(57)【要約】本発明は、エンドリシン活性およびSEQ ID No.1に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドならびにその断片または誘導体に関する。さらに、本発明は、該ポリペプチドをコードする核酸分子、該核酸分子を含むベクター、および該核酸分子または該ベクターのいずれかを含む宿主細胞に関する。加えて、本発明は、医薬として、特にグラム陰性細菌感染症を治療または予防するための医薬として、診断手段として、化粧用物質として、または消毒剤として使用するための、該ポリペプチドに関する。本発明は、食料品の、食品加工機器の、食品加工工場の、食料品と接触する表面の、医療装置の、病院および診療所における表面の細菌汚染、特にグラム陰性細菌の汚染を処置または予防するための該ポリペプチドの使用にも関する。さらに、本発明は、該ポリペプチドを含む薬学的組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
SEQ ID No.1に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその断片もしくは誘導体。
【請求項２】
前記断片がSEQ ID No.3に記載のアミノ酸配列を含む、請求項1記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記誘導体が、SEQ ID No.1、3、5、6および／または7に記載のアミノ酸配列中に欠失、付加、挿入、および／または置換を有する、請求項1または2記載のポリペプチド。
【請求項４】
N末端またはC末端で、膜またはLPSを破壊する活性を有するペプチドストレッチに融合している、請求項1〜3のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項５】
タグ、好ましくはHis6タグをさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項６】
エンドリシン活性を有する、前記請求項のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項７】
請求項1〜6のいずれか一項記載のポリペプチドをコードする、単離核酸分子。
【請求項８】
請求項7記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項９】
請求項7記載の核酸分子または請求項8記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１０】
手術または療法によってヒトまたは動物の体を治療する方法およびヒトまたは動物の体に対して行われる診断方法で、使用するための、請求項1〜6のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項１１】
食品、飼料における、もしくは化粧品における抗菌剤としての、または殺菌剤としての、請求項1〜6のいずれか一項記載のポリペプチドの使用。
【請求項１２】
グラム陰性細菌感染症を治療または予防するための方法で使用するための、請求項1〜6のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項１３】
食料品の、食品加工機器の、食品加工工場の、食料品と接触する表面の、飼料の、飼料加工機器の、飼料加工工場の、飼料と接触する表面の、医療装置の、病院および診療所における表面のグラム陰性細菌汚染を処置または予防するための、請求項1〜6のいずれか一項記載のポリペプチドの使用。
【請求項１４】
請求項1〜6のいずれか一項記載のポリペプチドおよび薬学的に許容される希釈剤または賦形剤を含む、薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、エンドリシン活性およびSEQ ID No.1に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドならびにその断片または誘導体に関する。さらに、本発明は、該ポリペプチドをコードする核酸分子、該核酸分子を含むベクター、および該核酸分子または該ベクターのいずれかを含む宿主細胞に関する。加えて、本発明は、医薬として、特にグラム陰性細菌感染症を治療もしくは予防するための医薬として、診断手段として、化粧用物質として、または消毒剤として使用するための、該ポリペプチドに関する。本発明は、食料品の、食品加工機器の、食品加工工場の、食料品と接触する表面の、医療装置の、病院および診療所における表面の細菌汚染、特にグラム陰性細菌の汚染を処置または予防するための、該ポリペプチドの使用にも関する。さらに、本発明は、該ポリペプチドを含む薬学的組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
細菌性病原体によって引き起こされる命に関わるヒト感染症は、部分的には抗生物質への耐性の増大が理由で、現在再出現している。グラム陰性細菌は、薬物耐性病原体の顕著な部分に相当し、感染性疾患によって引き起こされる罹患率および死亡率の増加につながる、公衆衛生の主な脅威になっている。多くの取り組みが提唱されたが、そうであっても、多剤耐性グラム陰性細菌の割合は依然として世界中で上昇しており、ますます大きな問題になってきている。グラム陽性細菌で起こったこととは対照的に、多剤耐性グラム陰性細菌用に特に開発された新しい活性抗生物質は不足しているかまたは存在しないことさえあり、その結果、汎薬剤耐性単離菌、すなわち利用可能なすべての抗生物質に耐性がある細菌に分類される、臨床試料および環境中で単離されるグラム陰性生物の数が、現在増加している。
【０００３】
グラム陰性の細胞壁は、大抵の抗菌剤にとって大きな障害物である外膜によって構成される。若干の例外はあるものの、外膜は、リン脂質の非対称性膜（内葉）、リポ多糖（LPS）（外葉）、ならびにタンパク質、例えば拡散チャネルとして働くポリン、およびペプチドグリカンに共有結合し内葉に固着しているリポタンパク質からなる。LPSは外膜の主要な成分であり、多くの外部作用物質に対する透過性障壁を細菌に提供する。LPSは、優勢な環境条件に応じて変わり得る非常に多様な構造である（Nikaido, 2003）。3つの異なる領域が、それらの化学構造、生合成、遺伝的特質および機能に従って区別され得る：（i）リピドA成分、（ii）コア領域、および（iii）O特異的多糖またはO側鎖としても公知である、O抗原。LPSは、ラフ（R型、O抗原なし）、スムース（S型、O抗原あり）、または混合（SR型）で提供され得る。全体的な外膜の完全性は、2つの主な安定化力、すなわち、LPSカチオン結合部位（イオン性相互作用）とリピドAアシル鎖基の高密度疎水性スタッキング（疎水性相互作用）とによって維持され、抗菌剤に対する天然の障壁としての効率的な拡散障壁機能として作用する。したがって、グラム陰性細菌に対して活性な新しい抗菌剤の必要性がある。
【０００４】
「酵素」と「抗生物質」の混成用語である「エンザイバイオティクス（enzybiotics）」として使用されるエンドリシンは、この必要性を完全に満たした。エンドリシンは、すべての二本鎖DNAバクテリオファージにコードされる、特殊化したペプチドグリカン分解酵素である（Young et al., Trends Microbiol. 2000 Mar;8(3):120-128）。エンドリシン媒介性作用は、バクテリオファージの複製サイクルの終わりに細菌のペプチドグリカン（PG）層を分解しかつ損なうように、他のタンパク質によって調整および調節される事象である。それらの活性とそれが加水分解する結合とに応じて、エンドリシンを異なるクラスに分けることができる：（i）N−アセチルグルコサミン（GlcNAc）の還元末端でまたはN−アセチルムラミン酸（MurNAc）の還元末端で、グリカン成分を切断する、グリコシダーゼ；（ii）溶解性トランスグリコシダーゼと同じグリカン標的を有するが異なる最終産物を産み出す、N−アセチル−β−D−ムラミダーゼ（リゾチームまたはムラミダーゼと呼ばれることが多い）；（iii）MurNAcとL−アラニンの間の重要なアミド結合の加水分解を触媒し、ステムペプチドからグリカン鎖を分離する、アミダーゼ；ならびに（iv）細胞壁を架橋するステムペプチド中のLD結合およびDD結合を攻撃する、異なるクラスのエンドペプチダーゼおよびカルボキシペプチダーゼ。
【０００５】
エンドリシンの潜在力は長い間公知であったが、その抗菌的使用は、抗生物質の成功および優位性によって影が薄かった。警戒すべき抗生物質耐性細菌の出現の理由だけから、科学界およびビジネス関係者は、代替療法として、エンドリシンへの関心を復活させた。2001年に最初のエンドリシンの研究によって、14種の他の共生連鎖球菌を無傷で残したままA群、C群、およびE群の連鎖球菌（streptococci）を数秒で破壊するという優れた能力が明らかになった。外部から加えた場合に、種特異的にPGを迅速に切断するというエンドリシンのこの独特な能力によって研究者が駆り立てられ、他のグラム陽性病原体を首尾よく標的にするために、膨大な数のエンドリシンが単離された。しかし、グラム陰性細胞を攻撃するエンドリシンはほとんど注目を受けておらず、これは、エンドリシンそれ自体では、PGに作用できるように破壊することができない非常に保護的な外膜の存在が主な理由である。その結果、病院および食品由来の病原体（例えば、サルモネラ属（Salmonella）、大腸菌（Escherichia coli）、シュードモナス属の種（Pseudomonas spp.）、アシネトバクター属の種（Acinetobacter spp.））などのグラム陰性細胞を標的にするためのエンドリシンに基づく技術は、現在、エンドリシン療法において、おそらく最も重要な課題のうちの1つである。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、グラム陰性細菌に対して抗菌活性を有する、シトロバクター・コセリ（Citrobacter koseri）ファージCkP1から単離された、ペプチドグリカン分解活性を有する新規ポリペプチドに関する。
【０００７】
本発明の第1の目的は、SEQ ID No.1に記載のアミノ酸配列を含むエンドリシン活性を有するポリペプチドまたはその断片もしくは誘導体を提供することである。SEQ ID No.1に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドは、好ましくは、SEQ ID No.2に記載のヌクレオチド配列によってコードされる。好ましい態様では、該断片はSEQ ID No.3に記載のアミノ酸配列を含み、このアミノ酸配列は、好ましくは、ヌクレオチド配列SEQ ID No.4によってコードされる。さらに別の好ましい態様では、該誘導体は、SEQ ID No.1およびSEQ ID No.3に記載のアミノ酸配列中に、欠失、付加、挿入、および／または置換を有する。さらに別の好ましい態様では、本発明によるポリペプチドは、N末端またはC末端に、膜またはLPSを破壊する活性を有するペプチドストレッチ、特にカチオン性またはポリカチオン性ペプチドを含む。該ポリペプチドは、タグ、好ましくはHis6タグをさらに含むことができる。
【０００８】
本発明の第2の目的は、本発明によるポリペプチドをコードする単離核酸分子を提供することである。
【０００９】
本発明の第3の目的は、本発明による核酸分子を含むベクターに関する。
【００１０】
本発明の第4の目的は、本発明による核酸分子または本発明によるベクターを含む宿主細胞に関する。
【００１１】
本発明の第5の目的は、手術もしくは療法によってヒトもしくは動物の体を治療する方法で使用するための、およびまたはヒトもしくは動物の体に対して行われる診断方法で使用するための、本発明によるポリペプチドに関する。特に、本発明は、ヒトまたは動物などの対象においてグラム陰性細菌感染症を治療または予防する方法で使用するための、本発明によるポリペプチドに関する。本発明によるポリペプチドは、診断物質として使用することもできる。例えば、（例えば、対象の試料からまたは環境から確立された細菌培養において）、本発明によるポリペプチドとエクスビボで接触した際の細菌の溶解は、グラム陰性細菌の存在を示す。
【００１２】
本発明の第6の目的は、食品、飼料における、もしくは化粧品における抗菌剤としての、または殺菌剤としての、本発明によるポリペプチドの使用に関する。別の好ましい態様は、食料品の、食品加工機器の、食品加工工場の、食料品と接触する（無生物）表面の、飼料の、飼料加工機器の、飼料加工工場の、飼料と接触する（無生物）表面の、医療装置の、病院および診療所における（無生物）表面のグラム陰性細菌汚染を処置または予防するための、本発明によるポリペプチドの使用に関する。
【００１３】
詳細な説明
以下の図は本発明を説明するのに役立つ。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】BLASTpおよびPfamシステムを使用する、野生型シトロバクター・コセリのエンドリシンCkP1gp131のバイオインフォマティクス解析。野生型ファージ中に現れるDNAおよびアミノ酸配列は、それぞれ、（A）SEQ ID No.2および（B）SEQ ID No.1である。リゾチーム様スーパーファミリーの触媒ドメイン（アミノ酸1〜163、SEQ ID No.3、下線）をスキーム（図1C）ならびに配列（図1AおよびB；下線）において可視化した。
【図２】いくつかのグラム陰性細菌性病原体に対するCkP1gp131の抗菌活性。指数関数的に増殖する細胞（約3×107 CFU/ml）を、20mM HEPES pH7.0中に再懸濁した50μg/ml（2.4μM）のCkP1gp131とともに、または陰性対照としてのHEPESとともに、37℃で2時間インキュベートした。インキュベーション後に、抗菌性効果を、CFUの数を定量化することにより評価し、対数単位の相対的不活性化（＝log10(N0/Ni）、N0＝未処理細胞の数およびNi＝処理後の細胞の数）として表した。平均±標準偏差はn＝3反復に対して与えられる。CK−シトロバクター・コセリ系統（＃1〜11）；CF−シトロバクター・フロインデイ（Citrobacter freundii）系統（＃1〜7）；＊検出限界未満（＜10cfu/ml）。
【図３】CkP1gp131の抗菌活性：（A）異なるpH値下における活性。（B）異なるイオン強度下における活性。エンドリシンの2種の濃度（5および50μg/ml）を試験した。活性は、対数単位の相対的不活性化（＝log10(NO/Ni)、NO＝未処理細胞の数およびNi＝処理後の細胞の数）として表した。平均±標準偏差はn＝4反復に対して与えられる。＊検出限界未満（＜10CFU/ml）。
【図４】CkP1gp131の抗菌活性：（A）異なる温度下における活性。エンドリシンの2種の濃度（5および50μg/ml）を試験した。平均±標準偏差はn＝4反復に対して与えられる。（B）30日間にわたる活性（50μg/ml）。活性は、対数単位の相対的不活性化（＝log10(NO/Ni) 、NO＝未処理細胞の数およびNi＝処理後の細胞の数）として表した。＊検出限界未満（＜10CFU/ml）。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
説明
定義：
本明細書に現れる場合、次に挙げる用語は、以下に述べる定義を有するものとする。
【００１６】
本明細書において使用される用語「ポリペプチド」は、用語「タンパク質」を同義的に指す。本明細書において使用される用語「ポリペプチド」は、特定の配列においてペプチド結合によって連結したアミノ酸残基の直鎖状ポリマーを指す。タンパク質のアミノ酸残基は、例えば、炭水化物およびリン酸などの様々な基の共有結合によって、修飾され得る。ヘムまたは脂質などの他の物質がポリペプチド鎖とより緩く結合することができ、これによって、コンジュゲートされたタンパク質が生じ、これも本明細書において使用される用語「ポリペプチド」に含まれる。ポリペプチド鎖が折り畳まれる様々な様式が、特にアルファヘリックスおよびベータプリーツシートの存在に関して、明らかにされている。本明細書において使用される用語「ポリペプチド」は、すべてアルファ、すべてベータ、アルファ/ベータおよびアルファ＋ベータである4クラスすべてのタンパク質を指す。
【００１７】
本明細書において使用される用語「ペプチドストレッチ」は、エンドリシンなどのタンパク質に連結される任意の種類のペプチドを指す。しかし、本発明の意味におけるペプチドストレッチは、His6タグ、Strepタグ、Aviタグ、Mycタグ、Gstタグ、JSタグ、システインタグ、FLAGタグ、もしくは当技術分野において公知である他のタグ、チオレドキシンまたはマルトース結合タンパク質（MBP）を指さない。本明細書において使用される用語「ペプチドストレッチ」と対照的に、用語「タグ」は、ポリペプチドの発現および／もしくは親和性精製を容易にするのに、ポリペプチドを表面に固定するのに、または例えば様々なELISAアッセイ形式において抗体結合によってポリペプチドを検出するためのマーカーもしくは標識部分として働くのに有用であり得るペプチドを指すが、これは、上に列挙された容易化のうちの1つについてタグを有用にする機能が該ペプチドの正電荷によって引き起こされない限りにおいてである。しかし、His6タグは、それぞれのpHに応じて正に荷電することもあり得るが、固定された二価カチオンに結合するので親和性精製ツールとして使用され、本発明によるペプチドストレッチとしては使用されない。
【００１８】
本明細書において使用される用語「ペプチドストレッチ」は、約2〜10約100アミノ酸残基、より好ましくは約4〜約50アミノ酸残基、より好ましくは約5〜約30アミノ酸残基からなる短いポリペプチド配列を指し、ここでは1つのアミノ酸残基のアミノ基は別のアミノ酸残基のカルボキシル基にペプチド結合によって連結している。
【００１９】
本明細書において使用される用語「エンドリシン活性」は、特に、グラム陰性細菌のペプチドグリカンなどの細菌のペプチドグリカンを分解することによって、細菌細胞壁を加水分解する活性を指す。
【００２０】
本明細書において使用される用語「野生型」または「wt」は、SEQ ID No.1に示される、エンドリシンCkP1gp131のアミノ酸配列を指す。野生型エンドリシンCkP1gp131をコードする核酸配列は、SEQ ID No.2に示される。
【００２１】
本明細書において使用される用語「欠失」は、それぞれの参照配列と比較した場合の、誘導体配列における1、2、3、4、5個の（またはさらに5個を超える）連続的なアミノ酸または核酸残基の欠如を好ましくは指す。誘導体は、1個、2個またはそれ以上のそのような欠失を示し得る。
【００２２】
本明細書において使用される用語「挿入」は、それぞれの参照配列と比較した場合の、誘導体配列における1、2、3、4、5個の（またはさらに5個を超える）連続的なアミノ酸または核酸残基の配列内の付加的な存在を好ましくは指す。本発明の誘導体は、1個、2個またはそれ以上のそのような挿入を示し得る。
【００２３】
本明細書において使用される用語「付加」は、それぞれの参照配列と比較した場合の、誘導体配列のN末端および／またはC末端における1、2、3、4、5個（またはさらに5個を超える）連続的なアミノ酸または核酸残基の付加的な存在を好ましくは指す。
【００２４】
本明細書において使用される用語「置換」は、参照配列の対応する位置に存在するまたは存在しないアミノ酸または核酸残基と異なる、誘導体配列のある特定の位置に位置する、アミノ酸または核酸残基の存在を指す。本発明の誘導体は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個またはそれ以上のそのような置換を示し得る。前述のように、好ましくは、そのような置換は保存的置換である。
【００２５】
本明細書において使用される用語「細胞壁」は、グラム陰性細菌の細胞の外側の囲いを形成し、それによりそれらの完全性を保証する、すべての成分を指す。特に、本明細書において使用される用語「細胞壁」は、ペプチドグリカン、リポ多糖を有するグラム陰性細菌の外膜、細菌の細胞膜を指すが、例えば、莢膜、外側のタンパク質層、または粘液のような、ペプチドグリカンを被覆するさらなる層も指す。
【００２６】
本発明は、グラム陰性細菌に対する新規抗菌剤の調製に有用な、シトロバクター・コセリファージCkP1から単離された新しいエンドリシンに関する。特に、本発明は、SEQ ID No.1に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその断片もしくは誘導体に関する。SEQ ID No.1に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドは、好ましくは、SEQ ID No.2に記載のヌクレオチド配列にコードされる。
【００２７】
SEQ ID No.1に記載のアミノ酸配列を有するエンドリシンCkP1gp131は、164アミノ酸の長さを有する。酵素的活性ドメイン（EAD）（アミノ酸1〜163）は、SEQ ID No.3に記載のアミノ酸配列およびSEQ ID No.4に記載のヌクレオチド配列を有するリゾチーム様スーパーファミリードメインモチーフに適合する。
【００２８】
したがって、SEQ ID No.1の好ましい断片は、SEQ ID No.3に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。SEQ ID No.1の他の好ましい断片は、CkP1gp131のN末端メチオニンを欠くポリペプチドである（例えば、SEQ ID No.5およびSEQ ID No.6を参照されたい）。好ましくは、本発明によるポリペプチドの断片は、少なくとも80、より好ましくは少なくとも100、さらにいっそう好ましくは少なくとも120、さらにいっそう好ましくは少なくとも140、最も好ましくは少なくとも160アミノ酸の長さである。好ましくは、SEQ ID No.1の断片を含む本発明によるポリペプチドは、SEQ ID No.1の配列を含まない。好ましくは、SEQ ID No.1の断片を含む本発明によるポリペプチドは、wt CkP1gp131エンドリシン（SEQ ID No.1）の溶解活性を本質的に示す。該活性は、好ましくは、wt CkP1gp131エンドリシンの活性の約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、または約200％に相当する。
【００２９】
いくつかの態様では、本発明のポリペプチドは、SEQ ID No.1に記載のアミノ酸の誘導体であるアミノ酸配列を含む。そのような誘導体は、SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5および／またはSEQ ID No.6に記載のアミノ酸配列を本質的に含むが、付加的な改変および／または変更を有するポリペプチドであり得る。
【００３０】
一態様では、本発明によるエンドリシンの該誘導体の該改変および／または変更は、変異、特に、欠失、挿入、付加、置換またはこれらの任意の組み合わせであり得る。本発明による該誘導体は、wt CkP1gp131エンドリシン（SEQ ID No.1）の溶解活性を本質的に示す。該活性は、好ましくは、wt CkP1gp131エンドリシンの活性の約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、または約200％に相当する。
【００３１】
wt CkP1gp131エンドリシン（SEQ ID No.1）の断片および誘導体を含むポリペプチドの活性は、例えば（Briers et al., J. Biochem. Biophys 20 Methods 70: 531-533, (2007)）に記載されている、例えばプレート溶解アッセイまたは液体溶解アッセイのような当技術分野において周知のアッセイによって、当業者が測定することができる。
【００３２】
本発明の好ましい態様では、本発明によるポリペプチドは、N末端またはC末端に、His6タグ、Strepタグ、Aviタグ、Mycタグ、Gstタグ、JSタグ、システインタグ、FLAGタグ、または当技術分野において公知である他のタグなどのタグをさらに含む。本発明の好ましい態様では、該タグは、C末端で、SEQ ID No.1の配列またはその断片および／もしくは誘導体に連結している（例えば、N−タグ−SEQ ID No.1−C）。該タグは、付加的なアミノ酸残基を通してSEQ ID No.1またはその断片もしくは誘導体に連結していてもよい。該付加的なアミノ酸残基は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個の付加的なアミノ酸残基からなり得る。本発明の好ましい態様では、タグは、付加的なアミノ酸残基Leu-GluまたはLys-Glyによって、SEQ ID No.1、その断片またはその誘導体に連結している。好ましい態様では、本発明は、SEQ ID No.7に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドに関する。SEQ ID No.7に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、それぞれ、SEQ ID No.1に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドと比較した場合、SEQ ID No.1のN末端に連結した付加的なHis6タグを含む。SEQ ID No.7に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドは、好ましくは、SEQ ID No.8に記載のヌクレオチド配列にコードされる。
【００３３】
本発明は、さらに、本発明によるポリペプチドをコードする単離核酸分子に関する。本発明による特に好ましい単離核酸分子は、SEQ ID No.2、SEQ ID No.4および／またはSEQ ID No.8に記載の核酸配列を含む。好ましくは、核酸分子は、SEQ ID No.1に対して異種性のプロモーターを含む。
【００３４】
本発明はさらに、本発明による核酸分子を含むベクターに関する。該ベクターは、本発明によるポリペプチドの構成的または誘導的発現を提供することができる。
【００３５】
本発明は、本発明によるポリペプチド、核酸、および／またはベクターを含む宿主細胞にも関する。宿主細胞は、該ポリペプチドを発現する、遺伝子改変された適切な宿主細胞でもよい。該宿主細胞は、細菌もしくは酵母などの微生物、または例えば哺乳動物細胞、特にヒト細胞のような動物細胞でもよい。本発明による宿主細胞は、多細胞生物の一部ではなく、単離されている（例えば、不死化細胞株など）。本発明の一態様では、宿主細胞は大腸菌細胞である。宿主は、単なる生物工学的な理由、例えば、収量、溶解度、費用などにより選択することができるが、医学的見地、例えば、非病性細菌もしくは酵母またはヒト細胞より選択することもできる。
【００３６】
本発明の別の局面は、本発明によるポリペプチドの発現を得るために適切な宿主細胞を遺伝的に形質転換するための方法に関し、宿主細胞は、本発明によるポリペプチドをコードする本発明による核酸を宿主細胞に導入することによって、遺伝子改変される。本発明によるポリペプチドの翻訳および発現は、当業者に周知の遺伝子工学的方法によって得ることができる。
【００３７】
本発明は、本発明による宿主細胞、例えば、本発明によるポリペプチドを発現する遺伝子改変された適切な宿主細胞から該ポリペプチドを得るための方法にも関し、本方法は、本発明によるポリペプチドを該宿主細胞から単離する工程を含む。
【００３８】
さらなる局面では、本発明は、本発明によるポリペプチド、および／または本発明による核酸分子もしくはベクターで形質転換された宿主細胞を含み、希釈剤、賦形剤、または担体、例えば、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、または担体をさらに含む、組成物、好ましくは薬学的組成物に関する。
【００３９】
本発明の好ましい態様では、組成物は、例えば、EDTA、TRIS、乳酸、ラクトフェリン、ポリミキシン、クエン酸、および／または例えばVaara（Agents that increase the permeability of the outer membrane. Vaara M. Microbiol Rev. 1992 Sep;56(3):395-441）によって記載されるような他の物質といった金属キレート剤など、グラム陰性細菌の外膜を透過性にする作用物質をさらに含む。上述の透過性作用物質の組み合わせを含む組成物も好ましい。約10μM〜約100mM EDTA、より好ましくは約50μM〜約10mM EDTA、より好ましくは約0.5mM〜約10mM EDTA、より好ましくは約0.5mM〜約2mM EDTA、より好ましくは約0.5mM〜約1mM EDTAを含む組成物が特に好ましい。約0.5mM〜約2mM EDTA、より好ましくは約1mM EDTA、およびさらに約10〜約100mM TRISを含む組成物も好ましい。
【００４０】
本発明は、手術または療法によってヒトまたは動物の体を治療する方法において、およびヒトまたは動物の体に対して行われる診断方法において使用するための、本発明によるポリペプチドおよび／または本発明によるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された宿主にも関する。さらなる局面では、本発明は、グラム陰性細菌と関係がある障害、疾患、または状態を治療および／または予防するための方法における、本発明によるポリペプチドおよび／または本発明によるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含むベクターで形質転換された宿主の使用に関する。特に、該障害、疾患、または状態は、腸内細菌科（Enterobacteriaceae）（大腸菌属（Escherichia）、特に大腸菌、サルモネラ属、赤痢菌属（Shigella）、シトロバクター属（Citrobacter）、エドワードシエラ属（Edwardsiella）、エンテロバクター属（Enterobacter）、ハフニア属（Hafnia）、クレブシエラ属（Klebsiella）、特に肺炎桿菌（K. pneumoniae）、モルガネラ属（Morganella）、プロテウス属（Proteus）、プロビデンシア属（Providencia）、セラチア属（Serratia）、エルシニア属（Yersinia））、シュードモナス科（Pseudomonadaceae）（シュードモナス属、特に緑膿菌（P. aeruginosa））、バークホルデリア属（Burkholderia）、ステノトロホモナス属（Stenotrophomonas）、シュワネラ属（Shewanella）、スフィンゴモナス属（Sphingomonas）、コマモナス属（Comamonas）、ナイセリア属（Neisseria）、モラクセラ属（Moraxella）、ビブリオ属（Vibrio）、エロモナス属（Aeromonas）、ブルセラ属（Brucella）、フランシセラ属（Francisella）、ボルデテラ属（Bordetella）、レジオネラ属（Legionella）、バルトネラ属（Bartonella）、コクシエラ属（Coxiella）、ヘモフィルス属（Haemophilus）、パスツレラ属（Pasteurella）、マンヘミア属（Mannheimia）、アクチノバチルス属（Actinobacillus）、ガードネレラ属（Gardnerella）、スピロヘータ科（Spirochaetaceae）（トレポネーマ属（Treponema）およびボレリア属（Borrelia））、レプトスピラ科（Leptospiraceae）、カンピロバクター属（Campylobacter）、ヘリコバクター属（Helicobacter）、スピリルム属（Spirillum）、ストレプトバチルス属（Streptobacillus）、バクテロイデス科（Bacteroidaceae）（バクテロイデス属（Bacteroides）、フソバクテリウム属（Fusobacterium）、プレボテラ属（Prevotella）、ポルフィロモナス属（Porphyromonas））、アシネトバクター属（Acinetobacter）、特にA.バウマンニ（A. baumannii）のような、ヒトまたは動物に病原性のある系統を含む細菌の群、科、属、または種のグラム陰性細菌によって引き起こされ得る。特に、該障害、疾患、または状態の治療および／または予防は、緑膿菌、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、類鼻疽菌（Burkholderia pseudomallei）、大腸菌、および／またはネズミチフス菌（Salmonella Typhimurium）に引き起こされ得る。
【００４１】
さらなる局面では、本発明は、治療および／または予防を必要としている対象において、障害、疾患または状態を治療する方法に関し、この方法は、本発明によるポリペプチドの有効量、および／または本発明によるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された宿主の有効量、または本発明による組成物の有効量を、該対象に投与することを含む。対象は、例えば、ヒトまたは動物でもよい。特に該治療方法は、グラム陰性細菌によって、特に上に列挙したグラム陰性細菌によって引き起こされる、皮膚、軟組織、呼吸器系、肺、消化管、眼、耳、歯、鼻咽頭、口、骨、膣の感染症、菌血症の創傷、および／または心内膜炎の治療および／または予防のためであってよい。
【００４２】
本発明による治療の方法（または予防法）で使用される投薬量および投与経路は、治療される特定の疾患/感染部位に依存する。投与経路は、例えば、経口的、局所的、鼻咽頭の、非経口的、静脈内、直腸の、または任意の他の投与経路でもよい。本発明によるポリペプチド、および／または本発明によるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された宿主もしくは本発明による組成物の有効量を、感染部位（または、感染の危険にさらされた部位）に適用するために、活性化合物が感染部位に到達するまで、プロテアーゼ、酸化、免疫応答などのような環境上の影響から活性化合物を保護する製剤を使用することができる。したがって、製剤は、カプセル剤、糖衣錠、丸剤、坐剤、注射用液剤、または任意の他の医学的に妥当なガレヌス製剤でもよい。好ましくは、ガレヌス製剤は、適切な担体、安定化剤、香料、緩衝液、または他の適切な試薬を含んでもよい。例えば、局所適用については、製剤はローション剤または硬膏剤でもよく、鼻咽頭の適用については、製剤は噴霧器を介して鼻に適用される生理食塩水でもよい。
【００４３】
好ましくは、治療される（または予防される）感染症が多耐性細菌系統によって、特に以下の抗生物質の1つまたは複数に耐性である系統によって引き起こされる場合、本発明によるポリペプチドは医学的治療のために使用される：ストレプトマイシン、テトラサイクリン、セファロチン、ゲンタマイシン、セフォタキシム、セファロスポリン、セフタジジムまたはイミペネム。さらに、本発明によるポリペプチドは、これを従来の抗菌剤、例えば、抗生物質、ランチビオティクス、バクテリオシン、またはエンドリシンなどと組み合わせて投与することによって、治療方法で使用することができる。
【００４４】
本発明は、1つまたは複数の区画を含む薬学的パックにも関し、少なくとも1つの区画は、本発明による1種もしくは複数種のポリペプチド、本発明によるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された1種もしくは複数種の宿主、および／または本発明による組成物を含む。
【００４５】
別の局面では、本発明は薬学的組成物を調製するプロセスに関し、該プロセスは、本発明による1種もしくは複数種のポリペプチドおよび／または本発明によるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された1種もしくは複数種の宿主を、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、または担体と混合することを含む。
【００４６】
なおさらなる局面では、本発明による組成物は化粧用組成物である。いくつかの細菌種は、環境にさらされた患者の体の表面、例えば皮膚に刺激を引き起こし得る。そのような刺激を予防するために、または該細菌性病原体の軽微な症状発現を排除するために、既に存在するかまたは新しく定着する病原性グラム陰性細菌を分解するのに十分な量の本発明によるポリペプチドを含む、特別な化粧用調製物を用いることができる。
【００４７】
さらなる局面では、本発明は、医薬品診断、食品診断、飼料診断または環境診断における診断手段として、具体的には、特にグラム陰性細菌によって引き起こされる細菌の感染症または汚染の診断のための診断手段として使用するための、本発明によるポリペプチドに関する。この点で、本発明によるポリペプチドは、病原性細菌、特にグラム陰性病原性細菌を特異的に分解するためのツールとして使用することができる。本発明のポリペプチドによる細菌細胞の分解は、Triton X-100のようなデタージェント、またはポリミキシンBのような細菌細胞の外被を弱める他の添加剤を加えることによって支援され得る。核酸ベースの方法、例えば、PCR、核酸ハイブリダイゼーション、もしくはNASBA（核酸配列ベース増幅）；免疫学的方法、例えば、IMS、免疫蛍光法もしくはELISA技法；または細菌細胞の細胞内容物に依拠する他の方法、例えば、異なる細菌の群もしくは種に特異的なタンパク質（例えば、腸内細菌に対するβーガラクトシダーゼ、コアグラーゼ陽性系統に対するコアグラーゼ）を使用する酵素的アッセイを使用して、その後に細菌を特異的に検出するための初期工程として、特異的な細胞分解が必要とされる。
【００４８】
さらなる局面では、本発明は、食料品の、食品加工機器の、食品加工工場の、棚および食品保管領域のような食料品と接触する（無生物）表面の、ならびに病原性細菌、通性病原性細菌、または他の望ましくない細菌が食品材料に潜在的にはびこる可能性があるすべての他の状況におけるグラム陰性細菌汚染を処置または予防するための、本発明によるポリペプチドの使用に関する。同様に、本発明によるポリペプチドは、家畜飼料の、飼料加工機器の、飼料加工工場の、棚および飼料保管領域のような家畜飼料と接触する（無生物）表面の、ならびに病原性細菌、通性病原性細菌、または他の望ましくない細菌が飼料材料に潜在的にはびこる可能性があるすべての他の状況におけるグラム陰性細菌汚染を処置または予防するために使用することができる。本発明によるポリペプチドは、医療装置の、ならびに病院および診療所におけるすべての種類の（無生物）表面のグラム陰性細菌汚染を処置または予防するために使用することもできる。
【００４９】
特に、本発明のポリペプチドは、消毒剤として予防的に使用することができる。該消毒剤は、手術の前もしくは後に、または例えば、血液透析の間に使用することができる。さらに、早産児および免疫無防備状態の人、または補綴具を必要とする対象を本発明によるポリペプチドで処置することができる。該処置は、予防的または急性感染症の間のいずれでもよい。同じ文脈で、特に、緑膿菌（FQRP）、アシネトバクター属の種ならびに腸内細菌科、例えば大腸菌、サルモネラ属、赤痢菌属、シトロバクター属、エドワードシエラ属、エンテロバクター属、ハフニア属、クレブシエラ属、モルガネラ属、プロテウス属、プロビデンシア属、セラチア属、およびエルシニア属の種のような抗生物質耐性系統による院内感染を、予防的にまたは急性期の間に、本発明のポリペプチドで処置することができる。したがって、本発明によるポリペプチドは、デタージェント、界面活性剤、溶媒、抗生物質、ランチビオティクス、またはバクテリオシンのような有用な他の成分と殺菌溶液中で組み合わせて、殺菌薬として使用することもできる。
【００５０】
以下の実施例は本発明を説明するが、本開示または添付の特許請求の範囲を限定するものとはみなされない。別に指示されない限り、例えば、Sambrock et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold 15 Spring Harbor, New Yorkによって記載されているような、分子生物学的の標準的な方法を使用した。
【実施例】
【００５１】
実施例1．シトロバクター・コセリファージCkP1のエンドリシンCkP1gp131のクローニング、発現および精製
CkP1gp131（164アミノ酸長、MW=18609 Da；SEQ ID No.1）は、リゾチーム様スーパーファミリー触媒ドメイン（アミノ酸1〜163；SEQ ID No.3）を有すると予想される、シトロバクター・コセリファージCkP1由来の球状エンドリシンである（図1を参照されたい）。以下のPCRパラメーターを使用する、KAPA HiFiポリメラーゼ（Kapa Biosystems）を用いる標準的なPCR反応において、エンドリシンCkP1gp131をコードするオープンリーディングフレームORF131を増幅するための鋳型として、ファージCkP1の精製ゲノムDNAを使用した：
開始：95℃、2分；続いて、［98℃（20秒）→60℃（15秒）→72℃（20秒）］の35サイクル、続いて72℃（5分）および4℃に冷却および保存。
【００５２】
エンドリシンCkP1gp131をコードするORF131の標準的なPCR増幅中に使用したプライマーは、以下のものであった。
ORF131フォワードプライマー
2020504602.tif 000002
ORF131リバースプライマー
2020504602.tif 000003
【００５３】
次いで、得られたPCR断片を市販の入手可能なpET28a発現ベクター（Novagen）にライゲーションした。組換えCkP1gp131について得られたアミノ酸＆DNA配列を、それぞれSEQ ID No.7およびSEQ ID No.8に記載する。
【００５４】
CkP1gp131の組換発現は、0.5mM IPTG（イソプロピルチオガラクトシド）で4時間にわたって37℃で誘導した後に、指数関数的に増殖する大腸菌BL21（λDE3）細胞中で実施した。次いで、pET28a発現ベクターによってコードされるN末端の6×Hisタグを使用して精製するために、HisTrap（商標）HPの1mlカラム（GE Healthcare）中に積み重ねられたNi2+−NTA樹脂にエンドリシンを添加した。精製方法は、以下の4工程を含んでいた：
1．平衡化工程−10mLの洗浄緩衝液（25mMイミダゾール、0.5mM NaCl、および20mM NaH2P04、濃NaOHによりpH7.4）。
2．ローディング工程−洗浄緩衝液（25mMイミダゾール、0.5mM NaCl、および20mM NaH2P04、濃NaOHによりpH7.4）中に再懸濁した、発現された全可溶性大腸菌抽出物のローディング。
3．洗浄工程−10mLの洗浄緩衝液（25mMイミダゾール、0.5mM NaCl、および20mM NaH2P04、濃NaOHによりpH7.4）。
4．溶出工程−2mLの溶出緩衝液（250mMイミダゾール、0.5mM NaCl、および20mM NaH2P04、濃NaOHによりpH7.4）。
【００５５】
CkP1gp131（MW＝20772 Da）の溶出タンパク質画分を標準的な変性SDS-PAGEゲルによって可視化し（図2）、これによると、95％を上回る純度が達成された。pH7.0の10mM HEPES中でタンパク質を透析し（Maxi GeBAflex-tube Dialysis Kit - Gene Bio- Application L.T.Dを使用）、標準としてウシ血清アルブミンを用いるBCA（商標）Protein Assay Kit（Thermo Scientific）によって、濃度を決定した。大腸菌発現培養物のリットルあたり37.2mgの発現収量が得られた。
【００５６】
実施例2．グラム陰性病原性細菌のパネルに対するシトロバクター・コセリファージCKP1のエンドリシン（SEQ ID No.7）の抗菌性効果
抗菌性効果の評価については、すべての抗菌性実験は、10mM HEPES（pH7.0）中で、対数中期の細胞に対して50μg/mlの組換えCkP1gp131（SEQ ID No.7）を使用して実施し、37℃で2時間インキュベートした（図3）。
【００５７】
対数単位の相対的不活性化（＝log10(N0/Ni)、N0＝（陰性対照中の）未処理細胞の数およびNi＝処理細胞の数。これらはインキュベーション後に計数した）を使用して、抗菌活性を定量化する。平均±標準偏差はn＝4反復に対して与えられる。
【００５８】
上記の式を使用すると、CkP1gp131は、すべての試験したグラム陰性細菌に対して、1〜＞5log（＜100cfu/mlの検出限界に達する）までの範囲の抗菌活性を有する。
【００５９】
実施例3．様々なpH条件下における、シトロバクター・コセリに対するシトロバクター・コセリファージCKP1のエンドリシン（SEQ ID No.7）の抗菌性効果
指数関数的に増殖するC.コセリ細胞（約3×109 CFU/ml）を、20mMの以下の異なる緩衝系に100倍希釈した：クエン酸ナトリウム（pH6）、HEPES（pH7〜8）、およびホウ酸（pH9）。5または50μg/mlの終濃度を有するように、50μLの細胞を50μLの組換えエンドリシン（または陰性対照としてのHepes緩衝液）と混合することによって、反応を開始させた。2時間インキュベートしてから、抗菌性効果を、CFUの数を定量化することにより評価し、対数単位の相対的不活性化（＝log10(N0 /Ni)、N0＝未処理細胞の数およびNi＝処理後の細胞の数）として表した。
【００６０】
実施例4．様々なイオン強度条件下における、シトロバクター・コセリに対するシトロバクター・コセリファージCKP1のエンドリシン（SEQ ID No.7）の抗菌性効果
指数関数的に増殖するC.コセリ細胞（約3×109 CFU/ml）を20mMのHEPES pH7中に100倍希釈し、NaCl（0〜500mM）の量を増大させながら、5または50μg/mlのエンドリシン（終濃度）とともに2時間インキュベートした。2時間インキュベートしてから、抗菌性効果を、CFUの数を定量化することにより評価し、対数単位の相対的不活性化（＝log10(N0/Ni）、N0＝未処理細胞の数およびNi＝処理後の細胞の数）として表した。
【００６１】
実施例5．様々な温度条件下における、シトロバクター・コセリに対するシトロバクター・コセリファージCKP1のエンドリシン（SEQ ID No.7）の抗菌性効果
指数関数的に増殖するC.コセリ細胞を、20mMのHEPES緩衝液、pH7.0；0mM NaClを使用して、エンドリシンとともにインキュベートした。2時間インキュベートしてから、抗菌性効果を、CFUの数を定量化することにより評価し、対数単位の相対的不活性化（＝log10(N0/Ni）、N0=未処理細胞の数およびNi＝処理後の細胞の数）として表した。
【００６２】
実施例6．シトロバクター・コセリに対するシトロバクター・コセリファージCKP1のエンドリシン（SEQ ID No.7）の経時的な抗菌性効果
エンドリシン（SEQ ID No.7）を20mM Hepes pH7.0の緩衝液中に37℃で数日間保持した。（a）0、5、10、20および30日目に、50μg/mlのエンドリシンを、（a）陰性対照としてHEPES緩衝液を再び使用して、指数関数的に増殖するC.コセリ細胞（約3×107 CFU/ml）に対して37℃で2時間試験した。インキュベーション後に、抗菌性効果を、CFUの数を定量化することにより評価し、対数単位の相対的不活性化（＝log10(N0/Ni)、N0＝未処理細胞の数およびNi＝処理後の細胞の数）として表した。
【００６３】
0、5、10、20および30日目に、遠および近UV領域（190〜260nm）における円二色性スペクトルで同じ試料を解析した。エンドリシンは、有意な二次構造の変化が観察されなかったので、非常に安定であることが実証された。したがって、CD熱安定性解析により、エンドリシン活性が、37℃で1か月経過した後に依然として存在することが実証されている。
【００６４】
本発明の他の態様は、本明細書の考察および本明細書において開示される本発明の実施から当業者に明らかであると考えられる。本明細書および実施例は例示的なものに過ぎないとして考慮されることが意図され、本発明の真の範囲および趣旨は以下の特許請求の範囲によって示される。
【図１】
2020504602.tif 000004
【図２】
2020504602.tif 000005
【図３】
2020504602.tif 000006
【図４】
2020504602.tif 000007
【配列表】
2020504602000001.app
【国際調査報告】
2020504602.tif 000008
2020504602.tif 000009
2020504602.tif 000010