(57)【要約】  細胞老化及び悪性形質転換に同時に抵抗するヒト多能性幹細胞の製造方法を提供する。ゲノム編集技術によりNRF2タンパク質の82位のグルタミン酸をグリシンに突然変異させ、ストレス抵抗性が向上した遺伝子強化型幹細胞が得られ、体内・体外実験により、当該幹細胞が、ストレス及び細胞老化に抵抗でき、より好ましい組織修復機能及び悪性腫瘍形成・形質転換の抵抗能を有することが証明された。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（1）体外でのヒト多能性幹細胞におけるNRF2タンパク質の82位のグルタミン酸をグリシンに突然変異させ、NRF2遺伝子強化型の多能性幹細胞を得る工程と、
（2）前記NRF2遺伝子強化型の多能性幹細胞を指向性誘導分化させ、NRF2遺伝子強化型の間葉幹細胞を得る工程と、
を含む間葉幹細胞の製造方法。
【請求項２】
工程（1）において、前記体外でのヒト多能性幹細胞におけるNRF2タンパク質の82位のグルタミン酸をグリシンに突然変異させる方法は、NRF2遺伝子の245位の塩基Aを塩基Gに突然変異させることであることを特徴とする請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記NRF2遺伝子の245位の塩基Aを塩基Gに突然変異させる方法は、部位特異的ゲノム編集であることを特徴とする請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記部位特異的ゲノム編集方法は、ZFN編集、TALEN編集、CRISPR/Cas9編集又はHdADVが媒介する部位特異的編集であることを特徴とする請求項3に記載の方法。
【請求項５】
前記部位特異的ゲノム編集方法は、HdADVが媒介する部位特異的編集であることを特徴とする請求項4に記載の方法。
【請求項６】
工程（2）において、前記指向性誘導分化方法は、
（b1）NRF2遺伝子強化型の多能性幹細胞を胚様体分化させ、胚様体を得る工程と、
（b2）前記胚様体を線維細胞が現れるまで培養し、さらに継代培養し、そのうちCD73、CD90、CD105がいずれも陽性である細胞群、即ち、前記NRF2遺伝子強化型の間葉幹細胞を選別する工程と、
を含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
【請求項７】
前記ヒト多能性幹細胞は、ヒト胚性幹細胞又はヒト誘導多能性幹細胞であることを特徴とする請求項6に記載の方法。
【請求項８】
前記ヒト胚性幹細胞は、ヒト胚性幹細胞H9細胞株であることを特徴とする請求項7に記載の方法。
【請求項９】
請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法により製造されたNRF2遺伝子強化型の間葉幹細胞。
【請求項１０】
請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法により製造されたNRF2遺伝子強化型の多能性幹細胞。
【請求項１１】
請求項9に記載のNRF2遺伝子強化型の間葉幹細胞又は請求項10に記載のNRF2遺伝子強化型の多能性幹細胞の次のc1）〜c5）のいずれかへの応用。
c1）細胞老化の抵抗及び/又は遅延、
c2）腫瘍発生の抵抗、
c3）悪性腫瘍形成・形質転換の抵抗、
c4）細胞移植治療、
c5）損傷した血管の再生及び/又は修復。
【請求項１２】
請求項9に記載のNRF2遺伝子強化型の間葉幹細胞又は請求項10に記載のNRF2遺伝子強化型の多能性幹細胞の次のd1）〜d5）のいずれかへの応用。
d1）細胞老化に抵抗し、及び/又はそれを遅延させる製品の製造、
d2）腫瘍発生に抵抗する製品の製造、
d3）悪性腫瘍形成・形質転換に抵抗する製品の製造、
d4）細胞移植治療用製品の製造、
d5）損傷した血管を再生及び/又は修復する製品の製造。
【請求項１３】
請求項9に記載のNRF2遺伝子強化型の間葉幹細胞を活性成分とし、
機能が次のm1）〜m5）のいずれかである製品。
m1）細胞老化の抵抗及び/又は遅延、
m2）腫瘍発生の抵抗、
m3）悪性腫瘍形成・形質転換の抵抗、
m4）細胞移植治療、
m5）損傷した血管の再生及び/又は修復。
【請求項１４】
前記細胞老化の抵抗及び/又は遅延は、次のn1）〜n6）のいずれかで表現されることを特徴とする請求項11又は12に記載の応用、又は請求項13に記載の製品。
n1）外来刺激物による刺激下で細胞の活力が向上すること、
n2）体外で連続して継代培養する過程においてより強い増殖能を発現すること、
n3）有害代謝物を除去する能力が向上すること、
n4）細胞老化に関連する遺伝子の発現レベルが低下すること、
n5）より完全な細胞核構造を有すること、
n6）人又は動物の体内での滞在期間がより長いこと。
【請求項１５】
前記悪性腫瘍形成・形質転換の抵抗は、次のe1）〜e3）のいずれかで表現されることを特徴とする請求項11又は12に記載の応用、又は請求項13に記載の製品。
e1）腫瘍化細胞の増殖能が低下すること、
e2）腫瘍形成に関連する足場非依存性増殖能が低下すること、
e3）体内で腫瘍を形成させる能力が低下すること。
【請求項１６】
前記細胞移植治療は、細胞移植修復治療であることを特徴とする請求項11又は12に記載の応用、又は請求項13に記載の製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジーの分野に属しており、細胞老化及び悪性形質転換に同時に抵抗するヒト多能性幹細胞の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞移植治療は、近年再生医学の分野で最も見通しと潜在力がある発展方向となっている。細胞移植は、体内での、疾患又は老化等の因子によりもともと消耗された、又は正常な機能が失われた細胞を補充又は代替することを目的とし、移植された細胞は、体内で生存し正常な機能を発揮し、組織内の安定状態を回復させ、さらに組織修復と再生を実現する。細胞移植治療は既に、例えば、骨髄幹細胞移植による白血病の治療等で極めて好ましい治療効果を発現しているにもかかわらず、より広い応用は、依然として多くの問題による挑戦に臨んでいる。現在、細胞移植治療を制限する要因は、有効性と安全性の両方に集中する。
【０００３】
細胞移植治療の有効性は、主に、移植物の移植する前の品質、及び体内に入った後生存して組み込まれて再生機能を発揮することができるか否かによる。一方、移植物は、体外で培養する過程において一定の「寿命」があり、具体的には、複製ストレスに連続的に影響され、有限の連続継代をした後、速やかに細胞老化（cellular senescence）状態になり、増殖が停止し機能が失われる。他方、細胞移植の箇所は、通常、疾患又は老化にある組織微小環境に位置しており、そのうちの炎症性因子、有害代謝生成物等は、外来移植物に損害を与えてしまう。以上の両方のいずれによっても、細胞に深刻な機能的衰退が発生し、移植効率を低下させる。細胞移植治療の安全性は、主に、長期間移植後の腫瘍形成リスクに集中する。細胞移植物は、病体でストレスに連続的に脅迫されて、ゲノムが極めて不安定になる可能性があり、癌遺伝子又は癌抑制遺伝子が突然変異すると、癌になる可能性があり、安全に脅威をもたらす。
【０００４】
如何に所定の介入手段により細胞移植治療の効率を向上させ、腫瘍形成リスクをできるだけ低下させるかは、従来から、再生医学を広く応用できる決定的な課題である。しかしながら、これまで、この技術的ボトルネックを克服できる簡単で有効な方法がまだ開発されていない。現在、細胞移植効果を向上させる試みは、主に、移植箇所の微小環境の改善と、移植物の「ストレス抵抗」特性の強化との両方に集中している。多くの研究では、細胞が正常な機能を発揮するのに不利な病体微小環境に対して外来の「栄養と保護因子」を補充することにより移植効果を改善するが、当該方法では、短時間の移植環境改善ができ、移植再発等の予後不良問題が目立っている。これに対して、所定の方法により移植物の「内因」を改善し、即ち、移植材料本体固有のストレス抵抗能を強化させることで移植効果の改善を実現することは、より直接で持続的な手段である。現在、少数の研究によると、レンチウイルス又はレトロウイルスベクターによりストレス抵抗関連タンパク質を導入し、細胞内の所定の信号経路又は遺伝子発現を調節し、細胞のストレスへの抵抗を強化させ、さらに細胞移植治療効果の向上を実現することができる。一連の臨床前研究により、細胞固有のストレス抵抗性を向上させる実行可能性が証明されたが、組込み型ウイルスベクターが媒介する遺伝子調節には、必ずゲノムのランダム組込みがあり、遺伝子の突然変異リスクが大きくなり、安全性が懸念され、臨床上の応用価値を大きく弱める。
【０００５】
遺伝子標的編集技術の発展により、細胞移植治療の発展を大きく推進する。この技術により、ゲノム上の遺伝暗号を精確に編集できるようになり、現在、遺伝子標的編集技術により疾患細胞の病因性突然変異を矯正する大量の事例が報告されている。機能が正常に回復した遺伝子矯正細胞は、体外で増幅されることにより、自家移植に使用でき、細胞移植治療に最適な材料である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の1つの目的は、細胞老化及び悪性形質転換に同時に抵抗するNRF2遺伝子強化型の間葉幹細胞の製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明で提供される間葉幹細胞の製造方法は、
（1）体外でのヒト多能性幹細胞におけるNRF2タンパク質の82位のグルタミン酸をグリシンに突然変異させて、NRF2遺伝子強化型の多能性幹細胞を得る工程と、
（2）前記NRF2遺伝子強化型の多能性幹細胞を指向性誘導分化させ、NRF2遺伝子強化型の間葉幹細胞を得る工程と、を含む。
【０００８】
前記方法では、工程（1）において、上述した体外でのヒト多能性幹細胞におけるNRF2タンパク質の82位のグルタミン酸をグリシンに突然変異させる方法は、NRF2遺伝子の245位の塩基Aを塩基Gに突然変異させることである。前記遺伝子の245位は、NRF2遺伝子コード領域の245位である。
【０００９】
前記方法では、上述したNRF2遺伝子の245位の塩基Aを塩基Gに突然変異させる方法は、部位特異的ゲノム編集である。
【００１０】
前記方法では、前記部位特異的ゲノム編集の方法は、ZFN編集、TALEN編集、CRISPR/Cas9編集又はHdADVが媒介する部位特異的編集であってもよい。
【００１１】
前記方法では、前記部位特異的ゲノム編集の方法は、HdADVが媒介する部位特異的編集である。
【００１２】
本発明の実施例において、前記HdADVが媒介する部位特異的編集は、次の方法により実現できる。
【００１３】
ステップ1、突然変異断片を得る
ヒトゲノムのNRF2遺伝子の1と2番目のイントロン（intron1-exon2-intron2）の遺伝子断片における、NRF2遺伝子に対応するcDNA配列の245位のヌクレオチドサイトを、野生型の塩基Aから塩基Gに突然変異させるとともに、他の配列が変わらないようにすることにより、突然変異後の断片を得る。
【００１４】
ステップ2、ウイルス発現プラスミドを構築する
前記突然変異後の断片をpCIHDAdGT8-4ベクターのAscIとSpeI制限酵素切断サイトに挿入し、組換えプラスミドを得る。
【００１５】
ステップ3、ウイルス発現プラスミドとヘルパープラスミドをパッケージング細胞に同時トランスフェクションさせて、組換えアデノウイルス粒子を得る
PI-SceI（NEB）により前記組換えプラスミドを酵素切断し、線状化プラスミドを得、前記線状化プラスミドをヘルパーウイルスAdHPBGF35とともにパッケージング細胞に導入して組換えアデノウイルスのパッケージングを行い、組換えアデノウイルス粒子を得る。前記パッケージング細胞は、具体的には、ヒト胚性腎細胞株293由来の細胞株116の細胞である。
【００１６】
ステップ4、組換えアデノウイルス粒子で目的細胞を感染させる
組換えアデノウイルス粒子によりヒト多能性幹細胞を感染させ、スクリーニングにより、1つのNRF2対立遺伝子上のサイトが正確に編集された細胞を得、NRF2AG/+hESC細胞と表記する。
【００１７】
ステップ5、前記線状化プラスミドと前記ヘルパーウイルスAdHPBGF35を前記NRF2AG/+hESC細胞に同時に導入し、再びゲノム編集を行い、編集後の細胞を同定し、2つのNRF2対立遺伝子上のサイトが正確に編集された細胞、即ち、NRF2遺伝子強化型の多能性幹細胞を得る。
【００１８】
前記方法では、工程（2）において、前記指向性誘導分化方法は、
（b1）NRF2遺伝子強化型の多能性幹細胞を胚様体分化させ、胚様体を得る工程と、
（b2）前記胚様体を線維細胞が現れるまで培養し、さらに継代培養し、そのうちCD73、CD90、CD105がいずれも陽性である細胞群、即ち、前記NRF2遺伝子強化型の間葉幹細胞を選別する工程と、を含む。
【００１９】
前記方法では、前記胚様体分化の具体的な方法としては、300〜500個の細胞を含有し、大きさが均一なNRF2AG/AGhESCクローンを準備し、室温PBSで一回洗浄し、Dispaseで37℃で20〜30min消化させる。ESCクローンが球体を形成した後、CDF12培地により再懸濁させ、その後、低接着培養プレート（Corning社、品番3471）に加え、37℃、5%CO2の条件で1〜3日培養した後、胚様体を形成する。
【００２０】
前記胚様体を線維細胞が現れるまで培養する具体的な方法としては、前記胚様体をマトリゲルで被覆された6ウェルプレートに播種して培養し、線維細胞が現れるまで2週間培養し続ける。
【００２１】
前記方法では、前記ヒト多能性幹細胞は、ヒト胚性幹細胞又はヒト誘導多能性幹細胞である。
【００２２】
前記方法では、前記ヒト胚性幹細胞は、具体的には、ヒト胚性幹細胞H9細胞株である。
【００２３】
本発明の他の目的は、前記方法により製造されたNRF2遺伝子強化型の間葉幹細胞を提供することである。
【００２４】
前記方法により製造されたNRF2遺伝子強化型の多能性幹細胞も、本発明の保護範囲に属している。
【００２５】
本発明のさらに他の目的は、前記NRF2遺伝子強化型の間葉幹細胞又は前記NRF2遺伝子強化型の多能性幹細胞の新規な用途を提供することである。
【００２６】
本発明は、前記NRF2遺伝子強化型の間葉幹細胞又は前記NRF2遺伝子強化型の多能性幹細胞の次のc1）〜c5）のいずれかへの応用を提供する。
c1）細胞老化の抵抗及び/又は遅延、
c2）腫瘍発生の抵抗、
c3）悪性腫瘍形成・形質転換の抵抗、
c4）細胞移植治療、
c5）損傷した血管の再生及び/又は修復。
【００２７】
本発明は、さらに、前記NRF2遺伝子強化型の間葉幹細胞又は前記NRF2遺伝子強化型の多能性幹細胞の次のd1）〜d5）のいずれかへの応用を提供する。
d1）細胞老化に抵抗し、及び/又はそれを遅延させる製品の製造、
d2）腫瘍発生に抵抗する製品の製造、
d3）悪性腫瘍形成・形質転換に抵抗する製品の製造、
d4）細胞移植治療用製品の製造、
d5）損傷した血管を再生及び/又は修復する製品の製造。
【００２８】
本発明の最後の目的は、製品を提供することである。
【００２９】
本発明で提供される製品は、前記NRF2遺伝子強化型の間葉幹細胞を活性成分とし、
機能が次のm1）〜m5）のいずれかである。
m1）細胞老化の抵抗及び/又は遅延、
m2）腫瘍発生の抵抗、
m3）悪性腫瘍形成・形質転換の抵抗、
m4）細胞移植治療、
m5）損傷した血管の再生及び/又は修復。
【００３０】
前記応用又は前記製品において、
前記細胞老化の抵抗及び/又は遅延は、次のn1）〜n6）のいずれかで表現される。
n1）外来刺激物による刺激下で細胞の活力が向上すること、
n2）体外で連続して継代培養する過程においてより強い増殖能を発現すること、
n3）有害代謝物を除去する能力が向上すること、
n4）具体的には、p16遺伝子、p21遺伝子及びGATA4遺伝子である、細胞老化に関連する遺伝子の発現レベルが低下すること、
n5）より完全な細胞核構造を有すること、
n6）人又は動物の体内での滞在期間がより長いこと。
【００３１】
前記応用又は前記製品において、
前記悪性腫瘍形成・形質転換の抵抗は、次のe1）〜e3）のいずれかで表現される。
e1）腫瘍化細胞の増殖能が低下すること、
e2）腫瘍形成に関連する足場非依存性増殖能が低下すること、
e3）体内で腫瘍を形成させる能力が低下すること。
前記応用又は前記製品において、前記細胞移植治療は、細胞移植修復治療である。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１Ａ】本発明ではストレス抵抗性遺伝子NRF2の単一のサイトで編集された多能性幹細胞を生じ、これにより遺伝子強化型間葉幹細胞が誘導される場合であり、この細胞におけるNRF2活性が継続的に活性化される。図1Aは、ゲノム編集の模式図である。
【図１Ｂ】本発明ではストレス抵抗性遺伝子NRF2の単一のサイトで編集された多能性幹細胞を生じ、これにより遺伝子強化型間葉幹細胞が誘導される場合であり、この細胞におけるNRF2活性が継続的に活性化される。図1Bは、NRF2遺伝子A245Gサイトのシーケンシング結果である。
【図１Ｃ】本発明ではストレス抵抗性遺伝子NRF2の単一のサイトで編集された多能性幹細胞を生じ、これにより遺伝子強化型間葉幹細胞が誘導される場合であり、この細胞におけるNRF2活性が継続的に活性化される。図1Cは、得られた多能性幹細胞の形態及び体内での三胚葉分化の免疫蛍光同定である。
【図１Ｄ】本発明ではストレス抵抗性遺伝子NRF2の単一のサイトで編集された多能性幹細胞を生じ、これにより遺伝子強化型間葉幹細胞が誘導される場合であり、この細胞におけるNRF2活性が継続的に活性化される。図1Dは、多能性幹細胞での幹性遺伝子の発現状況である。
【図１Ｅ】本発明ではストレス抵抗性遺伝子NRF2の単一のサイトで編集された多能性幹細胞を生じ、これにより遺伝子強化型間葉幹細胞が誘導される場合であり、この細胞におけるNRF2活性が継続的に活性化される。図1Eは、分化して得られたMSCにおける、MSCに関連する或いは関連していない表面マーカーの同定状況である。
【図１Ｆ】本発明ではストレス抵抗性遺伝子NRF2の単一のサイトで編集された多能性幹細胞を生じ、これにより遺伝子強化型間葉幹細胞が誘導される場合であり、この細胞におけるNRF2活性が継続的に活性化される。図1Fは、MSCにおけるNRF2タンパク質の細胞核内外での含有量分析である。
【図１Ｇ】本発明ではストレス抵抗性遺伝子NRF2の単一のサイトで編集された多能性幹細胞を生じ、これにより遺伝子強化型間葉幹細胞が誘導される場合であり、この細胞におけるNRF2活性が継続的に活性化される。図1Gは、NRF2の下流の標的遺伝子のmRNAレベルである。
【図１Ｈ】本発明ではストレス抵抗性遺伝子NRF2の単一のサイトで編集された多能性幹細胞を生じ、これにより遺伝子強化型間葉幹細胞が誘導される場合であり、この細胞におけるNRF2活性が継続的に活性化される。図1Hは、NRF2及びその肝心な下流の標的遺伝子NQO1とHO-1のタンパク質の発現状況である。
【図２Ａ】遺伝子強化型間葉幹細胞のストレス及び細胞老化抵抗特性である。図2Aは、外来刺激物の処理下での細胞の活力の検出である。
【図２Ｂ】遺伝子強化型間葉幹細胞のストレス及び細胞老化抵抗特性である。図2Bは、MSC増殖曲線である。
【図２Ｃ】遺伝子強化型間葉幹細胞のストレス及び細胞老化抵抗特性である。図2Cは、SA-β-Gal染色結果である。
【図２Ｄ】遺伝子強化型間葉幹細胞のストレス及び細胞老化抵抗特性である。図2Dは、活性酸素の含有量の検出である。
【図２Ｅ】遺伝子強化型間葉幹細胞のストレス及び細胞老化抵抗特性である。図2Eは、老化に関連するマーカーの発現状況の結果である。
【図２Ｆ】遺伝子強化型間葉幹細胞のストレス及び細胞老化抵抗特性である。図2Fは、細胞増殖に関連するマーカーKi67の検出である。
【図２Ｇ】遺伝子強化型間葉幹細胞のストレス及び細胞老化抵抗特性である。図2Gは、核膜の完全性の検出である。
【図３Ａ】遺伝子強化型間葉幹細胞の悪性形質転換抵抗特性である。図3Aは、体外での悪性形質転換の模式図である。
【図３Ｂ】遺伝子強化型間葉幹細胞の悪性形質転換抵抗特性である。図3Bは、悪性形質転換後のMSCの足場非依存性増殖状況である。
【図３Ｃ】遺伝子強化型間葉幹細胞の悪性形質転換抵抗特性である。図3Cは、悪性形質転換後のMSCの体内での腫瘍形成能である。
【図３Ｄ】遺伝子強化型間葉幹細胞の悪性形質転換抵抗特性である。図3Dは、マウスの腫瘍形成部分の横縦方向切片の染色同定である。
【図４Ａ】遺伝子強化型間葉幹細胞を移植して後肢虚血モデルの血流回復に応用する実例である。図4Aは、MSCの筋肉微小環境での滞在能である。
【図４Ｂ】遺伝子強化型間葉幹細胞を移植して後肢虚血モデルの血流回復に応用する実例である。図4Bは、各匹の後肢虚血マウスの血流回復状況である。
【図４Ｃ】遺伝子強化型間葉幹細胞を移植して後肢虚血モデルの血流回復に応用する実例である。図4Cは、異なる時点でのマウスの脚部の代表的な写真である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
下記実施例で用いられる実験方法は、特に断りがない限り、いずれも常法である。
【００３４】
下記実施例で用いられる材料、試薬等は、特に断りがない限り、いずれも商業的に得ることができる。
【実施例】
【００３５】
下記実施例における定量試験については、いずれも繰り返し実験を三回設定し、平均値を結果とする。
【００３６】
1、下記実施例における培地の処方は以下のとおりである。
（1）CDF12培地の処方：
DMEM/F12培地（インビトロジェン、11320-033）、
0.1mM非必須アミノ酸（インビトロジェン、11140-050）、
1mM GlutaMAX（インビトロジェン、35050-061）、
20%（容量%での含有量）Knockout血清代替物（インビトロジェン、N10828-028）、
1%（1g/100ml）ペニシリン/ストレプトマイシン（インビトロジェン、15070-063）、
55μM β-メルカプトエタノール（インビトロジェン、21985-023）、
10ng/mlヒトFGF2（Joint Protein Central）。
【００３７】
（2）間葉幹細胞（MSC）の培地の処方：
MEM培地（インビトロジェン、12571071）、
10%（容量%での含有量）ウシ胎児血清（インビトロジェン、10091148）、
1%（1g/100ml）ペニシリン/ストレプトマイシン（インビトロジェン、15070-063）、
10ng/ml組換えヒト線維芽細胞増殖因子（JPC、bFGF）、
MSC分化培地に5ng/ml TGFβ（Humanzyme、HZ1131）を追加して添加した。
【００３８】
2、細胞株は以下のとおりである。
ヒト胚性幹細胞H9細胞株：WiCell社製、品番：WA09（H9）-DL-7。
ヒト胚性腎細胞293T：ATCCから購入、品番CRL-3216。
【００３９】
3、ヒト胚性幹細胞H9細胞株の培養方法は以下のとおりである。
（1）H9細胞を、マイトマイシン（米国Sigma社製、品番：M0503）で不活性化されたマウス胚線維芽細胞（米国インビトロジェン社製、品番：S1520-100）を予め培養した培養用プレートに播種し、ヒト胚性幹細胞培地（CDF12培地）によりマウス胚線維芽細胞とともに培養した。
【００４０】
（2）H9細胞を、予め細胞外マトリックス（qualified-Matrigel、米国BD Biosciences製、品番：354277）で被覆された培養用プレートに播種し、mTeSR培地（米国StemCell Technologies製）により培養した。
【００４１】
4、ウイルスパッケージングで用いられる生物材料は以下のとおりである。
（1）組換えアデノウイルスパッケージングで用いられる生物材料は以下のとおりである。
pCR2.1-TOPOベクター：インビトロジェン社製。
ヘルパーアデノウイルスベクターであるpCIHDAdGT8-4ベクター：詳細は、「An HSV amplicon-based helper system for helper-dependent adenoviral vectors. Shuji Kubo, et al. BBRC. 2003. 307（4）：826-830」を参照し、原文の作者又は中国科学院生物物理研究所から取得することができる。
トランスフェクションされるヒト胚性腎細胞株293由来の細胞株116の細胞：詳細は、「Improved system for helper-dependent adenoviral vector production. Palmer D. and Ng P. Molecular Therapy. 2003. 8（5）：846-52.」を参照し、原文の作者又は中国科学院生物物理研究所から取得することができる。
ヘルパーアデノウイルスAdHPBGF35：詳細は、「Genome Size and Structure Determine Efficiency of Postinternalization Steps and Gene Transfer of Capsid-Modified Adenovirus Vectors in a Cell-Type-Specific Manner. Dmitry M. Shayakhmetov, et al., Journal of Virology. 2004. 78（18）：10009-10022.」を参照し、原文の作者又は中国科学院生物物理研究所から取得することができる。
【００４２】
（2）レトロウイルスパッケージングで用いられる生物材料は以下のとおりである。
レトロウイルスベクター及びパッケージングプラスミドは、いずれもAddgeneから購入され、品番は、pBABE-neo-hTERT（1774）、pBABE-zeo-large T genomic（1778）、pBABE-puro-HRAS V12（1768）、gag/pol（14887）、VSV-G（8454）である。
【００４３】
（3）レンチウイルスパッケージングで用いられる生物材料は以下のとおりである。
過剰発現ルシフェラーゼluciferaseのレンチウイルスベクタープラスミド：詳細は、「SIRT6 safeguards human mesenchymal stem cells from oxidative stress by coactivating NRF2. Pan et. al., Cell research.（2016）26：190-205.」を参照し、中国科学院生物物理研究所から取得することができる。
P53がノックダウンされたレンチウイルスベクタープラスミドPLVTHM-shP53：詳細は、「PTEN deficiency reprogrammes human neural stem cells towards a glioblastoma stem cell-like phenotype. Duan et. al., Nature communication.（2015）10. 1038.」を参照し、中国科学院生物物理研究所から取得することができる。
レンチウイルスパッケージングプラスミドは、Addgeneから購入され、品番は、psPAX（12260）、pMD2.G（12259）である。
【００４４】
5、フローサイトメトリーによるMSC選別に用いられる蛍光標識抗体は以下のとおりである。
ルシフェリンFITCで標識された抗ヒト細胞表面認識分子CD90抗体、BD Biosciences、品番：555595。
ルシフェリンPEで標識された抗ヒト細胞表面認識分子CD73抗体、BD Biosciences、品番：550257。
ルシフェリンAPCで標識された抗ヒト細胞表面認識分子CD105抗体、BD Biosciences、品番：17-1057-42。
ルシフェリンAPCで標識されたアイソタイプコントロール抗体、BD Biosciences、品番：555751。
ルシフェリンPEで標識されたアイソタイプコントロール抗体、BD Biosciences、品番：555749。
ルシフェリンFITCで標識されたアイソタイプコントロール抗体、BD Biosciences、品番：555742。
【００４５】
6、免疫蛍光に用いられる抗体は以下のとおりである。
抗ヒトFOXA2抗体、Cell Signaling Technology、品番：8186S。
抗ヒトSMA抗体、中杉金橋、品番：ZM-0003。
抗ヒトTUJ1抗体、Sigma、品番：T2200。
抗ヒトLAP2抗体、BD Biosciences、品番：611000。
抗ヒトラミンB1抗体、Santa Cruz Biotechnology、品番：sc-6217。
抗ヒトKi67抗体、Vector Laboratories、品番：VP-RM04。
抗ヒトP16抗体、BD Biosciences、品番：550834。
抗ヒトP21抗体、Cell Signaling Technology、品番：2947。
【００４６】
実施例1、ストレス抵抗性遺伝子NRF2が標的修飾されたヒト多能性幹細胞の製造
一、NRF2強化型多能性幹細胞の製造
本発明は、多能性幹細胞（Pluripotent Stem Cell、PSC）におけるヒトストレス抵抗性遺伝子NRF2の単一のサイトを標的編集することにより、NRF2遺伝子（Gene Bank ID：4780）のcDNA配列の245位を野生型の塩基Aから塩基Gに突然変異させ、NRF2タンパク質のアミノ酸配列の82位をグルタミン酸（E）からグリシン（G）に変異させ、NRF2強化型多能性幹細胞を得た。具体的な工程は以下のとおりである（具体的な工程は、図1Aを参照する）。
【００４７】
1、ウイルス発現プラスミドの構築
まず、RP11-483K11 BAC DNAライブラリー（BACPAC Resources）からPCR増幅によりヒトゲノムのNRF2遺伝子の1と2番目のイントロン（intron1-exon2-intron2）にわたる遺伝子断片を得た。その後、部位特異的突然変異キット（インビトロジェン、品番：A13282）により当該断片上のNRF2遺伝子に対応するcDNA配列の245位のヌクレオチドサイト（A245G）を、野生型の塩基Aから塩基Gに突然変異させるとともに、他の配列が変わらないようにすることにより、突然変異後の断片を得、突然変異後の断片をpCIHDAdGT8-4ベクターのAscIとSpeI制限酵素切断サイトに挿入し、組換えプラスミドを得た。
【００４８】
2、ウイルス発現プラスミドとヘルパープラスミドをパッケージング細胞に同時トランスフェクションさせ、組換えアデノウイルス粒子を得た
PI-SceI（NEB）酵素により工程1で得られた組換えプラスミドを切断し、線状化プラスミドを得、当該線状化プラスミドをヘルパーウイルスAdHPBGF35とともにヒト胚性腎細胞株293由来の細胞株116の細胞に導入して組換えアデノウイルスパッケージングを行い、超高速遠心により精製して組換えアデノウイルス粒子を得た。
【００４９】
3、組換えアデノウイルス粒子により目的細胞を感染させた
組換えアデノウイルス粒子によりhESCs細胞（H9）を感染させ（1×107個の細胞であり、ウイルスの使用量が15 bgal-transducing units（btu）であり、ウイルスの使用量の単位は、文献「Palmer, D. J. & Ng, P. Physical and infectious titers of helper-dependent adenoviral vectors：a method of direct comparison to the adenovirus reference material. Mol Ther 10, 792-798（2004）.」及び「Suzuki, K. et al. Highly efficient transient gene expression and gene targeting in primate embryonic stem cells with helper-dependent adenoviral vectors. Proc Natl Acad Sci USA 105, 13781-13786（2008）.」を参照できる）、感染後2〜4日目に、G418（25〜400g/ml、インビトロジェン社製）を加えて陽性のスクリーニングを行い、感染後10〜13日目に、4μM Ganciclovir（GANC、インビトロジェン社製）を加えて陰性のスクリーニングを行った。最後、生存してきた細胞をシーケンス同定し（PCRプライマーがNRF2A245GseqF：ACCATTTGTGACTTTGCCCTTTAGTGACCTCTACCATC及びNRF2A245GseqR：AACCTGCCATAACTTTCCCAAGAACTGAであり、シーケンシングプライマーがaaaaacagaaaaaacttgaaである）、1つのNRF2対立遺伝子上のサイトが正確に編集された細胞を得、NRF2AG/+hESC細胞と表記した。
【００５０】
4、前記線状化プラスミドをヘルパーウイルスAdHPBGF35とともにNRF2AG/+hESC細胞に導入し、再びゲノム編集を行い、編集後の細胞を同定し、2つのNRF2対立遺伝子上のサイトが正確に編集された細胞を得、NRF2強化型多能性幹細胞であるNRF2AG/AGhESC細胞と表記した。
【００５１】
二、NRF2強化型多能性幹細胞の同定
1、NRF2強化型多能性幹細胞のシーケンス同定
NRF2強化型多能性幹細胞に対してシーケンス同定を行ったところ、NRF2強化型多能性幹細胞におけるNRF2遺伝子のA245Gサイトが正確に編集され（図1B）、NRF2強化型成体細胞におけるNRF2遺伝子の二本の相同染色体の245位が、いずれも塩基Aから塩基Gに突然変異したことが示された。
【００５２】
2、NRF2強化型多能性幹細胞の形態同定
NRF2強化型多能性幹細胞に対して形態同定を行い、NRF2AG/AGhESCの形態同定結果は、図1Cに示される。また、図面から分かるように、NRF2強化型多能性幹細胞は、依然として、体内で内中外の三胚葉細胞に分化する能力を有する。
【００５３】
3、NRF2強化型多能性幹細胞における多能性幹性遺伝子の発現レベルの検出
それぞれ野生型ヒト胚性幹細胞H9細胞株（NRF2+/+）、NRF2AG/+hESC細胞（NRF2AG/+hESC）及びNRF2AG/AGhESC細胞（NRF2AG/AGhESC）での、多能性幹性遺伝子OCT4、SOX2、NANOGを発現させる発現レベルを検出した。PCR同定に用いられるプライマーは以下のとおりである。
18S-F：GTAACCCGTTGAACCCCATT、
18S-R：CCATCCAATCGGTAGTAGCG、
OCT4-F：GGGTTTTTGGGATTAAGTTCTTCA、
OCT4-R：GCCCCCACCCTTTGTGTT、
SOX2-F：CAAAAATGGCCATGCAGGTT、
SOX2-R：AGTTGGGATCGAACAAAAGCTATT、
NANOG-F：ACAACTGGCCGAAGAATAGCA、
NANOG-R：GGTTCCCAGTCGGGTTCAC。
【００５４】
結果は、図1Dに示される。図面から分かるように、NRF2+/+、NRF2AG/+hESC及びNRF2AG/AGhESC細胞では、いずれも多能性幹性遺伝子OCT4、SOX2、NANOGを正常に発現させた。
【００５５】
実施例2、NRF2強化型間葉幹細胞の製造及びその機能の検出
本発明は、実施例1で得られたNRF2強化型多能性幹細胞を、NRF2強化型間葉幹細胞（NRF2強化型MSC）にさらに分化させた。そして、実験により、NRF2強化型MSCにおいてNRF2が能動的に活性化され、体内でも体外でもストレス抵抗性、細胞老化抵抗性及び悪性形質転換抵抗性という特性を発現したことが証明された。具体的な工程は以下のとおりである。
【００５６】
一、NRF2強化型MSCの製造
1、NRF2AG/AGhESCを胚様体（EB）分化させ、具体的な工程としては、300〜500個の細胞を含有し、大きさが均一なNRF2AG/AGhESCクローンを準備し、室温PBSで一回洗浄し、Dispase（インビトロジェン社、品番17105041）で37℃で20〜30min消化させた。ESCクローンが球体を形成した後、CDF12培地により再懸濁させ、その後、低接着培養プレート（Corning社、品番3471）に加え、37℃、5%CO2の条件で1〜3日培養した後、胚様体を形成した。
【００５７】
2、工程1で得られた胚様体をマトリゲル（matrigel）（インビトロジェン社）で被覆された6ウェルプレートに播種して培養し、線維細胞が現れるまで2週間培養し続けた。さらに一回継代した後、フローサイトメトリーにより、そのうちCD73、CD90及びCD105がいずれも陽性である細胞群、即ち、NRF2強化型MSCを選別し、NRF2AG/AGMSCと表記した。
前記工程におけるNRF2AG/AGhESCを野生型ヒト胚性幹細胞H9細胞株に置き換え、他の工程が変わらないようにし、指向性誘導分化させて野生型間葉細胞を得、NRF2+/+MSCと表記した。
【００５８】
二、NRF2強化型MSCの表現型同定及び機能検出
1、NRF2強化型MSCの表現型同定
工程一で得られたNRF2AG/AGMSC及びNRF2+/+MSCの表面マーカーを検出した。
結果は、図1Eに示される。図面から分かるように、工程一で得られたNRF2AG/AGMSC及びNRF2+/+MSCは、いずれも、関連していないCD34、CD43及びCD45を発現させることなく、MSC特異的表面マーカーCD73、CD90及びCD105を発現させることができた。
【００５９】
2、NRF2強化型MSCにおけるストレス抵抗性遺伝子NRF2の能動活性化
（1）NRF2強化型MSCにおけるNRF2タンパク質の量
それぞれNRF2AG/AGMSC及びNRF2+/+MSCを供試細胞とし、供試細胞におけるNRF2タンパク質の量を検出した。具体的な工程としては、RIPA細胞溶解液（Beyotime、P0013B）を用いて供試細胞を溶解させた後、BCAタンパク質定量キット（Beyotime、P0010）により供試細胞におけるタンパク質の濃度を測定し、最後に、それぞれタンパク質を20μg取ってウェスタンブロット実験を行った。一次抗体にNRF2（abcam、62352）、二次抗体にヤギ抗ウサギIgG/HRP（中杉金橋、ZDR-5306）を用いた。
【００６０】
結果は、図1Hに示される。図面から分かるように、NRF2AG/AGMSC（NRF2強化型MSC）におけるNRF2タンパク質の量が明らかにNRF2+/+MSCよりも高かった。
【００６１】
（2）核内局在化
それぞれNRF2AG/AGMSC及びNRF2+/+MSCを供試細胞とし、それぞれ細胞質及び核質におけるNRF2タンパク質の含有量を検出した。具体的な工程としては、細胞核タンパク質及び細胞質タンパク質抽出キット（Beyotime、P0028）を用いて、それぞれ細胞質及び核質画分タンパク質を抽出した後、等量のタンパク質を取ってそれぞれウェスタンブロット実験を行い、細胞質マーカーであるβ-チューブリン及び核質マーカーであるラミンB1をコントロールとした。
【００６２】
結果は、図1Fに示される。図面から分かるように、NRF2AG/AGMSC（NRF2強化型MSC）におけるNRF2タンパク質の細胞質及び核質での含有量が、いずれもNRF2+/+MSCよりも高かった。
【００６３】
（3）NRF2強化型MSCにおけるストレス抵抗性遺伝子NRF2の下流の標的遺伝子のmRNAとタンパク質のレベルの検出
1）リアルタイム定量PCR実験
それぞれNRF2AG/AGMSC及びNRF2+/+MSCを供試細胞とし、それぞれ供試細胞のRNAを抽出してcDNAに逆転写し、それぞれ次のプライマーを用いてリアルタイム定量PCRを行い、供試細胞におけるストレス抵抗性遺伝子NRF2の下流の標的遺伝子であるNQO1遺伝子、HO-1遺伝子、GCLC遺伝子、GCLM遺伝子、GR遺伝子、TXN遺伝子、TRXR1遺伝子の発現量を検出した。
NQO1-F：CGCAGACCTTGTGATATTCCAG、
NQO1-R：CGTTTCTTCCATCCTTCCAGG、
HO1-F：AAGACTGCGTTCCTGCTCAAC、
HO1-R：AAAGCCCTACAGCAACTGTCG、
GCLC-F：GGATTTGGAAATGGGCAATTG、
GCLC-R：CTCAGATATACTGCAGGCTTGGAA、
GCLM-F：TGCAGTTGACATGGCCTGTT、
GCLM-R：TCACAGAATCCAGCTGTGCAA、
GSR-F：TTGTCGGGCTTGGAAGTCAG、
GSR-R：TGGTAGCCTACCGGGAACTG、
TXN-F：GTGAAGCAGATCGAGAGCAAG、
TXN-R：CGTGGCTGAGAAGTCAACTACTA、
TRXR1-F：GGGCAATTTATTGGTCCTCA、
TRXR1-R：GGTCTTTCACCAGTGGCAAT。
【００６４】
2）それぞれNRF2AG/AGMSC及びNRF2+/+MSCを供試細胞とし、供試細胞におけるタンパク質を抽出してウェスタンブロット実験を行い、供試細胞におけるNQO1及びHO-1タンパク質の発現レベルを検出した。そして、細胞質マーカーであるβ-チューブリンをコントロールとした。抗体にNQO1（Santa Cruz Biotechnology、32793）、HO-1（ENZO、ADI-SPA-895-D）を用いた。
【００６５】
結果は、図1G及び図1Hに示される。図面から分かるように、NRF2AG/AGMSC（NRF2強化型MSC）における下流の標的遺伝子であるNQO1遺伝子、HO-1遺伝子、GCLC遺伝子、GCLM遺伝子、GR遺伝子、TXN遺伝子及びTRXR1遺伝子の発現量が、いずれもNRF2+/+MSCよりも高かった。かつ、NRF2AG/AGMSCにおけるNQO1及びHO-1タンパク質の発現レベルもNRF2+/+MSCよりも高かった。
【００６６】
以上をまとめると、NRF2を単一のサイトで修飾した後、NRF2遺伝子が構成的活性化された。
【００６７】
3、NRF2強化型MSCのストレス抵抗・細胞老化抵抗特性
（1）外来刺激下での高い活力
酸化ストレス、小胞体ストレス、DNA損傷ストレス及びアポトーシス刺激を含む外来刺激物によりMSCを処理した。具体的な工程としては、供試細胞NRF2AG/AGMSC及びNRF2+/+MSCを96ウェルプレートに広げ、それぞれ次の外来刺激物（括弧内は、外来刺激物の最終濃度及び購入先である）により供試細胞を48時間刺激した。
1）酸化ストレス：DMSO（0.1%、Sigma）、PQ（2mM、パラコート、Sigma）、PX12（50μM、Santa Cruz Technology）、TBH（100μM、tert-ブチルヒドロペルオキシド、Sigma）、L-BSO（500μM、L-ブチオニンスルホキシイミン、Sigma）、
2）小胞体ストレス：TM（6μg/mL、ツニカマイシン、Sigma）及びTG（1.5μg/mL、タプシガルギン、Sigma）、
3）DNA損傷：4NQO（100μM、4-ニトロキノリンN-オキシド、Sigma）及びAAT2（50μM、Apoptosis Activator 2、TOCRIS）、
4）アポトーシス：CCCP（100μM、カルボニルシアニド3-クロロフェニルヒドラゾン、Sigma）。
【００６８】
刺激終了後、CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Kit（Promega、G3582）キット及びその使用方法に従って刺激後の供試細胞の活力を検出した。検出の際に、直接細胞を培養する培地にCellTiter 96 AQueous One Solution試薬を加え、インキュベーターで1時間インキュベートした後、490nmにおける吸光度値を検出し、OD490の数値から細胞の相対活力を計算した。細胞の相対活力の計算式は、Log2（OD490（NRF2AG/AG）/OD490（NRF2+/+））であった。
【００６９】
結果から、バックグラウンドレベル及び刺激条件で、NRF2強化型MSCがいずれもより強い細胞の活力を有することが示された（図2A）。
【００７０】
（2）増殖能の測定
細胞カウンターにより、連続して継代培養されたNRF2AG/AGMSC及びNRF2+/+MSCの増殖能を測定した。
【００７１】
結果は、図2Bに示される。図面から分かるように、NRF2AG/AGMSC細胞（NRF2強化型MSC）は、増幅レートが明らかにNRF2+/+MSC細胞よりも高かく、明らかな細胞老化抵抗能を発現した。
【００７２】
（3）SA-β-Gal染色
細胞老化関連β-ガラクトシダーゼ染色とは、老化時のSA-beta-Gal（senescence-associated beta-galactosidase）の活性レベルの上昇に基づいて老化細胞又は組織を染色検出する方法である。それぞれ工程一で得られたNRF2AG/AGMSC及びNRF2+/+MSCをSA-β-Gal染色し、普通の光学顕微鏡で細胞又は組織の老化状況を観測でき、さらに、2つのグループの細胞におけるSA-β-Gal染色陽性細胞の割合を定量的統計分析した。具体的な工程は以下のとおりである。
【００７３】
それぞれNRF2AG/AGMSC及びNRF2+/+MSCを供試細胞とし（初期世代：第5世代、後期世代：第11世代）、PBSで1回洗浄し、染色定着液（2%ホルムアルデヒド＋0.2%グルタルアルデヒド）を加え、室温で5分間定着させた。定着液を捨て、PBSで1回洗浄し、ウェル毎に染色液を1ml加えた。X-Galを基質とし、老化特異的β-ガラクトシダーゼの触媒により、濃青色の生成物を生成した。
【００７４】
結果は、図2Cに示される。図面から分かるように、後期世代のNRF2+/+MSCが明らかな青色となり、初期世代のNRF2+/+MSC及び後期世代のNRF2AG/AGMSC（NRF2強化型MSC）の陽性率が低かった。よって、NRF2強化型MSCの老化プロセスを遅延させた。
【００７５】
（4）有害代謝物の含有量検出
それぞれNRF2AG/AGMSC及びNRF2+/+MSCを供試細胞とし（初期世代EP：第5世代、後期世代LP：第11世代）、1μM酸素ラジカルプローブDCFDA（インビトロジェン、品番：C6827）とともに30分間インキュベートし、フローサイトメーターによりDCFDA強度（即ち、プローブによる細胞内の活性酸素の含有量）を検出した。詳しい工程は、インビトロジェン社の説明書を参照できる。
【００７６】
結果は、図2Dに示されるとおり、NRF2AG/AGMSC（NRF2強化型MSC）は、初期世代でも後期世代でもより少ない活性酸素が集積し、NRF2強化型MSCによりこの有害代謝物をより効果的に除去できることが示された。
【００７７】
（5）老化遺伝子発現の検出
それぞれNRF2AG/AGMSC及びNRF2+/+MSCを供試細胞とし（初期世代EP：第5世代、後期世代LP：第11世代）、ウェスタンブロット実験により供試細胞における老化高発現遺伝子p16、p21、GATA4のタンパク質発現状況を検出した。一次抗体にp16（BD、550834）、P21（Cell signaling、2947）、GATA4（Santa cruz、SC-1237）を用いた。対応する二次抗体は、ヤギ抗マウスIgG/HRP（中杉金橋、ZDR-5307）、ヤギ抗ウサギIgG/HRP（中杉金橋、ZDR-5306）及びウサギ抗ヤギIgG/HRP（中杉金橋、ZDR-5308）であった。
【００７８】
結果は、図2Eに示される。図面から分かるように、NRF2+/+MSCに比べて、遺伝子強化型MSC（NRF2AG/AGMSC）では、ずっと存在量の低い老化関連遺伝子p16、p21及びGATA4を発現させた。
【００７９】
（6）増殖能の検出
それぞれNRF2AG/AGMSC及びNRF2+/+MSCを供試細胞とし（初期世代EP：第5世代、後期世代LP：第11世代）、免疫蛍光染色法により増殖活力に関連するKi67の発現を検出した。具体的な工程としては、供試細胞を円形スライドガラスに広げ、4%パラホルムアルデヒドにより定着させた後、0.4%TritonX-100を透過させた。透過した細胞をロバ血清で1hブロッキングした後、一次抗体で一晩インキュベートし、一次抗体にKi67（Vector Laboratories、品番：VP-RM04）を用いた。対応する二次抗体で45分間インキュベートした後、共焦点レーザー顕微鏡により細胞の写真を撮影した。
【００８０】
結果は、図2Fに示される。図面から分かるように、NRF2+/+MSCに比べて、NRF2AG/AGMSC（NRF2強化型MSC）は、初期世代でも後期世代でもより高いKi67陽性細胞率を有する。
【００８１】
（7）細胞核の構造完全性の検出
それぞれNRF2AG/AGMSC及びNRF2+/+MSCを供試細胞とし（初期世代：第5世代、後期世代：第11世代）、免疫蛍光染色法により核膜タンパク質ラミンB1及びLAP2の発現を検出した。具体的な工程としては、供試細胞を円形スライドガラスに広げ、4%パラホルムアルデヒドにより定着させた後、0.4%TritonX-100を透過させた。透過した細胞をロバ血清で1hブロッキングした後、一次抗体で一晩インキュベートし、一次抗体にラミンB1（Abcam、品番：16048）及びLAP2（BD、品番：611000）を用いた。対応する二次抗体で45分間インキュベートした後、共焦点レーザー顕微鏡により細胞の写真を撮影した。
【００８２】
結果は、図2Gに示される。図面から分かるように、NRF2+/+MSCに比べて、後期世代のNRF2AG/AGMSC（NRF2強化型MSC）の核膜が異常である細胞（図2Gにおける矢印で示されるのは、核膜異常細胞であり、核膜タンパク質染色を行った後、明らかな核膜の輪郭が認められなかった）の数が明らかに少なくなり、NRF2AG/AGMSC（NRF2強化型MSC）がより完全な細胞核構造を有することが示された。
【００８３】
4、NRF2強化型MSCの悪性形質転換抵抗特性
（1）NRF2AG/AGTMSC及びNRF2+/+TMSCの製造
体外悪性形質転換システムにより、それぞれNRF2AG/AGMSC及びNRF2+/+MSCに腫瘍形成因子を導入し、非腫瘍性のMSCを腫瘍性のMSC（transformed MSC、以下、TMSCという）に転換し、それぞれNRF2AG/AGTMSC及びNRF2+/+TMSCを得た。その後、腫瘍に関連する特性を検出した。具体的な工程は以下のとおりである。
【００８４】
1）体外悪性形質転換システムに必要なレトロウイルスベクタープラスミドpBABE-neo-hTERT、pBABE-zeo-large T genomic、pBABE-puro-HRAS V12をそれぞれパッケージングプラスミドgag/pol及びVSV-Gと293T細胞に同時トランスフェクションさせ、培養上澄みを回収し、超高速遠心によりレトロウイルス粒子を精製した。体外悪性形質転換システムに必要なレンチウイルスベクタープラスミドPLVTHM-shP53をそれぞれパッケージングプラスミドpsPAX及びpMD.2Gと293T細胞に同時トランスフェクションさせ、培養上澄みを回収し、超高速遠心によりレンチウイルス粒子を精製した。
【００８５】
2）精製により得られたウイルスでそれぞれNRF2AG/AGMSC及びNRF2+/+MSCを感染させた。図3Aに示されるように、MSCの悪性形質転換は、テロメア延長、癌抑制遺伝子欠失及び発癌遺伝子の突然変異の三つを含み、当該過程は、3種類のレトロウイルス及び1種類のレンチウイルスを感染させることにより実現された。レンチウイルスは、緑色蛍光GFPタンパク質を同時に発現できるとともに、細胞の可視化標識を実現した。具体的な操作過程としては、初期世代のMSCに工程（1）で得られたpBABE-neo-hTERT、pBABE-zeo-large T genomic及びpBABE-puro-HRAS V12の3つのレトロウイルスを順に感染させた。3つのウイルスは、それぞれneo、zeo及びpuroの抗性標識を有するので、順に、対応するG418（インビトロジェン、10131035）、zeocin（インビトロジェン、R25001）及びpuromycin（インビトロジェン、A1113803）の3つの薬物によりポジティブスクリーニングを行い、3つのウイルスがいずれも組み込まれた細胞を得、最後、PLVTHM-shP53レンチウイルスを感染させて癌抑制遺伝子による抑制、及びGFPによる標識を強化させた。この工程により、それぞれNRF2AG/AGTMSC及びNRF2+/+TMSCを得た。
【００８６】
（2）足場非依存性増殖能
腫瘍細胞は、接着できない寒天でクローンになることができるが、非腫瘍性の細胞ではできないので、足場非依存性増殖能は、腫瘍細胞が固形腫瘍を形成することに密接に関連する。それぞれNRF2AG/AGTMSC及びNRF2+/+TMSCを溶解状態のアガロース（0.35%）と均一に混合し、細胞培養ディッシュに速やかに広げ、アガロースが凝固した後TMSC培地を覆って培養し、足場非依存性増殖能を観察した。
【００８７】
結果は、図3Bに示されるように、NRF2AG/AGTMSCを悪性形質転換させた後、その足場非依存性増殖能が、形質転換させた野生型細胞よりも大きく弱くなった（図3B）。
【００８８】
（3）体内での腫瘍形成能
それぞれNRF2AG/AGTMSC及びNRF2+/+TMSC（3×106個の細胞）をヌードマウス（系統：Balb/C nude mice）の後肢関節近傍に移植した。接着培養されたTMSCを単核球に消化させ、20%Matrigel（BD Biosciences、354277）を混合したPBS（Gibco、10010023）溶液に再懸濁させ、通常の注射器により細胞懸濁液を後肢関節近傍の筋肉に注射した。移植後2〜3ヶ月後、後肢に明らかに腫れが隆起した場合、マウスを致死させた。後肢を切り取り天秤で秤量し、相対質量（相対質量＝NRF2+/+TMSCが移植された後肢の質量/NRF2AG/AGTMSCが移植された後肢の質量）を計算した。
【００８９】
結果は、図3C及び図3Dに示される。図面から分かるように、相対質量が2.73±0.22であり、NRF2+/+TMSCが移植された後肢の質量が、明らかにNRF2AG/AGTMSCが移植された後肢の質量よりも大きかった。NRF2+/+TMSCが骨肉腫状腫瘍を生成できたが、NRF2AG/AGTMSCが腫瘍形成能を全く失ったことが示された。
【００９０】
実施例3、NRF2強化型間葉幹細胞の細胞移植治療への応用
実施例2で得られたNRF2強化型間葉幹細胞（NRF2強化型MSC）は、ストレス抵抗、細胞老化抵抗及び腫瘍発生抵抗特性を有するので、本発明は、実施例2で得られたNRF2強化型間葉幹細胞を細胞移植治療に用いた。具体的な工程は以下のとおりである。
【００９１】
一、NRF2強化型MSCをマウスの前脛骨筋に移植した
1、それぞれNRF2AG/AGMSC及びNRF2+/+MSCに対してルシフェラーゼ標識を行った。具体的な工程としては、過剰発現ルシフェラーゼluciferaseのレンチウイルスベクタープラスミドをレンチウイルスパッケージングプラスミドpsPAX及びpMD2.Gと293T細胞に同時トランスフェクションさせ、培養上澄みを回収し、超高速遠心によりウイルス粒子を精製した。精製により得られたウイルスでNRF2AG/AGMSC及びNRF2+/+MSCを感染させ、それぞれルシフェラーゼで標識されたNRF2AG/AGMSC及びNRF2+/+MSCを得た。
【００９２】
2、それぞれルシフェラーゼで標識されたNRF2AG/AGMSC及びNRF2+/+MSC（1×106個の細胞）をマウスの前脛骨筋に移植し、7日後動物生体撮影装置により、脚部に滞在したMSCを検出した。
【００９３】
結果は、図4Aに示されるように、NRF2AG/AGMSC（NRF2強化型MSC）がNRF2+/+MSCよりも長く滞在できた。
【００９４】
二、NRF2強化型MSCを後肢虚血の免疫不全マウスの筋肉に移植した
それぞれNRF2AG/AGMSC及びNRF2+/+MSCを後肢虚血の免疫不全マウスの筋肉に移植し、レーザードップラー血流計により移植後0、4、8、12、16日目のマウスの後肢の血流回復状況を検出した。同時に、PBS溶液（control）（Gibco、10010023）をコントロールとした。
【００９５】
結果は、図4B及び4Cに示されるように、PBS溶液の注射又はNRF2+/+MSCの移植に比べて、NRF2AG/AGMSC（NRF2強化型MSC）の移植により、損傷した後肢の血流を速く回復させることができ、NRF2AG/AGMSCが損傷した血管の再生と修復に関与したことが示された。
【産業上の利用可能性】
【００９６】
本発明は、初回ゲノム編集技術によりストレス抵抗性に関連する遺伝子の改良に成功し、単一のコーディングサイトで修飾するだけで、内因性ストレス抵抗性遺伝子の制御可能な能動活性化を実現し、ストレス抵抗性が向上した遺伝子強化型幹細胞を得、体内・体外実験により、遺伝子強化型幹細胞がストレス及び細胞老化に抵抗でき、より好ましい組織修復機能及び悪性腫瘍形成・形質転換抵抗能を有することが証明された。本発明の方法は、細胞移植治療における有効性と安全性という+とボトルネックとなる2つの難題を同時に解決した。
【図１Ａ】
2020501501.tif 000002
【図１Ｂ】
2020501501.tif 000003
【図１Ｃ】
2020501501.tif 000004
【図１Ｄ】
2020501501.tif 000005
【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年8月29日(2019.8.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（1）体外でのヒト多能性幹細胞におけるNRF2タンパク質の82位のグルタミン酸をグリシンに突然変異させ、NRF2遺伝子強化型の多能性幹細胞を得る工程と、
（2）前記NRF2遺伝子強化型の多能性幹細胞を指向性誘導分化させ、NRF2遺伝子強化型の間葉幹細胞を得る工程と、
を含む間葉幹細胞の製造方法。
【請求項２】
工程（1）において、前記体外でのヒト多能性幹細胞におけるNRF2タンパク質の82位のグルタミン酸をグリシンに突然変異させる方法は、NRF2遺伝子の245位の塩基Aを塩基Gに突然変異させることであることを特徴とする請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記NRF2遺伝子の245位の塩基Aを塩基Gに突然変異させる方法は、部位特異的ゲノム編集であることを特徴とする請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記部位特異的ゲノム編集方法は、ZFN編集、TALEN編集、CRISPR/Cas9編集又はHdADVが媒介する部位特異的編集であることを特徴とする請求項3に記載の方法。
【請求項５】
前記部位特異的ゲノム編集方法は、HdADVが媒介する部位特異的編集であることを特徴とする請求項4に記載の方法。
【請求項６】
工程（2）において、前記指向性誘導分化方法は、
（b1）NRF2遺伝子強化型の多能性幹細胞を胚様体分化させ、胚様体を得る工程と、
（b2）前記胚様体を線維細胞が現れるまで培養し、さらに継代培養し、そのうちCD73、CD90、CD105がいずれも陽性である細胞群、即ち、前記NRF2遺伝子強化型の間葉幹細胞を選別する工程と、
を含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
【請求項７】
前記ヒト多能性幹細胞は、ヒト胚性幹細胞又はヒト誘導多能性幹細胞であることを特徴とする請求項6に記載の方法。
【請求項８】
前記ヒト胚性幹細胞は、ヒト胚性幹細胞H9細胞株であることを特徴とする請求項7に記載の方法。
【請求項９】
請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法により製造されたNRF2遺伝子強化型の間葉幹細胞。
【請求項１０】
請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法により製造されたNRF2遺伝子強化型の多能性幹細胞。
【請求項１１】
請求項9に記載のNRF2遺伝子強化型の間葉幹細胞又は請求項10に記載のNRF2遺伝子強化型の多能性幹細胞の次のd1）〜d5）のいずれかへの応用。
d1）細胞老化に抵抗し、及び/又はそれを遅延させる製品の製造、
d2）腫瘍発生に抵抗する製品の製造、
d3）悪性腫瘍形成・形質転換に抵抗する製品の製造、
d4）細胞移植治療用製品の製造、
d5）損傷した血管を再生及び/又は修復する製品の製造。
【請求項１２】
請求項9に記載のNRF2遺伝子強化型の間葉幹細胞を活性成分とし、
機能が次のm1）〜m5）のいずれかである製品。
m1）細胞老化の抵抗及び/又は遅延、
m2）腫瘍発生の抵抗、
m3）悪性腫瘍形成・形質転換の抵抗、
m4）細胞移植治療、
m5）損傷した血管の再生及び/又は修復。
【請求項１３】
前記細胞老化の抵抗及び/又は遅延は、次のn1）〜n6）のいずれかで表現されることを特徴とする請求項11に記載の応用、又は請求項12に記載の製品。
n1）外来刺激物による刺激下で細胞の活力が向上すること、
n2）体外で連続して継代培養する過程においてより強い増殖能を発現すること、
n3）有害代謝物を除去する能力が向上すること、
n4）細胞老化に関連する遺伝子の発現レベルが低下すること、
n5）より完全な細胞核構造を有すること、
n6）人又は動物の体内での滞在期間がより長いこと。
【請求項１４】
前記悪性腫瘍形成・形質転換の抵抗は、次のe1）〜e3）のいずれかで表現されることを特徴とする請求項11に記載の応用、又は請求項12に記載の製品。
e1）腫瘍化細胞の増殖能が低下すること、
e2）腫瘍形成に関連する足場非依存性増殖能が低下すること、
e3）体内で腫瘍を形成させる能力が低下すること。
【請求項１５】
前記細胞移植治療は、細胞移植修復治療であることを特徴とする請求項11に記載の応用、又は請求項12に記載の製品。
【国際調査報告】
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