(57)【要約】本発明は、ヒトグレムリン−１タンパク質の結晶、及び阻害抗体との複合体におけるヒトグレムリン−１タンパク質の結晶に関する。本発明は、ヒトグレムリン−１の構造（それ自体で、又は抗体との複合体において）及びグレムリン−１活性を調節する薬剤についてのスクリーニングにおけるこれらの構造の使用にも関する。本発明は、グレムリン−１上のアロステリック阻害部位に結合する抗体と共に医薬組成物、並びにかかる抗体の医学的使用及びスクリーニング方法によって同定される薬剤をさらに提供する。【選択図】図２
2020511946.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｉｌｅ１３１、Ｌｙｓ１４７、Ｌｙｓ１４８、Ｐｈｅ１４９、Ｔｈｒ１５０、Ｔｈｒ１５１、Ａｒｇ１６９、Ｌｙｓ１７４及びＧｌｎ１７５から選択される少なくとも１つの残基（ここで、残基ナンバリングは配列番号：１に従う）を含む、グレムリン−１上のエピトープへ結合する抗体。
【請求項２】
Ｉｌｅ１３１、Ｌｙｓ１４７、Ｌｙｓ１４８、Ｐｈｅ１４９、Ｔｈｒ１５０、Ｔｈｒ１５１、Ａｒｇ１６９、Ｌｙｓ１７４及びＧｌｎ１７５のすべて含むエピトープを結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
Ｌｙｓ１４７、Ｌｙｓ１４８、Ｐｈｅ１４９、Ｔｈｒ１５０、Ｔｈｒ１５１、Ａｒｇ１６９、Ｌｙｓ１７４及びＧｌｎ１７５は同じグレムリン−１モノマー上に所在し、Ｉｌｅ１３１は第２のグレムリン−１モノマー上に所在する、請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項４】
抗体パラトープがＸ線結晶学によって決定されるグレムリン−１残基の４Å内にあるならば、前記抗体が前記グレムリン−１残基に結合する、請求項１、２又は３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項５】
Ｈｅｋ−Ｉｄ１レポーター遺伝子アッセイにおいてシグナルを回復させる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項６】
配列番号：１０もしくは１２の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）内に含有される重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）配列、及び／又は配列番号：１１もしくは１３の軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）内に含有される軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）配列を含む、抗グレムリン−１抗体。
【請求項７】
配列番号：３、４、５及び６から選択される少なくとも１つのＨＣＤＲ配列、並びに／又は配列番号：７、８及び９から選択される少なくとも１つのＬＣＤＲ配列を含む、抗グレムリン−１抗体。
【請求項８】
配列番号：６のＨＣＤＲ３配列を含む、請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
前記ＨＣＤＲ１／ＨＣＤＲ２／ＨＣＤＲ３配列の組み合わせが、配列番号：４／５／６もしくは配列番号：３／５／６から選択される、及び／又は、前記ＬＣＤＲ１／ＬＣＤＲ２／ＬＣＤＲ３配列の組み合わせが、配列番号：７／８／９から選択される、請求項７又は８に記載の抗体。
【請求項１０】
配列番号：４／５／６／７／８／９又は配列番号：３／５／６／７／８／９のＨＣＤＲ１／ＨＣＤＲ２／ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ１／ＬＣＤＲ２／ＬＣＤＲ３配列の組み合わせを含む、請求項７、８又は９のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１１】
配列番号：１０もしくは１２の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）配列及び／又は配列番号：１１もしくは１３の軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）配列、又はそれへ少なくとも９５％同一の配列を含む、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１２】
配列番号：１０／１１もしくは１２／１３のＨＣＶＲ及びＬＣＶＲの配列ペア、又はそれへ少なくとも９５％同一の配列を含む、請求項１１に記載の抗体。
【請求項１３】
前記ＨＣＤＲ１／ＨＣＤＲ２／ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ１／ＬＣＤＲ２／ＬＣＤＲ３配列が、配列番号：４／５／６／７／８／９又は配列番号：３／５／６／７／８／９からなり、前記ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲの残りが、それぞれ配列番号：１０、１１、１２及び／又は１３に対して少なくとも９５％の同一性を含む、請求項１２に記載の抗体。
【請求項１４】
配列番号：１４、１６、１８、２２、２８、３０、３２もしくは３４の重鎖及び／又は配列番号：１５、１７、１９、２３、２９、３１、３３もしくは３５の軽鎖、又はそれへ少なくとも９５％同一の配列を含む、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１５】
配列番号：１４／１５、１６／１７、１８／１９、２２／２３、２８／２９もしくは３０／３１、３２／３３、３４／３５の重鎖及び軽鎖ペア、又はそれへ少なくとも９５％同一の配列を含む、請求項１４に記載の抗体。
【請求項１６】
前記ＨＣＤＲ１／ＨＣＤＲ２／ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ１／ＬＣＤＲ２／ＬＣＤＲ３配列が、配列番号：４／５／６／７／８／９又は配列番号：３／５／６／７／８／９からなり、前記重鎖及び軽鎖の残りが、それぞれ配列番号：１４、１５、１６及び／又は１７に対して少なくとも９５％の同一性を含む、請求項１５に記載の抗体。
【請求項１７】
請求項６〜１６のいずれか一項において定義された抗体と、グレムリン−１への結合を競合する抗体。
【請求項１８】
請求項６〜１６のいずれか一項において定義された抗体と、同じグレムリン−１上のエピトープを結合する抗体。
【請求項１９】
キメラ抗体、ヒト抗体又はヒト化抗体である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２０】
Ｆａｂ、修飾Ｆａｂ、Ｆａｂ’、修飾Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単一ドメイン抗体又はｓｃＦｖである、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか一項において定義された抗体をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２２】
請求項２１に記載のポリヌクレオチドを担持する、発現ベクター。
【請求項２３】
請求項２２において定義されたベクターを含む、宿主細胞。
【請求項２４】
抗体の産生を許容する条件下で請求項４９に記載の宿主細胞を培養すること、及び、産生された前記抗体を回収することを含む、請求項１〜２０のいずれか一項において定義された抗体を産生する方法。
【請求項２５】
請求項１〜２０のいずれか一項において定義された抗体、並びに薬学的に許容されるアジュバント及び／又は担体を含む、医薬組成物。
【請求項２６】
治療法によるヒト又は動物の体の治療の方法における使用のための、請求項１〜２０のいずれか一項において定義された抗体、又は請求項２５において定義された医薬組成物。
【請求項２７】
糖尿病性腎症等の腎線維症、特発性肺線維症、肺動脈性肺高血圧症、血管新生及び／又はがんが、治療／予防される、請求項２６に記載の使用のための抗体又は医薬組成物。
【請求項２８】
治療有効量の請求項１〜２０のいずれか一項に記載の抗体、又は請求項２５に記載の医薬組成物をそれを必要とする患者へ投与することを含む、糖尿病性腎症等の腎線維症、特発性肺線維症、肺動脈性肺高血圧症、血管新生及び／又はがんを治療又は予防する方法。
【請求項２９】
グレムリン−１の結晶。
【請求項３０】
前記グレムリン−１がヒトグレムリン−１である、請求項２９に記載の結晶。
【請求項３１】
ａ＝８４．５５Å、ｂ＝１０７．２２Å及びｃ＝７７．０９Åの単位格子寸法を備えたＣ２空間群からなる、請求項３０に記載の結晶。
【請求項３２】
抗体との複合体における、ヒトグレムリン−１の結晶。
【請求項３３】
前記抗体が、配列番号：１８の重鎖及び配列番号：１９の軽鎖を含む、請求項３２に記載の結晶。
【請求項３４】
表１中の座標によって定義された、ヒトグレムリン−１の構造。
【請求項３５】
表１中のグレムリン−１の構造座標又は構造のホモログを定義する座標によって定義された、機械読み取り可能データによりコードされたデータストレージ材料を含む、機械読み取り可能データストレージ媒体。
【請求項３６】
構造モデルとしての、請求項３４に記載の構造の使用。
【請求項３７】
ハイスループット化学スクリーニングのための、請求項３６に記載の構造モデルの使用。
【請求項３８】
グレムリン−１と相互作用する１つ又は複数の薬剤の同定のための、請求項３６又は３７に記載の構造モデルの使用。
【請求項３９】
前記薬剤がグレムリン−１の阻害物質である、請求項３８に記載の使用。
【請求項４０】
前記薬剤が、糖尿病性腎症等の腎線維症、特発性肺線維症、肺動脈性肺高血圧症、血管新生及び／又はがんの治療のために可能性のある薬剤である、請求項３８又は３９に記載の使用。
【請求項４１】
請求項３８、３９又は４０のいずれか一項に記載の使用によって同定される、薬剤。
【請求項４２】
（ａ）表１中の構造座標からリガンド結合部位を同定するステップと；
（ｂ）前記リガンド結合部位の少なくとも一部と相互作用する候補薬剤を同定するステップと；
（ｃ）前記薬剤を得るか又は合成するステップと、
を含む、グレムリン−１活性の調節薬剤についてのスクリーニング方法。
【請求項４３】
ステップ（ａ）及び（ｂ）がインシリコで遂行される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記薬剤がグレムリン−１活性の阻害物質である、請求項４２又は４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記方法が、グレムリン−１の以下の残基：
Ｔｒｐ９３；
Ｐｈｅ１１７；
Ｔｙｒ１１９；
Ｐｈｅ１２５；
Ｔｙｒ１２６、及び／又は
Ｐｈｅ１３８、
（ここで、残基ナンバリングは配列番号：１に基づく）
のうちの少なくとも１つと相互作用する候補薬剤を同定することを含む、
請求項４２、４３又は４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記薬剤が、グレムリン−１のすべての以下の残基：Ｔｒｐ９３、Ｐｈｅ１１７、Ｔｙｒ１１９、Ｐｈｅ１２５、Ｔｙｒ１２６及びＰｈｅ１３８と相互作用する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
候補薬剤がＸ線結晶学によって決定される残基の６Å内にあるならば、前記薬剤がグレムリン−１と相互作用する、請求項４５又は４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記リガンド結合部位がアロステリック部位である、請求項４２、４３又は４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記方法が、グレムリン−１の以下の残基：Ｉｌｅ１３１、Ｌｙｓ１４７、Ｌｙｓ１４８、Ｐｈｅ１４９、Ｔｈｒ１５０、Ｔｈｒ１５１、Ａｒｇ１６９、Ｌｙｓ１７４及びＧｌｎ１７５（ここで、残基ナンバリングは配列番号：１に基づく）のうちの少なくとも１つと相互作用する候補薬剤を同定することを含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記薬剤が、グレムリン−１のすべての以下の残基：Ｉｌｅ１３１、Ｌｙｓ１４７、Ｌｙｓ１４８、Ｐｈｅ１４９、Ｔｈｒ１５０、Ｔｈｒ１５１、Ａｒｇ１６９、Ｌｙｓ１７４及びＧｌｎ１７５と相互作用する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
Ｌｙｓ１４７、Ｌｙｓ１４８、Ｐｈｅ１４９、Ｔｈｒ１５０、Ｔｈｒ１５１、Ａｒｇ１６９、Ｌｙｓ１７４及びＧｌｎ１７５は同じグレムリン−１モノマー上に所在し、Ｉｌｅ１３１は第２のグレムリン−１モノマー上に所在する、請求項４９又は５０に記載の方法。
【請求項５２】
候補薬剤がＸ線結晶学によって決定される残基の４Å内にあるならば、前記候補薬剤がグレムリン−１と相互作用する、請求項４８〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記薬剤が小分子又は抗体である、請求項４２〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
請求項４２〜５３のいずれか一項に記載の方法によって同定される、グレムリン−１調節薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトグレムリン−１タンパク質の結晶、及び阻害抗体との複合体におけるヒトグレムリン−１タンパク質の結晶に関する。本発明は、ヒトグレムリン−１の構造（それ自体で、又は抗体との複合体において）及びグレムリン−１活性を調節する薬剤についてのスクリーニングにおけるこれらの構造の使用にも関する。本発明は、グレムリン−１上のアロステリック阻害部位に結合する抗体と共に医薬組成物、並びにかかる抗体の医学的使用及びスクリーニング方法によって同定される薬剤をさらに提供する。
【背景技術】
【０００２】
グレムリン−１（Ｄｒｍ及びＣＫＴＳＦ１Ｂ１としても公知である）は、シスチンノット分泌タンパク質のＤＡＮファミリーの一部を形成する（数ある中でもケルベロス及びＤａｎと共に）１８４アミノ酸の糖タンパク質である。グレムリンは、ＢＭＰ−２、４及び７に結合し、その能力を阻害してシグナル伝達し、それと共に、おそらくＶＥＧＦＲ２のアゴニズムを介して報告されている血管新生促進の役割を果たす。グレムリン−１の主要な役割は発生の間であり、そこで、腎臓形成及び肢芽形成の間に不可欠なものである。これらの不可欠な役割のために、胚マウスにおけるグレムリンホモ接合ノックアウトは致死性となる。
【０００３】
成体期において、グレムリンのレベルの増加は特発性肺線維症及び肺動脈性肺高血圧症と関連し、そこで、ＢＭＰ−２、４及び７のシグナリングは低減し、ＴＧＦ−βレベルの関連した上昇がある。糖尿病性腎症及び慢性移植腎症の両方において、グレムリン−１の発現は線維化スコアと相関する。
【０００４】
グレムリンのレベルの増加は、硬皮症、糖尿病性腎症及び結腸直腸がんにもリンクする。グレムリン−１はがん細胞の浸潤及び分裂増殖を活性化することが示されており、子宮頚部がん、肺がん、卵巣がん、腎臓がん、乳がん、大腸がん、膵臓がん及び肉腫における役割を果たすと考えられる。
【０００５】
今日まで、グレムリン−１の研究と関連する多くの挑戦があり、グレムリン−１（及びそのパートナーのグレムリン−２）の周囲の一般的な理解が欠如している。ＢＭＰ生物学は複雑であり、高い相同性が種の間に存在する。グレムリン−１は取り組むことが難しいタンパク質であり、その生物学の研究のための好適なツール及び試薬は欠如している。グレムリン−１の作製も分かりやすいプロセスではない。システインノットタンパク質は産生することが難しいという悪評が高く、グレムリン−１の遊離システインは難題を追加する。グレムリン−１は精製どころか発現させることが難しい。これまでのところ、構造情報は入手可能ではなく、文献におけるこのタンパク質についての情報は非常に少ない。
【発明の概要】
【０００６】
本発明において使用されるようなグレムリン−１という用語は、典型的には、ＵｎｉＰｒｏｔエントリーＯ６０５６５（配列番号：１）において設定されるような配列を有する。グレムリン−１という用語は、
（ａ）Ｎ末端シグナルペプチド有りもしくは無しの配列番号：１のアミノ酸配列を含むかもしくはそれからなる（すなわち配列番号：２１において示されるような成熟ペプチド配列を含み得るか又はそれからなり得る）、又は
（ｂ）Ｎ末端シグナルペプチド有り又は無しの配列番号：１のアミノ酸配列（配列番号：２１において示されるような）と比べて、１つ又は複数のアミノ酸の置換、修飾、欠失又は挿入を有する誘導体であり、それはグレムリン−１の活性を保持する（配列番号：２０のアミノ酸配列）、
（ｃ）そのバリアントであり、かかるバリアントが、典型的には配列番号：１（又は配列番号：２０もしくは２１）に対して、少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％又は９５％の同一性（又は場合によっては約９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性）を保持する、
グレムリン−１ポリペプチドも指し得る。換言すれば、かかるバリアントは、配列番号：１に対して約６０％〜約９９％の同一性、好適には配列番号：１に対して８０％〜約９９％の同一性、より好適には配列番号：１に対して９０％〜約９９％の同一性、及び最も好適には配列番号：１に対して約９５％〜約９９％の同一性を保持し得る。バリアントはさらに以下で記載される。
【０００７】
さらに以下で検討されるように、残基数は典型的には、配列番号：１の配列に基づいて引用される。しかしながら、残基ナンバリングは、上で論じられるような誘導体配列又はバリアント配列に対して、当業者によって容易に推定され得る。残基数が引用される場合に、本発明は、バリアント配列又は誘導体配列上のこれら残基も網羅する。
【０００８】
本発明者は、ヒトグレムリン−１を、単独、及びＡｂ７３２６（Ｆａｂ断片）と称される抗体との複合体において、結晶させた。グレムリン−１の結晶化は、ＢＭＰ結合部位中の推定上の残基の決定を可能にした。さらに、アロステリック阻害抗体であるＡｂ７３２６との結晶化は、抗体エピトープ中の残基の決定を可能にした。このエピトープに結合する抗体は、グレムリン−１と関連する疾患の治療中に治療剤としての能力を有する。
【０００９】
したがって、本発明は、グレムリン−１の結晶を提供する。
【００１０】
本発明は、表１中の座標によって定義される、ヒトグレムリン−１の構造も提供する。
【００１１】
さらに、本発明は、
・表１中のグレムリン−１の構造座標又は構造のホモログを定義する座標によって定義される、機械読み取り可能データによりコードされたデータストレージ材料を含む、機械読み取り可能データストレージ媒体、
・構造モデルとして表１中の座標によって定義されるグレムリン−１の構造の使用、
・構造モデルの使用によって同定される薬剤、
・（ａ）表１中の構造座標からリガンド結合部位を同定するステップと；
（ｂ）リガンド結合部位の少なくとも一部と相互作用する候補薬剤を同定するステップと；
（ｃ）前記薬剤を得るか又は合成するステップと、
を含む、グレムリン−１活性の調節薬剤についてのスクリーニング方法、
・このスクリーニング方法によって同定されるような、グレムリン−１調節薬剤、
・Ｉｌｅ１３１、Ｌｙｓ１４７、Ｌｙｓ１４８、Ｐｈｅ１４９、Ｔｈｒ１５０、Ｔｈｒ１５１、Ａｒｇ１６９、Ｌｙｓ１７４及びＧｌｎ１７５から選択される少なくとも１つの残基（そこで、残基ナンバリングは配列番号：１に基づく）を含む、グレムリン−１上のエピトープへ結合する抗体、
・配列番号：１０もしくは１２の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）内に含有される重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）配列、及び／又は配列番号：１１もしくは１３の軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）内に含有される軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）配列を含む、抗グレムリン−１抗体、
・配列番号：３、４、５及び６から選択される少なくとも１つのＨＣＤＲ配列、並びに／又は配列番号：７、８及び９から選択される少なくとも１つのＬＣＤＲ配列を含む、抗グレムリン−１抗体、
・抗体をコードする、単離ポリヌクレオチド、
・ポリヌクレオチドを担持する、発現ベクター、
・ベクターを含む、宿主細胞、
・抗体の産生を許容する条件下で宿主細胞を培養すること、及び産生された抗体を回収することを含む、抗体を産生する方法、
・抗体を含む、医薬組成物、
・治療法によるヒト又は動物の体の治療の方法における使用のための、抗体又は医薬組成物、
・治療有効量の抗体又は医薬組成物をそれを必要とする患者へ投与することを含む、糖尿病性腎症等の腎線維症、特発性肺線維症、肺動脈性肺高血圧症、血管新生及び／又はがんを治療又は予防する方法、
を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】表１は、グレムリン−１結晶学についての構造データを提示する。
【図２】ヒトグレムリン−１の構造を示す。各々のモノマーのリボン表示を灰色の異なる陰で示す。フィンガー１及び２（Ｆ１及びＦ２）を、「リスト」領域（ｗ）及びシスチンノット（ＣＫ）と共にマークする。ジスルフィド結合を形成するシステインを、黒色の棒として示す。
【図３】ヒトグレムリン−１及びマウスグレムリン−２（ＰＲＤＣ）の配列アライメントを示す。星印によりマークされる残基はＢＭＰ結合において重要であり、ダイマーインターフェース中の残基を形成する鍵となる接触は四角で囲われる。
【図４】疎水性のＢＭＰ結合残基をハイライト表示するサーフェスレンダリングを示す。モノマーを灰色の２つの陰で示し、ＢＭＰ結合に関与する６つの鍵となる残基を白色で示す。
【図５】ヒトグレムリン−１及びマウスグレムリン−２のオーバーレイを提示する。上部画像はアライメントさせた２つのタンパク質によるリボン表示である。下部画像は棒としてＢＭＰ結合に関与するアミノ酸を詳細に示す（白色でマウスグレムリン−２及び黒色でヒトグレムリン−１）。
【図６】図６（Ａ）は、Ｈｅｋ  Ｉｄ１レポーター遺伝子アッセイにおける全長グレムリン−１の阻害効果の描写を示す。図６（Ｂ）は、Ｈｅｋ  Ｉｄ１レポーター遺伝子アッセイにおける短縮グレムリン−１の阻害効果の描写を示す。
【図７】Ｈｅｋ−Ｉｄ１レポーター遺伝子アッセイにおける免疫由来の抗体についてのシグナルのパーセンテージ回復を示す。
【図８】Ｈｅｋ−Ｉｄ１レポーター遺伝子アッセイにおけるライブラリー由来抗体についてのシグナルのパーセンテージ回復を示す。
【図９】ＢＭＰのシグナリングの回復における、ヒトグレムリン（図９Ａ）及びマウスグレムリン（図９Ｂ）のタイトレーション並びに抗体７３２６（抗体ＰＢ３７６として示される）の効果による、Ｈｅｋ−Ｉｄ１レポーター遺伝子アッセイについての結果を示す。
【図１０】グレムリン−Ｆａｂ複合体の構造モデルを示し、可能性のあるＢＭＰ結合領域及びＦａｂエピトープをハイライト表示する。
【図１１】灰色の２つの陰で各々のグレムリン−１モノマー、黒色でＢＭＰ結合に関与する突然変異誘発によって同定される６つの鍵となる残基、及びそれらの６つの鍵となる残基の６Å内の表面上のすべての残基を描写するサーフェスレンダリングを示す。
【図１２】右心室収縮期圧（ＲＶＳＰ）の査定。ＲＶＳＰに対する抗グレムリン１抗体の効果を、酸素正常状態及び低酸素状態／ＳＵ５４１６処理のＣ５７Ｂｌ／６マウスにおいて査定した。肺動脈性肺高血圧症（ＰＡＨ）発症に対する、抗グレムリン１（ｎ＝８）、ＩｇＧ１抗体対照（ｎ＝６）、ＰＢＳ（ｎ＝２）、イマチニブ（ｎ＝８）の効果を、３日ごとにＳＵ５４１６（２０ｍｇ／ｋｇ）を皮下注射し、続いて、２１日間慢性的な常圧低酸素状態（１０％のＯ２）又は酸素正常状態へ曝露した、メスＣ５７Ｂｌ／６マウスにおいて決定した。ＲＶＳＰを決定し、平均ＲＶＳＰ±ＳＥＭをプロットした。一元配置ＡＮＯＶＡによって、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００５；＊＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図１３】平均動脈性体循環圧（ＭＡＢＰ）の査定。ＭＡＢＰに対する抗グレムリン１抗体の効果を、抗グレムリン１（ｎ＝４）、ＩｇＧ１抗体対照（ｎ＝４）、イマチニブ（ｎ＝４）により処理した、低酸素状態／ＳＵ５４１６  Ｃ５７Ｂｌ／６マウス、及び酸素正常状態／ＳＵ５４１６で抗グレムリン１（ｎ＝４）、ＩｇＧ１抗体対照（ｎ＝４）において査定し、２１日後にＭＡＢＰ±ＳＥＭをプロットした。一元配置ＡＮＯＶＡによって、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００５；＊＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図１４】右心室肥大の査定。右心肥大（ＲＶ／ＬＶ＋Ｓ）に対する抗グレムリン１抗体の効果を、低酸素状態／ＳＵ５４１６のＣ５７Ｂｌ／６マウスにおいて査定した。肺動脈性肺高血圧症（ＰＡＨ）発症に対する、抗グレムリン１（ｎ＝８）、ＩｇＧ抗体対照（ｎ＝６）、ＰＢＳ（ｎ＝２）、イマチニブ（ｎ＝８）の効果を、３日ごとにＳＵ５４１６（２０ｍｇ／ｋｇ）を皮下注射し、続いて、２１日間慢性的な常圧低酸素状態（１０％のＯ２）又は酸素正常状態へ曝露した、メスＣ５７Ｂｌ／６マウスにおいて決定した。ＲＶＳＰを決定し、平均ＲＶＳＰ±ＳＥＭをプロットした。一元配置ＡＮＯＶＡによって、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００５；＊＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図１５】肺血管筋性化の組織学的評価。抗グレムリン１抗体の効果を査定した。抗グレムリン１（ｎ＝６）、ＩｇＧ抗体対照（ｎ＝６）、イマチニブ（ｎ＝６）のいずれかから単離したパラフィン包埋した肺の切片を、筋性化の程度を査定するために平滑筋アクチン（αＳＭＡ）及び内皮細胞を同定するためにフォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）について免疫組織化学によって染色した。肺切片をＮａｎｏｚｏｏｍｅｒバーチャル顕微鏡（Ｈａｍａｍａｔｓｕ、Ｗｅｌｗｙｎ  Ｇａｒｄｅｎ  Ｃｉｔｙ、英国）によってデジタル化し、独立した盲検化観察者によって、１群あたり＞４０の血管を、非筋性化、部分筋性化又は完全筋性化としてスコアリングした。各々の血管の様式のスコアの各々の群の平均スコア±ＳＥＭを、プロットした。パラフィン包埋した肺の切片の代表的な画像は、酸素正常状態でＩｇＧ１；低酸素状態／ＳＵ５４１６でＩｇＧ１；低酸素状態／ＳＵ５４１６でイマチニブ；低酸素状態／ＳＵ５４１６で抗グレムリン１を、αＳＭＡ及びｖＷＦについて染色したものである。一元配置ＡＮＯＶＡによって、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００５；＊＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【００１３】
配列リストの簡潔な記載
配列番号：１は、２４アミノ酸のＮ末端シグナル配列を含む、ヒトグレムリン−１の配列（Ｕｎｉｐｒｏｔ  ＩＤ  Ｏ６０５６５）を示す。
配列番号：２は、Ｎ末端タグを含む、結晶学において使用される短縮ヒトグレムリン−１の配列を示す。
配列番号：３は、Ａｂ７３２６のＨＣＤＲ１（Ｃｈｏｔｈｉａ）示す。
配列番号：４は、Ａｂ７３２６のＨＣＤＲ１（Ｋａｂａｔ）示す。
配列番号：５は、Ａｂ７３２６のＨＣＤＲ２（Ｋａｂａｔ）示す。
配列番号：６は、Ａｂ７３２６のＨＣＤＲ３（Ｋａｂａｔ）示す。
配列番号：７は、Ａｂ７３２６のＬＣＤＲ１（Ｋａｂａｔ）示す。
配列番号：８は、Ａｂ７３２６のＬＣＤＲ２（Ｋａｂａｔ）示す。
配列番号：９は、Ａｂ７３２６のＬＣＤＲ３（Ｋａｂａｔ）示す。
配列番号：１０は、Ａｂ７３２６の重鎖可変領域（バリアント１）を示す。
配列番号：１１は、Ａｂ７３２６の軽鎖可変領域（バリアント１）を示す。
配列番号：１２は、Ａｂ７３２６の重鎖可変領域（バリアント２）を示す。
配列番号：１３は、Ａｂ７３２６の軽鎖可変領域（バリアント２）を示す。
配列番号：１４は、マウスＡｂ７３２６の全長ＩｇＧ１重鎖（バリアント１）を示す。
配列番号：１５は、マウスＡｂ７３２６の全長ＩｇＧ１軽鎖（バリアント１）を示す。
配列番号：１６は、ヒトＡｂ７３２６の全長ＩｇＧ１重鎖（バリアント２）を示す。
配列番号：１７は、ヒトＡｂ７３２６の全長ＩｇＧ１軽鎖（バリアント２）を示す。
配列番号：１８は、Ａｂ７３２６のＦａｂ重鎖（バリアント１）を示す。
配列番号：１９はＡｂ７３２６のＦａｂ軽鎖（バリアント１）を示す。
配列番号：２０は、Ｎ末端タグ無しの、結晶学において使用される短縮ヒトグレムリン−１の配列を示す。
配列番号：２１は、成熟グレムリン−１の配列（シグナルペプチド無しの配列番号：１）を示す。
配列番号：２２は、ヒトＩｇＧ４Ｐ重鎖（バリアント１）を示す。
配列番号：２３は、ヒトＩｇＧ４Ｐ軽鎖（バリアント１）を示す。
配列番号：２４は、ヒトＩｇＧ１重鎖ＤＮＡ（バリアント１）を示す。
配列番号：２５は、ヒトＩｇＧ１軽鎖ＤＮＡ（バリアント１）を示す。
配列番号：２６は、ヒトＩｇＧ４Ｐ重鎖ＤＮＡ（バリアント１）を示す。
配列番号：２７は、ヒトＩｇＧ４Ｐ軽鎖ＤＮＡ（バリアント１）を示す。
配列番号：２８は、マウス全長ＩｇＧ１重鎖（バリアント２）を示す。
配列番号：２９は、マウス全長ＩｇＧ１軽鎖（バリアント２）を示す。
配列番号：３０は、ヒト全長ＩｇＧ１重鎖（バリアント１）を示す。
配列番号：３１は、ヒト全長ＩｇＧ１軽鎖（バリアント１）を示す。
配列番号：３２は、Ｆａｂ重鎖（バリアント２）を示す。
配列番号：３３は、Ｆａｂ軽鎖（バリアント２）を示す。
配列番号：３４は、ヒトＩｇＧ４Ｐ重鎖（バリアント２）を示す。
配列番号：３５は、ヒトＩｇＧ４Ｐ軽鎖（バリアント２）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
グレムリン−１結晶構造
本発明は、ヒトグレムリン−１の構造座標を提供する。完全な座標は、図１（表１）中でリストされる。
【００１５】
本発明は、ａ＝８４．５５Å、ｂ＝１０７．２２Å及びｃ＝７７．０９Åの単位格子寸法を備えたＣ２空間群からなる、ヒトグレムリン−１の結晶も提供する。
【００１６】
本発明は、抗体（より具体的には配列番号：１８の重鎖及び配列番号：１９の軽鎖を備えたＦａｂ）との複合体におけるグレムリン−１の結晶をさらに提供する。
【００１７】
本発明は、表１中のグレムリン−１の構造座標又は構造のホモログを定義する座標によって定義される、機械読み取り可能データによりコードされたデータストレージ材料を含む、機械読み取り可能データストレージ媒体を、さらに提供する。
【００１８】
本発明は、グレムリン−１についての構造モデルとしての、表１中の構造データ及び機械読み取り可能データストレージ媒体の使用を提供する。かかる構造モデルは、グレムリン−１と相互作用する薬剤についてのスクリーンに使用され得る。スクリーニングはハイスループットスクリーニングであり得る。
【００１９】
グレムリン−１と相互作用する薬剤は、典型的にはグレムリン−１を結合する薬剤である。グレムリン−１と相互作用する薬剤は、グレムリン−１を調節し得る。阻害性調節薬剤はグレムリン−１の機能のうちの任意のものに対する効果を有し得るが、典型的にはＢＭＰ（ＢＭＰ  ２／４／７）へのグレムリン−１の結合を低減する。グレムリン−１はＢＭＰの負のレギュレーターであり、そのため、結合の低減は、ＢＭＰを介するシグナリングを増加させる。活性化調節薬剤は、ＢＭＰへのグレムリン−１の結合を増加させ得る。
【００２０】
ＢＭＰの結合及びシグナリングは当技術分野において公知の任意の方法によって検出され得る。例えば、本出願の実施例はＳＭＡＤリン酸化アッセイを記載する。ＳＭＡＤ１、５及び８は、ＢＭＰシグナリングに際してリン酸化される。したがって、ＳＭＡＤリン酸化の増加を使用して、ＢＭＰシグナリングの増加（それはグレムリン−１への結合の低減を反映し得る）を決定することができる。
【００２１】
実施例は、Ｉｄ１遺伝子がＢＭＰシグナリングの標的遺伝子である場合のＩｄ１レポーター遺伝子アッセイも記載する。したがって、このアッセイにおけるシグナルの復活における増加も使用して、薬剤がＢＭＰへのグレムリン−１結合を阻害するかどうかを決定することができる。
【００２２】
薬剤は、本明細書において参照される時、グレムリン−１と相互作用できる可能性があるが、好ましくは小分子又は抗体である、任意の分子であり得る。
【００２３】
本発明は、
（ａ）表１中の構造座標からリガンド結合部位を同定するステップと；
（ｂ）リガンド結合部位の少なくとも一部と相互作用する候補薬剤を同定するステップと；
（ｃ）前記薬剤を得るか又は合成するステップと、
を含む、グレムリン−１活性の調節薬剤についてのスクリーニング方法も提供する。
【００２４】
リガンド結合部位は、タンパク質（リガンド）と相互作用するグレムリン−１上の任意の推定上の部位であり得る。リガンド結合部位は典型的にはＢＭＰ結合部位である。実施例において示されるように、本発明者は、グレムリン−１結晶構造に基づいた推定上のＢＭＰ結合部位を同定した。この結合部位は、以下のアミノ酸：Ｔｒｐ９３、Ｐｈｅ１１７、Ｔｙｒ１１９、Ｐｈｅ１２５、Ｔｙｒ１２６及びＰｈｅ１３８、（そこで、残基ナンバリングは配列番号：１に基づく）を含む。
【００２５】
したがって、本発明のスクリーニング方法は、これらの残基のうちの１つ又は複数（好ましくはこれらの残基のうちの少なくとも２、３、４又は６のすべて）と相互作用する薬剤を同定することを含み得る。
【００２６】
タンパク質残基と薬剤の相互作用は、当技術分野において公知の任意の適切な方法によって決定され、Ｘ線結晶学によって決定されるような残基と薬剤との間の距離（典型的には６Å未満又は４Å未満）等である。実施例において以下で論じられるように、治療物質によって標的とされ得るグレムリン−１の領域は、アミノ酸Ａｓｐ９２〜Ｌｅｕ９９、Ａｒｇ１１６〜Ｈｉｓ１３０、Ｓｅｒ１３７〜Ｓｅｒ１４２、Ｃｙｓ１７６〜Ｃｙｓ１７８を含み得る。これらは、グレムリン−１の表面上の変異の６Å内にある。
【００２７】
スクリーニング方法のステップ（ａ）及び（ｂ）は典型的にはインシリコで遂行され、薬剤は当技術分野において公知の任意の方法によって得られ合成され得る。
【００２８】
一実施形態において、本発明は、Ｔｒｐ９３、Ｐｈｅ１１７、Ｔｙｒ１１９、Ｐｈｅ１２５、Ｔｙｒ１２６及びＰｈｅ１３８から選択される少なくとも１つの残基（そこで、残基ナンバリングは配列番号：１に従う）を含む、グレムリン−１上のエピトープへ結合する抗体を提供する。本発明は、Ｔｒｐ９３、Ｐｈｅ１１７、Ｔｙｒ１１９、Ｐｈｅ１２５、Ｔｙｒ１２６及びＰｈｅ１３８のすべて含むエピトープを結合する抗体も提供する。
【００２９】
本発明は、（阻害の可能性のある）抗体を生成するための、グレムリン−１のこのＢＭＰ結合領域の使用も提供する。例えば、本発明は、上でリストされた残基のうちの少なくとも１つ（好ましくはすべて）を含む抗原を提供し、それは抗体生成のために使用され得る。
【００３０】
薬剤は、グレムリン−１のＢＭＰ結合部位と相互作用する代わりに、アロステリック的に作用し得る。この点で、薬剤は、正常な結合部位から離れて結合するが、例えばタンパク質における誘導された立体配座的変化を介してグレムリン−１の活性をそれでもなお調節することが可能である。したがって、本発明の構造モデル及びスクリーニング方法を使用して、グレムリン−１のアロステリック調節因子も同定することができる。
【００３１】
本発明のＡｂ７３２６抗体はアロステリック的に作用することが見出された。この抗体のエピトープは、以下の残基：Ｉｌｅ１３１、Ｌｙｓ１４７、Ｌｙｓ１４８、Ｐｈｅ１４９、Ｔｈｒ１５０、Ｔｈｒ１５１、Ａｒｇ１６９、Ｌｙｓ１７４及びＧｌｎ１７５（そこで、残基ナンバリングは配列番号：１に基づく）を含む。したがって、本発明のスクリーニング方法は、これらの残基のうちの少なくとも１、２、３、４、５又は９のすべてと相互作用する薬剤を同定することを包含し得る。次いでかかる薬剤は、例えば実施例中で記載されるアッセイを使用して、ＢＭＰ結合の阻害について試験され得る。好ましくは、Ｌｙｓ１４７、Ｌｙｓ１４８、Ｐｈｅ１４９、Ｔｈｒ１５０、Ｔｈｒ１５１、Ａｒｇ１６９、Ｌｙｓ１７４及びＧｌｎ１７５は、グレムリン−１の１つのモノマー上に所在し、Ｉｌｅ１３１はグレムリン−１の他のモノマー上に所在する（グレムリン−１ダイマーはＢＭＰダイマーへ結合する）。
【００３２】
もう一度繰り返すと、本発明は、抗グレムリン−１抗体の産生のためのこれらの残基のうちの少なくとも１つ（好ましくはすべて）を含む抗原も網羅する。
【００３３】
さらに、薬剤は、当技術分野において公知の任意の適切な方法によって、これらの残基と相互作用するとして同定され得る。薬剤は好ましくは小分子又は抗体である。
【００３４】
抗体
本発明は、グレムリン−１を結合する抗体を提供する。
【００３５】
「抗体」という用語は、本明細書において参照される時、抗体全体及び任意の抗原結合断片（すなわち「抗原結合部分」）又はその一本鎖を含む。抗体は、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖）を含む糖タンパク質、又はその抗原結合部分を指す。各々の重鎖は、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ又はＶＨと本明細書において省略される）及び重鎖定常領域からなる。各々の軽鎖は、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ又はＶＬと本明細書において省略される）及び軽鎖定常領域からなる。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。ＶＨ及びＶＬの領域は、より保存された領域（フレームワーク領域（ＦＲ）と称される）が散在する超可変性の領域（相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される）へとさらに細分することができる。
【００３６】
抗体の定常領域は、宿主の組織又は因子（免疫系の様々な細胞（例えばエフェクター細胞）及び古典的補体系の第１の構成要素（Ｃｌｑ）が挙げられる）への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。
【００３７】
本発明の抗体はモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であってもよく、典型的にはモノクローナル抗体であるだろう。本発明の抗体は、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト抗体、ナノボディ、ヒト抗体もしくはヒト化抗体、又はそのうちの任意のものの抗原結合部分であり得る。モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の両方の産生のために、実験動物は、典型的には非ヒト哺乳類（ヤギ、ウサギ、ラット又はマウス等）であるが、抗体は他の種においても作製され得る。
【００３８】
ポリクローナル抗体は、ルーチンの方法（対象となる抗原による好適な動物の免疫等）によって産生され得る。後続して血液は動物から取り出され、ＩｇＧ画分が精製され得る。
【００３９】
グレムリン−１に対する抗体は、周知のルーチンのプロトコールを使用して、動物の免疫が必要な場合に、動物（例えば非ヒト動物）へポリペプチドを投与することによって得られ得る（例えばＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ（編）、４巻、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、英国、１９８６年を参照）。多くの温血動物（ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ウシ、ラクダ又はブタ等）が免疫され得る。しかしながら、マウス、ウサギ、ブタ及びラットが一般的には好適である。
【００４０】
モノクローナル抗体は、当技術分野において公知の任意の方法（ハイブリドーマ技法（Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７）、トリオーマ技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Ｋｏｚｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，４：７２）及びＥＢＶハイブリドーマ技法（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、７７〜９６ページ、Ａｌａｎ  Ｒ  Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、１９８５年）等）によっても調製され得る。
【００４１】
本発明の抗体は、例えばＢａｂｃｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３（１５）：７８４３−７８４８１；ＷＯ９２／０２５５１；ＷＯ２００４／０５１２６８及びＷＯ２００４／１０６３７７によって記載される方法によって、特異的抗体の産生のために選択された単一リンパ球から生成された免疫グロブリン可変領域ｃＤＮＡをクローン化及び発現させることによる、単一リンパ球抗体方法を使用しても、生成され得る。
【００４２】
本発明の抗体は、当技術分野において公知の様々なファージディスプレイ方法を使用しても生成され、Ｂｒｉｎｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９５，１８２：４１−５０）、Ａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９５，１８４：１７７−１８６）、Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４，２４：９５２−９５８）、Ｐｅｒｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．（Ｇｅｎｅ，１９９７  １８７  ９−１８）、Ｂｕｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９４，５７：１９１−２８０）、並びにＷＯ９０／０２８０９；ＷＯ９１／１０７３７；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９３／１１２３６；ＷＯ９５／１５９８２；ＷＯ９５／２０４０１；並びにＵＳ５，６９８，４２６；同５，２２３，４０９；同５，４０３，４８４；同５，５８０，７１７；同５，４２７，９０８；同５，７５０，７５３；同５，８２１，０４７；同５，５７１，６９８；同５，４２７，９０８；同５，５１６，６３７；同５，７８０，２２５；同５，６５８，７２７；同５，７３３，７４３及び同５，９６９，１０８によって開示されるものを包含する。完全ヒト抗体は、重鎖及び軽鎖の両方の可変領域及び定常領域（存在する場合）が、必ずしも同じ抗体からではないが、すべてヒト起源又はヒト起源の配列に実質的に同一である、抗体である。
【００４３】
完全ヒト抗体の例としては、例えば上で記載されるファージディスプレイ方法によって産生される抗体、並びに例えばＥＰ０５４６０７３、Ｕ５，５４５，８０６、ＵＳ５，５６９，８２５、ＵＳ５，６２５，１２６、ＵＳ５，６３３，４２５、ＵＳ５，６６１，０１６、ＵＳ５，７７０，４２９、ＥＰ０４３８４７４及びＥＰ０４６３１５１において一般的な用語で記載されるような、それらのヒトカウンターパートによってマウス免疫グロブリン可変領域遺伝子及び随意に定常領域遺伝子を置き換えたマウスによって産生された抗体が挙げられ得る。
【００４４】
あるいは、本発明に記載の抗体は、グレムリン−１免疫原により非ヒト哺乳類を免疫すること；前記哺乳類から抗体調製物を得ること；グレムリン−１を認識するモノクローナル抗体をそれから導き出すこと、を含む方法によって産生され得る。
【００４５】
本発明の抗体分子は、全長の重鎖及び軽鎖を有する完全な抗体分子、又はその断片もしくは抗原結合部分を含み得る。抗体の「抗原結合部分」という用語は、抗原へ選択的に結合する能力を保持する、１つ又は複数の抗体の断片を指す。抗体の抗原結合機能が全長抗体の断片によって実行され得ることが示されている。抗体並びにその断片及び抗原結合部分は、Ｆａｂ、修飾Ｆａｂ、Ｆａｂ’、修飾Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単一ドメイン抗体（例えばＶＨ又はＶＬ又はＶＨＨ）、ｓｃＦｖ、二価、三価また四価の抗体、Ｂｉｓ−ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、及び上記のものの任意のエピトープ結合断片であり得るがこれらに限定されない（例えばＨｏｌｌｉｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈｕｄｓｏｎ，２００５，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３（９）：１１２６−１１３６；Ａｄａｉｒ  ａｎｄ  Ｌａｗｓｏｎ，２００５，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｏｎｌｉｎｅ  ２（３），２０９−２１７を参照）。これらの抗体断片を生成及び製造する方法は、当技術分野において周知である（例えばＶｅｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２１６，１６５−１８１を参照）。本発明における使用のための他の抗体断片としては、国際特許出願ＷＯ２００５／００３１６９、ＷＯ２００５／００３１７０及びＷＯ２００５／００３１７１中で記載されるＦａｂ断片及びＦａｂ’断片、並びに国際特許出願ＷＯ２００９／０４０５６２中で記載されるＦａｂ−ｄＡｂ断片が挙げられる。多価抗体は複数の特異性を含み得るか、又は単一特異的であり得る（例えばＷＯ９２／２２８５３及びＷＯ０５／１１３６０５を参照）。これらの抗体断片は当業者に公知の従来の技法を使用して得られ、断片はインタクトな抗体と同じ様式で有用性についてスクリーニングされ得る。
【００４６】
本発明の抗体分子の定常領域ドメインは、存在するならば、抗体分子の提案された機能、及び特に要求され得るエフェクター機能を考慮して、選択することができる。例えば、定常領域ドメインは、ヒトのＩｇＡドメイン、ＩｇＤドメイン、ＩｇＥドメイン、ＩｇＧドメイン又はＩｇＭドメインであり得る。特に、ヒトＩｇＧ定常領域ドメイン（特に抗体分子が治療使用について意図され、抗体エフェクター機能が要求される場合に、ＩｇＧ１イソタイプ及びＩｇＧ３イソタイプのもの）が使用され得る。あるいは、抗体分子が治療目的について意図され、抗体エフェクター機能が要求されない場合に、ＩｇＧ２イソタイプ及びＩｇＧ４イソタイプが使用され得る。
【００４７】
本発明の抗体は、組み換え手段によって、調製、発現、生成、又は単離され、（ａ）対象となる免疫グロブリン遺伝子についての遺伝子導入動物もしくは染色体導入動物（例えばマウス）又はそれから調製されたハイブリドーマから単離された抗体、（ｂ）対象となる抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から（例えばトランスフェクトーマから）単離された抗体、（ｃ）組み換えコンビナトリアル抗体ライブラリーから単離された抗体、及び（ｄ）免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングに関与する任意の他の手段によって調製、発現、生成又は単離された抗体等である。
【００４８】
本発明の抗体は、ヒト抗体又はヒト化抗体であり得る。「ヒト抗体」という用語は、本明細書において使用される時、フレームワーク及びＣＤＲの両方の領域がヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を包含することを意図する。さらに、抗体が定常領域を含有するならば、定常領域もヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えばインビトロのランダム突然変異誘発もしくは部位特異的変異誘発又はインビボの体細胞突然変異によって導入された突然変異）を包含し得る。しかしながら、「ヒト抗体」という用語は、本明細書において使用される時、別の哺乳類種（マウス等）の生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列の上へグラフトされた抗体を包含することを意図しない。
【００４９】
かかるヒト抗体はヒトモノクローナル抗体であり得る。かかるヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞へ融合した、ヒト重鎖導入遺伝子及び軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する遺伝子導入非ヒト動物（例えば遺伝子導入マウス）から得られたＢ細胞を含む、ハイブリドーマによって産生され得る。
【００５０】
ヒト抗体は、ヒトリンパ球のインビトロの免疫、続いてエプスタインバーウイルスによるリンパ球の形質転換によって調製され得る。
【００５１】
「ヒト抗体誘導体」という用語は、ヒト抗体の任意の修飾形状（例えば抗体のコンジュゲート及び他の薬剤又は抗体）を指す。
【００５２】
「ヒト化抗体」という用語は、本明細書において使用される時、別の哺乳類種（マウス等）の生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列の上へグラフトされた、ＣＤＲグラフト抗体分子を指すことを意図する。追加のフレームワーク領域修飾は、ヒトフレームワーク配列内で行われ得る。
【００５３】
本明細書において使用される時、「ＣＤＲグラフト抗体分子」という用語は、重鎖及び／又は軽鎖が、アクセプター抗体（例えばヒト抗体）の重鎖及び／又は軽鎖の可変領域フレームワークの中へグラフトされたドナー抗体（例えばマウス又はラットのモノクローナル抗体）からの１つ又は複数のＣＤＲを含有する（所望されるならば、１つ又は複数の修飾ＣＤＲを含む）、抗体分子を指す。総説については、Ｖａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６，５３５−５３９，１９９８を参照されたい。一実施形態において、むしろＣＤＲ全体が移されるのではなく、本明細書において上で記載されるＣＤＲのうちの任意の１つからの特異性決定残基のうちの１つ又は複数のみが、ヒト抗体フレームワークへ移される（例えばＫａｓｈｍｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｍｅｔｈｏｄｓ，３６，２５−３４を参照）。一実施形態において、本明細書において上で記載されるＣＤＲのうちの１つ又は複数からの特異性決定残基のみが、ヒト抗体フレームワークへ移される。別の実施形態において、本明細書において上で記載されるＣＤＲの各々からの特異性決定残基のみが、ヒト抗体フレームワークへ移される。
【００５４】
ＣＤＲ又は特異性決定残基がグラフトされる場合に、ＣＤＲが由来するドナー抗体のクラス／タイプを考慮して、任意の適切なアクセプター可変領域フレームワーク配列を使用することができ、マウス、霊長動物及びヒトのフレームワーク領域が挙げられる。好適には、本発明に記載のＣＤＲグラフト抗体は、ヒトアクセプターフレームワーク領域を含む可変ドメインに加えて、上で記載されるＣＤＲ又は特異性決定残基のうちの１つ又は複数を有する。したがって、可変ドメインがヒトアクセプターフレームワーク領域及び非ヒトドナーＣＤＲを含む、中和ＣＤＲグラフト抗体が、一実施形態において提供される。
【００５５】
本発明において使用できるヒトフレームワークの例は、ＫＯＬ、ＮＥＷＭ、ＲＥＩ、ＥＵ、ＴＵＲ、ＴＥＩ、ＬＡＹ及びＰＯＭである（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．、前出）。例えば、ＫＯＬ及びＮＥＷＭは重鎖のために使用することができ、ＲＥＩは軽鎖のために使用することができ、ＥＵ、ＬＡＹ及びＰＯＭは重鎖及び軽鎖の両方のために使用することができる。あるいは、ヒト生殖細胞系列配列を使用することができ、これらは、例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｖｂａｓｅ２．ｏｒｇ／で利用可能である（Ｒｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（２００５）３３（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １），Ｄ６７１−Ｄ６７４を参照）。
【００５６】
本発明のＣＤＲグラフト抗体において、アクセプターの重鎖及び軽鎖は、必ずしも同じ抗体に由来する必要はなく、所望されるならば、異なる鎖に由来するフレームワーク領域を有する複合鎖を含み得る。
【００５７】
さらに、本発明のＣＤＲグラフト抗体において、フレームワーク領域はアクセプター抗体のものと正確に同じ配列を有する必要はない。例えば、通常ではない残基は、そのアクセプター鎖のクラス又はタイプで、より頻繁に起こる残基へ変化させることができる。あるいは、アクセプターフレームワーク領域中の選択された残基がドナー抗体中の同じ位置で見出される残基へ対応するように、それらは変化され得る（Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ，３３２，３２３−３２４を参照）。かかる変化は、ドナー抗体の親和性を復活させるのに必要な最小限へ抑えられるべきである。変化させることが必要であり得るアクセプターフレームワーク領域中の残基の選択のためのプロトコールは、ＷＯ９１／０９９６７中で説明される。
【００５８】
抗体が多様な翻訳後修飾を受け得ることも、当業者によって理解されるだろう。これらの修飾のタイプ及び程度は、多くの場合、抗体の発現に使用される宿主細胞株に加えて培養条件に依存する。かかる修飾としては、糖鎖付加、メチオニン酸化、ジケトピペラジン形成、アスパラギン酸異性化、及びアスパラギン脱アミド化におけるバリエーションが挙げられ得る。頻度の高い修飾は、カルボキシペプチダーゼの作用に起因するカルボキシ末端の塩基性残基（リジン又はアルギニン等）の喪失である（Ｈａｒｒｉｓ，ＲＪ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ７０５：１２９−１３４，１９９５中で記載されるような）。
【００５９】
一実施形態において、抗体重鎖はＣＨ１ドメインを含み、抗体軽鎖はＣＬドメイン（κ又はλのいずれか）を含む。
【００６０】
生物学的分子（抗体又は断片等）は酸性及び／又は塩基性の官能基を含有し、それによって分子に正味の正又は負の電荷を与える。全体の「観察される」電荷の量は、実体の絶対的なアミノ酸配列、三次元構造中の荷電基の局部的な環境、及び分子の環境条件に依存するだろう。等電点（ｐＩ）は、特定の分子又は表面が正味の電荷を担持しないｐＨである。一実施形態において、本開示に記載の抗体又は断片は少なくとも７の等電点（ｐＩ）を有する。一実施形態において、抗体又は断片は、少なくとも８（８．５、８．６、８．７、８．８又は９等）の等電点を有する。一実施形態において、抗体のｐＩは８である。＊＊ＥｘＰＡＳＹ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｔｏｏｌｓ／ｐｉ＿ｔｏｏｌ．ｈｔｍｌ等のプログラム（Ｗａｌｋｅｒ、Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（２００５）、５７１−６０７を参照）を使用して、抗体又は断片の等電点を予測することができる。
【００６１】
本明細書において開示されるエピトープへ結合する抗体は、配列番号：４〜６（それぞれＨＣＤＲ１／ＨＣＤＲ２／ＨＣＤＲ３）のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つすべての重鎖ＣＤＲ配列を含み得る。これらは、Ｋａｂａｔ方法論を用いて決定されるような実施例のＡｂ７３２６抗体のＨＣＤＲ１／ＨＣＤＲ２／ＨＣＤＲ３配列である。
【００６２】
ＣＤＲ配列を決定するＫａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの方法は、当技術分野において（他の技法に加えて）周知である。ＣＤＲ配列は任意の適切な方法を使用して決定され、本発明において典型的にはＫａｂａｔが用いられるが、同様に他の技法が使用され得る。本事例において、配列番号：３は、Ｃｈｏｔｈｉａ及びＫａｂａｔを組み合わせた定義を使用して決定されるようなＡｂ７３２６  ＨＣＤＲ１配列を提示する。
【００６３】
本発明の抗体は、配列番号：７〜９（それぞれＬＣＤＲ１／ＬＣＤＲ２／ＬＣＤＲ３）のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つすべての軽鎖ＣＤＲ配列を含み得る。これらは、Ｋａｂａｔ方法論を用いる、Ａｂ７３２６のＬＣＤＲ１／ＬＣＤＲ２／ＬＣＤＲ３配列である。
【００６４】
抗体は、好ましくは少なくとも配列番号：６のＨＣＤＲ３配列を含む。
【００６５】
典型的には、抗体は、配列番号：３〜５から選択される少なくとも１つの重鎖ＣＤＲ配列、及び配列番号：７〜９から選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲ配列を含む。抗体は、配列番号：３〜５から選択される少なくとも２つの重鎖ＣＤＲ配列、及び配列番号：７〜９から選択される少なくとも２つの軽鎖ＣＤＲ配列を含み得る。抗体は、典型的には、配列番号：３〜５のすべての３つの重鎖ＣＤＲ配列（それぞれＨＣＤＲ１／ＨＣＤＲ２／ＨＣＤＲ３）、及びすべての３つの軽鎖ＣＤＲ配列の配列番号：７〜９（それぞれＬＣＤＲ１／ＬＣＤＲ２／ＬＣＤＲ３）を含む。抗体は、キメラ抗体、ヒト抗体、又はヒト化抗体であり得る。
【００６６】
抗体は、配列番号：１０又は１２の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）配列（Ａｂ７３２６バリアント１及び２のＨＣＶＲ）を含み得る。抗体は、配列番号：１０又は１２の軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）配列（Ａｂ７３２６バリアント１及び２のＬＣＶＲ）を含み得る。抗体は、好ましくは配列番号：１０又は１２の重鎖可変領域配列、及び配列番号：１１又は１３の軽鎖可変領域配列（特に配列番号：１０／１１又は１２／１３のＨＣＶＲ／ＬＶＣＲペア）を含む。
【００６７】
抗体は、
配列番号：１４マウス全長ＩｇＧ１重鎖バリアント１、又は
配列番号：２８マウス全長ＩｇＧ１重鎖バリアント２、又は
配列番号：３０ヒト全長ＩｇＧ１重鎖バリアント１、又は
配列番号：１６ヒト全長ＩｇＧ１重鎖バリアント２、又は
配列番号：２２ヒト全長ＩｇＧ４Ｐ重鎖バリアント１、又は
配列番号：３４ヒト全長ＩｇＧ４Ｐ重鎖バリアント２、又は
配列番号：１８  Ｆａｂ重鎖バリアント１、又は
配列番号：３２  Ｆａｂ重鎖バリアント２
の重鎖（Ｈ鎖）配列を含み得る。
【００６８】
抗体は、
配列番号：１５マウス全長ＩｇＧ１軽鎖バリアント１、又は
配列番号：２９マウス全長ＩｇＧ１軽鎖バリアント２、又は
配列番号：３１ヒト全長ＩｇＧ１軽鎖バリアント１、又は
配列番号：１７ヒト全長ＩｇＧ１軽鎖バリアント２、又は
配列番号：２３ヒト全長ＩｇＧ４Ｐ軽鎖バリアント１、又は
配列番号：３５ヒト全長ＩｇＧ４Ｐ軽鎖バリアント２、又は
配列番号：１９  Ｆａｂ軽鎖バリアント１、又は
配列番号：３３  Ｆａｂ軽鎖バリアント２
の軽鎖（Ｌ鎖）配列を含み得る。
【００６９】
一実施例において、抗体は、
配列番号：１４／１５マウス全長ＩｇＧ１バリアント１、又は
配列番号：２８／２９マウス全長ＩｇＧ１バリアント２、又は
配列番号：３０／３１ヒト全長ＩｇＧ１バリアント１、又は
配列番号：１６／１７ヒト全長ＩｇＧ１バリアント２、又は
配列番号：２２／２３ヒト全長ＩｇＧ４Ｐバリアント１、又は
配列番号：３４／３５ヒト全長ＩｇＧ４Ｐバリアント２、又は
配列番号：１８／１９  Ｆａｂ軽鎖バリアント１、又は
配列番号：３２／３３  Ｆａｂ軽鎖バリアント２
の重鎖／軽鎖配列ペアを含む。
【００７０】
対応する配列のバリアント型は交換され得る。例えば、抗体は、
配列番号：１４／２９マウス全長ＩｇＧ１重鎖バリアント１／軽鎖バリアント２、又は
配列番号：２８／１５マウス全長ＩｇＧ１重鎖バリアント２／軽鎖バリアント１、又は
配列番号：３０／１７ヒト全長ＩｇＧ１重鎖バリアント１／軽鎖バリアント２、又は
配列番号：１６／３１ヒト全長ＩｇＧ１重鎖バリアント２／軽鎖バリアント１、又は
配列番号：２２／３５ヒト全長ＩｇＧ４Ｐ重鎖バリアント１／軽鎖バリアント２、又は
配列番号：３４／２３ヒト全長ＩｇＧ４Ｐ重鎖バリアント２／軽鎖バリアント１、又は
配列番号：１８／３３  Ｆａｂ軽鎖重鎖バリアント１／軽鎖バリアント２、又は
配列番号：３２／１９  Ｆａｂ軽鎖重鎖バリアント２／軽鎖バリアント１
の重鎖／軽鎖配列ペアを含み得る。
【００７１】
抗体は、キメラ抗体、ヒト抗体、又はヒト化抗体であり得る。
【００７２】
抗体は、あるいは上で列挙した具体的な配列のうちの１つのバリアントであり得るか、又はそれを含み得る。例えば、バリアントは、上記のアミノ酸配列のうちの任意のものの置換バリアント、欠失バリアント、又は追加バリアントであり得る。
【００７３】
バリアント抗体は、上で論じられた具体的な配列からの、１、２、３、４、５、１０まで、２０まで、又はそれ以上（典型的には最大５０まで）のアミノ酸の置換及び／又は欠失を含み得る。「欠失」バリアントは、個別のアミノ酸の欠失、アミノ酸の小集団（２、３、４又は５アミノ酸等）の欠失、又はより大きなアミノ酸領域の欠失（特異的アミノ酸ドメイン又は他の特色の欠失等）を含み得る。「置換」バリアントは、典型的には、１つ又は複数のアミノ酸を同じ数のアミノ酸により置換すること及び保存的アミノ酸置換を行うことを包含する。例えば、アミノ酸は、類似する特性を有する代替のアミノ酸（例えば別の塩基性アミノ酸、別の酸性アミノ酸、別の中性アミノ酸、別の荷電アミノ酸、別の親水性アミノ酸、別の疎水性アミノ酸、別の極性アミノ酸、別の芳香族アミノ酸、別の脂肪族アミノ酸）による置換であり得る。好適な置換物の選択に使用され得る２０の主要なアミノ酸のいくつかの特性は、以下の通りである。
【表１】
2020511946.tif 000003
【００７４】
「誘導体」又は「バリアント」は、一般的に、配列中で現われるアミノ酸が、天然に存在するアミノ酸の代わりに、その構造類似体であるものを含む。もし抗体の機能に有意に悪影響を与えなければ、配列中で使用されるアミノ酸は誘導体化又は修飾（例えば標識）もされ得る。
【００７５】
誘導体及びバリアントは、抗体の合成の間にもしくは産生後修飾によって、又は、抗体が組み換え型である場合に、核酸の部位特異的突然変異誘発、ランダム突然変異誘発、又は酵素による切断及び／もしくはライゲーションの既知の技法を使用して、上記のように調製され得る。
【００７６】
バリアント抗体は、本明細書において開示されるアミノ酸配列（特にＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ配列並びにＨ鎖及びＬ鎖配列）に、約６０％を超える、又は約７０％を超える（例えば７５又は８０％）、典型的には約８５％を超える（例えば約９０又は９５％を超える）アミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。さらに、抗体は、本明細書において開示されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ配列並びにＨ鎖及びＬ鎖配列に、約６０％を超える、又は約７０％を超える（例えば７５又は８０％）、典型的には約８５％を超える（例えば約９０又は９５％を超える）アミノ酸同一性を有する一方で、これらの配列について開示された正確なＣＤＲを保持するバリアントであり得る。バリアントは、本明細書において開示されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ配列並びにＨ鎖及びＬ鎖配列に、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を保持し得る（いくつかの状況において、正確なＣＤＲを保持しながら）。
【００７７】
バリアントは典型的には、約６０％〜約９９％の同一性、約８０％〜約９９％の同一性、約９０％〜約９９％の同一性、又は約９５％〜約９９％の同一性を保持する。アミノ酸同一性のこのレベルは、全長ポリペプチドのサイズに依存して、関連する配列番号の配列の全長の一帯に、又はその配列の一部にわたって（約２０、３０、５０、７５、１００、１５０、２００又はそれ以上のアミノ酸の一帯に等）、観察され得る。
【００７８】
アミノ酸配列に関して、「配列同一性」は、以下のパラメーター：
Ｐａｉｒｗｉｓｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ−Ｍｅｔｈｏｄ：ａｃｃｕｒａｔｅ、Ｍａｔｒｉｘ：ＰＡＭ、Ｇａｐ  ｏｐｅｎ  ｐｅｎａｌｔｙ：１０．００、Ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ：０．１０；
Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ−Ｍａｔｒｉｘ：ＰＡＭ、Ｇａｐ  ｏｐｅｎ  ｐｅｎａｌｔｙ：１０．００、％  ｉｄｅｎｔｉｔｙ  ｆｏｒ  ｄｅｌａｙ：３０、Ｐｅｎａｌｉｚｅ  ｅｎｄ  ｇａｐｓ：ｏｎ、Ｇａｐ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｄｉｓｔａｎｃｅ：０、Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｍａｔｒｉｘ：ｎｏ、Ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ：０．２０、Ｒｅｓｉｄｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｉｅｓ：ｏｎ、Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｉｅｓ：ｏｎ、Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ：ＧＰＳＮＤＱＥＫＲ
によりＣｌｕｓｔａｌＷ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４、前出）を使用して査定された場合に、規定値を有する配列を指す。特定の残基での配列同一性は、単純に誘導体化された同一の残基を含むように意図される。
【００７９】
したがって、これらの鎖の機能又は活性を維持する、特異的配列を有する抗体及びバリアントが提供される。
【００８０】
抗体は、Ｈ鎖／Ｌ鎖、ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲもしくはＣＤＲの配列に関して上で定義されるものとグレムリン−１への結合について競合し得るか、又はＨ鎖／Ｌ鎖、ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲもしくはＣＤＲの配列に関して上で定義されるものと同じエピトープへ結合し得る。特に、抗体は、配列番号：４／５／６／７／８／９のＨＣＤＲ１／ＨＣＤＲ２／ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ１／ＬＣＤＲ２／ＬＣＤＲ３配列の組み合わせを含む抗体とグレムリン−１への結合について競合し得るか、又はＨＣＤＲ１／ＨＣＤＲ２／ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ１／ＬＣＤＲ２／ＬＣＤＲ３配列の組み合わせを含む抗体と同じエピトープへ結合し得る。抗体は、配列番号：１０／１１もしくは１２／１３のＨＣＶＲ及びＬＣＶＲの配列ペア又は配列番号：１４／１５もしくは１６／１７の全長鎖を含む抗体とグレムリン−１への結合について競合し得るか、又は、配列番号：１０／１１もしくは１２／１３のＨＣＶＲ及びＬＣＶＲの配列ペア又は配列番号：１４／１５もしくは１６／１７の全長鎖を含む抗体と同じエピトープへ結合し得る。
【００８１】
「エピトープ」という用語は、抗体によって結合される抗原の領域である。エピトープは、構造的又は機能的に定義され得る。機能的エピトープは、一般的に構造エピトープのサブセットであり、相互作用の親和性に直接寄与するそれら残基を有する。エピトープは立体配座的でもあり、すなわち非直線状アミノ酸から構成され得る。ある特定の実施形態において、エピトープは、化学的に活性のある分子の表面基（アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基、又はスルホニル基等）である決定基を含み得る。また、ある特定の実施形態において、特異的な三次元構造特徴及び／又は比電荷特徴を有し得る。
【００８２】
当技術分野において公知のルーチンの方法の使用によって、抗体が、参照抗体と同じエピトープへ結合するかどうか、又は参照抗体と結合について競合するかどうかを容易に決定することができる。例えば、試験抗体が本発明の参照抗体と同じエピトープへ結合するかどうかを決定するために、参照抗体を飽和条件下でタンパク質又はペプチドへ結合させる。次に、試験抗体がタンパク質又はペプチドへ結合する能力が査定される。試験抗体が、参照抗体による飽和結合に続いて、タンパク質又はペプチドへ結合することができるならば、試験抗体が参照抗体とは異なるエピトープへ結合することを結論付けることができる。その一方で、試験抗体が参照抗体による飽和結合に続いて、タンパク質又はペプチドへ結合することができないならば、その時、試験抗体は、本発明の参照抗体によって結合されるエピトープと同じエピトープへ結合し得る。
【００８３】
抗体が参照抗体と結合について競合するかどうかを決定するために、上述の結合方法論が２つの方向で遂行される。第１の方向において、参照抗体を飽和条件下でタンパク質／ペプチドへ結合させ、続いて、タンパク質／ペプチド分子への試験抗体の結合を査定する。第２の方向において、試験抗体を飽和条件下でタンパク質／ペプチドへ結合させ、続いて、タンパク質／ペプチドへの参照抗体の結合を査定する。両方の方向において、第１の（飽和）抗体のみがタンパク質／ペプチドへ結合することが可能ならば、その時、試験抗体及び参照抗体がタンパク質／ペプチドへの結合について競合することを結論付けることができる。当業者によって認識されるように、参照抗体と結合について競合する抗体は、必ずしも参照抗体と同一のエピトープへ結合しなくてもよいが、オーバーラップするエピトープ又は隣接するエピトープの結合によって参照抗体の結合を立体的にブロックし得る。
【００８４】
各々が他のものの抗原への結合を競合的に阻害する（ブロックする）ならば、２つの抗体は同じエピトープ又はオーバーラップするエピトープへ結合する。すなわち、競合結合アッセイにおいて測定されるように、１、５、１０、２０又は１００倍過剰量の１つの抗体は、少なくとも５０％、７５％、９０％又は場合によっては９９％まで、他のものの結合を阻害する（例えばＪｕｎｇｈａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，１９９０：５０：１４９５−１５０２を参照）。あるいは、１つの抗体の結合を低減又は消失させる抗原中の本質的にすべてのアミノ酸突然変異が、他のものの結合を低減又は消失させるならば、２つの抗体は同じエピトープを有する。１つの抗体の結合を低減又は消失させるいくつかのアミノ酸突然変異が、他のものの結合を低減又は消失させるならば、２つの抗体はオーバーラップするエピトープを有する。
【００８５】
次いで、追加のルーチンの実験（例えばペプチド突然変異及び結合分析）を実行して、試験抗体の結合の観察された欠如が、実際は参照抗体と同じエピトープへの結合に起因するのか、又は立体的なブロッキング（又は別の現象）が、観察された結合の欠如の原因であるかどうかを確認することができる。この種の実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、表面プラズモン共鳴、フローサイトメトリー、又は当技術分野において利用可能な他の定量的もしくは定性的な抗体結合アッセイを使用して遂行され得る。
【００８６】
抗体は、例えばスタンダードなＥＬＩＳＡ又はウエスタンブロットによって、グレムリン−１への結合について試験され得る。ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、標的タンパク質との陽性反応性を示すハイブリドーマについてスクリーニングすることもできる。抗体の結合選択性も、標的タンパク質を発現する細胞への抗体の結合を、例えばフローサイトメトリーによってモニターすることによって決定され得る。したがって、スクリーニング方法は、ＥＬＩＳＡ又はウエスタンブロットの実行によって、又はフローサイトメトリーによって、グレムリン−１を結合可能な抗体を同定するステップを含み得る。
【００８７】
抗体は、グレムリン−１を選択的に（又は特異的に）認識し得る。タンパク質へ選択的又は高親和性で結合し、その結合について選択的であるが、他のタンパク質へ実質的に結合しないか又は低親和性で結合する場合に、抗体（又は他の化合物）は、タンパク質を「選択的に結合する」か、又は「選択的に認識する」。抗体の選択性は、抗体が上で論じられるような他の関連するタンパク質へ結合するか、又は抗体が他の関連するタンパク質を弁別するかどうかを決定することによってさらに研究され得る。本発明の抗体は典型的にはヒトグレムリン−１を認識する。
【００８８】
抗体は、関連するタンパク質、又はヒトグレムリン−１及び他の種からのグレムリン−１についての交差反応性も有し得る。
【００８９】
特異的（又は選択的）、によって、抗体が他の分子への有意な交差反応性無しに対象となるタンパク質へ結合することが理解されるだろう。交差反応性は、任意の好適な本明細書において記載される方法によって査定され得る。抗体が、対象となるタンパク質へ結合するのと、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は１００％同じくらい強く他の分子へ結合するならば、抗体の交差反応性は、有意であると判断され得る。特異的（又は選択的）抗体は、対象となるタンパク質へ結合する強度の約９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％又は３０％、２５％又は２０％未満で、別の分子へ結合し得る。抗体は、対象となるタンパク質へ結合する強度の約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約２未満、約１％未満で、他の分子へ結合し得る。
【００９０】
抗グレムリンの抗体は以前に記載されており、例えば、ＷＯ２０１４／１５９０１０Ａ１（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）は、２５℃で６２５ｐＭ〜２７０ｎＭの範囲の結合親和性ＫＤ値を備えた、グレムリン−１活性を阻害する抗グレムリンの抗体を記載する。Ｃｉｕｃｌａｎ  ｅｔ  ａｌ（２０１３）は、結合親和性ＫＤ５．６×１０−１０Ｍを備えた抗グレムリン−１モノクローナル抗体を記載する。
【００９１】
本発明の抗グレムリン−１抗体は、グレムリン−１活性のアロステリック阻害物質であり、新規のエピトープ（ＢＭＰ結合部位から遠位）へ結合する。この抗体は、＜１００ｐＭのＫｄ値という並外れて高い親和性でグレムリン−１へ結合する。本発明の抗体は、したがって現在利用可能な抗体を上回る有意な改善を提示し、グレムリン−１媒介性の疾患の治療のために特に有用であると予想される。
【００９２】
したがって、本発明による使用に好適な抗体は、（ヒト）グレムリン−１について高い親和結合を有し得る。抗体は、＜１ｎＭ未満、好ましくは＜５００ｐＭの解離定数（ＫＤ）を有し得る。一実施例において、抗体は２００ｐＭ未満の解離定数（ＫＤ）を有する。一実施例において、抗体は１００ｐＭ未満の解離定数（ＫＤ）を有する。多様な方法（当業者に周知であるような、表面プラズモン共鳴アッセイ、飽和アッセイ、又は免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ又はＲＩＡ）等）を使用して、その標的抗原についての抗体の結合親和性を決定することができる。結合親和性を決定する例示的な方法は、Ｋｒｉｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｆｅｂｒｕａｒｙ；４４（５）：９１６−２５．（Ｅｐｕｂ  ２００６  Ｍａｙ  １１）によって記載されるような、ＣＭ５センサーチップを使用するＢＩＡｃｏｒｅ（商標）２０００  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、ドイツ）上の表面プラズモン共鳴分析によるものである。
【００９３】
本発明の抗体は、典型的には阻害抗体である。グレムリン−１はＢＭＰ−２、４及び７を負にレギュレートし、そのため、グレムリン−１の阻害はＢＭＰを介するシグナリングの増加をもたらす。
【００９４】
上記のように、本出願の実施例は、抗体がグレムリン１を阻害できるかどうかをスクリーニングするための２つの機能アッセイ（すなわちＳＭＡＤリン酸化アッセイ及びＨｅｋ  Ｉｄ１レポーター遺伝子アッセイ）を記載する。典型的には、阻害抗体は、ＳＭＡＤリン酸化を回復させる、及び／又はＨｅｋ  Ｉｄ１レポーター遺伝子アッセイにおいてＢＭＰのシグナリングを回復させる。ＢＭＰ対照と比較した場合に、ＳＭＡＤリン酸化は、少なくとも８０％、９０％又は１００％へ回復し得る。Ｈｅｋ  Ｉｄ１レポーター遺伝子アッセイにおいて、阻害抗体は、１０ｎＭ未満、好ましくは５ｎＭ未満のＩＣ５０を有し得る。
【００９５】
一旦好適な抗体が同定及び選択されたならば、抗体のアミノ酸配列は当技術分野において公知の方法によって同定され得る。抗体をコードする遺伝子は、縮重プライマーを使用してクローン化され得る。抗体は、ルーチンの方法によって組み換えで産生され得る。
【００９６】
本発明は、本発明の抗体分子の重鎖及び／又は軽鎖の可変領域（複数可）（又は全長Ｈ鎖及びＬ鎖）をコードする単離されたＤＮＡ配列も提供する。
【００９７】
バリアントポリヌクレオチドは、配列リスト中で与えられた配列からの１、２、３、４、５、１０まで、２０まで、３０まで、４０まで、５０まで、７５まで、又は以上の核酸の置換及び／又は欠失を含み得る。一般的に、バリアントは、１〜２０、１〜５０、１〜７５、又は１〜１００の置換及び／又は欠失を有する。
【００９８】
好適なバリアントは、本明細書において開示される核酸配列のうちの任意の１つのポリヌクレオチドに対して少なくとも約７０％相同であり、典型的にはそれへ少なくとも約８０又は９０％及びより好適には少なくとも約９５％、９７％又は９９％相同である。バリアントは、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を保持し得る。バリアントは典型的には、約６０％〜約９９％の同一性、約８０％〜約９９％の同一性、約９０％〜約９９％の同一性、又は約９５％〜約９９％の同一性を保持する。これらのレベルでの相同性及び同一性は、一般的には、少なくともポリヌクレオチドのコーディング領域に関して存在する。相同性を測定する方法は当技術分野において周知であり、本文脈において相同性が核酸同一性に基づいて計算されることは当業者によって理解されるだろう。かかる相同性は、少なくとも約１５、少なくとも約３０、例えば少なくとも約４０、６０、１００、２００又はそれ以上のコンティグヌクレオチドの領域にわたって存在し得る（長さに依存して）。かかる相同性は、非修飾ポリヌクレオチド配列の全体の長さにわたって存在し得る。
【００９９】
ポリヌクレオチドの相同性又は同一性を測定する方法は、当技術分野において公知である。例えば、ＵＷＧＣＧパッケージは、相同性の計算に使用され得るＢＥＳＴＦＩＴプログラム（例えばデフォルト設定で使用される）を提供する（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２，ｐ３８７−３９５）。
【０１００】
ＰＩＬＥＵＰアルゴリズム及びＢＬＡＳＴのアルゴリズムも使用して、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ．Ｆ．（１９９３）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｖｏｌ  ３６：２９０−３００；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ，Ｆ  ｅｔ  ａｌ（１９９０）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５：４０３−１０中で記載されるように、相同性を計算するか、又は配列を並べることができる（典型的にはそれらのデフォルト設定で）。
【０１０１】
ＢＬＡＳＴ分析の遂行のためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を介して公的に利用可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の長さＷのワードとアライメントさせた場合に、クエリ配列中の同じ長さのショートワード（一致するか又はいくつかの正の値の閾値スコアＴを満たすかのいずれかである）の同定によって、高スコア配列ペア（ＨＳＰ）を最初に同定することを包含する。Ｔは、隣接ワードスコア閾値と称される（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ、前出）。これらの最初の隣接ワードヒットは検索の開始のためのシードとして作用して、それらを含有しているＨＳＰが見出される。ワードヒットは、累積アライメントスコアが増加し得る限り、各々の配列に沿って両方向で伸長される。各々の方向におけるワードヒットについての伸長は、累積アライメントスコアが１つもしくは複数の負スコアの残基アライメントの蓄積に起因して０以下になる場合；又は、いずれかの配列の末端に到達する場合に中断される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ及びＸは、アライメントの感度及びスピードを決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）＝１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５−１０９１９を参照）アライメント（Ｂ）＝５０、期待値（Ｅ）＝１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、及び両鎖の比較を使用する。
【０１０２】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列の間の類似性の統計解析を遂行する。例えばＫａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７を参照されたい。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの測定値は、最小和確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド又はアミノ酸の配列の間の一致が偶然によって起こる確率の指標を提供する。例えば、第２の配列への第１の配列の比較において、最小和確率が約１未満、典型的には約０．１未満、好適には約０．０１未満、及び最も好適には約０．００１未満ならば、配列は別の配列へ類似すると判断される。例えば、最小和確率は、約１〜約０．００１、多くの場合０．０１〜約０．００１の範囲であり得る。
【０１０３】
ホモログは、約３未満、５、１０、１５、２０又はそれ以上の突然変異（その各々は置換、欠失又は挿入であり得る）によって、関連するポリヌクレオチドの配列から異なり得る。例えば、ホモログは、３〜５０の突然変異、多くの場合３〜２０の突然変異によって異なり得る。これらの突然変異は、ホモログの少なくとも３０、例えば少なくとも約４０、６０又は１００又はそれ以上のコンティグヌクレオチドの領域にわたって測定され得る。
【０１０４】
一実施形態において、バリアント配列は、遺伝コードの冗長性により、配列リスト中で与えられる特異的な配列から変動し得る。ＤＮＡコードは４つの一次核酸残基（Ａ、Ｔ、Ｃ及びＧ）を有し、これらを使用して、生物体の遺伝子中でコードされるタンパク質のアミノ酸を提示する３文字コドンを「スペリングする」。ＤＮＡ分子に沿ったコドンの直線状の配列は、それらの遺伝子によってコードされるタンパク質（複数可）のアミノ酸の直線状の配列へと翻訳される。コードは高度に縮重しており、２０の天然アミノ酸及び「終止」シグナルを提示する３つのコドンについて６１のコドンコーディングがある。したがって、大部分のアミノ酸は２つ以上のコドンによってコードされ、実際いくつかのものは４つ以上の異なるコドンによってコードされる。したがって、本発明のバリアントポリヌクレオチドは、本発明の別のポリヌクレオチドと同じポリペプチド配列をコードし得るが、同じアミノ酸をコードする異なるコドンの使用に起因する異なる核酸配列を有し得る。
【０１０５】
本発明のＤＮＡ配列は、例えば化学的プロセシングによって産生される、合成ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又はその任意の組み合わせを含み得る。
【０１０６】
本発明の抗体分子をコードするＤＮＡ配列は、当業者に周知の方法によって得られ得る。例えば、抗体の重鎖及び軽鎖の一部又はすべてについてのＤＮＡ配列コーディングは、決定されたＤＮＡ配列から又は対応するアミノ酸配列に基づいて、所望に応じて合成され得る。
【０１０７】
ベクターを構築できる一般的方法、トランスフェクション方法、及び培養方法は、当業者に周知である。この点において、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、１９９９年、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（編）、Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、及びＣｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇによって製作されたＭａｎｉａｔｉｓ  Ｍａｎｕａｌが参照される。
【０１０８】
さらに、本発明の抗体をコードする１つ又は複数のＤＮＡ配列を含む１つ又は複数クローニングベクター又は発現ベクターを含む宿主細胞が提供される。任意の好適な宿主細胞／ベクター系が、本発明の抗体分子をコードするＤＮＡ配列の発現のために使用され得る。細菌（例えばＥ．ｃｏｌｉ）及び他の微生物性システムが使用され得るか、又は真核生物（例えば哺乳動物）宿主細胞発現系も使用され得る。好適な哺乳類宿主細胞としては、ＣＨＯ細胞、骨髄腫細胞又はハイブリドーマ細胞が挙げられる。
【０１０９】
本発明は、本発明の抗体分子をコードするＤＮＡからのタンパク質の発現を導くのに好適な条件下で本発明のベクターを含有する宿主細胞を培養すること、及び抗体分子を単離することを含む、本発明に記載の抗体分子の産生のためのプロセスも提供する。
【０１１０】
本発明のＡｂ７３２６抗体は、グレムリン−１の以下の残基：Ｉｌｅ１１０（１３１）、Ｌｙｓ１２６（１４７）、Ｌｙｓ１２７（１４８）、Ｐｈｅ１２８（１４９）、Ｔｈｒ１２９（１５０）、Ｔｈｒ１３０（１５１）、Ａｒｇ１４８（１６９）、Ｌｙｓ１５３（１７４）、Ｇｌｎ１５４（１７５）を結合すると同定され、そこで、Ｌｙｓ１２６（１４７）、Ｌｙｓ１２７（１４８）、Ｐｈｅ１２８（１４９）、Ｔｈｒ１２９（１５０）、Ｔｈｒ１３０（１５１）、Ａｒｇ１４８（１６９）、Ｌｙｓ１５３（１７４）及びＧｌｎ１５４（１７５）は１つのグレムリン−１モノマー上に存在し、Ｉｌｅ１１０（１３１）は第２のグレムリン−１モノマー上に存在する。カッコ中にないナンバリングは構造ファイルに基く（それは構造アライメントに基づいたマウスグレムリン−２のナンバリングと一致する）。カッコ中の数は、配列番号：１のＵｎｉＰｒｏｔエントリーＯ６０５６５に基づいた残基を提示する。実施例のセクションにおいて論じられるように、これらのエピトープ残基は、グレムリン−１−Ａｂ７３２６のＦａｂ複合体から４ÅでのＮＣＯＮＴ分析を使用して同定された。
【０１１１】
したがって、本発明の抗体は、Ｉｌｅ１３１、Ｌｙｓ１４７、Ｌｙｓ１４８、Ｐｈｅ１４９、Ｔｈｒ１５０、Ｔｈｒ１５１、Ａｒｇ１６９、Ｌｙｓ１７４及びＧｌｎ１７５（配列番号：１に基づく残基ナンバリングで）から選択される少なくとも１つの残基を含むエピトープへ結合し得る。本発明の抗体は、２、３、４、５、６、７、８又はすべての９のこれらの残基（好ましくは少なくとも５残基）を含むエピトープを結合し得る。
【０１１２】
本発明の抗体は、Ｉｌｅ１３１が他の残基とは異なるグレムリン−１モノマー上に存在する場合のエピトープも認識し得る。
【０１１３】
これらの残基はヒトグレムリン−１の特定の配列について提供されるが、当業者は、ルーチンの技法を使用して、他の対応するグレムリン配列（例えばマウス）に対するこれらの残基の位置を容易に推測できるだろう。したがって、これらの他のグレムリン配列内の対応する残基を含むエピトープへ結合する抗体も、本発明によって提供される。
【０１１４】
特定のエピトープへ結合する抗体についてスクリーニングするために、ルーチンのクロスブロッキングアッセイ（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ．、ＮＹ）中で記載されるもの等）が、遂行され得る。他の方法としては、アラニンスキャニング突然変異、ペプチドブロット（Ｒｅｉｎｅｋｅ（２００４）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２４８：４４３−６３）、又はペプチド切断分析が挙げられる。加えて、抗原のエピトープ切り出し、エピトープ抽出及び化学的修飾等の方法が用いられ得る（Ｔｏｍｅｒ（２０００）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ９：４８７−４９６）。かかる方法は当技術分野において周知である。
【０１１５】
抗体エピトープはＸ線結晶学分析によっても決定され得る。したがって、本発明の抗体は、グレムリン−１へ結合された抗体のＸ線結晶学分析を介して査定され得る。エピトープは、特に、抗体パラトープ残基の４Å内のグレムリン−１上の残基の決定によるような手法で同定され得る。
【０１１６】
医薬組成物、投薬量、及び投薬量レジメン  
本発明の抗体、又はスクリーニング方法によって同定されるグレムリン−１を調節する薬剤は、医薬組成物において提供され得る。医薬組成物は通常は滅菌され、典型的には薬学的に許容される担体及び／又はアジュバントを含むだろう。本発明の医薬組成物は、薬学的に許容されるアジュバント及び／又は担体を追加で含み得る。
【０１１７】
本明細書において使用される時、「薬学的に許容される担体」としては、任意の及びすべての溶媒、分散物培地、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、並びに生理学的に適合性がある同種のものが挙げられる。担体は、非経口投与経路（例えば静脈内投与経路、筋肉内投与経路、皮内投与経路、眼内投与経路、腹腔内投与経路、皮下投与経路、脊髄投与経路、又は例えば注射もしくは点滴による他の非経口投与経路）に好適であり得る。あるいは、担体は、非経口投与でないもの（局所投与経路、表皮投与経路又は粘膜投与経路等）に好適であり得る。担体は経口投与に好適であり得る。投与経路に依存して、調節物質を材料中でコーティングして、化合物を不活性化し得る酸及び他の天然の条件の作用から化合物を保護することができる。
【０１１８】
本発明の医薬組成物は、１つ又は複数の薬学的に許容される塩を含み得る。「薬学的に許容される塩」は、親化合物の所望される生物学的活性を保持し、所望されない毒性学的作用を与えない塩を指す。かかる塩の例としては、酸付加塩及び塩基付加塩が挙げられる。
【０１１９】
薬学的に許容される担体は水性担体又は希釈物質を含む。本発明の医薬組成物中で用いられ得る好適な水性担体の例としては、水、緩衝された水及び食塩水が挙げられる。他の担体の例としては、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール及び同種のもの等）及び好適なその混合物、植物油（オリーブ油等）、並びに注射可能有機エステル（オレイン酸エチル等）が挙げられる。多くの事例において、組成物中に等張剤（例えば糖、多価アルコール（マンニトール、ソルビトール等）、又は塩化ナトリウム）を含むことが所望されるだろう。
【０１２０】
治療用組成物は典型的には滅菌され、製造及び保管の条件下で安定してなくてはならない。組成物は、溶液、マイクロエマルション、リポソーム、又は高い薬物濃度に適切な他の秩序のある構造として製剤化され得る。
【０１２１】
本発明の医薬組成物は、追加の活性成分を含み得る。
【０１２２】
さらに、本発明の抗体又は調節薬剤及び使用説明書を含むキットは、本発明の範囲内である。キットは、１つ又は複数の追加の試薬（上で論じられるような追加の治療剤又は予防剤等）をさらに含有し得る。
【０１２３】
本発明の調節物質及び／もしくは抗体又はその製剤もしくは組成物は、予防処理及び／又は治療処理のために投与され得る。
【０１２４】
治療上の適用において、化合物は、病態又はその症状のうちの１つもしくは複数を治癒、緩和、又は部分的に停止するのに十分な量で、障害又は病態を既に患う被験体へ上記のように投与される。かかる治療処理は、疾患症状の重症度の減少、又は症状無しの期間の頻度もしくは継続時間の増加をもたらし得る。これを達成するのに適切な量は「治療有効量」として定義される。
【０１２５】
予防上の適用において、製剤は、病態の後続効果又はその症状のうちの１つもしくは複数を予防又は低減するのに十分な量で、障害又は病態のリスクのある被験体へ上記のように投与される。これを達成するのに適切な量は「予防有効量」として定義される。各々の目的について有効量は、被験体の体重及び一般的な状態に加えて疾患又は傷の重症度にも依存するだろう。
【０１２６】
投与のための被験体は、ヒト又は非ヒト動物であり得る。「非ヒト動物」という用語は、すべての脊椎動物、例えば哺乳動物及び非哺乳動物（非ヒト霊長動物、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生動物、爬虫類動物など等）を包含する。ヒトへの投与が典型的である。
【０１２７】
抗体／調節物質又は本発明の医薬組成物は、当技術分野において公知の多様な方法のうちの１つ又は複数を使用して、１つ又は複数の投与経路経由で投与され得る。当業者によって認識されるように、投与経路及び／又は投与モードは所望される結果に依存して変動するだろう。本発明の化合物又は医薬組成物のための投与経路の例としては、静脈内投与経路、筋肉内投与経路、皮内投与経路、眼内投与経路、腹腔内投与経路、皮下投与経路、脊髄投与経路、又は例えば注射もしくは点滴による非経口の他の投与経路が挙げられる。「非経口投与」という語句は、本明細書において使用される時、通常注射による、腸内投与及び局所投与以外の投与モードを意味する。あるいは、本発明の抗体／調節薬剤又は医薬組成物は、非経口経路でないもの（局所投与経路、表皮投与経路又は粘膜投与経路）経由で投与され得る。本発明の抗体／調節薬剤又は医薬組成物は、経口投与のためのものであり得る。
【０１２８】
本発明の抗体／調節薬剤又は医薬組成物の好適な投薬量は、熟練医師によって決定され得る。本発明の医薬組成物中の実際の投薬量レベルの活性成分は、患者への毒性無しに、特定の患者、組成物及び投与モードについて所望の治療応答を達成するのに有効な活性成分の量を得るように、変動され得る。選択される投薬レベルは、様々な薬物動態学的因子に依存し、本発明で用いられる特定の組成物の活性、投与経路、投与の時間、用いられる特定の化合物の排泄率、治療の継続期間、用いられる特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物及び／又は材料、治療される患者の年齢、性別、体重、病態、全体的な健康及び従来の病歴、並びに医学分野において周知の同種の因子が挙げられる。
【０１２９】
好適な用量は、例えば約０．０１μｇ／ｋｇ〜約１０００ｍｇ／治療される患者のｋｇ体重、典型的には約０．１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲中であり得る。例えば、好適な投薬量は、１日あたり約１μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、又は１日あたり約１０μｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。
【０１３０】
投薬量レジメンは、至適の所望の応答（例えば治療応答）を提供するように調整され得る。例えば、単回用量が投与され得るか、複数の分割用量が経時的に投与され得るか、又は、用量は治療状況の要件によって指摘されるように比例して低減もしくは増加され得る。投薬量単位形態は、本明細書において使用される時、治療される被験体のための一体型投薬量として適した物理的に分離した単位を指し；各々の単位は、要求される医薬担体と共同して、所望される治療上の効果を産生することが意図される既定の量の活性化合物を含有する。
【０１３１】
投与は単一用量又は複数用量であり得る。複数の用量は、同じ経路又は異なる経路を経由して、及び同じ所在位置又は異なる所在位置へ投与され得る。あるいは、用量は持続放出製剤を経由し、その場合には、よりそれほど頻繁でない投与が要求される。投薬量及び頻度は、患者中のアンタゴニストの半減期及び所望される治療の継続期間に依存して変動し得る。
【０１３２】
上記のように、本発明の調節物質／抗体又は医薬組成物は、１つ又は複数の他の治療剤と共に共投与され得る。
【０１３３】
２つ以上の薬剤の組み合わせ投与は、多くの異なる手法において達成され得る。両者は、単一組成物中で一緒に投与され得るか、又は、それらは組み合わせ療法の一部として分離した組成物中で投与され得る。例えば、１つのものは、他のものの前、後又は同時に投与され得る。
【０１３４】
治療指標
本発明の抗体、又は本発明のスクリーニング方法によって同定される調節薬剤は、グレムリン−１活性と関連する任意の病態の治療、予防又は寛解において使用され得る。例えば、グレムリン−１を介するシグナリングから全体又は部分的にもたらされる任意の病態である。換言すれば、本発明は、グレムリンによって媒介されるか又は影響を受ける病態の治療、予防又は寛解に関する。かかる病態としては、腎線維症（例えば糖尿病性腎症及び慢性移植腎症）及び特発性肺線維症を包含する線維症、肺動脈性肺高血圧症、血管新生並びにがん（例えば結腸直腸がん）が挙げられる。
【０１３５】
以下の実施例は本発明を例証する。
【０１３６】
例１  −  タンパク質発現、精製、再折たたみ及び構造決定。
タンパク質発現及び封入体調製
Ｅ．ｃｏｌｉ中での発現について至適化された短縮ヒトグレムリン−１コーディング配列（配列番号：２０）を、ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩを使用して修飾ｐＥＴ３２ａベクター（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の中へクローン化し、Ｎ末端６Ｈｉｓ−ＴＥＶタグ（ｐＥＴ−ｈグレムリン１）を備えたグレムリン配列をコードするベクターを生成した。
【０１３７】
【化１】
2020511946.tif 000004
配列番号：２（イタリック体で示された６Ｈｉｓ−ＴＥＶタグの非グレムリン残基が存在する）。配列ナンバリングはＵｎｉＰｒｏｔ  Ｏ６０５６５及び配列番号：１に基づいていた。
【０１３８】
ｐＥＴ−ｈグレムリン１プラスミドＤＮＡを使用して、ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を形質転換した。単一のアンピシリン耐性コロニーをＬＢ／アンピシリン寒天プレートから取り、１００ｍｌＬＢ／アンピシリンの開始培養物を使用して接種した。３７℃で１６時間振盪した（２００ｒｐｍ）後に、２５ｍｌの開始培養物を使用して５００ｍＬの２×ＴＹ／アンピシリン培地に接種した。３のＯＤ６００が達成されるまで、培養を３７℃で振盪した（２５０ｒｐｍ）。後続して、培養に、２０ｍＬのＭＯＰＳ＋グリセロールフィード混合物（１ＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．４）、４０％のグリセロール、０．５％のＭｇＳＯ４、０．４２％のＭｇＣｌ２）を補足し、３００μＭのＩＰＴＧにより誘導し、１７℃で１６時間１８０ｒｐｍでさらにインキュベーションした。細胞を、遠心分離機（４℃で２０分間４，０００ｇ）で収穫した。
【０１３９】
細胞ペレットを、溶解バッファー（ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、０．３５ｍｇ／ｍｌのリゾチーム、１０μｇ／ｍｌのＤＮａｓｅ及び３ｍＭのＭｇＣｌ２）中で４℃で再懸濁し、不溶性画分を４℃で３０分間の３，５００ｇの遠心分離によって収穫した。ペレット化した封入体を、洗浄バッファー（５０ｍＭのトリス、５００ｍＭのＮａＣｌ、０．５％のトリトンＸ−１００（ｐＨ８．０））中で再懸濁することによって３回洗浄し、続いて１５分間２１，０００ｇで遠心分離した。追加の２回の洗浄をトリトンＸ−１００無しの洗浄バッファーを使用して遂行した。
【０１４０】
可溶化
封入体を、変性バッファー（８Ｍの尿素、１００ｍＭのトリス、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＮａ２Ｓ４Ｏ６及び１００ｍＭのＮａ２ＳＯ３（ｐＨ８．５））中で再懸濁し、室温で１６時間撹拌し、１５分間２１，０００ｇの遠心分離によって清澄化した。
【０１４１】
再折たたみ前の精製
可溶化した封入体を、８Ｍの尿素、５０ｍＭのＭＥＳ、２００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ６．０）中で平衡化したセファクリルＳ−２００  ２６／６０カラム（１２０ｍＬ）の上へロードした。グレムリン−１タンパク質を含有する画分を６Ｍの尿素、２０ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ６．０）により希釈し、ＨｉＴｒａｐ  ＳＰ  ＨＰ陽イオン交換カラムの上へロードし、１ＭのＮａＣｌ勾配により１０カラム体積（１０ＣＶ）にわたって溶出させた。精製し変性させたｈグレムリン−１タンパク質を含有する画分をプールした。
【０１４２】
再折たたみ
変性した精製グレムリン−１タンパク質を、再折りたたみバッファー（５０ｍＭのトリス（ｐＨ８．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＧＳＨ及び５ｍＭのＧＳＳＧ、０．５ｍＭのシステイン、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．５Ｍのアルギニン）へ、０．１ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで滴加し、定常的な撹拌により４℃で５日間インキュベーションした。５日後に、グレムリン−１タンパク質を２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．５）に対して透析した。
【０１４３】
透析に続いて、タンパク質をヘパリンＨｉＴｒａｐカラムへ適用し、２０ＣＶにわたって０〜１００％のヘパリン溶出バッファー（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．５））の勾配を使用して溶出した。正確に折りたたまれたタンパク質は１ＭのＮａＣｌで溶出されるが、任意の誤って折りたたまれたタンパク質はより低い塩濃度で溶出された。
【０１４４】
１ＭのＮａＣｌで溶出されたタンパク質を濃縮し、２０ｍＭのヘペス（ｐＨ７．５）、１ＭのＮａＣｌにより平衡化したＳ７５  ２６／６０カラム上でさらに精製した。
【０１４５】
タンパク質を、予想される分子量を有することを実証するＳＤＳ  ＰＡＧＥ（ゲル中のシフト）、及び液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）を使用してジスルフィド結合の正確なアレンジ、及び細胞アッセイ（ＩＤ１レポーターアッセイ）における活性によって、特徴づけた。
【０１４６】
グレムリン１構造決定
グレムリン１タンパク質結晶を、６．６ｍｇ／ｍｌのグレムリン１の溶液、及びｐＨ４の０．１Ｍのクエン酸、１Ｍの塩化リチウム及び２７％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）６０００を、１：１比で混合することによって、ハンギングドロップ法を使用して成長させた。データ収集の前に、結晶を、結晶化バッファーへの２０％のグリセロールの添加によって凍結保護した。回析データをＤｉａｍｏｎｄ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｏｕｒｃｅで収集し、ＸＤＳを使用してプロセシングした（Ｋａｂｓｃｈ，Ｗｏｌｆｇａｎｇ（２０１０）Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｄ  ６６，１２５−１３２）。回析データ統計を以下の表中で要約する。
表２：回析データ統計
【表２】
2020511946.tif 000005
【０１４７】
グレムリン−１構造を、Ｐｈａｓｅｒ（ＭｃＣｏｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｃｒｙｓｔ（２００７），４０，６５８−６７４）を使用する分子置換、及び独自のグレムリン−１／Ｆａｂ複合体座標から利用可能なグレムリン−１モデルによって説明した。もたらされたグレムリン−１のモデルは、２つのダイマーとして組織化された、４コピーのグレムリン１モノマーを含有していた。モデル補正を、Ｃｏｏｔ（Ｅｍｓｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｄ：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ  ６６（４），４８６−５０１）により行い、座標を、Ｒｅｆｍａｃ（Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖ  ｅｔ  ａｌ  ＲＥＦＭＡＣ５  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ．Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｄ：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ．２０１１；６７（Ｐｔ  ４）：３５５−３６７）を使用して精密化した。最終的な座標をＭｏｌｐｒｏｂｉｔｙ（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）ＭｏｌＰｒｏｂｉｔｙ：ａｌｌ−ａｔｏｍ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ．Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ  Ｄ６６：１２−２１）により認証した。モデル精密化統計値の要約を上で表２中で示す。
【０１４８】
例２  −  グレムリン−１上のＢＭＰ結合残基
上で論じられるように、グレムリン−１は、ＤＡＮファミリーとして公知のサブグループ内の骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）アンタゴニストタンパク質ファミリーに属する。ＤＡＮファミリー内で、グレムリン−１はグレムリン−２（ＰＲＤＣ）と最も高い相同性を共有する。
【０１４９】
例１において記載される２．７Åのヒトグレムリン−１構造は、公表されているマウスグレムリン−２構造と共通の多くの特色を共有する（Ｎｏｌａｎ  ｅｔ  ａｌ（２０１３），Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，２１，１４１７−１４２９）。全体的な折りたたみは非常に類似し、２コピーのグレムリン−１はアーチでアレンジされた逆平行の非共有結合のダイマーを形成する。各々のモノマーは、フィンガーの反対側のリスト端部に向かってシスチンノットモチーフを備えた、特徴的なフィンガー−リスト−フィンガーアレンジを採用する（図２）。タンパク質間の配列同一性は、２つの構造における目視可能な配列内で５２％から６７％である。最も高度に保存された領域は、すべての鍵となる接触残基が１００％保存される広範囲なダイマーインターフェース中に存在する（図３）。
【０１５０】
マウスグレムリン−２（ＰＲＤＣ）及びＤＡＮ（ＮＢＬ１）へのＢＭＰ  ２、４及び７の結合に関与する残基は、突然変異誘発を使用して同定されている（Ｎｏｌａｎ  ｅｔ  ａｌ（２０１３），Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，２１，１４１７−１４２９及びＮｏｌａｎ  ｅｔ  ａｌ（２０１４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２９０，４７５９−４７７１）。予測されたＢＭＰ結合エピトープは、ダイマーの凸面上で両方のモノマー一帯に広がる疎水性パッチにわたる（図４及び５）。６つの残基を突然変異誘発によって同定し（Ｔｒｐ７２、Ｐｈｅ９６、Ｔｙｒ９８、Ｐｈｅ１０４、Ｔｙｒ１０５及びＰｈｅ１１７）、それらはヒトグレムリン−１中で１００％保存されている（ナンバリングはマウスグレムリン−２配列に基づく）。相同性の程度は、両方のタンパク質において同一の立体配座を採用する側鎖のポジショニングへ拡張される（図５）。
【０１５１】
グレムリンＰＤＢファイル中で使用されるアミノ酸ナンバリングは、構造アライメントに基づく公表されているマウスグレムリン−２構造中のナンバリングと一致する。これは、構造を記載する場合に、アミノ酸の同じ条件のもとでの比較を可能にする。しかしながら、明確にするために、ＢＭＰ結合における役割を果たすとして同定された鍵となる残基を、ＰＤＢファイル及びカッコ中の配列番号：１のＵｎｉＰｒｏｔファイルに基づいたナンバリングにより、以下に示す。Ｔｒｐ７２（９３）、Ｐｈｅ９６（１１７）、Ｔｙｒ９８（１１９）、Ｐｈｅ１０４（１２５）、Ｔｙｒ１０５（１２６）及びＰｈｅ１１７（１３８）。
【０１５２】
マウスグレムリン−２及びヒトグレムリン−１の両方中で、疎水性のＢＭＰ結合エピトープは、各々のタンパク質のＮ末端によって形成されるαヘリックスによって部分的に埋没される。ＢＭＰ結合のモデルが提案され、それによれば、Ｎ末端は撓曲し、完全なＢＭＰ結合インターフェースが曝露される（Ｎｏｌａｎ  ｅｔ  ａｌ（２０１３），Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，２１，１４１７−１４２９）。図４中で、各々のタンパク質上のＢＭＰ結合表面の類似性を表面について明らかにする前に、ヒトグレムリン−１及びマウスグレムリン−２構造からＮ末端を除去した。
【０１５３】
文献は、ＢＭＰ結合に対する効果を有する６つの残基の突然変異誘発のみを記載する。実際のＢＭＰエピトープはより大きな表面領域をカバーし、近隣のアミノ酸にわたる可能性がある。グレムリン−１の表面上のすべての残基（変異したものの６Å内）をハイライト表示することによって、治療物質によって標的化される可能性のあるグレムリン−１のより大きな領域が明らかにされる（図１１）。このより広範囲な領域は、ヒトグレムリン−１の以下のアミノ酸：
Ａｓｐ９２〜Ｌｅｕ９９
Ａｒｇ１１６〜Ｈｉｓ１３０
Ｓｅｒ１３７〜Ｓｅｒ１４２
Ｃｙｓ１７６〜Ｃｙｓ１７８
（配列番号：１に基づくナンバリング）
にわたる。
【０１５４】
ヒトグレムリン−１の結晶構造情報と公表されている情報を組み合わせることによって、ＢＭＰとのその相互作用をブロックする治療介入のための可能な経路として提供される、ヒトグレムリン−１の領域が同定された。
【０１５５】
例３  −  Ｈｅｋ  Ｉｄ１レポーター遺伝子アッセイ
背景
Ｈｅｋ  Ｉｄ１レポーター遺伝子アッセイは、クローン１２  Ｈｅｋ２９３−Ｉｄ１レポーター細胞を使用する。この細胞株を、Ｉｄ１転写因子により安定的にトランスフェクションした。Ｉｄ１はＢＭＰシグナリング経路における転写因子である。グレムリンはＢＭＰを結合し、ＢＭＰの受容体への結合を阻止し、レポーター遺伝子からのルシフェラーゼシグナルを低減することが公知である。したがって、このレポーターアッセイを使用して、抗グレムリン抗体をスクリーニングし、ＢＭＰとグレムリンの相互作用をブロックする任意のものがあるかどうかを調べることは可能である。この相互作用のブロッキングがあるならば、ルシフェラーゼシグナルの回復はこれらの細胞において観察される。
【０１５６】
方法
クローン１２細胞を、１０％のＦＣＳ、１×Ｌ−グルタミン及び１×ＮＥＡＡを含有するＤＭＥＭ中で培養した。細胞をハイグロマイシンＢ（２００μｇ／ｍｌ）の存在下においても増殖させて、細胞がＩｄ１遺伝子発現を損失していないことを保証する。細胞を、０．５％のＦＣＳ、１×Ｌ−グルタミン及び１×ＮＥＡＡを含有するＤＭＥＭ中でアッセイした。ハイグロマイシンＢは、細胞がアッセイ中である短い時間については必要とされない。
【０１５７】
細胞をＰＢＳ中で洗浄し、細胞解離バッファーを使用して外し、遠心し、カウントし、その後７０μｌ中で５×１０４／ウェルで播種した（７．１４×１０５／ｍｌの密度）。使用されるプレートは、滅菌済みの白色不透明のポリ−Ｄ−リジンコーティング９６ウェルであった。細胞を約３〜４時間インキュベーター中に入れて、沈降させる。ＢＭＰヘテロダイマーを４ｍＭのＨＣＬ中で２００μｇ／ｍｌへ再構成した。ＢＭＰをガラスバイアルを使用してアッセイ培地中で１０μｇ／ｍｌへ希釈して、新しい作業ストックを生じた。
【０１５８】
ポリプロピレンプレート中で、グレムリン−１を、１μｇ／ｍｌの上部の最終的な用量で８ポイント用量応答曲線のために１：２で希釈した。
【０１５９】
１ウェルあたり２０μｌの培地の追加体積を添加し、プレートを３７℃で４５分間インキュベーションした。
【０１６０】
１００×で調製されたＢＭＰを、細胞のみを含有するウェル以外のすべてのウェルへ添加した。すべてのウェルにアッセイ培地を６０μｌまで追加し、３７℃でさらに４５分間インキュベーションした。
【０１６１】
インキュベーション後に、アッセイプレートの１ウェルあたり３０μｌのサンプルを移し、発光シグナルの測定の前に２０〜２４時間インキュベーションした。
【０１６２】
Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅａｄｙ  Ｇｌｏを先立って室温で融解した。アッセイプレートを、試薬の添加の前に約１０〜１５分間室温へ冷却した。ルシフェラーゼシグナルを、振盪機上でｃｅｌｌ  ｓｔｅａｄｙ  ｇｌｏ試薬（１００μｌ）を室温で２０分間追加すること、及びＳｙｎｅｒｇｙ  ２上でｃｅｌｌ  ｔｉｔｒｅ  ｇｌｏプロトコールを使用して発光を測定することによって、検出した。
【０１６３】
最大シグナルはＢＭＰを含有するウェルから生成され、最小シグナルは細胞のみを含有するウェルから生成された。
【０１６４】
結果
グレムリン−１の全長形態及び短縮形態をＨｅｋ−Ｉｄ１レポーター遺伝子アッセイにおいて試験して、ＢＭＰ４／７に対するブロッキング活性を確認する。全長タンパク質についての結果を図６Ａ中で示し、短縮タンパク質についての結果を図６Ｂ中で示す。
【０１６５】
用量応答アッセイからの阻害のパーセンテージを、アッセイにおける最大シグナル及び最小シグナル、並びに４つのパラメーターロジスティックフィット（ｌｏｇｉｓｔｉｃａｌ  ｆｉｔ）を使用してフィットさせたデータに基づいて計算した。ＩＣ５０を曲線の変曲点に基づいて計算した。
表３：Ｈｅｋ−Ｉｄ１レポーター遺伝子アッセイにおける全長グレムリン−１及び短縮グレムリン−１についての効力の結果。
【表３】
2020511946.tif 000006
【０１６６】
結論
グレムリン１は、Ｈｅｋ−Ｉｄ１レポーター遺伝子アッセイにおいてＢＭＰ  ４／７シグナリングを阻害することができた。
【０１６７】
例４  −  抗グレムリン−１抗体の産生
抗グレムリン−１抗体は、免疫及びライブラリーパニングに由来した。ライブラリーを、献血から増幅されたＶ領域によるナイーブヒトライブラリーとしてインハウスで生成した。
【０１６８】
免疫により、免疫の第１のラウンドからグレムリン−１を結合する２６の別個の抗体がもたらされた。これらの抗体を、スクリーニングアッセイにおける試験のためにスケールアップ及び精製した。
【０１６９】
ライブラリーからの２５のヒトとマウスに交差反応性の抗体を、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓからの組み換えヒトグレムリンを使用して選別した。１０の抗体をスケールアップのために選択し、スクリーニングアッセイにおける試験のためにｓｃＦｖとして精製した。
【０１７０】
例５  −  抗グレムリン−１抗体のスクリーニング
抗体を、例３において記載されるＨｅｋ−Ｉｄ１レポーター遺伝子アッセイを使用して、及びＳＭＡＤリン酸化の測定によって、スクリーニングした。ＳＭＡＤ１、５及び８は、ＢＭＰシグナリングに際してリン酸化される。したがって、グレムリン−１の阻害物質はＳＭＡＤリン酸化を増加させる。
【０１７１】
ＳＭＡＤリン酸化アッセイを、Ａ５４９細胞又はヒト肺線維芽細胞で遂行した。リン酸化レベルを、ＭＳＤを使用して決定した。
【０１７２】
結果
Ｈｅｋ−Ｉｄ１レポーター遺伝子アッセイにおいて、免疫由来抗体との明らかなヒットはなかった（１０倍過剰量の抗体をＢＭＰ４／７ヘテロダイマーに対して試験した）。結果を図７中で示す。
【０１７３】
これとは対照的に、多くのライブラリー由来抗体は、Ｈｅｋ−Ｉｄ１レポーター遺伝子アッセイにおいてシグナルを回復させることができた（５０％のグレムリン用量で５０倍過剰量の抗体）（図８）。これらのうちで、Ａｂ２４１６及びＡｂ２４１７は高レベルのエンドトキシンを含有していた。Ａｂ７３２６は、１０倍過剰量及び８０％阻害のグレムリン−１濃度でブロッキング能力を維持していた。
【０１７４】
追加の結果を、図９Ａ（ヒトグレムリン）及び９Ｂ（マウスグレムリン）中で提示する。これらの図は、１５ｎＭまでのＡｂ７３２６（ＰＢ３７６とラベルされた）のタイトレーションを示す。Ａｂ７３２６は、ヒトグレムリン（１．３ｎＭのＩＣ５０）又はマウスグレムリン（０．２ｎＭのＩＣ５０）のいずれかによってブロッキングされた場合のＢＭＰのシグナリングを回復させることが示された。抗体は、ヒト及びマウスのＩｇＧ１として機能する。
【０１７５】
マウス及びヒトの全長ＩｇＧ１の配列を以下で提示する。マウス及びヒトの全長ＩｇＧ１タンパク質を合成するために、ライブラリーに由来するＡｂ７３２６可変領域を、適切な抗体定常ドメインを含むベクターの中へ再クローン化した。
【０１７６】
Ａｂ７３２６がナイーブヒトライブラリー（この場合抗体はｓｃＦｖとしてクローン化される）から生ずるので、全長抗体又はＦａｂとして７３２６の可変領域を再クローン化するために、ＶＨ及びＶＫを、プライマーのプール／縮重プライマーを使用してＰＣＲ増幅することが必要であった。次いで増幅したＰＣＲ産物を消化し、マウスベクター及びヒトベクターの中へ同時にクローン化した。ＶＨ及びＶＫをプライマーのプール／縮重プライマーによって増幅したので、産物の２つのバリアント形態が得られ、それらは、ＰＣＲプロセスの間にアニールする微細に異なるプライマーに由来する単一のアミノ酸残基で異なる。
【０１７７】
以下に示すように、重鎖可変領域の２つのバリアント形態は位置６での単一のアミノ酸で異なり、軽鎖可変領域の２つのバリアント形態は位置７での単一のアミノ酸で異なっていた。
・重鎖可変領域バリアント１は、位置６でグルタミン酸（Ｅ）を有する。
・重鎖可変領域バリアント２は、位置６でグルタミン（Ｑ）を有する。
・軽鎖可変領域バリアント１は、位置７でセリン（Ｓ）を有する。
・軽鎖可変領域バリアント２は、位置７でスレオニン（Ｔ）を有する。
【０１７８】
マウス全長ＩｇＧ１  −  重鎖バリアント１（配列番号：１４）
【化２】
2020511946.tif 000007
【０１７９】
マウス全長ＩｇＧ１  −  軽鎖バリアント１（配列番号：１５）
【化３】
2020511946.tif 000008
【０１８０】
マウス全長ＩｇＧ１  −  重鎖バリアント２（配列番号：２８）
【化４】
2020511946.tif 000009
【０１８１】
マウス全長ＩｇＧ１  −  軽鎖バリアント２（配列番号：２９）
【化５】
2020511946.tif 000010
【０１８２】
ヒト全長ＩｇＧ１  −  重鎖バリアント１（配列番号：３０）
【化６】
2020511946.tif 000011
【０１８３】
ヒト全長ＩｇＧ１  −  軽鎖バリアント１（配列番号：３１）
【化７】
2020511946.tif 000012
【０１８４】
ヒト全長ＩｇＧ１  −  重鎖バリアント２（配列番号：１６）
【化８】
2020511946.tif 000013
【０１８５】
ヒト全長ＩｇＧ１  −  軽鎖バリアント２（配列番号：１７）
【化９】
2020511946.tif 000014
【０１８６】
抗体ＣＤＲをＫａｂａｔ方法を使用して決定した（上の配列中で太字でハイライト表示した）。Ｃｈｏｔｈｉａ定義を使用する追加のＨＣＤＲ１残基は、イタリック体である。
【０１８７】
抗グレムリン１抗体によるｐ−ＳＭＡＤシグナリングの回復を、表４中で以下に示す。
表４：ｐ−ＳＭＡＤシグナリングの回復
【表４】
2020511946.tif 000015
【０１８８】
結果を、ＢＭＰ単独（対照ＢＭＰ）によるＳＭＡＤリン酸化のパーセンテージとして示す。特発性肺線維症患者からの肺線維芽細胞を使用して、実験を遂行した。ｒｈグレムリン−１及び抗グレムリン−１抗体を室温で４５分間プレインキュベーションした。次いでｒｈグレムリン−１及び抗グレムリン−１抗体をＢＭＰと共に細胞へ３０分間添加した。
【０１８９】
次いで、表５は、ＳＭＡＤリン酸化アッセイ（そこで、抗グレムリン−１抗体によるグレムリン１−ＢＭＰ複合体からのＢＭＰ−２又はＢＭＰ４／７の置換が調査される）におけるさらなる結果を示す。特発性肺線維症患者からの肺線維芽細胞を使用して、実験を再び遂行した。ｒｈＢＭＰ−２又はｒｈＢＭＰ  ４／７を、ｒｈグレムリン−１により室温で１時間プレインキュベーションした。ＢＭＰ−２−グレムリン−１複合体又はＢＭＰ４／７グレムリン−１複合体を、抗グレムリン−１抗体の異なる濃度により、４℃で一晩インキュベーションした。抗体濃度はプレート上での最終的な濃度を提示する。
表５：抗グレムリン−１抗体による、グレムリン１−ＢＭＰ複合体からのＢＭＰ−２又はＢＭＰ４／７の置換
【表５】
2020511946.tif 000016
【０１９０】
表５中で示された結果は、Ａｂ７３２６がグレムリン１−ＢＭＰ複合体から、既に複合体形成していたＢＭＰ−２又はＢＭＰ４／７を置き換えることができることを実証する。Ａｂ７３２６は、比較抗体２４８４よりもはるかに低い濃度でこの置換を達成することができる。このことは、Ａｂ７３２６がアロステリック阻害物質であるという証拠を提供し、Ａｂ７３２６についての結合部位がグレムリン−１上での既知のＢＭＰ結合領域から遠位であるという我々の所見と一致する。したがって、Ａｂ７３２６は、ＢＭＰがグレムリン−１へ複合体化された場合でさえ、アロステリック結合部位へアクセスすることが可能であり、グレムリン活性の有意に改善された阻害をもたらす。
【０１９１】
例６  −  ７３２６  Ｆａｂとの複合体でグレムリン−１の結晶構造を得る
Ａｂ７３２６  Ｆａｂによる複合体におけるヒトグレムリン−１の結晶構造を、２．１Åの分解能で解像した。Ｆａｂ配列を以下に示す。
【０１９２】
【化１０】
2020511946.tif 000017
【０１９３】
【化１１】
2020511946.tif 000018
【０１９４】
次いでＣＣＰ４ソフトウェアＮＣＯＮＴを使用して、グレムリン−１とＦａｂとの間の４Åでの接触をすべて同定した。以下の残基：Ｉｌｅ１３１、Ｌｙｓ１４７、Ｌｙｓ１４８、Ｐｈｅ１４９、Ｔｈｒ１５０、Ｔｈｒ１５１、Ａｒｇ１６９、Ｌｙｓ１７４及びＧｌｎ１７５を同定した（ナンバリングは配列番号：１のＵｎｉＰｒｏｔ配列に基づく（マウスグレムリン−２のナンバリングを一致させる構造ファイルにおいて、Ｉｌｅ１１０、Ｌｙｓ１２６、Ｌｙｓ１２７、Ｐｈｅ１２８、Ｔｈｒ１２９、Ｔｈｒ１３０、Ａｒｇ１４８、Ｌｙｓ１５３及びＧｌｎ１５４としてナンバリングされる））。
【０１９５】
図１０はグレムリン−Ｆａｂ複合体の構造モデルを示し、ＢＭＰ結合領域に比べたＦａｂエピトープ残基を示す。
【０１９６】
Ａｂ７３２６は、アロステリックに作用する（すなわちＢＭＰ結合領域から離れて結合する）阻害抗体である。
【０１９７】
例７  −  グレムリン−１への抗グレムリン−１抗体Ａｂ７３２６の結合についての親和性測定。
方法
ヒトグレムリン１についての抗グレムリンｍＩｇＧの親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００  ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ）上で表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術を使用して、ｂｉａ分子（ｂｉａｍｏｌｅｃｕｌａｒ）相互作用分析によって決定した。抗グレムリンｍＩｇＧを固定化抗マウスＦｃ表面によって捕捉し、グレムリン１を捕捉ｍＩｇＧに対してタイトレーションした。捕捉リガンド（ヤギ抗マウスＩｇＧのａｆｆｉｎｉｐｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｃ断片特異的、１１５−００６−０７１、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．）を、約１６００反応単位（ＲＵ）のレベルへ、６００秒の活性化注入及び非活性化注入を使用して、アミンカップリング化学経由でＣＭ４  Ｓｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐのフローセル２上に１０ｍＭのＮａＡｃ（ｐＨ５．０）中で５０μｇ／ｍｌで固定化した。ＨＢＳ−ＥＰ＋バッファー（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％のサーファクタントＰ２０）を、１０μＬ／分の最小流速で、ランニングバッファーとして使用した。参照表面を、捕捉リガンドを省いて、フローセル２のためのような表面の活性化及び非活性化によって、フローセル１上で調製した。
【０１９８】
アッセイバッファーは、ＨＢＳ−ＥＰ＋プラス余剰の１５０ｍＭのＮａＣｌ（３００ｍＭの最終的なＮａＣｌ濃度を与える）プラス１％のＣＭＤ４０であった。抗グレムリンｍＩｇＧ（ランニングバッファー中で５μｇ／ｍｌで）の６０秒の注入を、フローセル１及び２にわたって通過させて、固定化抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ）表面上でおよそ１００ＲＵの捕捉レベルを生じさせた。組み換えヒトグレムリン１を５ｎＭから（２倍の希釈を使用して）ランニングバッファー中でタイトレーションし、３０μｌ／分の流速でフローセル１及び２にわたって３分間注入し、５分間の解離相が続いた。バッファーのみの対照も包含されていた。表面を、１０μｌ／分の流速での、５０ｍＭのＨＣｌの６０秒の注入、５ｍＭのＮａＯＨの３０秒の注入、及び５０ｍＭのＨＣｌの３０秒の注入によって再生した。
【０１９９】
速度論的データを、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００評価ソフトウェアを使用して決定した。親和性測定を２５℃で行った。
【０２００】
結果
結合親和性（５つの決定についての平均ＫＤ値として取得した）は、１００ｐＭ未満であることが見出された。
【０２０１】
例８  −  マウスにおける慢性低酸素状態／ＳＵ５４１６誘導性の肺動脈性肺高血圧症に対する抗グレムリン−１抗体のインビボの効果の査定
要約
ＴＧＦβスーパーファミリーにおける不均衡は、肺動脈性肺高血圧症（ＰＡＨ）を包含する多くの肺病理学に強く関与している（Ｂｕｄｄ  ＆  Ｈｏｌｍｅｓ  Ｐｈａｒｍ  Ｔｈｅｒ  ２０１２）。グレムリン−１はＰＡＨの発症及び進行に関与している（Ｔｈｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌ  ＡＪＰ  ２００９；Ｃｉｕｃｌａｎ  ｅｔ  ａｌ  ＡＪＰ  ２０１３）。最近の研究により、抗グレムリン−１抗体はＰＡＨの前臨床低酸素状態／ＳＵ５４１６モデルにおける肺動脈性肺高血圧症の発症を阻害できることが実証された（Ｃｉｕｃｌａｎ  ｅｔ  ａｌ  ＡＪＰ  ２０１３）。本明細書において、ＰＡＨの前臨床的な低酸素状態／ＳＵ５４１６マウスモデルにおける血行動態及び血管リモデリングに対する抗グレムリン１抗体の効果を査定した。
【０２０２】
低酸素状態／ＳＵ５４１６は右心室収縮期圧（ＲＶＳＰ）の有意な増加及び右心肥大を導いた（図１２及び１５）。抗グレムリン−１の投与は、ＩｇＧ１及びＰＢＳの対照群に比較して、ＲＶＳＰの有意な（Ｐ＜０．００５）低減を導いた。抗グレムリン−１の有意な効果は、酸素正常状態で維持された動物におけるＲＶＳＰで観察されなかった（図１２）。効果は、体循環圧（平均動脈圧又はＭＡＢＰ；図１３）、又は右心肥大（図１４）に対して観察されなかった。まとめると、本研究は、ＰＡＨの慢性低酸素状態／ＳＵ５４１６モデルにおける肺血管リモデリングの発症及びＲＶＳＰの上昇におけるグレムリン−１の役割並びにその治療における抗グレムリン−１抗体の使用を支持する。
【０２０３】
背景
肺高血圧症（ＰＨ）は、肺動脈において測定される圧が上昇する血行動態的状態である。臨床的には、これは、＞２５ｍｍＨｇの平均安静時肺動脈圧（ｍＰＡＰ）、≧３のＷｏｏｄ単位の肺血管抵抗（ＰＶＲ）、及び≦１５ｍｍＨｇの肺動脈楔入圧によって定義される（Ｂａｄｅｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ  ２００９）。ＰＨの病理学的特徴は多面であり、肺動脈圧、小動脈から中血管への血管リモデリング、右心室肥大、及び最終的な右心不全が挙げられる（Ｆａｂｅｒ  ＆  Ｌｏｓｃａｌｚｏ  ２００４）。ＰＨは、５つの主要なカテゴリー（第Ｉ群を包含する）へとＷＨＯによって分類される。第Ｉ群は、特発性ＰＡＨ及び遺伝性ＰＡＨに加えて、他の合併症（全身性硬化症等）と同時に生じる関連ＰＡＨを包含する、肺動脈性肺高血圧症を提示する（Ｓｉｍｏｎｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ  ２００９）。多くの素因となる突然変異が遺伝性ＰＡＨ患者及び特発性ＰＡＨ患者におけるＰＡＨの発症へリンクしており、最も主なものは骨形成タンパク質受容体（ＢＭＰＲ２）への突然変異である（Ｂｕｄｄ  ＆  Ｈｏｌｍｅｓ  Ｐｈａｒｍ  Ｔｈｅｒ  ２０１２）。加えて、ＢＭＰにより活性化される下流のシグナル伝達構成要素のＳｍａｄｓにおける突然変異もＰＡＨを発症する患者において報告されている（Ｂｕｄｄ  ＆  Ｈｏｌｍｅｓ  Ｐｈａｒｍ  Ｔｈｅｒ  ２０１２）。より最近では、ＰＡＨのある患者において、ＢＭＰ阻害物質（グレムリン（グレムリン−１及び２））のレベルが促進されることが、研究により同定された（Ｃａｈｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ  Ｃｉｒｃ  ２０１２）。ＰＡＨの発症におけるグレムリン−１についての機能的役割と合致して、グレムリン−１のハプロ欠損は、低酸素のマウス肺におけるＢＭＰシグナリングを増大させ、血管リモデリングの減弱によって肺血管抵抗の低減を導く（Ｃａｈｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ  Ｃｉｒｃ  ２０１２）。これらの観察は、抗グレムリン−１抗体がマウスにおける慢性低酸素状態／ＳＵ５４１６誘導性の肺動脈性肺高血圧症を寛解することを実証したＣｉｕｃｌａｎ及び共同研究者（ＡＪＰ  ２０１３）によって、さらに支持された。最近の研究は、非遺伝性の機構が全身性硬化症患者におけるＢＭＰＲ２発現の低減に寄与し、ＰＡＨの発症に寄与し得ることを示唆する（Ｇｉｌｂａｎｅ  ｅｔ  ａｌ  ＡＪＲＣＣＭ）。まとめると、ＢＭＰスーパーファミリー軸における不均衡は肺病理学（ＰＡＨ）の発症を導き得る。
【０２０４】
本研究の目的は、慢性低酸素状態／ＳＵ５４１６マウスモデルにおけるＰＡＨの発症に対する抗グレムリン−１のインビボの効果を査定することであった。
【０２０５】
材料及び方法
試薬
イマチニブ：Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｗａｒｅｈｏｕｓｅ  １６２５−１０００。
ＳＵ５４１６：Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ３０３７。
αＳＭＡ抗体：Ｄａｋｏ  Ｍ０８５１２９−２。
ＶＷＦ抗体：Ｄａｋｏ  Ａ００８２０２−２。
ビオチン化ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体：Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ  ＢＡ−１０００。
ビオチン化ウマ抗マウスＩｇＧ抗体（ラット吸着）：Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ  ＢＡ−２００１。
カルボキシメチルセルロース：Ｓｉｇｍａ  Ｃ５６７８  ４１９２７３。
ツイーン８０：Ｓｉｇｍａ  Ｐ１７５４。
ベンジルアルコール：Ｓｉｇｍａ  ３０５１９７；４０２８３４。
塩化ナトリウム：Ｓｉｇｍａ  Ｓ７６５３；ＶＷＲ  １０２４１。
ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ  ＡＢＣ−ＡＰキット：Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ  ＡＫ−５０００。
ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ  Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣキット：Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ  ＰＫ−６１００。
正常ウマ血清：Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ、カタログ参照番号Ｓ−２０００。
ポリソルベート：Ｓｉｇｍａ  ５９９２４。
【０２０６】
実験プロトコール
動物
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスを特定病原体除去施設中で収容し、食物及び水へ自由裁量でアクセスさせ、１２時間の明／暗サイクルへ曝露した。本動物研究は、ＵＫ  Ｈｏｍｅ  Ｏｆｆｉｃｅ  Ａｎｉｍａｌｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）Ａｃｔ  １９８６下で許可された。
【０２０７】
肺動脈性肺高血圧症の低酸素状態／ＳＵ５４１６マウスモデル
８〜１０週齢のＣ５７Ｂｌ／６メスマウスを群へ割り付けた（表６）。すべての群を計量し、Ｃｉｕｃｌａｎ  ｅｔ  ａｌ  ＡＪＲＣＣＭ  ２０１３中で記載されるように、１００μｌのベヒクル（脱イオン水中の０．５％のカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）；０．９％の塩化ナトリウム；０．４％のポリソルベート８０；０．９％のベンジルアルコール（ＮａＣｌ））中の２０ｍｇ／ｋｇのＳＵ５４１６を、皮下（ｓ．ｃ．）投与した。必要に応じて、表６中で略述されるように、ＰＢＳ、３０ｍｇ／ｋｇのＩｇＧ１、又は３０ｍｇ／ｋｇの抗グレムリン−１のいずれかを含有する第２の皮下注入を投与した。一方で、低酸素状態＋イマチニブ群におけるマウスにイマチニブを注入した餌を与えて、１００ｍｇ／ｋｇ／日を送達した。次いで低酸素状態マウス群を常圧低酸素状態（１０％のＯ２）チャンバーの中へ置く一方で、酸素正常状態群におけるマウスをチャンバーと同じ部屋中の酸素正常状態（２１％のＯ２）条件で収容した。
表６：処理群：
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスを示されるように処理群へ割り付けた。
【表６】
2020511946.tif 000019
【０２０８】
７及び１４日目に、すべてのマウスを計量し、２０ｍｇ／ｋｇのＳＵ５４１６のさらなるｓ．ｃ．用量を与えた。必要に応じて、マウスに、ＰＢＳ、３０ｍｇ／ｋｇのＩｇＧ１、又は３０ｍｇ／ｋｇの抗グレムリン−１をさらなるｓ．ｃ．注入により投与した（表６中で略述されるように）。これらの研究において使用される抗グレムリン−１抗体は、例５中で記載されるようなＡｂ７３２６マウス全長ＩｇＧ１フォーマット（バリアント１）であった。２１日目に、右心室収縮期圧（ＲＶＳＰ）及び平均動脈圧（ＭＡＢＰ）を得て、組織を収集した。
【０２０９】
右心室収縮期圧及び組織収集
ＲＶＳＰ及びＭＡＢＰの血行動態測定値を、３週間の低酸素状態曝露及び表６中で略述されるような関連する薬物処理後に動物から得た。動物を１．５％のイソフルオランにより麻酔し、サーモスタットで３７℃に制御した加熱用毛布の上へ仰臥位で置いた。第一に、右頸動脈を単離し、プレッシャーカテーテル（１．４Ｆの直径を備えたＭｉｌｌａｒ  ｍｏｕｓｅ  ＳＰＲ−６７１ＮＲプレッシャーカテーテル（Ｍｉｌｌａｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、英国））を右心室の中へ導入及び前進させて、ＲＶＳＰを決定した。第二に、ＭＡＢＰを左総頚動脈の単離によって測定し、プレッシャーカテーテルを導入した。ＲＶＳＰ及びＭＡＢＰの両方を、前較正したＰｏｗｅｒＬａｂ  ｓｙｓｔｅｍ（ＡＤＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（オーストラリア））で記録した。
【０２１０】
動物をイソフルオラン麻酔薬過剰用量経由によって安楽死させ、全血液を収集した。全血液を遠心分離し（２２０×ｇ；２分間）、血清を取り出し、−８０℃で保存した。心臓を取り出し、右心室及び左心室の重量を記録した。肺を右心室経由で２．５ｍｌの食塩水により潅流した。左肺を１０％のホルマリンによるインフレーションによって固定し、その後パラフィン包埋及び切片を作成を行った。右肺を液体窒素中で急冷凍結し、−８０℃で保存した。
【０２１１】
組織学
スライドを脱ワックスし、キシレン及びエタノールの濃度勾配を使用して再水和した。スライドをメタノール中の０．３％のＨ２Ｏ２中に３０分間浸して抗原を取り戻し、ＰＢＳ中で３回洗浄し、１：３０のＰＢＳ中の正常なウマ血清中で１時間ブロッキングした。１：１００の濃度で抗αＳＭＡ一次抗体を各々のスライドへ添加し、４℃で一晩インキュベーションし、次いで５分間ＰＢＳ中で３回リンスした。ビオチン化ウマ抗マウスＩｇＧ抗体（ラット吸着二次抗体）を１：２００で希釈し、各々のスライドの上へピペットで移し、４５分間インキュベーションし、次いで５分間ＰＢＳ中で３回洗浄した。製造者の指示に従って、アビジンビオチン複合体アルカリフォスフォターゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｔａｓｅ）（ＡＢＣ−ＡＰ）を３０分前に調製し、各々のスライド上に３０分間置き、次いで５分間３回洗浄した。ＡＰ基質をキットの指示に従って調製し、各々のスライドの上へピペットで移し、放置して現像させ、次いで５分間３回洗浄した。１：１００の濃度で抗ｖＷＦ一次抗体を各々のスライドへ添加し、４℃で一晩インキュベーションし、次いで５分間ＰＢＳ中で３回リンスした。ビオチン化ヤギ抗ウサギＩｇＧ二次抗体を１：２００で希釈し、各々のスライド上に４５分間放置し、次いで５分間ＰＢＳ中で３回洗浄した。キットの指示に従って、ＡＢＣを３０分前に調製し、各々のスライド上に３０分間置き、次いで５分間３回洗浄した。ＤＡＢ基質をキットの指示に従って調製し、各々のスライドの上へピペットで移し、放置して約５〜１０分現像させ、次いで５分間３回洗浄した。スライドをヘマトキシリンにより約４０秒対比染色し、脱水し、ｐｅｒｔｅｘを使用してカバーガラスによりマウントした。すべてのスライドを、Ｈａｍａｍａｔｓｕ  ＮａｎｏＺｏｏｍｅｒ  ２．０−ＨＴ  Ｓｌｉｄｅ  Ｓｃａｎｎｅｒ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ、Ｗｅｌｗｙｎ  Ｇａｒｄｅｎ  Ｃｉｔｙ、英国）によりデジタルスキャンした。
【０２１２】
データ及び統計解析
各々の低酸素状態群からランダムで取得した４０を超える血管を、筋性化の程度について査定した。少なくとも４人の独立した観察者によって、血管をスコアリングした。０＝非筋性化；１＝部分筋性化；２＝完全筋性化とし；各々の血管についての様式の値を決定した。完全筋性化、部分筋性化、又は非筋性化の血管のパーセンテージを決定し、平均±ＳＥＭをプロットした。一元配置ＡＮＯＶＡを遂行して、有意性＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００５；＊＊＊＊Ｐ＜０．００１を決定する。
【０２１３】
結果
ＳＵ５４１６（２０ｍｇ／ｋｇ）の投与、続いて慢性的な常圧低酸素状態（１０％のＯ２）への曝露は、ＰＢＳ単独群又はＩｇＧ１対照群の両方において、２１日間の酸素正常状態／ＳＵ５４１６単独に比較して、ＲＶＳＰの有意な（Ｐ＜０．０１）増加を導いた（図１２）。有意差は、ＩｇＧ１処理群とＰＢＳ処理群との間に観察されなかった。低酸素状態で維持されたＳＵ５４１６を投与したマウスにおけるＲＶＳＰの上昇に対する薬物治療（イマチニブ）の効果は、対照群に比較して、ＲＶＳＰの有意な（Ｐ＜０．００１）低減を導いた。抗グレムリン１は、ＩｇＧ１対照群及びＰＢＳ対照群に比較して、ＲＶＳＰの有意な（Ｐ＜０．００５）低減を導いた。抗グレムリン１の有意な効果は、酸素正常状態で維持された動物におけるＲＶＳＰに対して観察されなかった（図１２）。
【０２１４】
低酸素状態及び酸素正常状態下での、抗グレムリン１（ｎ＝４）又はＩｇＧ１ベヒクル対照（ｎ＝４）のＭＡＢＰに対する効果を査定した（図１３）。ＭＡＢＰに対する処理の有意な効果は観察されなかった。
【０２１５】
右心肥大（右心室／左心室＋隔壁の重量）を決定した（図１４）。ＳＵ５４１６（２０ｍｇ／ｋｇ）の投与、続いて慢性的な常圧低酸素状態（１０％のＯ２）への曝露は、ＰＢＳ単独群又はＩｇＧ１対照群の両方において、２１日後の酸素正常状態／ＳＵ５４１６単独に比較して、右心肥大（ＲＶ／ＬＶ＋Ｓ）の有意な（Ｐ＜０．０１）増加を導いた（図１４）。低酸素状態で維持されたＳＵ５４１６を投与したマウスにおけるＲＶＳＰの上昇に対する薬物治療（イマチニブ又は抗グレムリン１）の有意な効果は、観察されなかった。
【０２１６】
血管リモデリングの程度を、パラフィン包埋肺切片の染色によって査定した。血管をフォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）について染色して内皮細胞を同定し、平滑筋アクチン（αＳＭＡ）について染色して筋性化の程度を査定した。画像をＨａｍａｍａｔｓｕ  ＮａｎｏＺｏｏｍｅｒ  ２．０−ＨＴ  Ｓｌｉｄｅ  Ｓｃａｎｎｅｒによってデジタル化し、酸素正常状態ＩｇＧ１群及び各々の低酸素状態群からランダムで取得した少なくとも４０の血管を、筋性化の程度について査定した。少なくとも４人の独立した観察者によって、血管をスコアリングした。０＝非筋性化；１＝部分筋性化；２＝完全筋性化とし；各々の血管についての様式の値を決定し、非筋性化、部分筋性化、完全筋性化の血管をプロットした（図１５）。ＳＵ５４１６（２０ｍｇ／ｋｇ）の投与、続いて慢性的な常圧低酸素状態（１０％のＯ２）への曝露は、完全筋性化の血管（Ｐ＜０．００１）及び部分筋性化の血管（Ｐ＜０．０１）の有意な増加、そして非筋性化の血管（Ｐ＜０．００１）複合的に有意な低減を導いた。低酸素状態で維持されたＳＵ５４１６を投与したマウスにおけるＲＶＳＰの上昇に対する薬物治療（イマチニブ）の効果は、完全筋性化の血管（Ｐ＜０．０１）の低減を導いた。さらに、抗グレムリン１は、低酸素状態ＳＵ５４１６のＩｇＧ１対照群に比較して、有意性（それぞれＰ＜０．００１及び  Ｐ＜０．０５）を導いた（図１５）。部分筋性化の血管のパーセンテージに対する薬物治療（イマチニブ又は抗グレムリン１）の有意な効果は、低酸素状態のＳＵ５４１６のＩｇＧ１対照群に比較して、観察されなかった。薬物治療（イマチニブ又は抗グレムリン１）は低酸素状態のＳＵ５４１６のＩｇＧ１対照群に比較して、非筋性化血管のパーセンテージの増加を導いたが、これは有意性に達しなかった。
【０２１７】
考察
本明細書において、慢性低酸素状態／ＳＵ５４１６モデルにおけるＰＡＨの発症に対する抗グレムリン−１抗体の効果を査定した。抗グレムリン−１抗体はＲＶＳＰ（図１２）及び血管リモデリング（図１５）を有意に阻害したが、ＰＡＨの低酸素状態／ＳＵ５４１６のマウスモデルにおける体循環（ＭＡＢＰ）圧（図１３）に対する効果を示さなかった。酸素正常状態／ＳＵ５４１６処理マウスにおけるＲＶＳＰに対する、抗グレムリン−１抗体による有意な効果は、観察されなかった。抗グレムリン１の抗体の効果はＣｉｕｃｌａｎ及び共同研究者（ＡＪＰ  ２０１３）によって行われた観察と合致し、それにおいて、抗グレムリン−１抗体によるアンタゴニズムは、ＰＡＨの慢性低酸素状態／ＳＵ５４１６マウスモデルにおいて、ＲＶＳＰの上昇及び血管リモデリングを寛解することが実証された（図１２及び１５）。Ｃｉｕｃｌａｎ及び共同研究者とは対照的に、本発明者は、本研究において抗グレムリン−１抗体による右心肥大に対する有意な効果を認めなかった（図１４）。しかしながら本研究において、本発明者は、低酸素状態／ＳＵ５４１６マウスにおける右心肥大の発症に対して、対照薬物イマチニブによる有意な効果を認めなかった。まとめると、本研究は、ＰＡＨの慢性低酸素状態／ＳＵ５４１６モデルにおける肺血管リモデリングの発症及びＲＶＳＰの上昇におけるグレムリン−１の役割並びにその治療における抗グレムリン−１抗体の使用を支持する。
参考文献：
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【０２１８】
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【配列表フリーテキスト】
【０２１９】
配列番号１〜３５：＜２２３＞組み換え配列
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図１−７】
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【図１−８】
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【図１−９】
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【図１−１０】
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【図１−１１】
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【図１−１２】
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【図１−１３】
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【図１−１４】
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【図１−１５】
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【図１−１６】
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【図１−１７】
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【図１−１８】
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【図１−１９】
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【図１−２０】
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【図１−２１】
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【図１−２２】
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【図１−２３】
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【図１−２４】
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【図１−２５】
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【図１−２６】
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【図１−２７】
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【図１−２８】
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【図１−２９】
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【図１−３０】
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【図１−３１】
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【図１−３２】
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【図１−３３】
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【図１−３４】
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【図１−３５】
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【図１−３６】
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【図１−３７】
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【図１−３８】
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【図１−３９】
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【図１−４０】
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【図１−４１】
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【図１−４２】
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【図１−４３】
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【図１−４４】
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【図１−４５】
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【図１−４６】
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【図１−４７】
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【図１−４８】
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【図１−４９】
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【図１−５０】
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【図１−５１】
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【図１−５２】
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【図１−５３】
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【図１−５４】
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【図１−５５】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６（Ａ）】
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【図６（Ｂ）】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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