(57)【要約】  本発明は、腫瘍の診断及び治療における使用のための卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）受容体のリガンドに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２に対応する配列、又はそれと少なくとも約９０％、好ましくは約９０％〜９９．９％、より好ましくは約９５％〜９７％の類似性を有する配列を特徴とする、ヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）のリガンド。
【請求項２】
配列番号３に対応する配列によってコードされる、ヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）のリガンド。
【請求項３】
成熟タンパク質のアルギニン残基Ｎ１３及びＮ３０にグリコシル化部位を含み、前記グリコシル化部位がそれぞれ２つのＮ−アセチルグルコサミン残基及びマンノース残基を含む、請求項１又は２に記載のヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）のリガンド。
【請求項４】
医学的使用のための、先の請求項に記載のヒト卵胞刺激ホルモン受容体のリガンド。
【請求項５】
腫瘍の治療及び／又は診断における医学的使用のための、先の請求項に記載のヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）のリガンド。
【請求項６】
前記腫瘍が原発性又は転移性の固形腫瘍である、腫瘍の治療及び／又は診断における使用のための請求項４又は５に記載のヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）のリガンド。
【請求項７】
前記腫瘍が、前立腺癌、特に、前立腺腺癌、乳腺、結腸、膵臓、腎臓、肺、肝臓、精巣、卵巣、脳及び甲状腺の癌、肉腫を含む、腫瘍の治療における使用のための、請求項４〜６のいずれか１項に記載のヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）のリガンド。
【請求項８】
−細胞毒性剤のクラスであって、かかる化合物が、好ましくは、カペシタビン等のピリミジンアンタゴニスト、カンプトテシンファミリー等の酵素阻害剤、例えばイリノテカンを含む群から選択される、細胞毒性剤のクラス、
−アルキル化剤のクラスであって、かかる化合物が、好ましくは、シスプラチン等の金属塩ファミリー、ドキソルビシン等のＤＮＡインターカレータ、アントラサイクリンファミリーを含む群から選択される、アルキル化剤のクラス、
−タンパク質合成調節剤のクラスであって、かかる化合物が、好ましくは、ボルテゾミブ等のプロテアソーム阻害剤ファミリー、テムシロリムス等のｍＴＯＲ阻害剤ファミリーを含む群から選択される、タンパク質合成調節剤のクラス、
−有糸分裂阻害剤のクラスであって、かかる化合物が、好ましくは、マイタンシン等のアンサマイトシンファミリー、オーリスタチンＥ等の微小管重合阻害剤ファミリーを含む群から選択される、有糸分裂阻害剤のクラス、
−β放出放射性同位元素のクラスであって、かかる化合物が、好ましくは、１３１Ｉ、１６９Ｅｒ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１５３Ｓｍ、８９Ｓｒ及び９０Ｙを含む群から選択される、β放出放射性同位元素のクラス、
を含む群から選択される抗腫瘍活性を有する分子と複合化された、腫瘍の治療における使用のための、請求項４〜７のいずれか１項に記載のヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）のリガンド。
【請求項９】
抗腫瘍活性を有する１以上の薬剤と組み合わせた、腫瘍の治療における使用のための、複合化形態又は非複合化形態である、請求項４〜８のいずれか１項に記載のヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）のリガンド。
【請求項１０】
−フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）若しくはインドシアニン（Ｃｙ５）を含む群から選択される蛍光分子、又は
−１２３Ｉ、１１１Ｉｎ、１８８Ｒｅ、１８Ｆ、３５Ｓ、９９Ｔｃを含む群から選択される放射性分子、
−ナノ粒子、
に複合化された、腫瘍の診断における使用のための及び／又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析のための、請求項４〜７のいずれか１項に記載のヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）のリガンド。
【請求項１１】
−細胞毒性剤のクラスであって、かかる化合物が、好ましくは、カペシタビン等のピリミジンアンタゴニスト、カンプトテシンファミリー等の酵素阻害剤、例えばイリノテカンを含む群から選択される、細胞毒性剤のクラス、
−アルキル化剤のクラスであって、かかる化合物が、好ましくは、シスプラチン等の金属塩ファミリー、ドキソルビシン等のＤＮＡインターカレータ、アントラサイクリンファミリーを含む群から選択される、アルキル化剤のクラス、
−タンパク質合成調節剤のクラスであって、かかる化合物が、好ましくは、ボルテゾミブ等のプロテアソーム阻害剤ファミリー、テムシロリムス等のｍＴＯＲ阻害剤ファミリーを含む群から選択される、タンパク質合成調節剤のクラス、
−有糸分裂阻害剤のクラスであって、かかる化合物が、好ましくは、マイタンシン等のアンサマイトシンファミリー、オーリスタチンＥ等の微小管重合阻害剤ファミリーを含む群から選択される、有糸分裂阻害剤のクラス、
−β放出放射性同位元素のクラスであって、かかる化合物が、好ましくは、１３１Ｉ、１６９Ｅｒ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１５３Ｓｍ、８９Ｓｒ及び９０Ｙを含む群から選択される、β放出放射性同位元素のクラス、
を含む群から選択される抗腫瘍活性を有する分子に複合化された、請求項１又は２又は３に記載のヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）のリガンド。
【請求項１２】
−フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）若しくはインドシアニン（Ｃｙ５）を含む群から選択される蛍光分子、
−１２３Ｉ、１１１Ｉｎ、１８８Ｒｅ、１８Ｆ、３５Ｓ、９９Ｔｃを含む群から選択される放射性分子、
−ナノ粒子、
を含む群から選択される診断活性を有する分子に複合化された、請求項１又は２又は３に記載のヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）のリガンド。
【請求項１３】
請求項１又は２又は３に記載のヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）のリガンドと、１以上の薬学的に許容可能な担体及び／又は賦形剤と、を含む、医薬品。
【請求項１４】
請求項１１又は１２に記載のヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）のリガンドと、１以上の薬学的に許容可能な担体及び／又は賦形剤と、を含む、医薬品。
【請求項１５】
静脈内投与用である、請求項１３又は１４に記載の医薬品。
【請求項１６】
前記受容体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ不活性化のための、請求項１又は２又は３に記載のヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）のリガンドの使用。
【請求項１７】
アミノ酸配列ＫＤＥＬの導入によって、前記ヒト卵胞刺激ホルモンのβサブユニット（ＦＳＨβ）の配列のＣ末端領域を修飾する工程を含む、請求項１又は２又は３に記載のヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）のリガンドの調製方法。
【請求項１８】
前記ヒト卵胞刺激ホルモンのβサブユニット（ＦＳＨβ）の配列のＮ末端終末にＨｉｓタグを導入する更なる工程を含む、先の請求項に記載のヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）のリガンドの調製方法。
【請求項１９】
医学的使用のための前記ヒト卵胞刺激ホルモンのβサブユニット（ＦＳＨβ）に代表されることを特徴とする、前記ヒト卵胞刺激ホルモン受容体のリガンド。
【請求項２０】
腫瘍の治療及び／又は診断における医学的使用のための、先の請求項に記載のヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）のリガンド。
【請求項２１】
前記腫瘍が原発性又は転移性の固形腫瘍である、腫瘍の治療及び／又は診断における使用のための請求項１９又は２０に記載のヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）のリガンド。
【請求項２２】
前記腫瘍が、前立腺癌、特に前立腺腺癌、乳腺、結腸、膵臓、腎臓、肺、肝臓、精巣、卵巣、脳及び甲状腺の癌、肉腫を含む、請求項２０又は２１に記載のヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）のリガンド。
【請求項２３】
−細胞毒性剤のクラスであって、かかる化合物が、好ましくは、カペシタビン等のピリミジンアンタゴニスト、カンプトテシンファミリー等の酵素阻害剤、例えばイリノテカンを含む群から選択される、細胞毒性剤のクラス、
−アルキル化剤のクラスであって、かかる化合物が、好ましくは、シスプラチン等の金属塩ファミリー、ドキソルビシン等のＤＮＡインターカレータ、アントラサイクリンファミリーを含む群から選択される、アルキル化剤のクラス、
−タンパク質合成調節剤のクラスであって、かかる化合物が、好ましくは、ボルテゾミブ等のプロテアソーム阻害剤ファミリー、テムシロリムス等のｍＴＯＲ阻害剤ファミリーを含む群から選択される、タンパク質合成調節剤のクラス、
−有糸分裂阻害剤のクラスであって、かかる化合物が、好ましくは、マイタンシン等のアンサマイトシンファミリー、オーリスタチンＥ等の微小管重合阻害剤ファミリーを含む群から選択される、有糸分裂阻害剤のクラス、
−β放出放射性同位元素のクラスであって、かかる化合物が、好ましくは、１３１Ｉ、１６９Ｅｒ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１５３Ｓｍ、８９Ｓｒ及び９０Ｙを含む群から選択される、β放出放射性同位元素のクラス、
を含む群から選択される抗腫瘍活性を有する分子に複合化された、腫瘍の治療における使用のための、請求項４〜２２のいずれか１項に記載のヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）のリガンド。
【請求項２４】
抗腫瘍活性を有する１以上の薬剤と組み合わせた、腫瘍の治療における使用のための、複合化形態又は非複合化形態の、請求項１９〜２３のいずれか１項に記載のヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）のリガンド。
【請求項２５】
−フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）若しくはインドシアニン（Ｃｙ５）を含む群から選択される蛍光分子、又は
−１２３Ｉ、１１１Ｉｎ、１８８Ｒｅ、１８Ｆ、３５Ｓ、９９Ｔｃを含む群から選択される放射性分子、又は
−ナノ粒子
に複合化された、腫瘍の診断における使用のための及び／又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析を行うための、請求項１９〜２４のいずれか１項に記載のヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）のリガンド。
【請求項２６】
−細胞毒性剤のクラスであって、かかる化合物が、好ましくは、カペシタビン等のピリミジンアンタゴニスト、カンプトテシンファミリー等の酵素阻害剤、例えばイリノテカンを含む群から選択される、細胞毒性剤のクラス、
−アルキル化剤のクラスであって、かかる化合物が、好ましくは、シスプラチン等の金属塩ファミリー、ドキソルビシン等のＤＮＡインターカレータ、アントラサイクリンファミリーを含む群から選択される、アルキル化剤のクラス、
−タンパク質合成調節剤のクラスであって、かかる化合物が、好ましくは、ボルテゾミブ等のプロテアソーム阻害剤ファミリー、テムシロリムス等のｍＴＯＲ阻害剤ファミリーを含む群から選択される、タンパク質合成調節剤のクラス、
−有糸分裂阻害剤のクラスであって、かかる化合物が、好ましくは、マイタンシン等のアンサマイトシンファミリー、オーリスタチンＥ等の微小管重合阻害剤ファミリーを含む群から選択される、有糸分裂阻害剤のクラス、
−β放出放射性同位元素のクラスであって、かかる化合物が、好ましくは、１３１Ｉ、１６９Ｅｒ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１５３Ｓｍ、８９Ｓｒ及び９０Ｙを含む群から選択される、β放出放射性同位元素のクラス、
を含む群から選択される抗腫瘍活性を有する分子に複合化された、請求項１９〜２５のいずれか１項に記載のヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）のリガンド。
【請求項２７】
−フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）又はインドシアニン（Ｃｙ５）を含む群から選択される蛍光分子、
−１２３Ｉ、１１１Ｉｎ、１８８Ｒｅ、１８Ｆ、３５Ｓ、９９Ｔｃを含む群から選択される放射性分子、
−ナノ粒子、
を含む群から選択される診断活性を有する分子に複合化された、請求項１９〜２６のいずれか１項に記載のヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）のリガンド。
【請求項２８】
前記サブユニットがヒト起源であるか、又は組み換えＤＮＡ手法によって得られる、請求項１９〜２７のいずれか１項に記載のヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）のリガンド。
【請求項２９】
請求項１９〜２８のいずれか１項に記載のヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）のリガンドと、１以上の薬学的に許容可能な担体及び／又は賦形剤と、を含む、医薬品。
【請求項３０】
静脈内投与用である、請求項２９に記載の医薬品。
【請求項３１】
ＦＳＨＲ受容体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ不活性化に対する、ヒト卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨＲ）のＦＳＨβサブユニットの使用。
【請求項３２】
神経芽細胞腫の治療及び／又は診断における医学的使用のための卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）のリガンド。
【請求項３３】
−前記卵胞刺激ホルモンのβサブユニット（ＦＳＨβ）の配列、又は
−配列番号２に対応する前記アミノ酸配列
を含む、先の請求項に記載の卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）のリガンド。
【請求項３４】
前記アミノ酸配列が、成熟タンパク質のアルギニン残基Ｎ１３及びＮ３０にグリコシル化部位を含み、前記グルコシル化部位がそれぞれ２つのＮ−アセチルグルコサミン残基及びマンノース残基を含む、先の請求項に記載の卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）のリガンド。
【請求項３５】
前記腫瘍が、小児科患者、好ましくは６歳以下の患者に存在する、請求項３２〜３４のいずれか１項に記載のリガンド。
【請求項３６】
−細胞毒性剤のクラスであって、かかる化合物が、好ましくは、カペシタビン等のピリミジンアンタゴニスト、カンプトテシンファミリー等の酵素阻害剤、例えばイリノテカンを含む群から選択される、細胞毒性剤のクラス、
−アルキル化剤のクラスであって、かかる化合物が、好ましくは、シスプラチン等の金属塩ファミリー、ドキソルビシン等のＤＮＡインターカレータ、アントラサイクリンファミリーを含む群から選択される、アルキル化剤のクラス、
−タンパク質合成調節剤のクラスであって、かかる化合物が、好ましくは、ボルテゾミブ等のプロテアソーム阻害剤ファミリー、テムシロリムス等のｍＴＯＲ阻害剤ファミリーを含む群から選択される、タンパク質合成調節剤のクラス、
−有糸分裂阻害剤のクラスであって、かかる化合物が、好ましくは、マイタンシン等のアンサマイトシンファミリー、オーリスタチンＥ等の微小管重合阻害剤ファミリーを含む群から選択される、有糸分裂阻害剤のクラス、
−β放出放射性同位元素のクラスであって、かかる化合物が、好ましくは、１３１Ｉ、１６９Ｅｒ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１５３Ｓｍ、８９Ｓｒ及び９０Ｙを含む群から選択される、β放出放射性同位元素のクラス、
を含む群から選択される抗腫瘍活性を有する分子に複合化される、神経芽細胞腫の治療における医学的使用のための請求項３２〜３５のいずれか１項に記載の卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）のリガンド。
【請求項３７】
前記リガンドが、複合化形態又は非複合化形態で、抗腫瘍活性を有する１又は薬剤と組み合わせて使用される、神経芽細胞腫の治療における医学的使用のための、請求項３２〜３６のいずれか１項に記載の卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）のリガンド。
【請求項３８】
前記サブユニットが、
−フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）又はインドシアニン（Ｃｙ５）を含む群から選択される蛍光分子、又は
−１２３Ｉ、１１１Ｉｎ、１８８Ｒｅ、１８Ｆ、３５Ｓ、９９Ｔｃを含む群から選択される放射性分子、又は
−ナノ粒子
に複合化された、神経芽細胞腫の診断における使用のための、請求項３２〜３７のいずれか一項に記載の卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）のリガンド。
【請求項３９】
神経芽細胞腫の治療及び／又は診断における医学的使用のための請求項３２〜３８のいずれか１項に記載の卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）のリガンドと、１以上の薬学的に許容可能な担体及び／又は賦形剤と、を含む、医薬品。
【請求項４０】
静脈内投与用である、先の請求項に記載の医薬品。
【請求項４１】
Ｉ）配列番号３に対応する配列を含むプラスミドで形質転換された好適なベクターを得る工程、
ＩＩ）工程Ｉ）の前記ベクターでニコチアナ・ベンサミアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）細胞を形質転換する工程、
ＩＩＩ）前記ニコチアナ・ベンサミアナ細胞を選択する工程、
ＩＶ）前記安定したニコチアナ・ベンサミアナ細胞を増殖させる工程、
Ｖ）細胞抽出物を作製する工程、
ＶＩ）ＦＳＨＲ受容体リガンドを精製する工程、
を含む、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）のβサブユニットによって表される卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）受容体のリガンドを調製する方法。
【請求項４２】
工程Ｉ）の前記ベクターがアグロバクテリウム・ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）によって表される、先の請求項に記載の方法。
【請求項４３】
工程ＩＩ）において、前記形質転換が約２５℃の暗闇で撹拌し続けながら４８時間の共培養に対して行われる、請求項４１又は４２に記載の方法。
【請求項４４】
工程ＩＩＩ）において選択培地を使用し、前記選択培地が０．９％重量／体積のアガー及び抗生物質で補足したＭＳを含む、請求項４１〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
工程ＩＩＩ）においてカルベニシリン及びカナマイシンを使用する、請求項４１〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
工程Ｖ）において、前記ニコチアナ・ベンサミアナ細胞を懸濁液中で培養する、請求項４１〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
工程Ｖ）において、前記ニコチアナ・ベンサミアナ細胞を、２４℃〜２７℃で１５日間に亘り、５０ｍｂａｒ〜１００ｍｂａｒの通気を維持して、ショ糖、ナフタレン−酢酸（ＮＡＡ）、及びカイネチンで補足したＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  １９６２）中でのインキュベーションにおいて維持する、請求項４１〜４６のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
工程（Ｖ）において抽出バッファーを使用し、前記抽出バッファーが、１％（重量／体積）ＸＡＤ−４及び１％（重量／体積）ポリビニルポリピロリドン（ＰＶＰＰ）で補足した、５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭクエン酸、４０ｍＭアスコルビン酸、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、０．０５％（重量／重量）Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ６．５を含む、請求項４１〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
工程ＶＩ）が、クロマトグラフィーカラムＩＭＡＣ、脱塩（ｄｅｓａｌｉｎｇ）カラム、及びイオン交換クロマトグラフィーカラムの順で使用して行われる、請求項４１〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
請求項４１〜４９のいずれか１項に記載の方法によって入手可能な前記卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）のサブユニットβによって表される、前記卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）受容体のリガンド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学分野における、特に腫瘍の診断及び治療における適用を見出す。
【背景技術】
【０００２】
卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）は糖タンパク質であり、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、及び絨毛膜性ゴナドトロピン（ＣＧ）等の高い構造類似性を特徴とするタンパク質を含む糖タンパク質ホルモン（ＧＰＨ）のクラスに属する。
【０００３】
ＦＳＨは脳下垂体前葉で合成され、ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）の刺激の結果として血流へと放出される。
【０００４】
ＦＳＨは、女性において卵胞の成熟を誘導する一方で、男性においてはセルトリ細胞を刺激して精子形成を促進し、生殖の生理学に重要な役割を果たす（非特許文献１）。
【０００５】
「Ｐｕｒｅｇｏｎ」（商標）及び「Ｇｏｎａｌ−Ｆ」（商標）等の組み換えＦＳＨに基づく調剤、又は「Ｆｏｓｔｉｍｏｎ」（商標）等の尿からの抽出物による調剤は、女性及び男性の両方の不妊を治療するため、並びに生殖補助プロトコルにおいて臨床現場で日常的に使用されている（非特許文献２）。
【０００６】
ＦＳＨは、非共有結合によって会合した２つのサブユニットα及びβで構成されるヘテロダイマーである。
【０００７】
αサブユニットは全てのＧＰＨに共通するが、βサブユニットは異なる糖タンパク質ホルモンでは異なり、それらの特定の生物学的活性を規定する。
【０００８】
ヒト卵胞刺激ホルモンのβサブユニット（ＦＳＨβ）（ＵｎｉＰｒｏｔコード：Ｐ０１２２５）は約１２．５ｋＤａの分子量を有し、１１１個のアミノ酸残基からなり、その１２個のシステイン残基は６つのジスルフィド架橋の形成に関与する。タンパク質中、アスパラギン７残基及びアスパラギン２４残基のレベルに２つのＮ−グリコシル化部位が存在する。
【０００９】
ＦＳＨホルモンの生物活性は、生体反応の誘導に重要な役割を果たすα鎖のアスパラギン５２残基のグリコシル化状態に依存する。
【００１０】
更に、ＦＳＨβレベルにおけるグリコシル化パターンは、特定の受容体に対するホルモン結合能に影響を及ぼす。
【００１１】
低グリコシル化形態は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて受容体に対してより大きな親和性を備えるが、ｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期はより短いのに対して、完全なグリコシル化を特徴とするアイソフォームについては真逆の現象が観察される（非特許文献３）。
【００１２】
血流に放出されたＦＳＨは、微小循環によって生体のあらゆる領域にも達することができる。ＦＳＨは、特定の受容体（ＦＳＨ受容体、ＦＳＨＲ）の結合及び活性化を通してその生理活性を発揮する。
【００１３】
生理学的条件下では、該受容体は、男性では精巣のセルトリ細胞においてのみ発現され、女性では顆粒膜卵巣細胞においてのみ発現される。
【００１４】
ＦＳＨ受容体はＧタンパク質共役型受容体のファミリーに属し、リガンド−受容体複合体の形成は、その代謝的意義が完全にはわかっていない一連のカスケードシグナルを誘発する。
【００１５】
最も研究されている生理学的効果は、セカンドメッセンジャーである環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）においてアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）を変換して、その細胞質基質濃度を増加させる、アデニリルシクラーゼ酵素の活性化である。
【００１６】
ｃＡＭＰは、細胞の生命にとって不可欠な種々のプロセスの調節において鍵酵素となるプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）の強い活性化因子である。
【００１７】
セルトリ細胞では、例えばＦＳＨＲの活性化は、テストステロンを１７β−エストラジオールに変換して、それと関連する代謝プロセスを刺激する酵素である、アロマターゼの発現の増加をもたらす（非特許文献４）。
【００１８】
１９９９年〜２０００年には既に、科学社会は、前立腺癌、とりわけ卵巣癌におけるＦＳＨＲの異常発現を強調し始めた（非特許文献５、非特許文献６）。
【００１９】
後年、その効果に対する証拠は著しく増加したが、２０１０年、Ｒａｄｕと同僚ら（非特許文献７）のみが、ＦＳＨＲが、多くの固形腫瘍の微小循環内皮組織のレベルで異常に発現されることを実証した。
【００２０】
その後、卵巣腫瘍において、ＦＳＨＲの過剰発現は疾患の重症度と相関するという証拠が強固となり、Ｒａｄｕの研究（非特許文献７）を確認する幾つかの証拠ももたらされ、ＦＳＨＲが異なる種類の原発性又は転移性の固形腫瘍において高レベルで発現されることが実証された（非特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２）。
【００２１】
開発されているＦＳＨＲリガンド
現在、ＦＳＨＲ特異的リガンドに対する研究は、２つの主な方法論、即ち、ｉ）合成ペプチドの開発、ｉｉ）モノクローナル抗体の開発、に従う。
【００２２】
いずれの戦略も、ペプチドの場合の限定的な特異性、又は抗体の場合の本質的な不安定性等の著しい欠点を有する。
【００２３】
現在、ＦＳＨＲに対して最も高い結合親和性を有する分子は、血流中ナノモル（ｎＭ）濃度で生理学的に存在するＦＳＨである。
【００２４】
従って、ＦＳＨ受容体が関与する癌に特異的に到達し、診断し、治療することを可能とする、既存のものに対して新しい有効な代替物を同定することが必要である。
【００２５】
先行技術文献である非特許文献１３は、前立腺癌の診断用のＦＳＨβサブユニットペプチドを記載する。非特許文献１３は、神経芽細胞腫に対する適用を記載していない。
【００２６】
非特許文献１４の出版物は、がんの治療におけるＦＳＨβサブユニットペプチドのパクリタキセルとの複合化を記載する。
【００２７】
特許文献１（Ｉｎｓｔ．Ｎａｔ．Ｒｅｃｈ．Ｍｅｄ．）は、ＦＳＨによって代表され得る、腫瘍の画像化及び治療に対するＦＳＨＲのリガンドを記載する。既知の通り、ＦＳＨは２つのサブユニット（α及びβ）を含む。
【００２８】
特許文献２は、刺激ホルモン関連疾患の治療におけるキメラゴナドトロピンの使用を記載する。
【００２９】
特許文献３は、ＦＳＨβサブユニットのフラグメント又はリシックドメイン（ｌｉｔｈｉｃ  ｄｏｍａｉｎ）に結合したＦＳＨβサブユニットを含む融合コンストラクトを記載する。特許文献３は、神経芽細胞腫の治療に対する使用における証拠は何ら示してない。
【００３０】
特許文献４は、ＦＳＨ又はＦＳＨβサブユニットのフラグメントを含む遺伝子コンストラクトを記載する。
【００３１】
非特許文献１５の出版物は、癌の治療におけるパクリタキセルとＦＳＨβサブユニットのフラグメントとの複合化を記載する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００３２】
【特許文献１】欧州特許出願番号第２，０９０，３２２号明細書
【特許文献２】欧州特許出願番号第２，９２４，０４９号明細書
【特許文献３】国際特許出願番号第２０１４／０７８５３３号明細書
【特許文献４】国際特許出願番号第２０１６／０５４１５３号明細書
【非特許文献】
【００３３】
【非特許文献１】Ｓｉｍｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９７
【非特許文献２】Ｄｅ  Ｂａｒｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．２０１３
【非特許文献３】Ｕｌｌｏａ−Ａｇｕｉｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．２０１１
【非特許文献４】Ｕｌｌｏａ−Ａｇｕｉｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９８
【非特許文献５】Ｂｅｎ−Ｊｏｓｅｆ  ｅｔ  ａｌ．１９９９
【非特許文献６】Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０００
【非特許文献７】Ｒａｄｕ  ｅｔ  ａｌ．２０１０
【非特許文献８】Ｐａｗｌｉｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１５
【非特許文献９】Ｐｌａｎｅｉｘ  ｅｔ  ａｌ．２０１５
【非特許文献１０】Ｓｉｒａｊ  ｅｔ  ａｌ．２０１３
【非特許文献１１】Ｓａｒｄｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．２０１２
【非特許文献１２】Ｓｉｒａｊ  ｅｔ  ａｌ．２０１０
【非特許文献１３】Ｌｕｏ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｍａｇｉｎｇ，ｖｏｌ．４０，ｎｏ．２，（１６  Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２０１３））
【非特許文献１４】Ｚｈａｎｇ  Ｘｉａｏｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，ｖｏｌ．４５３，ｎｏ．２，２０１３）
【非特許文献１５】Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ  （Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．６９，ｎｏ．１６，（１５  Ａｕｇｕｓｔ  ２００９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３４】
本発明は、驚いたことに、ヒト卵胞刺激ホルモンのβサブユニット（ＦＳＨβ）が高親和性でＦＳＨＲに結合し得ることを見出したことに基づく。
【００３５】
特に、ヒト卵胞刺激ホルモンのβサブユニット（ＦＳＨβ）は、ＦＳＨＲを不活性化することができることがわかった。
【００３６】
更に、本特許出願の発明者らは、組み換えＤＮＡ技術を利用することによって得られたＦＳＨβサブユニットの形態が、非常に安定な形態で産生され得ることも見出した。
【００３７】
これらの形態は、ＦＳＨＲに対して高い親和性で結合することを示し、格別で驚くべき利点を可能とする。
【課題を解決するための手段】
【００３８】
本発明の目的
本発明の第１の目的は、ヒト卵胞刺激ホルモンβ（ＦＳＨβ）サブユニットの医学的使用に表される。
【００３９】
特定の態様によれば、ヒト卵胞刺激ホルモンβ（ＦＳＨβ）サブユニットは、腫瘍の治療及び／又は診断における医学的使用のための適用を見出す。
【００４０】
本発明の第２の目的では、本発明は、組み換え形態のヒト卵胞刺激ホルモンのβサブユニット（ＡＢＲβ）の調製のための生物工学プラットフォームを記載する。
【００４１】
かかるプラットフォームで得られたヒト卵胞刺激ホルモンのβサブユニット（ＡＢＲβ）は、本発明の更なる目的である。
【００４２】
これらのサブユニットの医学的使用、特にがんの治療及び／又は診断における医学的使用は、本発明の更なる目的である。
【００４３】
別の態様によれば、ＦＳＨβ及びＡＢＲβのサブユニットを投与するための医薬品が記載される。
【００４４】
かかる医薬品では、上記ＦＳＨβ及びＡＢＲβサブユニットを、治療又は診断の活性がある分子と複合化することができる。
【００４５】
記載される組み換え形態を得るために使用されるコンストラクト及びベクターのヌクレオチド配列は、それぞれ、記載される新規なアミノ酸配列として、本発明の更なる態様となる。
【００４６】
本発明の別の目的では、本発明は、ＦＳＨβ又はＡＢＲβのサブユニットの使用を含むがんの治療及び／又は診断に関する方法を記載する。
【００４７】
本発明の更なる目的では、ＦＳＨ（ＦＳＨＲ）受容体不活性化のためのＦＳＨβ又はＡＢＲβのサブユニットの使用が記載される。
【００４８】
本発明の更なる態様によれば、ＫＤＥＬ配列の導入に代表されるＣ末端領域の修飾を有する、組み換えヒト卵胞刺激ホルモンのβサブユニット（ＦＳＨβ）の作製を含む、ヒト卵胞刺激ホルモン（ＡＢＲβ又はＡＢＲβ１）受容体のリガンドを作製する方法が本明細書に記載される。
【００４９】
特定の態様では、かかる方法は、Ｈｉｓタグの導入に代表される、ヒト卵胞刺激ホルモンのβサブユニット（ＦＳＨβ）の配列のＮ末端終末の修飾を更に含んでもよい。
【００５０】
従って、ヒト卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨβ）受容体のリガンドを調製するためのヒト卵胞刺激ホルモンのβサブユニット（ＦＳＨβ）の配列のＣ末端終末のＫＤＥＬ配列の使用、及び場合によってはＮ末端終末のＨｉｓタグの使用は、本発明の更なる目的となる。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】図１は、バイナリベクターｐＡＢＲの構造、即ち、ＲＢ／ＬＢ、左末端及び右末端の特異的組み換え部位；Ｔｍｌ＿ｐ、腫瘍形態学的に大きな（ｔｕｍｍｏｒ  ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｌａｒｇｅ）ＤＮＡのプロモータ；ＮＰＴ  ＩＩ、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ；Ｔｍｌ＿ｔ、腫瘍形態学的に大きなＤＮＡのターミネータ；ＣａＭＶ３５ｘ２＿ｐ、カリフラワーモザイクウイルスのプロモータ；ＴＥＶ５’、翻訳されていないＴＥＶ配列；Ｎｏｓ＿ｔ、ノパリンシンターゼのターミネータを示す。
【図２】図２は、精製されたＡＢＲβ１の電気泳動分析の結果を示す。
【図３】図３は精製されたＡＢＲβ１の脱グリコシル化後のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図４】図４は、精製されたＡＢＲβ１（２５ｋＤａのバンド）の質量スペクトルを示す。
【図５】図５は、ＨＰＬＣにおけるサイズ排除クロマトグラフィーによるリガンドＡＢＲβ１の凝集状態の分析結果を示す。
【図６】図６は、蛍光測定手法によるリガンドＡＢＲβ１の安定性の分析結果を示す。
【図７】図７は、セルトリ細胞におけるエストラジオール（Ｅ２）の産生の測定による、ＦＳＨＲの活性化に対するＡＢＲβ１の効果の分析結果を示す。データは平均±ＳＤ（ｎ＝３）として表される。ＣＴＲ：未処理の細胞；Ｇｏｎａｌ  Ｆ：市販薬で処理した細胞；ＡＢＲβ１：精製されたリガンドＡＢＲβ１で処理した細胞；Ｔ：テストステロンで補足した細胞。
【図８】図８は、ＮＢＤで標識されたＡＢＲβ１の癌細胞中のＦＳＨＲに対する結合の分析結果を示す。
【図９】図９は、ヒトＦＳＨＲで形質転換したＨｅＬａ細胞におけるＧｏｎａｌ  Ｆ（パネルＡ及びパネルＢ）及びＡＢＲβ１（パネルＣ及びパネルＤ）の内部移行の分析結果を示す。ＦＩＴＣの二次抗体のみ（パネルＡ及びＣ）と共にインキュベートした細胞。
【図１０】図１０は、Ｇｏｎａｌ  Ｆによって誘導され、リガンドＡＢＲβ１によって中和されたｃＡＭＰ産生の結果を示す。
【図１１】図１１は、癌細胞の増殖に対するリガンドＡＢＲβ１の効果を示す。
【図１２】図１２は、癌細胞の増殖に対するＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７で標識されたリガンドＡＢＲβ１の効果を示す。
【図１３】図１３は、フローサイトメトリ手法を用いて行われたがん細胞におけるリガンドＡＢＲβ１の内部移行の分析結果を示す。
【図１４】図１４は、リガンドＡＢＲβ１の位置及びがん細胞のリソソームコンパートメントにおけるその局在化を示す。
【図１５】図１５は、ヒトがん細胞のパネルにおける免疫フローサイトメトリ手法によるＦＳＨＲの発現分析の結果を示す。
【図１６】図１６は、ＡｒｒａｙＥｘｐｒｅｓｓ（ＥＭＢＬ）データベースを検索することによって行われたＦＳＨＲ遺伝子発現データ分析によるアウトプットとして得られた箱ひげ図の例を示す。分析したデータセットは、５０４個のヒト乳児神経芽細胞腫試料を含む。
【図１７】図１７は、ＮＢ３細胞におけるＦＳＨＲに対するＮＢＤで標識されたＡＢＲβ１の結合の分析結果を示す。
【図１８】図１８は、ＮＢ３細胞におけるＮＢＤで標識されたＡＢＲβ１の内部移行の分析結果を示す（処理した細胞の９６％超の画分は、細胞質小胞（パネルＢ）（ｎ＝３）に局在化したシグナルの出現を示す。未処理の細胞（パネルＡ））。
【図１９】図１９は、トリプシン消化に供されたリガンドＡＢＲβ１の脱グリコシル化形態の質量分析の解析によるアミノ酸配列被覆率を示す（ＣＡＭ：カルバミド−メチルステイン、（１）：誤った切断、ＭＳＯ：メチオニンスルフォキシド）。
【図２０】図２０は、ヒト神経芽細胞腫のがん細胞における免疫フローサイトメトリ手法によるＦＳＨＲの発現分析を示す。
【図２１】図２１は、マウスモデルにおけるＡＢＲβ１の尾静脈注射の（経時的な）効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
定義
本発明の明細書では、別段の指示がない場合、用語は、以下に述べられる意味を有すると理解されるものとする。
【００５３】
「ＦＳＨＲ」は、ヒト卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）受容体を意味し、このホルモンは２つのαサブユニット及びβサブユニットを含む。
【００５４】
「ＦＳＨβ」は、ヒト卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の単一のベータサブユニットを意味し、このサブユニットは配列番号１に対応する配列を特徴とする。
【００５５】
「ＡＢＲβ」は、本発明による生物工学的プラットフォームを使用して得ることができるヒト卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）のベータサブユニットを意味する。
【００５６】
「ＡＢＲβ１」は、本発明によるニコチアナ・ベンサミアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）の植物細胞における産生に対する生物工学プラットフォームを使用して得られるヒト卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の特定のベータサブユニットを意味し、このサブユニットは配列番号２に対応するアミノ酸配列を特徴とする。
【００５７】
より一般には、ＦＳＨβ、ＡＢＲβ、及びＡＢＲβ１のサブユニットは、それらが受容体自体に結合することができることから、ＦＳＨＲ受容体の「リガンド」と称される場合がある。
【００５８】
本発明の第１の目的によれば、ヒト卵胞刺激ホルモンのβサブユニット（ＦＳＨβ）の医学的使用が記載される。
【００５９】
特に、本発明は、がんの治療及び／又は診断におけるヒト卵胞刺激ホルモンのβサブユニット（ＦＳＨβ）の使用を記載する。
【００６０】
がんの用語は、腫瘍及びがん、即ち、制御されていない細胞増殖によって引き起こされる異常増殖を特徴とするそれらの組織を指す。
【００６１】
好ましい態様では、かかる腫瘍又はがんは、原発性又は転移性の固形腫瘍である。
【００６２】
詳しくは、前立腺（特に前立腺腺癌）、乳腺、結腸、膵臓、腎臓、肺、肝臓、精巣、卵巣、脳、及び甲状腺の腫瘍及び癌が含まれ、肉腫も含まれる。
【００６３】
本発明の態様によれば、かかる医学的使用は、新生児神経芽細胞腫の治療における適用を見出し得る。
【００６４】
特に、かかる医学的使用は、小児科患者において、好ましくは６歳以下の患者において記載される。
【００６５】
本発明の目期のため、ＦＳＨβサブユニットは、それ自体ががん治療法に使用されるか、又は抗がん剤と組み合わされる。
【００６６】
いかなる薬物にも複合化されていない形態では、ＦＳＨβサブユニットは、ＦＳＨＲとの結合においてＦＳＨ競合物質として使用され得て、従って、受容体の活性を遮断することができる。
【００６７】
使用可能であってβサブユニットに複合化され得る抗癌剤について、これらは、以下に属してもよい：
−細胞毒性薬のクラス。好ましくは、かかる化合物は、カペシタビン等のピリミジンアンタゴニスト、カンプトテシンファミリー等の酵素阻害剤、例えばイリノテカンを含む群から選択される；
−アルキル化剤のクラス。好ましくは、かかる化合物は、シスプラチン等の金属塩ファミリー、ドキソルビシン等のＤＮＡインターカレータ、アントラサイクリンファミリーを含む群から選択される；
−タンパク質合成調節剤のクラス。好ましくは、かかる化合物は、ボルテゾミブ等のプロテアソーム阻害剤ファミリー、テムシロリムス等のｍＴＯＲ阻害剤ファミリーを含む群から選択される；
−有糸分裂阻害剤のクラス。好ましくは、かかる化合物は、マイタンシン等のアンサマイトシンファミリー、オーリスタチンＥ等の微小管重合阻害剤ファミリーを含む群から選択される；
−β放出放射性同位元素のクラス。好ましくは、かかる化合物は、１３１Ｉ、１６９Ｅｒ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１５３Ｓｍ、８９Ｓｒ及び９０Ｙを含む群から選択される。
【００６８】
本発明の態様によれば、ＦＳＨβサブユニットは腫瘍の診断に使用される。
【００６９】
特に、腫瘍は、上に言及される腫瘍及びがんである。
【００７０】
一回適切に複合化されると、ＦＳＨβサブユニットは、従って、腫瘍学の画像診断における検出を可能とする。
【００７１】
この目的を達成するために使用される手法として、例えば、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、単一光子エミッショントモグラフィー（ＳＰＥＣＴ）、及び超音波が挙げられ、従って、ＦＳＨβサブユニットは、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、単一光子エミッショントモグラフィー（ＳＰＥＣＴ）、及び超音波等の手法を使用する診断に適した分子と適切に複合化され得る。
【００７２】
また、本発明の目的のため、診断の用語は、経時的な腫瘍の進行及び／又は治療の治療的処置の間の腫瘍の進行若しくは退縮を確認する能力を指す。
【００７３】
また、本発明の目的ため、診断は、検査目的でｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析を行うためＦＳＨβサブユニットを使用することも意味する。
【００７４】
第１の態様によれば、ＦＳＨβサブユニットは、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、又はインドシアニン（Ｃｙ５）等の蛍光分子と適切に複合化され得る。
【００７５】
核医学の分野では、ＦＳＨβサブユニットは、１２３Ｉ、１１１Ｉｎ、１８８Ｒｅ、１８Ｆ、３５Ｓ、９９Ｔｃ等の放射性分子と複合化され得る。
【００７６】
また、特定の態様では、ＦＳＨβサブユニットは、異なる性質のナノ粒子と複合化されてもよい。
【００７７】
ナノ粒子との複合化は、好適なリンカーによる場合がある。
【００７８】
ナノ粒子
担体（例えば、薬物、放射性同位元素、蛍光分子又は酵素に対する）として医学で使用されるナノ粒子は、通常、１ｎｍ〜１μｍのサイズを有する。
【００７９】
ナノ粒子は、平滑な又は不規則な表面を有してもよく、固体、中空であってもよく、細管によって交差されてもよく、又はレンズ形構造からなってもよい。
【００８０】
ナノ粒子は、無機材料又は有機材料で作製された粒子であり、無機系ナノ粒子は、Ａｕ、Ａｇ、Ｓｉ、Ｓｅ、Ｃｄ、又はグラフェン等の炭素化合物からなってもよく、一方、有機起源のナノ粒子は、例えば、糖若しくは脂質のポリマー（ミセル、リポソーム）、又はポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）等の分子からなってもよい。
【００８１】
ナノ粒子の目的は、該ナノ粒子内に含まれる大量の分子を参照部位へと運ぶことである。
【００８２】
本発明の目的のため、「複合化された」の用語は、ＦＳＨβサブユニット若しくはＡＢＲβサブユニット、又はより具体的にはＡＢＲβ１サブユニットが、診断的又は治療的な活性を有する分子に好適に連結されることを意味する。
【００８３】
かかる結合は、特に、好適なリンカーによって配向される若しくは得られる共有化学結合によって、又は配位結合によって表され得る。
【００８４】
ＦＳＨβサブユニットの起源について、これは、ヒトの尿の精製から又は組み換えＤＮＡ手法を使用して得ることができ、Ｆｅｒｔｉｎｅｘ（商標）、メトロジンＨＰ（商標）、Ｇｏｎａｌ−Ｆ（商標）（Ｓｅｒｏｎｏ）、Ｆｏｌｌｉｓｔｉｍ（商標）、Ｐｕｒｅｇｏｎ（商標）（Ｍｅｒｋ  Ｓｈａｒｐ＆Ｄｏｈｍｅ）等の市販の製品から得ることもできる。
【００８５】
本発明の別の態様によれば、ＦＳＨβサブユニットは、治療活性を有する分子との複合化形態又は非複合化形態で、治療剤と組み合わせて、腫瘍の治療方法に使用される（コンボ療法）。
【００８６】
ＦＳＨβサブユニットと治療剤との組み合わせは、相乗効果を提供することができる。
【００８７】
かかる治療剤は、特定の形態のがんの治療に使用される一群の分子から選択され得る。
【００８８】
第２の目的では、本発明は、植物細胞、より具体的にはニコチアナ・ベンサミアナに由来するヒト卵胞刺激ホルモンのβサブユニット（ＡＢＲβ１）の作製のための生物工学プラットフォームを記載する。
【００８９】
より一般的には、生物工学プラットフォームは、小胞体へと方向付けるために植物細胞のシグナルペプチド特性を挿入するようにＦＳＨβサブユニットアミノ酸配列が好適に修飾される方法を使用する。
【００９０】
従って、本発明は、ヒト卵胞刺激ホルモンのβサブユニット（ＦＳＨβ）のＣ末端領域を修飾するため、特に小胞体においてタンパク質を保持するために、ＫＤＥＬ配列を使用する。
【００９１】
従って、得られるタンパク質は、特有のグリコシル化プロセスを経て、驚いたことに、タンパク質の折りたたみが変化しないように導くプロセスを離れる。
【００９２】
特に、本発明のＡＢＲβ１リガンドは、成熟タンパク質のアスパラギン残基１３〜３０に対してグリコシル化される。
【００９３】
より詳しくは、グリコシル化部位は、マンノース残基の分岐鎖構造を含む。
【００９４】
マンノース残基は、約４５個〜７５個、好ましくは約５０個〜７０個、更に好ましくは約５８個〜６２個の合計数であり、６０個又は６１個であってもよい。
【００９５】
各グリコシル化部位は、２つのＮ−アセチルグルコサミン残基及びマンノース残基の分岐鎖構造を含む。
【００９６】
特に、各分岐鎖構造は、２９個、３０個、又は３１個のマンノース残基を含む。
【００９７】
各マンノース残基は、リン酸化、スルホリル化（ｓｕｌｆｏｒｙｌａｔｉｏｎ）、又はメチル化を含んでもよい。
【００９８】
更に、多糖部分は、フェノール基を含む分子に結合されてもよい。
【００９９】
フェノール基を含む分子は植物細胞の特徴である。
【０１００】
特に、かかるフェノール基は、ニコチアナ・ベンサミアナの植物細胞に典型的である。
【０１０１】
特定の態様では、本発明の目的は、本明細書に記載される方法で得られたＦＳＨβサブユニット（ＡＢＲβ１）である。
【０１０２】
特に、かかる方法は、ＫＤＥＬ配列によるＣ末端終末、及びヒト卵胞刺激ホルモンのβサブユニット（ＦＳΗβ）の６つのＨｉｓタグによるＮ末端終末の修飾を含む。
【０１０３】
従って、本発明によって記載されるプラットフォームは、ヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）のリガンドの調製に、Ｃ末端終末のＫＤＥＬ配列、またおそらくは、ヒト卵胞刺激ホルモンβサブユニット（ＦＳＨβ）の配列のＮ末端終末のＨｉｓタグを使用する。
【０１０４】
従って、好ましい態様によれば、本発明は、
Ｉ）配列番号３に対応する配列を含むプラスミドで形質転換された好適なベクターを得る工程、
ＩＩ）工程Ｉ）のベクターでニコチアナ・ベンサミアナを形質転換する工程、
ＩＩＩ）形質転換されたニコチアナ・ベンサミアナ細胞を選択する工程、
ＩＶ）安定したニコチアナ・ベンサミアナ細胞を増殖させる工程、
Ｖ）細胞抽出物を作製する工程、
ＶＩ）ＦＳＨＲ受容体リガンドを精製する工程、
を含む、組み換え形態の卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）のβサブユニットの作製方法を記載する。
【０１０５】
好ましい態様では、工程Ｉ）のベクターは、アグロバクテリウム・ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）に代表される。
【０１０６】
特に、工程ＩＩ）では、暗闇の中、約２５℃で撹拌し続けながら、４８時間の共培養で形質転換を行う。
【０１０７】
その後、細胞を選択する。
【０１０８】
好ましくは、工程ＩＩＩ）では、０．９％重量／体積のアガー及び抗生物質で補足したＭＳを含む、選択培地を使用する。
【０１０９】
好ましい態様では、この目的のため以下を使用する：カルベニシリン及びカナマイシン、より好ましくは２５０ｍｇ／Ｌのカルベニシリン及び１００ｍｇ／Ｌのカナマイシン。
【０１１０】
本発明の好ましい態様では、工程Ｖ）では、ニコチアナ・ベンサミアナ細胞は懸濁液中で培養される。
【０１１１】
別の好ましい態様では、培養は、最終培養容量の１０％に等しいニコチアナ・ベンサミアナ細胞の初回接種を提供する。
【０１１２】
ショ糖、ナフタレン−酢酸（ＮＡＡ）、及びカイネチンで補足したＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  １９６２）において、２４℃〜２７℃にて１５日間に亘って、５０ｍｂａｒ〜１００ｍｂａｒに通気を維持したインキュベーションで細胞培養を維持する。
【０１１３】
更に、新たな培地に細胞懸濁液のアリコートを移して７日毎に継代培養を作製する。
【０１１４】
暗闇の中、２５℃の一定温度で撹拌しながら細胞をインキュベートする。
【０１１５】
本発明によれば、工程Ｖ）は、１％（重量／体積）ＸＡＤ−４及び１％（重量／体積）ポリビニルポリピロリドン（ＰＶＰＰ）で補足した、５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭクエン酸、４０ｍＭアスコルビン酸、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、０．０５％（重量／重量）Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ  ６．５を含む抽出バッファーの使用を含む。
【０１１６】
その後、７０％飽和濃度を得るまで硫酸アンモニウムを抽出物に添加し、撹拌し続けながら４℃で１時間インキュベートする。
【０１１７】
次いで、沈殿物を遠心分離によって回収し、ＩＭＡＣバッファーに再懸濁する。
【０１１８】
調製物を遠心分離し、濾過する。
【０１１９】
得られた溶液を、カラムの通過によって工程ＶＩ）で精製する。
【０１２０】
特に、該溶液をＩＭＡＣクロマトグラフィーカラムに充填する。
【０１２１】
好ましくは、Ｎｉ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  ＦＦカラムを使用する。
【０１２２】
その後、目的の画分を合わせ、脱塩カラムに充填する。
【０１２３】
好ましくは、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５  Ｍｅｄｉｕｍカラムを使用する。
【０１２４】
その後、目的の画分を合わせ、イオン交換クロマトグラフィーカラムに充填する。
【０１２５】
好ましくは、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰカラムを使用する。
【０１２６】
精製の間、２８０ｎｍ及び２５４ｎｍで吸光度をモニターする。
【０１２７】
上に記載されるように、本明細書に記載される方法に従って得られるヒト卵胞刺激ホルモンのβサブユニット（ＦＳＨβ）（ＡＢＲβ１）、並びに腫瘍の治療及び／又は診断におけるその医学的使用は、本発明の更なる目的である。
【０１２８】
特に、本発明は、がんの治療及び／又は診断におけるＡＢＲβサブユニットの使用を記載する。
【０１２９】
がんの用語は、腫瘍及びがん、すなわち、制御されていない細胞増殖によって引き起こされる異常増殖を特徴とするそれらの組織を指す。
【０１３０】
好ましい態様では、かかる腫瘍又はがんは、原発性又は転移性の固形腫瘍である。
【０１３１】
詳しくは、前立腺、乳腺、結腸、膵臓、腎臓、肺、肝臓、精巣、卵巣、脳及び甲状腺の腫瘍及びがんが含まれ、肉腫も含まれる。
【０１３２】
本発明の態様によれば、かかる医学的使用は、新生児神経芽細胞腫の治療における適用を見出し得る。
【０１３３】
特に、かかる医学的使用は、小児科患者において、好ましくは６歳以下の患者において記載される。
【０１３４】
上に記載される通り、ＡＢＲβ１サブユニットは、懸濁液中でのニコチアナ・ベンサミアナの植物細胞の培養から生物工学的経路によって得られる。
【０１３５】
本発明の代替的な態様によれば、ＡＢＲβサブユニットは、哺乳動物、酵母、細菌の細胞、又は他の植物細胞等の他の細胞において生物工学的経路によって得られてもよい。
【０１３６】
特に植物細胞のうち、ダウカス・カロタ（Ｄａｕｃｕｓ  ｃａｒｏｔａ）、オリザ・サティバ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、グリキーネ・マックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）、トウモロコシの細胞が使用され得る。
【０１３７】
別の態様によれば、ＦＳＨβサブユニット及びＡＢＲβサブユニット、より詳しくはＡＢＲβ１サブユニットを投与する医薬品が記載される。
【０１３８】
より具体的には、かかる医薬品は、ＦＳＨβサブユニット又はＡＢＲβサブユニット、又はより具体的には、ＡＢＲβ１サブユニットと、１以上の薬学的に許容可能な担体及び／又は賦形剤とを含み得る。
【０１３９】
かかるサブユニットは、本発明の好ましい態様では、ＦＳＨβサブユニットに関して上に記載される、治療的又は診断的な活性を有する好適な分子と複合化され得る。
【０１４０】
また、本発明の別の態様によれば、ＡＢＲβ１サブユニットは、治療活性を有する分子との複合化形態で又は非複合化形態で、治療剤と組み合わせて、癌の治療方法において使用される（コンボ療法）。
【０１４１】
ＡＢＲβ１サブユニットと治療剤との組み合わせは、相乗効果を提供することができる。
【０１４２】
かかる治療剤は、特定の形態のがんの治療において使用される一群の分子から選択され得る。
【０１４３】
従って、本発明は、ＡＢＲβ１、上に記載されるＦＳＨβサブユニット、又は他のＡＢＲβサブユニット（他の細胞に適用される組み換えＤＮＡ技術によって取得可能）を含む診断用及び治療用の製剤を提供する。
【０１４４】
より具体的には、かかる医薬品は、静脈内投与用に製剤化される。
【０１４５】
更なる目的によれば、本発明は、ＦＳＨβ、ＡＢＲβ１サブユニット、又は他のＡＢＲβサブユニットの使用を含む、腫瘍を治療及び／又は診断する方法を記載する。
【０１４６】
特に、かかる方法は、おそらくは好適な医薬品に製剤化された、薬学的に有効量のＦＳＨβサブユニット、又はＡＢＲβサブユニット若しくはＡＢＲβ１サブユニットを、それを必要とする患者に投与する工程を含む。
【０１４７】
本発明の目的のため、患者は、原発性の又は転移性の固形腫瘍に苦しむ被験体であることが意図される。
【０１４８】
詳しくは、前立腺（特に前立腺腺癌）、乳腺、結腸、膵臓、腎臓、肺、肝臓、精巣、卵巣、脳、及び甲状腺の腫瘍及びがんが含まれ、肉腫も含まれる。
【０１４９】
特定の態様によれば、かかる方法は、新生児神経芽細胞腫の治療における適用を見出し得る。
【０１５０】
特に、かかる医学的使用は、小児科患者において、好ましくは６歳以下の患者において記載される。
【０１５１】
また、診断方法は、経時的な腫瘍の進行及び／又は治療的処置の間の腫瘍の進行若しくは退縮を確認する能力を指す。
【０１５２】
言い換えれば、異なる及びその後の時（Ｔ０及びＴ１等）に被験体における腫瘍の程度を判定する工程を含み、上記時間の間（Ｔ０〜Ｔ１等）に腫瘍の治療工程が行われ得る、経時的な腫瘍の進行及び／又は治療的処置の間の腫瘍の進行若しくは退縮を確認する方法に関する。
【０１５３】
本発明は、薬学的に活性な量のＦＳＨβサブユニット、又はＡＢＲβサブユニット若しくはＡＢＲβ１サブユニットを投与する工程を含む、ＦＳＨＲ受容体のｉｎ  ｖｉｖｏ不活性化方法を提供する。
【０１５４】
かかる方法は、代替的には、異なる目的で実験室においてｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われ得る。
【０１５５】
本発明の更なる態様によれば、ＦＳＨＲ受容体を不活性化するためのＦＳＨβ、又はＡＢＲβ若しくはＡＢＲβ１サブユニットの使用が記載される。
【０１５６】
かかる不活性化は、特に、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われ得る。
【０１５７】
従って、本特許出願では、以下の配列が記載される：
【表１】
2020501599.tif 000002
【０１５８】
ＡＢＲβ１サブユニットの配列を参照すれば、ＦＳＨＲ受容体との相互作用を修飾しないような、配列番号２と類似性を有する全ての配列が本発明の目的に含まれることが意図される。
【０１５９】
特に、「類似性」により、異なった又は構造上等価なアミノ酸で置換され得る同じ位置を占めるアミノ酸のパーセンテージを意味し、１００％に等しい類似性は２つの配列が同一であることを意味する。
【０１６０】
類似性はアラインメントによって特定されてもよく、特に、ＣＬＵＳＴＡＬＷ又はＢＬＡＳＴ等の１以上の既知のアルゴリズム又はプログラムに従って行われ得る。
【０１６１】
本発明の好ましい態様では、類似性のパーセンテージは、ＦＳＨβサブユニットの配列と共通するＡＢＲβ１サブユニットの配列のみに関する。
【０１６２】
本発明の別の好ましい態様では、類似性のパーセンテージは、上記受容体との相互作用に関与するアミノ酸を含まないＡＢＲβ１のアミノ酸の部分配列のみに関する。
【０１６３】
上記受容体との相互作用に関与するＡＢＲβ１のアミノ酸は、ＦＳＨβ配列のアミノ酸３３〜５３に対応する。
【０１６４】
本発明の目的のため、類似性は約９０％超、好ましくは約９０％〜９９．９％、より好ましくは約９５％〜９７％である。
【実施例】
【０１６５】
１．ＡＢＲリガンドの産生及び精製
ヒトＦＳＨβ（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ０１２２５）のタンパク質配列を、材料及び方法に関連する以下の欄に記載される通りｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで修飾した。シグナルペプチド領域（ＡＢＲβ１リガンド）を含む新規タンパク質をコードする遺伝子配列を植物における発現に対して最適化した（配列番号３）。
【０１６６】
次いで、ヌクレオチド配列をバイナリベクターｐＡＢＲ発現カセット（図１）に挿入し、植物細胞形質転換系としてアグロバクテリウム・ツメファシェンスを使用して、最も高いレベルのＡＢＲβ１リガンドを発現するニコチアナ・ベンサミアナの安定したクローンを得て、選択した。
【０１６７】
ＡＢＲβ１リガンドを、連続するクロマトグラフィーを使用して、懸濁液中で培養した植物細胞から精製した。
【０１６８】
２．ＡＢＲβ１リガンドの化学的特性評価
精製工程を最適化した後に得られたＡＢＲβ１リガンドをＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を使用して分析した。
【０１６９】
ヒトＦＳＨβ特異的抗体による免疫ブロッティング分析、及びクーマシーブリリアントブルー又はより感受性の銀染色法を用いる染色に供されたポリアクリルアミドゲルは、ＡＢＲβ１リガンドが９５％〜９８％の純度レベルを達成することを示す。上記分析は、ＦＳＨβ抗体に対する２つの反応性種の存在を明らかにする。
【０１７０】
図２は、精製したＡＢＲβ１の電気泳動分析の結果を示す。０．１μｇの精製したＡＢＲβ１をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析する。ＭＷ  分子量マーカー；ＳＳ、銀染色；ＷＢ、ヒトＦＳＨβ特異的抗体を使用する免疫ブロッティング。銀染色法によって検出された２５ｋＤａ及び３７ｋＤａの形態は、ヒトＦＳＨβ特異的抗体に反応性である。見かけ上の分子量が２５ｋＤａ及び３７ｋＤａの２つの種は、異なるタンパク質グリコシル化パターンの結果である。グリコシラーゼ（ＰＮＧａｓｅ  Ｆ）による試料の処理は、２つの高分子量種を、見かけ上の分子量が１４ｋＤａの単一の形態へと消滅させる。
【０１７１】
図３は、精製されたＡＢＲβ１の脱グリコシル化後のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果を示す。０．１μｇの精製されたＡＢＲβ１を脱グリコシル化プロトコルに供し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び後の銀染色法において分析した。左に向かって、分子量マーカー；１、精製され、脱グリコシル化されていないＡＢＲβ１リガンド；２、精製され、脱グリコシル化に供されたＡＢＲβ１リガンド。２５ｋＤａ及び３７ｋＤａのグリコシル化形態は、脱グリコシル化後に消滅し、１４ｋＤａの見かけ重量を有する脱グリコシル化されていない形態の生成が観察される。
【０１７２】
全ての分子種を異なる質量分析手法によって分析し、正確な分子量及びそのアミノ酸配列を特定した。グリコシル化された種を、２４４９３．２Ｄａ及び３７６５４．５７Ｄａの分子量にそれぞれ割り当て、脱グリコシル化タンパク質は１３７８３．６Ｄａの分子量を有する。
【０１７３】
タンパク質フィンガープリント分析は、ＡＢＲβ１リガンドのアミノ酸配列が、本特許出願に記載されている通り行われた修飾を有する成熟ヒトＦＳＨβのアミノ酸配列と同一であることを示した（図１９）。
【０１７４】
ＦＳＨＲによる効率的な結合にとって三次構造が必須であることから、ＡＢＲβ１リガンドのジスルフィド結合の構築パターンを検証した。ＡＢＲβ１リガンドの部分的なタンパク質分解によって得られた試料の質量分析の解析は、ジスルフィド結合の形成に関与するシステイン対の識別を可能とした。ジスルフィド結合の形成に関与するシステイン対の識別は、成熟ヒトＦＳＨβで観察されるものと同じパターンを示し、ＡＢＲβ１リガンドが正しいタンパク質の折り畳みを有することを確認する。
【０１７５】
３．グリコシル化
ＡＢＲβ１リガンドは、Ｃ末端にＫＤＥＬアミノ酸配列を有する。２つのグリコシル化タンパク質の形態及び脱グリコシル化された形態の分子量を考慮すると、タンパク質中のグルコース部分の質量を得ることができる。同じタンパク質にある２つのアスパラギン残基において同様のグリコシル化パターンを形成すると仮定して、本発明者らは、２４４９３Ｄａのタンパク質には、Ｎ−アセチルグルコサミン及び３０個のマンノース残基からなる第１のグルコース部分、並びに２個のＮ−アセチルグルコサミン及び３１個のマンノース残基からなる第２のグルコース部分が存在すると推測し得る。３７６５４のタンパク質形態では、Ｎ−アセチルグルコサミン及び７０個のマンノース残基からなるグルコース部分、並びに２個のＮ−アセチルグルコサミン及び７１個のマンノース残基からなる第２のグルコース部分が存在する。
【０１７６】
ＡＢＲβ１リガンドの製造及び精製の方法の第２の工程では、方法の最適化及び単一で特定の形態のグリコシル化ＡＢＲβ１の製造を達成するため細胞培養条件を修正した。そのようにして得られたＡＢＲβ１の唯一の形態は、脱グリコシル化されたアミノ酸配列の分子量１３７８３．６を有する。２４４９３のグリコシル化形態に対応するバンドには、質量分析の解析によって示されるように（図４）、１個又は２個のマンノースリン酸残基の存在により互いに異なる３つのグリコシル化アイソフォームがある。この高グリコシル化配置は全く予想されておらず、哺乳動物細胞、特にヒトにおけるグリコシル化パターンと非常に異なっている。
【０１７７】
４．安定性及び凝集
ＡＢＲβ１リガンドの安定性及び凝集傾向を検証するため、精製したタンパク質を、３回の凍結／解凍サイクル、真空下での凍結乾燥、又は２０℃及び３７℃で７２時間のインキュベーションに供した。ＨＰＬＣにおけるサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）手法を使用して凝集評価を行った。上記分析は、精製工程の終わりにＡＢＲβ１リガンドにおける総タンパクに関する凝集したタンパク質パーセンテージが４％未満であることを明らかにした。
【０１７８】
図５は、ＨＰＬＣにおけるサイズ排除クロマトグラフィーによる、ＡＢＲβ１リガンドの凝集状態の分析結果を示す。ＡＢＲβ１リガンドは、可溶性形態に対応する１つのメインピークのみの存在を有するクロマトグラフィープロファイルを示す。ピーク下面積の分析は、分析した全ての試料において４％未満の凝集を示す（ｎ＝３、ｐ≦０．０５）。
【０１７９】
精製されたＡＢＲβ１リガンド及び溶液中での経時的な安定性を、蛍光測定手法によって分析した。ＡＢＲβ１のアリコートを解凍し、最終容量１６００μｌとした（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファー、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１％ＰＥＧ−８０００（重量／体積）を含む、１μＭの濃度）。次いで、試料を直ちに分析し、その後４℃の冷蔵庫で保管した。蛍光発光スペクトルを測定し、記録して、試料を経時的に再度分析した。図６に示されるように、ＡＢＲβ１の蛍光スペクトルの特性は、最初の分析から７日間まで経時的に変化しない。
【０１８０】
上に記載される処理に供した精製タンパク質の試料は、凝集のパーセンテージに著しい変動を示さず、かかる条件下で該タンパク質が優れた可溶性及び経時的な安定性を特徴とすることを示す。
【０１８１】
５．セルトリ細胞におけるＦＳＨＲ受容体の活性化に対するＡＢＲβ１リガンドの効果。
セルトリ細胞は、ＦＳＨの研究及び「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」でのＦＳＨＲの活性化で一般に選択されるモデルの代表である。これらの細胞では、ＦＳＨＲの活性化は、テストステロンをエストラジオールに変換するアロマターゼ酵素の発現の増加を誘導する。従って、産生されるエストラジオールの増加は、ある分子がＦＳＨＲを活性化することができるかどうかを判断するのに重要なパラメーターとなる。このモデルでは、Ｇｏｎａｌ−Ｆ（商標）は、未処理の細胞と比べて、エストラジオールの産生の約３００％の増加を誘導する。驚いたことに、同じ実験条件では、ＡＢＲβ１リガンドはエストラジオール産生に何らの変化ももたらさず、従って、ＦＳＨＲを全く活性化することができないことを証明する。
【０１８２】
図７は、セルトリ細胞におけるエストラジオール（Ｅ２）産生の測定による、ＦＳＨＲの活性化に対するＡＢＲβ１の効果の分析結果を示す。データは平均±ＳＤ（ｎ＝３）として表される。ＣＴＲ：未処理の細胞；Ｇｏｎａｌ  Ｆ：市販薬で処理した細胞；ＡＢＲβ１：精製されたリガンドであるＡＢＲβ１で処理した細胞；Ｔ：テストステロンで補足した細胞。様々な試薬を図に示される濃度で使用する。Ｇｏｎａｌ  ＦはＦＳＨＲを結合して、対照と比べて約３００％のＥ２の増加をもたらし、ＡＢＲβ１リガンドはＦＳＨＲを活性化することができず、Ｅ２の産生はゼロである（ｐ＜０．０００１）。テストステロンによる処理は、種々の条件下で最大の潜在的なアロマターゼ活性を明らかにする（実験対照）。
【０１８３】
６．ＡＢＲβ１リガンドの標識化及びＦＳＨＲへの結合
ＡＢＲβ１リガンドが特異的且つ効率的にＦＳＨＲを結合することができるという仮説を検証するため、蛍光プローブを用いて精製されたタンパク質を誘導体化し、リガンド−受容体結合分析をｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞モデルに対して行うことを可能とすることが必要であった。この目的のため、蛍光顕微鏡検査及びフローサイトメトリに基づく手法を使用した。ＡＢＲβ１リガンドを、４−クロロ−７−ニトロベンゾフラザン（ＮＢＤ）及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７の２つの異なる蛍光分子で誘導体化した。ヒト不死化細胞株（卵巣癌モデル）であるＯＶＣＡＲ−３、ＯＶＣＡＲ−５、ＣＡＯＶ−３を、ＦＳＨＲを発現するｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルとして選択した。蛍光ＡＢＲβ１リガンドと短時間インキュベートした細胞は、均質で顕著な細胞膜修飾を示し、これは、インキュベーションで使用した蛍光タンパク質の濃度と相関し、ＡＢＲβ１リガンドのＦＳＨＲとの結合特異性を実証するためにＧｏｎａｌ−Ｆ（商標）との同時インキュベーションの場合に消失する。
【０１８４】
フローサイトメトリ分析は、全細胞に対する標識化された細胞のパーセンテージがいずれの場合も９６％超であることを明らかにする。
【０１８５】
同じ結果が、ＬＳ−１８０（ヒト結腸癌モデル）等他の細胞株に対しても得られた。
【０１８６】
図８は、癌細胞において、ＮＢＤで標識されたＡＢＲβ１のＦＳＨＲへの結合の分析結果を示す。
【０１８７】
図に示される癌細胞を、標識化ＡＢＲβ１リガンドで処理した後、蛍光シグナル（ＦＬ：ＦＩＴＣチャネル）の分析に先立って生理食塩水中で洗浄した。フローサイトメータを使用して実験を行った。上記分析は、ＡＢＲβ１を結合する細胞（薄い灰色のピーク）が、処理した細胞の合計（濃い灰色のピーク）の９６％超を表すことを示す（ｎ＝３）。
【０１８８】
７．ＡＢＲβ１の内部移行の分析
ＦＳＨＲ受容体の内部移行動態に対するＡＢＲβ１リガンドの効果の分析を、免疫蛍光法及び共焦点顕微鏡検査によって行った。
【０１８９】
スライドに蒔いたＨｅＬａ細胞（完全ＤＭＥＭ培地で培養）を、ヒトＦＳＨＲを過剰発現させるプラスミドでトランスフェクトし、播種から２４時間後、０．１μｇ／ｍｌのＧｏｎａｌ−Ｆ（商標）、ＡＢＲβ１、又はＮＢＤで標識したＡＢＲβ１で細胞を処理した。
【０１９０】
ＮＢＤで標識したＡＢＲβ１により処理した細胞を（材料及び方法の欄に記載されるように）固定し、共焦点顕微鏡を使用する蛍光顕微鏡検査で分析した。Ｇｏｎａｌ−Ｆ（商標）又は非標識化ＡＢＲβ１リガンドで処理した細胞を固定し、免疫細胞化学プロトコルに供した。この場合、ヒトＦＳＨＲに対する特異的抗体、及び共焦点蛍光顕微鏡においてその顕色を可能とする二次抗体の使用によって、ＦＳＨＲの内部移行を強調した。図９に示されるように、蛍光細胞質小胞の出現はいずれの場合にも観察される。スライドに付着したＨｅＬａ細胞を、ヒトＦＳＨＲ発現のためのプラスミドで形質転換した。トランスフェクションから２４時間後、細胞をＧｏｎａｌ  Ｆ又はＡＢＲβ１リガンドと共にインキュベートし（１００ｎｇ／ｍｌで１５分間）、次いで、生理食塩水中で洗浄し、固定してヒトＦＳＨＲ特異的抗体及び共焦点蛍光によって検出されるＦＩＴＣと複合化された二次抗体を使用する免疫組織化学分析に供される前に、３７℃で３０分間、更にインキュベートした。上記分析は、Ｇｏｎａｌ  Ｆ（パネルＡ及びパネルＢ）及びＡＢＲβ１リガンド（パネルＣ及びパネルＤ）が、細胞質小胞において局在化したシグナルの出現によって証明される高率の内部移行を有することを示す。二次ＦＩＴＣ抗体単独とインキュベートされた細胞（パネルＡ及びパネルＣ）。使用した種々の手法は、観察される現象が、ＦＳＨＲの特異的なリガンド誘導性内部移行に起因することを明らかにし、確認する。
【０１９１】
８．Ｇｏｎａｌ−Ｆ（商標）誘導性ｃＡＭＰ産生及びＡＢＲβ１誘導性中和の分析
ＦＳＨＲに対するＡＢＲβ１リガンドの結合特異性及び結合効率を検証するため、ｃＡＭＰ産生（受容体の結合及び活性化の結果）に対するその効果を、Ｇｏｎａｌ−Ｆ（商標）を用いる競合研究で評価した。ヒトＦＳＨＲをコードする遺伝子を含むプラスミド、及び蛍光顕微鏡によってｃＡＭＰの変化を測定することを可能とするタンパク質プローブであるＥｐａｃ１−ｃａｍｐｓをコードするプラスミドでＨＥＫ２９３細胞を同時トランスフェクトした。Ｇｏｎａｌ−Ｆ（商標）を用いる予備的な用量応答分析は、感受性、上記系の動的応答範囲、及びＧｏｎａｌ−Ｆ（商標）が最も大きな効果をもたらす濃度を規定することを可能とした。ＡＢＲβ１リガンドの濃度が５００ｎｇ／ｍｌに固定され、Ｇｏｎａｌ−Ｆ（商標）の濃度が１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌの範囲で変化される競合実験におけるｃＡＭＰ変動の測定は、Ｇｏｎａｌ−Ｆ（商標）／ＡＢＲβ１リガンドの競合曲線の生成を可能とした。
【０１９２】
図１０は、Ｇｏｎａｌ  Ｆによって誘導され、ＡＢＲβ１リガンドによって中和されたｃＡＭＰ産生の結果を示す。ＨＥＫ２９３細胞を、ヒトＦＳＨＲ及びＦＲＥＴ（Ｅｐａｃ２−ｃａｍｐｓ）による蛍光でｃＡＭＰの細胞質濃度を測定することを可能とするプローブでトランスフェクトした。Ｇｏｎａｌ  Ｆは、用量依存的な方法でｃＡＭＰの産生を誘導する（黒線）。５００ｎｇ／ｍｌの濃度のＡＢＲβ１リガンドの存在下で（灰色線）、競合のない状況でのその最大活性の５０％を得るためには、５０ｎｇ／ｍｌのＧｏｎａｌ  Ｆの添加が必要とされる。Ｄｒ／Ｒ／分、基準蛍光に対して正規化された蛍光変動。データは平均±ＳＤ（＊＝ｐ≦０．０１；＊＊＝ｐ≦０．０５）として表される。
【０１９３】
得られたデータは、５００ｎｇ／ｍｌのＡＢＲβ１リガンドの存在下で、競合のない状況での薬物の最大活性の５０％を達成するためには５０ｎｇ／ｍｌのＧｏｎａｌ−Ｆ（商標）が必要とされることを示す。従って、５０ｎｇ／ｍｌのＧｏｎａｌ−Ｆ（商標）を中和するためには、既知の最も強力なＦＳＨＲリガンドであるＡＢＲβ１リガンド５００ｎｇ／ｍｌは十分であるということになる。かかる濃度比、即ち１：１０は非常に低いことが判明し、ヒトＦＳＨＲに対するＧｏｎａｌ−Ｆ（商標）との競合の際のＡＢＲβ１の極端な有効性を強調し、またその極端な親和性及び特異性を確認する。
【０１９４】
９．癌細胞の増殖速度に対するＡＢＲβ１リガンドの効果：Ｇｏｎａｌ  Ｆとの競合
ＦＳＨＲの活性化が細胞増殖を調節する機構に関与することから、本発明者らは、ヒト腫瘍、即ちＣＡＯＶ−３、ＯＶＣＡＲ−３（卵巣腫瘍）及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１（トリプルネガティブ乳癌）の３つのモデル株における細胞増殖速度に対するＡＢＲβ１リガンドの効果を試験した。いずれ細胞株でも、Ｇｏｎａｌ  Ｆ（０．１μｇ／ｍｌ）による処理は、投与から４８時間に細胞増殖の速度の著しい増加を誘導する（ＣＡＯＶ−３、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＋４０％  ＯＶＣＡＲ−３  ＋２０％）。ＡＢＲβ１リガンド（０．１μｇ／ｍｌ）による処理は、対照条件で測定したものと比べて、細胞増殖の速度をＣＡＯＶ−３細胞では１５％、及びＯＶＣＡＲ−３細胞では４０％減少させる。驚いたことに、全ての株においてＡＢＲβ１リガンドは、細胞増殖に対するＧｏｎａｌ  Ｆの効果を取り消すことができ、その作用を無効にする。
【０１９５】
図１１は、癌細胞の増殖に対するＡＢＲβ１リガンドの効果を示す。図に示される癌細胞を、ｔ＝０時間に単回用量のＡＢＲβ１リガンド（０．１μｇ／ｍｌ）、Ｇｏｎａｌ  Ｆ（０．１μｇ／ｍｌ）、又はＧｏｎａｌ  Ｆ＋ＡＢＲβ１の両方の混合物（いずれのも０．１μｇ／ｍｌの濃度）で処理した。Ｇｏｎａｌ  Ｆは、対照（Ｃｔｒ）に関し、４８時間で、ＣＡＯＶ−３細胞及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１では約４０％（ｐ≦０．０５）、並びにＯＶＣＡＲ−３では約２０％（ｐ≦０．０５）の増殖速度の増加を誘導する。ＡＢＲβ１リガンドは、４８時間で、ＣＡＯＶ−３細胞において約１５％（ｐ≦０．１）、及びＯＶＣＡＲ−３細胞において約４０％（ｐ≦０．０５）の増殖速度の減少を誘導する。細胞株では、ＡＢＲβ１リガンドはＧｏｎａｌ  Ｆと競合して、その細胞増殖に対する効果を無効にする（ｐ≦０．００５）。明瞭にするため、Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）は図に示されていない。
【０１９６】
これは、「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」において、ＡＢＲβ１リガンドはＦＳＨＲと相互作用して、匹敵する濃度でＧｏｎａｌ  Ｆと競合することを意味する。
【０１９７】
１０．癌細胞の増殖速度に対するＡｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ６４７で標識されたＡＢＲβ１リガンドの効果：Ｇｏｎａｌ  Ｆとの競合
「ｉｎ  ｖｉｖｏ」実験で動物において追跡可能な分子を得るように、ＡＢＲβ１リガンドをＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７で標識した。これは、例えば、動物において誘導された腫瘍腫瘤（ｔｕｍｏｒ  ｍａｓｓ）内での特異的なＡＢＲβ１リガンドの蓄積を確認するのに重要である。標識化プロセスがＡＢＲβ１リガンドのＦＳＨＲに対する結合能に影響しないことを検証するため、項目８に記載の実験を繰り返した。ＡＢＲβ１  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７は、非標識化ＡＢＲβ１リガンドと比べて幾分効率の低い方法であるがＧｏｎａｌ  Ｆと競合することができる（図１２）。
【０１９８】
特に、図１２は、癌細胞の増殖に対するＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７で標識されたＡＢＲβ１リガンドの効果を示す。癌細胞を、ｔ＝０時間に単回用量のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７で標識されたＡＢＲβ１リガンド（ＡＢＲβ１＿ＦＬ）（０．１μｇ／ｍｌ）、Ｇｏｎａｌ  Ｆ（０．１μｇ／ｍｌ）又はＧｏｎａｌ  Ｆ＋ＡＢＲβ１＿ＦＬの両方の混合物（いずれも０．１μｇ／ｍｌの濃度）で処理した。ＡＢＲβ１＿ＦＬリガンドは、ＡＢＲβ１リガンドによってもたらされるものに類似する方法でＧｏｎａｌ  Ｆの効果を阻害し、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７標識化は、その有効性の一部のみに影響することを証明する。明瞭にするため、Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）は図に示されていない。効率の喪失は、ＡＢＲβ１リガンドのＦＳＨＲと相互作用する能力を損なう蛍光分子との結合に起因する。観察される効果がなおも含まれて、ＡＢＲβ１  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７が「ｉｎ  ｖｉｖｏ」実験において使用可能であることを確認する。
【０１９９】
１１．ＯＶＣＡＲ−３及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１におけるＡＢＲβ１  ＮＢＤの国際化（ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）のフローサイトメトリ分析。
細胞（４×１０４個のＯＶＣＡＲ−３又はＭＤＡ−ＭＢ−２３１）を実験の２４時間前に２４ウェルプレートに蒔いた。最良の実験条件を特定するため、蛍光ＡＢＲβ１リガンドの濃度を増加させて細胞をインキュベートした。１時間のインキュベーションの後、細胞をバーゼン液で洗浄し、２００μｌのＦＢＳを添加することによって中和されるトリプシンを使用してプレートから剥離した。遠心分離した細胞を、ＦＡＣＳ蛍光測定のためバーゼン液に再懸濁した。４８８ｎｍのレーザをフルオロフォアの励起に使用した（ＮＢＤによって誘導体化されたＡＢＲβ１）。３回繰り返した１×１０４個の事象を各実験について分析した。ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアを使用してデータ分析を行った。図１３に示されるように、細胞における蛍光リガンドの内部移行は、インキュベーションに使用される蛍光リガンドの濃度に依存する。
【０２００】
１２．ＡＢＲβ１はＯＶＣＡＲ−３及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１における内部移行の後リソソームに蓄積する。
Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７で誘導体化されたリガンドを使用してＡＢＲβ１リガンドの内部移行及び細胞内局在化を行い、ＦＳＨＲを過剰発現する細胞であるＯＶＣＡＲ−３及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１に対して共焦点顕微鏡により評価した。細胞（１×１０５個のＯＶＣＡＲ−３及び８×１０４個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１）を、蛍光リガンドとのインキュベーションの２４時間前に共焦点顕微鏡用スライドに蒔いた。次いで、細胞を標識化ＡＢＲβ１リガンド（５００ｎｇ／ｍｌのＡＢＲβ１  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７及びＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ  ＤＮＤ−２６、７５ｎＭ）と共に完全培地中３７℃で１時間に亘り同時にインキュベートした。画像取得に先立って、細胞をＨＢＳＳ液で２回洗浄し、同じバッファーに維持して、共焦点顕微鏡によって直ちに分析した。図１４に示されるように、両方の細胞株において、細胞リソソームに特異的に蓄積するＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ  ＧｒｅｅｎによるシグナルがＡＢＲβ１シグナルと共局在する。これは、内部移行の後、ＡＢＲβ１が細胞リソソームにおいて区画化されることを意味する。
【０２０１】
１３．腫瘍細胞株のパネルにおけるＦＳＨＲ発現の分析
細胞表面上のＦＳＨＲの存在を検証するため、ヒト腫瘍の細胞株モデルのパネルをＦＡＣＳで分析し、その分析をヒトＦＳＨＲに対して作製された特異的一次抗体を使用して行った。細胞（０．５×１０６個／試料）を培養フラスコから採取し、実験の間、フローサイトメトリチューブ中、氷上で維持した。３つの試料、すなわち、ｉ）未処理の細胞、ｉｉ）ウサギで作製されたＦＳＨＲに対する一次抗体（ＳＡＢ４５０１０４１、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（商標）４８８（ＴｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）と複合化された抗ＩｇＧ二次抗体と共にインキュベートした細胞、ｉｉｉ）二次抗体単独とインキュベートした細胞、を各細胞株に対して作製した。標識化プロトコルの終わりに、細胞をＦＡＣＳで分析し、２×１０５個の事象を取得し、ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアを使用して各試料を分析した。分析した細胞株の一覧及び結果を図１５に示す。
【０２０２】
１４．新生児神経芽細胞腫におけるＡＢＲβ１及びＦＳＨＲ
新生児神経芽細胞腫（ＮＢ）においてＦＳＨＲ遺伝子発現パターンを定義するため、欧州分子生物学研究所（ＥＭＢＬ）に寄託された「Ｅ−ＭＴＡＢ−１６」と称されるデータセットを分析した。
【０２０３】
上記データセットにおいて、マイクロアレイ技術を使用して得られた遺伝子発現分析を収集した。
【０２０４】
上記コレクションは、以下に列挙される７つのクラス、即ち、リスククラス、腫瘍進展期、ＭＹＣＮ遺伝子状態、生存者／死亡者、再発、診断時の年齢、及び診断後の生存に分類された５０４個のＮＢ試料からなる。
【０２０５】
プライマリデータを正規化されたデータとしてデータベースから取得した（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ａｒｒａｙｅｘｐｒｅｓｓ／ｆｉｌｅｓ／Ｅ−ＭＴＡＢ−１６１／Ｅ−ＭＴＡＢ−１６１．ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ．１．ｚｉｐ）。
【０２０６】
目的の遺伝子に対するプローブとして同定された配列を、ｂｏｗｔｉｅ２ソフトウェアを使用して、参照ゲノムｈｇｌ９に再び割り当てた。
【０２０７】
高い特異性及び信頼性で目的の遺伝子を同定するプローブのみを後の分析に使用した。
【０２０８】
同じ遺伝子上にあると思われる異なったプローブの場合に得られた遺伝子発現レベルを、利用可能なデータの中央値を使用して正規化した。
【０２０９】
診断時の患者の年齢、腫瘍ステージ、ＭＹＣＮ発現状態等のＮＢの分類に使用される多くの異なるパラメーターに関してＦＳＨＲ遺伝子発現の境界を定めるため、上記分析を行った。
【０２１０】
ＦＳＨＲ遺伝子発現の箱ひげ図（図１６）を作成し、ウィルコクソン統計検定を使用し、異なる群に関係するデータに統計的有意値を割り当てて分析した。
【０２１１】
本特許出願の発明者らは、病理学的状態の発展状態にかかわらず、患者群を形成する全ての試料で、新生児神経芽細胞腫ＦＳＨＲにおいてＦＳＨＲが過剰発現されることを見出した。それは、早期診断及び高い生存率を伴う患者に由来する試料と、診断が遅れた患者及び死亡した患者に由来する試料の両方において、ＦＳＨＲが過剰発現されることに関連する。
【０２１２】
上記発現を検証するため、神経芽細胞腫ＮＢ３細胞におけるＦＳＨＲタンパク質の存在を使用した（神経芽細胞腫細胞モデル）。細胞を蛍光ＡＢＲβ１リガンドと共にインキュベートし、蛍光顕微鏡検査及びフローサイトメトリにおいて分析した。
【０２１３】
これらのデータは、（蛍光）ＡＢＲβ１リガンドで標識され、したがって細胞表面にＦＳＨＲを発現する細胞のパーセンテージが、全ての分析した細胞において９６％超であることを示す。
【０２１４】
図１７は、ＮＢ３細胞におけるＮＢＤで標識されたＡＢＲβ１のＦＳＨＲに対する結合の分析結果を示す。ＮＢ３細胞（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ神経芽細胞腫モデル）を標識化ＡＢＲβ１リガンドで処理し、次いで、ＦＩＴＣチャネルでフローサイトメトリによって行われる蛍光シグナル（ＦＬ）の分析に先立って、生理食塩水液中で洗浄した。上記分析は、ＡＢＲβ１を結合する細胞が（パネルＢ）、処理した全細胞（パネルＡ）の９６％超を占めることを示す（ｎ＝３）。
【０２１５】
更に、分析した細胞の９６％超において蛍光細胞質小胞の出現によって実証されるように、顕微鏡実験は、ＡＢＲβ１リガンドが、細胞ＮＢ３において高率の内部移行を有し、それが大半の細胞に影響を及ぼすことを示す。
【０２１６】
図１８は、ＮＢ３細胞におけるＮＢＤで標識されたＡＢＲβ１の内部移行の結果を示す。スライドに付着したＮＢ３細胞を標識化ＡＢＲβ１リガンド（１５０ｎｇ／ｍｌで１５分間）と共にインキュベートした後、生理食塩水中で洗浄して、蛍光顕微鏡分析（ＦＩＴＣチャネル）に先立って３７℃で３０分間に亘り再びインキュベートした。分析は、ＡＢＲβ１リガンドが高率の内部移行を有することを示す。処理した細胞の画分の９６％超が、細胞小胞において局在化したシグナルの出現を示す（パネルＢ）（ｎ＝３）。未処理の細胞（パネルＡ）。ヒト神経芽細胞腫モデル細胞ＩＭＲ−３２及びＳＨ−ＳＹ５Ｙに対する、ヒトＦＳＨＲに対する特異的抗体を使用するフローサイトメトリ分析は、細胞膜上の受容体の存在を明らかにする、図２０。
【０２１７】
１５．ＡＢＲβ１リガンドの急性毒性の予備分析
予備的研究では、ｉｎ  ｖｉｖｏでＡＢＲβ１リガンドの急性毒性を評価した。この目的のため、１２週齢〜１４週齢のＣＤ１株の雄性マウス（ｎ＝３）及び雌性マウス（ｎ＝３）をＡＢＲβ１リガンドで処理した（担体：１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＮａＨＰＯ４、６０μΜ  Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ  ６．８）。０．２２μｍＰＥＳ膜で予め濾過した１．２５ｍｇ／ｍｌの濃度のＡＢＲβ１を含む溶液２００μｌ／２５ｇで各マウスを処理した。５０μｌの溶液をＬＢ／ペプトン／アガーに蒔き、３７℃で３日間インキュベートし（Ｃ．Ｆ．Ｕ．＝０）、エンドトキシン含有量を特定した（Ｅ．Ｕ．＜０．１／１μｇ  ＡＢＲβ１）。対照マウスを処理していない動物（ｎ＝２）又は担体単独（ｎ＝２）で処理した動物によって表す。処理の前、静脈内（Ｉ．Ｖ．）注射から２４時間後、及びその後７２時間毎に１５日目まで動物を計量し、処理後２時間及び午前９：００〜午前１０：００の間に行われるその後の各計量操作の後に行動を観察した。
【０２１８】
担体単独で処理した動物は、処理の際及びその後２時間の間、痛みの兆候を示さない。次の１５日間に亘る行動観察は、異常の出現又は苦痛の兆候を示さない。処理後２時間又は１５日間に亘り、ＡＢＲβ１リガンド（１０ｍｇ／ｋｇ）で処理したいずれのマウスにおいても痛みは観察されなかった。体重は、１５日間に亘って、いずれの場合にも処理前に測定されたものと一致したままであり（図２１）、同じ性別の異なる動物群間で有意差はなかった。
【０２１９】
マウスを処理から１５日後に犠牲にし、主な臓器の状態を肉眼で評価した。観察した全ての臓器（胸腺、心臓、肺、胃、肝臓、脾臓、腸、腎臓、副腎、卵巣、精巣）において、担体又はＡＢＲβ１（１０ｍｇ／ｋｇ）による処理に起因する肉眼で見える顕著な変化（対照と比べて）は観察されなかった。
【０２２０】
材料及び方法
ベクターの構築
細菌及び植物細胞の形質転換のため、本発明者らは、ポリクローニング部位及びｌａｃＺ遺伝子配列が除去され、真核生物においてカナマイシン耐性を与える遺伝子を含む新たな配列及び新たな発現カセットで置換された、バイナリベクターｐＧｒｅｅｎＩＩに由来するｐＡＢＲベクターを使用した。
【０２２１】
発現カセットを、複製カリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ  ３５Ｓｘ２（Ｆｒａｎｃｋ  ｅｔ  ａｌ．１９８０）の遺伝子転写のプロモータによって形成し、その下流に、ヒトタンパク質をコードする遺伝子の転写と翻訳の両方を促進するＴＥＶ配列（Ｎｏｐｏ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）を挿入した。
【０２２２】
ＶＴＥ配列と、生成されるｍＲＮＡの安定性及びその翻訳を終了する際の効率を改善するようにはたらくノパリンシンターゼターミネータ（Ｌｕｏ  Ｚ．  ｅｔ  ａｌ．２００７）との間に、外因性タンパク質をコードするｃＮＤＡ配列を挿入するためのポリクローニング部位がある（図１、図中、ＲＢ／ＬＢ：組み換え特異的部位、左及び右の境界；
Ｔｍｌ  ｐ：腫瘍形態学的に大きなＤＮＡプロモータ；ＮＰＴ  ＩＩ：ネオマイシンリン酸転移酵素ＩＩ；Ｔｍｌ  ｔ：腫瘍形態学的に大きなＤＮＡターミネータ；ＣａＭＶ３５  ｘ２＿ｐ：カリフラワーモザイクウィルスプロモーター；ＴＥＶ５’：非翻訳ＴＥＶ、５’配列；Ｎｏｓ  ｔ：ノパリンシンターゼターミネータ）。
【０２２３】
ＡＢＲβ１リガンドをコードする配列（ヒトＦＳＨβ）の構築
ヒトＦＳＨβのアミノ酸配列は、ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇで利用可能なＵｎｉＰｒｏｔＫＢデータベースを検索することによって得られた。タンパク識別番号はＰ０１２２５である。
【０２２４】
成熟タンパク質の配列は、本発明の目的のため好適に改変され、以下に示される新たなアミノ酸配列を得た。
【表２】
2020501599.tif 000003
【０２２５】
バイオインフォマティクスツールの使用を通じて、かかるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を作成し、次いで、かかる配列を植物細胞における発現に対して最適化した。
【０２２６】
かかる配列の５’及び３’には、ｐＡＢＲベクター中の発現カセット内での正しいクローニングのため、Ｅｃｏ  ＲＩ及びＸｂａ  Ｉの制限酵素に対する認識部位がある。
【０２２７】
かかる配列に対応するＤＮＡフラグメントを、実験室において遺伝子合成プロセスによって得た。
【０２２８】
小胞体に対するシグナルペプチドを含むＡＢＲβ１リガンドをコードする新たな配列を以下に示す。
【表３】
2020501599.tif 000004
【０２２９】
ニコチアナ・ベンサミアナの懸濁液中での細胞培養
ニコチアナ・ベンサミアナの細胞培養物を、２５０ｍｌ容量の液体ＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  １９６２）、３０ｇ／Ｌスクロース及び２ｍｇ／Ｌのナフタレン酢酸（ＮＡＡ）及び０．２ｍｇ／Ｌカイネチンで維持する。
【０２３０】
新しい培地に細胞懸濁液１２５ｍｌのアリコートを移すことによって、７日毎に継代培養を作製する。細胞を暗闇で２５℃の一定温度にて撹拌（１２０ｒｐｍ）しながらインキュベートする。
【０２３１】
ニコチアナ・ベンサミアナ細胞培養物の安定的な形質転換
ｐＡＢＲプラスミドで形質転換されたアグロバクテリウム・ツメファシェンス（ＬＢＡ４４０４）を、１００ｍｇ／Ｌストレプトマイシン及び５０ｍｇ／Ｌカナマイシン（Ｄｕｃｈｅｆａ）で補足した、ＹＥＰ培地（０．５％重量／体積の酵母抽出物、０．５％重量／体積の植物ペプトン、２５ｇ／ＬのＬＢ−Ｂｒｏｔｈ  Ｍｉｌｌｅｒ）で培養した。
【０２３２】
２５ｍｌの細菌培養物を１００ｍｌフラスコに用意し、１ＯＤに達するまで２８℃、１２０ｒｐｍでインキュベートした。
【０２３３】
次いで、細菌を遠心分離（室温で４０００ｇにて１０分間）によって採取し、２５ｍｌのＭＳに再懸濁した。２００μｌの細菌懸濁液を２５ｍｌのニコチアナ・ベンサミアナ培養物（９ｇに等しい植物細胞の生体重）に接種する。
【０２３４】
４８時間の暗闇で２５℃にて１２０ｒｐｍでの共培養の後、ナイロンメッシュを使用して細胞を濾過し、過剰量の培養培地で洗浄した後、同じ培地２５ｍｌに再懸濁した。次いで、細胞を、０．９％重量／体積のアガー、２５０ｍｇ／Ｌのカルベニシリン及び１００ｍｇ／Ｌのカナマイシン（Ｄｕｃｈｅｆａ）で補足したＭＳからなる選択培地を含むペトリ皿に蒔いた。
【０２３５】
カプセルを、カルスの出現まで約３週間暗闇で２５℃にてインキュベートした。その後、カルスを１５日毎に２カ月間、新鮮な選択培地に移す。この期間の後、抗体を含まないＭＳで安定なクローンを維持する。
【０２３６】
ニコチアナ・ベンサミアナの懸濁液中での細胞培養物からのＡＢＲβ１リガンドの精製プロトコル
１．抽出バッファーの作製
抽出バッファー：１％（重量／体積）ＸＡＤ−４及び１％（重量／体積）ポリビニルポリピロリドン（ＰＶＰＰ）で補足した、５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭクエン酸、４０ｍＭアスコルビン酸、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、０．０５％（重量／重量）Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ６．５。
【０２３７】
ポリスチレン樹脂ＸＡＤ−４は、抽出バッファーに添加される前に処理を必要とし、処理は少なくとも１時間又は２時間のメタノール中での洗浄に続く、脱イオン水による豊富な濯ぎで構成される。
【０２３８】
ＰＶＰＰを水和させるため、使用の少なくとも２時間前〜４時間前に抽出バッファーにＰＶＰＰを添加しなければならない。
【０２３９】
２．抽出
ブレード（ｂｒａｉｄ）（約５０μｍのカットオフ）上で濾過され、−８０℃で保管された懸濁液中の細胞のアリコートを４℃に置き、一晩解凍する。２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２のバッファーを２：１の比率で、即ち細胞１グラム当たり２ｍｌのバッファーを添加する。懸濁液を４℃で１時間に亘って撹拌し続けながら維持し、次いで、４℃に温度を管理して１８０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を廃棄する。
【０２４０】
抽出バッファーを、３：１（３ｍｌ／グラム細胞）の比率でペレットに添加し、４℃で１時間維持する。次いで、抽出物を温度４℃にて１８０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して、上清を回収する。
【０２４１】
３．硫酸アンモニウムによる沈殿
硫酸アンモニウムを７０％の飽和濃度（ＡＢＲβ１リガンドの完全な沈殿が実証される濃度）を得るまで抽出物に添加する。
【０２４２】
該溶液を温度４℃で１時間、撹拌し続けながら維持する。４℃にて１８０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離の後、上清を廃棄し、タンパク質とＩＭＡＣ樹脂との相互作用を促進するのに適したバッファー中、１／１０の初期容量で沈殿物を再懸濁する。
【０２４３】
４．ＩＭＡＣクロマトグラフィー
硫酸アンモニウムによる処理後に得られた沈殿物を２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０のバッファーに１／１０の初期容量で再懸濁し、１８０００ｒｐｍで遠心分離して０．２２μｍで濾過する。
【０２４４】
得られた溶液を、２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０のバッファーで平衡化された、Ｎｉ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  ＦＦ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７−５３１８−０１）でパックしたカラムに充填し、多段階の勾配を使用して、２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０のバッファーで溶出する。吸光度を２８０ｎｍ及び２５４ｎｍでモニターする。検出手法としてＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動及び増強化学発光（ＥＣＬ：Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍｉＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）を使用する免疫ブロッティング手法によって採取された画分。
【０２４５】
これらの分析は、ウサギで発現された抗ｈＦＳＨβポリクローナル一次抗体（Ａｂｅａｍ、ＡＢ１７１４３１）、西洋ワサビペルオキシダーゼで誘導体化された二次ＩｇＧ抗ウサギ抗体（ＫＰＬ、４７４−１５０６）、及び参照スタンダードとしてＥ．ｃｏｌｉで発現されたヒト組み換えｈＦＳＨ−β（Ａｂｎｏｖａ、Ｈ００００２４８８−Ｑ０１）を使用する。
【０２４６】
５．サイズ排除クロマトグラフィー
ＡＢＲβ１リガンドが見つかったＩＭＡＣクロマトグラフィーに由来する画分を合わせ、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５  Ｍｅｄｉｕｍ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７−００３３−０１）でパックしたカラムに充填する。該カラムを、５０ｍＭの酢酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、６０μΜＴｗｅｅｎ−２０、ｐＨ５．５のバッファーで平衡化し、溶出する。吸光度を２８０ｎｍ及び２５４ｎｍでモニターする。
【０２４７】
クロマトグラフィーのピークで採取された溶出物を、その中の組み換えタンパク質の存在をモニターするため、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動及びＥＣＬ検出による免疫ブロッティング手法によって分析する。
【０２４８】
これらの分析は、ウサギで発現された抗ｈＦＳＨβポリクローナル一次抗体（Ａｂｅａｍ、ＡＢ１７１４３１）、西洋ワサビペルオキシダーゼで誘導体化された二次ＩｇＧ抗ウサギ抗体（ＫＰＬ、４７４−１５０６）、及び参照スタンダードとしてＥ．ｃｏｌｉで発現されたヒト組み換えｈＦＳＨ−β（Ａｂｎｏｖａ，  Ｈ００００２４８８−Ｑ０１）を使用する。
【０２４９】
６．イオン交換クロマトグラフィー
ＡＢβＲリガンドの存在に対して陽性であることが分かった分子排除クロマトグラフィーに由来する画分を合わせ、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、６０μΜ  Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ５．５のバッファーで平衡化された、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ樹脂でパックされたカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７−１０８７−０１）に充填し、多段階の勾配を使用して、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、１Ｍ  ＮａＣｌ、６０μΜ  Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ５．５のバッファーで溶出した。吸光度を２８０ｎｍ及び２５４ｎｍでモニターする。先のクロマトグラフィーと同様に、どの画分にヒト組み換えタンパク質の存在があるかを判断するため、採取した画分を分析する必要がある。
【０２５０】
ＰＮＧａｓｅ  Ｆによる脱グリコシル化
イオン交換クロマトグラフィーからのＡＢＲβ１リガンドのアリコートを約１０ｋＤａのカットオフでＶｉｖａｓｐｉｎ（ＶＳ０４０３、Ｓａｒｔｏｒｉｏｕｓ）を使用して０．５ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、５０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３、０．１％（重量／重量）Ｒａｐｉｇｅｓｔ  ＳＦ（英国マンチェスターのＷａｔｅｒｓ）ｐＨ７．９のバッファーで上記バッファーを置き換えた。
【０２５１】
製造業者によって記載されるプロトコルを使用して、ビシンコニン酸（ｂｉｃｉｎｃｏｎｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）アッセイ（ＱｕａｎｔｉＰｒｏ（商標）ＢＣＡ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ、ＱＰＢＣＡ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）によりタンパク質濃度を特定した。１：５０（酵素：基質）のモル比でＰＮＧａｓｅ  Ｆ（ドイツ国マンハイムのＲｏｃｈｅ  Ｃｕｓｔｏｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）で補足した試料を、３７℃の一定温度で一晩インキュベートした。
【０２５２】
反応の終わりに、溶液を４５トリフルオロ酢酸（ｔｒｉｆｌｕｏｒａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）（重量／体積）で補足し、１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。
【０２５３】
次いで、試料を１２％ポリアクリルアミドゲル上のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｌａｅｍｍｌｉ  １９７０）及び高速質量分析計で分析した。
【０２５４】
Ｉｎ  ｓｉｔｕトリプシン消化
Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ＢｌｕｅＧ２５０で染色したポリアクリルアミドゲルを超純水で濯ぎ、配列決定されるタンパク質に対応する電気泳動のバンドを刻んだ。バンドを小さなフラグメントに切り、それを１００μｌ〜１５０μｌの超純水で５分間洗浄する。それを遠心分離し、液体を排除する。フラグメントの３倍〜４倍の容量に等しいアセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）の容量を添加し、立方体の「折り目のついた」収縮が得られるまで１０分間〜１５分間待つ。上清を除去し、フリーズドライ装置を用いて乾燥させる。フラグメントを覆うまで０．１Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３、１０ｍＭ  ＤＴＴのバッファーで回収し、タンパク質のジスルフィド結合を還元するため５６℃で３０分間インキュベートする。
【０２５５】
該フラグメントを遠心分離し、液体を除去して、上に示されるようにアセトニトリルで再び処理する。
【０２５６】
アセトニトリルを０．１ＭのＮＨ４ＨＣＯ３、５５ｍＭヨードアセトアミドのバッファーで置き換え、システイン残基を誘導体化するように、室温で２０分間、遮光してインキュベートする。
【０２５７】
ヨードアセトアミド溶液を除去し、０．１Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３のバッファー約１５０μｌで１５分間洗浄する。それを遠心分離し、液体を除去して、アセトニトリルで再び処理する。
【０２５８】
ゲルフラグメントがなおも青色で染色されている場合、ゲルフラグメントを０．１Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３のバッファー１５０μｌで１０分間〜１５分間再水和する。
【０２５９】
次いで、等容量のアセトニトリルを添加し、２０分間オービタルシェーカー上で維持する。
【０２６０】
それを遠心分離し、溶液を除去して、アセトニトリルで処理し、フリーズドライ装置で乾燥させる。
【０２６１】
青色染色が継続するまで、これらの工程を繰り返す。
【０２６２】
その後、１２．５ｎｇ／ｍｌのトリプシン修飾溶液の１３μｌの溶液を添加し（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｇｒａｄｅ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｔｒｙｐｓｉｎ  Ｖ５１１１、Ｐｒｏｍｅｇａ）、フラグメントをμｇ５０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３で覆う。
【０２６３】
該試料を４℃で約３０分間〜４５分間維持して、フラグメントを再水和させ、酵素を含む溶液を吸収させる。
【０２６４】
この工程の間、溶液の体積が上記フラグメントを覆うのに十分であるかを確認し、５０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３のバッファーを適宜添加する。該試料を、３７℃に温度を管理して２４時間インキュベートする。
【０２６５】
インキュベーションの終わりに、トリプシン消化タンパク質分解に由来するペプチドを抽出する。
【０２６６】
１）２５ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３のバッファー１０μｌ〜１５μｌを上記溶液に添加し、サーモミキサを使用して３７℃で１５分間に亘り試料を撹拌する。該試料を遠心分離し、ゲルフラグメントの１倍〜２倍に等しい容量のＣＨ３ＣＮを添加する。該試料を３７℃で１５間に亘ってサーモミキサで撹拌する。該試料を遠心分離し、上清を収集する。
【０２６７】
２）残存するゲルフラグメントをギ酸（ＨＣＯＯＨ）４０μｌ〜５０μｌと５％（重量／重量）で混合する。試料を３７℃で１５分間に亘って撹拌し続けながら維持する。該試料を遠心分離し、ゲルフラグメントの１倍〜２倍に等しい容量のＣＨ３ＣＮを添加する。該試料を３７℃で１５間に亘ってサーモミキサで撹拌する。該試料を遠心分離し、上清を収集する。
【０２６８】
上記抽出物を合わせ、凍結乾燥装置において蒸発乾固させる。
【０２６９】
トリプシン消化のクロマトグラフ分析
ｉｎ  ｓｉｔｕでのタンパク質分解の後、タンパク質材料を凍結乾燥し、ギ酸：アセトニトリル：水２：３：９５に再懸濁した。
【０２７０】
２％（重量／重量）水溶液アセトニトリル、２％（重量／重量）ギ酸で平衡化したＶｙｄａｃ  Ｃ１８カラム（１×１５０ｍｍ、粒子径５μｍ、多孔度３００Å）に２０μｌを充填した。３％〜６５％のアセトニトリルの直線勾配で２５分間に亘って５０μｌ／分でカラムを溶出した。
【０２７１】
質量分析計Ｘｅｖｏ  Ｇ２−ＸＳ  Ｑ−ＴＯＦを使用し、トータルイオンカレント（ＴＩＣ）をモニターすることによって溶出物を検査した。
分子排除クロマトグラフィーによる凝集パーセンテージの特定
【０２７２】
ＡＢＲβ１リガンドの標準凝集状態を、１０ｋＤａ〜６００ｋＤａの分割インターバルで、ＹＡＲＲＡカラム、３ｍｍ  ＳＥＣ３０００、１５０ｍｍ×７．８ｍｍ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を使用して、分子排除クロマトグラフィーにより評価した。
【０２７３】
ＡＢＲβ１リガンド（１６０μｇ／ｍｌ）のアリコート２０μｌを充填し、カラムを２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４のバッファーで溶出した。
【０２７４】
蛍光測定手法による安定性分析
ＡＢＲβ１のアリコート（精製されたタンパク質２５０μＬ）を、最終容量１６００μｌ（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１％ＰＥＧ−８０００（重量／体積）のバッファーで１μΜに等しいＡＢＲβ１最終濃度）に希釈した。試料を分析し（Ｔ０）、次いで１週間４℃で保管した。上記分析を、同じ試料に対して２４時間の間隔で繰り返した。蛍光スペクトルを以下の条件で行った：Ｔ＝２５℃、λｅｘｃ＝２８０ｎｍ、λｅｍ＝２９５ｎｍ〜５００ｎｍ。
スルフィド結合の割り当て
【０２７５】
ＡＢＲβ１リガンドのアリコートを上に記載されるようにＰＮＧａｓｅ  Ｆによる酵素脱グリコシル化に供し、該反応混合物を非還元条件下でポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。ゲルをＣｏｕｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ  Ｇ２５０で染色した。完全に脱グリコシル化されたＡＢＲβ１リガンドに対応するバンドは、上に記載されるようにｉｎ  ｓｉｔｕで３回繰り返して消化に供したが、スルフィド結合を無傷のまま維持することによりシステイン残基の還元及びアルキル化を回避した。
【０２７６】
トリプシン消化性タンパク質分解に由来するペプチド混合物のフリーズドライ生成物を、１：５０に等しい酵素：基質のモル比で、サブチリシン（Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ  Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ  Ｐ−５３８０、Ｓｉｇｍａ）で補足された５０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ８．２のバッファー中に回収した。
【０２７７】
該溶液を、３７℃に温度を管理して一晩インキュベートした後、凍結乾燥した。
【０２７８】
試料をギ酸：アセトニトリル：水２：３：９５に再度可溶化した。２０μｌに等しい容量をＶｙｄａｃ  Ｃ１８カラム（１×１５０ｍｍ、粒子径５μｍ、多孔度３００Å）に充填した。カラムを３％〜６５％のアセトニトリルの直線勾配によって、５０μｌ／分の一定流量で１２分間に亘って溶出した。質量分析計Ｘｅｖｏ  Ｇ２−ＸＳ  Ｑ−ＴＯＦを使用してＴＩＣ（トータルイオンカレント）シグナルを記録することによって分析をモニターし、存在する種の分子量を各クロマトグラフィーのピークについて特定した。
【０２７９】
セルトリ細胞の単離及び培養
性成熟前の雄性動物、７日齢〜１５日齢のＬａｒｇｅ−Ｗｈｉｔｅ種に由来する子ブタの睾丸をセルトリ細胞（ＳＣ）の作製に使用した。材料を、繁殖に関連する去勢の通例の操作中に有資格者によって適切に収集して保管したため、その研究目的のｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験での使用は地域倫理委員会による承認を必要としなかった。
【０２８０】
ＳＣ単離手順は、麻酔をかけた子ブタからの精巣の摘除を含む。線維被膜の除去後、睾丸を均質な組織フラグメント化を得るため細かく切断し、その後、それをハンクス平衡生理食塩水（ＨＢＳＳ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中２ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＰ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して連続する酵素消化に供した。
【０２８１】
消化は精細管の物理的な分解まで継続する。
【０２８２】
洗浄後、分解した組織の懸濁液をトリプシン及びＤＮａｓｅ  Ｉで補足したＨＢＳＳ液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と共に１５分間インキュベートした。
【０２８３】
この第２の消化の終わりに、デカント後に得られた組織のペレットを、ＨＢＳＳ中で２回洗浄し、次いで１２０ｒｐｍで３分間遠心分離した。得られたペレットをステンレス鋼の５００マイクロメートルメッシュを通して濾過し、２Ｍグリシン、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２からなるバッファーに再懸濁した。目的は、残存するライディッヒ細胞を全て排除することである。
【０２８４】
次いで、管周細胞を含まない残りの細管を採取し、０．１６６ｎＭレチノイン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、及び５ｍｌ／５００ｍｌのインスリン／セレニウム（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）の存在下での培養で維持した。細胞培養を、３７℃のインキュベータにおいて立ち上げる。３日間の培養後、いかなる残留生殖細胞も排除するように細胞を処理した（Ｇａｌｄｉｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．１９８１；Ｋｏｒｂｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．１９９７；Ｌｕｃａ  ｅｔ  ａｌ．２００５；Ｌｕｃａ  ｅｔ  ａｌ．２００７）。
【０２８５】
アロマターゼ酵素活性の測定
様々なホルモン処理を進める前に、蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｏｐｔｉｐｈｏｔ−２、Ｎｉｋｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）において、臭化エチジウム及びフルオレセインジアセテート（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で染色することによって、培養細胞の生存率を評価した。α−アロマターゼの活性を評価するため、２０×１０６個を３日間に亘り、種々の濃度の卵胞刺激ホルモン（Ｇｏｎａｌ−Ｆ）、又は同じ濃度のＡＢＲβ１リガンドで処理し、処理期間の終わりに、０．２ｍｇ／ｍｌのテストステロンを培養物に添加し、更に８時間インキュベートした。
【０２８６】
刺激の終わりに、生成された１７β−エストラジオール（Ｅ２）は細胞培養培地に放出され、それを特異的な高感度キット（ＡＤＶＩＡ  Ｃｅｎｔａｕｒ、Ｅｓｔｒａｄｉｏｌ−６  ＩＩＩ、Ｂａｙｅｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して評価した。
【０２８７】
蛍光分子によるＡＢＲβ１リガンド標識化
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合及びｉｎ  ｖｉｖｏ局在化の実験のため、ＡＢＲβ１リガンドを２つの異なる蛍光分子、４−クロロ−７−ニトロベンゾフラザン（ＮＢＤ）（Ｓｉｇｍａ）及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と複合化した。
【０２８８】
ＮＢＤ標識化のため、アセトニトリル中の５０ｍＭの蛍光プローブの濃縮溶液を作製した。
【０２８９】
ＡＢＲβ１リガンド５０μＭ／ｍｌの標識化反応は、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、６０μΜ  Ｔｗｅｅｎ  ２０、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、３０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス／ＨＣｌ）ｐＨ  ７．０及び５  ｍＭ  ＮＢＤの溶液中で起こる  （Ｂｅｒｎａｌ−Ｐｅｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）。
【０２９０】
上記溶液を２４℃で１６時間インキュベートし、タンパク質の標識化及び凝集の存在可能性をフルオロメーター及び蛍光顕微鏡分析（励起４６５ｎｍ；発光５１５ｎｍ）によって評価する。ＡＢＲβ１リガンドのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７（励起６５０ｎｍ；発光６６５ｎｍ）との複合化について、製造業者によって提供される指示書に従い、市販のキットであるＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用した。
【０２９１】
フローサイトメトリによるＡＢＲβ１リガンド受容体への結合の分析
安定化されたヒト細胞株（ＯＶＣＡＲ−３、卵巣癌のＯＶＣＡＲ−５及び結腸癌のＬＳ１８０）及び初代卵巣癌株Ａ１１６を、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清、１％グルタミン及び１％ペニシリンストレプトマイシンで補足したＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。血清成分又は抗生物質によるあらゆる干渉を排除するため、抗生物質の不在下で又は血清不含培地中での２４時間の培養後に幾つかの対照実験を行った。
【０２９２】
免疫蛍光アッセイの際、トリプシン−ＥＤＴＡと共にインキュベートすることで培養基体から細胞を剥離し、計数した後、それらの細胞を１００，０００細胞／１００μｌの濃度まで希釈し、蛍光ＡＢＲβ１リガンド共にインキュベートした。細胞蛍光分析を使用する直接免疫蛍光法を、ＮＢＤでの標識されたＡＢＲβ１リガンド１０μｌ／ｍｌ（３５０ｎｇ）と共に３７℃で１５分間予備インキュベーションした細胞に対して行い、フローサイトメーターでＦＩＴＣチャネルを使用して分析を行った。また、細胞標識化は、低濃度のＡＢＲβ１リガンドで強調され得て、蛍光シグナルは、７０ｎｇ／ｍｌ未満の濃度のＡＢＲβ１リガンドと細胞を予備インキュベーションする場合には、もはや顕著ではない。フローサイトメトリ分析の前に、細胞の生存率、及び特定の受容体からのリガンドの解離を引き起こすことによって結果を変更する可能性がある、タンパク質分解酵素の介入を伴わないＡＢＲβ１リガンドの結合を評価するため、基質から細胞を剥離させずに幾つかの実験を行い、かかる分析を共焦点顕微鏡Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＦＶ５００を使用して行った。
【０２９３】
ＡＢＲβ１内部移行
ＡＢＲβ１リガンドのＦＳＨＲ受容体の内部移行動態に対する効果の分析を、免疫蛍光及び共焦点顕微鏡によって行った。
【０２９４】
スライド上に蒔いたＨｅＬａ細胞（完全ＤＭＥＭ培地中で培養）を、ヒトＦＳＨＲを過剰発現させるプラスミドでトランスフェクトし、細胞の播種から２４時間後に０．１μｇ／ｍｌのＧｏｎａｌ−Ｆ（商標）、ＡＢＲβ１又はＮＢＤで標識されたＡＢＲβ１で処理した。
【０２９５】
次いで、細胞を４％パラホルムアルデヒド（重量：体積  ＰＢＳ  １×、リン酸緩衝生理食塩水）中、４℃で３０分間固定し、ＰＢＳ  １×で洗浄する（各５分間で３回の洗浄）。免疫蛍光法の場合、固定した細胞を、室温で５分間、１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）及び０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（Ｓｉｇｍａ）で補足したＰＢＳ  １×と共にインキュベーションすることによって透過処理する。透過処理溶液をＰＢＳ  １×（各５分間で３回の洗浄）で洗浄することにより排除する。次いで、１％ＢＳＡで補足した生理食塩水に希釈した一次抗体（抗ＦＳＨＲ  ＳＡＢ４５０１０４１）と共に３７℃で２時間に亘り細胞をインキュベートする。インキュベーションの終わりに、ＰＢＳ  １×（各５分間で３回）で洗浄することによって一次抗体を除去し、１％ＢＳＡで補足したＰＢＳ  １×に希釈した適切な二次抗体と共に３７℃で３０分間に亘り細胞をインキュベートした。この研究では、シアニン−３に複合化された二次抗体を使用した（５５０ｎｍで励起され、５７０ｎｍで赤色光を発光する）。次いで、細胞をＰＢＳ  １×で洗浄し（各５分間で３回の洗浄）、室温で５分間、ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジン−２−フェニルインドール（１：５０００、ＰＢＳ  １×中の重量：重量）（Ｓｉｇｍａ）で核を標識する。スライドをＥｌｖａｎｏｌでマウントし、４℃で保管して、共焦点顕微鏡Ｌｅｉｃａ  ＳＰ５又は蛍光顕微鏡ＬＥＩＣＡ  ＤＦＣ３００ＦＸによって分析する。ＮＢＤで標識されたＡＢＲβ１リガンドによる処理の場合、細胞を洗浄後に固定し、ＦＩＴＣチャネルでの観察用の一対のフィルターを使用する顕微鏡（上に記載される）における観察のため直ちに用意する。
【０２９６】
細胞増殖曲線の分析
１０％ウシ胎仔血清及び２ｍＭグルタミン（Ｓｉｇｍａ）で補足したＤＭＥＭでＣＡＯＶ−３細胞を培養し、１０％ウシ胎仔血清で補足したＬ１５培地（ＡＴＣＣ）でＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を培養した。ＯＶＣＡＲ−３細胞を、２０％ウシ胎仔血清及び２ｍＭグルタミン及び０．０１ｍｇ／ｍｌインスリン（Ｓｉｇｍａ）で補足したＲＰＭＩで培養した。
【０２９７】
細胞培養物を３７℃のインキュベータに維持する。増殖速度の分析のため、細胞株に応じて適切な培地の存在下で５×１０４細胞／ウェルの濃度で細胞を６ウェルプレートに蒔いた。細胞を０．１μｇ／ｍｌの濃度のＧｏｎａｌ−Ｆ（商標）、ＡＢＲβ１リガンド、又はそれらの両方で処理した。細胞増殖をＧｏｎａｌ−Ｆ（商標）及びＡＢＲβ１を培養培地に添加してから２４時間後、４８時間後、及び７２時間後に評価した。指定の時間に生死判別試験であるトリパンブルー排除試験を使用して、細胞数によって細胞増殖速度を評価した。
【０２９８】
ヒト腫瘍系統におけるＦＳＨＲ発現の分析。
ヒトＦＳＨＲに対して作製された特異的一次抗体を使用するフローサイトメトリにおいて分析を行った。細胞を培養フラスコから採取し、測定するまで氷上で維持した。３つの比較試料：ｉ）未処理の細胞、ｉｉ）ウサギにおいて作製されたＦＳＨＲに対する一次抗体（ＳＡＢ４５０１０４１、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及び二次抗体ＩｇＧ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（商標）４８８コンジュゲート抗（ＴｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）と共にインキュベートされた細胞、ｉｉｉ）二次抗体のみと共にインキュベートされた細胞、を各分析について作製した。３つの実験条件の準備は、シグナル陽性を割り当て、あらゆる偽陽性を排除することを可能とする。標識化及び洗浄の終わりに、細胞をＦＡＣＳにおいて分析する。２×１０５個の事象（細胞）を各試料について取得し、分析した。
【０２９９】
ＮＢ３細胞（新生児神経芽細胞腫モデル）におけるＦＳＨＲへのＡＢＲβ１の結合分析
ＮＢＤで標識されたＡＢＲβ１リガンドを使用するＦＡＣＳ分析によって得られたデータは、標識化された細胞、したがって細胞表面上にＦＳＨＲを発現する細胞のパーセンテージが、分析された全ての細胞において９６％超であることを示す。
【０３００】
ＮＢＤで標識されたＡＢＲβ１の国際化（ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）のフローサイトメトリ分析
細胞（４×１０４個のＯＶＣＡＲ−３又はＭＤＡ−ＭＢ−２３１）を実験の２４時間前に２４ウェルプレートに蒔き、蛍光ＡＢＲβ１リガンドの濃度を漸増させて１時間インキュベートした。細胞をバーゼン液で洗浄し、トリプシンで培養プレートから剥離させ、その後、２００μｌのＦＢＳを添加することによって中和した。次いで、細胞を遠心分離し、フローサイトメトリ測定用のバーゼン液に再懸濁した。４８８ｎｍのレーザをフルオロフォアの励起に使用した（ＮＢＤで誘導体化されたＡＢＲβ１）。
【０３０１】
内部移行後のリソソームにおけるＡＢＲβ１の蓄積の分析。
リガンドＢＲβ１リガンドの内部移行及びリガンドの細胞内局在を、共焦点顕微鏡を使用して行った。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７で誘導体化された蛍光ＡＢＲβ１リガンドとのインキュベーションの２４時間前に、細胞を共焦点顕微鏡用スライドに蒔いた。細胞を、完全培地中、３７℃で１時間、標識化ＡＢＲβ１リガンド（２５０ｎｇ／ｍｌのＡＢＲβ１及びＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ  ＤＮＤ−２６、７５ｎＭ）と共に同時インキュベートした。画像取得に先立って、細胞をＨＢＳＳ液で２回洗浄し、同じバッファー中に維持して、顕微鏡で直ちに分析した。
【０３０２】
ＮＢ３細胞におけるＡＢＲβ１の内部移行
ＮＢ３細胞をＤＭＥＭ中で培養し、実験の２４時間前にスライド上に蒔いた。細胞を、ＮＢＤで標識したＡＢＲβ１リガンド１５０ｎｇ／ｍｌと共に３７℃のインキュベータで１５分間インキュベートした。処理の終わりに、細胞を生理食塩水中で洗浄し、完全培養培地中で異なる時間に亘りインキュベートし、生理食塩水で濯ぎ、ＦＩＴＣ用の一対のフィルターを使用して蛍光顕微鏡のもとで観察した。これは、細胞質中に局在化した蛍光小胞の出現による、細胞における蛍光ＡＢＲβ１の内部移行を評価することを可能とする。
【０３０３】
Ｇｏｎａｌ−Ｆ（商標）誘導性ｃＡＭＰ産生及びＡＢＲβ１による中和の分析
上記分析はＨＥＫ２９３細胞を使用し、ここで、ヒトＦＳＨＲ（ＨＧ１５９６０−ＵＴ  ＤＢＡ）及び環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）に対するバイオセンサーであるＥｐａｃ１−ｃａｍｐｓの外因性発現を、２つのコンストラクトをコードする遺伝子の一過性の同時トランスフェクションにより得た。上記分析は、以前に実験室で最適化され、検証されたプロトコルを用いて、単一の生細胞において蛍光顕微鏡を使用した。
【０３０４】
アゴニストＧｏｎａｌ−Ｆ（商標）によるヒトＦＳＨＲの活性化によって誘導された細胞内ｃＡＭＰ変動の動的測定を、ＡＢＲβ１リガンドの不在下、又は様々な使用濃度のＡＢＲβ１リガンドの存在下で比較した。ＦＳＨＲ受容体の内部移行動態に対するＡＢＲβ１リガンドの効果の分析を免疫蛍光法及び共焦点顕微鏡検査によって行った。ＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクションを、実験室において最適化された製造業者の指示書に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により得た。同時トランスフェクション混合物を１：１の比率のＥｐａｃ２−ｃａｍｐｓ及びＦＳＨＲのＤＮＡを混合することによって得る。同時トランスフェクション手順の終わりに、細胞を洗浄し、ＤＭＥＭ培養培地中、３７℃で４８時間インキュベートした（トランスフェクトされた外因性タンパク質合成をさせるため）。
【０３０５】
その合成が非常に急速で、ＦＳＨ受容体活性化によって活性化される、生存細胞におけるｃＡＭＰの細胞内レベルの変化を測定することによりＡＢＲβ１分子の薬理分析を行った。上記方法は、ｃＡＭＰに対するＦＲＥＴ技術に基づくバイオセンサーの細胞での発現に基づく（Ｎｉｋｏｌａｅｖ  ｅｔ  ａｌ．２００６）。バイオセンサーは、ｃＡＭＰ高親和性タンパク質ドメインによって接続される蛍光タンパク質ＧＦＰの２つの色彩変異体をコードする。２つのＧＦＰ変異体の相対発光強度は、ｃＡＭＰの細胞内濃度に依存して変化する。蛍光変化の測定は、検証された増感された発光比率法に依存して、４８０＋／−２５ｎｍのチャネルと５３５＋／−３５ｎｍのチャネルにおける発光強度間の比を計算することによって、単一細胞での蛍光顕微鏡検査によって行われる。ＨＥＫ２９３細胞を直径２４ｍｍのスライドに蒔き、ＥＰＡＣ１−ｃＡＭＰ及びＦＳＨＲを共発現させるためにトランスフェクトした。実験を画像化するため、倒立顕微鏡による使用に適した小さいチャンバーにスライドを取り付ける。培養培地を除去し、Ｈｅｐｅｓで緩衝したリンゲル生理食塩水（改変リンゲル：Ｈ２Ｏ中、１２５  ＮａＣｌ、５  ＫＣ１；１  Ｎａ３ＰＯ４；１  ＭｇＳＯ４；５．５  グルコース；２０  Ｈｅｐｅｓ；１．８  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．４）で置き換える。
【０３０６】
ｃＡＭＰ合成を判断するため、細胞を１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌの濃度のＧｏｎａｌ−Ｆ（商標）で処理した。ベースラインＦＲＥＴレベルの推定を目的とする２分間の取得の後、アゴニスト薬を直接、画像化溶液に添加した。別々のセットの実験では、１０ｎｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度のＡＢＲβ１リガンドと共に５分間インキュベートした細胞中、同じ濃度のＧｏｎａｌ−Ｆ（商標）を用いてｃＡＭＰ測定を行った。
画像の取得及び分析をＩｍａｇｅ  Ｊソフトウェア（米国メリーランド州ベセスダのＮＩＨ）によって行った。実験群間の比較を、Ｐ＜０．０５を統計学的に有意として、Ａｎｏｖａ検定を使用して行った。全てのデータを平均±ＳＥＭで表す。
【０３０７】
当業者は、上の記載から本発明の利点を理解することができるであろう。
【０３０８】
ＦＳＨのβサブユニットに関して、驚いたことに、いわゆるｃＡＭＰカスケードを活性化しないことがわかった。
【０３０９】
代わりに、組み換えによって産生されたβサブユニット、特に組み換え技術及びニコチアナ・ベンサミアナでの発現によって得られたＡＢＲβ１サブユニットについて、これは、治療用タンパク質の生産に通常使用されるウイルス、がん遺伝子、プリオン、毒物、又は有害な試薬の残留による汚染リスクがほぼゼロであることに起因する高い品質及び生物学的安全性を含む多くの利点を提供し得ることが証明された。
【０３１０】
植物宿主においてかかるＡＢＲβ１サブユニットを得る能力は、同じく有用であり、驚くべきことである。
【０３１１】
更に、ＡＢＲβ１サブユニットは、ＦＳＨ及び抗体よりも著しく高い驚くほどの安定性を実証した。
【０３１２】
これらの利点は、ＦＳＨ受容体に対する活性及び親和性の障害になるものではなく、特に親和性はナノモル（ｎＭ）レベルであった。
【０３１３】
更なる利点は、ＡＢＲβ１サブユニットもまた、ｃＡＭＰカスケードの非活性化によって証明されるように、ＦＳＨ受容体を活性化しないことである。
【０３１４】
これらの特性は、特に、酵母、昆虫、哺乳動物、特にヒトの細胞におけるＦＳＨβサブユニットのグリコシル化パターンと異なるグリコシル化パターンに照らして、驚くべきことであり予想外である。
【０３１５】
ＦＳＨβとＡＢＲβ１の両方のサブユニットについて、ＦＳＨＲとの特異的結合は、癌細胞の増殖速度を増加させないことがわかった。
【０３１６】
受容体を活性化しない一方で、ＡＢＲβ１はモデル系として使用した細胞における著しい内部移行率を示した。
【０３１７】
先行技術は、治療にＦＳＨβサブユニットのペプチドフラグメントの可能性のある適用を記載した。
【０３１８】
これは、ＦＳＨβサブユニットの治療適用を何ら明らかにするものではない。
【０３１９】
実際、２つの構造物には顕著な違いがある。
【０３２０】
例えば、Ａｇｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ（Ｊ．Ｐｒｏｔ．Ｃｈｅｍ．１９９２）によって知られているＦＳＨ３３〜５３ペプチドの構造は、４１〜４６と５０〜５２の残基の間に２つのターンを含むのに対し、ＦＳＨβサブユニットの同じ領域には、β鎖コンフォメーションがある。更に、上記ペプチドは、アミノ酸３４〜３６の間に小さなヘリックス領域を有するのに対し、ＦＳＨβサブユニットでは、同じ領域はβ鎖である。別の違いは、システインＣｙｓ５１がＦＳＨβサブユニットにおいてジスルフィド結合を形成し、その結合は上記ペプチドには不在であることである。
【０３２１】
本発明の決定的に重要な利点は、神経芽細胞腫の治療及び診断に対する適用可能性である。
【０３２２】
神経芽細胞腫は、実際、乳児年齢で最も一般的な頭蓋外の固形がんであり、神経冠の未分化細胞を起源とする。
【０３２３】
神経芽細胞腫は、１歳未満の子供において最も頻度の高いがんであり、６歳までの年齢集団にも広がっている。
【０３２４】
原発腫瘍は副腎の髄質領域又は傍神経節にしばしば見られ、残念なことに、診断時には、５０％超の症例で既に転移がある。
【０３２５】
神経芽細胞腫の患者では、ＭＹＣＮ癌遺伝子発現分析（Ｖ−Ｍｙｃトリ骨髄細胞腫症ウイルス癌遺伝子神経芽細胞腫）が２０％の症例で陽性であり、これは高リスクの致命的な予後と密接に相関する。
【０３２６】
現在、ＭＹＣＮ増幅は、神経芽細胞腫におけるリスク配分に関して最良の遺伝マーカーを代表する。
【０３２７】
死亡率リスクの配分は、神経芽細胞腫の進行段階（Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９３）、診断時の年齢（Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．１９８８）、ＭＹＣＮの増幅（Ｓｅｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９８５）及び組織学的検査（Ｓｈｉｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．１９８４）を含む、幾つかの臨床上の及び生物学的な因子の統合に基づく。
【０３２８】
これらの全ての基準において、年齢及び早期診断は、転移患者におけるリスク配分に最も重要な変数である。
【０３２９】
中間リスク群は、誕生後１年より前に診断される患者を含む。
【０３３０】
代わりに診断が遅れた患者は、ハイリスククラスに含まれ、一方、低リスク及び中リスクの患者は、一般的には約８０％の生存率で好ましい予後を有する。
【０３３１】
生存率が４０％未満に低下するハイリスクの患者では、状態は極めて不利である。
【０３３２】
更に、「非常にハイリスク」クラスの患者は、最近、抗がん治療に対して反応しないか、又は再発が起こる可能性が高いと確認された（Ｍａｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．２００７；Ｍａｔｔｈａｙ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）。
【０３３３】
神経芽細胞腫の治療に対して現在研究されている治療法は、健康な組織と比べて優先して腫瘍によって捕捉される放射性標識分子、表面腫瘍抗原に対するモノクローナル抗体を使用する免疫療法、及び細胞サイクルを制御するキナーゼの合成阻害剤に基づく。
【０３３４】
しかしながら、抗体の不安定性及び腫瘍組織に対する他の分子の限定的な特異性のため、患者において重大な副作用が起こり、治療プロトコルの有効性を制限する（Ｍａｔｔｈａｙ  ｅｔ  ａｌ．２０１２ｂ）。
【０３３５】
本発明は、現在利用可能な治療に対する有望な代替法を代表し得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年10月17日(2018.10.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト卵胞刺激ホルモンのβサブユニット（ＦＳＨβ）により、又は配列番号２に対応する配列を有することにより表される、医学的使用のためのヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）のリガンド。
【請求項２】
配列番号３に対応する配列によってコードされる、配列番号２に対応する配列を有する請求項１に記載のヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）のリガンド。
【請求項３】
成熟タンパク質のアルギニン残基Ｎ１３及びＮ３０にグリコシル化部位を含み、前記グリコシル化部位がそれぞれ２つのＮ−アセチルグルコサミン残基及びマンノース残基を含む、配列番号２に対応する配列を有する請求項１又は２に記載のヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）のリガンド。
【請求項４】
腫瘍の治療及び／又は診断における医学的使用のための、先の請求項のいずれか１項に記載のヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）のリガンド。
【請求項５】
前記腫瘍が原発性又は転移性の固形腫瘍である、腫瘍の治療及び／又は診断における使用のための先の請求項に記載のヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）のリガンド。
【請求項６】
前記腫瘍が、前立腺癌、特に、前立腺腺癌、乳腺、結腸、膵臓、腎臓、肺、肝臓、精巣、卵巣、脳及び甲状腺の癌、肉腫、並びに神経芽細胞腫を含む、腫瘍の治療における使用のための、先の請求項に記載のヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）のリガンド。
【請求項７】
前記腫瘍、好ましくは前記神経芽細胞腫が、小児科患者、好ましくは６歳以下の患者に存在する、先の請求項に記載のリガンド。
【請求項８】
−細胞毒性剤のクラスであって、かかる化合物が、好ましくは、カペシタビン等のピリミジンアンタゴニスト、カンプトテシンファミリー等の酵素阻害剤、例えばイリノテカンを含む群から選択される、細胞毒性剤のクラス、
−アルキル化剤のクラスであって、かかる化合物が、好ましくは、シスプラチン等の金属塩ファミリー、ドキソルビシン等のＤＮＡインターカレータ、アントラサイクリンファミリーを含む群から選択される、アルキル化剤のクラス、
−タンパク質合成調節剤のクラスであって、かかる化合物が、好ましくは、ボルテゾミブ等のプロテアソーム阻害剤ファミリー、テムシロリムス等のｍＴＯＲ阻害剤ファミリーを含む群から選択される、タンパク質合成調節剤のクラス、
−有糸分裂阻害剤のクラスであって、かかる化合物が、好ましくは、マイタンシン等のアンサマイトシンファミリー、オーリスタチンＥ等の微小管重合阻害剤ファミリーを含む群から選択される、有糸分裂阻害剤のクラス、
−β放出放射性同位元素のクラスであって、かかる化合物が、好ましくは、１３１Ｉ、１６９Ｅｒ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１５３Ｓｍ、８９Ｓｒ及び９０Ｙを含む群から選択される、β放出放射性同位元素のクラス、
を含む群から選択される抗腫瘍活性を有する分子と複合化された、腫瘍の治療における使用のための、先の請求項のいずれか１項に記載のヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）のリガンド。
【請求項９】
抗腫瘍活性を有する１以上の薬剤と組み合わせた、腫瘍の治療における使用のための、複合化形態又は非複合化形態である、先の請求項のいずれか１項に記載のヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）のリガンド。
【請求項１０】
−フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）若しくはインドシアニン（Ｃｙ５）を含む群から選択される蛍光分子、又は
−１２３Ｉ、１１１Ｉｎ、１８８Ｒｅ、１８Ｆ、３５Ｓ、９９Ｔｃを含む群から選択される放射性分子、
−ナノ粒子、
に複合化された、腫瘍の診断における使用のための及び／又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析のための、先の請求項のいずれか１項に記載のヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）のリガンド。
【請求項１１】
配列番号２に対応する配列を含む、ヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）のリガンド。
【請求項１２】
配列番号２に対応する配列と少なくとも約９０％、好ましくは約９０％〜９９．９％、より好ましくは約９５％〜９７％の類似性を有する配列を有する、請求項１１に記載のヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）のリガンド。
【請求項１３】
前記アミノ酸配列は、成熟タンパク質のアルギニン残基Ｎ１３及びＮ３０にグリコシル化部位を含み、前記グリコシル化部位がそれぞれ２つのＮ−アセチルグルコサミン残基及びマンノース残基を含む、先の請求項に記載のヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）のリガンド。
【請求項１４】
−細胞毒性剤のクラスであって、かかる化合物が、好ましくは、カペシタビン等のピリミジンアンタゴニスト、カンプトテシンファミリー等の酵素阻害剤、例えばイリノテカンを含む群から選択される、細胞毒性剤のクラス、
−アルキル化剤のクラスであって、かかる化合物が、好ましくは、シスプラチン等の金属塩ファミリー、ドキソルビシン等のＤＮＡインターカレータ、アントラサイクリンファミリーを含む群から選択される、アルキル化剤のクラス、
−タンパク質合成調節剤のクラスであって、かかる化合物が、好ましくは、ボルテゾミブ等のプロテアソーム阻害剤ファミリー、テムシロリムス等のｍＴＯＲ阻害剤ファミリーを含む群から選択される、タンパク質合成調節剤のクラス、
−有糸分裂阻害剤のクラスであって、かかる化合物が、好ましくは、マイタンシン等のアンサマイトシンファミリー、オーリスタチンＥ等の微小管重合阻害剤ファミリーを含む群から選択される、有糸分裂阻害剤のクラス、
−β放出放射性同位元素のクラスであって、かかる化合物が、好ましくは、１３１Ｉ、１６９Ｅｒ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１５３Ｓｍ、８９Ｓｒ及び９０Ｙを含む群から選択される、β放出放射性同位元素のクラス、
を含む群から選択される抗腫瘍活性を有する分子に複合化された、請求項１１〜１３のいずれか１項又は前記ヒト卵胞刺激ホルモンのβサブユニット（ＦＳＨβ）で表される、ヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）のリガンド。
【請求項１５】
−フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）若しくはインドシアニン（Ｃｙ５）を含む群から選択される蛍光分子、
−１２３Ｉ、１１１Ｉｎ、１８８Ｒｅ、１８Ｆ、３５Ｓ、９９Ｔｃを含む群から選択される放射性分子、
−ナノ粒子、
を含む群から選択される診断活性を有する分子に複合化された、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載のヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）のリガンド。
【請求項１６】
請求項１１〜１５のいずれか１項に記載のヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）のリガンドと、１以上の薬学的に許容可能な担体及び／又は賦形剤と、を含む、医薬品。
【請求項１７】
静脈内投与用である、請求項１６に記載の医薬品。
【請求項１８】
前記受容体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ不活性化のための、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載のヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）のリガンドの使用。
【請求項１９】
アミノ酸配列ＫＤＥＬの導入によって、前記ヒト卵胞刺激ホルモンのβサブユニット（ＦＳＨβ）の配列のＣ末端領域を修飾する工程を含む、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載のヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）のリガンドの調製方法。
【請求項２０】
前記ヒト卵胞刺激ホルモンのβサブユニット（ＦＳＨβ）の配列のＮ末端終末にＨｉｓタグを導入する更なる工程を含む、先の請求項に記載のヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）のリガンドの調製方法。
【請求項２１】
前記サブユニットが組み換えＤＮＡ手法によって得られる、配列番号２に対応する配列を有する請求項１１〜１３のいずれか１項に記載のヒト卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）のリガンド。
【請求項２２】
前記リガンドが、複合化形態又は非複合化形態で、抗腫瘍活性を有する１又は薬剤と組み合わせて使用される、神経芽細胞腫の治療における医学的使用のための、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）のリガンド。
【請求項２３】
Ｉ）配列番号３に対応する配列を含むプラスミドで形質転換された好適なベクターを得る工程、
ＩＩ）工程Ｉ）の前記ベクターでニコチアナ・ベンサミアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）細胞を形質転換する工程、
ＩＩＩ）前記ニコチアナ・ベンサミアナ細胞を選択する工程、
ＩＶ）前記安定したニコチアナ・ベンサミアナ細胞を増殖させる工程、
Ｖ）細胞抽出物を作製する工程、
ＶＩ）ＦＳＨＲ受容体リガンドを精製する工程、
を含み、前記ニコチアナ・ベンサミアナ細胞を懸濁液中で培養する、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）のβサブユニットによって表される卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）受容体のリガンドを調製する方法。
【請求項２４】
工程Ｉ）の前記ベクターがアグロバクテリウム・ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）によって表される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
工程ＩＩ）において、前記形質転換が約２５℃の暗闇で撹拌し続けながら４８時間の共培養に対して行われる、請求項２３又は２４に記載の方法。
【請求項２６】
工程ＩＩＩ）において選択培地を使用し、前記選択培地が０．９％重量／体積のアガー及び抗生物質で補足したＭＳを含む、請求項２３〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
工程ＩＩＩ）においてカルベニシリン及びカナマイシンを使用する、請求項２３〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
工程Ｖ）において、前記ニコチアナ・ベンサミアナ細胞を、２４℃〜２７℃で１５日間に亘り、５０ｍｂａｒ〜１００ｍｂａｒの通気を維持して、ショ糖、ナフタレン−酢酸（ＮＡＡ）、及びカイネチンで補足したＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  １９６２）中でのインキュベーションにおいて維持する、請求項２３〜４７のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
工程（Ｖ）において抽出バッファーを使用し、前記抽出バッファーが、１％（重量／体積）ＸＡＤ−４及び１％（重量／体積）ポリビニルポリピロリドン（ＰＶＰＰ）で補足した、５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭクエン酸、４０ｍＭアスコルビン酸、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、０．０５％（重量／重量）Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ６．５を含む、請求項２３〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
工程ＶＩ）が、クロマトグラフィーカラムＩＭＡＣ、脱塩（ｄｅｓａｌｉｎｇ）カラム、及びイオン交換クロマトグラフィーカラムの順で使用して行われる、請求項２３〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【国際調査報告】
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