(57)【要約】  本発明は、それらのネイティブ抗原特性を保持する安定化された空ポリオウイルスのカプシドを含むポリオウイルス様粒子を提供する。本発明は、このようなポリオウイルス様粒子の産生において有用な変異を特定する方法、このようなポリオウイルス様粒子を産生する方法及びポリオウイルスに対してワクチン接種をする方法におけるこのようなポリオウイルス様粒子の使用も提供する。
2020513840.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリオウイルス粒子から誘導されるポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）であって、前記ポリオウイルス粒子に対して、少なくとも１つの改変を含み、前記少なくとも１つの改変が前記ＶＬＰを安定化する、前記ポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項２】
少なくとも１つの改変が、表１、２又は３に定義される改変である、請求項１に記載のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項３】
（ａ）プロトマー界面；及び（ｂ）ペンタマー界面のそれぞれに少なくとも１つの改変が存在し、前記プロトマー界面及びペンタマー界面のそれぞれにおける前記少なくとも１つの改変が、表１、２又は３に定義される改変である、請求項１又は２に記載のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項４】
野生型ポリオウイルス又はワクチン株から誘導される、請求項１〜３のいずれかに記載のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項５】
１型、２型又は３型ポリオウイルスから誘導される、請求項１〜４のいずれかに記載のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項６】
（ａ）Ｍａｈｏｎｅｙ及びＳａｂｉｎ  １から選択される１型ポリオウイルス；
（ｂ）ＭＥＦ及びＳａｂｉｎ  ２から選択される２型ポリオウイルス；又は
（ｃ）Ｓａｕｋｅｔｔ及びＳａｂｉｎ  ３から選択される３型ポリオウイルス
から誘導される、請求項５に記載のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項７】
ＶＬＰが誘導されるポリオウイルス粒子に対して、前記ＶＬＰを安定化する少なくとも３つの改変を含み、
（ａ）プロトマー界面；及び
（ｂ）ペンタマー界面
のそれぞれに、少なくとも１つの改変が存在する、請求項１〜６のいずれかに記載のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項８】
ＶＬＰが誘導されるポリオウイルス粒子に対して、ポケットドメインに、少なくとも１つの改変をさらに含む、請求項１〜７のいずれかに記載のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項９】
ポケットドメインの改変が、表１、２又は３に定義されている通りである、請求項８に記載のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項１０】
ポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）が１型ポリオウイルスから誘導され、
（ａ）プロトマー界面が、残基３１７８と１２４８若しくはそれらに対応する残基のうちの一方若しくは両方に変異を含み；及び／又は
（ｂ）ペンタマー界面が、残基２０２５と２０５７若しくはそれらに対応する残基のうちの一方若しくは両方に変異を含み；
前記ＶＬＰが、ポケットドメインに改変を含んでもよく、前記改変が、好ましくは、残基１１９６又はそれに対応する残基における変異である、請求項１〜９のいずれかに記載のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項１１】
（ａ）プロトマー界面が、変異Ｑ３１７８ＬとＨ１２４８Ｐのうちの一方若しくは両方を含み；及び／又は
（ｂ）ペンタマー界面が、変異Ｔ２０２５ＡとＤ２０５７Ｅのうちの一方若しくは両方を含み；
前記ＶＬＰが、ポケットドメインに改変を含んでもよく、前記改変が、好ましくは、変異Ｖ１１９６Ｌである、
請求項１０に記載のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項１２】
プロトマー界面の残基３１７８と１２４８又はそれらに対応する残基において両方の変異、及びペンタマー界面の残基２０２５と２０５７又はそれらに対応する残基において両方の変異を含み、かつポケットドメインの残基１１９６又はそれに対応する残基において変異を含んでもよい、請求項１０又は１１に記載のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項１３】
ポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）が２型ポリオウイルスから誘導され、
（ａ）プロトマー界面が、残基３１７８と１１０７若しくはそれらに対応する残基のうちの一方若しくは両方において変異を含み；並びに／又は
（ｂ）ペンタマー界面が、残基３０８５、１０４１及び／若しくは２０５７又はそれに対応する残基のうちの１若しくは２以上において変異を含み；
前記ＶＬＰが、ポケットドメインに改変を含んでもよく、前記改変が、好ましくは、残基１１３４、１１５９及び１１８３若しくはそれらに対応する残基のうちの１若しくは２以上における変異である、請求項１〜９のいずれかに記載のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項１４】
（ａ）プロトマー界面が、変異Ｑ３１７８ＬとＶ１１０７Ｉのうちの一方若しくは両方を含み；並びに／又は
（ｂ）ペンタマー界面が、変異Ｌ３０８５Ｆ、Ｔ１０４１Ｉ及び／又はＤ２０５７Ａのうちの１若しくは２以上を含み；
前記ＶＬＰが、ポケットドメインに改変を含んでもよく、及び前記改変は、好ましくは、変異Ｆ１１３４Ｌ、Ｙ１１５９Ｆ及びＶ１１８３Ｌのうちの１若しくは２以上である、請求項１３に記載のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項１５】
（ａ）プロトマー界面の残基３１７８若しくはそれに対応する残基において変異、及びペンタマー界面の両残基３０８５及び１０４１若しくはそれらに対応する残基において変異を含み、かつポケットドメインの両残基１１３４及び１１５９若しくはそれらに対応する残基において変異を含んでもよく；又は
（ｂ）前記プロトマー界面の残基３１７８及び１１０７若しくはそれらに対応する残基において両方の変異、及び前記ペンタマー界面の残基２０５７若しくはそれに対応する残基において変異を含み、かつポケットドメインの両残基１１３４及び１１８３若しくはそれらに対応する残基において変異を含んでもよい、請求項１３又は１４に記載のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項１６】
ポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）が３型ポリオウイルスから誘導され、
（ａ）プロトマー界面が、残基２２１５と３０９１若しくはそれらに対応する残基のうちの一方若しくは両方において変異を含み；及び／又は
（ｂ）ペンタマー界面が、残基２０１８と３０８５若しくはそれらに対応する残基のうちの一方若しくは両方において変異を含み；
前記ＶＬＰが、ポケットドメインに改変を含んでもよく、前記改変が、好ましくは、残基１１３２（ＶＰ１  １３２）又はそれに対応する残基における変異である、請求項１〜９のいずれかに記載のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項１７】
（ａ）プロトマー界面が、変異Ｌ２２１５ＭとＦ３０９１Ｓのうちの一方若しくは両方を含み；及び／又は
（ｂ）ペンタマー界面が、変異Ｌ２０１８ＩとＬ３０８５Ｆのうちの一方若しくは両方を含み；
前記ＶＬＰが、ポケットドメインに改変を含んでもよく、前記改変が、好ましくは、変異Ｆ１１３２Ｌである、請求項１６に記載のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項１８】
プロトマー界面の残基２２１５及び３０９１若しくはそれらに対応する残基において両方の変異、及びペンタマー界面の残基２０１８及び３０８５若しくはそれらに対応する残基において両方の変異を含み、かつポケットドメインの残基１１３２、若しくはそれに対応する残基において変異を含んでもよい、請求項１６又は１７に記載のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項１９】
ポケットドメイン、プロトマー界面及び／又はペンタマー界面のうちの１又は２以上に、１又は２以上の追加の改変を含み、前記１又は２以上の追加の改変が、表１、２又は３に定義されている通りの改変であってもよい、請求項１〜１８のいずれかに記載のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項２０】
１又は２以上の追加の構造ドメインに、少なくとも１つのさらなる改変を含み、前記１又は２以上の追加の改変が、表１、２又は３に定義されている通りの改変であってもよい、請求項１〜１９のいずれかに記載のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項２１】
１又は２以上の追加の構造ドメインが、
（ａ）ＶＰ２／ＶＰ３界面；
（ｂ）内部ネットワーク；及び／又は
（ｃ）キャニオン
から選択される、請求項２０に記載のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項２２】
内部ネットワークが、三回軸、五回軸、及び／又は五回軸下の管を含み、前記少なくとも１つのさらなる改変が、前記三回軸、五回軸、若しくは五回軸下の管に又はそれと近接して位置する、請求項２１に記載のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項２３】
ポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）が１型ポリオウイルスから誘導され、
（ａ）ＶＰ２／ＶＰ３界面が、残基３１１９若しくはそれに対応する残基において変異を含み；及び／又は
（ｂ）内部ネットワークが、残基４０１８若しくはそれに対応する残基において変異を含む、
請求項２０〜２２のいずれかに記載のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項２４】
（ａ）ＶＰ２／ＶＰ３界面が、変異Ｌ３３１９Ｍを含み；及び／又は
（ｂ）内部ネットワークが、変異Ｒ４０１８Ｇを含む、
請求項２３に記載のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項２５】
ポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）が２型ポリオウイルスから誘導され、内部ネットワークが、残基４０５７又はそれに対応する残基において変異を含む、請求項２０〜２２のいずれかに記載のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項２６】
内部ネットワークが、変異Ｉ４０５７Ｖを含む、請求項２５に記載のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項２７】
ポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）が３型ポリオウイルスから誘導され、
（ａ）ＶＰ２／ＶＰ３界面が、残基２２４１若しくはそれに対応する残基において変異を含み；
（ｂ）内部ネットワークが、残基１０５４、４０６７及び３０１９若しくはそれらに対応する残基のうちの１若しくは２以上において変異を含み；並びに／又は
（ｃ）キャニオンが、残基１１０５若しくはそれに対応する残基において変異を含む、
請求項２０〜２２のいずれかに記載のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項２８】
（ａ）ＶＰ２／ＶＰ３界面が、変異Ｄ２２４１Ｅを含み；
（ｂ）内部ネットワークが、ＶＰ１  ５４アラニンのバリンへの変異、変異Ｔ４０６７Ａ及びＨ３０１９Ｙのうちの１若しくは２以上を含み；並びに／又は
（ｃ）キャニオンが、変異Ｔ１１０５Ｍを含む、
請求項２７に記載のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項２９】
ＶＰ２／ＶＰ３界面、内部ネットワーク及び／又はキャニオンのうちの１又は２以上に１又は２以上の追加の改変を含み、前記１又は２以上の追加の改変が、表１、２、又は３に定義されている通りの改変であってもよい、請求項１７〜２８のいずれかに記載のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項３０】
（ａ）１型ポリオウイルスから誘導され、（ｉ）プロトマー界面に変異Ｑ３１７８Ｌ及びＨ１２４８Ｐ、（ii）ペンタマー界面に変異Ｔ２０２５Ａ及びＤ２０５７Ｅ、（iii）ＶＰ２／ＶＰ３界面に変異Ｌ３１１９Ｍ、並びに（iv）内部ネットワークに変異Ｒ４０１８Ｇを含み、前記ＶＬＰが、ポケットドメインに変異Ｖ１１９６Ｌをさらに含んでもよいか；
（ｂ）２型ポリオウイルスから誘導され、（ｉ）前記ポケットドメインに変異Ｆ１１３４Ｌ及びＹ１１５９Ｆ、（ii）前記プロトマー界面に変異Ｑ３１７８Ｌ、並びに（iii）前記ペンタマー界面に変異Ｌ３０８５Ｆ及びＴ１０４１Ｉを含むか；又は
（ｃ）２型ポリオウイルスから誘導され、（ｉ）前記ポケットドメインに変異Ｆ１１３４Ｌ及びＶ１１８３Ｌ、（ii）前記プロトマー界面に変異Ｑ３１７８Ｌ及びＶ１１０７Ｉ、（iii）前記ペンタマー界面に変異Ｄ２０５７Ａ；並びに（iv）内部ネットワークに変異Ｉ４０５Ｖを含むか、又は
（ｄ）３型ポリオウイルスから誘導され、（ｉ）前記ポケットドメインに変異Ｆ１１３２Ｌ、（ii）前記プロトマー界面に変異Ｌ２２１５Ｍ及びＦ３０９１Ｓ、（iii）前記ペンタマー界面に変異Ｌ２０１８Ｉ及びＬ３０８５Ｆ、（iv）前記ＶＰ２／ＶＰ３界面に変異Ｄ２２４１Ｅを含み、（ｖ）前記内部ネットワークに変異Ｔ４０６７Ａ、Ｈ３０１９Ｙ、及び任意で変異Ａ１０５４Ｖを含み、並びに（vi）キャニオンに変異Ｔ１１０５Ｍを含む、請求項１〜２９のいずれかに記載のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項３１】
（ａ）（ｉ）配列番号１６若しくは１７のアミノ酸配列を有するＰ１；（ii）配列番号１のアミノ酸配列を有するＶＰ１、配列番号５のアミノ酸配列を有するＶＰ０、及び配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＰ３、（iii）配列番号１のアミノ酸配列を有するＶＰ１、配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＰ２、及び配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＰ３及び配列番号４のアミノ酸配列を有するＶＰ４；並びに／又は（iv）Ｐ１；ＶＰ１、ＶＰ０及びＶＰ３；若しくは（ｉ）〜（iii）のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３及びＶＰ４を有する１型ポリオウイルスから誘導される１型ＶＬＰ；
（ｂ）（ｉ）配列番号１８若しくは１９のアミノ酸配列を有するＰ１；（ii）配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＰ１、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＶＰ０、及び配列番号８のアミノ酸配列を有するＶＰ３、（iii）配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＰ１、配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＰ２、及び配列番号８のアミノ酸配列を有するＶＰ３及び配列番号９のアミノ酸配列を有するＶＰ４；並びに／又は（iv）Ｐ１；ＶＰ１、ＶＰ０及びＶＰ３；若しくは（ｉ）〜（iii）のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３及びＶＰ４を有する２型ポリオウイルスから誘導される２型ＶＬＰ；又は
（ｃ）（ｉ）配列番号２０若しくは２１のアミノ酸配列を有するＰ１；（ii）配列番号１１のアミノ酸配列を有するＶＰ１、配列番号１５のアミノ酸配列を有するＶＰ０、及び配列番号１３のアミノ酸配列を有するＶＰ３、（iii）配列番号１１のアミノ酸配列を有するＶＰ１、配列番号１２のアミノ酸配列を有するＶＰ２、及び配列番号１３のアミノ酸配列を有するＶＰ３及び配列番号１４のアミノ酸配列を有するＶＰ４；並びに／又は（iv）Ｐ１；ＶＰ１、ＶＰ０及びＶＰ３；若しくは（ｉ）〜（iii）のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３及びＶＰ４を有する３型ポリオウイルスから誘導される３型ＶＬＰである、請求項１〜３０のいずれかに記載のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項３２】
ポリオウイルスのカプシドの安定性を増加させる前記ポリオウイルスのカプシド内の改変を特定する方法であって、
（ａ）不安定化する変異をポリオウイルス株の前記カプシドへと導入するステップと；
（ｂ）半許容温度で、前記ポリオウイルス株を増殖させるステップと；
（ｃ）得られたポリオウイルスをスクリーニングして、前記不安定化する変異の作用を逆転させる１又は２以上の改変を特定するステップと
を含む、前記方法。
【請求項３３】
半許容温度が、約３８℃〜約４０℃の範囲内の温度である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ステップ（ｃ）で特定された１又は２以上の改変を野生型ポリオウイルスへと導入するステップと、前記１又は２以上の改変がポリオウイルスのカプシドの安定性を増加させることを確認するステップとをさらに含む、請求項３２又は３３に記載の方法。
【請求項３５】
ポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）を産生する方法であって、
（ａ）前記ＶＬＰをコードする感染性ＲＮＡ転写物を宿主哺乳動物細胞へと導入するステップ；又は
（ｂ）請求項２７〜２９のいずれかに記載の方法によって特定された１又は２以上の改変を含むポリオウイルスのカプシド由来ポリペプチドを組換えにより産生するステップ、及び前記ポリペプチドをアセンブルしてＶＬＰを形成するステップ
を含む、前記方法。
【請求項３６】
請求項３５に記載の方法によって得ることができるポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項３７】
請求項１〜２６のいずれかで定義されている通りのＶＬＰである、請求項３６に記載のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項３８】
請求項１〜３１、３６又は３７のいずれかに記載のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）と薬学的に許容される賦形剤又は希釈剤とを含む組成物。
【請求項３９】
請求項１〜３１、３６又は３７のいずれかで定義されている通りのポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）をコードするポリヌクレオチド分子。
【請求項４０】
プロモーターに作動可能に連結する、請求項３９で定義されている通りのポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項４１】
（ｉ）請求項１〜３１、３６又は３７のいずれかに記載のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）；又は
（ii）請求項１〜３１、３６又は３７のいずれかに記載のＶＬＰをコードする核酸；
及びアジュバント
を含むワクチン。
【請求項４２】
請求項３９に記載のポリヌクレオチド又は請求項４０に記載の発現ベクターを含む核酸ベクターである、請求項４１に記載のワクチン。
【請求項４３】
ポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）をコードし、Ｐ１前駆体の切断のためのウイルスのプロテアーゼをさらにコードするＰ１  ＲＮＡを含むＲＮＡワクチンである、請求項４１又は４２に記載のワクチン。
【請求項４４】
ポリオウイルスに対してワクチン接種をする方法において使用するための、請求項１〜３１、３６又は３７のいずれかに記載のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）、請求項３８に記載の組成物又は請求項４１〜４３のいずれかに記載のワクチン。
【請求項４５】
ポリオウイルスに対してワクチン接種をする方法において使用するための医薬の製造における、請求項１〜３１、３６若しくは３７のいずれかに記載のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）、又は請求項３８に記載の組成物の使用。
【請求項４６】
ポリオウイルスに対して対象にワクチン接種をする方法であって、有効量の、請求項１〜３１、３６又は３７のいずれかに記載のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）、請求項３８に記載の組成物又は請求項４１〜４３のいずれかに記載のワクチンを、それを必要とする対象に投与するステップを含む方法。
【請求項４７】
請求項１〜３１、３６又は３７のいずれかで定義されている通りのポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）を産生する細胞。
【請求項４８】
請求項３９で定義されている通りのポリヌクレオチド、又は請求項４０で定義されている通りの発現ベクターを含む、請求項４７に記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、ポリオワクチンに関する。詳細には、本発明は、ポリオウイルス様粒子、このようなポリオウイルス様粒子の産生において有用な改変を特定する方法、このようなポリオウイルス様粒子を産生する方法及びポリオウイルスに対してワクチン接種をする方法におけるこのようなポリオウイルス様粒子の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
世界保健機関（ＷＨＯ，World Health Organisation）の世界ポリオ根絶イニシアティブ（global polio eradication initiative）は、大きな進歩を遂げてきた。この根絶イニシアティブにおいて使用される主要なツールは、弱毒化経口生ポリオワクチンである。このイニシアティブの結果として、天然に存在する野生の２型ポリオウイルスは、１９９９年以来、３型は、２０１２年以来、世界的に見られなくなり、内在的な１型ウイルスが依然として流行している国はアフガニスタンとパキスタンだけである。
【０００３】
しかし、主として、弱毒化生ワクチンの性質の結果として、この状況は複雑である。特に、弱毒化生ワクチンは、低い割合の受容者又はその接触者において、ワクチンに関連した灰白髄炎を引き起こすことが長年にわたって知られており、より最近では、感染性の表現型に復帰し得ることが知られており、これは、ポリオが消滅したためにワクチン計画があまり活発に行われなくなっている世界のいくつかの地域で大流行を引き起こす。一部の免疫不全患者によるワクチン由来のポリオウイルスの、より長期にわたる排出についても詳細に報告されている。したがって、経口ポリオワクチンの使用とその表現型を変更する能力は、世界的に、ポリオの根絶における問題点である。
【０００４】
一部の地域では監視不足のために野生型ウイルスが検出されずに循環していることもあるため、最後の野生型ウイルスが単離されたと考えられた直後にワクチン接種を停止することは極めて愚かなこととなる。また、免疫不全の個体は、ワクチン接種後、非常に長い時間をかけてウイルスの排出を継続することもあり、再発生の供給源となり得る。さらに、経口ワクチンの使用の最終回から、それによって引き起こされる大流行が依然として存在する場合がある。
【０００５】
したがって、ワクチン接種及び監視は、野生型ウイルスの根絶が宣言された後しばらくの間継続しなければならない。ポリオが、根絶されたら再出現しないことを保証するためのプロセスが導入されており、これらは、生ウイルスに関する作業及び起こり得る再出現から守るために、適用範囲が維持されることを保証するのに必要なワクチン産生の封じ込めを包含する。これらの問題点は、２０１６年代半ばから経口ポリオワクチン（ＯＰＶ）由来の２型構成成分を撤回し、不活性化ポリオワクチン（ＩＰＶ）による単回免疫化を導入するＷＨＯの決定によって注目されてきた。
【０００６】
現在使用されているすべてのワクチンは、ウイルスの増殖に依存し、非複製的ワクチン（すなわち、ＩＰＶ）のほとんどは、灰白髄炎を引き起こすことが知られている野生型ウイルスを伴う。より詳細には、ＩＰＶ産生は、多量の生ポリオウイルスの増殖を伴い、次いで、ホルマリンにより不活性化される。現在使用されているポリオウイルス株は、主に、ヒトにおいて灰白髄炎を引き起こす可能性のあることが知られている野生型であるが、２つの会社が、現在の経口ポリオワクチンにおいて使用される弱毒化生Ｓａｂｉｎ株に基づく許諾製品を有している。ＩＰＶの安全な産生が必須であり、従来の研究は、現在使用されている弱毒化生株よりも本質的により安全である生存可能な産生株を考案することに焦点を当てている。
【０００７】
Ｓａｌｋワクチンは、生体外のベロ細胞内で増殖させる、３つの野生の、毒性野生型株のポリオウイルス、すなわち、Ｍａｈｏｎｅｙ（１型ポリオウイルス）、ＭＥＦ−１（２型ポリオウイルス）、及びＳａｕｋｅｔｔ（３型ポリオウイルス）株をベースとする（Wood et al, Biologicals 25:59-64, 1997）。次いで、野生型ポリオウイルスは、ホルマリンにより不活性化され、ＩＰＶを産生する。ＩＰＶ産生において現在使用されている野生型株は、ヒトにおいて麻痺性であることが知られており、ＩＰＶ産生において多量に使用される。このことは、ＩＰＶに必要とされる産生規模についての妥協が容易でない可能性のある、重大な封じ込めの問題点を呈する。経口ワクチンにおいて使用されているのと同じ株を、不活性化ワクチンの製造において使用することに、いくらかの興味が示されてきた。それらが弱毒化されておりし、したがって、逃げ出した場合もそれほど危険性はないことが理由である。しかし、ヒトにおける複製に関するそれらの不安定性は、それらが危険なままであり、それらの免疫原性特性が、現在使用されている野生型株のものと異なり、その結果、これらの株をベースとするＩＰＶを開発するために、重要な臨床開発プログラムが必要とされることを意味する。
【０００８】
本質的に経験的な手順を使用して１９５０年代にSabinによって開発された弱毒化生ポリオウイルスワクチンは、経口生ポリオワクチンとして世界中で使用されてきた。過去数年にわたり、科学者達は、これらのワクチン株の神経毒性が低減される機序を明らかにする試みにおいていくつかの分子生物学的技術を用いてきた。この研究の大部分は、血清型１及び３に集中している。これらの両方について、ワクチン株の完全なヌクレオチド配列が、神経毒性のあるそれらの原種のものと比較されている。１型ポリオウイルスの場合には、ワクチン株は、７４４１塩基のゲノム内の４７位でその原種と異なっている（Nomoto et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:5793-5797, 1982）。３型ポリオウイルス関する類似した試験により、ワクチンとその原種株との間で７４３２塩基のゲノム内にちょうど１０個のヌクレオチド配列の相違が明らかにされている（Stanway et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1539-1543, 1984）。２型株は、天然に弱毒化した親から開発されたが、ワクチンに関連した灰白髄炎の症例から単離された、神経毒性復帰株の解析により、Ｓａｂｉｎ  ２との１７個の相違が特定された（Pollard et al., J. Virol. 63: 4949-4951, 1989）。しかし、上記に記載されるように、悪性感染性形態への復帰のリスクなどの、弱毒化生ウイルスの使用に関連した課題が存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Wood et al, Biologicals 25:59-64, 1997
【非特許文献２】Nomoto et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:5793-5797, 1982
【非特許文献３】Stanway et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1539-1543, 1984
【非特許文献４】Pollard et al., J. Virol. 63: 4949-4951, 1989
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、産生工程のいかなる段階でも感染性ポリオウイルスを伴わないワクチンを開発することは、非常に望ましいであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
ウイルス増殖に対する必要性への可能な解決策は、組換え技術によって空ウイルスのカプシドを作製することであろう。しかし、今のところ、このような粒子は、使用できない程不安定である。本発明者らは、カプシドの安定性を調節するポリオウイルスのカプシド内の改変、特にポリオウイルスのカプシドを安定化する改変の特定を可能にする方法を開発した。このような改変は、典型的には、カプシドのアミノ酸配列における変異である。この方法を使用して、本発明者らは、ポリオウイルスのカプシドを遺伝子操作して、全部で３つの血清型に対するポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）としても知られる、安定な空カプシドを産生した。本発明者らは、前記ＶＬＰが極めて安定であり、動物モデルにおいて、高レベルの防御抗体を生じることを実証した。したがって、これらのＶＬＰは、安全性と産生物の特性の両方の点で、現在のＯＰＶ及びＩＰＶと比較して、多数の利点をもたらす。
【００１２】
したがって、本発明は、ＶＬＰが派生するポリオウイルス粒子に対して、少なくとも１つの改変を含むポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ：poliovirus-like particle）であって、前記少なくとも１つの改変が、ＶＬＰを安定化させる、ポリオウイルス様粒子を提供する。前記少なくとも１つの改変は、表１、２又は３に定義される改変であってよい。典型的には、（ａ）プロトマー界面、及び（ｂ）ペンタマー界面のそれぞれにおいて少なくとも１つの改変が存在し、プロトマー界面とペンタマー界面のそれぞれにおいて、前記少なくとも１つの改変が、表１、２又は３に定義される改変である。本発明のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、野生型ポリオウイルスからか、又はワクチン株から誘導されてもよく、１型、２型又は３型ポリオウイルスから誘導されてもよい。本発明のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、（ａ）Ｍａｈｏｎｅｙ及びＳａｂｉｎ  １から選択される１型ポリオウイルス；（ｂ）ＭＥＦ及びＳａｂｉｎ  ２から選択される２型ポリオウイルス；又は（ｃ）Ｓａｕｋｅｔｔ及びＳａｂｉｎ  ３から選択される３型ポリオウイルスから誘導されてもよい。
【００１３】
好ましい実施形態では、本発明は、ＶＬＰを安定化させるＶＬＰが誘導されるポリオウイルス粒子に対して、少なくとも３つの改変を含み、（ａ）プロトマー界面；及び（ｂ）ペンタマー界面のそれぞれに少なくとも１つの改変が存在する、ポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）を提供する。
【００１４】
本発明のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、ＶＬＰが誘導されるポリオウイルス粒子に対して、ポケットドメインに少なくとも１つの改変をさらに含んでもよく、前記改変は、表１、２又は３に定義されるものであってもよい。
【００１５】
本発明のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、１型ポリオウイルスから誘導されてもよく、（ａ）プロトマー界面は、残基３１７８と１２４８若しくはそれに対応する残基のうちの一方若しくは両方に変異を含み；及び／又は（ｂ）ペンタマー界面は、残基２０２５と２０５７若しくはそれに対応する残基のうちの一方若しくは両方に変異を含み；前記ＶＬＰは、ポケットドメインに改変を含んでもよく、前記改変は、好ましくは、残基１１９６又はそれに対応する残基における変異である。一部の実施形態では、（ａ）プロトマー界面は、変異Ｑ３１７８ＬとＨ１２４８Ｐのうちの一方若しくは両方を含み；及び／又は（ｂ）ペンタマー界面は、変異Ｔ２０２５ＡとＤ２０５７Ｅのうちの一方若しくは両方を含み；前記ＶＬＰは、ポケットドメインに改変を含んでもよく、前記改変は、好ましくは、変異Ｖ１１９６Ｌである。ポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、プロトマー界面の残基３１７８と１２４８又はそれに対応する残基において両方の変異、ペンタマー界面の残基２０２５と２０５７又はそれに対応する残基において両方の変異、及びポケットドメインの残基１１９６又はそれに対応する残基において変異を含んでもよい。
【００１６】
本発明のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）は２型ポリオウイルスから誘導されてもよく、（ａ）プロトマー界面は、残基３１７８と１１０７若しくはそれに対応する残基のうちの一方若しくは両方において変異を含み；並びに／又は（ｂ）ペンタマー界面は、残基３０８５、１０４１及び２０５７若しくはそれに対応する残基のうちの１若しくは２以上において変異を含み；前記ＶＬＰは、ポケットドメインに改変を含んでもよく、前記改変は、好ましくは、残基１１３４、１１５９及び１１８３若しくはそれに対応する残基のうちの１若しくは２以上における変異である。一部の実施形態では、（ａ）プロトマー界面は、変異Ｑ３１７８ＬとＶ１１０７Ｉのうちの一方若しくは両方を含み；並びに／又は（ｂ）ペンタマー界面は、変異Ｌ３０８５Ｆ、Ｔ１０４１Ｉ及びＤ２０５７Ａのうちの１若しくは２以上を含み；前記ＶＬＰは、ポケットドメインに改変を含んでもよく、前記改変は、好ましくは、変異Ｆ１１３４Ｌ、Ｙ１１５９Ｆ及びＶ１１８３Ｌのうちの１若しくは２以上である。ポリオウイルス様粒子は、（ａ）プロトマー界面の残基３１７８若しくはそれに対応する残基において変異、ペンタマー界面の両残基３０８５及び１０４１若しくはそれに対応する残基において変異並びにポケットドメインの両残基１１３４及び１１５９若しくはそれに対応する残基において変異；又は（ｂ）プロトマー界面の残基３１７８及び１１０７若しくはそれに対応する残基において両方の変異、ペンタマー界面の残基２０５７若しくはそれに対応する残基において変異、並びにポケットドメインの両残基１１３４及び１１８３若しくはそれに対応する残基において変異を含んでもよい。
【００１７】
本発明のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、３型ポリオウイルスから誘導されてもよく、（ａ）プロトマー界面は、残基２２１５と３０９１若しくはそれに対応する残基のうちの一方若しくは両方において変異を含み；及び／又は（ｂ）ペンタマー界面は、残基２０１８と３０８５若しくはそれに対応する残基のうちの一方若しくは両方において変異を含み；前記ＶＬＰは、ポケットドメインに改変を含んでもよく、前記改変は、好ましくは、残基１１３２（ＶＰ１  １３２）又はそれに対応する残基における変異である。一部の実施形態では、（ａ）プロトマー界面は、変異Ｌ２２１５ＭとＦ３０９１Ｓのうちの一方若しくは両方を含み；及び／又は（ｂ）ペンタマー界面は、変異Ｌ２０１８ＩとＬ３０８５Ｆのうちの一方若しくは両方を含み；前記ＶＬＰは、ポケットドメインに改変を含んでもよく、前記改変は、好ましくは、変異Ｆ１１３２Ｌである。ポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、プロトマー界面の残基２２１５及び３０９１若しくはそれに対応する残基において両方の変異、ペンタマー界面の残基２０１８及び３０８５若しくはそれに対応する残基において両方の変異、並びにポケットドメインの残基１１３２、若しくはそれに対応する残基において変異を含んでもよい。
【００１８】
本発明のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、ポケットドメイン、プロトマー界面及び／又はペンタマー界面のうちの１又は２以上内に、１又は２以上の追加の改変をさらに含んでもよく、前記１又は２以上の追加の改変は、表１、２又は３に定義される改変であってもよい。
【００１９】
本発明のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、１又は２以上の追加の構造ドメインに、少なくとも１つのさらなる改変をさらに含んでもよく、前記１又は２以上の追加の改変は、表１、２又は３に定義される改変であってもよい。前記１又は２以上の追加の構造ドメインは、（ａ）ＶＰ２／ＶＰ３界面；（ｂ）内部ネットワーク；及び／又は（ｃ）キャニオンから選択されてもよい。内部ネットワークは、三回軸、五回軸、及び／又は五回軸下の管を含んでもよく、前記少なくとも１つのさらなる改変は、前記三回軸、五回軸、又は五回軸下の管に又はそれと近接して位置する。
【００２０】
本発明のＶＬＰは、１型ポリオウイルスから誘導されてもよく、（ａ）ＶＰ２／ＶＰ３界面は、残基３１１９若しくはそれに対応する残基において変異を含み；及び／又は内部ネットワークは、残基４０１８若しくはそれに対応する残基において変異を含む。一部の実施形態では、（ａ）ＶＰ２／ＶＰ３界面は、変異Ｌ３３１９Ｍを含み；及び／又は（ｂ）内部ネットワークは、変異Ｒ４０１８Ｇを含む。本発明のＶＬＰは、２型ポリオウイルスから誘導されてもよく、内部ネットワークは、残基４０５７又はそれに対応する残基において変異を含む。一部の実施形態では、内部ネットワークは、変異Ｉ４０５７Ｖを含む。ポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、３型ポリオウイルスから誘導されてもよく、（ａ）ＶＰ２／ＶＰ３界面は、残基２２４１若しくはそれに対応する残基において変異を含み；（ｂ）内部ネットワークは、残基１０５４、４０６７及び３０１９若しくはそれに対応する残基のうちの１若しくは２以上において変異を含み；並びに／又は（ｃ）キャニオンは、残基１１０５若しくはそれに対応する残基において変異を含む。一部の実施形態では、（ａ）ＶＰ２／ＶＰ３界面は、変異Ｄ２２４１Ｅを含み；（ｂ）内部ネットワークは、ＶＰ１  ５４アラニンのバリンへの変異、変異Ｔ４０６７Ａ及びＨ３０１９Ｙのうちの１若しくは２以上を含み；並びに／又は（ｃ）キャニオンは、変異Ｔ１１０５Ｍを含む。ポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、ＶＰ２／ＶＰ３界面、内部ネットワーク及び／又はキャニオンのうちの１又は２以上内に１又は２以上の追加の改変をさらに含んでもよく、前記１又は２以上の追加の改変は、表１、２、又は３に定義される改変であってもよい。
【００２１】
一部の実施形態では、本発明のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、（ａ）１型ポリオウイルスから誘導され、（ｉ）プロトマー界面に変異Ｑ３１７８Ｌ及びＨ１２４８Ｐ、（ii）ペンタマー界面に変異Ｔ２０２５Ａ及びＤ２０５７Ｅ、（iii）ＶＰ２／ＶＰ３界面に変異Ｌ３１１９Ｍ、並びに（iv）内部ネットワークに変異Ｒ４０１８Ｇを含み；前記ＶＬＰは、ポケットドメインに変異Ｖ１１９６Ｌをさらに含んでもよいか；（ｂ）２型ポリオウイルスから誘導され、（ｉ）ポケットドメインに変異Ｆ１１３４Ｌ及びＹ１１５９Ｆ、（ii）プロトマー界面に変異Ｑ３１７８Ｌ、並びに（iii）ペンタマー界面に変異Ｌ３０８５Ｆ及びＴ１０４１Ｉを含むか；（ｃ）２型ポリオウイルスから誘導され、（ｉ）ポケットドメインに変異Ｆ１１３４Ｌ及びＶ１１８３Ｌ、（ii）プロトマー界面に変異Ｑ３１７８Ｌ及びＶ１１０７Ｉ、（iii）ペンタマー界面に変異Ｄ２０５７Ａ；並びに（iv）内部ネットワークに変異Ｉ４０５Ｖを含むか、又は（ｄ）３型ポリオウイルスから誘導され、（ｉ）ポケットドメインに変異Ｆ１１３２Ｌ、（ii）プロトマー界面に変異Ｌ２２１５Ｍ及びＦ３０９１Ｓ、（iii）ペンタマー界面に変異Ｌ２０１８Ｉ及びＬ３０８５Ｆ、（iv）ＶＰ２／ＶＰ３界面に変異Ｄ２２４１Ｅを含み、（ｖ）内部ネットワークに変異Ｔ４０６７Ａ、Ｈ３０１９Ｙを含み、変異Ａ１０５４Ｖを含んでもよく、並びに（vi）キャニオンに変異Ｔ１１０５Ｍを含む。
【００２２】
一部の実施形態では、本発明のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、（ａ）（ｉ）配列番号１６若しくは１７のアミノ酸配列を有するＰ１；（ii）配列番号１のアミノ酸配列を有するＶＰ１、配列番号５のアミノ酸配列を有するＶＰ０、及び配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＰ３、（iii）配列番号１のアミノ酸配列を有するＶＰ１、配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＰ２、及び配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＰ３及び配列番号４のアミノ酸配列を有するＶＰ４；並びに／若しくは（iv）Ｐ１；ＶＰ１、ＶＰ０及びＶＰ３；若しくは（ｉ）から（iii）のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３及びＶＰ４を有する１型ポリオウイルスから誘導される１型ＶＬＰ；（ｂ）（ｉ）配列番号１８若しくは１９のアミノ酸配列を有するＰ１；（ii）配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＰ１、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＶＰ０、及び配列番号８のアミノ酸配列を有するＶＰ３、（iii）配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＰ１、配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＰ２、及び配列番号８のアミノ酸配列を有するＶＰ３及び配列番号９のアミノ酸配列を有するＶＰ４；並びに／若しくは（iv）Ｐ１；ＶＰ１、ＶＰ０及びＶＰ３；若しくは（ｉ）から（iii）のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３及びＶＰ４を有する２型ポリオウイルスから誘導される２型ＶＬＰ；又は（ｃ）（ｉ）配列番号２０若しくは２１のアミノ酸配列を有するＰ１；（ii）配列番号１１のアミノ酸配列を有するＶＰ１、配列番号１５のアミノ酸配列を有するＶＰ０、及び配列番号１３のアミノ酸配列を有するＶＰ３、（iii）配列番号１１のアミノ酸配列を有するＶＰ１、配列番号１２のアミノ酸配列を有するＶＰ２、及び配列番号１３のアミノ酸配列を有するＶＰ３及び配列番号１４のアミノ酸配列を有するＶＰ４；並びに／若しくは（iv）Ｐ１；ＶＰ１、ＶＰ０及びＶＰ３；若しくは（ｉ）から（iii）のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３及びＶＰ４を有する３型ポリオウイルスから誘導される３型ＶＬＰである。
【００２３】
本発明は、ポリオウイルスのカプシドの安定性を増加させる前記ポリオウイルスのカプシド内の改変を特定する方法であって、（ａ）不安定化する変異をポリオウイルス株のカプシドへと導入するステップと；（ｂ）半許容温度で、前記ポリオウイルス株を増殖させるステップと；（ｃ）得られたポリオウイルスをスクリーニングして、不安定化する変異の作用を逆転させる１又は２以上の改変を特定するステップとを含む方法をさらに提供する。半許容温度は、約３８℃〜約４０℃の範囲内の温度であり得る。前記方法は、ステップ（ｃ）で特定された１又は２以上の改変を野生型ポリオウイルスへと導入するステップと前記１又は２以上の改変がポリオウイルスのカプシドの安定性を増加させることを確認するステップとをさらに含んでもよい。
【００２４】
本発明はまた、ポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）を産生する方法であって、（ａ）ＶＬＰをコードする感染性ＲＮＡ転写物を宿主哺乳動物細胞へと導入するステップ；又は（ｂ）本発明の方法によって特定された１又は２以上の改変を含むポリオウイルスのカプシドから誘導されるポリペプチドを組換えにより産生するステップ、及び前記ポリペプチドをアセンブルしてＶＬＰを形成するステップを含む方法を提供する。
【００２５】
本発明は、本発明の方法によって得ることができるポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）をさらに提供する。前記ＶＬＰは、本明細書で定義されるものであってよい。
【００２６】
本発明はまた、本発明のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）と薬学的に許容される賦形剤又は希釈剤とを含む組成物を提供する。
【００２７】
本発明は、（ｉ）本発明のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）；又は（ii）本発明のＶＬＰをコードする核酸；及びアジュバントを含むワクチンをさらに提供する。前記ワクチンは、本発明のポリヌクレオチド又は発現ベクターを含む核酸ベクターであってもよい。前記ワクチンは、ポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）をコードし、Ｐ１前駆体の切断のためのウイルスのプロテアーゼをさらにコードするＰ１  ＲＮＡを含むＲＮＡワクチンであってもよい。
【００２８】
本発明はまた、ポリオウイルスに対してワクチン接種をする方法において使用するための、本発明のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）、組成物又はワクチンを提供する。
【００２９】
本発明は、ポリオウイルスに対してワクチン接種をする方法において使用するための医薬の製造における、本発明のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）又は組成物の使用をさらに提供する。
【００３０】
本発明はまた、ポリオウイルスに対して、対象にワクチン接種をする方法であって、有効量の、本発明のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）、組成物又はワクチンを、それを必要とする対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【００３１】
本発明はまた、本発明のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）をコードするポリヌクレオチド分子を提供する。
【００３２】
本発明は、プロモーターに作動可能に連結する、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターをさらに提供する。
【００３３】
本発明はまた、本発明のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）を産生する細胞であって、本発明のポリヌクレオチド又は発現ベクターを含んでもよい細胞を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】Ｍａｈｏｎｅｙ、Ｓａｂｉｎ  １、ＭＥＦ、Ｓａｂｉｎ  ２、Ｓａｕｋｅｔｔ及びＳａｂｉｎ  ３株のＰ１カプシド前駆体ポリペプチドのアラインメントを示す図である。以下のように示されるＰ１前駆体から切断された成熟ＶＰタンパク質：太字で示されるＶＰ０（Ｍａｈｏｎｅｙの残基１〜３４１）；下線で示されるＶＰ３（Ｍａｈｏｎｅｙの残基３４２〜５７９）；イタリック体で示されるＶＰ１（Ｍａｈｏｎｅｙの残基５８０〜８８２）。ＶＰ０は、成熟ポリオウイルスのビリオンにおいて、点線の下線で示されるＶＰ２（Ｍａｈｏｎｅｙの残基７０〜３４１）；及び二重下線で示されるＶＰ４（Ｍａｈｏｎｅｙの残基１〜６９）にさらに切断される。
【図２】３つのポリオウイルス血清型における安定化する変異の位置を示す図である。（ａ）個々プロトマーサブユニット（ＶＰ１を青色、ＶＰ２を緑色及びＶＰ３を赤色で着色したタンパク質鎖）を囲む領域に灰色で焦点を当てた、１型ポリオウイルスカプシド（Ｍａｈｏｎｅｙ株）の概略図。表６及び７に記載されたカプシドの特徴は、以下のようにカプシドに関して特定される−黄色い輪：キャニオン、青緑色の星：ＶＰ１ポケット、紫色の線：ペンタマー界面、黒色の五角形：五回軸、黒色の三角形：三回軸、赤色の円：ＶＰ３ベータアニュラス、オレンジ色の線：ＶＰ２／ＶＰ３界面、黒色の線：プロトマー界面及び赤紫色の線：ＶＰ１／ＶＰ２界面。（ｂ）青色：Ｍａｈｏｎｅｙ−ＳＣ７（１型）、緑色：ＭＥＦ−ＳＣ５ａ（２型）及び赤色：Ｓａｕｋｅｔｔ−ＳＣ８（３型）のように色分けして示す全部で３つの血清型に対する変異を有する灰色の拡大したプロトマーサブユニット。
【図３】ウイルス粒子の安定化が感染性を低減することを示すグラフである。表４及び６／７に記載の安定化する変異の様々な数及び組合せ、並びに同様の方法で特定した他のものを感染性クローンのカプシドコード配列へと導入した。ＨＥｐ２ｃ細胞に感染性ＲＮＡ転写物をトランスフェクトし、１００％の細胞変性効果（ＣＰＥ，cytopathic effect）が観察されるまで、３７℃でインキュベートするか、又はＣＰＥが現れなかった場合は、７日後に凍結させた。これらの細胞培養物の清澄化した上清を、新鮮なＨＥｐ２ｃ細胞へとブラインド継代し、１００％のＣＰＥが観察されるまでか又はさらに７日間、細胞を３７℃でインキュベートした。（Ａ）１型Ｍａｈｏｎｅｙのカプシド変異体、（Ｂ）２型ＭＥＦ−１のカプシド変異体、（Ｃ）３型Ｌｅｏｎのカプシド変異体。＊ブラインド継代の後、ＣＰＥは観察されなかった。
【図４】３型Ｌｅｏｎ粒子の熱安定性を示すグラフである。異なる温度で１０分間インキュベートした後のＥＬＩＳＡでのＭＡｂ  ５２０及びＭＡｂ  ５１７に関する（Ａ）ウイルス、（Ｂ）空カプシドのアリコートの反応性。ＭＡｂ  ５２０は、Ｄ抗原に特異的であり、ＭＡｂ  ５１７は、Ｃ抗原に特異的である。
【図５】ＩＰＶ基準と比較した、ウイルス及び空カプシド調製物の長期安定性を示すグラフである。４℃でのインキュベーションに対する３７℃でのインキュベーション後に残っているＤ抗原反応性の比率。ＩＰＶ、ウイルス及び空カプシド試料のアリコートを３７℃でインキュベートし、試料を間をおいて取り除き、Ｄ抗原ＥＬＩＳＡによって分析した；反応性は、４℃で同じ期間インキュベートした試料に対して表す。（Ａ）１型、（Ｂ）２型、（Ｃ）３型。
【図６】ＶＬＰによって誘導されたチャレンジに対するセロコンバージョン及び防御を示すグラフである。ヒトポリオウイルス受容体を発現するトランスジェニックマウスを、ＰＢＳ又は０．５ヒト用量当量のＩＰＶ若しくはＶＬＰ（Ａ、Ｂ−１型；Ｃ、Ｄ−２型；Ｅ、Ｆ−３型）により、１回又は２回（×２）、腹腔内により免疫化し、次いで、相同の野生型ウイルスである２５  ＰＤ５０により、筋肉内にチャレンジした。グラフＡ、Ｃ及びＥは、チャレンジの前日に採取した血液試料における、相同な血清型ウイルスに対する中和抗体力価を示す。グラフＢ、Ｄ及びＦは、（Ｂ）１型Ｍａｈｏｎｅｙ、（Ｄ）２型ＭＥＦ−１及び（Ｆ）３型Ｓａｕｋｅｔｔによるチャレンジ後の生存率を示す。バー（Ａ、Ｃ及びＥ）は、幾何平均力価の９５％ＣＩを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
ポリオウイルス及びポリオウイルス様粒子
ポリオウイルスは、ピコナウイルス科のヒトエンテロウイルスである。ウイルス粒子は、直径がおよそ３０ｎｍ及び形状が正二十面体である。ポリオウイルスのゲノムは、単一直鎖状ＲＮＡ分子である。このＲＮＡ分子は、高度に構造化された長い５’末端を含み、これは、ポリペプチド産物をコードしておらず、Ｉ〜VIの６つのドメインを含有している。これらのドメインのうちのいくつか（ドメインＶを含む）は、翻訳の開始を決定する内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ，Internal Ribosome Entry Site）を共に含む。ポリオウイルスＲＮＡのコード領域は、２つの領域に分けられ、１つは、ウイルスのカプシドを構成する構造タンパク質をコードし、もう１つは、ウイルスのプロテアーゼ及びウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼなどの非構造タンパク質をコードしている。３’非翻訳領域は、５’非コード領域よりも複雑でない。
【００３６】
ポリオウイルスのＲＮＡ分子は、１つの長いポリペプチドとして宿主細胞によって翻訳され、次いで、ウイルスのプロテアーゼによって、個々のウイルスのタンパク質へと切断される。ポリオウイルスのカプシドは、カプシドコード領域、Ｐ１によってコードされる。Ｐ１カプシド前駆体は、ウイルスのプロテアーゼ（３Ｃ又は３ＣＤ）によって、ＶＰ０、ＶＰ１及びＶＰ３タンパク質へのさらに切断され、十分に理解されていない機序によって、ＶＰ０が最終的にＶＰ４及びＶＰ２へと切断され、ＲＮＡカプシド形成を起こす。完全なポリオウイルス粒子のカプシドは、正二十面体の形状であり、１２個のペンタマーから形成されている。完全なポリオウイルス粒子の各ペンタマーは、５つのプロトマーからなり、各プロトマーは、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３及びＶＰ４のそれぞれの単一コピーを含む。
【００３７】
ＲＮＡカプシド形成の前には、カプシドのタンパク質ＶＰ０、ＶＰ１及びＶＰ３は、アナログプロトマー及びペンタマーサブユニットにおける感染細胞、並びに１２個のペンタマーからなる正二十面体粒子内に存在するが、ウイルスのＲＮＡは含有していない。これらの粒子は、空カプシドとして公知である。空カプシドは、感染性ウイルス粒子と比較して、いくつかのサブユニット間の相互作用を欠き、これらの相互作用は、ＲＮＡカプシド形成及びＶＰ０のＶＰ２及びＶＰ４への切断（いわゆる、成熟切断）後にのみ形成される。これらの相互作用は、感染性ウイルス粒子の熱安定性において重要な役割を果たす。
【００３８】
ポリオウイルスビリオンとしても知られる完全なポリオウイルス粒子は、ポリオウイルスのカプシドとポリオウイルスのＲＮＡ分子の両方を含む、ポリオウイルスの完全な感染形態である。本明細書で定義されるように、ポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、空ポリオウイルス粒子であり、すなわち、ＶＬＰは、ポリオウイルスのカプシドを含むが、ポリオウイルスのＲＮＡ分子は欠く。本発明のＶＬＰは、ポリオウイルスのカプシドを含むか又はこれからなってもよい。ゆえに、ＶＬＰのカプシドは、典型的には、それぞれが５つのプロトマーから構成される、１２個のペンタマーを含む。ＶＬＰの各プロトマーは、典型的には、ＶＰ０、ＶＰ１及びＶＰ３のそれぞれの単一のコピーを含む。本明細書で定義されるＶＬＰは、例えば、ＲＮＡの除去によって、完全なポリオウイルス粒子から導出することができないことが留意されるべきである。
【００３９】
本明細書に記載されているように、本発明のＶＬＰは、ＶＰ０、ＶＰ１及びＶＰ３を含む。本発明者らによって特定される安定化する改変のうちのいくつかは、本発明のＶＬＰが導出される成熟したポリオウイルス粒子のＶＰ２又はＶＰ４内の位置によって言及される。より詳細には、本明細書に記載されているように、ポリオウイルスＶＰ０は、ビリオンのアセンブリの間に切断されて、ＶＰ２及びＶＰ４を産生する。ゆえに、本明細書において、ＶＰ２及びＶＰ４の特定の位置における改変に対して言及される場合、これらの改変の位置は、簡単な手法で、ＶＰ０配列上で容易に読み取ることができる。非限定例として、Ｍａｈｏｎｅｙ（１型）株の２０２５は、ＭａｈｏｎｅｙＶＰ２（配列番号２）の残基２５であり、ＭａｈｏｎｅｙＶＰ０（配列番号５）の残基９３に対応する。同様に、Ｓａｕｋｅｔｔ（３型）株の４０６７は、Ｓａｕｋｅｔｔ  ＶＰ４（配列番号１４）の残基６７であり、Ｓａｕｋｅｔｔ  ＶＰ０（配列番号１５）の残基６７に対応する。ゆえに、本明細書において、ＶＰ２（例えば、２０２５、２０５７、２０６７、２１９７、２１３９、２２１５、２０１６、２０１８、２１２４及び２２４１）又はＶＰ４（例えば、４０１７、４０１８、４０２３、４０４６、４０５５、４０５７、４０６５及び４０６７）内の残基への言及は、ＶＬＰのＶＰ０配列内の対応する残基によって、容易かつ互換的に言及され得る。これは、ＶＰ０、ＶＰ２及びＶＰ４アミノ酸配列が明示的に示されている、種々の１型、２型及び３型ポリオウイルスのカプシド前駆体Ｐ１ポリペプチド配列のアラインメントを提供する、図１から明らかである。ポリオウイルスに対する従来の命名法との一貫性を保つために、ポリオウイルスのビリオンにおける成熟ＶＰ２及び／又はＶＰ４タンパク質内に見られる改変は、典型的には、ＶＰ２／ＶＰ４におけるそれらの位置を参照して、本明細書において、言及される。しかし、上記で説明されるように、本発明のＶＬＰでは、これらの改変は、実際に、ＶＰ０内の対応する位置で見られる。
【００４０】
ポリオウイルス粒子は、２つの別個の抗原を発現する。Ｄ抗原は、主に、感染性ウイルスと関連し、Ｃ抗原は、例えば、加熱によって生じる異なる立体構造の非感染性粒子と関連する；細胞外の野生型の空カプシドは、特に、Ｃ抗原特異性に変換される傾向がある。
【００４１】
ネイティブ（「Ｄ」）立体構造の空ポリオウイルス粒子は、タンパク質分解のためにフォールディングされていないか又は疎水性のモチーフを標的とする細胞経路に抵抗性である形態のカプシドサブユニットのリザーバーをおそらく提供するため、アセンブリプロセスの必要な部分として、ポリオウイルス及び他のピコナウイルスによって産生されているようである。天然に存在する空の粒子は、成熟ウイルス粒子に存在するサブユニット間の相互作用の一部を欠いており、ペンタマーサブユニットに解離することができ、おそらく、その結果、これらは、次いで、ゲノムのカプシド形成の間に、ウイルスＲＮＡ周辺に再度アセンブルすることができる。それゆえに、天然に存在する空の粒子は、極端に不安定であり、したがって、ワクチン産生に適していない。細胞外で、これらの粒子は、生理学的温度で、Ｃ抗原性（又は、時として、Ｈ抗原性）として知られる、異なる、ネイティブでない抗原の立体構造へと容易に変換される。ネイティブＤ抗原形態（時として、Ｎ抗原性として知られる）は、防御的免疫応答を誘導する原因であり、ネイティブでないＣ抗原形態は、防御的免疫原性を欠く。
【００４２】
この問題を解決するために、本発明者らは、カプシドの安定性を調節するポリオウイルスのカプシド内の改変（典型的には、変異）、特に、ネイティブ抗原のポリオウイルスのカプシドを安定化させる変異の特定を可能とする方法を開発した。
【００４３】
この方法を使用して、本発明者らは、正しい抗原性及び免疫原性を有するが、カプシド、及びそれゆえにＶＬＰを安定化させるポリオウイルスのカプシドに改変を含むＶＬＰ（すなわち、空のウイルス粒子）を産生した。ゆえに、本発明のＶＬＰは、典型的には、（ｉ）少なくとも、ＩＰＶと同程度に安定であり；（ii）ネイティブウイルスと同じ抗原構造を有し；、（iii）少なくとも、ＩＰＶと同程度に免疫原性である。
【００４４】
本発明のＶＬＰは、組換え技術によって発現することができ、ワクチン産生のいずれの段階でも感染性ウイルスを必要とせずに、ポリオウイルスワクチンの産生において使用することができる。ゆえに、本発明のＶＬＰは、ワクチン産生の安全性と特性の両方に関して、現在のＩＰＶ及びＯＰＶ並びに製造方法と比較して大きな利点をもたらす。
【００４５】
ポリオウイルスの血清型
３つの公知のポリオウイルス血清型：１、２及び３型が存在する。野生型ポリオウイルスの例として、Ｍａｈｏｎｅｙ（１型）、ＭＥＦ−１（２型）及びＳａｕｋｅｔｔ（３型）が挙げられる。弱毒化生ポリオウイルス株は、１９５０年代にSabinによって野生型株から開発され、Ｓａｂｉｎ  １（１型）、Ｓａｂｉｎ  ２（２型）及びＳａｂｉｎ  ３（３型）と称される。
【００４６】
本発明のＶＬＰは、任意のポリオウイルス血清型、すなわち、血清型１、２又は３から誘導されてもよい。さらに、本発明のＶＬＰは、野生型ポリオウイルス又はワクチン株から誘導されてもよい。ゆえに、本発明のＶＬＰは、１型野生型株（例えば、Ｍａｈｏｎｅｙ）、１型ワクチン株（例えば、Ｓａｂｉｎ  １）、２型野生型株（例えば、ＭＥＦ−１）、２型ワクチン株（例えば、Ｓａｂｉｎ  ２）、３型野生型株（例えば、Ｓａｕｋｅｔｔ）又は３型ワクチン株（例えば、Ｓａｂｉｎ  ３）から誘導されてもよい。
【００４７】
本発明の文脈では、ポリオウイルスのカプシドタンパク質、ポリオウイルスのポリペプチド又は前記ポリオウイルスの前記ポリオウイルスのカプシドタンパク質若しくはポリオウイルスのポリペプチドをコードする対応するポリオウイルスのＲＮＡ分子が、本明細書に開示の１又は２以上の改変を含むよう改変された場合に、ＶＬＰは、典型的には、特定のポリオウイルスから誘導されるとみなされ得る。非限定例として、本発明のＶＬＰは、本明細書に開示の１又は２以上の改変を含むように改変されたＳａｂｉｎ  ３カプシドタンパク質を含む（又はＳａｂｉｎ  ３ポリペプチド若しくはＳａｂｉｎ  ３  ＲＮＡ分子を使用して産生される）場合、Ｓａｂｉｎ  ３から誘導される。例えば、本発明のＶＬＰは、（ａ）配列番号１に対応するＶＰ１アミノ酸配列、若しくは配列番号１と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくはそれより多い配列同一性を有する配列；（ｂ）配列番号３に対応するＶＰ３アミノ酸配列、若しくは配列番号３と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくはそれより多い配列同一性を有する配列；（ｃ）配列番号５に対応するＶＰ０アミノ酸配列、若しくは配列番号５と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくはそれより多い配列同一性を有する配列；（ｄ）配列番号２に対応するＶＰ２アミノ酸配列、若しくは配列番号２と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくはそれより多い配列同一性を有する配列；及び／又は（ｅ）配列番号４に対応するＶＰ４アミノ酸配列、若しくは配列番号４と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくはそれより多い配列同一性を有する配列、又はそれらの任意の組合せを有する１型ポリオウイルスから誘導されてもよい。本発明のＶＬＰは、配列番号１６若しくは１７に対応するＰ１アミノ酸配列、又は配列番号１６若しくは１７と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくはそれより多い配列同一性を有する配列を有する１型ポリオウイルスから誘導されてもよい。典型的には、本発明の１型ＶＬＰは、配列番号１に対応するＶＰ１アミノ酸配列、又は配列番号１と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくはそれより多い配列同一性を有する配列；配列番号３に対��するＶＰ３アミノ酸配列、又は配列番号３と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくはそれより多い配列同一性を有する配列；及び配列番号５に対応するＶＰ０アミノ酸配列、又は配列番号５と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくはそれより多い配列同一性を有する配列を有する。好ましくは、前記ＶＰ１、ＶＰ３及び／又はＶＰ０アミノ酸配列は、記載された配列番号と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又はそれより多い配列同一性を有する。好ましくは、本発明の１型ＶＬＰは、配列番号１に対応するＶＰ１アミノ酸配列、又は配列番号１と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくはそれより多い配列同一性を有する配列；配列番号３に対応するＶＰ３アミノ酸配列、又は配列番号３と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくはそれより多い配列同一性を有する配列；配列番号２に対応するＶＰ２アミノ酸配列、又は配列番号２と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくはそれより多い配列同一性を有する配列；及び配列番号４に対応するＶＰ４アミノ酸配列、又は配列番号４と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくはそれより多い配列同一性を有する配列を有する。好ましくは、前記ＶＰ１、ＶＰ３、ＶＰ２及び／又はＶＰ４アミノ酸配列は、記載された配列番号と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又はそれより多い配列同一性を有する。ゆえに、本発明の１型ＶＬＰは、上記で定義されるアミノ酸配列を有するＰ１、ＶＰ０、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３及び／又はＶＰ４（又はこれらの任意の組合せ）有するが、本明細書に記載されている１又は２以上の安定化する改変を有してもよい。
【００４８】
本発明のＶＬＰは、（ａ）配列番号６に対応するＶＰ１アミノ酸配列、若しくは配列番号６と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくはそれより多い配列同一性を有する配列；（ｂ）配列番号８に対応するＶＰ３アミノ酸配列、若しくは配列番号８と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくはそれより多い配列同一性を有する配列；（ｃ）配列番号１０に対応するＶＰ０アミノ酸配列、若しくは配列番号１０と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくはそれより多い配列同一性を有する配列；（ｄ）配列番号７に対応するＶＰ２アミノ酸配列、若しくは配列番号７と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくはそれより多い配列同一性を有する配列；及び／又は（ｅ）配列番号９に対応するＶＰ４アミノ酸配列、若しくは配列番号９と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくはそれより多い配列同一性を有する配列、又はこれらの任意の組合せを有する２型ポリオウイルスに由来してもよい。本発明のＶＬＰは、配列番号１８若しくは１９に対応するＰ１アミノ酸配列、又は配列番号１８若しくは１９と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくはそれより多い配列同一性を有する配列を有する２型ポリオウイルスから誘導されてもよい。典型的には、本発明の２型ＶＬＰは、配列番号６に対応するＶＰ１アミノ酸配列、又は配列番号６と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくはそれより多い配列同一性を有する配列；配列番号８に対応するＶＰ３アミノ酸配列、又は配列番号８と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくはそれより多い配列同一性を有する配列；及び配列番号１０に対応するＶＰ０アミノ酸配列、又は配列番号１０と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくはそれより多い配列同一性を有する配列を有する。好ましくは、前記ＶＰ１、ＶＰ３及び／又はＶＰ０アミノ酸配列は、記載された配列番号と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又はそれより多い配列同一性を有する。好ましくは、本発明の２型ＶＬＰは、配列番号６に対応するＶＰ１アミノ酸配列、又は配列番号６と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくはそれより多い配列同一性を有する配列；配列番号８に対応するＶＰ３アミノ酸配列、又は配列番号８と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくはそれより多い配列同一性を有する配列；配列番号７に対応するＶＰ２アミノ酸配列、又は配列番号７と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくはそれより多い配列同一性を有する配列；及び配列番号９に対応するＶＰ４アミノ酸配列、又は配列番号９と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくはそれより多い配列同一性を有する配列を有する。好ましくは、前記ＶＰ１、ＶＰ３、ＶＰ２及び／又はＶＰ４アミノ酸配列は、記載された配列番号と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくはそれより多い配列同一性を有する。ゆえに、本発明の２型ＶＬＰは、上記で定義されるアミノ酸配列を有するＰ１、ＶＰ０、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３及び／又はＶＰ４（又はこれらの任意の組合せ）有するが、本明細書に記載されている１又は２以上の安定化する改変を有してもよい。
【００４９】
本発明のＶＬＰは、（ａ）配列番号１１に対応するＶＰ１アミノ酸配列、若しくは配列番号１１と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくはそれより多い配列同一性を有する配列；（ｂ）配列番号１３に対応するＶＰ３アミノ酸配列、若しくは配列番号１３と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくはそれより多い配列同一性を有する配列；（ｃ）配列番号１５に対応するＶＰ０アミノ酸配列、若しくは配列番号１５と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくはそれより多い配列同一性を有する配列；（ｄ）配列番号１２に対応するＶＰ２アミノ酸配列、若しくは配列番号１２と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくはそれより多い配列同一性を有する配列；及び／又は（ｅ）配列番号１４に対応するＶＰ４アミノ酸配列、若しくは配列番号１４と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくはそれより多い配列同一性を有する配列、又はこれらの任意の組合せを有する３型ポリオウイルスから誘導されてもよい。本発明のＶＬＰは、配列番号２０若しくは２１に対応するＰ１アミノ酸配列、又は配列番号２０若しくは２１と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくはそれより多い配列同一性を有する配列を有する３型ポリオウイルスから誘導されてもよい。典型的には、本発明の３型ＶＬＰは、配列番号１１に対応するＶＰ１アミノ酸配列、又は配列番号１１と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくはそれより多い配列同一性を有する配列；配列番号１３に対応するＶＰ３アミノ酸配列、又は配列番号１３と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくはそれより多い配列同一性を有する配列；及び配列番号１５に対応するＶＰ０アミノ酸配列、又は配列番号１５と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくはそれより多い配列同一性を有する配列を有する。好ましくは、前記ＶＰ１、ＶＰ３及び／又はＶＰ０アミノ酸配列は、記載された配列番号と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくはそれより多い配列同一性を有する。好ましくは、本発明の３型ＶＬＰは、配列番号１１に対応するＶＰ１アミノ酸配列、又は配列番号１１と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくはそれより多い配列同一性を有する配列；配列番号１３に対応するＶＰ３アミノ酸配列、又は配列番号１３と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくはそれより多い配列同一性を有する配列；配列番号１２に対応するＶＰ２アミノ酸配列、又は配列番号１２と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくはそれより多い配列同一性を有する配列；及び配列番号１４に対応するＶＰ４アミノ酸配列、又は配列番号１４と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくはそれより多い配列同一性を有する配列を有する。好ましくは、前記ＶＰ１、ＶＰ３、ＶＰ２及び／又はＶＰ４アミノ酸配列は、記載された配列番号と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくはそれより多い配列同一性を有する。ゆえに、本発明の３型ＶＬＰは、上記で定義されるアミノ酸配列を有するＰ１、ＶＰ０、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３及び／又はＶＰ４（又はこれらの任意の組合せ）有するが、本明細書に記載されている１又は２以上の安定化する改変を有してもよい。
【００５０】
ポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）の構造
本発明者らは、ポリオウイルスワクチンにおいて使用するのに適する安定化されたＶＬＰを提供する最初の者である。前記ＶＬＰは、本明細書で定義される必要な安定性及び免疫原性の特徴を有するため、ポリオウイルスワクチンにおいて有用性を有する。これらの特徴は、ＶＬＰが誘導されるポリオウイルスに対して、ＶＬＰのカプシド内の１又は２以上の改変の存在によって付与される。
【００５１】
したがって、本発明は、ＶＬＰが誘導されるポリオウイルス粒子に対して、少なくとも１つの改変を含み、前記少なくとも１つの改変が、ＶＬＰを安定化する、ＶＬＰを提供する。
【００５２】
本発明のＶＬＰは、ＶＬＰが誘導されるポリオウイルス粒子に対して、１若しくは２以上、２若しくは３以上、３若しくは４以上、４若しくは５以上、５若しくは６以上、６若しくは７以上、７若しくは８以上、８若しくは９以上、９若しくは１０以上、１０若しくは１１以上、又はそれより多い改変を含んでもよく、但し、前記改変が、ＶＬＰが誘導されるポリオウイルス粒子に対して、（独立して又は組み合わせて）ＶＬＰを安定化させることを条件とする。好ましくは、本発明のＶＬＰは、ＶＬＰが誘導されるポリオウイルス粒子に対して、少なくとも３つの改変を含み、前記改変は、ＶＬＰを安定化させる。
【００５３】
ＶＬＰの特定されたドメインのいずれかにおける、本明細書に記載の好ましいアミノ酸残基における、改変、特に、アミノ酸の変異／置換の任意及びすべての組合せが本発明によって包含され、但し、得られるＶＬＰが、安定であり、本明細書で定義される必要な免疫原性特性を保持することを条件とする。言い換えれば、本発明のＶＬＰへの言及は、安定かつ免疫原性のＶＬＰへの言及である。
【００５４】
ポリオウイルスの空カプシドは、本明細書に記載されているＶＰ０、ＶＰ１、及びＶＰ３タンパク質の複数のコピーから構成される。
【００５５】
複数のカプシドタンパク質がアセンブルして、正二十面体対称のカプシドを形成し、これは、以下のようないくつかの別個の特徴／領域を含む：
【００５６】
−  異なるカプシドタンパク質、ＶＰ０、ＶＰ１及びＶＰ３（成熟ポリオウイルスのビリオンにおけるＶＰ２及びＶＰ４、ＶＰ１及びＶＰ３に対応する）の間の界面、例えば、ＶＰ０とＶＰ１、ＶＰ０とＶＰ３及び／又はＶＰ１とＶＰ３との間の界面（すなわち、成熟ポリオウイルスのビリオンにおけるＶＰ１とＶＰ２；ＶＰ１とＶＰ３；ＶＰ１とＶＰ４；ＶＰ２とＶＰ３；ＶＰ２とＶＰ４；及びＶＰ３とＶＰ４との間の界面）；
−  プロトマーサブユニット間の界面；
−  ペンタマーサブユニット間の界面；
−  疎水性分子（例えば、脂肪酸）を含有するポケットドメイン；
−  サブユニットを連結する内部ポリペプチドネットワーク；並びに
−  キャニオンとして知られる外面のくぼみ。
【００５７】
これらのドメインは、ポリオウイルス研究の分野において周知であり、実際に、すべてのピコナウイルスに共通している（例えば、これらのいずれも参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ehrenfeld, Domingo and Roos（2010）The Picronaviruses, Washington, DC: ASM Press, chapter 10, “Virion Structure” by Fry, E. E. and Stuart, D. I.；及びKoch, F. and Koch, G.（1985）The Molecular Biology of Poliovirus, New York: Springer-Verlag Wien, chapter 3 “Composition and Structure of the Virion” and chapter 10 “Assembly of the Virion”を参照のこと）。さらに、これらのドメインは、これらに限定されないが、タンパク質構造データバンク（ＰＤＢ，Protein Data Bank）ＩＤ番号：１ＨＸＳ（Ｍａｈｏｎｅｙ株、２００１年１月１６日に寄託された）、ＰＤＢ  ＩＤ番号：１ＥＡＨ（２型Ｌａｎｓｉｎｇ株、１９９７年７月２２日に寄託された）及びＰＤＢ  ＩＤ番号：１ＰＶＣ（Ｓａｂｉｎ  ３株、１９９５年３月３０日に寄託された）を含む市販のソフトウェア及び公開されたポリオウイルスの結晶構造を使用して、容易に特定することができる。ＰＤＢのエントリーは、ＮＣＢＩウェブサイト（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/structure）から自由に利用できる。ゆえに、上記ドメインのうちのいずれか１つへの言及は、任意の公知のポリオウイルスの結晶構造の文脈において、ＰＤＢ  ＩＤ番号：１ＨＸＳ、１ＥＡＨ及び／又は１ＰＶＣを含むものとして解釈されてよい。非限定例として、プロトマー界面、ペンタマー界面及び／又はポケットドメインへの言及は、ＰＤＢ  ＩＤ番号：１ＨＸＳ、１ＥＡＨ及び／又は１ＰＶＣのいずれか１つによって定義されるプロトマー界面、ペンタマー界面及び／又はポケットドメインへの言及であってもよい。
【００５８】
本発明のＶＬＰは、これらの領域のうちの１又は２以上において１又は２以上の改変を含んでもよい。本発明のＶＬＰは、これらの領域のうちのいずれか１つ、いずれか２つ、いずれか３つ、いずれか４つ、いずれか５つ、いずれか６つ、いずれか７つ、いずれか８つ又はそれより多くにおいて、１又は２以上の改変を含んでもよい。典型的には、本発明のＶＬＰは、プロトマー界面に１若しくは２以上の改変及び／又はペンタマー界面に１若しくは２以上の改変、好ましくは、プロトマー界面に１若しくは２以上の改変及びペンタマー界面に１若しくは２以上の改変を含み、他のドメインのいずれか又はこれらの組合せに１又は２以上の改変を含んでよい。非限定例として、本発明のＶＬＰは、ポケットドメイン、１若しくは２以上のプロトマーサブユニット間の界面（本明細書において、プロトマー界面とも称される）、１若しくは２以上のペンタマーサブユニット間の界面（本明細書において、ペンタマー界面とも称される）、ＶＰ２／ＶＰ３界面（ＶＬＰのＶＰ０／ＶＰ３界面に対応して、成熟ポリオウイルスのビリオンにおいて定義され、このような用語ＶＰ０／ＶＰ３界面とＶＰ２／ＶＰ３界面とは、本明細書において互換的に使用されてもよい）、内部ネットワーク又はキャニオンにおいて１又は２以上の改変を含んでもよい。
【００５９】
あるいは、本発明のＶＬＰは、これらの領域のうちのいずれか２つ、いずれか３つ、いずれか４つ、いずれか５つ又は６つ全部において、１又は２以上の改変を含んでもよい。非限定例として、本発明のＶＬＰは、プロトマー界面に１若しくは２以上の改変、ペンタマー界面に１若しくは２以上の改変、及び、ポケットドメインに１若しくは２以上の改変を含んでもよい。
【００６０】
典型的には、本発明のＶＬＰは、ＶＬＰが誘導されるポリオウイルスに対して、少なくとも３つの改変、好ましくは少なくとも４つの改変、より好ましくは少なくとも５つの改変及びさらにより好ましくは少なくとも６つの改変を含み、好ましくは、プロトマー界面  ペンタマー界面のそれぞれに少なくとも１つの改変を含み、ポケットドメインの少なくとも１つの改変も含んでよい。
【００６１】
本発明のＶＬＰは、（ａ）プロトマー界面；及び（ｂ）ペンタマー界面を含んでもよく；（ａ）及び（ｂ）のそれぞれは、ＶＬＰが誘導されるポリオウイルス粒子に対して少なくとも１つの改変を含む。例えば、ＶＬＰは、プロトマー界面に１、２、３、４、５若しくは６以上の改変並びに／又はペンタマー界面１、２、３、４、５若しくは６以上の改変を含んでもよく、但し、プロトマー界面とペンタマー界面のそれぞれは、少なくとも１つの改変（本明細書で定義される）、好ましくは少なくとも１つのアミノ酸置換を含むことを条件とする。典型的には、前記ＶＬＰは、ＶＬＰが誘導されるポリオウイルス粒子に対して、少なくとも３つの改変を含む。
【００６２】
非限定例として、本発明のＶＬＰは、（ａ）ポケットドメイン；（ｂ）プロトマー界面；及び（ｃ）ペンタマー界面を含んでもよく；（ａ）から（ｃ）のそれぞれは、ＶＬＰが誘導されるポリオウイルス粒子に対して、少なくとも１つの改変を含む。例えば、ＶＬＰは、ポケットドメインに１、２、３、４、５若しくは６以上の改変、プロトマー界面に１、２、３、４、５若しくは６以上の改変及び／又はペンタマー界面に１、２、３、４、５若しくは６以上の改変を含んでもよく、但し、ポケットドメイン、プロトマー界面及びペンタマー界面のそれぞれは、少なくとも１つの改変（本明細書で定義される）、好ましくは少なくとも１つのアミノ酸置換を含むことを条件とする。
【００６３】
安定化されたＶＬＰを産生するように改変され得る１型、２型及び３型ポリオウイルスのそれぞれのカプシドタンパク質における特定のアミノ酸残基は、本発明者らによって特定され、本明細書に記載されている。本発明は、１型、２型及び３型ポリオウイルスのカプシドタンパク質内の本開示のアミノ酸残基の任意の組合せにおける改変の任意の組合せを包含し、但し、改変の組合せが、ポリオワクチンとして使用するのに適するようにするために必要な特性（例えば、安定性、抗原性及び／又は免疫原性）を有するＶＬＰを生じることを条件とする。例として、１１３４という表記は、ＶＰ１の残基１３４、又はＶＰ１−１３４を指す。同様に、１１３２という表記は、ＶＰ１の残基１３２を指し、また、ＶＰ１−１３２とも称される。
【００６４】
特定のポリオウイルスの血清型内の所与のアミノ酸残基に言及がなされる場合、本発明は、他の２つの血清型内の対応する位置における改変も包含する。非限定例として、１／２型血清型ポリオウイルスの残基１１３４は、３型血清型ポリオウイルスの残基１１３２に対応し（１型及び２型と比較して、３型ポリオウイルスのＶＰ１に２つのアミノ酸欠失が存在する（残基１５〜１６））、その結果、２型ポリオウイルスの残基１１３４に対応する残基における改変への言及は、３型ポリオウイルスの残基１１３２における改変も包含する。３つの血清型のＶＰ１配列には、２つの他の挿入／欠失が存在し、その結果、同等の残基のナンバリングは以下の通りである：
【００６５】
【表１】
2020513840.tif 000003
【００６６】
ゆえに、１型又は２型ＶＬＰの特定の残基における変異又は改変への言及は、１型又は２型ＶＬＰにおける前記変異だけでなく、３型ＶＬＰの対応する残基における同じ変異も包含する（例えば、１型又は２型ＶＬＰのＶＰ１において、残基１７〜２２１の間の位置から２を減算すると、３型ＶＬＰにおいて対応する位置を与えることとなる）。逆に、３型ＶＬＰの特定の残基における変異又は改変への言及は、３型ＶＬＰにおける前記変異だけでなく、１型又は２型ＶＬＰの対応する残基における同じ変異も包含し、これは、ＶＰ１内にある場合にも同じ番号を有さないかもしれない（対応する位置は、上記表から誘導され得る）。したがって、任意の特定のポリオウイルスの型に関連して本明細書に記載の任意の変異は、他のポリオウイルスの型の文脈でも開示されている。特に、１型ポリオウイルス／ＶＬＰの特定の残基における変異は、２型又は３型ポリオウイルス／ＶＬＰの文脈でも開示されており；２型ポリオウイルス／ＶＬＰの特定の残基における変異は、１型又は３型ポリオウイルス／ＶＬＰの文脈でも開示されており；３型ポリオウイルス／ＶＬＰの特定の残基における変異は、１型又は２型ポリオウイルス／ＶＬＰの文脈でも開示されている。
【００６７】
本発明のＶＬＰは、ポリオワクチンにおいて使用するのに適するのに十分に安定である。ＶＬＰの安定性は、対照に対して測定してもよい。典型的には、対照は、ＶＬＰが誘導されるポリオウイルスの未改変形態を含有するＩＰＶの基準調製物である。典型的には、基準調製物におけるポリオウイルスの未改変形態は、ホルムアルデヒドで処理されている。非限定例として、本発明のＶＬＰが、Ｍａｈｏｎｅｙから誘導される場合、これは典型的に、ＩＰＶの１型構成成分、すなわち、ホルムアルデヒドで処理されたＭａｈｏｎｅｙウイルスと、少なくとも同程度に安定となる。本発明のＶＬＰは、対照と、少なくとも同程度に安定であるか、対照より少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％又はそれより高い割合で安定となり得る。
【００６８】
ＶＬＰの安定性は、任意の適当な技法を使用して測定されてもよい。これらに限定されないが、加熱時のネイティブＤ抗原構造の保持（Ｄ抗原特異的モノクローナル抗体（ＭＡｂｓ）に関するＥＬＩＳＡ反応性が、１０分のインキュベーションで５０％低減する温度として表される）又は３７℃で長期インキュベーション時のネイティブＤ抗原構造の保持（Ｄ抗原特異的ＭＡｂｓに関するＥＬＩＳＡ反応性が５０％低減した後の時間の長さ（日数）として示される）を含む、標準的技法が当技術分野において公知である。例えば、本発明のＶＬＰについて、１０分間のインキュベーションで、Ｄ抗原特異的モノクローナル抗体（ＭＡｂｓ）に関するＥＬＩＳＡ反応性が５０％低減する温度は、４５℃より高いか、４６℃より高いか、４７℃より高いか、４８℃より高いか、４９℃より高いか、５０℃より高いか、５１℃より高いか、５２℃より高いか、５３℃より高いか、５４℃より高いか、５５℃より高いか、５６℃より高いか、又はそれより高くてもよい。典型的には、本発明のＶＬＰについて、１０分間のインキュベーションで、Ｄ抗原特異的モノクローナル抗体（ＭＡｂｓ）に関するＥＬＩＳＡ反応性が５０％低減する温度は、５０℃より高いか、５１℃より高いか、５２℃より高いか、５３℃より高いか、５４℃より高いか、５５℃より高いか、５６℃より高いか、又はそれより高いか；好ましくは、５４℃より高いか、５５℃より高いか、５６℃より高いか、又はそれより高い。
【００６９】
好ましい実施形態では、本発明のＶＬＰは、供給／分配に関して有利である冷却保存を必要としないほど安定である。したがって、本発明のＶＬＰの安定性は、長期間、高温（例えば、３７℃）に曝された場合のＤ抗原の損失に関して定量化され得る。典型的には、本発明のＶＬＰは、３７℃で、少なくとも５０日間、少なくとも１００日間、少なくとも１５０日間、少なくとも１８０日間又はそれより長い間保存した後のその活性の少なくとも５０％、その活性の少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％又はそれより高い割合（４℃で、同じ期間保存した対応するＶＬＰと比較して）を保持する。好ましくは、本発明のＶＬＰは、３７℃で、少なくとも５０日間保存した後のその活性の少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％若しくはそれより高い割合（４℃で、同じ期間保存した対応するＶＬＰと比較して）、及び／又は３７℃で、少なくとも１８０日間保存した後のその活性の少なくとも５０％、少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくとも６０％若しくはそれより高い割合（４℃で、同じ期間保存した対応するＶＬＰと比較して）を保持する。
【００７０】
本発明のＶＬＰは、ポリオワクチンにおいて使用するのに適するよう十分に免疫原性である。ＶＬＰの免疫原性は、対照に対して測定されてもよい。典型的には、対照は、ＶＬＰが誘導されるポリオウイルスの未改変形態を含有するＩＰＶ又は関連する血清型の現在のＩＰＶの基準調製物である。典型的には、基準調製物におけるポリオウイルスの未改変形態は、ホルムアルデヒドで処理されている。非限定例として、本発明のＶＬＰが、Ｍａｈｏｎｅｙから誘導される場合、これは典型的に、ＩＰＶの１型構成成分、すなわち、ホルムアルデヒドで処理されたＭａｈｏｎｅｙウイルスと、少なくとも同程度に免疫原性となる。本発明のＶＬＰは、少なくとも同程度に免疫原性であるか、好ましくは、対照より少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍又はそれより高い倍率で免疫原性であってもよい。好ましくは、本発明のＶＬＰは、少なくとも同程度に免疫原性であり、好ましくは、対照より少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍又はそれより高い倍率で免疫原性であってもよい。ＶＬＰの免疫原性は、任意の適当な技法を使用して測定されてもよい。これらに限定されないが、Ｃ／Ｄ抗原ＥＬＩＳＡ及びラットにおけるインビボ効能試験（相対的効能が１．０以上であることが、国際的基準調製物の免疫原性と、少なくとも同程度に免疫原性であることを意味する）を含む標準的技法が、当技術分野で公知である。
【００７１】
改変
本明細書に記載されているように、改変という用語は、核酸レベルとアミノ酸レベルの両方における改変を包含する。典型的には、改変は、アミノ酸レベルの改変を指す。各アミノ酸の改変は、独立して、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、及びアミノ酸欠失から選択され得る。好ましい実施形態では、前記アミノ酸の改変は、アミノ酸置換であり、本明細書において、互換的にアミノ酸の変異とも称される。
【００７２】
アミノ酸置換では、ポリオウイルスのカプシドタンパク質のアミノ酸配列の一部を形成するアミノ酸残基が、異なるアミノ酸残基で置き換えられる。置き換えアミノ酸残基は、以下の表の２０種の標準アミノ酸のうちの１つであってもよい。
【００７３】
【表２】
2020513840.tif 000004
【００７４】
以下のアミノ酸は、荷電アミノ酸であると考えられる：アスパラギン酸（負）、グルタミン酸（負）、アルギニン（正）、及びリシン（正）。
【００７５】
以下のアミノ酸は、無電荷の、極性（これらが、水素結合に加わることができることを意味する）アミノ酸であると考えられる：アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、メチオニン、及びトリプトファン。
【００７６】
以下のアミノ酸は、無電荷の、疎水性アミノ酸であると考えられる：アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、プロリン、及びグリシン。
【００７７】
あるいは、アミノ酸置換における置き換えアミノ酸は、非標準アミノ酸（上述の２０種の標準のセットの一部ではないアミノ酸）であってもよい。例として、置き換えアミノ酸は、塩基性の非標準アミノ酸、例えば、Ｌ−オルニチン、Ｌ−２−アミノ−３−グアニジノプロピオン酸、又はリシン、アルギニン及びオルニチンのＤ−異性体であってもよい。非標準アミノ酸をタンパク質へと導入するための方法は、当技術分野において公知であり、大腸菌（E. coli）の栄養要求性発現宿主を使用する組換えタンパク質合成を含む。
【００７８】
アミノ酸挿入では、追加のアミノ酸残基（通常は存在しないもの）をポリペプチドのアミノ酸配列へと組み込み、ゆえに、前記配列におけるアミノ酸残基の総数を増加させる。アミノ酸欠失では、アミノ酸残基は、ポリペプチドのアミノ酸配列から除去され、ゆえに、前記配列におけるアミノ酸残基の総数は低減する。
【００７９】
アミノ酸残基の置換、挿入又は欠失によってタンパク質を改変するための方法は、当技術分野において公知である。例として、アミノ酸の改変は、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の改変によって導入されてもよい。これは、例えば、所望のアミノ酸（複数可）をコードするＤＮＡ（オリゴヌクレオチド）の短鎖を使用して、ポリメラーゼ酵素を使用して元のコード配列を置き換える部位特異的変異誘発による、又は種々の酵素（例えば、リガーゼ及び制限エンドヌクレアーゼ）を用いて遺伝子の一部を挿入する／欠失することによる、標準的分子クローニング技法を使用して達成することができる。あるいは、改変された遺伝子配列は、化学的に合成することができる。
【００８０】
本発明による各アミノ酸置換は、独立して、保存的置換、すなわち、同じクラスの側鎖（例えば、上記表に定義されるように、酸性と酸性、塩基性と塩基性、極性と極性、疎水性と疎水性）を有する任意のアミノ酸による置換であってよい。あるいは、本発明の各アミノ酸置換は、独立して、非保存的置換、すなわち、異なるクラスの側鎖（例えば、上記表に定義されるように、酸性と塩基性、極性若しくは疎水性；塩基性と酸性、極性若しくは疎水性；極性と酸性、塩基性若しくは疎水性；又は疎水性と酸性、塩基性若しくは極性）を有する任意のアミノ酸による置換であってよい。非限定例として、少なくとも１つのアミノ酸の改変は、酸性アミノ酸残基の塩基性アミノ酸残基による置換；酸性アミノ酸残基の無電荷アミノ酸残基による置換；無電荷アミノ酸残基の塩基性アミノ酸残基による置換；塩基性アミノ酸残基の挿入、及び酸性アミノ酸残基の欠失から選択され得る。
【００８１】
好ましい実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸の改変は、典型的には、ポリペプチドにおいて、同数のアミノ酸残基を維持するのが有利である、置換である。一部のアミノ酸残基について、好ましい改変は、欠失である。欠失である好ましい改変の例は、２型ＶＬＰの１１０４位（すなわち、ＶＰ１の残基１０４）、又は１型若しくは３型ＶＬＰの対応する位置におけるロイシン残基の欠失である（表２を参照のこと）。
【００８２】
本発明のＶＬＰは、以下の表１、２又は３に列挙された位置のうちの１又は２以上における、１若しくは２以上、２若しくは３以上、３若しくは４以上、４若しくは５以上、５若しくは６以上、６若しくは７以上、７若しくは８以上、８若しくは９以上、９若しくは１０以上、１０若しくは１１以上、若しくはそれより多い改変、又はこれらの任意の組合せ、並びに以下の表１、２又は３に列挙された位置における、好ましくは少なくとも４つの改変、より好ましくは少なくとも５つの改変及びさらにより好ましくは少なくとも６つの改変を含んでもよい。特に、本発明のＶＬＰは、以下の表１、２又は３に列挙された特定の改変のうちの１若しくは２以上、２若しくは３以上、３若しくは４以上、４若しくは５以上、５若しくは６以上、６若しくは７以上、７若しくは８以上、８若しくは９以上、９若しくは１０以上、１０若しくは１１以上、又はそれより多く、又はこれらの任意の組合せ、並びに以下の表１、２又は３に列挙された位置における、好ましくは少なくとも４つの改変、より好ましくは少なくとも５つの改変及びさらにより好ましくは少なくとも６つの改変を含んでもよい。あるいは又はさらに、本発明のＶＬＰは、本明細書に記載されている本発明の方法によって特定される任意の改変であってもよい、１又は２以上の追加の安定化する改変を含んでもよい。
【００８３】
本発明のＶＬＰは、典型的には、プロトマー界面に少なくとも１つの（好ましくは、１又は２つの）改変及び／又はペンタマー界面に少なくとも１つの（好ましくは、１又は２つの）改変を含み、ポケットドメインに少なくとも１つの（好ましくは、１又は２つの）改変を有してもよい。前記ＶＬＰは、以下の表１、２又は３に列挙された位置のうちの１又は２以上における、１若しくは２以上の追加の改変、又はこれらの任意の組合せ、例えば、ＶＰ２／ＶＰ３界面における少なくとも１つの（好ましくは、１つの）改変及び／又は内部ネットワークにおける少なくとも１つの（好ましくは、１、２又は３つの）改変及び／又はキャニオンドメインにおける少なくとも１つの（好ましくは、１つの）改変をさらに含んでもよい。
【００８４】
本発明の１型ＶＬＰは、ＶＬＰが誘導されるポリオウイルス粒子に対して、以下の表１に列挙された位置のうちの１又は２以上における、１若しくは２以上、２若しくは３以上、３若しくは４以上、４若しくは５以上、５若しくは６以上、６若しくは７以上、７若しくは８以上、８若しくは９以上、９若しくは１０以上、１０若しくは１１以上、又はそれより多い改変を含んでもよい。これらの位置のうちのいずれか１つにおける特定の変異は、以下の表１に与えられるものであってもよい。
【００８５】
本発明の１型ＶＬＰは、以下の表１に提示される本開示のアミノ酸位のいずれかの組合せにおいて改変のいずれかの組合せを含んでもよく、但し、改変の組合せが、ポリオワクチンとして使用するのに適するようにするために必要な特性（例えば、安定性、抗原性及び／又は免疫原性）を有するＶＬＰを生じることを条件とする。一部の実施形態では、ＶＬＰは、前記ＶＬＰにおける改変の総数にかかわらず、任意の特定領域に最大２つの改変を含んでもよい。本発明の１型ＶＬＰは、例えば、以下の表１に列挙されたペンタマー界面の位置のいずれかにおいて、ペンタマー界面に複数の改変、例えば、ペンタマー界面に少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ若しくはそれより多い改変、又はそれらの任意の組合せ、好ましくは、以下の表１に列挙されたペンタマー界面における特定の変異のいずれか、又はそれらの任意の組合せを含んでもよい。
【００８６】
本発明の１型ＶＬＰは、典型的には、プロトマー界面に少なくとも１つの改変及びペンタマー界面に少なくとも１つの改変を含み、ポケットドメインに少なくとも１つの改変を含んでもよい。好ましくは、本発明の１型ＶＬＰは、プロトマー界面に少なくとも１つの（好ましくは、１つ又は２つの）改変及び／又はペンタマー界面に少なくとも１つの（好ましくは、１又は２つの）改変、ポケットドメインに少なくとも１つの（好ましくは、１つの）改変及び／又はＶＰ２／ＶＰ３界面に少なくとも１つの（好ましくは、１つの）改変及び／又は内部ネットワークに少なくとも１つの（好ましくは、１つの）改変を含んでもよい。非限定例として、本発明の１型ＶＬＰは、それが誘導されるポリオウイルス粒子に対して、６つの改変：プロトマー界面に２つの改変（例えば、３１１８及び１２４８に）、ペンタマー界面に２つの改変（例えば、２０２５及び２０５７に）、ＶＰ２／ＶＰ３界面に１つの改変（例えば、３１１９に）及び内部ネットワークに１つの改変（例えば、４０１８に）を含んでもよい。さらなる例として、本発明の１型ＶＬＰは、ポケットドメインに（例えば、１１９６に）これら６つの改変及び、さらに、７個の改変を含んでもよい。
【００８７】
【表３】
2020513840.tif 000005
【００８８】
本発明の２型ＶＬＰは、ＶＬＰが誘導されるポリオウイルス粒子に対して、以下の表２に列挙された位置のうちの１又は２以上における、１若しくは２以上、２若しくは３以上、３若しくは４以上、４若しくは５以上、５若しくは６以上、６若しくは７以上、７若しくは８以上、８若しくは９以上、９若しくは１０以上、１０若しくは１１以上、又はそれより多い改変を含んでもよい。これらの位置のうちのいずれか１つにおける特定の変異は、以下の表２に与えられるものであってもよい。
【００８９】
本発明の２型ＶＬＰは、以下の表３に提示される本開示のアミノ酸位のいずれかの組合せにおいて改変のいずれかの組合せを含んでもよく、但し、改変の組合せが、ポリオワクチンとして使用するのに適するようにするために必要な特性（例えば、安定性、抗原性及び／又は免疫原性）を有するＶＬＰを生じることを条件とする。一部の実施形態では、ＶＬＰは、前記ＶＬＰにおける改変の総数にかかわらず、任意の特定領域に最大２つの改変を含んでもよい。本発明の２型ＶＬＰは、例えば、以下の表２に列挙されたポケットドメインの位置のいずれかにおいて、ポケットドメインに複数の改変、例えば、ポケットドメインに少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ若しくはそれより多い改変、又はそれらの任意の組合せ、好ましくは、以下の表２に列挙されたポケットドメインにおける特定の変異のいずれか、又はそれらの任意の組合せを含んでもよい。
【００９０】
本発明の２型ＶＬＰは、典型的には、プロトマー界面に少なくとも１つの改変及びペンタマー界面に少なくとも１つの改変を含む。好ましくは、本発明の２型ＶＬＰは、プロトマー界面に少なくとも１つの（好ましくは、１つの）改変及び／又はペンタマー界面に少なくとも１つの（好ましくは、１又は２つの）改変を含み、ポケットドメインに少なくとも１つの（好ましくは、１又は２つの）改変及び／又は内部ネットワークに少なくとも１つの（好ましくは、１つの）改変を含んでもよい。非限定例として、本発明の２型ＶＬＰは、それが誘導されるポリオウイルス粒子に対して、５つの改変：プロトマー界面に１つの改変（例えば、３１７８に）、ペンタマー界面に２つの改変（例えば、３０８５及び１０４１に）、及びポケットドメインに２つの改変（例えば、１１３４及び１１５９に）を含んでもよい。別の非限定例として、本発明の２型ＶＬＰは、それが誘導されるポリオウイルス粒子に対して、６つの改変：プロトマー界面に２つの改変（例えば、３１７８及び１１０７に）、ペンタマー界面に１つの改変（例えば、２０５７に）、ポケットドメインに２つの改変（例えば、１１３４及び１１８３に）及び内部ネットワークに１つの改変（例えば、４０５７に）を含んでもよい。
【００９１】
【表４】
2020513840.tif 000006
2020513840.tif 000007
【００９２】
本発明の３型ＶＬＰは、ＶＬＰが誘導されるポリオウイルス粒子に対して、以下の表３に列挙された位置のうちの１又は２以上における、１若しくは２以上、２若しくは３以上、３若しくは４以上、４若しくは５以上、５若しくは６以上、６若しくは７以上、７若しくは８以上、８若しくは９以上、９若しくは１０以上、１０若しくは１１以上、又はそれより多い改変を含んでもよい。これらの位置のうちのいずれか１つにおける特定の変異は、以下の表３に与えられるものであってもよい。
【００９３】
本発明の３型ＶＬＰは、以下の表３に提示される本開示のアミノ酸位のいずれかの組合せにおいて改変のいずれかの組合せを含んでもよく、但し、改変の組合せが、ポリオワクチンとして使用するのに適するようにするために必要な特性（例えば、安定性、抗原性及び／又は免疫原性）を有するＶＬＰを生じることを条件とする。一部の実施形態では、ＶＬＰは、前記ＶＬＰにおける改変の総数にかかわらず、任意の特定領域に最大２つの改変を含んでもよい。本発明の３型ＶＬＰは、典型的には、プロトマー界面に少なくとも１つの改変及びペンタマー界面に少なくとも１つの改変を含み、ポケットドメインに少なくとも１つの改変を含んでもよい。好ましくは、本発明の３型ＶＬＰは、プロトマー界面に少なくとも１つの（好ましくは、１つ又は２つの）改変及び／又はペンタマー界面に少なくとも１つの（好ましくは、１又は２つの）改変を含み、ポケットドメインに少なくとも１つの（好ましくは、１つの）改変及び／又はＶＰ２／ＶＰ３界面に少なくとも１つの（好ましくは、１つの）改変及び／又は内部ネットワークに少なくとも１つの（好ましくは、１、２又は３つの）改変及び／又はキャニオンドメインに少なくとも１つの（好ましくは、１つの）改変を含んでもよい。非限定例として、本発明の３型ＶＬＰは、それが誘導されるポリオウイルス粒子に対して、９つの改変：プロトマー界面に２つの改変（例えば、２２１５及び３０９１に）、ペンタマー界面に２つの改変（例えば、２０１８及び３０８５に）、ポケットドメインに１つの改変（例えば、１１３２に）、ＶＰ２／ＶＰ３界面に１つの改変（例えば、２２４１に）、内部ネットワークに２つの改変（例えば、４０６７及び）及びキャニオンドメインに１つの改変（例えば、１１０５に）を含んでもよい。さらなる例では、本発明の３型ＶＬＰは、これらの９つの改変と、さらに、内部ネットワークにさらなる（１０番目の）改変（例えば、１０５４に）を含んでもよい。
【００９４】
【表５】
2020513840.tif 000008
【００９５】
本明細書で定義されるように、本発明のＶＬＰは、好ましくは、ＶＬＰが誘導されるポリオウイルス粒子に対して、少なくとも３つの改変を含み、（ａ）プロトマー界面；及び（ｂ）ペンタマー界面のそれぞれにおいて、少なくとも１つの改変が存在する。非限定例として、本発明のＶＬＰは、（ａ）ポケットドメイン；（ｂ）プロトマー界面；及び（ｃ）ペンタマー界面を含んでもよく；（ａ）〜（ｃ）のそれぞれは、ＶＬＰが誘導されるポリオウイルス粒子に対して、少なくとも１つの改変を含む。前記改変は、本明細書で特定される、特に、表１〜３のいずれか１つにおける改変の任意の組合せであってもよい。さらに好ましくは、本発明のＶＬＰは、ＶＬＰが誘導されるポリオウイルス粒子に対して、少なくとも４つの、さらにより好ましくは少なくとも５つの及びさらにより好ましくは少なくとも６つの改変を含み；前記改変は、プロトマー界面に少なくとも１つの改変及びペンタマー界面に少なくとも１つの改変を含み、ポケットドメインに少なくとも１つの改変を含んでよい。再度、前記改変は、本明細書で特定される、特に、表１〜３のいずれか１つにおける改変のいずれかの組合せであってもよい。
【００９６】
例えば、プロトマー界面は、アミノ酸残基３１０８（１又は２型）、３１７８（１、２又は３型）、１１０１（１型）、１１６８（１型）、１２３１（１又は２型）、１２３２（１又は２型）、１２３６（１型）、１２４７（１型）、１２４８（１型）、２１３９（２型）、３１４１（２型）、３１７５（２型）、３１８０（２型）、３１８４（２型）、３２２９（２型）、１０３０（２型）、１０４１（２型）、１０６７（２型）、１１０４（２型）、１１０７（２型）、１１６０（２型）、１１７９（２型）、１１９９（２型）、１２２２（２型）、１２２３（２型）、１２３４（２型）、２２１５（３型）、３０９１（３型）、３１９０（３型）、１０７５（３型）、１１８１（３型）、１１９９（３型）及び／若しくは１１５５、又はそれに対応するアミノ酸残基のうちの１又は２以上において改変を含んでもよい。好ましくは、プロトマー界面は、アミノ酸残基１２４８、すなわち、ＶＰ１の残基２４８（１型）、２２１５、すなわち、ＶＰ２の残基２１５（３型）、３１７８、すなわち、ＶＰ３の残基１７８（１及び２型）、１１０７、すなわち、ＶＰ１の残基１０７（２型）及び／若しくは３０９１、すなわち、ＶＰ３の残基９１（３型）、又はそれに対応するアミノ酸残基のうちの１又は２つにおいて改変を含んでもよい。
【００９７】
例えば、ペンタマー界面は、アミノ酸残基２０１４（１又は２型）、２０２５（１型）、２０５７（１型）、２０６７（１型）、２２５１（１又は２型）、２２５２（１型）、１０４０（１型）、１０４１（１型）、２０１３（２型）、２０５７（２型）、２２４６（２型）、３０７３（２型）、３０８５（２又は３型）、３１４１（２型）、１０３９（２型）、２０１６（３型）、２０１８（３型）、３１９０（３型）及び／若しくは１０３４（３型）、又はそれに対応するアミノ酸残基のうちの１又は２以上において改変を含んでもよい。好ましくは、ペンタマー界面は、アミノ酸残基１０４１、すなわち、ＶＰ１の残基４１（２型）、２０１８、すなわち、ＶＰ２の残基１８（３型）、２０２５、すなわち、ＶＰ２の残基２５（１型）、２０５７、すなわち、ＶＰ２の残基５７（１及び２型）、３０８５、すなわち、ＶＰ３の残基８５（２及び３型）、又はそれに対応するアミノ酸残基のうちの１又は２以上において改変を含んでもよい。
【００９８】
本発明は、上記アミノ酸残基のうちのいずれかにおいて改変を含むＶＬＰを包含し、但し、プロトマー界面とペンタマー界面のそれぞれにおいて、少なくとも１つの改変、好ましくは少なくとも１つの変異（アミノ酸置換）が存在することを条件とする。
【００９９】
ポケットドメインが１又は２以上の改変を含む実施形態では、前記１又は２以上の改変は、アミノ酸残基１１９６（１型）、１１３４（２型）、１１５９（２型）、１１８３（２型）、１１９４（２型）、１１３２（３型）及び／若しくは１２６０（３型）、又はそれに対応するアミノ酸残基のうちの１又は２以上において改変を含んでもよい。好ましくは、このような実施形態では、ポケットドメインは、アミノ酸残基１１３２、すなわち、ＶＰ１の残基１３２（３型）、１１３４、すなわち、ＶＰ１の残基１３４（２型）、１１５９、すなわち、ＶＰ１の残基１５９（２型）、残基１１８３、すなわち、ＶＰ１の残基１８３（２型）及び／若しくは１１９６、すなわち、ＶＰ１の残基１９６（１型）、又はそれに対応するアミノ酸残基のうちの１又は２以上において改変を含む。
【０１００】
好ましい実施形態では、ＶＬＰは、１型ポリオウイルスから誘導され、（ａ）プロトマー界面は、残基３１７８（すなわち、ＶＰ３の残基１７８）と１２４８（すなわち、ＶＰ１の残基２４８）若しくはそれに対応する残基のうちの一方若しくは両方において変異を含み；及び／又は（ｂ）ペンタマー界面は、残基２０２５（すなわち、ＶＰ２の残基２５）と２０５７（すなわち、ＶＰ２の残基５７）若しくはそれに対応する残基のうちの一方若しくは両方において変異を含む。特に好ましい実施形態では、プロトマー界面は、変異Ｑ３１７８ＬとＨ１２４８Ｐのうちの一方若しくは両方を含み；及び／又はペンタマー界面は、変異Ｔ２０２５ＡとＤ２０５７Ｅのうちの一方若しくは両方を含む。ＶＬＰが１型ポリオウイルスから誘導され、ポケットドメインがまた、１又は２以上の改変を含む実施形態では、前記改変は、好ましくは、残基１１９６（すなわち、ＶＰ１の残基１９６）又はそれに対応する残基において変異を含み；より好ましくは、ポケットドメインが、変異Ｖ１１９６Ｌを含む。
【０１０１】
別の好ましい実施形態では、ＶＬＰは、２型ポリオウイルスから誘導され、（ａ）プロトマー界面は、残基３１７８（すなわち、ＶＰ３の残基１７８）と１１０７（すなわち、ＶＰ１の残基１０７）若しくはそれに対応する残基のうちの一方若しくは両方において変異を含み；並びに／又は（ｂ）ペンタマー界面は、残基３０８５（すなわち、ＶＰ３の残基８５）、１０４１（すなわち、ＶＰ１の残基４１）及び２０５７（すなわち、ＶＰ２の残基５７）若しくはそれに対応する残基のうちの１又は２以上において変異を含む。特に好ましい実施形態では、プロトマー界面は、変異Ｑ３１７８ＬとＶ１１０Ｉのうちの一方若しくは両方を含み；並びに／又はペンタマー界面は、変異Ｌ３０８５Ｆ、Ｔ１０４１Ｉ及びＤ２０５７Ａのうちの１又は２以上を含む。ＶＬＰが２型ポリオウイルスから誘導され、ポケットドメインがまた、１又は２以上の改変を含む実施形態では、前記改変は、好ましくは、残基１１３４（すなわち、ＶＰ１の残基１３４）、１１５９（すなわち、ＶＰ１の残基１５９）及び１１８３（すなわち、ＶＰ１の残基１８３）又はそれに対応する残基のうちの１又は２以上において変異を含み；より好ましくは、ポケットドメインが、変異Ｆ１１３４Ｌ、Ｙ１１５９Ｆ及びＶ１１８３Ｌのうちの１又は２以上を含む。特に好ましい実施形態では、プロトマー界面は、残基３１７８（例えば、Ｑ３１７８Ｌ）において改変を含み、及び／又はペンタマー界面は、両残基１０４１（例えば、Ｔ１０４１Ｉ）及び３０８５（例えば、Ｌ３０８５Ｆ）において改変を含み、並びに、ポケットドメインはまた、両残基１１３４（例えば、Ｆ１１３４Ｌ）及び１１５９（例えば、Ｙ１１５９Ｆ）において改変を含んでもよい。別の特に好ましい実施形態では、プロトマー界面は、両残基３１７８（例えば、Ｑ３１７８Ｌ）及び１１０７（例えば、Ｖ１１０７Ｉ）において改変を含み、並びに／又はペンタマー界面は、残基２０５７（例えば、Ｄ２０５７Ａ）において改変を含み、並びにポケットドメインはまた、両残基１１３４（例えば、Ｆ１１３４Ｌ）及び１１８３（例えば、Ｖ１１８３Ｌ）において改変を含んでもよい。
【０１０２】
別の好ましい実施形態では、ＶＬＰは、３型ポリオウイルスから誘導され、（ａ）プロトマー界面は、残基２２１５（すなわち、ＶＰ２の残基２１５）と３０９１（すなわち、ＶＰ３の残基９１）若しくはそれに対応する残基のうちの一方若しくは両方において変異を含み；及び／又は（ｃ）ペンタマー界面は、残基２０１８（すなわち、ＶＰ２の残基１８）と３０８５（すなわち、ＶＰ３の残基８５）若しくはそれに対応する残基のうちの一方若しくは両方において変異を含む。特に好ましい実施形態では、プロトマー界面は、変異Ｌ２２１５ＭとＦ３０９１Ｓのうちの一方若しくは両方を含み；及び／又はペンタマー界面は、変異Ｌ２０１８ＩとＬ３０８５Ｆのうちの一方若しくは両方を含む。ＶＬＰが３型ポリオウイルスから誘導され、ポケットドメインがまた、１若しくは２以上の改変を含む実施形態では、前記改変は、好ましくは、残基１１３２（すなわち、ＶＰ１の残基１３２）又はそれに対応する残基において変異を含み；より好ましくは、ポケットドメインが、変異Ｆ１１３２Ｌを含む。残基３０９１（すなわち、ＶＰ３の残基９１）における安定化する変異の場合には、安定化する変異は、ＶＬＰが誘導される３型ポリオウイルスに存在してもよく、又は本発明の方法によりＶＬＰへと導入されてもよい。例えば、３型ポリオウイルスであるＬｅｏｎ及びＳａｕｋｅｔｔは、残基３０９１においてセリンを含み、一方、Ｓａｂｉｎ  ３ポリオウイルスは、この位置においてフェニルアラニンを有する。３０９１Ｆは、Ｓａｂｉｎ  ３ポリオウイルスを温度感受性にし、すなわち、その作用を不安定化するものであり、一方、３０９１Ｓは、安定化するものである。したがって、本発明のＶＬＰは、３０９１Ｆ（例えば、Ｓａｂｉｎ  ３）を含む株から作製され、安定化する変異（例えば、Ｆ３０９１Ｓ）が導入されてもよい。代案では、Ｌｅｏｎ又はＳａｕｋｅｔｔから出発して、安定化する残基３０９１Ｓが既に存在する。残基３０９１における安定化する変異に対して本明細書において言及される場合、これは、安定化する残基が、元のポリオウイルス株に存在するか、又は本発明に従って、変異が導入されるＶＬＰを包含する。同じことが、一部のポリオウイルス（１、２又は３型）株のアミノ酸を安定化するが、他のものの変異を不安定化することを含み得る他の位置についても当てはまる。それぞれの場合には、所望の残基における安定化する変異に対して本明細書において言及される場合、これは、安定化する残基が元のポリオウイルス株に存在するか、又は本発明に従って、変異が導入されるＶＬＰを包含する。さらなる非限定例として、Ｓａｕｋｅｔｔ  ３型ポリオウイルスは、位置１０５４における安定化するバリン残基を含み、一方、Ｌｅｏｎ及びＳａｂｉｎ  ３  ３型ポリオウイルスは含まない。本発明の３型ＶＬＰが、位置１０５４における変異を安定化することを含むこの例では、これは、安定化する１０５４Ｖを既に包含するＳａｕｋｅｔｔから誘導されるＶＬＰ及び安定化する変異Ａ１０５４Ｖが導入されるＬｅｏｎ又はＳａｂｉｎ  ３から誘導されるＶＬＰも包含する。
【０１０３】
上述の特定のアミノ酸残基に加えて、本発明のＶＬＰは、プロトマー界面、ペンタマー界面及び／又はポケットドメインのうちの１又は２以上内に１又は２以上の追加の改変を含んでもよい。
【０１０４】
さらに、プロトマー界面とペンタマー界面のそれぞれにおいて少なくとも１つの改変を含むことと同様に、本発明のＶＬＰは、１又は２以上の追加の構造ドメインに、少なくとも１つのさらなる改変を含んでもよい。典型的には、前記１又は２以上追加の構造ドメインは、本明細書に記載されているポケットドメイン、ＶＰ２／ＶＰ３界面、内部ネットワーク及び／又はキャニオンから選択されるが、外部のくぼみ、ＶＰ１／ＶＰ２界面又は本明細書で定義される他のドメイン内に改変を含んでもよい。ＶＬＰが、内部ネットワークに１又は２以上のさらなる改変を含む場合、前記内部ネットワークは、三回軸付近の、異なるカプシドタンパク質から誘導されるポリペプチド鎖、及び／又は五回軸下のベータアニュラス（管様構造）の間の相互作用を含んでもよく、前記少なくとも１つのさらなる改変が、前記三回軸、五回軸、及び／又は五回軸下の管に又はそれと近接して位置していてもよい。
【０１０５】
ＶＬＰが１型ポリオウイルスから誘導される本発明の態様では、１又は２以上の追加の構造ドメインにおける前記少なくとも１つのさらなる改変は、（ａ）ＶＰ２／ＶＰ３界面の残基３１１９（すなわち、ＶＰ３の残基１１９）若しくはそれに対応する残基における変異；及び／又は（ｂ）内部ネットワークの残基４０１８（すなわち、ＶＰ４の残基１８）若しくはそれに対応する残基における変異；及び／又は（ｃ）ポケットドメインの残基１１９６（すなわち、ＶＰ１の残基１９６）若しくはそれに対応する残基における変異から選択されてもよい。好ましい実施形態では、ＶＰ２／ＶＰ３界面は、変異Ｌ３１１９Ｍを含み；及び／又は内部ネットワークは、変異Ｒ４０１８Ｇを含み；及び／又はポケットドメインは、変異Ｖ１１９６Ｌを含む。
【０１０６】
ＶＬＰが２型ポリオウイルスから誘導される本発明の態様では、１又は２以上の追加の構造ドメインにおける前記少なくとも１つのさらなる改変は、内部ネットワークの残基４０５７（すなわち、ＶＰ４の残基５７）又はそれに対応する残基における変異であってもよい。好ましい実施形態では、内部ネットワークは、変異Ｉ４０５７Ｖを含む。
【０１０７】
ＶＬＰが３型ポリオウイルスから誘導される本発明の態様では、１又は２以上の追加の構造ドメインにおける前記少なくとも１つのさらなる改変は、（ａ）ＶＰ２／ＶＰ３界面の残基２２４１（すなわち、ＶＰ２の残基２４１）若しくはそれに対応する残基における変異；（ｂ）内部ネットワークの残基１０５４（すなわち、ＶＰ１の残基５４）、４０６７（すなわち、ＶＰ４の残基６７）及び３０１９（すなわち、ＶＰ３の残基１９）若しくはそれに対応する残基のうちの１若しくは２以上における変異；並びに／又は（ｃ）キャニオンの残基１１０５（すなわち、ＶＰ１の残基１０５）若しくはそれに対応する残基における変異；及び／又は（ｄ）ポケットドメインの残基１１３２（すなわち、ＶＰ１の残基１３２）若しくはそれに対応する残基における変異から選択されてもよい。好ましい実施形態では、ＶＰ２／ＶＰ３界面は、変異Ｄ２２４１Ｅを含み；内部ネットワークは、変異Ａ１０５４Ｖ、Ｔ４０６７Ａ及びＨ３０１９Ｙのうちの１若しくは２以上を含み；並びに／又はキャニオンは、変異Ｔ１１０５Ｍを含み；並びに／又はポケットドメインは、変異Ｆ１１３２Ｌを含む。
【０１０８】
典型的には、ＶＰ２／ＶＰ３界面、内部ネットワーク、キャニオン及び／又はポケットドメインにおける上述の改変は、本明細書に記載されているプロトマー界面及び／又はペンタマー界面における改変に加えて存在する。好ましい実施形態では、本発明のＶＬＰは、本明細書に記載されているプロトマー界面及び／若しくはペンタマー界面、又はこれらの組合せ内の好ましいアミノ酸残基における少なくとも１つの改変、並びに本明細書に記載されているＶＰ２／ＶＰ３界面、内部ネットワーク、キャニオン及び／又はポケットドメイン内の好ましいアミノ酸残基のうちの１つにおける少なくとも１つのさらなる改変を含む。特に好ましい実施形態では、本発明のＶＬＰは、本明細書に記載されているプロトマー界面及び／若しくはペンタマー界面、又はこれらの組合せ内の好ましいアミノ酸残基における好ましいアミノ酸変異のうちの少なくとも１つ、並びに本明細書に記載されているＶＰ２／ＶＰ３界面、内部ネットワーク、キャニオン及び／又はポケットドメインの好ましいアミノ酸残基のうちの１つにおける少なくとも１つのさらに好ましいアミノ酸変異を含む。ＶＬＰの特定されたドメインのいずれかにおける本明細書に記載の好ましいアミノ酸残基における改変、特に、アミノ酸変異／置換の任意及びすべての組合せは、本発明によって包含される。非限定例として、本発明のＶＬＰは、１型ポリオウイルスから誘導され、（ｉ）プロトマー界面に残基３１７８及び１２４８、（ii）ペンタマー界面に残基２０２５及び２０５７、並びにまた、（iii）ポケットドメインに残基１１９６、（iv）ＶＰ２／ＶＰ３界面に残基３１１９、並びに（ｖ）内部ネットワークに残基４０１８における改変、特に、（ｉ）プロトマー界面に変異Ｑ３１７８Ｌ及びＨ１２４８Ｐ、（ii）ペンタマー界面に変異Ｔ２０２５Ａ及びＤ２０５７Ｅ、並びにまた、（iii）ポケットドメインに変異Ｖ１１９６Ｌ、（iv）ＶＰ２／ＶＰ３界面に変異Ｌ３１１９Ｍ、並びに（ｖ）内部ネットワークに変異Ｒ４０１８Ｇを含んでもよい。好ましい実施形態では、本発明のＶＬＰは、１型ポリオウイルスに由来し、（ｉ）プロトマー界面にＱ３１７８Ｌ及びＨ１２４８Ｐ、（ii）ペンタマー界面に変異Ｔ２０２５Ａ及びＤ２０５７Ｅ、（iii）ＶＰ２／ＶＰ３界面に変異Ｌ３１１９Ｍ、（iv）内部ネットワークに変異Ｒ４０１８Ｇ、並びに、（ｖ）ポケットドメインに変異Ｖ１１９６Ｌを含んでもよい。
【０１０９】
本発明による１型ポリオウイルスから誘導されるＶＬＰの他の非限定例は、以下の変異又は変異の組合せを有してもよい：（ｉ）内部ネットワークの変異（例えば、残基４０１８、好ましくは、Ｒ４０１８Ｇにおける）及びペンタマー界面の変異（例えば、残基２０２５、好ましくは、Ｔ２０２５Ａにおける又は残基２０５７、好ましくは、Ｄ２０５７Ｅにおける）；（ii）内部ネットワークの変異（例えば、残基４０１８、好ましくは、Ｒ４０１８Ｇにおける）及びペンタマー界面の２つの変異（例えば、残基２０２５及び２０５７、好ましくは、Ｔ２０２５Ａ及びＤ２０５７Ｅにおける）；（iii）内部ネットワークの変異（例えば、残基３１１９、好ましくは、Ｌ３１１９Ｍにおける）及びプロトマー界面の３つの変異（例えば、残基３１７８、好ましくは、Ｑ３１７８Ｌにおける、残基１２３１、好ましくは、Ａ１２３１Ｖにおける及び残基１２４８、好ましくは、Ｈ１２５８Ｐにおける）；（iv）内部ネットワークの変異（例えば、残基４０１８、好ましくは、Ｒ４０１８Ｇにおける）、ペンタマー界面の２つの変異（例えば、残基２０２５及び２０５７、好ましくは、Ｔ２０２５Ａ及びＤ２０５７Ｅにおける）及びプロトマー界面の２つの変異（例えば、残基３１７８、好ましくは、Ｑ３１７８Ｌにおける及び残基１２４８、好ましくは、Ｈ１２５８Ｐにおける）；（ｖ）内部ネットワークの変異（例えば、残基４０１８、好ましくは、Ｒ４０１８Ｇにおける）、ペンタマー界面の２つの変異（例えば、残基２０２５及び２０５７、好ましくは、Ｔ２０２５Ａ及びＤ２０５７Ｅにおける）、プロトマー界面の２つの変異（例えば、残基３１７８、好ましくは、Ｑ３１７８Ｌにおける及び残基１２４８、好ましくは、Ｈ１２５８Ｐにおける）及びポケットドメインの変異（例えば、残基１１９６、好ましくは、Ｖ１１９６Ｌにおける）；（vi）内部ネットワークの変異（例えば、残基４０１８、好ましくは、Ｒ４０１８Ｇにおける）、ペンタマー界面の２つの変異（例えば、残基２０２５及び２０５７、好ましくは、Ｔ２０２５Ａ及びＤ２０５７Ｅにおける）、及びプロトマー界面の３つの変異（例えば、残基３１７８、好ましくは、Ｑ３１７８Ｌにおける、残基１２３１、好ましくは、Ａ１２３１Ｖにおける及び残基１２４８、好ましくは、Ｈ１２５８Ｐにおける）；（vii）内部ネットワークの変異（例えば、残基４０１８、好ましくは、Ｒ４０１８Ｇにおける）、ペンタマー界面の２つの変異（例えば、残基２０２５及び２０５７、好ましくは、Ｔ２０２５Ａ及びＤ２０５７Ｅにおける）、プロトマー界面の２つの変異（例えば、残基３１７８、好ましくは、Ｑ３１７８Ｌにおける及び残基１２４８、好ましくは、Ｈ１２５８Ｐにおける）及び内部ネットワークの変異（例えば、残基３１１９、好ましくは、Ｌ３１１９Ｍにおける）；（viii）内部ネットワークの２つの変異（例えば、残基４０１８、好ましくは、Ｒ４０１８Ｇにおける及び残基３１１９、好ましくは、Ｌ３１１９Ｍにおける）、ペンタマー界面の変異（例えば、残基２０２５、好ましくは、Ｔ２０２５Ａにおける又は残基２０５７、好ましくは、Ｄ２０５７Ｅにおける）、プロトマー界面の３つの変異（例えば、残基３１７８、好ましくは、Ｑ３１７８Ｌ��おける、残基１２３１、好ましくは、Ａ１２３１Ｖにおける及び残基１２４８、好ましくは、Ｈ１２５８Ｐにおける）；（ix）内部ネットワークの２つの変異（例えば、残基４０１８、好ましくは、Ｒ４０１８Ｇにおける及び残基３１１９、好ましくは、Ｌ３１１９Ｍにおける）、ペンタマー界面の２つの変異（例えば、残基２０２５及び２０５７、好ましくは、Ｔ２０２５Ａ及びＤ２０５７Ｅにおける）、プロトマー界面の２つの変異（例えば、残基３１７８、好ましくは、Ｑ３１７８Ｌにおける及び残基１２４８、好ましくは、Ｈ１２５８Ｐにおける）及びポケットドメインの変異（例えば、残基１１９６、好ましくは、Ｖ１１９６Ｌにおける）；（ｘ）内部ネットワークの２つの変異（例えば、残基４０１８、好ましくは、Ｒ４０１８Ｇにおける及び残基３１１９、好ましくは、Ｌ３１１９Ｍにおける）、ペンタマー界面の２つの変異（例えば、残基２０２５及び２０５７、好ましくは、Ｔ２０２５Ａ及びＤ２０５７Ｅにおける）、及びプロトマー界面の３つの変異（例えば、残基３１７８、好ましくは、Ｑ３１７８Ｌにおける、残基１２３１、好ましくは、Ａ１２３１Ｖにおける、及び残基１２４８、好ましくは、Ｈ１２５８Ｐにおける）；（xi）内部ネットワークの２つの変異（例えば、残基４０１８、好ましくは、Ｒ４０１８Ｇにおける及び残基３１１９、好ましくは、Ｌ３１１９Ｍにおける）、ペンタマー界面の変異（例えば、残基２０２５、好ましくは、Ｔ２０２５Ａにおける又は残基２０５７、好ましくは、Ｄ２０５７Ｅにおける）、プロトマー界面の３つの変異（例えば、残基３１７８、好ましくは、Ｑ３１７８Ｌにおける、残基１２３１、好ましくは、Ａ１２３１Ｖにおける及び残基１２４８、好ましくは、Ｈ１２５８Ｐにおける）及びポケットドメインの変異（例えば、残基１１９６、好ましくは、Ｖ１１９６Ｌにおける）；及び（xii）内部ネットワークの２つの変異（例えば、残基４０１８、好ましくは、Ｒ４０１８Ｇにおける及び残基３１１９、好ましくは、Ｌ３１１９Ｍにおける）、ペンタマー界面の２つの変異（例えば、残基２０２５及び２０５７、好ましくは、Ｔ２０２５Ａ及びＤ２０５７Ｅにおける）、プロトマー界面の３つの変異（例えば、残基３１７８、好ましくは、Ｑ３１７８Ｌにおける、残基１２３１、好ましくは、Ａ１２３１Ｖにおける、及び残基１２４８、好ましくは、Ｈ１２５８Ｐにおける）及びポケットドメインの変異（例えば、残基１１９６、好ましくは、Ｖ１１９６Ｌにおける）。
【０１１０】
別の非限定例として、本発明のＶＬＰは、２型ポリオウイルスから誘導され、（ｉ）プロトマー界面残基３１７８、及び（ii）ペンタマー界面の残基３０８５及び１０４１、並びに、（iii）ポケットドメインの残基１１３４及び１１５９における改変、特に、（ｉ）プロトマー界面の変異Ｑ３１７８Ｌ、並びに（ii）ペンタマー界面の変異Ｌ３０８５Ｆ及びＴ１０４１Ｉ、並びに、（iii）ポケットドメインの変異Ｆ１１３４Ｌ及びＹ１１５９Ｆを含んでもよい。あるいは、本発明のＶＬＰは、２型ポリオウイルスから誘導される、（ｉ）プロトマー界面の残基３１７８及び１１０７、並びに（ii）ペンタマー界面の残基２０５７、並びに、（iii）ポケットドメインの残基１１３４及び１１８３並びに（iv）内部ネットワークに残基４０５７における改変、特に、（ｉ）プロトマー界面の変異Ｑ３１７８Ｌ及びＶ１１０７Ｉ、並びに（ii）ペンタマー界面の変異Ｄ２０５７Ａ、並びに、（iii）ポケットドメインの変異Ｆ１１３４Ｌ及びＶ１１８３Ｌ並びに（iv）内部ネットワークの変異Ｉ４０５７Ｖを含んでもよい。
【０１１１】
本発明による２型ポリオウイルスから誘導されるＶＬＰの他の非限定例は、以下の変異又は変異の組合せを有してもよい：（ｉ）ポケットドメインの２つの変異（例えば、残基１１３４、好ましくは、Ｆ１１３４Ｌ、１１５９、好ましくは、Ｙ１１５９Ｆ、１１８３、好ましくは、Ｖ１１８３Ｌ及び１１９４好ましくは、Ｉ１１９４Ｖのうちのいずれか２つにおける、好ましくは、残基１１３４及び１１５９又は残基１１３４及び１１９４における）；（ii）ポケットドメインの３つの変異（例えば、残基１１３４、好ましくは、Ｆ１１３４Ｌ、１１５９、好ましくは、Ｙ１１５９Ｆ、１１８３、好ましくは、Ｖ１１８３Ｌ及び１１９４、好ましくは、Ｉ１１９４Ｖのうちのいずれか３つにおける、好ましくは、残基１１３４、１１５９及び１１９４における）；（iii）ペンタマー界面の２つの変異（例えば、残基３０８５、好ましくは、Ｌ３０８５Ｆにおける及び残基１０４１、好ましくは、Ｔ１０４１Ｉにおける）及びプロトマー界面の変異（例えば、残基３１７８、好ましくは、Ｑ３１７８Ｌにおける）；（iv）ペンタマー界面の変異（例えば、残基１０４１、好ましくは、Ｔ１０４１における）、プロトマー界面の変異（例えば、残基３１７８、好ましくは、Ｑ３１７８Ｌにおける）及びポケットドメインの変異（例えば、残基１１３４、好ましくは、Ｆ１１３４Ｌにおける）；（ｖ）ペンタマー界面の２つの変異（例えば、残基３０８５、好ましくは、Ｌ３０８５Ｆにおける及び残基１０４１、好ましくは、Ｔ１０４１Ｉにおける）、プロトマー界面の変異（例えば、残基３１７８、好ましくは、Ｑ３１７８Ｌにおける）及びポケットドメインの変異（例えば、残基１１３４、好ましくは、Ｆ１１３４Ｌにおける）；（vi）ペンタマー界面の変異（例えば、残基１０４１、好ましくは、Ｔ１０４１Ｉにおける）、プロトマー界面の変異（例えば、残基３１７８、好ましくは、Ｑ３１７８Ｌにおける）及びポケットドメインの２つの変異（例えば、残基１１３４、好ましくは、Ｆ１１３４Ｌにおける及び残基１１５９、好ましくは、Ｙ１１５９Ｆにおける）；（vii）ペンタマー界面の２つの変異（例えば、残基３０８５、好ましくは、Ｌ３０８５Ｆにおける及び残基１０４１、好ましくは、Ｔ１０４１Ｉにおける）、プロトマー界面の変異（例えば、残基３１７８、好ましくは、Ｑ３１７８Ｌにおける）及びポケットドメインの２つの変異（例えば、残基１１３４、好ましくは、Ｆ１１３４Ｌにおける及び残基１１５９、好ましくはＹ１１５９Ｆにおける）；（viii）ペンタマー界面の変異（例えば、残基１０４１、好ましくは、Ｔ１０４１Ｉにおける）、プロトマー界面の変異（例えば、残基３１７８、好ましくは、Ｑ３１７８Ｌにおける）及びポケットドメインの３つの変異（例えば、残基１１３４、好ましくは、Ｆ１１３４Ｌにおける、残基１１５９、好ましくは、Ｙ１１５９Ｆにおける及び残基１１９４、好ましくは、Ｉ１１９４Ｖにおける）；（ix）ペンタマー界面の２つの変異（例えば、残基３０８５、好ましくは、Ｌ３０８５Ｆにおける及び残基１０４１、好ましくは、Ｔ１０４１Ｉにおける）、プロトマー界面の変異（例えば、残基３１７８、好ましくは、Ｑ３１７８Ｌにおける）及びポケットドメインの３つの変異（例えば、残基１１３４、好ましくは、Ｆ１１３４Ｌにおける、残基１１５９、好ましくは、Ｙ１１５９Ｆにおける及び残基１１９４、好ましくは、Ｉ１１９４Ｖにおける）；及び（ｘ）ペンタマー界面の変異（例えば、残基２０５７、好ましくは、Ｄ２０５７Ａにおける）、プロトマー界面の２つの変異（例えば、残基３１７８、好ましくは、Ｑ３１７８Ｌにおける及び残基１１０７、好ましくは、Ｖ１１０７Ｉにおける）、ポケットドメインの２つの変異（例えば、残基１１３４、好ましくは、Ｆ１１３４Ｌにおける及び残基１１８３、好ましくは、Ｖ１１８３Ｌにおける）及び内部ネットワークの変異（例えば、残基４０５７、好ましくは、Ｉ４０５７Ｖにおける）。
【０１１２】
さらなる非限定例では、本発明のＶＬＰは、３型ポリオウイルスから誘導され、（ｉ）プロトマー界面の残基２２１５及び３０９１、（ii）ペンタマー界面の残基２０１８及び３０８５、並びに、（iii）ポケットドメインの残基１１３２、（iv）ＶＰ２／ＶＰ３界面の残基２２４１、（ｖ）内部ネットワークの残基４０６７、３０１９及び１０５４、並びに（vi）キャニオンの残基１１０５における改変、特に、（ｉ）プロトマー界面の変異Ｌ２２１５Ｍ及びＦ３０９１Ｓ、（ii）ペンタマー界面の変異Ｌ２０１８Ｉ及びＬ３０８５Ｆ、並びに、（iii）ポケットドメインの変異Ｆ１１３２Ｌ、（iv）ＶＰ２／ＶＰ３界面の変異Ｄ２２４１Ｅ、（ｖ）内部ネットワークの変異Ｔ４０６７Ａ、Ｈ３０１９Ｙ及びＡ１０５４Ｖ、並びに（vi）キャニオンの変異Ｔ１１０５Ｍを含んでもよい。好ましい実施形態では、本発明のＶＬＰは、３型ポリオウイルスから誘導され、（ｉ）プロトマー界面の変異Ｌ２２１５Ｍ及びＦ３０９１Ｓ、（ii）ペンタマー界面の変異Ｌ２０１８Ｉ及びＬ３０８５Ｆ、（iii）ポケットドメインの変異Ｆ１１３２Ｌ、（iv）ＶＰ２／ＶＰ３界面の変異Ｄ２２４１Ｅ、（ｖ）内部ネットワークの変異Ｔ４０６７Ａ、Ｈ３０１９Ｙ及び、Ａ１０５４Ｖ、並びに（vi）キャニオンの変異Ｔ１１０５Ｍを含んでもよい。
【０１１３】
本発明による３型ポリオウイルスから誘導されるＶＬＰの別の非限定例は、以下の変異の組合せを有してもよい：（ｉ）ペンタマー界面の２つの変異（例えば、残基２０１８、好ましくは、Ｌ２０１８Ｉにおける及び残基３０８５、好ましくは、Ｌ３０８５Ｆにおける）、プロトマー界面の変異（例えば、残基２２１５、好ましくは、Ｌ２２１５Ｍにおける）、内部ネットワークの２つの変異（例えば、残基４０６７、好ましくは、Ｔ４０６７Ａにおける及び残基３０１９、好ましくは、Ｈ３０１９Ｙにおける）、ＶＰ２／ＶＰ３界面の変異（例えば、残基２２４１、好ましくは、Ｄ２２４１Ｅにおける）、ポケットドメインの変異（例えば、残基１１３２、好ましくは、Ｆ１１３２Ｌにおける）及びキャニオンドメインの変異（例えば、残基１１０５、好ましくは、Ｔ１１０５Ｍにおける）。
【０１１４】
上記特定のアミノ酸残基に加えて、本発明のＶＬＰは、ＶＰ２／ＶＰ３界面、内部ネットワーク、キャニオン及び／又はポケットドメインのうちの１又は２以上内に１又は２以上の追加の改変を含んでもよい。典型的には、前記１又は２以上の追加の改変は、本明細書に記載されている本発明の方法を使用して特定される。
【０１１５】
本発明のポリヌクレオチド
本発明は、本発明のＶＬＰをコードするポリヌクレオチドも提供する。ポリヌクレオチドという用語は、ＤＮＡ配列とＲＮＡ配列の両方を包含するが、典型的には、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ配列を含む。
【０１１６】
ゆえに、本発明のポリヌクレオチドは、典型的には、適切なプロテアーゼと一緒に、本発明のＶＬＰの改変されたカプシドに対するカプシド前駆体（Ｐ１）をコードする。適切なプロテアーゼの例として、ポリオウイルス又は別のエンテロウイルス由来の３Ｃ及び３ＣＤが挙げられる。プロテアーゼ発現のレベルは、宿主細胞タンパク質のバイスタンダーによる切断によって細胞毒性を最小限にしながら、適当な発現（Ｐ１前駆体の成熟ＶＰ０、ＶＰ１及びＶＰ３タンパク質への完全プロセシングを可能とする）を確保するために制御される。このような制御は、従来の方法によって容易に行うことができる。本発明のポリヌクレオチドは、本発明のＶＬＰの組換え発現に対して、又はＤＮＡ／ＲＮＡワクチンとして使用することができる。
【０１１７】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターをさらに提供する。典型的には、発現ベクターにおいて、本発明のポリヌクレオチドは、適切なプロモーターに作動可能に連結される。ポリヌクレオチドは、適切なターミネーター配列にも連結され得る。適切なプロモーター配列及びターミネーター配列は、当技術分野において周知である。
【０１１８】
この場合、プロモーターの選択は、発現のために使用される発現系に依存する。一般的に、構成的プロモーターが好ましいが、誘導性プロモーターも同様に使用されてよい。この方式で産生された構築物は、ベクターの少なくとも一部、特に、制御エレメントを含む。ベクターは、好ましくは、所与の宿主細胞において核酸を発現することができる。任意の適当な宿主細胞、例えば、哺乳動物、昆虫、酵母、及び／又は植物宿主細胞が使用され得る。さらに、無細胞タンパク質合成が使用されてもよい。このような発現系及び宿主細胞は、当技術分野において標準である。
【０１１９】
哺乳動物細胞におけるウイルスフリー発現は、ＶＬＰが通常のウイルス増殖中にプロセシング及びアセンブルされる自然環境に最も近い系であろう。ポリオウイルスのＶＬＰに関する１つの例示的な哺乳動物での発現は、ワクシニアウイルスの発現系（Ａｎｋａｒａ株−ＭＶＡ）である。この系は、最も真正な環境；哺乳動物細胞において発現した産生物の真正翻訳後修飾を維持するという利点と共に、高レベルの組換えタンパク質発現を可能とする。
【０１２０】
本発明のＶＬＰ、及び前記ＶＬＰをコードするポリヌクレオチドは、バキュロウイルスベクターを使用して昆虫細胞において発現され得る。バキュロウイルスベクターを介した昆虫細胞におけるヒトワクチン産生は、現在使用されている市販のヒトパピローマウイルスワクチンがこのように産生されるため、先行の利点を有する。適切な昆虫細胞系の非限定例として、Ｓｆ９、Ｔ．Ｎｉ及びＡｏ３８が挙げられる。
【０１２１】
本発明のＶＬＰ、及び前記ＶＬＰをコードするポリヌクレオチドは、酵母において発現され得る。産生物の高収率及び低コストという有効な利点が、酵母発現系を魅力的なものとする。サッカロマイセス属（Saccharomyces）又はピキア属（Pichia）のいずれかを使用する酵母発現技術は、標準的技法を使用して可能である。
【０１２２】
本発明のＶＬＰ、及び前記ＶＬＰをコードするポリヌクレオチドは、植物細胞において発現され得る。植物は、いくつかの有効な利点を有する；植物は、強健であり、成長するのに費用がかからず、植物から誘導されるいずれの産生物も、エンドドキシン又は哺乳動物の病原体による汚染のリスクが低い。その上、方法及び技法は、当技術分野において公知である。
【０１２３】
あるいは、無細胞タンパク質合成系が使用されてもよい。このような系は、タンパク質産生に対する伝統的なインビボでの方法に優る明確な利点を有する。細胞生存能を維持する必要性がないことにより、タンパク質を産生する無細胞抽出物のタンパク質合成能の最適化が可能となる。さらに、細胞膜の欠如により、転写、翻訳及びフォールディングを操作するために使用され、タンパク質発現プロセスの正確な調節をもたらすことができる非天然因子の直接的添加が可能となる。大腸菌から誘導される例示的無細胞系は、当技術分野において公知である。細菌細胞内での哺乳動物のＮ−ミリスチルトランスフェラーゼの同時発現は、適切なフォールディング及びカプシドのアセンブリを容易にするためのウイルス前駆体タンパク質の正しい改変を達成するために必要とされる場合がある。
【０１２４】
本発明の核酸分子は、当技術分野において公知である任意の適切なプロセスを使用して作製することができる。ゆえに、核酸分子は、化学的合成技法を使用して作製することができる。あるいは、本発明の核酸分子は、分子生物学的技法を使用して作製することができる。
【０１２５】
本発明の発現ベクターは、好ましくは、インシリコで設計され、次いで、従来のポリヌクレオチド合成技法によって合成される。
【０１２６】
ポリヌクレオチド配列の情報は、用いられる最終的宿主細胞（例えば、植物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、大腸菌）発現系に従って、コドンバイアスに関して修正されてもよい。
【０１２７】
本発明は、上記に記載されているポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドも提供する。
【０１２８】
２又は３以上の核酸配列又はアミノ酸配列の間の「パーセント配列同一性」は、配列によって共有される同一の位置の数の関数である。ゆえに、％同一性は、ヌクレオチドの総数／アミノ酸の総数で除した同一のヌクレオチド数／同一のアミノ酸数に、１００を乗じて算出することができる。％配列同一性の計算には、２又は３以上の配列のアラインメントを最適化するために導入される必要のあるギャップの数、及び各ギャップの長さも考慮されてよい。配列の比較及び２又は３以上の配列間のパーセント同一性の決定は、特定の数学的アルゴリズム、例えば、当業者によく知られているＢＬＡＳＴを使用して行うことができる。
【０１２９】
ポリオウイルスのカプシドの安定性を調節する改変を特定する方法
本発明者らは、安定化する改変、特に、ポリオウイルスのカプシド内の安定化する変異を特定するための革新的方法を考案した。特に、本発明者らの手法は、アセンブリに欠陥を有するポリオウイルス株の選択から始まる。このような出発株の１つの非限定例は、Ｓａｂｉｎ  ３であり、これは、ＶＰ３の残基９１における変異（すなわち、３０９１における変異）を含む。野生型Ｌｅｏｎ株では、この位置はセリンであり、一方Ｓａｂｉｎ  ３株では、残基はフェニルアラニンである。この変異は、カプシドのアセンブリ中間体のアセンブリを阻害することによって、Ｓａｂｉｎ  ３のアセンブリを温度感受性（ｔｓ）とし、温度が高い程、阻害は大きくなる。本発明者らは、驚くべきことに、この温度感受性を克服する変異が、野生型カプシドタンパク質へと導入されると、ＶＬＰを安定化することを見出した。
【０１３０】
ゆえに、本発明は、前記ポリオウイルスのカプシドの安定性を調節する（典型的には、増加させる）ポリオウイルスのカプシド内の１又は２以上の改変を特定する方法をさらに提供する。前記方法は、（ａ）不安定化する変異（例えば、Ｓ３０９１Ｆ）をポリオウイルス株のカプシドへと導入するステップと；（ｂ）前記ポリオウイルス株を、半許容温度で増殖させるステップと；（ｃ）得られた（非温度感受性の）ポリオウイルスをスクリーニングして、不安定化する変異の作用を逆転させる１又は２以上の改変を特定するステップとを含む。一部の実施形態では、前記方法で使用されるポリオウイルス株は、アセンブリの欠陥を既に有するポリオウイルス株である。このような実施形態では、この方法のステップ（ａ）は必要とされず、本発明は、このステップが省略される方法を提供する。この株は、既存の（ワクチン又は天然に存在する）株であってもよい。適切な出発ポリオウイルス株の非限定例は、Ｓａｂｉｎ  ３であり、他に、アセンブリの欠陥は、この方法（ステップ（ａ））に対する出発点として望ましい株へと導入されてもよい。この型の適切な出発ポリオウイルス株の非限定例は、Ｍａｈｏｎｅｙであり、適切なアセンブリの欠陥は、ＶＰ３の残基９１（Ｓ３０９１Ｆ）における、セリンからフェニルアラニンへの置換から得られるものとなる。ゆえに、本発明者らにより開発された方法は独特であり、これは、ポリオウイルス試験株への不安定化する変異の導入（又は、このような変異を有する既存の株の使用）、及び前記試験株を、半許容温度で増殖させて、再度安定化する変異を有するウイルスを作製することに依拠する。典型的には、前記方法は、安定化する変異を特定するための、得られた安定化されたポリオウイルス株のディープシークエンシング（すなわち、精製なし）を伴う。
【０１３１】
本明細書に記載されているように、次いで、これらの安定化する変異は、異なる組合せのポリオウイルスゲノムのＰ１領域へと導入することができ、次いで、組換え発現により、生ウイルスを必要とすることなく、ワクチンとして使用するための安定なＶＬＰの産生を可能とすることになる。したがって、本発明の方法は、ステップ（ｃ）において特定される１又は２以上の改変を野生型ポリオウイルスへと導入するステップと、前記１又は２以上の改変が、ポリオウイルスのカプシドの安定性を増加させることを実証するステップとをさらに含んでもよい。
【０１３２】
本方法は、ポリオウイルス試験株への任意の適切な不安定化する変異の導入、又は任意の適切な不安定化する変異を有する既存の試験株の使用を伴ってもよい。適切な不安定化する変異は、例えば、ポリオウイルスを、低温／低減した温度（典型的には、３３℃未満）の条件下で増殖させること、安定化した変異体の変異体ポリオウイルス受容体（ＰＶＲ）又は偽復帰変異を発現する細胞において増殖させることによって選択され得る。典型的には、適切な不安定化する変異の表現効果として、増殖に対して増加した温度感受性、及び／又は「低温」感受性の低下（すなわち、３３℃未満の温度における）及び／又は受容体使用の範囲の拡大、及び生存能の増加が挙げられる。一部の実施形態では、不安定化する変異の組合せが使用されてもよい。
【０１３３】
本発明の方法において使用するのに適する不安定化する変異の非限定例として、以下が挙げられる：
【０１３４】
【表６】
2020513840.tif 000009
2020513840.tif 000010
【０１３５】
この方法は、選択されるポリオウイルス株の増殖に対して半許容的である任意の温度で行われてよい。この文脈では、「半許容」温度は、カプシドのアセンブリを除くすべての複製ステップを可能とする任意の温度として定義され得る。例えば、半許容温度は、約３８℃〜約４０℃の範囲内であり得る。
【０１３６】
典型的には、半許容温度におけるポリオウイルス株の増殖が改変なしに低減する場合、前記方法を使用して、ポリオウイルスのカプシドの安定性を増加させる改変を特定する。安定化する変異の他の効果は、「低温」感受性の増加（すなわち、３３℃未満の温度で増殖する場合に感受性が増加される）を含んでもよい。安定化する変異は、プラークアッセイを使用すること対して又はディープシークエンシング／次世代シークエンシングなどの他の方法によって、スクリーニングされてもよい。
【０１３７】
本発明は、ポリオウイルスのカプシドの安定性を調節する候補改変を特定する他の方法も包含する。例えば、上記方法によって特定される安定化する変異は、異なる組合せで野生型株へと導入され得る。変異体の前記組合せが、アセンブリ又はアンコーティングにとって最適であるものよりもウイルスのカプシドを安定化する場合、野生型の複製の全ステップに対して十分に許容される温度におけるウイルスの増殖は、典型的には、低減される。これらのウイルスが、十分に、許容温度で増殖する場合、新たな増殖速度のより速いポリオウイルスバリアントが生じる。これらの増殖速度のより速いバリアントは、典型的には、最初に獲得した安定化する変異のうちの１又は２以上を失った、及び／又はカプシドタンパク質内の他の残基において、新たな不安定化する変異を獲得したかのいずれかである。これらの不安定化する変異の位置は、他のウイルスにおいて標的化され、本発明に開示の技法を使用して安定化する変異を産生し得る。
【０１３８】
カプシドを安定化する変異の候補の特定するための他の手法は、原子構造から安定化する相互作用を予測することと、高温への曝露を制限することによって熱安定性ウイルス変異体を選択することを含み、本発明に従って使用され得る。
【０１３９】
産生方法
本発明は、本発明のＶＬＰを産生する方法をさらに提供し、前記方法は、（ａ）ＶＬＰをコードする感染性ＲＮＡ転写物を宿主哺乳動物細胞へと導入するステップ、又は（ｂ）本明細書に記載の特定方法によって特定される１又は２以上の改変（好ましくは、１又は２以上の変異）を含むポリオウイルスのカプシドから誘導されるポリペプチドを組換えにより産生するステップ、及び前記ポリペプチドをアセンブルしてＶＬＰを形成するステップを伴う。
【０１４０】
典型的には、前記方法（ｂ）は、細胞内で、本発明のポリヌクレオチドを、適当なプロテアーゼと一緒に発現させるステップであって、カプシドから誘導されるポリペプチドが発現され、切断後に、自己アセンブルしてＶＬＰとなる、ステップと、発現したＶＬＰを回収するステップとを含む。この方法は、典型的には、本発明のポリヌクレオチドを細胞内へと導入するステップをさらに含む。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載されている発現ベクターの形態で、細胞内へと導入され得る。
【０１４１】
例えば、本発明のＶＬＰを産生するための前記方法は、ポリヌクレオチド（上述される）を適切な宿主細胞内で発現させるステップと、宿主細胞を溶解して、ＶＬＰを含有する宿主細胞ホモジネートを提供するステップと、ＶＬＰを単離するステップとを含んでもよい。
【０１４２】
細胞に提供される／導入されるポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はそれらの組合せであってもよい。ポリヌクレオチドは、さらに、そのヌクレアーゼ耐性に関して、例えば、ホスホロチオエート結合を挿入することによって、改変され得る。核酸は、出発核酸から産生されてもよく、出発核酸は、例えば、ゲノムデータベース又はｃＤＮＡデータベースからクローニングすることによって利用可能である。さらに、核酸は、固相合成によって直接産生され得る。適切な方法は、当業者に公知である。出発核酸が仮定されると、特定の改変は、例えば、局所特異的変異誘発によって、もたらされ、アミノ酸レベルで、少なくとも１つの付加、挿入、欠失及び／又は置換をもたらし得る。次いで、核酸は、本明細書に記載されているように、適切なプロモーターに作動可能に連結される。
【０１４３】
典型的には、本発明のＶＬＰは、組換え手段によって作製される。特に、安定化する変異は、本明細書に記載の方法によって特定することができる。前記方法によって作製された安定化したポリオウイルス由来のＤＮＡを、クローニング及び転写して、ＲＮＡを形成することができる。このＲＮＡは、標準的細胞培養技法を使用して適切な発現細胞中に導入され、単回の産生方法で、空の、非感染性ＶＬＰを作製するために使用することができる。
【０１４４】
この細胞由来の本発明のＶＬＰは、典型的には、この細胞から回収された後に、精製及び／又は濃縮される。任意の適切な方法が、本発明のポリペプチドの回収、精製及び／又は濃縮のために使用され得る。回収、精製及び／又は濃縮のための標準的技法、例えば、クロマトグラフィー方法及び／又は電気泳動は、当技術分野において公知である。
【０１４５】
細胞
本発明のＶＬＰは、本発明のＶＬＰをコードする組換え発現ベクターを増殖させる、適切な細胞（宿主細胞としても知られる）、例えば、大腸菌（Escherichia coli）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）又はバチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）によって産生され得る。
【０１４６】
したがって、本発明は、本発明のＶＬＰを産生する細胞をさらに提供する。典型的には、本発明の細胞は、本発明のポリヌクレオチド又は発現ベクターを含有し、ポリヌクレオチド又はベクターを発現するのに適している。多数の原核発現系及び真核発現系が、本技術水準において知られており、細胞は、例えば、大腸菌、Ｂ．メガテリウム（B. megaterium）などの原核細胞、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）及びＰ．パストリス（P. pastoris）などの真核細胞から選択される。高等真核細胞、例えば、昆虫細胞、植物細胞又は哺乳動物細胞も同様に使用され得る。
【０１４７】
組成物及び治療指標／美容指標
本発明は、本発明のＶＬＰを含む医薬組成物も提供する。典型的には、医薬組成物である組成物は、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、担体、噴霧剤、塩及び／又は添加剤を含んでもよい。典型的には、本発明の組成物は、ポリオウイルスに対するワクチン接種に適している。この組成物は、特に、皮下、筋肉内、移植及び／又は局所投与に適している。筋肉内投与が好ましい。注射に適する組成物は、溶液、懸濁液若しくはエマルジョン、又は使用前に適切なビヒクルに溶解若しくは懸濁される乾燥粉末の形態であってもよい。
【０１４８】
本発明のＶＬＰの投与に対する投与量の範囲は、所望の治療効果を生じる範囲である。必要な投与量の範囲は、ＶＬＰ又は組成物の正確な性質、投与経路、製剤の性質、患者の年齢、患者の状態の性質、程度又は重症度、あるとすれば禁忌、主治医の判断に応じて変わることが認識される。これらの投与量レベルの変動は、最適化のための標準的な経験的ルーチンを使用して調整することができる。
【０１４９】
適切な投与量は、ヒト用量に対するＤ抗原ユニットに関して現在のＩＰＶの投与量と同じ範囲内にあってもよく（１、２及び３型に対して４０、８及び３２）、ＶＬＰが、ヒトにおいてＩＰＶよりも免疫原性であることが証明される場合には、それらが動物においてもそうであると思われるため、より少なくてもよい。
【０１５０】
液体剤形は、典型的には、ＶＬＰとパイロジェンフリー滅菌媒体を利用して調製される。ＶＬＰは、使用される媒体及び濃度に応じて、媒体に溶解するか又は懸濁することができる。溶液を調製する際に、ＶＬＰは、媒体中に溶解され、この溶液は、必要であれば、塩化ナトリウムの添加によって等張にされ、適切な滅菌バイアル又はアンプルに充填し、密封する前に、無菌技法を使用して、滅菌フィルターを通す濾過によって滅菌される。有利には、緩衝剤、可溶化剤、安定剤、保存剤又は殺菌剤、懸濁剤又は乳化剤及び又は局所麻酔剤などの添加剤を、媒体に溶解させてもよい。
【０１５１】
使用前に適切な媒体に溶解又は懸濁される乾燥粉末は、滅菌領域で、無菌技法を使用して、滅菌前の成分を滅菌容器に充填することによって調製することができる。あるいは、この成分は、滅菌領域で、無菌技法を使用して、適切な容器中に溶解されてもよい。次いで、産生物を凍結乾燥し、容器を無菌的に密封する。
【０１５２】
筋肉内注射、皮下注射又は経皮注射に適する、非経口懸濁剤は、滅菌成分を溶解させる代わりに滅菌媒体に懸濁させ、滅菌を濾過によって達成することができないことを除いて、実質的に同様の方式で調製される。構成成分は、滅菌状態で単離されてもよく、あるいは、単離後に、例えば、ガンマ線照射によって滅菌されてもよい。
【０１５３】
懸濁剤、例えば、ポリビニルピロリドンは、構成成分の均一な分布を容易にするために組成物中に含まれ得る。
【０１５４】
本発明に従った投与は、微粒子のカプセル封入、ウイルス送達系又は高圧エアロゾルインピンジメントを含む様々な送達技術を利用することができる。
【０１５５】
本発明は、ポリオウイルスに対してワクチン接種をする方法において使用するための、本明細書に記載されているＶＬＰ、組成物又はワクチンをさらに提供する。本発明は、ポリオウイルスに対してワクチン接種をする方法において使用するための医薬の製造における本明細書に記載されているＶＬＰ及び／又は組成物の使用をさらに提供する。本発明は、ポリオウイルスに対して対象にワクチン接種をする方法であって、有効量のＶＬＰ、組成物又はワクチンを、それを必要とする対象に投与するステップを含む方法をさらに提供する。
【０１５６】
ワクチン
本発明のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、例えば、血清学アッセイにおける抗原として小規模に（例えば、血清有病率の研究又は他の調査活動の一部として）又はワクチン産生において大規模に使用することができる。本発明のＶＬＰは、非感染性であり（ポリオウイルスのゲノムを欠いている）、組換え発現を介した産生は生ウイルスを必要としないため、ポリオウイルスの根絶前と、根絶後の両方の封じ込め（ヒトに感染性の生存可能な株に対する現行のＷＨＯガイダンスによって要求されるカテゴリーＢＳＬ３−ｐｏｌｉｏにおける）が必要とされない。
【０１５７】
本発明のＶＬＰは、典型的には、組換え技術を使用する任意の適当な方法（本明細書に記載されている）によって産生され得る。本発明のＶＬＰは非感染性であるため、ワクチンとして使用する前に不活性化は必要とされない。
【０１５８】
本発明のＶＬＰは、薬学的に許容される担体又は希釈剤と組み合わせることができる。不活性化ウイルス調製物又は他のポリオウイルスワクチン、例えば、ＩＰＶ調製物において従来より使用される任意の担体又は希釈剤を用いることができる。ＶＬＰ調製物は、１型、２型及び／又は３型のカプシドタンパク質を含むＶＬＰを含んでもよい。
【０１５９】
したがって、本発明のＶＬＰは、ヒト患者の灰白髄炎に対してワクチン接種をするために使用することができる。したがって、本発明は、ポリオウイルスに対して対象にワクチン接種をする方法であって、有効量の、本発明のＶＬＰを、それを必要とする対象に投与するステップを含む方法を提供する。有効量は、ポリオウイルスに対する防御的免疫応答を誘発するのに十分な量である。この目的のために、これらは、任意の適切な経路により、例えば、非経口的に投与され得る。非経口投与は、皮下注射、経皮注射又は筋肉内注射によるものであってよい。本発明のＶＬＰは、アジュバントと共に投与されてもよい。
【０１６０】
従来のＩＰＶとして投与される量に対応する用量、例えば、８〜４０ユニットのＤ抗原が投与されてもよい。
【０１６１】
本発明のＶＬＰの用量は、所望の程度の免疫原性を実現するために調整されてもよい。例えば、カプシドタンパク質が、Ｓａｂｉｎ  ２又はＳａｂｉｎ  ３から誘導される場合、カプシドタンパク質が、Ｓａｂｉｎ  １、ＭＥＦ、Ｍａｈｏｎｅｙ又はＳａｕｋｅｔｔから誘導される場合よりも高い用量が使用され得る。例えば、約１６〜約８０ユニットのＤ抗原、例えば、約３０ユニットのＤ抗原（例えば、３２ユニットのＤ抗原）又は約６０ユニットのＤ抗原（例えば、６４ユニットのＤ抗原）という用量が使用されてもよい。適当なアジュバントと共にワクチンが投与される場合、より低い用量が使用され得る。
【０１６２】
本発明は、本発明の１又は２以上のＶＬＰと薬学的に許容される担体又は希釈剤とを含むワクチンを提供する。ワクチンは、アジュバントをさらに含んでもよい。ワクチンは、１又は２以上の異なる内部型の、本発明の組換えＶＬＰを含んでもよい。例えば、ワクチンは、１型及び２型、１型及び３型、２型及び３型又は１型、２型及び３型のポリオウイルス株由来の構造タンパク質を含むＶＬＰの混合物を含んでもよい。典型的には、１型のカプシドタンパク質は、Ｓａｂｉｎ  １又はＭａｈｏｎｅｙ、好ましくはＭａｈｏｎｅｙに由来し、２型カプシドタンパク質は、Ｓａｂｉｎ  ２又はＭＥＦ、好ましくはＭＥＦに由来し、３型カプシドタンパク質は、Ｓａｂｉｎ  ３又はＳａｕｋｅｔｔ、好ましくはＳａｕｋｅｔｔに由来することとなる。
【０１６３】
本発明の１型、２型及び３型ポリオウイルスの異なる相対的免疫原性の点から、ワクチンは、１型、２型及び／又は３型のカプシドタンパク質を含有する、異なる量のＶＬＰを含んでもよい。例えば、ｘ：ｙ：ｚという１型：２型：３型の比は、ｘ＜ｙ＜ｚの場合に使用され得る。具体的な一例では、比は、４０：８：３２ユニットのＤ抗原であってもよい。
【０１６４】
本発明のＶＬＰは、スタンドアローンポリオワクチンとして又は他の構成成分、例えば、ＤＴＰ（ジフテリア、百日咳、破傷風）、Ｈｉｂ（Ｂ型インフルエンザ菌（Haemophilus influenza））又はＢ型肝炎を含有する組合せワクチンにおいて、投与されてもよい。
【０１６５】
本発明は、ポリオウイルスに対してワクチン接種をする方法において使用するための医薬の製造における、本発明によるＶＬＰの使用、及びポリオウイルスに対してワクチン接種をする方法において使用するための本発明によるＶＬＰも提供する。
【０１６６】
安定化されたＶＬＰが、本明細書の実施例で実証されるように、ポリオウイルスワクチンにおいて有用な、必要な安定性及び免疫原性を有することを本発明者らが初めて認めた。したがって、本発明は、安定化されたＶＬＰを準備することを含む、ポリオウイルスワクチンを作製する方法を提供する。典型的には、前記方法は、１又は２以上のカプシドの安定化する改変を特定するステップと、前記１又は２以上の安定化する改変をＶＬＰへと導入するステップと、１又は２以上の安定化する改変を有するＶＬＰを産生するステップとを含む。前記１又は２以上の安定化する改変を特定する方法及び／又は前記ＶＬＰを産生する方法は、本明細書に記載されている通りであってよい。１又は２以上のカプシドの安定化する改変は、本明細書に記載されている任意の改変／変異、又はそれらの任意の組合せであってもよい。
【０１６７】
本発明は、本発明のＶＬＰを発現するベクターを提供する。典型的には、ベクターは、ワクチン製剤の形態で存在する。
【０１６８】
ベクターは、ウイルスベクターであってもよい。このようなウイルスベクターは、アデノウイルス（ヒト血清型、例えば、ＡｄＨｕ５、サル血清型、例えば、ＣｈＡｄ６３、ＣｈＡｄＯＸ１若しくはＣｈＡｄＯＸ２、又は別の形態の）又はポックスウイルスベクター（例えば、改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ，modified vaccinia Ankara））であってもよい。ＣｈＡｄＯＸ１及びＣｈＡｄＯＸ２は、ＷＯ２０１２／１７２２７７に開示されている。ＣｈＡｄＯＸ２は、ＢＡＣ誘導及びＥ４改変ＡｄＣ６８ベースのウイルスベクターである。
【０１６９】
ウイルスベクターは、通常、非複製又は複製障害ベクターであり、これは、このウイルスベクターが、例えば、ＤＮＡ合成及び／又はウイルス力価の測定よって、従来の手段によって測定した際に、正常細胞（例えば、正常ヒト細胞）において任意の有意な程度まで複製できないことを意味する。非複製又は複製障害ベクターは、自然にそうなったもの（すなわち、それ自体天然から単離されたもの）又は人為的にそうなったもの（例えば、インビトロ育種によるか又は遺伝子操作による）でもよい。複製障害ウイルスベクターは一般的に少なくとも１つの細胞型で、その中で増殖可能であり、例えば、改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）はＣＥＦ細胞において増殖可能である。一実施形態では、ベクターは、ヒト又はサルのアデノウイルス又はポックスウイルスベクターから選択される。
【０１７０】
典型的には、ウイルスベクターは、動物対象、典型的には、哺乳動物対象、例えば、ヒト又は他の霊長類において有意な感染を引き起こすことができない。
【０１７１】
本発明は、本発明のＶＬＰをコードする核酸ワクチンをさらに提供する。このようなワクチンは、本発明のＶＬＰをコードするＤＮＡ又はＲＮＡを含んでもよい。
【０１７２】
例えば、本発明のＶＬＰを発現するＤＮＡベクター又はワクチンは、プラスミドベースのＤＮＡワクチンであってもよい。一実施形態では、ＤＮＡベクターは、哺乳動物細胞発現系、例えば、免疫化細胞において発現することができる。
【０１７３】
ベクターは、ＲＮＡベクター、例えば、自己増幅ＲＮＡワクチンであってもよい（参照により本明細書に組み込まれる、Geall, A.J. et al., Proc Natl Acad Sci USA 2012；109（36）pp. 14604-9）。
【０１７４】
本発明の核酸ワクチンは、典型的には、ＶＬＰアセンブリのためにＰ１カプシド前駆体をＶＰ１、ＶＰ３及びＶＰ３カプシドタンパク質へと切断することができるウイルスプロテアーゼと一緒に、ＶＬＰに対する前記Ｐ１カプシド前駆体ポリヌクレオチドをコードする核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を含む。適切なウイルスプロテアーゼの例として、３Ｃ及び３ＣＤが挙げられる。前記核酸ワクチンにおける核酸は、典型的には、適切なプロモーターに作動可能に連結する。適切なプロモーターの例は、当技術分野において容易に利用可能である。
【０１７５】
配列番号検索表
ヒト１型ポリオウイルスＭａｈｏｎｅｙ（全ゲノム）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｖ０１１４９（２００３年２月１０日に寄託された、バージョンＶ０１１４９．１）
【０１７６】
ヒト２型ポリオウイルス株ＭＥＦ−１（ポリタンパク質遺伝子、全ｃｄｓ）ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ２３８４７３（２００４年９月２３日に寄託された、バージョンＡＹ２３８４７３．１）
【０１７７】
ヒト３型ポリオウイルスＳａｕｋｅｔｔ（Ｈカプシドタンパク質（ＶＰ４、ＶＰ２、ＶＰ３、及びＶＰ１）ＲＮＡ、５’末端）
ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｌ２３８４８（１９９４年７月１１日に寄託された、バージョンＬ２３８４８．１）
【０１７８】
配列番号１−Ｍａｈｏｎｅｙ  ＶＰ１
GLGQMLESMIDNTVRETVGAATSRDALPNTEASGPTHSKEIPALTAVETGATNPLVPSDTVQTRHVVQHRSRSESSIESFFARGACVTIMTVDNPASTTNKDKLFAVWKITYKDTVQLRRKLEFFTYSRFDMELTFVVTANFTETNNGHALNQVYQIMYVPPGAPVPEKWDDYTWQTSSNPSIFYTYGTAPARISVPYVGISNAYSHFYDGFSKVPLKDQSAALGDSLYGAASLNDFGILAVRVVNDHNPTKVTSKIRVYLKPKHIRVWCPRPPRQLAYYGPGVDYKDGTLTPLSTKDLTTY
配列番号２−Ｍａｈｏｎｅｙ  ＶＰ２
SPNIEACGYSDRVLQLTLGNSTITTQEAANSVVAYGRWPEYLRDSEANPVDQPTEPDVAACRFYTLDTVSWTKESRGWWWKLPDALRDMGLFGQNMYYHYLGRSGYTVHVQCNASKFHQGALGVFAVPEMCLAGDSNTTTMHTSYQNANPGEKGGTFTGTFTPDNNQTSPARSSARWITSLEMARCWGMPLCSAQIINLRTNNCATLVLPYVNSLSLDSMVKHNNWGIAILPLAPLNFVSESSPEIPITLTIAPMCCEFNGLRNITLPRLQ
配列番号３−Ｍａｈｏｎｅｙ  ＶＰ３
GLPVMNTPGSNQYLTADNFQSPCALPEFDVTPPIDIPGEVKNMMLAEIDTMIPFDLSATKKNTMEMYRVRLSDKPHTAASILCLSLSPASDPRLSHTMLGEILNYYTHWAGSLKFTFLFCGSMMATGKLLVSYAPPGADPPKKRKEAMLGTHVIWDIGLQSSCTMVVPWISNSTYRQTIDDSFTEGGYISVFYQTRIVVPLSTPREMDILGFVSACNDFSVRLLRDTTHIEQKALAQ
配列番号４−Ｍａｈｏｎｅｙ  ＶＰ４
GAQVSSQKVGAHENSNRAYGGSTINYTTINYYRDSASNAASKQDFSQDPSKFTEPIKDVLIKTAPMLN
配列番号５−Ｍａｈｏｎｅｙ  ＶＰ０
GAQVSSQKVGAHENSNRAYGGSTINYTTINYYRDSASNAASKQDFSQDPSKFTEPIKDVLIKTAPMLN
SPNIEACGYSDRVLQLTLGNSTITTQEAANSVVAYGRWPEYLRDSEANPVDQPTEPDVAACRFYTLDTVSWTKESRGWWWKLPDALRDMGLFGQNMYYHYLGRSGYTVHVQCNASKFHQGALGVFAVPEMCLAGDSNTTTMHTSYQNANPGEKGGTFTGTFTPDNNQTSPARSSARWITSLEMARCWGMPLCSAQIINLRTNNCATLVLPYVNSLSLDSMVKHNNWGIAILPLAPLNFVSESSPEIPITLTIAPMCCEFNGLRNITLPRLQ
配列番号６−ＭＥＦ  ＶＰ１
GLGDLIEGVVEGVTRNALTPLTPANNLPDTQSSGPAHSKETPALTAVETGATNPLVPSDTVQTRHVIQKRTRSESTVESFFARGACVAIIEVDNDAPTKRASKLFSVWKITYKDTVQLRRKLEFFTYSRFDMEFTFVVTSNYTDANNGHALNQVYQIMYIPPGAPIPGKWNDYTWQTSSNPSVFYTYGAPPARISVPYVGIANAYSHFYDGFAKVPLAGQASTEGDSLYGAASLNDFGSLAVRVVNDHNPTKLTSKIRVYMKPKHVRVWCPRPPRAVPYYGPGVDYKDGLAPLPEKGLTTY
配列番号７−ＭＥＦ  ＶＰ２
SPNIEACGYSDRVMQLTLGNSTITTQEAANSVVAYGRWPEYIKDSEANPVDQPTEPDVAACRFYTLDTVTWRKESRGWWWKLPDALKDMGLFGQNMFYHYLGRAGYTVHVQCNASKFHQGALGVFAVPEMCLAGDSTTHMFTKYENANPGEKGGEFKGSFTLDTNATNPARNFCPVDYLFGSGVLAGNAFVYPHQIINLRTNNCATLVLPYVNSLSIDSMTKHNNWGIAILPLAPLDFATESSTEIPITLTIAPMCCEFNGLRNITVPRTQ
配列番号８−ＭＥＦ  ＶＰ３
GLPVLNTPGSNQYLTADNYQSPCAIPEFDVTPPIDIPGEVRNMMELAEIDTMIPLNLTNQRKNTMDMYRVELNDAAHSDTPILCLSLSPASDPRLAHTMLGEILNYYTHWAGSLKFTFLFCGSMMATGKLLVSYAPPGAEAPKSRKEAMLGTHVIWDIGLQSSCTMVVPWISNTTYRQTINDSFTEGGYISMFYQTRVVVPLSTPRKMDILGFVSACNDFSVRLLRDTTHISQEAMPQ
配列番号９−ＭＥＦ  ＶＰ４
MGAQVSSQKVGAHENSNRAYGGSTINYTTINYYRDSASNAASKQDFAQDPSKFTEPIKDVLIKTAPTLN
配列番号１０−ＭＥＦ  ＶＰ０
SPNIEACGYSDRVMQLTLGNSTITTQEAANSVVAYGRWPEYIKDSEANPVDQPTEPDVAACRFYTLDTVTWRKESRGWWWKLPDALKDMGLFGQNMFYHYLGRAGYTVHVQCNASKFHQGALGVFAVPEMCLAGDSTTHMFTKYENANPGEKGGEFKGSFTLDTNATNPARNFCPVDYLFGSGVLAGNAFVYPHQIINLRTNNCATLVLPYVNSLSIDSMTKHNNWGIAILPLAPLDFATESSTEIPITLTIAPMCCEFNGLRNITVPRTQ
配列番号１１−Ｓａｕｋｅｔｔ  ＶＰ１
GIEDLITEVAQGALTLSLPKQQDSLPDTKASGPAHSKEVPALTAVETGATNPLVPSDTVQTRHVIQRRSRSESTIESFFARGACVAIIEVDNEEPTTRAQKLFATWRITYKDTVQLRRKLEFFTYSRFDMEFTFVVTANFTNTNNGHALNQVYQIMYIPPGAPTPKSWDDYTWQTSSNPSIFYTYGAAPARISVPYVGLANAYSHFYDGFAKVPLKTDANDQIGDSLYSAMTVDDFGVLAIRVVNDHNPTKVTSKVRIYMKPKHVRVWCPRPPRAVPYYGPGVDYKDNLNPLSEKGLTTY
配列番号１２−Ｓａｕｋｅｔｔ  ＶＰ２
SPNVEACGYSDRVLQLTLGNSTITTQEAANSVVAYGRWPEFIRDDEANPVDQPTEPDVATCRFYTLDTVMWGKESKGWWWKLPDALRDMGLFGQNMYYHYLGRSGYTVHVQCNASKFHQGALGVFAIPEYCLAGDSDKQRYTSYANANPGEKGGKFYSQFNRDTAVTSPKREFCPVDYLLGCGVLLGNAFVYPHQIINLRTNNSATIVLPYVNALAIDSMVKHNNWGIAILPLSPLDFAQDSSVEIPITVTIAPMCSEFNGLRNVTAPKFQ
配列番号１３−Ｓａｕｋｅｔｔ  ＶＰ３
GLPVLNTPGSNQYLTSDNHQSPCAIPEFDVTPPIDIPGEVKNMMELAEIDTMIPLNLENTKRNTMDMYRVTLSDSADLSQPILCLSLSPASDPRLSHTMLGEVLNYYTHWAGSLKFTFLFCGSMMATGKILVAYAPPGAQPPTSRKEAMLGTHVIWDLGLQSSCTMVVPWISNVTYRQTTQDSFTEGGYISMFYQTRIVV
PLSTPKSMSMLGFVSACNDFSVRLLRDTTHISQSALPQ
配列番号１４−Ｓａｕｋｅｔｔ  ＶＰ４
MGAQVSSQKVGAHENSNRAYGGSTINYTTINYYKDSASNAASKQDYSQDPSKFTEPLKDVLIKTAPTLN
配列番号１５−Ｓａｕｋｅｔｔ  ＶＰ０
MGAQVSSQKVGAHENSNRAYGGSTINYTTINYYKDSASNAASKQDYSQDPSKFTEPLKDVLIKTAPTLNSPNVEACGYSDRVLQLTLGNSTITTQEAANSVVAYGRWPEFIRDDEANPVDQPTEPDVATCRFYTLDTVMWGKESKGWWWKLPDALRDMGLFGQNMYYHYLGRSGYTVHVQCNASKFHQGALGVFAIPEYCLAGDSDKQRYTSYANANPGEKGGKFYSQFNRDTAVTSPKREFCPVDYLLGCGVLLGNAFVYPHQIINLRTNNSATIVLPYVNALAIDSMVKHNNWGIAILPLSPLDFAQDSSVEIPITVTIAPMCSEFNGLRNVTAPKFQ
配列番号１６−Ｍａｈｏｎｅｙ  Ｐ１
MGAQVSSQKVGAHENSNRAYGGSTINYTTINYYRDSASNAASKQDFSQDPSKFTEPIKDVLIKTAPMLNSPNIEACGYSDRVLQLTLGNSTITTQEAANSVVAYGRWPEYLRDSEANPVDQPTEPDVAACRFYTLDTVSWTKESRGWWWKLPDALRDMGLFGQNMYYHYLGRSGYTVHVQCNASKFHQGALGVFAVPEMCLAGDSNTTTMHTSYQNANPGEKGGTFTGTFTPDNNQTSPARRFCPVDYLLGNGTLLGNAFVFPHQIINLRTNNCATLVLPYVNSLSIDSMVKHNNWGIAILPLAPLNFASESSPEIPITLTIAPMCCEFNGLRNITLPRLQGLPVMNTPGSNQYLTADNFQSPCALPEFDVTPPIDIPGEVKNMMELAEIDTMIPFDLSATKKNTMEMYRVRLSDKPHTDDPILCLSLSPASDPRLSHTMLGEILNYYTHWAGSLKFTFLFCGSMMATGKLLVSYAPPGADPPKKRKEAMLGTHVIWDIGLQSSCTMVVPWISNTTYRQTIDDSFTEGGYISVFYQTRIVVPLSTPREMDILGFVSACNDFSVRLLRDTTHIEQKALAQGLGQMLESMIDNTVRETVGAATSRDALPNTEASGPTHSKEIPALTAVETGATNPLVPSDTVQTRHVVQHRSRSESSIESFFARGACVTIMTVDNPASTTNKDKLFAVWKITYKDTVQLRRKLEFFTYSRFDMELTFVVTANFTETNNGHALNQVYQIMYVPPGAPVPEKWDDYTWQTSSNPSIFYTYGTAPARISVPYVGISNAYSHFYDGFSKVPLKDQSAALGDSLYGAASLNDFGILAVRVVNDHNPTKVTSKIRVYLKPKHIRVWCPRPPRAVAYYGPGVDYKDGTLTPLSTKDLTTY 
配列番号１７−Ｓａｂｉｎ  １  Ｐ１
MGAQVSSQKVGAHENSNRAYGGSTINYTTINYYRDSASNAASKQDFSQDPSKFTEPIKDVLIKTSPMLNSPNIEACGYSDRVLQLTLGNSTITTQEAANSVVAYGRWPEYLRDSEANPVDQPTEPDVAACRFYTLDTVSWTKESRGWWWKLPDALRDMGLFGQNMYYHYLGRSGYTVHVQCNASKFHQGALGVFAVPEMCLAGDSNTTTMHTSYQNANPGEKGGTFTGTFTPDDNQTSPARRFCPVDYLFGNGTLLGNAFVFPHQIINLRTNNCATLVLPYVNSLSIDSMVKHNNWGIAILPLAPLNFASESSPEIPITLTIAPMCCEFNGLRNITLPRLQGLPVMNTPGSNQYLTADNFQSPCALPEFDVTPPIDIPGEVKNMMELAEIDTMIPFDLSAKKKNTMEMYRVRLSDKPHTDDPILCLSLSPASDPRLSHTMLGEILNYYTHWAGSLKFTFLFCGSMMATGKLLVSYAPPGADPPKKRKEAMLGTHVIWDIGLQSSCTMVVPWISNTTYRQTIDDSFTEGGYISVFYQTRIVVPLSTPREMDILGFVSACNDFSVRLMRDTTHIEQKALAQGLGQMLESMIDNTVRETVGAATSRDALPNTEASGPAHSKEIPALTAVETGATNPLVPSDTVQTRHVVQHRSRSESSIESFFARGACVAIITVDNSASTKNKDKLFAVWKITYKDTVQLRRKLEFFTYSRFDMEFTFVVTANFTETNNGHALNQVYQIMYVPPGAPVPEKWDDYTWQTSSNPSIFYTYGTAPARISVPYVGISNAYSHFYDGFSKVPLKDQSAALGDSLYGAASLNDFGILAVRVVNDHNPTKVTSKIRVYLKPKHIRVWCPRPPRAVAYYGPGVDYKDGTLTPLSTKDLTTY 
配列番号１８−ＭＥＦ  Ｐ１
MGAQVSSQKVGAHENSNRAYGGSTINYTTINYYRDSASNAASKQDFAQDPSKFTEPIKDVLIKTAPMLNSPNIEACGYSDRVMQLTLGNSTITTQEAANSVVAYGRWPEYIKDSEANPVDQPTEPDVAACRFYTLDTVTWRKESRGWWWKLPDALKDMGLFGQNMFYHYLGRSGYTVHVQCNASKFHQGALGVFAVPEMCLAGDSTTHMFTKYENANPGEKGGEFKGSFTLDTNATNPARNFCPVDYLFGSGVLAGNAFVYPHQIINLRTNNCATLVLPYVNSLSIDSMTKHNNWGIAILPLAPLDFATESSTEIPITLTIAPMCCEFNGLRNITVPRTQGLPVLNTPGSNQYLTADNYQSPCAIPEFDVTPPIDIPGEVRNMMELAEIDTMIPLNLTNQRKNTMDMYRVELNDAAHSDTPILCLSLSPASDPRLAHTMLGEILNYYTHWAGSLKFTFLFCGSMMATGKLLVSYAPPGAEAPKSRKEAMLGTHVIWDIGLQSSCTMVVPWISNTTYRQTINDSFTEGGYISMFYQTRVVVPLSTPRKMDILGFVSACNDFSVRLLRDTTHISQEAMPQGLGDLIEGVVEGVTRNALTPLTPANNLPDTQSSGPAHSKETPALTAVETGATNPLVPSDTVQTRHVIQKRTRSESTVESFFARGACVAIIEVDNDAPTKRASKLFSVWKITYKDTVQLRRKLEFFTYSRFDMEFTFVVTSNYTDANNGHALNQVYQIMYIPPGAPIPGKWNDYTWQTSSNPSVFYTYGAPPARISVPYVGIANAYSHFYDGFAKVPLAGQASTEGDSLYGAASLNDFGSLAVRVVNDHNPTKLTSKIRVYMKPKHVRVWCPRPPRAVPYYGPGVDYKDGLAPLPEKGLTTY 
配列番号１９−Ｓａｂｉｎ  ２  Ｐ１
MGAQVSSQKVGAHENSNRAYGGSTINYTTINYYRDSASNAASKQDFAQDPSKFTEPIKDVLIKTAPMLNSPNIEACGYSDRVLQLTLGNSTITTQEAANSVVAYGRWPEYIRDTEANPVDQPTEPDVAACRFYTLDTVTWRKESRGWWWKLPDALKDMGLFGQNMFYHYLGRAGYTVHVQCNASKFHQGALGVFAVPEMCLAGDSTTHMFTKYENANPGEKGGEFKGSFTLDTNATNPARNFCPVDYLFGSGVLVGNAFVYPHQIINLRTNNCATLVLPYVNSLSIDSMTKHNNWGIAILPLAPLDFATESSTEIPITLTIAPMCCEFNGLRNITVPRTQGLPVLNTPGSNQYLTADNYQSPCAIPEFDVTPPIDIPGEVRNMMELAEIDTMIPLNLTSQRKNTMDMYRVELSDTAHSDTPILCLSLSPASDPRLAHTMLGEILNYYTHWAGSLKFTFLFCGSMMATGKLLVSYAPPGAEAPKSRKEAMLGTHVIWDIGLQSSCTMVVPWISNTTYRQTINDSFTEGGYISMFYQTRVVVPLSTPRKMDILGFVSACNDFSVRLLRDTTHISQEAMPQGIGDMIEGAVEGITKNALVPPTSTNSLPDTKPSGPAHSKEIPALTAVETGATNPLVPSDTVQTRHVIQRRTRSESTVESFFARGACVAIIEVDNDAPTKRASRLFSVWKITYKDTVQLRRKLEFFTYSRFDMEFTFVVTSNYIDANNGHALNQVYQIMYIPPGAPIPGKWNDYTWQTSSNPSVFYTYGAPPARISVPYVGIANAYSHFYDGFAKVPLAGQASTEGDSLYGAASLNDFGSLAVRVVNDHNPTRLTSKIRVYMKPKHVRVWCPRPPRAVPYFGPGVDYKDGTLTPLPEKGLTTY 
配列番号２０−Ｓａｕｋｅｔｔ  Ｐ１
MGAQVSSQKVGAHENSNRAYGGSTINYTTINYYKDSASNAASKQDYSQDPSKFTEPLKDVLIKTAPTLNSPNVEACGYSDRVLQLTLGNSTITTQEAANSVVAYGRWPEFIRDDEANPVDQPTEPDVATCRFYTLDTVMWGKESKGWWWKLPDALRDMGLFGQNMYYHYLGRSGYTVHVQCNASKFHQGALGVFAIPEYCLAGDSDKQRYTSYANANPGEKGGKFYSQFNRDTAVTSPKREFCPVDYLLGCGVLLGNAFVYPHQIINLRTNNSATIVLPYVNALAIDSMVKHNNWGIAILPLSPLDFAQDSSVEIPITVTIAPMCSEFNGLRNVTAPKFQGLPVLNTPGSNQYLTSDNHQSPCAIPEFDVTPPIDIPGEVKNMMELAEIDTMIPLNLENTKRNTMDMYRVTLSDSADLSQPILCLSLSPASDPRLSHTMLGEVLNYYTHWAGSLKFTFLFCGSMMATGKILVAYAPPGAQPPTSRKEAMLGTHVIWDLGLQSSCTMVVPWISNVTYRQTTQDSFTEGGYISMFYQTRIVVPLSTPKSMSMLGFVSACNDFSVRLLRDTTHISQSALPQGIEDLITEVAQGALTLSLPKQQDSLPDTKASGPSHSKEVPALTAVETGATNPLVPSDTVQTRHVIQRRSRSESTIESFFARGACVAIIEVDNEEPTTRAQKLFATWRITYKDTVQLRRKLEFFTYSRFDMEFTFVVTANFTNTNNGHALNQVYQIMYIPPGAPTPKSWDDYTWQTSSNPSIFYTYGAAPARISVPYVGLANAYSHFYDGFAKVPLKTDANDQIGDSLYSAMTVDDFGVLAIRVVNDHNPTKVTSKVRIYMKPKHVRVWCPRPPRAVPYYGPGVDYKDNLNPLSEKGLTTY 
配列番号２１−Ｓａｂｉｎ  ３  Ｐ１
MGAQVSSQKVGAHENSNRAYGGSTINYTTINYYKDSASNAASKQDYSQDPSKFTEPLKDVLIKTAPALNSPNVEACGYSDRVLQLTLGNSTITTQEAANSVVAYGRWPEFIRDDEANPVDQPTEPDVATCRFYTLDTVMWGKESKGWWWKLPDALRDMGLFGQNMYYHYLGRSGYTVHVQCNASKFHQGALGVFAIPEYCLAGDSDKQRYTSYANANPGERGGKFYSQFNKDNAVTSPKREFCPVDYLLGCGVLLGNAFVYPHQIINLRTNNSATIVLPYVNSLAIDSMVKHNNWGIAILPLSPLDFAQDSSVEIPITVTIAPMCSEFNGLRNVTAPKFQGLPVLNTPGSNQYLTSDNHQSPCAIPEFDVTPPIDIPGEVKNMMELAEIDTMIPLNLESTKRNTMDMYRVTLSDSADLSQPILCLSLSPAFDPRLSHTMLGEVLNYYTHWAGSLKFTFLFCGSMMATGKILVAYAPPGAQPPTSRKEAMLGTHVIWDLGLQSSCTMVVPWISNVTYRQTTQDSFTEGGYISMFYQTRIVVPLSTPKSMSMLGFVSACNDFSVRLLRDTTHISQSALPQGIEDLISEVAQGALTLSLPKQQDSLPDTKASGPAHSKEVPALTAVETGATNPLAPSDTVQTRHVVQRRSRSESTIESFFARGACVAIIEVDNEQPTTRAQKLFAMWRITYKDTVQLRRKLEFFTYSRFDMEFTFVVTANFTNANNGHALNQVYQIMYIPPGAPTPKSWDDYTWQTSSNPSIFYTYGAAPARISVPYVGLANAYSHFYDGFAKVPLKTDANDQIGDSLYSAMTVDDFGVLAVRVVNDHNPTKVTSKVRIYMKPKHVRVWCPRPPRAVPYYGPGVDYRNNLDPLSEKGLTTY 
配列番号２２−プライマーＰ１Ｆ
GCGAGTTGGATTGGCCATCCAGTG
配列番号２３−プライマーＰ１Ｒ
TGGAAGGTGGGTCCCACAAACGAC
［実施例］
【０１７９】
本発明は、以下の実施例によってさらに明確化されることになるが、これらの実施例は、純粋に本発明の例示を意図し、決して制限されない。
【実施例１】
【０１８０】
３型ポリオウイルスにおける安定化する変異の特定
３型Ｓａｂｉｎワクチン株
３型Ｓａｂｉｎワクチン株における２つの主な弱毒化変異のうちの１つは、野生型Ｌｅｏｎ株ではセリンであり、ワクチン株ではフェニルアラニンである、残基９１における構造タンパク質ＶＰ３（３０９１）内にある。ＶＰ３のアミノ酸９１は、プロトマー間の界面に位置し、インビトロで、ウイルスを増殖させ、カプシドのアセンブリを温度感受性とする。経口ポリオワクチンを与えられた小児は、変異が復帰されるか抑制されるかのいずれかであるウイルスを、最終的に排出し、サプレッサー変異によってカプシドのアセンブリ中間体の安定性が増加することを示した。
【０１８１】
表現型を抑制する追加の変異を、３型ワクチン株を半許容温度で増殖させることによって特定した。特定された、カプシドの安定性を増加させる変異を本明細書の表１に列挙する。変異のうちの８つをさらなる研究用に選択した（それらが特定された方法及びそれらの起源と一緒に、表５を参照のこと）。表５に示す変異は、２つの変異が構造内で同じポイントで作用したかどうかに基づいて特定した合計から選択し、１つだけをさらに研究した。
【０１８２】
【表７】
2020513840.tif 000011
【０１８３】
３型Ｌｅｏｎ株
カプシドの安定化する変化の候補として特定した変異を、異なる組合せでは、３型のＳａｂｉｎワクチン株の毒性前駆体であるＬｅｏｎへと導入した。ｐＴ７／Ｌｅｏｎ  ｃＤＮＡクローンの派生物が、以前に記載されている（Stanway G, et al. Arch Virol. 1984；81（1-2）:67-78）。簡潔には、リボザイム配列をＴ７プロモーターとポリオｃＤＮＡの間に挿入し、その結果、ＲＮＡ転写が、真正５’末端で開始する。Ｐ１コード領域を置き換えるために、ヌクレオチド３４０８−１３におけるコード変化のない標準的ＰＣＲ法を使用して、ＳａｃＩＩ部位を導入した。
【０１８４】
次いで、Ｍａｈｏｎｅｙ、ＭＥＦ−１及びＳａｕｋｅｔｔ由来のカプシド領域を、標準的ＰＣＲ法を使用して正確に導入した。合成ＤＮＡ及び適切な制限酵素切断部位を使用して、これらのクローンのカプシドタンパク質コード領域へと変異を導入した。
【０１８５】
２μｇのＴ７転写物を含む２５ｃｍ２のフラスコにおけるＨＥｐ２Ｃ単層のトランスフェクションによって、ウイルスを回収し、続いて、完全な細胞変性効果（ＣＰＥ）が現れるまで、３３℃、３５℃又は３７℃でインキュベートした。７日目にＣＰＥの徴候を示さないトランスフェクト細胞を凍結し、細胞溶解物を、新鮮なＨＥｐ２ｃ細胞で、さらに７日間ブラインド継代した。
【０１８６】
カプシドが、アセンブリ又はアンコーティングに関して最適のものよりも安定化された場合には、増殖が減速することとなると仮定された。３又は４以上の変異を有するウイルスは、野生型株に対して十分に許容される温度である３５℃でＨＥｐ２ｃ細胞において回収及び増殖された場合、親のＬｅｏｎよりも有意にゆっくりと増殖することが見出された。３７℃での継代では、野生型３ウイルス、Ｓａｕｋｅｔｔ（表６に示すように）において見られる両方の場合で、ＶＰ４の残基６７においてアラニンがトレオニンによって置き換えられたもの及びＶＰ１の残基１０５においてメチオニンがトレオニンによって置き換えられた別のものを含む、安定化するカプシドの変異又は導入された追加の変異のうちの１又は２以上を失った、より早く増殖するバリアントが出現した。これらの変化によって、より安定な構造を有するウイルスが救出されたため、導入されたアミノ酸が不安定化する作用を有したと結論付けられた。ゆえに、これらの残基の親バージョンを有する構造（ＶＰ４  ６７Ａ、すなわち、ＶＰ４の残基６７におけるアラニン及びＶＰ１  １０５Ｍ、すなわち、ＶＰ１の残基１０５におけるメチオニン）は、これらを有さなかったものより、より安定である傾向があると考えられた。
【０１８７】
【表８】
2020513840.tif 000012
【０１８８】
３型Ｓａｕｋｅｔｔ株  ＳＣ８の起源
不活性ポリオワクチンの産生に使用される、毒性の、野生型Ｓａｕｋｅｔｔ３型株（３型）は、抗原部位の一部である、１４アミノ酸位において、Ｌｅｏｎのものとは異なるカプシドタンパク質を有する。野生型Ｓａｕｋｅｔｔは、Ｓａｂｉｎ３型株において特定された変異（ＶＰ３  ９１のセリン及びＶＰ１  ５４のバリン）のうちの２つの熱安定性バージョンを既に有する。Ｓａｕｋｅｔｔは、Ｌｅｏｎ構築物の継代によって特定された２つの変異の不安定化する残基も有する。したがって、表５における残りの６アミノ酸及び表６における２つの変異が、安定化する形態と交換され、そのため、表７に示されるＳａｕｋｅｔｔ配列と異なる８つのアミノ酸を有するＳａｕｋｅｔｔ−ＳＣ８を与える構築物が作製された。
【０１８９】
【表９】
2020513840.tif 000013
【実施例２】
【０１９０】
１型（Ｍａｈｏｎｅｙ−ＳＣ７）及び２型（ＭＥＦ−ＳＣ５ａ）ポリオウイルス株における安定化する変異の特定
１型Ｍａｈｏｎｅｙ  ＳＣ７及び２型ＭＥＦ  ＳＣ５ａ株の起源
１、２及び３型ポリオウイルスの構造における類似性によって、３型に対して特定された安定化する変異が、１及び２型にも安定化する効果を有し得ることが示唆された。しかし、最新のＩＰＶ産生において使用される１型Ｍａｈｏｎｅｙ株は、Ｓａｕｋｅｔｔ−ＳＣ８へと組み込まれた変異のうちの４つを既に有する。残りの４つが、さらに導入されたが、構築物は、検出不能なカプシドタンパク質又は感染の徴候しか生じなかった。
【０１９１】
したがって、Ｓａｂｉｎ  ３株におけるように、ＶＰ３の残基９１（３０９１）においてフェニルアラニンを有するＭａｈｏｎｅｙの変異体を構築することを伴う第２の特定ストラテジーが続けられ；このウイルスが回収され、インビトロでのその増殖において温度感受性であることが示された。ＨＥｐ２ｃ細胞に、この構築物由来のＲＮＡ転写物をトランスフェクトし、少なくとも８０％の細胞変性効果（ＣＰＥ）が見られるまで、３９℃の非許容温度でインキュベートされ、得られた子孫は、ディープシークエンシングによって調査し、非温度感受性変異体の亜集団を特定した。トランスフェクションを独立して６回繰り返し、各集団を２回のディープシークエンシングに供し、ディープシークエンシング増幅アーチファクトを除去した。
【０１９２】
ディープシークエンシングを行うために、Ｒｏｃｈｅ  Ｈｉｇｈ  ＰｕｒｅウイルスＲＮＡキットを使用して、ＲＮＡを抽出した。水のみの対照を抽出し、増幅して、試料の各セットに関してパラレルでシークエンシングした。カプシドコード領域を、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＨｉＦｉキット及びプライマーＰ１Ｆ（5'-GCGAGTTGGATTGGCCATCCAGTG-3'）及びＰ１Ｒ（5'-TGGAAGGTGGGTCCCACAAACGAC-3'）を使用するワンステップＲＴ−ＰＣＲによって二連で増幅した。産生物を、ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ磁気ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社）を使用して精製し、Ｑｕｂｉｔ  Ｈｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｄｓＤＮＡアッセイ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を使用して定量化し、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｈｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ＤＮＡチップ（Ａｇｉｌｅｎｔ社）において分析し及び分子グレードのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０中で０．２ｎｇ／μｌまで希釈した。
【０１９３】
Ｎｅｘｔｅｒａ  ＸＴ試薬（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）及び製造業者のプロトコールを使用してシークエンシングライブラリーを調製し、２×２５１対合末端ｖ２  Ｆｌｏｗ  Ｃｅｌｌ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）を使用して、ＭｉＳｅｑにおいてシークエンシングした。クオリティトリミング及びアセンブリを行い、次いで、Ｇｅｎｉｏｕｓ  Ｒ７（Ｂｉｏｍａｔｔｅｒｓ）ソフトウェア及び特定した、０．５％以上で存在するＳＮＰを使用して、読み取りデータを親基準配列にマッピングした。両複製アンプリコンに存在するこれらのＳＮＰのみが保持された。
【０１９４】
特定された変異を、本明細書の表１に示す。このように特定された変異の一部を選択し、Ｍａｈｏｎｅｙへと挿入し、Ｍａｈｏｎｅｙ  ＳＣ７を与え、表８に示す。
【０１９５】
同じストラテジーを２型株ＭＥＦ−１に対して続け、特定され、ＭＥＦ−ＳＣ５ａへと挿入された変異を表８に与える。ＶＰ３−９１（Ｆ−Ｓ）の復帰は、両集団の有意な比率で起こった。
【０１９６】
【表１０】
2020513840.tif 000014
【実施例３】
【０１９７】
３つのポリオウイルス血清型における安定化する変異の部位
プロトマーサブユニット内のすべての変更された残基の位置及び関連するカプシドの特徴の部位を、図２に示すように、ポリオウイルスのカプシド結晶構造にマッピングした。重要なことには、３つの血清型のいずれかにおいて選択された候補の安定化する変異はいずれも、抗原部位に寄与するとして以前に特定された残基において生じなかった。したがって、これらは、これらが存在する粒子の抗原構造を変更する傾向にないと考えられた。
【実施例４】
【０１９８】
候補熱安定性変異体による感染
特定される、様々な数の候補変異を含んだゲノムを構築し、ポリオの増殖に対して許容性のＨｅｐ２Ｃ細胞へとＲＮＡをトランスフェクトした。得られた結果を図３に示した。図３では、３７℃における細胞培養の完全溶解までの時間は、挿入された変異の数と共に増加し、ついにはブラインド継代後でさえＣＰＥを全く検出することができなくなったことが分かった（３型では野生型Ｌｅｏｎに８つの変異を含有するＳＣ８、２型では野生型ＭＥＦ１に５又は６つの変異を含有するＳＣ５ｂ、ＳＣ６ａ及びＳＣ６ｂ並びに１型では野生型Ｍａｈｏｎｅｙに７つの変異を含有するＳＣ７）。３３℃では、インキュベーション時間がさらに長かった。３型の構築物Ｓａｕｋｅｔｔ  ＳＣ８のトランスフェクションは、Ｌｅｏｎ  ＳＣ８と同様に、いずれの検出可能なＣＰＥも生じなかった。Ｓａｕｋｅｔｔ  Ｓｃ８（３型）  ＭＥＦ  Ｓｃ５ａ（２型）及びＭａｈｏｎｅｙ  ＳＣ７（１型）の特性をさらに調査した。
【０１９９】
表９及び１０は、それぞれ、１及び２型ポリオウイルスにおいて、実施例１及び２で特定した安定化する変異の種々の組合せの効果を示す。ＶＬＰのＤ抗原（ＤＡｇ）反応性が５０％まで低減する温度及び対応するウイルスによって１００％のＣＰＥを得るために必要とされる日数を、すべての変異について決定した。これらの値は、改変されたポリオウイルスの安定性の指標である（ＤＡｇにおける５０％低減に対する温度の増加及び安定性の増加に相関する１００％ＣＰＥまでの時間の増加の両方）。ＳＣ８  ３型変異体に対して対応するデータを比較のために表１１に提供する。
【０２００】
【表１１】
2020513840.tif 000015
【０２０１】
【表１２】
2020513840.tif 000016
【０２０２】
【表１３】
2020513840.tif 000017
【実施例５】
【０２０３】
トランスフェクションによって産生された粒子の熱安定性
ポリオウイルス粒子は、２つの別個の抗原を発現する。例えば、加熱後には、Ｄ抗原は主に感染性ウイルスに関連し、Ｃ抗原は非感染性粒子に関連する；空カプシドは、細胞の外側で、特に、Ｃ抗原特異性に変換される傾向がある。ＩＰＶ効力は、Ｄ抗原が防御的免疫応答の誘導体であると考えられるため、Ｄ抗原ユニットで発現する。市販のワクチンの抗原含量を定量化するために開発されたＥＬＩＳＡを、１、２及び３型に対するＤ抗原特異的モノクローナル抗体、並びに１及び３型に対するＣ抗原特異的モノクローナル抗体の使用に基づいて、ウイルス粒子調製物のＤ抗原又はＣ抗原含量を測定するために適合させた。Ｃ特異的抗体は、２型には利用不能であった。
【０２０４】
マウスのＬ細胞は、ポリオウイルスに対する受容体を欠き、それゆえ、全ウイルスによって感染不能であるが、野生型又はカプシドが安定化された変異体をコードする構築物由来の全長ＲＮＡ転写物を用いて電気穿孔し、単一サイクルの感染を得た。終夜のインキュベーションによって、野生型構築物に関してＣ抗原性の空の粒子が優先的に産生したため、これらの場合では６時間のインキュベーションを使用した；終夜のインキュベーション後の変異体構築物に関するＤ抗原性の空の粒子の優先的な産生は、導入された変異が有意な安定化する効果を有することの早期の指標であった。
【０２０５】
生じた粒子は、ショ糖勾配で精製した。より詳細には、粒子調製物を、全長ＲＮＡ転写物の高効率電気穿孔によってマウスのＬ細胞中に作製した。直線化したクローン（１μｇ）を、Ｔ７  Ｍｅｇａｓｃｒｉｐｔキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を使用して転写した；９０％コンフルエントの７５ｃｍ２フラスコ由来の細胞をトリプシン処理によって除去し、洗浄して、ＨｅＢＳ（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１３７ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、０．７ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、６ｍＭのグルコース、ｐＨ  ７．０５）中に再懸濁し、ＲＮＡ転写物を用いて電気穿孔し（２５０Ｖ、２５０μＦ，３６０Ω）、次いで、フラスコに戻して、３７℃で、終夜又は６時間、ＤＭＥＭ中でインキュベートした。各構築物に対して６つのフラスコを使用した。次いで、細胞シートを−７０℃で凍結させ、解凍して、細胞デブリを遠心分離によって除去した。Ｉｇｅｐａｌを上清に添加し、最終濃度を０．１％とし、溶解緩衝液（０．５％のデオキシコール酸ナトリウム、２０ｍＭのＥＤＴＡ及び１％のＩｇｅｐａｌを含有する６塩ＰＢＳ）中で作製した１０ｍｌの３０％ショ糖クッションを介して、４℃で遠心分離することによって、ウイルス粒子を濃縮した。ペレットを６つのフラスコに対して１ｍｌの６塩ＰＢＳ中に再懸濁し、溶解緩衝液中の１０ｍｌの１５％〜３０％のショ糖勾配で層状にし、２０個の０．５ｍｌ画分に採取する前に、４℃にて、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＳＷ４１ローター中で１８，０００ｒｐｍで１２時間遠心分離した。
【０２０６】
画分をＣ又はＤ抗原特異的ＥＬＩＳＡによってスクリーニングし、ウイルスと空カプシドのピークを特定した。具体的には、非競合サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを使用して、ポリオウイルスのＤ抗原含量を測定した。簡潔には、抗原の２倍希釈液を血清型特異的ポリクローナル抗体で捕捉し、次いで、血清型特異的、Ｄ抗原又はＣ抗原特異的モノクローナル抗体、続いて、抗マウスペルオキシダーゼコンジュゲートを使用して検出した。各被検試料のＤ抗原含量を、パラレルライン分析（parallel line analysis）（Ｃｏｍｂｉｓｔａｔｓ）によって、割り当てたＤ抗原含量の基準に対して評価した。Ｄ抗原特異的ＥＬＩＳＡでは、使用したモノクローナル抗体は、１型では２３４個、２型では１０５０個及び３型では５２０個であり、Ｃ抗原特異的ＥＬＩＳＡでは、１型では１５８４８個及び３型では５１７個であった。Ｃ特異的２型抗体は利用不能であった。
【０２０７】
１型と３型のピーク画分をＶＰ２特異的抗体を用いる免疫ブロッティングによってもスクリーニングした；ビリオン画分はＶＰ２を含有し、空カプシド画分はＶＰ０を含有した。免疫ブロットに対する一次抗体は、１型ではウサギ抗ＶＰ２ペプチド血清Ｒ２７１及び３型ではＲ２６８であった。
【０２０８】
次いで、ビリオン及び空カプシドに対応する画分を熱安定性試験に供した。ＤからＣ抗原性への立体構造変化が生じた温度を、３０〜６０℃の温度範囲に加熱し、続いてＤ及びＣ抗原ＥＬＩＳＡによって（後者は可能な場合）決定した。試料を、Ｄ抗原ＥＬＩＳＡにおいて、ＯＤ  １．０を得るのに必要な濃度の２倍まで、６塩ＰＢＳ中で希釈し、二連の試料を各温度で１０分間加熱し、次いで、６塩ＰＢＳ中４％乾燥ミルクで１：１に希釈し、氷上で冷却した。Ｄ及びＣ抗原含量をＥＬＩＳＡで測定した。
【０２０９】
Ｄ抗原ＥＬＩＳＡにおいて、ＯＤ  １．０を得るのに必要な濃度の２倍まで、６塩ＰＢＳ中で希釈したＩＰＶ、ウイルス及び空カプシド試料の複数のアリコートを、３７℃でインキュベートすることによって、長期安定性を分析した。試料を一定間隔で取り除く、Ｄ抗原ＥＬＩＳＡで分析した。
【０２１０】
未改変３型株Ｌｅｏｎに対する結果を、感染性ウイルスに関して図４Ａで、空カプシドに関して図４Ｂで示し、ここでは、期待されたＣ抗原の高出発バックグラウンドが存在した。Ｄ抗原の損失は、Ｃ抗原含量の増加に反映され；感染性粒子に対しては、５０％のＤ抗原が失われた温度が４２℃であったが、一方、空カプシドでは３３℃であった。
【０２１１】
すべての野生型と選択された安定化されたカプシド変異体の空カプシド調製物に関する結果を表１２にまとめる。１、２及び３型の安定化形態についてそれぞれ５４℃、５６℃及び５５℃においてＤからＣ抗原特異性に変換された改変された空カプシドを、対応する野生型株に関する３６℃、４２℃及び３３℃と比較した。市販のＩＰＶがＤからＣ抗原特異性に変換された温度は、３つの血清型で４９℃〜５２℃の範囲であった。したがって、このアッセイによって、熱安定性の改善に関して選択された変異体株由来の空カプシドのすべてが、生ウイルスのホルマリン処理によって産生された現在市販されているＩＰＶよりも安定であった。他の抗原部位を対象とする様々なＤ抗原特異的ＭＡｂｓを使用するアッセイは、区別がつかない結果をもたらし、試験したすべての抗体は、ＥＬＩＳＡにおいて野生型粒子及び安定化した粒子と等しく反応した。
【０２１２】
【表１４】
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【０２１３】
この研究は、１０分間の高温への曝露を伴った。より現実的な使用を模倣する研究は、材料を長期間３７℃に曝露することを伴った；同じ期間、４℃でインキュベートした試料に対して、空カプシド（ＶＬＰ）ピークとウイルスピークの両方について、ＩＰＶと比較したＤ抗原の損失に関する結果を図５に示す。４℃の試料は、インキュベーション期間を通して有意な反応性の損失を示さず、アッセイ間変動に関する対照として使用した。３型（図５Ｃ）では、ＩＰＶは、６２日目の第２の時点までにすべての活性を損失した；全体的損失はもっと早く起こった可能性もある。３型のＳａｕｋｅｔｔ  ＳＣ８ウイルスは、１８０日間完全な活性を保持し、ＳＣ８の空カプシド（ＳＣ８  ＶＬＰ）は、６２日目に活性の５６％を、１８０日目に１３％を保持した。ＩＰＶの２型構成成分（図５Ｂ）は、３型に関して観察されたより遅れてＤ抗原含量を損失したが、６２日目には出発値の４１％、１１１日目には８％まで低減した。変異体２型ウイルスＭＥＦ−ＳＣ５ａのウイルス粒子は、１１１日目に出発Ｄ抗原含量の７５％を保持し、１８０日目に６４％を保持した。ＭＥＦ−ＳＣ５ａの空のカプシドは、１１０日目までに出発Ｄ抗原含量の８２％、１８０日目に活性の５２％を保持した。ＩＰＶの１型構成成分（図５Ａ）は、４３日目までにＤ抗原含量の３５％、８６日目までに４％のみを保持した；反応性は１８２日目までに消失した。変異体１型ウイルスＭａｈ−ＳＣ７のウイルス粒子も空カプシドも８６日目までにＤ抗原含量を何ら失わなかった；ＭＥＦ−ＳＣ７の空カプシドは、１８２日目にＤ抗原含量の８７％を保持した。したがって、安定化した空カプシドは、３７°のＩＰＶよりも際立って安定であった。これが、市販製品についても真実であった場合、コールドチェーン外でも十分に生存可能となり得る。
【実施例６】
【０２１４】
ラットにおける免疫原性
Ｓａｂｉｎ  ＩＰＶの２型構成成分は、古典的なＩＰＶにおいて、野生の２型株よりも免疫原性が低いことが知られていおり、この観察は、以前には満足のいくように説明されていなかった。したがって、安定化した株の空カプシド（又はＶＬＰ）の免疫原性を調査して、古典的ＩＰＶと比較することが必要であった。
【０２１５】
市販のＩＰＶの免疫原性アッセイは、通常、上記ＥＬＩＳＡによって、抗原含量を測定すること、次いで、ヒト用量に基づく希釈範囲でラットを免疫化することを伴う。中和アッセイにおける特異的カットオフで、血清変換を生じる動物の割合を、同じ時間に試験した基準調製物で見られるものと比較し、相対効力を計算することができる。免疫原性は、ＩＰＶロットのリリースに対してＮＩＢＳＣで確立した薬局方の方法を使用して評価した。Ｄ抗原含量はＥＬＩＳＡによって測定し、免疫原性をＷｉｓｔｅｒラットにおいて評価した。読み出しは、表１３で与えられる所定のカットオフを超える中和力価を有する動物の割合に基づいた。
【０２１６】
この試験では、最新の産生において使用される２型株がより高い血清学的応答を誘導し、したがって、カットオフはさらに高くなる。１、２及び３型の結果を表１３に示す。
【０２１７】
【表１５】
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【０２１８】
【表１６】
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【０２１９】
【表１７】
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【０２２０】
熱安定性ＶＬＰのＭａｈＳＣ７（１型）及びＳｋｔＳＣ８（３型）は、与えられたすべての用量で、すべての動物において、血清変換を引き起こしたが、一方、同じ用量の古典的ＩＰＶを与えられた動物の応答は、５０％の応答用量に及んだ。２型では、ＩＰＶを与えられた動物の応答は、５０％エンドポイントに及び、Ｓｃ５ａ  ＶＬＰの効力は、少なくとも４倍高かった。したがって、安定化したＶＬＰは、同等のＩＰＶ構成成分よりも少なくとも４倍免疫原性である。
【実施例７】
【０２２１】
マウスにおけるチャレンジからの防御
ポリオウイルスに対するヒト受容体（ＴｇＰＶＲ）を有するトランスジェニックマウスは、感染及び麻痺に対して感受性が強い。
【０２２２】
両方の性別のＴｇＰＶＲマウス（１試験群当たり８頭）が、ＰＢＳ（対照）又は０．５ヒト用量の精製したＶＬＰに対応する当量のＤ抗原又はＩＰＶの欧州基準のＢＲＰの１又は２回の腹腔内注射を受けた。ＶＬＰ調製物は、７日後のＨＥｐ２Ｃ単層及びブラインド継代の接種により非感染性であることが示された。与えられる場合、第２の投与は、１４日目である。３５日目に、血液試料を得て、関連血清型の野生型ポリオウイルス（Ｍａｈｏｎｅｙ１型、ＭＥＦ−１  ２型又はＳａｕｋｅｔｔ  ３型）のＰＤ５０の２５倍の当量で、マウスを筋肉内チャレンジし、次いで、１４日間、麻痺の任意の徴候についてモニタリングした。結果は、チャレンジ前の中和抗体力価も示す、図６Ａ〜Ｆに示す。すべての場合に、１又は２回いずれかの投与で与えられた安定化したカプシドは、ＩＰＶよりも免疫原性であり、すべての動物を、対応する毒性のウイルスのチャレンジから守った。
【０２２３】
倫理的陳述
すべての動物実験は、２０１３年に改訂された英国内務省の動物（科学的処置）法（Animal (Scientific Procedures) Act 1986）１９８６によって許可されたライセンスの下に実施し、内部ＮＩＢＳＣの動物愛護及び倫理審査会（Animal Welfare and Ethics Review Board）によって再調査された。ＴｇＰＶＲマウスとラットの免疫原性実験は、提出前に、ＮＩＢＳＣの動物愛護及び倫理審査会によって再調査及び承認された内務省のライセンスＰＰＬ  ８０／２４７８及びＰＰＬ  ８０／２０５０の下に実施した。
【０２２４】
結論
ポリオウイルスの増殖を伴わない、組換えバキュロウイルスに感染した昆虫細胞におけるポリオウイルスタンパク質の発現による空カプシドの産生について、２０年前よりも多く報告されたが、粒子が不安定であるあまり、ワクチン候補として有用ではなかった。免疫原性であるが、不安定なＶＬＰは、酵母における組換え発現によっても産生された。本明細書に記載の研究は、安定な空カプシドの最初の開発を表し、ポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）としても知られる。本発明者らは、安定化する改変の候補を特定し、次いで、複数の変化を組み合わせてカプシドタンパク質中へと導入する革新的手法を開発した。より詳細には、本明細書で使用される方法には、ビリオンの安定性に影響を及ぼすことなく、カプシドのアセンブリ中間体（空カプシドを含む）を不安定化する３型Ｓａｂｉｎワクチン株のポリオウイルスに存在することが知られている変異が関与とした。ゆえに、ワクチン及び他の供給源に由来する復帰変異体は、アセンブリを修復し、空カプシドの安定性を増加させる変異を有するようであると考えられた。１及び２型の株における安定化する変異を、不安定化するＳａｂｉｎ  ３型の変異を挿入し、非許容温度においてトランスフェクト細胞を選択し、ディープシークエンシングによって復帰ゲノムをスクリーニングすることによって特定した。この手法を使用して、他の、非ポリオのピコナウイルスに対する選択もガイドすることができた。一部の場合には、３型で見られた安定化する変異は、１型及び２型のウイルスで既に存在していた。
【０２２５】
ほとんどの場合では、空カプシドを安定化する要因である変異の構造的部位によって、それらの作用機序への洞察がもたらされる。ゆえに、一部の変異は、粒子サブユニット間の相互作用を安定化することによって作用すると思われ；他の変異は、立体構造の遷移に対して粒子を安定化させるために作用する、すべてのポリオウイルスに存在する単鎖脂肪酸であると考えられる「ポケット因子」を有するものを含むサブユニット内の接触を安定化することができ、さらに他のものは、五回軸下の管様のベータアニュラス構造などの、サブユニットを一緒に保持する、内部ネットワーク内のサブユニット間の相互作用を妥当に強化する。全体的ストラテジーは、他のピコナウイルスに対する安定なＶＬＰワクチンの開発において有用であり得る。
【０２２６】
新たなワクチンの認可と規制は、通常、標的疾患に対する有効性を実証する臨床試験を必要とする。世界中で症例数がゼロに近づいている場合に、これは、新たなポリオワクチンに対して非実際的である。他の手法に対しても先行例が存在する；ＳａｂｉｎをベースとするＩＰＶは、免疫原性研究の結果から中国と日本で認可され、行われる可能性のある臨床試験及び前臨床試験の種類に関するＷＨＯのガイドラインでガイダンスが提供されている。Ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ  Ｃワクチンは、臨床試験からの免疫原性データに基づいて英国で許可及び実施され、ヒトパピローマウイルスワクチンは、子宮頸がんではない非がん性病変を防御する能力に関して許可された。ワクチンを許可するかどうかの決定は、ＷＨＯよりも国家規制当局（ＮＲＡｓ，National Regulatory Authorities）次第であるが、これらの例は、自然のチャレンジからの防御を示す研究由来の臨床的有効性の直接的エビデンスがなくても承認を得ることが可能であることを証明する。
【０２２７】
研究された最終的ＶＬＰは、ＩＰＶと比較して極めて安定であり、コールドチェーンを必要としないワクチンとしての潜在的有用性を有する。さらに、ＶＬＰは、ＩＰＶの効力を試験するために使用される動物モデルにおいて、及びトランスジェニックマウスにおけるチャレンジ研究において、同等の株から作製されるＩＰＶよりも免疫原性であった。理論に拘泥されることなく、このことは、ある程度は、ＶＬＰが、ＩＰＶと異なり、ホルマリンで処理されなかったことによるかもしれない。それらが誘導されるウイルスは、それらの極端に安定なカプシドのせいでアンコーティングできなかったために、感染性を喪失したのであろう。ＶＬＰの特性により、それらは、非常に有望なワクチンの候補となる。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年11月12日(2019.11.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリオウイルス粒子から誘導されるポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）であって、前記ポリオウイルス粒子に対して、少なくとも１つの改変を含み、前記少なくとも１つの改変が前記ＶＬＰを安定化する、前記ポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項２】
少なくとも１つの改変が、表１、２又は３に定義される改変である、請求項１に記載のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項３】
（ａ）プロトマー界面；及び（ｂ）ペンタマー界面のそれぞれに少なくとも１つの改変が存在し、前記プロトマー界面及びペンタマー界面のそれぞれにおける前記少なくとも１つの改変が、表１、２又は３に定義される改変である、請求項１又は２に記載のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項４】
野生型ポリオウイルス又はワクチン株から誘導される、請求項１〜３のいずれかに記載のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項５】
１型、２型又は３型ポリオウイルスから誘導される、請求項１〜４のいずれかに記載のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項６】
（ａ）Ｍａｈｏｎｅｙ及びＳａｂｉｎ  １から選択される１型ポリオウイルス；
（ｂ）ＭＥＦ及びＳａｂｉｎ  ２から選択される２型ポリオウイルス；又は
（ｃ）Ｓａｕｋｅｔｔ及びＳａｂｉｎ  ３から選択される３型ポリオウイルス
から誘導される、請求項５に記載のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項７】
ＶＬＰが誘導されるポリオウイルス粒子に対して、前記ＶＬＰを安定化する少なくとも３つの改変を含み、
（ａ）プロトマー界面；及び
（ｂ）ペンタマー界面
のそれぞれに、少なくとも１つの改変が存在する、請求項１〜６のいずれかに記載のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項８】
ＶＬＰが誘導されるポリオウイルス粒子に対して、ポケットドメインに、少なくとも１つの改変をさらに含む、請求項１〜７のいずれかに記載のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項９】
プロトマー界面における改変がＱ３１７８Ｌであり、かつ、
ポケットドメインにおける改変が、
１型若しくは２型ポリオウイルスから誘導されるＶＬＰにおけるＦ１１３４Ｌであるか、あるいは、３型ポリオウイルスから誘導されるＣＬＰにおけるＦ１１３２Ｌである、
請求項８に記載のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項１０】
ポケットドメインの改変が、表１、２又は３に定義されている通りである、請求項９に記載のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項１１】
ポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）が１型ポリオウイルスから誘導され、
（ａ）プロトマー界面が、残基３１７８と１２４８若しくはそれに対応する残基のうちの一方若しくは両方に変異を含み；及び／又は
（ｂ）ペンタマー界面が、残基２０２５と２０５７若しくはそれに対応する残基のうちの一方若しくは両方に変異を含み；
前記ＶＬＰが、ポケットドメインに改変を含んでもよく、前記改変が、好ましくは、残基１１９６又はそれに対応する残基における変異である、請求項１〜１０のいずれかに記載のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項１２】
（ａ）プロトマー界面が、変異Ｑ３１７８ＬとＨ１２４８Ｐのうちの一方若しくは両方を含み；及び／又は
（ｂ）ペンタマー界面が、変異Ｔ２０２５ＡとＤ２０５７Ｅのうちの一方若しくは両方を含み；
前記ＶＬＰが、ポケットドメインに改変を含んでもよく、前記改変が、好ましくは、変異Ｖ１１９６Ｌである、
請求項１１に記載のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項１３】
プロトマー界面の残基３１７８と１２４８又はそれに対応する残基において両方の変異、及びペンタマー界面の残基２０２５と２０５７又はそれに対応する残基において両方の変異を含み、かつポケットドメインの残基１１９６又はそれに対応する残基において変異を含んでもよい、請求項１１又は１２に記載のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項１４】
ポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）が２型ポリオウイルスから誘導され、
（ａ）プロトマー界面が、残基３１７８と１１０７若しくはそれらに対応する残基のうちの一方若しくは両方において変異を含み；並びに／又は
（ｂ）ペンタマー界面が、残基３０８５、１０４１及び／若しくは２０５７又はそれに対応する残基のうちの１若しくは２以上において変異を含み；
前記ＶＬＰが、ポケットドメインに改変を含んでもよく、前記改変が、好ましくは、残基１１３４、１１５９及び１１８３若しくはそれに対応する残基のうちの１若しくは２以上における変異である、請求項１〜１０のいずれかに記載のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項１５】
（ａ）プロトマー界面が、変異Ｑ３１７８ＬとＶ１１０７Ｉのうちの一方若しくは両方を含み；並びに／又は
（ｂ）ペンタマー界面が、変異Ｌ３０８５Ｆ、Ｔ１０４１Ｉ及び／又はＤ２０５７Ａのうちの１若しくは２以上を含み；
前記ＶＬＰが、ポケットドメインに改変を含んでもよく、及び前記改変は、好ましくは、変異Ｆ１１３４Ｌ、Ｙ１１５９Ｆ及びＶ１１８３Ｌのうちの１若しくは２以上である、請求項１４に記載のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項１６】
（ａ）プロトマー界面の残基３１７８若しくはそれに対応する残基において変異、及びペンタマー界面の両残基３０８５及び１０４１若しくはそれらに対応する残基において変異を含み、かつポケットドメインの両残基１１３４及び１１５９若しくはそれらに対応する残基において変異を含んでもよく；又は
（ｂ）前記プロトマー界面の残基３１７８及び１１０７若しくはそれらに対応する残基において両方の変異、及び前記ペンタマー界面の残基２０５７若しくはそれに対応する残基において変異を含み、かつポケットドメインの両残基１１３４及び１１８３若しくはそれらに対応する残基において変異を含んでもよい、請求項１４又は１５に記載のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項１７】
ポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）が３型のポリオウイルスから誘導され、
（ａ）プロトマー界面が、残基２２１５と３０９１若しくはそれらに対応する残基のうちの一方若しくは両方において変異を含み；及び／又は
（ｂ）ペンタマー界面が、残基２０１８と３０８５若しくはそれらに対応する残基のうちの一方若しくは両方において変異を含み；
前記ＶＬＰが、ポケットドメインに改変を含んでもよく、前記改変が、好ましくは、残基１１３２（ＶＰ１  １３２）又はそれに対応する残基における変異である、請求項１〜１０のいずれかに記載のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項１８】
（ａ）プロトマー界面が、変異Ｌ２２１５ＭとＦ３０９１Ｓのうちの一方若しくは両方を含み；及び／又は
（ｂ）ペンタマー界面が、変異Ｌ２０１８ＩとＬ３０８５Ｆのうちの一方若しくは両方を含み；
前記ＶＬＰが、ポケットドメインに改変を含んでもよく、前記改変が、好ましくは、変異Ｆ１１３２Ｌである、請求項１７に記載のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項１９】
プロトマー界面の残基２２１５及び３０９１若しくはそれに対応する残基において両方の変異、及びペンタマー界面の残基２０１８及び３０８５若しくはそれに対応する残基において両方の変異を含み、かつポケットドメインの残基１１３２、若しくはそれに対応する残基において変異を含んでもよい、請求項１７又は１８に記載のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項２０】
ポケットドメイン、プロトマー界面及び／又はペンタマー界面のうちの１又は２以上に、１又は２以上の追加の改変を含み、前記１又は２以上の追加の改変が、表１、２又は３に定義されている通りの改変であってもよい、請求項１〜１９のいずれかに記載のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項２１】
１又は２以上の追加の構造ドメインに、少なくとも１つのさらなる改変を含み、前記１又は２以上の追加の改変が、表１、２又は３に定義されている通りの改変であってもよい、請求項１〜２０のいずれかに記載のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項２２】
１又は２以上の追加の構造ドメインが、
（ａ）ＶＰ２／ＶＰ３界面；
（ｂ）内部ネットワーク；及び／又は
（ｃ）キャニオン
から選択される、請求項２１に記載のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項２３】
内部ネットワークが、三回軸、五回軸、及び／又は五回軸下の管を含み、前記少なくとも１つのさらなる改変が、前記三回軸、五回軸、若しくは五回軸下の管に又はそれと近接して位置する、請求項２２に記載のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項２４】
ポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）が１型ポリオウイルスから誘導され、
（ａ）ＶＰ２／ＶＰ３界面が、残基３１１９若しくはそれに対応する残基において変異を含み；及び／又は
（ｂ）内部ネットワークが、残基４０１８若しくはそれに対応する残基において変異を含む、
請求項２１〜２３のいずれかに記載のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項２５】
（ａ）ＶＰ２／ＶＰ３界面が、変異Ｌ３３１９Ｍを含み；及び／又は
（ｂ）内部ネットワークが、変異Ｒ４０１８Ｇを含む、
請求項２４に記載のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項２６】
ポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）が２型ポリオウイルスから誘導され、内部ネットワークが、残基４０５７又はそれに対応する残基において変異を含む、請求項２１〜２３のいずれかに記載のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項２７】
内部ネットワークが、変異Ｉ４０５７Ｖを含む、請求項２６に記載のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項２８】
ポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）が３型ポリオウイルスから誘導され、
（ａ）ＶＰ２／ＶＰ３界面が、残基２２４１若しくはそれに対応する残基において変異を含み；
（ｂ）内部ネットワークが、残基１０５４、４０６７及び３０１９若しくはそれらに対応する残基のうちの１若しくは２以上において変異を含み；並びに／又は
（ｃ）キャニオンが、残基１１０５若しくはそれに対応する残基において変異を含む、
請求項２１〜２３のいずれかに記載のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項２９】
（ａ）ＶＰ２／ＶＰ３界面が、変異Ｄ２２４１Ｅを含み；
（ｂ）内部ネットワークが、ＶＰ１  ５４アラニンのバリンへの変異、変異Ｔ４０６７Ａ及びＨ３０１９Ｙのうちの１若しくは２以上を含み；並びに／又は
（ｃ）キャニオンが、変異Ｔ１１０５Ｍを含む、
請求項２８に記載のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項３０】
ＶＰ２／ＶＰ３界面、内部ネットワーク及び／又はキャニオンのうちの１又は２以上に１又は２以上の追加の改変を含み、前記１又は２以上の追加の改変が、表１、２、又は３に定義されている通りの改変であってもよい、請求項１８〜２９のいずれかに記載のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項３１】
（ａ）１型ポリオウイルスから誘導され、（ｉ）プロトマー界面に変異Ｑ３１７８Ｌ及びＨ１２４８Ｐ、（ii）ペンタマー界面に変異Ｔ２０２５Ａ及びＤ２０５７Ｅ、（iii）ＶＰ２／ＶＰ３界面に変異Ｌ３１１９Ｍ、並びに（iv）内部ネットワークに変異Ｒ４０１８Ｇを含み；前記ＶＬＰが、ポケットドメインに変異Ｖ１１９６Ｌをさらに含んでもよいか；
（ｂ）２型ポリオウイルスから誘導され、（ｉ）前記ポケットドメインに変異Ｆ１１３４Ｌ及びＹ１１５９Ｆ、（ii）前記プロトマー界面に変異Ｑ３１７８Ｌ、並びに（iii）前記ペンタマー界面に変異Ｌ３０８５Ｆ及びＴ１０４１Ｉを含むか；又は
（ｃ）２型ポリオウイルスから誘導され、（ｉ）前記ポケットドメインに変異Ｆ１１３４Ｌ及びＶ１１８３Ｌ、（ii）前記プロトマー界面に変異Ｑ３１７８Ｌ及びＶ１１０７Ｉ、（iii）前記ペンタマー界面に変異Ｄ２０５７Ａ；並びに（iv）内部ネットワークに変異Ｉ４０５Ｖを含むか、又は
（ｄ）３型ポリオウイルスから誘導され、（ｉ）前記ポケットドメインに変異Ｆ１１３２Ｌ、（ii）前記プロトマー界面に変異Ｌ２２１５Ｍ及びＦ３０９１Ｓ、（iii）前記ペンタマー界面に変異Ｌ２０１８Ｉ及びＬ３０８５Ｆ、（iv）前記ＶＰ２／ＶＰ３界面に変異Ｄ２２４１Ｅを含み、（ｖ）前記内部ネットワークに変異Ｔ４０６７Ａ、Ｈ３０１９Ｙ、及び任意で変異Ａ１０５４Ｖを含み、並びに（vi）キャニオンに変異Ｔ１１０５Ｍを含む、請求項１〜３０のいずれかに記載のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項３２】
（ａ）（ｉ）配列番号１６若しくは１７のアミノ酸配列を有するＰ１；（ii）配列番号１のアミノ酸配列を有するＶＰ１、配列番号５のアミノ酸配列を有するＶＰ０、及び配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＰ３、（iii）配列番号１のアミノ酸配列を有するＶＰ１、配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＰ２、及び配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＰ３及び配列番号４のアミノ酸配列を有するＶＰ４；並びに／又は（iv）Ｐ１；ＶＰ１、ＶＰ０及びＶＰ３；若しくは（ｉ）〜（iii）のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３及びＶＰ４を有する１型ポリオウイルスから誘導される１型ＶＬＰ；
（ｂ）（ｉ）配列番号１８若しくは１９のアミノ酸配列を有するＰ１；（ii）配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＰ１、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＶＰ０、及び配列番号８のアミノ酸配列を有するＶＰ３、（iii）配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＰ１、配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＰ２、及び配列番号８のアミノ酸配列を有するＶＰ３及び配列番号９のアミノ酸配列を有するＶＰ４；並びに／又は（iv）Ｐ１；ＶＰ１、ＶＰ０及びＶＰ３；若しくは（ｉ）〜（iii）のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３及びＶＰ４を有する２型ポリオウイルスから誘導される２型ＶＬＰ；又は
（ｃ）（ｉ）配列番号２０若しくは２１のアミノ酸配列を有するＰ１；（ii）配列番号１１のアミノ酸配列を有するＶＰ１、配列番号１５のアミノ酸配列を有するＶＰ０、及び配列番号１３のアミノ酸配列を有するＶＰ３、（iii）配列番号１１のアミノ酸配列を有するＶＰ１、配列番号１２のアミノ酸配列を有するＶＰ２、及び配列番号１３のアミノ酸配列を有するＶＰ３及び配列番号１４のアミノ酸配列を有するＶＰ４；並びに／又は（iv）Ｐ１；ＶＰ１、ＶＰ０及びＶＰ３；若しくは（ｉ）〜（iii）のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３及びＶＰ４を有する３型ポリオウイルスから誘導される３型ＶＬＰである、請求項１〜３１のいずれかに記載のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項３３】
ＶＬＰが誘導されるポリオウイルス粒子に対する少なくとも１つの改変が、ポリオウイルスのカプシドのネイティブ抗原の立体構造を安定化させる、請求項１〜３２のいずれかに記載のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項３４】
ポリオウイルスのカプシドの安定性を増加させる前記ポリオウイルスのカプシド内の改変を特定する方法であって、
（ａ）不安定化する変異をポリオウイルス株の前記カプシドへと導入するステップと；
（ｂ）半許容温度で、前記ポリオウイルス株を増殖させるステップと；
（ｃ）得られたポリオウイルスをスクリーニングして、前記不安定化する変異の作用を逆転させる１又は２以上の改変を特定するステップと
を含む、前記方法。
【請求項３５】
半許容温度が、約３８℃〜約４０℃の範囲内の温度である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ステップ（ｃ）で特定された１又は２以上の改変を野生型ポリオウイルスへと導入するステップと、前記１又は２以上の改変がポリオウイルスのカプシドの安定性を増加させることを確認するステップとをさらに含む、請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項３７】
ポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）を産生する方法であって、
（ａ）前記ＶＬＰをコードする感染性ＲＮＡ転写物を宿主哺乳動物細胞へと導入するステップ；又は
（ｂ）請求項３４〜３６のいずれかに記載の方法によって特定された１又は２以上の改変を含むポリオウイルスのカプシド由来ポリペプチドを組換えにより産生するステップ、及び前記ポリペプチドをアセンブルしてＶＬＰを形成するステップ
を含む、前記方法。
【請求項３８】
請求項３７に記載の方法によって得ることができるポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項３９】
請求項１〜３３のいずれかで定義されている通りのＶＬＰである、請求項３８に記載のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項４０】
請求項１〜３３、３８、及び３９のいずれかに記載のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）と、薬学的に許容される賦形剤又は希釈剤とを含む組成物。
【請求項４１】
請求項１〜３３、３８、及び３９のいずれかで定義されている通りのポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）をコードするポリヌクレオチド分子。
【請求項４２】
プロモーターに作動可能に連結する、請求項４１で定義されている通りのポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項４３】
（ｉ）請求項１〜３３、３８、及び３９のいずれかに記載のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）；又は
（ii）請求項１〜３３、３８、及び３９のいずれかに記載のＶＬＰをコードする核酸；と、
アジュバントと
を含むワクチン。
【請求項４４】
請求項４１に記載のポリヌクレオチド又は請求項４２に記載の発現ベクターを含む核酸ベクターである、請求項４３に記載のワクチン。
【請求項４５】
ポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）をコードし、Ｐ１前駆体の切断のためのウイルスのプロテアーゼをさらにコードするＰ１  ＲＮＡを含むＲＮＡワクチンである、請求項４３又は４４に記載のワクチン。
【請求項４６】
ポリオウイルスに対してワクチン接種をする方法において使用するための、請求項１〜３３、３８、及び３９のいずれかに記載のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）、請求項４０に記載の組成物又は請求項４３〜４５のいずれかに記載のワクチン。
【請求項４７】
ポリオウイルスに対してワクチン接種をする方法において使用するための医薬の製造における、請求項１〜３３、３８、及び３９のいずれかに記載のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）、又は請求項４０に記載の組成物の使用。
【請求項４８】
ポリオウイルスに対して対象にワクチン接種をする方法であって、有効量の、請求項１〜３３、３８、及び３９のいずれかに記載のポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）、請求項４０に記載の組成物又は請求項４３〜４５のいずれかに記載のワクチンを、それを必要とする対象に投与するステップを含む方法。
【請求項４９】
請求項１〜３３、３８、及び３９のいずれかで定義されている通りのポリオウイルス様粒子（ＶＬＰ）を産生する細胞。
【請求項５０】
請求項４１で定義されている通りのポリヌクレオチド、又は請求項４２で定義されている通りの発現ベクターを含む、請求項４９に記載の細胞。
【国際調査報告】
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