(57)【要約】  本開示は、癌治療に使用することができるドキソルビシン−金ナノコンジュゲートを提供する。本開示は、ナノコンジュゲートを作製及び使用する方法を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）と、ジチオール化ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＤＴＰＡ）と、チオクト酸末端ペプチドと、ドキソルビシンと、を含み、
前記ＤＴＤＴＰＡが少なくとも１つのＡｕ−Ｓ結合を介して前記金ナノ粒子表面に直接連結され、
前記チオクト酸末端ペプチドが少なくとも１つのＡｕ−Ｓ結合を介して前記金ナノ粒子表面に直接連結され、
前記ドキソルビシンが前記ＤＴＤＴＰＡに連結されている、
ナノコンジュゲート。
【請求項２】
前記チオクト酸末端ペプチドが、チオクト酸末端ボンベシンである、請求項１に記載のナノコンジュゲート。
【請求項３】
前記チオクト酸末端ボンベシンが、配列：リポ酸−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＮＨ２を有する、請求項２に記載のナノコンジュゲート。
【請求項４】
前記ドキソルビシンが、アミド結合を介して前記ＤＴＤＴＰＡに連結されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載のナノコンジュゲート。
【請求項５】
ＡｕＮＰ−ＤＴＤＴＰＡナノ粒子を前記チオクト酸末端ペプチドとコンジュゲートさせることを含むプロセスによって調製され、前記金ナノ粒子中の金及び前記チオクト酸末端ペプチドが、約１：０．５〜約１：４の化学量論比でコンジュゲーション反応中に存在する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のナノコンジュゲート。
【請求項６】
前記金ナノ粒子中の金及び前記チオクト酸末端ペプチドが、約１：２の化学量論比で前記コンジュゲーション反応中に存在する、請求項５に記載のナノコンジュゲート。
【請求項７】
前記チオクト酸末端ペプチドが、前記ナノコンジュゲートの約１重量％〜約４０重量％を構成する、請求項１〜６のいずれか一項に記載のナノコンジュゲート。
【請求項８】
前記チオクト酸末端ペプチドが、前記ナノコンジュゲートの約２０重量％〜約３０重量％を構成する、請求項７に記載のナノコンジュゲート。
【請求項９】
前記ドキソルビシンが、前記ナノコンジュゲートの約０．０１重量％〜約０．０５重量％を構成する、請求項１〜８のいずれか一項に記載のナノコンジュゲート。
【請求項１０】
前記ドキソルビシンが、前記ナノコンジュゲートの約０．０３重量％を構成する、請求項９に記載のナノコンジュゲート。
【請求項１１】
前記ナノコンジュゲートが、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定されるとき、約１１０ｎｍ〜約１４０ｎｍの流体力学的直径を有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のナノコンジュゲート。
【請求項１２】
前記ナノコンジュゲートが、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定されるとき、約１２０ｎｍ〜約１３０ｎｍの流体力学的直径を有する、請求項１１に記載のナノコンジュゲート。
【請求項１３】
前記ナノコンジュゲートが、約−１５ｍＶ〜約−３０ｍＶのゼータ電位値を有する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のナノコンジュゲート。
【請求項１４】
前記ナノコンジュゲートが、約−２０ｍＶ〜約−２５ｍＶのゼータ電位値を有する、請求項１３に記載のナノコンジュゲート。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載のナノコンジュゲートと、医薬的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
【請求項１６】
治療有効量の請求項１〜１４のいずれか一項に記載のナノコンジュゲートを、癌の治療を必要とする対象に投与することを含む、癌を治療するための方法。
【請求項１７】
前記癌が、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄芽球性白血病（ＡＭＬ）、骨肉腫、乳癌、子宮内膜癌、胃癌、頭頸部癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、肝臓癌、腎臓癌、多発性骨髄腫、神経芽腫、卵巣癌、肺癌、軟部肉腫、胸腺腫、甲状腺癌、膀胱癌、子宮肉腫、前立腺癌、結腸癌、卵巣癌、非小細胞肺癌、膵臓癌、ウィルムス腫瘍、及びワルデンシュトレームマクログロブリン血症からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ナノコンジュゲートが、注射によって前記対象に投与される、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項１９】
金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）と、ジチオール化ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＤＴＰＡ）と、ドキソルビシンとを含み、前記ＤＴＤＴＰＡが少なくとも１つのＡｕ−Ｓ結合を介して前記金ナノ粒子表面に直接連結され、前記ドキソルビシンが前記ＤＴＤＴＰＡに連結されている、ナノコンジュゲート。
【請求項２０】
請求項１９に記載のナノコンジュゲートと、医薬的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
【請求項２１】
治療有効量の請求項１９に記載のナノコンジュゲートを、癌の治療を必要とする対象に投与することを含む、癌を治療するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、癌治療に使用することができるドキソルビシン−金ナノコンジュゲートに関する。本開示はまた、ナノコンジュゲートを作製及び使用する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ドキソルビシン（Doxorubicin、ＤＯＸ）は、現在、乳癌、卵巣癌、肝臓癌、腎臓癌などを含むいくつかの腫瘍に臨床的に使用されている化学療法薬である。
【化１】
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ドキソルビシンに関連する主要な副作用の１つは、その心臓毒性である。心臓毒性は、標的化投与によって、又は薬物の濃度を低下させることによって最小限に抑えることができる。しかしながら、投与される薬物の量を減少させることにより、細胞毒性及び有効性が低下する。抗体−薬物コンジュゲートは標的化送達のために開発されてきたが、低心臓毒性及び／又は高有効性を有するドキソルビシン送達プラットフォームを開発する必要性が依然として存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本開示は、ドキソルビシンの標的化送達のための金ナノコンジュゲートを提供する。本開示は、金ナノ粒子（gold nanoparticle、ＡｕＮＰ）と、ジチオール化ジエチレントリアミン五酢酸（dithiolated diethylenetriamine pentaacetic acid、ＤＴＤＴＰＡ）と、チオクト酸末端ペプチドと、ドキソルビシンと、を含むナノコンジュゲートであって、ＤＴＤＴＰＡが少なくとも１つのＡｕ−Ｓ結合を介して金ナノ粒子表面に直接連結され、チオクト酸末端ペプチドが少なくとも１つのＡｕ−Ｓ結合を介して金ナノ粒子表面に直接連結され、ドキソルビシンがＤＴＤＴＰＡに連結されるナノコンジュゲートを提供する。
【０００４】
いくつかの実施形態では、チオクト酸末端ペプチドはチオクト酸ボンベシンである。いくつかの実施形態では、チオクト酸ボンベシンは、配列：リポ酸−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＮＨ２を有する。
【０００５】
いくつかの実施形態では、ドキソルビシンは、アミド結合を介してＤＴＤＴＰＡに連結される。
【０００６】
本開示はまた、本明細書に開示されるナノコンジュゲートを調製するためのプロセスを提供し、このプロセスは、ＡｕＮＰ−ＤＴＤＴＰＡナノ粒子をチオクト酸末端ペプチドにコンジュゲートさせることを含み、金ナノ粒子中の金及びチオクト酸末端ペプチドは、約１：０．５〜約１：４の化学量論比で存在する。いくつかの実施形態では、金ナノ粒子中の金及びチオクト酸末端ペプチドは、約１：２の化学量論比で存在する。
【０００７】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるナノコンジュゲートは、ナノコンジュゲートの約１重量％〜約４０重量％のチオクト酸末端ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるナノコンジュゲートは、ナノコンジュゲートの約２０重量％〜約３０重量％のチオクト酸末端ペプチドを含む。
【０００８】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるナノコンジュゲートは、ナノコンジュゲートの約０．０１重量％〜約０．０５重量％のドキソルビシンを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるナノコンジュゲートは、ナノコンジュゲートの約０．０３重量％のドキソルビシンを含む。
【０００９】
いくつかの実施形態では、ナノコンジュゲートは、動的光散乱（dynamic light scattering、ＤＬＳ）によって測定されるとき、約１１０ｎｍ〜約１４０ｎｍの流体力学的直径を有する。いくつかの実施形態では、ナノコンジュゲートは、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定されるとき、約１２０ｎｍ〜約１３０ｎｍの流体力学的直径を有する。
【００１０】
いくつかの実施形態では、ナノコンジュゲートは、約−１５ｍＶ〜約−３０ｍＶのゼータ電位値を有する。いくつかの実施形態では、ナノコンジュゲートは、約−２０ｍＶ〜約−２５ｍＶのゼータ電位値を有する。
【００１１】
本開示はまた、本明細書に開示されるナノコンジュゲートと医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。
【００１２】
本開示は、治療有効量の本明細書に開示されるナノコンジュゲートを、癌の治療を必要とする対象に投与することを含む、癌を治療するための方法を更に提供する。
【００１３】
いくつかの実施形態では、癌は、急性リンパ性白血病（acute lymphoblastic leukemia、ＡＬＬ）、急性骨髄芽球性白血病（acute myeloblastic leukemia、ＡＭＬ）、骨肉腫、乳癌、子宮内膜癌、胃癌、頭頸部癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、肝臓癌、腎臓癌、多発性骨髄腫、神経芽腫、卵巣癌、肺癌、軟部肉腫、胸腺腫、甲状腺癌、膀胱癌、子宮肉腫、前立腺癌、結腸癌、卵巣癌、非小細胞肺癌、膵臓癌、ウィルムス腫瘍、及びワルデンシュトレームマクログロブリン血症からなる群から選択される。
【００１４】
いくつかの実施形態では、ナノコンジュゲートは、注射によって対象に投与される。
【００１５】
以下は、本明細書に開示される例示的な実施形態を限定する目的ではなく、それを例示する目的で提示される、図面の簡単な説明である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＢＢＮ−ＡｕＮＰ−ＤＴＤＴＰＡ−ＤＯＸ（ＮＰ２−ＤＯＸ）の合成を示す。
【図２】ＢＢＮ−ＡｕＮＰ−ＤＴＤＴＰＡ−ＤＯＸ（ＮＰ２−ＤＯＸ）の概略構造を示す。
【図３】ＨＰＬＣにより測定したときの［ＡｕＮＰ（ＤＴＤＴＰＡ）］に含まれるＴＡ−ＢＢＮの量を決定するための、［ＡｕＮＰ（ＤＴＤＴＰＡ）］によるチオクト酸末端ボンベシン（ＴＡ−ＢＢＮ）滴定のグラフを示す。Ａｕ：ＢＢＮの化学量論比を括弧内に示す。
【図４Ａ】ナノコンジュゲートＮＰ１及びＮＰ２のＴＥＭ画像をそれぞれ示す。
【図４Ｂ】ナノコンジュゲートＮＰ１及びＮＰ２のＴＥＭ画像をそれぞれ示す。
【図４Ｃ】ナノコンジュゲートＮＰ１及びＮＰ２のＵＶ可視吸収スペクトルを示す。
【図５Ａ】ナノコンジュゲートＮＰ２のＸＰＳ調査スペクトルを示す。
【図５Ｂ】ナノコンジュゲートＮＰ２のＣ１ｓ領域のＸＰＳ高分解能スペクトルを示す。
【図６Ａ】ナノコンストラクトＮＰ２のＳ２ｐ領域のＸＰＳ高分解能スペクトルを示す。
【図６Ｂ】ナノコンストラクトＮＰ２のＡｕ４ｆ領域のＸＰＳ高分解能スペクトルを示す。
【図７】５８０ｎｍで励起され、５９０ｎｍで放出するときの、ドキソルビシンの蛍光スペクトルを示す。
【図８】蛍光分光法によるナノコンジュゲートＮＰ１及びＮＰ２上のドキソルビシン負荷の推定を示す。
【図９】ナノコンジュゲートＮＰ１及びＮＰ１−ＤＯＸの蛍光スペクトルを示す。
【図１０】ナノコンジュゲートＮＰ２及びＮＰ２−ＤＯＸの蛍光スペクトルを示す。
【図１１】ＮＰ１、ＮＰ２、ＮＰ１−ＤＯＸ、及びＮＰ２−ＤＯＸのＵＶ可視吸収スペクトルを示す。
【図１２Ａ】ＵＶ可視吸収分光法によるナノコンジュゲートＮＰ１及びＮＰ２のインビトロ安定性試験を示す。
【図１２Ｂ】ＵＶ可視吸収分光法によるナノコンジュゲートＮＰ１及びＮＰ２のインビトロ安定性試験を示す。
【図１２Ｃ】流体力学的サイズによるナノコンジュゲートＮＰ１及びＮＰ２のインビトロ安定性試験を示す。
【図１２Ｄ】流体力学的サイズによるナノコンジュゲートＮＰ１及びＮＰ２のインビトロ安定性試験を示す。
【図１２Ｅ】様々な生物学的に適切な溶液中でインキュベートしたときのゼータ電位によるナノコンジュゲートＮＰ１及びＮＰ２のインビトロ安定性試験を示す。
【図１２Ｆ】様々な生物学的に適切な溶液中でインキュベートしたときのゼータ電位によるナノコンジュゲートＮＰ１及びＮＰ２のインビトロ安定性試験を示す。
【図１３】ＧＲＰ受容体発現前立腺腫瘍ＰＣ−３細胞における、１２５Ｉ−ＢＢＮに対する、ＡＵ：ＢＢＮ（１：０．４、１：２、１：４）の様々な化学量論比でのナノコンジュゲートＮＰ２のＩＣ５０値を示す。
【図１４】ＧＲＰ非発現ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞における、ドキソルビシン単独、ＮＰ１−ＤＯＸ、及びＮＰ２−ＤＯＸのインビトロ細胞毒性を示す。
【図１５】ＧＲＰ非発現ヒト乳癌細胞における、ＮＰ１−ＤＯＸ、ＮＰ２−ＤＯＸの効果をドキソルビシン単独と比較する。
【図１６】ＧＲＰ発現ＰＣ３ヒト前立腺癌細胞における、ドキソルビシン単独、ＮＰ１−ＤＯＸ、及びＮＰ２−ＤＯＸのインビトロ細胞毒性を示す。
【図１７】ＧＲＰ発現ヒト前立腺癌細胞において、ＮＰ１−ＤＯＸ、ＮＰ２−ＤＯＸの効果をドキソルビシン単独と比較する。
【図１８】ＧＲＰ発現（ＰＣ３）ヒト癌細胞において、ナノコンジュゲート（ＮＰ１−ＤＯＸ及びＮＰ２−ＤＯＸ）中のドキソルビシンのＩＣ５０値をドキソルビシン単独と比較する。
【図１９】ＧＲＰ非発現（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）ヒト癌細胞において、ナノコンジュゲート（ＮＰ１−ＤＯＸ及びＮＰ２−ＤＯＸ）中のドキソルビシンのＩＣ５０値をドキソルビシン単独と比較する。
【図２０】ＧＲＰ発現（ＰＣ３）ヒト癌細胞及びＧＲＰ非発現（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）ヒト癌細胞において、ＮＰ１−ＤＯＸ及びＮＰ２−ＤＯＸの細胞死のパーセンテージの差を比較する。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
ガストリン放出ペプチド（gastrin releasing peptide、ＧＲＰ）受容体は、乳癌、前立腺癌、結腸癌、及び他の癌などの様々なヒト癌細胞において過剰発現している。ボンベシンペプチド及びその類似体は、ＧＲＰ受容体を標的とすることが知られている。ある特定の実施形態では、本開示は、金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）と、標的化剤（例えば、ボンベシン（bombesin、ＢＢＮ））と、癌治療薬としてのドキソルビシン（ＤＯＸ）とを含む多成分ナノ粒子送達系（ナノコンジュゲート）を提供する。金ナノ粒子は、ジチオール化ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＤＴＰＡ）で安定化され、多層構造を有することができる。したがって、特定の実施形態では、ナノコンジュゲートはＢＢＮ−ＡｕＮＰ（ＤＴＤＴＰＡ）−ＤＯＸであり得る。乳癌細胞において実施されるインビトロ細胞毒性アッセイは、驚くべきことに、ＢＢＮ−ＡｕＮＰ（ＤＴＤＴＰＡ）−ＤＯＸが遊離ドキソルビシンと比較してはるかに強力であることが実証された。
【００１８】
本明細書に開示される本発明の主題の様々な実施例及び実施形態が可能であり、本開示の恩恵を受けて当業者には明らかとなるであろう。本開示において、「いくつかの実施形態」、「特定の実施形態」、及び同様の語句はそれぞれ、これらの実施形態が本発明の主題の非限定的な例であることを意味し、除外されない代替的な実施形態が存在することを意味する。
【００１９】
冠詞「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、本明細書では、物品の文法的対象物の１つ又は１つより多くの（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用される。例として、「要素」は、１つの要素又は１つより多い要素を意味する。用語「又は」は、「及び／又は」を意味する。用語「含む（comprising）」、「有する（having）」、「含む（including）」及び「含む（containing）」は、無制限の用語（すなわち、「含むが、これらに限定されない」を意味する）と解釈されるべきである。
【００２０】
「含む（comprising）」という語は、その無制限の意味と一致する方法で使用され、すなわち、所与の製品又はプロセスが、所望により、明示的に記載されたものを超える追加の特徴又は要素も有することができることを意味する。当然のことながら、本実施形態は、「含む（comprising）」という言葉で説明されている場合、「からなる」及び／又は「から本質的になる」という用語で説明されるその他が類似の実施形態もまた企図され、本開示の範囲内であることが理解される。
【００２１】
本明細書で使用するとき、「約」という用語は、記載された値の±１０％を意味する。ほんの一例として、「約３０重量％」の化合物を含む組成物は、２７重量％の化合物から３３重量％までの化合物及びそれを含む化合物を含むことができる。
【００２２】
本明細書で使用するとき、用語「ナノコンジュゲート」は、金ナノ粒子、並びに安定化剤、標的化剤及び治療薬などの他の成分を含むナノ材料を指す。特定の実施形態では、安定化剤及び標的化剤は、１つ以上の共有結合又は非共有結合を介して金ナノ粒子表面に直接結合され得る。治療薬などのいくつかの成分は、安定化剤などの別の成分を介して金ナノ粒子に連結され得る。
【００２３】
本明細書で使用するとき、「治療有効量」という用語は、患者に投与されたときに意図される治療効果をもたらすのに有効な量を意味する。「有効」である量は、個人の年齢及び全身状態などに応じて、対象間で変動し得る。
【００２４】
特定の実施形態では、本開示は、金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）と、ジチオール化ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＤＴＰＡ）と、チオクト酸末端ペプチドと、ドキソルビシンと、を含むナノコンジュゲートであって、ＤＴＤＴＰＡが少なくとも１つのＡｕ−Ｓ結合を介して金ナノ粒子表面に直接連結され、チオクト酸末端ペプチドが少なくとも１つのＡｕ−Ｓ結合を介して金ナノ粒子表面に直接連結され、ドキソルビシンがＤＴＤＴＰＡに連結されている、ナノコンジュゲートを提供する。
【００２５】
特定の実施形態では、本明細書で開示されるナノコンジュゲートは、金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）と、ジチオール化ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＤＴＰＡ）と、チオクト酸末端ペプチドと、ドキソルビシンとから本質的になり、ＤＴＤＴＰＡが少なくとも１つのＡｕ−Ｓ結合を介して金ナノ粒子表面に直接連結され、チオクト酸末端ペプチドが少なくとも１つのＡｕ−Ｓ結合を介して金ナノ粒子表面に直接連結され、ドキソルビシンがＤＴＤＴＰＡに連結されている。
【００２６】
ＤＴＤＴＰＡで安定化された金ナノ粒子、すなわち、ＡｕＮＰ−ＤＴＤＴＰＡは当該技術分野において既知である。例えば、国際公開第２０１５／１０３０２８号及びＤｅｂｏｕｔｔｉｅｒｅｅｔ  ａｌ．、Ａｄｖａｎ．Ｆｕｎｔ．Ｍａｔｅｒ．２００６，１６：２３３０−３９は、ＡｕＮＰ−ＤＴＤＴＰＡの調製及び使用を記載し、両方の参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＤＴＤＴＰＡの化学構造を以下に示す。ＤＴＤＴＰＡ分子は、１つ又は２つのＡｕ−Ｓ結合を介して金ナノ粒子表面に連結され得る。
【化２】
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【００２７】
理論に束縛されるものではないが、ＡｕＮＰ表面を取り囲むＤＴＤＴＰＡループは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又はそれ以上のＤＴＤＴＰＡ分子を含み得ると考えられる。例えば、いくつかの実施形態では、同様に特定の理論に束縛されるものではないが、所与のＤＴＤＴＰＡ分子の両方のチオール基は両方ともＡｕＮＰ表面にＡｕ−Ｓ結合を形成することができ、したがって、１つのＤＴＤＴＰＡ分子とループを形成することができると考えられる。別の実施形態では、所与のＤＴＤＴＰＡ分子の１つのチオール基は、ＡｕＮＰ表面にＡｕ−Ｓ結合を形成することができ、一方、第２のチオール基は、第２のＤＴＤＴＰＡ分子と分子間ジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ）を形成することができる。第２のＤＴＤＴＰＡ分子は、ジスルフィド結合を介して更に別のＤＴＤＴＰＡ分子に連結されてもよく、又はＡｕ−Ｓ結合を介してＡｕＮＰ表面に連結されてもよく、したがって、２つ以上のＤＴＤＴＰＡ分子からなるループを形成することができる。ＤＴＤＴＰＡ分子自体がどのように配置されるかに応じて、安定化ナノ粒子は、ＡｕＮＰの表面上に五酢酸分子の多層有機シェルを含み得る。Ｄｅｂｏｕｔｔｉｅｒｅｅｔ  ａｌ．、Ａｄｖａｎ．Ｆｕｎｔ．Ｍａｔｅｒ．２００６，１６：２３３０−３９、及び図２を参照されたい。
【００２８】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるナノコンジュゲートは、ナノコンジュゲートの約１０重量％〜約６０重量％のＤＴＤＴＰＡを含む。いくつかの実施形態では、ナノコンジュゲートは、ナコンジュゲートの約１０重量％、約１５重量％、約２０重量％、約２５重量％、約３０重量％、約３５重量％、約４０重量％、約４１重量％、約４２重量％、約４３重量％、約４４重量％、約４５重量％、約４６重量％、約４７重量％、約４８重量％、約４９重量％、約５０重量％、約５１重量％、約５２重量％、約５３重量％、約５４重量％、約５５重量％、若しくは約６０重量％の、例えば、約４５重量％、又は先行する値のうちの任意の２つの間の範囲、例えば、約３０重量％〜約６０重量％、若しくは約４０重量％〜約５０重量％のＤＴＤＴＰＡを含む。いくつかの実施形態では、ナノコンジュゲートは、ナノコンジュゲートの約４５重量％のＤＴＤＴＰＡを含む。
【００２９】
典型的な実施形態では、及び上述のように、本明細書に開示されるナノコンジュゲートは、標的化剤としてチオクト酸末端ペプチドを含み得る。特定の実施形態では、標的化ペプチドは、ボンベシンペプチドであり得る。特定の腫瘍細胞を標的化するために、ボンベシンペプチドを使用して金ナノ材料を官能化することができる。Ｃｈａｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．２００９，９（５）：１７９８−１８０５；Ｃｈａｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ  ２０１０，１０７（１９）：８７６０−８７６５；Ｓｕｒｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２０１４，２５，１５６５−１５７９；及びＳｉｌｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２０１６，２７，１１５３−１１６４を参照されたい。これらの参考文献の全ては、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。１４−アミノ酸ペプチドであるボンベシンは、両生類のボンビナ属の皮膚から単離され、関連するガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）は、例えば、小細胞肺癌、前立腺癌、乳癌、及び結腸癌における、様々な腫瘍組織において増強された応答を示す。改変された構造を有するボンベシンの類似体は、ＧＲＰ受容体に対して、同様又は更に高い親和性を示したことが報告されている。例えば、Ｃｈａｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．２００９，９（５）：１７９８−１８０５及びその中に引用される参考文献を参照されたい。本明細書に記載の特定の実施形態では、図１に示される７つのアミノ酸切断型ボンベシン類似体（ＢＢＮ）を標的化剤として使用した。
【００３０】
いくつかの実施形態では、チオクト酸末端ペプチドは、配列：リポ酸−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＮＨ２を有するチオクト酸末端ボンベシン（ＴＡ−ＢＢＮ、代替的に本明細書でＢＢＮと呼ばれる）であってもよい。
【００３１】
いくつかの実施形態では、チオクト酸末端ペプチド（例えば、ＴＡ−ＢＢＮ）は、１つ又は２つのＡｕ−Ｓ結合を介して金ナノ粒子表面に直接連結され得る。
【００３２】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるナノコンジュゲートは、ナノコンジュゲートの約１重量％〜約４０重量％のチオクト酸末端ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ナノコンジュゲートは、ナノコンジュゲートの約１重量％、約５重量％、約１０重量％、約１１重量％、約１２重量％、約１３重量％、約１４重量％、約１５重量％、約１６重量％、約１７重量％、約１８重量％、約１９重量％、約２０重量％、約２１重量％、約２２重量％、約２３重量％、約２４重量％、約２５重量％、約２６重量％、約２７重量％、約２８重量％、約２９重量％、約３０重量％、約３５重量％、若しくは約４０％の、例えば、約２０重量％若しくは約２５重量％、又は先行する値のうちの任意の２つの間の範囲、例えば、約１０重量％〜約３０重量％、約２０重量％〜約３０重量％、若しくは約１５重量％〜約２５重量％のチオクト酸末端ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ナノコンジュゲートは、ナノコンジュゲートの約２０重量％又は約２５重量％のチオクト酸末端ペプチドを含む。
【００３３】
いくつかの実施形態では、続いてドキソルビシンと連結され得るＡｕＮＰ−ＤＴＤＴＰＡ−ＢＢＮコンストラクトは、ＡｕＮＰ−ＤＴＤＴＰＡナノ粒子をチオクト酸末端ペプチドとコンジュゲートさせることを含むプロセスによって調製することができ、金ナノ粒子中の金とチオクト酸末端ペプチドとは、約１：０．５〜約１：４の化学量論比でコンジュゲーション反応中に存在し得る。本明細書で使用される化学量論比は、モル比を指す。
【００３４】
いくつかの実施形態では、コンジュゲーション反応に使用される、金ナノ粒子中の金対チオクト酸末端ペプチドの化学量論比は、約１：０．７５、約１：１、約１：１．５、約１：２、約１：２．５、約１：３、約１：３．５、若しくは約１：４、例えば、１：２、又は先行する比のいずれか２つの間の範囲、例えば、約１：１〜約１：４、約１：１〜約１：３、約１：１〜約１：２、約１：１．５〜約１：４、約１：１．５〜約１：３、約１：１．５〜約１：２．５、若しくは約１：１．５〜約１：２であり得る。
【００３５】
いくつかの実施形態では、コンジュゲーション反応に使用されるチオクト酸末端ペプチドの量は、金ナノ粒子中の金との比は、少なくとも約１：１．５、少なくとも約１：２、少なくとも約１：２．５、又は少なくとも約１：３である。
【００３６】
いくつかの実施形態では、コンジュゲーション反応に使用される金ナノ粒子中の金の、チオクト酸末端ペプチドに対する化学量論比は、約１：２である。
【００３７】
典型的には、ナノコンジュゲート中のドキソルビシンは、ＤＴＤＴＰＡのカルボキシレート基とドキソルビシンのアミノ基との間に形成されるアミド結合を介してＤＴＤＴＰＡに連結される。
【００３８】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるナノコンジュゲートは、ナノコンジュゲートの約０．０１重量％〜約０．０５重量％のドキソルビシンを含む。いくつかの実施形態では、ナノコンジュゲートは、ナノコンジュゲートの約０．０１重量％、約０．０１５重量％、約０．０２重量％、約０．０２５重量％、約０．０３重量％、約０．０３５重量％、約０．０４重量％、約０．０４５重量％、若しくは約０．０５重量％の、例えば、約０．０３重量％、又は先行する値のうちの任意の２つの間の範囲、例えば、約０．０１重量％〜約０．０４重量％、約０．０１重量％〜約０．０３重量％、約０．０２重量％〜約０．０５重量％、約０．０２重量％〜約０．０４重量％、約０．０２重量％〜約０．０３重量％、若しくは約０．０２５重量％〜０．０３５重量％のドキソルビシンを含むことができる。いくつかの実施形態では、ナノコンジュゲートは、ナノコンジュゲートの約０．０３重量％のドキソルビシンを含む。
【００３９】
ナノコンジュゲートは、それらの流体力学的直径（すなわち、流体力学的サイズ）によって特徴付けることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるナノコンジュゲートは、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定されるとき、約１００ｎｍ〜約１５０ｎｍ又は約１１０ｎｍ〜約１４０ｎｍの流体力学的直径を有する。いくつかの実施形態では、ナノコンジュゲートは、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定されるとき、約１００ｎｍ、約１１０ｎｍ、約１１５ｎｍ、約１２０ｎｍ、約１２５ｎｍ、約１３０ｎｍ、約１３５ｎｍ、約１４０ｎｍ、約１４５ｎｍ、若しくは約１５０ｎｍの、例えば、約１２５ｎｍ、又は先行する値のうちの任意の２つの間の範囲、例えば、約１２０ｎｍ〜約１２５ｎｍ、約１２０ｎｍ〜約１３０ｎｍ、又は約１２５ｎｍ〜約１３０ｎｍの流体力学的直径を有する。いくつかの実施形態では、ナノコンジュゲートは、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定されるとき、約１２５ｎｍの流体力学的直径を有する。
【００４０】
ナノコンジュゲートはまた、それらのゼータ電位によって特徴付けることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるナノコンジュゲートは、約−１５ｍＶ〜約−３０ｍＶのゼータ電位値を有する。いくつかの実施形態では、ナノコンジュゲートは、約−１５ｍＶ、約−１６ｍＶ、約−１７ｍＶ、約−１８ｍＶ、約−１９ｍＶ、約−２０ｍＶ、約−２１ｍＶ、約−２２ｍＶ、約−２３ｍＶ、約−２４ｍＶ、約−２５ｍＶ、約−２６ｍＶ、約−２７ｍＶ、約−２８ｍＶ、約−２９ｍＶ、若しくは約−３０ｍＶ、例えば、約−２３ｍＶ、又は先行する値のうちの任意の２つの間の範囲、例えば、約−１５ｍＶ〜約−２５ｍＶ、約−２０ｍＶ〜約−２５ｍＶ、若しくは約−２０ｍＶ〜約−３０ｍＶのゼータ電位値を有する。いくつかの実施形態では、ナノコンジュゲートは、約−２０ｍＶ〜約−２５ｍＶのゼータ電位値を有する。
【００４１】
一実施形態では、本明細書に開示されるナノコンジュゲートは、金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）と、ジチオール化ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＤＴＰＡ）と、チオクト酸末端ボンベシンペプチド（ＴＡ−ＢＢＮ）と、ドキソルビシンとから本質的になり、ＤＴＤＴＰＡは、少なくとも１つのＡｕ−Ｓ結合を介して金ナノ粒子表面に直接連結され、ＴＡ−ＢＢＮは、少なくとも１つのＡｕ−Ｓ結合を介して金ナノ粒子表面に直接連結され、ドキソルビシンはＤＴＤＴＰＡに連結され、ＡｕＮＰ−ＤＴＤＴＰＡ−ＢＢＮナノコンジュゲート前駆体は、ＡｕＮＰ−ＤＴＤＴＰＡナノ粒子をＴＡ−ＢＢＮとコンジュゲートさせることを含むプロセスによって調製され、金ナノ粒子中の金とチオクト酸末端ボンベシンペプチドとは、約１：２の化学量論比でコンジュゲーション反応中に存在する。
【００４２】
特定の実施形態では、上記のナノコンジュゲートは、金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）と、ジチオール化ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＤＴＰＡ）と、チオクト酸末端ボンベシンペプチド（ＴＡ−ＢＢＮ）と、ドキソルビシンとを含み得、ナノコンジュゲートは、ナノコンジュゲートの約１５重量％〜約２５重量％のＴＡ−ＢＢＮと、約２５重量％〜約３５重量％のＤＴＤＴＰＡと、約０．０１重量％〜約０．０５重量％のドキソルビシンとを含む。
【００４３】
別の実施形態では、本明細書に開示されるナノコンジュゲートは、金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）と、ジチオール化ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＤＴＰＡ）と、チオクト酸末端ボンベシンペプチド（ＴＡ−ＢＢＮ）と、ドキソルビシンとを含み得、ナノコンジュゲートは、ナノコンジュゲートの約２０重量％のＴＡ−ＢＢＮと、約３０重量％のＤＴＤＴＰＡと、約０．０３重量％のドキソルビシンとを含む。
【００４４】
標的化ペプチドは、典型的には、本明細書に記載のナノコンジュゲート上に存在するが、いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるナノコンジュゲートは、チオクト酸末端ペプチドを含まない。例えば、いくつかの実施形態では、ナノコンジュゲートは、金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）と、ジチオール化ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＤＴＰＡ）と、ドキソルビシンとを含み、ＤＴＤＴＰＡは、少なくとも１つのＡｕ−Ｓ結合を介して金ナノ粒子表面に直接連結され、ドキソルビシンは、本明細書のどこかに記載されるようにＤＴＤＴＰＡに連結される。このコンストラクトは、本明細書ではＡｕＮＰ（ＤＴＤＴＰＡ）−ＤＯＸと称される。
【００４５】
特定の実施形態では、本開示は、本明細書に開示されるナノコンジュゲートを調製するための方法を提供し、方法は、ドキソルビシンをＤＴＤＴＰＡで官能化されたナノ粒子とカップリングさせることを含む。いくつかの実施形態では、方法は、（１）ＡｕＮＰ−ＤＴＤＴＰＡを、チオクト酸末端ペプチド（例えば、ＴＡ−ＢＢＮ）とコンジュゲートしてコンジュゲートを形成することと、（２）コンジュゲートをドキソルビシンとカップリングさせてナノコンジュゲートを形成することと、を含む。
【００４６】
いくつかの実施形態では、カップリング工程は、ＤＴＤＴＰＡのカルボキシル基とＤＯＸのアミン基との間にアミド結合を形成する。いくつかの実施形態では、カップリング工程は、ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）及びスルホＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド）などの活性化剤を使用して行われる。
【００４７】
特定の実施形態では、本開示は、本明細書に開示されるナノコンジュゲートと医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。
【００４８】
特定の実施形態では、本開示はまた、治療有効量の本明細書に開示されるナノコンジュゲートを、癌の治療を必要とする対象に投与することを含む、癌を治療するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。
【００４９】
いくつかの実施形態では、治療される癌は、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄芽球性白血病（ＡＭＬ）、骨肉腫、乳癌、子宮内膜癌、胃癌、頭頸部癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、肝臓癌、腎臓癌、多発性骨髄腫、神経芽腫、卵巣癌、肺癌（例えば、小細胞肺癌及び非小細胞肺癌）、軟部肉腫、胸腺腫、甲状腺癌、膀胱癌（例えば、移行上皮細胞膀胱癌）、子宮肉腫、前立腺癌、結腸癌、卵巣癌、膵臓癌、ウィルムス腫瘍、並びにワルデンシュトレームマクログロブリン血症からなる群から選択され得る。
【００５０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法に従って治療される癌は、ＧＲＰ過剰発現に関連する。いくつかの実施形態では、ＧＲＰ過剰発現に関連する癌は、小細胞肺癌、前立腺癌、乳癌、結腸癌、卵巣癌、非小細胞肺癌、又は膵臓癌であり得る。
【００５１】
本明細書に開示されるナノコンジュゲート又は医薬組成物は、当業者に既知の様々な方法によって対象に投与することができる。例えば、本開示のナノコンジュゲート又は医薬組成物は、注射又は経口投与によって投与することができる。
【００５２】
以下の実施例は、本明細書に開示される組成物及び方法の単なる例示であり、本明細書の範囲を限定することを意図するものではない。
【００５３】
実施例
一般的方法：金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）の合成に使用される材料は、標準的な供給業者から入手した。四塩化金酸三水和物（ＨＡｕＣｌ４．３Ｈ２Ｏ）、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、無水酢酸、無水ピリジン、２−アミノエタンチオールヒドロクロリド、トリエチルアミン、氷酢酸（ＣＨ３ＣＯＯＨ）、硝酸ガリウム（Ｇａ（ＮＯ３）３）、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、塩酸（ＨＣｌ）、メタノール（ＭｅＯＨ）、ジエチルエーテル（Ｅｔ２Ｏ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）をＡｌｄｒｉｃｈから購入し、そのまま使用した。水溶液の調製及び金ナノ粒子のすすぎのために、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（ＤＩ）水（ρ＞１８ＭΩ）を使用した。ＭＴＴ細胞増殖アッセイキットを、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ＵＳＡ）から入手した。
【００５４】
ＵＶ可視分光法：ＵＶ可視吸収スペクトルを、経路長補正を伴って、使い捨て９６ウェルプレート内で、Ｃｙｔａｔｉｏｎ  ３分光光度計（Ｂｉｏｔｅｋ）を使用して、室温で記録した。
【００５５】
電子顕微鏡：透過型電子顕微鏡画像は、ＪＥＯＬ  ＬＴＤ．，Ｔｏｋｙｏ，ＪａｐａｎのＪＥＯＬ  １４００透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で得た。３００メッシュの炭素コーティングされた銅グリッド上に、５μＬの金ナノ粒子溶液を配置することによって、ＴＥＭサンプルを調製した。余分な溶液を慎重に取り出し、グリッドを更に５分間乾燥させた。ナノ粒子の平均サイズ及びサイズ分布は、ＴＥＭ画像をＦＯＶＥＡプラグインを備えたＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐで処理することによって決定した。
【００５６】
動的光散乱（ＤＬＳ）及びゼータ電位分析：ＤＬＳ測定は、６３３ｎｍのＨｅ−Ｎｅレーザーを装備し、１７３°の角度で動作する、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ．）で実施した。データを収集及び分析するために使用されたソフトウェアは、ＭａｌｖｅｒｎからのＤｉｓｐｅｒｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＤＴＳ）バージョン５．１０であった。各サンプルの６００μｌを、１０ｍｍの経路長を有する少量の半マイクロ使い捨てサイジングキュベット（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）で測定した。３回の測定は、自動減衰器を備えたキュベット壁から４．６５ｍｍの位置で行った。各サンプルについて、１５回の１０秒の測定を行った。全てのナノ粒子サンプルについて「汎用モード」を用いて、自己相関関数から、サイズ分布、Ｚ平均直径、及び多分散指数（ＰＤＩ）を得た。デフォルトのフィルタ係数５０％並びにデフォルト下限閾値０．０５及び上限閾値０．０１を使用した。分散剤としての水、及びＨｕｃｋｅｌモデルを使用して、ゼータ電位測定を３回行った。各サンプルについて、自動分析モードで２０回の測定を行った。
【００５７】
ナノ粒子追跡分析：ＡｕＮＰの流体力学的直径は、５３２ｎｍ（緑色）レーザー（ＮａｎｏＳｉｇｈｔ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ａｍｅｓｂｕｒｙ，ＵＫ）を装備した温度制御ＬＭ１４Ｇサンプル視認ユニットを備えたＮａｎｏＳｉｇｈｔ  ＬＭ１０−ＨＳＧＦＴシステムを使用して測定した。Ｒａｌｅｉｇｈ散乱に基づくＡｕＮＰのビデオトラッキングを、モノクロームマーリンＣＣＤカメラ（Ａｌｌｉｅｄ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）でキャプチャした。１ｍＬシリンジ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＮＪ）を使用して、サンプルを視認チャンバに送達し、温度を２２℃で一定に保持した。ＮａｎｏＳｉｇｈｔ  ２．２プログラムを使用して、サンプルデータを収集及び分析した。各サイズ測定は、３０秒のビデオに基づいており、平均流体力学的直径を計算するために、ストークス・アインシュタインの式を使用した。以下に記載されるように、ＮＴＡ測定前に、サンプルをストックＡｕＮＰ濃度に対して３０倍に希釈した。この希釈は、約９００の粒子が３０秒間のビデオで追跡されるように選択された。これらの条件は、サンプル全体の代表的なサンプリングを提供し、著しくより多くのナノ粒子が分析されたより長いビデオで、サイズ分布が変化しなかったという事実によって確認された。各サンプルについて３回の測定を行い、平均サイズ及び標準偏差を得た。
【００５８】
細胞培養：ＰＣ−３ヒト前立腺癌細胞及びＭＤＡ−ＭＢ２３１ヒト乳癌細胞（ＡＴＣＣ，ＵＳＡ）を、４．５ｇ／ＬのＤ−グルコース、２５ｍＭのＨｅｐｅｓ、０．１１ｇ／Ｌピルビン酸ナトリウム、１．５ｇ／Ｌ炭酸ナトリウム、２ｍＭＬ−グルタミン、１０％熱不活化ウシ胎児血清（Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，ＵＳＡ）、及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン抗生物質溶液を補充したＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹから入手）中で増殖させた。細胞を、３７℃で、９５％空気及び５％ＣＯ２の加湿雰囲気（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）中で培養し、培地を１日おきに交換した。細胞を単層に接着させ、コンフルエントになると、トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて細胞培養フラスコから採取し、間隔をあけて播種した。
【００５９】
ＩＣ５０測定：コンジュゲートの受容体結合親和性は、ＧＲＰ特異的放射リガンドとして１２５Ｉ−Ｔｙｒ４−ボンベシンを使用して、ＰＣ−３細胞培養における競合的細胞結合アッセイによって決定した。約３０，０００細胞を、２００００ｃｐｍの１２５Ｉ−Ｔｙｒ４−ボンベシン（２２００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の存在下で５％ＣＯ２下で３７℃で４０分間インキュベートし、試験したコンジュゲートの濃度を増加させた。インキュベーション後、反応培地を吸引し、細胞を冷ＲＰＭＩ  １６４０改変緩衝液で３回洗浄した。細胞に結合した放射線を、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｒｉａｓｔａｒ  γ計数システムで計数することによって決定した。ＩＣ５０値は、Ｇｒａｐｈ  Ｆｉｔ  ４．０グラフ化ソフトウェアを使用して計算した。細胞に結合した１２５Ｉ−Ｔｙｒ４−ボンベシンの％を、試験したコンジュゲートの増加する濃度に対してプロットし、そのＩＣ５０値を決定した。
【００６０】
インビトロ細胞毒性アッセイ：ＮＰ１、ＮＰ２、遊離ドキソルビシンなどのそれぞれの対照を有するＮＰ１−ＤＯＸ及びＮＰ２−ＤＯＸのインビトロ細胞毒性評価を、ＧＲＰ発現癌細胞及びＧＲＰ非発現癌細胞である、それぞれＰＣ３及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１で実施した。細胞毒性評価を３回実施し、プロトコールは製造業者によって記載されているように実施した。簡潔に述べると、指数増殖期の１×１０５ｍｌ−１細胞を、平底９６ウェルポリスチレンコーティングプレートに入れ、ＣＯ２インキュベーター内で５％ＣＯ２及び３７℃で１２時間インキュベートした。ＮＰ１−Ｄｏｘ及びＮＰ２−Ｄｏｘの０〜１０μｇ／ｍＬの範囲の一連の濃度（０、０．３１、０．６２５、１．２５、２．５、５．０、及び１０μｇ／ｍＬ）を培地で調製した。各濃度を四重でプレートに添加した。２４時間のインキュベーション後、１０μＬ／ウェルのＭＴＴ（製造元（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＵＳＡ）から入手したもの）を添加し、４時間保持し、そのように形成されたホルマザン結晶を１００μＬの洗剤／可溶化緩衝液に溶解した。プレートを２５℃で暗所で２時間保持して全ての結晶を溶解し、発色した色の強度を、５７０  ｎｍの波長で動作するマイクロプレートリーダー（Ｅｐｏｃｈ，ＢｉｏＴｅｋ，ＵＳＡ）によって測定した。完全培地、ナノ粒子、及びＭＴＴを有するが、細胞を有しないウェルをブランクとして使用した。未処理細胞は、１００％生存可能であると考えられた。
【００６１】
インビトロ安定性試験：様々なｐＨ条件下（２、５、７、１０、及び１２）でＮＰ１及びＮＰ２の溶液をインキュベートすることにより、インビトロ安定性試験を２４時間の期間実施した。両方の安定性挙動はまた、０．２Ｍシステイン、０．２Ｍヒスチジン、０．２Ｍ  ＨＳＡ、及び１０％生理食塩水溶液のそれぞれ０．５ｍＬで、ＮＰ１及びＮＰ２の水溶液（０．５ｍＬ）をチャレンジすることによってもモニターした。安定性は、０時間〜９６時間（０、１、２４、４８、７２、及び９６時間）でのＵＶ可視吸光度、流体力学的半径、及びゼータ電位測定値をモニターすることによって測定した。ＮＰ１及びＮＰ２のＵＶ  Ｖｉｓプラズモン帯域における無視できる変化は、システイン以外の全てのチャレンジ溶液における安定挙動を有するナノ微粒子組成物の保持を確認した。処理された溶液は、流体力学的半径の顕著な変化を示さず、したがってこれらのコンジュゲートの安定性を確認した。
【００６２】
実施例１
ＢＢＮ−ＡｕＮＰ−ＤＴＤＴＰＡコンジュゲートの合成及び特徴付け
ジチオール化ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＤＴＰＡ）官能化金ナノ粒子（ＡｕＮＰ  ＤＴＤＴＰＡ；ＮＰ１）を、標的化ペプチド、ボンベシン（ＢＢＮ）、及び化学療法剤ＤＯＸをナノ粒子表面上にコンジュゲートさせる前駆体として使用した。図１を参照されたい。
【００６３】
第１の工程は、標的化ペプチドをＮＰ１にコンジュゲートさせることであった。チオオクチル末端ボンベシン（ＴＡ−ＢＢＮ）を使用して、ペプチドを金−チオール結合を介してＮＰ１にコンジュゲートさせた。ＡｕＮＰ：ＢＢＮの３つの異なる化学量論比を使用した（１：０．５、１：２、及び１：４）。過剰の未反応ＢＢＮを繰り返し洗浄により除去し、ＢＢＮ−ＡｕＮＰ−ＤＴＤＴＰＡ（ＮＰ２）を純粋なナノ粒子ペレットとして単離した。ＴＡ−ＢＢＮのＮＰ１へのコンジュゲーション後に得られた上清溶液のＨＰＬＣ分析を利用して、ＮＰ２に結合したＴＡ−ＢＢＮを定量化した。標準検量線を、異なる濃度のＴＡ−ＢＢＮと、反応で使用された既知濃度のＴＡ−ＢＢＮの曲線下面積（ＡＵＣ）をＨＰＬＣにより測定して作成した。上清中のＡＵＣの分析及び既知の濃度のＴＡ−ＢＢＮを相関させて、ＮＰ２の表面上にコンジュゲートしたＴＡ−ＢＢＮの量を決定した（図３）。１：２比（Ａｕ：ＴＡ−ＢＢ）でＡｕＤＴＤＴＰＡコンストラクトをＴＡ−ＢＢＮとコンジュゲートさせると、１ｍｇのＡｕＤＴＤＴＰＡ当たり約０．２６ｍｇのＴＡ−ＢＢＮがコンストラクトに組み込まれた。図３を参照されたい。１：２比を使用して調製したＮＰ２は、顕著な安定性を示し、したがって更なる試験のために選択した。
【００６４】
ナノコンジュゲートは、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像分析、ＵＶ可視吸収分光法、動的光散乱（ＤＬＳ）、及びゼータ電位測定により詳細に特徴付けられた。ＴＥＭ画像は、３〜５ｎｍのサイズ範囲を有するナノコンジュゲートの均一なサイズ分布を示した（図４Ａ及び４Ｂ）。ＮＰ２は、ＢＢＮへのコンジュゲーション時にＮＰ１と比較してＵＶ可視吸収スペクトルの変化は示さなかった。（図４Ｃ）。ＢＢＮとコンジュゲーション（１：２、Ａｕ：ＢＢＮ）すると、ＮＰ１と比較して、ＮＰ２において、流体力学的直径の２０ｎｍの変化が観察された。ゼータ電位変化は、ＮＰ１と比較して、ＮＰ２において無視できる（約３単位）。ナノ粒子トラッキング分析（ＮＴＡ）を用いて決定された平均粒径は、動的光散乱測定値と良好に相関した。ＮＰ１及びＮＰ２コンジュゲートの物理化学的特性を表１に要約する。
【表１】
2020504130.tif 000005
【００６５】
実施例２
ＸＰＳ分析
ＡｕＮＰ−ＤＴＤＴＰＡとＴＡ−ＢＢＮとの間の結合及び化学的相互作用の性質を理解するために、詳細なＸＰＳ分析を実施した。ＮＰ２のＸＰＳスペクトルは、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、及びＡｕの特徴的なピークを示す（図５Ａ）。Ｃ１ｓ領域のＸＰＳ高分解能スペクトルは、コンジュゲートしたＴＡ−ＢＢＮペプチドから予想される様々なＣ−Ｃ、Ｃ−Ｈ、Ｃ−Ｏ、Ｃ−Ｎ、Ｏ−Ｃ＝Ｏ、Ｎ−Ｃ＝Ｏ領域を示す（図５Ｂ）。ＮＰ２の炭素種に対する相対的な元素組成及びピーク割り当ては、それぞれ表２及び３に示される。
【表２】
2020504130.tif 000006
【表３】
2020504130.tif 000007
【００６６】
Ｓ  ２ｐ領域のＸＰＳ高分解能スペクトルの分析は、２つの異なるＳ種（種１及び種１）が存在し、それぞれが二重線に分割されることを示唆している。種１は、ＤＴＤＴＰＡのＡｕ−Ｓ結合に起因する、１６２．３及び１６３．５ｅＶにおける２つの別個の硫黄ピークを示す。二重線硫黄ピークＳ  ２ｐ３／２及びＳ  ２ｐ１／２は、１．２ｅＶのカップリングにより金表面上へのチオールの吸着を確認する。結合エネルギー及びカップリング値は、ＮＰ１について文献に報告されているものとよく相関するが、ピークは、ＢＢＮへのコンジュゲーション時に、わずかに高い結合エネルギー（０．５ｅＶ）領域にシフトする。加えて、比２：１の１６３．２及び１６４．４ｅＶにおける種２の２つの別個の硫黄ピークは、それぞれＡｕ−Ｓ（ＡｕＮＰに配位された硫黄）及びＳ−ＣＨ３（ＢＢＮペプチド骨格中のメチルシステインアミノ酸中に存在する硫黄）に対応する。硫黄ピークの各クラスは、１．２ｅＶのカップリングによって二重線Ｓ２ｐ３／２及びＳ２ｐ１／２に更に分割され、文献に報告されているようにＢＢＮのＡｕＮＰとのコンジュゲーションを確認した。より高い結合エネルギーにおける等価領域を有する二重線のこのような存在は、ＡｕＮＰ表面上にＡｕ−Ｓ結合を形成したＴＡ−ＢＢＮの硫黄原子の両方を示す。ＢＢＮとのコンジュゲーションの際、結合エネルギー値は、文献に報告されているＡｕＮＰ−ＢＢＮと比較して、より低いエネルギー領域にシフトする。これは、ＢＢＮのコンジュゲーションに使用されたナノ粒子のコアサイズの差に起因し得る。元素Ｓのエネルギー、及びいくつかの有機形態のＳは、１６２〜１６４ｅＶの範囲内にある（図６Ａ）。酸化硫黄に対応するスペクトルのより高いエネルギー領域において更なるピークが観察されないため、これらの測定は、ＢＢＮ−ＡｕＮＰ−ＤＴＤＴＰＡ（ＮＰ２）が、ナノコンジュゲーション反応中に形成された排他的な生成物であるという観察結果と一致する。
【００６７】
スペクトルの４ｆ領域は、Ａｕ  ４ｆ７／２及びＡｕ  ４ｆ５／２について８３．６、８４．３、及び８７．２、８８．０ｅＶのエネルギーを有する金の２つの異なる信号を示し、それぞれコア金原子Ａｕ（０）及び部分的にＡｕ（Ｉ）特性を有する表面金に対応する（図６Ｂ）。様々な最近の研究から、チオクト酸におけるジスルフィドがＡｕＮＰに酸化的に付加され、ナノ粒子の表面の部分的なＡｕ（Ｉ）の特性が得られると広く考えられている。４ｆ領域におけるＡｕピークに対する８４．３及び８８ｅＶの結合エネルギーに対応するシグナルは、文献に報告されているペプチドコンジュゲートしたＡｕＮＰと類似しており、ＡｕはＤＴＤＴＰＡ及びＴＡ−ＢＢＮのＳ原子に結合していることを示唆している。この事実と一致して、表面及びコア金原子に対応する金の２つの異なる酸化状態をＸＰＳスペクトル中で注目した。金ナノ粒子上の様々なＸＰＳ研究の結果により、同様の所見が確認された。上記の観察結果は、ＮＰ２ナノコンジュゲートにおけるＴＡ−ＢＢＮの結合を明確に確立した。
【００６８】
実施例３
ＢＢＮ−ＡｕＮＰ−ＤＴＤＴＰＡ−ＤＯＸコンジュゲートの合成及び特徴付け
ＡｕＮＰの表面上のＤＴＤＴＰＡのカルボキシル基は、更なる官能化のために利用可能である。これらのカルボキシル基を、ドキソルビシンをコンジュゲートするために利用した。従来のＥＤＣ−ｓｕｌｆｏＮＨＳ化学物質を使用して、ＤＯＸのアミン基をＤＴＤＴＰＡのカルボキシル基にコンジュゲートさせて、非標的化ＡｕＮＰ−ＤＴＤＴＰＡ−ドキソルビシン（ＮＰ１−ＤＯＸ）及び標的化ＢＢＮ−ＡｕＮＰ−ＤＴＤＴＰＡ−ＤＯＸ（ＮＰ２−ＤＯＸ）を得た。
【００６９】
ＮＰ１及びＮＰ２上のドキソルビシン負荷を蛍光分光法により推定した。ドキソルビシンは、４８５ｎｍで励起され、５９０ｎｍで放出されたときの６００ｎｍでの蛍光サインを示す（図７）。ＤＯＸの連続希釈を行い、標準検量線を構築して蛍光強度を記録した（図８）。上清の蛍光強度を記録し、標準検量線と相関させて、ＡｕＮＰにコンジュゲートしたドキソルビシンの量を定量化した。蛍光測定により、０．５３μｇ及び０．３μｇのドキソルビシン／ｍｇのＡｕＮＰ−ＤＴＤＴＰＡ及びＢＢＮ−ＡｕＮＰ−ＤＴＤＴＰＡをそれぞれコンジュゲートさせたことが見出された。更に、ＮＰ１−ＤＯＸ及びＮＰ２−ＤＯＸの連続希釈を行い、蛍光強度を記録した。蛍光強度の変動は比例し、一貫性があり、ＤＯＸのＮＰ１及びＮＰ２とのコンジュゲーションが確認された。蛍光測定はまた、ドキソルビシン蛍光がＡｕＮＰ上でのコンジュゲートに影響を受けないままであることも示唆している（図９及び１０）。ＮＰ１−ＤＯＸ、ＮＰ２−ＤＯＸ及びそれらの対応する対照のＵＶ可視スペクトルは、図１１に示されている。流体力学的直径の１０〜２０ｎｍの変化は、ＮＰ１とＮＰ２の両方とＤＯＸとのコンジュゲーションの際に観察された。ゼータ電位は、ＤＯＸとのコンジュゲーションの際に正にシフトした。ＮＰ１及びＮＰ２についてそれぞれ−７２及び−６９ｍＶの負のゼータ電位値は、粒子が互いに反発し、粒子が凝集する傾向がないことを示す、−２３ｍＶに変化した。ＮＰ１−ＤＯＸ及びＮＰ２−ＤＯＸコンジュゲートの物理化学的特性を表１にまとめる。
【００７０】
実施例４
インビトロ安定性試験
ＮＰ１及びＮＰ２コンジュゲートの安定性を、様々な生物学的に適切な溶液中で調査した。ＮＰ１及びＮＰ２の溶液は、０．９％ＮａＣｌ、０．５％システイン、０．２Ｍヒスチジン、０．５％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、及び０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でチャレンジした。異なる時点におけるナノコンジュゲートの安定性を３つの技術：（ｉ）ＵＶ可視分光法を用いてプラズモン共鳴をモニターすること、（ｉｉ）流体力学的直径の変化、及び（ｉｉｉ）電気泳動電荷（ゼータ電位）測定によって分析した。表面プラズモン共鳴波長及びプラズモン帯域幅の変化、並びに流体力学的直径の測定の変化は、ナノ粒子の凝集挙動を理解する際に直接関連する。ゼータ電位測定は、水溶液中に存在する反発力の指標であり、ナノ微粒子分散体のインビトロ／インビボ安定性の長期的な予測に使用することができる。ＡＵ：ＢＢＮの１：２及び１：４の化学量論比で調製したナノコンジュゲートについて安定性試験を行った。Ａｕ：ＢＢＮの１：４比の使用は、２４時間の期間にわたって凝集を示し、一方、コンジュゲートＮＰ１及びＮＰ２［１：２（Ａｕ：ＢＢＮ）比］の両方は、これらの生物学的に適切な溶液中で安定であった。ＵＶ−可視吸収ピークは変化していないままであり、流体力学的直径及びゼータ電位の変化は最小限であり、コンジュゲートの構造的一体性及び堅牢性を確認する（図１２）。しかしながら、システインの存在下では、ＮＰ１とＮＰ２の両方が、金チオール相互作用に起因してある期間（２４時間）にわたって流体力学的サイズの増加を示し、増加は顕著ではなかったことが観察された。インビトロ安定性データは、ＮＰ１及びＮＰ２が、インビボでの後続の受容体標的化の開示において使用するための最適な動的安定性を有することを示す。
【００７１】
実施例５
ＮＰ２のインビトロ受容体結合親和性試験
ヒト前立腺腫瘍ＰＣ−３細胞は、細胞表面上に多数のＧＲＰ受容体を発現する。ＮＰ２の結合親和性を、競合阻害アッセイを実施し、ＩＣ５０値を決定することによって評価した。Ａｕ：ＢＢＮ（１：０．５、１：２、１：４）の３つの異なる化学量論比で調製したナノ粒子を使用した。Ａｕ：ＢＢＮ（１：０．５、１：２、１：４）の異なる化学量論比のＩＣ５０値の比較をプロットした（図１３）。ナノコンジュゲートの分子量を正確に決定することができないため、コンジュゲートＮＰ２の異なる比のＩＣ５０値をマイクログラム単位で報告する。コンジュゲートのＩＣ５０値又は細胞結合親和性は、ＡｕＮＰの表面上のＴＡ−ＢＢＮペプチドコーティングの程度に依存することがデータから明らかである。例えば、ＡＵ：ＢＢＮ＝１：４の比を有するコンジュゲートＮＰ２は、ＡｕＮＰの表面上により多くの数のＴＡ−ＢＢＮペプチド分子を有し、他のコンジュゲートと比較してより低いＩＣ５０値（又はより高い細胞結合親和性）を示した。しかしながら、このコンジュゲートは非常に安定ではなく、細胞研究には使用されなかった。競合阻害試験は、ＮＰ２の受容体標的化特性を確認する。
【００７２】
実施例６
インビトロ細胞毒性アッセイ：
ＧＲＰ発現及びＧＲＰ非発現ヒト癌細胞に対するドキソルビシンコンジュゲートＡｕＮＰ、ＮＰ１−ＤＯＸ及びＮＰ２−ＤＯＸのインビトロ細胞毒性を、ＭＴＴアッセイによって適切な対照を用いて試験した。ヒト前立腺癌（ＰＣ３）細胞は、細胞表面上に多数のＧＲＰ受容体を有する。具体的には、文献は、４４０００のボンベシン受容体部位がヒト前立腺癌細胞の表面上に存在することを示す。ヒト乳房（ＭＤＡ−ＭＢ２３１）癌細胞を、ＧＲＰ非発現癌細胞として使用した。遊離ドキソルビシンは、ＰＣ３（図１４）において９．５μｇ／ｍｌのＩＣ５０を、ＭＤＡ−ＭＢ２３１（図１６）癌細胞において＞１０μｇ／ｍｌのＩＣ５０を示した。ＧＲＰ発現細胞とＧＲＰ非発現細胞の両方の細胞毒性に対する、ＮＰ１−ＤＯＸ及びＮＰ２−ＤＯＸの効果の、ＤＯＸとの比較図を図１５、１７、及び２０に示す。ＮＰ１−ＤＯＸ及びＮＰ２−ＤＯＸは、ＧＲＰ非発現癌細胞において、それぞれ６μｇ／ｍｌ及び９μｇ／ｍｌのＩＣ５０を示したが、ＰＣ３細胞では、ＩＣ５０値は、それぞれ１０μｇ／ｍｌ及び５μｇ／ｍｌであることが見出された（表４）。ＮＰ１−ＤＯＸ及びＮＰ２−ＤＯＸについてここで表されるＩＣ５０値は、ナノコンジュゲートの総重量に基づき、ナノコンジュゲート上に負荷されたＤＯＸの量は、それぞれ０．５３μｇ／ｍｇ及び０．３μｇ／ｍｇであることに留意されたい。ドキソルビシンに関するナノコンジュゲートのＩＣ５０値を表４並びに図１８及び１９に列挙する。
【表４】
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【００７３】
上記で分かるように、ドキソルビシンコンジュゲートＡｕＮＰは、遊離ドキソルビシンよりもはるかに強力な細胞毒性を示した。例えば、ＮＰ２−ＤＯＸの細胞毒性は、ＧＲＰ非発現癌細胞及びＧＲＰ発現癌細胞における遊離ドキソルビシンと比較して、それぞれ３０００倍及び６０００倍に増加した。
【００７４】
実施例７
ＡｕＮＰ−ＤＴＤＴＰＡの合成
ジチオール化ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＤＴＰＡ）官能化ＡｕＮＰを、Ｂｒｕｓｔ  ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９５，１６５５−１６５６による修飾プロトコールによって調製した。簡潔に述べると、２００ｍｇ（０．５０７ミリモル）のＨＡｕＣｌ４．３Ｈ２Ｏを、５００ｍｌ丸底フラスコ中の１２０ｍｌのメタノールに溶解した。別のフラスコ中で、４８２ｍｇ（０．９４３ｍｍｏｌ）のＤＴＤＴＰＡを、４０ｍｌのＭｅＯＨ及び２ｍｌの氷酢酸に溶解した。この溶液を、金塩の水溶液に連続的に撹拌しながら添加し、橙色溶液を生成した。この混合物に、１４ｍｌのＤＩ水中に溶解した１９０ｍｇ（５ｍｍｏｌ）のＮａＢＨ４を、室温で激しく撹拌しながら添加した。ＮａＢＨ４の添加直後に、溶液は暗褐色になり、続いて黒色凝集の外観が得られた。得られた混合物を室温で１時間撹拌した後、５ｍｌの１Ｍ  ＨＣｌ水溶液を添加した。次いで、金ナノ粒子のこの黒色溶液を７０００ＲＰＭで２０分間遠心分離した。上清を除去し、粒子を０．０１Ｍ  ＨＣｌで２回洗浄し、上記と同じ遠心分離パラメーターを維持した。粒子をＤＩ水で十分に、連続的に更に洗浄し、続いてジエチルエーテルで洗浄した。得られたＡｕＮＰ−ＤＴＤＴＰＡの黒色粉末を真空下で乾燥させ、−２０℃で保存した。必要に応じて、粒子は、０．０１Ｍ  ＮａＯＨに容易に分散し、１ヶ月にわたって安定であった。
【００７５】
実施例８
チオクト酸−ＢＢＮペプチドの合成
Ｆｍｏｃ化学法を用いた固相ペプチド合成を用いて合成ＢＢＮを行い、最終ペプチドをＨＰＬＣにより精製した。合成の固体支持体として４−ヒドロキシメチルフェノキシアセチル−４’−メチルベンジルヒドリルアミン樹脂を使用した。１当量の０．４５Ｍ  ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ溶液及び２当量のＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを使用して、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸を活性化した。アミノ酸は、ピペリジンを用いて脱保護され、ＮＭＭ．ＨＢＴＵを使用してカップリングした。適切な配列中の全てのアミノ酸のカップリング後、チオクト酸（リポ酸）をＤＩＣ．ＨＯＢｔ．を使用してカップリングした。ＴＦＡを使用して、樹脂からペプチドを切断した。この切断工程により、アミノ酸側鎖保護基も除去される。このペプチドを、Ａが水中０．１％  ＴＦＡであり、Ｂがアセトニトリル中０．１％  ＴＦＡである、０％ＢからのＡＢ勾配を使用して逆相ＨＰＬＣ／Ｃ１８カラムで精製した。精製後、ペプチド質量を、液体クロマトグラフィー−質量分析又はマトリックス支援レーザー脱着／イオン化によって測定し、ＨＰＬＣ逆相クロマトグラフィーを用いて純度を測定した。
【００７６】
実施例９
ＤＴＤＴＰＡで安定化されたボンベシン受容体特異的金ナノコンジュゲート（ＢＢＮ−ＡＵＮＰ−ＤＴＤＴＰＡ）の合成
チオクト酸末端ボンベシンを、１：０．２５、１：０．５、１：１、１：２、及び１：４のＡｕ：ＢＢＮの化学量論比で金ナノ粒子と反応させた。典型的には、２０ｍｌのガラスバイアル内で、０．０１Ｍ  ＮａＯＨの水／メタノール混合物（１：９）を使用して、ＡｕＮＰ−ＤＴＤＴＰＡ（［Ａｕ］＝２．２８μｍｏｌ）の溶液を調製した。チオクト酸末端ボンベシン（ＴＡ−ＢＢＮ）０．６４ｍｇ（０．５７μｍｏｌ）、１．２８ｍｇ（１．１４μｍｏｌ）、２．５６ｍｇ（２．２７μｍｏｌ）、５．１２ｍｇ（４．５４μｍｏｌ）、及び１０．２４ｍｇ（９．０８μｍｏｌ）を４ｍＬのＭｅＯＨに溶解し、次いでナノ粒子溶液に添加した。反応混合物を室温で２時間撹拌し、暗褐色の沈殿物の形成を観察した。混合物を遠心分離し（２０℃で９３００ｇ、１０分間）、上清を除去した。沈殿したＡｕＮＰをＭｅＯＨで２回洗浄し、水で３回洗浄した。ＢＢＮ−ＡｕＮＰ−ＤＴＤＴＰＡを低圧で乾燥させ、−２０℃で保存した。
【００７７】
実施例１０
ＡｕＮＰ−ＤＴＤＴＰＡ−ドキソルビシン及びＢＢＮ−ＡｕＮＰ−ＤＴＤＴＰＡ−ドキソルビシンの合成
ボンベシンペプチドを有する及び有しないドキソルビシンコンジュゲート金ナノ粒子の合成を三重で実施した。金ナノ粒子は、超音波処理により０．５ｍｇを１×ＰＢＳ中に懸濁させた。１００μｌのこの溶液に、０．１Ｍ  ２−（モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液（ｐＨ４．６）中の２ｍｇの１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）及び２ｍｇのスルホ−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド）を添加した。ＭＥＳ緩衝液を使用して、反応混合物のｐＨを５．３〜５．４に維持した。反応物を、３７℃において７００ＲＰＭで３時間撹拌した。３時間後、反応混合物を２５℃において２００００ｇで２０分間遠心分離した。臨床的なドキソルビシン０．７ｍｇを、ナノ粒子とのコンジュゲートに使用した。ドキソルビシン溶液に、活性化カルボキシル基を有するナノ粒子を添加し、反応混合物をボルテックスした。カップリングは、２５℃において７５０ｒｐｍで一晩実施した。反応混合物を２５℃において２００００ｇで２０分間遠心分離し、続いてペレットを１×ＰＢＳで２回洗浄し、１×ＰＢＳ溶液中に再懸濁した。ペレットと上清の両方を使用して、蛍光分光分析によってコンジュゲーション効率を試験した。
【００７８】
全ての引用された特許、特許開示、及び他の参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。しかしながら、本開示における用語が、組み込まれた参考文献における用語と矛盾するか又は相反する場合、本開示の用語は、組み込まれた参考文献からの相反する用語に優先する。
【００７９】
特定の実施形態について説明してきたが、本出願人ら又は当業者は、現在予見しないか、予見し得ない代替物、修正、変形、改善、及びほぼ均等物に想到し得る。したがって、出願されたままの、及び補正され得る、添付の特許請求の範囲は、そのような全ての代替物、修正、変形、改善、及びほぼ均等物を包含することが意図される。
【００８０】
（付記）
（付記１）
金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）と、ジチオール化ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＤＴＰＡ）と、チオクト酸末端ペプチドと、ドキソルビシンと、を含み、
前記ＤＴＤＴＰＡが少なくとも１つのＡｕ−Ｓ結合を介して前記金ナノ粒子表面に直接連結され、
前記チオクト酸末端ペプチドが少なくとも１つのＡｕ−Ｓ結合を介して前記金ナノ粒子表面に直接連結され、
前記ドキソルビシンが前記ＤＴＤＴＰＡに連結されている、
ナノコンジュゲート。
【００８１】
（付記２）
前記チオクト酸末端ペプチドが、チオクト酸末端ボンベシンである、付記１に記載のナノコンジュゲート。
【００８２】
（付記３）
前記チオクト酸末端ボンベシンが、配列：リポ酸−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＮＨ２を有する、付記２に記載のナノコンジュゲート。
【００８３】
（付記４）
前記ドキソルビシンが、アミド結合を介して前記ＤＴＤＴＰＡに連結されている、付記１〜３のいずれか一つに記載のナノコンジュゲート。
【００８４】
（付記５）
ＡｕＮＰ−ＤＴＤＴＰＡナノ粒子を前記チオクト酸末端ペプチドとコンジュゲートさせることを含むプロセスによって調製され、前記金ナノ粒子中の金及び前記チオクト酸末端ペプチドが、約１：０．５〜約１：４の化学量論比でコンジュゲーション反応中に存在する、付記１〜４のいずれか一つに記載のナノコンジュゲート。
【００８５】
（付記６）
前記金ナノ粒子中の金及び前記チオクト酸末端ペプチドが、約１：２の化学量論比で前記コンジュゲーション反応中に存在する、付記５に記載のナノコンジュゲート。
【００８６】
（付記７）
前記チオクト酸末端ペプチドが、前記ナノコンジュゲートの約１重量％〜約４０重量％を構成する、付記１〜６のいずれか一つに記載のナノコンジュゲート。
【００８７】
（付記８）
前記チオクト酸末端ペプチドが、前記ナノコンジュゲートの約２０重量％〜約３０重量％を構成する、付記７に記載のナノコンジュゲート。
【００８８】
（付記９）
前記ドキソルビシンが、前記ナノコンジュゲートの約０．０１重量％〜約０．０５重量％を構成する、付記１〜８のいずれか一つに記載のナノコンジュゲート。
【００８９】
（付記１０）
前記ドキソルビシンが、前記ナノコンジュゲートの約０．０３重量％を構成する、付記９に記載のナノコンジュゲート。
【００９０】
（付記１１）
前記ナノコンジュゲートが、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定されるとき、約１１０ｎｍ〜約１４０ｎｍの流体力学的直径を有する、付記１〜１０のいずれか一つに記載のナノコンジュゲート。
【００９１】
（付記１２）
前記ナノコンジュゲートが、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定されるとき、約１２０ｎｍ〜約１３０ｎｍの流体力学的直径を有する、付記１１に記載のナノコンジュゲート。
【００９２】
（付記１３）
前記ナノコンジュゲートが、約−１５ｍＶ〜約−３０ｍＶのゼータ電位値を有する、付記１〜１２のいずれか一つに記載のナノコンジュゲート。
【００９３】
（付記１４）
前記ナノコンジュゲートが、約−２０ｍＶ〜約−２５ｍＶのゼータ電位値を有する、付記１３に記載のナノコンジュゲート。
【００９４】
（付記１５）
付記１〜１４のいずれか一つに記載のナノコンジュゲートと、医薬的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
【００９５】
（付記１６）
治療有効量の付記１〜１４のいずれか一つに記載のナノコンジュゲートを、癌の治療を必要とする対象に投与することを含む、癌を治療するための方法。
【００９６】
（付記１７）
前記癌が、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄芽球性白血病（ＡＭＬ）、骨肉腫、乳癌、子宮内膜癌、胃癌、頭頸部癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、肝臓癌、腎臓癌、多発性骨髄腫、神経芽腫、卵巣癌、肺癌、軟部肉腫、胸腺腫、甲状腺癌、膀胱癌、子宮肉腫、前立腺癌、結腸癌、卵巣癌、非小細胞肺癌、膵臓癌、ウィルムス腫瘍、及びワルデンシュトレームマクログロブリン血症からなる群から選択される、付記１６に記載の方法。
【００９７】
（付記１８）
前記ナノコンジュゲートが、注射によって前記対象に投与される、付記１６又は１７に記載の方法。
【００９８】
（付記１９）
金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）と、ジチオール化ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＤＴＰＡ）と、ドキソルビシンとを含み、前記ＤＴＤＴＰＡが少なくとも１つのＡｕ−Ｓ結合を介して前記金ナノ粒子表面に直接連結され、前記ドキソルビシンが前記ＤＴＤＴＰＡに連結されている、ナノコンジュゲート。
【００９９】
（付記２０）
付記１９に記載のナノコンジュゲートと、医薬的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
【０１００】
（付記２１）
治療有効量の付記１９に記載のナノコンジュゲートを、癌の治療を必要とする対象に投与することを含む、癌を治療するための方法。
【図１】
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【図２】
2020504130.tif 000010
【図３】
2020504130.tif 000011
【図４Ａ】
2020504130.tif 000012
【図４Ｂ】
2020504130.tif 000013
【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
2020504130.tif 000015
【図５Ｂ】
2020504130.tif 000016
【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2020504130.tif 000023
【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
2020504130.tif 000027
【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【誤訳訂正書】
【提出日】令和1年12月5日(2019.12.5)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３５】
いくつかの実施形態では、コンジュゲーション反応に使用されるチオクト酸末端ペプチドの量は、金ナノ粒子中の金と少なくとも約１：１．５、少なくとも約１：２、少なくとも約１：２．５、又は少なくとも約１：３の比にある。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５８】
細胞培養：ＰＣ−３ヒト前立腺癌細胞及びＭＤＡ−ＭＢ２３１ヒト乳癌細胞（ＡＴＣＣ，ＵＳＡ）を、４．５ｇ／ＬのＤ−グルコース、２５ｍＭのＨｅｐｅｓ、０．１１ｇ／Ｌピルビン酸ナトリウム、１．５ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム、２ｍＭＬ−グルタミン、１０％熱不活化ウシ胎児血清（Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，ＵＳＡ）、及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン抗生物質溶液を補充したＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹから入手）中で増殖させた。細胞を、３７℃で、９５％空気及び５％ＣＯ２の加湿雰囲気（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）中で培養し、培地を１日おきに交換した。細胞を単層に接着させ、コンフルエントになると、トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて細胞培養フラスコから採取し、間隔をあけて播種した。
【国際調査報告】
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