(57)【要約】本発明は、ボツリヌス毒素（ＢｏＮＴ）等の治療用ペプチドに融合した１つ又は複数のジンクフィンガーモチーフを含む、キメラポリペプチドを提供する。ジンクフィンガーモチーフは、ＢｏＮＴのＣ末端側に位置していてよく、キメラポリペプチドは、任意選択で２つ以上のそのようなジンクフィンガーモチーフを含むことができる。本発明のキメラポリペプチドが、被験体に経皮で効率良く送達されることを示す。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ボツリヌス毒素（ＢｏＮＴ）軽鎖と、（ｂ）前記ＢｏＮＴ軽鎖のＣ末端に位置するか、又は前記ＢｏＮＴ重鎖のＣ末端に位置する第１のジンクフィンガーモチーフとを含み、前記ＢｏＮＴ重鎖は、前記ＢｏＮＴ軽鎖のＣ末端に位置するか、又は前記ＢｏＮＴ軽鎖にジスルフィド結合を介して結合している、キメラポリペプチド。
【請求項２】
２０００個以下のアミノ酸残基を含む、請求項１に記載のキメラポリペプチド。
【請求項３】
前記ＢｏＮＴ軽鎖と前記第１のジンクフィンガーモチーフとが、同じペプチド鎖上にある、請求項１又は２に記載のキメラポリペプチド。
【請求項４】
前記ＢｏＮＴ軽鎖と前記第１のジンクフィンガーモチーフとが、異なるペプチド鎖上にある、請求項１又は２に記載のキメラポリペプチド。
【請求項５】
前記ＢｏＮＴ軽鎖又は前記ＢｏＮＴ重鎖のＣ末端に位置する更に１つのジンクフィンガーモチーフを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項６】
前記ＢｏＮＴ軽鎖又は前記ＢｏＮＴ重鎖のＣ末端に位置する更に２つのジンクフィンガーモチーフを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項７】
前記ジンクフィンガーモチーフが、直接又はペプチドリンカーを介して連結している、請求項５又は６に記載のキメラポリペプチド。
【請求項８】
前記ＢｏＮＴ軽鎖のＮ末端に位置する第２のジンクフィンガーモチーフを更に含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項９】
前記ＢｏＮＴ軽鎖のＮ末端に位置する更に１つ又は２つのジンクフィンガーモチーフを更に含む、請求項８に記載のキメラポリペプチド。
【請求項１０】
前記ジンクフィンガーモチーフの少なくとも１つが、Ｃｙｓ２−Ｈｉｓ２ジンクフィンガーモチーフである、請求項１〜９のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項１１】
前記ジンクフィンガーモチーフが、前記ジンクフィンガーモチーフのアルファ−ヘリカルフラグメントの残基１、２、３、又は６に少なくとも１つのアラニンを含む、請求項１０に記載のキメラポリペプチド。
【請求項１２】
前記ジンクフィンガーモチーフの少なくとも１つが、配列番号１及び５〜７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項１３】
前記ジンクフィンガーモチーフが、配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載のキメラポリペプチド。
【請求項１４】
前記第１のジンクフィンガーが、ＢｏＮＴ軽鎖又はＢｏＮＴ重鎖のＣ末端から２００アミノ酸残基以下離れている、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項１５】
（ａ）ボツリヌス毒素（ＢｏＮＴ）軽鎖と、前記ＢｏＮＴ軽鎖のＮ末端に位置する３つのジンクフィンガーモチーフとを含む第１の鎖と、（ｂ）ＢｏＮＴ重鎖と、前記ＢｏＮＴ重鎖のＣ末端に位置する３つのジンクフィンガーモチーフとを含む第２の鎖とを含み、前記ＢｏＮＴ軽鎖がジスルフィド結合を介して前記ＢｏＮＴ軽鎖に結合している、二本鎖ポリペプチド。
【請求項１６】
Ｎ末端からＣ末端に、３つのジンクフィンガーモチーフ、ボツリヌス毒素（ＢｏＮＴ）軽鎖、ＢｏＮＴ重鎖、及び更に３つのジンクフィンガーモチーフを含む、キメラポリペプチド。
【請求項１７】
前記ＢｏＮＴが、ＢｏＮＴ  Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、若しくはＧ、又はそれらと少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体から選択される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項１８】
前記ＢｏＮＴが、ＢｏＮＴのサブタイプＡ１〜Ａ１０、Ｂ１〜Ｂ８、Ｅ１〜Ｅ９、及びＦ１〜Ｆ７から選択される、請求項１７に記載のキメラポリペプチド。
【請求項１９】
前記ＢｏＮＴが、ＢｏＮＴ  Ａである、請求項１７に記載のキメラポリペプチド。
【請求項２０】
前記ＢｏＮＴ軽鎖が、配列番号８のアミノ酸配列又は配列番号８と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ配列を含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
前記ＢｏＮＴ重鎖が、配列番号９のアミノ酸配列又は配列番号９と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ配列を含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
配列番号１０〜１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む一本鎖ポリペプチド、又は前記アミノ酸配列から処理された二本鎖ポリペプチドを含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
ボツリヌス毒素（ＢｏＮＴ）軽鎖と少なくとも１つのジンクフィンガーモチーフとを含む、キメラポリペプチド。
【請求項２４】
前記ジンクフィンガーモチーフが、前記ＢｏＮＴ軽鎖のＣ末端に位置し、且つ、前記ＢｏＮＴ軽鎖から２００アミノ酸残基しか離れていない、請求項２３に記載のキメラポリペプチド。
【請求項２５】
治療用ペプチドと、前記治療用ペプチドのＣ末端に位置する少なくとも１つのジンクフィンガーモチーフとを含み、前記ジンクフィンガーモチーフのＮ末端が、前記治療用ペプチドのＣ末端から１００アミノ酸残基しか離れていない、キメラポリペプチド。
【請求項２６】
前記治療用ペプチドが、上皮成長因子（ＥＧＦ）及びスーパーオキシド・ジスムターゼ（ＳＯＤ）からなる群から選択される、請求項２５に記載のキメラポリペプチド。
【請求項２７】
請求項１〜２４のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドを含む製剤を局所に又は筋肉内に適用することを含む、ＢｏＮＴ軽鎖を哺乳動物に投与する方法。
【請求項２８】
前記局所適用は、皮膚、又は眼、耳、鼻、口、唇、尿道口、肛門、若しくは舌の粘膜に対してである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記局所適用は、破壊された皮膚の角質層に対してである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記破壊が、前記製剤の送達に使用される針又は極微針を用いて行われる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記局所適用は、哺乳動物の顔又は首の皮膚に対してである、請求項２７〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記製剤が、クリーム、ゲル、又はスプレーを含む、請求項２７〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記哺乳動物は、顔の皺、ジストニア、痙縮、片側顔面痙攣、多汗症、又は唾液分泌過多症の処置の必要がある、請求項２７〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
請求項１〜２６のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項３５】
請求項３４に記載のポリヌクレオチドを含む、細胞。
【請求項３６】
細菌細胞である、請求項３５に記載の細胞。
【請求項３７】
前記細菌細胞が、ボツリヌス菌細胞である、請求項３６に記載の細胞。
【請求項３８】
昆虫細胞である、請求項３５に記載の細胞。
【請求項３９】
前記昆虫細胞が、スポドプテラ細胞である、請求項３８に記載の細胞。
【請求項４０】
前記ポリヌクレオチドにコードされるタンパク質を発現する条件下で、請求項３５〜３９のいずれか一項に記載の細胞を培養することを含む、タンパク質を産生する方法。
【請求項４１】
請求項１〜２６のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド及び薬学的に適切な担体を含む、製剤。
【請求項４２】
薬剤を試験動物に投与し、前記試験動物をトレッドミル又は平均台の上に置き、移動距離、足跡の大きさ、又は前記平均台を渡る時間を測定することを含み、コントロールと比較した前記移動距離、前記足跡の大きさ、又は前記平均台を渡る時間が、筋肉麻痺に対する前記薬剤の作用を反映する、筋肉麻痺に対する薬剤の作用を試験する方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴ）は、クロストリジウム属ボツリヌス菌及び関連種により産生される天然の神経毒である。ＢｏＮＴには７つの既知の血清型、Ａ、Ｂ、Ｃ１、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧがある。ＢｏＮＴは、一本鎖ポリペプチドとして細菌から放出され、その後、１つのジスルフィド結合で結合している１００ｋＤａの重鎖及び５０ｋＤａの軽鎖に自己切断する。重鎖は、ボツリヌス毒素をシナプス前神経末端に誘導し、軽鎖の細胞質への内在化を媒介する。ボツリヌスの軽鎖は、ＳＮＡＲＥ（可溶性Ｎ−エチルマレイミド感受性融合付着タンパク質受容体）複合タンパク質を特異的に切断するメタロプロテアーゼである。
【０００２】
ＳＮＡＲＥは、哺乳動物細胞では６０種類超のメンバーからなる大きなタンパク質スーパーファミリーである。コアのＳＮＡＲＥ複合体は、シナプトブレビン（ベシクル関連膜タンパク質、ＶＡＭＰとも呼ばれる）及びシンタキシン−１それぞれに由来する１つずつのヘリックスと、シナプトソーム関連タンパク質２５（ＳＮＡＰ−２５）に由来する２つのヘリックスとを含む、４α−ヘリックスバンドルである。これらのＳＮＡＲＥタンパク質由来の４つのヘリックスは、お互いを包み込んで、コイルドコイル４次構造を構築する。シンタキシン−１は、ＳＮＡＰ−２５のＮ末端ヘリックスに結合し、シナプトブレビンヘリックスは、ＳＮＡＰ−２５のＣ末端ヘリックスに結合する。ＳＮＡＲＥ複合体の主な役割は、小胞融合、例えば、ニューロンにおけるシナプス小胞とシナプス前膜との融合を媒介することである。
【０００３】
ＢｏＮＴは、３つのコアＳＮＡＲＥタンパク質の１つ、シナプトブレビン、シンタキシン−１、又はＳＮＡＰ−２５を特異的に切断する。これら３つのタンパク質のいずれかを不活化すると、コアＳＮＡＲＥ複合体の形成、又はＳＮＡＲＥスーパー複合体におけるコアＳＮＡＲＥ複合体と他の構成成分との相互作用が破壊される。ＳＮＡＲＥスーパーコンプレックスの機能の遮断は、小胞と細胞膜との融合を阻み、それにより、神経伝達物質であるアセチルコリンの軸索終末からの放出を阻害し、筋肉麻痺へと導く。
【０００４】
ＢｏＮＴは、地球上で最も強力な天然毒素であり、わずか５０ｎｇ程度の物質でヒトのボツリヌス症を引き起こす。自然界において、ＢｏＮＴは、主に野生及び家畜動物に感染し、無脊椎動物を通じて広まる。毒素の起源に応じて、ヒトのボツリヌス症は、５つのクラス：食餌性ボツリヌス症、乳児ボツリヌス症、吸入ボツリヌス症、医原性ボツリヌス症（ＢｏＮＴの過剰な臨床用量に起因する）、及び創傷ボツリヌス症（主に薬物注射に起因する）に分類される。最初の２つは、最も一般的に見られるヒトのボツリヌス症である。
【０００５】
ＢｏＮＴの治療的使用は、アラン・Ｂ・スコットにより１９６０年代後半に最初に提案され、１９７７年に斜視の子供達に対して実施された。ＢｏＮＴの並外れた特異性により、ＢｏＮＴは神経終末の活動亢進を特徴とするヒトの疾患に対して効果的な薬剤となっている。ＢｏＮＴの治療的使用のうち最も多い割合は、ジストニア、痙縮、片側顔面痙攣、多汗症（過剰な発汗）、唾液分泌過多症（過剰な唾液）等の神経障害である。ＢｏＮＴのもう１つの重要な用途は、排尿筋・括約筋筋失調、特発性排尿筋過活動、神経因性排尿筋過活動、尿閉、裂肛、前立腺肥大症等の泌尿器疾患の治療である。稀ではあるが、ＢｏＮＴは消化器疾患及び耳鼻咽喉科疾患の治療に使用することができる。ＢｏＮＴＡは、６５歳以上の成人患者における中等度から重度の眉間の皺の治療用として、２００２年に米国（ＵＳ）食品医薬品局（ＦＤＡ）により承認された。２００５年以降、ＢｏＮＴＡは、最も広く使用されている非侵襲的な医師のほう助による美容処置となっている。患者全体の満足度は８０％を超えているが、注射用ＢｏＮＴＡは、痛み、注射痕、圧痛、出血、及びあざ等の多くの難点がある。特に、目尻の皺又は外眼角の領域へのＢｏＮＴＡの注射は、薄い皮膚及び表層の血管によるあざの高リスクを伴う可能性がある。一部の治療では、最大の効果を得るために複数回の注射が必要である。
【発明の概要】
【０００６】
１つの実施形態において、本発明は、（ａ）ボツリヌス毒素（ＢｏＮＴ）軽鎖と、（ｂ）ＢｏＮＴ軽鎖のＣ末端に位置するか、又はＢｏＮＴ重鎖のＣ末端に位置する第１のジンクフィンガーモチーフとを含み、ＢｏＮＴ重鎖は、ＢｏＮＴ軽鎖のＣ末端に位置するか、又はＢｏＮＴ軽鎖にジスルフィド結合を介して結合している、キメラポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態において、キメラポリペプチドは、２０００個以下のアミノ酸残基を含む。
【０００７】
いくつかの実施形態において、ＢｏＮＴ軽鎖と第１のジンクフィンガーモチーフとは、同じペプチド鎖上にある。いくつかの実施形態において、ＢｏＮＴ軽鎖と第１のジンクフィンガーモチーフとは、異なるペプチド鎖上にある。
【０００８】
いくつかの実施形態において、キメラポリペプチドは、ＢｏＮＴ軽鎖のＮ末端に位置する第２のジンクフィンガーモチーフを更に含む。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーモチーフ及び第２のジンクフィンガーモチーフの少なくとも１つが、少なくとももう１つのフィンガーモチーフに連結している。いくつかの実施形態において、ジンクフィンガーモチーフの少なくとも１つが、Ｃｙｓ２−Ｈｉｓ２ジンクフィンガーモチーフである。いくつかの実施形態において、ジンクフィンガーモチーフが、ジンクフィンガーモチーフのアルファ−ヘリカルフラグメントの残基１、２、３、又は６に少なくとも１つのアラニンを含む。
【０００９】
１つの例の実施形態において、（ａ）ボツリヌス毒素（ＢｏＮＴ）軽鎖と、前記ＢｏＮＴ軽鎖のＮ末端に位置する３つのジンクフィンガーモチーフとを含む第１の鎖と、（ｂ）ＢｏＮＴ重鎖と、前記ＢｏＮＴ重鎖のＣ末端に位置する３つのジンクフィンガーモチーフとを含む第２の鎖とを含み、ＢｏＮＴ軽鎖がジスルフィド結合を介してＢｏＮＴ軽鎖に結合している、二本鎖ポリペプチドを提供する。同様に、１つの実施形態において、Ｎ末端からＣ末端に、３つのジンクフィンガーモチーフ、ボツリヌス毒素（ＢｏＮＴ）軽鎖、ボツリヌス毒素（ＢｏＮＴ）重鎖、及び更に３つのジンクフィンガーモチーフを含む、キメラポリペプチドを提供する。
【００１０】
いくつかの実施形態において、ジンクフィンガーモチーフの少なくとも１つが、配列番号１及び５〜７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ジンクフィンガーモチーフが、配列番号１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のジンクフィンガーが、ＢｏＮＴ軽鎖又はＢｏＮＴ重鎖のＣ末端から２００アミノ酸残基以下離れている。
【００１１】
いくつかの実施形態において、ＢｏＮＴが、ＢｏＮＴ  Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、又はそれらと少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体から選択される。いくつかの実施形態において、ＢｏＮＴが、ＢｏＮＴのサブタイプＡ１〜Ａ１０、Ｂ１〜Ｂ８、Ｅ１〜Ｅ９、及びＦ１〜Ｆ７から選択される。いくつかの実施形態において、ＢｏＮＴが、ＢｏＮＴ  Ａである。いくつかの実施形態において、ＢｏＮＴ軽鎖が、配列番号８のアミノ酸配列又は配列番号８と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ配列を含む。いくつかの実施形態において、ＢｏＮＴ重鎖が、配列番号９のアミノ酸配列又は配列番号９と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ配列を含む。
【００１２】
いくつかの実施形態において、キメラポリペプチドが、配列番号１０〜１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む一本鎖ポリペプチド、又は前記アミノ酸鎖から処理された二本鎖ポリペプチドを含む。
【００１３】
また、１つの実施形態において、ボツリヌス毒素（ＢｏＮＴ）軽鎖と少なくとも１つのジンクフィンガーモチーフとを含む、キメラポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態において、キメラポリペプチドは、２０００以下のアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態において、ジンクフィンガーモチーフは、ＢｏＮＴ軽鎖のＣ末端に位置し、且つ、ＢｏＮＴ軽鎖から２００アミノ酸残基しか離れていない。
【００１４】
本発明の別の実施形態は、治療用ペプチドと、治療用ペプチドのＣ末端に位置する少なくとも１つのジンクフィンガーモチーフとを含み、ジンクフィンガーモチーフのＮ末端が、治療用ペプチドのＣ末端から１００アミノ酸残基しか離れていない、キメラポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態において、治療用ペプチドが、上皮成長因子（ＥＧＦ）及びスーパーオキシド・ジスムターゼ（ＳＯＤ）からなる群から選択される。
【００１５】
医薬品の製造のための使用及び治療方法も提供する。いくつかの実施形態において、本発明のキメラＢｏＮＴポリペプチドを含む製剤を局所適用することを含む、ＢｏＮＴ軽鎖を哺乳動物被験体に投与する方法を提供する。いくつかの実施形態において、投与は、代わりに筋肉内とすることもできる。
【００１６】
いくつかの実施形態において、局所適用は、皮膚、又は眼、耳、鼻、口、唇、尿道口、肛門、若しくは舌の粘膜に対してである。いくつかの実施形態において、局所適用は、破壊された皮膚の角質層に対してである。いくつかの実施形態において、破壊が、製剤の送達に使用される針又は極微針を用いて行われる。いくつかの実施形態において、局所適用は、被験体の顔又は首の皮膚に対してである。いくつかの実施形態において、製剤は、クリーム、ゲル、又はスプレーを含む。
【００１７】
いくつかの実施形態において、被験体は、顔の皺、ジストニア、痙縮、片側顔面痙攣、多汗症、又は唾液分泌過多症の処置の必要がある。
【００１８】
また、特定の実施形態において、本発明のキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドを含む細胞、及びポリペプチドを含む製剤を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、実施例で試験された種々のＢｏＮＴＡ融合タンパク質の構造を示す。
【図２】図２は、パネルＡとＢにより、大腸菌から発現したＢｏＮＴＡ−ＣＰＰ組み換え融合タンパク質の精製結果を示す。（Ａ）ＴＡＴ及びＰｅｐ−１では、タンパク質の発現及び精製の収率が良好ではなかった。（Ｂ）ＢｏＮＴＡ−ＺＦＰ（タンパク質番号６）は、タンパク質の発現及び精製の収率が良好だった。
【図３】図３は、細胞透過性ＢｏＮＴＡタンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの活性のＳＮＡＰｔｉｄｅアッセイの結果を示す。ポジティブコントロールは、市販の組み換えＢｏＮＴＡ軽鎖（ＢｏＮＴＡ−ＬＣ、Ｒ＆Ｄシステムズ）である。Ｍｏｃｋは、ＳＮＡＰｔｉｄｅのみの反応である。
【図４】図４は、細胞浸透性ＢｏＮＴＡタンパク質で処置したヒト皮膚線維芽細胞の細胞溶解のＳＮＡＰｔｉｄｅアッセイの結果を示す。ネガティブコントロールは、市販の組み換えＢｏＮＴＡ−ＬＣ（Ｒ＆Ｄシステムズ）である。
【図５】図５は、細胞浸透性ＢｏＮＴＡタンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏでの効果の代表的な画像を示す。
【図６】図６は、細胞透過性ＢｏＮＴＡタンパク質で処置したマウスの指外転（ｄｉｇｉｔ  ａｂｄｕｃｔｉｏｎ）の散布図である。Ａ：０．９％ＮａＣｌ生理食塩水で処置。Ｂ：ＢＯＴＯＸを注射。Ｃ：極微針での前処置後、ＢＯＴＯＸで処置。Ｄ：極微針での前処置後、細胞浸透性ＢｏＮＴＡ−ＺＦＰ（タンパク質番号６）で処置。Ｅ：極微針での前処置なしで、細胞透過性ＢｏＮＴＡ−ＺＦＰ（タンパク質番号６）で処置。
【図７】図７は、昆虫細胞におけるＢｏＮＴＡ−ＺＦＰ（タンパク質番号６）の発現を示す。Ｍ：タンパク質マーカー。Ｔ：全細胞溶解物。Ｓ：可溶性フラクション。＋：ローディングコントロール。
【図８】図８は、ＢｏＮＴＡ−ＺＦＰの筋肉麻痺作用を分析するためのトレッドミル実験の試験結果を示す。
【図９】図９は、ＢｏＮＴＡ−ＺＦＰの筋肉麻痺作用を分析するための平均台実験の試験結果を示す。
【図１０】図１０は、ＢｏＮＴＡ−ＺＦＰの筋肉麻痺作用を分析するための足跡実験の試験結果を示している。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
定義
用語「１つ（ａ）」又は「１つ（ａｎ）」の実体は、その実体の１つ又は複数を指すことに留意されたい。例えば、「１つの抗体（ａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、１つ又は複数の抗体を表すと理解される。従って、用語「１つ（ａ）」（又は「１つ（ａｎ）」）、「１つ又は複数」、及び「少なくとも１つ」は、本明細書において互換的に使用することができる。
【００２１】
本明細書で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、単一の「ポリペプチド」並びに複数の「ポリペプチド」を包含するよう意図されており、アミド結合（ペプチド結合としても知られる）により線状に結合されるモノマー（アミノ酸）で構成される分子を指す。用語「ポリペプチド」は、２つ以上のアミノ酸の任意の鎖（複数可）を指し、特定の長さの産生物を指すものではない。そのため、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、又は２つ以上のアミノ酸の鎖（複数可）を指すために使用される任意の他の用語は、「ポリペプチド」の定義内に含まれ、用語「ポリペプチド」は、これらの用語のいずれかの代わりに、又はそれらと互換的に使用してもよい。用語「ポリペプチド」はまた、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解切断、又は非天然型アミノ酸による修飾を制限なく含む、ポリペプチドの発現後修飾の産生物を指すことも意図する。ポリペプチドは、天然の生物源に由来しても、組み換え技術により産生されてもよいが、必ずしも指定された核酸配列から翻訳されるわけではない。ポリペプチドは、化学合成を含め、任意の様式で生成されてよい。
【００２２】
本明細書で使用される場合、細胞、ＤＮＡ又はＲＮＡ等の核酸に関する用語「単離された」は、それぞれ高分子の自然源に存在する他のＤＮＡ又はＲＮＡから分離された分子を指す。また、本明細書で使用される場合、用語「単離された」は、組み換えＤＮＡ技術により産生された場合の細胞材料、細菌材料、若しくは培地、又は化学合成された場合の前駆体化学物質又は他の化学物質を実質的に含まない核酸又はペプチドを指す。更に、「単離された核酸」は、断片として自然発生せず、自然の状態では発見されない核酸断片を含むことが意図される。また、用語「単離された」は、本明細書において、他の細胞タンパク質又は組織から単離された細胞又はポリペプチドを指すために使用される。単離されたポリペプチドは、精製されたポリペプチドと組み換えポリペプチドの両方を包含することが意図される
【００２３】
本明細書で使用される場合、ポリペプチド又はポリヌクレオチドに係る用語「組み換え」は、天然に存在しないポリペプチド又はポリヌクレオチドの一種を意図し、限定されない例は、通常は同時に生じないポリヌクレオチド又はポリペプチドを組み合わせて作製することができる。
【００２４】
「相同性」又は「同一性」又は「類似性」は、２つのペプチド間又は２つの核酸分子間の配列類似性を指す。相同性は、比較のために並べることが可能な各配列中の位置を比較することにより、決定することができる。比較した配列のある位置が同じ塩基又はアミノ酸で占められている場合、これらの分子はその位置においては相同である。配列間の相同性の程度は、配列が共有する対合又は相同的位置の数の関数である。「無関係」又は「非相同的」配列は、本発明の配列の１つと４０％未満の同一性、好ましくは２５％未満の同一性を共有する。
【００２５】
ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド領域（或いは、ポリペプチド又はポリペプチド領域）が、別の配列と特定のパーセンテージ（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８」％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％）の「配列の同一性」を有するとは、位置合せをしたときに、２つの配列の比較においてその割合の塩基（又はアミノ酸）が同じであることを意味する。
【００２６】
用語「同等の核酸又はポリヌクレオチド」は、核酸又はその相補鎖のヌクレオチド配列とある程度の相同性又は配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する核酸を指す。二本鎖核酸の相同体は、二本鎖核酸又はその相補鎖とある程度の相同性を有するヌクレオチド配列を有する核酸を含むことを意図する。１つの態様において、核酸の相同体は、核酸又はその相補鎖とハイブリダイズすることができる。同様に、「同等のポリペプチド」とは、参照ポリペプチドのアミノ酸配列とある程度の相同性又は配列同一性を有するポリペプチドを指す。いくつかの態様において、配列同一性は、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％である。いくつかの態様において、同等のポリペプチド又はポリヌクレオチドは、参照ポリペプチド又はポリヌクレオチドと比較して、１、２、３、４、又は５つの付加、欠損、置換、及びそれらの組み合わせを有する。いくつかの態様において、同等の配列は、参照配列の活性（例えば、エピトープ結合）又は構造（例えば、塩橋）を保持する。
【００２７】
ハイブリダイゼーション反応は、異なる「ストリンジェンシー」の条件下で、実施することができる。一般に、低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション反応は、約４０℃で、約１０×ＳＳＣ又は同等のイオン強度／温度の溶液で行われる。中程度ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、典型的には、約５０℃、約６×ＳＳＣで行われ、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、一般に、約６０℃、約１×ＳＳＣで行われる。又はイブリダイゼーション反応は、当業者に周知の「生理学的条件」下で行うこともできる。生理的条件の非限定的な例は、細胞内で通常見出される温度、イオン強度、ｐＨ、及びＭｇ２＋の濃度である。
【００２８】
ポリヌクレオチドは、４つのヌクレオチド塩基：アデニン（Ａ）；シトシン（Ｃ）；グアニン（Ｇ）；チミン（Ｔ）；及びポリヌクレオチドがＲＮＡの場合はチミンの代わりにウラシル（Ｕ）の特定の配列で構成される。従って、用語「ポリヌクレオチド配列」は、ポリヌクレオチド分子のアルファベット表現である。このアルファベット表現は、中央処理ユニットを備えたコンピューターのデータベースに入力し、機能ゲノミクス及び相同性検索等のバイオインフォマティクスアプリケーションに使用することができる。用語「多型」は、遺伝子又はその部分の１つ超の形の共存を指す。少なくとも２つの異なる形、即ち、２つの異なるヌクレオチド配列がある遺伝子の部分は、「遺伝子の多型領域」と称される。多型領域は、単一のヌクレオチドであり得、その同一性は、異なる対立遺伝子で異なる。
【００２９】
用語「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」は、交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチド又はそれらの類似体のいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマーの形を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有することができ、既知又は未知の任意の機能を実施する可能性がある。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子又は遺伝子断片（例えば、プローブ、プライマー、ＥＳＴ、又はＳＡＧＥタグ）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、組み換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ及びプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体等の修飾ヌクレオチドを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリヌクレオチドのアセンブリーの前又は後に付与することができる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成要素により中断され得る。ポリヌクレオチドは、標識化構成要素とのコンジュゲーション等により、重合後更に修飾することができる。この用語はまた、二本鎖分子と一本鎖分子の両方を指す。別段に特定又は要求されない限り、ポリヌクレオチドである本発明の任意の実施形態は、二本鎖形態、及び二本鎖形態を構成することが公知であるか又は予測される２つの相補的な一本鎖形態の各々の両方を包含する。
【００３０】
ポリヌクレオチドに適用する用語「コードする」は、天然の状態で又は当業者に周知の方法で操作されたときに、転写及び／又は翻訳されて、ポリペプチド及び／又はその断片に対するｍＲＮＡを産生することができる場合、そのポリペプチドを「コードする」と言われるポリヌクレオチドを指す。アンチセンス鎖は、そのような核酸の相補鎖であり、そこからコード配列を推定することができる。
【００３１】
本明細書で使用される場合、用語「ジスルフィド結合」は、２つの硫黄原子間で形成される共有結合性結合を含む。アミノ酸システインは、ジスルフィド結合を形成するか、又は第２のチオール基と架橋することができるチオール基を含む。
【００３２】
本明細書で使用される場合、用語「処置する」又は「処置」は、治療的処置と予防的又は防止的手段の両方を指し、目的は、望ましくない皺等の望ましくない生理学的変化又は障害を防止又は遅くする（減らす）ことである。有益な又は所望の臨床結果には、検出可能又は検出不可能に関わらず、症状の軽減、疾患の程度の減弱、疾患の安定化（すなわち、悪化しない）状態、疾患進行の遅延又は減速、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解（部分的又は全体的に関わらず）が挙げられるが、それらに限定されない。「処置」はまた、処置を受けなかった場合の予想される生存と比較して、生存の延長を意味し得る。処置を必要とするものとしては、状態若しくは障害をすでに有するもの、加えて、状態若しくは障害を有する傾向にあるもの、又は状態若しくは障害が防止されるべきであるものが挙げられる。
【００３３】
「被験体」又は「個体」又は「動物」又は「患者」又は「哺乳動物」とは、診断、予後診断、又は治療が望まれる任意の被験体、特に哺乳動物被験体を意味する。哺乳動物被験体には、ヒト、家畜動物、農場動物、及び動物園、スポーツ、又はペット動物、例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、畜牛、雌ウシ等が挙げられる。
【００３４】
本明細書で使用される場合、「処置を必要とする患者へ」又は「処置を必要とする被験体」等の句は、例えば、検出のために、診断手順のために、及び／又は処置のために使用される本発明の抗体又は組成物の投与から利益を得るであろう、哺乳動物被験体等の被験体を含む。
【００３５】
ジンクフィンガーモチーフを有するキメラポリペプチド
ＢｏＮＴタンパク質の経皮送達は、市場で必要とされている。タンパク質の経皮送達は本質的に困難であり、特に皮膚の通過が困難である。皮膚は、表皮及び真皮として知られる細胞の２つの層で構成される。皮膚の最上層である表皮は、基底と分化したケラチノサイトとで構成される層状の扁平上皮である。ケラチノサイトは、表皮の主要な細胞型である。基底層のケラチノサイトは、有糸分裂を通じて増殖し、複数の細胞分化段階を経て、無核細胞になる。無核又は分化したケラチノサイトは、高度に組織化された組織構造であり、病原体等の侵入物質に対する保護バリアを提供するケラチンタンパク質及び脂質を分泌する。
【００３６】
経皮ＢｏＮＴ組成物の開発は成功していなかった。しかしながら、本発明は、ＢｏＮＴポリペプチドを１つ又は複数のジンクフィンガーモチーフ（又はジンクフィンガータンパク質ドメイン、又はＺＦＰ）に融合させることにより、ＢｏＮＴの皮膚浸透を可能にすることができることを示す。ジンクフィンガータンパク質は、天然の転写因子であり、標的ゲノム遺伝子座を認識するように再プログラムすることができる。ジンクフィンガーヌクレアーゼ−キメラタンパク質は、Ｎ末端ＺＦＰドメインとＣ末端Ｆｏｋ  Ｉエンドヌクレアーゼドメインとを含み、本質的に細胞透過性であることが示されている。一部のＺＦＰは、Ｃｙｓ２−Ｈｉｓ２ドメインを含む。Ｃｙｓ２−Ｈｉｓ２ＺＦＰは、ββα構造を有する約３０のアミノ酸で構成される。
【００３７】
この発見は驚くべきことであり、少なくとも以下の理由から予想外である。第一に、動物の皮膚を横切って大きなタンパク質を効率的に送達する能力は、それ自体が驚くべきことであり、予想外である。特に、ＺＦＰの細胞透過活性は、エネルギー依存的であることが知られていた。これは、皮膚の最外層であり、死んだ角質細胞から形成される角質層において、あるとしてもごく限られた効率であると予測されたことを意味し、死んだ角質細胞は、物理的又は化学的手段で破壊されても、依然として、典型的な生物学的分子に対して乗り越えられないバリアを構成する。
【００３８】
第二に、ＺＦＰは亜鉛依存性メタロプロテアーゼであり、ボツリヌス毒素の活性は、プロテアーゼ阻害剤及び亜鉛キレート剤によって阻害される可能性があるため、亜鉛を必要とすることも知られている。ＺＦＰ及びＢｏＮＴは、どちらも亜鉛イオンの取り込みを必要とするため、融合タンパク質中にＺＦＰ及びＢｏＮＴの両方が存在すると、それらの間の干渉を引き起こし、それにより活性が低下するか、又は不活化すらする疑いがあった。
【００３９】
これに関して、本発明者らは、ＢｏＮＴのＣ末端方向でＺＦＰを融合することにより、このような干渉を回避又は低減することができることを構想した。加えて、又は代わりに、二要素（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）（タンデム）ＺＦＰの使用により、確実にＺＦＰの活性を維持することができた。
【００４０】
第三に、実施例で実証されたように、ＢｏＮＴ−ＺＦＰ融合タンパク質は、細菌細胞から大量に発現され、これは、ＢｏＮＴを、一般に研究される２つの細胞透過性ペプチド、ＴＡＴ又はＰｅｐ−１と融合させた場合よりもはるかに高かった。この効果への示唆はなく、予想外でもあった。
【００４１】
最後に、発現したＢｏＮＴ−ＺＦＰ融合タンパク質は、高い酵素活性を示した（例えば、図３参照）だけでなく、細胞メンバーを越えて細胞内空間に入った後も、当該活性を保持した（例えば、図４参照）。更に、ｉｎ  ｖｉｖｏ設定で用いた場合、好ましくは極微針で処置した動物の皮膚に局所適用したＢｏＮＴＡ−ＺＦＰ融合タンパク質は、注射したＢｏＮＴＡと同様に筋肉麻痺をもたらした。そのような治療効果が局所製剤で達成されることは当該技術分野において予想されていなかったため、このこともまた、驚くべきことであった。
【００４２】
従って、本発明の１つの実施形態において、（ａ）ボツリヌス毒素（ＢｏＮＴ）軽鎖と、（ｂ）ＢｏＮＴ軽鎖のＣ末端に位置するジンクフィンガーモチーフとを含むキメラ（又は融合）ポリペプチドを提供する。
【００４３】
また、１つの実施形態において、（ａ）ボツリヌス毒素（ＢｏＮＴ）軽鎖と、（ｂ）ＢｏＮＴ重鎖と、（ｃ）ＢｏＮＴ重鎖のＣ末端に位置するジンクフィンガーモチーフとを含むキメラ（又は融合）ポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態において、軽鎖と重鎖とは同じペプチド鎖上にある。いくつかの実施形態において、軽鎖は、重鎖のＮ末端側にある。いくつかの実施形態において、軽鎖は、重鎖のＣ末端側にある。いくつかの実施形態において、軽鎖と重鎖とは異なるペプチドペプチド鎖上にあり、ジスルフィド結合で結合している。
【００４４】
また、いくつかの実施形態において、ボツリヌス毒素（ＢｏＮＴ）軽鎖と少なくとも１つのジンクフィンガーモチーフとを含むキメラポリペプチドを提供する。１つの実施形態において、キメラポリペプチドは更にＢｏＮＴ重鎖を含む。
【００４５】
いくつかの実施形態において、キメラポリペプチド全体のサイズは、５０００アミノ酸残基以下、或いは、４０００アミノ酸残基以下、３０００アミノ酸残基以下、２０００アミノ酸残基り、１８００アミノ酸残基以下、１６００アミノ酸残基以下、１５００アミノ酸残基以下、１４００アミノ酸残基以下、１３００アミノ酸残基以下、１２００アミノ酸残基以下、１１００アミノ酸残基以下、１０００アミノ酸残基以下、９００アミノ酸残基以下、８００アミノ酸残基以下、７００アミノ酸残基以下、６００アミノ酸残基以下、５００アミノ酸残基以下、４５０アミノ酸残基以下、４００アミノ酸残基以下、３５０アミノ酸残基以下、３００アミノ酸残基以下、２５０アミノ酸残基以下、又は２００アミノ酸残基以下である。
【００４６】
ボツリヌス毒素には少なくとも７つのタイプがあり、タイプＡ−Ｇと名付けられている。タイプＡ及びＢは、ヒトの病気を引き起こすことができ、商業的にも医学的にも使用されている。タイプＣ〜Ｇは、あまり一般的ではない。ボツリヌス毒素タイプＡ及びＢは、過過剰活性筋肉を特徴とする様々な筋肉の痙攣及び疾患を治療するために医学の分野で使用される。各ＢｏＮＴ血清型には、サブタイプがある場合がある。例えば、次のサブタイプが知られている：ＢｏＮＴ  Ａ１〜Ａ１０、Ｂ１〜Ｂ８、Ｅ１〜Ｅ９、Ｆ１−Ｆ〜７。
【００４７】
用語ＢｏＮＴ、又はＢｏＮＴの特定のタイプ、又はＢｏＮＴのサブタイプは、それらの等価のポリヌクレオチド、例えば、あるレベル（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％）の配列同一性を有するポリヌクレオチド、又は１つ又は複数のアミノ酸残基の付加、欠損、又は置換により修飾されたポリヌクレオチドも同様に包含する。いくつかの実施形態において、置換は、同類アミノ酸置換である。
【００４８】
「同類アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似した側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられているものである。類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で規定されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝状側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。従って、ポリペプチドの非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基に置き換えられることが好ましい。別の実施形態において、アミノ酸鎖は、側鎖ファミリーメンバーの順序及び／又は組成が異なる構造的に類似の鎖に置き換えることができる。
【００４９】
同類アミノ酸置換の非限定的な例を、以下の表に提供する。表中、０以上の類似性スコアは、２つのアミノ酸間の同類置換を示す。
【表１−１】
2020532316.tif 000002
【表１−２】
2020532316.tif 000003
【００５０】
いくつかの実施形態において、ＢｏＮＴペプチドは、天然のＢｏＮＴペプチドからの上記置換を１つのみ、２つのみ、又は３つのみ含む。
【００５１】
ＢｏＮＴ軽鎖の非限定的な例としては、配列番号８（ＢｏＮＴ  Ａ軽鎖）及び配列番号８と少なくとも９０％（或いは、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％）の配列同一性を有するアミノ配列が挙げられる。ＢｏＮＴ重鎖の非限定的な例としては、配列番号９（ＢｏＮＴ  Ａ重鎖）及び配列番号９と少なくとも９０％（或いは、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％）の配列同一性を有するアミノ配列が挙げられる。配列番号８及び９のアミノ酸配列は、以下の表２に提供する。
【表２】
2020532316.tif 000004
【００５２】
「ジンクフィンガーモチーフ」は、折り畳みを安定させるための１つ又は複数の亜鉛イオンの配位を特徴付とする、小さなタンパク質構造モチーフである。一般に、ジンクフィンガーは、システイン残基とヒスチジン残基との組み合わせに亜鉛イオンを配位させる。これらの残基の数及び順序を用いて、異なるタイプのジンクフィンガーを分類することができる（例えば、Ｃｙｓ２Ｈｉｓ２、Ｃｙｓ４、及びＣｙｓ６）。更に別の方法では、ジンクフィンガータンパク質を、折り畳まれたドメイン内のタンパク質主鎖の全体的な形状に基づいて、折り畳みグループに分類する。ジンクフィンガーの最も多い折り畳み群は、Ｃｙｓ２Ｈｉｓ２（クラシックジンクフィンガー）、トレブルクレフ（ｔｒｅｂｌｅ  ｃｌｅｆ）、亜鉛リボン、ｇａｇナックル、Ｚｎ２／Ｃｙｓ６、及びＴＡＺ２ドメイン等である。
【００５３】
Ｃｙｓ２Ｈｉｓ２折り畳み群は、単純なββα折り畳みを採用し、アミノ酸配列モチーフ：Ｘ２−Ｃｙｓ−Ｘ２，４−Ｃｙｓ−Ｘ１２−Ｈｉｓ−Ｘ３，４，５−Ｈｉｓを有する。
【００５４】
個々のジンクフィンガードメインは、タンデムリピートとして、タンパク質のＤＮＡ結合ドメインを含む２つ、３つ、又はそれ以上のフィンガーで生じ得る。
【００５５】
ジンクフィンガーモチーフは、修飾してＤＮＡ結合能を除去又は低減することができる。例えば、修飾Ｃｙｓ２Ｈｉｓ２は、ジンクフィンガーモチーフのアルファ−ヘリカルフラグメントの残基１、２、３、又は６に少なくともアラニンを含む。ジンクフィンガーモチーフの非限定的な例を以下の表３に示す。表３の配列の一部、配列番号１及び５〜７は、単独のジンクフィンガーモチーフであるが、その他少数（ジンクフィンガーモチーフのタンデム）の配列番号２〜４は、複数の連結ジンクフィンガーモチーフを含む。２つ以上のジンクフィンガーがタンデムで用いられる場合、それらは、互いにすぐ隣に位置するか、又はペプチドリンカーを介して結合することができる。即ち、１、２、又は３アミノ酸残基から２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０アミノ酸残基の長さの短いペプチドである。配列番号１の修飾アラニン残基に下線を引き、太字で示す。
【表３】
2020532316.tif 000005
【００５６】
いくつかの実施形態において、キメラポリペプチドは、ＢｏＮＴ軽鎖のＮ末端側に位置するジンクフィンガーモチーフを更に含む。いくつかの実施形態において、キメラポリペプチドは、ＢｏＮＴ重鎖のＮ末端側にジンクフィンガーモチーフを更に含む。いくつかの実施形態において、キメラポリペプチドは、二本鎖ポリペプチドであり、ＢｏＮＴ軽鎖のＣ末端側にジンクフィンガーモチーフ（或いは、２つのジンクフィンガー又は３つのジンクフィンガーのタンデム）を含む。いくつかの実施形態において、キメラポリペプチドは、二本鎖ポリペプチドであり、ＢｏＮＴ軽鎖のＣ末端側にジンクフィンガー（或いは、２つのジンクフィンガー又は３つのジンクフィンガーのタンデム）と、ＢｏＮＴ重鎖のＮ末端側にジンクフィンガー（或いは、２つのジンクフィンガー又は３つのジンクフィンガーのタンデム）を含む。
【００５７】
いくつかの実施形態において、ジンクフィンガーモチーフの少なくとも１つは、少なくとも１つ又は２つ以上のジンクフィンガーモチーフに連結して、二要素又は三要素（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）ジンクフィンガーモチーフ（例えば、タンデムジンクフィンガーモチーフ）を形成する。いくつかの実施形態において、タンデムジンクフィンガーモチーフは、これらの間に、ゼロ、１、２、３、４、又は５アミノ酸残基有する。
【００５８】
ＢｏＮＴ軽鎖、重鎖、及びジンクフィンガーモチーフ間の距離は、所望や必要に応じて調整することができる。いくつかの実施形態において、ジンクフィンガーは、隣接するＢｏＮＴ軽鎖又は重鎖のＮ末端又はＣ末端から２００アミノ酸残基以下離れている。いくつかの実施形態において、距離は、０〜約１５０、５〜１００、１０〜７５、１０〜５０、１０〜４０、１０〜３０、１０〜２０、２０〜１５０、２０〜１００、２０〜５０、又は５０〜１００のアミノ酸残基である。いくつかの実施形態において、スペーサー配列（例えば、アラニンの、グリシンの、又はそれらの組み合わせの）を挿入することにより距離がもたらされる。
【００５９】
キメラポリペプチド配列の非限定的な例を、配列番号１０〜１７に提供する（表３）。これらの配列のいくつかは、ＢｏＮＴ軽鎖及びＢｏＮＴ重鎖の両方を含み、これらの配列は、非切断一本鎖型及び非切断二本鎖型の両方を包含する。
【表４−１】
2020532316.tif 000006
【表４−２】
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【表４−３】
2020532316.tif 000008
【表４−４】
2020532316.tif 000009
【００６０】
更に、本技術は、上皮成長因子（ＥＧＦ）及びスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）等の他の治療用ペプチドにも制限なく適用することができると考えられる。従って、１つの実施形態において、本発明は、治療用ペプチド及び少なくとも１つのジンクフィンガーモチーフを含むキメラポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態において、ジンクフィンガーモチーフは、治療用ペプチドのＣ末端側に位置する。いくつかの実施形態において、ジンクフィンガーモチーフは、治療用ペプチドから１００アミノ酸残基しか（或いは、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、又は５アミノ酸残基しか）離れていない。いくつかの実施形態において、ジンクフィンガーモチーフは、もう１つのジンクフィンガーモチーフに連結して、二要素ジンクフィンガーモチーフを形成する。いくつかの実施形態において、キメラポリペプチドは、治療用ペプチドのＮ末端側とＣ末端側の両方にジンクフィンガーモチーフ（又は二要素ジンクフィンガーモチーフ）を含む。
【００６１】
いくつかの実施形態において、治療用ペプチドは、ＥＧＦ及びＳＯＤから選択され、それらの配列例を表５に示す。また、ジンクフィンガーモチーフの例、スペーサー配列の例、及びジンクフィンガーモチーフと治療用ペプチド間の距離も本明細書で説明する。
【表５】
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【００６２】
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、治療薬、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生物学的反応修飾物質、医薬品、又はＰＥＧにコンジュゲートしてもよい。ポリペプチドは、放射性標識等の検出可能な標識を含むことができる治療薬、免疫調節薬、ホルモン、酵素、オリゴヌクレオチド、光活性治療又は診断薬、薬物又は毒素であってよい細胞毒性薬、超音波増強剤、非放射性標識、それらの組み合わせ、及び当該技術分野で知られている他のそのような薬剤にコンジュゲート又は融合してもよい。
【００６３】
ポリペプチドは、化学発光化合物にカップリングすることにより、検出可能に標識することができる。次いで、化学発光タグ化抗原結合ポリペプチドの有無を、化学反応の過程で生じる発光の有無を検出することにより決定する。特に有用な化学発光標識化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、芳香族（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ）アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、及びシュウ酸エステルである。
【００６４】
また、ポリペプチドは、ランタニド系列の１５２Ｅｕ又は他の金属等の蛍光発光金属を用いて検出可能に標識することもできる。これらの金属は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）又はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等の金属キレート基を用いて、抗体に結合させることができる。
【００６５】
また、本発明は、単離したポリヌクレオチド又はポリペプチドをコードする核酸分子、本発明のポリペプチドの変異体又は誘導体を提供する。本発明のポリヌクレオチドは、同じポリヌクレオチド分子又は別のポリヌクレオチド分子上に、ポリペプチド、その変異体又は誘導体の重鎖及び軽鎖全体をコードしていてもよい。更に、本発明のポリヌクレオチドは、同じポリヌクレオチド分子又は別のポリヌクレオチド分子上に、ポリペプチド、その変異体又は誘導体の重鎖及び軽鎖の一部をコードしていてもよい。
【００６６】
融合ポリペプチド又はそのドメインをコードするポリヌクレオチドは、「発現ベクター」に挿入することができる。用語「発現ベクター」は、プラスミド、ウイルス、又は本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むように設計することができる、当該技術分野で知られている他の媒体等の遺伝的構築物を指す。そのような発現ベクターは、典型的には、宿主細胞において挿入された遺伝的配列の転写を促進するプロモーター配列を含むプラスミドである。発現ベクターは、典型的には、複製の起源及びプロモーター、並びに形質転換細胞の表現型選択を可能にする遺伝子（例えば、抗生物質抵抗性遺伝子）を含む。誘導性及び構成的プロモーターを含む種々のプロモーターを本発明で使用することができる。典型的には、発現ベクターは、宿主細胞と互換性のある種由来のレプリコンサイト及び制御配列を含む。
【００６７】
ポリヌクレオチドによる宿主細胞の形質転換又はトランスフェクションは、当業者に周知の従来技術を用いて実施することができる。例えば、宿主細胞が大腸菌である場合、ＤＮＡを取り込むことが可能なコンピテント細胞は、当該技術分野で公知のＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、又はＲｂＣｌ法を用いて調製することができる。或いは、エレクトロポレーション又はマイクロインジェクション等の物理的手段を使用することができる。エレクトロポレーションは、高電圧の電気インパルスにより細胞内にポリヌクレオチドを移入することができる。更に、当該技術分野で周知の方法を用いて、プロトプラスト融合によりポリヌクレオチドを宿主細胞に導入することができる。エレクトロポレーション及びリポフェクション等の真核細胞を形質転換するための適切な方法もまた、公知である。
【００６８】
本発明に包含される「宿主細胞」は、本発明のポリヌクレオチドが、融合ポリペプチド又はその機能ドメインを発現するために用いることができる任意の細胞である。また、この用語には、宿主細胞の子孫が含まれる。有用な宿主細胞としては、細菌細胞（例えば、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ））、真菌細胞（例えば、酵母細胞）、昆虫細胞（例えば、スポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ））、植物細胞、及び動物細胞が挙げられる。本発明の融合ポリペプチドは、原核生物において融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現させることにより生成することができる。これらとしては、本発明の融合ポリペプチドをコードする組み換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、又はコスミドＤＮＡベクターにより形質転換された細菌等の微生物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、又はエレクトロポレーションにより達成することができる。
【００６９】
構築物は、ＢｏＮＴタンパク質が自然に産生される場であるボツリヌス菌で発現することができる。ＢｏＮＴの軽鎖及び／又は重鎖を含むキメラタンパク質を昆虫細胞（例えば、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）Ｓｆ９）で効率的に産生することができることは、本発明の驚くべき発見である。従って、１つの実施形態において、宿主細胞は、鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）細胞、ヤガ科（Ｎｏｃｔｕｉｄａｅ）細胞、スポドプテラ細胞、及びヨトウガ細胞等の昆虫細胞とすることができる。
【００７０】
組み換えタンパク質の長期にわたる高収量産生には、通常、安定した発現が使用される。複製のウイルス起源を含む発現ベクターを用いるよりもむしろ、宿主細胞を、適切な発現制御要素（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネータ、ポリアデニル化部位等）及び選択可能なマーカーにより制御された、本発明の融合ポリペプチドをコードするｃＤＮＡで、形質転換することができる。選択可能なマーカーは、選択的殺傷剤に対する耐性を付与し、異種ポリヌクレオチドの安定した組み込みにより、耐性細胞の成長を可能にする。そのような耐性細胞が増殖してフォーカスを形成し、次いでそのフォーカスは、細胞株にクローン化し、拡大することができる。
【００７１】
処置方法及び使用
本明細書で説明するように、本発明のジンクフィンガーモチーフ含有キメラ（融合）ポリペプチドは、効果的に経皮送達することができる。従って、キメラポリペプチドは、融合した治療用タンパク質に応じて、治療用途を有する。
【００７２】
ＢｏＮＴ軽鎖を含むキメラポリペプチドは、任意選択でＢｏＮＴ重鎖を更に含み、広範な美容及び治療用途がある。美容用途の場合、このようなキメラポリペプチドは、皺を処置し、口角又は上唇のラインを調整するのに有用である。治療においては、キメラポリペプチドは、ジストニア、痙縮、片側顔面痙攣、多汗症（過剰な発汗）、唾液分泌過多症（過剰な唾液）等の神経障害の処置に有用である。また、キメラポリペプチドは、排尿筋・括約筋筋失調、特発性排尿筋過活動、神経因性排尿筋過活動、尿閉、裂肛、良性前立腺肥大症等の泌尿器疾患に使用される場合がある。更なる適応として、消化器疾患、耳鼻咽喉科疾患、又はその他の医学的症状がある。いくつかの実施形態において、キメラポリペプチドは、顔の皺、ジストニア、痙縮、片側顔面痙攣、多汗症、又は唾液分泌過多症の処置に用いられる。
【００７３】
他の例では、ＥＧＦを含むキメラポリペプチドを、糖尿病性足潰瘍等の状態を処置するために、又は一般的な創傷治癒に使用することができる。更に別の例では、ＳＯＤペプチドを含むキメラポリペプチドを、皮膚へのフリーラジカルによる損傷、例えば、乳癌のための放射線後の線維症を軽減するために使用することができる。
【００７４】
キメラポリペプチドの局所適用は、被験体の皮膚部位、例えば、皮膚、又は眼、耳、鼻、口、唇、尿道口、肛門、若しくは舌の粘膜に行うことができる。特定の部分の例としては、制限されず、顔、首、頭、脚、肩、背中、手のひら、足、鼠径部、腋窩、肘、腕、膝、臀部、胴部、及び骨盤等が挙げられる。同様に、キメラポリペプチドは、これらの部分で筋肉内投与することもできる。
【００７５】
従って、いくつかの実施形態において、ジンクフィンガーモチーフを含むキメラペプチド、及び哺乳動物被験体に対する治療用ペプチドを含む製剤を局所的に又は筋肉内に適用することを含む、治療用ペプチド（例えば、ＢｏＮＴ、ＥＧＦ、又はＳＯＤ）を哺乳動物被験体に投与する方法を提供する。
【００７６】
いくつかの実施形態において、局所適用が皮膚の角質層に対する場合、角質層が破壊されることが好ましい。角質層の破壊は、実施例に示されるように、極微針等の針を用いて実施してもよい。或いは、適用を筋肉内にすることができる。
【００７７】
特定の患者に対する特定の投与量及び治療レジメンは、使用する特定のポリペプチド、その変異体又は誘導体、患者の年齢、体重、全身健康状態、性別、及び食生活、並びに投与時間、排泄率、薬物の組み合わせ、及び治療中の特定の疾患の重症度を含む様々な因子に依存する。医療従事者によるそのような因子の判断は、当該技術分野の通常のスキルの範囲内である。また、量は、治療を受ける個々の患者、投与の経路、製剤の種類、使用される化合物の特性、疾患の重症度、及び所望の効果に依存する。使用量は、当該技術分野で周知の薬理学的及び薬物動態学的原理により決定することができる。
【００７８】
組成物
本発明はまた、医薬品組成物を提供する。そのような組成物は、有効量のキメラポリペプチド及び許容可能な担体を含む。
【００７９】
特定の実施形態において、用語「薬学的に許容される」は、動物、特にヒトでの使用のために米国連邦政府又は州政府の規制機関により承認されること又は米国薬局方若しくは他の一般的に認識されている薬局方に列挙されることを意味する。更に、「薬学的に許容される担体」は、一般に、非毒性固体、半固体又は液体充填剤、希釈剤、封入材料、又は任意の補助製剤を指す。
【００８０】
用語「担体」は、治療薬を共に投与する希釈剤、アジュバント、賦形剤、又はビヒクルを指す。そのような薬学的担体は、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱物油、ゴマ油等の、石油、動物、植物又は合成起源のものを含めた、水及び油等の無菌液体とすることができる。医薬組成物を静脈内投与する場合は、水が好ましい担体である。また、生理食塩水及びデキストロース水溶液及びグリセロール溶液は、特に注射用液剤のための液体担体として用いることもできる。適切な医薬賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等が挙げられる。所望する場合は、組成物は、少量の湿潤剤若しくは乳化剤、又はｐＨ緩衝剤（酢酸塩、クエン酸塩、又はリン酸塩等）も含むことができる。また、ベンジルアルコール又はメチルパラベン等の抗菌剤；アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウム等の抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸等のキレート剤；及び塩化ナトリウム又はデキストロース等の張性調節剤も想定される。これらの組成物は、ゲル、クレーム、スプレー、溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、丸薬、カプセル、粉末、徐放性製剤等の形態をとることができる。組成物は、伝統的な結合剤及びトリグリセリド等の担体を用いて、坐薬として製剤化することができる。
【００８１】
また、特定の実施形態において、キメラポリペプチド、又はその組成物若しくは製剤、及びキメラポリペプチド、組成物、又は製剤の使用についての説明書を含む、キット及びパッケージを提供する。いくつかの実施形態において、キット又はパッケージは、キメラポリペプチド、組成物、又は製剤を送達するための針又は極微針を更に含む。上述のように、極微針は、皮膚の角質層を破壊し、それにより送達を改善するのに役立てることができる。
【００８２】
動物試験方法
現在、ラット指外転スコア（ＤＡＳ）アッセイは、ＢｏＮＴ誘導性骨格筋麻痺の評価のための主要な生理学的モデルである。このアッセイは、完全に客観的ではなく、誤差が生じやすい。いくつかの実施形態において、本発明は、動物のＢｏＮＴ誘導性骨格筋麻痺を定量的に測定するための新しい方法を説明する。
【００８３】
１つの例では、動物を、試験薬剤を与える前又は後にトレッドミルに置く。トレッドミルが開始されると、動物は、最長３０分の稼働時間で身体的に可能な限り長く移動するように強制される。動作の持続、距離、又は時間は、試験薬剤の効果を定量的に反映することができる（試験薬剤を与えない動物等の適切なコントロールを用いて）。
【００８４】
別の例では、動物を平均台に置き、もう一方の端に向かって歩くように動物を導く。バランスを保つ能力の低下をもたらす筋肉麻痺は、動物が平均台を渡るのにかかる時間に反映される。
【００８５】
更に別の例では、動物の足跡を測定し、立っている間又は歩いている間（トレッドミル上等）に測定する。足跡のサイズもまた、麻痺の程度の定量的測定となり得る。
【実施例】
【００８６】
実施例１：大腸菌からのＢｏＮＴＡ−ＣＰＰ融合タンパク質の発現及び精製
この実験は、ＢｏＮＴＡ−ＣＰＰ（細胞浸透性ペプチド）融合タンパク質を大腸菌細胞から発現及び精製できることを示している。
【００８７】
方法
タンパク質発現
異なるＢｏＮＴＡ構築物を含むｐＥＴ２８ｂベクター（タンパク質番号１〜８、図１）を、ＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌細胞に形質転換した。これらの構築物の配列は、配列番号１０−１７に示す。Ｈｉｓ６：ヒスチジンタグ；ＢｏＮＴＡ−ＬＣ：ＢｏＮＴ  Ａ軽鎖；ＢｏＮＴＡ−ＨＣ：ＢｏＮＴ  Ａ重鎖；ＺＦＰ２：タンデムジンクフィンガーペプチド（配列番号１）；ＴＡＴ：転写ペプチドの転写活性化因子；Ｐｅｐ−１：ｐｅｐ−１ペプチド。ＴＡＴ及びＰｅｐ−１は、細胞浸透性ペプチド（ＣＰＰ）として知られている。
【００８８】
単一コロニーを、寒天プレートから採取し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンと９０μＭのＺｎＣｌ２とを添加した１０ｍＬの溶原培地（ＬＢ培地）で３７°Ｃで一晩培養した。翌日、１０ｍＬのスターター培養物を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンと９０μＭのＺｎＣｌ２とを添加した１リットルのＬＢ培地に接種し、増殖させてＯＤ６００を０．８にした。タンパク質の発現を、０．１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）により２５°Ｃで４時間誘導した。細胞ペレットを、５，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により収集した。
【００８９】
タンパク質精製
２リットルの培養物からの細胞ペレット（約３０グラム）を２００ｍＬのＢｏＮＴＡ溶解バッファー（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、５００μＭ  ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１×プロテアーゼ混合物（ロシュ）、及び１０％グリセロール）に再懸濁し、氷上で３回超音波分解した。溶解した細胞を、２５，０００ｇで１時間、４°Ｃで遠心分離し、上清を新しいチューブに移した。この上清に１ｍＬ（沈定体積（（ｓｅｔｔｌｅｄ  ｖｏｌｕｍｅ））の平衡Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）を添加した。Ｈｉｓ６タグを含むＢｏＮＴＡタンパク質を、３０分間回転させて樹脂と結合させた。樹脂をカラムに移し、フロースルーは廃棄した。樹脂を５０ｍＬのＢｏＮＴＡ洗浄バッファー（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、５００ｍＭ  ＮａＣｌ及び１０％グリセロール、２０ｍＭイミダゾール）で洗浄し、次いで、５０ｍＬのＢｏＮＴＡ溶出バッファー（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、５００ｍＭ  ＮａＣｌ及び１０％グリセロール、３００ｍＭイミダゾール）で溶出した。次いで、溶出画分を濃縮した後、開始バッファー（２０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８．５）及び終了バッファー（２０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８．５、１Ｍ  ＮａＣｌ）を用いてイオン交換により更に精製した。最適な純度の画分を再度合わせ、スピン濃縮により濃縮し、１０％グリセロールを添加した後、更なる使用のために−８０℃で保存した。
【００９０】
結果及びデータ分析
ワンステップアフィニティー精製では、ごく低純度（ｏｎｌｙ  ｍｏｄｅｓｔ  ｐｕｒｉｔｙ）のタンパク質を得た。第２段階のイオン交換後、純度が大幅に向上した。総収量は、１リットルの培養当たり０．１ｍｇと推定され、最終産物の純度は９０％だった（図２パネルＡ−Ｂ）。驚くべきことに、ＺＦＰを用いた融合タンパク質は、細胞浸透性ペプチドを用いた融合よりも高いタンパク質発現及び精製をもたらした（ＴＡＴ及びＰｅｐ−１、図２、パネルＡ）。
【００９１】
この実施例は、ＢｏＮＴＡ−ＣＰＰ融合タンパク質を、大腸菌からの組み換えタンパク質として発現させ、アフィニティー精製及びその後のイオン交換により精製することができることを示している。
【００９２】
実施例２：ＢｏＮＴＡ−ＣＰＰ融合タンパク質によるボツリヌス基質の切断
この実験は、発現ＢｏＮＴＡ−ＣＰＰ融合タンパク質がＢｏＮＴ基質ＳＮＡＰ−２５に対して活性を有することを示している。
【００９３】
ＳＮＡＰｔｉｄｅ（商標）アッセイを用いたボツリヌス活性試験
ＳＮＡＰｔｉｄｅ（ミリポア、Ｃａｔ．Ｎｏ．５６７３３３−２００ＮＭＯＬ）を、反応バッファー（２０ｍＭ、ｐＨ７．４、０．２５ｍＭ  ＺｎＣｌ２、５ｍＭ  ＤＴＴ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で５μＭに希釈した。各組み換えＢｏＮＴＡ−ＺＦＰ融合タンパク質（２００ｎＭ；タンパク質番号１〜８）を、ＳＮＡＰｔｉｄｅを含む反応バッファーに添加した。反応は、３７°Ｃで４０分間インキュベートした。蛍光を、プレートリーダーを用いて励起波長３２０ｎｍ及び発光波長４２０ｎｍで記録した。ＳＮＡＰｔｉｄｅは、ＢｏＮＴＡの細胞内基質であるＳＮＡＰ−２５に由来する短いペプチドだった。ＳＮＡＰｔｉｄｅは、ＢｏＮＴＡの切断部位、並びに蛍光色素基及び消光基の両方を含んでいた。ペプチドの切断により、蛍光色素が遊離し、蛍光が活性化される。反応ポジティブコントロールは、Ｒ＆Ｄシステムズから購入した市販の組み換えＢｏＮＴＡ軽鎖（ＢｏＮＴＡ−ＬＣ）タンパク質（Ｃａｔ．Ｎｏ．４４８９−ＺＮ−０１０）とした。全てのデータについて、３回再現した。
【００９４】
結果及びデータ分析
図３のデータは、平均±標準偏差で示され、片側スチューデントのｔ検定により分析されている。市販のＢｏＮＴＡ−ＬＣを含めた全ての試験サンプルが、ＳＮＡＰｔｉｄｅコントロール群よりも有意に（ｐ＜０．０５）高いシグナルを有している。図３に示すように、ＺＦＰのシングル末端及び２要素融合は、どちらも、ＳＮＡＰ−２５由来のペプチド基質に対するＢｏＮＴＡの活性を保持した。
【００９５】
実施例３：ＢｏＮＴＡ−ＺＦＰ融合タンパク質の細胞透過活性アッセイ
この実験は、選択したＢｏＮＴＡ−ＺＦＰ融合タンパク質が、ヒトの皮膚線維芽細胞（ｈＤＦ）を効果的に透過できることを示している。
【００９６】
組み換えＢｏＮＴＡ−ＺＦＰ融合タンパク質によるｈＤＦ細胞の形質導入
ｈＤＦ細胞を、ポリリジンでコーティングされた６ウェルプレートに播種した。播種から２４時間後に、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄した。ＢｏＮＴＡ−ＺＦＰタンパク質（タンパク質番号５及び６）及びコントロールタンパク質（Ｒ＆Ｄ  ＢｏＮＴＡ−ＬＣ、Ｒ＆Ｄシステムズの市販のＢｏＮＴＡ軽鎖）を、ＤＭＥＭ無血清培地で希釈した。細胞を、ＢｏＮＴＡ−ＺＦＰタンパク質（０．１５μＭ）及びＢｏＮＴＡ−ＬＣ（０．５μＭ）で３７°Ｃで２時間処理した。次いで、細胞を０．５ｍｇ／ｍＬのヘパリンを添加したＰＢＳで３回洗浄して表面結合タンパク質を除去した後、トリプシン処理で採取した。収集した細胞を超音波分解により溶解し、ＢｏＮＴＡ活性を上記のように分析した。
【００９７】
結果及びデータ分析
図４に示すデータは、平均±標準偏差で示され、片側スチューデントのｔ検定により分析されている。ＢｏＮＴＡ−ＺＦＰタンパク質（タンパク質番号５及び６）で処置したｈＤＦ細胞は、コントロール群よりも有意に高いシグナル（ｐ＜０．０５）で明らかなＢｏＮＴＡ活性を示した。これは、ＢｏＮＴＡ−ＺＦＰタンパク質が細胞を効果的に透過できることを示している。
【００９８】
実施例４：マウスにおけるＢｏＮＴＡ−ＺＦＰタンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ活性
この実験は、無傷の又は極微針で処理したマウスの皮膚に適用した場合に、ＢｏＮＴＡ−ＺＦＰ融合タンパク質が、指外転を特徴とする筋肉麻痺を引き起こすことを示している。
【００９９】
指外転実験
体重約３６ｇの１５匹のＣ５７雌マウスを、ランダムに５つの群に分けた（ｎ＝＝３）。全てのマウスにおいて、左脚はコントロールとして処置せず、右脚を異なる薬物で処置した。処置前にマウスに麻酔をかけた。ｍｏｃｋ群（Ａ）では、マウスに保存バッファー（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ及び１０％グリセロール）を投与した。ＢＯＴＯＸ（アラガン）注射群（Ｂ）では、ＢＯＴＯＸを指示通りに０．９％ＮａＣｌ生理食塩水で再構成し、５μＬの４５Ｕ／ｍＬ溶液を右脚に注射した。群Ｃでは、マウスの脚及び足を極微針ローラー（ＲｏＨＳ  ＭＲ２０、０．２ｍｍ、ハウス使用）で前処置した後、６０μＬの４５Ｕ／ｍＬ  ＢＯＴＯＸを局所適用した。群Ｄでは、マウスの脚及び足を極微針ローラー（ＲｏＨＳ  ＭＲ２０、０．２ｍｍ、ハウス使用）で前処置した後、保存バッファー（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ及び１０％グリセロール）中のＢｏＮＴＡ−ＺＦＰタンパク質（タンパク質番号６）０．０５ｍｇ／ｍＬを６０μＬ、局所適用した。群Ｅでは、保存バッファー（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ及び１０％グリセロール）中のＢｏＮＴＡ−ＺＦＰタンパク質０．０５ｍｇ／ｍＬを６０μＬ、局所適用した。極微針ローラー処置は、脚及び足を３回ローリングすることにより適用した。局所適用の場合は、脚及び足に薬物を均一に広げ、マッサージした後、風乾した。これを、全ての溶液が投与されるまで数回繰り返した。指外転は、０日目にマウスが目覚めた後、記録し、その後、続く４日間、毎日記録した。
【０１００】
結果及びデータ分析
注射ＢＯＴＯＸと、極微針による前処置を伴うＢｏＮＴＡ−ＺＦＰは、どちらも、コントロール群Ａよりも有意に高いスコア（ｐ＜０．０５；スチューデントのｔ検定）で、注目すべき指外転を示した（図５）。ＢｏＮＴＡ−ＺＦＰの直接適用は、最小限の効果だった。指外転スコア（ＤＡＳ）は、３人の別の研究者により盲検で評価した。ＤＡＳは、２日目でピーク値に達した（図６）。従って、この実施例は、マウスの皮膚に適用した場合、細胞透過性ＢｏＮＴＡ−ＺＦＰは、ＮＡＰ−２５切断のｉｎ  ｖｉｖｏ活性を示す筋肉麻痺を引き起こすことを示している。
【０１０１】
実施例５：昆虫細胞での発現
この実験は、ＢｏＮＴＡ−ＺＦＰ融合タンパク質を昆虫細胞で高収率で発現できることを示している。天然のＢｏＮＴがバクテリアのクロストリジウム属ボツリヌス菌（原核生物）から産生されることを考慮すると、昆虫細胞（真核生物）からのＢｏＮＴＡの大量産生は実に驚くべきことである。
【０１０２】
方法
タンパク質番号６（配列番号１５）を含むｐＦａｓｔＢａｃベクターを、バキュロウイルス（ＢＶ）にパッケージ化した。タンパク質番号６の組み換えタンパク質を含むＢＶを用いて、ヨトウガＳｆ９昆虫細胞を感染させた。細胞生存率が６０％未満となったとき、細胞を収穫した。約１ｍＬの培養物を遠心分離して、細胞を収集した。これらの細胞を１ｍＬのＰＢＳ緩衝液に再懸濁し、超音波分解した。約１０μＬの細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。タンパク質を抗Ｈｉｓ抗体を用いて検出し、画像化した。
【０１０３】
結果及びデータ分析
可溶性ＢｏＮＴＡ−ＺＦは、総タンパク質のほぼ１００％に近い（図７）。タンパク質の量は、ローディングコントロール（５μｇタンパク質）と比較して１μｇであると定量した（図７）。従って、発現収量は、１リットルの培養物当たり１００ｍｇであると計算される。
【０１０４】
実施例６：筋肉内注射により筋肉麻痺が生じる
方法
種々の用量のＢｏＮＴＡ−ＺＦＰを、ハミルトン注射器を用いて、右腓腹筋に筋肉内注射した。筋肉麻痺を、実施例４で説明したようにモニターした。
【０１０５】
結果及びデータ分析
ＢｏＮＴＡ−ＺＦＰ（タンパク質番号６）の１又は３ｎｇの筋肉内注射により、明らかな指外転がもたらされた。全てのマウスでスコア４に到達した（各群ｎ＝３）。
【０１０６】
実施例７：トレッドミル試験
この実施例では、薬剤の筋肉麻痺作用を測定する方法を試験する。自発的な実施中の研究と比較して、この方法は、細胞浸透性ＢｏＮＴＡ−ＺＦＰの筋肉麻痺作用を客観的に反映することができる。
【０１０７】
方法
ＢｏＮＴＡ−ＺＦＰを、実施例４で説明したように、ＣＪ５７雌マウスに局所適用した。マウスに、以下の一連の角度及び速度の設定を受けさせた：０°／５ｍ／分、３°／８ｍ／分、６°／１１ｍ／分、９°／１４ｍ／分、１２°／１７ｍ／分、１２°／２０ｍ／分。マウスを各ステップで５分間維持した。合計距離を計測した。
【０１０８】
結果及びデータ分析
Ｂｏｔｏｘ注射又は局所ＢｏＮＴＡ−ＺＦＰで処置したマウスは、緩衝生理食塩水の場合と比較して、トレッドミル実験で運動能力の低下を示した（図８）。
【０１０９】
実施例８：平均台試験
この実施例では、薬剤の筋肉麻痺作用を測定する別の方法を試験する。
【０１１０】
方法
ＢｏＮＴＡ−ＺＦＰを、実施例４で説明したように、ＣＪ５７雌マウスに局所適用した。マウスに平均台実験を受けさせた。マウスが平均台を通過する時間を計測した。
【０１１１】
結果及びデータ分析
Ｂｏｔｏｘ注射又は局所ＢｏＮＴＡ−ＺＦＰで処置したマウスは、緩衝生理食塩水の場合と比較して、平均台実験で運動能力の低下を示した（図９）。
【０１１２】
実施例９：足跡試験
この実施例では、薬剤の筋肉麻痺作用を測定する別の方法を試験する。
【０１１３】
方法
ＢｏＮＴＡ−ＺＦＰを、実施例４で説明したように、ＣＪ５７雌マウスに局所適用した。マウスに足跡分析実験を受けさせた。足跡の幅を記録した。
【０１１４】
Ｂｏｔｏｘ注射又は局所ＢｏＮＴＡ−ＺＦＰで処置したマウスは、緩衝生理食塩水の場合と比較して、足跡分析で接触面積の減少を示した（図１０）。
【０１１５】
実施例８〜１０は、試験薬剤の筋肉麻痺作用を測定するためのこれらの試験の有効性と定量的性質を示している。
【０１１６】
本発明は、本発明の個々の態様の単一の説明として意図される記載された特定の実施形態によって範囲が限定されることはなく、機能的に同等である組成物又は方法は本発明の範囲内にある。本発明の精神又は範囲から逸脱することなく、種々の改変及び変更を本発明の方法及び組成物に行うことができることは、当業者に明らかであろう。そのような改変は添付のクレームの範囲内に入るように意図される。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲及びその均等物の範囲内であれば、本発明の改変及び変更を包含することを意図する。
【０１１７】
本明細書で挙げた全ての出版物及び特許出願は、各個々の出版物又は特許出願が参照により組み込まれることが具体的且つ個別に示されるのと同じように、参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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