(57)【要約】本開示は、前駆体核酸脂質ナノ粒子の形成後に修飾剤を使用する核酸脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物を生成する新規の方法、その生成された組成物、ならびに、例えばポリペプチド、タンパク質、または遺伝子発現を調節するための哺乳動物細胞または臓器に対する核酸などの治療薬及び／または予防薬の送達に有用な核酸脂質ナノ粒子を含む方法を特徴とする。【選択図】図１
2020532528.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸脂質ナノ粒子組成物の生成方法であって、
イオン化可能脂質を含む脂質溶液を核酸を含む溶液と混合し、それにより前駆体核酸脂質ナノ粒子を形成することと；
修飾剤を含む脂質ナノ粒子修飾剤を前記前駆体核酸脂質ナノ粒子に添加し、それにより修飾された核酸脂質ナノ粒子を形成することと；
前記前駆体核酸脂質ナノ粒子、前記修飾された核酸脂質ナノ粒子、またはその両方を処理することにより、前記核酸脂質ナノ粒子組成物を形成することと、を含む前記方法。
【請求項２】
前記前駆体核酸脂質ナノ粒子が、前記脂質ナノ粒子修飾剤を添加する前に処理されない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記前駆体核酸脂質ナノ粒子が、前記脂質ナノ粒子修飾剤を添加する前に処理される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記脂質溶液が、第１のＰＥＧ脂質をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記前駆体核酸脂質ナノ粒子が、第１のＰＥＧ脂質をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記脂質溶液が、ＰＥＧ脂質を全く含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記前駆体核酸脂質ナノ粒子が、ＰＥＧ脂質を全く含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記前駆体核酸脂質ナノ粒子がリン脂質をさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記前駆体核酸脂質ナノ粒子が、構造脂質をさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記修飾剤が、第２のＰＥＧ脂質及び界面活性剤からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記修飾剤が第２のＰＥＧ脂質である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記修飾剤が界面活性剤である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１のＰＥＧ脂質対前記修飾剤のモル比が、約１：１００〜約１：１、約１：５０〜約１：１、約１：２５〜約１：１、または約１：１０〜約１：１の範囲内である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記混合することが、乱流混合及び／または微小流体混合を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記処理することが濾過を含み、必要に応じて、前記処理することがタンジェント流濾過を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記処理することが、凍結及び／または凍結乾燥を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記核酸脂質ナノ粒子組成物を包装することをさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１のＰＥＧ脂質及び前記第２のＰＥＧ脂質が同一である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１のＰＥＧ脂質及び前記第２のＰＥＧ脂質が同一ではない、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記第２のＰＥＧ脂質対前記第１のＰＥＧ脂質のモル比が、約１：１〜約１００：１、または約１：１〜約１０：１の範囲内である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記前駆体核酸脂質ナノ粒子が、
約３０〜６０ｍｏｌ％のイオン化可能脂質と；
約０〜３０ｍｏｌ％のリン脂質と；
約１５〜５０ｍｏｌ％の構造脂質と；
約０．０１〜１０ｍｏｌ％の前記第１のＰＥＧ脂質と、
を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記前駆体核酸脂質ナノ粒子が、
約３０〜６０ｍｏｌ％のイオン化可能脂質と；
約０〜３０ｍｏｌ％のリン脂質と；
約１５〜５０ｍｏｌ％の構造脂質と；
約０．０１〜１ｍｏｌ％の前記第１のＰＥＧ脂質と、
を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記前駆体核酸脂質ナノ粒子組成物が、
約３０〜６０ｍｏｌ％のイオン化可能脂質と；
約０〜３０ｍｏｌ％のリン脂質と；
約１５〜５０ｍｏｌ％の構造脂質と；
約０．０１〜２０ｍｏｌ％の総量の前記第１のＰＥＧ脂質及び第２のＰＥＧ脂質と、
を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記前駆体核酸脂質ナノ粒子組成物が、
約４０〜６０ｍｏｌ％のイオン化可能脂質と；
約５〜１５ｍｏｌ％のリン脂質と；
約３５〜４５ｍｏｌ％の構造脂質と；
約０．５〜３．０ｍｏｌ％の総量の前記第１のＰＥＧ脂質及び前記第２のＰＥＧ脂質と、
を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記前駆体核酸脂質ナノ粒子内の前記核酸の約９０％〜約１００％、約９５％〜約１００％、または約９８％〜約１００％が、前記イオン化可能脂質と結合している、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記前駆体核酸脂質ナノ粒子内の前記核酸の全てが、前記イオン化可能脂質と結合している、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記核酸脂質ナノ粒子組成物中の前記核酸の約９０％〜約１００％、約９５％〜約１００％、または約９８％〜約１００％が前記イオン化可能脂質と結合している、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記核酸脂質ナノ粒子組成物中の前記核酸の全てが、前記イオン化可能脂質と結合している、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記核酸脂質ナノ粒子組成物が、前記核酸をカプセル化する修飾された脂質ナノ粒子を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記修飾された核酸脂質ナノ粒子が、前記核酸をカプセル化する修飾された脂質ナノ粒子を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記修飾された核酸脂質ナノ粒子が、前記修飾剤と結合した修飾された脂質ナノ粒子を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記核酸脂質ナノ粒子組成物が、前記修飾剤と結合した修飾された脂質ナノ粒子を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記修飾された脂質ナノ粒子が、１つ以上の共有結合を介して前記修飾剤と結合している、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記修飾された脂質ナノ粒子が、１つ以上の非共有相互作用を介して前記修飾剤と結合している、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記修飾された脂質ナノ粒子対前記核酸のｗｔ／ｗｔ比が、約１０：１〜約６０：１の範囲内である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記第１のＰＥＧ脂質及び前記第２のＰＥＧ脂質が、各々独立して、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、及びＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロールからなる群から選択される少なくとも１つのＰＥＧ脂質である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記第１のＰＥＧ脂質及び前記第２のＰＥＧ脂質が、各々独立して、式（ＰＬ−Ｉ）：
【化１】
2020532528.tif 000056
の化合物
またはその塩であり、式中：
Ｒ３は、−ＯＲＯであり；
ＲＯは、水素、必要に応じて置換されたアルキル、または酸素保護基であり；
ｒは１〜１００の整数であり、両端を含み；
Ｌ１は、必要に応じて置換されたＣ１−１０アルキレンであり、前記必要に応じて置換されたＣ１−１０アルキレンの少なくとも１つのメチレンは、必要に応じて置換されたカルボシクリレン、必要に応じて置換されたヘテロシクリレン、必要に応じて置換されたアリーレン、必要に応じて置換されたヘテロアリーレン、Ｏ、Ｎ（ＲＮ）、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、またはＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）によって独立して置き換えられ；
Ｄは、クリックケミストリーによって得られる部分または生理学的条件下で切断可能な部分であり；
ｍは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり；
Ａは、式：
【化２】
2020532528.tif 000057
であり；
Ｌ２の各々の例は、独立して、結合または必要に応じて置換されたＣ１−６アルキレンであり、前記必要に応じて置換されたＣ１−６アルキレンの１つのメチレン単位は、Ｏ、Ｎ（ＲＮ）、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、またはＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）によって必要に応じて置き換えられ；
Ｒ２の各々の例は、独立して、必要に応じて置換されたＣ１−３０アルキル、必要に応じて置換されたＣ１−３０アルケニル、または必要に応じて置換されたＣ１−３０アルキニルであり；必要に応じて、Ｒ２の１つ以上のメチレン単位は、必要に応じて置換されたカルボシクリレン、必要に応じて置換されたヘテロシクリレン、必要に応じて置換されたアリーレン、必要に応じて置換されたヘテロアリーレン、Ｎ（ＲＮ）、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、Ｓ（Ｏ）、ＯＳ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｏ、−ＯＳ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２Ｏ、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ、Ｓ（Ｏ）２、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、または−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏによって独立して置き換えられ；
ＲＮの各々の例は、独立して、水素、必要に応じて置換されたアルキル、または窒素保護基であり；
環Ｂは、必要に応じて置換されたカルボシクリル、必要に応じて置換されたヘテロシクリル、必要に応じて置換されたアリール、または必要に応じて置換されたヘテロアリールであり；
ｐは１または２である、
先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記第１のＰＥＧ脂質及び前記第２のＰＥＧ脂質が、各々独立して、式（ＰＬ−Ｉ−ＯＨ）：
【化３】
2020532528.tif 000058
の化合物またはその塩である、
先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記第１のＰＥＧ脂質及び前記第２のＰＥＧ脂質が、各々独立して、式（ＰＬ−ＩＩ）：
【化４】
2020532528.tif 000059
の化合物またはその塩であり、式中：
Ｒ３は−ＯＲＯであり；
ＲＯは、水素、必要に応じて置換されたアルキル、または酸素保護基であり；
ｒは１〜１００の整数であり；
Ｒ５は、必要に応じて置換されたＣ１０−４０アルキル、必要に応じて置換されたＣ１０−４０アルケニル、または必要に応じて置換されたＣ１０−４０アルキニルであり；必要に応じて、Ｒ５の１つ以上のメチレン基は、必要に応じて置換されたカルボシクリレン、必要に応じて置換されたヘテロシクリレン、必要に応じて置換されたアリーレン、必要に応じて置換されたヘテロアリーレン、Ｎ（ＲＮ）、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）、−ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、Ｓ（Ｏ）、ＯＳ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２Ｏ、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）、−Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ、Ｓ（Ｏ）２、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、またはＮ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏによって置き換えられ；
ＲＮの各々の例は、独立して、水素、必要に応じて置換されたアルキル、または窒素保護基である、
先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記第１のＰＥＧ脂質及び前記第２のＰＥＧ脂質が、各々独立して、式（ＰＬ−ＩＩ−ＯＨ）：
【化５】
2020532528.tif 000060
の化合物またはその塩であり、式中：
ｒは１〜１００の整数であり；
Ｒ５は、必要に応じて置換されたＣ１０−４０アルキル、必要に応じて置換されたＣ１０−４０アルケニル、または必要に応じて置換されたＣ１０−４０アルキニルであり；必要に応じて、Ｒ５の１つ以上のメチレン基は、必要に応じて置換されたカルボシクリレン、必要に応じて置換されたヘテロシクリレン、必要に応じて置換されたアリーレン、必要に応じて置換されたヘテロアリーレン、Ｎ（ＲＮ）、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、−ＮＲＮＣ（Ｏ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）、−ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、Ｓ（Ｏ）、ＯＳ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２Ｏ、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）、−Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ、Ｓ（Ｏ）２、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、またはＮ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏによって置き換えられ；
ＲＮの各々の例は、独立して、水素、必要に応じて置換されたアルキル、または窒素保護基である、
先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
ｒが４０〜５０の整数である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
ｒが４５である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
Ｒ５がＣ１７アルキルである、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記第１のＰＥＧ脂質及び前記第２のＰＥＧ脂質が、各々独立して、式（ＰＬ−ＩＩ）：
【化６】
2020532528.tif 000061
の化合物またはその塩である、
先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記第１のＰＥＧ脂質及び前記第２のＰＥＧ脂質が、各々独立して、式（ＰＬ−ＩＩ）：
【化７】
2020532528.tif 000062
である、
先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記第１のＰＥＧ脂質及び前記第２のＰＥＧ脂質が、各々独立して、式（ＰＬ−ＩＩＩ）：
【化８】
2020532528.tif 000063
の化合物、またはその塩もしくは異性体であり、式中、ｓが１〜１００の整数である、
先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記第１のＰＥＧ脂質及び前記第２のＰＥＧ脂質が、各々独立して、以下の式：
【化９】
2020532528.tif 000064
の化合物である、
先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記界面活性剤が両親媒性ポリマーである、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記界面活性剤が非イオン性界面活性剤である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記非イオン性界面活性剤が、ポリエチレングリコールエーテル（Ｂｒｉｊ）、ポロキサマー、ポリソルベート、ソルビタン、及びそれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１つの界面活性剤である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記ポリエチレングリコールエーテルが、式（Ｓ−１）：
【化１０】
2020532528.tif 000065
の化合物、あるいはその塩及び／または異性体であり、式中：
ｔは１〜１００の整数であり；
Ｒ１ＢＲＩＪはＣ１０−４０アルキル、Ｃ１０−４０アルケニル、またはＣ１０−４０アルキニルであり；
必要に応じて、Ｒ５ＰＥＧの１つ以上のメチレン基は、Ｃ３−１０カルボシクリレン、４〜１０員のヘテロシクリレン、Ｃ６−１０アリーレン、４〜１０員のヘテロアリーレン、−Ｎ（ＲＮ）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｏ）−、−Ｃ（＝ＮＲＮ）−、−Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｓ）−、−ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＯＳ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）２Ｏ−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）−、−ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）−、または−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏ−によって独立して置き換えられ；
ＲＮの各々の例は、独立して、Ｃ１−６アルキル、または窒素保護基である、
先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
Ｒ１ＢＲＩＪがＣ１８アルキルである、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記ポリエチレングリコールエーテルが、式（Ｓ−ｌａ）：
【化１１】
2020532528.tif 000066
の化合物、あるいはその塩及び／または異性体であり、式中、ｓが１〜１００の整数である、
先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
Ｒ１ＢＲＩＪがＣ１８アルケニルである、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記ポリエチレングリコールエーテルが、式（Ｓ−１ｂ）：
【化１２】
2020532528.tif 000067
の化合物、あるいはその塩及び／または異性体であり、式中、ｓが１〜１００の整数である、
先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
前記ポロキサマーが、ポロキサマー１０１、ポロキサマー１０５、ポロキサマー１０８、ポロキサマー１２２、ポロキサマー１２３、ポロキサマー１２４、ポロキサマー１８１、ポロキサマー１８２、ポロキサマー１８３、ポロキサマー１８４、ポロキサマー１８５、ポロキサマー１８８、ポロキサマー２１２、ポロキサマー２１５、ポロキサマー２１７、ポロキサマー２３１、ポロキサマー２３４、ポロキサマー２３５、ポロキサマー２３７、ポロキサマー２３８、ポロキサマー２８２、ポロキサマー２８４、ポロキサマー２８８、ポロキサマー３３１、ポロキサマー３３３、ポロキサマー３３４、ポロキサマー３３５、ポロキサマー３３８、ポロキサマー４０１、ポロキサマー４０２、ポロキサマー４０３、及びポロキサマー４０７からなる群から選択される少なくとも１つのポロキサマーである、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記ポリソルベートが、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）４０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）６０、及びＴｗｅｅｎ（登録商標）８０からなる群から選択される少なくとも１つのポリソルベートである、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
前記ソルビタンが、Ｓｐａｎ（登録商標）２０、Ｓｐａｎ（登録商標）６０、Ｓｐａｎ（登録商標）６５、Ｓｐａｎ（登録商標）８０、及びＳｐａｎ（登録商標）８５からなる群から選択される少なくとも１つのソルビタンである、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
前記構造脂質が、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、ウルソール酸、アルファ−トコフェロール、及びそれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１つの脂質である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記リン脂質が、以下からなる群から選択される少なくとも１つの脂質である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法：
１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジウンデカノイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン（ＤＵＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：０  Ｄｉｅｔｈｅｒ  ＰＣ）、１−オレオイル−２−コレステリルヘミスクシノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、１−ヘキサデシル−ｓｎ−グリセロ−３ホスホコリン（Ｃ１６  Ｌｙｓｏ  ＰＣ）、１，２−ジリノレノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジアラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＭＥ  １６．０  ＰＥ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジリノレノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジアラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）、スフィンゴミエリン、及びそれらの誘導体。
【請求項６１】
前記イオン化可能脂質が、イオン化可能アミノ脂質を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
前記イオン化可能脂質が式（ＩＬ−１）：
【化１３】
2020532528.tif 000068
の化合物またはそれらのＮ−オキシド、またはその塩もしくは異性体であり、式中：
Ｒ１は、Ｃ５−３０アルキル、Ｃ５−２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され；
Ｒ２及びＲ３は、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、Ｃ２−１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から独立して選択されるか、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって複素環もしくは炭素環を形成し；
Ｒ４は、水素、Ｃ３−６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、−ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換のＣ１−６アルキルからなる群から選択され、Ｑは、炭素環、複素環、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ８、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、及び−Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各々のｎは、１、２、３、４、及び５から独立して選択され；
各々のＲ５は、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され；
各々のＲ６は、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され；
Ｍ及びＭ’は、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）−Ｍ”−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、及びヘテロアリール基から独立して選択され、Ｍ”は結合、Ｃ１−１３アルキル、またはＣ２−１３アルケニルであり；
Ｒ７は、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され；
Ｒ８は、Ｃ３−６炭素環及び複素環からなる群から選択され；
Ｒ９は、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１−６アルキル、−ＯＲ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ３−６炭素環及び複素環からなる群から選択され；
各々のＲは、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され；
各々のＲ’は、Ｃ１−１８アルキル、Ｃ２−１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及びＨからなる群から独立して選択され；
各々のＲ”は、Ｃ３−１５アルキル及びＣ３−１５アルケニルからなる群から独立して選択され；
各々のＲ＊は、Ｃ１−１２アルキル及びＣ２−１２アルケニルからなる群から独立して選択され；
各々のＹは、独立してＣ３−６炭素環であり；
各々のＸは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から独立して選択され；
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択され；Ｒ４が−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、または−ＣＱ（Ｒ）２であるとき、（ｉ）ｎが１、２、３、４、もしくは５であるときにＱは、−Ｎ（Ｒ）２でないか、または（ｉｉ）ｎが１もしくは２であるときにＱは、５、６、もしくは７員のヘテロシクロアルキルではない、
先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
前記イオン化可能脂質が式（ＩＬ−ＩＡ）：
【化１４】
2020532528.tif 000069
の化合物、
またはそのＮ−オキシド、またはその塩もしくは異性体であり、式中、ｌは、１、２、３、４、及び５から選択され；ｍは、５、６、７、８、及び９から選択され；Ｍ１は結合またはＭ’であり；Ｒ４は、水素、非置換のＣ１−３アルキル、または−（ＣＨ２）ｎＱであり、Ｑは、ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、−ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルであり；Ｍ及びＭ’は、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）−Ｍ”−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、及びヘテロアリール基から独立して選択され；ならびにＲ２及びＲ３は、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、及びＣ２−１４アルケニルからなる群から独立して選択され、いくつかの実施形態では、ｍは、５、７、または９であり、いくつかの実施形態では、Ｑは、ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、または−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２であり、いくつかの実施形態では、Ｑは、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、または−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒである、
先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
前記イオン化可能脂質が式（ＩＬ−ＩＢ）：
【化１５】
2020532528.tif 000070
の化合物、
またはそのＮ−オキシド、またはその塩もしくは異性体であり、全ての変数はここで定義されているものであり、いくつかの実施形態では、ｍは、５、６、７、８、及び９から選択され；Ｒ４は、水素、非置換のＣ１−３アルキル、または−（ＣＨ２）ｎＱであり、Ｑは、−ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、−ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルであり；Ｍ及びＭ’は、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）−Ｍ”−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、及びヘテロアリール基から独立して選択され；ならびにＲ２及びＲ３は、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、及びＣ２−１４アルケニルからなる群から独立して選択され、いくつかの実施形態では、ｍは、５、７、または９であり、いくつかの実施形態では、Ｑは、ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、または−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２であり、いくつかの実施形態では、Ｑは、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、または−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒである、
先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
前記イオン化可能脂質が式（ＩＬ−ＩＩ）：
【化１６】
2020532528.tif 000071
の化合物、
またはそのＮ−オキシド、またはその塩もしくは異性体であり、式中、ｌは、１、２、３、４、及び５から選択され；Ｍ１は結合またはＭ’であり；Ｒ４は、水素、非置換のＣ１−３アルキル、または−（ＣＨ２）ｎＱであり、ｎは、２、３、または４であり、Ｑは、−ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、−ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルであり；Ｍ及びＭ’は、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）−Ｍ”−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、及びヘテロアリール基から独立して選択され；ならびにＲ２及びＲ３は、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、及びＣ２−１４アルケニルからなる群から独立して選択される、
先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６６】
前記イオン化可能脂質が式（ＩＬ−ＩＩａ）：
【化１７】
2020532528.tif 000072
の化合物、またはそれらのＮ−オキシド、またはその塩もしくは異性体であり、式中、Ｒ４は本明細書において記載されるものである、
先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
前記イオン化可能脂質が式（ＩＬ−ＩＩｂ）：
【化１８】
2020532528.tif 000073
の化合物、またはそれらのＮ−オキシド、またはその塩もしくは異性体であり、式中、Ｒ４は本明細書において記載されるものである、
先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６８】
前記イオン化可能脂質が式（ＩＬ−ＩＩｃ）または（ＩＬ−ＩＩｅ）：
【化１９】
2020532528.tif 000074
の化合物、またはそれらのＮ−オキシド、またはその塩もしくは異性体であり、式中、Ｒ４は本明細書において記載されるものである、
先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６９】
前記イオン化可能脂質が式（ＩＬ−ＩＩｆ）：
【化２０】
2020532528.tif 000075
の化合物、またはそれらのＮ−オキシド、またはその塩もしくは異性体であり、式中、Ｍは、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−または−ＯＣ（Ｏ）−であり、Ｍ”は、Ｃ１−６アルキルまたはＣ２−６アルケニルであり、Ｒ２及びＲ３は、Ｃ５−１４アルキル及びＣ５−１４アルケニルからなる群から独立して選択され、ｎは、２、３、及び４から選択される、
先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７０】
前記イオン化可能脂質が式（ＩＬ−ＩＩｄ）：
【化２１】
2020532528.tif 000076
の化合物、またはそれらのＮ−オキシド、またはその塩もしくは異性体であり、式中、ｎは、２、３、または４であり；ｍ、Ｒ’、Ｒ”、及びＲ２〜Ｒ６は、本明細書において記載されるものであり、いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３の各々は、Ｃ５−１４アルキル及びＣ５−１４アルケニルからなる群から独立して選択され得る、
先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７１】
前記イオン化可能脂質が式（ＩＬ−ＩＩｇ）：
【化２２】
2020532528.tif 000077
の化合物、またはそれらのＮ−オキシド、またはその塩もしくは異性体であり、式中、ｌは、１、２、３、４、及び５から選択され；ｍは、５、６、７、８、及び９から選択され；Ｍ１は、結合またはＭ’であり；Ｍ及びＭ’は、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）−Ｍ”−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、及びヘテロアリール基から独立して選択され；ならびに、Ｒ２及びＲ３は、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、及びＣ２−１４アルケニルからなる群から独立して選択され、いくつかの実施形態では、Ｍ”は、Ｃ１−６アルキル（例えば、Ｃ１−４アルキル）またはＣ２−６アルケニル（例えば、Ｃ２−４アルケニル）であり、いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、Ｃ５−１４アルキル及びＣ５−１４アルケニルからなる群から独立して選択される、
先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７２】
前記イオン化可能脂質が、
【化２３】
2020532528.tif 000078
、またはその塩である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７３】
前記イオン化可能脂質が、
【化２４】
2020532528.tif 000079
、またはその塩である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７４】
前記イオン化可能脂質が
【化２５】
2020532528.tif 000080
、またはその塩である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７５】
前記イオン化可能脂質が、
【化２６】
2020532528.tif 000081
、またはその塩である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７６】
前記イオン化可能脂質が式（ＩＬ−ＩＩＩ）：
【化２７】
2020532528.tif 000082
の化合物またはその塩もしくは異性体であり、式中
Ｗは、
【化２８】
2020532528.tif 000083
であり、
環Ａは、
【化２９】
2020532528.tif 000084
であり；
ｔは１または２であり；
Ａ１及びＡ２は各々、ＣＨまたはＮから独立して選択され；
Ｚは、ＣＨ２または存在せず、ＺがＣＨ２であるとき、破線（１）及び（２）はそれぞれ単結合を表し；Ｚが存在しないとき、破線（１）及び（２）は両方とも存在せず；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、Ｃ５−２０アルキル、Ｃ５−２０アルケニル、−Ｒ”ＭＲ’、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から独立して選択され；
ＲＸ１及びＲＸ２は各々独立して、ＨまたはＣ１−３アルキルであり；
各々のＭは、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｏ）−、アリール基、及びヘテロアリール基からなる群から独立して選択され；
Ｍ＊はＣ１−Ｃ６アルキルであり、
Ｗ１及びＷ２は各々、−Ｏ−及び−Ｎ（Ｒ６）−からなる群から独立して選択され；
各々のＲ６は、Ｈ及びＣ１−５アルキルからなる群から独立して選択され；
Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３は、結合、−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２−、−ＣＨＲ−、−ＣＨＹ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎ−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｃ（Ｓ）−、及び−ＣＨ（ＳＨ）−からなる群から独立して選択され；
各々のＹは、独立してＣ３−６炭素環であり；
各々のＲ＊は、Ｃ１−１２アルキル及びＣ２−１２アルケニルからなる群から独立して選択され；
各々のＲは、Ｃ１−３アルキル及びＣ３−６炭素環からなる群から独立して選択され；
各々のＲ’は、Ｃ１−１２アルキル、Ｃ２−１２アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され；
各々のＲ”は、Ｃ３−１２アルキル、Ｃ３−１２アルケニル、及び−Ｒ＊ＭＲ’からなる群から独立して選択され；
ｎは、１〜６の整数であり；
環Ａが
【化３０】
2020532528.tif 000085
であるとき、
ｉ）Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３のうちの少なくとも１つが、−ＣＨ２−ではなく；及び／または
ｉｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも１つが−Ｒ”ＭＲ’である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７７】
前記イオン化可能脂質が式（ＩＬ−ＩＩＩａ１）−（ＩＬ−ＩＩＩａ８）のうちのいずれかの化合物：
【化３１】
2020532528.tif 000086
である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７８】
前記イオン化可能脂質が、
【化３２】
2020532528.tif 000087
、またはその塩である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７９】
前記イオン化可能脂質が、以下からなる群から選択される少なくとも１つの脂質である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法：
３−（ジドデシルアミノ）−Ｎ１，Ｎ１，４−トリドデシル−１−ピペラジンエタンアミン（ＫＬ１０）、Ｎ１−［２−（ジドデシルアミノ）エチル］−Ｎ１，Ｎ４，Ｎ４−トリドデシル−１，４−ピペラジンジエタンアミン（ＫＬ２２）、１４，２５−ジトリデシル−１５，１８，２１，２４−テトラアザ−オクタトリアコンタン（ＫＬ２５）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）、ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、２−（｛８−［（３β）−コレスタ−５−エン−３−イルオキシ］オクチル｝オキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−１−アミン（Ｏｃｔｙｌ−ＣＬｉｎＤＭＡ）、（２Ｒ）−２−（｛８−［（３β）−コレスタ−５−エン−３−イルオキシ］オクチル｝オキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−１−アミン（Ｏｃｔｙｌ−ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｒ））、及び（２Ｓ）−２−（｛８−［（３β）−コレスタ−５−エン−３−イルオキシ］オクチル｝オキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−１−アミン（Ｏｃｔｙｌ−ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｓ））。
【請求項８０】
前記核酸がリボ核酸（ＲＮＡ）である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８１】
前記リボ核酸が、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ダイサー基質ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、スモールヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、及び長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）からなる群から選択される少なくとも１つのリボ核酸である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８２】
前記核酸がメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８３】
前記ｍＲＮＡが、ステムループ、鎖終結ヌクレオシド、ポリＡ配列、ポリアデニル化シグナル、及び５’キャップ構造からなる群から選択される少なくとも１つのモチーフを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８４】
前記核酸がゲノム編集技術に適している、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８５】
前記ゲノム編集技術が、クラスター化等間隔短鎖回分リピート（ＣＲＩＳＰＲ）または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８６】
前記核酸が、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、及びＤＮＡ修復テンプレートからなるグループから選択されるゲノム編集技術に適した少なくとも１つの核酸である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８７】
前記ｍＲＮＡが、少なくとも３０ヌクレオチドの長さである、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８８】
前記ｍＲＮＡが、少なくとも３００ヌクレオチドの長さである、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８９】
前記核酸脂質ナノ粒子組成物が、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％のカプセル化効率を有する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９０】
前記核酸脂質ナノ粒子組成物が、約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍの範囲の平均サイズを有する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９１】
前記核酸脂質ナノ粒子組成物中のカプセル化された前記核酸の量の定量値が、イオン交換（ＩＥＸ）クロマトグラフィーアッセイを使用して生成される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９２】
先行請求項のいずれか１項に記載の方法により調製されている前駆体核酸脂質ナノ粒子。
【請求項９３】
先行請求項のいずれか１項に記載の方法により調製されている核酸脂質ナノ粒子組成物。
【請求項９４】
前記イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）アッセイによって決定されるとき、前記ＬＮＰ組成物中の前記ＬＮＰの少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９５％が、その中にカプセル化されたｍＲＮＡを有する、先行請求項のいずれか１項に記載の核酸脂質ナノ粒子組成物。
【請求項９５】
核酸脂質ナノ粒子組成物を特性評価する方法であって、イオン交換（ＩＥＸ）クロマトグラフィーアッセイを使用して、前記核酸脂質ナノ粒子組成物中のカプセル化された前記核酸の量の定量値を生成することを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１７年１１月２２日に出願された米国仮出願第６２／５９０，１９３号、２０１７年８月３１日に提出された同６２／５５３，０８８号；及び２０１７年８月３１日に出願された同６２／５５３，０８５号の優先権及び権益を主張し、それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、核酸脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物を生成する新規の方法、その生成された組成物、ならびに核酸などの１つ以上の治療薬及び／または予防薬を哺乳動物細胞もしくは臓器に送達し、及び／または哺乳動物細胞もしくは臓器でポリペプチドを産生するための核酸脂質ナノ粒子を含む方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
小分子薬、タンパク質、及び核酸などの生物活性物質の効果的な標的化送達は、継続的な医学的な課題を表している。特に、細胞への核酸の送達は、そのような種の相対的な不安定性及び低い細胞透過性により困難になる。したがって、細胞への核酸などの治療薬及び予防薬の送達を促進するための方法及び組成物を開発する必要性が存在する。
【０００４】
脂質含有ナノ粒子または脂質ナノ粒子、リポソーム、及びリポプレックスは、小分子薬、タンパク質、及び核酸などの生物活性物質の細胞及び／または細胞内区画への輸送ビヒクルとして有効であることが証明されている。様々なそのような脂質含有ナノ粒子が実証されているが、安全性、有効性、及び特異性の改善は未だ足りていない。
【発明の概要】
【０００５】
いくつかの態様では、本開示は、核酸脂質ナノ粒子組成物を生成する方法であって、ｉ）イオン化可能脂質を含む脂質溶液を核酸を含む溶液と混合し、それにより前駆体核酸脂質ナノ粒子を形成することと、ｉｉ）修飾剤を含む脂質ナノ粒子修飾剤を前駆体核酸脂質ナノ粒子に添加し、それによって修飾された核酸脂質ナノ粒子を形成することと、ｉｉｉ）前駆体核酸脂質ナノ粒子、修飾された核酸脂質ナノ粒子、またはその両方を処理し、それによって核酸脂質ナノ粒子組成物を形成することと、を含む、方法を提供する。
【０００６】
いくつかの実施形態では、前駆体核酸脂質ナノ粒子は、脂質ナノ粒子修飾剤を添加する前に処理されない。
【０００７】
いくつかの実施形態では、前駆体核酸脂質ナノ粒子は、脂質ナノ粒子修飾剤を添加する前に処理される。
【０００８】
いくつかの実施形態では、脂質溶液は、第１のＰＧＥ脂質をさらに含む。
【０００９】
いくつかの実施形態では、前駆体核酸脂質ナノ粒子は、第１のＰＥＧ脂質をさらに含む。
【００１０】
いくつかの実施形態では、脂質溶液は、ＰＥＧ脂質を全く含まない。
【００１１】
いくつかの実施形態では、前駆体核酸脂質ナノ粒子は、ＰＥＧ脂質を全く含まない。
【００１２】
いくつかの実施形態では、前駆体核酸脂質ナノ粒子は、リン脂質をさらに含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、前駆体核酸脂質ナノ粒子は、構造脂質をさらに含む。
【００１４】
いくつかの実施形態では、修飾剤は、第２のＰＥＧ脂質及び界面活性剤からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤である。
【００１５】
いくつかの実施形態では、修飾剤は第２のＰＥＧ脂質である。
【００１６】
いくつかの実施形態では、修飾剤は界面活性剤である。
【００１７】
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に開示される方法によって調製される前駆体核酸脂質ナノ粒子を提供する。
【００１８】
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に開示される方法によって調製される核酸脂質ナノ粒子組成物を提供する。
【００１９】
いくつかの態様では、本開示は、イオン交換（ＩＥＸ）クロマトグラフィーアッセイを使用して、核酸脂質ナノ粒子組成物中のカプセル化された核酸の量の定量値を生成することを含む、核酸脂質ナノ粒子組成物を特性評価する方法を提供する。
【００２０】
別途説明されない限り、本明細書において使用される技術用語及び科学用語は、本開示の所属する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書において記載されているものと類似または同等の方法及び物質を本開示の実施または試験において使用することができるが、適切な方法及び物質を以下に記載する。本明細書において言及される全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優位となるであろう。更に、物質、方法、及び例は、例示にすぎず、限定を意図しない。
【００２１】
本開示の他の特徴及び利点は、以下の発明を実施するための形態、及び特許請求の範囲から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１Ａ〜１Ｂは、ＬＮＰのｍＲＮＡカプセル化に対する後挿入の効果を示す図である。図１Ａは、後挿入を伴わないプロセス（Ｔ−Ｍｉｘ段階で０〜３ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を添加）によって調製されたＬＮＰのカプセル化効率を示す。図１Ｂは、後挿入を伴うプロセス（Ｔ−Ｍｉｘ段階で０〜３ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を添加し、後挿入中に残りのＰＥＤ脂質を添加する）によって調製されたＬＮＰ（総量３ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含む）のカプセル化効率を示す。
【図２−１】図２Ａ〜２Ｃは、ＬＮＰ製剤の安定性に対する後挿入の効果を示す図である。図２Ａは、タンジェント流濾過（ＴＦＦ）でのＬＮＰ製剤（総量３ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含む；Ｔ−Ｍｉｘ段階で０〜３ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を添加し、後挿入中に残りのＰＥＤ脂質を添加する）の粒径の変化を示す。図２Ｂは、１〜５回の凍結／融解サイクルの前及び後における、ＬＮＰ製剤（総量０．２５〜４ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含む；Ｔ−Ｍｉｘ段階で０．２５ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を添加し、後挿入中に残りのＰＥＤ脂質を添加する）の粒径を示す。
【図２−２】図２Ａ〜２Ｃは、ＬＮＰ製剤の安定性に対する後挿入の効果を示す図である。図２Ｃは、１〜５回の凍結／融解サイクルの前及び後における、ＬＮＰ製剤（総量２ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含む；後挿入または加熱を伴うかまたは伴わないプロセスによって調製）の粒径を示す。
【図３】図３Ａ〜３Ｂは、ＬＮＰ製剤の安定性に対する界面活性剤の後添加の効果を示す図である。図３Ａは、３回の凍結／融解サイクルでのＬＮＰ製剤（後添加中に添加された、０〜１．５ｍｏｌ％のＰＥＧ−１、及び０〜０．１ｗ／ｖ％のＢｒｉｊ  Ｓ２０界面活性剤を含む）の粒径を示す。図３Ｂは、３回の凍結／融解サイクルでのＬＮＰ製剤（後添加中に添加された、０〜１．５ｍｏｌ％のＰＥＧ−１、及び０〜０．１ｗ／ｖ％のＢｒｉｊ  Ｏ２０界面活性剤を含む）の粒径を示す。
【図４】図４Ａ〜４Ｂは、ＬＮＰ製剤の発現に対する界面活性剤の後添加の効果を示す図である。図４Ａは、６時間にわたるＬＮＰ製剤（後添加中に添加された、様々な量のＢｒｉｊ  Ｏ２０界面活性剤を含む）の平均発現を示す。図４Ｂは、２４時間にわたるＬＮＰ製剤（後添加中に添加された、様々な量のＢｒｉｊ  Ｏ２０界面活性剤を含む）の平均発現を示す。
【図５】図５Ａ〜５Ｂは、３回の凍結／融解サイクルでのＬＮＰ製剤（ｗ／ｖ％及びｍｏｌ％で示される、様々な量のＰＥＧ−１を含む）の粒径を示す図である。
【図６】図６Ａ〜６Ｂは、ＬＮＰ製剤に対する様々な量のＰＥＧ脂質の効果を示す図である。図６Ａは、０〜２．５ｍｏｌ％のＰＥＧ−２またはＰＥＧ−１を含むＬＮＰ製剤のｍＲＮＡカプセル化効率を示す。図６Ｂは、０〜２．５ｍｏｌ％のＰＥＧ−２またはＰＥＧ−１を含むＬＮＰ製剤の粒径を示す。
【図７−１】図７Ａ〜７Ｃは、ＬＮＰ製剤の発現に対するＰＥＧ脂質の効果を示す図である。図７Ａは、様々な量のＰＥＧ−２を含むｅＧＦＰ  ｍＲＮＡ  ＬＮＰ製剤の発現を示す。図７Ｂは、様々な量のＰＥＧ−２またはＰＥＧ−１を含むｆｆＬｕｃ  ｍＲＮＡ  ＬＮＰ製剤の発現を示す。
【図７−２】図７Ａ〜７Ｃは、ＬＮＰ製剤の発現に対するＰＥＧ脂質の効果を示す図である。図７Ｃは、図７Ａ〜７Ｂに示されたデータの比較を示す。
【図８】図８は、イオン化可能脂質を含み、様々な量のＰＥＧ脂質を含むＬＮＰ製剤を使用したＣＤ−１マウスにおける複数回投与研究の総流量を示す図である。
【図９】図９は、イオン化可能脂質を含み、様々な量のＰｌ８８ポロキサマーまたはＰＥＧ脂質を含むｈＥＰＯ  ｍＲＮＡ  ＬＮＰ製剤のｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現を示す図である。
【図１０】図１０は、様々な量のＰＥＧ−１を含むＬＮＰ製剤の取り込みとｅＧＦＰ  ｍＲＮＡ発現を示す図である。
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｂは、様々な量のＰＥＧ−１を含むイオン化可能脂質を含むＬＮＰ製剤のｍＲＮＡカプセル化を示す表である。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｂは、本開示のナノ粒子（ＬＮＰ）の効力及び安定性に対するＰＥＧの重要性を示す一対のグラフである。図１２Ａは、ウイルス複合体における五量体特異的ＩｇＧの力価を要約する。この図は、ＬＮＰのＰＥＧが少ないほど、より免疫原性の高いＬＮＰが生成されることを示す。図１２Ｂは、保存時間の関数として、イオン化可能脂質を含むＬＮＰのサイズのＰＥＧに対する依存性を示す。
【図１３Ａ】図１３Ａは、本明細書に記載のプロセスに従って作製されたナノ粒子でのｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現を要約する一対のグラフである。バッチ１は、標準プロセスを使用して作製される。バッチ２及び４は後挿入プロセスによって作製され、バッチ３及び５は後添加プロセスを使用して作製される。図１３Ａは、バッチ１〜５の脂質ナノ粒子のｉｎ  ｖｉｔｒｏタンパク質発現のヒストグラムである。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、本明細書に記載のプロセスに従って作製されたナノ粒子でのｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現を要約する一対のグラフである。バッチ１は、標準プロセスを使用して作製される。バッチ２及び４は後挿入プロセスによって作製され、バッチ３及び５は後添加プロセスを使用して作製される。図１３Ｂは、バッチ１〜５の脂質ナノ粒子の幾何平均のヒストグラムである。
【図１４】図１４は、タンジェント流濾過（ＴＦＦ）中に本明細書に記載のプロセスによって作製されたナノ粒子の性能を示すグラフである。
【図１５】図１５は、本明細書に開示されるプロセスを介して形成された脂質ナノ粒子についてＲｉｂｏｇｒｅｅｎによって決定されたｍＲＮＡカプセル化パーセントのヒストグラムである。
【図１６】図１６は、本明細書に記載のプロセスによって形成された脂質ナノ粒子のｍＲＮＡカプセル化及び粒径を示す一対のヒストグラムである。バッチ１は、標準プロセスを使用して作製される。バッチ２及び４は後挿入プロセスによって作製され、バッチ３及び５は後添加プロセスを使用して作製される。図１６は、陰イオン交換クロマトグラフィーによって決定されたｍＲＮＡカプセル化パーセントを示すヒストグラムである。
【図１７】図１７は、本明細書に記載のプロセスによって形成された脂質ナノ粒子のｍＲＮＡカプセル化及び粒径を示す一対のヒストグラムである。バッチ１は、標準プロセスを使用して作製される。バッチ２及び４は後挿入プロセスによって作製され、バッチ３及び５は後添加プロセスを使用して作製される。図１７は、目に見えない粒子の平均粒径（＞０．８μｍ）を示すヒストグラムである。
【図１８】図１８は、凍結融解の前及び５回までの凍結融解サイクルの後の動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定された、本開示のプロセスによって作製されたナノ粒子の粒径のヒストグラムである。
【図１９】図１９は、本開示のプロセスによって作製されたナノ粒子のナノ粒子トラッキング解析の結果を要約したグラフである。
【図２０】図２０は、本開示のプロセスによって作製されたナノ粒子の一連の低温電子顕微鏡画像である。番号１〜５は、バッチ１〜５のナノ粒子を指し、バッチ１は標準プロセスを使用して作製され、バッチ２及び４は後挿入プロセスによって作製され、バッチ３及び５は後添加プロセスを使用して作製される。
【図２１】図２１は、ヘパリンセファロースカラムへの液体ナノ粒子の結合を示すヒストグラムである。
【図２２】図２２は、本開示のプロセスを介して形成された脂質ナノ粒子の凍結融解拡散秩序化分光法（ＤＯＳＹ）の結果を示すヒストグラムである。バッチ１は標準プロセスを使用して作製され、バッチ２及び４は後挿入プロセスによって作製され、バッチ３及び５は後添加プロセスを使用して作製される。この図は、初期ＰＥＧがより多いサンプルがより安定していたことを示す。拡散の小さな変化を考慮すると、不安定性は重要ではない場合がある。バッチ４及び５では保存安定性が低い場合があるが、不安定性が高いことは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのより多いＲＮＡの放出／発現に寄与する場合がある。
【図２３】図２３は、本開示のプロセスを介して形成された脂質ナノ粒子のマウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ免疫原性（血清ＩｇＧ力価）のグラフである（五量体をコーティングしたプレートで評価）。
【図２４】図２４は、本開示のプロセスを介して形成された脂質ナノ粒子のｉｎ  ｖｉｖｏ免疫原性（血清ＩｇＧ力価）のグラフである（ｇＢをコーティングしたプレートで評価）。
【図２５】図２５は、循環ホルモンタンパク質レベルによって評価された、化合物１８及びＰＥＧ−１を含む製剤を投与されたＷＫＹラットにおけるタンパク質薬物動態を示すグラフである。
【図２６】図２６は、後挿入を伴うプロセス（Ｔ−Ｍｉｘ段階で添加されたＰＥＧ脂質と、後挿入中で添加されたＰＥＤ脂質との間の０〜１の範囲の比率）によって調製されたＬＮＰ（総量３ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含む）のカプセル化効率を示す図である。
【図２７】図２７Ａ〜２７Ｂは、ＬＮＰ製剤の安定性及び発現に対するＰＥＧ−１の後添加（様々な総量のＰＥＧ脂質を含む；Ｔ−Ｍｉｘ段階で０．２５ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を添加する）の効果を示す図である。
【図２８】図２８は、ＬＮＰ製剤の調製における様々な条件を示す表である。
【図２９】図２９Ａ〜２９Ｂは、ＬＮＰ製剤の膜透過性に対するＰＥＧ脂質の後挿入の効果を示す図である。
【図３０】図３０Ａ〜３０Ｂは、ＬＮＰ製剤の膜透過性に対するＰＥＧ脂質の後添加の効果を示す図である。
【図３１Ａ】図３１Ａは、イオン化可能脂質を含むＬＮＰ製剤の安定性に対するＰＥＧ−１による後挿入及び後添加の効果を示す図である。図３１Ａは、１〜１０回の凍結／融解サイクルの前及び後における、後挿入を伴うプロセスによって調製されたＬＮＰ製剤の粒径を示す。
【図３１Ｂ】図３１Ｂは、イオン化可能脂質を含むＬＮＰ製剤の安定性に対するＰＥＧ−１による後挿入及び後添加の効果を示す図である。図３１Ｂは、１〜１０回の凍結／融解サイクルの前及び後における、後添加を伴うプロセスによって調製されたＬＮＰ製剤の粒径を示す。
【図３２】図３２Ａ〜３２Ｂは、イオン化可能脂質を含むＬＮＰ製剤のｍＲＮＡカプセル化効率に対するＰＥＧ−１による後挿入及び後添加の効果を示す図である。
【図３３−１】図３３Ａ〜３３Ｃは、ＰＥＧ−１の後添加を伴うプロセスによって調製されたイオン化可能脂質を含むＬＮＰ製剤のｍＲＮＡカプセル化効率に対するＮａＣｌ、ＤＴＰＡ、またはエタノールの添加の効果を示す図である。
【図３３−２】図３３Ａ〜３３Ｃは、ＰＥＧ−１の後添加を伴うプロセスによって調製されたイオン化可能脂質を含むＬＮＰ製剤のｍＲＮＡカプセル化効率に対するＮａＣｌ、ＤＴＰＡ、またはエタノールの添加の効果を示す図である。
【図３４−１】図３４Ａ〜３４Ｃは、ＰＥＧ−１の後挿入を伴うプロセスによって調製されたイオン化可能脂質を含むＬＮＰ製剤のｍＲＮＡカプセル化効率に対するＮａＣｌ、ＤＴＰＡ、またはエタノールの添加の効果を示す図である。
【図３４−２】図３４Ａ〜３４Ｃは、ＰＥＧ−１の後挿入を伴うプロセスによって調製されたイオン化可能脂質を含むＬＮＰ製剤のｍＲＮＡカプセル化効率に対するＮａＣｌ、ＤＴＰＡ、またはエタノールの添加の効果を示す図である。
【図３５】図３５は、ナノ粒子の安定性に対する様々な緩衝液の影響を示す。凍結製剤緩衝液からのエタノールの除去により、凍結／融解ストレスに対するカプセル化の感受性が緩和された。
【図３６】図３６は、ナノ粒子のサイズに対する様々な緩衝液の影響を示す。Ｔｒｉｓ−スクロース−ＮａＣｌ−エタノール−ＤＴＰＡ緩衝液は、凍結／融解ストレスに対するＬＮＰ直径の保護をもたらした。Ｔｒｉｓ−スクロース緩衝液は、直径の安定性の低下を示す。Ｔｒｉｓ−スクロースベースの製剤は、ＰＥＧ−１後添加によって安定化される。
【図３７】図３７は、ナノ粒子のカプセル化効率に対する様々な緩衝液の影響を示す。Ｔｒｉｓ−スクロース−ＮａＣｌ−エタノール−ＤＴＰＡ緩衝液は、ｍＲＮＡカプセル化に対する感受性をもたらす。Ｔｒｉｓ−スクロースは堅牢なカプセル化値を示す。
【図３８】図３８は、後挿入プロセスと比較した、後添加プロセスで作製された粒子のタンジェント流濾過（ＴＦＦ）の流量を示す。
【図３９】図３９は、後挿入プロセスと比較した、後添加プロセスで作製された粒子のタンジェント流濾過（ＴＦＦ）の流量の変化を要約する。
【図４０】図４０は、本明細書に記載の後添加プロセスにおいてＰＥＧ−１を含んで作製されたナノ粒子組成物のバッチを要約する表である。
【図４１】図４１は、０〜５回の凍結／融解（ＦＴ）事象に供されるときの、様々な量のＰＥＧ脂質を含む標準処理によって調製された様々なＬＮＰのＬＮＰ粒径（ｎｍ）の変化を示すグラフである。
【図４２】図４２は、標準処理によって調製された様々な量のＰＥＧ−脂質を含むＬＮＰの分解速度の単位での長期保存を示すグラフである。
【図４３】図４３は、様々な量のＰＥＧ脂質を含む標準処理によって調製された様々なＬＮＰのｍＲＮＡ捕捉％を示すグラフである。
【図４４】図４４は、ヒトＩｇＧ検出（ｎｇ／ｍＬ）の単位で測定したときの、ＡＵＣ  ｅＧＦＰの発現に悪影響を与えるＰＥＧ脂質を示すグラフである。
【図４５】図４５は、ＳＡＸＳ回折パターンを示すグラフであり、１４ｍｏｌ％のＰＥＧ−ＤＭＧを含むラメラ構造には秩序がなく、顕著な回折ピークは２ｍｏｌ％のＰＥＧ−ＤＭＧでの規則的なラメラ構造を示す。
【図４６】図４６は、単位時間当たりの単位面積当たりの膜を流れる体積として定義されるプロセス流量の変化を示すグラフである。プロセス流量の低下は、生物物理学的変化、例えば凝集または拡散性を示し得る。後挿入は、緩衝液交換よりも一貫して流量損失を低減／排除した。
【図４７】図４７Ａ及び４７Ｂは、標準処理で調製したＬＮＰ、ＰＥＧ脂質の後挿入で調製したＬＮＰ、及び界面活性剤の後添加で調製したＬＮＰの、ＡＵＣ  ｅＧＦＰ発現を比較したグラフである。
【図４８】図４８は、様々な総量のＰＥＧ脂質（ＰＥＧ−１）を含むＬＮＰ組成物の凍結／融解ストレス事象及びＡＵＣ  ｅＧＦＰ発現によるＬＮＰ直径の変化を示すグラフである。
【図４９Ａ】図４９Ａは、低塩濃度から高塩濃度に勾配が変化するとき、ＬＮＰが空隙に溶出し、ｍＲＮＡが溶出することを示す分離結果を示す一連のグラフである。図４９Ａは、ｍＲＮＡ製剤の緩衝液条件に基づいた様々なカプセル化効率を示す。
【図４９Ｂ】図４９Ｂは、低塩濃度から高塩濃度に勾配が変化するとき、ＬＮＰが空隙に溶出し、ｍＲＮＡが溶出することを示す分離結果を示す一連のグラフである。図４９Ｂは、ｍＲＮＡ製剤の塩濃度に基づいた様々なカプセル化効率を示す。
【図５０】図５０は、カラムに保持されたｍＲＮＡ％と試料のｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現との相関を示すグラフである。
【図５１】図５１は、Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ及び陰イオン交換クロマトグラフィーで測定したｍＲＮＡカプセル化パーセント対ｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現のグラフである。
【図５２Ａ】図５２Ａは、本開示のプロセスを介して形成された脂質ナノ粒子のｉｎ  ｖｉｖｏ免疫原性（血清Ｉｇ力価）を示す一連のグラフである。図５２Ａは、３６日目の血清ＩｇＧ力価を示す（五量体をコーティングしたプレートで評価）。
【図５２Ｂ】図５２Ｂは、本開示のプロセスを介して形成された脂質ナノ粒子のｉｎ  ｖｉｖｏ免疫原性（血清Ｉｇ力価）を示す一連のグラフである。図５２Ｂは、３６日目の血清ＩｇＧ力価を示す（ｇＢをコーティングしたプレートで評価）。
【図５２Ｃ】図５２Ｃは、本開示のプロセスを介して形成された脂質ナノ粒子のｉｎ  ｖｉｖｏ免疫原性（血清Ｉｇ力価）を示す一連のグラフである。図５２Ｃは、２１日目の血清ＩｇＧ力価を示す（五量体をコーティングしたプレートで評価）。
【図５２Ｄ】図５２Ｄは、本開示のプロセスを介して形成された脂質ナノ粒子のｉｎ  ｖｉｖｏ免疫原性（血清Ｉｇ力価）を示す一連のグラフである。図５２Ｄは、２１日目の血清ＩｇＧ力価を示す（ｇＢをコーティングしたプレートで評価）。
【図５２Ｅ】図５２Ｅは、本開示のプロセスを介して形成された脂質ナノ粒子のｉｎ  ｖｉｖｏ免疫原性（血清Ｉｇ力価）を示す一連のグラフである。図５２Ｅは、２１日目と３６日目の血清ＩｇＧ力価の比較を示す（五量体をコーティングしたプレートで評価）。
【図５２Ｆ】図５２Ｆは、本開示のプロセスを介して形成された脂質ナノ粒子のｉｎ  ｖｉｖｏ免疫原性（血清Ｉｇ力価）を示す一連のグラフである。図５２Ｆは、２１日目と３６日目の血清ＩｇＧ力価の比較を示す（ｇＢをコーティングしたプレートで評価）。
【図５３】図５３は、陰イオン交換クロマトグラフィーで測定したｍＲＮＡカプセル化パーセント対ｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現のグラフである。
【図５４】図５４は、陰イオン交換クロマトグラフィーで測定したｍＲＮＡカプセル化パーセント対ｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現のグラフである。
【図５５】図５５は、陰イオン交換クロマトグラフィーで測定したｍＲＮＡカプセル化パーセント対ｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現のグラフである。
【図５６】図５６は、陰イオン交換クロマトグラフィーで測定したｍＲＮＡカプセル化パーセント対ｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現のグラフである。
【図５７】図５７は、様々な界面活性剤を含んで調製され、５回の−２０℃での凍結及び室温での融解の後の２０ｍＭのｔｒｉｓ８％スクロースで保存された１％ＰＥＧを含むＬＮＰ製剤の平均サイズ変化パーセンテージ（％）のグラフである。
【図５８Ａ】図５８Ａは、界面活性剤を含まないか、または様々なｗｔ％の界面活性剤が添加され、２０ｍＭのｔｒｉｓ８％スクロース中で、０．５ｍｇ／ｍＬＲＮＡで６か月の期間にわたって−２０℃で保存された、１％ＰＥＧを含むＬＮＰ製剤のサイズ（ｎｍ）のグラフである。
【図５８Ｂ】図５８Ｂは、界面活性剤を含まないか、または様々なｗｔ％の界面活性剤が添加され、２０ｍＭのｔｒｉｓ８％スクロース中で、０．５ｍｇ／ｍＬＲＮＡで６か月の期間にわたって−２０℃で保存された、１．５％ＰＥＧを含むＬＮＰ製剤のサイズ（ｎｍ）のグラフである。
【図５９】図５９は、１．５％ＰＥＧを含むＬＮＰ中の０．２μｇのｍＲＮＡを筋肉内注射し、２０ｍＭのｔｒｉｓ８％スクロース中の様々なｗｔ％の様々な界面活性剤でスパイクしたメスＣＤ−１マウス（群あたりｎ＝５マウス）のｉｎ  ｖｉｖｏ  ＥＰＯ発現のグラフであり、注射の６時間後に採血し、界面活性剤の添加と同等の発現を示した。
【図６０】図６０は、コア中に０．５％ＰＥＧを含んで製剤化され、２０ｍＭトリス（ｐＨ  ７．４）に透析後に後添加により１％ＰＥＧを添加し、次いで様々なｗｔ％の界面活性剤とともに１０ｗｔ％スクロースを添加したＬＮＰについて０．２ｍｇ／ｍＬのＲＮＡでの凍結乾燥前から凍結乾燥後までのサイズ変化（ｎｍ）のグラフであり、多くの界面活性剤が凍結乾燥中のサイズ増殖を低減することを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本開示は、一部には、脂質ナノ粒子を生成する方法が脂質ナノ粒子内の特定の成分の分布に影響を及ぼし、この分布が脂質ナノ粒子の物理的（例えば、安定性）及び／または生物学的（例えば、有効性、細胞内送達、免疫原性）特性に影響を及ぼし得、及び／または決定づけ得るという発見に基づいている。
【００２４】
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、成分の有利な分布を有する脂質ナノ粒子を含む組成物をもたらす。
【００２５】
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、生成された脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤からの望ましくない特性変化を緩和する。
【００２６】
いくつかの実施形態では、望ましくない特性変化は、ＬＮＰ製剤またはその中のＬＮＰに対するストレスによって引き起こされる。いくつかの実施形態では、ストレスは、ＬＮＰ製剤の生成、精製、包装、保存、輸送、及び／または使用中に誘発される。いくつかの実施形態では、ストレスは、熱、せん断、過度の攪拌、膜濃度分極（荷電状態の変化）、脱水、凍結ストレス、乾燥ストレス、凍結／融解ストレス、及び／または噴霧ストレスである。いくつかの実施形態では、ストレスは、ＬＮＰ製剤の凍結または凍結乾燥中に誘発される。
【００２７】
いくつかの実施形態では、望ましくない特性変化は、ＬＮＰ製剤の物理的安定性の低下である。いくつかの実施形態では、望ましくない特性変化は、不純物及び／または目に見えない粒子の量の増加、あるいはＬＮＰ製剤中のＬＮＰの平均サイズの増加である。
【００２８】
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、同等の方法（例えば、本明細書に開示されているステップｉ）、ｉａ）、ｉｂ）、ｉｉ）、ｉｉａ）、ｉｉｂ）、ｉｉｃ）、ｉｉｄ）、ｉｉｅ）、及びｉｉｆ）のうちの１つ以上を含まない方法（例えば、ステップｉａ）及び／またはステップｉｉａ）を含まない方法））によって生成されたＬＮＰ製剤と比較して、生成されたＬＮＰ製剤の物理的安定性の低下（例えば、ＬＮＰの平均サイズの増加）を緩和する。
【００２９】
いくつかの実施形態では、本開示の方法によって生成されるＬＮＰ製剤は、同等の方法（例えば、本明細書に開示されているステップのうちの１つ以上の方法を含まない方法）によって生成されるＬＮＰ製剤の平均ＬＮＰ直径と比較して、約９９％以下、約９８％以下、約９７％以下、約９６％以下、約９５％以下、約９０％以下、約８５％以下、約８０％以下、約７５％以下、約７０％以下、約６５％以下、約６０％以下、約５５％以下、約５０％以下、約４０％以下、約３０％以下、約２０％以下、または約１０％以下の平均ＬＮＰ直径を有する。
【００３０】
いくつかの実施形態では、望ましくない特性変化は、ＬＮＰ製剤の化学的安定性の低下である。いくつかの実施形態では、望ましくない特性変化は、ＬＮＰ製剤中の核酸（例えば、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ））の完全性の低下である。
【００３１】
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、同等の方法（例えば、本明細書に開示されているステップのうちの１つ以上の方法を含まない方法）によって生成されるＬＮＰ製剤と比較するとき、生成されたＬＮＰ製剤からの化学的安定性の低下（例えば、ＬＮＰ製剤中の核酸の完全性の低下）を緩和する。
【００３２】
いくつかの実施形態では、本開示の方法により生成されるＬＮＰ製剤は、ＬＮＰ製剤を生成するために使用されるＬＮＰの完全性とほぼ同一であるＬＮＰの完全性を有する。
【００３３】
いくつかの実施形態では、本開示の方法によって生成されるＬＮＰ製剤は、ＬＮＰ製剤を生成するために使用されるＬＮＰの完全性よりも約５０％以下、約４０％以下、約３０％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約８％以下、約６％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、または約１％以下だけ低いＬＮＰの完全性を有する。
【００３４】
いくつかの実施形態では、本開示の方法により生成されるＬＮＰ製剤は、同等の方法（本明細書に開示されているステップｉ）、ｉａ）、ｉｂ）、ｉｉ）、ｉｉａ）、ｉｉｂ）、ｉｉｃ）、ｉｉｄ）、ｉｉｅ）、及びｉｉｆ）のうちの１つ以上を含まない方法（例えば、本明細書に開示されているステップのうちの１つ以上を含まない方法））により生成されたＬＮＰ製剤のＬＮＰの完全性よりも高いＬＮＰの完全性を有する。
【００３５】
いくつかの実施形態では、本開示の方法によって生成されるＬＮＰ製剤は、同等の方法によって生成されたＬＮＰ製剤のＬＮＰの完全性よりも約５％以上、約１０％以上、約１５％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約１倍以上、約２倍以上、約３倍以上、約４倍以上、約５倍以上、約１０倍以上、約２０倍以上、約３０倍以上、約４０倍以上、約５０倍以上、約１００倍以上、約２００倍以上、約３００倍以上、約４００倍以上、約５００倍以上、約１０００倍以上、約２０００倍以上、約３０００倍以上、約４０００倍以上、約５０００倍以上、または約１００００倍以上高い、ＬＮＰの完全性を有する。
【００３６】
いくつかの実施形態では、望ましくない特性変化は、ＬＮＰ製剤の生物学的特性の低下である。いくつかの実施形態では、望ましくない特性変化は、ＬＮＰ製剤の有効性、細胞内送達、及び／または免疫原性の低下である。
【００３７】
いくつかの実施形態では、本開示の方法により生成されるＬＮＰ製剤は、同等の方法（例えば、本明細書に開示されているステップのうちの１つ以上を含まない方法）により生成されたＬＮＰ製剤の有効性、細胞内送達、及び／または免疫原性よりも高い有効性、細胞内送達、及び／または免疫原性を有する。
【００３８】
いくつかの実施形態では、本開示の方法によって生成されるＬＮＰ製剤は、同等の方法によって生成されたＬＮＰ製剤の有効性、細胞内送達、及び／または免疫原性よりも約５％以上、約１０％以上、約１５％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約１倍以上、約２倍以上、約３倍以上、約４倍以上、約５倍以上、約１０倍以上、約２０倍以上、約３０倍以上、約４０倍以上、約５０倍以上、約１００倍以上、約２００倍以上、約３００倍以上、約４００倍以上、約５００倍以上、約１０００倍以上、約２０００倍以上、約３０００倍以上、約４０００倍以上、約５０００倍以上、または約１００００倍以上高い、有効性、細胞内送達、及び／または免疫原性を有する。
【００３９】
いくつかの実施形態では、本開示の方法によって生成されたＬＮＰ製剤は、同等の方法によって生成されたＬＮＰ製剤の核酸発現（例えば、ｍＲＮＡ発現）よりも高い核酸発現（例えば、ｍＲＮＡ発現）を示す。
【００４０】
いくつかの実施形態では、本開示の方法によって生成されるＬＮＰ製剤は、同等の方法によって生成されたＬＮＰ製剤の核酸発現（例えば、ｍＲＮＡ発現）よりも約５％以上、約１０％以上、約１５％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約１倍以上、約２倍以上、約３倍以上、約４倍以上、約５倍以上、約１０倍以上、約２０倍以上、約３０倍以上、約４０倍以上、約５０倍以上、約１００倍以上、約２００倍以上、約３００倍以上、約４００倍以上、約５００倍以上、約１０００倍以上、約２０００倍以上、約３０００倍以上、約４０００倍以上、約５０００倍以上、または約１００００倍以上高い、核酸発現（例えば、ｍＲＮＡ発現）を示す。
【００４１】
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物の生成方法及びその生成されるＬＮＰ組成物
本開示は、核酸脂質ナノ粒子組成物を生成する方法であって、ｉ）イオン化可能脂質を含む脂質溶液を核酸を含む溶液と混合し、それにより前駆体核酸脂質ナノ粒子を形成することと、ｉｉ）修飾剤を含む脂質ナノ粒子修飾剤を前駆体核酸脂質ナノ粒子に添加し、それによって修飾された核酸脂質ナノ粒子を形成することと、ｉｉｉ）前駆体核酸脂質ナノ粒子、修飾された核酸脂質ナノ粒子、またはその両方を処理し、それによって核酸脂質ナノ粒子組成物を形成することと、を含む、方法を提供する。
【００４２】
いくつかの実施形態では、前駆体核酸脂質ナノ粒子は、脂質ナノ粒子修飾剤を添加する前に処理されない。本明細書で使用されるとき、この実施形態は、「後挿入」の方法またはプロセスと呼ばれることがある。
【００４３】
いくつかの実施形態では、前駆体核酸脂質ナノ粒子は、脂質ナノ粒子修飾剤を添加する前に処理される。本明細書で使用されるとき、この実施形態は、「後添加」の方法またはプロセスと呼ばれることがある。
【００４４】
いくつかの実施形態では、脂質溶液は、第１のＰＧＥ脂質をさらに含む。
【００４５】
いくつかの実施形態では、脂質溶液は、ＰＥＧ脂質を全く含まない。
【００４６】
いくつかの実施形態では、前駆体核酸脂質ナノ粒子は、第１のＰＥＧ脂質をさらに含む。
【００４７】
いくつかの実施形態では、前駆体核酸脂質ナノ粒子は、ＰＥＧ脂質を全く含まない。
【００４８】
いくつかの実施形態では、修飾剤は、第２のＰＥＧ脂質及び界面活性剤からなる群から選択される少なくとも１つである。いくつかの実施形態では、修飾剤は第２のＰＥＧ脂質である。いくつかの実施形態では、修飾剤は界面活性剤である。
【００４９】
いくつかの実施形態では、修飾剤は第２のＰＥＧ脂質である。いくつかの実施形態では、第１のＰＥＧ脂質と第２のＰＥＧ脂質とは同一である。いくつかの実施形態では、第１のＰＥＧ脂質と第２のＰＥＧ脂質とは同一ではない。
【００５０】
いくつかの実施形態では、第１のＰＥＧ脂質対修飾剤のモル比は、約１：１００〜約１：１、好ましくは約１：５０〜約１：１、好ましくは約１：２５〜約１：１、好ましくは約１：１０〜約１：１の範囲内である。いくつかの実施形態では、修飾剤は第２のＰＥＧ脂質であり、第１のＰＥＧ脂質対第２のＰＥＧ脂質のモル比は約１：１００〜約１：１、好ましくは約１：５０〜約１：１、好ましくは約１：２５〜約１：１、好ましくは約１：１０〜約１：１の範囲内である。いくつかの実施形態では、修飾剤は界面活性剤であり、第１のＰＥＧ脂質対界面活性剤のモル比は約１：１００〜約１：１、好ましくは約１：５０〜約１：１、好ましくは約１：２５〜約１：１、好ましくは約１：１０〜約１：１の範囲内である。
【００５１】
脂質混合物は、水混和性有機溶媒、好ましくは無水エタノールに可溶化することができる。いくつかの実施形態では、有機溶媒は市販されている形態で使用される。例示的な一実施形態では、脂質の混合物は、イオン化可能脂質と第１のＰＥＧ脂質との混合物であり、有機溶媒に共可溶化される。いくつかの実施形態では、脂質混合物は、イオン化可能脂質及びＰＥＧ脂質、ならびに必要に応じてリン脂質及び／または構造脂質から本質的になる。好ましいモル範囲は、３０〜６０ｍｏｌ％のイオン化可能脂質と０．０１〜１０ｍｏｌ％の第１のＰＥＧ脂質、好ましくは０．０１〜５ｍｏｌ％、好ましくは０．０１〜４ｍｏｌ％、好ましくは０．０１〜３ｍｏｌ％、好ましくは０．０１〜２ｍｏｌ％、好ましくは０．０１〜１ｍｏｌ％、好ましくは０．０１〜０．８ｍｏｌ％、好ましくは０．０１〜０．６ｍｏｌ％、好ましくは０．０１〜０．５ｍｏｌ％、好ましくは０．０１〜０．２５ｍｏｌ％の第１のＰＥＧ脂質である。脂質の総濃度は、好ましくは２５ｍｇ／ｍｌ未満、好ましくは５ｍｇ／ｍｌ未満である。脂質混合物は、膜、例えば０．４５または０．２μｍフィルターを通して濾過されてもよい。
【００５２】
本発明によれば、脂質混合物は、好ましくは緩衝水溶液の形態の核酸溶液と組み合わせることができる。緩衝水溶液は、緩衝液が脂質混合物中のプロトン化脂質のｐＫａより低いｐＨを有する溶液であり得る。適切な緩衝液の例には、クエン酸塩、リン酸塩、及び酢酸塩が含まれるが、これらに限定されない。特に好ましい緩衝液は酢酸緩衝液である。好ましい緩衝液は、カプセル化される核酸の化学的性質に応じて、陰イオンの１〜１０００ｍＭの濃度範囲にあり、緩衝液濃度の最適化は、高負荷レベルを達成するために重要であり得る。例えば、粒子を透析してエタノールを除去したり、ｐＨを上昇させたり、または薬学的に許容される担体もしくは希釈剤と混合したときに、粒子膜全体の浸透ポテンシャルのバランスをとる凍結防止剤及び／または非イオン溶質を加えることが適切であり得る。緩衝液中の核酸の量は、好ましくは約０．０１〜１．０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．０８〜０．８ｍｇ／ｍＬである。
【００５３】
脂質溶液（例えばエタノール）の添加時に、核酸水溶液の温度は２５〜４５℃、好ましくは３０〜４０℃である。いくつかの実施形態では、高温で核酸水溶液を短時間加熱すること（例えば、６５℃で１〜２分）が有用であり得る。脂質溶液は、空気−水界面に狭いストリームで噴霧するか、核酸水溶液に浸されたチューブを介して送達される脂質溶液間の液液界面のいずれかにより水溶液に添加され得る。
【００５４】
有機脂質溶液は、重力によって、または有機脂質溶液を制御された速度、好ましくは一定の速度で核酸水溶液に送達するポンプによって添加することができる。いくつかの実施形態では、有機脂質の送達は連続的である（例えば、連続流下で作動するポンプによる）。有機脂質溶液の送達は、１分〜６時間、１分〜１００分、または１〜２５分で完了することができる。有機脂質溶液は、単一のスプレーもしくはストリームを介して、チューブまたはアウトレット（ｏｕｔｌｅｔ）を介して、またはマルチアウトレットシステムを介して添加されてもよい。脂質有機溶液は核酸水溶液に添加されるが、得られる溶液は、攪拌、振盪、または再循環により混合されてもよい。本明細書で使用されるとき、「混合」は、好ましくは、乱流混合（「Ｔ混合」）、渦混合（「Ｖ混合」）、微小流体混合、またはその両方を含む。添加／混合ステップは、１０〜４５％エタノール、好ましくは１１〜３０％エタノール、より好ましくは１２．５〜２５％エタノールである最終濃度をもたらす。好ましくは、形成は、有機相の脂質と水相の核酸との沈殿を誘発する溶液の乱流もしくは微小流体混合、またはＬＮＰを作成するための膜を通しての核酸と脂質の既に相分離した混合物の押し出しを含む。
【００５５】
プロセスの１つのステップにおいて、第１のＰＥＧ脂質を含む脂質溶液は、核酸を含む溶液と混合され、それにより前駆体核酸脂質ナノ粒子を形成する。いくつかの実施形態では、前駆体核酸が提供される。別の態様では、前駆体脂質ナノ粒子が提供される。本明細書で使用されるとき、「前駆体脂質ナノ粒子」とは、本明細書に記載の脂質ナノ粒子の前駆体である脂質ナノ粒子を指す。いくつかの実施形態では、前駆体脂質ナノ粒子は、粒子形成プロセスの１つ以上のステップで形成及び／またはその間に存在し得る。脂質ナノ粒子がＰＥＧ分子を含むいくつかの実施形態では、前駆体脂質ナノ粒子は、比較的低い割合のＰＥＧ分子を含んでもよい（例えば、少なくとも約０．０１ｍｏｌ％及び約１．０ｍｏｌ％以下、少なくとも約０．０５ｍｏｌ％、少なくとも約０．１ｍｏｌ％、少なくとも約０．２ｍｏｌ％、少なくとも約０．３ｍｏｌ％、少なくとも約０．４ｍｏｌ％、少なくとも約０．５ｍｏｌ％、少なくとも約０．６ｍｏｌ％、少なくとも約０．７ｍｏｌ％、または０．８ｍｏｌ％）。
【００５６】
いくつかの実施形態では、前駆体核酸脂質ナノ粒子内の核酸の全ては、イオン化可能脂質と結合している。いくつかの実施形態では、前駆体核酸脂質ナノ粒子中の核酸の約８０％〜約１００％、約８５％〜約１００％、または約９０％〜約１００％がイオン化可能脂質と結合しており、好ましくは約９５％〜約１００％、好ましくは約９８％〜約１００％、好ましくは約９９％〜約１００％が結合している。
【００５７】
脂質ナノ粒子がＰＥＧ分子を含むいくつかの実施形態では、前駆体脂質ナノ粒子は、ＰＥＧ分子よりも多くのイオン化可能脂質に結合する核酸を有し得る。例えば、前駆体脂質ナノ粒子中の核酸の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％がイオン化可能脂質と結合している。いくつかのそのような場合、前駆体脂質ナノ粒子中の核酸の約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満、または約１０％未満がＰＥＧ分子と結合している（例えば、ＰＥＧ脂質）。いくつかの実施形態では、前駆体脂質ナノ粒子中のイオン化可能脂質と結合している核酸対ＰＥＧ脂質と結合している核酸の比は少なくとも約２：１である。いくつかの実施形態では、前駆体脂質ナノ粒子を含む組成物は、１つ以上の有機溶媒（例えば、エタノール）を含んでもよい。いくつかの実施形態では、核酸脂質ナノ粒子組成物は、前駆体脂質ナノ粒子に富んでいてもよい。例えば、核酸脂質ナノ粒子組成物中の脂質ナノ粒子の少なくとも約５０％は、前駆体脂質ナノ粒子であり得る。
【００５８】
いくつかの実施形態では、前駆体核酸脂質ナノ粒子は、約３０〜６０ｍｏｌ％のイオン化可能脂質と；約０〜３０ｍｏｌ％のリン脂質と；約１５〜５０ｍｏｌ％の構造脂質と；約０．０１〜１０ｍｏｌ％の第１のＰＥＧ脂質とを含む。いくつかの実施形態では、前駆体核酸脂質ナノ粒子は、約３０〜６０ｍｏｌ％のイオン化可能脂質と；約０〜３０ｍｏｌ％のリン脂質と；約１５〜５０ｍｏｌ％の構造脂質と；約０．０１〜１ｍｏｌ％の第１のＰＥＧ脂質とを含む。いくつかの実施形態では、前駆体核酸脂質ナノ粒子は、約４０〜６０ｍｏｌ％のイオン化可能脂質と；約５〜１５ｍｏｌ％のリン脂質と；約３５〜４５ｍｏｌ％の構造脂質と；約０．０１〜１０ｍｏｌ％の第１のＰＥＧ脂質とを含む。いくつかの実施形態では、前駆体核酸脂質ナノ粒子は、約４０〜６０ｍｏｌ％のイオン化可能脂質と；約５〜１５ｍｏｌ％のリン脂質と；約３５〜４５ｍｏｌ％の構造脂質と；約０．０１〜１ｍｏｌ％の第１のＰＥＧ脂質とを含む。いくつかの実施形態では、前駆体核酸脂質ナノ粒子は、約３０〜６０ｍｏｌ％のイオン化可能脂質と；約０〜３０ｍｏｌ％のリン脂質と；約１５〜５０ｍｏｌ％の構造脂質と；約０．０１〜０．７５ｍｏｌ％の第１のＰＥＧ脂質とを含む。いくつかの実施形態では、前駆体核酸脂質ナノ粒子は、約３０〜６０ｍｏｌ％のイオン化可能脂質と；約０〜３０ｍｏｌ％のリン脂質と；約１５〜５０ｍｏｌ％の構造脂質と；約０．０１〜０．５ｍｏｌ％の第１のＰＥＧ脂質とを含む。
【００５９】
いくつかの実施形態では、処理には、透析または濾過、好ましくは透析濾過による有機溶媒（すなわち、エタノール）の除去処理が含まれ得る。本明細書で使用されるとき、「処理」には、ＬＮＰを精製、ｐＨ調整、緩衝液交換、及び／または濃縮するステップが含まれる。いくつかの実施形態では、処理には滅菌濾過などの濾過が含まれる。より好ましい実施形態では、処理には、タンジェント流濾過（ＴＦＦ）が含まれる。エタノールを除去しながら、水溶液を、中性ｐＨ、ｐＨ６．５〜７．８、ｐＨ６．８〜ｐＨ  ７．５、好ましくはｐＨ７．０〜ｐＨ７．２で緩衝化されたもの、例えばリン酸塩またはＨＥＰＥＳ緩衝液に変換する。得られた水溶液は、保存または使用前に、例えば０．２２μｍフィルターによる濾過などにより滅菌することが好ましい。
【００６０】
いくつかの実施形態では、処理は凍結及び／または凍結乾燥を含んでもよい。凍結乾燥ステップは、適切なガラス容器、好ましくは１ｍｌ〜１０ｍｌ（例えば３ｍｌ）の円筒形ガラスバイアルで実施することができる。ガラスバイアルは、−４０℃未満及び室温を超える温度の極端な変化に短時間耐え、均一な形状に切断する必要がある。核酸脂質ナノ粒子を含む組成物は、好ましくは約０．１ｍｌ〜約５ｍｌ、０．２ｍｌ〜約３ｍｌ、０．３ｍｌ〜約１ｍｌ、または約０．４ｍｌ〜約０．８ｍｌ（例えば、約０．５ｍｌ）の範囲の体積でバイアルに添加され、好ましくは約９ｍｇ／ｍｌの脂質を含む。凍結乾燥のステップは、約−４０℃を超える温度、または例えば約−３０℃未満の温度で組成物を凍結し、凍結組成物を形成し、凍結組成物を乾燥させて、凍結乾燥組成物を形成することを含んでもよい。凍結ステップは、好ましくは、約１００〜１８０分（例えば、約１３０分）にわたって、好ましくは０．１〜１℃／分（例えば、約０．５℃／分）で２０℃から−４０℃まで、最終的に温度が直線的に低下する結果となる。より好ましくは、５〜１５％（例えば、８〜１２％）のスクロースを使用することができ、乾燥ステップは、約５０〜１５０ｍＴｏｒｒにおいてであり、最初は約−１５〜約−３５℃の低温であり、その後室温から約２５℃の高温で、３〜７日で完了する。本開示の別の実施形態では、乾燥ステップは、約５０〜１００ｍＴｏｒｒであり、最初に約−４０℃〜約−２０℃の低温で、次いでより高い温度である。
【００６１】
いくつかの実施形態では、方法は、核酸脂質ナノ粒子組成物を包装することをさらに含んでもよい。本明細書で使用する場合、「保存」または「包装」は、最終製品を最終包装に入れる前の、最終状態での製剤の保存またはＬＮＰの製造中の保存を指し得る。保存及び／または包装のモードには、滅菌バッグでの冷蔵、バイアルでの冷蔵または冷凍製剤、バイアル及びシリンジでの凍結乾燥製剤などが含まれるが、これらに限定されない。
【００６２】
いくつかの実施形態では、核酸脂質ナノ粒子は、約３０〜６０ｍｏｌ％のイオン化可能脂質と；約０〜４０ｍｏｌ％のリン脂質と；約１５〜５０ｍｏｌ％の構造脂質と；約０．０１〜２０ｍｏｌ％の第１のＰＥＧ脂質及び第２のＰＥＧ脂質の総量とを含む。いくつかの実施形態では、核酸脂質ナノ粒子は、約３０〜６０ｍｏｌ％のイオン化可能脂質と；約０〜３０ｍｏｌ％のリン脂質と；約１５〜５０ｍｏｌ％の構造脂質と；約０．５〜３．０ｍｏｌ％の第１のＰＥＧ脂質及び第２のＰＥＧ脂質の総量とを含む。いくつかの実施形態では、核酸脂質ナノ粒子は、約４０〜６０ｍｏｌ％のイオン化可能脂質と；約５〜１５ｍｏｌ％のリン脂質と；約３５〜４５ｍｏｌ％の構造脂質と；約０．０１〜２０ｍｏｌ％の第１のＰＥＧ脂質及び第２のＰＥＧ脂質の総量とを含む。いくつかの実施形態では、核酸脂質ナノ粒子は、約４０〜６０ｍｏｌ％のイオン化可能脂質と；約５〜１５ｍｏｌ％のリン脂質と；約３５〜４５ｍｏｌ％の構造脂質と；約０．５〜３ｍｏｌ％の第１のＰＥＧ脂質及び第２のＰＥＧ脂質の総量とを含む。いくつかの実施形態では、核酸脂質ナノ粒子は、約３０〜６０ｍｏｌ％のイオン化可能脂質と；約０〜３０ｍｏｌ％のリン脂質と；約１５〜５０ｍｏｌ％の構造脂質と；約０．５〜２．５ｍｏｌ％の第１のＰＥＧ脂質及び第２のＰＥＧ脂質の総量とを含む。いくつかの実施形態では、核酸脂質ナノ粒子は、約３０〜６０ｍｏｌ％のイオン化可能脂質と；約０〜３０ｍｏｌ％のリン脂質と；約１５〜５０ｍｏｌ％の構造脂質と；約０．５〜２．２５ｍｏｌ％の第１のＰＥＧ脂質及び第２のＰＥＧ脂質の総量とを含む。
【００６３】
いくつかの実施形態では、核酸ＬＮＰ製剤中の非イオン性界面活性剤の濃度は、約０．００００１％ｗ／ｖ〜約１％ｗ／ｖ、例えば約０．００００５％ｗ／ｖ〜約０．５％ｗ／ｖ、または約０．０００１％ｗ／ｖ〜約０．１％ｗ／ｖの範囲である。
【００６４】
いくつかの実施形態では、核酸ＬＮＰ製剤中の非イオン性界面活性剤の濃度は、約０．０００００１ｗｔ％〜約１ｗｔ％、例えば、約０．０００００２ｗｔ％〜約０．８ｗｔ％、または約０．０００００５ｗｔ％〜約０．５ｗｔ％の範囲である。
【００６５】
いくつかの実施形態では、安定化ＬＮＰ製剤中のＰＥＧ脂質の濃度は、約０．０１ｍｏｌ％〜約５０ｍｏｌ％、例えば約０．０５ｍｏｌ％〜約２０ｍｏｌ％、約０．０７ｍｏｌ％〜約１０ｍｏｌ％、約０．１ｍｏｌ％〜約８ｍｏｌ％、約０．２ｍｏｌ％〜約５ｍｏｌ％、または約０．２５ｍｏｌ％〜約３ｍｏｌ％の範囲である。
【００６６】
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子中の１つ以上の成分の分布は、少なくとも部分的に、成分が組み立てられるプロセスによって決定される場合がある。例えば、いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子内の核酸（例えば、ｍＲＮＡ）の分布（例えば、アクセス可能性、配置）は、少なくとも部分的には、製剤化プロセスによって制御できる。例えば、製剤化プロセスは、以下により詳細に説明するように、ｍＲＮＡの分布を調整することを可能にする１つ以上のステップを含んでもよい。例えば、製剤プロセスでは、粒子形成ステップ（例えば、ナノ沈殿反応）中に特定の成分（例えば、ＰＥＧ脂質）を比較的低い重量パーセンテージで使用でき、及び／または、粒子形成後に特定の脂質ナノ粒子成分を追加できる。
【００６７】
いくつかの実施形態では、使用されるプロセスに関係なく、脂質ナノ粒子内の１つ以上の成分の分布は、少なくとも部分的に、脂質ナノ粒子内の別の成分の分布によって影響を受け得る。例えば、脂質ナノ粒子内の核酸の分布は、少なくとも部分的に、ポリエチレングリコールを含む分子（「ＰＥＧ分子」とも呼ばれる）などの脂質ナノ粒子内の別の成分の分布によって決定され得る。理論に縛られることなく、ＰＥＧ分子の特定の分布が有益なｍＲＮＡ分布をもたらす特定の結合を促進すると考えられている。ＰＥＧを含む分子（例えば、ＰＥＧ脂質）の分布がｍＲＮＡの分布に影響を与えるかどうかに関係なく、ポリエチレングリコールを含む分子（例えば、ＰＥＧ脂質）の特定の分布は有益な特性をもたらし得る。
【００６８】
本明細書に記載されるように、いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコールを含む分子（例えば、ＰＥＧ脂質）の特定の分布を有する脂質ナノ粒子は、有益な物理的及び／または生物学的特性を有し得る。いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコールを含む分子（例えば、ＰＥＧ脂質）は、ポリエチレングリコールを含む分子（例えば、ＰＥＧ脂質）の比較的高いパーセンテージ（例えば、大部分）が、脂質ナノ粒子の表面からアクセス可能であるように分布し得る。本明細書で使用されるとき、ポリエチレングリコールを含む分子（例えば、ＰＥＧ脂質）に関して「アクセス可能」（「表面アクセス可能」とも呼ばれる）という用語は、脂質ナノ粒子の表面に局在するＰＥＧ分子及び／または、特定の条件下（例えば、生理学的条件、血清中、緩衝液中）で脂質ナノ粒子の表面に、容易な再編成などにより容易に局在化できるＰＥＧ分子を指し得る。表面アクセス可能でないＰＥＧ分子は、「残留」ＰＥＧ分子と呼ばれる場合がある。いくつかの実施形態では、残留ＰＥＧ分子は、脂質ナノ粒子の１つ以上の内部領域に配置され得る。いくつかの実施形態では、表面アクセス可能なＰＥＧ分子は、脂質ナノ粒子の外部領域内に配置される場合がある。
【００６９】
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子の表面アクセス可能性は、１つ以上のアッセイ（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ）によって決定できる。一般に、任意の適切なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイが使用され得る。いくつかの実施形態では、拡散秩序化分光法（ＤＯＳＹ）ＮＭＲで評価された脂質ナノ粒子からのＰＥＧ分子のシェディングを使用して、脂質ナノ粒子及び／または組成物中の表面アクセス可能及び残留ＰＥＧ分子の相対パーセンテージを決定できる。ＰＥＧシェディング及びＤＯＳＹ  ＮＭＲについては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｗｉｌｓｏｎ，  Ｓ．Ｃ．；Ｂａｒｙｚａ，  Ｊ．Ｌ．；Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，  Ａ．  Ｊ．；Ｂｏｗｍａｎ，  Ｋ．；Ｒａｊａｎ，  Ｓ．；ｅｔ  ａｌ．  （２０１５）．  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ＰＥＧ  Ｓｈｅｄｄｉｎｇ  ｆｒｏｍ  Ｌｉｐｉｄ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｉｎ  Ｓｅｒｕｍ  ｖｉａ  ＮＭＲ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，  １２（２）：３８６−９２でさらに説明される。いくつかの実施形態では、表面アクセス可能なＰＥＧ分子のパーセンテージは、特定の条件下（例えば、２５℃のマウス血清中）で一定期間（例えば、６時間、２４時間）後にシェディングしたＰＥＧ分子のパーセンテージに対応する。
【００７０】
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子は、半減期が比較的短くなる方法で分布していてもよい。本明細書で使用されるとき、ポリエチレングリコールを含む分子の「半減期」は、特定の条件下（例えば、２５℃のマウス血清中）で、ＤＯＳＹ  ＮＭＲにより決定されるとき、ポリエチレングリコールを含む分子の５０％が脂質ナノ粒子の表面からシェディングするのにかかる時間である。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、特定の同等の脂質ナノ粒子よりも半減期が短い場合がある。
【００７１】
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子の表面アクセス可能性、配置、及び／または半減期は、脂質ナノ粒子の１つ以上の生物学的及び／または物理的特性と相関する場合がある。例えば、いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子の表面アクセス可能性、配置、及び／または半減期は、脂質ナノ粒子及び／または組成物の免疫原性と相関する場合がある。例えば、いくつかの実施形態では、比較的高いパーセンテージの表面アクセス可能なＰＥＧ分子及び／または比較的短い半減期は、免疫原性が低いか、またはそれがないことに対応する場合がある。特定の本発明の組成物は、同等の組成物よりも低い免疫原性を有し得る。
【００７２】
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ分子の表面アクセス可能性、配置、及び／または半減期は、脂質ナノ粒子の１つ以上の物理的特性と相関する場合がある。例えば、比較的高いパーセンテージの表面アクセス可能なＰＥＧ分子及び／または比較的短い半減期は、高い核酸カプセル化効率に対応する場合がある。別の例として、ＰＥＧ分子の表面アクセス可能性、配置、及び／または半減期は、表面分極と相関する場合がある。例えば、いくつかの実施形態では、比較的高いパーセンテージの表面アクセス可能なＰＥＧ分子及び／または比較的短い半減期を有する脂質ナノ粒子は、比較的低い表面分極（例えば、低い表面極性）を有する場合がある。
【００７３】
本明細書に記載されるように、いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、１つ以上の成分の有益な分布を有し得る。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、２つ以上の成分（例えば、３つ以上の成分、４つ以上の成分、５つ以上の成分）の有益な分布を有し得る。例えば、脂質ナノ粒子は、核酸の有益な分布及びＰＥＧ分子の有益な分布を有することを有し得る。いくつかのそのような場合、脂質ナノ粒子は、各成分の有益な分布に関連する有利な特性のうちの少なくともいくつか（例えば、全て）を有し得る。
【００７４】
いくつかの実施形態では、組成物が提供される。組成物は、本明細書に記載の脂質ナノ粒子を含んでもよい。いくつかの実施形態では、組成物は、本明細書に記載の比較的高いパーセンテージの脂質ナノ粒子を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子は、製剤中の他の脂質ナノ粒子よりも優れた１つ以上の特性を有し得る。製剤中の別の脂質ナノ粒子よりも優れた１つ以上の特性を有するそのような脂質ナノ粒子は、「強化脂質ナノ粒子」と呼ばれる場合がある。例えば、強化脂質ナノ粒子は、組成物中の別の脂質ナノ粒子（例えば、他の全ての脂質ナノ粒子）よりもアクセス可能でないｍＲＮＡを有し得る。いくつかの例では、強化脂質ナノ粒子は、アクセス可能なｍＲＮＡよりもアクセス可能でないｍＲＮＡを有する場合がある。特定の実施形態では、強化脂質ナノ粒子は、比較的高いパーセンテージ（例えば、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％）の表面アクセス可能なＰＥＧ分子を有し得る。強化脂質ナノ粒子が、組成物中の総脂質ナノ粒子の比較的高いパーセンテージ（例えば、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％）を構成するいくつかの実施形態では、組成物は強化脂質ナノ粒子に富んでいると呼ばれる場合がある。
【００７５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子及び／または組成物は、少ない量のアクセス可能な核酸（例えばｍＲＮＡ）を有する場合がある。例えば、いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子及び／または組成物中の核酸の総量のうち、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、または約５％以下が、アクセス可能な核酸（例えば、ｍＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子及び／または組成物は、アクセス可能な核酸を含んでもよい。いくつかのそのような実施形態では、脂質ナノ粒子及び／または組成物は、少なくとも約０．０１％、少なくとも約０．０５％、少なくとも約０．１％、少なくとも約０．５％、少なくとも約１％、または少なくとも約２％のアクセス可能な核酸を含み得る。上述の範囲の全ての組み合わせが可能である（例えば、少なくとも約０．０１％及び約５０％以下）。
【００７６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子及び／または組成物は、有益な量のアクセス可能でない核酸（例えばｍＲＮＡ）を有する場合がある。例えば、いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子及び／または組成物中の核酸の総量のうち、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、約９０％以下、または少なくとも約９５％が、アクセス可能でない核酸（例えばｍＲＮＡ）である。
【００７７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子及び／または組成物は、脂質ナノ粒子の１つ以上の内部領域に有益な量の核酸（例えばｍＲＮＡ）が配置されていてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子及び／または組成物中の核酸の総量のうち、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、約７０％以下、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、約９０％以下、または少なくとも約９５％が、脂質ナノ粒子の内部領域（複数可）に配置される。
【００７８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子及び／または組成物は、少なくとも部分的に（例えば、完全に）カプセル化された有益な量の核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を有し得る。例えば、いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子及び／または組成物中の核酸の総量のうち、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、約７０％以下、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、約９０％以下、または少なくとも約９５％が、少なくとも部分的に（例えば、完全に）カプセル化される。いくつかの実施形態では、少なくとも部分的に（例えば、完全に）カプセル化された核酸のパーセンテージは、本明細書に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ（例えば、ＩＥＸ）により決定され得る。
【００７９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子及び／または組成物は、有益な量の表面アクセス可能なＰＥＧ分子（例えば、ＰＥＧ脂質）を有し得る。例えば、いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子及び／または組成物中のＰＥＧを含む分子（例えば、ＰＥＧ脂質）の総量のうち、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、約９０％以下、または少なくとも約９５％が、表面アクセス可能なＰＥＧ分子である。
【００８０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子及び／または組成物は、有益な量のＰＥＧを含む残留分子（例えば、ＰＥＧ脂質）を有し得る。例えば、いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子及び／または組成物中のＰＥＧ分子（例えば、ＰＥＧ脂質）の総量のうち、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、または約５％以下が、残留ＰＥＧ分子である。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子及び／または組成物は残留ＰＥＧ分子を含んでもよい。いくつかのそのような実施形態では、脂質ナノ粒子及び／または組成物は、少なくとも約０．０１％、少なくとも約０．０５％、少なくとも約０．１％、少なくとも約０．５％、少なくとも約１％、または少なくとも約２％の残留ＰＥＧ分子を含み得る。上述の範囲の全ての組み合わせが可能である（例えば、少なくとも約０．０１％及び約５０％以下）。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子及び／または組成物は残留ＰＥＧ分子を含まない場合がある。
【００８１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子及び／または組成物は、脂質ナノ粒子（複数可）の外部領域に有益な量のＰＥＧ分子（例えば、ＰＥＧ脂質）が配置されていてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子及び／または組成物中のＰＥＧ分子（例えば、ＰＥＧ脂質）の総量のうち、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、約７０％以下、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、約９０％以下、または少なくとも約９５％が、脂質ナノ粒子（複数可）の外部領域（複数可）に配置されていてもよい。
【００８２】
脂質ナノ粒子がポリエチレングリコールを含む分子（例えば、ＰＥＧ−脂質）を含むいくつかの実施形態では、ポリエチレングリコールを含む分子の半減期は比較的短くてもよい。例えば、半減期は、約５時間以下、約４．５時間以下、約４時間以下、約３時間以下、約２．７５時間以下、約２．２５時間以下、約２．０時間以下、約１．７５時間以下、約１．５時間以下、約１．２５時間以下、約１．０時間以下、約０．７５時間以下、または約０．５時間以下であり得る。いくつかの場合では、半減期は少なくとも約０．０１時間、少なくとも約０．０５時間、少なくとも約０．１時間、少なくとも約０．５時間であり得る。上述の範囲の全ての組み合わせが可能である（例えば、少なくとも約０．０１時間及び約５時間以下、少なくとも約０．０１時間及び約３時間以下、少なくとも約０．５時間及び約３時間以下）。
【００８３】
脂質ナノ粒子及び／または組成物がポリエチレングリコールを含む分子（例えば、ＰＥＧ脂質）を含むいくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子及び／または組成物中のＰＥＧ分子のモルパーセンテージは比較的小さくてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子及び／または組成物中のＰＥＧ分子（複数可）のモルパーセンテージは、約５％以下、約４．５％以下、約４．０％以下、約３．５％以下、約３．０％以下、約２．５％以下、約２．０％以下、約１．５％以下、約１．０％以下、または約０．５％以下である。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子及び／または組成物は、ＰＥＧ分子（複数可）を含んでもよい。いくつかのそのような実施形態では、脂質ナノ粒子及び／または組成物は、少なくとも約０．０１％、少なくとも約０．０５％、少なくとも約０．１％、少なくとも約０．５％、少なくとも約１％、または少なくとも約２％のモルパーセントのＰＥＧ分子を含み得る。上述の範囲の全ての組み合わせが可能である（例えば、少なくとも約０．０１％及び約５．０％以下）。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子及び／または組成物中のＰＥＧ分子（例えば、ＰＥＧ脂質）のモルパーセンテージは、ＰＥＧ分子（例えば、ＰＥＧ脂質）の臨界ミセル濃度よりも低くてもよい。
【００８４】
いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコールを含む分子はＰＥＧ脂質であってもよい。いくつかのそのような実施形態では、ＰＥＧ脂質は、１つ以上の脂肪族基を含み得る。いくつかの場合では、ＰＥＧ脂質は２つ以上の脂肪族基を含み得る。２つ以上の脂肪族基は、同一の脂肪族鎖内にない脂肪族基を指すことを理解されたい。例えば、第１の脂肪族基の炭素原子は、第２の脂肪族基の炭素原子と直接的な炭素−炭素共有結合を形成しなくてもよい。すなわち、２つ以上の脂肪族基は互いに間接的に結合していてもよい。
【００８５】
ＬＮＰ溶液の処理
本明細書で使用される「処理」という用語は、ＬＮＰを精製、ｐＨ調整、緩衝液交換、及び／または濃縮するための１つ以上のステップを含む。
【００８６】
いくつかの実施形態では、ＬＮＰ溶液の処理ステップは以下を含む：
ａ）ＬＮＰ溶液を濾過すること。
【００８７】
いくつかの実施形態では、濾過は、ＬＮＰ溶液から有機溶媒（例えば、エタノール）を除去する。いくつかの実施形態では、処理には滅菌濾過などの濾過が含まれる。いくつかの実施形態では、処理には、タンジェント流濾過（ＴＦＦ）が含まれる。いくつかの実施形態では、有機溶媒（例えば、エタノール）を除去すると、ＬＮＰ溶液は中性ｐＨ、ｐＨ６．５〜７．８、ｐＨ６．８〜ｐＨ７．５、好ましくはｐＨ７．０〜ｐＨ７．２で緩衝化された溶液（例えばリン酸塩またはＨＥＰＥＳ緩衝液）に変換される。いくつかの実施形態では、得られたＬＮＰ溶液は、保存または使用前に、例えば濾過（例えば、０．２２μｍフィルターを通して）により滅菌することが好ましい。
【００８８】
いくつかの実施形態では、ＬＮＰ溶液の処理ステップはＬＮＰ溶液を包装することをさらに含む。
【００８９】
本明細書で使用する場合、「包装」は、最終製品を最終包装に入れる前の、最終状態での製剤の保存またはＬＮＰの製造中の保存を指し得る。保存及び／または包装のモードには、滅菌バッグでの冷蔵、バイアルでの冷蔵または冷凍製剤、バイアル及びシリンジでの凍結乾燥製剤などが含まれるが、これらに限定されない。
【００９０】
いくつかの実施形態では、ＬＮＰ溶液を包装するステップは、次のうちの１つ以上のステップを含む：
ｂ）凍結保護剤をＬＮＰ溶液に添加することと；
ｃ）ＬＮＰ溶液を凍結乾燥し、それにより凍結乾燥ＬＮＰ組成物を形成することと；
ｄ）ＬＮＰ溶液または凍結乾燥ＬＮＰ組成物を保存することと；
再構成溶液をＬＮＰ溶液または凍結乾燥ＬＮＰ組成物に添加し、それによりＬＮＰ製剤を形成すること。
【００９１】
いくつかの実施形態では、凍結保護剤は、凍結乾燥の前にＬＮＰ溶液に添加される。いくつかの実施形態では、凍結保護剤は１つ以上の凍結防止剤を含み、１つ以上の凍結防止剤のそれぞれは独立してポリオール（例えば、プロピレングリコール（すなわち、１，２−プロパンジオール）、１，３−プロパンジオール、グリセロール、（＋／−）−２−メチル−２，４−ペンタンジオール、１，６−ヘキサンジオール、１，２−ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、エチレングリコール、もしくはジエチレングリコールなどのジオールもしくはトリオール）、非界面活性剤スルホベタイン（例えば、ＮＤＳＢ−２０１（３−（１−ピリジノ）−１−プロパンスルホネート）、オスモライト（例えば、Ｌ−プロリンもしくはトリメチルアミンＮ−オキシド二水和物）、ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール２００（ＰＥＧ２００）、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧ３３５０、ＰＥＧ４０００、ＰＥＧ８０００、ＰＥＧ１００００、ＰＥＧ２００００、ポリエチレングリコールモノメチルエーテル５５０（ｍＰＥＧ５５０）、ｍＰＥＧ６００、ｍＰＥＧ２０００、ｍＰＥＧ３３５０、ｍＰＥＧ４０００、ｍＰＥＧ５０００、ポリビニルピロリドン（例えば、ポリビニルピロリドンＫ１５）、ペンタエリスリトールプロポキシレート、もしくはポリプロピレングリコールＰ４００）、有機溶媒（例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）もしくはエタノール）、糖（例えば、Ｄ−（＋）−スクロース、Ｄ−ソルビトール、トレハロース、Ｄ−（＋）−マルトース一水和物、メソエリスリトール、キシリトール、ミオイノシトール、Ｄ−（＋）−ラフィノース五水和物、Ｄ−（＋）−トレハロース二水和物、もしくはＤ−（＋）−グルコース一水和物）、または塩（例えば、酢酸リチウム、塩化リチウム、ギ酸リチウム、硝酸リチウム、硫酸リチウム、酢酸マグネシウム、塩化ナトリウム、ギ酸ナトリウム、マロン酸ナトリウム、硝酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、もしくはそれらの水和物）、あるいはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、凍結保護剤はスクロースを含む。
【００９２】
いくつかの実施形態では、凍結乾燥は適切なガラス容器（例えば、２、３、５、または１０ｍｌの円筒形ガラスバイアル）で実施された。ガラス容器は、好ましくは、−４０℃未満から室温より高い温度を超える温度の極端な変化に短時間耐え、及び／または、均一な形状にカットされる。いくつかの実施形態では、凍結乾燥のステップは、約−４０℃より低い温度でＬＮＰ溶液を凍結し、それによって凍結ＬＮＰ溶液を形成し、凍結ＬＮＰ溶液を乾燥させて、凍結乾燥ＬＮＰ組成物を形成することを含む。凍結ステップは、好ましくは、約１００〜１８０分（例えば、約１３０分）にわたって、好ましくは０．１〜１℃／分（例えば、約０．５℃／分）で２０℃から−４０℃まで、最終的に温度が直線的に低下する結果となる。より好ましくは、５〜１５％（例えば、８〜１２％）のスクロースを使用することができ、乾燥ステップは、約５０ｍＴｏｒｒ〜約１５０ｍＴｏｒｒの範囲の真空で、好ましくは最初に−１０℃未満（例えば、約−３５℃〜約−１５℃）、−２０℃未満、−３０℃未満、または−４０℃未満より低い低温で実施され、その後、室温から約２５℃までのより高い温度で実施され、好ましくは、乾燥ステップは３〜７日で完了する。いくつかの実施形態では、乾燥ステップは、約５０ｍＴｏｒｒから約１００ｍＴｏｒｒの範囲の真空で、好ましくは最初に約０℃未満、約−１０℃未満、約−２０℃未満、または約−３０℃未満（例えば、約−３５℃）の低温で、次いでより高い温度で実施される。
【００９３】
いくつかの実施形態では、ＬＮＰ溶液または凍結乾燥ＬＮＰ組成物は、再構成溶液を添加する前に、約−４０℃、約−３５℃、約−３０℃、約−２５℃、約−２０℃、約−１５℃、約−１０℃、約−５℃、約０℃、約５℃、約１０℃、約１５℃、約２０℃、または約２５℃の温度で保存される。
【００９４】
いくつかの実施形態では、ＬＮＰ溶液または凍結乾燥ＬＮＰ組成物は、再構成溶液を添加する前に、約−４０℃〜約０℃、約−３５℃〜約−５℃、約−３０℃〜約−１０℃、約−２５℃〜約−１５℃、約−２２℃〜約−１８℃、または約−２１℃〜約−１９℃の範囲の温度で保存される。
【００９５】
いくつかの実施形態では、ＬＮＰ溶液または凍結乾燥ＬＮＰ組成物は、再構成溶液を添加する前に、約−２０℃の温度で保存される。
【００９６】
いくつかの実施形態では、ＬＮＰ溶液または凍結乾燥ＬＮＰ組成物は、再構成溶液を添加する前に、約−１５℃〜約２５℃、約−１０℃〜約２０℃、約−５℃〜約１５℃、約０℃〜約１０℃、約１℃〜約９℃、または約２℃〜約８℃の範囲の温度で保存される。
【００９７】
いくつかの実施形態では、ＬＮＰ溶液または凍結乾燥ＬＮＰ組成物は、再構成溶液を添加する前に、約３０分、約１時間、約２時間、約４時間、約６時間、約１２時間、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約１か月、約２か月、約３か月、約４か月、約６か月、約９か月、約１年、約２年、約３年、約４年、約５年、約６年、約７年、約８年、約９年、または約１０年、保存される。
【００９８】
いくつかの実施形態では、ＬＮＰ溶液または凍結乾燥ＬＮＰ組成物は、再構成溶液を添加する前に、約１か月〜約１０年、約３か月〜約８年、約６か月〜約６年、約９か月〜約４年、約１年〜約３年、または約１．５年〜約２．５年の範囲の期間、保存される。
【００９９】
いくつかの実施形態では、ＬＮＰ溶液または凍結乾燥ＬＮＰ組成物は、再構成溶液を添加する前に、約２年、保存される。
【０１００】
ＬＮＰ製剤の安定化方法
本開示は、核酸脂質ナノ粒子組成物を生成する方法を提供する。
【０１０１】
本開示は、ストレスが適用される前もしくはそのとき、またはその生成中に修飾剤をＬＮＰ製剤に添加することにより、ストレスの適用時に脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤を安定化する方法を提供する。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、ストレスには、製剤の製造、精製、包装、保存、輸送、使用時に製剤に適用される熱、せん断、過度の攪拌、膜濃度分極（荷電状態の変化）、脱水、凍結ストレス、乾燥ストレス、凍結／融解ストレス、噴霧ストレスなどの任意のストレスが含まれる。例えば、ストレスは、不純物、目に見えない粒子、またはその両方の増量、ＬＮＰサイズの増加、カプセル化効率、治療効果、またはその両方の低下、及び忍容性の低下（例えば、免疫原性の増加）などのうちの１つ以上の望ましくない特性変化を製剤に引き起こし得る。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、適用されるストレスは、ＬＮＰ製剤を生成すること、例えば有機溶媒（例えばエタノール）で脂質成分を混合して有機相を生成すること、ｍＲＮＡを酸性溶液へと混合して水相を生成すること、水相のｐＨ値を調整すること、及び／または有機相と水相とを混合してＬＮＰ製剤を生成することに由来する。例えば、上述の各混合ステップは、乱流混合またはマイクロ流体混合を含み得る。例えば、有機物を水相と混合する前に、各相は、例えば濾過（タンジェント流濾過またはＴＦＦなど）を介して精製され得る。例えば、適用されるストレスはそのような精製に由来する。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、適用されるストレスは、ＬＮＰ形成後のＬＮＰの処理、例えば、タンジェント流濾過（ＴＦＦ）による下流の精製及び濃縮に由来する。例えば、一般的なＴＦＦプロセスでは、ＬＮＰ分散液は様々な疎水性界面、せん断力、乱流に曝露される。例えば、典型的なＴＦＦプロセス中に、膜の孔よりも大きい分子（すなわち、ＬＮＰ）が膜表面に蓄積して、ゲルまたは濃度分極層を形成する。例えば、ＬＮＰの濃度の増加は不安定化ストレスとして機能し、より大きな粒子種を生成する可能性のある分子間相互作用を促進する。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、適用されるストレスはＬＮＰ製剤の精製に由来する。したがって、本開示は、両親媒性ポリマーの存在下で第１のＬＮＰ製剤を濾過して第２のＬＮＰ製剤を得ることを含む、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤を精製する方法も特徴とする。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、適用されるストレスはＬＮＰ製剤の凍結または凍結乾燥に由来する。したがって、本開示は、修飾剤の存在下で第１のＬＮＰ製剤を凍結または凍結乾燥することを含む、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤を凍結または凍結乾燥する方法も特徴とする。
【０１０７】
例えば、修飾剤は、約０．０２５％ｗ／ｖ〜約１％ｗ／ｖの範囲の濃度（例えば、約０．０２５％ｗ／ｖ、約０．０５％ｗ／ｖ、約０．１％ｗ／ｖ、約０．５％ｗ／ｖ、約１％ｗ／ｖ、約０．０２５〜０．５％ｗ／ｖ、約０．０５〜１％ｗ／ｖ、約０．１〜１％ｗ／ｖ、または約０．１〜０．５％ｗ／ｖ）で存在する。例えば、修飾剤は、約０．０２５％ｗ／ｗ〜約１％ｗ／ｗの範囲の濃度（例えば、約０．０２５％ｗ／ｗ、約０．０５％ｗ／ｗ、約０．１％ｗ／ｗ、約０．５％ｗ／ｗ、約１％ｗ／ｗ、約０．０２５〜０．５％ｗ／ｗ、約０．０５〜１％ｗ／ｗ、約０．１〜１％ｗ／ｗ、または約０．１〜０．５％ｗ／ｗ）で存在する。
【０１０８】
例えば、修飾剤は、約０．０２５％ｗ／ｖ〜約１％ｗ／ｖの範囲の濃度（例えば、約０．０２５％ｗ／ｖ、約０．０５％ｗ／ｖ、約０．１％ｗ／ｖ、約０．５％ｗ／ｖ、約１％ｗ／ｖ、約０．０２５〜０．５％ｗ／ｖ、約０．０５〜１％ｗ／ｖ、約０．１〜１％ｗ／ｖ、または約０．１〜０．５％ｗ／ｖ）で存在する。例えば、修飾剤は、約０．０２５％ｗ／ｗ〜約１％ｗ／ｗの範囲の濃度（例えば、約０．０２５％ｗ／ｗ、約０．０５％ｗ／ｗ、約０．１％ｗ／ｗ、約０．５％ｗ／ｗ、約１％ｗ／ｗ、約０．０２５〜０．５％ｗ／ｗ、約０．０５〜１％ｗ／ｗ、約０．１〜１％ｗ／ｗ、または約０．１〜０．５％ｗ／ｗ）で存在する。
【０１０９】
例えば、第３の両親媒性ポリマーは、約０．１％ｗ／ｖ〜約３％ｗ／ｖの範囲の濃度（例えば、約０．１％ｗ／ｖ、約０．５％ｗ／ｖ、約１％ｗ／ｖ、約２％ｗ／ｖ、約２．５％ｗ／ｖ、約０．１〜２．５％ｗ／ｖ、約０．１〜１％ｗ／ｖ、約０．１〜０．５％ｗ／ｖ、または約０．１〜０．４％ｗ／ｖ）で存在する。例えば、第３の両親媒性ポリマーは、約０．１％ｗ／ｗ〜約３％ｗ／ｗの範囲の濃度（例えば、約０．１％ｗ／ｗ、約０．５％ｗ／ｗ、約１％ｗ／ｗ、約２％ｗ／ｗ、約２．５％ｗ／ｗ、約０．１〜２．５％ｗ／ｗ、約０．１〜１％ｗ／ｗ、約０．１〜０．５％ｗ／ｗ、または約０．１〜０．４％ｗ／ｗ）で存在する。
【０１１０】
例えば、第４の両親媒性ポリマーは、約０．１％ｗ／ｖ〜約３％ｗ／ｖの範囲の濃度（例えば、約０．１％ｗ／ｖ、約０．５％ｗ／ｖ、約１％ｗ／ｖ、約２％ｗ／ｖ、約０．１〜２．５％ｗ／ｖ、約０．１〜１％ｗ／ｖ、約０．１〜０．５％ｗ／ｖ、または約０．１〜０．４％ｗ／ｖ）で存在する。例えば、第４の両親媒性ポリマーは、約０．１％ｗ／ｗ〜約３％ｗ／ｗの範囲の濃度（例えば、約０．１％ｗ／ｗ、約０．５％ｗ／ｗ、約１％ｗ／ｗ、約２％ｗ／ｗ、約２．５％ｗ／ｗ、約０．１〜２．５％ｗ／ｗ、約０．１〜１％ｗ／ｗ、約０．１〜０．５％ｗ／ｗ、または約０．１〜０．４％ｗ／ｗ）で存在する。
【０１１１】
例えば、修飾剤対核酸の重量比は約０．０２５：１〜約１００：１である。
【０１１２】
例えば、修飾剤は、修飾剤対ＬＮＰの重量比が約０．０００４：１〜約１００：１（例えば、約０．００１：１〜約１０：１、約０．００１：１〜約５：１、約０．００１：１〜約０．１：１、約０．００５〜約０．４：１、または約０．５：１〜約４：１、約０．０５：１〜約５：１、約０．１：１〜約５：１、または約０．０５：１〜約２．５：１、約１：１〜約５０：１、約２：１〜約５０：１、または約１：１〜約２５：１）となるように添加される。
【０１１３】
ＬＮＰ組成物を特性評価する方法
いくつかの実施形態では、ＬＮＰを含むＬＮＰ組成物中の核酸のアクセス可能性は、１つ以上のアッセイ（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ）によって決定され得る。一般に、任意の適切なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイが使用され得る。適切なアッセイは、核酸の様々なカプセル化状態及び／または核酸と脂質ナノ粒子の成分との結合状態を区別することができる。例えば、核酸のアクセス可能性は、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）アッセイによって決定できる。ある特定の実施形態では、以下により詳細に説明されるように、特定の従来のアッセイは、核酸のアクセス可能性を決定するのに適さない場合がある。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイは、核酸（例えば、ｍＲＮＡ）のアクセス可能性を判定するには適さない。いくつかの実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを使用して、脂質ナノ粒子または組成物中のアクセス可能またはアクセス可能でない核酸（例えば、ｍＲＮＡ）の量の定量値を生成することができる。例えば、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）アッセイを使用して、脂質ナノ粒子を含む組成物中のアクセス可能なまたはアクセス可能でないｍＲＮＡの量の定量値を生成することができる。一般に、全組成物及び／または組成物の画分（例えば、特定の脂質ナノ粒子を含む画分）について、アクセス可能でないまたはアクセス可能な核酸の量を決定してもよい。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子内の核酸のアクセス可能性は、脂質ナノ粒子の１つ以上の生物学的特性と相関している場合がある。ある特定の実施形態では、脂質ナノ粒子内の核酸のアクセス可能性は、タンパク質発現レベル及び／または細胞内核酸送達の有効性と相関している場合がある。例えば、いくつかの実施形態では、アクセス可能でない核酸が比較的高いパーセンテージであるため、アクセス可能な核酸のパーセンテージが比較的低いことにより、タンパク質発現レベル（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ）が高くなる場合がある。そのような場合、低いパーセンテージのアクセス可能なｍＲＮＡを有する組成物は、高いパーセンテージのアクセス可能なｍＲＮＡを有する同等の組成物よりも高いレベルのｍＲＮＡ発現を有し得る。
【０１１５】
いくつかの態様では、本開示は、クロマトグラフィーアッセイを使用してＬＮＰ組成物（例えば、本開示の方法によって調製されたＬＮＰ組成物）を特性評価する方法を提供する。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、ＬＮＰ組成物中のカプセル化された核酸（例えばｍＲＮＡ）の量の定量値は、クロマトグラフィーアッセイを使用して測定される。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーアッセイは、イオン交換（ＩＥＸ）クロマトグラフィーアッセイである。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）アッセイによって決定されるとき、ＬＮＰ組成物中のＬＮＰの少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９５％が、その中にカプセル化されたｍＲＮＡを有する。
【０１１９】
イオン交換（ＩＥＸ）クロマトグラフィー法を開発して、通常のＴミックス方法論（実施例４）またはＶミックス方法論に従って生成された、イオン化可能脂質ベースのＬＮＰにカプセル化されたｍＲＮＡのカプセル化効率を正確に決定した。ＩＥＸクロマトグラフィーを使用して、結合ｍＲＮＡと遊離ｍＲＮＡを分離できる。ＩＥＸスクリーニング法は、低塩濃度から高塩濃度への勾配変化があるとき、ＬＮＰから遊離ｍＲＮＡを分離する。勾配が低塩濃度から高塩濃度に変化するとき、ＬＮＰは空隙に溶出し（ピーク１）、ｍＲＮＡが溶出する（「アクセス可能なｍＲＮＡ」と呼ばれるピーク２）。
【０１２０】
理論に拘束されることなく、ＬＮＰ（例えば、ｍＲＮＡをカプセル化するＬＮＰ）の集団内で、ｍＲＮＡは、例えば、完全にカプセル化されている、表面に結合している、ゆるくカプセル化されている（または他の物理的状態）など、様々な異なるカプセル化状態で存在し得ると考えられている。核酸のカプセル化効率を決定するための当該技術分野で認識されている方法、特に日常的に使用されるＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイでは、そのような物理的状態を区別することができない（例えば、構造的特徴及び状況における重要な違いを識別しない）。本発明のＩＥＸ法の有用性を例示するために、ＬＮＰ試料集団は、例えばサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）などの当該技術分野で認識されている分離技術に供することができる。これは、サイズに基づいて粒子を分画化する。画分は、例えば、生物学的アッセイ、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏタンパク質発現アッセイに供され得る。画分も同様に、本発明のＩＥＸ法によるカプセル化効率の決定に供することができる。
【０１２１】
イオン化可能脂質
本開示は、好ましくは中心アミン部分及び少なくとも１つの生分解性基を含むイオン化可能脂質を提供する。本明細書に記載の脂質は、核酸などの治療薬及び／または予防薬を哺乳動物細胞または臓器に送達するための脂質ナノ粒子に有利に使用することができる。
【０１２２】
実施形態では、本開示のイオン化可能脂質は、式（ＩＬ−１）：
【化１】
2020532528.tif 000003
の化合物のうちの１つ以上またはそれらのＮ−オキシド、またはその塩もしくは異性体であり得、式中：
Ｒ１は、Ｃ５−３０アルキル、Ｃ５−２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され；
Ｒ２及びＲ３は、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、Ｃ２−１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から独立して選択されるか、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって複素環もしくは炭素環を形成し；
Ｒ４は、水素、Ｃ３−６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、−ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換のＣ１−６アルキルからなる群から選択され、Ｑは、炭素環、複素環、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ８、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、及び−Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各々のｎは、１、２、３、４、及び５から独立して選択され；
各々のＲ５は、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され；
各々のＲ６は、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され；
Ｍ及びＭ’は、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）−Ｍ”−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、及びヘテロアリール基から独立して選択され、Ｍ”は結合、Ｃ１−１３アルキル、またはＣ２−１３アルケニルであり；
Ｒ７は、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され；
Ｒ８は、Ｃ３−６炭素環及び複素環からなる群から選択され；
Ｒ９は、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１−６アルキル、−ＯＲ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ３−６炭素環及び複素環からなる群から選択され；
各々のＲは、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され；
各々のＲ’は、Ｃ１−１８アルキル、Ｃ２−１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及びＨからなる群から独立して選択され；
各々のＲ”は、Ｃ３−１５アルキル及びＣ３−１５アルケニルからなる群から独立して選択され；
各々のＲ＊は、Ｃ１−１２アルキル及びＣ２−１２アルケニルからなる群から独立して選択され；
各々のＹは、独立してＣ３−６炭素環であり；
各々のＸは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から独立して選択され；ならびに、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択され；Ｒ４が−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、または−ＣＱ（Ｒ）２であるとき、（ｉ）ｎが１、２、３、４、もしくは５であるときにＱは、−Ｎ（Ｒ）２でないか、または（ｉｉ）ｎが１もしくは２であるときにＱは、５、６、もしくは７員のヘテロシクロアルキルではない。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、式（ＩＬ−Ｉ）の化合物のサブセットには、式（ＩＬ−ＩＡ）の化合物：
【化２】
2020532528.tif 000004
またはそのＮ−オキシド、またはその塩もしくは異性体が含まれ、式中、ｌは、１、２、３、４、及び５から選択され；ｍは、５、６、７、８、及び９から選択され；Ｍ１は結合またはＭ’であり；Ｒ４は、水素、非置換のＣ１−３アルキル、または−（ＣＨ２）ｎＱであり、Ｑは、ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、−ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルであり；Ｍ及びＭ’は、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）−Ｍ”−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、及びヘテロアリール基から独立して選択され；ならびにＲ２及びＲ３は、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、及びＣ２−１４アルケニルからなる群から独立して選択される。いくつかの実施形態では、ｍは、５、７、または９である。いくつかの実施形態では、Ｑは、ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、または−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２である。いくつかの実施形態では、Ｑは、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、または−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒである。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットには、式（ＩＬ−ＩＢ）の化合物：
【化３】
2020532528.tif 000005
またはそのＮ−オキシド、またはその塩もしくは異性体が含まれ、全ての変数はここで定義されているものである。いくつかの実施形態では、ｍは、５、６、７、８、及び９から選択され；Ｒ４は、水素、非置換のＣ１−３アルキル、または−（ＣＨ２）ｎＱであり、Ｑは、−ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、−ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルであり；Ｍ及びＭ’は、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）−Ｍ”−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、及びヘテロアリール基から独立して選択され；ならびにＲ２及びＲ３は、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、及びＣ２−１４アルケニルからなる群から独立して選択される。いくつかの実施形態では、ｍは、５、７、または９である。いくつかの実施形態では、Ｑは、ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、または−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２である。いくつかの実施形態では、Ｑは、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、または−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒである。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、式（ＩＬ−Ｉ）の化合物のサブセットには、式
【化４】
2020532528.tif 000006
の化合物：
またはそのＮ−オキシド、またはその塩もしくは異性体が含まれ、式中、ｌは、１、２、３、４、及び５から選択され；Ｍ１は結合またはＭ’であり；Ｒ４は、水素、非置換のＣ１−３アルキル、または−（ＣＨ２）ｎＱであり、ｎは、２、３、または４であり、Ｑは、−ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、−ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルであり；Ｍ及びＭ’は、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）−Ｍ”−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、及びヘテロアリール基から独立して選択され；ならびにＲ２及びＲ３は、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、及びＣ２−１４アルケニルからなる群から独立して選択される。
【０１２６】
一実施形態では、式（ＩＬ−Ｉ）の化合物は式（ＩＬ−ＩＩａ）：
【化５】
2020532528.tif 000007
のもの、またはそれらのＮ−オキシド、またはその塩もしくは異性体であり、式中、Ｒ４は本明細書において記載されるものである。
【０１２７】
別の実施形態では、式（ＩＬ−１）の化合物は式（ＩＬ−ＩＩｂ）：
【化６】
2020532528.tif 000008
のもの、またはそれらのＮ−オキシド、またはその塩もしくは異性体であり、式中、Ｒ４は本明細書において記載されるものである。
【０１２８】
別の実施形態では、式（ＩＬ−Ｉ）の化合物は式（ＩＬ−ＩＩｃ）または（ＩＬ−ＩＩｅ）：
【化７】
2020532528.tif 000009
のもの、またはそれらのＮ−オキシド、またはその塩もしくは異性体であり、式中、Ｒ４は本明細書において記載されるものである。
【０１２９】
別の実施形態では、式（ＩＬ−Ｉ）の化合物は式（ＩＬ−ＩＩｆ）：
【化８】
2020532528.tif 000010
のもの、またはそれらのＮ−オキシド、またはその塩もしくは異性体であり、式中、Ｍは、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−または−ＯＣ（Ｏ）−であり、Ｍ”は、Ｃ１−６アルキルまたはＣ２−６アルケニルであり、Ｒ２及びＲ３は、Ｃ５−１４アルキル及びＣ５−１４アルケニルからなる群から独立して選択され、ｎは、２、３、及び４から選択される。
【０１３０】
さらなる実施形態では、式（ＩＬ−Ｉ）の化合物は式（ＩＬ−ＩＩｄ）：
【化９】
2020532528.tif 000011
のもの、またはそれらのＮ−オキシド、またはその塩もしくは異性体であり、式中、ｎは、２、３、または４であり；ｍ、Ｒ’、Ｒ”、及びＲ２〜Ｒ６は、本明細書において記載されるものである。いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３の各々は、Ｃ５−１４アルキル及びＣ５−１４アルケニルからなる群から独立して選択され得る。
【０１３１】
別の実施形態では、式（ＩＬ−１）の化合物は式（ＩＬ−ＩＩｇ）：
【化１０】
2020532528.tif 000012
のもの、またはそれらのＮ−オキシド、またはその塩もしくは異性体であり、式中、ｌは、１、２、３、４、及び５から選択され；ｍは、５、６、７、８、及び９から選択され；Ｍ１は、結合またはＭ’であり；Ｍ及びＭ’は、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）−Ｍ”−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、及びヘテロアリール基から独立して選択され；ならびに、Ｒ２及びＲ３は、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、及びＣ２−１４アルケニルからなる群から独立して選択される。いくつかの実施形態では、Ｍ”は、Ｃ１−６アルキル（例えば、Ｃ１−４アルキル）またはＣ２−６アルケニル（例えば、Ｃ２−４アルケニル）である。いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、Ｃ５−１４アルキル及びＣ５−１４アルケニルからなる群から独立して選択される。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、米国出願第６２／２２０，０９１号、同６２／２５２，３１６号、同６２／２５３，４３３号、同６２／２６６，４６０号、同６２／３３３，５５７号、同６２／３８２，７４０号、同６２／３９３，９４０号、同６２／４７１，９３７号、同６２／４７１，９４９号、同６２／４７５，１４０号、及び同６２／４７５，１６６号、ならびにＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５２３５２号に記載されている化合物の１つ以上である。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、米国出願第６２／４７５，１６６号に記載されている化合物１〜２８０から選択される。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、
【化１１】
2020532528.tif 000013
またはその塩である。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、
【化１２】
2020532528.tif 000014
、またはその塩である。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、
【化１３】
2020532528.tif 000015
、またはその塩である。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、
【化１４】
2020532528.tif 000016
、またはその塩である。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、本開示のイオン化可能脂質は、式（ＩＬ−ＩＩＩ）：
【化１５】
2020532528.tif 000017
の化合物のうちの１つ以上またはその塩もしくは異性体であり得、式中
Ｗは、
【化１６】
2020532528.tif 000018
であり、
環Ａは、
【化１７】
2020532528.tif 000019
であり；
ｔは１または２であり；
Ａ１及びＡ２はそれぞれ、ＣＨまたはＮから独立して選択され；
Ｚは、ＣＨ２または存在せず、ＺがＣＨ２であるとき、破線（１）及び（２）はそれぞれ単結合を表し；Ｚが存在しないとき、破線（１）及び（２）は両方とも存在せず；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、Ｃ５−２０アルキル、Ｃ５−２０アルケニル、−Ｒ”ＭＲ’、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から独立して選択され；
ＲＸ１及びＲＸ２は各々独立して、ＨまたはＣ１−３アルキルであり；
各々のＭは、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｏ）−、アリール基、及びヘテロアリール基からなる群から独立して選択され；
Ｍ＊はＣ１−Ｃ６アルキルであり、
Ｗ１及びＷ２は各々、−Ｏ−及び−Ｎ（Ｒ６）−からなる群から独立して選択され；
各々のＲ６が、Ｈ及びＣ１−５アルキルからなる群から独立して選択され；
Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３は、結合、−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２−、−ＣＨＲ−、−ＣＨＹ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎ−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｃ（Ｓ）−、及び−ＣＨ（ＳＨ）−からなる群から独立して選択され；
各々のＹは、独立してＣ３−６炭素環であり；
各々のＲ＊は、Ｃ１−１２アルキル及びＣ２−１２アルケニルからなる群から独立して選択され；
各々のＲは、Ｃ１−３アルキル及びＣ３−６炭素環からなる群から独立して選択され；
各々のＲ’は、Ｃ１−１２アルキル、Ｃ２−１２アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され；
各々のＲ”は、Ｃ３−１２アルキル、Ｃ３−１２アルケニル、及び−Ｒ＊ＭＲ’からなる群から独立して選択され；ならびに
ｎは、１〜６の整数であり；
環Ａが
【化１８】
2020532528.tif 000020
であるとき、
ｉ）Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３のうちの少なくとも１つが、−ＣＨ２−ではなく；及び／または
ｉｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも１つが−Ｒ”ＭＲ’である。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、化合物は、式（ＩＬ−ＩＩＩａ１）〜（ＩＬ−ＩＩＩａ８）のうちのいずれか：
【化１９】
2020532528.tif 000021
である。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、米国出願第６２／２７１，１４６号、同６２／３３８，４７４号、同６２／４１３，３４５号、及び同６２／５１９，８２６号、ならびにＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６８３００号に記載されている化合物の１つ以上である。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、米国出願第６２／５１９，８２６号に記載されている化合物１〜１５６から選択される。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、米国出願第６２／５１９，８２６号に記載されている化合物１〜１６、４２〜６６、６８〜７６、及び７８〜１５６から選択される。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、
【化２０】
2020532528.tif 000022
またはその塩である。
【０１４４】
式（ＩＬ−１）、（ＩＬ−ＩＡ）、（ＩＬ−ＩＢ）、（ＩＬ−ＩＩ）、（ＩＬ−ＩＩａ）、（ＩＬ−ＩＩｂ）、（ＩＬ−ＩＩｃ）、（ＩＬ−ＩＩｄ）、（ＩＬ−ＩＩｅ）、（ＩＬ−ＩＩｆ）、（ＩＬ−ＩＩｇ）、（ＩＬ−ＩＩＩ）、（ＩＬ−ＩＩＩａ１）、（ＩＬ−ＩＩＩａ２）、（ＩＬ−ＩＩＩａ３）、（ＩＬ−ＩＩＩａ４）、（ＩＬ−ＩＩＩａ５）、（ＩＬ−ＩＩＩａ６）、（ＩＬ−ＩＩＩａ７）、または（ＩＬ−ＩＩＩａ８）による脂質の中心アミン部分は、生理学的ｐＨでプロトン化されていてもよい。したがって、脂質は、生理学的ｐＨで正または部分的に正の電荷を有してもよい。そのような脂質は、カチオン性またはイオン化可能（アミノ）脂質と呼ばれる場合がある。脂質は、両性イオン、すなわち、正電荷と負電荷の両方を有する中性分子であってもよい。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、イオン化可能な脂質は、３−（ジドデシルアミノ）−Ｎ１，Ｎ１，４−トリドデシル−１−ピペラジンエタンアミン（ＫＬ１０）、Ｎ１−［２−（ジドデシルアミノ）エチル］−Ｎ１、Ｎ４，Ｎ４−トリドデシル−１，４−ピペラジンジエタンアミン（ＫＬ２２）、１４，２５−ジトリデシル−１５，１８，２１，２４−テトラアザ−オクタトリアコンタン（ＫＬ２５）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）、ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、２−（｛８−［（３β）−コレスタ−５−エン−３−イルオキシ］オクチル｝オキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−１−アミン（Ｏｃｔｙｌ−ＣＬｉｎＤＭＡ）、（２Ｒ）−２−（｛８−［（３β）−コレスタ−５−エン−３−イルオキシ］オクチル｝オキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−１−アミン（Ｏｃｔｙｌ−ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｒ））、及び（２Ｓ）−２−（｛８−［（３β）−コレスタ−５−エン−３−イルオキシ］オクチル｝オキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−１−アミン（Ｏｃｔｙｌ−ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｓ））からなる群から選択される。
【０１４６】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質
本明細書で使用されるとき、「ＰＥＧ脂質」という用語は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾脂質を指す。ＰＥＧ脂質の非限定的な例には、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジン酸、ＰＥＧ−セラミドコンジュゲート（例えば、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４またはＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０）、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、及びＰＥＧ修飾１，２−ジアシルオキシプロパン−３−アミンが含まれる。このような脂質は、ＰＥＧ化脂質とも呼ばれる。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ、ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−ＤＬＰＥ、ＰＥＧ−ＤＭＰＥ、ＰＥＧ−ＤＰＰＣ、またはＰＥＧ−ＤＳＰＥ脂質であり得る。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質には、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロールメトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＤＭＧ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［アミノ（ポリエチレングリコール）］（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）、ＰＥＧ−ジステリルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＳＧ）、ＰＥＧ−ジパルメトレイル、ＰＥＧ−ジオレイル、ＰＥＧ−ジステアリル、ＰＥＧ−ジアシルグリカミド（ＰＥＧ−ＤＡＧ）、ＰＥＧ−ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＤＰＰＥ）、またはＰＥＧ−１，２−ジミリスチルオクスルプロピル−３−アミン（ＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４８】
一実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びそれらの混合物からなる群から選択される。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質の脂質部分には、約Ｃ１４〜約Ｃ２２、好ましくは約Ｃ１４〜約Ｃ１６の長さを有するものが含まれる。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ部分、例えばｍＰＥＧ−ＮＨ２は、約１０００、２０００、５０００、１０，０００、１５，０００、または２０，０００ダルトンのサイズを有する。一実施形態では、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧである。
【０１５０】
一実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子は、非拡散性ＰＥＧであるＰＥＧ脂質を含むことができる。非拡散性ＰＥＧの非限定的な例には、ＰＥＧ−ＤＳＧ及びＰＥＧ−ＤＳＰＥが含まれる。
【０１５１】
ＰＥＧ脂質は、米国特許第８１５８６０１号及び国際公開ＷＯ２０１５／１３０５８４  Ａ２に記載されているものなど、当技術分野で知られており、これらは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５２】
一般に、本明細書に記載の様々な式の他の脂質成分のいくつか（例えば、ＰＥＧ脂質）は、２０１６年１２月１０日に出願された「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ」と題する国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０００１２９に記載のように合成することができ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５３】
脂質ナノ粒子組成物の脂質成分は、ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質などのポリエチレングリコールを含む１つ以上の分子を含んでもよい。そのような種は、代替的にＰＥＧ化脂質と呼ばれる場合がある。ＰＥＧ脂質は、ポリエチレングリコールで修飾された脂質である。ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びそれらの混合物を含む非限定的な群から選択され得る。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ、ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−ＤＬＰＥ、ＰＥＧ−ＤＭＰＥ、ＰＥＧ−ＤＰＰＣ、またはＰＥＧ−ＤＳＰＥ脂質であり得る。
【０１５４】
一実施形態では、本発明において有用なＰＥＧ脂質は、国際公開ＷＯ２０１２０９９７５５に記載されているＰＥＧ化脂質であり得、その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に記載されるこれらの例示的なＰＥＧ脂質のいずれも、ＰＥＧ鎖上にヒドロキシル基を含むように修飾され得る。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ−ＯＨ脂質である。本明細書で一般的に定義されるように、「ＰＥＧ−ＯＨ脂質」（本明細書では「ヒドロキシ−ＰＥＧ化脂質」とも呼ばれる）は、脂質上に１つ以上のヒドロキシル（−ＯＨ）基を有するＰＥＧ化脂質である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ−ＯＨ脂質には、ＰＥＧ鎖に１つ以上のヒドロキシル基が含まれている。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ−ＯＨまたはヒドロキシ−ＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ鎖の末端に−ＯＨ基を含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、本発明において有用なＰＥＧ脂質は、式（ＰＬ−１）の化合物である。本明細書に提供されるのは、式（ＰＬ−１）の化合物：
【化２１】
2020532528.tif 000023
またはその塩であり、式中：
Ｒ３は、−ＯＲＯであり；
ＲＯは、水素、必要に応じて置換されたアルキル、または酸素保護基であり；
ｒは１〜１００の整数であり、両端を含み；
Ｌ１は、必要に応じて置換されたＣ１−１０アルキレンであり、必要に応じて置換されたＣ１−１０アルキレンの少なくとも１つのメチレンは、必要に応じて置換されたカルボシクリレン、必要に応じて置換されたヘテロシクリレン、必要に応じて置換されたアリーレン、必要に応じて置換されたヘテロアリーレン、Ｏ、Ｎ（ＲＮ）、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、またはＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）によって独立して置き換えられ；
Ｄは、クリックケミストリーによって得られる部分または生理学的条件下で切断可能な部分であり；
ｍは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり；
Ａは、式：  
【化２２】
2020532528.tif 000024
であり；
Ｌ２の各々の例は、独立して、結合または必要に応じて置換されたＣ１−６アルキレンであり、必要に応じて置換されたＣ１−６アルキレンの１つのメチレン単位は、Ｏ、Ｎ（ＲＮ）、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、またはＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）によって必要に応じて置き換えられ；
Ｒ２の各々の例は、独立して、必要に応じて置換されたＣ１−３０アルキル、必要に応じて置換されたＣ１−３０アルケニル、または必要に応じて置換されたＣ１−３０アルキニルであり；必要に応じて、Ｒ２の１つ以上のメチレン単位は、必要に応じて置換されたカルボシクリレン、必要に応じて置換されたヘテロシクリレン、必要に応じて置換されたアリーレン、必要に応じて置換されたヘテロアリーレン、Ｎ（ＲＮ）、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、Ｓ（Ｏ）、ＯＳ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｏ、−ＯＳ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２Ｏ、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ、Ｓ（Ｏ）２、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、または−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏによって独立して置き換えられ；
ＲＮの各々の例は、独立して、水素、必要に応じて置換されたアルキル、または窒素保護基であり；
環Ｂは、必要に応じて置換されたカルボシクリル、必要に応じて置換されたヘテロシクリル、必要に応じて置換されたアリール、または必要に応じて置換されたヘテロアリールであり；
ｐは１または２である。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、式（ＰＬ−Ｉ）の化合物は、ＰＥＧ−ＯＨ脂質（すなわち、Ｒ３が−ＯＲＯであり、かつＲＯが水素である）。いくつかの実施形態では、式（ＰＬ−Ｉ）の化合物は、式（ＰＬ−Ｉ−ＯＨ）：
【化２３】
2020532528.tif 000025
またはその塩である。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、本発明において有用なＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ化脂肪酸である。いくつかの実施形態では、本発明において有用なＰＥＧ脂質は、式（ＰＬ−ＩＩ）の化合物である。本明細書に提供されるのは、式（ＰＬ−ＩＩ）の化合物：
【化２４】
2020532528.tif 000026
またはその塩であり、式中：
Ｒ３は、−ＯＲＯであり；
ＲＯは、水素、必要に応じて置換されたアルキル、または酸素保護基であり；
ｒは１〜１００の整数であり；
Ｒ５は、必要に応じて置換されたＣ１０−４０アルキル、必要に応じて置換されたＣ１０−４０アルケニル、または必要に応じて置換されたＣ１０−４０アルキニルであり；必要に応じて、Ｒ５の１つ以上のメチレン基は、必要に応じて置換されたカルボシクリレン、必要に応じて置換されたヘテロシクリレン、必要に応じて置換されたアリーレン、必要に応じて置換されたヘテロアリーレン、Ｎ（ＲＮ）、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、−ＮＲＮＣ（Ｏ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）、−ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、Ｓ（Ｏ）、ＯＳ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２Ｏ、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）、−Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ、Ｓ（Ｏ）２、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、またはＮ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏによって置き換えられ；
ＲＮの各々の例は、独立して、水素、必要に応じて置換されたアルキル、または窒素保護基である。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、式（ＰＬ−ＩＩ）の化合物は、式（ＰＬ−ＩＩ−ＯＨ）：
【化２５】
2020532528.tif 000027
またはその塩であり、式中：
ｒは１〜１００の整数であり；
Ｒ５は、必要に応じて置換されたＣ１０−４０アルキル、必要に応じて置換されたＣ１０−４０アルケニル、または必要に応じて置換されたＣ１０−４０アルキニルであり；必要に応じて、Ｒ５の１つ以上のメチレン基は、必要に応じて置換されたカルボシクリレン、必要に応じて置換されたヘテロシクリレン、必要に応じて置換されたアリーレン、必要に応じて置換されたヘテロアリーレン、Ｎ（ＲＮ）、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、−ＮＲＮＣ（Ｏ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）、−ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、Ｓ（Ｏ）、ＯＳ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２Ｏ、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）、−Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ、Ｓ（Ｏ）２、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、またはＮ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏによって置き換えられ；
ＲＮの各々の例は、独立して、水素、必要に応じて置換されたアルキル、または窒素保護基である。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、ｒは、１０〜８０、２０〜７０、３０〜６０、または４０〜５０の整数である。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、ｒは４５である。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、Ｒ５はＣ１７アルキルである。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、式（ＰＬ−ＩＩ）の化合物は：
【化２６】
2020532528.tif 000028
またはその塩である。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、式（ＰＬ−ＩＩ）の化合物は、
【化２７】
2020532528.tif 000029
である。
【０１６４】
いくつかの態様では、本明細書に記載の医薬組成物の脂質組成物は、ＰＥＧ脂質を含まない。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質は、米国特許出願第６２／５２０，５３０号に記載されているＰＥＧ脂質のいずれか１つである。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質は、式（ＰＬ−ＩＩＩ）：
【化２８】
2020532528.tif 000030
の化合物、またはその塩もしくは異性体であり、式中、ｓは１〜１００の整数である。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質は次の式：
【化２９】
2020532528.tif 000031
の化合物、またはその塩もしくは異性体である。
界面活性剤
【０１６７】
いくつかの実施形態では、修飾剤は界面活性剤である。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、界面活性剤は両親媒性ポリマーである。
【０１６９】
例えば、両親媒性ポリマーはブロックコポリマーである。
【０１７０】
例えば、両親媒性ポリマーは凍結保護剤である。
【０１７１】
例えば、両親媒性ポリマーは、約３０℃、大気圧の水中で２×１０−４Ｍ未満の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を有する。
【０１７２】
例えば、両親媒性ポリマーは、約３０℃、大気圧の水中で、約０．１×１０−４Ｍ〜約１．３×１０−４Ｍの範囲の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を有する。
【０１７３】
例えば、製剤中で、例えば、凍結または凍結乾燥の前で、両親媒性ポリマーの濃度は、そのＣＭＣからＣＭＣの約３０倍の範囲である（例えば、そのＣＭＣの約２５倍、約２０倍、約１５倍、約１０倍、約５倍、または約３倍まで）。
【０１７４】
例えば、両親媒性ポリマーは、ポロキサマー（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標））、ポロキサミン（Ｔｅｔｒｏｎｉｃ（登録商標））、ポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル（ポリソルベート）及びポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）から選択される。
【０１７５】
例えば、両親媒性ポリマーはポロキサマーである。例えば、両親媒性ポリマーは以下の構造：
【化３０】
2020532528.tif 000032
であり、式中、ａは、１０〜１５０の整数であり、ｂは、２０〜６０の整数である。例えば、ａは約１２かつｂは約２０、またはａは約８０かつｂは約２７、またはａは約６４かつｂは約３７、またはａは約１４１かつｂは約４４、またはａは約１０１かつｂは約５６である。
【０１７６】
例えば、両親媒性ポリマーはＰ１２４、Ｐ１８８、Ｐ２３７、Ｐ３３８、またはＰ４０７である。
【０１７７】
例えば、両親媒性ポリマーはＰ１８８である（例えば、ポロキサマー１８８、ＣＡＳ番号９００３−１１−６、Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ  Ｐ１８８としても知られる）。
【０１７８】
例えば、両親媒性ポリマーはポロキサミン、例えばテトロニック３０４またはテトロニック９０４である。
【０１７９】
例えば、両親媒性ポリマーは、分子量約３ｋＤａ、１０ｋＤａ、または２９ｋＤａのＰＶＰなどのポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）である。
【０１８０】
例えば、両親媒性ポリマーはＰＳ２０などのポリソルベートである。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、界面活性剤は非イオン性界面活性剤である。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、ＬＮＰ修飾剤は界面活性剤を含む。いくつかの実施形態では、界面活性剤は両親媒性ポリマーである。いくつかの実施形態では、界面活性剤は非イオン性界面活性剤である。
【０１８３】
例えば、非イオン性界面活性剤は、ポリエチレングリコールエーテル（Ｂｒｉｊ）、ポロキサマー、ポリソルベート、ソルビタン、及びそれらの誘導体からなる群から選択される。
【０１８４】
例えば、ポリエチレングリコールエーテルは、式（Ｓ−１）：
【化３１】
2020532528.tif 000033
の化合物、またはその塩もしくは異性体であり、式中：
ｔは１〜１００の整数であり；
Ｒ１ＢＲＩＪは、独立して、Ｃ１０−４０アルキル、Ｃ１０−４０アルケニル、またはＣ１０−４０アルキニルであり；必要に応じて、Ｒ５ＰＥＧの１つ以上のメチレン基は、Ｃ３−１０カルボシクリレン、４〜１０員のヘテロシクリレン、Ｃ６−１０アリーレン、４〜１０員のヘテロアリーレン、−Ｎ（ＲＮ）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｏ）−、−Ｃ（＝ＮＲＮ）−、−Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｓ）−、−ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＯＳ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）２Ｏ−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）−、−ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）−、または−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏ−によって独立して置き換えられ；
ＲＮの各々の例は、独立して、水素、Ｃ１−６アルキル、または窒素保護基である。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、Ｒ１ＢＲＩＪは、Ｃ１８アルキルである。例えば、ポリエチレングリコールエーテルは、式（Ｓ−１ａ）：
【化３２】
2020532528.tif 000034
の化合物、またはその塩もしくは異性体であり、式中、ｓは１〜１００の整数である。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、Ｒ１ＢＲＩＪは、Ｃ１８アルケニルである。例えば、ポリエチレングリコールエーテルは、式（Ｓ−１ｂ）：
【化３３】
2020532528.tif 000035
の化合物、またはその塩もしくは異性体であり、式中、ｓは１〜１００の整数である。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、ポロキサマーは、ポロキサマー１０１、ポロキサマー１０５、ポロキサマー１０８、ポロキサマー１２２、ポロキサマー１２３、ポロキサマー１２４、ポロキサマー１８１、ポロキサマー１８２、ポロキサマー１８３、ポロキサマー１８４、ポロキサマー１８５、ポロキサマー１８８、ポロキサマー２１２、ポロキサマー２１５、ポロキサマー２１７、ポロキサマー２３１、ポロキサマー２３４、ポロキサマー２３５、ポロキサマー２３７、ポロキサマー２３８、ポロキサマー２８２、ポロキサマー２８４、ポロキサマー２８８、ポロキサマー３０４、ポロキサマー３３１、ポロキサマー３３３、ポロキサマー３３４、ポロキサマー３３５、ポロキサマー３３８、ポロキサマー４０１、ポロキサマー４０２、ポロキサマー４０３、及びポロキサマー４０７からなる群から選択される。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）４０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）６０、またはＴｗｅｅｎ（登録商標）８０である。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、界面活性剤は、Ｓｐａｎ（登録商標）２０、Ｓｐａｎ（登録商標）４０、Ｓｐａｎ（登録商標）６０、Ｓｐａｎ（登録商標）６５、Ｓｐａｎ（登録商標）８０、またはＳｐａｎ（登録商標）８５である。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、界面活性剤は、Ｂｒｉｊ（登録商標）Ｃ１０、Ｂｒｉｊ（登録商標）Ｓ１０、Ｂｒｉｊ（登録商標）５８、Ｂｒｉｊ（登録商標）Ｓ１００、Ｂｒｉｊ（登録商標）Ｏ１０、Ｂｒｉｊ（登録商標）Ｏ２０、Ｂｒｉｊ（登録商標）Ｓ２０、Ｂｒｉｊ（登録商標）５８、Ｂｒｉｊ（登録商標）９３である。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、界面活性剤は、ＰＶＰ１０ｋまたはＰＶＰ４０ｋである。
【０１９２】
いくつかの実施形態では、核酸ＬＮＰ組成物中の非イオン性界面活性剤の濃度は、約０．００００１％ｗ／ｖ〜約１％ｗ／ｖ、例えば約０．００００５％ｗ／ｖ〜約０．５％ｗ／ｖ、または約０．０００１％ｗ／ｖ〜約０．１％ｗ／ｖの範囲である。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、核酸ＬＮＰ製剤中の非イオン性界面活性剤の濃度は、約０．０００００１ｗｔ％〜約１ｗｔ％、例えば、約０．０００００２ｗｔ％〜約０．８ｗｔ％、または約０．０００００５ｗｔ％〜約０．５ｗｔ％の範囲である。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、核酸ＬＮＰ製剤中のＰＥＧ脂質の濃度は、約０．０１ｍｏｌ％〜約５０ｍｏｌ％、例えば約０．０５ｍｏｌ％〜約２０ｍｏｌ％、約０．０７ｍｏｌ％〜約１０ｍｏｌ％、約０．１ｍｏｌ％〜約８ｍｏｌ％、約０．２ｍｏｌ％〜約５ｍｏｌ％、または約０．２５ｍｏｌ％〜約３ｍｏｌ％の範囲である。
【０１９５】
構造脂質
本明細書で使用されるとき、「構造脂質」という用語は、ステロールを指し、ステロール部分を含む脂質をも指す。
【０１９６】
脂質ナノ粒子への構造脂質の組み込みは、粒子内の他の脂質の凝集を緩和するのを助ける。構造脂質は、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、トマチン、ウルソール酸、アルファ−トコフェロール、ホパノイド、フィトステロール、ステロイド、及びそれらの混合物を含むがこれらに限定されない群から選択できる。いくつかの実施形態では、構造脂質は、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、トマチン、ウルソール酸、アルファ−トコフェロール、ホパノイド、フィトステロール、及びステロイドから各々独立して選択される２つ以上の成分の混合物である。いくつかの実施形態では、構造脂質はステロールである。いくつかの実施形態では、構造脂質は２つ以上のステロールの混合物である。本明細書で定義されるとき、「ステロール」は、ステロイドアルコールからなるステロイドのサブグループである。いくつかの実施形態では、構造脂質はステロイドである。いくつかの実施形態では、構造脂質はコレステロールである。いくつかの実施形態では、構造脂質はコレステロールの類似体である。いくつかの実施形態では、構造脂質はアルファ−トコフェロールである。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、構造脂質は、米国特許出願第６２／５２０，５３０号に記載されている１つ以上の構造脂質であり得る。
【０１９８】
リン脂質
リン脂質は、１つ以上の脂質二重層に集合する場合がある。一般に、リン脂質はリン脂質部分及び１つ以上の脂肪酸部分を含む。
【０１９９】
リン脂質部分は、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、２−リゾホスファチジルコリン、及びスフィンゴミエリンからなる非限定的な群から選択することができる。
【０２００】
脂肪酸部分は、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、ミリストレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、アルファ−リノレン酸、エルカ酸、フィタン酸、アラキジン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ベヘン酸、ドコサペンタエン酸、及びドコサヘキサエン酸からなる非限定的な群から選択することができる。
【０２０１】
特定のリン脂質は、膜への融合を促進することができる。いくつかの実施形態では、カチオン性リン脂質は、膜（例えば、細胞膜または細胞内膜）の１つ以上の負に荷電したリン脂質と相互作用できる。膜へのリン脂質の融合は、脂質含有組成物（例えば、ＬＮＰ）の１つ以上の要素（例えば、治療薬）が膜を通過することを可能にし、例えば、１つ以上の要素の標的組織への送達を可能にする。
【０２０２】
分岐、酸化、環化、及びアルキンを含む修飾及び置換を伴う天然種を含む非天然リン脂質種もまた想定される。いくつかの実施形態では、リン脂質は、１つ以上のアルキン（例えば、１つ以上の二重結合が三重結合で置き換えられたアルケニル基）で官能化または架橋することができる。適切な反応条件下で、アルキン基は、アジドへの曝露時に銅触媒による環化付加を起こし得る。そのような反応は、ナノ粒子組成物の脂質二重層を官能化して膜透過もしくは細胞認識を促進するか、またはナノ粒子組成物をターゲティングまたはイメージング部分（例えば、色素）などの有用な成分に結合するのに有用である。
【０２０３】
リン脂質には、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、及びホスファチジン酸などのグリセロリン脂質が含まれるが、これらに限定されない。リン脂質には、スフィンゴミエリンなどのスフィンゴ糖脂質も含まれる。
【０２０４】
いくつかの実施形態では、本発明において有用または潜在的に有用なリン脂質は、ＤＳＰＣの類似体またはバリアントである。いくつかの実施形態では、本発明において有用または潜在的に有用なリン脂質は、式（ＰＬ−Ｉ）：
【化３４】
2020532528.tif 000036
の化合物またはその塩であり、式中：
各々のＲ１は、独立して、必要に応じて置換されたアルキルであるか；または必要に応じて、２つのＲ１は、介在原子と一緒になって、必要に応じて置換された単環式カルボシクリルもしくは必要に応じて置換された単環式ヘテロシクリルを形成するか；または、必要に応じて３つのＲ１が介在原子と一緒になって、必要に応じて置換された二環式カルボシクリルもしくは必要に応じて置換された二環式ヘテロシクリルを形成し；
ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり；
ｍは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり；
Ａは、式：  
【化３５】
2020532528.tif 000037
であり；
Ｌ２の各々の例は、独立して、結合または必要に応じて置換されたＣ１−６アルキレンであり、必要に応じて置換されたＣ１−６アルキレンの１つのメチレン単位は、−Ｏ−、−Ｎ（ＲＮ）−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ−、または−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−によって必要に応じて置き換えられ；
Ｒ２の各々の例は、独立して、必要に応じて置換されたＣ１−３０アルキル、必要に応じて置換されたＣ１−３０アルケニル、または必要に応じて置換されたＣ１−３０アルキニルであり；必要に応じて、Ｒ２の１つ以上のメチレン単位は、必要に応じて置換されたカルボシクリレン、必要に応じて置換されたヘテロシクリレン、必要に応じて置換されたアリーレン、必要に応じて置換されたヘテロアリーレン、−Ｎ（ＲＮ）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｏ）−、−Ｃ（＝ＮＲＮ）−、−Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｓ）−、−ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＯＳ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）２Ｏ−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）−、−ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）−、または−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏ−によって独立して置き換えられ；
ＲＮの各々の例は、独立して、水素、必要に応じて置換されたアルキル、または窒素保護基であり；
環Ｂは、必要に応じて置換されたカルボシクリル、必要に応じて置換されたヘテロシクリル、必要に応じて置換されたアリール、または必要に応じて置換されたヘテロアリールであり；
ｐは１または２であり；
ただし、この化合物は式：
【化３６】
2020532528.tif 000038
であって、
式中、Ｒ２の各例が、独立して、非置換アルキル、非置換アルケニル、または非置換アルキニルであるものではない。
【０２０５】
いくつかの実施形態では、リン脂質は、米国特許出願第６２／５２０，５３０号に記載されているリン脂質のうちの１つ以上であり得る。
【０２０６】
いくつかの実施形態では、リン脂質は、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジウンデカノイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン（ＤＵＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：０  Ｄｉｅｔｈｅｒ  ＰＣ）、１−オレオイル−２−コレステリルヘミスクシノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、１−ヘキサデシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（Ｃ１６  Ｌｙｓｏ  ＰＣ）、１，２−ジリノレノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジアラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＭＥ  １６．０  ＰＥ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジリノレノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジアラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）、及びスフィンゴミエリンからなる非限定的群から選択することができる。いくつかの実施形態では、ＬＮＰにはＤＳＰＣが含まれる。いくつかの実施形態では、ＬＮＰにはＤＯＰＥが含まれる。いくつかの実施形態では、ＬＮＰにはＤＳＰＣとＤＯＰＥの両方が含まれる。
【０２０７】
ｉ）リン脂質頭部の修飾
いくつかの実施形態では、本発明において有用または潜在的に有用なリン脂質は、修飾リン脂質頭部（例えば、修飾コリン基）を含む。いくつかの実施形態では、修飾された頭部を有するリン脂質は、修飾された第４級アミンを有するＤＳＰＣまたはその類似体である。いくつかの実施形態では、式（ＰＬ−Ｉ）の実施形態において、Ｒ１のうちの少なくとも１つはメチルではない。いくつかの実施形態では、Ｒ１の少なくとも１つは、水素でもメチルでもない。いくつかの実施形態では、式（ＰＬ−Ｉ）の化合物は以下の式：
【化３７】
2020532528.tif 000039
のうちの１つまたはその塩であり、式中：
各々のｔは、独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり；
各々のｕは、独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり；
各々のｖは、独立して、１、２、または３である。
いくつかの実施形態では、式（ＰＬ−Ｉ）の化合物は、式（ＰＬ−Ｉ−ａ）：
【化３８】
2020532528.tif 000040
のものまたはその塩である。
【０２０８】
いくつかの実施形態では、本発明において有用または潜在的に有用なリン脂質は、グリセリド部分の代わりに環状部分を含む。いくつかの実施形態では、本発明において有用なリン脂質は、グリセリド部分の代わりに環状部分を有するＤＳＰＣまたはその類似体である。いくつかの実施形態では、式（ＰＬ−Ｉ）の化合物は、式（ＰＬ−Ｉ−ｂ）：
【化３９】
2020532528.tif 000041
のものまたはその塩である。
【０２０９】
ｉｉ）リン脂質尾部の修飾
いくつかの実施形態では、本発明において有用または潜在的に有用なリン脂質は、修飾された尾部を含む。いくつかの実施形態では、本発明において有用または潜在的に有用なリン脂質は、修飾された尾部を有するＤＳＰＣまたはその類似体である。本明細書において記載されるとき、「修飾された尾部」は、より短いまたはより長い脂肪族鎖、分岐が導入された脂肪族鎖、置換基が導入された脂肪族鎖、１つ以上のメチレンが環状またはヘテロ原子基で置換された脂肪族鎖、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、いくつかの実施形態では、（ＰＬ−Ｉ）の化合物は、式（ＰＬ−Ｉ−ａ）のものまたはその塩であり、式中、Ｒ２の少なくとも１つの例は、必要に応じて置換されたＣ１−３０アルキルであるＲ２の各々の例であり、Ｒ２のうちの１つ以上のメチレン単位は、必要に応じて置換されたカルボシクリレン、必要に応じて置換されたヘテロシクリレン、必要に応じて置換されたアリーレン、必要に応じて置換されたヘテロアリーレン、−Ｎ（ＲＮ）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｏ）−、−Ｃ（＝ＮＲＮ）−、−Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｓ）−、−ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＯＳ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）２Ｏ−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）−、−ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）−、または−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏ−によって独立して置き換えられる。
【０２１０】
いくつかの実施形態では、式（ＰＬ−Ｉ）の化合物は、式（ＰＬ−Ｉ−ｃ）：
【化４０】
2020532528.tif 000042
のものまたはその塩であり、式中：
各々のｘは、独立して、０〜３０の整数であり、その両端を含み；
各々の例は、必要に応じて置換されたカルボシクリレン、必要に応じて置換されたヘテロシクリレン、必要に応じて置換されたアリーレン、必要に応じて置換されたヘテロアリーレン、−Ｎ（ＲＮ）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｏ）−、−Ｃ（＝ＮＲＮ）−、−Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｓ）−、−ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＯＳ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）２Ｏ−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）−、−ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）−、または−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏ−、からなる群から独立して選択されるＧである。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０２１１】
いくつかの実施形態では、本発明において有用または潜在的に有用なリン脂質は、修飾ホスホコリン部分を含み、第４級アミンをホスホリル基に連結するアルキル鎖はエチレンではない（例えば、ｎは２ではない）。したがって、いくつかの実施形態では、本発明において有用または潜在的に有用なリン脂質は、式（ＰＬ−Ｉ）の化合物であり、式中、ｎは１、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。いくつかの実施形態では、式（ＰＬ−Ｉ）の化合物は以下の式のうちの１つ：
【化４１】
2020532528.tif 000043
のものまたはその塩である。
【０２１２】
代替的な脂質
いくつかの実施形態では、本開示のリン脂質の代わりに代替的な脂質が使用される。そのような代替的な脂質の非限定的な例には以下：
【化４２】
2020532528.tif 000044
が含まれる。
【０２１３】
アジュバント
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の脂質を含むＬＮＰは、１つ以上のアジュバント、例えば、グルコピラノシル脂質アジュバント（ＧＬＡ）、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（例えば、クラスＡまたはＢ）、ポリ（Ｉ：Ｃ）、水酸化アルミニウム、及びＰａｍ３ＣＳＫ４をさらに含んでもよい。
【０２１４】
治療薬
脂質ナノ粒子は、核酸などの１つ以上の治療薬及び／または予防薬を含んでもよい。本開示は、哺乳動物細胞または臓器に核酸などの治療薬及び／または予防薬を送達し、哺乳動物細胞で目的のポリペプチドを産生し、それを必要とする哺乳動物の疾患または障害を治療する方法であって、核酸などの治療薬及び／または予防薬を含むＬＮＰを、哺乳動物に投与すること、及び／または哺乳動物細胞に接触させることを含む、方法を特徴とする。
【０２１５】
治療薬及び／または予防薬には、生物学的に活性な物質が含まれ、代替的に「活性剤」とも呼ばれる。治療薬及び／または予防薬は、細胞または臓器に送達されると、細胞、臓器、または他の身体組織もしくは系に望ましい変化をもたらす物質であり得る。そのような種は、１つ以上の疾患、障害、または状態の治療に有用であり得る。いくつかの実施形態では、治療薬及び／または予防薬は、特定の疾患、障害、または状態の治療に有用な小分子薬である。脂質ナノ粒子に有用な薬物の例には、抗悪性腫瘍薬（例えば、ビンクリスチン、ドキソルビシン、ミトキサントロン、カンプトテシン、シスプラチン、ブレオマイシン、シクロホスファミド、メトトレキサート、及びストレプトゾトシン）、抗腫瘍薬（例えば、アクチノマイシンＤ、ビンクリスチン、ビンブラスチン、シトシンアラビノシド、アントラサイクリン、アルキル化剤、白金化合物、代謝拮抗剤、及びメトトレキサート及びプリン及びピリミジン類似体などのヌクレオシド類似体）、抗感染薬、局所麻酔薬（例えば、ジブカイン及びクロルプロマジン）、ベータアドレナリン遮断薬（例えば、プロプラノロール、チモロール、及びラベタロール）、降圧剤（例えば、クロニジン及びヒドララジン）、、抗うつ薬（例えば、イミプラミン、アミトリプチリン、及びドキセピン）、抗けいれん薬（例えば、フェニトイン）、抗ヒスタミン薬（例えば、ジフェンヒドラミン、クロルフェニラミン、及びプロメタジン）、抗生物質／抗菌剤（例えば、ゲンタマイシン、シプロフロキサシン、及びセフォキシチン）、抗真菌剤（ミコナゾール、テルコナゾール、エコナゾール、イソコナゾール、ブタコナゾール、クロトリマゾール、イトラコナゾール、ナイスタチン、ナフチフィン、及びアンホテリシンＢ）、駆虫薬、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、免疫調節薬、神経伝達物質アンタゴニスト、緑内障治療薬、ビタミン、麻酔薬、ならびに造影剤が含まれるが、これに限定されない。
【０２１６】
いくつかの実施形態では、治療薬及び／または予防薬は、細胞毒素、放射性イオン、化学療法薬、ワクチン、免疫応答を誘発する化合物、及び／または別の治療薬及び／または予防薬である。細胞毒素または細胞傷害剤には、細胞に有害である可能性のあるあらゆる薬剤が含まれる。例には、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、メイタンシノイド、例えば、メイタンシノール、ラケルマイシン（ＣＣ−１０６５）、及びそれらの類似体または同族体が含まれるが、これらに限定されない。放射性イオンには、ヨウ素（例えば、ヨウ素１２５またはヨウ素１３１）、ストロンチウム８９、リン、パラジウム、セシウム、イリジウム、リン酸塩、コバルト、イットリウム９０、サマリウム１５３、及びプラセオジムが含まれるが、これらに限定されない。ワクチンには、インフルエンザ、麻疹、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、狂犬病、髄膜炎、百日咳、破傷風、ペスト、肝炎、及び結核などの感染症に関連する１つ以上の状態に対する免疫を提供できる化合物及び製剤が含まれ、感染症由来の抗原及び／またはエピトープをコードするｍＲＮＡが含まれ得る。ワクチンには、がん細胞に対する免疫応答を誘導する化合物及び製剤も含まれ、腫瘍細胞由来の抗原、エピトープ、及び／またはネオエピトープをコードするｍＲＮＡが含まれ得る。免疫応答を誘発する化合物には、ワクチン、コルチコステロイド（例えば、デキサメタゾン）、及びその他の種が含まれるが、これらに限定されない。
【０２１７】
他の実施形態では、治療薬及び／または予防薬はタンパク質である。本開示のナノ粒子に有用な治療用タンパク質には、ゲンタマイシン、アミカシン、インスリン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、因子ＶＩＲ、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）類似体、インターフェロン、ヘパリン、Ｂ型肝炎表面抗原、腸チフスワクチン、コレラワクチンが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ワクチン及び／または免疫応答を誘発できる化合物は、式（Ｉ）、（ＩＡ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、または（ＩＩｅ）による化合物（例えば、化合物３、１８、２０、２６、または２９）を含む組成物を介して筋肉内投与される。他の治療薬及び／または予防薬には、代謝拮抗薬（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパクロラムブシル、ラケルマイシン（ＣＣ−１０６５）、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロトスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、及びｃｉｓ−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（従前はダウノマイシン）及びドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（従前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、及びアントラマイシン（ＡＭＣ））、ならびに有糸分裂阻害剤（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、タキソール、及びマイタンシノイド）が含まれるが、これらに限定されない。
【０２１８】
ポリヌクレオチド及び核酸
いくつかの実施形態では、治療薬は、ポリヌクレオチドまたは核酸（例えば、リボ核酸またはデオキシリボ核酸）である。「ポリヌクレオチド」という用語には、その最も広い意味で、オリゴヌクレオチド鎖に組み込まれているか、または組み込むことができる任意の化合物及び／または物質が含まれる。本開示に従って使用するための例示的なポリヌクレオチドには、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含むリボ核酸（ＲＮＡ）、それらのハイブリッド、ＲＮＡｉ誘導剤、ＲＮＡｉ剤、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、触媒ＤＮＡ、三重らせん形成を誘発するＲＮＡ、アプタマー、ベクターなどのうちの１つ以上が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、治療薬及び／または予防薬はＲＮＡである。本明細書に記載の組成物及び方法に有用なＲＮＡは、ショートマー、アンタゴマー、アンチセンス、リボザイム、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ダイサー基質ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、スモールヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、及びそれらの混合物からなる群から選択できるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＲＮＡはｍＲＮＡである。
【０２１９】
いくつかの実施形態では、治療薬及び／または予防薬はｍＲＮＡである。ｍＲＮＡは、任意の天然に存在するかもしくは天然に存在しない、またはそうでなければ修飾されたポリペプチドを含む、目的のポリペプチドをコードしてもよい。ｍＲＮＡによってコードされるポリペプチドは任意のサイズものであってよく、任意の二次構造または活性を有してもよい。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡによってコードされるポリペプチドは、細胞内で発現すると治療効果を発揮し得る。
【０２２０】
他の実施形態では、治療薬及び／または予防薬はｓｉＲＮＡである。ｓｉＲＮＡは、目的の遺伝子の発現を選択的にノックダウンまたは下方制御することができるものであってよい。例えば、ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡを含むＬＮＰのそれを必要とする対象への投与時に特定の疾患、障害、または状態に関連する遺伝子をサイレンシングするように選択され得る。ｓｉＲＮＡは、目的の遺伝子またはタンパク質をコードするｍＲＮＡ配列に相補的な配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは免疫調節性ｓｉＲＮＡであってもよい。
【０２２１】
いくつかの実施形態では、治療薬及び／または予防薬は、ｓｈＲＮＡまたはそれをコードするベクターもしくはプラスミドである。核への適切なコンストラクトの送達により、標的細胞内でｓｈＲＮＡが産生され得る。ｓｈＲＮＡに関連するコンストラクト及びメカニズムは、関連技術分野で周知である。
【０２２２】
本開示において有用な核酸及びポリヌクレオチドは、典型的には、目的のポリペプチドをコードする連結ヌクレオシドの第１の領域（例えば、コード領域）、第１の領域の５’末端に位置する第１の隣接領域（例えば、５’−ＵＴＲ）、第１の領域の３’末端に位置する第２の隣接領域（例えば、３’−ＵＴＲ）、少なくとも１つの５’キャップ領域、及び３’安定化領域を含む。いくつかの実施形態では、核酸またはポリヌクレオチドは、ポリＡ領域またはコザック配列を（例えば、５’−ＵＴＲ内に）さらに含む。場合によっては、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドから切除できる１つ以上のイントロンヌクレオチド配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドまたは核酸（例えば、ｍＲＮＡ）は、５’キャップ構造、鎖終結ヌクレオチド、ステムループ、ポリＡ配列、及び／またはポリアデニル化シグナルを含み得る。核酸の領域のいずれか１つは、１つ以上の複数の代替成分（例えば、代替ヌクレオシド）を含んでもよい。例えば、３’安定化領域は、Ｌ−ヌクレオシド、逆向きチミジン、もしくは２’−Ｏ−メチルヌクレオシドなどの代替ヌクレオシドを含んでもよく、及び／またはコード領域、５’−ＵＴＲ、３’−ＵＴＲ、もしくはキャップ領域は、５−置換ウリジン（例えば、５−メトキシウリジン）、１−置換シュードウリジン（例えば、１−メチル−シュードウリジン）、及び／または５−置換シチジン（例えば、５−メチル−シチジン）などの代替ヌクレオシドを含んでもよい。
【０２２３】
一般に、ポリヌクレオチドの最短の長さは、ジペプチドをコードするのに十分なポリヌクレオチド配列の長さであり得る。別の実施形態において、ポリヌクレオチド配列の長さは、トリペプチドをコードするのに十分である。別の実施形態において、ポリヌクレオチド配列の長さは、テトラペプチドをコードするのに十分である。別の実施形態において、ポリヌクレオチド配列の長さは、ペンタペプチドをコードするのに十分である。別の実施形態において、ポリヌクレオチド配列の長さは、ヘキサペプチドをコードするのに十分である。別の実施形態において、ポリヌクレオチド配列の長さは、ヘプタペプチドをコードするのに十分である。別の実施形態において、ポリヌクレオチド配列の長さは、オクタペプチドをコードするのに十分である。別の実施形態において、ポリヌクレオチド配列の長さは、ノナペプチドをコードするのに十分である。別の実施形態において、ポリヌクレオチド配列の長さは、デカペプチドをコードするのに十分である。
【０２２４】
代替ポリヌクレオチド配列がコードできるジペプチドの例には、カルノシン及びアンセリンが含まれるが、これらに限定されない。
【０２２５】
場合によっては、ポリヌクレオチドは、３０ヌクレオチドを超える長さである。別の実施形態では、ポリヌクレオチド分子は、３５ヌクレオチドを超える長さである。別の実施形態では、長さは、少なくとも４０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも４５ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも５０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも５５ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも６０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも８０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも９０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも１００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも１２０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも１４０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも１６０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも１８０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも２００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも２５０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも３００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも３５０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも４００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも４５０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも５００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも６００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも７００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも８００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも９００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも１０００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも１１００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも１２００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも１３００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも１４００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも１５００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも１６００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも１８００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも２０００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも２５００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも３０００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも４０００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも５０００ヌクレオチドであるか、または５０００ヌクレオチドを超える。
【０２２６】
核酸及びポリヌクレオチドには、標準ヌクレオチド、Ａ（アデノシン）、Ｇ（グアノシン）、Ｃ（シトシン）、Ｕ（ウリジン）、またはＴ（チミジン）のいずれかを含む、１つ以上の天然に存在する成分を含み得る。いくつかの実施形態では、（ａ）５’−ＵＴＲ、（ｂ）オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、（ｃ）３’−ＵＴＲ、（ｄ）ポリＡテール、及び（上述のａ、ｂ、ｃ、またはｄ）のいずれかの組み合わせを含むヌクレオチドの全てまたは実質的に全ては、天然に存在する標準ヌクレオチド、Ａ（アデノシン）、Ｇ（グアノシン）、Ｃ（シトシン）、Ｕ（ウリジン）、またはＴ（チミジン）を含む。
【０２２７】
核酸及びポリヌクレオチドは、安定性の増加及び／またはポリヌクレオチドが導入される細胞の自然免疫応答の実質的な誘導の欠如を含む有用な特性を付与する、本明細書に記載の１つ以上の代替成分を含んでもよい。例えば、代替のポリヌクレオチドまたは核酸は、対応する変更されていないポリヌクレオチドまたは核酸と比較して、ポリヌクレオチドまたは核酸が導入される細胞において低下した分解を示す。これらの代替種は、タンパク質産生の効率、ポリヌクレオチドの細胞内保持、及び／または接触した細胞の生存率を高め、免疫原性を低下させ得る。
【０２２８】
ポリヌクレオチド及び核酸は、天然に存在するものまたは天然に存在しないものであり得る。ポリヌクレオチド及び核酸は、１つ以上の修飾された（例えば、変更されたまたは代替の）核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。ＬＮＰに有用な核酸及びポリヌクレオチドには、核酸塩基、糖、またはヌクレオシド間結合（例えば、リン酸結合、ホスホジエステル結合、リン酸ジエステル骨格へ）などへの、あらゆる有用な修飾または変更を含めることができる。いくつかの実施形態では、変更（例えば、１つ以上の変更）が、核酸塩基、糖、及びヌクレオシド間結合のそれぞれに存在する。本開示による変更は、リボ核酸（ＲＮＡ）のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）への変更、例えば、リボフラノシル環の２’−ＯＨの２’−Ｈ、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、またはそれらのハイブリッドへの置換であってもよい。さらなる変更については、本明細書で説明される。
【０２２９】
ポリヌクレオチド及び核酸は、分子の全長に沿って均一に変更されても均一に変更されなくてもよい。例えば、１つ以上または全てのタイプのヌクレオチド（例えば、プリンもしくはピリミジン、またはＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのうちの１つ以上もしくは全て）は、ポリヌクレオチドもしくは核酸で、またはその所定の所定の配列領域で、均一に変更されても均一に変更されなくてもよい。場合によっては、ポリヌクレオチド（またはその所定の配列領域）の全てのヌクレオチドＸが変更され、ＸはヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのいずれか１つ、またはＡ＋Ｇ、Ａ＋Ｕ、Ａ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ、Ｇ＋Ｃ、Ｕ＋Ｃ、Ａ＋Ｇ＋Ｕ、Ａ＋Ｇ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ＋Ｃ、もしくはＡ＋Ｇ＋Ｕ＋Ｃの組み合わせのいずれか１つであってよい。
【０２３０】
ポリヌクレオチドの様々な位置に、異なる糖の変更及び／またはヌクレオシド間結合（例えば、骨格構造）が存在してもよい。当業者は、ヌクレオチド類似体または他の変更（複数可）は、ポリヌクレオチドの機能が実質的に低下しないような、ポリヌクレオチドの任意の位置（複数可）に位置してもよいことを理解するであろう。変更は、５’または３’末端の変更であってもよい。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドには３’末端に変更を含む。ポリヌクレオチドは、約１％〜約１００％（全体のヌクレオチド含量に関して、もしくは１つ以上のタイプのヌクレオチド、すなわちＡ、Ｇ、Ｕ、もしくはＣのうちの１つ以上に関して）、または介在するパーセンテージ（例えば、１％〜２０％、１％〜２５％、１％〜５０％、１％〜６０％、１％〜７０％、１％〜８０％、１％〜９０％、１％〜９５％、１０％〜２０％、１０％〜２５％、１０％〜５０％、１０％〜６０％、１０％〜７０％、１０％〜８０％、１０％〜９０％、１０％〜９５％、１０％〜１００％、２０％〜２５％、２０％〜５０％、２０％〜６０％、２０％〜７０％、２０％〜８０％、２０％〜９０％、２０％〜９５％、２０％〜１００％、５０％〜６０％、５０％〜７０％、５０％〜８０％、５０％〜９０％、５０％〜９５％、５０％〜１００％、７０％〜８０％、７０％〜９０％、７０％〜９５％、７０％〜１００％、８０％〜９０％、８０％〜９５％、８０％〜１００％、９０％〜９５％、９０％〜１００％、及び９５％〜１００％）の、代替ヌクレオチドを含んでもよい。任意の残りのパーセンテージは、標準的なヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｕ、またはＣなど）の存在によって説明されることが理解されよう。
【０２３１】
ポリヌクレオチドには、最小ゼロから最大１００％の代替ヌクレオチド、または少なくとも５％の代替ヌクレオチド、少なくとも１０％の代替ヌクレオチド、少なくとも２５％の代替ヌクレオチド、少なくとも５０％の代替ヌクレオチド、少なくとも８０％の代替ヌクレオチド、もしくは少なくとも９０％の代替ヌクレオチドなどの任意の介在するパーセンテージの代替ヌクレオチドを含んでもよい。例えば、ポリヌクレオチドは、代替ウラシルまたはシトシンなどの代替ピリミジンを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または１００％のウラシルが代替ウラシル（例えば、５−置換ウラシル）で置き換えられている。代替ウラシルは、単一の特有の構造を有する化合物で置き換えることができ、または異なる構造（例えば、２、３、４、もしくはそれ以上の特有の構造）を有する複数の化合物で置き換えることができる。場合によっては、ポリヌクレオチドの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または１００％のシトシンが代替シトシン（例えば、５−置換シトシン）で置き換えられている。代替シトシンは、単一の特有の構造を有する化合物で置き換えることができ、または異なる構造（例えば、２、３、４、もしくはそれ以上の特有の構造）を有する複数の化合物で置き換えることができる。
【０２３２】
場合によっては、核酸は、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）が導入される細胞の自然免疫応答を実質的に誘発しない。誘導された自然免疫応答の特徴には、１）炎症誘発性サイトカインの発現増加、２）細胞内ＰＲＲ（ＲＩＧ−Ｉ、ＭＤＡ５など）の活性化、及び／または３）タンパク質翻訳の停止もしくは減少が含まれる。
【０２３３】
核酸は、他の薬剤（例えば、ＲＮＡｉ誘導剤、ＲＮＡｉ剤、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、触媒ＤＮＡ、ｔＲＮＡ、三重らせん形成を誘導するＲＮＡ、アプタマー、ベクター）を必要に応じて含むことができる。いくつかの実施形態では、核酸は、１つ以上の代替ヌクレオシドまたはヌクレオチド（すなわち、代替ｍＲＮＡ分子）を有する１つ以上のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含んでもよい。
【０２３４】
いくつかの実施形態では、核酸（例えば、ｍＲＮＡ）分子、製剤、組成物、またはそれらの関連する方法は、その全てが参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２００２／０９８４４３、ＷＯ２００３／０５１４０１、ＷＯ２００８／０５２７７０、ＷＯ２００９１２７２３０、ＷＯ２００６１２２８２８、ＷＯ２００８／０８３９４９、ＷＯ２０１００８８９２７、ＷＯ２０１０／０３７５３９、ＷＯ２００４／００４７４３、ＷＯ２００５／０１６３７６、ＷＯ２００６／０２４５１８、ＷＯ２００７／０９５９７６、ＷＯ２００８／０１４９７９、ＷＯ２００８／０７７５９２、ＷＯ２００９／０３０４８１、ＷＯ２００９／０９５２２６、ＷＯ２０１１０６９５８６、ＷＯ２０１１０２６６４１、ＷＯ２０１１／１４４３５８、ＷＯ２０１２０１９７８０、ＷＯ２０１２０１３３２６、ＷＯ２０１２０８９３３８、ＷＯ２０１２１１３５１３、ＷＯ２０１２１１６８１１、ＷＯ２０１２１１６８１０、ＷＯ２０１３１１３５０２、ＷＯ２０１３１１３５０１、ＷＯ２０１３１１３７３６、ＷＯ２０１３１４３６９８、ＷＯ２０１３１４３６９９、ＷＯ２０１３１４３７００、ＷＯ２０１３／１２０６２６、ＷＯ２０１３１２０６２７、ＷＯ２０１３１２０６２８、ＷＯ２０１３１２０６２９、ＷＯ２０１３１７４４０９、ＷＯ２０１４１２７９１７、ＷＯ２０１５／０２４６６９、ＷＯ２０１５／０２４６６８、ＷＯ２０１５／０２４６６７、ＷＯ２０１５／０２４６６５、ＷＯ２０１５／０２４６６６、ＷＯ２０１５／０２４６６４、ＷＯ２０１５１０１４１５、ＷＯ２０１５１０１４１４、ＷＯ２０１５０２４６６７、ＷＯ２０１５０６２７３８、ＷＯ２０１５１０１４１６に記載される特徴を含む１つ以上のポリヌクレオチドを含む。
【０２３５】
核酸塩基の代替物
代替のヌクレオシド及びヌクレオチドは、代替の核酸塩基を含むことができる。核酸の核酸塩基は、プリンもしくはピリミジンまたはその誘導体などの有機塩基である。核酸塩基は、標準的な塩基（例えば、アデニン、グアニン、ウラシル、チミン、及びシトシン）であってよい。これらの核酸塩基を変更または完全に置き換えて、強化された特性、例えばヌクレアーゼ耐性などの安定性の向上を有するポリヌクレオチド分子を提供することができる。非標準または修飾塩基は、例えば、アルキル、アリール、ハロ、オキソ、ヒドロキシル、アルキルオキシ、及び／またはチオ置換、１つ以上の融合または開環；酸化；及び／または還元を含むがこれらに限定されない１つ以上の置換または修飾を含んでもよい。
【０２３６】
代替ヌクレオチド塩基対形成には、標準のアデニンチミン、アデニン−ウラシル、またはグアニン−シトシン塩基対だけでなく、非標準または代替塩基を含むヌクレオチド及び／または代替ヌクレオチド間で形成された塩基対も含まれ、水素結合ドナーと水素結合アクセプターとの配置により、非標準塩基と標準塩基の間、または２つの相補的な非標準塩基構造間の水素結合が可能となる。そのような非標準の塩基対形成の一例は、代替ヌクレオチドのイノシンとアデニン、シトシン、またはウラシルの間の塩基対形成である。
【０２３７】
いくつかの実施形態では、核酸塩基は代替ウラシルである。代替ウラシルを有する例示的な核酸塩基及びヌクレオシドには、シュードウリジン（ψ）、ピリジン−４−オンリボヌクレオシド、５−アザ−ウラシル、６−アザ−ウラシル、２−チオ−５−アザ−ウラシル、２−チオ−ウラシル（ｓ２Ｕ）、４−チオ−ウラシル（ｓ４Ｕ）、４−チオ−シュードウリジン、２−チオ−シュードウリジン、５−ヒドロキシ−ウラシル（ｈｏ５Ｕ）、５−アミノアリル−ウラシル、５−ハロ−ウラシル（例えば、５−ヨード−ウラシルまたは５−ブロモ−ウラシル）、３−メチル−ウラシル（ｍ３Ｕ）、５−メトキシ−ウラシル（ｍｏ５Ｕ）、ウラシル５−オキシ酢酸（ｃｍｏ５Ｕ）、ウラシル５−オキシ酢酸メチルエステル（ｍｃｍｏ５Ｕ）、５−カルボキシメチル−ウラシル（ｃｍ５Ｕ）、１−カルボキシメチル−シュードウリジン、５−カルボキシヒドロキシメチル−ウラシル（ｃｈｍ５Ｕ）、５−カルボキシヒドロキシメチル−ウラシルメチルエステル（ｍｃｈｍ５Ｕ）、５−メトキシカルボニルメチル−ウラシル（ｍｃｍ５Ｕ）、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオ−ウラシル（ｍｃｍ５ｓ２Ｕ）、５−アミノメチル−２−チオ−ウラシル（ｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−メチルアミノメチル−ウラシル（ｍｎｍ５Ｕ）、５−メチルアミノメチル−２−チオ−ウラシル（ｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−メチルアミノメチル−２−セレノ−ウラシル（ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ）、５−カルバモイルメチル−ウラシル（ｎｃｍ５Ｕ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−ウラシル（ｃｍｎｍ５Ｕ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオ−ウラシル（ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−プロピニル−ウラシル、１−プロピニル−シュードウラシル、５−タウリノメチル−ウラシル（τｍ５Ｕ）、１−タウリノメチル−シュードウリジン、５−タウリノメチル−２−チオ−ウラシル（τｍ５ｓ２Ｕ）、１−タウリノメチル−４−チオ−シュードウリジン、５−メチル−ウラシル（ｍ５Ｕ、すなわち核酸塩基デオキシチミンを有する）、１−メチル−シュードウリジン（ｍ１ψ）、５−メチル−２−チオ−ウラシル（ｍ５ｓ２Ｕ）、１−メチル−４−チオ−シュードウリジン（ｍ１ｓ４ψ）、４−チオ−１−メチル−シュードウリジン、３−メチル−シュードウリジン（ｍ３ψ）、２−チオ−１−メチル−シュードウリジン、１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、ジヒドロウラシル（Ｄ）、ジヒドロシュードウリジン、５，６−ジヒドロウラシル、５−メチル−ジヒドロウラシル（ｍ５Ｄ）、２−チオ−ジヒドロウラシル、２−チオ−ジヒドロシュードウリジン、２−メトキシ−ウラシル、２−メトキシ−４−チオ−ウラシル、４−メトキシ−シュードウリジン、４−メトキシ−２−チオ−シュードウリジン、Ｎ１−メチル−シュードウリジン、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウラシル（ａｃｐ３Ｕ）、１−メチル−３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）シュードウリジン（ａｃｐ３ψ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）ウラシル（ｉｎｍ５Ｕ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）−２−チオ−ウラシル（ｉｎｍ５ｓ２Ｕ）、５，２’−Ｏ−ジメチル−ウリ���ン（ｍ５Ｕｍ）、２−チオ−２’−Ｏ＿メチル−ウリジン（ｓ２Ｕｍ）、５−メトキシカルボニルメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｍｃｍ５Ｕｍ）、５−カルバモイルメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｎｃｍ５Ｕｍ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕｍ）、３，２’−Ｏ−ジメチル−ウリジン（ｍ３Ｕｍ）、及び５−（イソペンテニルアミノメチル）−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｉｎｍ５Ｕｍ）、１−チオ−ウラシル、デオキシチミジン、５−（２−カルボメトキシビニル）−ウラシル、５−（カルバモイルヒドロキシメチル）−ウラシル、５−カルバモイルメチル−２−チオ−ウラシル、５−カルボキシメチル−２−チオ−ウラシル、５−シアノメチル−ウラシル、５−メトキシ−２−チオ−ウラシル、５−［３−（１−Ｅ−プロペニルアミノ）］ウラシルが含まれるが、これらに限定されない。
【０２３８】
いくつかの実施形態では、核酸塩基は代替シトシンである。代替シトシンを有する例示的な核酸塩基及びヌクレオシドには、５−アザ−シトシン、６−アザ−シトシン、シュードイソシチジン、３−メチル−シトシン（ｍ３Ｃ）、Ｎ４−アセチル−シトシン（ａｃ４Ｃ）、５−ホルミル−シトシン（ｆ５Ｃ）、Ｎ４−メチル−シトシン（ｍ４Ｃ）、５−メチル−シトシン（ｍ５Ｃ）、５−ハロシトシン（例えば、５−ヨードシトシン）、５−ヒドロキシメチル−シトシン（ｈｍ５Ｃ）、１−メチル−シュードイソシチジン、ピロロ−シトシン、ピロロ−シュードイソシチジン、２−チオ−シトシン（ｓ２Ｃ）、２−チオ−５メチル−シトシン、４−チオ−シュードイソシチジン、４−チオ−１−メチル−シュードイソシチジン、４−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードイソシチジン、１−メチル−１−デアザ−シュードイソシチジン、ゼブラリン、５−アザ−ゼブラリン、５−メチル−ゼブラリン、５−アザ−２−チオ−ゼブラリン、２−チオ−ゼブラリン、２−メトキシ−シトシン、２−メトキシ−５−メチル−シトシン、４−メトキシ−シュードイソシチジン、４−メトキシ−１−メチル−シュードイソシチジン、リシジン（ｋ２Ｃ）、５，２’−Ｏ−ジメチルシチジン（ｍ５Ｃｍ）、Ｎ４−アセチル−２’−Ｏ−メチル−シチジン（ａｃ４Ｃｍ）、Ｎ４，２’−Ｏ−ジメチル−シチジン（ｍ４Ｃｍ）、５−ホルミル−２’−Ｏ−メチル−シチジン（ｆ５Ｃｍ）、Ｎ４，Ｎ４，２’−Ｏ−トリメチル−シチジン（ｍ４２Ｃｍ）、１−チオ−シトシン、５−ヒドロキシ−シトシン、５−（３−アジドプロピル）−シトシン、及び５−（２−アジドエチル）−シトシンが含まれるが、これらに限定されない。
【０２３９】
いくつかの実施形態では、核酸塩基は代替アデニンである。代替アデニンを有する例示的な核酸塩基及びヌクレオシドには、２−アミノ−プリン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノ−６−ハロ−プリン（例えば、２−アミノ−６−クロロ−プリン）、６−ハロ−プリン（例えば、６−クロロ−プリン）、２−アミノ−６−メチル−プリン、８−アジド−アデニン、７−デアザ−アデニン、７−デアザ−８−アザ−アデニン、７−デアザ−２−アミノ−プリン、７−デアザ−８−アザ−２−アミノ−プリン、７−デアザ−２，６−ジアミノ−プリン、７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノ−プリン、１−メチル−アデニン（ｍ１Ａ）、２−メチル−アデニン（ｍ２Ａ）、Ｎ６−メチル−アデニン（ｍ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−メチル−アデニン（ｍｓ２ｍ６Ａ）、Ｎ６−イソペンテニル−アデニン（ｉ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニル−アデニン（ｍｓ２ｉ６Ａ）、Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデニン（ｉｏ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデニン（ｍｓ２ｉｏ６Ａ）、Ｎ６−グリシニルカルバモイル−アデニン（ｇ６Ａ）、Ｎ６−トレオニルカルバモイル−アデニン（ｔ６Ａ）、Ｎ６−メチル−Ｎ６−トレオニルカルバモイル−アデニン（ｍ６ｔ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−トレオニルカルバモイル−アデニン（ｍｓ２ｇ６Ａ）、Ｎ６，Ｎ６−ジメチル−アデニン（ｍ６２Ａ）、Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイル−アデニン（ｈｎ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイル−アデニン（ｍｓ２ｈｎ６Ａ）、Ｎ６−アセチル−アデニン（ａｃ６Ａ）、７−メチル−アデニン、２−メチルチオ−アデニン、２−メトキシ−アデニン、Ｎ６，２’−Ｏ−ジメチル−アデノシン（ｍ６Ａｍ）、Ｎ６，Ｎ６，２’−Ｏ−トリメチル−アデノシン（ｍ６２Ａｍ）、１，２’−Ｏ−ジメチル−アデノシン（ｍ１Ａｍ）、２−アミノ−Ｎ６−メチル−プリン、１−チオ−アデニン、８−アジド−アデニン、Ｎ６−（１９−アミノ−ペンタオキサノナデシル）−アデニン、２，８−ジメチル−アデニン、Ｎ６−ホルミル−アデニン、及びＮ６−ヒドロキシメチル−アデニンが含まれるが、これらに限定されない。
【０２４０】
いくつかの実施形態では、核酸塩基は代替グアニンである。代替グアニンを有する例示的な核酸塩基及びヌクレオシドには、イノシン（Ｉ）、１−メチル−イノシン（ｍ１Ｉ）、ワイオシン（ｉｍＧ）、メチルワイオシン（ｍｉｍＧ）、４−デメチル−ワイオシン（ｉｍＧ−１４）、イソワイオシン（ｉｍＧ２）、ワイブトシン（ｙＷ）、ペルオキシワイブトシン（ｏ２ｙＷ）、ヒドロキシワイブトシン（ＯＨｙＷ）、低修飾ヒドロキシワイブトシン（ＯＨｙＷ＊）、７−デアザグアニン、キューオシン（Ｑ）、エポキシキューオシン（ｏＱ）、ガラクトシル−キューオシン（ｇａｌＱ）、マンノシル−キューオシン（ｍａｎＱ）、７−シアノ−７−デアザ−グアニン（ｐｒｅＱ０）、７−アミノメチル−７−デアザ−グアニン（ｐｒｅＱ１）、アルケオシン（Ｇ＋）、７−デアザ−８−アザ−グアニン、６−チオ−グアニン、６−チオ−７−デアザ−グアニン、６−チオ−７−デアザ−８−アザ−グアニン、７−メチルグアニン（ｍ７Ｇ）、６−チオ−７−メチル−グアニン、７−メチル−イノシン、６−メトキシ−グアニン、１−メチル−グアニン（ｍ１Ｇ）、Ｎ２−メチル−グアニン（ｍ２Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−グアニン（ｍ２２Ｇ）、Ｎ２，７−ジメチル−グアニン（ｍ２，７Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２，７−ジメチル−グアニン（ｍ２，２，７Ｇ）、８−オキソ−グアニン、７−メチル−８−オキソ−グアニン、１−メチル−６−チオ−グアニン、Ｎ２−メチル−６−チオ−グアニン、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−６−チオ−グアニン、Ｎ２−メチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ２Ｇｍ）、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ２２Ｇｍ）、１−メチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ１Ｇｍ）、Ｎ２，７−ジメチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ２，７Ｇｍ）、２’−Ｏ−メチル−イノシン（Ｉｍ）、１，２’−Ｏ−ジメチル−イノシン（ｍ１Ｉｍ）、１−チオ−グアニン、及びＯ−６−メチル−グアニンが含まれるが、これらに限定されない。
【０２４１】
ヌクレオチドの代替核酸塩基は、独立してプリン、ピリミジン、プリンまたはピリミジン類似体であり得る。例えば、核酸塩基は、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシル、またはヒポキサンチンの代替物であり得る。別の実施形態において、核酸塩基は、例えば、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６−メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２−プロピル及び他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５−プロピニルウラシル及びシトシン、６−アゾウラシル、シトシン及びチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ（例えば、８−ブロモなど）、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシ及びその他の８−置換アデニン及びグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル及びその他の５−置換ウラシル及びシトシン、７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、デアザグアニン、７−デアザグアニン、３−デアザグアニン、デアザアデニン、７−デアザアデニン、３−デアザアデニン、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、イミダゾ［１，５−ａ］１，３，５トリアジノン、９−デアザプリン、イミダゾ［４，５−ｄ］ピラジン、チアゾロ［４，５−ｄ］ピリミジン、ピラジン−２−オン、１，２，４−トリアジン、ピリダジン；または１，３，５トリアジンを含むがこれらに限定されない塩基の天然に存在する及び合成の誘導体も含み得る。ヌクレオチドが略記Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、またはＵを使用して示されているとき、各文字は代表的な塩基及び／またはその誘導体を指し、例えば、Ａにはアデニンまたはアデニン類似体、例えば７−デアザアデニンが含まれる）。
【０２４２】
糖での変更
ヌクレオシドには、核酸塩基と組み合わせた糖分子（例えば、ペントース、リボース、アラビノース、キシロース、グルコース、ガラクトース、またはそのデオキシ誘導体などの５炭素または６炭素糖）が含まれるが、ヌクレオチドは、ヌクレオシド及びリン酸基または代替基（例えば、ボラノリン酸、チオリン酸、セレノリン酸、ホスホン酸、アルキル基、アミデート、及びグリセロール）を含むヌクレオシドである。ヌクレオシドまたはヌクレオチドは、標準的な種、例えば、標準的な核酸塩基、糖、及びヌクレオチドの場合、リン酸基を含むヌクレオシドもしくはヌクレオチドであってもよく、または１つ以上の代替成分を含む代替のヌクレオシドもしくはヌクレオチドであってもよい。例えば、代替のヌクレオシド及びヌクレオチドは、ヌクレオシドまたはヌクレオチドの糖上で変更されていてもよい。いくつかの実施形態では、代替のヌクレオシドまたはヌクレオチドには次の構造：
【化４３】
2020532528.tif 000045
が含まれる。
式ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩの各々において、
ｍ及びｎの各々は、独立して、０〜５の整数であり、
Ｕ及びＵ’の各々は、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｎ（ＲＵ）ｎｕ、またはＣ（ＲＵ）ｎｕであり、ｎｕは、０〜２の整数であり、各々のＲＵは、独立して、Ｈ、ハロ、または必要に応じて置換されたアルキルであり；
Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ１”、Ｒ２”、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５の各々は、独立して、存在する場合、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、必要に応じて置換されたアルキル、必要に応じて置換されたアルコキシ、必要に応じて置換されたアルケニルオキシ、必要に応じて置換されたアルキニルオキシ、必要に応じて置換されたアミノアルコキシ、必要に応じて置換されたアルコキシアルコキシ、任必要に応じて置換されたヒドロキシアルコキシ、必要に応じて置換されたアミノ、アジド、必要に応じて置換されたアリール、必要に応じて置換アミノアルキル、必要に応じて置換されたアミノアルケニル、必要に応じて置換されたアミノアルキニルであるか、または存在せず；Ｒ３と、Ｒ１’、Ｒ１”、Ｒ２’、Ｒ２”、またはＲ５のうちの１つ以上との組み合わせ（例えば、Ｒ１’とＲ３との組み合わせ、Ｒ１”とＲ３との組み合わせ、Ｒ２’とＲ３との組み合わせ、Ｒ２”とＲ３との組み合わせ、または、Ｒ５とＲ３との組み合わせ）は、一緒に結合して必要に応じて置換されたアルキレンまたは必要に応じて置換されたヘテロアルキレンを形成し、それらが結合している炭素と一緒になって、必要に応じて置換されたヘテロシクリル（例えば、二環式、三環式、または四環式ヘテロシクリル）を提供し；Ｒ５と、Ｒ１’、Ｒ１”、Ｒ２’、またはＲ２”のうちの１つ以上との組み合わせ（例えば、Ｒ１’とＲ５との組み合わせ、Ｒ１”とＲ５との組み合わせ、Ｒ２’とＲ５との組み合わせ、Ｒ２”とＲ５との組み合わせ、または、Ｒ２”とＲ５との組み合わせ）は、一緒に結合して必要に応じて置換されたアルキレンまたは必要に応じて置換されたヘテロアルキレンを形成し、それらが結合している炭素と一緒になって、必要に応じて置換されたヘテロシクリル（例えば、二環式、三環式、または四環式ヘテロシクリル）を提供し；Ｒ４と、Ｒ１’、Ｒ１”、Ｒ２’、Ｒ２”、Ｒ３、またはＲ５のうちの１つ以上との組み合わせは、一緒に結合して必要に応じて置換されたアルキレンまたは必要に応じて置換されたヘテロアルキレンを形成し、それらが結合している炭素と一緒になって、必要に応じて置換されたヘテロシクリル（例えば、二環式、三環式、または四環式ヘテロシクリル）を提供し；ｍ’及びｍ”の各々は、独立して、０〜３の整数（例えば、０〜２、０〜１、１〜３、または１〜２）であり；
Ｙ１、Ｙ２、及びＹ３の各々は、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、−ＮＲＮ１−、必要に応じて置換されたアルキレン、または必要に応じて置換されたヘテロアルキレンであり、ＲＮ１はＨ、必要に応じて置換されたアルキル、必要に応じて置換されたアルケニル、必要に応じて置換されたアルキニル、必要に応じて置換アリールであるか、または存在せず；
各々のＹ４は、独立して、Ｈ、ヒドロキシ、チオール、ボラニル、必要に応じて置換されたアルキル、必要に応じて置換されたアルケニル、必要に応じて置換されたアルキニル、必要に応じて置換されたアルコキシ、必要に応じて置換されたアルケニルオキシ、必要に応じて置換されたアルキニルオキシ、必要に応じて置換されたチオアルコキシ、必要に応じて置換されたアルコキシアルコキシ、または必要に応じて置換されたアミノであり；
各々のＹ５は、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、必要に応じて置換されたアルキレン（例えば、メチレン）、または必要に応じて置換されたヘテロアルキレンであり；
Ｂは、修飾または未修飾の核酸塩基である。
【０２４３】
いくつかの実施形態では、２’−ヒドロキシ基（ＯＨ）は、多くの異なる置換基で修飾または置換できる。２’位の例示的な置換には、Ｈ、アジド、ハロ（例えば、フルオロ）、必要に応じて置換されたＣ１−６アルキル（例えば、メチル）、必要に応じて置換されたＣ１−６アルコキシ（例えば、メトキシまたはエトキシ）；必要に応じて置換されたＣ６−１０アリールオキシ；必要に応じて置換されたＣ３−８シクロアルキル；必要に応じて置換されたＣ６−１０アリール−Ｃ１−６アルコキシ、必要に応じて置換されたＣ１−１２（ヘテロシクリル）オキシ；糖（例えば、リボース、ペントース、または本明細書に記載の任意のもの）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲ、式中、ＲはＨまたは必要に応じて置換されたアルキルであり、ｎは０〜２０（例えば、０〜４、０〜８、０〜１０、０〜１６、１〜４、１〜８、１〜１０、１〜１６、１〜２０、２〜４、２〜８、２〜１０、２〜１６、２〜２０、４〜８、４〜１０、４〜１６、及び４〜２０）の整数；２’−ヒドロキシがＣ１−６アルキレンまたはＣ１−６ヘテロアルキレン架橋によって同一のリボース糖の４’−炭素に接続されている「ロックド」核酸（ＬＮＡ）、ここで例示的な架橋にはメチレン、プロピレン、エーテル、またはアミノ架橋が含まれる；本明細書で定義されるアミノアルキル；本明細書で定義されるアミノアルコキシ；本明細書で定義されるアミノ；ならびに本明細書で定義されるアミノ酸が含まれるが、これらに限定されない。
【０２４４】
一般的に、ＲＮＡには酸素を有する５員環である糖基リボースが含まれる。例示的な非限定的な代替ヌクレオチドには、リボースの酸素の置き換え（例えば、Ｓ、Ｓｅ、またはメチレンもしくはエチレンなどのアルキレンによる）；二重結合の追加（例えば、リボースをシクロペンテニルまたはシクロヘキセニルで置き換えるため）；リボースの環収縮（例えば、シクロブタンまたはオキセタンの４員環を形成するため）；リボースの環拡大（例えば、アンヒドロヘキシトール、アルトリトール、マンニトール、シクロヘキサニル、シクロヘキセニル、及びモルホリノ（ホスホルアミデート骨格も有する）などの追加の炭素またはヘテロ原子を有する６員または７員環を形成するため）；多環式形態（例えば、グリコール核酸（ＧＮＡ）などのトリシクロ及び「アンロックド」形態（例えば、Ｒ−ＧＮＡまたはＳ−ＧＮＡ、ここでリボースがホスホジエステル結合に結合したグリコール単位で置き換えられている）、トレオース核酸（ＴＮＡ、ここでリボースはα−Ｌ−トレオフラノシル−（３’→２’）で置き換えられている））、ならびにペプチド核酸（ＰＮＡ、２−アミノ−エチル−グリシン結合がリボース及びホスホジエステル骨格を置き換える）が含まれる。
【０２４５】
いくつかの実施形態では、糖基には、リボースの対応する炭素とは逆の立体化学配置を持つ１つ以上の炭素が含まれている。したがって、ポリヌクレオチド分子は、糖として、例えばアラビノースまたはＬ−リボースを含むヌクレオチドを含むことができる。
【０２４６】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、糖がＬ−リボース、２’−Ｏ−メチル−リボース、２’−フルオロ−リボース、アラビノース、ヘキシトールであるヌクレオシド、ＬＮＡ、またはＰＮＡの少なくとも１つを含む。
【０２４７】
ヌクレオシド間結合での変更
代替ヌクレオチドは、ヌクレオシド間結合（例えば、リン酸骨格）で変更できる。本明細書において、ポリヌクレオチド骨格の文脈において、語句「リン酸塩」及び「ホスホジエステル」は互換可能に使用される。骨格リン酸基は、１つ以上の酸素原子を異なる置換基で置き換えることで変更できる。
【０２４８】
代替ヌクレオチドは、本明細書に記載されるように、変更されていないリン酸部分の別のヌクレオシド間結合による大規模な置換を含むことができる。代替リン酸基の例には、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェート、ボラノホスフェートエステル、水素ホスホネート、ホスホルアミデート、ホスホロジアミデート、アルキルまたはアリールホスホネート、及びホスホトリエステルが含まれるが、これらに限定されない。ホスホロジチオエートは、両方の非結合酸素が硫黄に置き換わっている。リン酸リンカーは、結合酸素を窒素（架橋ホスホロアミデート）、硫黄（架橋ホスホロチオエート）、及び炭素（架橋メチレンホスホネート）に置き換えることによっても変更できる。
【０２４９】
代替のヌクレオシド及びヌクレオチドは、非架橋酸素のうちの１つ以上をボラン部分（ＢＨ３）、硫黄（チオ）、メチル、エチル、及び／またはメトキシで置き換えることを含むことができる。非限定的な例として、同一の位置（例えば、アルファ（α）、ベータ（β）、またはガンマ（γ）位）の２つの非架橋酸素を硫黄（チオ）及びメトキシで置き換えることができる。
【０２５０】
リン酸部分の位置の１つ以上の酸素原子の置き換え（例えば、α−チオリン酸）は、非天然ホスホロチオエート骨格結合を介してＲＮＡ及びＤＮＡに安定性（エキソヌクレアーゼ及びエンドヌクレアーゼに対するものなど）を付与するために提供される。ホスホロチオエートＤＮＡ及びＲＮＡは、ヌクレアーゼ耐性が増加し、続いて細胞環境での半減期が長くなる。
【０２５１】
リン原子を含まないヌクレオシド間結合を含む、本開示に従って使用され得る他のヌクレオシド間結合は、本明細書に記載されている。
【０２５２】
配列内リボソーム進入部位
ポリヌクレオチドは、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含んでもよい。ＩＲＥＳは、唯一のリボソーム結合部位として機能する場合もあれば、ｍＲＮＡの複数のリボソーム結合部位のうちの１つとして機能する場合もある。２つ以上の機能的リボソーム結合部位を含むポリヌクレオチドは、リボソームによって独立して翻訳されるいくつかのペプチドまたはポリペプチドをコードし得る（例えば、多シストロン性ｍＲＮＡ）。ポリヌクレオチドにＩＲＥＳが提供されるとき、さらに必要に応じて、第二の翻訳可能な領域が提供される。本開示に従って使用できるＩＲＥＳ配列の例には、ピコルナウイルス（例えば、ＦＭＤＶ）、ペストウイルス（ＣＦＦＶ）、ポリオウイルス（ＰＶ）、脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭＶ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、古典的なブタ熱ウイルス（ＣＳＦＶ）、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、またはクリケット麻痺ウイルス（ＣｒＰＶ）由来のものが含まれるが、これらに限定されない。
【０２５３】
５’キャップ構造
ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は５’キャップ構造を含んでもよい。ポリヌクレオチドの５’キャップ構造は核外輸送及びポリヌクレオチドの安定性の増加に関与し、細胞内のポリヌクレオチドの安定性及び成熟した環状ｍＲＮＡ種を形成するためのキャップ結合タンパク質（ＣＢＰ）とポリＡ結合タンパク質との結合を通じた翻訳能力に関与するｍＲＮＡキャップ結合タンパク質（ＣＢＰ）に結合する。キャップは、ｍＲＮＡスプライシング中の５’近位イントロンの除去をさらに助ける。
【０２５４】
内因性ポリヌクレオチド分子は、末端グアノシンキャップ残基とポリヌクレオチドの５’末端転写センスヌクレオチドとの間に５’−ｐｐｐ−５’−三リン酸結合を生成する５’末端キャップされていてもよい。次いで、この５’−グアニル酸キャップをメチル化して、Ｎ７−メチル−グアニル酸残基を生成することができる。ポリヌクレオチドの５’末端の末端及び／または前末端転写ヌクレオチドのリボース糖は、必要に応じて２’−Ｏ−メチル化されていてもよい。グアニル酸キャップ構造の加水分解及び開裂による５’−脱キャッピングは、分解のためにｍＲＮＡ分子などのポリヌクレオチド分子を標的とし得る。
【０２５５】
ポリヌクレオチドへの変更は、脱キャッピングを防止する非加水分解性のキャップ構造を生成し、これによりポリヌクレオチドの半減期を延長してもよい。キャップ構造の加水分解には５’−ｐｐｐ−５’ホスホジエステル結合の切断が必要であるため、キャッピング反応中に代替ヌクレオチドを使用してもよい。例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，  ＭＡ）のＶａｃｃｉｎｉａ  Ｃａｐｐｉｎｇ  Ｅｎｚｙｍｅは、５’−ｐｐｐ−５  ’キャップにホスホロチオエート結合を作成するために、製造者の取扱説明書に従ってα−チオ−グアノシンヌクレオチドとともに使用できる。α−メチル−ホスホネート及びセレノホスフェートヌクレオチドなどの追加の代替グアノシンヌクレオチドを使用してもよい。
【０２５６】
追加の変更には、ポリヌクレオチドの５’末端及び／または５’前末端ヌクレオチドのリボース糖の、糖の２’−ヒドロキシ基における、２’−Ｏ−メチル化（上述のように）が含まれるが、これに限定されない。複数の異なる５’キャップ構造を使用して、ｍＲＮＡ分子などのポリヌクレオチドの５’キャップを生成することができる。
【０２５７】
５’−キャップ構造には、国際特許公開ＷＯ２００８１２７６８８、同ＷＯ２００８０１６４７３、及び同ＷＯ２０１１０１５３４７に記載されているものが含まれ、各々のキャップ構造は参照により本明細書に組み込まれる。
【０２５８】
本明細書では合成キャップ類似体、化学キャップ、化学キャップ類似体、または構造的もしくは機能的キャップ類似体とも呼ばれるキャップ類似体は、天然（すなわち、内因性、野生型、または生理学的）の５’キャップとは、それらの化学構造が異なるが、キャップ機能を保持する。キャップ類似体は、化学的に（すなわち、非酵素的に）もしくは酵素的に合成してもよく、及び／またはポリヌクレオチドに連結されてもよい。
【０２５９】
例えば、アンチリバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ）キャップは、５’−５’−三リン酸基で連結された２つのグアノシンを含み、１つのグアノシンはＮ７−メチル基と３’−Ｏ−メチル基を含む（すなわち、Ｎ７，３’−Ｏ−ジメチル−グアノシン−５’−三リン酸−５’−グアノシン、ｍ７Ｇ−３’ｍｐｐｐ−Ｇ、これは、３’Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇと同等に示すことができる）。変更されていないもう一方のグアノシンの３’−Ｏ原子は、キャップされたポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’末端ヌクレオチドに結合する。Ｎ７−及び３’−Ｏ−メチル化グアノシンは、キャップされたポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の末端部分を提供する。
【０２６０】
別の例示的なキャップはｍＣＡＰであり、これはＡＲＣＡに類似しているが、グアノシンに２’−Ｏ−メチル基を有する（すなわち、Ｎ７，２’−Ｏ−ジメチル−グアノシン−５’−三リン酸−５’−グアノシン、ｍ７Ｇｍ−ｐｐｐ−Ｇ）。
【０２６１】
キャップは、ジヌクレオチドキャップ類似体であってもよい。非限定的な例として、ジヌクレオチドキャップ類似体は、参照によりそのキャップ構造が本明細書に組み込まれる米国特許第８，５１９，１１０号に記載されているジヌクレオチドキャップ類似体などのボラノホスフェート基またはホスホロセレノエート基によって異なるリン酸塩位置で修飾することができる。
【０２６２】
代替的に、キャップ類似体は、当該技術分野で公知の及び／または本明細書に記載のＮ７−（４−クロロフェノキシエチル）置換ジヌクレオチドキャップ類似体であってもよい。Ｎ７−（４−クロロフェノキシエチル）置換ジヌクレオチドキャップ類似体の非限定的な例には、Ｎ７−（４−クロロフェノキシエチル）−Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ及びＮ７−（４−クロロフェノキシエチル）−ｍ３’−ＯＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップ類似体が含まれる（例えば、そのキャップ構造が参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０１３  ２１：４５７０−４５７４に記載されている様々なキャップ類似体及びキャップ類似体の合成方法を参照されたい）。他の例では、本開示のポリヌクレオチドに有用なキャップ類似体は、４−クロロ／ブロモフェノキシエチル類似体である。
【０２６３】
キャップアナログにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応でポリヌクレオチドの同時のキャッピングが可能になるが、転写産物の２０％までがキャップされずに残る。これは、内因性の細胞転写機構によって生成されるポリヌクレオチドの内因性５’−キャップ構造からのキャップ類似体の構造的な違いと同様に、翻訳能力の低下及び細胞安定性の低下につながり得る。
【０２６４】
より確実な５’キャップ構造を生成するために、酵素を使用して、代替ポリヌクレオチドを転写後にキャップすることもできる。本明細書で使用されるとき、「より確実な」という語句は、構造的または機能的に、内因性または野生型の特徴を厳密に反映または模倣する特徴を指す。すなわち、「より確実な」特徴は、先行技術の合成特徴もしくは類似体と比較して、内因性、野生型、天然または生理学的な細胞機能及び／または構造のより良好な代表であるか、あるいは１つ以上の点において、対応する内因性、野生型、天然または生理学的な特徴を上回る。本開示のポリヌクレオチドにおいて有用なより確実な５’キャップ構造の非限定的な例は、とりわけ、当該技術分野で公知の合成５’キャップ構造（または野生型、天然、もしくは生理学的５’キャップ構造）と比較して、キャップ結合タンパク質の結合の強化、半減期の増加、５’−エンドヌクレアーゼに対する感受性の低下、及び／または、５’脱キャッピングの減少を有するものである。例えば、組換えワクシニアウイルスキャッピング酵素及び組換え２’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ酵素は、ポリヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドとグアノシンキャップヌクレオチドの間に標準的な５’−５’−三リン酸結合を作成することができ、キャップグアノシンはＮ７−メチル化を含み、ポリヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルを含む。このような構造はＣａｐ１構造と呼ばれる。このキャップは、例えば、当該技術分野で公知の他の５’キャップ類似体構造と比較して、より高い翻訳能力、細胞安定性、及び細胞炎症誘発性サイトカインの活性化の低下をもたらす。他の例示的なキャップ構造には、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ、ｐＮ２ｐ（Ｃａｐ０）、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐ（Ｃａｐ１）、７ｍＧ（５’）−ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮ２ｍｐ（Ｃａｐ２）、及びｍ（７）Ｇｐｐｐｍ（３）（６，６，２’）Ａｐｍ（２’）Ａｐｍ（２’）Ｃｐｍ（２）（３，２’）Ｕｐ（Ｃａｐ４）が含まれる。
【０２６５】
代替ポリヌクレオチドは転写後にキャップされる場合があり、このプロセスがより効率的であるため、代替ポリヌクレオチドのほぼ１００％がキャップされる場合がある。これは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応の過程でキャップ類似体がポリヌクレオチドに連結しているときの約８０％とは対照的である。
【０２６６】
５末端キャップには、内因性キャップまたはキャップ類似体が含まれる場合がある。５’末端キャップには、グアノシン類似体が含まれる場合がある。有用なグアノシン類似体には、イノシン、Ｎ１−メチルグアノシン、２’−フルオロ−グアノシン、７−デアザ−グアノシン、８−オキソ−グアノシン、２−アミノ−グアノシン、ＬＮＡ−グアノシン、及び２−アジド−グアノシンが含まれる。
【０２６７】
場合によっては、ポリヌクレオチドは修飾された５’キャップを含む。５’キャップにおける修飾は、ポリヌクレオチドの安定性を高め、ポリヌクレオチドの半減期を延長し、ポリヌクレオチドの翻訳効率を高めることができる。修飾された５’キャップには、以下の修飾のうち１つ以上が含まれるが、これらに限定されない：キャップ化グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）の２’位及び／または３’位での修飾、メチレン部分（ＣＨ２）による糖環酸素の置き換え（炭素環を生成した）、キャップ構造の三リン酸架橋部分の修飾、あるいは核酸塩基（Ｇ）部分の修飾。
【０２６８】
５’−ＵＴＲ
５’−ＵＴＲは、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の隣接領域として提供され得る。５’−ＵＴＲは、ポリヌクレオチドに見られるコード領域と同種でも異種でもよい。複数の５’−ＵＴＲが隣接領域に含まれていてもよく、同一の配列でも異なる配列でもよい。存在しないものを含む隣接領域の任意の部分は、コドン最適化されてもよく、コドン最適化の前及び／またはその後に、１つ以上の異なる構造的または化学的変更を独立して含んでもよい。
【０２６９】
参照により本明細書に組み込まれる、米国仮出願第６１／７７５，５０９号の表２１、及び米国仮出願第６１／８２９，３７２号の表２１及び表２２に示されているものは、代替ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の開始及び停止部位のリストである。表２１では、各々の５’−ＵＴＲ（５’−ＵＴＲ−００５〜５’−ＵＴＲ６８５１１）は、その天然または野生型（同種）転写物と比べた開始及び停止部位によって同定される（ＥＮＳＴ；ＥＮＳＥＭＢＬデータベースで使用される識別子）。
【０２７０】
ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の１つ以上の特性を変更するために、代替ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）のコード領域に対して異種である５’−ＵＴＲを改変してもよい。次いで、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）を細胞、組織、または生物に投与し、タンパク質レベル、局在化、及び／または半減期などの結果を測定して、異種５’−ＵＴＲが有する代替ポリヌクレオチド（ｍＲＮＡ）に対する有益な効果を評価することができる。Ａ、Ｔ、Ｃ、またはＧを含む１つ以上のヌクレオチドが末端に追加またはそこから除去される、５’−ＵＴＲのバリアントを利用してもよい。５’−ＵＴＲはまた、コドン最適化、または本明細書に記載の任意の方法で変更されてもよい。
【０２７１】
５’−ＵＴＲ、３’−ＵＴＲ、及び翻訳エンハンサーエレメント（ＴＥＥ）
ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’−ＵＴＲは、少なくとも１つの翻訳エンハンサーエレメントを含んでもよい。「翻訳エンハンサーエレメント」という用語は、ポリヌクレオチドから産生されるポリペプチドまたはタンパク質の量を増加させる配列を指す。非限定的な例として、ＴＥＥは転写プロモーターと開始コドンの間に位置してもよい。５’−ＵＴＲに少なくとも１つのＴＥＥを有するポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、５’−ＵＴＲにキャップを含み得る。さらに、少なくとも１つのＴＥＥは、キャップ依存性またはキャップ非依存性翻訳を受けるポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’−ＵＴＲに位置し得る。
【０２７２】
一態様では、ＴＥＥは、キャップ依存性またはカプチン非依存性翻訳などではあるが、これらに限定されない、ポリヌクレオチドの翻訳活性を促進することができるＵＴＲ内の保存されたエレメントである。ヒトを含む１４種にわたるこれらの配列の保存は、これまでにＰａｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２０１３，  １−１０）によって示されている。
【０２７３】
１つの非限定的な例では、既知のＴＥＥはＧｔｘホメオドメインタンパク質の５’リーダーにあり得る（Ｃｈａｐｐｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０１：９５９０−９５９４，  ２００４、そのＴＥＥは参照により本明細書に組み込まれる）。
【０２７４】
別の非限定的な例では、ＴＥＥは、米国特許公開第２００９／０２２６４７０号及び同第２０１３／０１７７５８１号、国際特許公開ＷＯ２００９／０７５８８６、同ＷＯ２０１２／００９６４４、及び同ＷＯ１９９９／０２４５９５、米国特許第６，３１０，１９７号及び同第６，８４９，４０５号に開示されており、それぞれのＴＥＥ配列は参照により本明細書に組み込まれる。
【０２７５】
さらに別の非限定的な例では、ＴＥＥは、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、ＨＣＶ−ＩＲＥＳ、または米国特許第７，４６８，２７５号、米国特許公開第２００７／００４８７７６号、同第２０１１／０１２４１０号、ならびに、国際特許公開ＷＯ２００７／０２５００８及び同ＷＯ２００１／０５５３６９に記載されているものなどのＩＲＥＳ要素であってもよいが、これらに限定されず、それぞれのＩＲＥＳ配列は参照により本明細書に組み込まれる。ＩＲＥＳ要素には、Ｃｈａｐｐｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０１：９５９０−９５９４，  ２００４）、及びＺｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．  （ＰＮＡＳ  １０２：６２７３−６２７８，  ２００５）、ならびに米国特許公開第２００７／００４８７７６号及び同第２０１１／０１２４１００号、ならびに国際特許公開ＷＯ２００７／０２５００８号によって記載されたＧｔｘ配列（例えば、Ｇｔｘ９−ｎｔ、Ｇｔｘ８−ｎｔ、Ｇｔｘ７−ｎｔ）が含まれ得るが、これらに限定されず、それぞれのＩＲＥＳ配列は参照により本明細書に組み込まれる。
【０２７６】
「翻訳エンハンサーポリヌクレオチド」は、本明細書で例示され、及び／または、従来技術（例えば、米国特許第６，３１０，１９７号、同第６，８４９，４０５号、同第７，４５６，２７３号、同第７，１８３，３９５号、米国特許公開第２００９０／２２６４７０号、同第２００７／００４８７７６号、同第２０１１／０１２４１００号、同第２００９／００９３０４９号、同第２０１３／０１７７５８１号、国際特許公開ＷＯ２００９／０７５８８６、同ＷＯ２００７／０２５００８、同ＷＯ２０１２／００９６４４、同ＷＯ２００１／０５５３７１、同ＷＯ１９９９／０２４５９５、及び欧州特許第２６１０３４１号及び同２６１０３４０号を参照されたい、それぞれのＴＥＥ配列は参照により本明細書に組み込まれる）に開示される特定のＴＥＥ、またはそれらのバリアント、ホモログ、もしくは機能性誘導体の１つ以上を含むポリヌクレオチドである。
特定のＴＥＥの１つ以上のコピーがポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）に存在してもよい。翻訳エンハンサーポリヌクレオチド内のＴＥＥは、１つ以上の配列セグメントに編成してもよい。配列セグメントは、本明細書に例示される特定のＴＥＥの１つ以上を保有することができ、各ＴＥＥは１つ以上のコピーで存在する。翻訳エンハンサーポリヌクレオチドに複数の配列セグメントが存在する場合、それらは同種でも異種でもよい。したがって、翻訳エンハンサーポリヌクレオチド内の複数の配列セグメントは、本明細書に例示される特定のＴＥＥの同一もしくは異なるタイプ、特定のＴＥＥの各々の同一もしくは異なるコピー数、及び／または各配列セグメント内のＴＥＥの同一もしくは異なる編成を保有することができる。
【０２７７】
ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、国際特許公開ＷＯ１９９９／０２４５９５、同ＷＯ２０１２／００９６４４、同ＷＯ２００９／０７５８８６、同ＷＯ２００７／０２５００８、同ＷＯ１９９９／０２４５９５、欧州特許公開第２６１０３４１号、及び同第２６１０３４０号、米国特許第６，３１０，１９７号、同第６，８４９，４０５号、同第７，４５６，２７３号、同第７，１８３，３９５号、ならびに米国特許公開第２００９／０２２６４７０号、同第２０１１／０１２４１００号、同第２００７／００４８７７６号、同第２００９／００９３０４９号、及び同第２０１３／０１７７５８１号に記載されている少なくとも１つのＴＥＥを含み得、それぞれのＴＥＥ配列が参照により本明細書に組み込まれている。ＴＥＥは、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’−ＵＴＲに位置し得る。
【０２７８】
ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、それぞれのＴＥＥ配列が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許公開第２００９／０２２６４７０号、同第２００７／００４８７７６号、同第２０１３／０１７７５８１号、及び同第２０１１／０１２４１００号、国際特許公開ＷＯ１９９９／０２４５９５、同ＷＯ２０１２／００９６４４、同ＷＯ２００９／０７５８８６、及び同ＷＯ２００７／０２５００８、欧州特許公開第２６１０３４１号及び同第２６１０３４０号、米国特許第６，３１０，１９７号、同第６，８４９，４０５号、同第７，４５６，２７３号、同第７，１８３，３９５号に記載されるＴＥＥと、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を有するＴＥＥを少なくとも１つ含み得る。
【０２７９】
ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’−ＵＴＲは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、または６０を超える、ＴＥＥ配列を含んでもよい。ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’−ＵＴＲ内のＴＥＥ配列は、同一または異なるＴＥＥ配列であり得る。ＴＥＥ配列は、ＡＢＡＢＡＢ、ＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢ、またはＡＢＣＡＢＣＡＢＣなどのパターン、またはそのバリアントであり得、１回、２回、または３回を超えて繰り返され得る。これらのパターンでは、各文字Ａ、Ｂ、またはＣは、ヌクレオチドレベルで異なるＴＥＥ配列を表す。
【０２８０】
場合によっては、５’−ＵＴＲは、２つのＴＥＥ配列を分離するスペーサーを含んでもよい。非限定的な例として、スペーサーは、１５ヌクレオチドスペーサー及び／または当該技術分野で公知の他のスペーサーであり得る。別の非限定的な例として、５’−ＵＴＲは、５’−ＵＴＲ内で少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、または９回を超えて反復する、配列−スペーサーモジュールを含んでもよい。
【０２８１】
他の例では、２つのＴＥＥ配列を分離するスペーサーは、ｍｉＲ配列（例えば、ｍｉＲ結合部位及びｍｉＲシード）などであるが、これらに限定されない、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の翻訳を調節することができる当該技術分野で公知の他の配列を含み得る。非限定的な例として、２つのＴＥＥ配列を分離するために使用される各スペーサーは、異なるｍｉＲ配列またはｍｉＲ配列の成分（例えば、ｍｉＲシード配列）を含んでもよい。
【０２８２】
場合によっては、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’−ＵＴＲ内のＴＥＥは、それぞれのＴＥＥ配列が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許公開第２００９／０２２６４７０号、同第２００７／００４８７７６号、同第２０１３／０１７７５８１号、及び同第２０１１／０１２４１００号、国際特許公開ＷＯ１９９９／０２４５９５、同ＷＯ２０１２／００９６４４、同ＷＯ２００９／０７５８８６、及び同ＷＯ２００７／０２５００８、欧州特許公開第２６１０３４１号及び同第２６１０３４０号、ならびに米国特許第６，３１０，１９７号、同第６，８４９，４０５号、同第７，４５６，２７３号、及び同第７，１８３，３９５号に開示されるＴＥＥ配列の、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または９９％を超えるものを含み得る。別の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’−ＵＴＲ内のＴＥＥは、それぞれのＴＥＥ配列が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許公開第２００９／０２２６４７０号、同第２００７／００４８７７６号、同第２０１３／０１７７５８１、及び同第２０１１／０１２４１００号、国際特許公開ＷＯ１９９９／０２４５９５、同ＷＯ２０１２／００９６４４、同ＷＯ２００９／０７５８８６、同ＷＯ２００７／０２５００８、欧州特許公開第２６１０３４１号及び同第２６１０３４０号、ならびに米国特許第６，３１０，１９７号、同第６，８４９，４０５号、同第７，４５６，２７３号、及び同第７，１８３，３９５号に開示されるＴＥＥ配列の、５〜３０ヌクレオチドフラグメント、５〜２５ヌクレオチドフラグメント、５〜２０ヌクレオチドフラグメント、５〜１５ヌクレオチドフラグメント、５〜１０ヌクレオチドフラグメントを含み得る。
【０２８３】
場合によっては、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’−ＵＴＲ内のＴＥＥは、それぞれのＴＥＥ配列が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｈａｐｐｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０１：９５９０−９５９４，  ２００４）及びＺｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（ＰＮＡＳ  １０２：６２７３−６２７８，  ２００５）、ならびに、Ｗｅｌｌｅｎｓｉｅｋ  ｅｔ  ａｌ（Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃａｐ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ−ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ２０１３；ＤＯＩ：１０．１０３８／ＮＭＥＴＨ．２５２２）に開示される補足表１及び補足表２に開示されるＴＥＥ配列の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または９９％を超えて含み得る。別の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’−ＵＴＲ内のＴＥＥは、それぞれのＴＥＥ配列が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｈａｐｐｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０１：９５９０−９５９４，  ２００４）及びＺｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（ＰＮＡＳ  １０２：６２７３−６２７８，  ２００５）、ならびに、Ｗｅｌｌｅｎｓｉｅｋ  ｅｔ  ａｌ（Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃａｐ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ−ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ２０１３；ＤＯＥ１０．１０３８／ＮＭＥＴＨ．２５２２）に開示される補足表１及び補足表２に開示されるＴＥＥ配列の、５〜３０ヌクレオチドフラグメント、５〜２５ヌクレオチドフラグメント、５〜２０ヌクレオチドフラグメント、５〜１５ヌクレオチドフラグメント、５〜１０ヌクレオチドフラグメントを含み得る。
【０２８４】
場合によっては、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’−ＵＴＲで使用されるＴＥＥは、それぞれのＴＥＥ配列が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，４６８，２７５号及び国際特許公開ＷＯ２００１／０５５３６９に記載されているものなどであるが、これらに限定されないＩＲＥＳ配列である。
【０２８５】
場合によっては、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’−ＵＴＲで使用されるＴＥＥは、米国特許公開第２００７／００４８７７６号及び同第２０１１／０１２４１００号、ならびに国際特許公開ＷＯ２００７／０２５００８及び同ＷＯ２０１２／００９６４４に記載される方法によって同定することができ、そのそれぞれの方法は参照により本明細書に組み込まれる。
【０２８６】
場合によっては、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’−ＵＴＲで使用されるＴＥＥは、それぞれのＴＥＥ配列が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，４５６，２７３号及び同第７，１８３，３９５号、米国特許公開第２００９／００９３０４９号、国際公開ＷＯ２００１／０５５３７１に記載された転写調節エレメントであり得る。転写調節エレメントは、米国特許第７，４５６，２７３号及び同第７，１８３，３９５号、米国特許公開第２００９／００９３０４９号、及び国際公開ＷＯ２００１／０５５３７１に記載される方法などであるが、これらに限定されない当該技術分野で公知の方法によって同定することができ、それぞれの方法は参照により本明細書に組み込まれる。
【０２８７】
さらに他の例では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’−ＵＴＲで使用されるＴＥＥは、それぞれのＴＥＥ配列が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，４５６，２７３号及び同第７，１８３，３９５号、米国特許公開第２００９／００９３０４９号、国際公開ＷＯ２００１／０５５３７１に記載されるようなポリペプチドまたはその部分である。
【０２８８】
本明細書に記載の少なくとも１つのＴＥＥを含む５’−ＵＴＲは、ベクターシステムまたはポリヌクレオチドベクターなどであるが、これらに限定されないモノシストロン性配列に組み込まれ得る。非限定的な例として、ベクターシステム及びポリヌクレオチドベクターには、それぞれのＴＥＥ配列が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，４５６，２７３号及び同第７，１８３，３９５号、米国特許公開第２００７／００４８７７６号、同第２００９／００９３０４９号、及び同第２０１１／０１２４１００号、ならびに国際特許公開ＷＯ２００７／０２５００８及び同ＷＯ２００１／０５５３７１に記載のものが含まれ得る。
【０２８９】
本明細書に記載のＴＥＥは、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’−ＵＴＲ及び／または３’−ＵＴＲに位置してもよい。３’−ＵＴＲに位置しているＴＥＥは、５’−ＵＴＲに位置している、及び／または５’−ＵＴＲへの組み込みが記載されているＴＥＥと同一及び／または異なるものであり得る。
【０２９０】
場合によっては、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の３’−ＵＴＲは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８  少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、または６０を超える、ＴＥＥ配列を含んでもよい。本開示のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の３’−ＵＴＲ内のＴＥＥ配列は、同一または異なるＴＥＥ配列であり得る。ＴＥＥ配列は、ＡＢＡＢＡＢ、ＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢ、もしくはＡＢＣＡＢＣＡＢＣなどのパターン、またはそのバリアントであり得、１回、２回、または３回を超えて繰り返され得る。これらのパターンでは、各文字Ａ、Ｂ、またはＣは、ヌクレオチドレベルで異なるＴＥＥ配列を表す。
【０２９１】
一例では、３’−ＵＴＲは、２つのＴＥＥ配列を分離するスペーサーを含んでもよい。非限定的な例として、スペーサーは、１５ヌクレオチドスペーサー及び／または当該技術分野で公知の他のスペーサーであり得る。別の非限定的な例として、３’−ＵＴＲは、３’−ＵＴＲ内で少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、または９回を超えて反復する、配列−スペーサーモジュールを含んでもよい。
【０２９２】
他の例では、２つのＴＥＥ配列を分離するスペーサーは、本明細書に記載のｍｉＲ配列（例えば、ｍｉＲ結合部位及びｍｉＲシード）などであるが、これに限定されない、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の翻訳を調節することができる当該技術分野で公知の他の配列を含み得る。非限定的な例として、２つのＴＥＥ配列を分離するために使用される各スペーサーは、異なるｍｉＲ配列またはｍｉＲ配列の成分（例えば、ｍｉＲシード配列）を含んでもよい。
【０２９３】
いくつかの実施形態では、本開示のポリリボヌクレオチドは、ｍｉＲ及び／またはＴＥＥ配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリリボヌクレオチドへのｍｉＲ配列及び／またはＴＥＥ配列の組み込みは、ステムループ領域の形状を変化させることができ、それは翻訳を増加及び／または減少させることができる。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｋｅｄｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１０  １２（１０）：  １０１４−２０を参照されたい。
【０２９４】
センサー配列及びマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位
センサー配列には、例えば、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位、転写因子結合部位、構造化ｍＲＮＡ配列及び／またはモチーフ、内因性核酸結合分子の疑似受容体として作用するように改変された人工結合部位、ならびにそれらの組み合わせが含まれる。センサー配列の非限定的な例は、米国公開第２０１４／０２００２６１号に記載されており、その内容は参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【０２９５】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む本開示のポリリボヌクレオチド（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））は、センサー配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、センサー配列はｍｉＲＮＡ結合部位である。
【０２９６】
ｍｉＲＮＡは、ポリリボヌクレオチドに結合し、ポリリボヌクレオチドの安定性を低下させるか、ポリリボヌクレオチドの翻訳を阻害することにより、遺伝子発現を下方制御する１９〜２５ヌクレオチドの長さの非コードＲＮＡである。ｍｉＲＮＡ配列は、「シード」領域、すなわち、成熟ｍｉＲＮＡの位置２〜８の領域内の配列を含む。ｍｉＲＮＡシードは、成熟ｍｉＲＮＡの位置２〜８または２〜７を含むことができる。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡシードは７ヌクレオチド（例えば、成熟ｍｉＲＮＡのヌクレオチド２〜８）を含むことができ、対応するｍｉＲＮＡ結合部位のシード相補部位は、ｍｉＲＮＡの位置１とは反対のアデノシン（Ａ）が隣接している。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡシードは６ヌクレオチド（例えば、成熟ｍｉＲＮＡのヌクレオチド２〜７）を含むことができ、対応するｍｉＲＮＡ結合部位のシード相補部位は、ｍｉＲＮＡの位置１とは反対のアデノシン（Ａ）が隣接している。例えば、Ｇｒｉｍｓｏｎ  Ａ，  Ｆａｒｈ  ＫＫ，  Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ＷＫ，  Ｇａｒｒｅｔｔ−Ｅｎｇｅｌｅ  Ｐ，  Ｌｉｍ  ＬＰ，  Ｂａｒｔｅｌ  ＤＰ；Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．  ２００７  Ｊｕｌ  ６；２７（ｌ）：９１−１０５を参照されたい。標的細胞または組織のｍｉＲＮＡプロファイリングを行って、細胞または組織内のｍｉＲＮＡの有無を判断できる。いくつかの実施形態では、本開示のポリリボヌクレオチド（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））は、１つ以上のマイクロＲＮＡ標的配列、マイクロＲＮＡ配列、またはマイクロＲＮＡシードを含む。そのような配列は、米国特許公開第２００５／０２６１２１８号及び米国特許公開第２００５／００５９００５号に教示されているものなどの任意の公知のマイクロＲＮＡに対応することができ、そのそれぞれの内容は参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【０２９７】
本明細書で使用する場合、「マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲ）結合部位」という用語は、ｍｉＲＮＡと相互作用、結合、または結合するためのｍｉＲＮＡの全てまたは領域に対する十分な相補性を有する、５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲを含む、ポリリボヌクレオチド内、例えばＤＮＡ内またはＲＮＡ転写物内の配列を指す。いくつかの実施形態では、ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む本開示のポリリボヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ結合部位をさらに含む。例示的な実施形態では、ポリリボヌクレオチドの５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲ（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））は、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。
【０２９８】
ｍｉＲＮＡに対して十分な相補性を有するｍｉＲＮＡ結合部位は、ポリリボヌクレオチドのｍｉＲＮＡ媒介調節、例えばポリリボヌクレオチドのｍｉＲＮＡ媒介翻訳抑制または分解を促進するのに十分な程度の相補性を指す。本開示の例示的な態様において、ｍｉＲＮＡに対して十分な相補性を有するｍｉＲＮＡ結合部位は、ポリリボヌクレオチドのｍｉＲＮＡ媒介分解、例えば、ｍＲＮＡの、ｍｉＲＮＡ誘導ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲｌＳＣ）媒介切断を促進するのに十分な程度の相補性を指す。ｍｉＲＮＡ結合部位は、例えば、１９〜２５ヌクレオチドｍｉＲＮＡ配列、１９〜２３ヌクレオチドｍｉＲＮＡ配列、または２２ヌクレオチドｍｉＲＮＡ配列に対して相補性を有し得る。ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡの一部のみ、例えば、天然に存在するｍｉＲＮＡ配列の全長の１、２、３、または４ヌクレオチド未満の部分のみに相補的であり得る。所望の調節がｍＲＮＡ分解であるとき、全部または完全な相補性（例えば、天然に存在するｍｉＲＮＡの長さの全てまたはかなりの部分にわたる全部の相補性または完全な相補性）が好ましい。
【０２９９】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位には、ｍｉＲＮＡシード配列との相補性（例えば、部分的または完全な相補性）を有する配列が含まれる。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位には、ｍｉＲＮＡシード配列と完全な相補性を有する配列が含まれる。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位には、ｍｉＲＮＡ配列と相補性（部分的または完全な相補性など）を有する配列が含まれる。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位には、ｍｉＲＮＡ配列と完全な相補性を有する配列が含まれる。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位はｍｉＲＮＡ配列と完全な相補性を有するが、１、２、または３ヌクレオチドの置換、末端付加、及び／または短縮化がある。
【０３００】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡと同一の長さである。他の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、５’末端、３’末端、またはその両方で、対応するｍｉＲＮＡよりも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２ヌクレオチド（複数可）短い。さらに他の実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位は、５’末端、３’末端、またはその両方で、対応するマイクロＲＮＡよりも２ヌクレオチド短い。対応するｍｉＲＮＡよりも短いｍｉＲＮＡ結合部位は、１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位を取り込んだｍＲＮＡを分解したり、ｍＲＮＡの翻訳を妨げたりすることがなおも可能である。
【０３０１】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ダイサーを含む活性ＲＩＳＣの一部である対応する成熟ｍｉＲＮＡに結合する。別の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位のＲＩＳＣ内の対応するｍｉＲＮＡへの結合は、ｍｉＲＮＡ結合部位を含むｍＲＮＡを分解するか、またはｍＲＮＡが翻訳されるのを防ぐ。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位はｍｉＲＮＡと十分な相補性を持っているため、ｍｉＲＮＡを含むＲＩＳＣ複合体はｍｉＲＮＡ結合部位を含むポリリボヌクレオチドを切断する。他の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は不完全な相補性を有するため、ｍｉＲＮＡを含むＲＩＳＣ複合体は、ｍｉＲＮＡ結合部位を含むポリリボヌクレオチドの不安定性を誘発する。別の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は不完全な相補性を持っているため、ｍｉＲＮＡを含むＲＩＳＣ複合体はｍｉＲＮＡ結合部位を含むポリリボヌクレオチドの転写を抑制する。
【０３０２】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡから１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２のミスマッチ（複数可）を有する。
【０３０３】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡの少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、または少なくとも約２１の連続したヌクレオチドのそれぞれに相補的な、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、または少なくとも約２１の連続したヌクレオチドを有する。
【０３０４】
１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位を本開示のポリリボヌクレオチド内に改変することにより、問題のｍｉＲＮＡが利用可能であれば、ポリリボヌクレオチドを分解または翻訳の減少の標的とすることができる。これにより、ポリリボヌクレオチドの送達時のオフターゲット効果を減らすことができる。例えば、本開示のポリリボヌクレオチドが組織または細胞に送達されることを意図していないが、そこで終わる場合、その組織または細胞に豊富なｍｉＲＮＡは、１つ以上のｍｉＲＮＡの結合部位がポリリボヌクレオチドの５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲに入れるよう改変されている場合、目的の遺伝子の発現を阻害し得る。
【０３０５】
逆に、ｍｉＲＮＡ結合部位は、特定の組織でのタンパク質発現を増加させるために、天然に存在するポリリボヌクレオチド配列から削除できる。例えば、特定のｍｉＲＮＡの結合部位をポリリボヌクレオチドから除去して、ｍｉＲＮＡを含む組織または細胞のタンパク質発現を改善することができる。
【０３０６】
いくつかの実施形態では、本開示のポリリボヌクレオチドは、正常及び／またはがん性細胞などであるが、これらに限定されない特定の細胞に細胞傷害性または細胞保護性ｍＲＮＡ治療薬を誘導するために、５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲに少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位を含むことができる。別の実施形態では、本開示のポリリボヌクレオチドは、正常及び／またはがん性細胞などであるが、これらに限定されない特定の細胞に細胞傷害性または細胞保護性ｍＲＮＡ治療薬を誘導するために、５’−ＵＴＲ及び／または３’−ＵＴＲに２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のｍｉＲＮＡ結合部位を含むことができる。
【０３０７】
複数の組織での発現の調節は、１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位の導入または除去によって実現できる。ｍｉＲＮＡ結合部位を除去または挿入するかどうかの決定は、ｍｉＲＮＡ発現パターン及び／または疾患におけるプロファイリングに基づいて行うことができる。ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ結合部位、ならびにそれらの発現パターン及び生物学における役割の同定が報告されている（例えば、Ｂｏｎａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ２０１０  １１：９４３−９４９；Ａｎａｎｄ  ａｎｄ  Ｃｈｅｒｅｓｈ  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ２０１１  １８：１７１−１７６；Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ  ａｎｄ  Ｒａｏ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ２０１２  ２６：４０４−４１３（２０１１  Ｄｅｃ  ２０．  ｄｏｉ：  １０．１０３８／ｌｅｕ．２０１１．３５６）；Ｂａｒｔｅｌ  Ｃｅｌｌ  ２００９  １３６：２１５−２３３；Ｌａｎｄｇｒａｆ  ｅｔ  ａｌ，  Ｃｅｌｌ，  ２００７  １２９：１４０１−１４１４；Ｇｅｎｔｎｅｒ  ａｎｄ  Ｎａｌｄｉｎｉ，  Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ．  ２０１２  ８０：３９３−４０３、及びそれらの中の引用；それぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０３０８】
ｍｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ結合部位は、米国公開第２０１４／０２００２６１号、同第２００５／０２６１２１８号、及び同第２００５／００５９００５号に記載された非限定的な例を含む、任意の公知の配列に対応することができ、これらはそれぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０３０９】
ｍｉＲＮＡがｍＲＮＡを制御し、それによりタンパク質発現を行うことが知られている組織の例には、肝臓（ｍｉＲ−１２２）、筋肉（ｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２０８）、内皮細胞（ｍｉＲ−１７−９２、ｍｉＲ−１２６）、骨髄細胞（ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２７）、脂肪組織（ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−３０ｃ）、心臓（ｍｉＲ−ｌｄ、ｍｉＲ−１４９）、腎臓（ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−２０４）、及び肺上皮細胞（ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−１２６）が含まれるが、これらに限定されない。
【０３１０】
具体的には、ｍｉＲＮＡは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、樹状細胞及びマクロファージ）、マクロファージ、単球、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、顆粒球、ナチュラルキラーなどの免疫細胞（造血細胞とも呼ばれる）で差次的に発現することが知られている。免疫細胞特異的ｍｉＲＮＡは、免疫原性、自己免疫、感染に対する免疫反応、炎症、ならびに遺伝子治療及び組織／臓器移植後の望ましくない免疫応答に関与している。免疫細胞固有のｍｉＲＮＡは、造血細胞（免疫細胞）の発生、増殖、分化、及びアポトーシスの多くの側面も制御する。例えば、ｍｉＲ−１４２及びｍｉＲ−１４６は免疫細胞でのみ発現し、特に骨髄樹状細胞で豊富である。ｍｉＲ−１４２結合部位をポリリボヌクレオチドの３’−ＵＴＲに付加することにより、ポリリボヌクレオチドに対する免疫応答を遮断できることが実証されており、組織及び細胞内でのより安定した遺伝子導入が可能になる。ｍｉＲ−１４２は、抗原提示細胞の外因性ポリリボヌクレオチドを効率的に分解し、形質導入細胞の細胞傷害性除去を抑制する（例えば、Ａｎｎｏｎｉ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，  ｂｌｏｏｄ，  ２００９，  １１４，  ５１５２−５１６１；Ｂｒｏｗｎ  ＢＤ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  ｍｅｄ．  ２００６，  １２（５），  ５８５−５９１；Ｂｒｏｗｎ  ＢＤ，  ｅｔ  ａｌ．，  ｂｌｏｏｄ，  ２００７，  １１０（１３）：  ４１４４−４１５２、それらのそれぞれは参照により本明細書に組み込まれる）。
【０３１１】
抗原媒介性免疫応答とは、外来抗原によって誘発される免疫応答を指し、外来抗原は、生物に侵入すると、抗原提示細胞によって処理され、抗原提示細胞の表面に表示される。Ｔ細胞は提示された抗原を認識し、抗原を発現する細胞の細胞傷害性排除を誘導できる。
【０３１２】
本開示のポリリボヌクレオチドの５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲにｍｉＲ−１４２結合部位を導入すると、ｍｉＲ−１４２を介した分解により抗原提示細胞の遺伝子発現を選択的に抑制し、抗原提示細胞（例えば樹状細胞）の抗原提示を制限でき、それによりポリリボヌクレオチドの送達後の抗原媒介性免疫応答を防ぐ。ポリリボヌクレオチドは、細胞傷害性除去を誘発することなく、標的組織または細胞で安定して発現する。
【０３１３】
いくつかの実施形態では、免疫細胞、抗原提示細胞で発現することが知られているｍｉＲＮＡの結合部位は、本開示のポリリボヌクレオチドに入れるよう改変され、ｍｉＲＮＡ媒介ＲＮＡ分解により抗原提示細胞のポリリボヌクレオチドの発現を抑制し、抗原媒介性免疫応答を抑制することができる。ポリリボヌクレオチドの発現は、免疫細胞特異的なｍｉＲＮＡが発現しない非免疫細胞で維持される。例えば、いくつかの実施形態では、肝臓特異的タンパク質に対する免疫原性反応を防ぐために、ｍｉＲ−１２２結合部位を除去し、ｍｉＲ−１４２（及び／またはｍｉｒＲ−１４６）結合部位を、本開示のポリリボヌクレオチドの５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲへと入れるよう改変することができる。
【０３１４】
ＡＰＣ及びマクロファージの選択的分解及び抑制をさらに促進するために、本開示のポリリボヌクレオチドは、単独であるいはｍｉＲ−１４２及び／またはｍｉＲ−１４６結合部位と組み合わせて、５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲにさらなる負の調節エレメントを含むことができる。非限定的な例として、さらなる負の調節エレメントは、構成的減衰エレメント（ＣＤＥ）である。
【０３１５】
免疫細胞特異的ｍｉＲＮＡには、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−２−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−３ｐ、ｈｓａ−７ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｃ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ−５ｐ、ｍｉＲ−１０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１１８４、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−ｌ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−２−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−１−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１２７９、ｍｉＲ−１３０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１３２−３ｐ、ｍｉＲ−１３２−５ｐ、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１４３−３ｐ、ｍｉＲ−１４３−５ｐ、ｍｉＲ−１４６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１４６ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１４７ａ、ｍｉＲ−１４７ｂ、ｍｉＲ−１４８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５０−３ｐ、ｍｉＲ−１５０−５ｐ、ｍｉＲ−１５１ｂ、ｍｉＲ−１５５−３ｐ、ｍｉＲ−１５５−５ｐ、ｍｉＲ−１５ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１５ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１６−１−３ｐ、ｍｉＲ−１６−２−３ｐ、ｍｉＲ−１６−５ｐ、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ａ−２−３ｐ、ｍｉＲ−１８２−３ｐ、ｍｉＲ−１８２−５ｐ、ｍｉＲ−１９７−３ｐ、ｍｉＲ−１９７−５ｐ、ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｍｉＲ−２１−３ｐ、ｍｉＲ−２１４−３ｐ、ｍｉＲ−２１４−５ｐ、ｍｉＲ−２２３−３ｐ、ｍｉＲ−２２３−５ｐ、ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｍｉＲ−２２１−５ｐ、ｍｉＲ−２３ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２３ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２４−１−５ｐ、ｍｉＲ−２４−２−５ｐ、ｍｉＲ−２４−３ｐ、ｍｉＲ−２６ａ−１−３ｐ、ｍｉＲ−２６ａ−２−３ｐ、ｍｉＲ−２６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２６ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２７ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２８−３ｐ、ｍｉＲ−２８−５ｐ、ｍｉＲ−２９０９、ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｂ−１−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｂ−２−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−２９ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−３３１−５ｐ、ｍｉＲ−３３９−３ｐ、ｍｉＲ−３３９−５ｐ、ｍｉＲ−３４５−３ｐ、ｍｉＲ−３４５−５ｐ、ｍｉＲ−３４６、ｍｉＲ−３４ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３６３−３ｐ、ｍｉＲ−３６３−５ｐ、ｍｉＲ−３７２、ｍｉＲ−３７７−３ｐ、ｍｉＲ−３７７−５ｐ、ｍｉＲ−４９３−３ｐ、ｍｉＲ−４９３−５ｐ、ｍｉＲ−５４２、ｍｉＲ−５４８ｂ−５ｐ、ｍｉＲ５４８ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−５４８ｉ、ｍｉＲ−５４８ｊ、ｍｉＲ−５４８ｎ、ｍｉＲ−５７４−３ｐ、ｍｉＲ−５９８、ｍｉＲ−７１８、ｍｉＲ−９３５、ｍｉＲ−９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−９９ｂ−３ｐ、及びｍｉＲ−９９ｂ−５ｐが含まれるが、これらに限定されない。さらに、マイクロアレイハイブリダイゼーション及びミクロトーム分析により免疫細胞で新規ｍｉＲＮＡを同定することができる（例えば、Ｊｉｍａ  ＤＤ  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｌｏｏｄ，  ２０１０，  １１６：ｅｌ  １８−ｅｌ２７；Ｖａｚ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，  ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，  ２０１０，  １１，２８８、それぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０３１６】
肝臓で発現することが知られているｍｉＲＮＡには、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−１２２−３ｐ、ｍｉＲ−１２２−５ｐ、ｍｉＲ−１２２８−３ｐ、ｍｉＲ−１２２８−５ｐ、ｍｉＲ−１２４９、ｍｉＲ−１２９−５ｐ、ｍｉＲ−１３０３、ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５１ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１５２、ｍｉＲ−１９４−３ｐ、ｍｉＲ−１９４−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２９６−５ｐ、ｍｉＲ−５５７、ｍｉＲ−５８１、ｍｉＲ−９３９−３ｐ、及びｍｉＲ−９３９−５ｐが含まれるが、これらに限定されない。任意の肝臓特異的ｍｉＲＮＡからのｍｉＲＮＡ結合部位を本開示のポリリボヌクレオチドに導入またはそこから除去して、肝臓におけるポリリボヌクレオチドの発現を調節することができる。肝臓特異的ｍｉＲＮＡ結合部位は、単独で、または本開示のポリリボヌクレオチド中の免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位とさらに組み合わせて改変することができる。
【０３１７】
肺で発現することが知られているｍｉＲＮＡには、ｌｅｔ−７ａ−２−３ｐ、ｌｅｔ−７ａ−３ｐ、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１２６−３ｐ、ｍｉＲ−１２６−５ｐ、ｍｉＲ−１２７−３ｐ、ｍｉＲ−１２７−５ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１３０ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１３０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１３３ｂ、ｍｉＲ−１３４、ｍｉＲ−１８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１８ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１８ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２４−１−５ｐ、ｍｉＲ−２４−２−５ｐ、ｍｉＲ−２４−３ｐ、ｍｉＲ−２９６−３ｐ、ｍｉＲ−２９６−５ｐ、ｍｉＲ−３２−３ｐ、ｍｉＲ−３３７−３ｐ、ｍｉＲ−３３７−５ｐ、ｍｉＲ−３８１−３ｐ、及びｍｉＲ−３８１−５ｐが含まれるが、これらに限定されない。任意の肺特異的ｍｉＲＮＡからのｍｉＲＮＡ結合部位を本開示のポリリボヌクレオチドに導入またはそこから除去して、肺におけるポリリボヌクレオチドの発現を調節することができる。肺特異的ｍｉＲＮＡ結合部位は、単独で、または本開示のポリリボヌクレオチド中の免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位とさらに組み合わせて改変することができる。
【０３１８】
心臓で発現することが知られているｍｉＲＮＡには、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１３３ｂ、ｍｉＲ−１４９−３ｐ、ｍｉＲ−１４９−５ｐ、ｍｉＲ−１８６−３ｐ、ｍｉＲ−１８６−５ｐ、ｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２９６−３ｐ、ｍｉＲ−３２０、ｍｉＲ−４５１ａ、ｍｉＲ−４５１ｂ、ｍｉＲ−４９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−４９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４９９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−４９９ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−７４４−３ｐ、ｍｉＲ−７４４−５ｐ、ｍｉＲ−９２ｂ−３ｐ、及びｍｉＲ−９２ｂ−５ｐが含まれるが、これらに限定されない。任意の心臓特異的マイクロＲＮＡからのｍｉＲＮＡ結合部位を本開示のポリリボヌクレオチドに導入またはそこから除去して、心臓におけるポリリボヌクレオチドの発現を調節することができる。心臓特異的ｍｉＲＮＡ結合部位は、単独で、または本開示のポリリボヌクレオチド中の免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位とさらに組み合わせて改変することができる。
【０３１９】
神経系で発現することが知られているｍｉＲＮＡには、ｍｉＲ−１２４−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−１−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１２７１−３ｐ、ｍｉＲ−１２７１−５ｐ、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１３２−５ｐ、ｍｉＲ−１３５ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１３５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１３５ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１３５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−１３９−５ｐ、ｍｉＲ−１３９−３ｐ、ｍｉＲ−１４９−３ｐ、ｍｉＲ−１４９−５ｐ、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−１８１ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−１８１ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−１８３−３ｐ、ｍｉＲ−１８３−５ｐ、ｍｉＲ−１９０ａ、ｍｉＲ−１９０ｂ、ｍｉＲ−２１２−３ｐ、ｍｉＲ−２１２−５ｐ、ｍｉＲ−２１９−１−３ｐ、ｍｉＲ−２１９−２−３ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−１−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−２−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐ、ｍｉＲ−３２９、ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｍｉＲ−３６６５、ｍｉＲ−３６６６、ｍｉＲ−３８０−３ｐ、ｍｉＲ−３８０−５ｐ、ｍｉＲ−３８３、ｍｉＲ−４１０、ｍｉＲ−４２５−３ｐ、ｍｉＲ−４２５−５ｐ、ｍｉＲ−４５４−３ｐ、ｍｉＲ−４５４−５ｐ、ｍｉＲ−４８３、ｍｉＲ−５１０、ｍｉＲ−５１６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−５４８ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−５４８ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−５７１、ｍｉＲ−７−１−３ｐ、ｍｉＲ−７−２−３ｐ、ｍｉＲ−７−５ｐ、ｍｉＲ−８０２、ｍｉＲ−９２２、ｍｉＲ−９−３ｐ、及びｍｉＲ−９−５ｐが含まれるが、これらに限定されない。神経系において豊富なｍｉＲＮＡには、ｍｉＲ−１３２−３ｐ、ｍｉＲ−１３２−３ｐ、ｍｉＲ−１４８ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１４８ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５１ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２１２−３ｐ、ｍｉＲ−２１２−５ｐ、ｍｉＲ−３２０ｂ、ｍｉＲ−３２０ｅ、ｍｉＲ−３２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３２３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３２４−５ｐ、ｍｉＲ−３２５、ｍｉＲ−３２６、ｍｉＲ−３２８、ｍｉＲ−９２２を含むがこれらに限定されないニューロンに特異的に発現するもの、ならびにｍｉＲ−１２５０、ｍｉＲ−２１９−１−３ｐ、ｍｉＲ−２１９−２−３ｐ、ｍｉＲ−２１９−５ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０６５−３ｐ、ｍｉＲ−３０６５−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−３２−５ｐ、ｍｉＲ−３３８−５ｐ、及びｍｉＲ−６５７を含むがこれらに限定されないグリア細胞で特異的に発現するものがさらに含まれる。任意のＣＮＳ特異的ｍｉＲＮＡからのｍｉＲＮＡ結合部位を本開示のポリリボヌクレオチドに導入またはそこから除去して、神経系におけるポリリボヌクレオチドの発現を調節することができる。神経系特異的ｍｉＲＮＡ結合部位は、単独で、または本開示のポリリボヌクレオチド中の免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位とさらに組み合わせて改変することができる。
【０３２０】
膵臓で発現することが知られているｍｉＲＮＡには、ｍｉＲ−１０５−３ｐ、ｍｉＲ−１０５−５ｐ、ｍｉＲ−１８４、ｍｉＲ−１９５−３ｐ、ｍｉＲ−１９５−５ｐ、ｍｉＲ−１９６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２１４−３ｐ、ｍｉＲ−２１４−５ｐ、ｍｉＲ−２１６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２１６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３７５、ｍｉＲ−７−１−３ｐ、ｍｉＲ−７−２−３ｐ、ｍｉＲ−４９３−３ｐ、ｍｉＲ−４９３−５ｐ、及びｍｉＲ−９４４が含まれるが、これらに限定されない。任意の膵臓特異的ｍｉＲＮＡからのｍｉＲＮＡ結合部位を本開示のポリリボヌクレオチドに導入またはそこから除去して、膵臓におけるポリリボヌクレオチドの発現を調節することができる。膵臓特異的ｍｉＲＮＡ結合部位は、単独で、または本開示のポリリボヌクレオチド中の免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位とさらに組み合わせて改変することができる。
【０３２１】
腎臓で発現することが知られているｍｉＲＮＡには、ｍｉＲ−１２２−３ｐ、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１９２−３ｐ、ｍｉＲ−１９２−５ｐ、ｍｉＲ−１９４−３ｐ、ｍｉＲ−１９４−５ｐ、ｍｉＲ−２０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２０４−３ｐ、ｍｉＲ−２０４−５ｐ、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２１６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２１６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２９６−３ｐ、ｍｉＲ−３０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−１−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−２−３ｐ、ｍｉＲ３０ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３２４−３ｐ、ｍｉＲ−３３５−３ｐ、ｍｉＲ−３３５−５ｐ、ｍｉＲ−３６３−３ｐ、ｍｉＲ−３６３−５ｐ、及びｍｉＲ−５６２が含まれるが、これらに限定されない。任意の腎臓特異的ｍｉＲＮＡからのｍｉＲＮＡ結合部位を本開示のポリリボヌクレオチドに導入またはそこから除去して、腎臓におけるポリリボヌクレオチドの発現を調節することができる。腎臓特異的ｍｉＲＮＡ結合部位は、単独で、または本開示のポリリボヌクレオチド中の免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位とさらに組み合わせて改変することができる。
【０３２２】
筋肉で発現することが知られているｍｉＲＮＡには、ｌｅｔ−７ｇ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｇ−５ｐ、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１２８６、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１３３ｂ、ｍｉＲ−１４０−３ｐ、ｍｉＲ−１４３−３ｐ、ｍｉＲ−１４３−５ｐ、ｍｉＲ−１４５−３ｐ、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−１８８−３ｐ、ｍｉＲ−１８８−５ｐ、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、ｍｉＲ−２５−３ｐ、及びｍｉＲ−２５−５ｐが含まれるが、これらに限定されない。任意の筋肉特異的ｍｉＲＮＡからのｍｉＲＮＡ結合部位を本開示のポリリボヌクレオチドに導入またはそこから除去して、筋肉におけるポリリボヌクレオチドの発現を調節することができる。筋肉特異的ｍｉＲＮＡ結合部位は、単独で、または本開示のポリリボヌクレオチド中の免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位とさらに組み合わせて改変することができる。
【０３２３】
ｍｉＲＮＡは、内皮細胞、上皮細胞、脂肪細胞を含むがこれらに限定されない様々なタイプの細胞でも差次的に発現する。
【０３２４】
内皮細胞で発現することが知られているｍｉＲＮＡには、ｌｅｔ−７ｂ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１００−３ｐ、ｍｉＲ−１００−５ｐ、ｍｉＲ−１０１−３ｐ、ｍｉＲ−１０１−５ｐ、ｍｉＲ−１２６−３ｐ、ｍｉＲ−１２６−５ｐ、ｍｉＲ−１２３６−３ｐ、ｍｉＲ−１２３６−５ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１７−３ｐ、ｍｉＲ−１８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９ｂ−１−５ｐ、ｍｉＲ−１９ｂ−２−５ｐ、ｍｉＲ−１９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２１−３ｐ、ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｍｉＲ−２２１−５ｐ、ｍｉＲ−２２２−３ｐ、ｍｉＲ−２２２−５ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２９６−５ｐ、ｍｉＲ−３６１−３ｐ、ｍｉＲ−３６１−５ｐ、ｍｉＲ−４２１、ｍｉＲ−４２４−３ｐ、ｍｉＲ−４２４−５ｐ、ｍｉＲ−５１３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−９２ａ−１−５ｐ、ｍｉＲ−９２ａ−２−５ｐ、ｍｉＲ−９２ａ−３ｐ、ｍｉＲ−９２ｂ−３ｐ、及びｍｉＲ−９２ｂ−５ｐが含まれるが、これらに限定されない。多くの新規ｍｉＲＮＡは、ディープシークエンシング解析から内皮細胞において発見されている（例えば、Ｖｏｅｌｌｅｎｋｌｅ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，  ＲＮＡ，  ２０１２，  １８，  ４７２−４８４、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。任意の内皮細胞特異的ｍｉＲＮＡからのｍｉＲＮＡ結合部位を本開示のポリリボヌクレオチドに導入またはそこから除去して、内皮細胞におけるポリリボヌクレオチドの発現を調節することができる。
【０３２５】
上皮細胞で発現することが知られているｍｉＲＮＡには、ｌｅｔ−７ｂ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１２４６、ｍｉＲ−２００ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２００ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２００ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２００ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２００ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−２００ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３３８−３ｐ、ｍｉＲ−４２９、ｍｉＲ−４５１ａ、ｍｉＲ−４５１ｂ、ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−８０２及びｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３４ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３４ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−４４９ａ、ｍｉＲ−４４９ｂ−３ｐ、呼吸器繊毛上皮細胞に特異的なｍｉＲ−４４９ｂ−５ｐ、ｌｅｔ−７ファミリー、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１３３ｂ、肺上皮細胞に特異的なｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−３８２−３ｐ、腎上皮細胞に特異的なｍｉＲ−３８２−５ｐ、角膜上皮細胞に特異的なｍｉＲ−７６２が含まれるが、これらに限定されない。任意の上皮細胞特異的ｍｉＲＮＡからのｍｉＲＮＡ結合部位を本開示のポリリボヌクレオチドに導入またはそこから除去して、上皮細胞におけるポリリボヌクレオチドの発現を調節することができる。
【０３２６】
さらに、ｍｉＲＮＡの大規模な群は胚性幹細胞に富んでおり、幹細胞の自己再生、ならびに神経細胞、心臓、造血細胞、皮膚細胞、骨形成細胞、及び筋肉細胞などの様々な細胞系統の発生及び／または分化を制御する（例えば、Ｋｕｐｐｕｓａｍｙ  ＫＴ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ，  ２０１３，  １３（５），  ７５７−７６４；Ｖｉｄｉｇａｌ  ＪＡ  ａｎｄ  Ｖｅｎｔｕｒａ  Ａ，  Ｓｅｍｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．  ２０１２，  ２２（５−６），  ４２８−４３６；Ｇｏｆｆ  ＬＡ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２００９，  ４：ｅ７１９２；Ｍｏｒｉｎ  ＲＤ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ，２００８，１８，  ６１０−６２１；Ｙｏｏ  ＪＫ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ．  ２０１２，  ２１（１１），  ２０４９−２０５７、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。胚性幹細胞に豊富なｍｉＲＮＡには、ｌｅｔ−７ａ−２−３ｐ、ｌｅｔ−ａ−３ｐ、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｌｅｔ７ｄ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｄ−５ｐ、ｍｉＲ−１０３ａ−２−３ｐ、ｍｉＲ−１０３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１０６ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１０６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１２４６、ｍｉＲ−１２７５、ｍｉＲ−１３８−１−３ｐ、ｍｉＲ−１３８−２−３ｐ、ｍｉＲ−１３８−５ｐ、ｍｉＲ−１５４−３ｐ、ｍｉＲ−１５４−５ｐ、ｍｉＲ−２００ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−２００ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−２９０、ｍｉＲ−３０１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３０１ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０２ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３０２ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０２ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−３０２ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３０２ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−３０２ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３０２ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−３０２ｄ−５ｐ、ｍｉＲ−３０２ｅ、ｍｉＲ−３６７−３ｐ、ｍｉＲ−３６７−５ｐ、ｍｉＲ−３６９−３ｐ、ｍｉＲ−３６９−５ｐ、ｍｉＲ−３７０、ｍｉＲ−３７１、ｍｉＲ−３７３、ｍｉＲ−３８０−５ｐ、ｍｉＲ−４２３−３ｐ、ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｍｉＲ−４８６−５ｐ、ｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−５４８ｅ、ｍｉＲ−５４８ｆ、ｍｉＲ−５４８ｇ−３ｐ、ｍｉＲ−５４８ｇ−５ｐ、ｍｉＲ−５４８ｉ、ｍｉＲ−５４８ｋ、ｍｉＲ−５４８ｌ、ｍｉＲ−５４８ｍ、ｍｉＲ−５４８ｎ、ｍｉＲ−５４８ｏ−３ｐ、ｍｉＲ−５４８ｏ−５ｐ、ｍｉＲ−５４８ｐ、ｍｉＲ−６６４ａ−３ｐ、ｍｉＲ−６６４ａ−５ｐ、ｍｉＲ−６６４ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−６６４ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−７６６−３ｐ、ｍｉＲ−７６６−５ｐ、ｍｉＲ−８８５−３ｐ、ｍｉＲ−８８５−５ｐ、ｍｉＲ−９３−３ｐ、ｍｉＲ−９３−５ｐ、ｍｉＲ−９４１、ｍｉＲ−９６−３ｐ、ｍｉＲ−９６−５ｐ、ｍｉＲ−９９ｂ−３ｐ及びｍｉＲ−９９ｂ−５ｐが含まれるが、これらに限定されない。予測される多くの新規ｍｉＲＮＡは、ヒト胚性幹細胞のディープシークエンシングによって発見される（例えば、Ｍｏｒｉｎ  ＲＤ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ，２００８，１８，  ６１０−６２１；Ｇｏｆｆ  ＬＡ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，  ２００９，  ４：ｅ７１９２；Ｂａｒ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ，  ２００８，  ２６，  ２４９６−２５０５、これらのそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）���
【０３２７】
いくつかの実施形態では、胚性幹細胞特異的ｍｉＲＮＡの結合部位は、本開示のポリリボヌクレオチドの３’ＵＴＲに含まれるか、またはそこから除去されて、胚性幹細胞の発生及び／または分化を調節し、変性状態（例えば、変性疾患）での幹細胞の老化を阻害し、あるいは疾患状態の幹細胞（例えば、がん幹細胞）の老化及びアポトーシスを刺激することができる。
【０３２８】
多くのｍｉＲＮＡ発現研究は、様々ながん細胞／組織及びその他の疾患でのｍｉＲＮＡの差次的発現をプロファイルするために実施される。いくつかのｍｉＲＮＡは特定のがん細胞で異常に過剰発現し、他のｍｉＲＮＡは過少発現している。例えば、ｍｉＲＮＡは、がん細胞において（ＷＯ２００８／１５４０９８、ＵＳ２０１３／００５９０１５、ＵＳ２０１３／００４２３３３、ＷＯ２０１１／１５７２９４）；がん幹細胞において（ＵＳ２０１２／００５３２２４）；膵臓癌及び疾患において（ＵＳ２００９／０１３１３４８、ＵＳ２０１１／０１７１６４６、ＵＳ２０１０／０２８６２３２、ＵＳ８３８９２１０）；喘息及び炎症において（ＵＳ８４１５０９６）；前立腺癌において（ＵＳ２０１３／００５３２６４）；肝細胞癌において（ＷＯ２０１２／１５１２１２、ＵＳ２０１２／０３２９６７２、ＷＯ２００８／０５４８２８、ＵＳ８２５２５３８）；胚細胞癌において（ＷＯ２０１１／０７６１４３、ＷＯ２０１３／０３３６４０、ＷＯ２００９／０７０６５３、ＵＳ２０１０／０３２３３５７）；皮膚Ｔ細胞リンパ腫において（ＷＯ２０１３／０１１３７８）；大腸癌細胞において（ＷＯ２０１１／０２８１７５６、ＷＯ２０１１／０７６１４２）；がん陽性リンパ節において（ＷＯ２００９／１００４３０、ＵＳ２００９／０２６３８０３）；上咽頭癌において（ＥＰ２１１２２３５）；慢性閉塞性肺疾患において（ＵＳ２０１２／０２６４６２６、ＵＳ２０１３／００５３２６３）；甲状腺癌において（ＷＯ２０１３／０６６６７８）；卵巣癌細胞において（ＵＳ２０１２／０３０９６４５、ＷＯ２０１１／０９５６２３）；乳癌細胞において（ＷＯ２００８／１５４０９８、ＷＯ２００７／０８１７４０、ＵＳ２０１２／０２１４６９９）、白血病及びリンパ腫において（ＷＯ２００８／０７３９１５、ＵＳ２００９／００９２９７４、ＵＳ２０１２／０３１６０８１、ＵＳ２０１２／０２８３３１０、ＷＯ２０１０／０１８５６３）差次的に発現しており、そのそれぞれの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０３２９】
非限定的な例として、特定の癌及び／または腫瘍細胞で過剰発現するｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ結合部位は、本開示のポリリボヌクレオチドの３’ＵＴＲから除去され、がん細胞において過剰発現したｍｉＲＮＡにより抑制された発現を回復することができ、したがって、例えば、転写刺激及び／または抑制、細胞周期停止、アポトーシス及び細胞死などの対応する生物学的機能を改善する。ｍｉＲＮＡの発現が上方制御されていない正常な細胞及び組織は、影響を受けない。
【０３３０】
ｍｉＲＮＡは、血管新生などの複雑な生物学的プロセスも調節できる（例えば、ｍｉＲ−１３２）（Ａｎａｎｄ  ａｎｄ  Ｃｈｅｒｅｓｈ  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ２０１１  １８：１７１−１７６）。本開示のポリリボヌクレオチドにおいて、ポリリボヌクレオチドの発現を生物学的に関連する細胞タイプまたは関連する生物学的プロセスに合わせるために、そのようなプロセスに関与するｍｉＲＮＡ結合部位を除去または導入することができる。これに関連して、本開示のポリリボヌクレオチドは栄養要求性ポリリボヌクレオチドとして定義される。
【０３３１】
ステムループ
ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、ヒストンステムループなどであるが、これに限定されないステムループを含み得る。ステムループは、参照により本明細書に組み込まれる国際特許公開ＷＯ２０１３／１０３６５９に記載されているものなどであるが、これらに限定されない約２５または約２６ヌクレオチドの長さのヌクレオチド配列であり得る。ヒストンステムループは、コード領域に対して３’に位置していてもよい（例えば、コード領域の３’末端に）。非限定的な例として、ステムループは、本明細書に記載のポリヌクレオチドの３’末端に位置してもよい。場合によっては、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、１つを超えるステムループ（例えば、２つのステムループ）を含む。ステムループ配列の例は、国際特許公開ＷＯ２０１２／０１９７８０及び同ＷＯ２０１５０２６６７に記載されており、そのステムループ配列は参照により本明細書に組み込まれる。場合によっては、ポリヌクレオチドはステムループ配列、ＣＡＡＡＧＧＣＴＣＴＴＴＴＣＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡ（配列番号１）を含む。他の場合では、ポリヌクレオチドはステムループ配列、ＣＡＡＡＧＧＣＵＣＵＵＵＵＣＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡ（配列番号２）を含む。
【０３３２】
ステムループは、ポリヌクレオチドの第２の末端領域に位置してもよい。非限定的な例として、ステムループは、第２の末端領域の非翻訳領域（例えば、３’−ＵＴＲ）内に位置してもよい。
【０３３３】
場合によっては、ヒストンステムループを含むｍＲＮＡなどであるが、これに限定されないポリヌクレオチドは、３’−安定化領域（例えば、少なくとも１つの鎖終結ヌクレオシドを含む３’−安定化領域）の付加により安定化され得る。理論に束縛されることを望まないが、少なくとも１つの鎖終結ヌクレオシドの付加は、ポリヌクレオチドの分解を遅延させることができ、したがってポリヌクレオチドの半減期を増加させることができる。
【０３３４】
他の場合では、ヒストンステムループを含むｍＲＮＡなどであるが、これに限定されないポリヌクレオチドは、オリゴ（Ｕ）の付加を防止及び／または阻害できるポリヌクレオチドの３’領域の変更により安定化され得る（例えば、国際特許公開ＷＯ２０１３／１０３６５９を参照されたい）。
【０３３５】
さらに他の場合では、ヒストンステムループを含むｍＲＮＡなどであるが、これに限定されないポリヌクレオチドは、３’−デオキシヌクレオシド、２’，３’−ジデオキシヌクレオシド、３’−Ｏ−メチルヌクレオシド、３’−Ｏ−エチルヌクレオシド、３’−アラビノシド、ならびに当該技術分野で公知の、及び／または本明細書に記載の他の代替ヌクレオシドで終結するオリゴヌクレオチドの付加により安定化され得る。
【０３３６】
場合によっては、本開示のポリヌクレオチドは、ヒストンステムループ、ポリＡ領域、及び／または５’キャップ構造を含み得る。ヒストンステムループは、ポリＡ領域の前及び／または後にあり得る。ヒストンステムループ及びポリＡ領域配列を含むポリヌクレオチドは、本明細書に記載の鎖終結ヌクレオシドを含み得る。
【０３３７】
他の例では、本開示のポリヌクレオチドは、ヒストンステムループ、及び５’キャップ構造を含み得る。５’キャップ構造は、本明細書に記載のもの及び／または当該技術分野で公知のものを含むことができるが、これらに限定されない。
【０３３８】
場合によっては、保存されたステムループ領域は、本明細書に記載のｍｉＲ配列を含んでもよい。非限定的な例として、ステムループ領域は、本明細書に記載のｍｉＲ配列のシード配列を含み得る。別の非限定的な例では、ステムループ領域はｍｉＲ−１２２シード配列を含んでもよい。
【０３３９】
特定の例において、保存されたステムループ領域は、本明細書に記載のｍｉＲ配列を含んでもよく、ＴＥＥ配列をも含んでもよい。
【０３４０】
場合によっては、ｍｉＲ配列及び／またはＴＥＥ配列を組み込むと、ステムループ領域の形状が変化し、翻訳が増加及び／または減少する場合がある。（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｅｄｄｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ａ  Ｐｕｍｉｌｉｏ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ＲＮＡ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｓｗｉｔｃｈ  ｉｎ  ｐ２７−３’ＵＴＲ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｍｉＲ−２２１  ａｎｄ  ｍｉＲ−  ２２  ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．  ２０１０を参照されたい）。
【０３４１】
ポリヌクレオチドは、少なくとも１つのヒストンステムループ及びポリＡ領域またはポリアデニル化シグナルを含み得る。少なくとも１つのヒストンステムループ及びポリＡ領域またはポリアデニル化シグナルをコードするポリヌクレオチド配列の非限定的な例は、国際特許公開ＷＯ２０１３／１２０４９７、同ＷＯ２０１３／１２０６２９、同ＷＯ２０１３／１２０５００、同ＷＯ２０１３／１２０６２７、同ＷＯ２０１３／１２０４９８、同ＷＯ２０１３／１２０６２６、同ＷＯ２０１３／１２０４９９及び同ＷＯ２０１３／１２０６２８に記載され、これらのそれぞれの配列は参照により本明細書に組み込まれる。ある特定の場合、ヒストンステムループ及びポリＡ領域またはポリアデニル化シグナルをコードするポリヌクレオチドは、国際特許公開ＷＯ２０１３／１２０４９９及び同ＷＯ２０１３／１２０６２８に記載されるポリヌクレオチド配列などの病原体抗原またはそのフラグメントをコードし得、この両方の配列は参照により本明細書に組み込まれる。他の場合、ヒストンステムループ及びポリＡ領域またはポリアデニル化シグナルをコードするポリヌクレオチドは、国際特許公開ＷＯ２０１３／１２０４９７及び同ＷＯ２０１３／１２０６２９に記載されるポリヌクレオチド配列などの治療用タンパク質をコードし得、この両方の配列は参照により本明細書に組み込まれる。場合によっては、ヒストンステムループ及びポリＡ領域またはポリアデニル化シグナルをコードするポリヌクレオチドは、国際特許公開ＷＯ２０１３／１２０５００及び同ＷＯ２０１３／１２０６２７に記載されるポリヌクレオチド配列などの腫瘍抗原またはそのフラグメントをコードし得、この両方の配列は参照により本明細書に組み込まれる。他の場合、ヒストンステムループ及びポリＡ領域またはポリアデニル化シグナルをコードするポリヌクレオチドは、国際特許公開ＷＯ２０１３／１２０４９８及び同ＷＯ２０１３／１２０６２６に記載されるポリヌクレオチド配列などのアレルゲン抗原または自己免疫自己抗原をコードし得、この両方の配列は参照により本明細書に組み込まれる。
【０３４２】
ポリＡ領域
ポリヌクレオチドまたは核酸（例えば、ｍＲＮＡ）は、ポリＡ配列及び／またはポリアデニル化シグナルを含み得る。ポリＡ配列は、完全にまたは大部分がアデニンヌクレオチドまたはその類似体もしくは誘導体から構成されていてもよい。ポリＡ配列は、核酸の３’非翻訳領域に隣接して位置する尾部であり得る。
【０３４３】
ＲＮＡの処理中、通常、アデノシンヌクレオチドの長鎖（ポリＡ領域）がメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子に付加されて、分子の安定性を高める。転写直後に、転写産物の３’末端が切断されて３’−ヒドロキシが遊離する。次いで、ポリＡポリメラーゼがアデノシンヌクレオチドの鎖をＲＮＡに付加する。このプロセスは、ポリアデニル化と呼ばれ、１００〜２５０残基の長さのポリＡ領域を付加する。
【０３４４】
固有のポリＡ領域の長さは、本開示の代替ポリヌクレオチドに特定の利点を提供し得る。
【０３４５】
概して、本開示のポリＡ領域の長さは少なくとも３０ヌクレオチドの長さである。別の実施形態では、ポリＡ領域は少なくとも３５ヌクレオチドの長さである。別の実施形態では、長さは、少なくとも４０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも４５ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも５５ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも６０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも７０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも８０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも９０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも１００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも１２０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも１４０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも１６０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも１８０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも２００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも２５０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも３００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも３５０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも４００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも４５０ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも５００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも６００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも７００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも８００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも９００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも１０００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも１１００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも１２００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも１３００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも１４００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも１５００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも１６００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも１７００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも１８００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも１９００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも２０００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも２５００ヌクレオチドである。別の実施形態では、長さは、少なくとも３０００ヌクレオチドである。
【０３４６】
場合によっては、ポリＡ領域は、本明細書に記載の代替ポリヌクレオチド分子上で、８０ヌクレオチド、１２０ヌクレオチド、１６０ヌクレオチドの長さであってもよい。
【０３４７】
他の例では、ポリＡ領域は、本明細書に記載の代替ポリヌクレオチド分子上で、２０、４０、８０、１００、１２０、１４０、または１６０ヌクレオチドの長さであってもよい。
【０３４８】
場合によっては、ポリＡ領域は代替ポリヌクレオチド全体の長さに対して設計される。この設計は、代替ポリヌクレオチドのコード領域の長さ、代替ポリヌクレオチド（ｍＲＮＡなど）の特定の特徴もしくは領域の長さ、または代替ポリヌクレオチドから発現する最終産物の長さに基づいてもよい。代替ポリヌクレオチドの任意の特徴（例えば、ポリＡ領域を含むｍＲＮＡ部分以外）に対するとき、ポリＡ領域は追加特徴よりも、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００％大きい長さであってもよい。ポリＡ領域はまた、それが属する代替ポリヌクレオチドの部分として設計されてもよい。この文脈において、ポリＡ領域は、コンストラクトの全長、またはコンストラクトの全長からポリＡ領域を引いたものの１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０％以上であってもよい。
【０３４９】
特定の場合には、ポリＡ結合タンパク質の改変された結合部位及び／またはポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）のコンジュゲーションを使用して、発現を増強することができる。改変された結合部位は、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の局所的な微小環境のリガンドの結合部位として機能できるセンサー配列であってもよい。非限定的な例として、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、ポリＡ結合タンパク質（ＰＡＢＰ）及びその類似体の結合親和性を変更するために少なくとも１つの改変された結合部位を含んでもよい。少なくとも１つの改変された結合部位の組み込みは、ＰＡＢＰ及びその類似体の結合親和性を増加させ得る。
【０３５０】
さらに、ポリＡ領域の３’末端の代替ヌクレオチドを使用して、３’末端を介して複数の異なるポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）を一緒に、ＰＡＢＰ（ポリＡ結合タンパク質）に結合することができる。トランスフェクション実験は関連する細胞株で実施でき、タンパク質産生はトランスフェクション後１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、及び７日目にＥＬＩＳＡでアッセイできる。非限定的な例として、トランスフェクション実験を使用して、少なくとも１つの改変された結合部位の付加の結果としてＰＡＢＰまたはその類似体の結合親和性に対する効果を評価することができる。
【０３５１】
特定の場合では、翻訳開始を調節するためにポリＡ領域が使用されてもよい。理論に拘束されることを望まないが、ポリＡ領域はＰＡＢＰを動員し、ＰＡＢＰは翻訳開始複合体と相互作用することができ、したがってタンパク質合成に不可欠であり得る。
【０３５２】
場合によっては、本開示ではポリＡ領域を使用して３’−５’−エキソヌクレアーゼ消化から保護することもできる。
【０３５３】
場合によっては、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）はポリＡ−Ｇカルテットを含み得る。Ｇカルテットは、ＤＮＡとＲＮＡの両方のＧリッチシークエンスによって形成できる４つのグアノシンヌクレオチドの環状水素結合アレイである。この実施形態では、ＧカルテットはポリＡ領域の端部に組み込まれる。得られたポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、安定性、タンパク質産生、及び様々な時点での半減期を含む他のパラメーターについてアッセイすることができる。ポリＡ−Ｇカルテットは、１２０ヌクレオチドのポリＡ領域のみを使用した場合に見られるタンパク質産生の少なくとも７５％に匹敵するタンパク質産生をもたらすことが発見されている。
【０３５４】
場合によっては、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）はポリＡ領域を含んでもよく、３’安定化領域の付加により安定化されてもよい。ポリＡ領域を有するポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、５’キャップ構造をさらに含み得る。
【０３５５】
他の場合では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）はポリＡ−Ｇカルテットを含み得る。ポリＡ−Ｇカルテットを有するポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、５’キャップ構造をさらに含み得る。
【０３５６】
場合によっては、ポリＡ領域またはポリＡ−Ｇカルテットを含むポリヌクレオチド（例えばｍＲＮＡ）を安定化するために使用できる３’安定化領域は、国際特許公開ＷＯ２０１３／１０３６５９に記載されるものであってよいが、これに限定されず、そのポリＡ領域及びポリＡ−Ｇカルテットは、参照により本明細書に組み込まれる。他の場合では、本開示で使用され得る３’−安定化領域には、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−デオキシウリジン、３’−デオキシシトシン、３’−デオキシグアノシン、３’−デオキシチミン、２’，３’−ジデオキシヌクレオシド、２’，３’−ジデオキシアデノシン、２’，３’−ジデオキシウリジン、２’，３’−ジデオキシシトシン、２’，３’−ジデオキシグアノシン、２’，３’−ジデオキシチミン、２’−デオキシヌクレオシド、またはＯ−メチルヌクレオシドなどの鎖終結ヌクレオシドが含まれる。
【０３５７】
他の場合では、ポリＡ領域またはポリＡ−Ｇカルテットを含むｍＲＮＡなどであるが、これらに限定されないポリヌクレオチドは、オリゴ（Ｕ）の付加を防止及び／または阻害できるポリヌクレオチドの３’領域の変更により安定化され得る（例えば、国際特許公開番号ＷＯ２０１３／１０３６５９を参照されたい）。
【０３５８】
さらに他の場合では、ポリＡ領域またはポリＡ−Ｇカルテットを含むｍＲＮＡなどであるが、これらに限定されないポリヌクレオチドは、３’−デオキシヌクレオシド、２’，３’−ジデオキシヌクレオシド、３’−Ｏ−メチルヌクレオシド、３’−Ｏ−エチルヌクレオシド、３’−アラビノシド、ならびに当該技術分野で公知の、及び／または本明細書に記載の他の代替ヌクレオシドで終結するオリゴヌクレオチドの付加により安定化され得る。
【０３５９】
鎖終結ヌクレオシド
核酸は、鎖終結ヌクレオシドを含んでもよい。例えば、鎖終結ヌクレオシドには、それらの糖基２’及び／または３’位で脱酸素化されたヌクレオシドが含まれ得る。そのような種には、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−デオキシウリジン、３’−デオキシシトシン、３’−デオキシグアノシン、３’−デオキシチミン、ならびに、２’，３’−ジデオキシアデノシン、２’，３’−ジデオキシウリジン、２’，３’−ジデオキシシトシン、２’，３’−ジデオキシグアノシン、及び２’，３’−ジデオキシチミンなどの２’，３’−ジデオキシヌクレオシドが含まれ得る。
【０３６０】
ゲノム編集技術
いくつかの実施形態では、核酸はゲノム編集技術に適している。
【０３６１】
いくつかの実施形態では、ゲノム編集技術は、クラスター化等間隔短鎖回分リピート（ＣＲＩＳＰＲ）または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である。
【０３６２】
いくつかの実施形態では、核酸は、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、及びＤＮＡ修復テンプレートからなるグループから選択されるゲノム編集技術に適した少なくとも１つの核酸である。
【０３６３】
他の成分
ＬＮＰには、先行するセクションで説明した成分に加えて、１つ以上の成分を含めることができる。例えば、ＬＮＰは、ビタミン（例えば、ビタミンＡもしくはビタミンＥ）またはステロールなどの１つ以上の小さな疎水性分子を含んでもよい。
【０３６４】
脂質ナノ粒子はまた、１つ以上の透過性エンハンサー分子、糖、ポリマー、表面改変剤、または他の成分を含んでもよい。透過性エンハンサー分子は、例えば、米国特許出願公開第２００５／０２２２０６４号に記載されている分子であってもよい。炭水化物には、単糖（例えば、グルコース）及び多糖類（例えば、グリコーゲンならびにその誘導体及び類似体）が含まれ得る。
【０３６５】
ポリマーは、ＬＮＰをカプセル化または部分的にカプセル化するために含まれるか、及び／または使用されてもよい。ポリマーは、生分解性及び／または生体適合性であり得る。ポリマーは、ポリアミン、ポリエーテル、ポリアミド、ポリエステル、ポリカルバメート、ポリ尿素、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリイミド、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリアセチレン、ポリエチレン、ポリエチレンイミン、ポリイソシアネート、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリロニトリル、及びポリアリレートから選択され得るが、これらに限定されない。例えば、ポリマーには、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、エチレン酢酸ビニルポリマー（ＥＶＡ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（Ｌ−乳酸）（ＰＬＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｌ−乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＬＧＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（ＰＤＬＡ）、ポリ（Ｌ−ラクチド）（ＰＬＬＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−カプロラクトン）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−カプロラクトン−コ−グリコリド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−ＰＥＯ−コ−Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−ＰＰＯ−コ−Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリウレタン、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）、ヒドロキシプロピルメタクリレート（ＨＰＭＡ）、ポリエチレングリコール、ポリ−Ｌ−グルタミン酸、ポリ（ヒドロキシ酸）、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリ（エステルアミド）、ポリアミド、ポリ（エステルエーテル）、ポリカーボネート、ポリエチレン及びポリプロピレンなどのポリアルキレン、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）などのポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリ（エチレンテレフタレート）などのポリアルキレンテレフタレート、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルエーテル、ポリ（酢酸ビニル）などのポリビニルエステル、ポリ（塩化ビニル）（ＰＶＣ）などのポリビニルハライド、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリシロキサン、ポリスチレン、ポリウレタン、アルキルセルロースなどの誘導体化セルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリ（メチル（メタ）アクリレート）（ＰＭＭＡ）、ポリ（エチル（メタ）アクリレート）、ポリ（ブチル（メタ）アクリレート）、ポリ（イソブチル（メタ）アクリレート）、ポリ（ヘキシル（メタ）アクリレート）、ポリ（イソデシル（メタ）アクリレート）、ポリ（ラウリル（メタ）アクリレート）、ポリ（フェニル（メタ）アクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、ポリ（オクタデシルアクリレート）などのアクリル酸のポリマーならびにそれらの共重合体及び混合物、ポリジオキサノン及びその共重合体、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリプロピレンフマレート、ポリオキシメチレン、ポロキサマー、ポロキサミン、ポリ（オルト）エステル、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド−コ−カプロラクトン）、トリメチレンカーボネート、ポリ（Ａ’−アクリロイルモルホリン）（ＰＡｃＭ）、ポリ（２−メチル−２−オキサゾリン）（ＰＭＯＸ）、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）（ＰＥＯＺ）、ならびにポリグリセロールが含まれ得る。
【０３６６】
表面改変剤には、陰イオンタンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン）、界面活性剤（例えば、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミドなどのカチオン性界面活性剤）、糖または糖誘導体（例えば、シクロデキストリン）、核酸、ポリマー（例えば、ヘパリン、ポリエチレングリコール、及びポロキサマー）、粘液溶解剤（例えば、アセチルシステイン、ヨモギ、ブロメライン、パパイン、クレロデンドラム、ブロムヘキシン、カルボシステイン、エプラジノン、メスナ、アンブロキソール、ソブレロール、ドミオドール、レトステイン、ステプロニン、チオプロニン、ゲルゾリン、サイモシンβ４、ドルナーゼアルファ、ネルテネキシン、及びエルドステイン）、ならびにＤＮａｓｅ（例えば、ｒｈＤＮａｓｅ）が含まれ得るが、これらに限定されない。表面改変剤は、ナノ粒子内及び／またはＬＮＰの表面上に配置され得る（例えば、コーティング、吸着、共有結合、または他のプロセスによる）。
【０３６７】
ＬＮＰはまた、１つ以上の官能化脂質を含んでもよい。例えば、脂質はアルキン基で官能化され、適切な反応条件下でアジドに曝露されると、環化付加反応を起こし得る。特に、脂質二重層は、膜透過、細胞認識、または画像化を促進するのに有用な１つ以上の基でこのように官能化されてもよい。ＬＮＰの表面はまた、１つ以上の有用な抗体と結合してもよい。標的細胞送達、画像化、及び膜透過に有用な官能基及びコンジュゲートは、当該技術分野で周知である。
【０３６８】
これらの成分に加えて、脂質ナノ粒子は、医薬組成物に有用な任意の物質を含んでもよい。例えば、脂質ナノ粒子は、１つ以上の溶媒、分散媒、希釈剤、分散助剤、懸濁助剤、造粒助剤、崩壊剤、充填剤、流動促進剤、液体ビヒクル、結合剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、緩衝剤、潤滑剤、油、保護剤、及びその他の種などであるが、これらに限定されない、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤または副成分を含んでもよい。ワックス、バター、着色剤、コーティング剤、香味料、香料などの賦形剤も含まれてもよい。薬学的に許容される賦形剤は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  ２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ａ．  Ｒ．  Ｇｅｎｎａｒｏ；Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，  ＭＤ，  ２００６を参照されたい）。
【０３６９】
希釈剤の例には、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸ナトリウムラクトース、スクロース、セルロース、微結晶セルロース、カオリン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、塩化ナトリウム、乾燥デンプン、コーンスターチ、粉砂糖、及び／またはそれらの組み合わせが含まれ得るが、これらに限定されない。造粒剤及び分散剤は、ジャガイモデンプン、コーンスターチ、タピオカデンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、粘土、アルギン酸、グアーガム、柑橘パルプ、寒天、ベントナイト、セルロース及び木材製品、天然スポンジ、陽イオン交換樹脂、炭酸カルシウム、ケイ酸塩、炭酸ナトリウム、架橋ポリビニルピロリドン）（クロスポビドン）、カルボキシメチルデンプンナトリウム（グリコール酸デンプンナトリウム）、カルボキシメチルセルロース、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム（クロスカルメロース）、メチルセルロース、アルファ化デンプン（デンプン１５００）、微結晶デンプン、水不溶性デンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ケイ酸アルミニウムマグネシウム（ＶＥＥＧＵＭ（登録商標））、ラウリル硫酸ナトリウム、第４級アンモニウム化合物、及び／またはそれらの組み合わせからなる非限定的なリストから選択され得る。
【０３７０】
界面活性剤及び／または乳化剤には、天然乳化剤（例えば、アカシアゴム、寒天、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、トラガカント、コンドラックス、コレステロール、キサンタン、ペクチン、ゼラチン、卵黄、カゼイン、羊毛脂肪、コレステロール、ワックス、及びレシチン）、コロイド粘土（例えば、ベントナイト［ケイ酸アルミニウム］及びＶＥＥＧＵＭ（登録商標）［ケイ酸マグネシウムアルミニウム］）、長鎖アミノ酸誘導体、高分子量アルコール（例えば、ステアリルアルコール、セチルアルコール、オレイルアルコール、トリアセチンモノステアレート、エチレングリコールジステアレート、グリセリルモノステアレート、及びプロピレングリコールモノステアレート、ポリビニルアルコール）、カルボマー（例えば、カルボキシポリメチレン、ポリアクリル酸、アクリル酸ポリマー、及びカルボキシビニルポリマー）、カラギーナン、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、粉末セルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース）、ソルビタン脂肪酸エステル（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート［ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０］、ポリオキシエチレンソルビタン［ＴＷＥＥＮ（登録商標）６０］、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート［ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０］、ソルビタンモノパルミテート［ＳＰＡＮ（登録商標）４０］、ソルビタンモノステアレート［ＳＰＡＮ（登録商標）６０］、トリステアリン酸ソルビタン［ＳＰＡＮ（登録商標）６５］、モノオレイン酸グリセリル、モノオレイン酸ソルビタン［ＳＰＡＮ（登録商標）８０］）、ポリオキシエチレンエステル（例えば、ポリオキシエチレンモノステアレート［ＭＹＲＪ（登録商標）４５］、ポリオキシエチレン水素化ヒマシ油、ポリエトキシ化ヒマシ油、ポリオキシメチレンステアレート、及びＳＯＬＵＴＯＬ（登録商標））、スクロース脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル（例えば、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ（登録商標））、ポリオキシエチレンエーテル（例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル［ＢＲＩＪ（登録商標）３０］）、ポリ（ビニルピロリドン）、ジエチレングリコールモノラウレート、オレイン酸トリエタノールアミン、オレイン酸ナトリウム、オレイン酸カリウム、オレイン酸エチル、オレイン酸、ラウリン酸エチル、ラウリル硫酸ナトリウム、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）Ｆ６８、ＰＯＬＯＸＡＭＥＲ（登録商標）１８８、臭化セトリモニウム、塩化セチルピリジニウム、塩化ベンザルコニウム、ドキュセートナトリウム、及び／またはそれらの組み合わせが含まれ得るが、これらに限定されない。
【０３７１】
結合剤はデンプン（例えば、コーンスターチ及びデンプンペースト）；ゼラチン；糖（例えば、スクロース、グルコース、デキストロース、デキストリン、糖蜜、ラクトース、ラクチトール、マンニトール）；天然及び合成ゴム（アカシアゴム、アルギン酸ナトリウム、アイリッシュコケの抽出物、パンワールガム、ガッティガム、イサポール殻の粘液、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、微結晶セルロース、酢酸セルロース、ポリ（ビニルピロリドン）、ケイ酸マグネシウムアルミニウム（ＶＥＥＧＵＭ（登録商標））、カラマツアラボガラクタン）；アルギン酸塩；ポリエチレンオキシド；ポリエチレングリコール；無機カルシウム塩；ケイ酸；ポリメタクリレート；ワックス；水；アルコール；及びそれらの組み合わせ、または他の任意の適切な結合剤であり得る。
【０３７２】
保存剤の例には、抗酸化剤、キレート剤、抗菌性保存剤、抗真菌性保存剤、アルコール保存剤、酸性保存剤、及び／または他の保存剤が含まれ得るが、これらに限定されない。抗酸化剤の例には、アルファトコフェロール、アスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、モノチオグリセロール、メタ重亜硫酸カリウム、プロピオン酸、没食子酸プロピル、アスコルビン酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、及び／または亜硫酸ナトリウムが含まれるが、これらに限定されない。キレート剤の例には、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸一水和物、エデト酸二ナトリウム、エデト酸二カリウム、エデト酸、フマル酸、リンゴ酸、リン酸、エデト酸ナトリウム、酒石酸、及び／またはエデト酸三ナトリウムが含まれる。抗菌性保存剤の例には、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、ブロノポール、セトリミド、塩化セチルピリジニウム、クロルヘキシジン、クロロブタノール、クロロクレゾール、クロロキシレノール、クレゾール、エチルアルコール、グリセリン、ヘキセチジン、イミド尿素、フェノール、フェノキシエタノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、プロピレングリコール、及び／またはチメロサールが含まれるが、これらに限定されない。抗真菌性保存剤の例には、ブチルパラベン、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、及び／またはソルビン酸が含まれるが、これらに限定されない。アルコール保存剤の例には、エタノール、ポリエチレングリコール、ベンジルアルコール、フェノール、フェノール化合物、ビスフェノール、クロロブタノール、ヒドロキシ安息香酸、及び／またはフェニルエチルアルコールが含まれるが、これらに限定されない。酸性保存剤の例には、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ベータカロチン、クエン酸、酢酸、デヒドロアスコルビン酸、アスコルビン酸、ソルビン酸、及び／またはフィチン酸が含まれるが、これらに限定されない。他の保存剤には、トコフェロール、酢酸トコフェロール、デシルオキシムメシレート、セトリミド、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、エチレンジアミン、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム（ＳＬＥＳ）、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、メタ重亜硫酸カリウム、ＧＬＹＤＡＮＴ  ＰＬＵＳ（登録商標）、ＰＨＥＮＯＮＩＰ（登録商標）、メチルパラベン、ＧＥＲＭＡＬＬ（登録商標）１１５、ＧＥＲＭＡＢＥＮ（登録商標）ＩＩ、ＮＥＯＬＯＮＥ（商標）、ＫＡＴＨＯＮ（商標）、及び／またはＥＵＸＹＬ（登録商標）が含まれるが、これらに限定されない。
【０３７３】
緩衝剤の例には、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、塩化アンモニウム、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、クエン酸カルシウム、グルビオン酸カルシウム、グルセプト酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、ｄ−グルコン酸、グリセロリン酸カルシウム、乳酸カルシウム、ラクトビオン酸カルシウム、プロパン酸、レブリン酸カルシウム、ペンタン酸、二塩基性リン酸カルシウム、リン酸、三塩基性リン酸カルシウム、水酸化リン酸カルシウム、酢酸カリウム、塩化カリウム、グルコン酸カリウム、カリウム混合物、二塩基性リン酸カリウム、一塩基性リン酸カリウム、リン酸カリウム混合物、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、二塩基性リン酸ナトリウム、一塩基性リン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム混合物、トロメタミン、アミノスルホン酸緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ）、水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウム、アルギン酸、パイロジェンフリー水、等張食塩水、リンガー溶液、エチルアルコール、及び／またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。潤滑剤は、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸、シリカ、タルク、麦芽、ベヘン酸グリセリル、硬化植物油、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ロイシン、ラウリル硫酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、及びそれらの組み合わせからなる非限定的な群から選択され得る。
【０３７４】
油の例には、アーモンド、アプリコットカーネル、アボカド、ババス、ベルガモット、ブラックカレントシード、ルリヂサ、ケイド、カモミール、キャノーラ、キャラウェイ、カルナウバ、ヒマシ、シナモン、ココアバター、ココナッツ、タラ肝、コーヒー、トウモロコシ、綿実、エミュー、ユーカリ、月見草、魚、亜麻仁、ゲラニオール、ヒョウタン、グレープシード、ヘーゼルナッツ、ヒソップ、ミリスチン酸イソプロピル、ホホバ、ククイナッツ、ラバンジン、ラベンダー、レモン、リトアキューブバ、マカデミアナッツ、ゼニアオイ、マンゴー種子、メドウフォーム種子、ミンク、ナツメグ、オリーブ、オレンジ、オレンジラフィー、パーム、パームカーネル、ピーチカーネル、ピーナッツ、ケシの実、パンプキンシード、ナタネ、米ぬか、ローズマリー、ベニバナ、サンダルウッド、サスカナ、サボリー、シーバックソーン、ゴマ、シアバター、シリコーン、大豆、ヒマワリ、ティーツリー、アザミ、ツバキ、ベチバー、クルミ、及び小麦胚芽油、ならびにステアリン酸ブチル、カプリル酸トリグリセリド、カプリン酸トリグリセリド、シクロメチコン、ジエチルセバケート、ジメチコン３６０、シメチコン、ミリスチン酸イソプロピル、鉱油、オクチルドデカノール、オレイルアルコール、シリコーンオイル、及び／またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【０３７５】
製剤
本開示の製剤は、少なくとも１つの脂質ナノ粒子成分を含む。脂質ナノ粒子は、脂質成分と、核酸などの治療薬及び／または予防薬などの１つ以上の追加の成分を含んでもよい。ＬＮＰは、１つ以上の特定の用途または標的用に設計できる。ＬＮＰの要素は、特定の用途もしくは標的に基づいて、及び／または１つ以上の要素の有効性、毒性、費用、使いやすさ、可用性、もしくはその他の特徴に基づいて選択できる。同様に、ＬＮＰの特定の製剤は、例えば、要素の特定の組み合わせの有効性及び毒性に応じて、特定の用途または標的に合わせて選択することができる。ＬＮＰ製剤の有効性及び忍容性は、製剤の安定性によって影響を受ける場合がある。
【０３７６】
いくつかの実施形態では、修飾剤対ＬＮＰの重量比は、約０．０００４：１〜約１００：１（例えば、約０．００１：１〜約１０：１、約０．００１：１〜約５：１、約０．００１：１〜約０．１：１、約０．００５〜約０．４：１、または約０．５：１〜約４：１、約０．０５：１〜約５：１、約０．１：１〜  約５：１、または約０．０５：１〜約２．５：１、約１：１〜約５０：１、約２：１〜約５０：１、または約１：１〜約２５：１）である。
【０３７７】
ＬＮＰの脂質成分には、例えば、式（Ｉ）、（ＩＡ）、（ＩＩ）、（Ｉｌａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、または（ＩＩｅ）による脂質、リン脂質（例えば、ＤＯＰＥまたはＤＳＰＣなどの不飽和脂質など）、ＰＥＧ脂質、及び構造脂質が含まれ得る。ＬＮＰの脂質成分には、例えば、式（Ｉ）、（ＩＡ）、（ＩＩ）、（Ｉｌａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、または（ＩＩｅ）による脂質、リン脂質（例えば、ＤＯＰＥまたはＤＳＰＣなどの不飽和脂質など）、及び構造脂質が含まれ得る。脂質成分の要素は、特定の画分で提供されてもよい。
【０３７８】
いくつかの実施形態では、ＬＮＰの脂質成分には、式（Ｉ）、（ＩＡ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）または（ＩＩｅ）による脂質、リン脂質、ＰＥＧ脂質、及び構造脂質が含まれる。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子の脂質成分には、約３０ｍｏｌ％〜約６０ｍｏｌ％の式（Ｉ）、（ＩＡ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、または（ＩＩｅ）の化合物、約０ｍｏｌ％〜約３０ｍｏｌ％のリン脂質、約１８．５ｍｏｌ％〜約４８．５ｍｏｌ％の構造脂質、約０ｍｏｌ％〜約１０ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質が含まれ、ただし、総ｍｏｌ％が１００％を超えない。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子の脂質成分には、約３５ｍｏｌ％〜約５５ｍｏｌ％の式（Ｉ）、（ＩＡ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、または（ＩＩｅ）の化合物、約５ｍｏｌ％〜約２５ｍｏｌ％のリン脂質、約３０ｍｏｌ％〜約４０ｍｏｌ％の構造脂質、約０ｍｏｌ％〜約１０ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質が含まれる。特定の実施形態では、脂質成分には、約５０ｍｏｌ％の前記化合物、約１０ｍｏｌ％のリン脂質、約３８．５ｍｏｌ％の構造脂質、及び約１．５ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質が含まれる。別の実施形態では、脂質成分には、約４０ｍｏｌ％の前記化合物、約２０ｍｏｌ％のリン脂質、約３８．５ｍｏｌ％の構造脂質、及び約１．５ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質が含まれる。いくつかの実施形態では、リン脂質はＤＯＰＥまたはＤＳＰＣであってよい。他の実施形態では、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ−ＤＭＧであってもよく、及び／または構造脂質はコレステロールであってもよい。
【０３７９】
脂質ナノ粒子は、１つ以上の特定の用途または標的用に設計できる。例えば、ＬＮＰは、哺乳動物の体内の特定の細胞、組織、臓器、または系もしくは群にＲＮＡなどの治療薬及び／または予防薬を送達するように設計されてもよい。脂質ナノ粒子の物理化学的特性は、特定の身体標的に対する選択性を高めるために変更し得る。例えば、粒径は、様々な臓器の開窓サイズに基づいて調整できる。ＬＮＰに含まれる治療薬及び／または予防薬は、所望の１つ以上の送達標的に基づいて選択することもできる。例えば、治療薬及び／または予防薬は、特定の適応症、状態、疾患、もしくは障害、及び／または特定の細胞、組織、臓器、またはその系もしくは群への送達（例えば、局所的または特異的送達）のために選択され得る。いくつかの実施形態では、ＬＮＰには、細胞内で翻訳されて目的のポリペプチドを産生することができる目的のポリペプチドをコードするｍＲＮＡが含まれ得る。そのような組成物は、特定の臓器に特異的に送達されるように設計されてもよい。いくつかの実施形態では、組成物は、哺乳動物の肝臓に特異的に送達されるように設計されてもよい。
【０３８０】
ＬＮＰにおける治療薬及び／または予防薬の量は、脂質ナノ粒子のサイズ、組成、所望の標的及び／または用途、あるいは他の特性、ならびに治療薬及び／または予防薬の特性に依存し得る。例えば、ＬＮＰで有用なＲＮＡの量は、ＲＮＡのサイズ、配列、及びその他の特性に依存し得る。ＬＮＰ中の治療薬及び／または予防薬ならびに他の要素（例えば、脂質）の相対量も変動し得る。いくつかの実施形態では、ＬＮＰにおける脂質成分対核酸などの治療薬及び／または予防薬のｗｔ／ｗｔ比は、約５：１〜約６０：１、例えば５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１、及び６０：１であってよい。例えば、脂質成分対治療薬及び／または予防薬のｗｔ／ｗｔ比は、約１０：１〜約４０：１であってもよい。いくつかの実施形態では、ｗｔ／ｗｔ比は約２０：１である。ＬＮＰにおける治療薬及び／または予防薬の量は、例えば、吸収分光法（例えば、紫外可視分光法）を使用して測定され得る。
【０３８１】
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは１つ以上のＲＮＡを含み、１つ以上のＲＮＡ、脂質、及びそれらの量は、特定のＮ：Ｐ比を提供するように選択され得る。組成物のＮ：Ｐ比は、１つ以上の脂質中の窒素原子対ＲＮＡ中のリン酸基の数のモル比を指す。一般に、低いＮ：Ｐ比が好ましい。１以上のＲＮＡ、脂質、及びそれらの量は、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１２：１、１４：１、１６：１、１８：１、２０：１、２２：１、２４：１、２６：１、２８：１、または３０：１などの約２：１〜約３０：１のＮ：Ｐ比を提供するように選択され得る。いくつかの実施形態では、Ｎ：Ｐ比は約２：１〜約８：１である。他の実施形態では、Ｎ：Ｐ比は約５：１〜約８：１である。例えば、Ｎ：Ｐ比は、約５．０：１、約５．５：１、約５．６７：１、約６．０：１、約６．５：１、または約７．０：１であり得る。例えば、Ｎ：Ｐ比は約５．６７：１であり得る。
【０３８２】
いくつかの実施形態では、ＬＮＰを含む製剤は、塩化物塩などの塩をさらに含み得る。
【０３８３】
いくつかの実施形態では、ＬＮＰを含む製剤は、二糖類などの糖をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、製剤はさらに糖を含むが、塩化物塩などの塩は含まない。
【０３８４】
物理的特性
ＬＮＰの特性は、その成分に依存する。例えば、構造脂質としてコレステロールを含むＬＮＰは、異なる構造脂質を含むＬＮＰとは異なる特性を有し得る。同様に、ＬＮＰの特性は、その成分の絶対量または相対量に依存し得る。例えば、リン脂質のより高いモル分率を含むＬＮＰは、リン脂質のより低いモル分率を含むＬＮＰとは異なる特性を有し得る。特性は、脂質ナノ粒子の調製の方法及び条件によっても異なり得る。
【０３８５】
脂質ナノ粒子は、様々な方法で特性評価し得る。例えば、ＬＮＰの形態及びサイズ分布を調べるために、顕微鏡法（例えば、透過型電子顕微鏡法または走査型電子顕微鏡法）を使用できる。ゼータ電位の測定には、動的光散乱または電位差測定（例えば、電位差滴定）を使用できる。動的光散乱を利用して、粒径を決定することもできる。Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ，  Ｍａｌｖｅｒｎ，  Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，  ＵＫ）などの機器を使用して、粒子径、多分散性指数、及びゼータ電位などのＬＮＰの複数の特性を測定することもできる。
【０３８６】
ＬＮＰの平均サイズは、例えば動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定される数十ｎｍ〜数百ｎｍであり得る。例えば、平均サイズは、約４０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、例えば約４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、５５ｎｍ、６０ｎｍ、６５ｎｍ、７０ｎｍ、７５ｎｍ、８０ｎｍ、８５ｎｍ、９０ｎｍ、９５ｎｍ、１００ｎｍ、１０５ｎｍ、１１０ｎｍ、１１５ｎｍ、１２０ｎｍ、１２５ｎｍ、１３０ｎｍ、１３５ｎｍ、１４０ｎｍ、１４５ｎｍ、または１５０ｎｍであってよい。いくつかの実施形態では、ＬＮＰの平均サイズは、約５０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約５０ｎｍ〜約９０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約８０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約７０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約６０ｎｍ、約６０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約６０ｎｍ〜約９０ｎｍ、約６０ｎｍ〜約８０ｎｍ、約６０ｎｍ〜約７０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約７０ｎｍ〜約９０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約８０ｎｍ、約８０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約８０ｎｍ〜約９０ｎｍ、または約９０ｎｍ〜約１００ｎｍであり得る。いくつかの実施形態では、ＬＮＰの平均サイズは、約７０ｎｍ〜約１００ｎｍであってもよい。特定の実施形態では、平均サイズは約８０ｎｍであってもよい。他の実施形態では、平均サイズは約１００ｎｍであってもよい。
【０３８７】
ＬＮＰは比較的同種であってもよい。多分散指数を使用して、ＬＮＰの均一性、例えば脂質ナノ粒子の粒径分布を示すことができる。小さい（例えば、０．３未満）多分散指数は、一般に狭い粒径分布を示す。ＬＮＰは、約０〜約０．２５、例えば、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１０、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、０．１９、０．２０、０．２１、０．２２、０．２３、０．２４、または０．２５などの多分散性指数を有し得る。いくつかの実施形態では、ＬＮＰの多分散性指数は約０．１０〜約０．２０であってよい。
【０３８８】
ＬＮＰのゼータ電位を使用して、組成物の動電学的電位を示すことができる。例えば、ゼータ電位は、ＬＮＰの表面電荷を表し得る。より高い電荷を帯びた種が細胞、組織、及び体内の他の要素と望ましくない相互作用をする可能性があるため、正または負の比較的低い電荷をもつ脂質ナノ粒子が、一般的に望ましい。いくつかの実施形態では、ＬＮＰのゼータ電位は約−１０ｍＶ〜約＋２０ｍＶ、約−１０ｍＶ〜約＋１５ｍＶ、約−１０ｍＶ〜約＋１０ｍＶ、約−１０ｍＶ〜約＋５ｍＶ、約−１０ｍＶ〜約０ｍＶ、約−１０ｍＶ〜約−５ｍＶ、約−５ｍＶ〜約＋２０ｍＶ、約−５ｍＶ〜約＋１５ｍＶ、約−５ｍＶ〜約＋１０ｍＶ、約−５ｍＶ〜約＋５ｍＶ、約−５ｍＶ〜約０ｍＶ、約０ｍＶ〜約＋２０ｍＶ、約０ｍＶ〜約＋１５ｍＶ、約０ｍＶ〜約＋１０ｍＶ、約０ｍＶ〜約＋５ｍＶ、約＋５ｍＶ〜約＋２０ｍＶ、約＋５ｍＶ〜約＋１５ｍＶ、または約＋５ｍＶ〜約＋１０ｍＶであり得る。
【０３８９】
核酸などの治療薬及び／または予防薬のカプセル化の効率は、提供される初期量と比較して、調製後にＬＮＰにカプセル化されるか、さもなければ結合する治療薬及び／または予防薬の量を表す。カプセル化効率は、望ましくは高い（例えば、１００％に近い）。カプセル化効率は、例えば、脂質ナノ粒子を１つ以上の有機溶媒または界面活性剤で粉砕する前と後の脂質ナノ粒子を含む溶液中の治療薬及び／または予防薬の量を比較することにより測定できる。蛍光を使用して、溶液中の遊離した治療薬及び／または予防薬（例えば、ＲＮＡ）の量を測定してもよい。本明細書に記載の脂質ナノ粒子の場合、治療薬及び／または予防薬のカプセル化効率は少なくとも５０％、例えば５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。いくつかの実施形態では、カプセル化効率は少なくとも８０％であってよい。いくつかの実施形態では、カプセル化効率は少なくとも９０％であってよい。
【０３９０】
ＬＮＰは、必要に応じて、１つ以上のコーティングを含み得る。例えば、ＬＮＰは、コーティングを有するカプセル、フィルム、または錠剤に製剤化され得る。本明細書に記載の組成物を含むカプセル、フィルム、または錠剤は、任意の有用なサイズ、引張強度、硬度、または密度を有し得る。
【０３９１】
医薬組成物
脂質ナノ粒子を含む製剤は、医薬組成物として全体的または部分的に製剤化し得る。医薬組成物は、１つ以上の脂質ナノ粒子を含み得る。例えば、医薬組成物は、１つ以上の異なる治療薬及び／または予防薬を含む１つ以上の脂質ナノ粒子を含み得る。医薬組成物は、本明細書に記載されるような１つ以上の薬学的に許容される賦形剤または副成分をさらに含んでもよい。医薬組成物及び薬剤の製剤及び製造に関する一般的なガイドラインは、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  ２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ａ．  Ｒ．  Ｇｅｎｎａｒｏ；Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，  ＭＤ，  ２００６におけるものが利用可能である。任意の従来の賦形剤または副成分が本開示の製剤中のＬＮＰの１つ以上の成分と適合しない場合を除いて、従来の賦形剤及び副成分を任意の医薬組成物に使用することができる。賦形剤または副成分は、成分またはＬＮＰとの組み合わせにより、望ましくない生物学的効果またはさもなくば有害な効果が生じる可能性がある場合、製剤のＬＮＰの成分と適合しない可能性がある。
【０３９２】
いくつかの実施形態では、１つ以上の賦形剤または副成分は、ＬＮＰを含む医薬組成物の総質量または体積の５０％超を構成する場合がある。例えば、１つ以上の賦形剤または副成分は、製薬上の慣習の５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上を構成し得る。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される賦形剤は、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％純粋である。いくつかの実施形態では、賦形剤は、ヒトでの使用及び獣医学での使用が承認されている。いくつかの実施形態では、賦形剤は米国食品医薬品局によって承認されている。いくつかの実施形態では、賦形剤は医薬品グレードである。いくつかの実施形態では、賦形剤は、米国薬局方（ＵＳＰ）、欧州薬局方（ＥＰ）、英国薬局方、及び／または国際薬局方の基準を満たしている。
【０３９３】
本開示による医薬組成物中の１つ以上の脂質ナノ粒子、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤、及び／または任意の追加の成分の相対量は、その同一性、サイズ、及び／または治療される対象の状態によって異なり、さらに組成物が投与される経路にも依存する。例として、医薬組成物は、０．１％〜１００％（ｗｔ／ｗｔ）の１つ以上の脂質ナノ粒子を含んでもよい。別の例として、医薬組成物は、０．１％〜１５％（ｗｔ／ｖｏｌ）の１つ以上の両親媒性ポリマー（例えば、０．５％、１％、２．５％、５％、１０％、または１２．５％ｗ／ｖ）を含み得る。
【０３９４】
いくつかの実施形態では、本開示の脂質ナノ粒子及び／または医薬組成物は、貯蔵及び／または輸送のために冷蔵または冷凍される（例えば、約−１５０℃〜約０℃または約−８０℃〜約−２０℃（例えば、約−５℃、−１０℃、−１５℃、−２０℃、−２５℃、−３０℃、−４０℃、−５０℃、−６０℃、−７０℃、−８０℃、−９０℃、−１３０℃、または−１５０℃）の温度などの４℃以下の温度で貯蔵される）。例えば、１つ以上の脂質ナノ粒子を含む医薬組成物は、例えば約−２０℃、−３０℃、−４０℃、−５０℃、−６０℃、−７０℃、または−８０℃での貯蔵及び／または輸送のために冷蔵される溶液または固体（例えば、凍結乾燥による）である。いくつかの実施形態では、本開示はまた、脂質ナノ粒子の安定性を増加させる方法に関し、例えば、約−１５０℃〜約０℃または約−８０℃〜約−２０℃、例えば、約−５℃、−１０℃、−１５℃、−２０℃、−２５℃、−３０℃、−４０℃、−５０℃、−６０℃、−７０℃、−８０℃、−９０℃、−１３０℃、または−１５０℃の温度などの４℃以下の温度で、脂質ナノ粒子及び／またはその医薬組成物を貯蔵することによる。
【０３９５】
脂質ナノ粒子及び／または１つ以上の脂質ナノ粒子を含む医薬組成物は、１つ以上の特定の細胞、組織、臓器、または腎臓系などの系もしくは群への治療薬及び／または予防薬の送達によって提供される治療効果から利益を得る可能性がある患者または対象を含む任意の患者または対象に投与することができる。本明細書で提供される脂質ナノ粒子及び脂質ナノ粒子を含む医薬組成物の説明は、ヒトへの投与に適した組成物を主に対象としているが、このような組成物は一般に任意の他の哺乳動物への投与に適していることを当業者は理解するであろう。組成物を様々な動物への投与に適するようにするためのヒトへの投与に適する組成物の修正はよく理解されており、通常の獣医薬理学者は、もしあれば、通常に過ぎない実験でそのような修正を設計及び／または実施できる。組成物の投与が企図される対象には、ヒト、他の霊長類、ならびにウシ、ブタ、ホース、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウス、及び／またはラットなどの商業的に適切な哺乳動物を含む他の哺乳動物が含まれるが、これらに限定されない。
【０３９６】
１つ以上の脂質ナノ粒子を含む医薬組成物は、薬理学の分野で知られているかまたは今後開発される任意の方法によって調製することができる。一般に、そのような調製方法には、活性成分を賦形剤及び／または１つ以上の他の副成分と組み合わせ、その後、必要ならばまたは必要に応じて、製品を所望の単回用量単位または複数回用量単位に分割、成形、及び／または包装することが含まれる。
【０３９７】
本開示による医薬組成物は、単回単位用量として、及び／または複数の単回単位用量として、大量に調製、包装、及び／または販売することができる。本明細書で使用されるとき、「単位用量」は、所定量の活性成分（例えば、脂質ナノ粒子）を含む医薬組成物の個別の量である。活性成分の量は、一般に、対象に投与される活性成分の投与量及び／または例えばそのような投与量の半分もしくは３分の１などのそのような投与量の便利な画分に等しい。
【０３９８】
医薬組成物は、様々な投与経路及び方法に適した様々な形態で調製することができる。例えば、医薬組成物は、液体剤形（例えば、エマルジョン、マイクロエマルジョン、ナノエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ、及びエリキシル）、注射可能な形態、固体剤形（例えば、カプセル、錠剤、丸薬、粉末、及び顆粒）、局所及び／または経皮投与用の剤形（例えば、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、粉末、溶液、スプレー、吸入剤、及びパッチ）、懸濁液、粉末、ならびに他の形態で調製され得る。
【０３９９】
経口及び非経口投与用の液体剤形には、薬学的に許容されるエマルジョン、マイクロエマルジョン、ナノエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ、及び／またはエリキシルが含まれるが、これらに限定されない。活性成分に加えて、液体剤形は、例えば水または他の溶媒、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に綿実油、落花生油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、ゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、ソルビタンの脂肪酸エステル、及びそれらの混合物などの可溶化剤及び乳化剤など、当技術分野で一般的に使用される不活性希釈剤を含んでもよい。不活性希釈剤に加えて、経口組成物は、追加の治療薬及び／または予防薬、湿潤剤、乳化剤及び懸濁剤、甘味料、香味料、及び／または香料などの追加の薬剤を含むことができる。非経口投与のいくつかの実施形態では、組成物は、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）、アルコール、油、改質油、グリコール、ポリソルベート、シクロデキストリン、ポリマー、及び／またはそれらの組み合わせなどの可溶化剤と混合される。
【０４００】
注射用製剤、例えば、滅菌注射用水性または油性懸濁液は、適切な分散剤、湿潤剤、及び／または懸濁剤を使用して、公知の技術に従って製剤化することができる。滅菌注射用製剤は、例えば１，３−ブタンジオール溶液として、非毒性の非経口的に許容される希釈剤及び／または溶媒中の滅菌注射用溶液、懸濁液、及び／またはエマルジョンであり得る。使用され得る許容可能なビヒクル及び溶媒は、水、リンガー液、Ｕ．Ｓ．Ｐ、及び生理食塩液である。滅菌の不揮発性油が、従来、溶媒または懸濁媒体として使用されている。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む任意の無刺激性不揮発性油が使用され得る。オレイン酸などの脂肪酸も注射剤の調製に使用することができる。
【０４０１】
注射用製剤は、例えば、細菌保持フィルターを通しての濾過により、及び／または使用前に滅菌水もしくは他の滅菌注射用媒体に溶解もしくは分散できる滅菌固体組成物の形態で滅菌剤を組み込むことにより滅菌することができる。
【０４０２】
活性成分の効果を長引かせるために、皮下または筋肉内注射からの活性成分の吸収を遅延させることがしばしば望ましい。これは、水への溶解度が低い結晶性またはアモルファス材料の液体懸濁液を使用することで実現できる。したがって、薬物の吸収速度はその溶解速度に依存し、結果として、結晶サイズ及び結晶形に依存し得る。代替的に、非経口投与された薬物形態の遅延吸収は、薬物を油性ビヒクルに溶解または懸濁することにより達成される。注射可能なデポー剤は、ポリラクチド−ポリグリコリドなどの生分解性ポリマー中に薬物のマイクロカプセル化されたマトリックスを形成することにより作製される。薬物のポリマーに対する比率及び使用する特定のポリマーの性質に応じて、薬物放出の速度を制御できる。他の生分解性ポリマーの例には、ポリ（オルソエステル）及びポリ（無水物）が含まれる。デポー注射製剤は、薬物を体組織に適合するリポソームまたはマイクロエマルジョンに捕捉することにより調製される。
【０４０３】
直腸または膣投与用の組成物は、典型的には、周囲温度では固体であるが体温では液体であり、したがって直腸または膣腔で溶解して活性成分を放出するカカオバター、ポリエチレングリコールまたは坐薬ワックスなどの適切な非刺激性賦形剤と組成物を混合することによって調製できる坐薬である。
【０４０４】
経口投与用の固体剤形には、カプセル、錠剤、丸薬、フィルム、粉末、及び顆粒が含まれる。そのような固体剤形では、活性成分は、クエン酸ナトリウムもしくはリン酸二カルシウム及び／または充填剤もしくは増量剤（例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、及びケイ酸）、結合剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース、アカシアゴム）、保湿剤（例えば、グリセロール）、崩壊剤（例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、特定のケイ酸塩、炭酸ナトリウム）、溶液遅延剤（例えば、パラフィン）、吸収促進剤（例えば、第４級アンモニウム化合物）、湿潤剤（例えば、セチルアルコール及びグリセロールモノステアレート）、吸収剤（例えば、カオリン及びベントナイト粘土、ケイ酸塩）、ならびに潤滑剤（例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム）、ならびにそれらの混合物などの少なくとも１つの不活性な薬学的に許容される賦形剤と混合される。カプセル、錠剤及び丸薬の場合、剤形は緩衝剤を含んでもよい。
【０４０５】
同様のタイプの固体組成物は、ラクトースまたは乳糖、ならびに高分子量ポリエチレングリコールなどの賦形剤を使用して、軟及び硬充填ゼラチンカプセルの充填剤として使用することができる。錠剤、糖衣錠、カプセル、丸薬、及び顆粒の固体剤形は、腸溶性コーティング及び薬学的製剤化技術で周知の他のコーティングなどのコーティング及びシェルで調製することができる。それらは、必要に応じて乳白剤を含んでもよく、腸管の特定の部分でのみ、または優先的に、必要に応じて遅延様式で活性成分（複数可）を放出する組成物であってもよい。使用できる包埋組成物の例には、ポリマー物質及びワックスが含まれる。同様のタイプの固体組成物は、ラクトースまたは乳糖、ならびに高分子量ポリエチレングリコールなどの賦形剤を使用して、軟及び硬充填ゼラチンカプセルの充填剤として使用することができる。
【０４０６】
組成物の局所及び／または経皮投与用の剤形には、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、粉末、溶液、スプレー、吸入剤、及び／またはパッチが含まれ得る。一般に、活性成分は、滅菌条件下で、薬学的に許容される賦形剤及び／または必要に応じて必要な保存剤及び／または緩衝液と混合される。さらに、本開示は、経皮パッチの使用を企図しており、これは、身体への化合物の制御された送達を提供するという追加の利点をしばしば有する。そのような剤形は、例えば、適切な媒体に化合物を溶解及び／または分配することにより調製することができる。代替的または追加的に、速度制御膜を提供することにより、及び／または化合物をポリマーマトリックス及び／またはゲルに分散させることにより、速度を制御することができる。
【０４０７】
本明細書に記載の皮内医薬組成物を送達する際に使用するのに適したデバイスには、米国特許第４，８８６，４９９号；同第５，１９０，５２１号；同第５，３２８，４８３号；同第５，５２７，２８８号；同第４，２７０，５３７号；同第５，０１５，２３５号；同第５，１４１，４９６号；及び同第５，４１７，６６２号に記載されるもののような、短針デバイスが含まれる。皮内組成物は、ＰＣＴ公開ＷＯ９９／３４８５０及びその機能的同等物に記載されているものなど、針の皮膚への有効な浸透長を制限するデバイスによって投与することができる。液体ジェット注射器及び／または角質層を突き刺して真皮に到達するジェットを生成する針を介して真皮に液体組成物を送達するジェット注射装置が適切である。ジェット噴射装置は、例えば、米国特許第５，４８０，３８１号、同第５，５９９，３０２号；同第５，３３４，１４４号；同第５，９９３，４１２号；同第５，６４９，９１２号；同第５，５６９，１８９号；同第５，７０４，９１１号；同第５，３８３，８５１号；同第５，８９３，３９７号；同第５，４６６，２２０号；同第５，３３９，１６３号；同第５，３１２，３３５号；同第５，５０３，６２７号；同第５，０６４，４１３号；同第５，５２０，６３９号；同第４，５９６，５５６号；同第４，７９０，８２４号；同第４，９４１，８８０号；同第４，９４０，４６０号；ならびにＰＣＴ公開ＷＯ９７／３７７０５及び同ＷＯ９７／１３５３７に記載されている。圧縮ガスを使用して粉末形態のワクチンを皮膚の外層から真皮まで加速する弾道粉末／粒子送達装置が適切である。代替的または追加的に、従来の注射器を皮内投与の古典的なマントー法で使用してもよい。
【０４０８】
局所投与に適した製剤には、リニメント、ローション、クリーム、軟膏及び／またはペーストなどの水中油及び／または油中水エマルジョン、及び／または溶液及び／または懸濁液などの液体及び／または半液体製剤が含まれるが、これらに限定されない。局所投与可能な製剤は、例えば、約１％〜約１０％（ｗｔ／ｗｔ）の活性成分を含んでもよいが、活性成分の濃度は、溶媒中の活性成分の溶解限度と同じくらい高くてもよい。局所投与用の製剤は、本明細書に記載の１つ以上の追加の成分をさらに含んでもよい。
【０４０９】
医薬組成物は、口腔を介した肺投与に適した製剤で調製、包装、及び／または販売することができる。そのような製剤は、活性成分を含む乾燥粒子を含んでもよい。そのような組成物は、好都合には、噴射剤の流れが粉末を分散するように向けられ得る乾燥粉末リザーバーを含むデバイスを使用するか、及び／または密封容器内の低沸点噴射剤に溶解及び／または懸濁した活性成分を含むデバイスなどの自己推進溶媒／粉末分配容器を使用する投与用の乾燥粉末の形態である。乾燥粉末組成物には、砂糖などの固体微粉末希釈剤を含むことができ、単位用量形態で便利に提供される。
【０４１０】
低沸点噴射剤には、一般に、大気圧で沸点が６５°Ｆ未満の液体噴射剤が含まれる。一般に、推進剤は組成物の５０％〜９９．９％（ｗｔ／ｗｔ）を構成してもよく、活性成分は組成物の０．１％〜２０％（ｗｔ／ｗｔ）を構成してもよい。噴射剤は、液体非イオン性及び／または固体陰イオン性界面活性剤及び／または固体希釈剤（活性成分を含む粒子と同程度の粒径を有し得る）などの追加成分をさらに含み得る。
【０４１１】
肺送達用に製剤化された医薬組成物は、溶液及び／または懸濁液の液滴の形態で活性成分を提供し得る。そのような製剤は、活性成分を含む、必要に応じて滅菌された水性及び／または希釈アルコール溶液及び／または懸濁液として調製、包装、及び／または販売され得、任意の噴霧及び／または噴霧デバイスを使用して都合よく投与され得る。そのような製剤は、サッカリンナトリウムなどの香味剤、揮発性油、緩衝剤、界面活性剤、及び／またはメチルヒドロキシベンゾエートなどの保存剤を含むがこれらに限定されない１つ以上の追加成分をさらに含んでもよい。この投与経路により提供される液滴は、約１ｎｍ〜約２００ｎｍの範囲の平均直径を有し得る。
【０４１２】
本明細書で肺送達に有用であると記載されている製剤は、医薬組成物の鼻腔内送達に有用である。鼻腔内投与に適した別の製剤は、活性成分を含み、約０．２μｍ〜５００μｍの平均粒子を有する粗い粉末である。そのような製剤は、嗅ぎタバコを摂取する方法で、すなわち鼻の近くに保持された粉末の容器から鼻道を介して急速に吸入することにより投与される。
【０４１３】
経鼻投与に適した製剤は、例えば、約０．１％（ｗｔ／ｗｔ）という少量から約１００％（ｗｔ／ｗｔ）という多量までの活性成分を含んでもよく、本明細書に記載の１つ以上の追加成分を含んでもよい。医薬組成物は、頬側投与に適した製剤で調製、包装、及び／または販売することができる。そのような製剤は、例えば、従来の方法を使用して作られた錠剤及び／またはロゼンジの形態であり得、例えば、０．１％〜２０％（ｗｔ／ｗｔ）の活性成分であり得、残りは経口溶解性及び／または分解性組成物、ならびに必要に応じて、本明細書に記載の１つ以上の追加成分を含む。代替的に、口腔投与に適した製剤は、活性成分を含む粉末及び／またはエアロゾル化及び／または噴霧化された溶液及び／または懸濁液を含み得る。そのような粉末、エアロゾル化、及び／またはエアロゾル化された製剤は、分散されるとき、約０．１ｎｍ〜約２００ｎｍの範囲の平均粒子及び／または液滴サイズを有し、さらに本明細書に記載の１つ以上の追加成分を含んでもよい。
【０４１４】
医薬組成物は、点眼に適した製剤で調製、包装、及び／または販売することができる。そのような製剤は、例えば、水性または油性液体賦形剤中の活性成分の０．１／１．０％（ｗｔ／ｗｔ）溶液及び／または懸濁液を含む点眼薬の形態であってもよい。そのような液滴は、緩衝剤、塩、及び／または本明細書に記載の任意の追加の成分のうちの１つ以上をさらに含み得る。有用な他の眼科的に投与可能な製剤には、微結晶形態及び／またはリポソーム製剤中の活性成分を含むものが含まれる。点耳薬及び／または点眼薬は、本開示の範囲内であると考えられる。
【０４１５】
細胞内でポリペプチドを産生する方法
本開示は、哺乳動物細胞において目的のポリペプチドを産生する方法を提供する。ポリペプチドを産生する方法は、目的のポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含むＬＮＰを含む本開示の製剤と細胞を接触させることを含む。細胞を脂質ナノ粒子と接触させると、ｍＲＮＡが取り込まれ、細胞内で翻訳されて、目的のポリペプチドが産生され得る。
【０４１６】
一般に、哺乳動物細胞を目的のポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含むＬＮＰと接触させるステップは、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、培養内、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施され得る。細胞と接触する脂質ナノ粒子の量、及び／またはその中のｍＲＮＡの量は、接触する細胞または組織の型、投与手段、その中の脂質ナノ粒子及びｍＲＮＡの物理化学的特性（例えばサイズ、荷電、化学組成）、ならびにその他の要因に依存し得る。一般に、脂質ナノ粒子の有効量は、細胞内での効率的なポリペプチド産生を可能にする。効率の測定基準には、ポリペプチドの翻訳（ポリペプチドの発現によって示される）、ｍＲＮＡ分解のレベル、及び免疫応答の指標が含まれ得る。
【０４１７】
ｍＲＮＡを含むＬＮＰを細胞と接触させるステップは、トランスフェクションを含むか、または引き起こしてもよい。ＬＮＰの脂質成分に含まれるリン脂質は、例えば、細胞膜または細胞内膜と相互作用及び／または融合することにより、トランスフェクションを促進し、及び／またはトランスフェクション効率を高め得る。トランスフェクションにより、細胞内のｍＲＮＡの翻訳が可能になる。
【０４１８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子は治療的に使用され得る。例えば、ＬＮＰに含まれるｍＲＮＡは、治療用ポリペプチドをコードし（例えば、翻訳可能な領域内）、細胞への接触及び／または侵入（例えば、トランスフェクション）時に治療用ポリペプチドを産生し得る。他の実施形態では、ＬＮＰに含まれるｍＲＮＡは、対象の免疫を改善または増加させる可能性があるポリペプチドをコードしてもよい。例えば、ｍＲＮＡは顆粒球コロニー刺激因子またはトラスツズマブをコードしてもよい。
【０４１９】
いくつかの実施形態では、ＬＮＰに含まれるｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子と接触する細胞に実質的に存在しない可能性のある１つ以上のポリペプチドを置き換えることのできる組換えポリペプチドをコードし得る。１つ以上の実質的に存在しないポリペプチドは、コード遺伝子またはその調節経路の遺伝的変異のために欠けている可能性がある。代替的に、ｍＲＮＡの翻訳により産生される組換えポリペプチドは、細胞内、細胞表面上に存在、または細胞から分泌される内因性タンパク質の活性に拮抗してもよい。拮抗組換えポリペプチドは、内因性タンパク質の活性によって引き起こされる有害な影響、例えば、変異によって引き起こされる活性の変化または局在化と戦うために望ましい場合がある。別の代替として、ｍＲＮＡの翻訳により産生される組換えポリペプチドは、細胞内、細胞表面上に存在、または細胞から分泌される生物学的部分の活性に間接的または直接的に拮抗してもよい。拮抗される生物学的部分には、脂質（例えば、コレステロール）、リポタンパク質（例えば、低密度リポタンパク質）、核酸、炭水化物、及び小分子毒素が含まれるが、これらに限定されない。ｍＲＮＡの翻訳によって産生される組換えポリペプチドは、核などの特定のコンパートメント内など、細胞内での局在化のために改変されるか、または細胞からの分泌もしくは細胞の原形質膜への移行のために改変することができる。
【０４２０】
いくつかの実施形態では、細胞をｍＲＮＡを含むＬＮＰと接触させると、外因性核酸に対する細胞の自然免疫応答が低下し得る。細胞は、翻訳可能な領域を含む第１の外因性ｍＲＮＡの第１の量を含む第１の脂質ナノ粒子と接触し、第１の外因性ｍＲＮＡに対する細胞の自然免疫応答のレベルが決定され得る。続いて、細胞を、第１の量と比較してより少ない量の第１の外因性ｍＲＮＡの第２の量を含む第２の組成物と接触させることができる。代替的に、第２の組成物は、第１の外因性ｍＲＮＡとは異なる第２の外因性ｍＲＮＡを第１の量で含んでもよい。細胞を第１及び第２の組成物と接触させるステップは、１回以上繰り返されてもよい。さらに、細胞におけるポリペプチド産生（例えば、翻訳）の効率を必要に応じて決定することができ、標的タンパク質産生効率が達成されるまで、細胞を第１及び／または第２の組成物と繰り返し接触させることができる。
【０４２１】
細胞及び臓器に治療薬を送達する方法
本開示は、核酸などの治療薬及び／または予防薬を哺乳動物の細胞または臓器に送達する方法を提供する。細胞への治療薬及び／または予防薬の送達は、核酸などの治療薬及び／または予防薬を含むＬＮＰを含む本開示の製剤を対象に投与することを含み、組成物の投与は細胞を組成物と接触させることを含む。例えば、タンパク質、細胞傷害剤、放射性イオン、化学療法剤、または核酸（ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡなど）を細胞または臓器に送達してもよい。治療薬及び／または予防薬がｍＲＮＡである場合、細胞を脂質ナノ粒子と接触させると、翻訳可能なｍＲＮＡが細胞内で翻訳されて、目的のポリペプチドが産生され得る。しかしながら、実質的に翻訳可能でないｍＲＮＡも細胞に送達され得る。実質的に翻訳可能でないｍＲＮＡはワクチンとして有用であり得、及び／または細胞内での他の種の発現を減らすために細胞の翻訳成分を隔離し得る。
【０４２２】
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、特定の型またはクラスの細胞（例えば、特定の臓器またはその系の細胞）を標的化し得る。例えば、目的の治療薬及び／または予防薬を含むＬＮＰは、哺乳動物の肝臓、腎臓、脾臓、大腿骨、または肺に特異的に送達され得る。特定のクラスの細胞、臓器、またはその系もしくは群への特異的な送達は、治療薬及び／または予防薬を含む脂質ナノ粒子のより高い割合が、例えば、哺乳動物へのＬＮＰの投与時に、他の目的地に比べて目的の目的地（例えば組織）に送達されることである。いくつかの実施形態では、特異的な送達により、標的とする目的地（例えば、肝臓などの目的の組織）の組織１ｇあたりの治療薬及び／または予防薬の量が、別の目的地（例えば、脾臓）と比較したときの、２倍、５倍、１０倍、１５倍、または２０倍を超えて増加し得る。いくつかの実施形態では、目的の組織は、肝臓、腎臓、肺、脾臓、大腿骨、血管内（例えば、冠内もしくは大腿内）の血管内皮または腎臓、及び腫瘍組織（例えば、腫瘍内注射）からなる群から選択される。
【０４２３】
標的化または特異的送達の別の例として、タンパク質結合パートナー（例えば、抗体もしくはその機能的フラグメント、足場タンパク質、もしくはペプチド）または細胞表面上の受容体をコードするｍＲＮＡがＬＮＰに含まれてもよい。さらにまたは代わりに、ｍＲＮＡを使用して、脂質、糖、または他の生物学的部分の合成及び細胞外局在化を誘導してもよい。代替的に、ＬＮＰが受容体を含む標的細胞集団とより容易に相互作用できるように、特定の受容体（例えば、低密度リポタンパク質受容体）に対する親和性に基づいて、ＬＮＰの他の治療薬及び／または予防薬または要素（例えば、脂質またはリガンド）を選択してもよい。例えば、リガンドには、特定の結合対のメンバー、抗体、モノクローナル抗体、Ｆｖフラグメント、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、単一ドメイン抗体、ラクダ化抗体及びそのフラグメント、ヒト化抗体及びそのフラグメント、及びその多価バージョン；ジスルフィド安定化Ｆｖフラグメント、ｓｃＦｖタンデム、ダイアボディ、トリボディ、またはテトラボディなどの単一または二重特異性抗体を含む多価結合試薬；ならびにアプタマー、受容体、融合タンパク質が含まれ得るが、これらに限定されない。
【０４２４】
いくつかの実施形態では、リガンドは、細胞標的化特異性の調整を可能にできる表面結合抗体であってもよい。これは、非常に特異的な抗体が目的の標的部位の目的のエピトープに対して産生できるため、特に有用である。いくつかの実施形態では、複数の抗体が細胞の表面に発現し、各抗体は所望の標的に対して異なる特異性を有し得る。そのようなアプローチは、標的化相互作用の結合力及び特異性を高めることができる。
【０４２５】
リガンドは、例えば、細胞の所望の局在化または機能に基づいて、生物学分野の当業者によって選択され得る。例えば、タモキシフェンなどのエストロゲン受容体リガンドは、細胞表面のエストロゲン受容体の数が増加しているエストロゲン依存性の乳癌細胞に、細胞を標的化することができる。リガンド／受容体相互作用の他の非限定的な例には、ＣＣＲ１（例えば、関節リウマチ及び／または多発性硬化症の炎症関節組織または脳の治療用）、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８（例えば、リンパ節組織を標的とする）、ＣＣＲ６、ＣＣＲ９、ＣＣＲ１０（例えば、腸組織を標的とする）、ＣＣＲ４、ＣＣＲ１０（例えば、皮膚を標的とするため）、ＣＸＣＲ４（例えば、一般的な遊出の促進）、ＨＣＥＬＬ（例えば、炎症及び炎症性障害の治療用、骨髄）、Ａｌｐｈａ４ｂｅｔａ７（例えば、腸粘膜を標的とするため）、及びＶＬＡ−４ＮＣＡＭ−１（例えば、内皮を標的とする）が含まれる。一般に、標的化（例えば、がん転移）に関与する任意の受容体は、本明細書に記載の方法及び組成物で使用するために利用することができる。
【０４２６】
標的化細胞には、肝細胞、上皮細胞、造血細胞、上皮細胞、内皮細胞、肺細胞、骨細胞、幹細胞、間葉細胞、神経細胞、心臓細胞、脂肪細胞、血管平滑筋細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、ベータ細胞、下垂体細胞、滑膜細胞、卵巣細胞、精巣細胞、線維芽細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、網状赤血球、白血球、顆粒球、及び腫瘍細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【０４２７】
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは肝細胞を標的化してもよい。アポリポタンパク質Ｅ（ａｐｏＥ）などのアポリポタンパク質は、体内の中性または中性に近い脂質含有脂質ナノ粒子と結合することが示されており、肝細胞の表面に見出される低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）などの受容体と結合することが知られている。したがって、対象に投与される中性または中性に近い電荷を有する脂質成分を含むＬＮＰは、対象の体内でａｐｏＥを獲得し得、その後、ＬＤＬＲを含む肝細胞に治療薬及び／または予防薬（例えばＲＮＡ）を、標的化した方法で送達し得る。
【０４２８】
疾患及び障害の治療方法
脂質ナノ粒子は、疾患、障害、または状態の治療に有用であり得る。特に、そのような組成物は、タンパク質またはポリペプチドの活性の欠如または異常を特徴とする疾患、障害、または状態の治療に有用であり得る。例えば、欠如または異常なポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含むＬＮＰを含む本開示の製剤は、細胞に投与または送達されてもよい。ｍＲＮＡのその後の翻訳はポリペプチドを産生し、それにより、ポリペプチドによって引き起こされる活性の欠如または異常な活性によって引き起こされる問題を軽減または排除することができる。翻訳は急速に起こる可能性があるため、この方法及び組成物は、敗血症、脳卒中、及び心筋梗塞などの急性疾患、障害、または状態の治療に有用であり得る。ＬＮＰに含まれる治療薬及び／または予防薬はまた、特定の種の転写速度を変えることができ、それにより遺伝子発現に影響を及ぼすことができる。
【０４２９】
組成物を投与できる機能不全または異常なタンパク質またはポリペプチドの活性を特徴とする疾患、障害、及び／または状態には、まれな疾患、感染症（ワクチンと治療薬の両方として）、がん及び増殖性疾患、遺伝病（例えば、嚢胞性線維症）、自己免疫疾患、糖尿病、神経変性疾患、心血管疾患及び腎血管疾患、ならびに代謝疾患が含まれるが、これらに限定されない。複数の疾患、障害、及び／または状態は、タンパク質活性の欠如（または実質的に減少して適切なタンパク質機能が発生しないようになる）によって特徴付けられ得る。そのようなタンパク質は存在しないか、本質的に機能しない場合がある。機能不全タンパク質の具体例は、嚢胞性線維症を引き起こす嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）タンパク質の機能不全タンパク質バリアントを産生するＣＦＴＲ遺伝子のミスセンス変異バリアントである。本開示は、ＲＮＡを含むＬＮＰならびに式（Ｉ）による脂質、リン脂質（必要に応じて不飽和）、ＰＥＧ脂質、及び構造脂質を含む脂質成分を投与することにより、対象におけるそのような疾患、障害、及び／または状態を治療する方法であって、ＲＮＡが、対象の細胞に存在する異常なタンパク質活性に拮抗するか、さもなければ克服するポリペプチドをコードするｍＲＮＡであり得る、方法を提供する。
【０４３０】
本開示は、核酸などの１つ以上の治療薬及び／または予防薬を含む脂質ナノ粒子ならびにそれを含む医薬組成物の投与を含む方法を提供する。治療薬及び予防薬という用語は、本開示の特徴及び実施形態に関して本明細書で互換可能に使用することができる。治療組成物、またはそのイメージング、診断、または予防組成物は、疾患、障害、及び／または状態の予防、治療、診断、またはイメージング、及び／または他の目的のために有効な任意の合理的な量及び任意の投与経路を使用して対象に投与することができる。特定の対象に投与される具体的な量は、対象の種、年齢、及び全身状態；管理の目的；特定の組成物；管理モード；などに応じて変動し得る。本開示による組成物は、投与の容易性及び投与量の均一性のために、単位剤形で製剤化され得る。しかしながら、本開示の組成物の毎日の総使用量は、健全な医学的判断の範囲内で主治医によって決定されることが理解されるであろう。特定の患者の特定の治療上有効、予防上有効、またはその他の適切な用量レベル（例えば、イメージング用）は、存在する場合の、治療中の障害の重症度及び識別；使用される１つ以上の治療薬及び／または予防薬；採用された特定の組成；患者の年齢、体重、全体的な健康状態、性別、及び食事；採用される特定の医薬組成物の投与時間、投与経路、及び排泄速度；治療期間；使用される特定の医薬組成物と組み合わせてまたは同時に使用される薬物；ならびに医学の分野で周知の同様の要因を含む様々な要因に依存するであろう。
【０４３１】
核酸などの１つ以上の治療薬及び／または予防薬を含むＬＮＰは、任意の経路で投与することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の脂質ナノ粒子を含む予防薬、診断薬、またはイメージング組成物を含む組成物は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、くも膜下腔内、皮下、脳室内、経皮または皮内、皮内、直腸、膣内、腹腔内、局所（例えば、粉末、軟膏、クリーム、ゲル、ローション、及び／または液滴による）、粘膜、鼻、頬、腸内、硝子体内、腫瘍内、舌下、鼻腔内；気管内点滴、気管支点滴、及び／または吸入による；経口スプレー及び／または粉末、鼻スプレー、及び／またはエアロゾルとして、及び／または門脈カテーテルを通して、を含む様々な経路の１つ以上により投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、静脈内、筋肉内、皮内、動脈内、腫瘍内、皮下、または吸入により投与され得る。しかしながら、本開示は、薬物送達の科学における可能性のある進歩を考慮した任意の適切な経路による本明細書に記載の組成物の送達または投与を包含する。一般に、最も適切な投与経路は、１つ以上の治療薬及び／または予防薬を含む脂質ナノ粒子の性質（例えば、血流及び消化管などの様々な身体環境での安定性）、患者の状態（例えば、患者が特定の投与経路に耐えられるかどうか）などを含む様々な要因に依存するであろう。
【０４３２】
いくつかの実施形態では、本開示による組成物は、所定の用量あたり、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜約２．５ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約２．５ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約２．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約２．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約２．５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約２．５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ〜約２．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜約０．２５ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約０．２５ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約０．２５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約０．２５ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約０．２５ｍｇ／ｋｇ、または約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約０．２５ｍｇ／ｋｇの治療薬及び／または予防薬（例えば、ｍＲＮＡ）を送達するのに十分な投与量で投与され、１ｍｇ／ｋｇの用量（ｍｐｋ）は、対象の体重１ｋｇあたり１ｍｇの治療薬及び／または予防薬を提供する。いくつかの実施形態では、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの用量のＬＮＰの治療薬及び／または予防薬（例えばｍＲＮＡ）を投与することができる。他の実施形態では、約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約２．５ｍｇ／ｋｇの用量の治療薬及び／または予防薬を投与することができる。いくつかの実施形態では、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇの用量を投与することができる。他の実施形態では、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約０．２５ｍｇ／ｋｇの用量を投与することができる。所望のレベルのｍＲＮＡの発現及び／または治療、診断、予防、もしくはイメージング効果を得るために、用量を１日１回以上、同一または異なる量で投与してもよい。所望の投与量は、例えば、１日３回、１日２回、１日１回、１日おき、３日ごと、毎週、２週間ごと、３週間ごと、または４週間ごとに送達することができる。いくつかの実施形態では、所望の投与量は、複数回投与（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、またはそれ以上の投与）を使用して送達され得る。いくつかの実施形態では、単回投与は、例えば、外科的処置の前もしくは後に、または急性の疾患、障害、もしくは状態の場合に投与され得る。
【０４３３】
核酸などの１つ以上の治療薬及び／または予防薬を含む脂質ナノ粒子は、１つ以上の他の治療薬、予防薬、診断薬、または造影剤と組み合わせて使用することができる。「組み合わせて」によって、薬剤を同時に投与し、及び／または一緒に送達するために製剤化しなければならないことを意味するものではないが、これらの送達方法は本開示の範囲内である。例えば、１つ以上の異なる治療薬及び／または予防薬を含む１つ以上の脂質ナノ粒子を組み合わせて投与することができる。組成物は、１つ以上の他の望ましい治療法または医療処置と同時に、その前に、またはその後に投与することができる。概して、各薬剤は、その薬剤について決定された用量及び／またはタイムスケジュールで投与される。いくつかの実施形態では、本開示は、組成物、あるいはそのバイオアベイラビリティを改善し、代謝を低減及び／または変更し、排泄を阻害し、及び／または体内での分布を変更する薬剤と組み合わせたそのイメージング、診断、または予防組成物の送達を包含する。
【０４３４】
さらに、組み合わせて利用される治療的、予防的、診断的、またはイメージング活性剤は、単一の組成物で一緒に投与されるか、または異なる組成物で別々に投与され得ることがさらに理解されよう。概して、組み合わせて使用される薬剤は、個別に使用されるレベルを超えないレベルで使用されることが予想される。いくつかの実施形態では、組み合わせて使用されるレベルは、個別に使用されるレベルよりも低くなり得る。
【０４３５】
併用レジメンで使用する特定の療法（治療薬または手順）の組み合わせは、望ましい治療法及び／または手順、ならびに達成すべき望ましい治療効果の適合性を考慮に入れる。また、採用される治療法は、同一の障害に対して望ましい効果を達成できること（例えば、がんの治療に有用な組成物を化学療法剤と同時に投与できる）、または異なる効果を達成できること（例えば、インフュージョンリアクションなどの任意の有害作用の制御）もまた評価されるであろう。
【０４３６】
組成物の有効性及び／または治療濃度域を増加させるために、ＬＮＰを薬剤と組み合わせて使用してもよい。そのような薬剤は、例えば、抗炎症化合物、ステロイド（例えば、コルチコステロイド）、スタチン、エストラジオール、ＢＴＫ阻害剤、Ｓ１Ｐ１アゴニスト、グルココルチコイド受容体モジュレーター（ＧＲＭ）、または抗ヒスタミンであってよい。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、デキサメタゾン、メトトレキサート、アセトアミノフェン、Ｈ１受容体遮断薬、またはＨ２受容体遮断薬と組み合わせて使用できる。いくつかの実施形態では、それを必要とする対象を治療する方法、あるいは対象（例えば哺乳動物）に治療薬及び／または予防薬を送達する方法は、ＬＮＰを投与する前に１つ以上の薬剤で対象を前処理することを含み得る。例えば、対象は、有用な量（例えば、１０ｍｇ、２０ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、６０ｍｇ、７０ｍｇ、８０ｍｇ、９０ｍｇ、１００ｍｇ、または任意のその他の有用な量）のデキサメタゾン、メトトレキサート、アセトアミノフェン、Ｈ１受容体遮断薬、またはＨ２受容体遮断薬で前処理し得る。前処理は、脂質ナノ粒子の投与前２４時間以内（例えば、２４時間、２０時間、１６時間、１２時間、８時間、４時間、２時間、１時間、５０分、４０分、３０分、２０分、または１０分）に行われ得、例えば、投与量を増やして１回、２回、またはそれ以上の回数で起こり得る。
【０４３７】
当業者は、日常的な実験にすぎないものを用いて、本明細書において記載される本開示による具体的な実施形態に対する多くの均等物を認識するか、またはそれを確かめることができるであろう。本開示の範囲は、上記の説明に限定されることを意図するものではなく、添付した特許請求の範囲に記述されるようなものである。
【０４３８】
定義
本明細書で使用されるとき、「アルキル」または「アルキル基」という用語は、１つ以上の炭素原子（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上の炭素原子）を含む直鎖または分岐の、必要に応じて置換されている飽和炭化水素を意味する。「Ｃ１−１４アルキル」という表記は、１〜１４の炭素原子を含む、必要に応じて置換されている、直鎖または分岐の飽和炭化水素を意味する。別段の定めがない限り、本明細書に記載のアルキル基は、非置換及び置換アルキル基の両方を指す。
【０４３９】
本明細書で使用されるとき、「アルケニル」または「アルケニル基」という用語は、２つ以上の炭素原子（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上の炭素原子）及び少なくとも１つの二重結合を含む直鎖または分岐の、必要に応じて置換されている炭化水素を意味する。「Ｃ２−１４アルケニル」という表記は、２〜１４の炭素原子及び少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む、必要に応じて置換されている、直鎖または分岐の炭化水素を意味する。アルケニル基は、１、２、３、４、またはそれ以上の炭素−炭素二重結合を含んでもよい。例えば、Ｃ１８アルケニルは、１つ以上の二重結合を含んでもよい。２つの二重結合を含むＣ１８アルケニル基はリノレイル基であり得る。別段の定めがない限り、本明細書に記載のアルケニル基は、非置換及び置換アルケニル基の両方を指す。
【０４４０】
本明細書で使用されるとき、「アルキニル」または「アルキニル基」という用語は、２つ以上の炭素原子（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上の炭素原子）及び少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含む直鎖または分岐の、必要に応じて置換されている炭化水素を意味する。「Ｃ２−１４アルキニル」という表記は、２〜１４の炭素原子及び少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含む、必要に応じて置換されている、直鎖または分岐の炭化水素を意味する。アルキニル基は、１、２、３、４、またはそれ以上の炭素−炭素三重結合を含んでもよい。例えば、Ｃ１８アルキニルは、１つ以上の炭素−炭素三重結合を含んでもよい。別段の定めがない限り、本明細書に記載のアルキニル基は、非置換及び置換アルキニル基の両方を指す。
【０４４１】
本明細書で使用されるとき、「炭素環」または「炭素環式基」という用語は、炭素原子の１つ以上の環を含む必要に応じて置換された単環式または多環式系を意味する。環は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０員環である。「Ｃ３−６炭素環」という表記は、３〜６つの炭素原子を有する単環を含む炭素環を意味する。炭素環は、１つ以上の炭素−炭素二重結合または三重結合を含んでもよく、非芳香族または芳香族（例えば、シクロアルキルまたはアリール基）でもよい。炭素環の例には、シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル、フェニル、ナフチル、及び１，２−ジヒドロナフチル基が含まれる。本明細書で使用されるとき、「シクロアルキル」という用語は、非芳香族炭素環を意味し、任意の二重結合または三重結合を含んでも含まなくてもよい。特に明記しない限り、本明細書に記載の炭素環は、非置換及び置換炭素環基の両方、すなわち、必要に応じて置換された炭素環を指す。
【０４４２】
本明細書で使用されるとき、「複素環」または「複素環基」という用語は、１つ以上の環を含み、少なくとも１つの環が少なくとも１つのヘテロ原子を含み、必要に応じて置換された単環式または多環式系を意味する。ヘテロ原子は、例えば、窒素、酸素、または硫黄原子であり得る。環は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４員環である。複素環は、１つ以上の二重結合または三重結合を含んでもよく、非芳香族または芳香族（例えば、ヘテロシクロアルキルまたはヘテロアリール基）でもよい。複素環の例には、イミダゾリル、イミダゾリジニル、オキサゾリル、オキサゾリジニル、チアゾリル、チアゾリジニル、ピラゾリジニル、ピラゾリル、イソオキサゾリジニル、イソオキサゾリル、イソチアゾリジニル、イソチアゾリル、モルホリニル、ピロリニル、ピロリジニル、フリル、テトラヒドロフリル、チオフェニル、ピリジニル、ピペリジニル、キノリル、及びイソキノリル基が含まれる。本明細書で使用されるとき、「ヘテロシクロアルキル」という用語は、非芳香族複素環を意味し、任意の二重結合または三重結合を含んでも含まなくてもよい。特に明記しない限り、本明細書に記載の複素環は、非置換及び置換複素環基の両方、すなわち、必要に応じて置換された複素環を指す。
【０４４３】
本明細書で使用されるとき、「生分解性基」とは、哺乳動物実体内で脂質のより速い代謝を促進し得る基である。生分解性グループは、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、アリール基、及びヘテロアリール基からなる群から選択され得るが、これらに限定されない。本明細書で使用されるとき、「アリール基」は、１つ以上の芳香環を含む必要に応じて置換された炭素環式基である。アリール基の例には、フェニル及びナフチル基が含まれる。本明細書で使用されるとき、「ヘテロアリール基」は、１つ以上の芳香環を含む必要に応じて置換された複素環基である。ヘテロアリール基の例には、ピロリル、フリル、チオフェニル、イミダゾリル、オキサゾリル、及びチアゾリルが含まれる。アリール基とヘテロアリール基の両方が任意に置換されていてもよい。例えば、Ｍ及びＭ’は、必要に応じて置換されたフェニル、オキサゾール、及びチアゾールからなる非限定的な群から選択され得る。本明細書の式において、Ｍ及びＭ’は、上述の生分解性基のリストから独立して選択することができる。特に明記しない限り、本明細書に記載のアリールまたはヘテロアリール基は、非置換及び置換基の両方、すなわち、必要に応じて置換されたアリールまたはヘテロアリール基を指す。
【０４４４】
アルキル、アルケニル、及びシクリル（例えば、カルボシクリル及びヘテロシクリル）基は、特に明記しない限り、必要に応じて置換されてもよい。必要に応じた置換基は、ハロゲン原子（例えば、塩化物、臭化物、フッ化物、またはヨウ化物基）、カルボン酸（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ）、アルコール（例えば、ヒドロキシル、−ＯＨ）、エステル（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＯＲまたは−ＯＣ（Ｏ）Ｒ）、アルデヒド（例えば、−Ｃ（Ｏ）Ｈ）、カルボニル（例えば、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、代替的にＣ＝Ｏで表される）、ハロゲン化アシル（例えば、−Ｃ（Ｏ）Ｘ、式中、Ｘは臭化物、フッ化物、塩化物、及びヨウ化物から選択されるハロゲン化物）、炭酸塩（例えば、−ＯＣ（Ｏ）ＯＲ）、アルコキシ（例えば、−ＯＲ）、アセタール（例えば、−Ｃ（ＯＲ）２Ｒ””、式中、各ＯＲは同一または異なるアルコキシ基であり、Ｒ””はアルキルまたはアルケニル基である）、リン酸塩（例えば、Ｐ（Ｏ）４３−）、チオール（例えば、−ＳＨ）、スルホキシド（例えば、−Ｓ（Ｏ）Ｒ）、スルフィン酸（例えば、−Ｓ（Ｏ）ＯＨ）、スルホン酸（例えば、−Ｓ（Ｏ）２ＯＨ）、チアール（例えば、−Ｃ（Ｓ）Ｈ）、硫酸塩（例えば、Ｓ（Ｏ）４２−）、スルホニル（例えば、−Ｓ（Ｏ）２−）、アミド（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、または−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ）、アジド（例えば、−Ｎ３）、ニトロ（例えば、−ＮＯ２）、シアノ（例えば、−ＣＮ）、イソシアノ（例えば、−ＮＣ）、アシルオキシ（例えば、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ）、アミノ（例えば、−ＮＲ２、−ＮＲＨ、または−ＮＨ２）、カルバモイル（例えば、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ２、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲＨ、または−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ２）、スルホンアミド（例えば、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲＨ、−Ｓ（Ｏ）２ＮＨ２、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｈ、または−Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｈ）、アルキル基、アルケニル基、及びシクリル（例えば、カルボシクリルまたはヘテロシクリル）基からなる群から選択され得るが、これらに限定されない。前述のいずれかにおいて、Ｒは、本明細書で定義されるアルキルまたはアルケニル基である。いくつかの実施形態では、置換基自体は、例えば、本明細書で定義される１、２、３、４、５、または６つの置換基でさらに置換されていてもよい。例えば、Ｃ１−６アルキル基は、本明細書に記載の１、２、３、４、５、または６つの置換基でさらに置換されていてもよい。
【０４４５】
約、およそ：本明細書で使用されるとき、「およそ」及び「約」という用語は、目的の１つ以上の値に適用される場合、言及された参照値に類似する値を指す。いくつかの実施形態では、「およそ」または「約」という用語は、特に明記されていない限り、または文脈から明らかでない限り（そのような数が可能な値の１００％を超える場合を除いて）、言及された参照値の２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％またはそれ以下のいずれかの方向（より大きいまたはより小さい）の範囲内の値の範囲を指す。例えば、ＬＮＰの脂質成分中の所定の化合物の量の文脈で使用されるとき、「約」は、言及された値の＋／−１０％を意味し得る。例えば、所与の化合物の約４０％を有する脂質成分を含むＬＮＰは、化合物の３０〜５０％を含み得る。
【０４４６】
本明細書で使用される場合、「化合物」という用語は、描かれた構造の全ての異性体及び同位体を含むことを意味する。「同位体」とは、原子番号が同一であるが、原子核内の中性子の数が異なるために質量数が異なる原子を指す。例えば、水素の同位体にはトリチウム及び重水素が含まれる。さらに、本開示の化合物、塩、または複合体は、溶媒または水分子と組み合わせて調製して、通常の方法により溶媒和物及び水和物を形成することができる。
【０４４７】
本明細書で使用されるとき、「接触させること」という用語は、２つ以上の実体間の物理的な接続を確立することを意味する。例えば、哺乳動物細胞をＬＮＰと接触させることは、哺乳動物細胞及びナノ粒子が物理的接続を共有するようにされることを意味する。ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｅｘ  ｖｉｖｏの両方で細胞を外部実体と接触させる方法は、生物学分野で周知である。例えば、ＬＮＰと哺乳動物内に配置された哺乳動物細胞とを接触させることは、様々な投与経路（例えば、静脈内、筋肉内、皮内、及び皮下）によって行われてよく、様々な量の脂質ナノ粒子を含み得る。さらに、１つを超える哺乳動物細胞をＬＮＰと接触させてもよい。
【０４４８】
本明細書で使用する場合、「送達すること」という用語は、実体を目的地に提供することを意味する。例えば、治療薬及び／または予防薬を対象に送達することは、治療薬及び／または予防薬を含むＬＮＰを対象に投与すること（例えば、静脈内、筋肉内、皮内、または皮下経路による）を含み得る。哺乳動物または哺乳動物細胞へのＬＮＰの投与は、１つ以上の細胞を脂質ナノ粒子と接触させることを含み得る。
【０４４９】
本明細書で使用されるとき、「増強された送達」という用語は、目的の標的組織への対照のナノ粒子（例えば、ＭＣ３、ＫＣ２、またはＤＬｉｎＤＭＡ）による治療薬及び／または予防薬の送達レベルと比較して、目的の標的組織（例えば、哺乳動物の肝臓）へのナノ粒子による治療薬及び／または予防薬のより多く（例えば、少なくとも１．５倍多く、少なくとも２倍多く、少なくとも３倍多く、少なくとも４倍多く、少なくとも５倍多く、少なくとも６倍多く、少なくとも７倍多く、少なくとも８倍多く、少なくとも９倍多く、少なくとも１０倍多く）の送達を意味する。特定の組織へのナノ粒子の送達レベルは、組織で産生されたタンパク質の量を前記組織の重量と比較すること、組織中の治療薬及び／または予防薬の量を前記組織の重量と比較すること、組織で産生されたタンパク質の量を前記組織の総タンパク質の量と比較すること、あるいは組織中の治療薬及び／または予防薬の量を前記組織の総治療薬及び／または予防薬の量と比較することによって測定され得る。標的組織へのナノ粒子の増強された送達は、治療されている対象において決定される必要はなく、動物モデル（例えば、ラットモデル）などの代替物で決定されてもよいことが理解されるであろう。
【０４５０】
本明細書で使用されるとき、「特異的な送達」、「特異的に送達する」、または「特異的に送達すること」という用語は、オフターゲット組織（例えば、哺乳動物の脾臓）と比較して、目的の標的組織（例えば、哺乳動物の肝臓）へのナノ粒子による治療薬及び／または予防薬のより多く（例えば、少なくとも１．５倍多く、少なくとも２倍多く、少なくとも３倍多く、少なくとも４倍多く、少なくとも５倍多く、少なくとも６倍多く、少なくとも７倍多く、少なくとも８倍多く、少なくとも９倍多く、少なくとも１０倍多く）の送達を意味する。特定の組織へのナノ粒子の送達レベルは、組織で産生されたタンパク質の量を前記組織の重量と比較すること、組織中の治療薬及び／または予防薬の量を前記組織の重量と比較すること、組織で産生されたタンパク質の量を前記組織の総タンパク質の量と比較すること、あるいは組織中の治療薬及び／または予防薬の量を前記組織の総治療薬及び／または予防薬の量と比較することによって測定され得る。例えば、腎血管標的化の場合、治療薬及び／または予防薬の全身投与後に肝臓または脾臓へと送達されることと比較して、組織１ｇあたり１．５倍、２倍、３倍、５倍、１０倍、１５倍、または２０倍多くの治療薬及び／または予防薬が腎臓に送達される場合、肝臓及び脾臓と比較して、哺乳動物の腎臓へと治療薬及び／または予防薬が特異的に提供される。標的組織へと特異的に送達されるナノ粒子の能力は、治療されている対象において決定される必要はなく、動物モデル（例えば、ラットモデル）などの代替物で決定されてもよいことが理解されるであろう。
【０４５１】
本明細書で使用されるとき、「カプセル化効率」とは、ＬＮＰの調製に使用される治療薬及び／または予防薬の初期総量に対する、ＬＮＰの一部となる治療薬及び／または予防薬の量を指す。例えば、組成物に最初に提供された合計１００ｍｇの治療薬及び／または予防薬のうち９７ｍｇの治療薬及び／または予防薬がＬＮＰにカプセル化される場合、カプセル化効率は９７％として与えられ得る。本明細書で使用されるとき、「カプセル化」は、完全な、実質的な、または部分的な封入、閉じ込め、囲い込み、または包装を指し得る。
【０４５２】
本明細書で使用されるとき、核酸配列の「発現」とは、ｍＲＮＡのポリペプチドもしくはタンパク質への翻訳及び／またはポリペプチドもしくはタンパク質の翻訳後修飾を指す。
【０４５３】
本明細書で使用されるとき、「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」という用語は、生物（例えば、動物、植物、または微生物）内よりも人工環境、例えば試験管または反応容器、細胞培養、ペトリ皿などで発生する事象を指す。
【０４５４】
本明細書で使用されるとき、「ｉｎ  ｖｉｖｏ」という用語は、生物（例えば、動物、植物、微生物、またはそれらの細胞もしくは組織）内で発生する事象を指す。
【０４５５】
本明細書で使用されるとき、「ｅｘ  ｖｉｖｏ」という用語は、生物（例えば、動物、植物、微生物、またはそれらの細胞もしくは組織）の外で発生する事象を指す。ｅｘ  ｖｉｖｏ事象は、天然（ｉｎ  ｖｉｖｏなど）環境から最小限に変更された環境で発生し得る。
【０４５６】
本明細書で使用されるとき、「異性体」という用語は、化合物の任意の幾何異性体、互変異性体、双性イオン、立体異性体、エナンチオマー、またはジアステレオマーを意味する。化合物は１つ以上のキラル中心及び／または二重結合を含んでもよく、したがって、二重結合異性体（すなわち、幾何学的Ｅ／Ｚ異性体）またはジアステレオマー（例えば、エナンチオマー（すなわち、（＋）もしくは（−））またはｃｉｓ／ｔｒａｎｓ異性体）などの立体異性体として存在し得る。本開示は、立体異性的に純粋な形態（例えば、幾何学的に純粋、エナンチオマー的に純粋、またはジアステレオマー的に純粋）ならびにエナンチオマー及び立体異性体の混合物、例えばラセミ体を含む、本明細書に記載の化合物のありとあらゆる異性体を包含する。化合物のエナンチオマー及び立体異性体の混合物、ならびにそれらをそれらの成分エナンチオマーまたは立体異性体に分割する手段はよく知られている。
【０４５７】
本明細書で使用されるとき、「脂質成分」とは、１つ以上の脂質を含む脂質ナノ粒子の成分である。例えば、脂質成分は、リン脂質などの１つ以上のカチオン性／イオン化可能、ＰＥＧ化、構造、または他の脂質を含んでもよい。
【０４５８】
本明細書で使用されるとき、「リンカー」は、２つの部分をつなぐ部分、例えばキャップ種の２つのヌクレオシド間の接続である。リンカーは、リン酸基（例えば、リン酸、ボラノリン酸、チオリン酸、セレノリン酸、及びホスホン酸）、アルキル基、アミデート、またはグリセロールを含むがこれらに限定されない１つ以上の基を含み得る。例えば、キャップ類似体の２つのヌクレオシドは、三リン酸基によって、または２つのリン酸部分とボラノリン酸部分を含む鎖によって、５’位置で連結され得る。
【０４５９】
本明細書で使用されるとき、「投与方法」には、静脈内、筋肉内、皮内、皮下、または対象に組成物を送達する他の方法が含まれ得る。投与方法は、身体の特定の領域または系への送達を標的とする（例えば、特異的に送達する）ように選択され得る。
【０４６０】
本明細書で使用されるとき、「修飾された」とは、非天然を意味する。例えば、ＲＮＡは修飾ＲＮＡであってもよい。すなわち、ＲＮＡは、天然に存在しない１つ以上の核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、またはリンカーを含んでもよい。「修飾された」種は、本明細書では「変更された」種と呼ばれることもある。種は、化学的、構造的、または機能的に修飾または変更されていてもよい。例えば、修飾された核酸塩基種には、天然に存在しない１つ以上の置換が含まれていてもよい。
【０４６１】
本明細書で使用されるとき、「Ｎ：Ｐ比」は、脂質中の（生理学的ｐＨ範囲内で）イオン化可能な窒素原子対ＲＮＡ、例えば脂質成分及びＲＮＡを含むＬＮＰ中のリン酸基のモル比である。
【０４６２】
本明細書で使用されるとき、「脂質ナノ粒子」は、１つ以上の脂質を含む組成物である。脂質ナノ粒子は、通常、マイクロメートルオーダーまたはそれ以下のサイズであり、脂質二重層を含んでもよい。本明細書で使用されるとき、脂質ナノ粒子は、特に明記しない限り、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リポソーム（例えば、脂質小胞）、及びリポプレックスを包含する。例えば、ＬＮＰは、直径が５００ｎｍ以下の脂質二重層を有するリポソームであり得る。
【０４６３】
本明細書で使用されるとき、「天然に存在する」とは、人工的な援助なしで天然に存在することを意味する。
【０４６４】
本明細書で使用されるとき、「患者」とは、治療を求めるかもしくは治療を必要とする、治療を要求する、治療を受けている、治療を受けようとする対象、または特定の疾患もしくは状態について訓練を受けた専門家による治療を受けている対象を指す。
【０４６５】
本明細書で使用されるとき、「ＰＥＧ脂質」または「ＰＥＧ化脂質」は、ポリエチレングリコール成分を含む脂質を指す。
【０４６６】
「薬学的に許容される」という語句は、妥当な医学的判断の範囲内で、妥当な利益／リスク比に見合って、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、またはその他の問題もしくは合併症もなくヒト及び動物の組織と接触させて使用するのに適した化合物、物質、組成物、及び／または剤形を指すために本明細書で使用される。
【０４６７】
本明細書で使用されるとき、「薬学的に許容される賦形剤」という語句は、本明細書に記載の化合物以外の任意の成分（例えば、活性化合物を懸濁、複合化、または溶解することができるビヒクル）を指し、患者において、実質的に無毒で非炎症性の特性を有する。賦形剤には、例えば、付着防止剤、酸化防止剤、結合剤、コーティング、圧縮補助剤、崩壊剤、染料（着色剤）、皮膚軟化剤、乳化剤、充填剤（希釈剤）、皮膜形成剤またはコーティング剤、香味剤、香料、流動促進剤（流動促進剤）、潤滑剤、保存剤、印刷インク、吸着剤、懸濁剤または分散剤、甘味料、及び水和水が含まれ得る。例示的な賦形剤には、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム（二塩基性）、ステアリン酸カルシウム、クロスカルメロース、架橋ポリビニルピロリドン、クエン酸、クロスポビドン、システイン、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、マルチトール、マンニトール、メチオニン、メチルセルロース、メチルパラベン、微結晶セルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポビドン、アルファ化デンプン、プロピルパラベン、パルミチン酸レチニル、シェラック、二酸化ケイ素、カルボキシメチルセルロースナトリウム、クエン酸ナトリウム、ナトリウムデンプングリコール酸、ソルビトール、デンプン（トウモロコシ）、ステアリン酸、スクロース、タルク、二酸化チタン、ビタミンＡ、ビタミンＥ（アルファトコフェロール）、ビタミンＣ、キシリトール、及び本明細書に開示されている他の種が含まれるが、これらに限定されない。
【０４６８】
組成物はまた、１つ以上の化合物の塩を含んでもよい。塩は、薬学的に許容される塩であり得る。本明細書で使用されるとき、「薬学的に許容される塩」とは、既存の酸または塩基部分をその塩形態に変換することにより（例えば、遊離塩基基を適切な有機酸と反応させることにより）親化合物が変更される、開示される化合物の誘導体を指す。薬学的に許容される塩の例には、アミンなどの塩基性残基の無機または有機酸塩、カルボン酸などの酸性残基のアルカリまたは有機塩などが含まれるが、これらに限定されない。代表的な酸付加塩には、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプトン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバレート、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸、吉草酸塩などが含まれる。代表的なアルカリまたはアルカリ土類金属塩には、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなど、ならびに無毒のアンモニウム、第４級アンモニウム、及びアンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなどを含むがこれらに限定されないアミンカチオンが含まれる。本開示の薬学的に許容される塩には、例えば、非毒性の無機酸または有機酸から形成される親化合物の従来の非毒性の塩が含まれる。本開示の薬学的に許容される塩は、従来の化学的方法により、塩基性または酸性部分を含む親化合物から合成することができる。一般的に、このような塩は、これらの化合物の遊離酸または塩基形態を、水中もしくは有機溶媒または２つの混合物中の化学量論的な量の適切な塩基または酸と反応させることによって調製することができ、一般に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルのような非水性媒体が好ましい。適切な塩のリストは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １７ｔｈ  ｅｄ．，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｅａｓｔｏｎ，  Ｐａ．，  １９８５，  ｐ．  １４１８、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ：  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，  ａｎｄ  Ｕｓｅ，  Ｐ．Ｈ．  Ｓｔａｈｌ  ａｎｄ  Ｃ．Ｇ．  Ｗｅｒｍｕｔｈ  （ｅｄｓ．），  Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，  ２００８、及びＢｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ６６，  １−１９  （１９７７）に見出され、その各々は参照により本明細書に組み込まれる。
【０４６９】
本明細書で使用されるとき、「リン脂質」は、リン酸部分と、不飽和脂肪酸鎖などの１つ以上の炭素鎖とを含む脂質である。リン脂質は、１つ以上の多重（例えば、二重または三重）結合（例えば、１つ以上の不飽和）を含んでもよい。リン脂質またはその類似体もしくは誘導体はコリンを含んでもよい。リン脂質またはその類似体もしくは誘導体はコリンを含まない場合がある。特定のリン脂質は、膜への融合を促進することができる。例えば、カチオン性リン脂質は、膜（例えば、細胞膜または細胞内膜）の１つ以上の負に荷電したリン脂質と相互作用できる。膜へのリン脂質の融合は、脂質含有組成物の１つ以上の要素が膜を通過することを可能にでき、例えば、１つ以上の要素の細胞への送達を可能にする。
【０４７０】
本明細書で使用されるとき、「多分散指数」は、系の粒径分布の均一性を表す比率である。例えば、０．３未満の小さい値は、狭い粒径分布を示す。
【０４７１】
本明細書で使用されるとき、両親媒性「ポリマー」は、オリゴマーまたはポリマーを含む両親媒性化合物である。例えば、両親媒性ポリマーは、２つ以上のＰＥＧモノマー単位などのオリゴマーフラグメントを含むことができる。例えば、本明細書に記載の両親媒性ポリマーはＰＳ  ２０であり得る。
【０４７２】
本明細書で使用されるとき、「ポリペプチド」または「目的のポリペプチド」という用語は、天然に（例えば、単離または精製）または合成的に生成できるペプチド結合により典型的に連結されるアミノ酸残基のポリマーを指す。
【０４７３】
本明細書で使用されるとき、「ＲＮＡ」とは、天然に存在するかまたは天然に存在しないリボ核酸を指す。例えば、ＲＮＡは、１つ以上の核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、またはリンカーなどの修飾された、及び／または天然に存在しない成分を含んでもよい。ＲＮＡは、キャップ構造、鎖終結ヌクレオチド、ステムループ、ポリＡ配列、及び／またはポリアデニル化シグナルを含み得る。ＲＮＡは、目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有し得る。例えば、ＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であってもよい。特定のポリペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳、例えば、哺乳動物細胞内のｍＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏ翻訳は、コードされたポリペプチドを産生し得る。ＲＮＡは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ダイサー基質ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ｍＲＮＡ、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、及びその混合物からなる非制限的な群から選択され得る。
【０４７４】
本明細書で使用されるとき、「単回単位用量」とは、１用量／一度／単一経路／単一接触点、すなわち単一投与事象で投与される任意の治療薬の用量である。
【０４７５】
本明細書で使用されるとき、「分割用量」は、単回単位用量または総１日用量を２つ以上の用量に分割することである。
【０４７６】
本明細書で使用されるとき、「総１日用量」は、２４時間の期間に投与されるか、または処方される量である。単回単位用量として投与してもよい。
【０４７７】
本明細書で使用されるとき、脂質ナノ粒子の文脈における「サイズ」または「平均サイズ」は、ＬＮＰの平均直径を指す。
【０４７８】
本明細書で使用されるとき、「対象」という用語は、例えば実験、診断、予防、及び／または治療目的で、本開示による組成物または製剤を投与することができる任意の生物を指す。典型的な対象には、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、及びヒトなどの哺乳動物）及び／または植物が含まれる。
【０４７９】
本明細書で使用されるとき、「標的細胞」とは、目的の任意の１つ以上の細胞を指す。細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｓｉｔｕ、または生物の組織もしくは臓器に見出し得る。生物は、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒト、最も好ましくは患者であり得る。
【０４８０】
本明細書で使用されるとき、「標的組織」とは、治療薬及び／または予防薬の送達が所望の生物学的及び／または薬理学的効果をもたらす、目的の１つ以上の組織タイプを指す。目的の標的組織の例には、特定の組織、臓器、及びそれらの系または群が含まれる。特定の用途において、標的組織は、腎臓、肺、脾臓、血管内（例えば、冠内または大腿内）の血管内皮、または腫瘍組織（例えば、腫瘍内注射による）であり得る。「オフターゲット組織」とは、コードされたタンパク質の発現が所望の生物学的及び／または薬理学的効果をもたらさない１つ以上の組織タイプを指す。特定の用途では、オフターゲット組織には肝臓及び脾臓が含まれ得る。
【０４８１】
「治療薬」または「予防薬」という用語は、対象に投与されたとき、治療効果、診断効果、及び／または予防効果を有し、及び／または所望の生物学的効果及び／または薬理効果を誘発する任意の薬剤を指す。治療薬は「活性分」または「活性剤」とも呼ばれる。そのような薬剤には、細胞毒素、放射性イオン、化学療法剤、小分子薬、タンパク質、及び核酸が含まれるが、これらに限定されない。
【０４８２】
本明細書で使用されるとき、「治療有効量」という用語は、感染、疾患、障害、及び／または状態の治療、症状の改善、診断、予防、及び／または発症の遅延のために、感染、疾患、障害、及び／または状態に苦しんでいるか、またはそれらに感染しやすい対象に投与されるときに十分な送達される薬剤（例えば、核酸、薬物、組成物、治療薬、診断薬、予防薬など）の量を意味する。
【０４８３】
本明細書で使用されるとき、「トランスフェクション」とは、種（例えば、ＲＮＡ）の細胞への導入を指す。トランスフェクションは、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｖｏで起こり得る。
【０４８４】
本明細書で使用されるとき、「治療する」という用語は、特定の感染、疾患、障害、及び／または状態の、１つ以上の症状または特徴を部分的もしくは完全に軽減、改善、改善、緩和、その発症の遅延、その進行の阻害、その重症度の低下、及び／またはその発生率の低下を指す。例えば、がんを「治療すること」とは、腫瘍の生存、増殖、及び／または拡大を抑制することを指し得る。治療は、疾患、障害、及び／または状態に関連する病態の発生のリスクを低減する目的で、疾患、障害、及び／または状態の兆候を示さない対象に、及び／または疾患、障害、及び／または状態の初期兆候のみを示す対象に投与され得る。
【０４８５】
本明細書で使用されるとき、「ゼータ電位」は、例えば粒子組成物中の脂質の動電学的電位である。
【０４８６】
特許請求の範囲において、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」などの記事は、反対の指示がない限り、または文脈から明白でない限り、１つ以上を意味し得る。グループの１つ以上のメンバー間の「または」を含むクレームまたは記載は、反対の指示がない限り、または文脈から明白でない限り、グループの１つ、１つを超える、または全てのメンバーが所与の製品またはプロセスに存在、採用、またはさもなくば関連する場合、満たされているとみなされる。本開示は、グループの厳密に１つのメンバーが、所与の製品またはプロセス存在、採用、またはさもなくば関連する実施形態を含む。本開示は、グループの１つを超える、または全てのメンバーが、所与の製品またはプロセス存在、採用、またはさもなくば関連する実施形態を含む。
【０４８７】
また、「含むこと」という用語は、オープンであることを意図しており、追加の要素またはステップの包含を許可するものであるが、その包含は必ずしも必要ではないことに留意されたい。本明細書で「含むこと」という用語が使用されるとき、「〜から本質的になる」及び「〜からなる」という用語もそれによって包含され、開示される。組成物が特定の成分を有する、含む、または含むと記載されている説明全体を通して、組成物はまた列挙された成分から本質的になるか、またはそれからなると考えられる。同様に、方法またはプロセスが特定のプロセスステップを有する、含む、または含むと記載されている場合、プロセスは記載された処理ステップから本質的になるか、またはそれからなる。さらに、ステップの順序または特定の行動を実行する順序は、本発明が動作可能なままである限り重要ではないことを理解されたい。さらに、２つ以上のステップまたは行動を同時に実行できる。
【０４８８】
範囲が指定されている場合、端点が含まれている。さらに、別段の指示がない限り、または文脈及び当業者の理解から明白でない限り、範囲として表される値は、本開示の異なる実施形態で述べられた範囲内の任意の特定の値または部分範囲を、文脈の別段の定めがない限り、範囲の下限の単位の１０分の１までをとることができることを理解されたい。
【０４８９】
さらに、先行技術に含まれる本開示の任意の特定の実施形態は、特許請求の範囲のうちのいずれか１つ以上から明示的に除外され得ることを理解されたい。そのような実施形態は、当業者に知られているとみなされるため、除外が本明細書に明示的に記載されていない場合でも、除外されてもよい。
【０４９０】
全ての引用元、例えば、参照文献、出版物、特許出願、データベース、データベース登録、及びここに引用された技術は、引用に明示的に記載されていない場合でも、参照により本出願に組み込まれる。引用された情報源及び本出願の記述が矛盾する場合、本出願の記述が優先するものとする。
【実施例】
【０４９１】
実施例１：ＰＥＧを脂質ナノ粒子に添加する方法を変更する。
脂質ナノ粒子の効力及び安定性に対する本開示の製造プロセスの効果を評価するために、表１に要約されているようにナノ粒子の５つのバッチが作製された。
【表１】
2020532528.tif 000046
【０４９２】
３つの異なる方法で形成されたＬＮＰを調査した。ＬＮＰは、粒子形成プロセスのみが大きく異なる。この例では、ＬＮＰは５０ｍｏｌ％のカチオン性脂質、１０ｍｏｌ％のＤＳＰＣ、３８．５ｍｏｌ％のコレステロール、及び１．５ｍｏｌ％のＰＥＧ−ＤＭＧを含んだ。全てのＬＮＰは、Ｔミキサーを使用したナノ沈殿反応によって形成された。しかしながら、３つの異なる手順（すなわち、標準、後挿入、後添加）が、ナノ沈殿反応後に使用された。標準手順は、（ｉ）エタノールに溶解した脂質と水溶液中のｍＲＮＡの間のナノ沈殿反応、（ｉｉ）タンジェント流濾過、及び（ｉｉｉ）最終濾過ステップを含んだ。ナノ沈殿反応で使用されるＰＥＧ−ＤＭＧのｍｏｌ％は、標準手順では１．５ｍｏｌ％であった。
【０４９３】
後挿入の手順は、（ｉ）エタノールに溶解した脂質と水溶液中のｍＲＮＡの間のナノ沈殿反応、（ｉｉ）特定の重量パーセンテージのＰＥＧ−ＤＭＧを含む溶液への得られた粒子の曝露、（ｉｉｉ）タンジェント流濾過、及び（ｉｖ）最終濾過ステップを含んだ。ナノ沈殿反応で使用されるＰＥＧ−ＤＭＧのｍｏｌ％は、粒子形成後の曝露ステップで使用されるＰＥＧ−ＤＭＧの量に応じて変化した。得られた粒子が１．０ｍｏｌ％ＰＥＧ−ＤＭＧに曝露されたとき、０．５ｍｏｌ％のＰＥＧ−ＤＭＧが使用された。ナノ沈殿反応で使用されるＰＥＧ−ＤＭＧのｍｏｌ％は、得られた粒子が０．５ｍｏｌ％のＰＥＧ−ＤＭＧに曝露されたとき、１．０ｍｏｌ％であった。
【０４９４】
後添加の手順は、（ｉ）エタノールに溶解した脂質と水溶液中のｍＲＮＡの間のナノ沈殿反応、（ｉｉ）タンジェント流濾過、（ｉｉｉ）特定の重量パーセンテージのＰＥＧ−ＤＭＧを含む溶液への濾過された粒子の曝露、及び（ｉｖ）最終濾過ステップを含んだ。ナノ沈殿反応で使用されるＰＥＧ−ＤＭＧのｍｏｌ％は、濾過後の曝露ステップで使用されるＰＥＧ−ＤＭＧの量に応じて変化した。濾過された粒子が１．０ｍｏｌ％ＰＥＧ−ＤＭＧに曝露されたとき、ナノ沈殿反応で使用されるＰＥＧ−ＤＭＧのｍｏｌ％は０．５ｍｏｌ％であった。ナノ沈殿反応で使用されるＰＥＧ−ＤＭＧのｍｏｌ％は、濾過された粒子が０．５ｍｏｌ％のＰＥＧ−ＤＭＧに曝露されたとき、１．０ｍｏｌ％であった。各手順で添加されるＰＥＧの量は、以下の表に示される。
【０４９５】
ナノ粒子は、イオン化可能脂質：ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＰＥＧ−２を、５０：１０：３８．５：１．５の最終モル比で含んだ。１．５ｍｏｌ％コア（対照）；１．０ｍｏｌ％コア；または０．５ｍｏｌ％コアＰＥＧを、ｔミックス中に添加した。後挿入プロセスで作製されたナノ粒子では、タンジェント流濾過（ＴＦＦ）の前にＰＥＧレベルが１．５ｍｏｌ％に調整された。後添加プロセスで作製されたナノ粒子では、滅菌濾過の前にＰＥＧレベルが１．５ｍｏｌ％に調整された。１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４を透析濾過緩衝液として使用し、９３ｍＭ  ｔｒｉｓ  ７．０ｗ％ＰＧ＋１ｍＭ  ＤＴＰＡ  ｐＨ  ７．４を最終緩衝液として使用した。最終的な脂質組成を表２に要約する。
【表２】
2020532528.tif 000047
【０４９６】
ｉｎ  ｖｉｖｏ研究
ｉｎ  ｖｉｖｏ試験では、表３に要約されているように、メスのＢａｌｂ／Ｃマウスに投与した。そして、ｇＢ  ＥＬＩＳＡ及びＰｅｎｔａｍｅｒ  ＥＬＩＳＡで分析した。
【表３】
2020532528.tif 000048
【０４９７】
粒子径の評価
粒径に対するＰＥＧ添加の影響は、様々な方法、例えば、動的光散乱またはナノ粒子追跡分析によって調査された。図１７及び１８を参照されたい。脂質は、小角Ｘ線散乱（ＳＡＸＳ）でも評価された。散乱曲線に基づいた明らかなコアシェル構造を示す試料は存在しないことが判明した。ＬＮＰサイズはプロセスによって異なる：バッチ１〜バッチ２＜バッチ３〜バッチ４＜バッチ５、これは距離分布関数からも示される。直径は、バッチ１及び２で約３５ｎｍ、バッチ３及び４で約４０ｎｍ、バッチ５で約５２ｎｍと推定された。ＳＡＸＳスペクトルは球状構造を示した。エンドトキシンレベルが決定され、全てのバッチで低いことが判明した（表４）。
【表４】
2020532528.tif 000049
【０４９８】
実施例２：ホルモンタンパク質の薬物動態研究
イオン化可能脂質及びＰＥＧ−１を含むナノ粒子組成物におけるｍＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏ発現に対する表５に要約されたプロセスの効果を評価した。要約された研究デザイン：ｉｖボーラス、単回投与、０．５ｍｐｋ、Ｎ＝４ラット／群、タンパク質ＰＫの毎日の採血（陰性対照としての投与前）。ホルモンタンパク質は分泌タンパク質であるため、血漿中のホルモンタンパク質の定量化によりｍＲＮＡの発現が試験される。結果を図３７に示す。
【表５】
2020532528.tif 000050
【０４９９】
実施例３：ｍＲＮＡ  ＬＮＰ製剤の効力及び安定性に対する後挿入及び後添加の影響。
脂質ナノ粒子の効力及び安定性に対する本開示の製造プロセスの影響を評価するために、様々な後挿入及び／または後添加条件で追加のＬＮＰ製剤を調製した。これらのＬＮＰ製剤の膜透過性、安定性、更新、及び／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏでの発現を試験した。例えば、図１Ａ〜１Ｃ、２Ａ〜２Ｃ、３Ａ〜３Ｂ、４Ａ〜４Ｂ、５Ａ〜５Ｂ、６Ａ〜６Ｇ、７Ａ〜７Ｃ、８〜１０、１１Ａ〜１１Ｂ、１２Ａ〜１２Ｂ、１３Ａ〜１３Ｂ、１４〜２６、２７Ａ〜２７Ｂ、２８、２９Ａ〜２９Ｂ、３０Ａ〜３０Ｂ、３１Ａ〜３１Ｂ、３２Ａ〜３２Ｂ、３３Ａ〜３３Ｃ、３４Ａ〜３４Ｃ、３５〜３９、４０、４１〜４６、４７Ａ〜４７Ｂ、４８、５２Ａ〜５２Ｆ、及び５７〜５９を参照されたい。
【０５００】
実施例４：カプセル化効率を決定するためのイオン交換クロマトグラフィー
ＩＥＸ法は、遊離ｍＲＮＡとＬＮＰカプセル化ｍＲＮＡを分離するために開発された。例示的なプロセスを使用して、勾配が低塩濃度から高塩濃度に変化すると、ＬＮＰは空隙に溶出し、ｍＲＮＡが溶出する。代表的な分離を図４９Ａ〜４９Ｂに示す。図４９Ａは、ｍＲＮＡ製剤の緩衝液条件に基づいた様々なカプセル化効率を示す。図４９Ｂは、ｍＲＮＡ製剤の塩濃度に基づいた様々なカプセル化効率を示す。
【０５０１】
以下の方法条件を使用して、感染症抗原をコードする遊離ｍＲＮＡからカプセル化されたものを分離した。
【表６】
2020532528.tif 000051
勾配は以下のようであった：
【表７】
2020532528.tif 000052
【０５０２】
実施例５：ＩＥＸによって決定されたカプセル化効率と生物活性の相関
ｍＲＮＡワクチン組成物をカプセル化したＬＮＰをＳＥＣに従って分画し、二次元分析（ＳＥＣ画分の物理化学分析）にかけた。粒径は、動的光散乱に従って決定された。ＳＥＣのピーク全体のｍＲＮＡの質量％は、次のように決定された：ｍＲＮＡの質量％＝画分の濃度＊収集した画分の体積／収量。
【０５０３】
画分は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現アッセイ及びカプセル化効率アッセイの両方にかけられた。図５０のデータは、ｍＲＮＡのアクセス可能性またはＩＥＸカラムでの保持の％が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏタンパク質発現と（逆に）相関することを示す。
【０５０４】
実施例６：ｍＲＮＡのカプセル化パーセント
脂質ナノ粒子へのｍＲＮＡのカプセル化パーセントは、塩化ナトリウム塩勾配を使用したアクセス可能なＲＮＡの溶出を伴う２５ｍＭ水酸化ナトリウム及びグリシン緩衝液の４．６×５０ｍｍ  Ｐｒｏｓｗｉｆｔ  ＷＡＸ−ＩＳ弱陰イオン交換カラムを使用して決定される。１０ｍＭ  ＴＲＩＳ−ＨＣＬ  １ｍＭ  ＥＤＴＡ緩衝液を使用して、試料を０．１ｍｇ／ｍＬ  ＲＮＡの目標濃度に希釈し、アクセス可能なＲＮＡピークを外部参照標準で定量化する。方法を表に示す。
【表８】
2020532528.tif 000053
【０５０５】
計算：
【数１】
2020532528.tif 000054
【０５０６】
アクセス可能なＲＮＡ−これは、製剤が非変性条件で希釈され、方法条件に従ってアッセイされるときに定量化できるＲＮＡの濃度である。このＲＮＡは、遊離の、または脂質と緩く結合しているｍＲＮＡの組み合わせを表す。
【０５０７】
総ＲＮＡ−これは、製剤を変性条件で希釈したときに定量化できるＲＮＡの濃度である。このＲＮＡは、カプセル化された緩やかに結合した遊離ＲＮＡを表す。
【０５０８】
非保持ＬＮＰ−これは、カラムの空隙に溶出する非保持物質である。強く結合しているカプセル化状態にあるｍＲＮＡで構成されている可能性が高く、保持のための大きな表面電荷を欠く。
【０５０９】
図５１のｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現及び図５２のｉｎ  ｖｉｖｏ免疫原性のグラフで示されるように、Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイはプロトタイプ製剤を区別できず、それらが同じカプセル化状態にあることを示す。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎは真に遊離したＲＮＡしか検出できず、緩んでいるかまたは不十分に構造化したカプセル化状態を区別できない。弱陰イオン交換クロマトグラフィーによるカプセル化は、製剤を区別することができ、以下に示すｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現データと十分に相関する。以下の表は、図５１の組成にＲｉｂｏｇｒｅｅｎ及びＡＥＸを使用したカプセル化パーセントを示す。
【０５１０】
【表９】
2020532528.tif 000055
【０５１１】
例示的な製剤ＳＥＣ画分は、陰イオン交換クロマトグラフィー及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現による様々なカプセル化により評価された。サイズ排除クロマトグラフィーを使用して２つのバッチを分画し、物理化学的特性及び生物活性について特性評価した。ＳＥＣ画分は、図５３及び５４に示すように、弱いイオン交換クロマトグラフィーによってカプセル化状態が異なり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現とよく相関した。
【０５１２】
陰イオン交換クロマトグラフィー及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現による様々なカプセル化により、例示的なサイトカインプロトタイプ製剤を評価した。データを図５５に示す（ｘ軸＝ｐｇ／ｍｌでのサイトカイン発現）。
【０５１３】
例示的なサイトカインをコードするＲＮＡ製剤−陰イオン交換クロマトグラフィー及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現による様々なカプセル化を伴うＳＥＣ画分。
【０５１４】
サイズ排除クロマトグラフィーを使用してサイトカインＲＮＡバッチを分画し、物理化学的特性及び生物活性について特性評価した。ＳＥＣ画分は、弱いイオン交換クロマトグラフィーによってカプセル化状態が異なり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現とよく相関した。データを図５６に示す（ｘ軸＝ｐｇ／ｍｌでのサイトカイン発現）。
【０５１５】
均等物
本発明は、それらの詳細な説明とともに記載されてきたが、上述の説明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本開示の範囲を例示することを意図し、それを限定することを意図しないことを理解されたい。他の態様、利点、及び変更は、以下の特許請求の範囲の範囲内にある。
【図１】
2020532528.tif 000088
【図２−１】
2020532528.tif 000089
【図２−２】
2020532528.tif 000090
【図３】
2020532528.tif 000091
【図４】
2020532528.tif 000092
【図５】
2020532528.tif 000093
【図６】
2020532528.tif 000094
【図７−１】
2020532528.tif 000095
【図７−２】
2020532528.tif 000096
【図８】
2020532528.tif 000097
【図９】
2020532528.tif 000098
【図１０】
2020532528.tif 000099
【図１１】
2020532528.tif 000100
【図１２】
2020532528.tif 000101
【図１３Ａ】
2020532528.tif 000102
【図１３Ｂ】
2020532528.tif 000103
【図１４】
2020532528.tif 000104
【図１５】
2020532528.tif 000105
【図１６】
2020532528.tif 000106
【図１７】
2020532528.tif 000107
【図１８】
2020532528.tif 000108
【図１９】
2020532528.tif 000109
【図２０】
2020532528.tif 000110
【図２１】
2020532528.tif 000111
【図２２】
2020532528.tif 000112
【図２３】
2020532528.tif 000113
【図２４】
2020532528.tif 000114
【図２５】
2020532528.tif 000115
【図２６】
2020532528.tif 000116
【図２７】
2020532528.tif 000117
【図２８】
2020532528.tif 000118
【図２９】
2020532528.tif 000119
【図３０】
2020532528.tif 000120
【図３１Ａ】
2020532528.tif 000121
【図３１Ｂ】
2020532528.tif 000122
【図３２】
2020532528.tif 000123
【図３３−１】
2020532528.tif 000124
【図３３−２】
2020532528.tif 000125
【図３４−１】
2020532528.tif 000126
【図３４−２】
2020532528.tif 000127
【図３５】
2020532528.tif 000128
【図３６】
2020532528.tif 000129
【図３７】
2020532528.tif 000130
【図３８】
2020532528.tif 000131
【図３９】
2020532528.tif 000132
【図４０】
2020532528.tif 000133
【図４１】
2020532528.tif 000134
【図４２】
2020532528.tif 000135
【図４３】
2020532528.tif 000136
【図４４】
2020532528.tif 000137
【図４５】
2020532528.tif 000138
【図４６】
2020532528.tif 000139
【図４７】
2020532528.tif 000140
【図４８】
2020532528.tif 000141
【図４９Ａ】
2020532528.tif 000142
【図４９Ｂ】
2020532528.tif 000143
【図５０】
2020532528.tif 000144
【図５１】
2020532528.tif 000145
【図５２Ａ】
2020532528.tif 000146
【図５２Ｂ】
2020532528.tif 000147
【図５２Ｃ】
2020532528.tif 000148
【図５２Ｄ】
2020532528.tif 000149
【図５２Ｅ】
2020532528.tif 000150
【図５２Ｆ】
2020532528.tif 000151
【図５３】
2020532528.tif 000152
【図５４】
2020532528.tif 000153
【図５５】
2020532528.tif 000154
【図５６】
2020532528.tif 000155
【図５７】
2020532528.tif 000156
【図５８Ａ】
2020532528.tif 000157
【図５８Ｂ】
2020532528.tif 000158
【図５９】
2020532528.tif 000159
【図６０】
2020532528.tif 000160
【配列表】
2020532528000001.app
【国際調査報告】
2020532528.tif 000161
2020532528.tif 000162
2020532528.tif 000163