(57)【要約】  ラセミ２−（ジフルオロメチル）−１−（アルコキシカルボニル）シクロプロパンカルボン酸及び２−（ビニル）−１−（アルコキシカルボニル）シクロプロパンカルボン酸と、ジシクロヘキシルアミン塩等のそれらの塩の合成方法を開示する。エナンチオ濃縮された（１Ｒ，２Ｒ）−１−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−２−（ジフルオロメチル）シクロプロパン−１−カルボン酸とそのエステルの製造方法も開示する。これらの化合物はウイルスプロテアーゼ阻害薬の合成における有用な中間体である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
反応スキームＡ：
【化１】
2020505952.tif 000025
［式中、Ｒ１は（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり；
Ｒ２は−ＣＦ２Ｈ又は−ＣＨ＝ＣＨ２であり；
第１の酵素はＢｓｔｅＥエステラーゼの突然変異体である。］に従う方法。
【請求項２】
Ｒ１が（Ｃ６）アルキルである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｒ１が（Ｃ５）アルキルである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
Ｒ１が（Ｃ４）アルキルである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
Ｒ１が（Ｃ３）アルキルである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
Ｒ１がエチルである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
Ｒ１がメチルである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
Ｒ２が−ＣＦ２Ｈである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
Ｒ２が−ＣＨ＝ＣＨ２である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ＢｓｔｅＥエステラーゼの前記突然変異体が、Ｔ２５Ｈの第１の突然変異と、Ｌ９２Ｈの第２の突然変異と、Ｃ１１５Ｓ、Ｃ１１５Ａ、Ｋ１２１Ｒ、Ｋ１２１Ｙ、Ｋ１２１Ｈ、Ｋ１２１Ｄ、Ｋ１２１Ｌ、Ｋ１２１Ｔ、Ｋ１２１Ａ、Ｋ１２１Ｎ、Ｅ１２３Ｔ、Ｍ１２６Ｆ、Ｍ１２６Ｖ、Ｍ１２６Ｉ、Ｍ１２６Ｑ、Ｍ１２６Ｎ、Ｋ１６４Ｓ、Ｌ１６６Ｎ、Ｌ１６６Ｍ、Ｌ１６６Ｉ、Ｌ１６６Ｔ、Ｌ１６６Ａ、Ｉ１７０Ｎ、Ｉ１７０Ｑ、Ｉ１７０Ｖ、Ｉ１７０Ｔ、Ｉ１７０Ａ、Ｄ１７２Ｎ、Ｍ１９４Ａ、Ｍ１９４Ｌ、Ｉ１９５Ｇ、Ｉ１９５Ａ、Ｉ１９５Ｖ及びＫ２１５Ｎからなる群から選択される第３の突然変異を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ＢｓｔｅＥエステラーゼの前記突然変異体が、Ｔ２５Ｈの第１の突然変異と、Ｌ９２Ｈの第２の突然変異と、Ｋ１２１Ｒ、Ｋ１２１Ｙ、Ｋ１２１Ｈ、Ｋ１２１Ｄ、Ｋ１２１Ｌ、Ｍ１２６Ｆ、Ｍ１２６Ｖ、Ｍ１２６Ｉ、Ｍ１２６Ｑ、Ｍ１９４Ｌ、Ｍ１９４Ａ、Ｌ１６６Ｎ、Ｌ１６６Ｍ、Ｉ１７０Ｎ及びＩ１７０Ｑからなる群から選択される第３の突然変異を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記第３の突然変異が、Ｋ１２１Ｒ、Ｋ１２１Ｙ、Ｋ１２１Ｈ、Ｋ１２１Ｄ、Ｋ１２１Ｌ、Ｍ１２６Ｖ、Ｍ１２６Ｉ、Ｍ１２６Ｑ、Ｍ１９４Ｌ及びＬ１６６Ｍからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第３の突然変異が、Ｋ１２１Ｙ、Ｋ１２１Ｈ、Ｋ１２１Ｄ、Ｋ１２１Ｌ、Ｍ１２６Ｖ、Ｍ１２６Ｉ、Ｍ１２６Ｑ及びＬ１６６Ｍからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記第３の突然変異が、Ｋ１２１Ｙ、Ｋ１２１Ｈ、Ｋ１２１Ｄ及びＫ１２１Ｌからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１の酵素の負荷が、スキームＡにおける出発原料に対して約５０重量％〜約２００重量％である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１の溶媒が１種以上の有機溶媒を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１の溶媒がヘプタンとメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１の溶媒が更に水性緩衝液を含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１の溶媒が更に塩基を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記塩基がジ（シクロアルキル）アミン又はジ（アラルキル）アミン等のジ（アルキル）アミンである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記塩基がジ（シクロヘキシル）アミン又はジ（ベンジル）アミンである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記第１のｐＨが約５〜約１０である、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１の温度が約１０℃〜約６０℃である、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記第１の時間が約２時間〜約４８時間である、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
更に反応スキームＡの反応生成物を塩基と反応させて前記化合物の塩を得る工程を含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記塩基がジ（シクロアルキル）アミン又はジ（アラルキル）アミン等のジ（アルキル）アミンである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記塩基がジ（シクロヘキシル）アミン又はジ（ベンジル）アミンである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記反応生成物のジアステレオマー過剰率が約９０％超である、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記反応生成物のジアステレオマー過剰率が約９５％超である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
更に反応スキームＢ：
【化２】
2020505952.tif 000026
［式中、Ｒ２は−ＣＦ２Ｈであり；
第２の酵素はアルカラーゼ（登録商標）２．４Ｌ、エスペラーゼ（登録商標）８．０Ｌ、及びサビナーゼ（登録商標）１６．０Ｌからなる群から選択される。］に従う工程を含む、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記第２の酵素がアルカラーゼ（登録商標）２．４Ｌである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記第２の酵素の負荷が、スキームＢにおける出発原料に対して約５０重量％〜約２００重量％である、請求項３０又は３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記第２の溶媒が水性緩衝液を含む、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記第２の溶媒が重炭酸ナトリウム／炭酸ナトリウム緩衝液を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記第２の溶媒が更にアセトン等の有機溶媒を含む、請求項３３又は３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記第２のｐＨが約５〜約１０である、請求項３０〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記第２の温度が約１０℃〜約６０℃である、請求項３０〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記第２の時間が約２時間〜約４８時間である、請求項３０〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
配列番号２に対して少なくとも２箇所にアミノ酸置換をもつアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、前記アミノ酸配列がＴ２５Ｈの第１の突然変異と、Ｌ９２Ｈの第２の突然変異を含む、前記ポリペプチド。
【請求項４０】
Ｃ１１５Ｓ、Ｃ１１５Ａ、Ｋ１２１Ｒ、Ｋ１２１Ｙ、Ｋ１２１Ｈ、Ｋ１２１Ｄ、Ｋ１２１Ｌ、Ｋ１２１Ｔ、Ｋ１２１Ａ、Ｋ１２１Ｎ、Ｅ１２３Ｔ、Ｍ１２６Ｆ、Ｍ１２６Ｖ、Ｍ１２６Ｉ、Ｍ１２６Ｑ、Ｍ１２６Ｎ、Ｋ１６４Ｓ、Ｌ１６６Ｎ、Ｌ１６６Ｍ、Ｌ１６６Ｉ、Ｌ１６６Ｔ、Ｌ１６６Ａ、Ｉ１７０Ｎ、Ｉ１７０Ｑ、Ｉ１７０Ｖ、Ｉ１７０Ｔ、Ｉ１７０Ａ、Ｄ１７２Ｎ、Ｍ１９４Ａ、Ｍ１９４Ｌ、Ｉ１９５Ｇ、Ｉ１９５Ａ、Ｉ１９５Ｖ及びＫ２１５Ｎからなる群から選択される第３の突然変異を含む、請求項３９に記載のポリペプチド。
【請求項４１】
Ｋ１２１Ｒ、Ｋ１２１Ｙ、Ｋ１２１Ｈ、Ｋ１２１Ｄ、Ｋ１２１Ｌ、Ｍ１２６Ｆ、Ｍ１２６Ｖ、Ｍ１２６Ｉ、Ｍ１２６Ｑ、Ｍ１９４Ｌ、Ｍ１９４Ａ、Ｌ１６６Ｎ、Ｌ１６６Ｍ、Ｉ１７０Ｎ及びＩ１７０Ｑからなる群から選択される第３の突然変異を含む、請求項４０に記載のポリペプチド。
【請求項４２】
前記第３の突然変異が、Ｋ１２１Ｒ、Ｋ１２１Ｙ、Ｋ１２１Ｈ、Ｋ１２１Ｄ、Ｋ１２１Ｌ、Ｍ１２６Ｖ、Ｍ１２６Ｉ、Ｍ１２６Ｑ、Ｍ１９４Ｌ及びＬ１６６Ｍからなる群から選択される、請求項４１に記載のポリペプチド。
【請求項４３】
前記第３の突然変異が、Ｋ１２１Ｙ、Ｋ１２１Ｈ、Ｋ１２１Ｄ、Ｋ１２１Ｌ、Ｍ１２６Ｖ、Ｍ１２６Ｉ、Ｍ１２６Ｑ及びＬ１６６Ｍからなる群から選択される、請求項４２に記載のポリペプチド。
【請求項４４】
前記第３の突然変異が、Ｋ１２１Ｙ、Ｋ１２１Ｈ、Ｋ１２１Ｄ及びＫ１２１Ｌからなる群から選択される、請求項４２に記載のポリペプチド。
【請求項４５】
反応スキームＢ：
【化３】
2020505952.tif 000027
［式中、Ｒ１は（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり；
Ｒ２は−ＣＦ２Ｈであり；
第２の酵素はアルカラーゼ（登録商標）２．４Ｌ、エスペラーゼ（登録商標）８．０Ｌ、及びサビナーゼ（登録商標）１６．０Ｌからなる群から選択される。］に従う方法。
【請求項４６】
前記第２の酵素がアルカラーゼ（登録商標）２．４Ｌである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記第２の酵素の負荷が、スキームＢにおける出発原料に対して約５０重量％〜約２００重量％である、請求項４５又は４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記第２の溶媒が水性緩衝液を含む、請求項４５〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記第２の溶媒が重炭酸ナトリウム／炭酸ナトリウム緩衝液を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記第２の溶媒が更にアセトン等の有機溶媒を含む、請求項４８又は４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記第２のｐＨが約５〜約１０である、請求項４５〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記第２の温度が約１０℃〜約６０℃である、請求項４５〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記第２の時間が約２時間〜約４８時間である、請求項４５〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
複雑な生物活性分子を合成することは難しく、費用と時間がかかる。ジアステレオ選択性レベルが良好な化合物を合成することは更に難しい。このような合成を行うには一般に、その後の必要な合成変換においてその立体配置を維持できるジアステレオ濃縮中間体を単離又は合成する必要がある。
【０００２】
生物活性分子の合成における有用な中間体の１例は（±）−２−（ジフルオロメチル）−１−（エトキシカルボニル）シクロプロパンカルボン酸である。従来、この中間体はスキーム１に示すように、加水分解法を使用して（±）−２−（ジフルオロメチル）シクロプロパン−１，１−ジカルボン酸ジエチルから合成されているが、この方法ではジアステレオ選択性が低かった。
【０００３】
【化１】
2020505952.tif 000002
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
エナンチオ濃縮されたジフルオロアルキルシクロプロピルエステル及びビニルアルキルシクロプロピルエステルをより高レベルのジアステレオ選択性で創製するための新規な合成方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
所定の実施形態において、本発明は反応スキームＡ：
【０００６】
【化２】
2020505952.tif 000003
に従う方法に関し、
上記式中、Ｒ１は（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり；
Ｒ２は−ＣＦ２Ｈ又は−ＣＨ＝ＣＨ２であり；
第１の酵素はＢｓｔｅＥエステラーゼの突然変異体である。
【０００７】
他の実施形態において、本発明は反応スキームＢ：
【０００８】
【化３】
2020505952.tif 000004
に従う方法に関し、
上記式中、Ｒ１は（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり；
Ｒ２は−ＣＦ２Ｈであり；
第２の酵素はアルカラーゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ）（登録商標）２．４Ｌ、エスペラーゼ（Ｅｓｐｅｒａｓｅ）（登録商標）８．０Ｌ、及びサビナーゼ（Ｓａｖｉｎａｓｅ）（登録商標）１６．０Ｌからなる群から選択される。
【０００９】
本発明は更に、配列番号２に対して少なくとも２箇所にアミノ酸置換をもつアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、前記アミノ酸配列はＴ２５Ｈの第１の突然変異と、Ｌ９２Ｈの第２の突然変異を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ＢｓｔｅＥエステラーゼの系統樹である。ＢｓｔｅＥエステラーゼに近縁の酵素はアミノ酸配列が似ているため、本明細書に記載するジアステレオ選択的方法においてＢｓｔｅＥエステラーゼと同様に機能することができる。
【図２】突然変異体Ｔ２５Ｈ／Ｌ９２Ｈ及びＴ２５Ｈ／Ｌ９２Ｈ／Ｋ１２１Ｈとバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）野生型エステラーゼの変換率及びジアステレオマー選択率（％ｄ．ｅ．）の比較を示す２種類のグラフである。反応条件：２００ｍＭ  ＮａＨＰＯ４（ｐＨ８）、２５０ＲＰＭ、４０℃、基質１０ｇ／Ｌ、反応容量１０ｍＬ及び各酵素の清澄化ライセート１ｍｇ／ｍＬ。
【図３】突然変異体Ｔ２５Ｈ／Ｌ９２Ｈ及びＴ２５Ｈ／Ｌ９２Ｈ／Ｋ１２１Ｈとバチルス・ステアロサーモフィルス野生型エステラーゼの変換率及びジアステレオマー選択率（％ｄ．ｅ．）の比較を示すグラフである。反応条件：２００ｍＭ  ＮａＨＰＯ４（ｐＨ８）、２５０ＲＰＭ、４０℃、基質１０ｇ／Ｌ、反応容量１０ｍＬ及び各酵素の清澄化ライセート１ｍｇ／ｍＬ。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
Ｉ．概要
所定の実施形態において、本発明はジアステレオ選択的酵素加水分解による（±）−２−（ジフルオロメチル）−１−（エトキシカルボニル）シクロプロパンカルボン酸等のジアステレオ濃縮化合物の合成方法に関する。本発明の方法は、（ｉ）ラセミ体を合成してジアステレオマーを分離する必要がなく、（ｉｉ）ジアステレオマー濃縮レベルの高い化合物が得られるため、公知方法よりも効率的である。本明細書に記載する発明は、この変換を行う酵素として、活性でジアステレオ選択的な突然変異体酵素にも関する。本発明の突然変異体酵素は野生型酵素に比較して所望の基質に対する活性の向上、望ましくないジアステレオマーの生成の抑制、及び所望のエナンチオマー対の個々の異性体とほぼ同等の活性が得られる等の点で特性の改善を示し、ジアステレオ濃縮ラセミ体をもたらす。
【００１２】
本明細書に記載するジアステレオ選択的酵素加水分解は、所定の処理工程が不要でありながら、生成物収率とジアステレオ選択性を改善することにより、公知方法に勝る利点を提供する。例えば、本明細書に記載する方法は公知方法で利用される２回のＭＴＢＥスラリー化工程が不要である。本明細書に記載する改良法は例えば化学合成のスループットを高めることができる。
【００１３】
所定の実施形態において、本発明はスキーム２に示すように（１Ｒ，２Ｒ）−１−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−２−（ジフルオロメチル）シクロプロパンカルボン酸を経て原薬を合成する方法に関する。所定の実施形態では、代替として、（±）−２−（ビニル）−１−（エトキシカルボニル）シクロプロパンカルボン酸の中間体を経て原薬を合成することもできる。
【００１４】
【化４】
2020505952.tif 000005
【００１５】
所定の実施形態において、ラセミジエステル出発原料はスキーム３の方法に従って製造される。本明細書に記載するジアステレオ選択的酵素加水分解はスキーム４に示すように、前記ジエステル出発原料を所望の生成物であるジアステレオ濃縮（±）−２−（ジフルオロメチル）−１−（アルコキシカルボニル）シクロプロパンカルボン酸に変換する。
【００１６】
【化５】
2020505952.tif 000006
【００１７】
【化６】
2020505952.tif 000007
【００１８】
所定の実施形態において、前記方法は単離された中間体の処理性を改善する。
【００１９】
所定の実施形態において、本明細書に記載する方法は加水分解反応のジアステレオ選択性を改善する。
【００２０】
所定の実施形態において、本明細書に記載する方法は加水分解反応の生成物収率を改善する。
【００２１】
ＩＩ．定義
本発明を説明するために使用する種々の用語の定義を以下に述べる。個々の事例で特段限定しない限り、これらの定義は本明細書及び特許請求の範囲の全文を通して使用されるこれらの用語に個々に又はより大きな語群の一部として適用される。
【００２２】
炭化水素置換基における炭素原子数は、接頭辞「Ｃｘ−Ｃｙ」により表すことができ、ここで、ｘはこの置換基における最小炭素原子数であり、ｙは最大炭素原子数である。「（Ｃｘ）アルキル」とは、炭素原子数ｘのアルキル基を意味する。
【００２３】
本明細書で使用する「アルキル」なる用語は、一般的に炭素原子数１〜２０の飽和直鎖又は分岐鎖炭化水素基を意味する。例えば、「Ｃ１−Ｃ６アルキル」又は「Ｃ１−Ｃ８アルキル」は夫々炭素原子数１〜６又は１〜８である。アルキル置換基の例としては、メチル置換基、エチル置換基、プロピル置換基、イソプロピル置換基、ｎ−ブチル置換基、ｔｅｒｔ−ブチル置換基、ネオペンチル置換基、ｎ−ヘキシル置換基、ヘプチル置換基、オクチル置換基等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２４】
本明細書で使用する「塩」なる用語は、適切な医学的判断の範囲内で過度の毒性、刺激、アレルギー反応等を生じることなしにヒト及び他の脊椎動物、好ましくは哺乳動物の組織と接触させて使用するのに適しており、妥当なメリット／リスク比に見合う「薬学的に許容される塩」を含む。薬学的に許容される塩は当分野で周知である。例えば、Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅらは薬学的に許容される塩について、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，６６：１−１９（１９７７）に詳細に記載している。このような塩は本明細書に記載するような反応生成物の単離・精製中にｉｎ  ｓｉｔｕ調製することもできるし、遊離塩基官能基を有機酸等の適切な酸と反応させるなどの方法により別個に調製することもできる。薬学的に許容される塩の例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩、過塩素酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩又はマロン酸塩が挙げられるが、これらに限定されるものではない。他の薬学的に許容される塩としては、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、硼酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、グルコン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、蓚酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、硫酸塩、チオシアン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。代表的なアルカリ又はアルカリ土類金属塩としては、ナトリウム塩、リチウム塩、カリウム塩、カルシウム塩又はマグネシウム塩等が挙げられる。その他の薬学的に許容される塩としては、適切な場合には、アンモニウムカチオン、第四級アンモニウムカチオン及びアミンカチオンと、ハロゲン化物イオン、水酸化物イオン、カルボン酸イオン、硫酸イオン、リン酸イオン、硝酸イオン、炭素原子数１〜６のアルキルイオン、スルホン酸イオン及びアリールスルホン酸イオン等の対イオンとの会合体も挙げられる。
【００２５】
本明細書で使用する「エナンチオ濃縮」なる用語は、２種類のエナンチオマーのうちの一方がより多量に存在する（例えば、エナンチオマー過剰率（ｅｅ）が約９０％超、約９５％超、好ましくは約９８％超、最も好ましくは９９％超である）エナンチオマー混合物を意味する。この用語は純エナンチオマー化合物も包含する。
【００２６】
本明細書で使用する「ジアステレオ濃縮」なる用語は、ジアステレオマーのうちの一方がより多量に存在する（例えば、ジアステレオマー過剰率（ｄｅ）が約９０％超、約９５％超、好ましくは約９８％超、最も好ましくは９９％超である）ジアステレオマー混合物を意味する。この用語は純ジアステレオマー化合物も包含する。
【００２７】
以下、本発明の種々の態様について更に詳細に説明する。
【００２８】
ＩＩＩ．典型的な方法と使用
本発明の化合物を製造することができる以下の具体的な方法を参照することにより、本発明の化合物及び方法はよりよく理解されよう。当然のことながら、本明細書に記載する全ての反応及びその全ての変形は、各スキームに示す順序と実質的に同様の順序で本明細書に記載する他の反応の１種以上及びその全ての変形と順次組合せることができる。
【００２９】
所定の実施形態において、本発明は反応スキームＡ：
【００３０】
【化７】
2020505952.tif 000008
に従う反応分割を含む方法に関し、
上記式中、Ｒ１は（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり；
Ｒ２は−ＣＦ２Ｈ又は−ＣＨ＝ＣＨ２であり；
第１の酵素はＢｓｔｅＥエステラーゼの突然変異体である。
【００３１】
所定の実施形態において、Ｒ１は（Ｃ６）アルキルである。あるいは、Ｒ１は（Ｃ５）アルキル、（Ｃ４）アルキル、（Ｃ３）アルキル（例えばｎ−プロピル又はイソプロピル）、エチル又はメチルとすることができる。所定の実施形態において、Ｒ１はエチルである。
【００３２】
所定の実施形態において、Ｒ２は−ＣＦ２Ｈである。他の実施形態において、Ｒ２は−ＣＨ＝ＣＨ２である。
【００３３】
所定の実施形態において、ＢｓｔｅＥエステラーゼの前記突然変異体はＴ２５Ｈの第１の突然変異と、Ｌ９２Ｈの第２の突然変異と、Ｋ１２１Ｒ、Ｋ１２１Ｙ、Ｋ１２１Ｈ、Ｋ１２１Ｄ、Ｋ１２１Ｌ、Ｍ１２６Ｆ、Ｍ１２６Ｖ、Ｍ１２６Ｉ、Ｍ１２６Ｑ、Ｍ１９４Ｌ、Ｍ１９４Ａ、Ｌ１６６Ｎ、Ｌ１６６Ｍ、Ｉ１７０Ｎ及びＩ１７０Ｑからなる群から選択される第３の突然変異を含む。
【００３４】
所定のこのような実施形態において、前記第３の突然変異はＫ１２１Ｒ、Ｋ１２１Ｙ、Ｋ１２１Ｈ、Ｋ１２１Ｄ、Ｋ１２１Ｌ、Ｍ１２６Ｖ、Ｍ１２６Ｉ、Ｍ１２６Ｑ、Ｍ１９４Ｌ及びＬ１６６Ｍからなる群から選択される。他のこのような実施形態において、前記第３の突然変異はＫ１２１Ｙ、Ｋ１２１Ｈ、Ｋ１２１Ｄ、Ｋ１２１Ｌ、Ｍ１２６Ｖ、Ｍ１２６Ｉ、Ｍ１２６Ｑ及びＬ１６６Ｍからなる群から選択される。所定の実施形態において、前記第３の突然変異はＫ１２１Ｙ、Ｋ１２１Ｈ、Ｋ１２１Ｄ及びＫ１２１Ｌからなる群から選択される。
【００３５】
所定の実施形態において、前記第１の酵素の負荷は出発原料に対して約５０重量％〜約２００重量％であり、例えば、出発原料に対して約５０重量％、約６０重量％、約７０重量％、約８０重量％、約９０重量％、約１００重量％、約１１０重量％、約１２０重量％、約１３０重量％、約１４０重量％、約１５０重量％、約１６０重量％、約１７０重量％、約１８０重量％、約１９０重量％、又は約２００重量％であり、約１００重量％が好ましい。
【００３６】
所定の実施形態において、前記第１の溶媒は１種以上の有機溶媒を含む。例えば、前記溶媒はヘプタンとメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルを含むことができる。
【００３７】
所定の実施形態において、前記第１の溶媒は更に水性緩衝液を含む。
【００３８】
所定の実施形態において、前記水性緩衝液は例えば濃度約０．０５Ｍ〜約２．０Ｍ、例えば、約０．０５Ｍ、約０．０６Ｍ、約０．０７Ｍ、約０．０８Ｍ、約０．０９Ｍ、約０．１０Ｍ、約０．１１Ｍ、約０．１２Ｍ、約０．１３Ｍ、約０．１４Ｍ、約０．１５Ｍ、約０．２Ｍ、約０．３Ｍ、約０．４Ｍ、約０．５Ｍ、約０．６Ｍ、約０．７Ｍ、約０．８Ｍ、約０．９Ｍ、約１．０Ｍ、約１．１Ｍ、約１．２Ｍ、約１．３Ｍ、約１．４Ｍ、約１．５Ｍ、約１．６Ｍ、約１．７Ｍ、約１．８Ｍ、約１．９Ｍ、又は約２．０Ｍのクエン酸ナトリウム又は酢酸カルシウム水溶液である。所定の実施形態において、前記濃度は約０．１Ｍである。
【００３９】
所定の実施形態において、前記第１の溶媒は更に塩基を含む。所定の実施形態において、前記塩基はジ（シクロアルキル）アミン又はジ（アラルキル）アミン等のジ（アルキル）アミンである。所定の実施形態において、前記塩基はジ（シクロヘキシル）アミン又はジ（ベンジル）アミンである。
【００４０】
所定の実施形態において、前記第１のｐＨは約５〜約１０であり、例えば、約５、約５．２５、約５．５、約５．７５、約６、約６．２５、約６．５、約６．７５、約７．０、約７．２５、約７．５、約７．７５、約８．０、約８．２５、約８．５、約８．７５、約９．０、約９．２５、約９．５、約９．７５、又は約１０．０である。所定の実施形態において、前記第１のｐＨは約５〜約６．５である。所定の実施形態において、前記第１のｐＨは約５．７５である。
【００４１】
所定の実施形態において、前記第１の温度は約１０℃〜約６０℃であり、例えば、約１５℃、約２０℃、約２５℃、約３０℃、約３５℃、約４０℃、約４５℃、約５０℃、約５５℃、又は約６０℃である。所定の実施形態において、前記第１の温度は約２０℃である。
【００４２】
所定の実施形態において、前記第１の時間は約２時間〜約８時間であり、例えば、約２時間、約４時間、約６時間、約８時間である。あるいは、前記第１の時間は約２時間〜約４８時間であり、例えば、約２時間、約４時間、約６時間、約８時間、約１０時間、約１２時間、約１４時間、約１６時間、約１８時間、約２０時間、約２２時間、約２４時間、約２６時間、約２８時間、約３０時間、約３２時間、約３４時間、約３６時間、約３８時間、約４０時間、約４２時間、約４４時間、約４６時間、又は約４８時間である。
【００４３】
所定の実施形態において、前記方法は更に反応スキームＡの反応生成物を塩基と反応させて前記化合物の塩を得る工程を含む。
【００４４】
所定のこのような実施形態において、前記塩基はジ（シクロアルキル）アミン又はジ（アラルキル）アミン等のジ（アルキル）アミンである。前記塩基はジ（シクロヘキシル）アミン又はジ（ベンジル）アミンが好ましい。
【００４５】
所定の実施形態において、前記反応生成物のジアステレオマー過剰率は約９０％超である。他の実施形態において、前記反応生成物のジアステレオマー過剰率は約９５％超である。
【００４６】
所定の実施形態において、本発明は反応スキームＢ：
【００４７】
【化８】
2020505952.tif 000009
に従う反応分割を含む方法に関し、
上記式中、Ｒ１は（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり；
Ｒ２は−ＣＦ２Ｈ又は−ＣＨ＝ＣＨ２、好ましくは−ＣＦ２Ｈであり；
第２の酵素はアルカラーゼ（登録商標）２．４Ｌ、エスペラーゼ（登録商標）８．０Ｌ、及びサビナーゼ（登録商標）１６．０Ｌからなる群から選択される。
【００４８】
アルカラーゼ（登録商標）２．４Ｌ、エスペラーゼ（登録商標）８．０Ｌ、及びサビナーゼ（登録商標）１６．０Ｌは各々ノボザイムズ社（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）から入手可能である。スキームＢに示す反応の所定の実施形態において、前記第２の酵素はアルカラーゼ（登録商標）２．４Ｌである。
【００４９】
アルカラーゼ（登録商標）はサブチリシン型であり、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）に由来するプロテアーゼである。アルカラーゼ（登録商標）はエステラーゼとして作用し、ある種のエステルの立体選択的加水分解を触媒すると共に、複素環式アミノ酸エステルを含むアミノ酸エステルの加水分解を触媒することができる。
【００５０】
サビナーゼ（登録商標）はバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌種に由来するプロテアーゼであり、セリンエンドペプチダーゼである。サビナーゼ（登録商標）はある種のエステルと歪んだアミドの立体選択的加水分解をアルカリ条件下で触媒することができる。
【００５１】
エスペラーゼ（登録商標）は特異性の広いエンドペプチダーゼ（主にサブチリシンＡ）であり、他の微生物セリンプロテアーゼに比較してアルカリ条件下・高温下で良好に機能する。用途としては、鎖内ペプチド結合の加水分解が挙げられる。エスペラーゼ（登録商標）は高温・高ｐＨでの性能に優れることを特徴とする。
【００５２】
所定の実施形態において、前記第２の酵素の負荷はスキームＢにおける出発原料に対して約５０重量％〜約２００重量％であり、例えば、スキームＢにおける出発原料に対して約５０重量％、約６０重量％、約７０重量％、約８０重量％、約９０重量％、約１００重量％、約１１０重量％、約１２０重量％、約１３０重量％、約１４０重量％、約１５０重量％、約１６０重量％、約１７０重量％、約１８０重量％、約１９０重量％、又は約２００重量％であり、約１２０重量％〜約１４０重量％、又は約１３０重量％が好ましい。
【００５３】
所定の実施形態において、前記第２の溶媒は水性緩衝液を含む。所定の実施形態において、前記水性緩衝液は例えば濃度約０．０５Ｍ〜約２．０Ｍ、例えば、約０．０５Ｍ、約０．０６Ｍ、約０．０７Ｍ、約０．０８Ｍ、約０．０９Ｍ、約０．１０Ｍ、約０．１１Ｍ、約０．１２Ｍ、約０．１３Ｍ、約０．１４Ｍ、約０．１５Ｍ、約０．２Ｍ、約０．３Ｍ、約０．４Ｍ、約０．５Ｍ、約０．６Ｍ、約０．７Ｍ、約０．８Ｍ、約０．９Ｍ、約１．０Ｍ、約１．１Ｍ、約１．２Ｍ、約１．３Ｍ、約１．４Ｍ、約１．５Ｍ、約１．６Ｍ、約１．７Ｍ、約１．８Ｍ、約１．９Ｍ、又は約２．０Ｍの重炭酸ナトリウム及び／又は炭酸ナトリウム水溶液である。所定の実施形態において、前記濃度は約０．１Ｍである。
【００５４】
所定の実施形態において、前記第２の溶媒は更に有機溶媒を含む。本発明の方法で使用することができる典型的な有機溶媒としては、アセトン、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、ジオキサン、エタノール、イソプロパノール及びジメチルスルホキシドが挙げられる。ある種の好ましい実施形態において、スキームＢの反応方法で使用される有機溶媒はアセトンである。所定の実施形態において、前記有機溶媒は前記第２の溶媒の総体積の約５％〜約７５％である。例えば、前記有機溶媒は前記第２の溶媒の総体積に対して約５体積％、１０体積％、１５体積％、２０体積％、２５体積％、３０体積％、３５体積％、４０体積％、４５体積％、５０体積％、５５体積％、６０体積％、６５体積％又は７０体積％とすることができる。ある種の実施形態において、前記有機溶媒は前記第２の溶媒の総体積の約５％〜２０％であり、１０％が好ましい。
【００５５】
所定の実施形態において、前記第２のｐＨは約５〜約１０であり、例えば、約５、約５．２５、約５．５、約５．７５、約６、約６．２５、約６．５、約６．７５、約７．０、約７．２５、約７．５、約７．７５、約８．０、約８．２５、約８．５、約８．７５、約９．０、約９．２５、約９．５、約９．７５、又は約１０．０である。所定の実施形態において、前記第２のｐＨは約７．５〜約９である。所定の実施形態において、前記第１のｐＨは約８．０である。
【００５６】
所定の実施形態において、前記第２の温度は約１０℃〜約６０℃であり、例えば、約１５℃、約２０℃、約２５℃、約３０℃、約３５℃、約４０℃、約４５℃、約５０℃、約５５℃、又は約６０℃である。所定の実施形態において、前記第２の温度は約４０℃である。
【００５７】
所定の実施形態において、前記第２の時間は約２時間〜約８時間であり、例えば、約２時間、約４時間、約６時間、約８時間である。あるいは、前記第２の時間は約２時間〜約４８時間であり、例えば、約２時間、約４時間、約６時間、約８時間、約１０時間、約１２時間、約１４時間、約１６時間、約１８時間、約２０時間、約２２時間、約２４時間、約２６時間、約２８時間、約３０時間、約３２時間、約３４時間、約３６時間、約３８時間、約４０時間、約４２時間、約４４時間、約４６時間、又は約４８時間である。
【００５８】
所定の実施形態において、本発明は本明細書に記載する工程の２種以上を含む方法に関する。例えば、本発明はスキームＡの方法とスキームＢの方法を含む方法でもよい。
【００５９】
所定の実施形態において、本発明は医薬品製造における本明細書に記載する化合物のいずれかの使用に関する。
【００６０】
本明細書に記載するスキームにおける構造中の可変基の定義は本明細書中で具体的に記載する式における対応する位置の可変基の定義に相応する。
【００６１】
本明細書に記載する化合物は不斉中心を１つ以上含むため、Ｒ体かＳ体、あるいはアミノ酸の場合にはＤ体かＬ体といった絶対立体配置により定義することができるエナンチオマー、ジアステレオマー及び他の立体異性体を生じる。光学異性体は上記手順により夫々の光学活性な前駆体から調製することもできるし、ラセミ混合物を分割することにより調製することもできる。分割は分割剤の存在下、クロマトグラフィー、結晶化の繰返し、又は当業者に公知のこれらの技術の何らかの組合せにより実施することができる。分割に関する更に詳細については、Ｊａｃｑｕｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ．Ｒａｃｅｍａｔｅｓ，ａｎｄ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９８１）を参照されたい。
【００６２】
合成された化合物を反応混合物から分離し、カラムクロマトグラフィー、高圧液体クロマトグラフィー又は再結晶等の方法により更に精製することができる。当業者に了解される通り、当技術分野における通常の知識を有する者であれば、本明細書に記載する式の化合物の他の合成方法も容易に想到するであろう。また、各種合成工程を別の順序又は順番で実施して所望の化合物を得ることもできる。更に、本明細書中で具体的に記載する溶媒、温度、反応時間等は単に説明の目的に過ぎず、当技術分野における通常の知識を有する者であれば、反応条件を変えても本発明の所望の生成物を生成できることを理解されよう。本明細書に記載する化合物の合成に有用な合成化学変換と保護基操作方法（保護及び脱保護）は当分野で公知であり、例えば、Ｒ．Ｌａｒｏｃｋ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９８９）；Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｄ．Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９１）：Ｌ．Ｆｉｅｓｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｆｉｅｓｅｒ，Ｆｉｅｓｅｒ  ａｎｄ  Ｆｉｅｓｅｒ’ｓ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９４）；及びＬ．Ｐａｑｕｅｔｔｅ，ｅｄ．，Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９５）とその続版に記載されているようなものが挙げられる。
【００６３】
ＩＶ．ポリペプチド
所定の実施形態において、本発明はＢｓｔｅＥエステラーゼの突然変異体であるポリペプチドと、その酵素活性断片を提供する。ある種の実施形態において、前記ポリペプチドはＢｓｔｅＥエステラーゼの変異体、又はその酵素活性断片である。全長野生型バチルス・ステアロサーモフィルス（ＢｓｔｅＥ）エステラーゼの典型的なＤＮＡ配列は以下の通りである。
【００６４】
【化９】
2020505952.tif 000010
【００６５】
野生型バチルス・ステアロサーモフィルス（ＢｓｔｅＥ）エステラーゼのＤＮＡ配列が翻訳されると、配列番号２の配列をもつポリペプチドが得られる。
【００６６】
【化１０】
2020505952.tif 000011
【００６７】
したがって、所定の実施形態において、本発明の方法で使用されるＢｓｔｅＥエステラーゼの突然変異体のアミノ酸配列は配列番号２と少なくとも５０％の相同性、少なくとも５５％の相同性、少なくとも６０％の相同性、少なくとも６５％の相同性、少なくとも７０％の相同性、少なくとも７５％の相同性、少なくとも８０％の相同性、少なくとも８２％の相同性、少なくとも８４％の相同性、少なくとも８６％の相同性、少なくとも８８％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、又は少なくとも９９％の相同性をもつ。
【００６８】
他の実施形態において、本発明は配列番号２に対して少なくとも２箇所にアミノ酸置換をもつアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、前記アミノ酸配列はＴ２５Ｈの第１の突然変異と、Ｌ９２Ｈの第２の突然変異を含む。
【００６９】
更に他の実施形態において、本発明は配列番号２と少なくとも９５％の相同性をもち、配列番号２に対して少なくとも２箇所にアミノ酸置換をもつアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、前記アミノ酸配列はＴ２５Ｈの第１の突然変異と、Ｌ９２Ｈの第２の突然変異を含む。
【００７０】
所定のこのような実施形態において、前記ポリペプチドはＫ１２１Ｒ、Ｋ１２１Ｙ、Ｋ１２１Ｈ、Ｋ１２１Ｄ、Ｋ１２１Ｌ、Ｍ１２６Ｆ、Ｍ１２６Ｖ、Ｍ１２６Ｉ、Ｍ１２６Ｑ、Ｍ１９４Ｌ、Ｍ１９４Ａ、Ｌ１６６Ｎ、Ｌ１６６Ｍ、Ｉ１７０Ｎ及びＩ１７０Ｑからなる群から選択される第３のアミノ酸置換を含む。
【００７１】
所定のこのような実施形態において、前記第３のアミノ酸置換はＫ１２１Ｒ、Ｋ１２１Ｙ、Ｋ１２１Ｈ、Ｋ１２１Ｄ、Ｋ１２１Ｌ、Ｍ１２６Ｖ、Ｍ１２６Ｉ、Ｍ１２６Ｑ、Ｍ１９４Ｌ及びＬ１６６Ｍからなる群から選択される。
【００７２】
他の実施形態において、前記第３のアミノ酸置換はＫ１２１Ｙ、Ｋ１２１Ｈ、Ｋ１２１Ｄ、Ｋ１２１Ｌ、Ｍ１２６Ｖ、Ｍ１２６Ｉ、Ｍ１２６Ｑ及びＬ１６６Ｍからなる群から選択される。
【００７３】
更に他の実施形態において、前記第３のアミノ酸置換はＫ１２１Ｙ、Ｋ１２１Ｈ、Ｋ１２１Ｄ及びＫ１２１Ｌからなる群から選択される。
【００７４】
所定の実施形態において、野生型バチルス・ステアロサーモフィルス（ＢｓｔｅＥ）エステラーゼのＤＮＡ配列は配列番号３の配列をもつ。
【００７５】
【化１１】
2020505952.tif 000012
【００７６】
配列番号３のＤＮＡ配列が翻訳されると、配列番号４の配列をもつポリペプチドが得られる。Ｔ２５Ｈ、Ｌ９２Ｈ及びＫ１２１Ｌの突然変異を太字下線で示す。
【００７７】
【化１２】
2020505952.tif 000013
【００７８】
所定の実施形態において、本発明の方法で使用されるＢｓｔｅＥエステラーゼの突然変異体は、以下からなる群から選択される１組の突然変異を含む：
Ｔ２５Ｈ／Ｌ９２Ｈ／Ｋ１２１Ｌ、Ｔ２５Ｈ／Ｌ９２Ｈ／Ｋ１２１Ｈ、Ｔ２５Ｈ／Ｌ９２Ｈ／Ｋ１２１Ｈ／Ｉ１９５Ｌ、Ｔ２５Ｈ／Ｌ９２Ｈ、Ｔ２５Ｈ／Ｌ９２Ｈ／Ｋ２１５Ｎ、Ｔ２５Ｈ／Ｌ９２Ｈ／Ｄ１７２Ｎ、Ｔ２５Ｈ／Ｌ９２Ｈ／Ｍ１２６Ｑ、Ｔ２５Ｈ／Ｌ９２Ｈ／Ｅ１２３Ｔ、Ｔ２５Ｈ／Ｌ９２Ｈ／Ｍ１２６Ｖ、Ｔ２５Ｈ／Ｌ９２Ｈ／Ｍ１２６Ｉ、Ｔ２５Ｈ／Ｌ９２Ｈ／Ｋ１２１Ｙ、Ｔ２５Ｈ／Ｌ９２Ｈ／Ｍ１９４Ａ、Ｔ２５Ｈ／Ｌ９２Ｈ／Ｋ１２１Ｈ、Ｔ２５Ｈ／Ｌ９２Ｈ／Ｌ１６６Ｍ、Ｔ２５Ｈ／Ｌ９２Ｈ／Ｋ１２１Ｒ、Ｔ２５Ｈ／Ｌ９２Ｈ／Ｋ１６４Ｓ、Ｔ２５Ｈ／Ｌ９２Ｈ／Ｍ１２６Ｆ、Ｔ２５Ｈ／Ｌ９２Ｈ／Ｍ１９４Ｌ、Ｔ２５Ｈ／Ｌ９２Ｈ／Ｌ１６６Ｎ、Ｔ２５Ｈ／Ｌ９２Ｈ／Ｉ１７０Ｎ、Ｔ２５Ｈ／Ｌ９２Ｈ／Ｉ１７０Ｑ、Ｔ２５Ｈ／Ｌ９２Ｈ／Ｉ１７０Ｎ、Ｔ２５Ｈ／Ｌ９２Ｈ／Ｋ１２１Ｈ／Ｉ１７０Ｎ、Ｔ２５Ｈ／Ｌ９２Ｈ／Ｋ１２１Ｈ／Ｋ１６４Ｓ、Ｔ２５Ｈ／Ｌ９２Ｈ／Ｋ１２１Ｈ／Ｌ１６６Ｍ、Ｔ２５Ｈ／Ｌ９２Ｈ／Ｋ１２１Ｈ／Ｉ１７０Ｎ、Ｔ２５Ｈ／Ｌ９２Ｈ／Ｋ１２１Ｈ／Ｉ１９５Ｇ、Ｔ２５Ｈ／Ｌ９２Ｈ／Ｋ１２１Ｈ／Ｉ１９５Ａ、Ｔ２５Ｈ／Ｌ９２Ｈ／Ｋ１２１Ｈ／Ｉ１９５Ｖ、Ｔ２５Ｈ／Ｌ９２Ｈ／Ｋ１２１Ｈ／Ｃ１１５Ｓ、Ｔ２５Ｈ／Ｌ９２Ｈ／Ｋ１２１Ｈ／Ｃ１１５Ａ、Ｔ２５Ｈ／Ｌ９２Ｈ／Ｋ１２１Ｈ／Ｉ１７０Ｖ、Ｔ２５Ｈ／Ｌ９２Ｈ／Ｋ１２１Ｈ／Ｌ１６６Ｉ、２５Ｈ／Ｌ９２Ｈ／Ｉ１７０Ｔ、Ｔ２５Ｈ／Ｌ９２Ｈ／Ｉ１７０Ａ、Ｔ２５Ｈ／Ｌ９２Ｈ／Ｍ１２６Ｎ、Ｔ２５Ｈ／Ｌ９２Ｈ／Ｌ１６６Ｔ、Ｔ２５Ｈ／Ｌ９２Ｈ／Ｌ１６６Ａ、Ｔ２５Ｈ／Ｌ９２Ｈ／Ｋ１２１Ｈ／Ｉ１７０Ｎ、Ｔ２５Ｈ／Ｌ９２Ｈ／Ｋ１２１Ｈ／Ｉ１７０Ｖ、Ｔ２５Ｈ／Ｌ９２Ｈ／Ｋ１２１Ｄ、Ｔ２５Ｈ／Ｌ９２Ｈ／Ｋ１２１Ｔ、Ｔ２５Ｈ／Ｌ９２Ｈ／Ｋ１２１Ａ、及びＴ２５Ｈ／Ｌ９２Ｈ／Ｋ１２１Ｎ。
【００７９】
他の実施形態において、本発明の方法で使用されるＢｓｔｅＥエステラーゼの突然変異体は、以下からなる群から選択される１組の突然変異を含む：
Ｔ２５Ｆ／Ｌ９２Ｈ、Ｔ２５Ｆ／Ｌ９２Ｈ／Ｉ１７０Ｑ、Ｔ２５Ｆ／Ｉ１７０Ｑ、Ｌ１６６Ｈ、Ｔ２５Ｆ、Ｔ２５Ｈ、Ｔ２５Ｆ／Ｋ１２１Ｙ／Ｌ１６６Ｍ、Ｔ２５Ｈ／Ｋ１２１Ｈ、Ｉ１７０Ｎ、Ｌ１６６Ｍ、Ｆ２４Ｃ／Ｔ２５Ｆ、Ｔ２５Ｎ、及びＩ９２Ｈ。
【００８０】
他の実施形態において、本発明の方法で使用されるＢｓｔｅＥエステラーゼの突然変異体は以下の突然変異の１種以上を含む。
【００８１】
【表１】
2020505952.tif 000014
【実施例】
【００８２】
以下、実施例により本発明を更に説明するが、以下の実施例は発明を制限するものと解釈すべきではない。本明細書に記載する実施例と開示は代表的なものである。したがって、本明細書の実施例のセクションに記載する試験と結果はガイドラインとして使用されたい。
【００８３】
［実施例１］ジアステレオ選択的酵素加水分解
【００８４】
【化１３】
2020505952.tif 000015
【００８５】
［実施例１ａ］ジアステレオ選択的酵素加水分解が可能な酵素のスクリーニング
同一条件下で同一サンプリング手順による実験室規模の加水分解反応を使用して酵素変異体を野生型酵素及び他の酵素変異体と比較した。反応条件とサンプリングタイミングを同一とすることにより、各時点（即ち４時間）で変異体間の変換率と選択性の相対比較を行った。従来のコンピテント大腸菌発酵条件を使用して各突然変異体を発現させた（５０ｍＬのＩｎｖｏｔｒｏｇｅｎ  ＭａｇｉｃＭｅｄｉａ＃Ｋ６８０３に一晩培養液からの１％接種菌液を接種し、２５℃、２５０ＲＰＭで２４時間発現させた）。総体積５０ｍＬの遠心により細胞培養液を回収した後、細胞ペレットを２００ｍＭ  ＮａＨＰＯ４緩衝液（ｐＨ８）５ｍＬに再懸濁した。細胞懸濁液を超音波処理（３０秒ずつ３回）して細胞を破砕し、遠心し、細胞破片をペレット化した（６０００ＲＰＭで３５分間）。得られた５ｍＬの清澄化ライセートをスクリーニング反応で活性酵素溶液として使用した。
【００８６】
２００ｍＭ  ＮａＨＰＯ４緩衝液（ｐＨ８）５ｍＬと２−（ジフルオロメチル）シクロプロパン−１，１−カルボン酸（±）−ジプロピル（ジエステル最終濃度約１０ｇ／Ｌ）１００μＬを加えることにより２０ｍＬ容バイアル内で反応液を調製した。上記５ｍＬの清澄化ライセートを各反応液に加え（ｔ＝０時間）、反応液を４０℃にて菱形磁気撹拌棒により２５０ＲＰＭで撹拌しながらインキュベートした。２時間、４時間、及び１８時間の時点で５００μＬの反応液アリコートを分析用に採取した。アリコートに２０％ＨＣｌ溶液３滴を加え、ＭＴＢＥ  １ｍＬで抽出した。有機相をキラル順相ＨＰＬＣにより分析し、変換率と選択性を測定した（カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｘ  ３μｍ  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ−２；２５０ｍｍ×４．６ｍｍ；２０℃；移動相：ヘプタン／ｉＰｒＯＨ／ＴＦＡＡ，９８．５／１．５／０．１；流速：０．７ｍＬ／ｍｉｎ；注入量：２０μＬ；検出器：ＵＶ２１０ｎｍ）。選択した突然変異体の比較を表１に示す。
【００８７】
【表２】
2020505952.tif 000016
【００８８】
変異体活性は著しく改善したので、高活性の突然変異体間の分離度を高めるためにより厳格な活性アッセイを利用した。同一手順で発現を行い、５０ｍＬペレットを得た。ペレットのデカント後、細胞を２００ｍＭ  ＮａＨＰＯ４緩衝液（ｐＨ８）５ｍＬに再懸濁した。細胞懸濁液を超音波処理（１０秒オン、１０秒オフを合計１分間）して細胞を破砕し、遠心し、細胞破片をペレット化した（９０００ＲＰＭで１５分間）。得られた５ｍＬの清澄化ライセートについて、標準ブラッドフォードクーマシータンパク質アッセイを使用して可溶性タンパク質含量を測定した。タンパク質測定によりライセート添加を規準化し、最終濃度が２０ｍＬ容バイアル内で緩衝液（２００ｍＭ  ＮａＨＰＯ４緩衝液，ｐＨ８）１０ｍＬ中に総タンパク質１ｍＬ当たり１ｍｇとなるようにした。２−（ジフルオロメチル）シクロプロパン−１，１−カルボン酸（±）−ジプロピル１００μＬ（ジエステル最終濃度約１０ｇ／Ｌ）を各反応液に加え（ｔ＝０時間）、反応液を４０℃にて菱形磁気撹拌棒により２５０ＲＰＭで撹拌しながらインキュベートした。１時間、３時間、５時間、及び２４．５時間の時点で５００μＬの反応液アリコートを分析用に採取した。アリコートに２０％ＨＣｌ溶液３滴を加え、ＭＴＢＥ  １ｍＬで抽出した。有機相をキラル順相ＨＰＬＣにより分析し、変換率と選択性を測定した（カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｘ  ３μｍ  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ−２；２５０ｍｍ×４．６ｍｍ；２０℃；移動相：ヘプタン／ｉＰｒＯＨ／ＴＦＡＡ，９８．５／１．５／０．１；流速０．７：ｍＬ／ｍｉｎ；注入量：２０μＬ；検出器：ＵＶ２１０ｎｍ）。選択した突然変異体の比較を表２に示す。
【００８９】
【表３】
2020505952.tif 000017
【００９０】
［実施例１ｂ］酵素加水分解における野生型ＢｓｔｅＥエステラーゼと突然変異体ＢｓｔｅＥエステラーゼの比較
選択性の高い三重変異体であるＴ２５Ｈ／Ｌ９２Ｈ／Ｋ１２１Ｌ（表２に記載）を含む新規変異体酵素は（±）−２−（ジフルオロメチル）−１−（エトキシカルボニル）シクロプロパンカルボン酸ジシクロヘキシルアミン塩の生成において野生型バチルス・ステアロサーモフィルスエステラーゼ（スキーム５）に比較して選択性と活性の改善を示し、以下のプロセスで適用した場合に収率の増加と処理時間の改善をもたらす。
【００９１】
工程１：三重変異体酵素（即ちＴ２５Ｈ／Ｌ９２Ｈ／Ｋ１２１Ｌ）はｒａｃ−シクロプロピルジエチルエステル（２−（ジフルオロメチル）シクロプロパン−１，１−カルボン酸（±）−ジエチル）の選択的な加水分解を触媒する。人工的に作製したバチルス・ステアロサーモフィルスエステラーゼ清澄化ライセートをリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８）に懸濁し、撹拌槽型反応器にてｒａｃ−シクロプロピルジエチルエステルを処理した。１５％重炭酸ナトリウム溶液の添加によりｐＨを８に制御しながら反応が完了するまで反応液を撹拌すると、ｒａｃ−ＤＦ酸エステルへの選択的な加水分解が得られ、望ましくないジアステレオマーの生成率は＜３％であった。ＭＴＢＥで抽出することによりｒａｃ−ＤＦ酸エステルを水性緩衝液から回収した。
【００９２】
工程２：抽出したｒａｃ−ＤＦ酸エステルをＭＴＢＥ：ヘプタン中で（±）−２−（ジフルオロメチル）−１−（エトキシカルボニル）シクロプロパンカルボン酸ジシクロヘキシルアミン塩に変換し、固体として回収する。工程１のモノ酸のｄ．ｅ．が高いため、再スラリー化又は再結晶を行わずに１段階でこの回収が可能になる。
【００９３】
改良酵素変異体であるＴ２５Ｈ／Ｌ９２Ｈ／Ｋ１２１Ｌはプロセス要件を満たすために十分な品質とキラル純度で約８０〜９０％の（±）−２−（ジフルオロメチル）−１−（エトキシカルボニル）シクロプロパンカルボン酸ジシクロヘキシルアミン塩を生成することができる。野生型変異体は上記プロセスで使用するには不適切なモノ酸エステルのアンバランスな分布を生じていた。
【００９４】
【化１４】
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【００９５】
【化１５】
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【００９６】
［実施例１ｃ］突然変異体ＢｓｔｅＥプラスミドの調製
Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ（ＴＭ）ＰＣＲ増幅により所望のプラスミドに突然変異を組込んだ。Ａｇｉｌｉｅｎｔ  Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎツールを利用することにより所望の突然変異の各々に対応するＤＮＡプライマーをデザインした。ＤＭＳＯ  ０．５μＬ、濃度１０μＭの各プライマー０．５μＬ、５０μｇ／ｍＬの鋳型プラスミド１μＬ、２０ｍＭ  ｄＮＴＰ  １μＬ（各ヌクレオチド５ｍＭ）、１０×ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液２．５μＬ、超純水１８．５μＬ、ＤＮＡポリメラーゼ０．５μＬを加えることによりＰＣＲ反応液を調製した。ＰＣＲ反応液に以下の温度サイクル手順、即ち９５℃で３分、［サイクル開始］９５℃で３０秒、５５℃で１分、６８℃で８分、［以上を「サイクル開始」から１５回繰返す］、６８℃で１０分、４℃保持の温度サイクル手順を行った。増幅後、親ＤＮＡを３７℃にてＤｐｎＩ  ２μＬで４時間消化し、完了したら２０分間８０℃で熱不活性化させた。標準形質転換手順を使用してＰＣＲ産物０．５μＬをＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセルに導入して形質転換し、ＬＢ＋ＫＡＮ（５０μｇ／ｍＬ）選択プレートに播種した。
【００９７】
［実施例２］ジアステレオ選択的酵素加水分解のスケールアップ
【００９８】
【化１６】
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【００９９】
ジエチルエステル出発原料（１）３０ｇを利用して実施例１ａの手順に従った。得られた物質（２ａ）は純度（≧９７面積％）とジアステレオマー（≦１．５０面積％）の生成物規格を満たした。
【０１００】
パイロットスケール発酵からの酵素製造
通常の増殖・発現手順とＩＰＴＧ誘導を使用して５５Ｌ容発酵槽で酵素発現を行った。得られた細胞（湿潤細胞重量約２０％で２８Ｌ）をディスク型遠心分離機により１０，０００×ｇ、遠心時間１２分間でペレット化した。細胞を５０ｍＭ  ＮａＨＰＯ４緩衝液（ｐＨ８）に対して１：１の体積比となるように撹拌により再懸濁した。細胞懸濁液をホモジナイザーに２回通し、細胞を破砕した。得られた生成物流をバッチ式遠心分離機に１０，０００×ｇで３０分間通し、細胞破片を除去した。得られた流出液をブラッドフォード法によるタンパク質濃度測定値１６．８ｍｇ／ｍＬの清澄化酵素溶液として使用した。
【０１０１】
酵素加水分解
５０ｍＭ  ＮａＨＰＯ４緩衝液（ｐＨ８）の添加により１６．８ｍｇ／ｍＬの上記流出液をタンパク質濃度３ｍｇ／ｍＬまで更に希釈した。得られた溶液は緩衝液（ｐＨ７．２）体積５００ｍＬ中にタンパク質３ｍｇ／ｍＬとなり、これをシングルガラスバッフル付５００ｍＬ容ＣｈｅｍＧｌａｓｓ反応器に仕込んだ。ジエステル基質（２５．３１ｇ）を反応器にピペットで加えた。ピッチブレード撹拌機により４５０ＲＰＭで撹拌を開始した。反応液ｐＨを常にモニターし、３０重量％重炭酸ナトリウムの添加によりｐＨ８に制御した。反応器内温度が４５℃となるように、反応槽ジャケット温度を４７℃に設定した。４０．５時間後に、反応はＨＰＬＣによると変換率９９．８％に達しており、塩基は３３．６７ｍＬであった。２５℃まで冷却することにより反応のワークアップを行った。５０重量％ＨＣｌ  ３０ｍＬを加えて反応液ｐＨを１．６９に調整し、３０分間撹拌した。ＭＴＢＥ３５０ｍＬの添加により反応液を抽出した。二相混合物を３２００×ｇで３０分間遠心して、分離を促進させると共に、ラグ層を圧縮した。有機層をデカントし、保持した。ＭＴＢＥ２００ｍＬの添加により水層を逆抽出した。得られたＭＴＢＥ層を合わせてロータリーエバポレーターで濃縮し、概算％ＰＡジアステレオマーが２．５％ＰＡである所望のモノ酸混合物（２５．３１４ｇ，純度９０．８％）を得た。
【０１０２】
ＤＣＨＡ塩形成
乾燥した清浄な１００ｍＬ容三つ口フラスコに撹拌棒、還流冷却器、窒素導入管及び温度プローブを取り付け、ＤＦ酸エステル（５．０５ｇ，０．０２４３ｍｏｌ，１．０当量）を仕込んだ。ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル２．２ｍＬ［ＤＦ酸エステル１ｇ当たり０．４３ｍＬ］を加え、撹拌を開始した。ｎ−ヘプタン４０．８ｍＬ［ＤＦ酸エステル１ｇ当たり８．０８ｍＬ］を加え、溶液を７５℃まで加熱した。ジシクロヘキシルアミン（５．９ｍＬ，０．０２９４ｍｏｌ，１．２当量）を窒素下に１０分間かけてゆっくりと滴下した。この間に、反応槽の内容物は均一なスラリーを形成した。添加の完了後、得られたスラリーを７５℃で１時間撹拌した後、室温（２３℃）まで冷却した。スラリーを室温で４時間撹拌した後、８℃まで冷却し、２時間維持した。冷却したスラリーを濾過し、１：１（体積比）ＭＴＢＥ／ヘプタンの冷溶液各４．７ｍＬで３回洗浄した［予想されるＤＦ酸エステルＤＣＨＡ１ｇ当たり合計１．５ｍＬ］。濾過後の固形分を４０℃で減圧乾燥し、ＤＦ酸エステルＤＣＨＡを白色粉末として得た（９．２２ｇ、ジアステレオマー０．７３％、ＨＰＬＣによる測定値９７．６面積％、収率８９％）。
【０１０３】
【表４】
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【０１０４】
［比較例２ａ］２−（ジフルオロメチル）シクロプロパン−１，１−カルボン酸（±）−ジエチル（１）の非酵素加水分解
【０１０５】
【化１７】
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【０１０６】
エタノール（３．７９当量）と精製水（５当量）を清浄な反応器に仕込んだ。２−（ジフルオロメチル）シクロプロパン−１，１−カルボン酸（±）−ジエチル（１，１当量）を１５〜２５℃で上記混合液に加えた。反応液を５℃まで冷却し、水酸化テトラブチルアンモニウム（１当量）を滴下した。２時間撹拌後、反応液をＨＰＬＣによりサンプリングし、加水分解レベルを測定した。ＨＰＬＣによるジエステル残量が＜２％になるまで水酸化テトラブチルアンモニウムを更に添加した。ｐＨが≦３になるように、０〜１０℃でＨＣｌ（０．６９当量）水（６．９当量）溶液を反応器に加えた。ＭＴＢＥ（７．４当量）を反応器に加え、１５〜２５℃で３０〜６０分間撹拌した。有機相を分離し、保持した。１５〜２５℃で３０〜４０分間撹拌しながら水相をＭＴＢＥ（３．１８当量）で逆抽出した。有機層を水層から分離し、先の抽出層と合わせた。有機層をブライン（水３．４４当量、ＮａＣｌ  ０．８６当量）で洗浄した後、水洗（４．３当量）した。有機層を分離し、＜４０℃で減圧濃縮した。反応液を１５〜２５℃まで冷却し、ＤＣＨＡ（．８４５当量）を加えた。反応液を１〜２時間還流下に５５〜５９℃まで加熱した。反応液を１５〜２５℃まで冷却し、＞８時間維持した。望ましくないジアステレオマーのＨＰＬＣ測定値が＜４％ＰＡになるまでヘプタン（約４．４当量）を必要に応じて加えた。得られた固形分を濾取し、ＭＴＢＥ（１．５当量）でリンスした。次に固形分をＭＴＢＥ（４．２４当量）で繰返し再スラリー化した後、望ましくないジアステレオマーのＨＰＬＣ測定値が＜１．５％ＰＡになるまで同様の加熱（５５〜５９℃）・冷却・濾過手順を行った。得られたフィルターケーキを減圧乾燥してＭＴＢＥを除去し、所望のＤＣＨＡラセミ塩を得た（純度９８％、ｄ．ｅ．＞９７％、収率５１〜５８％）。
【０１０７】
比較例２ａに概要を述べた手順によると、ジアステレオマー混合物（ｄ．ｅ．約６０％、化合物２ａ〜２ｂ）としての生成物が収率約５１％〜５６％で得られる。加水分解サイクルは約２４時間かけて行った。
【０１０８】
一方、実施例１ａ及び２に例示した本発明の方法では、ジアステレオ濃縮生成物２ａがｄ．ｅ．約９８％と収率約８５％で得られる。加水分解サイクルは同様に約２４時間かけて行った。
【０１０９】
［実施例３］：原薬に至る酵素的分割
スキーム２に示すように、一連のアミノ化反応と分割反応により（±）−２ａを原薬に変換又は組込むことができる。
【０１１０】
典型的なアミノ化反応を下記スキーム７に示す。
【０１１１】
【化１８】
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【０１１２】
スキーム８に示し、以下の合成手順に記載するように、酵素的分割を使用してアミノ化生成物であるラセミアミノ酸エステル（（±）−３）の分割を行ってもよい。
【０１１３】
【化１９】
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【０１１４】
アミノ酸（（±）−３）のアセトン溶液を重炭酸ナトリウム／炭酸ナトリウム緩衝液の水溶液と混合した。アルカラーゼ（登録商標）２．４Ｌ（（±）−３グラム当たり１．３ｇ）を加え、混合液を４０℃で撹拌した。反応完了後、エナンチオマー（ＳＳ−４）を水層で除去し、生成物（ＲＲ−３）をＭＴＢＥで抽出した。標準的な鹸化手順により生成物（ＲＲ−３）をアミノ酸（ＲＲ−４）に変換することができる。
【０１１５】
文献援用
本明細書の全文を通して引用する全ての文献（非特許文献、発行済特許、公開特許出願及び同時係属特許出願を含む）の内容全体を明示的に本明細書に援用する。特に定義しない限り、本明細書で使用する全科学技術用語は当技術分野における通常の知識を有する者に広く知られている意味に従う。
【０１１６】
等価物
当業者であれば、単なる日常的な実験を使用するだけで本明細書に記載する本発明の特定の実施形態の多くの等価物に着想又は想到することができよう。このような等価物も以下の特許請求の範囲に含むものとする。本明細書の全文を通して引用する全ての文献、特許、公開特許出願及び特許出願の内容を本明細書に援用する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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