(57)【要約】本明細書の開示は、次世代ＤＮＡ塩基配列決定法、及び１個以上の核酸標的の正確な超並列定量化のための使用に関する。より詳細には、本発明は、ヒト及び動物集団並びに環境試料における遺伝子標的及び変異体の検出に主に使用される複合ＤＮＡプール中の遺伝子標的を検出し、定量化するためのプローブを含む方法及びキットに関係する。さらに、本発明は、生検材料、唾液及び他の分泌物、呼気水分抽出物、組織、血漿（液体生検材料）などを含めて、ただしそれらに限定されない、人体から得られる試料中の疾患を引き起こす遺伝子変化の検出の分野に特に応用される。本発明は、遺伝子標的１個当たり１個以上の標的特異的核酸プローブ（左プローブ及び右プローブ）及び架橋オリゴを含む。 【選択図】図２A
2020532970.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の試料における１つ以上の標的ヌクレオチド配列のハイスループット検出方法であって、
（ｉ）前記試料の各々における各標的ヌクレオチド配列に対して第１のプローブ、第２のプローブ及び架橋オリゴを与えること、
ここで、前記第１のプローブは、分子の５'末端から出発して、第１の架橋オリゴ特異的配列、任意選択で第１の配列バーコード、及び第１のプローブの３'末端における第１の標的特異的部分を含み、
前記第２のプローブは、分子の５'末端から出発して、第２の標的特異的部分、任意選択で第２の配列バーコード、及び第２のプローブの３'末端における第２の架橋オリゴ特異的配列を含み、
前記架橋オリゴは、前記第１のプローブ及び前記第２のプローブのそれぞれ前記第１の架橋オリゴ特異的配列及び前記第２の架橋オリゴ特異的配列に相補的な配列、並びに任意選択で第３のバーコードを含み、
前記第１の配列バーコード又は前記第２の配列バーコード又は前記第３のバーコードの少なくとも１つがそれぞれ前記第１のプローブ又は前記第２のプローブ又は前記架橋オリゴ中に存在し、
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ用プロモーター配列が前記第１のプローブ、前記第２のプローブ又は前記架橋オリゴ中に存在する、
前記与えること、
（ｉｉ）前記１つ以上の標的ヌクレオチド配列の各々について、前記第１のプローブ及び前記第２のプローブを、好ましくは分離管中の前記試料の各々で、前記架橋オリゴと接触させ、自己アニーリングさせて複数の連結複合体にすること、
（ｉｉｉ）前記標的ヌクレオチド配列について試験される前記複数の試料中に存在する核酸を前記複数の連結複合体と接触させること、
（ｉｖ）前記第１のプローブ及び前記第２のプローブのそれぞれ前記第１の標的特異的部分及び前記第２の標的特異的部分を前記標的配列上の本質的に隣接するセクションとハイブリッド形成させ、それによってハイブリダイゼーション複合体を形成すること、
（ｖ）連結された連結複合体を与えるために前記ハイブリダイゼーション複合体中の前記第１のプローブと前記第２のプローブを連結すること、
（ｖｉ）前記複数の試料からの前記連結された連結複合体を貯蔵すること、
（ｖｉｉｉ）前記連結された連結複合体に埋め込まれた前記Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターからＲＮＡ合成を開始するＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて、前記１個以上の連結複合体からＲＮＡを増幅すること、
（ｘｉ）任意選択で、汎用部位２に対して逆相補的であるＤＮＡオリゴヌクレオチド分子を用いて前記ＲＮＡ分子からｃＤＮＡを調製すること、
（ｘｉｉ）１つ又は複数の識別配列を決定するために、前記ＲＮＡ又は前記ｃＤＮＡ分子をハイスループット配列決定技術に供すること、並びに
（ｘｉｉｉ）前記第１の標的特異的部分及び／又は前記第２の標的特異的部分の少なくとも一部、及び／又は前記第１のバーコード及び／又は前記第２のバーコードの少なくとも一部、及び／又は前記第３のバーコードの少なくとも一部の測定によって前記複数の試料中の前記標的ヌクレオチド配列の存在及び／又は数を特定すること、
を含む、方法。
【請求項２】
前記第１のプローブ、前記第２のプローブ又は前記架橋オリゴが、ウラシル特異的切り出し試薬を用いた切断によって直鎖化を可能にするデオキシウリジン部分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記配列決定が次世代ＤＮＡ又はＲＮＡ配列決定によって行われる、請求項１から２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記第１のプローブの前記３'末端若しくは前記第２のプローブの前記５'末端又はその両方が、前記第１のプローブと前記第２のプローブの化学連結を可能にするように修飾された、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記第１のプローブ若しくは前記第２のプローブ又はその両方の前記架橋部分が、前記架橋オリゴとの結合を改善することができる化学修飾塩基を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記第１の標的特異的部分、前記第２の標的特異的部分、前記第１の架橋オリゴ特異的配列及び／又は前記第２の架橋オリゴ特異的配列が、１個以上の化学修飾ヌクレオチドを互いに独立に含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
遺伝子標的の列挙が、標的１個当たり及び試料１個当たりの分子バーコードの数をカウントすることによって可能にされる、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＲＮＡ分子又は前記ｃＤＮＡ分子が、増幅産物を与えるために第１のプライマー及び第２のプライマーを用いて増幅される、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
２個以上の試料に対して、又は２つ以上の遺伝子座／対立遺伝子組合せに対して、ＳＮＰ及び／又はインデルなどの１つ以上の配列及び／又は多形について１つ又は複数の試料の遺伝子型を同定するためにバーコード配列が使用される、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
複数の容器を含む部品のキットであって、少なくとも１個の容器が１組以上の第１のプローブと第２のプローブを含み、少なくとも１個の容器が１個以上の架橋オリゴを含み、
前記第１のプローブが、分子の５'末端から出発して、第１の架橋オリゴ特異的配列、任意選択で第１の配列バーコード、及び第１のプローブの３'末端における第１の標的特異的部分を含み、
前記第２のプローブが、分子の５'末端から出発して、第２の標的特異的部分、任意選択で第２の配列バーコード、及び第２のプローブの３'末端における第２の架橋オリゴ特異的配列を含み、
前記架橋オリゴが、前記第１及び第２のプローブのそれぞれ前記第１及び第２の架橋オリゴ特異的配列に相補的な配列、並びに任意選択で第３のバーコードを含み、
前記第１の配列バーコード又は前記第２の配列バーコード又は前記第３のバーコードの少なくとも１つがそれぞれ前記第１のプローブ又は前記第２のプローブ又は前記架橋オリゴ中に存在し、
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ用プロモーター配列が前記第１のプローブ、前記第２のプローブ又は前記架橋オリゴ中に存在する、
キット。
【請求項１１】
前記第１のプローブの前記３'末端若しくは前記第２のプローブの前記５'末端又はその両方が、前記第１のプローブと前記第２のプローブの化学連結を可能にするように修飾された、請求項１０に記載の部品のキット。
【請求項１２】
前記架橋オリゴが、前記第１のプローブの配列に相補的な配列若しくは前記第２のプローブの配列に相補的な配列又はその両方に１個以上の化学修飾ヌクレオチドを含む、請求項１１に記載の部品のキット。
【請求項１３】
好ましくは前記第１の標的特異的部分、前記第２の標的特異的部分、前記第１の架橋オリゴ特異的配列及び／又は前記第２のオリゴ特異的配列が１個以上の化学修飾ヌクレオチドを互いに独立に含む、請求項１１又は１２に記載の部品のキット。
【請求項１４】
複数の試料中の少なくとも１つの標的配列の有無の判定及び／又は定量化におけるハイスループット配列決定のための第１のプローブ、第２のプローブ及び架橋オリゴの使用であって、
前記第１のプローブが、分子の５'末端から出発して、第１の架橋オリゴ特異的配列、任意選択で第１の配列バーコード、及び第１のプローブの３'末端における第１の標的特異的部分を含み、
前記第２のプローブが、分子の５'末端から出発して、第２の標的特異的部分、任意選択で第２の配列バーコード、及び前記第２のプローブの３'末端における第２の架橋オリゴ特異的配列を含み、
前記架橋オリゴが、前記第１のプローブ及び前記第２のプローブのそれぞれ前記第１の架橋オリゴ特異的配列及び前記第２の架橋オリゴ特異的配列に相補的な配列、並びに任意選択で第３のバーコードを含み、
前記第１の配列バーコード又は前記第２の配列バーコード又は前記第３のバーコードの少なくとも１つがそれぞれ前記第１のプローブ又は前記第２のプローブ又は前記架橋オリゴ中に存在し、
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ用プロモーター配列が前記第１のプローブ、前記第２のプローブ又は前記架橋オリゴ中に存在し、
前記第１のプローブと前記第２のプローブのそれぞれの標的特異的セクションが、連結プローブを与えるために前記標的配列上の本質的に隣接するセクションとハイブリッド形成されるときに、前記第１のプローブと前記第２のプローブが連結され、前記複数の試料からの前記連結プローブが貯蔵され、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて増幅され、１つ又は複数の識別配列を決定するために増幅産物がハイスループット配列決定技術に供される、
使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書の開示は、次世代ＤＮＡ塩基配列決定法、及び１個以上の核酸標的の正確な超並列定量化のための使用に関する。より詳細には、本発明は、ヒト及び動物集団並びに環境試料における遺伝子標的及び変異体の検出に主に使用される複合ＤＮＡプール中の遺伝子標的を検出し、定量化するためのプローブを含む方法及びキットに関係する。さらに、本発明は、生検材料、唾液及び他の分泌物、呼気水分抽出物、組織、血漿（液体生検材料）などを含めて、ただしそれらに限定されない、人体から得られる試料中の疾患を引き起こす遺伝子変化の検出の分野に特に応用される。本発明は、遺伝子標的１個当たり１個以上の標的特異的核酸プローブ（左プローブ及び右プローブ）及び架橋オリゴを含む。
【背景】
【０００２】
遺伝的変異を研究する技術の進歩とともに、植物及び動物における遺伝的変異の検出は厄介ではなくなった。しかし、予防及び治療手段を容易にするための必要な情報を提供するために、突然変異、他の遺伝的変異などの遺伝子変化に対するヌクレオチド配列の非常に貴重な研究を提供する技術の進歩が必要である。ヌクレオチド配列決定は、目的の遺伝子標的におけるヌクレオチドの順番を決定するプロセスである。目的の遺伝子標的のヌクレオチド配列における変異の検出は、核酸配列決定法を用いて行われる。Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ、Ｓａｎｇｅｒなど、ただしそれらに限定されない、最もよく知られた配列決定法が、ヌクレオチド配列の検出に使用される。核酸配列決定技術は、分子生物学、進化生物学、メタゲノミクス、医薬品、法医学などの多数の分野で重要な役割を果たす。理想的には、遺伝子標的の検出及び定量化、例えば、母体血中のＤＮＡの定量化は、非侵襲性出生前トリソミースクリーニングの基礎であり、循環ＤＮＡ中の希少変異の定量化は、癌液体生検の基礎であり、抗生物質耐性遺伝子の定量化は、抗生物質耐性遺伝子の拡散のリスク推定の基礎である。
【０００３】
一般に、癌診断法は、循環ＤＮＡ中の腫瘍学的に関連する変異の検出及び定量化を必要とする。同様に、胎児の異常は、母体血中に低濃度で存在する胎児ＤＮＡの検出及び定量化を必要とする。こうした弱いシグナルを検出し、正確に定量化することは、配列決定費用の低下にもかかわらず、今でも骨が折れ、費用のかかるものである。コンセンサスバックグラウンドに対して遺伝子シグナルを検出するための特異性、弱い遺伝子シグナルを検出するための感度、検出シグナルの正確な定量化のための精度、アッセイ１回当たりの標的遺伝子標的の処理数、アッセイ１回当たりの費用、複数の試料を並行して検査するときのアッセイ費用規模を求めるスケーリング、サンプリングから結果までの時間を求める回転率などの様々な問題をより正確に示すことができる。
【０００４】
現在、液体生検及び概念的に類似したアッセイ（抗生物質耐性遺伝子検出など）の典型的な定量化法としては、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、アレイｑＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、多重連結依存性プローブ増幅（ＭＬＰＡ）、次世代ＤＮＡ塩基配列決定データからの定量化などが挙げられる。定量化法は、堅牢な確立された方法ではあるが、方法の各々は、以下でより詳細に考察する特定の問題に関連する。
定量的ＰＣＲ：定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）は、ＰＣＲ中の、すなわち実時間の標的ＤＮＡ分子の増幅を含む分子生物学に基づく技術である。リアルタイムＰＣＲは、定量的（定量的リアルタイムＰＣＲ）及び半定量的に、すなわちある量のＤＮＡ分子を超えて、又は未満で（半定量的リアルタイムＰＣＲ）使用することができる。
定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）は、遺伝子標的定量化の標準である。現在、ｑＰＣＲ反応の検査室費用は約＄２である。しかし、定量化された各標的の複製と一緒に、反応の準備のためのかなりの操作時間（労務費）、検量線の必要性を勘定に入れと、実費は実際にははるかに高い。別々の定量化実験が各遺伝子標的で必要なので、操作時間の量は、試料数とともに急勾配で増加する。試料１組当たりの定量化された標的１個当たり推定で少なくとも４０の反応は、手作業の費用を除いて、約＄８０の単価になり、定量化することができる反応量の明確な限界を示している。
アレイＰＣＲ：ＰＣＲアレイは、関連する経路又は疾患に焦点を合せた一団の遺伝子の発現を解析するための最も信頼できるツールである。各９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート又は１００ウェルディスクＰＣＲアレイは、焦点を合せた一団の遺伝子の徹底的に研究された一団のＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎに最適化されたプライマーアッセイを含む。より新しいｑＰＣＲ技術は、個々のｑＰＣＲ反応を小型化したアレイｑＰＣＲである。アレイＰＣＲは、個々のｑＰＣＲ反応の費用を削減し、複数の標的及び試料に対する方法の拡張性を改善する。しかし、該方法は、現在、チップ１個当たり数千ドルの費用と解読インフラストラクチャーの大きい資本費で、１２個の試料からの３８４個の標的（又は逆に３８４個の試料からの１２個の標的）のプロファイリングに限定されている。したがって、数千の試料を上記構成でプロファイリングすると、法外に高価なものになる。
デジタルＰＣＲ：デジタルポリメラーゼ連鎖反応（デジタルＰＣＲ、ＤｉｇｉｔａｌＰＣＲ、ｄＰＣＲ又はｄｅＰＣＲ）は、液滴−マイクロ流体工学及び蛍光検出によって標的を絶対的定量化する方法である。該方法は、比較的費用効果が高いが（試料１個当たり１個の標的の費用約＄３）、各試料における各標的に対する個々の実験の準備、設置及び運転の操作時間を数千の試料に拡張するのに不十分である。
多重連結依存性プローブ増幅（ＭＬＰＡ）
ＭＬＰＡは、個々の試料における複数の遺伝子標的の検出を単純化する手法を提供する。しかし、ＭＬＰＡは、標的の相対定量化に過ぎず、各試料で別々の検出実験を必要とする。より最近では、ＭＬＰＡの一変形法がＤＮＡバーコーディング由来の概念を導入している。この概念は、従来のＭＬＰＡワークフローよりも良好な定量的解決及び試料多重化を可能にする。
次世代の配列決定に基づく手法：配列に基づく遺伝子発現分析をアナログ技術の代わりに「デジタル」にするハイスループット配列決定としても知られる次世代配列決定（ＮＧＳ）。次世代ＤＮＡ塩基配列決定データからの標的カウントは、ＤＮＡ塩基配列決定の費用が低下し続けており、ますます魅力的になり、現在、例えば、ＮＩＰＴスクリーニングに使用されている。しかし、現行手法は、高い配列決定ライブラリ調製費用、及び関連しない遺伝子標的の配列決定に費やされる無駄な配列決定労力の点で不利である。例えば、癌関連液体生検では、非標的手法は、腫瘍学的に関連しない遺伝子座に対する配列決定労力の損失を招く。胎児診断法においては、遺伝子座の非標的サンプリングは、データを解釈するための統計学的選択肢をかなり制限する。Ｇｕａｒｄａｎｔ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｉｎｃは、より標的を定めた配列決定手法を提供し、一連のＲＮＡ捕捉プローブによって次世代ＤＮＡ塩基配列決定の標的を豊富にしている。
【０００５】
したがって、上記考察に鑑みて、特異性、感度、精度、処理量、費用、規模、回転率など、ただしそれらに限定されない上記欠点を核酸標的の正確な超並列定量化によって克服する必要がある。
【発明の概要】
【０００６】
本開示は、多重連結アッセイ（ＭＬＡ）を測定するための方法及び組成物を提供しようとするものである。多重連結アッセイは、バーコーディングＭＬＰＡの単純性及び並行の可能性をｑＰＣＲの精度及び感度と組み合わせようとする分子連結に基づくアッセイである。
【０００７】
本発明は、より詳細には、連結依存性アッセイを強化することによって極めて多数の試料における標的ヌクレオチド配列検出のハイスループット検出方法に関する。一実施形態においては、標的ヌクレオチド配列をＤＮＡ又はＲＮＡ、好ましくはＤＮＡとすることができる。一実施形態においては、方法及び組成物は、複数の試料中の少なくとも１つの標的配列の有無の判定及び／又は定量化におけるハイスループット配列決定によって標的を解析するステップを含む。
【０００８】
一側面においては、本開示の実施形態は、試料の各々における各標的ヌクレオチド配列に対する１組の標的特異的プローブを更に含む方法を提供する。標的特異的プローブアセンブリの設計は、遺伝子標的１個当たり２個の標的特異的核酸プローブ（左プローブ及び右プローブ）を含み、又は３個の標的特異的核酸プローブを有し、そのうち２個が遺伝子標的に特異的であり（左プローブ及び右プローブ）、１個が汎用（架橋オリゴ）である、標的特異的プローブアセンブリの設計を含む。汎用（架橋オリゴ）は、左プローブと右プローブの結合に使用される。
【０００９】
一実施形態においては、第１のプローブは、分子の５'末端から出発して、任意選択で５'リン酸、第１の架橋オリゴ特異的配列、任意選択で第１の汎用配列、任意選択で第１の配列バーコード、及び第１のプローブの３'末端における第１の標的特異的部分を含む。第２のプローブは、分子の５'末端から出発して、任意選択で５'リン酸、第２の標的特異的部分、任意選択で第２の配列バーコード、任意選択で第２の汎用配列、及び第２のプローブの３'末端における第２の架橋オリゴ特異的配列を含む。好ましくは、第１の配列バーコード又は第２の配列バーコードの少なくとも一方は、それぞれ第１のプローブ又は第２のプローブ中に存在し、第１の配列バーコード若しくは第２の配列バーコード又はその両方は、ランダム配列とすることができ、又は標的ヌクレオチド配列識別配列、試料識別配列及び／又は標的列挙用分子バーコードを含むことができる。
【００１０】
好ましくは、汎用架橋オリゴプローブは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ用プロモーター配列、第１のプローブ及び第２のプローブのそれぞれ第１の架橋オリゴ特異的配列及び第２の架橋オリゴ特異的配列に相補的な配列を含み、ランダム配列とすることができる、又は試料識別配列若しくは標的識別配列を含むことができる、第３のバーコードを任意選択で含む。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列は架橋オリゴ中に存在することが好ましいが、プロモーターが架橋オリゴ中に存在する代わりに、第１又は第２のプローブ中に存在することもできる。しかし、こうした場合には、プローブ及びオリゴの設計は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが試料及び標的の同定並びに標的配列の列挙に必要であるすべての配列を転写することができるようでなければならない。
【００１１】
第１のプローブ及び第２のプローブは、第１の標的特異的部分、第２の標的特異的部分、第１の架橋オリゴ特異的配列及び／又は第２の架橋オリゴ特異的配列を含む。第１のプローブと第２のプローブは、配列を互いに独立に含む。第１のプローブ及び第２のプローブは、好ましくは、１個以上の化学修飾ヌクレオチド配列で化学修飾される。
【００１２】
第１のプローブ及び第２のプローブは、好ましくは分離管中の試料の各々で、架橋オリゴと接触する。複数の第１及び第２のプローブは、複数の架橋オリゴに自己アニールして、複数の連結複合体になる。好ましくは、各連結複合体は、第１の標的特異的配列、第２の標的特異的配列及び１個以上のバーコード配列の組合せごとに独特である。これによって、増幅及び結果の分析後に標的配列を列挙することができる。
【００１３】
続いて、各試料中の１つ以上の標的ヌクレオチド配列（単数又は複数）を連結複合体と接触させ、自己アニールさせて、複数のハイブリッド連結複合体にすることができる。第１のプローブ及び第２のプローブのそれぞれ第１の標的特異的部分及び第２の標的特異的部分は、標的配列上の本質的に隣接するセクションとハイブリッド形成し、それによってハイブリダイゼーション複合体を形成する。形成されたハイブリッド複合体における第１のプローブと第２のプローブの連結は、酵素的又は化学的に行われ、連結された連結複合体を与える。次いで、１個以上の試料中の連結された連結複合体が続いて貯蔵される。
【００１４】
第１のプローブと第２のプローブの間にギャップが存在する場合、ギャップは、ポリメラーゼ及び１個以上のヌクレオチドを導入することによって充填されてもよい。ポリメラーゼは、（ａ）汎用架橋オリゴ配列に相補的なヌクレオチド及び（ｂ）標的配列に相補的なヌクレオチドを付加し、それによって第１のプローブと第２のプローブの間の２つのギャップを充填して、左プローブと右プローブを連結する。架橋オリゴは、標的配列識別配列が架橋オリゴに組み込まれ、それによって１個以上の連結された連結複合体を形成するように、連結プローブに相補的な５'部位又は３'部位から伸長する。
【００１５】
第１のプローブと第２のプローブが標的配列部分で連結される前にポリメラーゼが架橋オリゴを第１及び第２のプローブ上のそれぞれの標的配列中に伸長させるのを防止するために、好ましくは、適切なポリメラーゼが使用され、より好ましくは、二本鎖ＤＮＡ配列中に伸長しないポリメラーゼが使用される。こうしたポリメラーゼの典型的な例は、Ｔａｑポリメラーゼである。
【００１６】
次に、連結された連結複合体の架橋オリゴ配列上の二本鎖Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター部位上で結合し、ＲＮＡを下流に転写するＴ７ＲＮＡポリメラーゼ。１個以上の連結された連結複合体からの合成ＲＮＡの増幅は、例えば、エマルジョン逆転写酵素（ＲＴ）ＰＣＲ又はＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて行われる。遊離試料及びプローブ核酸の除去は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ合成後かつｃＤＮＡ合成又はＲＴ−ＰＣＲ前に、ＤＮＡ特異的エキソヌクレアーゼ及びエンドヌクレアーゼを貯蔵増幅反応物に任意選択で添加することによって行われる。
【００１７】
好ましくは、連結断片の精製プロセスは、連結反応混合物の構成成分を精製カラム又はビーズ精製を用いて除去することによって行われる。ｃＤＮＡは、汎用部位２に対して逆相補的であるＤＮＡオリゴヌクレオチド分子を用いてＲＮＡ分子から調製されてもよい。ｃＤＮＡが調製された後、従来のＰＣＲ又は好ましくはエマルジョンＰＣＲを使用して、シグナルを増加させることができる。あるいは、ＲＴ−ＰＣＲ又はエマルジョンＲＴ−ＰＣＲを使用することができる。
【００１８】
標的ヌクレオチド配列の有無は、増幅されたＲＮＡ又はｃＤＮＡ分子をハイスループット配列決定技術に供して、１つ又は複数の識別配列を決定することによって判定される。
【００１９】
別の一側面においては、本開示の一実施形態は、本発明の方法及び組成物に使用されるキットを提供する。キットは複数の容器を含み、少なくとも１個の容器は１組の第１のプローブと第２のプローブを含み、少なくとも１個の容器は架橋オリゴを含む。特定の一実施形態においては、１組の第１のプローブと第２のプローブを含む少なくとも１個の容器と架橋オリゴを含む少なくとも１個の容器は、１個の同じ容器である。こうした場合においては、３個のプローブは、あらかじめアニールし、連結複合体を形成することができる。
【００２０】
本発明の特定の一効果は、独特のプローブ設計、すなわちプローブトリプレットを用いて目的の標的配列の検出及び増幅を可能にすることである。結合性の改善されたプローブが設計され、アッセイの特異性、感度及び精度が高くなる。本発明は、分子生物学、進化生物学、メタゲノミクス、遺伝子型同定、より具体的には、それらに限定されないが、癌診断法及び胎児染色体異常の領域で応用される。
【００２１】
本開示の更なる側面、効果、特徴及び目的は、以下の添付の特許請求の範囲と併せて解釈される図面及び説明のための実施形態の詳細な説明から明らになるはずである。
【００２２】
本開示の特徴は、添付の特許請求の範囲によって規定される本開示の範囲から逸脱することなく、種々の組合せで組み合わせ可能であることを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
上記摘要及び説明のための実施形態の以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むとより良く理解される。本開示を説明する目的で、本開示の例示的構成を図面に示す。しかし、本開示は、本明細書に開示される特定の方法及び手段に限定されない。さらに、当業者は、図面が一定の縮尺ではないことを理解するであろう。可能な時はいつでも、同様の要素は同一の番号で示される。
【００２４】
以下、本開示の実施形態を単なる例として以下の図を参照して記述する。
【００２５】
【図１】本明細書の一実施形態に係る多重連結アッセイ（ＭＬＡ）の流れ図である。
【００２６】
【図２Ａ】本明細書の一実施形態に係る複数のプローブ体を有するプローブトリプレットの原理構造を示す。
【００２７】
【図２Ｂ】本明細書の一実施形態に係る第１のプローブと第２のプローブの間を満たすギャップを示す。
【００２８】
【図３】プローブ結合効率を高め、連結効率を改善する、可能な化学修飾を示す。
【００２９】
【図４】本明細書の一実施形態に係る複製染色体カウントデータの分析の概要を示す。
【００３０】
【図５】本明細書の一実施形態に係る複数の遺伝子の変異体の割合を定量するための概要を示す。
【００３１】
【図６】本明細書の一実施形態に係る多重連結依存性プローブ増幅のフローチャートである。
【実施形態の詳細説明】
【００３２】
以下の詳細な説明は、本開示の実施形態及びそれらを実施することができる方法を示す。本開示を実施する幾つかの様式を開示するが、当業者は、本開示を実施又は実行する別の実施形態も可能であることを認識されたい。
【００３３】
第１の実施形態においては、本発明は、複数の試料における１つ以上の標的ヌクレオチド配列のハイスループット検出方法であって、以下のステップを含む方法を提供する。
【００３４】
（ｉ）試料の各々における各標的ヌクレオチド配列に対して第１のプローブ、第２のプローブ及び架橋オリゴを与えること。ただし、
第１のプローブは、分子の５'末端から出発して、任意選択で５'リン酸、第１の架橋オリゴ特異的配列、任意選択で第１の汎用配列、任意選択で第１の配列バーコード、及び第１のプローブの３'末端における第１の標的特異的部分を含み、
第２のプローブは、分子の５'末端から出発して、任意選択で５'リン酸、第２の標的特異的部分、任意選択で第２の配列バーコード、任意選択で第２の汎用配列、及び第２のプローブの３'末端における第２の架橋オリゴ特異的配列を含み、
架橋オリゴは、第１のプローブ及び第２のプローブのそれぞれ第１の架橋オリゴ特異的配列及び第２の架橋オリゴ特異的配列に相補的な配列を含み、ランダム配列とすることができる、又は試料識別配列若しくは標的識別配列を含むことができる、第３のバーコードを任意選択で含み、
第１の配列バーコード又は第２の配列バーコード又は第３のバーコードの少なくとも１つは、それぞれ第１のプローブ又は第２のプローブ又は架橋オリゴ中に存在し、第１の配列バーコード若しくは第２の配列バーコード又はその両方は、ランダム配列とすることができ、又は標的ヌクレオチド配列識別配列、試料識別配列及び／又は標的列挙用分子バーコードを含むことができ、
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ用プロモーター配列は、第１のプローブ、第２のプローブ又は架橋オリゴ中に存在し、好ましくは第１の標的特異的部分、第２の標的特異的部分、第１の架橋オリゴ特異的配列及び／又は第２の架橋オリゴ特異的配列は、互いに独立に１個以上の化学修飾ヌクレオチドを含む。
（ｉｉ）１つ以上の標的ヌクレオチド配列の各々について、第１のプローブ及び第２のプローブを、好ましくは分離管中の試料の各々で、架橋オリゴと接触させ、自己アニーリングさせて複数の連結複合体にすること。
（ｉｉｉ）標的ヌクレオチド配列について試験される複数の試料中に存在する核酸を複数の連結複合体と接触させること。
（ｉｖ）第１のプローブ及び第２のプローブのそれぞれ第１の標的特異的部分及び第２の標的特異的部分を標的配列上の本質的に隣接するセクションとハイブリッド形成させ、それによってハイブリダイゼーション複合体を形成すること。
（ｖ）連結された連結複合体を与えるためにハイブリダイゼーション複合体中の第１のプローブと第２のプローブを連結すること。
（ｖｉ）複数の試料からの連結された連結複合体を貯蔵すること。
（ｖｉｉ）任意選択で、架橋オリゴ上の第１のプローブと第２のプローブの間に存在するギャップが充填されるように、架橋オリゴ中に存在するバーコード配列が連結プローブに組み込まれるように連結プローブが５'部位若しくは３'部位から伸長するように、又は第１のプローブ若しくは第２のプローブ中に存在するバーコード配列が架橋オリゴに組み込まれるように架橋オリゴが５'部位若しくは３'部位から伸長するように、又はその両方であるように、ハイブリダイゼーション複合体にポリメラーゼ及び１個以上のヌクレオチドを与え、それによって１個以上の連結された連結複合体を形成すること。
（ｖｉｉｉ）連結複合体に埋め込まれたＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターからＲＮＡ合成を開始するＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて、１個以上の連結された連結複合体からＲＮＡを増幅すること。
（ｉｘ）任意選択で、ＤＮＡ特異的エキソヌクレアーゼ及びエンドヌクレアーゼを貯蔵増幅反応物に添加して、試料及びプローブＤＮＡを除去すること。
（ｘ）任意選択で、残りのＲＮＡをビーズ又はカラム精製によって精製すること。
（ｘｉ）任意選択で、第２の汎用部位に対して逆相補的であるＤＮＡオリゴヌクレオチド分子を用いて、ＲＮＡ分子からｃＤＮＡを調製すること。
（ｘｉｉ）１つ又は複数の識別配列を決定するために、増幅されたＲＮＡ又はｃＤＮＡ分子をハイスループット配列決定技術に供すること。
（ｘｉｉｉ）第１の標的特異的部分及び／又は第２の標的特異的部分の少なくとも一部、第１のバーコード配列及び／又は第２のバーコード配列の少なくとも一部、及び／又は第３のバーコード配列の少なくとも一部の測定によって複数の試料中の標的ヌクレオチド配列の存在及び／又は数を特定すること。
【００３５】
定義：
【００３６】
標的ヌクレオチド配列：標的ヌクレオチド配列という用語は、その検出が要求される目的の任意のヌクレオチド配列とすることができる。この用語は、隣接ヌクレオチドの配列、及び相補配列を有する核酸分子を指すことを理解されたい。標的配列は、好ましくは、多形である、又は多形に関連する、ヌクレオチド配列である。
【００３７】
多形：多形という用語は、集団中の２個以上の遺伝的に決定された選択的配列又は対立遺伝子の出現を指す。多形マーカー又は部位は、配列の分岐が起こる遺伝子座である。多形遺伝子座は、１塩基対と小さい場合もある。
【００３８】
試料：試料という用語は、本明細書では、２つ以上の標的配列を含む２個以上の試料に使用される。本発明に係る方法において用意される試料は、好ましくは、少なくとも標的核酸を抽出し、それらが本発明で使用されるプローブに接近できるようにするために調製される。特に、試料は各々少なくとも２個、好ましくは少なくとも１００個、より好ましくは少なくとも２５０個、より好ましくは少なくとも５００個、最も好ましくは少なくとも２０００個、又はそれ以上の異なる標的配列を含む。試料という用語は、生検材料、唾液及び他の分泌物、呼気水分抽出物、組織、血漿（液体生検材料）を含めた人体から得られる２個以上の試料、水、廃水、土壌などを含めた環境から得られる２個以上の試料を指し得るが、それらに限定されない。
【００３９】
プローブ：プローブという用語は、プローブ中の配列に相補的であるヌクレオチド配列（ＤＮＡ又はＲＮＡ標的）の存在を検出するためにＤＮＡ又はＲＮＡ試料中で使用することができる長さ可変（通常、５０〜１０００塩基長、好ましくは５０〜２００塩基長）のＤＮＡ又はＲＮＡの断片である。標的配列に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブのセクションは、試料中の各標的配列に対して１対の左プローブと右プローブが与えられるように設計され、それによってプローブは各々、標的配列の一部に相補的であるセクションをそれらの末端に含む。さらに、本発明は、左プローブと右プローブを結合するのに使用される架橋オリゴを提供する。
【００４０】
汎用：増幅手順を記述するのに使用されるときの汎用という用語は、複数の増幅反応に対して単一のプライマー又は１組のプライマーの使用を可能にする配列を指す。こうしたプライマーの使用は、複数の選択された核酸配列を増幅するのに２個のプライマーしか必要とされない点で多重化を大いに簡略化する。プライミング部位の記述に使用されるときの汎用という用語は、汎用プライマーがハイブリッド形成する部位である。汎用プライミング配列／プライマーの「組」を使用できることにも注目すべきである。
【００４１】
ハイブリダイゼーション：ハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ又はｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ）という用語は、相補ＤＮＡ又はＲＮＡへのデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）分子アニーリングのプロセスを言う。ＤＮＡ又はＲＮＡ複製及びＲＮＡへのＤＮＡの転写は、どちらもヌクレオチドハイブリダイゼーションに依拠する。
【００４２】
連結：連結という用語は、酵素の作用による２個の核酸断片の結合である。ＤＮＡリガーゼは、相補鎖上の隣接部位で結合する２本のポリヌクレオチド鎖（の末端）間のリン酸ジエステル結合の形成を触媒することができる酵素である。特にポリヌクレオチドの両方の隣接末端が化学連結可能なように修飾されている場合、連結を化学的に行うこともできる。
【００４３】
増幅：本明細書で使用する増幅という用語は、ヌクレオチド配列の混合物内の特定のヌクレオチド配列の濃度を増加させるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用を表す。「ＰＣＲ」、すなわち「ポリメラーゼ連鎖反応」は、特異的ＤＮＡ／ＲＮＡセグメントのインビトロ酵素増幅の迅速な手順である。増幅されるＤＮＡ／ＲＮＡは、試料を加熱することによって変性される。プライマーという用語は、ＤＮＡ合成の出発点として役立つＲＮＡ又はＤＮＡの短鎖（一般に約１８〜２２塩基）である。このプロセスを触媒する酵素ＤＮＡポリメラーゼは、新しいヌクレオチドを既存のＤＮＡ鎖に付加することしかできないので、ＤＮＡ複製にはプライマーが必要である。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、単一のＤＮＡ分子をＲＮＡの複数のコピーに転写し、増幅することができる。ＲＮＡはｃＤＮＡに戻すことができる。
【００４４】
ポリメラーゼ：ポリメラーゼは、核酸の長鎖又はポリマーを合成する酵素である。ＤＮＡポリメラーゼ及びＲＮＡポリメラーゼを使用して、ＤＮＡ又はＲＮＡ鋳型鎖を塩基対合相互作用を利用してコピーすることによって、それぞれＤＮＡ及びＲＮＡ分子を組み立てる。本明細書で使用する特異的ポリメラーゼＴ７ＲＮＡポリメラーゼは、５'→３'方向のＲＮＡの形成を触媒するＴ７バクテリオファージ由来のＲＮＡポリメラーゼである。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡの合成の補因子として部分二本鎖ＤＮＡ鋳型及びＭｇ２＋イオンを必要とする。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、単一のＤＮＡ分子をＲＮＡの複数のコピーに転写し、増幅することができる。
【００４５】
ハイスループット：ハイスループットという用語は、多数のＤＮＡ試料を同時に処理し、スクリーニングする能力、及び単一のＤＮＡ試料内の多数の異なる遺伝子座を同時にスクリーニングする能力を表す。ハイスループット配列決定又はスクリーニングは、しばしばＨＴＳと略記され、特に多量の試料を同時に効果的にスクリーニングすることに関連した科学的実験法である。
【００４６】
ウラシル特異的切り出し試薬（ＵＳＥＲ）：ＵＳＥＲとしても知られるウラシル特異的切り出し試薬は、切断によってデオキシウリジンヌクレオチドが存在する環状ＤＮＡ分子の直鎖化を可能にする。
【００４７】
本発明は、次世代配列決定によって可能になる技術を用いて複合核酸プール中の遺伝子標的の配列を決定する方法を開示する。本発明は、連結依存性アッセイを強化することによって、幾つかの試料、好ましくは極めて多数の試料における複数の遺伝子標的をプロファイルする方法を提供する。本発明は、複数の試料における異なる標的核酸の問合せを可能にする多重連結依存性プローブ増幅の方法を提供する。本開示は、遺伝子変異体の有無の検出のために、試料中に存在する目的の核酸標的の正確な超並列定量化による標的核酸の配列決定のための方法及び組成物を当業者に提供する。さらに、配列決定データを処理するときに遺伝子標的を同定し、試料プールからの個々の試料の絶対的定量化をするために独特の配列識別配列が使用される。
【００４８】
好ましい一実施形態においては、本発明の方法及び組成物は、ハイスループット配列決定技術を用いた複数の核酸試料の同定に関係する。本発明の方法及び組成物は、複数の試料における１つ以上の標的ヌクレオチド配列の配列決定を可能にし、異なる標的核酸用の複数の異なるプローブセットを提供する。本発明の方法及び組成物は、３個の核酸プローブを利用し、そのうち２個の標的特異的核酸プローブ（左プローブ及び右プローブ）は遺伝子標的に特異的であり、１個の核酸プローブは汎用（架橋オリゴ）である。左及び右プローブは架橋プローブとハイブリッド形成して、連結複合体を形成する。試料ＤＮＡ／ＲＮＡ上に標的同定部位を有する（１個以上のバーコード配列を含む）連結複合体は、クエリー試料の相補的標的配列と周囲条件下でハイブリッド形成することができる。ハイブリダイゼーション後、左プローブと右プローブは、化学的に、又はＤＮＡリガーゼによって酵素的に連結し、連結された連結複合体を形成する。本発明においては、複数のこうした連結された連結複合体が、複数の分析試料における試料分析中に生成する。
【００４９】
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ、ＨｉＳｅｑ又はＮｅｘｔＳｅｑを含めて、ただしそれらに限定されない次世代配列決定プラットホームを用いた配列決定に使用される結合プローブを増幅する。試料は、配列データから分離され（デコンボリューション）、配列標的は、ＤＮＡ塩基配列決定後にコンピュータで定量化される。好ましい一実施形態においては、本発明に係る方法が提供され、配列決定が次世代ＤＮＡ又はＲＮＡ配列決定によって行われる。
【００５０】
一実施形態においては、「複数の試料」という用語は、生検材料、唾液及び他の分泌物、呼気水分抽出物、組織、血漿（液体生検材料）を含めた人体から得られる２個以上の試料、水、廃水、土壌などを含めた環境から得られる２個以上の試料を指し得るが、それらに限定されない。使用される試料は、エタノール沈殿、フェノール−クロロホルム抽出、シリカカラムなどの現在利用可能な抽出技術のいずれかによって抽出されたＤＮＡ又はＲＮＡとすることができる。
【００５１】
一実施形態においては、方法及び組成物は、複数の試料中の少なくとも１つの標的配列の検出及び／又は定量化におけるハイスループット配列決定によって標的を解析するステップを含む。標的配列は、検出が必要な目的の任意のヌクレオチド配列を含む。本開示の標的ヌクレオチド配列は、患者の血中のわずかなＤＮＡ又は母体血中のわずかなＤＮＡから得られるが、それらに限定されない。患者の血中のわずかなＤＮＡは、アポトーシス／壊死癌細胞から、又は胎児由来の母体血中のわずかなＤＮＡから得られる。さらに、分析結果を使用して、例えば、所与のタイプの癌に対する個体のリスク、所与の癌に対する所与の処置の有効性の判定、腫瘍における薬剤耐性関連変異の発生、又は胎児が一般的なトリソミーダウン、パトー、エドワーズ症候群などの遺伝性疾患を有するリスクを評価する。
【００５２】
一実施形態においては、１個以上の試料に由来し得る１つ以上の標的ヌクレオチド配列のハイスループット検出方法が提供される。ある実施形態においては、方法は、各標的ヌクレオチド配列に対して複数の異なるプローブセットを用意することを含む。本明細書では、プローブセットという用語は、第１のプローブ、第２のプローブ及び架橋オリゴを含む。
【００５３】
ある実施形態においては、第１のプローブは、分子の５'末端から出発して、任意選択で５'リン酸、第１の架橋オリゴ特異的配列、任意選択で第１の汎用配列、任意選択で第１の配列バーコード、及びその３'末端における第１の標的特異的部分を含む。ある実施形態においては、第２のプローブは、分子の５'末端から出発して、任意選択で５'リン酸、第２の標的特異的部分、任意選択で第２の配列バーコード、任意選択で第２の汎用配列、及びその３'末端における第２の架橋オリゴ特異的配列を含む。
【００５４】
好ましい一実施形態においては、第１のプローブ又は第２のプローブは、第１の配列バーコード又は第２の配列バーコードの少なくとも一方を含む。第１の配列バーコード若しくは第２の配列バーコード又はその両方は、ランダム配列とすることができ、又は標的ヌクレオチド配列識別配列、試料識別配列及び／又は標的列挙用分子バーコードを含むことができる。
【００５５】
好ましい実施形態においては、架橋オリゴは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ用プロモーター配列、第１及び第２のプローブのそれぞれ第１及び第２の架橋オリゴ特異的配列に相補的な配列、汎用配列を含み、及び／又はランダム配列とすることができる第３のバーコードを含むことができ、又は試料若しくは配列識別配列を含むことができる。なお、第３のバーコードは、第１及び第２のバーコードが既に存在することを必ずしも意味しない。上述したように、すべての試験試料におけるすべての連結複合体内の複合体を一義的に定義することができる少なくとも１個のバーコードが、連結された連結複合体中に存在すべきである。
【００５６】
第１の標的特異的部分、第２の標的特異的部分、第１の架橋オリゴ特異的配列、及び／又は第２の架橋オリゴ特異的配列は、好ましくは、少なくとも１個の化学修飾ヌクレオチドを互いに独立に含む。プローブ結合を増加させる化学修飾としては、リボ核酸、ペプチド核酸及びロックド核酸が挙げられるが、それらに限定されない。ある実施形態においては、化学修飾は、隣接プローブの化学連結を可能にする。上記プローブは、完全に隣接する遺伝子座に、又は最高５０塩基対離れて、好ましくは最高４０塩基対離れて、より好ましくは最高３０塩基対離れて、より好ましくは最高２０塩基対離れて、より好ましくは最高１０塩基対離れて、最も好ましくは最高５塩基対離れて結合する。
【００５７】
標的配列を含む試料にプローブを接触させる前に、第１のプローブ及び第２のプローブを架橋オリゴと、好ましくは分離管中の試料の各々で接触させ、自己アニーリングによって連結複合体にすることができる。その後、複数の試料における１つ以上の標的ヌクレオチド配列を複数の連結複合体と接触させる。第１のプローブ及び第２のプローブのそれぞれ第１の標的特異的部分及び第２の標的特異的部分は、標的配列上の本質的に隣接するセクションとハイブリッド形成し、それによってハイブリダイゼーション複合体を形成する。形成されたハイブリッド複合体における第１のプローブと第２のプローブの連結は、酵素的又は化学的に行われ、連結された連結複合体を与える。次いで、連結された連結複合体は、１個以上の標的試料から続いて貯蔵される。
【００５８】
第１のプローブと第２のプローブの間にギャップが存在する場合、ギャップは、ポリメラーゼ及び１個以上のヌクレオチドを導入することによって充填することができる。ポリメラーゼは、（ａ）汎用架橋オリゴ配列に相補的なヌクレオチド及び／又は（ｂ）バーコード配列に相補的なヌクレオチドを付加し、それによって第１のプローブと第２のプローブの間の２つのギャップを充填して、左プローブと右プローブを連結し、汎用配列及び／又は第３のバーコード配列を架橋相補鎖に含める。架橋オリゴは、第１のプローブ又は第２のプローブ中に存在する標的配列識別配列が架橋オリゴに組み込まれるように、連結プローブに相補的な５'部位又は３'部位から伸長する。好ましくは、第１のプローブと第２のプローブが標的配列にアニールされたときに第１のプローブと第２のプローブの連結を妨害しないために、例えばＴａｑポリメラーゼなどの二本鎖ＤＮＡを分解しないポリメラーゼが使用される。
【００５９】
好ましくは、プローブ又は架橋オリゴのどちらかは、ウラシル特異的切り出し試薬を用いた切断によって直鎖化を可能にするデオキシウリジン部分を含む。これによって、架橋オリゴ又は第１若しくは第２のプローブに埋め込まれたＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターからＲＮＡ合成を開始するＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて、直鎖化された連結された連結複合体からＲＮＡを転写することができる。増幅後、遊離試料及びプローブ核酸の除去は、ＤＮＡ特異的エキソヌクレアーゼ及びエンドヌクレアーゼを貯蔵増幅反応物に任意選択で添加することによって行われる。上述したように、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列は、架橋オリゴ、第１のプローブ又は第２のプローブ中に位置することができる。同じことがデオキシウリジン部分にも当てはまる。しかし、当業者には明らかなように、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列及びデオキシウリジン部分は、異なる試料における異なる標的の列挙に必要であるすべての情報をＴ７ＲＮＡポリメラーゼが転写できるように位置すべきである。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼとデオキシウリジン部分の間に以下の配列が存在すべきである：標的の同定を可能にする少なくとも１個の配列、試料の同定を可能にする少なくとも１個の配列、及び試料中の標的配列のコピー数を決定することができる少なくとも１個の独特の識別配列。
【００６０】
連結断片の精製プロセスは、連結反応混合物の構成成分を精製カラム又はビーズ精製を用いて除去することによって行うことができる。ｃＤＮＡは、汎用部位２に対して逆相補的であるＤＮＡオリゴヌクレオチド分子を用いてＲＮＡ分子から調製されてもよい。ＲＮＡ分子は、ｃＤＮＡに変換されてもよく、プローブの汎用部分に結合するプライマーを用いてＰＣＲ又はエマルジョンＰＣＲによって増幅されてもよい。
【００６１】
ハイスループット配列決定技術による第１及び／又は第２の標的特異的部分の少なくとも一部、第１及び／又は第２のバーコードの少なくとも一部、及び／又は第３のバーコードの少なくとも一部の測定による複数の試料中の標的ヌクレオチド配列の存在及び／又は数の特定。好ましくは、遺伝子標的の列挙は、標的１個当たり及び試料１個当たりの分子バーコードの数をカウントすることによって可能になる。
【００６２】
標的ヌクレオチド配列の有無は、増幅されたＲＮＡ又はｃＤＮＡ分子をハイスループット配列決定技術に供して、１つ又は複数の識別配列を決定することによって判定される。好ましい一実施形態においては、ＲＮＡ分子又はｃＤＮＡ分子が、増幅産物を与えるために第１のプライマー及び第２のプライマーを用いて増幅される、本発明に係る方法が提供される。好ましくは、連結複合体中に存在する第１及び第２の汎用配列に相補的な汎用第１のプライマー及び汎用第２のプライマーが使用される。
【００６３】
本発明の方法及び組成物は、ヌクレオチド配列決定及び増幅のために先行技術で使用される方法に比べて有利である様々な側面を含む。本発明に開示された方法及び組成物は、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、アレイＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、多重連結依存性プローブ増幅などを限定せずに、既存の標的のどれよりも良好なアッセイを提供することを目的とする。
【００６４】
本発明の効果としては、従来の核酸配列決定技術に比べて、低コスト、高い単純性、高い特異性、高感度、高精度、ハイスループット、高い拡張性及び高い回転率の定量化アッセイが挙げられるが、それらに限定されない。本発明の別の一側面は、本発明の方法及び組成物によって、ヒト及び動物集団を含めた複数の試料における複数の核酸標的の正確な超並列定量化が可能になることである。本発明の特定の一効果は、独特のプローブ設計、すなわちプローブトリプレットを用いて目的の標的配列の検出及び増幅を可能にすることである。プローブは、アニーリング及び結合効率を改善する特別に位置付けられた修飾ヌクレオチドを用いて設計される。結合性の改善によって、アッセイ特異性、感度及び精度が高くなる。本発明の方法及び組成物は、遺伝子変異体の研究にも同様に適用可能であり、ＳＮＰ及び／又はインデルなどの１つ以上の配列及び／又は多形についての１つ又は複数の試料の遺伝子型の同定、癌診断法又は母体血からの胎児染色体異常を含めて、ただしそれらに限定されない診断及び予後に応用される。好ましい一実施形態においては、２個以上の試料に対して、又は２つ以上の遺伝子座／対立遺伝子組合せに対して、ＳＮＰ及び／又はインデルなどの１つ以上の配列及び／又は多形について試料の遺伝子型を同定するためにバーコード配列が使用される、本発明に係る方法が提供される。
【００６５】
別の一側面においては、本発明は、複数の容器を含む部品のキットであって、少なくとも１個の容器が１組以上の第１のプローブと第２のプローブを含み、少なくとも１個の容器が１個以上の架橋オリゴを含む、キットを提供する。
【００６６】
ここで、第１のプローブは、分子の５'末端から出発して、任意選択で５'リン酸、第１の架橋オリゴ特異的配列、任意選択で第１の汎用配列、任意選択で第１の配列バーコード、及び第１のプローブの３'末端における第１の標的特異的部分を含み、
【００６７】
第２のプローブは、分子の５'末端から出発して、任意選択で５'リン酸、第２の標的特異的部分、任意選択で第２の配列バーコード、任意選択で第２の汎用配列、及び第２のプローブの３'末端における第２の架橋オリゴ特異的配列を含み、
【００６８】
架橋オリゴは、第１のプローブ及び第２のプローブのそれぞれ第１の架橋オリゴ特異的配列及び第２の架橋オリゴ特異的配列に相補的な配列を含み、ランダム配列とすることができる、又は標的ヌクレオチド識別配列若しくは試料識別配列を含むことができる、第３のバーコードを任意選択で含み、
【００６９】
第１の配列バーコード又は第２の配列バーコード又は第３のバーコードの少なくとも１つは、それぞれ第１のプローブ又は第２のプローブ又は架橋オリゴ中に存在し、第１の配列バーコード若しくは第２の配列バーコード又はその両方は、ランダム配列とすることができ、又は標的ヌクレオチド配列識別配列、試料識別配列及び／又は標的列挙用分子バーコードを含むことができ、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ用プロモーター配列が第１のプローブ、第２のプローブ又は架橋オリゴ中に存在し、
【００７０】
好ましくは、第１の標的特異的部分、第２の標的特異的部分、第１の架橋オリゴ特異的配列及び／又は第２のオリゴ特異的配列は、１個以上の化学修飾ヌクレオチドを互いに独立に含むことができる。
【００７１】
好ましくは、第１のプローブの３'末端若しくは第２のプローブの５'末端又はその両方は、第１のプローブと第２のプローブの化学連結を可能にするように修飾される。
【００７２】
好ましくは、架橋オリゴは、第１のプローブの配列に相補的な配列若しくは第２のプローブの配列に相補的な配列又はその両方に１個以上の化学修飾ヌクレオチドを含む。
【００７３】
好ましくは、第１のプローブ、第２のプローブ又は架橋オリゴは、ウラシル特異的切り出し試薬を用いた切断によって直鎖化を可能にするデオキシウリジン部分を含む。
【００７４】
好ましくは、第１のプローブの３'末端若しくは第２のプローブの５'末端又はその両方は、第１のプローブと第２のプローブの化学連結を可能にするように修飾される。
【００７５】
好ましくは、第１のプローブ若しくは第２のプローブ又はその両方の架橋部分は、架橋オリゴとの結合を改善することができる化学修飾塩基を含む。
【００７６】
別の一側面においては、本発明は、複数の試料中の１つ以上の標的配列の有無の判定及び／又は定量化におけるハイスループット配列決定のための、第１のプローブ、第２のプローブ及び架橋オリゴの使用を提供する。
【００７７】
第１のプローブは、分子の５'末端から出発して、任意選択で５'リン酸、第１の架橋オリゴ特異的配列、任意選択で第１の汎用配列、任意選択で第１の配列バーコード、及び第１のプローブの３'末端における第１の標的特異的部分を含む。
【００７８】
第２のプローブは、分子の５'末端から出発して、任意選択で５'リン酸、第２の標的特異的部分、任意選択で第２の配列バーコード、任意選択で第２の汎用配列、及び第２のプローブの３'末端における第２の架橋オリゴ特異的配列を含む。
【００７９】
架橋オリゴは、第１のプローブ及び第２のプローブのそれぞれ第１の架橋オリゴ特異的配列及び第２の架橋オリゴ特異的配列に相補的な配列を含み、ランダム配列とすることができる、又は試料識別配列を含むことができる、第３のバーコードを任意選択で含む。
【００８０】
第１の配列バーコード又は第２の配列バーコード又は第３のバーコードの少なくとも１つは、それぞれ第１のプローブ又は第２のプローブ又は架橋オリゴ中に存在し、第１の配列バーコード若しくは第２の配列バーコード又はその両方は、ランダム配列とすることができ、又は標的ヌクレオチド配列識別配列、試料識別配列及び／又は標的列挙用分子バーコードを含むことができ、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ用プロモーター配列が第１のプローブ、第２のプローブ又は架橋オリゴ中に存在する。
【００８１】
第１の標的特異的部分、第２の標的特異的部分、第１の架橋オリゴ特異的配列及び／又は第２の架橋オリゴ特異的配列は、好ましくは、１個以上の化学修飾ヌクレオチドを互いに独立に含む。
【００８２】
第１のプローブと第２のプローブは、プローブのそれぞれの標的特異的セクションが標的配列上の本質的に隣接するセクションとハイブリッド形成すると連結して、連結プローブを与える。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、好ましくは複数の試料の貯蔵後に、複数の試料からの連結プローブの増幅に使用される。増幅産物は、さらに、１つ又は複数の識別配列を決定するためにハイスループット配列決定技術に供される。
【００８３】
好ましくは、第１のプローブの３'末端若しくは第２のプローブの５'末端又はその両方は、第１のプローブと第２のプローブの化学連結を可能にするように修飾される。
【００８４】
好ましくは、架橋オリゴは、第１のプローブの配列に相補的な配列若しくは第２のプローブの配列に相補的な配列又はその両方に１個以上の化学修飾ヌクレオチドを含む。
【００８５】
好ましくは、第１のプローブ、第２のプローブ又は架橋オリゴは、ウラシル特異的切り出し試薬を用いた切断によって直鎖化を可能にするデオキシウリジン部分を含む。
【００８６】
好ましくは、第１のプローブの３'末端若しくは第２のプローブの５'末端又はその両方は、第１のプローブと第２のプローブの化学連結を可能にするように修飾される。
【００８７】
好ましくは、第１のプローブ若しくは第２のプローブ又はその両方の架橋部分は、架橋オリゴとの結合を改善することができる化学修飾塩基を含む。
【００８８】
本発明の更なる一側面は、本発明の方法に使用されるキットに関する。キットは、本明細書に記載の第１のプローブ、第２のプローブ及び架橋オリゴを含む。本発明の特定の一効果は、独特のプローブ設計、すなわちプローブトリプレットを用いて目的の標的配列の検出及び増幅を可能にすることである。結合性の改善されたプローブが設計され、アッセイの特異性、感度及び精度が高くなる。本発明は、癌診断法又は胎児染色体異常に応用されるが、ＳＮＰ及び／又はインデルなどの１つ以上の配列及び／又は多形について１つ又は複数の試料の遺伝子型を同定することに限定されない。
【００８９】
特定の好ましい一実施形態においては、架橋オリゴは、試料を同定する情報を含み、独特の識別配列を含む。こうした場合においては、第１及び第２のプローブは、すべての試料に普遍的に適用可能である（かつ標的を同定する情報のみを含む）。好ましい一実施形態においては、したがって、各試料の標的配列の列挙を可能にする独特の配列を含むバーコードを架橋オリゴが含む、本発明に係る方法、キット又は使用が提供される。
実験の項
【００９０】
以下の実験は、本発明の様々な実施形態の例示を提供するが、本発明はこれらの実験に限定されない。
【００９１】
ケース１：進行肺癌の高齢者は、第一選択の処置として化学療法により前処置される。組織生検による腫瘍の分析は、化学療法及び患者の状態のために適用できない。したがって、患者の腫瘍から組織ＤＮＡを得る可能性はない。第二選択の処置の場合、Ｇｕａｒｄａｎｔ３６０液体生検が行われ、その結果に基づいて、患者は癌の標的処置を受ける。経過観察では、標的変異及び関連する耐性変異を追跡すべきである。処置費用は７０００ユーロ／月であり、使用薬物に対して起こり得る耐性の検出のためには週１回の試料が最適であろう。（急速なＴＡ時間の）個別化された標的変異分析をちょうど耐性発生時に非侵襲的に行うことができた場合、新しい広範囲な液体生検を考慮することができ、新しい標的薬物を考慮することができる。
【００９２】
耐性の発生したもはや効果のない薬物を除外する節減は、１〜３か月の処置で７〜２１０００ユーロである。さらに、次世代処置の選択肢の利点がより速く得られ、疾患の結果を改善することができる。
【００９３】
ケース２：母体血における胎児染色体のトリソミーを検出する多重連結アッセイ。
【００９４】
各関連遺伝子が、典型的な変異を検出することができる複数のプローブによって標的にされる。複数のプローブを使用することによって、複数の遺伝子の変異体の割合を定量的に確認することができる。一般に、１０種の連結複合体が、母体血からの胎児染色体異常の検出のために各染色体を標的にする。１０種のプローブの使用は、各染色体で１０種の独立した複製をもたらす。１組の複数の連結複合体が重要な変異を検出する。複製染色体カウントデータが、染色体標的の標準偏差パターンからの有意な偏差を検出するために統計学的ツールを用いて分析される。染色体標的の標準偏差パターンからの偏差によって、欠失（ウィリアムズ症候群など）及びトリソミー（パトー、エドワーズ、ダウン症候群など）を確認することができる。
【００９５】
ケース３：癌患者の循環ＤＮＡ中の腫瘍学的に関連する変異を検出する多重連結アッセイ。
【００９６】
癌患者由来の循環ＤＮＡ中の腫瘍学的に関連する遺伝子変異を検出する場合、各関連遺伝子が、癌タイプに典型的な変異を検出することができる複数の連結複合体によって標的にされる。多重連結アッセイによって、複数の遺伝子の変異体の割合を定量的に確認することができる。
【００９７】
ケース４：糞便又は廃水試料中の多剤耐性遺伝子を検出し、定量化する多重連結アッセイ。
【００９８】
糞便又は廃水材料から抽出されたＤＮＡ中の抗生物質耐性遺伝子を検出する場合、各抗生物質耐性遺伝子が複数の特異的連結複合体によって標的にされる。標的遺伝子１個当たり数個の異なる連結複合体を使用すると、各遺伝子に対して独立した技術的複製が得られる。この複製カウントデータを統計学的ツールで分析して、多数の試料中の多数の抗生物質耐性遺伝子のコピー数を定量化する。
図面の詳細な説明
【００９９】
図１に、本発明の一実施形態のワークフローを示す。ステップ１においては、試料から抽出した核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）（１０２）を１組の連結複合体（１０４）と接触させる。連結複合体を標的核酸（１０６）上でアニールする。ステップ２においては、アニールされた連結複合体を連結し、連結された連結複合体（１０８）を得る。ステップ３においては、複数の試料からの連結された連結複合体（１１０）を一緒に貯蔵する（１１２）。ステップ４においては、連結された連結複合体からＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡ（１１４）を合成する。プローブ及び試料ＤＮＡをエンドヌクレアーゼとエキソヌクレアーゼの混合物を用いて除去してもよい。ステップ５においては、ＲＮＡをｃＤＮＡ（１１６）に変換し、ＰＣＲ又はエマルジョンＰＣＲによって任意選択で増幅する。ステップ６においては、増幅されたＤＮＡを次世代ＤＮＡ塩基配列決定法によって配列決定する。ステップ７においては、ＤＮＡ塩基配列決定結果を生物情報学パイプラインによって標的カウントに変換する。
【０１００】
図２Ａは、本明細書の一実施形態に係る複数のプローブ体を有するプローブトリプレットの原理構造を示す。複数のプローブ体は、試料アニーリング前に組み立てられる左プローブ、右プローブ及び架橋オリゴを含む。左プローブの最初の塩基は、修飾１（２００）と称される、酵素連結のためのリン酸部分又は隣接プローブの５'末端への化学連結を可能にする修飾を任意選択で含む。左プローブの１５〜２５塩基は、架橋部位１と称される、効率的架橋オリゴ結合のための化学修飾塩基を更に含む架橋結合配列１（２０２）を含む。上述のセグメントは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの逆相補配列も任意選択で含む。上述したように、異なる試料における標的配列の列挙のためのすべての必要情報をＴ７ＲＮＡポリメラーゼが転写することができるように架橋オリゴ並びに第１のプローブ及び第２のプローブが設計されたとすれば、このプロモーター配列は、架橋オリゴ中の代わりに、第１のプローブ又は第２のプローブ中に存在してもよい。左プローブの次の１５〜３０塩基は、汎用部位１（２０４）と本明細書で称されるＰＣＲプライマー用の汎用結合部位を任意選択で含む。さらに、左プローブは、バーコード１（２０６）と称される分子特異的バーコード又は試料特異的バーコードを形成するランダムヌクレオチドのセグメントを含む５'末端から次の１０〜２０塩基を任意選択で含む。さらに、左プローブは、遺伝子標的に結合する５'末端から次の１５〜３０塩基も含む（２０８）。２０２又は２０８のヌクレオチドの一部又はすべては、標的又は架橋オリゴ（２２６）に対するプローブの親和性を高める化学修飾を含むことができる。左プローブの最後の塩基は、修飾１（２１０）と称される、酵素連結のためのリン酸部分又は隣接プローブの５'末端への化学連結を可能にする修飾を任意選択で含む。
【０１０１】
右プローブの最初の塩基は、修飾２（２１２）と称される、酵素連結のためのリン酸部分又は隣接プローブの５'末端への化学連結を可能にする修飾を任意選択で含む。右プローブの５'末端から１５〜３０塩基は、遺伝子標的に結合する右プローブの一部を含む（２１４）。右プローブの５'末端から次の１０〜２０塩基は、バーコード２（２１６）と称される分子特異的バーコード又は試料特異的バーコードを形成するランダムヌクレオチドのセグメントを任意選択で含む。右プローブの５'末端から次の１５〜３０塩基は、汎用部位２（２１８）と称されるＰＣＲプライマー用の汎用結合部位を任意選択で含む。右プローブの最後の１５〜２５塩基は、架橋配列２（２２０）と称される効率的架橋オリゴ結合のためのアンカー配列を含む。上述のセグメントは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの逆相補配列も任意選択で含む。上述したように、異なる試料における標的配列の列挙のためのすべての必要情報をＴ７ＲＮＡポリメラーゼが転写することができるように架橋オリゴ並びに第１のプローブ及び第２のプローブが設計されたとすれば、このプロモーター配列は、架橋オリゴ中の代わりに、第１のプローブ又は第２のプローブ中に存在してもよい。２１４又は２２０のヌクレオチドの一部又はすべては、標的又は架橋オリゴ（２２４）に対するプローブの親和性を高める化学修飾を含むことができる。右プローブの最後の塩基は、修飾２（２２２）と称される、酵素連結のためのリン酸部分又は隣接プローブの５'末端への化学連結を可能にする修飾を任意選択で含む。
【０１０２】
架橋配列３（２２６）と称される架橋オリゴの５'末端から最初の１５〜２５塩基は、左プローブの架橋配列１（２０２）に逆相補的であり、結合増強のための化学修飾ヌクレオチドを任意選択で含む。架橋配列４（２２４）と称される架橋オリゴの次の１５〜２５塩基は、右プローブの架橋配列２配列（２２０）に逆相補的であり、結合増強のための化学修飾ヌクレオチドを任意選択で含む。架橋配列３（２２６）又は架橋配列４（２２４）は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの配列を任意選択で含む。
【０１０３】
図２Ｂは、本明細書の一実施形態に係る第１のプローブと第２のプローブの間を満たすギャップを示す。ここで、架橋オリゴは、架橋配列３（２２６）と架橋配列４（２２４）の間にギャップ配列（２２８）を含む。ギャップ配列（２２８）は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの配列を任意選択で含む。左プローブと右プローブの間のギャップは、ポリメラーゼ及び１個以上のヌクレオチドを導入することによって充填される。このプロセスでは、Ｓｔｏｆｆｅｌ断片、Ｔａｑポリメラーゼ又はＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼを使用することができる。ポリメラーゼは、（ａ）汎用架橋オリゴ配列に相補的なヌクレオチド及び（ｂ）標的配列に相補的なヌクレオチドを付加し、それによって第１のプローブと第２のプローブの間の２つのギャップ、すなわちギャップ１とギャップ２を充填して、架橋オリゴに相補的な左プローブと右プローブを連結する。こうした方法においては、架橋オリゴ中の位置２２８にバーコードが存在する場合、バーコードは相補配列に組み込まれる。プローブ１若しくはプローブ２及び／又は標的配列２０８及び２１４中にバーコードが存在する場合、バーコードが架橋オリゴに組み込まれるように、架橋オリゴプローブ２２４が、連結プローブに相補的な５'部位又は３'部位から伸長し、それによって１個以上の連結された連結複合体が形成されてもよい。しかし、ポリメラーゼの作用が標的配列の部位において第１のプローブと第２のプローブの連結を妨げないことに注意すべきである。例えば、標的配列とハイブリッド形成する第１のプローブ及び第２のプローブの部分に例えば存在する二本鎖ＤＮＡ部分にポリメラーゼが到達するとその作用を停止するポリメラーゼを使用することができる。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列は、連結複合体中の架橋オリゴの位置２２６、２２８又は２２４中に埋め込むことができる。デオキシウリジン部分は、左プローブの位置２０４と２０６の間又は２０６内に埋め込むことができる。
【０１０４】
図３は、標的との結合を改善する、又は化学連結を可能にする、プローブ修飾例の略図である。標的結合を改善する化学修飾としては、リボ核酸、ペプチド核酸及び／又はロックド核酸が挙げられるが、それらに限定されない。化学連結を可能にする化学修飾としては、銅によって触媒される付加環化において結合することができる５'−アジド３'−アルキン修飾が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１０５】
図４は、染色体標的の標準偏差パターンからの有意な偏差を検出するために統計学的ツールを用いた複製染色体のカウントデータの分析の概要である。複数の試料における複数の遺伝子標的（４０４）のプロファイリングを複数の標的特異的連結複合体混合物（４０２）を用いて行う。さらに、複数の遺伝子標的４０４は、母体血から抽出した核酸を含む。複数のプローブは、典型的な変異を検出することができる各関連遺伝子を標的にする。一般に、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１００、より好ましくは少なくとも５００、最も好ましくは少なくとも１０００種のプローブが、母体血からの胎児染色体異常の検出のための各染色体を標的にする。少なくとも１０種のプローブの使用は、各染色体で少なくとも１０種の独立した複製をもたらす。１組の複数のプローブは、特定の変異を検出する。複製染色体カウントデータが、染色体標的の標準偏差パターンからの有意な偏差を検出するために統計学的ツールを用いて分析される。染色体標的の標準偏差パターンからの偏差によって、ウィリアムズ症候群などの欠失及びパトー、エドワーズ、ダウン症候群などのトリソミーを確認することができる。
【０１０６】
図５は、１組の標的特異的連結複合体混合物（５０２）を複数の遺伝子標的（５０４）と混合することによって、複数の遺伝子の変異体の割合を定量的に確認する概要である。複数の遺伝子標的（５０４）は、患者の血漿から抽出した核酸（ＤＮＡ）を含む。極めて多数の試料における複数の遺伝子標的（５０４）のプロファイリングを複数の標的特異的連結複合体混合物（５０２）を用いて行う。各関連遺伝子が、典型的な変異を検出することができる複数の異なるプローブによって標的にされる。複数の遺伝子標的（５０４）のプロファイリングの場合、２０種のプローブが各遺伝子を標的にして、癌患者由来の循環ＤＮＡ中の腫瘍学的に関連する変異を検出する。
【０１０７】
図６は、本明細書の一実施形態に係る多重連結依存性プローブ増幅のフローチャートである。ステップ６０４においては、（標的）核酸ＤＮＡ／ＲＮＡが２個以上の試料から抽出される。こうした試料は、生検材料、唾液及び他の分泌物、呼気水分抽出物、組織、血漿（液体生検材料）を含めた人体から前もって得ることができ、２個以上の試料を水、廃水、土壌などを含めた環境から得ることができる。ステップ６０６においては、試料の各々に、連結複合体が用意される。連結複合体は、左プローブ、右プローブ及び架橋オリゴプローブを含む。ステップ６０８においては、標的試料を連結複合体と混合して、自己アニーリング可能にする。任意選択のステップ６１０においては、第１のプローブと第２のプローブの間でギャップを充填してもよく、さらに、環状に連結された連結複合体が形成されるように架橋オリゴプローブ伸長をポリメラーゼ酵素を用いて行ってもよい。これは、例えば、プローブトリプレットが組み立てられるとき、又は結合した標的特異的部分が伸長及び連結されるときに起こり得る。ステップ６１２においては、環状に連結された連結複合体が形成されるように、連結複合体がリガーゼ酵素を用いて連結される。ステップ６１４においては、複数のこうした連結された連結複合体が複数の試料セットから貯蔵される。任意選択のステップ６１６においては、任意選択のウラシル特異的切り出し試薬を添加して、環状に連結された連結複合体の切断によって直鎖化を促進する。ステップ６１８においては、連結された連結複合体の架橋オリゴ配列（又は第１若しくは第２のプローブ）上のＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター部位に結合するＴ７ＲＮＡポリメラーゼを添加して、ＲＮＡを転写する。任意選択のステップ６２０においては、ＤＮＡ特異的エキソヌクレアーゼ及びエンドヌクレアーゼを反応混合物に添加して、遊離試料及びプローブを除去する。ステップ６２２においては、ｃＤＮＡをＲＮＡから逆転写プロセスによって合成する。任意選択のステップ６２４においては、ｃＤＮＡは、ＰＣＲ又はエマルジョンＰＣＲによって増幅される。ステップ６２６においては、配列決定がハイスループット配列決定によって行われる。
【０１０８】
添付の特許請求の範囲によって規定される本開示の範囲から逸脱することなく、上に記載の本開示の実施形態の改変が可能である。 
【図１】
2020532970.tif 000003
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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2020532970.tif 000011