(57)【要約】  ウイルスＤＮＡを標的にする遺伝子エディタ、ウイルスＲＮＡを標的にする遺伝子エディタ、及びそれらの組み合わせから選択される２つ以上の遺伝子エディタをコードする単離核酸をコードするベクターを含む、溶原性ウイルスを処置するための組成物。ウイルスＤＮＡを標的にする少なくとも１つの遺伝子エディタをコードする単離核酸をコードするベクター及びウイルスＲＮＡ標的化組成物を含む、溶菌性ウイルスを処置するための組成物。ウイルスＲＮＡを標的にする２つ以上の遺伝子エディタをコードする単離核酸をコードするベクターを含む、溶原性及び溶菌性ウイルスの双方を処置するための組成物。溶菌性ウイルスを処置するための組成物。上記組成物をウイルスを有する個体に投与し、このウイルスを不活性化することにより、溶原性ウイルス又は溶菌性ウイルスを処置する方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶原性ウイルスを処置するための組成物において、ウイルスＤＮＡを標的にする遺伝子エディタ、ウイルスＲＮＡを標的にする遺伝子エディタ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される２つ以上の遺伝子エディタをコードする単離核酸をコードするベクターを含むことを特徴とする組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物において、ウイルスＤＮＡを標的にする前記遺伝子エディタが、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ及びアルゴノートエンドヌクレアーゼｇＤＮＡからなる群から選択されることを特徴とする、組成物。
【請求項３】
請求項２に記載の組成物において、前記ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９  ｇＲＮＡ、Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ、Ｃ２ｃ１  ｇＲＮＡ、Ｃ２ｃ３  ｇＲＮＡ、ＴｅｖＣａｓ９  ｇＲＮＡ、古細菌Ｃａｓ９  ｇＲＮＡ、ＣａｓＹ．１  ｇＲＮＡ、ＣａｓＹ．２  ｇＲＮＡ、ＣａｓＹ．３  ｇＲＮＡ、ＣａｓＹ．４  ｇＲＮＡ、ＣａｓＹ．５  ｇＲＮＡ、ＣａｓＹ．６  ｇＲＮＡ、及びＣａｓＸ  ｇＲＮＡからなる群から選択されることを特徴とする組成物。
【請求項４】
請求項１に記載の組成物において、ウイルスＲＮＡを標的にする前記遺伝子エディタが、Ｃ２ｃ２及びリボヌクレアーゼＰ  ＲＮＡからなる群から選択されることを特徴とする組成物。
【請求項５】
請求項１に記載の組成物において、前記ウイルスＤＮＡ又はＲＮＡの複製決定セグメントを除去することを特徴とする組成物。
【請求項６】
請求項１に記載の組成物において、前記溶原性ウイルスの全ウイルスゲノムを宿主細胞から切除することを特徴とする組成物。
【請求項７】
請求項１に記載の組成物において、前記溶原性ウイルスが、Ａ型肝炎（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ａ）、Ｂ型肝炎（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ）、Ｄ型肝炎（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｄ）、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）、エプスタイン・バーウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ）、水痘帯状疱疹ウイルス（Ｖａｒｉｃｅｌｌａ  Ｚｏｓｔｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、ＨＩＶ１、ＨＩＶ２、ＨＴＬＶ１、ＨＴＬＶ２、ラウス肉腫ウイルス（Ｒｏｕｓ  Ｓａｒｃｏｍａ  ｖｉｒｕｓ）、ＨＰＶウイルス、黄熱病（ｙｅｌｌｏｗ  ｆｅｖｅｒ）、ジカ（ｚｉｋａ）、デング（ｄｅｎｇｕｅ）、ウエストナイル（Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ）、日本脳炎（Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）、リッサウイルス（ｌｙｓｓａ  ｖｉｒｕｓ）、ベジクロウイルス（ｖｅｓｉｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）、サイトハブドウイルス（ｃｙｔｏｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ）、ハンターンウイルス（Ｈａｎｔａａｎ  ｖｉｒｕｓ）、リフトバレーウイルス（Ｒｉｆｔ  Ｖａｌｌｅｙ  ｖｉｒｕｓ）、ブニヤムウェラウイルス（Ｂｕｎｙａｍｗｅｒａ  ｖｉｒｕｓ）、ラッサウイルス（Ｌａｓｓａ  ｖｉｒｕｓ）、フニンウイルス（Ｊｕｎｉｎ  ｖｉｒｕｓ）、マチュポウイルス（Ｍａｃｈｕｐｏ  ｖｉｒｕｓ）、サビアウイルス（Ｓａｂｉａ  ｖｉｒｕｓ）、タカリベウイルス（Ｔａｃａｒｉｂｅ  ｖｉｒｕｓ）、フレクサルウイルス（Ｆｌｅｘａｌ  ｖｉｒｕｓ）、ホワイトウォーターアロヨウイルス（Ｗｈｉｔｅｗａｔｅｒ  Ａｒｒｏｙｏ  ｖｉｒｕｓ）、エボラ（ｅｂｏｌａ）、マールブルグウイルス（Ｍａｒｂｕｒｇ  ｖｉｒｕｓ）、ＪＣウイルス（ＪＣ  ｖｉｒｕｓ）、及びＢＫウイルス（ＢＫ  ｖｉｒｕｓ）からなる群から選択されることを特徴とする組成物。
【請求項８】
溶菌性ウイルスを処置するための組成物において、ウイルスＤＮＡを標的にする少なくとも１つの遺伝子エディタをコードする単離核酸をコードするベクター及びウイルスＲＮＡ標的化組成物を含むことを特徴とする組成物。
【請求項９】
請求項８に記載の組成物において、ウイルスＤＮＡを標的にする前記遺伝子エディタが、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ及びアルゴノートエンドヌクレアーゼｇＤＮＡからなる群から選択されることを特徴とする組成物。
【請求項１０】
請求項９に記載の組成物において、前記ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９  ｇＲＮＡ、Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ、Ｃ２ｃ１  ｇＲＮＡ、Ｃ２ｃ３  ｇＲＮＡ、ＴｅｖＣａｓ９  ｇＲＮＡ、古細菌Ｃａｓ９  ｇＲＮＡ、ＣａｓＹ．１  ｇＲＮＡ、ＣａｓＹ．２  ｇＲＮＡ、ＣａｓＹ．３  ｇＲＮＡ、ＣａｓＹ．４  ｇＲＮＡ、ＣａｓＹ．５  ｇＲＮＡ、ＣａｓＹ．６  ｇＲＮＡ、及びＣａｓＸ  ｇＲＮＡからなる群から選択されることを特徴とする組成物。
【請求項１１】
請求項８に記載の組成物において、前記ウイルスＲＮＡ標的化組成物が、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ、アルゴノートエンドヌクレアーゼｇＤＮＡ、Ｃ２ｃ２、及びリボヌクレアーゼＰ  ＲＮＡからなる群から選択されることを特徴とする組成物。
【請求項１２】
請求項８に記載の組成物において、前記ウイルスＤＮＡ又はＲＮＡの複製決定セグメントを除去することを特徴とする組成物。
【請求項１３】
請求項８に記載の組成物において、前記溶菌性ウイルスの全ウイルスゲノムを宿主細胞から切除することを特徴とする組成物。
【請求項１４】
請求項８に記載の組成物において、前記溶菌性ウイルスが、Ａ型肝炎（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ａ）、Ｃ型肝炎（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ）、Ｄ型肝炎（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｄ）、コクサッキーウイルス（ｃｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓ）、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）、エプスタイン・バーウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ｖａｒｉｃｅｌｌａ  ｚｏｓｔｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、ＨＩＶ１、ＨＩＶ２、ＨＴＬＶ１、ＨＴＬＶ２、ラウス肉腫ウイルス（Ｒｏｕｓ  Ｓａｒｃｏｍａ  ｖｉｒｕｓ）、ロタ（ｒｏｔａ）、セアドーンウイルス（ｓｅａｄｏｒｎｖｉｒｕｓ）、コルチウイルス（ｃｏｌｔｉｖｉｒｕｓｓ）、ＪＣウイルス（ＪＣ  ｖｉｒｕｓ）、及びＢＫウイルス（ＢＫ  ｖｉｒｕｓ）からなる群から選択されることを特徴とする組成物。
【請求項１５】
溶原性及び溶菌性ウイルスの双方を処置するための組成物において、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ、アルゴノートエンドヌクレアーゼｇＤＮＡ、Ｃ２ｃ２、リボヌクレアーゼＰ  ＲＮＡ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、ウイルスＲＮＡを標的にする２つ以上の遺伝子エディタをコードする単離核酸をコードするベクターを含むことを特徴とする組成物。
【請求項１６】
請求項１５に記載の組成物において、前記ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９  ｇＲＮＡ、Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ、Ｃ２ｃ１  ｇＲＮＡ、Ｃ２ｃ３  ｇＲＮＡ、ＴｅｖＣａｓ９  ｇＲＮＡ、古細菌Ｃａｓ９  ｇＲＮＡ、ＣａｓＹ．１  ｇＲＮＡ、ＣａｓＹ．２  ｇＲＮＡ、ＣａｓＹ．３  ｇＲＮＡ、ＣａｓＹ．４  ｇＲＮＡ、ＣａｓＹ．５  ｇＲＮＡ、ＣａｓＹ．６  ｇＲＮＡ、及びＣａｓＸ  ｇＲＮＡからなる群から選択されることを特徴とする組成物。
【請求項１７】
請求項１５に記載の組成物において、前記ウイルスＲＮＡの複製決定セグメントを除去することを特徴とする組成物。
【請求項１８】
請求項１５に記載の組成物において、前記溶原性及び溶菌性ウイルスの全ウイルスゲノムを宿主細胞から切除することを特徴とする組成物。
【請求項１９】
請求項１５に記載の組成物において、前記溶原性及び溶菌性ウイルスが、Ａ型肝炎（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ａ）、Ｃ型肝炎（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ）、Ｄ型肝炎（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｄ）、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）、エプスタイン・バーウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ｖａｒｉｃｅｌｌａ  ｚｏｓｔｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、ＨＩＶ１、ＨＩＶ２、ＨＴＬＶ１、ＨＴＬＶ２、ラウス肉腫ウイルス（Ｒｏｕｓ  Ｓａｒｃｏｍａ  ｖｉｒｕｓ）、ＪＣウイルス（ＪＣ  ｖｉｒｕｓ）、及びＢＫウイルス（ＢＫ  ｖｉｒｕｓ）からなる群から選択されることを特徴とする組成物。
【請求項２０】
溶菌性ウイルスを処置するための組成物において、ウイルスＲＮＡを標的にする２つ以上の遺伝子エディタをコードする単離核酸をコードするベクター及びウイルスＲＮＡ標的化組成物を含むことを特徴とする組成物。
【請求項２１】
請求項２０に記載の組成物において、ウイルスＲＮＡを標的にする前記遺伝子エディタが、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ及びアルゴノートエンドヌクレアーゼｇＤＮＡからなる群から選択されることを特徴とする組成物。
【請求項２２】
請求項２１に記載の組成物において、前記ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９  ｇＲＮＡ、Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ、Ｃ２ｃ１  ｇＲＮＡ、Ｃ２ｃ３  ｇＲＮＡ、ＴｅｖＣａｓ９  ｇＲＮＡ、古細菌Ｃａｓ９  ｇＲＮＡ、ＣａｓＹ．１  ｇＲＮＡ、ＣａｓＹ．２  ｇＲＮＡ、ＣａｓＹ．３  ｇＲＮＡ、ＣａｓＹ．４  ｇＲＮＡ、ＣａｓＹ．５  ｇＲＮＡ、ＣａｓＹ．６  ｇＲＮＡ、及びＣａｓＸ  ｇＲＮＡからなる群から選択されることを特徴とする組成物。
【請求項２３】
請求項２０に記載の組成物において、前記ウイルスＲＮＡ標的化組成物が、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ、Ｃ２ｃ２、及びリボヌクレアーゼＰ  ＲＮＡからなる群から選択されることを特徴とする組成物。
【請求項２４】
請求項２０に記載の組成物において、前記ウイルスＲＮＡの複製決定セグメントを除去することを特徴とする組成物。
【請求項２５】
請求項２０に記載の組成物において、前記溶菌性ウイルスの全ウイルスゲノムを宿主細胞から切除することを特徴とする組成物。
【請求項２６】
請求項２０に記載の組成物において、前記溶菌性ウイルスが、Ａ型肝炎（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ａ）、Ｃ型肝炎（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ）、Ｄ型肝炎（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｄ）、コクサッキーウイルス（ｃｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓ）、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）、エプスタイン・バーウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ｖａｒｉｃｅｌｌａ  ｚｏｓｔｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、ＨＩＶ１、ＨＩＶ２、ＨＴＬＶ１、ＨＴＬＶ２、ラウス肉腫ウイルス（Ｒｏｕｓ  Ｓａｒｃｏｍａ  ｖｉｒｕｓ）、ロタ（ｒｏｔａ）、セアドーンウイルス（ｓｅａｄｏｒｎｖｉｒｕｓ）、コルチウイルス（ｃｏｌｔｉｖｉｒｕｓｓ）、ＪＣウイルス（ＪＣ  ｖｉｒｕｓ）、及びＢＫウイルス（ＢＫ  ｖｉｒｕｓ）からなる群から選択されることを特徴とする組成物。
【請求項２７】
溶原性ウイルスを処置する方法において、
ウイルスＤＮＡを標的にする遺伝子エディタ、ウイルスＲＮＡを標的にする遺伝子エディタ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される２つ以上の遺伝子エディタをコードする単離核酸をコードするベクターを含む組成物を、溶原性ウイルスを有する個体に投与するステップと；
前記溶原性ウイルスを不活性化するステップと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法において、ウイルスＤＮＡを標的にする前記遺伝子エディタが、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ及びアルゴノートエンドヌクレアーゼｇＤＮＡからなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項２９】
請求項２８に記載の方法において、前記ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９  ｇＲＮＡ、Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ、Ｃ２ｃ１  ｇＲＮＡ、Ｃ２ｃ３  ｇＲＮＡ、ＴｅｖＣａｓ９  ｇＲＮＡ、古細菌Ｃａｓ９  ｇＲＮＡ、ＣａｓＹ．１  ｇＲＮＡ、ＣａｓＹ．２  ｇＲＮＡ、ＣａｓＹ．３  ｇＲＮＡ、ＣａｓＹ．４  ｇＲＮＡ、ＣａｓＹ．５  ｇＲＮＡ、ＣａｓＹ．６  ｇＲＮＡ、及びＣａｓＸ  ｇＲＮＡからなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項３０】
請求項２７に記載の方法において、ウイルスＲＮＡを標的にする前記遺伝子エディタが、Ｃ２ｃ２及びリボヌクレアーゼＰ  ＲＮＡからなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項３１】
請求項２７に記載の方法において、前記不活性化するステップが、前記ウイルスＤＮＡ又はＲＮＡの複製決定セグメントを除去するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項３２】
請求項２７に記載の方法において、前記不活性化するステップが、前記溶原性ウイルスの全ウイルスゲノムを宿主細胞から切除するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項３３】
請求項２７に記載の方法において、前記溶原性ウイルスが、Ａ型肝炎（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ａ）、Ｂ型肝炎（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ）、Ｄ型肝炎（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｄ）、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）、エプスタイン・バーウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ）、水痘帯状疱疹ウイルス（Ｖａｒｉｃｅｌｌａ  Ｚｏｓｔｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、ＨＩＶ１、ＨＩＶ２、ＨＴＬＶ１、ＨＴＬＶ２、ラウス肉腫ウイルス（Ｒｏｕｓ  Ｓａｒｃｏｍａ  ｖｉｒｕｓ）、ＨＰＶウイルス、黄熱病（ｙｅｌｌｏｗ  ｆｅｖｅｒ）、ジカ（ｚｉｋａ）、デング（ｄｅｎｇｕｅ）、ウエストナイル（Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ）、日本脳炎（Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）、リッサウイルス（ｌｙｓｓａ  ｖｉｒｕｓ）、ベジクロウイルス（ｖｅｓｉｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）、サイトハブドウイルス（ｃｙｔｏｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ）、ハンターンウイルス（Ｈａｎｔａａｎ  ｖｉｒｕｓ）、リフトバレーウイルス（Ｒｉｆｔ  Ｖａｌｌｅｙ  ｖｉｒｕｓ）、ブニヤムウェラウイルス（Ｂｕｎｙａｍｗｅｒａ  ｖｉｒｕｓ）、ラッサウイルス（Ｌａｓｓａ  ｖｉｒｕｓ）、フニンウイルス（Ｊｕｎｉｎ  ｖｉｒｕｓ）、マチュポウイルス（Ｍａｃｈｕｐｏ  ｖｉｒｕｓ）、サビアウイルス（Ｓａｂｉａ  ｖｉｒｕｓ）、タカリベウイルス（Ｔａｃａｒｉｂｅ  ｖｉｒｕｓ）、フレクサルウイルス（Ｆｌｅｘａｌ  ｖｉｒｕｓ）、ホワイトウォーターアロヨウイルス（Ｗｈｉｔｅｗａｔｅｒ  Ａｒｒｏｙｏ  ｖｉｒｕｓ）、エボラ（ｅｂｏｌａ）、マールブルグウイルス（Ｍａｒｂｕｒｇ  ｖｉｒｕｓ）、ＪＣウイルス（ＪＣ  ｖｉｒｕｓ）、及びＢＫウイルス（ＢＫ  ｖｉｒｕｓ）からなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項３４】
溶菌性ウイルスを処置するための方法において、
ウイルスＤＮＡを標的にする少なくとも１つの遺伝子エディタをコードする単離核酸をコードするベクター及びウイルスＲＮＡ標的化組成物を含む組成物を、溶菌性ウイルスを有する個体に投与するステップと；
前記溶菌性ウイルスを不活性化するステップと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項３５】
請求項３４に記載の方法において、ウイルスＤＮＡを標的にする前記遺伝子エディタが、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ及びアルゴノートエンドヌクレアーゼｇＤＮＡからなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項３６】
請求項３５に記載の方法において、前記ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９  ｇＲＮＡ、Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ、Ｃ２ｃ１  ｇＲＮＡ、Ｃ２ｃ３  ｇＲＮＡ、ＴｅｖＣａｓ９  ｇＲＮＡ、古細菌Ｃａｓ９  ｇＲＮＡ、ＣａｓＹ．１  ｇＲＮＡ、ＣａｓＹ．２  ｇＲＮＡ、ＣａｓＹ．３  ｇＲＮＡ、ＣａｓＹ．４  ｇＲＮＡ、ＣａｓＹ．５  ｇＲＮＡ、ＣａｓＹ．６  ｇＲＮＡ、及びＣａｓＸ  ｇＲＮＡからなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項３７】
請求項３４に記載の方法において、前記ウイルスＲＮＡ標的化組成物が、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ、アルゴノートエンドヌクレアーゼｇＤＮＡ、Ｃ２ｃ２、及びリボヌクレアーゼＰ  ＲＮＡからなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項３８】
請求項３４に記載の方法において、前記不活性化するステップが、前記ウイルスＤＮＡ又はＲＮＡの複製決定セグメントを除去するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項３９】
請求項３４に記載の方法において、前記不活性化するステップが、前記溶菌性ウイルスの全ウイルスゲノムを宿主細胞から切除するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項４０】
請求項３４に記載の方法において、前記溶菌性ウイルスが、Ａ型肝炎（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ａ）、Ｃ型肝炎（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ）、Ｄ型肝炎（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｄ）、コクサッキーウイルス（ｃｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓ）、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）、エプスタイン・バーウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ｖａｒｉｃｅｌｌａ  ｚｏｓｔｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、ＨＩＶ１、ＨＩＶ２、ＨＴＬＶ１、ＨＴＬＶ２、ラウス肉腫ウイルス（Ｒｏｕｓ  Ｓａｒｃｏｍａ  ｖｉｒｕｓ）、ロタ（ｒｏｔａ）、セアドーンウイルス（ｓｅａｄｏｒｎｖｉｒｕｓ）、コルチウイルス（ｃｏｌｔｉｖｉｒｕｓｓ）、ＪＣウイルス（ＪＣ  ｖｉｒｕｓ）、及びＢＫウイルス（ＢＫ  ｖｉｒｕｓ）からなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項４１】
溶原性及び溶菌性ウイルスの双方を処置するための方法において、
ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ、アルゴノートエンドヌクレアーゼｇＤＮＡ、Ｃ２ｃ２、リボヌクレアーゼＰ  ＲＮＡ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、ウイルスＲＮＡを標的にする２つ以上の遺伝子エディタをコードする単離核酸をコードするベクターを含む組成物を、溶原性ウイルス及び溶菌性ウイルスを有する個体に投与するステップと；
前記溶原性ウイルス及び溶菌性ウイルスを不活性化するステップと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項４２】
請求項４１に記載の方法において、前記ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９  ｇＲＮＡ、Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ、Ｃ２ｃ１  ｇＲＮＡ、Ｃ２ｃ３  ｇＲＮＡ、ＴｅｖＣａｓ９  ｇＲＮＡ、古細菌Ｃａｓ９  ｇＲＮＡ、ＣａｓＹ．１  ｇＲＮＡ、ＣａｓＹ．２  ｇＲＮＡ、ＣａｓＹ．３  ｇＲＮＡ、ＣａｓＹ．４  ｇＲＮＡ、ＣａｓＹ．５  ｇＲＮＡ、ＣａｓＹ．６  ｇＲＮＡ、及びＣａｓＸ  ｇＲＮＡからなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項４３】
請求項４１に記載の方法において、前記不活性化するステップが、前記ウイルスＲＮＡの複製決定セグメントを除去するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項４４】
請求項４１に記載の方法において、前記不活性化するステップが、前記溶原性及び溶菌性ウイルスの全ウイルスゲノムを宿主細胞から切除するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項４５】
請求項４１に記載の方法において、前記溶原性及び溶菌性ウイルスが、Ａ型肝炎（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ａ）、Ｃ型肝炎（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ）、Ｄ型肝炎（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｄ）、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）、エプスタイン・バーウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ｖａｒｉｃｅｌｌａ  ｚｏｓｔｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、ＨＩＶ１、ＨＩＶ２、ＨＴＬＶ１、ＨＴＬＶ２、ラウス肉腫ウイルス（Ｒｏｕｓ  Ｓａｒｃｏｍａ  ｖｉｒｕｓ）、ＪＣウイルス（ＪＣ  ｖｉｒｕｓ）、及びＢＫウイルス（ＢＫ  ｖｉｒｕｓ）からなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項４６】
溶菌性ウイルスを処置するための方法において、
ウイルスＲＮＡを標的にする２つ以上の遺伝子エディタをコードする単離核酸をコードするベクター及びウイルスＲＮＡ標的化組成物を含む組成物を、溶菌性ウイルスを有する個体に投与するステップと；
前記溶菌性ウイルスを不活性化するステップと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項４７】
請求項４６に記載の方法において、ウイルスＲＮＡを標的にする前記遺伝子エディタが、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ及びアルゴノートエンドヌクレアーゼｇＤＮＡからなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項４８】
請求項４７に記載の方法において、前記ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９  ｇＲＮＡ、Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ、Ｃ２ｃ１  ｇＲＮＡ、Ｃ２ｃ３  ｇＲＮＡ、ＴｅｖＣａｓ９  ｇＲＮＡ、古細菌Ｃａｓ９  ｇＲＮＡ、ＣａｓＹ．１  ｇＲＮＡ、ＣａｓＹ．２  ｇＲＮＡ、ＣａｓＹ．３  ｇＲＮＡ、ＣａｓＹ．４  ｇＲＮＡ、ＣａｓＹ．５  ｇＲＮＡ、ＣａｓＹ．６  ｇＲＮＡ、及びＣａｓＸ  ｇＲＮＡからなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項４９】
請求項４６に記載の方法において、前記ウイルスＲＮＡ標的化組成物が、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ、Ｃ２ｃ２、及びリボヌクレアーゼＰ  ＲＮＡからなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項５０】
請求項４６に記載の方法において、前記不活性化するステップが、前記ウイルスＲＮＡの複製決定セグメントを除去するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項５１】
請求項４６に記載の方法において、前記不活性化するステップが、前記溶菌性ウイルスの全ウイルスゲノムを宿主細胞から切除するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項５２】
請求項４６に記載の方法において、前記溶菌性ウイルスが、Ａ型肝炎（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ａ）、Ｃ型肝炎（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ）、Ｄ型肝炎（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｄ）、コクサッキーウイルス（ｃｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓ）、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）、エプスタイン・バーウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ｖａｒｉｃｅｌｌａ  ｚｏｓｔｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、ＨＩＶ１、ＨＩＶ２、ＨＴＬＶ１、ＨＴＬＶ２、ラウス肉腫ウイルス（Ｒｏｕｓ  Ｓａｒｃｏｍａ  ｖｉｒｕｓ）、ロタ（ｒｏｔａ）、セアドーンウイルス（ｓｅａｄｏｒｎｖｉｒｕｓ）、コルチウイルス（ｃｏｌｔｉｖｉｒｕｓｓ）、ＪＣウイルス（ＪＣ  ｖｉｒｕｓ）、及びＢＫウイルス（ＢＫ  ｖｉｒｕｓ）からなる群から選択されることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子治療薬を送達するための組成物及び方法に関する。より詳細には、本発明は、感染宿主細胞からウイルスを切除し、且つウイルスを不活性化するための組成物及び治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子編集は、ヌクレアーゼを用いることにより、ＤＮＡ又はＲＮＡの、生物のゲノムにおける挿入、欠失、又は置換を可能にする。現在用いられるヌクレアーゼには、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）−Ｃａｓヌクレアーゼを含む、幾つかのタイプが存在する。これらのヌクレアーゼは、ＤＮＡを編集するため、ＤＮＡの部位特異的二本鎖切断を作出し得る。
【０００３】
メガヌクレアーゼは、非常に長い認識配列を有し、ＤＮＡに非常に特異的である。メガヌクレアーゼは、他の遺伝子エディタと比べて有毒でない一方で、それは、公知であるのが多くなく、特異的配列を認識する変異体を作出するには突然変異誘発を用いる必要があることから、構築するのが高価である。
【０００４】
ジンクフィンガー及びＴＡＬＥＮヌクレアーゼの双方は、ＤＮＡに非特異的であるが、ＤＮＡ配列認識ペプチドに連結され得る。しかし、これらのヌクレアーゼの各々は、オフターゲット効果及び細胞傷害性をもたらし、ＤＮＡ配列認識ペプチドを作出するための時間を必要とする可能性がある。
【０００５】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓヌクレアーゼは、原核生物系に由来し、ＤＮＡ編集のため、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ又はＣｐｆ１ヌクレアーゼのいずれかを用い得る。ＣＲＩＳＰＲは、多数の微生物中に見出される適応免疫系である。ＣＲＩＳＰＲシステムは十分に理解されなかったが、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）と称される、エキソヌクレアーゼ及び／又はヘリカーゼをコードするＣＲＩＳＰＲ領域に関連した遺伝子が存在することが見出された。Ｃａｓタンパク質では、多重タンパク質複合体を用いるもの（タイプＩ）、標的ＤＮＡ配列に特異的な一般的なｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡを有する単一の（ｓｉｎｇｅ）エフェクタータンパク質を用いるもの（タイプＩＩ）、及び古細菌に見出されるもの（タイプＩＩＩ）といった幾つかの異なるタイプが見出された。Ｃａｓ９（タイプＩＩのＣａｓタンパク質）は、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）細菌が研究されていて、異常なＣＲＩＳＰＲ遺伝子座が見出された際、発見された（Ｂｏｌｏｔｉｎ，ｅｔ  ａｌ．２００５）。スペーサーが一末端で共通配列（プロトスペーサー隣接モチーフＰＡＭ）を共有し、標的配列認識に用いられることも見出された。Ｃａｓ９は、スクリーニングでは見出されなかったが、特異的な細菌を試験することにより見出された。
【０００６】
Ｋｈａｌｉｌｉらに交付された米国特許出願第１４／８３８，０５７号明細書は、潜在的にレトロウイルスに感染した宿主細胞のゲノムに組み込まれたプロウイルスＤＮＡを、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼ、及び２つ以上の異なるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む組成物で宿主細胞を処置し；プロウイルスＤＮＡを不活性化することにより、不活性化する方法を開示し、ここで少なくとも２つのｇＲＮＡの各々は、プロウイルスＤＮＡの長い末端リピート（ＬＴＲ）内の異なる標的核酸配列に対して相補的である。プロウイルスＤＮＡを不活性化するための組成物も提供される。ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ及びｇＲＮＡの送達は、様々な発現ベクター、例えば、プラスミドベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、又はアデノ随伴ウイルスベクターを介し得る。
【０００７】
ウイルスは、溶菌サイクル又は溶原サイクルのいずれかといった２つのサイクルの１つによって複製する。溶菌サイクルでは、最初にウイルスが宿主細胞に侵入し、それ自身の核酸を放出する。次に、ウイルス核酸を複製し、ウイルスを宿主細胞内部に蓄積するため、宿主細胞の代謝機構が用いられる。一旦十分なビリオンが宿主細胞内部で生成されると、宿主細胞は破裂し（溶解）、ビリオンは、引き続きさらなる細胞に感染する。溶菌性ウイルスは、ウイルスＤＮＡを宿主ゲノムに組み込み得るとともに、細胞の感染期間にわたって溶解が生じない場合には組み込まれ得ない。
【０００８】
溶菌性ウイルスは、ジョン・カニンガム（Ｊｏｈｎ  Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ）ウイルス（ＪＣＶ）、Ａ型肝炎（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ａ）、及び様々なヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓｅｓ）を含む。溶原サイクルでは、ビリオンＤＮＡが宿主細胞に組み込まれ、宿主細胞が複製するとき、ビリオンＤＮＡは、細胞分裂から得られる細胞内で複製される。溶原サイクルでは、宿主細胞は破裂しない。溶原性ウイルスは、Ｂ型肝炎（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ）、ジカウイルス（Ｚｉｋａ  ｖｉｒｕｓ）、及びＨＩＶを含む。λファージなどのウイルスは、溶菌及び溶原サイクルの間で変化し得る。
【０００９】
上記の方法及び組成物が宿主細胞のゲノムに組み込まれている溶原性ウイルスを処置するのに有用である一方で、遺伝子編集システムは、溶菌性ウイルスを有効に処置することができない。溶菌性ウイルスを処置することは、ＨＩＶの場合など、ウイルス発現を抑制するため、阻害薬が利用可能でない条件でこのシステムを単独で用いる場合、ウイルスの非効率的なクリアランスをもたらすことになる。現在、大部分のウイルスには、標的阻害薬が欠如している。特に、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼは、ビリオン中に含まれる（すなわち、例えばカプシド又はエンベロープタンパク質によって保護された）ウイルス核酸に接近することができない。
【００１０】
Ｂｒｏａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  ＭＩＴ  ａｎｄ  Ｈａｒｖａｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｒｕｔｇｅｒｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ−Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ及びＳｋｏｌｋｏｖｏ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙからの研究者は、ＤＮＡでなくＲＮＡを標的にする新しいＣＲＩＳＰＲシステムを特徴づけている。この手法は、ＲＮＡを編集することに関連する細胞操作において、さらなる道を開く可能性を有する。ＤＮＡ編集が細胞のゲノムに対して永久的変化をもたらす一方で、ＣＲＩＳＰＲに基づくＲＮＡ標的化手法は、上方又は下方に調節され得るような一時的変化を可能にし、ＲＮＡ干渉において既存の方法よりも大きい特異性及び機能性を伴う可能性がある。詳細には、それはＲＮＡ組み込みウイルス感染及び生じる疾患に対処することができる。その研究では、Ｃ２ｃ２の同定及び機能的特徴づけ、ＲＮＡを標的化及び分解する能力があるＲＮＡ誘導型酵素について報告されている。
【００１１】
その知見は、Ｃ２ｃ２（２０１５年１０月にこの共同グループによって発見された、同定されているＲＮＡのみを標的にする最初の天然に存在するＣＲＩＳＰＲシステム）が、ウイルス感染に対する細菌の保護に役立つことを示す。彼らは、Ｃ２ｃ２が、細菌細胞内の特定のＲＮＡ配列を切断するようにプログラム可能であり、分子生物学のツールボックスへの追加として重要になることを示している。Ｃ２ｃ２のＲＮＡに特化した作用は、細胞の同一性及び機能におけるゲノムの青写真であるＤＮＡを標的にするＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムを補完する。ゲノムの指示の実行を補助する、ＲＮＡのみを標的にする能力は、ハイスループットな様式でＲＮＡを特異的に操作する、すなわち遺伝子機能をより広範に操作する能力をもたらす。これは、疾患を理解、治療及び予防するための進歩を加速する可能性を有する。
【００１２】
ウイルスＤＮＡ又はＲＮＡを有効に標的にし得る遺伝子編集における使用に向けて、さらなるＣＲＩＳＰＲ酵素が必要であり続ける。
【発明の概要】
【００１３】
本発明は、ウイルスＤＮＡを標的にする遺伝子エディタ、ウイルスＲＮＡを標的にする遺伝子エディタ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される２つ以上の遺伝子エディタをコードするベクターを含む、溶原性ウイルスを処置するための組成物を提供する。
【００１４】
本発明はまた、ウイルスＤＮＡを標的にする少なくとも１つの遺伝子エディタをコードする単離核酸をコードするベクター及びウイルスＲＮＡ標的化組成物を含む、溶菌性ウイルスを処置するための組成物を提供する。
【００１５】
本発明はまた、ウイルスＲＮＡを標的にする、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ、アルゴノートエンドヌクレアーゼｇＤＮＡ、Ｃ２ｃ２、リボヌクレアーゼＰ  ＲＮＡ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される２つ以上の遺伝子エディタをコードする単離核酸をコードするベクターを含む、溶原性及び溶菌性ウイルスの双方を処置するための組成物を提供する。
【００１６】
本発明は、ウイルスＲＮＡを標的にする２つ以上の遺伝子エディタをコードする単離核酸をコードするベクター及びウイルスＲＮＡ標的化組成物を含む、溶菌性ウイルスを処置するための組成物を提供する。
【００１７】
本発明は、ウイルスＤＮＡを標的にする遺伝子エディタ、ウイルスＲＮＡを標的にする遺伝子エディタ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される２つ以上の遺伝子エディタをコードする単離核酸をコードするベクターを含む組成物を、溶原性ウイルスを有する個体に投与し、溶原性ウイルスを不活性化することにより、溶原性ウイルスを処置する方法を提供する。
【００１８】
本発明はまた、ウイルスＤＮＡを標的にする少なくとも１つの遺伝子エディタをコードする単離核酸をコードするベクターを含む組成物及びウイルスＲＮＡ標的化組成物を、溶菌性ウイルスを有する個体に投与し、溶菌性ウイルスを不活性化することにより、溶菌性ウイルスを処置するための方法を提供する。
【００１９】
本発明はまた、ウイルスＲＮＡを標的にする、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ、アルゴノートエンドヌクレアーゼｇＤＮＡ、Ｃ２ｃ２、リボヌクレアーゼＰ  ＲＮＡ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される２つ以上の遺伝子エディタをコードする単離核酸をコードするベクターを含む組成物を、溶原性ウイルス及び溶菌性ウイルスを有する個体に投与し、溶原性ウイルス及び溶菌性ウイルスを不活性化することにより、溶原性及び溶菌性ウイルスの双方を処置するための方法を提供する。
【００２０】
本発明は、ウイルスＲＮＡを標的にする２つ以上の遺伝子エディタをコードする単離核酸をコードするベクター及びウイルスＲＮＡ標的化組成物を含む組成物を、溶菌性ウイルスを有する個体に投与し、溶菌性ウイルスを不活性化することにより、溶菌性ウイルスを処置するための方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
本発明の他の利点は、以下の詳細な説明を以下の貼付図面とつなげて考察するときに参照することによってより十分に理解されることから、容易に理解される。
【００２２】
【図１】図１は、細胞内部の溶菌性及び溶原性ウイルスの描像であり、どのポイントでもＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ９が使用可能であり、またどのポイントでもＲＮＡ標的システムが使用可能である。
【図２】図２は、本発明の様々な古細菌Ｃａｓ９エフェクター、ＣａｓＹ．１〜ＣａｓＹ．６エフェクター、及びＣａｓＸエフェクターの表である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、一般に、溶原性及び溶菌性ウイルスを様々な遺伝子編集システム及び酵素エフェクターを用いて処置するための組成物及び方法を対象とする。この組成物は、溶原性ウイルスと溶菌性ウイルスの双方を、又は任意選択的には複製の両方法を用いるウイルスを処置することができる。
【００２４】
用語「ベクター」は、クローニング及び発現ベクター、並びにウイルスベクター及び組み込みベクターを含む。「発現ベクター」は、調節領域を含むベクターである。ベクターはまた、以下にさらに説明される。
【００２５】
用語「レンチウイルスベクター」は、組み込み及び非組み込みレンチウイルスベクターの双方を含む。
【００２６】
ウイルスは、２つのサイクルの１つ、すなわち溶菌サイクル又は溶原サイクルのいずれかにより複製する。溶菌サイクルでは、まずウイルスが宿主細胞に侵入し、それ自身の核酸を放出する。次に、ウイルス核酸を複製し、ウイルスを宿主細胞内部に蓄積させるため、宿主細胞の代謝機構が用いられる。一旦十分なビリオンが宿主細胞内部で生成されると、宿主細胞が破裂し（溶解）、ビリオンがさらなる細胞に感染するようになる。溶菌性ウイルスは、ウイルスＤＮＡを宿主ゲノム内に組み込むとともに、細胞の感染期間にわたり溶解が生じない場合、組み込まれない可能性がある。λファージなどのウイルスは、溶菌及び溶原サイクルの間で切り替り得る。
【００２７】
「溶原性ウイルス」は、本明細書で用いられるとき、溶原サイクルによって複製する（すなわち、宿主細胞の破裂を引き起こさず、ウイルス核酸を宿主細胞ＤＮＡに組み込む）ウイルスを指す。溶原性ウイルスは、主に溶原サイクルにより複製するが、時として溶菌サイクルにより複製し得る。溶原サイクルでは、ビリオンＤＮＡは、宿主細胞に組み込まれ、宿主細胞が複製するとき、ビリオンＤＮＡは、細胞分裂から得られる細胞内に複製される。溶原サイクルでは、宿主細胞は破裂しない。
【００２８】
「溶菌性ウイルス」は、本明細書で用いられるとき、溶菌サイクルによって複製する（すなわち、宿主細胞の、この細胞内部でのウイルスの蓄積後の破裂を引き起こす）ウイルスを指す。溶菌性ウイルスは、主に溶菌サイクルにより複製するが、時として溶原サイクルにより複製し得る。
【００２９】
「ｇＲＮＡ」は、本明細書で用いられるとき、ガイドＲＮＡを指す。本明細書では、ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ９システムにおけるｇＲＮＡが、ウイルスゲノムセグメントの切除、ひいてはウイルスのタンパク質を複製／生成する能力の大規模破壊のために用いられる。これは、ウイルスエスケープ又は突然変異などの単一のｇＲＮＡとともに見られる課題を回避するため、２つ以上の特別に設計されたｇＲＮＡを用いることにより達成される。ｇＲＮＡは、コード又は非コード配列に対して相補的な配列であり得、標的化されるべき特定ウイルスに適合され得る。ｇＲＮＡは、タンパク質コード配列に対して相補的な配列、例えば１つ以上のウイルス構造タンパク質をコードする配列であり得る（例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ及びｔａｔ）。ｇＲＮＡ配列は、センス又はアンチセンス配列であり得る。
【００３０】
「核酸」は、本明細書で用いられるとき、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、及び核酸類似体を含有するＤＮＡ（又はＲＮＡ）を含む、ＲＮＡ及びＤＮＡの双方を指し、それらのいずれかは、本発明のポリペプチドをコードしてもよく、それらのすべては本発明によって包含される。ポリヌクレオチドは、本質的に任意の三次元構造を有し得る。核酸は、二本鎖又は一本鎖（すなわちセンス鎖又はアンチセンス鎖）であり得る。ポリヌクレオチドの非限定例として、遺伝子、遺伝子断片、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）及びそれらの一部、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマー、並びに核酸類似体が挙げられる。本発明と関連して、核酸は、天然に存在するＣａｓ９の断片又はその生物活性変異体及びウイルス中の配列に対して相補的であるような少なくとも２つのｇＲＮＡをコードし得る。
【００３１】
「単離」核酸は、例えば、天然に存在するゲノム中のＤＮＡ分子に直に隣接することが通常見出される核酸配列の少なくとも１つが除去されるか又は不在であるという条件で、天然に存在するＤＮＡ分子又はその断片であり得る。したがって、単離核酸は、限定はされないが、他の配列と独立した別分子として存在するＤＮＡ分子（例えば、化学合成された核酸、又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）若しくは制限エンドヌクレアーゼ処理によって生成されるｃＤＮＡ若しくはゲノムＤＮＡ断片）を含む。単離核酸はまた、ベクター、自律的に複製するプラスミド、ウイルス、又は原核生物若しくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれるＤＮＡ分子を指す。さらに、単離核酸は、ハイブリッド又は融合核酸の一部であるＤＮＡ分子などの改変された核酸を含み得る。例えば、ｃＤＮＡライブラリー若しくはゲノムライブラリー、又はゲノムＤＮＡ制限消化物を含有するゲルスライス中の多数（例えば、数ダース、又は数百〜数千）の他の核酸中に存在する核酸は、単離核酸ではない。
【００３２】
単離核酸分子は、標準的技術によって生成され得る。例えば、本明細書に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、本明細書に記載のヌクレオチド配列を含有する単離核酸を得るため、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いることができる。ＤＮＡ及びＲＮＡからの特定の配列、例えば全ゲノムＤＮＡ又は全細胞ＲＮＡからの配列を増幅するため、ＰＣＲを用いることができる。様々なＰＣＲ法が、例えば、ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ  ａｎｄ  Ｄｖｅｋｓｌｅｒ，ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９５に記載されている。一般に、目的の領域の末端からの、又はそれを超える配列情報が、配列が増幅されるべき鋳型の逆鎖に対して同一又は類似のオリゴヌクレオチドプライマーを設計するために用いられる。部位特異的ヌクレオチド配列修飾が鋳型核酸に導入され得るような様々なＰＣＲ法もまた、利用可能である。
【００３３】
単離核酸はまた、単一の核酸分子（例えば、ホスホラミダイト技術を用いて３’から５’方向に自動化ＤＮＡ合成を用いる）又は一連のオリゴヌクレオチドのいずれかとして化学的に合成され得る。例えば、所望される配列を有する１つ以上の長いオリゴヌクレオチド（例えば、＞５０〜１００ヌクレオチド）対が合成され得、ここで各対は、オリゴヌクレオチド対がアニールされるときに二本鎖が形成されるように、短い相補性セグメント（例えば、約１５ヌクレオチド）を有する。ＤＮＡポリメラーゼを用いることで、オリゴヌクレオチドが伸長され、１オリゴヌクレオチド対あたり単一の二本鎖核酸分子がもたらされ、次にベクターにライゲートされ得る。本発明の単離核酸はまた、例えば、（例えば上の式に従う）Ｃａｓ９をコードするＤＮＡの天然に存在する部分の突然変異誘発により得ることができる。
【００３４】
ウイルス中のＤＮＡ又はＲＮＡのいずれかを標的にする、本発明の方法及び組成物とともに用いることができる多くの異なる遺伝子エディタ（ＣＲＩＳＰＲシステム又はその他）及び酵素エフェクターが存在する。これらは、アルゴノートタンパク質、リボヌクレアーゼＰ  ＲＮＡ、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３、様々なＣａｓ９酵素、Ｃｐｆ１、ＴｅｖＣａｓ９、古細菌Ｃａｓ９、ＣａｓＹ．１〜ＣａｓＹ．６エフェクター、及びＣａｓＸエフェクターを含む。さらに、これらの各々は下記の通りである。
【００３５】
「アルゴノートタンパク質」は、本明細書で用いられるとき、ＰＩＷＩ（Ｐ  ｅｌｅｍｅｎｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｗｉｍｐｙ  ｔｅｓｔｉｓ）ドメイン、ＭＩＤ（ミドル）ドメイン、ＰＡＺ（Ｐｉｗｉ−Ａｒｇｏｎａｕｔｅ−Ｚｗｉｌｌｅ）ドメイン及びＮ末端ドメインを有する、ＰＩＷＩタンパク質スーパーファミリーのタンパク質を指す。アルゴノートタンパク質は、小型ＲＮＡ、例えばマイクロＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、及びＰｉｗｉ相互作用ＲＮＡに結合する能力がある。アルゴノートタンパク質は、ｍＲＮＡを切断し、翻訳を阻害し、又は標的配列におけるｍＲＮＡ分解を誘導するため、これらのＲＮＡを有する標的配列に導かれ得る。小型ＲＮＡと会合する、ＡＧＯ１、ＡＧＯ２、ＡＧＯ３、及びＡＧＯ４を含む、幾つかの異なるヒトアルゴノートタンパク質が存在する。ＡＧＯ２は、スライサーの能力を有する、すなわちエンドヌクレアーゼとして作用する。アルゴノートタンパク質は、遺伝子編集用に用いることができる。アルゴノートタンパク質ファミリーからの（高度好塩菌（Ｎａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｒｅｇｏｒｙｉ）アルゴノートからの）エンドヌクレアーゼはまた、侵入ゲノムを分解するためのガイドとしてオリゴヌクレオチドを用いる。Ｇａｏらによる研究によると、高度好塩菌（Ｎａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｒｅｇｏｒｙｉ）アルゴノート（ＮｇＡｇｏ）が、ヒト細胞におけるゲノム編集に適したＤＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼであることが示されている。ＮｇＡｇｏは、約２４ヌクレオチドの５’リン酸化一本鎖ガイドＤＮＡ（ｇＤＮＡ）に結合し、ｇＤＮＡが負荷されるとき、部位特異的ＤＮＡ二重鎖切断を効率的にもたらす。ＮｇＡｇｏ−ｇＤＮＡ系は、Ｃａｓ９のように、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を必要とせず、予備的特徴づけによると、ガイド−標的ミスマッチに対する耐容性が低く、（Ｇ＋Ｃ）リッチゲノム標的を編集する際の効率が高いことが示唆される。本発明で用いられるアルゴノートタンパク質エンドヌクレアーゼはまた、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）アルゴノート（ＲｓＡｒｇｏ）であり得る。ＲｓＡｒｇｏは、Ｎ末端とＰＩＷＩドメインとの間のガイドＲＮＡの３’領域内で塩基対合を維持することができることから、標的ＤＮＡ鎖及びガイドＲＮＡと安定な相互作用を提供し得る。ＲｓＡｒｇｏはまた、ガイドＲＮＡの５’塩基Ｕを特異的に認識することができ、ガイドＲＮＡを有するＰＡＺドメインの二本鎖認識ループが、ＤＮＡサイレンシング活性において重要であり得る。他の原核生物アルゴノートタンパク質（ｐＡｇｏｓ）もまた、ＤＮＡ干渉及び切断にて用いることができる。アルゴノートタンパク質は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、キイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、超好熱性真正細菌（Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ）、高度好熱菌（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、高度好熱菌（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＪＬ−１８、高度好熱菌（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）株ＨＢ２７、超好熱性真正細菌（Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ）株ＶＦ５、アーケオグロブス・フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、アノキシバチルス・フラビサーマス（Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｉｔｈｅｒｍｕｓ）、高度好塩性古細菌（Ｈａｌｏｇｅｏｍｅｔｒｉｃｕｍ  ｂｏｒｉｎｑｕｅｎｓｅ）、アオコ原因種（Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、クロストリジウム・バルトレティイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂａｒｔｌｅｔｔｉｉ）、ハロルブルム・ラクスプロフンジ（Ｈａｌｏｒｕｂｒｕｍ  ｌａｃｕｓｐｒｏｆｕｎｄｉ）、サーモシネココッカス・エロンガタス（Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）、及びシネココッカス・エロンガタス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）に由来し得る。エンドヌクレアーゼ的に不活性であるが、保存された触媒残基に翻訳後修飾を設け、それらをエンドヌクレアーゼとして活性化することができるアルゴノートタンパク質もまた用いることができる。
【００３６】
ヒトＷＲＮは、ウェルナー症候群遺伝子によってコードされるＲｅｃＱヘリカーゼである。それは、複製、組換え、切除修復及びＤＮＡ損傷応答を含むゲノム維持に関与する。ＷＲＮのこれらの遺伝的プロセス及び発現は、がんの多くのタイプにおいて同時に上方制御される。したがって、このヘリカーゼの標的化切断ががん細胞の除去にとって有用であり得ることが提起されている。報告では、リボヌクレアーゼＰ  ＲＮＡが培養されたヒト細胞株中のＷＲＮ  ｍＲＮＡを効率的に切断するように仕向けることにより、この特有の３’−５’ＤＮＡヘリカーゼ−ヌクレアーゼの翻訳及び活性を消失させるような外部ガイド配列（ＥＧＳ）手法が適用されている。リボヌクレアーゼＰ  ＲＮＡは、本発明での使用が意図されるもう一つの有望なエンドヌクレアーゼである。
【００３７】
クラス２タイプＶＩ−Ａ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクター「Ｃ２ｃ２」は、ＲＮＡ誘導型リボヌクレアーゼ機能を示す。レプトトリキア・シャーイイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｓｈａｈｉｉ）細菌由来のＣ２ｃ２は、ＲＮＡファージに対する干渉をもたらす。インビトロ生化学分析によると、Ｃ２ｃ２が単一のｃｒＲＮＡによって誘導され、相補的プロトスペーサーを保有するｓｓＲＮＡ標的を切断するようにプログラムされ得ることが示される。細菌において、Ｃ２ｃ２は、特定のｍＲＮＡをノックダウンするようにプログラムされ得る。切断は、２つの保存されたＨＥＰＮドメイン内の触媒残基、触媒的に不活性なＲＮＡ結合タンパク質が生成する突然変異によって媒介される。Ｃ２ｃ２のＲＮＡに特化した作用は、細胞の同一性及び機能におけるゲノムの青写真であるＤＮＡを標的にする、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムを補完する。ゲノムの指示の実行を補助するＲＮＡのみを標的にする能力は、ハイスループットな方法でＲＮＡを特異的に操作し、且つ遺伝子機能をより広範に操作する能力をもたらす。これらの結果は、Ｃ２ｃ２の新しいＲＮＡ標的化ツールとしての能力を実証する。
【００３８】
ＤＮＡを編集するための本発明においては、もう一つのクラス２タイプＶ−Ｂ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクター「Ｃ２ｃ１」も用いることができる。Ｃ２ｃ１は、Ｃｐｆ１（下記）と遠い関係があるＲｕｖＣ様エンドヌクレアーゼドメインを有する。Ｃ２ｃ１は、標的ＤＮＡ部位の両鎖を特異的に標的にし、切断し得る。Ｙａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（ＰＡＭ−Ｄｅｐｅｎｅｄｎｔ  Ｔａｒｇｅｔ  ＤＮＡ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  ｂｙ  Ｃ２ｃ１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ，Ｃｅｌｌ，２０１６  Ｄｅｃ  １５；１６７（７）：１８１４−１８２８））によると、結晶構造により、アリサイクロバチルス・アシドテレストリス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）Ｃ２ｃ１（ＡａｃＣ２ｃ１）が二成分複合体としてｓｇＲＮＡに結合し、三元複合体としてＤＮＡを標的にし、それにより、標的及び非標的ＤＮＡ鎖の双方が単一のＲｕｖＣ触媒ポケット内部に独立して位置づけられた、ＡａｃＣ２ｃ１の触媒が競合した高次構造が捕捉されることが確認される。Ｙａｎｇらは、Ｃ２ｃ１媒介性切断により、標的ＤＮＡのねじれた７ヌクレオチド切断がもたらされ、ｃｒＲＮＡが二成分複合体中に予め整列された５ヌクレオチドのＡ型シード配列の形をとり、挿入されたトリプトファンの放出とともに、三元複合体形成に対する２０ｂｐのガイドＲＮＡ：標的ＤＮＡヘテロ二本鎖のジッパーアップが促進され、且つＰＡＭと相互作用するクレフトが三元複合体形成に対する「ロックド」立体構造をとることを確認している。
【００３９】
Ｃ２ｃ３は、Ｃ２ｃ１と僅かに関連するタイプＶ−Ｃの遺伝子エディタ・エフェクターであり、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインも有する。Ｃ２ｃ３はまた、下記のＣａｓＹ．１〜ＣａｓＹ．６グループに類似する。
【００４０】
「ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ９」は、本明細書で用いられるとき、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼＣａｓ９を指す。細菌では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子座は、可動性遺伝要素（ウイルス、転位因子及び接合性プラスミド）に対するＲＮＡ誘導型適応免疫系をコードする。ＣＲＩＳＰＲシステムの３つのタイプ（Ｉ〜ＩＩＩ）が同定されている。ＣＲＩＳＰＲクラスターは、先の可動性要素に対して相補的な配列であるスペーサーを有する。ＣＲＩＳＰＲクラスターは、成熟ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）への転写及びプロセシングがなされる。ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼＣａｓ９は、タイプＩＩのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに属し、標的ＤＮＡを切断するような強力なエンドヌクレアーゼ活性を有する。Ｃａｓ９は、（スペーサーと称される）約２０塩基対（ｂｐ）の固有の標的配列を有する成熟ｃｒＲＮＡ及びプレｃｒＲＮＡのリボヌクレアーゼＩＩＩ補助プロセシングにおけるガイドとして機能するトランス活性化された小型ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）によって導かれる。ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二本鎖は、Ｃａｓ９が、ｃｒＲＮＡ上のスペーサーと標的ＤＮＡ上の（プロトスペーサーと称される）相補的配列との間の相補的塩基対合を介してＤＮＡを標的にするように誘導する。Ｃａｓ９は、トリヌクレオチド（ＮＧＧ）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識することで、切断部位（ＰＡＭから３番目のヌクレオチド）を特定する。ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、別々に発現され得るか、又は合成ステムループ（ＡＧＡＡＡＵ）を介して人工的に融合された小型ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）に改変されることで、天然ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ二本鎖を模倣し得る。かかるｓｇＲＮＡは、ｓｈＲＮＡ同様、直接的ＲＮＡトランスフェクション用に合成又はインビトロ転写され得るか、又はＵ６若しくはＨ１プロモーター駆動ＲＮＡ発現ベクターから発現され得るが、人工的ｓｇＲＮＡの切断効率は、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡが別々に発現されるシステムの場合よりも低い。
【００４１】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１は、２０１５年にＢｒｏａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ及びＭＩＴからのＦｅｎｇ  Ｚｈａｎｇのグループによって特徴づけられた、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムに類似するＤＮＡ編集技術である。Ｃｐｆ１は、クラスＩＩのＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼである。この獲得された免疫機構は、プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）及びフランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）細菌で見出されている。それは、ウイルスからの遺伝子損傷を阻止する。Ｃｐｆ１遺伝子は、ガイドＲＮＡを用いてウイルスＤＮＡを発見し、切断するエンドヌクレアーゼをコードする、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に関連する。Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９よりも小さく且つ単純なエンドヌクレアーゼであり、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの制限の一部を克服する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１は、遺伝的疾病及び変性状態の治療を含む、複数の用途を有し得る。上に参照される通り、アルゴノートは、もう一つの有望な遺伝子編集システムである。
【００４２】
ＣＲＩＳＰＲ／ＴｅｖＣａｓ９システムもまた、用いることができる。場合によっては、一旦ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９があるスポットでＤＮＡを切断すると、生物の細胞内のＤＮＡ修復システムがこの切断部位を修復することが示されている。標的の２つの部位でＤＮＡを切断することで、この切断の修復が細胞のＤＮＡ修復システムにとってより困難であることから、ＴｅｖＣａｓ９酵素が開発された（Ｗｏｌｆｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉａｓｉｎｇ  ｇｅｎｏｍｅ−ｅｄｉｔｉｎｇ  ｅｖｅｎｔｓ  ｔｏｗａｒｄ  ｐｒｅｃｉｓｅ  ｌｅｎｇｔｈ  ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ＴｅｖＣａｓ９  ｄｕａｌ  ｎｕｃｌｅａｓｅ，ＰＮＡＳ，ｄｏｉ：１０．１０７３）。ＴｅｖＣａｓ９ヌクレアーゼは、Ｉ−ＴｅｖｉヌクレアーゼドメインのＣａｓ９との融合体である。
【００４３】
Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、野生型化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）配列と同一のヌクレオチド配列を有し得る。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、他種、例えば他のストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、例えば、サーモフィルス（ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）；緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、又は他の配列決定された細菌ゲノム及び古細菌、又は他の原核微生物からの配列であり得る。或いは、野生型化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９配列は、修飾され得る。この核酸配列は、哺乳動物細胞内での効率的発現のため、コドン最適化（すなわち「ヒト化」）され得る。ヒト化Ｃａｓ９ヌクレアーゼ配列は、例えば、ジェンバンク受入番号ＫＭ０９９２３１．１  ＧＩ：６６９１９３７５７；ＫＭ０９９２３２．１  ＧＩ：６６９１９３７６１；又はＫＭ０９９２３３．１  ＧＩ：６６９１９３７６５に列挙される発現ベクターのいずれかによってコードされるＣａｓ９ヌクレアーゼ配列であり得る。或いは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ配列は、例えば、Ａｄｄｇｅｎｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）製のＰＸ３３０又はＰＸ２６０などの市販のベクター内部に含まれる配列であり得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、ジェンバンク受入番号ＫＭ０９９２３１．１  ＧＩ：６６９１９３７５７；ＫＭ０９９２３２．１  ＧＩ：６６９１９３７６１；又はＫＭ０９９２３３．１  ＧＩ：６６９１９３７６５のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ配列のいずれかの変異体若しくは断片であるアミノ酸配列、又はＰＸ３３０若しくはＰＸ２６０（Ａｄｄｇｅｎｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）のＣａｓ９アミノ酸配列を有し得る。Ｃａｓ９ヌクレオチド配列は、Ｃａｓ９の生物活性変異体をコードするように修飾され得、これらの変異体は、例えば、１つ以上の突然変異（例えば、付加、欠失、若しくは置換突然変異又はかかる突然変異の組み合わせ）を有することが理由で野生型Ｃａｓ９と異なるアミノ酸配列を有し得る、又は含み得る。置換突然変異の１つ以上は、置換（例えば、保存的アミノ酸置換）であり得る。例えば、Ｃａｓ９ポリペプチドの生物活性変異体は、野生型Ｃａｓ９ポリペプチドに対して少なくとも又は約５０％の配列同一性（例えば、少なくとも又は約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を有し得る。保存的アミノ酸置換は、典型的には、以下の群：グリシン及びアラニン；バリン、イソロイシン、及びロイシン；アスパラギン酸及びグルタミン酸；アスパラギン、グルタミン、セリン及びトレオニン；リジン、ヒスチジン及びアルギニン；並びにフェニルアラニン及びチロシン、の範囲内の置換を含む。Ｃａｓ９アミノ酸配列内のアミノ酸残基は、天然に存在しないアミノ酸残基であり得る。天然に存在するアミノ酸残基は、遺伝暗号によって天然にコードされるもの、及び非標準アミノ酸（例えば、Ｌ−立体配置でなくＤ−立体配置を有するアミノ酸）を含む。本ペプチ���はまた、標準残基の修飾バージョンであるアミノ酸残基を含み得る（例えば、ピロールリジンは、リジンの代わりに使用可能であり、セレノシステインは、システインの代わりに使用可能である）。天然に存在しないアミノ酸残基は、天然に見出されていないが、アミノ酸の基本式に準拠するものであり、ペプチドに組み込まれ得る。これらは、Ｄ−アロイソロイシン（２Ｒ，３Ｓ）−２−アミノ−３−メチルペンタン酸及びＬ−シクロペンチルグリシン（Ｓ）−２−アミノ−２−シクロペンチル酢酸を含む。他の例については、教本又はワールドワイドウェブ（サイトは、カリフォルニア工科大学（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）によって現在維持され、機能的タンパク質に巧みに組み込まれている非天然アミノ酸の構造を表示する）を閲覧することができる。Ｃａｓ−９はまた、下の表１に示されるいずれかであり得る。
2020513783.tif 000003
【００４４】
ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼＣａｓ９は、多用途のゲノム編集プラットフォームとして出現しているが、一部、一般に用いられる化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）のサイズが、非常に多用途のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）送達媒体を用いる基礎研究及び治療用途におけるその有用性を制限することが報告されている。したがって、６倍より小型のＣａｓ９オルソログが用いられており、報告では、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）からのＣａｓ９（ＳａＣａｓ９）がこのゲノムをＳｐＣａｓ９の場合に類似した効率で編集し得る一方で、１より大きいキロベース分より短いことが示されている。ＳａＣａｓ９は１０５３ｂｐである一方、ＳｐＣａｓ９は１３５８ｂｐである。
【００４５】
Ｃａｓ９ヌクレアーゼ配列、又は本明細書に記載の遺伝子エディタ・エフェクター配列のいずれかは、突然変異配列であり得る。例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、鎖特異的切断に関与する、保存されたＨＮＨ及びＲｕｖＣドメイン内で突然変異され得る。例えば、ＲｕｖＣ触媒ドメイン内でのアスパラギン酸からアラニンへの（Ｄ１０Ａ）突然変異は、Ｃａｓ９ニッカーゼ突然変異体（Ｃａｓ９ｎ）がＤＮＡを切断するのではなく切れ目を入れることにより、一本鎖切断をもたらすことを可能にし、その後のＨＤＲを通じた優先的修復が、オフターゲット二本鎖切断からの望まれないインデル突然変異の頻度を潜在的に低減し得る。一般に、遺伝子エディタ・エフェクター配列の突然変異は、オフターゲット作用を最小化又は阻止し得る。
【００４６】
遺伝子エディタ・エフェクターはまた、古細菌Ｃａｓ９であり得る。古細菌Ｃａｓ９のサイズについては、９５０ａａのＡＲＭＡＮ１及び９６７ａａのＡＲＭＡＮ４である。古細菌Ｃａｓ９は、ＡＲＭＡＮ−１（カンジダトゥス・ミクラルカエウム・アシディフィルム（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｍｉｃｒａｒｃｈａｅｕｍ  ａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｍ）ＡＲＭＡＮ−１）又はＡＲＭＡＮ−４（カンジダトゥス・パルヴァルカエウム・アシディフィルム（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｐａｒｖａｒｃｈａｅｕｍ  ａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｍ）ＡＲＭＡＮ−４）に由来し得る。ＡＲＭＡＮ−１及びＡＲＭＡＮ−４に由来する、古細菌Ｃａｓ９の２つの例が図２に提示される。ＡＲＭＡＮ１及びＡＲＭＡＮ４における配列は下記の通りである。
【００４７】
ＡＲＭＡＮ１アミノ酸配列９５０ａａ
（配列番号１）：
2020513783.tif 000004
【００４８】
ＡＲＭＡＮ１核酸配列
（配列番号２）：
2020513783.tif 000005
2020513783.tif 000006
【００４９】
ＡＲＭＡＮ４アミノ酸配列９６７ａａ
（配列番号３）：
2020513783.tif 000007
【００５０】
ＡＲＭＡＮ４核酸配列
（配列番号４）：
2020513783.tif 000008
2020513783.tif 000009
【００５１】
遺伝子エディタ・エフェクターはまた、ＣａｓＸであり得、その例が図２に示される。ＣａｓＸは、（Ｃｐｆ１と同様）５’末端にＴＴＣ  ＰＡＭを有する。ＴＴＣ  ＰＡＭは、ＧＣリッチであるウイルスゲノム中に制限を有し得るが、ＧＣが乏しい場合にはあまり制限がない。ＣａｓＸのサイズ（９８６ｂｐ）は、他のタイプＶタンパク質より小さいものであり、送達プラスミド内に４つのｇＲＮＡ＋１つのｓｉＲＮＡの可能性を提示する。ＣａｓＸは、デルタプロテオバクテリア（Ｄｅｌｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）又はプランクトミケス門（Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）に由来し得る。これらのＣａｓＸエフェクターにおける配列は、下記の通りである。
【００５２】
ＣａｓＸ．１プランクトミケス門（Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）アミノ酸配列９７８ａａ
（配列番号５）：
2020513783.tif 000010
【００５３】
ＣａｓＸ．１プランクトミケス門（Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）核酸配列
（配列番号６）：
2020513783.tif 000011
2020513783.tif 000012
2020513783.tif 000013
【００５４】
ＣａｓＸ．１デルタプロテオバクテリア（Ｄｅｌｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）アミノ酸配列９８６ａａ
（配列番号７）：
2020513783.tif 000014
【００５５】
ＣａｓＸ．１デルタプロテオバクテリア（Ｄｅｌｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）核酸配列
（配列番号８）：
2020513783.tif 000015
2020513783.tif 000016
【００５６】
遺伝子エディタ・エフェクターはまた、ＣａｓＹ．１〜ＣａｓＹ．６であり得、その例が図２に示される。ＣａｓＹ．１〜ＣａｓＹ．６は、ＴＡ  ＰＡＭを有し、より短いＰＡＭ配列は、標的制限がより少ないことから、有用であり得る。ＣａｓＹ．１〜ＣａｓＹ．６のサイズ（１１２５ｂｐ）は、送達プラスミド内に２つのｇＲＮＡ＋１つのｓｉＲＮＡ又は４つのｇＲＮＡの可能性を提示する。ＣａｓＹ．１〜ＣａｓＹ．６は、フィラ・ラジエーション（ｐｈｙｌａ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ）（ＣＰＲ）細菌、例えば限定はされないが、カタノバクテリア（ｋａｔａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、ヴォゲルバクテリア（ｖｏｇｅｌｂａｃｔｅｒｉａ）、パルクバクテリア（ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ）、コメイリバクテリア（ｋｏｍｅｉｌｉｂａｃｔｅｒｉａ）、又はケルフェルドバクテリア（ｋｅｒｆｅｌｄｂａｃｔｅｒｉａ）に由来し得る。ＣａｓＹ．１〜ＣａｓＹ．６における配列は、下記の通りである。
【００５７】
ＣａｓＹ．１カンディダトゥス・カタノバクテリア（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  ｋａｔａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）アミノ酸配列１１２５ａａ
（配列番号９）：
2020513783.tif 000017
【００５８】
ＣａｓＹ．１カンディダトゥス・カタノバクテリア（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  ｋａｔａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）核酸配列
（配列番号１０）：
2020513783.tif 000018
2020513783.tif 000019
【００５９】
ＣａｓＹ．２カンディダトゥス・ヴォゲルバクテリア（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  ｖｏｇｅｌｂａｃｔｅｒｉａ）アミノ酸配列１２２６ａａ
（配列番号１１）：
2020513783.tif 000020
【００６０】
ＣａｓＹ．２カンディダトゥス・ヴォゲルバクテリア（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  ｖｏｇｅｌｂａｃｔｅｒｉａ）核酸配列
（配列番号１２）：
2020513783.tif 000021
2020513783.tif 000022
【００６１】
ＣａｓＹ．３カンディダトゥス・ヴォゲルバクテリア（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  ｖｏｇｅｌｂａｃｔｅｒｉａ）アミノ酸配列１２００ａａ
（配列番号１３）：
2020513783.tif 000023
【００６２】
ＣａｓＹ．３カンディダトゥス・ヴォゲルバクテリア（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  ｖｏｇｅｌｂａｃｔｅｒｉａ）核酸配列
（配列番号１４）：
2020513783.tif 000024
2020513783.tif 000025
【００６３】
ＣａｓＹ．４カンディダトゥス・パルクバクテリア（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ）アミノ酸配列１２１０ａａ
（配列番号１５）：
2020513783.tif 000026
【００６４】
ＣａｓＹ．４カンディダトゥス・パルクバクテリア（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ）核酸配列
（配列番号１６）：
2020513783.tif 000027
2020513783.tif 000028
【００６５】
ＣａｓＹ．５カンディダトゥス・コメイリバクテリア（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  ｋｏｍｅｉｌｉｂａｃｔｅｒｉａ）アミノ酸配列１１９２ａａ
（配列番号１７）：
2020513783.tif 000029
【００６６】
ＣａｓＹ．５カンディダトゥス・コメイリバクテリア（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  ｋｏｍｅｉｌｉｂａｃｔｅｒｉａ）核酸配列
（配列番号１８）：
2020513783.tif 000030
2020513783.tif 000031
【００６７】
ＣａｓＹ．６カンディダトゥス・ケルフェルドバクテリア（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  ｋｅｒｆｅｌｄｂａｃｔｅｒｉａ）アミノ酸配列１２８７ａａ
（配列番号１９）：
2020513783.tif 000032
【００６８】
ＣａｓＹ．６カンディダトゥス・ケルフェルドバクテリア（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  ｋｅｒｆｅｌｄｂａｃｔｅｒｉａ）核酸配列
（配列番号２０）：
2020513783.tif 000033
2020513783.tif 000034
【００６９】
本明細書中の遺伝子エディタ・エフェクター（ｇｅｎｅ  ｅｄｉｔｏｒ  ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ）のいずれかはまた、Ｔｅｖ又は任意の他の好適なホーミングタンパク質ドメインで標識され得る。Ｗｏｌｆｓ，ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０１６  Ｄｅｃ２７；１１３（５２）：１４９８８−１４９９３．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１６１６３４３１１４．Ｅｐｕｂ  ２０１６  Ｄｅｃ  １２）によると、Ｔｅｖは、標的部位で２つの不適合なＤＮＡ切断をもたらし、標的部位の大部分を複製できないように有効に欠失させる、ＲＮＡ誘導型二重活性部位ヌクレアーゼ（ｄｕａｌ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ  ｎｕｃｌｅａｓｅ）である。
【００７０】
本発明は、ウイルスＤＮＡを標的にする、２つ以上のＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ３、ＴｅｖＣａｓ９、古細菌Ｃａｓ９、ＣａｓＹ．１〜ＣａｓＹ．６、及びＣａｓＸ  ｇＲＮＡ、アルゴノートエンドヌクレアーゼｇＤＮＡ及び他の遺伝子エディタ、並びにＣ２ｃ２などのＲＮＡエディタをコードするベクターを含む、溶原性ウイルス（出芽ウイルス）を処置するための組成物を提供する。好ましくは、この組成物は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ９又は上記の任意のそれ以外）及び溶原性ウイルス中の標的配列に対して相補的である２つ以上のｇＲＮＡをコードする単離核酸を含む。各ｇＲＮＡは、溶原性ウイルス内部の異なる配列に対して相補的であり得る。この組成物は、ゲノム自身内部のウイルスゲノム（ＤＮＡ）及び翻訳産物の複製決定セグメントをＣ２ｃ２などのＲＮＡエディタを用いて（又はＲＮＡをＣ２ｃ２などのＲＮＡエディタを用いて）除去する。最も好ましくは、全ウイルスゲノムが、ウイルスに感染された宿主細胞から切除され得る。或いは、付加、欠失、又は突然変異をウイルスのゲノムに設けることができる。この組成物は、任意選択的には、ＤＮＡを標的にする他のＣＲＩＳＰＲ又は遺伝子編集システムを含み得る。ｇＲＮＡは、オフターゲット効果もウイルスエスケープももたらさないように、安全性において最適であるように設計される。この組成物は、溶原性複製サイクルを有するものとして示される、下表中の任意のウイルスを処置することができ、特にレトロウイルスに対して有用である。この組成物は、下記の通り、ベクター又は任意の他の方法により送達され得る。
【００７１】
本発明はまた、溶原性であるウイルス中のウイルス遺伝子の切除を意図してウイルスＤＮＡゲノムを標的にするための、２つ以上のＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ３、ＴｅｖＣａｓ９、古細菌Ｃａｓ９、ＣａｓＹ．１〜ＣａｓＹ．６、及びＣａｓＸ  ｇＲＮＡ、アルゴノートエンドヌクレアーゼｇＤＮＡ及び他の遺伝子エディタをコードするベクター、並びに、１）ウイルスタンパク質及び／又はビリオンの形成に関与する（非コーディング又はコーディング）ウイルスタンパク質を翻訳するクリティカルＲＮＡ（ウイルスｍＲＮＡ）を標的にする低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）／マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短いヘアピンＲＮＡ、及び干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）（ＲＮＡ干渉用）、又は２）ビリオンの形成に関与する（非コーディング又はコーディング）ウイルスタンパク質を翻訳する、ＲＮＡ（ウイルスｍＲＮＡ）を標的にする、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ３、ＴｅｖＣａｓ９、古細菌Ｃａｓ９、ＣａｓＹ．１〜ＣａｓＹ．６、及びＣａｓＸ  ｇＲＮＡ、アルゴノートエンドヌクレアーゼｇＤＮＡ及び他の遺伝子エディタ、例えばＣ２ｃ２、のいずれか、を含む、溶菌性ウイルスを処置するための組成物を提供する。好ましくは、この組成物は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ９）、ウイルス中の標的ＤＮＡ配列に相補的な２つ以上のｇＲＮＡをコードする単離核酸、並びにウイルス中の標的ＲＮＡ配列に相補的であるｓｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ／ＲＮＡｉ又はＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ３、ＴｅｖＣａｓ９、古細菌Ｃａｓ９、ＣａｓＹ．１〜ＣａｓＹ．６、及びＣａｓＸ  ｇＲＮＡ、アルゴノートエンドヌクレアーゼｇＤＮＡ及び他の遺伝子エディタのいずれか、を含む。各ｇＲＮＡは、ウイルス内部の異なる配列に相補的であり得る。この組成物は、ウイルスＤＮＡゲノムを標的にし、それらゲノムのセグメントを切除する、任意の他のＣＲＩＳＰＲ又は遺伝子編集システムをさらに含み得る。この共治療剤（ｃｏ−ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）は、Ｃａｓ９システム単独では治療できない溶菌性ウイルスに感染された個体を処置するのに有用である。図１に示す通り、溶菌性及び溶原性ウイルスは、異なる方法で治療される必要がある。ＤＮＡを標的にするのにＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ９が常用されるが、この遺伝子編集システムは、溶菌性ウイルスを標的にするため、ウイルス内部のＲＮＡを標的にするように設計され得る。例えば、Ｎｅｌｌｅｓ，ｅｔ  ａｌ．（Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌｕｍｅ  １６５，Ｉｓｓｕｅ  ２，ｐ．４８８−４９６，Ａｐｒｉｌ  ７，２０１６）は、ＲＮＡを標的にするＣａｓ９がｍＲＮＡに結合することができたことを示す。下表に列挙される溶菌性ウイルスのいずれかは、この組成物を用いて標的にすることができる。この組成物は、下記の通り、ベクター又は任意の他の方法により送達され得る。
【００７２】
本明細書における組成物中のｓｉＲＮＡ及びＣ２ｃ２は、ウイルス中の特定遺伝子又は遺伝子ｍＲＮＡに標的化される。ｓｉＲＮＡは、ウイルス遺伝子又は遺伝子ｍＲＮＡ配列の一部のヌクレオチド配列に対して実質的に同一である二本鎖の第１鎖を有し得る。ｓｉＲＮＡ二本鎖の第２鎖は、ｓｉＲＮＡ二本鎖の第１鎖とウイルス遺伝子ｍＲＮＡの同じ部分の双方に相補的である。単離ｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡに標的化される、約１７ヌクレオチド〜約２９ヌクレオチド長、好ましくは約１９〜約２５ヌクレオチド長の短い二本鎖ＲＮＡを含み得る。ｓｉＲＮＡ二本鎖は、標準的なワトソン・クリック塩基対相互作用により一緒にアニールされた、センスＲＮＡ鎖及び相補的なアンチセンスＲＮＡ鎖を含む。センス鎖は、標的ｍＲＮＡ中に含まれる標的配列に対して実質的に同一である核酸配列を含む。本発明のｓｉＲＮＡは、当業者に公知の幾つかの技術を用いて得ることができる。例えば、このｓｉＲＮＡは、化学的に合成される、又は当該技術分野で公知の方法、例えば、Ｔｕｓｃｈｌらの米国特許出願公開第２００２／００８６３５６号明細書（その全開示内容は参照により本明細書中に援用される）に記載のインビトロ系でのショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）を用いて組換え的に作製され得る。好ましくは、本発明のｓｉＲＮＡは、適切に保護されたリボヌクレオシドホスホラミダイト及び通常のＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを用いて化学的に合成される。このｓｉＲＮＡは、２つの分かれた相補的ＲＮＡ分子として、又は２つの相補的領域を有する単一のＲＮＡ分子として合成され得る。合成ＲＮＡ分子又は合成試薬の供給業者として、Ｐｒｏｌｉｇｏ（Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，Ｃｏｌｏ．，ＵＳＡ）、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅの一部、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．，ＵＳＡ）、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，Ｖａ．，ＵＳＡ）、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ（Ａｓｈｌａｎｄ，Ｍａｓｓ，ＵＳＡ）及びＣｒｕａｃｈｅｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ，ＵＫ）が挙げられる。或いは、ｓｉＲＮＡはまた、任意の好適なプロモーターを用いて、組換え環状又は直鎖状ＤＮＡプラスミドから発現され得る。プラスミドから本発明のｓｉＲＮＡを発現するのに適したプロモーターとして、例えば、Ｕ６又はＨ１  ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター配列及びサイトメガロウイルスプロモーターが挙げられる。他の好適なプロモーターの選択は、当業者の範囲内である。本発明の組換えプラスミドはまた、特定組織内又は特定細胞内環境下でｓｉＲＮＡの発現用の誘導性又は調節性プロモーターを含み得る。組換えプラスミドから発現されるｓｉＲＮＡは、標準的技術により培養された細胞発現系から単離され得るか、又は細胞内で発現され得るかのいずれかである。本発明のｓｉＲＮＡは、２つの分かれた相補的ＲＮＡ分子、又は２つの相補的領域を有する単一のＲＮＡ分子のいずれかとして、組換えプラスミドから発現され得る。例えば、ｓｉＲＮＡは、ＪＣウイルス（ＪＣ  Ｖｉｒｕｓ）、ＢＫＶ、又はＳＶ４０ポリオーマウイルスの標的化において有用であり得（Ｋｈａｌｉｌｉ，ｅｔ  ａｌ．に交付された米国特許出願公開第２００７／０２４９５５２号明細書）、ここではＪＣＶアグノプロテイン遺伝子又は大型Ｔ抗原遺伝子のｍＲＮＡを標的にするようなｓｉＲＮＡが用いられ、またセンスＲＮＡ鎖は、アグノプロテイン遺伝子又は大型Ｔ抗原遺伝子のｍＲＮＡにおける約１９〜約２５の隣接ヌクレオチドの標的配列に対して実質的に同一であるヌクレオチド配列を含む。
【００７３】
本発明はまた、ウイルスＲＮＡを標的にする、２つ以上のＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ３、ＴｅｖＣａｓ９、古細菌Ｃａｓ９、ＣａｓＹ．１〜ＣａｓＹ．６、及びＣａｓＸ  ｇＲＮＡ、アルゴノートエンドヌクレアーゼｇＤＮＡ、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ１、及び他の遺伝子エディタをコードするベクターを含む、溶原性及び溶菌性ウイルスの双方を処置するための組成物を提供する。好ましくは、この組成物は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ９）及びウイルス中の標的ＲＮＡ配列に相補的である２つ以上のｇＲＮＡをコードする単離核酸を含む。各ｇＲＮＡは、ウイルス内部の異なる配列に相補的であり得る。この組成物は、ウイルスＲＮＡゲノムを標的にし、それらゲノムのセグメントを切除する任意の他のＣＲＩＳＰＲ又は遺伝子編集システムをさらに含み得る。この組成物は、下表に列挙されるような溶原性及び溶菌性複製の双方を有するウイルスを標的にすることができる。
【００７４】
本発明は、２つ以上のＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ３、ＴｅｖＣａｓ９、古細菌Ｃａｓ９、ＣａｓＹ．１〜ＣａｓＹ．６、及びＣａｓＸ  ｇＲＮＡ、アルゴノートエンドヌクレアーゼｇＤＮＡ及び他の遺伝子エディタをコードするベクター、並びにウイルスタンパク質及び／又はビリオンの形成に関与する（非コーディング又はコーディング）ウイルスタンパク質を翻訳するクリティカルＲＮＡ（ウイルスｍＲＮＡ）を標的にするｓｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ／ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）を含む、溶菌性ウイルスを処置するための組成物を提供する。好ましくは、この組成物は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ９又は上記の任意のそれ以外）及び溶菌性ウイルス中の標的ＲＮＡ配列に相補的な２つ以上のｇＲＮＡをコードする単離核酸を含む。各ｇＲＮＡは、溶菌性ウイルス内部の異なる配列に相補的であり得る。この組成物は、任意選択的には、溶菌性ウイルスにおける破壊のため、ウイルスＲＮＡゲノムを標的にし、それらゲノムのセグメントを切除する、他のＣＲＩＳＰＲ又は遺伝子編集システムを含み得る。
【００７５】
本発明の組成物及び方法により、様々なウイルスを標的にすることができる。それらが溶菌性であるか又は溶原性であるかに依存し、異なる組成物及び方法を必要に応じて用いることができる。
【００７６】
表２は、ピコルナウイルス（ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）科／ヘペウイルス（ｈｅｐｅｖｉｒｉｄａｅ）科／フラビウイルス（ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）科におけるウイルス及びそれらの複製方法を列挙する。
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【００７７】
Ｄ型肝炎（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｄ）がＢ型肝炎（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ）の存在下に限って増殖し、それ故、Ｄ型肝炎（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｄ）を処置するのに特に有用な組成物が、Ｂ型肝炎（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ）を同様に標的にするもの、例えば、溶原性ウイルスを処置するための２つ以上のＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ３、ＴｅｖＣａｓ９、古細菌Ｃａｓ９、ＣａｓＹ．１〜ＣａｓＹ．６、及びＣａｓＸ  ｇＲＮＡ、アルゴノートエンドヌクレアーゼｇＤＮＡ及び他の遺伝子エディタ、並びに溶菌性ウイルスを処置するためのｓｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ／ＲＮＡｉであることは注目されるべきである。
【００７８】
表３は、ヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）科におけるウイルス及びそれらの複製方法を列挙する。
2020513783.tif 000036
【００７９】
表４は、オルトミクソウイルス（ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）科におけるウイルス及びそれらの複製方法を列挙する。
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【００８０】
表５は、レトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）科におけるウイルス及びそれらの複製方法を列挙する。
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【００８１】
表６は、パピローマウイルス（ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｉｄａｅ）科におけるウイルス及びそれらの複製方法を列挙する。
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【００８２】
表７は、フラビウイルス（ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）科におけるウイルス及びそれらの複製方法を列挙する。
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【００８３】
表８は、レオウイルス（ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ）科におけるウイルス及びそれらの複製方法を列挙する。
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【００８４】
表９は、ラブドウイルス（ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）科におけるウイルス及びそれらの複製方法を列挙する。
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【００８５】
表１０は、ブニヤウイルス（ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ）科におけるウイルス及びそれらの複製方法を列挙する。
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【００８６】
表１１は、アレナウイルス（ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ）科におけるウイルス及びそれらの複製方法を列挙する。
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【００８７】
表１２は、フィロウイルス（ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）科におけるウイルス及びそれらの複製方法を列挙する。
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【００８８】
表１３は、ポリオーマウイルス（ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｉｄａｅ）科におけるウイルス及びそれらの複製方法を列挙する。
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【００８９】
活性又は潜伏ウイルスのいずれかを処置するため、本発明の組成物を用いることができる。潜伏ウイルスが存在するが、個体がまだウイルスの症状を呈していない個体を処置するため、本発明の組成物を用いることができる。この組成物は、個体における任意の細胞、例えば限定はされないが、ＣＤ４＋リンパ球、マクロファージ、線維芽細胞、単球、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー細胞、ランゲルハンス細胞及び濾胞樹状細胞などの樹状細胞、造血幹細胞、内皮細胞、脳ミクログリア細胞、及び胃腸上皮細胞におけるウイルスを標的にし得る。
【００９０】
本発明では、この組成物のいずれかが発現ベクター内に含まれるとき、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、ｇＲＮＡ配列と同じ核酸又はベクターによってコードされ得る。代替的又は追加的には、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、ｇＲＮＡ配列からの物理的に分かれた核酸又は分かれたベクターにおいてコードされ得る。
【００９１】
本明細書に記載のような核酸を含むベクターもまた提供される。「ベクター」は、レプリコン、例えば、プラスミド、ファージ、又はコスミドであり、その中に別のＤＮＡセグメントが、挿入されたセグメントの複製をもたらすように挿入されてもよい。一般に、ベクターは、適切な調節エレメントと会合されるとき、複製の能力がある。好適なベクター骨格として、当該技術分野でルーチン的に用いられるもの、例えば、プラスミド、ウイルス、人工染色体、ＢＡＣ、ＹＡＣ、又はＰＡＣが挙げられる。用語「ベクター」は、クローニング及び発現ベクター、並びにウイルスベクター及び組み込みベクターを含む。「発現ベクター」は、調節領域を含むベクターである。極めて多数のベクター及び発現系が、Ｎｏｖａｇｅｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）などの企業から市販されている。
【００９２】
本明細書に提供されるベクターがまた、例えば、複製起点、スキャフォールド付着領域（ＳＡＲ）、及び／又はマーカーを含み得る。マーカー遺伝子は、宿主細胞上に選択可能表現型を付与し得る。例えば、マーカーは、殺生剤耐性、例えば抗生物質（例えば、カナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、又はハイグロマイシン）に対する耐性を付与し得る。上記の通り、発現ベクターは、発現されるポリペプチドの操作又は検出（例えば、精製又は局所化）を容易にするように設計されたタグ配列を含み得る。タグ配列、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリヒスチジン、ｃ−ｍｙｃ、ヘマグルチニン、又はＦｌａｇ（商標）タグ（Ｋｏｄａｋ，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）配列は、典型的には、コードポリペプチドとの融合体として発現される。かかるタグは、カルボキシル又はアミノ末端のいずれかを含む、ポリペプチド内部のいずれかの場所に挿入され得る。
【００９３】
追加的な発現ベクターはまた、例えば、染色体、非染色体及び合成ＤＮＡ配列のセグメントを含み得る。好適なベクターは、ＳＶ４０の誘導体及び既知の細菌プラスミド、例えば、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）プラスミドｃｏｌ  Ｅ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭａｌ−Ｃ２、ｐＥＴ、ｐＧＥＸ、ｐＭＢ９及びそれらの誘導体、ＲＰ４などのプラスミド；ファージＤＮＡ、例えばファージ１、例えばＮＭ９８９、及び他のファージＤＮＡ、例えば、Ｍ１３及び繊維状一本鎖ファージＤＮＡの極めて多数の誘導体；２μプラスミド又はその誘導体などの酵母プラスミド、真核細胞において有用なベクター、例えば昆虫又は哺乳動物細胞において有用なベクター；プラスミドとファージＤＮＡとの組み合わせに由来するベクター、例えばファージＤＮＡ又は他の発現調節配列を用いるために修飾されているプラスミドを含む。
【００９４】
酵母発現系もまた用いることができる。例えば、２つだけ言及すると、非融合ｐＹＥＳ２ベクター（ＸｂａＩ、ＳｐｈＩ、ＳｈｏＩ、ＮｏｔＩ、ＧｓｔＸＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢｓｔＸＩ、ＢａｍＨ１、ＳａｃＩ、Ｋｐｎ１、及びＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）又は融合ｐＹＥＳＨｉｓＡ、Ｂ、Ｃ（ＸｂａＩ、ＳｐｈＩ、ＳｈｏＩ、ＮｏｔＩ、ＢｓｔＸＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨ１、ＳａｃＩ、ＫｐｎＩ、及びＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位、ＰｒｏＢｏｎｄ樹脂で精製され、エンテロキナーゼで切断されるＮ末端ペプチド；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を本発明に従って用いることができる。酵母ツーハイブリッド発現系もまた、本発明に従って調製され得る。
【００９５】
ベクターはまた、調節領域を含み得る。用語「調節領域」は、転写又は翻訳の開始及び速度、並びに転写又は翻訳産物の安定性及び／又は移動性に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。調節領域は、限定はされないが、プロモーター配列、エンハンサー配列、応答配列、タンパク質認識部位、誘導性エレメント、タンパク質結合配列、５’及び３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、転写開始部位、終結配列、ポリアデニル化配列、核局在化シグナル、及びイントロンを含む。
【００９６】
本明細書で用いられるとき、用語「作動可能に連結される」は、調節領域及び核酸内の転写されるべき配列の、かかる配列の転写又は翻訳に影響を及ぼすような位置決めを指す。例えば、プロモーターの制御下でコード配列をもたらすため、ポリペプチドの翻訳リーディングフレームの翻訳開始部位は、典型的には、プロモーターの下流の１ヌクレオチドと約５０ヌクレオチドとの間に位置決めされる。しかし、プロモーターは、翻訳開始部位の約５，０００ヌクレオチド上流又は転写開始部位の約２，０００ヌクレオチド上流に至るまで位置決めすることができる。プロモーターは、典型的には、少なくともコア（基礎）プロモーターを含む。プロモーターはまた、少なくとも１つの調節エレメント、例えば、エンハンサー配列、上流エレメント又は上流活性化領域（ＵＡＲ）を含んでもよい。含めるべきプロモーターの選択は、限定はされないが、効率、選択性、誘導能、所望される発現レベル、及び細胞又は組織優先的発現を含む、いくつかの要素に依存する。コード配列に対するプロモーター及び他の調節領域を適切に選択し、位置決めすることにより、コード配列の発現を調節することは、当業者にとっての日常的問題である。
【００９７】
ベクターは、例えば、ウイルスベクター（アデノウイルス（「Ａｄ」）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、及び水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）及びレトロウイルス）、リポソーム及び他の脂質含有複合体、並びにポリヌクレオチドの宿主細胞への送達を媒介する能力がある他の高分子複合体を含む。ベクターはまた、遺伝子送達及び／若しくは遺伝子発現をさらに調節する、又はそれ以外として標的化細胞に対して有利な特性をもたらす他の成分又は機能性を含み得る。下にさらに詳細に説明及び例示される通り、かかる他の成分は、例えば、細胞に対する結合又は標的化に影響を及ぼす成分（細胞型又は組織に特異的な結合を媒介する成分を含む）；ベクター核酸の細胞による取り込みに影響を及ぼす成分；取り込み後の細胞内部でのポリヌクレオチドの局所化に影響を及ぼす成分（核局在化を媒介する作用物質など）；及びポリヌクレオチドの発現に影響を及ぼす成分を含む。かかる成分であれば、ベクターによって送達された核酸を取り込んでいて、発現している細胞を検出又は選択するために使用可能な検出可能及び／又は選択可能マーカーなどのマーカーを含んでもよい。かかる成分は、ベクターの天然特性として提供され得る（結合及び取り込みを媒介する成分又は機能性を有する特定のウイルスベクターの使用など）、又はベクターは、かかる機能性を提供するため、修飾され得る。他のベクターとして、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ；ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３４：１６７−１７１（２００３）に記載のものが挙げられる。多種多様なかかるベクターは、当該技術分野で公知であり、一般に利用可能である。
【００９８】
「組換えウイルスベクター」は、１つ以上の異種遺伝子産物又は配列を含むウイルスベクターを指す。多数のウイルスベクターがパッケージングに関連したサイズ制限を示すことから、異種遺伝子産物又は配列は、典型的にはウイルスゲノムの１つ以上の部分を置換することにより導入される。かかるウイルスは、複製欠損になり、（例えば、複製及び／又はキャプシド形成にとって必要な遺伝子産物を保有するヘルパーウイルス又はパッケージング細胞株を用いることにより）ウイルス複製及びキャプシド形成の間にトランスで備えられるべきその欠失された機能を必要とすることがある。送達対象のポリヌクレオチドがウイルス粒子の外側で運搬される場合の修飾ウイルスベクターについての記載もなされている（例えば、Ｃｕｒｉｅｌ，Ｄ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ８８：８８５０−８８５４，１９９１を参照）。
【００９９】
好適な核酸送達系は、組換えウイルスベクター、典型的には、アデノウイルス、アデノウイルス随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルパー依存性アデノウイルス、レトロウイルス、又はセンダイウイルス−リポソーム（ＨＶＪ）複合体の少なくとも１つからの配列を含む。かかる場合、ウイルスベクターは、ポリヌクレオチドに作動可能に連結された強力な真核生物プロモーター、例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを含む。組換えウイルスベクターは、その中に１つ以上のポリヌクレオチド、好ましくは約１つのポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、本発明の方法で用いられるウイルスベクターは、約１０８〜約５×１０１０ｐｆｕのｐｆｕ（プラーク形成単位）を有する。ポリヌクレオチドが非ウイルスベクターを用いて投与されるべきであるような実施形態では、約０．１ｎｇ〜約４０００μｇの間、例えば約１ｎｇ〜約１００μｇの使用は、有用となることが多い。
【０１００】
さらなるベクターは、ウイルスベクター、融合タンパク質及び化学的コンジュゲートを含む。レトロウイルスベクターは、モロニーマウス白血病ウイルス及びＨＩＶに基づくウイルスを含む。１つのＨＩＶに基づくウイルスベクターは、少なくとも２つのベクターを含み、ここでｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子はＨＩＶゲノムに由来し、ｅｎｖ遺伝子は別のウイルスに由来する。ＤＮＡウイルスベクターは、オルソポックス又はトリポックスベクターなどのポックスベクター、単純ヘルペスＩウイルス（ＨＳＶ）ベクターなどのヘルペスウイルスベクター［Ｇｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ，６４：４８７（１９９５）；Ｌｉｍ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ，Ｅｄ．（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｅｎｇｌａｎｄ）（１９９５）；Ｇｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．：Ｕ．Ｓ．Ａ．：９０  ７６０３（１９９３）；Ｇｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ：８７：１１４９（１９９０）］、アデノウイルスベクター［ＬｅＧａｌ  ＬａＳａｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５９：９８８（１９９３）；Ｄａｖｉｄｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３：２１９（１９９３）；Ｙａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：２００４（１９９５）］及びアデノ関連ウイルスベクター［Ｋａｐｌｉｔｔ，Ｍ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．８：１４８（１９９４）］を含む。
【０１０１】
ポックスウイルスベクターは、遺伝子を細胞の細胞質に導入する。トリポックスウイルスベクターは、核酸の短期間の発現のみをもたらす。アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター及び単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクターは、いくつかの発明実施形態のための指標であってもよい。アデノウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスよりも短期間の発現（例えば約１か月未満）をもたらし、いくつかの実施形態でははるかにより長期間の発現を示すことがある。選択される特定ベクターは、処置されている標的細胞及び状態に依存することになる。適切なプロモーターの選択は、容易に行うことができる。好適なプロモーターの例が、７６３塩基対のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターである。遺伝子発現用に用いてもよい他の好適なプロモーターとして、限定はされないが、ラウス肉腫ウイルス（Ｒｏｕｓ  ｓａｒｃｏｍａ  ｖｉｒｕｓ）（ＲＳＶ）（Ｄａｖｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ４：１５１（１９９３））、ＳＶ４０初期プロモーター領域、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター、メタロチオネイン（ＭＭＴ）遺伝子の制御配列、β−ラクタマーゼプロモーターなどの原核生物発現ベクター、ｔａｃプロモーター、Ｇａｌ４プロモーターなどの酵母又は他の真菌からのプロモーターエレメント、ＡＤＣ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター；及び組織特異性を示し、トランスジェニック動物において利用されている動物転写調節領域：膵臓腺房細胞内で活性があるエラスターゼＩ遺伝子制御領域、膵β細胞内で活性があるインスリン遺伝子制御領域、リンパ系細胞内で活性がある免疫グロブリン遺伝子制御領域、精巣、乳房、リンパ系及びマスト細胞において活性があるマウス乳腺腫瘍ウイルス制御領域、肝臓において活性があるアルブミン遺伝子制御領域、肝臓において活性があるα−フェトプロテイン遺伝子制御領域、肝臓において活性があるα１−アンチトリプシン遺伝子制御領域、骨髄系細胞内で活性があるβ−グロビン遺伝子制御領域、脳におけるオリゴデンドロサイト細胞内で活性があるミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域、骨格筋において活性があるミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域、及び視床下部において活性がある性腺刺激放出ホルモン遺伝子制御領域、が挙げられる。特定のタンパク質は、その天然プロモーターを用いて発現され得る。発現を増強し得る他のエレメント、例えばｔａｔ遺伝子及びｔａｒエレメントなどの高レベルの発現をもたらすエンハンサー又はシステムもまた、含めることができる。次に、このカセットは、ベクター、例えばプラスミドベクター、例えば、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＢＲ３２２、又は他の既知のプラスミドベクター（例えば、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）複製起点を含む）に挿入され得る。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ，（１９８９）を参照のこと。プラスミドベクターはまた、マーカーポリペプチドが処置されている生物の代謝に悪影���を及ぼさないという条件で、アンピシリン耐性のためのβ−ラクタマーゼ遺伝子などの選択可能マーカーを含んでもよい。このカセットはまた、合成送達系、例えば国際公開第９５／２２６１８号パンフレットに開示される系における核酸結合部分に結合され得る。
【０１０２】
必要に応じて、本発明のポリヌクレオチドはまた、カチオン性リポソーム及びアデノウイルスベクターなどのミクロ送達媒体とともに用いることができる。リポソームの調製、標的化及び内容物の送達における手順のレビューについては、Ｍａｎｎｉｎｏ  ａｎｄ  Ｇｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，６：６８２（１９８８）を参照のこと。Ｆｅｌｇｎｅｒ  ａｎｄ  Ｈｏｌｍ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓ．Ｌａｂ．Ｆｏｃｕｓ，１１（２）：２１（１９８９）及びＭａｕｒｅｒ，Ｒ．Ａ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓ．Ｌａｂ．Ｆｏｃｕｓ，１１（２）：２５（１９８９）も参照のこと。
【０１０３】
複製欠損組換えアデノウイルスベクターは、公知の技術に従って生成され得る。Ｑｕａｎｔｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：２５８１−２５８４（１９９２）；Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｄｅｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９０：６２６−６３０（１９９２）；及びＲｏｓｅｎｆｅｌｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，６８：１４３−１５５（１９９２）を参照のこと。
【０１０４】
別の送達方法は、発現生成物を細胞内に生成し得る一本鎖ＤＮＡ生成ベクターを用いることである。例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３４：１６７−１７１（２００３）（その全体が参照により本明細書中に援用される）を参照のこと。
【０１０５】
上記の通り、本発明の組成物は、当業者に公知の種々の方法で調製され得る。それらの供給元又はそれらが得られる方法と無関係に、本発明の組成物は、それらの使用に従って配合され得る。例えば、上記の核酸及びベクターは、組織培養物中の細胞への適用又は患者又は被験者への投与のための組成物中で配合され得る。本発明の医薬組成物のいずれかは、薬剤の調製における使用において配合され得、特定使用が、治療、例えばウイルスを有するか又はウイルスに罹患するリスクがある被験者の治療との関連で以下に示される。医薬品として用いられるとき、核酸及びベクターのいずれかは、医薬組成物の形態で投与され得る。これらの組成物は、薬学的技術における周知の方法で調製され得、局所又は全身治療のいずれが所望されるかや治療対象領域に応じて、種々の経路により投与され得る。投与は、局所（例えば点眼及び粘膜向け、例えば鼻腔内、膣及び直腸送達）、肺（例えば、粉末又はエアロゾルの吸入又は吹送による、例えば噴霧器；気管内、鼻腔内、上皮及び経皮による）、眼内、経口又は非経口であってもよい。眼内送達のための方法は、局所投与（点眼剤）、結膜下、眼周囲若しくは硝子体内注射又は結膜嚢内に外科的に配置されたバルーンカテーテル若しくは眼インサートによる導入を含み得る。非経口投与は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内若しくは筋肉内注射又は注入；又は頭蓋内、例えばくも膜下腔内若しくは脳室内投与を含む。非経口投与は、単回ボーラス投与の形態であり得るか、又は例えば連続注入ポンプを介してもよい。局所投与用の医薬組成物及び製剤は、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、坐剤、スプレー、液体、粉末などを含んでもよい。通常の薬学的担体、水性、粉末又は油性基材、増粘剤などが、必要であるか又は望ましい場合がある。
【０１０６】
本発明はまた、活性成分として、１つ以上の薬学的に許容できる担体と組み合わせた本明細書に記載の核酸及びベクターを含有する医薬組成物を含む。用語「薬学的に許容できる」（又は「薬理学的に許容できる」）は、必要に応じて、動物又はヒトに投与されるときに有害なアレルギー反応又は他の有害な反応をもたらさない分子実体及び組成物を指す。本明細書で開示される方法及び組成物は、広範囲の種、例えば、ヒト、非ヒト霊長類（例えばサル）、ウマ又は他の家畜、イヌ、ネコ、フェレット又はペットとして維持される他の哺乳類、ラット、マウス、又は他の実験動物に適用され得る。用語「薬学的に許容できる担体」は、本明細書で用いられるとき、薬学的に許容できる物質用の培地として用いてもよい、ありとあらゆる溶剤、分散媒、コーティング剤、抗菌剤、等張化及び吸収遅延剤、緩衝液、賦形剤、結合剤、滑沢剤、ゲル剤、界面活性剤などを含む。本発明の組成物を作製する場合、活性成分は、典型的には、賦形剤によって希釈された、又は例えばカプセル、錠剤、サシェ剤、ペーパー、又は他の容器の形態でかかる担体中に封入された賦形剤と混合される。賦形剤が希釈剤として働くとき、それは、固体、半固体、又は液体材料（例えば通常の生理食塩水）であり得、活性成分用の媒体、担体又は培地として作用する。したがって、この組成物は、錠剤、丸剤、散剤、トローチ剤、サシェ剤、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁液、乳剤、溶液、シロップ剤、エアロゾル（固体として又は液体培地中）、ローション剤、クリーム、軟膏剤、ゲル剤、ソフト及びハードゼラチンカプセル剤、坐剤、滅菌注射可能溶液、及び滅菌封入粉末剤の形態であり得る。当該技術分野で公知の通り、希釈剤のタイプは、意図される投与経路に応じて変更され得る。得られる組成物は、追加的な作用剤、例えば保存剤を含み得る。いくつかの実施形態では、担体は、脂質に基づく又はポリマーに基づくコロイドであり得る、又はそれを含み得る。いくつかの実施形態では、担体材料は、リポソーム、ハイドロゲル、微小粒子、ナノ粒子、又はブロック共重合体ミセルとして配合されるコロイドであり得る。上記の通り、担体材料は、カプセル剤を形成し得、その材料は、ポリマーに基づくコロイドであってもよい。
【０１０７】
本発明の核酸配列は、被験者の適切な細胞に送達され得る。これは、例えば、マクロファージなどの食細胞による食作用を最適化するようにサイズ分類された、高分子、生分解性微小粒子又はマイクロカプセル送達媒体の使用により、達成され得る。例えば、直径が約１〜１０μｍのＰＬＧＡ（ポリ−ラクト−コ−グリコリド）微小粒子を用いることができる。ポリヌクレオチドは、これらの微小粒子中に封入され、微小粒子はマクロファージにより取り込まれ、細胞内部で徐々に生物分解され、それによりポリヌクレオチドが放出される。ＤＮＡは、一旦放出されると、細胞内部で発現される。微小粒子の第２のタイプは、細胞によって直接的に取り込まれず、むしろ主に生分解を通じた微小粒子からの放出時に限って細胞によって取り込まれる核酸の徐放リザーバーとして役立つことが意図される。したがって、これらのポリマー粒子は、食作用を排除するように十分に大きい（すなわち、５μｍより大きい、好ましくは２０μｍより大きい）必要がある。核酸の取り込みを達成するための別の方法は、標準的方法によって調製される、リポソームを用いることである。核酸は、単独でこれらの送達媒体に組み込まれ得る、又は組織特異的抗体、例えば、一般にＨＩＶ感染の潜在感染リザーバーである細胞型、例えば、脳マクロファージ、ミクログリア、星状細胞、及び腸関連リンパ系細胞を標的にする抗体と共に組み込まれ得る。或いは、静電気力又は共有結合力によりポリ−Ｌ−リジンに結合されたプラスミド又は他のベクターから構成される分子複合体を調製することができる。ポリ−Ｌ−リジンは、標的細胞上の受容体に結合し得るリガンドに結合する。「ネイキッドＤＮＡ」（すなわち送達媒体を伴わない）の筋肉内、皮内、又は皮下部位への送達は、インビボ発現を達成するためのもう一つの手段である。関連ポリヌクレオチド（例えば発現ベクター）において、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡをコードする配列を含む単離核酸配列をコードする核酸配列は、プロモーター又はエンハンサーとプロモーターの組み合わせに作動可能に連結される。プロモーター及びエンハンサーは、上記の通りである。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、ナノ粒子、例えば、ＤＮＡと複合され、ポリエチレングリコール修飾（ＰＥＧ化）低分子量ＬＰＥＩのシェルで包囲された高分子量線状ポリエチレンイミン（ＬＰＥＩ）のコアからなるナノ粒子として配合され得る。
【０１０９】
核酸及びベクターはまた、デバイス（例えばカテーテル）の表面に適用される、又はポンプ、パッチ、若しくは他の薬物送達デバイスの内部に含められてもよい。本発明の核酸及びベクターは、単独で、又は混合物で、薬学的に許容できる賦形剤又は担体（例えば生理食塩水）の存在下で投与され得る。賦形剤又は担体は、投与のモード及び経路に基づいて選択される。好適な薬学的担体、並びに医薬製剤における使用が意図される医薬品の必要性については、当該技術分野、及びＵＳＰ／ＮＦ（米国薬局方及び国民医薬品集）における周知の参照テキストであるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ）に記載されている。
【０１１０】
本発明は、ウイルスＤＮＡを標的にする、２つ以上のＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、及びＴｅｖＣａｓ９  ｇＲＮＡ、アルゴノートエンドヌクレアーゼｇＤＮＡ及び他の遺伝子エディタを含む組成物を、溶原性ウイルスを有する個体に投与することにより、溶原性ウイルスを処置し、溶原性ウイルスを不活性化する方法を提供する。溶原性ウイルスは、宿主細胞のゲノムに組み込まれ、この組成物は、宿主細胞からウイルスＤＮＡを切除することにより溶原性ウイルスを不活性化する。この組成物は、上記のような特性のいずれかを含み得、例えば、単離核酸中に存在し得、ベクター送達系内にパッケージングされ得、又はＤＮＡを標的にする他のＣＲＩＳＰＲ若しくは遺伝子編集システムを含み得る。溶菌性ウイルスは、上の表に列挙されるいずれかであり得る。
【０１１１】
本明細書に記載の方法のいずれかにおいて、処置は、インビボ（組成物を直接的に投与する）又は生体外（例えば、細胞若しくは複数の細胞、又は組織外植片が、ウイルス感染を有する被験者から除去され、培養下に置かれ、次に組成物で処置され得る）であり得る。有用なベクター系及び製剤は、上記の通りである。いくつかの実施形態では、ベクターは、この組成物を特定の細胞型に送達し得る。しかし、本発明は、それほど制限されることはなく、ＤＮＡ送達の他の方法、例えば、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、リポソーム、リポプレックス、界面活性剤、及びパーフルオロ化学液体を用いる化学的トランスフェクションなどもまた、物理的送達方法、例えば、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、弾道粒子、及び「遺伝子銃」システムと同様、検討される。本明細書に記載の方法のいずれかにおいて、投与される組成物の量は、個体に存在するウイルスのすべてを不活化するのに十分である。個体は、臨床的に有利な結果が生じるときはいつでも有効に処置される。これは、例えば、疾患の症状の完全消失、疾患の症状の重症度における低下、又は疾患の進行の緩徐化を意味してもよい。本方法はまた、投与及びスケジューリングの最適化を補助するとともに、アウトカムを予測するため、監視するステップを含んでもよい。
【０１１２】
本明細書に記載の任意の組成物は、宿主の身体のいずれかの部分に投与され、その後に標的細胞に送達され得る。組成物は、限定はされないが、哺乳動物の脳、脳脊髄液、関節、鼻粘膜、血液、肺、腸、筋肉組織、皮膚、又は腹膜腔に送達され得る。送達経路の観点でいえば、組成物は、静脈内、頭蓋内、腹腔内、筋肉内、皮下、筋肉内、直腸内、腟内、くも膜下腔内、気管内、皮内、又は経皮注射により、経口又は経鼻投与により、又は経時的な段階的灌流により、投与され得る。さらなる例では、組成物のエアロゾル製剤が、吸入により宿主に投与され得る。
【０１１３】
必要とされる用量は、投与経路、製剤の性質、患者の疾病の性質、患者の身長、体重、体表面積、年齢、及び性別、その他の投与中の薬剤、並びに主治医の判断に依存することになる。必要用量における大幅な変動は、細胞標的の多様性及び様々な投与経路の異なる効率を考慮して想定されるべきである。これらの用量レベルにおける変動は、当該技術分野で十分に理解されているように、最適化における標準の経験的ルーチンを用いて調節され得る。投与は、単回又は複数回（例えば、２回又は３回、４回、６回、８回、１０回、２０回、５０回、１００回、１５０回、又はより多回）であり得る。好適な送達媒体（例えば、高分子微小粒子又は移植可能デバイス）への化合物の封入により、送達の効率が増加することがある。
【０１１４】
本明細書に提供される任意の組成物による処置の持続時間は、１日程度の短さから宿主の寿命程度の長さまで（例えば多年）の任意の時間の長さであり得る。例えば、化合物は、週１回（例えば、４週から長い年月にかけて）；月１回（例えば、３〜１２か月間又は長年にかけて）；又は年１回として５年間、１０年間、又はそれより長い期間、投与され得る。処置の頻度が変動し得ることも知られている。例えば、本化合物は、１回（又は２回、３回など）として毎日、毎週、毎月、又は毎年、投与され得る。
【０１１５】
本明細書に提供される任意の組成物は、有効量で治療を必要とする個体に投与され得る。用語「有効な」は、本明細書で用いられるとき患者において所望される応答を誘導する一方で有意な毒性を誘導しない任意の量を指す。かかる量は、特定組成物の既知量での投与後に患者の応答を評価することにより判定され得る。さらに、毒性のレベルは、存在する場合、特定組成物の既知量での投与の前と後に患者の臨床症状を評価することにより判定され得る。患者に投与される特定組成物の有効量、並びに患者の応答及び毒性のレベルは、所望されるアウトカムに従って調節され得る。有意な毒性は、特定患者の各々において変動し得、限定はされないが、患者の病態、年齢、及び副作用に対する耐性を含む複数の要素に依存する。
【０１１６】
本発明はまた、溶菌性ウイルスを処置するための方法であって、ウイルスＤＮＡを標的にする、２つ以上のＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ３、ＴｅｖＣａｓ９、古細菌Ｃａｓ９、ＣａｓＹ．１〜ＣａｓＹ．６、及びＣａｓＸ  ｇＲＮＡ、アルゴノートエンドヌクレアーゼｇＤＮＡ及び他の遺伝子エディタをコードするベクター、並びにウイルスＲＮＡを標的にする、ｓｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ／ＲＮＡｉ及びＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ３、ＴｅｖＣａｓ９、古細菌Ｃａｓ９、ＣａｓＹ．１〜ＣａｓＹ．６、及びＣａｓＸ  ｇＲＮＡ、アルゴノートエンドヌクレアーゼｇＤＮＡ及び他の遺伝子エディタから選択される組成物を、溶菌性ウイルスを有する個体に投与するステップと、溶菌性ウイルスを不活性化するステップと、を含む、方法を提供する。この組成物は、溶菌性ウイルスを、ウイルスＤＮＡ及びＲＮＡを宿主細胞から切除することにより不活性化する。この組成物は、上記のような特性のいずれかを含み得、例えば、単離核酸中に存在し得、ベクター送達系内にパッケージングされ得、又はＤＮＡを標的にする他のＣＲＩＳＰＲ若しくは遺伝子編集システムを含み得る。溶菌性ウイルスは、上の表に列挙されるいずれかであり得る。
【０１１７】
本発明はまた、ウイルスＲＮＡを標的にする、２つ以上のＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ３、ＴｅｖＣａｓ９、古細菌Ｃａｓ９、ＣａｓＹ．１〜ＣａｓＹ．６、及びＣａｓＸ  ｇＲＮＡ、アルゴノートエンドヌクレアーゼｇＤＮＡ及び他の遺伝子エディタをコードするベクターを含む組成物を、溶原性ウイルス及び溶菌性ウイルスを有する個体に投与し、溶原性ウイルス及び溶菌性ウイルスを不活性化することにより、溶原性及び溶菌性ウイルスの双方を処置するための方法を提供する。この組成物は、ウイルスを、ウイルスＲＮＡを宿主細胞から切除することにより不活性化する。この組成物は、上記のような特性のいずれかを含み得、例えば、単離核酸中に存在し得、又はＲＮＡを標的にする他のＣＲＩＳＰＲ若しくは遺伝子編集システムを含み得る。溶原性ウイルス及び溶菌性ウイルスは、上の表に列挙されるいずれかであり得る。
【０１１８】
感染のポイントで又はウイルスが細胞質に侵入しているとき、それは、非組み込み性の（ＤＮＡに変換されない）ＲＮＡに基づくゲノムを含み得るが、溶原型の複製サイクルに寄与する。この上流ポイントで、ウイルスゲノムは除去され得る。他方で、この手法は、（ゲノムが翻訳されるとき）下流で生じるウイルスｍＲＮＡを標的にするためにも用いることができる。今日まで、当該技術全体を通じてアルゴノートが引用されるが、それはＲＮＡ分子を認識するために修飾されていない。
【０１１９】
本発明は、ウイルスＲＮＡを標的にする、２つ以上のＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ３、ＴｅｖＣａｓ９、古細菌Ｃａｓ９、ＣａｓＹ．１〜ＣａｓＹ．６、及びＣａｓＸ  ｇＲＮＡ、アルゴノートエンドヌクレアーゼｇＤＮＡ及び他の遺伝子エディタをコードするベクター、並びにウイルスＲＮＡを標的にするｓｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ／ＲＮＡｉを含む組成物を、溶菌性ウイルスを有する個体に投与し、溶菌性ウイルスを不活性化することにより、溶菌性ウイルスを処置するための方法を提供する。この組成物は、溶菌性ウイルスを、ウイルスＲＮＡを宿主細胞から切除することにより不活性化する。この組成物は、上記のような特性のいずれかを含み得、例えば単離核酸中に存在し得、又はＲＮＡを標的にする他のＣＲＩＳＰＲ若しくは遺伝子編集システムを含み得る。ＲＮＡを標的にし、ＲＮＡに基づくウイルスゲノム及び／又は下流に存在するウイルスｍＲＮＡを切除し得る、２つ以上の遺伝子エディタが利用されることになる。ヌクレアーゼに基づく機構を用いないｓｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ／ＲＮＡｉの場合、ウイルスＲＮＡ転写物（非コーディング又はコーディング）に対する分解によるサイレンシングのために１つ以上が利用される。溶菌性ウイルスは、上の表に列挙されるいずれかであり得る。
【０１２０】
本願全体を通じて、米国特許を含む様々な出版物が著者及び年度により、また特許が番号により参照される。出版物に対するすべての引用が、下記に列挙される。本発明が関係する最新技術をより完全に説明するため、これらの出版物及び特許の開示は、それら全体がここで参照により本願中に援用される。
【０１２１】
本発明は、例示的様式で記載されており、用いられている用語が、制限するものではなく、説明する用語の性質の中に含まれることが意図されることは理解されるべきである。
【０１２２】
明らかに、本発明の多数の修飾及びバリエーションは、上記教示のおかげで可能である。したがって、添付の特許請求の範囲の範囲内で、本発明が詳細説明した通り以外にも実施可能であることは理解されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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