(57)【要約】  本発明は、参照抗体とヒトＣＤ１３７との結合を阻害することができる、ヒトＣＤ１３７のドメイン２に対する結合特異性を有する抗体（およびその断片、変異体、融合体および誘導体）に関する。抗体および断片は、癌等の疾患の治療に有用性を有する。本発明はまた、そのような抗体を含む医薬組成物、使用、方法およびキットにも関する。
2020501531.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＣＤ１３７のドメイン２に対する結合特異性を有する抗体またはその抗原結合断片であって、前記抗体または抗原結合断片が、ＣＤ１３７アゴニストであり、かつ参照抗体「１６３０／１６３１」のヒトＣＤ１３７への結合を阻害することができる、抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
前記抗体または抗原結合断片が、参照抗体「２６７４／２６７５」のヒトＣＤ１３７への結合を阻害することができる、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３】
前記抗体または抗原結合断片は、以下の特性、
ａ）架橋依存性機構を介してＣＤ１３７を刺激し、Ｔ細胞および他の免疫細胞を活性化する能力、および／または
ｂ）カニクイザルＣＤ１３７抗体との交差反応性、
のうちの１つ以上を示す、請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４】
前記抗体または抗原結合断片が、Ｆｃ受容体に結合することができる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体または抗原。
【請求項５】
前記抗体がＴ細胞を活性化する能力が、ＣＤ１３７およびＦｃ受容体の両方への結合に依存する、請求項４に記載の抗体または抗原。
【請求項６】
前記抗体または抗原結合断片が、ＣＤ１３７を発現する細胞に結合すると、
ａ）抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）
ｂ）抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）および／または
ｃ）補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、
を誘導することが実質的にできない、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体またはその    
抗原結合断片。
【請求項７】
前記抗体または抗原結合断片が腫瘍免疫を誘導することができる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項８】
前記抗体または抗原結合断片が、参照抗体１６３０／１６３１が結合することができるＣＤ１３７のエピトープと少なくとも部分的に重複する、ＣＤ１３７の細胞外ドメインのエピトープに結合することができる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項９】
前記抗体または抗原結合断片が、参照抗体２６７４／２６７５が結合することができるＣＤ１３７のエピトープと少なくとも部分的に重複する、ＣＤ１３７の細胞外ドメインのエピトープに結合することができる、請求項８に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１０】
前記エピトープが、ヒトＣＤ１３７のアミノ酸６６〜１０７に位置する、またはその中に位置する、請求項８または９に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１１】
ＣＤ１３７が細胞の表面に局在する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項１２】
インタクトな抗体、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４抗体を含むまたはそれからなる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１３】
ＩｇＧ４抗体を含むまたはそれからなる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体、またはその抗原結合断片。
【請求項１４】
Ｆｖ断片（例えば、単鎖Ｆｖおよびジスルフィド結合Ｆｖ）、Ｆａｂ様断片（例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片およびＦ（ａｂ）２断片）、およびドメイン抗体（例えば、単一のＶＨ可変ドメインまたはＶＬ可変ドメイン）からなる群から選択される抗原結合断片を含むまたはそれからなる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１５】
前記抗原結合断片がｓｃＦｖを含むまたはそれからなる、請求項１４に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項１６】
前記抗体またはその抗原結合断片が組換えポリペプチドである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項１７】
前記抗体またはその抗原結合断片がモノクローナルである、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項１８】
前記抗体またはその抗原結合断片がヒトまたはヒト化である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項１９】
ａ）コンセンサス配列Ｇ、Ｆ、Ｔ／Ｎ、Ｆ、Ｇ、Ｙ、Ｓ、Ｙを有する重鎖ＣＤＲ１配列、
ｂ）コンセンサス配列Ｉ、Ｇ、Ｓ、Ｇ／Ｔ、Ｓ、Ｓ、Ｙ／Ｈ、Ｔを有する重鎖ＣＤＲ２配列、および
ｃ）配列ＡＲＶＹＳＳＰＧＩＤＹを有する重鎖ＣＤＲ３配列、を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項２０】
ａ）コンセンサス配列Ｑ、Ｓ、Ｉ、Ｓ／Ｇ、Ｓ、Ｙ／Ｔを有する軽鎖ＣＤＲ１配列、
ｂ）コンセンサス配列Ａ／Ｇ、Ａ、Ｓを有する軽鎖ＣＤＲ２配列、および
ｃ）配列ＱＱＹＹＴＷＶＰＦＴを有する軽鎖ＣＤＲ３配列、を含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項２１】
ａ）ＧＦＴＦＧＹＳＹ［配列番号３］、または配列番号３と比較して最大３個のアミノ酸変異、例えば、１、２もしくは３個の変異を含むアミノ酸配列のＣＤＲ、
ｂ）ＩＧＳＧＳＳＹＴ［配列番号４］、または配列番号４と比較して最大３個のアミノ酸変異、例えば、１、２もしくは３個の変異を含むアミノ酸配列のＣＤＲ、および
ｃ）ＡＲＶＹＳＳＰＧＩＤＹ［配列番号５］、または配列番号５と比較して最大３個のアミノ酸変異、例えば、１、２もしくは３個の変異を含むアミノ酸配列のＣＤＲ、を含む、重鎖可変領域を含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２２】
配列番号３、４および５のＣＤＲを含む重鎖可変領域を含む、請求項２１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２３】
配列番号１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも６０％、例えば、少なくとも７０％、８０％、もしくは９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、請求項２２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２４】
ａ）ＱＳＩＳＳＹ［配列番号６］、または配列番号６と比較して最大３個のアミノ酸変異、例えば、１、２もしくは３個の変異を含むアミノ酸配列のＣＤＲ、
ｂ）ＡＡＳ［配列番号７］、または配列番号７と比較して最大２個のアミノ酸変異、例えば、１もしくは２個の変異を含むアミノ酸配列のＣＤＲ、および
ｃ）ＱＱＹＹＴＷＶＰＦＴ［配列番号８］、または配列番号８と比較して最大３個のアミノ酸変異、例えば、１、２もしくは３個の変異を含むアミノ酸配列のＣＤＲ、を含む、軽鎖可変領域を含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２５】
配列番号６、７および８のＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む、請求項２４に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２６】
配列番号２のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも６０％、例えば、少なくとも７０％、８０％、もしくは９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、請求項２５に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２７】
配列番号３、４、５、６、７および８のＣＤＲを含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２８】
配列番号１のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる重鎖可変領域と、配列番号２のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖可変領域と、を含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２９】
ａ）ＧＦＮＦＧＹＳＹ［配列番号２１］、または配列番号２１と比較して最大３個のアミノ酸変異、例えば、１、２もしくは３個の変異を含むアミノ酸配列のＣＤＲ、
ｂ）ＩＧＳＴＳＳＨＴ［配列番号２２］、または配列番号２２と比較して最大３個のアミノ酸変異、例えば、１、２もしくは３個の変異を含むアミノ酸配列のＣＤＲ、および
ｃ）ＡＲＶＹＳＳＰＧＩＤＹ［配列番号２３］、または配列番号２３と比較して最大３個のアミノ酸変異、例えば、１、２もしくは３個の変異を含むアミノ酸配列のＣＤＲ、を含む、重鎖可変領域を含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３０】
配列番号２１、２２および２３のＣＤＲを含む重鎖可変領域を含む、請求項２９に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３１】
配列番号１９のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも６０％、例えば、少なくとも７０％、８０％、もしくは９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、請求項３０に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３２】
ｄ）ＱＳＩＧＳＴ［配列番号２４］、または配列番号２４と比較して最大３個のアミノ酸変異、例えば、１、２もしくは３個の変異を含むアミノ酸配列のＣＤＲ、
ｅ）ＧＡＳ［配列番号２５］、または配列番号２５と比較して最大２個のアミノ酸変異、例えば、１もしくは２個の変異を含むアミノ酸配列のＣＤＲ、および
f）ＱＱＹＹＴＷＶＰＦＴ［配列番号２６］、または配列番号２６と比較して最大３個のアミノ酸変異、例えば、１、２もしくは３個の変異を含むアミノ酸配列のＣＤＲ、を含む、軽鎖可変領域を含む、請求項１〜２０および２９〜３１のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３３】
配列番号２４、２５および２６のＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む、請求項３２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３４】
配列番号２０のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも６０％、例えば、少なくとも７０％、８０％、もしくは９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、請求項３３に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３５】
配列番号２１、２２、２３、２４、２５および２６のＣＤＲを含む、請求項２９〜３４に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３６】
配列番号１９のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖可変領域と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる軽鎖可変領域と、を含む、請求項２９〜３５に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３７】
重鎖定常領域、またはその一部を含む、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３８】
前記重鎖定常領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４からなる群から選択される免疫グロブリンサブタイプのものである、請求項３７に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３９】
前記重鎖定常領域が、免疫グロブリンサブタイプＩｇＧ４のものである、請求項３８に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４０】
前記重鎖定常領域が、配列番号１２、１３、１４および１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなる、請求項３９に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４１】
軽鎖定常領域、またはその一部を含む、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４２】
前記軽鎖定常領域がκまたはλ軽鎖のものである、請求項４１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４３】
前記軽鎖定常領域がκ軽鎖のものである、請求項４２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４４】
前記軽鎖定常領域が、配列番号１６のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる、請求項４３に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４５】
Ｆｃ領域を含む、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４６】
前記Ｆｃ領域が天然に存在する、請求項４５に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４７】
前記Ｆｃ領域が天然に存在しない、請求項４５に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４８】
前記Ｆｃ領域が、抗体または抗原結合断片の半減期を短縮するための突然変異を含む、請求項４７に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４９】
（ａ）配列番号１３の定常領域と一緒に配列番号１の可変領域を含む重鎖、および
（ｂ）配列番号１６の定常領域と一緒に配列番号２の可変領域を含む軽鎖、を含む、請求項１〜４８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５０】
（ｃ）配列番号１３の定常領域と一緒に配列番号１９の可変領域を含む重鎖、および
（ｄ）配列番号１６の定常領域と一緒に配列番号２０の可変領域を含む軽鎖、を含む、請求項１〜４９のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５１】
前記抗体が、配列番号１７のアミノ酸配列を有する２本の重鎖および配列番号１８のアミノ酸配列を有する２本の軽鎖を含むまたはそれらからなるインタクトなＩｇＧ４分子である、請求項１〜５０のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５２】
前記抗体が、配列番号２９のアミノ酸配列を有する２本の重鎖および配列番号３０のアミノ酸配列を有する２本の軽鎖を含むまたはそれらからなるインタクトなＩｇＧ４分子である、請求項１〜５１のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５３】
細胞傷害性部分をさらに含む、請求項１〜５２のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５４】
前記細胞傷害性部分が、放射性同位元素を含むまたはそれからなる、請求項５３に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５５】
前記細胞傷害性部分が、細胞傷害性薬物を含むまたはそれからなる、請求項５３に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５６】
検出可能部分をさらに含む、請求項１〜５５のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５７】
前記検出可能部分が、放射性同位元素を含むまたはそれからなる、請求項５６に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５８】
前記細胞傷害性部分および／または検出可能部分が、結合部分を介して間接的に前記抗体またはその抗原結合断片に結合している、請求項５３〜５７のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５９】
前記結合部分がキレート剤である、請求項５８に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６０】
前記キレート剤が、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０，四酢酸（ＤＯＴＡ）の誘導体、デフェロキサミン（ＤＦＯ）、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）の誘導体、Ｓ−２−（４−イソチオシアナトベンジル）−１，４，７−トリアザシクロノナン−１，４，７−三酢酸（ＮＯＴＡ）の誘導体、および１，４，８，１１−テトラアザシクロドデカン−１，４，８，１１−四酢酸（ＴＥＴＡ）の誘導体からなる群から選択される、請求項５９に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６１】
前記抗体または抗原結合断片が、細胞傷害性部分または検出可能部分を含まない、請求項１〜５２のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６２】
前記請求項のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、またはその成分ポリペプチド鎖をコードする単離された核酸分子。
【請求項６３】
前記核酸分子がｃＤＮＡ分子である、請求項６２に記載の核酸分子。
【請求項６４】
抗体重鎖またはその可変領域をコードする、請求項６２または６３に記載の核酸分子。
【請求項６５】
配列番号９のヌクレオチド配列を含むまたはそれからなる、請求項６４に記載の核酸分子。
【請求項６６】
配列番号２７のヌクレオチド配列を含むまたはそれからなる、請求項６４に記載の核酸分子。
【請求項６７】
抗体軽鎖またはその可変領域をコードする、請求項６２〜６６のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項６８】
配列番号１０のヌクレオチド配列を含むまたはそれからなる、請求項６７に記載の核酸分子。
【請求項６９】
配列番号２８のヌクレオチド配列を含むまたはそれからなる、請求項６７に記載の核酸分子。
【請求項７０】
請求項６２〜６９のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項７１】
前記ベクターが発現ベクターである、請求項７０に記載のベクター。
【請求項７２】
請求項６２〜６９のいずれか一項に記載の核酸分子、または請求項７０もしくは７１に記載のベクターを含む、組換え宿主細胞。
【請求項７３】
前記宿主細胞が細菌細胞である、請求項７２に記載の宿主細胞。
【請求項７４】
前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項７２に記載の宿主細胞。
【請求項７５】
前記宿主細胞がヒト細胞である、請求項７４に記載の宿主細胞。
【請求項７６】
請求項１〜６１のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片を産生する方法であって、請求項７２〜７５のいずれかに記載の宿主細胞を、コードされる抗体またはその抗原結合断片の発現を許容する条件下で培養することを含む、方法。
【請求項７７】
有効量の請求項１〜６１のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片と、薬学的に許容される希釈剤、担体または賦形剤と、を含む、医薬組成物。
【請求項７８】
非経口送達に適合する、請求項７７に記載の医薬組成物。
【請求項７９】
静脈内送達に適合された、請求項７８に記載の医薬組成物。
【請求項８０】
局所送達に適合された、請求項７７に記載の医薬組成物。
【請求項８１】
医薬に使用するための、請求項１〜６１のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項８２】
癌の治療に使用するための、請求項１〜６１のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項８３】
前記癌が、前立腺癌、乳癌、結腸直腸癌、腎臓癌、膵癌、卵巣癌、肺癌、子宮頸癌、横紋筋肉腫、神経芽細胞腫、骨癌、多発性骨髄腫、白血病（急性リンパ芽球性白血病［ＡＬＬ］および急性骨髄性白血病［ＡＭＬ］等）、皮膚癌（例えば、黒色腫）、膀胱癌および神経膠芽腫からなる群から選択される、請求項８２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項８４】
前記使用は、事前にスクリーニングされ、ＣＤ１３７およびＦｃγＲを発現する細胞を含む腫瘍を有すると同定された患者を治療するためのものである、請求項８３記載の使用のための抗体またはその抗原結合断片。
【請求項８５】
癌の治療用の薬剤の製造における、請求項１〜６１のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片の使用。
【請求項８６】
前記癌が、前立腺癌、乳癌、結腸直腸癌、腎臓癌、膵癌、卵巣癌、肺癌、子宮頸癌、横紋筋肉腫、神経芽細胞腫、骨癌、多発性骨髄腫、白血病（急性リンパ芽球性白血病［ＡＬＬ］および急性骨髄性白血病［ＡＭＬ］等）、皮膚癌（例えば、黒色腫）、膀胱癌および神経膠芽腫からなる群から選択される、請求項８５に記載の抗体または抗原結合断片の使用。
【請求項８７】
前記薬剤が、事前にスクリーニングされ、ＣＤ１３７およびＦｃγＲを発現する細胞を含む腫瘍を有すると同定された患者を治療するためのものである、請求項８６に記載の抗体または抗原結合断片の使用。
【請求項８８】
有効量の請求項１〜６１のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片を、それを必要とする個体に投与するステップを含む、癌を有する個体を治療するための方法。
【請求項８９】
前記癌が、前立腺癌、乳癌、結腸直腸癌、腎臓癌、膵癌、卵巣癌、肺癌、子宮頸癌、横紋筋肉腫、神経芽細胞腫、骨癌、多発性骨髄腫、白血病（急性リンパ芽球性白血病［ＡＬＬ］および急性骨髄性白血病［ＡＭＬ］等）、皮膚癌（例えば、黒色腫）、膀胱癌および神経膠芽腫からなる群から選択される、請求項８８に記載の個体を治療するための方法。
【請求項９０】
事前にスクリーニングされ、ＣＤ１３７およびＦｃγＲを発現する細胞を含む腫瘍を有すると同定されている、請求項８９に記載の個体を治療するための方法。
【請求項９１】
患者がＣＤ１３７およびＦｃγＲを発現する細胞を含む腫瘍を有するかどうかを同定するために、患者をスクリーニングすることを含む、請求項１〜６１のいずれかに記載の抗体による治療に対して感受性を示す患者を同定する方法。
【請求項９２】
請求項１〜６１のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片と、１つ以上のさらなる治療剤と、を含む、併用療法。
【請求項９３】
前記１つ以上のさらなる治療剤が癌の治療剤である、請求項９２に記載の併用療法。
【請求項９４】
明細書を参照して特許請求の範囲に記載される、抗体またはその抗原結合断片。
【請求項９５】
実質的に前記明細書を参照して特許請求の範囲に定義される通りである、医薬組成物または核酸分子またはベクターまたは宿主細胞またはキット。
【請求項９６】
前記明細書を参照して特許請求の範囲に実質的に定義される通りである、使用または方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌等の疾患の治療に有用性を有する、ＣＤ１３７に対する結合特異性を有する抗体ベースのポリペプチドに関する。本発明はまた、そのような抗体を含む医薬組成物、使用、方法およびキットにも関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＤ１３７（４−１ＢＢ、ＴＮＦＲＳＦ９）はＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーのメンバーであり、活性化されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ、ＤＣ、単球、肥満細胞ならびに好酸球に発現する。ＣＤ１３７の活性化は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化および生存において重要な役割を果たす（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｐｕｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。それは、エフェクター機能を開始させるのではなく、持続および増強させ、Ｔｈ１サイトカイン産生を優先的に支持する（Ｓｈｕｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。ＣＤ４＋Ｔ細胞において、ＣＤ１３７刺激は最初に活性化、後に活性化誘導性細胞死をもたらし、なぜＣＤ１３７アゴニスト抗体が腫瘍免疫だけではなく自己免疫においても治療効果を示したかを説明する（Ｚｈａｎｇ，ＪＣＩ，２００７，Ｓｕｎ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ，２００３）。ＣＤ１３７はＴｒｅｇ機能も抑制する（Ｓｏ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ，２００８）。ＣＤ１３７の活性化は、受容体のオリゴマー化に依存する（Ｒａｂｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｗｙｚｇｏｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。
【０００３】
ＣＤ１３７アゴニスト抗体は、腫瘍環境において内皮細胞を活性化し、ＩＣＡＭ−１およびＶＣＡＭ−１の上方制御およびＴ細胞動員の改善をもたらすことが示されている（Ｐａｌａｚｏｎ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２０１１）。
【０００４】
ＣＤ１３７は、マウスまたはヒトにおいて、それぞれサイトカインまたはＣＤ１６によって活性化されたＮＫ細胞で上方制御される（例えば、Ｍｅｌｅｒｏ，ＣＣＲ１９（５）１０４４−５３，２０１３およびそこに引用される参考文献を参照されたい）。ＣＤ１３７は、マウスだけではなくヒトにおいてもＮＫ細胞を活性化し、ＡＤＣＣを増強することが示されている（Ｋｏｈｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）が、マウスにおいてＮＫ細胞活性化をもたらし、ヒトにおいて阻害をもたらすという、マウスおよびヒトにおいてＮＫ細胞に対する反対の作用を示唆する報告が存在する（Ｂａｅｓｓｌｅｒ，Ｂｌｏｏｄ，２０１０）。
【０００５】
いくつかの研究は、アゴニストＣＤ１３７抗体を用いた処置による腫瘍免疫の誘導を実証している（Ｄｕｂｒｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｇａｕｔｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；ＭｃＭｉｌｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｍｅｌｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｓａｌｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｔａｒａｂａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｕｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｖｉｎａｙ  ａｎｄ  Ｋｗｏｎ，２０１２；Ｗｉｌｃｏｘ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。さらに、それは、前臨床モデルにおいてＣｐＧ、ＴＲＡＩＬ、ＣＤ４０、ＯＸ−４０、ＤＲ５、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４Ｔｉｍ−３、ＩＬ−２、ＩＬ−１２を含むいくつかの免疫調節剤と相乗作用を発揮する（Ｃｕｒｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｇｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｋｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｍｏｒａｌｅｓ−Ｋａｓｔｒｅｓａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｐａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｓｔ  Ｒｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｕｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｗｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｗｅｓｔｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｗｅｓｔｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４ａ；Ｗｅｓｔｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４ｂ）。
【０００６】
２つのＣＤ１３７抗体が臨床開発中である。ウレルマブ（ＢＭＳ−６６５１３）は、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂによって開発された完全ヒトＩｇＧ４抗体である。種々の適応症におけるいくつかの第Ｉ相試験および第ＩＩ相試験が現在進行中である。他の開発中のＣＤ１３７抗体は、Ｐｆｉｚｅｒによって開発された完全ヒトＩｇＧ２抗体、ＰＦ−０５０８２５６６である。これは現在、リンパ腫および種々の固形癌において第Ｉ相開発段階にある。
【０００７】
ＣＤ１３７抗体のアゴニスト効果は、Ｆｃ領域のアイソタイプによって影響を受ける。診療所で検査される抗体は、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４のいずれかである。ほとんどのＴＮＦＲファミリーメンバーと同様に、ＣＤ１３７は活性化のために架橋に依存する（Ｗｉｌｓｏｎ２０１１，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ）。ＡＰＣの膜上に発現されるＣＤ１３７Ｌは、受容体の著しい複数の架橋を誘導し得る。抗体は、それ自体では２つのＣＤ１３７受容体と架橋できるのみであり、強いシグナルを誘導するためには、他の細胞上で発現されるＦｃγＲｓを介したさらなる架橋（トランス）が強いＣＤ１３７媒介シグナルの誘導に必要であり得る。これに対する例外は、未知の機構によって架橋非依存性シグナル伝達を誘導するＩｇＧ２抗体であり得る（Ｗｈｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ，２０１５Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ）。Ｔ細胞はＦｃγＲｓを発現せず、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＦｃγＲｓ媒介性架橋は、単球、マクロファージ、ＤＣ、ならびに潜在的にＢ細胞および他の細胞型によって媒介されると考えられている。ＣＤ４０アゴニストのマウスモデルにおいて、阻害性ＦｃγＲであるＦｃγＲＩＩＢとの相互作用がこの効果に大きな役割を果たすことが示唆されている（Ｌｉ２０１１，Ｓｃｉｅｎｃｅ）が、ＯＸ４０抗体の場合、活性化受容体との相互作用がより重要であり得る（Ｂｕｌｌｉａｒｄ２０１４，Ｉｍｍ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ）。ＣＤ１３７抗体の場合、ＦｃγＲＩＩは重要ではない（Ｓａｎｍａｍｅｄ２０１５，Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃ）。ヒトのＦｃγＲ分布、および異なるＦｃγＲに対する異なるＩｇＧアイソタイプの親和性がマウスと異なるため、この解釈の妥当性は不明である。さらに、ヒトＩｇＧ１は、ｍＩｇＧＩＩａと同様であり、またｍＩｇＧ１よりも著しく低い、比較的低い親和性でｍＩｇＧＩＩａに結合するが、後者はｉｎ  ｖｉｖｏで最も強力な効果を有する（Ｌｉ  Ｓｃｉｅｎｃｅ２０１１，Ｏｖｅｒｄｉｊｋ２０１２ＪＩ，Ｈｏｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ２００８，Ｗｈｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ２０１１ａｎｄ２０１４）。
【０００８】
考慮すべき別の要因は、ＦｃγＲ受容体の関与が、抗体でコーティングした細胞で、ＡＤＣＣ、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）も引き起こす可能性があるということである（簡略化のために、以下のＡＤＣＣはＡＤＣＰおよびＣＤＣを含むものとする）。典型的には、ヒトＩｇＧ１は、標的の性質、細胞型および受容体密度に応じて、ＮＫ／マクロファージ依存性ＡＤＣＣの強力な誘導物質である。ＩｇＧ４抗体もまたＡＤＣＣを誘導し得るが、ＩｇＧ１よりも低い程度である（Ｗａｎｇ２０１５，Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍ；Ｖｉｄａｒｓｏｎ２０１４Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍ）。
【０００９】
したがって、アイソタイプが異なるＣＤ１３７アゴニスト抗体の効果は、１）より強い免疫活性化をもたらす架橋の誘導と、２）エフェクターＴ細胞（主にＣＤ８Ｔ細胞）およびＴｒｅｇｓの両方の死滅をもたらし得るＡＤＣＣの誘導とのバランスによって影響を受け得る。１）および２）の正味の効果は、ＣＤ１３７発現細胞の分布、標的細胞がＦｃγＲ発現免疫細胞と結合する可能性、受容体密度および親和性、ならびにＡＤＣＣに対するＴｅｆｆ対Ｔｒｅｇの感受性に依存する可能性が高い。ＣＤ１３７の発現は、黒色腫腫瘍においてＣＤ８およびＴｒｅｇの両方で高い（Ｑｕｅｚａｄａ，ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ＳＩＴＣ２０１５）。ＩｇＧ４型は、マクロファージおよび単球によるＦｃγＲＩ媒介性架橋を可能にするが、それでもなおエフェクターＣＤ８Ｔ細胞のＮＫ媒介性ＡＤＣＣを最小限に抑える。
【００１０】
しかしながら、上記で概説したように、マウスとヒトのＦｃＲ間の発現および親和性の違いのために、マウスモデルにおいて異なるヒトＦｃの比較を説明することは困難である。さらに、ＣＤ１３７とＣＤ１３７Ｌとの結合をブロックする抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの機能的帰結が現在議論されている。
【００１１】
いくつかの研究は、アゴニストＣＤ１３７ｍＡｂを用いた処置による腫瘍免疫の誘導を実証している（Ｄｕｂｒｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｇａｕｔｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；ＭｃＭｉｌｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｍｅｌｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｓａｌｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｔａｒａｂａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｕｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｖｉｎａｙ  ａｎｄ  Ｋｗｏｎ，２０１２；Ｗｉｌｃｏｘ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。２つの異なる抗体、Ｌｏｂ１２．３および３Ｈ３が、マウスのｉｎ  ｖｉｖｏ試験に一般的に使用される（Ｓｈｕｆｏｒｄ１９９７Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ）。
【００１２】
マウスモデルに見られる毒性は、時間依存的ではあるが用量依存的ではない様式で反復投与した後に検出された（Ａｓｃｉｅｒｔｏ２０１０Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃ，Ｄｕｂｒｏｔ２０１０Ｃａｎ  Ｉｍｍ，Ｎｉｕ２００７ＪＩ）。毒性は、皮膚毒性および肝毒性：アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ／アラニンアミノトランスフェラーゼ比（ＡＳＡＴ／ＡＬＡＴ）およびサイトカイン放出を含む。これは、毒性が、免疫細胞集団（おそらくＴ細胞）のＣＤ１３７媒介性の事前活性化を必要とするか、または増強された架橋をもたらし得るＣＤ１３７抗体の凝集体を潜在的に形成する抗薬物抗体（ＡＤＡ）応答によって引き起こされる二次効果に依存するかを示唆しているマウスに見られる毒性は可逆的であり、ＴＮＦα／ＣＤ８細胞依存性に依存すると考えられる（Ａｓｃｉｅｒｔｏ２０１０Ｓｅｍ  Ｏｎｃ）。サルの毒性試験では、４週間にわたって週１回、最大１００ｍｇ／ｋｇの単回投与および反復投与の両方が、皮膚毒性または肝毒性が検出されることなく許容されることが示された（Ａｓｃｉｅｒｔｏ２０１０，Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃ）。
ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーを介した長期かつ継続的な活性化は、免疫枯渇につながる可能性がある。したがって、受容体を発現している細胞の休止期間を可能にする様式でそのような抗体を投与することが有利であるかもしれない。特定の投薬プロトコルにおいて休止期間を延長するための１つのアプローチは、例えば、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）との結合を減少させることによって、抗体の半減期を短縮することである。これは、投与経路にもよるが、治療に付随する毒性も軽減することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】米国特許第４，２３５，８７１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
改善された抗腫瘍療法、特に臨床用途に適した、軽減された毒性等の改善された特性を有する抗ＣＤ１３７抗体に対する必要性が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の第１の態様は、ＣＤ１３７のドメイン２に対する結合特異性を有する抗体またはその抗原結合断片（「抗体ポリペプチド」）を提供し、該抗体または抗原結合断片は、ＣＤ１３７アゴニストであり、かつ参照抗体「１６３０／１６３１」とヒトＣＤ１３７との結合を阻害することができる。
【００１６】
本発明の第２の態様は、ＣＤ１３７のドメイン２に対する結合特異性を有する抗体またはその抗原結合断片（「抗体ポリペプチド」）を提供し、該抗体または抗原結合断片はＣＤ１３７アゴニストであり、かつ参照抗体「２６７４／２６７５」とヒトＣＤ１３７との結合を阻害することができる。
【００１７】
本発明の上記態様の一実施形態において、抗体または抗原結合断片は、参照抗体「１６３０／１６３１」および／または「２６７４／２６７５」とヒトＣＤ１３７との結合を阻害することができる。
【００１８】
本発明の第１の態様によれば、１つ以上の参照抗体とヒトＣＤ１３７との結合を阻害することができる抗体ポリペプチドが提供される。
【００１９】
誤解を避けるために、以下の開示は本発明の第１および第２の態様の両方に適用できる。
【００２０】
「ＣＤ１３７」は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＨ０６１９６．１（その配列は以下の配列番号１１に記載される）に記載されるような、ヒトＣＤ１３７タンパク質を特に含む。ＣＤ１３７は、科学文献において４−１ＢＢおよびＴＮＦＲＳＦ９としても知られている。
【００２１】
ヒトＣＤ１３７、アミノ酸配列：＞ｇｉ｜５７１３２１｜ｇｂ｜ＡＡＡ５３１３３．１｜４−１ＢＢ［ホモサピエンス］
【化１】
2020501531.tif 000003
【００２２】
「ドメイン２」は、ヒトＣＤ１３７のアミノ酸６６〜１０７に対応する（上記配列番号１１の太字の下線領域を参照）。
【００２３】
したがって、本発明の抗体ポリペプチドは、ＣＤ１３７に対する特異性を有する。「特異性」は、抗体ポリペプチドが、ｉｎ  ｖｉｖｏで、すなわち、ＣＤ１３７が人体内に存在する生理学的条件下で、ＣＤ１３７に結合することができることを意味する。好ましくは、抗体ポリペプチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏでは他のいかなるタンパク質にも結合しない。そのような結合特異性は、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学、免疫沈降、ウェスタンブロット、およびＣＤ１３７を発現するトランスフェクト細胞を用いたフローサイトメトリー等の当該技術分野において周知の方法によって決定することができる。
【００２４】
抗体は、好ましくは、１０×１０−９Ｍ未満または７×１０−９Ｍ未満、より好ましくは４、または２×１０−９Ｍ未満、最も好ましくは１．２×１０−９Ｍ未満のＫｄ値でヒトＣＤ１３７に結合する。有利には、抗体ポリペプチドは、ＣＤ１３７に選択的に結合することができる、すなわち、他のいかなるタンパク質と比べて少なくとも１０倍強力にＣＤ１３７に結合する。抗ＣＤ１３７抗体は、好ましくはＣＤ１３７に特異的に結合する、すなわち、ＣＤ１３７には結合するが他の分子には結合しないかまたはより低い親和性で結合する。したがって、典型的には、ヒトＣＤ１３７に対する抗体のＫｄは、他の非標的分子、例えば、マウスＣＤ１３７、他のＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー、または環境中の任意の他の無関係な物質もしくは付随する物質に対するＫｄの２倍、好ましくは５倍、より好ましくは１０倍低い。より好ましくは、Ｋｄは、５０倍少ない、さらにより好ましくは１００倍少ない、さらにより好ましくは２００分倍少ない。
【００２５】
相互作用（抗体とリガンドとの間の相互作用等）の全体的な親和性（ＫＤ）ならびにオン速度（ｋａ）およびオフ速度（ｋｄ）を測定するための方法は、当該技術分野において周知である。例示的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ法は、添付の実施例に記載される。フローサイトメトリーに基づく方法を使用することも考えられる（Ｓｋｌａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｔｒｕｃｔ，（３１），９７−１１９，２００２）。
【００２６】
本明細書で使用されるＣＤ１３７という用語は、典型的にはヒトＣＤ１３７を指す。抗体は、非ヒト霊長類、例えばＭａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（カニクイザル）由来のＣＤ１３７等の、他の哺乳動物由来のＣＤ１３７に対してある程度の結合親和性を有し得る。抗体は、好ましくはマウスＣＤ１３７に結合しない、かつ／または他のヒトＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー、例えばヒトＯＸ４０もしくはＣＤ４０に結合しない。
【００２７】
典型的には、本発明は、その天然状態にあるＣＤ１３７、特に細胞表面に局在するＣＤ１３７に対して親和性を有する抗体または抗原結合断片を提供する。
【００２８】
「細胞の表面に局在する」は、ＣＤ１３７の１つ以上の領域が細胞表面の外面に存在するように、ＣＤ１３７が細胞と会合していることを意味する。例えば、ＣＤ１３７は、細胞外表面に提示された１つ以上の領域とともに細胞原形質膜に挿入され得る（すなわち、膜貫通タンパク質として配向される）。これは細胞によるＣＤ１３７の発現の過程で起こり得る。したがって、一実施形態において、「細胞の表面に局在する」は、「細胞の表面に発現する」ことを意味し得る。代替として、ＣＤ１３７は、それを細胞表面の特定の領域（単数または複数）に局在化させる共有結合的および／またはイオン的な相互作用によって細胞外に存在してもよい。
【００２９】
本明細書に定義される抗体およびその抗原結合断片は、ＣＤ１３７アゴニストである。例えば、それらはＣＤ８＋Ｔ細胞からのインターフェロンγの放出を誘導することが可能であり得る。抗ＣＤ１３７抗体のアゴニスト活性は、初代ＣＤ８＋Ｔ細胞に基づくＴ細胞アッセイにおいて評価され得る（実施例を参照）。
【００３０】
したがって、抗体はＣＤ１３７を発現する細胞の活性を調節することができ、該調節は該細胞の活性の増加または低下である。細胞は、典型的にはＴ細胞である。抗体は、ＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋エフェクター細胞の活性を増加させることができるか、または制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の活性を低下させることができるか、もしくは該細胞を枯渇させることができる。いずれの場合も、抗体の正味の効果は、エフェクターＴ細胞、特にＣＤ４＋、ＣＤ８＋、またはＮＫエフェクターＴ細胞の活性の増加である。エフェクターＴ細胞の活性の変化を決定するための方法は周知であり、先に記載される通りである。
【００３１】
抗体は、好ましくはｉｎ  ｖｉｔｒｏでＣＤ８＋Ｔ細胞における活性の増加を引き起こし、任意選択的に、該活性の増加は、Ｔ細胞による増殖、ＩＦＮ−γ産生および／またはＩＬ−２産生の増加である。増加は、同じアッセイで測定されたアイソタイプ対照抗体によって引き起こされる活性の変化より、好ましくは少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも１０倍、さらにより好ましくは少なくとも２５倍高い。
【００３２】
上記で概説したように、１つ以上の参照抗体とヒトＣＤ１３７との結合を阻害することができる抗体ポリペプチドが提供される。本明細書に記載される参照抗体は、参照抗体１６３０／１６３１および参照抗体２６７４／２６７５である。
【００３３】
参照抗体「１６３０／１６３１」は、それぞれ配列番号１７および１８のアミノ酸配列を有する重鎖および軽鎖を含むインタクトなＩｇＧ抗体を意味する。
【化２】
2020501531.tif 000004
【化３】
2020501531.tif 000005
【００３４】
参照抗体「２６７４／２６７５」は、それぞれ配列番号２９および３０のアミノ酸配列を有する重鎖および軽鎖を含むインタクトなＩｇＧ抗体を意味する。
【化４】
2020501531.tif 000006
【化５】
2020501531.tif 000007
【００３５】
以下に論じるように、参照抗体「１６３０／１６３１」は、ＣＤ１３７のドメイン２に結合する。参照抗体２６７４／２６７５もまた、ＣＤ１３７のドメイン２に結合する。したがって、本発明の抗体または抗原結合断片は、ＣＤ１３７のドメイン２にも結合することを理解されたい。
【００３６】
「参照抗体「１６３０／１６３１」とヒトＣＤ１３７との結合を阻害することができる」は、本発明の抗体ポリペプチドの存在が、「１６３０／１６３１」とヒトＣＤ１３７との結合を全体的または部分的に阻害することを意味する。同様に、「参照抗体「２６７４／２６７５」とヒトＣＤ１３７との結合を阻害することができる」は、本発明の抗体ポリペプチドの存在が、「２６７４／２６７５」とヒトＣＤ１３７との結合を全体的または部分的に阻害することを意味する。そのような競合的結合阻害は、当該技術分野において周知のアッセイおよび方法を用いて、例えば、固定化されたＣＤ１３７を有するＢＩＡｃｏｒｅチップを使用して、試験される抗体ポリペプチドを用いておよび用いずに、参照抗体「１６３０／１６３１」または「２６７４／２６７５」とともにインキュベートすることにより決定することができる。代替として、参照抗体「１６３０／１６３１」または「２６７４／２６７５」をＢＩＡｃｏｒｅチップの表面に固定化し、ＣＤ１３７抗原を固定化した抗体に結合させ、次いで二次抗体を同時ＣＤ１３７結合能について試験する、ペアワイズマッピング手法を用いることができる（例えば、「ＢＩＡｃｏｒｅ  Ａｓｓａｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ’，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２９−０１９４−００ＡＡ０５／２０１２（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。
【００３７】
さらなる代替例において、競合的結合阻害はフローサイトメトリーを用いて決定することができる。例えば、試験抗体が１６３０／１６３１または２６７４／２６７５参照抗体の細胞表面抗原との結合を阻害することができるかどうかを調べるために、抗原を発現する細胞を、細胞を洗浄する前に試験抗体とともに２０分間プレインキュベートし、フローサイトメトリーによって検出することができるフルオロフォアにコンジュゲートした参照１６３０／１６３１または２６７４／２６７５抗体とともにインキュベートすることができる。試験抗体とのプレインキュベーションがフローサイトメトリーにおける参照１６３０／１６３１または２６７４／２６７５抗体の検出率を低下させる場合、試験抗体は参照抗体と細胞表面抗原との結合を阻害する。試験される抗体がＣＤ１３７に対して高い親和性を示す場合、より短いプレインキュベーション期間が用いられてもよい（またはプレインキュベーションを全く行わなくてもよい）。
【００３８】
さらなる代替例において、競合的結合阻害は、（例えば、実施例８に記載されるように）ＥＬＩＳＡを用いて決定することができる。
【００３９】
「抗体またはその抗原結合断片」は、実質的にインタクトな抗体分子だけではなく、キメラ抗体、ヒト化抗体、単離されたヒト抗体、単鎖抗体、二重特異性抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖および／または軽鎖のホモ二量体およびヘテロ二量体、ならびにそれらの抗原結合断片および誘導体を含む。好適な抗原結合断片および誘導体として、必ずしも限定されないが、Ｆｖ断片（例えば、単鎖Ｆｖおよびジスルフィド結合Ｆｖ）、Ｆａｂ様断片（例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片およびＦ（ａｂ）２断片）、単一可変ドメイン（例えばＶＨおよびＶＬドメイン）およびドメイン抗体（ｄＡｂ、単一および二重形式［すなわちｄＡｂ−リンカー−ｄＡｂ］を含む）が挙げられる。全抗体ではなく抗体断片を使用する潜在的な利点は、数倍にもなる。より小さいサイズの断片は、固形組織のより良好な透過性等の改善された薬理学的特性をもたらし得る。さらに、Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、およびｄＡｂ抗体断片等の抗原結合断片は、Ｅ．ｃｏｌｉで発現されてそこから分泌され得るため、大量の該断片を容易に産生することを可能にする。
【００４０】
例えば、抗原結合断片は、ｓｃＦｖ分子、すなわち、ＶＨおよびＶＬパートナードメインが柔軟なオリゴペプチドを介して結合している分子を含んでもよい。
【００４１】
「抗体またはその抗原結合断片」という句はまた、抗体模倣物（例えば、高度の安定性を有するが、特定の位置に可変性を導入することを可能にする非抗体足場構造）を包含することが意図される。生化学の当業者は、Ｇｅｂａｕｅｒ＆Ｓｋｅｒｒａ，２００９，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ１３（３）：２４５−２５５（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）に論じられるように、多くのそのような分子に精通しているであろう。例示的な抗体模倣物として、アフィボディ（トリネクチンとも称される、Ｎｙｇｒｅｎ，２００８，ＦＥＢＳ  Ｊ，２７５，２６６８−２６７６）、ＣＴＬＤ（テトラネクチンとも称される、Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ  Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．（２００６），２７−３０）、アドネクチン（モノボディとも称される、Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３５２（２００７），９５−１０９）、アンチカリン（Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ（２００５），１０，２３−３３）、ＤＡＲＰｉｎ（アンキリン、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００４），２２，５７５−５８２）、アビマー（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００５），２３，１５５６−１５６１）、マイクロボディ（ＦＥＢＳ  Ｊ，（２００７），２７４，８６−９５）、ペプチドアプタマー（Ｅｘｐｅｒｔ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．（２００５），５，７８３−７９７）、クニッツドメイン（Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．（２００６）３１８，８０３−８０９）、アフィリン（Ｔｒｅｎｄｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００５），２３，５１４−５２２）、アフィマー（Ａｖａｃｔａ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗｅｔｈｅｒｂｙ，ＵＫ）が挙げられる。
【００４２】
当業者はさらに、本発明が、現在存在するかまたは将来的に存在するかにかかわらず、抗体およびその抗原結合断片の修飾型、例えば、ポリエチレングリコールまたは別の好適なポリマーの共有結合により修飾された型も包含することを理解するであろう（下記参照）。
【００４３】
抗体および抗体断片を作製する方法は、当該技術分野において周知である。例えば、抗体分子のｉｎ  ｖｉｖｏ産生の誘導、免疫グロブリンライブラリーのスクリーニング（Ｏｒｌａｎｄｉ．ｅｔ  ａｌ，１９８９．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：３８３３−３８３７、Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ３４９：２９３−２９９（その開示は参照により本明細書に組み込まれる））、または培養中の細胞株によるモノクローナル抗体分子の形成を用いるいくつかの方法のうちのいずれか１つを介して抗体を作製することができる。これらは、限定されないが、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、およびエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）−ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９７５．Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５０４９７；Ｋｏｚｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ８１：３１−４２；Ｃｏｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８０：２０２６−２０３０；Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６２：１０９−１２０（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）を含む。
【００４４】
モノクローナル抗体の産生に適した方法はまた、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，Ｈ  Ｚｏｌａ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８（その開示は参照により本明細書に組み込まれる））および「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ｊ  Ｇ  Ｒ  Ｈｕｒｒｅｌｌ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９８２（その開示は参照により本明細書に組み込まれる））にも開示されている。
【００４５】
同様に、抗体断片は、当該技術分野において周知の方法を用いて得ることができる（例えば、Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ，１９８８，“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。例えば、本発明による抗体断片は、抗体のタンパク質分解性加水分解によって、または断片をコードするＤＮＡのＥ．ｃｏｌｉもしくは哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞培養物または他のタンパク質発現系）における発現によって調製することができる。代替として、抗体断片は、従来の方法による全抗体のペプシンまたはパパイン消化によって得ることができる。
【００４６】
本発明の抗体は、参照抗体１６３０／１６３１および２６７４／２６７５の可変領域を参照することによって定義される。
【００４７】
「１６３０／１６３１」と命名された参照抗体は以下を含む：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域
【化６】
2020501531.tif 000008
および
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域
【化７】
2020501531.tif 000009
【００４８】
「２６７４／２６７５」と命名された参照抗体は以下を含む：
（ａ）配列番号１９のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域
【化８】
2020501531.tif 000010
および
（ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域
【化９】
2020501531.tif 000011
【００４９】
本明細書で使用される「アミノ酸」という用語は、標準的な２０個の遺伝的にコードされたアミノ酸およびそれらの対応する（天然の「Ｌ」型と比較して）「Ｄ」型の立体異性体、ωアミノ酸および他の天然に存在するアミノ酸、非従来型アミノ酸（例えば、α，α−ジ置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸等）ならびに化学的に誘導されたアミノ酸を含む（下記参照）。
【００５０】
アミノ酸が「アラニン」または「Ａｌａ」または「Ａ」のように具体的に列挙されている場合、その用語は、他に明示的に述べられていない限り、Ｌ−アラニンおよびＤ−アラニンの両方を指す。所望の機能特性がポリペプチドによって保持されている限り、他の非従来型アミノ酸も本発明のポリペプチドに適した成分であり得る。示されたペプチドについて、各コードされたアミノ酸残基は、必要に応じて、従来型アミノ酸の慣用名に対応する一文字表記によって表される。
【００５１】
一実施形態において、本明細書に定義される抗体ポリペプチドは、Ｌ−アミノ酸を含むかまたはそれからなる。
【００５２】
当業者は、抗体またはその抗原結合断片の結合特異性が、構成重鎖および軽鎖の可変領域内の相補性決定領域（ＣＤＲ）、例えば、本明細書に記載されるＣＤＲ等の存在によって付与されることを理解するであろう。
【００５３】
当業者はさらに、上記可変領域を含む任意のインタクトなＩｇＧ抗体が、１６３０／１６３１または２６７４／２６７５がＣＤ１３７と結合するのを競合的に阻害する本発明の抗体ポリペプチドを同定するための参照抗体として使用され得ることを理解するであろう。しかしながら、好ましくは、参照抗体１６３０／１６３１は、それぞれ配列番号１７および１８に定義される重鎖および軽鎖からなり、参照抗体２６７４／２６７５は、それぞれ配列番号２９および３０に定義される重鎖および軽鎖からなる。
【００５４】
競合的結合は、典型的には、試験抗体が参照抗体（この場合は１６３０／１６３１または２６７４／２６７５）に結合する抗原のエピトープで結合するか、または少なくともそれに非常に近接して結合するために生じる。しかしながら、当業者は、競合的結合が立体障害によっても生じ得ることを理解するであろう：したがって、試験抗体は、参照抗体が結合するエピトープとは異なるエピトープで結合し得るが、それでもなお参照抗体と抗原との結合を妨げるのに十分なサイズまたは構成であり得る。
【００５５】
本発明の抗体および抗原結合断片は、それらを癌の診断薬および治療剤として特に好適にする特性を示すことに基づいて、抗ＣＤ１３７抗体のスクリーニング後に同定された。
【００５６】
したがって、一実施形態において、抗体または抗原結合断片は、以下の特性のうちの１つ以上を示す：
ａ）架橋依存性機構を介してＣＤ１３７を刺激し、Ｔ細胞および他の免疫細胞を活性化する能力（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞からのインターフェロンγの放出を誘導するため、実施例を参照）、および／または
ｂ）カニクイザルＣＤ１３７との交差反応性（実施例を参照）。
【００５７】
例えば、抗体または抗原結合断片は、上記特性の両方を示し得る。
【００５８】
上記のように、本発明の抗体は架橋依存性機構を有し得る。「架橋依存性機構」は、ＣＤ１３７を刺激するために抗体がＣＤ１３７およびＦｃ受容体の両方に結合しなければならない、Ｆｃ架橋依存性の機構を含む。そのため、抗体は、ＣＤ１３７およびＦｃ受容体の両方に結合することができなければならない。
【００５９】
好ましい実施形態において、標的とされるＦｃ受容体はＦｃγＲである。ＦｃγＲの例として、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＢが挙げられる。したがって、一実施形態において、ＦｃγＲはＦｃγＲＩＩＡであり得る。ＦｃγＲＩＩＡは、ＦｃγＲＩＩＡのＲ１３１およびＨ１３１アロタイプの両方を含む。したがって、一実施形態において、標的とされるＦｃγＲは、ＦｃγＲＩＩＡのＲ１３１アロタイプである。
【００６０】
代替の実施形態において、抗体は、Ｆｃ受容体との結合の非存在下でＣＤ１３７を刺激することができるように、Ｆｃ架橋非依存性であり得る。
【００６１】
したがって、例示的な抗体２６７４／２６７５および１６３０／１６３１は、共刺激性ＣＤ１３７受容体を標的とするＦｃγＲ架橋依存性アゴニスト抗体である。したがって、それらはＣＤ１３７およびＦｃγＲを発現する細胞を含む組織または腫瘍においてのみ活性である。「ＣＤ１３７およびＦｃγＲを発現する細胞を含む腫瘍」は、ＣＤ１３７およびＦｃγＲを発現する腫瘍細胞および／または腫瘍浸潤性免疫細胞（単球、マクロファージ、樹状細胞、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞および顆粒球等）を含む腫瘍または腫瘍流入領域リンパ節を含む。ＣＤ１３７およびＦｃγＲは、腫瘍内の別々の細胞上で発現され得、かつ／または同じ細胞で同時発現され得ることを理解されたい。したがって、参照抗体２６７４／２６７５および１６３０／１６３１は、腫瘍の微小環境においてＣＤ１３７およびＦｃγＲの両方を発現する細胞に関連した適応症において腫瘍指向性の免疫活性化を提供するであろう：これは、全身性免疫活性化を誘導することができるＦｃγＲ非依存性ＣＤ１３７アゴニスト（例えば、ウレルマブ）とは対照的である。抗体２６７４／２６７５および１６３０／１６３１の腫瘍局在化作用は、主として異なるＦｃγＲを発現する腫瘍浸潤マクロファージ／骨髄細胞の数に依存する。
【００６２】
ＩｇＧ４は、ＦｃγＲＩに対して高親和性で結合し、またＦｃγＲＩＩａおよびＦｃγＲＩＩｂに対して中程度／低い親和性で結合することが知られている。ＦｃγＲＩおよびＦｃγＲＩＩａは単球に発現し、ＦｃγＲＩＩｂはＢ細胞に高密度で発現する。抗体２６７４／２６７５および１６３０／１６３１の架橋は、腫瘍内でおよび隣接する流入領域リンパ節において優先的に起こる。血清ＩｇＧレベルが高い全身血中では、遊離型の非ブロックＦｃγＲの利用可能性は、効果的な架橋が起こるには低すぎると考えられる。したがって、全身性免疫活性化のリスクは低いと考えられており、これは他のＣＤ１３７ｍＡｂと比較してリスク便益プロファイルを改善する。
【００６３】
２６７４／２６７５および１６３０／１６３１等の本発明の抗体を用いた治療のための患者選択およびバイオマーカーの理論的根拠は、ＣＤ１３７およびＦｃγＲを発現する浸潤細胞を有する腫瘍型によって導かれ得る。したがって、本発明の抗体は、ＣＤ１３７およびＦｃγＲを発現する細胞を含む腫瘍を有することに基づいて（すなわち、コンパニオン診断試験として）選択された患者に使用するためのものであり得る。
【００６４】
「浸潤細胞」は、単球、マクロファージ、樹状細胞、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、顆粒球等の腫瘍浸潤性免疫細胞を含む
【００６５】
有利には、抗体または抗原結合断片は、腫瘍免疫を誘導することができる。腫瘍免疫は、当該技術分野において周知の方法を用いて、例えば、同じ腫瘍を用いたＣＤ３１７抗体処置によって所与の腫瘍から治癒したマウスを再チャレンジすることによって、実証することができる。腫瘍免疫が抗体療法によって誘導されている場合、その腫瘍は再チャレンジの際に拒絶される。
【００６６】
一実施形態において、抗体または抗原結合断片は、ＣＤ１３７を発現する細胞に結合すると、以下を誘導することが実質的にできない：
ａ）抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）
ｂ）抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）および／または
ｃ）補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）。
【００６７】
一実施形態において、抗体または抗原結合断片は、参照抗体１６３０／１６３１および／または２６７４／２６７５が結合することができるＣＤ１３７のエピトープと少なくとも部分的に重複する、ＣＤ１３７の細胞外ドメインのエピトープに結合することができる。したがって、抗体または抗原結合断片は、ＣＤ１３７のドメイン２に／その中に位置するエピトープに結合することが可能であり得る。
【００６８】
一実施形態において、本発明の抗体ポリペプチドは、インタクトな抗体（ＩｇＧ１またはＩｇＧ４抗体等）を含むかまたはそれからなる。好ましい態様において、抗体はＩｇＧ４抗体である。
【００６９】
代替の実施形態において、本発明の抗体ポリペプチドは、Ｆｖ断片（例えば、単鎖Ｆｖおよびジスルフィド結合Ｆｖ）、Ｆａｂ様断片（例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片およびＦ（ａｂ）２断片）、およびドメイン抗体（例えば、単一のＶＨ可変ドメインまたはＶＬ可変ドメイン）からなる群から選択される抗原結合断片を含むかまたはそれからなる。特に、抗体ポリペプチドはｓｃＦｖであり得る。
【００７０】
さらなる実施形態において、上で論じたように、本発明のポリペプチドは、アフィボディ、テトラネクチン（ＣＴＬＤ）、アドネクチン（モノボディ）、アンチカリン、ＤＡＲＰｉｎ（アンキリン）、アビマー、ｉＭａｂ、マイクロボディ、ペプチドアプタマー、クニッツドメインおよびアフィリンを含むかまたはそれらからなる群から選択される抗体模倣物を含むかまたはそれからなる。
【００７１】
一実施形態において、本発明の第１または第２の態様による抗体またはその抗原結合断片は、
ａ）コンセンサス配列Ｇ、Ｆ、Ｔ／Ｎ、Ｆ、Ｇ、Ｙ、Ｓ、Ｙを有する重鎖ＣＤＲ１配列
ｂ）コンセンサス配列Ｉ、Ｇ、Ｓ、Ｇ／Ｔ、Ｓ、Ｓ、Ｙ／Ｈ、Ｔを有する重鎖ＣＤＲ２配列、および
ｃ）配列ＡＲＶＹＳＳＰＧＩＤＹを有する重鎖ＣＤＲ３配列、を含む。
【００７２】
一実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、
ａ）コンセンサス配列Ｑ、Ｓ、Ｉ、Ｓ／Ｇ、Ｓ、Ｙ／Ｔを有する軽鎖ＣＤＲ１配列
ｂ）コンセンサス配列Ａ／Ｇ、Ａ、Ｓを有する軽鎖ＣＤＲ２配列、および
ｃ）配列ＱＱＹＹＴＷＶＰＦＴを有する軽鎖ＣＤＲ３配列、を含む。
【００７３】
好ましい態様において、本発明の第１の態様による抗体またはその抗原結合断片は、以下のＣＤＲを含む重鎖可変領域を含む：
ａ）ＧＦＴＦＧＹＳＹ［配列番号３］、または配列番号３と比較して最大３個のアミノ酸変異、例えば、１、２もしくは３個の変異を含むアミノ酸配列
ｂ）ＩＧＳＧＳＳＹＴ［配列番号４］、または配列番号４と比較して最大３個のアミノ酸変異、例えば、１、２もしくは３個の変異を含むアミノ酸配列、および
ｃ）ＡＲＶＹＳＳＰＧＩＤＹ［配列番号５］、または配列番号５と比較して最大３個のアミノ酸変異、例えば、１、２もしくは３個の変異を含むアミノ酸配列。
【００７４】
したがって、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３、４および５のＣＤＲを含む重鎖可変領域を含み得る。
【００７５】
例えば、抗体またはその抗原結合断片は、１６３０／１６３１参照抗体の対応する領域のアミノ酸配列、すなわち配列番号１を有する重鎖可変領域を含み得る。
【００７６】
代替の好ましい実施形態において、本発明の第１または第２の態様による抗体またはその抗原結合断片は、以下のＣＤＲを含む重鎖可変領域を含む：
ａ）ＧＦＮＦＧＹＳＹ［配列番号２１］、または配列番号２１と比較して最大３個のアミノ酸変異、例えば、１、２もしくは３個の変異を含むアミノ酸配列、
ｂ）ＩＧＳＴＳＳＨＴ［配列番号２２］、または配列番号２２と比較して最大３個のアミノ酸変異、例えば、１、２もしくは３個の変異を含むアミノ酸配列、および
ｃ）ＡＲＶＹＳＳＰＧＩＤＹ［配列番号２３］、または配列番号２３と比較して最大３個のアミノ酸変異、例えば、１、２もしくは３個の変異を含むアミノ酸配列。
【００７７】
したがって、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２１、２２および２３のＣＤＲを含む重鎖可変領域を含み得る。
【００７８】
例えば、抗体またはその抗原結合断片は、２６７４／２６７５参照抗体の対応する領域のアミノ酸配列、すなわち配列番号１９を有する重鎖可変領域を含み得る。
【００７９】
しかしながら、ＣＤＲ配列内の低レベルの変異（典型的には、わずか１、２または３個のアミノ酸）は、ＣＤ１３７に対する抗体または抗原結合断片の特異性を喪失することなく許容され得ることを理解されたい（いずれかの実施形態に関して、１６３０／１６３１または２６７４／２６７５）。
【００８０】
例えば、代替の実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、上記で定義されたＣＤＲを含む重鎖可変領域を含んでもよく、Ｈ１およびＨ２のＣＤＲは、それぞれ、配列番号３および４の変異型であり、Ｈ３ＣＤＲは配列番号５である。
【００８１】
さらなる代替の実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、上記で定義されたＣＤＲを含む重鎖可変領域を含んでもよく、Ｈ１およびＨ２のＣＤＲは、それぞれ、配列番号２１および２２の変異型であり、Ｈ３ＣＤＲは配列番号２３である。
【００８２】
パーセント同一性は、例えば、Ｅｘｐａｓｙ機関のサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈ．ｅｍｂｎｅｔ．ｏｒｇ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＬＡＬＩＧＮ＿ｆｏｒｍ．ｈｔｍｌ）において、Ｍａｔｈ．パラメータとして、グローバルアライメントオプション、スコアリングマトリックスＢＬＯＳＵＭ６２、開始ギャップペナルティ−１４、伸長ギャップペナルティ−４を使用して、ＬＡＬＩＧＮプログラム（Ｈｕａｎｇ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．（１９９１）１２：３３７−３５７その開示は参照により本明細書に組み込まれる））によって決定することができる。代替として、２つのポリペプチド間のパーセント配列同一性は、好適なコンピュータプログラム、例えば、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  ＧｒｏｕｐのＧＡＰプログラムを使用して判定されてもよく、パーセント同一性は、配列が最適に整列されたポリペプチドに関連して算出されることを理解されたい。
【００８３】
アライメントは、代替として、（参照により本明細書に組み込まれる、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２２：４６７３−４６８０に記載されるような）ＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを使用して実施されてもよい。使用されるパラメータは、次の通りであり得る。
−高速ペアワイズアライメントパラメータ：Ｋタプル（ワード）：サイズ１、ウィンドウサイズ：５、ギャップペナルティ：３、上対角成分の数：５。スコアリング方法：ｘパーセント。
−マルチプルアライメントパラメータ：ギャップ開始ペナルティ：１０、ギャップ伸長ペナルティ；０．０５。
−スコアリングマトリックス：ＢＬＯＳＵＭ。
【００８４】
代替として、ＢＥＳＴＦＩＴプログラムを使用して、局所配列アライメントを判定してもよい。
【００８５】
さらに好ましい実施形態において、本発明の第１の態様による抗体またはその抗原結合断片は、以下のＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む：
ａ）ＱＳＩＳＳＹ［配列番号６］、または配列番号６と比較して最大３個のアミノ酸変異、例えば１、２もしくは３個の変異を含むアミノ酸配列
ｂ）ＡＡＳ［配列番号７］、または配列番号７と比較して最大２個のアミノ酸変異、例えば、１もしくは２個の変異を含むアミノ酸配列、および
ｃ）ＱＱＹＹＴＷＶＰＦＴ［配列番号８］、または配列番号８と比較して最大３個のアミノ酸変異、例えば１、２もしくは３個の変異を含むアミノ酸配列。
【００８６】
したがって、抗体ポリペプチドは、配列番号６、７および８のＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含み得る。
【００８７】
例えば、抗体またはその抗原結合断片は、１６３０／１６３１参照抗体の対応する領域のアミノ酸配列、すなわち配列番号２を有する軽鎖可変領域を含み得る。
【００８８】
代替の実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、上記で定義されたＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含んでもよく、Ｌ１およびＬ２のＣＤＲは、それぞれ、配列番号６および７の変異型であり、Ｌ３ＣＤＲは配列番号８である。
【００８９】
さらなる好ましい実施形態において、本発明の第１または第２の態様による抗体またはその抗原結合断片は、以下のＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む：
ａ）ＱＳＩＧＳＴ［配列番号２４］、または配列番号２４と比較して最大３個のアミノ酸変異、例えば、１、２もしくは３個の変異を含むアミノ酸配列
ｂ）ＧＡＳ［配列番号２５］、または配列番号２５と比較して最大２個のアミノ酸変異、例えば、１もしくは２個の変異を含むアミノ酸配列、および
ｃ）ＱＱＹＹＴＷＶＰＦＴ［配列番号２６］、または配列番号２６と比較して最大３個のアミノ酸変異、例えば、１、２もしくは３個の変異を含むアミノ酸配列。
【００９０】
したがって、抗体ポリペプチドは、配列番号２４、２５および２６のＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含み得る。
【００９１】
例えば、抗体またはその抗原結合断片は、１６３０／１６３１参照抗体の対応する領域のアミノ酸配列、すなわち配列番号２０を有する軽鎖可変領域を含み得る。
【００９２】
代替の実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、上記で定義されたＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含んでもよく、Ｌ１およびＬ２のＣＤＲは、それぞれ、配列番号２４および２５の変異型であり、Ｌ３ＣＤＲは配列番号２６である。
【００９３】
当業者は、ヒト治療のために、好ましくはヒト抗体またはヒト化抗体が使用されることを理解するであろう。非ヒト（例えば、マウス）抗体のヒト化形態は、非ヒト抗体に由来する最小部分を有する遺伝子操作されたキメラ抗体または抗体断片である。ヒト化抗体は、ヒト抗体（レシピエント抗体）の相補的決定領域が、所望の機能を有するマウス、ラット、またはウサギ等の非ヒト種（ドナー抗体）の相補的決定領域に由来する残基によって置き換えられた抗体を含む。いくつかの例において、ヒト抗体のＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体にも、移入された相補性決定領域またはフレームワーク配列にも見られない残基を含み得る。一般に、ヒト化抗体は、相補性決定領域の全てまたは実質的に全てが非ヒト抗体のものに対応し、フレームワーク領域の全てまたは実質的に全てが関連するヒトコンセンサス配列のものに対応する、少なくとも１つの、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、典型的にはヒト抗体に由来するＦｃ領域等の抗体定常領域の少なくとも一部も含むことが最適である（例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６．Ｎａｔｕｒｅ３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ３３２：３２３−３２９；Ｐｒｅｓｔａ，１９９２，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。
【００９４】
非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当該技術分野において周知である。概して、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば移入残基と称され、典型的には移入可変ドメインから得られる。ヒト化は、本質的に、ヒト相補性決定領域を対応するげっ歯類の相補性決定領域で置換することにより、記載されるように行うことができる（例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ３２１：５２２−５２５；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８．Ｎａｔｕｒｅ３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９：１５３４−１５３６ｌ；ＵＳ４，８１６，５６７（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。したがって、そのようなヒト化抗体は、実質的にインタクト未満のヒト可変ドメインが、非ヒト種由来の対応する配列によって置換されているキメラ抗体である。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかの相補性決定領域残基およびおそらくいくつかのフレームワーク残基が、げっ歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されているヒト抗体であり得る。キメラ抗体は、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒらによって論じられている（１９９８，８ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｐａｒｔ２，７９２−７９９）。
【００９５】
ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリーを含む当該技術分野で既知の種々の技術を用いて同定することもできる（例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ＆Ｗｉｎｔｅｒ，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１；Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐｐ．７７；Ｂｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：８６−９５（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。
【００９６】
当業者は、本発明のヒト化抗体または抗原結合断片が、重鎖定常領域またはその一部をさらに含み得ることを理解するであろう（下記参照）。
【００９７】
一実施態様において、抗体ポリペプチドは、ＩｇＧ重鎖（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖等）のＣＨ１、ＣＨ２および／またはＣＨ３領域を含む。したがって、抗体ポリペプチドは、ＩｇＧ４重鎖由来の定常領域の一部または全てを含み得る。例えば、抗体ポリペプチドは、それぞれ上記で定義された重鎖および軽鎖可変領域のいずれかと組み合わせて、ＣＨ１およびＣＬ定常領域を含むＦａｂ断片であり得る。
【００９８】
同様に、上記で定義された本発明の抗体または抗原結合断片は、軽鎖定常領域またはその一部をさらに含み得る（下記参照）。例えば、抗体ポリペプチドは、κまたはλ軽鎖由来のＣＬ領域を含み得る。
【００９９】
一実施形態において、本発明の抗体または抗原結合断片は、抗体Ｆｃ領域を含む。当業者は、Ｆｃ部分がＩｇＧ抗体、または異なるクラスの抗体（ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥ等）に由来し得ることを理解するであろう。一実施形態において、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４抗体に由来する。しかしながら、有利には、Ｆｃ領域はＩｇＧ４抗体に由来する。
【０１００】
Ｆｃ領域は、天然に存在し得る（例えば、内因性に産生された抗体の一部）か、または人工的であり得る（例えば、天然に存在するＦｃ領域に対して１つ以上の点突然変異を含む）。Ｆｃ領域の変異体は、典型的には、ＦｃγＲおよび／または新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）等のＦｃ受容体に改変された親和性で結合し、ポリペプチドの機能および／または半減期を改善する。生物学的機能および／または半減期は、天然Ｆｃ領域を含むポリペプチドの半減期と比較して延長または短縮することができる。変異体Ｆｃ領域の存在によって調節され得るそのような生物学的機能の例として、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、および／またはアポトーシスが挙げられる。
【０１０１】
したがって、Ｆｃ領域は、天然に存在し得る（例えば、内因性に産生されたヒト抗体の一部）か、または人工的であり得る（例えば、天然に存在するヒトＦｃ領域に対して１つ以上の点突然変異を含む）。
【０１０２】
当該技術分野において十分に実証されているように、抗体のＦｃ領域は、その血清半減期および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）等のエフェクター機能を媒介する。
【０１０３】
治療用モノクローナル抗体またはＦｃ融合タンパク質のＦｃ領域を遺伝子操作することにより、それらに必要とされる薬理活性により適した分子の作製が可能となる（Ｓｔｒｏｈｌ，２００９，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２０（６）：６８５−９１（その開示は参照により本明細書に組み込まれる））。
【０１０４】
（ａ）半減期を延長するために遺伝子操作されるＦｃ領域
治療用抗体の有効性を改善するための１つのアプローチは、その血清持続性を増大させることであり、それによってより高い循環レベル、より少ない頻度の投与、およびより少ない用量を可能にする。
【０１０５】
ＩｇＧの半減期は、新生児受容体ＦｃＲｎへのそのｐＨ依存性結合に左右される。内皮細胞の表面に発現されるＦｃＲｎは、ＩｇＧにｐＨ依存的に結合し、それを分解から保護する。
【０１０６】
ｐＨ６．０ではＦｃＲｎに選択的に結合するが、ｐＨ７．４では選択的に結合しないいくつかの抗体は、様々な動物モデルにおいてより高い半減期を示す。
【０１０７】
Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ（Ｈｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｊ  ＢｉｏｌＣｈｅｍ．２７９（８）：６２１３−６（その開示は参照により本明細書に組み込まれる））およびＭ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ＋Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ（Ｖａｃｃａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（１０）：１２８３−８（その開示は参照により本明細書に組み込まれる））等の、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとの界面に位置するいくつかの突然変異は、ＦｃＲｎに対する結合親和性およびｉｎ  ｖｉｖｏでのＩｇＧ１の半減期を延長することが示されている。
【０１０８】
（ｂ）改変されたエフェクター機能のために遺伝子操作されるＦｃ領域
治療用抗体またはＦｃ融合タンパク質の用途に応じて、（ＡＤＣＣ等の）エフェクター機能を低下または増大させることが望ましい場合がある。
【０１０９】
細胞表面分子、特に免疫細胞上の分子を標的とする抗体については、特定の臨床的適応のためにエフェクター機能を無効にすることが必要な場合がある。
【０１１０】
４つのヒトＩｇＧアイソタイプは、活性化Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩａ）、阻害性ＦｃγＲＩＩｂ受容体、および補体の第１成分（Ｃ１ｑ）と異なる親和性で結合し、非常に異なるエフェクター機能をもたらす（Ｂｒｕｈｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｂｌｏｏｄ．１１３（１６）：３７１６−２５（その開示は参照により本明細書に組み込まれる））。
【０１１１】
ＩｇＧ４対ＩｇＧ２のＦｃγＲＩ結合親和性
Ｂｒｕｈｎｓらは、既知のヒトＦｃγＲおよびそれらの多型変異体の、異なるヒトＩｇＧサブクラスに対する特異性および親和性を評価する一連の実験を行った（Ｂｒｕｈｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｂｌｏｏｄ．１１３（１６）：３７１６−２５（その開示は参照により本明細書に組み込まれる））。この研究において、ＩｇＧ２はＦｃγＲＩに対して検出可能な親和性を有しなかったが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４は全て、ＦｃγＲＩに対するナノモル範囲の結合親和性を示したことが明確に実証された（Ｂｒｕｈｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｂｌｏｏｄ．１１３（１６）：３７１６−２５，Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１１２（３）：８３３−８（その開示は参照により本明細書に組み込まれる））。主要なヒトＦｃγＲおよびそれらの変異体とＩｇＧアイソタイプとの間の相対的結合親和性の概要を表Ａにまとめる。（Ｓｔｅｗａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．２０１４，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２（２９）（その開示は参照により本明細書に組み込まれる））。
【表Ａ】
2020501531.tif 000012
【０１１２】
しかしながら、細胞活性化は、ＩｇＧ免疫複合体に対するＦｃγＲＩの親和性に影響を及ぼし、Ｂｒｕｈｎｓの論文における表面プラズモン共鳴によって生成されたデータは、炎症部位で起こることを正確に再現しない可能性がある。Ｈｏｇａｒｔｈらによる総説（Ｈｏｇａｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．２０１２，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ１１（４）：３１１−３１（その開示は、参照により本明細書に組み込まれる））は、この研究およびＦｃγＲとＩｇＧとの結合に焦点を当てた他の研究の概要を述べている。
【０１１３】
骨髄細胞サブセットにおけるＦｃγＲＩ発現
ヒトＦｃγＲは主に骨髄系統の細胞によって発現され、このことは循環骨髄細胞サブセットに関する多数の研究において実証されている。通常、ＣＤ１４＋ＣＤ１６として同定される古典的単球は、高レベルのＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、中間レベルのＦｃγＲＩ、および低レベルのＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）を呈する（Ａｌｍｅｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．２００１，１００（３）：３２５−３８，Ｃｈｅｅｓｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１６，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ１１（５）：ｅ０１５４６５６（その開示は参照により本明細書に組み込まれる））。しかしながら、ＣＤ１４−ＣＤ１６＋非古典的単球は、高レベルのＦｃγＲＩＩＩ、中間レベルのＦｃγＲＩＩ、および低レベルのＦｃγＲＩを呈する（Ａｌｍｅｉｄａ  ｅｔ  ａｌ。２００１）。異なる骨髄細胞サブセットにおけるヒトＦｃγＲ遺伝子の発現を示すいくつかの公表されているマイクロアレイデータセットの要約および編纂が、これらの観察を裏付けている（Ｇｕｉｌｌｉａｍｓｅｔ  ａｌ．２０１４，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４（２）：９４−１０８（その開示は参照により本明細書に組み込まれる））。
【０１１４】
一旦、組織内に入ると、単球はマクロファージに分化し、環境要因に応じて、これらのマクロファージは特定の表現型を得る。Ｒｏｕｓｓｅｌらによる研究（Ｒｏｕｓｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．２０１７、Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ．１０２（２）：４３７−４４７（その開示は参照により本明細書に組み込まれる））では、種々の炎症性刺激を用いることにより末梢血単球を異なるマクロファージ系統に分極させ、これらの細胞の発現プロファイルを評価した。この場合、ＩＦＮ−γで刺激した単球は、特異的にＣＤ６４の高度に上昇した発現をもたらした。循環ＣＤ１４＋単球上でＣＤ６４発現の増加が検出されたＳＬＥ患者において同様の所見が認められ、それはインターフェロン刺激遺伝子の発現と相関していた（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１０，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ  Ｔｈｅｒ１２（３）：Ｒ９０（その開示は参照により本明細書に組み込まれる））。
【０１１５】
種々のヒト腫瘍内の骨髄細胞浸潤
炎症性単球、単球性骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）およびマクロファージ等の種々の骨髄細胞サブセットが、多数の研究において癌患者に蓄積することが示されている（Ｓｏｌｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．２０１４，Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ１３１９：４７−６５、Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．２０１６，Ｃｌｉｎ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｏｎｃｏｌ．１８（３）：２５１−８（その開示は参照により本明細書に組み込まれる））。最近の試みは、これらの細胞の特徴付けを標準化するための戦略を提案することを目的としているが（Ｂｒｏｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．２０１６，Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．７：１２１５０（その開示は参照により本明細書に組み込まれる））、これらの細胞集団の多くの表現型の定義は依然として文献中に見出すことができる（Ｅｌｌｉｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．２０１７，Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：８６（その開示は参照により本明細書に組み込まれる））。最も一般的には、これらの細胞は、マーカーＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ３３の発現およびＨＬＡ−ＤＲ（単球ＭＤＳＣ）の低発現によって定義される（Ｂｒｏｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．２０１６）。さらに、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）は、ＣＤ６４およびＣＤ６８（Ｍ１分極化、抗腫瘍形成性）、またはＣＤ１６３およびＣＤ２０６（Ｍ２分極化、抗腫瘍形成性）の発現によって一般に同定される（Ｅｌｌｉｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．２０１７）。
【０１１６】
Ｅｌｌｉｏｔｔらによる最近の総説（上記参照）は、癌患者において骨髄細胞サブセットを同定するために使用される多数の表現型の概要を述べている。これらの研究のほとんどは、循環細胞にそれらの分析の重点を置いており、骨髄ＣＤ１１ｂ＋細胞の頻度の増加が、例えば、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、肝細胞癌、膵臓癌、前立腺癌および腎細胞癌の患者の血中に観察されている（Ｓｏｌｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．２０１４，Ｅｌｌｉｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．２０１７）。他の研究もまた、これらの細胞の腫瘍組織への浸潤のレベルを特徴付けることを試みた。結腸直腸腫瘍では、高頻度のＣＤ１４＋ＣＤ１６９＋細胞が観察された。これらの細胞はＣＤ１６３およびＣＤ２０６も発現したことから、Ｍ２分極化ＴＡＭであることが示唆された（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１５，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ１０（１０）：ｅ０１４１８１７（その開示は参照により本明細書に組み込まれる））。結腸直腸癌患者における別の研究はまた、健康な個体と比較して増加した数のＣＤ１１ｂ＋ＣＤ３３＋ＨＬＡ−ＤＲ−細胞を検出した（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１３，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ８（２）：ｅ５７１１４（その開示は参照により本明細書に組み込まれる））。
【０１１７】
同様に、ＣＤ１１ｂ＋骨髄細胞も膀胱腫瘍において同定されており、それらは全有核細胞の１０〜２０％を占めていた（Ｅｒｕｓｌａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．２０１２，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ１３０（５）：１１０９−１９（その開示は参照により本明細書に組み込まれる））。さらに高い頻度のＣＤ１１ｂ＋細胞が膵臓癌において観察され、ＣＤ４５＋細胞の６０％超がＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１５＋ＣＤ３３＋であった（Ｐｏｒｅｍｂｋａ  ｅｔ  ａｌ．２０１２，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ６１（９）：１３７３−８５（その開示は参照により本明細書に組み込まれる））。また、ある研究では、非小細胞肺癌内の主要な骨髄細胞集団はＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１５＋ＣＤ６６ｂ＋好中球様集団であると結論付けた。興味深いことに、一旦これらの細胞が血液から腫瘍組織に移動すると、これらの細胞は上方制御されたＦｃγＲＩを含む発現プロファイルの改変を示す（Ｅｒｕｓｌａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．２０１４，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．１２４（１２）：５４６６−８０（その開示は参照により本明細書に組み込まれる））。
【０１１８】
腫瘍浸潤細胞におけるＦｃγＲＩの発現
多数の研究がヒト腫瘍内の骨髄細胞の高い浸潤を確認したが、これらの細胞上のＦｃγＲの発現を詳細に探求した研究はない。しかしながら、いくつかの刊行物が腫瘍組織内のＦｃγＲＩ発現細胞の存在を示している。
【０１１９】
Ｍｏｒｉｍｕｒａらによる研究（Ｍｏｒｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．１９９０，Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．８０（３）：２８７−９４（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）は、免疫細胞化学により１２のヒト試料からの神経膠腫を評価し、これらを腫瘍周囲対照組織と比較した。この研究は、腫瘍周囲組織と比較して、神経膠腫におけるマクロファージの高い存在（マーカーＣＤ１６３、ＲＭ３／１を使用）、ならびにＦｃγＲＩおよびＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）の増加を実証した。Ｇｒｉｅｓｉｎｇｅｒらによる最近の研究（Ｇｒｉｅｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１３，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９１（９）：４８８０−８（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）は、種々の小児脳腫瘍型のフローサイトメトリー分析を実施することによりこれらの観察を確認した。ここで、高頻度のＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋骨髄細胞が、毛様細胞性星細胞腫および上衣腫患者由来の組織に観察された。これらの細胞はまた、高レベルのＦｃγＲＩも発現した。
【０１２０】
脳腫瘍に加えて、ＦｃγＲＩ発現は他の種類の腫瘍についても示されている。Ｇｒｕｇａｎら（Ｇｒｕｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１２，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８９（１１）：５４５７−６６（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）は、ヒト乳房腫瘍組織内のＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１４＋細胞の存在を実証した。これらの細胞は、高レベルのＦｃγＲＩおよびＦｃγＲＩＩａ、ならびにＦｃγＲＩＩｂおよびＦｃγＲＩＩＩを発現することが示された。また、ＦｃγＲＩの発現を呈する消化管間質腫瘍において、ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１４＋ＣＤ６８＋ＴＡＭが同定された（Ｃａｖｎａｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１３，Ｊ  Ｅｘｐ“Ｍｅｄ．“２１０（１３）：２８７３−８６（その開示は参照により本明細書に組み込まれる））。ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋ＦｃγＲＩ＋細胞も、結腸直腸癌患者において同定されており、これらの細胞は健康な対照組織と比較して腫瘍組織においてより高いＦｃγＲＩの発現を示した（Ｎｏｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１６，Ｃｌｉｎ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．５（４）：ｅ７６（その開示は参照により本明細書に組み込まれる））。ＦｃγＲＩ発現はまた、黒色腫転移についても実証されている（Ｈａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２００６，Ａｃｔａ  Ｏｎｃｏｌ４５（４）：４００−５（その開示は参照により本明細書に組み込まれる））。
【０１２１】
ＩｇＧとＦｃγＲまたはＣ１ｑとの結合は、ヒンジ領域およびＣＨ２ドメインに位置する残基に依存する。ＣＨ２ドメインの２つの領域は、ＦｃγＲおよびＣ１ｑの結合にとって重要であり、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４に特有の配列を有する。２３３〜２３６位のＩｇＧ２残基、ならびに３２７、３３０および３３１位のＩｇＧ４残基のヒトＩｇＧ１への置換は、ＡＤＣＣおよびＣＤＣを大きく減少させることが示された（Ａｒｍｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９（８）：２６１３−２４；Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ  ＢｉｏｌＣｈｅｍ．２７６（９）：６５９１−６０４，（その開示は参照により本明細書に組み込まれる））。さらに、Ｉｄｕｓｏｇｉｅらは、Ｋ３２２を含む異なる位置でのアラニン置換が、補体活性化を有意に減少させることを実証した（Ｉｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４（８）：４１７８−８４（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）。同様に、マウスＩｇＧ２ＡのＣＨ２ドメインにおける変異は、ＦｃγＲＩおよびＣ１ｑとの結合を減少させることが示された（Ｓｔｅｕｒｅｒ．ｅｔ  ａｌ．，１９９５．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５（３）：１１６５−７４（その開示は参照により本明細書に組み込まれる））。
【０１２２】
ヒトＩｇＧ１のＣＨ２ドメインにおいて多数の突然変異が行われており、それらがＡＤＣＣおよびＣＤＣに及ぼす影響がｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験されている（上記で引用した参考文献）。特に、３３３位のアラニン置換はＡＤＣＣおよびＣＤＣの両方を増大させることが報告されている（Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，上記参照、Ｓｔｅｕｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５、上記参照）。Ｌａｚａｒらは、ＦｃγＲＩＩＩａに対してより高い親和性を有し、ＦｃγＲＩＩｂに対してより低い親和性を有し、結果としてＡＤＣＣの増強をもたらす三重変異体（Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ）について記載した（Ｌａｚａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，ＰＮＡＳ１０３（１１）：４００５−４０１０（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）。同じ突然変異を用いて、ＡＤＣＣが増大した抗体を作製した（Ｒｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．６：３００９−３０１８（その開示は参照により本明細書に組み込まれる））。Ｒｉｃｈａｒｄｓらは、マクロファージによる標的細胞の食作用の増強を媒介する、改善されたＦｃγＲＩＩＩａ親和性およびＦｃγＲＩＩａ／ＦｃγＲＩＩｂ比を有する、わずかに異なる三重変異体（Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ｇ２３６Ａ）を研究した（Ｒｉｃｈａｒｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８．Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．７（８）：２５１７−２７（その開示は参照により本明細書に組み込まれる））。
【０１２３】
ＩｇＧ４抗体は、そのエフェクター機能の欠如のために、細胞枯渇を伴わない受容体調節のための好ましいＩｇＧサブクラスを意味する。ＩｇＧ４分子は、Ｆａｂアーム交換と呼ばれる動的プロセスにおいて半分子を交換することができる。この現象は、治療用抗体と内因性ＩｇＧ４の間でもｉｎ  ｖｉｖｏで起こり得る。
【０１２４】
Ｓ２２８Ｐ変異は、この組み換えプロセスを妨げ、それほど予測不能ではない治療用ＩｇＧ４抗体の設計を可能にすることが示されている（Ｌａｂｒｉｊｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２７（８）：７６７−７１（その開示は参照により本明細書に組み込まれる））。
【０１２５】
さらなる実施形態において、Ｆｃ領域のエフェクター機能は、その中のＣＨ２ドメイン内の炭水化物部分の修飾によって、例えば、産生中のフコース、ガラクトース、バイセクティングＮ−アセチルグルコサミンおよび／またはシアル酸の相対レベルを変更することによって改変され得る（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ，２００９，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．８（３）：２２６−３４ａｎｄ  Ｒａｊｕ，２００８，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０（４）：４７１−８（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。
【０１２６】
したがって、Ｆｃ領域中のフコース残基が欠如しているかまたは少ない治療用抗体は、ヒトにおいて増強されたＡＤＣＣ活性を示し得ることが知られている（例えば、Ｐｅｉｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｂｌｏｏｄ１１２（６）：２３９０−９、Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ＆Ｓａｔｏｈ，２００９，ＭＡｂｓ１（３）：２３０−２６、Ｉｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，ＢＭＣ  Ｃａｎｃｅｒ９；５８（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。低フコース抗体ポリペプチドは、キンフネンシン等のマンノシダーゼの阻害剤を含む培地中で培養した細胞における発現によって産生することができる（以下の実施例Ｉを参照）。
【０１２７】
抗体のグリコシル化を低フコース型に変更するための他の方法は、ラムノースを代謝することができない細胞における細菌酵素ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースレダクターゼの使用を含む（例えばＰｒｏＢｉｏＧｅｎ  ＡＧ（Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のＧｌｙｍａｘＸ（登録商標）技術を用いる）。
【０１２８】
低フコース抗体を作製するための別の方法は、抗体産生細胞におけるα−（１，６）−フコシルトランスフェラーゼの阻害または枯渇による（例えば、Ｌｏｎｚａ  Ｌｔｄ（Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）のＰｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ（登録商標）ＣＨＯＫ１ＳＶ技術を用いる）。
【０１２９】
（完全な重鎖を形成するために）本明細書に開示される任意のＶＨ領域配列と組み合わせることができる例示的な重鎖定常領域アミノ酸配列は、本明細書において再現されるＩｇＧ１重鎖定常領域配列である。
【化１０】
2020501531.tif 000013
【０１３０】
他の重鎖定常領域配列は、当該技術分野において既知であり、本明細書に開示される任意のＶＨ領域と組み合わせることもできる。例えば、前述のように、好ましい定常領域は、本明細書で再現されるもの等の修飾されたＩｇＧ４定常領域である。
【化１１】
2020501531.tif 000014
【０１３１】
この修飾されたＩｇＧ４配列は、ＩｇＧ４のコアヒンジの安定化をもたらし、ＩｇＧ４をより安定にし、Ｆａｂアーム交換を阻止する。
【０１３２】
別の好ましい定常領域は、本明細書で再現されるもの等の修飾されたＩｇＧ４定常領域である。
【化１２】
2020501531.tif 000015
【０１３３】
この修飾されたＩｇＧ４配列は、減少したＦｃＲｎ結合を示し、故に、野生型ＩｇＧ４と比較して短縮された血清半減期をもたらす。さらに、それはＩｇＧ４をより安定にするＩｇＧ４のコアヒンジの安定化を示し、Ｆａｂアーム交換を防ぐ。
【０１３４】
また、本明細書で再現されるもの等の野生型ＩｇＧ４定常領域も、本発明のポリペプチドにおける使用に適している。
【化１３】
2020501531.tif 000016
【０１３５】
（完全な軽鎖を形成するために）本明細書に開示される任意のＶＬ領域配列と組み合わせることができる例示的な軽鎖定常領域アミノ酸配列は、本明細書において再現されるκ鎖定常領域配列である。
【化１４】
2020501531.tif 000017
【０１３６】
他の軽鎖定常領域配列は、当該技術分野において既知であり、本明細書中に開示される任意のＶＬ領域と組み合わせることもできる。
【０１３７】
本発明の例示的実施形態において、抗体ポリペプチドは、それぞれ配列番号１３および１６のＩｇＧ４定常領域を含み得る。
【０１３８】
したがって、本発明の例示的な抗体ポリペプチドは、
（ａ）配列番号１３の定常領域と一緒に配列番号１の可変領域を含む重鎖、および
（ｂ）配列番号１６の定常領域と一緒に配列番号２の可変領域を含む軽鎖、を含む。
【０１３９】
例えば、抗体ポリペプチドは、配列番号１７のアミノ酸配列を有する２本の重鎖および配列番号１８のアミノ酸配列を有する２本の軽鎖を含むかまたはそれらからなるインタクトなＩｇＧ４分子であり得る。
【０１４０】
本発明の代替の例示的ポリペプチドは、
（ａ）配列番号１３の定常領域と一緒に配列番号１９の可変領域を含む重鎖、および
（ｂ）配列番号１６の定常領域と一緒に配列番号２０の可変領域を含む軽鎖、を含む。
【０１４１】
例えば、抗体ポリペプチドは、配列番号２９のアミノ酸配列を有する２本の重鎖および配列番号３０のアミノ酸配列を有する２本の軽鎖を含むかまたはそれらからなるインタクトなＩｇＧ４分子であり得る。
【０１４２】
本発明の第１または第２の態様の一実施形態において、本発明の抗体ポリペプチドは「融合」ポリペプチドであるかまたはそれを含む。
【０１４３】
薬物動態特性を改善するためにある部分に融合されていることに加えて、本発明のポリペプチドはまた、該ポリペプチドの精製を容易にするためにグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはプロテインＡ等のポリペプチドに融合され得ることを理解されたい。そのような融合の例は当業者に周知である。同様に、該ポリペプチドは、Ｈｉｓ６等のオリゴヒスチジンタグに、または周知のＭｙｃタグエピトープ等の抗体によって認識されるエピトープに融合されてもよい。該ポリペプチドの任意の変異体または誘導物への融合も、本発明の範囲内に含まれる。ＩＬ−１Ｒ結合特性またはｉｎ  ｖｉｖｏ半減期等の望ましい特性を保持または改善する融合体（またはその変異体、誘導体もしくは融合体）が好ましいことを理解されたい。
【０１４４】
したがって、融合体は、上記本発明のポリペプチドに望ましい特徴を付与するさらなる部分と一緒に、上に詳述したようなアミノ酸配列を含み得る：例えば、この部分は、ポリペプチドを検出もしくは単離すること、またはポリペプチドの細胞取り込みを促進することにおいて有用であり得る。該部分は、当業者に周知であるように、例えば、ビオチン部分、放射活性部分、蛍光部分、例えば小さなフルオロフォアまたは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）フルオロフォアであり得る。該部分は、当業者に既知のように、免疫原性タグ、例えば、Ｍｙｃタグであり得るか、または当業者に既知のように、親油性分子もしくはポリペプチドの細胞取り込みを促進することができるポリペプチドドメインであり得る。
【０１４５】
当業者は、本発明の抗体ポリペプチドが、修飾または誘導体化されている１つ以上のアミノ酸を含み得るかまたはそれらからなり得ることを理解するであろう。
【０１４６】
１つ以上のアミノ酸の化学誘導体は、官能側鎖との反応によって達成され得る。そのような誘導体化分子は、例えば、遊離アミノ基が、アミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボキシベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基またはホルミル基を形成するように誘導体化された分子を含む。遊離カルボキシル基は、塩、メチル、およびエチルエステルまたは他の種類のエステル、ならびにヒドラジドを形成するように誘導体化され得る。遊離ヒドロキシル基は、Ｏ−アシルまたはＯ−アルキル誘導体を形成するように誘導体化され得る。また、２０個の標準アミノ酸の天然に存在するアミノ酸誘導体を含むペプチドも、化学的誘導体として含まれる。例えば、４−ヒドロキシプロリンはプロリンと置換され得、５−ヒドロキシリジンはリジンと置換され得、３−メチルヒスチジンはヒスチジンと置換され得、ホモセリンはセリンと置換され得、オルニチンはリジンと置換され得る。誘導体はまた、必要な活性が維持される限り、１つ以上の付加または欠失を含むペプチドを含む。他の含まれる修飾は、アミド化、アミノ末端アシル化（例えばアセチル化またはチオグリコール酸アミド化）、末端カルボキシルアミド化（例えばアンモニアまたはメチルアミンを用いる）、および同様の末端修飾である。
【０１４７】
当業者は、ペプチド模倣化合物もまた有用であり得ることをさらに理解するであろう。「ペプチド模倣物」という用語は、治療剤としてある特定のペプチドの立体構造および望ましい特徴を模倣する化合物を指す。
【０１４８】
例えば、上記ポリペプチドは、アミノ酸残基がペプチド（−ＣＯ−ＮＨ−）結合によって結合された分子だけではなく、ペプチド結合が反転している分子も含む。そのようなレトロ−インベルソペプチド模倣物は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＭｅｚｉｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９，３２３０−３２３７に記載されるもの等の、当該技術分野で既知の方法を用いて作製されてもよい。このアプローチは、側鎖の配向ではなく、主鎖に関与する変化を含む疑似ペプチドを作製することを含む。ＣＯ−ＮＨペプチド結合の代わりにＮＨ−ＣＯ結合を含むレトロ−インバースペプチドは、タンパク質分解に対する耐性がはるかに高い。代替として、上記ポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸残基が、従来のアミド結合の代わりに−ｙ（ＣＨ２ＮＨ）−結合によって連結されたペプチド模倣化合物であり得る。
【０１４９】
さらなる代替例において、アミノ酸残基の炭素原子間の間隔を保持する適切なリンカー部分が使用される限り、ペプチド結合は完全に省略されてもよい：リンカー部分が、ペプチド結合と実質的に同じ電荷分布および実質的に同じ平面性を有することが有利であり得る。
【０１５０】
また、エキソタンパク質分解消化に対する感受性を低下させるのに役立つように、上記ポリペプチドは、そのＮ末端またはＣ末端で都合よくブロックされ得ることも理解されたい。
【０１５１】
Ｄ−アミノ酸およびＮ−メチルアミノ酸等の様々な非コードアミノ酸または修飾アミノ酸も、哺乳動物ペプチドを修飾するために使用されている。さらに、環化等の共有結合的修飾によって、またはラクタムもしくは他の種類の架橋を組み込むことによって、推測される生理活性立体構造が安定化され得る：例えば、参照により本明細書に組み込まれるＶｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７５：２６３６およびＴｈｕｒｓｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｂｉｏｃｈｅｍ．ＢｉｏｐｈｙｓＲｅｓ．Ｃｏｍｍ．１１１：１６６を参照されたい。
【０１５２】
典型的には、本発明の抗体ポリペプチドは、「裸の」抗体ポリペプチドであり、すなわち、細胞傷害性部分または検出可能部分等のさらなる機能的部分を含まない。例えば、治療効果が、例えば、炎症を低減するために、免疫細胞に対する本発明の抗体の直接的作用によって媒介される場合、抗体は任意の細胞傷害活性を欠くことが有利であり得る。
【０１５３】
しかしながら、代替の実施形態において、本発明の抗体ポリペプチドは、例えば、診断薬（例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングにおける）または治療剤としてのそれらの意図された使用を容易にするために機能的部分を用いて増強されてもよい。したがって、一実施形態において、抗体ポリペプチドは治療的部分と直接的または間接的に結合している。好適な治療的部分は、癌細胞（または関連する幹細胞もしくは前駆細胞）の増殖を減少させるもしくは阻害すること、または特に死滅させることができる部分である。例えば、治療剤は、放射性同位元素（例えば、９０Ｙ、１７７Ｌｕ、９９Ｔｃｍ等）または細胞傷害性薬物（例えば、代謝拮抗薬、毒素、細胞分裂阻害薬）等の細胞傷害性部分であってもよい。
【０１５４】
代替として、細胞傷害性部分は、光子活性化療法、中性子活性化療法、中性子誘導性オージェ電子療法、シンクロトロン照射療法、または低エネルギーＸ線光子活性化療法等の活性化療法における使用に適した１つ以上の部分を含み得るかまたはそれらからなり得る。
【０１５５】
任意選択的に、本発明の抗体ポリペプチドは、検出可能部分をさらに含んでもよい。例えば、検出可能部分は、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７２Ａｓ、８９Ｚｒ、１２３Ｉおよび２０１Ｔｌからなる群から選択される放射性同位元素等の放射性同位元素を含み得るかまたはそれらからなり得る。任意選択的に、薬剤は、８６Ｙ／９０Ｙまたは１２４Ｉ／２１１Ａｔ等の一対の検出可能な細胞傷害性の放射性核種を含み得る。代替として、抗体ポリペプチドは、いわゆる「マルチモーダル・セラノスティクス」を提供するために、検出可能部分として、また細胞傷害性部分としてマルチモーダル様式で同時に作用することが可能な放射性同位元素を含んでもよい。したがって、結合部分は、放射性核種または化学療法薬等の細胞傷害性薬物を用いた治療能力と一緒に、マルチイメージング（例えば、ＳＰＥＣＴ、ＰＥＴ、ＭＲＩ、光学的、または超音波）の能力を有するナノ粒子に結合されてもよい。
【０１５６】
治療的部分および／または検出可能部分（放射性同位元素、細胞傷害性部分等）は、抗体またはその断片に直接的または間接的に結合していてもよい。好適なリンカーは当該技術分野において既知であり、例えば、補欠分子族、非フェノール系リンカー（Ｎ−スクシミジルベンゾエートの誘導体；ドデカボレート）、大環状化合物および非環式キレート剤の両方のキレート化部分、例えば、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０，四酢酸（ＤＯＴＡ）の誘導体、デフェロキサミン（ＤＦＯ）、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）の誘導体、Ｓ−２−（４−イソチオシアナトベンジル）−１，４，７−トリアザシクロノナン−１，４，７−三酢酸（ＮＯＴＡ）の誘導体、および１，４，８，１１−テトラアザシクロドデカン−１，４，８，１１−四酢酸（ＴＥＴＡ）の誘導体、３，６，９，１５−テトラアザビシクロ￥［９．３．１］−ペンタデカ−１（１５），１１，１３−トリエン−４−（Ｓ）−（４−イソチオシアナト−ベンジル）−３，６，９−三酢酸（ＰＣＴＡ）の誘導体、５−Ｓ−（４−アミノベンジル）−１−オキサ−４，７，１０−トリアザシクロドデカン−４，７，１０−トリス（酢酸）（ＤＯ３Ａ）の誘導体、ならびに他のキレート化部分を含む。
【０１５７】
好ましいリンカーの１つは、例えば、１７７Ｌｕ−ＤＴＰＡ−［本発明の抗体ポリペプチド］において使用されるＤＴＰＡである。さらに好ましいリンカーは、例えば、８９Ｚｒ−ＤＦＯ−［本発明の抗体ポリペプチド］において使用されるデフェロキサミン、ＤＦＯである。
【０１５８】
しかしながら、当業者は、本発明の抗体ポリペプチドの多くの医学的用途は細胞傷害性または診断用部分の存在を必要としないことを理解するであろう。
【０１５９】
上で論じたように、本発明の抗体ポリペプチドの産生のための方法は当該技術分野において周知である。
【０１６０】
好都合には、抗体ポリペプチドは、組換えポリペプチドであるかまたはそれを含む。そのような組換えポリペプチドの産生に適した方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、原核生物または真核生物の宿主細胞における発現等である（例えば、文献内の関連性のある開示内容が参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｒｅｅｎ＆Ｓａｍｂｒｏｏｋ，２０１２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい）。
【０１６１】
抗体はポリクローナル抗体であってもよいが、抗体がモノクローナル抗体であること、またはその抗原結合断片、変異体、融合体もしくは誘導体がモノクローナル抗体に由来することが好ましい。
【０１６２】
好適なモノクローナル抗体は、既知の技術、例えば、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；Ａ  ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，Ｈ  Ｚｏｌａ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８）および「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ”，ＳＧＲ  Ｈｕｒｒｅｌｌ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９８２）」、に開示される技術によって調製され得る。多特異性または単一特異性のポリクローナル抗体が産生され得る。それらは単一特異性であることが好ましい。
【０１６３】
本発明の抗体ポリペプチドはまた、ウサギ網状赤血球溶解物またはコムギ胚芽溶解物（Ｐｒｏｍｅｇａから入手可能）等の市販のｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系を用いて産生することもできる。好ましくは、翻訳系はウサギ網状赤血球溶解物である。好都合には、翻訳系は、ＴＮＴ転写−翻訳系（Ｐｒｏｍｅｇａ）等の転写系に結合させることができる。この系は、翻訳と同じ反応でコード化ＤＮＡポリヌクレオチドから好適なｍＲＮＡ転写物を産生するという利点を有する。
【０１６４】
当業者は、本発明の抗体ポリペプチドが、代替として、例えば周知の液相または固相合成技術（例えば、ｔ−ＢｏｃまたはＦｍｏｃ固相ペプチド合成）を用いて、人工的に合成され得ることを理解するであろう。
【０１６５】
本発明の第３の態様は、本発明の第１または第２の態様の抗体もしくは抗原結合断片、またはその成分ポリペプチド鎖をコードする単離された核酸分子を提供する。「核酸分子」は、一本鎖または二本鎖であり得るＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡまたは相補的ＤＮＡ）およびｍＲＮＡ分子を含む。「単離された」は、核酸分子が細胞内に位置しないか、または別様に細胞内に提供されていないことを意味する。
【０１６６】
一実施形態において、核酸分子はｃＤＮＡ分子である。
【０１６７】
好ましくは、核酸分子は、以下に再現される、配列番号９および配列番号１０のいずれかから選択される１つ以上のヌクレオチド配列を含む。
「１６３０」のＶＨ領域をコードするヌクレオチド配列
【化１５】
2020501531.tif 000018
「１６３１」のＶＬ領域をコードするヌクレオチド配列
【化１６】
2020501531.tif 000019
【０１６８】
代替の好ましい実施形態において、核酸分子は、以下に再現される、配列番号２７および配列番号２８のいずれかから選択される１つ以上のヌクレオチド配列を含む。
「２６７４」のＶＨ領域をコードするヌクレオチド配列
【化１７】
2020501531.tif 000020
「２６７５」のＶＬ領域をコードするヌクレオチド配列
【化１８】
2020501531.tif 000021
【０１６９】
当業者は、ある特定の宿主細胞における抗体ポリペプチドの発現のために、例えば、ヒト細胞における発現のために、核酸分子がコドン最適化され得ることを理解するであろう（例えば、Ａｎｇｏｖ，２０１１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．６（６）：６５０−６５９（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。
【０１７０】
また、本発明の範囲内には以下も含まれる：
（ａ）本発明の第４の態様は、本発明の第３の態様による核酸分子を含むベクター（発現ベクター等）を提供する。
（ｂ）本発明の第５の態様は、本発明の第３の態様による核酸分子、または本発明の第４の態様によるベクターを含む宿主細胞（例えば、哺乳類細胞、例えばヒト細胞、またはチャイニーズハムスター卵巣細胞、例えばＣＨＯＫ１ＳＶ細胞）を提供する。
（ｃ）本発明の第６の態様は、発明の第１または第２の態様による抗体ポリペプチドを作製する方法であって、本発明の第５の態様による宿主細胞の集団を該ポリペプチドが発現される条件下で培養することと、そこからポリペプチドを単離することと、を含む、方法を提供する。
【０１７１】
本発明の第７の態様は、薬学的有効量の本発明の第１または第２の態様による抗体または抗原結合断片と、薬学的に許容される希釈剤、担体、アジュバントまたは賦形剤と、を含む、医薬組成物を提供する。
【０１７２】
当業者は、ＥＤＴＡ、クエン酸塩、ＥＧＴＡまたはグルタチオン等のキレート剤を含む追加の化合物も、医薬組成物に含まれ得ることを理解するであろう。
【０１７３】
医薬組成物は、十分に貯蔵安定性であり、ヒトおよび動物への投与に適した、当該技術分野において既知の方法で調製することができる。例えば、医薬組成物は、例えば、フリーズドライ、噴霧乾燥、噴霧冷却により、または超臨界粒子形成からの粒子形成の使用により、凍結乾燥されてもよい。
【０１７４】
「薬学的に許容される」は、本発明の抗体ポリペプチドのＣＤ１３７結合活性の有効性を低下させない非毒性物質を意味する。そのような薬学的に許容される緩衝剤、担体または賦形剤は、当該技術分野において周知である（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ  Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９０）、およびｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｋｉｂｂｅ，Ｅｄ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ（２０００）（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。
【０１７５】
「緩衝剤」という用語は、ｐＨを安定化する目的で酸−塩基混合物を含む水溶液を意味することが意図される。緩衝剤の例は、トリズマ、ビシン、トリシン、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＢＳ、トリス、ヘペス、ＨＥＰＢＳ、ＭＥＳ、リン酸塩、炭酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、グリコール酸塩、乳酸塩、ホウ酸塩、ＡＣＥＳ、ＡＤＡ、酒石酸塩、ＡＭＰ、ＡＭＰＤ、ＡＭＰＳＯ、ＢＥＳ、ＣＡＢＳ、カコジル酸、ＣＨＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＥＰＰＳ、エタノールアミン、グリシン、ＨＥＰＰＳＯ、イミダゾール、イミダゾール乳酸、ＰＩＰＥＳ、ＳＳＣ、ＳＳＰＥ、ＰＯＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＴＡＢＳ、ＴＡＰＳＯおよびＴＥＳである。
【０１７６】
「希釈剤」という用語は、薬学的調製物に抗体ポリペプチドを希釈することを目的とした水溶液または非水溶液を意味することが意図される。希釈剤は、食塩水、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノールまたは油（ベニバナ油、トウモロコシ油、落花生油、綿実油またはゴマ油等）のうちの１つ以上であり得る。
【０１７７】
「アジュバント」という用語は、本発明の抗体ポリペプチドの生物学的効果を高めるために製剤に添加される任意の化合物を意味することが意図される。アジュバントは、異なるアニオンを有する１つ以上の亜鉛塩、銅塩または銀塩であってもよく、例えば、限定されないが、異なるアシル組成の、フッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物、チオシアン酸塩、亜硫酸塩、水酸化物、リン酸塩、炭酸塩、乳酸塩、グリコール酸塩、クエン酸塩、ホウ酸塩、酒石酸塩、および酢酸塩であり得る。アジュバントはまた、カチオン性ポリマー、例えば、カチオン性セルロースエーテル、カチオン性セルロースエステル、脱アセチル化ヒアルロン酸、キトサン、カチオン性デンドリマー、カチオン性合成ポリマー、例えば、ポリ（ビニルイミダゾール）、ならびにカチオン性ポリペプチド、例えば、ポリヒスチジン、ポリリジン、ポリアルギニン、およびこれらのアミノ酸を含むペプチドであり得る。
【０１７８】
賦形剤は、炭水化物、ポリマー、脂質およびミネラルのうちの１つ以上であり得る。炭水化物の例として、ラクトース、グルコース、スクロース、マンニトール、およびシクロデキストリンが挙げられ、これらは、例えば、凍結乾燥を容易にするために組成物に添加される。ポリマーの例は、全て異なる分子量の、デンプン、セルロースエーテル、セルロースカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、アルギネート、カラギーナン、ヒアルロン酸およびそれらの誘導体、ポリアクリル酸、ポリスルホン酸、ポリエチレングリコール／ポリエチレンオキシド、ポリエチレンオキシド／ポリプロピレンオキシドコポリマー、加水分解の程度が異なるポリビニルアルコール／ポリビニルアセテート、およびポリビニルピロリドンであり、これらは、例えば、粘度制御のため、生体接着を達成するため、または化学的分解およびタンパク質分解から脂質を保護するために組成物に添加される。脂質の例は、全て異なるアシル鎖長および飽和度の、脂肪酸、リン脂質、モノ−、ジ−、およびトリグリセリド、セラミド、スフィンゴ脂質および糖脂質、卵レシチン、大豆レシチン、水素添加卵レシチンおよび大豆レシチンであり、これらはポリマーと同様の理由で組成物に添加される。ミネラルの例は、タルク、酸化マグネシウム、酸化亜鉛および酸化チタンであり、これらは、液体蓄積の減少または有利な顔料特性等の利点を得るために組成物に添加される。
【０１７９】
本発明の抗体ポリペプチドは、その送達に適していることが当該技術分野において既知である任意の種類の医薬組成物に製剤化され得る。
【０１８０】
一実施形態において、本発明の医薬組成物はリポソームの形態であってもよく、抗体ポリペプチドは、他の薬学的に許容される担体に加えて、ミセル、不溶性単層、および液晶として凝集形態で存在する脂質等の両親媒性薬剤と組み合わされる。リポソーム製剤に適した脂質として、限定されないが、モノグリセリド、ジグリセリド、スルファチド、リゾレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸等が挙げられる。好適な脂質はまた、血流循環時間を延長するために極性頭部基においてポリ（エチレングリコール）によって修飾された上記の脂質を含む。そのようなリポソーム製剤の調製は、例えば、米国特許第４，２３５，８７１号に見出すことができ、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１８１】
本発明の医薬組成物はまた、生分解性微粒子の形態であってもよい。脂肪族ポリエステル、例えば、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ＰＬＡとＰＧＡとのコポリマー（ＰＬＧＡ）、またはポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）等、およびポリ無水物は、微粒子の生成において生分解性ポリマーとして広く使用されている。そのような微粒子の調製物は、米国特許第５，８５１，４５１号および欧州特許第０２１３３０３号に見出すことができ、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１８２】
さらなる実施形態において、本発明の医薬組成物はポリマーゲルの形態で提供され、ポリマー、例えばデンプン、セルロースエーテル、セルロースカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、アルギネート、カラギーナン、ヒアルロン酸およびそれらの誘導体、ポリアクリル酸、ポリビニルイミダゾール、ポリスルホン酸塩、ポリエチレングリコール／ポリエチレンオキシド、ポリエチレンオキシド／ポリプロピレンオキシドコポリマー、加水分解度の程度が異なるポリビニルアルコール／ポリビニルアセテート、およびポリビニルピロリドンが、薬剤を含む溶液の増粘のために使用される。ポリマーはまた、ゼラチンまたはコラーゲンも含み得る。
【０１８３】
代替として、抗体ポリペプチドは、食塩水、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノールもしくは油（ベニバナ油、トウモロコシ油、落花生油、綿実油またはゴマ油等）、トラガカントガム、および／または種々の緩衝剤に単純に溶解してもよい。
【０１８４】
本発明の医薬組成物は、活性抗体ポリペプチドの作用を増強するためのイオンおよび規定のｐＨを含み得ることを理解されたい。さらに、組成物は、滅菌等の従来の薬学的操作に供されてもよく、かつ／または防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝剤、充填剤等の従来のアジュバントを含んでもよい。
【０１８５】
本発明による医薬組成物は、当業者に既知の任意の好適な経路を介して投与され得る。したがって、可能な投与経路は、非経口（静脈内、皮下、および筋肉内）、局所、眼、鼻、肺、口腔、経口、非経口、膣内および直腸内を含む。また、インプラントからの投与も可能である。
【０１８６】
好ましい一実施形態において、医薬組成物は、非経口的に、例えば、静脈内、脳室内、関節内、動脈内、腹腔内、髄腔内、心室内、胸骨内、頭蓋内、筋肉内、もしくは皮下に投与されるか、または注入技術によって投与されてもよい。それらは、他の物質、例えば、溶液を血液と等張にするのに十分な塩またはグルコースを含み得る滅菌水溶液の形態で好都合に使用される。水溶液は、必要に応じて（好ましくはｐＨ３〜９に）好適に緩衝されるべきである。無菌条件下の好適な非経口用製剤の調製は、当業者には周知の標準的な薬学的技術によって容易に達成される。
【０１８７】
非経口投与に適した製剤は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌薬、ならびに該製剤を該当するレシピエントの血液と等張にするための溶質を含み得る水性および非水性の滅菌注射液、また、懸濁化剤および増粘剤を含み得る水性および非水性の滅菌注射液を含む。製剤は、単位用量または複数用量容器、例えば、密封されたアンプルおよびバイアル内に提示されてもよく、使用直前に滅菌液体担体、例えば注射用水の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存されてもよい。即時注射液および懸濁液は、以前に記載した種類の滅菌散剤、顆粒剤、および錠剤から調製され得る。
【０１８８】
したがって、本発明の医薬組成物は、非経口投与、例えば静脈内投与に特に適している。
【０１８９】
代替として、医薬組成物は、鼻腔内にまたは吸入によって（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、１，１，１，２−テトラフルオロエタン（ＨＦＡ１３４Ａ３または１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン（ＨＦＡ２２７ＥＡ３）等のヒドロフルオロアルカン、二酸化炭素、または他の好適なガス等の好適な噴射剤を使用して、加圧容器、ポンプ、スプレーまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー提示形態で）投与されてもよい。加圧エアロゾルの場合、投与量単位は、計量された量を送達するための弁を備えることによって決定されてもよい。加圧容器、ポンプ、スプレー、またはネブライザーは、例えば、エタノールと、溶媒としての噴射剤との混合物を使用する活性ポリペプチドの溶液または懸濁液を含んでもよく、これはさらに、滑沢剤、例えばトリオレイン酸ソルビタンをさらに含んでもよい。吸入器または注入器内で使用するためのカプセルおよびカートリッジ（例えばゼラチン製）は、本発明の化合物とラクトースまたはデンプン等の好適な粉末基剤との粉末混合物を含むように製剤化され得る。
【０１９０】
エアロゾルまたは乾燥粉末製剤は、好ましくは、各計量された用量または「一吹き」が、患者への送達のために少なくとも１ｍｇの本発明の化合物を含むように準備される。エアロゾルを用いた全体的な１日用量は患者ごとに異なり、単回用量で、より一般的には、１日を通して分割された用量で投与され得ることを理解されたい。
【０１９１】
代替として、本発明の抗体ポリペプチドは、坐剤もしくはペッサリーの形態で投与することができるか、またはローション、溶液、クリーム、軟膏もしくは散布剤の形態で局所投与されてもよい。本発明の化合物はまた、例えば皮膚パッチの使用により、経皮投与されてもよい。それらはまた、具体的には、眼内経路によって投与されてもよい。
【０１９２】
眼に使用するために、本発明の抗体ポリペプチドは、任意選択的に塩化ベンジルアルコニウム等の防腐剤と組み合わせた、等張性のｐＨ調整した滅菌生理食塩水中の微粒子化した懸濁液として、または好ましくは、等張性のｐＨ調整した滅菌生理食塩水中の溶液として製剤化することができる。代替として、それらは、ワセリン等の軟膏に製剤化されてもよい。
【０１９３】
皮膚への局所適用のために、本発明の抗体ポリペプチドは、例えば、以下のうちの１つ以上との混合物中に懸濁または溶解された活性化合物を含む好適な軟膏として製剤化することができる：鉱油、液体ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックスおよび水。代替として、それらは、例えば、以下のうちの１つ以上との混合物中に懸濁または溶解された好適なローションまたはクリームとして製剤化することができる：鉱油、ソルビタンモノステアレート、ポリエチレングリコール、流動パラフィン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール、および水。
【０１９４】
医薬組成物は、薬学的に有効な量で患者に投与される。本明細書で使用される「治療有効量」、または「有効量」、または「治療上有効な」は、所与の状態および投与計画に対して治療効果をもたらす量を指す。これは、必要な添加剤および希釈剤、すなわち担体または投与ビヒクルと相まって所望の治療効果をもたらすように計算された活性物質の所定量である。さらに、それは宿主の活性、機能および応答における臨床的に有意な欠陥を低減させる、最も好ましくは防止するのに十分な量を意味することが意図される。代替として、治療有効量は、宿主において臨床的に重要な状態の改善を引き起こすのに十分な量である。当業者には理解されるように、化合物の量はその比活性に応じて変動し得る。好適な投与量は、必要な希釈剤と相まって所望の治療効果をもたらすように計算された所定量の活性組成物を含み得る。本発明の組成物の製造方法および使用において、治療有効量の活性成分が提供される。治療有効量は、当該技術分野において周知であるように、年齢、体重、性別、状態、合併症、他の疾患等の患者の特徴に基づいて、通常の技能を有する医療従事者または獣医学従事者によって決定され得る薬学的に有効な用量の投与は、個々の用量単位、さもなければいくつかのより小さな用量単位の形態における単回投与、および特定の間隔で細分化された用量の複数回投与の両方によって行われ得る。代替として、用量は、長期間にわたる連続注入として提供されてもよい。
【０１９５】
本発明の抗体ポリペプチドの診断用途の文脈において、本明細書中で使用される「薬学的有効量」、または「有効量」、または「診断上有効な」は、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏイメージング目的で、診断のために検出可能なシグナルを提供する量を指す。
【０１９６】
抗体ポリペプチドは、使用されているポリペプチドの有効性／毒性に応じて種々の濃度で製剤化することができる。例えば、製剤は、０．１μＭ〜１ｍＭ、より好ましくは、１μＭ〜５００μＭ、５００μＭ〜１ｍＭ、３００μＭ〜７００μＭ、１μＭ〜１００μＭ、１００μＭ〜２００μＭ、２００μＭ〜３００μＭ、３００μＭ〜４００μＭ、４００μＭ〜５００μＭ、５００μＭ〜６００μＭ、６００μＭ〜７００μＭ、８００μＭ〜９００μＭ、または９００μＭ〜１ｍＭの濃度で活性抗体ポリペプチドを含んでもよい。典型的には、製剤は、３００μＭ〜７００μＭの濃度で活性抗体ポリペプチドを含む。
【０１９７】
典型的には、ヒト患者における抗体ポリペプチドの治療用量（治療的部分を含むかまたは含まない）は、投与１回当たり１００μｇ〜１ｇの範囲である（７０ｋｇの体重に基づいて、例えば、投与１回当たり３００μｇ〜７００ｍｇである）。例えば、最大治療用量は、投与１回当たり０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ、例えば０．１〜５ｍｇ／ｋｇ、または１〜５ｍｇ／ｋｇ、または０．１〜２ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。そのような用量は、腫瘍専門医／医師によって決定されるような異なる間隔で投与され得ることを理解されたく、例えば、用量は、毎日、週２回、毎週、隔週または毎月投与されてもよい。
【０１９８】
当業者は、本発明のポリペプチドおよび医薬製剤が医学および獣医学の両方の分野において有用性を有することをさらに理解するであろう。したがって、本発明の方法は、ヒトおよび非ヒト動物（ウマ、イヌおよびネコ等）の両方の治療に用いられ得る。しかしながら、好ましくは、患者はヒトである。
【０１９９】
獣医学的使用のために、本発明の薬剤、薬物および医薬組成物は、通常の獣医学的診療に従って適宜許容される製剤として投与され、獣医師は、ある特定の動物にとって最も適切であろう投与計画および投与経路を決定する。
【０２００】
本発明の第８の態様は、医薬に使用するための、本発明の第１または第２の態様による抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【０２０１】
一実施形態において、本発明の抗体ポリペプチドおよび製剤は、癌に罹患しているか、または癌に罹患するリスクがある患者または対象を治療するために使用することができる。
【０２０２】
「治療」は、患者の治療的処置および予防的処置の両方を含む。「予防的」という用語は、患者または対象における癌の可能性、または癌細胞の蔓延、播種、もしくは転移を予防または低減する、本明細書に記載される薬剤またはその製剤の使用を包含するように使用される。「予防的」という用語はまた、腫瘍性障害のために以前に治療されたことのある患者における癌の再発を予防するための、本明細書に記載される薬剤またはその製剤の使用も包含する。
【０２０３】
癌は固形腫瘍の形成と関連しているか、または血液癌であり得る。治療され得る癌の種類には、癌腫、肉腫、リンパ腫、白血病、芽細胞腫および胚細胞腫瘍が含まれる。
【０２０４】
例えば、抗体またはその抗原結合断片は、前立腺癌、乳癌、結腸直腸癌、腎臓癌、膵癌、卵巣癌、肺癌、子宮頸癌、横紋筋肉腫、神経芽細胞腫、骨癌、多発性骨髄腫、白血病（急性リンパ芽球性白血病［ＡＬＬ］および急性骨髄性白血病［ＡＭＬ］等）、皮膚癌（例えば、黒色腫）、膀胱癌および神経膠芽腫からなる群から選択される癌の治療に使用するためのものであり得る。
【０２０５】
一実施形態において、癌は、表１６または表１７の癌のリストから選択され得る。
【０２０６】
典型的には、本発明の治療剤は、例えば血流中への注射または腫瘍の部位もしくはその近傍への注射によって、非経口形態で投与される。
【０２０７】
一実施形態において、薬剤は、事前にスクリーニングされ、ＣＤ１３７およびＦｃγＲ、例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢまたはそれらの組み合わせを発現する細胞を含む腫瘍を有すると同定された患者を治療するためのものである。
【０２０８】
本発明の関連する態様は以下を提供する：
（ｉ）癌を治療するための薬物の調製における、本発明の第１または第２の態様による抗体またはその抗原結合断片の使用、および
（ｉｉ）有効量の本発明の第１または第２の態様による抗体またはその抗原結合断片を、それを必要とする個体に投与するステップを含む、癌を有する個体を治療するための方法。
【０２０９】
本発明の抗体ベースの薬剤は、患者における癌の唯一の治療として、または併用治療（さらなる治療は医薬品、放射線療法および／または手術であり得る）の一部として用いられ得ることをさらに理解されたい。
【０２１０】
したがって、患者はまた、癌のための１つ以上のさらなる治療、例えば、医薬品（化学療法剤等）、放射線療法および／または手術を受けてもよい。
【０２１１】
例えば、本発明の医薬組成物は、癌の治療に用いられる他の治療剤、例えば、代謝拮抗薬、アルキル化剤、アントラサイクリンおよび他の細胞傷害性抗生物質、ビンカアルキロイド、エトポシド、白金化合物、タキサン、トポイソメラーゼＩ阻害薬、抗増殖性免疫抑制剤、コルチコステロイド、性ホルモンおよびホルモン拮抗薬、ならびに他の治療用抗体（トラスツズマブ）等と組み合わせて投与され得る。
【０２１２】
一実施形態において、１つ以上のさらなる治療は、従来の化学療法剤（アルキル化剤、代謝拮抗薬、植物アルカロイドおよびテルペノイド、トポイソメラーゼ阻害薬、ならびに抗悪性腫瘍薬等）、放射線療法剤、抗体ベースの治療剤（ゲムツズマブ、アレムツズマブ、リツキシマブ、トラスツズマブ、ニモツズマブ、セツキシマブ、ベバシズマブ）、およびステロイドからなる群から選択される。
【０２１３】
本発明の第９の態様は、本発明の第１または第２の態様による抗体を用いた治療に感受性を示す患者を同定する方法であって、患者がＣＤ１３７およびＦｃγＲを発現する細胞を含む腫瘍を有するかどうかを同定するために患者をスクリーニングすることを含む、方法を提供する。
【０２１４】
任意選択的に、スクリーニングされるＦｃγＲはＦｃγＲＩＩＡである。一実施形態において、ＦｃγＲＩＩＡはＲ１３１アロタイプである。
【０２１５】
好適なバイオマーカースクリーニング法は、当該技術分野において周知である。例えば、腫瘍生検試料を患者から採取し、その中のＣＤ１３７および／またはＦｃγＲの発現レベル（ＲＮＡレベルおよび／またはタンパク質レベル）を決定するために、例えば、免疫組織化学的検査、フローサイトメトリーまたはプロテオームアプローチを用いて分析してもよい。
【０２１６】
本発明の所与の態様、特徴、またはパラメータの優先度および選択肢は、文脈に別段の指示がない限り、本発明の全ての他の態様、特徴、およびパラメータに関するありとあらゆる優先度および選択肢と組み合わせて開示されている通りであると見なされるべきである。
【０２１７】
本明細書における明白な先行公開文献の記載または考察は、該文献が先端水準の一部であるかまたは共通の一般知識であることを認めるものとして必ずしも解釈されるべきではない。
【０２１８】
特許請求の範囲および／または本明細書において用語「含む」と合わせて使用される場合の「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」という用語の使用は、「１つ」を意味する場合もあるが、それはまた「１つ以上」、「少なくとも１つ」、および「１つまたは１つ以上」の意味とも一致する。
【０２１９】
本発明のこれらおよび他の実施形態は、上記の説明および添付の図面と併せて考慮すると、よりよく認識および理解されるであろう。しかしながら、上記の説明は、本発明の種々の実施形態およびその多数の具体的な詳細を示しているが、それは限定ではなく例示として示されていることを理解されたい。本発明の主旨から逸脱することなく、多くの置換、変更、追加、および／または再編が本発明の範囲内で行われてもよく、本発明は、全てのそのような置換、変更、追加、および／または再編を含む。
【０２２０】
以下の図面は本明細書の一部を形成し、本発明の特定の態様をさらに実証するために含まれる。本発明は、これらの図面のうちの１つ以上を、本明細書に提示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて参照することによってよりよく理解され得る。
【０２２１】
次に、本発明の特定の態様を具体化する好ましい非限定的な実施例を、以下の図面を参照して説明する。
【図面の簡単な説明】
【０２２２】
【図１】ヒトＣＤ１３７およびカニクイザルＣＤ１３７との結合を示す。別々の２つの実験のデータが含まれる。
【図２】実施例６のＣＤ１３７変異体を示す。
【図３】滴定時（左から右へ２５μｇ／ｍｌ）のＣＨＯ−ｈｕＣＤ１３７細胞に対するＣＤ１３７ＬとＣＤ１３７ｍＡｂとの競合の２つの実験の概要である。
【図４】参照ＲＥＦ１に対して正規化したクローンの刺激指数を示す。
【図５】架橋した場合および架橋しない場合の、抗体によるＮＦ−κＢ媒介性シグナル伝達の誘導を示す。
【図６】１６３０／１６３１抗体による治療が、マウス腫瘍モデルにおいて腫瘍体積に及ぼす影響を示す。
【図７】Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ社の分析により２６７４／２６７５および親クローンである１６３０／１６３１クローンについて決定されたパッチサイズおよびＡｇｇＳｃｏｒｅを示す。
【図８】２６７４／２６７５とヒトおよびカニクイザルＣＤ１３７との結合を示す。
【図９】ＣＤ１３７レポーターアッセイにおける、２６７４／２６７５および親クローン１６３０／１６３１とＦｃγＲＩでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞との架橋を示す。
【図１０】ＣＤ１３７レポーターアッセイにおける、２６７４／２６７５および親クローン１６３０／１６３１とＦｃγＲＩＩａＲ１３１およびＦｃγＲＩＩｂとの架橋を示す。
【図１１】レポーター細胞株における架橋非依存性活性化を決定するために使用される、空のベクター（ｐｃＤＮＡ３．１）でトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を示す。
【図１２】ＦｃγＲＩでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞と架橋した場合の、ＣＤ１３７ｍＡｂで刺激した後のＣＤ８＋Ｔ細胞のＩＦＮ−γ産生を示す。ＣＤ８＋Ｔ細胞アゴニストアッセイにおいて２６７４／２６７５アゴニスト応答に対して正規化したＩＦＮ−γ応答の概要（ｎ＝５）。
【図１３】種々のヒト癌について、Ｆｃγ受容体（Ｘ軸）およびＴＮＦＲＳＦ９（ＣＤ１３７、Ｙ軸）の平均発現値間の相関を示すドットプロットを示す。Ｆｃγ受容体およびＣＤ１３７の両方の平均を上回る発現（平均発現レベル≧１０）を示す癌は、白抜きの記号として強調されている。
【実施例】
【０２２３】
実施例１−Ａｌｌｉｇａｔｏｒ  ＧＯＬＤからのＣＤ１３７抗体の選択
ファージディスプレイ選択は、ヒト抗体（ｓｃＦｖ）ライブラリー、Ａｌｌｉｇａｔｏｒ  ＧＯＬＤを用いて行った。ビーズもしくは試験管の表面上にコーティングした、またはＣＤ１３７でトランスフェクトした細胞の表面上に発現された、可溶性形態の組換えＣＤ１３７に対する選択を行った。ＣＴＬＡ４−Ｆｃおよび無関係のＨｉｓタグ化タンパク質を、選択において過剰に含まれる非標的として用いた。各選択ラウンドの前に、ファージストックを非標的タンパク質、ビーズ、またはＣＤ１３７陰性細胞に対して予め選択して、非特異的結合物質を除去した。
【０２２４】
ファージ選択から特異的結合物質を同定するために、約４５００個の個々のクローンを、組換え標的（ＣＤ１３７−Ｆｃ）または非標的タンパク質のいずれかでコーティングしたＥＬＩＳＡを用いてファージ型でスクリーニングし、続いていくつかのクローンについて可溶性ｓｃＦｖとして確認した。ＣＤ１３７への特異的結合を示すクローンを配列決定し、さらなる特徴付けのために特有のクローンをＩｇＧとして生成した。
【０２２５】
実施例２−ＥＬＩＳＡによって測定されるヒトＣＤ１３７との結合
目的
目的は、ＣＤ１３７抗体の結合能を決定することであった。
【０２２６】
材料および方法
ＣＤ１３７抗体と組換えヒトＣＤ１３７との結合は、サンドイッチＥＬＩＳＡにより決定した。簡潔に述べると、組換えヒトＣＤ１３７−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ番号８３８−４Ｂ）でコーティングしたＥＬＩＳＡプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ番号６５５０７４）を、調査する種々のＣＤ１３７抗体の段階希釈物とともにインキュベートした。ＨＲＰ結合ヤギ抗ヒトκ軽鎖（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ番号ＳＴＡＲ１２７Ｐ）を用いてＣＤ１３７抗体を検出し、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  ＥＬＩＳＡ  Ｐｉｃｏ化学発光基質（Ｐｉｅｒｃｅ番号３７０６９）を用いて発色させた。種々の抗体のＥＣ５０値を、２〜６回の別々の実験において決定した。
【０２２７】
公表されているアミノ酸配列情報から合成された、ＣＤ１３７に対する特異性を有する２つの異なる参照抗体を本試験に使用した（「ＲＥＦ１」および「ＲＥＦ２」と命名）。
【０２２８】
使用した他の参照抗体、すなわち、ＲＥＦ３、ＲＥＦ４およびＲＥＦ８は、Ａｌｌｉｇａｔｏｒ  ＧＯＬＤライブラリーから得られたヒトＣＤ１３７特異的な単一特異性ＩｇＧ抗体である。それらはアゴニスト性であり、ＣＤ１３７に結合するとＴ細胞を刺激する。参照抗体の結合エピトープは、実施例６〜８に概説されるように確立された（下記参照）。
【０２２９】
参照抗体は、それらが以前に少なくともいくつかの臨床試験を受けており、それに対して新しい抗ＣＤ１３７抗体が改善された特性および／または機能について評価することができるベンチマークを示すため選択された。
【０２３０】
結果および結論
例示的な抗体１６３０／１６３１は、参照抗体と同様の範囲、すなわちサブナノモルのＥＣ５０値を示す。データを表１にまとめる。
【表１】
2020501531.tif 000022
【０２３１】
実施例３−フローサイトメトリーによって測定されるヒトおよびカニクイザルＣＤ１３７との結合
目的
本試験の目的は、ヒトおよびカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＣＤ１３７との結合を決定することであった。
【０２３２】
材料および方法
結合およびＥＣ５０は、ヒトＣＤ１３７、カニクイザルＣＤ１３７、または空のベクターでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞のフローサイトメトリーを用いて決定した。ヒトまたはカニクイザルＣＤ１３７の細胞外部分をヒトＣＤ４０の膜貫通部分および細胞内部分に融合し、ｐｃＤＮＡ３．１にクローニングした。続いて、ベクターをＣＨＯ細胞に安定にトランスフェクトした。ＣＤ１３７の発現は、４℃で３０分間、ＣＤ１３７抗体（ヒトＣＤ１３７−ＰＥ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ番号５５５９５６）を用いてフローサイトメトリーにより確認した。ＣＤ１３７でトランスフェクトした細胞および空のベクターでトランスフェクトした細胞を、ＣＤ１３７抗体とともに４℃で少なくとも１時間インキュベートして結合を飽和させた。抗体の内在化を最小限に抑えるために、０．０５％アジ化ナトリウムをインキュベーション緩衝液中で使用し、全ての作業を氷上で行った。ＰＥ結合抗ｈＩｇＧ抗体（１０９−１１５−０９８、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いてＣＤ１３７抗体を検出し、４℃で３０分間インキュベートした。染色直後に、細胞をパラホルムアルデヒド溶液（１０倍濃縮ＢＤ  ＣｅｌｌＦＩＸ、ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ番号３４０１８１）で固定化した。細胞をＦＡＣＳＶｅｒｓｅ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてフローサイトメトリーにより分析した。各試料の蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を決定し、Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して用量反応データを分析した。
【０２３３】
ＭＦＩデータを各抗体について正規化した：各抗体の用量滴定において、０％は最低値として定義され、１００％は最高値である。ＥＣ５０および９５％信頼区間は、２つの実験のデータ（非線形回帰（曲線適合）、制約は０および１００に設定）に基づいてＧｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して算出した。
【０２３４】
結果および結論
ＣＨＯ−ｈｕＣＤ１３７、ＣＨＯ−ｃｙＣＤ１３７、およびＣＨＯ−ｐｃＤＮＡとの結合は、２つの別々の実験において確認した（図１）。１６３０／１６３１は、２つの参照抗体ＲＥＦ１およびＲＥＦ２と同等のＥＣ５０でヒトＣＤ１３７に結合する。１６３０／１６３１は、カニクイザルＣＤ１３７に十分に結合する。参照抗体ＲＥＦ１およびＲＥＦ８（図１）は、カニクイザルＣＤ１３７に対して非常に弱く結合するかまたは全く結合しない。ＲＥＦ８は、弱い結合を示し、完全な飽和には達しない。
【０２３５】
ＥＣ５０の決定は、アッセイ間およびアッセイ内変動を含めるために、試験した各ＣＤ１３７抗体について９５％信頼区間として提示されている（表２）。
【表２】
2020501531.tif 000023
【０２３６】
実施例４−Ｂｉａｃｏｒｅによって測定される親和性
目的
目的は、異なるＣＤ１３７抗体の親和性、オン速度およびオフ速度を推定することであった。
【０２３７】
材料および方法
従来のアミンカップリングを用いて、ヒトＣＤ１３７（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）をＢｉａｃｏｒｅ（商標）センサーチップ、ＣＭ５に固定化した。試験した抗体および対照（段階希釈した１／２の１０〜０．６３ｎＭ）を、３０μｌ／ｍｌの流速でＨＢＳ−Ｐ（ＧＥ、番号ＢＲ−１００３−６８）中で結合について分析した。その後５分間会合させ、１５分間解離させた。１０ｍＭグリシンｐＨ１．７を３０秒間用いて、再生を２回行った。速度論的パラメータおよび親和性定数は、１：１Ｌａｎｇｍｕｉｒモデルを用いて算出した。
【０２３８】
結果および結論
抗体の親和性は、チップ表面上にコーティングしたＣＤ１３７上に流した二価抗体を用いて測定されたナノモルからサブナノモルの範囲内であった（表３）。
【表３】
2020501531.tif 000024
【０２３９】
実施例５−ＣＤ１３７抗体の標的特異性
目的
この試験の目的は、ＣＤ１３７抗体のいずれかがＣＤ１３７以外の標的に結合するリスクを評価することであった。
【０２４０】
材料および方法
ＥＬＩＳＡ法が既に確立されているＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー（ＣＤ４０およびＯＸ４０）との結合を評価して、非標的タンパク質と交差反応する潜在的傾向を検出した。さらに、ＢＬＡＳＴ検索を行い、最も類似した配列としてＴＮＦＲＳＦ２１を同定した（３４％の配列同一性）。この配列類似性は比較的低いため、ＯＸ４０およびＣＤ４０への非標的結合の決定は十分であると考えられた。
【０２４１】
ＥＬＩＳＡプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ番号６５５０７４）を、５０μｌ／ウェルの組換えヒトＯＸ４０（Ｒ＆Ｄ番号１４９３−ＣＤ）、ＣＤ４０−Ｆｃ（Ａｎｃｅｌｌ番号５０４−８２０）、またはＰＢＳ中０．５μｇ／ｍｌの最終濃度に希釈したＣＤ１３７（Ｒ＆Ｄ番号８３８−４Ｂ）で、３７℃で１時間または４℃で一晩コーティングした。プレートをＰＢＳ＋０．０５％ＴＷＥＥＮ２０（ＰＢＳＴ）で洗浄し、続いてＰＢＳＴ＋１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロックした。抗体試料を、ＰＢＳＴ＋１％ＢＳＡ中の１０〜０．０１μｇ／ｍｌから１／１０の連続希釈液として調製し、室温で１時間インキュベートし、続いて西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ヒトκ軽鎖抗体（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ番号ＳＴＡＲ１２７Ｐ）を用いて検出し、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  ＥＬＩＳＡ  Ｐｉｃｏ化学発光基質（Ｐｉｅｒｃｅ  ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ番号３７０６９）を用いて発色させた。
【０２４２】
結果および結論
【表４】
2020501531.tif 000025
【０２４３】
２つの実験の結果は類似していた。１つの抗体（ＲＥＦ４）がＯＸ４０およびＣＤ４０に対して弱い結合を示したが、残りの抗体はどれも、ＯＸ４０またはＣＤ４０のいずれに対してもいずれの検出可能な結合も示さなかった。分析した抗体の概要、および２つの実験の結果を表４に示す。
【０２４４】
さらに、複数の供血者からの初代ＰＢＬとの結合を試験した。１６３０／１６３１および２６７４／２６７５とＰＢＬとの結合は参照抗体と同様であった。非標的タンパク質への関連性のある非特異的結合は検出されなかった。
【０２４５】
実施例６−ＣＤ１３７に結合する抗体のドメインマッピング
目的
目的は、異なるクラスのエピトープ特異性を定義し、参照抗体の特性と比較することであった。
【０２４６】
材料および方法
トランスフェクトされた細胞の表面に発現されたヒト／マウスＣＤ１３７キメラのパネルに結合する各抗体の能力をフローサイトメトリーによって分析した。
【０２４７】
キメラは、ヒトＣＤ１３７のドメインまたはモジュールを、対応するマウスドメインと交換することによって設計した。ＣＤ１３７ヒト／マウスキメラの遺伝子を合成し（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）、構築物をｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３−Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に一過性にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞をＣＤ１３７抗体および対照抗体とともにインキュベートし、続いて検出のために抗ヒトＩｇＧ−ＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）とともにインキュベートし、ＦＡＣＳ  Ｖｅｒｓｅ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により分析した。異なるキメラ構築物との結合を、アイソタイプ対照の結合と比較した相対ＭＦＩとして算出し、続いて個々の抗体間の親和性の差の影響を最小限に抑えるために全長ヒトＣＤ１３７構築物に対して正規化を行った。
【０２４８】
結果および結論
後述の図２に記載されるように、３つの結合パターンが観察された。データを表５にまとめる。
【０２４９】
パターンＡ
抗体ＲＥＦ１は、ヒトＣＤ１３７との結合のためにドメイン１に依存する。
【０２５０】
パターンＢ
抗体ＲＥＦ３、ＲＥＦ４、２６７４／２６７５および１６３０／１６３１は、ヒトＣＤ１３７との結合のために主にドメイン２に依存する。
【０２５１】
パターンＣ
抗体ＲＥＦ２（参照抗体）およびＲＥＦ８は、ヒトＣＤ１３７との結合のために主にドメイン３Ｂ〜４Ａに依存していると考えられる。
【表５】
2020501531.tif 000026
【０２５２】
実施例７−ＣＤ１３７リガンドのブロック
目的および背景
目的は、ＣＤ１３７抗体がＣＤ１３７リガンド結合をブロックするかどうかを決定することであった。
【０２５３】
ＣＤ１３７抗体がリガンド結合領域に近接したエピトープに結合すると、抗原との結合がリガンド結合の部分的または全体的なブロックをもたらし得る。ＣＤ１３７リガンド結合エピトープに近接した結合もまた、ＣＤ１３７リガンド結合エピトープの立体障害または立体構造変化に起因してリガンド結合に影響を及ぼし得る。リガンドブロッキング特性を評価するために、全てのＣＤ１３７抗体を一定濃度のＣＤ１３７Ｌに対して滴定した。
【０２５４】
材料および方法
ヒトＣＤ１３７でトランスフェクトしたＣＨＯ細胞をリガンド競合に用いた。ヒトＣＤ１３７の細胞外部分をｈＣＤ４０の膜貫通部分および細胞内部分に融合し、ｐｃＤＮＡ３．１にクローニングした。続いて、ベクターをＣＨＯ細胞に安定にトランスフェクトした。ＣＤ１３７の発現は、ＣＤ１３７を標的とする市販の抗体で染色することにより確認した。
【０２５５】
ＥＣ５０の濃度のＣＤ１３７リガンドを添加する前に、ＣＨＯ−ｈｕＣＤ１３７をＣＤ１３７モノクローナル抗体とともにプレインキュベートし、所定の飽和濃度（０．２５μｇ／ｍｌ）から＋４℃で１時間滴定した。＋４℃でさらに３０分間共インキュベートした後、細胞を洗浄し、結合したＣＤ１３７リガンドを抗ＦＬＡＧ−ＡＰＣ（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で検出した。分析前に、細胞をパラホルムアルデヒド（１０倍濃縮ＢＤ  ＣｅｌｌＦＩＸ、ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で固定化した。分析はＦＡＣＳｖｅｒｓｅを用いて行い、ＭＦＩ（蛍光強度中央値）はＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて算出した。
【０２５６】
結果および結論
試験した全てのＣＤ１３７ｍＡｂはＣＤ１３７リガンド結合をブロックしていなかったと結論付けることができる（表６、図３）。ドメイン２Ｂ〜４Ａに結合する、グループＢおよびＣに属するＣＤ１３７ｍＡｂは、ＣＤ１３７Ｌをブロックする（２６７４／２６７５および１６３０／１６３１を含む）。ドメイン１に結合したグループＡに属するＲＥＦ１は、ＣＤ１３７リガンドをブロックしなかった。ＲＥＦ１はＣＤ１３７Ｌの結合を増加させた。
【表６】
2020501531.tif 000027
【０２５７】
実施例８−競合ＥＬＩＳＡ
目的および背景
各ＣＤ１３７抗体を互いに競合させることによって、それらのブロックパターンに基づいて類似のエピトープに結合する抗体を決定することが可能である。競合ＥＬＩＳＡは、コーティングされたＣＤ１３７−Ｆｃに結合したときに、ビオチン化ＣＤ１３７抗体を非ビオチン化ＣＤ１３７抗体と共インキュベートすることによって行われる。競合は、ビオチン化ＣＤ１３７抗体からのシグナルの喪失として定義される。低い競合値は、抗体間に競合がないこと、または抗体の結合動態いずれかに起因し得る。１つの抗体の結合はまた、他のＣＤ１３７抗体の結合に影響を与える抗原に結合したときに立体障害または立体構造変化をもたらし得る。
【０２５８】
材料および方法
ＣＤ１３７抗体をビオチン化し（ＥＺ−ｌｉｎｋ  ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ＣＤ１３７−Ｆｃに対するインタクトな結合特性を、ビオチン化抗ＣＤ１３７ｍＡｂと非ビオチン化抗ＣＤ１３７ｍＡｂのＥＣ５０を比較することによりＥＬＩＳＡで検証した。非ビオチン化抗ＣＤ１３７（抗ＣＤ１３７−ｂｉｏ）を、決定されたＥＣ５０より３０倍高い濃度のＣＤ１３７−Ｆｃと０．５時間プレインキュベートした。洗浄せずに、抗ＣＤ１３７−ｂｉｏを添加し、さらに１時間共インキュベートした。抗ＣＤ１３７−ｂｉｏの結合はストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）で検出した。競合は、その最大競合（それ自体と競合する）と比較して他の抗体に対して測定された結合を除すことによって相対数として算出した。得られた相対値を最大ブロック能に対して正規化した（表７）。
【表７】
2020501531.tif 000028
【０２５９】
結果および結論
競合ＥＬＩＳＡを２回繰り返した。両方の実験において、ＣＤ１３７ｍＡｂのうちのいくつかは、それ自体と完全には競合しなかった（表７）。ドメインマッピンググループＡに属する抗体ＲＥＦ１は、競合ＥＬＩＳＡにおいて特有のパターンを示した。分析した他のＣＤ１３７抗体は、同様のブロックパターンを示した。これらの抗体間の結合動態の差は、これらの抗体の間の結合パターンのわずかな変化をある程度説明し得るが、グループ内の小さな変化が結合エピトープにおける実際の差を反映するということを考慮しないわけにはいかない。
【０２６０】
実施例９−ＣＤ１３７抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ効果
目的
目的は、アゴニスト活性を有するＣＤ１３７抗体を同定することであった。
【０２６１】
材料および方法
ＣＤ１３７抗体のアゴニスト活性は、初代ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞に基づくＴ細胞アッセイにおいて評価した。簡潔に述べると、ＣＤ８＋Ｔ細胞を製造業者のプロトコルに従ってＭＡＣＳ分離（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ番号１３０−０９６−４９５）によりヒト末梢血単核球から分離した。細胞を、抗ＣＤ３抗体（クローンＯＫＴ３、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ番号１６−００３７）で予めコーティングした９６ウェルマイクロタイタープレート（ＮｕｎｃＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ番号２６８２００）中でインキュベートし、試験されるＣＤ１３７抗体の濃度を滴定した。７２時間または９６時間のインキュベーション後、培地を回収し、ＩＦＮ−γレベルをＥＬＩＳＡ（ＢＤ番号５５５１４２）により決定した。
【０２６２】
各クローンを少なくとも６つのドナーにおいて分析し、参照ＣＤ１３７抗体ＲＥＦ１および陰性対照抗体と比較した。
【０２６３】
ドナー内の変動が大きいため、刺激指数（ＳＩ、陰性対照と比較した抗体による誘導倍率）を各試料について決定し、参照抗体ＲＥＦ１の刺激指数に対して正規化した。
【０２６４】
結果および結論
参照ＲＥＦ１と同等の有効性を有するいくつかのクローンが同定された。データを図４にまとめる。
【０２６５】
表８  表８は、ＣＤ１３７刺激により誘導された絶対ＩＦＮ−γレベルを示す。しかしながら、全てのドナーにおいて全ての抗体を突き合わせて分析したわけではなく、正規化されたＳＩは有効性の比較により関連している。
【表８】
2020501531.tif 000029
【０２６６】
実施例１０−ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＮＦｋＢレポーターアッセイ
２９３Ｔ細胞（３，０００万個）を、ヒトＣＤ１３７、ＮＦ−κＢプロモーター下のホタルルシフェラーゼ、およびウミシイタケをコードするプラスミドでトランスフェクトした。５時間のトランスフェクション後、抗体を３つの異なる濃度で添加した。１８時間後、細胞を回収し、ルシフェラーゼレポーターアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を行った。細胞を、架橋せずに、および架橋させて（抗ＩｇＧ抗体を用いて５μｇ／ｍｌで架橋）、可溶性抗体とともに培養した。
【０２６７】
結果
１６３０／１６３１は、架橋されるとＣＤ１３７によるＮＦ−κＢ媒介性シグナル伝達の誘導を刺激するが、架橋剤の非存在下では刺激しない。対照的に、ＲＥＦ１は架橋剤の非存在下でもＣＤ１３７によるシグナル伝達を誘導する。
【０２６８】
実施例１１−ＨＴ−２９結腸癌モデルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍効果
概要
ｈＰＢＭＣヒト化免疫不全マウスおよびＨＴ−２９結腸癌の皮下腫瘍モデルを用いて１６３０／１６３１の抗腫瘍効果を調べた。
【０２６９】
１６３０／１６３１は、統計的に有意な腫瘍体積の抑制を示した。
【０２７０】
材料および方法
白血球濃縮物は、Ｌｕｎｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌから入手した。
【０２７１】
Ｔａｃｏｎｉｃ’ｓ  ＤｅｎｍａｒｋからのメスＳＣＩＤ−Ｂｅｉｇｅマウス（７〜８週齢）を実験に用いた。全ての実験はＭａｌｍｏ／Ｌｕｎｄ倫理委員会の承認によって行われた。
【０２７２】
ＨＴ−２９結腸癌をＡＴＣＣから入手し、ＡＴＣＣの推奨に従って培養した。対数期に増殖しているＨＴ−２９細胞株を皮下注射した（０日目（Ｄ０）に２００μＬ中４×１０６細胞）。白血球濃縮物から単離したヒトＰＢＭＣ（１００μＬ中７×１０６）を同じ日に腹腔内注射した。６、１３、および２０日目に腹腔内処置（１００μｇ）を行った。
【０２７３】
ノギスを用いて幅、長さおよび高さを測定し、腫瘍体積を算出した（幅／２×長さ／２×高さ／２×π×（４／３））。創傷時に腫瘍体積が２ｃｍ３に達する前、またはマウスの健康に影響を与える前に、動物を屠殺した。
【０２７４】
ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍプログラムを用いたマン・ホイットニー検定によってデータを分析した。
【０２７５】
結果
４つの異なるドナーを用いて移植したマウスからのプールデータは、ビヒクル群との比較において、１２〜１６日目に１６３０／１６３１抗体で処置した場合に腫瘍増殖の阻害の形で統計的に有意な抗腫瘍効果を示した（ｐ＝０．０６７５〜ｐ＝０．０１３２、マン・ホイットニーのノンパラメトリックな両側検定）。腫瘍体積抑制率は、１０日目〜２１日目に１６３０／１６３１で２９〜４２％の範囲であった（図６および表９を参照）。
【０２７６】
結論として、１６３０／１６３１の抗腫瘍効果をｈＰＢＭＣヒト化免疫不全マウスおよびＨＴ−２９結腸癌の皮下腫瘍モデルを用いて調べた。１６３０／１６３１は、統計的に有意な腫瘍体積の抑制を示した。
【表９】
2020501531.tif 000030
【０２７７】
実施例１２−ＣＤ１３７親抗体クローン１６３０／１６３１の最適化
最適化の目的は、親和性および生物物理学的特性に関して、１６３０／１６３１抗体の改良型変異体を作製することであった。ビーズの表面上にコーティングした組換えＣＤ１３７に対するファージ選択を行い、各選択ラウンドの前に、ファージストックをビーズと同様に非標的タンパク質に対して予め選択した。４回目の選択の前に、６５℃で熱インキュベーションステップを行った。全体として、選択戦略は、洗浄ステップを延長し、ファージプールとＣＤ１３７との間のインキュベーション時間を短縮することにより、遅いオフ速度ならびに速いオン速度でクローンの単離を促進するように設計された。
【０２７８】
ファージ選択後、可溶性ｓｃＦｖ型でスクリーニングを行い、標的結合クローンを同定すると同時に多様性を評価した。改善された温度安定性、カニクイザル反応性、および親和性または解離速度を有するクローンを同定するために、拡張一次スクリーニングを行った。Ｓ２２８Ｐ安定化変異を有する最終ＩｇＧ４型に合計５０クローンを再クローン化した。最適化変異体のさらなる評価を最終形態で行い、ＥＬＩＳＡ設定における結合、ＦＡＣＳにより決定される細胞結合、親和性、ＥＬＩＳＡ設定およびＤＳＦの両方によって決定される温度安定性、ＳＥ−ＨＰＬＣ、Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ社のモデル化および特異性に焦点を合わせた。
【０２７９】
実施例１３−クローン２６７４／２６７５の改善された安定性
ＤＳＦ分析による目的は、親クローン１６３０／１６３１と比較してクローン２６７４／２６７５のＴｍを決定し、最適化後の温度安定性における改善を評価することであった。
【０２８０】
材料および方法
全ての抗体を、ＳＡＲｏｍｉｃｓ  Ｂｉｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅにおいて示差走査蛍光分析法（ＤＳＦ）により分析した。試料を滅菌濾過したＰＢＳ中０．１ｍｇ／ｍｌに希釈し、１５０μｌの体積をＳＡＲｏｍｉｃｓに送った。
【０２８１】
ＤＳＦ測定用の試料（ＰＢＳ緩衝液中０．１ｍｇ／ｍｌ）は、６３μｌの試料＋７μｌのＰＢＳ緩衝液、１：１００倍に希釈したＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅ）で構成されていた。全体で、ＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅを１：１０００倍に希釈した。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＭＸ３０００Ｐ、ｑＰＣＲ機を用いて各構築物について二重測定を行った。測定は２５℃〜９５℃の温度範囲で行った。全ての試料について平均融解温度Ｔｍを算出した。
【０２８２】
結果および結論
全試料の融解曲線を得、２６７４／２６７５および親クローン１６３０／１６３１について決定されたＴｍ１およびＴｍ２は以下の表１０に見ることができる。２６７４／２６７５は、親クローン１６３０／１６３１と比較して１〜２℃改善されたＴｍ２を示した。
【表１０】
2020501531.tif 000031
【０２８３】
実施例１４−Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ社での抗体凝集予測により分析されたクローン２６７４／２６７５の凝集傾向の減少
最適化変異体をＳｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ社で分析することの目的は、親クローン１６３０と比較して疎水性パッチのサイズおよび２６７４／２６７５の凝集傾向を評価することであった。
【０２８４】
材料および方法
異なる変異体の配列をＳｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ社に送り、３Ｄ構造を作成した。３ＤモデルをＰｒｏｔｅｉｎ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒで分析し、ＡｇｇＳｃｏｒｅでランク付けした。ＲＥＦ９−２４は、ヒトＣＤ１３７に対する結合能に基づいて最適化の間に得られたクローンである。
【０２８５】
結果および結論
クローン２６７４／２６７５およびＲＥＦ９−２４（選択の間に得られたクローン）ならびに親クローン１６３０／１６３１について定義されたパッチサイズおよびＡｇｇＳｃｏｒｅは図７に見ることができる。モデル化分析によれば、導入された突然変異は疎水性パッチを明らかに破壊し、凝集傾向を減少させたと結論付けることができる。
【０２８６】
実施例１５−ＥＬＩＳＡによって測定された２６７４／２６７５とヒトおよびカニクイザルＣＤ１３７との結合
目的および背景
評価の目的は、ＥＬＩＳＡにおいて親クローン１６３０／１６３１と比較して２６７４／２６７５とヒトおよびカニクイザルＣＤ１３７の両方との結合を決定することであった。
【０２８７】
材料および方法
ＣＤ１３７抗体と組換えヒトＣＤ１３７との結合はサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定した。簡潔に述べると、組換えヒトＣＤ１３７−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ番号８３８−４Ｂ）でコーティングしたＥＬＩＳＡプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ番号６５５０７４）を、調査する種々のＣＤ１３７抗体の段階希釈物とともにインキュベートした。ＣＤ１３７抗体は、ＨＲＰ結合ヤギ抗ヒトκ軽鎖（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ番号ＳＴＡＲ１２７Ｐ）を用いて検出し、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  ＥＬＩＳＡ  Ｐｉｃｏ化学発光基質（Ｐｉｅｒｃｅ番号３７０６９）を用いて発色させた。種々の抗体のＥＣ５０値を、２〜６回の別々の実験において決定した。
【０２８８】
結果および結論
２６７４／２６７５は、親クローン１６３０／１６３１と同様の範囲、すなわちサブナノモルのＥＣ５０値を示す。データを下の表１１にまとめる。
【表１１】
2020501531.tif 000032
【０２８９】
実施例１６−２６７４／２６７５とヒトおよびカニクイザルＣＤ１３７との結合（Ｏｃｔｅｔ）
目的
目的は、Ｏｃｔｅｔプラットフォームを用いて、ヒトおよびカニクイザルＣＤ１３７に対する２６７４／２６７５および１６３０／１６３１の相対的結合親和性を比較することであった。
【０２９０】
材料および方法
ＣＤ１３７の親和性を、Ｏｃｔｅｔ  Ｒｅｄ９６プラットフォーム（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を用いて決定した。２６７４／２６７５、１６３０／１６３１、ＲＥＦ１、ＲＥＦ２および１１８８アイソタイプ対照を、ＥＤＣおよびＮＨＳとのアミンカップリングにより、１０μｇ／ｍｌでＡＲＧ２バイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ番号１８−５０９２）に結合した。１００ｎＭからのＣＤ１３７（Ａｃｒｏ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ番号４１Ｂ−Ｈ５２２７および番号４１Ｂ−Ｃ５２Ｈ４）の７２倍段階希釈物を１×Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ番号１８−１０９２）中で調製した。会合を１８０秒間測定し、続いて１×Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｂｕｆｆｅｒ中で１８０秒間解離させた。再生には１０ｍＭグリシンｐＨ２．２を使用した。
【０２９１】
生成されたデータを参照ウェルのサブトラクション（１１８８）により参照し、ベースラインをｙ軸と整列させ、関連性に対する整列により段階間相関を実施し、データ分析ソフトウェア（ｖ．９．０．０．１４）におけるＳａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙフィルタリングによりデータを平滑化した。フィッティング精度の測定として、Ｘ２を有する１：１ラングミュア結合モデルを用いて処理データをフィットさせた。
【０２９２】
結果および結論
ヒトおよびカニクイザルＣＤ１３７に対する２６７４／２６７５、１６３０／１６３１およびＲＥＦ抗体の結合親和性を表１２に示す。ヒトＣＤ１３７に対する２６７４／２６７５の親和性は、１６３０／１６３１と比較して２倍改善された。カニクイザルＣＤ１３７に対する２６７４／２６７５の親和性は、１６３０／１６３１と同じ範囲内であった。
【表１２】
2020501531.tif 000033
【０２９３】
実施例１７−ヒトＦｃγＲに対する２６７４／２６７５の結合親和性
目的
目的は、Ｏｃｔｅｔプラットフォームを用いて、ヒトＦｃγＲに対する２６７４／２６７５の相対的結合親和性を決定することであった。
【０２９４】
材料および方法
Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  Ｆａｂ−ＣＨ１（ＦＡＢ２Ｇ）センサーチップ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を備えたＯｃｔｅｔ  ＲＥＤ９６プラットフォームを用いてＦｃγＲ親和性を決定した。抗体を１×Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）中で２００ｎＭに希釈し、１組の８個の平行センサーに３００秒間ロードして、＞１．５ｎｍの固定化反応を得た次いで、固定化抗体を、１００ｎＭから開始して、７ ２倍希釈のＦｃγＲに対してアッセイした。参照用に１つの固定化センサーを１×Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  Ｂｕｆｆｅｒに対してアッセイし、二重参照を可能にするために抗体を固定化せずにアッセイ全体を繰り返した。含まれるＦｃγＲは、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから入手した（ヒトＦｃγＲＩ、番号１２５７−ＦＣ−０５０；ヒトＦｃγＲＩＩａ、番号１３３０−ＣＤ−０５０；ヒトＦｃγＲＩＩｂ、番号１４６０−ＣＤ−０５０；ヒトＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ１５８）、番号４３２５−ＦＣ−０５０；ヒトＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ１５８）、番号８８９４−ＦＣ−０５０）。ＦｃγＲとの結合を６０秒間行い、続いて１×Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  Ｂｕｆｆｅｒ中で６０秒間解離させ、１０ｍＭグリシン、ｐＨ１．７を用いてセンサーチップを再生した。生成されたデータを標準的な二重参照により参照し、ベースラインをｙ軸と整列させ、解離に対する整列による段階間相関を実施し、データ分析ソフトウェア（ｖ．９．０．０．１４）におけるＳａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙフィルタリングによりデータを平滑化した。フィッティング精度の測定として、Ｘ２を有する１：１ラングミュア結合モデルを用いて処理データをフィットさせた。非常に速い解離速度でＦｃγＲに対して生成された解離曲線の曲線フィッティングの品質を改善するために、解離曲線の最初の１０秒のみを曲線フィッティングに含めた。
【０２９５】
結果および結論
２６７４／２６７５およびＲＥＦ抗体のヒトＦｃγＲに対する結合親和性を表１３に示す。ＩｇＧ４抗体と高親和性受容体ＦｃγＲＩとの結合に予想されるように、２６７４／２６７５は、ヒトＦｃγＲＩに対して全ての他のアッセイされたＦｃ受容体よりも強い結合を有する。２６７４／２６７５は、ＲＥＦ１抗体と同等のヒトＦｃγＲとの結合を有する。
【表１３】
2020501531.tif 000034
【０２９６】
実施例１８−ＦＡＣＳによって測定された２６７４／２６７５とヒトおよびカニクイザルＣＤ１３７との結合
本試験の目的は、ヒトおよびカニクイザルＣＤ１３７との結合を決定することであった。
【０２９７】
材料および方法
結合およびＥＣ５０は、ヒトＣＤ１３７、カニクイザルＣＤ１３７または空のベクターでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞のフローサイトメトリーを用いて決定した。ヒトまたはカニクイザルＣＤ１３７の細胞外部分をヒトＣＤ４０の膜貫通部分および細胞内部分に融合し、ｐｃＤＮＡ３．１にクローニングした。続いて、ベクターをＣＨＯ細胞に安定にトランスフェクトした。ＣＤ１３７の発現は、４℃で３０分間、ＣＤ１３７抗体（ヒトＣＤ１３７−ＰＥ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ番号５５５９５６）を用いたフローサイトメトリーにより確認した。ＣＤ１３７でトランスフェクトした細胞および空のベクターでトランスフェクトした細胞を、ＣＤ１３７抗体とともに４℃で少なくとも１時間インキュベートして結合を飽和させた。抗体の内在化を最小限に抑えるために、０．０５％アジ化ナトリウムをインキュベーション緩衝液中で使用し、全ての作業を氷上で行った。ＰＥ結合抗ｈＩｇＧ抗体（１０９−１１５−０９８、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いてＣＤ１３７抗体を検出し、４℃で３０分間インキュベートした。染色直後に、細胞をパラホルムアルデヒド溶液（１０倍濃縮ＢＤ  ＣｅｌｌＦＩＸ、ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ番号３４０１８１）で固定化した。細胞をＦＡＣＳＶｅｒｓｅ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてフローサイトメトリーにより分析した。各試料の蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を決定し、Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して用量反応データを分析した。
【０２９８】
ＭＦＩデータを各抗体について正規化した：各抗体の用量滴定において、０％は最低値として定義され、１００％は最高値である。ＥＣ５０および９５％信頼区間は、２つの実験のデータ（非線形回帰（曲線適合）、制約は０および１００に設定）に基づいてＧｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して算出した。
【０２９９】
結果および結論
２６７４／２６７５は、親クローン１６３０ならびにＲＥＦ１およびＲＥＦ２  ＣＤ１３７ｍＡｂと同等のヒトＣＤ１３７との結合を示す（図８および表１４）。２６７４／２６７５および１６３０／１６３１はカニクイザルＣＤ１３７に対して同等の結合を有するが、ＲＥＦ１はカニクイザルＣＤ１３７には全く結合しない。
【表１４】
2020501531.tif 000035
【０３００】
実施例１９−ＣＤ１３７ｍＡｂの架橋のためにＦｃγＲ発現細胞を用いたＣＤ１３７レポーターアッセイ
目的および背景
ＣＤ１３７ｍＡｂをＦｃγＲでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞と架橋した場合のＣＤ１３７レポーターアッセイにおける親クローン１６３０／１６３１を用いた２６７４／２６７５の機能的評価。
【０３０１】
材料および方法
ヒトＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ  Ｒ１３１、ＦｃγＲＩＩｂまたは空のベクター（ｐｃＤＮＡ３．１）でトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を架橋に用いた。ＦｃγＲ遺伝子をｐｃＤＮＡ３．１にクローニングした。続いて、ベクターをＣＨＯ細胞に安定にトランスフェクトした。ＦｃγＲの発現は、ＣＤ３２またはＣＤ６４を標的とする市販の抗体で染色することにより確認した。
【０３０２】
ＣＤ１３７ｍＡｂのアゴニスト機能は、ＣＤ１３７レポーターアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＣＤ１３７Ｂｉｏａｓｓａｙ  Ｋｉｔ  ＣＳ１９６００５）を用いて評価した。製造業者のプロトコルに従ってアッセイを行った。簡潔に述べると、ＦｃγＲでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞および滴定濃度のＣＤ１３７ｍＡｂを１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩに希釈し、ＣＤ１３７（ジャーカット／ＣＤ１３７細胞）レポーター細胞を添加する前にアッセイプレートに添加した。アッセイプレートを、Ｂｉｏ−Ｇｌｏ  ＴＭ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎの添加まで３７℃で６時間インキュベートし、プレートをＢＭＧリーダーで読み取った。
【０３０３】
結果および結論
ＣＤ１３７レポーターアッセイにおけるＦｃγＲＩでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞とＣＤ１３７  ｍＡｂの架橋は、２６７４／２６７５および親クローン１６３０／１６３１がレポーター細胞株においてＮＦ−κＢのＣＤ１３７依存性の活性化を誘導することを示している（図９）。ＣＤ１３７抗体が架橋依存性である場合、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ  Ｒ１３１およびＦｃγＲＩＩｂに対する結合親和性（前の実施例において示した）は、ＦｃγＲ架橋後にＣＤ１３７レポーターアッセイにおいて誘導されたアゴニスト活性と十分に相関すると結論付けることができる（図１０）。２６７４／２６７５、１６３０／１６３１またはＲＥＦ２ではなく、ＲＥＦ１のＦｃγＲ架橋依存性の活性化は、空のベクターでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を用いて決定した（図１１）。
【０３０４】
実施例２０−Ｄ１３７抗体の架橋のためにＦｃγＲＩ発現ＣＨＯ細胞を用いたＣＤ８＋Ｔ細胞アゴニストアッセイ
目的および背景
ＣＤ１３７ｍＡｂをＦｃγＲＩ発現細胞と架橋した場合のＣＤ８＋Ｔ細胞アゴニストアッセイにおける親クローン１６３０／１６３１を用いた２６７４／２６７５の機能的評価
【０３０５】
材料および方法
ヒトＦｃγＲＩでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を架橋に用いた。ＦｃγＲＩ遺伝子をｐｃＤＮＡ３．１にクローニングした。続いて、ベクターをＣＨＯ細胞に安定にトランスフェクトした。ＦｃγＲＩの発現は、ＣＤ６４を標的とする市販の抗体で染色することにより確認した。
【０３０６】
ＣＤ１３７抗体のアゴニスト活性は、初代ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞に基づくＴ細胞アッセイにおいて評価した。簡潔に述べると、ＣＤ８＋Ｔ細胞を製造業者のプロトコルに従ってＭＡＣＳ分離（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ番号１３０−０９６−４９５）によりヒト末梢血単核球から分離した。細胞を、ＦｃγＲＩでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞とプレインキュベートした９６ウェルマイクロタイタープレート（ＮｕｎｃＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ番号２６８２００）中でインキュベートし、抗ＣＤ３抗体（クローンＯＫＴ３、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ番号１６−００３７）でコーティングしたトシルビーズとインキュベートし、試験されるＣＤ１３７抗体の濃度を滴定した。７２時間のインキュベーション後、培地を回収し、ＩＦＮ−γレベルをＥＬＩＳＡ（ＢＤ番号５５５１４２）により決定した。
【０３０７】
各クローンを少なくとも５つのドナーにおいて分析し、参照ＣＤ１３７抗体ＲＥＦ２と比較した。ドナー内の変動が大きいため、比較のためにＩＦＮ−γレベルを各ドナー内の２６７４／２６７５で正規化した。
【０３０８】
結果および結論
ＣＤ８Ｔ細胞アゴニストアッセイにおけるＦｃγＲＩ発現ＣＨＯ細胞とＣＤ１３７ｍＡｂの架橋は、２６７４／２６７５および親クローン１６３０／１６３１が、７２時間後のＩＦＮ−γ産生の増加として測定されたＴ細胞活性化を誘導したが、ＲＥＦ２は誘導しなかったことを示している（図１２）。２６７４／２６７５、１６３０／１６３１およびＲＥＦ２のＦｃγＲに対するＩｇＧ結合親和性を決定し、前の実施例において示した。ＦｃγＲに対するＩｇＧ結合親和性はＣＤ８＋Ｔ細胞において誘導されるアゴニスト活性と相関すると結論付けることができる。
【０３０９】
実施例２１−ＨＴ−２９結腸癌モデルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍効果
目的
ｈＰＢＭＣヒト化免疫不全マウスおよびＨＴ−２９結腸癌の皮下腫瘍モデルを用いて２６７４／２６７５の抗腫瘍効果を調べた。
【０３１０】
材料および方法
白血球濃縮物は、Ｌｕｎｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌから入手した。Ｔａｃｏｎｉｃ’ｓ  ＤｅｎｍａｒｋからのメスＳＣＩＤ−Ｂｅｉｇｅマウス（７〜８週齢）を実験に用いた。全ての実験はＭａｌｍｏ／Ｌｕｎｄ倫理委員会の承認によって行われた。
【０３１１】
ＨＴ−２９結腸癌をＡＴＣＣから入手し、ＡＴＣＣの推奨に従って培養した。対数期に増殖しているＨＴ−２９細胞株を皮下注射した（０日目（Ｄ０）に２００μＬ中４×１０６細胞）。白血球濃縮物から単離したヒトＰＢＭＣ（１００μＬ中１０×１０６）を同じ日に腹腔内注射した。７日目から始めて３週間、腹腔内治療（１００μｇ）を週２回行った。
【０３１２】
ノギスを用いて幅、長さおよび高さを測定し、腫瘍体積を算出した（幅／２×長さ／２×高さ／２×π×（４／３））。創傷時に腫瘍体積が２ｃｍ３に達する前、またはマウスの健康に影響を与える前に、動物を屠殺した。
【０３１３】
結果および結論
２６７４／２６７５は、ビヒクル群と比較して、ヒト化マウスモデルにおいて抗腫瘍効果を示した。腫瘍体積抑制率は、１９日〜２８日に２６７４／２６７５で０〜３５％の範囲であった（表１５）。
【０３１４】
結論として、２６７４／２６７５の抗腫瘍効果をｈＰＢＭＣヒト化免疫不全マウスおよびＨＴ−２９結腸癌の皮下腫瘍モデルを用いて調べた。２６７４／２６７５は、腫瘍体積の抑制を示した。
【表１５】
2020501531.tif 000036
【０３１５】
実施例２２−ヒト腫瘍組織におけるＦｃγＲおよびＣＤ１３７の同時発現の遺伝子発現分析
目的
マイクロアレイおよびＲＮＡ配列データセットの精巧かつ品質管理されたデータベースを用いて、広範囲のヒト癌における種々のＦｃγ受容体およびＣＤ１３７の遺伝子発現を評価すること。
【０３１６】
方法
ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩｂおよびＣＤ１３７の平均発現値は、ヒト組織についてのＲＮＡマイクロアレイ研究の精巧かつ品質管理されたデータベースであるＧｅｎｅｖｅｓｔｉｇａｔｏｒを用いて遺伝子発現プロファイリングを行うことによって得た（Ｈｒｕｚ  ｅｔ  ａｌ．２００８，Ａｄｖ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ２００８：４２０７４７（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）。ＣＤ１３７に対する種々のＦｃγ受容体遺伝子の平均発現値をプロットすることによって相関プロットを得た（図１３）。Ｆｃγ受容体およびＣＤ１３７の両方の平均を上回る発現（平均発現レベル≧１０）を示す癌を同定し、上位１０の固形腫瘍型および血液悪性腫瘍をそれぞれ表１６および表１７に示す。
【０３１７】
結果および結論
Ｆｃγ受容体の高い発現およびＣＤ１３７の平均を上回る発現を示すいくつかのヒト腫瘍をこの方法を用いて同定した。下の表は、本発明において定義される抗体に対して高い感受性を示し得る適応症の例を提供する。このアプローチは、アゴニストＣＤ１３７抗体による治療から利益を受け得る患者コホートまたは個々の患者を同定するために使用することができる実際に、この種のアプローチは、治療から利益を受け得る患者を個人レベルで同定するために使用することができる。腫瘍を分子的に特徴付けるために使用されている他の方法、例えば、次世代シーケンシング、または免疫組織化学、フローサイトメトリーもしくはプロテオミクスアプローチ等のタンパク質分析に基づく方法も想定することができる。
【表１６Ａ】
2020501531.tif 000037
【表１６Ｂ】
2020501531.tif 000038
【表１７Ａ】
2020501531.tif 000039
【表１７Ｂ】
2020501531.tif 000040
参考文献
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Ｈｕ  Ｗ，Ｌｉ  Ｘ，Ｚｈａｎｇ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒｓ．Ｃｌｉｎ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｏｎｃｏｌ．２０１６  Ｍａｒ；１８（３）：２５１−８．
Ｋｉｍ，Ｊ．Ａ．，Ａｖｅｒｂｏｏｋ，Ｂ．Ｊ．，Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ｋ．，Ｒｏｔｈｃｈｉｌｄ，Ｋ．，Ｋｊａｅｒｇａａｒｄ，Ｊ．，Ｐａｐａｙ，Ｒ．，ａｎｄ  Ｓｈｕ，Ｓ．（２００１）Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ４−１ＢＢ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｏｎ  ａｎｔｉｔｕｍｏｕｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｏｎ  ｔｕｍｏｕｒ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６１，２０３１−２０３７．
Ｋｗｏｎｇ，Ｂ．，Ｇａｉ，Ｓ．Ａ．，Ｅｌｋｈａｄｅｒ，Ｊ．，Ｗｉｔｔｒｕｐ，Ｋ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｉｒｖｉｎｅ，Ｄ．Ｊ．（２０１３）Ｌｏｃａｌｉｚｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｖｉａ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ａｎｃｈｏｒｅｄ  Ａｎｔｉ−ＣＤ１３７＋ＩＬ−２ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｌｅｔｈａｌ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｅｌｉｃｉｔｓ  ｌｏｃａｌ  ａｎｄ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ａｎｔｉｔｕｍｏｕｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７３，１５４７−１５５８．
Ｌｅｅ，Ｈ．Ｗ．，Ｐａｒｋ，Ｓ．Ｊ．，Ｃｈｏｉ，Ｂ．Ｋ．，Ｋｉｍ，Ｈ．Ｈ．，Ｎａｍ，Ｋ．Ｏ．，ａｎｄ  Ｋｗｏｎ，Ｂ．Ｓ．（２００２）４−１ＢＢ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｔｈｅ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  ＣＤ８＋  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｂｙ  ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｃｌ−ｘＬ  ａｎｄ  Ｂｆｌ−１．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６９，４８８２−４８８８．
Ｌｅｅ，Ｓ．Ｊ．，Ｍｙｅｒｓ，Ｌ．，Ｍｕｒａｌｉｍｏｈａｎ，Ｇ．，Ｄａｉ，Ｊ．，Ｑｉａｏ，Ｙ．，Ｌｉ，Ｚ．，Ｍｉｔｔｌｅｒ，Ｒ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｖｅｌｌａ，Ａ．Ｔ．（２００４）４−１ＢＢ  ａｎｄ  ＯＸ４０  ｄｕａｌ  ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃａｌｌｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＣＤ８  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｒｏｂｕｓｔ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３，３００２−３０１２．
Ｌｉ  Ｙ，Ｌｅｅ  ＰＹ，Ｋｅｌｌｎｅｒ  ＥＳ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｃｇａｍｍａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＲＩ（ＣＤ６４），ａ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｒｅｆｌｅｃｔｉｎｇ  ｔｙｐｅ−Ｉ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ  Ｔｈｅｒ．２０１０；１２（３）：Ｒ９０
Ｌｉ  Ｃ，Ｌｕｏ  Ｘ，Ｌｉｎ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．Ａ  Ｈｉｇｈｅｒ  Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｏｆ  ＣＤ１４＋ＣＤ１６９＋Ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ／Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１５  Ｏｃｔ  ２８；１０（１０）：ｅ０１４１８１７．
Ｌｉ，Ｆ．ａｎｄ  Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｊ．Ｖ．（２０１１）Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｆｃｇａｍｍａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ  ｄｒｉｖｅｓ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ａｎｄ  ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｕｒ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ａｇｏｎｉｓｔｉｃ  ＣＤ４０  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３３，１０３０−１０３４．
Ｌｕ  Ｊ，Ｃｈｕ  Ｊ，Ｚｏｕ  Ｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ＦｃγＲＩ  ｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｗｉｔｈ  Ｆｃ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｔｈｅ  ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｇｌｙｃａｎ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＩｇＧ  ｂｉｎｄｉｎｇ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２０１５  Ｊａｎ  ２０；１１２（３）：８３３−８
ＭｃＭｉｌｌｉｎ，Ｄ．Ｗ．，Ｈｅｗｅｓ，Ｂ．，Ｇａｎｇａｄｈａｒａｎ，Ｂ．，Ａｒｃｈｅｒ，Ｄ．Ｒ．，Ｍｉｔｔｌｅｒ，Ｒ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｈ．Ｔ．（２００６）Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｌａｒｇｅ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｕｒｓ  ｕｓｉｎｇ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｄｒｕｇ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ａｎｔｉ−ＣＤ１３７ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ１７，７９８−８０６．
Ｍｅｌｅｒｏ，Ｉ．，Ｓｈｕｆｏｒｄ，Ｗ．Ｗ．，Ｎｅｗｂｙ，Ｓ．Ａ．，Ａｒｕｆｆｏ，Ａ．，Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ，Ｊ．Ａ．，Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｋ．Ｅ．，Ｍｉｔｔｌｅｒ，Ｒ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｃｈｅｎ，Ｌ．（１９９７）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｈｅ４−１ＢＢ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｅｒａｄｉｃａｔｅ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ  ｔｕｍｏｕｒｓ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ３，６８２−６８５．
Ｍｅｌｅｒｏ  Ｉ，Ｄａｎｉｅｌ  Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ−Ｃｙｍｅｒｍａｎ，Ａｉｚｅａ  Ｍｏｒａｌｅｓ−Ｋａｓｔｒｅｓａｎａ，ｅｔ  ａｌ．Ａｇｏｎｉｓｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ＴＮＦＲ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  Ｔｈａｔ  Ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｅ  Ｔ  ａｎｄ  ＮＫ  ｃｅｌｌｓ  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０１３；１９：１０４４−１０５３．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  Ｍａｒｃｈ  ３，２０１３．
Ｍｅｌｅｒｏ  Ｉ，Ａｎｔｏｎｉｏ  Ｍ．Ｇｒｉｍａｌｄｉ，Ｊｏｓｅ  Ｌ．Ｐｅｒｅｚ−Ｇｒａｃｉａ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０１３；１９：９９７−１００８．
Ｍｉｌｌｅｒ，Ｒ．Ｅ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｊ．，Ｌｅ，Ｔ．，Ｗｈｉｔｍｏｒｅ，Ｊ．，Ｂｏｉａｎｉ，Ｎ．，Ｇｌｉｎｉａｋ，Ｂ．，ａｎｄ  Ｌｙｎｃｈ，Ｄ．Ｈ．（２００２）４−１ＢＢ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｕｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｂｙ  ｄｉｒｅｃｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ８  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ａ  ＣＤ４０−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍａｎｎｅｒ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６９，  １７９２−１８００．
Ｍｏｒａｌｅｓ−Ｋａｓｔｒｅｓａｎａ，Ａ．，Ｓａｎｍａｍｅｄ，Ｍ．Ｆ．，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｉ．，Ｐａｌａｚｏｎ，Ａ．，Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｆｏｒｅｒｏ，Ｉ．，Ｌａｂｉａｎｏ，Ｓ．，Ｈｅｒｖａｓ−Ｓｔｕｂｂｓ，Ｓ．，Ｓａｎｇｒｏ，Ｂ．，Ｏｃｈｏａ，Ｃ．，Ｒｏｕｚａｕｔ，Ａ．，Ａｚｐｉｌｉｋｕｅｔａ，Ａ．，Ｂｏｌａｎｏｓ，Ｅ．，Ｊｕｒｅ−Ｋｕｎｋｅｌ，Ｍ．，Ｇｕｔｇｅｍａｎｎ，Ｉ．，ａｎｄ  Ｍｅｌｅｒｏ，Ｉ．（２０１３）Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｅｘｔｅｎｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  ａｎ  ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９，６１５１−６１６２．
Ｍｏｒｉｍｕｒａ  Ｔ，Ｎｅｕｃｈｒｉｓｔ  Ｃ，Ｋｉｔｚ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｇｌｉｏｍａｓ：ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｃ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｕｍｏｒ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．１９９０；８０（３）：２８７−９４．
Ｎｏｒｔｏｎ  ＳＥ，Ｄｕｎｎ  ＥＴ，ＭｃＣａｌｌ  ＪＬ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｕｔ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｉｓ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｔｕｍｏｒ  ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ｉｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃｌｉｎ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１６  Ａｐｒ  ２９；５（４）：ｅ７６．
Ｎｉｕ，Ｌ．，Ｓｔｒａｈｏｔｉｎ，Ｓ．，Ｈｅｗｅｓ，Ｂ．，Ｚｈａｎｇ，Ｂ．，Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，Ａｒｃｈｅｒ，Ｄ．，Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｔ．，Ｄｉｌｌｅｈａｙ，Ｄ．，Ｋｗｏｎ，Ｂ．，Ｃｈｅｎ，Ｌ．，Ｖｅｌｌａ，Ａ．Ｔ．，ａｎｄ  Ｍｉｔｔｌｅｒ，Ｒ．Ｓ．（２００７）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ，ｈｅｍｏｐｏｉｅｓｉｓ，ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈｏｐｅｎｉａ，ａｎｅｍｉａ，ａｎｄ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ  ｉｎ  ａｎｔｉ−ＣＤ１３７−ｔｒｅａｔｅｄ  ｍｉｃｅ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７８，４１９４−４２１３．
Ｏｖｅｒｄｉｊｋ  ＭＢ，Ｖｅｒｐｌｏｅｇｅｎ  Ｓ，Ｏｒｔｉｚ  Ｂｕｉｊｓｓｅ  Ａ，Ｖｉｎｋ  Ｔ，Ｌｅｕｓｅｎ  ＪＨ，Ｂｌｅｅｋｅｒ  ＷＫ，Ｐａｒｒｅｎ  ＰＷ．Ｃｒｏｓｓｔａｌｋ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  ｉｓｏｔｙｐｅｓ  ａｎｄ  ｍｕｒｉｎｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１２  Ｏｃｔ  １；１８９（７）：３４３０−８．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２２９５６５７７．
Ｐａｌａｚｏｎ  Ａ，Ｉｖａｎ  Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｆｏｒｅｒｏ，Ａｌｖａｒｏ  Ｔｅｉｊｅｉｒａ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ＨＩＦ−１ａ  Ｈｙｐｏｘｉａ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  Ｔｕｍｏｕｒ−Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ  Ｔ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  Ｉｎｄｕｃｅｓ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ２０１２；２：６０８−６２３．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ＯｎｌｉｎｅＦｉｒｓｔ  Ｊｕｎｅ  １９，２０１２．
Ｐａｌａｚｏｎ  Ａ，Ｔｅｉｊｅｉｒａ  Ａ，Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｆｏｒｅｒｏ  Ｉ，Ｈｅｒｖａｓ−Ｓｔｕｂｂｓ  Ｓ，Ｒｏｎｃａｌ  Ｃ，Ｐｅｎｕｅｌａｓ  Ｉ，Ｄｕｂｒｏｔ  Ｊ，Ｍｏｒａｌｅｓ−Ｋａｓｔｒｅｓａｎａ  Ａ，Ｐｅｒｅｚ−Ｇｒａｃｉａ  ＪＬ，Ｏｃｈｏａ  ＭＣ，Ｏｃｈｏａ−Ｃａｌｌｅｊｅｒｏ  Ｌ，Ｍａｒｔｉｎｅｚ  Ａ，Ｌｕｑｕｅ  Ａ，Ｄｉｎｃｈｕｋ  Ｊ，Ｒｏｕｚａｕｔ  Ａ，Ｊｕｒｅ−Ｋｕｎｋｅｌ  Ｍ，Ｍｅｌｅｒｏ  Ｉ．Ａｇｏｎｉｓｔ  ａｎｔｉ−ＣＤ１３７ｍＡｂ  ａｃｔ  ｏｎ  ｔｕｍｏｕｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１１  Ｆｅｂ  １；７１（３）：８０１−１１．ｄｏｉ：１０．１１５８／０００８−５４７２．ＣＡＮ−１０−１７３３．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２１２６６３５８．
Ｐａｎ，Ｐ．Ｙ．，Ｚａｎｇ，Ｙ．，Ｗｅｂｅｒ，Ｋ．，Ｍｅｓｅｃｋ，Ｍ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｃｈｅｎ，Ｓ．Ｈ．（２００２）ＯＸ４０  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｐｒｉｍａｒｙ  ａｎｄ  ｍｅｍｏｒｙ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｃｏｌｏｎ  ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ６，５２８−５３６．
Ｐｏｒｅｍｂｋａ  ＭＲ，Ｍｉｔｃｈｅｍ  ＪＢ，Ｂｅｌｔ  ＢＡ  ｅｔ  ａｌ．Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｙｅｌｏｉｄ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｗｈｉｃｈ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０１２  Ｓｅｐ；６１（９）：１３７３−８５．
Ｐｕｌｌｅ，Ｇ．，Ｖｉｄｒｉｃ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｗａｔｔｓ，Ｔ．Ｈ．（２００６）ＩＬ−１５−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ４−１ＢＢ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ＣＤ８  ｍｅｍｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７６，２７３９−２７４８．
Ｒａｂｕ，Ｃ．，Ｑｕｅｍｅｎｅｒ，Ａ．，Ｊａｃｑｕｅｓ，Ｙ．，Ｅｃｈａｓｓｅｒｉｅａｕ，Ｋ．，Ｖｕｓｉｏ，Ｐ．，ａｎｄ  Ｌａｎｇ，Ｆ．（２００５）Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｔｒｉｍｅｒｉｃ  ＣＤ１３７Ｌ（４−１ＢＢＬ）．Ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｔｏ  ｉｔｓ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８０，４１４７２−４１４８１．
Ｒｏｕｓｓｅｌ  Ｍ，Ｆｅｒｒｅｌｌ  ＰＢ  Ｊｒ，Ｇｒｅｅｎｐｌａｔｅ  ＡＲ  ｅｔ  ａｌ．Ｍａｓｓ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ｄｅｅｐ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｐｈａｇｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ｍｙｅｌｏｉｄ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ．Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ．２０１７  Ａｕｇ；１０２（２）：４３７−４４７
Ｓａｌｌｉｎ，Ｍ．Ａ．，Ｚｈａｎｇ，Ｘ．，Ｓｏ，Ｅ．Ｃ．，Ｂｕｒｃｈ，Ｅ．，Ｃａｉ，Ｌ．，Ｌｉｎ，Ｗ．，Ｃｈａｐｏｖａｌ，Ａ．Ｉ．，ａｎｄ  Ｓｔｒｏｍｅ，Ｓ．Ｅ．（２０１４）Ｔｈｅ  ａｎｔｉ−ｌｙｍｐｈｏｍａ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ＣＤ１３７  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｒｅ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｉｎ  ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＩ（−／−）ｍｉｃｅ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．６３，９４７−９５８．
Ｓａｎｍａｍｅｄ，Ｍ．Ｆ．，Ｐａｓｔｏｒ，Ｆ．，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ａ．，Ｐｅｒｅｚ−Ｇｒａｃｉａ，Ｊ．Ｌ．，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｒｕｉｚ，Ｍ．Ｅ．，Ｊｕｒｅ−Ｋｕｎｋｅｌ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｍｅｌｅｒｏ，Ｉ．（２０１５）Ａｇｏｎｉｓｔｓ  ｏｆ  Ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ａｇａｉｎｓｔ  ＣＤ１３７，ＯＸ４０，ＧＩＴＲ，  ＣＤ２７，ＣＤ２８，ａｎｄ  ＩＣＯＳ．Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．４２，６４０−６５５．
Ｓｈｕｆｏｒｄ，Ｗ．  Ｗ．，Ｋｌｕｓｓｍａｎ，Ｋ．，Ｔｒｉｔｃｈｌｅｒ，Ｄ．  Ｄ．，Ｌｏｏ，Ｄ．Ｔ．，Ｃｈａｌｕｐｎｙ，Ｊ．，Ｓｉａｄａｋ，Ａ．Ｗ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｔ．Ｊ．，Ｅｍｓｗｉｌｅｒ，Ｊ．，Ｒａｅｃｈｏ，Ｈ．，Ｌａｒｓｅｎ，Ｃ．Ｐ．，Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｔ．Ｃ．，Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ，Ｊ．Ａ．，Ａｒｕｆｆｏ，Ａ．，ａｎｄ  Ｍｉｔｔｌｅｒ，Ｒ．Ｓ．（１９９７）４−１ＢＢ  ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｓｉｇｎａｌｓ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｉｎｄｕｃｅ  ＣＤ８＋  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｌｅａｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｏｆ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｊ  Ｅｘｐ．Ｍｅｄ  １８６，４７−５５．
Ｓｏ，Ｔ．，Ｌｅｅ，Ｓ．Ｗ．，ａｎｄ  Ｃｒｏｆｔ，Ｍ．（２００８）Ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ＯＸ４０  ａｎｄ  ４−１ＢＢ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ．１９，２５３−２６２．
Ｓｏｌｉｔｏ  Ｓ，Ｍａｒｉｇｏ  Ｉ，Ｐｉｎｔｏｎ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｙｅｌｏｉｄ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｃｅｌｌ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒｓ．Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．２０１４  Ｊｕｎ；１３１９：４７−６５．
Ｓｔｅｗａｒｔ  Ｒ，Ｈａｍｍｏｎｄ  Ｓ，Ｏｂｅｒｓｔ  Ｍ，Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ  Ｒ．（２０１４）Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｆｃ  ｇａｍｍａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２：２９
Ｓｔ  Ｒｏｓｅ，Ｍ．Ｃ．，Ｔａｙｌｏｒ，Ｒ．Ａ．，Ｂａｎｄｙｏｐａｄｈｙａｙ，Ｓ．，Ｑｕｉ，Ｈ．Ｚ．，Ｈａｇｙｍａｓｉ，Ａ．Ｔ．，Ｖｅｌｌａ，Ａ．Ｔ．，ａｎｄ  Ａｄｌｅｒ，Ａ．Ｊ．（２０１３）ＣＤ１３４／ＣＤ１３７  ｄｕａｌ  ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ−ｅｌｉｃｉｔｅｄ  ＩＦＮ−ｇａｍｍａ  ｍａｘｉｍｉｚｅｓ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｂｕｔ  ｌｉｍｉｔｓ  Ｔｒｅｇ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９１，１７３−１８３．
Ｓｕｎ  Ｙ，Ｓｕｂｕｄｈｉ  ＳＫ，Ｆｕ  ＹＸ．Ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ａｇｏｎｉｓｔｓ  ａｓ  ａ  ｎｅｗ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ“Ｍｅｄ．“２００３  Ｎｏｖ；９（１１）：４８３−９．Ｒｅｖｉｅｗ．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：１４６０４８２６．
Ｔａｒａｂａｎ，Ｖ．Ｙ．，Ｒｏｗｌｅｙ，Ｔ．Ｆ．，Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｌ．，Ｃｈａｎ，Ｈ．Ｔ．，Ｈａｓｗｅｌｌ，Ｌ．Ｅ．，Ｇｒｅｅｎ，Ｍ．Ｈ．，Ｔｕｔｔ，Ａ．Ｌ．，Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｍ．Ｊ．，ａｎｄ  Ａｌ−Ｓｈａｍｋｈａｎｉ，Ａ．（２００２）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＴＮＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒｓ  ＣＤ１３４（ＯＸ４０）ａｎｄ  ＣＤ１３７（４−１ＢＢ），ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｕｒ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３２，３６１７−３６２７．
Ｕｎｏ，Ｔ．，Ｔａｋｅｄａ，Ｋ．，Ｋｏｊｉｍａ，Ｙ．，Ｙｏｓｈｉｚａｗａ，Ｈ．，Ａｋｉｂａ，Ｈ．，Ｍｉｔｔｌｅｒ，Ｒ．Ｓ．，Ｇｅｊｙｏ，Ｆ．，Ｏｋｕｍｕｒａ，Ｋ．，Ｙａｇｉｔａ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｓｍｙｔｈ，Ｍ．Ｊ．（２００６）Ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ  ｔｕｍｏｕｒｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｂｙ  ａ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｂａｓｅｄ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔ．”Ｍｅｄ．“１２，６９３−６９８．
Ｖｉｄａｒｓｓｏｎ  Ｇ，Ｄｅｋｋｅｒｓ  Ｇ，Ｒｉｓｐｅｎｓ  Ｔ．ＩｇＧ  ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ  ａｎｄ  ａｌｌｏｔｙｐｅｓ：ｆｒｏｍ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｔｏ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１４  Ｏｃｔ  ２０；５：５２０．ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１４．００５２０．Ｒｅｖｉｅｗ．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２５３６８６１９；ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ４２０２６８８．
Ｖｉｎａｙ，Ｄ．Ｓ．ａｎｄ  Ｋｗｏｎ，Ｂ．Ｓ．（２０１２）Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｗｉｔｈ  ４−１ＢＢ．Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．１１，１０６２−１０７０．
Ｗａｎｇ  Ｗ，Ｅｒｂｅ  ＡＫ，Ｈａｎｋ  ＪＡ，Ｍｏｒｒｉｓ  ＺＳ，Ｓｏｎｄｅｌ  ＰＭ．ＮＫ  Ｃｅｌｌ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１５  Ｊｕｌ  ２７；６：３６８．ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１５．００３６８．Ｒｅｖｉｅｗ．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２６２８４０６３；  ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ４５１５５５２．
Ｗｅｉ，Ｈ．，Ｚｈａｏ，Ｌ．，Ｌｉ，Ｗ．，Ｆａｎ，Ｋ．，Ｑｉａｎ，Ｗ．，Ｈｏｕ，Ｓ．，Ｗａｎｇ，Ｈ．，Ｄａｉ，Ｍ．，Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ．，Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｋ．Ｅ．，ａｎｄ  Ｇｕｏ，Ｙ．（２０１３）Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ＰＤ−１  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ａｎｄ  ＣＤ１３７  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｈａｓ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｉｎ  ｍｕｒｉｎｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｏｄｅｌｓ  ａｎｄ  ｓｙｎｅｒｇｉｚｅｓ  ｗｉｔｈ  ｃｉｓｐｌａｔｉｎ．ＰＬｏＳ．ＯＮＥ．８，ｅ８４９２７．
Ｗｅｓｔｗｏｏｄ，Ｊ．Ａ．，Ｄａｒｃｙ，Ｐ．Ｋ．，Ｇｕｒｕ，Ｐ．Ｍ．，Ｓｈａｒｋｅｙ，Ｊ．，Ｐｅｇｒａｍ，Ｈ．Ｊ．，Ａｍｏｓ，Ｓ．Ｍ．，Ｓｍｙｔｈ，Ｍ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｋｅｒｓｈａｗ，Ｍ．Ｈ．（２０１０）Ｔｈｒｅｅ  ａｇｏｎｉｓｔ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ−ｄｏｓｅ  ＩＬ−２  ｅｒａｄｉｃａｔｅ  ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｊ．Ｔｒａｎｓｌ．“Ｍｅｄ．“８，４２．
Ｗｅｓｔｗｏｏｄ，Ｊ．Ａ．，Ｍａｔｔｈｅｗｓ，Ｇ．Ｍ．，Ｓｈｏｒｔｔ，Ｊ．，Ｆａｕｌｋｎｅｒ，Ｄ．，Ｐｅｇｒａｍ，Ｈ．Ｊ．，Ｄｕｏｎｇ，Ｃ．Ｐ．，Ｃｈｅｓｉ，Ｍ．，Ｂｅｒｇｓａｇｅｌ，Ｐ．Ｌ．，Ｓｈａｒｐ，Ｌ．Ｌ．，Ｈｕｈｎ，Ｒ．Ｄ．，Ｄａｒｃｙ，Ｐ．Ｋ．，Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ，Ｒ．Ｗ．，ａｎｄ  Ｋｅｒｓｈａｗ，Ｍ．Ｈ．（２０１４ａ）Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｔｉ−ＣＤ１３７  ａｎｄ  ａｎｔｉ−ＣＤ４０  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｙｃ−ｄｒｉｖｅｎ  ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒｓ．Ｌｅｕｋ．Ｒｅｓ．３８，９４８−９５４．
Ｗｈｉｔｅ  ＡＬ，Ｃｈａｎ  ＨＴ，Ｆｒｅｎｃｈ  ＲＲ，Ｗｉｌｌｏｕｇｈｂｙ  Ｊ，Ｍｏｃｋｒｉｄｇｅ  ＣＩ，Ｒｏｇｈａｎｉａｎ  Ａ，Ｐｅｎｆｏｌｄ  ＣＡ，Ｂｏｏｔｈ  ＳＧ，Ｄｏｄｈｙ  Ａ，Ｐｏｌａｋ  ＭＥ，  Ｐｏｔｔｅｒ  ＥＡ，Ａｒｄｅｒｎ−Ｊｏｎｅｓ  ＭＲ，Ｖｅｒｂｅｅｋ  ＪＳ，Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＰＷ，Ａｌ−Ｓｈａｍｋｈａｎｉ  Ａ，Ｃｒａｇｇ  ＭＳ，Ｂｅｅｒｓ  ＳＡ，Ｇｌｅｎｎｉｅ  ＭＪ．Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ２  ｈｉｎｇｅ  ｉｍｐａｒｔｓ  ｓｕｐｅｒａｇｏｎｉｓｔｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｔｏ  ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ．２０１５  Ｊａｎ  １２；２７（１）：１３８−４８．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｃｅｌｌ．２０１４．１１．００１．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２５５００１２２；ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ４２９７２９０．
Ｗｅｓｔｗｏｏｄ，Ｊ．Ａ．，Ｐｏｔｄｅｖｉｎ  Ｈｕｎｎａｍ，Ｔ．Ｃ．，Ｐｅｇｒａｍ，Ｈ．Ｊ．，Ｈｉｃｋｓ，Ｒ．Ｊ．，Ｄａｒｃｙ，Ｐ．Ｋ．，ａｎｄ  Ｋｅｒｓｈａｗ，Ｍ．Ｈ．（２０１４ｂ）Ｒｏｕｔｅｓ  ｏｆ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｆｏｒ  ＣｐＧ  ａｎｄ  ａｎｔｉ−ＣＤ１３７  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ  ｔｕｍｏｕｒｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．ＰＬｏＳ．ＯＮＥ．９，ｅ９５８４７．
Ｗｉｌｃｏｘ，Ｒ．Ａ．，Ｆｌｉｅｓ，Ｄ．Ｂ．，Ｚｈｕ，Ｇ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ａ．Ｊ．，Ｔａｍａｄａ，Ｋ．，Ｃｈａｐｏｖａｌ，Ａ．Ｉ．，Ｓｔｒｏｍｅ，Ｓ．Ｅ．，Ｐｅａｓｅ，Ｌ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｃｈｅｎ，Ｌ．（２００２）Ｐｒｏｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ  ａｎｄ  ＣＤ１３７  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｂｒｅａｋｓ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｇｎｏｒａｎｃｅ，ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｏｒｌｙ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ｔｕｍｏｕｒｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １０９，６５１−６５９．
Ｗｉｌｓｏｎ，Ｎ．Ｓ．，Ｙａｎｇ，Ｂ．，Ｙａｎｇ，Ａ．，Ｌｏｅｓｅｒ，Ｓ．，Ｍａｒｓｔｅｒｓ，Ｓ．，Ｌａｗｒｅｎｃｅ，Ｄ．，Ｌｉ，Ｙ．，Ｐｉｔｔｉ，Ｒ．，Ｔｏｔｐａｌ，Ｋ．，Ｙｅｅ，Ｓ．，Ｒｏｓｓ，Ｓ．，Ｖｅｒｎｅｓ，Ｊ．Ｍ．，Ｌｕ，Ｙ．，Ａｄａｍｓ，Ｃ．，Ｏｆｆｒｉｎｇａ，Ｒ．，Ｋｅｌｌｅｙ，Ｂ．，Ｈｙｍｏｗｉｔｚ，Ｓ．，Ｄａｎｉｅｌ，Ｄ．，Ｍｅｎｇ，Ｇ．，ａｎｄ  Ａｓｈｋｅｎａｚｉ，Ａ．（２０１１ｂ）Ａｎ  Ｆｃｇａｍｍａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｄｒｉｖｅｓ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔａｒｇｅｔ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  １９，１０１−１１３．
Ｗｙｚｇｏｌ，Ａ．，Ｍｕｌｌｅｒ，Ｎ．，Ｆｉｃｋ，Ａ．，Ｍｕｎｋｅｌ，Ｓ．，Ｇｒｉｇｏｌｅｉｔ，Ｇ．Ｕ．，Ｐｆｉｚｅｎｍａｉｅｒ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｗａｊａｎｔ，Ｈ．（２００９）Ｔｒｉｍｅｒ  ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ，ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｔｒｉｍｅｒｓ  ｏｆ  ＣＤ２７Ｌ，ＣＤ４０Ｌ，４１ＢＢＬ，ａｎｄ  ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ＴＮＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｌｉｇａｎｄ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８３，１８５１−１８６１．
Ｚｈａｎｇ，Ｎ．，Ｓａｄｕｎ，Ｒ．Ｅ．，Ａｒｉａｓ，Ｒ．Ｓ．，Ｆｌａｎａｇａｎ，Ｍ．Ｌ．，Ｓａｃｈｓｍａｎ，Ｓ．Ｍ．，Ｎｉｅｎ，Ｙ．Ｃ．，Ｋｈａｗｌｉ，Ｌ．Ａ．，Ｈｕ，Ｐ．，ａｎｄ  Ｅｐｓｔｅｉｎ，Ａ．Ｌ．（２００７）Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ａｎｄ  ｕｎｔａｒｇｅｔｅｄ  ＣＤ１３７Ｌ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｕｒｓ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１３，２７５８−２７６７．
Ｚｈａｎｇ  Ｂ，Ｗａｎｇ  Ｚ，Ｗｕ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ−ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ  ｍｙｅｌｏｉｄ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１３；８（２）：ｅ５７１１４
【図１】
2020501531.tif 000041
【図２】
2020501531.tif 000042
【図３】
2020501531.tif 000043
【図４】
2020501531.tif 000044
【図５】
2020501531.tif 000045
【図６】
2020501531.tif 000046
【図７】
2020501531.tif 000047
【図８】
2020501531.tif 000048
【図９】
2020501531.tif 000049
【図１０】
2020501531.tif 000050
【図１１】
2020501531.tif 000051
【図１２】
2020501531.tif 000052
【図１３】
2020501531.tif 000053
【配列表】
2020501531000001.app
【国際調査報告】
2020501531.tif 000054
2020501531.tif 000055
2020501531.tif 000056
2020501531.tif 000057
2020501531.tif 000058
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2020501531.tif 000060