(57)【要約】  ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１及び配列番号３に示されるとおりであるか又は配列番号１及び配列番号３の単一リピート又は複数リピートを有するタンデム又は分岐ペプチド分子配列であり、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する。このペプチドは、高親和性で腫瘍壊死因子αと結合することができ、腫瘍壊死因子αの機能をアンタゴナイズすることができる。動物に直接注入したとき、このペプチドは、動物体の炎症の発生度を有意に低下させ、炎症性障害に対する動物体の抵抗性を改善することができる。このペプチドは、腫瘍壊死因子αアンタゴニストを開発するために、及び物理的、化学的および生物学的因子によって引き起こされる、炎症性傷害、自己免疫損傷およびストレス傷害のような、急性および慢性炎症によって引き起こされる身体障害を処置するするために用いることができ、極めて広範な適用の見込みがあるさらに、このペプチドは、低分子量及び低免疫原性を特徴とし、合成が容易であり、従来のモノクローナル抗体薬剤アンタゴニストの副作用及び欠点を回避することができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＮＦ−αに高親和性を有するペプチドであって、該ペプチドは、配列番号１又は配列番号３のアミノ酸配列を有するか、又は該ペプチドは、配列番号１及び配列番号３の単一リピート又は複数リピートを有するタンデム又は分岐ペプチドであり、配列番号４のアミノ酸配列を有する、該ペプチド。
【請求項２】
ＴＮＦ−αに高親和性を有するペプチドをコードする遺伝子であって、該ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有し、該遺伝子は、配列番号２に記載のヌクレオチド配列を有する、該遺伝子。
【請求項３】
コア配列として請求項１に記載のＴＮＦ−αに高親和性を有するペプチドを含み、抗原又は薬物と連結するか又はそのＣ末端、Ｎ末端又は側鎖基においてＰＥＧによって修飾されるか又は他の分子基によって共有結合によって修飾された構造的に特徴のある分子である、生物学的材料又は化学基によって修飾されたペプチド。
【請求項４】
請求項１に記載のＴＮＦ−αに高親和性を有するペプチドを含む、修飾されたペプチドであって、該修飾されたペプチドが、ＴＮＦ−α検出のためのＦＩＴＣフルオロフォア、アイソトープ、化学発光基又は酵素試薬でラベルされている、該修飾されたペプチド。
【請求項５】
ＴＮＦ−αアンタゴニストの調製における、請求項１に記載のＴＮＦ−αに高親和性を有するペプチドの使用。
【請求項６】
ＴＮＦ−α発現の検出のための薬剤又は臨床試験薬剤の調製における、請求項１に記載のＴＮＦ−αに高親和性を有するペプチドの使用。
【請求項７】
ＴＮＦ−αアンタゴニストの調製又はトレーサー検出における、請求項２に記載のＴＮＦ−αに高親和性を有するペプチドをコードする遺伝子の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物工学の分野に属する。本発明は、特に、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）に高親和性を有するペプチド、ＴＮＦ−αアンタゴニストペプチド、及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
１９７５年にエンドトキシン注射によって最初に誘導された腫瘍壊死因子は、マウスに移植した腫瘍のアポトーシスを誘導する血清活性因子として同定され、それゆえに腫瘍壊死因子と命名される。研究が進むにつれて、ＴＮＦ−αは、極めて重要な炎症性因子であることが見出された。免疫介在性疾患において、組織におけるＴＮＦ−αの発現は、増加し、一連の病原性反応及び関連する炎症性因子の発現を誘導し、究極的には、組織損傷（たとえば、骨破壊、軟骨分解、線維芽細胞増殖、ケラチノサイト増殖等）をもたらす。よって、ＴＮＦ−αは、多様な炎症性疾患の処置のために重要な標的である。
【０００３】
現存するＴＮＦ−αアンタゴニストは、主にモノクローナル抗体及びその誘導体に焦点を合わせている。しかしながら、モノクローナル抗体ベースの薬物は、高度に免疫原性であり、薬物の治療有効性に疑いの余地なく影響する、インビボで抗薬物抗体（すなわち、抗−抗体）の産生を誘導することができる。一方、モノクローナル抗体ベース薬物は、抗−抗体の産生によって生じる有効性の減少に加えて身体に対する損傷や副作用を生じ得る、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び補体依存性抗体介在性細胞傷害を誘導し得る。異なる分子構造が、分子の免疫原性を決定する。抗体と比べて、ペプチドは、その分子サイズが小さいために、免疫原性が小さく、より組織透過性である。したがって、ペプチドは、より有利なＴＮＦ−αアンタゴニストである。ペプチドが配列特異的ペプチドを合成し、ＥＬＩＳＡを用いてＴＮＦ−αに対するアンタゴニストペプチドの親和性を検出し、そして炎症を有する動物内にアンタゴニストペプチドを注入することによって炎症に対する阻害効果を有するか否かを観察することは好都合である。
【発明の概要】
【０００４】
本発明の課題は、腫瘍壊死因子αに高い結合親和性を有するペプチド及び腫瘍壊死因子αの機能をアンタゴナイズすることにおけるペプチドの使用を提供することである。本開示は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する、ＴＮＦ−αに高親和性を有するペプチドを提供する。該ペプチドは、ペプチド６３２又はＴＮＦ−αアンタゴニストペプチドと呼ばれる。該ペプチドは、以下の機能的特徴を有する：（１）ＴＮＦ−αに高い親和性、及び１３８ｎＭの解離定数Ｋｄ（Ｋｄ値は、レセプターの半分がリガンドによって結合されたときのリガンドの濃度を示し、Ｋｄ値が小さければ小さいほど、リガンドに対するレセプター親和性が高くなる）；（２）炎症の動物モデル内に注入された後の炎症の発症を有効に阻害し、炎症障害を予防することができる。
【０００５】
本開示は、また、配列番号２に記載のヌクレオチド配列を有する、（対応するアミノ酸の縮重コドンからなる）ＴＮＦ−αに高親和性を有するペプチドをコードする遺伝子も提供する。
【０００６】
本開示は、また、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有し、ペプチド６３６と呼ばれる、生物工学的修飾によってＴＮＦ−αに高親和性を有するペプチドと同一の機能を有するペプチドを得る。
【０００７】
本開示は、また、配列番号１及び配列番号３に記載のＴＮＦ−αに高親和性のペプチドのアミノ酸配列を含む、ペプチドであって、該ペプチドは、単一リピート又は複数リピートのタンデム又は分岐ペプチド分子配列であり、これらのコア配列特徴を含む分子（すなわち、７０％を超える相同性を有する）であり、該分子は、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する、該ペプチドを提供する。
【０００８】
本開示は、また、コア配列としてＴＮＦ−αに高親和性を有する配列番号１及び配列番号３のペプチドを含む生物学的材料又は化学基によって修飾され、抗原又は薬物と連結した構造的特徴分子であるか、又はＰＥＧで修飾されるか又はそのＣ末端（又はＮ末端、又は側鎖）基上の他の分子基によって共有結合で修飾されたペプチドも提供する。
【０００９】
本開示は、また、ＴＮＦ−αに高親和性を有する上記ペプチドを含む、修飾ペプチドであって、該修飾ペプチドが、ＴＮＦ−α検出のためのＦＩＴＣフルオロフォア、アイソトープ、化学発光基又は酵素試薬でラベルされている、該修飾ペプチドも提供する。
【００１０】
本開示は、また、ＴＮＦ−αアンタゴニストの調製におけるＴＮＦ−αに高親和性を有する上記ペプチドの使用も提供する。
【００１１】
本開示は、また、ＴＮＦ−α発現の検出のための薬剤又は臨床試験試薬の調製におけるＴＮＦ−αに高親和性を有する上記ペプチドの使用も提供する。
【００１２】
本開示は、ＴＮＦ−αアンタゴニストの調製におけるか又はトレーサー検出における配列番号２に記載のヌクレオチド配列を有する遺伝子の使用も提供する。
【００１３】
配列番号１のアミノ酸配列を有する本発明のペプチドは、ＴＮＦ−αアンタゴニスト薬物として用いることができる。
【００１４】
配列番号１のアミノ酸配列を有する本発明のペプチドは、ＴＮＦ−αアンタゴニスト薬物として用いることができる。このペプチドは、ＴＮＦ−αに高親和性を有し、ＴＮＦ−αの生物学的活性を阻害し、そしてＴＮＦ−α誘導炎症傷害を予防する。配列番号３のアミノ酸配列を有する本発明のペプチドは、また、有望なＴＮＦ−αアンタゴニスト薬物として用いることができ、また、ＴＮＦ−αに高親和性を有し、ＴＮＦ−αの生物学的活性を阻害する。
【００１５】
ＴＮＦ−αに対するペプチドの親和性アッセイ
【００１６】
９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを２μｇ／ｍｌＴＮＦ−α溶液を用いて、４℃で、一晩コートした。ＦＩＴＣでラベルした異なる濃度のペプチド６３２を各ウェルに加え、２時間インキュべーションした。インキュベーション後に、ＨＲＰコンジュゲート抗ＦＩＴＣモノクローナル抗体を加え、１時間インキュベーションし、次に、ＡＢＴＳコントロール溶液を加えた。１時間の発色の後、４１０ｎｍでのＯＤをマイクロプレートリーダーを用いて測定し、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５をプロッティング及びアナリシスのために用いた。この結果は、ペプチド６３２が１３８ｎＭの解離定数を有し、ＴＮＦ−αタンパク質に強い親和性を有することを立証した。
【００１７】
炎症の動物モデルにおける炎症インデックスに対するペプチドの効果
【００１８】
実験動物をブランク群、非関連ペプチド対照群及びアンタゴニストペプチド（ペプチド６３２）群の３群に分けた。実施例としてマウスを用い、６週齢、雄の昆明マウスに連続３日間、右腹部に皮下注射した。最後の注射の後、各群のマウスの右の耳介の両側にｐ−キシレンをスメアした。処理の１時間後に、マウスを屠殺し、マウスの左右の耳を切断した。耳膨張パンチャーを用いて、耳を切り詰め、耳断片を得た。マウス耳の膨張度を右耳断片の重量から左耳断片の重量を減算することによって得た。異なる群間の差を比較すると、アンタゴニストペプチドがマウス耳の膨張を有意に阻害することができることが見出され、このペプチドが炎症誘導障害を予防することができることを示した。
【００１９】
本願で提供されるペプチドは、ＴＮＦ−αタンパク質に強い親和性を有し、ＴＮＦ−α誘導炎症性障害を予防することができることが分かる。よって、このペプチドは、ＴＮＦ−αの生物学的活性を阻害するために用いることができ、ＴＮＦ−αと強く関連する炎症性疾患を治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、ＴＮＦ−αタンパク質へのペプチド６３２の結合親和性を示す。
【図２】図２は、ＴＮＦ−αタンパク質へのペプチド６３６の結合親和性を示す。
【図３】図３は、炎症の昆明マウスモデルにおける炎症をペプチド６３２が阻害する程度を示す。
【００２１】
実施態様の詳細な説明
１．ペプチド配列の取得と修飾
ＴＮＦ−αタンパク質に親和性を有する所望のペプチドを化学的方法によって人工的に合成した。
【００２２】
ＬＹＳ（Ｄｄｅ）ワングレジンをＤＣＭ中に１０分間浸漬し、ＤＣＭを排出した。３倍体積の２５％ピペリジン（ピペリジン／ＤＭＦ）をレジンに加え、２０分間窒素を通気した後にピペリジンを排出した。ＤＭＦを加え、１分間ブローした。６サイクル後、ＤＭＦを排出し、レジンはニンヒドリンによって青であることが検出された。この生成物は、Ｈ−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）ワングレジンである。ＤＭＦ中の３つの等価物Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、ＨＡＴＵ、ＤＩＥＡをレジンに加えた。窒素で２０分間ブローした後、ＤＭＦ反応溶液を排出した。ＤＭＦを加え、排出の前に窒素で１分間ブローした。３サイクル後、レジンはニンヒドリンによって青であることが検出された。この生成物は、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）ワングレジンである。この粗生成物を同様の方法によって得た。アセトニトリル及びＭｉｌｌｉ−Ｑ水を用いるハンバン（Hanbang）ＹＣＭ  Ｃ１８カラムで精製を行った。このように、高親和性及び高活性を有するペプチドを得た。
【００２３】
３．ＴＮＦ−αへのペプチド６３２の親和性アッセイ及びその動物モデルの炎症性インデックスに対する効果
（１）ＴＮＦ−αタンパク質へのペプチド６３２の親和性の実験結果
９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを４℃で一晩、２μｇ／ｍｌＴＮＦ−αタンパク質でコートした。ＢＳＡでブロッキングした後、異なる濃度のＦＩＴＣでラベルしたペプチド６３２を各ウェルに加え、２時間インキュベーションした。
インキュベーション後、ＨＲＰ結合抗ＦＩＴＣモノクローナル抗体を加え、１時間インキュベーションし、ＡＢＴＳ着色溶液を加えた。１時間発色展開の後、４１０ｎｍでのＯＤ値をマイクロプレートリーダーを用いて測定し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ５をプロッティング及び解析のために用いた。この結果は、ペプチド６３２が１３８ｎＭの解離定数（Ｋｄ）を有し、ＴＮＦ−αタンパク質に高親和性を有することを立証した。
【００２４】
（２）炎症の動物モデルにおける炎症インデックスに対するペプチド６３２の効果
実験動物を３群：ブランク群、非関連ペプチド対照群、及びアンタゴニストペプチド（ペプチド６３２）群に分けた。６週齢の雄の昆明マウスに３日間連続で、ペプチドを右腹部に皮下注射した。最後の注射から３０分後、各群のマウスの右の耳介の両側をｐ−キシレン（０．０３ｍｌ／マウス）でスメアし炎症を誘導し、左の耳介は正常コントロールとした。炎症１時間後、動物を屠殺し、マウスの耳を完全に切断し、同一マウスの左右の耳を識別するためにマークした。マウスの耳の両側を同一の紙片でコートした。直径８ｍｍの耳膨張パンチャーを用いて、左右の耳の同一部分を切断し、耳断片を得た。この耳断片を紙と一緒に重量を測定し、その結果を記録した。マウス耳の膨張度＝炎症の誘導されている耳断片の重量−炎症のない耳断片の重量
【産業上の利用可能性】
【００２５】
４．産業適用性
重要な炎症性因子として、ＴＮＦ−αは、炎症の発生及び発達に重要な役割を奏している。炎症によって誘導された免疫疾患において、ＴＮＦ−αの増加したレベルは、組織損傷を生じる、一連の病原性反応及び関連サイトカインの発現を誘導する。ＴＮＦ−αの拮抗作用は、関節リウマチ及び乾癬のような種々の炎症性疾患における有効な処置であることが証明されている。しかしながら、現在のアンタゴニストは、モノクローナル抗体及びその誘導体に焦点を併せている。モノクローナル抗体及びその誘導体は、強い副作用、特に薬剤における用途を制限する高い免疫原性を有する。したがって、ここで提供されるＴＮＦ−αに高い親和性を有するペプチドは、ＴＮＦ−αに強い親和性を有するのみならず、ＴＮＦ−αの生物学的活性も阻害する。よって、本発明のペプチドは、関連する炎症性損傷を予防することができ、有望なＴＮＦ−αアンタゴニスト薬として用いることができる。さらに、修飾ペプチド６３２は、ＴＮＦ−αタンパク質の発現を検出するための検出試薬として用いることができる。
【００２６】
配列リスト
配列番号１（Ｎ末端→Ｃ末端）：HYIDFRW
配列番号２：CATTATATTGATTTTAGGTGG
配列番号３（Ｎ末端→Ｃ末端）：KASGSPSGFWPS
配列番号４（Ｎ末端→Ｃ末端）：HYIDFRWDMKASGSPSGFWPS
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【誤訳訂正書】
【提出日】令和1年10月17日(2019.10.17)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２４】
（２）炎症の動物モデルにおける炎症インデックスに対するペプチド６３２の効果
実験動物を３群：ブランク群、非関連ペプチド対照群、及びアンタゴニストペプチド（ペプチド６３２）群に分けた。６週齢の雄の昆明マウスに３日間連続で、ペプチドを右腹部に皮下注射した。最後の注射から３０分後、各群のマウスの右の耳介の両側をｐ−キシレン（０．０３ｍｌ／マウス）でスメアし炎症を誘導し、左の耳介は正常コントロールとした。炎症１時間後、動物を屠殺し、マウスの耳を完全に切断し、同一マウスの左右の耳を識別するためにマークした。マウスの耳の両側を同一の紙片でコートした。直径８ｍｍの耳膨張パンチャーを用いて、左右の耳の同一部分を切断し、耳断片を得た。この耳断片を紙と一緒に重量を測定し、その結果を記録した。マウス耳の膨張度＝炎症の誘導されている耳断片の重量−炎症のない耳断片の重量
図１及び図２に示されるとおり、ペプチド６３２は、ＴＮＦ−αタンパク質に高い結合親和性を有する。動物実験は、ペプチド６３２を注射した実験群の耳膨張度が対照群に比べて有意に低かったことを示した。上記の結果は、ペプチド６３２がＴＮＦ−αの活性をアンタゴナイズすることによって炎症ダメージを防止する効果を達成することができることを示している。
【国際調査報告】
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