(57)【要約】  本発明は、ヒトSCN9AプレmRNA内のエクソン4の3'スプライス部位を標的とするペプチド核酸誘導体を提供する。本ペプチド核酸誘導体は、細胞内においてSCN9Aエクソン4を欠失するSCN9A mRNAスプライス変異体を強力に誘導し、疼痛又はNav1.7活性が関与する状態を安全に処置するのに有用である。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Iによって表されるペプチド核酸誘導体、又はそれらの薬学的に許容される塩:
【化１】
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[式中、
nは、10〜25の整数であり;
式Iの化合物は、ヒトSCN9AプレmRNA内の[(5'→3') UGUUUAGGUACACU]の14量体プレmRNA配列と少なくとも10量体の相補的重複を有し;
式Iの化合物は、ヒトSCN9AプレmRNAに完全に相補的であるか、又は1つ若しくは2つのミスマッチによりヒトSCN9AプレmRNAに部分的に相補的であり;
S1、S2、...、Sn-1、Sn、T1、T2、...、Tn-1、及びTnは、独立して、デューテリド[D]、ヒドリド[H]、置換若しくは無置換アルキル、又は置換若しくは無置換アリール基を表し;
X及びYは、独立して、ヒドリド、ホルミル[H-C(=O)-]、アミノカルボニル[NH2-C(=O)-]、アミノチオカルボニル[NH2-C(=S)-]、置換若しくは無置換アルキル、置換若しくは無置換アリール、置換若しくは無置換アルキルアシル、置換若しくは無置換アリールアシル、置換若しくは無置換アルキルオキシカルボニル、置換若しくは無置換アリールオキシカルボニル、置換若しくは無置換アルキルアミノカルボニル、置換若しくは無置換アリールアミノカルボニル、置換若しくは無置換アルキルアミノチオカルボニル、置換若しくは無置換アリールアミノチオカルボニル、置換若しくは無置換アルキルオキシチオカルボニル、置換若しくは無置換アリールオキシチオカルボニル、置換若しくは無置換アルキルスルホニル、置換若しくは無置換アリールスルホニル、置換若しくは無置換アルキルホスホニル基、又は置換若しくは無置換アリールホスホニル基を表し;
Zは、ヒドリド、ヒドロキシ、置換若しくは無置換アルキルオキシ、置換若しくは無置換アリールオキシ、置換若しくは無置換アミノ、置換若しくは無置換アルキル、又は置換若しくは無置換アリール基を表し;
B1、B2、...、Bn-1及びBnは、独立して、アデニン、チミン、グアニン、シトシン及びウラシルを含む天然核酸塩基並びに非天然核酸塩基から選択され;
B1、B2、...、Bn-1及びBnのうちの少なくとも4つは、独立して、核酸塩基部分に共有結合されている置換又は無置換アミノ基を有する非天然核酸塩基から選択される]。
【請求項２】
nが10〜25の整数であり;
式Iの化合物が、ヒトSCN9AプレmRNA内の[(5'→3') UGUUUAGGUACACU]の14量体プレmRNA配列と少なくとも10量体の相補的重複を有し;
式Iの化合物が、ヒトSCN9AプレmRNAに完全に相補的であるか、又は1つ若しくは2つのミスマッチによりヒトSCN9AプレmRNAに部分的に相補的であり;
S1、S2、...、Sn-1、Sn、T1、T2、...、Tn-1、及びTnが、独立して、デューテリド、ヒドリド、置換若しくは無置換アルキル、又は置換若しくは無置換アリール基を表し;
X及びYが、独立して、ヒドリド、ホルミル、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、置換若しくは無置換アルキル、置換若しくは無置換アリール、置換若しくは無置換アルキルアシル、置換若しくは無置換アリールアシル、置換若しくは無置換アルキルオキシカルボニル、置換若しくは無置換アリールオキシカルボニル、置換若しくは無置換アルキルアミノカルボニル、置換若しくは無置換アリールアミノカルボニル、置換若しくは無置換アルキルアミノチオカルボニル、置換若しくは無置換アリールアミノチオカルボニル、置換若しくは無置換アルキルオキシチオカルボニル、置換若しくは無置換アリールオキシチオカルボニル、置換若しくは無置換アルキルスルホニル、置換若しくは無置換アリールスルホニル、置換若しくは無置換アルキルホスホニル基、又は置換若しくは無置換アリールホスホニル基を表し;
Zが、ヒドリド、ヒドロキシ、置換若しくは無置換アルキルオキシ、置換若しくは無置換アリールオキシ、置換若しくは無置換アミノ、置換若しくは無置換アルキル、又は置換若しくは無置換アリール基を表し;
B1、B2、...、Bn-1及びBnが、独立して、アデニン、チミン、グアニン、シトシン及びウラシルを含む天然核酸塩基並びに非天然核酸塩基から選択され;
B1、B2、...、Bn-1及びBnのうちの少なくとも4つが、独立して、式II、式III又は式IVによって表される非天然核酸塩基:
【化２】
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[式中、
R1、R2、R3、R4、R5及びR6は、独立して、ヒドリド、及び置換又は無置換アルキル基から選択され;
L1、L2及びL3は、塩基性アミノ基を核酸塩基部分に共有結合している式V:
【化３】
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(式中、
Q1及びQmは、置換又は無置換メチレン(-CH2-)基であり、Qmは、塩基性アミノ基に直接結合されており;
Q2、Q3、...及びQm-1は、独立して、置換又は無置換メチレン、酸素(-O-)、硫黄(-S-)、及び置換又は無置換アミノ基[-N(H)-、若しくは-N(置換)-]から選択され;
mは、1から15の整数である)
によって表される共有結合リンカーである]
から選択される、
請求項1に記載のペプチド核酸誘導体、又はそれらの薬学的に許容される塩。
【請求項３】
S1、S2、...、Sn-1、Sn、T1、T2、...、Tn-1及びTnが、独立して、デューテリド又はヒドリド基を表し、Zが、ヒドリド、ヒドロキシ、置換若しくは無置換アルキルオキシ、置換若しくは無置換アリールオキシ、又は置換若しくは無置換アミノ基を表す、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
S1、S2、...、Sn-1、Sn、T1、T2、...、Tn-1及びTnのうちの少なくとも1つが、独立して、置換若しくは無置換アルキル、又は置換若しくは無置換アリール基を表し、並びに/或いは、Zが置換若しくは無置換アルキル、又は置換若しくは無置換アリール基を表す、請求項2に記載の方法。
【請求項５】
nが11〜21の整数であり;
式Iの化合物が、ヒトSCN9AプレmRNA内の[(5'→3') UGUUUAGGUACACU]の14量体プレmRNA配列と少なくとも10量体の相補的重複を有し;
式Iの化合物が、ヒトSCN9AプレmRNAに完全に相補的であるか、又は1つ若しくは2つのミスマッチによりヒトSCN9AプレmRNAに部分的に相補的であり;
S1、S2、...、Sn-1、Sn、T1、T2、...、Tn-1及びTnがヒドリド基であり;
X及びYが、独立して、ヒドリド、置換若しくは無置換アルキル、置換若しくは無置換アリール、置換若しくは無置換アルキルアシル、置換若しくは無置換アリールアシル、置換若しくは無置換アルキルオキシカルボニル、置換若しくは無置換アリールオキシカルボニル、置換若しくは無置換アルキルアミノカルボニル、置換若しくは無置換アリールアミノカルボニル、置換若しくは無置換アルキルスルホニル、又は置換若しくは無置換アリールスルホニル基を表し;
Zが置換又は無置換アミノ基を表し;
B1、B2、...、Bn-1及びBnが、独立して、アデニン、チミン、グアニン、シトシン及びウラシルを含む天然核酸塩基並びに非天然核酸塩基から選択され;
B1、B2、...、Bn-1及びBnのうちの少なくとも4つが、独立して、式II、式III又は式IVによって表される非天然核酸塩基から選択され;
R1、R2、R3、R4、R5及びR6が、独立して、ヒドリド、及び置換又は無置換アルキル基から選択され;
Q1及びQmが置換又は無置換メチレン基であり、Qmが塩基性アミノ基に直接結合されており;
Q2、Q3、...及びQm-1が、独立して、置換又は無置換のメチレン、酸素及びアミノ基から選択され;
mが1〜11の整数である、
請求項1に記載のペプチド核酸誘導体、又はそれらの薬学的に許容される塩。
【請求項６】
X及びYが、独立して、ヒドリド、置換若しくは無置換アルキル、置換若しくは無置換アリール、置換若しくは無置換アルキルアシル、置換若しくは無置換アリールアシル、置換若しくは無置換アルキルオキシカルボニル、又は置換若しくは無置換アリールオキシカルボニル基を表す、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
X及びYのうちの少なくとも1つが、独立して、置換若しくは無置換アルキルアミノカルボニル、置換若しくは無置換アリールアミノカルボニル、置換若しくは無置換アルキルスルホニル、又は置換若しくは無置換アリールスルホニル基を表す、請求項5に記載の方法。
【請求項８】
nが11〜19の整数であり;
式Iの化合物が、ヒトSCN9AプレmRNA内の[(5'→3') UGUUUAGGUACACU]の14量体プレmRNA配列と少なくとも10量体の相補的重複を有し;
式Iの化合物が、ヒトSCN9AプレmRNAに完全に相補的であり;
S1、S2、...、Sn-1、Sn、T1、T2、...、Tn-1及びTnがヒドリド基であり;
X及びYが、独立して、ヒドリド、置換若しくは無置換アルキル、置換若しくは無置換アリール、置換若しくは無置換アルキルアシル、置換若しくは無置換アリールアシル、置換若しくは無置換アルキルオキシカルボニル、置換若しくは無置換アルキルアミノカルボニル、置換若しくは無置換アルキルスルホニル、又は置換若しくは無置換アリールスルホニル基を表し;
Zが置換又は無置換アミノ基を表し;
B1、B2、...、Bn-1及びBnが、独立して、アデニン、チミン、グアニン、シトシン及びウラシルを含む天然核酸塩基並びに非天然核酸塩基から選択され;
B1、B2、...、Bn-1及びBnのうちの少なくとも4つが、独立して、式II、式III又は式IVによって表される非天然核酸塩基から選択され;
R1、R2、R3、R4、R5及びR6が、独立して、ヒドリド、及び置換又は無置換アルキル基から選択され;
Q1及びQmがメチレン基であり、Qmが塩基性アミノ基に直接結合されており;
Q2、Q3、...及びQm-1が、独立して、メチレン、酸素及びアミノ基から選択され;
mが1〜9の整数である、
請求項1に記載のペプチド核酸誘導体、又はそれらの薬学的に許容される塩。
【請求項９】
X及びYが、独立して、ヒドリド、置換若しくは無置換アルキルアシル、又は置換若しくは無置換アルキルオキシカルボニル基を表す、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
X及びYのうちの少なくとも1つが、独立して、置換若しくは無置換アルキル、置換若しくは無置換アリール、置換若しくは無置換アリールアシル、置換若しくは無置換アルキルアミノカルボニル、置換若しくは無置換アルキルスルホニル、又は置換若しくは無置換アリールスルホニル基を表す、請求項8に記載の方法。
【請求項１１】
nが11〜19の整数であり;
式Iの化合物が、ヒトSCN9AプレmRNA内の[(5'→3') UGUUUAGGUACACU]の14量体プレmRNA配列と少なくとも10量体の相補的重複を有し;
式Iの化合物が、ヒトSCN9AプレmRNAに完全に相補的であり;
S1、S2、...、Sn-1、Sn、T1、T2、...、Tn-1及びTnがヒドリド基であり;
X及びYが、独立して、ヒドリド、置換若しくは無置換アルキル、置換若しくは無置換アリール、置換若しくは無置換アルキルアシル、置換若しくは無置換アリールアシル、置換若しくは無置換アルキルオキシカルボニル基を表し;
Zが置換又は無置換アミノ基を表し;
B1、B2、...、Bn-1及びBnが、独立して、アデニン、チミン、グアニン、シトシン及びウラシルを含む天然核酸塩基並びに非天然核酸塩基から選択され;
B1、B2、...、Bn-1及びBnのうちの少なくとも4つが、独立して、式II、式III又は式IVによって表される非天然核酸塩基から選択され;
R1、R3、及びR5がヒドリド基であり、R2、R4及びR6が、独立して、ヒドリド、又は置換若しくは無置換アルキル基を表し;
Q1及びQmがメチレン基であり、Qmが塩基性アミノ基に直接結合されており;
Q2、Q3、...及びQm-1が、独立して、メチレン、酸素基から選択され;
mが1〜8の整数である、
請求項1に記載のペプチド核酸誘導体、又はそれらの薬学的に許容される塩。
【請求項１２】
X及びYが、独立して、ヒドリド、置換若しくは無置換アルキルアシル、又は置換若しくは無置換アルキルオキシカルボニル基を表す、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
X及びYのうちの少なくとも1つが、独立して、置換若しくは無置換アルキル、置換若しくは無置換アリール、又は置換若しくは無置換アリールアシル基を表す、請求項11に記載の方法。
【請求項１４】
nが11〜19の整数であり;
式Iの化合物が、ヒトSCN9AプレmRNA内の[(5'→3') UGUUUAGGUACACU]の14量体プレmRNA配列と少なくとも10量体の相補的重複を有し;
式Iの化合物が、ヒトSCN9AプレmRNAに完全に相補的であり;
S1、S2、...、Sn-1、Sn、T1、T2、...、Tn-1及びTnがヒドリド基であり;
X及びYが、独立して、ヒドリド、置換若しくは無置換アルキルアシル、置換若しくは無置換アリールアシル、又は置換若しくは無置換アルキルオキシカルボニル基を表し;
Zが置換又は無置換アミノ基を表し;
B1、B2、...、Bn-1及びBnが、独立して、アデニン、チミン、グアニン、シトシン、及び非天然核酸塩基から選択され;
B1、B2、...、Bn-1及びBnのうちの少なくとも5つが、独立して、式II、式III又は式IVによって表される非天然核酸塩基から選択され;
R1、R2、R3、R4、R5及びR6がヒドリド基であり;
Q1及びQmがメチレン基であり、Qmが塩基性アミノ基に直接結合されており;
Q2、Q3、...及びQm-1が、独立して、メチレン、及び酸素基から選択され;
mが1〜8の整数である、
請求項1に記載のペプチド核酸誘導体、又はそれらの薬学的に許容される塩。
【請求項１５】
X及びYが、独立して、ヒドリド、置換若しくは無置換アルキルアシル、又は置換若しくは無置換アルキルオキシカルボニル基を表す、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
X及びYのうちの少なくとも1つが、独立して、置換若しくは無置換アリールアシルを表す、請求項14に記載の方法。
【請求項１７】
nが11〜19の整数であり;
式Iの化合物が、ヒトSCN9AプレmRNA内の[(5'→3') UGUUUAGGUACACU]の14量体プレmRNA配列と少なくとも10量体の相補的重複を有し;
式Iの化合物が、ヒトSCN9AプレmRNAに完全に相補的であり;
S1、S2、...、Sn-1、Sn、T1、T2、...、Tn-1及びTnがヒドリド基であり;
Xがヒドリド基であり;
Yが置換若しくは無置換アルキルアシル、置換若しくは無置換アリールアシル、又は置換若しくは無置換アルキルオキシカルボニル基を表し;
Zが置換又は無置換アミノ基を表し;
B1、B2、...、Bn-1及びBnが、独立して、アデニン、チミン、グアニン、シトシン、及び非天然核酸塩基から選択され;
B1、B2、...、Bn-1及びBnのうちの少なくとも5つが、独立して、式II、式III又は式IVによって表される非天然核酸塩基から選択され;
R1、R2、R3、R4、R5及びR6がヒドリド基であり;
L1が-(CH2)2-O-(CH2)2-、-CH2-O-(CH2)2-、-CH2-O-(CH2)3-、-CH2-O-(CH2)4-、又は-CH2-O-(CH2)5-を表し、右端が塩基性アミノ基に直接結合しており;
L2及びL3が、独立して、-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)4-、-(CH2)5-、-(CH2)6-、-(CH2)7-、-(CH2)8-、-(CH2)2-O-(CH2)2-、-(CH2)3-O-(CH2)2-、及び-(CH2)2-O-(CH2)3-から選択され、右端が塩基性アミノ基に直接結合している、
請求項1に記載のペプチド核酸誘導体、又はそれらの薬学的に許容される塩。
【請求項１８】
Yが、置換若しくは無置換アルキルアシル、又は置換若しくは無置換アルキルオキシカルボニル基を表す、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
Yが置換若しくは無置換アリールアシルを表す、請求項17に記載の方法。
【請求項２０】
下記で提供されているペプチド核酸誘導体:
(N → C) Fethoc-TA(5)A-A(5)AG(6)-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)-NH2;
(N → C) Fethoc-TA(5)A-A(4)AG(6)-TG(6)T-A(5)CC(1O3)-TA(5)A-A-NH2;
(N → C) Fmoc-TA(5)A-A(4)AG(6)-TG(6)T-A(5)CC(1O3)-TA(5)A-A-NH2;
(N → C) Piv-Leu-TA(5)A-A(5)AG(3O2)-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)-NH2;
(N → C) Fethoc-TA(5)T-A(5)AG(6)-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)-NH2;
(N → C) ベンゾイル-Gly-TA(2O2)A-A(5)AG(6)-TG(6)T-A(5)CT-TA(5)A-Lys-NH2;
(N → C) Fethoc-AA(5)G-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TAA(5)-A-NH2;
(N → C) Fethoc-AA(5)G-CG(6)T-A(5)CC(1O2)-TAA(5)-A-NH2;
(N → C) Fmoc-AA(5)G-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TAA(5)-A-NH2;
(N → C) ベンゼンスルホニル-AA(5)G-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TAA(5)-A-NH2;
(N → C) Ac-AA(5)G-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TAA(5)-A-NH2;
(N → C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(3)A-A(5)-NH2;
(N → C) Fmoc-AA(5)G-TG(6)T-AC(1O2)C-TAA(5)-A-NH2;
(N → C) メチル-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(3)A-A(5)-Gly-Arg-NH2;
(N → C) Fethoc-A(5)AG-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TAA-A(5)-NH2;
(N → C) Ac-Val-A(5)AG-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TAA-A(5)-NH2;
(N → C) Fethoc-AAG(6)-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A-NH2;
(N → C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)-NH2;
(N → C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N → C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)AC(1O2)-TA(5)T-A(5)C-NH2;
(N → C) H-AA(5)G-TG(2O2)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N → C) Fethoc-Lys-Leu-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(2O2)A-A(5)C-Lys-NH2;
(N → C) [N-(2-フェニルエチル)アミノ]カルボニル-AA(3)G-TG(5)T-A(5)CC(1O5)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N → C) N,N-フェニル-Me-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(4)C-NH2;
(N → C) Fethoc-AA(5)G-TA(5)T-A(5)CC(1O2)-TG(5)A-A(5)C-NH2;
(N → C) p-トルエンスルホニル-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N → C) p-トルエンスルホニル-AA(5)G-TG(2O3)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-Lys-NH2;
(N → C) Fethoc-AA(5)G-TG(2O3)T-A(5)CC(1O3)-TA(7)A-A(5)C-NH2;
(N → C) n-プロピル-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O3)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N → C) ベンゾイル-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N → C) ベンジル-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O3)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N → C) ベンゾイル-AA(5)G-TG(3)T-A(5)CC(2O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N → C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-Leu-Lys-NH2;
(N → C) Piv-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N → C) Fethoc-TA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N → C) Fethoc-AA(5)C-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N → C) メチルスルホニル-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N → C) n-ヘキシル-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N → C) n-ヘキサノイル-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N → C) n-ヘキサノイル-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(8)A-A(5)C-NH2;
(N → C) Fethoc-AA(3)G-TG(2O2)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N → C) Fethoc-AA(3)G-TG(2O2)T-A(5)CC(1O3)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N → C) Fethoc-AA(3)G-TG(2O2)T-A(5)CC(2O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N → C) FAM-HEX-HEX-AA(3)G-TG(2O2)T-A(5)CC(2O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N → C) Fethoc-A(5)GT-G(5)TA(5)-CC(1O2)T-A(5)AA(5)-C-NH2;
(N → C) Fethoc-AG(5)T-G(7)TA-CC(1O2)T-AA(6)A-C-NH2;
(N → C) Fethoc-AA(6)G-TG(5)T-A(6)CC(1O2)-TA(6)A-A(6)C-NH2;
(N → C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(3)CA-C(1O5)AA-NH2;
(N → C) Fethoc-AA(5)G-TCT-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(3)CA-C(1O5)AA-NH2;
(N → C) Fethoc-AA(5)G-TCT-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(3)CA(3)-CTA-NH2;
(N → C) Fethoc-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(3)CA-CA(7)A-NH2;
(N → C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(3)CA(5)-C-NH2;
(N → C) Fethoc-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(3)CA(5)-C-NH2;
(N → C) p-トルエンスルホニル-TG(2O3)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(3)CA-C-Lys-NH2;
(N → C) Fethoc-TG(5)T-A(5)CC(2O2)-TA(5)A-A(3)CA-CA(5)A-NH2;
(N → C) Piv-TG(5)T-A(5)CC(2O2)-TA(5)A-A(3)CA-CA(5)A-NH2;
(N → C) ベンゾイル-TG(5)T-A(5)CC(2O2)-TA(5)A-A(3)CA-CA(5)A-NH2;
(N → C) プロピオニル-TG(5)T-A(5)CC(2O2)-TA(5)A-A(3)CA-CA(5)A-NH2;
(N → C) Fethoc-TG(5)T-A(5)CC(2O2)-TA(5)A-A(3)CA-CA(5)A-Arg-Val-NH2;
(N → C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)G-NH2;
(N → C) Fethoc-AG(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)G-NH2;
(N → C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)CA-NH2;
(N → C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)GG-NH2;及び、
(N → C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-ACC(1O2)-TA(5)A-A(5)CA(5)-C-NH2:
[式中、
A、G、T及びCは、それぞれ、アデニン、グアニン、チミン及びシトシンの天然核酸塩基を有するPNAモノマーであり;
C(pOq)、A(p)、A(pOq)、G(p)及びG(pOq)は、それぞれ、式VI、式VII、式VIII、式IX、及び式X
【化４】
2020506686.tif 000015
によって表される非天然核酸塩基を有するPNAモノマーであり;
式中、p及びqは整数であり;
N末端及びC末端の置換基に関する略語は、特に以下のように定義される:「Fmoc-」は、「[(9-フルオレニル)メチルオキシ]カルボニル-」の略語であり;「Fethoc-」は、「[2-(9-フルオレニル)エチル-1-オキシ]カルボニル」の略語であり;「Ac-」は、「アセチル-」の略語であり;「n-ヘキサノイル-」は、「1-(n-ヘキサノイル)-」の略語であり;「ベンゾイル-」は、「ベンゼンカルボニル-」の略語であり;「Piv-」は、「ピバリル-」の略語であり;「n-プロピル-」は、「1-(n-プロピル)-」の略語であり;「n-ヘキシル-」は、「1-(n-ヘキシル)-」の略語であり;「H-」は、「ヒドリド-」の略語であり;「p-トルエンスルホニル」は、「(4-メチルベンゼン)-1-スルホニル-」の略語であり;「ベンゼンスルホニル」は、「ベンゼン-1-スルホニル-」の略語であり;「メチルスルホニル」は、「メチル-1-スルホニル-」の略語であり;「-Lys-」は、アミノ酸残基「リジン」の略語であり;「-Val-」は、アミノ酸残基「バリン」の略語であり;「-Leu-」は、アミノ酸残基「ロイシン」の略語であり;「-Arg-」は、アミノ酸残基「アルギニン」の略語であり;「-Gly-」は、アミノ酸残基「グリシン」の略語であり;「[N-(2-フェニルエチル)アミノ]カルボニル-」は、「[N-1-(2-フェニルエチル)-アミノ]カルボニル-」の略語であり;「ベンジル-」は、「1-(フェニル)メチル-」の略語であり;「フェニル-」は、「フェニル-」の略語であり;「Me-」は、「メチル-」の略語であり;「-HEX-」は、6-アミノ-1-ヘキサノイル-」の略語であり;「FAM-」は、「5-又は6-フルオレセイン-カルボニル-」(異性体混合物)の略語であり;「-NH2」は、無置換の「-アミノ」基の略語である]
の群から選択される、請求項1に記載のペプチド核酸誘導体、又はそれらの薬学的に許容される塩。
【請求項２１】
請求項1に記載のペプチド核酸誘導体を投与することによってNav1.7活性が関与する状態又は疼痛を処置する方法。
【請求項２２】
請求項1に記載のペプチド核酸誘導体を投与することによって慢性的疼痛を処置する方法。
【請求項２３】
請求項1に記載のペプチド核酸誘導体を投与することによって神経障害性疼痛を処置する方法。
【請求項２４】
請求項1に記載のペプチド核酸誘導体を投与することによってNav1.7活性が関与する疼痛を処置する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、電位依存性ナトリウムチャネルNav1.7サブタイプによって媒介される疼痛及び障害を処置するためのヒトSCN9AプレmRNAを相補的に標的とするペプチド核酸誘導体に関し、2017年1月24日に出願された米国仮出願第62/449,738号に対する優先権の利益を主張するものであり、参照によりその全体を本明細書に組み入れる。
【背景技術】
【０００２】
電位依存性ナトリウムチャネル(VGSC)は、α及びβサブユニットから構成されている膜貫通タンパク質である。VGSCは、細胞膜を通過するためのナトリウムイオンの入口として機能する。ナトリウムチャネル活性は、α-サブユニットによって生じる。VGSCサブタイプは、α-サブユニットのサブタイプによって定義される。現在まで、VGSCの少なくとも10のサブタイプ、すなわちNav1.1、Nav1.2、...Nav1.9、及びNaxがある。
【０００３】
各VGSCサブタイプは個別のαサブユニットを有しており、発現の組織に応じて特有の生理学的役割を示すように定められている。例えば、Nav1.2サブタイプは中枢神経において発現され、てんかんと関連しているように思われる。[Human Mol. Genet. vol 24(5), 1459〜1468 (2015)]。Nav1.5サブタイプは、心筋細胞において多く発現される。Nav1.5を阻害すると、QT延長症候群及び突然死を招き得る。[Handbook Exp. Pharmacol. vol 221, 137〜168 (2014)]。Nav1.7サブタイプは、後根神経節において多く発現される。Nav1.7活性の上方制御は、肢端紅痛症をもたらす。[J. Med. Genet. vol 41, 171〜174 (2004)]。一方、Nav1.7活性を遺伝学的に欠失している人々(すなわち、SCN9Aチャネル病)は、それらの個体で他の感覚機能は正常であることが確認されているが、激痛を感じることはない。[Nature vol 444, 894〜898 (2006)]。
【０００４】
テトロドトキシン(TTX)は、フグで見つかった神経毒である。TTXは非常に有毒であり、その腹腔内LD50はマウスにおいて10μg/kgである。[Toxins vol 6, 693〜755 (2014)]。TTXの経口摂取により、唇及び舌の知覚異常(parethesia)、唾液分泌亢進、発汗、頭痛、振戦、麻痺、チアノーゼ、発作、失調、下痢、腹痛、低血圧、呼吸困難、心律動異常、昏睡などを引き起こす可能性がある。TTXは、VGSCサブタイプの活性部位に非特異的に結合することにより、そのような有害作用を誘発することが知られている。したがって、VGSCサブタイプの非特異的阻害は重篤な有害事象を招く。
【０００５】
リドカインは非特異的VGSC阻害剤であり、局所麻酔薬として広く使用されている。静脈内投与した場合、リドカインは、望ましくない副作用、例えば、筋痙攣、嘔吐、不整脈、眠気などを引き起こし得る。そのような副作用は、VGSCサブタイプの非特異的阻害によるものと考えられる。しかし、リドカインによるNav1.5の阻害は、心室頻脈の処置に有用である。それにもかかわらず、リドカインの全身投与は、ナトリウムチャネルサブタイプの非特異的阻害から生じる有害事象のため、慢性的疼痛の処置には望ましくないと考えられる。
【０００６】
SCN9Aチャネル病:SCN9A(ナトリウムチャネルサブタイプ9A)遺伝子は、VGSCサブタイプNav1.7のα-サブユニットをコードする。激痛は感じないが他の感覚機能において正常である個体は非常に少数である。そのような個体は、非機能性Nav1.7サブタイプをコードするように変異されたSCN9A遺伝子を有していることが分かった。[Nature vol 444, 894〜898 (2006)]。これは、SCN9Aチャネル病と命名された。ヒトSCN9Aチャネル病の行動表現型は、SCN9Aノックアウトマウスにおいてかなり顕著に再現されている。[PLoS One 9(9): e105895 (2014)]。したがって、Nav1.7サブタイプの選択的阻害は、ヒト患者における慢性疼痛を安全に処置するのに有用である。
【０００７】
Nav1.7選択的小分子阻害剤:VGSCの生理機能を反映して、VGSCサブタイプの活性部位は、それらの3D構造において類似している。小分子阻害剤を用いて活性部位を直接標的することによるNav1.7サブタイプの選択的阻害は、高度に挑戦的である。リドカイン及びテトロドトキシンは、VGSCサブタイプのそのような非選択的阻害剤の優れた例である(図1A参照)。
【０００８】
Nav1.5よりも控えめな選択性を有するNav1.7阻害剤(約8倍)は、Nav1.8選択的阻害剤を同定するための200,000化合物のライブラリーでのハイスループットスクリーニング活動によって同定した。[J. Gen. Physiol. vol 131(5), 399〜405 (2008)]。1-ベンズアゼピン-2オン誘導体は、電気生理学アッセイによって、控えめなNav1.7選択性を有するNav1.5よりもNav1.7を選択的に阻害すると分かった(約8倍)。(図1B参照)。
【０００９】
現在まで、多くのNav1.7選択的小分子阻害剤が開示されてきており、いくつかのものはヒト患者において評価された。(図1C参照)。例えば、フナピド(XEN-402/TV-45070)は、少数の肢端紅痛症患者において評価された。[Pain vol 153, 80〜85 (2012)]。フナピドは鎮痛活性を示したが、フナピドは、比較的大部分の登録患者におけるめまい及び傾眠を含む処置関連及び用量制限の有害事象を示した。CNS有害事象は、フナピドのNav1.7選択性が慢性疼痛を安全に処置するには十分ではないことを示唆している。
【００１０】
ラクサトリジン(CNV1014802/GSK-1014802)は、Nav1.7並びに他のVGSCサブタイプを阻害する。しかし、ラクサトリジンは、ナトリウムチャネルの不活性状態を選択的に安定化させることによりナトリウムチャネルの機能的活性を阻害することが主張されてきた。ラクサトリジンはCNSにおけるナトリウムチャネルサブタイプを阻害するが、それは治療用量で十分に許容された。[The Pharmaceutical J. 11 Mar. 2016. Nav1.7: a new channel for pain treatment]。ラクサトリジンは三叉神経痛を有する患者において良好な鎮痛活性を示したが、患者は、比較的不十分なNav1.7選択性による潜在的心臓毒性のため厳密な心臓病理基準に基づいた臨床評価について登録された。
【００１１】
PF-05089771は、11nMのIC50を有するNav1.7選択的阻害剤である。PF-05089771は、不活性型のNav1.7を安定化させることが主張された。[Biophysical J. vol 108(2) Suppl., 1573a〜1574a (2015)]。PF-05089771の治療可能性が、肢端紅痛症又は親知らずの抜歯後の歯痛の患者において評価された。PF-05089771の薬物動態解析は、神経障害性疼痛の原因である標的組織における薬剤濃度が低いと、ヒト患者におけるその鎮痛活性が不十分であることを説明することができることを示唆した。[Clin. Pharmacokinet. vol 55(7), 875〜87 (2016)]。PF-05089771はNav1.5よりも優れたNav1.7選択性を有することが主張されたが、その分子の大きさは、慢性神経障害性疼痛に対する治療上懸念のCNS組織への良好な分配を示すには大きすぎるように思われる。
【００１２】
Nav1.7選択的小分子阻害剤は構造的局面から概説されている。[Bioorg. Med. Chem. Lett. vol 24, 3690〜3699 (2014)]。そのようなNav1.7選択的阻害剤の分子の大きさは、VGSCサブタイプの非選択的阻害剤であるリドカインよりもかなり大きい傾向にある。Nav1.7選択性が分子の大きさを大きくすることにより改善された。各Nav1.7選択的阻害剤は、Nav1.7タンパク質内の個別のドメインに結合すると考えられ、結合ドメインは阻害剤の化学構造に依存して変化する。皮肉にも、Nav1.7選択的阻害剤の鎮痛効果は強力ではなく、SCN9Aチャネル病を有する人々における所見から示唆されたその期待に応えることはできなかった。[Expert Opin. Ther. Targets vol 20(8), 975〜983 (2016)]。
【００１３】
他のタイプのNav1.7選択的阻害剤:タランチュラ毒物ペプチドProTx-IIは、他のVGSCサブタイプよりも選択的にNav1.7を阻害することが分かった。しかし、この毒物は急性炎症性疼痛の動物モデルにおいて弱い鎮痛活性を示した。[Mol. Pharmacol. vol 74, 1476〜1484 (2008)]。毒物ペプチドの電気生理学がVGSCの各サブタイプを多く発現するように操作されたHEK-293細胞において評価されたことを考えると、ProTx-IIは初代神経細胞においてNav1.7の活性部位に結合しない可能性がある。初代神経細胞は、α-及びβ-鎖からなるNav1.7を発現し、一方、HEK-293細胞は、通常、各VGSCサブタイプのα-鎖のみを安定的に発現するように操作されている。
【００１４】
ムカデ毒から単離された46量体ペプチドであるSsm6aは、他のVGSCサブタイプよりもNav1.7を選択的に阻害することが分かった。観察されたNav1.7のIC50は、Nav1.7を過剰発現するように操作されたHEK-293細胞において0.3nMであった。ムカデ毒ペプチドは、急性炎症性疼痛モデルのマウスにおけるホルマリン試験により、モルヒネに匹敵する鎮痛効果を示した。また46量体ペプチドは、ラットDRG細胞においてナトリウム電流を抑制した。毒ペプチドは血清中で強い安定性を示したが、鎮痛活性は数時間しか続かなかった。[Proc. Nat. Acad. Sci. USA vol 110(43), 17534〜17539 (2013)]。
【００１５】
SVmab1は、各VGSCサブタイプを過剰発現するHEK-293細胞において他のVGSCサブタイプよりもNav1.7を選択的に標的とするモノクローナル抗体である。SVmab1は、HEK-293細胞において30nMのIC50でNav1.7により誘起されたナトリウム電流を選択的に阻害した。モノクローナル抗体は、マウスにおけるホルマリン試験に対して静脈内(50mg/kg)又は鞘内(10μg、すなわち約0.5mg/kg)投与時に、著しい鎮痛活性を示した。2つの投与経路の鎮痛効力の差に基づいて、脊髄又はCNSにおけるNav1.7の阻害は、ホルマリン試験に対する鎮痛活性の主要要因となるはずである。[Cell vol 157(6), 1393〜1404 (2014)]。
【００１６】
痛覚へのNav1.7寄与における種間差:最近、健康なボランティアからのヒトDRGを、VGSCサブタイプの相対的発現レベルについてqPCRにより評価した。[Neurosci. Bull. DOI 10.1007/s12264-017-0132-3, オンライン出版、19 April (2017)]。ヒトDRGにおいて、Nav1.7サブタイプの発現は全VGSC発現の約50%であった。Nav1.8は、約12%に寄与した。ヒトDRG神経細胞のパクリタキセルとの24時間インキュベーションは、Nav1.7を上方制御したがNav1.8は上方制御せず、このことは、Nav1.7がヒトにおいてNav1.8よりも神経障害の主要なサブタイプであるはずであることを示唆している。これらの所見は、ヒトSCN9Aチャネル病において観察された表現型を強く支持する。[Nature vol 444, 894〜898 (2006)]。
【００１７】
一方、Nav1.8の寄与は、マウスDRGにおいて全VGSC発現の48%を占めるため重要であった。Nav1.7の寄与は、ナイーブCDマウス(8〜10週齢)由来のDRGにおいて18%であった。したがって、動物疼痛データからヒト対象における治療用量を推定する際には慎重さが求められる。同様に、動物疼痛モデルは、標的組織におけるNav1.7発現レベルを考慮した上で注意深く評価する必要がある。
【００１８】
プレmRNA:遺伝情報は、DNA(2-デオキシリボース核酸)で運ばれる。DNAは転写され、核においてプレmRNA(プレメッセンジャーリボ核酸)を産生する。哺乳動物のプレmRNAは、通常、エクソン及びイントロンからなり、エクソン及びイントロンは相互に接続している。エクソン及びイントロンは、図1Dに説明したように番号が付けられている。
【００１９】
プレmRNAのスプライシング:プレmRNAは、図2Aに概略的に説明したように、「スプライシング」と総称される一連の複雑な反応によってイントロンの欠失後、mRNAにプロセシングされる。[Ann. Rev. Biochem. 72(1), 291〜336 (2003); Nature Rev. Mol. Cell Biol. 6(5), 386〜398 (2005); Nature Rev. Mol. Cell Biol. 15(2), 108〜121 (2014)]。
【００２０】
スプライシングは、プレmRNAとスプライシングアダプター因子との間に「スプライソソームE複合体」(すなわち「初期スプライソソーム複合体」)を形成することにより開始される。「スプライソソームE複合体」において、U1はエクソンN及びイントロンNの連結部に結合し、U2AF35はイントロンN及びエクソン(N+1)の連結部に結合する。したがって、エクソン/イントロン又はイントロン/エクソンの連結部は、初期スプライソソーム複合体の形成において重要である。「スプライソソームE複合体」は、U2とのさらなる複合体形成時に「スプライソソームA複合体」へと展開する。「スプライソソームA複合体」は、隣りのエクソンに隣接するようにイントロンを除去又はスプライスアウトするための一連の複雑な反応を経る。
【００２１】
リボソームタンパク質合成:タンパク質は、mRNA(メッセンジャーリボ核酸)によってコードされている。細胞刺激に応答して、又は自発的に、DNAは転写され核においてプレmRNA(プレメッセンジャーリボ核酸)を産生する。プレmRNAのイントロンは酵素的にスプライスアウトされてmRNAを産生し、次いでそれは細胞質へと移動する。細胞質において、リボソームと呼ばれる翻訳機構の複合体がmRNAに結合し、mRNAに沿ってコードされている遺伝情報をスキャンしながらタンパク質合成を実施する。[Biochemistry vol 41, 4503〜4510 (2002); Cancer Res. vol 48, 2659〜2668 (1988)]。
【００２２】
アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO):配列特異的方法で(すなわち相補的)にDNA、mRNA及びプレmRNAを含む核酸に結合するオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)と呼ばれる。
【００２３】
例えば、ASOが細胞質中のmRNAと強く結合する場合、ASOはmRNAに沿ったリボソームタンパク質合成を阻害し得る。ASOは、その標的タンパク質のリボソームタンパク質合成を阻害するために細胞質内に存在する必要がある。
【００２４】
ASOが核内のプレmRNAと強く結合する場合、ASOはプレmRNAのmRNAへのスプライシングを阻害又はモジュレートし得る。ASOは、プレmRNAのmRNAへのスプライシングを阻害又はモジュレートするために核内に存在する必要がある。そのようなスプライシングのアンチセンス阻害は、ASOによって標的とされるエクソンを欠失している1つ又は複数のmRNAを産生する。そのようなmRNA(複数可)は「スプライス変異体(複数可)」と呼ばれ、完全長mRNAによってコードされているタンパク質よりも小さいタンパク質(複数可)をコードする。
【００２５】
原則として、スプライシングは「スプライソソームE複合体」の形成を阻害することにより中断することができる。ASOが(5'→3')エクソン-イントロンの連結部、すなわち「5 'スプライス部位」に強く結合する場合、ASOは、プレmRNAと因子U1との間の複合体形成、したがって、「スプライソソームE複合体」の形成を阻止する。同様に、「スプライソソームE複合体」は、ASOが(5'→3')イントロン-エクソンの連結部、すなわち、「3'スプライス部位」に強く結合する場合は形成することができない。3'スプライス部位及び5'スプライス部位を図2Bに概略的に説明している。
【００２６】
非天然オリゴヌクレオチド:DNA又はRNAのオリゴヌクレオチドは内因性ヌクレアーゼによる分解に弱く、それらの治療的有用性を限定する。現在まで、多くのタイプの非天然(すなわち、天然には生じない)オリゴヌクレオチドが開発され、集中的に研究されてきた。[Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. vol 33, 533〜540 (2006)]。それらのうちのいくつかは、DNA及びRNAと比較して、拡大された代謝安定性を示す。図3Aに、いくつかの代表的な非天然オリゴヌクレオチドの化学構造を示す。そのようなオリゴヌクレオチドは、予想通りDNA又はRNAのように相補的核酸に結合する。
【００２７】
ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド:ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド(PTO)は、モノマー当たり骨格リン酸酸素原子のうちの1つが硫黄原子と置き換えられているDNA類似体である。このような小さな構造変化は、ヌクレアーゼによる分解に対してPTOを比較的耐性にした。[Ann. Rev. Biochem. vol 54, 367〜402 (1985)]。
【００２８】
PTO及びDNAの骨格における構造類似性を反映して、それらは両方とも、ほとんどの哺乳動物細胞型において細胞膜の透過性は不十分である。しかし、DNAのトランスポーター(複数可)を多く発現するいくつかのタイプの細胞については、DNA及びPTOは良好な細胞透過性を示す。全身投与されたPTOは、肝臓及び腎臓に容易に分布されることが知られている。[Nucleic Acids Res. vol 25, 3290〜3296 (1997)]。
【００２９】
PTOの細胞透過をin vitroで促進するために、広くリポフェクションが適用されてきた。しかし、リポフェクションは細胞膜を物理的に変化させ、細胞傷害性を引き起こすため、長期的なin vivoでの治療用途にとっては理想的ではない。
【００３０】
過去30年にわたり、アンチセンスのPTO及びPTOの変異体は、がん、免疫学的障害、代謝病などを処置するために臨床的に評価されてきた。[Biochemistry vol 41, 4503〜4510 (2002); Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. vol 33, 533〜540 (2006)]。そのようなアンチセンス薬剤の候補の多くは、部分的にPTOの細胞透過性が不十分であるために順調に開発されていない。不十分な細胞透過性を解決するため、PTOは、治療活性の高用量で投与する必要がある。しかし、PTOは、凝固時間の増加、補体活性化、尿細管性腎症、クッパー細胞活性化、及び脾腫、リンパ過形成、単核細胞浸潤を含む免疫刺激を含む用量制限毒性を伴うことが知られている。[Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. vol 33, 533〜540 (2006)]
【００３１】
多くのアンチセンスPTOが、肝臓又は腎臓からの有意な寄与を伴う疾患に対して十分な臨床活性を示すことが分かっている。ミポメルセンは、LDLコレステロール輸送に関与するタンパク質であるapoB-100の合成を阻害するPTO類似体である。ミポメルセンは、肝臓へのその優先的分布による可能性が最も高い、アテローム性動脈硬化患者集団における十分な臨床活性を示した。[Circulation vol 118(7), 743〜753 (2008)]。ISIS-113715は、タンパク質チロシンホスファターゼ1B(PTP1B)の合成を阻害するPTOのアンチセンス類似体であり、II型糖尿病患者において治療活性を示すことが分かっている。[Curr. Opin. Mol. Ther. vol 6, 331〜336 (2004)]。
【００３２】
ロックド核酸:ロックド核酸(LNA)において、RNAの骨格リボース環は、RNA又はDNAに対する結合親和性を高めるように構造的に制限されている。したがって、LNAは高親和性DNA又はRNA類似体と見なすことができる。[Biochemistry vol 45, 7347〜7355 (2006)]。またLNAは、不十分な細胞透過性を示す。
【００３３】
ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド:ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド(PMO)において、DNAの骨格ホスフェート及び2-デオキシリボースは、ホスホロアミデート及びモルホリンでそれぞれ置き換えられた。[Appl. Microbiol. Biotechnol. vol 71, 575〜586 (2006)]。DNA骨格は負に帯電しているが、一方、PMO骨格は帯電していない。したがって、PMOとmRNAとの間の結合は骨格間の静電反発力がなく、DNAとmRNAとの間の結合よりも強い傾向にある。PMOは化学構造においてDNAとは著しく異なるので、PMOは、DNA又はRNAを認識する肝トランスポーター(複数可)によって認識されない。それにもかかわらず、PMOは細胞膜を容易に通過しない。
【００３４】
ペプチド核酸:ペプチド核酸(PNA)は、単位骨格としてN-(2-アミノエチル)グリシンを有するポリペプチドであり、Peter Nielsenらによって発見された。[Science vol 254, 1497〜1500 (1991)]。PNAの化学構造及び略称命名法を図3Bで説明している。DNA及びRNAと同様に、PNAはまた相補的核酸に選択的に結合する。[Nature (London) vol 365, 566〜568 (1992)]。相補的核酸への結合において、PNAのN末端は、DNA又はRNAの「5'末端」と等しいと見なされ、PNAのC末端は、DNA又はRNAの「3'末端」と等しいものと見なされる。
【００３５】
PMOと同様に、PNA骨格は荷電していない。したがって、PNAとRNAの間の結合は、DNAとRNAの間の結合より強い傾向がある。PNAは化学構造においてDNAとは顕著に異なるので、PNAは、DNAを認識する肝トランスポーター(複数可)によって認識されず、DNA又はPTOとは異なる組織分布プロファイルを示す。しかし、PNAはまた、哺乳動物細胞膜の透過は不十分である。(Adv. Drug Delivery Rev. vol 55, 267〜280, 2003)
【００３６】
PNAの膜透過性を改善するための修飾核酸塩基:PNAは、カチオン性脂質又はそれに共有結合したその等価物を有する修飾核酸塩基を導入することにより哺乳動物細胞膜に対して高度に透過性になった。そのような修飾核酸塩基の化学構造を図3Cに示す。シトシン、アデニン及びグアニンのそのような修飾核酸塩基は、それぞれ、グアニン、チミン及びシトシンと予測可能に、かつ相補的にハイブリダイズすることが分かった。[PCT Appl. No. PCT/KR2009/001256; EP2268607; 米国特許第8,680,253号]。
【００３７】
そのような修飾核酸塩基のPNAへの取り込みは、リポフェクションの状況をシミュレートする。リポフェクションによって、ホスフェート骨格を有するオリゴヌクレオチド分子はカチオン性脂質分子、例えばリポフェクタミンで包まれ、そのようなリポフェクタミン/オリゴヌクレオチド複合体は、裸のオリゴヌクレオチド分子と比較して、かなり容易に細胞膜を透過する傾向がある。
【００３８】
良好な膜透過性に加えて、それらの修飾PNA誘導体は、相補的核酸に対して極めて強い親和性を示すことが分かった。例えば、11量体から13量体のPNA誘導体への4〜5個の修飾核酸塩基の導入によって、相補的DNAとの二本鎖形成において、20℃以上のTm増加が容易に得られた。そのようなPNA誘導体は、一塩基ミスマッチに対して高度に感受性である。一塩基ミスマッチは、修飾塩基のタイプ並びにPNA配列に応じて、11〜22℃のTm損失をもたらした。
【００３９】
低分子干渉RNA(siRNA):低分子干渉RNA(siRNA)は、20〜25塩基対の二本鎖RNAを意味する。[Microbiol. Mol. Biol. Rev. vol 67(4), 657〜685 (2003)]。siRNAのアンチセンス鎖は、どういう訳かタンパク質と相互作用し、「RNA誘導サイレンシング複合体」(RISC)を形成する。次いで、RISCは、siRNAのアンチセンス鎖に相補的なmRNAのある特定の部分に結合する。RISCと複合体を形成したmRNAは切断される。したがって、siRNAは、触媒的にその標的mRNAの切断を誘導し、結果的に、mRNAによるタンパク質発現を阻害する。RISCは、必ずしもその標的mRNA内の完全相補配列に結合するとは限らず、そのことは、siRNA療法のオフターゲット効果に関係する懸念を引き起こす。DNA又はRNA骨格を有する他のクラスのオリゴヌクレオチドと同様に、siRNAは細胞透過性が不十分であり、したがって、良好な膜透過性を有するように適切に製剤化又は化学修飾されない限り、in vitro又はin vivoでの治療活性が不十分であることを示す傾向がある。
【００４０】
SCN9A siRNA:先行技術は、ヒトSCN9A mRNAのエクソン8内の19量体配列[(5'→3')GAUUAUGGCUACACGAGCU]を標的とするsiRNAを開示している。[米国特許第8,183,221号]。髄腔内注入した場合、siRNAは神経障害性疼痛及び炎症性疼痛の動物モデルにおいて治療活性を示すことが主張された。siRNAは、ラットDRG細胞におけるNav1.7発現を下方制御すると報告された。
【００４１】
SCN9A ASO:ラットSCN9A mRNAを相補的に標的とする2'-O-メトキシエチルPTO ASOを、対象当たり30mgのASOの単回皮下注射した際、ラットのDRGにおけるNav1.7タンパク質の発現を阻害するそれらの能力について評価された。ASOは、投与後4週目に、DRGにおけるNav1.7タンパク質の発現を80%より高く阻害した。これらのSCN9A ASOは、Randall-Selitto試験により機械的疼痛を阻害した。その効果は、DRGにおけるNav1.7タンパク質の発現レベルと大いに関連していた。[Pain, Mohan and Fitzsimmons et al. 出版準備中]。
【００４２】
SCN9AプレmRNAスプライシングのアンチセンス阻害:現在まで、SCN9AプレmRNAの選択的スプライシングを誘導するSCN9A ASOの事例は報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００４３】
【特許文献１】PCT出願番号PCT/KR2009/001256
【特許文献２】EP2268607
【特許文献３】米国特許第8,680,253号
【特許文献４】米国特許第8,183,221号
【非特許文献】
【００４４】
【非特許文献１】Human Mol. Genet. vol 24(5), 1459〜1468 (2015)
【非特許文献２】Handbook Exp. Pharmacol. vol 221, 137〜168 (2014)
【非特許文献３】J. Med. Genet. vol 41, 171〜174 (2004)
【非特許文献４】Nature vol 444, 894〜898 (2006)
【非特許文献５】Toxins vol 6, 693〜755 (2014)
【非特許文献６】PLoS One 9(9): e105895 (2014)
【非特許文献７】J. Gen. Physiol. vol 131(5), 399〜405 (2008)
【非特許文献８】Pain vol 153, 80〜85 (2012)
【非特許文献９】The Pharmaceutical J. 11 Mar. 2016. Nav1.7: a new channel for pain treatment
【非特許文献１０】Biophysical J. vol 108(2) Suppl., 1573a〜1574a (2015)
【非特許文献１１】Clin. Pharmacokinet. vol 55(7), 875〜87 (2016)
【非特許文献１２】Bioorg. Med. Chem. Lett. vol 24, 3690〜3699 (2014)
【非特許文献１３】Expert Opin. Ther. Targets vol 20(8), 975〜983 (2016)
【非特許文献１４】Mol. Pharmacol. vol 74, 1476〜1484 (2008)
【非特許文献１５】Proc. Nat. Acad. Sci. USA vol 110(43), 17534〜17539 (2013)
【非特許文献１６】Cell vol 157(6), 1393〜1404 (2014)
【非特許文献１７】Neurosci. Bull. DOI 10.1007/s12264-017-0132-3, オンライン出版、19 April (2017)
【非特許文献１８】Nature vol 444, 894〜898 (2006)
【非特許文献１９】Ann. Rev. Biochem. 72(1), 291〜336 (2003)
【非特許文献２０】Nature Rev. Mol. Cell Biol. 6(5), 386〜398 (2005)
【非特許文献２１】Nature Rev. Mol. Cell Biol. 15(2), 108〜121 (2014)
【非特許文献２２】Biochemistry vol 41, 4503〜4510 (2002)
【非特許文献２３】Cancer Res. vol 48, 2659〜2668 (1988)
【非特許文献２４】Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. vol 33, 533〜540 (2006)
【非特許文献２５】Ann. Rev. Biochem. vol 54, 367〜402 (1985)
【非特許文献２６】Nucleic Acids Res. vol 25, 3290〜3296 (1997)
【非特許文献２７】Biochemistry vol 41, 4503〜4510 (2002)
【非特許文献２８】Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. vol 33, 533〜540 (2006)
【非特許文献２９】Circulation vol 118(7), 743〜753 (2008)
【非特許文献３０】Curr. Opin. Mol. Ther. vol 6, 331〜336 (2004)
【非特許文献３１】Biochemistry vol 45, 7347〜7355 (2006)
【非特許文献３２】Appl. Microbiol. Biotechnol. vol 71, 575〜586 (2006)
【非特許文献３３】Science vol 254, 1497〜1500 (1991)
【非特許文献３４】Nature (London) vol 365, 566〜568 (1992)
【非特許文献３５】Adv. Drug Delivery Rev. vol 55, 267〜280, 2003
【非特許文献３６】Microbiol. Mol. Biol. Rev. vol 67(4), 657〜685 (2003)
【非特許文献３７】Pain, Mohan and Fitzsimmons et al. 出版準備中
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００４５】
本発明は、式Iによって表されるペプチド核酸誘導体、又はそれらの薬学的に許容される塩:
【化１】
2020506686.tif 000003
[式中、
nは、10〜25の整数であり;
式Iの化合物は、ヒトSCN9AプレmRNA内の[(5'→3')UGUUUAGGUACACU]の14量体プレmRNA配列と少なくとも10量体の相補的重複を有し;
式Iの化合物は、ヒトSCN9AプレmRNAに完全に相補的であるか、又は1つ若しくは2つのミスマッチによりヒトSCN9AプレmRNAに部分的に相補的であり;
S1、S2、...、Sn-1、Sn、T1、T2、...、Tn-1、及びTnは、独立して、デューテリド(deuterido)[D]、ヒドリド[H]、置換若しくは無置換アルキル、又は置換若しくは無置換アリール基を表し;
X及びYは、独立して、ヒドリド、ホルミル[H-C(=O)-]、アミノカルボニル[NH2-C(=O)-]、アミノチオカルボニル[NH2-C(=S)-]、置換若しくは無置換アルキル、置換若しくは無置換アリール、置換若しくは無置換アルキルアシル、置換若しくは無置換アリールアシル、置換若しくは無置換アルキルオキシカルボニル、置換若しくは無置換アリールオキシカルボニル、置換若しくは無置換アルキルアミノカルボニル、置換若しくは無置換アリールアミノカルボニル、置換若しくは無置換アルキルアミノチオカルボニル、置換若しくは無置換アリールアミノチオカルボニル、置換若しくは無置換アルキルオキシチオカルボニル、置換若しくは無置換アリールオキシチオカルボニル、置換若しくは無置換アルキルスルホニル、置換若しくは無置換アリールスルホニル、置換若しくは無置換アルキルホスホニル基、又は置換若しくは無置換アリールホスホニル基を表し;
Zは、ヒドリド、ヒドロキシ、置換若しくは無置換アルキルオキシ、置換若しくは無置換アリールオキシ、置換若しくは無置換アミノ、置換若しくは無置換アルキル、又は置換若しくは無置換アリール基を表し;
B1、B2、...、Bn-1及びBnは、独立して、アデニン、チミン、グアニン、シトシン及びウラシルを含む天然核酸塩基並びに非天然核酸塩基から選択され;
B1、B2、...、Bn-1及びBnのうちの少なくとも4つは、独立して、核酸塩基部分に共有結合されている置換又は無置換アミノ基を有する非天然核酸塩基から選択される]
を提供する。
【００４６】
式Iの化合物は、ヒトSCN9AプレmRNA内の「エクソン4」のスキッピングを誘導し、「エクソン4」を欠失するヒトSCN9A mRNAスプライス変異体(複数可)を生じ、したがって、疼痛、又はNav1.7活性が関与する状態の処置に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１Ａ】リドカイン及びテトロドトキシンの化学構造、電位依存性ナトリウムチャネルの非選択的小分子阻害剤を示す図である。
【図１Ｂ】Nav1.7の1-ベンズアゼピン-2オン阻害剤がNav1.5よりもNav1.7に対して低い選択性を示す図である。
【図１Ｃ】電位依存性ナトリウムチャネルの選択的小分子阻害剤フナピド、ラクサトリジン及びPF-05089771の化学構造を示す図である。
【図２Ａ】プレmRNA内のエクソン及びイントロンの番号付与の概略図である。
【図２Ｂ】イントロンNの欠失をもたらすスプライシングプロセスの概略図である。
【図２Ｃ】スプライソソームE複合体に関連する3'スプライス部位及び5'スプライス部位の概略図である。
【図３Ａ】DNA及び非天然核酸の代表的な化学構造を示す図である。
【図３Ｂ】PNAの化学構造及び略語の説明図である。
【図３Ｃ】ペプチド核酸の細胞透過性の改善に使用した修飾核酸塩基の例を示す図である。
【図４Ａ】式Iのペプチド核酸誘導体に対して選択可能な天然又は非天然(修飾)核酸塩基の例を示す図である。
【図４Ｂ】式Iのペプチド核酸誘導体に対して選択可能な天然又は非天然(修飾)核酸塩基の例を示す図である。
【図４Ｃ】式Iのペプチド核酸誘導体に対して選択可能な天然又は非天然(修飾)核酸塩基の例を示す図である。
【図５Ａ】式Iのペプチド核酸誘導体に対して選択可能な置換又は無置換アルキル基の例を示す図である。
【図５Ｂ】式Iのペプチド核酸誘導体に対して選択可能な置換又は無置換アルキルアシル、及び置換又は無置換アリールアシル基の例を示す図である。
【図５Ｃ】式Iのペプチド核酸誘導体について選択可能な、置換アルキルアミノ、置換アリールアミノ、置換若しくは無置換アリール、置換若しくは無置換アルキルスルホニル、置換若しくは無置換アリールスルホニル、置換若しくは無置換アルキルホスホニル、及び置換若しくは無置換アリールホスホニル基の例を示す図である。
【図５Ｄ】式Iのペプチド核酸誘導体について選択可能な、置換又は無置換アルキルオキシカルボニル、置換又は無置換アリールオキシカルボニル、置換又は無置換アルキルアミノカルボニル、及び置換又は無置換アリールアミノカルボニル基の例を示す図である。
【図５Ｅ】式Iのペプチド核酸誘導体について選択可能な、置換又は無置換アルキルオキシチオカルボニル、置換又は無置換アルキルアミノチオカルボニル、置換又は無置換アリールアミノチオカルボニル、及び置換又は無置換アルキルオキシチオカルボニル基の例を示す図である。
【図６】A(アデニン)、G(グアニン)、T(チミン)、C(シトシン)、C(pOq)、A(p)、A(pOq)、G(p)、及びG(pOq)として略記されたPNAモノマーの化学構造を示す図である。
【図７】式Iの化合物のN末端又はC末端に対する置換基を記載するために使用される略語の化学構造を示す図である。
【図８】「(N→C) Fethoc-TA(5)A-A(5)TA(5)-CGC(1O2)-AA(5)A-A(5)A-NH2」として表される14量体 PNA誘導体の化学構造を示す図である。
【図９】「(N→C) Fethoc-AG(5)C-A(5)CT-TA(5)C-GC(1O2)A-A(5)AA(2O2)-A-Lys-NH2」として略記される16量体 PNA誘導体の化学構造を示す図である。
【図１０】本発明のPNA誘導体の合成に使用されるFmoc-PNAモノマーの化学構造を示す図である。
【図１１】本発明のSPPSにおいて採用された典型的なモノマー伸長サイクルの概略図を示す図である。
【図１２Ａ】HPLC精製前の「ASO 2」に対するC18-逆相HPLCクロマトグラムを示す図である。
【図１２Ｂ】HPLC精製後の「ASO 2」に対するC18-逆相HPLCクロマトグラムを示す図である。
【図１３】HPLC精製後の「ASO 2」を用いて得られたES-TOF質量スペクトルデータを示す図である。
【図１４Ａ】0(陰性対照)、10又は100zMで5時間「ASO 7」で処理したPC3細胞におけるSCN9AネスティッドRT-PCR産物の電気泳動データを示す図である。
【図１４Ｂ】エクソン4〜5のスキッピングに割り当てられたPCR産物バンドのサンガーシーケンシングデータを示す図である。
【図１４Ｃ】0(陰性対照)、1、10、100又は1,000aMで24時間「ASO 7」で処理したPC3細胞におけるSCN9AネスティッドRT-PCR産物の電気泳動データを示す図である。
【図１５Ａ】0(陰性対照)、0.1、1又は10aMの「ASO 7」で24時間処理したPC3細胞における完全長SCN9A mRNAのqPCRデータを示す図である。cDNAはワンステップPCRによって合成した。(標準誤差によるエラーバー;及び*p<0.05の場合)
【図１５Ｂ】0(陰性対照)、0.1、1又は10aMの「ASO 7」で24時間処理したPC3細胞における完全長SCN9A mRNAのqPCRデータを示す図である。cDNAは、ランダムヘキサマーを使用して合成した。(標準誤差によるエラーバー;及び**p<0.05の場合)
【図１６Ａ】0(陰性対照)、1、3又は6pmole/kgの「ASO 7」で2日に1回皮下投与したSDラットにおけるL5/L6結紮によって誘発されたアロディニアの転換を示す図である。プレガバリン30mpkのフォンフレイ閾値は、自社の履歴バックグラウンドを取り入れることにより追加された。(*スチューデントt検定によりp<0.05の場合)。
【図１６Ｂ】0(陰性対照)、20pmole/kg QD、100pmole/kg QD、500pmole/kg QD及び100pmole/kg Q2Dの「ASO 2」を皮下投与されたSDラットにおけるSNL(L5/L6結紮)によって誘発されたアロディニアの転換を示す図である。プレガバリン30mpkのフォンフレイ閾値は、自社の履歴バックグラウンドを取り入れることにより加えられた。(*スチューデントt検定によりp<0.05の場合)。
【図１７Ａ】0(陰性対照)、100又は1,000zMの「ASO 7」との30時間インキュベーション後の「L5/L6結紮」したラットL5 DRG神経細胞における細胞蛍光強度の平均トレース(左)と、「CoroNa Green」で処理したDRG神経細胞の試料蛍光画像(右)を示す図である。
【図１７Ｂ】0(陰性対照)、100又は1,000zMの「ASO 7」と30時間インキュベーションした後の「L5/L6結紮」なしのラットL5 DRG神経細胞における細胞蛍光強度の平均トレースを示す図である。
【図１８Ａ】100pmole/kgの「ASO 1」を皮下投与したラットにおけるDPNPで誘発されたアロディニアの転換を示す図である。(標準誤差によるエラーバー;*スチューデントt検定によるp<0.05の場合)。
【図１８Ｂ】0、2及び4日目に60pmole/kgの「ASO 2」又は30pmole/kgの「ASO 6」を皮下投与したラットにおけるDPNPで誘発されたアロディニアの転換を示す図である。DPNPなしのフォンフレイ閾値は自社の履歴バックグラウンドを取り入れることにより加えられた。(標準誤差によるエラーバー; *及び**はそれぞれスチューデントt検定によるp<0.05及びp<0.01の場合)。
【図１９Ａ】0(陰性対照)、10、30又は100pmole/kgの「ASO 7」を皮下投与したラットにおける5%ホルマリンの足底内注射によって誘発された疼痛の阻害を示す図である。(標準誤差によるエラーバー;*スチューデントt検定によるp<0.05)。
【図１９Ｂ】0(陰性対照)、15、50又は150pmole/kgの「ASO 10」を皮下投与したラットにおける5%ホルマリンの足底内注射によって誘発された疼痛の阻害を示す図である。(標準誤差によるエラーバー;*スチューデントt検定によるp<0.05)。
【図２０Ａ】0(陰性対照)、1、6又は30pmole/kgの「ASO 7」を皮下投与したラットにおけるL5 DRGのNav1.7発現についての群毎の代表的なIHC画像を示す図である。
【図２０Ｂ】0(陰性対照)、1、6又は30pmole/kgの「ASO 7」を皮下投与したラットにおけるL5 DRGの相対的Nav1.7発現レベルを示す図である。(標準誤差によるエラーバー;スチューデントt検定によるp<0.05の場合*、p<0.01の場合**)。
【図２１Ａ】1pmole/kg(3及び7日目に30pmole/kgに増大)、3及び10pmole/kgの「ASO 10」を皮下投与したL5/L6結紮を有するラットにおけるアロディニアの転換を示す図である。(標準誤差によるエラーバー;*スチューデントt検定によるp<0.05の場合)。
【図２１Ｂ】4日又は5日毎に1回、100pmole/kgの「ASO 10」を皮下投与した、或いはプレガバリン30mpkを経口投与したL5/L6結紮を有するラットにおけるアロディニアの転換を示す図である。
【図２２】0及び4日目に投与した「ASO 10」の処理群から(上図画像)、及び陰性対照群から(下図画像)から得られた脊髄試料を用いたNav1.7発現(赤色)、神経細胞体(緑色)及び核(青色)のIHC画像を示す図である。(1群当たりN=3)。
【図２３Ａ】0(陰性対照)、10、100又は1,000zMで24時間「ASO 10」で処理したL5 DRG神経細胞におけるNav1.7発現のウエスタンブロットデータを示す図である。
【図２３Ｂ】24時間0(陰性対照)、10、30、100又は300zMの「ASO 10」で処理したL5 DRG神経細胞におけるワンステップPCRによるcDNA合成(左図)、及びランダムヘキサマーを使用したcDNA合成(右図)による完全長SCN9A mRNAのqPCRデータを示す図である。(標準誤差によるエラーバー;スチューデントt検定によるp<0.05の場合*、p<0.01の場合**)。
【図２３Ｃ】0(陰性対照)、10、30、又は100zMで約6時間「ASO 10」で処理したL5 DRG神経細胞のナトリウム電流データのプールした平均(左側図);並びに陰性対照細胞及び約6時間100zMの「ASO 10」で処理した細胞に関するプールしたナトリウム電流データの平均トレース(右側図)を示す図である。ナトリウム電流データは細胞サイズに対して標準化してプールした。(Nは、1群当たりのデータ分析用にプールした細胞の数を意味する;標準誤差によるエラーバー;*スチューデントt検定によるp<0.05の場合)。
【図２４Ａ】0、3及び6日目に0(陰性対照)、5、25、125又は625fmole/kgの「ASO 7」を皮下投与したSDラットにおけるL5/L6結紮によって誘発されたアロディニアの転換を示す図である。プレガバリン30mg/kg poの処理群を陽性対照として含めた。(1群当たりN=8;及び標準誤差によるエラーバー)。
【図２４Ｂ】0及び1日目に0(陰性対照)又は100pmole/kgの「ASO 2」を皮下投与したラットにおけるRandall-Selitto試験による痛覚閾値の変化を示す図である。(標準誤差によるエラーバー;*スチューデントt検定によるp<0.05の場合)。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
本発明は、式Iによって表されるペプチド核酸誘導体、又はそれらの薬学的に許容される塩:
【化２】
2020506686.tif 000004
[式中、
nは、10〜25の整数であり;
式Iの化合物は、ヒトSCN9AプレmRNA内の[(5'→3')UGUUUAGGUACACU]の14量体プレmRNA配列と少なくとも10量体の相補的重複を有し;
式Iの化合物は、ヒトSCN9AプレmRNAに完全に相補的であるか、又は1つ若しくは2つのミスマッチによりヒトSCN9AプレmRNAに部分的に相補的であり;
S1、S2、...、Sn-1、Sn、T1、T2、...、Tn-1、及びTnは、独立して、デューテリド[D]、ヒドリド[H]、置換若しくは無置換アルキル、又は置換若しくは無置換アリール基を表し;
X及びYは、独立して、ヒドリド、ホルミル[H-C(=O)-]、アミノカルボニル[NH2-C(=O)-]、アミノチオカルボニル[NH2-C(=S)-]、置換若しくは無置換アルキル、置換若しくは無置換アリール、置換若しくは無置換アルキルアシル、置換若しくは無置換アリールアシル、置換若しくは無置換アルキルオキシカルボニル、置換若しくは無置換アリールオキシカルボニル、置換若しくは無置換アルキルアミノカルボニル、置換若しくは無置換アリールアミノカルボニル、置換若しくは無置換アルキルアミノチオカルボニル、置換若しくは無置換アリールアミノチオカルボニル、置換若しくは無置換アルキルオキシチオカルボニル、置換若しくは無置換アリールオキシチオカルボニル、置換若しくは無置換アルキルスルホニル、置換若しくは無置換アリールスルホニル、置換若しくは無置換アルキルホスホニル基、又は置換若しくは無置換アリールホスホニル基を表し;
Zは、ヒドリド、ヒドロキシ、置換若しくは無置換アルキルオキシ、置換若しくは無置換アリールオキシ、置換若しくは無置換アミノ、置換若しくは無置換アルキル、又は置換若しくは無置換アリール基を表し;
B1、B2、...、Bn-1及びBnは、独立して、アデニン、チミン、グアニン、シトシン及びウラシルを含む天然核酸塩基並びに非天然核酸塩基から選択され;
B1、B2、...、Bn-1及びBnのうちの少なくとも4つは、独立して、核酸塩基部分に共有結合されている置換又は無置換アミノ基を有する非天然核酸塩基から選択される]
を提供する。
【００４９】
式Iの化合物は、ヒトSCN9AプレmRNA内の「エクソン4」のスキッピングを誘導し、「エクソン4」を欠失するヒトSCN9A mRNAスプライス変異体(複数可)を生じ、したがって、疼痛、又はNav1.7活性が関与する状態の処置に有用である。
【００５０】
一部の実施形態において、式Iの化合物のうち、nは、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23及び24から選択される整数である。
【００５１】
式Iの化合物は、ゲノムDNA[NCBIリファレンス配列:NC_000002.12]から読み出されるヒトSCN9AプレmRNA内のイントロン3及びエクソン4の連結部にまたがる3'スプライス部位に相補的に結合する。ヒトSCN9AプレmRNA内の[(5'→3') UGUUUAGGUACACU]の14量体配列は、「イントロン3」由来の7量体及び「エクソン4」由来の7量体からなる3'スプライス部位配列である。したがって、14量体プレmRNA配列は、慣例通りに、[(5'→3') uguuuag┃GUACACU]として表すことができ、ここで、イントロン配列及びエクソン配列はそれぞれ「小」文字、「大」文字で示されており、「イントロン3」と「エクソン4」の間の連結部は、「┃」の印が付けられている。
【００５２】
プレmRNAに関する従来の表示は、ヒトSCN9AプレmRNA内の「イントロン3」及び「エクソン4」の連結部にまたがる[(5'→3') gaaucuuguguuuag┃GUACACUUUUACUGG]の30量体配列によってさらに示される。エクソンの番号付与は、報告のSCN9A mRNA転写産物に応じて変わり得る。30量体のSCN9A配列の提供は、SCN9A mRNAの報告されたエクソンの番号付与にかかわらず、式Iの化合物の標的スプライス部位を明白に同定することである。
【００５３】
式IのPNA誘導体中の天然(すなわち、天然に存在する)又は非天然(すなわち、天然に存在しない)核酸塩基の化学構造を図4に例示している。本発明の天然又は非天然の核酸塩基は、図4で提供されている核酸塩基を含むが、これらに限定されない。例としてのこのような天然及び非天然の核酸塩基の提供は、許容される核酸塩基の多様性を説明するものであり、したがって、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。
【００５４】
式IのPNA誘導体の説明に採用された置換基は、図5Aから図5Eに例示されている。図5Aは、置換又は無置換アルキル基の例を示す。置換又は無置換アルキルアシル、及び置換又は無置換アリールアシル基は、図5Bに例示されている。図5Cは、置換アルキルアミノ、置換アリールアミノ、置換若しくは無置換アリール、置換若しくは無置換アルキルスルホニル、置換若しくは無置換アリールスルホニル、置換若しくは無置換アルキルホスホニル、及び置換若しくは無置換アリールホスホニル基の例を示す。図5Dは、置換又は無置換アルキルオキシカルボニル、置換又は無置換アリールオキシカルボニル、置換又は無置換アルキルアミノカルボニル、及び置換又は無置換アリールアミノカルボニル基の例を示す。図5Eにおいては、置換又は無置換アルキルオキシチオカルボニル、置換又は無置換アルキルアミノチオカルボニル、置換又は無置換アリールアミノチオカルボニル、及び置換又は無置換アルキルオキシチオカルボニル基の例を示す。例としてのこのような置換基の提供は、許容される置換基の多様性を説明するためのものであり、したがって、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。オリゴヌクレオチド配列は、N末端又はC末端の置換基よりも標的プレmRNA配列に対するオリゴヌクレオチドの配列特異的結合の主要因子であることは、当業者には容易に理解されよう。
【００５５】
式Iの化合物は、先行技術[PCT/KR2009/001256]に例示されているように、相補DNAに強く結合する。式IのPNA誘導体とその完全長相補DNA又はRNAの間の二本鎖は、水性緩衝液中で確実に判定するには極めて高いTm値を有する。式IのPNA化合物は、より短い長さの相補DNAと高いTm値を生じる。
【００５６】
式Iの化合物は、ヒトSCN9A遺伝子から転写されたヒトSCN9AプレmRNAの標的3'スプライス部位に強く結合し、化合物の標的エクソンを含む「スプライソソーム初期複合体」の形成に干渉する。本発明の化合物は「スプライソソーム初期複合体」の形成を立体的に阻害するので、SCN9A「エクソン4」はスプライスアウトされて「エクソン4」を欠失するSCN9A mRNAスプライス変異体を生じる。結果的に、本発明の化合物は、SCN9A mRNA内の「エクソン4」のスキッピングを誘導する。
【００５７】
前記化合物の相補プレmRNA配列に対する親和性が強いため、本発明の化合物は、1つ又は2つのミスマッチを有する部分的に相補的なプレmRNA配列にも強く結合し、SCN9AプレmRNA内の標的エクソンのスキッピングを誘導し得る。例えば、式Iの14量体 PNA誘導体がSCN9AプレmRNAとの単一のミスマッチを有していても、14量体 SCN9A ASOは、依然としてSCN9A mRNA中の「エクソン4」のスキッピングを誘導する。
【００５８】
式Iの化合物は良好な細胞透過性を有し、先行技術[PCT/KR2009/001256]で例示されているように「裸の」オリゴヌクレオチドとして細胞内に容易に送達することができる。したがって、本発明の化合物は、SCN9AプレmRNA内の「エクソン4」のスキッピングを誘導し、「裸の」オリゴヌクレオチドとして式Iの化合物で処理した細胞においてSCN9A「エクソン4」を欠失するSCN9A mRNAスプライス変異体(複数可)を産生する。前記の化合物は、細胞での標的エクソンのスキッピングを強力に誘導するのに、細胞内に送達するためのいかなる手段又は製剤も必要ではない。式Iの化合物は、サブフェムトモル濃度の「裸の」オリゴヌクレオチドとして、本発明の化合物で処置された細胞においてSCN9A「エクソン4」のスキッピングを容易に誘導する。
【００５９】
「裸のオリゴヌクレオチド」としての式Iの化合物で処置された細胞は、低レベルの完全長SCN9A mRNAを発現するので、化合物で処置していない細胞よりも弱いNav1.7の機能活性を示す。式Iの化合物は、「裸のオリゴヌクレオチド」として全身投与した際、ニューロン細胞又は組織におけるNav1.7発現を阻害する。したがって、前記化合物は、疼痛、又はNav1.7の過剰発現が関与する障害を処置するのに有用である。
【００６０】
式IのPNA誘導体は、「裸の」オリゴヌクレオチドとして全身投与し標的組織におけるSCN9A「エクソン4」のスキッピングを誘導することができるので、したがって、完全長のSCN9A mRNAの発現を阻害することができる。式Iの化合物は、目的の治療活性又は生物活性のため、標的組織への全身送達を強化する特定の製剤を必要としない。通常、式Iの化合物はPBS又は食塩水で溶解され、全身投与されて標的組織における所望の治療活性を誘発する。本発明の化合物は、全身的治療活性を誘発するために、多量に又は侵襲的に処方する必要はない。
【００６１】
式Iの化合物は、限定するものではないが水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、塩酸、メタンスルホン酸、クエン酸、トリフルオロ酢酸などを含む、薬学的に許容される酸又は塩基と組み合わせて使用することができる。
【００６２】
式IのPNA誘導体又はそれらの薬学的に許容される塩は、限定するものではないがクエン酸、塩酸、酒石酸、ステアリン酸、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エタノール、イソプロパノール、炭酸水素ナトリウム、蒸留水、防腐剤など含む、薬学的に許容されるアジュバントと組み合わせて対象に投与することができる。
【００６３】
本発明の化合物は、1fmole/kgから1nmole/kgを超える治療用量で対象に全身投与することができるが、これは対象の投与スケジュール、状態又は状況などに応じて変わり得る。
【００６４】
好ましいのは、
nが10〜25の整数であり;
式Iの化合物が、ヒトSCN9AプレmRNA内の[(5'→3') UGUUUAGGUACACU]の14量体プレmRNA配列と少なくとも10量体の相補的重複を有し;
式Iの化合物が、ヒトSCN9AプレmRNAに完全に相補的であるか、又は1つ若しくは2つのミスマッチによりヒトSCN9AプレmRNAに部分的に相補的であり;
S1、S2、...、Sn-1、Sn、T1、T2、...、Tn-1、及びTnが、独立して、デューテリド、ヒドリド、置換若しくは無置換アルキル、又は置換若しくは無置換アリール基を表し;
X及びYが、独立して、ヒドリド、ホルミル、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、置換若しくは無置換アルキル、置換若しくは無置換アリール、置換若しくは無置換アルキルアシル、置換若しくは無置換アリールアシル、置換若しくは無置換アルキルオキシカルボニル、置換若しくは無置換アリールオキシカルボニル、置換若しくは無置換アルキルアミノカルボニル、置換若しくは無置換アリールアミノカルボニル、置換若しくは無置換アルキルアミノチオカルボニル、置換若しくは無置換アリールアミノチオカルボニル、置換若しくは無置換アルキルオキシチオカルボニル、置換若しくは無置換アリールオキシチオカルボニル、置換若しくは無置換アルキルスルホニル、置換若しくは無置換アリールスルホニル、置換若しくは無置換アルキルホスホニル基、又は置換若しくは無置換アリールホスホニル基を表し;
Zが、ヒドリド、ヒドロキシ、置換若しくは無置換アルキルオキシ、置換若しくは無置換アリールオキシ、置換若しくは無置換アミノ、置換若しくは無置換アルキル、又は置換若しくは無置換アリール基を表し;
B1、B2、...、Bn-1及びBnが、独立して、アデニン、チミン、グアニン、シトシン及びウラシルを含む天然核酸塩基並びに非天然核酸塩基から選択され;
B1、B2、...、Bn-1及びBnのうちの少なくとも4つが、独立して、式II、式III又は式IVによって表される非天然核酸塩基:
【化３】
2020506686.tif 000005
[式中、
R1、R2、R3、R4、R5及びR6は、独立して、ヒドリド、及び置換又は無置換アルキル基から選択され;
L1、L2及びL3は、塩基性アミノ基を核酸塩基部分に共有結合している式V:
【化４】
2020506686.tif 000006
(式中、
Q1及びQmは、置換又は無置換メチレン(-CH2-)基であり、Qmは、塩基性アミノ基に直接結合されており;
Q2、Q3、...及びQm-1は、独立して、置換又は無置換メチレン、酸素(-O-)、硫黄(-S-)、及び置換又は無置換アミノ基[-N(H)-、若しくは-N(置換)-]から選択され;
mは、1から15の整数である)
によって表される共有結合リンカーである]
から選択される、式IのPNA誘導体、又はそれらの薬学的に許容される塩である。
【００６５】
ある特定のそのような実施形態において、S1、S2、...、Sn-1、Sn、T1、T2、...、Tn-1及びTnは、独立して、デューテリド又はヒドリド基を表し、Zは、ヒドリド、ヒドロキシ、置換若しくは無置換アルキルオキシ、置換若しくは無置換アリールオキシ、又は置換若しくは無置換アミノ基を表す。別のそのような実施形態において、S1、S2、...、Sn-1、Sn、T1、T2、...、Tn-1及びTnのうちの少なくとも1つは、独立して、置換若しくは無置換アルキル、又は置換若しくは無置換アリール基を表し、並びに/或いは、Zは置換若しくは無置換アルキル、又は置換若しくは無置換アリール基を表す。
【００６６】
いくつかの実施形態において、式Vのmは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13及び14から選択される整数である。
【００６７】
興味深いのは、
nが11〜21の整数であり;
式Iの化合物が、ヒトSCN9AプレmRNA内の[(5'→3') UGUUUAGGUACACU]の14量体プレmRNA配列と少なくとも10量体の相補的重複を有し;
式Iの化合物が、ヒトSCN9AプレmRNAに完全に相補的であるか、又は1つ若しくは2つのミスマッチによりヒトSCN9AプレmRNAに部分的に相補的であり;
S1、S2、...、Sn-1、Sn、T1、T2、...、Tn-1及びTnがヒドリド基であり;
X及びYが、独立して、ヒドリド、置換若しくは無置換アルキル、置換若しくは無置換アリール、置換若しくは無置換アルキルアシル、置換若しくは無置換アリールアシル、置換若しくは無置換アルキルオキシカルボニル、置換若しくは無置換アリールオキシカルボニル、置換若しくは無置換アルキルアミノカルボニル、置換若しくは無置換アリールアミノカルボニル、置換若しくは無置換アルキルスルホニル、又は置換若しくは無置換アリールスルホニル基を表し;
Zが置換又は無置換アミノ基を表し;
B1、B2、...、Bn-1及びBnが、独立して、アデニン、チミン、グアニン、シトシン及びウラシルを含む天然核酸塩基並びに非天然核酸塩基から選択され;
B1、B2、...、Bn-1及びBnのうちの少なくとも4つが、独立して、式II、式III又は式IVによって表される非天然核酸塩基から選択され;
R1、R2、R3、R4、R5及びR6が、独立して、ヒドリド、及び置換又は無置換アルキル基から選択され;
Q1及びQmが置換又は無置換メチレン基であり、Qmが塩基性アミノ基に直接結合されており;
Q2、Q3、...及びQm-1が、独立して、置換又は無置換のメチレン、酸素及びアミノ基から選択され;
mが1〜11の整数である、
式IのPNAオリゴマー、又はそれらの薬学的に許容される塩である。
【００６８】
式IのPNAオリゴマー、又はそれらの薬学的に許容される塩の一実施形態において、X及びYは、独立して、ヒドリド、置換若しくは無置換アルキル、置換若しくは無置換アリール、置換若しくは無置換アルキルアシル、置換若しくは無置換アリールアシル、置換若しくは無置換アルキルオキシカルボニル、又は置換若しくは無置換アリールオキシカルボニル基を表す。
【００６９】
式IのPNAオリゴマー、又はそれらの薬学的に許容される塩の別の実施形態において、X及びYのうちの少なくとも1つは、独立して、置換若しくは無置換アルキルアミノカルボニル、置換若しくは無置換アリールアミノカルボニル、置換若しくは無置換アルキルスルホニル、又は置換若しくは無置換アリールスルホニル基を表す。
【００７０】
特に興味深いのは、
nが11〜19の整数であり;
式Iの化合物が、ヒトSCN9AプレmRNA内の[(5'→3') UGUUUAGGUACACU]の14量体プレmRNA配列と少なくとも10量体の相補的重複を有し;
式Iの化合物が、ヒトSCN9AプレmRNAに完全に相補的であり;
S1、S2、...、Sn-1、Sn、T1、T2、...、Tn-1及びTnがヒドリド基であり;
X及びYが、独立して、ヒドリド、置換若しくは無置換アルキル、置換若しくは無置換アリール、置換若しくは無置換アルキルアシル、置換若しくは無置換アリールアシル、置換若しくは無置換アルキルオキシカルボニル、置換若しくは無置換アルキルアミノカルボニル、置換若しくは無置換アルキルスルホニル、又は置換若しくは無置換アリールスルホニル基を表し;
Zが置換又は無置換アミノ基を表し;
B1、B2、...、Bn-1及びBnが、独立して、アデニン、チミン、グアニン、シトシン及びウラシルを含む天然核酸塩基並びに非天然核酸塩基から選択され;
B1、B2、...、Bn-1及びBnのうちの少なくとも4つが、独立して、式II、式III又は式IVによって表される非天然核酸塩基から選択され;
R1、R2、R3、R4、R5及びR6が、独立して、ヒドリド、及び置換又は無置換アルキル基から選択され;
Q1及びQmがメチレン基であり、Qmが塩基性アミノ基に直接結合されており;
Q2、Q3、...及びQm-1が、独立して、メチレン、酸素及びアミノ基から選択され;
mが1〜9の整数である、
式IのPNA誘導体、又はそれらの薬学的に許容される塩である。
【００７１】
式IのPNAオリゴマー、又はそれらの薬学的に許容される塩の一実施形態において、X及びYは、独立して、ヒドリド、置換若しくは無置換アルキルアシル、又は置換若しくは無置換アルキルオキシカルボニル基を表す。
【００７２】
式IのPNAオリゴマー、又はそれらの薬学的に許容される塩の別の実施形態において、X及びYのうちの少なくとも1つは、独立して、置換若しくは無置換アルキル、置換若しくは無置換アリール、置換若しくは無置換アリールアシル、置換若しくは無置換アルキルアミノカルボニル、置換若しくは無置換アルキルスルホニル、又は置換若しくは無置換アリールスルホニル基を表す。
【００７３】
特に興味深いのは、
nが11〜19の整数であり;
式Iの化合物が、ヒトSCN9AプレmRNA内の[(5'→3') UGUUUAGGUACACU]の14量体プレmRNA配列と少なくとも10量体の相補的重複を有し;
式Iの化合物が、ヒトSCN9AプレmRNAに完全に相補的であり;
S1、S2、...、Sn-1、Sn、T1、T2、...、Tn-1及びTnがヒドリド基であり;
X及びYが、独立して、ヒドリド、置換若しくは無置換アルキル、置換若しくは無置換アリール、置換若しくは無置換アルキルアシル、置換若しくは無置換アリールアシル、又は置換若しくは無置換アルキルオキシカルボニル基を表し;
Zが置換又は無置換アミノ基を表し;
B1、B2、...、Bn-1及びBnが、独立して、アデニン、チミン、グアニン、シトシン及びウラシルを含む天然核酸塩基並びに非天然核酸塩基から選択され;
B1、B2、...、Bn-1及びBnのうちの少なくとも4つが、独立して、式II、式III又は式IVによって表される非天然核酸塩基から選択され;
R1、R3、及びR5がヒドリド基であり、R2、R4及びR6が、独立して、ヒドリド、又は置換若しくは無置換アルキル基を表し;
Q1及びQmがメチレン基であり、Qmが塩基性アミノ基に直接結合されており;
Q2、Q3、...及びQm-1が、独立して、メチレン、酸素基から選択され;
mが1〜8の整数である、
式IのPNA誘導体、又はそれらの薬学的に許容される塩である。
【００７４】
式IのPNAオリゴマー、又はそれらの薬学的に許容される塩の一実施形態において、X及びYは、独立して、ヒドリド、置換若しくは無置換アルキルアシル、又は置換若しくは無置換アルキルオキシカルボニル基を表す。
【００７５】
式IのPNAオリゴマー、又はそれらの薬学的に許容される塩の別の実施形態において、X及びYのうちの少なくとも1つは、独立して、置換若しくは無置換アルキル、置換若しくは無置換アリール、又は置換若しくは無置換アリールアシルを表す。
【００７６】
より特に興味深いのは、
nが11〜19の整数であり;
式Iの化合物が、ヒトSCN9AプレmRNA内の[(5'→3') UGUUUAGGUACACU]の14量体プレmRNA配列と少なくとも10量体の相補的重複を有し;
式Iの化合物が、ヒトSCN9AプレmRNAに完全に相補的であり;
S1、S2、...、Sn-1、Sn、T1、T2、...、Tn-1及びTnがヒドリド基であり;
X及びYが、独立して、ヒドリド、置換若しくは無置換アルキルアシル、置換若しくは無置換アリールアシル、又は置換若しくは無置換アルキルオキシカルボニル基を表し;
Zが置換又は無置換アミノ基を表し;
B1、B2、...、Bn-1及びBnが、独立して、アデニン、チミン、グアニン、シトシン、及び非天然核酸塩基から選択され;
B1、B2、...、Bn-1及びBnのうちの少なくとも5つが、独立して、式II、式III又は式IVによって表される非天然核酸塩基から選択され;
R1、R2、R3、R4、R5及びR6がヒドリド基であり;
Q1及びQmがメチレン基であり、Qmが塩基性アミノ基に直接結合されており;
Q2、Q3、...及びQm-1が、独立して、メチレン、酸素基から選択され;
mが1〜8の整数である、
式IのPNA誘導体、又はそれらの薬学的に許容される塩である。
【００７７】
式IのPNAオリゴマー、又はそれらの薬学的に許容される塩の一実施形態において、X及びYは、独立して、ヒドリド、置換若しくは無置換アルキルアシル、又は置換若しくは無置換アルキルオキシカルボニル基を表す。
【００７８】
式IのPNAオリゴマー、又はそれらの薬学的に許容される塩の一実施形態において、X及びYのうちの少なくとも1つは、独立して、置換若しくは無置換アリールアシル基を表す。
【００７９】
より特に興味深いのは、
nが11〜19の整数であり;
式Iの化合物が、ヒトSCN9AプレmRNA内の[(5'→3') UGUUUAGGUACACU]の14量体プレmRNA配列と少なくとも10量体の相補的重複を有し;
式Iの化合物が、ヒトSCN9AプレmRNAに完全に相補的であり;
S1、S2、...、Sn-1、Sn、T1、T2、...、Tn-1及びTnがヒドリド基であり;
Xがヒドリド基であり;
Yが置換若しくは無置換アルキルアシル、置換若しくは無置換アリールアシル、又は置換若しくは無置換アルキルオキシカルボニル基を表し;
Zが置換又は無置換アミノ基を表し;
B1、B2、...、Bn-1及びBnが、独立して、アデニン、チミン、グアニン、シトシン、及び非天然核酸塩基から選択され;
B1、B2、...、Bn-1及びBnのうちの少なくとも5つが、独立して、式II、式III又は式IVによって表される非天然核酸塩基から選択され;
R1、R2、R3、R4、R5及びR6がヒドリド基であり;
L1が-(CH2)2-O-(CH2)2-、-CH2-O-(CH2)2-、-CH2-O-(CH2)3-、-CH2-O-(CH2)4-、又は-CH2-O-(CH2)5-を表し、右端が塩基性アミノ基に直接結合しており;
L2及びL3が、独立して、-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)4-、-(CH2)5-、-(CH2)6-、-(CH2)7-、-(CH2)8-、-(CH2)2-O-(CH2)2-、-(CH2)3-O-(CH2)2-、及び-(CH2)2-O-(CH2)3-から選択され、右端が塩基性アミノ基に直接結合している、
式IのPNA誘導体、又はそれらの薬学的に許容される塩である。
【００８０】
式IのPNAオリゴマー、又はそれらの薬学的に許容される塩の一実施形態において、Yは、置換若しくは無置換アルキルアシル、又は置換若しくは無置換アルキルオキシカルボニル基を表す。
【００８１】
式IのPNAオリゴマー、又はそれらの薬学的に許容される塩の別の実施形態において、Yは、置換若しくは無置換アリールアシルを表す。
【００８２】
特に興味深いのは、下記で提供されている化合物の群から選択される式IのPNA誘導体、又はそれらの薬学的に許容される塩である:
(N → C) Fethoc-TA(5)A-A(5)AG(6)-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)-NH2;
(N → C) Fethoc-TA(5)A-A(4)AG(6)-TG(6)T-A(5)CC(1O3)-TA(5)A-A-NH2;
(N → C) Fmoc-TA(5)A-A(4)AG(6)-TG(6)T-A(5)CC(1O3)-TA(5)A-A-NH2;
(N → C) Piv-Leu-TA(5)A-A(5)AG(3O2)-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)-NH2;
(N → C) Fethoc-TA(5)T-A(5)AG(6)-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)-NH2;
(N → C) ベンゾイル-Gly-TA(2O2)A-A(5)AG(6)-TG(6)T-A(5)CT-TA(5)A-Lys-NH2;
(N → C) Fethoc-AA(5)G-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TAA(5)-A-NH2;
(N → C) Fethoc-AA(5)G-CG(6)T-A(5)CC(1O2)-TAA(5)-A-NH2;
(N → C) Fmoc-AA(5)G-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TAA(5)-A-NH2;
(N → C) ベンゼンスルホニル-AA(5)G-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TAA(5)-A-NH2;
(N → C) Ac-AA(5)G-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TAA(5)-A-NH2;
(N → C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(3)A-A(5)-NH2;
(N → C) Fmoc-AA(5)G-TG(6)T-AC(1O2)C-TAA(5)-A-NH2;
(N → C) メチル-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(3)A-A(5)-Gly-Arg-NH2;
(N → C) Fethoc-A(5)AG-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TAA-A(5)-NH2;
(N → C) Ac-Val-A(5)AG-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TAA-A(5)-NH2;
(N → C) Fethoc-AAG(6)-TG(6)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A-NH2;
(N → C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)-NH2;
(N → C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N → C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)AC(1O2)-TA(5)T-A(5)C-NH2;
(N → C) H-AA(5)G-TG(2O2)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N → C) Fethoc-Lys-Leu-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(2O2)A-A(5)C-Lys-NH2;
(N → C) [N-(2-フェニルエチル)アミノ]カルボニル-AA(3)G-TG(5)T-A(5)CC(1O5)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N → C) N,N-フェニル-Me-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(4)C-NH2;
(N → C) Fethoc-AA(5)G-TA(5)T-A(5)CC(1O2)-TG(5)A-A(5)C-NH2;
(N → C) p-トルエンスルホニル-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N → C) p-トルエンスルホニル-AA(5)G-TG(2O3)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-Lys-NH2;
(N → C) Fethoc-AA(5)G-TG(2O3)T-A(5)CC(1O3)-TA(7)A-A(5)C-NH2;
(N → C) n-プロピル-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O3)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N → C) ベンゾイル-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N → C) ベンジル-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O3)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N → C) ベンゾイル-AA(5)G-TG(3)T-A(5)CC(2O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N → C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-Leu-Lys-NH2;
(N → C) Piv-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N → C) Fethoc-TA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N → C) Fethoc-AA(5)C-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N → C) メチルスルホニル-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N → C) n-ヘキシル-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N → C) n-ヘキサノイル-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N → C) n-ヘキサノイル-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(8)A-A(5)C-NH2;
(N → C) Fethoc-AA(3)G-TG(2O2)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N → C) Fethoc-AA(3)G-TG(2O2)T-A(5)CC(1O3)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N → C) Fethoc-AA(3)G-TG(2O2)T-A(5)CC(2O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N → C) FAM-HEX-HEX-AA(3)G-TG(2O2)T-A(5)CC(2O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2;
(N → C) Fethoc-A(5)GT-G(5)TA(5)-CC(1O2)T-A(5)AA(5)-C-NH2;
(N → C) Fethoc-AG(5)T-G(7)TA-CC(1O2)T-AA(6)A-C-NH2;
(N → C) Fethoc-AA(6)G-TG(5)T-A(6)CC(1O2)-TA(6)A-A(6)C-NH2;
(N → C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(3)CA-C(1O5)AA-NH2;
(N → C) Fethoc-AA(5)G-TCT-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(3)CA-C(1O5)AA-NH2;
(N → C) Fethoc-AA(5)G-TCT-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(3)CA(3)-CTA-NH2;
(N → C) Fethoc-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(3)CA-CA(7)A-NH2;
(N → C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(3)CA(5)-C-NH2;
(N → C) Fethoc-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(3)CA(5)-C-NH2;
(N → C) p-トルエンスルホニル-TG(2O3)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(3)CA-C-Lys-NH2;
(N → C) Fethoc-TG(5)T-A(5)CC(2O2)-TA(5)A-A(3)CA-CA(5)A-NH2;
(N → C) Piv-TG(5)T-A(5)CC(2O2)-TA(5)A-A(3)CA-CA(5)A-NH2;
(N → C) ベンゾイル-TG(5)T-A(5)CC(2O2)-TA(5)A-A(3)CA-CA(5)A-NH2;
(N → C) プロピオニル-TG(5)T-A(5)CC(2O2)-TA(5)A-A(3)CA-CA(5)A-NH2;
(N → C) Fethoc-TG(5)T-A(5)CC(2O2)-TA(5)A-A(3)CA-CA(5)A-Arg-Val-NH2;
(N → C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)G-NH2;
(N → C) Fethoc-AG(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)G-NH2;
(N → C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)CA-NH2;
(N → C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)GG-NH2; 及び、
(N → C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-ACC(1O2)-TA(5)A-A(5)CA(5)-C-NH2:
式中、
A、G、T及びCは、それぞれ、アデニン、グアニン、チミン及びシトシンの天然核酸塩基を有するPNAモノマーであり;
C(pOq)、A(p)、A(pOq)、G(p)及びG(pOq)は、それぞれ、式VI、式VII、式VIII、式IX、及び式X
【化５】
2020506686.tif 000007
によって表される非天然核酸塩基を有するPNAモノマーであり;
式中、p及びqは整数であり;
N末端及びC末端の置換基に関する略語は、特に以下のように定義される:「Fmoc-」は、「[(9-フルオレニル)メチルオキシ]カルボニル-」の略語であり;「Fethoc-」は、「[2-(9-フルオレニル)エチル-1-オキシ]カルボニル」の略語であり;「Ac-」は、「アセチル-」の略語であり;「n-ヘキサノイル-」は、「1-(n-ヘキサノイル)-」の略語であり;「ベンゾイル-」は、「ベンゼンカルボニル-」の略語であり;「Piv-」は、「ピバリル-」の略語であり;「n-プロピル-」は、「1-(n-プロピル)-」の略語であり;「n-ヘキシル-」は、「1-(n-ヘキシル)-」の略語であり;「H-」は、「ヒドリド-」の略語であり;「p-トルエンスルホニル」は、「(4-メチルベンゼン)-1-スルホニル-」の略語であり;「ベンゼンスルホニル」は、「ベンゼン-1-スルホニル-」の略語であり;「メチルスルホニル」は、「メチル-1-スルホニル-」の略語であり;「-Lys-」は、アミノ酸残基「リジン」の略語であり;「-Val-」は、アミノ酸残基「バリン」の略語であり;「-Leu-」は、アミノ酸残基「ロイシン」の略語であり;「-Arg-」は、アミノ酸残基「アルギニン」の略語であり;「-Gly-」は、アミノ酸残基「グリシン」の略語であり;「[N-(2-フェニルエチル)アミノ]カルボニル-」は、「[N-1-(2-フェニルエチル)-アミノ]カルボニル-」の略語であり;「ベンジル-」は、「1-(フェニル)メチル-」の略語であり;「フェニル-」は、「フェニル-」の略語であり;「Me-」は、「メチル-」の略語であり;「-HEX-」は、「6-アミノ-1-ヘキサノイル-」の略語であり;「FAM-」は、「5-又は6-フルオレセイン-カルボニル-」(異性体混合物)の略語であり;「-NH2」は、無置換の「-アミノ」基の略語である。
【００８３】
図6に、A、G、T、C、C(pOq)、A(p)、A(pOq)、G(p)、及びG(pOq)と略されたPNAモノマーに関する化学構造をまとめて示す。先行技術[PCT/KR2009/001256]で論じられているように、C(pOq)は、「グアニン」に対するその好ましいハイブリダイゼーションのため、「シトシン」に対応する修飾PNAモノマーと見なされる。A(p)及びA(pOq)は、「チミン」に対するそれらの強い親和性のため、「アデニン」として作用する修飾PNAモノマーとして得られる。同様に、G(p)及びG(pOq)は、「シトシン」とのそれらの相補的塩基対形成のために、「グアニン」と同等の修飾PNAモノマーであると考えられる。
【００８４】
図7は、式IのPNA誘導体のN末端又はC末端での多様性導入に使用される置換基に関する様々な略語の化学構造を明示する。
【００８５】
PNA誘導体の略語を説明するために、「(N→C) Fethoc-TA(5)A-A(5)TA(5)-CGC(1O2)-AA(5)A-A(5)A-NH2」として示されている14量体 PNA誘導体の化学構造を図8に提供する。別の例示として、「(N→C) Fethoc-AG(5)C-A(5)CT-TA(5)C-GC(1O2)A-A(5)AA(2O2)-A-Lys-NH2」と略記された16量体 PNA誘導体の化学構造を図9に提供する。
【００８６】
「(N→C) Fethoc-AA(3)G-TG(2O2)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2」の14量体 PNA配列は、「(5'→3') AAG-TGT-ACC-TAA-AC」のDNA配列と等しく、これはヒトSCN9AプレmRNA内のイントロン3及びエクソン4の連結部にまたがる[(5'→3') uuguguuuag┃GUACACUUUU]において「太字」と「下線」でマークした20量体プレmRNA配列との14量体相補的重複を有する。
【００８７】
「(N→C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(3)CA-C(1O5)AA-NH2」の18量体 PNA配列は、「(5'→3') AAG-TGT-ACC-TAA-ACA-CAA」のDNA配列と等しく、これは[(5'→3') uuguguuuag┃GUACACUUUU]において「太字」と「下線」でマークした20量体 SCN9AプレmRNA配列との18量体相補的重複を有する。
【００８８】
「(N→C) Fethoc-AA(5)G-TCT-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(3)CA(3)-CTA-NH2」の18量体 PNA配列は、「(5'→3') AAG-TCT-ACC-TAA-ACA-CTA」のDNA配列と等しく、これは[(5'→3') u"u"guguuuag┃GUA"C"ACUUUU]において「太字」と「下線」でマークした20量体 SCN9AプレmRNA配列との16量体相補的重複を有する。したがって、18量体 PNAは、ヒトSCN9AプレmRNA内のエクソン4の3'スプライス部位との2つの単一ミスマッチを有する。2つの単一ミスマッチは、引用のサイン("")でマークしたようにイントロン3及びエクソン4で確認される。
【００８９】
「(N→C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)G-NH2」の14量体 PNA配列は、「(5'→3') AAG-TGT-ACC-TAA-AG」のDNA配列と等しく、これは[(5'→3') uugu"g"uuuag┃GUACACUUUU]において「太字」と「下線」でマークした20量体 SCN9AプレmRNA配列との13量体相補的重複を有する。したがって、14量体 PNAは、ヒトSCN9AプレmRNA内のエクソン4の3'スプライス部位との1つの単一ミスマッチを有している。この単一ミスマッチは、引用のサイン("")でマークしたようにイントロン3で確認される。
【実施例】
【００９０】
発明の詳細な説明
PNAオリゴマーを調製するための一般的手順
PNAオリゴマーは、先行技術[米国特許第6,133,444号;WO 96/40685]に開示されている方法に従って、必要ならばわずかな改変を行い、Fmoc化学に基づいた固相ペプチド合成(SPPS)によって合成した。この研究で使用した固体担体は、PCAS BioMatrix Inc. (Quebec, Canada)から購入したH-Rink Amide-ChemMatrixであった。修飾核酸塩基を有するFmoc-PNAモノマーは、先行技術[PCT/KR 2009/001256]に開示されているように、又はわずかな改変を行い合成した。修飾核酸塩基を有するそのようなFmoc-PNAモノマー及び天然核酸塩基を有するFmoc-PNAモノマーを使用して、本発明のPNA誘導体を合成した。修飾核酸塩基を有するFmoc-PNAモノマーは、図10に示している。しかし、当業者には、そのようなPNAモノマー上の保護基に対して多数のわずかな変形が明らかに可能であることは明白であろう。したがって、図10のFmoc-PNAモノマーは例示として理解されるべきであり、したがって、本発明の範囲を限定するものと理解すべきではない。PNAオリゴマーは、C18逆相HPLC(水/アセトニトリル又は0.1%のTFAを有する水/メタノール)によって精製し、ESI/TOF/MSを含む質量分析法により特性決定した。
【００９１】
図11は、本研究のSPPSにおいて採用された典型的なモノマー伸長サイクルを概略的に示しており、合成の詳細は下記の通りである。しかし、当業者には、自動ペプチド合成機又は手動ペプチド合成機でのそのようなSPPS反応の有効な実施において多数のわずかな変形が明らかに可能であることは明白であろう。各反応のステップを下記に簡潔に述べる。
【００９２】
[H-Rink-ChemMatrix樹脂の活性化]
1.5mLの20%ピペリジン/DMF中のChemMatrix樹脂の0.01mmol(約20mg樹脂)を20分間、libraチューブ中でボルテックスし、脱Fmoc溶液を濾過した。樹脂を、1.5mLの塩化メチレン(MC)、1.5mLのジメチルホルムアミド(DMF)、1.5mLのMC、1.5mLのDMF、及び1.5mLのMCで連続してそれぞれ30秒間洗浄した。得られた固体支持体上の遊離アミンを、Fmoc-PNAモノマー又はFmoc保護アミノ酸誘導体のいずれかとカップリングさせた。
【００９３】
[脱Fmoc]
樹脂を、1.5mLの20%ピペリジン/DMF中で7分間ボルテックスし、脱Fmoc溶液を濾過した。樹脂を、1.5mLのMC、1.5mLのDMF、1.5mLのMC、1.5mLのDMF、及び1.5mLのMCで連続してそれぞれ30秒間洗浄した。得られた固体支持体上の遊離アミンを、直ちにFmoc-PNAモノマーとカップリングさせた。
【００９４】
[Fmoc-PNAモノマーとのカップリング]
固体支持体上の遊離アミンを、以下のようにFmoc-PNAモノマーとカップリングさせた。0.04mmolのFmoc-PNAモノマー、0.05mmolのHBTU[2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート]、及び10mmolのDIEA(N,N-ジイソプロピルエチルアミン)を、1mLの無水DMF中で2分間インキュベートし、遊離のアミンと共に樹脂に添加した。樹脂溶液を1時間ボルテックスし、反応媒体を濾過した。次いで、樹脂を、1.5mLのMC、1.5mLのDMF及び1.5mLのMCで連続してそれぞれ30秒間洗浄した。
【００９５】
[キャッピング]
カップリング反応後、未反応の遊離アミンを、1.5mLのキャッピング溶液(5%の無水酢酸及び6%の2,6-ルチジン(2,6-leutidine)を含むDMF)中で5分間振盪することによりキャッピングした。次いで、キャッピング溶液を濾過し、1.5mLのMC、1.5mLのDMF及び1.5mLのMCで連続してそれぞれ30秒間洗浄した。
【００９６】
[N末端における「Fethoc-」基の導入]
「Fethoc-」基は、通常の塩基性カップリング条件下で、樹脂上の遊離アミンを「Fethoc-OSu」と反応させることによってN末端に導入した。「Fethoc-OSu」の化学構造[CAS番号第179337-69-0、C20H17NO5、MW 351.36]を以下に示す。
【００９７】
【化６】
2020506686.tif 000008
【００９８】
[樹脂からの切断]
樹脂に結合されたPNAオリゴマーは、1.5mLの切断溶液(2.5%のトリイソプロピルシラン及び2.5%のトリフルオロ酢酸水)中で3時間振盪することによって樹脂から切断した。樹脂を濾過し、濾液を減圧下で濃縮した。得られた残留物をジエチルエーテルで粉砕し、得られた沈澱物を濾過によって回収し、逆相HPLCにより精製した。
【００９９】
[HPLC分析及び精製]
樹脂から切断した後、各PNA誘導体の粗製生成物を、0.1%のTFAを含有する水/アセトニトリル又は水/メタノール(勾配法)で溶出するC18-逆相HPLCにより精製した。図12A及び図12Bは、それぞれ、HPLC精製前後の「ASO 2」に関する例示的なHPLCクロマトグラムである。「ASO 2」のオリゴマー配列は、表1に示した通りである。
【０１００】
式IのPNA誘導体の合成例
ヒトSCN9AプレmRNA内のイントロン3及びエクソン4の連結部にまたがる3'スプライス部位を相補的に標的とするために、本発明のPNA誘導体を、上記に示した合成法に従って、又はわずかに改変して調製した。ヒトSCN9AプレmRNAを標的とするそのようなPNA誘導体の提供は、式IのPNA誘導体を例示することであり、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。
【０１０１】
表1に、ヒトSCN9AプレmRNA内の「エクソン4」の3'スプライス部位を相補的に標的とするPNA誘導体を、質量分析法による構造的特性決定データと共に示す。表1のSCN9A ASOの提供は、式IのPNA誘導体を例示することであり、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。
【０１０２】
【表１】
2020506686.tif 000009
2020506686.tif 000010
【０１０３】
図12Aは、「ASO 2」の粗製生成物を用いて得られたHPLCクロマトグラムである。粗製生成物は、C18-逆相(RP)分取HPLCによって精製した。図12Bは、「ASO 2」の精製生成物についてのHPLCクロマトグラムである。「ASO 2」の純度は、分取HPLC精製によって著しく改善された。図13は、「ASO 2」の精製生成物を用いて得られたESI-TOF質量スペクトルを示す。「ASO 2」に関する分析データの提供は、式IのPNA誘導体が本発明においてどのように精製され同定されたかを例示することであり、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。
【０１０４】
相補的DNAに対するPNA誘導体の結合親和性
表1のPNA誘導体を、PNAのN末端又はC末端のいずれかを相補的に標的とする10量体 DNAに対するそれらの結合親和性について評価した。結合親和性は、PNAと10量体の相補的DNAとの間の二本鎖に対するTm値によって評価した。表1のPNA誘導体と完全相補的DNAとの間の二本鎖は、水性緩衝液溶液中で確実に判定するにはあまりにも高いTm値を示すが、それは緩衝液がTm測定中に沸騰する傾向があったためである。
【０１０５】
Tm値は、UV/Vis分光計で以下のように決定した。15mLポリプロピレンファルコンチューブに入れた4mL水性緩衝液(pH7.16、10mMリン酸ナトリウム、100mM NaCl)中の4μM PNAオリゴマー及び4μMの相補的10量体 DNAの混合溶液を1分間90℃でインキュベートし、ゆっくりと周囲温度まで冷却した。次いで、その溶液を、気密キャップを装備した3mLの石英UVキュベットに移し、先行技術[PCT/KR2009/001256]に開示されているように、又はわずかに改変して、260nmでUV/可視分光光度計でTm測定を行った。Tm測定用の10量体相補的DNAはBioneer(www.bioneer.com, Dajeon, South Korea)から購入し、それ以上精製を行うことなく使用した。
【０１０６】
式IのPNA誘導体の観察Tm値は10量体 DNAへの相補的結合については非常に高く、未修正として表2に示している。例えば、「ASO 7」は、[(N→C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2]において「太字」及び「下線」でマークしたPNA内のN末端10量体を標的とする10量体相補的DNA[すなわち、(5'→3') AGG-TAC-ACT-T]との二本鎖については77.0℃のTm値を示した。一方、「ASO 7」は、[(N→C) Fethoc-AA(5)G-TG(5)T-A(5)CC(1O2)-TA(5)A-A(5)C-NH2]において「太字」及び「下線」でマークしたPNA内のC末端10量体を標的とする10量体相補的DNA[すなわち(5'→3') GTT-TAG-GTA-C]との二本鎖については69.0℃のTmを示した。
【０１０７】
【表２】
2020506686.tif 000011
【０１０８】
式IのPNA誘導体の生物活性についての例
式IのPNA誘導体を、in vitro及びin vivoでの生物活性について評価した。以下に示した生物学的な例は、細胞内及び動物内における式IのPNA誘導体のアンチセンス活性を説明するものであり、したがって、本発明の範囲を表1に列挙した化合物に限定するものと解釈すべきではない。
【０１０９】
[実施例1]
PC3細胞における「ASO 7」によって誘導されたエクソンスキッピング(A)。
表1で指定した「ASO 7」は、ヒトSCN9AプレmRNA内のイントロン3及びエクソン4の連結部にまたがる3'スプライス部位の14量体配列に相補的に結合する14量体 ASOである。3'スプライス部位内の14量体標的配列は、[(5'→3') uuguguuuag┃GUACACUUUU]において「太字」及び「下線」でマークした通りである。「ASO 7」はイントロン3と6量体相補的重複を有し、エクソン4と8量体相補的重複を有する。
【０１１０】
PC3細胞(カタログ番号CRL1435、ATCC)は、ヒトSCN9A mRNAを多く発現することが知られているので[Br. J. Pharmacol. vol 156, 420〜431 (2009)]、「ASO 7」を、PC3細胞のエクソン4のスキッピングを誘導するその能力について、以下のように評価した。
【０１１１】
[細胞培養及びASO処理]
5mLのF-12K培地を入れた60mmの培養皿で増殖させたPC3細胞を、0(陰性対照)、1、10又は100zMの「ASO 7」で処理した。
【０１１２】
[ワンステップPCRによるRNA抽出及びcDNA合成]
「ASO 7」と5時間インキュベーションした後、全RNAを、「ユニバーサルRNA抽出キット」(カタログ番号9767、Takara)を使用して、製造業者の説明書に従い抽出した。200ngのRNA鋳型を、[エクソン2_フォワード: (5'→3') CTTTCTCCTTTCAGTCCTCT;及びエクソン9_リバース: (5'→3') CGTCTGTTGGTAAAGGTTTT]の1セットのエクソン特異的プライマーに対するPlatinum(登録商標)Taqポリメラーゼ(カタログ番号10928-042、Invitrogen)を含むSuper Script(登録商標)One-Step RT-PCRキットを使用し、以下のサイクル条件:30分間50℃及び2分間94℃、続いて30秒間94℃、30秒間55℃及び2分間72℃を15サイクルに従って、25μLの逆転写反応に供した。
【０１１３】
[ネスティッドPCR増幅]
次いで、1μLのcDNAを、以下のサイクル条件:2分間95℃、続いて30秒間95℃、30秒間55℃、1分間72℃を34サイクルに従って、[エクソン2n_フォワード: (5'→3') CCACCGGACTGGACCAAAAA;及びエクソン9n_リバース: (5'→3') GCTAAGAAGGC-CCAGCTGAA]の1セットのエクソン特異的プライマーに対する20μLのネスティッドPCR反応(カタログ番号K2612、Bioneer)に供した。
【０１１４】
[エクソンスキッピング産物の同定]
PCR産物を2%アガロースゲルでの電気泳動分離に供した。標的サイズのバンドを回収し、サンガーシーケンシングによって分析した。
【０１１５】
図14AはネスティッドPCR産物の電気泳動データを示すが、この場合、「ASO 7」で処理した細胞がエクソン4〜5のスキッピングに割り当て可能な強力なPCRバンドを生じた。しかし、完全長SCN9A mRNAに関するPCRバンドは、10zM又は100zMのASOで処理した試料において、陰性対照試料に比べてより強い傾向があった。ネスティッドPCRにおける珍しい用量応答パターンは、「ASO 7」によるエクソンスキッピング中に蓄積された「エクソンイントロン環状RNA(EIciRNA)」による転写上方制御に起因し得る。[Nature Struc. Mol. Biol. vol 22(3), 256〜264 (2015)]。エクソンスキッピングPCR産物は、図14Bにおいて示したように、サンガーシーケンシングによりエクソン4〜5のスキッピングであることが確認された。
【０１１６】
[実施例2]
PC3細胞における「ASO 7」によって誘導されたエクソンスキッピング(B)。
特記しない限り、「ASO 7」を、PC3細胞における「エクソン4」のスキッピングを誘導するその能力について、「実施例1」のように評価した。この実験において、PC3細胞を、0(陰性対照)、1、10、100及び1,000aMの「ASO 7」で24時間処理した。ネスティッドPCR反応は、エクソン3及びエクソン6の連結配列を有する産物を増幅するように設計された[エクソン3/6_フォワード: (5'→3') GGACCAAAAATGTCGAGCCT;及びエクソン9_リバース: (5'→3') GCTAAGAAGGCCCAGCTGAA]の1セットのプライマーに対して実施した。
【０１１７】
「エクソン3/6_フォワード」のプライマー配列は、完全長SCN9A mRNAで確認された「エクソン3及びエクソン4の連結部」に比べてより選択的に「エクソン3及びエクソン6の連結部」を認識する。このプライマー配列は、完全長SCN9A mRNAに比べてエクソン4〜5を欠失するSCN9Aスプライス変異体をより高感度に検出するように設計した。完全長mRNAは何十億年にもわたる進化によって得られた良好な代謝安定性を示す傾向があることから、このようなエクソンスキッピングプライマーは、代謝安定性が不十分なmRNAスプライス変異体を検出するのに有用である。
【０１１８】
図14CはネスティッドPCR産物の電気泳動データを示すが、この場合、「ASO 7」で処理した細胞がエクソン4〜5のスキッピングに割り当て可能な強いPCRバンドを生じた。エクソンスキッピングPCR産物は、サンガーシーケンシングによって、エクソン4〜5のスキッピングであることが確認された。
【０１１９】
[実施例3]
「ASO 7」で処理したPC3細胞におけるSCN9A mRNAのqPCR(A)。
「ASO 7」を、SCN9AネスティッドのqPCRによって、下記のようにPC3細胞におけるヒトSCN9A mRNAレベルの変化を誘導するその能力について評価した。
【０１２０】
[ASO処理]
PC3細胞を、0(陰性対照)、0.1、1又は10aMの「ASO 7」で処理した。(各ASO濃度につき2枚の培養皿)。
【０１２１】
[ワンステップPCRによるRNA抽出及びcDNA合成]
「ASO 7」と24時間インキュベーションした後、全RNAを抽出し、「実施例1」に述べたように、ワンステップPCR増幅に供した。
【０１２２】
[ネスティッドqPCR増幅]
cDNA溶液を100倍希釈し、以下のサイクル条件:30秒95℃、続いて5秒95℃、及び30秒60℃の40サイクルに従って、それぞれの1μLの希釈PCR産物を、[エクソン3_フォワード: (5'→3') TGACCATGAATAACCCAC;及びエクソン4_リバース: (5'→3') GCAAGGATTTTTACAAGT]の1セットのエクソン特異的プライマーに対する20μLのリアルタイムPCR反応に供した。qPCR反応を、完全長SCN9A mRNA内のエクソン3及びエクソン4の連結部を標的とする[(5'→3') 5,6-FAM-GGACCAAAA-Zen-ATGTCGAGTACAC-3IABkFQ]のTaqManプローブを用いて追跡した。
【０１２３】
図15Aに観察されたqPCRデータを要約しているが、この場合、完全長SCN9A mRNAレベルは、「ASO 7」で処理した細胞において約35〜45%有意に減少した(スチューデントt検定)。
【０１２４】
[実施例4]
「ASO 7」で処理したPC3細胞におけるSCN9A mRNAのqPCR(B)。
特記しない限り、「ASO 7」は、SCN9AネスティッドqPCRによって、「実施例3」のように、PC3細胞におけるヒトSCN9A mRNAレベルの変化を誘導するその能力について評価した。cDNAを、ランダムヘキサマーを使用して合成し、TaqManプローブに対するSCN9A qPCR反応に供した。
【０１２５】
図15Bに観察されたqPCRデータを示すが、この場合、完全長SCN9A mRNAレベルは「ASO 7」で処理した細胞において約50〜60%有意に減少した(スチューデントt検定)。
【０１２６】
[実施例5]
L5/L6脊髄神経結紮によるラットにおける脊髄神経障害の誘発。
脊髄神経結紮(SNL)は、後根神経節(DRG)及び脊髄において神経障害を誘発し、神経障害性疼痛のモデルとして広く使用されてきた。[Pain vol 50(3), 355〜363 (1992)]。しかし、脊髄神経束をどのように結紮するかによって、SNLのいくつかの変様がある。DRGにおける神経障害の程度及び期間は、脊髄神経束をどのように結紮するかによって変わるようである。[Pain vol 43(2), 205〜218 (1990)]。当社の経験によれば、L5及びL6の脊髄神経の2重結紮(すなわち「L5/L6結紮」)は、L5脊髄神経の単一結紮(すなわち「L5結紮」)よりも重症で持続の長い神経障害を誘発する。
【０１２７】
[L5/L6結紮によるSNL手術]
オスSDラットをゾレチル/ロンプンで麻酔した。次いで、L5及びL6脊髄神経束(左側)を露出させ、固く結紮した。次いで、筋肉及び皮膚を閉じ、相応の無菌の手順に従ってクリッピングした。
【０１２８】
[神経障害性疼痛の誘発]
SNL手術の6〜7日後、結紮した側の足を、下記のように、電子フォンフレイ痛覚測定装置(モデル番号2390、IITC Inc. Life Science)を使用するフォンフレイスコアリングにより刺激した。フォンフレイスコアリングは、薬理学評価のための群分けまで毎日実施した。
【０１２９】
[電子フォンフレイスコアリング]
フォンフレイスコアリング用にカスタマイズされたプラスチックケージ内の各動物を30分未満で安定化させた後、各動物の左後足を、スコアリングの間、数分間隔で6回、フォンフレイスコアリングに供した。動物が最初のスコアリング中安定化しなかったので、最初のスコアリングからスコアを除いた。残りの5つのスコアのうち、最高スコア及び最低スコアは除外した。次いで、残りの3つのスコアの平均を動物のフォンフレイスコアとして得た。
【０１３０】
[実施例6]
脊髄神経障害のラットにおける「ASO 7」によるアロディニアの転換。(1)
「ASO 7」は、標的配列の3'末端に単一のミスマッチを有する、ラットゲノムDNA[NCBI参照配列:NC_000002.12]から読み出されたラットSCN9AプレmRNAと部分的に相補的な14量体 SCN9A ASOである。ラットSCN9AプレmRNA内の「ASO 7」の標的13量体配列は、[(5'→3') uuuc"c"uuuag┃GUACACUUUU]の20量体 SCN9AプレmRNA配列においてマークしたように「太字」及び「下線」で明示されており、ここで、イントロン3で確認された単一ミスマッチは、引用符("")でマークされている。
【０１３１】
「ASO 7」を、下記のように、「L5/L6結紮」によって誘発された脊髄神経障害を有するラットにおけるアロディニアを転換させるその能力について評価した。
【０１３２】
[SNL手術及び群分け]
-10日目に、オスSDラット(6週齢、Harlan Laboratories、Italy)を「L5/L6結紮」に供した。動物を、-4日目から毎日、フォンフレイスコアリングにより刺激した。0日目に、30匹の動物を0日目の個々のフォンフレイスコアに基づいて選択し、陰性対照群(すなわち、ASO処理なし)と1、3及び6pmole/kgの「ASO 7」の3つの処理群の4群に割り当てた。(1群当たり6又は9匹の動物)。
【０１３３】
[ASO処理及びフォンフレイスコアリング]
0、2、4、6、8及び10日目の午後に、0(陰性対照)、1、3又は6pmole/kgの「ASO 7」をラットに皮下投与した。アロディニアを、午前に、「実施例5」で述べた電子フォンフレイスコアリング法によってスコアリングした。ASOは「裸の」オリゴヌクレオチドとして、すなわち、PBSに溶解させて投与した。
【０１３４】
[アロディニアの転換]
図16Aに、観察されたフォンフレイスコアリングの結果を要約する。陰性対照群の動物は、群分け後、12日の期間にわたり、約6から7gの間で安定化した平均フォンフレイスコア(逃避反射閾値(withdrawal threshold))を示した。「ASO 7」は、4日目以降、アロディニアを有意に転換した(スチューデントt検定)。たとえ治療活性がすべての処理群において同程度であったとしても、6pmole/kgの群は、最初の投与後2日目から治療活性を示し始めた。
【０１３５】
この特定の評価に陽性対照の対象薬は含まれていなかったが、30mg/kgのプレガバリンが経口投与されたラット(「L5/L6結紮」あり)において、10〜12gのフォンフレイスコアが当社評価によって頻繁に観察された。したがって、1〜6pmole/kgの「ASO 7」の有効性は、この特定の神経障害性疼痛モデルにおけるプレガバリン30mg/kgに匹敵するであろう。
【０１３６】
[実施例7]
脊髄神経障害を有するラットにおける「ASO 2」によるアロディニアの転換。
表1で明示した「ASO 2」は、[(5'→3') uuguguuuag┃GUACACUUUU]において「太字」及び「下線」でマークしたように、ヒトSCN9AプレmRNA内のイントロン3及びエクソン4の連結部にまたがる3'スプライス部位に完全に相補的な13量体 ASOである。「ASO 2」はイントロン3と5量体の重複を有し、エクソン4と8量体の重複を有する。「ASO 2」の標的配列は、ラットSCN9AプレmRNAに保存されている。
【０１３７】
「ASO 2」は、特記しない限り、「実施例6」に述べているように、「L5/L6結紮」によって誘発された脊髄神経障害を有するラットにおけるアロディニアを転換するその能力について評価した。
【０１３８】
[群分け及びASO処理]
オスSDラット(5週齢、Harlan Laboratories、Italy)は、-16日目にSNL手術を行った。0日目に、30匹のラットを選択し、陰性対照群(すなわち、ASO処理なし)と、20pmole/kg QD(すなわち、毎日1回)、100pmole/kg QD、500pmole/kg QD、及び100pmole/kg Q2D(すなわち、2日毎に1回)「ASO 2」の4つの処理群の5群へと割り当てた。(1群当たり動物6匹)。QD及びQ2Dの投与スケジュールに従って、0〜13日の間、「ASO 2」を動物に皮下投与した。ASOは、「裸の」オリゴヌクレオチドとして、すなわち、PBSに溶解して投与した。
【０１３９】
[アロディニアのスコアリング]
アロディニアは、「実施例5」に述べたように、フォンフレイ法に従って、0〜14日の間スコアリングした。7日目に、右足(非結紮側)をフォンフレイスコアリングに供した。
【０１４０】
[アロディニアの転換]
図16Bに、観察されたフォンフレイスコアリングの結果を要約する。陰性対照群の動物は、群分け後、14日の期間にわたり約6から8gの間で安定化した平均フォンフレイ閾値スコアを示した。
【０１４１】
結紮側の足の場合、100pmole/kg QD群を除き、20pmole/kg QD、100pmole/kg Q2D、及び500pmole/kg QDでASOを投与した動物において、アロディニアは、1日目及びそれ以降に有意に転換した(スチューデントt検定)。しかし、14日目に、アロディニアは100pmole/kg QDにおいても有意に転換した。
【０１４２】
非結紮側の足の場合、7日目のASO処理群のフォンフレイスコアは、陰性対照群のスコアよりも高かった。観察されたフォンフレイスコアは、15.3g(陰性対照)、17.6g(20pmole/kg QD)、19.2g(100pmole/kg QD)、20.1g(100pmole/kg Q2D)、及び19.5g(500pmole/kg QD)であった。しかし、ASO処理群と陰性対照群の間に有意差はなかった。
【０１４３】
[実施例8]
L5/L6脊髄神経結紮で活性化されたラットL5 DRG細胞における「ASO 7」によるナトリウム電流の阻害。
細胞のナトリウム電流は、通常、パッチクランプによって測定される。ナトリウムイオンが細胞に取り込まれる場合、細胞内のナトリウムイオンレベルが上昇する。細胞内のナトリウムレベルは、ナトリウムイオン感受性染料を使用して評価することができる。「CoroNa Green」は、クラウンエーテルタイプのナトリウムイオン特異的キレート剤を含む染料である。ナトリウムイオンのキレート化の際、「CoroNa Green」は緑色蛍光を発する。「CoroNa Green」は、細胞内のナトリウムレベルを間接的に測定するために使用されてきた。「CoroNa Green」によって測定されたナトリウムレベルは、ナトリウムイオンパッチクランプによって測定されたナトリウムイオン電流と非常に相関することが分かった。[Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol 106(38), 16145〜16150 (2009)]。
【０１４４】
「ASO 7」を、以下のように「CoroNa Green」を使用して、ラットDRG細胞のナトリウムイオン電流を下方制御するその能力について評価した。
【０１４５】
[DRGの抽出]
0日目に、オスSDラット(6週齢、Harlan Laboratories、Italy)を「実施例5」に述べたように「L5/L6結紮」に供した。ラットは、4週間の期間をかけて、フォンフレイスコアリングに散発的にかけた。31日目に、低フォンフレイスコアを示すラットを安楽死させ、左側(結紮側)及び右側(非結紮側)の両方のL5 DRGを抽出した。DRGは、抽出直後に0.5mL PBSに浸漬した。
【０１４６】
[L5 DRG神経細胞の調製]
DRG細胞は、文献[Methods Mol Biol. vol 846, 179〜187 (2012); PLoS One vol 8(4); e60558 (2013)]に開示されている手順に従って調製したが、以下に系列的に簡潔に述べる:(1) HBSS(ハンクス液、カタログ番号14025-092、Life Technologies)中に0.2mL 0.125%コラゲナーゼ(コラゲナーゼIV型、カタログ番号C5138-100MG、Sigma)を含む1.5mLのe-チューブにDRGを移し、鋏でできるだけ小片に切り刻み、5% CO2及び95% RHで、37℃のCO2インキュベーターにおいて20分インキュベートした;(2) 50μLの0.25%トリプシン/EDTAをe-チューブに加え、それをさらに10分間インキュベーター内で保持した;(3) e-チューブに1mLの完全DMEM培地を入れ、5分間600gでの遠心沈降にかけた;(4) 得られたペレットを、2X B-27(B-27(登録商標) Serum-Free Supplement、カタログ番号17504-044、Gibco)、1×ペニシリン-ストレプトマイシン、1×L-グルタミンを補充した、4mLのNeurobasal-A培地(Neurobasal(登録商標)培地、カタログ番号21103-049、Gibco)に懸濁し、細胞懸濁液1mLを、35mm培養皿内に置いたラミニン被覆カバーグラス(カタログ番号GG-25-1.5-laminin、Neuvitro)上に注意深く播種した;(5) 播種の1日後、皿に別の1mLの新鮮なNeurobasal-A培地を慎重に満たした;(6) 播種の2日後、DRG神経細胞以外の細胞の増殖を選択的に抑制するために、培地を、1μMのAra-C (シトシンβ-D-アラビノフラノシド、カタログ番号C1768-100MG、Sigma)を補充した2mLの新鮮なNeurobasal-A培地と交換した;(7) 播種の4日後、培地を、1μMのAra-Cを補充した2mLの新鮮なNeurobasal-A培地と再び交換した;(8) 播種の5日又は6日後、DRG神経細胞をASOで処理した。
【０１４７】
[ASO処理及びCoroNaアッセイ]
「L5/L6結紮」あり、又は「L5/L6結紮」なしのいずれかのL5 DRG神経細胞を、0(陰性対照)、100又は1,000zMの「ASO 7」で処理した。30時間後、細胞を2mLのHBSSで洗浄し、次いで、新鮮な2mLのHBSSを入れた。次いで、細胞を37℃で5μMの「CoroNa Green」(カタログ番号C36676、Life Technologies)で処理した。30分後、細胞を、2mLのHBSSで2回洗浄し、2mLの新鮮なHBSSを入れた。細胞の緑色蛍光画像を連続的に捕らえるためのCCDカメラを装備したオリンパス蛍光顕微鏡(Model BX53、Olympus)に培養皿を載せた。細胞を10mMのNaClで速やかに処理し、次いで、細胞の蛍光強度の変化を300秒間にわたりデジタル的に記録した。フレーム当たり、すなわちASO濃度当たり4〜5個の細胞であった。各個別細胞からの蛍光強度は、秒の解像力でトレースした。個別細胞からの細胞内蛍光強度のトレースは、ImageJプログラム(バージョン1.50i、NIH)を使用して平均化し、その平均トレースを、図13(A)及び図13(B)で、それぞれ、「L5/L6結紮」ありの細胞及び「L5/L6結紮」なしの細胞について提供する。平均蛍光強度トレースは、0(陰性対照)、100又は1,000zMの「ASO 7」で処理した細胞について、個々の細胞内ナトリウム濃度トレースとして得た。
【０１４８】
[CoroNaアッセイの結果]
「L5/L6結紮」で刺激したDRG神経細胞において[図17Aを参照]、100zM又は1aMの「ASO 7」による処理は、平均細胞蛍光強度を顕著に阻害した。例えば、150秒の時点で、平均細胞蛍光強度(すなわちナトリウム電流)は、ASOで処理した細胞において80〜85%減少した。
【０１４９】
「L5/L6結紮」なしのDRG神経細胞において[図17Bを参照]、1aMの「ASO 7」による処理は、平均細胞蛍光強度の減少を誘導した。しかし、観察された減少は150秒の時点で約50%であり、「L5/L6結紮」で刺激された細胞におけるほど顕著ではなかった。さらに、100zMの「ASO 7」による処理は、「L5/L6刺激」なしの神経細胞においてナトリウム電流を阻害することはなかった。
【０１５０】
神経障害性刺激のないDRG神経細胞は、Nav1.7、Nav1.8、Nav1.2などを含むVGSCの様々なサブタイプを発現することが知られている。Nav1.7サブタイプは、刺激のないDRG神経細胞において全ナトリウム電流への限定型寄与を示す。[Nat Comm. vol 3, Article Number 791: DOI:10.1038/ncomms1795 (2012)]。「L5/L6結紮」なしのラットDRG神経細胞は、神経障害のないそのようなDRG神経細胞をシミュレートすることができる。「L5/L6結紮」なしのDRG細胞において観察されたナトリウム電流の阻害は、Nav1.7サブタイプからのナトリウム電流の寄与のみを反映し得る。
【０１５１】
一方、神経細胞は、持続性神経障害に応答してNav1.7発現を上方制御することが知られている。[J Biol Chem. vol 279(28), 29341〜29350 (2004); J Neurosci. vol 28(26), 6652〜6658 (2008)]。「L5/L6結紮」を有するラットDRG神経細胞は、神経障害を有するDRG神経細胞をシミュレートすることができる。100zM及び1aMの両方の「ASO 7」は、「L5/L6結紮」によって刺激された神経細胞において80〜85%ナトリウム電流を阻害した。「L5/L6結紮」を有するDRG細胞における「ASO 7」によるナトリウム電流の強い阻害は、慢性神経障害による神経細胞におけるNav1.7の上方制御と一致している。
【０１５２】
「L5/L6結紮」有無のラットDRG神経細胞において観察された知見をまとめると、「ASO 7」は、Nav1.7サブタイプの発現を選択的に阻害すると結論付けられる。「ASO 7」は、神経障害を有する神経細胞において、神経障害のないそれらの細胞よりもNav1.7発現をより強く阻害するように思われる。
【０１５３】
[実施例9]
DPNPを有するラットにおける「ASO 1」によるアロディニアの転換。
表1で明示した「ASO 1」は、[(5'→3') uuguguuuag┃GUACACUUUUACUGG]の25量体 SCN9AプレmRNA配列において「太字」及び「下線」でマークした、ヒトSCN9AプレmRNA内のイントロン3及びエクソン4の連結部にまたがる3'スプライス部位に完全に相補的な16量体 ASOである。「ASO 1」はイントロン3との5量体重複を有し、エクソン4との11量体重複を有する。「ASO 1」は、ラットSCN9AプレmRNAに完全に相補的である。
【０１５４】
「ASO 1」を、ラットにおいて糖尿病性末梢神経障害性疼痛(DPNP)によって誘発されたアロディニアを転換させるその能力について評価した。
【０１５５】
[DPNPの誘発及び群分け]
0日目に、クエン酸塩緩衝液(pH6)に溶解したストレプトゾトシンを、約200g体重のオスSDラットに60mg/kgで腹腔内投与し、I型糖尿病を誘発させた。[J. Ethnopharmacol. vol 72(1-2), 69〜76 (2000)]。10日目に、DPNPを有するラットを、陰性対照(ビヒクル単独、PBS)及び100pmole/kgの「ASO 1」の2群に、下記で述べるフォンフレイ・マイクロフィラメントを使用して10日目に個々の動物のフォンフレイスコアに基づき、無作為に割り当てた。(1群当たりN=8)。
【０１５６】
[アップ&ダウン法によるフォンフレイスコアリング]
アロディニアは、「アップ&ダウン」法に従って、1セットのフォンフレイ・マイクロフィラメント(Touch Test(登録商標))でスコアリングした。[J Neurosci. Methods vol 53(1), 55〜63 (1994)]。
【０１５７】
[ASO投与及びアロディニアスコアリング]
「ASO 1」をPBSに溶解し、11、13、15、17及び19日目に、ラットに皮下投与した。アロディニアを、11、13、15、17及び19日目に、さらに21及び23日目に、投与後2時間スコアリングし、最終投与後の治療活性の期間を評価した。
【０１５８】
[アロディニアの転換]
図18Aに、観察されたフォンフレイスコアリングの結果を要約する。陰性対照群の動物は、10〜23日の期間にわたり6〜7gの間で安定化した平均フォンフレイ閾値を示した。100pmole/kgの「ASO 1」を投与された動物において、アロディニアは、最初の投与の2時間後、すなわち11日目に約80%有意に転換した(スチューデントt検定)。ASOが19日目まで繰り返し投与されるにつれて、治療活性は、わずかに、しかし徐々に約90%まで増加した。最終投与の2日後に、すなわち21日目に治療活性が完全にウォッシュアウトされたとすると、「ASO 1」は、2日に1回の投与スケジュール、すなわちQ2Dをサポートするのに十分な長い薬力学的半減期を有していない可能性がある。
【０１５９】
しかしながら、11日目のフォンフレイスコアによって判断した場合、「ASO 1」は、アロディニアの転換において数時間の発症時間を示した。
【０１６０】
[実施例10]
DPNPを有するラットにおける「ASO 2」及び「ASO 6」によるアロディニアの転換。
「ASO 6」は[(5'→3') uuguguuuag┃GUACACUUUUACUGG]の25量体 SCN9AプレmRNA配列において「太字」及び「下線」でマークした、ヒトSCN9AプレmRNA内のイントロン3及びエクソン4の連結部にまたがる3'スプライス部位の13量体配列に相補的に結合する13量体 ASOである。「ASO 6」はイントロン3と5量体重複を有し、エクソン4と8量体重複を有する。「ASO 2」及び「ASO 6」はヒトSCN9AプレmRNA内の同一配列を標的とするが、「ASO 6」は「ASO 2」より相補的RNAに対して高い親和性を有すると考えられる。
【０１６１】
特記しない限り、「ASO 2」及び「ASO 6」を、「実施例9」で述べたように、ラットにおいてDPNPによって誘発されたアロディニアを転換させるそれらの能力について評価した。
【０１６２】
糖尿病は、-10日目に60mg/kgのストレプトゾトシンを腹腔内注射することによってオスSDラット(6週齢、Harlan Laboratories、Italy)において誘発させた。0日目に、最も低いフォンフレイスコアを示す18匹の動物を選択し、陰性対照(ビヒクル単独、PBS)、60pmole/kg「ASO 2」及び30pmole/kg「ASO 6」の3群に割り当てた。(1群当たりN=6)。0、2及び4日目に、ラットにビヒクル又はPBSに溶解したASOを皮下投与した。アロディニアは、「実施例5」に述べたように、エレクトロニック・フォンフレイ法によってスコアリングした。
【０１６３】
[アロディニアの転換]
図18Bに、観察されたフォンフレイスコアを要約する。陰性対照群の動物は、0〜9日の期間にわたり、約10〜12gで安定化した平均フォンフレイ閾値を示した。
【０１６４】
60pmole/kgの「ASO 2」を投与した動物において、アロディニアは、0日目の最初の投与の4日後に、糖尿病性神経障害なくベースライン値(すなわち、自社の過去の閾値による全快レベル)に徐々に転換した。治療活性は、4日目の最終投与後さらに3日間、有意に持続した(スチューデントt検定)。
【０１６５】
30pmole/kgの「ASO 6」を投与した動物において、治療活性は2日目に有意に上昇し(スチューデントt検定)、4日目の最終投与後さらに4日間持続した。したがって、「ASO 6」は、「ASO 2」よりもアロディニアを強く転換させた。「実施例9」における「ASO 1」と異なり、「ASO 6」は、ラットにおいて週2回の投与スケジュールをサポートするのに十分な長い治療活性の期間を示した。
【０１６６】
[雑件]
糖尿病が続いたので、陰性対照群の動物は、フォンフレイスコアリング中に身体的衰弱の徴候を示した。処理群の動物はフォンフレイ負荷にはっきりと反応したが、それはASOの治療活性と一致している。
【０１６７】
[実施例11]
ラットホルマリン試験における「ASO 7」の鎮痛活性。
20μLの2%ホルマリン足底内注射によって誘発された疼痛は、SCN9A KOマウス全体において顕著に減少した。阻害の程度は、フェーズI(ホルマリン注射後0〜10分)、及びフェーズII(ホルマリン注射後15〜45分)について、それぞれ73%及び86%であった。[PLoS One vol 9(9), e105895 (Sep 2014)]。
【０１６８】
「ASO 7」はラットSCN9AプレmRNAの5'末端に単一ミスマッチを有しており、以下のようにラットホルマリン試験におけるその鎮痛活性について評価した。
【０１６９】
[群分け及びASO処理]
-6日目に、24匹のオスSDラット(6週齢、Harlan Laboratories、Italy)を、陰性対照(ASO処理なし)と、10、30及び100pmole/kgの3つの「ASO 7」処理群の4群に無作為に割り当てた。(1群当たりN=6)。動物の各群に、0(陰性対照)、10、30又は100pmole/kgの「ASO 7」を-6及び-2日目に皮下投与した。「ASO 7」は注射用のPBSで希釈した。
【０１７０】
[ホルマリン試験]
0日目に、急性疼痛を、左後足に50μLの5%ホルマリンを足底内注射することによって誘発した。ホルマリン注射直後、各ラットをホルマリン注射後1時間、個別のビデオ録画に供した。ビデオを再生し、苦痛を与えた各動物について疼痛反応を視覚的にスコアリングした。
【０１７１】
[鎮痛活性]
図19Aに、ホルマリン注射後の様々な時点での群毎に観察された疼痛スコアを要約する。フェーズIIの疼痛反応(10〜40分のAUC)は、10、30及び100pmole/kgの処理群においてそれぞれ33%、36%及び32%有意に減少した(*スチューデントt検定によりp<0.05)。一方、フェーズIの疼痛反応(0〜10分間のAUC)は、10、30及び100pmole/kgの処理群において、それぞれ、統計的有意差なしで14%、40%及び43%減少した。
【０１７２】
[実施例12]
ラットホルマリン試験における「ASO 10」の鎮痛活性。
表1に明示した「ASO 10」は、[(5'→3') uugu"g"uuuag┃GUACACUUUUACUGG]の25量体 SCN9AプレmRNA配列において「太字」及び「下線」でマークした、標的プレmRNA配列の5'末端に単一ミスマッチを有するヒトSCN9AプレmRNAに部分的に相補的な14量体 SCN9A ASOであり、ここで、イントロン3内の単一ミスマッチは引用符("")でマークしている。一方、「ASO 10」は、[(5'→3') uuuccuuuag┃GUACACUUUU]の20量体ラットSCN9AプレmRNA配列において「太字」及び「下線」でマークした、ラットSCN9AプレmRNA内のイントロン3及びエクソン4の連結部にまたがる3'スプライス部位に完全に相補的である。「ASO 10」はイントロン3と6量体重複を有し、エクソン4と8量体重複を有する。
【０１７３】
特記しない限り、「ASO 10」を、「実施例11」に述べたように、ラットホルマリン試験におけるその鎮痛活性について評価した。
【０１７４】
[群分け及びASO処理]
36匹のオスSDラット(7週齢、Harlan Laboratories、Italy)を、陰性対照(ASO処理なし)と、15、50及び150pmole/kgの3つの「ASO 10」処理群の4群に無作為に割り当てた。(1群当たりN=9)。各群の動物に、0(陰性対照)、15、50又は150pmole/kgの「ASO 10」を-6及び-2日目に皮下投与した。ASOはPBSに溶解して投与した。
【０１７５】
[鎮痛活性]
図19Bに、様々な時点での群毎に観察された疼痛スコアを要約する。フェーズIIの疼痛反応(10〜40分のAUC)は、15及び50pmole/kgの処理群においてそれぞれ17%及び41%有意に減少した(スチューデントt検定)。一方、フェーズIの疼痛反応(0〜10分間のAUC)は、15及び50pmole/kgの処理群において、それぞれ、38%及び50%有意に減少した。
【０１７６】
興味深いことには、150pmole/kg群は、フェーズI及びフェーズIIの両方において治療活性を示さなかった。150pmole/kgの「ASO 10」は、「ASO 10」でのエクソンスキッピング中に蓄積された「エクソンイントロン環状RNA(EIciRNA)」による転写上方制御を誘導する過剰投与であろう。[Nature Struc. Mol. Biol. vol 22(3), 256〜264 (2015)]。
【０１７７】
[実施例13]
足底内ホルマリン注射で苦痛を与えたラットにおける「ASO 7」によるL5 DRGでのNav1.7発現の阻害。
「ASO 7」を、以下のようにホルマリンの足底内注射で苦痛を与えたオスSDラットのL5 DRGでのNav1.7の発現を阻害するその能力について、IHC(免疫組織化学)により評価した。
【０１７８】
[ASO処理及びホルマリン注射]
-5日目に、オスSDラット(6週齢、Harlan Laboratories、Italy)を、陰性対照(ASO処理なし)と、1、6及び30pmole/kgの3つの「ASO 7」処理群の4群に無作為に割り当てた。動物の各群に、-5及び-1日目に、0(陰性対照)、1、6又は30pmole/kgの「ASO 7」を皮下投与した。「ASO 7」はPBSで希釈し、注射に使用した。0日目に、すべての動物に、50μLの5%ホルマリンを単回足底内注射で投与した。
【０１７９】
[L5 DRGの抽出及びNav1.7 IHC]
8日目に、ラットにゾレチル/ロンプンで麻酔し、ホルマリン注射した側のL5 DRGのサンプリングを行った。(1群当たりN=2)。DRG試料を、下記で簡単に説明したようにNav1.7 IHCに供した。
【０１８０】
DRG試料を凍結切片化し、1:500希釈の一次抗Nav1.7抗体(カタログ番号ASC-008、Alomone)で、1:200希釈の二次抗IgG(カタログ番号BA-1100、Vector)で、次いで赤色螢光標識用の1:200希釈のDylight 594-ストレプトアビジン(steptavidin)(カタログ番号SA-5594、Vector、CA、USA)で連続して免疫染色を実施した。IHC画像は、DRGにおけるNav1.7発現についてZeissスライドスキャナーで捕らえた。
【０１８１】
[L5 DRGにおけるNav1.7発現の阻害]
図20Aに、群毎の代表的なNav1.7 IHC画像のセットを提供する。DRGにおけるNav1.7発現は、ASO処理群における発現と比較して、陰性対照群において顕著に高かった。
【０１８２】
それぞれの個別のIHC画像中の赤色レベルは、NIH ImageJプログラムを使用してデジタルでスコアリングし、個々のレベルに対し群毎に統計分析を行った。(1群当たりN=2)。図20Bに、群毎にデジタル定量したNav1.7発現レベルを要約する。Nav1.7発現レベルは、すべてのASO処理群において約50〜60%有意に減少した(スチューデントt検定)。
【０１８３】
[実施例14]
「ASO 10」による脊髄神経障害を有するラットにおけるアロディニアの転換(1)。
特記しない限り、「ASO 10」を、「実施例6」で述べたように、「L5/L6結紮」によって誘発された脊髄神経障害を有するラットにおけるアロディニアを転換するその能力について評価した。
【０１８４】
[群分け]
-14日目に、オスSDラット(5週齢、Harlan Laboratories、Italy)に「L5/L6結紮」を行った。0日目に、36匹の動物を0日目のそれらの個別のフォンフレイスコアに基づいて選択し、陰性対照群(すなわち、ASO処理なし)と、1、3及び10pmole/kgの3つのASO処理群の4群に割り当てた。(1群当たりN=9)。
【０１８５】
[ASO処理及びフォンフレイスコアリング]
0、3及び7日目に、ラットに0(陰性対照)、3及び10pmole/kgの「ASO 10」を午後に皮下投与した。1pmole/kgの処理群において、用量は最初0日目に1pmole/kgであり、次いで、2及び3日目に1pmole/kgで治療活性がなかったため、3及び7日目に30pmole/kgに増やした。
【０１８６】
[アロディニアの転換]
図21Aに、観察されたフォンフレイスコアを要約する。陰性対照群の動物は、群分け後9日の期間にわたり約6〜7gの間で安定化した平均フォンフレイスコア(逃避反射閾値)を示した。
【０１８７】
アロディニアは、3〜30pmole/kgの「ASO 10」による投与によって、1週間にわたり徐々にかつ有意に転換した。治療活性は、すべての処理群において約13gのフォンフレイスコアで横ばいになった。
【０１８８】
しかし、1pmole/kg群においては、用量を3日目に1pmole/kgから30pmole/kgに増やした後、治療活性は増加し始めた。「L5/L6」結紮なしのフォンフレイスコアとして約18gの履歴バックグラウンド閾値が得られた場合、アロディニアは、用量を30pmole/kgに増やした後、6日目に約40%有意に転換した。鎮痛効果は、8日目に約60%に増加した。
【０１８９】
3pmole/kg群において、アロディニアは、適度な(約40〜50%)効果で6日目に有意に転換した(スチューデントt検定)。治療効果は、8日目に65+%に増加した。
【０１９０】
10pmole/kg群において、アロディニアは、約25〜30%の効果で4日目に有意に転換した。治療効果は、9日目に約60%に増加した。しかし、効果は6日目から停滞したままであった。
【０１９１】
[実施例15]
「ASO 10」による脊髄神経障害を有するラットにおけるアロディニアの転換(2)。
特記しない限り、「ASO 10」を、「実施例6」で述べたように、「L5/L6結紮」によって誘発された脊髄神経障害を有するラットにおけるアロディニアを転換するその能力について評価した。
【０１９２】
[群分け]
-10日目に、オスSDラット(6週齢、Harlan Laboratories、Italy)に「L5/L6結紮」を行った。0日目に、36匹の動物を0日目のそれらの個々のフォンフレイスコアに基づいて選択し、陰性対照群(すなわち、ASO処理なし)、100pmole/kgを4日又は5日毎に1回の2つのASO処理群、及びプレガバリン30mg/kgの陽性対照群の4群に無作為に割り当てた。(1群当たりN=9)
【０１９３】
[ASO処理及びフォンフレイスコアリング]
0日目に0(陰性対照)、100pmole/kg、並びに0及び5日目に4及び100pmole/kgの「ASO 10」を、ラットに午後皮下投与した。アロディニアを毎日午前中にスコアリングした。陽性対照群のラットには、フォンフレイスコアリングの1時間前にプレガバリン30mg/kgを経口投与した。ASOは、PBSに溶解させて投与した。
【０１９４】
[アロディニアの転換]
図21Bに、観察されたフォンフレイスコアを要約する。陰性対照群の動物は、最初のASO処理後7日間にわたり約6〜7gの間で安定化した平均フォンフレイスコア(逃避反射閾値)を示した。プレガバリン30mg/kg群のラットは、約10〜11gの平均フォンフレイスコアを示したが、7日目に観察されたスコアは鎮静のため約13gであった。
【０１９５】
4日毎に1回のASO処理群において、アロディニアは、3、6及び7日目のすべての試験の場合において有意に転換し(スチューデントt検定)、3日目及び6日目のプレガバリン30mg/kgよりも有意に優れていた。したがって、ラットにおいて4日毎に1回の投与頻度は、プレガバリン30mpkよりも優れている治療活性の維持に適切であると思われる。アロディニアは、8日目に、自社の履歴バックグラウンドに対して脊髄神経障害を伴わずに基礎レベルの約90%まで転換したことに留意されたい。
【０１９６】
5日毎に1回のASO処理群において、アロディニアは、3、6及び7日目のすべての試験の場合において有意に転換し(スチューデントt検定)、3日目だけがプレガバリン30mg/kgよりも有意に優れていた。したがって、5日毎に1回の投与頻度は、プレガバリン30mg/kgよりも有意に優れた治療活性を保証するのには長すぎると思われる。
【０１９７】
[脊髄におけるNav1.7の発現]
7日目に、動物にゾレチル/ロンプンで麻酔をかけ、脊髄の構造的完全性を保持するためにホルマリンを補充したPBSで潅流し、脊髄のサンプリングに供した。(1群当たりN=3)。脊髄試料をパラフィンブロックに加工し、Nav1.7抗体(カタログ番号ASC-008、Alomone)を用いるNav1.7発現(赤色染色)について、及びNeu抗体(カタログ番号Ab104224、Abcam)を用いる神経細胞体(緑色染色)について、連続してIHCを行った。核はDAPI(青色)で染色した。
【０１９８】
図22に、Zeissスライドスキャナーで捕らえたIHC画像を示す。Nav1.7発現レベルは、0及び4日目に投与するASO処理群の脊髄試料において、陰性対照群の脊髄試料における発現レベルと比較して著しく減少した。したがって、ASOは脊髄に分配されやすく、皮下投与時に脊髄においてNav1.7の発現を阻害したと思われる。
【０１９９】
[実施例16]
「ASO 10」によるラットDRG神経細胞におけるNav1.7発現の阻害。
「ASO 10」を、下記で述べるように、ラットL5 DRG神経細胞においてNav1.7の発現を阻害するその能力について評価した。
【０２００】
[L5 DRG神経細胞の調製]
オスSDラット(7週齢、Harlan Laboratories, Italy)に、「実施例5」で述べたようなきつい「L5/L6結紮」を行った。7日後、4匹のラットに、結紮側のL5 DRGを抽出するため、ゾレチル/ロンプンで麻酔をかけた。DRGをプールし、「実施例8」で述べたようにDRG神経細胞を調製するために処理した。
【０２０１】
[ASO処理]
DRG神経細胞を、24時間、0(陰性対照)、10、100又は1,000zMの「ASO 10」で処理し、次いで、Nav1.7タンパク質のC末端をプローブするNav1.7抗体(カタログ番号ab85015、Abcam)に対するウエスタンブロットのため溶解させた。β-アクチンを参照のためプローブした。「ASO 10」ストック溶液をDDWに溶解し、培地に分注した。
【０２０２】
[Nav1.7発現の阻害]
図23Aは、0(陰性対照)、10、100又は1,000zMの「ASO 10」で処理したDRG神経細胞で得られたウエスタンブロットデータを示す。すべての溶解産物は170〜200Kで強いバンドを生じたが、それはNav1.7タンパク質の代謝産物である。完全長Nav1.7タンパク質のバンドは、陰性対照及び10zMの「ASO 10」の溶解産物を用いた場合にのみ220〜240Kで検出された。したがって、Nav1.7発現は、100〜1,000zMの「ASO 10」で24時間インキュベーションした後、ラットDRG神経細胞において完全に阻害された。
【０２０３】
「ASO 10」はラットSCN9AプレmRNAに完全に相補的な14量体 ASOであり、一方、「ASO 7」はヒトSCN9AプレmRNAに完全に相補的な14量体 ASOである。ラット神経細胞における「ASO 10」で得られたSCN9A阻害プロファイルは、ヒト神経細胞における「ASO 7」のSCN9A阻害のプロファイルを予想し推定することができる。
【０２０４】
[実施例17]
ワンステップPCRによって合成したcDNAによる「ASO 10」で処理したラットDRG神経細胞におけるSCN9A mRNAに対するqPCR
「ASO 10」を、下記で述べるように、ラットDRG細胞においてラットSCN9A mRNAレベルの変化を誘導するその能力について、SCN9AネスティッドqPCRにより評価した。
【０２０５】
[L5 DRG神経細胞の調製]
オスSDラット(6週齢、Harlan Laboratories、Italy)にゾレチル/ロンプンで麻酔をかけ、L5 DRGを抽出した。L5 DRG試料は「実施例8」で述べたように処理し、L5 DRG神経細胞を調製した。
【０２０６】
[ASO処理]
ラットL5 DRG神経細胞を、0(陰性対照)、10、30、100又は300zMの「ASO 10」で処理した。(各ASO濃度につき培養皿1枚)。「ASO 10」ストック溶液をDDWに溶解し、培地に分注した。
【０２０７】
[ワンステップPCRによるRNA抽出及びcDNA合成]
24時間「ASO 10」とインキュベーションした後、全RNAを、「ユニバーサルRNA抽出キット」(カタログ番号9767、Takara)を使用し、メーカーの説明書に従い、細胞から抽出した。200ngのRNA鋳型を、以下のサイクル条件: 50℃30分及び94℃2分、その後94℃で30秒、55℃で30秒、及び72℃で2分の15サイクルに従って、[エクソン2_フォワード: (5'→3') CAATCTTCCG-TTTCAACGCC、及びエクソン10_リバース: (5'→3') ACCACAGCCAGGATCAAGTT]の1セットのエクソン特異的プライマーに対してOne Step RT-PCRキット(Invitrogen、USA)を使用する25μL逆転写反応に供した。
【０２０８】
[ネスティッドqPCR増幅]
cDNA溶液(ASO濃度につき2連)を100倍希釈し、希釈した各cDNA溶液の1μLを、以下のサイクル条件:95℃で30秒、続いて95℃で5秒及び60℃で30秒を40サイクルに従って、SCN9AプレmRNA内のエクソン3及びエクソン4の連結部を標的とするTaqManプローブ(カタログ番号Rn01514993_mH、ThermoFisher)を用いる20μLリアルタイムPCR反応に供した。
【０２０９】
図23Bの左側の図に観察されたqPCRデータを要約するが、この場合、完全長のSCN9A mRNAレベルは、「ASO 10」で処理した細胞において約50〜60%有意に減少した(スチューデントt検定)。
【０２１０】
[実施例18]
ランダムヘキサマーを用いるcDNA合成による「ASO 10」で処理したラットDRG神経細胞におけるSCN9A mRNAに対するqPCR。
「ASO 10」を、ラットL5 DRG神経細胞におけるSCN9A mRNAの発現を阻害するその能力について、SCN9A qPCRにより評価した。全RNAを「実施例17」で述べたように調製し、ランダムヘキサマーを使用してcDNA合成に供した。cDNA溶液(ASO濃度につき2連)を100倍希釈し、希釈した各PCR産物の1μLを、以下のサイクル条件:95℃で30秒、続いて95℃で5秒及び60℃で30秒を40サイクルに従って、SCN9Aエクソン3及びエクソン4の連結部を標的とするTaqManプローブを用いる20μLリアルタイムPCR反応に供した。
【０２１１】
またcDNA溶液をGAPDH mRNAのqPCR増幅に供した。SCN9A mRNAのCt値をGAPDH mRNAのCt値に対して標準化した。
【０２１２】
図23Bの右側の図は、GAPDHに対して標準化したSCN9A qPCRデータを示す。完全長のSCN9A mRNA発現レベルは、「ASO 10」で処理した細胞において約45〜75%有意に減少した(スチューデントt検定)。
【０２１３】
[実施例19]
「ASO 10」によるL5 DRG神経細胞におけるナトリウム電流の阻害(1)。
「ASO 10」を、以下のように、ラットL5 DRG神経細胞におけるナトリウム電流を阻害するその能力について評価した。
【０２１４】
[DRG神経細胞の調製]
オスSDラット(5週齢、Daehan Biolink、South Korea、www.dbl.co.kr)を、「実施例5」で述べたように、きつい「L5/L6結紮」に供した。結紮後の10〜14日目に、結紮側のL5 DRGを抽出するため、ラットをゾレチル/ロンプンで麻酔した。L5 DRG神経細胞は、下記で述べるように調製した。
【０２１５】
(1) HBSS(ハンクス平衡化塩溶液、カタログ番号14025-092、Life Technologies)中に0.2mL 0.125%コラゲナーゼ(コラゲナーゼIV型、カタログ番号C5138-100MG、Sigma)を含有する1.5mLのe-チューブに、ラットから急性的に抽出したL5 DRGを移し、鋏でできるだけ小片に切り刻み、5% CO2及び95% RHで、37℃のCO2インキュベーターにおいて20分インキュベートした;(2) 50μLの0.25%トリプシン/EDTAをe-チューブに加え、それをさらに10分間インキュベーター内で保持した;(3) e-チューブに1mLの完全DMEM培地を入れ、5分間600gの遠心沈降にかけた;(4) 次いで、得られたペレットを懸濁させ、約15mLのNeurobasal-A培地を含む15mLファルコンチューブに密封して移送した;(5) 約1時間の移送後、0.5mLの細胞懸濁液を24ウェルプレート培養皿のウェルに入れたラミニン被覆カバーガラス上に慎重に播種した。(6) 培養皿を2時間37℃のCO2インキュベーター内でインキュベートし、カバーガラス上に細胞を付着させた。
【０２１６】
[ASO処理]
上記のように調製したL5 DRG神経細胞を0(陰性対照)、10、30、又は100zMの「ASO 10」で処理し、4時間インキュベーター内で保持した。ASOストック溶液は、0.1%(v/v)のTween80を補充したDDWで調製した。ストック溶液(陰性対照についてはビヒクルのみを含む)を、パッチクランプアッセイ用の0.0001%(v/v) Tween80を含むように、それぞれ培地に分注した。
【０２１７】
[手動パッチクランプアッセイ]
次いで、DRG神経細胞を、ナトリウムパッチクランプ装置(Axopatch 200B Amplifier、Axon Instruments)で、ナトリウム電流手動パッチクランプアッセイにかけた。パッチクランプアッセイは、通常4時間かかった。したがって、細胞は、4〜8時間(すなわち平均約6時間)、ASOで処理されたと考えられる。
【０２１８】
[データのプール及び分析]
ASO用量当たりの統計力を高めるため、上記の実験を数回の独立した機会にわたり繰り返した。TTX感受性細胞からのナトリウム電流データのみ、統計分析用のプールに含めた。
【０２１９】
図23Cに、DRG神経細胞の細胞サイズに対して標準化した、プールされたナトリウム電流データを要約する。ナトリウム電流は、ASO濃度が10zMから100zMへと上昇するにつれて徐々に減少した。ナトリウム電流は、平均約6時間、100zMの「ASO 10」で処理した細胞において約40%有意に減少した。DRG神経細胞がNav1.7だけでなく電位依存性ナトリウムチャネルの他のサブタイプも発現するとすれば、100zMの「ASO 10」でナトリウム電流の約40%が減少したことが観察されたことは、「ASO 10」によるNav1.7ノックダウンがマークされたものと理解されよう。
【０２２０】
[実施例20]
「ASO 10」によるL5 DRG神経細胞におけるナトリウム電流の阻害(2)。
多くの供給業者から得たラットの自社での評価は、L5 DRGにおけるNav1.7発現レベルが年齢及び供給業者で非常に異なることを示している。「ASO 10」を、特記しない限り、「実施例19」で述べたように、異なる供給元のラットL5 DRG神経細胞においてナトリウム電流を阻害するその能力について評価した。
【０２２１】
[DRG神経細胞の調製]
オスSDラット(5週齢、Harlan Laboratories/Envigo、Denmark)を、「実施例5」で述べたように、きつい「L5/L6結紮」に供した。結紮後10〜14日目に、結紮側のL5 DRGを抽出するため、ラットにゾレチル/ロンプンで麻酔をかけた。L5 DRG神経細胞は、下記で述べるように調製した。
【０２２２】
[ASO処理]
上記のように調製したL5 DRG神経細胞を0(陰性対照)又は100zMの「ASO 10」で処理し、4時間インキュベーター内で保持した。ASOストック溶液は、DDWで調製した。
【０２２３】
細胞サイズに対して標準化したナトリウム電流は、平均約6時間100zMの「ASO 10」で処理した細胞において、約55%有意に(p<0.05)減少した。(陰性対照についてはN=14;及び100zMの「ASO 10」についてはN=15)。陰性対照の標準化したナトリウム電流は、「実施例19」の場合よりもこの実施例の場合37%高かった。したがって、DRG神経細胞におけるナトリウム電流に対するNav1.7の寄与は、「実施例19」のDaehan Biolinkからのラットの場合よりも、この実施例のHarlan Laboratoriesからのラットにおいてかなり高いはずである。
【０２２４】
[実施例21]
脊髄神経障害を有するラットにおける「ASO 7」によるアロディニアの転換。(2)
「ASO 7」を、特記しない限り、「実施例6」で述べたように、「L5/L6結紮」によって誘発された脊髄神経障害を有するラットにおけるアロディニアを転換するその能力について評価した。
【０２２５】
[SNL手術及び群分け]
-10日目に、オスSDラット(5週齢、Daehan Biolink、South Korea、www.dbl.co.kr)を「L5/L6結紮」に供した。0日目に、48匹の動物を0日目の最も低い個々のフォンフレイスコアに基づいて選択し、陰性対照群(すなわち、ASO処理なし)、プレガバリン30mg/kg、及び5、25、125及び625fmole/kgの「ASO 7」の4つの処理群の6群へ無作為に割り当てた。(1群当たり動物8匹)。
【０２２６】
[ASO処理及びフォンフレイスコアリング]
ラットに、0、3、6及び9日目の午後に0(陰性対照)、1、3又は6pmole/kgの「ASO 7」を皮下投与した。アロディニアは、午前中、「実施例5」で述べたエレクトロニックフォンフレイスコアリング法によってスコアリングした。プレガバリンは、各フォンフレットスコアリングの機会の1時間前に経口投与した。ASOは、0.1%のTween80を補充したPBSに溶解させて投与した。
【０２２７】
[アロディニアの転換]
図24Aに、観察されたフォンフレイスコアリングの結果を要約する。陰性対照群の動物は、4〜8日にわたって約6gで安定化した平均フォンフレイスコア(逃避反射閾値)を示した。一方、プレガバリン30mg/kgの群(すなわち陽性対照群)は、約10gで安定化した平均フォンフレイスコアを示した。約21gの平均フォンフレイスコアがナイーブ動物(すなわち結紮及び処置なし)で観察されたとすれば、アロディニアは、プレガバリン処理群において2、4及び6日目に20〜30%有意に転換された。
【０２２８】
「ASO 7」は、2〜8日目に5fmole/kg、2、4及び6日目に25及び125fmole/kg、及び4及び6日目に625fmole/kgでアロディニアを有意に転換した(スチューデントt検定)。ASO処理群の間に有意差はなかったが、活性が最も高い群は5fmole/kg群であった。またプレガバリンも、2〜8日の間にアロディニアを20〜30%有意に転換した。活性が最も高い群は5fmole/kg群であり、たとえASO処理群の間に有意差がなかったとしても、アロディニアの約40%の転換を示した。しかし、処理群の有効性は、プレガバリン群の有効性とは有意に相違していなかった。
【０２２９】
[実施例22]
ラットにおける亜慢性炎症性疼痛に対する「ASO 2」の鎮痛活性。
「ASO 2」を、下記で述べるように、フロインド完全アジュバント(FCA)の足底内注射で苦痛を与えたラットにおける亜慢性炎症性疼痛を阻害するその能力について評価した。
【０２３０】
[亜慢性炎症の誘発]
-17日目に、オスSDラット(7週齢)に、100μLのFCA(カタログ番号F5881-6X10ML、Sigma)を左後足で足底内注射により投与した。
【０２３１】
[炎症性疼痛のスコアリング及び群分け]
左後足の炎症性疼痛は、電子式Randall-Selitto装置[モデル2390、IITC Life sciences]を使用して、Randall-Selitto試験によってスコアリングした。ラットは、疼痛スコアリングの前に、10分間ハンモックで順応させた。(1群当たりN=5)。
【０２３２】
0日目に、数日間にわたり安定して最も低い痛覚閾値スコアを示す10匹の動物を群分けのため選択した。10匹の動物を、陰性対照群(ASO処理なし)、及び処理群(「ASO 2」100pmole/kg)の2群に割り当てた。
【０２３３】
[ASO処理及び疼痛評価]
処理群動物は、0日目の午後、及び1日目の午前に、100pmole/kgの「ASO 2」の投与を受けた。ASOをPBSに溶解し、皮下投与した。疼痛は、1日目に、及び4日目の午前に、投与2時間後に評価した。
【０２３４】
[鎮痛活性]
図24Bに、観察した疼痛スコアを要約する。1日目のASO処理群の痛覚閾値は、0日目の値と比較して約27gに増加したが、陰性対照群の閾値は約3gに減少した。足浮腫誘発前の痛覚閾値は、約23gであった。したがって、ASO投与は、足浮腫のないレベルまで炎症性疼痛を完全に転換した。しかし、「ASO 2」の鎮痛活性は、4日目に完全にウォッシュアウトされた。
【図１Ａ】
2020506686.tif 000016
【図１Ｂ】
2020506686.tif 000017
【図１Ｃ】
2020506686.tif 000018
【図２Ａ】
2020506686.tif 000019
【図２Ｂ】
2020506686.tif 000020
【図２Ｃ】
2020506686.tif 000021
【図３Ａ】
2020506686.tif 000022
【図３Ｂ】
2020506686.tif 000023
【図３Ｃ】
2020506686.tif 000024
【図４Ａ】
2020506686.tif 000025
【図４Ｂ】
2020506686.tif 000026
【図４Ｃ】
2020506686.tif 000027
【図５Ａ】
2020506686.tif 000028
【図５Ｂ】
2020506686.tif 000029
【図５Ｃ】
2020506686.tif 000030
【図５Ｄ】
2020506686.tif 000031
【図５Ｅ】
2020506686.tif 000032
【図６】
2020506686.tif 000033
【図７】
2020506686.tif 000034
【図８】
2020506686.tif 000035
【図９】
2020506686.tif 000036
【図１０】
2020506686.tif 000037
【図１１】
2020506686.tif 000038
【図１２Ａ】
2020506686.tif 000039
【図１２Ｂ】
2020506686.tif 000040
【図１３】
2020506686.tif 000041
【図１４Ａ】
2020506686.tif 000042
【図１４Ｂ】
2020506686.tif 000043
【図１４Ｃ】
2020506686.tif 000044
【図１５Ａ】
2020506686.tif 000045
【図１５Ｂ】
2020506686.tif 000046
【図１６Ａ】
2020506686.tif 000047
【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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