(57)【要約】  免疫炎症性皮膚障害を予防または治療するための方法が提供される。免疫炎症性皮膚障害を予防または治療するための医薬組成物も提供される。
2020505362.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫炎症性皮膚障害の予防または治療方法であって、それを必要としている対象に、治療有効量のベルベリンもしくは生物学的に等価なベルベリンの類似体または薬学的に許容されるその塩を含む医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記免疫炎症性皮膚障害が、急性熱性好中球性皮膚症、皮膚筋炎、剥離性皮膚炎、汗疱、好中球性汗腺炎、無菌性膿疱症、妊娠性そう痒性蕁麻疹様丘疹、水疱性類天疱瘡、尋常性天疱瘡、ヘルペス状皮膚炎、妊娠性類天疱瘡、腸管関連皮膚炎性関節炎症候群、リウマチ性の好中球性皮膚症、手背の好中球性皮膚症、形質細胞限局性亀頭炎、亀頭包皮炎、ベーチェット病、遠心性環状紅斑、色素異常性固定性紅斑、多形性紅斑、環状肉芽腫、手皮膚炎、光沢苔癬、扁平苔癬、硬化性萎縮性苔癬、慢性単純性苔癬、棘状苔癬、貨幣状湿疹、壊疽性膿皮症、サルコイドーシス、角層下膿疱性皮膚症、じんま疹、掌蹠膿疱症、薬疹、急性汎発性発疹性膿疱症、接触性皮膚炎、および一過性棘融解性皮膚症からなる群より選択される、請求項１に記載方法。
【請求項３】
前記免疫炎症性皮膚障害が水疱性類天疱瘡である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記生物学的に等価なベルベリンの類似体が、ジャトロリジン、パルマチン、コプチシン、９−デメチルベルベリン、９−デメチルパルマチン、１３−ヒドロイベルベリン、ベルベルビン、パルマトルビン、９−Ｏ−エチルベルベルビン、９−Ｏ−エチル−１３−エチルベルベルビン、１３−メチルジヒドロベルベリン  Ｎ−メチル塩、テトラヒドロプロトベルベリンおよびそのＮ−メチル塩、ならびに９−ラウロイルベルベルビンクロリドからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記薬学的に許容される塩がベルベリンクロリドである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ベルベリンもしくは生物学的に等価なベルベリンの類似体または薬学的に許容されるその塩が、主要な薬学的活性成分である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ベルベリンもしくは生物学的に等価なベルベリンの類似体または薬学的に許容されるその塩が、唯一の薬学的活性成分である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記対象がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
免疫炎症性皮膚障害の予防または治療方法であって、それを必要としている対象に、ジアセレイン、レイン、モノアセチルレイン、およびその塩またはエステルもしくはプロドラッグからなる群より選択される治療有効量の化合物を含む医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項１０】
前記免疫炎症性皮膚障害が、急性熱性好中球性皮膚症、皮膚筋炎、剥離性皮膚炎、汗疱、好中球性汗腺炎、無菌性膿疱症、妊娠性そう痒性蕁麻疹様丘疹、水疱性類天疱瘡、尋常性天疱瘡、ヘルペス状皮膚炎、妊娠性類天疱瘡、腸管関連皮膚炎性関節炎症候群、リウマチ性の好中球性皮膚症、手背の好中球性皮膚症、形質細胞限局性亀頭炎、亀頭包皮炎、ベーチェット病、遠心性環状紅斑、色素異常性固定性紅斑、多形性紅斑、環状肉芽腫、手皮膚炎、光沢苔癬、扁平苔癬、硬化性萎縮性苔癬、慢性単純性苔癬、棘状苔癬、貨幣状湿疹、壊疽性膿皮症、サルコイドーシス、角層下膿疱性皮膚症、じんま疹、掌蹠膿疱症、薬疹、急性汎発性発疹性膿疱症、接触性皮膚炎、および一過性棘融解性皮膚症からなる群より選択される、請求項９に記載方法。
【請求項１１】
前記免疫炎症性皮膚障害が水疱性類天疱瘡である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記化合物がジアセレインである、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記化合物が主要な薬学的活性成分である、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記化合物が唯一の薬学的活性成分である、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記対象がヒトである、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記治療有効量の前記化合物が、１日当たりの基準で、１０〜２００ｍｇのジアセレインと等価である、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫炎症性皮膚障害を予防または治療するための方法および医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫炎症性皮膚障害は、自己免疫性皮膚疾患、増殖性皮膚疾患、および炎症性皮膚病を含む種々の状態を包含する。免疫炎症性皮膚障害は、炎症過程、免疫系の調節不全、および望ましくない細胞増殖により、健康な組織の破壊を生ずる。
【０００３】
水疱性類天疱瘡（ＢＰ）は、最もよくある自己免疫性の水疱形成性皮膚疾患であり、これは通常、高齢で発生し、発症は７０歳代後半で、８０歳を超える人でかなりの発生率の増加が認められる。
【０００４】
ＢＰの原因には、補体活性化、マスト細胞脱顆粒、好中球および好酸球の動員および活性化、ならびにこれらのエフェクター細胞からの基底膜領域（ＢＭＺ）分解プロテイナーゼの放出が含まれることが示唆されている。
【０００５】
これらの事象の正確な順序はほとんど知られていないが、ＢＰの水疱形成に至る最初のステップの１つは、コラーゲンＸＶＩＩ（ＣＯＬ１７）としても知られるヘミデスモソーム膜貫通タンパク質ＢＰ１８０を標的とする自己抗体（ａｕｔｏＡｂ）を含み、ＢＰ１８０は、真皮−表皮接合部内の主要自己抗原（ａｕｔｏＡｇ）であると想定されることが提唱されている。ＢＰ１８０の細胞外ドメインであるＮＣ１６Ａの結合後、ａｕｔｏＡｂは、基底層ケラチノサイトからのインターロイキン（ＩＬ）−６およびＩＬ−８の用量依存性および時間依存性放出に繋がる、Ｆｃ受容体とは独立した事象を開始する。さらに、ａｕｔｏＡｂおよびＢＰ１８０の結合は、ＢＰ１８０内部移行を誘導し、これは、ＢＰ疾患の病態形成の開始に重要な役割を果たすことが報告された（Ｂｕｌｌｏｕｓ  Ｐｅｍｐｈｉｇｏｉｄ  ＩｇＧ  Ｉｎｄｕｃｅｓ  ＢＰ１８０  Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｖｉａ  ａ  Ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｉｃ  Ｐａｔｈｗａｙ，Ｈｉｒｏｙａｓｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８２，Ｎｏ．３，Ｍａｒｃｈ  ２０１３，ｐ８２８−８４０）。
【０００６】
本出願の発明者らは、ジアセレインおよび／またはベルベリンは、免疫炎症性皮膚障害に関連する炎症促進性サイトカインの産生ならびにＢＰ１８０内部移行を抑制可能であり、したがって、免疫炎症性皮膚障害、特にＢＰの治療潜在能力を有することを見出した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｂｕｌｌｏｕｓ  Ｐｅｍｐｈｉｇｏｉｄ  ＩｇＧ  Ｉｎｄｕｃｅｓ  ＢＰ１８０  Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｖｉａ  ａ  Ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｉｃ  Ｐａｔｈｗａｙ，Ｈｉｒｏｙａｓｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８２，Ｎｏ．３，Ｍａｒｃｈ  ２０１３，ｐ８２８−８４０
【発明の概要】
【０００８】
一実施形態では、本発明は、免疫炎症性皮膚障害の予防または治療方法を提供し、該方法は、それを必要としている対象に、治療有効量のベルベリンもしくは生物学的に等価なベルベリンの類似体または薬学的に許容されるその塩を含む医薬組成物を投与することを含む。
【０００９】
別の実施形態では、本発明は、免疫炎症性皮膚障害の予防または治療方法を提供し、該方法は、それを必要としている対象に、ジアセレイン、レイン、モノアセチルレイン、およびその塩またはエステルもしくはプロドラッグからなる群より選択される治療有効量の化合物を含む医薬組成物を投与することを含む。
【００１０】
本発明はまた、免疫炎症性皮膚障害の予防または治療のための医薬組成物を提供し、該医薬組成物は、治療有効量のベルベリンもしくは生物学的に等価なベルベリンの類似体または薬学的に許容されるその塩を含む。
【００１１】
本発明はまた、免疫炎症性皮膚障害の予防または治療のための医薬組成物を提供し、該医薬組成物は、ジアセレイン、レイン、モノアセチルレイン、およびその塩またはエステルもしくはプロドラッグからなる群より選択される治療有効量の化合物を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１ａ】ＩＬ−６の産生に対するプロピオン酸クロベタゾールの抑制効果を示す統計的棒グラフである。
【図１ｂ】ＩＬ−８の産生に対するプロピオン酸クロベタゾールの抑制効果を示す統計的棒グラフである。
【図２ａ】ＩＬ−６の産生に対するジアセレインの抑制効果を示す統計的棒グラフである。
【図２ｂ】ＩＬ−８の産生に対するジアセレインの抑制効果を示す統計的棒グラフである。
【図３ａ】ＩＬ−６の産生に対するベルベリンの抑制効果を示す統計的棒グラフである。
【図３ｂ】ＩＬ−８の産生に対するベルベリンの抑制効果を示す統計的棒グラフである。
【図４ａ】ＩＬ−６およびＩＬ−８のｍＲＮＡの産生に対するプロピオン酸クロベタゾールの抑制効果を示す統計的棒グラフである。
【図４ｂ】ＩＬ−６およびＩＬ−８のｍＲＮＡの産生に対するジアセレインの抑制効果を示す統計的棒グラフである。
【図４ｃ】ＩＬ−６およびＩＬ−８のｍＲＮＡの産生に対するベルベリンの抑制効果を示す統計的棒グラフである。
【図５ａ】蛍光色染色（細胞核：暗青色；ＢＰ１８０：鮮緑色）ならびにＩｇＧ処理（右パネル）および対照（左パネル；ＩｇＧ処理なし）のケラチノサイトの共焦点顕微鏡写真を示す。
【図５ｂ】蛍光色で染色し、ＩｇＧで処理したケラチノサイトの共焦点顕微鏡写真を示す。
【図５ｃ】蛍光色で染色し、異なる濃度のＩｇＧおよびベルベリンで処理したケラチノサイトの共焦点顕微鏡写真を示す。
【図６ａ】蛍光色で染色した、ＩｇＧで処理した（右パネル）および対照の（左パネル；ＩｇＧによる処理なし）ケラチノサイトの共焦点顕微鏡写真を示す。
【図６ｂ】蛍光色で染色し、ＩｇＧで処理したケラチノサイトの共焦点顕微鏡写真を示す。
【図６ｃ】蛍光色で染色し、異なる濃度のＩｇＧおよびジアセレインで処理したケラチノサイトの共焦点顕微鏡写真を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書で使用される場合、用語の「治療有効量」は、少なくとも１人または複数人の患者の疾患の１つまたは複数の症状を軽減または減らす量を意味する。
【００１４】
本明細書で使用される場合、用語の「ジアセレインまたはその類似体」は、ジアセレイン、レイン、モノアセチルレイン、またはその薬学的に許容される塩またはエステルもしくはプロドラッグを意味する。
【００１５】
本明細書で使用される場合、用語の「プロドラッグ」は、その親化合物に代謝され、身体内で親化合物の形でその生理学的機能を発揮する任意の化合物を意味する。
【００１６】
本明細書で別に定める場合を除き、本明細書中（特に以下の特許請求の範囲）で使用される用語の「ａ（ａｎ）」、「ｔｈｅ」などは、単数形および複数形の両方を包含すると理解されるものとする。
【００１７】
化学的には、レインは、式（Ｉ）の構造を有する、９，１０−ジヒドロ−４，５−ジヒドロキシ−９，１０−ジオキソ−２−アントラセンカルボン酸、およびそのプロドラッグの１つであるジアセレインは、式（ＩＩ）の構造を有する、４，５−ビス（アセチルオキシ）９，１０−ジヒドロ−４，５−ジヒドロキシ−９，１０−ジオキソ−２−アントラセンカルボン酸である。ジアセレインは、体循環に到達する前にレインに完全に変換され、身体内でレインの形でその生理学的機能を発揮する。
式（Ｉ）
【化１】
2020505362.tif 000003
式（ＩＩ）
【化２】
2020505362.tif 000004
【００１８】
ジアセレインは、変形性関節症の治療に広く使用される抗炎症剤であり、インターロイキン−１（ＩＬ−１）シグナル伝達を阻害することが示されている。現在、ジアセレインカプセルは、５０ｍｇの製剤含量で入手可能であり、Ａｒｔ  ５０（登録商標）、Ａｒｔｒｏｄａｒ（登録商標）などを含む種々の商標名で、各国で市販されている。
【００１９】
ベルベリン（ナチュラルイエロー１８；５，６−ジヒドロ−９，１０−ジメトキシベンゾ（ｇ）−１，３−ベンゾジオキソロ（５，６−ａ）キノリジニウム）は、オウレン（Ｃｏｐｔｉｄｉｓ  ｒｈｉｚｏｍｅ）、キハダ、コガネバナ、ヒイラギナンテンおよびメギなどのハーブ植物中に存在するイソキノリンアルカロイドである。ベルベリンおよびその誘導体は、抗菌性および抗マラリア活性を有することがわかっている。これは、真菌、酵母菌、寄生生物、細菌およびウイルスなどの様々な病原体に対抗して作用できる。
【００２０】
本出願の発明者らは、ジアセレインおよびベルベリンは、免疫炎症性皮膚障害に関連する炎症促進性サイトカインの産生ならびにＢＰ１８０内部移行を抑制可能であり、これらの障害の治療に使用できることを見出した。したがって、本発明は、免疫炎症性皮膚障害の予防または治療方法を提供し、該方法は、それを必要としている対象に、治療有効量のベルベリンもしくは生物学的に等価なベルベリンの類似体または薬学的に許容されるその塩を含む医薬組成物を投与することを含む。
【００２１】
本方法における生物学的に等価なベルベリンの類似体には、限定されないが、例えば、ジャトロリジン、パルマチン、コプチシン、９−デメチルベルベリン、９−デメチルパルマチン、１３−ヒドロイベルベリン、ベルベルビン、パルマトルビン、９−Ｏ−エチルベルベルビン、９−Ｏ−エチル−１３−エチルベルベルビン、１３−メチルジヒドロベルベリン  Ｎ−メチル塩、テトラヒドロプロトベルベリンおよびそのＮ−メチル塩、ならびに９−ラウロイルベルベルビンクロリドが挙げられる。
【００２２】
好ましくは、薬学的に許容される塩は、ベルベリンクロリドである。
【００２３】
一実施形態では、ベルベリンまたは生物学的に等価なベルベリンの類似体または薬学的に許容されるその塩は、本方法における、主要な薬学的活性成分である。
【００２４】
別の実施形態では、ベルベリンまたは生物学的に等価なベルベリンの類似体または薬学的に許容されるその塩は、本方法における、唯一の薬学的活性成分である。
【００２５】
本発明はまた、本発明は、免疫炎症性皮膚障害の予防または治療方法を提供し、該方法は、それを必要としている対象に、ジアセレイン、レイン、モノアセチルレイン、およびその塩またはエステルもしくはプロドラッグ（すなわち、ジアセレインおよびその類似体）からなる群より選択される治療有効量の化合物を含む医薬組成物を投与することを含む。
【００２６】
一実施形態では、化合物はジアセレインである。
【００２７】
一実施形態では、ジアセレインまたはその類似体は、本方法における、主要な薬学的活性成分である。
【００２８】
別の実施形態では、ジアセレインまたはその類似体は、本方法における、唯一の薬学的活性成分である。
【００２９】
一実施形態では、前記治療有効量の前記化合物は、１日当たりの基準で、１０〜２００ｍｇのジアセレインと等価である。
【００３０】
好ましくは、本発明の対象はヒトである。
【００３１】
一実施形態では、前記免疫炎症性皮膚障害は、急性熱性好中球性皮膚症、皮膚筋炎、剥離性皮膚炎、汗疱、好中球性汗腺炎、無菌性膿疱症、妊娠性そう痒性蕁麻疹様丘疹、水疱性類天疱瘡、尋常性天疱瘡、ヘルペス状皮膚炎、妊娠性類天疱瘡、腸管関連皮膚炎性関節炎症候群、リウマチ性の好中球性皮膚症、手背の好中球性皮膚症、形質細胞限局性亀頭炎、亀頭包皮炎、ベーチェット病、遠心性環状紅斑、色素異常性固定性紅斑、多形性紅斑、環状肉芽腫、手皮膚炎、光沢苔癬、扁平苔癬、硬化性萎縮性苔癬、慢性単純性苔癬、棘状苔癬、貨幣状湿疹、壊疽性膿皮症、サルコイドーシス、角層下膿疱性皮膚症、じんま疹、掌蹠膿疱症、薬疹、急性汎発性発疹性膿疱症、接触性皮膚炎、および一過性棘融解性皮膚症からなる群より選択される。
【００３２】
好ましくは、免疫炎症性皮膚障害は、水疱性類天疱瘡である。
【００３３】
以降で、本発明を次の実施例に関連してさらに説明する。しかし、これらの実施例は、例証する目的のためのみで提供されており、本発明の範囲を限定するためのものではない。
【００３４】
実施例
実施例１．サイトカイン産生抑制試験
抗ＢＰ１８０免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）刺激による、ヒト成人皮膚ケラチノサイト、ＨａＣａＴ細胞からの、ＢＰ関連炎症促進性サイトカイン、ＩＬ−６またはＩＬ−８の産生を低減するジアセレインまたはベルベリンの効果を試験した。ＢＰならびに他の種々の皮膚障害の治療によく使われるコルチコステロイドである、プロピオン酸クロベタゾールを陽性対照として用いた。
【００３５】
ＩｇＧを正常またはＢＰ患者血液から精製した。したがって、健康なドナーまたはＢＰ患者からの採血がこの試験に含まれた。精製されたＩｇＧを用いて、ＨａＣａＴ細胞からの、ＩＬ−６およびＩＬ−８などの炎症促進性サイトカイン産生を刺激した。
【００３６】
採血
国立台湾大学病院（ＮＴＵＨ）皮膚科で治療された患者は、典型的な臨床所見ならびに直接免疫蛍光法（ＤＩＦ）顕微鏡による真皮−表皮接合部でのＩｇＧおよび／またはＣ３の線状沈着の検出または酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）（ＭＢＬ  Ｃｏ  Ｌｔｄ、名古屋、日本）によるＢＰ１８０−ＮＣ１６Ａに対する循環ＩｇＧ自己抗体の検出の証拠書類に基づいたＢＰの確定診断がなければならない。
【００３７】
ＢＰ患者ならびに健康なボランティアから、２回採血した。血液の合計量は、健康なドナー（複数可）またはＢＰ患者（複数可）から４０ｍＬで、１回来診時の対象当たりの最大採血量は２０ｍＬとした。
【００３８】
年齢、性別、ＢＰおよび診断情報を含む病歴、ならびに循環正常ＩｇＧ、抗ＢＰ１８０、または抗ＢＰ２３０  ＩｇＧ自己抗体のレベルを含む人口統計が記録された。
【００３９】
血液試料の採取は、ＮＴＵＨの研究倫理委員会（ＲＥＣ）により承認を受け、ヘルシンキ宣言に従ってインフォームドコンセントを取得した。
【００４０】
ＢＰ１８０−ＮＣ１６Ａタンパク質の発現
ＢＰ１８０−ＮＣ１６Ａ発現プラスミドを、Ｈｉｒｏｓｈｉ  Ｓｈｉｍｉｚｕ教授およびＷａｔａｒｕ  Ｎｉｓｈｉｅ教授（北海道大学大学院医学研究科皮膚科学分野、札幌、日本）から親切に提供を受けた。ＮＣ１６Ａドメイン（７７アミノ酸）をコードする構築物をｐＧＥＸ−６Ｐ１ベクターのＭＣＳ内に挿入した。プラスミドをＤＨ５ａコンピテント細胞中に形質転換した後、ＤＮＡを抽出し、配列がヒトＢＰ１８０  ＮＣ１６Ａであることを確認した。大量のＮＣ１６Ａタンパク質を得るために、プラスミドを導入することによりＢＬ２１を形質転換した後、Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎシステム（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて、製造業者の説明書に従い、ＮＣ１６Ａドメインタンパク質を発現させた。
【００４１】
ＩｇＧの精製
健康な血液ドナー由来のＩｇＧ（健康−ＩｇＧ）およびＢＰと診断された患者由来のＩｇＧ（ＢＰ−ＩｇＧ）の全血清ＩｇＧを、Ｈｉｔｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて単離した。免疫グロブリンを０．１ＭのＮａＰｉ、ｐＨ８．０（平衡化）、０．１Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ６．０（洗浄）、および０．１Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．０（溶出）を用いて溶出した。その後、濃縮した免疫グロブリンをＢＰ１８０−ＮＣ１６Ａタンパク質と結合したＣＮＢｒ活性化セファロースカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）によりさらに溶出し、濃縮したＮＣ１６Ａに反応性の特異的ＩｇＧが単離できる（プロテインＡ  Ｅｌｕ−ＮＣ１６Ａ−Ｅｌｕ）。親和性精製したＢＰ  ＩｇＧ調製物の免疫反応性を、抗ＢＰ１８０−ＮＣ１６Ａ  ＥＬＩＳＡ（ＭＢＬ  Ｃｏ  Ｌｔｄ、名古屋、日本）により確認した。
【００４２】
細胞培養
ＨａＣａＴ細胞（ＣＬＳ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、４．５ｇ／Ｌのグルコース、２ｍＫのＬ−グルタミンおよび１０％ウシ胎仔血清を補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。細胞を２４または１２ウェルプレートに播種し、以下のアッセイのために、８０％コンフルエンスまで増殖させた。
【００４３】
細胞生存率または細胞傷害性評価
継代＃３〜６（１００μｌ培地中の３０００細胞／ウエル）の指数増殖期細胞を９６ウェルプレートに一晩播種して細胞付着（８０％集密度）を行わせた後、異なる濃度のジアセレイン（０．１、１、１０μＭ）またはベルベリン（０．１、１、１０μＭ）またはプロピオン酸クロベタゾール（０．１、１、１０μＭ）、および２ｍｇ／ｍＬの健康−ＩｇＧ、ＢＰ−ＩｇＧ、または特異的−ＩｇＧに、３７℃で４８時間、曝露した。
【００４４】
薬物処理後、細胞培養培地をゆっくり除去した。その後、細胞を暖かい培地で静かに３回洗浄し、全ての脱離細胞および死細胞を除去した。細胞を細胞培地中、１．０ｍｇ／ｍＬの最終濃度で、ＭＴＴ試薬と共に２時間インキュベートした。ホルマザンの量（生存細胞の数に正比例すると想定）をＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて５７０ｎｍで吸光度の変化を記録することにより測定した。
【００４５】
炎症促進性サイトカインの測定
以前の試験に基づいて、サイトカイン測定を実施した。手短に説明すると、細胞を培地単独でまたは２ｍｇ／ｍＬの精製ＢＰ−ＩｇＧ、または特異的−ＩｇＧと共にインキュベートし、ジアセレインまたはベルベリンまたはプロピオン酸クロベタゾール（０．１、１、および１０μＭ）の非存在下または存在下で培養し、インキュベーションの４８時間後に培養上清を収集し、−２０℃での分析のために保存した。細胞培養上清中のＩＬ−６およびＩＬ−８レベルをＥＬＩＳＡ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により製造業者の説明書に従って分析した。
【００４６】
定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応による、ＩＬ−６およびＩＬ−８  ｍＲＮＡ発現の定量化
ＩＬ−６およびＩＬ−８メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）レベルを、以前に報告したように、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を用いて定量した。ＢＰ  ＩｇＧ処理ＨａＣａＴ細胞をジアセレインまたはベルベリンまたはプロピオン酸クロベタゾールと共にまたはそれらなしで、４８時間培養した。製造業者の説明書に従ってＴＲｉｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、培養したＨａＣａＴ細胞から全ＲＮＡを単離した。製造業者の説明書に従って、１μｇのＲＮＡをＲｅｖｅｒｔ  Ａｉｄ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と共にインキュベートすることにより、相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を単離ＲＮＡから逆転写した。ＳＹＢＲ（登録商標）Ｓｅｌｅｃｔ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）により定量ＲＴ−ＰＣＲを実施した。ＰＣＲ混合物には、０．５μＭの各順方向および逆方向プライマーを含めた。各反応混合物を、５０℃で２分間および９５℃で２分間、続けて、９５℃で１５秒間および６０℃で１分間の４０サイクルに供した。データを、ハウスキーピング遺伝子グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）に対して正規化した。ＲＴ−ＰＣＲに使用したプライマーは以下の通りである：ＩＬ−８メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、順方向、５’−ＡＣＣ  ＧＧＡ  ＡＧＧ  ＡＡＣ  ＣＡＴ  ＣＴＣ  ＡＣ−３’、および逆方向、５’−ＡＡＡ  ＣＴＧ  ＣＡＣ  ＣＴＴ  ＣＡＣ  ＡＣＡ  ＧＡＧ−３’およびＩＬ−６メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、順方向、５’−ＧＧＴ  ＡＣＡ  ＴＣＣ  ＴＣＧ  ＡＣＧ  ＧＣＡ  ＴＣＴ−３’、および逆方向、５’−ＧＴＧ  ＣＣＴ  ＣＴＴ  ＴＧＣ  ＴＧＣ  ＴＴＴ  ＣＡＣ−３’、およびＧＡＰＤＨ、順方向、５’−ＡＣＡ  ＡＣＴ  ＴＴＧ  ＧＴＡ  ＴＣＧ  ＴＧＧ  ＡＡＧ  Ｇ−３’、および逆方向、５’−ＧＣＣ  ＡＴＣ  ＡＣＧ  ＣＣＡ  ＣＡＧ  ＴＴＴ−３’。
【００４７】
統計分析
データをスチューデントのｔ検定 または一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて分析した。Ｐ＜０．０５の場合に、統計的に有意な差異を示すと見なした。
【００４８】
結果
合計１３人の対象をこの試験の間に動因した。その内の６人は正常対照であり、その他の７人の対象は、最初に水疱性類天疱瘡（ＢＰ）を有すると診断された。７人のＢＰ患者の内の１人（症例番号１２）は、陰性のＤＩＦ／ＩＩＦ所見のために、スクリーニング不適格症例であった。症例番号１、２、３、４、および１３は、ＢＰ１８０  ＮＣ１６Ａに対する循環ＩｇＧ自己抗体がＥＬＩＳＡで分析して上昇した。
【００４９】
ＧＳＴ−ＢｕｌｋキットおよびＢ−ＰＥＲ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いることにより大量のヒトＮＣ１６Ａタンパク質を得、その後、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅａｓｅシステムを用いることにより、ＧＳＴタグの切断を実施した。
【００５０】
健康な血液ドナー由来のＩｇＧ（健康−ＩｇＧ）およびＢＰと診断された患者由来のＩｇＧ（ＢＰ−ＩｇＧ）の血清ＩｇＧを単離するために、Ｈｉｔｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＨＰカラムを用い、濃縮免疫グロブリンをＢＰ１８０−ＮＣ１６Ａタンパク質に結合したＣＮＧＢｒ活性化セファロースカラムによりさらに溶出した。単離効率は、初期ステップ（プロテインＡ  Ｅｌｕ）から、および濃縮したＮＣ１６Ａに対し反応性の特異的ＩｇＧ（プロテインＡ  Ｅｌｕ−ＮＣ１６Ａ−Ｅｌｕ、すなわち、特異的ＩｇＧ）から単離されたＩｇＧ中の相対倍率変化により示され、これは、最大精製倍率２３．４６まで、および６８２１  ＩＵ／ｍｇの特異的ＩｇＧであった。
【００５１】
異なる濃度のジアセレイン、ベルベリンまたはプロピオン酸クロベタゾール下でのケラチノサイト細胞傷害性をＭＴＴ試験により評価した。０．１〜１０μＭのジアセレイン処理は、ＨａＣａＴ細胞に対する有意な細胞傷害性を有し、生存率は５０％に低下した。健康な対照（健康−ＩｇＧ）、ＢＰ−ＩｇＧまたはＢＰ特異的ＩｇＧ由来の血清試料による処理は、ＨａＣａＴの生存率を２５０％高めたが、１０μＭのジアセレイン処理はまだ、ＨａＣａＴ生存率を有意に低下させた。対照的に、０．１〜１０μＭのベルベリンおよびプロピオン酸クロベタゾール処理は、ＨａＣａＴ細胞に対する有意な細胞傷害性はなかった。
【００５２】
ＨａＣａＴ細胞を培地単独でまたは２ｍｇ／ｍＬの精製ＢＰ−ＩｇＧ、または特異的−ＩｇＧと共に、異なる濃度のジアセレインまたはベルベリンまたはプロピオン酸クロベタゾール（０、０．１、１、および１０μＭ）の存在下でインキュベートしし、インキュベーションの４８時間後に培養上清を収集した後、ＩＬ−６およびＩＬ−８の変化を調査した。陽性対照のプロピオン酸クロベタゾールによる処理は、ＩＬ−６分泌（図１ａ）およびＩＬ−８分泌（図１ｂ）を用量依存性的に低減した。ジアセレインは、特異的抗ＢＰ１８０  ＩｇＧで処理したＨａＣａＴ細胞中のＩＬ−６の分泌を有意に低減した（図２ａ）。対照的に、０．１μＭのジアセレインは、特異的抗ＢＰ１８０  ＩｇＧで処理したＨａＣａＴ細胞中のＩＬ−８の分泌を低減しなかった。ジアセレインのＩＬ−８分泌に対する抑制効果は、１または１０μＭの濃度でのみ認められた（図２ｂ）。
【００５３】
ベルベリンは、特異的抗ＢＰ１８０  ＩｇＧで処理したＨａＣａＴ細胞中のＩＬ−６の分泌を低減しなかった（図３ａ）。ベルベリンは、ＢＰ特異的抗ＩｇＧで処理したＨａＣａＴ細胞中のＩＬ−８の分泌を用量依存的に低減した。抑制効果は、ＢＰ特異的ＩｇＧで処理した細胞で有意に良好であった（図３ｂ）。
【００５４】
ＢＰ  ＩｇＧ処理ＨａＣａＴ細胞を異なる濃度（０、０．１、１、１０μＭ）のジアセレイン、ベルベリンまたはプロピオン酸クロベタゾールと共に４８時間培養した。全ＲＮＡを培養ＨａＣａＴ細胞から単離し、定量ＲＴ−ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）分析を実施した。結果は、プロピオン酸クロベタゾールがＩＬ−６およびＩＬ−８ｍ  ＲＮＡ発現レベルを有意に低減させることを示し（図４ａ）、一方、ジアセレインは、ＩＬ−６  ｍＲＮＡ発現レベルに対し、用量依存的抑制効果を有するが、ＩＬ−８  ｍＲＮＡに対しては、１０μＭの場合のみ抑制効果を有する（図４ｂ）。対照的に、ベルベリンは、ＩＬ−６およびＩＬ−８  ｍＲＮＡ発現の両方に対し、用量依存的抑制効果を有した（図４ｃ）。
【００５５】
上記試験は、ジアセレインおよびベルベリンが、免疫炎症性皮膚障害に関連する炎症促進性サイトカインの産生に対し抑制効果を有し、したがって、免疫炎症性皮膚障害に対し治療の潜在能力を有し得ることを示す。
【００５６】
実施例２．ＢＰ１８０内部移行試験
ＢＰ１８０は、ヘミデスモソームの重要な成分であり、ヘミデスモソームは、皮膚の基底膜へのケラチノサイトの付着状態を保つ。ＢＰ１８０の損傷は、ケラチノサイトの不十分な付着に繋がることがあり、また、皮膚障害または水疱形成疾患と関連する。ＢＰ１８０の内部移行は、水疱性類天疱瘡の病態形成における重要な役割と見なされており、したがって、この疾患の評価のための尺度となり得る。次の試験を実施して、ベルベリン、ジアセレインまたはレインのａｕｔｏＡｂ（ＢＰ−ＩｇＧ）誘導ＢＰ１８０内部移行およびＢＰ−ＩｇＧで処理したケラチノサイト中のヘミデスモソーム破壊に対する効果を評価した。
【００５７】
方法：ＢＰ１８０内部移行の免疫蛍光法試験
このＢＰ１８０内部移行試験のために、実施例１で記載の手順に従って、ＢＰ患者由来および異なるＩｇＧおよび薬剤（ジアセレインまたはベルベリン）で処理した細胞培養液由来のＩｇＧの精製を実施した。
【００５８】
ガラス製カバーガラス上で増殖したケラチノサイトを、４％のパラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳで完全に洗浄し、ＰＢＳ中の０．１％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００中で１０分間透過処理した。一次抗体を細胞に重ねて入れ、調製物を室温で１時間インキュベートした。カバーガラス上の細胞をＰＢＳで洗浄し、蛍光標識二次抗体を室温で１時間適用した。ＰＢＳで洗浄後、カバーガラスをスライド上に取り付けた。細胞核用の蛍光色は、暗青色でＢＰ１８０は鮮緑色であった。全ての調製物を共焦点顕微鏡により検査した。
【００５９】
結果
ベルベリン処理
対照ケラチノサイト（すなわち、ＩｇＧで処理なし）および健康な対象由来のＩｇＧで処理したケラチノサイトでは、ＢＰ１８０の免疫蛍光法分析（鮮緑色）は、顕著な細胞質および膜局在化を示した（図５ａ）。対照的に、ＢＰ−ＩｇＧで処理した細胞中でのＢＰ１８０の膜局在化は、有意に低下し、細胞質中でよりびまん性であるように見え、ＢＰ−ＩｇＧ処理により誘導されたＢＰ１８０内部移行およびヘミデスモソーム破壊の発生を示唆している（図５ｂ）。ベルベリン濃度が増加するに伴い（０．１〜１０μＭ）、ＢＰ１８０の膜局在化が回復し、ベルベリン処理後のＢＰ１８０内部移行の抑制およびヘミデスモソーム完全性の維持を示唆する（図５ｃ）。
【００６０】
ジアセレイン処理
対照ケラチノサイト（すなわち、ＩｇＧ処理なし）および健康−ＩｇＧで処理したケラチノサイトに比べて（図６ａ）、ＢＰ−ＩｇＧで処理したケラチノサイトの細胞質中で、細胞膜中のＢＰ１８０分布が小さくなり、よりびまん性であるように見え、ＢＰ−ＩｇＧ処理により誘導されたＢＰ１８０内部移行の発生を示唆する（図６ｂ）。ジアセレイン濃度が増加するに伴い（０．１〜１０μＭ）、ＢＰ１８０の膜局在化が回復し、ジアセレイン処理後の、ＢＰ１８０内部移行の抑制およびヘミデスモソーム完全性の維持を示唆する（図６ｃ）。
【００６１】
結果は、ジアセレインおよびベルベリンがＢＰ１８０内部移行を抑制し、したがって、ＢＰのための治療の潜在能力を有し得ることを示す。
【００６２】
上記開示は、詳細な技術内容およびその発明の特徴に関する。当業者なら、記述された本開示および本発明の示唆に基づいて、その特徴から逸脱することなく、種々の修正および置換を行い得る。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【国際調査報告】
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