(57)【要約】  本開示は、公知の臨床で使用されている分子と比べて好ましい治療プロファイルを有する抗体のＣＤＲ配列にグラフト化されたＩＬ２を提供する。詳細には、提供される抗体サイトカイングラフト化タンパク質組成物は、Ｔｒｅｇ細胞の活性を低下させる一方で、ＣＤ８＋  Ｔエフェクター細胞を増加させるか又はそれを維持する。加えて、提供される組成物は、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）などの組換えヒトＩＬ２製剤と比べて向上した半減期、安定性及び産生性を付与する。
2020520665.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）相補性決定領域（ＣＤＲ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域（ＶＨ）；及び
（ｂ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含む、軽鎖可変領域（ＶＬ）；及び
（ｃ）ＶＨ又はＶＬのＣＤＲにグラフト化されたインターロイキン２（ＩＬ２）分子
を含む抗体サイトカイングラフト化タンパク質。
【請求項２】
前記ＩＬ２分子が重鎖ＣＤＲにグラフト化されている、請求項１に記載の抗体サイトカイングラフト化タンパク質。
【請求項３】
重鎖ＣＤＲが、相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、及び相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）から選択される、請求項２に記載の抗体サイトカイングラフト化タンパク質。
【請求項４】
前記ＩＬ２分子がＨＣＤＲ１にグラフト化されている、請求項３に記載の抗体サイトカイングラフト化タンパク質。
【請求項５】
前記ＩＬ２分子が軽鎖ＣＤＲにグラフト化されている、請求項１に記載の抗体サイトカイングラフト化タンパク質。
【請求項６】
前記軽鎖ＣＤＲが、相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、及び相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）から選択される、請求項５に記載の抗体サイトカイングラフト化タンパク質。
【請求項７】
前記ＩＬ２分子が、高親和性ＩＬ２受容体に対する前記ＩＬ２分子の親和性を低下させる突然変異を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体サイトカイングラフト化タンパク質。
【請求項８】
前記抗体サイトカイングラフト化タンパク質によるＣＤ８  Ｔエフェクター細胞増殖の刺激が組換えＩＬ２又はＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）よりも大きい、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体サイトカイングラフト化タンパク質。
【請求項９】
前記抗体サイトカイングラフト化タンパク質によるＣＤ４  Ｔ制御性細胞増殖の刺激が組換えＩＬ２又はＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）よりも小さい、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体サイトカイングラフト化タンパク質。
【請求項１０】
前記抗体サイトカイングラフト化タンパク質によるＮＫ細胞増殖の刺激が組換えＩＬ２又はＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）よりも大きい、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体サイトカイングラフト化タンパク質。
【請求項１１】
前記抗体サイトカイングラフト化タンパク質が天然ＩＬ２又はＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）よりも長い半減期を有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体サイトカイングラフト化タンパク質。
【請求項１２】
前記ＩＬ２分子が配列番号４からなる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体サイトカイングラフト化タンパク質。
【請求項１３】
前記ＩＬ２分子が配列番号６からなる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体サイトカイングラフト化タンパク質。
【請求項１４】
ＩｇＧクラス抗体重鎖を更に含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗体サイトカイングラフト化タンパク質。
【請求項１５】
前記ＩｇＧクラス重鎖が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４から選択される、請求項１４に記載の抗体サイトカイングラフト化タンパク質。
【請求項１６】
標的に対する前記ＣＤＲの結合特異性が前記グラフト化されたＩＬ２分子によって１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％低下する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗体サイトカイングラフト化タンパク質。
【請求項１７】
標的に対する前記ＣＤＲの結合特異性が前記グラフト化されたＩＬ２分子の存在下で１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％保持される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗体サイトカイングラフト化タンパク質。
【請求項１８】
前記ＣＤＲの結合特異性が前記ＩＬ２分子の結合特異性と異なる、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の抗体サイトカイングラフト化タンパク質。
【請求項１９】
前記ＣＤＲの結合特異性が非ヒト抗原に対するものである、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の抗体サイトカイングラフト化タンパク質。
【請求項２０】
前記非ヒト抗原がウイルスである、請求項１９に記載の抗体サイトカイングラフト化タンパク質。
【請求項２１】
前記ウイルスが呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）である、請求項２０に記載の抗体サイトカイングラフト化タンパク質。
【請求項２２】
前記ＲＳＶが、ＲＳＶサブグループＡ及びＲＳＶサブグループＢから選択される、請求項２１に記載の抗体サイトカイングラフト化タンパク質。
【請求項２３】
前記抗体サイトカイングラフト化タンパク質の前記抗体足場部分がヒト化又はヒトである、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の抗体サイトカイングラフト化タンパク質。
【請求項２４】
（ｉ）（ａ）配列番号１３のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号１４のＨＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域及び（ｄ）配列番号２９のＬＣＤＲ１、（ｅ）配列番号３０のＬＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号３１のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；又は
（ｉｉ）（ａ）配列番号４５のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号４６のＨＣＤＲ２、（ｃ）配列番号４７のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；及び（ｄ）配列番号６１のＬＣＤＲ１、（ｅ）配列番号６２のＬＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号６３のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域
を含む抗体サイトカイングラフト化タンパク質。
【請求項２５】
（ｉ）配列番号１９を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号３５を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；又は
（ｉｉ）配列番号５１を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号６７を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含む抗体サイトカイングラフト化タンパク質。
【請求項２６】
低下したエフェクター機能に対応する修飾Ｆｃ領域を更に含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の抗体サイトカイングラフト化タンパク質。
【請求項２７】
前記修飾Ｆｃ領域が、Ｄ２６５Ａ、Ｐ３２９Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｎ２９７Ａ、Ｌ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａの１つ以上から選択される突然変異を含む、請求項２６に記載の抗体サイトカイングラフト化タンパク質。
【請求項２８】
前記修飾Ｆｃ領域が、Ｄ２６５Ａ／Ｐ３２９Ａ、Ｄ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａ、Ｌ２３４／Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ａ／Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ／Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａの１つ以上から選択される突然変異の組み合わせを含む、請求項２７に記載の抗体サイトカイングラフト化タンパク質。
【請求項２９】
配列番号１３のＨＣＤＲ１、配列番号１４のＨＣＤＲ２、配列番号１５のＨＣＤＲ３、配列番号２９のＬＣＤＲ１、配列番号３０のＬＣＤＲ２、配列番号３１のＬＣＤＲ３、突然変異Ｄ２６５Ａ／Ｐ３２９Ａを含む修飾Ｆｃ領域を含む抗体サイトカイングラフト化タンパク質であって、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）と比較したとき低いＴｒｅｇ細胞の活性化を刺激する抗体サイトカイングラフト化タンパク質。
【請求項３０】
配列番号４５のＨＣＤＲ１、配列番号４６のＨＣＤＲ２、配列番号４７のＨＣＤＲ３、配列番号６１のＬＣＤＲ１、配列番号６２のＬＣＤＲ２、配列番号６３のＬＣＤＲ３、突然変異Ｄ２６５Ａ／Ｐ３２９Ａを含む修飾Ｆｃ領域を含む抗体サイトカイングラフト化タンパク質であって、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）と比較したとき低いＴｒｅｇ細胞の活性化を刺激する抗体サイトカイングラフト化タンパク質。
【請求項３１】
（ｉ）配列番号２２の重鎖及び配列番号３８の軽鎖；又は（ｉｉ）配列番号５４の重鎖及び配列番号７０の軽鎖を含む抗体サイトカイングラフト化タンパク質をコードする単離核酸。
【請求項３２】
抗体サイトカイングラフト化タンパク質の産生に好適な組換え宿主細胞であって、前記抗体サイトカイングラフト化タンパク質の重鎖及び軽鎖ポリペプチドをコードする請求項３１に記載の核酸と、任意選択で分泌シグナルとを含む組換え宿主細胞。
【請求項３３】
哺乳類細胞株である、請求項３２に記載の組換え宿主細胞。
【請求項３４】
前記哺乳類細胞株がＣＨＯ細胞株である、請求項３３に記載の組換え宿主細胞。
【請求項３５】
請求項１〜３０のいずれか一項に記載の抗体サイトカイングラフト化タンパク質と薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。
【請求項３６】
それを必要としている個体の癌の治療方法であって、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の抗体サイトカイングラフト化タンパク質又は請求項３５に記載の医薬組成物の治療有効量を前記個体に投与することを含む方法。
【請求項３７】
前記癌が、黒色腫、肺癌、結腸直腸癌、前立腺癌、乳癌及びリンパ腫からなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記抗体サイトカイングラフト化タンパク質又は医薬組成物が別の治療剤と併用して投与される、請求項３６又は３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記治療剤が別の抗体サイトカイングラフト化タンパク質である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記治療剤が免疫チェックポイント阻害薬である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記免疫チェックポイントが、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−５、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４及びＴＧＦＲからなる群から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
それを必要としている患者におけるＣＤ８  Ｔエフェクター細胞の拡大方法であって、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の抗体サイトカイングラフト化タンパク質又は請求項３５に記載の医薬組成物を前記患者に投与することを含む方法。
【請求項４３】
前記ＣＤ８  Ｔエフェクター細胞が拡大され、且つＴｒｅｇ細胞が拡大されない、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記ＣＤ８  Ｔエフェクター細胞が拡大され、且つＮＫ細胞が拡大されない、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
免疫チェックポイント阻害薬の投与を更に含む、請求項４２〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記免疫チェックポイントが、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−５、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４及びＴＧＦＲからなる群から選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
癌の治療における、
（ｉ）（ａ）配列番号１３のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号１４のＨＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域及び（ｄ）配列番号２９のＬＣＤＲ１、（ｅ）配列番号３０のＬＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号３１のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；又は
（ｉｉ）（ａ）配列番号４５のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号４６のＨＣＤＲ２、（ｃ）配列番号４７のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；及び（ｄ）配列番号６１のＬＣＤＲ１、（ｅ）配列番号６２のＬＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号６３のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域
を含む抗体サイトカイングラフト化タンパク質の使用。
【請求項４８】
前記抗体サイトカイングラフト化タンパク質が別の治療剤と併用して投与される、請求項４７に記載の使用。
【請求項４９】
前記治療剤が免疫チェックポイント阻害薬である、請求項４８に記載の使用。
【請求項５０】
前記免疫チェックポイントが、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−５、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４及びＴＧＦＲからなる群から選択される、請求項４９に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年５月２４日に出願された米国仮特許出願第６２／５１０５３３号の利益を主張するものであり、この仮特許出願の内容は、全体が参照により本明細書に援用される。
【０００２】
本発明は、インターロイキン−２（ＩＬ２）低親和性受容体に結合する抗体−サイトカイングラフト化タンパク質、並びに癌の治療方法に関する。
【０００３】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に援用される。２０１８年４月５日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、ＰＡＴ０５７４６２−ＷＯ−ＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔと称され、６９，４８９バイトのサイズである。
【背景技術】
【０００４】
ＩＬ２は１９８３年に初めてクローニングされた（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９８３，３０２：３０５−３１０、Ｄｅｖｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９８３，１１（１３）：４３０７−４３２３、Ｍａｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１９８３，１１５：１０４０−１０４７）。ＩＬ２タンパク質は、アミノ酸１〜２０のシグナルペプチドを含めて１５３アミノ酸の長さがあり、４つの逆平行両親媒性αヘリックス構造に折り畳まれている（Ｓｍｉｔｈ  Ｋ．Ａ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８８，２４０：１１６９−１１７６）。
【０００５】
ＩＬ２は、高親和性又は低親和性受容体を通じたシグナル伝達によってその生物学的効果を媒介する（Ｋｒｅｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ２０１０，１０７（２６）１１９０６−１１９１１）。高親和性受容体は、ＩＬ２−Ｒα（ＣＤ２５）ＩＬ２−Ｒβ（ＣＤ１２２）及びＩＬ２−Ｒγ（ＣＤ１３２）からなる三量体である。低親和性受容体は、ＩＬ２−Ｒβ（ＣＤ１２２）及びＩＬ２−Ｒγ（ＣＤ１３２）鎖のみからなる二量体である。低親和性受容体はＩＬ２に結合するが、親和性は三量体である高親和性受容体の１０〜１００分の１であり、ＩＬ２−Ｒα（ＣＤ２５）が親和性の増加に重要であるものの、シグナル伝達成分ではないことが示唆される（Ｋｒｅｉｇ  ｅｔ  ａｌ．、前掲）。ＩＬ２受容体の発現もまた特徴的である。高親和性ＩＬ２受容体は、活性化Ｔ細胞及びＣＤ４＋／Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に発現する。対照的に、低親和性ＩＬ２受容体はＣＤ８＋  Ｔエフェクター、及びナチュラルキラー細胞（ＮＫ）に見られる。
【０００６】
組換えＩＬ２（ｒｈＩＬ２）は当初、１９９２年に臨床使用が承認された（Ｃｏｖｅｎｔｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｇｔ  Ｒｅｓ．２０１２  ４：２１５−２２１）。Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）（アルデスロイキン）は、非グリコシル化型の、Ｎ末端アラニンを欠いた、且つアミノ酸１２５でシステインがセリンに置換された修飾ＩＬ２である。Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）は当初、悪性黒色腫及び腎細胞癌に対する療法薬として適応されたが、結腸直腸癌、乳癌、肺癌及び中皮腫などの他の癌型に使用されるようになっている（Ｃｏｖｅｎｔｒｙ、前掲）。１９８６〜２００６年の２５９人の腎細胞癌患者にわたる研究では、２３人の患者が完全奏効となり、３０人が部分奏効となったことが見出された（Ｋｌａｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  ２００８  １１３（２）：２９３−３０１）。これは２０％の全客観的奏効率に相当し、腎細胞癌患者の７％で完全腫瘍退縮が得られた（Ｋｌａｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、前掲）。
【０００７】
しかしながら、ＩＬ２による癌治療に有害作用がなかったわけではない。この２５９人の患者の研究では、毛細血管／血管漏出、血管拡張及び乏尿が認められた。また、カテーテル感染症及び一般感染症の両方の、好中球機能不全に起因するグレード３及びグレード４の感染症もあった（Ｋｌａｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、前掲）。Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）の文献は、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）が、クローン病、強皮症、甲状腺炎、炎症性関節炎、真性糖尿病、眼筋・球麻痺型重症筋無力症、半月体形成性ＩｇＡ糸球体腎炎、胆嚢炎、脳血管炎、スティーブンス・ジョンソン症候群及び水疱性類天疱瘡などの自己免疫疾患及び炎症性障害の増悪と関連付けられていることを指摘している。
【０００８】
Ｔｒｅｇ細胞が高親和性ＩＬ２受容体を構成的に発現し、生存及び機能に関してＩＬ２に依存したという発見は、何故この副作用が見られたのかを示唆するものであった（Ｄ’Ｃｒｕｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏ．２００５，６：１１５２−１１５９）。これは、薬物動態が改善された、且つ高親和性受容体を介してＴｒｅｇ細胞を活性化することなく、低親和性受容体を介したＣＤ８＋  Ｔ細胞細胞の活性化に選択性のある、それによりＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）で見られる望ましくない副作用のない癌の治療を可能にするＩＬ２療法薬の必要性を示すものである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
説明
本開示は、公知の臨床で使用されている分子と比べて好ましい治療プロファイルを有する抗体のＣＤＲ配列にグラフト化されたＩＬ２を提供する。詳細には、提供される抗体サイトカイングラフト化タンパク質組成物は、Ｔｒｅｇ細胞の活性を低下させる一方で、ＣＤ８＋  Ｔエフェクター細胞を増加させるか又はそれを維持する。加えて、提供される組成物は、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）などの組換えヒトＩＬ２製剤と比べて向上した半減期、安定性及び産生性を付与する。従って本開示は、ＩＬ２高親和性受容体への結合が低下した、ＩＬ２低親和性受容体に結合し且つそれを通じた好ましいシグナル伝達を促進する抗体サイトカイングラフト化タンパク質を提供する。（ｉ）重鎖可変領域（ＶＨ）を含む免疫グロブリン重鎖配列と（ｉｉ）軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む免疫グロブリン軽鎖配列とを含む抗体−サイトカイングラフト化タンパク質が提供され、ここで抗体のＶＨ又はＶＬの相補性決定領域（ＣＤＲ）にＩＬ２分子がグラフト化される。
【００１０】
本開示の実施形態は、
（ａ）相補性決定領域（ＣＤＲ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域（ＶＨ）；及び
（ｂ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含む、軽鎖可変領域（ＶＬ）；及び
（ｃ）ＶＨ又はＶＬのＣＤＲにグラフト化されたインターロイキン２（ＩＬ２）分子
を含む抗体サイトカイングラフト化タンパク質を提供する。
【００１１】
重鎖ＣＤＲにグラフト化されたＩＬ２分子を含む、抗体サイトカイングラフト化タンパク質。
【００１２】
ＩＬ２分子が、相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）又は相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）から選択される領域にグラフト化されている、抗体サイトカイングラフト化タンパク質。
【００１３】
ＨＣＤＲ１にグラフト化されたＩＬ２分子を含む、抗体サイトカイングラフト化タンパク質。
【００１４】
軽鎖ＣＤＲにグラフト化されたＩＬ２分子を含む、抗体サイトカイングラフト化タンパク質。
【００１５】
ＩＬ２分子が、相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、又は相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）から選択される領域にグラフト化されている、抗体サイトカイングラフト化タンパク質。
【００１６】
高親和性ＩＬ２受容体に対するＩＬ２分子の親和性を低下させる突然変異を含むＩＬ２分子を含む、抗体サイトカイングラフト化タンパク質。
【００１７】
抗体サイトカイングラフト化タンパク質によるＣＤ８  Ｔ細胞エフェクター増殖の刺激が組換えＩＬ２又はＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）よりも大きい、抗体サイトカイングラフト化タンパク質。
【００１８】
抗体サイトカイングラフト化タンパク質によるＴｒｅｇ細胞増殖の刺激が組換えＩＬ２又はＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）よりも小さい、抗体サイトカイングラフト化タンパク質。
【００１９】
抗体サイトカイングラフト化タンパク質によるＮＫ細胞増殖の刺激が組換えＩＬ２又はＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）よりも大きい、抗体サイトカイングラフト化タンパク質。
【００２０】
抗体サイトカイングラフト化タンパク質が組換えＩＬ２又はＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）よりも長い半減期を有する、抗体サイトカイングラフト化タンパク質。
【００２１】
ＩＬ２分子が配列番号４からなる、抗体サイトカイングラフト化タンパク質。
【００２２】
ＩＬ２分子が配列番号６からなる、抗体サイトカイングラフト化タンパク質。
【００２３】
ＩｇＧクラス抗体重鎖を含む、抗体サイトカイングラフト化タンパク質。
【００２４】
ＩｇＧが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ４から選択される、抗体サイトカイングラフト化タンパク質。
【００２５】
標的に対するＣＤＲの結合特異性が、グラフト化されたＩＬ２分子によって１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％低下する、抗体サイトカイングラフト化タンパク質。
【００２６】
標的に対するＣＤＲの結合特異性が、グラフト化されたＩＬ２分子の存在下で１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％保持される、抗体サイトカイングラフト化タンパク質。
【００２７】
ＣＤＲの結合特異性がＩＬ２分子の結合特異性と異なる、抗体サイトカイングラフト化タンパク質。
【００２８】
ＣＤＲの結合特異性が非ヒト標的に対するものである、抗体サイトカイングラフト化タンパク質。
【００２９】
非ヒト抗原がウイルスである、抗体サイトカイングラフト化タンパク質。
【００３０】
ウイルスが呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）である、抗体サイトカイングラフト化タンパク質。
【００３１】
ＲＳＶが、ＲＳＶサブグループＡ及びＲＳＶサブグループＢから選択される、抗体サイトカイングラフト化タンパク質。
【００３２】
抗体サイトカイングラフト化タンパク質の抗体足場部分がヒト化又はヒトである、抗体サイトカイングラフト化タンパク質。
【００３３】
本開示の実施形態は、（ｉ）（ａ）配列番号１３のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号１４のＨＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域及び（ｄ）配列番号２９のＬＣＤＲ１、（ｅ）配列番号３０のＬＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号３１のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；又は（ｉｉ）（ａ）配列番号４５のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号４６のＨＣＤＲ２、（ｃ）配列番号４７のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；及び（ｄ）配列番号６１のＬＣＤＲ１、（ｅ）配列番号６２のＬＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号６３のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体サイトカイングラフト化タンパク質を提供する。
【００３４】
本開示の実施形態は、（ｉ）配列番号１９を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号３５を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；又は（ｉｉ）配列番号５１を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び配列番号６７を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体サイトカイングラフト化タンパク質を提供する。
【００３５】
抗体が、低下したエフェクター機能に対応する修飾Ｆｃ領域を含む、抗体サイトカイングラフト化タンパク質。
【００３６】
修飾Ｆｃ領域が、Ｄ２６５Ａ、Ｐ３２９Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｎ２９７Ａ、Ｌ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａの１つ以上から選択される突然変異を含む、抗体サイトカイングラフト化タンパク質。
【００３７】
修飾Ｆｃ領域が、Ｄ２６５Ａ／Ｐ３２９Ａ、Ｄ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａ、Ｌ２３４／Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ａ／Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ／Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａの１つ以上から選択される突然変異の組み合わせを含む、抗体サイトカイングラフト化タンパク質。
【００３８】
本開示の実施形態は、配列番号１３のＨＣＤＲ１、配列番号１４のＨＣＤＲ２、配列番号１５のＨＣＤＲ３、配列番号２９のＬＣＤＲ１、配列番号３０のＬＣＤＲ２、配列番号３１のＬＣＤＲ３、突然変異Ｄ２６５Ａ／Ｐ３２９Ａを含む修飾Ｆｃ領域を含む抗体サイトカイングラフト化タンパク質を提供し、ここで抗体サイトカイングラフト化タンパク質は組換えＩＬ２又はＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）と比較したとき低いＴｒｅｇ細胞の活性化を刺激する。
【００３９】
本開示の実施形態は、配列番号４５のＨＣＤＲ１、配列番号４６のＨＣＤＲ２、配列番号４７のＨＣＤＲ３、配列番号６１のＬＣＤＲ１、配列番号６２のＬＣＤＲ２、配列番号６３のＬＣＤＲ３、突然変異Ｄ２６５Ａ／Ｐ３２９Ａを含む修飾Ｆｃ領域を含む抗体サイトカイングラフト化タンパク質を提供し、ここで抗体サイトカイングラフト化タンパク質は組換えＩＬ２又はＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）と比較したとき低いＴｒｅｇ細胞の活性化を刺激する。
【００４０】
本開示の実施形態は、（ｉ）配列番号２２の重鎖及び／又は配列番号３８の軽鎖；又は（ｉｉ）配列番号５４の重鎖及び／又は配列番号７０の軽鎖を含む抗体サイトカイングラフト化タンパク質をコードする単離核酸を提供する。
【００４１】
本開示の実施形態は、タンパク質の重鎖及び軽鎖ポリペプチド、及び任意選択で分泌シグナルをコードする本明細書に開示される核酸を含む、抗体サイトカイングラフト化タンパク質の産生に好適な組換え宿主細胞を提供する。
【００４２】
哺乳類細胞株である組換え宿主細胞。
【００４３】
哺乳類細胞株がＣＨＯ細胞株である、組換え宿主細胞。
【００４４】
本開示の実施形態は、本明細書に開示される抗体サイトカイングラフト化タンパク質と１つ以上の薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物を提供する。
【００４５】
本開示の実施形態は、それを必要としている個体の癌を治療する方法を提供し、この方法は、本明細書に開示される抗体サイトカイングラフト化タンパク質又は医薬組成物の治療有効量を個体に投与することを含む。
【００４６】
癌が、黒色腫、肺癌、結腸直腸癌、前立腺癌、乳癌及びリンパ腫からなる群から選択される、癌の治療方法。
【００４７】
抗体サイトカイングラフト化タンパク質又は医薬組成物が別の治療剤と併用して投与される、癌の治療方法。
【００４８】
治療剤が別の抗体サイトカイングラフト化タンパク質である、癌の治療方法。
【００４９】
治療剤が免疫チェックポイント阻害薬である、癌の治療方法。
【００５０】
免疫チェックポイントが、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−５、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４及びＴＧＦＲからなる群から選択される、癌の治療方法。
【００５１】
本開示の実施形態は、それを必要としている患者のＣＤ８  Ｔエフェクター細胞を拡大する方法を提供し、この方法は、本明細書に開示される抗体サイトカイングラフト化タンパク質又は医薬組成物を患者に投与することを含む。
【００５２】
ＣＤ８  Ｔエフェクター細胞が拡大され、且つＴｒｅｇ細胞が拡大されない、ＣＤ８  Ｔエフェクター細胞を拡大する方法。
【００５３】
ＣＤ８  Ｔエフェクターが拡大され、且つＮＫ細胞が拡大されない、ＣＤ８  Ｔエフェクター細胞を拡大する方法。
【００５４】
免疫チェックポイント阻害薬の投与を更に含む、ＣＤ８  Ｔエフェクター細胞を拡大する方法。
【００５５】
免疫チェックポイントが、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−５、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４及びＴＧＦＲからなる群から選択される、ＣＤ８  Ｔエフェクター細胞を拡大する方法。
【００５６】
本開示の実施形態は、癌の治療における、（ｉ）（ａ）配列番号１３のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号１４のＨＣＤＲ２、（ｃ）配列番号１５のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域及び（ｄ）配列番号２９のＬＣＤＲ１、（ｅ）配列番号３０のＬＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号３１のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；及び（ｉｉ）（ａ）配列番号４５のＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号４６のＨＣＤＲ２、（ｃ）配列番号４７のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；及び（ｄ）配列番号６１のＬＣＤＲ１、（ｅ）配列番号６２のＬＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号６３のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む癌の治療における抗体サイトカイングラフト化タンパク質の使用を提供する。
【００５７】
抗体サイトカイングラフト化タンパク質が別の治療剤と併用して投与される、抗体サイトカイングラフト化タンパク質の使用。
【００５８】
治療剤が免疫チェックポイント阻害薬のアンタゴニストである、抗体サイトカイングラフト化タンパク質の使用。
【００５９】
免疫チェックポイント阻害薬のアンタゴニストが、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−５、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４及びＴＧＦＲからなる群から選択される、使用。
【００６０】
特定の実施形態において、抗体サイトカイングラフト化タンパク質はＩｇＧクラス抗体Ｆｃ領域を含む。詳細な実施形態において、免疫グロブリンは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ４サブクラスＦｃ領域から選択される。抗体、抗体断片、又は抗原結合分子は、任意選択で、Ｆｃ受容体への抗体又は抗体断片の結合を調節する（即ち増加又は低下させる）少なくとも１つの修飾を含む。免疫グロブリン重鎖は、任意選択で、修飾されたエフェクター機能を付与する修飾を含み得る。詳細な実施形態において、免疫グロブリン重鎖は、Ｄ２６５Ａ、Ｐ３２９Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｎ２９７Ａ、Ｄ２６５Ａ／Ｐ３２９Ａ、Ｄ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａ、Ｌ２３４／Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ａ／Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ／Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａのいずれかから選択されるエフェクター機能の低下を付与する突然変異を含み得る。
【００６１】
一部の実施形態において、抗体サイトカイングラフト化タンパク質はまた、分子のＩＬ２部分の変異も含む。この変異は、単一のアミノ酸変化、単一のアミノ酸欠失、複数のアミノ酸変化及び複数のアミノ酸欠失であってもよい。分子のＩＬ２サイトカイン部分のこれらの変化は、高親和性ＩＬ２受容体に対する抗体サイトカイングラフト化タンパク質の親和性を低下させることができる。
【００６２】
更には、本開示は、本明細書に記載されるとおりの抗体サイトカイングラフト化タンパク質の少なくとも重鎖及び／又は軽鎖タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。別の関連する態様において、宿主細胞は、本明細書に記載されるとおりの抗体サイトカイングラフト化タンパク質の産生に好適な宿主細胞を提供する。詳細な実施形態において、宿主細胞は、抗体サイトカイングラフト化タンパク質の軽鎖及び／又は重鎖ポリペプチドをコードする核酸を含む。更に別の態様において、抗体サイトカイングラフト化タンパク質の作製方法が提供され、この方法は、抗体サイトカイングラフト化タンパク質の発現、形成、及び分泌に好適な条件下で本明細書に記載されるとおりの提供される宿主細胞を培養すること、及び培養物から抗体サイトカイングラフト化タンパク質を回収することを含む。更なる態様において、本開示は、本明細書に記載されるとおりの抗体サイトカイングラフト化タンパク質を含むキットを更に提供する。
【００６３】
別の関連する態様において、本開示は、本明細書に記載されるとおりの抗体サイトカイングラフト化タンパク質と、薬学的に許容可能な担体とを含む組成物を更に提供する。一部の実施形態において、本開示は、個体に投与するための抗体サイトカイングラフト化タンパク質を含む医薬組成物を提供する。
【００６４】
別の態様において、それを必要としている個体の癌を治療する方法であって、本明細書に記載されるとおりの抗体サイトカイングラフト化タンパク質の治療有効量を個体に投与することを含む方法。更なる態様において、個体の癌の治療又は予防における使用のための抗体サイトカイングラフト化タンパク質が提供される。
【００６５】
一部の実施形態において、患者は細胞増殖障害又は癌、例えば、黒色腫、肺癌、結腸直腸癌、前立腺癌、乳癌及びリンパ腫を有する。
【００６６】
定義
「抗体」は、四量体構造単位を含む免疫グロブリンファミリーの分子を指す。各四量体が２つの同一のポリペプチド鎖対を含み、各対が、ジスルフィド結合で結び付けられた１つの「軽」鎖（約２５ｋＤ）と１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤ）とを有する。認められている免疫グロブリン遺伝子には、κ、λ、α、γ、δ、ε、及びμ定常領域遺伝子、並びに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖はκ又はλのいずれかに分類される。重鎖はγ、μ、α、δ、又はεに分類され、ひいてはこれが免疫グロブリンクラス、それぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥを定義する。抗体は、任意のアイソタイプ／クラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ）、又は任意のサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）であり得る。
【００６７】
軽鎖及び重鎖は両方とも、構造的及び機能的相同性領域に分けられる。構造的及び機能的に、用語「定常」及び「可変」が用いられる。各鎖のＮ末端は、抗原認識に一義的に関与する約１００〜１１０アミノ酸又はそれ以上の可変（Ｖ）領域又はドメインを画成する。用語の可変軽鎖（ＶL）及び可変重鎖（ＶH）は、それぞれ軽鎖及び重鎖のこれらの領域を指す。ＶHとＶLとが共に対になって単一の抗原結合部位を形成する。Ｖ領域に加え、重鎖及び軽鎖は両方とも定常（Ｃ）領域又はドメインを含む。分泌型の免疫グロブリンＣ領域は、３つのＣドメインＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、任意選択でＣＨ４（Ｃμ）、及びヒンジ領域で構成される。膜結合型の免疫グロブリンＣ領域はまた、膜ドメイン及び細胞内ドメインを有する。各軽鎖はＮ末端にＶLを有し、続いてその他端に定常ドメイン（Ｃ）を有する。軽鎖（ＣＬ）及び重鎖（ＣＨ１、ＣＨ２又はＣＨ３）の定常ドメインは、分泌、経胎盤移動、Ｆｃ受容体結合、補体結合など、重要な生物学的特性を付与する。慣習上、定常領域ドメインの番号は、抗原結合部位又は抗体のアミノ末端から遠位になるに従い大きくなる。Ｎ末端が可変領域であり、Ｃ末端が定常領域である；実際にはＣＨ３及びＣＬドメインが、それぞれ重鎖及び軽鎖のカルボキシ末端ドメインを含む。ＶＬはＶＨと整列し、及びＣＬは重鎖の第１の定常ドメインと整列する。本明細書で使用されるとき、「抗体」は、従来の抗体構造及び変種の抗体を包含する。従って、この概念の範囲内には、抗体サイトカイングラフト化タンパク質、完全長抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、及びその抗体断片がある。
【００６８】
抗体は、インタクトな免疫グロブリン鎖として存在するか、又は様々なペプチダーゼによる消化によって産生される幾つもの十分に特徴付けられた抗体断片として存在する。用語「抗体断片」は、本明細書で使用されるとき、６つのＣＤＲを保持している抗体の１つ以上の一部分を指す。従って、例えば、ペプシンがヒンジ領域のジスルフィド結合の下で抗体を消化すると、それ自体軽鎖がジスルフィド結合によってＶH−ＣH１に連結したものであるＦａｂ’の二量体、Ｆ（ａｂ）’2が産生される。Ｆ（ａｂ）’2を穏和条件下で還元するとヒンジ領域のジスルフィド結合が壊れ、それによりＦ（ａｂ）’2二量体がＦａｂ’単量体に変換され得る。Ｆａｂ’単量体は本質的に、ヒンジ領域の一部分を有するＦａｂである（Ｐａｕｌ，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３ｄ  ｅｄ．（１９９３））。様々な抗体断片がインタクトな抗体の消化という観点で定義されているが、当業者は、かかる断片が化学的に、或いは組換えＤＮＡ方法を用いることによりデノボ合成されてもよいことを理解するであろう。本明細書で使用されるとき、「抗体断片」は、全抗体の修飾によって作製されるか、又は組換えＤＮＡ方法を用いてデノボ合成されるかのいずれかの、結合特異性及び機能活性を保持している抗体の１つ以上の一部分を指す。抗体断片の例としては、同じ結合特異性を備えたＦｖ断片、単鎖抗体（ＳｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｄ（Ｖｈ及びＣＨ１ドメイン）、ｄＡｂ（Ｖｈ及び単離ＣＤＲ）；及びこれらの断片の多量体型（例えば、Ｆ（ａｂ’）2）が挙げられる。抗体サイトカイングラフト化タンパク質はまた、所望の結合特異性及び活性を実現するのに必要な抗体断片も含み得る。
【００６９】
「Ｆａｂ」ドメインは、この文脈で使用されるとき、重鎖可変ドメイン、定常領域ＣＨ１ドメイン、軽鎖可変ドメイン、及び軽鎖定常領域ＣＬドメインを含む。これらのドメインの相互作用はＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの間のジスルフィド結合によって安定している。一部の実施形態において、Ｆａｂの重鎖ドメインはＮ末端からＣ末端にＶＨ−ＣＨの順序であり、Ｆａｂの軽鎖ドメインはＮ末端からＣ末端にＶＬ−ＣＬの順序である。一部の実施形態において、Ｆａｂの重鎖ドメインはＮ末端からＣ末端にＣＨ−ＶＨの順序であり、Ｆａｂの軽鎖ドメインはＣＬ−ＶＬの順序である。Ｆａｂ断片は歴史的にはインタクトな免疫グロブリンのパパイン消化によって同定されたが、この開示の文脈において、「Ｆａｂ」は、典型的には任意の方法により組換えで作製される。各Ｆａｂ断片は抗原結合に関して一価であり、即ちそれは単一の抗原結合部位を有する。
【００７０】
「相補性決定ドメイン」又は「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）は、同義的に、ＶL及びＶHの超可変領域を指す。ＣＤＲは、抗体鎖の中でかかる標的タンパク質に対する特異性を備えた標的タンパク質結合部位である。各ヒトＶＬ又はＶＨ中に３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１〜３、Ｎ末端から連続的に番号付けされる）があり、可変ドメインの約１５〜２０％を占める。ＣＤＲは、標的タンパク質のエピトープに対して構造的に相補的であり、したがって、結合特異性に直接関与している。ＶＬ又はＶＨの残りの区間、いわゆるフレームワーク領域（ＦＲ）は、アミノ酸配列の変化をあまり示さない（Ｋｕｂｙ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  ｅｄ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  ４．Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２０００）。
【００７１】
ＣＤＲ及びフレームワーク領域の位置は、当該技術分野における様々な周知の定義、例えば、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、及びＡｂＭ（例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．１９９１  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２，Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２９：２０５−２０６（２００１）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１−９１７（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４２：８７７−８８３（１９８９）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：７９９−８１７（１９９２）；Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７３：９２７−７４８（１９９７）を参照）を用いて決定され得る。抗原結合部位の定義は、以下にも記載されている：Ｒｕｉｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２８：２１９−２２１（２０００）；及びＬｅｆｒａｎｃ，Ｍ．Ｐ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２９：２０７−２０９（２００１）；（ＩｍＭｕｎｏＧｅｎＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ）Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．，Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ，７，１３２−１３６（１９９９）；Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ２７，５５−７７（２００３）；ＭａｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６２：７３２−７４５（１９９６）；及びＭａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：９２６８−９２７２（１９８９）；Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２０３：１２１−１５３（１９９１）；及びＲｅｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ  Ｍ．Ｊ．Ｅ．（ｅｄ．），Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１４１−１７２（１９９６）。
【００７２】
Ｋａｂａｔに基づけば、ＶHのＣＤＲアミノ酸残基は３１〜３５（ＨＣＤＲ１）、５０〜６５（ＨＣＤＲ２）、及び９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）と付番され；及びＶLのＣＤＲアミノ酸残基は２４〜３４（ＬＣＤＲ１）、５０〜５６（ＬＣＤＲ２）、及び８９〜９７（ＬＣＤＲ３）と付番される。Ｃｈｏｔｈｉａに基づけば、ＶHのＣＤＲアミノ酸は２６〜３２（ＨＣＤＲ１）、５２〜５６（ＨＣＤＲ２）、及び９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）と付番され；及びＶLのアミノ酸残基は２６〜３２（ＬＣＤＲ１）、５０〜５２（ＬＣＤＲ２）、及び９１〜９６（ＬＣＤＲ３）と付番される。Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの両方のＣＤＲ定義を組み合わせることにより、ＣＤＲはヒトＶＨにおいてアミノ酸残基２６〜３５（ＨＣＤＲ１）、５０〜６５（ＨＣＤＲ２）、及び９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）、及びヒトＶＬにおいてアミノ酸残基２４〜３４（ＬＣＤＲ１）、５０〜５６（ＬＣＤＲ２）、及び８９〜９７（ＬＣＤＲ３）からなる。
【００７３】
「抗体可変軽鎖」又は「抗体可変重鎖」は、本明細書で使用されるとき、それぞれＶL又はＶHを含むポリペプチドを指す。内因性ＶLは遺伝子セグメントＶ（可変）及びＪ（連結）によってコードされ、及び内因性ＶHはＶ、Ｄ（多様性）、及びＪによってコードされる。ＶL又はＶHの各々はＣＤＲ並びにフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。用語「可変領域」又は「Ｖ領域」は、同義的に、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を含む重鎖又は軽鎖を指す。Ｖ領域は天然に存在するもの、組換え又は合成であってもよい。本願において、抗体軽鎖及び／又は抗体重鎖は、時折、まとめて「抗体鎖」と称することができる。本明細書に提供され及び更に記載されるとおり、「抗体可変軽鎖」又は「抗体可変重鎖」及び／又は「可変領域」及び／又は「抗体鎖」は任意選択で、ＣＤＲに組み込まれたサイトカインポリペプチド配列を含む。
【００７４】
本明細書における免疫グロブリン重鎖の、例えばＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含むＣ末端部分は、「Ｆｃ」ドメインである。「Ｆｃ領域」は、本明細書で使用されるとき、第１の定常領域（ＣＨ１）免疫グロブリンドメインを除外した抗体の定常領域を指す。Ｆｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメイン、ＩｇＥ及びＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメイン、並びにこれらのドメインの可動性ヒンジＮ末端を指す。ＩｇＡ及びＩｇＭについては、ＦｃはＪ鎖を含み得る。ＩｇＧについては、Ｆｃは免疫グロブリンドメインＣγ２及びＣγ３並びにＣγ１とＣγとの間のヒンジを含む。当該技術分野においては、Ｆｃ領域の境界は様々であり得るが、しかしながらヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は通常は残基Ｃ２２６又はＰ２３０〜そのカルボキシル末端まで（使用する付番はＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ９１−３２４２，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ，Ｖａ．）にあるＥＵインデックスに従う）を含むと定義されることが理解される。「Ｆｃ領域」は、この領域を単独で指すこともあり、又は抗体若しくは抗体断片のコンテクストでこの領域を指すこともある。「Ｆｃ領域」は、例えばエフェクター機能を調節する修飾を含め、Ｆｃ領域の天然に存在する対立遺伝子変異体を例えばＣＨ２及びＣＨ３領域に含む。Ｆｃ領域はまた、生物学的機能に変化をもたらさない変異体も含む。例えば、免疫グロブリンのＦｃ領域のＮ末端又はＣ末端から、生物学的機能を実質的に失うことなく１つ以上のアミノ酸が欠失される。例えば、特定の実施形態においてＣ末端リジンが修飾され、置き換えられ、又は除去される。詳細な実施形態においてＦｃ領域の１つ以上のＣ末端残基が変更又は除去される。特定の実施形態においてＦｃの１つ以上のＣ末端残基（例えば、末端リジン）が欠失される。特定の他の実施形態においてＦｃの１つ以上のＣ末端残基が別のアミノ酸で置換される（例えば、末端リジンが置き換えられる）。かかる変異体は、活性に及ぶ効果が最小限となるように当該技術分野において公知の一般的規則に従い選択される（例えば、Ｂｏｗｉｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：３０６−１３１０，１９９０を参照のこと）。Ｆｃドメインは、ＦｃＲなどの細胞受容体によって認識される免疫グロブリン（Ｉｇ）の一部分であり、そこに補体活性化タンパク質Ｃ１ｑが結合する。ＣＨ２エクソンの５’部分にコードされる下方のヒンジ領域は、ＦｃＲ受容体への結合のための抗体内の可動性を提供する。
【００７５】
「キメラ抗体」は、（ａ）異なる又は変更されたクラス、エフェクター機能及び／又は種の定常領域、又はそのキメラ抗体に新規特性を付与する完全に異なる分子、例えば、酵素、毒素、ホルモン、成長因子、及び薬物に抗原結合部位（可変領域）が連結するように定常領域、又はその一部分が変更され、置き換えられ、又は交換されている；又は（ｂ）異なる又は変更された抗原特異性を有する可変領域によって可変領域、又はその一部分が変更され、置き換えられ、又は交換されている抗体分子である。
【００７６】
「ヒト化」抗体は、ヒトにおいて免疫原性が低いながらも非ヒト抗体の反応性（例えば、結合特異性、活性）を保持している抗体である。これは、例えば、非ヒトＣＤＲ領域を保持し、且つ抗体の残りの部分をヒト対応物に置き換えることによって実現し得る。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｏｉ，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４４：６５−９２（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．，２８：４８９−４９８（１９９１）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．，３１（３）：１６９−２１７（１９９４）を参照のこと。
【００７７】
「ヒト抗体」という用語は、フレームワーク及びＣＤＲ領域の両方が、ヒト起源の配列に由来する可変領域を有する抗体を含む。さらに、抗体が定常領域を含む場合、定常領域はまた、このようなヒト配列、例えば、ヒト生殖系列配列、又はヒト生殖系列配列の突然変異型、又は例えば、Ｋｎａｐｐｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：５７−８６，２０００）に記載されるような、ヒトフレームワーク配列分析から得られるコンセンサスフレームワーク配列を含む抗体に由来する。ヒト抗体は、ヒト配列によってコードされないアミノ酸残基を含み得る（例えば、インビトロでのランダム若しくは部位特異的突然変異によって、又はインビボでの体細胞突然変異によって、又は安定性若しくは製造を促進するための保存的置換によって導入される突然変異）。
【００７８】
「対応するヒト生殖系列配列」という用語は、ヒト生殖系列免疫グロブリン可変領域配列によってコードされる全ての他の公知の可変領域アミノ酸配列と比較して、参照可変領域アミノ酸配列又はサブ配列との最も高い決定されたアミノ酸配列同一性を有するヒト可変領域アミノ酸配列又はサブ配列をコードする核酸配列を指す。対応するヒト生殖系列配列はまた、全ての他の評価された可変領域アミノ酸配列と比較して、参照可変領域アミノ酸配列又はサブ配列との最も高いアミノ酸配列同一性を有するヒト可変領域アミノ酸配列又はサブ配列を指し得る。対応するヒト生殖系列配列は、フレームワーク領域のみ、相補性決定領域のみ、フレームワーク及び相補性決定領域、可変セグメント（上で定義されるような）、又は可変領域を含む配列若しくはサブ配列の他の組合せであり得る。配列同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、又は当該技術分野において公知の別のアラインメントアルゴリズムを用いて、２つの配列を整列する、本明細書に記載される方法を用いて決定され得る。対応するヒト生殖系列核酸又はアミノ酸配列は、参照可変領域核酸又はアミノ酸配列との少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有し得る。
【００７９】
用語「価数」は、本明細書で使用されるとき、ポリペプチド中の潜在的な標的結合部位の数を指す。各標的結合部位は、１つの標的分子又は標的分子の特異的部位に特異的に結合する。ポリペプチドが２つ以上の標的結合部位を含むとき、各標的結合部位は同じ又は異なる分子に特異的に結合し得る（例えば、異なる分子、例えば異なる抗原、又は同じ分子上の異なるエピトープに結合し得る）。従来の抗体は、例えば２つの結合部位を有し、二価であり；「三価」及び「四価」は、抗体分子にそれぞれ３つの結合部位及び４つの結合部位が存在することを指す。抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、一価（即ち、１つの標的分子に結合する）、二価、又は多価（即ち、２つ以上の標的分子に結合する）であり得る。
【００８０】
語句「特異的に結合する」又は「結合特異性」は、標的（例えば、タンパク質）と抗体サイトカイングラフト化タンパク質との間の相互作用について記載する文脈で使用されるとき、タンパク質及び他の生物学的物質の異種集団中、例えば、生体試料、例えば、血液、血清、血漿又は組織試料中の標的の存在を決定付ける結合反応を指す。従って、特定の指定される条件下では、特定の結合特異性を有する抗体サイトカイングラフト化タンパク質は特定の標的にバックグラウンドの少なくとも２倍結合し、その試料中に存在する他の標的に有意な量で結合することは実質的にない。一実施形態において、指定される条件下では、特定の結合特異性を有する抗体サイトカイングラフト化タンパク質は特定の抗原にバックグラウンドの少なくとも１０倍結合し、その試料中に存在する他の標的に有意な量で結合することは実質的にない。かかる条件下での抗体サイトカイングラフト化タンパク質との特異的結合には、抗体サイトカイングラフト化タンパク質が特定の標的タンパク質に対するその特異性に関して選択されている必要があり得る。本明細書で使用されるとき、特異的結合は、ヒトＩＬ２低親和性受容体に選択的に結合する抗体サイトカイングラフト化タンパク質を含み、例えば他のサイトカイン受容体スーパーファミリーメンバーと交差反応する抗体サイトカイングラフト化タンパク質を含まない。一部の実施形態において、ヒトＩＬ２低親和性受容体に選択的に結合し、且つ非ヒト霊長類ＩＬ２Ｒ（例えばカニクイザルＩＬ２Ｒ）と交差反応する抗体サイトカイングラフト化タンパク質が選択される。一部の実施形態において、ヒトＩＬ２低親和性受容体に選択的に結合し、且つ更なる標的と反応する抗体グラフト化タンパク質が選択される。特定の標的タンパク質と特異的反応性を示す抗体サイトカイングラフト化タンパク質の選択には、種々のフォーマットが用いられ得る。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイが、タンパク質と特異的に免疫反応性の抗体を選択するのに日常的に使用される（例えば、特異的免疫反応性を決定するのに使用され得るイムノアッセイ形式及び条件の説明については、Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９９８）を参照されたい）。典型的に、特異的又は選択的結合反応は、バックグラウンドシグナルの少なくとも２倍、より典型的に、バックグラウンドより少なくとも１０〜１００倍、シグナルを生成するであろう。
【００８１】
「平衡解離定数（ＫＤ、Ｍ）」という用語は、解離速度定数（ｋｄ、時間−１）を結合速度定数（ｋａ、時間−１、Ｍ−１）で除算した値を指す。平衡解離定数は、当該技術分野における任意の公知の方法を用いて測定され得る。抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、一般に、約１０-7又は１０-8Ｍ未満、例えば、約１０-9Ｍ又は１０-10Ｍ未満、ある実施形態において、約１０-11Ｍ、１０-12Ｍ又は１０-13Ｍ未満の平衡解離定数を有するであろう。
【００８２】
本明細書で使用されるとき、用語「エピトープ」又は「結合領域」は、抗体ＣＤＲと抗原タンパク質との間の特異的結合に関与する抗原タンパク質におけるドメインを指す。
【００８３】
本明細書で使用されるとき、用語「受容体−サイトカイン結合領域」は、グラフト化されたサイトカインとその受容体（例えばＩＬ２低親和性受容体）との間の特異的結合に関与する抗体サイトカイングラフト化タンパク質のグラフト化されたサイトカイン部分におけるドメインを指す。各抗体サイトカイングラフト化タンパク質に少なくとも１つのかかる受容体−サイトカイン結合領域が存在し、結合領域の各々は他と同一であることも、又は異なることもある。
【００８４】
用語「アゴニスト」は、同義的に、受容体を活性化させて完全な又は部分的な受容体媒介性応答を誘導する能力を有する抗体を指す。例えば、ＩＬ２低親和性受容体のアゴニストはＩＬ２低親和性受容体に結合し、ＩＬ２媒介性細胞内シグナル伝達、細胞活性化及び／又はＣＤ８＋Ｔエフェクター細胞及びＮＫ細胞の増殖を誘導する。抗体サイトカイングラフト化タンパク質アゴニストは、幾つかの点で天然ＩＬ２リガンドと同様にＩＬ低親和性受容体を通じたシグナル伝達を刺激する。ＩＬ２がＩＬ２低親和性受容体に結合するとＪａｋ１及びＪａｋ２活性化が誘導され、それによりＳＴＡＴ５リン酸化がもたらされる。一部の実施形態において、抗体サイトカイングラフト化タンパク質アゴニストは、ＩＬ２低親和性受容体に結合し、且つＳＴＡＴ５リン酸化、及び／又はＣＤ８＋Ｔエフェクター細胞又はＮＫ細胞の増殖を誘導するその能力によって同定することができる。
【００８５】
用語「ＩＬ２」又は「インターロイキン２」又は「インターロイキン−２」又は「ＩＬ−２」は、同義的に、天然タンパク質が炎症過程の調節及び維持において機能するαヘリックスサイトカインファミリーメンバーを指す。ＩＬ２の特性は、Ｎ末端とＣ末端とが空間的に互いに近いことであり、そのためＩＬ２サイトカインタンパク質は抗体グラフトに好適となる。アゴニスト抗体サイトカイングラフト化タンパク質のコンテクストでは、完全長天然ヒトの残基２１〜１５３を含むＩＬ２が利用される。本明細書に開示されるとおりのヒトＩＬ２は、その全長にわたってアミノ酸配列番号２と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有し、及び本明細書に記載されるとおりの抗体サイトカイングラフト化タンパク質の優先的なアゴニスト活性を保持し、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００５７７として公開されている。配列番号１はヒトＩＬ２  ｃＤＮＡ配列である。本明細書に開示されるとおりのＩＬ２タンパク質をコードするヒトＩＬ２核酸は、その全長にわたって配列番号１の核酸配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有し、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００５８６の下に公開された。
【００８６】
用語「抗体サイトカイングラフト化タンパク質」又は「抗体サイトカイングラフト」又は「グラフト化された」は、少なくとも１つのサイトカインが抗体のＣＤＲ内に直接取り込まれ、ＣＤＲの配列に割り込んでいることを意味する。サイトカインは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２又はＬＣＤＲ３内に取り込むことができる。サイトカインは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２又はＬＣＤＲ３内に取り込み、ＣＤＲのＮ末端配列の方に、又はＣＤＲのＣ末端配列の方に取り込むことができる。ＣＤＲ内に取り込まれたサイトカインは、元の標的タンパク質に対する抗体部分の特異的結合を中断させてもよく、又は抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、その標的タンパク質に対するその特異的結合を保持していてもよい。例示的サイトカインとしては、限定はされないが、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α、及びＴＮＦ−βが挙げられる。また、サイトカインを抗体の一方の「アーム」の特異的ＣＤＲにグラフト化すること、及び別の異なるサイトカインを抗体の他方の「アーム」のＣＤＲにグラフト化することも可能である。例えば、ＩＬ２を抗体の一方の「アーム」のＨＣＤＲ１にグラフト化し、且つＩＬ−７を抗体サイトカイングラフト化タンパク質の他方の「アーム」のＬＣＤＲ１にグラフト化すると、二重機能抗体サイトカイングラフト化タンパク質を作り出すことができる。
【００８７】
用語「単離された」は、核酸又はタンパク質に適用されるとき、核酸又はタンパク質に自然状態でそれが関連している他の細胞成分が本質的に含まれないことを意味する。これは好ましくは均一状態にある。これは乾燥又は水溶液のいずれかである。純度及び均一性は、典型的にはポリアクリルアミドゲル電気泳動又は高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学技法を用いて決定される。調製物中に存在する優勢種であるタンパク質が、実質的に精製される。詳細には、単離された遺伝子は、その遺伝子に隣接し、且つ目的の遺伝子以外のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームと分離されている。用語「精製される」は、核酸又はタンパク質が電気泳動ゲルに本質的に１つのバンドを生じさせることを意味する。特に、これは核酸又はタンパク質が少なくとも８５％純度、より好ましくは少なくとも９５％純度、及び最も好ましくは少なくとも９９％純度であることを意味する。
【００８８】
用語「核酸」又は「ポリヌクレオチド」は、一本鎖形態又は二本鎖形態のいずれかのデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）及びこれらのポリマーを指す。具体的に限定しない限り、この用語には、参照核酸と同様の結合特性を有し、且つ天然に存在するヌクレオチドと同じように代謝される天然ヌクレオチドの公知の類似体を含む核酸が包含される。特に指示されない限り、特定の核酸配列はまた、明示的に指示される配列のみならず、その保存的に修飾された変異体（例えば、縮重コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、ＳＮＰ、及び相補配列も黙示的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つ以上の選ばれた（又は全ての）コドンの３番目の位置が混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基に置換されている配列を作成することにより実現し得る（Ｂａｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；及びＲｏｓｓｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８（１９９４））。
【００８９】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書では、アミノ酸残基のポリマーを指して同義的に使用される。これらの用語は、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工の化学的模倣体であるアミノ酸ポリマー、並びに天然に存在するアミノ酸ポリマー及び天然に存在しないアミノ酸ポリマーに適用される。
【００９０】
「アミノ酸」という用語は、天然、及び合成アミノ酸、並びに天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣体を指す。天然アミノ酸は、遺伝子コードによってコードされるもの、並びに後に修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、及びＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を有する化合物、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、及びＲ基、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムに結合されたα−炭素を指す。このような類似体は、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）又は修飾されたペプチド骨格を有するが、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。アミノ酸模倣体は、アミノ酸の一般的な化学構造と異なる構造を有するが、天然アミノ酸と同様に機能する化合物を指す。
【００９１】
「保存的に修飾された変異体」は、アミノ酸及び核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に修飾された変異体は、同一の若しくは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸、又は核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一の配列を指す。遺伝子コードの縮重のため、多数の機能的に同一の核酸が、任意の所与のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ及びＧＣＵは全て、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンによって特定される全ての位置で、コドンは、コードされるポリペプチドを変化させずに、記載される対応するコドンのいずれかに変化され得る。このような核酸変化は、「サイレント変異」であり、これは、保存的に修飾された変異の１種である。ポリペプチドをコードする、本明細書における全ての核酸配列はまた、核酸の全ての可能なサイレント変異を説明する。当業者は、核酸中の各コドン（通常はメチオニンのための唯一のコドンであるＡＵＧ、及び通常はトリプトファンのための唯一のコドンであるＴＧＧを除く）が、機能的に同一の分子を生じるように修飾され得ることを認識するであろう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、それぞれの記載される配列において黙示的なものである。
【００９２】
アミノ酸配列に関して、コード配列における単一のアミノ酸又はごく一部のアミノ酸を変化させ、付加し又は欠失させる核酸、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質配列に対する個々の置換、欠失又は付加は、その変化が化学的に同様のアミノ酸によるアミノ酸置換をもたらす場合に「保存的に修飾された変異体」であることは、当業者であれば認識するであろう。機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的置換表は、当該技術分野において周知である。このような保存的に修飾された変異体は、多型変異体、種間相同体、及び対立遺伝子に対して追加的なものであり、それらを除外しない。以下の８つの群の各々は、互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；及び８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４）を参照）。
【００９３】
「配列同一性パーセンテージ」は、２つの最適にアラインメントした配列を比較ウィンドウにわたって比較することにより決定され、ここでポリヌクレオチド配列のうち比較ウィンドウ内にある部分は、２つの配列の最適アラインメントのため、付加又は欠失を含まない参照配列（例えばポリペプチド）と比較したとき付加又は欠失（即ちギャップ）を含み得る。パーセンテージは、両方の配列に同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が現れる位置の数を決定してマッチする位置の数を求め、そのマッチする位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で除し、その結果に１００を乗じて配列同一性パーセンテージを求めることにより計算される。
【００９４】
２つ以上の核酸又はポリペプチド配列の文脈における「同一である」又はパーセント「同一性」という用語は、２つ以上の配列又はサブ配列が同じ配列でこと程度を指す。以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを用いて、又は手作業でのアラインメント及び目視検査によって測定したとき、２つの配列が比較ウィンドウ、又は指示領域にわたって最大限対応するように比較及びアラインメントしたときに同じであるアミノ酸残基又はヌクレオチドを指定のパーセンテージだけ有する（即ち、参照配列の指定の領域にわたって、又は指定されない場合には配列全体にわたって少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する）場合に、２つの配列は「実質的に同一である」。本開示は、本明細書に例示されるそれぞれポリペプチド又はポリヌクレオチド（例えば、配列番号１９、配列番号３５、配列番号５１、又は配列番号６７のいずれか１つに例示される可変領域と実質的に同一であるポリペプチド又はポリヌクレオチドを提供する。同一性は、参照配列の少なくとも約１５、２５又は５０ヌクレオチド長の領域にわたって、又はより好ましくは１００〜５００又は１０００ヌクレオチド長又はそれ以上の領域にわたって、又は完全長にわたって存在する。アミノ酸配列に関して、同一性又は実質的な同一性は、参照配列の少なくとも５、１０、１５又は２０アミノ酸長、任意選択で少なくとも約２５、３０、３５、４０、５０、７５又は１００アミノ酸長、任意選択で少なくとも約１５０、２００又は２５０アミノ酸長の領域にわたって、又は完全長にわたって存在し得る。より短いアミノ酸配列、例えば、２０アミノ酸以下のアミノ酸配列に関しては、１又は２アミノ酸残基が本明細書に定義される保存的置換に従い保存的に置換されているとき、実質的な同一性が存在する。
【００９５】
配列比較のために、典型的に、１つの配列は、試験配列が比較される参照配列として働く。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験及び参照配列が、コンピュータに入力され、サブ配列が、指定され、必要に応じて、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。デフォルトプログラムパラメータが使用され得るか、又は代替パラメータが指定され得る。次に、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、参照配列と比べた試験配列に対する配列同一性パーセントを計算する。
【００９６】
本明細書において使用される際の「比較ウィンドウ」は、２つの配列が最適に整列された後、配列が、同じ数の連続する位置の参照配列と比較され得る、２０〜６００、通常、約５０〜約２００、より通常は、約１００〜約１５０からなる群から選択される連続する位置の数のいずれか１つのセグメントに対する参照を含む。比較のための配列のアラインメントの方法は、当該技術分野において周知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，（１９７０）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２ｃの部分相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４の類似検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）によって、又は手動によるアラインメント及び視覚的検査（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５補遺）を参照）によって行われ得る。
【００９７】
配列同一性及び配列類似性パーセントを決定するのに好適なアルゴリズムの２つの例は、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムであり、これらはそれぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ（１９７７）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，；及びＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎによって公表されている。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードと整列される場合、いくつかの正の値の閾値スコア（ｓｏｍｅ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ−ｖａｌｕｅｄ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｓｃｏｒｅ）Ｔと一致するか、又はそれを満たす、クエリー配列中の短いワード長Ｗを同定することによって、高スコア配列ペア（ＨＳＰ）をまず同定することを含む。Ｔは、近隣ワードスコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．上掲）。これらの初期近隣ワードヒットは、それらを含有するより長いＨＳＰを発見するための検索を開始させるためのシードとして働く。ワードヒットは、累積アラインメントスコアが増加され得る限り、各配列に沿った両方の方向に伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列について、パラメータＭ（一致する残基のペアに関する報酬スコア；常に＞０）及びＮ（不一致の残基に関するペナルティースコア；常に＜０）を用いて計算される。アミノ酸配列について、スコアリングマトリックスが、累積スコアを計算するのに使用される。各方向におけるワードヒットの伸長は、以下の場合に停止される：累積アラインメントスコアが、その最大達成値から量Ｘだけ減少する場合；１つ又は複数の負のスコアの残基アラインメントの累積のため、累積スコアが、ゼロ以下になる場合；又はいずれかの配列の末端に到達する場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、及びＸは、アラインメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４及び両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、３のワード長、及び１０の期待値（Ｅ）、及び５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５を参照）アラインメントｓ（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び両鎖の比較を使用する。
【００９８】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計分析を行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７，を参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間の一致が偶然生じる確率の指標を提供する最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、試験核酸と参照核酸との比較における最小合計確率が、約０．２未満、より好ましくは、約０．０１未満、最も好ましくは、約０．００１未満である場合、核酸は、参照配列と類似すると考えられる。
【００９９】
２つの核酸配列又はポリペプチドが実質的に同一であることの別の指標は、後述されるように、第１の核酸によってコードされるポリペプチドが、第２の核酸によってコードされるポリペプチドに対して生じた抗体と免疫学的に交差反応することである。したがって、例えば、２つのペプチドの保存的置換のみが異なる場合、ポリペプチドは、典型的に、第２のポリペプチドと実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一であることの別の指標は、後述されるように、２つの分子又はその補体が、ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。２つの核酸配列が実質的に同一であることのさらに別の指標は、同じプライマーを用いて、配列を増幅することができることである。
【０１００】
用語「連結」は、この発明の抗体サイトカイングラフト化タンパク質内で結合領域がどのようにつながっているかについて記載する文脈で使用されるとき、それらの領域を物理的に結び付ける可能なあらゆる手段を包含する。多数の結合領域が高頻度で共有結合（例えば、ペプチド結合又はジスルフィド結合）又は非共有結合などの化学結合によって結び付けられ、これは直接結合（即ち、２つの結合領域間にリンカーなし）又は間接的結合（即ち、２つ以上の結合領域間に少なくとも１つのリンカー分子の助けを借りる）のいずれかであり得る。
【０１０１】
用語「対象」、「患者」、及び「個体」は、同義的に、哺乳類、例えばヒト又は非ヒト霊長類哺乳類を指す。哺乳類はまた、実験動物哺乳類、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスターであることもある。一部の実施形態において、哺乳類は、農業動物哺乳類（例えば、ウマ、ヒツジ、ウシ、ブタ、ラクダ）又は家庭内動物哺乳類（例えば、イヌ、ネコ）であることもある。
【０１０２】
本明細書において使用される際、任意の疾患又は障害の「治療する」、「治療すること」、又は「治療」という用語は、一実施形態において、疾患又は障害を改善すること（すなわち、疾患又はその臨床症状の少なくとも１つの発生を減速するか又は停止させるか又は軽減すること）を指す。別の実施形態において、「治療する」、「治療すること」、又は「治療」は、患者によって認識できないものを含む少なくとも１つの物理的パラメータを軽減又は改善することを指す。さらに別の実施形態において、「治療する」、「治療すること」、又は「治療」は、疾患又は障害を、身体的に、（例えば、認識できる症状の安定化）、生理学的に、（例えば、物理的パラメータの安定化）、又はその両方で調節することを指す。更に別の実施形態において、「治療する」、「治療している」、又は「治療」は、疾患又は障害の発生又は発症又は進行を妨げる又は遅らせることを指す。
【０１０３】
「治療的に許容できる量」又は「治療的に有効な用量」という用語は、所望の結果（すなわち、炎症の減少、痛みの阻害、炎症の防止、炎症反応の阻害又は防止）をもたらすのに十分な量を同義的に指す。ある実施形態において、治療的に許容できる量は、望ましくない副作用を誘導しないか、又は引き起こさない。治療的に許容できる量は、最初は低用量を投与し、次に、所望の効果が達成されるまでその用量を徐々に増加することによって決定され得るＩＬ２抗体サイトカイングラフト化タンパク質の「予防的に有効な投与量」、及び「治療的に有効な投与量」は、免疫関連障害に関連する症状を含む疾患の症状の、開始を防止するか、又はその重症度の低下をもたらし得る。
【０１０４】
「同時投与する」という用語は、個体中の２つ（以上）の活性薬剤の同時の存在を指す。同時投与される活性薬剤は、同時に又は連続的に送達され得る。
【０１０５】
本明細書で使用されるとき、語句「〜から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、方法又は組成物に含まれる医薬活性薬剤の属又は種、並びにその方法又は組成物の意図される目的のための任意の不活性担体又は賦形剤を指す。一部の実施形態において、語句「〜から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、ＩＬ２抗体サイトカイングラフト化タンパク質以外の１つ以上の追加的な活性薬剤の包含を明示的に除外する。一部の実施形態において、語句「〜から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、ＩＬ２抗体サイトカイングラフト化タンパク質以外の更なる追加的な活性薬剤及び第２の共投与される薬剤の包含を明示的に除外する。
【０１０６】
用語「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上特に明確に指示されない限り複数の指示対象を含む。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】例示的ＩＬ２抗体サイトカイングラフト化タンパク質及びＣＤ８  Ｔエフェクター細胞に対するその活性を要約する表である。
【図２】ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１がＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）よりも長い半減期を有することを示す。グラフに示されるとおり、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１は１２〜１４時間の半減期を有し、一方、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）は４時間未満のＴ１／２を有し、グラフ上に図示することができない。
【図３Ａ】図３Ａ−Ｃ：１００μｇ等価用量でＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて、４日目、８日目及び１１日目の時点で、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１がＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）又はＩＬ２−Ｆｃ融合分子よりも有効に、且つ低い毒性でＣＤ８＋  Ｔエフェクター細胞を拡大することを実証する。
【図３Ｂ】（上記の通り。）
【図３Ｃ】（上記の通り。）
【図３Ｄ】図３Ｄ−Ｆ：５００μｇ等価用量でＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて、４日目、８日目及び１１日目の時点で、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１がＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）又はＩＬ２−Ｆｃ融合分子よりも有効に、且つ低い毒性でＣＤ８＋  Ｔエフェクター細胞を拡大することを実証する。
【図３Ｅ】（上記の通り。）
【図３Ｆ】（上記の通り。）
【図４Ａ】ＮＯＤマウスにおいてＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１がＣＤ８  Ｔエフェクターを選択的に拡大し、且つＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）よりも良好に忍容されることを示す。
【図４Ｂ】ＮＯＤマウスにおけるＣＤ８  Ｔエフェクターに対するＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１及びＩｇＧ．ＩＬ２Ｆ７１Ａ．Ｈ１の活性の増加を図示する表を示す。
【図５】ＣＴ２６腫瘍モデルにおけるＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１の単剤有効性のグラフを示す。
【図６】Ｂ１６メラノーママウスモデルにおける単剤としての、又は抗体との併用でのいずれかでのＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１のデータを提示する。このグラフは、抗ＴＲＰ１抗体であるＴＡ９９との併用でのＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１が、ＴＡ９９単独、ＩＬ２−Ｆｃ融合分子単独、ＴＡ９９＋ＩＬ２−Ｆｃ融合物よりも効果的であることを示す。１００及び５００μｇ用量のＴＡ９９及びＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１で相乗作用が見られた。
【図７】ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１及びＩｇＧ．ＩＬ２Ｆ７１Ａ．Ｈ１をＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）と比較するヒト細胞のパネルにおけるｐＳＴＡＴ５活性をモニタする値を含むグラフを示す。
【図８】ＩＬ２を抗ＲＳＶ抗体のＣＤＲＨ１にグラフト化したとき（ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１）、ＲＳＶ結合が維持されることを示すＥＬＩＳＡデータのグラフを示す。しかしながら、ＩＬ２をＣＤＲＬ３又はＣＤＲＨ３にグラフト化すると、ＲＳＶへの結合は低下する。ＩＬ２を異なる抗体骨格（Ｘｏｌａｉｒ）にグラフト化したとき、ＲＳＶへの結合はない。
【発明を実施するための形態】
【０１０８】
ＩＬ２低親和性受容体を標的化する抗体サイトカイングラフト化タンパク質
本明細書には、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）にグラフト化されたＩＬ２分子を含むタンパク質構築物が提供される。本開示の抗体サイトカイングラフト化タンパク質はヒト患者での使用に好適な特性を示し、例えば、天然又は組換えヒトＩＬ２と同様の免疫刺激活性を保持している。しかしながら、負の効果、例えばＴｒｅｇ細胞の刺激は減少している。他の活性及び特徴もまた本明細書全体を通じて実証される。従って、これまで公知のＩＬ２及び修飾ＩＬ２治療剤、例えばＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）と比べて治療プロファイルが改善された抗体サイトカイングラフト化タンパク質、及び提供される抗体サイトカイングラフト化タンパク質の癌治療における使用方法が提供される。
【０１０９】
従って、本開示は、選択的活性プロファイルを備えた、ＩＬ２低親和性受容体のアゴニストである抗体サイトカイングラフト化タンパク質を提供する。免疫グロブリン重鎖配列と免疫グロブリン軽鎖配列とを含む抗体サイトカイングラフト化タンパク質が提供される。各免疫グロブリン重鎖配列は重鎖可変領域（ＶＨ）と重鎖定常領域（ＣＨ）とを含み、ここで重鎖定常領域はＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３定常領域からなる。各免疫グロブリン軽鎖配列は軽鎖可変領域（ＶＬ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）とを含む。各抗体サイトカイングラフト化タンパク質において、ＩＬ２分子はＶＨ又はＶＬの相補性決定領域（ＣＤＲ）に取り込まれる。
【０１１０】
一部の実施形態において、抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、重鎖ＣＤＲに取り込まれたＩＬ２分子を含む。特定の実施形態においてＩＬ２分子は重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）に取り込まれる。特定の実施形態においてＩＬ２分子は重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）に取り込まれる。特定の実施形態においてＩＬ２分子は重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）に取り込まれる。
【０１１１】
一部の実施形態において、抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、軽鎖ＣＤＲに取り込まれたＩＬ２分子を含む。特定の実施形態においてＩＬ２分子は軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）に取り込まれる。特定の実施形態においてＩＬ２分子は軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）に取り込まれる。特定の実施形態においてＩＬ２分子は軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）に取り込まれる。
【０１１２】
一部の実施形態において、グラフト化される抗体サイトカインは、ＣＤＲに取り込まれるＩＬ２配列を含み、それによりＩＬ２配列がＣＤＲ配列に挿入される。挿入はＣＤＲのＮ末端領域若しくはその近傍、ＣＤＲの中央領域、又はＣＤＲのＣ末端領域若しくはその近傍であってもよい。他の実施形態において、抗体サイトカイングラフト化はＣＤＲに取り込まれたＩＬ２分子を含み、それによりＩＬ２配列がＣＤＲ配列をフレームシフトさせることがない。他の実施形態において、グラフト化される抗体サイトカインは、ＣＤＲに取り込まれるＩＬ２分子を含み、それによりＩＬ２配列がＣＤＲ配列の全て又は一部に置き換わる。置き換えは、ＣＤＲのＮ末端領域、ＣＤＲの中央領域又はＣＤＲのＣ末端領域若しくはその近傍であってもよい。置き換えは、ＣＤＲ配列の１又は２アミノ酸ほどの少ないものであっても、又はＣＤＲ配列全体であってもよい。
【０１１３】
一部の実施形態においてＩＬ２分子はペプチドリンカーなしにＣＤＲに直接グラフト化され、ＣＤＲ配列とＩＬ２配列との間に追加的なアミノ酸はない。
【０１１４】
一部の実施形態において抗体サイトカイングラフト化タンパク質はＩｇＧクラス抗体重鎖の免疫グロブリン重鎖を含む。特定の実施形態においてＩｇＧ重鎖は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４サブクラスのいずれか１つである。
【０１１５】
一部の実施形態において抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、既知の臨床的に利用されている免疫グロブリン配列から選択される重鎖及び軽鎖免疫グロブリン配列を含む。特定の実施形態において抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、ヒト化配列である重鎖及び軽鎖免疫グロブリン配列を含む。他の特定の実施形態において抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、ヒト配列である重鎖及び軽鎖免疫グロブリン配列を含む。
【０１１６】
一部の実施形態において抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、生殖細胞系列免疫グロブリン配列から選択される重鎖及び軽鎖免疫グロブリン配列を含む。
【０１１７】
一部の実施形態において抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、ＩＬ２分子の結合特異性と異なる標的に対する免疫グロブリン可変ドメインの結合特異性を有する重鎖及び軽鎖免疫グロブリン配列を含む。一部の実施形態において免疫グロブリン可変ドメインのその標的に対する結合特異性は、グラフト化されたサイトカインの存在下で１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％保持される。特定の実施形態において保持される結合特異性は非ヒト標的に対するものである。特定の実施形態において保持される結合特異性は、ウイルス、例えばＲＳＶに対するものである。他の実施形態において結合特異性は、ＩＬ２療法と併せて治療的有用性を有するヒト標的に対するものである。特定の実施形態において、免疫グロブリンの結合特異性を標的化することにより、ＩＬ２成分に更なる治療利益が付与される。特定の実施形態において免疫グロブリンのその標的に対する結合特異性はＩＬ２との相乗活性を付与する。
【０１１８】
なおも他の実施形態において、免疫グロブリンの結合特異性は、ＩＬ２分子をグラフト化することにより１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％低下する。
【０１１９】
提供される抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、ＶＨ又はＶＬの相補性決定領域（ＣＤＲ）にグラフト化されたＩＬ２分子を含む。一部の実施形態において、ＩＬ２配列は、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する。一部の実施形態において、ＩＬ２分子は配列番号４の配列を含む。一部の実施形態において、ＩＬ２分子は配列番号４の配列からなる。提供される抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、抗体サイトカイングラフト化タンパク質のＶＨ又はＶＬの相補性決定領域（ＣＤＲ）に取り込まれたＩＬ２分子を含む。一部の実施形態において、ＩＬ２配列は、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する。一部の実施形態において、ＩＬ２分子は配列番号４の配列を含む。一部の実施形態において、ＩＬ２分子は配列番号４の配列からなる。
【０１２０】
提供される抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、ＶＨ又はＶＬの相補性決定領域（ＣＤＲ）にグラフト化されたＩＬ２分子を含む。一部の実施形態において、ＩＬ２配列は、配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する。一部の実施形態において、ＩＬ２分子は配列番号６の配列を含む。一部の実施形態において、ＩＬ２分子は配列番号６の配列からなる。
【０１２１】
一部の実施形態において、抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、ヒトＩＬ２、組換えヒトＩＬ２、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）又はＦｃに融合したＩＬ２よりも優れた免疫調節促進特性を付与する。抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、ヒトＩＬ２、組換えヒトＩＬ２、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）又はＦｃに融合したＩＬ２と比較したときＣＤ８  Ｔエフェクター細胞に対する活性の増加を付与する一方、Ｔｒｅｇ活性の低下をもたらす。
【０１２２】
一部の実施形態において、抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、修飾エフェクター機能を付与する修飾Ｆｃを有する修飾免疫グロブリンＩｇＧを含む。特定の実施形態において修飾Ｆｃ領域は、Ｄ２６５Ａ、Ｐ３２９Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｎ２９７Ａ、Ｌ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａの１つ以上から選択される突然変異を含む。詳細な実施形態において免疫グロブリン重鎖は、Ｄ２６５Ａ、Ｐ３２９Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｎ２９７Ａ、Ｄ２６５Ａ／Ｐ３２９Ａ、Ｄ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａ、Ｌ２３４／Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ａ／Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ／Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａのいずれかから選択されるエフェクター機能の低下を付与する突然変異又は突然変異の組み合わせを含み得る。
【０１２３】
一部の実施形態において、抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、（ｉ）配列番号１９の重鎖可変領域と少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有する重鎖可変領域及び（ｉｉ）配列番号３５の軽鎖可変領域と少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。免疫グロブリン鎖は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ４から選択されるＩｇＧクラスである。特定の実施形態において免疫グロブリンは、任意選択で、Ｄ２６５Ａ、Ｐ３２９Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｎ２９７Ａ、Ｄ２６５Ａ／Ｐ３２９Ａ、Ｄ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａ、Ｌ２３４／Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ａ／Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ／Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａのいずれかから選択されるエフェクター機能の低下を付与する突然変異又は突然変異の組み合わせを含む。
【０１２４】
一部の実施形態において、抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、（ｉ）配列番号５１の重鎖可変領域と少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有する重鎖可変領域及び（ｉｉ）配列番号６７の軽鎖可変領域と少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。免疫グロブリン鎖は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ４から選択されるＩｇＧクラスである。特定の実施形態において免疫グロブリンは、任意選択で、Ｄ２６５Ａ、Ｐ３２９Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｎ２９７Ａ、Ｄ２６５Ａ／Ｐ３２９Ａ、Ｄ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａ、Ｌ２３４／Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ａ／Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ／Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａのいずれかから選択されるエフェクター機能の低下を付与する突然変異又は突然変異の組み合わせを含む。
【０１２５】
操作及び修飾された抗体サイトカイングラフト化タンパク質
特定の態様において、抗体サイトカイングラフト化構築物は、ＩＬ２配列を免疫グロブリン足場のＣＤＲ領域にグラフト化することにより作成される。重鎖及び軽鎖の両方の免疫グロブリン鎖が作製されて、最終的な抗体グラフト化タンパク質が生じる。抗体サイトカイングラフト化タンパク質はＣＤ８  Ｔエフェクター細胞に好ましい治療活性を付与し、抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、天然又は組換えヒトＩＬ２（ｒｈＩＬ２又はＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標））又はＦｃに融合したＩＬ２と比較したときＴｒｅｇ活性が低下している。
【０１２６】
抗体サイトカイングラフト化タンパク質を操作するため、特定のムテインを含有するＩＬ２配列（配列番号４又は配列番号６）が免疫グロブリン鎖足場タンパク質のＣＤＲループに挿入される。グラフト化構築物は、臨床セッティングで利用されている種々の公知の免疫グロブリン配列、現在創薬及び／又は臨床開発中の公知の免疫グロブリン配列、ヒト生殖細胞系列抗体配列、並びに新規抗体免疫グロブリン鎖の配列のいずれを使用して調製してもよい。構築物は、関連性のある配列をコードする組換えＤＮＡを利用した標準的な分子生物学的方法を用いて作製される。ＧＦＴＸ３ｂと称される例示的足場におけるＩＬ２の配列を表２に示す。挿入点は、利用可能な構造又は相同性モデルデータに基づきループの中間点となるように選択されたが、しかしながら挿入点はＣＤＲループのＮ端側又はＣ端側末端の方に調整することができる。
【０１２７】
従って本開示は、グラフト化タンパク質が作成されるように異種抗体タンパク質又はポリペプチドに組み換えで挿入されたＩＬ２タンパク質を含む低親和性ＩＬ２受容体に特異的に結合する抗体又はその断片を提供する。詳細には、本開示は、本明細書に記載される抗体又は抗体の抗原結合断片又は任意の他の関連性のある足場抗体ポリペプチド（例えば、完全抗体免疫グロブリンタンパク質、Ｆａｂ断片、Ｆｃ断片、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ）２断片、ＶＨドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ、ＶＬドメイン、ＶＬ  ＣＤＲ等）と、異種サイトカインタンパク質、ポリペプチド、又はペプチド、例えばＩＬ２とを含むグラフト化タンパク質を提供する。タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドを抗体又は抗体断片と融合又はコンジュゲートする方法は当該技術分野において公知である。例えば、米国特許第５，３３６，６０３号明細書、同第５，６２２，９２９号明細書、同第５，３５９，０４６号明細書、同第５，３４９，０５３号明細書、同第５，４４７，８５１号明細書、及び同第５，１１２，９４６号明細書；欧州特許第３０７，４３４号明細書及び同第３６７，１６６号明細書；国際公開第９６／０４３８８号パンフレット及び同第９１／０６５７０号パンフレット；Ａｓｈｋｅｎａｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１０５３５−１０５３９；Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５５９０−５６００；及びＶｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１１３３７−１１３４１を参照のこと。加えて、抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング、エクソンシャッフリング、及び／又はコドンシャッフリング（まとめて「ＤＮＡシャフリング」と称される）の技法によって作成することができる。ＤＮＡシャフリングは、グラフト化タンパク質構築物を調製するため、及び／又は抗体又はその断片の活性を変化させる（例えば、より高い親和性及びより低い解離速度を有する抗体又はその断片）ために用いることができる。概して、米国特許第５，６０５，７９３号明細書、同第５，８１１，２３８号明細書、同第５，８３０，７２１号明細書、同第５，８３４，２５２号明細書、及び同第５，８３７，４５８号明細書；Ｐａｔｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：７２４−３３；Ｈａｒａｙａｍａ，１９９８，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（２）：７６−８２；Ｈａｎｓｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８７：２６５−７６；及びＬｏｒｅｎｚｏ  ａｎｄ  Ｂｌａｓｃｏ，１９９８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２４（２）：３０８−３１３を参照のこと。抗体若しくはその断片、又はコードされる抗体若しくはその断片は、組換え前にエラープローンＰＣＲ、ランダムヌクレオチド挿入又は他の方法によるランダム突然変異誘発に供することにより変化させることができる。目的の抗原タンパク質に特異的に結合する抗体又はその断片をコードするポリヌクレオチドが、本明細書に提供されるとおりの抗体サイトカイングラフト化タンパク質の調製のため、１つ以上の異種サイトカイン分子、例えばＩＬ２の１つ以上の成分、モチーフ、セクション、パート、ドメイン、断片等で組み換えられてもよい。
【０１２８】
抗体Ｆａｂは、サイトカインタンパク質の潜在的な挿入部位として働き得る６つのＣＤＲループ、軽鎖に３つ（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３）及び重鎖に３つ（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３）を含む。どの１つ又は複数のＣＤＲループにサイトカインを挿入すべきかの決定には、構造的及び機能的考慮点が勘案される。ＣＤＲループのサイズ及びコンホメーションは異なる抗体間で大きく変わるため、挿入に最適なＣＤＲは、詳細な抗体／タンパク質の組み合わせ毎に実験的に決定することができる。加えて、サイトカインタンパク質はＣＤＲループに挿入されることになるため、実施例１で考察するとおり、これがサイトカインタンパク質の構造に更なる制約を課し得る。
【０１２９】
免疫グロブリン鎖のＣＤＲは、本明細書に記載されるものを含め、当該技術分野において公知の周知の付番方式によって決定される。例えば、ＣＤＲは、（１）Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１），“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（「Ｋａｂａｔ」付番スキーム），ＮＩＨ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２；及び（２）Ｃｈｏｔｈｉａに記載される付番方式を用いることにより識別及び定義されており、Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）“Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ，”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７−９４８を参照のこと。２０アミノ酸長未満の識別されるＣＤＲアミノ酸配列については、所望の特異的結合及び／又はアゴニスト活性をなお保持しながら、１又は２つの保存的アミノ酸残基置換が許容され得る。
【０１３０】
抗体サイトカイングラフト化タンパク質は更に、出発抗体グラフト化タンパク質から特性が変化していてもよい修飾抗体サイトカイングラフト化タンパク質を操作するための出発材料として、本明細書（例えば表２）に示されるＣＤＲ及び／又はＶＨ及び／又はＶＬ配列のうちの１つ以上を有する抗体を使用して調製することができる。或いは、修飾抗体サイトカイングラフト化タンパク質を操作するための足場として任意の公知の抗体配列を利用してもよい。例えば、任意の公知の臨床で利用されている抗体を抗体グラフト化タンパク質の調製用の出発材料足場として利用してもよい。公知の抗体及び対応する免疫グロブリン配列としては、例えば、パリビズマブ、アリロクマブ、メポリズマブ、ネシツムマブ、ニボルマブ、ジヌツキシマブ、セクキヌマブ、エボロクマブ、ブリナツモマブ、ペンブロリズマブ、ラムシルマブ、ベドリズマブ、シルツキシマブ、オビヌツズマブ、トラスツズマブ、ラキシバクマブ、ペルツズマブ、ベリムマブ、イピリムマブ、デノスマブ、トシリズマブ、オファツムマブ、カナキヌマブ、ゴリムマブ、ウステキヌマブ、セルトリズマブ、カツマキソマブ、エクリズマブ、ラニビズマブ、パニツムマブ、ナタリズマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、エファリズマブ、オマリズマブ、トシツモマブ、イブリツモマブチウキセタン、アダリムマブ、アレムツズマブ、ゲムツズマブ、インフリキシマブ、バシリキシマブ、ダクリズマブ、リツキシマブ、アブシキシマブ、ムロモナブ、又はこれらの修飾体が挙げられる。公知の抗体及び免疫グロブリン配列としてはまた、生殖細胞系列抗体配列も挙げられる。フレームワーク配列は、生殖細胞系列抗体遺伝子配列を含む公的なＤＮＡデータベース又は既発表の参考文献から入手することができる。例えば、ヒト重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子の生殖細胞系列ＤＮＡ配列については、「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖系列配列データベース並びにＫａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９１  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｉ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９２  Ｊ．ｆｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６−７９８；及びＣｏｘ，Ｊ．Ｐ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，１９９４  Ｅｕｒ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：８２７−８３６を参照することができる。なおも他の例では、初期創薬及び／又は薬剤開発中であり得る他の公知の実体からの抗体及び対応する免疫グロブリン配列が、同様に修飾抗体サイトカイングラフト化タンパク質を操作するための出発材料として適合し得る。
【０１３１】
結果として生じるポリペプチドがサイトカイン（例えばＩＬ２）の取り込みに適応した少なくとも１つの結合領域を含む限り、多種多様な抗体／免疫グロブリンフレームワーク又は足場を用いることができる。かかるフレームワーク又は足場は、ヒト免疫グロブリン、又はその断片の５つの主要なイディオタイプを含み、他の動物種の、好ましくはヒト化及び／又はヒトの側面を有する免疫グロブリンを含む。新規抗体、フレームワーク、足場及び断片が当業者により継続的に発見及び開発される。
【０１３２】
抗体は、当該技術分野において公知の方法を用いて作成することができる。モノクローナル抗体の調製には、当該技術分野において公知の任意の技法を用いることができる（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７（１９７５）；Ｋｏｚｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２（１９８３）；Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ｐｐ．７７−９６．Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５を参照のこと）。単鎖抗体の作製技法（米国特許第４，９４６，７７８号明細書）は、抗体サイトカイングラフト化タンパク質に使用するための抗体の作製に適合させることができる。また、トランスジェニックマウス、又は他の哺乳類などの他の生物を使用して霊長類化若しくはヒト化抗体又はヒト抗体を発現させ、同定してもよい。或いは、ファージディスプレイ技術を用いて、抗体サイトカイングラフト化タンパク質に使用するための選択の抗原に特異的に結合する抗体及びヘテロマーＦａｂ断片を同定することができる（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．、前掲；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９−７８３，（１９９２）を参照のこと）。
【０１３３】
霊長類化又はヒト化非ヒト抗体のための方法は当該技術分野において周知である。概して、霊長類化又はヒト化抗体は、そこに非霊長類又は非ヒトの供給源から導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。かかる非霊長類又は非ヒトアミノ酸残基は多くの場合に移入残基（ｉｍｐｏｒｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ）と称され、これは典型的には移入可変ドメイン（ｉｍｐｏｒｔ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎ）から取られる。ヒト化は、本質的にＷｉｎｔｅｒ及び共同研究者の方法に従い（例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照のこと）、ヒト抗体の対応する配列をげっ歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列に置換することにより実施し得る。従って、かかるヒト化抗体はキメラ抗体であり（米国特許第４，８１６，５６７号明細書）、ここでは実質的にインタクトに満たないヒト可変ドメインが、非ヒト種からの対応する配列によって置換されている。実際には、霊長類化又はヒト化抗体は典型的には、霊長類又はヒト抗体であって、一部の相補性決定領域（「ＣＤＲ」）残基及び場合により一部のフレームワーク（「ＦＲ」）残基が結合特異性を付与するため由来種（例えばげっ歯類抗体）の類似部位からの残基によって置換されているものである。
【０１３４】
それに代えて又は加えて、非ヒト抗体と比べて同じ結合特性を維持しつつ又はより良好な結合特性を提供しつつ抗体においてヒト可変領域で非ヒト抗体可変領域を置き換えるインビボ方法を利用して非ヒト抗体を操作されたヒト抗体に変換してもよい。例えば、米国特許出願公開第２００５０００８６２５号明細書、米国特許出願公開第２００５／０２５５５５２号明細書を参照のこと。或いは、逐次的なカセット置換によりヒトＶセグメントライブラリを作成することができ、ここでは初めに参照抗体Ｖセグメントの一部のみがヒト配列のライブラリに置き換えられ；次に残りの参照抗体アミノ酸配列のコンテクストで結合を支持する同定されたヒト「カセット」が第２のライブラリスクリーニングで組み換えられて完全ヒトＶセグメントが作成される（米国特許出願公開第２００６／０１３４０９８号明細書を参照のこと）。
【０１３５】
抗体サイトカイングラフト化タンパク質の調製に使用するための様々な抗体又は抗原結合断片は、インタクトな抗体の酵素的又は化学的修飾によって作製することができ、又は組換えＤＮＡ方法を用いてデノボ合成することができ（例えば単鎖Ｆｖ）、又はファージディスプレイライブラリを用いて同定することができる（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４，１９９０を参照のこと）。例えばミニボディは、当該技術分野において、例えばＶａｕｇｈａｎ  ａｎｄ  Ｓｏｌｌａｚｚｏ，Ｃｏｍｂ  Ｃｈｅｍ  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ．４：４１７−３０  ２００１に記載される方法を用いて作成することができる。二重特異性抗体は、ハイブリドーマのグラフト化又はＦａｂ’断片の連結を含め、種々の方法によって作製することができる。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ  ＆  Ｌａｃｈｍａｎｎ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５−３２１（１９９０）；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８，１５４７−１５５３（１９９２）を参照のこと。単鎖抗体は、ファージディスプレイライブラリ又はリボソームディスプレイライブラリ、遺伝子シャフリングライブラリを用いて同定することができる。かかるライブラリは、合成、半合成又は天然及び免疫適格供給源から構築することができる。従って、本明細書に提供されるとおりの抗体サイトカイングラフト化タンパク質構築物の調製においては、選択の免疫グロブリン配列を利用し得る。
【０１３６】
本開示で使用される抗体、抗原結合分子又は抗体サイトカイングラフト化分子は、二重特異性抗体を更に含む。二重特異性又は二機能性抗体は、２つの異なる重鎖／軽鎖対及び２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体である。他の抗原結合断片又は抗体部分としては、二価ｓｃＦｖ（ダイアボディ）、抗体分子が２つの異なるエピトープを認識する二重特異性ｓｃＦｖ抗体、シングル結合ドメイン（ｄＡｂ）、及びミニボディが挙げられる。従って、本明細書に提供されるとおりの抗体サイトカイングラフト化タンパク質構築物の調製においては、選択の免疫グロブリン配列を利用することができる。
【０１３７】
抗体の抗原結合断片、例えばＦａｂ断片、ｓｃＦｖを構成要素として使用して抗体サイトカイングラフト化タンパク質を構築することができ、任意選択で多価形態が含まれてもよい。一部の実施形態において、かかる多価分子は抗体の定常領域（例えばＦｃ）を含む。
【０１３８】
抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、抗体の一方又は両方の可変領域（即ち、ＶＨ及び／又はＶＬ）内、例えば１つ以上のＣＤＲ領域内の１つ以上の残基を修飾することにより操作することができ、及びかかる適合されたＶＨ及び／又はＶＬ領域配列は、サイトカインのグラフト化に、又はサイトカイングラフト化の調製に利用することができる。抗体は、主に６つの重鎖及び軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）に位置するアミノ酸残基を通じて標的抗原と相互作用する。このため、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、個々の抗体間の多様性がＣＤＲ外の配列よりも高い。ＣＤＲ配列はほとんどの抗体−抗原相互作用に関与し、異なる特性を有する異なる抗体由来のフレームワーク配列にグラフトされた特異的抗体からのＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することにより特異的抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現することが可能である（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，１９９８  Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７；Ｊｏｎｅｓ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，１９８６  Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５；Ｑｕｅｅｎ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，１９８９  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：１００２９−１００３３；Ｗｉｎｔｅｒに対する米国特許第５，２２５，５３９号明細書、並びにＱｕｅｅｎらに対する米国特許第５，５３０，１０１号明細書；同第５，５８５，０８９号明細書；同第５，６９３，７６２号明細書及び同第６，１８０，３７０号明細書を参照のこと）。特定の例では、フレームワーク領域内の残基を突然変異させることにより抗体の抗原結合能力を維持又は増強することが有益である（例えば、Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌに対する米国特許第５，５３０，１０１号明細書；同第５，５８５，０８９号明細書；同第５，６９３，７６２号明細書及び同第６，１８０，３７０号明細書を参照のこと）。
【０１３９】
一部の態様において、目的の抗体の１つ以上の結合特性（例えば、親和性）を改善するための、「親和性成熟」として知られるＶＨ及び／又はＶＬ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／又はＣＤＲ３領域内のアミノ酸残基の突然変異が、例えばサイトカイングラフト化タンパク質のコンテクストと併せた抗体の抗原結合の最適化に有益であり得る。部位特異的突然変異誘発又はＰＣＲ媒介突然変異誘発を実施して１つ又は複数の突然変異を導入することができ、及び抗体結合への効果、又はその他の目的の機能特性について、本明細書に記載されるインビトロ若しくはインビボアッセイ及び／又は当該技術分野において公知の代替的若しくは追加的アッセイで評価することができる。保存的修飾を導入することができる。突然変異はアミノ酸置換、付加又は欠失であってもよい。更に、典型的にはＣＤＲ領域内の１、２、３、４又は５つ以下の残基を変化させる。
【０１４０】
操作された抗体又は抗体断片は、ＶＨ及び／又はＶＬ内のフレームワーク残基に例えば抗体の特性を改善するため修飾が行われたものを含む。一部の実施形態においてかかるフレームワーク修飾は、抗体の免疫原性を低下させるために行われる。例えば、一つの手法は、１つ以上のフレームワーク残基を対応する生殖系列配列に変更することである。より具体的には、体細胞突然変異を受けた抗体は、その抗体の由来である生殖系列配列と異なるフレームワーク残基を含み得る。かかる残基は、抗体フレームワーク配列をその抗体の由来である生殖系列配列と比較することにより同定し得る。フレームワーク領域配列をその生殖細胞系列構成に戻すため、体細胞突然変異を例えば部位特異的突然変異誘発によって生殖系列配列に「復帰突然変異」させることができる。追加的なフレームワーク修飾は、フレームワーク領域内、又は更には１つ以上のＣＤＲ領域内の１つ以上の残基を突然変異させてＴ細胞エピトープを除去し、それにより抗体の潜在的な免疫原性を低下させることを含む。この手法は「脱免疫化」とも称され、Ｃａｒｒらによる米国特許出願公開第２００３０１５３０４３号明細書に更に詳細に記載されている。
【０１４１】
抗体サイトカイングラフト化タンパク質の調製に利用される抗体又は抗体断片の定常領域は、適宜、任意のタイプ又はサブタイプであってよく、本方法によって治療される対象の種（例えば、ヒト、非ヒト霊長類又は他の哺乳類、例えば、農業動物哺乳類（例えば、ウマ、ヒツジ、ウシ、ブタ、ラクダ）、家庭用動物哺乳類（例えば、イヌ、ネコ）又はげっ歯類（例えば、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ）から選択することができる。一部の実施形態において、抗体サイトカイングラフト化タンパク質に利用される抗体は、ヒト化抗体又はＨｕｍａｎｅｅｒｅｄ（登録商標）抗体が作成されるように操作される。一部の実施形態において、抗体サイトカイングラフト化タンパク質に利用される抗体はヒト抗体である。一部の実施形態において、抗体定常領域アイソタイプはＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４である。特定の実施形態において、定常領域アイソタイプはＩｇＧ1である。一部の実施形態において、抗体サイトカイングラフト化タンパク質はＩｇＧを含む。一部の実施形態において、抗体サイトカイングラフト化タンパク質はＩｇＧ１  Ｆｃを含む。一部の実施形態において、抗体サイトカイングラフト化タンパク質はＩｇＧ２  Ｆｃを含む。
【０１４２】
フレームワーク又はＣＤＲ領域内に行われる修飾に加えて、又はそれに代えて、抗体サイトカイングラフト化タンパク質の調製に利用される抗体又は抗体断片は、典型的には抗体の１つ以上の機能特性、例えば血清半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合、及び／又は抗原依存性細胞傷害などを変化させるため、Ｆｃ領域内に修飾を含むように操作されてもよい。更に、抗体、その抗体断片、又は抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、この場合もやはり抗体サイトカイングラフト化タンパク質の１つ以上の機能特性を変化させるため、化学的に修飾することができ（例えば、１つ以上の化学的部分を抗体に付加することができる）又はそのグリコシル化が変化するように修飾することができる。
【０１４３】
一実施形態では、ヒンジ領域のシステイン残基の数が変化する、例えば増加又は減少するようにＣＨ１のヒンジ領域が修飾される。例えば、この手法は更にＢｏｄｍｅｒらによる米国特許第５，６７７，４２５号明細書に記載され、ここでは例えば軽鎖及び重鎖のアセンブリが促進されるように、又は抗体サイトカイングラフト化タンパク質の安定性が増加若しくは減少するように、ＣＨ１のヒンジ領域にあるシステイン残基の数を変化させる。別の実施形態では、抗体サイトカイングラフト化タンパク質の生物学的半減期が変化するように抗体のＦｃヒンジ領域を突然変異させる。より具体的には、抗体サイトカイングラフト化タンパク質のブドウ球菌プロテインＡ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｙｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ）（ＳｐＡ）結合が天然Ｆｃ−ヒンジドメインＳｐＡ結合と比べて損なわれるように、Ｆｃ−ヒンジ断片のＣＨ２−ＣＨ３ドメイン接合部領域に１つ以上のアミノ酸突然変異が導入される。この手法については、Ｗａｒｄらによる米国特許第６，１６５，７４５号明細書に更に詳細に記載されている。
【０１４４】
本開示は、長いインビボ半減期を有するＩＬ２低親和性受容体に特異的に結合する抗体サイトカイングラフト化タンパク質を提供する。別の実施形態において、抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、その生物学的半減期が増加するように修飾される。様々な手法が可能である。インビボ半減期が増加した抗体サイトカイングラフト化タンパク質はまた、１つ以上のアミノ酸修飾（即ち、置換、挿入又は欠失）をＩｇＧ定常ドメイン、又はそのＦｃＲｎ結合断片（好ましくはＦｃ又はヒンジＦｃドメイン断片）に導入して作成することもできる。例えば、Ｗａｒｄに対する米国特許第６，２７７，３７５号明細書に記載されるとおり、以下の突然変異のうちの１つ以上を導入することができる：Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆ。例えば、国際公開第９８／２３２８９号パンフレット；国際公開第９７／３４６３１号パンフレット；及び米国特許第６，２７７，３７５号明細書を参照のこと。或いは、生物学的半減期を増加させるため、抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、Ｐｒｅｓｔａらによる米国特許第５，８６９，０４６号明細書及び同第６，１２１，０２２号明細書に記載されるとおり、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから取られたサルベージ受容体結合エピトープを含むようにＣＨ１又はＣＬ領域内で変化させる。更に他の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基に置き換えることによりＦｃ領域を変化させて、抗体サイトカイングラフト化タンパク質のエフェクター機能を変化させる。例えば、エフェクターリガンドに対する親和性は変化しているが、親抗体の抗原結合能力は保持している抗体サイトカイングラフト化タンパク質となるように、１つ以上のアミノ酸を異なるアミノ酸残基に置き換えることができる。親和性を変化させる対象のエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）又は補体のＣ１成分であってもよい。この手法については、いずれもＷｉｎｔｅｒらによる米国特許第５，６２４，８２１号明細書及び同第５，６４８，２６０号明細書に更に詳細に記載されている。
【０１４５】
別の実施形態では、抗体サイトカイングラフト化タンパク質のＣ１ｑ結合が変化し及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）が低下又は消失するように、アミノ酸残基から選択される１つ以上のアミノ酸を異なるアミノ酸残基に置き換えることができる。この手法については、Ｉｄｕｓｏｇｉｅらによる米国特許第６，１９４，５５１号明細書に更に詳細に記載されている。
【０１４６】
かかる突然変異を含む抗体サイトカイングラフト化タンパク質によって媒介される抗体依存細胞傷害（ＡＤＣＣ）又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）は低下し、又は全くなくなる。一部の実施形態では、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸残基Ｌ２３４及びＬ２３５がＡｌａ２３４及びＡｌａ２３５に置換される。一部の実施形態では、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸残基Ｎ２６７がＡｌａ２６７に置換される。
【０１４７】
別の実施形態では、１つ以上のアミノ酸残基を変化させて、それにより抗体サイトカイングラフト化タンパク質の補体結合能力を変化させる。この手法については、Ｂｏｄｍｅｒらによる国際公開第９４／２９３５１号パンフレットに更に記載されている。
【０１４８】
更に別の実施形態では、抗体が抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する能力が増加するように及び／又はＦｃγ受容体に対する抗体サイトカイングラフト化タンパク質の親和性が増加するように、Ｆｃ領域が１つ以上のアミノ酸の修飾によって修飾される。この手法については、Ｐｒｅｓｔａによる国際公開第００／４２０７２号パンフレットに更に記載されている。更に、ＦｃγＲｌ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ及びＦｃＲｎに対するヒトＩｇＧ１上の結合部位がマッピングされており、結合が改善した変異体が記載されている（Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，２００１  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｎ．２７６：６５９１−６６０４を参照のこと）。
【０１４９】
なおも別の実施形態において、抗体サイトカイングラフト化タンパク質のグリコシル化が修飾される。例えば、非グリコシル化抗体サイトカイングラフト化タンパク質を作ることができる（即ち、この抗体サイトカイングラフト化タンパク質はグリコシル化を欠いている）。グリコシル化は、例えば、「抗原」に対する抗体の親和性を増加させるため変化させることができる。かかる糖質修飾は、例えば抗体配列内の１つ以上のグリコシル化部位を変化させることにより達成し得る。例えば、１つ以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位の除去をもたらし、それにより当該部位でのグリコシル化を除去する１つ以上のアミノ酸置換を作ることができる。かかる非グリコシル化は抗原に対する抗体の親和性を増加させ得る。かかる手法については、Ｃｏらによる米国特許第５，７１４，３５０号明細書及び同第６，３５０，８６１号明細書に更に詳細に記載されている。
【０１５０】
それに加えて又は代えて、フコシル残基の量が低下した低フコシル化抗体サイトカイングラフト化タンパク質又は二分ＧｌｃＮａｃ構造が増加した抗体など、変化したタイプのグリコシル化を有する抗体サイトカイングラフト化タンパク質を作ることができる。かかる変化したグリコシル化パターンは、抗体の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）能力を増加させることが実証されている。かかる糖質修飾は、例えば、グリコシル化機構が変化した宿主細胞において抗体サイトカイングラフト化タンパク質を発現させることにより達成し得る。グリコシル化機構が変化した細胞については当該技術分野において記載されており、組換え抗体サイトカイングラフト化タンパク質を発現して、それによりグリコシル化が変化した抗体サイトカイングラフト化タンパク質を産生する宿主細胞として使用することができる。例えば、Ｈａｎｇらによる欧州特許第１，１７６，１９５号明細書は、機能が破壊されたＦＵＴ８遺伝子を有する細胞株について記載しており、この遺伝子はフコシルトランスフェラーゼをコードするため、かかる細胞株において発現する抗体サイトカイングラフト化タンパク質は低フコシル化を呈することになる。Ｐｒｅｓｔａによる国際公開第０３／０３５８３５号パンフレットは、フコースをＡｓｎ（２９７）結合糖質に付加する能力が低下した変異ＣＨＯ細胞株、Ｌｅｃｌ３細胞について記載し、これもまた当該宿主細胞において発現する抗体サイトカイングラフト化タンパク質の低フコシル化をもたらす（Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，２００２  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−２６７４０もまた参照のこと）。Ｕｍａｎａらによる国際公開第９９／５４３４２号パンフレットは、糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、β（１，４）−ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現するように操作された細胞株について記載しており、この操作された細胞株で発現する抗体サイトカイングラフト化タンパク質は二分ＧｌｃＮａｃ構造の増加を呈し、それにより抗体のＡＤＣＣ活性の増加がもたらされる（Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６−１８０もまた参照のこと）。
【０１５１】
一部の実施形態において、抗体サイトカイングラフト化タンパク質の１つ以上のドメイン、又は領域は、当該技術分野において周知のものなど、リンカー、例えばペプチドリンカーを介して接続される（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８；Ｐｏｌｊａｋ，ＲＪ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３を参照のこと）。ペプチドリンカーは長さが様々であってよく、例えばリンカーは１〜１００アミノ酸長であることができ、典型的にはリンカーは５〜５０アミノ酸長、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０アミノ酸長である。
【０１５２】
一部の実施形態において、ＩＬ２は、任意選択で１つ以上のペプチドリンカー配列を用いてＣＤＲ配列にグラフト化される。特定の実施形態において、１つ以上のペプチドリンカーは、（Ｇｌｙn−Ｓｅｒ）m配列（配列番号７１）、（Ｇｌｙn−Ａｌａ）m配列（配列番号７２）、又は（Ｇｌｙn−Ｓｅｒ）m／（Ｇｌｙn−Ａｌａ）m配列の任意の組み合わせ（配列番号７１〜７２）［式中、各ｎは独立に１〜５の整数であり、各ｍは独立に０〜１０の整数である］から独立して選択される。リンカーの例としては、限定はされないが、グリシンベースのリンカー又はｇｌｙ／ｓｅｒリンカーＧ／Ｓ、例えば（ＧmＳ）n［式中、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０に等しい正の整数であり、ｍは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０に等しい整数である］（配列番号７３）が挙げられる。特定の実施形態において、１つ以上のリンカーはＧ4Ｓ（配列番号７４）リピート、例えばＧｌｙ−Ｓｅｒリンカー（Ｇ4Ｓ）n［式中、ｎは１以上の正の整数である（配列番号７４）。例えば、ｎ＝１、ｎ＝２、ｎ＝３、ｎ＝４、ｎ＝５及びｎ＝６、ｎ＝７、ｎ＝８、ｎ＝９及びｎ＝１０］を含む。一部の実施形態において、ＳｅｒはＡｌａに置き換えることができ、例えば、（ＧmＡ）n［式中、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０に等しい正の整数であり、ｍは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０に等しい整数である］（配列番号７５）などのリンカーＧ／Ａである。特定の実施形態において、１つ以上のリンカーはＧ4Ａ（配列番号７６）リピート、（Ｇ4Ａ）n［式中、ｎは１以上の正の整数である（配列番号７６）。例えば、ｎ＝１、ｎ＝２、ｎ＝３。ｎ＝４、ｎ＝５及びｎ＝６、ｎ＝７、ｎ＝８、ｎ＝９及びｎ＝１０］を含む。一部の実施形態において、リンカーはリンカーの複数のリピートを含む。他の実施形態において、リンカーは組み合わせ及び複数のＧ4Ｓ（配列番号７４）及びＧ4Ａ（配列番号７６）を含む。
【０１５３】
リンカーの他の例としては、リンカー及び接合部によって生じる免疫原性を最小限に抑えるため、抗体において天然に存在する可動性リンカー配列をベースとするものが挙げられる。例えば、抗体分子構造の可変ドメインとＣＨ１定常ドメインとの間には天然の可動性連結がある。この天然の連結は、ＶドメインのＣ末端から４〜６残基が寄与し且つＣＨ１ドメインのＮ末端から４〜６残基が寄与する約１０〜１２アミノ酸残基を含む。抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、例えば、ＣＨ１の末端５〜６アミノ酸残基、又は１１〜１２アミノ酸残基をリンカーとして取り込むリンカーを用いることができる。ＣＨ１ドメインのＮ末端残基、特に最初の５〜６アミノ酸残基は、強力な二次構造のないループコンホメーションをとり、従って可動性リンカーとして働くことができる。ＣＨ１ドメインのＮ末端残基は、それがＩｇ配列の一部であるとおり、可変ドメインの天然の伸長部であり、従ってリンカー及び接合部によって潜在的に生じる可能性のある任意の免疫原性を大幅に最小限に抑える。一部の実施形態においてリンカー配列は、ヒンジ配列をベースとする修飾ペプチド配列を含む。
【０１５４】
更に、抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、抗体サイトカイングラフト化タンパク質の精製を促進するためペプチドなどのマーカー配列を含むことができる。好ましい実施形態において、マーカーアミノ酸配列は、とりわけ、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，９２５９  Ｅｔｏｎ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ，９１３１１）に提供されるタグなど、ヘキサヒスチジンペプチド（配列番号１２１）であり、その多くは市販されている。Ｇｅｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８２１−８２４に記載されるとおり、例えばヘキサヒスチジン（配列番号７８）は、グラフト化タンパク質の好都合な精製をもたらす。精製に有用な他のペプチドタグとしては、限定はされないが、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質に由来するエピトープに対応するヘマグルチニン（「ＨＡ」）タグ（Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ  ３７：７６７）、及び「ｆｌａｇ」タグが挙げられる。
【０１５５】
抗体はまた固体支持体に付加されてもよく、これは標的抗原のイムノアッセイ又は精製に特に有用である。かかる固体支持体としては、限定はされないが、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル又はポリプロピレンが挙げられる。
【０１５６】
抗体サイトカイングラフト化タンパク質活性のアッセイ
抗体サイトカイングラフト化タンパク質を同定するためのアッセイは当該技術分野において公知であり、本明細書に記載される。アゴニスト抗体サイトカイングラフト化タンパク質はＩＬ２低親和性受容体に結合し、細胞内シグナル伝達を促進、誘導、刺激してＣＤ８  Ｔエフェクター細胞増殖並びに他の免疫刺激効果をもたらす。
【０１５７】
抗体サイトカイングラフト化タンパク質によるＩＬ２低親和性受容体への結合は、当該技術分野において公知の任意の方法を用いて決定することができる。例えば、ＩＬ２低親和性受容体への結合は、限定なしに、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ）、及びフローサイトメトリーを含めた公知の技法を用いて決定することができる。
【０１５８】
ＩＬ２低親和性受容体を通じた細胞内シグナル伝達は、当該技術分野において公知の任意の方法を用いて測定することができる。例えば、ＩＬ２によるＩＬ２低親和性受容体の活性化はＳＴＡＴ５活性化及びシグナル伝達を促進する。ＳＴＡＴ５活性化の測定方法は当該技術分野において標準的である（例えば、ＳＴＡＴ５タンパク質のリン酸化状態、レポーター遺伝子アッセイ、下流シグナル伝達アッセイ等）。ＩＬ２低親和性受容体を通じた活性化はＣＤ８  Ｔエフェクター細胞を拡大し、そのためＣＤ８  Ｔエフェクター細胞の絶対数をアッセイすることができ、又はＣＤ８  Ｔエフェクター細胞とＴｒｅｇとの比をアッセイすることができる。細胞増殖の測定方法は当該技術分野において標準的である（例えば、3Ｈ−チミジン取込みアッセイ、ＣＦＳＥ標識）。サイトカイン産生の測定方法は当該技術分野において周知である（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ）。インビトロアッセイの実施においては、抗体サイトカイングラフト化タンパク質に接触させた試験細胞又は試験細胞からの培養上清と、抗体サイトカイングラフト化タンパク質に接触させていない対照細胞又は対照細胞からの培養上清及び／又は組換えヒトＩＬ２（例えばＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標））又はＩＬ２−ＦＣ融合分子と接触させたものとを比較することができる。
【０１５９】
抗体サイトカイングラフト化タンパク質の活性はまた、エキソビボ及び／又はインビボで測定することができる。一部の態様において、未治療の対照動物及び／又はＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）で同様に治療した動物と比較したときの抗体サイトカイングラフト化タンパク質で治療した動物からエキソビボで様々な細胞型にわたってＳＴＡＴ５活性化を測定する方法を用いて、細胞型間でのアゴニスト抗体グラフト化タンパク質の差次的活性を示すことができる。好ましいアゴニスト抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、ＣＤ８  Ｔエフェクター細胞を活性化して拡大する能力を有する。例えば、ＣＤ８  Ｔエフェクター細胞のインビボでの活性化及び拡大は、当該技術分野において公知の任意の方法を用いて、例えばフローサイトメトリーにより測定することができる。好ましいアゴニスト抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、癌、例えば：黒色腫、肺癌、結腸直腸癌、前立腺癌、乳癌及びリンパ腫の予防、低減、改善又は治療において治療上有用であり得る。抗体サイトカイングラフト化タンパク質の有効性は、治療有効量の抗体サイトカイングラフト化タンパク質を対象に投与し、抗体サイトカイングラフト化タンパク質の投与前及び投与後の対象を比較することにより決定し得る。抗体サイトカイングラフト化タンパク質の有効性はまた、治療有効量の抗体サイトカイングラフト化タンパク質を試験対象に投与し、試験対象を抗体未投与の対照対象と比較すること及び／又はＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）で同様に治療した対象との比較によっても決定し得る。
【０１６０】
抗体サイトカイングラフト化タンパク質をコードするポリヌクレオチド
別の態様において、抗体サイトカイングラフト化タンパク質の重鎖及び軽鎖タンパク質をコードする単離核酸が提供される。抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、限定はされないが、組換え発現、化学合成、及び抗体四量体の酵素消化を含め、当該技術分野において公知の任意の手段により作製することができる。組換え発現は、当該技術分野において公知の任意の適切な宿主細胞、例えば、哺乳類宿主細胞、細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、昆虫宿主細胞等からであってよい。
【０１６１】
本明細書には、配列番号２０、配列番号３６、配列番号５２、及び配列番号６８のいずれか１つに例示される可変領域をコードするポリヌクレオチドが提供される。
【０１６２】
従って本開示は、本明細書に記載される抗体サイトカイングラフト化タンパク質の軽鎖及び／又は重鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば、本明細書に記載されるとおりの相補性決定領域を含む軽鎖又は重鎖可変領域又はセグメントをコードするポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態において、重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは、配列番号２０、及び配列番号５２からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の核酸配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態において、軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは、配列番号３６、及び配列番号６８からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の核酸配列同一性を有する配列を含む。
【０１６３】
一部の実施形態において、重鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号２２のポリヌクレオチドと少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の核酸配列同一性を有する。一部の実施形態において、軽鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号３８のポリヌクレオチドと少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の核酸配列同一性を有する。
【０１６４】
一部の実施形態において、重鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号５４のポリヌクレオチドと少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の核酸配列同一性を有する。一部の実施形態において、軽鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号７０の選択されたポリヌクレオチドと少なくとも８５％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の核酸配列同一性を有する。
【０１６５】
ポリヌクレオチドは、抗体サイトカイングラフト化タンパク質の可変領域配列のみをコードすることができる。ポリヌクレオチドはまた、抗体サイトカイングラフト化タンパク質の可変領域及び定常領域の両方をコードすることもできる。一部のポリヌクレオチド配列は、抗体サイトカイングラフト化タンパク質のうちの１つの重鎖及び軽鎖の両方の可変領域を含むポリペプチドをコードする。他の一部のポリヌクレオチドは、抗体サイトカイングラフト化タンパク質のうちの１つの重鎖及び軽鎖の可変領域とそれぞれ実質的に同一の２つのポリペプチドセグメントをコードする。
【０１６６】
特定の実施形態において、ポリヌクレオチド又は核酸はＤＮＡを含む。他の実施形態において、ポリヌクレオチド又は核酸はＲＮＡを含み、これは一本鎖であっても又は二本鎖であってもよい。
【０１６７】
一部の実施形態において、抗体サイトカイングラフト化タンパク質の１つ以上の免疫グロブリンタンパク質鎖、及び任意選択で分泌シグナルをコードする核酸を含む組換え宿主細胞が提供される。特定の実施形態において組換え宿主細胞は、１つの免疫グロブリンタンパク質鎖と分泌シグナルとをコードするベクターを含む。他の特定の実施形態において組換え宿主細胞は、抗体サイトカイングラフト化タンパク質の２つの免疫グロブリンタンパク質鎖と分泌シグナルとをコードする１つ以上のベクターを含む。一部の実施形態において組換え宿主細胞は、抗体サイトカイングラフト化タンパク質の２つの免疫グロブリンタンパク質鎖と分泌シグナルとをコードするシングルベクターを含む。一部の実施形態において組換え宿主細胞は、１つが抗体サイトカイングラフト化タンパク質の重鎖免疫グロブリンタンパク質鎖をコードし、もう１つが軽鎖免疫グロブリンタンパク質鎖をコードする２つのベクターを含み、各々が分泌シグナルを含む。組換え宿主細胞は原核細胞又は真核細胞であってもよい。一部の実施形態において宿主細胞は真核細胞株である。一部の実施形態において宿主細胞は哺乳類細胞株である。一部の実施形態において、宿主細胞株は抗体産生用のＣＨＯ細胞株である。
【０１６８】
加えて、抗体サイトカイングラフト化タンパク質の作製方法が提供される。一部の実施形態において、この方法は、（ｉ）抗体サイトカイングラフト化タンパク質の免疫グロブリンタンパク質鎖をコードする１つ以上のベクターを含む宿主細胞を抗体サイトカイングラフト化タンパク質の発現、形成、及び分泌に好適な条件下で培養する工程、及び（ｉｉ）抗体サイトカイングラフト化タンパク質を回収する工程を含む。
【０１６９】
ポリヌクレオチド配列は、抗体サイトカイングラフト化タンパク質のポリペプチド鎖をコードする既存の配列（例えば、本明細書に記載される配列）のデノボ固相ＤＮＡ合成又はＰＣＲ突然変異誘発によって生成され得る。核酸の直接化学合成が、Ｎａｒａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０，１９７９のホスホトリエステル法；Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９，１９７９のホスホジエステル法；Ｂｅａｕｃａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．，２２：１８５９、１９８１のジエチルホスホロアミダイト法；及び米国特許第４，４５８，０６６号明細書の固体担体法などの、当該技術分野において公知の方法によって行われ得る。ＰＣＲによるポリヌクレオチド配列への突然変異の導入が、例えば、ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ（Ｅｄ．），Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ＮＹ，１９９２；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９０；Ｍａｔｔｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：９６７，１９９１；及びＥｃｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  １：１７，１９９１に記載されるように行われ得る。
【０１７０】
また、上記に記載される抗体サイトカイングラフト化タンパク質を作製するための発現ベクター及び宿主細胞も本開示で提供される。抗体サイトカイングラフト化タンパク質の免疫グロブリンポリペプチド鎖、又は断片をコードするポリヌクレオチドを発現させるため、様々な発現ベクターを用いることができる。哺乳類宿主細胞における免疫グロブリンタンパク質の作製には、ウイルスベースの発現ベクター及び非ウイルス発現ベクターの両方を使用することができる。非ウイルスベクター及び系としては、典型的に、タンパク質又はＲＮＡを発現するための発現カセットを含む、プラスミド、エピソームベクター、及びヒト人工染色体（例えば、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  １５：３４５，１９９７を参照）が挙げられる。例えば、哺乳動物（例えば、ヒト）細胞内での抗体サイトカイングラフト化タンパク質ポリヌクレオチド及びポリペプチドの発現に有用な非ウイルスベクターとしては、ｐＴｈｉｏＨｉｓ  Ａ、Ｂ  ＆  Ｃ、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ、ｐＥＢＶＨｉｓ  Ａ、Ｂ  ＆  Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＭＰＳＶベクター、及び他のタンパク質を発現するための当該技術分野において公知の多くの他のベクターが挙げられる。有用なウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスに基づくベクター、ＳＶ４０に基づくベクター、パピローマウイルス、ＨＢＰエプスタインバーウイルス、ワクシニアウイルスベクター及びセムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）が挙げられる。Ｂｒｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．、上掲；Ｓｍｉｔｈ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４９：８０７，１９９５；及びＲｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ６８：１４３，１９９２を参照されたい。
【０１７１】
発現ベクターの選択は、ベクターが発現される意図される宿主細胞に応じて決まる。典型的に、発現ベクターは、抗体サイトカイングラフト化タンパク質の免疫グロブリンタンパク質をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されるプロモーター及び他の調節配列（例えば、エンハンサー）を含有する。ある実施形態において、誘導性プロモーターが、誘導条件下を除いて挿入された配列の発現を防止するのに用いられる。誘導性プロモーターとしては、例えば、アラビノース、ｌａｃＺ、メタロチオネインプロモーター又は熱ショックプロモーターが挙げられる。形質転換された生物の培養物が、発現生成物が宿主細胞によってより良好に許容されるコード配列について集団を偏らせずに非誘導条件下で拡張され得る。プロモーターに加えて、他の調節エレメントも抗体サイトカイングラフト化タンパク質の免疫グロブリン鎖又はフラグメントの効率的発現のために必要とされるか又は所望され得る。これらのエレメントは、典型的に、ＡＴＧ開始コドン及び隣接するリボソーム結合部位又は他の配列を含む。さらに、発現の効率が、使用の際に細胞系への適切なエンハンサーの包含によって高められ得る（例えば、Ｓｃｈａｒｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒ．２０：１２５，１９９４；及びＢｉｔｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５３：５１６，１９８７を参照）。例えば、ＳＶ４０エンハンサー又はＣＭＶエンハンサーは、哺乳動物宿主細胞内での発現を増加させるのに使用され得る。
【０１７２】
発現ベクターはまた、細胞から運び出されて培養培地中に入る抗体サイトカイングラフト化タンパク質を形成するように分泌シグナル配列位置も提供することができる。特定の態様において、挿入される抗体サイトカイングラフト化タンパク質の免疫グロブリン配列は、ベクターに含める前にシグナル配列に連結される。免疫グロブリン軽鎖及び重鎖可変ドメインをコードする配列を受け取るために使用されるベクターは、時にまた定常領域又はその一部もコードする。かかるベクターは、定常領域を含むグラフト化タンパク質としての可変領域の発現を可能にし、それによりインタクトな抗体サイトカイングラフト化タンパク質又はその断片の作製につながる。典型的には、かかる定常領域はヒトである。
【０１７３】
抗体サイトカイングラフト化タンパク質鎖を担持及び発現するための宿主細胞は、原核又は真核のいずれかであり得る。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、本開示のポリヌクレオチドをクローニングし、発現するのに有用な１つの原核宿主である。使用するのに好適な他の微生物宿主としては、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などの桿菌、並びにサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、及び様々なシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種などの他の腸内細菌科が挙げられる。これらの原核宿主においては、典型的に、宿主細胞と適合する発現制御配列（例えば、複製起点）を含む発現ベクターを作製することもできる。さらに、ラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、β−ラクタマーゼプロモーター系、又はラムダファージに由来するプロモーター系などの、任意の数の様々な周知のプロモーターば存在することになる。プロモーターは、典型的に、任意選択的に、オペレーター配列とともに発現を制御し、転写及び翻訳を開始及び完了させるためのリボソーム結合部位配列などを有する。酵母などの他の微生物も、抗体サイトカイングラフト化タンパク質ポリペプチドを発現するのに用いられ得る。バキュロウイルスベクターと組み合わせた昆虫細胞も使用され得る。
【０１７４】
一部の好ましい実施形態では、抗体サイトカイングラフト化タンパク質ポリペプチドの発現及び作製に哺乳類宿主細胞が使用される。例えば、それは外因性発現ベクターを有するいずれかの哺乳類細胞株であってもよい。これらは、任意の正常な死滅する又は正常若しくは異常な不死の動物又はヒト細胞を含む。例えば、ＣＨＯ細胞株、様々なＣｏｓ細胞株、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞株、形質転換されたＢ細胞及びハイブリドーマを含む、無傷の免疫グロブリンを分泌することが可能ないくつかの好適な宿主細胞株が開発されている。ポリペプチドを発現するための哺乳動物組織細胞培養物の使用は、例えば、Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎ．Ｙ．，Ｎ．Ｙ．，１９８７に一般に記載されている。哺乳動物宿主細胞のための発現ベクターは、複製起点、プロモーター、及びエンハンサーなどの発現制御配列（例えば、Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．８９：４９−６８，１９８６を参照）、並びにリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写ターミネーター配列などの必要なプロセッシング情報部位を含み得る。これらの発現ベクターは、通常、哺乳動物遺伝子又は哺乳動物ウイルスに由来するプロモーターを含有する。好適なプロモーターは、構成的、細胞型特異的、段階特異的、及び／又は調節可能又は制御可能であり得る。有用なプロモーターとしては、限定はされないが、メタロチオネインプロモーター、構成的アデノウイルス主要後期プロモーター、デキサメタゾン誘導性ＭＭＴＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＭＲＰｐｏｌＩＩＩプロモーター、構成的ＭＰＳＶプロモーター、テトラサイクリン誘導性ＣＭＶプロモーター（ヒト最初期ＣＭＶプロモーターなど）、構成的ＣＭＶプロモーター、及び当該技術分野において公知のプロモーター−エンハンサーの組合せが挙げられる。
【０１７５】
対象とするポリヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを導入するための方法は、細胞宿主の型に応じて変化する。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションが、原核細胞のために一般的に用いられるが、リン酸カルシウム処理又はエレクトロポレーションが、他の細胞宿主のために使用され得る（一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，上掲を参照）。他の方法としては、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム処理、リポソーム媒介性形質転換、インジェクション及びマイクロインジェクション、弾道法、ビロソーム、免疫リポソーム、ポリカチオン：核酸コンジュゲート、裸のＤＮＡ、人工ビリオン、ヘルペスウイルス構造タンパク質ＶＰ２２へのグラフト化（Ｅｌｌｉｏｔ  ａｎｄ  Ｏ’Ｈａｒｅ，Ｃｅｌｌ  ８８：２２３，１９９７）、ＤＮＡの薬剤促進性取り込み、及びエクスビボ形質導入が挙げられる。組み換えタンパク質の長期の高収率の生成のために、安定した発現が望ましいことが多い。例えば、抗体サイトカイングラフト化タンパク質鎖を安定に発現する細胞株は、ウイルスの複製起点又は内因性発現エレメントと、選択マーカー遺伝子とを含有する発現ベクターを用いて調製され得る。ベクターの導入後、細胞が、富化培地中で１〜２日間成長されてから、選択培地に切り替えられる。選択マーカーの目的は、選択に対する耐性を付与することであり、その存在が、選択培地中で導入された配列を首尾よく発現する細胞の成長を可能にする。耐性の安定にトランスフェクトされた細胞が、細胞型にとって適切な組織培養技術を用いて増殖され得る。
【０１７６】
抗体サイトカイングラフト化タンパク質を含む組成物
薬学的に許容可能な担体と共に製剤化された抗体サイトカイングラフト化タンパク質を含む医薬組成物が提供される。任意選択で、医薬組成物は、所与の障害の治療又は予防に好適な他の治療剤を更に含む。薬学的に許容可能な担体は組成物を増強し、若しくは安定化させるか、又は組成物の調製を促進する。薬学的に許容可能な担体としては、生理的に適合性のある溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などが挙げられる。
【０１７７】
本開示の医薬組成物は、当該技術分野において公知の種々の方法によって投与することができる。投与経路及び／又は投与様式は所望の結果に応じて変わる。投与が非経口投与（例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、髄腔内、動脈内、又は皮下のいずれかから選択される）によるか、又は標的部位の近位に投与されることが好ましい。薬学的に許容可能な担体は、静脈内、筋肉内、腹腔内、髄腔内、動脈内、皮下、鼻腔内、吸入、脊髄又は表皮投与（例えば、注射により）のうちの任意の１つ以上による投与に好適である。投与経路に応じて、活性化合物、例えば抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、酸の作用及びその他、化合物を不活性化し得る天然条件から化合物を保護する材料でコーティングすることができる。一部の実施形態において、医薬組成物は静脈内投与用に製剤化される。一部の実施形態において、医薬組成物は皮下投与用に製剤化される。
【０１７８】
抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、単独で、又は他の好適な成分と組み合わせて、吸入によって投与するためのエアロゾル製剤にされてもよい（即ち、それは「噴霧化」されてもよい）。エアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素など、加圧された許容可能な噴射剤の中に置かれ得る。
【０１７９】
一部の実施形態において、医薬組成物は無菌且つ流動体である。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散剤の場合には必要な粒径の維持、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば糖類、マンニトール又はソルビトールなどの多価アルコール類、及び塩化ナトリウムを含むことが好ましい。吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム又はゼラチンを組成物中に含めることにより、注射用組成物の長期吸収をもたらすことができる。特定の実施形態では、組成物は、適切な賦形剤（例えばスクロース）を使用して凍結乾燥形態での貯蔵用に調製することができる。
【０１８０】
医薬組成物は、当該技術分野において周知の常法に従い調製することができる。薬学的に許容可能な担体は、一部には、投与される詳細な組成物、並びに組成物の投与に用いられる詳細な方法によって決まる。従って、医薬組成物の好適な製剤の種類は幅広くある。抗体サイトカイングラフト化タンパク質の製剤化並びに適切な投与及びスケジュールの決定に適用可能な方法については、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１st  Ｅｄ．，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｅｄｓ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（２００５）；及びＭａｒｔｉｎｄａｌｅ：Ｔｈｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，Ｓｗｅｅｔｍａｎ，２００５，Ｌｏｎｄｏｎ：Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ．、及びＭａｒｔｉｎｄａｌｅ，Ｍａｒｔｉｎｄａｌｅ：Ｔｈｅ  Ｅｘｔｒａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ，３１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．，１９９６，Ａｍｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｎ、及びＳｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７８を参照することができる。医薬組成物は、好ましくはＧＭＰ条件下で製造される。典型的には、医薬組成物中には治療有効用量又は効果的用量の抗体サイトカイングラフト化タンパク質が利用される。抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、当業者に公知の従来方法によって薬学的に許容可能な剤形に製剤化される。投薬量レジメンは、所望の応答（例えば治療応答）を提供するように調整される。治療上又は予防上有効な用量の決定においては、低用量を投与し、次に望ましくない副作用は最小限として又は全くなく所望の応答が達成されるまで漸増させることができる。例えば、単回ボーラスが投与されてもよく、数回に分割された用量が時間をかけて投与されてもよく、又は治療状況の危急性が示すところに従い用量を比例的に増減させてもよい。特に、容易な投与及び投薬量の均一性のため、非経口組成物を投薬量単位形態で製剤化することが有利である。投薬量単位形態は、本明細書で使用されるとき、治療対象への単位投薬量として適した物理的に別個の単位を指し；各単位が、必要な医薬担体に関連して所望の治療効果を生じるように計算された所定の分量の活性化合物を含有する。
【０１８１】
医薬組成物中にある活性成分の実際の投薬量レベルは、患者にとって毒性でなく、詳細な患者、組成物、及び投与様式に対して所望の治療応答を実現するのに有効な活性成分の量に達するように変えられてもよい。選択される投薬量レベルは、用いられる詳細な組成物、又はそのエステル、塩若しくはアミドの活性、投与経路、投与時間、用いられる詳細な化合物の排泄速度、治療継続期間、他の薬物、用いられる詳細な組成物と併用して使用される化合物及び／又は材料、治療下の患者の年齢、性別、体重、状態、全般的な健康及び前病歴などの要因を含め、種々の薬物動態学的要因に依存する。
【０１８２】
製品／キット
一部の態様において、抗体サイトカイングラフト化タンパク質は製品（即ちキット）で提供される。提供される抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、概してバイアル又は容器内にある。従って、製品は、容器及び容器上にある又はそれと関連付けられたラベル又は添付文書を含む。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、溶液バッグ等が挙げられる。適宜、抗体サイトカイングラフト化タンパク質は液体又は乾燥形態（例えば、凍結乾燥形態）であってもよい。容器は、それ自体で、又は別の組成物との組み合わせで、癌の治療、予防及び／又は改善用の組成物の調製に有効な組成物を保持する。ラベル又は添付文書は、組成物が癌の治療、予防及び／又は改善に使用されることを指示する。本明細書に記載されるとおりの抗体サイトカイングラフト化タンパク質を含む製品（キット）は、任意選択で１つ以上の追加的薬剤を含む。一部の実施形態において、製品（キット）は抗体サイトカイングラフト化タンパク質と薬学的に許容可能な希釈剤とを含む。一部の実施形態において、抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、製品（キット）において１つ以上の追加的な活性薬剤と共に同じ製剤に（例えば、混合物として）提供される。一部の実施形態において、抗体サイトカイングラフト化タンパク質は製品（キット）において第２又は第３の薬剤と共に別個の製剤に（例えば、別個の容器に）提供される。特定の実施形態において、製品（キット）は抗体サイトカイングラフト化タンパク質のアリコートを含み、ここでアリコートは１用量以上を提供する。一部の実施形態において複数回投与用のアリコートが提供され、ここで用量は均一であるか、又は変化する。詳細な実施形態において、変化する投与レジメンは、適宜、漸増又は漸減するものである。一部の実施形態において、抗体サイトカイングラフト化タンパク質及び第２の薬剤の投薬量は、独立に均一であるか、又は独立に変化する。特定の実施形態において、製品（キット）は抗癌剤又は免疫チェックポイント分子などの追加的な薬剤を含む。１つ以上の追加的薬剤の選択は、投薬量、送達、及び治療しようとする疾患状態に依存することになる。
【０１８３】
癌の治療方法及びその治療用組成物の使用
治療又は予防の対象となる病態
抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、癌の治療、改善又は予防に使用が見出される。一態様において、本開示は、それを必要としている個体の癌の治療方法を提供し、この方法は、本明細書に記載されるとおりの抗体サイトカイングラフト化タンパク質の治療有効量を個体に投与することを含む。一部の実施形態において、個体の癌の治療又は予防における治療剤としての使用のための抗体サイトカイングラフト化タンパク質が提供される。更なる態様において、本開示は、それを必要としている個体の癌の治療又は改善における使用のためのかかる抗体サイトカイングラフト化タンパク質を含む組成物を提供する。
【０１８４】
治療の対象となる病態には、様々な癌疾患が含まれる。治療目的では、個体は癌と診断された。防御又は予防目的では、個体は癌からの寛解期にあってもよく、又は将来の発症が見込まれてもよい。一部の実施形態において、患者は癌を有するか、癌を有する疑いがあるか、又は癌からの寛解期にある。抗体サイトカイングラフト化タンパク質による治療の対象となる癌は、通常、本明細書に記載されるとおり、ＩＬ２低親和性受容体シグナル伝達の活性化から利益を得る。治療の対象となる癌疾患としては、限定なしに：黒色腫、肺癌、結腸直腸癌、前立腺癌、乳癌及びリンパ腫が挙げられる。
【０１８５】
抗体サイトカイングラフト化タンパク質の投与
医師又は獣医師は、医薬組成物中に用いる抗体サイトカイングラフト化タンパク質の用量を所望の治療効果の実現に必要な用量よりも低いレベルで開始し、所望の効果が実現するまで投薬量を徐々に増加させることができる。一般に、組成物の有効用量は、治療されることになる具体的な疾患又は病態、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトか、それとも動物か、投与されている他の薬物療法、及び治療が予防的か、それとも療法的かを含め、多くの異なる要因に応じて変わる。治療投薬量は、安全性及び有効性を最適化するため典型的には滴定が必要である。抗体サイトカイングラフト化タンパク質を伴う投与について、投薬量は宿主体重の約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、及びより通常は０．０１〜５ｍｇ／ｋｇの範囲である。例えば投薬量は１ｍｇ／ｋｇ体重又は１０ｍｇ／ｋｇ体重又は１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であってもよい。投与は必要又は所望に応じて毎日、毎週、隔週、毎月、又はそれより多い若しくは少ない頻度であってもよい。例示的治療レジームは必然的に、週１回、２週間毎に１回又は月１回又は３〜６ヵ月毎に１回の投与を伴う。
【０１８６】
抗体サイトカイングラフト化タンパク質は単回用量又は分割用量で投与することができる。抗体サイトカイングラフト化タンパク質は通常、複数の機会に投与される。単回投薬量間の間隔は、必要又は所望に応じて毎週、隔週、毎月又は毎年であってもよい。間隙はまた、患者における抗体サイトカイングラフト化タンパク質の血中レベルの測定によって指示されるとおり不規則であってもよい。一部の方法では、投薬量は、１〜１０００μｇ／ｍｌ、及び一部の方法では２５〜３００μｇ／ｍｌの血漿抗体サイトカイングラフト化タンパク質濃度が実現するように調整される。或いは、抗体サイトカイングラフト化タンパク質は徐放製剤として投与することができ、この場合より低い頻度での投与が必要である。投薬量及び頻度は患者における抗体サイトカイングラフト化タンパク質の半減期に応じて変わる。一般に、抗体グラフト化タンパク質は天然ＩＬ２又はＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）などの組換えサイトカインよりも長い半減期を示す。投薬量及び投与頻度は、治療が予防的か、それとも療法的かに応じて変わり得る。一部の患者は、その生涯にわたって治療を受け続ける。一般に予防適用については、比較的低い投薬量が比較的低い頻度間隔で長期にわたって投与される。一般に療法適用については、疾患の進行が減少又は終了するまで、及び好ましくは患者が疾患の症状の部分的又は完全な改善を示すまで、比較的短い間隔での比較的高い投薬量が時に必要となる。その後、患者は予防レジームを投与されてもよい。
【０１８７】
第２の薬剤との共投与
用語「併用療法」は、本開示に記載される治療上の病態又は障害を治療するための２つ以上の治療剤の投与を指す。このような投与は、固定比の活性成分を有する単一のカプセルなどの、実質的に同時の様式でのこれらの治療剤の同時投与を包含する。或いは、このような投与は、各活性成分について、複数の、又は別々の容器（例えば、カプセル、粉末、及び液体）中での同時投与を包含する。粉末及び／又は液体は、投与前に所望の用量に再構成又は希釈され得る。さらに、このような投与は、ほぼ同時に又は異なる時間に、連続的様式での、それぞれのタイプの治療剤の使用も包含する。いずれの場合も、治療計画は、本明細書に記載される病態又は障害を治療する際に薬物の組合せの有益な効果を提供する。
【０１８８】
併用療法は「相乗作用」を提供することができ、「相乗的」である、即ち、活性成分を併せて使用したときに達成される効果が、それらの化合物を個別に使用して得られる効果の総和より高いことが判明し得る。相乗効果は、活性成分が（１）共製剤化されて投与されるか、又は組み合わせた単位投薬量製剤で同時に送達されるとき；（２）別個の製剤として交互に又は並行して送達されるとき；又は（３）他の何らかのレジメンによるとき、達成され得る。交互投与療法で送達される場合、相乗効果は、化合物が例えば別個のシリンジでの異なる注射によって逐次的に投与又は送達されるときに達成され得る。一般に、交互投与療法に際して、各活性成分の有効投薬量は逐次的に、即ち連続的に投与され、一方併用療法では、２つ以上の活性成分の有効投薬量は一緒に投与される。
【０１８９】
一態様において、本開示は、限定はされないが、ＥＧＦＲ阻害薬、Ｈｅｒ２阻害薬、Ｈｅｒ３阻害薬、ＩＧＦＲ阻害薬、及びＭｅｔ阻害薬を含めた１つ以上のチロシンキナーゼ阻害薬と併用して抗体サイトカイングラフト化タンパク質をそれを必要としている対象に投与することによる癌の治療方法を提供する。
【０１９０】
例えば、チロシンキナーゼ阻害薬としては、限定はされないが、エルロチニブ塩酸塩（Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標））；リニファニブ（Ｎ−［４−（３−アミノ−１Ｈ−インダゾール−４−イル）フェニル］−Ｎ’−（２−フルオロ−５−メチルフェニル）尿素、別名ＡＢＴ  ８６９、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈから入手可能）；リンゴ酸スニチニブ（Ｓｕｔｅｎｔ（登録商標））；ボスチニブ（４−［（２，４−ジクロロ−５−メトキシフェニル）アミノ］−６−メトキシ−７−［３−（４−メチルピペラジン−１−イル）プロポキシ］キノリン−３−カルボニトリル、別名ＳＫＩ−６０６、及び米国特許第６，７８０，９９６号明細書に記載される）；ダサチニブ（Ｓｐｒｙｃｅｌ（登録商標））；パゾパニブ（Ｖｏｔｒｉｅｎｔ（登録商標））；ソラフェニブ（Ｎｅｘａｖａｒ（登録商標））；Ｚａｃｔｉｍａ（ＺＤ６４７４）；ニロチニブ（Ｔａｓｉｇｎａ（登録商標））；レゴラフェニブ（Ｓｔｉｖａｒｇａ（登録商標））及びイマチニブ又はメシル酸イマチニブ（Ｇｉｌｖｅｃ（登録商標）及びＧｌｅｅｖｅｃ（登録商標））が挙げられる。
【０１９１】
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害薬としては、限定はされないが、エルロチニブ塩酸塩（Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標））、ゲフィチニブ（Ｇｅｆｉｔｎｉｂ）（Ｉｒｅｓｓａ（登録商標））；Ｎ−［４−［（３−クロロ−４−フルオロフェニル）アミノ］−７−［［（３”Ｓ”）−テトラヒドロ−３−フラニル］オキシ］−６−キナゾリニル］−４（ジメチルアミノ）−２−ブテンアミド、Ｔｏｖｏｋ（登録商標））；バンデタニブ（Ｃａｐｒｅｌｓａ（登録商標））；ラパチニブ（Ｔｙｋｅｒｂ（登録商標））；（３Ｒ，４Ｒ）−４−アミノ−１−（（４−（（３−メトキシフェニル）アミノ）ピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−５−イル）メチル）ピペリジン−３−オール（ＢＭＳ６９０５１４）；カネルチニブ二塩酸塩（ＣＩ−１０３３）；６−［４−［（４−エチル−１−ピペラジニル）メチル］フェニル］−Ｎ−［（１Ｒ）−１−フェニルエチル］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−アミン（ＡＥＥ７８８、ＣＡＳ  ４９７８３９−６２−０）；ムブリチニブ（ＴＡＫ１６５）；ペリチニブ（ＥＫＢ５６９）；アファチニブ（ＢＩＢＷ２９９２）；ネラチニブ（ＨＫＩ−２７２）；Ｎ−［４−［［１−［（３−フルオロフェニル）メチル］−１Ｈ−インダゾール−５−イル］アミノ］−５−メチルピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−６−イル］−カルバミン酸、（３Ｓ）−３−モルホリニルメチルエステル（ＢＭＳ５９９６２６）；Ｎ−（３，４−ジクロロ−２−フルオロフェニル）−６−メトキシ−７−［［（３ａα，５β，６ａα）−オクタヒドロ−２−メチルシクロペンタ［ｃ］ピロール−５−イル］メトキシ］−４−キナゾリンアミン（ＸＬ６４７、ＣＡＳ  ７８１６１３−２３−８）；及び４−［４−［［（１Ｒ）−１−フェニルエチル］アミノ］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−６−イル］−フェノール（ＰＫＩ１６６、ＣＡＳ  １８７７２４−６１−４）が挙げられる。
【０１９２】
ＥＧＦＲ抗体としては、限定はされないが、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））；パニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標））；マツズマブ（ＥＭＤ−７２０００）；ニモツズマブ（ｈＲ３）；ザルツムマブ；ＴｈｅｒａＣＩＭ  ｈ−Ｒ３；ＭＤＸ０４４７（ＣＡＳ  ３３９１５１−９６−１）；及びｃｈ８０６（ｍＡｂ−８０６、ＣＡＳ  ９４６４１４−０９−１）が挙げられる。
【０１９３】
ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２受容体）（別名Ｎｅｕ、ＥｒｂＢ−２、ＣＤ３４０、又はｐ１８５）阻害薬としては、限定はされないが、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））；ペルツズマブ（Ｏｍｎｉｔａｒｇ（登録商標））；ネラチニブ（ＨＫＩ−２７２、（２Ｅ）−Ｎ−［４−［［３−クロロ−４−［（ピリジン−２−イル）メトキシ］フェニル］アミノ］−３−シアノ−７−エトキシキノリン−６−イル］−４−（ジメチルアミノ）ブタ−２−エナミド、及び国際公開第０５／０２８４４３号パンフレットに記載される）；ラパチニブ又は二トシル酸ラパチニブ（Ｔｙｋｅｒｂ（登録商標））；（３Ｒ，４Ｒ）−４−アミノ−１−（（４−（（３−メトキシフェニル）アミノ）ピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−５−イル）メチル）ピペリジン−３−オール（ＢＭＳ６９０５１４）；（２Ｅ）−Ｎ−［４−［（３−クロロ−４−フルオロフェニル）アミノ］−７−［［（３Ｓ）−テトラヒドロ−３−フラニル］オキシ］−６−キナゾリニル］−４−（ジメチルアミノ）−２−ブテンアミド（ＢＩＢＷ−２９９２、ＣＡＳ  ８５０１４０−７２−６）；Ｎ−［４−［［１−［（３−フルオロフェニル）メチル］−１Ｈ−インダゾール−５−イル］アミノ］−５−メチルピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−６−イル］−カルバミン酸、（３Ｓ）−３−モルホリニルメチルエステル（ＢＭＳ  ５９９６２６、ＣＡＳ  ７１４９７１−０９−２）；カネルチニブ二塩酸塩（ＰＤ１８３８０５又はＣＩ−１０３３）；及びＮ−（３，４−ジクロロ−２−フルオロフェニル）−６−メトキシ−７−［［（３ａα，５β，６ａα）−オクタヒドロ−２−メチルシクロペンタ［ｃ］ピロール−５−イル］メトキシ］−４−キナゾリンアミン（ＸＬ６４７、ＣＡＳ  ７８１６１３−２３−８）が挙げられる。
【０１９４】
ＨＥＲ３阻害薬としては、限定はされないが、ＬＪＭ７１６、ＭＭ−１２１、ＡＭＧ−８８８、ＲＧ７１１６、ＲＥＧＮ−１４００、ＡＶ−２０３、ＭＰ−ＲＭ−１、ＭＭ−１１１、及びＭＥＨＤ−７９４５Ａが挙げられる。
【０１９５】
ＭＥＴ阻害薬としては、限定はされないが、カボザンチニブ（ＸＬ１８４、ＣＡＳ  ８４９２１７−６８−１）；フォレチニブ（ＧＳＫ１３６３０８９、旧ＸＬ８８０、ＣＡＳ  ８４９２１７−６４−７）；チバンチニブ（ＡＲＱ１９７、ＣＡＳ  １０００８７３−９８−２）；１−（２−ヒドロキシ−２−メチルプロピル）−Ｎ−（５−（７−メトキシキノリン−４−イルオキシ）ピリジン−２−イル）−５−メチル−３−オキソ−２−フェニル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミド（ＡＭＧ  ４５８）；クリゾチニブ（ｃｒｙｚｏｔｉｎｉｂ）（Ｘａｌｋｏｒｉ（登録商標）、ＰＦ−０２３４１０６６）；（３Ｚ）−５−（２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−１−イルスルホニル）−３−（｛３，５−ジメチル−４−［（４−メチルピペラジン−１−イル）カルボニル］−１Ｈ−ピロール−２−イル｝メチレン）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−オン（ＳＵ１１２７１）；（３Ｚ）−Ｎ−（３−クロロフェニル）−３−（｛３，５−ジメチル−４−［（４−メチルピペラジン−１−イル）カルボニル］−１Ｈ−ピロール−２−イル｝メチレン）−Ｎ−メチル−２−オキソインドリン−５−スルホンアミド（ＳＵ１１２７４）；（３Ｚ）−Ｎ−（３−クロロフェニル）−３−｛［３，５−ジメチル−４−（３−モルホリン−４−イルプロピル）−１Ｈ−ピロール−２−イル］メチレン｝−Ｎ−メチル−２−オキソインドリン−５−スルホンアミド（ＳＵ１１６０６）；６−［ジフルオロ［６−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，２，４−トリアゾロ［４，３−ｂ］ピリダジン−３−イル］メチル］−キノリン（ＪＮＪ３８８７７６０５、ＣＡＳ  ９４３５４０−７５−８）；２−［４−［１−（キノリン−６−イルメチル）−１Ｈ−［１，２，３］トリアゾロ［４，５−ｂ］ピラジン−６−イル］−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］エタノール（ＰＦ０４２１７９０３、ＣＡＳ  ９５６９０５−２７−４）；Ｎ−（（２Ｒ）−１，４−ジオキサン−２−イルメチル）−Ｎ−メチル−Ｎ’−［３−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−５−オキソ−５Ｈ−ベンゾ［４，５］シクロヘプタ［１，２−ｂ］ピリジン−７−イル］スルファミド（ＭＫ２４６１、ＣＡＳ  ９１７８７９−３９−１）；６−［［６−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，２，４−トリアゾロ［４，３−ｂ］ピリダジン−３−イル］チオ］−キノリン（ＳＧＸ５２３、ＣＡＳ  １０２２１５０−５７−７）；及び（３Ｚ）−５−［［（２，６−ジクロロフェニル）メチル］スルホニル］−３−［［３，５−ジメチル−４−［［（２Ｒ）−２−（１−ピロリジニルメチル）−１−ピロリジニル］カルボニル］−１Ｈ−ピロール−２−イル］メチレン］−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−オン（ＰＨＡ６６５７５２、ＣＡＳ  ４７７５７５−５６−７）が挙げられる。
【０１９６】
ＩＧＦ１Ｒ阻害薬としては、限定はされないが、ＢＭＳ−７５４８０７、ＸＬ−２２８、ＯＳＩ−９０６、ＧＳＫ０９０４５２９Ａ、Ａ−９２８６０５、ＡＸＬ１７１７、ＫＷ−２４５０、ＭＫ０６４６、ＡＭＧ４７９、ＩＭＣＡ１２、ＭＥＤＩ−５７３、及びＢＩ８３６８４５が挙げられる。レビューについては、例えば、Ｙｅｅ，ＪＮＣＩ，１０４；９７５（２０１２）を参照のこと。
【０１９７】
別の態様において、本開示は、限定はされないが、ＭＥＫ阻害薬、Ｂｒａｆ阻害薬、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ阻害薬、ＳＨＰ２阻害薬、及びまたｍＴｏｒ阻害薬を含めた１つ以上のＦＧＦ下流シグナル伝達経路阻害薬と併用して抗体サイトカイングラフト化タンパク質をそれを必要としている対象に投与することによる癌の治療方法を提供する。
【０１９８】
例えば、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＥＫ）阻害薬としては、限定はされないが、ＸＬ−５１８（別名ＧＤＣ−０９７３、ＣＡＳ番号１０２９８７２−２９−４、ＡＣＣ  Ｃｏｒｐ．から入手可能）；２−［（２−クロロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−Ｎ−（シクロプロピルメトキシ）−３，４−ジフルオロ−ベンズアミド（別名ＣＩ−１０４０又はＰＤ１８４３５２及び国際公開第２００００３５４３６号パンフレットに記載される）；Ｎ−［（２Ｒ）−２，３−ジヒドロキシプロポキシ］−３，４−ジフルオロ−２−［（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−ベンズアミド（別名ＰＤ０３２５９０１及び国際公開第２００２００６２１３号パンフレットに記載される）；２，３−ビス［アミノ［（２−アミノフェニル）チオ］メチレン］−ブタンジニトリル（別名Ｕ０１２６及び米国特許第２，７７９，７８０号明細書に記載される）；Ｎ−［３，４−ジフルオロ−２−［（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−６−メトキシフェニル］−１−［（２Ｒ）−２，３−ジヒドロキシプロピル］−シクロプロパンスルホンアミド（別名ＲＤＥＡ１１９又はＢＡＹ８６９７６６及び国際公開第２００７０１４０１１号パンフレットに記載される）；（３Ｓ，４Ｒ，５Ｚ，８Ｓ，９Ｓ，１１Ｅ）−１４−（エチルアミノ）−８，９，１６−トリヒドロキシ−３，４−ジメチル−３，４，９，１９−テトラヒドロ−１Ｈ−２−ベンゾオキサシクロテトラデシン−１，７（８Ｈ）−ジオン］（別名Ｅ６２０１及び国際公開第２００３０７６４２４号パンフレットに記載される）；２’−アミノ−３’−メトキシフラボン（別名ＰＤ９８０５９  Ｂｉａｆｆｉｎ  ＧｍｂＨ  ＆  Ｃｏ．，ＫＧ、Ｇｅｒｍａｎｙから入手可能）；ベムラフェニブ（ＰＬＸ−４０３２、ＣＡＳ  ９１８５０４−６５−１）；（Ｒ）−３−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−６−フルオロ−５−（２−フルオロ−４−ヨードフェニルアミノ）−８−メチルピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４，７（３Ｈ，８Ｈ）−ジオン（ＴＡＫ−７３３、ＣＡＳ  １０３５５５５−６３−５）；ピマセルチブ（ＡＳ−７０３０２６、ＣＡＳ  １２０４５３１−２６−９）；及びトラメチニブジメチルスルホキシド（ＧＳＫ−１１２０２１２、ＣＡＳ  １２０４５３１−２５−８０）が挙げられる。
【０１９９】
ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害薬としては、限定はされないが、４−［２−（１Ｈ−インダゾール−４−イル）−６−［［４−（メチルスルホニル）ピペラジン−１−イル］メチル］チエノ［３，２−ｄ］ピリミジン−４−イル］モルホリン（別名ＧＤＣ  ０９４１並びに国際公開第０９／０３６０８２号パンフレット及び国際公開第０９／０５５７３０号パンフレットに記載される）；２−メチル−２−［４−［３−メチル−２−オキソ−８−（キノリン−３−イル）−２，３−ジヒドロイミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］フェニル］プロピオニトリル（別名ＢＥＺ  ２３５又はＮＶＰ−ＢＥＺ  ２３５、及び国際公開第０６／１２２８０６号パンフレットに記載される）；４−（トリフルオロメチル）−５−（２，６−ジモルホリノピリミジン−４−イル）ピリジン−２−アミン（別名ＢＫＭ１２０又はＮＶＰ−ＢＫＭ１２０、及び国際公開第２００７／０８４７８６号パンフレットに記載される）；トザセルチブ（ＶＸ６８０又はＭＫ−０４５７、ＣＡＳ  ６３９０８９−５４−６）；（５Ｚ）−５−［［４−（４−ピリジニル）−６−キノリニル］メチレン］−２，４−チアゾリジンジオン（ＧＳＫ１０５９６１５、ＣＡＳ  ９５８８５２−０１−２）；（１Ｅ，４Ｓ，４ａＲ，５Ｒ，６ａＳ，９ａＲ）−５−（アセチルオキシ）−１−［（ジ−２−プロペニルアミノ）メチレン］−４，４ａ，５，６，６ａ，８，９，９ａ−オクタヒドロ−１１−ヒドロキシ−４−（メトキシメチル）−４ａ，６ａ−ジメチル−シクロペンタ［５，６］ナフト［１，２−ｃ］ピラン−２，７，１０（１Ｈ）−トリオン（ＰＸ８６６、ＣＡＳ  ５０２６３２−６６−８）；及び８−フェニル−２−（モルホリン−４−イル）−クロメン−４−オン（ＬＹ２９４００２、ＣＡＳ  １５４４４７−３６−６）が挙げられる。
【０２００】
ｍＴｏｒ阻害薬としては、限定はされないが、テムシロリムス（Ｔｏｒｉｓｅｌ（登録商標））；リダフォロリムス（正式には別名デフォロリムス（ｄｅｆｅｒｏｌｉｍｕｓ）、（１Ｒ，２Ｒ，４Ｓ）−４−［（２Ｒ）−２［（１Ｒ，９Ｓ，１２Ｓ，１５Ｒ，１６Ｅ，１８Ｒ，１９Ｒ，２１Ｒ，２３Ｓ，２４Ｅ，２６Ｅ，２８Ｚ，３０Ｓ，３２Ｓ，３５Ｒ）−１，１８−ジヒドロキシ−１９，３０−ジメトキシ−１５，１７，２１，２３，２９，３５−ヘキサメチル−２，３，１０，１４，２０−ペンタオキソ−１１，３６−ジオキサ−４−アザトリシクロ［３０．３．１．０4,9］ヘキサトリアコンタ−１６，２４，２６，２８−テトラエン−１２−イル］プロピル］−２−メトキシシクロヘキシルジメチルホスフィネート、別名ＡＰ２３５７３及びＭＫ８６６９、及び国際公開第０３／０６４３８３号パンフレットに記載される）；エベロリムス（Ａｆｉｎｉｔｏｒ（登録商標）又はＲＡＤ００１）；ラパマイシン（ＡＹ２２９８９、シロリムス（登録商標））；セマピモド（ｓｉｍａｐｉｍｏｄ）（ＣＡＳ  １６４３０１−５１−３）；（５−｛２，４−ビス［（３Ｓ）−３−メチルモルホリン−４−イル］ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル｝−２−メトキシフェニル）メタノール（ＡＺＤ８０５５）；２−アミノ−８−［トランス−４−（２−ヒドロキシエトキシ）シクロヘキシル］−６−（６−メトキシ−３−ピリジニル）−４−メチル−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−オン（ＰＦ０４６９１５０２、ＣＡＳ  １０１３１０１−３６−４）；及びＮ2−［１，４−ジオキソ−４−［［４−（４−オキソ−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−２−イル）モルホリニウム−４−イル］メトキシ］ブチル］−Ｌ−アルギニルグリシル−Ｌ−α−アスパルチルＬ−セリン−（配列番号７７として開示される「Ｌ−アルギニルグリシル−Ｌ−α−アスパルチルＬ−セリン−」）、内塩（ＳＦ１１２６、ＣＡＳ  ９３６４８７−６７−１）が挙げられる。
【０２０１】
更に別の態様において、本開示は、限定はされないが、ＩＡＰ阻害薬、Ｂｃｌ２阻害薬、ＭＣｌ１阻害薬、Ｔｒａｉｌ薬剤、Ｃｈｋ阻害薬を含めた１つ以上のアポトーシス促進物質と併用して抗体サイトカイングラフト化タンパク質をそれを必要としている対象に投与することによる癌の治療方法を提供する。
【０２０２】
例えば、ＩＡＰ阻害薬としては、限定はされないが、ＮＶＰ−ＬＣＬ１６１、ＧＤＣ−０９１７、ＡＥＧ−３５１５６、ＡＴ４０６、及びＴＬ３２７１１が挙げられる。ＩＡＰ阻害薬の他の例としては、限定はされないが、国際公開第０４／００５２８４号パンフレット、国際公開第０４／００７５２９号パンフレット、国際公開第０５／０９７７９１号パンフレット、国際公開第０５／０６９８９４号パンフレット、国際公開第０５／０６９８８８号パンフレット、国際公開第０５／０９４８１８号パンフレット、米国特許出願公開第２００６／００１４７００号明細書、米国特許出願公開第２００６／００２５３４７号明細書、国際公開第０６／０６９０６３号パンフレット、国際公開第０６／０１０１１８号パンフレット、国際公開第０６／０１７２９５号パンフレット、及び国際公開第０８／１３４６７９号パンフレットに記載されるものが挙げられる。
【０２０３】
ＢＣＬ−２阻害薬としては、限定はされないが、４−［４−［［２−（４−クロロフェニル）−５，５−ジメチル−１−シクロヘキセン−１−イル］メチル］−１−ピペラジニル］−Ｎ−［［４−［［（１Ｒ）−３−（４−モルホリニル）−１−［（フェニルチオ）メチル］プロピル］アミノ］−３−［（トリフルオロメチル）スルホニル］フェニル］スルホニル］ベンズアミド（別名ＡＢＴ−２６３及び国際公開第０９／１５５３８６号パンフレットに記載される）；テトロカルシンＡ；アンチマイシン；ゴシポール（（−）ＢＬ−１９３）；オバトクラックス；エチル−２−アミノ−６−シクロペンチル−４−（１−シアノ−２−エトキシ−２−オキソエチル）−４Ｈクロモン−３−カルボキシレート（ＨＡ１４−１）；オブリメルセン（Ｇ３１３９、Ｇｅｎａｓｅｎｓｅ（登録商標））；Ｂａｋ  ＢＨ３ペプチド；（−）−ゴシポール酢酸（ＡＴ−１０１）；４−［４−［（４’−クロロ［１，１’−ビフェニル］−２−イル）メチル］−１−ピペラジニル］−Ｎ−［［４−［［（１Ｒ）−３−（ジメチルアミノ）−１−［（フェニルチオ）メチル］プロピル］アミノ］−３−ニトロフェニル］スルホニル］−ベンズアミド（ＡＢＴ−７３７、ＣＡＳ  ８５２８０８−０４−９）；及びナビトクラクス（ＡＢＴ−２６３、ＣＡＳ  ９２３５６４−５１−６）が挙げられる。
【０２０４】
限定はされないが、デュラネルミン（ＡＭＧ−９５１、ＲｈＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ）；マパツムマブ（ＨＲＳ−ＥＴＲ１、ＣＡＳ  ６５８０５２−０９−６）；レクサツムマブ（ＨＧＳ−ＥＴＲ２、ＣＡＳ  ８４５８１６−０２−６）；Ａｐｏｍａｂ（Ａｐｏｍａｂ（登録商標））；コナツムマブ（ＡＭＧ６５５、ＣＡＳ  ８９６７３１−８２−１）；及びチガツズマブ（ＣＳ１００８、ＣＡＳ  ９４６４１５−３４−５、第一三共（Ｄａｉｉｃｈｉ  Ｓａｎｋｙｏ）から入手可能）を含め、ＤＲ４（ＴＲＡＩＬＲ１）及びＤＲ５（ＴＲＡＩＬＲ２）を含めたアポトーシス促進性受容体作動薬（ＰＡＲＡ）。
【０２０５】
チェックポイントキナーゼ（ＣＨＫ）阻害薬としては、限定はされないが、７−ヒドロキシスタウロスポリン（ＵＣＮ−０１）；６−ブロモ−３−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−５−（３Ｒ）−３−ピペリジニル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−アミン（ＳＣＨ９００７７６、ＣＡＳ  ８９１４９４−６３−６）；５−（３−フルオロフェニル）−３−ウレイドチオフェン−２−カルボン酸Ｎ−［（Ｓ）−ピペリジン−３−イル］アミド（ＡＺＤ７７６２、ＣＡＳ  ８６０３５２−０１−８）；４−［（（３Ｓ）−１−アザビシクロ［２．２．２］オクタ−３−イル）アミノ］−３−（１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル）−６−クロロキノリン−２（１Ｈ）−オン（ＣＨＩＲ  １２４、ＣＡＳ  ４０５１６８−５８−３）；７−アミノダクチノマイシン（７−Ａｍｉｎｏｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）（７−ＡＡＤ）、イソグラヌラチミド、デブロモヒメニアルジシン；Ｎ−［５−ブロモ−４−メチル−２−［（２Ｓ）−２−モルホリニルメトキシ］−フェニル］−Ｎ’−（５−メチル−２−ピラジニル）尿素（ＬＹ２６０３６１８、ＣＡＳ  ９１１２２２−４５−２）；スルホラファン（ＣＡＳ  ４４７８−９３−７、４−メチルスルフィニルブチルイソチオシアネート）；９，１０，１１，１２−テトラヒドロ−９，１２−エポキシ−１Ｈ−ジインドロ［１，２，３−ｆｇ：３’，２’，１’−ｋｌ］ピロロ［３，４−ｉ］［１，６］ベンゾジアゾシン−１，３（２Ｈ）−ジオン（ＳＢ−２１８０７８、ＣＡＳ  １３５８９７−０６−２）；及びＴＡＴ−Ｓ２１６Ａ（Ｓｈａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｔｈｅｒ  ２００７；６（１）：１４７−１５３）、及びＣＢＰ５０１が挙げられる。
【０２０６】
一態様において、本開示は、１つ以上のＦＧＦＲ阻害薬と併用して抗体サイトカイングラフト化タンパク質をそれを必要としている対象に投与することによる癌の治療方法を提供する。例えば、ＦＧＦＲ阻害薬としては、限定はされないが、ブリバニブアラニネート（ＢＭＳ−５８２６６４、（Ｓ）−（（Ｒ）−１−（４−（４−フルオロ−２−メチル−１Ｈ−インドール−５−イルオキシ）−５−メチルピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−６−イルオキシ）プロパン−２−イル）２−アミノプロパノエート）；バーガテフ（ＢＩＢＦ１１２０、ＣＡＳ  ９２８３２６−８３−４）；ドビチニブ二乳酸（ＴＫＩ２５８、ＣＡＳ  ８５２４３３−８４−２）；３−（２，６−ジクロロ−３，５−ジメトキシ−フェニル）−１−｛６−［４−（４−エチル−ピペラジン−１−イル）−フェニルアミノ］−ピリミジン−４−イル｝−１−メチル−尿素（ＢＧＪ３９８、ＣＡＳ  ８７２５１１−３４−７）；ダヌセルチブ（ＰＨＡ−７３９３５８）；及び（ＰＤ１７３０７４、ＣＡＳ  ２１９５８０−１１−７）が挙げられる。ある具体的な態様において、本開示は、３−（２，６−ジクロロ−３，５−ジメトキシフェニル）−１−（６（（４−（４−エチルピペラジン−１−イル）フェニル）アミノ）ピリミジン−４−イル）−１−メチル尿素（別名ＢＧＪ−３９８）；又は４−アミノ−５−フルオロ−３−（５−（４−メチルピペラジン１−イル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−２−イル）キノリン−２（１Ｈ）−オン（別名ドビチニブ又はＴＫＩ−２５８）、ＡＺＤ４５４７（Ｇａｖｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７２，２０４５−５６、Ｎ−［５−［２−（３，５−ジメトキシフェニル）エチル］−２Ｈ−ピラゾール−３−イル］−４−（３Ｒ，５Ｓ）−ジメチルピペラジン（ｄｉｅｍｔｈｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎ）−１−イル）ベンズアミド）、ポナチニブ（ＡＰ２４５３４；Ｇｏｚｇｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．，１１；６９０−９９；３−［２−（イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−３−イル）エチニル］−４−メチル−Ｎ−｛４−［（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル］−３−（トリフルオロメチル）フェニル｝ベンズアミド、ＣＡＳ  ９４３３１９−７０−８）などのＦＧＦＲ２阻害薬と併用して抗体薬物コンジュゲートをそれを必要としている対象に投与することによる癌の治療方法を提供する。
【０２０７】
抗体サイトカイングラフト化タンパク質はまた、免疫チェックポイント阻害薬と併用して投与することもできる。一実施形態において、抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−５、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４又はＴＧＦＲのうちの１つ以上から選択される免疫チェックポイント分子の阻害薬と併用して投与することができる。一実施形態において、免疫チェックポイント阻害薬は抗ＰＤ−１抗体であり、ここで抗ＰＤ−１抗体は、ニボルマブ、ペンブロリズマブ又はピジリズマブから選択される。一部の実施形態において、抗ＰＤ−１抗体分子はニボルマブである。ニボルマブの別名には、ＭＤＸ−１１０６、ＭＤＸ−１１０６−０４、ＯＮＯ−４５３８、又はＢＭＳ−９３６５５８が含まれる。一部の実施形態において、抗ＰＤ−１抗体はニボルマブ（ＣＡＳ登録番号：９４６４１４−９４−４）である。ニボルマブは、ＰＤ１を特異的に遮断する完全ヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体である。ニボルマブ（クローン５Ｃ４）及びその他の、ＰＤ１に特異的に結合するヒトモノクローナル抗体が、米国特許第８，００８，４４９号明細書及び国際公開第２００６／１２１１６８号パンフレットに開示されている。
【０２０８】
一部の実施形態において、抗ＰＤ−１抗体はペンブロリズマブである。ペンブロリズマブ（別名ランブロリズマブ、ＭＫ−３４７５、ＭＫ０３４７５、ＳＣＨ−９００４７５又はＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）；Ｍｅｒｃｋ）は、ＰＤ−１に結合するヒト化ＩｇＧ４モノクローナル抗体である。ペンブロリズマブ及び他のヒト化抗ＰＤ−１抗体について、Ｈａｍｉｄ，Ｏ．ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３６９（２）：１３４−４４、米国特許第８，３５４，５０９号明細書及び国際公開第２００９／１１４３３５号パンフレットに開示されている。
【０２０９】
一部の実施形態において、抗ＰＤ−１抗体はピジリズマブである。ピジリズマブ（ＣＴ−０１１；Ｃｕｒｅ  Ｔｅｃｈ）は、ＰＤ１に結合するヒト化ＩｇＧ１ｋモノクローナル抗体である。ピジリズマブ及び他のヒト化抗ＰＤ−１モノクローナル抗体について、国際公開第２００９／１０１６１１号パンフレットに開示されている。
【０２１０】
他の抗ＰＤ１抗体としては、ＡＭＰ  ５１４（Ａｍｐｌｉｍｍｕｎｅ）及び、例えば、米国特許第８，６０９，０８９号明細書、米国特許出願公開第２０１０／０２８３３０号明細書、及び／又は米国特許出願公開第２０１２／０１１４６４９号明細書及び米国特許出願公開第２０１６／０１０８１２３号明細書に開示される抗ＰＤ１抗体が挙げられる。一部の実施形態において、抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、米国特許出願公開第２０１５／０２１８２７４号明細書に開示される抗Ｔｉｍ３抗体と共に投与することができる。他の実施形態において、抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、米国特許出願公開第２０１６／０１０８１２３号明細書に開示される抗ＰＤ−Ｌ１抗体、Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ（登録商標）（ＭＥＤＩ４７３６）、Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ（登録商標）（ＭＰＤＬ３２８０Ａ）又はＡｖｅｌｕｍａｂ（登録商標）と共に投与することができる。
【実施例】
【０２１１】
実施例１：ＩＬ２抗体サイトカイングラフト化タンパク質の創製
ＩＬ２配列を様々な免疫グロブリン足場のＣＤＲ領域内に操作することにより抗体サイトカイングラフト化タンパク質を作成し、次に重鎖及び軽鎖の両方の免疫グロブリン鎖を使用して最終的な抗体サイトカインタンパク質を作成した。抗体サイトカイングラフト化タンパク質はＩＬ２の好ましい治療特性を付与する；しかしながら、抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、ｒｈＩＬ２と比較したときＴｒｅｇ細胞活性の増加などの望ましくない効果が低下している。
【０２１２】
抗体サイトカイングラフト化タンパク質を創製するため、ムテインを含むＩＬ２配列（配列番号４又は６）を免疫グロブリン鎖足場のＣＤＲループに挿入した。臨床的セッティングで利用されている種々の公知の免疫グロブリン配列並びに生殖細胞系列抗体配列を使用して抗体サイトカイングラフト化タンパク質を調製した。ＧＦＴＸ３ｂと称される例示的足場におけるＩＬ２の配列を表２に示す。挿入点は、利用可能な構造的又は相同性モデルデータに基づいて、ループの中間点であると選択された。抗体サイトカイン移植タンパク質を、関連する配列をコードする組み換えＤＮＡを用いる標準的な分子生物学方法を用いて生成した。
【０２１３】
サイトカイングラフト化にどのＣＤＲを選ぶかの選択は、以下のパラメータに関して選択された：要求される生物学、生物物理学的特性及び好ましい開発プロファイル。どのＣＤＲ及びＣＤＲ内のどの位置が所望のパラメータを提供することになるかを予測する際にモデル化ソフトウェアが部分的にのみ有用であったため、従って６つ全ての可能な抗体サイトカイングラフトを作り、次に生物学的アッセイで評価する。要求される生物学的活性が実現する場合、次に抗体サイトカイングラフト化分子がそれぞれのサイトカイン受容体とどのように相互作用するかに関する構造分解などの生物物理学的特性を解く。
【０２１４】
ＩＬ２抗体サイトカイングラフト化分子について、初めにサイトカイングラフト化に考えられる抗体候補の構造を解いた。この構造から、パラトープが抗体「アーム」のＮ末端先端にあること、及びサイトカインをこの位置にグラフト化すればそのそれぞれの受容体に対してサイトカインが提示されるであろうことが分かった。グラフト技術に起因して、各抗体ＩＬ２グラフト化タンパク質は、異なる長さ、配列及び構造環境のＣＤＲループの制約を受ける。そのため、ＬＣＤＲ−１、ＬＣＤＲ−２、ＬＣＤＲ−３及びＨＣＤＲ−１、ＨＣＤＲ−２及びＨＣＤＲ−３に対応する６つ全てのＣＤＲにＩＬ２をグラフト化した。図１のこの表から、ＣＤＲ２の軽鎖にグラフト化されたＩＬ２（ＩｇＧ．ＩＬ２．Ｌ２）が発現しなかったことを含め、抗体サイトカイングラフト化タンパク質がその活性の点で異なることが明らかである。また、Ｆｃ機能が変化した（例えばＦｃサイレントの）ＩＬ２抗体サイトカイングラフトがより良好なプロファイルを有することも観察された。
【０２１５】
特性（生物物理学的及び生物学的）の最良の組み合わせを有し、且つ含まれたＩＬ２点突然変異が所望の生物学的特性を増強したため、ＨＣＤＲ−１が選択された。挿入点の選択については、ＣＤＲループの構造中心が、いずれの側にも最も大きい（直線サイズ３．８Å×残基数の）間隔をもたらし得ることに伴い選ばれ、及びいかなる一つの理論によっても拘束されるものではないが、これはＩＬ２のより容易な折り畳みを独立に可能にすることにより安定分子を提供した。グラフト足場ＧＦＴＸ３ｂの構造は既に分かっていたため、各ＣＤＲの構造中心もまた分かっていた。これは、Ｃｈｏｔｈｉａ付番方式を用いて定義したときのＣＤＲループ配列の中心と一致した。既述のとおり、ＩＬ−２グラフトの挿入点をＣＤＲループの中心から離れてＮ末端部分又はＣ末端部分のいずれかの方にシフトさせた。しかしながら、ＣＤＲループ内でＩＬ２をシフトさせても生物学的活性に大きな差は生じなかった。
【０２１６】
要約すれば、ＣＤＲ内にグラフトすることによりあるレベルの立体障害がＩＬ２受容体の個々のサブユニットにもたらされ得るという仮説の下、構造に基づき各ＣＤＲにおける挿入点を選択した。特定のサイトカインにどのＣＤＲグラフトが最良かについての最終的な選択は、所望の生物学及び生物物理学的特性に基づいた。サイトカイン受容体の性質、サイトカイン／受容体相互作用及びシグナル伝達機構もまた役割を果たしたとともに、これは各個別の抗体サイトカイン分子をそのそれぞれの特性に関して比較することにより行った。
【０２１７】
【表１−１】
2020520665.tif 000003
【０２１８】
【表１−２】
2020520665.tif 000004
【０２１９】
【表２−１】
2020520665.tif 000005
【０２２０】
【表２−２】
2020520665.tif 000006
【０２２１】
【表２−３】
2020520665.tif 000007
【０２２２】
【表２−４】
2020520665.tif 000008
【０２２３】
【表２−５】
2020520665.tif 000009
【０２２４】
【表２−６】
2020520665.tif 000010
【０２２５】
【表２−７】
2020520665.tif 000011
【０２２６】
【表２−８】
2020520665.tif 000012
【０２２７】
実施例２：ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１はＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）（ＩＬ−２）と比較して長い半減期を有する
ナイーブＣＤ−１マウスにＩ．Ｐ．投与し、投与前、投与後１時間、３、７、２４、３１、４８、５５及び７２時間で全ての動物から採血した。血液試料を遠心し、血漿試料を入手した。得られた血漿試料を単一のポリプロピレンチューブに移し、−８０℃で凍結した。全ての試料を分析し、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１の血漿濃度をイムノアッセイを用いて測定した。半減期などの薬物動態パラメータを計算した。各試料はデュプリケートで実行し、デュプリケート分析の各々には、１：２０希釈した５μＬの試料が必要であった。捕捉：ヤギ抗ヒトＩＬ−２ビオチン化抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＢＡＦ２０２）検出：Ａｌｅｘａ  ６４７抗ヒトＩＬ−２、クローンＭＱ１−１７Ｈ１２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  ＃５００３１５）  イムノアッセイは全て、Ｇｙｒｏｌａｂ（登録商標）Ｂｉｏａｆｆｙ２００をＧｙｒｏｓ  ＣＤ−２００と共に使用して行った。図２のグラフに示されるとおり、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１の半減期は約１２時間であり、次にその後４８時間かけて減少する。Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）半減期は、その半減期が約４時間であるため、このグラフには図示できなかった。
【０２２８】
実施例３：ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１は正常Ｂ６マウスにおいてＣＤ８  Ｔエフェクターを選択的に拡大し、且つＩＬ−２  Ｆｃ又はＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）よりも良好に忍容される
ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１は、Ｔｒｅｇと比べてＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）投与で見られる有害事象を引き起こすことなくＣＤ８  Ｔエフェクターを増大させる。１日目のマウスへの投与後、４日目、８日目及び１１日目にＣＤ８  Ｔエフェクターの拡大をモニタした。各時点でＣＤ８  Ｔエフェクター細胞集団は大幅に拡大し、Ｔｒｅｇの拡大はなかった。これは、等モル用量のＩＬ−２で死亡及び罹患が観察されたＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）及びＩＬ−２Ｆｃ融合物と対照的であった。
【０２２９】
Ｂ６雌マウスにＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）（週５回）、ＩＬ−２  Ｆｃ及びＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１（１回／週）を等モル濃度で投与した。初回治療から８日後、脾臓を処理して単一細胞懸濁液を入手し、ＲＰＭＩ（１０％ＦＢＳ）で洗浄した。赤血球を赤血球溶解緩衝液（Ｓｉｇｍａ  ＃Ｒ７７５７）で溶解させて、細胞数及び生存能に関して細胞をカウントした。標準プロトコルに基づきＦＡＣＳ緩衝液（１×ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ＋０．０５％ナトリウムアジド）を使用してＦＡＣＳ染色を実施した。細胞を表面抗体：ラット抗マウスＣＤ３−ｅｆｌｕｏｒ４５０（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＃４８−００３２）、ラット抗マウスＣＤ４−パシフィックブルー（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  ＃５５８１０７）、ラット抗マウスＣＤ８−ＰｅｒＣｐ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  ＃５５３０３６）、ラット抗マウスＣＤ４４  ＦＩＴＣ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  ＃５５３１３３）、ラット抗マウスＣＤ２５−ＡＰＣ（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＃１７−０２５１）、ラット抗マウスＮｋ１．１（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＃９５−５９４１）で染色し、続いて固定／透過処理し、抗マウス／ラットＦｏｘＰ３染色セットＰＥ（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＃７２−５７７５）に従いＦｏｘＰ３染色した。細胞をＢｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ（登録商標）又はＢｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳ  ＬＳＲ  ＩＩで分析し、データをＦｌｏｗＪｏ（登録商標）ソフトウェアで分析した。
【０２３０】
図３Ａ〜図３Ｃは、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）（週５回）、ＩＬ２−Ｆｃ及びＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１（１回／週）をＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）等モル濃度（ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１及びＩＬ２−Ｆｃ  １００μｇ  約１ｎｍｏｌ  ＩＬ２当量）で投与した後のＢ６雌マウスにおけるＣＤ８  Ｔエフェクター細胞の優先的拡大を示す。これらのグラフのデータは、ＣＤ８  Ｔエフェクター細胞がＴｒｅｇの同様の増殖を伴うことなく増殖することを実証している。このデータは、ＣＤ８  Ｔエフェクター及びＴｒｅｇの両方を拡大したＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）と対照的である。ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１がＣＤ８  Ｔエフェクター細胞拡大の絶対数及びＣＤ８  Ｔエフェクター細胞：Ｔｒｅｇ比の両方の点でＩＬ２−Ｆｃ融合構築物より優れていたことに留意されたく、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１抗体サイトカイングラフト化タンパク質に構造的及び機能的基礎があることを実証している。図３Ｄ〜図３Ｆは、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１の有益な効果が高用量ほど一層明らかであることを示す。５００μｇ（５ｎｍｏｌ  ＩＬ２当量）のＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１をＢ６マウスに投与したとき、低用量と同様に、Ｔｒｅｇ細胞と比べたＣＤ８  Ｔエフェクター細胞の優先的拡大が見られた。しかしながら、ＩＬ２−Ｆｃ治療群では、より高レベルのときマウスは僅か単回の投与後に死亡しているのが見つかった（データは示さず）。このことから、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１がＩＬ２−Ｆｃ融合構築物よりも高い治療指数を有し、より幅広い投薬量範囲で安全に投与できることが指摘される。
【０２３１】
実施例４：ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１はＮＯＤマウスにおいてＣＤ８  Ｔエフェクター細胞を選択的に拡大し、且つＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）よりも良好に忍容される
非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスは１型糖尿病を自然発症し、ヒト１型糖尿病の動物モデルとして使用されることが多い。実施例３に記載されるＢ６マウスについての同じプロトコルを用いて、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１、ＩＬ２−Ｆｃ及びＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）をＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）等モル当量でＮＯＤマウスに投与した。この場合もやはり、図４Ａのグラフに示されるとおり、この用量のＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１の投与はＴｒｅｇと比べてＣＤ８  Ｔエフェクター細胞を優先的に拡大した。加えて、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１の投与はＮＯＤマウスにおいて有害事象を示さなかったが、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）治療群では５匹の瀕死マウス及び２匹の死亡があった。図４Ｂは、ＮＯＤマウスモデルからの投薬量、細胞変化倍数及び細胞型を報告するグラフである。
【０２３２】
実施例５：ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１はＣＴ２６結腸腫瘍マウスモデルにおいて単剤有効性を示す
ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１の安全性を調べた後、ＣＴ２６マウスモデルでその単剤有効性を試験した。マウスＣＴ２６細胞は、５００を超える既発表の研究で使用されている、急速に成長するグレードＩＶ結腸癌細胞であり、薬剤開発においてよく使用される細胞株及びモデルの１つである。ＣＴ２６（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２６３８）細胞を５％ＣＯ2の３７℃インキュベーターにおいて無菌条件で成長させた。細胞は、１０％ＦＢＳを補足したＲＰＭＩ  １６４０培地で培養した。細胞は３〜４日毎に継代した。注射当日、細胞を回収し（継代１１代目）、ＨＢＳＳ中に２．５×１０6／ｍｌの濃度で再懸濁した。細胞をマイコプラズマ及びマウスウイルスに関してＲａｄｉｌ試験した。Ｂａｌｂｃマウスを使用した。各マウスにつき０．２５×１０6細胞を２８ｇ針（１００μｌ注射容積）を使用して右側腹部に皮下注射で移植した。移植後、腫瘍が触知可能になったら、動物を週３回ノギスで測り、秤量した。ノギス測定値は（Ｌ×Ｗ×Ｗ）／２を用いて計算した。マウスには通常食を与え、実験動物の管理と使用に関する指針（Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ）及び動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の規定に従いＳＰＦ動物施設で飼育した。
【０２３３】
腫瘍が約１００ｍｍ3に達したとき、マウスに１２．５〜１００μｇのＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１を腹腔内経路によって投与した。腫瘍を週２回測定した。Ｐｒｉｓｍ  ５（ＧｒａｐｈＰａｄ（登録商標））ソフトウェアを使用して平均腫瘍容積をプロットした。腫瘍サイズが１０００ｍｍ3の容積に達したとき、有効性試験のエンドポイントが実現した。注射後、マウスはまた、臨床的増悪の徴候についても注意深くモニタした。マウスが何らかの理由で、呼吸窮迫、背弯姿勢、活動性低下、後肢完全麻痺、胸水の徴候としての頻呼吸、２０％又は１５％に近い体重減少＋他の徴候を含めた何らかの病的状態の徴候を示した場合、又は通常の活動（摂餌、移動）を行う能力が損なわれた場合、マウスは安楽死させた。
【０２３４】
２０日間試験で１７日間にわたるＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１の４回の投与としたとき、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１はＣＴ２６マウスモデルにおいて１２．５μｇ〜１００μｇの範囲の用量で効果的であった。図５に示される腫瘍容積曲線は、腫瘍容積が１５日間にわたり２００ｍｍ未満に保たれ、次に残りの５日間は４００ｍｍ未満に保たれたことに伴い、本試験におけるＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１の有効性を示すものである。
【０２３５】
実施例６：ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１及び追加的な癌療法薬はＢ１６マウスモデルにおいて有効性を示す
他の癌療法薬と併用したＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１の有効性を評価するため、Ｂ１６Ｆ１０メラノーママウスモデルを使用した。Ｂ１６Ｆ１０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−６４７５）を５％ＣＯ2の３７℃インキュベーターにおいて無菌条件で２週間成長させた。Ｂ１６Ｆ１０細胞はＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中で培養した。細胞を回収し、ＦＢＳ不含培地ＤＭＥＭに１×１０6／１００μｌの濃度で再懸濁した。Ｂ１６Ｆ１０細胞をマイコプラズマ及びマウスウイルスに関してＲａｄｉｌ試験した。２８ゲージ針（１００μｌ注射容積）を使用して細胞をＢ６マウスの右側腹部に移植した。移植後、腫瘍が触知可能になったらマウスを週２回ノギスで測り、秤量した。ノギス測定値は（Ｌ×Ｗ×Ｗ）／２を用いて計算した。
【０２３６】
この試験では、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１を単剤として、又はＢ１６Ｆ１０細胞に発現する抗原であるＴｒｐ１に結合するＴＡ９９抗体との併用で使用した。ＩＬ２−Ｆｃ融合物を単剤として、又はＴＡ９９抗体との併用で投与した。対照として、ＴＡ９９抗体を単剤として投与した。
【０２３７】
意外にも、このモデルでは、５００μｇ用量の単剤として投与したときのＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１が最も効果的な治療であった（図６）。次に良い治療は、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１（１００μｇ）とＴＡ９９との併用であった。この併用は、１００μｇの単剤としてのＩｇＧ．ＩＬ２Ｆ７１Ａ．Ｈ１、５００μｇのＩｇＧ．ＩＬ２Ｆ７１Ａ．Ｈ１と併用したＴＡ９９、及び単剤としての、又はＩＬ２−Ｆｃ／ＴＡ９９併用としてのＩＬ２−Ｆｃよりも効果的であった。ＴＡ９９を単剤として投与したとき効果はなく、平均腫瘍容積は未治療の対照と同程度であった。このデータは、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１がメラノーママウス腫瘍モデルにおいて単剤として効果的であるが、それがまた、別の抗癌剤と組み合わせたときも効果的であることを実証している。
【０２３８】
実施例７：ヒト細胞におけるＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１及びＩｇＧ．ＩＬ２Ｆ７１Ａ．Ｈ１の活性
ヒトＣＤ８  Ｔエフェクターに対するＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１の活性を試験するため、ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）をｐＳＴＡＴ５活性に関してアッセイした。ＰＢＭＣ細胞を無血清試験培地中に静置し、プレーティングした。ＰＢＭＣにＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｆ７１Ａ．Ｈ１又はＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）を加え、３７℃で２０分間インキュベートした。２０分後、細胞を１．６％ホルムアルデヒドで固定し、洗浄し、表面マーカーで染色した。室温で３０分後、試料を洗浄し、再懸濁した細胞ペレットを−２０℃メタノールで透過処理し、洗浄し、ｐＳＴＡＴ５及びＤＮＡインターカレーターに関して染色した。細胞をＣｙｔｏｆ（登録商標）にかけ、データをＦｌｏｗＪｏ（登録商標）ソフトウェアで分析することによりｐＳＴＡＴ５活性レベルを定量化した。図７の表は、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１がＣＤ８  Ｔエフェクター細胞に対して有する、且つＴｒｅｇ細胞の活性化を最小限に抑える優先的活性化を実証する。
【０２３９】
実施例８：抗体サイトカイングラフト化タンパク質の結合
ムテインを含むＩＬ２配列（配列番号４）を免疫グロブリン鎖足場のＣＤＲループに挿入した。抗体サイトカイングラフト化タンパク質は、臨床セッティングで利用されている種々の既知の免疫グロブリン配列並びに生殖細胞系列抗体配列を使用して調製した。使用した抗体のうちの１つはその抗原としてＲＳＶを有する。ＩＬ２をこの抗体のＣＤＲにグラフト化するとＲＳＶへの結合が低下又は消失したかどうかを決定するため、ＰＢＳ又は炭酸塩緩衝液のいずれかにおいてＲＳＶタンパク質に関するＥＬＩＳＡアッセイを行った。図８に示すとおり、これはＩＬ２グラフト化にどのＣＤＲを選択したかに影響を受けるように見える。例えば、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１は、元の非グラフト化（非修飾）抗体と同様のＲＳＶ結合を有する。対照的に、ＩＬ２をＣＤＲ３の軽鎖（ＣＤＲ−Ｌ３）又はＣＤＲ−Ｈ３にグラフト化すると、結合が低下する。予想どおり、ＩＬ２を無関係の抗体（Ｘｏｌａｉｒ）にグラフト化すると、結合は生じない。これは、抗体サイトカイングラフト化タンパク質が抗体足場の元の標的に対する結合を保持し得ること、又はこの結合が低下し得ることを実証している。
【０２４０】
本明細書に記載される例及び実施形態は例示を目的とし、それらを踏まえた様々な修正又は変更が当業者に提案され得るとともに本願の趣旨及び範囲並びに添付の特許請求の範囲に包含されるべきであることが理解される。本明細書に引用される刊行物、配列受託番号、特許、及び特許出願は全て、本明細書によってあらゆる目的から全体として参照により援用される。
【図１】
2020520665.tif 000013
【図２】
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【図３Ａ】
2020520665.tif 000015
【図３Ｂ】
2020520665.tif 000016
【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
2020520665.tif 000019
【図３Ｆ】
2020520665.tif 000020
【図４Ａ】
2020520665.tif 000021
【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
2020520665.tif 000024
【図７】
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【図８】
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【配列表】
2020520665000001.app
【国際調査報告】
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