(57)【要約】  本発明は、同じＴＮＦＲの２つの異なる部分に対する複数の結合部分を含む、新しいクラスのＴＮＦＲアゴニストに関する。本発明は、本発明によるＴＮＦＲアゴニストの投与を介して患者の免疫系成分を活性化する方法、ならびにさらなる治療および他の目的でのこのような物質の使用にも関する。【選択図】図１７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＮＦＲアゴニストの少なくとも２つの異なる部分に特異的な結合部分を含む、ＴＮＦＲアゴニスト。
【請求項２】
前記ＴＮＦＲがＴ細胞応答の共刺激に関わる、請求項１に記載のＴＮＦＲアゴニスト。
【請求項３】
前記ＴＮＦＲがＣＤ２７、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＨＶＥＭ、ＣＤ３０およびＧＩＴＲを含む群から選択される、請求項１または２に記載のＴＮＦＲアゴニスト。
【請求項４】
前記結合部分が前記ＴＮＦＲに同時に結合し得る、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＴＮＦＲアゴニスト。
【請求項５】
前記アゴニストにより結合される前記ＴＮＦＲの各部分に対する少なくとも２つの結合部分を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＴＮＦＲアゴニスト。
【請求項６】
前記結合部分が、抗体、ＤＡＲＰｉｎ、フィノマー、アフィマー、可変リンパ球受容体、アンチカリン、ナノフィチン、可変新抗原受容体（ＶＮＡＲ）およびこれらの誘導体、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆａｂ′−ＳＨ、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆ（ａｂ′）２、ｓｃＦｖ、Ｆｃａｂ、二重特異性一本鎖Ｆｖ二量体、ダイアボディ、トリアボディを含む群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載のＴＮＦＲアゴニスト。
【請求項７】
前記ＴＮＦＲの同じ部分に結合する前記少なくとも２つの結合部分が、前記アゴニストの同じペプチド末端に配置される、請求項５または６に記載のＴＮＦＲアゴニスト。
【請求項８】
前記結合部分が、前記ＴＮＦＲの異なるシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）に結合する、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＴＮＦＲアゴニスト。
【請求項９】
ＯＸ４０をアゴナイズし、ＯＸ４０のＣＲＤ  １およびＣＲＤ  ３またはＣＲＤ  １およびＣＲＤ  ４中のエピトープに結合する、請求項１〜８のいずれか一項に記載のＴＮＦＲアゴニスト。
【請求項１０】
少なくとも１つのＯＸ４０結合部分が配列番号２、３、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９を含む群、またはこれらと少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有する単離ポリペプチドから選択される、請求項９に記載のＴＮＦＲアゴニスト。
【請求項１１】
配列番号４５および１６またはこれらと少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有する単離ポリペプチドによりコードされるＯＸ４０アゴニスト。
【請求項１２】
薬剤としての請求項１〜１１のいずれか一項に記載のアゴニストの使用。
【請求項１３】
ヒト免疫系成分を活性化する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のアゴニストの使用。
【請求項１４】
薬剤としての請求項１〜１１のいずれか一項に記載のＯＸ４０アゴニストの使用。
【請求項１５】
別の薬剤との組み合わせでの請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）の少なくとも２つの異なる部分に対する複数の結合部分を含む、新しいクラスの腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーアゴニストに関する。本発明は、本発明によるＴＮＦＲアゴニストの投与を介して患者の免疫系成分を活性化する方法、ならびに治療および他の目的でのこのような物質の使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫療法は、成功すると、患者が原発腫瘍だけでなく転移性病変も根絶する長期抗腫瘍免疫応答を有し、防御的抗腫瘍記憶免疫応答の確立につながり得るので、抗癌治療法の開発における革新の重要な焦点となっている。研究者らは、これらの受容体の抗体媒介アンタゴニズムを介して抗腫瘍Ｔ細胞応答のインビボ阻害を除去する、ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１などのチェックポイント阻害因子を相殺する治療法に焦点を当て、大きな成功を収めた。しかし、１つ以上のチェックポイント阻害因子の作用を除去するのでは、大部分の患者において腫瘍退縮を促進するのに十分でないことが次第に明らかになってきた。確固とした治療免疫応答をもたらすには、阻害経路を除去するだけでなく、刺激経路を活性化することが必要とされる。
【０００３】
腫瘍内でのチェックポイント阻害因子の存在は、抗腫瘍免疫応答を抑制するＴ細胞機能を阻害し得る。ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１などのチェックポイント阻害因子は、Ｔ細胞増殖およびサイトカイン産生を減衰する。ＣＤ８  Ｔ細胞応答も、Ｔ細胞受容体の活性化および共刺激を必要とし、これは、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）および４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）を含む腫瘍壊死因子受容体ファミリーメンバーのライゲーションから得られ得る。活性化（アゴニスト）抗ＯＸ４０ｍＡｂでの処置が、Ｔ細胞の分化および細胞傷害性機能を促進し、様々な腫瘍に対する抗腫瘍免疫の増強につながるとして、ＯＸ４０は特に関心を集めている。これらの薬物は、単剤として用いられた場合、転移性疾患を有する患者において強力な臨床および免疫応答を誘導し得る。しかし、これらの剤は各々、一部の患者にのみ有益であり、これは免疫系のより多くの経路／成分を介して作用するより有効な組み合わせ治療戦略が大いに必要とされていることを強調している。
【０００４】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）／腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーのメンバーは、免疫系の恒常性維持に大いに関与する。免疫系の生物学的機能は、炎症における有益で保護的な作用および宿主防御、ならびに器官形成における重要な役割を包含する。
【０００５】
ＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーを以下の表１に列挙する。
【０００６】
【表１】
2020504105.tif 000003
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【０００７】
ＯＸ４０（ＣＤ１３４；ＴＮＦＲＳＦ４）は、ＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーであり、コンカバナリンＡでの刺激後に胸腺およびリンパ節からのラットＣＤ４  Ｔ細胞により主として発現される受容体として当初は特徴付けられた。その後の研究で、マウスとヒトの両方において、ＯＸ４０が抗原特異的プライミング中にＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞により発現され、ＯＸ４０発現が、ＴＣＲ／ＣＤ３架橋後に、ならびにＩＬ−１、ＩＬ−２およびＴＮＦ−αを含む炎症性サイトカインの存在により誘導されることが実証された。抗原遭遇後のＯＸ４０の発現は、ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞のいずれに対しても主として一過性（２４〜７２時間）であり、ＣＤ８  Ｔ細胞によるＯＸ４０発現の期間は、ＣＤ４  Ｔ細胞のものより短いことが報告された。活性化シグナルの不在化では、比較的少ない成熟Ｔ細胞サブセットが生物学的に適切なレベルでＯＸ４０を発現することが分かった。しかし、濾胞性ヘルパーＣＤ４  Ｔ細胞（Ｔｆｈ）によるＯＸ４０の構成的発現がマウスとヒトの両方で示された。胚中心内で、Ｔｆｈ細胞のＣＤ４＋／ＣＸＣＲ５＋／ＣＣＲ７−亜集団は最高レベルのＯＸ４０発現を有することが分かり、抗体産生の重要なレギュレーターであると考えられる。マウスにおいて、ＯＸ４０はまた、その発現が誘導性であるヒトＴｒｅｇ細胞と対照的に、ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）に構成的に発現する。対照的に、抗原特異的活性化は、分化したＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞の様々なサブセットによりＯＸ４０発現を誘導し得る。マウスモデル系（ＯＴ−ＩＩ）において、Ｔｈ１およびＴｈ１７細胞はいずれも、ペプチド活性化に応答してＯＸ４０の同様に堅牢な誘導が可能であった。ヒトにおいて、かなりの割合の腫瘍浸潤性ＣＤ４  Ｔ細胞が、おそらく腫瘍抗原の認識によりＯＸ４０を発現し、ＯＸ４０＋ＣＤ４  Ｔ細胞の頻度は、患者の転帰に対して予後的であり得る。同様に活性化周辺ＣＤ８  Ｔ細胞も、マウスおよびヒトにおいてＯＸ４０を発現することが分かった。
【０００８】
その天然のリガンド（ＯＸ４０Ｌ）またはアゴニスト抗体のいずれかを用いた、ＣＤ８および従来の（非制御性）ＣＤ４  Ｔ細胞でのＯＸ４０のライゲーションは、これらの生存および増殖を促進する。この証拠はＯＸ４０およびＯＸ４０Ｌ欠損マウスを用いた研究に由来し、これはいくつかの最近の報告において詳細に考察されている。これらの研究から、ＯＸ４０またはＯＸ４０Ｌノックアウトマウスにおいて、抗原チャレンジ後の記憶応答不全と合わせて、ＣＤ４とＣＤ８  Ｔ細胞の両方の増殖が低減されたことが実証され、これは、Ｔ細胞の増殖を制御するのに内因性ＯＸ４０発現が重要であることを示している。さらに、野生型動物におけるＴＣＲ刺激と共にアゴニスト抗ＯＸ４０モノクローナル抗体（ｍＡｂ）での処置は、ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞の増殖、分化および生存率の増加を誘導した。同様に、ＣＤ８またはＣＤ４  Ｔ細胞の枯渇は、いくつかの腫瘍モデルにおいて腫瘍退縮を誘導する抗ＯＸ４０ｍＡｂの能力を排除した。ある研究から、抗ＯＸ４０投与が、自己抗原に対するＣＤ８  Ｔ細胞寛容を克服し、これらの細胞毒性活性を回復するのに十分であることが実証され、これはＯＸ４０アゴニストの治療可能性を強調している。腫瘍に対するＴ細胞寛容は、治療方法の主な障害であるため、これは、癌患者に特に重要である。
【０００９】
別のグループにより、ＣＤ４０−／−マウスでは、抗ＯＸ４０ｍＡｂ後に、流入領域リンパ節に移動するＣＤ１１ｃ＋樹状細胞が顕著に少ないため、抗ＯＸ４０処置後の増強ＣＤ８  Ｔ細胞機能は、エフェクターＴ細胞でのＣＤ４０Ｌ発現の誘導により媒介され、それによりＤＣ成熟が促進されることが実証された。実際、抗ＯＸ４０ｍＡｂで処置したＣＤ４０−／−マウスは、生存率６０％の野生型マウスとは対照的に、その腫瘍のためすべて死亡し、これはＯＸ４０刺激後のＣＤ４０発現の重要性を示唆している。総合すると、これらのデータは、ＯＸ４０シグナル伝達の外的操作は、停滞したＴ細胞応答をブーストし得ることを示唆している。何人かの研究者は、ＯＸ４０がＴ細胞の生存を促進するメカニズムを決定する研究を行った。活性化後、ＯＸ４０欠損ＣＤ４  Ｔ細胞が抗アポトーシスタンパク質Ｂｃｌ−ｘＬおよびＢｃｌ−２の発現を維持できないことが実証された。さらに、活性化ＣＤ４  Ｔ細胞の生存は、Ｂｃｌ−ｘＬまたはＢｃｌ−２のレトロウイルス形質導入により救済された。Ｂｃｌ−ｘＬの持続発現も、ＯＸ４０共刺激後の腫瘍反応性ＣＤ８  Ｔ細胞の生存に必要であった。その後の研究から、Ｔ細胞のＯＸ４０シグナル伝達がサバイビンの発現を誘導し、これは、Ｔ細胞分裂を経時的に制御および維持するのに必要とされることが実証された。サバイビン発現は、ＯＸ４０シグナル伝達によるＰＩ３ＫおよびＰＫＢの持続活性を介して維持された。しかし、サバイビン発現は、Ｔ細胞アポトーシスを阻害するためのＯＸ４０シグナル伝達後のＢｃｌ−ｘＬおよびＢｃｌ−２の要件に取って代わるものではない。サバイビンおよびＢｃｌ−２ファミリーメンバーの増強された発現は、ＯＸ４０シグナル伝達後のＩκＢキナーゼおよびＮＦ−κＢ１の活性化を介して媒介される。他の研究者らは、ＣＤ４  Ｔ細胞における優性阻害ＴＲＡＦ２の発現が、その増殖、生存およびサイトカイン産生を阻害するため、ＴＲＡＦ２が、抗原特異的ＣＤ４  Ｔ細胞におけるＯＸ４０シグナル伝達後に必要とされることを示した。抗原および抗ＯＸ４０ｍＡｂでＴ細胞をプライミングした際のＣＴＬＡ−４の遮断が、優性阻害ＴＲＡＦ２タンパク質を発現するマウスにおける増殖不全を部分的に修復するため、ＴＲＡＦ２の機能の一つは、ＯＸ４０を介したＴ細胞共刺激後のＣＴＬＡ−４発現を防止することと思われる。同じＴＲＡＦアダプターおよびＮＦ−κＢ経路が、ＣＤ２７およびＧＩＴＲなどの他のＴＮＦＲファミリーメンバーによるリガンド結合後にＴ細胞において活性化されるかどうかは不明なままである。
【００１０】
ＯＸ４０およびＣＤ２７などのＴＮＦＲファミリーメンバーとＣＤ２８およびＢ７ファミリーなどの免疫グロブリンスーパーファミリーメンバーの両方を含む、Ｔ細胞共刺激受容体により活性化されたシグナル伝達経路における類似性および相違性は、他でも広く総説されている。両方の共刺激受容体スーパーファミリーによる複数の経路の活性化は、細胞増殖およびエフェクター機能を増強し、生存を改善する。多くの研究者が現在、様々な臨床応用および免疫療法のためにこれらの受容体の調節について試験している。前臨床試験から、抗ＯＸ４０ｍＡｂとＯＸ４０Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質の両方を含む、ＯＸ４０アゴニストでの担腫瘍宿主の処置は、いくつかの前臨床モデルにおいて腫瘍退縮につながることが実証された。最近の研究では、これらのアゴニストが機能するメカニズムが調査された。エフェクターＴ細胞の増殖を促進することに加えて、ＯＸ４０はＴｒｅｇ細胞に構成的に発現するため、ＯＸ４０アゴニストは、Ｔｒｅｇ細胞を直接制御する能力を有する。これらのアゴニストがＴｒｅｇ細胞応答を促進するのか、または低下させるのかについて相反する報告が存在する。一部では、抗ＯＸ４０ｍＡｂが、インビボでＴｒｅｇ細胞の抑制機能を遮断することが観察され、一方ではＴｒｅｇ細胞の増殖が観察された。これらの研究は、抗ＯＸ４０が、刺激の状況およびサイトカイン環境に応じて、Ｔｒｅｇ細胞をどちらの方向に向かわせることもできることを示唆している。実際に、免疫を制御する上でのＯＸ４０の共刺激経路の重要性は、ＯＸ４０Ｌの構成的発現を伴うマウスにおける自己免疫様疾患の存在により例証される。ＯＸ４０シグナル伝達はまた、ＩＬ−１０の産生およびＴｒｅｇ細胞の抑制機能を阻害することが分かった。これらのデータは、腫瘍生着前の抗ＯＸ４０ｍＡｂの投与が、ＩＬ−１０産生を阻害し、ＣＤ８  Ｔ細胞応答のＴｒｅｇ細胞媒介性抑制を排除することにより、Ｔｒｅｇ細胞を機能的に不活性化したことにより支持される。ある最近の報告では、活性化ＦｃγＲを発現する細胞が、腫瘍からのＴｒｅｇ細胞の選択的枯渇に必要とされ、抗ＯＸ４０療法の５日後、流入領域リンパ節のＴｒｅｇ細胞に変化がないことが認められた。他の研究から、抗ＯＸ４０処置後の遅い時点でも、流入領域リンパ節においてＴｒｅｇ細胞の頻度に変化がなく、この作用は腫瘍に局所化され得ることが確認される。実際に、別の報告では、７日目に、同じＣＴ２６結腸癌モデルを用いた対照処置マウスと抗ＯＸ４０処置マウスとの間で腫瘍におけるＴｒｅｇ細胞頻度に差がなかったことが示されたため、この作用は一過性であり得る。この研究はまた、特に、抗ＯＸ４０療法の免疫学的作用が、調査した腫瘍モデルにより様々であり得、したがってＯＸ４０アゴニストの正確なメカニズムに関して一般化するのには注意が必要であることも示唆している。他の研究では、抗ＯＸ４０ｍＡｂが、インビトロおよびインビボでＴｒｅｇ細胞の抑制活性を低下させることが報告されている。抗ＯＸ４０がＴｒｅｇ細胞の抑制、欠質またはこれらの両方を介して機能するかどうかにかかわらず、これらのアゴニストでの処置により、Ｔｒｅｇ細胞により媒介される阻害作用が低減され、それにより、長期間��腫瘍免疫応答を維持するのに必要な抗腫瘍ＣＤ  ８Ｔ細胞応答が促進されるべきである。複数のメカニズムが、ＯＸ４０アゴニストの抗腫瘍活性に重要であり得る。
【００１１】
ヒト免疫系の複雑性および可塑性、ならびに治癒的免疫応答の誘導を回避するために腫瘍細胞により意図的に破壊されている癌患者の免疫系に対処することのさらなる複雑性を考慮すると、様々な免疫系の受容体／細胞集団を調節する併用療法は、前臨床患者と入院患者の両方でますます提案および実証されつつある。例えば、当分野の研究者により、同時投与ではＰＤ−１アンタゴニスト抗体およびＯＸ４０アゴニスト抗体の順番設定が重大な影響を及ぼし、ＯＸ４０アゴニストの作用を無効にすることが示された（Ｓｈｒｉｍａｌｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ；５（９）；１−１２）およびＭｅｓｓｅｎｈｉｅｍｅｒら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１７年１０月１５日；２３（２０）：６１６５−６１７７）。
【００１２】
この複雑性はまた、免疫腫瘍学の分野がさらに発展し、免疫調節剤を用いて治療免疫応答を誘導するのに最適な方法の理解が深まるにつれて、可能な限り広範な当該標的に対する薬理学的活性物質を製造することが必須となるであろうことを意味し、ＴＮＦＲは、おそらく最も重要なクラスの免疫腫瘍標的を表し、薬理学的活性アゴニストの製造が困難であることがこれまでに証明されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、ＴＮＦＲの少なくとも２つの異なる部分に対する結合部分を含むＴＮＦＲアゴニストに関する。
【００１４】
本発明者らは、驚くべきことに、ＴＮＦＲの少なくとも２つの異なる部分またはエピトープに結合する結合部分を含むアゴニストが、同じアゴニストに含まれない場合ならびにＴＮＦＲの天然のリガンドおよびＴＮＦＲの他の既に公知のアゴニストと比較した場合の結合部分の作用より良好なアゴニズムレベルを示すことを発見した。
【００１５】
本発明によれば、ＴＮＦＲは、表１に示す群またはＴＮＦＲスーパーファミリーの任意の他のメンバーから選択される。
【００１６】
好ましくは、ＴＮＦＲはＴ細胞応答の共刺激に関与する。
【００１７】
好ましくは、ＴＮＦＲは、ＣＤ２７、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＨＶＥＭ、ＣＤ３０およびＧＩＴＲを含む群から選択され、最も好ましくはＯＸ４０である。
【００１８】
本発明によれば、用語「ＴＮＦ受容体の２つの異なる部分」は、各結合部分の一つにより同時に結合され得るＴＮＦＲの２つの部分を意味するものとし、これは、結合部分が同じＴＮＦＲに同時に結合し得るか、または２つの同一のＴＮＦＲに同時に結合することによりこれらの間を架橋し得ることを意味する。
【００１９】
特に、本発明は、抗体、ＤＡＲＰｉｎ、フィノマー、アフィマー、可変リンパ球受容体、アンチカリン、ナノフィチン、可変新抗原受容体（ＶＮＡＲ）などであるが、これらに限定されないタンパク質ベースの標的特異的結合分子からの結合部分に関する。
【００２０】
特に、ＴＮＦＲは、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆａｂ′−ＳＨ、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆ（ａｂ′）２、ｓｃＦｖ、Ｆｃａｂ、二重特異性一本鎖Ｆｖ二量体、ダイアボディ、トリアボディなどの抗体から得られるか、またはこれらに由来する結合部分を含む。好ましい実施形態において、アゴニストは、Ｆａｂ、ＳｃＦｖおよびｄＡｂから得られるか、またはこれらに由来する結合部分を含む。
【００２１】
本発明の別の態様によれば、アゴニストに含まれる結合部分は、異なるタイプのものであり、好ましい実施形態は、同じアゴニストにおいてＦａｂとｓｃＦｖまたはＦａｂとｄＡｂの結合部分を組み合わせる。
【００２２】
Ｆａｂ結合部分をｓｃＦｖ、ｄＡｂ、ｓｃＦａｂなどの他のタイプの結合部分に転換し、同様にこのような結合部分をＦａｂに相互互換的に転換する方法が知られている。
【００２３】
特に、結合部分は、同じまたは異なる抗体Ｆｃを含む足場またはその一部に遺伝子融合され得る。本発明のこの態様によれば、ＩｇＧなどの第１の全長抗体は、本発明によるアゴニストの基礎を形成し得、結合部分の第２のセットは、本発明に従って出発抗体にグラフト化され得る。
【００２４】
あるいは、結合部分は、フィノマーで用いられるようなＦｙｎのＳＨ３ドメインに基づくもの、およびアフィマーで用いられるヒトプロテアーゼ阻害剤ステフィンＡに基づくものなど免疫グロブリンのＦｃ由来のもの以外の足場に遺伝子融合され得る。
【００２５】
本発明によれば、ＴＮＦＲの異なる部分に結合する結合部分は、ＴＮＦＲアゴニスト内に含まれる足場のＣおよびＮ末端に各々配置される。
【００２６】
本発明の別の態様によれば、結合部分は、ＣまたはＮ末端のいずれかに配置され、連結される。
【００２７】
好ましくは、ＴＮＦＲの同じ部分に結合する結合部分は、アゴニストの同じ末端に配置される。本発明によれば、ＴＮＦＲの第１の部分に対する結合部分は、ＣまたはＮ末端に配置され、ＴＮＦＲの第２の部分に対する結合部分は反対側の末端に配置される。本発明者らは、標的ＴＮＦＲの同じ部分に対する結合部分が、アゴニストの同じ末端に優先的に配置されるべきであることを見出した。
【００２８】
本発明の別の態様によれば、結合部分は、アプタマーなどのヌクレオチドベースであり得る。
【００２９】
好ましくは、アゴニストは２つ超の結合部分を含む。
【００３０】
より好ましくは、アゴニストは４つ以上の結合部分を含む。
【００３１】
好ましくは、アゴニストは、ＴＮＦＲの同じ部分／エピトープに結合する少なくとも２つの結合部分を含む。
【００３２】
最も好ましくは、アゴニストは、２つの同一の結合部分を少なくとも２セット含む。本発明者らは、アゴニストのいずれかの末端に配置される、ＴＮＦＲの各部分／エピトープに対する２つの結合部分を含むＴＮＦＲアゴニストは、一貫して高レベルのアゴニズムを示すことを見出した。
【００３３】
特に、本発明者らは、アゴニストが、同じＴＮＦＲの異なるシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）に結合する結合部分を含み、これは、アゴニストがＴＮＦＲの様々なシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）からの膜近位および膜遠位結合部分を含むことを意味していることを見出した。
【００３４】
好ましくは、アゴニストは、膜近位および遠位エピトープに結合する。
【００３５】
本発明のさらなる態様によれば、ＯＸ４０の２つの異なる部分／エピトープに対する複数のＯＸ４０結合部分を含む、ＯＸ４０受容体（ＯＸ４０）アゴニストに関する。
【００３６】
本発明によれば、ＯＸ４０アゴニストは、ＯＸ４０のシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）１およびＣＲＤ  ３のエピトープに結合する。あるいは、ＯＸ４０アゴニストはＣＲＤ  １およびＣＲＤ  ４に結合する。
【００３７】
本発明のさらなる態様によれば、ＯＸ４０結合部分は、配列番号２、３、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９を含む群から選択される配列、またはこれらと少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有する単離ポリペプチドから選択される。本発明は、本明細書および配列リストに含まれる他のＯＸ４０結合部分のいずれかを含む構築物にも関する。
【００３８】
本発明の好ましい実施形態によれば、ＯＸ４０アゴニストは、配列番号４５および１６またはこれらと少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有する単離ポリペプチドによりコードされる。
【００３９】
本発明は、本発明によるＯＸ４０アゴニストの投与を介して患者の免疫系成分を活性化する方法にも関する。
【００４０】
本発明は、薬剤としての本発明によるＯＸ４０アゴニストの使用にも関する。
【００４１】
本発明は、癌、免疫疾患または患者の免疫系の活性化により特徴付けられるか、またはこれにより悪化する他の疾患の治療のための薬剤としての本発明によるＯＸ４０アゴニストの使用にも関する。
【００４２】
本発明は、有効量のＯＸ４０アゴニストを患者に投与することを含む、癌に罹患している患者を治療する方法にも関する。
【００４３】
本発明は、有効量のＯＸ４０アゴニストおよび１つ以上の他の剤、例えば、患者の免疫系をさらに調節する小分子もしくは生物学的医薬品を患者に投与することを含む、癌に罹患している患者を治療する方法にも関する。このような剤の例としては、抗ＰＤ−１抗体および抗腫瘍小分子、例えば、マルチキナーゼ阻害剤が挙げられる。
【００４４】
さらに、本発明は、本発明によるＯＸ４０アゴニストおよび別の薬剤の患者への共投与であって、他の薬剤が相乗または相加効果を有する、前記共投与に関する。
【００４５】
本発明のさらなる態様によれば、複数のＣＤ４０結合部分を含むＣＤ４０受容体（ＣＤ４０）アゴニストに関する。
【００４６】
好ましくは、アゴニストは２つ超の結合部分を含む。
【００４７】
より好ましくは、アゴニストは４つの結合部分を含む。
【００４８】
好ましくは、アゴニストは少なくとも２つの同一の結合部分を含む。
【００４９】
好ましくは、アゴニストは２つの同一の結合部分を少なくとも２セット含む。
【００５０】
あるいは、アゴニストは、同じエピトープに結合する４つの結合部分を含む。
【００５１】
本発明は、本発明によるＣＤ４０アゴニストの投与を介して患者の免疫系成分を活性化する方法にも関する。
【００５２】
薬剤としての本発明によるＣＤ４０アゴニストの使用
【００５３】
本発明の別の態様によれば、ＴＮＦＲアゴニストは、同じＴＮＦＲの２つの異なる部分を認識し、これらに結合する２つのモノクローナル抗体を含み、それを必要とする患者に共投与され得る。
【００５４】
さらに本発明は、本発明のＴＮＦＲアゴニストおよび別の薬剤の患者への共投与であって、他の薬剤が相乗または相加効果を有する、前記共投与に関する。
【００５５】
薬剤の非排他的リストは、Ｔ細胞リダイレクト多重特異性抗体、チェックポイント阻害剤、免疫調節剤を含む。
【００５６】
本発明はさらなる治療上のおよび他の使用のためのこのような物質の使用にも関する。
【００５７】
他に定義しない限り、本発明と関連して用いられる科学および技術用語は、当業者に一般に理解されている意味を有するものとする。さらに、文脈により他に必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。一般に、本明細書に記載する細胞および組織培養、分子生物学、ならびにタンパク質およびオリゴまたはポリヌクレオチド化学およびハイブリダイゼーションの技術に関連して利用される命名法は、当技術分野において周知であり、一般に用いられるものである。標準的な技術は、組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織培養および形質転換（例えば、電気穿孔法、リポフェクション）に用いられる。酵素反応および精製技術は、製造業者の仕様書に従って、または当技術分野で一般に行われるように、もしくは本明細書に記載されるように行われる。前述の技術および手順は一般に、当技術分野で周知の従来法に従って、本明細書を通じて引用および考察される様々な全般的およびより具体的な参考文献に記載されているように行われる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９））参照。本明細書に記載する分析化学、合成有機化学、ならびに医薬品および薬剤化学の実験手順および技術に関連して利用される命名法は、当技術分野で周知であり、一般に用いられるものである。標準的な技術は、化学合成、化学分析、薬剤調製、配合および送達、ならびに患者の治療のために用いられる。
【００５８】
基本抗体構造単位は、四量体を含むことが知られている。各四量体は、ポリペプチド鎖の２つの同一の対からなり、各対は、１本の「軽」鎖（約２５ｋＤａ）、および１本の「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、抗原認識を主に担う約１００〜１１０以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能を主に担う定常領域を定義する。一般に、ヒトから得られる抗体分子は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＤクラスのいずれかに関連し、これは、分子に存在する重鎖の性質により互いに異なる。あるクラスはＩｇＧ１、ＩｇＧ２などのサブクラス（アイソタイプとしても知られる）を同様に有する。さらに、ヒトにおいて、軽鎖は、カッパ鎖またはラムダ鎖であり得る。
【００５９】
本明細書で使用する用語「モノクローナル抗体」（ＭＡｂ）または「モノクローナル抗体組成物」は、特有の軽鎖遺伝子産物および特有の重鎖遺伝子産物からなる抗体分子のただ１つの分子種を含有する抗体分子の集団を指す。特に、モノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、集団のすべての分子において同一である。ＭＡｂは、それに対する特有の結合親和性により特徴付けられる抗原の特定のエピトープと免疫反応可能な抗原結合部位を含有する。
【００６０】
用語「抗原結合部位」または「結合部分」は、抗原結合に参加する免疫グロブリン分子の一部分を指す。抗原結合部位は、重（「Ｈ」）鎖および軽（「Ｌ」）鎖のＮ末端可変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基により形成される。「超可変領域」と称される、重鎖および軽鎖のＶ領域内の３つの高度に分岐するストレッチは、「フレームワーク領域」または「ＦＲ」として公知のより保存的なフランキングストレッチ間に挿入されている。したがって、用語「ＦＲ」は、免疫グロブリンの超可変領域の間およびこれに隣接して天然に見出されるアミノ酸配列を指す。抗体分子において、軽鎖の３つの超可変領域および重鎖の３つの超可変領域は、３次元空間で互いに対して配置され、抗原結合表面を形成する。抗原結合表面は、結合抗原の３次元表面に相補的であり、重鎖および軽鎖各々の３つの超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」と称される。各ドメインに対するアミノ酸の帰属は、Ｋａｂａｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９８７および１９９１））、またはＣｈｏｔｈｉａ  ＆  Ｌｅｓｋ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）、Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８−８８３（１９８９）の定義による。
【００６１】
本開示の融合タンパク質の単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）断片部分は、本明細書の標的化ポリペプチドとして本明細書で互換的に称される。
【００６２】
本明細書で使用する用語「エピトープ」は、免疫グロブリンもしくはこれらの断片またはＴ細胞受容体に／これらにより特異的に結合することが可能な任意のタンパク質決定基を含む。用語「エピトープ」は、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体に／これらにより特異的に結合することが可能な任意のタンパク質決定基を含む。エピトープ決定基は通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面グルーピングからなり、通常特定の三次元構造特性、および特定の荷電特性を有する。抗体は、解離定数が≦１ｍＭ、例えば、いくつかの実施形態において、≦１μＭ、例えば、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭまたは≦１ｎＭである場合、抗原に特異的に結合すると言われている。
【００６３】
本明細書で使用する用語「免疫学的結合」および「免疫学的結合特性」は、免疫グロブリン分子と免疫グロブリンが特異的である抗原との間で生じるタイプの非共有相互作用を指す。免疫学的結合相互作用の強度または親和性は、相互作用の解離定数（Ｋｄ）で表わされ得、Ｋｄが小さければ小さいほど、親和性が強い。選択されたポリペプチドの免疫学的結合特性は、当技術分野で周知の方法を用いて定量され得る。一つのこのような方法は、抗原−結合部位／抗原複合体形成および解離の速度を測定することを必要とし、これらの速度は、複合体パートナーの濃度、相互作用の親和性、および両方向の速度に同等に影響を及ぼす幾何学的パラメータに依存する。したがって、「オンレート定数」（ｋｏｎ）および「オフレート定数」（ｋｏｆｆ）はいずれも濃度、ならびに会合および解離の実際の速度の計算により決定され得る（Ｎａｔｕｒｅ  ３６１：１８６−８７（１９９３）参照）。ｋｏｆｆ／ｋｏｎの比は、親和性に関連しないすべてのパラメータの相殺を可能にし、解離定数Ｋｄに等しい（全般的にＤａｖｉｅｓら（１９９０）Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ５９：４３９−４７３参照）。平衡結合定数（Ｋｄ）が、放射性リガンド結合アッセイ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、フローサイトメトリー結合アッセイまたは当業者に公知の同様のアッセイなどのアッセイにより測定されたように、≦１ｍＭ、いくつかの実施形態において≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭまたは≦１００ｐＭ〜約１ｐＭである場合、本開示の抗体は抗原に特異的に結合すると言われている。
【００６４】
用語「単離タンパク質」は、本明細書において、ｃＤＮＡ、組換えＲＮＡまたは合成起源もしくはいくつかのこれらの組み合わせのタンパク質を意味し、その起源、または派生源により、「単離タンパク質」は（１）天然に見出されないタンパク質と会合しない、（２）同じ源の他のタンパク質を含まない、例えば、海洋タンパク質を含まない、（３）異なる種の細胞により発現される、または（４）天然に存在しない。
【００６５】
用語「ポリペプチド」は、天然タンパク質、ポリペプチド配列の断片またはアナログを指す一般用語として本明細書で用いられる。したがって、天然タンパク質断片およびアナログは、ポリペプチド属の種である。
【００６６】
本明細書で用いられ、物体に対して適用される用語「天然に存在する」は、物体が天然に見出され得るという事実を指す。例えば、天然の供給源から単離され得、実験室で人間によりまたは別の方法で意図的に改変されていない生命体（ウイルスを含む）に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然に存在する。
【００６７】
用語「配列同一性」は、２つのポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列が、比較ウィンドウにわたって（すなわち、ヌクレオチド対ヌクレオチドまたは残基対残基基準で）同一であることを意味する。用語「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウィンドウにわたって２つの最適にアライメントされた配列を比較し、両方の配列において、同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、ＵまたはＩ）または残基が存在する位置の数を決定し、一致した位置の数を得て、一致した位置の数を比較ウィンドウにおける位置の総数（すなわち、ウィンドウの大きさ）で割り、結果に１００を掛けて、配列同一性のパーセンテージを得ることにより計算される。本明細書で使用する用語「実質的同一性」は、ポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列の特徴を示し、ポリヌクレオチドまたはアミノ酸は、少なくとも１８個のヌクレオチド（６個のアミノ酸）位置の比較ウィンドウにわたって、しばしば少なくとも２４〜４８個のヌクレオチド（８〜１６個のアミノ酸）位置のウィンドウにわたって参照配列と比較して、少なくとも８５％の配列同一性、例えば、少なくとも９０〜９５％の配列同一性、より通常は少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含み、配列同一性のパーセンテージは、比較ウィンドウにわたって、参照配列の合計２０％またはそれ以下である欠失または付加を含み得る配列と対照配列を比較することにより計算される。参照配列は大きな配列のサブセットであり得る。
【００６８】
本明細書で用いられるように、２０個の従来型アミノ酸およびこれらの略語は、従来の使用法に従う。Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（第２版、Ｅ．Ｓ．ＧｏｌｕｂおよびＤ．Ｒ．Ｇｒｅｎ編、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ７  Ｍａｓｓ．（１９９１））参照。２０個の従来型アミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）、非従来型アミノ酸、例えば、α−，α−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸および他の非従来型アミノ酸も、本開示のポリペプチドの好適な成分であり得る。非従来型アミノ酸の例としては、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、σ−Ｎ−メチルアルギニン、および他の類似のアミノ酸およびイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）が挙げられる。本明細書で使用するポリペプチド表記において、標準的な使用法および慣習に従って、左側方向はアミノ末端方向であり、右側方向はカルボキシ末端方向である。
【００６９】
同様に、そうでないと特定されない限り、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左側末端は、５′末端であり、２本鎖ポリヌクレオチド配列の左側方向は５′方向と称される。新生ＲＮＡ転写物の５′から３′付加の方向は転写方向と称され、ＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖上にあり、ＲＮＡ転写物の５′末端に対して５′となる配列領域は「上流配列」と称され、ＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖上にあり、ＲＮＡ転写物の３′末端に対して３′となる配列領域は「下流配列」と称される。
【００７０】
ポリペプチドに適用する用語「実質的同一性」は、２つのペプチド配列が、デフォルトギャップ重量を用いて、例えば、プログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴにより最適にアライメントされる場合、少なくとも８０％の配列同一性、例えば、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を共有することを意味する。
【００７１】
いくつかの実施形態において、同一でない残基の位置は、保存的アミノ酸置換により異なる。
【００７２】
保存的アミノ酸置換は、類似の側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群はグリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンであり；脂肪族−ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群はセリンおよびスレオニンであり：アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群はアスパラギンおよびグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸の群はフェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸の群はリジン、アルギニンおよびヒスチジンであり；ならびに硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群はシステインおよびメチオニンである。好適な保存的アミノ酸置換の群はバリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸およびアスパラギン−グルタミンである。
【００７３】
本明細書で考察される場合、抗体または免疫グロブリン分子のアミノ酸配列におけるわずかな変異は、アミノ酸配列における変異が少なくとも７５％、例えば、少なくとも８０％、９０％、９５％または９９％を維持する場合に限り、本開示に包含されることが企図される。特に保存的アミノ酸置換が企図される。保存的置換は、その側鎖に関連するアミノ酸のファミリー内で起こる置換である。遺伝的にコードされるアミノ酸は一般に以下のファミリーに分類される：（１）酸性アミノ酸はアスパラギン酸、グルタミン酸であり；（２）塩基性アミノ酸はリジン、アルギニン、ヒスチジンであり；（３）非極性アミノ酸はアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンであり；（４）非荷電極性アミノ酸はグリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシンである。親水性アミノ酸としてはアルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、セリンおよびスレオニンが挙げられる。疎水性アミノ酸としてはアラニン、システイン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシンおよびバリンが挙げられる。アミノ酸の他のファミリーとしては（ｉ）脂肪族−ヒドロキシファミリーであるセリンおよびスレオニン；（ｉｉ）アミド含有ファミリーであるアスパラギンおよびグルタミン；（ｉｉｉ）脂肪族ファミリーであるアラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン；ならびに（ｉｖ）芳香族ファミリーであるフェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンが挙げられる。例えば、ロイシンのイソロイシンまたはバリンへの、アスパラギン酸のグルタミン酸への、スレオニンのセリンへの単離された置き換え、またはアミノ酸の構造的に関連したアミノ酸への類似の置き換えが、特にフレームワーク部位内のアミノ酸を含まない場合、この置き換えが得られた分子の結合または特性に大きな影響を与えないと予想することは合理的である。アミノ酸変化が機能的ペプチドをもたらすかどうかは、ポリペプチド誘導体の特異的活性をアッセイすることにより容易に決定され得る。アッセイは本明細書で詳細に説明される。抗体または免疫グロブリン分子の断片またはアナログは、当業者により容易に調製され得る。断片またはアナログの好適なアミノおよびカルボキシ末端は機能的ドメインの境界付近に存在する。構造的および機能的ドメインは、ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列データと、公的または民間の配列データベースとの比較により同定され得る。いくつかの実施形態において、コンピュータ化された比較方法が、公知の構造および／または機能の他のタンパク質に存在する配列モチーフまたは予測タンパク質コンホメーションドメインを同定するために用いられる。公知の三次元構造にフォールディングされるタンパク質配列を同定するための方法が公知である。Ｂｏｗｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：１６４（１９９１）。したがって、前述の例は、当業者が本発明に従って構造的および機能的ドメインを定義するために用いられ得る配列モチーフおよび構造的コンホメーションを認識できることを実証してい���。
【００７４】
好適なアミノ酸置換は：（１）タンパク質分解に対する感受性を低減し、（２）酸化に対する感受性を低減し、（３）タンパク質複合体形成のための結合親和性を変化させ、（４）結合親和性を変化させ、かつ（４）このようなアナログの他の物理化学的または機能的特性を付与または改変するものである。アナログは天然に存在するペプチド配列以外の配列の様々なムテインを含み得る。例えば、単一または複数のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）は、天然に存在する配列中に（例えば、分子間接触を形成するドメイン（複数可）の外側のポリペプチドの部分に）作製され得る。保存的アミノ酸置換は、実質的に、親配列の構造的特徴を変化させてはならない（例えば、代替アミノ酸は親配列に存在するヘリックスを壊すか、または親配列を特徴付ける他のタイプの二次構造を破壊する傾向があってはならない）。当技術分野で認識されるポリペプチドの二次構造および三次構造の例はＰｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ編、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４））；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃ．ＢｒａｎｄｅｎおよびＪ．Ｔｏｏｚｅ編、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（１９９１））；ならびにＴｈｏｒｎｔｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：１０５（１９９１）に記載されている。
【００７５】
本明細書で使用する用語「ポリペプチド断片」は、アミノ末端および／またはカルボキシ末端の欠失を有するポリペプチドを指すが、残りのアミノ酸配列は、例えば、全長ｃＤＮＡ配列から推定される天然に存在する配列の対応する位置と同一である。断片は典型的には少なくとも５、６、８または１０アミノ酸長、例えば、少なくとも１４アミノ酸長、少なくとも２０アミノ酸長、少なくとも５０アミノ酸長または少なくとも７０アミノ酸長である。本明細書で使用する用語「アナログ」は、推定されるアミノ酸配列の一部と実質的同一性を有し、好適な結合条件下でＣＤ４７への特異的結合を有する少なくとも２５アミノ酸のセグメントからなるポリペプチドを指す。典型的には、ポリペプチドアナログは、天然に存在する配列に対して保存的アミノ酸置換（または付加もしくは欠失）を含む。アナログは典型的には少なくとも２０アミノ酸長、例えば、少なくとも５０アミノ酸長またはそれ以上であり、しばしば全長の天然に存在するポリペプチドと同じ長さであり得る。
【００７６】
ペプチドアナログは、鋳型ペプチドの特性と類似の特性を有する非ペプチド薬として製薬業界において一般的に用いられている。これらのタイプの非ペプチド化合物は「ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｉｍｅｔｉｃｓ、ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）」と称される。Ｆａｕｃｈｅｒｅ，Ｊ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．１５：２９（１９８６）、Ｖｅｂｅｒ  ａｎｄ  Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ  ＴＩＮＳ  ３９２頁（１９８５）；およびＥｖａｎｓら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０：１２２９（１９８７）。このような化合物はしばしばコンピュータ化された分子モデリングを用いて開発される。治療上有用なペプチドに構造的に類似したペプチド模倣物は、同等の治療または予防効果を得るために用いられ得る。一般に、ペプチド模倣物は、ヒト抗体などのパラダイムポリペプチド（すなわち、生化学的特性または薬理学的活性を有するポリペプチド）に構造的に類似しているが、当技術分野で周知の方法により−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス）、−ＣＯＣＨ２−、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−および−ＣＨ２ＳＯ−からなる群から選択される連結により任意で置き換えられる１つ以上のペプチド連結を有する。コンセンサス配列の１つ以上のアミノ酸の、同じタイプのＤ−アミノ酸への系統的な置換（例えば、Ｌ−リジンの代わりにＤ−リジン）はより安定なペプチドを産生するために用いられ得る。さらに、コンセンサス配列または実質的に同一のコンセンサス配列変異を含む拘束性ペプチドは当技術分野で公知の方法（Ｒｉｚｏ  ａｎｄ  Ｇｉｅｒａｓｃｈ  Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：３８７（１９９２））により、例えば、ペプチドを環化する分子内ジスルフィド架橋を形成することが可能な内在システイン残基を添加することにより産生され得る。
【００７７】
用語「剤」は化学化合物、化学化合物の混合物、生物学的高分子、および／または生物学的物質から作製される抽出物を示すために本明細書で用いられる。
【００７８】
本明細書において使用する用語「標識」または「標識された」は、例えば、放射標識されたアミノ酸の取り込み、またはマークされたアビジン（例えば、光学的または熱量測定法により検出され得る蛍光マーカーまたは酵素活性を含有するストレプトアビジン）により検出され得る、ビオチニル部分のポリペプチドへの結合による検出可能なマーカーの取り込みを指す。特定の状況において、標識またはマーカーも治療薬であり得る。ポリペプチドおよび糖タンパク質を標識する様々な方法が当技術分野で公知であり、用いられ得る。ポリペプチドに対する標識の例としては以下が挙げられるがこれらに限定されない：放射性同位体または放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニドリン光体）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光基、ビオチニル基、二次レポーターにより認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）。いくつかの実施形態において、標識は様々な長さのスペーサーアームに取り付けられて、潜在的な立体障害を低減する。本明細書で使用する用語「薬剤または薬物」は、患者に適切に投与された場合、所望の治療効果を誘導することが可能な化学化合物または組成物を指す。
【００７９】
用語「抗新生物剤」は、ヒトにおける新生物、特に癌腫、肉腫、リンパ腫または白血病などの悪性（癌性）病変の発症または進行を阻害する機能的特性を有する剤を指すために本明細書で用いられる。転移の阻害はしばしば抗新生物剤の特性である。
【００８０】
本明細書で使用する用語「治療する」、「治療している」、「治療」などは、障害および／またはそれに関連する症状を減少および／または寛解することを指す。「緩和する」および／または「緩和している」は、例えば、癌などの疾患の発症または進行を低減、抑制、減弱、減退、停止および／または安定化することを意味する。排除するわけではないが、障害または状態を治療することは、これらに関連する障害、状態または症状が完全に排除されなくてもよいことが理解されるであろう。
【００８１】
本発明における他の化学用語は、Ｔｈｅ  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｒｍｓ（Ｐａｒｋｅｒ，Ｓ．編、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ（１９８５））により例示されるように、当技術分野における従来の使用法に従って用いられる。
【００８２】
本明細書で使用する「実質的に純粋な」は、目的種が、存在する優勢種であること（すなわち、モル基準で、これが任意の他の個々の種よりも組成物中で豊富であること）を意味し、いくつかの実施形態において、実質的に精製された断片は、目的種が、存在する全高分子種の少なくとも約５０％（モル基準で）を占める組成物である。
【００８３】
一般に、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在する全高分子種の約８０％超、例えば、約８５％、９０％、９５％および９９％超を含む。いくつかの実施形態において、目的種は本質的に均質になるまで精製され（汚染種は従来の検出方法により組成物中で検出され得ない）、組成物は本質的に単一の高分子種からなる。
【００８４】
本開示において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」などは、米国および／または欧州特許法に帰属する意味を有し得、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味し得る；用語「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」または「本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ）」も同様に米国特許法に帰属する意味を有し、これらの用語はオープンエンドであり、列挙されているものの基本的または新規な特徴が、列挙されているもの以上の存在により変更されるものではないが、先行技術の実施形態を排除するものである限り、列挙されているもの以上の存在を許容する。
【００８５】
「有効量」は、未治療の患者に対して疾患の症状を寛解させるのに必要とされる量を意味する。疾患の治療的処置のために本発明を実施するのに用いられる活性化化合物（複数可）の有効量は、投与様式、対象の年齢、体重および全体的な健康に応じて変化する。最終的には担当医または担当獣医が適切な量および投与計画を決定する。このような量は、「有効」量と称される。
【００８６】
「対象」は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物、例えば、ウシ、ウマ、イヌ、齧歯類、ヒツジ、霊長類、ラクダまたはネコを含むがこれらに限定されない哺乳動物を意味する。本明細書で使用する用語「投与する」は、治療剤をこのような剤での治療を必要とする対象に移動、送達、導入または輸送する任意の様式を指す。このような様式は、経口、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮内、経鼻内および皮下投与を含むが、これらに限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】一定の濃度（２００ｎＭ）での２Ｈ６  ｓｃＦｖ−Ｆｃ（上線）および２Ｈ６  Ｍ１０８Ｌ  ｓｃＦｖ−Ｆｃ（下線）の、２５℃で６００ＲＵのリガンド密度でＣＭ５チップ上に捕獲されたヒトＯＸ４０Ｒへの結合のＳＰＲセンサーグラム。
【図２】平均±ＳＤでの４つの独立のＭＬＲ実験からの正規化された３Ｈ−チミジンの取り込みの結果を示すグラフである。各データ点は、個々の同種の組み合わせの三連値の平均である。点線は、同種反応（抗体なし）のレベルを表す。すべての組み合わせは有意差（ｎｓ）がなかった。
【図３】ＰＢＭＣをＳＥＢの存在下で抗体ありまたはなしで７日間インキュベートした；上清を５日目に採取した。グラフは、５つの独立した実験からの１ウェルあたりのＣＤ４  ＣＤ２５＋の正規化された絶対数（Ａ）および正規化されたＩＬ−２濃度（Ｂ）の平均±ＳＤを示している。各データ点は、三連値の平均であり、独立のＰＢＭＣドナーを表す。点線は、ＰＢＭＣをＳＥＢのみ（抗体なし）とインキュベートした状態のレベルを表す。ｎｓ、非有意；＊、ｐ＜０．０５；＊＊＊、ｐ＜０．００１は、片側ノンパラメトリックマン−ホイットニー検定を用いて得られた。
【図４】ＰＢＭＣをＰＨＡの存在下で抗体ありまたはなしで５日間インキュベートした。グラフは平均±ＳＤでの３つの独立した実験からの正規化された３Ｈ−チミジンの取り込みの結果を示している。各データ点は、三連値の平均であり、独立のＰＢＭＣドナーを表す。点線は、ＰＢＭＣをＰＨＡのみ（抗体なし）とインキュベートした状態のレベルを表す。ｎｓは非有意を表す。
【図５】Ｔｅｔｒａ−１およびＴｅｔｒａ−８のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。プロテインＡ精製後に得られたＴｅｔｒａ−１およびＴｅｔｒａ−８の非還元条件下でのクマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。（ＭＷ）は分子量マーカーを示す。
【図６】Ｔｅｔｒａ−１およびＴｅｔｒａ−８の分析サイズ排除クロマトグラフィー。図６Ａおよび６Ｂは、Ｔｅｔｒａ−１（図６Ａ）およびＴｅｔｒａ−８（図６Ｂ）のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）カラムからの溶出プロファイルを示す一連のグラフである。試料クロマトグラムにおける全体の「検出可能」ピークの％を示すピーク面積パーセンテージ（％）（１００％として検出）は、これらの保持時間に応じた各ピークに対して計算され、Ｔｅｔｒａ−１（図６Ｃ）およびＴｅｔｒａ−８（図６Ｄ）について表に示した。
【図７】Ｔｅｔｒａ−８のカチオン交換精製。図７Ａは、カチオン交換ＨｉＴｒａｐ  ＳＰ  ＨＰカラムからのＴｅｔｒａ−８（点線）の溶出プロファイルを示すグラフである。タンパク質分離のために用いた酢酸ナトリウム勾配は、黒線で示されている。図７Ｂは、Ｔｅｔｒａ−８のカチオン交換精製クロマトグラフィーから回収された様々な分画の非還元条件下でのクマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す写真である。
【図８】示差走査熱量測定によるＴｅｔｒａ−１およびＴｅｔｒａ−８の熱安定性評価。図８Ａおよび８Ｂは、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を用いたＴｅｔｒａ−１およびＴｅｔｒａ−８各々の熱安定性測定を表すグラフである。データは、過剰モル熱容量（Ｃｐ［ｋｃａｌ／ｍｏｌ／℃］と略記；Ｙ軸）対温度（℃；Ｘ軸）で表されている。ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインに対応するアンフォールディング事象が示されている。
【図９】ＯＸ４０の細胞外ドメイン構造。リボンは、ヒトＯＸ４０（ＲＣＳＢ：２ＨＥＶ）の細胞外ドメインを表す。システインリッチドメイン（ＣＲＤ）は、交互に灰色または黒色を用いてハイライト表示されている。ジスルフィド結合は球体で示されている。
【図１０】ヒト、カニクイザルおよびラットのＯＸ４０細胞外ドメインのアライメント。Ｔ−ｃｏｆｆｅｅで調製したヒト（配列番号１）、カニクイザル（配列番号１２２）（ｃｙｎｏと略記）およびラット（配列番号１２１）のＯＸ４０細胞外ドメインの多重配列アライメント。ＣＲＤは、白色または黒色の四角で示されている。ジスルフィド結合対形成は、矢印で示されている。種間で厳密に保存されている残基は、黒で陰影が付けられており、７０％保存の残基は灰色で陰影が付けられている。
【図１１】様々な抗体の用量反応を、組換えヒトＯＸ４０受容体上でインキュベートし、次いで西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素が結合する抗ヒトＦａｂ断片特異的抗体で検出した。グラフは、各処置に対する非直線シグモイド回帰結合曲線（４５０ｎＭでの吸光度）を示している。以下の処置を試験した：Ｔｅｔｒａ−８（〇）、７Ｈ１１＿ｖ８  ＩｇＧ１（□）、Ｔｅｔｒａ−２２（▽）。各データ点は二連値の平均±ＳＤである。
【図１２】様々な抗体の用量反応を、ジャーカットＮＦｋＢ−ＯＸ４０細胞でインキュベートし、次いでフィコエリスリンが結合する抗ヒトＦｃ断片特異的抗体で検出した。グラフは、各処置に対する非直線シグモイド回帰結合曲線（強度の幾何平均）を示している。以下の処置を試験した：Ｔｅｔｒａ−８（〇）、７Ｈ１１＿ｖ８  ＩｇＧ１（□）、２Ｈ６  ＩｇＧ１（△）、対照ＩｇＧ（▽）。
【図１３】様々な抗体の用量反応を、腫瘍壊死因子受容体ファミリーのメンバーである様々な受容体上でインキュベートし、次いで西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素に結合するストレプトアビジンで検出した。同じ処置をすべての受容体：Ｔｅｔｒａ−８（〇）、７Ｈ１１  ＩｇＧ１（□）、２Ｈ６  ＩｇＧ１（△）、対照ＩｇＧ（▽）、各市販の陽性対照（×）で試験した。グラフは、各処置に対する非直線シグモイド回帰結合曲線（４５０ｎＭでの吸光度）を示している。各データ点は、一連で行われた対照曲線を除く二連値の平均である。
【図１４】抗体の用量反応を、組換えカニクイザルＯＸ４０上でインキュベートし、次いで西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素が結合する抗ヒトＦａｂ断片特異的抗体で検出した。グラフは、各条件に対する非直線シグモイド回帰結合曲線（４５０ｎＭでの吸光度）を示している。以下の処置を試験した：Ｔｅｔｒａ−８（〇）、７Ｈ１１  ＩｇＧ１（□）、Ｔｅｔｒａ−２２（△）。各データ点は二連値の平均±ＳＤである。
【図１５】抗体を、ヒトおよびカニクイザルＰＢＭＣ上でインキュベートし、次いでフィコエリスリンが結合する抗ヒトＦｃ断片特異的抗体で検出した。グラフは、ヒトまたはアカゲザルＣＤ４＋Ｔ細胞のいずれかでの各抗体の複数のヒストグラム（蛍光の幾何平均）のオーバーレイを表す。
【図１６】ジャーカットＮＦｋＢ−ＯＸ４０細胞を、ＯＫＴ３でプレコートした（５μｇ／ｍＬ；一晩）プレートまたは通常の発光プレートに移した。その後、抗体または対照の用量反応をジャーカットＮＦｋＢ−ＯＸ４０細胞でインキュベートした。５時間のインキュベーション後、ルシフェラーゼ基質をウェルに添加して、発光を、マイクロプレートリーダー（読取テープ−終点；積分時間−１分；放出−孔；光学装置の位置−上部；ゲイン１３５；読取高さ−１．００ｍｍ）を用いて測定した。グラフは、各条件に対する非直線シグモイド回帰結合曲線（発光）を示している。以下の処置を試験した：Ｔｅｔｒａ−８（〇）、７Ｈ１１  ＩｇＧ１  ＬＡＬＡ（□）、２Ｈ６  ＩｇＧ１  ＬＡＬＡ（△）、対照ＩｇＧ（▽）、ＯＸ４０Ｌ（×）。各データ点は二連値の平均±ＳＤである。
【図１７】樹状細胞（ＤＣ）を６日間分化し、次いで新鮮単離ＣＤ４＋Ｔ細胞と共培養した。抗体または対照の用量反応をこのような細胞でインキュベートし、次いで６日間のインキュベーション後、三重水素チミジンを添加して、さらに１８〜２０時間インキュベートした。増殖指数を以下の方法で計算した：自家条件で誘導されるチミジン取り込みのバックグラウンド（ＣＤ４＋Ｔ細胞のみ）を、各試料（各ＣＤ４＋Ｔ細胞ドナーに特異的）に対して減算し、次いでこの結果を同種条件で誘導されるチミジン取り込みで割った。グラフは、各処置に対する増殖指数を示す。各データ点は、各ＤＣ−ＣＤ４＋Ｔ細胞の組み合わせに対して得られた三連値の平均である。Ｎ＝３６個の組み合わせ。Ｙ線＝１は、正規化された同種応答を表す。
【図１８】ＰＢＭＣをフィルターから単離し、抗体または対照の存在下でブドウ球菌エンテロトキシンＢスーパー抗原（ＳＥＢ）とインキュベートした。５日間のインキュベーション後、上清を採取し、ＩＬ−２放出量についてＬｕｍｉｎｅｘで定量した。正規化されたＩＬ−２放出量を以下の方法で計算した：非刺激細胞（ＳＥＢなしのＰＢＭＣ）において誘導されたＩＬ−２定量を各試料（各ＰＢＭＣドナーに特異的）に対して減算し、次いでこの結果をＳＥＢ−刺激細胞（未処置）において誘導されたＩＬ−２放出量で割った。黒太線は、応答閾値を表す。グラフは、各処置に対する正規化されたＩＬ−２放出量を示す。各データ点は、各ＰＢＭＣドナーに対して得られた三連値の平均である。Ｎ＝１７個のＰＢＭＣドナー。Ｙ線＝１は、正規化されたＳＥＢのみで誘導された応答を表す。
【図１９】ＰＢＭＣをフィルターから単離し、８０および１０ｎＭの抗体または対照の存在下でブドウ球菌エンテロトキシンＢスーパー抗原（ＳＥＢ）とインキュベートした。５日間のインキュベーション後、上清を採取し、ＩＬ−２放出量についてＬｕｍｉｎｅｘで定量した。正規化されたＩＬ−２放出量を以下の方法で計算した：非刺激細胞（ＳＥＢなしのＰＢＭＣ）において誘導されたＩＬ−２定量を各試料（各ＰＢＭＣドナーに特異的）に対して減算し、次いでこの結果をＳＥＢ−刺激細胞（未処置）において誘導されたＩＬ−２放出量で割った。黒太線は、応答閾値を表す。グラフは、各処置に対する正規化されたＩＬ−２放出量を示す。各データ点は、各ＰＢＭＣドナーに対して得られた三連値の平均である。Ｙ線＝１は、正規化されたＳＥＢのみで誘導された応答を表す。
【図２０】様々な結合価および構造を有する７Ｈ１１および２Ｈ６結合単位に基づく分子を表す図である。
【図２１】ＦａｂまたはｓｃＦｖフォーマットとしてＣ末端に融合した場合のＯＸ４０に結合する７Ｈ１１および２Ｈ６の分析。キメラＯＸ４０分子ｃｈｉＯＸ４０Ｒ−Ｆｃ  ＨＨＲＨ（図２１Ａ）またはｃｈｉＯＸ４０Ｒ−Ｆｃ  ＲＲＨＨ（図２１Ｂ）に対するヒンジ領域付近のタンパク質分解で切断された四価分子（示されるようにＦｃ−２Ｈ６  Ｆａｂ／２Ｈ６  Ｆａｂ、Ｆｃ−２Ｈ６  Ｆａｂ／７Ｈ１１  ｓｃＦｖ、Ｆｃ−７Ｈ１１  Ｆａｂ／７Ｈ１１  ＦａｂおよびＦｃ−７Ｈ１１  Ｆａｂ／２Ｈ６  ｓｃＦｖ）の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定。データは応答単位数（ＲＵと略記；Ｙ軸）対時間（Ｘ軸）で表されている。図２１Ｃは、分析で用いられたアゴニストを表す図である。
【図２２】Ｃ末端に融合した場合の７Ｈ１１  Ｆａｂおよび２Ｈ６  ｓｃＦｖによるＯＸ４０共結合の決定。Ｆｃ−７Ｈ１１  Ｆａｂ／２Ｈ６  ｓｃＦｖ断片と、ＣＨＩＰ上に固定化されたキメラＯＸ４０分子ｃｈｉＯＸ４０Ｒ−Ｆｃ  ＨＨＲＨ（図２２Ａ）またはｃｈｉＯＸ４０Ｒ−Ｆｃ  ＲＲＨＨ（図２２Ｂ）ならびに連続注入されたヒトＯＸ４０（ＨＨＨＨ）、ｃｈｉＯＸ４０Ｒ−Ｆｃ（ＨＨＲＨ）およびｃｈｉＯＸ４０Ｒ−Ｆｃ（ＲＲＨＨ）とのＳＰＲによる共結合測定。データは応答単位数（ＲＵと略記；Ｙ軸）対時間（Ｘ軸）で表されている。図２２Ｃは分析で用いたアゴニストを表す図である。
【図２３】Ｃ末端に融合した場合の７Ｈ１１  ｓｃＦｖおよび２Ｈ６  ＦａｂによるＯＸ４０共結合の決定。Ｆｃ−２Ｈ６  Ｆａｂ／７Ｈ１１  ｓｃＦｖ断片と、ＣＨＩＰ上に固定化されたキメラＯＸ４０分子ｃｈｉＯＸ４０Ｒ−Ｆｃ  ＨＨＲＨ（図２３Ａ）またはｃｈｉＯＸ４０Ｒ−Ｆｃ  ＲＲＨＨ（図２３Ｂ）、ならびに連続注入されたヒトＯＸ４０（ＨＨＨＨ）、ｃｈｉＯＸ４０Ｒ−Ｆｃ（ＨＨＲＨ）およびｃｈｉＯＸ４０Ｒ−Ｆｃ（ＲＲＨＨ）とのＳＰＲによる共結合測定。データは応答単位数（ＲＵと略記；Ｙ軸）対時間（Ｘ軸）で表されている。図２３Ｃは分析で用いたアゴニストを表す図である。
【図２４】ＰＢＭＣをフィルターから単離し、８０および１０ｎＭの抗体または対照の存在下でブドウ球菌エンテロトキシンＢスーパー抗原（ＳＥＢ）とインキュベートした。５日間のインキュベーション後、上清を採取し、ＩＬ−２放出量についてＬｕｍｉｎｅｘで定量した。正規化されたＩＬ−２放出量を以下の方法で計算した：非刺激細胞（ＳＥＢなしのＰＢＭＣ）において誘導されたＩＬ−２定量を各試料（各ＰＢＭＣドナーに特異的）に対して減算し、次いでこの結果をＳＥＢ−刺激細胞（未処置）において誘導されたＩＬ−２放出量で割った。黒太線は、応答閾値を表す。グラフは、各処置に対する正規化されたＩＬ−２放出量を示す。各データ点は、各ＰＢＭＣドナーに対して得られた三連値の平均である。Ｙ線＝１は、正規化されたＳＥＢのみで誘導された応答を表す。
【図２５】ＰＢＭＣをフィルターから単離し、８０および１０ｎＭの抗体または対照の存在下でブドウ球菌エンテロトキシンＢスーパー抗原（ＳＥＢ）とインキュベートした。５日間のインキュベーション後、上清を採取し、ＩＬ−２放出量についてＬｕｍｉｎｅｘで定量した。正規化されたＩＬ−２放出量を以下の方法で計算した：非刺激細胞（ＳＥＢなしのＰＢＭＣ）において誘導されたＩＬ−２定量を各試料（各ＰＢＭＣドナーに特異的）に対して減算し、次いでこの結果をＳＥＢ−刺激細胞（未処置）において誘導されたＩＬ−２放出量で割った。黒太線は、応答閾値を表す。グラフは、各処置に対する正規化されたＩＬ−２放出量を示す。各データ点は、各ＰＢＭＣドナーに対して得られた三連値の平均である。Ｙ線＝１は、正規化されたＳＥＢのみで誘導された応答を表す。
【図２６】分析用ゲル濾過クロマトグラムのオーバーレイ。Ｔｅｔｒａ−８単独、ｈＯＸ４０単独および１：４の比の抗体−ｈＯＸ４０複合体のクロマトグラムをオーバーレイした。予想分子量を示す矢印は、較正泳動のピークに対応し、フェリチン（４４０ｋＤａ）、アルドラーゼ（１５８ｋＤａ）および炭酸脱水酵素（２９ｋＤａ）である。Ｔｅｔｒａ−８と逆Ｔｅｔｒａ−８との間の差（矢印で示す）に留意されたい。Ｔｅｔｒａ−８は、Ｖ０にショルダーを有し、逆Ｔｅｔｒａ−８のものと比較して第２のピークは高分子量にシフトしている。
【図２７】Ｔｅｔｒａ−８−ｈＯＸ４０結晶様格子。大きな二次元格子構造の１つの可能性を示している。ＴＥＴＲＡ−８ごとに２つのｈＯＸ４０を用いて、理論上無限大構造を構築した。
【図２８】Ｔｅｔｒａ−８での処置後のジャーカットＯＸ４０−ＧＦＰ細胞株上のＯＸ４０−ＧＦＰの時間経過。ジャーカット発現ＯＸ４０  ｅＧＦＰ細胞を３７℃および５％ＣＯ２にて、フィブロネクチン（ＰＢＳ中１μｇ／ｃｍ２）でプレコートしたＦｌｕｏｒｏｄｉｓｈ（ＷＰＩ）細胞培養皿（２００００細胞／ｃｍ２）上で一晩インキュベートした。次いで、Ｔｅｔｒａ−８を、様々な時間間隔（２．５〜２７．５分の範囲）で８０ｎＭの最終濃度にて細胞培地に添加し、細胞を、共焦点モジュールＬＳＭ  ８００を備えたＺｅｉｓｓ倒立顕微鏡Ｚ１を用いて６３倍率で撮像した。
【図２９】Ｔｅｔｒａ−８および他のＯＸ４０標的化分子により誘導されたＯＸ４０クラスターの共焦点画像。ジャーカットＯＸ４０−ＧＦＰ細胞を、２０ｎＭ（Ａ）または８０ｎＭ（Ｂ）のいずれかで用いた、ＯＸ４０を標的化する様々な分子（Ｔｅｔｒａ−８、１Ａ７、ＯＸ４０ＬおよびＴｅｔｒａ−１４）で５、１０または２０分間のいずれかで処置した。
【図３０】ジャーカットＯＸ４０  ＧＦＰ細胞株上で様々な抗ＯＸ４０分子により誘導されるＯＸ４０クラスタリングの定量解析。ジャーカットＯＸ４０−ＧＦＰ細胞でＴｅｔｒａ−８および他のＯＸ４０標的化分子により誘導されるＯＸ４０クラスターの共焦点画像を、実施例に記載されるようにＫｕｒｔｏｓｉｓ法を用いて分析した。
【図３１】ＤＣ活性化アッセイ。樹状細胞（ＤＣ）をＰＢＭＣ（フィルターから３つのドナーおよび全血から１つのドナー）から単離し、６日間分化し、次いで抗体または対照の存在下でさらに２日間培養した。インキュベーション後、細胞を採取し、パネル１に対しては抗ＣＤ１ｃ−ＡＰＣ、抗ＣＤ８０−ＰＥ、抗ＣＤ８６−ＰｅｒＣＰ−ｅＦ７１０、またはパネル２に対しては抗ＣＤ１ｃ−ＡＰＣ、抗ＣＤ８３−ＦＩＴＣ、抗ＨＬＡ−ＤＲ−ＰｅｒＣＰ５．５で染色した。グラフは、未処置のＤＣと比較した、ＣＤ８３およびＣＤ８６マーカーに対する過剰発現細胞パーセンテージを示しており、これらはまた、ＣＤ８３およびＣＤ８６マーカーの一部を構成的に発現している。各データ点は、１つのＤＣドナーに対する値である。Ｎ＝４つのドナー。
【図３２】抗体または対照の用量反応を、ｔｈａｗ−ａｎｄ−ｕｓｅ  ＮＦｋＢ−Ｌｕｃ２Ｐ／Ｕ２ＯＳ細胞でインキュベートした。４時間のインキュベーション後、ルシフェラーゼ基質をウェルに添加し、発光をマイクロプレートリーダー（読取テープ−終点；積分時間−１分；放出−孔；光学装置の位置−上部；ゲイン１３５；読取高さ−１．００ｍｍ）を用いて測定した。グラフは、各条件に対する非直線シグモイド回帰結合曲線（発光）を示している。以下の処置を試験した：セリクレルマブＩｇＧ（〇）、ＡＤＣ−１０１３  ＩｇＧ１（□）、３ｈ５６  ＩｇＧ１  ＬＡＬＡ（△）、セリクレルマブ＿３ｈ５６（●）、ＡＤＣ−１０１３＿３ｈ５６（■）、ＣＤ４０Ｌ（×）。各データ点は二連値の平均±ＳＤである。
【００８８】
実施例１：マウス抗ヒトＯＸ４０抗体の産生およびスクリーニング
組換えヒトＯＸ４０−ｈｉｓタンパク質を産生するために、クローニングのための３′ＧＳＧ−６ｘＨｉｓリンカーおよび制限部位をＰＣＲにより付加することにより、ヒトＴＮＦＲＳＦ４の細胞外領域（配列番号１に記載のアミノ酸１〜２１４）を増幅した。その後、ＰＣＲ産物を上に記載の改変ｐｃＤＮＡ３．１（−）プラスミドにクローニングした。この組換えプラスミドは、哺乳動物細胞におけるヒトＯＸ４０−ｈｉｓタンパク質の発現と、ヒトＴＮＦＲＳＦ４の天然のシグナルペプチドにより誘導される細胞培養培地中への分泌とを可能にした。タンパク質産生のために、組換えベクターを、ｊｅｔＰＥＩ（商標）トランスフェクション試薬（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓ．Ａ．、Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ、フランス；流通業者：Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ、Ｂａｓｅｌ、スイス）を用いて、懸濁順化ＨＥＫ  ２９３細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ  １５７３）にトランスフェクトした。細胞培養上清を、トランスフェクションの５日後に回収し、ＡＫＴＡ  ＦＰＬＣシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、スイス）で操作されるＮｉ２＋−ＮＴＡ親和性精製カラム（ＨｉＴｒａｐ  Ｎｉ２＋−ＮＴＡセファロースカラム；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、スイス）を用いて精製した。
【００８９】
組換えヒトＯＸ４０−ＦｃおよびＯＸ４０−ｈｉｓタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで判断されるように９５％純粋であることが判明し、さらに使用前にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に緩衝液交換した。
【００９０】
組換えヒトＯＸ４０Ｌ−Ｆｃタンパク質を産生するために、ヒトＴＮＦＳＦ４のｃＤＮＡをｉｍａＧｅｎｅｓ（クローン名：ＩＯＨ４６２０３、ベルリン、ドイツ）から購入し、ヒトＴＮＦＳＦ４リガンド（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｑ６ＦＧＳ４配列に従ってナンバリング）の細胞外部分（アミノ酸５１〜１８３）を、ヒトＩｇＧ１のヒトＦｃ領域（ＥＵ位２２３〜４５１）、米国特許第５９２４９３９号に記載のＩｇドナーアクセプター断片を有するヒトＣＭＶプロモーター（第１イントロン）、ＯｒｉＰ配列（Ｋｏｏｎｓら、２００１、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７５（２２）：１０５８２−９２．）、ＳＶ４０エンハンサーおよびＫｉｍらにより記載されたガストリンターミネーターに融合したＳＶ４０ポリＡ（２００３、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ．１９（５）、１６２０〜２頁）を含有する、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのｐｃＤＮＡ３．１（−）プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ、Ｂａｓｅｌ、スイス、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｖ７９５−２０）に基づく改変哺乳動物発現ベクターにその後クローニングするためのフランキング制限部位を用いて増幅した。この組換えプラスミドは、哺乳動物細胞でのヒトＴＮＦＳＦ４細胞外ドメイン−Ｆｃ融合タンパク質の発現と、ＶＪ２Ｃリーダーペプチドにより誘導される細胞培養培地への分泌とを可能にした。組換えタンパク質産生のために、上記組換えベクターを、カチオン性ポリマーを用いて、懸濁順化ＨＥＫ  ２９３細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ  １５７３）にトランスフェクトした。細胞培養上清を５日後に回収し、ＣａｐｔｉｖＡ（商標）ｐｒｉｍＡＢ親和性ビーズ（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｓｅｔｓ、ＵＳＡ）を用いてさらにバッチ精製し、使用前にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にさらに緩衝液交換した。
【００９１】
組換えカニクイザルＯＸ４０−Ｆｃタンパク質を産生するために、カニクイザルＯＸ４０の細胞外部分（ＮＣＢＩ配列ＸＰ＿００１０９０８７０．１のアミノ酸２９〜２１４）に対応する合成遺伝子を、ヒトＩｇＧ１のヒトＦｃ領域（ＥＵ位２２３〜４５１）、米国特許第５９２４９３９号に記載のＩｇドナーアクセプター断片を有するヒトＣＭＶプロモーター（第１イントロン）、ＯｒｉＰ配列（Ｋｏｏｎｓら、２００１、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７５（２２）：１０５８２−９２．）、ＳＶ４０エンハンサーおよびＫｉｍらにより記載されたガストリンターミネーターに融合したＳＶ４０ポリＡ（２００３、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ．１９（５）、１６２０〜２頁）を含有する、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのｐｃＤＮＡ３．１（−）プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ、Ｂａｓｅｌ、スイス、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｖ７９５−２０）に基づく改変哺乳動物発現ベクターにその後クローニングするための制限部位を用いて産生した（ＧｅｎｅＡｒｔ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）。この組換えプラスミドは、哺乳動物細胞でのカニクイザルＯＸ４０細胞外ドメイン−Ｆｃ融合タンパク質の発現と、ＶＪ２Ｃリーダーペプチドにより誘導される細胞培養培地への分泌とを可能にした。組換えタンパク質産生のために、上記組換えベクターを、カチオン性ポリマーを用いて、懸濁順化ＨＥＫ  ２９３細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ  １５７３）にトランスフェクトした。細胞培養上清を、５日後に回収し、ＣａｐｔｉｖＡ（商標）ｐｒｉｍＡＢ親和性ビーズ（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｓｅｔｓ、ＵＳＡ）を用いてさらにバッチ精製し、使用前にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にさらに緩衝液交換した。組換えヒトＯＸ４０−Ｆｃタンパク質を産生するために、ヒトＴＮＦＲＳＦ４のｃＤＮＡをｉｍａＧｅｎｅｓから購入した（クローン番号：ＲＺＰＤＢ７３７Ｈ０３２９Ｄ、ベルリン、ドイツ）。このｃＤＮＡを鋳型として用いて、ヒトＴＮＦＲＳＦ４細胞外ドメインのＤＮＡコード領域（配列番号１に記載のアミノ酸１〜２１４）をＰＣＲにより増幅した。別のＰＣＲ反応において、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域（ＥＵ位２２３〜４５１）を増幅した。次いで、２つの得られた産物を、フランキングプライマーでのオーバーラップ伸長ＰＣＲを用いて融合し、米国特許第５９２４９３９号に記載のＩｇドナーアクセプター断片を有するヒトＣＭＶプロモーター（第１イントロン）、ＯｒｉＰ配列（Ｋｏｏｎｓら、２００１、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７５（２２）：１０５８２−９２．）、ＳＶ４０エンハンサーおよびＫｉｍらにより記載されたガストリンターミネーターに融合したＳＶ４０ポリＡ（２００３、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ．１９（５）、１６２０〜２頁）を含有する、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのｐｃＤＮＡ３．１（−）プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ、Ｂａｓｅｌ、スイス、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｖ７９５−２０）に基づく改変哺乳動物発現ベクターにその後クローニングするための制限部位を付加した。この組換えプラスミドは、哺乳動物細胞でのヒトＴＮＦＲＳＦ４細胞外ドメイン−Ｆｃ融合タンパク質の発現と、ヒトＴＮＦＲＳＦ４タンパク質の天然のシグナルペプチドにより誘導される細胞培養培地への分泌とを可能にした。組換えタンパク質産生のために、上記組換えベクターを、ｊｅｔＰＥＩ（商標）トランスフェクション試薬（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓ．Ａ．、Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ、フランス；流通業者：Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ、Ｂａｓｅｌ、スイス）を用いて、懸濁順化ＨＥＫ  ２９３細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ  １５７３）にトランスフェクトした。細胞培養上清を、５日後に回収し、ＡＫＴＡ  ＦＰＬＣシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、スイス）で操作されるプロテインＡ親和性精製カラム（ＨｉＴｒａｐプロテインＡセファロースカラム；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、スイス）を用いてさらに精製した。
【００９２】
ＰＢＳに溶解した組換えヒトＯＸ４０−Ｆｃタンパク質を、等量のＳｔｉｍｕｎｅアジュバント（Ｐｒｉｏｎｉｃｓ、スイス、ｒｅｆ：７９２５０００）と混合し、乳化液を調製した。乳化液を０．５ｍＬインスリンシリンジ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ａｌｌｓｃｈｗｉｌ、スイス）に移し、５０μｇの乳化タンパク質をＢＡＬＢ／ｃ動物（Ｈａｒｌａｎ、オランダ）の後肢の肉趾、尾の基部および頸部に皮下免疫付与した。２週間後、同じ量の抗原および同じ注射経路で免疫付与を繰り返した。
【００９３】
免疫付与したマウス血清中の循環抗ヒトＯＸ４０抗体の存在を、組換えヒトＯＸ４０−ｈｉｓタンパク質でコートしたプレートを用いて直接ＥＬＩＳＡにより評価した。異なるマウス血清の連続希釈物（１：１００〜１：１０９）をプレートに添加し、結合した抗体をヤギ抗マウスＨ＋Ｌ全分子−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ、Ｂｕｃｈｓ、スイス）を用いて検出した。
【００９４】
アジュバントなしで５０μｇの抗原での最終皮下ブーストを、最良の抗ヒトＯＸ４０  ＩｇＧ血清力価を示す動物で行い、３日後に屠殺した。
【００９５】
動物を安楽死させ、鼠径、腋窩、上腕、膝窩および坐骨リンパ節を回収し、リンパ節構造を２本の２５Ｇ注射針を用いてＤＮＡｓｅ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｓｃｈｗｅｉｚ）ＡＧ、Ｒｏｔｋｒｅｕｚ、スイス）およびコラゲナーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｓｃｈｗｅｉｚ）ＡＧ、Ｒｏｔｋｒｅｕｚ、スイス）溶液中で妨害することにより単一細胞懸濁液を調製した。単一細胞懸濁液を、骨髄腫細胞株Ｘ６３ＡＧ８．６５３（マウスＢＡＬＢ／ｃ骨髄腫細胞株、ＡＴＣＣ受入番号：ＣＲＬ  １５８０；Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９７９、１２３：１５４８−１５５０）に７：１の比でポリエチレングリコール１５００（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｓｃｈｗｅｉｚ）ＡＧ、Ｒｏｔｋｒｅｕｚ、スイス）を用いて融合させた。融合した細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐａｓｃｈｉｎｇ、オーストリア）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ、ドイツ）ペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ、ドイツ）、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ、Ｂａｓｅｌ、スイス）、５０μＭ  β−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ、Ｂｕｃｈｓ、スイス）、ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ、Ｂｕｃｈｓ、スイス）および１％増殖因子（ハイブリドカイン、Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ／Ｕｐｔｉｍａ、Ｍｏｎｔｌｕｃｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）を補足したＤＭＥＭ−１０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ、Ｂａｓｅｌ、スイス）にマウスマクロファージを含有する９６ウェル平底プレートに撒いた。
【００９６】
融合からの約８００００のウェルを、ヒトＯＸ４０を認識したマウスＩｇＧの存在についてＥＬＩＳＡでスクリーニングした。陽性ウェルを拡張し、２回のサブクローニングに供した。細胞を回収し、重鎖および軽鎖をクローニングし、配列決定した。
【００９７】
実施例２：ハイブリドーマ細胞からの抗ＯＸ４０抗体のＶＨおよびＶＬ鎖のクローニングおよび配列決定
各陽性選択したハイブリドーマについて、全ＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡに逆転写し、ＶＨおよびＶＬ遺伝子を各々ＰＣＲにより増幅した。これらのＰＣＲ産物をレスキューベクター（ｐＤｒｉｖｅベクター；ＱＩＡＧＥＮ  ＡＧ、Ｈｏｍｂｒｅｃｈｔｉｋｏｎ、スイス；Ｃａｔ．Ｎｏ．２３１１２４）にライゲーションし、個々のＰＣＲ産物のＤＮＡ配列決定および選択されたハイブリドーマの単または多クローン性の決定を可能にした。このベクターは、ＩＰＴＧおよびＸ−ｇａｌを含有するＬＢ−寒天プレート上の青／白の選択を可能にした（ＬａｃＺα−ペプチドによるＸ−ｇａｌの分解のため、挿入物を有さないコロニーは、青であった）。陽性（白）細菌クローンから組換えプラスミドを調製し、ベクター骨格に特異的な標準的ＤＮＡ配列決定プライマー（Ｍ１３ｒｅｖ、Ｍ１３ｆｗｄ、Ｔ７またはＳＰ６）を用いて配列決定した。ＤＮＡ配列を、哺乳動物細胞での目的の抗体の組換え発現のために発現ベクターに最終的にサブクローニングした。
【００９８】
ＲＮＡ単離
製造業者プロトコルに従って、ＱＩＡＧＥＮからのＲＮｅａｓｙミニキット（ＱＩＡＧＥＮ  ＡＧ、Ｈｏｍｂｒｅｃｈｔｉｋｏｎ、スイス；Ｃａｔ．Ｎｏ．７４１０６）を用いて、全ＲＮＡを２〜１０×１０６細胞から単離した；試料を、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ＮＤ−１０００分光光度計（ＷＩＴＥＣ  ＡＧ、Ｌｉｔｔａｕ、スイス）を用いて定量した。
【００９９】
ワンステップＲＴ−ＰＣＲ
上記の全ＲＮＡ調製物をさらにｃＤＮＡに逆転写し、ＶＨおよびＶＬ断片を縮合プライマーの２つの異なる混合物を用いてＰＣＲにより増幅し、各々、マウス免疫グロブリン重鎖可変断片および可変重鎖接合領域の様々なサブファミリーすべての回収、またはすべてのマウス免疫グロブリン軽鎖カッパ可変断片および可変軽鎖カッパ接合領域の回収を可能にした。逆転写および増幅に用いたプライマーをＭｉｃｒｏｓｙｎｔｈ（Ｂａｌｇａｃｈ、スイス）で合成し、ＨＰＬＣ精製した（表１〜４）。逆転写とＰＣＲによる増幅の両方を、ＱＩＡＧＥＮワンステップＲＴ−ＰＣＲキット（ＱＩＡＧＥＮ  ＡＧ、Ｈｏｍｂｒｅｃｈｔｉｋｏｎ、スイス；Ｃａｔ．Ｎｏ．２１０２１２）を用いて同時に行った。該技術に特定のプライマーを用いたため、次いで各ｍＲＮＡ試料を二連で処理し、ＶＨまたはＶＬ断片いずれかの個別の逆転写および増幅を可能にした。３０μｌの最終容量までＲＮａｓｅフリー水に溶解した２μｇの全ＲＮＡを：１０μｌのＱＩＡＧＥＮワンステップＲＴ−ＰＣＲ緩衝液の５倍貯蔵液、２μｌの１０ｍＭの濃度でのｄＮＴＰｓミックス、３μｌの１０μＭの濃度でのプライマーミックスおよび２μｌのＱＩＡＧＥＮワンステップＲＴ−ＰＣＲ酵素ミックスと混合した。次いで、最終混合物をＰＣＲチューブに入れ、以下の設定を用いてＰＣＲサーモサイクラー（ＢｉｏＲａｄ  ｉＣｙｃｌｅｒ版４．００６、Ｂｉｏ−ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＡＧ、Ｒｅｉｎａｃｈ、スイス）で循環させた：
５０℃で３０分
９５℃で１５分
４０サイクル：      ９４℃で３０秒
５５℃で３０秒
７２℃で１分
７２℃で１０分
４℃を維持
【０１００】
ｐＤｒｉｖｅクローニング
ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルで泳動させた。ＤＮＡ電気泳動後、目的の断片（約４５０ｂｐ）をアガロースゲルから切り出し、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ  ＮｕｃｌｏＳｐｉｎ抽出ＩＩキット２５０（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ、Ｏｅｎｓｉｎｇｅｎ、スイス；Ｃａｔ．Ｎｏ．７４０６０９．２５０）を用いてさらに抽出した。ＤＮＡ配列決定のために、抽出したＰＣＲ産物を上記のレスキューベクター（ｐＤｒｉｖｅベクター、ＱＩＡＧＥＮ  ＡＧ、Ｈｏｍｂｒｅｃｈｔｉｋｏｎ、スイス；Ｃａｔ．Ｎｏ．２３１１２４）にクローニングし、大腸菌ＴＯＰ１０株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ、Ｂａｓｅｌ、スイス；Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｃ４０４００６）に形質転換した。
【０１０１】
ミニプレップ抽出
陽性コロニーを、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ方形ウェルブロックプレート（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ、Ｏｅｎｓｉｎｇｅｎ、スイス；Ｃａｔ．Ｎｏ．７４０４８８．２４）に播種し、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを補足した１．５ｍｌのＬｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地中で３７℃にて一晩培養した（２５０ＲＰＭで振とう）。翌日、ＤＮＡミニプレップ抽出を、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎマルチ８プラスミドキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ、Ｏｅｎｓｉｎｇｅｎ、スイス；Ｃａｔ．Ｎｏ．７４０６２０．５）を用いて行った。
【０１０２】
配列決定
試料をＤＮＡ配列決定のためにＤＮＡ配列決定サービス会社Ｆａｓｔｅｒｉｓ（Ｐｌａｎ−ｌｅｓ−Ｏｕａｔｅｓ、スイス）に送付した。標準的なプライマー：Ｍ１３ｒｅｖ、Ｍ１３ｆｗｄ、Ｔ７、ＳＰ６を使用した（表５）。
【０１０３】
配列分析
クローンマネージャー９プロフェッショナル版（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＆Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＮＣ、ＵＳＡ）およびＢｉｏＥｄｉｔ配列アライメントエディタ（Ｈａｌｌ，Ｔ．Ａ．１９９９．ＢｉｏＥｄｉｔ：Ｗｉｎｄｏｗｓ９５／９８／ＮＴ用の使いやすい生物学的配列アライメントエディタおよび解析プログラム。Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．４１：９５−９８）をＤＮＡ配列分析に使用した。
【０１０４】
組換えキメラ抗体発現のための発現ベクターのクローニング
哺乳動物細胞の組換え発現のために、単離したマウスＶＨおよびＶＬ断片を、アセンブリーに基づくＰＣＲ法を用いてキメラ免疫グロブリンとしてフォーマットした。これらのキメラ抗体は、マウス重鎖可変ドメインをヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメイン（γ１、ヒンジ、γ２およびγ３領域）に融合した重鎖と、マウス軽鎖可変ドメインをヒトカッパ定常ドメイン（Ｃκ）に融合した軽鎖とからなる。その後、ＰＣＲによりアセンブルしたマウス可変およびヒト定常部分を、実施例１に言及したＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからの改変ｐｃＤＮＡ３．１（−）ベクターに基づく改変哺乳動物発現ベクターにクローニングしたが、ヒト免疫グロブリン軽鎖カッパリーダーペプチドを、タンパク質分泌を誘導するために利用したことが異なる。免疫グロブリン候補のタンパク質産生のために、等量の重鎖および軽鎖ベクターＤＮＡを、懸濁順化ＨＥＫ−２９３（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１５７３）に共トランスフェクトした。細胞培養上清を５日後に回収し、ＡＫＴＡ  ＦＰＬＣシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、スイス）で操作されるプロテインＡ親和性精製カラム（ＨｉＴｒａｐプロテインＡセファロースカラム；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、スイス）を用いて精製した。
【０１０５】
【表２】
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【０１０６】
【表３】
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【０１０７】
【表４】
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【０１０８】
【表５】
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【０１０９】
【表６】
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【０１１０】
実施例３：抗ヒトＯＸ４０抗体の生物学的特性評価
ＯＸ４０特異的抗体検出ＥＬＩＳＡ
ハイブリドーマおよび組換え抗体候補による抗体力価、特異性および産生を直接ＥＬＩＳＡにより決定した。簡単に言えば、９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ  ＵＳＡ、流通業者ＶＷＲ  ＡＧ、Ｎｙｏｎ、スイス）を、ＰＢＳ中２μｇ／ｍｌでの１００μｌの組換えヒトＯＸ４０−ｈｉｓでコートした（ＯＸ４０−ｈｉｓタンパク質の産生については実施例１を参照）。プレートを４℃で一晩インキュベートし、次いでＰＢＳ２％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン、ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐａｓｃｈｉｎｇ、オーストリア）を用いて室温（ＲＴ）で１時間遮断した。遮断液を除去し、ハイブリドーマ上清または精製抗体を添加した。プレートをＲＴで３０分間インキュベートし、次いでＰＢＳ０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ、Ｂｕｃｈｓ、スイス）で９回洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ヤギ抗マウスＨ＋Ｌ検出抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ、Ｂｕｃｈｓ、スイス）を１：１０００の希釈で添加した。ヒトＦｃを有する組換えキメラ抗体（実施例２参照）を検出するために、ＨＲＰ標識ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ、Ｂｕｃｈｓ、スイス）を１：１０００の希釈で検出抗体として用いた。プレートをＲＴで３０分間インキュベートし、ＰＢＳ０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０で９回洗浄し、ＴＭＢ基質（Ｂｉｏ−ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＡＧ、Ｒｅｉｎａｃｈ、スイス）をプレートに添加した。Ｈ２ＳＯ４を添加することにより６分後に反応を停止した。次いで、吸光度を４５０ｎｍにてマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ、ＵＳＡ；流通業者：ＷＩＴＴＥＣ  ＡＧ、Ｌｉｔｔａｕ、スイス）で読み取った。陽性クローンの中でも、ハイブリドーマ７Ｈ１１および２Ｈ６を選択し、これらの可変ドメインのコードＤＮＡ配列を得、マウス−ヒトＩｇＧ１キメラを実施例２に記載されるように調製した。
【０１１１】
実施例４：マウス７Ｈ１１抗体のヒト化および最適化
潜在的な翻訳後修飾を除去しながら、ヒトＣＤＲグラフト化アクセプターフレームワークの結合および特性を実質的に保有および／または改善するヒトアクセプターフレームワーク、復帰突然変異および突然変異を選択することを含む、抗ヒトＯＸ４０マウス抗体７Ｈ１１のヒト化について本明細書に記載する。マウス７Ｈ１１抗体は配列番号２に記載の可変重鎖ドメイン配列および配列番号３に記載の可変軽鎖ドメイン配列を有する。
【０１１２】
方法
抗体の組換え産生
様々なＶＨおよびＶＬドメインのコードＤＮＡ配列（ｃＤＮＡ）を、ＧＥＮＥＡＲＴ  ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、ドイツ）によりｓｃＦｖフォーマットに合成することにより、単一ＤＮＡ配列が両方の可変ドメインを包含することを可能にした。個々の可変ドメインｃＤＮＡを、このｓｃＦｖ構築物からＰＣＲにより取り出し、ＰＣＲアセンブリー法を用いて各定常ドメインｃＤＮＡ配列（複数可）の上流でさらにアセンブルした。最後に、完全重鎖および軽鎖ｃＤＮＡを、ＣＭＶプロモーターおよびウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを有する改変ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）に基づく独立のベクターにライゲーションした。軽鎖特異的ベクターは、ＢａｍＨＩおよびＢｓｉＷＩ制限酵素部位を用いて、カッパ軽鎖定常ドメインｃＤＮＡの前に目的の軽鎖可変ドメインｃＤＮＡをライゲーションすることにより、カッパアイソタイプ軽鎖の発現を可能にしたが、重鎖特異的ベクターは、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩ制限酵素部位を用いて、ＩＧＨＧ１  ＣＨ１、ＩＧＨＧ１ヒンジ領域、ＩＧＨＧ１  ＣＨ２およびＩＧＨＧ１  ＣＨ３定常ドメインをコードするｃＤＮＡ配列の前に目的の重鎖可変ドメインｃＤＮＡをライゲーションすることを可能にするように改変された。重鎖発現ベクターと軽鎖発現ベクターの両方において、分泌は、ＢａｍＨＩ部位を含有するマウスＶＪ２Ｃリーダーペプチドにより誘導された。ＢｓｉＷＩ制限酵素部位は、カッパ定常ドメインに位置するが、ＳａｌＩ制限酵素部位はＩＧＨＧ１  ＣＨ１ドメイン中に見出される。
【０１１３】
等量の重鎖および軽鎖ベクターを、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、Ｓｉｇｍａ、Ｂｕｃｈｓ、スイス）を用いて、懸濁順化ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ１細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）カタログ番号：ＣＲＬ−１０８５２）に共トランスフェクトすることにより、抗体を一過的に産生した。典型的には、１ｍｌあたり０．８〜１．２百万細胞の密度での懸濁液中１００ｍｌの細胞を、重鎖をコードする５０μｇの発現ベクターおよび軽鎖をコードする５０μｇの発現ベクターを含有するＤＮＡ−ＰＥＩ混合物でトランスフェクトする。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターを宿主細胞に導入する場合、細胞を４〜５日間さらに培養して、０．１％プルロニック酸、４ｍＭグルタミンおよび０．２５μｇ／ｍｌジェネティシンを補足した培養培地（ＥＸ−ＣＥＬＬ  ２９３、ＨＥＫ２９３−無血清培地；Ｓｉｇｍａ、Ｂｕｃｈｓ、スイス）への分泌を可能にすることにより、抗体を産生する。
【０１１４】
ヒト化抗体を、組換えプロテインＡストリームライン媒体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、スイス）を用いて無細胞上清から精製し、アッセイ前にリン酸緩衝生理食塩水に緩衝液交換した。
【０１１５】
ＦＡＣＳによるＨＰＢ−ＡＬＬ細胞の親和性測定
ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞（ＤＳＭＺ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ドイツ、Ｃａｔ．Ｎｏ：ＡＣＣ４８３）をＦＡＣＳ染色のためのヒトＯＸ４０陽性細胞株として使用した。ＨＰＢ−ＡＬＬを、１０％ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補足したＲＰＭＩ  １６４０中で維持した。ＦＡＣＳ緩衝液（１％ＢＳＡおよび０．１％アジ化ナトリウムを補足したＰＢＳ）中４×１０ｅ５ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞を、１０μｇ／ｍｌの濃度で保持される目的の抗ＯＸ４０抗体と氷上で４５分間インキュベートした。無関係のヒトＩｇＧ１をアイソタイプ対照として使用した；細胞を１／２００希釈の抗ヒトＦｃ−ＰＥ（ＥＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｖｉｅｎｎａ、オーストリア）と氷上で４５分間インキュベートした。次いで、細胞を再び洗浄し、２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。各試料の相対平均蛍光をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ装置（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ａｌｌｓｃｈｗｉｌ、スイス）で測定した。
【０１１６】
ＳＰＲによる親和性測定
ＳＰＲ分析を用いて、抗ＯＸ４０抗体の結合キネティックについて会合および解離速度定数を測定した。結合キネティックは、ＢＩＡｃｏｒｅ  ２０００（ＢＩＡｃｏｒｅ−ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、スイス）で室温にて測定し、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ｖ４．１、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ）で分析した。
【０１１７】
市販のアミンカップリングキット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ、Ｃａｔ．Ｎｏ：ＢＲ−１０００−５０）を用いてプロテインＡ（Ｓｉｇｍａ、Ｂｕｃｈｓ、スイス、Ｃａｔ．Ｎｏ：Ｐ７８３７）に個々に結合したＣＭ５センサーチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ  ２０００、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ、Ｃａｔ．Ｎｏ：ＢＲ−１０００−１４）で測定を行った。ヒト化抗体２００〜６００ＲＵを捕獲した。ＯＸ４０−ｈｉｓの希釈系列をＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ、Ｃａｔ．Ｎｏ：ＢＲ１００１−８８）に１０μｌ／分の流速で注入した。各結合事象後、表面を１０μｌのグリシン緩衝液ｐＨ１．５で再生した。実験データを、局所Ｒｍａｘを伴う１：１Ｌａｎｇｍｕｉｒモデルを用いて処理した。解離時間は約７分であった。測定を二連または三連で行って、ゼロ濃度試料を参照のために含めた。カイ２と残差の両方の値を用いて、実験データと個々の結合モデルとの間の適合度の質を評価した。
【０１１８】
示差走査熱量測定による熱安定性評価
ヒト化抗体の熱安定性を、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を用いて測定した。モノクローナル抗体溶融プロファイルは、これらのアイソタイプの特徴であるが（Ｇａｒｂｅｒ  ａｎｄ  Ｄｅｍａｒｅｓｔ（２００７）、ＢＢＲＣ  ３５５：７５１−７）、ＦＡＢ断片の中間溶融温度は、全長ＩｇＧとの関連においても容易に同定できる。ＦＡＢ部分のこのような中間溶融温度を用いて、ヒト化候補のモノクローナル安定性をモニタリングした。
【０１１９】
熱量測定をＶＰ−ＤＳＣ示差走査微小熱量計（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ、Ｍａｌｖｅｒｎ、ＵＫ）で行った。セル容量は０．１２８ｍｌ、加熱速度は２００℃／時であり、過圧を６５ｐ．ｓ．ｉで維持した。すべての抗体をＰＢＳ（ｐＨ７．４）中１ｍｇ／ｍｌの濃度で使用した。抗体が省略された同一の緩衝液を含有する複製試料と比較することにより、抗体のモル熱容量を推定した。部分的なモル熱容量および溶融曲線を標準的な手順を用いて分析した。サーモグラムをベースライン補正し、濃度を正規化した後、ソフトウェアＯｒｉｇｉｎ  ｖ７．０で非２状態モデルを用いてさらに分析した。
【０１２０】
結果
再形成された可変領域の設計
相同性マッチングを用いて、マウス７Ｈ１１抗体のＣＤＲのヒトアクセプターフレームワークを選択した。データベース（例えば、ヒトおよびマウスの免疫グロブリン遺伝子座からの生殖系列可変遺伝子のデータベース、ＩＭＧＴデータベース（ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）；Ｌｅｆｒａｎｃ  ＭＰら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、２７（１）：２０９−１２（１９９９）；Ｒｕｉｚ  Ｍら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、２８（１）：２１９−２１（２０００）；Ｌｅｆｒａｎｃ  ＭＰ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、２９（１）：２０７−９（２００１）；Ｌｅｆｒａｎｃ  ＭＰら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、３１（１）：３０７−１０（２００３）；Ｌｅｆｒａｎｃ  ＭＰら、Ｄｅｖ  Ｃｏｍｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２９（３）：１８５−２０３（２００５）；Ｋａａｓ  Ｑら、Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ  ｉｎ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ＆  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、６（４）：２５３−６４（２００７））、ＶＢＡＳＥ２（Ｒｅｔｔｅｒ  Ｉ．ら、２００５、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、３３、Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ  Ｄ６７１−Ｄ６７４）、Ｋａｂａｔデータベース（Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｇ．ら、２０００、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２８、２１４〜２１８頁）または刊行物（例えば、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、１９９２））を用いて、マウス重鎖および軽鎖Ｖ領域が属するヒトサブファミリーを同定し、最もよく適合するヒト生殖系列フレームワークを決定して、マウスＣＤＲのアクセプター分子として用いることができる。アクセプターとして用いられるこれらのサブファミリー内での重鎖および軽鎖可変配列（ＶＨおよびＶＬ）の選択は、配列相同性および／またはグラフト化後に６つのＣＤＲの適切な相対的提示を保持する一助となるＣＤＲ１およびＣＤＲ２領域の構造の一致に基づくものであり得る。
【０１２１】
例えば、ＩＭＧＴデータベースの使用は、７Ｈ１１重鎖可変ドメインフレームワークとヒト重鎖可変ドメインサブファミリー１のメンバーとの間の良好な相同性を示している。ＣＤＲとフレームワーク配列の両方の最高の相同性および同一性が、生殖系列配列：ＩＧＨＶ１−３＊０１（配列番号４）、ＩＧＨＶ１−２＊０２（配列番号５）およびＩＧＨＶ１−４６＊０１（配列番号６）で観察され、これらはすべて、ＣＤＲ３までの配列全体で６８％超の配列同一性を有していた。ＩＧＨＶ１−８＊０１（配列番号７）は、配列同一性が低かった（６６．３％）。
【０１２２】
同じ方式を用いて、７Ｈ１１軽鎖可変ドメイン配列は、ヒト軽鎖可変ドメインカッパサブファミリー３および４のメンバーと良好な相同性を示した。ＣＤＲとフレームワーク配列の両方の最高の相同性および同一性が、生殖系列配列：ＩＧＫＶ４−１＊０１（配列番号８）（８１．２％の相同性）、ＩＧＫＶ３Ｄ−７＊０１（配列番号９）（６７．３％の相同性）、ＩＧＫＶ３Ｄ−１５＊０１（配列番号１０）（６７．３％の相同性）およびＩＧＫＶ３−２０＊０１（配列番号１１）（６５．３％の相同性）で観察された。
【０１２３】
ヒトアクセプターフレームワークに最もよく一致するＪＨおよびＪＫセグメント配列を、上記のＩＭＧＴサーチから同定した。
【０１２４】
ヒト化プロセスの開始点として、上に示した４つの可変重鎖および軽鎖ドメインを、マウス７Ｈ１１  ＣＤＲのアクセプターとして選択した。ヒトガンマ１アイソタイプの１６個のヒト化抗体の第１のセットを調製した。これらの第１のヒト化候補は、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞中での一過性発現の評価およびフローサイトメトリーによるＨＢ−ＡＬＬ細胞への結合の評価を行った（表７）。
【０１２５】
【表７】
2020504105.tif 000010
【０１２６】
最良のヒト化候補は抗体ＶＨ１／ＶＬ１、ＶＨ２／ＶＬ１およびＶＨ３／ＶＬ１であった。これらの抗体は、親マウス抗体について観察されたレベルに近いＦＡＣＳ染色レベルを示し、発現収率は残りの候補を上回った。
【０１２７】
３つの候補を親和性ランキングについてＳＰＲによりさらにアッセイした（表８）。驚くべきことに、ヒト化ＶＨ２／ＶＬ１  ＩｇＧ１抗体は、キメラ７Ｈ１１抗体と比較して優れた親和性（すなわち、低いＫＤ）を有することが判明した。さらに、発現収率、ＨＢＰ−ＡＬＬ細胞に対する見掛け親和性およびＦａｂ安定性は、他の２つの変異体に匹敵していた。
【０１２８】
【表８】
2020504105.tif 000011
【０１２９】
その良好な結合、発現およびＦａｂ安定性に基づき、ＶＨ２／ＶＬ１抗体は、マウス抗体配列からのアミノ酸をヒト化抗体配列に導入する復帰突然変異として公知の方法を介して親和性をさらに改善するために選択された。ＶＨ２／ＶＬ１抗体がその親マウス抗体よりも良好な親和性を有しているという事実にかかわらず、親和性は該方法によりさらに改善できると考えられた。
【０１３０】
グラフト化ヒトフレームワークの復帰突然変異
復帰突然変異の方法は、親和性を保持または改善し、同時にヒト化抗体における潜在的な免疫原性を最小限に抑えるために保有する必要があるマウス抗体からの必須フレームワーク残基を同定および選択することを必要とする。多くのＣＤＲコンホメーションおよび／または可変ドメイン間パッキングに最も影響を与え得る残基を同定するために、可変ドメインのＶＨ２／ＶＬ１対の３Ｄモデルを、自動化モードに設定した構造相同性モデリングサーバＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬ（Ａｒｎｏｌｄ  Ｋら、（２００６）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２２（２）：１９５−２０１；ｈｔｔｐ：／／ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ）を用いて計算した。モデル解析は、ＣＤＲ領域および／または重鎖−軽鎖可変ドメインパッキングに対する推定上の影響に基づく位置のサブセットの選択を可能にした。位置のこのサブセットは、可変重鎖中に見出された２６個の可能性のある復帰突然変異の中から選択され、位置：３７、５８、６０、６１、８５、８９および９１（Ｋａｂａｔナンバリング）からなった（表９）。
【０１３１】
【表９】
2020504105.tif 000012
【０１３２】
これらの単一の復帰突然変異に基づくさらなるヒト化候補を、標準的なＰＣＲ突然変異誘発および上記の方法を用いてＶＨ２／ＶＬ１抗体配列との関連において調製した。次いで、ヒト化抗体候補を、ＳＰＲによりその結合親和性について、およびＤＳＣによりＦａｂ熱安定性についてアッセイした。産生収率、結合親和性および熱アンフォールディングのＦａｂ中点温度を表１０に示す。試験した７つの抗体の中で、Ｎ５８Ｋ復帰突然変異は、良好なＦａｂ熱安定性および発現を維持しながら、親和性を顕著に改善した。その結果、ヒト化ＶＨ２−Ｎ５８Ｋ／ＶＬ１抗体をさらなる最適化のために選択した。
【０１３３】
【表１０】
2020504105.tif 000013
【０１３４】
潜在的な異性化部位の除去
７Ｈ１１  ＶＨ２  Ｎ５８Ｋの配列分析は、５４位および５５位（Ｋａｂａｔナンバリング）での７Ｈ１１  ＣＤＲＨ２における推定上のアスパラギン酸異性化部位（ＤＧ）の存在を強調している。異性化部位を除去するために、部位特異的突然変異誘発を行って、７Ｈ１１アスパラギン酸５４残基をグルタミン酸、セリンおよびスレオニンなどの負荷電または中性極性アミノ酸に、ならびに７Ｈ１１グリシン５５をアラニンに置き換えた。ＰＣＲアセンブリー法を用いて、突然変異Ｄ５４Ｅ、Ｄ５４Ｓ、Ｄ５４ＴおよびＧ５５Ａを７Ｈ１１  ＶＨのｃＤＮＡに導入した後、ＣＭＶプロモーターおよびウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを有する改変ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）に基づくベクターにライゲーションした。
【０１３５】
これらの方式を用いて、ヒト化７Ｈ１１  ＶＨ  Ｄ５４Ｅ（ヒト化７Ｈ１１−ＶＨ２  Ｎ５８Ｋ−Ｄ５４Ｅ）、７Ｈ１１  ＶＨ  Ｄ５４Ｓ（ヒト化７Ｈ１１−ＶＨ２  Ｎ５８Ｋ−Ｄ５４Ｓ）、７Ｈ１１  ＶＨ  Ｄ５４Ｔ（ヒト化７Ｈ１１−ＶＨ２  Ｎ５８Ｋ−Ｄ５４Ｔ）および７Ｈ１１  ＶＨ  Ｇ５５Ａ（ヒト化７Ｈ１１−ＶＨ２  Ｎ５８Ｋ−Ｇ５５Ａ）をコードするいくつかのベクターを産生した。ヒト化７Ｈ１１  ＶＨの親配列および変異体と７Ｈ１１軽鎖とをＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ１細胞に共トランスフェクトした。次いで、細胞上清をトランスフェクションの４日後に回収し、プロテインＡを用いてさらに精製した。試験した突然変異では、親抗体と比較して哺乳動物細胞での７Ｈ１１の発現が変化しなかった（表１０）。
【０１３６】
これらの突然変異により、抗体の熱安定性が変化し得るかどうかを決定するために、示差走査蛍光測定を行った。最初に、ＰＢＳ中の抗体を、２０μｌの最終容量で２５０μｇ／ｍｌの濃度でＳＹＰＲＯオレンジ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｅｃｕｂｌｅｎｓ、スイス）の１０倍濃縮液と混合した。次いで、タンパク質アンフォールディングを記録するために、試料をＲｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ  Ｑ  ２ｐｌｅｘ  ＨＲＭ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）中での温度の漸次的上昇に曝露した後、その蛍光が極性環境において消光されるが、アンフォールディングの際のタンパク質の疎水性コアなどの疎水性環境に曝露されたとき、蛍光シグナルを強く放出するＳＹＰＲＯオレンジ色素の存在下で熱アンフォールディングを行った。記録された蛍光シグナルは、７Ｈ１１の親型と突然変異型の両方に類似しており、これは、ヒト化７Ｈ１１  ＶＨに導入された突然変異により、抗体の熱安定性が変化しなかったことを示している（表１１）。
【０１３７】
最後に、表面プラズモン共鳴分析を先に記載した対照抗体変異体の親和性に適用した。表１１の結果は、７Ｈ１１に導入された突然変異により、抗体の親和性が変化しなかったことを示している。
【０１３８】
【表１１】
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【０１３９】
実施例５：マウス２Ｈ６抗体のヒト化および最適化
マウスモノクローナル２Ｈ６のヒト化
潜在的な翻訳後修飾を除去しながら、ヒトＣＤＲグラフト化アクセプターフレームワークの結合特性を実質的に保有するヒトアクセプターフレームワークおよび突然変異を選択することを含む、抗ヒトＯＸ４０マウス抗体２Ｈ６のヒト化について本明細書に記載する。
【０１４０】
２Ｈ６  ＣＤＲをグラフト化するために選択されたヒトアクセプターフレームワークは、２Ｈ６のヒト化版に最大の発現および／または安定性を付与するために選択された。アクセプターとして用いられるヒト重鎖および軽鎖可変配列（ＶＨおよびＶＬ）の選択は、（Ｅｗｅｒｔ  Ｓら、（２００３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ、３２５、５３１−５５３に示されるような）良好な生物物理学的特性および／または（Ｇｌａｎｖｉｌｌｅ  Ｊら、（１９９９）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ、１０６（４８）：２０２１６−２１；ＤｅＫｏｓｋｙ  ＢＪら（２０１５）Ｎａｔ  Ｍｅｄ、２１（１）：８６−９１に示されるような）天然の抗体レパートリー中に見出されるように対形成を有する生殖系列に基づくものであり得る。良好な対形成および／または安定性について当技術分野で公知のフレームワーク配列は、ヒトＩＧＨＶ３−２３＊０１（配列番号３３）およびＩＧＫＶ１−１６＊０１（配列番号３４）であり、これらを２Ｈ６ヒト化のためのアクセプターフレームワークとして使用した。
【０１４１】
ヒトガンマ１アイソタイプの第１のヒト化抗体を調製した。抗体は、ヒト−マウスハイブリッド重鎖可変ドメインおよびヒト−マウスハイブリッド軽鎖可変ドメインを包含していた。ハイブリッド重鎖可変ドメインは、生殖系列ＣＤＲＨ１およびＨ２が各々２Ｈ６  ＣＤＲＨ１およびＣＤＲＨ２に置き換えられているヒト重鎖可変ドメインＩＧＨＶ３−２３＊０１に基づいていた。ヒトアクセプターフレームワークと最もよく一致するＪＨセグメント配列を、相同性サーチを用いてＩＭＧＴデータベースから同定した。ヒトＩＧＨＶ３−２３＊０１フレームワーク領域、２Ｈ６マウスＣＤＲおよびヒトアクセプターと最もよく一致するＪＨを有する得られたヒト−マウスハイブリッド重鎖可変配列は、本明細書において配列番号３１を有する重鎖可変ドメインＶＨ１と称される。
【０１４２】
同様に、第１のヒト化抗体候補に用いたヒト−マウスハイブリッド軽鎖可変ドメインは、ヒトＩＧＫＶ１−１６＊０１フレームワーク領域、２Ｈ６マウスＣＤＲおよびヒトアクセプターと最もよく一致するＪＫを有し、本明細書において配列番号３２を有する軽鎖可変ドメインＶＬ１と称される。ＶＨ１およびＶＬ１を包含する第１のヒト化抗体は、本明細書において２Ｈ６  ＶＨ１／ＶＬ１抗体と略記される。
【０１４３】
ヒト化２Ｈ６  ｓｃＦｖ−Ｆｃの産生
ＶＨ１およびＶＬ１のコードＤＮＡ配列（ｃＤＮＡ）をＧＥＮＥＡＲＴ  ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、ドイツ）によりｓｃＦｖフォーマットに合成し、それにより、単一ＤＮＡ配列が両方の可変ドメイン（配列番号３５）を包含することを可能にした。ｓｃＦｖ  ｃＤＮＡを、先に記載した改変ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）に基づくベクターにライゲーションした。ｓｃＦｖ−Ｆｃ特異的ベクターは、ＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩ制限酵素部位を用いて、ヒトＩＧＨＧ１ヒンジ領域、ＩＧＨＧ１  ＣＨ２およびＩＧＨＧ１  ＣＨ３定常ドメインをコードするｃＤＮＡ配列の前に目的のｓｃＦｖ  ｃＤＮＡをライゲーションすることを可能にするように改変された。分泌は、ＢａｍＨＩ部位を含有するマウスＶＪ２Ｃリーダーペプチドにより誘導された。人工グリシン−スレオニンリンカーを、ＫｐｎＩ部位を含有するｓｃＦｖのＣ末端部分に導入した。
【０１４４】
先に記載したようにｓｃＦｖ−Ｆｃベクターを懸濁順化ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ１細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）カタログ番号：ＣＲＬ−１０８５２）にトランスフェクトすることにより、ｓｃＦｖ−Ｆｃを一過的に産生した。次いで、ｓｃＦｖ−Ｆｃを、組換えプロテインＡストリームライン媒体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、スイス）を用いて無細胞上清から精製し、アッセイ前にリン酸緩衝生理食塩水に緩衝液交換した。ヒトおよびカニクイザルＯＸ４０への結合を、以下に記載する表面プラズモン共鳴により測定した。ＶＨ１およびＶＬ１を包含する２Ｈ６ヒト化ｓｃＦｖは２Ｈ６  ｓｃＦｖ１と略記される。
【０１４５】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によるヒトおよびカニクイザルＯＸ４０受容体細胞外ドメインに対するヒト化２Ｈ６  ｓｃＦｖ１−Ｆｃのキネティック結合親和性定数
キネティック結合親和性定数（ＫＤ）を、ＣＭ５チップ上に捕獲された組換えヒスチジン標識ヒトＯＸ４０受容体細胞外ドメインおよび組換えＦｃ融合カニクイザルＯＸ４０受容体細胞外ドメインならびに２Ｈ６  ｓｃＦｖ１−Ｆｃおよびマウスキメラ２Ｈ６  ｓｃＦｖ−Ｆｃを分析物として用いて測定した。測定をＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ−ＢＩＡｃｏｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）で室温にて行い、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００評価ソフトウェアで分析した。３５μｌの１：１Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（ＮＨＳ）／１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）溶液を注入することにより（ｖ／ｖ；５μｌ／分の流速；流路１、２、３および４）、ＣＭ５研究等級センサーチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、スイス；ＢＲ１００５３０）を活性化した。
【０１４６】
カニクイザルＯＸ４０Ｒ−Ｆｃを、酢酸緩衝液ｐＨ４．０（ＧＥ、ＢＲ−１００３−４９）中２５ｎＭの最終濃度まで希釈した後、流路２に１０μｌを注入することにより（１０μｌ／分）、予め活性化したＣＭ５センサーチップ上に固定化した。これは、６００応答単位（ＲＵ）にほぼ相当する。ヒトＯＸ４０Ｒ−Ｈｉｓを酢酸緩衝液ｐＨ４．０（ＧＥ、ＢＲ−１００３−４９）中２５ｎＭの最終濃度まで希釈した後、流路４に４５μｌを注入することにより（１０μｌ／分）、予め活性化したＣＭ５センサーチップ上に固定化した。これは、４００応答単位（ＲＵ）にほぼ相当する。次いで、３５μｌのエタノールアミン溶液を注入することにより（５μｌ／分）、ＯＸ４０Ｒ−ＣＭ５センサーチップを不活性化した。最後に、１０μｌのグリシン溶液（ＧＥ、ｒｅｆ．ＢＲ−１００３−５４；１０ｍＭ；ｐＨ１．５）を２回注入して、非架橋（ヒトおよびカニクイザル）ＯＸ４０Ｒ分子を放出させた。
【０１４７】
２Ｈ６  ｓｃＦｖ−Ｆｃを３０μｌ／分の流速で４つの流路（流路１および３は参照として用いられる）に異なる濃度（０．７８ｎＭ〜０．２μＭ）で注入した。各結合事象後、グリシン緩衝液ｐＨ１．５を３０秒間注入して（１０μｌ／分）、表面を再生した。
【０１４８】
測定（センサーグラム：ｆｃ２−ｆｃ１およびｆｃ４−ｆｃ３）は、物質移動ありの２：１二価分析物モデルに最もよく適合した。解離時間は少なくとも３００〜６００秒であった。カイ２値は、各点での実験データと参照データとの間の差の二乗和を表す；残差のプロットは、適合度における各点での実験データと参照データとの差を示す。カイ２と残差の両方の値を用いて、実験データと個々の結合モデルとの間の適合度の質を評価した。
【０１４９】
表１２に示す結果は、ヒト化２Ｈ６  ｓｃＦｖ１が、親マウス２Ｈ６  ｓｃＦｖよりもヒトおよびカニクイザルＯＸ４０に対して類似した親和性を有することを示している。
【０１５０】
【表１２】
2020504105.tif 000015
【０１５１】
ＪＨから除去された２Ｈ６  Ｍｅｔ
２Ｈ６  ｓｃＦｖの配列分析により、２Ｈ６  ＶＨ  ＪＨ領域における推定上の酸化部位（メチオニン１０８）の存在が強調された。この潜在的な酸化部位を除去するために、部位特異的突然変異誘発を行って、２Ｈ６  ＶＨメチオニン１０８残基をロイシンアミノ酸に置き換えた。ＰＣＲアセンブリー法を用いて、ＶＨ突然変異Ｍ１０８Ｌ（ｋａｂｂａｔナンバリング）を２Ｈ６  ｓｃＦｖのｃＤＮＡに導入した後、先に記載したように改変ｐｃＤＮＡ３．１ベクターに基づくベクターにライゲーションした。この方式を用いて、ヒト化２Ｈ６  ｓｃＦｖ  Ｍ１０８Ｌ（２Ｈ６  ｓｃＦｖ２と略記）をコードするベクターを産生した。２Ｈ６  ｓｃＦｖ−Ｆｃの親型および突然変異型を、先に記載したようにＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ１細胞にトランスフェクトした。次いで、細胞上清をトランスフェクションの４日後に回収し、プロテインＡを用いてさらに精製した。試験した突然変異では、親抗体と比較して哺乳動物細胞での２Ｈ６  ｓｃＦｖ−Ｆｃの発現が変化しなかった（表１３）。Ｍ１０８Ｌ突然変異により、ｓｃＦｖ熱安定性が変化し得るかどうかを決定するために、示差走査蛍光測定を先に記載したように行った。記録された蛍光シグナルは、２Ｈ６の親型と突然変異型の両方に類似しており、これは、Ｍ１０８Ｌ突然変異により、ｓｃＦｖの熱安定性が変化しなかったことを示している（表１２）。最後に、表面プラズモン共鳴分析を、先に記載したように２Ｈ６  ｓｃＦｖ２変異体の対照結合特性に適用した。図１の結果は、２Ｈ６  ｓｃＦｖに導入された突然変異により、その結合が変化しなかったことを示している。
【０１５２】
【表１３】
2020504105.tif 000016
【０１５３】
実施例７：四価抗ヒトＯＸ４０抗体の改変および産生
第１の四価分子
使用した四価フォーマットは、ｓｃＦｖが重鎖のＣ末端で（Ｇｌｙ４Ｔｈｒ）リンカーを介して結合するＩｇＧ全体である。２Ｈ６  ｓｃＦｖに融合した７Ｈ１１  ＩｇＧ１を有する四価抗体の産生のために、ヒト化７Ｈ１１−ＶＨ２  Ｎ５８Ｋ（配列番号２１）、ＶＬ１（配列番号１６）および２Ｈ６  ｓｃＦｖ１のコードＤＮＡ配列（ｃＤＮＡ）を、ＰＣＲにより増幅した後、先に記載した改変ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）に基づくベクターに消化およびライゲーションした。軽鎖特異的ベクターは、ＢａｍＨＩおよびＢｓｉＷＩ制限酵素部位を用いて、ヒトカッパ定常ドメインをコードするｃＤＮＡ配列の前に、目的のＶＬ  ｃＤＮＡをライゲーションすることを可能にするように改変された。重鎖特異的ベクターは、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩ制限酵素部位を用いて、ＩＧＨＧ１ヒンジ領域、Ｆｃ−ＦｃγＲ相互作用を低減するＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ二重突然変異を有する改変ＩＧＨＧ１  ＣＨ２ドメイン（ＬＡＬＡ、Ｅｕナンバリング、Ｈｅｚａｒｅｈ  Ｍら、（２００１）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７５：１２１６１−８）、およびそのＣ末端部分に（Ｇｌｙ４Ｔｈｒ）リンカーを有する改変ＩＧＨＧ１  ＣＨ３定常ドメインをコードするｃＤＮＡの前に、目的のＶＨ  ｃＤＮＡをライゲーションすることを可能にするように改変された。次いで、ＫｐｎＩおよびＮｏｔＩ制限酵素部位を用いて、重鎖特異的ベクターのＩＧＨＧ１  ＣＨ３定常ドメインおよび（Ｇｌｙ４Ｔｈｒ）リンカーの後に、目的のｓｃＦｖ  ｃＤＮＡをライゲーションした。重鎖と軽鎖の両方の発現ベクターにおいて、分泌は、ＢａｍＨＩ部位を含有するマウスＶＪ２Ｃリーダーペプチドにより誘導された。ＢｓｉＷＩ制限酵素部位はカッパ定常ドメインに位置しているが、ＳａｌＩ制限酵素部位は、ＩＧＨＧ１  ＣＨ１ドメイン中に見出される。グリシン−スレオニンリンカーは、ＫｐｎＩ部位を含有し、ＮｏｔＩ部位は、重鎖をコードする改変ｐｃＤＮＡ３．１ベクター中に見出されるウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルの前に存在する。
【０１５４】
先に記載したように、等量の７Ｈ１１ＶＬ１軽鎖およびＴｅｔｒａ−１重鎖ベクターを懸濁順化ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ１細胞に共トランスフェクトすることにより、この四価抗体（Ｔｅｔｒａ−１と略記）を一過的に産生した。四価抗体を、組換えプロテインＡストリームライン媒体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、スイス）を用いて無細胞上清から精製し、アッセイ前にリン酸緩衝生理食塩水に緩衝液交換した。
【０１５５】
最適化された７Ｈ１１×２Ｈ６四価抗体：
上記の四価分子において、ｓｃＦｖはＩｇＧのＣ末端に融合される。したがって、抗体の最後のＣ末端残基は、ＪＫ領域に天然に存在するリジンである。抗体のバイオロジーに影響を与え得る、循環中の四価分子のＣ末端リジンクリッピングを回避するために、部位特異的突然変異誘発を用いて、２Ｈ６  ｓｃＦｖのＣ末端リジンをロイシン残基に置き換えた。ＰＣＲアセンブリー法を用いて、ＶＬ突然変異Ｋ１０７Ｌ（Ｋａｂｂａｔナンバリング）を２Ｈ６  ｓｃＦｖのｃＤＮＡに導入した後、上記の四価抗体をコードするベクターにライゲーションした。四価抗体の親型および突然変異型を先に記載したようにＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ１細胞にトランスフェクトした。次いで、細胞上清をトランスフェクションの４日後に回収し、プロテインＡを用いてさらに精製した。試験した突然変異では、親抗体と比較して哺乳動物細胞での四価抗体の発現が変化しなかった（表１４）。Ｋ１０７Ｌ突然変異により、Ｃ末端ｓｃＦｖ熱安定性が変化し得るかどうかを決定するために、示差走査蛍光測定を先に記載したように行った。記録された蛍光シグナルは、２Ｈ６  ｓｃＦｖの親型と突然変異型の両方に類似しており、これはＫ１０７Ｌ突然変異により、ｓｃＦｖの熱安定性が変化しなかったことを示している（表１３）。
【０１５６】
【表１４】
2020504105.tif 000017
【０１５７】
四価抗体の最適化を終了するために、先に記載したように部位特異的突然変異誘発により、７Ｈ１１突然変異Ｄ５４Ｅ、２Ｈ６  ＶＨ突然変異Ｍ１０８ＬおよびＶＬ突然変異Ｋ１０７Ｌを、四価分子重鎖をコードするベクター（Ｔｅｔｒａ−６と略記）に導入した。前に示したように７Ｈ１１  ＶＬ１軽鎖およびＴｅｔｒａ−６重鎖ベクターを共トランスフェクトすることにより、Ｔｅｔｒａ−６を産生し、組換えプロテインＡストリームライン媒体を用いて無細胞上清から精製した。
【０１５８】
実施例８：四価抗ヒトＯＸ４０抗体のインビトロ特性評価
実施例８．１  Ｔｅｔｒａ−１およびＴｅｔｒａ−６は、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイで増殖作用を示す。
ＰＢＭＣを、ｆｉｃｏｌｌ密度勾配を用いて健康なドナーのクエン酸全血から単離した。単球を単球単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いてＰＢＭＣから単離し、５０ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ）および２０ｎｇ／ｍＬのｒｈＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ）で７日間培養して、これらを樹状細胞（ＤＣ）に分化した。樹状細胞の表現型を、ＣＤ１ｃ  ＡＰＣ（ｅＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）を用いてフローサイトメトリーにより実証した。７日目に、ＣＤ４  Ｔ細胞（同種ドナーから）をＥａｓｙＳｅｐキット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＰＢＭＣから単離した。ＣＤ４  Ｔ細胞（４００００細胞／ウェル）およびＤＣ（８０００細胞／ウェル）を、９６ウェル丸底プレート中の完全培地において８０ｎＭの抗体と６日間三連で共培養した。１３日目に、３Ｈ−チミジンを添加した（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、１ウェルあたり０．５μＣｉ）。パルスの２０時間後、細胞を採取し、取り込まれた放射能をＷａｌｌａｃベータ計数器で定量した。正規化された刺激指数（ＳＩ）を次式を用いて決定した：
（試料−Ｒｅｓｐのみ）／（Ａｌｌｏ−Ｒｅｓｐのみ）
「試料」は、ＤＣ＋ＣＤ４  Ｔ細胞＋試験した抗体を共培養した状態の数に相当する。「Ｒｅｓｐのみ」は、反応細胞（ＣＤ４  Ｔ細胞）のみを添加した状態の数に相当する。「Ａｌｌｏ」は、ＤＣ（刺激細胞）および同種ＣＤ４  Ｔ細胞（反応細胞）を共インキュベートした状態に相当する。データを、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ７ソフトウェアを用いて分析した；統計分析をマン−ホイットニー検定（ノンパラメトリック検定）またはウィルコクソンマッチドペア検定で行った。Ｐ＜０．０５は、統計的に有意とみなされた。
【０１５９】
ＯＸ４０Ｌ−Ｆｃは、Ｔ細胞表面でＯＸ４０に効率的に結合し、それを架橋することができる強力なアゴニスト分子である（Ｍｕｌｌｅｒ  ＦＥＢＳ  Ｊ．２００８年５月；２７５（９）：２２９６−３０４）。この特徴に従って、ＯＸ４０Ｌ−Ｆｃは、混合リンパ球反応を増加させることができた。このアッセイにおいて、Ｔｅｔｒａ−１とＴｅｔｒａ−６の両方で、ＯＸ４０Ｌ−Ｆｃと同様のレベルまで同種応答が増強された（これら３つの分子間の差は統計的に有意でなかった；図１）。同じ実験で試験したＴｅｔｒａ−１およびＴｅｔｒａ−６のＳＩを比較するウィルコクソンマッチドペア検定から、これらの２つの四価分子では同様に増殖が改善されたことが分かった（データは図示せず）。したがって、これらの結果は、Ｔｅｔｒａ−１およびＴｅｔｒａ−６でＯＸ４０を標的化することで、当該免疫刺激可能性が得られることを強調している。
【０１６０】
実施例８．２  Ｔｅｔｒａ−１およびＴｅｔｒａ−６は、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ刺激アッセイにおいて強い免疫刺激作用を誘導する。
末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）を、ｆｉｃｏｌｌ密度勾配分離を用いてＬａ  Ｃｈａｕｘ−ｄｅ−Ｆｏｎｄｓ  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒから得た血液フィルターから採取した。ＰＢＭＣ（１０５）を９６ウェル丸底プレートに三連で分配した。ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）を５０または１００ｎｇ／ｍＬの最終濃度（準最適な濃度）で、および抗体を８０ｎＭの最終濃度でウェルに添加した。プレートをＣＯ２インキュベータ中３７℃で７日間インキュベートした。５日目に、培養上清中でのＩＬ−２産生を、ＰｒｏｃａｒｔａＰｌｅｘキット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてＬｕｍｉｎｅｘで測定した。７日目に細胞を採取し、抗ヒトＣＤ４  ＥＣＤおよび抗ヒトＣＤ２５  Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ（ｅＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）で標識した。染色した細胞を１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ＣｙｔｏＦＬＥＸ  Ｓ（Ｂｅｃｋｍａｎ）でのフローサイトメトリーにより分析した。フローサイトメトリーデータをＣｙｔＥｘｐｅｒｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ）を用いて分析した。ゲーティング戦略は、生細胞（ＦＳＣおよびＳＳＣプロットに基づく）、ＣＤ４陽性細胞およびその後ＣＤ４＋ＣＤ２５＋にゲートをかけることに存する。目的のこのサブセット内の１ウェルあたりの細胞総数を、次式を用いて計算した：
（再懸濁した細胞に用いた容量＊ゲートにおける事象の数）／得られた試料容量
【０１６１】
各データ点は、ＰＢＭＣをＳＥＢのみ（抗体なし）とインキュベートした状態に正規化された。データをＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ７ソフトウェアを用いて分析し、統計的分析をマン−ホイットニー検定（ノンパラメトリック検定）で行った。Ｐ＜０．０５は統計的に有意とみなされた。
【０１６２】
このアッセイにおいて、Ｔｅｔｒａ−１は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の数を顕著に増加でき（試験したドナーの９１％が、ＳＥＢのみと比較して１．２倍誘導に到達した；閾値は任意に定義された）、ＯＸ４０Ｌ−ＦｃおよびＴｅｔｒａ−６は、比較的程度は低いが増加できた（各々６７％および８８％）。ＣＤ２５の発現により、活性化Ｔ細胞が定義される。ＣＤ４  Ｔ細胞を発現するＣＤ２５の増加は、Ｔ細胞活性化の増加および／または活性化Ｔ細胞の増殖の増加によるものであり得る。同様に、Ｔｅｔｒａ−１、Ｔｅｔｒａ−６およびＯＸ４０Ｌ−Ｆｃの添加もＳＥＢのみと比較してＩＬ−２の産生を実質的に増強した。ＩＬ−２産生でも、Ｔ細胞活性化が示され、これは、Ｔ細胞の増殖に直結する。実験のこの読み出しでおよび実験のこの段階（５日目）で３つの分子間での統計的差異はなかった。
【０１６３】
概して、このスーパー抗原媒介ＰＢＭＣ刺激でＯＸ４０を標的化することで、サイトカイン産生の増強（ＩＬ−２）またはＴ細胞活性化の増強（ＣＤ２５）により可視化されるように、Ｔ細胞応答が著しく改善された。
【０１６４】
実施例８．３  Ｔｅｔｒａ−１は、ＰＨＡ刺激アッセイにおいて強い免疫刺激作用を示す。
ＰＢＭＣをＳＥＢアッセイと同じ方法で調製した。ＰＢＭＣ（１０５）を９６ウェル丸底プレートに三連で分配した。ＰＨＡを２または１μｇ／ｍＬの最終濃度で、および抗体を８０ｎＭの最終濃度で添加した。プレートをＣＯ２インキュベータ中３７℃で７日間インキュベートした。アッセイ開始の６日後、細胞を１ウェルあたり０．５μＣｉの３Ｈ−チミジン（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）でパルスした。パルスの２０時間後、細胞を採取し、取り込まれた放射能をＷａｌｌａｃベータ計数器で定量した。刺激指数を、次式を用いて決定した：
試料／ＰＨＡのみ
「試料」は、ＰＢＭＣ＋ＰＨＡ＋試験した抗体の状態の数に相当する。「ＰＨＡのみ」は、ＰＢＭＣをＰＨＡのみ（抗体なし）で培養した状態の数に相当する。各データ点は、ＰＢＭＣをＰＨＡのみ（抗体なし）とインキュベートした状態に正規化された。データを、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ７ソフトウェアを用いて分析した。統計分析をマン−ホイットニー検定（ノンパラメトリック検定）で行った。Ｐ＜０．０５は、統計的に有意とみなされた。
【０１６５】
このアッセイにおいて、Ｔｅｔｒａ−１およびＴｅｔｒａ−６は、ＰＨＡの準最適な濃度に応答して細胞増殖を増加させた。顕著な差異はＴｅｔｒａ−１とＴｅｔｒａ−６とＯＸ４０Ｌ−Ｆｃの間で検出されなかった。
【０１６６】
実施例９：ジスルフィド結合安定化Ｔｅｔｒａ−８分子の産生
Ｔｅｔｒａ−６分子をさらに増強するために、ＶＨ突然変異Ｍ１０８ＬおよびＶＬ突然変異Ｋ１０７Ｌを有する２Ｈ６  ｓｃＦｖは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にジスルフィド結合を導入することによりその安定性を増加させるように改変された（Ｒｅｉｔｅｒ  Ｙら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１４（１０）：１２３９−４５、１９９６年１０月）。ＰＣＲアセンブリー法を用いて、ＶＨ  Ｇ４４ＣおよびＶＬ  Ｑ１００Ｃ突然変異を、突然変異２Ｈ６  ｓｃＦｖのｃＤＮＡに導入した後、新しい四価分子重鎖をコードするベクター（Ｔｅｔｒａ−８と略記）にライゲーションした。次いで、先に記載したように７Ｈ１１  ＶＬ１軽鎖（配列番号１６）およびＴｅｔｒａ−８重鎖（配列番号４５）ベクターを共トランスフェクトすることにより、Ｔｅｔｒａ−８を産生した。プロテインＡの精製後、分子を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図５）およびＳＥＣ−ＨＰＬＣ（図６）により分析した。いずれの分析法でも、四価分子のジスルフィド結合改変により、共有結合多量体の形成が誘導されることが分かった。単量体から多量体を分離するために、さらなるカチオン交換精製工程を行った。簡単に言えば、最初に、ＨｉＴｒａｐ  ＳＰ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、スイス）を、５０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．５緩衝液を用いて平衡化した。次いで、タンパク質試料を充填し、分子を、５０ｍＭ酢酸ナトリウム＋１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．５の勾配５％〜２０％および１００％を用いて分離した（図７）。次いで、単量体型のＴｅｔｒａ−８を含有する分画をプールし、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ、ＵＳＡ）に対して緩衝液交換を行った。最後に、単量体Ｔｅｔｒａ−８の熱安定性を示差走査熱量測定（ＤＳＣ）で評価し、Ｔｅｔｒａ−１と比較した（図８）。Ｔｅｔｒａ−８における突然変異２Ｈ６  ｓｃＦｖドメインの熱安定性の明らかな増加（３℃）が測定され、これは、ジスルフィド結合改変が、２Ｈ６  ｓｃＦｖの溶融温度を効率的に上昇させていることを示している。
【０１６７】
Ｔｅｔｒａ−８抗体の生物物理学的特性評価
Ｔｅｔｒａ−８における２Ｈ６  ｓｃＦｖ結合剤の親和性をＢｉａｃｏｒｅにより決定した。正確な測定を可能にするために、Ｔｅｔｒａ−８分子を、ＦａｂＡＬＡＣＴＩＣＡプロテアーゼ（Ｇｅｎｏｖｉｓ  ＡＢ、Ｌｕｎｄ、スウェーデン）で消化して、７Ｈ１１  Ｆａｂを除去した。簡単に言えば、最初に、Ｔｅｔｒａ−８分子に、１５０ｎＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０中での緩衝液交換を行った後、抗体１μｇあたり１ＦａｂＡＬＡＣＴＩＣＡ単位を添加した。抗体／プロテアーゼ混合物を３７℃で一晩インキュベートした。次いで、この物質を、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＦｃＸＬ親和性マトリックス樹脂（ＴｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いてさらに精製して、Ｆｃ−２Ｈ６  ｓｃＦｖ断片を捕獲しながら、７Ｈ１１  Ｆａｂおよびプロテアーゼを混合物から除去した。樹脂をＰＢＳで洗浄し、次いで、特定のＦｃ−２Ｈ６断片を０．１ＭグリシンｐＨ３．０で溶出し、最終的にＰＢＳ、ｐＨ７．４に配合した。ＣＭ５チップ上に固定化された抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃを用いて、Ｆｃ−２Ｈ６断片６００ＲＵを捕獲することにより、およびＯＸ４０−ＣＲＤ−Ａｖｉ−ｈｉｓ（配列番号１５９）の希釈系列を３０μｌ／分の流速でＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ、Ｃａｔ．Ｎｏ：ＢＲ１００１〜８８）に注入することにより、キネティックを測定した。各結合事象後、表面を１０μｌのＭｇＣｌ２（３Ｍ）緩衝液で再生した。実験データを、局所Ｒｍａｘを伴う１：１Ｌａｎｇｍｕｉｒモデルを用いて処理した。解離時間は約７分であった。Ｔｅｔｒａ−８分子のＣ末端に融合した２Ｈ６  ｓｃＦｖ（ＶＨ／Ｍ１０８Ｌ−ＶＬ／Ｋ１０７Ｌ−ジスルフィド改変）の測定された親和性は６０ｎＭであり、これはヒト化２Ｈ６  ｓｃＦｖ１−Ｆｃと比較して２倍喪失を表しているにすぎず（表６）、２Ｈ６の結合アームが機能的であることを示している。
【０１６８】
抗ＯＸ４０抗体
Ｔｅｔｒａ−８アゴニスト活性を評価するために、いくつかの公知のアゴニスト抗ＯＸ４０を産生した。１１Ｄ４  ＩｇＧ２（米国特許第２０１２／０２２５０８６Ａ１号）、９Ｂ１２  ＩｇＧ１（ＯＸ４０ｍａｂ２４、米国特許第２０１６／０１３７７４０Ａ１号）、１０６−２２２  ＩｇＧ１（米国特許第２０１６／００６８６０４Ａ１号）、１Ａ７  ＩｇＧ１（国際公開第２０１５／１５３５１３Ａ１号）およびｐａｂ１９４９（米国特許第２０１６／０３４７８４７Ａ１号）の重鎖および軽鎖配列を各特許出願から検索し、ｃＤＮＡとしてＧｅｎｅａｒｔ  ＡＧ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ、ＵＳＡ）により遺伝子合成した。次いで、重鎖および軽鎖配列を、先に記載したように改変ｐｃＤＮＡ３．１ベクターに基づく独立のベクターにライゲーションした。各抗体の各重鎖および軽鎖をコードするベクターを、先に記載したようにＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ１細胞に共トランスフェクトした（表１５）。次いで、細胞上清をトランスフェクションの４日後に回収し、プロテインＡを用いてさらに精製した。Ｔｅｔｒａ−ｈｚＧ３Ｖ９、Ｔｅｔｒａ−ｈｚ１Ｄ１０ｖ１、Ｈｅｘａ−ｈｚＧ３Ｖ９およびＨｅｘａ−ｈｚ１Ｄ１０ｖ１（国際公開第２０１７／１２３６７３Ａ２号）のドメイン抗体（ｄＡｂ）配列もＧｅｎｅａｒｔ  ＡＧにより遺伝子合成した後、改変ｐｃＤＮＡ３．１ベクターの突然変異ＩｇＧ１  Ｆｃ配列（ＬＡＬＡ）とインフレームでクローニングした。次いで、各分子をコードするベクターを、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ１細胞に単独でトランスフェクトし、上清を回収した後、プロテインＡで精製した。最後に、７Ｈ１１−ＶＨ２  Ｎ５８Ｋ−Ｄ５４Ｅを、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ１  ＬＡＬＡ配列とインフレームでクローニングし、７Ｈ１１  ＩｇＧ１またはＩｇＧ１  ＬＡＬＡの産生のために７Ｈ１１  ＶＬ１に結合させた（表ｘ）。２Ｈ６  ｓｃＦｖ１を、ＩｇＧ１−Ｆｃ  ＬＡＬＡドメインとインフレームでクローニングし、２Ｈ６  ｓｃＦｖ−Ｆｃ  ＬＡＬＡを産生した。２Ｈ６  ＶＨ１を、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ１  ＬＡＬＡ配列とインフレームでクローニングした。これらの配列を２Ｈ６  ＬＣと共トランスフェクトして、２Ｈ６  ＩｇＧ１およびＩｇＧ１  ＬＡＬＡを産生した（表１５）。
【０１６９】
【表１５】
2020504105.tif 000018
【０１７０】
抗体エピトープマッピングのためのキメラＯＸ４０分子
ＯＸ４０は、その細胞外部分におけるシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）として定義される４つのドメインの存在により特徴付けられるＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーである（図９）。アンタゴニスト抗体により標的化されるドメインを決定するために、ＯＸ４０キメラは、エピトープマッピングのためのツールとして用いられるように設計および発現されねばならない。ヒト、ラットおよびカニクイザルＯＸ４０の細胞外ドメインの配列をＵｎｉｐｒｏｔデータベースから検索し（各々配列番号１、１２１、１２２）、Ｇｅｎｅａｒｔにより遺伝子合成した後、Ｆｃ融合タンパク質としてクローニングした（各々配列番号１２３、１２４、１２５）。これらの構築物をＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ１細胞に発現させ、プロテインＡを用いて精製した。次いで、ヒトおよびラットＯＸ４０−Ｆｃを、ＥＬＩＳＡおよびＢｉａｃｏｒｅで試験して、抗体交差反応性を決定した。ＥＬＩＳＡ用に、９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ  ＵＳＡ、流通業者ＶＷＲ  ＡＧ、Ｎｙｏｎ、スイス）を、ＰＢＳ中２μｇ／ｍｌでの１００μｌの組換えヒトまたはラットＯＸ４０−Ｆｃでコートした。プレートを４℃で一晩インキュベートし、次いでＰＢＳ２％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン、ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐａｓｃｈｉｎｇ、オーストリア）を用いて室温（ＲＴ）にて１時間遮断した。遮断液を除去し、精製された抗体をＰＢＳ２％ＢＳＡ中１０μｇ／ｍｌで添加した。プレートをＲＴで１時間インキュベートし、次いでＰＢＳ０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ、Ｂｕｃｈｓ、スイス）で５回洗浄した。ヒトＦａｂを有する組換え抗体を検出するために、ＰＢＳ２％ＢＳＡ中１：２０００で希釈したペルオキシダーゼ複合ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆａｂ断片特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、１０９−０３５−００６）を検出抗体として使用した。プレートをＲＴにて１時間インキュベートし、ＰＢＳ０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０で５回洗浄し、ＴＭＢ基質（Ｂｉｏ−ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＡＧ、Ｒｅｉｎａｃｈ、スイス）をプレートに添加した。Ｈ２ＳＯ４を添加することにより５分後に反応を停止した。次いで、吸光度を４５０ｎｍにてマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ、ＵＳＡ；流通業者：ＷＩＴＴＥＣ  ＡＧ、Ｌｉｔｔａｕ、スイス）で読み取った。Ｂｉａｃｏｒｅ実験を、ｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質であるＨｅｘａ−ｈｚＧ３Ｖ９およびＨｅｘａ−ｈｚ１Ｄ１０ｖ１で特異的に行った。簡単に言えば、５μｌのＴｅｔｒａ−ｈｚ１Ｄ１０ｖ１（５μｇ／ｍＬ）を、１０μｌ／分の流速で流路２に注入することにより、予め活性化したＣＭ５センサーチップ上に固定化した。これは、２０６ＲＵにほぼ相当する。同様に１５μｌのＴｅｔｒａ−ｈｚＧ３Ｖ９（５μｇ／ｍＬ）を１０μｌ／分の流速で流路４に注入した。これは、２５１ＲＵにほぼ相当する。これらのタンパク質を、２００ｎＭの濃度および３０μＬ／分の流速で４つの流路（流路１および３は参照として用いられる）に２４０秒間連続注入することにより、ヒトおよびカニクイザルＯＸ４０−Ｆｃ分子の結合を決定した。２つの注入物間での���生を、３Ｍ  ＭｇＣｌ２を用いて３０μＬ／分で６０秒間行った。これらの２つの方式を用いて、ヒト／ラットＯＸ４０の結合を評価した（表１６）。
【０１７１】
【表１６】
2020504105.tif 000019
【０１７２】
これらの実験で、これらの抗体のほとんど（１Ａ７を除く）が、ラットＯＸ４０との交差反応性を欠くことが明確に実証され、これは、このタンパク質が、エピトープマッピングのためのヒトＯＸ４０配列を有するキメラを産生するために使用できることを示している。
【０１７３】
エピトープマッピング
ヒト（配列番号１）、カニクイザル（配列番号１２２）およびラット（配列番号１２１）ＯＸ４０細胞外ドメインの配列アライメントをＴ−ｃｏｆｆｅｅ（Ｎｏｔｒｅｄａｍｅ  Ｃ．ら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、３０２（２０５−２１７）２０００）で行った（図１０）。ＣＲＤをＯＸ４０の配列におけるジスルフィド結合パターンに基づき同定した。以下のＣＲＤ：ヒトＣＲＤ１、ＣＲＤ２、ＣＲＤ３およびラットＣＲＤ４（ＨＨＨＲ）（配列番号１２６）；ヒトＣＲＤ１、ＣＲＤ２、ラットＣＲＤ３およびヒトＣＲＤ４（ＨＨＲＨ）（配列番号１２７）；ヒトＣＲＤ１、ＣＲＤ２、ラットＣＲＤ３、ＣＲＤ４（ＨＨＲＲ）（配列番号１２８）；ヒトＣＲＤ１、ラットＣＲＤ２、ＣＲＤ３、ＣＲＤ４（ＨＲＲＲ）（配列番号１２９）；ラットＣＲＤ１、ＣＲＤ２、ヒトＣＲＤ３、ＣＲＤ４（ＲＲＨＨ）（配列番号１３０）；ラットＣＲＤ１、ヒトＣＲＤ２、ラットＣＲＤ３、ＣＲＤ４（ＲＨＲＲ）（配列番号１３１）を混合することにより、ヒト／ラットＯＸ４０キメラの理論的配列を確立した。次いで、設計された配列をＧｅｎｅａｒｔ  ＡＧにより遺伝子合成し、得られたｃＤＮＡを改変ｐｃＤＮＡ３．１ベクターにヒトＩｇＧ１−Ｆｃ領域とインフレームでクローニングした。次いで、タンパク質を、先に記載したように産生および精製した。次いで、これらの分子を、先に記載したＥＬＩＳＡおよびＢｉａｃｏｒｅ実験で用いて、これらの抗体により標的化されるＯＸ４０ドメインを決定した。結果は表１７に要約されている。
【０１７４】
【表１７】
2020504105.tif 000020
【０１７５】
ＯＸ４０キメラを用いて、７Ｈ１１および１１Ｄ４が、主としてＯＸ４０  ＣＲＤ１に結合していることを見出した。９Ｂ１２および１０６−２２２は主としてＯＸ４０  ＣＲＤ２に結合している。２Ｈ６およびｐＡＢ１９４９は主としてＣＲＤ３に結合している。ｈｚＧ３Ｖ９および１Ｄ１０ｖ１  ｄＡｂは主としてＣＲＤ４に結合している。１Ａ７はラットＯＸ４０と交差反応するので、この抗体のエピトープは特性評価されなかった。
【０１７６】
実施例１０：ｔｅｔｒａ−８のインビトロ生物学的特性評価
１０．１  Ｔｅｔｒａ−８はＯＸ４０に特異的に結合する。
可溶性ＯＸ４０に対するＴｅｔｒａ−８の結合活性を直接ＥＬＩＳＡ、次いで実施例３に上述される方法により評価した。簡単に言えば、Ｔｅｔｒａ−８を、様々な濃度（１０〜０．０００１７μｇ／ｍｌの範囲）で、ＰＢＳ中２μｇ／ｍｌで希釈した組換えヒトＯＸ４０  Ｈｉｓタンパク質（ＯＸ４０−ｈｉｓタンパク質の産生については実施例１参照）で一晩プレコートした９６ウェルマイクロタイタープレートで試験した。Ｔｅｔｒａ−８の２つの結合単位を個々に試験するために、７Ｈ１１＿ｖ８  ＩｇＧ１およびＴｅｔｒａ−２２分子を同じアッセイに含めた。以下に記載されるようにＴｅｔｒａ−２２は、２Ｈ６  ＳｃＦｖがＣ末端に融合されている無関係なＩｇＧ１  ＬＡＬＡからなる対照分子である。図１１の結果から、Ｔｅｔｒａ−８、７Ｈ１１＿ｖ８  ＩｇＧ１およびＴｅｔｒａ−２２分子が、同等の結合プロファイルを有する組換えヒトＯＸ４０タンパク質を認識することが分かる。
【０１７７】
膜結合ＯＸ４０に対するＴｅｔｒａ−８の結合を、ＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ（商標）ＮＦｋＢ  ｌｕｃ２／ＯＸ４０−ジャーカット細胞株（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてフローサイトメトリーにより評価した。簡単に言えば、細胞を採取し、計数し、９６ウェル丸底プレートに１０００００細胞／ウェルで撒いた。プレートを３５０ｇで３分間遠心分離し、細胞を様々な濃度（１００〜０．０００５６ｇ／ｍｌの範囲）のＴｅｔｒａ−８、７Ｈ１１＿ｖ８  ＩｇＧ１または２Ｈ６  ＩｇＧ１抗体のいずれかを含有する５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋１０％バーゼン液＋２％ＦＢＳ）に再懸濁した。染色した細胞を４℃で２０分間インキュベートし、３５０ｇでＦＡＣＳ緩衝液を用いて３分間２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液で希釈した１００ｌの抗ヒトＩｇＧ  ＰＥ第２抗体（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｃｈｅｒ）に再懸濁した。次いで細胞を２回洗浄し、２００ｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、試料をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ装置（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｌｌｓｃｈｗｉｌ、スイス）上に得た。細胞に、サイズに基づきＦＳＣ対ＳＳＣでゲートをかけ、ＰＥ−幾何平均蛍光強度についてＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて分析した。図１２に示すように、Ｔｅｔｒａ−８、７Ｈ１１＿ｖ８  ＩｇＧ１および２Ｈ６  ＩｇＧ１抗体は、トランスフェクトしたジャーカット細胞に発現する膜結合ＯＸ４０を認識する。また、３つの分子を製造業者の指示書（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｃｈｅｒ）に従ってＡＦ６４７色素で直接標識した後、様々なレベルのＯＸ４０を発現する他の細胞への結合について評価した。すべての試験した分子および細胞株のＫＤ値は、表１８に要約されている。
【０１７８】
【表１８】
2020504105.tif 000021
【０１７９】
ＯＸ４０へのＴｅｔｒａ−８の選択的結合をさらに実証するために、直接ＥＬＩＳＡを他のＴＮＦＲメンバーに対して行った。実験を先に記載したのと同じプロトコルに従って行った。このアッセイにおいて、Ｔｅｔｒａ−８の連続希釈（１０〜０．０００１μｇ／ｍｌの範囲）を組換えＢＡＦＦ、ＣＤ４０、ＤＲ３、ＤＲ６、ＧＩＴＲおよびＴＷＥＡＫ分子（Ｒ＆Ｄ）に対して試験した。これらの分子すべてを、４℃でＰＢＳ中２μｇ／ｍｌで一晩コートした。図１３の結果から、Ｔｅｔｒａ−８がＯＸ４０分子に選択的に結合し、そのアミノ酸配列と最大４０％の同一性を示すものを含む、ＴＮＦＲファミリーの他のメンバーを認識しないことが分かる。
【０１８０】
１０．２  Ｔｅｔｒａ−８はその２Ｈ６部分を介してカニクイザルＯＸ４０に結合する。
Ｔｅｔｒａ−８とカニクイザル０Ｘ４０との交差反応性を評価するために、直接ＥＬＩＳＡを先に記載したプロトコルに従って行った。このアッセイにおいて、Ｔｅｔｒａ−８およびリツキシマブ−２Ｈ６（Ｔｅｔｒａ−２２と同等の対照分子であり、無関係なＩｇＧ１  ＬＡＬＡ部分がリツキシマブからのものである）は、組換えカニクイザルＯＸ４０タンパク質に結合するが、７Ｈ１１＿ｖ８  ＩｇＧ１は結合しない（図１４）。これらのデータは、Ｔｅｔｒａ−８が、その２Ｈ６部分を介してカニクイザルＯＸ４０を認識することを実証している。ヒトおよびカニクイザルＯＸ４０に対する結合活性およびＥＣ５０値の結果は表１９に要約されている。
【０１８１】
【表１９】
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【０１８２】
Ｔｅｔｒａ−８とカニクイザルＯＸ４０との交差反応性をフローサイトメトリーによりさらに実証した。この手順において、商業的供給源（Ｓｉｌａｂｅ）からのカニクイザルＰＢＭＣをｃＲＰＭＩに希釈し、ＣＯ２インキュベータ中３７℃で５μｇ／ｍｌのＰＨＡの存在下で１×１０６細胞／ｍｌでＴ−２５フラスコに撒いた。同じ実験を、先に記載したように単離したヒトＰＢＭＣを用いて行った。２日後、活性化細胞を採取し、抗ヒトＣＤ４  ＡＰＣ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｃｈｅｒ）で標識した。その後、Ｔｅｔｒａ−８、７Ｈ１１＿ｖ８  ＩｇＧ１または２Ｈ６  ＩｇＧ１抗体のいずれかで染色し、次いで、抗ヒトＩｇＧ  ＰＥ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｃｈｅｒ）で検出した。染色した細胞を洗浄し、１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ＣｙｔＥｘｐｅｒｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ）を用いてフローサイトメトリーにより分析した。ゲーティング戦略は、生細胞（ＦＳＣおよびＳＳＣプロットに基づく）およびＣＤ４陽性細胞にゲートをかけることに存する。図１５の結果から、Ｔｅｔｒａ−８、２Ｈ６  ＩｇＧ１が、ＣＤ４陽性細胞上に発現した膜結合カニクイザルＯＸ４０に結合するが、７Ｈ１１＿ｖ８  ＩｇＧ１は結合しないことが分かる。これらのデータから、Ｔｅｔｒａ−８のカニクイザル交差反応性が、その２Ｈ６部分により媒介されることが確認される。
【０１８３】
１０．３  Ｔｅｔｒａ−８は、ＦｃγＲ非依存的にＯＸ４０−ＮＦｋＢルシフェラーゼレポーター細胞株の顕著な活性化を誘導する。
ＯＸ４０−シグナル伝達を活性化するＴｅｔｒａ−８の可能性を評価するために、ルシフェラーゼアッセイを、製造業者の指示書（Ｐｒｏｍｅｇａ）に従って、ＯＸ４０を発現するＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ（商標）ＮＦｋＢ  ｌｕｃ２／ＯＸ４０−ジャーカット細胞株を用いて行った。簡単に言えば、ジャーカットＮＦｋＢを採取し、計数し、完全ＲＰＭＩ培地（ＲＰＭＩ  １６４０＋１０％ＦＢＳ＋１％ＮＥＡＡ＋１％ＮａＰｙｒ＋ハイグロマイシン５００μｇ／ｍｌ＋Ｇ４１８  ８００μｇ／ｍｌ）に２×１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。５０μｌの細胞を９６ウェル発光プレートに分配し、３７℃、５％ＣＯ２で、アッセイ培地（ＲＰＭＩ  １６４０＋％ＦＢＳ）で連続希釈した２５μｌのＴｅｔｒａ−８、７Ｈ１１  ＩｇＧ１  ＬＡＬＡまたは２Ｈ６  ＩｇＧ１  ＬＡＬＡいずれかとインキュベートした。並行して、５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３クローン）を９６ウェル発光プレート上に固定化することにより、ＴＣＲ刺激を加えた状態でこれらの分子を試験した。５時間後、７５μｌのＢｉｏ−Ｇｌｏ溶液をウェルに添加し、すべてのプレートのシグナルを発光マイクロプレートリーダー（Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴ２−分光光度計、Ｂｉｏｔｅｋ）で読み取った。ルシフェラーゼアッセイを、任意の架橋条件なしで、すなわち、第２の抗体またはＦｃγＲを発現する細胞の不在化で行った。図１６に示すように、Ｔｅｔｒａ−８は、２つの異なる実験設定（ＴＣＲ刺激ありまたはなし）でＯＸ４０  ＮＦｋＢルシフェラーゼレポータージャーカット細胞株の用量依存的活性化を誘導し、その個々の結合単位（７Ｈ１１  ＩｇＧ１  ＬＡＬＡおよび２Ｈ６  ＩｇＧ１  ＬＡＬＡ）よりも高いＯＸ４０シグナル伝達を促進する。重要なことに、Ｔｅｔｒａ−８をＡＤＣＣアッセイでさらに試験すると、予想通り、顕著な活性が示されなかった（データは図示せず）。これらのデータは、Ｔｅｔｒａ−８と、Ｆｃ  Ｒ媒介架橋を介してその活性を示すことが示されている他のモノクローナルＯＸ４０アゴニスト抗体との間の重要な相違を強調している。
【０１８４】
１０．４  Ｔｅｔｒａ−８は、ＭＬＲアッセイにおいてＴ細胞同種活性を増加させる。
ＭＬＲアッセイは、一般に、同種Ｔ細胞応答を増強する、ＯＸ４０などの共刺激分子を標的化する免疫調節剤の可能性を評価するために用いられる（Ｋｅｌｉ  Ｌ．Ｈｉｐｐｅｎら、Ｂｌｏｏｄ  ２００８）。Ｔ細胞応答を増強するＴｅｔｒａ−８の可能性を評価するために、同種ＭＬＲアッセイを実施例３に記載のプロトコルに従って行った。このアッセイにおいて、Ｔｅｔｒａ−８を６つの異なる濃度（１６０〜０．００１ｎＭの範囲）で試験し、ＯＸ４０Ｌを８０および１０ｎＭで試験した。図１７に示す結果から、Ｔｅｔｒａ−８がＭＬＲアッセイにおいて同種反応性Ｔ細胞の増殖を強力かつ顕著に増強する（２倍〜３倍）ことが分かる。この作用は用量依存的であり、表２０に要約されているようにＯＸ４０Ｌよりもさらにより強力である。
【０１８５】
【表２０】
2020504105.tif 000023
【０１８６】
１０．５  Ｔｅｔｒａ−８は、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ刺激アッセイにおいて強力な免疫刺激作用を誘導する。
ＳＥＢ刺激アッセイも、Ｔ細胞応答を増強する、ＯＸ４０およびＴＮＦＲファミリーの他のメンバーを標的化する免疫調節剤の可能性を評価するために広く用いられている。プロトコルが実施例８．２に記載されているこのアッセイを用いて、Ｔｅｔｒａ−８の機能的活性を評価した。Ｔｅｔｒａ−８を８０〜０．０１ｎＭの範囲の様々な濃度で試験した。図１８に示すように、ヒトＰＢＭＣのＴｅｔｒａ−８とのインキュベーションは、ＳＥＢ抗原に応答してＴ細胞の増殖活性を大幅に増加させる。Ｔｅｔｒａ−８はまた、８０および１０ｎＭで用いた他のモノクローナル抗ＯＸ４０アゴニストと比較して試験された。図１９の結果から、同じＳＥＢアッセイで試験した７Ｈ１１＿ｖ８  ＩｇＧ１、２Ｈ６  ＩｇＧ１および他の抗ＯＸ４０モノクローナルアゴニスト抗体が、アイソタイプ対照と比較してＴ細胞のＳＥＢ誘導増殖を増強することが実証される。しかし、Ｔｅｔｒａ−８は、試験した単一特異性の二価抗ＯＸ４０分子すべてと比較して顕著に高いレベルのアゴニズムを示す。概して、ＳＥＢおよびＭＬＲアッセイの結果から、Ｔｅｔｒａ−８がＴ細胞応答を増強し、他のアゴニスト抗ＯＸ４０分子よりも高い有効性を示すことが分かる。本質的にＦｃγＲ媒介架橋を介して作用することが示されているモノクローナルアゴニスト抗ＯＸ４０抗体とは対照的に、Ｔｅｔｒａ−８の活性は、先に示すようにＦｃγＲ非依存的である。さらに、ＳＥＢアッセイでの９Ｂ１２の試験では、ＩＬ−２レベルは増加するが、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋）数が減少する。対照的に、Ｔｅｔｒａ−８は、高いレベルのＩＬ−２を誘導しながらこのＴ細胞サブセットの増殖を促進する（データは図示せず）。Ｔｅｔｒａ−８のこの強力なＦｃγＲ非依存的アゴニスト活性は、おそらく高い結合価および／またはその構造に関連している。この仮説を実施例１２および１４でさらに調査した。
【０１８７】
実施例１１：別のＴｅｔｒａ−８構造の産生
分子設計および発現
Ｔｅｔｒａ−８の生物学的活性に対するＦｃγＲの結合の影響をモニタリングするために、ｗｔ  ＩｇＧ１  Ｆｃを有するＴｅｔｒａ−８の改変版（Ｔｅｔｒａ−１３）を、先に記載したようにクローニングおよび産生した。次いで、そのアゴニスト特性に対するＴｅｔｒａ−８構造の影響を決定するために、異なる結合剤の組み合わせ、配向および結合価を有するいくつかの構築物を産生した（図２０）。
【０１８８】
Ｔｅｔｒａ−１４分子は、７Ｈ１１−ＶＨ２  Ｎ５８Ｋ−Ｄ５４Ｅおよび７Ｈ１１  ＶＬ１配列が、Ｔｅｔｒａ−８について先に記載したように、ジスルフィド結合で改変されたｓｃＦｖとしてフォーマットされ（Ｇｅｎｅａｒｔ  ＡＧにより遺伝子合成され）、さらに改変ｐｃＤＮＡ３．１ベクターに２Ｈ６  ＩｇＧ１  ＬＡＬＡ重鎖配列の３′でクローニングされた四価抗体である。２Ｈ６  ＶＬを、改変ｐｃＤＮＡ３．１ベクターにヒトカッパ定常領域（２Ｈ６−ＬＣ）とインフレームでクローニングした。Ｔｅｔｒａ−１４  ＨＣおよび２Ｈ６  ＬＣをコードするベクターをＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ１細胞に共トランスフェクトすることにより、Ｔｅｔｒａ−１４を産生した（表２１）。次いで、先に記載したように、細胞上清を回収し、分子をプロテインＡ親和性精製カラムを用いて精製した。次いで、Ｔｅｔｒａ−８について先に記載したように、さらなるカチオン交換精製工程を行って、共有結合多量体汚染物を除去した。したがって、この分子は、逆配向であるがＴｅｔｒａ−８で使用したのと同じ結合剤からなる。
【０１８９】
同じ４つの結合剤を有する四価分子も設計し、Ｇｅｎｅａｒｔ  ＡＧにより遺伝子合成した。Ｔｅｔｒａ−１５抗体は、２Ｈ６結合剤からなり、Ｔｅｔｒａ−１６は、７Ｈ１１結合剤からなる。このフォーマットにおいて、ジスルフィド結合で改変された２Ｈ６および７Ｈ１１  ｓｃＦｖ配列を、２Ｈ６および７Ｈ１１  ＩｇＧ１  ＬＡＬＡ重鎖配列に各々融合させた。Ｔｅｔｒａ−１５およびＴｅｔｒａ−１６重鎖をコードするベクターを２Ｈ６  ＬＣおよび７Ｈ１１  ＶＬ１をコードするベクターで各々トランスフェクトすることにより、Ｔｅｔｒａ−１５およびＴｅｔｒａ−１６を産生した。先に記載したように、タンパク質をプロテインＡクロマトグラフィーを用いて精製し、カチオン交換によりさらに精製した。したがって、Ｔｅｔｒａ−１５およびＴｅｔｒａ−１６は、４つの関連する結合アームを有しながら、Ｔｅｔｒａ−８分子に類似したフォーマットを有する。さらに、Ｔｅｔｒａ−１７およびＴｅｔｒａ−１８抗体は、４つの同一の結合アームを有するように設計された。Ｔｅｔｒａ−１７および１８フォーマットにおいて、ＦａｂをＩｇＧ１重鎖のＣ末端に融合させる。Ｔｅｔｒａ−１７重鎖配列は、７Ｈ１１−ＶＨ２  Ｎ５８Ｋ−Ｄ５４Ｅ−ＩｇＧ１  ＣＨ１配列を短いＧｌｙ４Ｔｈｒ（Ｇ４Ｔ）リンカーを介してＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインに融合させた、ＬＡＬＡ突然変異を有する７Ｈ１１−ＶＨ２  Ｎ５８Ｋ−Ｄ５４Ｅ  ＩｇＧ１重鎖からなる。同様に、Ｔｅｔｒａ−１８重鎖は、２Ｈ６  Ｆａｂをコードする配列に連結した２Ｈ６  ＩｇＧ１  ＬＡＬＡ配列からなる。先に記載した同じ方法を用いて、Ｔｅｔｒａ−１７およびＴｅｔｒａ−１８重鎖をコードするベクターと、７Ｈ１１  ＶＬ１および２Ｈ６  ＬＣをコードするベクター各々とをＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ１細胞に共トランスフェクトして、Ｔｅｔｒａ−１７およびＴｅｔｒａ−１８抗体を産生した（表２１）。
【０１９０】
他の四価抗体は、３つの同一な結合剤を一つの無関係な結合剤と組み合わせるように設計され、これを、Ｇｅｎｅａｒｔ  ＡＧにより遺伝子合成した。Ｔｅｔｒａ−１９抗体は、３つの７Ｈ１１  Ｆａｂと１つの２Ｈ６  ｓｃＦｖとの組み合わせである。このフォーマットにおいて、重鎖ヘテロ二量体化が必要とされる。そのため、ＢＥＡＴ技術（Ｓｋｅｇｒｏ  Ｄ．ら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．、２９２（２３）：９７４５−５９、２０１７年６月）を用いて、Ｆｃヘテロ二量体を産生および精製した。２つの異なる重鎖を構築し、２つの異なるベクターにクローニングした。第１の重鎖（Ｔｅｔｒａ−１９  ＨＣ１）は、ＮからＣ末端まで、７Ｈ１１−ＶＨ２  Ｎ５８Ｋ−Ｄ５４Ｅ、ＩｇＧ１  ＣＨ１、ＩｇＧ１ヒンジ、ＬＡＬＡ突然変異を含有するＩｇＧ１  ＣＨ２、ＩｇＧ３  ＣＨ３  ＢＥＡＴ（Ａ）、Ｇ４Ｔリンカーおよびジスルフィド結合で改変された２Ｈ６  ｓｃＦｖのドメイン配列を含む。第２の鎖（Ｔｅｔｒａ−１９  ＨＣ２）は、ＮからＣ末端まで、７Ｈ１１−ＶＨ２  Ｎ５８Ｋ−Ｄ５４Ｅ、ＩｇＧ１  ＣＨ１、ＩｇＧ１ヒンジ、ＬＡＬＡ突然変異を含有するＩｇＧ１  ＣＨ２、ＩｇＧ１  ＣＨ３  ＢＥＡＴ（Ｂ）、Ｇ４Ｔリンカー、７Ｈ１１−ＶＨ２  Ｎ５８Ｋ−Ｄ５４ＥおよびＩｇＧ１  ＣＨ１のドメイン配列からなる。これらの２つの異なる重鎖をコードするベクターを、等モル比で、７Ｈ１１  ＶＬ１軽鎖をコードするベクターでＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ１細胞に先に記載したのと同じプロトコルを用いてトランスフェクトした（表２１）。ＢＥＡＴ法は、鎖を含有するＢＥＡＴ（Ａ）およびＢＥＡＴ（Ｂ）の優先的なヘテロ二量体化を誘導する。しかし、いくつかのホモ二量体の不純物が依然として産生され得る。それにも関わらず、ＢＥＡＴ法は、重鎖非対称的にプロテインＡに結合するように作られているため、発現細胞の上清に存在するホモ二量体汚染物からのヘテロ二量体の効率的な精製が可能であった。簡単に言えば、トランスフェクトした細胞の清澄化上清を、０．２Ｍクエン酸／リン酸緩衝液ｐＨ６で予め平衡化され、ＡＫＴＡ（商標）ｐｕｒｉｆｉｅｒクロマトグラフィーシステムで１ｍｌ／分の流速で操作されるＨｉＴｒａｐ（商標）ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）プロテインＡカラムに充填した（いずれもＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨから）。泳動緩衝液は０．２Ｍクエン酸／リン酸緩衝液ｐＨ６であった。洗浄緩衝液は０．２Ｍクエン酸／リン酸緩衝液ｐＨ５であった。ヘテロ二量体の溶出を、２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．１を用いて行った。溶出は、２８０ｎｍの吸光度の読み取りでモニターした；ヘテロ二量体Ｔｅｔｒａ−１９を含有する当該分画をプールし、０．１容量の１Ｍ  ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８で中和した。次いで、さらなるカチオン交換精製工程を行って、共有結合多量体を除去した。３つの２Ｈ６  Ｆａｂと１つの７Ｈ１１  ｓｃＦｖとの組み合わせであるＴｅｔｒａ−２０抗体を、同じプロトコルを用いて産生および精製した。Ｔｅｔｒａ−２０  ＨＣ１は、ＮからＣ末端まで、２Ｈ６  ＶＨ、ＩｇＧ１  ＣＨ１、ＩｇＧ１ヒンジ、ＬＡＬＡ突然変異を含有するＩｇＧ１  ＣＨ２、ＩｇＧ３  ＣＨ３  ＢＥＡＴ（Ａ）、Ｇ４Ｔ��ンカーおよびジスルフィド結合で改変された７Ｈ１１  ｓｃＦｖのドメイン配列を含む。Ｔｅｔｒａ−２０  ＨＣ２は、ＮからＣ末端まで、２Ｈ６  ＶＨ、ＩｇＧ１  ＣＨ１、ＩｇＧ１ヒンジ、ＬＡＬＡ突然変異を含有するＩｇＧ１  ＣＨ２、ＩｇＧ１  ＣＨ３  ＢＥＡＴ（Ｂ）、Ｇ４Ｔリンカー、２Ｈ６  ＶＨおよびＩｇＧ１  ＣＨ１のドメイン配列からなる。これらの２つの鎖を２Ｈ６軽鎖と共発現させ、Ｔｅｔｒａ−２０を産生し（表２１）、これを、示差プロテインＡおよびカチオン交換クロマトグラフィーを用いて精製した。
【０１９１】
Ｔｅｔｒａ−２１抗体は、Ｆｃ領域のＮ末端に融合した１つの２Ｈ６  ｓｃＦｖおよび１つの７Ｈ１１  Ｆａｂ、ならびに同じＦｃ領域のＣ末端に融合した１つの２Ｈ６  ｓｃＦｖおよび１つの７Ｈ１１  Ｆａｂを有する４つの抗体結合ドメインを含有するように設計された。先に記載したように、Ｔｅｔｒａ−１９  ＨＣ１をＴｅｔｒａ−２１  ＨＣ２および７Ｈ１１  ＶＬ１軽鎖と共発現させることにより、このヘテロ二量体を産生した（表２１）。Ｔｅｔｒａ−２１  ＨＣ２は、ＮからＣ末端まで、ＬＡＬＡ突然変異を含有するＩｇＧ１  ＣＨ２に連結した２Ｈ６  ｓｃＦｖ、次いでＩｇＧ１  ＣＨ３  ＢＥＡＴ（Ｂ）、Ｇ４Ｔリンカー、７Ｈ１１−ＶＨ２  Ｎ５８Ｋ−Ｄ５４ＥおよびＩｇＧ１  ＣＨ１を含有するように構築された。この鎖をＧｅｎｅａｒｔ  ＡＧにより合成し、改変ｐｃＤＮＡ３．１ベクターにクローニングした。次いで、Ｔｅｔｒａ−２１を、先に記載したように示差プロテインＡクロマトグラフィーを用いて精製し、次いで、さらなるカチオン交換精製工程を行った。
【０１９２】
Ｔｅｔｒａ−２２は、トラスツズマブＦａｂと、２Ｈ６  ｓｃＦｖアゴニスト活性単独の対照としてＦｃ領域のＣ末端に融合した２Ｈ６  ｓｃＦｖとを組み合わせるように設計された。Ｔｅｔｒａ−２２  ＨＣは、ＮからＣ末端まで、トラスツズマブＶＨ、ＩｇＧ１  ＣＨ１、ＩｇＧ１ヒンジ領域、ＬＡＬＡ突然変異を含有するＩｇＧ１  ＣＨ２、ＩｇＧ１  ＣＨ３、Ｇ４Ｔリンカーおよびジスルフィド結合で改変された２Ｈ６  ｓｃＦｖを含有するように構築された。この重鎖ならびにトラスツズマブＶＬ（Ｔｅｔｒａ−２２  ＬＣ）をＧｅｎｅａｒｔ  ＡＧにより遺伝子合成し、次いで、両方の鎖を改変ｐｃＤＮＡ３．１ベクターにクローニングした。次いで、Ｔｅｔｒａ−２２を、Ｔｅｔｒａ−８について先に記載したように産生および精製した（表２１）。トラスツズマブＩｇＧ１  ＬＡＬＡへの２Ｈ６  ｓｃＦｖのＣ末端融合と同様に、リツキシマブを無関係な結合剤として使用し、四価分子リツキシマブ−２Ｈ６を、鋳型としてＴｅｔｒａ−８およびＴｅｔｒａ−２２構造を用いて産生した。
【０１９３】
最後に、Ｔｒｉ−８分子は、２つの７Ｈ１１  ＦａｂおよびＣ末端に融合した１つの２Ｈ６  ｓｃＦｖを有する三価分子になるように産生された。Ｔｅｔｒａ−１９  ＨＣ１とＴｒｉ−８  ＨＣ２および７Ｈ１１  ＶＬ１軽鎖とを組み合わせることにより、このヘテロ二量体を作製した（表２１）。Ｔｒｉ−８  ＨＣ２は、ＮからＣ末端まで、７Ｈ１１−ＶＨ２  Ｎ５８Ｋ−Ｄ５４Ｅ、ＩｇＧ１  ＣＨ１、ＬＡＬＡ突然変異を含有するＩｇＧ１  ＣＨ２、次いで、ＩｇＧ１  ＣＨ３  ＢＥＡＴ（Ｂ）からなる。この鎖をＧｅｎｅａｒｔ  ＡＧにより遺伝子合成し、改変ｐｃＤＮＡ３．１ベクターにクローニングした。次いで、Ｔｒｉ−８を、Ｔｅｔｒａ−１９、２０および２１について先に記載したように産生および精製した。
【０１９４】
【表２１】
2020504105.tif 000024
【０１９５】
別のＴｅｔｒａ−８構造を有する抗体の特性評価
次いで、分子を先に記載した方法を用いてＢｉａｃｏｒｅによりさらに特性評価した。タンパク質をＦａｂＡＬＡＣＴＩＣＡを用いて消化し、タンパク質分解後に得られたＦｃ融合Ｃ末端結合剤をＣａｐｔｕｒｅＳｌｅｃｔ（商標）ＦｃＸＬを用いて精製した。次いで、得られた物質を用いて、Ｃ末端結合剤の有効性をＢｉａｃｏｒｅにより試験した。
【０１９６】
ＯＸ４０に対するＴｅｔｒａ−１４分子のＣ末端に融合した７Ｈ１１  ｓｃＦｖの親和性を、Ｔｅｔｒａ−８におけるＯＸ４０に対する２Ｈ６  ｓｃＦｖの親和性の測定について記載したのと同じ方法を用いて測定した。１９ｎＭの親和性が測定され（表２２）、７Ｈ１１の親和性の２倍低下が測定されたが、Ｃ末端に融合したＴｅｔｒａ−１４結合アームが機能的であることを示している。
【０１９７】
【表２２】
2020504105.tif 000025
【０１９８】
また、Ｔｅｔｒａ−１７、Ｔｅｔｒａ−１８、Ｔｅｔｒａ−１９およびＴｅｔｒａ−２０を消化して、ＯＸ４０キメラを用いてＢｉａｃｏｒｅにより試験した。ｃｈｉＯＸ４０Ｒ  ＨＨＲＨ−ＦｃおよびｃｈｉＯＸ４０Ｒ  ＲＲＨＨ−Ｆｃを、両方の分子について３０００ＲＵに到達するように各々流路２および４に注入することにより、予め活性化されたＣＭ５センサーチップ上に固定化した（３０００ＲＵ）。次いで、Ｔｅｔｒａ−１７、Ｔｅｔｒａ−１８、Ｔｅｔｒａ−１９およびＴｅｔｒａ−２０の精製された消化産物を分析物として用いて、２００ｎＭの濃度および流速３０μＬ／分で４つの流路（流路１および３は参照として用いられる）に２４０秒間注入した。次いで、第２の注入をＨＢＳ−ＥＰ緩衝液を用いて３分間行い、次いで５分間解離した。注入間の再生を、グリシンｐＨ１．５緩衝液を用いて１分間行った（図２１および表２３）。７Ｈ１１結合剤は、ＯＸ４０  ＣＲＤ１に特異的であり、したがって、ｃｈｉＯＸ４０Ｒ  ＨＨＲＨ−Ｆｃにのみ結合し得、ｃｈｉＯＸ４０Ｒ  ＲＲＨＨ−Ｆｃには結合しない（表２３）。これらの設定において、７Ｈ１１のｃｈｉＯＸ４０Ｒ  ＨＨＲＨ−Ｆｃへの結合は、ＦａｂとしてＣ末端に融合した場合、ｓｃＦｖフォーマットにおいてよりも約４倍良好であることが観察され（Ｆｃ−７Ｈ１１Ｆａｂ／２Ｈ６  ｓｃＦｖとＦｃ−７Ｈ１１  ｓｃＦｖ／２Ｈ６  ｆａｂとの比較、各々４５０応答単位（ＲＵ）対１００ＲＵ）、これは、７Ｈ１１が、そのフォーマットにかかわらず機能的であることを示している。また、二価フォーマットにおいて、７Ｈ１１  ＦａｂのＯＸ４０  ＣＲＤ１への結合は、一価フォーマットにおいてよりも２倍良好であると判断し（Ｆｃ−７Ｈ１１Ｆａｂ／７Ｈ１１  ＦａｂとＦｃ−７Ｈ１１  Ｆａｂ／２Ｈ６  ｓｃＦｖとの比較、各々８７０ＲＵ対４５０ＲＵ）、これは、Ｃ末端に融合した２つのＦａｂがいずれも機能的であり、２つのＯＸ４０分子に潜在的に共結合し得ることを示唆している。２Ｈ６結合剤は、ＯＸ４０  ＣＲＤ３に特異的であり、したがって、これはｃｈｉＯＸ４０Ｒ  ＲＲＨＨ−Ｆｃにのみ結合し得、ｃｈｉＯＸ４０Ｒ  ＨＨＲＨ−Ｆｃには結合しない。ＦａｂとしてＣ末端に融合した２Ｈ６の、ｃｈｉＯＸ４０Ｒ  ＲＲＨＨ−Ｆｃへの結合が、ｓｃＦｖフォーマットにおいてよりも良好であることも観察され（Ｆｃ−７Ｈ１１Ｆａｂ／２Ｈ６  ｓｃＦｖとＦｃ−７Ｈ１１  ｓｃＦｖ／２Ｈ６  ｆａｂとの比較）、ＦａｂまたはｓｃＦｖとしてフォーマットされた場合、２Ｈ６が機能的であることが確認された。二価フォーマットにおいて、２Ｈ６  ＦａｂのＯＸ４０  ＣＲＤ３への結合は、一価フォーマットにおいてよりも良好であることも観察され（Ｆｃ−２Ｈ６  Ｆａｂ／２Ｈ６  ＦａｂとＦｃ−７Ｈ１１  ｓｃＦｖ／２Ｈ６  Ｆａｂとの比較）、これはＣ末端に融合した２Ｈ６結合単位がいずれも機能的であり、潜在的に２つのＯＸ４０分子に共結合し得ることを示唆している。
【０１９９】
【表２３】
2020504105.tif 000026
【０２００】
共結合事象を明確に実証するために、第１の注入については、分析物としてＦｃ−７Ｈ１１  Ｆａｂ／２Ｈ６−ｓｃＦｖまたはＦｃ−７Ｈ１１  ｓｃＦｖ／２Ｈ６  Ｆａｂのみ使用することにより、ならびに第２の注入工程については、緩衝液、ヒトＯＸ４０−Ｆｃ、ｃｈｉＯＸ４０Ｒ  ＨＨＲＨ−Ｆｃ（７Ｈ１１特異的）およびｃｈｉＯＸ４０Ｒ  ＲＲＨＨ−Ｆｃ（２Ｈ６特異的）キメラを４００ｎＭで３分間注入し、次いで５分間解離することにより、先に記載したＢｉａｃｏｒｅ設定をわずかに変更した。注入間の再生はグリシンｐＨ１．５緩衝液を用いて１分間行った（図２２および２３）。これらの方式を用いて、共結合事象をモニタリングできた。実質的に、Ｆｃ−７Ｈ１１  Ｆａｂ／２Ｈ６  ｓｃＦｖ部分を、７Ｈ１１のＯＸ４０  ＣＲＤ１への結合を介してＣＨＩＰ上に捕獲した場合、これはヒトＯＸ４０−ＦｃだけでなくｃｈｉＯＸ４０Ｒ  ＲＲＨＨ−Ｆｃ（２Ｈ６特異的）とも依然として相互作用し得る（図２２ａ）。同様に、ＯＸ４０  ＣＲＤ３に結合する２Ｈ６を介してＣＨＩＰ上に捕獲されるＦｃ−７Ｈ１１  Ｆａｂ／２Ｈ６  ｓｃＦｖ部分はヒトＯＸ４０およびｃｈｉＯＸ４０Ｒ  ＯＸ４０  ＨＨＲＨ−Ｆｃ（７Ｈ１１特異的）と相互作用し得る（図２２ｂ）。同様の結果がＦｃ−７Ｈ１１  ｓｃＦｖ／２Ｈ６  Ｆａｂで得られた（図２３ａおよび２３ｂ）。総合すれば、これらのデータは、Ｃ末端に融合した７Ｈ１１または２Ｈ６結合単位が、これらのＦａｂフォーマットまたはｓｃＦｖフォーマットにかかわらず機能的であり、これらが同時に２つの異なるＯＸ４０単位に共結合し得ることを示している。
【０２０１】
実施例１３：ｔｅｔｒａ−８のアゴニスト活性は、その構造および結合価に関連している。
４つの結合単位を示すＴｅｔｒａ−８は、実施例１０に示すように、モノクローナル二価７Ｈ１１＿ｖ８  ＩｇＧ１または２Ｈ６  ＩｇＧ１と比較して高いアゴニスト活性を示す。その生物学的機能におけるＴｅｔｒａ−８の構造の貢献を評価するために、異なる構造および結合価を示すＴｅｔｒａ−８のいくつかの変異体を産生し、ＳＥＢアッセイで試験した。これらの分子を図２０に列挙する。図２４に示すように、２つの異なるクローン由来の４つの結合部分からなるＴｅｔｒａ−８は、ｉ）１つのクローン由来の２つの結合部分（７Ｈ１１または２Ｈ６のいずれか）、ｉｉ）２つの異なるクローン由来の３つの結合部分（Ｔｒｉ−８）、ｉｉｉ）４つの同様の結合部分からなる四価分子（Ｔｅｔｒａ−１５およびＴｅｔｒａ−１６）からなる分子よりも高いアゴニスト活性を誘導する。Ｔｅｔｒａ−８と異なる構造を有する２つの他の四価抗ＯＸ４０変異体分子を、同じアッセイで試験した：Ｔｅｔｒａ−２１およびＴｅｔｒａ−１４。これらの２つの分子は、異なる配向であるがＴｅｔｒａ−８と同じＯＸ４０結合部分（７Ｈ１１および２Ｈ６クローンに由来）からなる。図２４に示すように、両方の四価分子は、ＳＥＢアッセイにおいてＴｅｔｒａ−８抗体と比較して、低いアゴニスト可能性を示す。また、Ｔｅｔｒａ−８は、表２４に要約されているように、７Ｈ１１と２Ｈ６との組み合わせ（７Ｈ１１  ＩｇＧ１  ＬＡＬＡ＋Ｔｅｔｒａ−２２）よりも高いＩＬ−２レベルを誘導し、これは同じ分子中の４つのＯＸ４０結合単位の存在が、Ｔｅｔｒａ−８の活性を誘導するのに重要であることを示している。総合すると、図２４の結果は、Ｔｅｔｒａ−８の高いアゴニスト特性が、その四価性およびその構造に関連していることを実証している。
【０２０２】
【表２４】
2020504105.tif 000027
2020504105.tif 000028
【０２０３】
実施例１３：ＯＸ４０ドメインを標的化する四価抗体
Ｔｅｔｒａ−８アゴニスト抗体はその７ｈ１１および２Ｈ６結合単位各々を介してＯＸ４０  ＣＲＤ１およびＣＲＤ３に結合する。ＩｇＧ１  ＬＡＬＡ重鎖のＣ末端部分に融合したジスルフィド改変ｓｃＦｖに存するＴｅｔｒａ−８四価構造は、そのアゴニスト活性に最適であると思われる。さらに、Ｔｅｔｒａ−８と同様の結合単位を共有するが異なる構造を有する抗体で得られたデータも、Ｎ末端Ｆａｂ部分は、膜遠位ＯＸ４０ドメインを標的化する必要があり、Ｃ末端ｓｃＦｖは、膜近位ＯＸ４０ドメインと相互作用する必要があることを示唆している。２Ｈ６、７Ｈ１１、９Ｂ１２、１１Ｄ４、１Ａ７、１０６−２２２、ｐａｂ１９４９およびｈｚＧ３Ｖ９  ＯＸ４０結合単位を用いて、四価フォーマットで組み合わせられた他のＯＸ４０結合剤がＯＸ４０をアゴナイズし得るかどうかを決定した。抗ＯＸ４０抗体配列を、鋳型としてＴｅｔｒａ−８特異的フォーマットを用いてアセンブルした（すなわち、Ｎ末端からＣ末端まで、ＶＨ、ＩｇＧ１  ＣＨ１、ＩｇＧ１ヒンジ、ＩｇＧ１  ＣＨ２  ＬＡＬＡ、ＩｇＧ１  ＣＨ３、リンカー、ジスルフィド改変ｓｃＦｖまたはｄＡｂからなる）。Ｎ末端において、７Ｈ１１、１１Ｄ４、１Ａ７、９Ｂ１２、１０６−２２２および２Ｈ６のＶＨを選択し、Ｃ末端において、９Ｂ１２、２Ｈ６、ｐａｂ１９４９およびｈｚＧ３ｖ９  ｄＡｂのｓｃＦｖを選択した。結合剤の組み合わせは、四価分子による様々なＯＸ４０エピトープの結合を調査するために設計された（表２５）。次いで、設計された重鎖、１Ａ７＿２Ｈ６＿８、１０６−２２２＿２Ｈ６＿８、７Ｈ１１＿１９４９＿８、１１Ｄ４＿１９４９、１Ａ７＿１９４９、９Ｂ１２＿１９４９、１０６−２２２＿１９４９、７Ｈ１１＿９Ｂ１２＿８、７Ｈ１１＿ｈｚＧ３ｖ９＿８、１１Ｄ４＿ｈｚＧ３ｖ９、１０６−２２２＿ｈｚＧ３ｖ９、９Ｂ１２＿ｈｚＧ３ｖ９および２Ｈ６＿ｈｚＧ３ｖ９＿８をコードするｃＤＮＡを、先に記載したようにＧｅｎｅＡｒｔにより遺伝子合成した後、改変ｐＣＤＮＡ３．１ベクターにクローニングした。これらの四価抗体の産生のために、重鎖とこれらの各軽鎖（表２６）とをＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ１細胞に共トランスフェクトし、上清を回収した後、プロテインＡで精製した。次いで、さらなるカチオン交換精製工程を用いて、Ｃ末端に融合したジスルフィド改変ｓｃＦｖを有する四価分子で形成された共有結合多量体を除去した。
【０２０４】
【表２５】
2020504105.tif 000029
【０２０５】
【表２６】
2020504105.tif 000030
【０２０６】
ＮまたはＣ末端に融合した場合のｐａｂ１９４９親和性の特性評価
Ｃ末端に融合したｐａｂ１９４９  ｓｃＦｖの親和性を、Ｔｅｔｒａ−８においてＯＸ４０に対する２Ｈ６  ｓｃＦｖの親和性の測定のために記載したのと同じ方式を用いて測定した。４６０ｎＭの親和性が測定された（表２７）。ＯＸ４０に対するｐａｂ１９４９  ＩｇＧ１の親和性を測定するために、この抗体約６００ＲＵを、抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃが予め固定化されたＣＭ５チップ上に捕獲した。次いで、ｈｓＯＸ４０＿ＣＲＤ＿Ａｖｉ＿Ｈｉｓ（配列番号１５９）の希釈系列を注入した。このフォーマットにおいて、ｐａｂ１９４９について３０４ｎＭの親和性が測定された。
【０２０７】
【表２７】
2020504105.tif 000031
【０２０８】
実施例１４：ＯＸ４０の複数のエピトープへの結合は、そのアゴニスト可能性を高める。
Ｔｅｔｒａ−８とＴｅｔｒａ−１６との間またはＴｅｔｒａ−８とＴｅｔｒａ−１５との間で観察された機能的相違は、ＯＸ４０の異なるエピトープを標的化する複数の結合単位からなる分子が、多価単一特異性分子より高いアゴニスト可能性を示すことを強く示唆している。この仮説を実証するために、様々なＯＸ４０エピトープを認識する結合単位からなる分子を産生し、ＳＥＢアッセイで試験した。図２５に示すように、ＯＸ４０のドメイン１および３に特異的な結合単位からなるいずれも四価分子であるＴｅｔｒａ−８、７Ｈ１１＿１９４９＿８および１１Ｄ４＿１９４９分子が、Ｔｅｔｒａ−１５またはＴｅｔｒａ−１６四価単一特異性抗体よりも高いアゴニズムを示す。同様に、ＯＸ４０のドメイン１および４を標的化する四価７Ｈ１１＿ｈｚＧ３ｖ９＿８および１１Ｄ４＿ｈｚＧ３ｖ９はその二価対応物よりも強力なアゴニスト活性を誘導する。これらのデータから、Ｔｅｔｒａ−８が、ＯＸ４０の膜遠位および近位ドメインの多価および二重エピトープ標的化を介して強力なＯＸ４０アゴニスト活性を示すことが分かる。さらに表２４に示すように、７Ｈ１１  ＩｇＧ１  ＬＡＬＡ＋Ｔｅｔｒａ−２２の組み合わせは、個々の分子と比較して高いＩＬ−２レベルを誘導するが、Ｔｅｔｒａ−８により誘導されるＩＬ−２のレベルを繰り返さない。これは、四価Ｔｅｔｒａ−８抗体により媒介されるＯＸ４０の二重エピトープ標的化が２つの二価分子の組み合わせにより媒介される二重エピトープ標的化より高いアゴニスト活性を誘導することを実証している。
【０２０９】
実施例１５：ＴＥＴＲＡ−８＋ｈＯＸ４０の多量体形成はインビトロ活性と相関している。
Ｔｅｔｒａ−８＋ｈＯＸ４０複合体の化学量論量を決定するために、分析用ゲル濾過クロマトグラフィーを、ＡｋｔａＰｕｒｉｆｉｅｒシステムに連結したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００  ＧＬ  ｉｎｃｒｅａｓｅカラムで行った（いずれもＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、スイス）。泳動緩衝液はＰＢＳ、ｐＨ７．４（Ｇｉｂｃｏ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｅｉｎａｃｈ、スイス）であり、流速は０．５ｍｌ／分であった。注入した試料容量は、２％のカラム容量を超えず、通常０．３〜０．５ｍｌであった。最初の泳動において、２５００ｐｍｏｌ（１部）の抗体を注入した。第２の泳動において、５０００ｐｍｏｌ（２部）のｈＯＸ４０（配列番号１６０）を注入した。第３の泳動については、２５００ｐｍｏｌ（１部）の抗体を１００００ｐｍｏｌ（４部）のｈＯＸ４０と混合し、室温で１０分間インキュベートした後、注入した。高および低分子量較正キット（２８−４０３８−４１、２８−４０３８−４２、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して事前に較正泳動を行った。Ｔｅｔｒａ−８単独、ｈＯＸ４０単独および１：４の比のＴｅｔｒａ−８／ｈＯＸ４０のクロマトグラムを図２６に示す。より初期の溶出容量にごくわずかにシフトした単一ピーク形状の複合体のピークが観察されたのではなく、１６ｋＤａリガンドの結合を考慮して予想されるよりもはるかに高い分子量のいくつかの新しいピークが観察された。アセンブリーのピークは、４４０ｋＤａ較正マーカーよりも早く溶出することが判明し、これは１超の抗体からなる複合体が形成されることを示唆している。約５０００ｐｍｏｌの非結合ｈＯＸ４０の過剰（曲線下の面積に由来）および１００００ｐｍｏｌが複合体混合物に添加された事実は、Ｔｅｔｒａ−８ごとに２つのｈＯＸ４０分子が結合したことを意味している。Ｔｅｔｒａ−８については１９８ｋＤａおよびｈＯＸ４０については１６ｋＤａの理論的分子量を考慮すると、第２のピークは、ｈＯＸ４０と複合した２〜３個のＴｅｔｒａ−８分子を含有し、第１のピークおよびそのショルダーは、高次の多量体（２超の抗体およびいくつかのｈＯＸ４０からなる複合体）を含有することが推論され得る。その二重パラトピック性により、Ｔｅｔｒａ−８は、ｈＯＸ４０と多量体を形成して、大きな結晶状格子を形成することができることが仮定される（図２７）。Ｔｅｔｒａ−８ごとに１つのｈＯＸ４０は、理論上無限大格子を形成するのに十分であるが、上記のように、２つの受容体が、抗体ごとに結合すると思われる。いくつかの対照分子を同じ実験で試験して、多量体形成とインビトロ活性とを相関させた。７Ｈ１１ドメインのみを含有する対照分子は、約４４０ｋＤａにピークを示し、これは、ｈＯＸ４０結合により誘導された非特異的二量体の形成を示唆している（図２６、簡略化のために対照抗体単独のピークは示されていない）。より高次の多量体は観察されなかった。この結果に即して、これらの分子についてインビトロ活性は観察できなかった。Ｔｒｉ−８は、約４４０ｋＤａにピークを示し、これは二量体形成を示唆しているが、顕著な量の高次の多量体は観察できなかった。この���果と一致して、Ｔｒｉ−８はインビトロ活性を示さなかった。Ｔｅｔｒａ−１４は２つのピークを示し、第１のピークは、高次の多量体をおそらく含有しており、４４０ｋＤａマーカー前に溶出する第２のピークは、二量体またはいくつかのｈＯＸ４０分子と複合した単一の抗体を含有し得る。Ｔｅｔｒａ−１４は、インビトロ活性を示さず、これは、Ｔｅｔｒａ−８と比較して多量体形成の傾向が低い結果であると仮定される。Ｔｅｔｒａ−８は、４４０ｋＤａマーカーにまたはその前にピークを示さなかったが、高次の多量体に対するピークのみを示した。さらに、Ｔｅｔｒａ−８／ｈＯＸ４０は、空隙量（Ｖ０）に溶出するショルダーを示し、Ｔｅｔｒａ−１４に関しては観察できなかった。７Ｈ１１＿１９４９＿８は、インビトロで最高の活性を示し、同時に、試験した任意の他の分子と比較して分析用ゲル濾過において最も高次な多量体形成を示し、タンパク質の多くはＶ０に溶出した。７Ｈ１１＿ｖ８  ＩｇＧ１も実験に含まれ、約４４０ｋＤａにピークを示し、これは潜在的に非特異的二量体の形成の結果である。予想通り、高次多量体形成のピークはこの分子では観察できなかった。総合すると、エピトープ構造と抗体構造との組み合わせは、多量体形成の傾向を決定し、高次多量体形成はインビトロ活性と相関することが提案される。
【０２１０】
実施例１６：Ｔｅｔｒａ−８は細胞表面での局所ＯＸ４０クラスタリングを誘導する
１６．１：ヒトＯＸ４０−ｅＧＦＰを発現する安定なジャーカット細胞株の産生
ジャーカットＥ６．１細胞（ＥＣＡＣＣ  ８８０４２８０３）を、電気穿孔法（Ｎｅｏｎ（登録商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて、ｐＴ１−ｈｓＯＸ４０−ｅＧＦＰ＿融合＿ＩＲＥＳ＿ピューロマイシンプラスミド（ＧＳＹ９３５ａ）でトランスフェクトした。ｈｓＯＸ４０−ｅＧＦＰはｈｓＯＸ４０のＣ末端部分に融合したｅＧＦＰを有する融合タンパク質である。翌日、限界希釈を、ピューロマイシンを含有する増殖培地（ＲＰＭＩ  １６４０、グルタミン＋１０％ＦＢＳ＋０．２５μｇ／ｍＬピューロマイシン）で行った。３７℃および５％ＣＯ２でのインキュベーションの２週間後、単一のプールを、Ｇｕａｖａ（登録商標）ｅａｓｙＣｙｔｅフローサイトメーターを用いてｅＧＦＰの発現について分析し、１９個のプールを選択した。５日後、これらのプールを、ＦＡＣＳを用いてｈｓＯＸ４０の発現について分析し、様々な発現レベルのｈｓＯＸ４０−ｅＧＦＰ融合タンパク質を有する７つの均一なプールを保持した。これらを増幅し、１０％ＤＭＳＯを含有する９０％ＦＢＳで凍結した。細胞表面でのＯＸ４０−ｅＧＦＰ融合タンパク質の発現は、細胞活性化の際のＯＸ４０の凝集の直接的な可視化を可能にした。
【０２１１】
１６．２  Ｔｅｔｒａ−８は、ジャーカットＯＸ４０−ｅＧＦＰ細胞株上での膜結合ＯＸ４０のクラスタリングを誘導する。
１６．２．１  Ｔｅｔｒａ−８で処置したＯＸ４０−ＧＦＰジャーカット細胞の低速度共焦点顕微鏡法
ＴＮＦＲＳＦの他のメンバーについて、下流シグナル伝達の活性化はＯＸ４０多量体形成に依存する。Ｔｅｔｒａ−８がＦｃγＲ非依存的にＯＸ４０シグナル伝達を誘導するという事実は、ＯＸ４０多量体形成に対する抗体の直接的な影響を強く示唆している。膜結合ＯＸ４０クラスタリングを誘導するＴｅｔｒａ−８の能力を調査するために、低速度共焦点顕微鏡法実験を、Ｔｅｔｒａ−８と予めインキュベートしたジャーカット発現ＯＸ４０  ｅＧＦＰ細胞で行った。簡単に言えば、Ｆｌｕｏｒｏｄｉｓｈ（ＷＰＩ）細胞培養皿を、１ｍＬのフィブロネクチン（ＰＢＳ中１μｇ／ｃｍ２）で室温にて４５分間プレコートした。次いで、皿をＰＢＳで２回洗浄し、ＲＰＭＩおよびピューロマイシン中３ｍＬの細胞懸濁液（２００００細胞／ｃｍ２）を皿に注入した。細胞を３７℃および５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。皿を顕微鏡下に置き、焦点を一般的な細胞に設定し、３０秒ごとに繰り返し撮影した。１．５分の時点で、Ｔｅｔｒａ−８を含有する溶液を、８０ｎＭの最終濃度で培地に添加した。細胞を、焦点モジュールＬＳＭ  ８００を備えたＺｅｉｓｓ倒立顕微鏡Ｚ１を用いて６３倍率で撮像した。図２８に示すように、ジャーカットＯＸ４０−ｅＧＦＰ細胞のＴｅｔｒａ−８での処置後、ＯＸ４０−ＧＦＰの蛍光パターンは、形質膜の均一の染色から形質膜の個々のパッチの明らかな凝集に経時的に切り替わる。
【０２１２】
１６．２．２  他のＯＸ４０特異的分子と比較したＴｅｔｒａ−８により誘導されるＯＸ４０クラスタリングの試験
前項で実証されたように、Ｔｅｔｒａ−８は、多くの他のモノクローナルＯＸ４０アゴニストよりも強力なＦｃγＲ非依存的アゴニスト活性を示す。これらの相違を、蛍光共焦点顕微鏡法を用いてＯＸ４０クラスタリング実験でさらに調査した。これらの実験において、膜結合ＯＸ４０の局所クラスタリングの誘導におけるＴｅｔｒａ−８の影響を、Ｔｅｔｒａ−１４、１Ａ７およびＯＸ４０Ｌ分子と比較して試験した。簡単に言えば、これらの分子を、前節に記載したプロトコルに従って、２０および８０ｎＭの２つの濃度にてジャーカットＯＸ４０  ｅＧＦＰ細胞で試験した。先の共焦点実験の結果に基づき、５、１０および２０分の時点を選択して、ＯＸ４０クラスタリングに対する試験した化合物の影響をモニタリングした。図２９の結果から、２０または８０ｎＭいずれかのＴｅｔｒａ−８で、ＯＸ４０−ＧＦＰの蛍光パターンが、３７℃でのインキュベーションの５分後すでに顕著な影響を受けることが分かる。比較すると、試験した他の分子の影響は２０分後でも視認できない：１Ａ７は何らかの定性的効果がないと思われるが、ＯＸ４０ＬおよびＴｅｔｒａ−１４は非常にわずかな濃度のＯＸ４０−ＧＦＰを誘導する。これらの相違をより正確に評価するために、定量的方法を開発した。第１の工程は、共焦点顕微鏡法で得られたＯＸ４０−ＧＦＰ蛍光の三次元スタックに基づき細胞膜の蛍光強度をマッピングすることに存する。この蛍光強度は、θ−ｚ座標系に示され、ここでθは、細胞の中心に対する細胞の膜の任意の点からの角度であり、ｚはカバースリップからの高さである。第２の工程として、単一の数値をこの蛍光マップから抽出した：表面の尖度。表面計測学で一般的に用いられるこのパラメータはとりわけ、平均線を超えるおよび下回るスパイクの分布の基準であるため、選択された（スパイクを有する表面、Ｒ＿ｋｕ＞３；凹凸のある表面、Ｒ＿ｋｕ＜３；完全にランダムな表面は尖度３を有する）。尖度値を各試料細胞に対して測定し、各細胞実験条件（すなわち、薬物の種類、薬物濃度、注入後時間）に対する平均の標準誤差を有する平均尖度値を得た。平均値の標準誤差は、σ＿ｘ＝σ／√ｎで定義され、σは集団の標準偏差、ｎは観察回数である；ｎは、実験条件あたり４つの細胞試料と通常等しかった。図３０に示すように、ＯＸ４０クラスタリングの定量分析の結果は、尖度値が、他の処置（１Ａ７、ＯＸ４０ＬおよびＴｅｔｒａ−１４）と比較して、ジャーカットＯＸ４０−ＧＦＰ細胞のＴｅｔｒａ−８での処置後経時的に増加することを示している。
【０２１３】
実施例１７  ＣＤ４０の異なるドメインを標的化する四価抗体
ＯＸ４０は、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＢＡＦＦＲ、ＢＣＭＡ、ＴＡＣＩ、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７、４−１ＢＢ、ＣＤ４０、ＤＲ３、ＨＶＥＭ、ＬＴβＲ、ＲＡＮＫ、Ｆｎ１４、ＦＡＳ、ＴＲＡＩＬＲ１およびＴＲＡＩＬＲ２を含むＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーである。これらの受容体は、システインリッチドメイン（ＣＲＤ）であるこれらの細胞外部分の共通の構造ドメインにより特徴付けられる。データから、ＯＸ４０を活性化する四価抗体の作用メカニズムが、２つの異なるＯＸ４０  ＣＲＤへの共結合に依存するらしいことが分かった。この作用メカニズムがＴＮＦＲスーパーファミリーに広く応用できるかどうかを決定するために、概念実証として抗ＣＤ４０四価分子を産生した。抗ＣＤ４０抗体を文献サーチから同定し、これらの各配列を特許出願またはデータベースサーチから検索した。２Ｃ１０（国際公開第２０１７／０４０９３２Ａ１号）、ＡＤＣ−１０１３（米国特許第２０１４／０３４８８３６Ａ１号）、ＣＤ４０．１（米国特許第２０１６／０３７６３７１Ａ１号）、セリクレルマブ（米国特許第８，３８８，９７１Ｂ２号）、テネレキシマブ（ＲＣＳＢ、５ＤＭＩ）および３ｈ５６−５（米国特許第２０１７／００１５７５４Ａ１号）、抗ＣＤ４０抗体は、ＣＤ４０のこれらのエピトープが公知であり、またこれらのアンタゴニストまたはアゴニスト活性が報告されたため選択された。２Ｃ１０、ＣＤ４０．１、ＡＤＣ−１０１３およびテネレキシマブは、ＣＤ４０  ＣＲＤ１を標的化すると報告されている。セリクレルマブは、ＣＤ４０のＣＲＤ１および２に結合し、３ｈ５６−５はＣＲＤ３と相互作用する。２Ｃ１０および３ｈ５６−５は、アンタゴニストとして記載されており、他の抗体はアゴニストである。これらの抗体の多くはＣＤ４０膜遠位ドメインを標的化しているが、例外として、３ｈ５６−５  ｄＡｂは、この受容体の膜近位ドメインに結合している。したがって、２Ｃ１０、セリクレルマブ、ＣＤ４０．１、ＡＤＣ−１０１３およびテネレキシマブの重鎖のＣ末端に３ｈ５６−５  ｄＡｂ配列を融合することにより、抗ＣＤ４０四価分子を産生した。これらの抗体のＶＨ、ＶＬおよびｄＡｂ配列をＧｅｎｅａｒｔ  ＡＧにより遺伝子合成した。これらの四価抗体に用いたフォーマットは、先に記載した四価抗体と類似している。ＶＨ  ｃＤＮＡ配列を、改変ｐｃＤＮＡ３．１ベクターにヒトＩｇＧ１−ＬＡＬＡ骨格、次いで、短いＧ４Ｔリンカー配列および３ｈ５６−５  ｄＡｂ配列とインフレームでクローニングした。ＶＬ  ｃＤＮＡ配列を、改変ｐｃＤＮＡ３．１ベクターにカッパまたはラムダ定常ドメインとインフレームでクローニングした。さらに、セリクレルマブおよびＡＤＣ−１０１３  ＶＨ配列を各々ヒトＩｇＧ１  ＬＡＬＡまたはヒトＩｇＧ１骨格とインフレームでクローニングし、３Ｈ５６−５配列を、ＬＡＬＡ突然変異を含有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ断片とインフレームでクローニングした。重鎖および軽鎖（表２８）または単一の重鎖のいずれかをＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ１細胞に共トランスフェクトすることにより、四価、セリクレルマブＩｇＧ１  ＬＡＬＡおよび３ｈ５６  ＩｇＧ１  ＬＡＬＡ分子を産生した。上清を回収した後、プロテインＡで精製した。
【０２１４】
【表２８】
2020504105.tif 000032
【０２１５】
実施例１８：ＣＤ４０の二重エピトープ標的化は、アゴニスト活性を増加させる。
二重エピトープ標的化を介したＯＸ４０アゴニズムを増強する方法を、ＯＸ４０と構造的相同性を示すＴＮＦＲスーパーファミリーの別のメンバーであるＣＤ４０にさらに拡大した。この目的のために、表２８に列挙されているように、抗ＣＤ４０モノクローナル抗体由来の結合単位を組み合わせる様々な分子を産生し、ＤＣ成熟アッセイで試験した。このアッセイにおいて、ヒトＰＢＭＣを先に記載したように単離し、単球を製造業者の指示書（Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）に従って単球精製キットを用いて精製した。ＤＣを産生するために、精製された単球を５０ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ）および２０ｎｇ／ｍＬのｒｈＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ）の存在下で３７℃、５％ＣＯ２にて６日間培養した。樹状細胞の表現型をＣＤ１ｃ  ＡＰＣ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｃｈｅｒ）を用いてフローサイトメトリーにより実証した。次いで、細胞を抗ＣＤ４０抗体または対照の存在下で培養した。２日後、ＤＣを採取し、抗ＣＤ１ｃ−ＡＰＣ、抗ＣＤ８０−ＰＥ、抗ＣＤ８６−ＰｅｒＣＰ−ｅＦ７１０、抗ＣＤ８３−ＦＩＴＣ、抗ＨＬＡ−ＤＲ−ＰｅｒＣＰ５．５（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｃｈｅｒ）で染色した。細胞を１００ｌのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、Ｃｙｔｏｆｌｅｘ上に得た。ＤＣでのＣＤ８３およびＣＤ８６のアップレギュレートについて、試験した抗ＣＤ４０抗体の可能性を評価するために、ＣＤ８３およびＣＤ８６を発現する細胞のパーセンテージの分析を、ＣｙｔＥｘｐｅｒｔを用いて行った。図３１に示すように、モノクローナル単一特異性または二重エピトープ抗ＣＤ４０抗体のいずれかでの単球由来ＤＣの処置により、ＤＣ成熟マーカーＣＤ８３およびＣＤ８６がアップレギュレートされる。同様に、ＣＤ４０およびＨＬＡ−ＤＲもアップレギュレートされた（データは図示せず）。試験した抗体の多くは、可溶性ＣＤ４０Ｌ（セリクレルマブＩｇＧ１  ＬＡＬＡ、ＡＤＣ−１０１３＿３ｈ５６、２Ｃ１０＿３ｈ５６およびＣＤ４０．１＿３ｈ５６）と同等のアゴニスト作用を誘導し、２つの二重エピトープ抗ＣＤ４０抗体は、より高いアゴニスト活性を示す（セリクレルマブ＿３ｈ５６およびテネリキシマブ＿３ｈ５６）。
【０２１６】
ＤＣ成熟アッセイで先に試験した抗ＣＤ４０分子のアゴニズム可能性を、製造業者の指示書（Ｐｒｏｍｅｇａ）に従ってＣＤ４０−バイオアッセイキットを用いてさらに評価した。このアッセイにおいて、ＮＦｋＢ−Ｌｕｃ２Ｐ／Ｕ２Ｏを完全ＲＰＭＩ培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％ＦＢＳ）に３×１０５細胞／ｍｌで再懸濁し、１００ｍｌのこの細胞懸濁液を９６発光プレートに分配した。次いで、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。翌日、試験した抗ＣＤ４０抗体すべてをアッセイ緩衝液（ＲＰＭＩ１６４０＋１％ＦＢＳ）で連続希釈し、７５ｍｌのこの調製物を細胞に添加した。３７℃、５％ＣＯ２で５時間インキュベートした後、７５μＬのＢｉｏ−Ｇｌｏ溶液をウェルに添加し、プレートをマイクロプレートリーダー中に得た。発光を、以下の設定：読取テープ−終点を用いて測定した。図３２の結果から、抗ＣＤ４０抗体が、様々なレベルのＣＤ４０依存的ルシフェラーゼ活性を示すことが分かる。このアッセイにおいて、３ｈ５６  ＩｇＧ１  ＬＡＬＡ、報告された抗ＣＤ４０アゴニスト抗体は、予想通り、ＣＤ４０シグナルを活性化しない。しかし、その結合単位と、セリクレルマブ（セリクレルマブ＿３ｈ５６）またはＡＤＣ−１０１３（ＡＤＣ−１０１３＿３ｈ５６）のいずれか由来の部分との組み合わせは、セリクレルマブまたはＡＤＣ−１０１３単独各々と比較して、活性を増加させる。
【０２１７】
総合すると、図３１および３２の結果から、ＯＸ４０で観察されたように、四価二重エピトープ抗体を用いてＣＤ４０を標的化する方法が、これらの単一特異性対応物と比較してアゴニスト活性の増強を促進することが分かる。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年9月27日(2019.9.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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