(57)【要約】本発明は、ワクチンを投与することによりブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）による感染からブタを保護する方法で使用するための、ブタサーコウイルス２のＯＲＦ２にコードされたタンパク質および薬学的に許容される担体を含むワクチンに関する。ワクチンは、用量あたり２０μｇ未満のＯＲＦ２コードタンパク質を含み、該タンパク質は遺伝子型２ｂのブタサーコウイルスのものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブタにワクチンを投与することにより該ブタをブタサーコウイルス２（ＰＣＶ２）による感染から保護する方法において使用するための、ブタサーコウイルス２のＯＲＦ２にコードされたタンパク質及び薬学的に許容される担体を含むワクチンであって、ここで、該ワクチンが用量あたり２０μｇ未満のＯＲＦ２にコードされたタンパク質を含み、該タンパク質が遺伝子型２ｂのブタサーコウイルスのものであることを特徴とする前記ワクチン。
【請求項２】
ワクチンが、用量あたり５μｇ未満を含むことを特徴とする、請求項１に記載の使用のためのワクチン。
【請求項３】
ワクチンが、抗ＰＣＶ２抗体を有するブタにおいて使用するためのものであることを特徴とする、請求項１又は２に記載された使用のためのワクチン。
【請求項４】
ワクチンが、母ブタ由来の抗ＰＣＶ２抗体を有するブタにおいて使用するためのものであることを特徴とする、請求項１乃至３のいずれか一項に記載された使用のためのワクチン。
【請求項５】
ワクチンが、４週齢以下のブタにおいて使用するためのものであることを特徴とする、請求項１乃至４のいずれか一項に記載された使用のためのワクチン。
【請求項６】
ワクチンが、ワクチンの単回投与の後に保護を提供することを特徴とする、請求項１乃至５のいずれか一項に記載された使用のためのワクチン。
【請求項７】
ワクチンが、ブタがチャレンジＰＣＶ２ウイルスに相同なＰＣＶ２のＯＲＦ２にコードされたタンパク質でワクチン接種された場合に与えられる保護に対応するレベルで、異種遺伝子型のＰＣＶ２に対する保護を提供することを特徴とする、請求項１乃至６のいずれか一項に記載された使用のためのワクチン。
【請求項８】
ワクチンが、ブタがＰＣＶ２ｄのＯＲＦ２にコードされたタンパク質でワクチン接種された場合に与えられる保護に対応するレベルで、遺伝子型２ｄのＰＣＶ２に対する保護を提供することを特徴とする、請求項１乃至７のいずれか一項に記載された使用のためのワクチン。
【請求項９】
ブタサーコウイルス２（ＰＣＶ２）のＯＲＦ２にコードされたタンパク質及び薬学的に許容される担体を含むワクチンであって、ＯＲＦ２にコードされたタンパク質がブタサーコウイルス遺伝子型２ｂのものであり、ここで、該ワクチンが、用量あたり２０μｇ未満のＯＲＦ２にコードされたタンパク質を含むことを特徴とする、前記ワクチン。
【請求項１０】
ワクチンが、用量あたり５μｇ未満を含むことを特徴とする、請求項９に記載の使用のためのワクチン。
【請求項１１】
ブタサーコウイルス２（ＰＣＶ）のＯＲＦ２にコードされたタンパク質及び薬学的に許容される担体を含むワクチンをブタに投与することにより該ブタをブタサーコウイルス２による感染から保護する方法であって、該ワクチンが用量あたり２０μｇ未満のＯＲＦ２にコードされたタンパク質を含み、該タンパク質が遺伝子型２ｂのブタサーコウイルスのものであることを特徴とする、前記方法。
【請求項１２】
ワクチンが、用量あたり５μｇ未満を含むことを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ワクチンが、ＰＣＶ２に対する抗体、特に母親由来の抗体を有するブタを保護するためのものであることを特徴とする、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
ワクチンの単一用量を投与して前記保護に達することを特徴とする、請求項１１乃至１３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、ブタサーコウイルス２型による感染からブタを保護するためのワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
２型ブタサーコウイルス（ＰＣＶ２）は経済的に重要なブタ病原体であり、小さいながらもＤＮＡウイルスの中で最も進化率が高い。１９９０年代後半のＰＣＶ２の発見以来、１．７ ｋｂの１本鎖ＤＮＡゲノムと２つの不可欠な遺伝子（ORF１およびＯＲＦ２）を備えたこの最小限のウイルスは、最も重要なブタ病原体の１つになり、現在では、世界のブタの生産において、ワクチンの形で予防的処置が最も多く行われている。ＰＣＶのＯＲＦ２遺伝子はこのウイルスのカプシドタンパク質をコードし、そのタンパク質の全長が約２３３アミノ酸であるタンパク質である。すべてのＰＣＶ２分離株のＯＲＦ２遺伝子は、９１〜１００％のヌクレオチド配列同一性と９０〜１００％の推定アミノ酸配列同一性を有している。ＰＣＶ２は現在、ＰＣＶ２aからＰＣＶ２ｅまでの５つの異なる遺伝子型に分類できる(Ｋａｒｕｐｐａｎｎａｎ ａｎｄ Ｏｐｒｉｅｓｓｎｉｇ ｉｎ Ｖｉｒｕｓｅｓ ２０１７, ９, ９９)。ＰＣＶ２は進化し続けており、これは遺伝子型の有病率の変化に反映されていることが十分に報告されている。２００６年に、ＰＣＶ２ｂの市販ワクチンが、主にＰＣＶ２ｂに感染したブタ集団に大規模に導入された。２０１２年以降、ＰＣＶ２ｄ遺伝子型が、北米で以前に優勢だったＰＣＶ２ｂ遺伝子型に本質的に置き換わり、同様の傾向は中国や韓国などの他の地理的地域でも実証されている。これは、このウイルスが発見されて以来２番目の主要なＰＣＶ２遺伝子型の変化である。出現したＰＣＶ２遺伝子型において毒性の潜在的な増加およびＰＣＶ２ｄ遺伝子型ウイルスに対するＰＣＶ２ａ遺伝子型に由来する現在のワクチンの有効性が、かなりの注目を受けている。ＰＣＶ２ウイルスの感染を例外なく保護するワクチンは、ＰＣＶ２のＯＲＦ２遺伝子に基づいており、対象動物への投与後に対応するタンパク質を提供するＤＮＡまたはＲＮＡ材料を含むか、ＯＲＦ２遺伝子にコードされたタンパク質（例えば、完全長タンパク質、１以上の短縮型またはそれらの混合物）を含むか、あるいは完全なウイルスを含み、したがって本質的にカプシドタンパク質を含んでいる。当分野において、ＰＣＶ２に対するワクチンがいくつか市販されている。Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＣＶ（ＭＳＤ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  オランダボクスメールから入手可能）は、２型ブタサーコウイルからブタを保護するためのワクチンであり、３週齢以降のブタで使用される。２ショット（２用量）ワクチンとして投与された場合、免疫期間（ＤＯＩ）は２２週間であり、ブタの肥育期間をほぼ完全にカバーする。ＩｎｇｅｌｖａｃＣｉｒｃｏＦｌｅｘ（登録商標）（ベーリンガーインゲルハイム  インゲルハイムから入手可能）は、２週齢以上のブタで使用するためのブタサーコウイルス２型からブタを保護するためのワクチンである。ワンショット（１用量）ワクチンとしてのみ登録されている。Ｃｉｒｃｏｖａｃ（登録商標）（フランスリヨンのＭｅｒｉａｌから入手可能）は、２型ブタサーコウイルスからブタを保護するためのワクチンであり、３週齢以上の豚で使用される。Ｓｕｖａｘｙｎ（登録商標）ＰＣＶ（オランダ、Ｚｏｅｔｉｓ，  Ｃａｐｅｌｌｅ  ａ/ｄ  ＩＪｓｓｅｌから入手可能）は、２型ブタサーコウイルス��らブタを保護するためのワクチンであり、３週齢以降のブタで使用する。他のＰＣＶ２ワクチンが例えばＷＯ２００７／０２８８２３、ＷＯ ２００７／０９４８９３ 及びＷＯ２００８／０７６９１５に記載されている。
【０００３】
上記の最近の総説論文（Ｖｉｒｕｓ２０１７）は、ＰＣＶ２生物学、抗原の変動性に関する実験的研究、ＰＣＶ２遺伝子型およびＰＣＶ２ワクチンの進化の分子疫学的分析に関する現在の知識を要約している。後者に関しては、同種保護は異種保護よりも優れている可能性があると述べられている。 交差保護に関して、「対照実験研究およびフィールド試験では、ＰＣＶ２ａベースのワクチン［Ｐｏｒｃｉｎｉｓ ＰＣＶやＣｉｒｃｏＦＬＥＸなど]およびＰＣＶ２ｂベースのワクチンが、ＰＣＶ２ａ、ＰＣＶ２ｂおよびＰＣＶ２ｄ遺伝子型ウイルスのチャレンジによる臨床疾患に対する適切な交差保護を与え、１日の平均体重増加を改善することを示している」と結論付けている（５ページ２９行目から３２行目）。したがって、各遺伝子型に交差保護が適切であると一般に理解されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２００７／０２８８２３号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００７／０９４８９３号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２００８／０７６９１５号パンフレット
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｋａｒｕｐｐａｎｎａｎ ａｎｄ Ｏｐｒｉｅｓｓｎｉｇ ｉｎ Ｖｉｒｕｓｅｓ ２０１７, ９, ９９
【発明の概要】
【０００６】
本発明の目的
ＰＣＶ２の感染に対する保護のための改善されたワクチンを提供することが目的である。
【０００７】
発明の概要
本発明の目的を満たすために、ＯＲＦ２にコードされたブタサーコウイルス２（ＰＣＶ２）のタンパク質と薬学的に許容される担体を含むワクチンが考案され、このワクチンはブタにワクチンを投与することにより、２型ブタサーコウイルスによる感染からブタを保護する方法で使用するためのものであって、ここで、このワクチンは、用量あたり２０μｇ未満のＯＲＦ２にコードされたタンパク質（例えば、全長タンパク質、１以上の短縮型またはそれらの混合物）を含み、タンパク質は遺伝子型２ｂのブタサーコウイルスのものである。用量当たり、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１μｇの任意の用であり得る。
【０００８】
驚いたことに、Ｖｉｒｕｓ ２０１７に反映されている現在の知識に反して、ＯＲＦ２にコードされるタンパク質（以後、「ＯＲＦ２タンパク質」ともいう）の２０μｇ未満の用量で、市場を支配するワクチン（すなわち、ＭＳＤ Ａｎｉｍａｌ ＨｅａｌｔｈのＰｏｒｃｉｌｉｓ ＰＣＶおよびＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ ＩｎｇｅｌｈｅｉｍのＣｉｒｃｏＦＬＥＸ）を含むほとんどの市販ワクチンに含まれる遺伝子型２ａのＯＲＦ２タンパク質と比較して、ＰＣＶ２遺伝子型２ｂに由来するタンパク質が著しく優れた交差保護を提供することが確認された。２０μｇを超えると、交差保護に違いは見られない。Ｐｏｒｃｉｌｉｓ ＰＣＶとＣｉｒｃｏＦＬＥＸの両方には１用量あたり２０μｇをはるかに超えるレベルが含まれているので、このことは両方のワクチンが異種チャレンジに対する保護に奏功する理由を説明している。しかし、ＰＣＶ２ｂのＯＲＦ２タンパク質を使用すると、ワクチン中の抗原の量を減らしつつも、適切な交差保護を可能にする機会が得られる。これは、経済的な観点から役立つだけでなく、調製済み（ｒｅａｄｙ-ｔｏ-ｕｓｅ）混合ワクチンの抗原間の干渉を回避し、また、皮内ワクチン接種のようなワクチン量が少ないワクチン接種戦略に非常に適切であり得る。
【０００９】
用量あたりのＯＲＦ２コードタンパク質の最小量は、ＰＣＶ２の感染に対する保護免疫が依然として得られる量である。この量は、通常の実験で特定可能であり、とりわけ必要な保護レベルに依存している。現在のワクチンについては、ワクチン中のＯＲＦ２タンパク質の最小保護量に関する現在のデータおよび先行技術に基づいて（特にＷＯ２００６／０７２０６５を参照）、最小量は投与当たり抗原０．２μｇであると考えられているが、投与あたり０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０μｇのようなより高い投与量でもかまわない。
【００１０】
本発明は、ワクチン自体およびこのワクチンをブタに投与することにより２型ブタサーコウイルスによる感染からブタを保護する方法にも関することに留意されたい。
【００１１】
定義
ワクチンは、対象動物に安全に投与できる医薬組成物であり、病原性微生物に対するその動物の保護免疫を誘導すること、すなわち、微生物による感染に対して成功裏に保護を誘導することができる。
【００１２】
薬学的に許容される担体は、生体適合性媒体、即ち、投与後に、対象動物に重大な有害反応を誘発せず、ワクチン投与後に抗原を宿主動物の免疫系に提示できる媒体である。そのような薬学的に許容される担体は、例えば、水および／または他の生体適合性溶媒を含む液体、または（糖および/またはタンパク質に基づく）凍結乾燥ワクチンを得るために一般的に使用されるような固体担体であり得て、場合により免疫刺激剤（アジュバント）を含んでいてもよい。必要に応じて、安定剤、粘度調整剤、または他の成分のような他の物質が、対応するワクチンの使用目的または必要な特性に応じて追加される。
【００１３】
微生物による感染に対する保護とは、当該微生物による感染あるいは感染から生じる疾患の予防、改善または治癒を助け、例えば、病原体による感染に関連する１以上の臨床徴候を予防または軽減することである。
【００１４】
単回投与後に保護を提供するワクチンとは、ワクチンを１回接種しただけで保護免疫が付与されることを意味し、したがって、この保護免疫に到達するために追加免疫ワクチン接種は必要ない。２ショット療法では、最初の（初回）ワクチン接種は、典型的には最初の投与から６週間以内、通常は最初の投与から３週間または２週間以内に追加免疫され、２回目（追加）投与保護免疫がなされた場合のみ、上記で定義されているように、成功裏に保護が得られると理解される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ＰＣＶ２ａチャレンジ後の動物からサンプリングした腸間膜リンパ節、扁桃腺リンパ節及び鼠径部リンパ節におけるＩＨＣスコアを示す。
【図２】ＰＣＶ２ｄチャレンジ後の動物からサンプリングした腸間膜リンパ節、扁桃腺リンパ節及び鼠径部リンパ節におけるＩＨＣスコアを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
第１の実施形態では、ワクチンは用量あたり抗原５μｇ未満を含む。ＰＣＶ２ｂ遺伝子型ＯＲＦ２タンパク質では、ＯＲＦ２タンパク質の完全用量である８０μｇの１／１６用量を含むワクチンでも適切な交差保護が得られることが示されている。
【００１７】
第２の実施形態では、ワクチンは、抗ＰＣＶ２抗体を有するブタで使用するためのものである。極めて驚くべきことに、２０μｇ未満の用量の遺伝子型２ｂのＯＲＦ２タンパク質で、ＰＣＶ２に対する保護免疫が得られることが確証された。従来技術、例えばＥＰ１９２６４９６からは、遺伝子型２ａのＯＲＦ２タンパク質で血清陽性の子豚を十分に保護するためには、２０μｇを超える用量が必要であることが知られている。事実、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ ＰＣＶやＣｉｒｃｏＦＬＥＸなどの商業的に成功したＰＣＶ２ワクチンは、２０μｇをはるかに超える用量で投与されている。したがって、本発明は、抗ＰＣＶ２抗体が母体由来であっても、用量あたり２０μｇ未満のＯＲＦ２タンパク質を使用する選択肢を提供する。
【００１８】
別の実施形態では、ワクチンは、４週齢以下のブタで使用するためのものである。５〜１０週齢の最も重要な時期に適切な保護を得るためには、この若い年齢では母体抗体の干渉があり得るにもかかわらず、４週齢前のワクチン接種が適切であることがわかっている。
【００１９】
さらに別の実施形態では、ワクチンは、単回投与後に保護を提供する。驚くべきことに、遺伝子型ＰＣＶ２ａのＯＲＦ２タンパク質では、ＰＣＶ２ウイルスによる異種チャレンジに対する保護を提供することができなかったのにもかかわらず、遺伝子型ＰＣＶ２ｂのＯＲＦ２タンパク質を含むワクチンは、単回投与で、１用量あたり５μｇという非常に低いレベルで適切な交差保護を提供できることが確証された。
【００２０】
さらに別の実施形態では、ワクチンは、ブタがチャレンジＰＣＶ２ウイルスに一致するＰＣＶ２のＯＲＦ２にコードされたタンパク質でワクチン接種された場合に与えられる保護に対応するレベルで、異種遺伝子型（すなわちＰＣＶ２ａ、ＰＣＶ２ｃ、ＰＣＶ２ｄまたはPVC２eのいずれか）のＰＣＶ２に対する保護を提供する。
【００２１】
さらに別の実施形態では、ワクチンは、ブタがＰＣＶ２ｄのＯＲＦ２にコードされたタンパク質でワクチン接種された場合に付与される保護に対応するレベルで、遺伝子型２ｄのＰＣＶ２に対する保護を提供する。
【００２２】
ここで、以下の非限定的な例を使用して本発明をさらに説明する。
【００２３】
実施例１では、サンプル中のＯＲＦ２タンパク質の量を測定する方法について説明する。
実施例２では、ＰＣＶ２ａ、２ｂおよび２ｄのＯＲＦ２タンパク質の交差保護の確立について説明する。
【００２４】
図１は、ＰＣＶ２ｂチャレンジ後のＩＨＣスコアを概略的に示している。
図２は、ＰＣＶ２ｄチャレンジ後のＩＨＣスコアを概略的に示している。
【実施例】
【００２５】
実施例１：サンプル中のＯＲＦ２タンパク質の量を測定する方法
ＯＲＦ２にコードされるタンパク質の量は、当該技術分野で既知のいずれかの方法により決定され得る。ＥＰ１９２６４９６は、実施例４において、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびクーマシーブリリアントブルーによる着色に基づく一般的な方法を記載している。サンプルのタンパク質含有量を測定するこのタイプの方法は広く知られており、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、２００２年９月第２版、ＪＭ Ｗａｌｋｅｒ編（ニュージャージー州トトワ、Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ社）の第２章第２３７−２４２頁に記載されている。完全長タンパク質の長さは約２６〜２７ｋＤａである。一般的な短縮型は通常２〜４ ｋＤａ短くなる。必要と思われる場合（たとえば、サンプルに同等の長さの他のタンパク質も存在する場合）、ＯＲＦ２タンパク質の正しいバンドは、標識抗体を使用して視覚化できる抗ＯＲＦ２抗体を使用して特定できる。
【００２６】
別の方法では、精製されたＯＲＦ２タンパク質を標準として使用する多重反応モニタリング（ＭＲＭ）質量分析により、ＯＲＦ２にコードされたタンパク質の量（全長タンパク質およびその短縮型も検出可能）が確認される。この方法においては、タンパク質は最初に例えばトリプシンを使用して消化される。その後、例えば液体クロマトグラフィーを使用してペプチドを分離し、次にシグナルの変動を正規化するために、ペプチドをシグナルペプチド（この場合「ＶＥＦＷＰＣＳＰＩＴＱＧＤＲ」）を使用して質量分析にかける。観察されたシグナルペプチドは、トリプシンで消化されたＰＣＶ２ＯＲＦ２に特有のものである。この方法の詳細な説明は、ＥＰ １９２６４９６に対する異議申立てにおいて、Ｈｏｆｆｍａｎｎ Ｅｉｔｌｅが代表するＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ Ｖｅｔｍｅｄｉｃａ ＧｍｂＨが２０１６年８月２３日に文書「Ｄ６０」として欧州特許庁に送付したＭｅｒｉｌｌ Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ博士の宣言に記載されている。
【００２７】
これらの方法をＰｏｒｃｉｌｉｓ ＰＣＶおよびＣｉｒｃｏＦＬＥＸに適用すると、ＯＲＦ２にコードされたタンパク質の量が１用量あたり２０μｇをはるかに超えることがわかる。
【００２８】
実施例２：ＰＣＶ２ａ、２ｂ、２ｄのＯＲＦ２タンパク質の交差保護の確認
当技術分野で知られているように、既存のワクチンの１００％レベルで、ＰＣＶ２ａおよび他の遺伝子型のＯＲＦ２タンパク質は、すべて同等のレベルで適切な交差保護を提供する。以下の実験では、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ ＰＣＶに対応するワクチンを使用し、完全（「１００％」）用量のワクチンと比較して４倍（「２５％」バージョン）または１６倍（「６.２５％」バージョン）に希釈した。ワクチンは、ＥＰ１９２６４９６の教示に沿って、ＯＲＦ２にコードされるタンパク質の完全用量である約８０μｇを有するように調製した。
【００２９】
この試験は、ＰＣＶ２ｂおよびＰＣＶ２ｄチャレンジに対するさまざまなＰＣＶ２株（ＰＣＶ２ａ、ＰＣＶ２ｂおよびＰＣＶ２ｄ）を含む家畜用ワクチンの有効性を評価するために行われ、特に 交差保護特性を評価する際に、低用量で特定の遺伝子型のＯＲＦ２タンパク質に対する選好性があるかどうかを調査するために実施された。
【００３０】
この試験では、各実験に７０匹の動物を用いる２つの別々の実験を実施した。１４０頭の動物は１４頭の雌豚に由来し、それぞれ１０頭の１４の処置群に割り当てられた。子豚は、低値から非常に高い値までに及ぶ範囲の検出可能なレベルの抗ＯＲＦ２抗体を有し、すべての動物の平均値は両方の実験で実質的に同じであった（ワクチン接種時に約５．８）。子豚は、約３週齢のときに２ ｍｌで筋肉内にワクチン接種された。７０匹の動物からなる各実験で、グループ１から６に、以下のようにＯＲＦ２にコードされたＰＣＶ２の濃度が異なり、そして、株のＰＣＶ２遺伝子型が異なるＰＣＶ２ワクチンを接種した。
【００３１】
実験１
グループ１の子豚にＰＣＶ２ａ株の２５％用量（約２０μｇ）をワクチン接種した。
グループ２の子豚にＰＣＶ２ａ株の６．２５％用量（約５μｇ）をワクチン接種した。
グループ３の子豚にＰＣＶ２ｂ株の２５％用量（約２０μｇ）をワクチン接種した。
グループ４の子豚にＰＣＶ２ｂ株の６．２５％用量（約５μｇ）をワクチン接種した。
グループ５の子豚にＰＣＶ２ｄ株の２５％用量（約２０μｇ）をワクチン接種した。
グループ６の子豚にＰＣＶ２ｄ株の６．２５％用量（約５μｇ）をワクチン接種した。
対照グループ７の子豚にはワクチン接種しなかった。
【００３２】
実験２
グループ１の子豚にＰＣＶ２ａ株の２５％用量（約２０μｇ）をワクチン接種した。
グループ２の子豚にＰＣＶ２ａ株の６．２５％用量（約５μｇ）をワクチン接種した。
グループ３の子豚にＰＣＶ２ｂ株の２５％用量（約２０μｇ）をワクチン接種した。
グループ４の子豚にＰＣＶ２ｂ株の６．２５％用量（約５μｇ）をワクチン接種した。
グループ５の子豚にＰＣＶ２ｄ株の２５％用量（約２０μｇ）をワクチン接種した。
グループ６の子豚にＰＣＶ２ｄ株の６．２５％用量（約５μｇ）をワクチン接種した。
対照グループ７の子豚にはワクチン接種しなかった。
【００３３】
ワクチン接種の２週間後、すべての動物をＩｎｔｅｒｖｅｔ ＩｎｔｅＲＮＡｔｉｏｎａｌ Ｂ．Ｖ.チャレンジ施設に輸送した。ワクチン接種の３週間後（６週齢）、５．０ ｌｏｇ１０ ＴＣＩＤ５０／ｍｌの野生型ＰＣＶ２ｂチャレンジウイルス株（実験１）または野生型ＰＣＶ２ｄ株（実験２）を使用して鼻孔あたり３ｍｌで鼻腔内に適用してすべての動物にチャレンジした。チャレンジの３週間後に、全ての動物の解剖を行い、腸間膜リンパ節、扁桃腺および鼠径部リンパ節をサンプリングし、０（特異的陽性染色なし）から３（リンパ濾胞の５０％以上が陽性染色の細胞を含む）の範囲のスコアリングを使用して、免疫組織化学（ＩＨＣ）分析によりＰＣＶ２ウイルスを検出した。
【００３４】
結果を図１および２に示す。図１から明らかなように、ＰＣＶ２ｂワクチンの同種保護は、予想どおり、異種保護よりも優れている。 ＰＣＶ２ａは、ＰＣＶ２ｄよりもＰＣＶ２ｂに対してわずかに優れた交差保護を提供するようであるが、最低用量では差はない。
【００３５】
驚くべきことに、図２に示すように、ＰＣＶ２ｂのＯＲＦ２にコードされたタンパク質は、テストされた低用量で、ＰＣＶ２ｄのＯＲＦ２にコードされたタンパク質の同種保護と同じレベルで異種保護を提供する。これは、試験した低用量であまり良好な保護を提供しないＰＣＶ２ａのＯＲＦ２でコードされたタンパク質によって提供される異種保護とは対照的である。したがって、ＰＣＶ２ａおよびＰＣＶ２ｂ遺伝子型のＯＲＦ２タンパク質が同等レベルの交差保護を提供するという一般的な認識とは対照的に、ＰＣＶ２に対するＭＤＡを効果的に突破するために必要な用量として知られている２０μｇ（ＥＰ １９２６４９６を参照）未満では、ＰＣＶ２ｂのＯＲＦ２にコードされたタンパク質は、ＰＣＶ２ａのＯＲＦ２にコードされたタンパク質よりも大幅に優れた交差保護を提供するようである。また、ＭＤＡの存在にもかかわらず、特にＰＣＶ２ｂのＯＲＦ２にコードされたタンパク質を使用する場合、これらの低用量レベルでの対照群とは対照的に、適切な保護に到達することができる。
【図１】
2020529407.tif 000002
【図２】
2020529407.tif 000003
【国際調査報告】
2020529407.tif 000004
2020529407.tif 000005
2020529407.tif 000006