(57)【要約】本発明は、転写システムであって、（ａ）第１の結合ドメインを含むドッキングコンポーネントと；（ｂ）転写因子、およびドッキングコンポーネントの第１の結合ドメインと結合する第２の結合ドメインを含む転写制御コンポーネントとを含み、第１の結合ドメインと第２の結合ドメインとの結合が作用剤の存在により妨害され、そのため、作用剤の非存在下では、ドッキングコンポーネントと転写制御コンポーネントとがヘテロ二量体を形成する、転写システムを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
転写システムであって、
（ａ）第１の結合ドメインを含むドッキングコンポーネントと；
（ｂ）転写因子、および該ドッキングコンポーネントの該第１の結合ドメインと結合する第２の結合ドメインを含む転写制御コンポーネントと
を含み、
該第１の結合ドメインと該第２の結合ドメインとの結合が作用剤の存在により妨害され、そのため、該作用剤の非存在下では、該ドッキングコンポーネントと該転写制御コンポーネントとがヘテロ二量体を形成する、転写システム。
【請求項２】
請求項１に記載の転写システムであって、
前記ドッキングコンポーネントが膜局在化ドメインも含み；そして
前記転写コンポーネントが核局在化シグナルも含み、
そのため、該転写システムが細胞内で発現されると、前記作用剤の非存在下では、該転写コンポーネントが細胞膜の細胞内側に保持される；他方、該作用剤の存在下では、該転写コンポーネントが該ドッキングコンポーネントから分離して、核へと移行し、そこで前記転写因子がＤＮＡに結合して遺伝子の転写を調節する、転写システム。
【請求項３】
請求項１に記載の転写システムであって、
前記ドッキングコンポーネントが核局在化シグナルも含み；そして
前記転写コンポーネントが核外輸出シグナルも含み、
そのため、該転写システムが細胞内で発現されると、前記作用剤の非存在下では、該転写コンポーネントが核内に保持され、そこで前記転写因子がＤＮＡに結合して遺伝子の転写を調節する；他方、該作用剤の存在下では、該転写コンポーネントが該ドッキングコンポーネントから分離して、細胞質へと移行する、転写システム。
【請求項４】
前記作用剤が、前記第１の結合ドメインと前記第２の結合ドメインとの結合を競合的に阻害する低分子である、前記の請求項のいずれかに記載の転写システム。
【請求項５】
前記の請求項のいずれかに記載の転写システムであって、前記第１の結合ドメインがＴｅｔリプレッサータンパク質（ＴｅｔＲ）を含み、前記第２の結合ドメインが転写誘導ペプチド（ＴｉＰ）を含むか；または、前記第１の結合ドメインがＴｉＰを含み、前記第２の結合ドメインがＴｅｔＲを含む；
そして、前記作用剤がテトラサイクリン、ドキシサイクリン、またはミノサイクリン、あるいはこれらのアナログである、転写システム。
【請求項６】
前記第１の結合ドメインまたは前記第２の結合ドメインが、シングルドメインバインダーを含む、請求項１から４のいずれかに記載の転写システム。
【請求項７】
前記シングルドメインバインダーが、ナノボディ、アフィボディ、フィブロネクチン人工抗体スキャフォールド、アンチカリン、アフィリン、ＤＡＲＰｉｎ、ＶＮＡＲ、ｉＢｏｄｙ、アフィマー、フィノマー、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、アブジュリン／ナノ抗体、センチリン、アルファボディ、またはナノフィチンを含む、請求項６に記載の転写システム。
【請求項８】
前記シグナルドメインバインダーが、ドメイン抗体（ｄＡｂ）を含む、請求項７に記載の転写システム。
【請求項９】
前記の請求項のいずれかに記載の転写システムであって：
前記第１の結合ドメインがシングルドメインバインダーを含み、前記第２の結合ドメインが該シングルドメインバインダーに結合するペプチドを含むか、または
前記第２の結合ドメインがシングルドメインバインダーを含み、前記第１の結合ドメインが該シングルドメインバインダーに結合するペプチドを含むか
のいずれかであって、
結合が前記作用剤によって競合的に阻害される、転写システム。
【請求項１０】
前記作用剤が、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、またはミノサイクリンである、請求項６から９のいずれかに記載の転写システム。
【請求項１１】
前記転写因子が、Ｔ細胞内で発現されたときに、Ｔ細胞の分化および／または疲弊を防ぐか、あるいは低減する、前記の請求項のいずれかに記載の転写システム。
【請求項１２】
前記転写因子が、セントラルメモリーをプロモートする、請求項１１に記載の転写システム。
【請求項１３】
前記転写因子が、ＥＯＭＥＳ、ＦＯＸ０１、Ｒｕｎｘ３、ＴＣＦ１、ＬＥＦ１、およびＩＤ３からなる群から選択される、請求項１２に記載の転写システム。
【請求項１４】
前記転写因子が、エフェクターメモリーをプロモートする、請求項１１に記載の転写システム。
【請求項１５】
前記転写因子が、Ｔ−ｂｅｔ、ＡＰ１、ＩＤ２、ＧＡＴＡ３、およびＲＯＲγｔからなる群から選択される、請求項１４に記載の転写システム。
【請求項１６】
前記転写因子が、セントラルメモリーリプレッサーである、請求項１１に記載の転写システム。
【請求項１７】
前記転写因子が、ＢＣＬ６およびＢＡＣＨ２からなる群から選択される、請求項１６に記載の転写システム。
【請求項１８】
前記転写因子が、エフェクターメモリーリプレッサーである、請求項１１に記載の転写システム。
【請求項１９】
前記転写因子が、ＢＬＩＭＰ−１である、請求項１６に記載の転写システム。
【請求項２０】
前記転写因子が、Ｂａｃｈ２であるか、またはＢａｃｈ２を含む、請求項１１に記載の転写システム。
【請求項２１】
前記転写因子が、ＡＬＫによってリン酸化される能力を、減ぜられているか、または取り除かれている、改変されたバージョンのＢａｃｈ２を含む、請求項１１に記載の転写システム。
【請求項２２】
前記転写因子が、配列番号８で示されるアミノ酸配列を参照して次の位置：Ｓｅｒ−５３５、Ｓｅｒ−５０９、Ｓｅｒ−５２０のうちの１つまたはそれより多くにおいて変異を有する、改変されたバージョンのＢａｃｈ２を含む、請求項２１に記載の転写システム。
【請求項２３】
前記の請求項のいずれかに記載の転写システムをコードする核酸コンストラクトであって、前記ドッキングコンポーネントをコードする第１の核酸配列、および前記転写制御コンポーネントをコードする第２の核酸配列を含む、核酸コンストラクト。
【請求項２４】
請求項２３に記載の核酸コンストラクトであって、次の構造：
ＤＣ−ｃｏｅｘｐｒ−ＴＣＣ；または
ＴＣＣ−ｃｏｅｘｐｒ−ＤＣ
を有し、式中：
ＤＣが前記ドッキングコンポーネントをコードする核酸配列であり；
ｃｏｅｘｐｒが該ドッキングコンポーネントおよび前記転写制御コンポーネントの共発現を可能にする核酸配列であり；そして
ＴＣＣが該転写制御コンポーネントをコードする核酸配列である、核酸コンストラクト。
【請求項２５】
キメラ抗原受容体をコードする第３の核酸配列を含む、請求項２４に記載の核酸コンストラクト。
【請求項２６】
請求項２５に記載の核酸コンストラクトであって、次の構造：
ＣＡＲ−ｃｏｅｘｐｒ１−ＤＣ−ｃｏｅｘｐｒ２−ＴＣＣ；
ＣＡＲ−ｃｏｅｘｐｒ１−ＴＣＣ−ｃｏｅｘｐｒ２−ＤＣ；
ＤＣ−ｃｏｅｘｐｒ１−ＴＣＣ−ｃｏｅｘｐｒ２−ＣＡＲ；または
ＴＣＣ−ｃｏｅｘｐｒ１−ＤＣ−ｃｏｅｘｐ２−ＣＡＲ
のうちの１つを有し、式中：
ＣＡＲがキメラ抗原受容体をコードする核酸配列であり；
ＤＣが前記ドッキングコンポーネントをコードする核酸配列であり；
同一または相違であり得るｃｏｅｘｐｒ１およびｃｏｅｘｐｒ２が、該ドッキングコンポーネント、前記転写制御コンポーネント、および該キメラ抗原受容体の共発現を可能にする核酸配列であり；そして
ＴＣＣが該転写制御コンポーネントをコードする核酸配列である、核酸コンストラクト。
【請求項２７】
ｃｏｅｘｐｒ、ｃｏｅｘｐｒ１、またはｃｏｅｘｐｒ２が、自己切断ペプチドを含む配列をコードする、請求項２３から２６のいずれかに記載の核酸コンストラクト。
【請求項２８】
請求項１から２２のいずれかにおいて定義されるドッキングコンポーネントをコードする第１の核酸配列と；請求項１から２２のいずれかにおいて定義される転写制御コンポーネントをコードする第２の核酸配列とを含む、核酸配列のキット。
【請求項２９】
キメラ抗原受容体をコードする第３の核酸配列を含む、請求項２８に記載の核酸配列のキット。
【請求項３０】
請求項２３から２７のいずれかに記載の核酸コンストラクトを含む、ベクター。
【請求項３１】
請求項１から２２のいずれかにおいて定義されるドッキングコンポーネントをコードする第１の核酸配列を含む第１のベクターと；請求項１から２２のいずれかにおいて定義される転写制御コンポーネントをコードする第２の核酸配列を含む第２のベクターとを含む、ベクターのキット。
【請求項３２】
キメラ抗原受容体をコードする第３の核酸配列を含む第３のベクターも含む、請求項３１に記載のベクターのキット。
【請求項３３】
請求項１から２２のいずれかに記載の転写システムを含む、細胞。
【請求項３４】
キメラ抗原受容体を発現する、請求項３３に記載の細胞。
【請求項３５】
請求項３３または３４に記載の細胞を作るための方法であって、請求項２３から２７のいずれかに記載の核酸コンストラクト、請求項２８もしくは２９に記載の核酸配列のキット、請求項３０に記載のベクター、または請求項３１もしくは３２に記載のベクターのキットを、細胞内へと導入するステップを含む、方法。
【請求項３６】
前記細胞が、被験体から単離される試料に由来する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
請求項３３または３４に記載の細胞の複数種を含む、医薬組成物。
【請求項３８】
請求項３７に記載の医薬組成物を被験体に投与するステップを含む、疾患の処置および／または予防のための方法。
【請求項３９】
請求項３８に記載の方法であって、次のステップ：
（ｉ）被験体から細胞を含む試料を単離すること；
（ｉｉ）請求項２３から２７のいずれかに記載の核酸コンストラクト、請求項２８もしくは２９に記載の核酸配列のキット、請求項３０に記載のベクター、または請求項２１もしくは３２に記載のベクターのキットを用いて、該細胞の形質導入またはトランスフェクションをすること；および
（ｉｉｉ）該被験体に（ｉｉ）に由来する該細胞を投与すること
を含む方法。
【請求項４０】
前記疾患が、がんである、請求項３８または３９に記載の方法。
【請求項４１】
疾患の処置および／または予防における使用のための、請求項３７に記載の医薬組成物。
【請求項４２】
疾患の処置および／または予防のための医薬の製造における、請求項３３または３４に記載の細胞の使用。
【請求項４３】
請求項３３または３４に記載の細胞内で、遺伝子の転写を調節するための方法であって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、該細胞へと前記作用剤を投与するステップを含む、方法。
【請求項４４】
被験体内の請求項３３または３４に記載の細胞内で、遺伝子の転写をｉｎ  ｖｉｖｏで調節するための方法であって、該被験体へと前記作用剤を投与するステップを含む、方法。
【請求項４５】
請求項４４に記載の方法であって、次のステップ：
ａ）請求項３７に記載の医薬組成物の、被験体への投与；および
ｂ）前記作用剤の、該被験体への投与
を含み、ａ）およびｂ）がいずれかの順番で、または同時に投与される、方法。
【請求項４６】
請求項１１に記載の転写システムを含む細胞内で、Ｔ細胞の分化または疲弊を防ぐか、あるいは低減するための方法であって、前記作用剤を該細胞へと、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで投与するステップを含む、方法。
【請求項４７】
被験体内の請求項１１に記載の転写システムを含む細胞内で、Ｔ細胞の分化または疲弊をｉｎ  ｖｉｖｏで防ぐか、あるいは低減するための方法であって、前記作用剤を該被験体へと投与するステップを含む、方法。
【請求項４８】
請求項４７に記載の方法であって、次のステップ：
ａ）請求項３７に記載の医薬組成物の被験体への投与であって、前記医薬組成物中で前記細胞が請求項１１に記載の転写システムを含む；および
ｂ）前記作用剤の、該被験体への投与
を含み、ａ）およびｂ）がいずれかの順番で、または同時に投与される、方法。
【請求項４９】
請求項３３また３４に記載の細胞の複数種、ならびに前記第１の結合ドメインと前記第２の結合ドメインとの結合を妨害する前記作用剤を含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低分子などの外部作用剤を用いて制御可能な転写システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞内での遺伝子発現をｉｎ  ｖｉｖｏで制御する、多数の機構がある。細胞内での遺伝子発現を人工的に制御するために、時として、このような内因性の機構の背後にある原理を用いることができる。
【０００３】
ＲＮＡ干渉をベースとするシステム
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、ＲＮＡポリヌクレオチドが遺伝子発現を特異的に抑制する、内因性の細胞プロセスである。
【０００４】
低分子干渉ＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ）は、ＲＮａｓｅＩＩＩエンドヌクレアーゼ分解によってｉｎ  ｖｉｖｏで生成され得る。この分解は、約２１から２３ヌクレオチド長の分子をもたらす。その後、この相対的に短いＲＮＡ種は、対応するＲＮＡメッセージおよび転写物の分解を媒介する。ＲＮＡｉヌクレアーゼ複合体（ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と呼ばれる）は、低分子ｄｓＲＮＡが塩基対形成の相互作用を通して相補的なｍＲＮＡを認識する手助けをする。ｓｉＲＮＡとその基質との相互作用の後、当該ｍＲＮＡは、ＲＩＳＣ内に存在する酵素による分解の標的となる。この経路は生物にとって、ウイルス感染、トランスポゾンジャンピング、および類似の現象を阻害するに際して有用であり、そして内因性遺伝子の発現を調節すると考えられている。
【０００５】
ＲＮＡｉが遍在するということは、この自然の遺伝子調節システムを遺伝子発現の操作のための道具へと変えるための方法および組成物の開発を促進している。その発現を抑制しようとする遺伝子（標的遺伝子）の配列に対して、十分に対応するように設計されたＲＮＡポリヌクレオチド配列が、細胞内へと導入される。適切に設計されたＲＮＡの存在はＲＮＡｉ経路を活性化し、標的遺伝子の抑制または調整をもたらす。
【０００６】
米国特許出願公開第２０１３／０９６３７０号明細書は、制御されたＲＮＡ干渉によって内因性遺伝子または外因性遺伝子のいずれかの調節を操作するための、外部から制御可能なシステム（ｓｙｓｔｅｍｓｆｏｒ）について記載する。このシステムは、ｓｉＲＮＡをコードするヌクレオチド配列の発現を調節するための、外部から投与される作用剤（薬物または他の化合物）の使用を含む。
【０００７】
しかし、ｓｉＲＮＡの不都合は、遺伝子発現を単に下方調節できるが上方調節できないことである。また、ｓｉＲＮＡは他の配列とクロスリアクトし、予期せぬ効果を伴って他の遺伝子の下方調節をもたらす可能性がある。最後に、複数種の遺伝子の発現を制御するためには、細胞が各々の対象遺伝子についてのｓｉＲＮＡを発現する必要がある。
【０００８】
ホルモン受容体ベースのシステム
所定の転写因子についての標的遺伝子を同定するために以前用いられていた１つのアプローチは、転写因子をリガンド結合ドメイン（例えば、グルココルチコイド受容体またはエストロゲン受容体の）へと融合（ｆｕｓｅ  ｔｈｉｎｇ）し、転写因子による転写の活性化（または抑制）がホルモン依存的であるシステムを産生することを含む（Ｓｕｐｅｒｔｉ−Ｆｕｒｇａ  ｅｔ  ａｌ  ＰＮＡＳ  ８８：５１１４−５１１８）。しかし、このようなシステムは、ホルモンが哺乳動物の組織内で遍在し得るため、ｉｎ  ｖｉｖｏでの転写制御のための使用を制限される。
【０００９】
Ｔｅｔベースのシステム
外部作用剤の投与による転写のトランス活性化の制御のために、様々なテトラサイクリンベースのシステムが開発されている。これらのＴｅｔベースのシステムは、培養細胞内および生物全体内（特にネズミ内）で多数のトランスジーンの発現を制御するために、うまく用いられている。オリジナルの、テトラサイクリンに制御される転写活性化因子（ｔＴＡ）は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｔｎ１０  ｔｅｔＲ遺伝子とＶＰ１６トランス活性化ドメインとのキメラコンストラクトからなる（図４ａを参照）。誘導因子であるドキシサイクリンの非存在下において、ｔＴＡ二量体は７回縦列反復する１９ｂｐのｔｅｔＯ配列へと特異的に結合し、これにより、最小プロモーターからの転写を活性化して、対象遺伝子をコードする標的トランスジーンの発現をドライブする。ドキシサイクリンに結合されると、ｔＴＡは構造変化してｔｅｔＯ配列に結合できなくなる。リバースｔＴＡ（ｒｔＴＡ）システム（図４ｂに示す）においてｔｅｔＲ遺伝子は変異され、そのため、ドキシサイクリンの存在下でのみｔｅｔＯ配列と結合して転写を活性化し、標的トランスジーンに関しての簡便な制御を与える。
【００１０】
したがって、Ｔｅｔをベースとするシステムを用いて転写をオンおよびオフにすることが可能である。しかし、細胞内でＴｅｔをベースとするシステムを用いて遺伝子の転写を制御するためには、細胞内の当該標的遺伝子または各標的遺伝子を操作して、７回縦列反復する１９ｂｐのｔｅｔＯ配列を最小プロモーターの上流に含めることが必要である。
【００１１】
したがって、上記のシステムの不都合と関連しない外部の様式において遺伝子発現を制御する代替機構が必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１３／０９６３７０号明細書
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｓｕｐｅｒｔｉ−Ｆｕｒｇａ  ｅｔ  ａｌ  ＰＮＡＳ  ８８：５１１４−５１１８
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】転写因子に媒介される制御が作用剤（低分子など）を用いてスイッチをＯＮにされる、本発明の第１の実施形態を例示する模式図。ドッキングコンポーネントが膜局在化ドメインを含み、そのため、作用剤の非存在下では、転写コンポーネントが細胞膜の細胞内側に保持される（Ａ）；他方、作用剤の存在下（Ｂ）では、転写コンポーネントがドッキングコンポーネントから分離し、これが核局在化シグナルを含むため、核へと移行し、そこで転写因子がＤＮＡに結合して遺伝子の転写を調節する。ＭＹＲ＝ミリスチル化シグナル；ＴＭ＝膜貫通；ＳＭＢＰ＝低分子結合タンパク質；Ｍ＝模倣物／ブロッカー；ＴＦ＝転写因子；ＮＬＳ＝核局在化シグナル；ＳＭ＝低分子；ＮＥＳ＝核外輸送シグナル。
【００１５】
【図２】転写因子に媒介される制御が作用剤（低分子など）を用いてスイッチをＯＦＦにされる、本発明の第２の実施形態を例示する模式図。ドッキングコンポーネントが核局在化シグナルを含み、そのため、作用剤の非存在下で（ａ）転写コンポーネントが保持され、他方（ｎｗｈｅｒｅａｓ）、作用剤の存在下では、転写コンポーネントがドッキングコンポーネントから分離して、これが核外輸送シグナルを含むため、細胞質へと移行し、転写因子に媒介される遺伝子転写の調節の停止を引き起こす。ＭＹＲ＝ミリスチル化シグナル；ＴＭ＝膜貫通；ＳＭＢＰ＝低分子結合タンパク質；Ｍ＝模倣物／ブロッカー；ＴＦ＝転写因子；ＮＬＳ＝核局在化シグナル；ＳＭ＝低分子；ＮＥＳ＝核外輸送シグナル。
【００１６】
【図３】各細胞タイプと関連する発現マーカーを示す、Ｔ細胞分化の直線モデルを例示する模式図。ＡＰＣ−抗原提示細胞；ＴＣＭ−セントラルメモリーＴ細胞；ＴＥＦＦ−エフェクターＴ細胞；ＴＥＭ−エフェクターメモリーＴ細胞；ＴＮ−ナイーブＴ細胞；ＴＳＣＭ−Ｔメモリー幹細胞。
【００１７】
【図４】転写のトランス活性化のためのテトラサイクリン応答性調節システムａ）ｔＴＡシステム：このシステムにおいてエフェクターは、テトラサイクリンに制御される転写のトランス活性化因子（ｔＴＡ）であり、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｔｎ１０  ｔｅｔＲ遺伝子（紫）とＶＰ１６トランス活性化ドメイン（オレンジ）とのキメラコンストラクトからなる。誘導因子であるドキシサイクリン（Ｄｏｘ）の非存在下では、ｔＴＡ二量体は、７回縦列反復する１９ｂｐのｔｅｔＯ配列（ｔｅｔＯ７）へと特異的に結合し、これにより、最小プロモーター（ＴＡＴＡ）からの転写を活性化して、対象遺伝子をコードする標的トランスジーン（標的ＯＲＦ）の発現をドライブする。Ｄｏｘに結合されると、ｔＴＡは構造変化してｔｅｔＯ配列に結合できなくなる。ｂ）リバースｔＴＡ（ｒｔＴＡ）システム：このシステムにおいて、ｔｅｔＲ遺伝子は変異され、そのため、Ｄｏｘの存在下でのみｔｅｔＯ配列と結合して転写を活性化する。
【００１８】
【図５】形質導入後（０日目）、およびＣＤ１９を発現する標的細胞との２４時間の共培養から６日後（７日目）での、エフェクター細胞、エフェクターメモリー（ＥＭ細胞）、セントラルメモリー（ＣＭ）細胞およびナイーブ細胞の割合を示すグラフ。Ｔ細胞は、非形質導入（ＮＴ）であるか、ＣＡＲのみを発現するベクター（ＨＤ３７）を用いて形質導入されたか、またはＣＡＲおよび転写因子ＦＯＸＯ１を発現するベクター（ＨＤ３７−ＦＯＸＯ１）を用いて形質導入されたかのいずれか（ｗｉｔｈｅｒ）であった。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋の部分集団が、別々に解析された。
【００１９】
【図６】ＣＤ１９を発現する標的細胞との２４時間の共培養から６日後での、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞における、ＣＤ２７およびＣＤ６２Ｌの発現を示すグラフ。Ｔ細胞は、非形質導入（ＮＴ）であるか、ＣＡＲのみを発現するベクター（ＨＤ３７）を用いて形質導入されたか、ＣＡＲおよび転写因子ＥＯＭＥＳを発現するベクター（ＨＤ３７−ＥＯＭＥＳ）を用いて形質導入されたか、またはＣＡＲおよび転写因子ＦＯＸＯ１を発現するベクター（ＨＤ３７−ＦＯＸＯ１）を用いて形質導入されたかのいずれか（ｗｉｔｈｅｒ）であった。
【００２０】
【図７】ＣＤ１９を発現する標的細胞との２４時間の共培養から６日後での、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞における、ＣＤ６２Ｌの発現を示すグラフ。Ｔ細胞は、非形質導入（ＮＴ）であるか、ＣＡＲのみを発現するベクター（ＨＤ３７）を用いて形質導入されたか、またはＣＡＲと転写因子Ｒｕｎｘ３およびＣＢＦベータとを発現するベクター（ＨＤ３７−Ｒｕｎｘ３＿ＣＢＦベータ）を用いて形質導入されたかのいずれか（ｗｉｔｈｅｒ）であった。
【００２１】
【図８】形質導入後（０日目）、およびＣＤ１９を発現する標的細胞との２４時間の共培養から６日後（７日目）での、エフェクター細胞、エフェクターメモリー（ＥＭ細胞）、セントラルメモリー（ＣＭ）細胞およびナイーブ細胞の割合を示すグラフ。Ｔ細胞は、非形質導入（ＮＴ）であるか、ＣＡＲのみを発現するベクター（ＨＤ３７）を用いて形質導入されたか、ＣＡＲおよび転写因子ＢＡＣＨ２を発現するベクター（ＨＤ３７−ＢＡＣＨ２）を用いて形質導入されたか、またはＣＡＲおよび転写因子ＢＡＣＨ２の変異バージョンを発現するベクター（ＨＤ３７−ＢＡＣＨ２＿Ｓ５２０Ａ）を用いて形質導入されたかのいずれか（ｗｉｔｈｅｒ）であった。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋の部分集団が、別々に解析された。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明の側面の要約
本発明者らは、外部作用剤を用いてある遺伝子、またはあるセットの遺伝子の転写をオンあるいはオフにすることを可能にする、ヘテロ二量体の転写システムを開発した。
【００２３】
したがって、第１の側面において本発明は、転写システムであって、
（ａ）第１の結合ドメインを含むドッキングコンポーネントと；
（ｂ）転写因子、およびドッキングコンポーネントの第１の結合ドメインと結合する第２の結合ドメインを含む転写制御コンポーネントと
を含み、
第１の結合ドメインと第２の結合ドメインとの結合が作用剤の存在により妨害され、そのため、作用剤の非存在下では、ドッキングコンポーネントと転写制御コンポーネントとがヘテロ二量体を形成する、転写システムを提供する。
【００２４】
本発明の第１の側面の第１の実施形態において、ドッキングコンポーネントが膜局在化ドメインも含み；そして転写コンポーネントが核局在化シグナルも含み、そのため、転写システムが細胞内で発現されると、作用剤の非存在下では、転写コンポーネントが細胞膜の細胞内側に保持される；他方、作用剤の存在下では、転写コンポーネントがドッキングコンポーネントから分離して、核へと移行し、そこで転写因子がＤＮＡに結合して遺伝子の転写を調節する（図１を参照）。
【００２５】
本発明の第１の側面の第２の実施形態において、ドッキングコンポーネントが核局在化シグナルも含み；そして転写コンポーネントが核外輸送シグナルも含み、そのため、転写システムが細胞内で発現されると、作用剤の非存在下では、転写コンポーネントが核内に保持され、そこで転写因子がＤＮＡに結合して遺伝子の転写を調節する；他方、作用剤の存在下では、転写コンポーネントがドッキングコンポーネントから分離して、細胞質へと移行する（図２を参照）。
【００２６】
作用剤は、第１の結合ドメインと第２の結合ドメインとの結合を競合的に阻害する低分子であり得る。
【００２７】
例えば、第１の結合ドメインはＴｅｔリプレッサータンパク質（ＴｅｔＲ）を含み得、第２の結合ドメインは転写誘導ペプチド（ＴｉＰ）を含み得る；この逆もまたあり得る；
そして、作用剤はテトラサイクリン、ドキシサイクリン、またはミノサイクリン、あるいはこれらのアナログであり得る。
【００２８】
第１の結合ドメインまたは第２の結合ドメインは、シングルドメインバインダー：ナノボディ、アフィボディ、フィブロネクチン人工抗体スキャフォールド、アンチカリン、アフィリン、ＤＡＲＰｉｎ、ＶＮＡＲ、ｉＢｏｄｙ、アフィマー、フィノマー、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、アブジュリン／ナノ抗体、センチリン、アルファボディ、またはナノフィチンなど、を含み得る。
【００２９】
シングルドメインバインダーは、ドメイン抗体（ｄＡｂ）であるか、またはこれを含み得る。
【００３０】
本発明の第１の側面の転写システムにおいて：
第１の結合ドメインはシングルドメインバインダーを含み得、第２の結合ドメインはシングルドメインバインダーに結合するペプチドを含み得るか、または
第２の結合ドメインはシングルドメインバインダーを含み得、第１の結合ドメインはシングルドメインバインダーに結合するペプチドを含み得るか
のいずれかであって、結合は作用剤によって競合的に阻害される。
【００３１】
作用剤は、例えば、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、またはミノサイクリンであり得る。
【００３２】
当該転写因子は、Ｔ細胞内で発現されたとき、Ｔ細胞の分化および／または疲弊を防ぐか、あるいは低減し得る。
【００３３】
例えば、当該転写因子はセントラルメモリーを促進し得る。当該転写因子は、ＥＯＭＥＳ，ＦＯＸ０１，Ｒｕｎｘ３，ＴＣＦ１，ＬＥＦ１，およびＩＤ３からなる群から選択される。
【００３４】
あるいは、当該転写因子はエフェクターメモリーを促進し得る。当該転写因子は、Ｔ−ｂｅｔ，ＡＰ１，ＩＤ２，ＧＡＴＡ３，およびＲＯＲγｔからなる群から選択され得る。
【００３５】
当該転写因子は、セントラルメモリーリプレッサーであり得る。当該転写因子は、ＢＣＬ６およびＢＡＣＨ２からなる群から選択され得る。
【００３６】
当該転写因子は、ＢＬＩＭＰ−１などのエフェクターメモリーリプレッサーであり得る。
【００３７】
当該転写因子は、Ｂａｃｈ２、またはＡＬＫによってリン酸化される能力を減ぜられているか、もしくは取り除かれている改変されたバージョンのＢａｃｈ２であるか、あるいはこれらを含み得る。改変されたバージョンのＢａｃｈ２は、配列番号８で示されるアミノ酸配列を参照して次の位置：Ｓｅｒ−５３５、Ｓｅｒ−５０９、Ｓｅｒ−５２０のうちの１つまたはそれより多くにおいて変異を含み得る。
【００３８】
当該転写因子は、ＦＯＸＯ１であり得る。
【００３９】
当該転写因子は、ＥＯＭＥＳであり得る。
【００４０】
当該転写因子は、Ｒｕｎｘ３および／またはＣＢＦベータを含み得る。
【００４１】
第２の側面において本発明は、本発明の第１の側面に記載の転写システムをコードする核酸コンストラクトであって、ドッキングコンポーネントをコードする第１の核酸配列、および転写制御コンポーネントをコードする第２の核酸配列を含む、核酸コンストラクトを提供する。
【００４２】
核酸コンストラクトは、次の構造を有し得る：
ＤＣ−ｃｏｅｘｐｒ−ＴＣＣ；または
ＴＣＣ−ｃｏｅｘｐｒ−ＤＣ
であって、式中：
ＤＣがドッキングコンポーネントをコードする核酸配列であり；
ｃｏｅｘｐｒがドッキングコンポーネントおよび転写制御コンポーネントの共発現を可能にする核酸配列であり；そして
ＴＣＣが転写制御コンポーネントをコードする核酸配列である。
【００４３】
核酸コンストラクトは、キメラ抗原受容体をコードする第３の核酸配列も含み得る。
【００４４】
この点において、核酸コンストラクトは、次の構造のうちの１つを有し得る：
ＣＡＲ−ｃｏｅｘｐｒ１−ＤＣ−ｃｏｅｘｐｒ２−ＴＣＣ；
ＣＡＲ−ｃｏｅｘｐｒ１−ＴＣＣ−ｃｏｅｘｐｒ２−ＤＣ；
ＤＣ−ｃｏｅｘｐｒ１−ＴＣＣ−ｃｏｅｘｐｒ２−ＣＡＲ；または
ＴＣＣ−ｃｏｅｘｐｒ１−ＤＣ−ｃｏｅｘｐ２−ＣＡＲ
であって、式中：
ＣＡＲがキメラ抗原受容体をコードする核酸配列であり；
ＤＣがドッキングコンポーネントをコードする核酸配列であり；
同一または相違であり得るｃｏｅｘｐｒ１およびｃｏｅｘｐｒ２が、ドッキングコンポーネント、転写制御コンポーネント、およびキメラ抗原受容体の共発現を可能にする核酸配列であり；そして
ＴＣＣが転写制御コンポーネントをコードする核酸配列である。
【００４５】
上記の構造において、ｃｏｅｘｐｒ、ｃｏｅｘｐｒ１、またはｃｏｅｘｐｒ２は、自己切断ペプチドを含む配列をコードし得る。
【００４６】
第３の側面において本発明は、本発明の第１の側面において定義されるドッキングコンポーネントをコードする第１の核酸配列と；本発明の第１の側面において定義される転写制御コンポーネントをコードする第２の核酸配列とを含む、核酸配列のキットを提供する。
【００４７】
キットは、キメラ抗原受容体をコードする第３の核酸配列も含み得る。
【００４８】
第４の側面において本発明は、本発明の第２の側面に記載される核酸コンストラクトを含むベクターを提供する。
【００４９】
第５の側面において本発明は、本発明の第１の側面において定義されるドッキングコンポーネントをコードする第１の核酸配列を含む第１のベクターと；本発明の第１の側面において定義される転写制御コンポーネントをコードする第２の核酸配列を含む第２のベクターとを含む、ベクターのキットを提供する。
【００５０】
ベクターのキットは、キメラ抗原受容体をコードする第３の核酸配列を含む第３のベクターも含み得る。
【００５１】
第６の側面において、本発明の第１の側面に記載の転写システムを含む細胞が提供される。
【００５２】
当該細胞は、キメラ抗原受容体を発現し得る。
【００５３】
第７の側面において本発明は、本発明の第６の側面に記載の細胞を作るための方法であって、本発明の第２の側面に記載の核酸コンストラクトか、本発明の第３の側面に記載の核酸配列のキットか、本発明の第４の側面に記載のベクターか、または本発明の第５の側面に記載のベクターのキットを、細胞内に導入するステップを含む方法を提供する。
【００５４】
当該細胞は、被験体から単離される試料に由来し得る。
【００５５】
第８の側面において、本発明の第６の側面に記載の細胞の複数種を含む、医薬組成物が提供される。
【００５６】
第９の側面において、本発明の第８の側面に記載の医薬組成物を被験体に投与するステップを含む、疾患の処置および／または予防のための方法が提供される。
【００５７】
当該方法は、以下のステップを含み得る：
（ｉ）被験体から細胞を含む試料を単離することと；
（ｉｉ）本発明の第２の側面に記載の核酸コンストラクトか、本発明の第３の側面に記載の核酸配列のキットか、本発明の第４の側面に記載のベクターか、または本発明の第５の側面に記載のベクターのキットを用いて、細胞の形質導入またはトランスフェクションをすることと；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）に由来する細胞を被験体に投与すること。
【００５８】
第１０の側面において、疾患の処置および／または予防における使用のための、本発明の第８の側面に記載の医薬組成物が提供される。
【００５９】
第１１の側面において、疾患の処置および／または予防のための医薬の製造における、本発明の第６の側面に記載の細胞の使用が提供される。
【００６０】
本発明の第９、１０、および１１の側面に関連して、疾患はがんであり得る。
【００６１】
第１２の側面において、本発明の第６の側面に記載の細胞内で、遺伝子の転写を調節するための方法（ａｍｅｔｈｏｄ）であって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、細胞へと作用剤を投与するステップを含む、方法が提供される。
【００６２】
第１３の側面において、被験体内の本発明の第６の側面に記載の細胞内で、遺伝子の転写をｉｎ  ｖｉｖｏで調節するための方法であって、被験体へと作用剤を投与するステップを含む、方法が提供される。
【００６３】
記載の方法は、次のステップを含み得る：
ａ）本発明の第７の側面に記載の医薬組成物の、被験体への投与；および
ｂ）作用剤の、被験体への投与
であって、ａ）およびｂ）が、いずれかの順番で、または同時に投与される。
【００６４】
第１４の側面において本発明は、Ｔ細胞内で発現されたとき、Ｔ細胞の分化および／または疲弊を防ぐか、あるいは低減する転写因子を含む、本発明の第１の側面に記載の転写システムを含む細胞内で、Ｔ細胞の分化または疲弊を防ぐか、あるいは低減するための方法であって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで作用剤を細胞へと投与するステップを含む方法を提供する。
【００６５】
第１５の側面において本発明は、Ｔ細胞内で発現されたとき、Ｔ細胞の分化および／または疲弊を防ぐか、あるいは低減する転写因子を含む、本発明の第１の側面に記載の転写システムを含む細胞内で、被験体内のＴ細胞の分化または疲弊をｉｎ  ｖｉｖｏで防ぐか、あるいは低減するための方法であって、作用剤を被験体へと投与するステップを含む方法を提供する。
【００６６】
当該方法は、次のステップを含み得る：
ａ）本発明の第７の側面に記載の医薬組成物の被験体への投与であって、その中で細胞が、Ｔ細胞内で発現されたときにＴ細胞の分化および／または疲弊を防ぐかあるいは低減する転写システムを含む；および
ｂ）作用剤の、被験体への投与
であって、ａ）およびｂ）がいずれかの順番で、あるいは同時に投与される。
【００６７】
第１６の側面において本発明は、第１の結合ドメインと第２の結合ドメインとの結合を妨害する作用剤、ならびに本発明の第６の側面に記載の細胞の複数種を含む、組成物を提供する。
【００６８】
本発明の転写システムは、外部から投与される作用剤によって制御可能なヘテロ二量体形成システムを使用して細胞内での転写因子の局在を制御し、その結果、転写因子の、１種またはそれより多くの種類の標的遺伝子の転写を上方調節または下方調節する能力を制御する。
【００６９】
転写システムが天然の転写因子を利用する場合、その転写因子に関連する標的遺伝子（複数可）の転写を、人工的な配列エレメントを含むように当該標的遺伝子を操作することなく、制御することが可能である。これにより当該システムは、プロモーターの上流にいくつかのＴｅｔＯ配列を挿入しなければならない古典的なＴｅｔベースのシステムと比較して（ｔｈａｔ）、ずいぶんと簡潔になる。
【００７０】
転写は、本発明のヘテロ二量体形成システムを用いて、ドッキングコンポーネントの細胞内での局在に依存的にオンまたはオフにされ得る（図１および図２の各々に示される、本発明の第１の側面の第１または第２の実施形態）。したがって、ドッキングコンポーネントおよび転写制御コンポーネント内のドメインの配置を選ぶことにより、同じ転写因子（これが、転写のサプレッサーであるか、またはアクチベーターであるかを問わず）を用いて、転写を上方調節および下方調節することが可能である。
【００７１】
本発明の転写システムにおける使用のために、ヘテロ二量体形成システムと、これに対応する妨害作用剤とを選ぶことも可能である。これは、望ましい特性（哺乳動物細胞内で薬理学的に不活性であること、優れた分布容積および細胞貫通性を有していること、など）を有する作用剤を選択できる、ということを意味する。本発明のシステムは、その実施について特定のホルモンまたは抗生物質に限定されない。
【００７２】
したがって本発明は、外部から投与される作用剤によって制御可能である、遺伝子発現の調節のための、簡潔、モジュラーかつ非常に柔軟な、転写システムを提供する。
【００７３】
詳細な説明
転写システム
本発明は、ドッキングコンポーネントと転写制御コンポーネントとを含む転写システムを提供する。ドッキングコンポーネントおよび転写制御コンポーネントは二量体形成結合ドメインを含み、これらのドメイン間の相互作用は作用剤の存在により妨害され得る。
【００７４】
ドッキングコンポーネント
ドッキングコンポーネントは、転写制御コンポーネントを細胞質内（遺伝子の転写に影響を与えない場所）；または核内（転写制御コンポーネントが、１種またはそれより多くの種類の標的遺伝子の転写を上方調節または下方調整する場所）のいずれかにつなぎとめるアンカーとして働く。
【００７５】
ドッキングコンポーネントは、転写制御コンポーネント上の相互ドメインと相互作用する第１のヘテロ二量体形成ドメインを含む。
【００７６】
本発明の第１の実施形態において、ドッキングコンポーネントは膜局在化ドメインを含み、（作用剤の非存在下で）細胞膜近位の細胞質内に転写制御コンポーネントを局在させる。
【００７７】
本発明の第２の実施形態において、ドッキングコンポーネントは核局在化シグナルを含み、（作用剤の非存在下で）核内に転写制御エレメントを局在させる。核内に局在すると、転写制御エレメントの一部である転写因子は、１種またはそれより多くの種類の標的遺伝子の転写を上方調節するか、または下方調節し得る。
【００７８】
転写制御コンポーネント
本発明の転写システムの転写制御コンポーネントは、転写因子、およびドッキングコンポーネント上の相互ドメインと相互作用する第１のヘテロ二量体形成ドメインを含む。
【００７９】
本発明の第１の実施形態において、転写制御コンポーネントは核局在化シグナルを含み、そのため、作用剤の存在下で転写制御コンポーネントがドッキングコンポーネントから分離すると、転写制御コンポーネントは核へと移行し、そこで転写制御エレメントの一部である転写因子は、１種またはそれより多くの種類の標的遺伝子の転写を上方調節または下方調節し得る。
【００８０】
本発明の第２の実施形態において、転写制御コンポーネントは核外輸送シグナルを含み、そのため、作用剤の存在下で転写制御コンポーネントがドッキングコンポーネントから分離すると、転写制御コンポーネントは核外へと移行し、転写因子の媒介する遺伝子の転写の制御はオフにされる。
【００８１】
ターゲティングペプチド
細胞内でのタンパク質ターゲティングのプロセス中に、タンパク質は、細胞内で適切に局在する（すなわち、オルガネラ、細胞内膜、細胞膜、または分泌を介して細胞外部）ように指示される；これは、タンパク質自体に含まれる情報に基づく。
【００８２】
この情報は、ターゲティングペプチド（一続きのアミノ酸配列である）；あるいは、ターゲティングパッチ（ポリペプチドの一次配列内に分散されているが、フォールディング後には機能的な形状へとまとめ上げられる、２つまたはそれより多くの数の配列を含む）という形をとり得る。
【００８３】
ターゲティングペプチドまたはターゲティングパッチは、一般に３から７０のアミノ酸を含む。この配列（複数可）が、細胞内の特定の領域（核、ミトコンドリア、小胞体、または細胞膜など）へのタンパク質の輸送を指示する。
【００８４】
膜局在化ドメイン
本発明の第１の実施形態において、ドッキングコンポーネントは膜局在化ドメインを含む。このドメインは、ドッキングコンポーネントを細胞膜に取りつけさせるか、または細胞膜の近位に保持させる、任意の配列であり得る。
【００８５】
膜局在化ドメインは、新生ポリペプチドをまずはＥＲ膜へと取り付けさせる配列であり得る。膜の物質はＥＲからゴルジへと、そして最終的に細胞膜へと「流れる」ため、当該タンパク質は、合成／輸送プロセスの終わりにおいても膜と会合したままである。
【００８６】
膜局在化ドメインは、例えば、膜貫通配列、輸送停止配列、ＧＰＩアンカー、またはミリストイル化／プレニル化／パルミトイル化部位を含み得る。
【００８７】
あるいは膜局在化ドメインは、細胞膜に局在するタンパク質または他のエンティティへと（例えば、膜近位のエンティティへの結合により）ドッキングコンポーネントを向かわせ得る。ドッキングコンポーネントは、例えば、免疫シナプスに関与する分子（ＴＣＲ／ＣＤ３，ＣＤ４，またはＣＤ８など）に結合するドメインを含み得る。
【００８８】
ミリストイル化は脂肪付加修飾であり、この修飾においては、ミリスチン酸に由来するミリストイル基が、アミド結合により、Ｎ末端グリシン残基のアルファアミノ基へと共有結合する。ミリスチン酸は炭素数１４の飽和脂肪酸であり、ｎ−テトラデカン酸としても知られる。この修飾は、翻訳と同時に、または翻訳後のいずれかに付加され得る。Ｎ−ミリストイルトランスフェラーゼ（ＮＭＴ）は、細胞の細胞質においてミリスチル酸付加反応を触媒する。疎水性であるミリストイル基は細胞膜内のリン脂質と相互作用するため、ミリストイル化は、これを取り付けられたタンパク質の膜へのターゲティングを引き起こす。
【００８９】
本発明のドッキングコンポーネントは、ＮＭＴ酵素によってミリストイル化され得る配列を含み得る。本発明のドッキングコンポーネントは、細胞内で発現されたときにミリストイル基を含み得る。
【００９０】
ドッキングコンポーネントは、ＮＭＴ酵素によって認識されるコンセンサス配列（ＮＨ２−Ｇ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｓ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８など）を含み得る。
【００９１】
パルミトイル化は、タンパク質のシステイン残基、ならびより低頻度でセリンおよびスレオニン残基に、パルミチン酸などの脂肪酸を、共有結合により取り付けることである。パルミトイル化はタンパク質の疎水性を増強し、膜との会合を誘導するために用いられ得る。プレニル化およびミリストイル化とは対照的に、パルミトイル化は通常、可逆的である（多くの場合、パルミチン酸とタンパク質との間の結合がチオエステル結合であるため）。逆反応は、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼにより触媒される。
【００９２】
Ｇタンパク質を介したシグナル伝達において、αサブユニットのパルミトイル化、γサブユニットのプレニル化、およびミリストイル化は、Ｇタンパク質を細胞膜の内側表面へとつなぎとめることに関与し、その結果、Ｇタンパク質がその受容体と相互作用できるようになる。
【００９３】
本発明のドッキングコンポーネントは、パルミトイル化され得る配列を含み得る。本発明のドッキングコンポーネントは追加の脂肪酸を含み得、細胞内で発現されたときに膜への局在を引き起こす。
【００９４】
プレニル化（イソプレニル化または脂肪付加としても知られる）は、タンパク質または化合物への疎水性分子の付加である。プレニル基（３−メチル−ブタ−２−エン−１−イル）は、ＧＰＩアンカーのような脂質アンカーと同様に、細胞膜への取り付けを容易にする。
【００９５】
タンパク質のプレニル化は、ファルネシル部分またはゲラニル−ゲラニル部分のいずれかの、標的タンパク質のＣ末端システイン（複数可）への転移を伴う。細胞内でプレニル化を行う、３種の酵素（ファルネシルトランスフェラーゼ、Ｃａａｘプロテアーゼ、およびゲラニルゲラニルトランスフェラーゼＩ）がある。
【００９６】
本発明のドッキングコンポーネントは、プレニル化され得る配列を含み得る。本発明のドッキングコンポーネントは１つまたはそれより多くの数のプレニル基を含み得、細胞内で発現されたときに膜への局在を引き起こす。
【００９７】
核外輸送シグナル
核外輸送シグナル（ＮＥＳ）はタンパク質中の４つの疎水性残基という短いアミノ酸配列であり、そのタンパク質を、核膜孔複合体を通って細胞核から細胞質へと至る、核輸送を用いた輸送の標的にする。このシグナルは、細胞質内に局在するタンパク質を核への移入の標的にする核局在化シグナルとは、反対の効果を有する。ＮＥＳは、エクスポーチンによって認識され、結合される。
【００９８】
ＮＥＳは多くの場合、いくつかの疎水性アミノ酸（多くの場合ロイシン）からなり、２から３個の他のアミノ酸がその間に配置される。既知のＮＥＳのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ解析により、疎水性残基の最も一般的なスペーシングが、ＬｘｘｘＬｘｘＬｘＬ（”Ｌ”は疎水性残基（多くの場合ロイシン）であり、”ｘ”は他の任意のアミノ酸）であることが見出された。
【００９９】
ＮＥＳｄｂデータベースは、２００種を超える核外輸送シグナルを収載している（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ（２０１２）Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  ２３：３６７７−３６９３）。
【０１００】
核局在化シグナル
核局在化シグナルまたは核局在化配列（ＮＬＳ）は、核輸送によって細胞核へと移入するためにタンパク質を「タグ」付けするアミノ酸配列である。典型的には、このシグナルは、タンパク質表面に露出される正電荷を帯びたアミノ酸（リシンまたはアルギニンなど）の、１つまたはそれより多くの短い（例えば、５アミノ酸の）配列からなる。ＮＬＳは、ポリペプチド鎖上のいかなる場所にも位置し得る。様々な核局在タンパク質が、同じＮＬＳを共有し得る。
【０１０１】
タンパク質は、核膜を通って核へと入る。核膜は、外膜と内膜という同心円状の膜からなる。内膜と外膜とは複数の部位でつながり、細胞質と核質との間にチャネルを形成する。このチャネルは、核膜を横断する輸送を媒介する複合多タンパク質構造である、核膜孔複合体（ＮＰＣ）によって占有される。
【０１０２】
翻訳されたＮＬＳを有するタンパク質はインポーチン（カリオフェリンとしても知られる）に強く結合し、続いて、この複合体が核膜孔を通って移動する。
【０１０３】
古典的なＮＬＳは、単節型または双節型のいずれかである。最初に発見されたＮＬＳは、ＳＶ４０ラージＴ抗原中の配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１）であった（単節型ＮＬＳ）。ヌクレオプラスミンのＮＬＳであるＫＲ［ＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡ］ＫＫＫＫ（配列番号２）は、遍在する双節型シグナル（約１０アミノ酸のスペーサによって分離された、塩基性アミノ酸の２つのクラスター）のプロトタイプである。いずれのシグナルも、インポーチンαによって認識される。
【０１０４】
単節型ＮＬＳは、コンセンサス配列（例えば、Ｋ−Ｋ／Ｒ−Ｘ−Ｋ／Ｒ）を有し得る。この配列は、双節型ＮＬＳの塩基性クラスターの下流側の一部であり得る。
【０１０５】
核局在化シグナルの他の例として、ヌクレオプラスミン（ＡＶＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫＬＤ−配列番号３）、ＥＧＬ−１３（ＭＳＲＲＲＫＡＮＰＴＫＬＳＥＮＡＫＫＬＡＫＥＶＥＮ−配列番号４）、ｃ−Ｍｙｃ（ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ−配列番号５）、およびＴＵＳ−タンパク質（ＫＬＫＩＫＲＰＶＫ−配列番号６）のＮＬＳを融合されたｅＧＦＰが挙げられる。
【０１０６】
多くの他のタイプの「非古典的な」ＮＬＳがあり、例えば、ｈｎＲＮＰ  Ａ１の酸性Ｍ９ドメイン、イースト転写リプレッサーＭａｔα２中の配列ＫＩＰＩＫ、およびＵ  ｓｎＲＮＰの複合シグナルなどがある。これらのＮＬＳの多くは、インポーチンβファミリーの特定の受容体によって、インポーチンα様タンパク質の介入なしに、直接的に認識されるように思われる。
【０１０７】
転写因子
本発明の転写システムの転写制御コンポーネントは、転写因子を含む。
【０１０８】
転写因子は特定のＤＮＡ配列に結合して、その配列を含むかまたは隣接する遺伝子の発現を調節することで、ＤＮＡからメッセンジャーＲＮＡへの遺伝情報の転写速度を制御するタンパク質である。
【０１０９】
転写因子は、ＲＮＡポリメラーゼの動員を促進（アクチベーターとして）するか、または妨害（リプレッサーとして）することで働く。
【０１１０】
本発明の第１の実施形態において、作用剤の存在は、転写制御コンポーネントを（したがって、転写因子を）核に再局在させる。したがって、転写因子がアクチベーターである場合、このシステムにおいて作用剤の存在は、標的遺伝子の転写を上方調節する。転写因子がリプレッサーである場合、作用剤の存在は標的遺伝子の転写を下方調節する。
【０１１１】
本発明の第２の実施形態において、作用剤の存在は、転写制御コンポーネントを（したがって、転写因子を）核から出させ、細胞質に再局在させる。したがって、転写因子がアクチベーターである場合、このシステムにおいて作用剤の存在は、標的遺伝子の転写を下方調節する。転写因子がリプレッサーである場合、作用剤の存在は、阻害を解除して標的遺伝子の転写の上方調節を引き起こす。
【０１１２】
転写因子は、ＤＮＡのエンハンサー領域またはプロモーター領域のいずれかに取りつく、少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を含む。転写因子に依存して、隣接する遺伝子の転写が上方または下方調節される。転写因子は、他のタンパク質（転写コレギュレーターなど）のための結合部位を有するトランス活性化ドメイン（ＴＡＤ）も含む。
【０１１３】
遺伝子発現の調節のために転写因子は様々な手段を用い、この手段としてＲＮＡポリメラーゼのＤＮＡへの結合の安定化もしくは妨害、またはヒストンタンパク質のアセチル化もしくは脱アセチル化の触媒が挙げられる。転写因子は、ヒストンタンパク質をアセチル化してＤＮＡとヒストンとの結合を弱め、そしてＤＮＡを転写しやすくし、これにより転写が上方調節される、ヒストンアセチル基転移酵素（ＨＡＴ）としての活性を有し得る。あるいは転写因子は、ヒストンタンパク質を脱アセチル化してＤＮＡとヒストンの結合を強め、そしてＤＮＡを転写しにくくし、これにより転写が下方調節される、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）としての活性を有し得る。転写因子が機能し得る別の機構は、転写因子ＤＮＡ複合体へのコアクチベーターまたはコリプレッサータンパク質の動員による。
【０１１４】
基本転写因子または上流転写因子という、２つの機構クラスの転写因子がある。
【０１１５】
基本転写因子は、転写開始前複合体の形成にかかわる。もっとも一般的なものは、ＴＦＩＩＡ，ＴＦＩＩＢ，ＴＦＩＩＤ，ＴＦＩＩＥ，ＴＦＩＩＦ，およびＴＦＩＩＨと略される。これらは遍在し、全てのクラスＩＩ遺伝子の転写開始部位（複数可）を囲むコアプロモーター領域と相互作用する。
【０１１６】
上流転写因子は、転写を刺激または抑制するために開始部位の上流に結合するタンパク質である。上流転写因子は、遺伝子の近くにどのような認識配列が存在するかに依存して相当に多様であるゆえに、これらは特定の転写因子と同義である。
特定の転写因子のいくつかの例を、以下の表において示す：
【表３−１】
2020501574.tif 000002
【表３−２】
2020501574.tif 000003
【０１１７】
転写因子はしばしば、配列の類似性、およびこれによるそのＤＮＡ結合ドメインの三次構造に基づいて分類される。
【０１１８】
ベーシックドメインを有する転写因子として、ロイシンジッパー因子（例えば、ｂＺＩＰ，ｃ−Ｆｏｓ／ｃ−Ｊｕｎ，ＣＲＥＢ，および植物のＧボックス結合因子）と；ヘリックスループヘリックス因子（例えば、ユビキタス（クラスＡ）因子；筋原性転写因子（ＭｙｏＤ）；Ａｃｈａｅｔｅ−ＳｃｕｔｅおよびＴａｌ／Ｔｗｉｓｔ／Ａｔｏｎａｌ／Ｈｅｎ）と；ヘリックスループヘリックス／ロイシンジッパー因子（例えば、ｂＨＬＨ−ＺＩＰ，ｃ−Ｍｙｃ，ＮＦ−１（Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｘ），ＲＦ−Ｘ（１，２，３，４，５，ＡＮＫ），およびｂＨＳＨ）とが挙げられる。
【０１１９】
亜鉛配位ＤＮＡ結合ドメインを有する転写因子として、核内受容体型のＣｙｓ４ジンクフィンガー（ステロイドホルモン受容体および甲状腺ホルモン受容体類似因子など）と；ダイバースＣｙｓ４ジンクフィンガー（ＧＡＴＡ因子など）と；Ｃｙｓ２Ｈｉｓ２ジンクフィンガードメイン（ＴＦＩＩＩＡおよびＳｐ１を含むユビキタス因子など）と；Ｋｒｕｐｐｅｌを含む発生／細胞周期調節因子と；ＮＦ−６Ｂ類似結合特性を有する大型因子と；Ｃｙｓ６システイン−亜鉛クラスターおよび交互配置型ジンクフィンガーとが挙げられる。
【０１２０】
ヘリックスターンヘリックスドメインを有する転写因子として、ホメオドメインを持つものと；ペアードボックスと；フォークヘッド／ウィングドヘリックスと；熱ショック因子と；トリプトファンクラスターと；ＴＥＡＤ１，ＴＥＡＤ２，ＴＥＡＤ３，ＴＥＡＤ４などのＴＥＡ（転写エンハンサー因子）ドメインとが挙げられる。
【０１２１】
最後に、副構との接触を伴うベータスキャフォールド因子があり、ＲＨＲ（Ｒｅｌ相同領域）クラスと；ＳＴＡＴと；ｐ５３と；ＭＡＤＳボックスと；ベータバレルアルファヘリックス転写因子と；ＴＡＴＡ結合タンパク質と；ＨＭＧボックスと；ヘテロメリックＣＣＡＡＴ因子と；Ｇｒａｉｎｙｈｅａｄと；低温ショックドメイン因子と；Ｒｕｎｔとが挙げられる。
【０１２２】
本発明の転写因子は、恒常的活性化型であるか、または条件的活性化型（すなわち、活性化を要する）であり得る。
【０１２３】
転写因子は天然由来であるか、または人工的であり得る。
【０１２４】
Ｔ細胞分化の抑制
活性化の後にＴ細胞は、図３に示す様々なＴ細胞サブタイプへと分化する。Ｔ細胞を用いる自家免疫治療アプローチにおいて、被験体内でのＴ細胞の持続性および生着性は、被験体へと投与されるナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、およびＴ幹細胞様メモリーＴ細胞の割合に関連すると考えられている。
【０１２５】
本発明の転写システムは、患者に投与するための組成物内で、ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、および／または幹細胞様メモリーＴ細胞の割合を効果的に増やすように、遺伝子発現を上方調節または下方調節し得る。
【０１２６】
本発明の第１の実施形態において、作用剤の存在は、転写因子を核へと移行させ、そこで転写因子は、１種またはそれより多くの種類の標的遺伝子の転写においてその効果を発揮し得る。
【０１２７】
本発明の第１の実施形態と関連して、転写因子は例えば、セントラルメモリーをリプレスする転写因子（ＢＣＬ６またはＢＡＣＨ２など）であり得る。セントラルメモリーリプレッサーは、Ｔ細胞のエフェクターメモリー細胞への分化を阻害し、そのためＴ細胞が、あまり分化していないＴ細胞サブタイプのもの（ナイーブＴ細胞および幹細胞様メモリーＴ細胞など）として残る。これらのリプレッサーは、図３に示す様々なステージを通してＴ細胞の分化速度を妨害または減少させ、Ｔ細胞集団をよりナイーブな表現型へとバイアスする。
【０１２８】
あるいは、本発明の第１の実施形態と関連して、当該転写因子は、エフェクターメモリーをリプレスする転写因子（ＢＬＩＭＰ−１など）であり得る。
【０１２９】
本発明の第２の実施形態において、作用剤の存在は、転写因子を細胞質へと移行させ、そのため、転写因子は標的遺伝子（複数可）の転写に、もはや影響しなくなる。
【０１３０】
本発明の第２の実施形態と関連して、当該転写因子は例えば、セントラルメモリー転写因子（ＥＯＭＥＳ，ＦＯＸ０１，Ｒｕｎｘ３，ＴＣＦ１，ＬＥＦ１，またはＩＤ３など）であり得る。セントラルメモリー転写因子は、エフェクターメモリー細胞へのＴ細胞の分化を促進する。作用剤の存在によるセントラルメモリー転写因子の阻害は、この機能をブロックし、これはつまり、細胞が、あまり分化していないＴ細胞サブタイプのもの（ナイーブＴ細胞および幹細胞様メモリーＴ細胞など）として残る、ということを意味する。
【０１３１】
あるいは、本発明の第２の実施形態と関連して、当該転写因子は、エフェクターメモリー転写因子（Ｔ−ｂｅｔ，ＡＰ１，ＩＤ２，ＧＡＴＡ３，またはＲＯＲγｔなど）であり得る。
【０１３２】
ＢＣＬ６
Ｂ細胞リンフォーマタンパク質（ＢＣＬ６）は、Ｎ末にＰＯＺ／ＢＴＢドメインを含む、進化的に保存されたジンクフィンガー転写因子である。ＢＣＬ６は配列特異的な転写のリプレッサーとして働き、Ｂ細胞のＳＴＡＴ依存的なインターロイキン４（ＩＬ−４）応答を調整することが示されている。ＢＣＬ６は、いくつかのコリプレッサー複合体と相互作用して転写を阻害する。
【０１３３】
ＢＣＬ６のアミノ酸配列はＵｎｉＰｒｏｔ（アクセッション番号Ｐ４１１８２）から入手でき、配列番号７として以下に示す。
配列番号７−ＢＣＬ６
【化１】
2020501574.tif 000004
【０１３４】
ＢＣＬ６は、以下のアミノ酸位置：５１８−５４１，５４６−５６８，５７４−５９６，６０２−６２４，６３０−６５２，６５８−６８１に、６つのジンクフィンガーを含む。
【０１３５】
ＢＡＣＨ２
Ｂｒｏａｄ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ａｎｄ  ｃａｐ’ｎ’ｃｏｌｌａｒ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ（Ｂａｃｈ）２タンパク質は、ｂｒｉｃ−ａ−ｂｒａｃ  ａｎｄ  ｔｒａｍｔｒａｃｋとしても知られる、９２ｋＤａの転写因子である。Ｂａｃｈ２タンパク質はベーシックロイシンジッパードメインを介して、ｍｕｓｃｕｌｏａｐｏｎｅｕｒｏｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓａｒｃｏｍａ（Ｍａｆ）ファミリーのタンパク質とヘテロ二量体を形成する。Ｂａｃｈ２の遺伝子座はスーパーエンハンサー（ＳＥ）内にあり、そしてＳＥに調節される遺伝子の発現を調節する。ＳＥは細胞系列遺伝子の発現に重要である。Ｔ細胞においては、ＳＥに調節される遺伝子の大部分が、サイトカインおよびサイトカイン受容体の遺伝子である。Ｂａｃｈ２は、全てのＴ細胞系列においてＳＥと関連する、主要な遺伝子である。
【０１３６】
Ｂａｃｈ２タンパク質は、７２のリン酸化部位からなる。これらの部位のうちＳｅｒ−３３５は、Ａｋｔの標的となるコンセンサス配列（ＲＸＲＸＸ（Ｓ／Ｔ）Ｘ）からなる。１１の部位（Ｓｅｒ−２６０，Ｓｅｒ−３１４，Ｔｈｒ−３１８，Ｔｈｒ−３２１，Ｓｅｒ−３３６，Ｓｅｒ−４０８，Ｔｈｒ−４４２，Ｓｅｒ−５０９，Ｓｅｒ−５３５，Ｓｅｒ−５４７，およびＳｅｒ−７１８）は、ｍＴＯＲの標的コンセンサス配列（＋１位のプロリン）を生ずる。Ｓｅｒ−５３５およびＳｅｒ−５０９のＡｌａへの置換は、Ｂａｃｈ２の核局在を増やし、その標的遺伝子の下方調節を増強する。
【０１３７】
Ｓｅｒ−５２０部位は、リン酸化についてのＡｋｔの基質として同定された。Ｓｅｒ−５２０のＡｌａへの置換は、Ｂａｃｈ２のリプレッサー能力も増加する。ＷＴまたは変異型Ｂａｃｈ２へのｅＧＦＰの融合により、Ｓ５２０Ａ  Ｂａｃｈ２の核局在の増強が明らかになった。Ｔ細胞活性化の際のＢａｃｈ２のリン酸化は、細胞質へのＢａｃｈ２の分離をもたらす。リン酸化部位での変異は、このような分離に対してＢａｃｈ２に抵抗性を与え、したがって、その核への局在を増やす。
【０１３８】
転写制御コンポーネントは、野生型タンパク質と比較してより核局在するＢａｃｈ２のバリアントを含み得る。当該バリアントは、配列番号８で示される配列を参照してＳｅｒ−５３５，Ｓｅｒ−５２０，またはＳｅｒ−５０９において変異を有し得る。当該変異は、ＳｅｒからＡｌａへの置換などの置換であり得る。
【０１３９】
Ｂａｃｈ２はコンセンサスモチーフ（５’−ＴＧＡ（Ｃ／Ｇ）ＴＣＡＧＣ−３’）に結合し、このモチーフはＡＰ−１ファミリーによって認識されるモチーフ（５’−ＴＧＡ（Ｃ／Ｇ）ＴＣＡ−３’）の一部である。転写因子であるＡＰ−１ファミリーは、ＴＣＲ活性化の下流の遺伝子の発現の誘導に関与する。ＡＰ−１転写因子ファミリーとしてｃ−Ｊｕｎ，ＪｕｎＢおよびｃ−Ｆｏｓが挙げられる。ＡＰ−１因子は、ＴＣＲ活性化に際してリン酸化され、その後エフェクターへの分化に関与する遺伝子を調節する。Ｂａｃｈ２は、重複するモチーフへの結合についてＡＰ−１と競合することで、これらの遺伝子の活性化をリプレスする。
【０１４０】
Ｂａｃｈ２のｍＲＮＡの発現はナイーブＣＤ８Ｔ細胞において高く、そしてセントラルメモリー細胞（ＣＤ６２Ｌ＋ＫＬＲＧ１−）、エフェクター細胞（ＣＤ６２Ｌ−ＫＬＲＧ１−）、および終末分化したエフェクター細胞（ＣＤ６２Ｌ−ＫＬＲＧ１＋）において、徐々に下方調節される。Ｂａｃｈ２の欠損は終末分化したＴ細胞をもたらし、アポトーシスを増加させる。
【０１４１】
Ｂａｃ２のアミノ酸配列はＵｎｉＰｒｏｔ（アクセッション番号Ｑ９ＢＹＶ９）から入手でき、配列番号８として以下に示す。
配列番号８−Ｂａｃｈ−２野生型
【化２】
2020501574.tif 000005
【０１４２】
５２０位においてＳからＡへの置換を有する変異型Ｂａｃｈ２の配列を、配列番号９として示す。Ｓ５２０Ａ置換は、太字で下線を引かれている。
配列番号９−Ｓ５２０Ａ  Ｂａｃｈ２変異体（ＡＫＴに対して非感受的）
【化３】
2020501574.tif 000006
【化４】
2020501574.tif 000007
【０１４３】
ＢＬＩＭＰ−１
Ｂ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １（ＢＬＩＭＰ１）は、ベータインターフェロン（β−ＩＦＮ）遺伝子発現のリプレッサーとして働く。このタンパク質は、β−ＩＦＮ遺伝子プロモーターのＰＲＤＩ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｄｏｍａｉｎ  Ｉ  ｅｌｅｍｅｎｔ）と特異的に結合する。
【０１４４】
Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、ＮＫ細胞および他の免疫系細胞内でＢｌｉｍｐ−１タンパク質の発現が増加すると、抗体を分泌するプラズマ細胞の増殖および分化を介して免疫反応が起こる。Ｂｌｉｍｐ−１は、造血幹細胞の「マスターレギュレーター」であるとも考えられている。
【０１４５】
ＢＬＩＭＰ−１は抗体分泌細胞（ＡＳＣ）の終末分化制御に関与し、エフェクターＴ細胞の恒常性の維持において重要な役割を果たす。
【０１４６】
ＢＬＩＭＰ−１のアミノ酸配列はＵｎｉＰｒｏｔ（アクセッション番号Ｏ７５６２６）から入手でき、配列番号１０として以下に示す。
配列番号１０−ＢＬＩＭＰ−１
【化５】
2020501574.tif 000008
【化６】
2020501574.tif 000009
【０１４７】
ＥＯＭＥＳ
Ｅｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎ（Ｅｏｍｅｓ）はＴ−ｂｏｘ  ｂｒａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２（Ｔｂｒ２）としても知られ、ヒトにおいてはＥＯＭＥＳ遺伝子によってコードされるタンパク質である。Ｔボックス遺伝子は、転写因子をコードする。Ｅｏｍｅｓは免疫応答に関与し、ＣＤ８＋Ｔ細胞において強く発現されるが、ＣＤ４＋Ｔ細胞では発現されない。
【０１４８】
Ｅｏｍｅｓのアミノ酸配列はＵｎｉＰｒｏｔ（アクセッション番号Ｏ９５９３６）から入手でき、配列番号１１として以下に示す。
配列番号１１−ＥＯＭＥＳ
【化７】
2020501574.tif 000010
【化８】
2020501574.tif 000011
【０１４９】
ＦＯＸ０１
フォークヘッドボックスタンパク質Ｏ１（ＦＯＸＯ１）は、横紋筋肉腫におけるフォークヘッドとしても知られ、ヒトにおいてはＦＯＸＯ１遺伝子によってコードされるタンパク質である。ＦＯＸＯ１はインスリンシグナリングによる糖新生およびグリコーゲン分解の調節において重要な役割を果たす転写因子であり、そして前脂肪細胞の脂肪生成への関与決定の中心でもある。
【０１５０】
ＦＯＸ０１のアミノ酸配列はＵｎｉＰｒｏｔ（アクセッション番号Ｏ１２７７８）から入手でき、配列番号１２として以下に示す。
配列番号１２−ＦＯＸ０１
【化９】
2020501574.tif 000012
【０１５１】
ＲＵＮＸ３
Ｒｕｎｔ関連転写因子３（Ｒｕｎｘ３）は、ｒｕｎｔドメインを含む転写因子ファミリーのメンバーである。このタンパク質とベータサブユニットのヘテロ二量体は、多数のエンハンサーおよびプロモーター内に見いだされるコアＤＮＡ配列（５’−ＹＧＹＧＧＴ−３’）に結合して複合体を形成し、転写を活性化または抑制し得る。
【０１５２】
ＲＵＮＸ３のアミノ酸配列はＵｎｉＰｒｏｔ（アクセッション番号Ｏ１３７６１）から入手でき、配列番号１３として以下に示す。
配列番号１３−ＲＵＮＸ３
【化１０】
2020501574.tif 000013
【０１５３】
ＴＣＦ１
ＴＣＦ−１は、ＨＮＦ−１αとしても知られ、肝臓、腎臓、膵臓、腸、胃、脾臓、胸腺、および睾丸を含む内胚葉由来の器官と、ヒト皮膚におけるケラチノサイトおよびメラノサイトとに発現される転写因子である。ＴＣＦ−１は、腸上皮細胞の成長および細胞系列分化に影響することが示されている。
【０１５４】
ＴＣＦ−１のアミノ酸配列はＵｎｉＰｒｏｔ（アクセッション番号Ｐ２０８２３）から入手でき、配列番号１４として以下に示す。
配列番号１４−ＴＣＦ１
【化１１】
2020501574.tif 000014
【化１２】
2020501574.tif 000015
【０１５５】
ＬＥＦ１
リンパ系エンハンサー結合因子−１（ＬＥＦ１）は４８ｋＤの核タンパク質であり、プレＢ細胞およびＴ細胞内で発現される。ＬＥＦ１は、Ｔ細胞受容体アルファ（ＴＣＲＡ）エンハンサー内の機能的に重要な部位に結合し、最大のエンハンサー活性を与える。ＬＥＦ１は、高移動度タンパク質−１（ＨＭＧ１）との相同性を共有する調節タンパク質のファミリーに属する。
【０１５６】
ＬＥＦ１のアミノ酸配列はＵｎｉＰｒｏｔ（アクセッション番号Ｑ９ＵＪＵ２）から入手でき、配列番号１５として以下に示す。
配列番号１５−ＬＥＦ１
【化１３】
2020501574.tif 000016
【０１５７】
ＩＤ３
ＤＮＡ結合タンパク質阻害因子ＩＤ−３はヘリックスループヘリックス（ＨＬＨ）タンパク質のＩＤファミリーのメンバーであり、これはベーシックＤＮＡ結合ドメインを欠く。そして、ＤＮＡと結合できない非機能性二量体の形成を通して転写を阻害する。
【０１５８】
ＩＤ３のアミノ酸配列はＵｎｉＰｒｏｔ（アクセッション番号Ｑ０２５３５）から入手でき、配列番号１６として以下に示す。
配列番号１６−ＩＤ３
【化１４】
2020501574.tif 000017
【０１５９】
Ｔ−ＢＥＴ
Ｔ−ｂｅｔ、またはＴボックス転写因子ＴＢＸ２１は、ＴＢＸ２１遺伝子によってコードされ、そして一般的なＤＮＡ結合ドメインであるＴボックスを共有する、系統学的に保存された遺伝子ファミリーのメンバーである。Ｔボックス遺伝子は、発生プロセスの調節に関与する転写因子をコードする。この遺伝子は、マウスのＴｂｘ２１／Ｔｂｅｔ遺伝子のヒトにおけるオーソログである。マウスについての研究では、Ｔｂｘ２１タンパク質はＴｈ１細胞に特異的な転写因子であり、特徴的なＴｈ１サイトカインであるインターフェロンガンマ（ＩＦＮＧ）の発現を制御することが示されている。ヒトのオーソログの発現も、Ｔｈ１細胞およびナチュラルキラー細胞におけるＩＦＮＧの発現と相関し、これは、ナイーブなＴｈ前駆細胞からのＴｈ１系列の発達の開始についての、この遺伝子の役割を示唆している。
【０１６０】
Ｔ−ｂｅｔのアミノ酸配列はＵｎｉＰｒｏｔ（アクセッション番号Ｑ９ＵＬ１７）から入手でき、配列番号１７として以下に示す。
配列番号１７−Ｔ−ｂｅｔ
【化１５】
2020501574.tif 000018
【０１６１】
ＡＰ１
アクチベータータンパク質１（ＡＰ−１）は、サイトカイン、成長因子、ストレス、ならびにバクテリアの感染あるいはウイルスの感染を含む様々な刺激に対する応答において、遺伝子発現を調節する転写因子である。ＡＰ−１は、分化、増殖、およびアポトーシスを含む多数の細胞プロセスを制御する。ＡＰ−１の構造は、ｃ−Ｆｏｓ，ｃ−Ｊｕｎ，ＡＴＦ，およびＪＤＰのファミリーに属するタンパク質からなるヘテロ二量体である。
【０１６２】
ＡＰ１のアミノ酸配列はＵｎｉＰｒｏｔ（アクセッション番号Ｐ０５４１２）から入手でき、配列番号１８として以下に示す。
配列番号１８−ＡＰ１
【化１６】
2020501574.tif 000019
【０１６３】
ＩＤ２
ＤＮＡ結合タンパク質阻害因子ＩＤ−２は、ＤＮＡ結合の阻害因子（ＩＤ）ファミリーに属し、このファミリーのメンバーは、ヘリックスループヘリックス（ＨＬＨ）ドメインを含むがベーシックドメインを含まない転写制御因子である。ＩＤファミリーのメンバーは、ベーシックヘリックスループヘリックス転写因子の機能を、そのヘテロ二量体形成のパートナーをＨＬＨドメインによって抑制することにより、ドミナントネガティブな様式で阻害する。このタンパク質は、細胞分化の負の調節に関与しているかもしれない。
【０１６４】
ＩＤ２のアミノ酸配列はＵｎｉＰｒｏｔ（アクセッション番号Ｑ０２３６３）から入手でき、配列番号１９として以下に示す。
配列番号１９−ＩＤ２
【化１７】
2020501574.tif 000020
【０１６５】
ＧＡＴＡ３
トランス活性化を起こす、Ｔ細胞特異的な転写因子であるＧＡＴＡ−３は、転写因子のＧＡＴＡファミリーに属する。ＧＡＴＡ−３は、乳腺において管腔上皮細胞の分化を調節する。当該タンパク質は、２つのＧＡＴＡタイプのジンクフィンガーを含み、Ｔ細胞発達の重要な調節因子である。ＧＡＴＡ−３は、Ｔｈ２細胞からのＩＬ−４，ＩＬ−５，およびＩＬ−１３の分泌を促進し、このＴｈ２細胞サブタイプへのＴｈ０細胞の分化を誘導する一方で、Ｔｈ１細胞へのＴｈ０細胞の分化を抑制する、ということが示されている。
【０１６６】
ＧＡＴＡ３のアミノ酸配列はＵｎｉＰｒｏｔ（アクセッション番号Ｐ２３７７１）から入手でき、配列番号２０として以下に示す。
配列番号２０−ＧＡＴＡ３
【化１８】
2020501574.tif 000021
【０１６７】
ＲＯＲγｔ
ＲＡＲ関連オーファン受容体ガンマ（ＲＯＲγ）は、転写因子の核内受容体ファミリーのメンバーであり、２つのアイソフォーム：ＲＯＲｙおよびＲＯＲｙｔを有する。２番目のアイソフォームＲＯＲγｔの組織分布は、胸腺に強く限定されるようであり、胸腺においてＲＯＲγｔは、未成熟なＣＤ４＋／ＣＤ８＋胸腺細胞内とリンパ組織誘導（ＬＴｉ）細胞内とで独占的に発現される。ＲＯＲγｔは、リンパ系、特にリンパ節およびパイエル板の器官形成に必須であるが、脾臓形成においては必須ではない。ＲＯＲγｔは胸腺リンパ球形成において重要な調節の役割を果たし、これは胸腺細胞のアポトーシスの低減と、炎症促進性Ｔヘルパー１７（Ｔｈ１７）細胞への胸腺細胞の分化の促進による。ＲＯＲγｔは、未分化なＴ細胞のアポトーシスの阻害、およびＴｈ１７細胞への未分化Ｔ細胞の分化の促進にも関与し、これは恐らく、ＦａｓリガンドおよびＩＬ２の各々の発現の下方調節による。
【０１６８】
ＲＯＲγｔのアミノ酸配列はＵｎｉＰｒｏｔ（アクセッション番号Ｐ５１４４９）から入手でき、配列番号２１として以下に示す。
配列番号２１−ＲＯＲγｔ
【化１９】
2020501574.tif 000022
【化２０】
2020501574.tif 000023
【０１６９】
ＣＢＦベータ
コア結合因子サブユニットベータ（ＣＢＦベータ）はヘテロ二量体型コア結合転写因子のベータサブユニットであり、造血（例えばＲＵＮＸ１）および骨形成（例えばＲＵＮＸ２）に特異的な多数の遺伝子をマスターレギュレートするＰＥＢＰ２／ＣＢＦ転写因子ファミリーに属する。このベータサブユニットは、ＤＮＡ非結合調節サブユニットである；複合体が様々なエンハンサーおよびプロモーター（ネズミ白血病ウイルス、ポリオーマウイルスエンハンサー、Ｔ細胞受容体エンハンサー、およびＧＭ−ＣＳＦプロモーターが挙げられる）のコア部位に結合するときに、このベータサブユニットはアルファサブユニットによるＤＮＡ結合をアロステリックに増強する。選択的スプライシングにより、異なるカルボキシル末端をコードする２つのｍＲＮＡバリアントが生成される。
【０１７０】
ＣＢＦベータのアミノ酸配列は（アクセッション番号Ｑ１３９５１）から入手でき、配列番号２２として以下に示す。
配列番号２２−ＣＢＦベータ
【化２１】
2020501574.tif 000024
【０１７１】
本発明の転写因子の転写制御コンポーネントは、配列番号７から２２に示す転写因子か、またはそれらのバリアントの１種を含み得る。バリアント転写因子は、それが野生型配列の機能（すなわち、１種またはそれより多くの種類の標的遺伝子の転写を上方調節または下方調節する能力）を保持する限り、配列番号７から２２に示す配列の１つに対して少なくとも７０％，８０％，９０％，９５％，または９９％の配列同一性を有し得る。
【０１７２】
第１の結合ドメイン、第２の結合ドメイン、および作用剤
本発明の転写システムの第１の結合ドメイン、第２の結合ドメイン、および作用剤は、作用剤の非存在下において、ドッキングコンポーネントと転写制御コンポーネントとの選択的な共局在化および二量体形成を可能にする分子／ペプチド／ドメインの任意の組み合わせであり得る。
【０１７３】
そのため、第１の結合ドメインと第２の結合ドメインとは、特異的に結合し得る。
【０１７４】
本発明の転写システムは、特定の二量体形成システムのアレンジメントに限定されない。転写制御コンポーネントが対応する相補的な結合ドメイン（ドッキングコンポーネントおよび転写制御コンポーネントを作用剤の非存在下で共局在させ得る）を含む限り、ドッキングコンポーネントは、所定の二量体形成システムの第１の結合ドメインまたは第２の結合ドメインのどちらかを含み得る。
【０１７５】
第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインは、ペプチドドメインおよびペプチド結合ドメインとであり得る；この逆もまたあり得る。ペプチドドメインおよびペプチド結合ドメインは、特異的に結合し得るペプチド／ドメインの任意の組み合わせであり得る。
【０１７６】
作用剤は、第１の結合ドメインと第２の結合ドメインとの間の結合よりも高い親和性で、第１の結合ドメインまたは第２の結合ドメインと特異的に結合できる分子（例えば低分子）であり得る。
【０１７７】
例えば結合システムは、ペプチド：ペプチド結合ドメインシステムを基にしたものであり得る。第１または第２の結合ドメインはペプチド結合ドメインを含み得、他方の結合ドメインは、ペプチドより低い親和性でペプチド結合ドメインと結合するペプチド模倣物を含み得る。作用剤としてペプチドを使用すると、ペプチド模倣物とペプチド結合ドメインとの結合が競合的な結合により妨害される。ペプチド模倣物は、「野生型」ペプチドと類似したアミノ酸配列であるが、ペプチド結合ドメインとの結合親和性を減ずるための１つまたはそれより多くの数のアミノ酸の変更を有する配列を有し得る。
【０１７８】
例えば作用剤は、第１の結合ドメインと第２の結合ドメインとの間の親和性よりも少なくとも１０、２０、５０、１００、１０００または１００００倍の強さの親和性で、第１の結合ドメインまたは第２の結合ドメインと結合し得る。
【０１７９】
作用剤は、第１の結合ドメインと第２の結合ドメインとの間の親和性よりも高い親和性で第１の結合ドメインまたは第２の結合ドメインと優先的に結合する、薬学的に許容される任意の分子であり得る。
【０１８０】
作用剤は、標的細胞の細胞質に送達され得、細胞内での結合のために用いられ得る。
【０１８１】
作用剤は、血液脳関門を通過する能力を有し得る。
【０１８２】
ペプチドの共局在化を制御するための低分子システムは本分野において知られており、例えばＴｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）、ＴｅｔＲ相互作用タンパク質（ＴｉＰ）、テトラサイクリンのシステムがある（Ｋｌｏｔｚｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０，２４５９１−２４５９９（２００５）；Ｌｕｃｋｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６８，７８０−７９０（２００７））。
【０１８３】
Ｔｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）システム
Ｔｅｔオペロンはよく知られた生物学的なオペロンであり、哺乳動物細胞における使用について適応されている。ＴｅｔＲはホモ二量体としてテトラサイクリンと結合し、結果としてＴｅｔＲ分子のＤＮＡとの結合を調整するような構造変化を受ける。Ｋｌｏｔｚｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．（上記）は、ファージディスプレイに由来する、ＴｅｔＲを活性化するペプチドについて記載した。このタンパク質（ＴｅｔＲ相互作用タンパク質／ＴｉＰ）はＴｅｔＲ内に、テトラサイクリン結合部位と重なるが、同一ではない結合部位を有する（Ｌｕｃｋｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．；上記）。したがって、ＴｉＰとテトラサイクリンとは、ＴｅｔＲの結合について競合する。
【０１８４】
本発明の転写システムにおいて、ドッキングコンポーネントの第１の結合ドメインは、ＴｅｔＲまたはＴｉＰであり得、もしそうであるならば転写制御コンポーネントの第２の結合ドメインは、対応した相補的な結合パートナーである。例えば、もしドッキングコンポーネントの第１の結合ドメインがＴｅｔＲであるとすると、転写制御コンポーネントの第２の結合ドメインはＴｉＰである。もしドッキングコンポーネントの第１の結合ドメインがＴｉＰであるとすると、転写制御コンポーネントの第２の結合ドメインはＴｅｔＲである。
【０１８５】
例えば、第１の結合ドメインまたは第２の結合ドメインは、配列番号２３または配列番号２４に示す配列を含み得る。
配列番号２３−ＴｅｔＲ
【化２２】
2020501574.tif 000025
配列番号２４−ＴｉＰ
ＭＷＴＷＮＡＹＡＦＡＡＰＳＧＧＧＳ
【０１８６】
機能するためには、ＴｅｔＲはホモ二量体を形成しなければならない。したがって、受容体コンポーネント上の第１の結合ドメインがＴｅｔＲであるとき、受容体コンポーネントは膜貫通ドメインと第１の結合ドメイン（ＴｅｔＲ）との間にリンカーを含み得る。当該リンカーは、ＴｅｔＲが、近隣の受容体コンポーネントからのＴｅｔＲとホモ二量体を形成し、正しい方向を向くことを可能にする。
【０１８７】
リンカーは、配列番号２５に示す配列であり得る。
配列番号２５−改変ＣＤ４エンドドメイン
【化２３】
2020501574.tif 000026
【０１８８】
あるいはリンカーは、配列番号２５に示す配列と類似した長さおよび／またはドメインスペーシング特性を有する代替のリンカー配列を含み得る。
【０１８９】
リンカーは、配列番号２５に対して少なくとも８０％，８５％，９０％，９５％，９８％，または９９％の配列同一性を有し得る（リンカーが、ＴｅｔＲが近隣の受容体コンポーネントからのＴｅｔＲとホモ二量体を形成し、適切な方向を向くことを可能にする機能を提供する限り）。
【０１９０】
ＴｅｔＲ／ＴｉＰシステムの潜在的な不都合の１つは、ＴｅｔＲが異種由来であり、免疫原性であることである。したがってＴｅｔＲ配列は、免疫原性がより低いが特異的にＴｉＰと結合する能力を保持するバリアントであり得る。
【０１９１】
第１および第２の結合ドメインが、ＴｅｔＲもしくはＴｉＰ、またはこれらのバリアントである場合、作用剤はテトラサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、またはこれらのアナログであり得る。
【０１９２】
アナログとは、ＴｅｔＲに特異的に結合する能力を保持する、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、またはミノサイクリンのバリアントを指す。
【０１９３】
現在のＣＡＲシステムにおいて用いられ得る、他の結合ドメインと作用剤との組み合わせが本分野で知られている。例えばＣＡＲシステムは、ストレプトアビジン／ビオチンベースの結合システムを用い得る。
【０１９４】
ストレプトアビジン結合エピトープ
第１または第２の結合ドメインは、１つまたはそれより多い数のストレプトアビジン結合エピトープ（複数可）を含み得る。もう一方の結合ドメインは、ビオチン模倣物を含み得る。
【０１９５】
ストレプトアビジンは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｉｄｉｎｉｉという細菌に由来する５２．８ｋＤａのタンパク質である。ストレプトアビジンのホモ四量体は、ビオチン（ビタミンＢ７あるいはビタミンＨ）に対して、解離定数（Ｋｄ）約１０−１５Ｍの非常に高い親和性を有する。ビオチン模倣物は、ストレプトアビジンに対して野生型ビオチンより低い親和性を有し、そのため、ストレプトアビジンドメインとビオチン模倣ドメインとの間のヘテロ二量体形成を妨害するか、または防ぐ作用剤として、ビオチンそれ自体が用いられ得る。ビオチン模倣物は、例えば１ｎＭから１００ｕＭまでのＫｄで、ストレプトアビジンに結合し得る。
【０１９６】
「ビオチン模倣」ドメインは、例えば、ストレプトアビジンと特異的に結合する短いペプチド配列（例えば、６から２０，６から１８，８から１８，または８から１５までのアミノ酸）を含み得る。
【０１９７】
ビオチン模倣物は、表１に示す配列を含み得る。
【表１】
2020501574.tif 000027
【０１９８】
ビオチン模倣物は、ＳｔｒｅｐｔａｇＩＩ，Ｆｌａｎｋｅｄｃｃｓｔｒｅｐｔａｇ，およびｃｃｓｔｒｅｐｔａｇからなる群から選択され得る。
【０１９９】
ストレプトアビジンドメインは、配列番号３３に示す配列を有するストレプトアビジンか、またはビオチンに結合する能力を保持する、ストレプトアビジンのフラグメントもしくはバリアントを含み得る。全長ストレプトアビジンは１５９のアミノ酸を有する。この１５９残基の全長タンパク質のＮまたはＣ末端は、短い「コア」ストレプトアビジン（通常、残基１３から残基１３９までからなる）をもたらすように加工される；ＮおよびＣ末端の除去は、ビオチンとの高い結合親和性のために必要である。
【０２００】
「コア」ストレプトアビジン（残基１３〜１３９）の配列を、配列番号３３として以下に示す。
配列番号３３
【化２４】
2020501574.tif 000028
【０２０１】
ストレプトアビジンは、自然状態ではホモ四量体として存在する。ストレプトアビジン単量体の二次構造は８つの逆平行β鎖からなり、これらは折りたたまれて逆平行βバレル三次構造を示す。ビオチン結合部位は各βバレルの一端に位置する。４つの同一のストレプトアビジン単量体（すなわち、４つの同一のβバレル）が会合して、ストレプトアビジンの四量体の四次構造をもたらす。各バレル中のビオチン結合部位は、バレル内部からの残基、ならびに隣接するサブユニットからの保存されたＴｒｐ１２０からなる。このようにして、各サブユニットは隣接するサブユニット上の結合部位に寄与し、そのため、四量体は機能的な二量体の二量体とも見なせられる。
【０２０２】
本発明のＣＡＲシステムのストレプトアビジンドメインは本質的に、ストレプトアビジンの単量体、二量体、または四量体からなり得る。
【０２０３】
ストレプトアビジンの単量体、二量体、または四量体の配列は、配列番号３３に示す配列のすべてまたは一部か、またはビオチンに結合する能力を保持するこれらのバリアントのすべてまたは一部を含み得る。
【０２０４】
ストレプトアビジンのバリアントの配列は、配列番号３３またはこの機能的な一部に対して、少なくとも７０，８０，９０，９５，または９９％の同一性を有し得る。ストレプトアビジンのバリアントは、ビオチン結合に関与する以下のアミノ酸：Ａｓｎ２３，Ｔｙｒ４３，Ｓｅｒ２７，Ｓｅｒ４５，Ａｓｎ４９，Ｓｅｒ８８，Ｔｈｒ９０，およびＡｓｐ１２８の残基の１つまたはそれより多くを含み得る。ストレプトアビジンのバリアント（ｖａｒｉａｎｙ）は、例えばこれらの残基の８つすべてを含み得る。結合ドメイン内のストレプトアビジンのバリアントが二量体または四量体として存在する場合、このバリアントは、隣接するサブユニットによるビオチンとの結合に関与するＴｒｐ１２０も含み得る。
【０２０５】
タンパク質−タンパク質相互作用を妨害する低分子作用剤は、薬学的な目的のために昔から開発されてきた（Ｖａｓｓｉｌｅｖ  ｅｔ  ａｌ；Ｓｍａｌｌ−Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ＩＳＢＮ：９７８−３−６４２−１７０８２−９によりレビュー）。記載の転写システムは、このような低分子を用い得る。その相互作用が妨害される当該タンパク質またはペプチド（あるいはこれらのタンパク質の関連フラグメント）は、第１および／または第２の結合ドメインとして用いられ得、そして当該低分子は、転写因子に媒介される遺伝子発現の制御のスイッチをオンにするか、またはオフにする作用剤として用いられ得る。このようなシステムは、低分子およびタンパク質（記載のように機能するが、当該低分子は望まぬ薬理活性を欠くような）を変更することにより多様であり得る（例えば、Ｒｉｖｅｒａ  ｅｔ  ａｌ（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ；１９９６；２；１０２８−１０３２）による記載に類似な様式において）。
【０２０６】
その相互作用が低分子などの作用剤を用いて妨害されるタンパク質／ペプチドの一覧を、表２に示す。これらの妨害可能なタンパク質−タンパク質相互作用（ＰＰＩ）は、本発明の転写システムにおいて用いられ得る。これらのＰＰＩについてのさらなる情報は、Ｗｈｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ  ２００８（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１０：ｅ８）より入手可能である。
【表２】
2020501574.tif 000029
【０２０７】
上記の作用剤が結合する第１の結合ドメインと同じドメインに競合的に結合する第２の結合ドメインであって、したがって作用剤の非存在下では、転写システムのドッキングコンポーネントと転写制御コンポーネントとを共局在させるために用いられ得る第２の結合ドメインは、本分野においてよく知られた技術および方法を用いて同定され得る。このような第２の結合ドメインは例えば、シングルドメインＶＨＨライブラリーの提示により同定され得る。
【０２０８】
転写システムの第１の結合ドメインおよび／または第２の結合ドメインは、相互な結合ドメインと特異的に結合し、したがってドッキングコンポーネントと転写制御コンポーネントとの共局在を容易にし得るバリアント（複数可）を含み得る。
【０２０９】
バリアント配列は、野生型配列に対して少なくとも８０％，８５％，９０％，９５％，９８％，または９９％の配列同一性を有し得る（この配列が有効な二量体形成システムを提供する限り）。すなわち、当該配列が、ドッキングコンポーネントと転写コンポーネントとの十分な共局在を容易にし、そのため、これらが作用剤の非存在下でヘテロ二量体を形成し得る限り、である。
【０２１０】
本発明は、本発明の第１の側面の転写システムを妨害するための方法にも関連し、この方法は、作用剤を投与するステップを含む。上記のように、作用剤の投与は、ドッキングコンポーネントと転写制御コンポーネントとの間の共局在の妨害をもたらす。
【０２１１】
第１および第２の結合ドメインは、転写システムにより、存在する作用剤の濃度に比例する様式で遺伝子発現を制御し得る。したがって作用剤が、第１の結合ドメインと第２の結合ドメインとの間の結合親和性よりも高い親和性で、第１の結合ドメインまたは第２の結合ドメインと結合する一方、低濃度の作用剤の存在下では、ドッキングコンポーネントと転写制御コンポーネントとの共局在は完全には取り除かれ得ない。例えば低濃度の作用剤は、遺伝子転写を完全に阻害するのではなく、その遺伝子転写の全体としてのレベルを低減し得る。作用剤の具体的な濃度というのは、必要とされる遺伝子転写のレベルと、具体的な結合ドメインおよび作用剤とに依存して、異なる。
【０２１２】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
本発明の細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）も発現し得る。
【０２１３】
古典的なＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメイン（バインダー）を細胞内シグナリングドメイン（エンドドメイン）へとつなぐ、キメラのＩ型膜貫通タンパク質である。バインダーは典型的に、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）に由来する一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）であるが、抗体様の抗原結合部位を含む他の形式にも基づき得る。スペーサードメインは通常、バインダーを細胞膜から単離するために、そしてそれを適切に配向させるために必要である。一般的に用いられるスペーサードメインは、ＩｇＧ１のＦｃである。抗原に依っては、さらにコンパクトなスペーサー（例えば、ＣＤ８α由来の軸およびＩｇＧ１のヒンジのみ）が十分であり得る。膜貫通ドメインは当該タンパク質を細胞膜内に係留し、そしてエンドドメインにスペーサーをつなぐ。
【０２１４】
初期のＣＡＲ設計は、ＦｃεＲ１またはＣＤ３ζいずれかのγ鎖の細胞内部分に由来するエンドドメインを有した。結果としてこれらの第１世代の受容体は、Ｔ細胞による同源の標的細胞の殺滅を誘発するに足るが、Ｔ細胞が増殖して生存するようにＴ細胞を完全には活性化できない免疫シグナル１を伝達した。この制限を克服するために、混成エンドドメインが構築された：Ｔ細胞共刺激分子の細胞内部位とＣＤ３ζの細胞内部位との融合体は、抗原認識後に活性化シグナルおよび共刺激シグナルを同時に伝達し得る第２世代の受容体をもたらす。もっとも一般的に用いられる共刺激ドメインは、ＣＤ２８のものである。これは、もっとも強力な共刺激シグナル−Ｔ細胞増殖を誘発するいわゆる免疫シグナル２を供給する。ＴＮＦ受容体ファミリー（生存シグナルを伝達し、密接に関係するＯＸ４０および４１ＢＢなど）のエンドドメインを含むいくつかの受容体も、記載されている。活性化シグナル、増殖シグナル、および生存シグナルを伝達し得るエンドドメインを有する、さらにいっそう強力な第３世代のＣＡＲも、現在記載されている。
【０２１５】
ＣＡＲをコードする核酸は、例えばレトロウイルスベクターを用いて、Ｔ細胞に輸送され得る。レンチウイルスベクターも使用され得る。この方法において、多数のがん特異的Ｔ細胞が養子細胞移植のために生成され得る。ＣＡＲが標的抗原に結合すると、これは、ＣＡＲが発現されるＴ細胞への活性化シグナルの伝達をもたらす。したがってＣＡＲは、標的抗原を発現する腫瘍細胞に対するＴ細胞の特異性及び細胞傷害性を導く。
【０２１６】
したがって、典型的にＣＡＲは、（ｉ）抗原結合ドメインと；（ｉｉ）スペーサーと；（ｉｉｉ）膜貫通ドメインと；（ｉｉｉ）シグナリングドメインを含むか、またはそれと関連する細胞内ドメインとを含む。
【０２１７】
抗原結合ドメイン
抗原結合ドメインは、抗原を認識するＣＡＲの部分である。多数の抗原結合ドメイン（抗体、抗体模倣物、およびＴ細胞受容体の抗原結合部位に基づくものを含む）が本分野で既知である。抗原結合ドメインは例えば、モノクローナル抗体に由来する一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）か；標的抗原の天然リガンドか；標的に対して十分な親和性を有するペプチドか；シングルドメイン抗体か；Ｄａｒｐｉｎ（設計アンキリンリピートタンパク質）などの人工的なシングルバインダーか；またはＴ細胞受容体に由来する一本鎖を含み得る。
【０２１８】
抗原結合ドメインは、抗体の抗原結合部位に基づかないドメインを含み得る。抗原結合ドメインは例えば、腫瘍細胞の表面受容体に対する可溶性リガンドであるタンパク質／ペプチド（例えば、サイトカインまたはケモカインなどの可溶性ペプチド）に基づくドメインか；膜に係留されるリガンドもしくは受容体の細胞外ドメインであって、これと結合するペア対応物が腫瘍細胞上で発現される細胞外ドメインを含み得る。
【０２１９】
抗原結合ドメインは、抗原の天然のリガンドに基づき得る。
【０２２０】
抗原結合ドメインは、コンビナトリアルライブラリーに由来する親和性ペプチド、または新規に設計された親和性タンパク質／ペプチドを含み得る。
【０２２１】
スペーサードメイン
ＣＡＲは、抗原結合ドメインを膜貫通ドメインとつなぎ、そして抗原結合ドメインをエンドドメインから空間的に分離するためのスペーサー配列を含む。柔軟なスペーサーは、結合を促進するために抗原結合ドメインが異なる方向に配位することを可能にする。
【０２２２】
膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインは、膜を渡るＣＡＲの配列である。
【０２２３】
膜貫通ドメインは、膜内において熱力学的に安定な任意のタンパク質構造であり得る。典型的にこれは、いくつかの疎水性残基を含むアルファヘリックスである。任意の膜貫通タンパク質の膜貫通ドメインが、本発明の膜貫通部分を供給するために用いられ得る。タンパク質の膜貫通ドメインの存在および幅は、当業者によりＴＭＨＭＭアルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ−２．０／）を用いて判別され得る。さらに、タンパク質の膜貫通ドメインが相対的に単純な構造（すなわち、膜を渡るために十分な長さの疎水性アルファヘリックスを作ると予想されるポリペプチド配列）であるとすると、人工的に設計されたＴＭドメインも用いられ得る（米国特許第７０５２９０６Ｂ１号は、合成膜貫通コンポーネントについて記載している）。
【０２２４】
膜貫通ドメインはＣＤ２８に由来し得、これは優れた受容体安定性を与える。
【０２２５】
エンドドメイン
エンドドメインは、ＣＡＲのシグナル伝達部分である。それはＣＡＲの細胞内ドメインの一部であるか、またはそれと関連し得る。抗原認識後に受容体はクラスターを形成し、天然のＣＤ４５およびＣＤ１４８がシナプスから除外され、そして細胞にシグナルが伝達される。もっとも一般的に用いられるエンドドメインのコンポーネントは、３つのＩＴＡＭを含むＣＤ３ゼータのものである。これは抗原の結合後、活性化シグナルをＴ細胞へと伝達する。ＣＤ３ゼータは、完全に適格（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）な活性化シグナルを提供し得ず、追加の共刺激シグナルが必要となり得る。例えば、キメラのＣＤ２８およびＯＸ４０が、ＣＤ３ゼータと共に増殖／生存シグナルを伝達するために用いられ得、または３つすべてが一緒に用いられ得る。
【０２２６】
本発明のＣＡＲまたはＴａｎＣＡＲのエンドドメインは、ＣＤ２８のエンドドメインならびにＯＸ４０およびＣＤ３ゼータのエンドドメインを含み得る。
【０２２７】
当該エンドドメインは：
（ｉ）ＣＤ３ゼータ由来のエンドドメインなどのＩＴＡＭを含むエンドドメイン；および／または
（ｉｉ）ＣＤ２８由来のエンドドメインなどの共刺激ドメイン；および／または
（ｉｉｉ）例えばＴＮＦ受容体ファミリー（ＯＸ−４０または４−１ＢＢなど）のエンドドメインといった生存シグナルを伝達するドメイン
を含み得る。
【０２２８】
抗原認識部分がシグナル伝達部分とは別個の分子上にある、多数の系が記述されている（国際公開第０１５／１５０７７１号；国際公開第２０１６／１２４９３０号および国際公開第２０１６／０３０６９１号に記載のものなど）。したがって本発明の細胞に発現されたＣＡＲは、抗原結合ドメインおよび膜貫通ドメインを含む抗原結合コンポーネントを含み得る；この抗原結合コンポーネントは、シグナリグドメインを含む別個の細胞内シグナリングコンポーネントと相互作用し得る。本発明の細胞は、抗原結合コンポーネントおよび細胞内シグナリングコンポーネントなどを含むＣＡＲシグナリング系を含み得る。
【０２２９】
シグナルペプチド
本発明の細胞はシグナルペプチドを含み得、そのためＣＡＲが細胞内で発現されるとき、新生タンパク質は小胞体へと、その後にその発現場所である細胞表面へと導かれる。
【０２３０】
シグナルペプチドは、分子のアミノ末端にあり得る。
【０２３１】
本発明のＣＡＲは、一般式：
シグナルペプチド−抗原結合ドメイン−スペーサードメイン−膜貫通ドメイン−細胞内Ｔ細胞シグナリングドメイン（エンドドメイン）
を有し得る。
【０２３２】
核酸配列
本明細書において用いられる場合、用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、および「核酸」は、互いに同義であるように意図される。
【０２３３】
多数の異なるポリヌクレオチドおよび核酸配列が、遺伝子コードの縮退の結果として同一のポリペプチドをコードし得るということが、当業者により理解される。さらに、当業者が常用技術を用いて、ポリペプチドが発現される特定のホスト生物のコドン使用頻度を反映するために、本明細書中に記載されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの配列に影響しないヌクレオチドの置換を作り得る、ということも理解される。
【０２３４】
本発明による核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含み得る。この核酸は、一本鎖または二本鎖であり得る。この核酸は、その中に合成または改変されたヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであり得る。オリゴヌクレオチドに対する多数の異なるタイプの改変が、本分野において知られている。この改変として、メチルホスホネートおよびホスホロチオエート骨格、当該分子の３’末端および／または５’末端におけるアクリジンまたはポリリジン鎖の付加が挙げられる。本明細書中に記載の使用目的のために、ポリヌクレオチドが本分野において利用できる任意の方法を用いて改変され得ることが理解される。このような改変は、対象ポリヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ活性または寿命を増強するために行われ得る。
【０２３５】
用語「バリアント」、「ホモログ」、または「派生物」はヌクレオチド配列との関連において、配列からのまたは配列への、１つ（またはそれを超える）の核酸の任意の置換、バリエーション、改変、交換、欠失、または付加を含む。
【０２３６】
核酸コンストラクト
本発明は、上で定義したドッキングコンポーネントをコードする第１の核酸配列および転写制御コンポーネントをコードする第２の核酸配列を含む、核酸コンストラクトを提供する。
【０２３７】
核酸配列は、いずれかの順番で当該核酸コンストラクト中にあり得る（すなわち、第１−第２；または第２−第１）。
【０２３８】
核酸コンストラクトは、以下の構造でありえる：
ＤＣ−ｃｏｅｘｐｒ−ＴＣＣ；または
ＴＣＣ−ｃｏｅｘｐｒ−ＤＣ
であって、式中：
ＤＣがドッキングコンポーネントをコードする核酸配列であり；
ｃｏｅｘｐｒがドッキングコンポーネントと転写制御コンポーネントとの共発現を可能にする核酸配列であり；そして
ＴＣＣが転写制御コンポーネントをコードする核酸配列である。
【０２３９】
核酸コンストラクトは、キメラ抗原受容体をコードする第３の核酸配列も含み得る。
【０２４０】
第１、第２、および第３の核酸は、任意の順番で核酸コンストラクト内にあり得る（すなわち、１−２−３，１−３−２，２−１−３，２−３−１，３−１−２，または３−２−１）。
【０２４１】
核酸コンストラクトは、例えば以下の構造の１つを有し得る：
ＣＡＲ−ｃｏｅｘｐｒ１−ＤＣ−ｃｏｅｘｐｒ２−ＴＣＣ；
ＣＡＲ−ｃｏｅｘｐｒ１−ＴＣＣ−ｃｏｅｘｐｒ２−ＤＣ；
ＤＣ−ｃｏｅｘｐｒ１−ＴＣＣ−ｃｏｅｘｐｒ２−ＣＡＲ；または
ＴＣＣ−ｃｏｅｘｐｒ１−ＤＣ−ｃｏｅｘｐ２−ＣＡＲ
であって、式中：
ＣＡＲがキメラ抗原受容体をコードする核酸配列であり；
ＤＣがドッキングコンポーネントをコードする核酸配列であり；
同一または相違であり得るｃｏｅｘｐｒ１およびｃｏｅｘｐｒ２が、ドッキングコンポーネント、転写制御コンポーネント、およびキメラ抗原受容体の共発現を可能にする核酸配列であり；そして
ＴＣＣが転写制御コンポーネントをコードする核酸配列である。
【０２４２】
核酸コンストラクトは、２つ以上のタンパク質を発現できる核酸配列も含み得る。例えば核酸コンストラクトは、２つの核酸配列間に切断部位をコードする配列を含み得る。当該切断部位は自己切断性であり得、そのため、新生ポリペプチドが産生されると、このポリペプチドはただちに、いかなる外部の切断活性をも要さずに２つのタンパク質に切断される。
【０２４３】
様々な自己切断部位が知られており、以下の配列を有する口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２ａの自己切断ペプチドが挙げられる：
配列番号３４
ＲＡＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ
または
配列番号３５
ＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ
【０２４４】
あるいは共発現配列は、内部リボソーム侵入配列（ＩＲＥＳ）または内部プロモーターであり得る。
【０２４５】
ベクター
本発明は、本発明による１つ以上の核酸配列（複数可）もしくはコンストラクト（複数可）を含む、ベクターまたはベクターのキットも提供する。このようなベクターは、核酸配列（複数可）またはコンストラクト（複数可）をホスト細胞内へと導入するために用いられ得、その結果、ホスト細胞は核酸配列またはコンストラクトによってコードされるタンパク質を発現する。
【０２４６】
当該ベクターは例えば、プラスミド、ウイルスベクター（レトロウイルスベクターもしくはレンチウイルスベクターなど）、トランスポゾンベースのベクター、または合成ｍＲＮＡであり得る。
【０２４７】
当該ベクターは、Ｔ細胞にトランスフェクションまたは形質導入し得る。
【０２４８】
キット
本発明は、上で定義したドッキングコンポーネントをコードする第１の核酸配列および転写制御コンポーネントをコードする第２の核酸配列を含む、核酸配列のキットも提供する。
【０２４９】
キットは、キメラ抗原受容体をコードする第３の核酸配列も含み得る。
【０２５０】
本発明は、上で定義した、ドッキングコンポーネントをコードする第１の核酸配列を含む第１のベクターと；転写制御コンポーネントをコードする第２の核酸配列を含む第２のベクターとを含む、ベクターのキットも提供する。
【０２５１】
キットは、キメラ抗原受容体をコードする第３の核酸配列を含む第３のベクターも含み得る。
【０２５２】
核酸配列のキット、またはベクターのキットは、ドッキングコンポーネントと転写制御コンポーネントとの分離を引き起こす作用剤も含み得る。
【０２５３】
細胞
本発明は、本発明に記載の転写システムを発現する細胞を提供する。当該細胞は、キメラ抗原受容体も発現し得る。
【０２５４】
当該細胞は、細胞溶解性免疫細胞であり得る。
【０２５５】
細胞溶解性免疫細胞は、細胞性免疫において中心的な役割を果たすタイプのリンパ球であるＴ細胞またはＴリンパ球であり得る。細胞溶解性免疫細胞は、細胞表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の存在により、Ｂ細胞およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）などの他のリンパ球から区別され得る。以下に要約するように、Ｔ細胞には様々なタイプがある。
【０２５６】
ヘルパーＴヘルパー細胞（ＴＨ細胞）は、Ｂ細胞からのプラズマ細胞およびメモリーＢ細胞への成熟と、細胞傷害性Ｔ細胞およびマクロファージの活性化などの免疫プロセスにおいて、他の白血球を支援する。ＴＨ細胞はその表面にＣＤ４を発現する。ＴＨ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上にあるＭＨＣクラスＩＩ分子によってペプチド抗原を提示されると、活性化状態になる。このＴＨ細胞は、ＴＨ１，ＴＨ２，ＴＨ３，ＴＨ１７，Ｔｈ９，またはＴＦＨを含むいくつかのサブタイプ（これらは、異なるタイプの免疫応答を促進するために異なるサイトカインを分泌する）のうちの１つへと分化し得る。
【０２５７】
細胞溶解性Ｔ細胞（ＴＣ細胞またはＣＴＬ）は、ウイルスに感染された細胞および腫瘍細胞を破壊し、そして移植拒絶反応にも関与する。ＣＴＬはその表面にＣＤ８を発現する。この細胞は、ＭＨＣクラスＩ（すべての有核細胞の表面に存在する）に会合される抗原への結合により標的を認識する。レギュラトリーＴ細胞によって分泌されるＩＬ−１０，アデノシン，および他の分子によってＣＤ８＋細胞はアネルギー状態へと不活化され得、実験的自己免疫性脳脊髄炎などの自己免疫疾患を防ぐ。
【０２５８】
メモリーＴ細胞は抗原特異的Ｔ細胞のサブセットであり、感染が回復した後であっても長期的に存続する。メモリーＴ細胞はその同種抗原への再暴露に際して、ただちに多数のエフェクターＴ細胞へと拡張し、したがって免疫系に、過去の感染に対する「メモリー」を提供する。メモリーＴ細胞は、３つのサブタイプを含む：セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ細胞）および２タイプのエフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ細胞およびＴＥＭＲＡ細胞）。メモリー細胞は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋のいずれかであり得る。典型的にメモリーＴ細胞は、細胞表面タンパク質ＣＤ４５ＲＯを発現する。
【０２５９】
レギュラトリーＴ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）は、以前はサプレッサーＴ細胞として知られており、免疫寛容の維持のために重要である。この細胞の主要な役割は、Ｔ細胞性免疫を免疫応答の終わりに向けてシャットダウンすることと、胸腺における負の選択のプロセスを逃れた自己反応性Ｔ細胞を抑制することである。
【０２６０】
２つの主要なクラスのＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞が、記載されている−内在性Ｔｒｅｇ細胞およびアダプティブＴｒｅｇ細胞。
【０２６１】
内在性Ｔｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋のＴｒｅｇ細胞としても知られる）は胸腺において生じ、成長途上のＴ細胞と、ＴＳＬＰによって活性化されている骨髄系（ＣＤ１１ｃ＋）および形質細胞様（ＣＤ１２３＋）樹状細胞の両方との間の相互作用に関連付けられる。内在性Ｔｒｅｇ細胞は、ＦｏｘＰ３と呼ばれる細胞内分子の存在により他のＴ細胞から区別され得る。ＦＯＸＰ３遺伝子の変異は、レギュラトリーＴ細胞の発生を防ぎ、致死的な免疫疾患であるＩＰＥＸを引き起こし得る。
【０２６２】
アダプティブＴｒｅｇ細胞（Ｔｒ１細胞またはＴｈ３細胞としても知られる）は、通常の免疫応答の間に生じ得る。
【０２６３】
ナチュラルキラー細胞（またはＮＫ細胞）は細胞溶解性細胞の１つのタイプであり、自然免疫系の一部を形成する。ＮＫ細胞は、ウイルスに感染した細胞からの自然シグナルに対する急速な応答を、ＭＨＣに依存しない様式により提供する。
【０２６４】
ＮＫ細胞（自然リンパ球のグループに属する）は大顆粒リンパ球（ＬＧＬ）として定義され、Ｂリンパ球およびＴリンパ球を産生するリンパ系共通前駆細胞から分化する第３種の細胞を構成する。ＮＫ細胞は骨髄、リンパ節、脾臓、扁桃および胸腺において分化および成熟し、その後これらから循環内へと入ることが知られている。
【０２６５】
本発明の細胞は、上記の細胞タイプのいずれかであり得る。
【０２６６】
本発明の細胞は、患者自身の末梢血（ファーストパーティー）からか、ドナー末梢血からの造血幹細胞移植の状況（セカンドパーティー）においてか、または縁故関係のないドナー由来の末梢血（サードパーティー）から、ｅｘ  ｖｉｖｏに作られ得る。
【０２６７】
あるいは細胞は、誘導前駆細胞または胚性前駆細胞から、例えばＴ細胞へのｅｘ  ｖｉｖｏな分化に由来し得る。あるいは、溶解機能を維持して治療上の細胞として働き得る不死化細胞系列が用いられる。
【０２６８】
これらすべての実施形態において細胞は、ＣＡＲおよび転写因子をコードするＤＮＡまたはＲＮＡの導入であって、ウイルスベクターを用いる形質導入、ＤＮＡまたはＲＮＡを用いるトランスフェクションを含む様々な手法の１つによる導入によって生成され得る。
【０２６９】
本発明の細胞は、被験体由来のｅｘ  ｖｉｖｏ細胞であり得る。当該細胞は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）試料由来であり得る。細胞は、本発明の核酸配列またはコンストラクトで形質導入される前に、例えば抗ＣＤ３モノクローナル抗体を用いる処置によって活性化および／または拡張され得る。
【０２７０】
本発明の細胞は：
（ｉ）被験体または上記の他の供給源から細胞を含む試料を単離することと；
（ｉｉ）本発明による核酸配列またはコンストラクトを用いて細胞の形質導入またはトランスフェクションすることと
によって作られ得る。
【０２７１】
組成物
本発明は、本発明の複数種の細胞を含む医薬組成物にも関連する。当該医薬組成物はさらに、薬学的に許容されるキャリアー、希釈剤、または賦形剤を含み得る。当該医薬組成物は必要に応じて、１つ以上のさらなる医薬活性ポリペプチドおよび／または医薬活性化合物を含み得る。このような製剤は、例えば静脈内注入のために適した形態であり得る。
【０２７２】
本発明は、本発明の複数種の細胞、ならびに第１の結合ドメインと第２の結合ドメインとの結合を妨害する作用剤を含む組成物も提供する。
【０２７３】
処置方法
本発明の細胞は、がん細胞などの標的細胞を殺す能力を有し得る。
【０２７４】
本発明の細胞は、ウイルス感染などの感染の処置のために用いられ得る。
【０２７５】
本発明の細胞は、病原となる免疫反応（例えば、自己免疫疾患、アレルギー、および移植片対ホスト拒絶反応）の制御にも用いられ得る。
【０２７６】
本発明の細胞は、膀胱がん、乳がん、結腸がん、子宮内膜がん、腎臓がん（腎細胞）、白血病、肺がん、メラノーマ、非ホジキンリンパ腫、すい臓がん、前立腺がん、および甲状腺がんなどの、がん性疾患の処置にも用いられ得る
【０２７７】
本発明の細胞は、以下の処置に用いられ得る：舌、口、および咽頭のがんを含む口腔ならびに咽頭のがん；食道、胃、および直腸結腸のがんを含む消化器系のがん；肝細胞癌および胆管癌を含む肝臓ならびに胆管（ｂｉｌｉａｒｙ  ｔｒｅｅ）のがん；気管支がんおよび喉頭のがんを含む呼吸器系のがん；骨肉腫を含む骨および関節のがん；メラノーマを含む皮膚のがん；乳がん；女性において子宮、卵巣および子宮頸部のがん、男性において前立腺および精巣のがんを含む生殖器のがん；腎細胞癌、および子宮（ｕｔｔｅｒｅｒ）または膀胱の移行上皮細胞癌を含む腎尿路のがん；神経膠腫、多型膠芽腫、および髄芽腫を含む脳のがん；甲状腺がん、副腎がん、および多発性内分泌腫瘍症候群に関連するがんを含む内分泌系のがん；ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫；多発性骨髄腫および形質細胞腫；急性および慢性の両方の白血病（骨髄性またはリンパ性）；ならびに、他および部位不特定のがん（神経芽腫を含む）。
【０２７８】
遺伝子転写の調節
本発明の細胞内で遺伝子の転写を調節するための、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞に作用剤を投与することによる方法も、提供される。
【０２７９】
本発明の第１の実施形態において、作用剤の投与は、転写因子に媒介される遺伝子調節をオンにする；他方、本発明の第２の実施形態において、作用剤の投与は、転写因子に媒介される遺伝子調節をオフにする。
【０２８０】
作用剤は、遺伝子転写をｉｎ  ｖｉｖｏで調節するためにも用いられ得、これは、本発明に記載の細胞を含む被験体に作用剤を投与することによる。作用剤は、本発明に記載の細胞を被験体に投与する前に、またはその後に、または同時に、被験体に投与され得る。
【０２８１】
本発明の転写システムによってオンまたはオフにされる転写因子は、Ｔ細胞の分化および／または疲弊のｉｎ  ｖｉｖｏでの制御に関与し得る。このような場合、作用剤は、本発明の細胞におけるＴ細胞の分化または疲弊を防ぐか、あるいは低減するために、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで用いられ得る。
【０２８２】
本発明は目下、実施例によってさらに記載される。実施例は、本発明を実施する当業者の支援に役立つことを意図し、いかなる方法においても本発明の範囲を限定することを意図しない。
【実施例】
【０２８３】
実施例１−転写制御システムの開発
転写のスイッチングについて試験するために、ｅＧＦＰの発現が調整されるモデルシステムを構築する。このモデルシステムは、（ａ）ＧＡＬ４応答性プロモーター、ｅＧＦＰをコードする配列、およびポリアデニル化配列からなる受信カセットと；（ｂ１）２Ａペプチドによって合成転写因子（核局在化配列または代替のトランスミッティングドメインを融合されたＶＰ１６を融合されたＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメイン、ＴＩＰからなる）と共発現される膜係留ＴｅｔＲをコードするＤＮＡからなる送信カセットか、または（ｂ２）２ＡペプチドによってＴＩＰ／ＧＡＬ４／ＶＰ１６融合物（核外輸送シグナルを伴う）と共発現される、核局在化シグナルを融合されたｔｅｔＲをコードするＤＮＡからなる送信カセット：を含むスプリットカセットからなる。安定的に組み入れられた受信カセットおよびいずれかの送信カセットを有するＴ細胞を生成する。テトラサイクリンを用いずに、そして様々な濃度のテトラサイクリンに曝露した後の様々な時点で、ｅＧＦＰをフローサイトメトリー法により測定する。
【０２８４】
実施例２−転写制御システムの試験
ＣＡＲ  Ｔ細胞の分化を調整する転写因子を伴う、本システムの利便性について試験するために、次のトリシストロニックなレトロウイルスベクターコンストラクトを生成する。ＢＡＣＨ２転写因子を改変し、ＴＩＰをアミノ末端に取りつける。これを、２Ａペプチドにより膜係留ＴｅｔＲと共発現させる。さらにこれを、再び２ＡペプチドによりＣＤ１９  ＣＡＲと共発現させる。Ｔ細胞をレトロウイルス形質導入により改変し、このトリシストロニックカセットを発現させる。産生の間に、テトラサイクリンの存在下または非存在下で、Ｔ細胞を培養する。形質導入後にＴ細胞の表現型を、Ｔ細胞分化について試験する抗体パネルを用いたフローサイトメトリーにより調査する。テトラサイクリンの非存在下または存在下のいずれかで生成したＣＡＲ  Ｔ細胞の機能も、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、テトラサイクリンの非存在下および存在下で試験する。最後に、テトラサイクリンの非存在下または存在下で生成したＣＡＲ  Ｔ細胞について、Ｂ細胞株（ホタルのルシフェラーゼを発現するように操作されたＲａｊｉおよびＮＡＬＭ６）の異種移植片を有するＮＳＧマウスにおいて試験する。マウスには、腹腔内テトラサイクリンか、または腹腔内キャリアーのいずれかを与える。生物発光イメージングを用いて、腫瘍を追跡する。屠殺した後、脾臓および骨髄のフローサイトメトリー解析を行う。
【０２８５】
実施例３−キメラ抗原受容体（ＣＡＲおよび転写因子（ＴＦ）の共発現
ＢＷ５Ｔ細胞内で、バイシストロニックコンストラクトを単一の転写物として発現した。この転写物は２Ａ部位において自己切断して、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）；および転写因子（ＴＦ）を生み出す。２Ａ部位および転写因子を欠くか（「ＣＡＲのみ」）、またはＣＡＲおよび２Ａ部位を欠く（「ＴＦのみ」）コントロールコンストラクトも生成した。
【０２８６】
当該ＣＡＲは、ＣＤ３ゼータおよび共刺激受容体４１ＢＢに由来するエンドドメインを含む抗ＣＤ１９ＣＡＲであった。
【０２８７】
以下の表に示す転写因子を含むコンストラクトが試験された：
【表４】
2020501574.tif 000030
【０２８８】
実施例２−表現型アッセイ
【０２８９】
Ｔ細胞の表面上での様々なＣＡＲの発現は、ＣＡＲ抗原の非存在下におけるＴ細胞のメモリー状態に影響し得る。さらに、ＣＡＲがその同種抗原へと結合するとそのＴ細胞が活性化し、よりナイーブなセントラルメモリー表現型から、より分化したエフェクターメモリー表現型／エフェクター表現型へのさらなる分化をもたらす。適切な転写因子／リプレッサーの発現により、このＣＡＲを介する分化が様々な程度に防がれると予想される。
【０２９０】
様々な組み合わせのＣＡＲ−ＴＦを発現するＴ細胞、ならびに関連するＣＡＲのみのコントロールおよびＴＦのみのコントロールを、２４時間に渡ってＣＤ１９陽性のＳＫＯＶ３標的細胞と共培養し、その後、当該Ｔ細胞を回収して７日目まで培養した。細胞をセントラルメモリーへとバイアスする因子を発現している細胞が、形質導入後によりナイーブであるか、そして抗原を有する標的細胞を用いた刺激に際してもよりナイーブなままであるかについて見るために、共培養から０日目、および７日目において、下記のメモリーマーカーをフローサイトメトリーによって解析した。
メモリーマーカー−ＣＣＲ７，ＣＤ４５ＲＡ，ＣＤ６２Ｌ，ＣＤ２７
【０２９１】
ＦＯＸＯ１についてのデータを図５に示す。ＦＯＸＯ１とＣＡＲ（ＨＤ３７）の共発現により、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋部分集団の両方について０日目および７日目のいずれにおいても、ナイーブ細胞およびセントラルメモリー細胞（ＣＭ）の割合が増加した。これは、ＦＯＸＯ１が、形質導入後および標的細胞との共培養後のいずれにおいても、細胞をナイーブ表現型／セントラルメモリー表現型へとバイアスするということを示す。
【０２９２】
図６は、標的細胞との２４時間の共培養から６日後における、ＣＤ２７およびＣＤ６２Ｌの発現についてのデータを示す。転写因子ＥＯＭＥＳは、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞部分集団の両方において、ＣＤ２７の有意な上方調節を引き起こした。ＦＯＸＯ１は、特にＣＤ８＋細胞において、ＣＤ２７の上方調節を引き起こした。転写因子ＦＯＸＯ１は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋部分集団の両方において、ＣＤ６２Ｌの有意な上方調節を引き起こした。ＣＤ６２Ｌはナイーブ細胞／セントラルメモリー細胞のマーカーであり、メモリーの表現型決定はＦＯＸ０１について、ＣＤ６２Ｌレベルと相関する：より多くのナイーブ細胞およびメモリー細胞。ＣＤ２７は完全に分化したエフェクター細胞以外のすべての細胞のマーカーであるため、ＥＯＭＥＳを発現する細胞は主に、ＣＤ６２Ｌの有意な上方調節を示さない、より分化していないエフェクターメモリーのサブタイプであり得る。
【０２９３】
図７に示すように、形質導入後（０日目）および２４時間の共培養の６日後において、Ｒｕｎｘ３およびＣＢＦベータのいずれの存在もＣＤ６２Ｌの上方調節を引き起こした。
【０２９４】
ＢＡＣＨ２およびＢＡＣＨ２変異体Ｓ５２０Ａについてのデータを図８に示す。ＢＡＣＨ２およびＢＡＣＨ２Ｓ５２０Ａのいずれも、０日目および７日目においてナイーブ細胞およびセントラルメモリー細胞（ＣＭ）の割合を増加させる。
【０２９５】
別個のアッセイにおいて、様々な組み合わせのＣＡＲ−ＴＦを発現するＴ細胞、ならびに関連するＣＡＲのみを有するＴ細胞を、ＣＤ１９陽性のＳｕｐＴ１標的細胞と共培養した。刺激に際して細胞が、より弱い程度に「疲弊」マーカーを発現しているかについて見るために、下記の疲弊マーカーの発現を、フローサイトメトリーによって共培養から０日目、２日目、４日目、および７日目において解析した。
疲弊マーカー−ＰＤ１，Ｔｉｍ３，Ｌａｇ３
【０２９６】
細胞を、ＣＡＲ発現（ＲＱＲ８形質導入マーカーを介して）、ならびに対象の部分集団に依存して、様々なＴ細胞およびＴ細胞サブセットのマーカー（ＣＤ３およびＣＤ８）によりゲートした。
【０２９７】
上記の明細書中に記載される刊行物のすべてが、参照により本明細書に援用される。本発明の記載の方法およびシステムの様々な改変およびバリエーションが、当業者にとって、本発明の範囲及び精神から離れることなく自明である。本発明は特定の好ましい実施形態と関連して記載されたが、請求される本発明は、このような特定の実施形態に過度に限定されてはならない、ということが理解されなければならない。実際、本発明を実施するための、記載の様式の、分子生物学または関連する分野における当業者にとって自明な様々な改変が、下記の請求項の範囲内であることが意図される。
【図１】
2020501574.tif 000031
【図２】
2020501574.tif 000032
【図３】
2020501574.tif 000033
【図４】
2020501574.tif 000034
【図５】
2020501574.tif 000035
【図６】
2020501574.tif 000036
【図７】
2020501574.tif 000037
【図８】
2020501574.tif 000038
【配列表】
2020501574000001.app
【国際調査報告】
2020501574.tif 000039
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