(57)【要約】  本発明は、一般的に、遺伝子発現の制御に使用されるシステム、方法および組成物に関する。このシステム、方法および組成物には、配列の標的化が伴う（ゲノム変化または遺伝子編集など）。配列の標的化には、リコンビナーゼ、ＣＲＩＳＰＲ（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）およびその要素に関連するベクターシステムを用いてもよい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１種類以上の遺伝子産物の発現を変化させる方法、および／または、ゲノム編集の方法であって、
細胞内に、下記（ａ）〜（ｃ）を導入する工程を含み、
（ａ）上記細胞の上記ゲノム内において上記遺伝子産物をコードする遺伝子内にある特定の標的配列に、２本鎖切断を導入する酵素；
（ｂ）上記２本鎖切断箇所において相同組み換えによって上記ゲノム内に挿入される、所定の核酸配列をコードする核酸分子；および、
（ｃ）リコンビナーゼ；
上記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の要素は、上記細胞内で発現しており、
（i）上記宿主細胞のゲノム内の標的箇所に２本鎖切断が導入されるとともに、（ii）所定の核酸配列をコードする上記核酸分子が、上記２本鎖切断箇所において相同組み換えによって挿入され、これによって、上記１種類以上の遺伝子産物の発現を変化させる、および／または、当該所定の遺伝子産物をコードする上記遺伝子をゲノム編集するものであり、
上記遺伝子産物をコードする遺伝子内にある特定の標的配列に２本鎖切断を導入する上記酵素と、当該２本鎖切断箇所において上記ゲノム内に挿入される所定の核酸配列をコードする上記核酸分子とは、天然では一緒に生じないものである、
方法。
【請求項２】
上記リコンビナーゼは、細菌性リコンビナーゼ、ウイルス性リコンビナーゼおよび哺乳動物性リコンビナーゼからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記リコンビナーゼは、Ｒａｄ５１リコンビナーゼ、ＲｅｃＡリコンビナーゼおよびＵｖｓＸリコンビナーゼからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
上記リコンビナーゼは、核酸ベクターによって導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
２種類以上の遺伝子産物の発現を変化させる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
上記細胞の上記ゲノム内において上記遺伝子産物をコードする遺伝子内にある特定の標的配列に２本鎖切断を導入する上記酵素は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＮＦヌクレアーゼ）、および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥヌクレアーゼ）からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
上記Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの一部であり、
上記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、上記標的配列とハイブリダイズするＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列をさらに含んでいる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
特定の標的配列に２本鎖切断を導入する上記酵素は、核酸ベクターによって導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
上記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）をさらに含んでいる、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
上記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、トランス活性化型ｃｒ配列（tracr配列）を含んでいる、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
上記ガイドＲＮＡは、tracr配列と融合したガイド配列を有している、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
上記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の要素は、同じまたは異なる調節要素と作動可能に関連付けられている、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
上記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の要素は、ｍＲＮＡ分子にコードされている、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
上記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の要素は、同じまたは異なる発現ベクター上に位置している、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
上記発現ベクターは、１つ以上のウイルス性発現ベクターである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
上記１つ以上のウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、および単純ヘルペスウイルスベクターからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
上記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の要素をコードする核酸配列は、真核細胞内での発現のためにコドン最適化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
上記細胞は真核細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
上記真核細胞は哺乳動物細胞である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
上記哺乳動物細胞はヒト細胞である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
１種類以上の遺伝子産物の発現を増加させる、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
１種類以上の遺伝子産物の発現を減少させる、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
遺伝子産物の発現を変化させるための、および／または、ゲノム編集のための、改変された非天然のシステムであって、
下記（ａ）〜（ｃ）を有している１つ以上の核酸配列を含んでおり、
（ａ）上記細胞の上記ゲノム内において上記遺伝子産物をコードする遺伝子内にある特定の標的配列に、２本鎖切断を導入する酵素をコードする核酸分子；
（ｂ）上記２本鎖切断箇所において上記ゲノム内に挿入される、所定の核酸配列をコードする核酸分子；および、
（ｃ）リコンビナーゼをコードする核酸配列；
上記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の要素は、細胞内で発現しており、
（i）上記細胞のゲノム内の標的箇所に２本鎖切断が導入されるとともに、（ii）所定の核酸配列をコードする上記核酸分子が、上記２本鎖切断箇所において相同組み換えによって挿入され、これによって、１種類以上の上記遺伝子産物の発現を変化させる、および／または、当該所定の遺伝子産物をコードする上記遺伝子をゲノム編集するものであり、
上記遺伝子産物をコードする遺伝子内にある特定の標的配列に２本鎖切断を導入する上記酵素と、当該２本鎖切断箇所において上記ゲノム内に挿入される所定の核酸配列をコードする上記核酸分子とは、天然では一緒に生じないものである、
システム。
【請求項２４】
上記リコンビナーゼは、細菌性リコンビナーゼ、ウイルス性リコンビナーゼおよび哺乳動物性リコンビナーゼからなる群より選択される、請求項２３に記載のシステム。
【請求項２５】
上記細菌性リコンビナーゼは、Ｒａｄ５１リコンビナーゼ、ＲｅｃＡリコンビナーゼおよびＵｖｓＸリコンビナーゼからなる群より選択される、請求項２３に記載のシステム。
【請求項２６】
２種類以上の遺伝子産物の発現を変化させる、請求項２３に記載のシステム。
【請求項２７】
上記細胞の上記ゲノム内において上記遺伝子産物をコードする遺伝子内にある特定の標的配列に２本鎖切断を導入する上記酵素は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＮＦヌクレアーゼ）、および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥヌクレアーゼ）からなる群より選択される、請求項２３に記載のシステム。
【請求項２８】
上記Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの一部であり、
上記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、上記標的配列とハイブリダイズするＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列をさらに含んでいる、請求項２７に記載のシステム。
【請求項２９】
上記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）をさらに含んでいる、請求項２７に記載のシステム。
【請求項３０】
上記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、トランス活性化型ｃｒ配列（tracr配列）を含んでいる、請求項２７に記載のシステム。
【請求項３１】
上記ガイドＲＮＡは、tracr配列と融合したガイド配列を有している、請求項２７に記載のシステム。
【請求項３２】
上記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の要素は、同じまたは異なる調節要素と作動可能に関連付けられている、請求項２３に記載のシステム。
【請求項３３】
上記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の要素は、ｍＲＮＡ分子にコードされている、請求項２３に記載のシステム。
【請求項３４】
上記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の要素は、同じまたは異なる発現ベクター上に位置している、請求項２３に記載のシステム。
【請求項３５】
上記発現ベクターは、１つ以上のウイルス性発現ベクターである、請求項３４に記載のシステム。
【請求項３６】
上記１つ以上のウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、および単純ヘルペスウイルスベクターからなる群より選択される、請求項２３に記載のシステム。
【請求項３７】
上記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の要素をコードする核酸配列は、真核細胞内での発現のためにコドン最適化されている、請求項２３に記載のシステム。
【請求項３８】
上記細胞は真核細胞である、請求項２３に記載のシステム。
【請求項３９】
上記真核細胞は哺乳動物細胞である、請求項３８に記載のシステム。
【請求項４０】
上記哺乳動物細胞はヒト細胞である、請求項３９に記載のシステム。
【請求項４１】
１種類以上の遺伝子産物の発現を増加させる、請求項２３に記載のシステム。
【請求項４２】
１種類以上の遺伝子産物の発現を減少させる、請求項２３に記載のシステム。
【請求項４３】
上記２本鎖切断箇所において相同組み換えによって上記ゲノム内に挿入される所定の核酸配列をコードする上記核酸分子の長さは、２５０塩基以上、５００塩基以上または１０００塩基以上である、請求項２３に記載のシステム。
【請求項４４】
請求項２３〜４３のいずれか１項に記載のシステムを含んでいる、細胞。
【請求項４５】
（i）標的細胞における遺伝子発現を変化させることによって、または（ii）標的細胞のゲノムを編集することによって、疾患を処置するための、請求項２３〜４３のいずれか１項に記載のシステムの使用。
【請求項４６】
１種類以上の遺伝子産物の発現を変化させる方法であって、
標的配列を有しており上記遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を含み、これ発現している細胞内に、Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats−Ｃａｓ関連システム（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム）を導入する工程を含み、
上記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、改変された非天然のものであり、かつ、１つ以上のウイルスベクターを含んでおり、
上記ウイルスベクターは、下記（ａ）〜（ｃ）を含んでおり、
（ａ）上記標的配列とハイブリダイズするＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムガイドＲＮＡをコードする１つ以上のヌクレオチド配列と作動可能に連結している、上記細胞内で作動可能な第１調節要素；
（ｂ）Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結している、上記細胞内で作動可能な第２調節要素；および、
（ｃ）リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結している、上記細胞内で作動可能な第３調節要素；
上記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の要素は、上記システムの同じまたは異なるベクター上に位置しており、
（i）上記ガイドＲＮＡが上記標的配列を標的化するとともに、（ii）上記Ｃａｓ９タンパク質がＤＮＡ分子を切断し、これによって、上記１種類以上の遺伝子産物の発現を変化させるものであり、
上記Ｃａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡは、天然では一緒に生じない、
方法。
【請求項４７】
上記Ｃａｓ９タンパク質はＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
上記Ｃａｓ９タンパク質はニッカーゼである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
上記リコンビナーゼは、細菌性リコンビナーゼ、ウイルス性リコンビナーゼおよび哺乳動物性リコンビナーゼからなる群より選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
上記細菌性リコンビナーゼは、Ｒａｄ５１リコンビナーゼ、ＲｅｃＡリコンビナーゼおよびＵｖｓＸリコンビナーゼからなる群より選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
２種類以上の遺伝子産物の発現を変化させる、請求項４６に記載の方法。
【請求項５２】
上記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）をさらに含んでいる、請求項４６に記載の方法。
【請求項５３】
上記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、トランス活性化型ｃｒ配列（tracr配列）を含んでいる、請求項４６に記載の方法。
【請求項５４】
上記ガイドＲＮＡは、tracr配列と融合したガイド配列を有している、請求項４６に記載の方法。
【請求項５５】
上記Ｃａｓ９タンパク質は、真核細胞内での発現のためにコドン最適化されている、請求項４６に記載の方法。
【請求項５６】
上記細胞は真核細胞である、請求項４６に記載の方法。
【請求項５７】
上記真核細胞は哺乳動物細胞である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
上記哺乳動物細胞はヒト細胞である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
１種類以上の遺伝子産物の発現を増加させる、請求項４６に記載の方法。
【請求項６０】
１種類以上の遺伝子産物の発現を減少させる、請求項４６に記載の方法。
【請求項６１】
上記１つ以上ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、および単純ヘルペスウイルスベクターからなる群より選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項６２】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを媒介とするゲノム編集方法であって、
標的配列を有しており１つ以上の遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を含み、これ発現している細胞内に、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを導入する工程を含み、
上記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、改変された非天然のものであり、かつ、１つ以上のベクターを含んでおり、
上記ベクターは、下記（ａ）〜（ｃ）を含んでおり、
（ａ）上記標的配列とハイブリダイズするＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムガイドＲＮＡをコードする１つ以上のヌクレオチド配列と作動可能に連結している、上記細胞内で作動可能な第１調節要素；
（ｂ）Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結している、上記細胞内で作動可能な第２調節要素；および、
（ｃ）リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結している、上記細胞内で作動可能な第３調節要素；
上記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の要素は、上記システムの同じまたは異なるベクター上に位置しており、
上記１種類以上の遺伝子産物の発現を、上記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを上記ＤＮＡ分子に作用させることによって変化させ、当該ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、当該ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを配列特異的に結合させる上記ガイドＲＮＡを含んでおり、これによって、ゲノム編集を実行するものであり、
上記Ｃａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡは、天然では一緒に生じない、
方法。
【請求項６３】
上記Ｃａｓ９タンパク質はＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
上記Ｃａｓ９タンパク質はニッカーゼである、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
上記リコンビナーゼは、細菌性リコンビナーゼ、ウイルス性リコンビナーゼおよび哺乳動物性リコンビナーゼからなる群より選択される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６６】
上記細菌性リコンビナーゼは、Ｒａｄ５１リコンビナーゼ、ＲｅｃＡリコンビナーゼおよびＵｖｓＸリコンビナーゼからなる群より選択される、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
２種類以上の遺伝子産物の発現を変化させる、請求項６２に記載の方法。
【請求項６８】
上記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、１つ以上のＮＬＳをさらに含んでいる、請求項６２に記載の方法。
【請求項６９】
上記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、tracr配列を含んでいる、請求項６２に記載の方法。
【請求項７０】
上記Ｃａｓ９タンパク質は、真核細胞内での発現のためにコドン最適化されている、請求項６２に記載の方法。
【請求項７１】
上記細胞は真核細胞である、請求項６２に記載の方法。
【請求項７２】
上記真核細胞は哺乳動物細胞である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
上記哺乳動物細胞はヒト細胞である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
１種類以上の遺伝子産物の発現を増加させる、請求項６２に記載の方法。
【請求項７５】
１種類以上の遺伝子産物の発現を減少させる、請求項６２に記載の方法。
【請求項７６】
改変された非天然のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムであって、
下記（ａ）〜（ｃ）を有している、１つ以上のベクターを含んでおり、
（ａ）ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムガイドＲＮＡをコードする１つ以上のヌクレオチド配列と作動可能に連結している、細胞内で作動可能な第１調節要素であって、
上記ガイドＲＮＡは、ＤＮＡ分子を含んでいる真核細胞内において、当該ＤＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズし、
上記ＤＮＡ分子は１種類以上の遺伝子産物をコードしており、上記真核細胞は当該１種類以上の遺伝子産物を発現している、
第１調節要素；
（ｂ）Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結している、上記細胞内で作動可能な第２調節要素；および、
（ｃ）リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結している、上記細胞内で作動可能な第３調節要素；
上記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の要素は、上記システムの同じまたは異なるベクター上に位置しており、
（i）上記ガイドＲＮＡが上記標的配列を標的化し、当該標的配列とハイブリダイズするとともに、（ii）上記Ｃａｓ９タンパク質が上記ＤＮＡ分子を切断し、これによって、上記１種類以上の遺伝子産物の発現を変化させるものであり、
上記Ｃａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡは、天然では一緒に生じない、
システム。
【請求項７７】
上記Ｃａｓ９タンパク質はＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質である、請求項７６に記載のシステム。
【請求項７８】
上記Ｃａｓ９タンパク質はニッカーゼである、請求項７６に記載のシステム。
【請求項７９】
上記リコンビナーゼは、細菌性リコンビナーゼ、ウイルス性リコンビナーゼおよび哺乳動物性リコンビナーゼからなる群より選択される、請求項７６に記載のシステム。
【請求項８０】
上記細菌性リコンビナーゼは、Ｒａｄ５１リコンビナーゼ、ＲｅｃＡリコンビナーゼおよびＵｖｓＸリコンビナーゼからなる群より選択される、請求項７９に記載のシステム。
【請求項８１】
上記１つ以上のベクターはウイルスベクターである、請求項７６に記載のシステム。
【請求項８２】
上記１つ以上ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、および単純ヘルペスウイルスベクターからなる群より選択される、請求項８１に記載のシステム。
【請求項８３】
上記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、１つ以上のＮＬＳをさらに含んでいる、請求項７６に記載のシステム。
【請求項８４】
上記Ｃａｓ９タンパク質は、真核細胞内での発現のためにコドン最適化されている、請求項７６に記載のシステム。
【請求項８５】
上記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、tracr配列を含んでいる、請求項７６に記載のシステム。
【請求項８６】
上記細胞は真核細胞である、請求項７６に記載のシステム。
【請求項８７】
上記真核細胞は哺乳動物細胞である、請求項８６に記載のシステム。
【請求項８８】
上記哺乳動物細胞はヒト細胞である、請求項８６に記載のシステム。
【請求項８９】
１種類以上の遺伝子産物の発現を増加させる、請求項７６に記載のシステム。
【請求項９０】
１種類以上の遺伝子産物の発現を減少させる、請求項７６に記載のシステム。
【請求項９１】
請求項７６〜９０のいずれか１項に記載のシステムを含んでいる、細胞。
【請求項９２】
（i）標的細胞における遺伝子発現を変化させることによって、または（ii）標的細胞のゲノムを編集することによって、疾患を処置するための、請求項７６〜９０のいずれか１項に記載のシステムの使用。
【請求項９３】
改変された非天然のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムであって、
下記（ａ）〜（ｃ）を有している、１つ以上のベクターを含んでおり、
（ａ）ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムガイドＲＮＡをコードする１つ以上のヌクレオチド配列と作動可能に連結している、細胞内で作動可能な第１調節要素であって、
上記ガイドＲＮＡは、ＤＮＡ分子を含んでいる真核細胞内において、当該ＤＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズし、
上記ＤＮＡ分子は１種類以上の遺伝子産物をコードしており、上記真核細胞は当該１種類以上の遺伝子産物を発現している、
第１調節要素；
（ｂ）Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結している、上記細胞内で作動可能な第２調節要素；および、
（ｃ）リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結している、上記細胞内で作動可能な第３調節要素；
上記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の要素は、上記システムの同じまたは異なるベクター上に位置しており、
上記１種類以上の遺伝子産物の発現を、上記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを上記ＤＮＡ分子に作用させることによって変化させ、当該ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、当該ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを配列特異的に結合させる上記ガイドＲＮＡを含んでおり、これによって、ゲノム編集を実行するものであり、
上記Ｃａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡは、天然では一緒に生じない、
システム。
【請求項９４】
上記Ｃａｓ９タンパク質はＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質である、請求項９３に記載のシステム。
【請求項９５】
上記Ｃａｓ９タンパク質はニッカーゼである、請求項９３に記載のシステム。
【請求項９６】
上記リコンビナーゼは、細菌性リコンビナーゼ、ウイルス性リコンビナーゼおよび哺乳動物性リコンビナーゼからなる群より選択される、請求項９３に記載のシステム。
【請求項９７】
上記細菌性リコンビナーゼは、Ｒａｄ５１リコンビナーゼ、ＲｅｃＡリコンビナーゼおよびＵｖｓＸリコンビナーゼからなる群より選択される、請求項９６に記載のシステム。
【請求項９８】
上記１つ以上のベクターはウイルスベクターである、請求項９３に記載のシステム。
【請求項９９】
上記１つ以上ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、および単純ヘルペスウイルスベクターからなる群より選択される、請求項９８に記載のシステム。
【請求項１００】
上記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、１つ以上のＮＬＳをさらに含んでいる、請求項９３に記載のシステム。
【請求項１０１】
上記Ｃａｓ９タンパク質は、真核細胞内での発現のためにコドン最適化されている、請求項９３に記載のシステム。
【請求項１０２】
上記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、tracr配列を含んでいる、請求項９３に記載のシステム。
【請求項１０３】
上記細胞は真核細胞である、請求項９３に記載のシステム。
【請求項１０４】
上記真核細胞は哺乳動物細胞である、請求項１０３に記載のシステム。
【請求項１０５】
上記哺乳動物細胞はヒト細胞である、請求項１０４に記載のシステム。
【請求項１０６】
１種類以上の遺伝子産物の発現を増加させる、請求項９３に記載のシステム。
【請求項１０７】
１種類以上の遺伝子産物の発現を減少させる、請求項９３に記載のシステム。
【請求項１０８】
請求項９３〜１０７のいずれか１項に記載のシステムを含んでいる、細胞。
【請求項１０９】
（i）標的細胞における遺伝子発現を変化させることによって、または（ii）標的細胞のゲノムを編集することによって、疾患を処置するための、請求項９３〜１０７のいずれか１項に記載のシステムの使用。
【請求項１１０】
１種類以上の遺伝子産物の発現を変化させる方法、および／または、ゲノム編集の方法であって、
ゲノムに挿入される所定の核酸配列をコードする１本鎖核酸分子を含んでいる核酸フィラメントを、上記ゲノムを有している細胞内に導入する工程を含み、
上記１本鎖核酸分子は、リコンビナーゼ多量体を結合させた状態であり、
上記所定の核は、上記遺伝子産物をコードするゲノムの標的配列に対して相同的な、５’フランキング領域および３’フランキング領域を有しており、
上記５’フランキング配列および３’フランキング配列は、上記ゲノムの標的配列とは異なる挿入配列に隣接しており、
上記ゲノムに挿入される所定の核酸配列をコードする上記核酸分子と、上記リコンビナーゼ多量体とは、天然では一緒に生じないものであり、
相同組み換えによって上記所定の核酸配列が上記ゲノム内に挿入され、これによって、上記１種類以上の遺伝子産物の発現を変化させる、および／または、当該所定の遺伝子産物をコードする上記遺伝子をゲノム編集する、
方法。
【請求項１１１】
上記フィラメント核酸フィラメントは、上記所定の１本鎖核酸をリコンビナーゼとともにインキュベート、in vitroで合成される、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
上記所定の１本鎖核酸を、ヌクレオチドとともにインキュベートする工程をさらに含む、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
上記ヌクレオチドは、ヌクレオチド三リン酸または類似体からなる群より選択される、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
上記ヌクレオチド三リン酸または類似体は、アデノシン三リン酸、アデノシン一リン酸、アデノシン二リン酸、アデノシン三リン酸−γＳ、アデノシン一リン酸−ＰＮＰ、およびアデノシン二リン酸−ＡｌＦ４からなる群より選択される、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
上記リコンビナーゼは、細菌性リコンビナーゼ、ウイルス性リコンビナーゼおよび哺乳動物性リコンビナーゼからなる群より選択される、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１６】
上記リコンビナーゼは、Ｒａｄ５１リコンビナーゼ、ＲｅｃＡリコンビナーゼおよびＵｖｓＸリコンビナーゼからなる群より選択される、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１７】
上記５’フランキング配列および３’フランキング配列の長さは、５０塩基超である、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１８】
上記５’フランキング配列および３’フランキング配列の長さは、１００塩基超である、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１９】
上記５’フランキング配列および３’フランキング配列の長さは、２００塩基超である、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１２０】
上記５’フランキング配列および３’フランキング配列の長さは、５００塩基超である、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１２１】
上記５’フランキング配列および３’フランキング配列の長さは、１０００塩基超である、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１２２】
上記５’フランキング配列および３’フランキング配列の長さは、約２０〜約１０００塩基である、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１２３】
上記５’フランキング配列および３’フランキング配列の長さは、約１００〜約１０００塩基である、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１２４】
上記１本鎖核酸は１本鎖ＤＮＡである、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１２５】
２種類以上の遺伝子産物の発現を変化させる、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１２６】
上記細胞の上記ゲノム内において上記遺伝子産物をコードする遺伝子内にある上記標的配列に、切断を導入する工程をさらに含む、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１２７】
上記切断は、２本鎖切断または１本鎖切断である、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
上記切断は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＮＦヌクレアーゼ）、および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥヌクレアーゼ）、ならびにＩ型制限エンドヌクレアーゼ、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ、ＩＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ、ＩＶ型制限エンドヌクレアーゼまたはニッカーゼからなる群より選択される酵素によって導入される、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２９】
上記標的配列とハイブリダイズするＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムガイドＲＮＡを、上記細胞内に導入する工程をさらに含む、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１３０】
上記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、トランス活性化型ｃｒ配列（tracr配列）を含んでいる、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１３１】
上記ガイドＲＮＡは、tracr配列と融合したガイド配列を有している、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３２】
上記フィラメントは、エレクトロポレーションによって上記細胞内に導入される、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１３３】
上記細胞は真核細胞である、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１３４】
上記真核細胞は哺乳動物細胞である、請求項１３３に記載の方法。
【請求項１３５】
上記哺乳動物細胞はヒト細胞である、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１３６】
１種類以上の遺伝子産物の発現を増加させる、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１３７】
１種類以上の遺伝子産物の発現を減少させる、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１３８】
上記挿入配列を、所定の遺伝子のコーディング領域内に挿入する、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１３９】
遺伝子産物の発現を変化させるための、および／または、ゲノム編集のための、改変された非天然のシステムであって、
上記ゲノム内に挿入される、所定の核酸配列をコードする１本鎖核酸分子を含む核酸フィラメントを含んでおり、
上記１本鎖核酸分子は、リコンビナーゼ多量体を結合させた状態であり、
上記所定の核は、上記遺伝子産物をコードするゲノムの標的配列に対して相同的な、５’フランキング領域および３’フランキング領域を有しており、
上記５’フランキング配列および３’フランキング配列は、上記ゲノムの標的配列とは異なる挿入配列に隣接しており、
上記ゲノムに挿入される所定の核酸配列をコードする上記１本鎖核酸分子と、上記リコンビナーゼ多量体とは、天然では一緒に生じないものであり、
ゲノムを有している細胞内に導入したとき、上記所定の核酸配列は、相同組み換えによって上記ゲノム内に挿入され、これによって、上記１種類以上の遺伝子産物の発現を変化させる、および／または、当該所定の遺伝子産物をコードする上記遺伝子をゲノム編集する、
システム。
【請求項１４０】
上記フィラメント核酸フィラメントは、上記所定の１本鎖核酸をリコンビナーゼとともにインキュベートして、当該所定の１本鎖核酸上にリコンビナーゼ多量体を形成させることによって、in vitroで合成される、請求項１３９に記載のシステム。
【請求項１４１】
上記所定の１本鎖核酸を、ヌクレオチドとともにインキュベートする工程をさらに含む、請求項１４０に記載のシステム。
【請求項１４２】
上記ヌクレオチドは、ヌクレオチド三リン酸または類似体からなる群より選択される、請求項１４１に記載のシステム。
【請求項１４３】
上記ヌクレオチド三リン酸または類似体は、アデノシン三リン酸、アデノシン一リン酸、アデノシン二リン酸、アデノシン三リン酸−γＳ、アデノシン一リン酸−ＰＮＰ、およびアデノシン二リン酸−ＡｌＦ４からなる群より選択される、請求項１４２に記載のシステム。
【請求項１４４】
上記リコンビナーゼは、細菌性リコンビナーゼ、ウイルス性リコンビナーゼおよび哺乳動物性リコンビナーゼからなる群より選択される、請求項１３９に記載のシステム。
【請求項１４５】
上記リコンビナーゼは、Ｒａｄ５１リコンビナーゼ、ＲｅｃＡリコンビナーゼおよびＵｖｓＸリコンビナーゼからなる群より選択される、請求項１３９に記載のシステム。
【請求項１４６】
上記５’フランキング配列および３’フランキング配列の長さは、５０塩基超である、請求項１３９に記載のシステム。
【請求項１４７】
上記５’フランキング配列および３’フランキング配列の長さは、１００塩基超である、請求項１３９に記載のシステム。
【請求項１４８】
上記５’フランキング配列および３’フランキング配列の長さは、２００塩基超である、請求項１３９に記載のシステム。
【請求項１４９】
上記５’フランキング配列および３’フランキング配列の長さは、５００塩基超である、請求項１３９に記載のシステム。
【請求項１５０】
上記５’フランキング配列および３’フランキング配列の長さは、１０００塩基超である、請求項１３９に記載のシステム。
【請求項１５１】
上記５’フランキング配列および３’フランキング配列の長さは、約２０〜約１０００塩基である、請求項１３９に記載のシステム。
【請求項１５２】
上記５’フランキング配列および３’フランキング配列の長さは、約１００〜約１０００塩基である、請求項１３９に記載のシステム。
【請求項１５３】
上記１本鎖核酸は１本鎖ＤＮＡである、請求項１３９に記載のシステム。
【請求項１５４】
２種類以上の遺伝子産物の発現を変化させる、請求項１３９に記載のシステム。
【請求項１５５】
上記細胞の上記ゲノム内において上記遺伝子産物をコードする遺伝子内にある上記標的配列に、切断を導入するための試薬をさらに含んでいる、請求項１３９に記載のシステム。
【請求項１５６】
上記切断は、２本鎖切断または１本鎖ＤＮＡ切断である、請求項１５５に記載のシステム。
【請求項１５７】
上記試薬は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＮＦヌクレアーゼ）、および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥヌクレアーゼ）、ならびにＩ型制限エンドヌクレアーゼ、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ、ＩＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ、ＩＶ型制限エンドヌクレアーゼまたはニッカーゼからなる群より選択される酵素である、請求項１５５に記載のシステム。
【請求項１５８】
上記標的配列とハイブリダイズするＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムガイドＲＮＡをさらに含んでいる、請求項１３９に記載のシステム。
【請求項１５９】
上記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、トランス活性化型ｃｒ配列（tracr配列）を含んでいる、請求項１５８に記載のシステム。
【請求項１６０】
上記ガイドＲＮＡは、tracr配列と融合したガイド配列を有している、請求項１５９に記載のシステム。
【請求項１６１】
上記フィラメントは、エレクトロポレーションによって上記細胞内に導入される、請求項１３９に記載のシステム。
【請求項１６２】
上記細胞は真核細胞である、請求項１３９に記載のシステム。
【請求項１６３】
上記真核細胞は哺乳動物細胞である、請求項１６２に記載のシステム。
【請求項１６４】
上記哺乳動物細胞はヒト細胞である、請求項１６３に記載のシステム。
【請求項１６５】
１種類以上の遺伝子産物の発現を増加させる、請求項１３９に記載のシステム。
【請求項１６６】
１種類以上の遺伝子産物の発現を減少させる、請求項１３９に記載のシステム。
【請求項１６７】
請求項１３９〜１６６のいずれか１項に記載のシステムを含んでいる、細胞。
【請求項１６８】
（i）標的細胞における遺伝子発現を変化させることによって、または（ii）標的細胞のゲノムを編集することによって、疾患を処置するための、請求項１３９〜１６６のいずれか１項に記載のシステムの使用。
【請求項１６９】
１種類以上の遺伝子産物の発現を変化させる方法、および／または、ゲノム編集の方法であって、
細胞内に下記（ａ）〜（ｂ）を導入する工程を含み、
（ａ）上記ゲノムの切断箇所において相同組み換えによって当該ゲノム内に挿入される所定の核酸配列を、コードする核酸分子；および
（ｂ）リコンビナーゼ；
上記（ａ）および（ｂ）の要素が、（i）上記細胞内に導入されるか、または（ii）上記細胞内で発現したとき、所定の核酸配列をコードする上記核酸分子は、上記切断箇所において相同組み換えによって挿入され、これによって、１種類以上の上記遺伝子産物の発現を変化させる、および／または、当該所定の遺伝子産物をコードする上記遺伝子をゲノム編集するものであり、
上記切断箇所において上記ゲノム内に挿入される所定の核酸配列をコードする上記核酸分子と、上記リコンビナーゼとは、天然では一緒に生じない、
方法。
【請求項１７０】
上記リコンビナーゼは、細菌性リコンビナーゼ、ウイルス性リコンビナーゼおよび哺乳動物性リコンビナーゼからなる群より選択される、請求項１６９に記載の方法。
【請求項１７１】
上記リコンビナーゼは、Ｒａｄ５１リコンビナーゼ、ＲｅｃＡリコンビナーゼおよびＵｖｓＸリコンビナーゼからなる群より選択される、請求項１６９に記載の方法。
【請求項１７２】
所定の核酸配列をコードする上記核酸分子は、５’配列および３’配列を有しており、
上記５’配列および３’配列は、上記ゲノムの標的配列とは異なる挿入配列に隣接しており、
上記５’フランキング配列および３’フランキング配列の長さは、５０塩基超である、請求項１６９に記載の方法。
【請求項１７３】
所定の核酸配列をコードする上記核酸分子は、５’配列および３’配列を有しており、
上記５’配列および３’配列は、上記ゲノムの標的配列とは異なる挿入配列に隣接しており、
上記５’フランキング配列および３’フランキング配列の長さは、１００塩基超である、請求項１６９に記載の方法。
【請求項１７４】
所定の核酸配列をコードする上記核酸分子は、５’配列および３’配列を有しており、
上記５’配列および３’配列は、上記ゲノムの標的配列とは異なる挿入配列に隣接しており、
上記５’フランキング配列および３’フランキング配列の長さは、２００塩基超である、請求項１６９に記載の方法。
【請求項１７５】
所定の核酸配列をコードする上記核酸分子は、５’配列および３’配列を有しており、
上記５’配列および３’配列は、上記ゲノムの標的配列とは異なる挿入配列に隣接しており、
上記５’フランキング配列および３’フランキング配列の長さは、５００塩基超である、請求項１６９に記載の方法。
【請求項１７６】
所定の核酸配列をコードする上記核酸分子は、５’配列および３’配列を有しており、
上記５’配列および３’配列は、上記ゲノムの標的配列とは異なる挿入配列に隣接しており、
上記５’フランキング配列および３’フランキング配列の長さは、１０００塩基超である、請求項１６９に記載の方法。
【請求項１７７】
所定の核酸配列をコードする上記核酸分子は、５’配列および３’配列を有しており、
上記５’配列および３’配列は、上記ゲノムの標的配列とは異なる挿入配列に隣接しており、
上記５’フランキング配列および３’フランキング配列の長さは、約２０〜約１０００塩基である、請求項１６９に記載の方法。
【請求項１７８】
所定の核酸配列をコードする上記核酸分子は、５’配列および３’配列を有しており、
上記５’配列および３’配列は、上記ゲノムの標的配列とは異なる挿入配列に隣接しており、
上記５’フランキング配列および３’フランキング配列の長さは、約１００〜約１０００塩基である、請求項１６９に記載の方法。
【請求項１７９】
所定の核酸配列をコードする上記核酸分子は１本鎖ＤＮＡである、請求項１６９に記載の方法。
【請求項１８０】
２種類以上の遺伝子産物の発現を変化させる、請求項１６９に記載の方法。
【請求項１８１】
上記切断は、２本鎖切断または１本鎖切断である、請求項１６９に記載の方法。
【請求項１８２】
上記切断は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＮＦヌクレアーゼ）、および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥヌクレアーゼ）からなる群より選択される酵素によって導入される、請求項１８１に記載の方法。
【請求項１８３】
上記切断は、Ｉ型制限エンドヌクレアーゼ、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ、ＩＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ、ＩＶ型制限エンドヌクレアーゼまたはニッカーゼによって導入される、請求項１８１に記載の方法。
【請求項１８４】
上記標的配列とハイブリダイズするＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムガイドＲＮＡを、上記細胞内に導入する工程をさらに含む、請求項１６９に記載の方法。
【請求項１８５】
上記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、トランス活性化型ｃｒ配列（tracr配列）を含んでいる、請求項１８４に記載の方法。
【請求項１８６】
上記ガイドＲＮＡは、tracr配列と融合したガイド配列を有している、請求項１８５に記載の方法。
【請求項１８７】
所定の核酸配列をコードする上記核酸分子は、エレクトロポレーションによって上記細胞内に導入される、請求項１６９に記載の方法。
【請求項１８８】
上記細胞は真核細胞である、請求項１６９に記載の方法。
【請求項１８９】
上記真核細胞は哺乳動物細胞である、請求項１８８に記載の方法。
【請求項１９０】
上記哺乳動物細胞はヒト細胞である、請求項１８９に記載の方法。
【請求項１９１】
１種類以上の遺伝子産物の発現を増加させる、請求項１６９に記載の方法。
【請求項１９２】
１種類以上の遺伝子産物の発現を減少させる、請求項１６９に記載の方法。
【請求項１９３】
遺伝子産物の発現を変化させるための、および／または、ゲノム編集のための、改変された非天然のシステムであって、
下記（ａ）〜（ｂ）を含んでおり、
（ａ）上記ゲノムの切断箇所において相同組み換えによって当該ゲノム内に挿入される所定の核酸配列を、コードする核酸分子；および
（ｂ）リコンビナーゼ；
上記（ａ）および（ｂ）の要素が、（i）上記細胞内に導入されるか、または（ii）上記細胞内で発現したとき、所定の核酸配列をコードする上記核酸分子は、上記切断箇所において相同組み換えによって挿入され、これによって、１種類以上の上記遺伝子産物の発現を変化させる、および／または、当該所定の遺伝子産物をコードする上記遺伝子をゲノム編集するものであり、
上記切断箇所において上記ゲノム内に挿入される所定の核酸配列をコードする上記核酸分子と、上記リコンビナーゼとは、天然では一緒に生じない、
システム。
【請求項１９４】
上記リコンビナーゼは、細菌性リコンビナーゼ、ウイルス性リコンビナーゼおよび哺乳動物性リコンビナーゼからなる群より選択される、請求項１９３に記載のシステム。
【請求項１９５】
上記リコンビナーゼは、Ｒａｄ５１リコンビナーゼ、ＲｅｃＡリコンビナーゼおよびＵｖｓＸリコンビナーゼからなる群より選択される、請求項１９３に記載のシステム。
【請求項１９６】
所定の核酸配列をコードする上記核酸分子は、５’配列および３’配列を有しており、
上記５’配列および３’配列は、上記ゲノムの標的配列とは異なる挿入配列に隣接しており、
上記５’フランキング配列および３’フランキング配列の長さは、５０塩基超である、請求項１９３に記載のシステム。
【請求項１９７】
所定の核酸配列をコードする上記核酸分子は、５’配列および３’配列を有しており、
上記５’配列および３’配列は、上記ゲノムの標的配列とは異なる挿入配列に隣接しており、
上記５’フランキング配列および３’フランキング配列の長さは、１００塩基超である、請求項１９３に記載のシステム。
【請求項１９８】
所定の核酸配列をコードする上記核酸分子は、５’配列および３’配列を有しており、
上記５’配列および３’配列は、上記ゲノムの標的配列とは異なる挿入配列に隣接しており、
上記５’フランキング配列および３’フランキング配列の長さは、２００塩基超である、請求項１９３に記載のシステム。
【請求項１９９】
所定の核酸配列をコードする上記核酸分子は、５’配列および３’配列を有しており、
上記５’配列および３’配列は、上記ゲノムの標的配列とは異なる挿入配列に隣接しており、
上記５’フランキング配列および３’フランキング配列の長さは、５００塩基超である、請求項１９３に記載のシステム。
【請求項２００】
所定の核酸配列をコードする上記核酸分子は、５’配列および３’配列を有しており、
上記５’配列および３’配列は、上記ゲノムの標的配列とは異なる挿入配列に隣接しており、
上記５’フランキング配列および３’フランキング配列の長さは、１０００塩基超である、請求項１９３に記載のシステム。
【請求項２０１】
所定の核酸配列をコードする上記核酸分子は、５’配列および３’配列を有しており、
上記５’配列および３’配列は、上記ゲノムの標的配列とは異なる挿入配列に隣接しており、
上記５’フランキング配列および３’フランキング配列の長さは、約２０〜約１０００塩基である、請求項１９３に記載のシステム。
【請求項２０２】
所定の核酸配列をコードする上記核酸分子は、５’配列および３’配列を有しており、
上記５’配列および３’配列は、上記ゲノムの標的配列とは異なる挿入配列に隣接しており、
上記５’フランキング配列および３’フランキング配列の長さは、約１００〜約１０００塩基である、請求項１９３に記載のシステム。
【請求項２０３】
所定の核酸配列をコードする上記核酸分子は１本鎖ＤＮＡである、請求項１９３に記載のシステム。
【請求項２０４】
２種類以上の遺伝子産物の発現を変化させる、請求項１９３に記載のシステム。
【請求項２０５】
上記細胞の上記ゲノム内において上記遺伝子産物をコードする遺伝子内にある上記標的配列に、切断を導入するための試薬をさらに含んでいる、請求項１９３に記載のシステム。
【請求項２０６】
上記切断は、２本鎖切断または１本鎖ＤＮＡ切断である、請求項１９３に記載のシステム。
【請求項２０７】
上記試薬は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＮＦヌクレアーゼ）、および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥヌクレアーゼ）からなる群より選択される酵素である、請求項２０６に記載のシステム。
【請求項２０８】
上記切断は、Ｉ型制限エンドヌクレアーゼ、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ、ＩＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ、ＩＶ型制限エンドヌクレアーゼまたはニッカーゼによって導入される、請求項２０６に記載のシステム。
【請求項２０９】
上記標的配列とハイブリダイズするＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムガイドＲＮＡをさらに含んでいる、請求項１９３に記載のシステム。
【請求項２１０】
上記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、トランス活性化型ｃｒ配列（tracr配列）を含んでいる、請求項２０９に記載のシステム。
【請求項２１１】
上記ガイドＲＮＡは、tracr配列と融合したガイド配列を有している、請求項１５９に記載のシステム。
【請求項２１２】
所定の核酸配列をコードする上記核酸分子は、エレクトロポレーションによって上記細胞内に導入される、請求項１９３に記載のシステム。
【請求項２１３】
上記細胞は真核細胞である、請求項１９３に記載のシステム。
【請求項２１４】
上記真核細胞は哺乳動物細胞である、請求項２１３に記載のシステム。
【請求項２１５】
上記哺乳動物細胞はヒト細胞である請求項２１４に記載のシステム。
【請求項２１６】
１種類以上の遺伝子産物の発現を増加させる、請求項１９３に記載のシステム。
【請求項２１７】
１種類以上の遺伝子産物の発現を減少させる、請求項１９３に記載のシステム。
【請求項２１８】
請求項１９３〜２１７のいずれか１項に記載のシステムを含んでいる、細胞。
【請求項２１９】
（i）標的細胞における遺伝子発現を変化させることによって、または（ii）標的細胞のゲノムを編集することによって、疾患を処置するための、請求項１９３〜２１７のいずれか１項に記載のシステムの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に、遺伝子発現の制御に使用されるシステム、方法および組成物に関する。このシステム、方法および組成物には、配列の標的化が伴う（ゲノム変化または遺伝子編集など）。配列の標的化には、リコンビナーゼ、ＣＲＩＳＰＲ（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）およびその要素に関連するベクターシステムを用いてもよい。
【背景技術】
【０００２】
ゲノム編集は、遺伝物質の特異的な（そして時には正確な）追加または除去を可能にする、強力な技術である。ゲノム編集は、標的細胞内の２本鎖ＤＮＡを切断することから始まる。この２本鎖ＤＮＡの切断は、何種類かの方法によって発生させることができる（メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥヌクレアーゼおよび／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９制限修飾システムなど）。いずれのシステムも、ユーザが指定したゲノム位置おいて、２本鎖ＤＮＡの切断をもたらす。２本鎖ＤＮＡの切断が生じると、細胞内の機構によって、即座に２本鎖ＤＮＡが修復される。この修復は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路または相同組み換え（ＨＤＲ）のいずれか一方によって行われる。ＮＨＥＪ経路は切断を効率的に修復するが、この修復はしばしば不完全であり、挿入および欠失が生じる。ＮＨＥＪ修復による挿入および欠失がオープンリーディングフレーム内に発生すると、最も多くの場合はフレームシフト変異が生じる。このフレームシフトによって、通常は、特定の遺伝子が不活性化される。ＨＤＲ経路による２本鎖ＤＮＡ切断の修復は、正確な修復を可能にするのみならず、実験的に設計されたゲノム要素の導入をも可能にする。細胞にＨＤＲを用いて２本鎖ＤＮＡ切断を修正させることによって、多くの疾患の修正や、効果的な遺伝子治療を達成することができる。遺伝子治療の研究者、臨床家、そして患者にとって不幸なことに、多くのヒト細胞には、より正確なＨＤＲ経路ではなく、エラーの発生しやすいＮＨＥＪ経路によって２本鎖ＤＮＡ切断を修正する強い傾向がある。内在性の細胞機構を使用すると、２本鎖ＤＮＡ切断の９５％がＮＨＥＪによって修復されるのに対し、２本鎖ＤＮＡ切断の５％しかＨＤＲによって修復されない。この統計は、次のような最良のシナリオを表している。すなわち、多くの種類の細胞はＨＤＲ機構を完全に失っており、正確なＨＤＲ経路による修復は発生しない。正確な遺伝子治療を成功させるために、ＨＤＲ経路を用いるための細胞の能力を増強させねばならない。
【発明の概要】
【０００３】
本発明者らは、ＣＡＳ−ＣＲＩＳＰＲによる遺伝子編集などの技術に関連して、ＨＤＲ経路を利用するための細胞の能力を顕著に増強させる方法を開発した。本明細書に示されているデータによると、本システムは、２本鎖ＤＮＡ修復経路に関する細胞の傾向を、エラーの発生しやすいＮＨＥＪ経路からＨＤＲ経路へと変化させることができると示される（５〜１２５倍に増加）。このＨＤＲの増加は、ウイルス性リコンビナーゼおよび／または細菌性リコンビナーゼ（ＵｖｓＸまたはＲｅｃＡ；それぞれ、E. coliまたはS. Pneumoniae由来）の追加によって達成される。これらのリコンビナーゼを、部位特異的ヌクレアーゼおよび相同組み換え基質（ＨＲ基質）とともに発現させることによって、ＨＤＲが増加し、ＨＤＲ機構を有さない細胞におけるＨＤＲが可能になる。
【０００４】
このＨＤＲによる２本鎖ＤＮＡ修復の増加は、研究への適用だけでなく、遺伝子治療にも大きく関わっている。この技術は、基礎研究を行う研究室において速やかに適用できるであろう。近い将来には、多くの代謝性疾患（ゴーシェ病、ファブリー病およびポンペ病など）において不充分である酵素を、この技術を用いて再活性化させることができる。これらの疾患は、現在では酵素補充療法（ＥＲＴ）によって治療されている。通常、ＥＲＴは非常に高価であり（年間２００，０００米ドル）、定期的な注射を必要とする。さらに、これらの治療法は、望ましくない免疫応答を引き起こすことがある。例えば、ポンペ病（糖原病ＩＩ型）は、酸性αグルコシダーゼ（ＧＡＡ）のコピーが不充分であることに起因する。最も一般的には、１箇所のチミンからグアノシンへの塩基置換のために、ＧＡＡのコピーが不充分となる。組み換えＧＡＡの注射によって、患者の生は顕著に改善される。しかし、ポンペ病患者の細胞のごく一部を、我々の技術を用いて変異を正確に修正すれば、活性型ＧＡＡを分泌させることができるであろう。この遺伝的変化によって、コストが大きく削減されうるだけでなく、ポンペ病患者の予後も大いに改善されうる。我々の技術を用いれば、同様の遺伝子治療を導入して、現在ではＥＲＴに頼っている患者を治療することができるかもしれない。
【０００５】
これらの疾患は患者の負担となるし、これらの障害の治療は高価である。たとえＥＲＴにより上首尾に苦痛が緩和されるとしても、ＥＲＴは非常に高価なので、政府や健康保険事業者によってはＥＲＴの提供を拒否する。我々の遺伝子置き換え技術が完全に開発されたならば、生涯にわたる点滴の必要がなくなり、何分の１かのコストでＥＲＴと同様の効果を与えるであろう。我々のＨＤＲ増加研究は初期段階ではあるが、我々の技術が従来技術よりも何倍も良く働くことを、我々は成功裡に示してきた。それゆえ、今こそ我々のプロジェクトに資源を投資すべきときなのだ。このプロジェクトは、それが成功した暁には、多くの人々の生を速やかに改善するものである。
【０００６】
したがって、一態様において、本発明は、１種類以上の遺伝子産物の発現を変化させるまたは改変する方法を提供する。この方法は、１種類以上の遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を含んでおり、これを発現している真核細胞内に、改変された非天然のベクターシステムを導入する工程を含んでもよい。このベクターシステムは、（ａ）上記１種類以上の遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子のゲノム位置にある標的配列とハイブリダイズする、Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats−ＣＲＩＳＰＲ関連システム（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム）ガイドＲＮＡの１つ以上をコードする核酸配列と作動可能に連結している第１調節要素と；（ｂ）Ｃａｓ９タンパク質（例えば、ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９ニッカーゼ）をコードする核酸配列と作動可能に連結している第２調節要素と；（ｃ）リコンビナーゼをコードする核酸配列と作動可能に連結している第３調節要素と；を含む、１つ以上のベクターを含んでいる。ここで、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の要素は、上記システムの同じまたは異なるベクター上に位置している。また、上記ガイドＲＮＡが上記１種類以上の遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子のゲノム位置を標的化し、上記Ｃａｓ９タンパク質が上記１種類以上の遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子のゲノム位置を切断し、これによって、上記１種類以上の遺伝子産物の発現が変化する。さらに、上記Ｃａｓ９タンパク質および上記ガイドＲＮＡは、天然では一緒に生じない。（i）２種類以上の遺伝子産物の発現を変化させること、および（ii）１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）をさらに有している上記システムのベクターも、本発明には包含される。tracr配列と融合したガイド配列を有しているガイドＲＮＡも、本発明には包含される。さらに、真核細胞内での発現のためにコドン最適化されたＣａｓ９タンパク質も、本発明には包含される。好ましい実施形態において、上記真核細胞は哺乳動物細胞またはヒト細胞である。本発明のさらなる実施形態においては、上記１種類以上の遺伝子産物の発現を減少させる。本発明の態様において、上記遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子のゲノム位置の切断には、ＤＮＡ二重構造のうちの、片方の鎖を切断することも両方の鎖を切断することもいずれも含まれる。
【０００７】
一態様において、本発明は、改変され設計可能な非天然のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを提供する。このシステムには、Ｃａｓ９タンパク質、リコンビナーゼおよび１つ以上のガイドＲＮＡが含まれている。上記ガイドＲＮＡは、真核細胞内の１種類以上の遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子のゲノム位置を標的化する。上記Ｃａｓ９タンパク質が上記１種類以上の遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子のゲノム位置を切断して、これによって、上記１種類以上の遺伝子産物の発現が変化する。そして、上記Ｃａｓ９タンパク質および上記ガイドＲＮＡは、天然では一緒に生じない。（i）２種類以上の遺伝子産物の発現を変化させること、および（ii）１つ以上のＮＬＳをさらに有しているＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムも、本発明には包含される。tracr配列と融合したガイド配列を有しているガイドＲＮＡも、本発明には包含される。さらに、真核細胞内での発現のためにコドン最適化されたＣａｓ９タンパク質も、本発明には包含される。好ましい実施形態において、上記真核細胞は哺乳動物細胞またはヒト細胞である。本発明の態様において、上記遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子のゲノム位置の切断には、ＤＮＡ二重構造のうちの、片方の鎖を切断することも両方の鎖を切断することもいずれも含まれる。
【０００８】
他の態様において、本発明は、改変された非天然のベクターシステムを提供する。このシステムは、（ａ）１種類以上の遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子のゲノム位置にある標的配列とハイブリダイズするClustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats−ＣＲＩＳＰＲ関連システム（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム）ガイドＲＮＡの１つ以上をコードする核酸配列と作動可能に連結している第１調節要素と；（ｂ）Ｃａｓ９タンパク質（例えば、ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９ニッカーゼ）をコードする核酸配列と作動可能に連結している第２調節要素と；（ｃ）リコンビナーゼをコードする核酸配列と作動可能に連結している第３調節要素と；を含む１つ以上のベクターを含んでいる。ここで、上記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の要素は、上記システムの同じまたは異なるベクター上に位置している。また、上記ガイドＲＮＡが真核細胞内にある上記１種類以上の遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子のゲノム位置を標的化し、上記Ｃａｓ９タンパク質が上記１種類以上の遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子のゲノム位置を切断し、これによって、上記１種類以上の遺伝子産物の発現が変化する。さらに、上記Ｃａｓ９タンパク質および上記ガイドＲＮＡは、天然では一緒に生じない。（i）２種類以上の遺伝子産物の発現を変化させること、および（ii）１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）をさらに有している上記システムのベクターも、本発明には包含される。tracr配列と融合したガイド配列を有しているガイドＲＮＡも、本発明には包含される。さらに、真核細胞内での発現のためにコドン最適化されたＣａｓ９タンパク質も、本発明には包含される。好ましい実施形態において、上記真核細胞は哺乳動物細胞またはヒト細胞である。本発明のさらなる実施形態においては、上記１種類以上の遺伝子産物の発現を減少させる。本発明の態様において、上記遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子のゲノム位置の切断には、ＤＮＡ二重構造のうちの、片方の鎖を切断することも両方の鎖を切断することもいずれも含まれる。
【０００９】
一態様において、本発明は、１つ以上のベクターを含むベクターシステムを提供する。いくつかの実施形態において、このシステムは、（ａ）（i）tracr mate配列、および（ii）当該tracr mate配列の上流にあり、１つ以上のガイド配列を挿入するための１つ以上挿入部位、と作動可能に連結している第１調節要素と；（ｂ）核局在化配列を有しており、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列と作動可能に連結している第２調節要素と；（ｃ）リコンビナーゼをコードする核酸配列と作動可能に連結している第３調節要素と；を含んでいる（要素（ａ）が発現すると、上記ガイド配列は、真核細胞内においてＣＲＩＳＰＲ複合体と標的配列との配列特異的な結合をもたらす。このＣＲＩＳＰＲ複合体には、（１）上記標的配列とハイブリダイズするガイド配列、および（２）tracr配列とハイブリダイズするtracr mate配列、と複合体を形成しているＣＲＩＳＰＲ酵素が含まれる）。ここで、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の要素は、上記システムの同じまたは異なるベクター上に位置している。いくつかの実施形態において、要素（ａ）は、tracr mate配列の下流にあり、第１調節要素の制御下にある、tracr配列をさらに有している。いくつかの実施形態において、要素（ａ）は、第１調節要素と作動可能に連結している２つ以上のガイド配列をさらに有している（要素（ａ）が発現すると、２つ以上のガイド配列のそれぞれは、真核細胞内において、（i）ＣＲＩＳＰＲ複合体と（ii）互いに異なる標的配列との配列特異的な結合をもたらす）。いくつかの実施形態において、上記システムは、第３調節要素（ポリメラーゼＩＩＩプロモーターなど）の制御下にあるtracr配列を含んでいる。いくつかの実施形態において、上記tracr配列は、最適にアラインメントさせた場合に、tracr mate配列の長さに対して、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上または９９％以上の配列相補性を示す。
【００１０】
最適なアラインメントの決定の仕方は、当業者の理解する範囲内にある。例えば、一般利用および商用利用が可能なアラインメント・アルゴリズムおよびプログラムがある（ClustalW、Smith-Waterman in matlab、Bowtie、Geneious、BiopythonおよびSeqManなどであるが、これらに限定されない）。いくつかの実施形態において、上記ＣＲＩＳＰＲ複合体には充分な強度の核局在化配列の１つ以上が含まれており、これによって、当該ＣＲＩＳＰＲ複合体は検出可能な量だけ真核細胞の核内に蓄積する。理論に拘束されるものではないが、核局在化配列は、真核生物におけるＣＲＩＳＰＲ複合体の活性に必須ではないと考えられている。しかし、このような配列を含ませると、上記システムの活性が向上するとも考えられている（とりわけ、核内での核酸分子の標的化に関して）。いくつかの実施形態において、上記ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステム酵素である。いくつかの実施形態において、上記ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ９酵素である。いくつかの実施形態において、上記Ｃａｓ９酵素は、S. pneumoniae、S. pyogenesまたはS. thermophilusのＣａｓ９であり、これらの生物に由来する変異Ｃａｓ９を含んでもよい。上記酵素は、Ｃａｓ９のホモログまたはオルソログであってもよい。いくつかの実施形態において、上記ＣＲＩＳＰＲ酵素は、真核細胞内での発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、上記ＣＲＩＳＰＲ酵素は、上記標的配列の位置において、片方の鎖または両方の鎖の切断をもたらす。いくつかの実施形態において、上記リコンビナーゼは細菌性リコンビナーゼである。いくつかの実施形態において、上記リコンビナーゼは、上記ベクターシステムで形質転換または形質導入する細胞の種類の中では自然に生じないものである。いくつかの実施形態において、上記リコンビナーゼは、Ｒａｄ５１リコンビナーゼ、ＲｅｃＡリコンビナーゼ、およびＵｖｓＸリコンビナーゼ、またはＲｅｃＡもしくはＲａｄＡドメインを有している任意のタンパク質からなる群より選択される。
【００１１】
いくつかの実施形態において、上記第１調節要素は、サイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶプロモーター）、ポリメラーゼＩＩＩプロモーターである。いくつかの実施形態において、上記第２調節要素は、ポリメラーゼＩＩプロモーターである。いくつかの実施形態において、上記ガイド配列の長さは、１５ヌクレオチド以上、１６ヌクレオチド以上、１７ヌクレオチド以上、１８ヌクレオチド以上、１９ヌクレオチド以上、２０ヌクレオチド以上、２５ヌクレオチド以上、または、１０〜３０ヌクレオチド、１５〜２５ヌクレオチド、１５〜２０ヌクレオチドである。一般的に（そして本明細書を通して）、用語「ベクター」は、それに連結されている他の核酸を輸送することのできる、核酸分子を表す。
【００１２】
ベクターには以下のものが含まれるが、これらに限定されない。（i）１本鎖の核酸分子、２本鎖の核酸分子、または部分的に２本鎖の核酸分子；（ii）１つ以上の自由末端を有する核酸分子、自由末端のない核酸分子（例えば、環状）；（iii）ＤＮＡ、ＲＮＡまたはその両方を含んでいる核酸分子；（iv）当業者に知られている他のポリヌクレオチドの種類。ベクターの一類型に、「プラスミド」がある。これは、追加のＤＮＡ断片を挿入することができる（標準的な分子クローニング技術などによって）、環状の２本鎖ＤＮＡループを表す。ベクターの他の類型に、ウイルスベクターがある。ウイルスベクターでは、ウイルス（例えば、レトロウイルス、複製能欠損レトロウイルス、アデノウイルス、複製能欠損アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）内に格納するために、ウイルス由来のＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列がベクター中に存在している。ウイルスベクターには、宿主細胞にトランスフェクションするためにウイルスによって輸送される、ポリヌクレオチドも含まれている。あるベクターは、導入された宿主細胞内において自己複製が可能である（例えば、細菌の複製開始点を有している細菌ベクター、および哺乳動物性のエピソーマルベクター）。他のベクターは、宿主細胞に導入されると当該宿主細胞のゲノム内に組み込まれ、その結果、宿主ゲノムとともに複製される（例えば、哺乳動物性の非エピソーマルベクター）。さらに、あるベクターは、作動可能に連結されている遺伝子を発現させることができる。このようなベクターを、本明細書では、「発現ベクター」と称する。組み換えＤＮＡ技術に有用な一般的な発現ベクターは、通常、プラスミドの形態をとる。
【００１３】
組み換え発現ベクターは、本発明の核酸を、宿主細胞内における核酸の発現に適した形態で含んでいてもよい。つまり、組み換え発現ベクターは、１つ以上の調節要素を含んでいてもよい。この調節要素は、発現に用いる宿主細胞に応じて選択することができ、発現させるべき核酸配列と作動可能に連結している。組み換え発現ベクターに関して、「作動可能に連結している」とは、所定のヌクレオチド配列が発現できるように（例えば、in vitro転写／翻訳システムにおいて、あるいは、ベクターが導入される宿主細胞内において）、当該ヌクレオチド配列が調節要素と連結されているという意味である。
【００１４】
用語「調節要素」には、プロモーター、エンハンサー、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、および他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナルやポリＵ配列などの転写終了シグナル）も含まれる。このような調節要素は、例えば、［Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)］に説明されている。調節要素には、多くの種類の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的な発現をもたらすものもあるし、特定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現をもたらすものもある（例えば、組織特異的な調節配列）。組織特異的プロモーターは、主に望ましい所定の組織における発現をもたらしうる。このような組織とは、筋肉、ニューロン、骨、皮膚、血液、特定の臓器（例えば、肝臓、膵臓）、または特定の細胞の種類（例えば、リンパ球）などである。調節要素はまた、時間依存的な様式での発現をももたらしうる（細胞サイクル依存的な発現様式、または発達段階依存的な発現様式など）。時間依存的な発現は、組織または細胞の種類に特異的であってもよいし、非特異的であってもよい。いくつかの実施形態において、ベクターは、１つ以上のｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上のｐｏｌ  Ｉプロモーター）、１つ以上のｐｏｌ  ＩＩプロモーター（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上のｐｏｌ  ＩＩプロモーター）、１つ以上のｐｏｌ  Ｉプロモーター（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上のｐｏｌ  Ｉプロモーター）、またはこれらの組み合わせを含んでいる。ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターの例としては、Ｕ６プロモーターおよびＨＩプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。ｐｏｌ  ＩＩプロモーターの例としては、レトロウイルス性のRous肉腫ウイルスＬＴＲプロモーター（ＲＳＶ  ＬＴＲプロモーター；任意構成でＲＳＶエンハンサーを伴う）、サイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶプロモーター；任意構成でＣＭＶエンハンサーを伴う；Boshart et al, Cell, 41:521-530 (1985)などを参照）ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、βアクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼプロモーター（ＰＧＫプロモーター）、およびＥＦ１αプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。用語「調節要素」には、エンハンサー要素も含まれる。エンハンサー要素には、ＷＰＲＥ、ＣＭＶエンハンサー、ＨＴＬＶ−ＩのＬＴＲにあるＲ−Ｕ５’セグメント（Mol. Cell. Biol., Vol. 8(1), p. 466-472, 1988）、ＳＶ４０エンハンサー、および、ウサギβグロビンのエキソン２とエキソン３との間にあるイントロン配列（Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol. 78(3), p. 1527-31, 1981）などがある。形質転換させるべき宿主細胞の選択、所望の発現レベルなどの要因に応じて発現ベクターを設計できることを、当業者は理解するであろう。宿主細胞内にベクターを導入して、本明細書に開示されている核酸にコードされている転写物、タンパク質またはペプチド（融合タンパク質または融合ペプチドを含む）を産生させることができる（例えば、ＣＲＩＳＰＲ（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）転写物、ＣＲＩＳＰＲタンパク質、ＣＲＩＳＰＲ酵素、それ由来���変異体、その融合タンパク質など）。
【００１５】
有用なベクターとしては、レンチウイルスおよびアデノ随伴ウイルスが挙げられる。特定の種類の細胞を標的化するために、これらのベクターのタイプを選択することもできる。
【００１６】
上述の方法およびシステム他のいくつかの実施形態においては、Ｃａｓ９酵素および／またはリコンビナーゼを、核酸ベクターにコードされた状態ではなく、タンパク質として導入してもよい。例えば、これらの分子を、タンパク質と核酸との複合体として導入することも予期されている（例えば、Ｃａｓ９−ＲＮＡ複合体およびＤＮＡ−ＲｅｃＡ複合体）。いくつかの実施形態においては、これらの複合体を、エレクトロポレーションなどによるトランスフェクションに先立って、事前にin vitroにて会合させる。
【００１７】
ある態様において、本発明は、記載されている実施形態のいずれかに係る宿主真核細胞を含んでいる、非ヒト真核生物（好ましくは、多細胞真核生物）を提供する。他の態様において、本発明は、記載されている実施形態のいずれかに係る宿主真核細胞を含んでいる、真核生物（好ましくは多細胞真核生物）を提供する。上述の態様のいくつかの実施形態において、上記生物は、動物であってもよい（例えば哺乳動物）。また、上記生物は、節足動物であってもよい（昆虫など）。さらに、上記生物は、植物であってもよい。さらにまた、上記生物は真菌であってもよい。
【００１８】
一態様において、本発明は、本明細書に記載の１つ以上の要素を備えている、キットを提供する。いくつかの実施形態において、上記キットは、ベクターシステムおよび当該キットの使用のための説明書を備えている。いくつかの実施形態において、上記ベクターシステムは、（ａ）（i）tracr mate配列、および（ii）当該tracr mate配列の上流にあり、１つ以上のガイド配列を挿入するための１つ以上の挿入部位、と作動可能に連結している第１調節要素（要素（ａ）が発現すると、上記ガイド配列は、ＣＲＩＳＰＲ複合体と標的配列との配列特異的な結合を、真核細胞内においてもたらす。このＣＲＩＳＰＲ複合体には、（１）上記標的配列とハイブリダイズするガイド配列、および（２）tracr配列とハイブリダイズするtracr mate配列、と複合体を形成しているＣＲＩＳＰＲ酵素が含まれている）；および／または、（ｂ）核局在化配列を有しており、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列と作動可能に連結している第２調節要素；を含んでいる。いくつかの実施形態において、上記キットは、上記システムの同じまたは異なるベクター上に位置している上記（ａ）および（ｂ）の要素を備えている。いくつかの実施形態において、要素（ａ）は、tracr mate配列の下流にあり、第１調節要素の制御下にある、tracr配列をさらに有している。いくつかの実施形態において、要素（ａ）は、第１調節要素と作動可能に連結している２つ以上のガイド配列をさらに有している（要素（ａ）が発現すると、２つ以上のガイド配列のそれぞれは、真核細胞内において、（i）ＣＲＩＳＰＲ複合体と（ii）互いに異なる標的配列との配列特異的な結合をもたらす）。いくつかの実施形態において、上記システムは、tracr配列と作動可能に連結している、第３調節要素（ポリメラーゼＩＩＩプロモーターなど）をさらに含んでいる。いくつかの実施形態において、上記tracr配列は、最適にアラインメントさせた場合に、tracr mate配列の長さに対して、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上または９９％以上の配列相補性を示す。いくつかの実施形態において、上記ＣＲＩＳＰＲ複合体には充分な強度の核局在化配列の１つ以上が含まれており、これによって、当該ＣＲＩＳＰＲ複合体は検出可能な量だけ真核細胞の核内に蓄積する。いくつかの実施形態において、上記ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステム酵素である。いくつかの実施形態において、上記ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ９酵素である。いくつかの実施形態において、上記Ｃａｓ９酵素は、S. pneumoniae、S. pyogenesまたはS. thermophilusのＣａｓ９であり、これらの生物に由来する変異Ｃａｓ９を含んでもよい。上記酵素は、Ｃａｓ９のホモログまたはオルソログであってもよい。いくつかの実施形態において、上記ＣＲＩＳＰＲ酵素は、真核細胞内での発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、上記ＣＲＩＳＰＲ酵素は、上記標的配列の位置において、片方の鎖または両方の鎖の切断をもたらす。いくつかの実施形態において、上記ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＤＮＡ鎖切断活性を失っている。いくつかの実施形態において、上記第１調節要素は、ポリメラーゼＩＩＩプロモーターである。いくつかの実施形態において、��記第２調節要素は、ポリメラーゼＩＩプロモーターである。いくつかの実施形態において、上記ガイド配列長さは、１５ヌクレオチド以上、１６ヌクレオチド以上、１７ヌクレオチド以上、１８ヌクレオチド以上、１９ヌクレオチド以上、２０ヌクレオチド以上、２５ヌクレオチド以上、または、１０〜３０ヌクレオチド、１５〜２５ヌクレオチド、１５〜２０ヌクレオチドである。
【００１９】
一態様において、本発明は、真核細胞内の標的ポリヌクレオチドを改変する方法を提供する。いくつかの実施形態において、上記方法は、ＣＲＩＳＰＲ複合体と上記標的ポリヌクレオチドとを結合させて、当該標的ポリヌクレオチドを切断させ、これによって、当該標的ポリヌクレオチドを改変する工程を含む。ここで、上記ＣＲＩＳＰＲ複合体には、ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体と、上記標的ポリヌクレオチド内の標的配列とハイブリダイズするガイド配列とが含まれている。このガイド配列には、tracr配列とハイブリダイズするtracr mate配列が連結されている。いくつかの実施形態において、上記切断には、上記標的配列の位置において、上記ＣＲＩＳＰＲ酵素によって片側の鎖または両側の鎖を切断する工程が含まれる。いくつかの実施形態においては、上記切断の結果、標的遺伝子の転写が減少する。いくつかの実施形態において、上記方法は、切断された上記標的ポリヌクレオチドを、外来性のテンプレート・ポリヌクレオチドを用いた相同組み換えによって修復する工程を、さらに含む。このとき、上記修復によって、上記標的ポリヌクレオチドのヌクレオチドの１つ以上が挿入、欠失または置換する変異がもたらされる。いくつかの実施形態において、上記変異の結果、上記標的配列を有している遺伝子からのタンパク質発現には、１つ以上のアミノ酸の変化が生じる。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記真核細胞に、１つ以上のベクターを送達する工程をさらに含む。ここで、上記１つ以上ベクターは、ＣＲＩＳＰＲ酵素、tracr mate配列と連結しているガイド配列、およびtracr配列の、１つ以上の発現をもたらす。いくつかの実施形態において、上記ベクターは、被験体の中にある真核細胞に送達される。いくつかの実施形態において、上記の改変は、細胞培養中の真核細胞に対して行われる。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記改変に先立って、被験体から真核細胞を単離する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、上記方法は、真核細胞および／またはそれに由来する細胞を、上記被験体に戻す工程をさらに含む。
【００２０】
一態様において、本発明は、真核細胞内におけるポリヌクレオチドの発現を変化させる方法を提供する。いくつかの実施形態において、上記方法は、ＣＲＩＳＰＲ複合体と上記ポリヌクレオチドとを結合させて、この結合によって上記ポリヌクレオチドの発現を増加または減少させる工程を含む。ここで、上記ＣＲＩＳＰＲ複合体には、上記標的ポリヌクレオチド内の標的配列とハイブリダイズするガイド配列と複合体を形成している、ＣＲＩＳＰＲ酵素が含まれている。このガイド配列には、tracr配列とハイブリダイズするtracr mate配列が連結されている。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記真核細胞に、１つ以上のベクターを送達する工程をさらに含む。ここで、上記１つ以上ベクターは、ＣＲＩＳＰＲ酵素、tracr mate配列と連結しているガイド配列、およびtracr配列の、１つ以上の発現をもたらす。
【００２１】
一態様において、本発明は、変異型疾患遺伝子を有しているモデル真核細胞を作出する方法を提供する。いくつかの実施形態において、疾患遺伝子とは、疾患の発症または進展のリスクの増加に関連している、任意の遺伝子である。いくつかの実施形態において、上記方法は、（ａ）真核細胞内に１つ以上のベクターを導入する工程（ここで、上記１つ以上のベクターは、ＣＲＩＳＰＲ酵素、tracr mate配列と連結しているガイド配列、およびtracr配列の、１つ以上の発現をもたらす）と；（ｂ）ＣＲＩＳＰＲ複合体と標的ポリヌクレオチドとを結合させて、上記疾患遺伝子内にある当該標的ポリヌクレオチドを切断させ、これによって、変異型疾患遺伝子を有しているモデル真核細胞を作出する工程（ここで、上記ＣＲＩＳＰＲ複合体には、（１）上記標的ポリヌクレオチド内の標的配列とハイブリダイズするガイド配列、および（２）tracr配列とハイブリダイズするtracr mate配列、と複合体を形成している、ＣＲＩＳＰＲ酵素が含まれている）と；を含む。いくつかの実施形態において、上記切断には、上記標的配列の位置において、上記ＣＲＩＳＰＲ酵素によって片側の鎖または両側の鎖を切断する工程が含まれる。いくつかの実施形態においては、上記切断の結果、標的遺伝子の転写が減少する。いくつかの実施形態において、上記方法は、切断された上記標的ポリヌクレオチドを、外来性のテンプレート・ポリヌクレオチドを用いた相同組み換えによって修復する工程を、さらに含む。このとき、上記修復によって、上記標的ポリヌクレオチドのヌクレオチドの１つ以上が挿入、欠失または置換する変異がもたらされる。いくつかの実施形態において、上記変異の結果、上記標的配列を有している遺伝子からのタンパク質発現には、１つ以上のアミノ酸の変化が生じる。
【００２２】
一態様において、本発明は、疾患遺伝子に関連する細胞シグナル・イベントを調節する、生物活性物質を開発する方法を提供する。いくつかの実施形態において、疾患遺伝子とは、疾患の発症または進展のリスクの増加に関連している、任意の遺伝子である。いくつかの実施形態において、上記方法は、（ａ）試験化合物と、上述の実施形態のいずれかに係るモデル細胞とを接触させる工程と；（ｂ）上記疾患遺伝子の変異に関連した細胞シグナル・イベントの減少または増加を示している読み出した情報の変化を検出して、これによって、上記疾患遺伝子に関連する細胞シグナル・イベントを調節する上記生物活性物質を開発するする工程と；を含む。
【００２３】
一態様において、本発明は、tracr mate配列の上流にガイド配列を有している、組み換えポリヌクレオチドを提供する。ここで、上記ガイド配列は、発現したときに、ＣＲＩＳＰＲ複合体と、真核細胞内にある対応する標的配列との、配列特異的な結合をもたらす。いくつかの実施形態において、上記標的配列は、真核細胞内に存在するウイルス性配列である。いくつかの実施形態において、上記標的配列は、癌原遺伝子または癌遺伝子である。
【００２４】
一態様において、本発明は、１つ以上の細胞の遺伝子に１つ以上の変異を導入することによって、当該１つ以上の細胞を選択する方法を提供する。この方法は、上記細胞に、１つ以上のベクターを導入する工程（ここで、上記１つ以上のベクターは、ＣＲＩＳＰＲ酵素、tracr mate配列と連結しているガイド配列、tracr配列、および編集テンプレートの、１つ以上の発現をもたらす。上記編集テンプレートは、ＣＲＩＳＰＲ酵素による切断に抵抗する、１つ以上の変異を有している）と；選択される細胞において、編集テンプレートを上記標的ポリヌクレオチドと相同組み換えさせる工程と；ＣＲＩＳＰＲ複合体と標的ポリヌクレオチドとを結合させて、上記遺伝子内にある上記標的ポリヌクレオチドを切断させ、これによって、１つ以上の変異が導入されている１つ以上の細胞を選択する工程（ここで、上記ＣＲＩＳＰＲ複合体には、（１）上記標的ポリヌクレオチド内の標的配列とハイブリダイズするガイド配列、および（２）tracr配列とハイブリダイズするtracr mate配列、と複合体を形成している、ＣＲＩＳＰＲ酵素が含まれている。上記ＣＲＩＳＰＲ複合体と上記標的ポリヌクレオチドとの結合により、細胞死が誘導される）と；を含む。好適な実施形態において、上記ＣＲＩＳＰＲ酵素はＣａｓ９である。本発明の他の好適な実施形態において、選択される上記細胞は、真核細胞であってもよい。本発明の態様によれば、（i）選択マーカーまたは（ii）カウンターセレクション・システムを含みうる２段階プロセスを必要とせずに、特定の細胞を選択することができる。したがって、本発明の目的は、あらゆる従来公知の物、物を生産する方法または物を使用する方法を、本発明に包含させないことにある。それゆえ出願人は、ここに、その権利を留保しつつも、あらゆる従来公知の物、製造方法または方法を放棄することを明示する。さらに、米国特許商標庁の記載要件および実施可能要件（米国特許法第１１２条第１パラグラフ）または欧州特許庁のそれ（欧州特許条約第８３条）を満たさない、あらゆる物、方法、物を生産する方法、または物を使用する方法を本発明の範囲に包含しようとすることを、本発明が意図していないことにも留意されたい。それゆえ出願人はここに、権利を留保しつつも、あらゆる従来公知の物、物を生産する方法、または物を使用する方法を放棄することを明示する。
【００２５】
いくつかの実施形態において、本発明は、１種類以上の遺伝子産物の発現を変化させる方法、および／または、ゲノム編集の方法を提供する。この方法は、ゲノムを含んでいる細胞内に、当該ゲノム内に挿入される所定の核酸配列をコードする１本鎖の核酸分子を含んでいる核酸フィラメントを導入する工程を含む。ここで、上記１本鎖核酸分子は、リコンビナーゼ多量体を結合させた状態である。上記所定の核(nucleic)は、上記遺伝子産物をコードするゲノムの標的配列に対して相同的な、５’フランキング領域および３’フランキング領域を有している。上記５’フランキング配列および３’フランキング配列は、上記ゲノムの標的配列とは異なる挿入配列に隣接している。上記ゲノムに挿入される所定の核酸配列をコードする上記核酸分子と、上記リコンビナーゼ多量体とは、天然では一緒に生じないものである。そして、上記所定の核酸配列は、相同組み換えによって上記ゲノム内に挿入され、これによって、上記１種類以上の遺伝子産物の発現を変化させる、および／または、当該所定の遺伝子産物をコードする上記遺伝子をゲノム編集する。いくつかの実施形態において、上記フランキング配列は、ゲノム内の標的領域に対して実質的に相同的である。いくつかの実施形態において、上記フランキング領域は、ゲノム内の標的領域に対して、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上または１００％以上相同的である。
【００２６】
いくつかの実施形態において、上記核酸フィラメントは、上記所定の１本鎖核酸をリコンビナーゼとともにインキュベートして、当該所定の１本鎖核酸上にリコンビナーゼ多量体を形成させることによって、in vitroで合成される。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記所定の１本鎖核酸を、ヌクレオチドとともにインキュベートする工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、上記ヌクレオチドは、ヌクレオチド三リン酸または類似体からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、上記ヌクレオチド三リン酸または類似体は、アデノシン三リン酸、アデノシン一リン酸、アデノシン二リン酸、アデノシン三リン酸−γＳ、アデノシン一リン酸−ＰＮＰ、およびアデノシン二リン酸−ＡｌＦ４からなる群より選択される。
【００２７】
いくつかの実施形態において、上記リコンビナーゼは、細菌性リコンビナーゼ、ウイルス性リコンビナーゼおよび哺乳動物性リコンビナーゼからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、上記リコンビナーゼは、Ｒａｄ５１リコンビナーゼ、ＲｅｃＡリコンビナーゼおよびＵｖｓＸリコンビナーゼからなる群より選択される。
【００２８】
いくつかの実施形態において、上記５’フランキング配列および３’フランキング配列の長さは、５０塩基超である。いくつかの実施形態において、上記５’フランキング配列および３’フランキング配列の長さは、１００塩基超である。いくつかの実施形態において、上記５’フランキング配列および３’フランキング配列の長さは、２００塩基超である。いくつかの実施形態において、上記５’フランキング配列および３’フランキング配列の長さは、５００塩基超である。いくつかの実施形態において、上記５’フランキング配列および３’フランキング配列の長さは、１０００塩基超である。いくつかの実施形態において、上記５’フランキング配列および３’フランキング配列の長さは、約２０〜約１０００塩基である。いくつかの実施形態において、上記５’フランキング配列および３’フランキング配列の長さは、約１００〜約１０００塩基である。
【００２９】
いくつかの実施形態において、上記１本鎖核酸は１本鎖ＤＮＡである。いくつかの実施形態において、上記方法は、細胞のゲノム内において上記遺伝子産物をコードする遺伝子内にある上記標的配列に、切断を導入する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、上記切断は、２本鎖切断または１本鎖切断である。いくつかの実施形態において、上記切断は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＮＦヌクレアーゼ）、および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥヌクレアーゼ）、ならびにＩ型制限エンドヌクレアーゼ、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ、ＩＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ、ＩＶ型制限エンドヌクレアーゼまたはニッカーゼからなる群より選択される酵素によって導入される。
【００３０】
いくつかの実施形態において、上記方法は、上記標的配列とハイブリダイズするＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムガイドＲＮＡを、細胞内に導入する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、上記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、トランス活性化型ｃｒ配列（tracr配列）を含んでいる。いくつかの実施形態において、上記ガイドＲＮＡは、tracr配列と融合したガイド配列を有している。
【００３１】
いくつかの実施形態において、上記フィラメントは、エレクトロポレーションによって細胞内に導入される。いくつかの実施形態において、上記細胞は真核細胞である。いくつかの実施形態において、上記真核細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、上記哺乳動物細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態においては、１種類以上の遺伝子産物の発現を増加させる。いくつかの実施形態においては、１種類以上の遺伝子産物の発現を減少させる。いくつかの実施形態においては、２種類以上の遺伝子産物の発現を変化させる。
【００３２】
いくつかの実施形態において、本発明は、遺伝子産物の発現を変化させるための、および／または、ゲノム編集のための、改変された非天然のシステムを提供する。このシステムは、上記ゲノムに挿入される所定の核酸配列をコードする１本鎖の核酸分子を含む、核酸フィラメントを含んでいる。ここで、上記１本鎖核酸分子は、リコンビナーゼ多量体を結合させた状態である。上記所定の核(nucleic)は、上記遺伝子産物をコードするゲノムの標的配列に対して相同的な、５’フランキング領域および３’フランキング領域を有している。上記５’フランキング配列および３’フランキング配列は、上記ゲノムの標的配列とは異なる挿入配列に隣接している。上記ゲノムに挿入される所定の核酸配列をコードする上記１本鎖核酸分子と、上記リコンビナーゼ多量体とは、天然では一緒に生じないものである。ゲノムを有している細胞内に導入したとき、上記所定の核酸配列は、相同組み換えによって上記ゲノム内に挿入され、これによって、上記１種類以上の遺伝子産物の発現を変化させる、および／または、当該所定の遺伝子産物をコードする上記遺伝子をゲノム編集する。
【００３３】
いくつかの実施形態において、上記核酸フィラメントは、上記所定の１本鎖核酸をリコンビナーゼとともにインキュベートして、当該所定の１本鎖核酸上にリコンビナーゼ多量体を形成させることによって、in vitroで合成される。いくつかの実施形態において、上記所定の１本鎖核酸は、ヌクレオチドをさらに含んでいる。いくつかの実施形態において、上記ヌクレオチドは、ヌクレオチド三リン酸または類似体からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、上記ヌクレオチド三リン酸または類似体は、アデノシン三リン酸、アデノシン一リン酸、アデノシン二リン酸、アデノシン三リン酸−γＳ、アデノシン一リン酸−ＰＮＰ、およびアデノシン二リン酸−ＡｌＦ４からなる群より選択される。
【００３４】
いくつかの実施形態において、上記リコンビナーゼは、細菌性リコンビナーゼ、ウイルス性リコンビナーゼおよび哺乳動物性リコンビナーゼからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、上記リコンビナーゼは、Ｒａｄ５１リコンビナーゼ、ＲｅｃＡリコンビナーゼおよびＵｖｓＸリコンビナーゼからなる群より選択される。
【００３５】
いくつかの実施形態において、上記５’フランキング配列および３’フランキング配列の長さは、５０塩基超である。いくつかの実施形態において、上記５’フランキング配列および３’フランキング配列の長さは、１００塩基超である。いくつかの実施形態において、上記５’フランキング配列および３’フランキング配列の長さは、２００塩基超である。いくつかの実施形態において、上記５’フランキング配列および３’フランキング配列の長さは、５００塩基超である。いくつかの実施形態において、上記５’フランキング配列および３’フランキング配列の長さは、１０００塩基超である。いくつかの実施形態において、上記５’フランキング配列および３’フランキング配列の長さは、約２０〜約１０００塩基である。いくつかの実施形態において、上記５’フランキング配列および３’フランキング配列の長さは、約１００〜約１０００塩基である。
【００３６】
いくつかの実施形態において、上記１本鎖核酸は１本鎖ＤＮＡである。いくつかの実施形態において、上記システムは、細胞のゲノム内において上記遺伝子産物をコードする遺伝子内にある上記標的配列に、切断を導入するための試薬をさらに含んでいる。いくつかの実施形態において、上記切断は、２本鎖切断または１本鎖ＤＮＡ切断である。いくつかの実施形態において、上記切断は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＮＦヌクレアーゼ）、および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥヌクレアーゼ）、ならびにＩ型制限エンドヌクレアーゼ、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ、ＩＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ、ＩＶ型制限エンドヌクレアーゼまたはニッカーゼからなる群より選択される酵素によって導入される。
【００３７】
いくつかの実施形態において、上記システムは、上記標的配列とハイブリダイズするＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムガイドＲＮＡをさらに含んでいる。いくつかの実施形態において、上記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、トランス活性化型ｃｒ配列（tracr配列）を含んでいる。いくつかの実施形態において、上記ガイドＲＮＡは、tracr配列と融合したガイド配列を有している。
【００３８】
いくつかの実施形態において、本発明は、上述のシステムを含んでいる細胞を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、（i）標的細胞における遺伝子発現を変化させることによって、または（ii）標的細胞のゲノムを編集することによって、疾患を処置するための、上述のシステムの使用を提供する。
【００３９】
いくつかの実施形態において、本発明は、１種類以上の遺伝子産物の発現を変化させる方法、および／または、ゲノム編集の方法を提供する。この方法は、（ａ）上記ゲノムの切断箇所において相同組み換えによって当該ゲノム内に挿入される所定の核酸配列を、コードする核酸分子と；（ｂ）リコンビナーゼと；を細胞内に導入する工程を含む。ここで、上記（ａ）および（ｂ）の要素が、（i）上記細胞内に導入されるか、または（ii）上記細胞内で発現したとき、所定の核酸配列をコードする上記核酸分子は、上記切断箇所において相同組み換えによって挿入され、これによって、１種類以上の上記遺伝子産物の発現を変化させる、および／または、当該所定の遺伝子産物をコードする上記遺伝子をゲノム編集する。上記切断箇所において上記ゲノム内に挿入される所定の核酸配列をコードする上記核酸分子と、上記リコンビナーゼとは、天然では一緒に生じない。
【００４０】
いくつかの実施形態において、上記リコンビナーゼは、細菌性リコンビナーゼ、ウイルス性リコンビナーゼおよび哺乳動物性リコンビナーゼからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、上記リコンビナーゼは、Ｒａｄ５１リコンビナーゼ、ＲｅｃＡリコンビナーゼおよびＵｖｓＸリコンビナーゼからなる群より選択される。
【００４１】
いくつかの実施形態において、所定の核酸配列をコードする上記核酸分子は５’配列および３’配列を有しており、上記５’配列および３’配列は上記ゲノムの標的配列とは異なる挿入配列に隣接しており、上記５’フランキング配列および３’フランキング配列の長さは５０塩基超である。いくつかの実施形態において、所定の核酸配列をコードする上記核酸分子は５’配列および３’配列を有しており、上記５’配列および３’配列は上記ゲノムの標的配列とは異なる挿入配列に隣接しており、上記５’フランキング配列および３’フランキング配列の長さは１００塩基超である。いくつかの実施形態において、所定の核酸配列をコードする上記核酸分子は５’配列および３’配列を有しており、上記５’配列および３’配列は上記ゲノムの標的配列とは異なる挿入配列に隣接しており、上記５’フランキング配列および３’フランキング配列の長さは２００塩基超である。いくつかの実施形態において、所定の核酸配列をコードする上記核酸分子は５’配列および３’配列を有しており、上記５’配列および３’配列は上記ゲノムの標的配列とは異なる挿入配列に隣接しており、上記５’フランキング配列および３’フランキング配列の長さは５００塩基超である。いくつかの実施形態において、所定の核酸配列をコードする上記核酸分子は５’配列および３’配列を有しており、上記５’配列および３’配列は上記ゲノムの標的配列とは異なる挿入配列に隣接しており、上記５’フランキング配列および３’フランキング配列の長さは１０００塩基超である。いくつかの実施形態において、所定の核酸配列をコードする上記核酸分子は５’配列および３’配列を有しており、上記５’配列および３’配列は上記ゲノムの標的配列とは異なる挿入配列に隣接しており、上記５’フランキング配列および３’フランキング配列の長さは約２０〜約１０００塩基である。いくつかの実施形態において、所定の核酸配列をコードする上記核酸分子は５’配列および３’配列を有しており、上記５’配列および３’配列は上記ゲノムの標的配列とは異なる挿入配列に隣接しており、上記５’フランキング配列および３’フランキング配列の長さは約１００〜約１０００塩基である。いくつかの実施形態において、上記フランキング配列は、ゲノム内の標的領域に対して実質的に相同的である。いくつかの実施形態において、上記フランキング領域は、ゲノム内の標的領域に対して、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上または１００％以上相同的である。
【００４２】
いくつかの実施形態において、所定の核酸配列をコードする上記核酸分子は１本鎖ＤＮＡである。いくつかの実施形態において、上記切断は、２本鎖切断または１本鎖切断である。いくつかの実施形態において、上記切断は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＮＦヌクレアーゼ）、および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥヌクレアーゼ）からなる群より選択される酵素によって導入される。いくつかの実施形態において、上記切断は、Ｉ型制限エンドヌクレアーゼ、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ、ＩＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ、ＩＶ型制限エンドヌクレアーゼまたはニッカーゼによって導入される。
【００４３】
いくつかの実施形態において、上記方法は、上記標的配列とハイブリダイズするＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムガイドＲＮＡを、細胞内に導入する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、上記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、トランス活性化型ｃｒ配列（tracr配列）を含んでいる。いくつかの実施形態において、上記ガイドＲＮＡは、tracr配列と融合したガイド配列を有している。
【００４４】
いくつかの実施形態において、所定の核酸配列をコードする上記核酸分子は、エレクトロポレーションによって細胞内に導入される。いくつかの実施形態において、上記細胞は真核細胞である。いくつかの実施形態において、上記真核細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、上記哺乳動物細胞はヒト細胞である。
【００４５】
いくつかの実施形態においては、１種類以上の遺伝子産物の発現を増加させる。いくつかの実施形態においては、１種類以上の遺伝子産物の発現を減少させる。いくつかの実施形態においては、２種類以上の遺伝子産物の発現を変化させる。
【００４６】
いくつかの実施形態において、本発明は、遺伝子産物の発現を変化させるための、および／または、ゲノム編集のための、改変された非天然のシステムを提供する。このシステムは、（ａ）上記ゲノムの切断箇所において相同組み換えによって当該ゲノム内に挿入される所定の核酸配列を、コードする核酸分子と；（ｂ）リコンビナーゼと；を含んでいる。ここで、上記（ａ）および（ｂ）の要素が、（i）上記細胞内に導入されるか、または（ii）上記細胞内で発現したとき、所定の核酸配列をコードする上記核酸分子は、上記切断箇所において相同組み換えによって挿入され、これによって、１種類以上の上記遺伝子産物の発現を変化させる、および／または、当該所定の遺伝子産物をコードする上記遺伝子をゲノム編集する。上記切断箇所において上記ゲノム内に挿入される所定の核酸配列をコードする上記核酸分子と、上記リコンビナーゼとは、天然では一緒に生じない。
【００４７】
いくつかの実施形態において、上記リコンビナーゼは、細菌性リコンビナーゼ、ウイルス性リコンビナーゼおよび哺乳動物性リコンビナーゼからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、上記リコンビナーゼは、Ｒａｄ５１リコンビナーゼ、ＲｅｃＡリコンビナーゼおよびＵｖｓＸリコンビナーゼからなる群より選択される。
【００４８】
いくつかの実施形態において、所定の核酸配列をコードする上記核酸分子は５’配列および３’配列を有しており、上記５’配列および３’配列は上記ゲノムの標的配列とは異なる挿入配列に隣接しており、上記５’フランキング配列および３’フランキング配列の長さは５０塩基超である。いくつかの実施形態において、所定の核酸配列をコードする上記核酸分子は５’配列および３’配列を有しており、上記５’配列および３’配列は上記ゲノムの標的配列とは異なる挿入配列に隣接しており、上記５’フランキング配列および３’フランキング配列の長さは１００塩基超である。いくつかの実施形態において、所定の核酸配列をコードする上記核酸分子は５’配列および３’配列を有しており、上記５’配列および３’配列は上記ゲノムの標的配列とは異なる挿入配列に隣接しており、上記５’フランキング配列および３’フランキング配列の長さは２００塩基超である。いくつかの実施形態において、所定の核酸配列をコードする上記核酸分子は５’配列および３’配列を有しており、上記５’配列および３’配列は上記ゲノムの標的配列とは異なる挿入配列に隣接しており、上記５’フランキング配列および３’フランキング配列の長さは５００塩基超である。いくつかの実施形態において、所定の核酸配列をコードする上記核酸分子は５’配列および３’配列を有しており、上記５’配列および３’配列は上記ゲノムの標的配列とは異なる挿入配列に隣接しており、上記５’フランキング配列および３’フランキング配列の長さは１０００塩基超である。いくつかの実施形態において、所定の核酸配列をコードする上記核酸分子は５’配列および３’配列を有しており、上記５’配列および３’配列は上記ゲノムの標的配列とは異なる挿入配列に隣接しており、上記５’フランキング配列および３’フランキング配列の長さは約２０〜約１０００塩基である。いくつかの実施形態において、所定の核酸配列をコードする上記核酸分子は５’配列および３’配列を有しており、上記５’配列および３’配列は上記ゲノムの標的配列とは異なる挿入配列に隣接しており、上記５’フランキング配列および３’フランキング配列の長さは約１００〜約１０００塩基である。いくつかの実施形態において、上記フランキング配列は、ゲノム内の標的領域に対して実質的に相同的である。いくつかの実施形態において、上記フランキング領域は、ゲノム内の標的領域に対して、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上または１００％以上相同的である。
【００４９】
いくつかの実施形態において、所定の核酸配列をコードする上記核酸分子は１本鎖ＤＮＡである。いくつかの実施形態において、上記切断は、２本鎖切断または１本鎖切断である。いくつかの実施形態において、上記切断は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＮＦヌクレアーゼ）、および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥヌクレアーゼ）からなる群より選択される酵素によって導入される。いくつかの実施形態において、上記切断は、Ｉ型制限エンドヌクレアーゼ、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ、ＩＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ、ＩＶ型制限エンドヌクレアーゼまたはニッカーゼによって導入される。
【００５０】
いくつかの実施形態において、上記システムは、上記標的配列とハイブリダイズするＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムガイドＲＮＡをさらに含んでいる。いくつかの実施形態において、上記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、トランス活性化型ｃｒ配列（tracr配列）を含んでいる。いくつかの実施形態において、上記ガイドＲＮＡは、tracr配列と融合したガイド配列を有している。
【００５１】
いくつかの実施形態において、本発明は、上述のシステムを含んでいる細胞を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、（i）標的細胞における遺伝子発現を変化させることによって、または（ii）標的細胞のゲノムを編集することによって、疾患を処置するための、上述のシステムの使用を提供する。
【００５２】
本開示において（具体的には特許請求の範囲および／または各段落において）、「含む／有する／備える("comprises," "comprised," "comprising")」などの用語は、米国特許法に帰される意味を有しうることに留意されたい（例えば、これらの表現は「含む／有する／備える("includes," "included," "including")」などを意味しうる）。また、「実質的に……からなる("consisting essentially of," "consists essentially of")」などの用語も、米国特許法に帰される意味を有していることに留意されたい（例えば、これらの表現は明示的に挙げられていない要素を許容するが、先行技術において見出された要素または本発明の基本的もしくは新規な特徴点を損なう要素は除外する）。これらの実施形態および他の実施形態は、下記の〔発明を実施するための形態〕に開示されているか、またはその記載から自明である（そのような実施形態も、〔発明を実施するための形態〕に包含される）。
【００５３】
以下に説明する図は、説明のみを目的としており、縮尺通りに描かれているとは限らない。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ  ＲＮＰ（不図示）およびリコンビナーゼ酵素を用いて、損傷したＤＮＡ塩基（赤色）を正確に遺伝子修復する。リコンビナーゼは、補助因子であるアデノシン三リン酸とともにフィラメント状になっているか、あるいは、アデノシン三リン酸なしでフィラメント状になっている（前者の方がより強力）。
【図２】ＲｅｃＡリコンビナーゼまたはＵｖｓＸリコンビナーゼのいずれかを発現させることにより、Ｈｅｌａ細胞におけるＨＤＲが増加する。（Ａ）組み換えの増加を示す生データ。（Ｂ）ＨＤＲの増加の定量化。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
用語「ポリヌクレオチド」「ヌクレオチド」「ヌクレオチド配列」「核酸」および「オリゴヌクレオチド」は、互換可能に用いられる。これらの用語は、ヌクレオチドの任意長の重合形態を表す（デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのいずれであってもよく、これらの類似体であってもよい）。ポリヌクレオチドは、既知と未知とを問わず、任意の三次元構造を取っていてよく、任意の機能を有していてよい。以下は、非限定的なポリヌクレオチドの例である。遺伝子のコーディング領域もしくは非コーディング領域、または遺伝子断片；連鎖解析によって定義される遺伝子座；エキソン；イントロン；メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）；トランスファーＲＮＡ；リボソームＲＮＡ；低分子量干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）；低分子量ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）；マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）；リボザイム；ｃＤＮＡ；組み換えポリヌクレオチド；分枝ポリヌクレオチド；プラスミド；ベクター；任意の配列の単離ＤＮＡ；任意の配列の単離ＲＮＡ；核酸プローブ；プライマー。ポリヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド（メチル化ヌクレオチドなど）およびヌクレオチド類似体の１つ以上を含んでいてもよい。ヌクレオチド構造への修飾が存在する場合、この修飾は高分子として組み立てられる前後のいずれに与えられてもよい。ヌクレオチド配列は、非ヌクレオチド要素によって中断されていてもよい。ポリヌクレオチドは、重合後にさらなる修飾を受けてもよい（例えば、ラベリング要素との複合化によって）。
【００５６】
本発明の態様において、用語「キメラＲＮＡ」「キメラガイドＲＮＡ」「ガイドＲＮＡ」「シングルガイドＲＮＡ」および「合成ガイドＲＮＡ」は、互換可能に用いられる。これらの用語は、ガイド配列、tracr配列およびtracr mate配列を有しているポリヌクレオチド配列を表す。用語「ガイド配列」は、標的部位を特定する、ガイドＲＮＡ内にある約２０ｂｐの配列を表す。「ガイド配列」は、用語「ガイド」または「スペーサー」と互換可能に用いられる場合がある。用語「tracr mate配列」は、用語「同方向反復(direct repeat)」と互換可能に用いられる場合がある。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの代表例は、ＵＳ８６９７３５９およびＵＳ２０１４０２３４９７２に与えられている（いずれも参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【００５７】
本明細書において用いられるとき、用語「フィラメント」は、それに結合したリコンビナーゼ多量体を有している、１本鎖核酸を表す。いくつかの実施形態においては、フィラメントは「単離」されて、生物学的適合性のある溶液（緩衝液など）中において提供される場合がある。
【００５８】
本明細書において用いられるとき、用語「野生型」は、当業者が理解するところの術語である。この用語は、生物、株、遺伝子または特徴点の、天然に生じる通常の形態を意味し、変異形態とは区別される。
【００５９】
本明細書において用いられるとき、用語「変異(variant)」は、自然に生じるパターンから逸脱したパターンを有する特質の表れを意味すると理解せねばならない。
【００６０】
用語「非天然の(non-naturally occurring)」または「改変された(engineered)」は、互換可能に用いられる。これらの用語は、人間の手の介入を示す。核酸分子またはポリペプチドについて言及する場合、当該核酸分子またはポリペプチドは、少なくとも大部分は、天然では通常関連している要素が１つ以上なくなっており、天然には見られない。
【００６１】
「相補性」とは、核酸と他の核酸配列とが水素結合を形成する能力を表す。この水素結合は、古典的なWatson-Crick型であってもよいし、非古典的な種類であってもよい。相補性の割合（％）とは、ある核酸分子中において、第２の核酸配列との間に水素結合（例えば、Watson-Crick塩基ペアリング）を形成できる残基の百分率を示す。例えば、そのような残基が１０個のうち５個、６個、７個、８個、９個、１０個であるならば、相補性は５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％である。「完全に相補的」とは、ある核酸配列の連続する残基の全てが、第２の核酸配列中の同数の連続する残基と水素結合しうることを意味する。本明細書において用いられるとき、「実質的に相補的」とは、相補性の程度が、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１１ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、１３ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、１９ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２１ヌクレオチド、２２ヌクレオチド、２３ヌクレオチド、２４ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、３５ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、４５ヌクレオチド、５０ヌクレオチドまたはそれ以上の領域にわたって、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０以上％、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上または１００％以上であることを表す。あるいは、「実質的に相補的」とは、２つの核酸がストリンジェント条件なハイブリダイズすることを表す。
【００６２】
本明細書において用いられるとき、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェントな条件」とは、標的配列に相補的な核酸の大部分が当該標的配列とハイブリダイズし、当該標的配列以外の配列とは実質的にハイブリダイズしない条件を表す。一般的に、ストリンジェントな条件は配列に依存し、種々の要因によって変化する。一般的に、配列が長くなるほど、配列と標的配列とが特異的にハイブリダイズする温度が高くなる。ストリンジェントな条件の非限定的な例は、［Tijssen (1993), Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid Probes Part 1, Second Chapter "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay", Elsevier, N.Y.］に詳細に記載されている。
【００６３】
「ハイブリダイゼーション」とは、１つ以上のポリヌクレオチドが、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合によって、安定な複合体を形成する反応を表す。この水素結合は、Watson-Crick塩基ペアリングによって生じてもよいし、Hoogstein結合によって生じてもよいし、他の任意の配列特異的な様式によって生じてもよい。この複合体には、（i）２本鎖構造を形成している２本の鎖が含まれていてもよいし、（ii）マルチストランド複合体を形成している３本以上の鎖が含まれていてもよいし、（iii）自身の内部でハイブリダイズしている１本の鎖が含まれていてもよいし、（iv）これらの任意の組み合わせが含まれていてもよい。ハイブリダイゼーション反応は、より大きなプロセスを構成するステップであってもよい（ＰＣＲの開始、または酵素によりポリヌクレオチドの切断など）。所与の配列とハイブリダイズ可能な配列を、当該所与の配列に「相補的」であると言う。
【００６４】
本明細書において用いられるとき「発現」とは、（i）ＤＮＡ鋳型から（ｍＲＮＡまたは他のＲＮＡ転写物などへと）ポリヌクレオチドが転写されるプロセス、および／または、（ii）転写されたｍＲＮＡが、その後、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質へと翻訳されるプロセス、を表す。転写物およびコードされているポリペプチドを、総称して「遺伝子産物」と呼ぶ場合がある。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来するならば、真核細胞における発現には、ｍＲＮＡのスプライシングが含まれる場合がある。
【００６５】
用語「ポリペプチド」「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書において互換可能に用いられ、アミノ酸の任意長の重合体を表す。この重合体は、直鎖であってもよいし、分枝を有していてもよい。また、この重合体は修飾されたアミノ酸を有していてもよいし、アミノ酸以外によって中断されていてもよい。この用語には、修飾されたアミノ酸重合体も含まれる。例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質付加、アセチル化、リン酸化、または他の任意の操作（ラベリング要素との複合体形成）がそれに当たる。本明細書において用いられるとき、用語「アミノ酸」には、天然アミノ酸および／または非天然もしくは合成アミノ酸が含まれる（グリシンおよびＤ型またはＬ型の光学異性体、ならびにアミノ酸類似体および擬似ペプチドなど）。
【００６６】
用語「被験体」「個体」および「患者」は、本明細書において互換可能に用いられ、脊椎動物（好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒト）を表す。哺乳動物には、ネズミ、サル、ヒト、家畜、スポーツ動物およびペットが含まれるが、これらに限定されない。組織、細胞、およびその生物学的存在に由来する物（in vivoで得られるものも、in vitroで培養されているものも）も含まれる。
【００６７】
用語「治療剤(therapeutic agent)」「治療可能な薬(therapeutic capable agent)」または「処置剤(treatment agent)」は、互換可能に用いられ、被験体に投与したときに有益な効果を与える分子または化合物を表す。有益な効果としては、診断上の決定を可能にすること；疾患、症状、障害または病理的状態を回復させること；疾患、症状、障害または状態の発生を軽減または予防すること；および、疾患、症状、障害または病理的状態の一般的に低減させること；が挙げられる。
【００６８】
本明細書において用いられるとき、「処置("treatment," "treating")」または「緩和」または「回復」は、互換可能に用いられる。これらの用語は、有益な結果または所望の結果（治療的な利益および／または予防的な利益などであるが、これらに限定されない）を得るためのアプローチを表す。治療的な利益とは、治療中の疾患、状態もしくは症状の１つ以上における任意の治療上の改善、またはそれらに対する任意の治療上の効果を意味する。予防的な効果のために、特定の疾患、状態もしくは症状が進展するおそれのある被験体に対して、あるいは疾患の病理症状の１つ以上が報告されている被験体に対して、組成物を投与してもよい（当該疾患、状態または症状が、未だ明確でなくとも構わない）。
【００６９】
用語「有効量」または「治療上有効な量」は、有益な結果または所望の結果をもたらすのに充分な薬剤の量を表す。治療上有効な量は、次のうち１つ以上に依存する場合がある。処置される被験体および疾患の状態；被験体の体重および年齢；疾患の状態の重篤度；投与方法など。これらは、当業者によって容易に決定されうる。これらの用語は、本明細書に開示されている画像化方法のいずれかによって、検出のための画像を与える用量にも適用される。特定の用量は、次のうちの１つ以上に応じて変わりうる。選択した特定の薬剤；従う投与レジメン；他の化合物と組み合わせて投与されたか否か；投与のタイミング；画像化する組織；および、薬剤が送達される物理的な送達システム。
【００７０】
別記しない限り、本発明の実施には、免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクスおよび組み換えＤＮＡの従来技術が用いられる（これらは、当該技術分野の技法の範囲内にある）。［Sambrook, Fritsch and Maniatis, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd edition (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, et al. eds., (1987)); the series METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames and G. R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, and ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, ed. (1987))］を参照。
【００７１】
本発明のいくつかの態様は、１つ以上のベクターを含んでいるベクターシステムに関する。原核細胞または真核細胞内でのＣＲＩＳＰＲ転写物（例えば、核酸転写物、タンパク質または酵素）の発現のために、ベクターを設計することができる。例えば、細菌細胞（Escherichia coliなど）、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを用いる）、酵母細胞または哺乳動物細胞の中で、ＣＲＩＳＰＲ転写物を発現させることができる。好適な宿主細胞に関しては、［Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)］にさらなる考察がある。あるいは、組み換え発現ベクターを、in vitroで転写および翻訳してもよい（例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用いて）。
【００７２】
原核生物にベクターを導入して、増幅させてもよい。いくつかの実施形態においては、原核細胞を用いて、真核細胞に導入するベクターのコピー数を増幅させたり、真核細胞に導入するベクターを生産する際の中間体ベクターとしたりする（例えば、ウイルスベクターを格納するシステムの一部として、プラスミドを増幅させる）。いくつかの実施形態においては、原核生物を用いてベクターのコピー数を増幅させ、さらに１つ以上の核酸を発現させる（例えば、宿主細胞または宿主生物に送達するための１種類以上のタンパク質を供給させる）。原核生物中でのタンパク質の発現は、最も一般的には、Escherichia coliの中で、構成的プロモーターまたは誘導可能なプロモーターを含むベクター（このベクターは、融合タンパク質または非融合タンパク質の発現をもたらす）を用いて行われる。融合ベクターは、それがコードしているタンパク質に、数個のアミノ酸を付け加える（例えば、組み換えタンパク質のアミノ末端に）。このような融合ベクターは、１つ以上の目的に供することができる。例えば、（i）組み換えタンパク質の発現を増加させる；（ii）組み換えタンパク質の溶解度を高める；および（iii）アフィニティー精製におけるリガンドとして機能させることにより、組み換えタンパク質の精製を補助する、などがある。通常、融合発現ベクターの中には、融合部位と組み換えタンパク質との間に、タンパク質分解による切断部位が導入されている。そのため、融合タンパク質を精製した後に、組み換えタンパク質を融合部位から分離させることができる。このような酵素（およびそれらと同根の認識配列）としては、第Ｘａ因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼが挙げられる。融合発現ベクターの例としては、ｐＧＥＸ（Pharmacia Biotech Inc; Smith and Johnson, 1988. Gene 67: 31-40）、ｐＭＡＬ（New England Biolabs, Beverly, Mass.）、およびｐＲＩＴ５（Pharmacia, Piscataway, N.J.）が挙げられる（それぞれ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質またはプロテインＡと、標的組み換えタンパク質とが融合している）。
【００７３】
誘導可能な非融合性E. coli発現ベクターの好適な例としては、ｐＴｒｃ（Amrann et al., (1988) Gene 69:301-315）、およびｐＥＴ  １１ｄ（Studier et al., GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 60-89）が挙げられる。
【００７４】
いくつかの実施形態において、ベクターは酵母発現ベクターである。酵母Saccharomyces cerivisaeにおける発現のためのベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Baldari, et al., 1987. EMBO J. 6: 229-234）、ｐＭＦａ（Kuijan and Herskowitz, 1982. Cell 30: 933-943）、ｐＪＲＹ８８（Schultz et al., 1987. Gene 54: 113-123）、ｐＹＥＳ２（Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.）、およびｐｉｃＺ（InVitrogen Corp, San Diego, Calif.）が挙げられる。
【００７５】
いくつかの実施形態において、ベクターは、バキュロウイルス発現ベクターを用いた昆虫細胞内でのタンパク質発現をもたらす。培養中の昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）においてタンパク質を発現させられるバキュロウイルスベクターとしては、ｐＡｃシリーズ（Smith, et al., 1983. Mol. Cell. Biol. 3: 2156-2165）、およびｐＶＬシリーズ（Lucklow and Summers, 1989. Virology 170: 31-39）が挙げられる。
【００７６】
いくつかの実施形態において、ベクターは、哺乳動物性発現ベクターを用いた哺乳動物細胞内での１つ以上の配列の発現をもたらすことができる。哺乳動物性発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８（Seed, 1987. Nature 329: 840）、およびｐＭＴ２ＰＣ（Kaufman, et al., 1987. EMBO J. 6: 187-195）が挙げられる。哺乳動物細胞内において用いられる場合、発現ベクターの制御機能は、通常、１つ以上の調節要素により与えられる。例えば、一般的に使用されているプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２型、サイトメガロウイルス、シミアンウイルス４０、および本明細書に開示されているか本技術分野で知られている他のもの、に由来する。原核細胞および真核細胞の双方に関して、他の好適な発現システムとしては、例えば、［Chapters 16 and 17 of Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989］を参照。
【００７７】
いくつかの実施形態において、哺乳動物性の組み換え発現ベクターは、特定の種類の細胞内において優先的に核酸を発現させることができる（例えば、組織特異的な調節要素を用いて核酸を発現させる）。組織特異的な調節要素は、本技術分野で知られている。好適な組織特異的なプロモーターの非限定的な例としては、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Pinkert, et al., 1987. Genes Dev. 1: 268-277）、リンパ系特異的なプロモーター（Calame and Eaton, 1988. Adv. Immunol. 43: 235-275）、特にＴ細胞受容体のプロモーター（Winoto and Baltimore, 1989. EMBO J. 8: 729-733）、および免疫グロブリン（Baneiji, et al., 1983. Cell 33: 729-740; Queen and Baltimore, 1983. Cell 33: 741-748）、ニューロン特異的なプロモーター（例えば、ニューロフィラメントプロモーター；Byrne and Ruddle, 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5473-5477）、膵臓特異的なプロモーター（Edlund, et al., 1985. Science 230: 912-916）、および乳腺特異的なプロモーター（例えば、乳清プロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号、欧州出願公開第２６４，１６６号）が挙げられる。発生により調節されるプロモーターも含まれる。例えば、ネズミｈｏｘプロモーター（Kessel and Gruss, 1990. Science 249: 374-379）、およびαフェトプロテインプロモーター（Campes and Tilghman, 1989. Genes Dev. 3: 537-546）が挙げられる。
【００７８】
いくつかの実施形態においては、ＣＲＩＳＰＲシステムの１つ以上の要素発現させるために、調節要素が当該ＣＲＩＳＰＲシステムの１つ以上の要素と作動可能に連結している。一般的に、ＣＲＩＳＰＲ（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats；ＳＰＩＤＲ（SPacer Interspersed Direct Repeats）としても知られる）は、通常は特定の細菌種に特異的な、ＤＮＡ座位のファミリーを構成している。ＣＲＩＳＰＲの座位には、他とは区別可能な散在している一群の短鎖反復配列（ＳＳＲ；short sequence repeats）が含まれている。ＳＳＲは、E. coliおよび関連する遺伝子に認められる（Ishino et al., J. Bacteriol., 169:5429-5433 [1987]; Nakata et al., J. Bacteriol., 171:3553-3556 [1989]）。同様な散在しているＳＳＲは、Haloferax mediterranei、Streptococcus pyogenes、AnabaenaおよびMycobacterium tuberculosisでも認められている（Groenen et al., Mol. Microbiol., 10:1057-1065 [1993]; Hoe et al., Emerg. Infect. Dis., 5:254-263 [1999]; Masepohl et al., Biochim. Biophys. Acta 1307:26-30 [1996]; and Mojica et al., Mol. Microbiol., 17:85-93 [1995]を参照）。通常、ＣＲＩＳＰＲ座位は他のＳＳＲとは反復の構造が異なり、規則的に隔離された短鎖反復（ＳＲＳＲ；short regularly spaced repeats）と呼ばれている（Janssen et al., OMICS J. Integ. Biol., 6:23-33 [2002]; Mojica et al., Mol. Microbiol., 36:244-246 [2000]）。一般的に、この反復はクラスター内に出現する短い要素であり、当該クラスターは固有の介在配列（大部分が固定長）によって規則的に隔離されている（Mojica et al., [2000], supra）。反復配列は、株間でかなりの程度保存されているが、散在している反復の個数およびスペーサー領域の配列は、通常は株ごとに異なっている（van Embden et al., J. Bacteriol., 182:2393-2401 [2000]）。４０種類を超える原核生物において、ＣＲＩＳＰＲ座位が特定されている（例えば、Jansen et al., Mol. Microbiol., 43:1565-1575 [2002]; Mojica et al., [2005]を参照）。このような原核生物としては次のものが挙げられるが、これらに限定されない。Aeropyrum、Pyrobaculum、Sulfolobus、Archaeoglobus、Halocarcula、Methanobacteriumn、Methanococcus、Methanosarcina、Methanopyrus、Pyrococcus、Picrophilus、Thernioplasnia、Corynebacterium、Mycobacterium、Streptomyces、Aquifrx、Porphvromonas、Chlorobium、Thermus、Bacillus、Listeria、Staphylococcus、Clostridium、Thermoanaerobacter、Mycoplasma、Fusobacterium、Azarcus、Chromobacterium、Neisseria、Nitrosomonas、Desulfovibrio、Geobacter、Myrococcus、Campylobacter、Wolinella、Acinetobacter、Erwinia、Escherichia、Legionella、Methylococcus、Pasteurella、Photobacterium、Salmonella、Xanthomonas、Yersinia、Treponema、およびThermotoga。
【００７９】
一般的に、「ＣＲＩＳＰＲシステム」とは、ＣＲＩＳＰＲ関連遺伝子（Ｃａｓ遺伝子）の機能の発現または誘導に関わっている、転写物および他の要素の総称である。これには、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列、tracr配列（トランス活性化型ＣＲＩＳＰＲ配列；例えば、tracrＲＮＡまたはtracrＲＮＡの活性断片）、tracr mate配列（内在性ＣＲＩＳＰＲシステムに関しては、「同方向反復(direct repeat)」、およびtracrＲＮＡによって修飾される同方向反復断片を含む）、ガイド配列（内在性ＣＲＩＳＰＲシステムに関しては、「スペーサー」とも呼ばれる）、またはＣＲＩＳＰＲ座位を形成する他の配列および転写物、が含まれる。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲシステムの１つ以上の要素は、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲシステム、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムまたはＩＩＩ型型ＣＲＩＳＰＲシステムに由来する。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲシステムの１つ以上の要素は、内在性ＣＲＩＳＰＲシステムを有している特定の生物に由来する（Streptococcus pyogenesなど）。一般的に、ＣＲＩＳＰＲシステムは、標的配列の位置においてＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する要素によって特徴づけられている（標的配列は、内在性ＣＲＩＳＰＲシステムに関しては、プロトスペーサーとも呼ばれる）。ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成に関して、「標的配列」とは、これに対する相補性を有するようにガイド配列が設計される配列を表す。標的配列とガイド配列とがハイブリダイズすることによって、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成が促進される。ハイブリダイズしてＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するのに充分な相補性があるならば、完全な相補性は要求されない。標的配列は、任意のポリヌクレオチドを含んでいてよい（ＤＮＡポリヌクレオチドまたはＲＮＡポリヌクレオチドなど）。いくつかの実施形態において、標的配列は、細胞の核または細胞質に位置している。いくつかの実施形態において、標的配列は、真核細胞の細胞小器官内にあってもよい（例えば、ミトコンドリアまたは葉緑体）。標的配列を含んでいる標的化された座位の組み換えに用いられうる、配列またはテンプレートを、「編集テンプレート」「編集ポリヌクレオチド」または「編集配列」と呼ぶ。本発明の態様において、外来性のテンプレート・ポリヌクレオチドのことを、「編集テンプレート」と称する場合がある。本発明のある態様において、組み換えは相同組み換えである。
【００８０】
通常、内在性ＣＲＩＳＰＲシステムに関しては、ＣＲＩＳＰＲ複合体（標的配列とハイブリダイズし、１つ以上のＣａｓタンパク質と複合体化しているガイド配列が含まれている）が形成されると、標的配列内またはその近傍の（例えば、標的配列から１塩基、２塩基、３塩基、４塩基、５塩基、６塩基、７塩基、８塩基、９塩基、１０塩基、２０塩基、５０塩基またはそれ以上の範囲内の）、片側の鎖または両側の鎖が切断される。理論に拘束されるつもりはないが、tracr配列も、ＣＲＩＳＰＲ複合体の一部を形成してもよい。このtracr配列は、野生型tracr配列の全部または一部を含んでいてもよいし、野生型tracr配列の全部または一部からなるものであってもよい。例えば、野生型tracr配列の、約２０ヌクレオチド、約２６ヌクレオチド、約３２ヌクレオチド、約４５ヌクレオチド、約４８ヌクレオチド、約５４ヌクレオチド、約６３ヌクレオチド、約６７ヌクレオチド、約８５ヌクレオチド、またはそれ以上のヌクレオチドを含んでいてもよい。あるいは、野生型tracr配列の、約２０ヌクレオチド超、約２６ヌクレオチド超、約３２ヌクレオチド超、約４５ヌクレオチド超、約４８ヌクレオチド超、約５４ヌクレオチド超、約６３ヌクレオチド超、約６７ヌクレオチド超、約８５ヌクレオチド超、またはそれ以上のヌクレオチドを含んでいてもよい。ＣＲＩＳＰＲ複合体による切断は、例えば、tracr配列の少なくとも一部が、ガイド配列と作動可能に連結しているtracr mate配列の全部または一部とハイブリダイズすることによって生じる。いくつかの実施形態において、tracr配列は、tracr mate配列とハイブリダイズするために充分な相補性を有しており、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成に参加する。標的配列に関して言えば、充分な機能があるならば、完全な相補性は必要ないと考えられている。いくつかの実施形態において、tracr配列は、最適にアラインメントさせた場合に、tracr mate配列の長さに対して、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上または９９％以上の配列相補性を有している。いくつかの実施形態においては、ＣＲＩＳＰＲシステムの１つ以上の要素を発現させる１つ以上のベクターを宿主細胞に導入して、当該ＣＲＩＳＰＲシステムの要素を発現させ、１箇所以上の標的部位においてＣＲＩＳＰＲ複合体を形成させる。例えば、Ｃａｓ酵素、tracr mate配列と連結しているガイド配列、およびtracr配列は、いずれも別々のベクター上の別々の調節要素と作動可能に連結していてもよい。あるいは、同じまたは異なる調節要素から発現する２つ以上の要素が、１つのベクターにまとめられていてもよい。この場合、ＣＲＩＳＰＲシステムの任意の要素を与える１つ以上の追加のベクターは、第１のベクターに含まれていなくてもよい。１つのベクターにまとめられているＣＲＩＳＰＲシステムの要素は、任意の適切な方向に配置してよい。例えば、第１の要素は、第２の要素に対して、５’側（「上流」）に位置していてもよいし、３’側（「下流」）に位置していてもよい。第１の要素のコーディング配列は、第２の要素のコーディング配列と同じ鎖上に位置していてもよいし、逆側の鎖上に位置していてもよい。これらの方向も、同方向でも逆方向でもよい。いくつかの実施形態においては、１つのプロモーターによって、（i）ＣＲＩＳＰＲ酵素と、（ii）ガイド配列、tracr mate配列（任意構成で、ガイド配列と作動可能に連結している）、およびtracr配列の１つ以上と、をコードする転写物を発現させる。これらの配列は、１つ以上のイントロン配列の中に埋め込まれている（例えば、それぞれの配列が異なるイントロン中に埋め込まれている、２つ以上の配列が１つ以上のイントロンに埋め込まれている、全ての配列が１つのイントロンに埋め込まれている）。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素、ガイド配列、tracr mate配列およびtracr配列は作動可能に連結しており、同じプロモーターから発現する。
【００８１】
好適な実施形態においては、宿主細胞内で、外来性リコンビナーゼをコードする核酸配列を、他のＣＲＩＳＰＲシステムの要素と共発現させる。いかなる理論にも拘束されるものではないが、外来性リコンビナーゼを他のＣＲＩＳＰＲシステムの要素と共に発現させると、当該システムで形質転換または形質導入した細胞において、ＨＤＲ経路を使用する確率および効率が上昇する。したがって、いくつかの好適な実施形態において、本発明のシステムは、リコンビナーゼをコードする核酸配列と作動可能に連結している調節要素を含むベクターを含んでいる。いくつかの実施形態において、リコンビナーゼは、細菌性リコンビナーゼである。いくつかの実施形態において、リコンビナーゼは、ベクターシステムによって形質転換または形質導入される細胞の種類では、天然に生じないものである。いくつかの実施形態において、リコンビナーゼは、Ｒａｄ５１リコンビナーゼ、ＲｅｃＡリコンビナーゼ、およびＵｖｓＸリコンビナーゼ、またはＲｅｃＡドメインもしくはＲａｄＡドメインを有しているタンパク質、からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、ベクターは、１つ以上の挿入部位を有している（制限エンドヌクレアーゼの認識配列（「クローニング部位」とも呼ばれる）など）。いくつかの実施形態において、１つ以上の挿入部位（例えば、約１個、約２個、約３個、約４個、約５個、約６個、約７個、約８個、約９個、約１０個、またはそれ以上の挿入部位；あるいは約１個超、約２個超、約３個超、約４個超、約５個超、約６個超、約７個超、約８個超、約９個超、約１０個超、またはそれ以上の挿入部位）は、１つ以上のベクターの１つ以上の配列要素の、上流および／または下流に位置している。いくつかの実施形態において、ベクターは、tracr mate配列の上流に挿入部位を有しており、任意構成で、調節要素の下流でtracr mate配列と作動可能に連結している。これによって、挿入部位にガイド配列が挿入された後、発現するときに、ガイド配列によって、真核細胞内における、ＣＲＩＳＰＲ複合体と標的配列との配列特異的な結合がもたらされる。いくつかの実施形態において、ベクターは２つ以上の挿入部位を有している。このとき、それぞれの挿入部位は２つのtracr mate配列の間に位置しており、そのため、それぞれの部位にガイド配列を挿入させることができる。このような配置の場合、２つ以上のガイド配列は、１つのガイド配列を２コピー以上含んでいてもよいし、２種類以上の異なるガイド配列を含んでいてもよいし、これらの組み合わせを含んでいてもよい。複数の異なるガイド配列を用いる場合、これに対応する複数の異なる細胞内の標的配列に対してＣＲＩＳＰＲの働きを標的化させるために、１つの発現コンストラクトを用いてもよい。例えば、１つのベクターに、約１個、約２個、約３個、約４個、約５個、約６個、約７個、約８個、約９個、約１０個、約１５個、約２０個またはそれ以上のガイド配列が含まれていてもよいし、約１個超、約２個超、約３個超、約４個超、約５個超、約６個超、約７個超、約８個超、約９個超、約１０個超、約１５個超、約２０個超またはそれ以上のガイド配列が含まれていてもよい。いくつかの実施形態においては、（i）約１個、約��個、約３個、約４個、約５個、約６個、約７個、約８個、約９個、約１０個もしくはそれ以上のガイド配列を有しているベクター、または（ii）約１個超、約２個超、約３個超、約４個超、約５個超、約６個超、約７個超、約８個超、約９個超、約１０個超もしくはそれ以上のガイド配列を有しているベクターが提供されてよく、任意で、細胞に送達される。
【００８２】
いくつかの実施形態において、ベクターは、ＣＲＩＳＰＲ酵素（Ｃａｓタンパク質など）をコードする酵素コード配列と作動可能に連結している調節要素を含んでいる。Ｃａｓタンパク質の非限定的な例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、これらのホモログ、またはこれらの変異体が挙げられる。これらの酵素は、公知である。例えば、S. pyogenesのＣａｓ９タンパク質のアミノ酸配列は、SwissProtデータベースではアクセッション番号Q99ZW2にて登録されている。いくつかの実施形態においては、改変されてないＣＲＩＳＰＲ酵素がＤＮＡ切断活性を有している（Ｃａｓ９など）。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素はＣａｓ９であり、S. pyogenesまたはS. pneumoniae由来のＣａｓ９であってよい。いくつかの実施形態においては、ＣＲＩＳＰＲ酵素によって、標的配列の位置の片側の鎖または両側の鎖が切断される（例えば、標的配列内および／または標的配列の相補鎖内が切断される）。いくつかの実施形態においては、ＣＲＩＳＰＲ酵素によって、標的配列の最初または最後のヌクレオチドから約１塩基対以内、約２塩基対以内、約３塩基対以内、約４塩基対以内、約５塩基対以内、約６塩基対以内、約７塩基対以内、約８塩基対以内、約９塩基対以内、約１０塩基対以内、約１５塩基対以内、約２０塩基対以内、約２５塩基対以内、約５０塩基対以内、約１００塩基対以内、約２００塩基対以内、約５００塩基対以内の箇所で、片側の鎖または両側の鎖が切断される。いくつかの実施形態において、ベクターは対応する野生型酵素から変異したＣＲＩＳＰＲ酵素をコードしており、そのため、変異型ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列を有する標的ポリヌクレオチドの片側の鎖または両側の鎖を切断する能力を失っている。例えば、S. pyogenes由来のＣａｓ９のＲｕｖＣ  Ｉ触媒ドメインにて、アスパラギン酸をアラニンへと置換することによって（Ｄ１０Ａ）、このＣａｓ９は、両方の鎖を切断するヌクレアーゼから、片側の鎖を切断するニッカーゼへと変化する。Ｃａｓ９をニッカーゼに変化させる他の変異の例としては、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４ＡおよびＮ８６３Ａが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の態様においては、相同組み換えによるゲノム編集のために、ニッカーゼを用いてもよい。
【００８３】
いくつかの実施形態においては、Ｃａｓ９ニッカーゼを、ＤＮＡ標的のセンス鎖およびアンチセンス鎖をそれぞれ標的とするガイド配列（例えば、２つのガイド配列）と組み合わせて用いてもよい。このような組み合わせによって、両方の鎖を切断し、ＮＨＥＪの誘導に用いることができる。出願人は、２つのニッカーゼによる標的化（つまり、ｓｇＲＮＡにより、ＤＮＡの同じ位置ではあるが異なる鎖を標的化する）による、変異原性のＮＨＥＪの誘導効率を、既に示している（データ不図示）。１つのニッカーゼ（Ｃａｓ９−Ｄ１０Ａおよび１つのｓｇＲＮＡ）では、ＮＨＥＪを誘導することができず、indelを生じさせることもできない。しかし出願人は、２つのニッカーゼ（Ｃａｓ９−Ｄ１０Ａ、および、同じ位置における異なる鎖を標的とする２つのｓｇＲＮＡ）ならば、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）にＮＨＥＪおよびindelを誘導できることを、既に示した。この効率は、ｈＥＳＣにおいては、ヌクレアーゼ（すなわち、Ｄ１０変異のない通常のＣａｓ９）の約５０％であった。
【００８４】
さらなる例として、Ｃａｓ９の２つ以上の触媒ドメイン（ＲｕｖＣ  Ｉ、ＲｕｖＣ  ＩＩおよびＲｕｖＣ  ＩＩＩ）を変異させて、全てのＤＮＡ切断活性を実質的に失っている変異型Ｃａｓ９を作製してもよい。いくつかの実施形態においては、Ｄ１０Ａ変異をＨ８４０Ａ変異、Ｎ８５４Ａ変異またはＮ８６３Ａ変異のうち１つ以上と組み合わせて、全てのＤＮＡ切断活性を実質的に失っているＣａｓ９酵素を作製する。いくつかの実施形態においては、変異型酵素のＤＮＡ切断活性が、非変異型の約２５％未満、約１０％未満、約５％未満、約１％未満、約０．１％未満、約０．０１％未満、またはそれ以下になった場合に、そのＣＲＩＳＰＲ酵素は全てのＤＮＡ切断活性を実質的に失ったものと見做される。他の変異も有用である場合がある。Ｃａｓ９または他のＣＲＩＳＰＲ酵素がS. pyogenes以外の種に由来する場合、対応するアミノ酸の変異によって同様の効果が得られる場合がある。
【００８５】
いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列は、特定の細胞内（真核細胞など）での発現のために、コドン最適化されている。この真核細胞は、特定の生物の細胞、またはそれに由来する細胞であってもよい。特定の生物としては、哺乳動物が挙げられる（ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌまたは非ヒト霊長類などであるが、これらに限定されない）。一般的に、コドン最適化とは、所定の宿主細胞内での発現を増進させるために、元の配列の１つ以上のコドン（例えば、約１個、約２個、約３個、約４個、約５個、約１０個、約１５個、約２０個、約２５個、約５０個、またはそれ以上のコドン；あるいは約１個超、約２個超、約３個超、約４個超、約５個超、約１０個超、約１５個超、約２０個超、約２５個超、約５０個超、またはそれ以上のコドン）を置換することにより、核酸配列を改変するプロセスを表す。このとき、置換後のコドンは、より頻繁に（または最も頻繁に）宿主細胞の遺伝子において使用されているものである。また、コドン最適化の前後では、元のアミノ酸配列は保存される。特定のアミノ酸に対応するコドンについては、様々な種において特定の傾向が見られる。コドンバイアス（生物間におけるコドンの使用の違い）は、通常、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳効率に相関している。このことは、とりわけ、翻訳されるコドンの特性と、特定のトランスファーＲＮＡ分子（ｔＲＮＡ分子）の利用可能性に依存していると考えられている。細胞内における一部のｔＲＮＡの優勢は、一般的に、ペプチド合成の際に最も頻繁に使用されるコドンを反映している。したがって、所与の生物における最適な遺伝子発現のために、コドン最適化に基づいて遺伝子を適応させることができる。コドンの使用表は、容易に入手できる（例えば、Codon Usage Database）。これらの表は、多種多様に適用できる。［Nakamura, Y., et al. "Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000" Nucl. Acids Res. 28:292 (2000)］を参照。特定の宿主細胞における発現のために、特定の配列をコドン最適化するためのコンピュータ・アルゴリズムも入手可能である（Gene Forge (Aptagen; Jacobus, Pa.)など）。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする配列中の、１つ以上のコドン（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、１０個、１５個、２０個、２５個、５０個、もしくはそれ以上、または全てのコドン）は、特定のアミノ酸について最も頻繁に使用されるコドンに対応している。
【００８６】
一般的に、ガイド配列とは、標的ポリヌクレオチド配列に対して充分な相補性を有しており、標的配列とハイブリダイズして、ＣＲＩＳＰＲ複合体と標的配列との配列特異的な結合をもたらす、任意のポリヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態において、ガイド配列と対応する標的配列との間の相補性の程度は、適切なアラインメント・アルゴリズムを用いて最適にアラインメントさせた場合に、約５０％、約６０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７．５％、約９９％またはそれ以上、あるいは約５０％超、約６０％超、約７５％超、約８０％超、約８５％超、約９０％超、約９５％超、約９７．５％超、約９９％超またはそれ以上である。最適なアラインメントは、配列を整列させる適切なアルゴリズムを用いて決定してもよい。その非限定的な例としては、Smith-Watermanアルゴリズム、Needleman-Wunschアルゴリズム、Burrows-Wheeler Transformに基づくアルゴリズム（例えば、Burrows Wheeler Aligner）、ClustalW、Clustal X、BLAT、Novoalign（Novocraft Technologies, ELAND (Illumina, San Diego, Calif.)）、SOAP（soap.genomics.org.cnにて利用可能）、およびMaq（maq.sourceforge.netにて使用可能）が挙げられる。いくつかの実施形態において、ガイド配列の長さは、約５ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド、約１１ヌクレオチド、約１２ヌクレオチド、約１３ヌクレオチド、約１４ヌクレオチド、約１５ヌクレオチド、約１６ヌクレオチド、約１７ヌクレオチド、約１８ヌクレオチド、約１９ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約２１ヌクレオチド、約２２ヌクレオチド、約２３ヌクレオチド、約２４ヌクレオチド、約２５ヌクレオチド、約２６ヌクレオチド、約２７ヌクレオチド、約２８ヌクレオチド、約２９ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約３５ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、約４５ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約７５ヌクレオチド、またはそれ以上である。あるいは、ガイド配列の長さは、約５ヌクレオチド超、約１０ヌクレオチド超、約１１ヌクレオチド超、約１２ヌクレオチド超、約１３ヌクレオチド超、約１４ヌクレオチド超、約１５ヌクレオチド超、約１６ヌクレオチド超、約１７ヌクレオチド超、約１８ヌクレオチド超、約１９ヌクレオチド超、約２０ヌクレオチド超、約２１ヌクレオチド超、約２２ヌクレオチド超、約２３ヌクレオチド超、約２４ヌクレオチド超、約２５ヌクレオチド超、約２６ヌクレオチド超、約２７ヌクレオチド超、約２８ヌクレオチド超、約２９ヌクレオチド超、約３０ヌクレオチド超、約３５ヌクレオチド超、約４０ヌクレオチド超、約４５ヌクレオチド超、約５０ヌクレオチド超、約７５ヌクレオチド超、またはそれ以上である。いくつかの実施形態において、ガイド配列の長さは、約７５ヌクレオチド未満、約５０ヌクレオチド未満、約４５ヌクレオチド未満、約４０ヌクレオチド未満、約３５ヌクレオチド未満、約３０ヌクレオチド未満、約２５ヌクレオチド未満、約２０ヌクレオチド未満、約１５ヌクレオチド未満、約１２ヌクレオチド未満、またはそれ以下である。ガイド配列がＣＲＩＳＰＲ複合体と標的配列との配列特異的な結合をもたらす能力を、任意の適切なアッセイによって評価してもよい。例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するのに充分なＣＲＩＳＰＲシステムの要素（試験するガイド配列を含む）を、ＣＲＩＳＰＲ配列の要素をコードするベクターと併せて、対応する標的配列を有している宿主細胞に与え（トランスフェクションなどにより）、その後、標的配列内の特異的な切断を評価してもよい（本明細書に記載のSurveyorアッセイなどによって）。同様に、標的ポリヌクレオチド配列の切断を、試験管内で評価してもよい。そのためには、標的配列、ＣＲＩＳＰＲ複合体の要素（試験するガイド配列、および当該試験するガイド配列とは異なるコントロール・ガイド配列を含む）を与え、試験するガイド配列の反応とコントロール・ガイド配列の反応との間で、標的配列との結合または標的配列の切断率を比較する。他のアッセイも可能であり、当業者ならば理解できるであろう。
【００８７】
ガイド配列は、任意の標的配列を標的化するように選択することができる。いくつかの実施形態において、標的配列は、細胞のゲノム内の配列である。代表的な標的配列としては、標的ゲノムに固有な配列が挙げられる。例えば、S. pyogenesのＣａｓ９に関して、ゲノム内の固有標的配列は、Ｃａｓ９の標的部位（MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXGG：配列番号９）を有していてもよい。このとき、NNNNNNNNNNNNXGG（配列番号１０；ＮはＡ、Ｇ、ＴまたはＣであり、Ｘは何でもよい）は、上記ゲノム内に１回だけ登場する。ゲノム内の固有標的配列は、S. pyogenesのＣａｓ９の標的部位（MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXGG：配列番号１１）遺伝子を有していてもよい。このとき、NNNNNNNNNNNXGG（配列番号１２；ＮはＡ、Ｇ、ＴまたはＣであり、Ｘは何でもよい）は、上記ゲノム内に１回だけ登場する。S. thermophilusのＣＲＩＳＰＲ１−Ｃａｓ９に関して、ゲノム内の固有標的配列は、Ｃａｓ９の標的部位（MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXXAGAAW：配列番号１）を有していてもよい。このとき、NNNNNNNNNNNNXXAGAAW（配列番号２；ＮはＡ、Ｇ、ＴまたはＣであり、Ｘは何でもよく、ＷはＡまたはＴである）は、上記ゲノム内に１回だけ登場する。ゲノム内の固有標的配列は、S. thermophilusのＣＲＩＳＰＲ１−Ｃａｓ９の標的部位（MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXXAGAAW：配列番号３）を有していてもよい。このとき、NNNNNNNNNNNXXAGAAW（配列番号４；ＮはＡ、Ｇ、ＴまたはＣであり、Ｘは何でもよく、ＷはＡまたはＴである）は、上記ゲノム内に１回だけ登場する。S. pyogenesのＣａｓ９に関して、ゲノム内の固有標的配列は、Ｃａｓ９の標的部位（MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXGGXG：配列番号１３）を有していてもよい。このとき、NNNNNNNNNNNNXGGXG（配列番号１４；ＮはＡ、Ｇ、ＴまたはＣであり、Ｘは何でもよい）は、上記ゲノム内に１回だけ登場する。ゲノム内の固有標的配列は、S. pyogenesのＣａｓ９の標的部位（MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXGGXG：配列番号１５）を有していてもよい。このとき、NNNNNNNNNNNXGGXG（配列番号１６；ＮはＡ、Ｇ、ＴまたはＣであり、Ｘは何でもよい）は、上記ゲノム内に１回だけ登場する。上記のいずれの配列においても、ＭはＡ、Ｇ、ＴまたはＣであり、固有配列を識別する際には考慮に入れる必要がない。
【００８８】
いくつかの実施形態において、ガイド配列は、当該ガイド配列内の二次構造が小さくなるように選択される。二次構造は、任意の適切なポリヌクレオチド折り畳みアルゴリズムによって決定することができる。いくつかのプログラムは、最小のGibbs自由エネルギーに基づいて計算している。このようなアルゴリズムの例としては、mFoldが挙げられる（Zuker and Stiegler (Nucleic Acids Res. 9 (1981), 133-148に記載）。折り畳みアルゴリズムの他の例としては、オンラインウェブサーバのRNAfold（Institute for Theoretical Chemistry at the University of Viennaが開発）がある。RNAfoldは、重心構造予測アルゴリズムを利用している（例えば、A. R. Gruber et al., 2008, Cell 106(1): 23-24; PA Carr and GM Church, 2009, Nature Biotechnology 27(12): 1151-62を参照）。さらなるアルゴリズムを、米国出願第６１／８３６，０８０号から見出してもよい（参照により本明細書に組み込まれる）。
【００８９】
一般的に、tracr mate配列には、tracr配列に対する充分な相補性を有している、任意の配列が含まれている。これにより、（１）対応するtracr配列を有している細胞内における、tracr mate配列に隣接しているガイド配列の切断、および（２）標的配列の位置におけるＣＲＩＳＰＲ複合体の形成（このＣＲＩＳＰＲ複合体には、tracr配列とハイブリダイズするtracr mate配列が含まれている）、の１つ以上が促進される。一般的に、相補性の程度とは、tracr配列およびtracr mate配列のうち長さが短い方に対する、両配列の最適なアラインメントを参照したものである。任意の適切なアラインメント・アルゴリズムによって最適なアラインメントを決定してよく、二次構造を考慮に入れてもよい（tracr配列またはtracr mate配列の内部の自己相補性など）。いくつかの実施形態において、tracr配列およびtracr mate配列の両配列のうち短い方の長さを基準とした両配列の相補性の程度は、最適なアラインメントにした場合に、約２５％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９７．５％、約９９％、またはそれ以上であるか；あるいは、約２５％超、約３０％超、約４０％超、約５０％超、約６０％超、約７０％超、約８０％超、約９０％超、約９５％超、約９７．５％超、約９９％超、またはそれ以上である。tracr配列とtracr mate配列との間における最適なアラインメントの説明例が、米国特許第８６９７３５９号に開示されている（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態において、tracr配列の長さは、約５ヌクレオチド、約６ヌクレオチド、約７ヌクレオチド、約８ヌクレオチド、約９ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド、約１１ヌクレオチド、約１２ヌクレオチド、約１３ヌクレオチド、約１４ヌクレオチド、約１５ヌクレオチド、約１６ヌクレオチド、約１７ヌクレオチド、約１８ヌクレオチド、約１９ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約２５ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、またはそれ以上であるか；あるいは、約５ヌクレオチド超、約６ヌクレオチド超、約７ヌクレオチド超、約８ヌクレオチド超、約９ヌクレオチド超、約１０ヌクレオチド超、約１１ヌクレオチド超、約１２ヌクレオチド超、約１３ヌクレオチド超、約１４ヌクレオチド超、約１５ヌクレオチド超、約１６ヌクレオチド超、約１７ヌクレオチド超、約１８ヌクレオチド超、約１９ヌクレオチド超、約２０ヌクレオチド超、約２５ヌクレオチド超、約３０ヌクレオチド超、約４０ヌクレオチド超、約５０ヌクレオチド超、またはそれ以上である。いくつかの実施形態において、tracr配列およびtracr mate配列は、単一の転写物中に含まれている。それゆえ、両者の間でのハイブリダイゼーションによって、転写物は二次構造を有している（ヘアピンなど）。ヘアピン構造に用いられ、ループを形成するのに好適である配列は、長さが４ヌクレオチドのものであり、最も好ましくはＧＡＡＡ配列である。しかし、ループ配列の長さはこれより長くても短くてもよいし、ＧＡＡＡ以外の配列であってもよい。好ましくは、この配列は、ヌクレオチド・トリプレット（例えば、ＡＡＡ）と、追加のヌクレオチド（例えば、ＣまたはＧ）とを含んでいる。ル���プを形成する配列の例としては、ＣＡＡＡおよびＡＡＡＧが挙げられる。本発明の実施形態において、転写物または転写されたポリヌクレオチド配列は、ヘアピンを２つ以上有している。好適な実施形態において、転写物は、ヘアピンを２つ、３つ、４つまたは５つ有している。本発明のさらなる実施形態において、転写物は、ヘアピンを最大で５つ有している。いくつかの実施形態において、単一の転写物には、転写終了配列がさらに含まれている。好ましくは、この配列はポリＴ配列である（例えば、６ヌクレオチドのＴ）。単一のポリヌクレオチドのさらなる非限定的な例には、下記のガイド配列、tracr mate配列およびtracr配列が含まれている（５’から３’の方向に記載してある）。ここで、Ｎはガイド配列の塩基を表す。先に登場する小文字の箇所は、tracr mate配列を表す。その次に登場する小文字の箇所は、tracr配列を表す。最後のポリＴ配列は、転写終了因子を表す。
【００９０】
【表１】
2020511931.tif 000002
【００９１】
いくつかの実施形態においては、配列（１）〜（３）と、S. thermophilusのＣＲＩＳＰＲ１由来のＣａｓ９と、を組み合わせて用いる。いくつかの実施形態においては、配列（４）〜（６）と、S. pyogenes由来のＣａｓ９と、を組み合わせて用いる。いくつかの実施形態において、tracr配列は、tracr mate配列を有している転写物とは別の転写物である。
【００９２】
いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、１つ以上の異種タンパク質ドメイン（例えば、当該ＣＲＩＳＰＲ酵素に加えて、約１個、約２個、約３個、約４個、約５個、約６個、約７個、約８個、約９個、約１０個、またはそれ以上のドメイン；あるいは、約１個超、約２個超、約３個超、約４個超、約５個超、約６個超、約７個超、約８個超、約９個超、約１０個超、またはそれ以上のドメイン）を有している、融合タンパク質の一部である。ＣＲＩＳＰＲ酵素融合タンパク質は、（i）任意の追加のタンパク質配列と、（ii）任意構成で、任意の２つのドメインの間にあるリンカー配列と、を有していてもよい。ＣＲＩＳＰＲ酵素と融合していてもよいタンパク質ドメインの例としては、エピトープタグ、レポーター遺伝子配列、および、以下の活性のうち１つ以上を有しているタンパク質ドメイン（メチル化活性、脱メチル化活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写終了因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性および核酸結合活性）、が挙げられるが、これらには限定されない。エピトープタグの非限定的な例としては、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザ血球凝集素タグ（ＨＡタグ）、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ−Ｇタグおよびチオレドキシンタグ（Ｔｒｘタグ）が挙げられる。レポーター遺伝子の例としては、グルタチオン−５−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、βガラクトシダーゼ、βグルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）および自家蛍光タンパク質（青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）など）が挙げられるが、これらに限定されない。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＤＮＡ分子または他の細胞内分子と結合するタンパク質またはタンパク質の断片をコードする遺伝子配列と融合していてもよい。このようなタンパク質の例としては、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓタグ、Ｌｅｘ  Ａ  ＤＮＡ結合ドメイン融合体（ＤＢＤ融合体）、ＧＡＬ４Ａ  ＤＮＡ結合ドメイン融合体、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＢＰ１６タンパク質融合体が挙げられるが、これらに限定されない。ＣＲＩＳＰＲ酵素を含んでいる融合タンパク質の一部を形成しうる追加のドメインは、ＵＳ２０１１００５９５０２に開示されている（参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態においては、タグ付けされたＣＲＩＳＰＲ酵素を用いて、標的配列の位置を特定する。
【００９３】
本発明のある態様において、レポーター遺伝子は、グルタチオン−５−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、βガラクトシダーゼ、βグルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）および自家蛍光タンパク質（青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）など）を含んでいる（ただし、これらに限定されない）。このレポーター遺伝子を細胞内に導入して、マーカーとして機能する遺伝子産物をコードさせ、これにより、遺伝子産物の発現の変化または改変を測定してもよい。本発明のさらなる実施形態においては、遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を、ベクターを介して細胞内に導入してもよい。本発明の好適な実施形態において、上記遺伝子産物はルシフェラーゼである。本発明のさらなる実施形態において、上記遺伝子産物の発現は減少する。
【００９４】
いくつかの実施形態において、本発明は、ゲノム内に挿入される所定の核酸配列をコードする所定の１本鎖核酸を含んでいる、核酸フィラメントを提供する。いくつかの好適な実施形態において、１本鎖核酸配列は１本鎖ＤＮＡである。いくつかの実施形態において、１本鎖核酸分子には、リコンビナーゼ多量体が結合している。いくつかの実施形態において、所定の核には、５’フランキング領域および３’フランキング領域が含まれている。好ましくは、これらの配列は、遺伝子産物をコードするゲノムの標的配列と約１００％相同的である。いくつかの実施形態において、５’フランキング配列および３’フランキング配列は、挿入配列に隣接している（この挿入配列は、ゲノムの標的配列とは異なる）。いくつかの実施形態において、挿入配列は、ゲノムの標的配列とは１塩基だけ異なっていてもよい。いくつかの実施形態において、挿入配列は、ゲノムの標的配列とは２つ以上の塩基が異なっていてもよい（すなわち、２塩基、３塩基、４塩基、５塩基、６塩基、７塩基、８塩基、９塩基、１０塩基、２０塩基、３０塩基、４０塩基、５０塩基、１００塩基またはそれ以上）。いくつかの実施形態においては、標的位置に所定の長さの配列が挿入されるように（例えば、２塩基、３塩基、４塩基、５塩基、６塩基、７塩基、８塩基、９塩基、１０塩基、２０塩基、３０塩基、４０塩基、５０塩基、１００塩基またはそれ以上）、挿入配列を設計する。いくつかの実施形態においては、標的位置において所定の長さの配列を削除するように（例えば、２塩基、３塩基、４塩基、５塩基、６塩基、７塩基、８塩基、９塩基、１０塩基、２０塩基、３０塩基、４０塩基、５０塩基、１００塩基またはそれ以上）、挿入配列を設計する。
【００９５】
いくつかの実施形態においては、所定の１本鎖核酸をリコンビナーゼとともにインキュベートして、当該所定の１本鎖核酸上にリコンビナーゼ多量体を形成させることによって、in vitroにてフィラメントを合成する。いくつかの実施形態において、上記フィラメントは、関連するヌクレオチドを含んでいる。いくつかの実施形態において、上記ヌクレオチドは、ヌクレオチド三リン酸または類似体からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、上記ヌクレオチド三リン酸または類似体は、アデノシン三リン酸、アデノシン一リン酸、アデノシン二リン酸、アデノシン三リン酸−γＳ、アデノシン一リン酸−ＰＮＰ、およびアデノシン二リン酸−ＡｌＦ４からなる群より選択される。
【００９６】
このシステムを総称して、リコンビナーゼ関連Ｃａｓ９媒介遺伝子修復システム（Recombinase Assisted Cas9-mediated gene Repair systems；ＲＡＣｅＲシステム）と呼ぶことがある。上記のフィラメントは、ＣＲＩＳＰＲシステム要素（Ｃａｓ９など）と併せて用いてもよいし、ＣＲＩＳＰＲシステム要素を伴わずに用いてもよいことが理解されよう。上記システムを用いるゲノム編集の際には、標的ゲノム配列の切断を伴っても、標的ゲノム配列の切断を伴わなくてもよいことが、さらに理解されよう。
【００９７】
上述した通り、上記リコンビナーゼは、細菌性リコンビナーゼ、ウイルス性リコンビナーゼおよび哺乳動物性リコンビナーゼからなる群より選択されてもよい。いくつかの実施形態において、上記リコンビナーゼは、Ｒａｄ５１リコンビナーゼ、ＲｅｃＡリコンビナーゼおよびＵｖｓＸリコンビナーゼからなる群より選択される。
【００９８】
いくつかの実施形態において、５’フランキング配列および３’フランキング配列の長さは、２０塩基超、５０塩基超、１００塩基超、２００塩基超、５００塩基超または１０００塩基超である。好ましくは、この長さは、約２０〜約１０００塩基、約１００〜約１０００塩基、約２０〜５０００塩基、約１００〜５０００塩基、または約１００〜１０，０００塩基であってもよい。
【００９９】
いくつかの実施形態において、本発明のフィラメントシステムは、ＣＲＩＳＰＲまたはＣＲＩＳＰＲ型要素をさらに含んでいる。したがって、いくつかの実施形態において、上記フィラメントシステムは、細胞のゲノム内において遺伝子産物をコードする遺伝子内にある標的配列に切断を導入するための、試薬を含んでいる。いくつかの実施形態において、上記切断は２本鎖切断である。いくつかの実施形態において、上記切断は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＮＦヌクレアーゼ）、および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥヌクレアーゼ）、またはＩ型制限エンドヌクレアーゼ、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ、ＩＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ、ＩＶ型制限エンドヌクレアーゼもしくはニッカーゼからなる群より選択される酵素によって導入される。いくつかの実施形態において、上記システムは、標的配列とハイブリダイズするＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムガイドＲＮＡをさらに含んでいる。いくつかの実施形態において、上記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、トランス活性化型ｃｒ配列（tracr配列）を含んでいる。いくつかの実施形態において、上記ガイドＲＮＡは、tracr配列と融合したガイド配列を有している。いくつかの実施形態において、上記フィラメントは、エレクトロポレーションによって細胞内に導入される。
【０１００】
いくつかの態様において、本発明は、１つ以上のポリヌクレオチド（本明細書に記載されている１つ以上のベクター、システムもしくはフィラメント、その１つ以上の転写物、および／または、そこから翻訳される１つ以上のタンパク質など）を、宿主細胞に送達する工程を含む方法を提供する。いくつかの態様において、本発明は、上記の方法によって作製される細胞、ならびに当該細胞を含んでいる生物または当該細胞から作製される生物（動物、植物または真菌など）をさらに提供する。いくつかの実施形態においては、ＣＲＩＳＰＲ酵素を、ガイド配列またはフィラメントとともに（そして任意構成で複合体化させて）、細胞に送達する。従来のウイルス系または非ウイルス系の遺伝子運搬方法を利用して、哺乳動物細胞内または標的組織内に核酸を導入することができる。このような方法を利用して、ＣＲＩＳＰＲシステムまたはＲＡＣｅＲシステムの要素をコードする核酸を、培養細胞または宿主生物へと投与することができる。非ウイルスベクター系の送達システムとしては、ＤＮＡプラスミド、ＲＮＡ（例えば、本明細書に記載のベクターの転写物）、裸の核酸、および送達担体（リポソームなど）と組み合わせた核酸複合体、が挙げられる。ウイルスベクター系送達システムとしては、ＤＮＡウイルスおよびＲＮＡウイルスが挙げられる（これらは、エピソーマルであってもよいし、細胞への送達後にゲノムを組み込んでもよい）。遺伝子治療の手順に関するレヴューとしては、［Anderson, Science 256:808-813 (1992); Nabel & Felgner, TIBTECH 11:211-217 (1993); Mitani & Caskey, TIBTECH 11:162-166 (1993); Dillon. TIBTECH 11:167-175 (1993); Miller, Nature 357:455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10): 1149-1154 (1988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995); Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1):31-44 (1995); Haddada et al., in Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and Bohm (eds) (1995); Yu et al., Gene Therapy 1:13-26 (1994)］を参照。
【０１０１】
非ウイルス系の核酸送達方法としては、リポフェクション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、バイオリスティクス、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオンまたは脂質−核酸複合体、裸のＤＮＡ、人工ビリオン、および薬剤によるＤＮＡ取り込み促進が挙げられる。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号、４，９４６，７８７号、および４，８９７，３５５号に開示されている。また、リポフェクション試薬は市販もされている（例えば、Transfectam(TM)およびLipofectin(TM)）。ポリヌクレオチドのリポフェクションの効果的な受容体認識に好適な、カチオン性脂質および中性脂質としては、ＷＯ９１／１７４２４およびＷＯ９１／１６０２４（いずれもFelgner）に開示のものがある。細胞への送達も（例えば、in vitroまたはex vivoの投与）、標的組織への送達も（例えば、in vivoの投与）、可能である。
【０１０２】
脂質−核酸複合体（抗体脂質複合体などの標的化リポソームを含む）の調製は、当業者にとって周知である。例えば、［Crystal, Science 270:404-410 (1995); Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2:291-297 (1995): Behr et al., Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994); Remy et al., Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994); Gao et al., Gene Therapy 2:710-722 (1995); Ahmad et al., Cancer Res. 52:4817-4820 (1992)］、米国特許４，１８６，１８３号、４，２１７，３４４号、４，２３５，８７１号、４，２６１，９７５号、４，４８５，０５４号、４，５０１，７２８号、４，７７４，０８５号、４，８３７，０２８号、４，９４６，７８７号を参照。
【０１０３】
ＲＮＡウイルス系またはＤＮＡウイルス系のシステムを核酸の送達に使用すると、ウイルスが体内の特定の細胞を標的化し、またウイルスに格納された中身を核まで移動させる、高度に進化した仕組みを利用できる。ウイルスベクターは、患者に直接投与することもできるし（in vivo）、in vitroでの細胞の処理にも用いることができる。また、改変した細胞を、任意で、患者に投与してもよい（ex vivo）。従来のウイルス系システムとしては、遺伝子導入用の、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターおよび単純ヘルペスウイルスベクターが挙げられる。レトロウイルス、レンチウイルスおよびアデノ随伴ウイルスを用いた遺伝子導入方法ならば、宿主ゲノムへの組み込みが可能である。組み込みの結果、通常は、挿入した導入遺伝子が長期間にわたって発現する。それに加えて、様々な細胞の種類および標的組織において、高効率での形質導入が観察されている。
【０１０４】
外来性のエンベロープタンパク質を組み込むことによって、レトロウイルスの親和性を変化させることができる。これにより、標的細胞の潜在的な標的数を増加させることができる。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞に形質導入または感染でき、一般的に高いウイルス力価を有しているレトロウイルスベクターである。それゆえ、レトロウイルスによる遺伝子導入システムの選択は、標的組織に応じたものになるであろう。レトロウイルスベクターは、シス作用性の長末端反復の中に含まれており、最大で６〜１０ｋｂの外来配列が格納できる。最小のシス作用性ＬＴＲでも複製には充分であり、ベクターを格納できる。このベクターを用いて標的細胞内に治療遺伝子を組み込み、導入遺伝子を恒常的に発現させる。広汎に使用されているレトロウイルスベクターとしては、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびこれらの組み合わせに基づくものが挙げられる（例えば、Buchscher et al., J. Virol. 66:2731-2739 (1992); Johann et al., J. Virol. 66:1635-1640 (1992); Sommnerfelt et al., Virol. 176:58-59 (1990); Wilson et al., J. Virol. 63:2374-2378 (1989); Miller et al., J. Virol. 65:2220-2224 (1991);国際特許出願第ＵＳ９４／０５７００号を参照）。一過性の発現が好ましい応用の場においては、アデノウイルス系システムを使用することができる。アデノウイルス系ベクターは、多くの細胞の種類において高効率での形質導入が可能であり、細胞分裂を必要としない。このようなベクターによれば、高い力価と高い発現レベルとが実現できる。このベクターは、比較的単純なシステムで大量生産が可能である。アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶベクター）もまた、細胞への標的核酸の形質導入に用いることができる。例えば、in vitroでの核酸およびペプチドの産生において、さらにはin vivoおよびex vivoでの遺伝子治療の手法に用いることができる（例えば、West et al., Virology 160:38-47 (1987);米国特許第４，７９７，３６８号；ＷＯ９３／２４６４１; Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994); Muzyczka, J. Clin. Invest. 94:1351 (1994)を参照）。組み換えＡＡＶベクターの構築については、多数の文献に開示されている（米国特許第５，１７３，４１４号; Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985); Tratschin, et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 (1984); Hermonat & Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984); and Samulski et al., J. Virol. 63:03822-3828 (1989)など）。
【０１０５】
宿主細胞への感染能力を有するウイルス粒子の作製には、通常はパッケージング細胞が用いられる。このような細胞としては、２９３細胞（アデノウイルスをパッケージングする）、およびψ２細胞またはＰＡ３１７細胞（いずれもレトロウイルスをパッケージングする）が挙げられる。遺伝子治療に用いられるウイルスベクターは、通常、ウイルス粒子内の核酸ベクターをパッケージングしている細胞株を作出することによって作製する。通常、ベクターは、パッケージングおよびその後の宿主への組み込みに必要な、最低限のウイルス性配列のみを有している。他のウイルス性配列は、発現させるポリヌクレオチドの発現カセットによって置換されている。失われたウイルスの機能は、通常、パッケージング細胞株によってin transに補われる。例えば、遺伝子治療に使われるＡＡＶベクターは、ＡＡＶのゲノム由来のものとしては、パッケージングおよび宿主ゲノム内への組み込みに必要となるＩＴＲ配列のみを通常は有している。他のＡＡＶ遺伝子（すなわちｒｅｐおよびｃａｐ）をコードするが、ＩＴＲ配列は存在しないヘルパープラスミドを含んでいる細胞株に、ウイルスのＤＮＡをパッケージングする。この細胞株は、ヘルパーとして、アデノウイルスに感染させてもよい。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製と、ヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドはＩＴＲ配列を欠いているので、大量にはパッケージングされない。例えば熱処理によって、アデノウイルスの混入を軽減できる。アデノウイルスの方が、ＡＡＶよりも熱に弱いためである。さらなる細胞への核酸送達方法は、当業者の知る所である。例えば、ＵＳ２００３００８７８１７を参照（参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１０６】
いくつかの実施形態においては、本明細書に記載の１つ以上のベクターで、一時的に（または非一時的に）宿主細胞をトランスフェクションさせる。いくつかの実施形態においては、被験体において天然に生じるようなやり方で、細胞をトランスフェクションさせる。いくつかの実施形態において、トランスフェクションさせる細胞は、被験体から採取されたものである。いくつかの実施形態において、上記細胞は、被験体から採取された細胞に由来するするものである（細胞株など）。組織培養のための種々の細胞株が、本技術分野では知られている。細胞株の例としては、Ｃ８１６１、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＭＯＬＴ、ｍＩＭＣＤ−３、ＮＨＤＦ、ＨｅＬａ−Ｓ３、Ｈｕｈ１、Ｈｕｈ４、Ｈｕｈ７、ＨＵＶＥＣ、ＨＡＳＭＣ、ＨＥＫｎ、ＨＥＫａ、ＭｉａＰａ細胞、Ｐａｎｅｌ、ＰＣ−３、ＴＦ１、ＣＴＬＬ−２、Ｃ１Ｒ、Ｒａｔ６、ＣＶ１、ＲＰＴＥ、Ａ１０、Ｔ２４、Ｊ８２、Ａ３７５、ＡＲＨ−７７、Ｃａｌｕ１、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０、ＳＫＯＶ３、ＳＫ−ＵＴ、ＣａＣｏ２、Ｐ３８８Ｄ１、ＳＥＭ−Ｋ２、ＷＥＨＩ−２３１、ＨＢ５６、ＴＩＢ５５、Ｊｕｒｋａｔ、Ｊ４５．０１、ＬＲＭＢ、Ｂｃｌ−１、ＢＣ−３、ＩＣ２１、ＤＬＤ２、Ｒａｗ２６４．７、ＮＲＫ、ＮＲＫ−５２Ｅ、ＭＲＣ５、ＭＥＦ、Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨｅＬａ  Ｂ、ＨｅＬａ  Ｔ４、ＣＯＳ、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−６、ＣＯＳ−Ｍ６Ａ、ＢＳ−Ｃ−１サル腎臓上皮、ＢＡＬＢ／３Ｔ３マウス胎児線維芽細胞、３Ｔ３  Ｓｗｉｓｓ、３Ｔ３−Ｌ１、１３２−ｄ５ヒト胎児線維芽細胞、１０．１マウス線維芽細胞、２９３−Ｔ、３Ｔ３、７２１、９Ｌ、Ａ２７８０、Ａ２７８０ＡＤＲ、Ａ２７８０ｃｉｓ、Ａ１７２、Ａ２０、Ａ２５３、Ａ４３１、Ａ−５４９、ＡＬＣ、Ｂ１６、Ｂ３５、ＢＣＰ−１細胞、ＢＥＡＳ−２Ｂ、ｂＥｎｄ．３、ＢＨＫ−２１、ＢＲ２９３、ＢｘＰＣ３、Ｃ３Ｈ−１０Ｔ１／２、Ｃ６／３６、Ｃａｌ−２７、ＣＨＯ、ＣＨＯ−７、ＣＨＯ−ＩＲ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｋ２、ＣＨＯ−Ｔ、ＣＨＯ  Ｄｈｆｒ  −／−、ＣＯＲ−Ｌ２３、ＣＯＲ−Ｌ２３／ＣＰＲ、ＣＯＲ−Ｌ２３／５０１０、ＣＯＲ−Ｌ２３／Ｒ２３、ＣＯＳ−７、ＣＯＶ−４３４、ＣＭＬ  Ｔ１、ＣＭＴ、ＣＴ２６、Ｄ１７、ＤＨ８２、ＤＵ１４５、ＤｕＣａＰ、ＥＬ４、ＥＭ２、ＥＭ３、ＥＭＴ６／ＡＲ１、ＥＭＴ６／ＡＲ１０．０、ＦＭ３、Ｈ１２９９、Ｈ６９、ＨＢ５４、ＨＢ５５、ＨＣＡ２、ＨＥＫ−２９３、ＨｅＬａ、Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７、ＨＬ−６０、ＨＭＥＣ、ＨＴ−２９、Ｊｕｒｋａｔ、ＪＹ細胞、Ｋ５６２細胞、Ｋｕ８１２、ＫＣＬ２２、ＫＧ１、ＫＹＯ１、ＬＮＣａｐ、Ｍａ−ＭｅＩ  １−４８、ＭＣ−３８、ＭＣＦ−７、ＭＣＦ−１０Ａ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ＭＤＣＫ  ＩＩ、ＭＤＣＫ  ＩＩ、ＭＯＲ／０．２Ｒ、ＭＯＮＯ−ＭＡＣ  ６、ＭＴＤ−１Ａ、ＭｙＥｎｄ、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＣＰＲ、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＬＸ１０、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＬＸ２０、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＬＸ４、ＮＩＨ−３Ｔ３、ＮＡＬＭ−１、ＮＷ−１４５、ＯＰＣＮ／ＯＰＣＴ細胞株、Ｐｅｅｒ、ＰＮＴ−１Ａ／ＰＮＴ  ２、ＲｅｎＣａ、ＲＩＮ−５Ｆ、ＲＭＡ／ＲＭＡＳ、Ｓａｏｓ−２細胞、Ｓｆ−９、ＳｋＢｒ３、Ｔ２、Ｔ−４７Ｄ、Ｔ８４、ＴＨＰ１細胞株、Ｕ３７３、Ｕ８７、Ｕ９３７、ＶＣａＰ、Ｖｅｒｏ細胞、ＷＭ３９、ＷＴ−４９、Ｘ６３、ＹＡＣ−１、ＹＡＲ、およびそのトランスジェニック変異体が挙げられるが、これらに限定されない。当業者に知られている様々な提供元から、細胞株を入手することができる（例えば、the American Type Culture Collection (ATCC) (Manassus, Va.)を参照）。いくつかの実施形態においては、本明細書に記載の１つ以上のベクターでトランスフェクションした細胞を用いて、新規な細胞株を確立させる。この細胞株は、１つ以上のベクターに由来する配列を含んでいる。いくつかの実施形態においては、本明細書に記載されているようにＣＲＩＳＰＲシステムの要素を一時的にトランスフェクションさせて（例えば、１つ以上のベクターの一過性のトランスフェクションによって。あるいは、ＲＮＡを用いたトランスフェクションによって）、ＣＲＩＳＰＲ複合体の活性を改変した細胞を用いて、新規な細胞株を確立する。この細胞株に含まれている細胞は、上記の改変を有しているが、他の外来性の配列は全く含んでいない。いくつかの実施形態においては、（i）本明細書に記載の１つ以上のベクターで、一時的に（もしくは非一時的に）トランスフェクションさせた細胞、または（ii）当該細胞に由来する細胞株を用いて、１種類以上の試験化合物を評価する。
【０１０７】
いくつかの実施形態においては、本明細書に記載の１つ以上のベクターを用いて、非ヒトトランスジェニック動物またはトランスジェニック植物を作出する。いくつかの実施形態において、上記トランスジェニック動物は、哺乳動物である（マウス、ラットまたはウサギなど）。特定の実施形態において、上記生物または被験体は、植物である。特定の実施形態において、上記生物、被験体または植物は、藻類である。トランスジェニック植物およびトランスジェニック動物を作出する方法は、本技術分野において知られており、一般的には細胞をトランスフェクションさせる方法（例えば、本明細書に記載の方法のような）から始まる。トランスジェニック植物（特に、作物および藻類）と同様に、トランスジェニック動物も作出される。トランスジェニック動物またはトランスジェニック植物は、疾患モデルを提供する以外の応用にとっても、有用でありうる。そのような例としては、食糧または飼料の生産において、タンパク質、炭水化物、栄養またはビタミンなどのレベルを、野生型で通常に見られるよりも高いレベルで発現させることが挙げられる。この観点からは、トランスジェニック植物（とりわけ、豆類および芋類）、トランスジェニック動物（とりわけ、家畜などの哺乳動物（ウシ、ヒツジ、ヤギおよびブタ））に加えて、家禽および食用昆虫が好ましい。
【０１０８】
トランスジェニック藻類または他のトランスジェニック植物（アブラナなど）は、例えば、植物油または生物燃料（アルコール、とりわけメタノールおよびエタノールなど）の生産において、特に有用でありうる。油脂産業または生物燃料産業で利用するために、これらの生物を改変して、油またはアルコールを高レベルで発現または過剰発現させてもよい。
【０１０９】
一態様において、本発明は、真核細胞内の標的ポリヌクレオチドを改変する方法を提供する。この方法は、in vivoであってもよく、ex vivoであってもよく、in vitroであってもよい。いくつかの実施形態において、上記方法は、ヒト、非ヒト動物または植物（微細藻類を含む）から細胞または細胞群をサンプリングして、当該細胞を改変する工程を含む。任意の段階において、ex vivoで培養を行ってもよい。上記細胞を、上記非ヒト動物または植物（微細藻類を含む）に再導入してもよい。
【０１１０】
一態様において、本発明は、真核細胞内の標的ポリヌクレオチドを改変する方法を提供する。いくつかの実施形態において、上記方法は、ＣＲＩＳＰＲ複合体を標的ポリヌクレオチドに結合させて、当該標的ポリヌクレオチドを切断し、これによって、当該標的ポリヌクレオチドを改変する工程を含む。ここで、上記ＣＲＩＳＰＲ複合体は、ガイド配列と複合体化しているＣＲＩＳＰＲ酵素を含んでいる。ガイド配列は、標的ポリヌクレオチド内にある標的配列とハイブリダイズする。また、ガイド配列は、tracr配列とハイブリダイズするtracr mate配列と連結されている。
【０１１１】
一態様において、本発明は、真核細胞内におけるポリヌクレオチドの発現を改変する方法を提供する。いくつかの実施形態において、上記方法は、ＣＲＩＳＰＲ複合体をポリヌクレオチドと結合させて、この結合の結果、当該ポリヌクレオチドの発現を増加または減少させる工程を含む。ここで、上記ＣＲＩＳＰＲ複合体は、ガイド配列と複合体化しているＣＲＩＳＰＲ酵素を含んでいる。ガイド配列は、上記ポリヌクレオチド内にある標的配列とハイブリダイズする。また、ガイド配列は、tracr配列とハイブリダイズするtracr mate配列と連結されている。他の態様において、本発明は、真核細胞内におけるポリヌクレオチドの発現を改変する方法を提供する。いくつかの実施形態において、上記方法は、ＲＡＣｅＲフィラメントをポリヌクレオチドと結合させて、この結合の結果、当該ポリヌクレオチドの発現を増加または減少させる工程を含む。
【０１１２】
昨今の作物ゲノミクスの進歩に加えて、ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムまたはＲＡＣｅＲシステムを用いた有効で費用対効果の高い遺伝子編集能力および遺伝子操作能力によれば、１または複数の遺伝子操作を迅速に選抜・比較することが可能になる。これによって、収穫量を増加させ特質を向上させるように、ゲノムを変化させることも可能になるであろう。この点に関しては、米国特許および出版物として、米国特許第６，６０３，０６１号（Agrobacteriumを媒介とする植物の形質転換方法）、米国特許第７，８６８，１４９号（植物のゲノム配列およびその使用）、米国特許出願公開第２００９／０１００５３６号（農業的特質を改良したトランスジェニック植物）を参照（それぞれの内容および開示の全体が、参照により本明細書に組み込まれる）。本発明の実施に当たっては、［Morrell et al "Crop genomics:advances and applications" Nat Rev Genet. 2011 Dec. 29; 13(2):85-96］の内容および開示もまた、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１３】
植物において、病原体は一般的に宿主特異的である。例えば、Fusarium oxysporum f. sp. lycopersiciはトマト萎凋病を引き起こすが、トマトのみを標的とする。一方、F. oxysporn f. dianthiiおよびPuccinia graminis f. sp. triticiは、コムギのみを標的とする。多くの病原体に抵抗する防衛網が植物には存在しており、また発展させてきた。植物の世代を超えた変異イベントおよび組み換えイベントによって、感受性の原因となる遺伝的多様性が生じる（特に、病原体の再生産は植物よりも頻繁であるため）。植物においては、宿主の抵抗を引き起こさない場合がある（例えば、宿主と病原体とは共存可能である）。また、水平方向の抵抗（例えば、全ての種類の病原体に対する部分的な抵抗で、通常は多くの遺伝子によって制御されている）や、垂直方向の抵抗（例えば、数種類の病原体に対する完全な抵抗で（そして他の種類の病原体に対する抵抗ではなく）、通常は少数の遺伝子によって制御されている）がある場合もある。遺伝子対遺伝子レベルでは、植物と病原体とは共進化しており、一方における遺伝的変化は、他方を変化させる。それゆえ育種家は、自然の可変性を用いて、収穫高、品質、均質性、頑健性、抵抗性にとって最も有用な遺伝子を組み合わせる。抵抗性遺伝子の出所としては、在来種または外来種、エアルーム品種、近縁の野生植物、および誘導変異（例えば、植物材料を変異原性薬剤で処理する）が挙げられる。本発明を用いることによって、変異を誘導する新たなツールが植物育種家に提供される。したがって当業者は、抵抗性遺伝子の出所のゲノムを解析し、また所望の特徴または特性を有している品種に対して本発明を利用して、抵抗性遺伝子の出現を誘導することができる。この方法は、従来の変異原性薬剤よりもより正確で、それゆえ、植物育種プログラムを加速させ改善するものである。
【０１１４】
一態様において、本発明は、上記の方法および組成物に記載されている１つ以上の任意の要素を備えているキットを提供する。いくつかの実施形態において、上記キットは、ベクターシステムと、当該キットの使用のための説明書を備えている。いくつかの実施形態において、上記ベクターシステムは、（ａ）（i）tracr mate配列、および（ii）当該tracr mate配列の上流にあり、ガイド配列を挿入するための１つ以上の挿入部位、と作動可能に連結している第１調節要素と（要素（ａ）が発現すると、上記ガイド配列は、ＣＲＩＳＰＲ複合体と標的配列との配列特異的な結合を、真核細胞内においてもたらす。このＣＲＩＳＰＲ複合体には、（１）上記標的配列とハイブリダイズするガイド配列、および（２）tracr配列とハイブリダイズするtracr mate配列、と複合体を形成しているＣＲＩＳＰＲ酵素が含まれている）；および／または、（ｂ）核局在化配列を有しており、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列と作動可能に連結している第２調節要素と；を含んでいる。いくつかの実施形態において、上記キットは、ＲＡＣｅＲシステムに使用される１本鎖ＤＮＡ配列、リコンビナーゼ酵素、および／または適切なヌクレオチド補助因子を備えていてもよい。要素を個別に提供してもよいし、組み合わせて提供してもよい。また、任意の適切な容器に入れて要素を提供してもよい（バイアル、ボトルまたはチューブなど）。いくつかの実施形態において、上記キットは、１種類以上の言語で書かれた説明書を備えている（例えば、２種類以上の言語）。
【０１１５】
いくつかの実施形態において、キットは、本明細書に記載の要素の１つ以上を利用したプロセスに使用するための、１つ以上の試薬を備えている。任意の適切な容器に試薬を入れて提供してもよい。例えば、１つ以上の反応バッファまたは保存バッファが、キットに含まれていてもよい。特定のアッセイに利用できるような形態で試薬を提供してもよいし、使用に先立って１つ以上の他の要素を加える必要のある形態で試薬を提供してもよい（例えば、濃縮形態または凍結乾燥形態）。バッファは、任意の緩衝液でありうる。例えば、炭酸ナトリウム緩衝液、重炭酸ナトリウム緩衝液、ホウ酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、およびこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、緩衝液はアルカリ性である。いくつかの実施形態において、緩衝液のｐＨは約７〜約１０である。いくつかの実施形態において、上記キットは、ガイド配列と調節要素とが作動可能に連結するようにベクター内に挿入するための、ガイド配列に対応する１種類以上のオリゴヌクレオチドを備えている。いくつかの実施形態において、上記キットは、相同組み換えテンプレート・ポリヌクレオチドを備えている。
【０１１６】
一態様において、本発明は、ＣＲＩＳＰＲシステムまたはＲＡＣｅＲシステムの１つ以上の要素の使用方法を提供する。本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体またはＲＡＣｅＲ複合体は、標的ポリヌクレオチドを改変する効果的な手段を提供する。本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体またはＲＡＣｅＲ複合体には、幅広い用途がある。例えば、多種多様な細胞の種類における、標的ポリヌクレオチドの改変（削除、挿入、転位、不活性化、活性化など）が挙げられる。このように、本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体またはＲＡＣｅＲ複合体には、広汎な応用の用途が開けている（例えば、遺伝子治療、薬物のスクリーニング、疾患の診断および予後の予測）。代表的なＣＲＩＳＰＲ複合体は、ガイド配列と複合体化しているＣＲＩＳＰＲ酵素を含んでいる。このガイド配列は、標的ポリヌクレオチド内にある標的配列とハイブリダイズする。また、ガイド配列はtracr mate配列と連結されており、このtracr mate配列はtracr配列とハイブリダイズする。
【０１１７】
ＣＲＩＳＰＲ複合体またはＲＡＣｅＲ複合体の標的ポリヌクレオチドは、真核細胞にとって内在性または外来性の、任意のポリヌクレオチドであってよい。例えば、標的ポリヌクレオチドは、真核細胞の核内にあるポリヌクレオチドであってもよい。標的ポリヌクレオチドは、遺伝子産物（例えば、タンパク質）をコードする配列であってもよいし、非コーディング配列（例えば、調節ポリヌクレオチドまたはジャンクＤＮＡ）であってもよい。理論に拘束されるつもりはないが、標的配列はＰＡＭ（protospacer adjacent motif；プロトスペーサー隣接モチーフ）を伴っている必要があると考えられている。ＰＡＭは、ＣＲＩＳＰＲ複合体によって認識される短い配列である。ＰＡＭの正確な配列および必要とされる長さは、使用するＣＲＩＳＰＲ酵素によって異なる。しかしＰＡＭは、通常は２〜５塩基対の配列であり、プロトスペーサー（つまり標的配列）に隣接している。ＰＡＭ配列の例は、下記の実施例に記載している。また当業者ならば、所与のＣＲＩＳＰＲ酵素とともに使用される、さらなるＰＡＭ配列について知ることができるであろう。
【０１１８】
ＣＲＩＳＰＲ複合体またはＲＡＣｅＲ複合体の標的ポリヌクレオチドは、疾患に関連する種々の遺伝子およびポリヌクレオチドの他にも、生化学経路のシグナリングに関連する遺伝子およびポリヌクレオチドを含んでいてもよい。これらの遺伝子およびポリヌクレオチドは、米国仮特許出願第６１／７３６，５２７号および第６１／７４８，４２７号（発明の名称はいずれも「配列操作のためのシステム、方法および組成物」。それぞれ２０１２年１２月１２日、２０１３年１月２日に出願）に列挙されている（これらの記載内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１１９】
標的ポリヌクレオチドの例としては、生化学経路のシグナリングに関連する配列が挙げられる（例えば、生化学経路のシグナリングに関連する遺伝子またはポリヌクレオチド）。標的ポリヌクレオチドの例としては、疾患に関連する遺伝子またはポリヌクレオチドが挙げられる。「疾患に関連する」遺伝子またはポリヌクレオチドとは、疾患に冒された組織に由来する細胞内において、疾患のないコントロール組織または細胞と比較した際に、異常なレベルまたは異常な形態の転写産物または翻訳産物をもたらす任意の遺伝子またはポリヌクレオチドを表す。疾患に関連する遺伝子は、発現が異常に高レベルになっている遺伝子である場合もある。あるいは、疾患に関連する遺伝子は、発現が異常に低レベルになっている遺伝子である場合もある。この変化した発現が、疾患の発症および／または進行と相関している。また、疾患に関連する遺伝子とは、変異または遺伝的多様性を有する遺伝子をも表す。この変異または遺伝的多様性は、疾患の直接の原因であるか、疾患の病因の原因となる遺伝子の不均衡と関連している。転写産物または翻訳産物は、公知のものであってもよいし、未知のものであってもよい。また、これらの産物は、正常レベルであってもよいし、異常レベルであってもよい。
【０１２０】
疾患に関連する遺伝子およびポリヌクレオチドの例は、McKusick-Nathans Institute of Genetic Medicine, Johns Hopkins University (Baltimore, Md.)およびNational Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine (Bethesda, Md.)から知ることができる（インターネットでアクセス可能）。
【０１２１】
疾患に関連する遺伝子およびポリヌクレオチドの例を、表Ａ、Ｂに列挙する。疾患の具体的な情報は、McKusick-Nathans Institute of Genetic Medicine, Johns Hopkins University (Baltimore, Md.)およびNational Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine (Bethesda, Md.)から知ることができる（インターネットでアクセス可能）。生化学経路のシグナリングに関連する遺伝子およびポリヌクレオチドの例を、表Ｃに列挙する。
【０１２２】
これらの遺伝子および経路の変異によって、不適切なタンパク質が産生されたり、不適切な量のタンパク質が産生されたりして、機能に影響を及ぼすことがある。遺伝子、タンパク質および経路は、ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的ポリヌクレオチドとなりうる。
【０１２３】
【表２】
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【０１２４】
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【０１２５】
【表３】
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【０１２６】
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【０１２７】
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【０１２８】
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【０１２９】
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【０１３０】
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【０１３１】
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【０１３２】
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【０１３３】
【表４】
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【０１３４】
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【０１３５】
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【０１３６】
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【０１３７】
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【０１３８】
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【０１３９】
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【０１４０】
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【０１４１】
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【０１４９】
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【０１５０】
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【０１５１】
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【０１５３】
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【０１５４】
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【０１５５】
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【０１５６】
本発明の実施形態はまた、（i）遺伝子のノックアウト、（ii）遺伝子の増幅、ならびに（iii）ＤＮＡのリピート不安定性および神経障害と関係のある特定の変異の修復、に関連している方法および組成物にも関する（Robert D. Wells, Tetsuo Ashizawa, Genetic Instabilities and Neurological Diseases, Second Edition, Academic Press, Oct. 13, 2011-Medical）。特定の態様のタンデムリピート配列が、２０種類を超えるヒト疾患の原因となっていることが判明している（New insights into repeat instability: role of RNA*DNA hybrids. McIvor E I, Polak U, Napierala M. RNA Biol. 2010 September-October; 7(5):551-8）。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを利用して、上述のゲノムの不安定性による欠陥を修正できる可能性がある。
【０１５７】
本発明のさらなるいくつかの態様は、様々な遺伝性疾患と関係している欠陥の修正に関する。米国国立衛生研究所のウェブサイトにある、"Genetic Disorders"のトピックサブセクションでは、これらの遺伝性疾患についてさらに記載されている（ウェブサイト：health.nih.gov/topic/GeneticDisorders）。遺伝性脳疾患としては、副腎白質ジストロフィー、脳梁欠損症、アルカディ症候群、アルパース病、アルツハイマー病、バース症候群、バッテン病、ＣＡＤＡＳＩＬ、小脳の変性、ファブリー病、ゲルストマン＝シュトロイスラー＝シャイカー病、ハンチントン病および他のトリプレットリピート障害、リー病、レッシュ＝ナイハン症候群、メンケス病、ミトコンドリアミオパチー、ならびにＮＩＮＤＳコルポセファニーが挙げられるが、これらに限定されない。米国国立衛生研究所のウェブサイトにある、"Genetic Brain Disorders"のサブセクションでは、これらの疾患についてさらに記載されている。
【０１５８】
いくつかの実施形態において、上記状態とは新生物でありうる。上記状態が新生物であるいくつかの実施形態において、標的となる上記遺伝子は、表Ａに列挙した遺伝子のいずれかでありうる（この場合、ＰＴＥＮなど）。いくつかの実施形態において、上記状態とは加齢黄斑変性でありうる。いくつかの実施形態において、上記状態とは統合失調症でありうる。いくつかの実施形態において、上記状態とはトリヌクレオチド反復障害でありうる。いくつかの実施形態において、上記状態とは脆弱Ｘ症候群でありうる。いくつかの実施形態において、上記状態とはセクレターゼ関連障害でありうる。いくつかの実施形態において、上記状態とはプリオン関連障害でありうる。いくつかの実施形態において、上記状態とはＡＬＳでありうる。いくつかの実施形態において、上記状態とは薬物依存でありうる。いくつかの実施形態において、上記状態とは自閉症でありうる。いくつかの実施形態において、上記状態とはアルツハイマー病でありうる。いくつかの実施形態において、上記状態とは炎症でありうる。いくつかの実施形態において、上記状態とはパーキンソン病でありうる。
【０１５９】
パーキンソン病に関連するタンパク質の例としては、α−シスクレイン、ＤＪ−１、ＬＲＲＫ２、ＰＩＮＫ１、Ｐａｒｋｉｎ、ＵＣＨＬ１、シンフィリン−１およびＮＵＲＲ１が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６０】
依存症に関連するタンパク質の例としては、ＡＢＡＴなどが挙げられる。
【０１６１】
炎症に関連するタンパク質の例としては、Ｃｃｒ２遺伝子にコードされている単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ１）、Ｃｃｒ５遺伝子にコードされているＣＣケモカイン受容体５（ＣＣＲ５）、Ｆｃｇｒ２ｂ遺伝子にコードされているＩｇＧ受容体ＩＩＢ（ＦＣＧＲ２ｂ；ＣＤ３２とも呼ぶ）、またはＦｃｅｒ１ｇ遺伝子にコードされているＦｃε受容体Ｉｇタンパク質（ＦＣＥＲ１ｇ）などが挙げられる。
【０１６２】
心血管疾患に関連するタンパク質の例としては、ＩＬ１Ｂ（インターロイキン１β）、ＸＤＨ（キサンチンデヒドロゲナーゼ）、ＴＰ５３（腫瘍タンパク質ｐ５３）、ＰＴＧＩＳ（プロスタグランジン１２（プロスタサイクリン）シンターゼ）、ＭＢ（ミオグロビン）、ＩＬ４（インターロイキン４）、ＡＮＧＰＴ１（アンギオポイエチン１）、ＡＢＣＧ８（ATP-binding cassette, sub-family G (WHITE), member 8）、またはＣＴＳＫ（カテプシンＫ）などが挙げられる。
【０１６３】
アルツハイマー病に関連するタンパク質の例としては、ＶＬＤＬＲ遺伝子にコードされている超低密度リポタンパク質受容体タンパク質（ＶＬＤＬＲ）、ＵＢＡ１遺伝子にコードされているユビキチン様修飾因子活性化酵素１（ＵＢＡ１）、またはＵＢＡ３遺伝子にコードされているＮＥＤＤ８活性化酵素Ｅ１触媒サブユニットタンパク質（ＵＢＥ１Ｃ）などが挙げられる。
【０１６４】
自閉症スペクトラム障害に関連するタンパク質の例としては、ＢＺＲＡＰ１遺伝子にコードされているベンゾジアゼピン受容体（末梢性）関連タンパク質１（ＢＺＲＡＰ１）、ＡＦＦ２遺伝子にコードされているＡＦＦ２（AF4/FMR2 family member 2 protein；ＭＦＲ２とも呼ぶ）、ＦＸＲ１遺伝子にコードされているＦＸＲ１（fragile X mental retardation autosomal homolog 1）、またはＦＸＲ２遺伝子にコードされているＦＸＲ２（fragile X mental retardation autosomal homolog 2 protein）などが挙げられる。
【０１６５】
黄斑変性に関連するタンパク質の例としては、ＡＢＣＲ遺伝子にコードされているＡＢＣＡ４（ATP-binding cassette, sub-family A (ABC1) member 4 protein）、ＡＰＯＥ遺伝子にコードされているアポリポプロテインＥタンパク質（ＡＰＯＥ）、またはＣＣＬ２遺伝子にコードされているＣＣＬ２（chemokine (C-C motif) Ligand 2 protein）などが挙げられる。
【０１６６】
統合失調症に関連するタンパク質の例としては、ＮＲＧ１、ＥｒｂＢ４、ＣＰＬＸ１、ＴＰＨ１、ＴＰＨ２、ＮＲＸＮ１、ＧＳＫ３Ａ、ＢＤＮＦ、ＤＩＳＣ１、ＧＳＫ３Ｂ、およびこれらの組み合わせが挙げられる。
【０１６７】
腫瘍の抑制に関連するタンパク質の例としては、ＡＴＭ（ataxia telangiectasia mutated）、ＡＴＲ（ataxia telangiectasia and Rad3 related）、ＥＧＦＲ（表皮成長因子受容体）、ＥＲＢＢ２（v-erb-b2 erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2）、ＥＲＢＢ３（v-erb-b2 erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 3）、ＥＲＢＢ４（v-erb-b2 erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 4）、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３またはＮｏｔｃｈ４などが挙げられる。
【０１６８】
セクレターゼ障害に関連するタンパク質の例としては、ＰＳＥＮＥＮ（presenilin enhancer 2 homolog (C. elegans)）、ＣＴＳＢ（カテプシンＢ）、ＰＳＥＮ１（プレセニリン１）、ＡＰＰ（アミロイドβ（Ａ４）前駆タンパク質）、ＡＰＨ１Ｂ（anterior pharynx defective 1 homolog B (C. elegans)）、ＰＳＥＮ２（プレセニリン２（アルツハイマー病４））、またはＢＡＣＥ１（ＡＰＰβ部位切断酵素１）などが挙げられる。
【０１６９】
筋萎縮性側索硬化症に関連するタンパク質の例としては、ＳＯＤ１（スーパーオキシドジスムターゼ１）、ＡＬＳ２（amyotrophic lateral sclerosis 2）、ＦＵＳ（fused in sarcoma）、ＴＡＲＤＢＰ（ＴＡＲ  ＤＮＡ結合タンパク質）、ＶＡＧＦＡ（血管内皮成長因子Ａ）、ＶＡＧＦＢ（血管内皮成長因子Ｂ）、およびＶＡＧＦＣ（血管内皮成長因子Ｃ）、ならびにこれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【０１７０】
プリオン疾患に関連するタンパク質の例としては、ＳＯＤＩ（スーパーオキシドジスムターゼ１）、ＡＬＳ２（amyotrophic lateral sclerosis 2）、ＦＵＳ（fused in sarcoma）、ＴＡＲＤＢＰ（ＴＡＲ  ＤＮＡ結合タンパク質）、ＶＡＧＦＡ（血管内皮成長因子Ａ）、ＶＡＧＦＢ（血管内皮成長因子Ｂ）、およびＶＡＧＦＣ（血管内皮成長因子Ｃ）、ならびにこれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【０１７１】
プリオン障害における神経変性状態に関連するタンパク質の例としては、Ａ２Ｍ（α２マクログロブリン）、ＡＡＴＦ（アポトーシス拮抗転写因子）、ＡＣＰＰ（前立腺酸性ホスファターゼ）、ＡＣＴＡ２（大動脈平滑筋アクチンα２）、ＡＤＡＭ２２（ＡＤＡＭ金属ペプチダーゼドメイン）、ＡＤＯＲＡ３（アデノシンＡ３受容体）、またはＡＤＲＡ１Ｄ（Alpha-1D adrenergic receptor for Alpha-1D adrenoreceptor）などが挙げられる。
【０１７２】
免疫不全に関連するタンパク質の例としては、Ａ２Ｍ（α２マクログロブリン）、ＡＡＮＡＴ（アリールアルキルアミン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ）、ＡＢＣＡ１（ATP-binding cassette, sub-family A (ABC1), member 1）、ＡＢＣＡ２（ATP-binding cassette, sub-family A (ABC1), member 2）、またはＡＢＣＡ３（ATP-binding cassette, sub-family A (ABC1), member 3）などが挙げられる。
【０１７３】
トリヌクレオチド反復障害に関連するタンパク質の例としては、ＡＲ（アンドロゲン受容体）、ＦＭＲ１（fragile X mental retardation 1）、ＨＴＴ（huntingtin）、またはＤＭＰＫ（筋緊張性ジストロフィータンパク質キナーゼ）、ＦＸＮ（フラタキシン）、ＡＴＸＮ２（アタキシン２）などが挙げられる。
【０１７４】
神経伝達障害に関連するタンパク質の例としては、ＳＳＴ（ソマトスタチン）、ＮＯＳ１（一酸化窒素シンターゼ１（神経性））、ＡＤＲＡ２Ａ（α２Ａアドレナリン受容体）、ＡＤＲＡ２Ｃ（α２Ｃアドレナリン受容体）、ＴＡＣＲ１（タキキニン受容体１）、またはＨＴＲ２ｃ（５−ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体２Ｃ）などが挙げられる。
【０１７５】
神経発達に関連する配列の例としては、Ａ２ＢＰ１（アタキシン２結合タンパク質１）、ＡＡＤＡＴ（アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ）、ＡＡＮＡＴ（アリールアルキルアミン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ）、ＡＢＡＴ（４−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ）、ＡＢＣＡ１（ATP-binding cassette, sub-family A (ABC1), member 1）、またはＡＢＣＡ１３（ATP-binding cassette, sub-family A (ABC1), member 13）などが挙げられる。
【０１７６】
本システムで好適に処置できる状態のさらなる例を、以下から選択してもよい：アイカルディ＝ゴーティエ症候群、アレキサンダー病、アラン＝ハーンドン＝ダドリー症候群、ＰＯＬＧ関連障害、αマンノース蓄積症（ＩＩ型およびＩＩＩ型）、アルストレーム症候群、アンジェルマン症候群、血管拡張性失調症、神経セロイドリポフスチン症、βサラセミア、両側性視神経委縮症および（乳児性）視神経委縮症Ｉ型、網膜芽細胞腫（両側性）、カンバン病、脳眼顔骨症候群１（ＣＯＦＳ１）、脳腱黄色腫症、コルネリア・デ・ランゲ症候群、ＭＡＰＴ関連障害、遺伝性プリオン病、ドラベ症候群、早期発症型家族性アルツハイマー病、フリードライヒ運動失調症（ＦＲＤＡ）、Ｆｒｙｎｓ症候群、フコース蓄積症、福山型先天性筋ジストロフィー、ガラクトシアリドーシス、ゴーシェ病、有機酸血症、血球貪食性リンパ組織球症、ハッチソン＝ギルフォード早老症候群、ムコリピドーシスＩＩ、乳児性遊離シアル酸蓄積症、ＰＬＡ２Ｇ６関連神経変性、ジャーベル＝ランゲ・ニールセン症候群、接合部型先天表皮水疱症、ハンチントン病、クラッベ病（乳児性）、ミトコンドリアＤＮＡ関連リー症候群およびＮＡＲＰ、レッシュ＝ナイハン症候群、ＬＩＳ１関連滑脳症、ロー症候群、メープルシロップ尿症、ＭＥＣＰ２重複症候群、ＡＴＰ７Ａ関連銅輸送異常症、ＬＡＭＡ２関連筋ジストロフィー、アリールスルファーゼＡ欠損症、ムコ多糖症（Ｉ型、ＩＩ型またはＩＩＩ型）、ペルオキシソーム形成異常症、ツェルベガー症候群スペクトラム、鉄蓄積性神経変性症、酸性スフィンゴミエリナーゼ欠損症、ニーマン＝ピック病Ｃ型、グリシン脳症、ＡＲＸ関連障害、尿素サイクル異常症ｓＣＯＬ１Ａ１／２関連骨形成不全症、ミトコンドリアＤＮＡ枯渇症候群、ＰＬＰ１関連障害、ペリー症候群、フェラン＝マクダーミド症候群、（乳児性）糖原病ＩＩ型（ポンペ病）、ＭＡＰＴ関連障害、ＭＥＣＰ２関連障害、根性点状軟骨異形成症１型、ロバート症候群、サンドホフ病、シンドラー病１型、アデノシンデアミナーゼ欠損症、スミス＝レムリ＝オピッツ症候群、脊髄性筋委縮症、乳児発生型脊髄小脳失調症、ヘキソサミニダーゼＡ欠損症、タナトフォリック骨異形成症１型、コラーゲンＶＩ型関連障害、アッシャー症候群Ｉ型、先天性筋ジストロフィー、ウォルフ＝ヒルショルン症候群、リソソーム性酸性リパーゼ欠損症、および色素性乾皮症。
【０１７７】
本システムを使用して、任意の所定のポリヌクレオチド配列を標的化できることが明白に予期される。本システムを用いて効果的に処置される可能性がある、いくつかの状態または疾患の例を、上記の表に挙げた。これらの状態と一般に関連している遺伝子の例もまた、上記の表に挙げた。しかし、例示されている遺伝子は網羅的なものではない。
【０１７８】
上記では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムとの絡みで本発明を説明してきた。しかし本発明は、宿主細胞ゲノム内にある標的配列に２本鎖切断を導入するために、他のシステムを使用して、その後、相同組み換えによって所定の配列を挿入することをも予期している。上記と同様に、これらのシステムでも、外来性リコンビナーゼを共発現させて、相同組み換えの効率を上昇させている。
【０１７９】
いくつかの実施形態においては、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）による標的化を利用して、相同組み換え箇所に２本鎖切断を導入する。例えば、［Carroll et al., Genetics (2011) 188:773-782; Meyer et al., Proc. Nat’l. Acad. Sci. (2010) 107(34):15022-15026; Porteus MH, Carroll D (2005) Gene targeting using zinc finger nucleases. Nat Biotechnol 23:967-973; Geurts AM, et al. (2009) Knockout rats via embryo microinjection of zinc-finger nucleases. Science 325:433; Mashimo T, et al. (2010) Generation of knockout rats with X-linked severe combined immunodeficiency (X-SCID) using zinc-finger nucleases. PLoS One 5:e8870; Meng X, Noyes MB, Zhu LJ, Lawson ND,Wolfe SA (2008) Targeted gene inactivation in zebrafish using engineered zinc-finger nucleases. Nat Biotechnol 26:695-701; Rouet P, Smih F, Jasin M (1994) Expression of a site-specific endonuclease stimulates homologous recombination in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci USA 91:6064-6068; Hockemeyer D, et al. (2009) Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases. Nat Biotechnol 27:851-857; Porteus MH, Baltimore D (2003) Chimeric nucleases stimulate gene targeting in human cells. Science 300:763; Santiago Y, et al. (2008) Targeted gene knockout in mammalian cells by using engineered zinc-finger nucleases. Proc Natl Acad Sci USA 105:5809-5814; Urnov FD, et al. (2005) Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases. Nature 435:646-651］を参照（いずれの文献も、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）では、ジンクフィンガー型のＤＮＡ結合ドメインと、ヌクレアーゼドメインＦｏｋＩとが連結されている。そしてＺＦＮは、正確なゲノム位置において２本鎖切断（ＤＳＢ）を導入することができる。ＤＳＢは、エラーの発生しやすい非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路にに進みがちである。この経路はしばしば、切断箇所においてヌクレオチドを欠失させたり挿入したりする。本発明は、外来性リコンビナーゼを共発現させることによって、この問題を解決するものである。
【０１８０】
いくつかの実施形態においては、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥヌクレアーゼ）による標的を利用して、相同組み換え箇所に２本鎖切断を導入する。例えば、［Shin et al., Development (2014) 141:3807-3818; Boch et al. (2009) Science 326, 1509-1512; Moscou and Bogdanove (2009) Science 326, 1501］を参照（いずれの文献も、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。他のさらなる実施形態においては、メガヌクレアーゼによる標的化を利用する。例えば、［Mol Cell Biol. 1994 Dec;14(12):8096-106. Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease. Rouet P1, Smih F, Jasin M］を参照。
【０１８１】
したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、（i）１種類以上の遺伝子産物の発現を変化させる方法、および／または、（ii）ゲノム編集の方法を提供する。上記方法は、ゲノムを有している細胞に、（ａ）上記細胞の上記ゲノム内において上記遺伝子産物をコードする遺伝子内にある特定の標的配列に、２本鎖切断を導入する酵素をコードする核酸分子と；（ｂ）上記２本鎖切断箇所において相同組み換えによって上記ゲノム内に挿入される、所定の核酸配列をコードする核酸分子と；（３）リコンビナーゼをコードする核酸配列と；を導入する工程を含む。ここで、上記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の要素は、上記細胞内で発現している。そして、（i）上記宿主細胞のゲノム内の標的箇所に２本鎖切断が導入されるとともに、（ii）所定の核酸配列をコードする上記核酸分子が、上記２本鎖切断箇所において相同組み換えによって挿入され、これによって、１種類以上の上記遺伝子産物の発現を変化させる、および／または、当該所定の遺伝子産物をコードする上記遺伝子をゲノム編集する。さらに、上記遺伝子産物をコードする遺伝子内にある特定の標的配列に２本鎖切断を導入する上記酵素と、当該２本鎖切断箇所において上記ゲノム内に挿入される所定の核酸配列をコードする上記核酸分子とは、天然では一緒に生じないものである。いくつかの実施形態において、上記リコンビナーゼは細菌性リコンビナーゼである。いくつかの実施形態において、上記細菌性リコンビナーゼは、ＲｅｃＡリコンビナーゼおよびＵｖｓＸリコンビナーゼからなる群より選択される。いくつかの実施形態においては、２種類以上の遺伝子産物の発現を変化させる。いくつかの実施形態において、上記細胞の上記ゲノム内において上記遺伝子産物をコードする遺伝子内にある特定の標的配列に２本鎖切断を導入する上記酵素は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＮＦヌクレアーゼ）、および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥヌクレアーゼ）からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、上記上記Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、上記に詳述したＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの一部である。上記システムは、好ましくは、上記標的配列とハイブリダイズするＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列をさらに含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、上記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の要素は、同じまたは異なる調節要素と作動可能に関連付けられている。いくつかの実施形態において、上記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の要素は、ｍＲＮＡ分子にコードされている。いくつかの実施形態において、上記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の要素は、同じまたは異なる発現ベクター上に位置している。いくつかの実施形態において、上記発現ベクターは、１つ以上のウイルス性発現ベクターである。いくつかの実施形態において、上記１つ以上のウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、および単純ヘルペスウイルスベクターからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、上記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の要素をコードする核酸配列は、真核細胞内での発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、上記細胞は真核細胞である。いくつかの実施形態において、上記真核細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、上記哺乳動物細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態においては、１種類以上の遺伝子産物の発現を増加させる。いくつかの実施形態においては、１種類以上の遺伝子産物の発現を減少させる。
【０１８２】
さらなる実施形態において、本発明は、（i）遺伝子産物の発現を変化させるための、および／または、（ii）ゲノム編集のための、改変された非天然のシステムを提供する。上記システムは、（ａ）上記細胞の上記ゲノム内において上記遺伝子産物をコードする遺伝子内にある特定の標的配列に、２本鎖切断を導入する酵素をコードする核酸分子と；（ｂ）上記２本鎖切断箇所において上記ゲノム内に挿入される、所定の核酸配列をコードする核酸分子と；（３）リコンビナーゼをコードする核酸配列と；を有する１つ以上の核酸配列を含んでいる。ここで、上記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の要素は、細胞内で発現している。そして、（i）上記細胞のゲノム内の標的箇所に２本鎖切断が導入されるとともに、（ii）所定の核酸配列をコードする上記核酸分子が、上記２本鎖切断箇所において相同組み換えによって挿入され、これによって、１種類以上の上記遺伝子産物の発現を変化させる、および／または、当該所定の遺伝子産物をコードする上記遺伝子をゲノム編集する。さらに、上記遺伝子産物をコードする遺伝子内にある特定の標的配列に２本鎖切断を導入する上記酵素と、当該２本鎖切断箇所において上記ゲノム内に挿入される所定の核酸配列をコードする上記核酸分子とは、天然では一緒に生じないものである。いくつかの実施形態において、上記リコンビナーゼは細菌性リコンビナーゼである。いくつかの実施形態において、上記細菌性リコンビナーゼは、ＲｅｃＡリコンビナーゼおよびＵｖｓＸリコンビナーゼからなる群より選択される。いくつかの実施形態においては、２種類以上の遺伝子産物の発現を変化させる。いくつかの実施形態において、上記細胞の上記ゲノム内において上記遺伝子産物をコードする遺伝子内にある特定の標的配列に２本鎖切断を導入する上記酵素は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＮＦヌクレアーゼ）、および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥヌクレアーゼ）からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、上記上記Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、上記に詳述したＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの一部である。上記システムは、好ましくは、上記標的配列とハイブリダイズするＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列をさらに含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、上記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の要素は、同じまたは異なる調節要素と作動可能に関連付けられている。いくつかの実施形態において、上記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の要素は、ｍＲＮＡ分子にコードされている。いくつかの実施形態において、上記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の要素は、同じまたは異なる発現ベクター上に位置している。いくつかの実施形態において、上記発現ベクターは、１つ以上のウイルス性発現ベクターである。いくつかの実施形態において、上記１つ以上のウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、および単純ヘルペスウイルスベクターからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、上記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の要素をコードする核酸配列は、真核細胞内での発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、上記細胞は真核細胞である。いくつかの実施形態において、上記真核細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、上記哺乳動物細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態においては、１種類以上の遺伝子産物の発現を増加させる。いくつかの実施形態においては、１種類以上の遺伝子産物の発現を減少させる。いくつかの実施形態では、上記２本鎖切断箇所において相同組み換えによって上記ゲノム内に挿入される所定の核酸配列をコードする上記核酸分子の長さは、２５０塩基以上、５００塩基以上または１０００塩基以上である。
【０１８３】
いくつかの実施形態において、本発明は、上述のシステムを含んでいる細胞を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、（i）標的細胞における遺伝子発現を変化させることによって、または（ii）標的細胞のゲノムを編集することによって、疾患を処置するための、上記システムの使用を提供する。
【実施例】
【０１８４】
〔実施例１〕
近年では、Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲを用いて、ＨＤＲ経路による挿入を発生させることができるようになった。通常、その効率は５％以下までに限られており、ある種の細胞においては、効率が事実上は０％となってしまっている。これは、（i）外来性ＤＮＡと組み合わせた場合に、哺乳動物性リコンビナーゼが効果的でないことと、（ii）ある種の細胞ではリコンビナーゼが全くコードされておらず、ＨＤＲが実質的に不可能となっていることと、が大きな原因である。ここで、Ｃａｓ９およびＨＲ基材に加えて、ＲｅｃＡリコンビナーゼまたはＵｖｓＸリコンビナーゼをin transで補うと、ＨＤＲレベルの上昇が観察された。この発見により、新規かつ改造された治療法の開発が可能となるのである。
【０１８５】
部位特異的ヌクレアーゼ（Ｃａｓ９および適切なｇＲＮＡ）を設計して、ヒトゲノムのＥＭＸ１座位を標的化させ、２本鎖ＤＮＡ切断の形成を触媒させた（図２Ａ）。さらに、５’領域および３’領域がＥＭＸ１ゲノム座位と相同的になっている、オリゴヌクレオチドも設計した。５’相動性アームと３’相動性アームの間には、ＢａｍＨＩ部位を存在させる。部位特異的ヌクレアーゼおよびオリゴヌクレオチド基材をＨｅｌａ細胞内にトランスフェクションさせた後、ＥＭＸ１領域をＰＣＲで増幅させ、さらにＢａｍＨＩで消化することによってＨＤＲの発生を検出した。ＮＨＥＪ産物および非切断産物は、ＢａｍＨＩによって切断されないが、ＨＤＲ産物はＢａｍＨＩによる消化で切断される。
【０１８６】
空ベクター、ＮＬＳ−ＲｅｃＡまたはＮＬＳ−ＵｖｓＸ（ＮＬＳとは、ＳＶ４０のラージＴ抗原由来の核局在化シグナルを表す）のいずれかを発現しているＨｅｌａ細胞を、６ウェルプレートに播種した。播種はトランスフェクションの２４時間前に行い、２ｍＬの完全ＤＭＥＭ中に４×１０５細胞／ウェルの密度とした。トランスフェクションの時点において、細胞は９０％コンフルエントであった。（i）２５００ｎｇのプラスミドＤＮＡと、（ii）ｓｓオリゴヌクレオチドであるＥｍｘ１−１  ＵまたはＥｍｘ１−１  Ｌ（下記；０ｐｍｏｌまたは１０００ｐｍｏｌのいずれか）と、を含んでいる反応液（２５０μＬ）を、２５０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ  Ｉ血清低減培地（Cat.no. 31985062, ThermoScientific, Waltham, MA, USA）で稀釈した。さらに、１０μＬのLIPOFECTAMINE 2000トランスフェクション試薬（Cat.no. 11668500, ThermoScientific, Waltham, MA, USA）を、２５０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ  Ｉ血清低減培地（Cat.no. 31985062, ThermoScientific, Waltham, MA, USA）で稀釈し、室温にて５分間インキュベートして、複合体を形成させた。インキュベートの後、２つの混合物を一緒にし、穏やかに混合した。室温にて２０分間インキュベートした後、５００μＬの混合物を各ウェルに注入した。プレートを緩やかに固定し、３７℃にて４８時間インキュベートした。４８時間後、トランスフェクション細胞からトランスフェクションＤＮＡを単離した。１５０ｎｇのゲノムＤＮＡ、５００μＭ  ｄＮＴＰ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．５％ジメチルスルホキシド、２５ｐｍｏｌの各プライマー、および１ユニットのPhusionHFＤＮＡポリメラーゼ、を含んでいるＰＣＲ反応液（５０μＬ）を加え、サーモサーキュラー（TC512, Keison Products, Grants Pass, Oregon, USA）にかけた。条件は次の通りである：９８℃にて１２０秒間→９８℃にて５秒間、６０．６℃にて１０秒間、７２℃にて２０秒間を４０サイクル→最後の延長として７２℃にて４２０秒間。
【０１８７】
QIAquick PCR Purification Kit（ID 28104, Qiagen, Hilden, Germany）を用いてＰＣＲ反応物を精製し、NanoDrop（ND-2000, ThermoScientific, Waltham, MA, USA）を用いて濃度を測定した。精製したＰＣＲ反応物のＤＮＡ（５００ｎｇ）、ＢａｍＨＩ−ＨＦ（１０ユニット）およびCutSmart Buffer（１×）を含んでいる制限消化液（５０μＬ）を、３７℃にて２時間インキュベートした。８％ポリアクリルアミドＴＢＥゲル（８％ポリアクリルアミド、１５％グリセロール、１×ＴＢＥ、１０％ＡＰＳ、ＴＥＭＥＤ）上で全反応物を分離させ、２５Ｖにて一晩電気泳動させた。翌日、２００ｍＬの緩衝液（８９ｍＭ  Ｔｒｉｓホウ酸塩、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．２〜８．４）に０．５μｇ／ｍＬの臭化エチジウム添加したもので、ゲルを染色した。Alphalmager HP（Cat.no. 92-13824-00, ProteinSimple, San Jose, Ca, USA）を使って、画像を得た。マーカーと比較した切断バンドおよびＰＣＲアンプリコンの強度を、ImageJによって測定することで、切断の頻度を測定した。
【０１８８】
HR_Oligo_Emx1-1U-BamHI（配列番号５）
ATTGCCACGA AGCAGGCCAA TGGGGAGGAC
ATCGATGTCA CCTCCAATGA CTAGGGATCC
GGGCAACCAC AAACCCACGA GGGCAGAGTG
CTGCTTGCTG CTGGCCAGGC CCCTGCGTGG
HR_Oligo_Emx1-1L-BamHI（配列番号６）
CCACGCAGGG GCCTGGCCAG CAGCAAGCAG
CACTCTGCCC TCGTGGGTTT GTGGTTGCCC
GGATCCCTAG TCATTGGAGG TGACATCGAT
GTCCTCCCCA TTGGCCTGCT TCGTGGCAAT
Emx1-1_Fwd2
CCATCCCCTTCTGTGAATGT（配列番号７）
Emx1-1_Rev2
GGAGATTGGAGACACGGAGA（配列番号８）。
【０１８９】
部位特異的ヌクレアーゼおよびオリゴヌクレオチド基材をトランスフェクションさせると（ＷＴ）、トランスフェクション後の細胞からは０〜５．８４％のＨＤＲ産物が得られた（図２Ｂ、２Ｃ）。部位特異的ヌクレアーゼおよびオリゴヌクレオチドに加えて、ＲｅｃＡまたはＵｖｓＸを共発現させると、ＨＤＲ産物はそれぞれ、８．２４〜１６．３％、１２．７〜３３．８８％となった（図２Ｂ、２Ｃ）。これらの結果が示唆するところによると、ＲｅｃＡまたはＵｖｓＸを共発現させることにより、ＨＤＲは実質的に増加する。ＨＤＲを増加させるには複数の方法があるが、しかし、上記の結果は本システムが他の方法よりも優れていることを示している。他の方法はＮＨＥＪを阻害するものであったが、本システムはＨＤＲ経路を直接に標的とするものである。ＮＨＥＪを阻害する方法とは対照的に、ＮＨＥＪ阻害剤と組み合わせて用いることができる点において、本システムは特有の存在である。本システムをＮＨＥＪ阻害剤と組み合わせて用いた場合、より大くＨＤＲを増加させると考えられる。上記に示したＨＤＲの増加は、近い将来において、ヒトの遺伝子治療に対する潜在的な有効性が本システムにはあることを示唆している。
【図１】
2020511931.tif 000036
【図２】
2020511931.tif 000037
【配列表】
2020511931000001.app
【国際調査報告】
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