(57)【要約】  抗ＧＩＴＲ抗体、その抗原結合性断片、およびその医薬用途が提供される。さらに、抗ＧＩＴＲ抗体のＣＤＲを含むキメラ抗体およびヒト化抗体、抗ＧＩＴＲ抗体およびその抗原結合性断片を含む医薬組成物、ならびに抗ガン剤の調製における抗ＧＩＴＲ抗体の使用が提供される。特に、ヒト化抗ＧＩＴＲ抗体、および、ＧＩＴＲ媒介疾患または障害の治療用の薬物の調製における使用が提供される。
2020532279.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号５７、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号５０、配列番号５１および配列番号５２からなる群より選択される少なくとも１つのＬＣＤＲを含む抗体軽鎖可変領域、および／または、
配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号１１、配列番号１２、配列番号５６、配列番号１３、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４７、配列番号４８および配列番号４９からなる群より選択される少なくとも１つのＨＣＤＲを含む抗体重鎖可変領域、を含む、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項２】
前記ＬＣＤＲが、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３の一つ以上を含み、前記ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列が配列番号６、配列番号１４、配列番号５７、配列番号４２または配列番号５０に示され、前記ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列が配列番号７、配列番号１５、配列番号４３または配列番号５１に示され、前記ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列が配列番号８、配列番号１６、配列番号４４または配列番号５２に示され、および／または、
前記ＨＣＤＲが、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３の一つ以上を含み、前記ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列が配列番号３、配列番号１１、配列番号３９または配列番号４７に示され、前記ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列が配列番号４、配列番号１２、配列番号５６、配列番号４０または配列番号４８に示され、前記ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列が配列番号５、配列番号１３、配列番号４１または配列番号４９に示される、請求項１に記載の抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項３】
前記抗体軽鎖可変領域が、配列番号６、配列番号７および配列番号８にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を、または、配列番号５７、配列番号１５および配列番号１６にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を、または、配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を、または、配列番号４２、配列番号４３および配列番号４４にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を、または、配列番号５０、配列番号５１および配列番号５２にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み、および／または、
前記抗体重鎖可変領域が、配列番号３、配列番号４および配列番号５にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を、または、配列番号１１、配列番号５６および配列番号１３にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を、または、配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を、または、配列番号３９、配列番号４０および配列番号４１にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を、または、配列番号４７、配列番号４８および配列番号４９にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む、請求項２に記載の抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項４】
前記抗体軽鎖可変領域が、配列番号６、配列番号７および配列番号８にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み、および、前記重鎖可変領域が、配列番号３、配列番号４および配列番号５にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む、および／または、
前記抗体軽鎖可変領域が、配列番号５７、配列番号１５および配列番号１６に示それぞれされるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み、および、前記重鎖可変領域が、配列番号１１、配列番号５６および配列番号１３にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む、および／または、
前記抗体軽鎖可変領域が、配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み、および、前記重鎖可変領域が、配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む、および／または、
前記抗体軽鎖可変領域が、配列番号４２、配列番号４３および配列番号４４にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み、および、前記重鎖可変領域が、配列番号３９、配列番号４０および配列番号４１にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む、および／または、
前記抗体軽鎖可変領域が、配列番号５０、配列番号５１および配列番号５２にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み、および、前記重鎖可変領域が、配列番号４７、配列番号４８および配列番号４９にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む、請求項３に記載の抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項５】
前記抗体またはその抗原結合性断片がマウス抗体またはキメラ抗体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項６】
前記マウス抗体または前記キメラ抗体の軽鎖可変領域ＬＣＶＲが配列番号２であり、および、重鎖可変領域のＨＣＶＲが配列番号１である、または、
軽鎖可変領域ＬＣＶＲが配列番号１０であり、および、重鎖可変領域ＨＣＶＲが配列番号９である、または、
軽鎖可変領域ＬＣＶＲが配列番号３８であり、および、重鎖可変領域ＨＣＶＲが配列番号３７である、または、
軽鎖可変領域ＬＣＶＲが配列番号４６であり、および、重鎖可変領域ＨＣＶＲが配列番号４５である、請求項５に記載の抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項７】
前記抗体またはその抗原結合性断片がヒト抗体またはヒト化抗体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項８】
前記ヒト化抗体の軽鎖可変領域の軽鎖ＦＲ領域の配列が、配列番号２２に示されるヒト生殖細胞系列の軽鎖ＩＧｋＶ４−１配列に、または、
配列番号２４に示されるヒト生殖細胞系列の軽鎖ＩＧｋＶ３−１１配列に、由来する、  請求項７に記載の抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項９】
前記抗体軽鎖配列が配列番号１８または配列番号２０に示される、または、その変異体であり、前記変異体は好ましくは軽鎖に０〜１０個のアミノ酸の変異を有し、配列番号１８のアミノ酸配列は好ましくは４９位で変異し、アミノ酸残基の前記変異は好ましくはＳ４９Ｐであり、配列番号２０のアミノ酸配列は好ましくは４６、５２および５７位で変異し、アミノ酸残基の前記変異は好ましくはＷ４６Ｌ、Ｄ５２ＮおよびＦ５７Ｉである、請求項７に記載の抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１０】
前記ヒト化抗体の重鎖可変領域が、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、または、ＩｇＧ４の重鎖ＦＲ領域、または、それらの変異体を含み、好ましくは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、または、ＩｇＧ４の重鎖ＦＲ領域、より好ましくは、ヒトＩｇＧ１、または、ＩｇＧ２の重鎖ＦＲ領域を含む、請求項７〜９のいずれか一項に記載の抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１１】
前記ヒト化抗体の重鎖可変領域の重鎖ＦＲ領域の配列が、配列番号２１に示されるヒト生殖細胞系列の重鎖ＩＧＨＶ３−４８配列に、または、
配列番号２３に示されるヒト生殖細胞系列の重鎖ＩＧＨＶ１−２配列に由来する、請求項１０に記載の抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１２】
前記ヒト化抗体の重鎖配列が配列番号１７または配列番号１９に示される、または、その変異体であり、前記変異体は好ましくは重鎖に０〜１０個のアミノ酸の変異を有し、配列番号１７のアミノ酸配列は好ましくは４９位で変異し、アミノ酸残基の前記変異は好ましくはＡ４９Ｓであり、配列番号１９のアミノ酸配列は好ましくは６１位および７６位で変異し、アミノ酸残基の前記変異は好ましくはＮ６１ＡおよびＳ７６Ｉである、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１３】
前記抗体がヒト化抗体ｈｕ１８Ｆ１０またはヒト化抗体ｈｕ８Ａ１１であり、前記ヒト化抗体の可変領域が以下に示される、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合性断片。
ヒト化抗体ｈｕ１８Ｆ１０：重鎖可変領域の配列が配列番号３３に示され、軽鎖可変領域の配列が配列番号３６に示される。
ヒト化抗体ｈｕ８Ａ１１：重鎖可変領域の配列が配列番号２６に示され、軽鎖可変領域の配列が配列番号２９に示される。
【請求項１４】
前記ヒト化抗体ｈｕ１８Ｆ１０が、配列番号１９に示される重鎖可変領域の配列および配列番号２０に示される軽鎖可変領域の配列を含み、
前記ヒト化抗体ｈｕ８Ａ１１が、配列番号１７に示される重鎖可変領域の配列および配列番号１８に示される軽鎖可変領域の配列を含む、請求項１３に記載の抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１５】
ＧＩＴＲを結合において、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合性断片と競合することができる、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１６】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合性断片の可変領域または重鎖可変領域を、または、請求項１５に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片を含む、多重特異性抗体。
【請求項１７】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合性断片、または、請求項１５に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片の軽鎖可変領域または重鎖可変領域を含む、単鎖抗体。
【請求項１８】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合性断片、または、請求項１５に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片の軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域を含む、抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項１９】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合性断片、請求項１６に記載の多重特異性抗体、または、請求項１７に記載の単鎖抗体をコードする核酸。
【請求項２０】
請求項１９に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項２１】
請求項２０に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項２２】
前記宿主細胞が細菌、好ましくは大腸菌である、または、前記宿主細胞が酵母、好ましくはピキア酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）である、または、前記宿主細胞が哺乳動物細胞、好ましくはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはヒト胚腎（ＨＥＫ）２９３細胞である、請求項２１に記載の宿主細胞。
【請求項２３】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合性断片を調製する方法であって、請求項２２に記載の宿主細胞において前記抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合性断片を発現させる工程、および、前記抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合性断片を前記宿主細胞から単離する工程を含む、方法。
【請求項２４】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合性断片、請求項１５に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片、請求項１６に記載の多重特異性抗体または請求項１７に記載の単鎖抗体、および、医薬賦形剤、希釈剤、または、担体を含む、医薬組成物。
【請求項２５】
好ましくは癌、最も好ましくは黒色腫、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、腎癌、肺癌、肝臓癌、胃癌、大腸癌、膀胱癌、食道癌、子宮頸癌、多発性骨髄腫、白血病、リンパ腫、胆嚢癌および膠芽腫である、ＧＩＴＲまたはＧＩＴＲＬ−関連疾患または障害を治療するための薬物の調製において使用するための、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合性断片、請求項１５に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片、請求項１６に記載の多重特異性抗体、請求項１７に記載の単鎖抗体、または、請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
ＧＩＴＲまたはＧＩＴＲＬ−関連の疾患または障害を治療および予防するための方法であって、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合性断片、請求項１５に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片、請求項１６に記載の多重特異性抗体、請求項１７に記載の単鎖抗体または請求項２４に記載の医薬組成物の治療有効量を、それを必要とする患者に投与する工程を含み、前記疾患は、好ましくは癌であり、前記癌は、最も好ましくは黒色腫、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、腎癌、肺癌、肝臓癌、胃癌、大腸癌、膀胱癌、食道癌、子宮頸癌、多発性骨髄腫、白血病、リンパ腫、胆嚢癌および膠芽腫である、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１７年６月３０日に出願された中国特許出願ＣＮ２０１７１０５２２７４２．４に対する優先権の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
技術分野
本発明は、抗ＧＩＴＲ抗体、ＧＩＴＲの抗原結合性断片、キメラ抗体、前記抗ＧＩＴＲ抗体のＣＤＲ領域を含むヒト化抗体、および、ヒト抗ＧＩＴＲ抗体とその抗原結合性断片とを含む医薬組成物、ならびに、抗癌剤の調製における前記抗ＧＩＴＲ抗体の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
腫瘍は、最大の健康阻害因子の１つとして人間社会が長期的に直面する重要な課題である。従来の手術、化学療法、放射線療法などの治療法は、多くの場合、播種性固形腫瘍の治療に対する効果が限定的である。腫瘍免疫療法、特にＴ細胞腫瘍免疫療法は、腫瘍療法の注目されている分野である。腫瘍免疫療法は、細胞傷害性Ｔ細胞を腫瘍患者に導入して腫瘍を殺すことにより、細胞傷害性Ｔ細胞を最大限に活用するものであり、腫瘍を治療する最も効果的で安全な方法である。これらの治療法は、播種性転移腫瘍を含むいくつかの異なるタイプの癌の治療に有望な見通しがある。
【０００４】
人体のＴ細胞活性化は、二つのシグナル伝達経路を含むシステムを採用している。抗原提示細胞（ＡＰＣ）を介してＭＨＣ抗原ペプチドを提示することによりＴ細胞に最初のシグナルを伝達することに加えて、一連の共刺激分子が２番目のシグナルを提供し、Ｔ細胞の正常な免疫応答を可能にすることが要求される。この二重シグナル伝達経路システムは、生体内の免疫システムのバランスに重要な役割を果たしている。身体を厳密に制御して、自己抗原と非自己抗原に対する異なる免疫応答を活性化する。共刺激機構によって提供される２番目のシグナルの欠如は、Ｔ細胞応答の失敗または持続する特定の免疫応答の喪失をもたらし、したがって免疫寛容をもたらす。すなわち、２番目のシグナル伝達経路は、免疫応答のプロセス全体を調節する上で非常に重要な役割を果たす。
【０００５】
ＧＩＴＲ（糖質コルチコイド誘発ＴＮＦＲ関連タンパク質、ＴＮＦＲＳＦ１８とも呼ばれる）は、２２８個のアミノ酸で構成される膜貫通タンパク質である。これは、１９アミノ酸のシグナル配列、三つのシステインリッチモチーフを含む１３４アミノ酸の細胞外領域、２３アミノ酸の膜貫通領域、および５２アミノ酸の細胞内ドメインを有し、前記細胞内ドメインは、マウスおよびヒトにおけるＴＮＦＲの細胞内ドメインである４−１ＢＢおよびＣＤ２７との相同性が高い。腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーのメンバーとして、ＧＩＴＲは、先天性および適応免疫系の多くのコンポーネントで発現し、乳房、前立腺、脳、心臓、腎臓、肝臓、唾液腺、脾臓、胃、胸腺および子宮を含むさまざまな正常組織での発現は最小限である。
【０００６】
ＧＩＴＲは不活性なＴ細胞に構成的に存在し、別の膜貫通タンパク質、すなわちＧＩＴＲリガンド（ＧＩＴＲＬ）に結合する。Ｔ細胞の活性化後、ＧＩＴＲの発現が増加し、エフェクターＴリンパ球（Ｔｅｆｆ）の共活性化を引き起こし、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の活性を調節する。ＧＩＴＲは、主にＡＰＣで発現するＧＩＴＲＬによって活性化される。ＡＰＣは、その細胞内ドメインを介してシグナルを伝達し、ＴＲＡＦ２／ＮＩＫ経路を介してＮＦ−ｋＢ活性化を引き起こす。この活性化プロセスは、腫瘍およびウイルス感染に対する耐性を高め、ＮＫ細胞の共活性化を通じて感染および腫瘍に対する応答を高めるなど、自己免疫および炎症プロセスに関与している。
【０００７】
近年、多くの国際的企業が、ＧＩＴＲに対するモノクローナル抗体を開発しており、腫瘍に対する患者自身の免疫システムの応答性を向上させ、免疫活性化を特異的に刺激してがん細胞を殺すという目的を達成している。関連する特許出願は、ＷＯ２００６１０５０２１（特許文献１）、ＷＯ２０１１０２８６８３（特許文献２）、ＷＯ２０１１０２８６８３（特許文献３）、ＷＯ２０１３０３９９５４（特許文献４）、ＷＯ２０１５１８４０９９（特許文献５）、ＷＯ２０１５１８７８３５（特許文献６）、ＷＯ２０１５０３１６６７（特許文献７）、ＷＯ２０１６０５４６３８（特許文献８）、ＷＯ２０１７０８７６７８（特許文献９）、およびＷＯ２０１７０６８１８６（特許文献１０）などである。今までのところ、Ｉｎｃｙｔｅ、ＢＭＳおよび他の企業が開発した抗ＧＩＴＲ抗体は、フェーズＩ／ＩＩａの臨床試験段階にあり、ノバルティス、メルクおよびその他の多国籍製薬会社が所有する関連製品も第１相臨床試験中である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２００６１０５０２１号
【特許文献２】国際公開第２０１１０２８６８３号
【特許文献３】国際公開第２０１１０２８６８３号
【特許文献４】国際公開第２０１３０３９９５４号
【特許文献５】国際公開第２０１５１８４０９９号
【特許文献６】国際公開第２０１５１８７８３５号
【特許文献７】国際公開第２０１５０３１６６７号
【特許文献８】国際公開第２０１６０５４６３８号
【特許文献９】国際公開第２０１７０８７６７８号
【特許文献１０】国際公開第２０１７０６８１８６号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、ＧＩＴＲおよびその経路を刺激することにより免疫応答を活性化する薬物／組成物および方法で使用するための、高い親和性、高い選択性および高い生物活性を有する抗ＧＩＴＲ抗体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の概要）
本発明は、以下を含む抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号５７、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号５０、配列番号５１および配列番号５２からなる群より選択される少なくとも１つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）を含む抗体軽鎖可変領域、および／または、
配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号１１、配列番号１２、配列番号５６、配列番号１３、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４７、配列番号４８および配列番号４９からなる群より選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）を含む抗体重鎖可変領域。
【００１１】
本発明の好ましい実施形態において、抗体軽鎖可変領域が、配列番号６、配列番号１４、配列番号５７、配列番号４２または配列番号５０に示されるＬＣＤＲ１を含む、上記の抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合性断片が提供される。
【００１２】
本発明の好ましい実施形態において、抗体軽鎖可変領域が、配列番号７、配列番号１５、配列番号４３または配列番号５１に示されるＬＣＤＲ２を含む、上記の抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合性断片が提供される。
【００１３】
本発明の好ましい実施形態において、抗体軽鎖可変領域が、配列番号８、配列番号１６、配列番号４４または配列番号５２に示されるＬＣＤＲ３を含む、上記の抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合性断片が提供される。
【００１４】
本発明の好ましい実施形態において、抗体重鎖可変領域が、配列番号３、配列番号１１、配列番号３９または配列番号４７に示されるＨＣＤＲ１を含む、上記の抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合性断片が提供される。
【００１５】
本発明の好ましい実施形態において、抗体重鎖可変領域が、配列番号４、配列番号１２、配列番号５６、配列番号４０または配列番号４８に示されるＨＣＤＲ２を含む、上記の抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合性断片が提供される。
【００１６】
本発明の好ましい実施形態において、抗体重鎖可変領域が、配列番号５、配列番号１３、配列番号４１または配列番号４９に示されるＨＣＤＲ３を含む、上記の抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合性断片が提供される。
【００１７】
本発明の好ましい実施形態において、前記抗体軽鎖可変領域が、配列番号６、配列番号７および配列番号８にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む、上記の抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合性断片が提供される。
【００１８】
本発明の好ましい実施形態において、前記抗体軽鎖可変領域が、配列番号５７、配列番号１５および配列番号１６にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む、上記の抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合性断片が提供される。
【００１９】
本発明の好ましい実施形態において、前記抗体軽鎖可変領域が、配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む、上記の抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合性断片が提供される。
【００２０】
本発明の好ましい実施形態において、前記抗体軽鎖可変領域が、配列番号４２、配列番号４３および配列番号４４にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む、上記の抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合性断片が提供される。
【００２１】
本発明の好ましい実施形態において、前記抗体軽鎖可変領域が、配列番号５０、配列番号５１および配列番号５２にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む、上記の抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合性断片が提供される。
【００２２】
本発明の好ましい実施形態において、前記抗体重鎖可変領域が、配列番号３、配列番号４および配列番号５にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む、上記の抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合性断片が提供される。
【００２３】
本発明の好ましい実施形態において、前記抗体重鎖可変領域が、配列番号１１、配列番号５６および配列番号１３にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む、上記の抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合性断片が提供される。
【００２４】
本発明の好ましい実施形態において、前記抗体軽鎖可変領域が、配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む、上記の抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合性断片が提供される。
【００２５】
本発明の好ましい実施形態において、前記抗体重鎖可変領域が配列番号３９、配列番号４０および配列番号４１にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む、上記の抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合性断片が提供される。
【００２６】
本発明の好ましい実施形態において、前記抗体重鎖可変領域が、配列番号４７、配列番号４８および配列番号４９にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む、上記の抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合性断片が提供される。
【００２７】
本発明の好ましい実施形態において、前記抗体軽鎖可変領域が、配列番号６、配列番号７および配列番号８にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を、または、配列番号５７、配列番号１５および配列番号１６にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を、または、配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を、または、配列番号４２、配列番号４３および配列番号４４にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を、または、配列番号５０、配列番号５１および配列番号５２にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み、
前記抗体重鎖可変領域が、配列番号３、配列番号４および配列番号５にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を、または、配列番号１１、配列番号５６および配列番号１３にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を、または、配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を、または、配列番号３９、配列番号４０および配列番号４１にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を、または、配列番号４７、配列番号４８および配列番号４９にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合性断片が提供される。
【００２８】
特に好ましくは、前記抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合性断片は、以下からなる群から選択されるいずれか一つであってもよい。
【００２９】
（１）前記抗体軽鎖可変領域が、配列番号６、配列番号７および配列番号８にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み、および前記重鎖可変領域が、配列番号３、配列番号４および配列番号５にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む。
【００３０】
（２）前記抗体軽鎖可変領域が、配列番号５７、配列番号１５および配列番号１６にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み、および前記重鎖可変領域が、配列番号１１、配列番号５６および配列番号１３にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む。
【００３１】
（３）前記抗体軽鎖可変領域が、配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み、および前記重鎖可変領域が、配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む。
【００３２】
（４）前記抗体軽鎖可変領域が、配列番号４２、配列番号４３および配列番号４４にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み、および前記重鎖可変領域が、配列番号３９、配列番号４０および配列番号４１にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む。
【００３３】
（５）前記抗体軽鎖可変領域が、配列番号５０、配列番号５１および配列番号５２にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み、および前記重鎖可変領域が、配列番号４７、配列番号４８および配列番号４９にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む。
【００３４】
本発明の好ましい実施形態において、抗体軽鎖可変領域の配列は、配列番号２または配列番号１０から選択され、抗体重鎖可変領域の配列は、配列番号１または配列番号９から選択される。
【００３５】
本発明は、前記抗体または抗原結合性断片の軽鎖可変領域ＬＣＶＲが配列番号３８であり、重鎖可変領域ＨＣＶＲが配列番号３７である抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合性断片も提供する。
【００３６】
本発明は、前記抗体または抗原結合性断片の軽鎖可変領域ＬＣＶＲが配列番号４６であり、重鎖可変領域ＨＣＶＲが配列番号４５である抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合性断片も提供する。
【００３７】
本発明の好ましい実施形態において、前記抗体がマウス抗体またはその断片である上記の抗ＧＩＴＲ抗体または抗原結合性断片が提供される。
【００３８】
本発明の好ましい実施形態において、前記抗体軽鎖可変領域が、さらに、マウスκ，λ鎖またはその変異体の軽鎖ＦＲ領域を含む、上記のマウス抗体またはその断片が提供される。
【００３９】
本発明の好ましい実施形態において、前記抗体軽鎖可変領域が、さらに、マウスκ，λ鎖またはその変異体の軽鎖定常領域を含む、上記のマウス抗体またはその断片が提供される。
【００４０】
本発明の好ましい実施形態において、前記抗体重鎖可変領域が、さらに、マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはその変異体の軽鎖ＦＲ領域を含む、上記のマウス抗体またはその断片が提供される。
【００４１】
本発明の好ましい実施形態において、前記抗体軽鎖可変領域が、さらに、マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはその変異体の重鎖定常領域を含む、上記のマウス抗体またはその断片が提供される。
【００４２】
本発明の好ましい実施形態において、前記抗体がキメラ抗体またはその断片である上記の抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合性断片が提供される。
【００４３】
本発明の好ましい実施形態において、前記抗体軽鎖可変領域ＬＣＶＲが配列番号２または配列番号１０である上記のマウス抗体またはキメラ抗体が提供される。
【００４４】
本発明の好ましい実施形態において、前記抗体重鎖可変領域ＨＣＶＲが配列番号１または配列番号９である上記のマウス抗体またはキメラ抗体が提供される。
【００４５】
本発明の好ましい実施形態において、さらに、ヒトκ，λ鎖またはその変異体の軽鎖定常領域を含む、上記のキメラ抗体またはその断片が提供される。
【００４６】
本発明の好ましい実施形態において、さらに、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはその変異体の重鎖定常領域を含む、上記のキメラ抗体またはその断片が提供される。
【００４７】
本発明の好ましい実施形態において、前記抗体がヒト抗体またはその断片である、上記の抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合性断片が提供される。
【００４８】
本発明の好ましい実施形態において、前記抗体がヒト化抗体またはヒト抗体である、上記の抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合性断片が提供される。
【００４９】
本発明の好ましい実施態様では、配列番号１８または配列番号２０の抗体軽鎖配列またはその変異体を有する上記のヒト化抗体が提供され、前記変異体は、好ましくは軽鎖に０〜１０個のアミノ酸の変異を有し、より好ましくはアミノ酸位置４６、４９、５２および５７に変異を有す、配列番号１８のアミノ酸は好ましくは４９位で変異し、アミノ酸の変異は好ましくはＳ４９Ｐであり、配列番号２０のアミノ酸は好ましくは４６、５２および５７位で変異し、アミノ酸の変異は好ましくはＷ４６Ｌ、Ｄ５２ＮおよびＦ５７Ｉである。
【００５０】
本発明の好ましい実施形態において、前記抗体重鎖可変領域が配列番号１７または配列番号１９またはその変異体であり、前記変異体は好ましくは軽鎖に０〜１０個のアミノ酸の変異を有する、上記のヒト化抗体が提供される。
【００５１】
本発明の好ましい実施形態において、さらに、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはその変異体の定常領域を含み、好ましくはヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４の定常領域を含む、上記のヒト抗体またはその断片が提供される。
【００５２】
本発明の好ましい実施形態において、前記抗体がヒト化抗体またはその断片である、上記の抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合性断片が提供される。
【００５３】
本発明の好ましい実施形態において、ヒト化抗体軽鎖可変領域が、さらに、ヒトκ，λ鎖の軽鎖ＦＲ領域またはその変異体を含む、上記のヒト化抗体またはその断片が提供される。
【００５４】
本発明の好ましい実施形態において、前記ヒト化抗体軽鎖可変領域の軽鎖ＦＲ領域の配列が、配列番号２２に示されるヒト生殖細胞系列の軽鎖ＩＧｋＶ４−１配列、または、配列番号２４に示されるヒト生殖細胞系列の軽鎖ＩＧｋＶ３−１１配列に由来する、ヒト化抗体または断片が提供される。
【００５５】
本発明の好ましい実施形態において、前記ヒト化抗体軽鎖可変領域が、配列番号２９または配列番号３６またはその変異体として示される、上記のヒト化抗体またはその断片が提供される。
【００５６】
本発明の好ましい実施形態において、さらに、ヒトκ，λ鎖の軽鎖定常領域またはその変異体を含む、上記のヒト化抗体またはその断片が提供される。
【００５７】
本発明の好ましい実施形態において、前記ヒト化抗体重鎖可変領域が、さらに、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはその変異体の重鎖ＦＲ領域を含む、上記のヒト化抗体またはその断片が提供される。
【００５８】
本発明の好ましい実施形態において、前記ヒト化抗体重鎖可変領域の重鎖ＦＲ領域の配列が、配列番号２１に示されるヒト生殖細胞系列の重鎖ＩＧＨＶ３−３８配列、または配列番号２３に示されるヒト生殖細胞系列の重鎖ＩＧＨＶ１−２配列に由来する、上記のヒト化抗体またはその断片が提供される。
【００５９】
本発明の好ましい実施形態において、前記ヒト化抗体重鎖可変領域が配列番号２６または配列番号３３またはその変異体として示される、上記のヒト化抗体またはその断片が提供される。
【００６０】
本発明の好ましい実施態様では、前記ヒト化抗体重鎖配列が、配列番号１７または配列番号１９またはその変異体として示される、上記のヒト化抗体またはその断片が提供され、前記変異体は、好ましくは重鎖に０〜１０個のアミノ酸の変異を有し、より好ましくはアミノ酸の４６、６１および７６位に変異を有し、配列番号１７のアミノ酸は好ましくは４９位で変異し、アミノ酸の変異は好ましくはＡ４９Ｓであり、配列番号１９のアミノ酸は、好ましくは６１および７６位で変異し、アミノ酸の変異は好ましくはＮ６１ＡおよびＳ７６Ｉである。
【００６１】
本発明の好ましい実施形態において、さらに、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはその変異体の重鎖定常領域を含み、好ましくはヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４の重鎖ＦＲ領域を含み、より好ましくはヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ２の重鎖ＦＲ領域を含む、上記のヒト化抗体またはその断片が提供される。
【００６２】
本発明の好ましい実施形態において、前記抗原結合性断片がＦａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２、線状抗体、単鎖抗体、ナノボディ、ドメイン抗体または多特異的抗体である、上記の抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合性断片が提供される。
【００６３】
本発明は、さらに、ＧＩＴＲへの結合に関して前記モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片と競合することができる、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
【００６４】
本発明は、さらに、前記抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合性断片をコードする核酸を提供する。
【００６５】
本発明は、さらに、上記の核酸を含む発現ベクターを提供する。
【００６６】
本発明は、さらに、上記の発現ベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。
【００６７】
本発明の好ましい実施形態において、前記宿主細胞が細菌である、好ましくは大腸菌である上記の宿主細胞が提供される。
【００６８】
本発明の好ましい実施形態において、酵母である、好ましくはピキア酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）である上記の宿主細胞が提供される。
【００６９】
本発明の好ましい実施形態において、哺乳動物細胞、好ましくはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはヒト胚腎（ＨＥＫ）２９３細胞である上記の宿主細胞が提供される。
【００７０】
本発明は、上記の軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む多重特異性抗体も提供する。
【００７１】
本発明は、上記の軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む単鎖抗体も提供する。
【００７２】
本発明は、前記軽鎖可変領域および／または前記重鎖可変領域を含む抗体−薬物コンジュゲートも提供する。前記抗体−薬物コンジュゲートは当技術分野で知られており、相互に連結された抗体−リンカー−薬物（毒素）によって形成される。当該技術分野で既知のリンカーは、切断可能なリンカー、切断不可能なリンカーを含み、例えば、前記リンカーは、ＳＭＣＣ、ＳＰＤＰなどを含むがこれらに限定されない。ＤＭＩ、ＤＭ４、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦなどの毒素も当技術分野で知られている。
【００７３】
本発明は、上記の宿主細胞において前記抗体またはその抗原結合性断片を発現させる工程、および、前記抗体またはその抗原結合性断片を前記宿主細胞から単離する工程を含む、抗ＧＩＴＲ抗体およびその抗原結合性断片を調製する方法も提供する。
【００７４】
本発明は、前記抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合性断片、前記単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片、前記多重特異性抗体または上記の単鎖抗体、および、医薬賦形剤、希釈剤、または、担体を含む医薬組成物を、さらに提供する。
【００７５】
本発明は、ＧＩＴＲまたはＧＩＴＲＬ−関連疾患または障害を治療するための薬物の調製における、上記の抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合性断片、前記単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片、前記多重特異性抗体、前記単鎖抗体または前記医薬組成物の使用を、さらに提供し、前記疾患は、好ましくは癌であり、前記癌は、最も好ましくは黒色腫、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、腎癌、肺癌、肝臓癌、胃癌、大腸癌、膀胱癌、食道癌、子宮頸癌、多発性骨髄腫、白血病、リンパ腫、胆嚢癌および膠芽腫である。
【００７６】
本発明は、ＧＩＴＲまたはＧＩＴＲＬ−関連疾患または障害を治療および予防するための方法であって、上記の抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合性断片、前記単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片、前記多重特異性抗体、前記単鎖抗体または前記医薬組成物の治療有効量を、それを必要とする患者に投与する工程を含む方法を、さらに提供し、前記疾患は、好ましくは癌であり、前記癌は、最も好ましくは黒色腫、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、腎癌、肺癌、肝臓癌、胃癌、大腸癌、膀胱癌、食道癌、子宮頸癌、多発性骨髄腫、白血病、リンパ腫、胆嚢癌および膠芽腫である。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】インビトロでのマウス抗ＧＩＴＲ抗体の細胞活性であり、各試験抗体がサイトカインＩＬ−２の分泌を効果的に刺激できることを示し、各抗体の機能は刺激されたＩＬ−２の濃度によって評価された。
【図２】インビトロでのヒト化抗ＧＩＴＲ抗体の細胞活性であり、試験された抗体ｈｕ１８Ｆ１０およびｈｕ８Ａ１１は両方ともサイトカインＩＬ−２の分泌を効果的に刺激することができ、それらの機能は対照抗体ＢＭＡＢと同等またはそれ以上であることを示す。
【図３】ヒトＰＢＭＣを共移植されたＡ３７５黒色腫を有するＮＣＧマウスの腫瘍成長曲線を示す。
【図４】ヒトＰＢＭＣを共移植されたＡ３７５黒色腫を有するＮＣＧマウスの重量変化曲線を示す。
【発明を実施するための形態】
【００７８】
（発明の詳細な説明）
１．定義
本発明をよりよく理解するために、いくつかの技術用語および科学用語を以下のように定義する。特記しない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されているものと同じ意味を有する。
【００７９】
本発明で使用されるアミノ酸３文字コードおよび１文字コードは、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２４３，ｐ３５５８（１９６８）に記載されている。
【００８０】
本発明の「抗体」という用語は、鎖間ジスルフィド結合によって連結された二つの同一の重鎖および二つの同一の軽鎖からなるテトラペプチド鎖構造である免疫グロブリンを指す。免疫グロブリン重鎖の定常領域のアミノ酸の組成と配列は異なるため、それらの抗原性も異なる。したがって、免疫グロブリンは５つのクラスに分類されるか、免疫グロブリンのアイソタイプ、すなわちＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥと呼ばれ、これらのアイソタイプの対応する重鎖はそれぞれμ鎖、δ鎖、γ鎖、α鎖およびε鎖である。ヒンジ領域のアミノ酸組成と重鎖ジスルフィド結合の数と位置の違いに応じて、同じタイプのＩｇＧを、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４などの異なるサブクラスにさらに分類することができる。軽鎖は、定常領域の違いに応じて、κ鎖またはλ鎖に分類することができる。Igの５つのクラスの各々がκ鎖またはλ鎖を有することができる。
【００８１】
本発明においては、本発明の抗体軽鎖は、ヒトまたはマウスκ，λ鎖またはその変異体を含む軽鎖定常領域をさらに含むことができる。
【００８２】
本発明において、本発明の抗体重鎖は、ヒトまたはマウスＩｇＧ１、２、３、４またはそれらの変異体を含む重鎖定常領域をさらに含むことができる。
【００８３】
抗体の重鎖と軽鎖のＮ末端に近い約１１０個のアミノ酸で構成される可変領域（Ｖ領域）は、そのアミノ酸配列がかなり異なる。抗体のＣ末端に近い残りのアミノ酸配列からなる定常領域（Ｃ領域）は比較的安定している。可変領域は、３つの超可変領域（ＨＶＲ）と４つの比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。抗体の特異性を決定する３つの超可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも称される。軽鎖可変領域（ＶＬ）および重鎖可変領域（ＶＨ）のそれぞれは、３つのＣＤＲ領域と４つのＦＲ領域で構成され、アミノ末端からカルボキシ末端まで次の順序で配置されている。ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。軽鎖の３つのＣＤＲ領域は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と呼ばれ、重鎖の３つのＣＤＲ領域は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３と呼ばれる。本発明の抗体または抗原結合性断片のＶＬおよびＶＨ領域のＣＤＲアミノ酸残基の数および位置は、既知のＩＭＧＴ番号付け基準に適合している。
【００８４】
「組換えヒト抗体」という用語には、組換え方法により調製、発現、作成または単離されたヒト抗体が含まれ、関連技術および方法は当該分野で良く知られており、例えば、（１）ヒト免疫グロブリン遺伝子を含むトランスジェニックまたは染色体導入動物（マウスなど）から単離された抗体、またはその調製されたハイブリドーマから単離された抗体、（２）トランスフェクトされた腫瘍のような、抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から単離された抗体、（３）組換え結合ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体、および（４）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列を他のＤＮＡ配列などにスプライシングすることにより調製、発現、作成または単離された抗体、である。これらの組換えヒト抗体は、生殖細胞系列遺伝子によってコードされる特定のヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列を利用する可変領域と定常領域だけでなく、抗体の成熟中に起こるようなその後の再配列と変異も含む。
【００８５】
本発明の「マウス抗体」という用語は、当技術分野の知識および技能に従って調製されたヒトＧＩＴＲに対するモノクローナル抗体である。調製中にＧＩＴＲ抗原が被験者に注入され、その後、所望の配列または機能特性を持つ抗体を発現するハイブリドーマが分離される。本発明の好ましい実施形態において、マウス抗体またはその断片は、マウスκ，λ鎖またはその変異体の軽鎖定常領域をさらに含み、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のまたはその変異体の重鎖定常領域をさらに含むことがある。
【００８６】
「ヒト抗体」という用語には、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列の可変および定常領域を有する抗体が含まれる。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダムまたは部位特異的変異誘発またはインビボでの体細胞変異により導入された変異）を含み得る。しかし、「ヒト抗体」という用語は、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植された抗体（すなわち、「ヒト化抗体」）を含まない。
【００８７】
ＣＤＲグラフト移植抗体としても知られる「ヒト化抗体」という用語は、マウスのＣＤＲ配列をヒト抗体可変領域のフレームワークにグラフトすることにより産生される抗体を指す。これは、大量のマウスタンパク質成分を担持するキメラ抗体によって引き起こされる強い免疫応答を克服することができる。免疫原性の低下によって引き起こされる活性の低下を回避するために、ヒト抗体可変領域を最小限の復帰変異にかけ、活性を維持することができる。
【００８８】
「キメラ抗体」という用語は、マウス抗体の可変領域をヒト抗体の定常領域と融合させることにより形成される抗体であり、マウス抗体によって誘導される免疫応答を緩和することができる。キメラ抗体を構築するために、マウス特異的モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを最初に構築して選択し、次にマウスハイブリドーマ細胞から可変領域遺伝子をクローニングする。その後、必要に応じて、ヒト抗体の定常領域遺伝子がクローニングされる。マウス可変領域遺伝子およびヒト定常領域遺伝子は、キメラ遺伝子に連結され、次いでヒトベクターに挿入され、最終的にキメラ抗体分子は真核生物または原核生物の産業系で発現される。ヒト抗体の定常領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４またはそれらの変異体の重鎖定常領域から選択することができ、好ましくは、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ２の重鎖定常領域、またはアミノ酸変異後にＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介細胞毒性）の毒性を有さないＩｇＧ１を含む。
【００８９】
本明細書に記載の「抗原結合性断片」は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、抗原結合活性を有するＦ（ａｂ’）２断片、またはヒトＧＩＴＲに結合したＦｖまたはｓＦｖ断片を意味し、本明細書に記載の抗体のＣＤＲ領域の一つ以上を含む。Ｆｖ断片は、抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み（定常領域なし）、すべての抗原結合部位を有する最小の抗体断片を有する。一般に、Ｆｖ抗体はＶＨとＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーも含み、抗原結合に必要な構造を形成することができる。また、さまざまな異なるリンカーを使用して、単鎖抗体または単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）と呼ばれる二つの抗体可変領域をポリペプチド鎖に連結することができる。本発明の「ＧＩＴＲへの結合」という用語は、ヒトＧＩＴＲと相互作用することができることを指す。本発明の「抗原結合部位」という用語は、本発明の抗体または抗原結合性断片によって認識される抗原の不連続な三次元空間部位を指す。
【００９０】
「エピトープ」という用語は、免疫グロブリンまたは抗体に特異的に結合するその抗原上の部位を示す。エピトープは、隣接するアミノ酸によって、またはタンパク質の三次元フォールディングによって並置された非隣接アミノ酸によって形成される。隣接するアミノ酸によって形成されるエピトープは通常、変性溶媒にさらされたときに維持されるが、三次元フォールディングによって形成されるエピトープは通常、変性溶媒で処理すると失われる。エピトープは通常、ユニークな空間的高次構造で少なくとも３〜１５のアミノ酸を含む。所定の抗体がどのエピトープに結合するかを決定する方法は、免疫ブロット法および免疫沈降アッセイなどを含み、当技術分野で周知である。エピトープの空間的高次構造を決定する方法は、当技術分野の技術を含み、本発明に記されており、例えばＸ線結晶構造解析および二次元核磁気共鳴がある。
【００９１】
本明細書で使用される「特異的に結合する」または「選択的に結合する」という用語は、所定の抗原上のエピトープへの抗体の結合を意味する。通常、組換えヒトＧＩＴＲが検体として使用され、その抗体が機器の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術によりリガンドとして測定される場合、抗体は約１０−７Ｍ以下の平衡解離定数（ＫＤ）で所定の抗原に結合し、所定の抗原に対するその親和性は、所定の抗原または密接に関連する抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡなど）に対するその親和性の少なくとも２倍である。「抗原を認識する抗体」という用語は、本明細書では「特異的に結合する抗体」という用語と互換的に使用することができる。
【００９２】
「競合的結合」という用語は、ヒトＧＩＴＲの細胞外領域上の同じエピトープ（抗原決定基としても知られている）または同じエピトープの一部を認識し、本発明のモノクローナル抗体のように抗原に結合する抗体を意味する。本発明のモノクローナル抗体と同じエピトープに結合する抗体は、本発明のモノクローナル抗体により認識されるヒトＧＩＴＲのアミノ酸配列を認識する抗体を指す。「核酸分子」という用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子を意味する。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であり得るが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。核酸が別の核酸配列と機能的な関係に置かれると、核酸は「効果的に連結」される。例えば、プロモーターまたはエンハンサーがコード配列の転写に影響する場合、プロモーターまたはエンハンサーはコード配列に効果的に連結されます。
【００９３】
「交差反応性」という用語は、異なる種由来のＧＩＴＲに結合する本発明の抗体の能力を指す。例えば、本発明のヒトＧＩＴＲに結合する抗体は、別の種のＧＩＴＲにも結合することができる。交差反応性は、抗体の精製抗原との特異的反応性または抗体と生理的にＧＩＴＲを発現する細胞との結合または機能的相互作用を検出することにより、結合アッセイ（ＳＰＲやＥＬＩＳＡなど）で測定される。交差反応性を決定する方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析またはフローサイトメトリーなど、本明細書に記載の標準的な結合アッセイを含む。
【００９４】
「阻害する」または「ブロックする」という用語は互換的に使用することができ、一時的および完全な阻害／遮断の両方を包含する。ＣＤ７０の阻害／遮断は、好ましくは、ＣＤ７０が阻害または遮断なしに結合するときに生じる活性の正常レベルまたはタイプを低減または変更する。阻害および遮断は、抗ＧＩＴＲ抗体にさらされていないＣＤ７０と比較して、抗ＧＩＴＲ抗体にさらされたときのＣＤ７０の結合親和性の測定可能な減少を減らすことも目的としている。
【００９５】
「成長の阻害」（例えば、細胞が関与する）という用語は、細胞成長の測定可能な減少を含むことを意図している。
【００９６】
「免疫応答の誘導」および「免疫応答の強化」という用語は互換的に使用でき、特定の抗原に対する免疫応答の刺激（すなわち、受動的または適応的）を指す。ＣＤＣまたはＡＤＣＣの誘導に特異的な「誘導する」という用語は、特定の直接的な細胞殺傷メカニズムを刺激することを指す。
【００９７】
本発明で記載される「ＡＤＣＣ」、すなわち抗体依存性細胞媒介細胞傷害性は、ＦＣ受容体を発現する細胞が抗体のＦＣ断片を認識することにより抗体被覆標的細胞を直接死滅させることを指す。ＩｇＧのＦＣ断片を改変することにより、抗体のＡＤＣＣ効果を低減または排除することができる。改変とは、抗体の重鎖定常領域における変異、例えば、Ｎ２９７Ａ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、ＩｇＧ２／４キメラ、ＩｇＧ４のＦ２３５Ｅ、およびＬ２３４Ａ／Ｅ２３５Ａからなる群から選択される変異を指す。
【００９８】
本発明に記載の融合タンパク質は、ＤＮＡ組換えにより二つの遺伝子を共発現させることにより得られるタンパク質産物である。組換えＧＩＴＲ細胞外ドメイン−Ｆｃ融合タンパク質は、ＤＮＡ組換えおよびＧＩＴＲ細胞外ドメインとヒト抗体Ｆｃ断片の共発現によって得られるタンパク質である。ＧＩＴＲ細胞外ドメインは、細胞膜の外側部分に発現するＧＩＴＲタンパク質の一部を指します。
【００９９】
抗体および抗原結合性断片を産生および精製する方法は、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒの５〜８および１５章のように、当該技術分野でよく知られており利用可能である。例えば、マウスを、ヒトＧＩＴＲまたはその断片で免疫することができ、従来の方法を使用して、得られた抗体を再生、精製し、アミノ酸配列決定を行うことができる。抗原結合性断片も、従来の方法で調製することができる。本明細書に記載の抗体または抗原結合性断片は、１つまたは複数のヒトＦＲ領域を非ヒトＣＤＲ領域に導入するように遺伝子操作される。ヒトＦＲ生殖細胞系列配列は、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  （ＩＭＧＴ）Ｗｅｂサイトｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒから、またはＴｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ＦａｃｔｓＢｏｏｋ  （２００１）ＩＳＢＮ：０１２４４１３５１から入手することができる。具体的には、本発明の抗体または抗原結合性断片に使用される軽鎖ＦＲ生殖細胞系列は、Ｖｋ３−１１およびＶｋ４−１を含む。本発明の抗体または抗原結合性断片に使用される具体的な重鎖ＦＲ生殖細胞系列は、ＶＨ３−４８およびＶＨ１−２を含む。
【０１００】
本明細書の操作された抗体または抗原結合性断片は、従来の方法で調製および精製することもできる。例えば、重鎖（配列番号９）および軽鎖（配列番号１０）をコードするｃＤＮＡ配列をクローニングし、ＧＳ発現ベクターに組み換えることができる。ＣＨＯ細胞は、組換え免疫グロブリン発現ベクターによって安定してトランスフェクトできる。より推奨される技術として、哺乳動物発現システムは、特にＦＣ領域の高度に保存されたＮ末端で、抗体のグリコシル化をもたらす。安定したクローンは、ヒト抗原に特異的に結合する抗体を発現させることにより得られる。陽性クローンは、抗体を産生するためにバイオリアクターで無血清培地で拡大される。抗体が分泌された培養液は、当該分野で公知の技術により精製および収集することができる。抗体は、当技術分野で知られている方法を介して濾過および濃縮することができる。可溶性混合物および多量体は、モレキュラーシーブおよびイオン交換などの当技術分野で知られている方法を介して除去することもでき、得られた生成物は、すぐに、例えば−７０℃で凍結保存する、または凍結乾燥する必要がある。
【０１０１】
本発明の抗体とは、モノクローナル抗体を指す。本発明のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、単一のクローン細胞株から得られる抗体を指し、これは真核生物、原核生物またはバクテリオファージのクローン細胞株に限定されない。モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片は、ハイブリドーマ、組換え、ファージディスプレイ技術、合成技術（ＣＤＲグラフトなど）、または当技術分野の他の技術による再組み合わせによって得ることができる。
【０１０２】
「投与」および「治療」は、動物、ヒト、実験対象、細胞、組織、器官または体液に適用する場合、外因性薬物、治療薬、診断薬または組成物を、動物、ヒト、対象、細胞、組織、臓器または体液と接触させることを意味する。「投与」および「治療」とは、例えば、治療、薬物動態、診断、研究、および実験方法を意味することができる。細胞処理は、試薬を細胞と接触させること、および試薬を体液と接触させることを含み、体液は細胞と接触している。「投与」および「治療」は、例えば、試薬、診断薬、結合組成物または別の細胞によるインビトロおよびエクスビボでの細胞の治療も意味する。「治療」は、ヒト、獣、または研究対象に適用される場合、治療的治療、予防または予防措置、研究および診断への応用を意味する。
【０１０３】
「治療」とは、本発明の結合化合物のいずれかを含む組成物などの内的または外的治療薬を患者に投与することを意味し、前記患者は、治療薬が治療効果を有することが知られている疾患の一つ以上の症状を持っている。通常、治療薬は、臨床的に測定することは困難であるがこれらの症状が改善されるまたはこれらの症状の発現が抑制される程度に、一つまたは複数の疾患の症状を効果的に緩和する量で、治療される患者または集団に投与される。特定の病気の症状を効果的に軽減する治療薬の量（「治療有効量」としても知られている）は、患者の病気の状態、年齢、体重、患者に望ましい効能を引き出す薬の能力などの多くの要因によって異なる。病気の症状が緩和されたかどうかは、これらの症状の重症度または進行を評価するために医師または他の医療専門家が一般的に使用する臨床検査によって評価することができる。本発明の実施形態（例えば、治療方法または調製物）が各患者の標的疾患の症状を緩和するのに効果がない場合でも、統計的に有意な数の患者において標的疾患の症状を緩和するのに効果的である、スチューデントｔ検定、Ｘ二乗検定、マン・アンド・ホイットニーに基づくＵテスト、クラスカル・ワリステスト（Ｈテスト）、ジョンクヒーレ・テプストラテスト、およびウィルコクソンテストのような、当該分野で知られている統計試験により決められる。
【０１０４】
本明細書および特許請求の範囲全体で使用される「本質的に構成される」という用語またはその変形は、すべてのそのような要素または要素グループを含み、任意で、前記要素と類似または自然に異なる他の要素を含み、上記の他の要素は、指定された投与計画、方法、または組成物の基本的特性または新規特性を大幅に変更することはない。非限定的な例として、言及したアミノ酸配列から本質的になる結合化合物は、結合化合物の特性に有意な影響を及ぼさない一つまたは複数のアミノ酸も含んでよい。
【０１０５】
本発明による対象体に適用される「自然発生」という用語は、対象体が自然界で見られるという事実を示す。例えば、自然源から単離することができる生物（ウイルスを含む）、および実験室で人工的に改変されていないポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は自然発生である。
【０１０６】
「有効量」は、疾患または障害の症状を改善または予防するのに十分な量を含む。有効量とは、診断を許可または促進するのに十分な量も意味する。特定の患者または獣の対象の有効量は、要因によって異なる。たとえば、治療する疾患、患者の全体的な健康状態、投与経路と投与量、および副作用の重症度である。有効量は、重大な副作用または毒性作用を回避する最大用量または投与レジメンとしてよい。
【０１０７】
「外因性」とは、バックグラウンドに応じて、生物、細胞、または人体の外部で生成される物質を示す。「内因性」とは、バックグラウンドに応じて生物、細胞、または人体で生成される物質を示す。
【０１０８】
「相同性」とは、二つのポリヌクレオチド配列または二つのポリペプチド間の配列類似性を指す。二つの比較配列の位置が同じ塩基またはアミノ酸モノマーサブユニットで占められている場合、たとえば、二つのＤＮＡ分子の両方の位置がアデニンで占められている場合、分子はこの位置で相同である。二つの配列間の相同性の割合は、二つの配列で共有される一致数または相同位置の数を、比較位置の数で割った関数×１００％である。例えば、配列が最適に整列している場合、二つの配列に６つの一致または１０の位置の相同位置がある場合、二つの配列は６０％の相同性がある。一般に、二つの配列を並べて相同性の最大割合が得られたときに比較が行われる。
【０１０９】
本明細書で使用される「細胞」、「細胞株」および「細胞培養」という表現は互換性があり、そのような名前にはすべてその子孫が含まれる。したがって、「形質転換体」および「形質転換細胞」という語は、転移の数に関係なく、試験された初代細胞およびそこから派生した培養物を含む。意図的または非意図的な変異のために、元の形質転換細胞でスクリーニングされたものと同じ機能または生物学的活性を有する変異子孫を含むすべての子孫がまったく同じＤＮＡ含有量を持つことは不可能であることも理解すべきであり、別の名で呼んでも内容から明らかである。
【０１１０】
「任意」または「任意に」とは、事象または環境が発生する場合と発生しない場合を含め、後に説明する事象または環境が必ずしも発生するわけではないことを意味する。例えば、「１〜３個の抗体重鎖可変領域を任意に含む」とは、抗体重鎖可変領域の特定の配列が必ずしも存在しなくてもよいことを意味する。
【０１１１】
「医薬組成物」とは、本明細書に記載の一つ以上の化合物、またはその生理学的／医学的塩またはそのプロドラッグ、および他の化学成分、ならびに生理学的／医学的に許容される担体および賦形剤などの他の成分を含む混合物を意味する。医薬組成物の目的は、生物への薬物の投与を促進し、活性成分の吸収を促進し、すなわち、生物学的活性を発揮することである。
【実施例】
【０１１２】
（発明を実施する具体的形態）
以下の実施形態は、本発明をさらに説明する。しかし、これらの実施形態は、本発明の範囲を限定すべきではない。本発明の実施形態で特定されていない実験方法は、通常、従来の条件に従って、例えば、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒに従って実行される、または、原材料または製品の製造業者が推奨する条件に従って実行される。特定の供給源が示されない試薬は、市販の従来の試薬である。
【０１１３】
実施例１：免疫抗原およびスクリーニングされた抗原の配列および調製
ｍＦｃタグを備えたヒトＧＩＴＲ（ｈｕＧＩＴＲ−ｍＦｃ）、ｈＦｃタグを備えたＧＩＴＲ（ｈｕＧＩＴＲ−ｈＦｃ）、およびＨｉｓ×６タグを備えたＧＩＴＲＬ（ｈｕＧＩＴＲＬ−Ｈｉｓ６）をコードする配列は、最適化後に合成され（本発明において、上記のすべてのＧＩＴＲ組換えタンパク質のテンプレート配列が設計されている）、それぞれ、ｐＣＤＮＡ３．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）中にクローニングされる。
【０１１４】
ｈｕＧＩＴＲ−ｍＦｃ配列
MAQHGAMGAFRALCGLALLCALSLGQRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTRCCRDYPGEECCSEWDCMCVQPEFHCGDPCCTTCRHHPCPPGQGVQSQGKFSFGFQCIDCASGTFSGGHEGHCKPWTDCTQFGFLTVFPGNKTHNAVCVPGSPPAEPKLENLYFQGPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK                                                         
配列番号５３
【０１１５】
ｈｕＧＩＴＲ−ｈＦｃ配列
MAQHGAMGAFRALCGLALLCALSLGQRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTRCCRDYPGEECCSEWDCMCVQPEFHCGDPCCTTCRHHPCPPGQGVQSQGKFSFGFQCIDCASGTFSGGHEGHCKPWTDCTQFGFLTVFPGNKTHNAVCVPGSPPAEPKLENLYFQGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号５４
【０１１６】
ｈｕＧＩＴＲＬ−Ｈｉｓ６配列
MGVLLTQRTLLSLVLALLFPSMASMQLETAKEPCMAKFGPLPSKWQMASSEPPCVNKVSDWKLEILQNGLYLIYGQVAPNANYNDVAPFEVRLYKNKDMIQTLTNKSKIQNVGGTYELHVGDTIDLIFNSEHQVLKNNTYWGIILLANPQFISHHHHHH
配列番号５５
【０１１７】
構築された組換えプラスミドで２９３Ｆ細胞を７日間トランスフェクトした後、２９３細胞によって発現された上清サンプルを、高速で遠心分離し、その後、０．４５μｍ膜で濾過して、不純物を除去した。プロテインＡカラムをＰＢＳ溶液で平衡化し、カラム容量の２〜５倍で洗浄してから、上清サンプルをカラムに負荷した。Ａ２８０値がベースラインまで低下するまで、カラムをＰＢＳ溶液で洗浄した。標的タンパク質を０．１Ｍクエン酸（ｐＨ３．２）溶液で溶出し、溶出ピークを１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）で中和した。中和された溶出液をＰＢＳ溶液と交換し、回収されたタンパク質を電気泳動により同定し、次に、その後の使用のために少量採取し、ｍＦｃおよびｈＦｃタグを有するｈｕＧＩＴＲを得た。
【０１１８】
構築された組換えプラスミドで２９３Ｆ細胞を７日間トランスフェクトした後、２９３細胞によって発現された上清サンプルを高速で遠心分離し、続いて０．４５μｍ膜で濾過して、不純物を除去した。イミダゾールを上清サンプルに添加して、最終濃度を５ｍＭとした。ニッケル親和性カラムを、５ｍＭのイミダゾールを含むＰＢＳ溶液の２〜５倍カラム体積で平衡化させ、次に、上澄みサンプルをカラム上に負荷した。Ａ２８０値がベースラインまで低下するまで、５ｍＭイミダゾールを含むＰＢＳ溶液でカラムを洗浄した。次に、クロマトグラフィーカラムをＰＢＳ＋１０ｍＭイミダゾールで洗浄して、望ましくない非特異的結合性タンパク質を除去し、流通部分を貯蔵した。次に、５００ｍＭイミダゾールを含むＰＢＳ溶液を用いて標的タンパク質を溶出し、その溶出液を貯蔵してからＰＢＳ溶液と交換し、回収したタンパク質を電気泳動により同定し、次に、後で使用するために少量採取し、Ｈｉｓタグを有するｈｕＧＩＴＲＬを得た。
【０１１９】
実施例２：抗ヒトＧＩＴＲモノクローナル抗体の製造
マウスを免疫することにより、抗ヒトＧＩＴＲモノクローナル抗体を製造した。実験で使用したＢＡＬＢ／ｃ白色マウスは雌で６週齢であり（広東医学研究所動物センター、動物生産許可番号：４４００７２０００２５２９１）、ＳＰＦ施設で飼育されたものである。購入後、５匹のマウスからなる各グループに、温度２０〜２５℃、湿度４０〜６０％で明暗サイクルを１２／１２時間に調整した実験室環境で１週間飼育した。免疫抗原は、ｍＦｃ標識を備えたヒトＧＩＴＲ組換えタンパク質（ＧＩＴＲ−ｍＦｃ）であった。グループは、フロイントアジュバント（シグマロット番号：Ｆ５８８１／Ｆ５５０６）で乳化した。完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）を初回免疫に使用し、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）を他の追加免疫に使用した。抗原とアジュバントとの体積比は１：１であり、初回免疫のための投与量は２５０μｇＬ／５０μｇ／マウスであり、および追加免疫のための投与量も２５０μＬ／５０μｇ／マウスであった。乳化抗原を、０、１４、２８、および４２日目に接種した。０日目は、５０μｇの乳化抗原を複数の部位で各マウスに皮下（ｓｃ）注射した。１４、２８、４２日目には、背中のしこりと腹部の腫れの状態に応じて、抗原を背部または腹腔内に注射した。脾臓細胞融合の３日前に免疫を強化した。
【０１２０】
血液検査を、それぞれ２４日目、３８日目、５２日目に行なった。実施例１に記載のＥＬＩＳＡ法によりマウス血清を検出して、マウス血清中の抗体の力価を決定した。血清中の抗体力価が高いマウスを脾臓細胞融合のために選択し、最適化されたＰＥＧ媒介融合手順により脾臓リンパ球をＳｐ２／０骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ＠ＣＲＬ−１５８１（商標））と融合してハイブリドーマ細胞を得た。実施例３のＥＬＩＳＡ法、実施例４のＧＩＴＲＬをブロックするための結合アッセイ、および実施例５のマウスＧＩＴＲおよびカニクイザルＧＩＴＲ（ｃｙｎｏ−ＧＩＴＲ）の交差結合アッセイを使用し、結果を表１に示す。
【０１２１】
【表１】
2020532279.tif 000003
【０１２２】
良好なインビトロ活性を有するモノクローナルハイブリドーマ細胞株を選択し、対数増殖期のハイブリドーマ細胞を収集した。ＲＮＡを、ユーザーマニュアルに従ってＲＮＡｐｒｅｐ  ｐｕｒｅ  Ｃｅｌｌ／  Ｂａｃｔｅｒｉａ  Ｋｉｔ（Ｔｉａｎｇｅｎ、カタログ番号：ＤＰ４３０）を使用して抽出し、逆転写（ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、Ｔａｋａｒａ、ｃａｔ＃２６８０Ａ）した。マウスＩｇ−プライマーセット（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＴＢ３２６  Ｒｅｖ．Ｂ  ０５０３）を使用して逆転写されたｃＤＮＡを増幅し、ＰＣＲで増幅してから、商業的配列決定に付した。同じＣＤＲを持つ冗長または非常に類似した配列を除去した後、マウスモノクローナル抗体配列８Ａ１１、１８Ｆ１０、７Ｄ９および１６Ｇ９を得た。
【０１２３】
マウスモノクローナル抗体８Ａ１１の重鎖および軽鎖可変領域配列は次のとおりである。
【０１２４】
８Ａ１１  ＨＣＶＲ
EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVAYISSGGSTYYPDSVKGRFTISRENARNILYLQMSSLRSEDTAMYYCAREGYGTYGDYWGQGTTLTVSS
配列番号１
【０１２５】
８Ａ１１  ＬＣＶＲ
DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLYSTNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYSYLRTFGGGTKLEIK
配列番号２
【０１２６】
８Ａ１１のＣＤＲ配列は次のとおりである。
2020532279.tif 000004
【０１２７】
マウスモノクローナル抗体１８Ｆ１０の重鎖および軽鎖可変領域配列は次のとおりである。
【０１２８】
１８Ｆ１０  ＨＣＶＲ
QVQLQQSGAELVRPGVSVKISCKCSGYTFTGYDLHWVKQSHAKSLDWIGVISTYYGDANYNQKFKGKATMTVDKSSSTAYMELARLTSEDSAIYYCTRLAESYFFDYWGQGTTLTVSS
配列番号９
【０１２９】
１８Ｆ１０  ＬＣＶＲ
QILLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWYQQKPGSSPKPWIYDTSDLASGFPARFSGTGSGTSYSLIISSMEAEDAATYYCHQRSSYPFTFGSGTKLEIK
配列番号１０
【０１３０】
１８Ｆ１０のＣＤＲ配列は次のとおりである。
2020532279.tif 000005
【０１３１】
マウスモノクローナル抗体７Ｄ９の重鎖および軽鎖可変領域配列は次のとおりである。
【０１３２】
７Ｄ９ ＨＣＶＲ
DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQFPGNKLEWLGYISYSGSTYYNPSLKSRISLTRDTSKNQFFLQLNSVTSEDTATYYCARWDYRYDGRGFDYWGQGTTLTVSS                                                                                                            配列番号３７
【０１３３】
７Ｄ９ ＬＣＶＲ
DIQMTQSPSSLSASLGERVSLTCRASQDIGSGLNWLQQEPDGTIKRLIYATSSLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFVDYNCLQYTSTPWTFGGGTKLEIK
配列番号３８
【０１３４】
７Ｄ９のＣＤＲ配列は次のとおりである。
2020532279.tif 000006
【０１３５】
マウスモノクローナル抗体１６Ｇ９の重鎖および軽鎖可変領域配列は次のとおりである。
【０１３６】
１６Ｇ９  ＨＣＶＲ
QVQLQQSGAELAKPGASVKMSCKASGYTFTTYWIHWIKQRPGQGLEWIGYINPSTGYTDYNQNFKDKATLTADQYSSTAYMQLSSLTFEDSAVYYCANYYGSTPYYWGRGTTLTVSS                                                                                                                                                   配列番号４５
【０１３７】
１６Ｇ９ ＬＣＶＲ
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVTYVHWYQQKSGASPERWIFDASKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMETEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELK
配列番号４６
【０１３８】
１６Ｇ９のＣＤＲ配列は次の通りである。
2020532279.tif 000007
【０１３９】
実施例３：ＥＬＩＳＡ結合アッセイ
抗ＧＩＴＲ抗体は、ＧＩＴＲに結合することにより、細胞膜上のＧＩＴＲ関連受容体へのＧＩＴＲの結合をブロックし、それにより、ＧＩＴＲの下流のシグナル伝達経路をブロックする。ＥＬＩＳＡを使用して、抗ＧＩＴＲ抗体の結合特異性を検出した。マイクロプレートをｈｕＧＩＴＲ−ｍＦｃで被覆し、抗体添加時のシグナル強度を使用して、抗体とＧＩＴＲの結合活性を測定した。
【０１４０】
ｈｕＧＩＴＲ−ｍＦｃを、ｐＨ９．５のＣＢＳ緩衝液を用いて１μｇ／ｍｌに希釈して、９６ウエルマイクロプレートに５０μｌ／ウエルで加え、４℃で一晩インキュベートした。上澄みを廃棄してから、ＰＢＳで希釈した１％ＢＳＡブロッキング緩衝液を３００μｌ／ウエルで添加して、ブロッキング用のインキュベーターにおいて３７℃で２．５時間インキュベートした。ブロッキング後、ブロッキング緩衝液を廃棄し、プレートを、ＰＢＳＴ緩衝液（０．０５％ｔｗｅｅｎ−２０を含有するｐＨ７．４のＰＢＳ）で２回洗浄してから、試験される抗体を５０μｌ／ウエルで添加し、これを、サンプル希釈剤で異なる濃度に希釈し、インキュベーターにおいて３７℃で３０分間インキュベートした。次に、プレートをＰＢＳＴで２回洗い、サンプル希釈剤で希釈したＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｅａｒｃｈ、１１５−０３５−０８８）を５０μｌ／ウエルで添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳＴでプレートを２回洗浄した後、ＴＭＢ発色性基剤を５０μｌ／ウエルで添加し、室温で５分間インキュベートしてから、１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を５０μｌ／ウエルで添加して反応を停止させ、４５０ｎｍでの吸収値を、ＭＤ＋３８４マイクロプレートリーダーで読み取った。ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏ６．２．１でデータを解析して、表１示すような、ＧＩＴＲへの抗ＧＩＴＲ抗体の結合ＥＣ５０値を得た。
【０１４１】
実施例４：抗ＧＩＴＲ抗体はＧＩＴＲとＧＩＴＲＬの結合をブロックする
ＧＩＴＲは細胞表面シグナル伝達経路の共受容体に結合して、経路の活性を阻害することができる。この実験では、スクリーニングされた抗ヒトＧＩＴＲ抗体によってブロックされたヒトＧＩＴＲＬへのヒトＧＩＴＲの結合を、インビトロブロッキングアッセイを使用して試験した。具体的には、ｈｕＧＩＴＲ−ｈＦｃを９６ウェルマイクロプレートに被覆した後、プレインキュベートのために抗ＧＩＴＲ抗体を添加し、その後、ＧＩＴＲＬ−ｈｉｓタンパク質を添加し、３０分間共インキュベートした。プレートを洗浄した後、ＧＩＴＲＬおよびＧＩＴＲの結合シグナルを検出し、ＧＩＴＲの活性部位をブロックする抗ＧＩＴＲ抗体のＥＣ５０値をＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏ６．２．１で分析した。
【０１４２】
ｈｕＧＩＴＲ−ｍＦｃを、ｐＨ９．５のＣＢＳ緩衝液を用いて２μｇ／ｍｌに希釈して、９６ウエルマイクロプレートに５０μｌ／ウエルで加え、４℃で一晩インキュベートした。上澄みを廃棄してから、ＰＢＳで希釈した１％ＢＳＡブロッキング緩衝液を３００μｌ／ウエルで添加して、インキュベーターにおいて３７℃で２．５時間インキュベートした。ブロッキング後、ブロッキング緩衝液を廃棄し、プレートを、ＰＢＳＴ緩衝液（０．０５％ｔｗｅｅｎ−２０を含有するｐＨ７．４のＰＢＳ）で２回洗浄してから、プレインキュベート用の抗体を加えた。前記抗体は、サンプル希釈剤でグラジエント濃度に希釈されていた。０．１５μｇ／ｍｌのＧＩＴＲＬ−Ｈｉｓタンパク質を５０μｌ／ウエルで添加し、よく混合し、インキュベーターにおいて３７℃で３０分間インキュベートした。その後、反応緩衝液を廃棄し、プレートをＰＢＳＴで２回洗い、サンプル希釈剤で希釈（１：４０００）したＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ二次抗体を５０μｌ／ウエルで添加し、次に、３７℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳＴでプレートを２回洗浄した後、ＴＭＢ発色性基剤を５０μｌ／ウエルで添加し、室温で５分間インキュベートしてから、２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を５０μｌ添加して反応を停止させ、４５０ｎｍでの吸収値を、ＭＤ＋３８４マイクロプレートリーダーで読み取った。ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏ６．２．１でデータを解析することにより、ＧＩＴＲへのＧＩＴＲ抗体の結合ＥＣ５０値を得た。
【０１４３】
実施例５：異なる種に由来する抗ＧＩＴＲ抗体およびＧＩＴＲの交差結合アッセイ
異なる種からのＧＩＴＲに対するスクリーニングされた抗ＧＩＴＲ抗体のインビトロ結合能力を検出するために、マウスＧＩＴＲおよびカニクイザルＧＩＴＲをインビトロ結合検出に使用した。
【０１４４】
異なる種からのＧＩＴＲタンパク質（マウス／カニクイザルＧＩＴＲ）をｐＨ９．５のＰＢＳ緩衝液で１μｇ／ｍｌに希釈し、次に、９６ウエルマイクロプレートに５０μｌ／ウエルで加え、４℃で一晩（１６〜１８時間）インキュベートした。プレート中の緩衝液を廃棄してから、ＰＢＳで希釈した１％ＢＳＡブロッキング緩衝液を３００μｌ／ウエルで添加し、ブロッキングのためにインキュベーターにおいて３７℃で２．５時間インキュベートした。ブロッキング後、ブロッキング緩衝液を廃棄し、プレートを、ＰＢＳＴ緩衝液（０．０５％ｔｗｅｅｎ−２０を含有するｐＨ７．４のＰＢＳ）で２回洗浄してから、試験される抗体を５０μｌ／ウエルでプレートに添加し、前記抗体を、サンプル希釈剤（ｐＨ７．４、ＰＢＳ）で異なる濃度に希釈し、インキュベーターにおいて３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベートの後、マイクロプレート中の反応緩衝液を廃棄してから、プレートをＰＢＳＴで２回洗浄し、サンプル希釈剤で希釈したＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１０９−０３５−０８８）を５０μｌ／ウエルで添加し、３７℃で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで６回洗浄した後、ＴＭＢ発色性基剤（ＮＥＯＧＥＮ、３０８１７７）を５０μｌ／ウエルで添加し、室温で５分間インキュベートしてから、２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を５０μｌ添加して反応を停止させ、４５０ｎｍでの吸収値を、ＭＤ＋３８４マイクロプレートリーダーで読み取った。表１示すような、ＧＩＴＲへのＧＩＴＲ抗体の結合ＥＣ５０値を計算した。
【０１４５】
実施例６：インビトロ結合親和性および動態アッセイ
試験されるヒト化抗ＧＩＴＲ抗体およびヒトＧＩＴＲの親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ，ＧＥ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓで測定した。
【０１４６】
Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００，ＧＥ）のタンパク質Ａバイオセンサーチップ（Ｃａｔ．２９−１２７５−５６，ＧＥ）を使用して、試験される特定量の抗体を親和性キャプチャーし、次に、一連の濃度グラジエントのＧＩＴＲ抗原（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙから選択されたヒトｈ−ＧＩＴＲ−ｈｉｓ抗原（Ｃａｔ．＃１３６４３−Ｈ０８Ｈ））を、チップの表面を流した。リアルタイム反応信号をＢｉａｃｏｒｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００，ＧＥ）により検出し、結合および分離曲線を得た。各分離サイクル後に、前記バイオチップを濯ぎ、ｐＨ１．５の１０ｍＭグリシンで再生した。緩衝液はｐＨ７．４のＰＢＳＴであった。実験データは、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ２．０，ＧＥソフトウェアを用いる（１：１）ラングミュアモデルに一致しており、表２に示すような親和性値を得た。
【０１４７】
実施例７：抗ＧＩＴＲ抗体の細胞活性アッセイ
この実験では、刺激されたＩＬ−２分泌レベルに応じて細胞活性を検出することにより、インビトロでのＧＩＴＲ抗体の活性を評価した。抗ＣＤ３（２．０μｇ／ｍＬ）を調製し、５０μＬ／ウエルでマイクロプレートを被覆し、被覆することにより４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートを、予め冷却したＰＢＳの３００μｌ／ウエルで一度洗い、前記抗ＧＩＴＲ抗体を実験的に設計された濃度までＰＢＳで希釈してから、５０μＬ／ウエルで９６ウエルマイクロプレートの被覆するために使用し（５０μＬのＰＢＳを、抗ＣＤ３対照のウエルに添加した）、５％ＣＯ２下に３７℃で３時間インキュベートした（前記９６ウエルプレートの周囲には３００μＬのＰＢＳしか添加しなかった）。プレートを、予め冷却したＰＢＳにより３００μＬ／ウェルで１回洗浄した（抗ＣＤ２８のウェルは洗浄する必要はなかった）。ＰＢＭＣを新たに単離する、または、１０％ＲＰＭＩ  １６４０培地で蘇生させ（蘇生細胞は３７℃で２〜３時間培養する必要がある）、密度が６×１０５／ｍｌである細胞懸濁液２００μｌおよび１０％ＲＰＭＩ  １６４０の培地を、９６ウエル細胞培養プレートに添加した（抗ＣＤ２８剤で共刺激したウエルに、２．０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８抗体を添加した：ウエルは抗ＣＤ３で被覆されていたが、抗ＧＩＴＲ抗体では被覆されていなかった）。細胞培養プレートを、インキュベーターにおいて４８時間インキュベート（３７℃、５％ＣＯ２）した。上澄みを１１０μｌ／ウエルで収集し、ＩＬ−２  ＥＬＩＳＡキットを用いてＩＬ−２の含量を測定した。種々のマウス抗体のインビトロ細胞活性の実験結果を図１に示す。８Ａ１１、１８Ｆ１０および２０Ｈ１１の機能活性は、参照抗体ＢＭＡＢ（ＭｅｒｃｋのＭＫ−４１６６抗体）の機能活性よりも強力である。（１８Ｆ１０と２０Ｈ１１はまったく同じＣＤＲ配列を共有しているため、同じ抗体として分類される）。
【０１４８】
実施例８：マウス抗体のヒト化
この例では、得られたマウス抗体の中で最も強力な機能活性を持つ二つの系統（８Ａ１１および１８Ｆ１０）をヒト化した。重鎖および軽鎖可変領域配列を、マウス抗体ＶＨ／ＶＬＣＤＲの典型的構造に基づく抗体生殖細胞系列データベースと比較することにより、相同性の高いヒト生殖細胞系列テンプレートを得た。ヒト生殖細胞系列の軽鎖フレームワーク領域は、ヒトκ軽鎖遺伝子に由来する。本発明の抗体において、軽鎖フレームワーク領域は、好ましくは、軽鎖テンプレートＩＧＫＶ４−１＊０１（８Ａ１１）およびＩＧＫＶ３−１１＊０１（１８Ｆ１０）である。ヒト生殖細胞系列の重鎖フレームワーク領域は、ヒト重鎖に由来する。本発明の抗体において、重鎖フレームワーク領域は、好ましくはヒト生殖細胞系列重鎖テンプレートＩＧＨＶ３−４８＊０３（８Ａ１１）およびＩＧＨＶ１−２＊０２（１８Ｆ１０）である。
【０１４９】
ヒト生殖細胞系列重鎖テンプレートＩＧＨＶ３−４８＊０３（配列番号２１）
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYEMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR
【０１５０】
ヒト生殖細胞系列軽鎖テンプレートＩＧＫＶ４−１＊０１（配列番号２２）DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSTP
【０１５１】
ヒト生殖細胞系列重鎖テンプレートＩＧＨＶ１−２＊０２（配列番号２３）
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAR
【０１５２】
ヒト生殖細胞系列軽鎖テンプレートＩＧＫＶ３−１１＊０１（配列番号２４）EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWP
【０１５３】
マウス抗体のＣＤＲ領域を、選択されたヒト化テンプレートに移植し、ヒト化可変領域を置換し、ＩｇＧの定常領域と組み換えた。次に、マウス抗体の３次元構造に基づいて、埋め込まれた残基、ＣＤＲ領域と直接相互作用する残基、およびＶＬおよびＶＨコンフォメーションに重要な影響を与える残基を逆変異させ、ＣＤＲ領域のアミノ酸残基を調節および最適化し、ＨＣＤＲ２：ＶＩＳＴＹＧＤＡＮＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号１２）の中のアミノ酸ＫをＱに最適化し、ＬＣＤＲ１：ＲＡＳＳＳＶＳＹＩＨ（配列番号１４）の中のアミノ酸Ｉを、マウス抗体１８Ｆ１０中のＬに最適化することにより、一連のヒト化分子を得た。前記重鎖可変領域を、配列番号２５〜３０に示す。前記軽鎖可変領域を、配列番号３１〜３６に示す。最適化されたＣＤＲ配列を、配列番号５６〜５７に示す。
【０１５４】
１８Ｆ１０の最適化されたＣＤＲ配列
2020532279.tif 000008
【０１５５】
ｈｕ８Ａ１１−ＶＨ−ａ（配列番号２５）
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPGKRLEWVAYISSGGSTYYPDSVKGRFTISRENAKNILYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGYGTYGDYWGQGTTLTVSS
【０１５６】
ｈｕ８Ａ１１−ＶＨ−ｂ（配列番号２６）
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVAYISSGGSTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGYGTYGDYWGQGTTLTVSS
【０１５７】
ｈｕ８Ａ１１−ＶＨ−ｃ（配列番号２７）
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSYISSGGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGYGTYGDYWGQGTTLTVSS
【０１５８】
ｈｕ８Ａ１１−ＶＬ−ａ（配列番号２８）
DIVMTQSPSSLAVSVGERVTMSCKSSQSLLYSTNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQQYYSYLRTFGGGTKLEIK
【０１５９】
ｈｕ８Ａ１１−ＶＬ−ｂ（配列番号２９）
DIVMTQSPSSLAVSVGERVTISCKSSQSLLYSTNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSYLRTFGGGTKLEIK
【０１６０】
ｈｕ８Ａ１１−ＶＬ−ｃ（配列番号３０）
DIVMTQSPSSLAVSVGERVTISCKSSQSLLYSTNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSYLRTFGGGTKLEIK
【０１６１】
ｈｕ１８Ｆ１０−ＶＨ−ａ（配列番号３１）
QVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKASGYTFTGYDLHWVKQAHGQGLDWIGVISTYYGDATYNQKFQGRATMTVDTSSSTAYMELSRLTSEDTAVYYCTRLAESYFFDYWGQGTTLTVSS
【０１６２】
ｈｕ１８Ｆ１０−ＶＨ−ｂ（配列番号３２）
QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTFTGYDLHWVRQAPGQGLEWIGVISTYYGDANYNQKFQGRVTMTVDTSSSTAYMELSRLRSEDTAVYYCTRLAESYFFDYWGQGTTLTVSS
【０１６３】
ｈｕ１８Ｆ１０−ＶＨ−ｃ（配列番号３３）
QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTFTGYDLHWVRQAPGQGLEWIGVISTYYGDANYNQKFQGRVTMTVDTSISTAYMELSRLRSEDTAVYYCTRLAESYFFDYWGQGTTLTVSS
【０１６４】
ｈｕ１８Ｆ１０−ＶＬ−ａ（配列番号３４）
QIVLTQSPATLSASPGERVTMTCRASSSVSYIHWYQQKPGQAPKPWIYDTSNLASGFPARFSGDGSGTDYSLIISSMEAEDAATYYCHQRSSYPFTFGSGTKLEIK
【０１６５】
ｈｕ１８Ｆ１０−ＶＬ−ｂ（配列番号３５）
EIVLTQSPATLSASPGERVTLTCRASSSVSYLHWYQQKPGQAPKPWIYDTSDLASGFPARFSGDGSGTDYTLTISSLEAEDAAVYYCHQRSSYPFTFGSGTKLEIK
【０１６６】
ｈｕ１８Ｆ１０−ＶＬ−ｃ（配列番号３６）
EIVLTQSPATLSASPGERVTLTCRASSSVSYLHWYQQKPGQAPKPLIYDTSDLASGIPARFSGDGSGTDYTLTISSLEAEDAAVYYCHQRSSYPFTFGSGTKLEIK
【０１６７】
最終的なヒト化ｈｕ８Ａ１１（ＶＨ−ｂ重鎖およびＶＬ−ｂ軽鎖を使用）およびｈｕ１８Ｆ１０抗体分子（ＶＨ−ｂ重鎖およびＶＬ−ｂ軽鎖を使用）を、前述の軽鎖と重鎖の組み合わせの逆変異の数の比較および小規模発現の試験により、包括的に評価および選択し、および、全長軽鎖および重鎖の配列を配列番号１７〜２０に示す。
【０１６８】
ｈｕ８Ａ１１ ＨＣ
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVAYISSGGSTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGYGTYGDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号１７
【０１６９】
ｈｕ８Ａ１１ ＬＣ
DIVMTQSPSSLAVSVGERVTISCKSSQSLLYSTNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSYLRTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号１８
【０１７０】
ｈｕ１８Ｆ１０ ＨＣ
QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTFTGYDLHWVRQAPGQGLEWIGVISTYYGDANYNQKFQGRVTMTVDTSSSTAYMELSRLRSEDTAVYYCTRLAESYFFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号１９
【０１７１】
ｈｕ１８Ｆ１０ ＬＣ
EIVLTQSPATLSASPGERVTLTCRASSSVSYLHWYQQKPGQAPKPWIYDTSDLASGFPARFSGDGSGTDYTLTISSLEAEDAAVYYCHQRSSYPFTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号２０
【０１７２】
実施例９：ヒト化抗体活性の試験データ
ヒト化重鎖および軽鎖（モル比＝１：１）を含む構築された組換えプラスミドを、それぞれ２９３Ｆ細胞にトランスフェクトした。７日後、２９３個の細胞によって発現された上清サンプルを高速で遠心分離してから、０．４５μｍ膜を通して濾過することにより不純物を除去した。タンパク質ＡカラムをＰＢＳ溶液で平衡化し、カラム容量の２〜５倍で洗浄した。上清をカラムに負荷し、Ａ２８０値がベースラインまで低下するまでＰＢＳ溶液で洗浄した。標的タンパク質を０．１Ｍクエン酸（ｐＨ３．２）溶液で溶出し、貯蔵溶出ピークを１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）で中和した。中和された溶出液をＰＢＳ溶液に置き換え、得られたタンパク質をＳＥＣ−ＨＰＬＣにより同定し、その後の使用のために少量採取した。
【０１７３】
抗体分子ｈｕ８Ａ１１およびｈｕ１８Ｆ１０の最終的なヒト化バージョンを、実施例６のインビトロ結合親和性および動態実験ならびに実施例７の細胞活性実験によって試験し、Ｍｅｒｃｋの参照抗体ＢＭＡＢと比較した。その結果を、それぞれ表２および図２に示す。
【０１７４】
【表２】
2020532279.tif 000009
【０１７５】
上記の結果は、ヒト化抗ヒトＧＩＴＲ抗体が、ヒト化前に結合活性を保持し、ＢＭＡＢ基準と比較して同等またはより強い細胞機能活性を持ち、インビトロで強い結合親和性を持つことを示している。
【０１７６】
実施例１０：抗ＧＩＴＲ抗体ｈｕ８Ａ１１による腫瘍細胞増殖の阻害
ＰＢＭＣは、密度勾配遠心分離によって健康な個人の末梢血から分離した。単球をＣＤ１４＋マイクロビーズキットで選別し、Ａ３７５黒色腫細胞（１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ培地で培養；上海生物科学研究所の細胞バンク）と混合し、各ＮＣＧマウス（南京大学の南京生物医学研究所から購入し、環境に適合させるために５日間飼育）に皮下接種した。実験動物はすべて、一定の温度と湿度の独立した換気ボックスで飼育した。給餌室の温度は１８．０〜２６．０℃、湿度は４０〜７０％、換気頻度は１時間あたり１０〜２０回とした。昼夜シフトは１２時間／１２時間であった。
【０１７７】
実験対象を、ヒトＩｇＧ１抗体対照群、すなわち、ｈｕ８Ａ１１グループの三つの一定投与量（２５０μｇ、５００μｇ、１０００μｇ）と参照抗体ＢＭＡＢグループ（１０００μｇ）とに分けた。各グループの８匹のマウスに皮下注射で投与した。実験の全過程において、腫瘍の長さと幅をキャリパーで週に２回測定し、腫瘍の体積を次の式に従って計算した。腫瘍体積（ｍｍ３）＝０．５×（腫瘍長×腫瘍幅２）。相対的な腫瘍成長阻害率ＴＧＩ（％）：ＴＧＩ％＝（１−Ｔ／Ｃ）×１００％。ＴＣ％は、相対的な腫瘍増殖率、すなわち、特定の時点での、治療群と対照群との相対的な腫瘍の体積または重量の百分率比である。ＴおよびＣは、それぞれ、治療群およびＩｇＧ１対照群における、特定の時点での、腫瘍体積（ＴＶ）または腫瘍重量（ＴＷ）である。
【０１７８】
結果を表３、図３および図４に示す。ヒト化抗ＧＩＴＲ抗体ｈｕ８Ａ１１は、ＩｇＧ１コントロールと比較して有意な抗腫瘍効果を示し、その抗腫瘍効果は、同じ用量の参照抗体ＢＭＡＢの抗腫瘍効果よりも著しく強力である。
【０１７９】
【表３】
2020532279.tif 000010
【０１８０】
以上、本発明の特定の実施形態について説明したが、本発明の原理および本質から逸脱することなく、これらの実施形態を複数の方法で変更または修正できることを、当業者は理解すべきである。すなわち、本発明の保護の範囲は添付の特許請求の範囲によって限定される。
【図１】
2020532279.tif 000011
【図２】
2020532279.tif 000012
【図３】
2020532279.tif 000013
【図４】
2020532279.tif 000014
【配列表】
2020532279000001.app
【国際調査報告】
2020532279.tif 000015
2020532279.tif 000016
2020532279.tif 000017
2020532279.tif 000018
2020532279.tif 000019
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