(57)【要約】  ＣＤ８Ａに対して特異的に結合するフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（ＦＮ３）、ＣＤ８Ａ特異的ＦＮ３ドメインをコードすることができる関連ポリヌクレオチド、ＦＮ３ドメインを発現する細胞、ならびに、関連ベクター、及び、検出可能に標識されたＦＮ３ドメインは、治療及び診断用途において有用である。【選択図】  図１
2020513744.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３５のアミノ酸配列を含むヒトＣＤ８Ａタンパク質に対して特異的に結合する、単離したＦＮ３ドメイン。
【請求項２】
前記ＦＮ３ドメインが、配列番号２７１のアミノ酸配列を含むカニクイザルＣＤ８Ａタンパク質と交差反応する、請求項１に記載の単離したＦＮ３ドメイン。
【請求項３】
ａ）前記ＦＮ３ドメインが、配列番号１のＴｅｎｃｏｎ配列に基づくものであり、
ｂ）前記ＦＮ３ドメインが、配列番号４のＴｅｎｃｏｎ２７配列に基づくものであり、及び／または
ｃ）前記ＦＮ３ドメインを、配列番号２、３、５、６、７、または、８の配列を含むライブラリーから単離する、請求項２に記載の単離したＦＮ３ドメイン。
【請求項４】
前記ＦＮ３ドメインが、第２の分子にコンジュゲートしている、請求項３に記載の単離したＦＮ３ドメイン。
【請求項５】
前記第２の分子が、検出可能な標識である、請求項４に記載の単離したＦＮ３ドメイン。
【請求項６】
前記検出可能な標識が、放射性同位体、磁性ビーズ、金属ビーズ、コロイド粒子、蛍光染料、電子密度の高い試薬、酵素、ビオチン、ジゴキシゲニン、または、ハプテンである、請求項５に記載の単離したＦＮ３ドメイン。
【請求項７】
前記ＦＮ３ドメインが、配列番号７９、８１、８３、８９、１２２、及び、６８に対応する残基位置５４に、システイン置換を有する、請求項３に記載の単離したＦＮ３ドメイン。
【請求項８】
前記ＦＮ３ドメインが、酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイで測定されるように、インビトロで、ＣＤ８＋  Ｔ細胞を活性化しない、請求項３に記載の単離したＦＮ３ドメイン。
【請求項９】
前記ＦＮ３ドメインが、ヒトＣＤ８Ａタンパク質への結合について、配列番号２２９〜２３４の１つのアミノ酸配列を含む前記ＦＮ３ドメインと競合する、請求項３に記載の単離したＦＮ３ドメイン。
【請求項１０】
前記ＦＮ３ドメインが、実施例３に記載した条件で実施した表面プラズモン共鳴で測定されるように、約０．０２〜約６．６ｎＭの間の親和性（ＫＤ）で、ヒトＣＤ８Ａタンパク質に結合する、請求項３に記載の単離したＦＮ３ドメイン。
【請求項１１】
前記ＦＮ３ドメインが、配列番号４０〜２６９のアミノ酸配列のいずれか１つを含む、請求項３に記載の単離したＦＮ３ドメイン。
【請求項１２】
前記ＦＮ３ドメインのＮ末端にメチオニンをさらに含む、請求項１１に記載の単離したＦＮ３ドメイン。
【請求項１３】
前記ＦＮ３ドメインが、半減期延長部分に結合している、請求項３に記載の単離したＦＮ３ドメイン。
【請求項１４】
前記半減期延長部分が、ＣＤ８結合分子、アルブミン、アルブミン変異体、アルブミン結合分子、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＣＤ８、ＣＤ８変異体、または、免疫グロブリンのＦｃ領域の少なくとも一部である、請求項１３に記載の単離したＦＮ３ドメイン。
【請求項１５】
請求項１１に記載のＦＮ３ドメインをコードする単離したポリヌクレオチド。
【請求項１６】
請求項１５に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１７】
請求項１６に記載のベクターを含む単離した宿主細胞。
【請求項１８】
ヒトＣＤ８Ａタンパク質に対して特異的に結合するＦＮ３ドメインを製造する方法であって、前記ＦＮ３ドメインを発現する条件下で請求項１７に記載の単離した宿主細胞を培養し、及び、前記ＦＮ３ドメインを精製する、ことを含む前記方法。
【請求項１９】
請求項１１に記載のＦＮ３ドメインを含む診断キット。
【請求項２０】
請求項１１に記載のＦＮ３ドメインを含む診断薬または捕捉剤。
【請求項２１】
前記ＦＮ３ドメインが、配列番号７９、８１、８３、８９、１２２、及び／または、６８に対応する残基位置５４に、システイン置換を有する、請求項２０に記載の診断薬または捕捉剤。
【請求項２２】
前記置換システインが、Ｚｒ−８９、または、Ｉ−１２４にコンジュゲートしている、請求項２１に記載の診断薬。
【請求項２３】
生物学的試料に含まれるＣＤ８発現細胞を検出する方法であって、前記生物学的試料を請求項２０に記載の診断試薬で処理し、及び、そのような診断薬のＦＮ３ドメインへの前記生物学的試料の結合を評価する、ことを含む前記方法。
【請求項２４】
前記診断薬が、配列番号７９、８１、８３、８９、１２２、及び／または、６８の残基位置５４に、システイン置換を有し、かつ、前記置換システインが、Ｚｒ−８９、または、I−１２４にコンジュゲートしている、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出をした配列表を含み、そして、その全内容を、本明細書の一部を構成するものとして援用する。２０１７年１２月５日に作成した前出のＡＳＣＩＩコピーは、ＪＢＩ５１１２ＷＯＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔの名称を付しており、その大きさは、２６６，９７８バイトである。
【０００２】
技術分野
本発明は、分化クラスター８ａ（ＣＤ８ａ）に対して特異的に結合するフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインに関する。かようなＦＮ３ドメインは、例えば、医用画像、診断、及び、薬物療法に使用し得る。かような分子の製造方法、及び、それらを含む診断薬も提供する。
【背景技術】
【０００３】
がん免疫療法が急速な進歩を遂げている分野では、最近、幾つかの新たにＦＤＡ承認を受けた免疫療法があり、現在では、ずっと数多くの療法が、様々ながんについて、臨床試験が行われている。さらに、細胞性、小分子、抗体ベースの免疫療法、及び、それらの組み合わせを、臨床解釈について、前臨床的に厳密に試験をしている。動的腫瘍微小環境及び腫瘍不均一性は、前臨床試験及び臨床試験の双方における重要なトピックとなっている（非特許文献；非特許文献２；非特許文献３）が、原発性病変、及び、転移性癌の免疫状態の変化をモニターする能力には限りがある。全血由来のリンパ球、または、異種腫瘍由来の生検をモニターする現在の方法は、その多くが、免疫細胞の数及び局在性に関する全身的変化を惹起するものであるが、治療的介入に対する免疫応答のモニターに必要であると考えられる動的及び空間的情報は反映していない。したがって、実験的治療期間での免疫細胞の数または局在性について、全身的変化、及び、腫瘍内での変化の双方を非侵襲的にモニターできる分子画像法は、免疫療法メカニズムの動態の理解を高めて、臨床的免疫療法応答を予測、及び／または、評価する解釈可能な方法の提供も可能にする。
【０００４】
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の分析は、腫瘍免疫微小環境の重要性、及び、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞の存在が、乳癌、肺癌、卵巣癌、悪性黒色腫、及び、大腸癌での全生存を予測できる、ことを実証している（非特許文献４及び、非特許文献５の文献で検討がされている）。腫瘍免疫微小環境を変化させる免疫療法の最近の臨床的成功として、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）−、または、キメラ抗原受容体形質導入細胞傷害性Ｔ細胞の養子細胞移入（ＡＣＴ）（非特許文献６；非特許文献７）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、及び、ＣＤ４０を標的とするアゴニスト抗体（非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０）、及び、チェックポイント阻害剤ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、及び、ＰＤ−Ｌ１の抗体遮断（非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３）があり、治療に対する腫瘍の免疫応答を非侵襲的にモニターする能力が、最も重要になってきている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】１Ｈａｎａｈａｎ  Ｄ，Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  ＲＡ．Ｃｅｌｌ  ２０１１；１４４：６４６−７４
【非特許文献２】Ｍ  ａｎｔｏｖａｎｉ  Ａ，Ａｌｌａｖｅｎａ  Ｐ，Ｓｉｃａ  Ａ，Ｂａｌｋｗｉｌｌ  Ｆ．Ｎａｔｕｒｅ  ２００８；４５４：４３６−４４
【非特許文献３】Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ  ＲＤ，Ｏｌｄ  ＬＪ，Ｓｍｙｔｈ  ＭＪ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１１；３３１：１５６５−７０
【非特許文献４】Ｐａｇｅｓ  Ｆ，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２０１０；２９：１０９３−１０２．
【非特許文献５】Ｇｏｏｄｅｎ  ＭＪ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２０１１；１０５：９３−１０３
【非特許文献６】Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＬＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  ２００９；１１４：５３５−４６
【非特許文献７】Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ＳＡ．Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ２０１２；４：１２７ｐｓ８
【非特許文献８】Ｍｅｌｅｌｏ  Ｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０１３；１９：９９７−１００８
【非特許文献９】Ｍｅｌｅｒｏ  Ｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００７；７：９５−１０６
【非特許文献１０】Ｖｉｎａｙ  ＤＳ，ａｎｄ  Ｋｗｏｎ  ＢＳ．Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  ２０１２；１１：１０６２−７０
【非特許文献１１】Ｃａｌｌａｈａｎ  ＭＫ，ａｎｄ  Ｗｏｌｃｈｏｋ  ＪＤ．Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ  ２０１３；９４：４１−５３
【非特許文献１２】Ｓｈｉｎ  ＤＳ，ａｎｄ  Ｒｉｂａｓ  Ａ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１５；３３Ｃ：２３−３５
【非特許文献１３】Ｔｏｐａｌｉａｎ  ＳＬ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２０１５；２７：４５０−６１
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、ＣＤ８Ａ結合フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインを含む。提供したＦＮ３ドメインをコードすることができる関連ポリヌクレオチド、提供したＦＮ３ドメインを発現する細胞、ならびに、関連ベクターも記載している。さらに、提供したＦＮ３ドメインを使用する方法も記載している。例えば、本発明のＦＮ３ドメインは、ＣＤ８＋  Ｔ細胞の存在及び存在量を、非侵襲的かつ定量的にモニターするために使用することができる。
【０００７】
幾つかの実施形態では、本発明は、単離したＦＮ３ドメインを含み、当該ＦＮ３ドメインは、配列番号３５を含むヒトＣＤ８Ａに結合する。その他の実施形態では、当該ＣＤ８Ａ特異的ＦＮ３ドメインは、ヒトＣＤ８Ａ、及び、カニクイザルＣＤ８Ａに結合する。さらに他の実施形態では、当該ＣＤ８Ａ特異的ＦＮ３ドメインは、配列番号１のＴｅｎｃｏｎ配列に基づいている。さらなる実施形態では、当該ＣＤ８Ａ特異的ＦＮ３ドメインは、配列番号４のＴｅｎｃｏｎ２７配列に基づいている。幾つかの実施形態では、当該アルブミン特異的ＦＮ３ドメインは、配列番号２、３、５、６、７、または、８の配列を含むライブラリーから単離する。幾つかの実施形態では、当該ＣＤ８Ａ特異的ＦＮ３ドメインは、酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイで測定されるように、インビトロで、ＣＤ８＋  Ｔ細胞を活性化しない。幾つかの実施形態では、当該ＣＤ８Ａ特異的ＦＮ３ドメインは、表面プラズモン共鳴で測定されるように、約０．０２〜約６．６ｎＭの間の親和性（ＫＤ）で、ヒトＣＤ８Ａに結合する。その他の実施形態では、当該ＣＤ８Ａ特異的ＦＮ３ドメインは、配列番号７９、８１、８３、８９、１２２、及び、６８の残基位置５４で、システイン置換を有する。その他の実施形態では、当該ＣＤ８Ａ特異的ＦＮ３ドメインは、配列番号４０〜２６９のアミノ酸配列を含む。その他の実施形態では、当該ＣＤ８Ａ特異的ＦＮ３ドメインは、検出可能な標識にコンジュゲートしている。
【０００８】
記載した当該ＣＤ８Ａ特異的ＦＮ３ドメインに加えて、記載したＦＮ３ドメインをコードすることができるポリヌクレオチド配列も提供する。本明細書に記載した当該ＣＤ８Ａ特異的ＦＮ３ドメインを発現する細胞と同様に、記載したポリヌクレオチドを含むベクターも提供する。開示したベクターを発現することができる細胞も記載している。これらの細胞を、哺乳動物細胞（２９３Ｆ細胞、ＣＨＯ細胞など）、昆虫細胞（Ｓｆ７細胞など）、酵母細胞、植物細胞、または、細菌細胞（Ｅ．ｃｏｌｉなど）とし得る。記載したＦＮ３ドメインの製造方法も提供する。
【０００９】
また、本発明は、記載した当該ＣＤ８Ａ特異的ＦＮ３ドメインを、診断目的のための様々な分子にコンジュゲートし、または、会合する方法を含む。例えば、Ｚｒ−８９、または、I−１２４は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞の存在を検出することができる診断薬の創製のための理想的な融合パートナーである。このように、当該ＣＤ８Ａ特異的ＦＮ３ドメインは、ＣＤ８Ａをバイオマーカーとして使用するがん診断において有用性を有する。
【００１０】
本発明の別の実施形態は、生物学的試料でのＣＤ８Ａ発現細胞を検出する方法であって、記載した当該ＣＤ８Ａ特異的ＦＮ３ドメインを含む診断薬で当該生物学的試料を処理することを含む。これらの方法を、実施例に提供している。
【００１１】
本発明の範囲内には、開示した当該ＣＤ８Ａ特異的ＦＮ３ドメインを含むキットがある。このキットは、本明細書で提供した当該ＣＤ８Ａ特異的ＦＮ３ドメインを使用する方法、または、当業者に公知のその他の方法を実行するために使用し得る。幾つかの実施形態では、記載した当該キットは、本明細書に記載のＦＮ３ドメイン、及び、生物学的試料でのヒトＣＤ８Ａの存在を検出するために使用する試薬を含み得る。本明細書に記載したように、記載した当該キットは、本明細書に記載の１つ以上のＦＮ３ドメイン、及び、未使用時に当該ＦＮ３ドメインを入れるための容器、固体支持体に固定した当該ＦＮ３ドメインの使用説明書、及び／または、ＦＮ３ドメインの検出可能な標識形態を含み得る。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＣＤ８Ｓ３６５−ＤＦＯコンジュゲートは、Ｔ細胞をデノボで活性化せず、そして、２４時間のＩＮＦγ  ＥｌｉＳｐｏｔアッセイで、Ｔ細胞の抗原依存性活性化を調節しない。ＣＭＶ反応性Ｔ細胞を、ＣＭＶペプチドの非存在下（Ａ）または存在下（Ｂ）で、３６５−ＤＦＯで処理した。第２のＭ１反応性ドナーもまた、Ｍ１ペプチドの非存在下（Ｃ）または存在下（Ｄ）で試験した。
【図２】ＣＤ８Ｓ３６５−ＤＦＯコンジュゲートは、Ｔ細胞をデノボで活性化せず、そして、６日間のＩＦＮγ  ＭＳＤアッセイで、Ｔ細胞の抗原依存性活性化を調節しない。ＣＭＶ反応性Ｔ細胞を、ＣＭＶペプチドの非存在下（Ａ）または存在下（Ｂ）で、３６５−ＤＦＯで処理した。
【図３】［１２４Ｉ］−ＩＰＥＭの粗分取ＨＰＬＣトレース。Ｗａｔｅｒｓ  １５２５  Ｂｉｎａｒｙ  ＨＰＬＣポンプ、Ｗａｔｅｒｓ  ２４８９二重波長ＵＶ／可視検出器（λ＝２１４及び２５４ｎｍ）、Ｂｉｏｓｃａｎ  Ｆｌｏｗ  Ｃｏｕｎｔ放射線検出器（Ｂ−ＦＣ−２０００）、及び、Ａｔｌａｎｔｉｓ  Ｔ３、１００オングストローム、５μｍ、１５０×４．６ｍｍのＨＰＬＣカラムを使用して、分取ＨＰＬＣを実施した。使用した溶出プロファイルは、以下の通りであった。溶媒Ａ＝Ｈ２Ｏ（０．１％ＡｃＯＨ（ｖ／ｖ））、溶媒Ｂ＝ＭｅＣＮ（０．１％ＡｃＯＨ（ｖ／ｖ））、流速＝１．５ｍＬ／分、初期＝８０％Ａ、２０分＝０％Ａ（線形勾配）。２５４ｎｍ（上方のグラフ）、及び、２１４ｎｍ（中央のグラフ）のＵＶ−ｖｉｓトレースでの複数の小分子吸光度は、粗反応混合物での不純物、及び、副生成物の存在を示す。放射性トレース（下方のグラフ）は、放射標識不純物に起因する予想ベースラインピークも示している。
【図４】［１２４Ｉ］−ＩＰＥＭの分析ＨＰＬＣトレース。Ｗａｔｅｒｓ  １５２５  Ｂｉｎａｒｙ  ＨＰＬＣポンプ、Ｗａｔｅｒｓ  ２７０７オートサンプラー、Ｗａｔｅｒｓ  ２４８９二重波長ＵＶ／可視検出器（λ＝２１４及び２８０ｎｍ）、Ｂｉｏｓｃａｎ  Ｆｌｏｗ  Ｃｏｕｎｔ放射線検出器（Ｂ−ＦＣ−２０００）、及び、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｋｉｎｅｔｅｘ  ５μｍ  ＸＢ−Ｃ１８  １００オングストローム、１５０×４．６ｍｍＨＰＬＣカラムを使用して、分析ＨＰＬＣを実施した。使用した溶出プロファイルは、以下の通りであった。溶媒Ａ＝Ｈ２Ｏ（０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ））、溶媒Ｂ＝ＭｅＣＮ（０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ））、流速＝１ｍＬ／分、初期＝９０％Ａ、１５分＝０％Ａ（線形勾配）。分析的に純粋な［Ｉ−１２４］ＩＰＥＭは、単一の放射性ピークを示しており（下方のグラフ）、滑らかなベースラインは、精製の成功を確認するものである。［Ｉ−１２４］ＩＰＥＭは、小さな有機分子であるので、２８０ｎｍ（上方のグラフ）、及び、２１４ｎｍ（中央のグラフ）では吸収が認められない。
【図５】精製した［１２４Ｉ］−ＩＰＥＭ  ＣＤ８Ｓ３６５のラジオＴＬＣ。ｉＴＬＣ−ＳＧプレート（Ａｇｉｌｅｎｔ、カタログ番号ＳＧＩ０００１）を、Ｂｉｏｓｃａｎ  ＡＲ−２０００ラジオ−ＴＬＣ画像スキャナーで読み取った。この放射線ＴＬＣプレート（図３）を、１μｌのＮａＩ（０．１Ｍ）と共スポットし、そして、溶離液としてクエン酸（０．５ｍＭ、ｐＨ＝５）を用いて発色させた。原点＝２０ｍｍ、及び、溶媒先端＝１００ｍｍ。この放射線ＴＬＣ溶離液を、９６ｍｇのクエン酸（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  カタログ番号Ｃｌ１３１）を、２５ｍＬのＴｒａｃｅ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｈ２Ｏに溶解し、次いで、Ｎａ２ＣＯ３を加えて（２４５μＬ、２Ｍ）調製し、そのｐＨを、ストリップでチェックした（ｐＨ＝５）。
【図６】精製した［１２４Ｉ］−ＩＰＥＭの分析ＨＰＬＣトレース。Ｗａｔｅｒｓ  １５２５  Ｂｉｎａｒｙ  ＨＰＬＣポンプ、Ｗａｔｅｒｓ  ２７０７オートサンプラー、Ｗａｔｅｒｓ  ２４８９二重波長ＵＶ／可視検出器（λ＝２１４及び２８０ｎｍ）、Ｂｉｏｓｃａｎ  Ｆｌｏｗ  Ｃｏｕｎｔ放射線検出器（Ｂ−ＦＣ−２０００）、及び、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｋｉｎｅｔｅｘ  ５μｍ  ＸＢ−Ｃ１８  １００オングストローム、１５０×４．６ｍｍＨＰＬＣカラムを使用して、分析ＨＰＬＣを実施した。使用した溶出プロファイルは、以下の通りであった。溶媒Ａ＝Ｈ２Ｏ（０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ））、溶媒Ｂ＝ＭｅＣＮ（０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ））、流速＝１ｍＬ／分、初期＝９０％Ａ、１５分＝０％Ａ（線形勾配）。２８０ｎｍでの生体分子（ＣＤ８Ｓ）吸光度（上方のグラフ）、及び、２１４ｎｍでの小分子（Ｉ１２４−ＩＰＥＭ）吸光度（中央のグラフ）は、コンジュゲーション反応が成功したことを確認している。ＵＶ及び放射線トレース（下方のグラフ）は、分析的に純粋な試料を示している。
【図７】ＩＰＥＭ  ＣＤ８Ｓ３６５のＭＡＬＤＩ−ＭＳ（理論値分子量＝１０７８６．１２）。ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析を、Ｂｒｕｋｅｒ  ＵｌｔｒａｆｌｅＸｔｒｅｍｅ  ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ／ＴＯＦを陽イオンモード（線形検出器）で使用して、Ｂｉｏｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅで実施した。シナピン酸の飽和溶液を、ＴＡ３０溶媒（３０：７０（ｖ／ｖ）ＭｅＣＮ：０．１％ＴＦＡの水）で調製した。試料（ｃ＝０．３９７ｍｇ／ｍＬ）を、マトリックス溶液と１：１の比で混合し、そして、１μｌをプレート上にスポットした。タンパク質溶液を、外部標準として使用した。
【図８】［１２４Ｉ］−ＩＰＥＭ  ＣＤ８Ｓ３６５と冷スタンダードとの共注入。Ｗａｔｅｒｓ  １５２５  Ｂｉｎａｒｙ  ＨＰＬＣポンプ、Ｗａｔｅｒｓ  ２７０７オートサンプラー、Ｗａｔｅｒｓ  ２４８９二重波長ＵＶ／可視検出器（λ＝２１４及び２８０ｎｍ）、Ｂｉｏｓｃａｎ  Ｆｌｏｗ  Ｃｏｕｎｔ放射線検出器（Ｂ−ＦＣ−２０００）、及び、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｋｉｎｅｔｅｘ  ５μｍ  ＸＢ−Ｃ１８  １００オングストローム、１５０×４．６ｍｍＨＰＬＣカラムを使用して、分析ＨＰＬＣを実施した。使用した溶出プロファイルは、以下の通りであった。溶媒Ａ＝Ｈ２Ｏ（０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ））、溶媒Ｂ＝ＭｅＣＮ（０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ））、流速＝１ｍＬ／分、初期＝９０％Ａ、１５分＝０％Ａ（線形勾配）。冷試料と共注入すると、ＵＶピークの重なりは完全なものとなり（上方と中央のグラフ）、生成物の分子的同一性が確認できる（すなわち、ヨウ素がヨウ素−１２４に置き換わっている以外は、冷標識物と放射標識物とは同一である）。
【図９】注射の２時間後に撮影した、I−１２４で放射標識したＣＤ８Ｓ３６５−ＩＰＥＭ５を示す代表的なＰＥＴ画像。この画像は、最大値投影像（前後方向）であり、脾臓は、十字線の中心にある。脾臓の下方にある臓器は腎臓であり、そして、この画像は、頭が上になるように調整してある。甲状腺への取り込みは、当該タンパク質が、幾ばくか脱ヨウ素化した証拠である。
【図１０】Ｚｒ−８９またはＩ−１２４のいずれかで標識した各抗ＣＤ８Ａ  ＦＮ３ドメインについての非ヒト霊長類における血液放射能についての時間−活性曲線。
【図１１】Ｚｒ−８９またはＩ−１２４のいずれかで標識した各センチリンについてのＮＨＰでの臓器放射能についての時間−活性曲線。図１１Ａは、腎臓、肝臓、脾臓を示しており、一方で、図１１Ｂは、脾臓に注目をしている。［１２４Ｉ］−ＩＰＥＭ  ＣＤ８Ｓ３６５の２４時間の時点は、技術的な問題のために欠落している。同位体の残留に起因する腎臓でのＺｒ−８９の大きな取り込みは、Ｉ−１２４のデータでは、ほとんど認められない。
【図１２】非ヒト霊長類から採取した血液での３日目までのＣＤ８  Ｔ細胞枯渇の確認（１２Ａ）。ＣＤ４（１２Ｂ）、及び、ＣＤ３  Ｔ細胞（１２Ｃ）での変化も示している。
【図１３】ＣＤ８枯渇動物での注射の２時間後に撮影した、Ｉ−１２４で放射標識した３６５抗ＣＤ８Ａ  ＦＮ３ドメインを示す代表的なＰＥＴ画像。この画像は、最大値投影像（前後方向）である。このものは、脾臓が明確に腎臓の上に認められる図９での非枯渇動物と比較する。
【図１４】［１２４Ｉ］−ＩＰＥＭ  ＣＤ８Ｓ３６５を投与した後の枯渇動物、及び、非枯渇動物の双方についてのカニクイザルにおける血液放射能についての時間−活性曲線。
【図１５Ａ】枯渇動物、及び、非枯渇動物の双方についてのカニクイザルにおける臓器放射能についての時間−活性曲線。１５Ａは、腎臓、肝臓、脾臓を示しており、一方で、図１５Ｂは、脾臓に注目をしている。
【図１５Ｂ】枯渇動物、及び、非枯渇動物の双方についてのカニクイザルにおける臓器放射能についての時間−活性曲線。１５Ａは、腎臓、肝臓、脾臓を示しており、一方で、図１５Ｂは、脾臓に注目をしている。
【図１６】注射の３時間後に撮影した、Ｉ−１２４で放射標識したＣＤ８Ｓ３６５−ＩＰＥＭを示す、同じように処置をした２匹のマウスの代表的なＰＥＴ画像。この画像は、ＣＴスキャンに重ね合わせた３Ｄ最大値投影像である。腫瘍（ｈｕＣＤ８＋を過剰発現するようにトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３−ｌｕｃから形成した）、及び、その他の器官を、矢印で示した。甲状腺への取り込みは、当該タンパク質が、幾ばくか脱ヨウ素化した証拠である。
【図１７】ＨＥＫ−２９３−ｌｕｃ  ＣＤ８＋、または、ＨＥＫ−２９３親腫瘍のいずれかを保有するマウスにおける血中放射能についての時間−活性曲線。
【図１８】ＨＥＫ−２９３−ｌｕｃ  ＣＤ８＋、または、ＨＥＫ−２９３親腫瘍のいずれかを保有するマウスにおける腫瘍放射能についての時間−活性曲線。
【図１９】移植細胞の数に応じた、ＨＥＫ２９３  ＣＤ８過剰発現細胞におけるＩ−１２４標識ＣＤ８Ｓ３６５の取り込み。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
定義
本明細書、及び、特許請求の範囲を通して、説明の態様に関する様々な用語を使用している。そのような用語には、特に断りの無い限りは、当該技術分野における通常の意味を付与する。具体的に定義をしたその他の用語は、本明細書で提供した定義と符合するように解釈する。
【００１４】
本明細書、及び、添付した特許請求の範囲で使用する単数形「ａ」、「ａｎ」、及び、「ｔｈｅ」は、その内容を具体的に明示していない限りは、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「ある細胞」という言及は、２つ以上の細胞の組み合わせなどを含む。
【００１５】
数量や持続時間などの測定可能な数値を指す場合に本明細書で使用する用語「約」とは、特定の値から±１０％までの変動を含んでおり、そのような変動が、開示した方法の実施に適している、ことを意味する。特に断りの無い限り、本明細書、及び、特許請求の範囲で使用している成分の量、分子量などの特性、反応条件などを示すあらゆる数字は、すべての場合において、用語「約」によって修飾される、と理解すべきである。したがって、特に断りの無い限り、以下の明細書、及び、添付した特許請求の範囲に記載の数値パラメーターは、本発明で取得することが必要とされる所望の特性に応じて変化し得る近似値である。少なくとも最小限で、かつ、特許請求の範囲に対する均等論の適用を制限する試みとしてではなく、各数値パラメーターは、少なくとも、報告された有効桁数を考慮し、そして、通常の丸め処理を行う、ものと解釈されるべきである。
【００１６】
本発明の広範な範囲を説明する数値範囲及びパラメーターは近似値であるにもかかわらず、特定の実施例に記載されている数値は、可能な限り正確に報告している。しかしながら、いずれの数値にあっても、それらの個々の試験測定値に認められる標準偏差から必然的に生じる特定の誤差を本質的に含む。
【００１７】
「単離した」とは、生物学的成分（核酸、ペプチド、または、タンパク質など）を、その成分が天然に存在している生物でのその他の生物学的成分、すなわち、その他の染色体、ならびに、染色体外のＤＮＡ、及び、ＲＮＡ、そして、タンパク質から実質的に分離、生成、または、精製した、ことを意味する。したがって、「単離した」核酸、ペプチド、及び、タンパク質は、標準的な精製方法で精製した核酸及びタンパク質を含む。「単離した」核酸、ペプチド、及び、タンパク質を、組成物の一部とすることができ、そして、そのような組成物が、当該核酸、ペプチド、または、タンパク質の本来の環境の一部ではない場合には、なおも単離することができる。また、この用語は、宿主細胞における組換え発現で調製した核酸、ペプチド、及び、タンパク質、ならびに、化学合成した核酸も含む。本明細書で使用する「単離した」ＦＮ３ドメインは、異なる抗原特異性を有するその他のＦＮ３ドメインを実質的に含まないＦＮ３ドメインを指すことを意図している（例えば、ヒト血清アルブミンに対して特異的に結合する単離したＦＮ３ドメインは、ヒト血清アルブミン以外の抗原に対して特異的に結合するＦＮ３ドメイン実質的に含まない）。しかしながら、ヒト血清アルブミンのエピトープ、アイソフォーム、または、変異体に対して特異的に結合する単離したＦＮ３ドメインは、例えば、その他の種（血清アルブミン種相同体など）に由来するその他の関連抗原に対する交差反応性を有し得る。
【００１８】
本明細書で使用する用語「フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン」（ＦＮ３ドメイン）は、フィブロネクチン、テネイシン、細胞内細胞骨格タンパク質、サイトカイン受容体、及び、原核細胞酵素を含むタンパク質に高頻度で認められるドメインのことを指す（Ｂｏｒｋ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：８９９０−８９９４，１９９２；Ｍｅｉｎｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １７５：１９１０−１９１８，１９９３；Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６５：１５６５９−１５６６５，１９９０）。代表的なＦＮ３ドメインとして、ヒトテネイシンＣに存在する１５個の異なるＦＮ３ドメイン、ヒトフィブロネクチン（ＦＮ）に存在する１５個の異なるＦＮ３ドメイン、及び、例えば、米国特許第８，２７８，４１９号に記載の非天然の合成ＦＮ３ドメインがある。個々のＦＮ３ドメインは、ドメイン番号とタンパク質の名称、例えば、テネイシンの３番目のＦＮ３ドメイン（ＴＮ３）、または、フィブロネクチンの１０番目のＦＮ３ドメイン（ＦＮ１０）で呼ばれる。
【００１９】
本明細書で使用する「センチリン」は、ヒトテネイシンＣに存在する１５個の異なるＦＮ３ドメインのコンセンサス配列に基づいたＦＮ３ドメインのことを指す。
【００２０】
用語「捕捉剤」は、特定の種類の細胞に結合し、そして、その他の細胞から当該細胞を単離することを可能とする物質のことを指す。捕捉剤の例として、磁気ビーズ、磁性流体、カプセル化試薬などがあるが、これらに限定されない。
【００２１】
用語「生物学的試料」は、血液、組織、骨髄、唾液などのことを指す。
【００２２】
用語「診断試薬」は、生物学的試料を分析するために使用することができるあらゆる物質のことを指し、当該物質は、単一の物質として流通させてもよく、または、診断キット内のその他の物質と組み合わせて流通させてもよい。
【００２３】
本明細書で使用する用語「置換する」、または、「置換した」、または、「突然変異する」、または、「突然変異した」は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列での１つ以上のアミノ酸またはヌクレオチドを、変化、欠失させるか、または、１つ以上のアミノ酸もしくはヌクレオチドを挿入することで、その配列の変異体を生成することを指す。
【００２４】
本明細書で使用する用語「ランダム化する」、または、「ランダム化した」、または、「多様化した」、または、「多様化する」は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に対して少なくとも１つの置換、挿入、または、欠失を行うことを指す。
【００２５】
本明細書で使用する「変異体」は、例えば、置換、挿入、または、欠失などの１つ以上の修飾を受けた、参照ポリペプチドまたは参照ポリヌクレオチドとは異なるポリペプチドまたはポリヌクレオチドのことを指す。
【００２６】
本明細書で使用する用語「特異的に結合する」または「特異的な結合」は、所定の抗原と、約１×１０−６Ｍ以下、例えば、約１×１０−７Ｍ以下、約１×１０−８Ｍ以下、約１×１０−９Ｍ以下、約１×１０−１０Ｍ以下、約１×１０−１１Ｍ以下、約１×１０−１２Ｍ以下、または、約１×１０−１３Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）で結合する本発明のＦＮ３ドメインの能力のことを指す。一般的に、本発明のＦＮ３ドメインは、例えば、Ｐｒｏｔｅｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＢｉｏＲａｄ）を使用した表面プラズモン共鳴によって測定した場合に、非特異的抗原（例えば、ＢＳＡまたはカゼイン）に対するＫＤよりも少なくとも１０倍低いＫＤで、所定の抗原（すなわち、ヒトＣＤ８Ａ）に結合する。しかしながら、ヒトＣＤ８Ａに特異的に結合する本発明の単離したＦＮ３ドメインは、その他の関連する抗原、例えば、Ｍａｃａｃａ  Ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（カニクイザル、ｃｙｎｏ）、または、Ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ（チンパンジー）などのその他の種に由来する同じ所定の抗原（オルソログ）に対して交差反応性を有し得る。
【００２７】
用語 「ライブラリー」は、変異体のコレクションのことを指す。このライブラリーは、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの変異体で構成し得る。
【００２８】
本明細書で使用する用語「ＣＤ８Ａ」または「ＣＤ８」は、例えば、ＮＣＢＩ参照配列、ＮＰ＿００１１３９３４５．１、ＮＰ＿００１１７５９．３、及び、ＮＰ＿７４１９６９．１に記載されたヒトＣＤ８アルファタンパク質を特異的に含む。また、ＣＤ８Ａも、科学文献において、ＣＤ８ａ分子、ＭＡＬ、ｐ３２、Ｌｅｕ２、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ８アルファ鎖、ＣＤ８抗原、アルファポリペプチド（ｐ３２）、Ｌｅｕ２  Ｔリンパ球抗原、ＯＫＴ８  Ｔ細胞抗原、Ｔ−細胞抗原Ｌｅｕ２、Ｔリンパ球分化抗原Ｔ８／Ｌｅｕ−２、及び、Ｔ８  Ｔ細胞抗原として公知である。
【００２９】
本明細書で使用する「Ｔｅｎｃｏｎ」は、配列番号１に示され、かつ、米国特許出願公開第２０１０／０２１６７０８号に記載の合成フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインのことを指す。
【００３０】
用語「ベクター」は、生物学的系内で複製し得る、または、こうした系間を移動することができるポリヌクレオチドのことを意味する。ベクターポリヌクレオチドは、一般的に、複製起点、ポリアデニル化シグナル、または、選択マーカーなどの要素を含んでおり、それらは、生物系でのこれらのポリヌクレオチドの複製または維持を促進するように機能する。そのような生物学的系の例として、細胞、ウイルス、動物、植物、及び、ベクターの複製を可能にする生物学的要素を利用して再構成した生物学的系がある。ベクターを構成するポリヌクレオチドは、ＤＮＡもしくはＲＮＡ分子、または、これらのハイブリッド分子とし得る。
【００３１】
用語「発現ベクター」は、生物学的系または再構成した生物学的系において利用可能で、当該発現ベクターに存在するポリヌクレオチド配列がコードするポリペプチドの翻訳を指示するベクターを意味する。
【００３２】
用語「ポリヌクレオチド」は、糖−リン酸骨格鎖、または、その他の同等の共有結合要素を介して共有結合したヌクレオチドの鎖を含む分子を意味する。二本鎖及び一本鎖のＤＮＡ及びＲＮＡが、ポリヌクレオチドの典型例である。
【００３３】
用語「ポリペプチド」または「タンパク質」は、ペプチド結合により連結されてポリペプチドを生成する、少なくとも２つのアミノ酸残基を含む分子を意味する。約５０個に満たないアミノ酸からなる小さいポリペプチドのことを、「ペプチド」と称し得る。
【００３４】
本明細書で使用する用語「〜と組み合わせて」は、２つ以上の治療薬が、対象に対して、混合物の状態で一緒に、それぞれ単独の作用物質として同時に、または、それぞれ単独の作用物質としてあらゆる順番で順次に投与できる、ことを意味する。
【００３５】
物質の組成
本発明は、ヒトＣＤ８Ａ結合ＦＮ３ドメイン、及び、検出可能な標識にコンジュゲートしたＣＤ８Ａ結合ＦＮ３ドメインを提供する。本発明は、本発明のＦＮ３ドメインをコードするポリヌクレオチド、または、その相補的核酸、ベクター、宿主細胞、ならびに、それらを作製、及び、使用する方法を提供する。
【００３６】
ＣＤ８Ａ結合分子
本発明は、ＣＤ８Ａに対して特異的に結合し、任意に、検出可能な標識にコンジュゲートするフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインを提供する。これらの分子は、前臨床用途、それに、ＣＤ８Ａをバイオマーカーとして使用するがん診断において広範に使用し得る。本発明は、本発明のＦＮ３ドメインをコードするポリヌクレオチド、または、その相補的核酸、ベクター、宿主細胞、ならびに、それらを作製、及び、使用する方法を提供する。
【００３７】
本発明のＦＮ３ドメインは、ＣＤ８Ａと強い親和性で結合し、そして、ＣＤ８発現細胞内を局在化することができ、それにより、腫瘍微小環境に診断試薬を送達するための効率的な方法を提供する。
【００３８】
本発明のある実施形態は、配列番号３５のアミノ酸配列を含むヒトＣＤ８Ａに特異的に結合する単離したＦＮ３ドメインである。
【００３９】
本明細書に記載の本発明の幾つかの実施形態では、本発明のＦＮ３ドメインは、配列番号２７１のアミノ酸配列を有するカニクイザルＣＤ８Ａと交差反応する。
【００４０】
本発明のＦＮ３ドメインは、ヒト、Ｍａｃａｃａ  Ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ、及び／または、Ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓのＣＤ８Ａと、当業者によって実施される表面プラズモン共鳴により測定した場合に、約１×１０−７Ｍ未満、例えば、約１×１０−８Ｍ未満、約１×１０−９Ｍ未満、約１×１０−１０Ｍ未満、約１×１０−１１Ｍ未満、約１×１０−１２Ｍ未満、または、約１×１０−１３Ｍの解離定数（ＫＤ）で結合し得る。特定のＦＮ３ドメイン−抗原相互作用について測定した親和性は、異なる条件下（例えば、浸透圧、ｐＨ）で測定した場合には変化する場合がある。したがって、親和性、及び、その他の抗原結合パラメータ（例えば、ＫＤ、Ｋｏｎ、Ｋｏｆｆ）の測定は、足場タンパク質、及び、抗原の標準化溶液、ならびに、本明細書に記載の緩衝液などの標準化緩衝液を用いて行われる。
【００４１】
幾つかの実施形態では、ＣＤ８Ａ結合ＦＮ３ドメインは、当該分子のＮ末端に連結した開始メチオニン（Ｍｅｔ）を含む。
【００４２】
幾つかの実施形態では、ＣＤ８Ａ結合ＦＮ３ドメインは、当該ＦＮ３ドメインに連結したシステイン（Ｃｙｓ）を含む。
【００４３】
Ｎ末端Ｍｅｔ、及び／または、Ｃｙｓの付加は、第２の分子の発現、及び／または、コンジュゲートを促進し得る。
【００４４】
本発明の別の実施形態は、ヒトＣＤ８Ａに対して特異的に結合し、そして、当該ＣＤ８Ａ特異的ＦＮ３ドメインが、インビトロで、ＣＤ８＋  Ｔ細胞を活性化しない、単離したＦＮ３ドメインである。ＣＤ８＋  Ｔ細胞活性化は、標準的方法を用いて測定し得る。例えば、酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイを使用し得る。このＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、サンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）技術を使用し得る。当該インターフェロン−ガンマ抗体を、ＰＶＤＦ（ポリビニリデンジフルオリド）で支持したマイクロプレート上にプレコートする。適切に刺激した細胞（細胞＋ペプチド、ＦＮ３ドメインなど）をウェルにピペットで入れ、そして、そのマイクロプレートを、加湿した、３７℃のＣＯ２インキュベーターに、特定の期間入れておく。このインキュベーション期間に、当該分泌細胞の直近にある固定化インターフェロン−ガンマ抗体は、分泌されたインターフェロン−ガンマに結合する。あらゆる細胞や未結合物質を洗い流した後、２番目のビオチン化インターフェロン−ガンマ抗体をウェルに添加する。あらゆる未結合ビオチン化抗体を除去するための洗浄の後に、ストレプトアビジンに結合したアルカリホスファターゼを添加する。続いて、未結合酵素を洗浄して除去し、そして、基質溶液（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）を添加する。青黒色の沈殿物が形成され、そして、インターフェロン−ガンマ局在部位にスポットとして出現し、個々の各スポットは、個々のインターフェロンガンマ−分泌細胞を表す。これらのスポットは、自動ＥＬＩＳｐｏｔリーダーシステムで、または、実体顕微鏡を使用して手動で計数することができる。本発明の単離したＣＤ８Ａ結合ＦＮ３ドメインは、実施例に記載したように、１μＭの濃度で試験した場合に、インビトロで、ＣＤ８＋  Ｔ細胞を活性化しない。
【００４５】
本明細書に記載の本発明の幾つかの実施形態では、当該単離したＦＮ３ドメインは、配列番号４０〜２６９のアミノ酸配列を含む。
【００４６】
本明細書に記載の本発明の幾つかの実施形態では、当該ＣＤ８Ａ特異的ＦＮ３ドメインは、配列番号７９、８１、８３、８９、１２２、及び、６８の残基位置５４で、システイン置換を有する。
【００４７】
タンパク質配列へのシステインの導入をもたらし得る置換は、標準的な化学的性質を使用して、細胞傷害剤、検出可能な標識、半減期延長分子、キレート剤、ポリエチレングリコール、及び／または、核酸などの小分子を、ＦＮ３ドメインに化学的に結合するために利用し得る。
【００４８】
幾つかの実施形態では、ヒトＣＤ８Ａに対して特異的に結合するＦＮ３ドメインは、ヒトＣＤ８Ａへの結合について、配列番号２２９〜２３４のＦＮ３ドメインと競合する。ＦＮ３ドメインは、周知のインビトロ方法を用いて、ヒトＣＤ８Ａと結合するための参照分子との競合について評価し得る。例示的な方法では、ヒトＣＤ８Ａを組換え発現するＨＥＫ細胞を、非標識参照分子と、４℃で、１５分間インキュベートし、続いて、過剰の蛍光標識試験ＦＮ３ドメインと、４℃で、４５分間インキュベートし得る。ＰＢＳ／ＢＳＡで洗浄した後、標準的な方法を用いて、フローサイトメトリーで蛍光を測定し得る。別の例示的な方法では、ヒトＣＤ８Ａの細胞外部分を、ＥＬＩＳＡプレートの表面にコーティングし得る。過剰の非標識参照分子を約１５分間添加し、続いて、ビオチン化試験ＦＮ３ドメインを添加し得る。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄した後に、試験ビオチン化ＦＮ３ドメインの結合を、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ストレプトアビジンを使用して検出し、そして、シグナルは、標準的な方法を使用して検出し得る。競合アッセイにおいて、参照分子は標識し得るものであり、また、試験ＦＮ３ドメインは標識しなくともよい、ことは自明である。当該参照分子が、当該試験ＦＮ３ドメインの結合を阻害する場合、または、当該試験ＦＮ３ドメインが、当該参照分子の結合を、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは、１００％阻害する場合、当該試験ＦＮ３ドメインは、当該参照分子と競合し得る。
【００４９】
幾つかの実施形態では、本発明のヒトＣＤ８Ａに対して特異的に結合する単離したＦＮ３ドメインは、放射性金属に結合することができるキレート剤にコンジュゲートし、そして、腫瘍分布を評価するための造影剤として、腫瘍内部のＣＤ８−Ｔ細胞の存在、及び／または、がん治療の有効性の診断に使用し得る。
【００５０】
幾つかの実施形態では、当該ＣＤ８Ａ特異的ＦＮ３ドメインを、腎臓、及び／または、肝臓のクリアランスを介して、血液から除去する。
【００５１】
Ｔｅｎｃｏｎ配列に基づいたライブラリーからのＣＤ８Ａ結合ＦＮ３ドメインの単離
Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）は、ヒトテネイシンＣ由来の１５個のＦＮ３ドメインのコンセンサス配列からデザインした、天然に存在しないフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインである（Ｊａｃｏｂｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ，ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２５：１０７−１１７，２０１２；米国特許出願公開第２０１０／０２１６７０８号）。Ｔｅｎｃｏｎの結晶構造は、ＦＮ３ドメインの特徴である７本のベータ鎖をつなぐ６回表面露出ループを示し、各ベータ鎖は、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及び、Ｇと呼ばれており、各ループは、ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、及び、ＦＧループと呼ばれている（Ｂｏｒｋ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：８９９０−８９９２，１９９２；米国特許第６，６７３，９０１号）。これらのループ、または、各ループ内の選択された残基を、フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインのライブラリーを構築するためにランダム化し得るものであり、これらを用いて、ＣＤ８Ａに結合する新規の分子を選択し得る。表１は、Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）の各ループ、及び、ベータ鎖の位置、及び、配列を示す。
【００５２】
したがって、後述するライブラリーＴＣＬ１またはＴＣＬ２などの、Ｔｅｎｃｏｎ配列に基づいてデザインしたライブラリーは、ランダム化ＦＧループ、または、ランダム化ＢＣ及びＦＧループを有し得る。Ｔｅｎｃｏｎ ＢＣループは、長さがアミノ酸７個であり、このため、１、２、３、４、５、６、または、７個のアミノ酸を、ＢＣループで多様化させて、Ｔｅｎｃｏｎ配列に基づいてデザインしたライブラリーにおいてランダム化し得る。Ｔｅｎｃｏｎ ＦＧループは、長さがアミノ酸７個であり、このため、１、２、３、４、５、６、または、７個のアミノ酸を、ＦＧループで多様化させて、Ｔｅｎｃｏｎ配列に基づいてデザインしたライブラリーにおいてランダム化し得る。Ｔｅｎｃｏｎライブラリーにおけるループでのさらなる多様性は、ループでの残基の挿入、及び／または、欠失によって達成し得る。例えば、ＦＧ及び／またはＢＣループを、アミノ酸１〜２２個だけ伸長させてもよく、または、アミノ酸１〜３個だけ減らしてもよい。ＴｅｎｃｏｎにおけるＦＧループは、長さがアミノ酸７個であり、抗体重鎖における対応するループは、４〜２８個の残基の範囲である。最大の多様性を提供するために、ＦＧループを、４〜２８個の残基の抗体ＣＤＲ３の長さの範囲に対応するように、配列ならびに長さを多様化し得る。例えば、追加の１、２、３、４、または、５個のアミノ酸によって、ループを伸長させることで、ＦＧループの長さをさらに多様化させることができる。
【００５３】
また、Ｔｅｎｃｏｎ配列に基づいてデザインしたライブラリーは、ＦＮ３ドメインの側面を形成するランダム化した代替表面を有してもよく、それらは、２本以上のベータ鎖と、少なくとも１つのループとを含み得る。そのような１つの代替表面は、Ｃ及びＦのベータ鎖、ならびに、ＣＤ及びＦＧループのアミノ酸によって形成される（Ｃ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ表面）。Ｔｅｎｃｏｎの代替的なＣ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ表面に基づいたライブラリーのデザインは、米国特許出願公開第２０１３／０２２６８３４号に記載されている。また、Ｔｅｎｃｏｎ配列に基づいてデザインしたライブラリーは、残基位置１１、１４、１７、３７、４６、７３、または、８６（残基の番号は、配列番号１に対応して付与する）に置換を有しており、かつ、改善された熱安定性を示すＴｅｎｃｏｎ変異体などのＴｅｎｃｏｎ変異体に基づいてデザインしたライブラリーを含む。代表的なＴｅｎｃｏｎ変異体が、米国特許出願公開第２０１１／０２７４６２３号に記載されており、そして、配列番号１のＴｅｎｃｏｎと比較して、Ｅ１１Ｒ、Ｌ１７Ａ、Ｎ４６Ｖ、及び、Ｅ８６Ｉの置換を有するＴｅｎｃｏｎ２７（配列番号４）を含む。
【００５４】
【表１】
2020513744.tif 000003
【００５５】
Ｔｅｎｃｏｎ、及び、その他のＦＮ３配列に基づいたライブラリーは、ランダムの、または、所定のアミノ酸のセットを用いて、選択した残基位置でランダム化し得る。例えば、ランダムの置換を有するライブラリーでの変異体を、天然に存在する２０種すべてのアミノ酸をコードするＮＮＫコドンを用いて作製し得る。その他の多様化スキームでは、アミノ酸Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、及び、Ｃｙｓをコードするために、ＤＶＫコドンを使用し得る。あるいは、２０種すべてのアミノ酸残基を生じさせ、そして、同時に停止コドンの頻度を低減するために、ＮＮＳコドンを使用することもできる。多様化させる位置で偏ったアミノ酸分布を有するＦＮ３ドメインのライブラリーは、例えば、Ｓｌｏｎｏｍｉｃｓ（登録商標）技術（ｈｔｔｐ：＿／／ｗｗｗ＿ｓｌｏｎｉｎｇ＿ｃｏｍ）を用いて合成し得る。この技術は、何千もの遺伝子合成プロセスにおいて充分な万能構成単位として機能する、既製の二本鎖トリプレットのライブラリーを使用する。このトリプレットのライブラリーは、あらゆる所望のＤＮＡ分子を構築するのに必要な、すべての考え得る配列組合せを示す。コドン指定は、周知のＩＵＢコードによる。
【００５６】
本発明のヒトＣＤ８Ａに特異的に結合するＦＮ３ドメインは、足場タンパク質をコードするＤＮＡ断片を、ｃｉｓディスプレイを用いて、ＲｅｐＡをコードするＤＮＡ断片にライゲートして、各タンパク質が、それをコードするＤＮＡと安定的に会合している、インビトロ翻訳後に形成されるタンパク質−ＤＮＡ複合体のプールを生成することで、ＴｅｎｃｏｎライブラリーなどのＦＮ３ライブラリーを生成させ（米国特許第７，８４２，４７６号；Ｏｄｅｇｒｉｐ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０１，２８０６−２８１０，２００４）、そして、このライブラリーを、当該技術分野で周知であり、また、実施例に記載されている、あらゆる方法によって、ＣＤ８Ａに対する特異的結合についてアッセイすることで、単離することができる。使用できる例示的な周知の方法は、ＥＬＩＳＡ、サンドイッチイムノアッセイ、ならびに、競合的及び非競合的アッセイである（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい）。ＣＤ８Ａに特異的に結合する同定されたＦＮ３ドメインは、それらのＣＤ８Ａ活性の阻害、内在化、安定性、及び、その他の所望の特性について、さらに特徴付けが行われる。
【００５７】
本発明のヒトＣＤ８Ａに特異的に結合するＦＮ３ドメインは、ライブラリーを作製するために鋳型として、あらゆるＦＮ３ドメインを用いること、及び、本明細書で提供した方法を用いて、ヒトＣＤ８Ａに特異的に結合する分子についてライブラリーをスクリーニングすることで、生成し得る。使用し得る例示的なＦＮ３ドメインは、テネイシンＣの３番目のＦＮ３ドメイン（ＴＮ３）（配列番号１４５）、フィブコン（配列番号１４６）、及び、フィブロネクチンの１０番目のＦＮ３ドメイン（ＦＮ１０）（配列番号１４７）である。標準的なクローニング及び発現技術を用いて、インビトロで、ライブラリーを発現または翻訳させるために、ベクターにおいてライブラリーをクローニングするか、または、ライブラリーの二本鎖ｃＤＮＡカセットを合成する。例えば、リボソームディスプレイ（Ｈａｎｅｓ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９４，４９３７−４９４２，１９９７）、ｍＲＮＡディスプレイ（Ｒｏｂｅｒｔｓ ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９４，１２２９７−１２３０２，１９９７）、または、その他の無細胞系（米国特許第５，６４３，７６８号）を使用することができる。ＦＮ３ドメイン変異体のライブラリーは、例えば、あらゆる好適なバクテリオファージの表面に表示された融合タンパク質として発現し得る。バクテリオファージの表面に融合ポリペプチドを提示する方法は、周知である（米国特許出願公開第２０１１／０１１８１４４号、国際特許公開第ＷＯ２００９／０８５４６２号、米国特許第６，９６９，１０８号、米国特許第６，１７２，１９７号、米国特許第５，２２３，４０９号、米国特許第６，５８２，９１５号、米国特許第６，４７２，１４７号）。
【００５８】
本明細書に記載した本発明の幾つかの実施形態では、ヒトＣＤ８Ａに特異的に結合するＦＮ３ドメインは、配列番号１のＴｅｎｃｏｎ配列、または、配列番号４のＴｅｎｃｏｎ２７の配列に基づいたものであり、配列番号１、または、配列番号４は、任意に、残基位置１１、１４、１７、３７、４６、７３、及び／または、８６に置換を有する。
【００５９】
本発明のヒトＣＤ８Ａに特異的に結合するＦＮ３ドメインは、熱安定性を改善するため、ならびに、熱によるフォールディング及びアンフォールディングの可逆性などの特性を改善するために改変し得る。タンパク質、及び、酵素の見かけの熱安定性を高めるために、非常に類似した高熱安定性配列との比較に基づいた合理的デザイン、ジスルフィド架橋を安定化するデザイン、アルファ−へリックス性向を強化する変異、塩架橋の改変、タンパク質の表面電荷の変化、定方向進化、及び、コンセンサス配列の組成を含む、幾つかの方法が適用されている（Ｌｅｈｍａｎｎ ａｎｄ Ｗｙｓｓ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１２，３７１−３７５，２００１）。高い熱安定性は、発現したタンパク質の収率を増加させ、溶解度または活性を改善し、免疫原性を減少させ、製造におけるコールドチェーンの必要性を最小限にし得る。Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）の熱安定性を改善するために置換し得る残基は、１１、１４、１７、３７、４６、７３、または、８６番目の残基位置であり、そして、米国特許出願公開第２０１１／０２７４６２３号に記載されている。これらの残基に対応する置換を、本発明の分子を含むＦＮ３ドメインに組み込み得る。
【００６０】
タンパク質安定性、及び、タンパク質不安定性の測定は、タンパク質完全性の同じ、または、異なる態様として見ることができる。タンパク質は、熱、紫外線、または、電離放射線、溶液の場合には周囲の浸透圧モル濃度及びｐＨの変化、小さな孔寸法での濾過によって負荷される力学的剪断力、紫外線放射、ガンマ線照射によるなどの電離放射線、化学的もしくは熱脱水、または、タンパク質構造の破壊を引き起こし得るその他のあらゆる作用もしくは力に起因する変性に対して、感受性がある、または、「不安定」である。分子の安定性は、標準的な方法を用いて決定することができる。例えば、分子の安定性は、標準的な方法を用いて、分子の半分がアンフォールドされる摂氏温度（℃）である、熱融解（「Ｔｍ」）温度を測定することで決定することができる。一般的には、Ｔｍが高いほど、分子はより安定している。熱に加えて、化学環境もまた、タンパク質が特定の三次元構造を維持する能力を変化させる。
【００６１】
ある実施形態では、本発明のヒトＣＤ８Ａに特異的に結合するＦＮ３ドメインは、Ｔｍの増大によって測定した場合に、改変前の同じドメインと比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または、９５％以上の安定性の増大を示しうる。
【００６２】
化学変性も同様に、様々な方法で、測定することができる。化学変性剤として、塩酸グアニジニウム、チオシアン酸グアニジニウム、尿素、アセトン、有機溶媒（ＤＭＦ、ベンゼン、アセトニトリル）、塩類（硫酸アンモニウム、臭化リチウム、塩化リチウム、臭化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化ナトリウム）、還元剤（例えば、ジチオスレイトール、ベータ−メルカプトエタノール、ジニトロチオベンゼン、及び、水素化ホウ素ナトリウムなどの水素化物）、非イオン性、及び、イオン性洗浄剤、酸（例えば、塩酸（ＨＣｌ）、酢酸（ＣＨ３ＣＯＯＨ）、ハロゲン化酢酸）、疎水性分子（例えば、リン脂質）、及び、標的化変性剤がある。変性の程度の定量化は、標的分子の結合能力など、機能的特性の喪失、または、凝集傾向、これまで溶媒が到達できなかった残基の露出、または、ジスルフィド結合の破壊もしくは形成などの物理化学的特性に依存させることができる。
【００６３】
本発明のＦＮ３ドメインは、例えば、価数を増加させ、そして、標的分子結合の結合力を増加させる手段として、または、２つ以上の異なる標的分子に同時に結合する二重特異性もしくは多重特異性の足場を作製する手段として、単量体、二量体、または、多量体として作製し得る。当該二量体及び多量体は、例えば、アミノ酸リンカー、例えば、ポリグリシン、グリシン、及び、セリン、または、アラニン及びプロリンを含むリンカーを含めて、単一特異性、二重特異性、または、多重特異性タンパク質足場を連結させることによって作製し得る。代表的なリンカーとして、（ＧＳ）２、（配列番号１４８）、（ＧＧＧＳ）２（配列番号１４９）、（ＧＧＧＧＳ）５（配列番号１５０）、（ＡＰ）２（配列番号１５１）、（ＡＰ）５（配列番号１５２）、（ＡＰ）１０（配列番号１５３）、（ＡＰ）２０（配列番号１５４）、及び、Ａ（ＥＡＡＡＫ）５ＡＡＡ（配列番号１４２）がある。当該二量体、及び、多量体は、ＮからＣ−方向に互いに連結し得る。ポリペプチドを、新規の連結した融合ポリペプチドに連結するための天然に存在するペプチドリンカー、及び、人工ペプチドリンカーの使用は、文献において周知である（Ｈａｌｌｅｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６４，５２６０−５２６８，１９８９；Ａｌｆｔｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８，７２５−７３１，１９９５；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ＆ Ｓａｕｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５，１０９−１１６，１９９６；米国特許第５，８５６，４５６号）。
【００６４】
診断薬
本発明では、本発明のＣＤ８Ａ特異的ＦＮ３ドメインは、検出可能な標識を含み得る。ある実施形態では、当該検出可能な標識は、ＦＮ３ドメインにコンジュゲートしているキレート剤と複合体を形成し得る。別の実施形態では、当該検出可能な標識は、ＦＮ３ドメインにコンジュゲートしているリンカーにコンジュゲートしているキレート剤と複合体を形成し得る。さらに別の実施形態では、当該検出可能な標識は、ＦＮ３ドメインにコンジュゲートしているリンカーに結合し得る。さらに別の実施形態では、検出可能な標識は、第２の分子によって特異的に結合する当該標識の能力によって、本発明のペプチドに間接的に結合し得る。このタイプの間接的に付着した標識の例として、第２の分子であるストレプトアビジンによって特異的に結合することができるビオチン標識がある。単一、二重、または、多重標識が、有利であり得る。本明細書で使用する「検出可能な標識」とは、本発明のＦＮ３ドメインに結合したときに、ＦＮ３ドメインを検出可能にするあらゆるタイプの標識である。検出可能な標識はまた、細胞に対して毒性、または、細胞傷害性とし得る。一般的に、検出可能な標識として、発光分子、化学発光分子、蛍光色素、発蛍光団、蛍光消光剤、着色分子、放射性同位体、放射性核種、シンチラント、金属原子などの質量標識（質量変化を介した検出用）、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、プロテインＡ、プロテインＧ、抗体またはその断片、Ｇｒｂ２、ポリヒスチジン、Ｎｉ２＋、フラッグタグ、ｍｙｃタグ、重金属、酵素、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、電子供与体／受容体、アクリジニウムエステル、及び、比色基質がある。特定の実施形態では、当該検出可能な標識は、放射性核種である。当業者であれば、本発明の実施において使用し得る、上記していないその他の有用な標識を、容易に認識する。
【００６５】
検出可能な標識は、シグナル伝達機が検出できるシグナルを発する。幾つかの事例では、当該検出可能な標識が放射性核種である場合などでは、当該検出可能な標識は、自発的にシグナルを発することができる。その他の事例では、当該検出可能な標識が緩和性金属である場合などでは、当該検出可能な標識は、外部場から刺激を受けた結果としてシグナルを発する。シグナルの例として、ガンマ線、Ｘ線、可視光、赤外線エネルギー、及び、電波があるが、これらに限定されない。シグナル変換機の例として、ＳＰＥＣＴ／ＣＴ装置、ＰＥＴスキャナー、蛍光光度計、及び、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）装置を装備したガンマカメラがあるが、これらに限定されない。したがって、当該検出可能な標識は、磁気共鳴画像法、シンチグラフィー画像法、超音波、または、蛍光を用いて検出することができる標識を含む。
【００６６】
好適な発蛍光団としては、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フルオレセインチオセミカルバジド、ローダミン、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、ＣｙＤｙｅｓ（例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒｓ（例えば、Ａｌｅｘａ４８８、Ａｌｅｘａ５５５、Ａｌｅｘａ５９４、Ａｌｅｘａ６４７）、近赤外（ＮＩＲ）（７００〜９００ｎｍ）蛍光染料、ならびに、カルボシアニン、及び、アミノスチリル染料があるが、これらに限定されない。本発明のＦＮ３ドメインは、当該技術分野において周知の技術を用いて、作用物質を発蛍光団で標識することで、蛍光検出のために標識することができる（例えば、Ｌｏｈｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ  Ｃｈｅｍ  ８：５０３−５０９（１９９７）を参照のこと）。例えば、多くの公知の染料は、ＮＨ２−末端アミノ酸残基に結合することができる。あるいは、フルオレセインなどの蛍光色素を、ペプチドリンカーのリジン残基に結合させることができる。
【００６７】
放射性核種を、γ放射性放射性核種、Ａｕｇｅｒ放射性放射性核種、β放射性放射性核種、アルファ放射性放射性核種、または、陽電子放射性放射性核種とし得る。放射性核種を、検出可能な標識、及び／または、細胞傷害剤とし得る。適切な放射性核種の例として、炭素−１１、窒素−１３、酸素−１５、フッ素−１８、フルオロデオキシグルコース−１８、リン−３２、スカンジウム−４７、銅−６４、６５及び６７、ガリウム−６７及び６８、臭素−７５、７７及び８０ｍ、ルビジウム−８２、ストロンチウム−８９、ジルコニウム−８９、イットリウム−８６及び９０、ルテニウム−９５、９７、１０３、及び、１０５、レニウム−９９ｍ、１０１、１０５、１８６、及び、１８８、テクネチウム−９９ｍ、ロジウム−１０５、水銀−１０７、パラジウム−１０９、インジウム−１１１、銀−１１１、インジウム−１１３ｍ、ランタニド−１１４ｍ、錫−１１７ｍ、テルル−１２１ｍ、１２２ｍ、及び、１２５ｍ、ヨウ素−１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１３１、及び、１３３、プラセオジム−１４２、プロメチウム−１４９、サマリウム−１５３、ガドリニウム−１５９、ツリウム−１６５、１６７、及び、１６８、ジスプロシウム−１６５、ホルミウム−１６６、ルテチウム−１７７、レニウム−１８６、及び、１８８、イリジウム１９２、白金−１９３、及び、１９５ｍ、金−１９９、タリウム−２０１、チタン−２０１、アスタチン−２１１、ビスマス−２１２、及び、２１３、鉛−２１２、ラジウム−２２３、アクチニウム−２２５、ならびに、それらから誘導した窒化物または酸化物形態があるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、放射性核種を、銅−６４、ジルコニウム−８９、イットリウム−９０、インジウム−１１１、及び、ルテチウム−１７７からなる群から選択する。別の特定の実施形態では、放射性核種を、イットリウム−９０、インジウム−１１１、及び、ルテチウム−１７７からなる群から選択する。例示的な実施形態では、放射性核種は、ジルコニウム−８９である。
【００６８】
様々な金属原子を、検出可能な標識として使用し得る。当該金属原子は、一般的には、２０以上の原子番号を有する金属からなる金属原子の群から選択し得る。例えば、当該金属原子は、カルシウム原子、スカンジウム原子、チタン原子、バナジウム原子、クロム原子、マンガン原子、鉄原子、コバルト原子、ニッケル原子、銅原子、亜鉛原子、ガリウム原子、ゲルマニウム原子、ヒ素原子、セレン原子、臭素原子、クリプトン原子、ルビジウム原子、ストロンチウム原子、イットリウム原子、ジルコニウム原子、ニオブ原子、モリブデン原子、テクネチウム原子、ルテニウム原子、ロジウム原子、パラジウム原子、銀原子、カドミウム原子、インジウム原子、錫原子、アンチモン原子、テルル原子、ヨウ素原子、キセノン原子、セシウム原子、バリウム原子、ランタン原子、ハフニウム原子、タンタル原子、タングステン原子、レニウム原子、オスミウム原子、イリジウム原子、白金原子、金原子、水銀原子、タリウム原子、鉛原子、ビスマス原子、フランシウム原子、ラジウム原子、アクチニウム原子、セリウム原子、プラセオジム原子、ネオジム原子、プロメチウム原子、サマリウム原子、ユーロピウム原子、ガドリニウム原子、テルビウム原子、ジスプロシウム原子、ホルミウム原子、エルビウム原子、ツリウム原子、イッテルビウム原子、ルテチウム原子、トリウム原子、プロトアクチニウム原子、ウラン原子、ネプツニウム原子、プルトニウム原子、アメリシウム原子、キュリウム原子、ベルケリウム原子、カリホルニウム原子、アインスタイニウム原子、フェミウム原子、メンデレビウム原子、ノベリウム原子、または、ローレンシウム原子とし得る。幾つかの実施形態では、当該金属原子は、２０を超える原子番号を有するアルカリ金属を含む群から選択し得る。その他の実施形態では、当該金属原子は、２０を超える原子番号を有するアルカリ土類金属を含む群から選択し得る。ある実施形態では、当該金属原子は、ランタニドを構成する金属の群から選択し得る。別の実施形態では、当該金属原子は、アクチニドを構成する金属の群から選択し得る。さらに別の実施形態では、当該金属原子は、遷移金属を構成する金属の群から選択し得る。さらに別の実施形態では、当該金属原子は、卑金属を構成する金属の群から選択し得る。その他の実施形態では、当該金属原子は、金原子、ビスマス原子、タンタル原子、及び、ガドリニウム原子を含む群から選択し得る。好ましい実施形態では、当該金属原子は、５３（すなわち、ヨウ素）〜８３（すなわち、ビスマス）の原子番号を有する金属を含む群から選択し得る。別の実施形態では、当該金属原子は、磁気共鳴画像法に適した原子とし得る。別の代替の実施形態では、当該金属原子は、ＣＴのＸ線エネルギー帯にＫ端を有する金属からなる群から選択し得る。好ましい金属原子として、マンガン、鉄、ガドリニウム、金、及び、ヨウ素があるが、これらに限定されない。
【００６９】
当該金属原子は、＋１、＋２、または、＋３酸化状態の形態の金属イオンとし得る。例えば、Ｂａ２＋、Ｂｉ３＋、Ｃｓ＋、Ｃａ２＋、Ｃｒ２＋、Ｃｒ３＋、Ｃｒ６＋、Ｃｏ２＋、Ｃｏ３＋、Ｃｕ＋、Ｃｕ２＋、Ｃｕ３＋、Ｇａ３＋、Ｇｄ３＋、Ａｕ＋、Ａｕ３＋、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｆ３＋、Ｐｂ２＋、Ｍｎ２＋、Ｍｎ３＋、Ｍｎ４＋、Ｍｎ７＋、Ｈｇ２＋、Ｎｉ２＋、Ｎｉ３＋、Ａｇ＋、Ｓｒ２＋、Ｓｎ２＋、Ｓｎ４＋、及び、Ｚｎ２＋があるが、これらに限定されない。当該金属原子は、金属酸化物を含み得る。例えば、金属酸化物の例として、酸化鉄、酸化マンガン、または、酸化ガドリニウムがあるが、これらに限定されない。追加の例は、磁鉄鉱、磁赤鉄鉱、または、それらの組み合わせを含み得る。
【００７０】
本発明では、キレート剤を含むＦＮ３ドメインに、放射性核種または金属原子を組み込み得る。ＦＮ３ドメイン−キレート剤錯体への当該放射性核種または金属原子の組み込みは、一般的に、配位化学の分野における様々な方法で達成し得る。
【００７１】
半減期延長部分
本発明のヒトＣＤ８Ａに特異的に結合するＦＮ３ドメインは、例えば、共有結合性相互作用を介してその他のサブユニットを組み込み得る。本発明のある態様では、本発明のＦＮ３ドメインは、半減期延長部分をさらに含む。代表的な半減期延長部分として、アルブミン、アルブミン変異体、アルブミン結合タンパク質、及び／または、ドメイン、トランスフェリン、ならびに、それらの断片及び類似体、及び、Ｆｃ領域がある。
【００７２】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子、例えば、ＰＥＧ５０００またはＰＥＧ２０，０００など、異なる鎖長の脂肪酸及び脂肪酸エステル、例えば、ラウリル酸塩、ミリスチン酸塩、ステアリン酸塩、アラキジン酸塩、ベヘン酸塩、オレイン酸塩、アラキドン酸塩、オクタン二酸、テトラデカン二酸、オクタデカン二酸、ドコサン二酸など、ポリリジン、オクタン、炭水化物（デキストラン、セルロース、オリゴ糖、または、多糖）などのさらなる部分を、所望の特性を得るために、本発明のＦＮ３ドメインに組み込み得る。これらの部分は、タンパク質足場コード配列との直接融合体とし得るものであり、また、標準的なクローニング及び発現技術で作製し得る。あるいは、周知の化学カップリング法を用いて、組換え生産した本発明の分子に、それらの部分を結合し得る。
【００７３】
例えば、システイン残基を、分子のＣ末端に組み込むか、または、分子のヒトＣＤ８Ａ結合面から離間する方向に面した残基位置にシステインを組み込んで、周知の方法を用いて、ＰＥＧ化基をシステインに結合させることで、本発明のＦＮ３ドメインにＰＥＧ化部分を付加し得る。さらなる部分を組み込んだ本発明のＦＮ３ドメインは、幾つかの公知のアッセイによって、官能性について比較し得る。例えば、Ｆｃドメイン、及び／または、Ｆｃドメイン変異体の組み込みに起因して変化した特性を、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、もしくは、ＦｃＲｎ受容体などの可溶性型受容体を用いるＦｃ受容体結合アッセイで、または、例えば、ＡＤＣＣもしくはＣＤＣを測定する周知の細胞系アッセイで、または、インビボモデルにおける本発明の分子の薬物動態特性を評価してアッセイし得る。
【００７４】
ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞
本発明は、本発明のヒトＣＤ８Ａに特異的に結合するＦＮ３ドメインをコードする核酸を、単離したポリヌクレオチドとして、または、発現ベクターの一部として、または、直鎖ＤＮＡ配列の一部として提供するものであり、インビトロでの転写／翻訳のために使用する直鎖ＤＮＡ配列、当該組成物の真核生物、原核生物、または、フィラメントファージ発現、分泌、及び／または、出現と適合するベクター、または、それらの標的化突然変異源を含む。特定のポリヌクレオチドの例を、本明細書に開示しているが、遺伝コードの縮重、または、特定の発現系におけるコドンの選択性を考慮すると、本発明のＦＮ３ドメインをコードする他のポリヌクレオチドも、本発明の範囲内に含まれる。
【００７５】
本発明のある実施形態は、配列番号４０〜２６９のアミノ酸配列を含むヒトＣＤ８Ａに特異的に結合するＦＮ３ドメインをコードする単離したポリヌクレオチドである。
【００７６】
本発明のポリヌクレオチドは、自動ポリヌクレオチド合成装置での固相ポリヌクレオチド合成などの化学合成によって製造し得るものであり、完全な一本鎖または二本鎖分子に構築し得る。あるいは、本発明のポリヌクレオチドは、ＰＣＲに続いて、通常のクローニングを行うなどのその他の技術で製造し得る。所定の公知の配列のポリヌクレオチドを製造または作り出す技術は、当該技術分野において周知である。
【００７７】
本発明のポリヌクレオチドは、プロモーターまたはエンハンサー配列、イントロン、ポリアデニル化シグナル、ＲｅｐＡ結合を促進するｃｉｓ配列など、少なくとも１つの非コード配列を含み得る。また、ポリヌクレオチド配列は、例えば、タンパク質の精製または検出を容易にするヒスチジンタグまたはＨＡタグなどのマーカーまたはタグ配列、シグナル配列、ＲｅｐＡ、Ｆｃなどの融合タンパク質パートナー、または、ｐＩＸもしくはｐＩＩＩなどのバクテリオファージコートタンパク質をコードする、さらなるアミノ酸をコードするさらなる配列を含み得る。
【００７８】
本発明の別の実施形態は、少なくとも１つの本発明のポリヌクレオチドを含むベクターである。そのようなベクターは、プラスミドベクター、ウイルスベクター、バキュロウイルス発現ベクター、トランスポゾンに基づいたベクター、または、あらゆる手段によって所定の生物または遺伝子的バックグラウンドに本発明のポリヌクレオチドを導入するのに適したその他のあらゆるベクターとし得る。そのようなベクターは、そのようなベクターによるコードを受けるポリペプチドの発現を制御、調節、誘発、または、許容することができる核酸配列要素を含む発現ベクターとし得る。そのような要素は、転写エンハンサー結合部位、ＲＮＡポリメラーゼ開始部位、リボソーム結合部位、及び、所定の発現系においてコードしたポリペプチドの発現を促進するその他の部位を含み得る。そのような発現系は、当該技術分野において公知の細胞に基づく系、または、無細胞系であり得る。
【００７９】
本発明の別の実施形態は、本発明のベクターを含む宿主細胞である。本発明のヒトＣＤ８Ａに特異的に結合するＦＮ３ドメインは、任意に、当該技術分野で周知の細胞株、混合細胞株、不死化細胞、または、不死化細胞のクローン集団によって産生させることができる。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，ＮＹ（１９８７−２００１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）；Ｃｏｌｌｉｇａｎ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ（１９９４−２００１）；Ｃｏｌｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ，ＮＹ，（１９９７−２００１）を参照されたい。
【００８０】
発現用に選択した宿主細胞は、哺乳動物起源とし得るものであり、または、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１、ＣＨＯ、ＢＳＣ−１、Ｈｅ Ｇ２、ＳＰ２／０、ＨｅＬａ、骨髄腫、リンパ腫、酵母、昆虫、もしくは、植物細胞、または、それらのあらゆる誘導体、不死化、もしくは、形質転換細胞から選択し得る。あるいは、当該宿主細胞は、ポリペプチドをグリコシル化できない種または生物、例えば、ＢＬ２１、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１−ＧＯＬＤ（ＤＥ３）、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、ＪＭ１０９、ＨＭＳ１７４、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、及び、天然の、もしくは、遺伝子操作したＥ．ｃｏｌｉ ｓｐｐ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐｐ、または、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ株のいずれか、などの原核細胞または生物から選択し得る。
【００８１】
本発明の別の実施形態は、本発明のヒトＣＤ８Ａに特異的に結合する単離したＦＮ３ドメインを製造する方法であって、本発明の単離した宿主細胞を、ヒトＣＤ８Ａに特異的に結合する単離したＦＮ３ドメインが発現されるような条件下で培養し、及び、当該ＦＮ３ドメインを精製する、ことを含む方法である。
【００８２】
ヒトＣＤ８Ａに特異的に結合する当該ＦＮ３ドメインは、周知の方法、例えば、プロテインＡ精製、硫酸アンモニウム、または、エタノール沈殿、酸抽出、陰イオン、もしくは、陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、及び、レクチンクロマトグラフィー、または、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって、組換え細胞培養物から精製し得る。
【００８３】
ヒトＣＤ８Ａを検出するためのキット
本明細書では、生物学的試料でのＣＤ８Ａを検出するためのキットを提供する。これらのキットは、本明細書に記載のＣＤ８Ａ特異的ＦＮ３ドメインの１つ以上、及び、キットの使用説明書を含む。
【００８４】
提供したＣＤ８Ａ特異的ＦＮ３ドメインは、溶液中にあり、凍結乾燥され、基板、担体、もしくは、プレートに固定され、または、検出可能に標識し得る。
【００８５】
また、記載したキットは、本明細書に記載した方法を実施するために有用なさらなる構成要素を含み得る。例として、当該キットは、対象由来の試料、コントロール試料もしくは参照試料、例えば、緩慢に進行するがんを保有する対象、及び／または、がんを保有しない対象に由来する試料を取得するための手段、１つ以上の試料区画、及び／または、本発明の方法の実施、及び、組織特異的コントロールもしくは標準についての説明書を含み得る。
【００８６】
ＣＤ８Ａのレベルを決定する手段は、例えば、ＣＤ８Ａのレベルを決定するためのアッセイにおいて使用する緩衝液、または、その他の試薬をさらに含むことができる。当該説明書は、例えば、アッセイの実施に関する印刷した説明書、及び／または、ＣＤ８Ａのレベルの評価についての説明書とすることができる。
【００８７】
また、記載したキットは、対象から試料を単離するための手段を含み得る。これらの手段は、対象から体液または組織を取得するために使用することができる装置、または、試薬の１つ以上の品目を含むことができる。また、対象から試料を取得するための手段は、血液試料から血清などの血液成分を単離するための手段を含み得る。好ましくは、当該キットは、ヒト対象について使用するようにデザインする。
【００８８】
本発明のヒトＣＤ８Ａ結合ＦＮ３ドメインの使用
本発明のヒトＣＤ８Ａに対して特異的に結合するＦＮ３ドメインは、バイオマーカーとしてＣＤ８Ａを使用して、細胞、組織、器官、体液、または、一般的には、宿主において、ヒトの疾患または特定の病変を診断するために使用し得る。本発明の方法は、あらゆる分類に属する動物患者に使用し得る。そのような動物の例として、ヒト、齧歯類、イヌ、ネコ、及び、家畜などの哺乳動物を含む。
【００８９】
実施形態
本発明は、以下の実施形態も提供するが、これらに限定されない。
【００９０】
１）配列番号３５のアミノ酸配列を含むヒトＣＤ８Ａタンパク質に対して特異的に結合する、単離したＦＮ３ドメイン。
【００９１】
２）前記ＦＮ３ドメインが、配列番号２７１のアミノ酸配列を含むカニクイザルＣＤ８Ａタンパク質と交差反応する、実施形態１に記載の単離したＦＮ３ドメイン。
【００９２】
３）
ａ）前記ＦＮ３ドメインが、配列番号１のＴｅｎｃｏｎ配列に基づくものであり、
ｂ）前記ＦＮ３ドメインが、配列番号４のＴｅｎｃｏｎ２７配列に基づくものであり、及び／または
ｃ）前記ＦＮ３ドメインを、配列番号２、３、５、６、７、または、８の配列を含むライブラリーから単離する、実施形態２に記載の単離したＦＮ３ドメイン。
【００９３】
４）前記ＦＮ３ドメインが、第２の分子にコンジュゲートしている、実施形態３に記載の単離したＦＮ３ドメイン。
【００９４】
５）前記第２の分子が、検出可能な標識である、実施形態４に記載の単離したＦＮ３ドメイン。
【００９５】
６）前記検出可能な標識が、放射性同位体、磁性ビーズ、金属ビーズ、コロイド粒子、蛍光染料、電子密度の高い試薬、酵素、ビオチン、ジゴキシゲニン、または、ハプテンである、実施形態５に記載の単離したＦＮ３ドメイン。
【００９６】
７）前記ＦＮ３ドメインが、配列番号７９、８１、８３、８９、１２２、及び、６８に対応する残基位置５４に、システイン置換を有する、実施形態３に記載の単離したＦＮ３ドメイン。
【００９７】
８）前記ＦＮ３ドメインが、酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイで測定されるように、インビトロで、ＣＤ８＋  Ｔ細胞を活性化しない、実施形態３に記載の単離したＦＮ３ドメイン。
【００９８】
９）前記ＦＮ３ドメインが、ヒトＣＤ８Ａタンパク質への結合について、配列番号２２９〜２３４の１つのアミノ酸配列を含む前記ＦＮ３ドメインと競合する、実施形態３に記載の単離したＦＮ３ドメイン。
【００９９】
１０）前記ＦＮ３ドメインが、実施例３に記載した条件で実施した表面プラズモン共鳴で測定されるように、約０．０２〜約６．６ｎＭの間の親和性（ＫＤ）で、ヒトＣＤ８Ａタンパク質に結合する、実施形態３に記載の単離したＦＮ３ドメイン。
【０１００】
１１）前記ＦＮ３ドメインが、配列番号４０〜２６９のアミノ酸配列のいずれか１つを含む、実施形態３に記載の単離したＦＮ３ドメイン。
【０１０１】
１２）前記ＦＮ３ドメインのＮ末端にメチオニンをさらに含む、実施形態１１に記載の単離したＦＮ３ドメイン。
【０１０２】
１３）前記ＦＮ３ドメインが、半減期延長部分に結合している、実施形態３に記載の単離したＦＮ３ドメイン。
【０１０３】
１４）前記半減期延長部分が、ＣＤ８結合分子、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＣＤ８、ＣＤ８変異体、または、免疫グロブリンのＦｃ領域の少なくとも一部である、実施形態１３に記載の単離したＦＮ３ドメイン。
【０１０４】
１５）実施形態３に記載のＦＮ３ドメインをコードする単離したポリヌクレオチド。
【０１０５】
１６）実施形態１５に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【０１０６】
１７）実施形態１６に記載のベクターを含む単離した宿主細胞。
【０１０７】
１８）ヒトＣＤ８Ａタンパク質に対して特異的に結合するＦＮ３ドメインを製造する方法であって、前記ＦＮ３ドメインを発現する条件下で実施形態１７に記載の単離した宿主細胞を培養し、及び、前記ＦＮ３ドメインを精製する、ことを含む前記方法。
【０１０８】
１９）実施形態３に記載のＦＮ３ドメインを含む診断キット。
【０１０９】
２０）実施形態３に記載のＦＮ３ドメインを含む診断薬または捕捉剤。
【０１１０】
２１）前記前記ＦＮ３ドメインが、配列番号７９、８１、８３、８９、１２２、及び／または、６８に対応する残基位置５４に、システイン置換を有する、実施形態２０に記載の診断薬または捕捉剤。
【０１１１】
２２）前記置換システインが、Ｚｒ−８９、または、Ｉ−１２４にコンジュゲートしている、実施形態２１に記載の診断薬。
【０１１２】
２３）生物学的試料に含まれるＣＤ８発現細胞を検出する方法であって、前記生物学的試料を実施形態２０に記載の診断試薬で処理し、及び、そのような診断薬のＦＮ３ドメインへの前記生物学的試料の結合を評価する、ことを含む前記方法。
【０１１３】
２４）前記診断薬が、配列番号７９、８１、８３、８９、１２２、及び／または、６８の残基位置５４に、システイン置換を有し、かつ、前記置換システインが、Ｚｒ−８９、または、I−１２４にコンジュゲートしている、実施形態２３に記載の方法。
【実施例】
【０１１４】
以下の実施例は、先行する開示を補足し、かつ、本明細書に記載の趣旨の理解を深めるために提供する。これらの実施例は、記載した趣旨を限定するものと見なすべきではない。本明細書に記載した実施例及び実施形態は、例示目的のものに過ぎず、そして、そのことを考慮した様々な変更または改変は当業者に自明の事項であり、また、そのようなことは、本発明の本質的な範囲内のものであり、かつ、本発明の本質的な範囲から逸脱せずに実施することができる。
【０１１５】
実施例１．ランダム化したループを有するＴＥＮＣＯＮライブラリーの構築
Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）は、ヒトテネイシンＣ由来の１５個のＦＮ３ドメインのコンセンサス配列からデザインした、免疫グロブリン様足場であるフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインである（Ｊａｃｏｂｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ，ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２５：１０７−１１７，２０１２；米国特許第８，２７８，４１９号）。Ｔｅｎｃｏｎの結晶構造は、７個のベータ−鎖を連結する６個の表面露出ループを示す。これらのループ、または、各ループで選択した残基をランダム化することで、フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインのライブラリーを構築することができ、このライブラリーを用いて、特異的標的に結合する新規分子を選択することができる。
【０１１６】
Ｔｅｎｃｏｎ：
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＫＧＧＨＲＳＮＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列番号１）：
【０１１７】
当該Ｔｅｎｃｏｎ足場、及び、様々なデザイン手法を用いて、様々なライブラリーを生成した。一般的に、ライブラリーＴＣＬ１及びＴＣＬ２は、良好な結合分子を生成した。ＴＣＬ１及びＴＣＬ２ライブラリーの生成については、国際特許公開第ＷＯ２０１４０８１９４４Ａ２号に詳細に記載されている。
【０１１８】
ＴＣＬ１ライブラリーの構築
ｃｉｓディスプレイシステムで使用するために、Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）のＦＧループだけをランダム化するようにデザインしたライブラリー、ＴＣＬ１を構築した（Ｊａｃｏｂｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ，ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２５：１０７−１１７，２０１２）。このシステムでは、Ｔａｃプロモーター、Ｔｅｎｃｏｎライブラリーコード配列、ＲｅｐＡコード配列、ｃｉｓ要素、及び、ｏｒｉ要素の配列を組み込んだ一本鎖ＤＮＡを作製する。インビトロ転写／翻訳系で発現させると、それをコードしたＤＮＡに対してｃｉｓで結合したＴｅｎｃｏｎ−ＲｅｐＡ融合タンパク質の複合体を産生する。次に、標的分子に結合する複合体を単離して、後述するようにして、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅する。
【０１１９】
ｃｉｓディスプレイで使用するためのＴＣＬ１ライブラリーの構築は、ＰＣＲの連続ラウンドによって行われ、最終的に直鎖状の二本鎖ＤＮＡ分子が、２つの半分子として産生され、当該５’末端断片は、プロモーターとＴｅｎｃｏｎ配列とを含み、一方で、３’末端断片は、ｒｅｐＡ遺伝子とｃｉｓ及びｏｒｉ要素とを含む。これらの２つの半分子同士を制限酵素消化によって結合させて、完全な構築物を生成する。ＴｅｎｃｏｎのＦＧループであるＫＧＧＨＲＳＮ（配列番号３２）だけに、ランダムなアミノ酸を組み込んで、ＴＣＬ１ライブラリーをデザインした。このライブラリーの構築にはＮＮＳコドンを使用し、これにより、２０種類すべてのアミノ酸と、１個の終止コドンとを、ＦＧループに組み入れられると考えられる。このＴＣＬ１ライブラリーは、さらなる多様性を付与するために、それぞれが７〜１２残基の異なるランダム化ＦＧループの長さを有する、６個の個別のサブライブラリーを含む。
【０１２０】
ＴＣＬ１ライブラリー（配列番号２）
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＸ７−１２ＰＬＳＡＥＦＴＴ；
配列中、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７は、あらゆるアミノ酸であり、及び、
Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１、及び、Ｘ１２は、あらゆるアミノ酸であり、または、削除されている。
【０１２１】
ＴＣＬ２ライブラリーの構築
ＴｅｎｃｏｎのＢＣ及びＦＧループの両方をランダム化し、かつ、それぞれの位置のアミノ酸の分布を厳密に制御したＴＣＬ２ライブラリーを構築した。表２は、ＴＣＬ２ライブラリーの所望のループ位置でのアミノ酸分布を示す。デザインしたアミノ酸分布には、２つの目的がある。まず、このライブラリーを、Ｔｅｎｃｏｎ結晶構造の解析、及び／または、ホモロジーモデリングに基づいて、Ｔｅｎｃｏｎのフォールディング及び安定性にとって構造的に重要となると予想された残基に偏らせた。例えば、２９番目の位置は、Ｔｅｎｃｏｎが折り畳まれる際に疎水性コアに埋もれるので、疎水性アミノ酸のサブセットだけになるように固定した。第２の層のデザインとしては、高親和性の結合分子を効率よく生成するため、抗体の重鎖ＨＣＤＲ３に選択的に認められる残基の分布に近くなるようにアミノ酸分布を偏らせた（Ｂｉｒｔａｌａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３７７：１５１８−２８，２００８；Ｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ １６：４７６−８４，２００７）。この目標のため、表１の「デザインした分布」は、以下の分布、すなわち、６％アラニン、６％アルギニン、３．９％アスパラギン、７．５％アスパラギン酸、２．５％グルタミン酸、１．５％グルタミン、１５％グリシン、２．３％ヒスチジン、２．５％イソロイシン、５％ロイシン、１．５％リジン、２．５％フェニルアラニン、４％プロリン、１０％セリン、４．５％トレオニン、４％トリプトファン、１７．３％チロシン、及び、４％バリンのことを指す。この分布には、メチオニン、システイン、及び、終止コドンは含まれない。
【０１２２】
ＴＣＬ２ライブラリー（配列番号３）
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＸ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３ＳＸ１４Ｘ１５ＬＳＡＥＦＴＴ；
配列中、
Ｘ１は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、または、Ｖａｌである、
Ｘ２は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、または、Ｖａｌである、
Ｘ３は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、または、Ｖａｌである、
Ｘ４は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、または、Ｖａｌである、
Ｘ５は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、または、Ｖａｌである、
Ｘ６は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、または、Ｖａｌである、
Ｘ７は、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、または、Ｔｙｒである、
Ｘ８は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、または、Ｔｈｒである、
Ｘ９は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、または、Ｖａｌである、
Ｘ１０は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、または、Ｖａｌである、
Ｘ１１は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、または、Ｖａｌである、
Ｘ１２は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、または、Ｖａｌである、
Ｘ１３は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、または、Ｖａｌである、
Ｘ１４は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、または、Ｖａｌである、及び
Ｘ１５は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、または、Ｖａｌである。
【０１２３】
【表２】
2020513744.tif 000004
【０１２４】
続いて、これらのライブラリーを、野生型Ｔｅｎｃｏｎと比較して、置換Ｅ１１Ｒ／Ｌ１７Ａ／Ｎ４６Ｖ／Ｅ８６Ｉを組み込む安定化したＴｅｎｃｏｎフレームワーク（Ｔｅｎｃｏｎ２７：配列番号４）でライブラリーを構築すること（米国特許第８，５６９，２２７号）、ならびに、ＢＣ及びＦＧループにおいてランダム化する位置を変えること、を含む様々な方法で改良した。Ｔｅｎｃｏｎ２７は、国際特許出願第ＷＯ２０１３０４９２７５号に記載されている。これより、ＴｅｎｃｏｎのＦＧループだけ（ライブラリーＴＣＬ９）、または、ＢＣ及びＦＧループの組み合わせ（ライブラリーＴＣＬ７）をランダム化するようにデザインした新たなライブラリーを作製した。これらのライブラリーは、ｃｉｓディスプレイシステムでの使用を目的として構築したものである（Ｏｄｅｇｒｉｐ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０１：２８０６−２８１０，２００４）。このデザインの詳細は、後述する。
【０１２５】
安定化Ｔｅｎｃｏｎ（Ｔｅｎｃｏｎ２７）（配列番号４）
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＫＧＧＨＲＳＮＰＬＳＡＩＦＴＴ
【０１２６】
ＴＣＬ７（ランダム化ＦＧ及びＢＣループ）（配列番号５）
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９ＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＸ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９ＳＮＰＬＳＡＩＦＴＴ；
配列中、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１３、Ｘ１４、Ｘ１５、及び、Ｘ１６は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、または、Ｙであり、及び
Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１７、Ｘ１８、及び、Ｘ１９は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙであり、または、削除されている。
【０１２７】
ＴＣＬ９（ランダム化ＦＧループ）（配列番号６）
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＳＮＰＬＳＡＩＦＴＴ；
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、及び、Ｘ７は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、または、Ｙであり、及び
Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１、及び、Ｘ１２は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙであり、または、削除されている。
【０１２８】
ライブラリー構築のため、ランダム化したＢＣループ（長さは６〜９個分の位置）、または、ＦＧループ（長さは７〜１２個分の位置）をコードするＤＮＡ断片を、Ｓｌｏｎｏｍｉｃｓ技術（Ｓｌｏｎｉｎｇ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＧｍｂＨ）を使用して合成して、ライブラリーのアミノ酸分布を制御し、そして、終止コドンを除去した。ＢＣループ、または、ＦＧループをランダム化したＤＮＡ分子の２つの異なるセットを別々に合成し、その後に、ＰＣＲを用いて結合させることで、完全なライブラリー産物を生成した。
【０１２９】
ＦＧループライブラリー（ＴＣＬ９）の構築
ＦＧループ内のコドンをランダム化した以外は、５’Ｔａｃプロモーターと、それに続く、Ｔｅｎｃｏｎの完全な遺伝子配列からなる合成ＤＮＡ分子のセットを作製した（配列番号２６〜３１）。ＦＧループのランダム化については、システイン及びメチオニンを除くすべてのアミノ酸を同比率でコードした。多様化した部分の長さは、これらの部分が、ＦＧループ内の７、８、９、１０、１１、または、１２個のアミノ酸をコードするようなものとした。それぞれの長さの変異体のサブライブラリーを、２ｕｇのスケールで個別に合成し、次いで、オリゴＳｌｏｎｉｎｇ−ＦＯＲ（配列番号９）、及び、Ｓｌｏｎｉｎｇ−Ｒｅｖ（配列番号１０）を使用するＰＣＲで増幅した。
【０１３０】
ライブラリーの３’末端断片は、ＰｓｐＯＭＩ制限部位、ｒｅｐＡ遺伝子のコード領域、ならびに、ｃｉｓ及びｏｒｉ要素を含む、ディスプレイ用の要素を含んだ一定のＤＮＡ配列である。鋳型としてのプラスミド（ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、Ｍ１３フォワードプライマー、及び、Ｍ１３リバースプライマーと共に使用して、ＰＣＲ反応を行って、この断片を増幅した。得られたＰＣＲ産物を、ＰｓｐＯＭＩで一晩消化し、そして、ゲル精製した。ライブラリーＤＮＡの５’部分を、ｒｅｐＡ遺伝子を含む３’ＤＮＡにライゲートするために、２ｐｍｏｌ（約５４０ｎｇ〜５６０ｎｇ）の５’末端ＤＮＡを、ＮｏｔＩ及びＰｓｐＯＭＩ酵素、ならびに、Ｔ４リガーゼの存在下で、３７℃で、一晩、等モル量（約１．２５μｇ）の３’ｒｅｐＡ ＤＮＡとライゲートした。このライゲートしたライブラリー産物を、オリゴＰＯＰ２２５０（配列番号１１）、及び、ＤｉｄＬｉｇＲｅｖ（配列番号１２）を使用して、１２サイクルのＰＣＲ反応で増幅した。それぞれのサブライブラリーについて、１２回のＰＣＲ反応で得たＤＮＡを加え合わせ、そして、Ｑｉａｇｅｎスピンカラムで精製した。ＴＣＬ９のそれぞれのサブライブラリーの収率は、３２〜３４μｇの範囲であった。
【０１３１】
ＦＧ／ＢＣループライブラリー（ＴＣＬ７）の構築
このＴＣＬ７ライブラリーは、ランダム化したＴｅｎｃｏｎＢＣ及びＦＧループを有するライブラリーを提供する。このライブラリーでは、６〜９個のアミノ酸の長さのＢＣループを、７〜１２個のアミノ酸の長さのランダム化したＦＧループとコンビナトリアルに混合した。合成Ｔｅｎｃｏｎ断片ＢＣ６、ＢＣ７、ＢＣ８、及び、ＢＣ９（配列番号１３〜１６）を、ＢＣループが、６、７、８、または、９個のランダム化したアミノ酸で置換されるように、残基ＶＸまでの、かつ、残基ＶＸを含むタンパク質のＮ末端部分をコードしたＴｅｎｃｏｎ遺伝子を含むように製造した。これらの断片は、Ｌ１７Ａ、Ｎ４６Ｖ、及び、Ｅ８３Ｉ突然変異（ＣＥＮ５２４３）の発見よりも前に合成されたものであるが、これらの突然変異は、後述する分子生物学的ステップで導入した。この断片を、ランダム化したＦＧループをコードする断片と結合するため、以下のステップを行った。
【０１３２】
まず、ＴａｃプロモーターとＴｅｎｃｏｎの５’配列を、アミノ酸Ａ１７をコードするヌクレオチドまでコードしたＤＮＡ断片（１３０ｍｅｒ−Ｌ１７Ａ、配列番号１７）を、オリゴＰＯＰ２２２２ｅｘｔ（配列番号１８）、及び、ＬＳ１１１４（配列番号１９）を使用したＰＣＲで作製した。これは、Ｌ１７Ａ突然変異が、ライブラリーに含まれるように行った（ＣＥＮ５２４３）。次に、ランダム化したＢＣループを含むＴｅｎｃｏｎの残基Ｒ１８−Ｖ７５をコードしたＤＮＡ断片を、鋳型としてのＢＣ６、ＢＣ７、ＢＣ８、または、ＢＣ９と、オリゴとしてＬＳ１１１５（配列番号２０）、及び、ＬＳ１１１７（配列番号２１）とを使用したＰＣＲで増幅した。このＰＣＲのステップによって、３’末端にＢｓａＩ部位を導入した。続いて、これらのＤＮＡ断片を、プライマーとしてオリゴＰＯＰ２２２２ｅｘｔ、及び、ＬＳ１１１７を使用した重複ＰＣＲで連結した。得られた２４０ｂｐのＰＣＲ産物をプールし、そして、ＱｉａｇｅｎＰＣＲ精製キットで精製した。精製したＤＮＡを、ＢｓａＩ−ＨＦで消化し、そして、ゲル精製した。
【０１３３】
ＦＧループをコードした断片を、鋳型としてのＦＧ７（配列番号３１）、ＦＧ８（配列番号３０）、ＦＧ９（配列番号２９）、ＦＧ１０（配列番号２８）、ＦＧ１１（配列番号２７）、及び、ＦＧ１２（配列番号２６）を、オリゴヌクレオチドＳＤＧ１０（配列番号２２）、及び、ＳＤＧ２４（配列番号２３）と共に使用したＰＣＲで増幅して、ＢｓａＩ制限部位、ならびに、Ｎ４６Ｖ及びＥ８６Ｉ変異を組み込んだ（ＣＥＮ５２４３）。
【０１３４】
消化したＢＣ断片とＦＧ断片とを、スリーウェイライゲーションを用いて、単一の工程で互いにライゲートした。それぞれのライゲーション反応で、２つのＢＣループの長さと、２つのＦＧループの長さとを組み合わせた４つのライゲーション反応を、１６個の可能な組み合わせで準備した。各ライゲーションは、約３００ｎｇの全ＢＣ断片と、３００ｎｇのＦＧ断片を含んでいた。次いで、これら４つのライゲーションプールを、オリゴＰＯＰ２２２２（配列番号２４）、及び、ＳＤＧ２８（配列番号２５）を使用したＰＣＲで増幅した。次いで、７．５μｇのそれぞれの反応産物を、ＮｏｔＩで消化し、そして、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製カラムで精製した。このＤＮＡの５．２μｇを、ＰｓｐＯＭＩで消化した等モル量のＲｅｐＡのＤＮＡ断片（約１４μｇ）とライゲートし、そして、生成物を、オリゴＰＯＰ２２２２を使用したＰＣＲで増幅した。
【０１３５】
実施例２：別の結合表面を有するＴＥＮＣＯＮライブラリーの生成
特定のライブラリーデザインにおいてランダム化する残基の選択は、形成される相互作用表面の全体の形状を定める。ＢＣ、ＤＥ、及び、ＦＧループをランダム化したライブラリーからマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）に結合するように選択した足場タンパク質を含むＦＮ３ドメインのＸ線結晶解析は、ＭＢＰの活性部位に嵌まり込み、大きく湾曲した界面を有していることを示した（Ｋｏｉｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０４：６６３２−６６３７，２００７）。これに対して、ＭＢＰに結合するように選択したアンキリン繰り返し足場タンパク質は、より平坦な相互作用表面を有しており、また、活性部位から離間したＭＢＰの外表面に結合することが認められた（Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２２：５７５−５８２，２００４）。これらの結果は、足場分子の結合表面の形状（湾曲と平坦）が、どの標的タンパク質が、または、それらの標的タンパク質上の特定のエピトープが、足場によって効果的に結合されるかを決定し得る、ことを示唆している。タンパク質結合用のＦＮ３ドメインを含んだタンパク質足場の遺伝子操作に関して報告をした研究は、標的に結合するための隣接したループを遺伝子操作し、これにより、湾曲した結合表面をもたらすことに頼っている。この手法は、こうした足場によってアクセス可能な標的及びエピトープの数を制限し得る。
【０１３６】
Ｔｅｎｃｏｎ、及び、その他のＦＮ３ドメインは、分子の互いに反対側の面に存在する２組のＣＤＲ様ループを有しており、第１の組は、ＢＣ、ＤＥ、及び、ＦＧループによって形成されており、そして、第２の組は、ＡＢ、ＣＤ、及び、ＥＦループによって形成されている。これら２つのループの組は、ＦＮ３構造の中心を形成するベータ−鎖によって分離されている。Ｔｅｎｃｏｎの像を９０°回転させると、代わりとなる表面が可視化することができる。このわずかに凹んだ表面は、ＣＤループ及びＦＧループと、２個の逆平行のベータ−鎖である、Ｃ及びＦベータ−鎖とによって形成されており、また、本明細書ではＣ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ表面と称している。このＣ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ表面は、表面を形成する残基のサブセットをランダム化することで、タンパク質足場相互作用表面のライブラリーをデザインするための鋳型として使用することができる。ベータ−鎖は、繰り返し構造を有しており、１つおきの残基の側鎖が、当該タンパク質の表面に露出している。このため、ベータ−鎖内の一部またはすべての表面露出残基をランダム化することで、ライブラリーを作製することができる。ベータ−鎖内の適当な残基を選択することで、Ｔｅｎｃｏｎ足場の本来の安定性の低下を最小限に抑える一方で、その他のタンパク質と相互作用するための固有の足場表面を提供すべきである。
【０１３７】
ライブラリーＴＣＬ１４（配列番号７）は、Ｔｅｎｃｏｎ２７足場内でデザインした（配列番号４）。
【０１３８】
このライブラリーを構築するために用いた方法の完全な説明は、米国特許出願公開第２０１３／０２２６８３４号に記載されている。
【０１３９】
ＴＣＬ１４ライブラリー（配列番号７）：
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＸ１ＩＸ２ＹＸ３ＥＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＸ８ＶＸ９ＩＸ１０ＧＶＫＧＧＸ１１Ｘ１２ＳＸ１３ＰＬＳＡＩＦＴＴ；
配列中、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２、及び、Ｘ１３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、または、Ｍである。
【０１４０】
Ｔｅｎｃｏｎ２７のＣ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ表面を形成する２本のベータ鎖は、Ｃ鎖が、Ｓ３０、Ｌ３２、Ｑ３４、Ｑ３６、Ｆ鎖が、Ｅ６６、Ｔ６８、Ｓ７０、Ｙ７２、及び、Ｖ７４の全部で９個の表面露出残基を有しているのに対して、ＣＤループは、Ｓ３８、Ｅ３９、Ｋ４０、Ｖ４１、Ｇ４２、及び、Ｅ４３の６個の可能な残基を有し、そして、ＦＧループは、Ｋ７５、Ｇ７６、Ｇ７７、Ｈ７８、Ｒ７９、Ｓ８０、及び、Ｎ８１の７個の可能な残基を有している。選択した残基は、２２個の残基すべてがランダム化された場合のライブラリーよりも大きな理論上の大きさが故に、ＴＣＬ１４のデザインに含まれるように選択した。
【０１４１】
ランダム化を行うために、Ｃ−鎖のＬ３２、Ｑ３４、及び、Ｑ３６、ＣＤループのＳ３８、Ｅ３９、Ｋ４０、及び、Ｖ４１、Ｆ鎖のＴ６８、Ｓ７０、及び、Ｙ７２、ＦＧループのＨ７８、Ｒ７９、及び、Ｎ８１の１３個のＴｅｎｃｏｎの位置を選択した。Ｃ及びＦ鎖において、Ｓ３０及びＥ６６は、ＣＤ及びＦＧループを超えてすぐの位置にあり、また、Ｃ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ表面の一部とは明確に認められないので、ランダム化しなかった。ＣＤループでは、Ｇ４２及びＥ４３は、柔軟性を付与するグリシンはループ領域において貴重な存在となるものであり、そして、Ｅ４３は、当該表面の接合部に位置することから、ランダム化しなかった。ＦＧループでは、Ｋ７５、Ｇ７６、Ｇ７７、及び、Ｓ８０は除外した。当該グリシンを、上記した理由で除外したのに対して、結晶構造を注意深く調べたところ、Ｓ８０はコアと主要な接点を形成して、安定的なＦＧループの形成を補助することが判明した。Ｋ７５は、Ｃ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ表面の表面から離れる方向に面しており、また、ランダム化の候補としてはさほど重要とは認められなかった。上記した残基は、当初のＴＣＬ１４のデザインではランダム化しなかったが、デノボ選択用、または、例えば、選択したＴＣＬ１４の標的特異的なヒットについての親和性成熟ライブラリー用にさらなる多様性を付与えるため、後出のライブラリーのデザインでは、これらを含めることができる。
【０１４２】
ＴＣＬ１４の製造に続いて、３つのさらなるＴｅｎｃｏｎライブラリーの同様のデザインを製造した。これら２つのライブラリー、ＴＣＬ１９、ＴＣＬ２１、及び、ＴＣＬ２３を、ＴＣＬ１４と同じ位置（上記を参照されたい）でランダム化したが、これらの位置に存在するアミノ酸の分布を変えた（表２）。ＴＣＬ１９及びＴＣＬ２１は、システイン及びメチオニンだけを除いて、すべての位置で、１８種類の天然アミノ酸の等しい分布（それぞれ、５．５５％）を有するようにデザインした。ＴＣＬ２３は、表２に示したように、それぞれのランダム化した位置が、機能性抗体のＨＣＤＲ３ループ（Ｂｉｒｔａｌａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３７７：１５１８−１５２８，２００８）に認められるアミノ酸分布に近似するようにデザインした。ＴＣＬ２１ランダム化と同様に、システイン及びメチオニンは除外した。
【０１４３】
その他のライブラリーの可能性のある標的結合表面を拡張するために、第３のさらなるライブラリーを構築した。このライブラリー、ＴＣＬ２４では、ＴＣＬ１４、ＴＣＬ１９、ＴＣＬ２１、及び、ＴＣＬ２３のライブラリーと比較して、４つのさらなるＴｅｎｃｏｎの位置をランダム化した。これらの位置は、Ｄ鎖のＮ４６及びＴ４８と、Ｇ鎖のＳ８４及びＩ８６とを含む。位置４６、４８、８４、及び、８６は、詳細には、これらの残基の側鎖が、ベータ−鎖Ｄ及びＧから表面露出しており、そして、Ｃ及びＦ鎖のランダム化した部分に構造的に隣接して位置するため、標的タンパク質との結合のためにアクセス可能な表面積が大きくなるので、選択をした。ＴＣＬ２４の各位置で用いたアミノ酸分布は、表２でＴＣＬ１９及びＴＣＬ２１について説明したものと同じである。
【０１４４】
ＴＣＬ２４ライブラリー（配列番号８）
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＸ１ＩＸ２ＹＸ３ＥＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＧＥＡＩＸ８ＬＸ９ＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＸ１０ＶＸ１１ＩＸ１２ＧＶＫＧＧＸ１３Ｘ１４ＳＸ１５ＰＬＸ１６ＡＸ１７ＦＴＴ；
配列中、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２、及び、Ｘ１３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、または、Ｗである。
【０１４５】
【表３】
2020513744.tif 000005
【０１４６】
ＴＣＬ２１、ＴＣＬ２３、及び、ＴＣＬ２４ライブラリーの作製
アミノ酸分布を制御するため、Ｃｏｌｉｂｒａライブラリー技術（Ｉｓｏｇｅｎｉｃａ）を使用して、ＴＣＬ２１ライブラリーを作製した。アミノ酸分布を制御するため、Ｓｌｏｎｏｍｉｃｓ技術（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ）を使用して、ＴＣＬ１９、ＴＣＬ２３、及び、ＴＣＬ２４遺伝子断片を作製した。最初の合成の後に、ＰＣＲを用いて各ライブラリーを増幅した後、ループライブラリーに関して先述したＣＩＳディスプレイシステム（Ｏｄｅｇｒｉｐ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０１：２８０６−２８１０，２００４）を使用する選択に用いるために、ＲｅｐＡの遺伝子とライゲートした。
【０１４７】
実施例３：ＣＤ８Ａに結合するフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインの選択
【０１４８】
ヒトＣＤ８アルファ抗原のデザイン及び製造
２つのヒトＣＤ８アルファ（Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ  Ｐ０１７３２）構築物を、ＨＥＫ細胞から発現及び精製して、ＣＩＳディスプレイパニング用の組換えタンパク質を産生した（表３）。
【０１４９】
【表４】
2020513744.tif 000006
【０１５０】
各構築物は、マウスＩｇＧカッパ分泌シグナル（配列番号３）を含むようにデザインしており、そして、ヒトＩｇＧ１のＦｃ断片（配列番号４）に融合した。このＣＤ８アルファ及びＦｃ断片配列は、フラッグ及びポリヒスチジンタグ配列（配列番号５）を含有するリンカーで連結した。
【０１５１】
これらのタンパク質をコードするプラスミドを、一過性トランスフェクションによって、ＨＥＫ  ２９３−Ｅｘｐｉ細胞にトランスフェクトし、そして、培養上清を、６０００×ｇの遠心分離で回収し、次いで、０．２ミクロンフィルターで清澄化した。上清を、ＨｉＴｒａｐ  Ｍａｂｓｕｒｅ  Ｓｅｌｅｃｔカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードし、そして、ＣＤ８Ａタンパク質を、０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ３．５、に溶出し、そして、２Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７を添加して中和した。次いで、それぞれの試料を、Ｎｏ  Ｗｅｉｇｈｔ  ＥＺ−Ｌｉｎｋ−Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎビオチン化キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いたビオチン化のために、ｐＨ７．４のＰＢＳで透析した。
【０１５２】
ライブラリースクリーニング
Ｃｉｓディスプレイを用いて、ＴＣＬ１８、ＴＣＬ１９、ＴＣＬ２１、ＴＣＬ２３、及び、ＴＣＬ２４ライブラリーからＣＤ８アルファ結合ドメインを選択した。ビオチン化ＣＤ８Ｗ７及びＣＤ８Ｗ１３をパニングに使用した。インビトロ転写及び翻訳（ＩＴＴ）を行うため、３μｇのライブラリーＤＮＡを、０．１ｍＭの完全アミノ酸、１Ｘ  Ｓ３０プレミクス成分、及び、１５μＬのＳ３０エクストラクト（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、５０μＬの全体積で、３０℃で、インキュベートした。１時間後、３７５μＬのブロッキング溶液（０．１％  Ｃａｓｅｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）、１００ｍｇ／ｍｌのＨｅｒｒｉｎｇ  Ｓｐｅｒｍ  ＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、１ｍｇ／ｍＬのヘパリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））を加え、そして、反応物を、氷上で、１５分間、インキュベートした。選択のために、ビオチン化抗原を、４００ｎＭ（ラウンド１）、２００ｎＭ（ラウンド２及び３）、及び、１００ｎＭ（ラウンド４及び５）の濃度で添加した。ニュートラアビジン磁気ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）（ラウンド１、３、５）、または、ストレプトアビジン磁気ビーズ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）（ラウンド２及び４）を用いて、結合ライブラリーメンバーを回収し、そして、これらのビーズを、５００μＬのＰＢＳＴで５〜１４回、続いて、５００μＬのＰＢＳで２回洗浄することで、未結合のライブラリーメンバーを除去した。改善した親和性を有する足場分子を同定するために、さらなる選択ラウンドを実施した。すなわち、ラウンド５からのアウトプットを、上記したようにして調製し、そして、以下の変更を伴うさらなる反復ラウンドに供した。ビオチン化標的濃度を、２５ｎＭ（ラウンド６及び７）、または、２．５ｎＭ（ラウンド８及び９）にまで減少させ、そして、過剰の非ビオチン化標的タンパク質の存在下で、さらに１時間洗浄を行った。これらの変更の目的は、潜在的に速いオン速度と遅いオフ速度を持つバインダーとを同時に選択して、実質的に低いＫＤをもたらすことにある。
【０１５３】
パニングした後に、選択したＦＮ３ドメインを、オリゴＴｃｏｎ６（配列番号３３）、及び、Ｔｃｏｎ５ｓｈｏｒｔＥ８６Ｉ（配列番号３４）を用いたＰＣＲで増幅し、ｐＥＴ１５−ＬＩＣにアニーリングしてサブクローニングし、そして、標準的な分子生物学的技術を用いたＥ．ｃｏｌｉでの可溶性発現に向けて、ＢＬ２１−ＧＯＬＤ（ＤＥ３）細胞（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）に形質転換した。単一クローンを拾い上げ、そして、３７℃で、９６ディープウェルプレートで、アンピシリンを含む１ｍＬのＬＢで、飽和まで増殖させた。翌日、２５μＬを、９６ディープウェルプレートの新しい１ｍＬ  ＬＢ−Ａｍｐ培地に移し、３７℃で、２時間、増殖させた。ＩＰＴＧを、１ｍＭの最終濃度で添加し、そして、タンパク質発現を、３０℃で、１６時間誘導した。細胞を、遠心分離して回収し、続いて、０．２ｍｇ／ｍＬの最終Ｃｈｉｋｅｎ  Ｅｇｇ  Ｗｈｉｔｅ  Ｌｙｓｏｚｙｍｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を補充したＢｕｇｂｕｓｔｅｒ  ＨＴ（ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）で溶解した。細胞を、遠心分離により約１６時間後に回収し、そして、−２０℃で凍結した。細胞溶解は、各ペレットを、０．６ｍＬのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（登録商標）ＨＴ溶解緩衝液（Ｎｏｖａｇｅｎ  ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にて、室温で、４５分間、振盪しながらインキュベートすることで達成した。
【０１５４】
ＣＤ８Ａに結合するＦＮ３ドメインの選択
ニュートラアビジンコートプレートを、Ｓｔａｒｔｉｎｇ  Ｂｌｏｃｋ  Ｔ２０（Ｐｉｅｒｃｅ）で、１時間、ブロックした後に、ビオチン化ＣＤ８Ｗ７もしくはＣＤ８Ｗ１３（パニングと同じ抗原）、または、ネガティブコントロール（ヒトＦｃ）で、１時間、コートした。これらのプレートを、ＴＢＳＴですすぎ、そして、希釈した溶解物を、１時間、プレートに塗布した。さらにすすぎを行った後に、ウェルを、ＨＲＰコンジュゲート抗ＦＮ３ドメイン抗体（ＰＡＢ２５）で、１時間、処理し、次いで、ＰＯＤ（Ｒｏｃｈｅ）でアッセイした。バックグラウンドよりも少なくとも１０倍強いシグナルを有するＦＮ３ドメイン分子を、さらなる分析のために選択した。
【０１５５】
ＣＤ８Ａに結合する同定したＦＮ３ドメインの小規模発現及び精製
生化学的結合ＥＬＩＳＡによって同定したユニークヒットから単離したクローンを、９６ウェルブロックプレートでの増殖のために単一ヒットプレートに合わせ、クローンを、振盪しながら、３７℃で、一晩、１ｍＬの培養物（選択のためにカナマイシンを補充したＬＢ培地）で増殖させた。９６ブロックプレートでのタンパク質発現のために、カナマイシンを補充した１ｍＬのＴＢ培地に、５０ｕＬの一晩培養物を接種し、そして、ＯＤ６００＝０．６〜１まで、３００ｒｐｍで連続的に振盪しながら、３７℃で、増殖させた。目標のＯＤに達したら、ＩＰＴＧを１ｍＭまで添加してタンパク質発現を誘導し、プレートを、一晩増殖のために、３０℃（３００ｒｐｍ）に移した。一晩培養物を遠心分離して細胞を回収し、細菌ペレットを、用時まで、−８０℃で保存した。ペレットを、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（登録商標）ＨＴ溶解緩衝液（Ｎｏｖａｇｅｎ  ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で溶解し、そして、Ｈｉｓ  ＭｕｌｔｉＴｒａｐ（商標）ＨＰプレート（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）での浄化溶解液を、Ｈｉｓ−タグしたセンチリンで精製し、次いで、２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム、及び、２５０ｍＭイミダゾールを含む緩衝液、ｐＨ  ７．４で溶出した。精製した試料を、ＰＤ  ＭｕｌｔｉＴｒａｐ（商標）Ｇ−２５プレート（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた分析のために、ＰＢＳ  ｐＨ７．４に交換した。
【０１５６】
サイズ排除クロマトグラフィー分析
サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、抗ＣＤ８アルファＦＮ３ドメイン分子の凝集状態を測定した。各精製ＦＮ３ドメインのアリコート（１０μＬ）を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ５／１５０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に、流速０．３ｍＬ／分で、ＰＢＳ  ｐＨ７．４を移動相として注入した。カラムからの溶出液を、２８０ｎｍの吸光度でモニターした。各実験でのコントロールとして、野生型Ｔｅｎｃｏｎを充てた。Ａｇｉｌｅｎｔ  ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェアを使用して、溶出プロファイルを分析した。同じ実験でのテネイシンコンセンサタンパク質の溶出プロファイルと同様の溶出プロファイルを示したタンパク質だけを、さらなる特徴決定のために考慮した。パニング、ＥＬＩＳＡスクリーニング、及び、サイズ排除クロマトグラフィー分析の後に、バックグラウンドの１０倍を超える強さで組換えヒトＣＤ８アルファに結合し、そして、ＳＥＣによる凝集体が認められない、合計で１９０個の独特な抗ヒトＣＤ８アルファＦＮ３ドメインを単離した（表４、配列番号４０〜２２８、及び、７０）。
【０１５７】
【表５】
2020513744.tif 000007
【０１５８】
【表６】
2020513744.tif 000008
【０１５９】
【表７】
2020513744.tif 000009
【０１６０】
【表８】
2020513744.tif 000010
【０１６１】
【表９】
2020513744.tif 000011
【０１６２】
ヒト及びカニクイザルドナー由来のＴ細胞に対する結合についてのスクリーニング
ヒト及びカニクイザル初代ＣＤ８  Ｔ細胞に対する１９０個のＥＬＩＳＡヒットの結合を、フローサイトメトリーによって評価した。このＦＮ３ドメイン分子を、ＰＢＳで２μＭ及び０．２μＭに希釈し、９６ウェルフォーマットで、ヒトまたはカニクイザルＣＤ８＋  Ｔ細胞と共にインキュベートした。４℃で、１時間後、これらの細胞をＰＢＳで１回洗浄した後、抗ＦＮ３ドメイン抗体（ＰＡＢ２５）溶液に再懸濁した。このインキュベートの後、これらの細胞を、ＰＢＳで２回洗浄し、そして、ＰＥコンジュゲート二次抗体、及び、生存色素を添加した。最後に、細胞を洗浄し、ＢＤ  Ｃａｎｔｏ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔを用いたフローサイトメトリー分析のために、ＰＢＳに再懸濁した。細胞を生細胞上でゲートし、結合したセンチリンの蛍光強度中央値（ＰＥチャネル）を、Ｃｙｔｏｂａｎｋソフトウェアを使用して計算した。結果を、表４にまとめている。
【０１６３】
抗ヒトＣＤ８アルファセンチリンのオフ速度分析
精製した抗ＣＤ８Ａ  ＦＮ３ドメインを、さらなる特徴決定をすべく、最も遅いオフ速度を有するクローンを選択するために、Ｐｒｏｔｅｏｎ表面プラズモン共鳴装置を使用して、オフ速度分析に供した。測定したオフ速度は、表４に示したように、２．６４Ｅ−５から１．０７Ｅ−２秒−１の範囲であった。
【０１６４】
ヤギ抗ヒトＦｃ  ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９−００５−０９８）を、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ）における３０μｌ／分の流速を有するチップでの垂直方向の６つすべてのリガンドチャネルに、アミンカップリング（ｐＨ５．０）を介して、１０μｇ／ｍｌ、ｐＨ５．０で、ＧＬＣセンサーチップに直接に固定した。固定したＧＡＨ−Ｆｃ  ＩｇＧ密度は、異なるチャネル間で、１％未満の変動で、平均約６０００応答単位（Ｒｕ）であった。自社のヒトＣＤ８Ａ−Ｆｃを、３０ｕｌ／分の流速で、５分間、１０、５、２．５μｇ／ｍｌの３つの異なるリガンド密度で、垂直方向に捕捉した。すべてのＦＮ３ドメインを、３μＭの濃度に正規化し、そして、水平方向での結合について試験した。スクリーニングスループットを最大にするために、６つ全ての分析物チャネルを、ＦＮ３ドメインに使用した。ランニング緩衝液としてＰＢＳＴを用いて、１００μｌ／分の流速で、１５分間、解離相をモニターした。表面の再生は、０．８５％リン酸の短パルス（１００ｕＬ／分で１８秒の接触時間）で達成した。データ解析は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＰｒｏｔｅＯｎ  Ｍａｎａｇｅｒソフトウェア（バージョン３．１．０．６）を用いて行った。生のデータは、スポット間（空のチップ表面、固定または捕捉したタンパク質は無い）シグナルの減算によって二重に参照して、プレコーティングしたＧＡＨ−Ｆｃ  ＩｇＧ表面へのＦＮ３ドメインの非特異的結合を補正し、続いて、ｈＣＤ８Ａ−Ｆｃが捕捉されなかった空のチャネルＬ６を使用して二重に補正をした。処理をした結合データを、１：１の単純なＬａｎｇｍｕｉｒ結合モデルに局所的に適合させて、捕捉したｈＣＤ８Ａ−Ｆｃに結合する各ＦＮ３ドメインについてのｋｏｆｆを抽出した。
【０１６５】
実施例４：抗ＣＤ８Ａ  ＦＮ３ドメインの遺伝子操作
酸化（メチオニンまたはトリプトファン）、脱アミド化（ＮＳ）、異性化（ＤＧ）及び、クリッピング（ＤＰ）の翻訳後修飾の危険性を排除するために、幾つかの突然変異を、抗ＣＤ８Ａ候補の上位候補にデザインした。プロリンは、ベータ鎖を不安定化させる可能性があるので、ベータ鎖に認められるプロリン残基もまた突然変異させた（Ｃｈｉｂａ  Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００３；２７８：４７０１６−２４）。ＦＮ３ドメインライブラリーデザイン位置に由来する残基のみを、突然変異について考慮した。親分子の類似の化学的性質（例えば、トリプトファンからチロシン）を模倣するか、または、その位置でその他のＣＤ８Ａ  ＦＮ３ドメインに認められるアミノ酸で、ＰＴＭリスクのあるアミノ酸を置換するために、変異体配列を選択した。遺伝子操作した配列の全リストを、表５に示す。各変異体と組換えＣＤ８アルファとの間の解離速度を、表面プラズモン共鳴で測定して、相対的結合強度を推定した。
【０１６６】
【表１０】
2020513744.tif 000012
【０１６７】
表５に示したデータから、変化する可能性のリスクを抑制する数多くの突然変異が、親分子のそれと類似の解離速度を維持することは明らかである。突然変異体ＣＤ８Ｓ４０２（ＤＰ部位の除去）、ＣＤ８Ｓ３９０（Ｔｒｐ残基の除去）、及び、ＣＤ８Ｓ４０３（ベータ鎖からのＰｒｏの除去）は、親の適切な分子よりも遅い解離速度をもたらし、このことは、強固な結合を示す。その他の数多くの変異は、親分子と同様に結合を維持し、したがって、これらの分子は、進行過程でのＣＭＣ関連リスクが少ないので、親よりも好ましいものとし得る。
【０１６８】
実施例５：ＣＤ８Ａ結合ＦＮ３ドメインの親和性測定
１９個の抗ＣＤ８Ａ候補を、組換えヒトＣＤ８アルファに対する結合の完全な動態分析のために選択した。これらの候補を、１）ヒトＴ細胞に対する強力な相対的結合、２）カニクイザルＴ細胞に対する強力な相対的結合、３）２ｕＭと比較して、０．２ｕＭでの細胞結合の最小減少、４）ＳＥＣを介した凝集体がないこと、５）オフ速度が、２．０７Ｅ−３秒−１未満であること、６）配列ファミリーに関する配列多様性、及び、７）潜在的に変化する可能性の課題（酸化、アミド分解、クリッピング、及び、疎水性）を有する配列の相対的傾向の基準を用いて、上記した陽性ヒット（表４）から選択した。
【０１６９】
ｈＣＤ８Ａ−Ｆｃに結合する、上位の１９個の候補、後に上位６候補の繰り返しの親和性を、ｋｏｆｆスクリーニングの場合と同様の条件下で、ＧＬＣセンサーチップを使用して、ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６機器（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で測定した。ヤギ抗ヒトＦｃ抗体を、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ）における３０μｌ／分の流速を有するチップでの垂直方向の６つすべてのリガンドチャネルに、標準アミンカップリングを介して、１０μｇ／ｍｌ、ｐＨ５．０で、当該チップに直接に固定して、各々のリガンドチャネルにて、平均で６２００のＲｕｓを達成した。次いで、ヒトＣＤ８Ａ−Ｆｃを、２００〜１２００応答単位の範囲の５つの表面密度で捕捉し、６番目のチャネルを、ＧＡＨ−Ｆｃ  ＩｇＧ表面に対する空のチャネルコントロールとして残した。捕捉したｈＣＤ８Ａ−Ｆｃ表面の水平方向に同時に５つの異なる濃度の抗ＣＤ８Ａ  ＦＮ３ドメイン（３倍希釈系列で希釈した１μＭ）を、流動緩衝液ＰＢＳＴのみを含む第６の分析物チャネルと共に流すことで、結合を測定した。すべての相互作用を、結合時間及び解離時間が、それぞれ４分、３０分である１００ｕＬ／分の流速で測定した。リガンド表面の再生を、０．８５％リン酸の１回の短いパルス（１００ｕＬ／分で１８秒間の接触時間）で達成した。データ解析を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＰｒｏｔｅＯｎ  Ｍａｎａｇｅｒソフトウェア（バージョン３．１．０．６）を用いて行った。生のデータは、スポット間（空のチップ表面、固定または捕捉したタンパク質は無い）シグナルの減算によって二重に参照して、ＦＮ３ドメインのプレコーティングしたＧＡＨ−Ｆｃ  ＩｇＧ表面への非特異的結合を補正し、続いて、（リガンドの解離から生じるあらゆるベースラインドリフトを経時的に補正するために）緩衝液ブランク応答を使用して、二重に参照をした。抗ＣＤ８Ａ  ＦＮ３ドメイン結合データを、１：１の単純なＬａｎｇｍｕｉｒ結合モデルに首尾良く適合しないことが複数の分析で一貫して認められており、このことは、試薬の問題、及び／または、本質的に複雑な結合メカニズムのいずれもが、単純な１：１結合モードを使用して解明することができない、ことを示している。ｈＣＤ８Ａ−ＦｃフォーマットのＧＡＨ−Ｆｃ捕捉が、潜在的な実験的アーチファクト（アミンカップリングに起因するリガンド活性損失、及び／または、人工エピトープ／異種リガンド集団など）の導入において、その他のフォーマットと比較して、最も攪乱が小さいと仮定すると、ここで報告されているＧＡＨ−Ｆｃ捕捉実験の結果は、数多くの事例で不適合な１：１のＬａｎｇｍｕｉｒ適合が認められているにもかかわらず、最も信頼のおけるＰｒｏｔｅＯｎ  ＳＰＲデータを表している。リガンドタンパク質集団における異質性、または、Ｆｃ融合タンパク質での２ｈＣＤ８Ａ単量体に対して結合する各々のＦＮ３ドメインについての潜在的に異なるメカニズムのいずれかに起因する２つの異なるリガンド種を仮定してデータを適合させるために、異種リガンドモデルを選択した。この場合、各々の抗ＣＤ８Ａ  ＦＮ３ドメインは、別々の親和性を有するので、結果として得られるセンサーグラムは、各々のＦＮ３ドメイン結合について報告された２組の速度定数を有する、２つの独立した反応の合計を反映する。
【０１７０】
【表１１】
2020513744.tif 000013
【０１７１】
実施例６：ＤＦＯ及び８９ＺＲを有する抗ＣＤ８Ａ  ＦＮ３ドメインの標識
抗ＣＤ８Ａ  ＦＮ３ドメインを、マレイミド含有キレート剤またはＰＥＴ標識のコンジュゲーションのために、単一のシステイン残基を含むように修飾した。残基Ｅ５４からシステインへの突然変異を有するクローンＰ２８２ＤＲ９Ｐ１３５９＿Ｆ５、Ｐ２８２ＤＲ９Ｐ１３５９＿Ｆ７、Ｐ２８２ＤＲ９Ｐ１３５９＿Ｇ７、Ｐ２８２ＥＲ９Ｐ１３６０＿Ｃ８、Ｐ２８３ＡＲ９Ｐ１３６２＿Ｄ６、及び、Ｐ２８２ＤＲ９Ｐ１３５９＿Ｃ５をコードする合成プラスミドＤＮＡを、ＤＮＡ２．０で合成した（表７）。Ｅ５４は、この残基で変異したその他のＦＮ３ドメインの結合親和性、安定性、及び、発現レベルの維持を実証した以前の研究に基づいて、変異の位置として選択した（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ２０１６  印刷版発行前の電子版）。
【０１７２】
【表１２】
2020513744.tif 000014
【０１７３】
遊離システインで修飾した抗ＣＤ８Ａ  ＦＮ３ドミンに放射性金属をキレート化するために、デフェロキサミン（ＤＦＯ）に結合させた。０．５ｍＬの１００〜５００μＭの抗ＣＤ８Ａ  ＦＮ３ドメイン溶液を、１０μＬの５００ｍＭ  ＴＣＥＰ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号６４６５４７）と合わせ、窒素で穏やかにフラッシュし、そして、室温で、１時間インキュベートした。氷上で、１０分間、インキュベートし、そして、１６，０００×ｇ以上で遠心分離してタンパク質をペレット化する前に、各管に１．０ｍＬの飽和硫酸アンモニウム（４．０２Ｍ）を添加して、３．２Ｍの最終濃度にした。得られたペレットを再懸濁し、そして、１００ｍＭのリン酸ナトリウム  ｐＨ７．２、及び、１ｍＭのＥＤＴＡを補充した１．０ｍＬの３．２Ｍ硫酸アンモニウムで洗浄をした後に、改めて遠心分離した。２回目の遠心分離工程の後に、得られたペレットを、１００ｍＭのリン酸ナトリウム７．０、１ｍＭのＥＤＴＡに溶解し、そして、１０ｕＬの５０ｍＭ  ＤＦＯ溶液と混合して、５：１のＤＦＯ対抗ＣＤ８Ａの最終モル比にした。この反応を、室温で、３０分間、進行させた後に、５．０マイクロリットルのベータ−メルカプトエタノールで急冷した。Ｚｅｂａ  ７ｋカラム（Ｐｉｅｒｃｅ  カタログ番号８９８８９）などの脱塩カラムを通過させる、上記したような２回目の硫酸アンモニウム沈殿を含む様々な方法によって、または、ニッケル−ＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ  番号３０４５０）を用いた精製で、過剰のＤＦＯを最終的に除去した。抗ＣＤ８Ａ  ＦＮ３ドメイン−ＤＦＯコンジュゲートを、さらなる分析に供するために、１×ＰＢＳで製剤した。
【０１７４】
ＤＦＯへのコンジュゲーションの後に、組換えヒトＣＤ８アルファに対する各々の抗ＣＤ８Ａ  ＦＮ３ドメインの結合を、前述したようにして、表面プラズモン共鳴で評価した。Ｅ５４からＣｙｓへの変異、及び、ＤＦＯへのコンジュケーションの後に、すべての試料は、ヒトＣＤ８Ａに対する強固な結合を保持していた（表８）。
【０１７５】
【表１３】
2020513744.tif 000015
【０１７６】
実施例７：抗ＣＤ８Ａ  ＦＮ３ドメインのヒト及びカニクイザルＴ細胞に対する結合
１９個の選択した抗ＣＤ８Ａ  ＦＮ３ドメインについて、全用量応答結合曲線を作成した。各々の候補を、ＰＢＳで、２０μＭに希釈し、続いて、１：３希釈系列で、１１点または１８点の用量反応曲線を作成した。ヒトまたはカニクイザルのＣＤ８＋  Ｔ細胞を、希釈したＦＮ３ドメインと共に、４℃で、１時間、インキュベートした。細胞を、ＰＢＳで、１回洗浄し、そして、抗センチリン抗体（ＰＡＢ２５）と共に、４℃で、１時間、インキュベートした。これらの細胞を、ＰＢＳで、２回洗浄し、続いて、ＰＥ二次抗体、抗ＣＤ３−ＰａｃＢ、抗ＣＤ４−ＡＰＣ、及び、生存色素とインキュベートした。最後に、細胞を洗浄し、ＢＤ  Ｃａｎｔｏ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔを用いたフローサイトメトリー分析のために、ＰＢＳで再懸濁した。ＣＤ８  Ｔ細胞を、生存ＣＤ３＋ＣＤ４−細胞と定義した。結合したセンチリンの蛍光強度の中央値（ＰＥチャネル）、及び、Ｃｙｔｏｂａｎｋソフトウェアを使用して陽性染色を示す細胞の％を計算した。結果を、Ｐｒｉｓｍを用いてグラフ化し、そして、ＥＣ５０値を、４パラメーター用量反応可変勾配方程式を用いて計算した。
【０１７７】
ＭｅｓｏＳｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ−Ｃｅｌｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＭＳＤ−ＣＡＴ）に基づいた平衡細胞結合アッセイを行って、一次ヒト細胞傷害性Ｔ細胞表面ＣＤ８Ａ受容体に対して結合する上位６つの抗ＣＤ８Ａ候補の親和性を決定した。５０ｐＭの一定濃度の各抗ＣＤ８Ａ  ＦＮ３ドメインを、１０種の異なる濃度の一次細胞傷害性ＣＤ８Ｔ細胞（縦列２〜１１）と一緒にプレインキュベートした。結合測定の前に細胞生存率を調べたところ、有効な分析には８５％を超える生存率が望まれた。これらの細胞は、異なるドナーに由来するので、ドナー間の変動の場合には、同じドナーの細胞のみを一緒に組み合わせた。それぞれの個々の抗ＣＤ８Ａ  ＦＮ３ドメイン結合を、同じドナー由来の細胞を用いて、反復して測定した。細胞、及び、ＦＮ３ドメインを、回転子上で、４℃で、一晩、インキュベートして平衡に至らしめた。インキュベートの後、これらの細胞を、細胞結合抗ＣＤ８Ａ  ＦＮ３ドメインと共に遠心沈降させ、そして、上清での未結合（遊離）抗ＣＤ８Ａ  ＦＮ３ドメインを、ＭＳＤアッセイを用いて定量し、ここで、ビオチン化組換えｈＣＤ８Ａ−Ｆｃタンパク質を、ストレプトアビジンＭＳＤプレートで、一晩、約１６時間、４℃としたアッセイ緩衝液にて、０．６ｕｇ／ｍＬで捕捉した。プレートをブロッキングした後に、遊離抗ＣＤ８Ａ  ＦＮ３ドメインを含む上清をプレートに添加し、１時間インキュベートした後に、１．６ｕｇ／ｍｌのＳｕｌｆｏＴａｇ  ｐＡｂｌ３９（自社製）検出を行った。１列目を、ＦＮ３ドメイン及びｈＣＤ８Ａを含まない緩衝液コントロール（プレートバックグラウンド結合コントロール）とし、ならびに、１２列目を、ｈＣＤ８Ａを含まないＦＮ３ドメイン単独のコントロール（１００％遊離／未結合）とした。マウス抗ｈＣＤ８Ａ  ｍＡｂ（ｍＩｇＧｌｋ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５５３６４、クローンＲＰＡ−Ｔ８）を、ポジティブコントロールとした。Ｔｅｎｃｏｎ２７を、ネガティブコントロールとして、最初のアッセイ検証で使い、有意な結合は観察されなかったので、細胞の利用可能性が故に、後の細胞結合には含めなかった。１：４のストックをＨ２Ｏに希釈することで、ＭＳＤ  Ｒｅａｄ  Ｂｕｆｆｅｒを添加した後に、これらのプレートを、ＭＳＤ  Ｓｅｃｔｏｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ６０００（商標）Ｒｅａｄｅｒで、直ちに発光レベルを読み取った。
【０１７８】
生のＭＳＤデータを、エクスポートし、そして、可変勾配関数を用いた非線形フィットを用いるＰｒｉｓｍで分析をして、Ｂｍａｘ及びＨｉｌｌｓｌｏｐｅ値を導出した。収束したＢｍａｘ値と、−１．５〜−０．５（理想的には、−１．０）の範囲内のｈｉｌｌｓｌｏｐｅを有するものだけを、さらなる解析のために考慮する。次いで、結合データを、Ｂｍａｘ値を用いて正規化して、正規化％遊離ＦＮ３ドメインを計算した。細胞当たり５０，０００受容体の表面ＣＤ８密度を、受容体濃度計算に使用した。１：１結合モデルについて「正規化データのための溶液親和性方程式」を用いて親和性を決定するために、最高ＣＤ８細胞濃度で、＜２０％の遊離センチリンの飽和基準が必要であった。
【０１７９】
抗ＣＤ８Ａ  ＦＮ３ドメインは、０．１６７〜２．８１ｎＭの範囲の親和性で、初代細胞に結合した（表９）。
【０１８０】
【表１４】
2020513744.tif 000016
【０１８１】
実施例８：ヒトＴ細胞の活性化
デノボ活性化
抗ＣＤ８Ａ  ＦＮ３ドメインが、Ｔ細胞を活性化するかどうかを決定するために、フローサイトメトリーアッセイを実施して、Ｔ細胞活性化マーカーの変化をモニターした。６つの抗ＣＤ８Ａ  ＦＮ３ドメインを、Ｔ細胞活性化について評価した。当該ＦＮ３ドメインを、１μＭまたは１０ｎＭのいずれかで、培地に含まれるヒトｐａｎ−Ｔ細胞と、二重に、４日間、インキュベートすることで、デノボでの活性化を評価した。２名の別個のドナーについて試験を行った。プレート結合抗ＣＤ３を、０．１ｕｇ／ｍＬ、及び、０．０１ｕｇ／ｍＬの２つの用量で、ポジティブコントロールとして使用した。ＰＢＳを、ネガティブコントロールとして使用した。次いで、細胞を生存色素で染色し、そして、次の抗体のパネル、すなわち、ＣＤ４−ＦＩＴＣ、ＣＤ３−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、ＣＤ６９−ＰａｃＢ、ＣＤ４５ＲＡ−ＢＶ６０５、ＣＤ２５−ＢＶ６５０、ＣＤ１２７−ＰＥ、及び、ＣＤ１３７−ＰＥ−Ｃｙ７で染色した。ＣＤ８＋細胞を、生存ＣＤ３＋ＣＤ４−細胞と定義し、そして、各々のＴ細胞活性化マーカーについてプロファイルした。蛍光強度の中央値を、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて計算し、そして、複製値を平均化した。結果を、表１０Ａ（ドナー０２２）、及び、１０Ｂ（ドナー１４６）にまとめている。３６５、３６６、３６７、３６８、及び、３７０では、１μＭの最高用量レベルで試験した２名のドナーの１名のみに、Ｔ細胞活性化マーカーの小さな変化が認められた。これらの変化は、１０ｎＭの投与量では、双方のドナーでは認められておらず、このことは、これらの分子が、関連する濃度で、Ｔ細胞をデノボで活性化しないことを示唆している。３６９の分子は、双方のドナーにおいて、最高用量レベルで、ＣＤ１３７発現を有意に活性化しているものと考えられる。
【０１８２】
【表１５】
2020513744.tif 000017
【０１８３】
【表１６】
2020513744.tif 000018
【０１８４】
Ｐａｎ  Ｔ細胞活性化
抗ＣＤ８Ａ  ＦＮ３ドメインが、ｐａｎ−活性化Ｔ細胞におけるＴ細胞活性化のマーカーに影響を及ぼし得るかどうかを決定するために、当該抗ＣＤ８Ａ  ＦＮ３ドメインもまた、低用量のプレート結合ＣＤ３と組み合わせて評価した。このアッセイでは、最適以下の濃度（０．０１μｇ／ｍＬ）のプレート結合抗ＣＤ３を使用して、１μＭまたは１０ｎＭの抗ＣＤ８Ａの存在下で、Ｔ細胞を活性化した。４日後に、これらの細胞を、上記したのと同じパネル及びゲート戦略を用いて評価した。２名の独立したドナーについて試験をした。蛍光強度の中央値を、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて計算し、そして、複製値を平均化した。結果を、表１１Ａ（ドナー０２２）、及び、１１Ｂ（ドナー１４６）にまとめている。
【０１８５】
【表１７】
2020513744.tif 000019
【０１８６】
【表１８】
2020513744.tif 000020
【０１８７】
サイトカイン応答
活性化マーカーで観察された変化のいずれかが、サイトカイン産生の変化をもたらすかどうかを決定するために、２つの抗ＣＤ８Ａ  ＦＮ３ドメインを用いて、抗原依存性Ｔ細胞活性化アッセイをも実施した。１セットのアッセイについて、ＣＭＶ反応性、または、Ｍ１反応性のヒトＰＢＭＣのいずれかを解凍し、そして、６ウェルプレートで、３７℃で、一晩静置した。翌日、ＰＢＭＣをピペッティングにより回収し、計数し、そして、１０μｇ／ｍＬペプチドの存在下または非存在下で、ＩＦＮｇ  Ｍａｂｔｅｃｈ  ＥＬＩＳｐｏｔプレートにプレーティングした。１μＭの抗ＣＤ８Ａ  ＦＮ３−ＤＦＯコンジュゲートをウェルに添加し、そして、それらのプレートを、３７℃で、約２４時間、静置してインキュベートした。これらの細胞を除去し、そして、当該プレートを、ＰＢＳで５回洗浄した。供給を受けた検出抗体を添加し、そして、プレートを、２時間、インキュベートした。プレートを再度洗浄し、そして、キット基質を各ウェルに加えた。プレートを水に潜らせて反応を停止させる前に、プレートを、約５分間、展開した。プレートを、暗所で、一晩、逆さまにして乾燥させた。プレートを、ＡＩＤ  ＥｌｉＳｐｏｔ  Ｒｅａｄｅｒで読み取り、そして、スポットカウントを、ＡＩＤ  ＥｌｉＳｐｏｔソフトウェアを使用して生成した。結果を、Ｐｒｉｓｍでグラフ化した。結果は、図１にまとめてある。このアッセイでは、培地単独またはペプチドの非存在下での非ＣＤ８Ａ結合ＴｅｎＣｏｎコントロールと比較して、３６５−ＤＦＯは、ＩＦＮｇスポットの個数を増加させない（図１Ａ、１Ｃ）。ペプチド及びＣＤ３を、ポジティブコントロールとして含む。ペプチドの存在下では、ペプチド単独または非ＣＤ８Ａ結合テンコンを有するペプチドと比較して、当該３６５−ＤＦＯは、ＩＦＮｇスポットの数を変化させない（図１Ｂ、１Ｄ）。培地を、ネガティブコントロールとして含み、そして、ＣＤ３を、ポジティブコントロールとして含む。これらの結果は、センチリンが、Ｔ細胞活性化に影響を及ぼさないことを示唆している。
【０１８８】
これらの結果を長期アッセイにおいて確認するために、ＩＦＮ−ガンマレベルも、６日間の活性化アッセイにおいて測定した。この研究のために、ＣＭＶ反応性ＰＢＭＣを、０．２５μｇ／ｍＬのｐｐ６５ペプチドの存在下または非存在下で、１ｕＭで抗ＣＤ８Ａ  ＦＮ３ドメインと共に３連でインキュベートした。細胞を、３７℃で、６日間、インキュベートした。各時点で、細胞を遠心分離し、そして、上清を回収した。分析するまで、試料を、−８０℃で保存した。解凍した試料は、一重のＭｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）に基づくＥＬＩＳＡを用いて、ＩＦＮ−ガンマについて分析をした。このアッセイのために、製造業者の説明書に従って標準曲線を作成した。試料及び標準を、プレコート９６ウェルＭＳＤプレートに添加した。２時間インキュベートした後、キット検出抗体を加えた。さらに２時間インキュベートした後、プレートを３回洗浄し、続いて、供給を受けた読取用緩衝液を添加した。プレートを、ＭＳＤ  Ｓｅｃｔｏｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ６０００プレートリーダーで読み取った。生のＭＳＤデータファイルを、ＭＳＤ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈソフトウェアを使用して作成した標準曲線に対して分析した。これらの分析データは、Ｔｉｂｃｏ  Ｓｐｏｔｆｉｒｅプログラムを用いてグラフ化した。結果を、図２にまとめている。このアッセイにおいて、ペプチドが存在しない培地単独と比較して、３６５−ＤＦＯは、培地へのＩＦＮｇの分泌を増加させない（図２Ａ）。ＣＭＶペプチドを、ポジティブコントロールとして含む。ペプチドの存在下では、ペプチド単独と比較して、３６５−ＤＦＯは、ＩＦＮｇ分泌量も変化させない（図２Ｂ）。培地を、ネガティブコントロールとして含む。これらの結果は、センチリンが、Ｔ細胞活性化に影響を及ぼさないことを示唆している。
【０１８９】
実施例９：Ｉ１２４／Ｉ１２５を有する抗ＣＤ８Ａ  ＦＮ３ドメインの標識
ＣＤ８Ｓ３６５をヨウ素−１２４で放射標識して、［１２４Ｉ］−ＩＰＥＭ  ＣＤ８Ｓ  ３６５を製造する現在の方法（スキーム１）は、文献（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１９９１，２，４３５−４４０；ＣｈｅｍｉｓｔｒｙＯｐｅｎ  ２０１５，４，１７４−１８２）の手順に依拠した。
【０１９０】
【化１】
2020513744.tif 000021
【０１９１】
１．５ｍＬのエッペンドルフ型バイアルに、Ｎａ１２４Ｉ溶液（≦１３μＬ、≦２．５ｍＣｉ）、ＡｃＯＨ（当該溶液を酸性化するための５μＬ）、１−（４−（トリブチルスタニル）フェネチル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン（７５μＬ、ＭｅＣＮに１．００ｍｇ／ｍＬ）、及び、ヨードゲン（５μＬ、ＭｅＣＮに１．００ｍｇ／ｍＬ）溶液の順に加えた。反応を、室温で、５分間、放置した。
【０１９２】
粗反応混合物を、０．５ｍＬの２０％ＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏで希釈し、そして、分取ＨＰＬＣで直接に精製し、保持時間は、１４．４分であった（図３）。この［１２４Ｉ］−ＩＰＥＭを、Ｓｉｇｍａ−Ｃｏｔｅ（商標）で前処理した（その後、３ｍＬの７０％ＥｔＯＨ、続いて、３ｍＬのＨ２Ｏですすいだ）１ドラムのバイアルに回収し、分取ＨＰＬＣから回収した総量は＜７５０μＬであった。
【０１９３】
次いで、当該精製画分のアリコート（約５〜２５μＣｉ）を、分析ＨＰＬＣに注入した（図４、保持時間＝１１．７分）。
【０１９４】
当該精製した［１２４Ｉ］−ＩＰＥＭを、次いで、周囲温度で、＜１００μＬの体積にまで真空濃縮した。
【０１９５】
リン酸ナトリウム緩衝液（１．０Ｍリン酸ナトリウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ＝６．８６）を加えて（≧２５μｌ）、ｐＨを約６．５〜７にした（検査紙で確認した）。最後に、新たに還元したＣＤ８Ｓ  ３６５（１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ＝６．８６で、濃度約４．５７ｍｇ／ｍＬ）を、適切な量で加えて、標的比活性を達成した（すなわち、２５ｍＣｉ／ｍｇの標的比活性の場合には、２．０ｍＣｉの［１２４Ｉ］−ＩＰＥＭを回収し、そして、１７．５μＬのセンチリンを、約４．５７ｍｇ／ｍＬの濃度で加えた）。コンジュケーション反応を、周囲温度で、６０分間放置し、そして、反応の進行をチェックして、ｉＴＬＣで、変換が９０％を超えたことを確認した。
【０１９６】
精製は、反応溶液を、ＰＢＳ／１０％ＥｔＯＨ（１ｍＬ、ｐＨ＝７）で希釈して、当該反応溶液を、１ドラムバイアルからＶｉｖａｓｐｉｎ  ６５ｋＤａ  ＭＷＣＯ遠心分離フィルターに移す（前処理については別表を参照されたい）、ことから構成されていた。移動後、当該反応エッペンドルフを、ＰＢＳ／１０％ＥｔＯＨ（２×１ｍＬ、ｐＨ＝７）ですすぎ、そして、洗液をフィルターに加えた。粗反応混合物を、４０００ｒｐｍ、２０℃で、３０分間、遠心分離した。遠心分離後は、＜５００μＬの溶液が残存しており、放射ＴＬＣによって、＞９５％の放射化学的純度（ＲＣＰ）を有することが認められた（図５）。精製した［１２４Ｉ］−ＩＰＥＭ  ＣＤ８Ｓ  ３６５を、５００μＬ未満の体積であれば、５００μＬの体積になるまでＰＢＳ／１０％ＥｔＯＨで希釈し、そして、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶ  ０．２２μｍの親水性Ｄｕｒａｐｏｒｅ（ＰＶＤＦ）メンブランを通して濾過した。
【０１９７】
プロトコルからの放射化学的収率は、放射ＴＬＣによる放射化学的純度が≧９５％のＲＣＰ）のものは、約５０％である。分析逆相ＨＰＬＣを用いて、タンパク質濃度、及び、最終生成物の比活性を決定した。λ＝２８０ｎｍのＵＶにおける保持時間＝７．３分のピークの平均積分を使用して、検量線からタンパク質濃度を推定した（代表例については図６）。非放射性冷却標準ＩＰＥＭ  ＣＤ８Ｓ  ３６５（図７に示すＭＡＬＤＩ分析）との同時注入も行った（図８を参照されたい）。細菌内毒素濃度は、ＬＡＬ試薬水で１０倍希釈したＥｎｄｏｓａｆｅ（登録商標）ポータブル試験システムを使用して測定した。
【０１９８】
実施例１０：カニクイザルにおけるＣＤ８発現の検出
２つの抗ＣＤ８Ａ  ＦＮ３分子（ＣＤ８Ｓ３６５、及び、ＣＤ８Ｓ３６８）を、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）におけるＰＥＴ画像化のために選択した。当該抗ＣＤ８Ａ分子を、Ｚｒ−８９（Ｚｅｖａｃｏｒ，Ｓｏｍｅｒｓｅｔ，ＮＪ）、または、Ｉ−１２４（ＣＰＤＣ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｃａｎａｄａ、及び、Ｚｅｖａｃｏｒ，Ｓｏｍｅｒｓｅｔ，ＮＪ）のいずれかで放射標識した。約１〜２ｍＣｉの放射標識抗ＣＤ８Ａ分子（複数可）を、イソフルランを含む酸素で麻酔をしながら、メスのＮＨＰ（カニクイザル）の伏在静脈に注射した。各々の動物を、ベッドを動かして動物の全身を（頭から下腹部まで）収容して、大口径ｍｉｃｒｏＰＥＴ  Ｆｏｃｕｓ  ２２０  ＰＥＴスキャナー（Ｓｉｅｍｅｎｓ，Ｋｎｏｘｖｉｌｌｅ，ＴＮ）でスキャンした。各スキャンは、約１時間続き、そして、これらの画像は、注射の１５分後、２時間後、及び、２４時間後に得た。ＰＥＴ画像は、２Ｄ最大尤度予測最大化（ＭＬ−ＥＭ）アルゴリズムを使用して、ボクセルサイズ１．８９８×１．８９８×０．７９６ｍｍ、寸法１２８×１２８×４７５の３Ｄ画像に再構成した。注射とは反対側の脚の伏在静脈から複数の時点で血液試料を採取し、そして、血中放射能をウェルカウンターで計数した。
【０１９９】
ＰＥＴ画像を、ＰＭＯＤ  ｖ３．７ソフトウェア（ＰＭＯＤ，Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて分析した。関心領域は、脾臓、腎臓、肝臓などの臓器の周囲に手書きで描写した。総数を、組織１グラム当たりのパーセント注射用量の単位（％ＩＤ／ｇ）に変換する一方で、血中放射能を、％ＩＤとして表した。代表的なＰＥＴ画像を、図９に示す。
【０２００】
各ＮＨＰ、及び、各抗ＣＤ８Ａ  ＦＮ３ドメイン分子（Ｚｒ−８９またはＩ−１２４のいずれかで標識したもの）の血中動態を表１１に示し、また、図１０にまとめている。同じ動物、及び、抗ＣＤ８Ａ分子について、臓器での生体内分布を、表１２に示しており（単位は、％ＩＤ／ｇである）、そして、図１１にまとめてある。Ｚｒ−８９で標識した分子は、排泄器官において放射性同位体の残留を示しており、このことは、腎臓において大きなバックグラウンドシグナルを引き起こしてしまい、その他の近くの組織を潜在的に覆い隠してしまった。このことは、Ｉ−１２４で標識した分子では、ほとんど認められなかった。脾臓の取り込みは、すべての時点において、２つの異なる分子と２つの異なる放射性同位体との間で、非常に類似していた。
【０２０１】
【表１９】
2020513744.tif 000022
【０２０２】
同じ動物、及び、抗ＣＤ８Ａ分子について、器官の生体内分布を表１２に示しており（単位は、％ＩＤ／ｇである）、そして、図１１にまとめてある。
【０２０３】
【表２０】
2020513744.tif 000023
【０２０４】
実施例１１：カニクイザルにおける抗ＣＤ８Ａ  ＦＮ３ドメインの特異性
抗ＣＤ８Ａ分子の特異性を試験するために、同カニクイザルを、キメラＣＤ８枯渇抗体（ＣＭ−Ｔ８０７マウスＶ／ヒトＦｃ抗ＣＤ８抗体）で処理して、画像化する前にＣＤ８＋  Ｔ細胞を減少させた。画像化する３日前に、１０ｍｇ／ｋｇのＣＤ８枯渇抗体を、動物の皮下に投与した。枯渇の前後に、各動物から採取した血液試料に含まれるＣＤ８  Ｔ細胞のパーセンテージを測定することで、ＣＤ８枯渇を確認した（図１２）。
【０２０５】
イソフルランを含む酸素で麻酔しながら、放射標識した［Ｉ−１２４］ＣＤ８Ｓ３６５抗ＣＤ８  ＦＮ３ドメイン分子の約１〜２ｍＣｉを、メスのＮＨＰ（カニクイザル）の伏在静脈に注射した。各々の動物を、ベッドを動かして動物の全身を（頭から下腹部まで）収容して、大口径ｍｉｃｒｏＰＥＴ  Ｆｏｃｕｓ  ２２０  ＰＥＴスキャナー（Ｓｉｅｍｅｎｓ，Ｋｎｏｘｖｉｌｌｅ，ＴＮ）でスキャンした。各スキャンは、約１時間続き、そして、これらの画像は、注射の１５分後、２時間後、及び、２４時間後に得た。ＰＥＴ画像は、２Ｄ最大尤度予測最大化（ＭＬ−ＥＭ）アルゴリズムを使用して、ボクセルサイズ１．８９８×１．８９８×０．７９６ｍｍ、寸法１２８×１２８×４７５の３Ｄ画像に再構成した。注射とは反対側の脚の伏在静脈から複数の時点で血液試料を採取し、そして、血中放射能をウェルカウンターで計数した。
【０２０６】
ＰＥＴ画像を、ＰＭＯＤ  ｖ３．７ソフトウェア（ＰＭＯＤ，Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて分析した。関心領域は、脾臓、腎臓、肝臓などの臓器の周囲に手書きで描写した。総数を、組織１グラム当たりのパーセント注射用量の単位（％ＩＤ／ｇ）に変換する一方で、血中放射能を、％ＩＤとして表した。代表的なＰＥＴ画像を、枯渇動物について図１３に示しており、このものは、図９の非枯渇動物に認められる脾臓シグナルの完全な欠如を示している。
【０２０７】
枯渇時と非枯渇時の各ＮＨＰの血中動態を図１４に示しており、また、臓器の取り込みを図１５に示している。枯渇動物と非枯渇動物との間での血中動態には、ほとんど差異が認められない。最も早い時点での脾臓の取り込みは、血流が支配的であるが故に、枯渇状態と非枯渇状態とでは類似している。しかしながら、遅い時点（２時間）では、枯渇動物における脾臓の取り込みは、非枯渇動物にて認められる取り込みの半分にも達しておらず、そして、本質的にバックグラウンドレベルであり、放射標識したセンチリンのＣＤ８Ａ特異性を実証している。
【０２０８】
実施例１２：ＣＤ８過剰発現腫瘍におけるＰＥＴ画像の感度及び特異性
抗ＣＤ８Ａ  ＦＮ３ドメイン分子、及び、ＰＥＴを用いて検出可能な細胞の最小数を決定するために、異なる数のＣＤ８過剰発現細胞を用いて、マウスで試験を実施した。４〜５週齢のメスのＮＯＤ−ｓｃｉｄ  ＩＬ２ｒγｎｕｌｌ（ＮＳＧ）マウス（ＪＡＸ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を使用し、そして、７〜１０日間、順応させた。これらのマウスを、１２時間の明暗周期（０６：３０の時間に点灯）の下、温度１９〜２２℃で、ＩＶＣケージに収容した。マウスには、標準的なオートクレーブ処理をした実験用固形飼料と水を自由に与えた。マウスに耳タグを付け、そして、試験開始の５〜７日前に尾に入れ墨を入れて、各動物を識別した。
【０２０９】
ＨＥＫ−２９３親細胞株、及び、ＨＥＫ−２９３−ｌｕｃ  ＣＤ８＋過剰発現細胞株を、２Ｄ培養として維持した。ＨＥＫ−２９３−ＬｕｃＣＤ８＋発現細胞と、ＨＥＫ−２９３親細胞とを様々な比率で含有し、培地とカルテレックスとが１：１であり、合計で１０６個の腫瘍細胞を含む混合物を、マウスの皮下に移植した。腫瘍が触知可能になり、約１０〜１４日で、２００〜３００ｍｍ３の大きさになれば、［Ｉ−１２４］ＣＤ８−Ｓ３６５を使用して、ヒトＣＤ８＋細胞を視覚化した。
【０２１０】
ＨＥＫ−２９３−Ｌｕｃ  ＣＤ８＋細胞のルシフェラーゼ発現は、ＩＶＩＳ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ光学イメージャー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）での生物発光画像を使用して、インビボで、定量化した。ピーク発光を同定するために、１５０ｍｇ／ｋｇのＤ−ルシフェリンを注射した直後に、動的光学画像を行った。
【０２１１】
イソフルランを含む酸素で麻酔しながら、約０．２〜０．５ｍＣｉの放射標識抗ＣＤ８Ａ  ＦＮ３ドメイン分子を尾静脈に注射した。各々の動物を、Ｉｎｖｅｏｎ  ｍｉｃｒｏＰＥＴ−ＣＴスキャナー（Ｓｉｅｍｅｎｓ，Ｋｎｏｘｖｉｌｌｅ，ＴＮ）で、２０分間、静的スキャンした。これらの画像は、トレーサー注射の２〜３時間後に得た。ＰＥＴ画像は、２Ｄ最大尤度予測最大化（ＭＬ−ＥＭ）アルゴリズムを使用して、ボクセルサイズ０．７７６×０．７７６×０．７９６ｍｍ、寸法１２８×１２８×１５９の３Ｄ画像に再構成した。
【０２１２】
ＰＥＴ画像を、ＰＭＯＤ  ｖ３．７ソフトウェア（ＰＭＯＤ，Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて分析した。関心領域は、腫瘍、及び、その他の臓器、脾臓、腎臓、肝臓などの臓器の周囲に手書きで描写した。総数を、組織１グラム当たりのパーセント注射用量の単位（％ＩＤ／ｇ）に変換した。代表的なＰＥＴ画像を、図１６に示す。ルシフェラーゼ発現は、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  ｖ４．４ソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）において関心領域を描画して定量化した。発光は、光子／秒／ｃｍ２／ステラジアンの単位で測定した。
【０２１３】
ＣＤ８＋  ＨＥＫ２９３細胞、及び、親細胞の双方についての血液、及び、腫瘍での放射標識した抗ＣＤ８Ａ  ＦＮ３ドメイン分子の時間−活性曲線を、図１７及び図１８に示す。親と比較して、ＣＤ８発現細胞における抗ＣＤ８Ａ  ＦＮ３結合の有意な増加が認められており、一方で、血液活性は、双方において同じである。ＣＤ８＋  ＨＥＫ２９３細胞による抗ＣＤ８Ａ  ＦＮ３の取り込みを、移植細胞の数に応じて、図１９に示す。これらのデータに基づいて、最低レベルの検出は、約７．５×１０６個の細胞であると推定される。
【０２１４】
配列表
配列番号１＝当初のＴｅｎｃｏｎ配列
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＫＧＧＨＲＳＮＰＬＳＡＥＦＴＴ
【０２１５】
配列番号２＝ＴＣＬ１ライブラリー
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶ（Ｘ）７−１２ＰＬＳＡＥＦＴＴ；
配列中、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７は、あらゆるアミノ酸であり、及び、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１、及び、Ｘ１２は、あらゆるアミノ酸であるか、または、削除されている。
【０２１６】
配列番号３＝ＴＣＬ２ライブラリー
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＸ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３ＳＸ１４Ｘ１５ＬＳＡＥＦＴＴ；
配列中、
Ｘ１は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、または、Ｖａｌであり、
Ｘ２は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、または、Ｖａｌであり、
Ｘ３、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、または、Ｖａｌ、
Ｘ４は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、または、Ｖａｌであり、
Ｘ５は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、または、Ｖａｌであり、
Ｘ６は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、または、Ｖａｌであり、
Ｘ７は、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、または、Ｔｙｒであり、
Ｘ８は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、または、Ｔｈｒであり、
Ｘ９は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、または、Ｖａｌであり、
Ｘ１０は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、または、Ｖａｌであり、
Ｘ１１は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、または、Ｖａｌであり、
Ｘ１２は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、または、Ｖａｌであり、
Ｘ１３は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、または、Ｖａｌであり、
Ｘ１４は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、または、Ｖａｌであり、及び
Ｘ１５は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、または、Ｖａｌである。
【０２１７】
配列番号４＝安定化したＴｅｎｃｏｎ（Ｔｅｎｃｏｎ  ２７）
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＫＧＧＨＲＳＮＰＬＳＡＩＦＴＴ
【０２１８】
配列番号５＝ＴＣＬ７（ＦＧ及びＢＣループ）
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９ＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＸ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９ＳＮＰＬＳＡＩＦＴＴ；
配列中、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１３、Ｘ１４、Ｘ１５、及び、Ｘ１６は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、または、Ｙであり、及び
Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１７、Ｘ１８、及び、Ｘ１９は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙであり、または、削除されている。
【０２１９】
配列番号６＝ＴＣＬ９（ＦＧループ）
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＳＮＰＬＳＡＩＦＴＴ；
配列中、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、及び、Ｘ７は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、または、Ｙであり、及び
Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１、及び、Ｘ１２は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙであり、または、削除されている。
【０２２０】
配列番号７＝ＴＣＬ１４ライブラリー
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＸ１ＩＸ２ＹＸ３ＥＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＸ８ＶＸ９ＩＸ１０ＧＶＫＧＧＸ１１Ｘ１２ＳＸ１３ＰＬＳＡＩＦＴＴ；
配列中、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２、及び、Ｘ１３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、または、Ｍである。
【０２２１】
配列番号８＝ＴＣＬ２４ライブラリー
ＴＣＬ２４ライブラリー（配列番号８）
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＸ１ＩＸ２ＹＸ３ＥＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＧＥＡＩＸ８ＬＸ９ＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＸ１０ＶＸ１１ＩＸ１２ＧＶＫＧＧＸ１３Ｘ１４ＳＸ１５ＰＬＸ１６ＡＸ１７ＦＴＴ；
配列中、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２、及び、Ｘ１３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、または、Ｗである。
【０２２２】
配列番号９＝Ｓｌｏｎｉｎｇ−ＦＯＲ
ＧＴＧＡＣＡＣＧＧＣＧＧＴＴＡＧＡＡＣ
【０２２３】
配列番号１０＝Ｓｌｏｎｉｎｇ−ＲＥＶ
ＧＣＣＴＴＴＧＧＧＡＡＧＣＴＴＣＴＡＡＧ
【０２２４】
配列番号１１＝ＰＯＰ２２５０
ＣＧＧＣＧＧＴＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＴＡＣＡＡＴＴＡＡＴＡＣ
【０２２５】
配列番号１２＝ＤｉｇＬｉｇＲｅｖ
ＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＣＣＡＡＧＣＴＣＡＧＡＡ
【０２２６】
配列番号１３＝ＢＣ９
ＧＴＧＡＣＡＣＧＧＣＧＧＴＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＴＡＣＡＡＴＴＡＡＴＡＣＡＴＡＡＣＣＣＣＡＴＣＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＧＡＴＣＴＡＣＣＡＴＧＣＴＧＣＣＧＧＣＧＣＣＧＡＡＡＡＡＣＣＴＧＧＴＴＧＴＴＴＣＴＧＡＡＧＴＴＡＣＣＧＡＡＧＡＣＴＣＴＣＴＧＣＧＴＣＴＧＴＣＴＴＧＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＴＴＹＧＡＣＴＣＴＴＴＣＣＴＧＡＴＣＣＡＧＴＡＣＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧＡＡＡＡＡＧＴＴＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＴＣＡＡＣＣＴＧＡＣＣＧＴＴＣＣＧＧＧＴＴＣＴＧＡＡＣＧＴＴＣＴＴＡＣＧＡＣＣＴＧＡＣＣＧＧＴＣＴＧＡＡＡＣＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＡＴＡＣＡＣＣＧＴＴＴＣＴＡＴＣＴＡＣＧＧＴＧＴＴＣＴＴＡＧＡＡＧＣＴＴＣＣＣＡＡＡＧＧＣ
【０２２７】
配列番号１４＝ＢＣ８
ＧＴＧＡＣＡＣＧＧＣＧＧＴＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＴＡＣＡＡＴＴＡＡＴＡＣＡＴＡＡＣＣＣＣＡＴＣＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＧＡＴＣＴＡＣＣＡＴＧＣＴＧＣＣＧＧＣＧＣＣＧＡＡＡＡＡＣＣＴＧＧＴＴＧＴＴＴＣＴＧＡＡＧＴＴＡＣＣＧＡＡＧＡＣＴＣＴＣＴＧＣＧＴＣＴＧＴＣＴＴＧＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＴＴＹＧＡＣＴＣＴＴＴＣＣＴＧＡＴＣＣＡＧＴＡＣＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧＡＡＡＡＡＧＴＴＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＴＣＡＡＣＣＴＧＡＣＣＧＴＴＣＣＧＧＧＴＴＣＴＧＡＡＣＧＴＴＣＴＴＡＣＧＡＣＣＴＧＡＣＣＧＧＴＣＴＧＡＡＡＣＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＡＴＡＣＡＣＣＧＴＴＴＣＴＡＴＣＴＡＣＧＧＴＧＴＴＣＴＴＡＧＡＡＧＣＴＴＣＣＣＡＡＡＧＧＣ
【０２２８】
配列番号１５＝ＢＣ７
ＧＴＧＡＣＡＣＧＧＣＧＧＴＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＴＡＣＡＡＴＴＡＡＴＡＣＡＴＡＡＣＣＣＣＡＴＣＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＧＡＴＣＴＡＣＣＡＴＧＣＴＧＣＣＧＧＣＧＣＣＧＡＡＡＡＡＣＣＴＧＧＴＴＧＴＴＴＣＴＧＡＡＧＴＴＡＣＣＧＡＡＧＡＣＴＣＴＣＴＧＣＧＴＣＴＧＴＣＴＴＧＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＴＴＹＧＡＣＴＣＴＴＴＣＣＴＧＡＴＣＣＡＧＴＡＣＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧＡＡＡＡＡＧＴＴＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＴＣＡＡＣＣＴＧＡＣＣＧＴＴＣＣＧＧＧＴＴＣＴＧＡＡＣＧＴＴＣＴＴＡＣＧＡＣＣＴＧＡＣＣＧＧＴＣＴＧＡＡＡＣＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＡＴＡＣＡＣＣＧＴＴＴＣＴＡＴＣＴＡＣＧＧＴＧＴＴＣＴＴＡＧＡＡＧＣＴＴＣＣＣＡＡＡＧＧＣ
【０２２９】
配列番号１６＝ＢＣ６
ＧＴＧＡＣＡＣＧＧＣＧＧＴＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＴＡＣＡＡＴＴＡＡＴＡＣＡＴＡＡＣＣＣＣＡＴＣＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＧＡＴＣＴＡＣＣＡＴＧＣＴＧＣＣＧＧＣＧＣＣＧＡＡＡＡＡＣＣＴＧＧＴＴＧＴＴＴＣＴＧＡＡＧＴＴＡＣＣＧＡＡＧＡＣＴＣＴＣＴＧＣＧＴＣＴＧＴＣＴＴＧＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＴＴＹＧＡＣＴＣＴＴＴＣＣＴＧＡＴＣＣＡＧＴＡＣＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧＡＡＡＡＡＧＴＴＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＴＣＡＡＣＣＴＧＡＣＣＧＴＴＣＣＧＧＧＴＴＣＴＧＡＡＣＧＴＴＣＴＴＡＣＧＡＣＣＴＧＡＣＣＧＧＴＣＴＧＡＡＡＣＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＡＴＡＣＡＣＣＧＴＴＴＣＴＡＴＣＴＡＣＧＧＴＧＴＴＣＴＴＡＧＡＡＧＣＴＴＣＣＣＡＡＡＧＧＣ
【０２３０】
配列番号１７＝１３０ｍｅｒ−Ｌ１７Ａ
ＣＧＧＣＧＧＴＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＴＡＣＡＡＴＴＡＡＴＡＣＡＴＡＡＣＣＣＣＡＴＣＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＧＡＴＣＴＡＣＣＡＴＧＣＴＧ
【０２３１】
配列番号１８＝ＰＯＰ２２２ｅｘｔ
ＣＧＧ  ＣＧＧ  ＴＴＡ  ＧＡＡ  ＣＧＣ  ＧＧＣ  ＴＡＣ  ＡＡＴ  ＴＡＡ  ＴＡＣ
【０２３２】
配列番号１９＝ＬＳ１１１４
ＣＣＡ  ＡＧＡ  ＣＡＧ  ＡＣＧ  ＧＧＣ  ＡＧＡ  ＧＴＣ  ＴＴＣ  ＧＧＴ  ＡＡＣ  ＧＣＧ  ＡＧＡ  ＡＡＣ  ＡＡＣ  ＣＡＧ  ＧＴＴ  ＴＴＴ  ＣＧＧ  ＣＧＣ  ＣＧＧ  ＣＡＧ  ＣＡＴ  ＧＧＴ  ＡＧＡ  ＴＣＣ  ＴＧＴ  ＴＴＣ
【０２３３】
配列番号２０＝ＬＳ１１１５
ＣＣＧ  ＡＡＧ  ＡＣＴ  ＣＴＧ  ＣＣＣ  ＧＴＣ  ＴＧＴ  ＣＴＴ  ＧＧ
【０２３４】
配列番号２１＝ＬＳ１１１７
ＣＡＧ  ＴＧＧ  ＴＣＴ  ＣＡＣ  ＧＧＡ  ＴＴＣ  ＣＴＧ  ＧＴＡ  ＣＴＧ  ＧＡＴ  ＣＡＧ  ＧＡＡ  ＡＧＡ  ＧＴＣ  ＧＡＡ
【０２３５】
配列番号２２＝ＳＤＧ１０
ＣＡＴＧＣＧＧＴＣＴＣＴＴＣＣＧＡＡＡＡＡＧＴＴＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＴＣＧＴＣＣＴＧＡＣＣＧＴＴＣＣＧＧＧＴ
【０２３６】
配列番号２３＝ＳＤＧ２４
ＧＧＴＧＧＴＧＡＡＧＡＴＣＧＣＡＧＡＣＡＧＣＧＧＧＴＴＡＧ
【０２３７】
配列番号２４＝ＰＯＰ２２２２
ＣＧＧＣＧＧＴＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＴＡＣ
【０２３８】
配列番号２５＝ＳＤＧ２８
ＡＡＧＡＴＣＡＧＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＧＡＣＴＡＧＡＡＣＣＧＣＴＧＣＣＡＣＣＧＣＣＧＧＴＧＧＴＧＡＡＧＡＴＣＧＣＡＧＡＣ
【０２３９】
配列番号２６＝ＦＧ１２
ＧＴＧＡＣＡＣＧＧＣＧＧＴＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＴＡＣＡＡＴＴＡＡＴＡＣＡＴＡＡＣＣＣＣＡＴＣＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＧＡＴＣＴＡＣＣＡＴＧＣＴＧＣＣＧＧＣＧＣＣＧＡＡＡＡＡＣＣＴＧＧＴＴＧＴＴＴＣＴＣＧＣＧＴＴＡＣＣＧＡＡＧＡＣＴＣＴＧＣＧＣＧＴＣＴＧＴＣＴＴＧＧＡＣＣＧＣＧＣＣＧＧＡＣＧＣＧＧＣＧＴＴＣＧＡＣＴＣＴＴＴＣＣＴＧＡＴＣＣＡＧＴＡＣＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧＡＡＡＡＡＧＴＴＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＴＣＣＧＧＧＴＴＣＴＧＡＡＣＧＴＴＣＴＴＡＣＧＡＣＣＴＧＡＣＣＧＧＴＣＴＧＡＡＡＣＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＡＴＡＣＡＣＣＧＴＴＴＣＴＡＴＣＴＡＣＧＧＴＧＴＴＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＴＣＴＡＡＣＣＣＧＣＴＧＴＣＴＧＣＧＡＴＣＴＴＣＡＣＣＡＣＣＧＧＣＧＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＧＧＣＡＧＣＧＧＴＴＣＴＡＧＴＣＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＣＴＧＡＴＣＴＴＧＧＣ
【０２４０】
配列番号２７＝ＦＧ１１
ＧＴＧＡＣＡＣＧＧＣＧＧＴＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＴＡＣＡＡＴＴＡＡＴＡＣＡＴＡＡＣＣＣＣＡＴＣＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＧＡＴＣＴＡＣＣＡＴＧＣＴＧＣＣＧＧＣＧＣＣＧＡＡＡＡＡＣＣＴＧＧＴＴＧＴＴＴＣＴＣＧＣＧＴＴＡＣＣＧＡＡＧＡＣＴＣＴＧＣＧＣＧＴＣＴＧＴＣＴＴＧＧＡＣＣＧＣＧＣＣＧＧＡＣＧＣＧＧＣＧＴＴＣＧＡＣＴＣＴＴＴＣＣＴＧＡＴＣＣＡＧＴＡＣＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧＡＡＡＡＡＧＴＴＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＴＣＣＧＧＧＴＴＣＴＧＡＡＣＧＴＴＣＴＴＡＣＧＡＣＣＴＧＡＣＣＧＧＴＣＴＧＡＡＡＣＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＡＴＡＣＡＣＣＧＴＴＴＣＴＡＴＣＴＡＣＧＧＴＧＴＴＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＴＣＴＡＡＣＣＣＧＣＴＧＴＣＴＧＣＧＡＴＣＴＴＣＡＣＣＡＣＣＧＧＣＧＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＧＧＣＡＧＣＧＧＴＴＣＴＡＧＴＣＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＣＴＧＡＴＣＴＴＧＧＣ
【０２４１】
配列番号２８＝ＦＧ１０
ＧＴＧＡＣＡＣＧＧＣＧＧＴＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＴＡＣＡＡＴＴＡＡＴＡＣＡＴＡＡＣＣＣＣＡＴＣＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＧＡＴＣＴＡＣＣＡＴＧＣＴＧＣＣＧＧＣＧＣＣＧＡＡＡＡＡＣＣＴＧＧＴＴＧＴＴＴＣＴＣＧＣＧＴＴＡＣＣＧＡＡＧＡＣＴＣＴＧＣＧＣＧＴＣＴＧＴＣＴＴＧＧＡＣＣＧＣＧＣＣＧＧＡＣＧＣＧＧＣＧＴＴＣＧＡＣＴＣＴＴＴＣＣＴＧＡＴＣＣＡＧＴＡＣＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧＡＡＡＡＡＧＴＴＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＴＣＣＧＧＧＴＴＣＴＧＡＡＣＧＴＴＣＴＴＡＣＧＡＣＣＴＧＡＣＣＧＧＴＣＴＧＡＡＡＣＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＡＴＡＣＡＣＣＧＴＴＴＣＴＡＴＣＴＡＣＧＧＴＧＴＴＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＴＣＴＡＡＣＣＣＧＣＴＧＴＣＴＧＣＧＡＴＣＴＴＣＡＣＣＡＣＣＧＧＣＧＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＧＧＣＡＧＣＧＧＴＴＣＴＡＧＴＣＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＣＴＧＡＴＣＴＴＧＧＣ
【０２４２】
配列番号２９＝ＦＧ９
ＧＴＧＡＣＡＣＧＧＣＧＧＴＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＴＡＣＡＡＴＴＡＡＴＡＣＡＴＡＡＣＣＣＣＡＴＣＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＧＡＴＣＴＡＣＣＡＴＧＣＴＧＣＣＧＧＣＧＣＣＧＡＡＡＡＡＣＣＴＧＧＴＴＧＴＴＴＣＴＣＧＣＧＴＴＡＣＣＧＡＡＧＡＣＴＣＴＧＣＧＣＧＴＣＴＧＴＣＴＴＧＧＡＣＣＧＣＧＣＣＧＧＡＣＧＣＧＧＣＧＴＴＣＧＡＣＴＣＴＴＴＣＣＴＧＡＴＣＣＡＧＴＡＣＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧＡＡＡＡＡＧＴＴＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＴＣＣＧＧＧＴＴＣＴＧＡＡＣＧＴＴＣＴＴＡＣＧＡＣＣＴＧＡＣＣＧＧＴＣＴＧＡＡＡＣＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＡＴＡＣＡＣＣＧＴＴＴＣＴＡＴＣＴＡＣＧＧＴＧＴＴＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＴＣＴＡＡＣＣＣＧＣＴＧＴＣＴＧＣＧＡＴＣＴＴＣＡＣＣＡＣＣＧＧＣＧＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＧＧＣＡＧＣＧＧＴＴＣＴＡＧＴＣＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＣＴＧＡＴＣＴＴＧＧＣ
【０２４３】
配列番号３０＝ＦＧ８
ＧＴＧＡＣＡＣＧＧＣＧＧＴＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＴＡＣＡＡＴＴＡＡＴＡＣＡＴＡＡＣＣＣＣＡＴＣＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＧＡＴＣＴＡＣＣＡＴＧＣＴＧＣＣＧＧＣＧＣＣＧＡＡＡＡＡＣＣＴＧＧＴＴＧＴＴＴＣＴＣＧＣＧＴＴＡＣＣＧＡＡＧＡＣＴＣＴＧＣＧＣＧＴＣＴＧＴＣＴＴＧＧＡＣＣＧＣＧＣＣＧＧＡＣＧＣＧＧＣＧＴＴＣＧＡＣＴＣＴＴＴＣＣＴＧＡＴＣＣＡＧＴＡＣＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧＡＡＡＡＡＧＴＴＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＴＣＣＧＧＧＴＴＣＴＧＡＡＣＧＴＴＣＴＴＡＣＧＡＣＣＴＧＡＣＣＧＧＴＣＴＧＡＡＡＣＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＡＴＡＣＡＣＣＧＴＴＴＣＴＡＴＣＴＡＣＧＧＴＧＴＴＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＴＣＴＡＡＣＣＣＧＣＴＧＴＣＴＧＣＧＡＴＣＴＴＣＡＣＣＡＣＣＧＧＣＧＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＧＧＣＡＧＣＧＧＴＴＣＴＡＧＴＣＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＣＴＧＡＴＣＴＴＧＧＣ
【０２４４】
配列番号３１＝ＦＧ７
ＧＴＧＡＣＡＣＧＧＣＧＧＴＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＴＡＣＡＡＴＴＡＡＴＡＣＡＴＡＡＣＣＣＣＡＴＣＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＧＡＴＣＴＡＣＣＡＴＧＣＴＧＣＣＧＧＣＧＣＣＧＡＡＡＡＡＣＣＴＧＧＴＴＧＴＴＴＣＴＣＧＣＧＴＴＡＣＣＧＡＡＧＡＣＴＣＴＧＣＧＣＧＴＣＴＧＴＣＴＴＧＧＡＣＣＧＣＧＣＣＧＧＡＣＧＣＧＧＣＧＴＴＣＧＡＣＴＣＴＴＴＣＣＴＧＡＴＣＣＡＧＴＡＣＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧＡＡＡＡＡＧＴＴＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＴＣＣＧＧＧＴＴＣＴＧＡＡＣＧＴＴＣＴＴＡＣＧＡＣＣＴＧＡＣＣＧＧＴＣＴＧＡＡＡＣＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＡＴＡＣＡＣＣＧＴＴＴＣＴＡＴＣＴＡＣＧＧＴＧＴＴＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＴＣＴＡＡＣＣＣＧＣＴＧＴＣＴＧＣＧＡＴＣＴＴＣＡＣＣＡＣＣＧＧＣＧＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＧＧＣＡＧＣＧＧＴＴＣＴＡＧＴＣＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＣＴＧＡＴＣＴＴＧＧＣ
【０２４５】
配列番号３２  ＴｅｎｃｏｎのＦＧループ
ＫＧＧＨＲＳＮ
【０２４６】
配列番号３３＝Ｔｃｏｎ  ６
ＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＡＣＣＧＧＴＡＴＧＣＴＧＣＣＧＧＣＧＣＣＧＡＡＡＡＡＣ
【０２４７】
配列番号３４＝Ｔｃｏｎ５Ｅ８６Ｉｓｈｏｒｔ
ＧＡＧ  ＣＣＧ  ＣＣＧ  ＣＣＡ  ＣＣＧ  ＧＴＴ  ＴＡＡ  ＴＧＧ  ＴＧＡ  ＴＧＧ  ＴＧＡ  ＴＧＧ  ＴＧＡ  ＣＣＡ  ＣＣＧ  ＧＴＧ  ＧＴＧ  ＡＡＧ  ＡＴＣ  ＧＣＡ  ＧＡＣ  ＡＧ
【０２４８】
＞配列番号３５  ＣＤ８Ｗ７
ＳＱＦＲＶＳＰＬＤＲＴＷＮＬＧＥＴＶＥＬＫＣＱＶＬＬＳＮＰＴＳＧＣＳＷＬＦＱＰＲＧＡＡＡＳＰＴＦＬＬＹＬＳＱＮＫＰＫＡＡＥＧＬＤＴＱＲＦＳＧＫＲＬＧＤＴＦＶＬＴＬＳＤＦＲＲＥＮＥＧＹＹＦＣＳＡＬＳＮＳＩＭＹＦＳＨＦＶＰＶＦＬＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＧＳＧＳＧＳＤＹＫＤＤＤＤＫＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【０２４９】
＞配列番号３６  ＣＤ８Ｗ１３
ＳＱＦＲＶＳＰＬＤＲＴＷＮＬＧＥＴＶＥＬＫＣＱＶＬＬＳＮＰＴＳＧＣＳＷＬＦＱＰＲＧＡＡＡＳＰＴＦＬＬＹＬＳＱＮＫＰＫＡＡＥＧＬＤＴＱＲＦＳＧＫＲＬＧＤＴＦＶＬＴＬＳＤＦＲＲＥＮＥＧＹＹＦＣＳＡＬＳＮＳＩＭＹＦＳＨＦＶＰＶＦＬＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＧＧＧＧＳＤＹＫＤＤＤＤＫＧＧＧＧＳＨＨＨＨＨＨＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【０２５０】
＞配列番号３７  ｍＩｇＧＫシグナルペプチド
Ｍｅｔｄｔｌｌｌｗｖｌｌｌｗｖｐｇｓｔｇ
【０２５１】
＞配列番号３８  ヒトＦｃ
Ｄｋｔｈｔｃｐｐｃｐａｐｅｌｌｇｇｐｓｖｆｌｆｐｐｋｐｋｄｔｌｍｉｓｒｔｐｅｖｔｃｖｖｖｄｖｓｈｅｄｐｅｖｋｆｎｗｙｖｄｇｖｅｖｈｎａｋｔｋｐｒｅｅｑｙｎｓｔｙｒｖｖｓｖｌｔｖｌｈｑｄｗｌｎｇｋｅｙｋｃｋｖｓｎｋａｌｐａｐｉｅｋｔｉｓｋａｋｇｑｐｒｅｐｑｖｙｔｌｐｐｓｒｄｅｌｔｋｎｑｖｓｌｔｃｌｖｋｇｆｙｐｓｄｉａｖｅｗｅｓｎｇｑｐｅｎｎｙｋｔｔｐｐｖｌｄｓｄｇｓｆｆｌｙｓｋｌｔｖｄｋｓｒｗｑｑｇｎｖｆｓｃｓｖｍｈｅａｌｈｎｈｙｔｑｋｓｌｓｌｓｐｇｋ
【０２５２】
＞配列番号３９  リンカー配列
Ｇｇｇｇｓｄｙｋｄｄｄｄｋｇｇｇｇｓｈｈｈｈｈｈ
【０２５３】
【表２１】
2020513744.tif 000024
【０２５４】
【表２２】
2020513744.tif 000025
【０２５５】
【表２３】
2020513744.tif 000026
【０２５６】
【表２４】
2020513744.tif 000027
【０２５７】
【表２５】
2020513744.tif 000028
【０２５８】
【表２６】
2020513744.tif 000029
【０２５９】
【表２７】
2020513744.tif 000030
【０２６０】
【表２８】
2020513744.tif 000031
【０２６１】
【表２９】
2020513744.tif 000032
【０２６２】
【表３０】
2020513744.tif 000033
【０２６３】
【表３１】
2020513744.tif 000034
【０２６４】
【表３２】
2020513744.tif 000035
【０２６５】
配列番号２７０  Ｔｅｎｃｏｎ２５
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＫＧＧＨＲＳＮＰＬＳＡＩＦＴＴ
【０２６６】
配列番号２７１  カニクイザルＣＤ８アルファ
ＭＲＮＱＡＰＧＲＰＫＧＡＴＳＰＰＰＬＰＴＧＳＲＡＰＰＶＡＰＥＬＲＡＥＰＲＰＧＥＲＶＭＡＰＰＶＴＡＬＬＬＰＬＶＬＬＬＨＡＡＲＰＮＱＦＲＶＳＰＬＧＲＴＷＮＬＧＥＴＶＥＬＫＣＱＶＬＬＳＮＰＴＳＧＣＳＷＬＦＱＰＲＧＴＡＡＲＰＴＦＬＬＹＬＳＱＮＫＰＫＡＡＥＧＬＤＴＱＲＦＳＧＫＲＬＧＤＴＦＶＬＴＬＲＤＦＲＱＥＮＥＧＹＹＦＣＳＡＬＳＮＳＩＭＹＦＳＨＦＶＰＶＦＬＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＴＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＳＶＮＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＡＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＮＨＲＮＲＲＲＶＣＫＣＰＲＰＶＶＫＳＧＧＫＰＳＬＳＤＲＹＶ
【図１】
2020513744.tif 000036
【図２】
2020513744.tif 000037
【図３】
2020513744.tif 000038
【図４】
2020513744.tif 000039
【図５】
2020513744.tif 000040
【図６】
2020513744.tif 000041
【図７】
2020513744.tif 000042
【図８】
2020513744.tif 000043
【図９】
2020513744.tif 000044
【図１０】
2020513744.tif 000045
【図１１】
2020513744.tif 000046
【図１２】
2020513744.tif 000047
【図１３】
2020513744.tif 000048
【図１４】
2020513744.tif 000049
【図１５Ａ】
2020513744.tif 000050
【図１５Ｂ】
2020513744.tif 000051
【図１６】
2020513744.tif 000052
【図１７】
2020513744.tif 000053
【図１８】
2020513744.tif 000054
【図１９】
2020513744.tif 000055
【配列表】
2020513744000001.app
【国際調査報告】
2020513744.tif 000056
2020513744.tif 000057
2020513744.tif 000058