好ましい実施形態の主題である組成物を投与する際に通例となっている。しかしながら、幾つかの実施形態では、本開示の方法に従って投与される組成物は、浣腸又は坐剤等によって直腸投与される。幾つかの実施形態では、化合物の投与は、例えばアフェレーシス又は透析により体外で起こり得る。
【００９７】
「薬剤」という用語は、本開示に鑑みて当業者によって理解される慣習的で通常の意味を有する。任意の物質、分子、要素、化合物、実態又はそれらの組み合わせが含まれる。「薬剤」には、例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド又は模倣物、有機小分子、多糖、ポリヌクレオチド、ポリマー、樹脂、有機又は無機微粒子、有機又は無機ナノ粒子等が含まれるが、これらに限定されない。「薬剤」は、天然物、合成化合物若しくは化学化合物、又は２つ以上の物質の組み合わせであってもよい。
【００９８】
幾つかの実施形態では、本開示の方法は、アミロイド形成に関連する１又は複数の神経障害の改善又は治療に有用な１又は複数の組成物の投与を企図する。上記組成物は、パーキンソン病（ＰＤ）、レビー小体型認知症、多系統萎縮症等のアミロイド形成に関連する神経疾患又は神経障害、並びに他の全てのα−シヌクレイノパチー、ＰＤ関連便秘、ＰＤ関連低血圧症、ハンチントン病、アレキサンダー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、及び／又はアルツハイマー病及び／又はアミロイドが関与する他の疾患の治療、阻害、又は改善に使用するための医薬組成物及び／又は栄養補助食品に製剤化され得る。その全体が引用することで本明細書の一部をなす、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ´ｓ  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ  Ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ（２００５）に開示されているもの等、標準的な医薬品及び／又は栄養補助食品製剤の技術が使用される。したがって、幾つか実施形態は：（ａ）安全で治療的に有効な量の本明細書に記載の１又は複数の化合物又はその薬学的に許容可能な塩と；（ｂ）薬学的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤又はそれらの組み合わせとを含む医薬及び／又は栄養補助食品組成物を含む
【００９９】
「薬学的に可能な担体」又は「薬学的に許容可能な賦形剤」という用語は、本開示に鑑みて当業者によって理解されるその慣習的で通常の意味を有する。該用語は、あらゆる溶媒、希釈剤、乳化剤、結合剤、緩衝剤、分散媒、コーティング剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤等、又は医薬製剤の調製に有用であることが当業者に知られている他の任意の化合物を含む。薬学的に活性な物質のためのかかる媒質及び薬剤の使用は、当該分野でよく知られている。任意の従来の媒質又は薬剤が活性成分と適合しない場合を除いて、治療組成物におけるその使用が企図される。補助的な活性成分も組成物に組み込むことができる。さらに、当技術分野で一般的に使用されているような様々なアジュバントが含まれてもよい。これら及び他のかかる化合物は、例えばニュージャージー州ラーウェイのＭｅｒｃｋ＆ＣｏｍｐａｎｙのＭｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘの文献に記載されている。医薬組成物に様々な成分を含めることに関する考慮事項は、例えば、Ｇｉｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｓ．）（１９９０）；Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ´ｓ：Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，８ｔｈ  Ｅｄ．，Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓに記載されている。
【０１００】
本明細書の幾つかの実施形態の方法及び組成物に従って薬学的に許容可能な担体又はその成分として機能することができる物質の幾つかの例は、ラクトース、グルコース及びスクロース等の糖；トウモロコシデンプン及びジャガイモデンプン等のデンプン；カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、メチルセルロース等のセルロース及びその誘導体；粉末トラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；ステアリン酸及びステアリン酸マグネシウム等の固体潤滑剤；硫酸カルシウム；ピーナッツ油、綿実油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油及びテオブロマ油等の植物油；プロピレングリコール、グリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコール等のポリオール；アルギン酸；ＴＷＥＥＮ等の乳化剤；ラウリル硫酸ナトリウム等の湿潤剤；着色剤；香料；打錠剤、安定剤；抗酸化剤；防腐剤；発熱物質を含まない水；等張生理食塩水；及び／又はリン酸バッファー、又はそれらの任意の組み合わせである。
【０１０１】
本明細書に記載の投与される１又は複数の化合物と併せて使用される薬学的に許容可能な担体の選択は、化合物の投与方法によって決定され得る。
【０１０２】
加えて、本開示は、本明細書に記載の化合物の様々な塩、エステル、水和物、プロドラッグ、フッ素化類縁体又は重水素化形態を含む同位体置換類縁体を含む組成物を含む。
【０１０３】
「全身循環」は、本明細書で使用される場合、本開示に鑑みて当業者によって理解されるその慣習的で通常の意味を有する。「全身循環」は、被験体の血液の循環又は循環系内を指する。
【０１０４】
「腸溶コーティング」は、本明細書で使用される場合、本開示に鑑みて当業者によって理解されるその慣習的で通常の意味を有する。「腸溶コーティング」は、例えば、胃酸に対する耐性を付与する又は中性若しくは塩基性のｐＨでより高い溶解度を与えることによって、その溶解性又は溶解のタイミングを制御することにより、消化管の所望の部分に到達するまで上記粒子が溶媒から保護される可能性を高める、粒子の周囲をコーティングする又はその周囲に配置される薬学的賦形剤を指す。代表的な腸溶性コーティングには、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ´ｓ  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ  Ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ（２００５）に記載されているものが含まれる。例示的な腸溶性コーティングとしては、シェラック、アルギン酸ナトリウム、ゼイン、酢酸トリメリット酸セルロース、メタクリル酸メチル−メタクリル酸共重合体、ポリ酢酸フタル酸ビニル、ポリ乳酸、ポリ乳酸−コ−グリコール酸、酢酸ヒプロメロース、酢酸コハク酸ヒプロメロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、酢酸コハク酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、アクリル酸メチル−メタクリル酸共重合体、酢酸フタル酸ポリビニル、Ｏｐａｄｒｙ（登録商標）、並びに薬物送達及び製剤化の分野で知られているその他のものが挙げられるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態の方法及び組成物によれば、本明細書に記載の化合物を含む組成物は、腸溶コーティングを更に含む。
【０１０５】
「腸管選択性」という用語は、本明細書で使用される場合、本開示に鑑みて当業者によって理解されるその慣習的で通常の意味を有する。「腸管選択性」は、被験体の腸内で放出され、好ましくは吸収されないか、又は吸収が起こった場合に全身循環に入らない組成物又は製剤を指す。
【０１０６】
「本質的に腸溶性」という用語は、本明細書で使用される場合、本開示に鑑みて当業者によって理解されるその慣習的で通常の意味を有する。医薬製剤に関して、胃環境での妨害又は放出を防ぐ能力を本来的に有する組成物を指す。
【０１０７】
本明細書に記載の被験体への投与のための組成物は、好ましくは単位剤形で提供される。「単位剤形」は、本明細書で使用される場合、本開示に鑑みて当業者によって理解されるその慣習的で通常の意味を有する。「単位剤形」は、良好な医療行為に従って、単回用量での被験体への投与に適した量の化合物を含む組成物を指す。しかしながら、単一又は単位剤形の調製は、剤形が１日１回又は治療過程ごとに１回投与されることを意味しない。単位剤形は、単一の１日用量又は部分分割用量を含み得て、幾つかの単位剤形は、１日用量を完了するために１日の間に投与されることとなっている。本開示によれば、単位剤形は、１日１回よりも多かれ少なかれ頻繁に投与されてもよく、治療過程中に２回以上投与されてもよい。かかる剤形は、経口、直腸、経鼻及び／又は非経口を含む、それらの製剤と一致する任意の方法で投与され得る。単回投与が特に考えられるが、本明細書に記載の方法に従って投与される組成物は、連続注入として、又は埋め込み可能な注入ポンプを介して投与されてもよい。
【０１０８】
本明細書に記載の方法は、例えば、経口、経鼻、直腸又は非経口の様々な投与経路に適した様々な形態のいずれかを利用し得る。所望の特定の投与経路に応じて、当技術分野でよく知られている様々な薬学的に許容可能な担体が使用され得る。薬学的に許容可能な担体としては、例えば、固体又は液体の充填剤、希釈剤、ヒドロトロープ、界面活性剤及びカプセル化物質が挙げられる。製剤中の１又は複数の化合物の活性を実質的に妨げない任意の薬学的に活性な材料が含まれてもよい。化合物と共に使用される担体の量は、化合物の単位用量当たりの投与のための材料の実用的な量を提供するのに十分である。本明細書に記載の方法において有用な剤形を作製するための技術及び組成物は、以下の参考文献に記載されており、いずれも引用することで本明細書の一部をなす：Ｍｏｄｅｒｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，４ｔｈ  Ｅｄ．，Ｃｈａｐｔｅｒｓ  ９  ａｎｄ１０（Ｂａｎｋｅｒ＆Ｒｈｏｄｅｓ，ｅｄｉｔｏｒｓ，２００２）；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ（１９８９）；及びＡｎｓｅｌ，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（２００４）。
【０１０９】
錠剤、カプセル剤、顆粒及び／又はバルク粉末等の固体形態を含む、様々な経口投与形態を使用することができる。好適な結合剤、潤滑剤、希釈剤、崩壊剤、着色剤、風味剤、流動誘導剤及び／又は融解剤を含む、錠剤は、圧縮、錠剤粉砕、腸溶コーティング、糖衣、フィルムコーティング又は複数圧縮され得る。さらなる固体剤形は、粉砕された粉末、噴霧乾燥された粉末、結晶形態、非晶質形態及びガラス状形態を含み得て、これらは、錠剤として投与され得るか、又は例えば鼻又は肺送達用のエアロゾル又は空中浮遊粒子として投与され得る。液体経口剤形には、好適な溶媒、防腐剤、乳化剤、懸濁剤、希釈剤、甘味料、融解剤、着色剤及び／又は香味料、又はそれらの任意の組み合わせを含む、水溶液、エマルジョン、懸濁液、非発泡性顆粒から再構成された溶液及び／又は懸濁液、並びに発泡性顆粒から再構成された発泡性調剤が含まれる。さらなる液体剤形は、鼻腔内又は肺送達用の形態を含み得る。かかる剤形は、鼻腔内注射、鼻洗浄、肺洗浄、噴霧又はエアロゾル送達用の液体を含んでもよい。
【０１１０】
本明細書の幾つかの実施形態の方法及び組成物による経口投与用の単位剤形の調製に適した薬学的に許容可能な担体は、当技術分野でよく知られている。錠剤は、通常、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、マンニトール、ラクトース及び／又はセルロース等の不活性希釈剤、デンプン、ゼラチン、及び／又はスクロース等の結合剤；デンプン、アルギン酸及び／又はクロスカルメロース等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、微結晶セルロース、カルボキシメチルセルロース及び／又はタルク等の潤滑剤として従来の薬学的に適合性のアジュバントを含む。錠剤は、ポロキサマー、クレモフォア／Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）／Ｌｕｔｒｏｌ（登録商標）、若しくはメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等の可溶化剤若しくは乳化剤、又は当技術分野で知られている他のもの、又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。粉末混合物の流動特性を改善するために、二酸化ケイ素等の流動促進剤を使用することができる。外観のため、ＦＤ＆Ｃ染料等の着色剤を追加することができる。アスパルテーム、サッカリン、メントール、ペパーミント、及び／又はフルーツフレーバー、又はそれらの任意の組み合わせ等の甘味料及び香味料は、チュアブル錠の有用なアジュバントである。カプセル剤は、典型的には上記で開示された１又は複数の固体希釈剤を含む。担体成分の選択は、味、コスト、及び貯蔵安定性のような二次的な考慮事項に依存し、これらは当業者によって容易に行われ得る。
【０１１１】
本明細書の幾つかの実施形態の方法及び組成物による経口（ＰＯ）組成物には、液体溶液、エマルジョン、又は懸濁液も含まれる。かかる組成物の調製に適した薬学的に許容可能な担体は、当技術分野でよく知られている。シロップ、エリキシル、エマルジョン及び／又は懸濁液用の担体の典型的な成分には、エタノール、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、液体スクロース、ソルビトール及び／又は水が含まれる。懸濁液の場合、典型的な懸濁剤には、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ＡＶＩＣＥＬ  ＲＣ−５９１、トラガカント及び／又はアルギン酸ナトリウムが含まれ；典型的な湿潤剤には、レシチン及び／又はポリソルベート８０が含まれ；典型的な防腐剤には、メチルパラベン及び／又は安息香酸ナトリウム、又はそれらの任意の組み合わせが含まれる。経口液体組成物はまた、上記に開示されるように、甘味料、香味料及び／又は着色剤等の１又は複数の成分を含み得る。
【０１１２】
かかる組成物はまた、対象の１又は複数の化合物が所望の適用の付近で、又は所望の作用を延長するために様々な時に消化管で放出されるように、典型的にｐＨ又は時間依存コーティングで従来の方法によってコーティングされてもよい。消化管での放出のための例示的な剤形は、酢酸フタル酸セルロース、酢酸フタル酸ポリビニル、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、オイドラギットコーティング、ワックス、アルギン酸塩及び／又はシェラック、又は当業者に知られている他の賦形剤、又はそれらの任意の組み合わせの１又は複数を組み込むことができる。幾つかの実施形態によれば、本明細書に記載の方法に従って投与される組成物は、消化管での放出用に製剤化される。幾つかの実施形態によれば、本明細書に記載の方法に従って投与される組成物は、下部消化管での放出用に製剤化される。幾つかの実施形態では、組成物は、腸溶コーティングされたカプセル、錠剤、ソフトゲル、又は本質的には腸溶カプセルとして提供される。
【０１１３】
本明細書の幾つかの実施形態の方法及び組成物による組成物の実際の単位用量は、製剤中の１又は複数の化合物に依存する。幾つかの実施形態では、製剤中の各化合物の量は、１日当たり０．０１ｍｇ／体重ｋｇ〜０．０５ｍｇ／体重ｋｇ、１日当たり０．０４ｍｇ／体重ｋｇ〜０．１ｍｇ／体重ｋｇ、１日当たり０．０９ｍｇ／体重ｋｇ〜０．１５ｍｇ／体重ｋｇ、１日当たり０．１４ｍｇ／体重ｋｇ〜０．２ｍｇ／体重ｋｇ、１日当たり０．２ｍｇ／体重ｋｇ〜０．５ｍｇ／体重ｋｇ、１日当たり０．４ｍｇ／体重ｋｇ〜１ｍｇ／体重ｋｇ、１日当たり１ｍｇ／体重ｋｇ〜６ｍｇ／体重ｋｇ、１日当たり５ｍｇ／体重ｋｇ〜５００ｍｇ／体重ｋｇ以上、１日当たり１０ｍｇ／体重ｋｇ以下〜７０ｍｇ／体重ｋｇ、１日当たり５０ｍｇ／体重ｋｇ〜８０ｍｇ／体重ｋｇ、１日当たり７０ｍｇ／体重ｋｇ〜１２０ｍｇ／体重ｋｇ、１日当たり１００ｍｇ／体重ｋｇ〜３００ｍｇ／体重ｋｇ、又は１日当たり２５０ｍｇ／体重ｋｇ〜５００ｍｇ／体重ｋｇであり得る。幾つかの実施形態では、用量は、１日当たり１００ｍｇ／体重ｋｇ、５００ｍｇ／体重ｋｇ、３００ｍｇ／体重ｋｇ、２００ｍｇ／体重ｋｇ、１５０ｍｇ／体重ｋｇ、１００ｍｇ／体重ｋｇ、５０ｍｇ／体重ｋｇ、４０ｍｇ／体重ｋｇ、３０ｍｇ／体重ｋｇ、２５ｍｇ／体重ｋｇ、２０ｍｇ／体重ｋｇ、１０ｍｇ／体重ｋｇ、７．５ｍｇ／体重ｋｇ、６ｍｇ／体重ｋｇ、５ｍｇ／体重ｋｇ、４ｍｇ／体重ｋｇ、３ｍｇ／体重ｋｇ、２．５ｍｇ／体重ｋｇ若しくは１ｍｇ／体重ｋｇ、又は前述のいずれかの２つの量で定義される範囲内の量であり得る。幾つかの実施形態では、実際の単位用量は、１日当たり５ｍｇ／体重ｋｇ、１０ｍｇ／体重ｋｇ、２５ｍｇ／体重ｋｇ、５０ｍｇ／体重ｋｇ、７５ｍｇ／体重ｋｇ、１００ｍｇ／体重ｋｇ、１５０ｍｇ／体重ｋｇ又は２００ｍｇ／体重ｋｇ、又は前述の量のいずれか２で定義される範囲内の量である。したがって、例えば７０ｋｇの人への投与の場合、用量範囲は０．１ｍｇ〜１ｍｇ、０．９ｍｇ〜２ｍｇ、１．５ｍｇ〜５ｍｇ、４ｍｇ〜１０ｍｇ、９ｍｇ〜２０ｍｇ、１５ｍｇ〜５０ｍｇ、４０ｍｇ〜７５ｍｇ、５０ｍｇ〜１００ｍｇ、７５ｍｇ〜２００ｍｇ、１００ｍｇ〜３００ｍｇ、２００ｍｇ〜４００ｍｇ、３５０ｍｇ〜７５０ｍｇ、５００ｍｇ〜１ｇ、７５０ｍｇ〜２ｇ、１ｇ〜５ｇ、２．５ｇ〜６ｇ、４ｇ〜１０ｇ、８ｇ〜２０ｇ、１５ｇ〜３５ｇ若しくは１ｇ以下〜３５ｇ以上、又は上記の量のいずれか２つで定義される範囲内の量である。幾つかの実施形態では、実際の単位用量は６ｇである。幾つかの実施形態では、実際の単位用量は１０ｇである。幾つかの実施形態では、実際の単位用量は３５ｇである。幾つかの実施形態では、実際の単位用量は１ｇ以下であるがゼロではない。幾つかの実施形態では、実際の単位用量は１０ｇ以下であるがゼロではない。幾つかの実施形態では、実際の単位用量は３５ｍｇ以下であるがゼロではない。
【０１１４】
「負荷投与量（ｌｏａｄｉｎｇ  ｄｏｓｅ）」は、本明細書で使用される場合、後続の用量よりも高い化合物の初期用量を指す。
【０１１５】
「維持量（ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｄｏｓｅ）」とは、本明細書で使用される場合、負荷投与量に続く後続用量を指し、負荷投与量よりも時間的に遅く発生する。当業者は、維持量の剤型又は投与様式が負荷投与量に使用されるものと異なっていてもよいことを知っているであろう。本明細書に開示される実施形態のいずれかにおいて、維持量は、一か月に１回又は複数回、隔週又は２週間ごとに複数回、毎週又は１週間に複数回、毎日又は１日に複数回を含むがこれらに限定されない、本明細書で企図される任意の投薬スケジュールでの単位剤形の投与を含み得る。本開示内では、投薬休日を維持量の投与期間に組み込み得ることが企図される。かかる投薬休日は、負荷投与量の投与直後、又は維持量の投与期間中の任意の時点で起こり得る。本明細書で使用される場合、維持量の投与期間は、治療期間の「維持段階（ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｐｈａｓｅ）」と呼ばれることがある。
【０１１６】
「投与様式」は、本明細書で使用される場合、１又は複数の化合物が被験体に投与される経路を指す。「投与様式」は、本明細書で使用される場合、剤形（例えば、錠剤、粉末、溶解液、懸濁液、エマルジョン等）、及び剤型が被験体に適用されるメカニズム（例えば、注射による、クリーム、ローション、パッチ等による局所投与、丸剤、溶解液、経口懸濁液、口腔フィルム又は口内洗浄等による経口投与）を含む。本明細書で使用される場合、「投与の様式」は、化合物が被験体に投与される用量、投薬量、及び投与スケジュールも含む。
【０１１７】
幾つかの実施形態では、本開示の方法に従って投与される組成物は、食材、飲料、又は他の摂取可能な品目と共に提供されるか、又はそれらに混合される。幾つかの実施形態では、上記飲料、食材、又は他の摂取可能な品目は、キャンディ、アップルソース、ヨーグルト、ソフトプディング、ゼラチン食材、ジュース、牛乳、大豆又はナッツ飲料、濃厚飲料、チーズ、又はそれらの任意の組み合わせのうちの１又は複数を含み得る。当業者は、本開示の方法に従って投与される組成物の組み合わせを任意の好適な食物又は飲料と組み合わせて、組成物の摂取を促進できることを容易に認識するであろう。
【０１１８】
本明細書の幾つかの実施形態の方法及び組成物による幾つかの実施形態では、投与様式は、負荷投与量の後に維持量を投与することを含む。幾つかの実施形態では、負荷投与量は２０ｇ以下であるがゼロではない；１５ｇ以下であるがゼロではない；１０ｇ以下であるがゼロではない、６ｇ以下であるがゼロではない、４ｇ以下であるがゼロではない、２ｇ以下であるがゼロではない若しくは１ｇ以下であるがゼロではない、又は上記の量のいずれか２つで定義される範囲内の量である。幾つかの実施形態では、維持量は２０ｇ以下であるがゼロではない；１０ｇ以下であるがゼロではない、６ｇ以下であるがゼロではない、４ｇ以下であるがゼロではない、２ｇ以下であるがゼロではない、１ｇ以下であるがゼロではない、５００ｍｇ以下であるがゼロではない若しくは２５０ｍｇ以下であるがゼロではない、又は前述の量のいずれか２つで定義される範囲内の量である。
【０１１９】
本明細書の幾つかの実施形態の方法及び組成物による幾つかの実施形態では、負荷投与量は１日又は２４時間の期間にわたって投与される。幾つかの実施形態では、負荷投与量は単回投与で投与される。幾つかの実施形態では、負荷投与量は複数回投与で投与される。幾つかの実施形態では、負荷投与量は、１日又は２４時間の間に複数回投与で投与される。幾つかの実施形態では、負荷投与量は２日間にわたって投与される。幾つかの実施形態では、負荷投与量は３日間にわたって投与される。幾つかの実施形態では、負荷投与量は４日間にわたって投与される。幾つかの実施形態では、負荷投与量は、５日間、６日間、又は７日間にわたって投与される。幾つかの実施形態では、負荷投与量は、８日〜１４日以下の期間にわたって投与される。幾つかの実施形態では、負荷投与量は１４日間にわたって投与される。
【０１２０】
本開示による方法は、投与される任意の治療の有効性を高めるために、本明細書に記載の組成物の投与のタイミングを変更又は制御することを企図する。幾つかの実施形態では、本開示の方法に従って投与される組成物は、食事又は他の食材の摂取と同時に等、食材と共に投与され得る。幾つかのさらなる実施形態では、本開示の方法に従って投与される組成物は、食事又は食材の他の摂取の直前又は直後に投与され得る。幾つかのさらなる実施形態では、本開示の方法に従って投与される組成物は、１分〜５分以内、３分〜１０分以内、６分〜１５分以内、１０分〜２０分以内、１５分〜３０分以内、２０分〜４５分以内、又は食事若しくはその他の食材摂取の前後１時間以内に投与され得る。幾つかの実施形態では、本開示の方法に従って投与される組成物は、食物なしで、例えば、１時間〜３時間、２時間〜５時間、４時間〜８時間、６時間〜１２時間、９時間〜１８時間、１２時間〜２４時間の間、又は食事若しくはその他の食材の摂取の２４時間以上前後に投与され得る。
【０１２１】
本明細書で使用される場合、「治療の期間」は、最初の用量の投与から始まり、最終用量の投与で終わる時間を指し、かかる時間の長さは、治療される被験体の症状及び健康を参照して、神経障害、又は腸の透過性亢進若しくは「腸管壁浸漏」に関係する障害を治療する当業者によって決定される。かかる期間は、本明細書に開示されている、又は神経障害を治療する当業者に知られているように、アミロイドのレベルの定期的、散発的又は継続的なモニタリングを参照して決定することができる。
【０１２２】
本明細書で使用される場合、「投薬休日」とは、被験体に用量が投与されない、又は用量が減らされて被験体に投与される２４時間以上の期間を指す。本明細書で使用する「用量の減少」とは、被験体に投与される１日の総用量よりも少ない用量を指す。
【０１２３】
本開示によれば、投薬スケジュールは、所望の治療効果を達成するように変更され得る。本明細書に開示される各実施形態において、投与スケジュールのバリエーションは、投与されている治療プロトコルの持続期間全体にわたって繰り返され得る。本明細書に開示される実施形態のそれぞれにおいて、最初の投与量は、最初の投与量に続く投与量よりも高くても、低くても、又は同じであってもよい。本明細書に開示される実施形態のそれぞれにおいて、負荷投与量は開示される投与計画に先行してもよく、投薬休日は負荷投与量の投与に続いてもよく、又は続かなくてもよい。
【０１２４】
幾つかの実施形態では、本開示の方法は、本明細書で提供される１又は複数の組成物の毎日又は毎日よりも低い頻度、例えば２日ごと、３日ごと、４日ごと、５日ごと、６日ごと若しくは７日ごと、又は前述の時間のいずれか２つで定義される範囲内の期間等の投与を含む。幾つかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、かかる投与用に製剤化される。
【０１２５】
本明細書に開示す方法によれば、アミロイド形成に関係する障害の治療又は阻害は、被験体が一定期間投薬の定期的な部分的又は完全な減少に続く投薬の再開を経験するように、投薬スケジュールを調節することにより達成され得る。幾つかの実施形態では、投薬量は１日〜３０日間毎日投与され、その後、１日〜３０日間にわたる投薬休日が続く。幾つかの実施形態では、投薬休日中に用量は投与されない。幾つかのさらなる実施形態では、本開示の組成物は、次の用量の投与の前に被験体の身体から完全に除去することを可能にする。幾つかの他の実施形態では、投薬休日中に、通常の１日用量よりも少ない用量が投与される。幾つかのさらなる実施形態では、治療有効量よりも少ない投与組成物の量により、投薬休日中に被験体内にとどまることが可能になる。幾つかのさらなる実施形態では、罹患組織の治療レベルを維持するのに十分な投与組成物の量が、被験体内に留まることが可能になる。幾つかの実施形態では、組成物は、アミロイド形成に関連する神経障害の前述の症状の１又は複数の発症後の任意の時点で投与される。幾つかの実施形態では、本明細書に記載の方法による組成物は、上記障害又は複数の障害の症状の発症前に投与される。幾つかの実施形態では、本明細書に記載の方法による組成物は、上記障害又は複数の障害の症状の発症と同時に、又は発症後に投与される。
使用の方法
【０１２６】
本開示は、アミロイド障害の阻害、改善、可能性の低減、発症の遅延、治療及び／又は予防のための方法を提供し、以下：（１）細菌表面若しくは近位細胞外空間での細菌アミロイド凝集；（２）消化管若しくは嗅覚系（腸内分泌細胞及び腸神経細胞を含む）における細菌のアミロイドとα−シヌクレインの相互作用；及び／又は（３）消化管におけるα−シヌクレインの凝集（腸内分泌細胞及び腸神経細胞を含む）の１又は複数を阻害又は妨害する方法が含まれる。
【０１２７】
本開示の方法によれば、α−シヌクレインは、アミロイド前駆体タンパク質、メジン、タウ、アポリポタンパク質ＡＩ、心房性ナトリウム利尿因子由来の１又は複数のベータアミロイド、ベータアミロイド、シスタチン、ＩＡＰＰ（アミリン）、ベータ−２ミクログロブリン、トランスサイレチン、ＰｒＰ、ゲルゾリン、リゾチーム、ハンチンチン、ケラトエピセリン、カルシトニン、プロラクチン、血清アミロイドＡ、スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）及び／又は免疫グロブリン軽鎖ＡＬを含む、より広範囲の既知の宿主アミロイドタンパク質の代表的なアミロイドタンパク質と見なされるべきであり、本明細書に開示される組成物及び方法は、或るアミロイドタンパク質（細菌又はヒト）が別のアミロイドタンパク質の凝集を促す任意のアミロイドタンパク質の凝集を妨害するように当業者によって適合され得る。
【０１２８】
理論に制限されることなく、本開示の方法を使用して阻害又は妨害され得る、アミロイド形成を示す代表的な障害及びこれらの障害に関与するタンパク質には、表３に開示されたものが含まれるが、これらに限定されない。
【０１２９】
表３．アミロイド障害
【表３】
2020529432.tif 000025
【０１３０】
本発明の組成物及び方法の方法はまた、腸ディスバイオシス、腸透過性亢進、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎及び／又はクローン病を含む消化管のアミロイド媒介障害を治療するために使用することができる。これらの障害は、嚥下障害、腸管運動性の低下、胃不全麻痺、便秘（慢性便秘及び慢性特発性便秘を含む）、小腸細菌異常増殖（ＳＩＢＯ）、下痢（慢性下痢を含む）、腹痛及び／又は腹痛発作、腹部膨満、鼓腸及び吐き気を含む１又は複数の症状と関連し得る。
【０１３１】
本明細書で使用される場合、「腸ディスバイオシス」という用語は、本開示に鑑みて当業者によって理解されるその慣習的で通常の意味を有し、腸管又は腸、特に小腸の細菌叢又は微生物叢の不均衡及び／又は不適応を指す。かかるディスバイオシスは、存在する種／株及び／又は存在する種／株の相対的存在量又は割合に関して、腸又は腸管のマイクロバイオームの組成の変化を特徴とし、その変化は宿主生物に対する有害な影響を有する。宿主生物への有害な影響は、電解質バランス、バイオフィルム形成、腸上皮内層によって形成されるバリアの完全性におけるミクロビオーム媒介変化、又は直接（例えば毒性又はエフェクターとして）若しくは間接的に（例えば、毒素又はエフェクターの前駆物質として）宿主の健康を害する代謝産物のミクロビオームからの放出に起因し得る。
【０１３２】
本明細書で使用される場合、「腸管透過性亢進性」という用語は、本開示に鑑みて当業者によって理解されるその慣習的で通常の意味を有する。「腸管透過性亢進性」は、腸管腔と周囲の問題との間にある腸上皮内層によって形成されるバリアの透過性の異常な増加を指す。かかる透過性亢進は、腸内膜の炎症及び／又は腸上皮の細胞間のタイトジャンクションの障害に起因する可能性があり、これにより、物質が管腔から周囲組織へと通過し、一部が腹腔及び／又は全身循環に入る可能性がある。腸管又は腸管腔からのこの物質の漏出のため、腸の透過性亢進は「腸管壁浸漏」又は「腸管壁浸漏症候群」と呼ばれることがある。
【０１３３】
本明細書で使用する場合、この語根の変形を含む「アミロイド障害」という用語には、表３の障害のいずれか又は全てと並んで、消化管のアミロイド媒介障害が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３４】
本明細書で使用される場合、「哺乳類アミロイド又は哺乳類アミロイド前駆体」という用語には、タウ、アミロイド前駆体タンパク質由来のベータアミロイド、メジン、アポリポタンパク質ＡＩ、心房性ナトリウム利尿因子、ベータアミロイド、シスタチン、ＩＡＰＰ（アミリン）、ベータ−２ミクログロブリン、トランスサイレチン、ＰｒＰ、ゲルゾリン、リゾチーム、ハンチンチン、ケラトエピセリン、カルシトニン、プロラクチン、血清アミロイドＡ、及び／又は免疫グロブリン軽鎖ＡＬの１又は複数が含まれるが、これらに限定されない。本明細書に開示される特定の方法及び組成物では、上記記微生物アミロイド又は微生物アミロイド前駆体はＣｓｇＡを含む。
【０１３５】
幾つかの実施形態は、アミロイド障害の阻害、改善、可能性の低減、発症の遅延、治療又は予防の方法を含み、本明細書に記載の組成物を、それを必要とする被験体に投与することを含む。アミロイド障害は、α−シヌクレイノパシー、パーキンソン病、レビー小体型認知症、偶発性レビー小体病、アルツハイマー病レビー小体亜型、多系統萎縮症、及び純粋自律神経失調症、又はこれらのいずれかの任意の組み合わせからなる群から選択され得る。アミロイド障害はまた、腸ディスバイオシス、腸透過性亢進、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎及び／又はクローン病からなる群から選択され得る。幾つかの実施形態では、この方法で投与される組成物は、表１又は表２の分子のいずれかを含む、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。幾つかの実施形態では、本方法で投与される組成物は、本明細書に記載の本発明の化合物を含む、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。本方法の幾つかの実施形態では、アミロイド障害は腸アミロイド凝集体を含む。例えば、凝集体は、細菌タンパク質、例えばＣｓｇＡ等のカーリー関連タンパク質を含み得る。したがって、幾つかの実施形態では、方法は、被験体の腸サンプル中のかかる細菌タンパク質の存在若しくはレベル、微生物（例えば細菌）タンパク質をコードする核酸の存在若しくはレベル、又は被験体の腸サンプル、例えば糞便サンプル中の細菌タンパク質（例えば、ＣｓｇＡ等のカーリー関連タンパク質）を産生する微生物の存在又はレベルを検出することを更に含む。例えば、タンパク質は、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、ラテラルフローアッセイ、無洗浄アッセイ（ｎｏ−ｗａｓｈ  ａｓｓａｙ）等の免疫アッセイにより検出され得る。例えば、微生物タンパク質を生産する微生物は、核酸分析（定性的又は定量的ＰＣＲ、マイクロアレイ分析、シーケンシング等）によって検出され得る。例えば、微生物タンパク質をコードする核酸は、定性的又は定量的ＰＣＲ、マイクロアレイ分析、シーケンシング又は分岐ＤＮＡ分析によって検出され得る。細菌タンパク質又はタンパク質を産生する微生物の腸内の存在、又は対照よりも高い細菌タンパク質（又はタンパク質を産生する微生物）のレベルにより、組成物を必要としている被験体を特定することができる。例として、好適な対照は、細菌タンパク質（又は細菌タンパク質を作る微生物）に陰性の被験体、例えば健康な個体、又は腸に細菌タンパク質（又は細菌タンパク質を作る微生物）を持たないと特定された個体を含み得る。幾つかの実施形態では、方法は、被験体のサンプル中の腸カーリー（又はＣｓｇＡ等のカーリー関連タンパク質）の存在若しくはレベル、又は腸カーリー関連タンパク質（ＣｓｇＡ等）を産生する微生物の腸レベルを検出することを含む。幾つかの実施形態では、被験体は、アミロイド障害を有し、組成物を必要としている被験体の亜集団のメンバーとして特定される。幾つかの実施形態では、この方法は、投与後の腸アミロイド凝集体の減少又は不在を判定することを更に含む。
【０１３６】
本開示の組成物は、幾つかの実施形態では、腸管の開始点でα−シヌクレイン凝集（例えば、原線維、レビー小体、又は他の凝集体）又は他の宿主アミロイドの形成を阻害し得るため、微生物により誘発されたアミロイド凝集を取り除くことは、α−シヌクレイン又は他の宿主アミロイド凝集のテンプレート又はシードとしての役割を果たし、そうすることで血液脳関門を通過しなくてもよいと考えられる。腸管内のα−シヌクレイン又は他の宿主アミロイド凝集を標的とすることで、薬物が血液脳関門を通過する必要がなくなり、低用量で有効性が得られ、全身曝露が減少することで副作用が少なくなる。さらに、その開始点でα−シヌクレイン又は他の宿主アミロイド凝集を標的とすることにより、病原性プロセスの初期段階での介入が可能になり、運動症状又は他の神経変性症状が発症する前に疾患の進行を防止又は阻害することができる。腸管のα−シヌクレイン凝集の標的化は、消化管機能障害にも対処し、及び／又は被験体の胃腸症状若しくは行動を改善することができ、これには、例えば、例えば、本明細書の幾つかの実施形態の組成物及び方法による、嚥下障害、腸管運動性の低下、胃不全麻痺、便秘（慢性便秘及び慢性特発性便秘を含む）、小腸内細菌異常増殖（ＳＩＢＯ）、下痢、腹痛及び／又は腹痛発作、腹部膨満、鼓腸、吐き気、又は過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ、例えば、潰瘍性大腸炎、クローン病等）、腸透過性亢進、唾液分泌過多（流涎症）、肛門直腸機能不全、排便協調障害のその他の任意の症状、又はそれらの任意の組み合わせが含まれ得る。
【０１３７】
神経変性疾患の治療又は阻害へのアプローチとして、脳内の宿主アミロイド凝集を標的とすることに加えて、細菌アミロイド凝集を標的とすることにより、尿路感染症（ＵＴＩ）等の感染症の新たな治療法が提供される。いずれの場合も、特定のクラスの化合物が特定されており、主に「ポリフェノール」又はα−シヌクレインの場合には脳及びＵＴＩの場合には尿中粘膜等の目的の組織でアミロイド凝集プロセスを阻害する能力を持つことから、ポリフェノール同等物として表される。
【０１３８】
幾つかの実施形態では、本開示の組成物及び方法は、α−シヌクレイン等の宿主アミロイドと、カーリー又は接着性線毛等の細菌アミロイドとの間の相互作用の阻害剤としてのポリフェノール及び／又はポリフェノール同等物の使用を企図する。幾つかの実施形態では、本開示の組成物及び方法は、脳よりも腸管又管は鼻咽頭等の末梢組織における宿主アミロイド凝集の阻害剤及び／又はアミロイド脱凝集の促進剤としてのポリフェノール及び／又はポリフェノール同等物の使用を企図する。本開示の組成物及び方法は、腸管で局所的に作用し、例えばアミロイド阻害活性を保持しているが腸管上皮を通過せず、一次循環に入らないポリフェノールの非経口的に利用可能な類縁体等、末梢組織に本質的に吸収されない修飾されたポリフェノール又はポリフェノール同等物を更に企図する。
【０１３９】
幾つかの実施形態では、本開示の組成物及び方法は、下部小腸、大腸及び／又は結腸の作用部位への上記組成物の送達を可能にする製剤を企図する。上記製剤は、胃又は上部消化管での薬物の放出を阻害するように、腸溶性錠剤、カプセル剤、液体ゲル又は粉末等を含み得る。或いは、上記組成物は、本質的に腸溶性カプセル剤又は同様の個体剤型を含んでもよく、カプセル組成物は、好ましくは下部消化管、より具体的には下部小腸、大腸又は結腸の作用部位又はその近くで溶解するポリマー又は材料、例えば本質的に腸溶性カプセルＥｎＴｒｉｎｓｉｃ（登録商標）等を含む。幾つかの実施形態では、上記組成物は吸収されず、消化管に残る。
【０１４０】
本開示の組成物及び方法は、アミロイド形成の１又は複数の要素を標的とする腸管制限性小分子阻害剤を企図する。本発明の例示的な化合物には、ポリフェノール部分が含まれ、その多くは経口で生物学的に利用可能である。本開示の組成物及び方法はまた、アミロイド形成を阻害する能力を有することが知られている非ポリフェノールクラスの腸管選択性又は腸管制限性の非経口吸収誘導体を企図する。本開示による組成物及び方法は、上記ポリフェノール又は非ポリフェノール化合物の非経口吸収性の腸管選択性の誘導体又は製剤を更に企図する。
【０１４１】
本明細書で使用される「被験体」は、本開示に鑑みて当業者によって理解されるその慣習的で通常の意味を有する。パーキンソン病、レビー小体型認知症、偶発性レビー小体病、アルツハイマー病レビー小体亜型、多系統萎縮症、純粋自律神経失調症、腸ディスバイオシス、腸管透過性亢進、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎、クローン病、又はそれらの任意の組み合わせ等の神経疾患若しくは微生物により誘発されたアミロイドに関連する神経障害の診断、治療、阻害、改善のため選択又は特定される、イヌ、ネコ、ウマ、ロバ、ラバ、ウシ、家畜のバッファロー、ラクダ、ラマ、アルパカ、バイソン、ヤク、ヤギ、ヒツジ、ブタ、エルク、シカ、家畜のカモシカ、又は非ヒト霊長類、を含むが、これらに限定されないヒト又は非ヒト哺乳動物を指す。
【０１４２】
「診断」は、本開示に鑑みて当業者によって理解される慣習的で通常の意味を有する。パーキンソン病、レビー小体型認知症、偶発性レビー小体病、アルツハイマー病レビー小体亜型、多系統萎縮症、純粋自律神経失調症、又はそれらの任意の組み合わせ等の微生物誘発性アミロイドに関連する神経疾患又は神経障害のいずれかの症状又は指標を被験体が示すかどうかを判断する行為又はプロセスを指す場合がある。また、被験体が、腸内ディスバイオシス、腸管透過性亢進、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎及び／又はクローン病等の微生物により誘発されるアミロイドに関連する胃腸障害のいずれかの症状又は指標を示すかどうかを判断する行為又はプロセスを指す場合もある。診断は、被験体の体、又はその任意の組織、体液、成分、器官若しくは区画が微生物により誘発されたアミロイドを含むかどうかの判断を更に含み得る。診断は、被験体の体、又はその任意の組織、体液、成分、器官若しくは区画が、微生物により誘発されたアミロイドの凝集又は脱凝集の速度に影響を及ぼすことができる任意の因子を含むかどうかの判断を更に含み得る。
【０１４３】
「有する疑いのある被験体」は、本開示に鑑みて、当業者によって理解される慣習的で通常の意味を有する。「有する疑いのある被験体」は、疾患又は状態の１又は複数の臨床指標を示す被験体を指す。特定の実施形態では、疾患又は状態は、パーキンソン病、レビー小体型認知症、偶発性レビー小体病、アルツハイマー病レビー小体亜型、多系統萎縮症、純粋自律神経失調症又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。幾つかの実施形態では、障害は、腸ディスバイオシス、腸透過性亢進、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎及び／又はクローン病からなる群から選択することができる。
【０１４４】
「それを必要とする被験体」は、本開示に鑑みて、当業者によって理解される慣習的で通常の意味を有する。「それを必要とする被験体」は、アミロイド形成を伴う障害の診断を必要とする者、又はパーキンソン病、レビー小体型認知症、偶発性レビー小体病、アルツハイマー病レビー小体亜型、多系統萎縮症、純粋自律神経失調症、又はそれらの任意の組み合わせ等の微生物により誘発されたアミロイドに関連する神経疾患又は神経障害の治療、阻害、改善を必要とする者として選択又は特定される被験体を指す。他の実施形態では、障害は、腸ディスバイオシス、腸透過性亢進、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎及び／又はクローン病からなる群から選択され得る。
【０１４５】
本明細書で使用される「微生物誘発アミロイド」は、本開示に鑑みて当業者によって理解される、その慣習的で通常の意味を有する。「微生物誘発アミロイド」は、哺乳類又は微生物のタンパク質と１又は複数の微生物のタンパク質との接触によって生成されるアミロイド原線維又は凝集体を指す。上記微生物タンパク質は、細菌又は真菌起源の１又は複数のタンパク質を含み得るが、本開示は、それらの起源にかかわらず、バクテリオファージ、ウイルス、細菌、古細菌、真菌、及び他の真核生物に起源を持つタンパク質とのタンパク質の相互作用によって産生されるアミロイドを企図する。
【０１４６】
「治療効果」は、本開示に鑑みて当業者によって理解される、その慣習的で通常の意味を有する。「治療効果」は、ある程度まで、疾患又は障害の症状の１又は複数を軽減し、疾患又は障害の治癒を含む。「治癒」とは、活動性疾患の症状を除去することを意味する。しかしながら、治癒が得られた後でも（組織の損傷等）、特定の長期的又は永続的な影響が存在する場合がある。
【０１４７】
「改善」は、本開示に鑑みて当業者によって理解されるよう、慣習的で通常の意味を有する。「改善」は、状態又は疾患の少なくとも１つの指標の重症度の低下を指す。特定の実施形態では、改善には、状態又は疾患の１又は複数の指標の進行の遅延又は遅れが含まれる。指標の重症度は、当業者に知られている主観的又は客観的な尺度によって決定され得る。
【０１４８】
「調節」は、本開示に鑑みて当業者によって理解される、その慣習的で通常の意味を有する。「調節」は、被験体の体内又はその任意の組織、体液、成分、臓器若しくは区画内の任意の因子の存在、絶対レベル、相対レベル、機能又は活性の変化を指す。特定の実施形態では、調節とは、遺伝子発現の増加を指す。特定の実施形態では、調節とは、遺伝子発現の減少を指す。特定の実施形態では、調節は、特定のタンパク質の総血清レベルの増加又は減少を指す。特定の実施形態では、調節は、特定のタンパク質の遊離血清レベルの増加又は減少を指す。特定の実施形態では、調節とは、タンパク質の凝集状態の増加又は減少を指す。特定の実施形態では、調節とは、アミロイド原線維の安定性を増加又は減少させることを指す。特定の実施形態では、調節とは、アミロイド原線維の長さ、幅、間隔又は密度を増加又は減少させることを指す。特定の実施形態では、調節とは、特定の非タンパク質因子、例えば代謝産物の総血清レベルの増加又は減少を指す。特定の実施形態では、調節は、特定の非タンパク質因子の遊離血清レベルの増加又は減少を指す。特定の実施形態では、調節は、特定のタンパク質の総バイオアベイラビリティの増加又は減少を指す。特定の実施形態では、調節とは、特定の非タンパク質因子の総バイオアベイラビリティの増加又は減少を指す。特定の実施形態では、調節とは、タンパク質の凝集状態の変化を指す。特定の実施形態では、調節とは、微生物により誘発されたアミロイドの凝集又は脱凝集の速度又は程度の変化を指す。
【０１４９】
本開示による幾つかの実施形態の幾つかの組成物及び方法では、本明細書に記載の組成物の投与を受ける被験体を選択又は特定する。幾つかの実施形態では、上記被験体は、腸管内のカーリーのレベルが高い被験体として選択又は特定される。かかる選択は、臨床評価又は診断評価によって行われ得る。幾つかの実施形態では、上記被験体は、腸管の微生物により誘発されたアミロイドのレベルが高い被験体として選択又は特定される。かかる選択はまた、臨床評価又は診断評価によって行われ得る。幾つかの実施形態では、上記被験体は、腸管のα−シヌクレインレベルが上昇している被験体として選択又は特定される。繰り返すが、このような選択は、臨床評価又は診断評価によって行われ得る。幾つかのさらなる実施形態では、上記被験体は、例えば、無呼吸、低呼吸、運動緩慢、運動失調、振戦、筋肉の硬直、姿勢及びバランスの障害、自動運動の喪失、構音障害又は他の発話の変化、筆跡の変化、起立性低血圧、記憶障害、嚥下障害、失禁、睡眠障害、心不整脈、視覚障害、うつ病及び視覚、聴覚、嗅覚若しくは触覚性の幻覚を含む精神医学的問題、めまい、認知機能障害、ドーパミンレベルの変化、セロトニンレベルの変化、及び／又はキヌレニンの変化、胃不全麻痺、肛門直腸機能不全、排便協調障害又はそれらの任意の組み合わせの提示等の神経変性障害の１又は複数の症状を示す者である。幾つかの実施形態では、上記被験体は、神経障害及びアミロイド障害の診断の分野で知られている方法に従って、アミロイド障害を有すると診断されている。幾つかのさらなる実施形態では、上記被験体は、レビー小体型認知症、偶発性レビー小体病、アルツハイマー病レビー小体亜型、多系統萎縮症、純粋自律神経失調症、又はそれらの任意の組み合わせを有する又は有するリスクがあると診断されている。幾つかの実施形態では、上記被験体は更に胃腸症状を示す。幾つかのさらなる実施形態では、上記胃腸症状は、便秘、下痢、腹痛及び／又は腹痛発作、腹部膨満、鼓腸、吐き気、又は過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎、クローン病、腸管透過性亢進のいずれかの症状の１つ若しくは複数、又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。
【０１５０】
本開示の幾つかの実施形態による組成物及び方法では、治療に選択される被験体は１８歳未満であり得る。幾つかの実施形態では、治療に選択される被験体は、１７歳〜３０歳であり得る。幾つかの実施形態では、治療に選択される被験体は、２９歳〜５０歳であり得る。幾つかの実施形態では、治療に選択される被験体は、４９歳〜６０歳であり得る。幾つかの実施形態では、治療に選択される被験体は、５９歳〜７０歳であり得る。幾つかの実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法による治療に選択される被験体は、６９歳を超えてもよい。
【０１５１】
本開示の幾つかの実施形態による組成物及び方法では、本明細書に記載の組成物の１又は複数の投与は、例えば、血液脳関門を通過することを必要とせずに、腸管、鼻腔、嗅球、又は腸神経組織におけるアミロイド又は微生物により誘発されるアミロイド形成を防止する、又はその脱凝集を促進する効果を提供する。幾つかの実施形態では、本明細書に記載の組成物の１又は複数の投与は、例えば、血液脳関門を通過することを必要とせずに、腸管、鼻腔、嗅球、又は腸神経組織におけるアミロイド又は微生物により誘発されたアミロイドの更なる凝集を阻害する効果を提供する。幾つかの実施形態では、本明細書に記載の組成物の１又は複数の投与は、例えば、血液脳関門を通過することを必要とせずに、腸管、鼻腔、嗅球、又は腸神経組織におけるアミロイド又は微生物により誘発されたアミロイドの脱凝集を引き起こす又は促進する効果を提供する。幾つかの実施形態では、本明細書に記載の組成物の１又は複数の投与は、例えば、血液脳関門を通過することを必要とせずに、腸管、鼻腔、嗅球、又は腸神経組織において既に存在するアミロイド又は微生物により誘発されたアミロイドの脱凝集を引き起こす又は促進する効果を提供する。幾つかの実施形態では、本明細書に記載の１又は複数の組成物の投与は、１又は複数の神経障害又は神経変性障害の１又は複数の症状の発症を予防する効果を提供する。幾つかの実施形態では、本明細書に記載の１又は複数の組成物の投与は、１又は複数の神経障害又は神経変性障害の１又は複数の症状を改善する効果を提供する。幾つかの実施形態では、本明細書に記載の１又は複数の組成物の投与は、１又は複数の神経障害又は神経変性障害の１又は複数の症状を逆転させる効果を提供する。幾つかの実施形態では、１又は複数の神経障害の上記１又は複数の症状は、例えば、無呼吸、低呼吸、運動緩慢、運動失調、振戦、筋肉の硬直、姿勢及びバランスの障害、自動運動の喪失、構音障害又は他の発話の変化、筆跡の変化、起立性低血圧、記憶障害、嚥下障害、失禁、睡眠障害、心不整脈、視覚障害、うつ病及び視覚、聴覚、嗅覚及び触覚性の幻覚を含む精神医学的問題、めまい、認知機能障害、ドーパミンレベルの変化、セロトニンレベルの変化、及び／又はキヌレニンの変化、胃不全麻痺、肛門直腸機能不全、排便協調障害又はそれらの任意の組み合わせ等の１又は複数の症状を含み得る。幾つかの実施形態では、上記１又は複数の神経障害は、アミロイド障害を含み得る。幾つかのさらなる実施形態では、上記１又は複数の神経障害は、レビー小体認知症、偶発性レビー小体疾患、アルツハイマー病レビー小体亜型、多系統萎縮症、及び／又は純粋自律神経失調症、又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。
【０１５２】
他の実施形態では、アミロイド形成の阻害剤は、腸の中枢神経系に全身的又は局所的に投与することを目的とし得る。例えば、哺乳類アミロイド又は哺乳類アミロイド前駆体タンパク質の凝集に対して有効な阻害剤は、本明細書に記載の１又は複数のアミロイド障害（表３）の治療に有用であり得る。したがって、かかる実施形態では、アミロイド形成の阻害剤を含む組成物は、全身投与（例えば、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内）又は局所投与（例えば、迷走神経付近の局所注射、脊髄内注射又は頭蓋内注射）を含む非経口投与用に製剤化され得る。ＣＮＳへの送達には、阻害剤が血液脳関門を通過する必要がある。したがって、かかる実施形態では、阻害剤は、好ましくは脂溶性分子であるか、又は脂質溶解度を高めるように修飾され得るか、又は血液脳関門の通過を促進する化合物と同時投与され得る（例えば、国際公開第２０１４０７６６５５号Ａ１、国際公開第２０１２１５９０５２号Ａ２、国際公開第１９９２０１８５２９号Ａ１を参照されたい）。
【０１５３】
本開示の幾つかの実施形態による組成物及び方法において、被験体の組織、体液、又は糞便中のアミロイド及び／又は微生物により誘発されたアミロイドのレベルを、治療過程の間に監視又は評価する。幾つかのさらなる実施形態では、治療過程の前及び／又は後に、アミロイド及び／又は微生物により誘発されたアミロイドのレベルを監視する。幾つかの実施形態では、被験体の組織、体液、又は糞便中のα−シヌクレインのレベルを治療過程の間に監視する。幾つかの実施形態では、α−シヌクレインのレベルを、治療過程の前及び／又は後に監視する。幾つかの実施形態では、アミロイド、微生物により誘発されたアミロイド、及び／又はα−シヌクレインの測定は、被験体に由来する糞便サンプルにおいて測定される。幾つかの実施形態では、アミロイド、微生物により誘発されたアミロイド、及び／又はα−シヌクレインの測定は、被験体に由来する組織サンプルで測定される。幾つかの実施形態では、上記組織サンプルは、腸管上皮、腹膜、腸神経組織、嗅覚組織、鼻内皮、副鼻腔内皮、脳及び／又は神経組織を含む。幾つかの実施形態では、上記組織サンプルは脳脊髄液又は滑液を含む。幾つかの実施形態では、上記組織サンプルは、血液、リンパ液、又は血漿を含む。
【０１５４】
化合物を特定する方法
本明細書に開示されるのは、真核生物タンパク質α−シヌクレインの凝集及びアミロイド形成を促進する細菌アミロイドの能力を変化させる化合物を特定する方法である。本明細書にさらに開示されるのは、神経変性疾患の治療又は阻害に有用な実体のスクリーニング方法、及び神経変性疾患の進行の予防又は改善に有用な実体のスクリーニング方法である。本明細書でさらに開示されるのは、神経変性疾患に関連する胃腸機能不全の治療又は阻害に有用な実体をスクリーニングする方法である。本明細書にさらに開示されるのは、哺乳類アミロイド疾患の分子病因及び細菌アミロイド産生と哺乳類アミロイド産生との間の分子的リンクを研究する方法である。本開示の方法によれば、上記神経変性疾患及び／又は哺乳類アミロイド疾患は、パーキンソン病（ＰＤ）、レビー小体型認知症、多系統萎縮症、及び他の全てのα−シヌクレイノパチー、ＰＤ関連便秘、ＰＤ関連低血圧症、ハンチントン病、アレキサンダー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病及びアミロイドが関係している他の疾患の１又は複数を含み得る。
【０１５５】
本明細書に開示される方法は、以下：（１）細菌表面又は近位細胞外空間における細菌性アミロイド凝集；（２）消化管又は嗅覚系（腸内分泌細胞及び腸神経細胞を含む）における細菌性アミロイドとα−シヌクレインとの相互作用；又は（３）消化管でのα−シヌクレインの凝集（腸内分泌細胞及び腸神経細胞を含む）の１又は複数を測定する一連のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを含む。本開示の方法によれば、α−シヌクレインは、広範な既知の哺乳類アミロイド又は哺乳類アミロイド前駆体タンパク質の代表的なアミロイドタンパク質と見なされるべきであり、本明細書に開示される方法は、或るアミロイドタンパク質（細菌又はヒト）が別のアミロイドタンパク質の凝集を促す、任意のアミロイドタンパク質の凝集を評価するように当業者によって適合され得る。本開示の方法を使用して評価され得るアミロイド形成を示す代表的な障害及びこれらの障害に関与するタンパク質には、表３に開示されたものが含まれるが、これらに限定されない。したがって、幾つかの実施形態では、上記方法は、上記組成物の存在下で、複数の濃度の微生物アミロイド若しくは微生物アミロイド前駆体を複数の濃度のα−シヌクレイン及び／又は他の哺乳類アミロイド若しくは哺乳類アミロイド前駆体と接触させること、上記の反応後のアミロイド形成又は脱凝集を分析又は測定すること；並びに該分析又は測定を対照の分析又は測定と比較することを含み、上記対照は、上記組成物の不在下での上記反応後のアミロイド形成の分析又は測定を含む。本明細書に開示される特定の方法及び組成物では、上記微生物アミロイド又は微生物アミロイド前駆体はＣｓｇＡを含む。
【０１５６】
幾つかの実施形態では、本開示による方法は、組成物の存在下で、微生物アミロイド又は微生物アミロイド前駆体（例えば、ＣｓｇＡを含む組成物）を様々な濃度の哺乳類アミロイド又は哺乳類アミロイド前駆体と接触させることを企図し、該組成物は、アミロイド形成を阻害するか、又はアミロイド脱凝集を増強する能力について試験される化合物又は混合物を含む。幾つかのさらなる実施形態では、微生物アミロイド又は微生物アミロイド前駆体、哺乳類アミロイド又は哺乳類アミロイド前駆体、及び試験組成物の上記組み合わせを、存在するアミロイドの量の変化について分析又は測定する。幾つかのさらなる実施形態では、微生物アミロイド又は微生物アミロイド前駆体、哺乳類アミロイド又は哺乳類アミロイド前駆体、及び試験組成物の上記組み合わせにおけるアミロイド形成の速度及び／又は程度を、上記組成物を欠く対照サンプル内のアミロイド形成速度と比較する。幾つかの実施形態では、アミロイドの形成速度を測定する。幾つかのさらなる実施形態では、アミロイド形成の総量を測定する。幾つかのさらなる実施形態では、アッセイの温度を変化させることにより、新たに形成されたアミロイド原線維の安定性を天然条件下で形成されたものと比較して測定する。幾つかの実施形態では、上記方法は、マルチウェルアッセイプレートのウェル内に上記組成物を配置することにより行われる。幾つかのさらなる実施形態では、本開示による方法は、物理的撹拌機の存在下で実施される。幾つかのさらなる実施形態では、上記物理的撹拌機は、ガラス、テフロン（登録商標）、又はポリマービーズを含む。幾つかのさらなる実施形態では、上記ポリマービーズは、ポリスチレン、ポリ乳酸、ポリ乳酸−コ−グリコール酸、ポリカーボネート、又はポリテトラフルオロエチレン（テフロン（登録商標））ビーズを含み得る。幾つかの実施形態では、撹拌に使用されるビーズ又は物体は、最長寸法で１０μＭ〜１０００μＭである。幾つかの実施形態では、撹拌に使用されるビーズ又は物体は、最長寸法が１０μＭ〜１００μＭ、８０〜２００、１８０μＭ〜３００μＭ、２８０μＭ〜４００μＭ、３８０μＭ〜５００μＭ、４８０μＭ〜６００μＭ、５８０μＭ〜７００μｍ、６８０μＭ〜８００μＭ、７８０μＭ〜９００μＭ、又は８８０μＭ〜１０００μＭである。幾つかの実施形態では、撹拌に使用されるビーズ又は物体は、その最長寸法が１ｍｍを超える。幾つかの実施形態では、撹拌に使用されるビーズ又は物体は、最長寸法が１０ｍｍ未満である。特定の実施形態では、ビーズ又は物体は、１ｍｍ〜３ｍｍ、１ｍｍ〜５ｍｍ、２ｍｍ〜５ｍｍ、３ｍｍ〜５ｍｍ、４ｍｍ〜５ｍｍ、５ｍｍ〜６ｍｍ、５ｍｍ〜７ｍｍ、５ｍｍ〜８ｍｍ、５ｍｍ〜９ｍｍ、５ｍｍ〜１０ｍｍ、２ｍｍ〜１０ｍｍ、４ｍｍ〜１０ｍｍ、６ｍｍ〜１０ｍｍ、又は８ｍｍ〜１０ｍｍである。特定の特定の実施形態では、ビーズ又は物体は、最長寸法が１ｍｍ、２ｍｍ、３ｍｍ、４ｍｍ、５ｍｍ、６ｍｍ、７ｍｍ、８ｍｍ、９ｍｍ、又は１０ｍｍである。
【０１５７】
幾つかの実施形態では、微生物アミロイド又は微生物アミロイド前駆体は、接着性線毛としても知られるカーリーの主要タンパク質成分であるＣｓｇＡ、又はその任意の類縁体若しくは相同体を含む。幾つかの実施形態では、微生物アミロイド又は微生物アミロイド前駆体は、ＣｓｇＡのアミロイド形態への変換の核となるＣｓｇＢ、又はそれに由来するポリペプチドを含む。幾つかの実施形態では、上記哺乳類アミロイド又は哺乳類アミロイド前駆体は、α−シヌクレインを含む。
【０１５８】
幾つかの実施形態では、微生物アミロイド又は微生物アミロイド前駆体（例えば、ＣｓｇＡを含む組成物）を様々な濃度の哺乳類アミロイド又は哺乳類アミロイド前駆体と組成物と接触させることは、アミロイド形成の指標の存在下で起こる。幾つかのさらなる実施形態では、上記指標は、サンプル中に存在するアミロイドの量と相関する様式で指標の蛍光強度が変化する蛍光指標を含み得る。上記変化は、集合性アミロイド原線維への標識の挿入に関連する分子環境の変化に関連する蛍光の変化により起こり得る。幾つかのさらなる実施形態では、上記指標は、チオフラビンＴ（ＴｈＴ）を含み得る。幾つかの実施形態では、アミロイド前駆体分子に結合した標識は、アミロイド原線維の形成と相関する分子間蛍光消光又は蛍光共鳴エネルギー移動による発光の強度又は波長の変化を示し得る。例示的な蛍光標識は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，２０１０）に開示されており、これはＦＲＥＴペア、蛍光消光、及びタンパク質に複合化可能な蛍光プローブに関する教示について引用することで本明細書の一部をなす。他の例示的な蛍光標識は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、ＡｍＣｙａｎ１、ＡｓＲＥｄ２、ｍＢａｎａｎａ、ｍＣｈｅｒｒｙ、Ｄｅｎｄｒａ２、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ−ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ−モノマー、ＤｓＲｅｄ、Ｅ２−Ｃｒｉｍｓｏｎ、ＧＦＰ−ＵＶ、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、ＨｃＲｅｄ１、ｍＯｒａｎｇｅ、ＰＡｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＰｌｕｍ、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ＺｓＧｒｅｅｎ１、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１若しくはＡｃＧＦＰ１、当該技術分野で知られている他の蛍光タンパク質を含むがこれらに限定されない蛍光タンパク質を含み得る。幾つかのさらなる実施形態では、哺乳類のアミロイド前駆体に付着した標識は、細菌性アミロイド又は細菌性アミロイド前駆体に付着した標識とは異なる。幾つかの実施形態では、細菌性アミロイド又は細菌性アミロイド前駆体は標識されていない。幾つかの実施形態では、哺乳類アミロイド、哺乳類アミロイド前駆体、細菌性アミロイド前駆体、又は細菌性アミロイドは複数の標識を含む。幾つかのさらなる実施形態では、上記指標は、比色インジケータ、スピンラベル（例えば、３Ｈ、１５Ｎ又は１３Ｃ等）、金属イオン結合化合物（例えば、ポルフィリン、キレート剤、ポリヒスチジン、又は他の金属結合ポリペプチド等に対する）、酵素、又はアミロイド特異的抗体を含み得る。幾つかの実施形態では、アミロイド原線維の発達は、光学顕微鏡検査によって直接観察される。幾つかの実施形態では、アミロイド形成は、直接的な光透過により、又は反射率により観察される。幾つかの実施形態では、アミロイド形成は、全内部反射ＦＴＩＲにより観察される。幾つかの実施形態では、アミロイド形成は、ＮＭＲ、ＦＴＩＲ、ＳＰＩＲ、又はＳＰＲ分光法により観察される。幾つかの実施形態では、アミロイド形成は、光学複屈折により観察及び／又は確認される。幾つかの実施形態では、サンプルは、視覚化の前にコンゴレッド色素で染色される。幾つかの実施形態では、アミロイド形成はラ��ン散乱により観察される。幾つかの実施形態では、アミロイド形成は、内部トリプトファン残基、チロシン残基、フェニルアラニン残基、ヒスチジン残基、及びアルギニン残基によるもの等、サンプルの内部蛍光の変化をモニタリングすることにより観察される。幾つか実施形態では、アミロイド形成は、上記抗体の蛍光標識、比色標識、スピン標識、放射性同位体、及び酵素への複合化、蛍光タンパク質、金属結合ドメイン、又は抗体の検出若しくは可視化のため当業者に知られている他の方法等による当該技術分野で知られている手段によってアミロイド特異的抗体の結合をモニタリングすることにより観察される。本明細書に記載の方法によれば、上記抗体は、アミロイド又はアミロイド前駆体のいずれかに対して選択的である結合活性を有する抗体を含み得る。
【０１５９】
幾つかの実施形態では、本開示の方法は、哺乳類アミロイド前駆体、及び１又は複数の細菌アミロイド前駆体若しくは凝集体の存在下でアミロイド特異的色素の蛍光強度の動態をモニタリングすることによって実行され得る。幾つかの実施形態では、上記哺乳類アミロイド前駆体はα−シヌクレインである。幾つかの実施形態では、上記細菌アミロイド前駆体又は凝集体はＣｓｇＡである。幾つかの実施形態では、上記アミロイド特異的色素はチオフラビンＴである。
【０１６０】
幾つかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の方法を実施するためのキットを企図する。幾つかの実施形態では、上記キットは、少なくとも哺乳類アミロイド又は哺乳類アミロイド前駆体、細菌アミロイド又は細菌アミロイド前駆体、本明細書に記載のアミロイド形成の指標と、１又は複数の反応容器を備え、かかる指標は上記哺乳類アミロイド又は哺乳類アミロイド前駆体、細菌性アミロイド又は細菌性アミロイド前駆体に複合化してもしなくてもよい。上記キットは、マルチウェルプレートを含み得る。上記キットは、本明細書に記載の方法を実施するための指示書を更に含み得る。
【０１６１】
本開示の方法は、アミロイド、特に微生物により誘発されたアミロイドの凝集及び／又は脱凝集を調節する化合物を特定するために候補化合物をスクリーニングする方法を提供する。幾つかの実施形態では、本開示の方法は、候補化合物のライブラリのスクリーニングを含む。幾つかのさらなる実施形態では、本明細書に開示される方法に従って哺乳類アミロイド又は哺乳類アミロイド前駆体、及び細菌アミロイド前駆体又は細菌アミロイドと接触される組成物は、アミロイド形成を阻害すると当該技術分野で疑われる１つ若しくは複数の化合物又はそれらの組み合わせを含む、又は既存のアミロイドを不安定化若しくは分解する。特定の実施形態では、哺乳類アミロイド又は哺乳類アミロイド前駆体、及び細菌アミロイド前駆体又は細菌アミロイドと接触する組成物は、本明細書に開示される方法に従って、天然産物又は天然産物からの抽出物を含む。幾つかの実施形態では、本明細書に開示される方法に従って、哺乳類アミロイド又は哺乳類アミロイド前駆体、及び細菌アミロイド前駆体又は細菌アミロイドと接触される組成物は、ハーブ、ハーブ抽出物又は植物物質を含む。幾つかの実施形態では、上記組成物は、動物、植物又は真菌からの組織又は体液を含み得る。幾つかのさらなる実施形態では、上記組成物は、植物の種子、果実、花、葉、茎、形成層若しくは根、又はそれらの組み合わせに由来する組織、流体又は組織若しくは体液の抽出物を含み得る。幾つかのさらなる実施形態では、上記組成物は、糞、尿、血液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、唾液、又は動物の任意の臓器に由来する組織、体液、又は組織若しくは体液の抽出物を含み得る。幾つかの実施形態では、上記組成物は、１又は複数の細菌、又はその溶解物、抽出物、馴化培地、凍結乾燥細菌、凍結乾燥溶解物、凍結乾燥培地、又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。幾つかの実施形態では、上記細菌は、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、パラバクテロイデス（Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、フェカリバクテリウム（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ユーバクテリウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ロゼブリア（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）、ブラウチア（Ｂｌａｕｔｉａ）、コプロコッカス（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ）及びビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、又はそれらの任意の組み合わせのうちの１又は複数を含む。
【０１６２】
幾つかの実施形態では、本開示の方法を使用して、被験体においてアミロイド障害を発症するリスクを診断又は評価することができる。本開示の方法は、パーキンソン病、レビー小体型認知症、偶発性レビー小体病、アルツハイマー病レビー小体亜型、多系統萎縮症、純粋自律神経失調症又はそれらの任意の組み合わせを含む１又は複数の神経障害の治療、予防及び／又は改善に使用され得る。上記障害には、振戦、麻痺、運動障害等の神経障害、及び／又は便秘、下痢、腹痛及び／又は腹痛発作、腹部膨満、鼓腸、吐き気、又は過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎、クローン病、腸管透過性亢進のその他の症状又はそれらの組み合わせ等の胃腸症状の診断及び治療の分野で知られている身体症状に加えて、臨床的診断の分野で知られている行動症状、並びにコミュニケーション症状、常同行動、感覚運動の問題及び／又は不安様行動等の神経障害の治療が含まれ得る。したがって、かかる臨床的及び／又は診断的評価及び判断を使用して、本開示で提供される１又は複数の方法に従って本明記細書に載の１又は複数の化合物を受ける１人又は複数の被験体を特定及び／又は選択することができる。本開示の方法は、幾つかの実施形態では、神経障害の診断及び治療の分野で知られている行動、身体及び／又は胃腸症状のモニタリングを含み得る。幾つかの実施形態では、本開示による方法は、被験体の行動の変化のモニタリングを組み込む。幾つかのさらなる実施形態では、本開示による方法は、パーキンソン病、レビー小体型認知症、偶発性レビー小体病、アルツハイマー病レビー小体亜型、多系統萎縮症、純粋自律神経失調症、又はそれらの任意の組み合わせに関連することが知られている行動症状について被験体をモニタリングすることを組み込む。幾つかのさらなる実施形態では、本開示による上記方法は、例えば、無呼吸、低呼吸、運動緩慢、運動失調、振戦、筋肉の硬直、姿勢及びバランスの障害、自動運動の喪失、構音障害又は他の発話の変化、筆跡の変化、起立性低血圧、記憶障害、嚥下障害、失禁、睡眠障害、心不整脈、視覚障害、うつ病及び視覚、聴覚、嗅覚及び触覚性の幻覚を含む精神医学的問題、めまい、認知機能障害、又はそれらの任意の組み合わせ、アミロイド障害、及び特にα−シヌクレイノパチーの診断に有用となる神経学的診断又は治療の当該技術分野で知られている任意の他の症状について被験体をモニタリングすることを組み込む。幾つかのさらなる実施形態では、本開示による方法は、胃不全麻痺、結腸運動性、肛門直腸機能不全及び排便協調障害を含む腸管運動性について被験体をモニタリングすることを組み込む。繰り返しになるが、かかる臨床的及び／又は診断的評価及び判断を使用して、本明細書に記載の方法による診断及び／治療について１人又は複数の被験体を特定及び／又は選択することができる。幾つかの実施形態では、本開示の方法は、前述の臨床モニタリングに加えて、本明細書に開示される細菌性、宿主由来、及び微生物誘発性アミロイドのレベルのモニタリングを含み得る。本開示の方法によれば、上記アミロイドを、被験体の腸管、糞便、尿、血液、唾液、脳脊髄液及び／又は滑液で監視することができる。本開示の方法は、���療過程中に被験体から得られる任意の組織又は体液中の上記アミロイドをモニタリングし、それにより上記サンプルがアミロイド形成を促進又は阻害する因子を含むかどうかを特定することを企図する。幾つか実施形態では、組織、体液又は他のサンプルが由来する被験体は、そのサンプルについて、本明細書に記載のアッセイが、アミロイド形成を増強又は促進する因子の存在を示し、アミロイド障害を発症するリスクが高いと見なされ得る。幾つかの実施形態では、上記被験体は、上記アミロイド障害を改善又は予防するための薬物又は治療を投与され得る。繰り返しになるが、かかる臨床的及び／又は診断的評価及び判断を使用して、本開示で提供される１又は複数の方法に従って本明記細書に載の１又は複数の化合物を受ける１人又は複数の被験体を特定及び／又は選択することができる。
【０１６３】
本明細書に開示す方法によれば、アミロイド形成に関係する障害の治療又は阻害は、被験体が一定期間投薬の定期的な部分的又は完全な減少に続く投薬の再開を経験するように、投薬スケジュールを調節することにより達成され得る。幾つかの実施形態では、投薬量は１日〜３０日間毎日投与され、その後、１日〜３０日間にわたる投薬休日が続く。幾つかの実施形態では、投薬休日中に用量は投与されない。幾つかのさらなる実施形態では、本開示の組成物は、次の用量の投与の前に被験体の身体から完全に除去することを可能にする。幾つかの他の実施形態では、投薬休日中に、通常の１日用量よりも少ない用量が投与される。幾つかのさらなる実施形態では、治療有効量よりも少ない投与組成物の量により、投薬休日中に被験体内にとどまることが可能になる。幾つかのさらなる実施形態では、罹患組織の治療レベルを維持するのに十分な投与組成物の量が、被験体内に留まることが可能になる。幾つかの実施形態では、組成物は、アミロイド形成に関連する神経障害の前述の症状の１又は複数の発症後の任意の時点で投与される。幾つかの実施形態では、本明細書に記載の方法による組成物は、上記障害又は複数の障害の症状の発症前に投与される。幾つかの実施形態では、本明細書に記載の方法による組成物は、上記障害又は複数の障害の症状の発症と同時に、又は発症後に投与される。
【０１６４】
以下の項目は、本明細書の幾つかの実施形態に従って記載されている。
【０１６５】
１．アミロイド又はアミロイドの前駆体を本発明の化合物を含む組成物と接触させることを含む、アミロイド凝集体の形成を妨害及び／又は阻害する方法。
【０１６６】
２．アミロイド又はアミロイドの前駆体を本発明の化合物を含む組成物と接触させることを含む、アミロイド凝集体の形成を阻害する方法。
【０１６７】
３．被験体においてアミロイド凝集体の形成を妨害する方法であって：
本発明の化合物を含む組成物を前記被験体に投与すること；並びに
任意に、前記組成物を投与する前に、臨床的又は診断的評価等により、アミロイド凝集体の形成を妨害する分子の利益を受けるように前記被験体を選択すること、及び／又は
任意に、前記組成物の投与後の前記被験体におけるアミロイド凝集体の形成の妨害若しくは阻害を測定すること、を含む方法。
【０１６８】
４．アミロイド又はアミロイドの前駆体を本発明の化合物を含む組成物と接触させることを含む、アミロイド凝集体の形成を妨害する方法。
【０１６９】
５．アミロイド障害の阻害、改善、可能性の低減、発症の遅延、治療又は予防の方法であって、本発明の化合物又はその医薬組成物を必要とする被験体に投与することを含む、方法。
【０１７０】
６．前記アミロイド障害が、α−シヌクレイノパシー、パーキンソン病、レビー小体型認知症、偶発性レビー小体病、アルツハイマー病レビー小体亜型、多系統萎縮症若しくは純粋自律神経失調症、又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、項５に記載方法。
【０１７１】
７．前記アミロイド障害が、腸アミロイド凝集体、例えばＣｓｇＡ等の細菌タンパク質を含む凝集体を含む、項５〜６のいずれか一項に記載の方法。
【０１７２】
８．前記アミロイド障害が、腸ディスバイオシス、腸透過性亢進、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎及びクローン病である、項５〜７のいずれか一項に記載の方法。
【０１７３】
９．ＣｓｇＡ等の細菌タンパク質、微生物タンパク質をコードする核酸、又は被験体の腸のサンプル中の細菌タンパク質を産生する微生物の存在又はレベルを検出することを更に含む、項５〜８のいずれか一項に記載の方法。
【０１７４】
１０．前記細菌タンパク質若しくは細菌タンパク質を産生する微生物の存在が腸サンプルで検出される場合、又は腸サンプル中の細菌タンパク質若しくは細菌タンパク質を産生する微生物のレベルが所定のレベル若しくは対照より大きい場合、前記被験体が前記組成物を必要としているものとして選択される、項９に記載の方法。
【０１７５】
１１．投与後の腸アミロイド凝集体の減少又は不在を判定することを更に含む、項７〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【０１７６】
１２．前記被験体が胃腸症状を示すと特定することを更に含む、項７〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【０１７７】
１４．前記被験体が、嚥下障害、腸管運動性の低下、胃不全麻痺、便秘（慢性便秘及び慢性特発性便秘を含む）小腸内細菌異常増殖（ＳＩＢＯ）、下痢、腹痛及び／又は腹痛発作、腹部膨満、鼓腸、唾液分泌過多（流涎症）、肛門直腸機能障害、排便協調障害、及び吐き気の１又は複数を含む胃腸症状を患っている、項５〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【０１７８】
１６．前記組成物が腸内又は鼻腔内送達用に製剤化されている、項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【０１７９】
１７．前記組成物が、下部腸又は結腸内の制御放出用に製剤化されている、項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【０１８０】
１８．前記組成物は、腸溶コーティングカプセル剤、錠剤、ソフトゲル、噴霧乾燥粉末、ポリマーマトリクス、ヒドロゲル、腸溶コーティング固体、結晶性固体、非晶質固体、ガラス状固体、コーティング微粉化粒子、液体、噴霧液、エアロゾル、又はマイクロカプセルである、項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【０１８１】
１９．前記アミロイド凝集体が、α−シヌクレイン、タウ、アミロイド前駆体タンパク質由来のベータアミロイド、メジン、アポリポタンパク質ＡＩ、心房性ナトリウム利尿因子、ベータアミロイド、シスタチン、ＩＡＰＰ（アミリン）、ベータ−２ミクログロブリン、トランスサイレチン、ＰｒＰ、ゲルゾリン、リゾチーム、ハンチンチン、ケラトエピセリン、カルシトニン、プロラクチン、血清アミロイドＡ、ＳＯＤ１、及び／又は免疫グロブリン軽鎖ＡＬ等の１又は複数の哺乳類タンパク質を含む、項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【０１８２】
２０．前記アミロイド凝集体が、ＣｓｇＡ等の１又は複数の細菌タンパク質又は真菌タンパク質を含む、項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【０１８３】
２１．前記アミロイド凝集体が、ＣｓｇＡ等の細菌タンパク質を含む、項１〜２０のいずれかに記載の方法。
【０１８４】
２２．前記アミロイド凝集体が、消化管、頭蓋洞、又は鼻腔内に存在する、項１〜２１のいずれかに記載の方法。
【０１８５】
２３．前記アミロイド凝集体が、腸神経組織又は嗅球内に存在する、項１〜２２のいずれかに記載の方法。
【０１８６】
２４．前記組成物が毎日投与される、項１〜２３のいずれかに記載の方法。
【０１８７】
２５．前記組成物が１日に複数回投与される、項１〜２４のいずれかに記載の方法。
【０１８８】
２６．前記組成物が毎日よりも少ない頻度で投与される、項１〜２５のいずれかに記載の方法。
【０１８９】
２７．前記組成物が２日ごと、３日ごと、４日ごと、５日ごと、６日ごと、又は７日ごとに投与される、項１〜２４又は項２６のいずれかに記載の方法。
【０１９０】
２８．投与の過程で腸内アミロイドレベル及び／又はアミロイド凝集を測定又は評価することを更に含む、項１〜２７のいずれかに記載の方法。
【０１９１】
２９．投与の過程後に腸内アミロイドレベル及び／又はアミロイド凝集を測定又は評価することを更に含む、項１〜２８のいずれかに記載の方法。
【０１９２】
３０．前記被験体の神経学的症状又は行動等の神経系の変化を測定又は評価することを更に含む、項１〜２９のいずれかに記載の方法。
【０１９３】
３１．前記被験体が１８歳、１８歳〜３０歳、３０歳〜５０歳、５０歳〜６０歳、６０歳〜７０歳、又は７０歳超である、項１〜３０のいずれかに記載の方法。
【０１９４】
３２．前記被験体の胃腸症状又は行動等の胃腸系の変化を測定又は評価することを更に含む、項１〜３１のいずれかに記載の方法。
【０１９５】
３３．前記胃腸症状が便秘を含む、項３２に記載の方法。
【０１９６】
３４．前記被験体が、便秘、下痢、腹痛及び／又は腹痛発作、腹部膨満、鼓腸、吐き気、又は過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ、潰瘍性大腸炎及びクローン病等）、腸管透過性亢進のいずれか１つ若しくは複数の症状、又はそれらの組み合わせを含む、項１〜３３のいずれかに記載の方法。
【０１９７】
３５．前記組成物が、神経学的症状又は状態の出現後に投与される、項１〜３４のいずれかに記載の方法。
【０１９８】
３６．前記神経学的症状又は状態が、無呼吸、低呼吸、運動緩慢、運動失調、振戦、筋肉の硬直、姿勢及びバランスの障害、自動運動の喪失、構音障害又は他の発話の変化、筆跡の変化、起立性低血圧、記憶障害、嚥下障害、失禁、睡眠障害、心不整脈、視覚障害、うつ病及び視覚、聴覚、嗅覚又は触覚性の幻覚を含む精神医学的問題、めまい、認知機能障害、ドーパミンレベルの変化、セロトニンレベルの変化、キヌレニンの変化、及び／又はそれらの任意の組み合わせの１又は複数の症状を含む、項３５に記載の方法。
【０１９９】
３７．前記組成物が、神経学的症状又は状態の出現前に投与される、項１〜３６のいずれかに記載の方法。
【０２００】
３８．前記方法が繰り返される、項１〜３７のいずれかに記載の方法。
【０２０１】
３９．所与の投与について、前記組成物が以前に投与された組成物とは異なる、項１〜３８のいずれかに記載の方法。
【０２０２】
４０．所与の投与について、前記投与される用量が以前に投与された用量とは異なる、項１〜３９のいずれかに記載の方法。
【０２０３】
４１．前記組成物がカフェイン、ニコチン、テオフィリン、テオブロミン、キサンチン、メチルキサンチン、又はそれらの誘導体と同時投与される、項１〜４０のいずれかに記載の方法。
【０２０４】
４２．α−シヌクレイン凝集の阻害剤を前記被験体に投与することを更に含む、項１〜４１のいずれかに記載の方法。
【０２０５】
４３．前記被験体が、臨床的又は診断的評価等により、パーキンソン病を発症するリスクがある、又は既にパーキンソン病に罹患していると特定又は選択された被験体である、項１〜４２のいずれかに記載の方法。
【０２０６】
４４．前記被験体が、臨床的又は診断的評価等によって、レビー小体型認知症、偶発性レビー小体疾患、アルツハイマー病レビー小体亜型、多系統萎縮症、純粋自律神経失調症又は任意の組み合わせを発症するリスクがある又は既に罹患していると特定された者である、項１〜４３のいずれかに記載の方法。
【０２０７】
４５．前記胃腸症状がパーキンソン病又はパーキンソニズムに関連している、項１４に記載の方法。
【０２０８】
４６．前記アミロイド障害が、腸内細菌アミロイド凝集体の存在又はレベルを検出することにより診断され得る、項１〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【０２０９】
追加の選択肢
以下の選択肢は、本明細書の幾つかの実施形態に従って記載される。
１．微生物誘発性アミロイドの形成に影響を与える組成物を特定する方法であって：
（ａ）本発明の化合物を含む組成物の存在下で、複数の濃度の微生物アミロイド又は微生物アミロイド前駆体（例えば、ＣｓｇＡ）を複数の濃度のα−シヌクレインと接触させること；
（ｂ）（ａ）に指定される反応によって産生されたアミロイドの形成を分析又は測定すること；及び
（ｃ）（ｂ）で行われた分析又は測定を対照の分析又は測定と比較し、該対照が、前記組成物の不在下で、（ａ）に指定される反応後のアミロイドの形成を分析又は測定することを含む、方法。
【０２１０】
２．前記微生物アミロイド又は微生物アミロイド前駆体がＣｓｇＡを含む、選択肢１に記載の方法。
【０２１１】
３．（ａ）中に撹拌を更に含む、選択肢１又は２に記載の方法。
【０２１２】
４．（ａ）で行われる接触が、アミロイド形成の指標の存在下で行われる、選択肢１〜３に記載の方法。
【０２１３】
５．前記指標が、蛍光インジケータ、スピン標識インジケータ、酵素、抗体、又は比色インジケータである、選択肢４に記載の方法。
【０２１４】
６．前記指標がチオフラビンＴである、選択肢４の方法。
【０２１５】
７．前記抗体が凝集したα−シヌクレインに対して特異性を有し、前記抗体が、任意に蛍光標識、酵素、比色標識、スピン標識、金属イオン結合部分、核酸、多糖、又はポリペプチドに複合化されている、選択肢４に記載の方法、
【０２１６】
８．前記ＣｓｇＡ及び前記α−シヌクレインがそれぞれ別々に標識される、選択肢１〜７のいずれかに記載の方法。
【０２１７】
９．前記形成が、内部蛍光、染料若しくは標識の蛍光、蛍光共鳴エネルギー移動、蛍光偏光、蛍光偏光移動、ＵＶ／Ｖｉｓ分光法、磁気共鳴、ラマン散乱、電子常磁性スピン共鳴、光学顕微鏡法、電子顕微鏡法、走査トンネル顕微鏡法、又は原子間力顕微鏡法により分析又は測定される、選択肢１〜８のいずれかに記載の方法。
【０２１８】
１０．前記組成物が化合物の混合物を含む、選択肢１〜９のいずれかに記載の方法。
【０２１９】
１１．前記組成物が組織、体液、又はその抽出物を含む、選択肢１〜１０のいずれかに記載の方法。
【０２２０】
１２．前記組成物が、糞便、尿、血液、髄液、若しくは唾液、又はその成分を含む、選択肢１〜１１のいずれかに記載の方法。
【０２２１】
１６．前記組成物が、１又は複数の細菌、細菌抽出物、溶解物、馴化培地、凍結乾燥細菌、凍結乾燥溶解物、凍結乾燥培地又はそれらの任意の組み合わせを含む、選択肢１〜１０のいずれかに記載の方法。
【０２２２】
１７．アミロイド形成を変化させる組成物を特定又は選択することを更に含む、選択肢１〜１６のいずれかに記載の方法。
【０２２３】
１８．アミロイド形成を低減する組成物を特定又は選択することを更に含む、選択肢１〜１７のいずれかに記載の方法。
【０２２４】
１９．（ｂ）において、アミロイドの形成速度を分析又は測定する、選択肢１〜１８のいずれかに記載の方法。
【０２２５】
２０．微生物誘発性アミロイドを作製する方法であって：
（ａ）本発明の化合物を含む組成物の存在下で、複数の濃度の微生物アミロイド又は微生物アミロイド前駆体（例えば、ＣｓｇＡ）を複数の濃度のα−シヌクレインと接触させること；
（ｂ）新たな微生物誘発性アミロイドの形成を可能にする条件を提供すること、及び
（ｃ）（ｂ）で形成された微生物誘発性アミロイドを分析又は定量化すること、を含む方法。
【０２２６】
２１．前記微生物アミロイド又は微生物アミロイド前駆体がＣｓｇＡを含む、選択肢２０に記載の方法。
【０２２７】
２２．（ａ）の間に撹拌を更に含む、選択肢２０又は２１に記載の方法。
【０２２８】
２３．（ａ）で行われる接触が、アミロイド形成の指標の存在下で行われる、選択肢２０〜２２のいずれかに記載の方法。
【０２２９】
２４．前記指標が、蛍光インジケータ、スピン標識インジケータ、又は比色インジケータである、選択肢２３に記載の方法。
【０２３０】
２５．前記指標がチオフラビンＴである、選択肢２３又は２４に記載の方法。
【０２３１】
２６．前記ＣｓｇＡ及び前記α−シヌクレインがそれぞれ別々に標識される、選択肢２０〜２５のいずれかに記載の方法。
【０２３２】
２７．前記形成が、内部蛍光、染料若しくは標識の蛍光、蛍光共鳴エネルギー移動、蛍光偏光、蛍光偏光移動、ＵＶ／Ｖｉｓ分光法、磁気共鳴、ラマン散乱、電子常磁性スピン共鳴、光学顕微鏡法、電子顕微鏡法、走査トンネル顕微鏡法、又は原子間力顕微鏡法により分析又は測定される、選択肢２０〜２６のいずれかに記載の方法。
【０２３３】
２８．前記組成物が化合物の混合物を含む、選択肢２０〜２７のいずれかに記載の方法。
【０２３４】
２９．前記組成物が組織、体液、又はその抽出物を含む、選択肢２０〜２８のいずれかに記載の方法。
【０２３５】
３０．前記組成物が、糞便、尿、血液、髄液、若しくは唾液、又はその成分を含む、選択肢２０〜２９のいずれかに記載の方法。
【０２３６】
３１．前記組成物が、１又は複数の細菌、細菌抽出物、溶解物、馴化培地、凍結乾燥細菌、凍結乾燥溶解物、凍結乾燥培地又はそれらの任意の組み合わせを含む、選択肢２８〜３０のいずれかに記載の方法。
【０２３７】
３５．アミロイド形成を低減する組成物を特定又は選択することを更に含む、選択肢２０〜３４のいずれかに記載の方法。
【０２３８】
３６．（ｃ）において、アミロイドの形成速度を定量化する、選択肢２０〜３５のいずれかに記載の方法。
【０２３９】
３７．キットであって、該キット内の１又は複数の容器に存在する、微生物アミロイド又は微生物アミロイド前駆体及びα−シヌクレインを含む、キット。
【０２４０】
３８．前記微生物アミロイド又は微生物アミロイド前駆体がＣｓｇＡを含む、選択肢３７に記載のキット。
【０２４１】
３９．被験体においてアミロイド障害を治療又は阻害する方法であって：
（ａ）組成物の存在下で、複数の濃度の微生物アミロイド又は微生物アミロイド前駆体を複数の濃度のα−シヌクレインと接触させること；
（ｂ）（ａ）に指定される反応後の新たなアミロイドの形成を分析又は測定すること；
（ｃ）（ｂ）で行われた分析又は測定を、対照の分析又は測定と比較し、該対照が、（ａ）に指定される反応後のアミロイド形成を分析又は測定することを含み；及び
（ｄ）前記組成物の存在下でのアミロイドの形成が、前記組成物の非存在下でのアミロイドの形成と比較して増加する場合、前記被験体に前記アミロイド障害を阻害又は治療するのに適した有効量の医薬組成物を投与すること、を含む方法。
【０２４２】
４０．前記微生物アミロイド又は微生物アミロイド前駆体がＣｓｇＡを含む、選択肢３９に記載の方法。
【０２４３】
４１．前記組成物が組織、体液、又はその抽出物を含む、選択肢３９〜４０のいずれかに記載の方法。
【０２４４】
４２．前記組成物が、糞便、尿、血液、髄液、若しくは唾液、又はその成分を含む、選択肢３９〜４１のいずれかに記載の方法。
【０２４５】
４３．前記医薬組成物が、１又は複数のプロバイオティクス細菌を含む、選択肢３９〜４２に記載の方法。
【０２４６】
４４．前記医薬組成物が、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、パラバクテロイデス（Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、フェカリバクテリウム（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ユーバクテリウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ロゼブリア（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）、ブラウチア（Ｂｌａｕｔｉａ）、コプロコッカス（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ）及びビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、又はそれらの任意の組み合わせのうちの１又は複数を含む、選択肢３９〜４３に記載の方法。
【０２４７】
４５．前記医薬組成物が、Ｂ．フラジリス（Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）、Ｂ．ブルガタス（Ｂ．ｖｕｌｇａｔｕｓ）、及びＢ．シータオタオーミクロン（Ｂ．ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）からなる群から選択される１若しくは複数の細菌；又はその任意の組み合わせを含む、選択肢３９〜４４に記載の方法。
【０２４８】
４６．アミロイドの形成速度が（ｂ）で分析又は定量化される、選択肢３９〜４５のいずれかに記載の方法。
【０２４９】
４７．前記被験体をアミロイド障害の治療又は阻害から利益を得る被験体として特定又は選択することを更に含む、選択肢３９〜４６のいずれかに記載の方法。
【０２５０】
４８．パーキンソン病、レビー小体型認知症、偶発性レビー小体病、アルツハイマー病レビー小体亜型、多系統萎縮症、純粋自律神経失調症又はそれらの任意の組み合わせの１又は複数のリスクにある又はそれを示す上記被験体を特定すること又は選択することを更に含む、選択肢３９〜４７のいずれかに記載の方法。
【実施例】
【０２５１】
実施例１
被験体に、上記の化合物の１又は複数（例えば、本発明の化合物を含む組成物）を、毎日等の定期的に経口又は直腸投与する。消化管内の細菌アミロイド形成及び／又は消化管組織内のα−シヌクレイン凝集レベルを、糞便サンプリング又は生検によって監視する。細菌のアミロイド（カーリー）の形成及び／又はα−シヌクレインの凝集を防ぐために治療を継続する。患者の消化管機能及び運動症状の変化を監視する。上記１又は複数の化合物の投与により、腸管内の微生物誘発性アミロイドの形成が減少される被験体について、１つ若しくは複数の消化管症状、１若しくは複数の運動症状及び／又は１若しくは複数の神経学的症状の改善が観察される。
【０２５２】
実施例２
本発明の化合物の１又は複数を入手又は合成し、作用部位で物質を放出し、胃及び小腸の大部分をバイパスするように腸溶性又は結腸選択性の製剤に組み込む。これは、カーリー産生及び／又はα−シヌクレイン凝集の部位での組成物の送達を提供し、全身循環への組成物の吸収を最小限に抑える。
【０２５３】
実施例３
本発明の化合物の１又は複数を取得又は合成し、下部小腸又は結腸での制御放出用製剤に組み込む。これにより、投薬の量を減らし及び／又は投薬頻度を減らし、副作用を最小限に抑えることができる。下部小腸又は結腸での制御放出は、当技術分野で知られている様々なアプローチのいずれかによって達成することができ、腸溶性コーティングカプセル剤、錠剤、ソフトゲル、本質的に腸溶性カプセル剤、多層製剤、ポリマー材料のコーティング微粉化形態等が挙げられる。
【０２５４】
実施例４
被験体に、本発明の化合物の２つ以上の組み合わせを投与する。カーリー阻害剤とα−シヌクレイン凝集阻害剤を組み合わせると、２つの重要なポイントでの凝集が同時にブロックされる。上記１又は複数の化合物の投与により、腸管内の微生物誘発性アミロイドの形成が減少される被験体について、１つ若しくは複数の消化管症状、１若しくは複数の運動症状及び／又は１つ若しくは複数の神経学的症状の改善が観察又は測定される。
【０２５５】
実施例５
Ｔｈｙ１−α−シヌクレイン（α−シヌクレイン過剰発現［ＡＳＯ］）マウスは、微細運動機能及び粗大運動機能の進行性の欠陥と並んで、腸管運動機能の欠陥を示す。証拠は、ヒトにおける未調節のα−シヌクレイン発現をＰＤのより高いリスクにつながり、Ｔｈｙ１−α−シヌクレインマウスモデルの疫学的基盤を提供する。協調運動課題の欠陥は、１２週齢で明らかになる。運動機能は、このモデルで以前に検証されたように、４つのテスト（ビーム横断、ポール降下、鼻接着剤除去、及び後肢抱擁反射）で測定される）Ｆｌｅｍｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２４，９４３４−９４４０（２００４）、及びＳａｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ１６７（６）：１４６９−１４８０（２０１６）に記載され、それらの内容は引用することでその全体が明示的に本明細書の一部をなす）。ＡＳＯマウスは、野生型の同腹子と比較して、挑戦的（ｃｈａｌｌｅｎｇｉｎｇ）ビームを横切るのに有意に多くの時間を必要とし、ポールを降下する時間の増加も示し、これらは２つの粗大運動機能の尺度である。微細運動制御の試験である鼻梁からの接着剤の除去も、線条体機能障害の尺度である後肢抱擁反射と同様に、ＳＰＦ−ＷＴマウスと比較してＳＰＦ−ＡＳＯマウスで損なわれる。
【０２５６】
ＡＳＯ新生児を２群に分ける。１つの群には、上記の１又は複数の組成物が投与し、もう１つの群は未治療であるか又は模擬治療が行われる。組成物は１２週間〜１３週間にわたり毎日投与される。１３週間以降、運動能力を評価する。上記の組成物で治療されたＡＳＯマウスは、未治療のＡＳＯマウスに比べて、挑戦的ビームを横断する時間を短くし、ポールを降下する時間を短縮し、鼻梁からの接着剤の除去を高め、後肢抱擁反射を強化した。
【０２５７】
また、糞便を試験動物から得る。治療されたＡＳＯマウスからの糞便は、未治療のＡＳＯ動物と比較して、細菌接着性線毛（カーリー）のレベルが低く、凝集したα−シヌクレインのレベルが低いことを示している。
【０２５８】
１６週間後、動物を屠殺し、α−シヌクレイン凝集体の存在について脳の腸神経組織を分析する。立体配座特異的α−シヌクレイン凝集体及び原線維のみを認識する抗体を利用して、免疫蛍光顕微鏡法を実施して、α−シヌクレインの封入体を可視化する。治療動物で見られるレベルと比較して、α−シヌクレインの有意な凝集が、未治療ＡＳＯ動物の尾側被殻（ＣＰ）、黒質（ＳＮ）、及び腸神経細胞で観察される。脳抽出物のウエスタンブロットも行った。不溶性α−シヌクレインは、治療されたＡＳＯ動物の脳及び腸神経組織で有意に減少している。
【０２５９】
実施例６
カーリー駆動性病態生理学における機能的アミロイド形成の役割を、同時係属中の出ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０３２６０５号に記載されている技術を使用してマウスで調べた。最初の問題として、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのαＳｙｎアミロイド形成に対するＥＧＣＧの効果と共に、野生型Ｅ．コリによるバイオフィルムの成長に対するエピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）の効果を調べた。図１Ａは、指定の濃度のＥＧＣＧを用いた、静置培養で４日後の野生型Ｅ．コリによるバイオフィルム成長のクリスタルバイオレット染色を示すグラフである；光学密度（ＯＤ）によって評価されるデータ。図１Ｂは、ＥＧＣＧ（５０μＭ）治療あり及びなしのαＳｙｎアミロイド形成単独又はＣｓｇＡ（２５：１モル比）の存在下でのチオフラビンＴ蛍光により測定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ  αＳｙｎ凝集を示すグラフである。
【０２６０】
無菌のＴｈｙ１−αＳｙｎマウス（ＡＳＯ）を５週齢〜６週齢でＷＴ  Ｅ．コリにより単コロニー化し、水のみを与えるか（Ｖｅｈｉｃｌｅ：Ｖｅｈ）又は自由飲水中のＥＧＣＧ（＋ＥＧＣＧ）治療した。糞塊からＲＮＡを抽出し、ｒｒｓＡと比較して、ｑＲＴ−ＰＣＲによりＣｓｇＡ発現を定量した。図１Ｃは、ＣｓｇＡ発現の倍率変化を示すグラフである。運動機能は、ビーム横断時間（図１Ｄ）、ポール降下時間（図１Ｅ）、鼻接着剤除去時間（図１Ｆ）、後肢抱擁スコア（図１Ｇ）、及びワイヤハングの試験（図１Ｈ）を定量化することにより、１５週齢〜１６週齢で評価した。ビヒクルで治療した対照と比較して、ＥＧＣＧで治療したマウスでは横断する時間、降下する時間、除去する時間、及び後肢スコアが低く、ＥＧＣＧで治療したマウスでは落下するまでの時間が長かった。
【０２６１】
図１Ｉは、（図１Ｄ〜図１Ｈ）の試験から収集された運動スコアの主成分分析を示すグラフである。図１Ｊ〜図１Ｋは、免疫蛍光顕微鏡法で画像化された黒質におけるプロテイナーゼＫ耐性αＳｙｎ凝集体（白い矢印で示される）を示す一連のグラフである。ビヒクル治療マウス（図１Ｊ）及びＥＧＣＧ治療マウス（図１Ｋ）が示されている。プロテイナーゼＫ耐性αＳｙｎ凝集体のレベルは、未治療の対照よりもＥＧＣＧ処理マウスで低かった。したがって、運動能力の評価により、本明細書の幾つかの実施形態によるＥＧＣＧ治療は、線条体及び中脳の両方におけるαＳｙｎ凝集を防止しながら、Ｅ．コリにより悪化した進行性運動障害をうまく抑制することを明らかにする。
【０２６２】
図１Ｌ〜Ｍは、ドットブロットアッセイによる線条体（図１Ｌ）及び腹側中脳（図１Ｍ）における不溶性αＳｙｎ原線維の定量化を示す。脳の薄切片をＩｂａ１（ミクログリア）で染色し、３Ｄ細胞再構成を生成し、線条体（図１Ｎ）及び黒質（図１Ｏ）に存在するミクログリアから形態学的特徴を定量化した。ｎ＝３（図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｎ、図１Ｏ）、ｎ＝８（図１Ｃ）、ｎ＝１０〜１１（図１Ｄ〜図Ｉ）、ｎ＝４（図１Ｌ〜図１Ｍ）。点は個体を表し、バーは平均及び標準誤差を表す。図１ＡのＴｕｋｅｙ事後検定、図Ｃ〜Ｋの両側Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ、又は図１Ｌの両側ｔ検定による一元配置ＡＮＯＶＡで分析したデータ。図１Ａ〜図１Ｌの場合、＊ｐ≦０．０５；＊＊ｐ≦０．０１；＊＊＊ｐ≦０．００１。運動データは、２つの独立したコホートから収集される。
【０２６３】
したがって、本明細書の幾つかの実施形態による組成物による化合物及び方法によるｉｎ  ｖｉｖｏ治療は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでαＳｙｎアミロイド形成を阻害又は低減することが示されている。さらに、これらの化合物は、本明細書の幾つかの実施形態によるパーキンソニズム等の凝集関連疾患の症状の阻害、改善、及び緩和と一致して、運動スコアを改善した。
【０２６４】
実施例７
同時係属中の出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０３２６０５号に記載されている技術を使用した追加実験（その全内容が引用することで本明細書の一部をなす）は、カーリーが十分な細菌による単コロニー化が、脳内のαＳｙｎ依存性の病状と炎症反応の増加を誘発することを示した。無菌（ＧＦ）野生型（ＷＴ）又はＴｈｙ１−αＳｙｎ（ＡＳＯ）マウスを、野生型のカーリーが十分な大腸菌（ＷＴ）又はカーリー欠損大腸菌（ΔｃｓｇＢＡＣ）のいずれかにより単コロニー化した。図２Ａは、ＥＬＩＳＡにより定量化された全脳溶解物中の総αＳｙｎを示すグラフである。図２Ｂは、ドットブロットアッセイによる線条体中の不溶性αＳｙｎ原線維の定量を示すグラフである。図２Ｃ〜図２Ｄは、線条体に由来する、ＥＬＩＳＡによるＴＮＦα（図２Ｃ）及びＩＬ−６（図２Ｄ）の定量化を示す。図２Ｅ〜図２Ｇは、ＡＳＯマウス由来の脳の薄切片を、Ｉｂａ１（ミクログリア）、３Ｄ細胞再構成、及び線条体に存在するミクログリアの形態的特徴について染色した結果を示す。ｎ＝３（図２Ａ〜図２Ｂ）、ｎ＝６〜７（図２Ｃ、図２Ｄ）、ｎ＝４（図２Ｅ〜図２Ｇ）（直径は２０個〜４０個の細胞による平均、又は分岐は５個〜７個の細胞による平均）。点は個体を表し、バーは平均及び標準誤差を表す。図２Ａ〜図２ＤのＴｕｋｅｙ事後検定、又は図２Ｅ及び２Ｆの両側ｔ検定による一元配置ＡＮＯＶＡで分析されたデータ；＊ｐ≦０．０５；＊＊ｐ≦０．０１；＊＊＊ｐ≦０．００１；＊＊＊＊ｐ≦０．０００１。マウスモデルに対するカーリーが十分な細菌のこの効果と一致して、ヒトパーキンソン病（ＰＤ）患者の腸管内でＣｓｇＡの相対量が増加することが示されている。ＣｓｇＡの相対存在量は、ヒトの糞便サンプルに由来する入手可能な１６ｓ  ＲＮＡデータ（ＥＮＡアクセッション：ＰＲＪＮＡ２６８５１５、ＰＲＪＥＢ４９２７、及びＰＲＪＥＢ１４６７４）のＰＩＣＲＵＳｔ分析によって決定された。この分析に基づいて、ＣｓｇＡの相対存在量はＰＤ患者の腸管内でより高いことが観察された（図２Ｈ）。さらに、野生型（図２Ｉ）又はＴｈｙ１−αＳｙｎ（ＡＳＯ）（図２Ｊ）マウスには、ＰＤ患者又は一致する対照（ＥＮＡアクセッション：ＰＲＪＥＢ１７６９４）に由来する微生物がコロニーを形成し、１６ｓ  ｒＲＮＡ配列のＰＩＣＲＵＳｔ帰属分析により、健康な対照と比較してＰＤ移植微生物叢の存在量がより多いことを示した（図２Ｋ）。図２Ｈ〜図２Ｊの場合、点は個人を表し、バーは平均を表し、両側Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定によって分析されたデータを表す。＊ｐ≦０．０５；＊＊ｐ≦０．０１。したがって、腸管のＣｓｇＡ等の細菌タンパク質の存在又はレベルの上昇（健康な対照と比較）は、ＰＤを含むアミロイド障害と相関することが観察される。
【０２６５】
実施例８
追加の実験は、その腸カーリーが進行性のシヌクレイン依存性の病態生理を促進することを示している。通常飼育したＴｈｙ１−αＳｙｎ（ＡＳＯ）動物に、３０μｇの合成ＣｓｇＡヘキサマー（ＣｓｇＡ；Ｎ−ＱＹＧＧＮＮ−Ｃ）又は非アミロイド形成ペプチド（Ｎ１２２Ａ；Ｎ−ＱＹＧＧＮＡ−Ｃ）を腸内注射した。各ペプチドはＣｓｇＡの凝集ドメインにまたがっていた。運動及び消化管の機能を、ビーム横断（図３Ａ）、ポール降下（図３Ｂ）、接着剤除去（図３Ｃ）、後肢抱擁スコア（図３Ｄ）、ワイヤハング（図３Ｅ）、糞便排出量（７０日目）（図３Ｆ）について注射後０日、７日、２１日、及び７０日に経時的に試験した。図３Ｇは、図３Ａ〜図３Ｆの収集された運動スコアの主成分分析を示すグラフである。図３Ｈ〜図３Ｉは、ドットブロットアッセイによる線条体（図３Ｈ）及び腹側中脳（図３Ｉ）の不溶性αＳｙｎ原線維の定量化を示す。ｎ＝８（図３Ａ〜図３Ｇ）、ｎ＝４（図３Ｈ）。点は個体を表し、バーは平均及び標準誤差を表す。群間比較に対するＳｉｄａｋ事後検定と共に、二元配置ＡＮＯＶＡによって分析された時間経過が個々の時間点上に示され、括弧は治療間の有意性を示す。図３Ｈのデータを、両側Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定によって分析した。図３Ａ〜図３Ｉの場合、＊ｐ≦０．０５；＊＊ｐ≦０．０１；＊＊＊ｐ≦０．００１；＊＊＊＊ｐ≦０．０００１。ＰＣＡによる運動能力の編集は、対照と比較してＣｓｇＡペプチドを注射したマウスの症候性の変化を示し、これらの動物の全体的な運動機能が損なわれていることを実証している（図３Ｇ）。さらに、アミロイド形成性ＣｓｇＡを注射した動物の中脳でαＳｙｎ原線維の増加が検出され（図３Ｈ）、消化管へのアミロイド投与後の中枢神経系（ＣＮＳ）病理の変化を実証している。したがって、アミロイドを形成することができるＣｓｇＡペプチドへの腸管曝露は、αＳｙｎ過剰発現マウスにおいて長期に運動障害を悪化させるのに十分である。
【０２６６】
したがって、本明細書では、腸カーリーは、マウス１匹当たりの通過時間、降下時間、除去時間、及び後肢スコアを増加させ、落下時間及び糞塊を減少させることが示された。マウス１匹当たりの通過時間、降下時間、及び後肢スコアの増加、並びにマウス１匹当たりの糞塊の減少は、上記のレベルで統計的に有意であった（図３Ｂ〜図３Ｄ及び図３Ｆを参照されたい）。したがって、腸カーリーがｉｎ  ｖｉｖｏでアミロイド障害の症状を誘発する可能性があると考えられる。
【０２６７】
実施例９
ミクロビオームとＰＤの因果関係を更に調査するために、それ以外は健康なヒトミクロビオームによるカーリーの産生が運動能力を低下させるのに十分であるかどうかを調べた。１６ｓ  ｒＲＮＡシーケンシング後のＰＩＣＲＵＳｔ分析で示されるように、低レベルのＣｓｇＡ生産菌を含むと予測される健康なヒトドナーの微生物叢をＧＦ  ＡＳＯマウスに移植した。これらのヒト化動物におけるアミロイド産生細菌の糞便量を研究した。以前のコホート（ＥＮＡアクセッション：ＰＲＪＥＢ１７６９４）からのヒトサンプルをＰＩＣＲＵＳｔで分析し、各集団内でコードされたＣｓｇＡの量を推測した（図４Ａ）。健康なヒト由来の糞便微生物を含む野生型のカーリーが十分なＥ．コリ（ＷＴ）又はカーリー―欠損Ｅ．コリ（ΔｃｓｇＢＡＣ）を摂取したＴｈｙ１−αＳｙｎ（ＡＳＯ）マウスの糞塊を、糞便細菌のＤＮＡに存在する１６ｓ  ｒＲＮＡに対するｒｒｓＡの存在量をｂ、ｑＰＣＲによって、及び糞便細菌ＲＮＡのｒｒｓＡに対するＣｓｇＡの発現をｃ、ｑＰＣＲ分析によって分析した。ｎ＝５（図４Ａ）、ｎ＝８（図４Ｂ〜図４Ｃ）。点は個体を表し、バーは平均及び標準誤差を表す。データを両側Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定によって分析した。＊＊＊ｐ≦０．００１。
【０２６８】
このように、アミロイド産生微生物の腸内レベルは、本明細書の幾つかの実施形態に従ってサンプルで検出できることが示され、さらに、アミロイド産生微生物の腸内レベルは、アミロイド障害をモデルとするアミロイド凝集体を有する被験体において（健康な対照と比較して）異なることが示されている。
【０２６９】
実施例１０
機能的アミロイド形成の阻害を研究した。無菌のＴｈｙ１−αＳｙｎマウス（ＡＳＯ）を野生型Ｅ．コリにより単コロニー化し、水のみ（ビヒクル、Ｖｅｈ）で処理するか、又は飲料水中のＥＧＣＧを自由摂取（＋ＥＧＣＧ）させた。運動機能を、１０週齢、１２週齢、及び１５週齢で、ビーム横断時間（図５Ａ）、ポール降下時間（図５Ｂ）、鼻接着剤除去時間（図５Ｃ）、後肢抱擁スコア（図５Ｄ）、及びワイヤハングの試験（図５Ｅ）により評価した。図５Ｆは、図５Ａ〜図５Ｄから編集された運動スコアの主成分分析を示す。脳の薄切片をＩｂａ１（ミクログリア）で染色し、線条体（図５Ｇ〜図５Ｈ）及び黒質（図５Ｉ〜図５Ｊ）に存在するミクログリアの形態的特徴を定量化した。ｎ＝１０〜１１（図５Ａ〜図５Ｆ）、ｎ＝３（図５Ｇ〜図５Ｊ）（分岐について５個〜７個の細胞からの平均）。バーは平均誤差及び標準誤差を表す。群間比較に対するＳｉｄａｋ事後検定と共に、二元配置ＡＮＯＶＡによって分析された時間経過が個々の時間点上に示され、括弧は治療間の有意性を示す。両側ｔ検定で分析されたデータ（図５Ｇ〜図５Ｊ）。＊ｐ≦０．０５；＊＊ｐ≦０．０１；＊＊＊＊ｐ≦０．０００１。
【０２７０】
したがって、本明細書の幾つかの実施形態による機能的アミロイド形成の阻害は、進行性運動障害を抑制する。理論に制限されることなく、大腸菌によって生成されたカーリーはアミロイド依存性経路を利用して、この前臨床モデルにおけるＰＤの特徴である運動障害及び病理を悪化させると考えられる。さらに、本明細書の幾つかの実施形態による細菌アミロイドの産生、哺乳類アミロイドとの形成及び／又は相互作用の阻害は、タンパク質凝集によって引き起こされる神経変性状態、例えば本明細書に記載のアミロイド障害の有用な介入であると考えられる。
【０２７１】
実施例１１
αＳｙｎ線維化のシーディングに対する細菌アミロイドタンパク質ＣｓｇＡの影響を研究した。精製されたαＳｙｎタンパク質及びＣｓｇＡタンパク質を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生物物理学的分析が実施した。主要なカーリーサブユニットであるＣｓｇＡがαＳｙｎ凝集体の形成をクロスシーディング（ｃｒｏｓｓ−ｓｅｅｄｉｎｇ）できるかどうかを試験した。精製されたＣｓｇＡをｉｎ  ｖｉｔｒｏでモノマーαＳｙｎに添加すると、αＳｙｎ凝集体の生成が著しく加速されることが観察された（図６Ａ〜図６Ｂ）。図６Ａは、αＳｙｎアミロイド形成中又はＣｓｇＡモノマーの存在下（２５：１モル比、黄色）での経時的なチオフラビンＴ蛍光により測定される凝集を示す。図６Ｂは、指数関数的線維化である遅滞期に達する時間を示す。図６Ｃ〜図６Ｈは、０時間（図６Ｃ〜図６Ｅ）及び凝集後６０時間（図６Ｆ〜図６Ｈ）でのαＳｙｎ単独（図６Ｃ、図６Ｆ）又はＣｓｇＡ単独（図６Ｅ、図６Ｈ）、又は組み合わせ（図６Ｄ、図６Ｇ）の一連の代表的な透過型電子顕微鏡写真である。図６Ｉ〜図６Ｋは、αＳｙｎ線維化の単独、又は凝集後０時間、１２．５時間及び６０時間でのＣｓｇＡの存在下での円二色性分光分析を示す一連のグラフである。図６Ａ及び図６Ｂでは、ｎ＝３である。バーは平均誤差及び標準誤差を表す。データは、両側ｔ検定によって分析される。＊＊ｐ≦０．０１。データは２つの独立した試験の代表である。したがって、本明細書の幾つかの実施形態による細菌性アミロイドタンパク質、ＣｓｇＡは、ＡＳｙｎ線維化をシードする。理論に制限されることなく、ＣｓｇＡはｉｎ  ｖｉｔｒｏでαＳｙｎ凝集体の生成を促進するだけでなく、これらの後続のαＳｙｎ構造は、プリオン様に伝播する他のアミロイドの観察と同様に、病原性の属性を維持すると考えられる。
【０２７２】
実施例１２
シヌクレインの凝集及び伝播のシーディングに対するＣｓｇＡの効果を一時的な相互作用を通じて研究した。
【０２７３】
図７Ａは、αＳｙｎアミロイド形成単独の間又はαＳｙｎ（図２Ａのように）又はαＳｙｎ単独へのＣｓｇＡモノマーの添加により以前に生成された５％シードの存在下でのチオフラビンＴ蛍光を示すグラフである。図７Ｂ〜図７Ｆは、上記のシード及びシード自体の添加により生成された原線維構造の一連の透過電子顕微鏡写真である。図７Ｇは、ＣｓｇＡモノマー若しくはシード、又は陽性対照としてのＤＯＰＳ−ＤＯＰＧコレステロールのいずれかを添加した表面固定化αＳｙｎの表面プラズモン共鳴測定を示すグラフである。したがって、完了した生化学反応から精製された最終的なＣｓｇＡ誘発シヌクレイン原線維は、αＳｙｎアミロイド形成を促進する能力を維持することが示されている。理論に制限されることなく、これらの結果は、アミロイド形成の後期段階におけるタンパク質の一過性相互作用又はオリゴマー形態間の相互作用と一致している（図７Ｇ）。
【０２７４】
したがって、ＣｓｇＡは一時的な相互作用を介してシヌクレインの伝播をシードすることが示された。
【０２７５】
実施例１３
可能性のあるアミロイド形成阻害剤のライブラリを取得する。かかるライブラリは、既存のリポジトリーで見つけることができ、又は例えば、当技術分野でよく知られている方法を利用するコンビナトリアル合成により若しくは固相ペプチド合成により新たに生成することができる。例えば、固相ペプチド合成、コンビナトリアルペプチド合成、及びペプチドライブラリの生成の教示について引用することで本明細書の一部をなす、Ｊｅｎｓｅｎ，Ｋ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２９１３を参照されたい。天然物ライブラリを利用することもできる。マルチウェルアッセイプレートでは、各ウェルがアミロイドイニシエータとアミロイド前駆体の異なる比率を含むように、Ｅ．コリＣｓｇＡ等の細菌アミロイドイニシエータが一次元で様々な濃度で配置され、α−シヌクレイン等の宿主由来のアミロイド形成タンパク質が二次元で様々な量で配置される。各ウェルに、一定量の個々の試験化合物と同様に、チオフラビン（ＴｈＴ）等の一定量のアミロイド形成の指標を加える。各トレイを撹拌してアミロイド形成を開始し、チオフラビン蛍光を監視する。経時的な蛍光発光速度に偏差を示す化合物は、アミロイド形成を促進又は阻害する候補として特定される。
【０２７６】
実施例１４
疑わしいアミロイド形成阻害剤は、チオフラビンＴ（ＴｈＴ）の存在下で、細菌のアミロイドイニシエータ及びアミロイド前駆体と組み合わされる。別に、対照として、細菌のアミロイドイニシエータ、アミロイド前駆体、及びチオフラビンＴが、アミロイド形成阻害剤の疑いがない場合に組み合わされる。チオフラビンＴ蛍光を経時的に監視する。対照サンプルと比較して、疑わしい阻害剤を含むサンプルのチオフラビンＴ蛍光の増加率の減少及び／又はチオフラビンＴ蛍光の最大レベルの減少は、疑わしいアミロイド形成阻害剤が実際にアミロイド形成を阻害するように機能していることを確認する。
【０２７７】
実施例１５
組織、体液、糞便、又は腸の内容物のサンプルを被験体から収集する。上記サンプルを、大腸菌ＣｓｇＡ等の細菌アミロイドイニシエータ、α−シヌクレイン等の宿主由来アミロイド形成タンパク質、及びチオフラビンＴ（ＴｈＴ）等のアミロイド形成の指標と組み合わせる。チオフラビンＴ蛍光を監視する。上記サンプルの不在下でのアミロイド形成の速度と比較した、上記サンプルの存在下でのアミロイドの形成速度の増加と一致する蛍光の増加は、パーキンソン病及び／又はレビー小体型認知症を含むα−シヌクレイノパチーのリスクの増加を示す。このリスクの増加は、アミロイド形成に関係するα−シヌクレイノパチー又は他の神経変性障害の開始及び／又は進行の定義されたリスクを計算するための従来の神経学的検査の結果と更に相関する。
【０２７８】
実施例１６
非結合の黒いプラスチック、９６ウェルプレートで、５０μＭ〜１００μＭのα−シヌクレインを０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ７．４）又は０．０５Ｍリン酸カリウムバッファーｐＨ７．３中で、１２μＭのチオフラビンＴ（水中に調製）の存在下でインキュベートする。０．０５Ｍリン酸カリウムバッファー、ｐＨ７．３中の精製ＣｓｇＡモノマーを、１：１０、１：２５、１：５０、又は１：１００のモル比で各ウェルに添加する。阻害化合物は、溶解度に基づいて、０．０５Ｍリン酸カリウムバッファー、ｐＨ７．３又はＤＭＳＯ等の適切なバッファーで調製する。化合物及び適切なバッファー対照を、α−シヌクレイン及びＣｓｇＡを含むウェルに、ウェル当たり１５０μＬの最終容量まで添加する。各化合物の濃度は、スクリーニングされる化合物の種類に依存するが、通常、初期スクリーニングでは１μＭ〜２００μＭの範囲内に収まると予想される。かかる化合物の添加に関する詳細は、アクセス可能な低分子ライブラリで利用可能な化合物の種類によって異なる。α−シヌクレインのみ及びＣｓｇＡのみを含む独立したウェルは、特異性対照として、又は潜在的な阻害剤の不在下で組み合わせて機能する。直径約１ｍｍ〜２ｍｍの単一の滅菌ガラス又はテフロンビーズを各ウェルに添加する。プレートを３７℃で連続振盪（約１００ｒｐｍ〜２５０ｒｐｍ）しながら蛍光対応マイクロプレートリーダー内でインキュベートする。蛍光を１時間〜２時間ごとに測定され、励起は４４０±１０ｎｍ、発光は４９０±１０ｎｍである。測定を２４時間〜７２時間にわたって行う。α−シヌクレインアミロイドが形成されると、Ｓ字曲線に従うこれらの条件下で、発光スペクトルが最大強度で最大約２４時間〜４８時間に達する。この時間が経過すると、アミロイドが不溶性になり非蛍光になって、発光強度が低下する可能性がある。
【０２７９】
アミロイド形成は、３つのフェーズ：（１）最初の約０時間〜２４時間にわたって発生する蛍光強度が低い遅滞期；（２）蛍光強度が約２時間〜４８時間から対数的に増加する対数期；（３）蛍光強度が最大に達し、残りの時間変化しないか、溶液から沈殿する不溶性α−シヌクレインにより減少し始めるプラトー段階、にわたって現れる（例えば、図１Ｂを参照されたい）。最大強度は２４時間〜７２時間の間に発生する。
【０２８０】
化合物の存在下でのチオフラビン蛍光により測定される凝集動態は、α−シヌクレイン及びＣｓｇＡのみで観察される動態に正規化され得る。可能性のある阻害剤は、遅滞期の延長、対数期中の変化率の低下、到達する最大強度の低下、又はそれらの任意の組み合わせに作用する可能性がある。
【０２８１】
最初の候補が特定されると、ＣｓｇＡ：シヌクレイン凝集体、又はＣｓｇＡ及びα−シヌクレイン個々に対する特異性と同様に、広範囲の濃度にわたる用量反応が決定され得る。このスクリーニングの幾つかのバリエーションでは、ＣｓｇＡ：シヌクレイン凝集体を対数期まで監視でき、この時点で潜在的な阻害化合物が導入される。続いて、アミロイド形成が既に進行中であるときに作用し得る阻害剤を特定することができる（例えば、図１Ｂを参照されたい）。
【０２８２】
実施例１７
アッセイは、実施例１６に記載されているように実施され、各化合物について完全な濃度曲線が作成される。これにより、各化合物のＥＣ５０を正確に決定することができ、特定の化合物の制限を明らかにすることができる（例えば、凝集の完全な阻害に至らない化合物を明らかにする）。
【０２８３】
実施例１８
アッセイは、実施例１６に記載されているように実施され、様々な方法でより高スループットのスクリーニング用にフォーマットされている。例えば、各化合物の完全な濃度曲線ではなく、３点濃度曲線を使用して、用量反応効果のある化合物を非特異的で濃度非依存の効果がある化合物と区別する。さらに高スループットスクリーニングのため、アッセイは９６ウェル、３８４ウェル、又は１５３６ウェルプレートでフォーマットされ、化合物は単一の濃度（１μＭ等）及び単一の時間点（２４時間〜７２時間等）で試験される。これにより、観察者は、効果がない、又は関連する濃度で効果がない化合物から潜在的な候補を区別することができる。
【０２８４】
実施例１９
アッセイは、実施例１６に記載されているように実施され、各化合物について全時間経過曲線が生成される。時間経過曲線は、化合物が経時的に線形又はＳ字状に阻害するかどうか、及び／又は所与の化合物で完全な阻害を達成できるかどうかを示す。
【０２８５】
実施例２０
アッセイを実施例１６に記載されているように実施し、該アッセイは、α−シヌクレイン（又は他の宿主アミロイドタンパク質）とカーリー（又は他の細菌アミロイド）の両方が存在するより動的な環境で機械的プロセス及び化合物活性を評価するため更に修飾される。次いで、観察者は、化合物が凝集テンプレートの存在下で１又は他のタンパク質の凝集を阻害する能力を評価する。例えば、細菌のアミロイド成分ＣｓｇＡは、α−シヌクレイン凝集を促進及び／又は加速することが知られている。ｉｎ  ｖｉｖｏ環境では、α−シヌクレイン凝集阻害活性を持つ候補化合物は、細菌アミロイドからの凝集促進又はテンプレート化活性に曝露される。したがって、モノマーα−シヌクレイン（又は他の宿主アミロイド）と凝集した細菌アミロイドの両方を含めることによりアッセイをフォーマットすることにより、より生理学的に関連するｉｎ  ｖｉｔｒｏ環境での薬物候補の評価が可能になる。
【０２８６】
実施例２１
アッセイは、実施例１６に記載されるように実施され、該方法は、カーリー（バクテリアアミロイド）凝集阻害剤をα−シヌクレイン凝集阻害剤と組み合わせることを更に含む。この組み合わせには、２つの重要なポイントで凝集を同時にブロックするという追加の利点がある。このアッセイは、α−シヌクレインとカーリー（ＣｓｇＡ）の両方のモノマー型を利用し、図１Ｂに示すものと類似の測定値が得られる。
【０２８７】
実施例２２
アッセイは、実施例１６に記載されるように実施され、該方法は、カーリー（バクテリアアミロイド）脱凝集プロモータをα−シヌクレイン脱凝集のプロモータと組み合わせることを更に含む。この組み合わせには、２つの重要なポイントで同時に脱凝集するという利点がある。アッセイは、α−シヌクレインとカーリーの両方の完全に凝集した形態を利用し、図１Ｂに示されるものと類似の測定値が得られる。
【０２８８】
実施例２３
アッセイは、実施例１６に記載されるように実施され、該方法は、カーリー（ＣｓｇＡ、細菌アミロイド）凝集阻害剤をα−シヌクレイン脱凝集プロモータと組み合わせることを更に含む。この組み合わせには、アミロイドの核形成又は発生を阻害すると同時に、既に開始されているプロセスの脱凝集をもたらすという追加の利点がある。このアッセイは、α−シヌクレインの完全に凝集した形態及びカーリーのモノマー形態（ＣｓｇＡ）を利用し、図２Ａ〜図３Ｉに示したものと類似の測定値が得られる。
【０２８９】
実施例２４
アッセイは、実施例１６に記載されるように実施され、この方法は、カーリー（細菌アミロイド）脱凝集プロモータをα−シヌクレイン凝集阻害剤と組み合わせることを更に含む。この組み合わせには、病原性細菌アミロイドを破壊すると同時にα−シヌクレインの凝集を阻害するという追加の利点がある。このアッセイは、モノマー形態のα−シヌクレインと完全に凝集した形態のカーリーを利用し、図２Ａ〜図３Ｉに示したものと類似の測定値が得られる。
【０２９０】
実施例２５
アッセイは、凝集できないＣｓｇＡ変異体が含まれることを除いて、実施例１６〜実施例２４のいずれかと同様に実施される。これらのプロセスで構造化された（凝集された）ＣｓｇＡの存在に依存する化合物は、このバージョンのアッセイで有効性の低下を示す。
【０２９１】
実施例２６
ヒトα−シヌクレインは、タグなしのヒトα−シヌクレインの全長遺伝子が挿入されたｐＴ７又はｐＥＴ１１ａに由来するプラスミドからＥ．コリＢＬ２１（ＤＥ３）で発現された。細胞をＯＤ６００  ０．６で０．８ｍＭ  ＩＰＴＧと共に４時間インキュベートし、遠心分離によって回収し、培養物の１０分の１の体積に相当する溶解バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、及び１ｍＭ  ＰＭＳＦ）に懸濁し、２０分間煮沸して溶解させた。細胞片を遠心分離によりペレット化し、清澄化した溶解物を１３６μＬ／ｍＬの１０％硫酸ストレプトマイシンで処理し、続いて２２８μＬ／ｍＬの氷酢酸で処理し、溶解物を遠心分離し、上清を新しいチューブに移し、等量の飽和（１００％）硫酸アンモニウムを加えることでタンパク質を沈殿させ、揺動シェーカーで４℃にて１時間インキュベートした。タンパク質を遠心分離によりペレット化し、等量の冷却エタノール中１００ｍＭ酢酸アンモニウムで洗浄し、遠心分離によりペレット化し、冷却エタノールで２回洗浄し、一晩乾燥させ、５０ｍＭリン酸カリウムバッファーｐＨ７．３又は１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４に再懸濁し、５０ｋＤａカットオフカラムを通過させた。使用する直前に、精製したα−シヌクレインを０．２μｍのナイロンフィルターで濾過した。α−シヌクレイン濃度を、２８０ｎｍでの吸収又はＢＣＡアッセイを使用して決定した。
【０２９２】
実施例２７
完全長の組換えＣｓｇＡモノマーを、Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８７（４２）による記載の通りに調製することができる。簡潔に言えば、ＣｓｇＡは、Ｃ末端６×Ｈｉｓタグを含むｐＥＴ１１ｄベクターにクローニングする。富栄養培地での増殖後、ＣｓｇＡの産生は、０．５ｍＭ  ＩＰＴＧにより３７℃にて１時間、およそ０．９のＯＤ６００で誘導される。細菌を、５０ｍＭリン酸カリウムバッファー、ｐＨ７．３の８Ｍ塩酸グアニジンで、一晩又は室温で約１時間〜２時間、揺動プラットフォームで溶解した。１００００×ｇで２０分間遠心分離した後、上清を氷上で６秒〜１０秒間隔で超音波処理し、ニッケル−ニトリロ三酢酸樹脂（Ｓｉｇｍａ）と室温で１時間インキュベートしてから、使い捨てのポリプロピレンカラム（Ｔｈｅｒｍｏ）にロードした。カラムを、ｐＨ７．３の５０ｍＭリン酸カリウムバッファー及び１２．５ｍＭイミダゾールを含むｐＨ７．３の５０ｍＭリン酸カリウムバッファーで洗浄した。タンパク質を、１２５ｍＭイミダゾールを含む５０ｍＭリン酸カリウムバッファー、ｐＨ７．３で溶出した。モノマーのＣｓｇＡを得るために、標的タンパク質を含む画分を組み合わせて、３０−ｋＤａの遠心フィルターユニット（Ｔｈｅｒｍｏ）にロードし、二量体及び他のオリゴマーを除去した。精製されたＣｓｇＡを事前に冷却した脱塩カラム（Ｚｅｂａ）に通して、イミダゾールを除去した。
【０２９３】
或いは、配列：Ｎ末端−ＱＹＧＧＮＮ−Ｃ末端からなるＣｓｇＡの合成ヘキサペプチドは、Ｂｉｏ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｃから商業的に入手可能である。
【０２９４】
実施例２８
別の選択肢は、Ｃｏｌｌｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．１７３（１５）に記載されているように、バイオフィルムから精製カーリー抽出物を調製することにより、事前に形成されたＣｓｇＡアミロイドシードを利用することである。野生型エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）を、コンゴレッド色素を添加した又は添加しないＹＥＳＣＡ培地で、室温で３日間〜７日間増殖させる。培養物を１０ｍＬ〜３０ｍＬの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８に掻き取る。細胞を超音波処理又は凍結融解により溶解する。細胞溶解物を０．１ｍｇのＲＮａｓｅ  Ａ、０．１ｍｇのＤＮａｓｅ  Ｉ及びＭｇＣｌ２を１ｍＭまで加えて処理し、３７℃で２０分間〜３０分間インキュベートする。リゾチームを１ｍｇ／ｍＬまで添加し、３７℃で２０分間〜４０分間更にインキュベートする。ＳＤＳを１％まで添加し、３７℃で２０分間〜４０分間インキュベートする。不溶性物質を１２０００×ｇで１５分間の遠心分離により収集する。サンプルを１ｍＬ〜１０ｍＬ  Ｔｒｉｓバッファーに再懸濁し、９０℃で１５分間煮沸し、上記のプロセスを繰り返す（ＲＮａｓｅ、ＤＮａｓｅ、リゾチーム、及びＳＤＳ処理による消化）。サンプルをＴｒｉｓバッファーで２回洗浄し、Ｌａｅｍｌｉバッファーに再懸濁し、煮沸して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（４％〜２０％）にロードする。サンプルを２０ｍＡで５時間電気泳動する。スタッキングゲルに残っている不溶性物質を集め、水で３回洗浄し、９５％エタノールで２回洗浄し、乾燥させる。サンプルを０．２ＭグリシンｐＨ１．５に再懸濁し、１０分間〜１５分間煮沸する。不溶性物質を１６ｋ×ｇで１０分間遠心分離することにより収集する。不溶性物質を水で５回洗浄し、ＰＢＳに再懸濁する。最後に、サンプルをＢＣＡにより又は２８０ｎｍの吸光度でタンパク質含有量を特定する前に、電極又は水浴で１時間超音波処理する。
【０２９５】
かかる変化は、凝集の動態、凝集を阻害するために必要な化合物の濃度、ＣｓｇＡ媒介シヌクレイン凝集を示すために必要な比率、又は上記の組み合わせを変更する可能性がある。
【０２９６】
実施例２９
実施例２７及び実施例２８のアッセイで使用されるタンパク質精製の他の反復では、ＣｓｇＡはヒスチジンタグなし又は代替タグ付きで産生され得て、細胞からの排泄を促進するための配列を含む場合がある。α−シヌクレインを、ヒスチジンタグ又は他のタグを含むように操作して、例えばニッケル等の固定化金属に対する親和性による精製を促進することができる。ＣｓｇＡ及びα−シヌクレインは、硫酸アンモニウムの濃度を上げながら、単一の工程若しくは複数の工程で硫酸アンモニウムの代替濃度による硫酸アンモニウム沈殿等の当業者によく知られている代替方法を使用して精製され得る；或いは、硫酸アンモニウム沈殿を省略してもよい。当業者によく知られているように、タンパク質親和性、陽イオン交換、陰イオン交換、疎水性相互作用、複数モード又は混合モードに基づいて他のタンパク質からＣｓｇＡ又はα−シヌクレインを分離する代替樹の脂又は材料を使用してもよい。タンパク質の分離は、バッチ精製、プレパックカラム、重力流、低圧、高圧、及び高圧液体クロマトグラフィーを使用して、当業者によく知られている方法を使用して実行でき、これらの方法は個別に又は組み合わせて使用され得る。ＣｓｇＡ又はα−シヌクレインは、サイズ排除クロマトグラフィー又は高圧液体クロマトグラフィー等の当業者によく知られている方法を使用して、サイズに基づいて他のタンパク質から分離され得る。ＣｓｇＡ及びα−シヌクレインを、アッセイ精製プロセスの全て又は一部の変性条件下で、代替濃度の塩酸グアニジニウムで、又は尿素等の当業者に知られている様々な濃度の代替変性剤で精製することができる。或いは、ＣｓｇＡ及びα−シヌクレインは、当業者によく知られている天然の条件下で精製され得る；天然の条件下又は非変性バッファーを使用する工程では、一般的にＣｓｇＡは迅速に精製され、精製プロセス中の凝集を回避する。Ｈｉｓタグ付きＣｓｇＡを、ｐＨの低下又はエチレンジアミン四酢酸等のキレート剤の添加等、当業者に知られている代替法を使用して、Ｎｉ−ＮＴＡ等の固定化金属親和性材料から溶出することができる。固定化ニッケルに対するタンパク質のヒスチジン残基の親和性に基づく固定化金属アフィニティクロマトグラフィーに加えて、又はその代わりに、当業者に知られているように、タンパク質中のヒスチジン、又はシステイン若しくはトリプトファン等の代替アミノ酸と相互作用する、固定化された銅、亜鉛、コバルト又はニッケル相互作用を含む材料等の代替の固定化金属アフィニティクロマトグラフィー又はバッチ精製法が使用され得る。当業者に知られているように、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースと共に、任意に、塩化ナトリウム、塩化カリウム又は他の塩、組成物の各種洗浄剤及び還元剤を含む、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（「Ｔｒｉｓ」）；４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（「ＨＥＰＥＳ」）；３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（「ＭＯＰＳ」）等の代替バッファー、及びＮｉ−ＮＴＡアガロースクロマトグラフィー又はバッチ精製に適合する濃度を使用してもよい。
【０２９７】
アッセイでは、代替濃度のジメチルスルホキシドを使用してもよく、１％を超えて著しく高い又は１％未満に減少したジメチルスルホキシドの濃度は、ＣｓｇＡ及びα−シヌクレインの凝集動態に影響を与える可能性がある。代替濃度のチオフラビンＴがアッセイに使用され、蛍光シグナル及びアッセイの感度に影響を与える可能性がある。ＣｓｇＡ及びα−シヌクレインの代替濃度が使用されてもよく、かかる変化は、アッセイにおけるα−シヌクレイン及びＣｓｇＡの凝集動態に影響を及ぼし得る。化合物の代替濃度をアッセイでテストし、用量反応を評価してもよい。ドデシル硫酸ナトリウム等の洗浄剤を含む、濃度に応じてα−シヌクレイン及びＣｓｇＡの凝集動態に影響を与える可能性のある追加の試薬をアッセイに追加してもよい。アッセイ中に交互の間隔で振盪を含んででもよく、ＣｓｇＡ及びα−シヌクレインの凝集動態に影響を与える可能性がある。２ｍｍのガラスビーズは、α−シヌクレインを含むアッセイから省略され得る、又はＣｓｇＡを含むアッセイに含まれ得る、又は他のサイズ若しくは組成のビーズが使用され得て、これらの変更はＣｓｇＡ及びα−シヌクレインの凝集動態に影響を与える可能性がある。Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ等の代替バッファー、及び代替バッファー濃度をアッセイで使用してもよく、ＣｓｇＡ及びα−シヌクレインの凝集動態に影響を与える可能性がある。４３８ｎＭで励起し、４９５ｎＭで発光し、１０ｎＭ等の十分に狭い帯域幅で蛍光を読み取ることができるプレートリーダーを使用してもよい。透明な底部を備えた黒いマイクロプレート等、代替のマイクロプレートをアッセイに使用してもよい。プレートは、ＴｈＴ蛍光を吸収しない代替のカバーで密封してもよく、又は読み取り前にカバーを外してもよい。蛍光を単一のエンドポイント又は様々な時間間隔で複数のポイントで読み取ることができ、蛍光が測定される時間間隔は一定であってもとく、又はアッセイの過程で変化してもよい。α−シヌクレイン及びＣｓｇＡ発現に対する化合物の効果を決定するため、チオフラビンＴ蛍光の遅滞期、蛍光シグナル、及び曲線の勾配を決定するための動態学的読み取りの過程でのチオフラビンＴシグナルの検査を含む、他の測定基準をしてもよい。
【０２９８】
実施例３０
α−シヌクレインの凝集に対する化合物の効果を評価するため、精製α−シヌクレイン及びチオフラビンＴを使用して無細胞アッセイを実施した。該アッセイでは、ヒトα−シヌクレインを、タグなしヒトα−シヌクレインに対する全長遺伝子が挿入されたｐＴ７又はｐＥＴ１１Ａに由来するプラスミドからＥ．コリＢＬ２１（ＤＥ３）で発現させた。細胞をＯＤ６００  ０．６で０．８ｍＭ  ＩＰＴＧと共に４時間インキュベートし、遠心分離によって回収し、培養物の１０分の１の体積に相当する溶解バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、及び１ｍＭ  ＰＭＳＦ）に懸濁し、２０分間煮沸して溶解させた。細胞片を遠心分離によりペレット化し、清澄化した溶解物を１３６μＬ／ｍＬの１０％硫酸ストレプトマイシンで処理し、続いて２２８μＬ／ｍＬの氷酢酸で処理し、溶解物を遠心分離し、上清を新しいチューブに移し、等量の飽和（１００％）硫酸アンモニウムを加えることでタンパク質を沈殿させ、揺動シェーカーで４℃にて１時間インキュベートした。タンパク質を遠心分離によりペレット化し、等量の冷却エタノール中１００ｍＭ酢酸アンモニウムで洗浄し、遠心分離によりペレット化し、冷却エタノールで２回洗浄し、一晩乾燥させ、５０ｍＭリン酸カリウムバッファーｐＨ７．３又は１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４に再懸濁し、５０ｋＤａカットオフカラムを通過させた。使用する直前に、精製したα−シヌクレインを０．２μｍのナイロンフィルターで濾過した。アッセイを、各ウェルに１ｍｍ〜２ｍｍのガラスビーズ、２０μＭ〜４０μＭのチオフラビンＴ、１％ＤＭＳＯ、５０μＭのα−シヌクレイン及び２０μＭ〜５０μＭの化合物を含む９６ウェル黒色マイクロプレートにおいて実施した。プレートをシーリングテープ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ２３２７０１）で密封し、Ｔｅｃａｎ  Ｎａｎｏ  Ｆ２００プレートリーダーで３７℃にて、８ｎｍの帯域幅で４３９ｎｍフィルターを使用して４３８ｎｍで励起し、１０ｎｍの帯域幅で４９０ｎｍフィルターを用いて４９５ｎｍで発光させた。アッセイ中、プレートを連続的に振盪するか、又は１８分ごとに９９９秒間振盪した。読み取りを最長７２時間行った。読み取りを１時間ごとに７３時間まで行った。アッセイにおけるα−シヌクレイン凝集に対する化合物の効果を、３６時間からのデータにより決定した。α−シヌクレインを含む各化合物の蛍光値は、α−シヌクレインの不在下で化合物の平均蛍光を差し引くことによって最初に調整した。これらの調整値は、α−シヌクレインを含む非化合物（すなわち、未処理）対照ウェルの平均蛍光でそれらを割り算することによって正規化され、化合物による平均正規化蛍光は、未処理の対照で観察される平均蛍光の割合として表された。化合物によるα−シヌクレイン凝集のパーセント阻害を、１００％から２４時間での化合物のパーセント平均蛍光を差し引くことにより決定した。結果を表４に示す。より高い正のパーセント阻害は、α−シヌクレイン凝集のより大きな阻害を反映し、負のパーセント阻害は、α−シヌクレイン凝集の増強を反映する。
【０２９９】
実施例３２
ＣｓｇＡ凝集に対する化合物の効果を判定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏチオフラビンＴアッセイ。Ｅ．コリＣｓｇＡの凝集に対する化合物の効果を評価するため、精製ＣｓｇＡ及びチオフラビンＴを使用して無細胞アッセイを行った。アッセイでは、Ｃ末端に６ヒスチジン残基の配列が付加され、Ｓｅｃシグナル（アミノ酸１〜２２）配列がないｃｓｇＡを含むｐＥＴ１１ｄベクターを保有するＥ．コリＮＥＢ３０１６ｓｌｙＤ：：ｋａｎ細胞においてヒスチジンタグ付きＣｓｇＡを過剰発現させた。ＣｓｇＡの過剰発現を誘導するため、６００ｎｍ（ＯＤ６００）の光学密度が０．８〜１の培養物に０．５ｍＭイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（「ＩＰＴＧ」）を添加し、誘導細胞を遠心分離により収集する前に３７℃で１時間培養した。細胞を変性条件下で、室温又は４℃で一晩、揺動プラットフォーム上で１時間〜２時間、５０ｍＭリン酸カリウムバッファーｐＨ７．３中の８Ｍ塩酸グアニジンで溶解し、ＣｓｇＡを、ニッケル−ＮＴＡアガロースと、使い捨てポリプロピレンカラムを通る低圧及び重力フローとの組み合わせによるバッチ精製による固定化金属アフィニティクロマトグラフィーにより精製し、これは５０ｍＭリン酸カリウムバッファーｐＨ７．３、その後５０ｍＭリン酸カリウムバッファーｐＨ７．３中の１２．５ｍＭイミダゾールを用いてカラムにシリンジプランジャーを適用することにより手動で行われる低圧洗浄、及び５０ｍＭリン酸カリウムバッファーｐＨ７．３中の１２５ｍＭイミダゾールを用いる重力フローによる溶出を含む。イミダゾールを含むバッファーを、タンパク質精製の前に新たに調製した。精製されたＣｓｇＡを３０ｋＤａの分子量カットオフフィルターと脱塩カラムに通過させた。塩酸グアニジンの不在下でのＣｓｇＡ精製の全ての工程は、可能な限りわずかな遅延で迅速に連続して実施された。ＣｓｇＡをＢＣＡアッセイにより定量化した。アッセイを、２０μＭ〜４０μＭチオフラビンＴ、５０ｍＭリン酸カリウムバッファーｐＨ７．３、１％ＤＭＳＯ、６μＭ〜２０μＭ  ＣｓｇＡ、及び２０μＭ化合物を含む９６ウェル黒色マイクロプレートで行った。プレートをＴｅｃａｎ  Ｎａｎｏ  Ｆ２００プレートリーダーにより２５℃でインキュベートし、８ｎｍの帯域幅で４３９ｎｍフィルターを使用して４３８ｎｍで励起し、１０ｎｍの帯域幅で４９０ｎｍフィルターを用いて４９５ｎｍで発光させるか、又はＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５又はＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）ｉ３Ｘで、４３８ｎｍで励起し及び４９５ｎｍで発光させた。アッセイ中、プレートを最初に５秒間振盪し、その後蛍光測定の前に３秒間振盪した。読み取りを２０分ごとに２４時間まで行った。アッセイにおけるＣｓｇＡ凝集に対する化合物の効果を、６時間〜９時間からのデータにより決定した。ＣｓｇＡを含む各化合物の蛍光値は、ＣｓｇＡの不在下で化合物の平均蛍光を差し引くことによって最初に調整した。これらの調整値は、ＣｓｇＡを含む非化合物（すなわち、未処理）対照ウェルの平均蛍光でそれらを割り算することにより正規化された。化合物を用いた６時間〜６．５時間又は８〜９時間の正規化蛍光の中央値は、同じ期間にわたって未処理の対照で観察された蛍光��央値の割合として表された。化合物によるＣｓｇＡ凝集の阻害パーセントを、１００％の化合物で平均蛍光パーセントを差し引くことにより決定した。結果を表４に示す。より高い正のパーセント阻害はＣｓｇＡ凝集のより大きな阻害を反映し、負のパーセント阻害はＣｓｇＡ凝集の増強を反映する。
【０３００】
ＣｓｇＡシードα−シヌクレイン凝集に対する化合物の効果を決定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏチオフラビンＴアッセイＥ．コリＣｓｇＡによりシードされるα−シヌクレインの凝集に対する化合物の効果を評価するため、精製α−シヌクレイン、精製ＣｓｇＡ及びチオフラビンＴを使用して無細胞アッセイを行った。アッセイでは、Ｃ末端に６ヒスチジン残基の配列が付加され、Ｓｅｃシグナル（アミノ酸１〜２２）配列がないｃｓｇＡを含むｐＥＴ１１ｄベクターを保有するＥ．コリＮＥＢ  ３０１６ｓｌｙＤ：：ｋａｎ細胞においてヒスチジンタグ付きＣｓｇＡを過剰発現させた。ＣｓｇＡの過剰発現を誘導するため、６００ｎｍ（ＯＤ６００）の光学密度が０．８〜１の培養物に０．５ｍＭ  ＩＰＴＧを添加し、誘導細胞を遠心分離により収集する前に３７℃で１時間培養した。細胞を変性条件下で、室温又は４℃で一晩、揺動プラットフォーム上で１時間〜２時間、５０ｍＭリン酸カリウムバッファーｐＨ７．３中の８Ｍ塩酸グアニジンで溶解し、ＣｓｇＡを、ニッケル−ＮＴＡアガロースと、使い捨てポリプロピレンカラムを通る低圧及び重力フローとの組み合わせによるバッチ精製による固定化金属アフィニティクロマトグラフィーにより精製し、これは５０ｍＭリン酸カリウムバッファーｐＨ７．３、その後５０ｍＭリン酸カリウムバッファーｐＨ７．３中の１２．５ｍＭイミダゾールを用いてカラムにシリンジプランジャーを適用することにより手動で行われる低圧洗浄、及び５０ｍＭリン酸カリウムバッファーｐＨ７．３中の１２５ｍＭイミダゾールによる溶出を含む。イミダゾールを含むバッファーを、タンパク質精製の前に新たに調製した。精製されたＣｓｇＡを３０ｋＤａの分子量カットオフフィルターと脱塩カラムに通した。塩酸グアニジンの不在下でのＣｓｇＡ精製の全ての工程は、可能な限りわずかな遅延で迅速に連続して実施された。ＣｓｇＡを、ＢＣＡアッセイ又はナノドロップ分光光度計による２８０ｎｍの吸光度を使用して定量化した。ヒトα−シヌクレインは、タグなしのヒトα−シヌクレインの全長遺伝子が挿入されたｐＴ７又はｐＥＴ１１ａに由来するプラスミドからＥ．コリＢＬ２１（ＤＥ３）で発現された。細胞をＯＤ６００  ０．６で０．８ｍＭ  ＩＰＴＧで４時間誘導した。２０分間煮沸することにより細胞を溶解し、遠心分離により細胞片をペレット化し、透明な溶解物を１３６μＬ／ｍＬの１０％硫酸ストレプトマイシン及び２２８μＬ／ｍＬの氷酢酸で処理し、溶解物を遠心分離し、上清を新しいチューブに移し、等量の飽和（１００％）硫酸アンモニウムの添加によりタンパク質を沈殿させた。硫酸アンモニウムペレットを等量のエタノール中１００ｍＭ酢酸アンモニウムで洗浄し、遠心分離によりペレット化し、エタノールで２回洗浄し、一晩乾燥させ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４に再懸濁し、５０ｋＤａカットオフカラムに通した。使用する直前に、精製したα−シヌクレインを０．２μＭのナイロンフィルターで濾過した。１ウェル当たり１ｍｍ〜２ｍｍのガラスビーズ、２０μＭ〜４０μＭ  ＴｈｉｏｆｌａｖｉｎＴ、１％ＤＭＳＯ、２μＭ  ＣｓｇＡ、５０μＭ〜６０μＭ  α−シヌクレイン、１００ｍＭ塩化ナトリウム、９．３ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．３、及���５０μＭ化合物を含む９６ウェル黒色マイクロプレートでアッセイを行った。化合物を３回試験した。プレートをシーリングテープ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ２３２７０１）で密封し、Ｔｅｃａｎ  Ｎａｎｏ  Ｆ２００プレートリーダーにより３７℃で連続振盪しながらインキュベートし、８ｎｍの帯域幅で４３９ｎｍフィルターを使用して４３８ｎｍで励起し、１０ｎｍの帯域幅で４９０ｎｍフィルターを用いて４９５ｎｍで発光するか、又はＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５又はＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）ｉ３Ｘで、４３８ｎｍで励起及び４９５ｎｍで発光し、読み取りを１時間ごとに７３時間まで行った。アッセイにおけるＣｓｇＡシードα−シヌクレイン凝集に対する化合物の効果を１７時間、１８時間又は５０時間〜５２時間のデータで判断した。ＣｓｇＡ及びα−シヌクレインを含む各化合物の蛍光値を、ＣｓｇＡ及びα−シヌクレインの不在下での化合物の平均蛍光を差し引くことによって最初に調整した。これらの調整値は、ＣｓｇＡ及びα−シヌクレインを含む化合物なし（すなわち、未処理）の対照ウェルの平均蛍光で割ることによって正規化され、１７時間、１８時間、又は５０時間〜５２時間での化合物による平均又は中央値の正規化蛍光を、同じ時間点の未処理の対照で観察された平均又は中央値の蛍光のパーセンテージとして表した。化合物によるＣｓｇＡシードα−シヌクレイン凝集のパーセント阻害を、１００％からの化合物のパーセント平均蛍光又は中央値蛍光を差し引くことにより決定した。結果を表４に示す。より高い正のパーセント阻害は、ＣｓｇＡシードα−シヌクレイン凝集のより大きな阻害を反映し、一方、負のパーセント阻害は、ＣｓｇＡシードα−シヌクレイン凝集の増強を反映する。
【０３０１】
【表４】
2020529432.tif 000026
2020529432.tif 000027
2020529432.tif 000028
【０３０２】
提示されている化合物の活性範囲は、次のように定義されている：（−−）−１０％未満の阻害；（−）−１０％〜１０％の阻害；（＋）１０％〜３０％の阻害；（＋＋）３０％〜６０％の阻害；及び（＋＋＋）は６０％超の阻害である。
【０３０３】
凝集に対する化合物の影響のチオフラビンＴアッセイの結果。化合物の活性範囲を、表４の下に定義する。試験した化合物は、α−シヌクレイン、ＣｓｇＡシードα−シヌクレイン、及びＣｓｇＡの凝集のチオフラビンＴアッセイにおいて様々な効果を示した。表４の化合物は、様々な活性を示した。表４に記載される様々なタイプの凝集の阻害は、本発明の化合物（例えば、表４に示される化合物）がα−シヌクレイン凝集、ＣｓｇＡ又はその他の微生物アミロイドによるα−シヌクレイン凝集のシーディング、及びα−シヌクレイン凝集をｉｎ  ｖｉｖｏでシードする可能性のある微生物アミロイドの形成の防止に有用となり得ることを示唆し、これらの化合物は、パーキンソン病及び他のα−シヌクレイノパチーの予防又は治療に有用となる可能性がある。これらの化合物の経口投与により、アミロイドを産生する微生物が豊富な腸管内で比較的高い濃度を達成することができ、化合物はα−シヌクレイン凝集のシーディングを阻害する可能性がある。これらの化合物によるα−シヌクレインの凝集の阻害は、独立して有益であるか、又は微生物アミロイドをシードとするα−シヌクレイン凝集の阻害と相乗的であり得る。腸管神経系から中枢神経系へのα−シヌクレインのプリオン様伝播のブラークの仮説に沿って（例えば、Ｒｉｅｔｄｉｊｋ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ  Ｂｒａａｋ’ｓ  Ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ”，Ｆｒｏｎｔ．Ｎｅｕｒｏｌ．，１３  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２０１７を参照されたい）、これらの抑制効果は、腸神経系及び中枢神経系の両方でα−シヌクレイン凝集体の伝播を防ぐのに有益である可能性がある；さらに、経口投与された化合物が微生物アミロイドによるα−シヌクレイン凝集の連続的なシーディング又はα−シヌクレイン凝集体の独立した形成を緩和する場合、被験体がα−シヌクレイン凝集体を除去できるプロセスは、より大きな正味効果を有する可能性があり（すなわち、形成された凝集物と歩調を合わせることができる）、それによって、上記化合物はパーキンソン病及び他の微生物アミロイドをシードとするα−シヌクレイノパチーの予防又は治療に効果的である。理論に制限されることなく、経口投与は消化管に特定の利益をもたらす可能性があり、それが損なわれている患者の胃腸機能を潜在的に回復する、又はα−シヌクレイノパチーの患者若しくはα−シヌクレイノパチーを発症するリスクのある被験体において、胃腸機能の更なる損失を予防若しくは遅延させ、及び／又は、例えば、嚥下障害、腸管運動性の低下、胃不全麻痺、便秘（慢性便秘及び慢性特発性便秘を含む）、小腸内細菌異常増殖（ＳＩＢＯ）、下痢、腹痛及び／又は腹痛発作、腹部膨満、鼓腸、吐き気、又は過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎、クローン病、腸管透過性亢進、又はそれらの組み合わせのその他の症状の１又は複数の症状を改善する可能性がある。
【０３０４】
表４に示すように、幾つかの化合物はアッセイで１種類又は２種類の凝集のみの抑制を示したが、他の化合物は１種類以上の凝集を不活性又は増強したように見え、幾つかの化合物はアッセイで３種類の凝集を抑制した。
【０３０５】
実施例３３
腸内分泌細胞（ＳＴＣ１細胞株細胞）を、大腸菌Ｋ１２又はΔｃｓｇＢＡＣ、カーリー欠損株で、ＭＯＩ  １０：１で４時間処理した。細胞を溶解し、タンパク質サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ、並びにローディング対照としてのアルファシヌクレイン（ＡＳｙｎ）及びアクチンのウエスタンブロットによって評価した。ウエスタンブロットを図９に示す。これらの結果は、ＣｓｇＡが腸管内のＡＳｙｎ凝集、例えば腸内分泌細胞に影響することを示している。
【０３０６】
本明細書における実質的に任意の複数及び／又は単数の用語の使用に関して、当業者は、文脈及び／又は用途に適切なように、複数から単数へ、及び／又は単数から複数へと翻訳することができる。本明細書では、明確にするために、様々な単数／複数の順列を明示的に指定することができる。
【０３０７】
実施例３４
２−（３，５−ジヒドロキシベンズアミド）−Ｎ−（３，４，５−トリヒドロキシフェニル）−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボキサミドの調製。（化合物３）
【化１５】
2020529432.tif 000029
【０３０８】
工程１：エチル２−（３，５−ジメトキシベンズアミド）−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボキシレートの合成。
【化１６】
2020529432.tif 000030
【０３０９】
２−アミノ−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボン酸エチル（１．０ｇ、４．４ｍｍｏｌ）をトルエンに溶解し、塩化３，５−トリメトキシベンゾイル（０．８９ｇ、４．４ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を３０分間撹拌し、１１０℃で３時間加熱した。反応混合物を０℃に冷却した。固体を濾過により収集し、冷トルエン（２×１０ｍＬ）で洗浄して、２−（３，５−ジメトキシベンズアミド）−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボン酸エチルを灰白色固体（１．５ｇ、８６．８％）として得た。分取高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法Ｈ：Ｓｈｉｍａｚｕ  ＬＣ−２０ＡＰ、カラムＸ−Ｂｒｉｄｇｅ  Ｃ１８（２５０×１９）ｍｍ、５ミクロン、流速１５．０ｍＬ／分、移動相Ａ：水中の５ｍＭ酢酸アンモニウム、Ｂ：１００％アセトニトリル。液体クロマトグラフィー質量スペクトル（ＬＣＭＳ）：９９．６７％（ＲＴ：２．４１２，２５８ｎｍ）（ＭＳ：ＥＳＩ＋ｖｅ３９０．５［Ｍ＋Ｈ］）．
【０３１０】
工程２：２−（３，５−ジメトキシベンズアミド）−Ｎ−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボキサミドの合成。（化合物３）
【化１７】
2020529432.tif 000031
【０３１１】
エチル２−（３，５−ジメトキシベンズアミド）−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボキシレート（０．２０ｇ、０．５１３ｍｍｏｌ）をトルエン（８．０ｍＬ）に溶解し、反応混合物を０℃及びトルエン中のトリメチルアルミニウムの２Ｍ溶液（０．４８７ｍＬ、０．９７５ｍｍｏｌ）を加えた。３０分後、３，４，５−トリメトキシアニリン（０．１１２ｇ、０．６１６ｍｍｏｌ）を加え、混合物を１１０℃で４時間加熱した。室温に冷却した後、反応を氷水（３０ｍＬ）で停止し、ジクロロメタン（３×３０ｍＬ）で抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮した。粗残渣をメタノール（１０ｍＬ）と共に摩砕して、２−（３，５−ジメトキシベンズアミド）−Ｎ−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボキサミド（化合物３）（７９ｍｇ、収率２９％）を灰白色固体として得た。ＬＣＭＳ：１００％（ＲＴ：２．２８６，２５４ｎｍ）（ＭＳ：ＥＳＩ＋ｖｅ５２６．８３［Ｍ＋Ｈ］）。１Ｈ  ＮＭＲ：（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：１．９７０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝２６．５），２．８１１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝２４．３）２．９３９（ｔ，２Ｈ  Ｊ＝２４．３）３．９０１（ｓ，９Ｈ），３．９４２（ｓ，６Ｈ），６．６８３（ｓ，１Ｈ），６．８８８（ｓ，２Ｈ）７．６１７（ｓ，１Ｈ），１２．９４９（ｓ，１Ｈ）．
【０３１２】
実施例３５
ｎ−フェニル−２−（３，４，５−トリメトキシベンズアミド）−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボキサミドの調製（化合物９）
【化１８】
2020529432.tif 000032
【０３１３】
工程１：エチル２−（３，４，５−トリメトキシベンズアミド）−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボキシレートの合成。
【化１９】
2020529432.tif 000033
【０３１４】
トルエン中のエチル２−アミノ−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボキシレート（１０ｇ、０．０４４ｍｏｌ）と塩化３，４，５−トリメトキシベンゾイル（１０．２３ｇ、０．０４４３ｍｏｌ）の混合物を３０分間撹拌した後、１１０℃で３時間加熱した。反応混合物を０℃に冷却した。得られた固体を濾過により収集し、冷トルエン（２×５０ｍＬ）で洗浄して、エチル２−（３，４，５−トリメトキシベンズアミド）−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボキシレートを灰白色の固体として得た（１０．５ｇ、収率５６．４％）。ＬＣＭＳ：９４．２６％（ＲＴ：２．３４５，２６５ｎｍ）（ＭＳ：ＥＳＩ＋ｖｅ４２０．５２［Ｍ＋Ｈ］）．
【０３１５】
工程２：ｎ−フェニル−２−（３，４，５−トリメトキシベンズアミド）−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボキサミドの合成（化合物９）
【化２０】
2020529432.tif 000034
【０３１６】
２−（３，４，５−トリメトキシベンズアミド）−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボン酸エチル（０．３ｇ、０．７１５ｍｍｏｌ）をトルエン（１０ｍＬ）に溶解した。反応混合物を０℃に冷却し、トルエン中のトリメチルアルミニウムの２Ｍ溶液（０．７ｍＬ、１．４ｍｍｏｌ）を滴下し、撹拌を３０分間続けた。アニリン（０．０８６ｇ、０．８８ｍｍｏｌ）を加え、混合物を１１０℃で４時間加熱した。室温まで冷却した後、反応混合物を氷水（４０ｍＬ）でクエンチし、酢酸エチル（３×３５ｍＬ）で抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮した。粗残渣をメタノール（１０ｍＬ）と共に摩砕し、逆相分取ＨＰＬＣで更に精製して、ｎ−フェニル−２−（３，４，５−トリメトキシベンズアミド）−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボキサミド（化合物９）（１７ｍｇ、収率５．１％）を得た。分取ＨＰＬＣ法Ｂ。ＬＣＭＳ：９８．４９％（ＲＴ：２．１６９，３４０．０ｎｍ）（ＭＳ：ＥＳＩ＋ｖｅ４６７．２［Ｍ＋Ｈ］）．１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：１．７９６（ｍ，４Ｈ）２．６８８（ｔ，４Ｈ，Ｊ＝２２．４２），３．７０９（ｓ，３Ｈ）３．９２４（ｓ，６Ｈ）７．０７３（ｓ，１Ｈ），７．１５７（ｓ，２Ｈ），７．３４１−７．３０３（ｔ，２Ｈ），７．７４１−７．７２１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８），９．８７１（ｓ，１Ｈ），１１．２７３（ｓ，１Ｈ）．
【０３１７】
実施例３６
ｎ−メチル−２−（３，４，５−トリメトキシベンズアミド）−Ｎ−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボキサミド（化合物７）
【化２１】
2020529432.tif 000035
【０３１８】
Ｎ−フェニル−２−（３，４，５−トリメトキシベンズアミド）−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボキサミド（化合物９）について記載した方法と同様の方法により、エチル２−（３，４，５−トリメトキシベンズアミド）−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボキシレート（３００ｍｇ、０．７１５ｍｍｏｌ）及び３，４，５−トリメトキシ−Ｎ−メチルアニリン（１６９ｍｇ、０．８５８ｍｍｏｌ）から調製して、Ｎ−メチル−２−（３，４，５−トリメトキシベンズアミド）−Ｎ−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボキサミド（化合物７）を灰白色固体として得た（３１ｍｇ、収率７．６０％）。分取ＨＰＬＣ法Ｃ。ＬＣＭＳ：１００％（ＲＴ：１．７２０，２５４．０ｎｍ）（ＭＳ：ＥＳＩ＋ｖｅ５７１．４［Ｍ＋Ｈ］）．１Ｈ  ＮＭＲ：（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：１．７２８（ｍ，４Ｈ），２．５１６−２．６８４（ｔ，４Ｈ，Ｊ＝３３．４），３．３５５（ｓ，９Ｈ）３．５４８（ｓ，３Ｈ）３．７３９（ｓ，３Ｈ）３．８７９（ｓ，６Ｈ），６．１３４（ｓ，２Ｈ），７．２９８（ｓ，２Ｈ），１０．５１１（ｓ，１Ｈ）．
【０３１９】
実施例３７
ｎ−（３，５−ジメトキシフェニル）−２−（３，４，５−トリメトキシベンズアミド）−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボキサミド（化合物５）の調製
【化２２】
2020529432.tif 000036
【０３２０】
Ｎ−フェニル−２−（３，４，５−トリメトキシベンズアミド）−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボキサミド（化合物９）について記載した方法と同様の方法により、２−（３，４，５−トリメトキシベンズアミド）−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボン酸エチル（０．２０ｇ、０．４７６ｍｍｏｌ）及び３，５−ジメトキシアニリン（０．１１２ｇ、０．５７２ｍｍｏｌ）から調製して、Ｎ−（３，５−ジメトキシフェニル）−２−（３，４，５−トリメトキシベンズアミド）−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボキサミド（化合物５）を灰白色固体として得た（１２８ｍｇ、収率５１％）。ＬＣＭＳ：１００％（ＲＴ：２．２２３，２２５ｎｍ）（ＭＳ：ＥＳＩ−ｖｅ５２５．５［Ｍ−Ｈ］）．１Ｈ  ＮＭＲ：（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：１．９６３（ｍ，４Ｈ），２．８０６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝２４．６），２．９３２（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝２４．６），３．８５４（ｓ，６Ｈ），３．９３８（ｓ，３Ｈ），３．９７８（ｓ，６Ｈ）６．３４１−６．３３６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．０），６．８７９−６．８７３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．４），７．３３３−７．３０４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．９），７．６９８（ｓ，１Ｈ），１３．１０２（ｓ，１Ｈ）．
【０３２１】
２−（３，４，５−トリメトキシベンズアミド）−Ｎ−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボキサミド（化合物１）の調製
【化２３】
2020529432.tif 000037
【０３２２】
Ｎ−フェニル−２−（３，４，５−トリメトキシベンズアミド）−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボキサミド（化合物９）について記載した方法と同様の方法により、２−（３，４，５−トリメトキシベンズアミド）−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボン酸エチル（０．２ｇ、０．４７７ｍｍｏｌ）及び３，４，５−トリメトキシアニリン（０．１０４ｇ、０．５７２ｍｍｏｌ）から調製して、２−（３，４，５−トリメトキシベンズアミド）−Ｎ−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボキサミド（化合物１）を得た（５１ｍｇ、１９．２２％）。ＬＣＭＳ：９８．９９％（ＲＴ：２．０５６，２７５．０ｎｍ）（ＭＳ：ＥＳＩ＋ｖｅ５５７．６［Ｍ＋Ｈ］）．１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：１．８０６（ｍ，４Ｈ）２．６９８（ｔ，４Ｈ  Ｊ＝２３．４２）３．６４２（ｓ，３Ｈ）３．７３６（ｓ，１５Ｈ）７．１６１（ｓ，２Ｈ）７．２０７（ｓ，２Ｈ）９．７１３（ｓ，１Ｈ）１１．３７２（ｓ，１Ｈ）
【０３２３】
実施例３９
２−（３，４，５−トリメトキシベンズアミド）−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボキサミド（化合物１２）の調製
【化２４】
2020529432.tif 000038
【０３２４】
ｎ−フェニル−２−（３，４，５−トリメトキシベンズアミド）−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボキサミド（化合物９）について記載した方法と同様の方法により、エチル２−（３，４，５−トリメトキシベンズアミド）−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３カルボキシレート（１００ｍｇ、０．２３８ｍｍｏｌ）及び炭酸アンモニウム（４５ｍｇ、０．３６４ｍｍｏｌ）から調製して、２−（３，４，５−トリメトキシベンズアミド）−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボキサミド（化合物１２）を灰白色の固体として得た（４０ｍｇ、収率４２．９７％）。ＬＣＭＳ：１００．０％（ＲＴ：１．６９２，２２２ｎｍ）（ＭＳ：ＥＳＩ＋ｖｅ３９１．５０［Ｍ＋Ｈ］）．１Ｈ  ＮＭＲ：（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）１．７６７（ｓ，４Ｈ），２．６７５−２．７６４（ｍ，４Ｈ），３．７６４（ｓ，３Ｈ），３．８８５（ｓ，６Ｈ），７．１９９（ｓ，２Ｈ），７．８２９（ｓ，２Ｈ）１３．１５５（ｓ，１Ｈ）
【０３２５】
実施例４０
２−ベンズアミド−Ｎ−フェニル−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボキサミド（化合物１０）の調製
【化２５】
2020529432.tif 000039
【０３２６】
工程１：エチル２−ベンズアミド−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボキシレートの合成
【化２６】
2020529432.tif 000040
【０３２７】
ピリジン（１．２５ｍＬ）及び安息香酸（５４２ｍｇ、４．４３８ｍｍｏｌ）を、０℃のジクロロメタン（１０ｍＬ）中エチル２−アミノ−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボキシレート（５００ｍｇ、２．２１９ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。１０分後、オキシ塩化リン（Ｖ）（１．２５ｍＬ）を加えた。混合物を室温までゆっくり温め、撹拌を１６時間続けた。氷水（５０ｍＬ）を加え、粗混合物をジクロロメタン（３×５０ｍＬ）で抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮した。粗残渣を、酢酸エチル：ヘキサンで溶出するカラムクロマトグラフィーにより精製して、２−ベンズアミド−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボン酸エチルを灰白色の固体として得た（２００ｍｇ、収率２７．４％）。ＬＣＭＳ：５７．８５％（ＲＴ：２．４２７，２３０．０ｎｍ）（ＭＳ：ＥＳＩ＋ｖｅ３３０．０８［Ｍ＋Ｈ］）
【０３２８】
工程２：２−ベンズアミド−Ｎ−フェニル−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボキサミドの合成。（化合物１０）
【化２７】
2020529432.tif 000041
【０３２９】
２−ベンズアミド−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボン酸エチル（１００ｍｇ、０．３０３ｍｍｏｌ）をトルエン（３．０ｍＬ）に溶解し、反応混合物を０℃に冷却し、トリメチルアルミニウムのトルエンの２Ｍ溶液（０．３ｍＬ）を滴下し、撹拌を３０分間続けた。アニリン（３３ｍｇ、０．３６４ｍｍｏｌ）を加え、混合物を１１０℃で４時間加熱した。室温に冷却した後、反応混合物を氷水（３０ｍＬ）でクエンチし、ジクロロメタン（３×３０ｍＬ）で抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮した。粗残渣を、酢酸エチル：ヘキサンで溶出するカラムクロマトグラフィーにより精製し、次いで逆相分取ＨＰＬＣにより更に精製して、２−ベンズアミド−Ｎ−フェニル−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボキサミド（化合物１０）を灰白色の固体として得た（７ｍｇ、収率６．１％）。ＬＣＭＳ：１００％（ＲＴ：２．２１２，２０２．０ｎｍ）（ＭＳ：ＥＳＩ＋ｖｅ３７７．１［Ｍ＋Ｈ］）．１Ｈ  ＮＭＲ：（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：１．８００（ｍ，４Ｈ），２．６８２−２．８８７（ｔ，４Ｈ），７．１０（ｓ，１Ｈ），７．３３２−７．３６８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．２），７．５５８（ｍ，３Ｈ），７．７０２−７．７２２（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８），７．９０１（ｓ，２Ｈ），９．６８９（ｓ，１Ｈ），１１．６２７（ｓ，１Ｈ）．
【０３３０】
実施例４１
２−ベンズアミド−Ｎ−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボキサミド（化合物１１）の調製
【化２８】
2020529432.tif 000042
【０３３１】
ｎ−フェニル−２−（３，４，５−トリメトキシベンズアミド）−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボキサミド（化合物９）について記載した方法と同様の方法により、エチル２−ベンズアミド−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボキシレート（１００ｍｇ、０．３０３ｍｍｏｌ及び３，４，５−トリメトキシアニリン（６７ｍｇ、０．３６４ｍｍｏｌ）から調製して、２−ベンズアミド−Ｎ−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボキサミド（化合物１１）を灰白色の固体として得た（２５ｍｇ、収率１７．７％）。分取ＨＰＬＣ法Ｄ。ＬＣＭＳ：９７．９７％（ＲＴ：２．０８２，２０２．０ｎｍ）（ＭＳ：ＥＳＩ＋ｖｅ４６７．２［Ｍ＋Ｈ］）．１Ｈ  ＮＭＲ：（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：１．７６７（ｍ，４Ｈ），２．７１１−２．７４３（ｔ，４Ｈ），３．６４９（ｓ，３Ｈ），３．７６４（ｓ，６Ｈ），７．１２４（ｓ，２Ｈ），７．５８６（ｍ，３Ｈ），７．８９９−７．９１７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２），９．６３５（ｓ，１Ｈ），１１．４９９（ｓ，１Ｈ）．
【０３３２】
実施例４２
２−（３，４，５−トリメトキシ−Ｎ−メチルベンズアミド）−Ｎ−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボキサミドの調製。（化合物１３）
【化２９】
2020529432.tif 000043
【０３３３】
工程１：エチル２−（メチルアミノ）−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボキシレートの合成
【化３０】
2020529432.tif 000044
【０３３４】
ジメチルホルムアミド（３０ｍＬ）中のエチル２−アミノ−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボキシレート（５ｇ、２２．１９ｍｍｏｌ）及びＫ２ＣＯ３（４．６ｇ、３３．２８ｍｍｏｌ）の懸濁液を０℃で３０分撹拌した。ヨウ化メチル（１．５３ｍＬ、２４．４０ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温まで温め、１６時間撹拌した。反応混合物を水（２００ｍＬ）でクエンチし、酢酸エチル（３×１００ｍＬ）で抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で濃縮した。粗残渣を、酢酸エチル：ヘキサンで溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、２−（メチルアミノ）−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボン酸エチルを茶色の固体として得た（１．２ｇ、収率２２．６％）。ＬＣＭＳ：８８．１２％，（ＲＴ：２．１３９）（ＭＳ：ＥＳＩ＋ｖｅ２４０．２［Ｍ＋Ｈ］）．１Ｈ  ＮＭＲ：（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：１．２４（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝０．４），１．６８（ｓ，４Ｈ），２．６３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝６），２．８６（ｓ，３Ｈ，），４．１２−４．１９（ｍ，２Ｈ），７．６３（ｓ，１Ｈ）．
【０３３５】
工程２：エチル２−（３，４，５−トリメトキシ−Ｎ−メチルベンズアミド）−４，５，６，７テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボキシレートの合成。
【化３１】
2020529432.tif 000045
【０３３６】
ベンゼン（２０ｍＬ）中エチル２−（メチルアミノ）−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボキシレート（１．０ｇ、４．１８ｍｍｏｌ）と３，４，５−トリメトキシベンゾイルクロリド（１．９３ｇ、８．３６ｍｍｏｌ）の混合物を９０℃で３時間加熱した。反応混合物を水（２００ｍＬ）でクエンチし、酢酸エチル（２×１００ｍＬ）で抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で濃縮した。粗残渣を酢酸エチル／ヘキサンで溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、エチル２−（３，４，５−トリメトキシ−Ｎ−メチルベンズアミド）−４，５，６，７テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボキシレートを黄色の固体として得た（１．１ｇ、収率６０．７％）。ＬＣＭＳ：８０．５２％（ＲＴ：１．８８５）（ＭＳ：ＥＳＩ＋ｖｅ４３４．４［Ｍ＋Ｈ］）．
【０３３７】
工程３：２−（３，４，５−トリメトキシ−Ｎ−メチルベンズアミド）−Ｎ−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボキサミド。（化合物１３）
【化３２】
2020529432.tif 000046
【０３３８】
トルエン中のトリメチルアルミニウムの２Ｍ溶液（２ｍＬ、４．０ｍｍｏｌ）を、０℃のトルエン（５ｍＬ）中のエチル２−（３，４，５−トリメトキシ−Ｎ−メチルベンズアミド）−４，５，６，７テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボキシレート（０．５ｇ、１．１５ｍｍｏｌ）の溶液に滴下した。反応混合物を３０分間撹拌した。３，４，５−トリメトキシアニリン（０．３１７ｇ、１．７３ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を１１０℃で１６時間加熱した。反応混合物を氷水（２５ｍＬ）でクエンチし、酢酸エチル（２×２５ｍＬ）で抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で濃縮した。粗残渣を分取ＨＰＬＣにより精製して、２−（３，４，５−トリメトキシ−Ｎ−メチルベンズアミド）−Ｎ−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボキサミド（化合物１３）を灰白色の固体として得た（０．０５ｇ、収率７．８％）。分取ＨＰＬＣ法Ｃ。ＬＣＭＳ：１００％，（ＲＴ：１．７３８）（ＭＳ：ＥＳＩ＋ｖｅ５７１．５［Ｍ＋Ｈ］）．１Ｈ  ＮＭＲ：（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：１．７５（ｓ，５Ｈ），２．６４（ｓ，３Ｈ），３．１８（ｓ，３Ｈ），３．４５（ｓ，６Ｈ，），３．６３−３．６６（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝１４．８），３．７４（ｓ，６Ｈ），６．７４（ｓ，２Ｈ），７．０３（ｓ，２Ｈ）．
【０３３９】
実施例４３
２−（３，４，５−トリメトキシベンズアミド）−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボン酸の調製。（化合物１７）
【化３３】
2020529432.tif 000047
【０３４０】
工程１：２−（３，４，５−トリメトキシベンズアミド）−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボン酸の合成。（化合物１７）
【化３４】
2020529432.tif 000048
【０３４１】
ＬｉＯＨ（５９９．６ｍｇ、１４．２９０ｍｍｏｌ）の水（２ｍＬ）溶液をＥｔＯＨ（２４ｍＬ）中のエチル２−（３，４，５−トリメトキシベンズアミド）−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボキシレート（１．０ｇ、２．３８３ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。混合物を３０分間撹拌し、次いで６０℃で１６時間加熱した。反応混合物を濃縮し、氷水で希釈した。１Ｎ塩酸（５ｍＬ）を添加してｐＨ２に調整し、撹拌を３０分間続けた。得られた沈殿物を濾過により収集し、乾燥させて、９７０ｍｇの粗生成物を得た。粗生成物１００ｍｇを逆相分取ＨＰＬＣで更に精製して、２−（３，４，５−トリメトキシベンズアミド）−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボン酸（化合物１７）を灰白色の固体として得た（２１．７５ｍｇ、収率２３．３％）。分取ＨＰＬＣ法Ｅ：Ｓｈｉｍaｚｕ  ＬＣ−２０ＡＰ、カラムＫｒｏｍａｓｉｌ  Ｅｔｅｒｎｉｔｙ  ＸＴ−５  Ｃ１８（２５０×２１．２）ｍｍ、５ミクロン、流速１４．０ｍＬ／分、移動相Ａ：０．１％トリフルオロ酢酸水溶液及びＢ：１００％アセトニトリル。ＬＣＭＳ：１００．００％（ＲＴ：１．９１４，２６５．０ｎｍ）（ＭＳ：ＥＳＩ−ｖｅ３９０．４１［Ｍ−Ｈ］）．１Ｈ  ＮＭＲ：（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：１．７３９−１．７４９（ｍ，４Ｈ），２．６４９−２．７５１（ｍ，４Ｈ），３．７６０（ｓ，３Ｈ），３．８８３（ｓ，６Ｈ），７．２１０（ｓ，２Ｈ），１２．４５９（ｓ，１Ｈ），１３．４５０（ｓ，１Ｈ）．
【０３４２】
実施例４４
２−アミノ−Ｎ−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボキサミドの調製。（化合物１４）
【化３５】
2020529432.tif 000049
【０３４３】
工程１：２−アミノ−Ｎ−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボキサミドの合成。（化合物１４）
【化３６】
2020529432.tif 000050
【０３４４】
工程−１：トルエン中の２Ｍトリメチルアルミニウム（１．３２ｍＬ、２．６６３ｍｍｏｌ）を３，４，５−トリメトキシアニリン（３６３．９ｍｇ、２．００ｍｍｏｌ）の溶液に０℃で加え、続いてエチル２−アミノ−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボキシレート（３００ｍｇ、１．３３１ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を３０分間撹拌し、次いで７５℃で１６時間加熱した。混合物を氷水（３０ｍＬ）でクエンチし、ジクロロメタン（３×３０ｍＬ）で抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮した。粗残渣をメタノール：ジクロロメタンで溶出するカラムクロマトグラフィーにより精製し、次いで逆相分取ＨＰＬＣにより更に精製して、２−アミノ−Ｎ−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボキサミド（化合物１４）を灰白色の固体として得た（１０ｍｇ、収率２．１％）。分取ＨＰＬＣ法Ｄ。ＬＣＭＳ：９８．２６％（ＲＴ：１．７７０，２３０．０ｎｍ）（ＭＳ：ＥＳＩ＋ｖｅ３６３．１３［Ｍ＋Ｈ］）．１Ｈ  ＮＭＲ：（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：１．７０１−１．７６６（ｍ，４Ｈ），２．５１６−２．６４７（ｍ，４Ｈ），３．６２２−３．６７１（ｓ，３Ｈ），３．７４４−３．７８０（ｓ，６Ｈ），６．５５５（ｓ，２Ｈ），７．０５９（ｓ，２Ｈ），８．８４３（ｓ，１Ｈ）．
【０３４５】
実施例４５
２−（３，５−ジヒドロキシベンズアミド）−Ｎ−（３，４，５−トリヒドロキシフェニル）−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボキサミドの調製。（化合物４）
【化３７】
2020529432.tif 000051
【０３４６】
工程１．２−（３，５−ジヒドロキシベンズアミド）−Ｎ−（３，４，５−トリヒドロキシフェニル）−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボキサミドの合成。（化合物４）
【化３８】
2020529432.tif 000052
【０３４７】
２−（３，５−ジメトキシベンズアミド）−Ｎ−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボキサミド（化合物３）（１００ｍｇ、０．１８９ｍｍｏｌ）、ジクロロメタン（１０ｍＬ）及びペンタン（１２ｍＬ）を０℃に冷却した。三臭化ホウ素（ジクロロメタン中１Ｍ）（２．２７ｍＬ、２．２７８ｍｍｏｌ）を滴下し、反応混合物を室温まで温め、１６時間撹拌した。０℃に冷却した後、メタノール（３ｍＬ）を滴下した。反応混合物を濃縮し、粗残渣を逆相分取ＨＰＬＣにより精製して、２−（３，５−ジヒドロキシベンズアミド）−Ｎ−（３，４，５−トリヒドロキシフェニル）−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボキサミド（化合物４）を灰白色の固体として得た（１７ｍｇ、収率１９．６％）。分取ＨＰＬＣ法Ａ：Ｓｈｉｍａｚｕ  ＬＣ−２０ＡＰ；カラム：ＹＭＣ  Ａｃｔｕｓ  Ｔｒｉａｒｔ  Ｃ１８（２５０×２０）ｍｍ、５ミクロン、流速１６．０ｍＬ／分、移動相Ａ：０．１％トリフルオロ酢酸水溶液、Ｂ：１００％アセトニトリル。ＬＣＭＳ：１００．００％（ＲＴ：１．６１９，２０２．０ｎｍ）（ＭＳ：ＥＳＩ−ｖｅ４５５．５［Ｍ−Ｈ］）．１Ｈ  ＮＭＲ：（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：１．７４８−１．７８６（ｍ，４Ｈ），２．３３７−２．７５５（ｔ，４Ｈ，Ｊ＝２５．７），６．４４９（ｓ，１Ｈ），６．７０２−６．７２３（ｓ，３Ｈ），７．９５１（ｓ，１Ｈ），８．８９９（ｓ，２Ｈ），９．０７０（ｓ，１Ｈ），９．７８０（ｓ，２Ｈ），１１．６７４（ｓ，１Ｈ）．
【０３４８】
実施例４６
ｎ−フェニル−２−（３，４，５−トリヒドロキシベンズアミド）−４、５、６、７テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボキサミドの調製。（化合物８）
【化３９】
2020529432.tif 000053
【０３４９】
（化合物４）について説明した方法と同様の方法により、Ｎ−フェニル−２−（３，４，５−トリメトキシベンズアミド）−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボキサミド（化合物９）（１００ｍｇ、０．２１４ｍｍｏｌ）から調製して、Ｎ−フェニル−２−（３，４，５−トリヒドロキシベンズアミド）−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボキサミド（化合物８）を得た（５ｍｇ、収率５．５０％  分取ＨＰＬＣ方法Ｂ：Ｓｈｉｍａｚｕ  ＬＣ−２０ＡＰ、カラムＹＭＣ  Ａｃｔｕｓ  Ｔｒｉａｒｔ  Ｃ１８（２５０×２０）ｍｍ、５ミクロン、流速１５．０ｍＬ／分、移動相Ａ：０．１％ギ酸水溶液、Ｂ：１００％アセトニトリル。ＬＣＭＳ：１００％（ＲＴ：１．７３９，２３０．０ｎｍ）（ＭＳ：ＥＳＩ＋ｖｅ４２５．１［Ｍ＋Ｈ］）．１Ｈ  ＮＭＲ：（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：１．７７３（ｍ，４Ｈ）２．６７９（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝２３．４）２．７７９（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝２３．４），６．８８６（ｓ，２Ｈ）７．１５２−７．１１５（ｔ，１Ｈ），７．３９７−７．３５８（ｔ，２Ｈ），７．７０５−７．６８６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８），９．０１５（ｓ，１Ｈ），９．４４８（ｓ，２Ｈ），９．５０２（ｓ，１Ｈ），１１．５０５（ｓ，１Ｈ）．
【０３５０】
実施例４７
ｎ−（３，５−ジヒドロキシフェニル）−２−（３，４，５−トリヒドロキシベンズアミド）−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボキサミドの調製。（化合物６）
【化４０】
2020529432.tif 000054
【０３５１】
（化合物４）について記載された方法と同様の方法により、Ｎ−（３，５−ジメトキシフェニル）−２−（３，４，５−トリメトキシベンズアミド）−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボキサミド（化合物５）（１００ｍｇ、０．１９０ｍｍｏｌ）から調整して、５，７−ジヒドロキシ−４−オキソ−Ｎ−（３，４，５−トリヒドロキシフェニル）−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミド（化合物６）を灰白色の固体として得た（４９ｍｇ、収率５６．５％）。分取ＨＰＬＣ法Ｃ：Ｓｈｉｍａｚｕ  ＬＣ−２０ＡＰ；カラムＳｕｎｆｉｒｅ  Ｃ１８（１５０×１９）ｍｍ、５ミクロン、流速１５．０ｍＬ／分。移動相Ａ：０．１％ギ酸水溶液、Ｂ：１００％アセトニトリル。ＬＣＭＳ：１００％（ＲＴ：１．４９１，２７７．０ｎｍ）（ＭＳ：ＥＳＩ−ｖｅ４５５．５［Ｍ−Ｈ］）．１Ｈ  ＮＭＲ：（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：１．７５２（ｍ，４Ｈ），２．６８１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝２５．６），２．７６９（ｔ，２Ｈ  Ｊ＝２５．６），５．９８１（ｓ，１Ｈ），６．６６４−６．６４４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．６），６．８７４（ｓ，２Ｈ），９．２２０（ｓ，３Ｈ），９．２５１（ｓ，２Ｈ），１１．４８０（ｓ，１Ｈ）．
【０３５２】
実施例４８
２−ベンズアミド−Ｎ−（３，４，５−トリヒドロキシフェニル）−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボキサミドの調製。（化合物１８）
【化４１】
2020529432.tif 000055
【０３５３】
（化合物４）について記載した方法と同様の方法により、２−ベンズアミド−Ｎ−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボキサミド（化合物１１）（１００ｍｇ、０．２１４ｍｍｏｌ）から調製して、２−ベンズアミド−Ｎ−（３，４，５−トリヒドロキシフェニル）−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボキサミド（化合物１８）を黄色の固体として得た（１０ｍｇ、１１％の収率）。分取ＨＰＬＣ法Ｃ。ＬＣＭＳ：１００％（ＲＴ：１．６７９，２０２．０ｎｍ）（ＭＳ：ＥＳＩ−ｖｅ４２３．５［Ｍ−Ｈ］）．１Ｈ  ＮＭＲ：（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：１．７５０−１．７９２（ｍ，４Ｈ），２．６９０−２．７４３（ｔ，４Ｈ），６．７２４（ｓ，２Ｈ），７．５８３−７．６４７（ｍ，３Ｈ），７．８７０−７．８８８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２），７．９６４（ｓ，１Ｈ），８．９３１（ｓ，２Ｈ），９．１９０（ｓ，１Ｈ），１１．７４４（ｓ，１Ｈ）．
【０３５４】
実施例４９
２−（３，４，５−トリヒドロキシベンズアミド）−Ｎ−（３，４，５−トリヒドロキシフェニル）−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボキサミドの調製。（化合物２）
【化４２】
2020529432.tif 000056
【０３５５】
（化合物４）について記載した方法と同様の方法により、２−（３，４，５リメトキシベンズアミド）−Ｎ−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−４，５，６，７テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボキサミド（化合物１）（１００ｍｇ、０．１７９ｍｍｏｌ）から調製して、２−（３，４，５−トリヒドロキシベンズアミド）−Ｎ−（３，４，５−トリヒドロキシフェニル）−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボキサミド（化合物２）を得た（１１ｍｇ、１２．９６％）。分取ＨＰＬＣ法Ｄ：Ｓｈｉｍａｚｕ  ＬＣ−２０ＡＰ、カラムＸ−Ｂｒｉｄｇｅ  Ｃ１８（１５０×１９）ｍｍ、５ミクロン、流速１５．０ｍＬ／分。移動相Ａ：０．１  ％ギ酸水溶液、Ｂ：１００％アセトニトリル。ＬＣＭＳ：１００％（ＲＴ：１．４５９，２３２．０ｎｍ）（ＭＳ：ＥＳＩ−ｖｅ４７１．５［Ｍ−Ｈ］）．１Ｈ  ＮＭＲ：（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：１．７７３（ｍ，４Ｈ）２．６７９（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝２３．４）２．７７９（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝２３．４）６．７６１（ｓ，２Ｈ）６．８８６（Ｓ，２Ｈ）７．９６６（ｓ，１Ｈ）９．００６（ｓ，４Ｈ）９．４４５（ｓ，２Ｈ）１１．６３２（ｓ，１Ｈ）．
【０３５６】
実施例５０
２−（３，４，５−トリヒドロキシベンズアミド）−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボキサミドの調製。（化合物１５）
【化４３】
2020529432.tif 000057
【０３５７】
（化合物４）について記載した方法と同様の方法により、２−（３，４，５−トリヒドロキシベンズアミド）−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボキサミド（化合物１２）（５０ｍｇ、０．１３７ｍｍｏｌ）から調製して、２−（３，４，５−トリヒドロキシベンズアミド）−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボキサミド（化合物１５）を灰白色固体として得た（９ｍｇ、１８．８３％）。分取ＨＰＬＣ法Ｃ。ＬＣＭＳ：１００．００％（ＲＴ：１．４８８，２２３．０ｎｍ）（ＭＳ：ＥＳＩ＋ｖｅ３４９．２６［Ｍ＋Ｈ］）．１Ｈ  ＮＭＲ：（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：１．７５９（ｍ，４Ｈ），２．６５１−２．７５８（ｍ，４Ｈ），６．８９６（ｓ，２Ｈ），７．６９３（ｓ，１Ｈ），９．４１２（ｓ，３Ｈ），１２．７５０（ｓ，１Ｈ）．
【０３５８】
実施例５１
２−アミノ−Ｎ−（３，４，５−トリヒドロキシフェニル）−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボキサミドの調製。（化合物１６）
【化４４】
2020529432.tif 000058
【０３５９】
（化合物４）について記載した方法と同様の方法により、２−アミノ−Ｎ−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボキサミド（化合物１４）（８０ｍｇ、０．２２０ｍｍｏｌ）から調製して、２−アミノ−Ｎ−（３，４，５−トリヒドロキシフェニル）−４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−カルボキサミド（化合物１６）を灰白色固体として得た（８ｍｇ、収率１１．３１％）。分取ＨＰＬＣ法Ｃ。ＬＣＭＳ：９７．３９％（ＲＴ：１．４６９，２３０．０ｎｍ）（ＭＳ：ＥＳＩ−ｖｅ３１９．３１［Ｍ−Ｈ］）．１Ｈ  ＮＭＲ：（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：１．６８２−１．７３３（ｍ，４Ｈ），２．５４７−２．６７６（ｍ，４Ｈ），６．３９９（ｓ，２Ｈ），６．３６６−６．７３５（ｓ，２Ｈ），７．７８７（ｓ，１Ｈ），８．５３３（ｓ，１Ｈ），８．７５５（ｓ，２Ｈ）．
【０３６０】
実施例５２
５，６，７−トリメトキシ−４−オキソ−２−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸（化合物３６）の調製
【化４５】
2020529432.tif 000059
【０３６１】
工程１．５，６，７−トリメトキシ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−２，４（１Ｈ）−ジオンの合成
【化４６】
2020529432.tif 000060
【０３６２】
１Ｎ水酸化ナトリウム（３１．５ｍＬ）を６−アミノ−３−ヒドロキシ−２，４−ジメトキシ安息香酸（５ｇ  ２２．０ｍｍｏｌ）のトルエン（６０ｍＬ）溶液に０℃で加え、続いてトリホスゲン（１４．３６ｇ、４８．４１１ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を１時間かけて室温まで温めた。得られた沈殿物を濾過により収集し、ヘキサン（３×１０ｍＬ）で粉砕して、５，６，７−トリメトキシ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−２，４（１Ｈ）−ジオンを灰白色の固体として得た（５．２ｇ、収率８７．６％）。ＬＣＭＳ：９１．４９％（ＲＴ：１．４０７，２５４ｎｍ）（ＭＳ：ＥＳＩ＋ｖｅ２５４．３２［Ｍ＋Ｈ］）．１Ｈ  ＮＭＲ：（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：３．７１５（ｓ，３Ｈ），３．８２７（ｓ，３Ｈ），３．８８１（ｓ，３Ｈ），６．４８２（ｓ，１Ｈ），１１．５４１（ｓ，１Ｈ）．
【０３６３】
工程２．エチル５，６，７−トリメトキシ−４−オキソ−２−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキシレートの合成
【化４７】
2020529432.tif 000061
【０３６４】
エチル３−オキソ−３−（３，４，５−トリメトキシフェニル）プロパノエート（２．９ｇ、１０．２７３ｍｍｏｌ）を乾燥ジメチルホルムアミド（４０ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却した。水素化ナトリウム（鉱油中６０％）（１．２３ｇ、３０．８１９ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を２０分間撹拌した。５，６，７−トリメトキシ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−２，４（１Ｈ）−ジオン（５．２ｇ、２０．５５ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温まで温めた後、８０℃で１６時間加熱した。室温に冷却した後、氷水（２５０ｍＬ）を加え、１Ｎ塩酸（１０ｍＬ）を加えてｐＨを６に調整した。混合物を酢酸エチル（３×１００ｍＬ）で抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮した。粗生成物を、メタノール：ジクロロメタンで溶出するカラムクロマトグラフィーにより精製して、エチル５，６，７−トリメトキシ−４−オキソ−２−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキシレートを茶色の液体として得た（１．７ｇ、収率３１．４％）。ＬＣＭＳ：７０．７５％（ＲＴ：１．５１７，２３０．０ｎｍ）（ＭＳ：ＥＳＩ＋ｖｅ４７４．５２［Ｍ＋Ｈ］）．
【０３６５】
工程３．５，６，７−トリメトキシ−４−オキソ−２−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸の合成。（化合物３６）
【化４８】
2020529432.tif 000062
【０３６６】
エチル５，６，７−トリメトキシ−４−オキソ−２−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキシレート（７００ｍｇ  １．４７９ｍｍｏｌ）及び２Ｎ水酸化ナトリウム（１４ｍＬ）を９０℃で４８時間加熱した。反応混合物を室温に冷却し、１Ｎ塩酸の添加によりｐＨを４に調整した。混合物を酢酸エチル（３×４０ｍＬ）で抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮した。粗残渣を逆相分取ＨＰＬＣにより精製して、５，６，７−トリメトキシ−４−オキソ−２−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸（化合物３６）を灰白色の固体として得た（２６ｍｇ、収率４．０％）。分取ＨＰＬＣ法Ｆ：Ｓｈｉｍａｚｕ  ＬＣ−２０ＡＰ、カラムＸ−Ｂｒｉｄｇｅ  Ｃ１８（２５０×１９）ｍｍ、５ミクロン、流速１４．０ｍＬ／分、移動相Ａ：５ｍｍ重炭酸アンモニウム及び０．１％アンモニア水溶液、Ｂ：１００％アセトニトリル。ＬＣＭＳ：９９．８１％（ＲＴ＝１．９０８，２６５ｎｍ）（ＭＳ：ＥＳＩ＋ｖｅ  ４４６．０［Ｍ＋Ｈ］）．１Ｈ  ＮＭＲ：（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：３．２４（ｓ，３Ｈ），３．７７４（ｓ，６Ｈ），３．８００（ｓ，３Ｈ），３．８３２（ｓ，３Ｈ），３．８９１（ｓ，３Ｈ），６．７１０（ｓ，２Ｈ）７．０５７（ｓ，１Ｈ）．
【０３６７】
実施例５３
５，６，７−トリメトキシ−４−オキソ−Ｎ、２−ビス（３，４，５−トリメトキシフェニル）−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドの調製。（化合物４０）
【化４９】
2020529432.tif 000063
【０３６８】
工程１．５，６，７−トリメトキシ−４−オキソ−Ｎ、２−ビス（３，４，５−トリメトキシフェニル）−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドの合成。（化合物４０）
【化５０】
2020529432.tif 000064
【０３６９】
（１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−１Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−Ｂ］ピリジニウム３−オキシドヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）（０．４６０ｇ、１．２１２ｍｍｏｌ）を５，６，７−トリメトキシ−４−オキソ−２−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸（化合物３６）（０．３６ｇ、０．８０８ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド（４ｍＬ）溶液に０℃で加えた。の溶液に加えた。３０分後、３，４，５−トリメトキシアニリン（０．１６１ｇ、０．８８９ｍｍｏｌ）を加えた。１５分後、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．４０ｍＬ、２．４２４ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で１６時間撹拌した。氷水（４０ｍＬ）を加え、混合物を酢酸エチル（３×４０ｍＬ）で抽出し、乾燥させ、濃縮した。粗残渣を逆相分取ＨＰＬＣにより精製して、５，６，７−トリメトキシ−４−オキソ−Ｎ、２−ビス（３，４，５−トリメトキシフェニル）−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミド（化合物４０）を灰白色の固体として得た（９０ｍｇ、収率１８．２４％）。分取ＨＰＬＣ法Ｇ：Ｓｈｉｍａｚｕ  ＬＣ−２０ＡＰ；カラムＳｕｎｆｉｒｅ  Ｃ１８（２５０×１９）ｍｍ、５ミクロン、流速１５．０ｍＬ／分、移動相Ａ：０．１％トリフルオロ酢酸水溶液、Ｂ：１００％アセトニトリル。ＬＣＭＳ：９９．８０％（ＲＴ１．４６３，２２５ｎｍ）（ＭＳ：ＥＳＩ＋ｖｅ６１１．５２［Ｍ＋Ｈ］）．１Ｈ  ＮＭＲ：（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：３．６１２−３．８８８（ｍ，２７Ｈ），６．９６５−７．２１５（ｍ，５Ｈ），１０．４７７（ｓ，１Ｈ），１１．５７２（ｓ，１Ｈ）．
【０３７０】
実施例５４
５，６，７−トリヒドロキシ−４−オキソ−Ｎ、２−ビス（３，４，５−トリヒドロキシフェニル）−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドの調製。（化合物４４）
【化５１】
2020529432.tif 000065
【０３７１】
工程１．５，６，７−トリヒドロキシ−４−オキソ−Ｎ、２−ビス（３，４，５−トリヒドロキシフェニル）−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドの合成。（化合物４４）
【化５２】
2020529432.tif 000066
【０３７２】
三臭化ホウ素（ジクロロメタン中１Ｍ）（０．７８６ｍＬ、０．７８６ｍｍｏｌ）を、−１０℃のジクロロメタン中の５，６，７−トリメトキシ−４−オキソ−Ｎ、２−ビス（３，４，５−トリメトキシフェニル）−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミド（化合物４０）（４０ｍｇ、０．０６５５ｍｍｏｌ）の溶液に滴下した。反応混合物をゆっくりと室温まで温め、１６時間撹拌した。反応混合物を０℃に冷却し、メタノール（４ｍＬ）を滴下した。２０分後、混合物を濃縮し、得られた固体をＭＴＢＥ（２×４ｍＬ）、次にペンタン（４×４ｍＬ）と共に摩砕した。逆相分取ＨＰＬＣによる更なる精製により、５，６，７−トリヒドロキシ−４−オキソ−Ｎ、２−ビス（３，４，５−トリヒドロキシフェニル）−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミド（化合物４４）白色固体として得た（２．２７ｍｇ、収率７．０％）。分取ＨＰＬＣ法Ｄ。ＬＣＭＳ：１００％（ＲＴ  １．５５７，２０２ｎｍ）（ＭＳ：ＥＳＩ＋ｖｅ  ４８５．０［Ｍ＋Ｈ］）．１Ｈ  ＮＭＲ：（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  ｐｐｍ：６．５３３−６．６０１（ｍ，５Ｈ），７．９００（ｓ，２Ｈ），８．５２６−８．８３０（ｓ，４Ｈ），８．８９４−９．１７９（ｓ，２Ｈ），９．７５９（ｓ，１Ｈ）１１．６６７（ｓ，１Ｈ）１４．４３９（ｓ，１Ｈ）．
【０３７３】
実施例５５
５，６，７−トリメトキシ−４−オキソ−Ｎ−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドの調製。（化合物１９）
【化５３】
2020529432.tif 000067
【０３７４】
工程１：ジエチル２−（（（３，４，５−トリメトキシフェニル）アミノ）メチレン）マロネートの合成
【化５４】
2020529432.tif 000068
【０３７５】
３，４，５−トリメトキシアニリン（２５ｇ、０．１３６ｍｏｌ）をジエチルエトキシメチレンマロネート（２８ｍＬ、０．１４０ｍｏｌ）に溶解し、混合物を１４０℃で２時間加熱した。粗混合物をジクロロメタン（１００ｍＬ）に溶解し、濃縮し、メタノール（２×２０ｍＬ）と共に摩砕して、ジエチル２−（（（３，４，５−トリメトキシフェニル）アミノ）メチレン）マロネートを茶色の固体として得た（４３．５ｇ、９９．６％収量）。ＬＣＭＳ：１００％（ＲＴ：２．２８６，２０２ｎｍ）（ＭＳ：ＥＳＩ＋ｖｅ３５４．０［Ｍ＋Ｈ］）．１Ｈ  ＮＭＲ：（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：１．２２−１．２８（ｍ，６Ｈ），３．６３−３．６６（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝１３．６），３．８１（ｓ，６Ｈ），４．１０−４．１５（ｍ，２Ｈ），４．１７−４．２３（ｍ，２Ｈ），６．７３（ｓ，２Ｈ）８．３７−８．４０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２）１０．６７−１０．７１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１６）
【０３７６】
工程２：５，６，７−トリメトキシ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸エチルの合成
【化５５】
2020529432.tif 000069
【０３７７】
ジフェニルエーテル（２５ｍＬ）中のジエチル２−（（（３，４，５−トリメトキシフェニル）アミノ）メチレン）マロネート（５ｇ、０．０１４ｍｏｌ）の溶液を２４０℃で１５分間加熱した。反応混合物を室温に冷却し、得られた沈殿物を濾過により収集し、ヘキサン（３×１０ｍＬ）で粉砕して、５，６，７−トリメトキシ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸エチルを茶色の固体として得た（１．５３ｇ、収率３５．２％）。ＬＣＭＳ：８４．５３％（ＲＴ：１．８１６，２５４ｎｍ）（ＭＳ：ＥＳＩ＋ｖｅ３０８［Ｍ＋Ｈ］）．
【０３７８】
工程３：５，６，７−トリメトキシ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸の合成
【化５６】
2020529432.tif 000070
【０３７９】
２Ｎ水酸化ナトリウム（１５０ｍＬ）中のエチル５，６，７−トリメトキシ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキシレート（３ｇ、０．００９ｍｏｌ）の混合物を９０℃で３時間加熱した。室温に冷却した後、２Ｎ塩酸を添加してｐＨを４に調整した。得られた沈殿物を濾過により収集し、メタノール（５ｍＬ）と共に摩砕して、５，６，７−トリメトキシ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸を淡紅色の固体として得た（２．２ｇ、収率８０．７％）。ＬＣＭＳ：８４．９４％（ＲＴ：１．３４８，３１５ｎｍ）（ＭＳ：ＥＳＩ＋ｖｅ２８０．０［Ｍ＋Ｈ］）．
【０３８０】
工程４：５，６，７−トリメトキシ−４−オキソ−Ｎ−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドの合成。（化合物１９）
【化５７】
2020529432.tif 000071
【０３８１】
５，６，７−トリメトキシ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸（８５０ｍｇ、３．０４３ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（５ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却した。３０分後にＨＡＴＵ（１．７ｇ、４．５６５ｍｍｏｌ）、続いて３，４，５−トリメトキシアニリン（５５７．６ｍｇ、３．０４３ｍｍｏｌ）。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１．５６ｍＬ、９．１４５ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温までゆっくりと温め、１６時間撹拌した。反応混合物を氷水（５０ｍＬ）でクエンチし、ジクロロメタン（３×５０ｍＬ）で抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮した。粗残渣をメタノール：ジクロロメタンで溶出するカラムクロマトグラフィーにより精製して３５０ｍｇを得て、これを逆相分取ＨＰＬＣにより更に精製して５，６，７−トリメトキシ−４−オキソ−Ｎ−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミド（化合物１９）を灰白色の固体として得た（１１０ｍｇ、収率８．１３％）。分取ＨＰＬＣ法Ｈ：Ｓｈｉｍａｚｕ  ＬＣ−２０ＡＰ、カラムＸ−Ｂｒｉｄｇｅ  Ｃ１８（２５０×１９）ｍｍ、５ミクロン、流量１５．０ｍＬ／分、移動相Ａ：５ｍｍ酢酸アンモニウム水溶液、Ｂ：１００％アセトニトリル。ＬＣＭＳ：９９．８６％（ＲＴ：１．４８０，２５４ｎｍ）（ＭＳ：ＥＳＩ＋ｖｅ４４５．４［Ｍ＋Ｈ］）．１Ｈ  ＮＭＲ：（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：３．６５（ｓ，３Ｈ），３．７９（ｓ，３Ｈ），３．８１（ｓ，６Ｈ），３．８６（ｓ，３Ｈ），３．９２（Ｓ，３Ｈ），６．９７（ｓ，１Ｈ），７．１１（ｓ，２Ｈ），８．７１（ｓ，１Ｈ），１２．７４（ｓ，１Ｈ）．
【０３８２】
実施例５６
５，７−ジメトキシ−４−オキソ−Ｎ−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドの調製。（化合物２１）
【化５８】
2020529432.tif 000072
【０３８３】
５，６，７−トリメトキシ−４−オキソ−Ｎ−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミド（化合物１９）について記載した手順と同様の手順により、５，７−ジメトキシ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸（０．９９ｇ、３．９７ｍｍｏｌ）及び３，４，５−トリメトキシアニリン（０．７３ｇ、３．９９ｍｍｏｌ）から調製して、５，７−ジメトキシ−４−オキソ−Ｎ−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミド（化合物２１）灰白色の固体として得た（６１２ｍｇ、収率３７．０％）。分取ＨＰＬＣ方法Ｈ：ＬＣＭＳ：１００％（ＲＴ：１．４５９，２３５．０ｎｍ）（ＭＳ：ＥＳＩ＋ｖｅ４１５．３［Ｍ＋Ｈ］）．１Ｈ  ＮＭＲ：（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ：３．７４９（ｓ，３Ｈ），３．８６２（ｓ，９Ｈ），４．０６６（ｓ，３Ｈ），６．４４１（ｓ，２Ｈ），７．１０９（ｓ，１Ｈ），７．５４３（ｓ，１Ｈ），８．９８３（ｓ，１Ｈ），１２．６４０（ｓ，１Ｈ）
【０３８４】
実施例５７
５，７−ジメトキシ−４−オキソ−Ｎ−フェニル−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドの調製。（化合物２５）
【化５９】
2020529432.tif 000073
【０３８５】
５，６，７−トリメトキシ−４−オキソ−Ｎ−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミド（化合物１９）について記載した手順と同様の手順により、５，７−ジメトキシ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸（３００ｍｇ、１．２０ｍｍｏｌ）及びアニリン（０．１１ｍＬ、１．２０ｍｍｏｌ）から調製して、５，７−ジメトキシ−４−オキソ−Ｎ−フェニル−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミド（化合物２５）を灰白色の固体として得た（４０ｍｇ、収率１０．３％）。分取ＨＰＬＣ法Ｄ。ＬＣＭＳ：９５．７３％（ＲＴ：１．４６６，２６０．０ｎｍ）（ＭＳ：ＥＳＩ＋ｖｅ３２５．４３［Ｍ＋Ｈ］）．１Ｈ  ＮＭＲ：（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：３．８７（ｓ，３Ｈ），３．８９（ｓ，３Ｈ），６．５２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２）６．６６−６．６７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２）７．０６−７．１０（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．２），７．３４−７．３８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８），７．７２−７．７４（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６），８．６４−８．６６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．４），１２．４１−１２．４３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．８），１２．７０（ｓ，１Ｈ）．
【０３８６】
実施例５８
ｎ−（３−ヒドロキシフェニル）−５，７−ジメトキシ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドの調製。（化合物２６）
【化６０】
2020529432.tif 000074
【０３８７】
５，６，７−トリメトキシ−４−オキソ−Ｎ−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミド（化合物１９）について記載した手順と同様の手順により、５，７−ジメトキシ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸（３００ｍｇ、１．２０ｍｍｏｌ）及び３−アミノフェノール（１３１．３６、１．２０ｍｍｏｌ）から調製して、Ｎ−（３−ヒドロキシフェニル）−５，７−ジメトキシ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミド（化合物２６）を灰白色の固体として得た（１８ｍｇ、収率４．４％）。分取ＨＰＬＣ法Ｆ。ＬＣＭＳ：１００．００％（ＲＴ：１．３９９，２０２ｎｍ）（ＭＳ：ＥＳＩ＋ｖｅ３４１．２７［Ｍ＋Ｈ］）．１Ｈ  ＮＭＲ：（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）（７３０４３）δｐｐｍ：３．３４（ｓ，３Ｈ），３．８７（ｓ，３Ｈ），６．４６−６．５１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝９．２），６．６６（ｓ，１Ｈ），６．９９−７．０１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８）７．１０−７．１４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．２），７．３４（ｓ，１Ｈ），８．６２（ｓ，１Ｈ）９．４３（ｓ，１Ｈ）１２．４０−１２．３９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８），１２．６０（ｓ，１Ｈ）．
【０３８８】
実施例５９
Ｎ−（３−ヒドロキシフェニル）−５、６、７−トリメトキシ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドの調製。（化合物２８）
【化６１】
2020529432.tif 000075
【０３８９】
５，６，７−トリメトキシ−４−オキソ−Ｎ−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミド（化合物１９）について報告される手順と同様の手順により、５，６，７−トリメトキシ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸（５００ｍｇ、１．７９ｍｏｌ）及び３−アミノフェノール（１９５．３ｍｇ、１．７９ｍｍｏｌ）から調製して、Ｎ−（３−ヒドロキシフェニル）−５、６，７−トリメトキシ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミド（化合物２８）を白色固体として得た（１５ｍｇ、収率２．３％）。分取ＨＰＬＣ法Ｄ。ＬＣＭＳ：９９．３６％（ＲＴ：１．４１９，３１７．０ｎｍ）（ＭＳ：ＥＳＩ＋ｖｅ３７１．４７［Ｍ＋Ｈ］）．１Ｈ  ＮＭＲ：（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：３．７８４（ｓ，３Ｈ），３．８４４（ｓ，３Ｈ），３．９２２（ｓ，３Ｈ），６．４６９−６．４９３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．６），７．００８（ｍ，２Ｈ），７．１２５（ｍ，１Ｈ），７．３２５（ｓ，１Ｈ），８．６９３（ｓ，１Ｈ），９．４４４（ｓ，１Ｈ），１２．５４６（ｓ，１Ｈ），１２．６２６（ｓ，１Ｈ）．
【０３９０】
実施例６０
５，６，７−トリメトキシ−４−オキソ−Ｎ−フェニル−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドの調製。（化合物３０）
【化６２】
2020529432.tif 000076
【０３９１】
５，６，７−トリメトキシ−４−オキソ−Ｎ−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミド（化合物１９）について報告された手順と同様の手順により、５，６，７−トリメトキシ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸（２００ｍｇ、０．７１６ｍｍｏｌ）及びアニリン（６６．６ｍｇ、０．７１６ｍｍｏｌ）から調製して、５，６，７−トリメトキシ−４−オキソ−Ｎ−フェニル−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミド（化合物３０）を灰白色の固体として得た（４３．５ｍｇ、収率１６．９％）。分取ＨＰＬＣ法Ｃ。ＬＣＭＳ：１００．００％（ＲＴ：１．５２０，２０２．０ｎｍ）（ＥＳＩ＋ｖｅ（Ｍ＋１）３５５．４８）．１Ｈ  ＮＭＲ：（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：３．８０１（ｓ，３Ｈ），３．８６６（ｓ，３Ｈ），３．９３７（ｓ，３Ｈ），７．００５（ｓ，１Ｈ），７．０９５（ｍ，１Ｈ），７．３７１（ｍ，２Ｈ），７．７２３−７．７４３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８），８．７２０（ｓ，１Ｈ），１２．５６９（ｓ，１Ｈ），１２．６９８（ｓ，１Ｈ）．
【０３９２】
実施例６１
Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）−５，６，７−トリメトキシ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドの調製。（化合物２９）
【化６３】
2020529432.tif 000077
【０３９３】
５，６，７−トリメトキシ−４−オキソ−Ｎ−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミド（化合物１９）について報告されている手順と同様の手順により、５，６，７−トリメトキシ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸（３００ｍｇ、１．０７５ｍｍｏｌ）及び４−アミノフェノール（１１７ｍｇ、１．０７５ｍｍｏｌ）から調製して、Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）−５，６を得る、７−トリメトキシ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミド（化合物２９）を白色の固体として得た（３４ｍｇ、８．５５％）。分取ＨＰＬＣ法Ｄ。ＬＣＭＳ：１００．００％（ＲＴ：１．３９３，２５４．０ｎｍ）（ＭＳ：ＥＳＩ＋ｖｅ３７１．４［Ｍ＋Ｈ］）．１Ｈ  ＮＭＲ：（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：３．７８２（ｓ，３Ｈ），３．８４  ０（ｓ，３Ｈ），３．９７０（ｓ，３Ｈ），６．５８６（ｓ，２Ｈ），６．７３４−６．７５６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８），６．９８５（ｓ，１Ｈ）７．４９６−７．５１８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．２），８．６７２（ｓ，１Ｈ），９．２４１（ｓ，１Ｈ），１２．４１５（ｓ，１Ｈ）．
【０３９４】
実施例６２
Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）−５，７−ジメトキシ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドの調製。（化合物３１）
【化６４】
2020529432.tif 000078
【０３９５】
５，６，７−トリメトキシ−４−オキソ−Ｎ−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミド（化合物１９）について報告されている手順と同様の手順により、５，７−ジメトキシ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸（３００ｍｇ、１．２０ｍｍｏｌ）及び４−アミノフェノール（１３１．３６、１．２０ｍｍｏｌ）から調製して、Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）−５，７−ジメトキシ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミド（化合物３１）を白色の固体として得た（７．２ｍｇ、収率１．８％）。分取ＨＰＬＣ法Ｄ。ＬＣＭＳ：９８．９９％（ＲＴ：１．３６５，２５９ｎｍ）（ＭＳ：ＥＳＩ＋ｖｅ３４１．２７［Ｍ＋Ｈ］）．１Ｈ  ＮＭＲ：（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：３．８５（ｓ，３Ｈ），３．８７（ｓ，３Ｈ），６．４８−６．４９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２），６．６４−６．６５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２），６．７２−６．７４（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８）７．４９−７．５２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８）８．６０（ｓ，１Ｈ），９．２１（ｓ，１Ｈ）１２．４３（ｓ，２Ｈ）．
【０３９６】
実施例６３
ｎ−（３−フルオロ−４−ヒドロキシフェニル）−５，６，７−トリメトキシ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドの調製。（化合物３４）
【化６５】
2020529432.tif 000079
【０３９７】
５，６，７−トリメトキシ−４−オキソ−Ｎ−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミド（化合物１９）について報告されている手順と同様の手順により、５，６，７−トリメトキシ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸（３００ｍｇ、１．０７５ｍｍｏｌ）及び５−アミノ−２−フルオロフェノール（１３６ｍｇ、１．０７５ｍｍｏｌ）から調製して、Ｎ−（３−フルオロ−４−ヒドロキシフェニル）−５，６，７−トリメトキシ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミド（化合物３４）を灰白色の固体として得た（３４ｍｇ、収率８．２％）。分取ＨＰＬＣ法Ｉ：Ｓｈｉｍａｚｕ  ＬＣ−２０ＡＰ。カラムＳｕｎｆｉｒｅ  Ｃ１８（１５０×１９）ｍｍ、５ミクロン、流速１５．０ｍＬ／分、移動相Ａ：０．１％ギ酸水溶液、Ｂ：アセトニトリル：メタノール（１：１）。ＬＣＭＳ：１００．００％（ＲＴ：１．４１４，２５４．０ｎｍ）（ＭＳ：ＥＳＩ＋ｖｅ３８９．４［Ｍ＋Ｈ］）．１Ｈ  ＮＭＲ：（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：３．７８３（ｓ，３Ｈ），３．８４０（ｓ，３Ｈ），３．９２２（ｓ，３Ｈ），６．９０１−６．９４７（ｍ，１Ｈ），６．９８６（ｓ，１Ｈ），７．１１８−７．１４０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８），７．７６２−７．８０１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．４，１５．５）８．６８３（ｓ，１Ｈ），９．６２３（ｓ，１Ｈ）１２．４３０（ｓ，１Ｈ），１２．５７５（ｓ，１Ｈ）．
【０３９８】
実施例６４
５，７−ジメトキシ−Ｎ−メチル−４−オキソ−Ｎ−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドの調製。（化合物３５）
【化６６】
2020529432.tif 000080
【０３９９】
５，６，７−トリメトキシ−４−オキソ−Ｎ−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミド（化合物１９）について報告された手順に類似する手順により、５，７−ジメトキシ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸（３００ｍｇ、１．２０ｍｍｏｌ）及び３，４，５−トリメトキシ−Ｎ−メチルアニリン（２３７ｍｇ、１．２０ｍｍｏｌ）から調製して、５，７−ジメトキシ−Ｎ−メチル−４−オキソ−Ｎ−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミド（化合物３５）を灰白色の固体として得た（４０ｍｇ、収率７．８％）。分取ＨＰＬＣ法Ｄ。ＬＣＭＳ：１００．００％（ＲＴ：１．３４４，２２５ｎｍ）（ＭＳ：ＥＳＩ＋ｖｅ４２９．３９［Ｍ＋Ｈ］）．１Ｈ  ＮＭＲ：（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：３．２７９（ｓ，３Ｈ），３．５６９（ｓ，３Ｈ），３．６６１（ｓ，６Ｈ），３．７４３（ｓ，３Ｈ），３．７９５（ｓ，３Ｈ），６．３０１（ｓ，１Ｈ），６．３９０（ｓ，１Ｈ），６．６４０（ｓ，２Ｈ），７．６２２（ｓ，１Ｈ），１１．３４７（ｓ，１Ｈ）．
【０４００】
実施例６５
Ｎ−（３−フルオロ−４−ヒドロキシフェニル）−５，７−ジメトキシ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドの調製。（化合物３７）
【化６７】
2020529432.tif 000081
【０４０１】
５，６，７−トリメトキシ−４−オキソ−Ｎ−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミド（化合物１９）について報告されている手順と同様の手順により、５，７−ジメトキシ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸（３００ｍｇ、１．２０ｍｍｏｌ）及び４−アミノ−２−フルオロフェノール（１５２ｍｇ、１．２０ｍｍｏｌ）から調製して、Ｎ−（３−フルオロ−４−ヒドロキシフェニル）−５，７−ジメトキシ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミド（化合物３７）を白色固体として得た（２６ｍｇ、収率６．０％）。分取ＨＰＬＣ法Ａ。ＬＣＭＳ：１００．０％（ＲＴ：１．４０９，２６０．０ｎｍ）（ＭＳ：ＥＳＩ＋ｖｅ３５９．０８［Ｍ＋Ｈ］）．１Ｈ  ＮＭＲ：（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：３．８６５（ｓ，６Ｈ），６．５１３−６．５１８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２），６．６５９−６．６６４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２），６．９００−６．９４６（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．２），７．１４７−７．１６８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４），７．７６４−７．８０４（ｑ，１Ｈ），８．６１７−８．６３４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．８），９．６２１（ｓ，１Ｈ），１２．３９８−１２．４１４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．４），１２．５７６（ｓ，１Ｈ）．
【０４０２】
実施例６６
Ｎ−（２−ヒドロキシフェニル）−５、６、７−トリメトキシ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドの調製。（化合物３９）
【化６８】
2020529432.tif 000082
【０４０３】
５，６，７−トリメトキシ−４−オキソ−Ｎ−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミド（化合物１９）について報告されている手順と同様の手順により、５，６，７−トリメトキシ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸（５００ｍｇ、１．７９ｍｍｏｌ）及び２−アミノフェノール（１９５．３ｍｇ、１．７９ｍｍｏｌ）から調製して、Ｎ−（２−ヒドロキシフェニル）−５，６，７−トリメトキシ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミド（化合物３９）を茶色の固体として得た（４０ｍｇ、収率６．０％）。分取ＨＰＬＣ法Ｂ。ＬＣＭＳ：９８．５７％（ＲＴ：３．５８４，２５４．０ｎｍ）（ＭＳ：ＥＳＩ＋ｖｅ３７１．４［Ｍ＋Ｈ］）．１Ｈ  ＮＭＲ：（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ：３．７８０−３．８３５（ｓ，６Ｈ），３．８８５−３．９１９（ｓ，３Ｈ），６．７６３−６．９７４（ｍ，３Ｈ），８．３０１−８．３２１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８），８．６８５
【０４０４】
実施例６７
Ｎ−（２−ヒドロキシフェニル）−５，７−ジメトキシ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドの調製。（化合物４１）
【化６９】
2020529432.tif 000083
【０４０５】
５，６，７−トリメトキシ−４−オキソ−Ｎ−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミド（化合物１９）について報告されている手順と同様の手順により、５，７−ジメトキシ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸（３００ｍｇ、１．２０ｍｍｏｌ）及び２−アミノフェノール（１３１．３ｍｇ、１．２０ｍｍｏｌ）から調製して、Ｎ−（３−フルオロ−４−ヒドロキシフェニル）−５，７−ジメトキシ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミド（化合物４１）を白色固体として得た（４．０ｍｇ、収率１．０％）。分取ＨＰＬＣ法Ｂ。ＬＣＭＳ：１００．０％（ＲＴ：１．４７７，２６０．０ｎｍ）（ＭＳ：ＥＳＩ＋ｖｅ  ３４１．３３［Ｍ＋Ｈ］）．１Ｈ  ＮＭＲ：（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  ｐｐｍ：３．８７８（ｓ，６Ｈ），６．４９２−６．４９６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．６），６．６５７−６．６６２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２），６．７６５−６．８０７（ｍ，１Ｈ），６．８８０−６．９１２（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．４），８．３１３−８．３３３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８），８．６３４（ｓ，１Ｈ），１０．００８（ｓ，１Ｈ），１２．６２３（ｓ，１Ｈ）．
【０４０６】
実施例６８
Ｎ−（３，５−ジメトキシフェニル）−５，７−ジメトキシ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドの調製。（化合物４９）
【化７０】
2020529432.tif 000084
【０４０７】
５，６，７−トリメトキシ−４−オキソ−Ｎ−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミド（化合物１９）について報告されている手順と同様の手順により、５，７−ジメトキシ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸（０．１５ｇ、０．６０２ｍｍｏｌ）及び３，５−ジメトキシアニリン（０．０９１ｇ、０．６０２ｍｍｏｌ）から調製して、Ｎ−（３，５−ジメトキシフェニル）−５，７−ジメトキシ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミド（化合物４９）を灰白色の固体として得た。分取ＨＰＬＣ法Ｃ。ＬＣＭＳ：１００％（ＲＴ  １．５３２，２６０ｎｍ）（ＭＳ：ＥＳＩ＋ｖｅ  ３８５．４１［Ｍ＋Ｈ］）．１Ｈ  ＮＭＲ：（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  ｐｐｍ：３．７７６（ｓ，６Ｈ），３．８８５−３．８７０（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝６），６．２４０（ｓ，１Ｈ），６．５２３−６．５１８（ｄ，１Ｈ  Ｊ＝２），６．６６５−６．６６１（ｓ，１Ｈ  Ｊ＝１．６），６．９６８−６．９６３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝２）８．６４８（ｓ，１Ｈ）１２．４９９（ｓ，１Ｈ），１２．６９５（ｓ，１Ｈ）．
【０４０８】
実施例６９
４−オキソ−Ｎ−フェニル−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドの調製。（化合物４５）
【化７１】
2020529432.tif 000085
【０４０９】
５，６，７−トリメトキシ−４−オキソ−Ｎ−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミド（化合物１９）について報告されている手順と同様の手順により、４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸（１５０ｍｇ、０．７９３２ｍｍｏｌ）及びアニリン（７３ｍｇ、０．７９３２ｍｍｏｌ）から調製して、４−オキソ−Ｎ−フェニル−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミド（化合物４５）を得た（８０．５ｍｇ、収率３８．２％）。分取ＨＰＬＣ法Ｃ。ＬＣＭＳ：１００．００％（ＲＴ：２．０８７，２２６ｎｍ）（ＭＳ：ＥＳＩ＋ｖｅ  ２６５．３［Ｍ＋Ｈ］）．１Ｈ  ＮＭＲ：（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  ｐｐｍ：７．０９２−７．１２８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．２）７．３６６−７．４０５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．８），７．５４０−７．５７７（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．４），７．７４５−７．８５４（ｍ，４Ｈ），８．３４０−８．３５８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．２），８．９０７（ｓ，１Ｈ），１２．５２（ｓ，１Ｈ），１２．９８（ｓ，１Ｈ）．
【０４１０】
実施例７０
Ｎ−（３−ヒドロキシフェニル）−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドの調製。（化合物４６）
【化７２】
2020529432.tif 000086
【０４１１】
工程１．Ｎ−（３−（ベンジルオキシ）フェニル）−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドの合成
【化７３】
2020529432.tif 000087
【０４１２】
ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）中の４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸（１５０ｍｇ、０．７９３２ｍｍｏｌ）及びＨＡＴＵ（４５２ｍｇ、１．１８９８ｍｍｏｌ）の混合物を０℃に冷却した。３０分後、３−（ベンジルオキシ）アニリン（１５８ｍｇ、０．７９３２ｍｍｏｌ）、続いてＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．７５ｍＬ、３．９６６ｍｍｏｌ）を加えた。混合物をゆっくりと室温まで温め、１６時間撹拌した。反応混合物を氷水（２５ｍＬ）でクエンチし、酢酸エチル（３×２０ｍＬ）で抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮してｎ−（３−（ベンジルオキシ）フェニル）−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドを茶色の固体として得た（２５０ｍｇ、８５．１２％）。ＬＣＭＳ：５３．１３％（ＲＴ：１．８５５，２０２．０ｎｍ）（ＭＳ：ＥＳＩ＋ｖｅ  ３７１．３６［Ｍ＋Ｈ］）．
【０４１３】
工程２．Ｎ−（３−ヒドロキシフェニル）−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドの合成。（化合物４６）
【化７４】
2020529432.tif 000088
【０４１４】
Ｎ−（３−（ベンジルオキシ）フェニル）−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミド（２００ｍｇ、０．５４０２５ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（１５ｍＬ）に溶解した。１０％パラジウム炭素（５０％水分）（５０ｍｇ）を添加し、オートクレーブ内で水素ガス２ｋｇの圧力下で２４時間にわたって室温で反応混合物を撹拌した。セライトのパッドを通して濾過することにより触媒を除去し、濾液を濃縮した。粗生成物を逆相分取ＨＰＬＣにより精製して、Ｎ−（３−ヒドロキシフェニル）−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミド（化合物４６）を灰白色の固体として得た（１６．０ｍｇ、収率１２．６％）。分取ＨＰＬＣ法Ｄ。ＬＣＭＳ：１００．００％（ＲＴ：１．４６３，２０２ｎｍ）（ＭＳ：ＥＳＩ＋ｖｅ  ２８１．３［Ｍ＋Ｈ］）．１Ｈ  ＮＭＲ：（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  ｐｐｍ：６．５０２−６．５２２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８），７．０２５−７．０４５（ｄ，１Ｈ，  Ｊ＝８），７．１３１−７．１７１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８），７．３７０（ｓ，１Ｈ），７．５３０−７．５６７（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．４），７．７５７−７．８４６（ｍ，２Ｈ），８．３３−８．３５３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８），８．８９０（ｓ，１Ｈ），９．４９２（ｓ，１Ｈ），１２．４６（ｓ，１Ｈ），１３．０（ｓ，１Ｈ）．
【０４１５】
実施例７１
５，６，７−トリヒドロキシ−４−オキソ−Ｎ−（３，４，５−トリヒドロキシフェニル）−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドの調製。（化合物２０）
【化７５】
2020529432.tif 000089
【０４１６】
工程１．５，６，７−トリヒドロキシ−４−オキソ−Ｎ−（３，４，５−トリヒドロキシフェニル）−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドの合成。（化合物２０）
【化７６】
2020529432.tif 000090
【０４１７】
工程１．５，６，７−トリメトキシ−４−オキソ−Ｎ−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミド（化合物１９）（３００ｍｇ、０．６７５ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（８ｍＬ）及びペンタン（４ｍＬ）の混合物に溶解し、０℃に冷却した。三臭化ホウ素（ジクロロメタン中１Ｍ）（８．１０ｍＬ、８．１００ｍｍｏｌ）を滴下し、反応混合物を室温までゆっくり温め、１６時間撹拌した。０℃に冷却した後、メタノール（８ｍＬ）を滴下し、混合物を濃縮した。粗残渣を逆相分取ＨＰＬＣにより精製して、５，６，７−トリヒドロキシ−４−オキソ−Ｎ−（３，４，５−トリヒドロキシフェニル）−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミド（化合物２０）を灰白色の固体として得た（３０ｍｇ、収率１２．３％）。分取ＨＰＬＣ法Ａ。ＬＣＭＳ：９９．２４％（ＲＴ：１．２６９，２７０．０ｎｍ）（ＭＳ：ＥＳＩ−ｖｅ  ３５９．４［Ｍ−Ｈ］）．１Ｈ  ＮＭＲ：（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  ｐｐｍ：６．６０５（ｓ，１Ｈ），６．７０９（ｓ，２Ｈ），７．８９４（ｓ，１Ｈ），８．６１１（ｓ，１Ｈ），８．７８０（ｓ，１Ｈ），８．９１３（ｓ，２Ｈ），１０．４０９（ｓ，１Ｈ），１１．４１４（ｓ，１Ｈ），１２．８０７（ｓ，１Ｈ），１３．５６７（ｓ，１Ｈ）．
【０４１８】
実施例７２
５，７−ジヒドロキシ−４−オキソ−Ｎ−（３，４，５−トリヒドロキシフェニル）−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドの合成の準備。（化合物２２）
【化７７】
2020529432.tif 000091
【０４１９】
５，６，７−トリヒドロキシ−４−オキソ−Ｎ−（３，４，５−トリヒドロキシフェニル）−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミド（化合物２０）について記載される手順と同様の手順により、５，７−ジメトキシ−４−オキソ−Ｎ−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミド（化合物２１）（２５０ｍｇ、０．６０３ｍｍｏｌ）から調製して、５，７−ジヒドロキシ−４−オキソを与える−Ｎ−（３，４，５−トリヒドロキシフェニル）−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミド（化合物２２）を灰白色の固体として得た（３０ｍｇ、収率１４．４％）。分取ＨＰＬＣ法Ａ。ＬＣＭＳ：９８．９８％（ＲＴ：２．７９２，２６０．０ｎｍ）（ＭＳ：ＥＳＩ＋ｖｅ  ３４５．５［Ｍ＋Ｈ］）．１Ｈ  ＮＭＲ：（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  ｐｐｍ：６．２０４（ｓ，１Ｈ），６．４８２（ｓ，１Ｈ），６．６８８（ｓ，２Ｈ），７．９１８（ｓ，１Ｈ），８．６６０（ｓ，１Ｈ），８．９３４（ｓ，２Ｈ），１０．６６７（ｓ，１Ｈ），１１．２７０（ｓ，１Ｈ），１２．８３２（ｓ，１Ｈ），１３．６７０（ｓ，１Ｈ）．
【０４２０】
実施例７３
５，７−ジヒドロキシ−４−オキソ−Ｎ−フェニル−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドの調製。（化合物２７）
【化７８】
2020529432.tif 000092
【０４２１】
５，６，７−トリヒドロキシ−４−オキソ−Ｎ−（３，４，５−トリヒドロキシフェニル）−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミド（化合物２０）について記載した手順と同様の手順により、５，７−ジメトキシ−４−オキソ−Ｎ−フェニル−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミド（化合物２５）（１５０ｍｇ、０．４６２ｍｍｏｌ）から調製して、５，７−ジヒドロキシ−４−オキソ−Ｎ−フェニル−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミド。（化合物２７）を灰白色の固体として得た（１５ｍｇ、収率３．３％）。分取ＨＰＬＣ法Ｄ。ＬＣＭＳ：９５．６６％（ＲＴ：１．６０９，２７２．０ｎｍ）（ＭＳ：ＥＳＩ＋ｖｅ  ２９７．２１［Ｍ｀＋Ｈ］）．１Ｈ  ＮＭＲ：（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  ｐｐｍ：６．２３２（ｓ，１Ｈ），６．５００（ｓ，１Ｈ），７．０８２−７．１１７（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７），７．３４５−７．３８０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７），７．４５１（ｓ，２Ｈ），８．７１０（ｓ，１Ｈ），１０．６７３（ｓ，１Ｈ），１１．６９２（ｓ，１Ｈ），１２．９２２（ｓ，１Ｈ），１３．６９６（ｓ，１Ｈ）．
【０４２２】
実施例７４
５，６，７−トリヒドロキシ−Ｎ−（３−ヒドロキシフェニル）−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドの調製。（化合物３２）
【化７９】
2020529432.tif 000093
【０４２３】
５，６，７−トリヒドロキシ−４−オキソ−Ｎ−（３，４，５−トリヒドロキシフェニル）−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミド（化合物２０）について記載される手順と同様の手順により、Ｎ−（３−ヒドロキシフェニル）−５，６，７−トリメトキシ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミド（化合物２８）（１５０ｍｇ、０．４０５ｍｍｏｌ）から調製して、５，６，７−トリヒドロキシ−Ｎ−（３−ヒドロキシフェニル）−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミド（化合物３２）を灰白色の固体として得た（４ｍｇ、収率３．０％）。分取ＨＰＬＣ法Ｄ。ＬＣＭＳ：９７．２８  ％（ＲＴ：１．８２８，２０２ｎｍ）（ＭＳ：ＥＳＩ−ｖｅ  ３２７．３［Ｍ−Ｈ］）．１Ｈ  ＮＭＲ：（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  ｐｐｍ：６．４７８−６．４９８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８），６．６５０（ｓ，１Ｈ），６．９８９−７．００９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８），７．１０２−７．１４２（ｔ，１Ｈ  Ｊ＝８），７．３３３（ｓ，１Ｈ），８．２３０（ｓ，１Ｈ），８．６２５（ｓ，１Ｈ），９．４７２（ｓ，１Ｈ），１１．７４４（ｓ，１Ｈ）１３．５３７（ｓ，１Ｈ）．
【０４２４】
実施例７５
５，６，７−トリヒドロキシ−４−オキソ−Ｎ−フェニル−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドの調製。（化合物３３）
【化８０】
2020529432.tif 000094
【０４２５】
５，６，７−トリヒドロキシ−４−オキソ−Ｎ−（３，４，５−トリヒドロキシフェニル）−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミド（化合物２０）について記載される手順と同様の手順により、５，６，７−トリメトキシ−４−オキソ−Ｎ−フェニル−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミド（５００ｍｇ、１．４１２ｍｍｏｌ）（化合物３０）から調製して、５，６，７−トリヒドロキシ−４−オキソ−Ｎ−フェニル−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミド（化合物３３）を灰白色の固体として得た（２０ｍｇ、収率４．５％）。分取ＨＰＬＣ法Ｃ。ＬＣＭＳ：１００．００％（ＲＴ：１．４８１，２２９．０ｎｍ）（ＭＳ：ＥＳＩ−ｖｅ  ３１１．２５［Ｍ−Ｈ］）．１Ｈ  ＮＭＲ：（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  ｐｐｍ：６．６２（ｓ，１Ｈ），７．１２−７．０８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８），７．３９−７．３５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８），７．７４−７．７２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８），８．６７（ｓ，１Ｈ），８．８３（ｓ，１Ｈ），１０．５０（ｓ，１Ｈ），１１．８１（ｓ，１Ｈ），１２．９０（ｓ，１Ｈ），１３．５４（ｓ，１Ｈ）．
【０４２６】
実施例７６
５，６，７−トリヒドロキシ−Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドの調製。（化合物３８）
【化８１】
2020529432.tif 000095
【０４２７】
５，６，７−トリヒドロキシ−４−Ｎ−（３，４，５−トリヒドロキシフェニル）−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミド（化合物２０）について記載される手順と同様の手順により、Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）−５，６，７−トリメトキシ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミド（化合物２９）（１００ｍｇ、０．２７０ｍｍｏｌ）から調製して、５，６，７−トリヒドロキシ−Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミド（化合物３８）を灰白色の固体として得た（７ｍｇ、７．９％収率）。分取ＨＰＬＣ法Ｃ。ＬＣＭＳ：９５．９５％（ＲＴ：２．９０７，２７８．０ｎｍ）（ＭＳ：ＥＳＩ＋ｖｅ  ３２９．４３［Ｍ＋Ｈ］）．１Ｈ  ＮＭＲ：（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  ｐｐｍ：６．５９３（ｓ，１Ｈ），６．７３２−６．７５４（ｄ，２Ｈ  Ｊ＝８．８），７．４９５−７．５１６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４），８．６１８（ｓ，１Ｈ），８．７９５（ｓ，１Ｈ）９．２７２，（ｓ，１Ｈ），１０．４０９（ｓ，１Ｈ），１１．５２９（ｓ，１Ｈ），１２．８３９（ｓ，１Ｈ），１３．５７４（ｓ，１Ｈ）．
【０４２８】
実施例７７
５，７−ジヒドロキシ−Ｎ−メチル−４−オキソ−Ｎ−（３，４，５−トリヒドロキシフェニル）−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドの調製。（化合物４２）
【化８２】
2020529432.tif 000096
【０４２９】
５，６，７−トリヒドロキシ−４−オキソ−Ｎ−（３，４，５−トリヒドロキシフェニル）−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミド（化合物２０）について記載される手順と同様の手順により、５，７−ジメトキシ−Ｎ−メチル−４−オキソ−Ｎ−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミド（１５０ｍｇ、０．３５０ｍｍｏｌ）から調製して、５，７−ジヒドロキシ−Ｎ−メチル−４−オキソ−Ｎ−（３，４，５−トリヒドロキシフェニル）−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミド（化合物４２）を灰白色の固体として得た（４ｍｇ、３．１９％）。分取ＨＰＬＣ法Ｇ。ＬＣＭＳ：１００．００％（ＲＴ：１．２５２，２０２ｎｍ）（ＭＳ：ＥＳＩ＋ｖｅ  ３５９．２６［Ｍ＋Ｈ］）．１Ｈ  ＮＭＲ：（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  ｐｐｍ：３．１９７（ｓ，３Ｈ），５．９９５（ｓ，１Ｈ），６．１８６（ｓ，３Ｈ），７．７７４（ｓ，１Ｈ），８．１１７（ｓ，１Ｈ），８．９２５（ｓ，２Ｈ），１０．９２６（ｓ，１Ｈ），１１．８７０（ｓ，１Ｈ），１４．３８６（ｓ，１Ｈ）．
【０４３０】
実施例７８
５，７−ジヒドロキシ−Ｎ−（３−ヒドロキシフェニル）−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドの調製。（化合物４８）
【化８３】
2020529432.tif 000097
【０４３１】
５，６，７−トリヒドロキシ−４−オキソ−Ｎ−（３，４，５−トリヒドロキシフェニル）−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミド（化合物２０）について記載される手順と同様の手順により、Ｎ−（３−ヒドロキシフェニル）−５，７−ジメトキシ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミド（化合物２６）（１００ｍｇ、０．２９４ｍｍｏｌ）から調製して、５，７−ジヒドロキシ−Ｎ−（３−ヒドロキシフェニル）灰白色の固体としての−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミド（化合物４８）を灰白色の固体として得た。分取ＨＰＬＣ法Ｇ。ＬＣＭＳ：９８．５４％（ＲＴ：１．４６４，２６３．０ｎｍ）（ＭＳ：ＥＳＩ  ｖｅ  ３１３．３１［Ｍ＋Ｈ］）．１Ｈ  ＮＭＲ：（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  ｐｐｍ：６．２３１（ｓ，１Ｈ），６．５１７−６．５０９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝３．２），７．０１２−６．９９２（ｄ，１Ｈ  Ｊ＝８．０），７．１５７−７．１３７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０），７．１３７−７．１１７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０），７．３４０（ｓ，１Ｈ），８．７２１−８．７０４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．８），９．４８１（ｓ，１Ｈ），１０．７０４（ｓ，１Ｈ），１１．５８７（ｓ，１Ｈ），１２．９２０−１２．９０５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．６），１３．６５０（ｓ，１Ｈ）．
【０４３２】
実施例７９
５，６，７−トリヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシフェニル）−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドの調製。（化合物４３）
【化８４】
2020529432.tif 000098
【０４３３】
５，６，７−トリヒドロキシ−４−Ｎ−（３，４，５−トリヒドロキシフェニル）−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミド（化合物２０）について記載される手順と同様の手順により、Ｎ−（２−ヒドロキシフェニル）−５，６，７−トリメトキシ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミド（１００ｍｇ、０．２７０ｍｍｏｌ）（化合物３９）から調製して、５，６，７−トリヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシフェニル）−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミド（化合物４３）を灰白色の固体として得た（７．０ｍｇ、収率７．１％）。分取ＨＰＬＣ法Ｄ。ＬＣＭＳ：１００．００％（ＲＴ：１．４２３，２７８．０ｎｍ）（ＭＳ：ＥＳＩ−ｖｅ  ３２７．４［Ｍ−Ｈ］）．１Ｈ  ＮＭＲ：（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  ｐｐｍ：６．６００（ｓ，１Ｈ），６．８０２（ｍ，１Ｈ），６．９０３−６．９１３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４），８．３８０−８．４００（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８），８．６５１（ｓ，２Ｈ），９．９９８（ｓ，２Ｈ），１１．８２３（ｓ，１Ｈ）１２．８００（ｓ，１Ｈ），１３．７５２（ｓ，１Ｈ）．
【０４３４】
実施例８０
Ｎ−（３，５−ジヒドロキシフェニル）−５，７−ジヒドロキシ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドの調製。（化合物４７）
【化８５】
2020529432.tif 000099
【０４３５】
５，６，７−トリヒドロキシ−４−オキソ−Ｎ−（３，４，５−トリヒドロキシフェニル）−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミド（化合物２０）について記載される手順と同様の手順により、Ｎ−（３，５−ジメトキシフェニル）−５，７−ジメトキシ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミド（化合物４９）（０．１５ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ）から調製して、Ｎ−（３，５−ジヒドロキシフェニル）−５を得る、７−ジヒドロキシ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミド（化合物４７）を灰白色の固体として得た（５ｍｇ、収率３．９％）。分取ＨＰＬＣ法Ｃ。ＬＣＭＳ：９８．１０％（ＲＴ：１．３７３，２３０．０ｎｍ）（ＭＳ：ＥＳＩ＋ｖｅ  ３２９．３１［Ｍ＋Ｈ］）．１Ｈ  ＮＭＲ：（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  ｐｐｍ：５．９６（ｓ，１Ｈ），６．２０（ｓ，１Ｈ），６．４９（ｓ，１Ｈ），６．６３（ｓ，２Ｈ），８．６９（ｓ，１Ｈ），９．２８（ｓ，２Ｈ）１０．６１（ｓ，１Ｈ）１１．５２（ｓ，１Ｈ）１２．８４（ｓ，１Ｈ）１３．７３（ｓ，１Ｈ）．
【０４３６】
実施例８１
３，４，５−トリメトキシフェニル５，６，７−トリメトキシ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキシレートの調製。（化合物２３）
【化８６】
2020529432.tif 000100
【０４３７】
工程１：３，４，５−トリメトキシフェニル５，６，７−トリメトキシ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキシレートの合成。（化合物２３）
【化８７】
2020529432.tif 000101
【０４３８】
ジメチルホルムアミド（２５ｍＬ）中の５，６，７−トリメトキシ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸（５００ｍｇ、１．７９０ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルピリジン−４−アミン（２１８ｍｇ、１．７９０ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ−ジメチルピリジン−４−アミン（２１８ｍｇ、１．７９０ｍｍｏｌ）を０℃に冷却した。（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）（１．７ｇ、４．４７６ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を３０分間撹拌した。３，４，５−トリメトキシフェノール（３２９．７ｍｇ、１．７９０ｍｍｏｌ）、続いてＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１．２ｍＬ、７．１６２ｍｍｏｌ）を加えた。混合物をゆっくりと室温まで温め、１６時間撹拌した。反応混合物を氷水（５０ｍＬ）に入れてクエンチし、生じた沈殿物を濾過により収集し、メタノールと共に摩砕した。粗残渣をメタノール：ジクロロメタンで溶出するカラムクロマトグラフィーにより精製して生成物１４０ｍｇを得て、これを逆相分取ＨＰＬＣにより更に精製して３，４，５−トリメトキシフェニル５，６，７−トリメトキシ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキシレート（化合物２３）を白色固体として得た（３５．８ｍｇ、４．４９％）。分取ＨＰＬＣ法Ｃ。ＬＣＭＳ：９７．８５％（ＲＴ：１．４０２，２５９．０ｎｍ）（ＭＳ：ＥＳＩ＋ｖｅ  ４４６．４６［Ｍ＋Ｈ］）．１Ｈ  ＮＭＲ：（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  ｐｐｍ：３．３６（ｓ，３Ｈ），３．７８（ｓ，１２Ｈ），３．９１（ｓ，３Ｈ），６．５５（ｓ，２Ｈ），６．９４（ｓ，１Ｈ），８．６０（ｓ，１Ｈ），１２．１０−１２．１２（ｓ，１Ｈ）．
【０４３９】
実施例８２
３，４，５−トリメトキシフェニル５，７−ジメトキシ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキシレートの調製。（化合物２４）
【化８８】
2020529432.tif 000102
【０４４０】
３，４，５−トリメトキシフェニル５，６，７−トリメトキシ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキシレート（化合物２３）について記載した手順と同様の手順で、５，７−ジメトキシ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸（０．９ｇ、３．６１ｍｍｏｌ）及び３，４，５−トリメトキシフェノールからの調製は、５，７−ジメトキシ−４−オキソ−Ｎ−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキサミドｆ（４０ｍｇ、２．７％収率）を灰白色固体として与えた。分取ＨＰＬＣ法Ｄ。ＬＣＭＳ：９８．１２％（ＲＴ：１．４９５，２６１．０ｎｍ）（ＭＳ：ＥＳＩ＋ｖｅ  ４１６．４９［Ｍ＋Ｈ］）．１Ｈ  ＮＭＲ：（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）（６９２７４）δ  ｐｐｍ：３．６６（ｓ，３Ｈ）３．７７（ｓ，６Ｈ）３．８０（ｓ，３Ｈ）３．９１（ｓ，３Ｈ）６．４４−６．６０（ｍ，４Ｈ），８．５２（ｓ，１Ｈ）１１．９８（ｓ，１Ｈ）．
【０４４１】
一般に、本明細書及び特に添付の特許請求の範囲（例えば、添付された特許請求の範囲の本文）で用いられる用語は、一般に、「開放」用語（例えば、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、「含んでいるが、それに限定されるものではない」と解釈すべきであり、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語は、「少なくとも有する」と解釈すべきであり、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」という用語は、「含むが、それに限定されるものではない」と解釈すべきである等）として意図されていることが、当業者によって理解されよう。さらに当業者であれば、特定数の導入されたクレームレシテーション（ｃｌａｉｍ  ｒｅｃｉｔａｔｉｏｎ）が意図的である場合には、かかる意図が、そのクレームにおいて明示的に挙げられ、かかるレシテーションがなければ、かかる意図が存在しないことが理解されよう。例えば、理解の助けとして、以下の添付された特許請求の範囲には、クレームレシテーションを導入するために、導入句「少なくとも１つの」及び「１又は複数の」の使用を含んでもよい。しかしながら、かかる句の使用は、不定冠詞「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」によるクレームレシテーションの導入は、かかる導入されたクレームレシテーションを含む任意の特定のクレームを、ただ１つのかかるレシテーションを含む発明に限定することを意味すると解釈すべきではなく、たとえ同じクレームが、導入句「１又は複数の」又は「少なくとも１つの」、並びに「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」等の不定冠詞（例えば、「１つの（ａ）」及び／又は「１つの（ａｎ）」は、「少なくとも１つの」又は「１又は複数の」を意味すると解釈すべきである）を含む場合であっても同様であり；同じことが、クレームレシテーションを導入するために用いられる定冠詞の使用にも当てはまる。さらに、たとえ導入されたクレームレシテーションの特定の数が、明示的に挙げられている場合であっても、当業者は、かかるレシテーションが、少なくとも挙げられた数を意味するように解釈されるべきであると認識する（例えば、他の修飾語がない「２つのレシテーション」のベアレシテーション（ｂａｒｅ  ｒｅｃｉｔａｔｉｏｎ）は、少なくとも２つのレシテーション、又は２つ以上のレシテーション意味する）。さらに、「Ａ、Ｂ及びＣの少なくとも１つ等」に類似した慣用語が用いられる例において、一般に、かかる構成は、当業者がその慣用語を理解するであろう意味に意図されている（例えば、「Ａ、Ｂ及びＣの少なくとも１つを有するシステム」は、限定されないが、Ａだけ、Ｂだけ、Ｃだけ、Ａ及びＢを一緒に、Ａ及びＣを一緒に、Ｂ及びＣを一緒に、及び／又はＡ、Ｂ及びＣを一緒に有するシステムを含む等）。「Ａ、Ｂ及びＣの少なくとも１つ等」に類似した慣用語が用いられる例において、一般に、かかる構成は、当業者がその慣用語を理解するであろう意味に意図されている（例えば、「Ａ、Ｂ及びＣの少なくとも１つを有するシステム」は、限定されないが、Ａだけ、Ｂだけ、Ｃだけ、Ａ及びＢを一緒に、Ａ及びＣを一緒に、Ｂ及びＣを一緒に、及び／又はＡ、Ｂ及びＣを一緒に有するシステムを含む等）。さらに、２つ以上の代替用語を表す実質的に任意の離接語及び／又��句は、明細書、特許請求の範囲又は図面にあっても、用語の１つ、用語のどちらか、又は両方の用語を含む可能性を考慮するように理解すべきである。例えば「Ａ又はＢ」の句は、「Ａ」若しくは「Ｂ」、又は「Ａ及びＢ」の可能性を含むように理解されよう。
【０４４２】
さらに、本開示の特徴又は態様がマーカッシュグループに関して記載されている場合、当業者は、それにより、マーカッシュグループの個々の任意のメンバー又はメンバーのサブグループに関しても本開示が記載されることを認識するであろう。
【０４４３】
当業者には理解されるように、書面による説明の提供等のあらゆる目的のために、本明細書に開示される全ての範囲は、あり得るあらゆる部分範囲及びその部分範囲の組み合わせも包含する。列挙される任意の範囲は、同じ範囲を少なくとも同等の半分、３分の１、４分の１、５分の１、１０分の１等に分割し、十分に記載し、有効にするものとして容易に認識され得る。非限定的な例として、本明細書に記載される各範囲は、下３分の１、中３分の１、上３分の１等に容易に分割され得る。また、当業者によって理解されるように、「最大」、「少なくとも」、「より大きい」、「より小さい」等の全ての言語は、列挙された数を含み、上記のように後に続くことができる範囲を指す部分範囲に分割され得る。最後に、当業者に理解されるように、範囲には各個々のメンバーが含まれる。したがって、例えば、１個〜３個の物を持つ群は、１個、２個、又は３個の物を持つ群を指す。同様に、１個〜５個の物を有する群とは、１個、２個、３個、４個、又は５個の物を有する群等を指す。
【０４４４】
組成物を使用する方法（例えば、アミロイド障害を有する被験体に組成物を投与することを含む方法）が本明細書で開示される場合は常に、使用のための対応する組成物も明確に企図される。例えば、アミロイド障害の抑制、改善、可能性の低減、発症の遅延、治療、又は予防の方法の開示について、組成物を被験体に投与すること、アミロイド障害の阻害、改善、可能性の低減、発症の遅延、治療、又は予防に使用するための対応する組成物も明確に企図される。
【０４４５】
本明細書において様々な態様及び実施形態を開示したが、他の態様及び実施形態が、当業者には明らかであろう。本明細書で開示される様々な態様及び実施形態は、例示のためであり、限定的であるようには意図されておらず、真の範囲及び趣旨は、以下の特許請求の範囲によって示される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図１Ｉ】
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【図１Ｊ】
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【図１Ｋ】
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【図１Ｌ】
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【図１Ｍ】
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【図１Ｎ】
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【図１Ｏ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図２Ｉ】
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【図２Ｊ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図３Ｉ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図５Ｉ】
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【図５Ｊ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ−Ｈ】
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【図６Ｉ】
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【図６Ｊ】
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【図６Ｋ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ−Ｄ】
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【図７Ｅ−Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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