(57)【要約】  本願発明は、一般的に、グルココルチコイドのインビボ投与によって介在される薬力学的応答をモニターする方法に関する。さらに具体的には、本願発明は、グルココルチコイド暴露の薬力学的マーカーとして遺伝子特性における変化を使用する方法に関する。
2020532302.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルココルチコイドに対するヒトの応答を決定する方法であって、
ａ）興味あるグルココルチコイドを該ヒトに投与すること、
ｂ）ステップ（ａ）の投与４時間後のヒトから血液を採取すること、
ｃ）ステップ（ｂ）において回収された血液からＲＮＡを単離すること、
ｄ）ステップ（ｃ）において単離されたＲＮＡの遺伝子発現をプロファイリングすること、および
ｅ）投与後の遺伝子特性スコアをコントロール遺伝子特性スコアと比較すること、
を含み、
ＦＫＢＰ５、ＥＣＨＤＣ３、ＩＬ１Ｒ２、ＺＢＴＢ１６、ＩＲＳ２、ＩＲＡＫ３、ＡＣＳＬ１、ＤＵＳＰ１についての遺伝子特性スコアの増加が、グルココルチコイドに対する応答を示す、
方法。
【請求項２】
グルココルチコイドに対するヒトの応答を決定する方法であって、
ａ）興味あるグルココルチコイドを該ヒトに投与すること、
ｂ）ステップ（ａ）の投与４時間後のヒトから血液を採取すること、
ｃ）ステップ（ｂ）において回収された血液からＲＮＡを単離すること、
ｄ）ステップ（ｃ）において単離されたＲＮＡの遺伝子発現をプロファイリングすること、および
ｅ）投与後の遺伝子特性スコアをコントロール遺伝子特性スコアと比較すること、
を含み、
ＦＫＢＰ５、ＥＣＨＤＣ３、ＩＬ１Ｒ２、ＺＢＴＢ１６、ＩＲＳ２、ＩＲＡＫ３、ＡＣＳＬ１、ＤＵＳＰ１、ＰＨＣ２、ＴＬＲ２、ＴＳＣ２２Ｄ３、ＳＬＡ、ＣＲＩＳＰＬＤ２、ＭＡＮ２Ａ２、ＦＡＲ２、ＣＥＢＰＤ、ＳＰＴＬＣ２、ＨＳＰＡ６についての遺伝子特性スコアの増加が、グルココルチコイドに対する応答を示す、
方法。
【請求項３】
グルココルチコイドに対するヒトの応答を決定する方法であって、
ａ）興味あるグルココルチコイドを該ヒトに投与すること、
ｂ）ステップ（ａ）の投与４時間後のヒトから血液を採取すること、
ｃ）ステップ（ｂ）において回収された血液からＲＮＡを単離すること、
ｄ）ステップ（ｃ）において単離されたＲＮＡの遺伝子発現をプロファイリングすること、および
ｅ）投与後の遺伝子特性スコアをコントロール遺伝子特性スコアと比較すること、
を含み、
ＦＫＢＰ５、ＥＣＨＤＣ３、ＩＬ１Ｒ２についての遺伝子特性スコアの増加が、グルココルチコイドに対する応答を示す、
方法。
【請求項４】
グルココルチコイドに対するヒトの応答を決定する方法であって、
ａ）興味あるグルココルチコイドを該ヒトに投与すること、
ｂ）ステップ（ａ）の投与４時間後のヒトから血液を採取すること、
ｃ）ステップ（ｂ）において回収された血液からＲＮＡを単離すること、
ｄ）ステップ（ｃ）において単離されたＲＮＡの遺伝子発現をプロファイリングすること、および
ｅ）投与後の遺伝子特性スコアをコントロール遺伝子特性スコアと比較すること、
を含み、
ＦＫＢＰ５、ＥＣＨＤＣ３、ＩＬ１Ｒ２、ＺＢＴＢ１６、ＩＲＳ２、ＩＲＡＫ３についての遺伝子特性スコアの増加が、グルココルチコイドに対する応答を示す、
方法。
【請求項５】
グルココルチコイドに対するヒトの応答を決定する方法であって、
ａ）興味あるグルココルチコイドを該ヒトに投与すること、
ｂ）ステップ（ａ）の投与４時間後のヒトから血液を採取すること、
ｃ）ステップ（ｂ）において回収された血液からＲＮＡを単離すること、
ｄ）ステップ（ｃ）において単離されたＲＮＡの遺伝子発現をプロファイリングすること、および
ｅ）投与後の遺伝子特性スコアをコントロール遺伝子特性スコアと比較すること、
を含み、
ＫＭＯ、ＣＣＲ５、ＣＸＣＬ８、ＦＰＲ３、ＰＬＡ２Ｇ７、ＰＥＡ１５、ＴＲＡＦ１、ＣＳＦ２ＲＢ、ＴＲＤＣ、ＯＬＲ１、ＫＩＡＡ０２２６Ｌ、ＦＣＧＲ２Ｂ、ＡＴＦ５、ＣＸ３ＣＲ１、ＭＹＯＦ、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ９、ＩＬ１ＲＮについての遺伝子特性スコアの減少が、グルココルチコイドに対する応答を示す、
方法。
【請求項６】
興味あるグルココルチコイドが、コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、トリアムシノロン、ベタメタゾン  ブデソニド、フルチカゾン、および合成グルココルチコイドからなる群から選択される、請求項１−５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
コントロール遺伝子特性が、グルココルチコイド投与前の同じヒトから、またはグルココルチコイドを投与されない正常健常コントロールから得られる、請求項１−５のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
コントロールと比較して遺伝子特性スコアの１．５倍の増加が、グルココルチコイドに対する応答を示す、請求項１−４のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
コントロールと比較して遺伝子特性スコアの２倍の増加が、グルココルチコイドに対する応答を示す、請求項１−４のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
グルココルチコイドに対するヒトの応答を試験することを含むリウマチ性関節炎（ＲＡ）と診断されたヒトを処置する方法であって、
ａ．興味あるグルココルチコイドを該ヒトに投与すること、
ｂ．ステップ（ａ）の投与４時間後のヒトから血液を採取すること、
ｃ．ステップ（ｂ）において回収された血液からＲＮＡを単離すること、
ｄ．ステップ（ｃ）において単離されたＲＮＡの遺伝子発現をプロファイリングすること、および
ｅ．投与後の遺伝子特性スコアをコントロール遺伝子特性スコアと比較すること、ここで、ＦＫＢＰ５、ＥＣＨＤＣ３、ＩＬ１Ｒ２、ＺＢＴＢ１６、ＩＲＳ２、ＩＲＡＫ３、ＡＣＳＬ１、ＤＵＳＰ１についての遺伝子特性スコアの増加が、ヒトがグルココルチコイドに対して応答するであろうことを示す；
および、グルココルチコイドをＲＡ患者に投与すること、
を含む、方法。
【請求項１１】
グルココルチコイドに対するヒトの応答を試験することを含む全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）と診断されたヒトを処置する方法であって、
ａ．興味あるグルココルチコイドを該ヒトに投与すること、
ｂ．ステップ（ａ）の投与４時間後のヒトから血液を採取すること、
ｃ．ステップ（ｂ）において回収された血液からＲＮＡを単離すること、
ｄ．ステップ（ｃ）において単離されたＲＮＡの遺伝子発現をプロファイリングすること、および
ｅ．投与後の遺伝子特性スコアをコントロール遺伝子特性スコアと比較すること、ここで、ＦＫＢＰ５、ＥＣＨＤＣ３、ＩＬ１Ｒ２、ＺＢＴＢ１６、ＩＲＳ２、ＩＲＡＫ３、ＡＣＳＬ１、ＤＵＳＰ１についての遺伝子特性スコアの増加が、ヒトがグルココルチコイドに対して応答するであろうことを示す；
および、グルココルチコイドをＳＬＥ患者に投与すること、
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本願は、３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．  §１１９（ｅ）の下に２０１７年８月３０日に出願された米国仮出願番号６２／５５１８３９の利益を主張する；その開示は、出典明示により本願明細書に包含させる。
【０００２】
本願全体で、種々の文献が参照されている。これらの刊行物の開示は、本願発明が関係する最先端をより完全に説明するために、それら全体において、出典明示により本願に包含させる。
【０００３】
技術分野
本願発明は、一般的に、グルココルチコイドのインビボ投与によって介在される薬力学的応答をモニターする方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
グルココルチコイド（ＧＣ）は、リウマチ性関節炎（ＲＡ）、炎症性腸疾患、乾癬、喘息、および全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を含む多数のヒト疾患を処置するために広範囲に使用される有効な抗炎症薬である（Buttgereit F. Bull NYU Hosp Jt Dis 2012;70 Suppl 1:S26-9）。しかしながら、これらの有用性は、糖尿病、骨粗鬆症、筋肉疲労、脂肪再分布、および視床下部−下垂体−副腎（ＨＰＡ）軸の抑制を含むこれらの薬物の毒性によって限定される（Desmet SJ, et.al., J Clin Invest 2017;127:1136-45）。有害な副作用の危険性は、より高い用量およびより長期の使用で増加する（Bijlsma JWJ, et.al. Rheumatology 2016;55 Suppl 2:ii3-5; Ruiz-Arruza I, et.al. Rheumatology 2014;53:1470-6）。副作用の可能性にもかかわらず、グルココルチコイドは、依然として重要な標準療法のままである。
【０００５】
グルココルチコイドは、核ホルモン受容体であるグルココルチコイド受容体アルファ（ＧＲ）との相互作用を介して生物学的効果を媒介する。グルココルチコイド受容体アルファは、グルココルチコイド応答配列にホモ二量体として結合することによって転写を誘導するリガンド活性化転写因子である（Weikum ER, et.al. Nat Rev Mol Cell Biol 2017;18:159-74）。多数のＧＲ活性化遺伝子が抗炎症活性を有する（Colotta F, et.al. Science 1993;261:472-5; Abraham SM, et.al. J Exp Med 2006;203:1883-9; Beaulieu E, et.al. Nat Rev Rheum 2011;7:340-8）。しかしながら、転写活性化遺伝子は副作用とも関連している（Cain DW, et.al. Nat Rev Immunol 2017;17:233-47）。ＧＲはまた、転写抑制と称されるプロセスにおけるＤＮＡ結合とは独立して、ＮＦ−κＢ、ＡＰ−１、ＩＲ３Ｆ、ＣＲＥＢ、ＮＦＡＴ、ＳＴＡＴ、Ｔ−Ｂｅｔ、およびＧａｔａ−３を含むいくつかの炎症性転写因子の活性を阻害することも示されている（Greulich F, et.al. Steroids 2016;114:7-15）。いくつかの合成グルココルチコイドは、治療の範囲を広げる試みにおいて低下した転写活性化であるが無傷な転写抑制活性で開発されている（Strehl C, et.al., Exp Opin Invest Drugs 2017;26:187-95）。
【０００６】
損傷効果を発生させる危険性に加えて、慢性的なグルココルチコイド使用はまた組織特異的耐性と関連する（Rodriguez JM, et.al.,Steroids 2016;115:182-92）。ＧＲ発現の下方調節ならびに受容体のドミナントネガティブアイソフォームの上方調節を含むいくつかの耐性メカニズムが、記載されている（Dendoncker K, et.al. Cytokine Growth Factor Rev 2017;35:85-96）。アゴニストに対する感受性を調節するＧＲの多型もまた、記載されている（Straub RH, et.al. Rheumatology 2016;55 Suppl 2:ii6-14）。グルココルチコイドに対する臨床反応の不均一性を考慮すると、グルココルチコイドの生物学的活性のバイオマーカーの仲間(companion)を有することが非常に重要であろう。
【発明の概要】
【０００７】
発明の概要
本願発明者らは、正常健常ボランティア（ＮＨＶ）ドナー由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のプレドニゾロンでの処置によって調節される遺伝子に基づく遺伝子特性を開発した。この特性の感度は、プレドニゾロンまたは部分的なＧＲアゴニストのいずれかの投与後の健常参加者において全血遺伝子発現を分析することによって確認された。特性の発現は、化合物の転写活性化の可能性と一致して、部分的なアゴニストを受けた対象よりもプレドニゾロンを投与された健常対象において高かった。全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）およびリウマチ性関節炎（ＲＡ）を有する患者からの全血における特性の発現は、より高いレベルの末梢血好中球およびより低いレベルの末梢血リンパ球を含む、公知のグルココルチコイド媒介薬力学的効果と相関している。特性の発現はまた、これらのコホートにおいてプレドニゾロンの報告された使用および投与と一致した。
【０００８】
本願発明は、グルココルチコイドに対するヒトの応答を決定する方法であって、興味あるグルココルチコイドを該ヒトに投与すること、興味あるグルココルチコイドを投与されたヒトから血液を採取すること、回収された血液からＲＮＡを単離すること、単離されたＲＮＡの遺伝子発現をプロファイリングすること、および投与後の遺伝子特性スコアをコントロール遺伝子特性スコアと比較すること、を含み、ＦＫＢＰ５、ＥＣＨＤＣ３、ＩＬ１Ｒ２、ＺＢＴＢ１６、ＩＲＳ２、ＩＲＡＫ３、ＡＣＳＬ１、ＤＵＳＰ１についての遺伝子特性スコアの増加が、グルココルチコイドに対する応答を示す、方法を含む。
【０００９】
本願発明は、グルココルチコイドに対するヒトの応答を決定する方法であって、興味あるグルココルチコイドを該ヒトに投与すること、興味あるグルココルチコイドを投与されたヒトから血液を採取すること、回収された血液からＲＮＡを単離すること、単離されたＲＮＡの遺伝子発現をプロファイリングすること、および投与後の遺伝子特性スコアをコントロール遺伝子特性スコアと比較すること、を含み、ＦＫＢＰ５、ＥＣＨＤＣ３、ＩＬ１Ｒ２、ＺＢＴＢ１６、ＩＲＳ２、ＩＲＡＫ３、ＡＣＳＬ１、ＤＵＳＰ１、ＰＨＣ２、ＴＬＲ２、ＴＳＣ２２Ｄ３、ＳＬＡ、ＣＲＩＳＰＬＤ２、ＭＡＮ２Ａ２、ＦＡＲ２、ＣＥＢＰＤ、ＳＰＴＬＣ２、ＨＳＰＡ６についての遺伝子特性スコアの増加が、グルココルチコイドに対する応答を示す、方法を含む。
【００１０】
本願発明は、グルココルチコイドに対するヒトの応答を決定する方法であって、興味あるグルココルチコイドを該ヒトに投与すること、興味あるグルココルチコイドを投与されたヒトから血液を採取すること、回収された血液からＲＮＡを単離すること、単離されたＲＮＡの遺伝子発現をプロファイリングすること、および投与後の遺伝子特性スコアをコントロール遺伝子特性スコアと比較すること、を含み、ＦＫＢＰ５、ＥＣＨＤＣ３、ＩＬ１Ｒ２についての遺伝子特性スコアの増加が、グルココルチコイドに対する応答を示す、方法を含む。
【００１１】
本願発明は、グルココルチコイドに対するヒトの応答を決定する方法であって、興味あるグルココルチコイドを該ヒトに投与すること、興味あるグルココルチコイドを投与されたヒトから血液を採取すること、回収された血液からＲＮＡを単離すること、単離されたＲＮＡの遺伝子発現をプロファイリングすること、および投与後の遺伝子特性スコアをコントロール遺伝子特性スコアと比較すること、を含み、ＦＫＢＰ５、ＥＣＨＤＣ３、ＩＬ１Ｒ２、ＺＢＴＢ１６、ＩＲＳ２、ＩＲＡＫ３についての遺伝子特性スコアの増加が、グルココルチコイドに対する応答を示す、方法を含む。
【００１２】
本願発明の態様において、興味あるグルココルチコイドは、コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、トリアムシノロン、ベタメタゾン  ブデソニド、フルチカゾン、および／または合成グルココルチコイドである。
【００１３】
本願発明の態様において、コントロール遺伝子特性スコアは、グルココルチコイド投与前の同じヒトから回収された血液および／またはグルココルチコイドを投与されない正常健常コントロールから回収された血液から得られる。
【００１４】
本願発明の態様において、血液サンプルは、投与４時間後の興味あるグルココルチコイドを投与されたヒトから回収される。
【００１５】
本願発明の態様において、興味あるグルココルチコイドに対して応答するヒトは、コントロールよりも少なくとも１．５倍以上の遺伝子特性スコアを有する。
【００１６】
本願発明の態様において、興味あるグルココルチコイドに対して応答するヒトは、コントロールよりも少なくとも２倍以上の遺伝子特性スコアを有する。
【００１７】
本願発明は、ＳＬＥまたはＲＡと診断されたヒトを処置する方法であって、１）興味あるグルココルチコイドをヒトに投与すること、興味あるグルココルチコイドを投与されたヒトから血液を採取すること、回収された血液からＲＮＡを単離すること、単離されたＲＮＡの遺伝子発現をプロファイリングすることによってグルココルチコイドに対するヒトの応答を決定すること、および２）投与後の遺伝子特性スコアをコントロール遺伝子特性スコアと比較すること、ここで、ＦＫＢＰ５、ＥＣＨＤＣ３、ＩＬ１Ｒ２、ＺＢＴＢ１６、ＩＲＳ２、ＩＲＡＫ３、ＡＣＳＬ１、ＤＵＳＰ１についての遺伝子特性スコアの増加が、ヒトが興味あるグルココルチコイドに対して応答するであろうことを示す、および３）グルココルチコイドをヒトに投与すること、を含む方法を含む。
【００１８】
本願発明は、ＳＬＥまたはＲＡと診断されたヒトを処置する方法であって、１）興味あるグルココルチコイドを該ヒトに投与すること、興味あるグルココルチコイドを投与されたヒトから血液を採取すること、回収された血液からＲＮＡを単離すること、単離されたＲＮＡの遺伝子発現をプロファイリングすることによってグルココルチコイドに対するヒトの応答を決定すること、および２）投与後の遺伝子特性スコアをコントロール遺伝子特性スコアと比較すること、ここで、ＦＫＢＰ５、ＥＣＨＤＣ３、ＩＬ１Ｒ２、ＺＢＴＢ１６、ＩＲＳ２、ＩＲＡＫ３、ＡＣＳＬ１、ＤＵＳＰ１、ＰＨＣ２、ＴＬＲ２、ＴＳＣ２２Ｄ３、ＳＬＡ、ＣＲＩＳＰＬＤ２、ＭＡＮ２Ａ２、ＦＡＲ２、ＣＥＢＰＤ、ＳＰＴＬＣ２、ＨＳＰＡ６についての遺伝子特性スコアの増加が、ヒトが興味あるグルココルチコイドに対して応答するであろうことを示す、および３）グルココルチコイドをヒトに投与すること、を含む方法を含む。
【００１９】
本願発明は、ＳＬＥまたはＲＡと診断されたヒトを処置する方法であって、１）興味あるグルココルチコイドを該ヒトに投与すること、興味あるグルココルチコイドを投与されたヒトから血液を採取すること、回収された血液からＲＮＡを単離すること、単離されたＲＮＡの遺伝子発現をプロファイリングすることによってグルココルチコイドに対するヒトの応答を決定すること、および２）投与後の遺伝子特性スコアをコントロール遺伝子特性スコアと比較すること、ここで、ＦＫＢＰ５、ＥＣＨＤＣ３、ＩＬ１Ｒ２についての遺伝子特性スコアの増加が、ヒトが興味あるグルココルチコイドに対して応答するであろうことを示す、および３）グルココルチコイドをヒトに投与すること、を含む方法を含む。
【００２０】
本願発明は、ＳＬＥまたはＲＡと診断されたヒトを処置する方法であって、１）興味あるグルココルチコイドを該ヒトに投与すること、興味あるグルココルチコイドを投与されたヒトから血液を採取すること、回収された血液からＲＮＡを単離すること、単離されたＲＮＡの遺伝子発現をプロファイリングすることによってグルココルチコイドに対するヒトの応答を決定すること、および２）投与後の遺伝子特性スコアをコントロール遺伝子特性スコアと比較すること、ここで、ＦＫＢＰ５、ＥＣＨＤＣ３、ＩＬ１Ｒ２、ＺＢＴＢ１６、ＩＲＳ２、ＩＲＡＫ３についての遺伝子特性スコアの増加が、ヒトが興味あるグルココルチコイドに対して応答するであろうことを示す、および３）グルココルチコイドをヒトに投与すること、を含む方法を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１Ａ−１Ｄは、グルココルチコイド（ＧＣ）調節遺伝子を示す。正常健常ボランティア（ＮＨＶ）からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、１μＭ  プレドニゾロンまたはＤＭＳＯビヒクル単独のいずれかで６時間インビトロで培養した。ＲＮＡを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  プロファイリングを使用して遺伝子発現について分析した。ビヒクルと比較してプレドニゾロンによって調節される遺伝子の分析を示す。軸は、ＦＤＲ調節ｌｏｇ１０  ｐ値  対  倍数変化を示す。＜０．０５のＦＤＲ調節ｐ値を有するプレドニゾロン  対  ビヒクルによる＞２倍の上方調節された（１Ａ）および下方調節された（１Ｂ）遺伝子が示される。インビトロでプレドニゾロンの増加する濃度で刺激された全血サンプルに対する上方調節された（１Ｃ）および下方調節された（１Ｄ）遺伝子についてのｓｓＧＳＥＡスコア。＊＊  Ｐ＝０．００５、＊＊＊  Ｐ＜０．００１．
【００２２】
【図２】図２Ａ−２Ｅは、部分的なＧＲアゴニストを使用するグルココルチコイド遺伝子特性の検証を示す。プレドニゾロン、ＧＲモジュレーター  ＢＭＳ−７９１８２６、およびＢＭＳ−７７６５３２によるＰＧＣ１（２Ａ）およびＴＩＦ２（２Ｂ）補充の哺乳動物２−ハイブリッド分析。データは、２００ｎＭ  デキサメタゾンによって誘導される活性に正規化されたトリプリケートの平均値を示す。２の典型的な実験の１つが示される。クロマチン免疫沈降、次にｑＰＣＲにより分析されるときの、１μＭ  プレドニゾロン、１μＭ  ＧＲモジュレーター  ＢＭＳ−７９１８２６、および２μＭ  ＢＭＳ−７７６５３２によるＡＮＧＰＴＬ４、ＡＬＯＸ５ＡＰ、およびＬＥＰＲＥＬ１のプロモーターへのＧＲ（２Ｃ）およびＴＩＦ２（２Ｄ）補充の分析。値は、トリプリケート反応の平均および標準偏差を示す。結合値は入力値に正規化される。ＣｈＩＰ＝クロマチン免疫沈降。ｐ値はＴ検定により計算された。＊Ｐ＜０．０１  ｖｓ  プレドニゾロン、＊＊  Ｐ＜０．０１  ｖｓ  プレドニゾロン、＊＊＊  Ｐ＜０．００１  ｖｓ  プレドニゾロン、ｎｓ＝有意でない。（２Ｅ）ＤＭＳＯビヒクル、５μＭ  プレドニゾロン、５μＭ  ＧＲモジュレーター  ＢＭＳ−７９１８２６、または１０μＭ  ＢＭＳ−７７６５３２のいずれかでインビトロで培養された全血サンプルに対するＧＣ遺伝子特性スコア。＊＊＊  Ｐ＜０．００１
【００２３】
【図３】図３Ａ−３Ｂは、ＧＣ遺伝子特性のインビボ検証を示す。（３Ａ）ＮＨＶに、経口用量の１５０または３００ｍｇ  ＧＲモジュレーター  ＢＭＳ−７９１８２６、１０ｍｇ  プレドニゾロン、またはプラセボを投与した。血液を、投与前および投与４時間後に回収した。全血発現プロフィールを、ＧＣ遺伝子特性について分析した。＊  Ｐ＝０．０２７；＊＊＊  Ｐ＜０．００１。（３Ｂ）ＮＨＶに、５、１０または３０ｍｇ  プレドニゾロンまたはプラセボ（すなわち０ｍｇ）を投与した。血液を、投与前および投与後の異なる時間で（２、４、８、４８、１４４、および２１６時間）採取した。全血発現プロフィールを、ＧＣ遺伝子特性について分析した。
【００２４】
【図４】図４Ａ−４Ｂは、ＳＬＥおよびＲＡコホートにおけるＧＣ使用に対するＧＣ遺伝子特性の関係を示す。（４Ａ）全血を、ＮＨＶおよびＲＡおよびＳＬＥを有する患者から回収した。ＲＮＡを単離し、プローブ  Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−２１９アレイに使用した。ＧＣ遺伝子特性スコアを、ＧＣを現在使用している患者（真）  対  他の標準療法における患者（偽）によって分けた。処置情報なしの患者は、‘ＮＡ’（利用できない）の下に列挙される。＊＊  Ｐ＝０．００３、＊＊＊  Ｐ＜０．００１。（４Ｂ）アバタセプト  ＳＬＥフェーズＩＩ試験からのベースラインサンプルに対するＧＣ遺伝子特性スコア。患者はＧＣ用量（低、中、または高）によって分類された。ｎｓ＝有意でない；＊＊Ｐ＝０．００１。
【００２５】
【図５】図５Ａ−５Ｃは、ＧＣ遺伝子特性の相関関係を示す。ＳＬＥ（５Ａ）およびＲＡ（５Ｂ）を有する患者からの末梢血ＣＤ４＋  Ｔ細胞、ＣＤ８＋  Ｔ細胞、およびＣＤ１９＋  Ｂ細胞のパーセンテージを、各患者についてＧＣ遺伝子特性スコアに対してプロットする。ＷＢＣ＝白血球。（５Ｃ）アバタセプト  ＳＬＥ試験ベースラインサンプルからの末梢血好中球数を、各患者についてＧＣ遺伝子特性スコアに対してプロットする。相関関係を、Ｓｐｅａｒｍａｎランク付け試験により分析した。
【００２６】
【図６】図６Ａ−６Ｂは、８遺伝子  ＧＣ特性の検証を示す。（６Ａ）プラセボ、１５０または３００ｍｇ  ＧＲモジュレーター  ＢＭＳ−７９１８２６、または１０ｍｇ  プレドニゾロンを投与された健常男性コホート２におけるプレドニゾロンからの参加者についての８遺伝子の短縮リストを使用するＧＣ遺伝子特性スコア。＊  Ｐ＝０．０１５；＊＊＊  Ｐ＜０．００１。（６Ｂ）アバタセプト  ＳＬＥ試験からのベースラインでの参加者についての、８遺伝子リストを使用するＧＣ遺伝子特性スコア  対  末梢血好中球数。相関関係を、Ｓｐｅａｒｍａｎランク付け試験を使用して計算した。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
発明の詳細な説明
グルココルチコイドは、各薬物についての処方情報に記載されているように投与される。一般的に、初期用量は、処置される特定の疾患の存在の重症度によって決定される。低い重症度の状況において、低用量が一般的に十分であるが、選択される患者においてより高い初期用量が必要とされ得る。満足のいく応答が認められるまで、初期量は典型的に維持または調整される。合理的な期間後、満足のいく臨床反応が不足しているとき、グルココルチコイドは中止され、患者は他の適当な治療に置かれる。良好な応答がなし遂げられた後、適切な維持量は、十分な臨床反応を維持する最低量に達するまで、適当な時間間隔で少しの減少において初期薬物量を減少させることによって決定される。明らかに、どのように患者がグルココルチコイドに応答するかを決定することができることは、患者の維持量を最適化するために必要とされる時間を減少させるであろう。
【００２８】
本願発明は、興味あるグルココルチコイドをヒトに投与すること、興味あるグルココルチコイドを投与されたヒトから血液を採取すること、回収された血液からＲＮＡを単離すること、単離されたＲＮＡの遺伝子発現をプロファイリングすること、および投与後の遺伝子特性をコントロール遺伝子特性と比較すること、ここで、選択される遺伝子の上方調節がグルココルチコイドに対する応答を示す、によって、グルココルチコイドに対するヒトの応答を決定する方法を含む。
【００２９】
本願発明者らは、グルココルチコイド遺伝子特性の発現が、グルココルチコイドの経口投与後に正常健常ボランティア（ＮＨＶ）の末梢血白血球において有意に上昇されることを見いだした。特性の発現は、用量依存的に増加し、投与４時間後でピークであり、および投与４８時間後までにベースラインに戻った。より低い発現が部分的なグルココルチコイド受容体アゴニストを投与されたＮＨＶにおいて検出され、この化合物の低下した転写活性化の可能性と一致する。全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）およびリウマチ性関節炎（ＲＡ）を有する患者のコホートにおいて、グルココルチコイド特性の発現は、末梢血リンパ球のパーセンテージと負に相関しており、末梢血好中球数と正に相関しており、グルココルチコイド受容体の公知の生物学と一致する。
【００３０】
グルココルチコイド調節遺伝子の同定
末梢血においてグルココルチコイド依存性応答をモニタリングするために、ヒトＰＢＭＣにおいてプレドニゾロンによって調節される遺伝子を同定した。１０人の個々の正常健常ボランティアドナーからのＰＢＭＣを、６時間、ＤＭＳＯコントロールまたは１μＭ  プレドニゾロンのいずれかで処理した。＞２倍変化および＜０．０５のＦＤＲ補正ｐ値を有する遺伝子を、上方調節されるまたは下方調節される遺伝子として同定した。
【００３１】
上方調節される遺伝子は、ＥＣＨＤＣ３、ＡＣＳＬ１、Ｐ２ＲＸ５、ＴＰＳＴ１、ＴＢＣ１Ｄ８、ＡＰＢＡ２、ＳＥＳＮ１、ＲＮＡＳＥ１、ＡＢＬＩＭ３、ＲＮＡＳＥ６、ＢＬＭ、ＫＩＦ１３Ｂ、ＤＮＭＢＰ、ＳＡＰ３０、ＳＦＭＢＴ１、ＴＭＥＭ２、ＨＳＰＨ１、ＭＥＴＴＬ７Ａ、ＨＳＰＡ１Ｂ、ＳＬＣ２５Ａ３７、ＶＩＰＲ１、ＦＡＲ２、ＨＳＰＡ６、ＰＨＣ２、ＰＥＬＩ１、ＰＯＬＲ１Ｅ、ＳＰＯＮ２、ＧＦＯＤ１、ＳＰＲＹ１、ＮＤＦＩＰ１、ＭＡＮ２Ａ２、ＩＳＧ２０、ＲＡＢ３１；ＦＫＢＰ５、ＩＬ１Ｒ２、ＺＢＴＢ１６、ＩＲＳ２、ＩＲＡＫ３、ＤＵＳＰ１、ＳＬＣＯ４Ａ１、ＴＳＣ３３Ｄ３、ＣＤ１６３、ＳＬＣ１Ａ３、ＡＬＯＸ１５Ｂ、ＣＣＮＤ３、ＲＨＯＢ、ＶＳＩＧ４、ＦＬＴ３、ＣＲＩＳＰＬＤ２、ＡＤＯＲＡ３、ＲＧＳ１、ＡＭＰＨ、ＣＰＭ、ＡＮＧ、ＣＤ９３、ＳＰＴＬＣ２、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＥＳＴＳ２、ＴＬＲ２、ＰＥＲ１、ＤＮＡＪＢ１、ＰＴＫ２Ｂ、ＣＥＢＰＤ、ＳＬＡを含む（図１Ａ）。
【００３２】
下方調節される遺伝子は、ＫＭＯ、ＣＣＲ５、ＣＸＣＬ８、ＦＰＲ３、ＰＬＡ２Ｇ７、ＰＥＡ１５、ＴＲＡＦ１、ＣＳＦ２ＲＢ、ＴＲＤＣ、ＯＬＲ１、ＫＩＡＡ０２２６Ｌ、ＦＣＧＲ２Ｂ、ＡＴＦ５、ＣＸ３ＣＲ１、ＭＹＯＦ、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ９、ＩＬ１ＲＮを含む（図１Ｂ）。
【００３３】
これらの遺伝子中の多くは、公知のグルココルチコイド調節遺伝子であった（Chinenov Y, et.al., BMC Genomics 2014;15:656）。しかしながら、上方調節される遺伝子ＥＣＨＤＣ３、ＡＣＳＬ１、Ｐ２ＲＸ５、ＴＰＳＴ１、ＴＢＣ１Ｄ８、ＡＰＢＡ２、ＳＥＳＮ１、ＲＮＡＳＥ１、ＡＢＬＩＭ３、ＲＮＡＳＥ６、ＢＬＭ、ＫＩＦ１３Ｂ、ＤＮＭＢＰ、ＳＡＰ３０、ＳＦＭＢＴ１、ＴＭＥＭ２、ＨＳＰＨ１、ＭＥＴＴＬ７Ａ、ＨＳＰＡ１Ｂ、ＳＬＣ２５Ａ３７、ＶＩＰＲ１、ＦＡＲ２、ＨＳＰＡ６、ＰＨＣ２、ＰＥＬＩ１、ＰＯＬＲ１Ｅ、ＳＰＯＮ２、ＧＦＯＤ１、ＳＰＲＹ１、ＮＤＦＩＰ１、ＭＡＮ２Ａ２、ＩＳＧ２０、ＲＡＢ３１は、グルココルチコイド制御に以前に関連していなかった。ＤＵＳＰ１（Abraham SM, et.al., J Exp Med 2006;203:1883-9）、ＴＳＣ２２Ｄ３（Beaulieu E, et.al. Nat Rev Rheum 2011;7:340-8）、ＩＲＡＫ３（Miyata M, et.al., Nat Commun 2015;6:606）、およびＣＤ１６３（Schaer DJ, et.al., Immunogenetics 2001;53:170-7）を含む上方調節される遺伝子のいくつかは、抗炎症性活性に以前に関連していたが、下方調節される遺伝子のいくつかは、ケモカイン、ケモカイン受容体、および他の炎症性メディエーターをコードした。調節遺伝子のネットワーク分析は、免疫応答経路に関して濃縮を示した。単一サンプル遺伝子セット濃縮分析（ｓｓＧＳＥＡ）アルゴリズムを使用して、個々のサンプルのトランスクリプトームにおけるこれらの遺伝子の濃縮について複合(composite)スコア（または遺伝子特性）を生成した（Barbie DA, et.al. Nature 2009;462:108-12）。全血をインビトロで５時間プレドニゾロンの異なる濃度で刺激し、上方および下方調節される遺伝子の発現レベルを計算した。上方調節される遺伝子についてのｓｓＧＳＥＡスコアは、用量依存的に増加した（図１Ｃ）。同様に、下方調節される遺伝子の発現は、用量依存的に減少した（図１Ｄ）。上方調節される遺伝子モジュールは、より広い動的な範囲を有し、したがって、この遺伝子モジュールは全ての他の分析のために利用された。
【００３４】
この遺伝子モジュールがＧＲ活性を正確に反映するというさらなる機械的証拠を提供するために、部分的なグルココルチコイド受容体（ＧＲ）アゴニストの活性を分析した。２つの選択的なＧＲモジュレーター、ＢＭＳ−７７６５３２およびＢＭＳ−７９１８２６のインビトロおよびインビボ活性は、以前に記載されている（Weinstein DS, et.al. J Med Chem 2011;54:7318-33）。両方の化合物は、ＧＲに結合し、ＡＰ−１および核因子−κＢ−依存性レポーターを抑制したが、プレドニゾロンと比較してＧＲ−依存性レポーターの有意に弱い誘導を証明した。ＢＭＳ−７９１８２６は、ＢＭＳ−７７６５３２と比較して転写抑制および転写活性化アッセイにおいてより強力であった。ＧＲは、ＴＩＦ２（Khan SH, et.al., Biol. Chem. 2012; 287:44546-44560）およびＰＧＣ１α（Knutti D, et.al., Mol. Cell. Biol. 2000; 20:2411-2422）を含む共調節因子の補充を介して転写を調節する。哺乳動物２−ハイブリッドシステムならびにクロマチン免疫沈降を使用して、これらの化合物の転写活性化の可能性を特徴付けた。プレドニゾロンと比較して、ＢＭＳ−７９１８２６およびＢＭＳ−７７６５３２は、ＧＲに対して有意に低いＰＧＣ１αおよびＴＩＦ２を補充し、プレドニゾロンによって補充されるレベルの３０−７５％でピークに達した（図２Ａ、２Ｂ）。ＢＭＳ−７９１８２６は、ＢＭＳ−７７６５３２と比較してより多くのＴＩＦ２であるが（５０％  ｖｓ  ３０％）、同様の量のＰＧＣ１αを補充した。クロマチン免疫沈降アッセイにおいて、両方の化合物は、プレドニゾロンと比較して、３つの標的遺伝子のプロモーターに対して有意に低い量のＧＲ（図２Ｃ）ならびにＴＩＦ２（図２Ｄ）を補充し、これらの化合物の低下した転写活性化の可能性を確認した。２人の独立した正常健常ボランティアドナーからの全血を、インビトロでこれらの化合物およびプレドニゾロンで５時間刺激し、次に、ＲＮＡ単離およびＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプロファイリングを行った。これらのサンプルについてのグルココルチコイド遺伝子特性スコアは、化合物の転写活性化の可能性とよく一致した：プレドニゾロン＞ＢＭＳ−７９１８２６＞ＢＭＳ−７７６５３２（図２Ｅ）。
【００３５】
本願発明は、グルココルチコイドに対するヒトの応答を決定する方法であって、それを必要とするヒトから回収された全血を興味あるグルココルチコイドで刺激すること、刺激された血液からＲＮＡを単離すること、単離されたＲＮＡの遺伝子発現をプロファイリングすること、および刺激後の遺伝子特性スコアをコントロール遺伝子特性スコアと比較すること、ここで、遺伝子特性が、遺伝子ＥＣＨＤＣ３、ＡＣＳＬ１、Ｐ２ＲＸ５、ＴＰＳＴ１、ＴＢＣ１Ｄ８、ＡＰＢＡ２、ＳＥＳＮ１、ＲＮＡＳＥ１、ＡＢＬＩＭ３、ＲＮＡＳＥ６、ＢＬＭ、ＫＩＦ１３Ｂ、ＤＮＭＢＰ、ＳＡＰ３０、ＳＦＭＢＴ１、ＴＭＥＭ２、ＨＳＰＨ１、ＭＥＴＴＬ７Ａ、ＨＳＰＡ１Ｂ、ＳＬＣ２５Ａ３７、ＶＩＰＲ１、ＦＡＲ２、ＨＳＰＡ６、ＰＨＣ２、ＰＥＬＩ１、ＰＯＬＲ１Ｅ、ＳＰＯＮ２、ＧＦＯＤ１、ＳＰＲＹ１、ＮＤＦＩＰ１、ＭＡＮ２Ａ２、ＩＳＧ２０、ＲＡＢ３１を含み、遺伝子特性スコアの増加が、グルココルチコイドに対する応答を示す、を含む方法を含む。
【００３６】
本願発明は、グルココルチコイドに対するヒトの応答を決定する方法であって、それを必要とするヒトから回収された全血をコルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、トリアムシノロン、ベタメタゾン  ブデソニド、フルチカゾン、および合成グルココルチコイドからなる群から選択される１つ以上のグルココルチコイドで刺激すること、刺激された血液からＲＮＡを単離すること、単離されたＲＮＡの遺伝子発現をプロファイリングすること、および刺激後の遺伝子特性スコアをコントロール遺伝子特性スコアと比較すること、ここで、遺伝子特性が、遺伝子ＥＣＨＤＣ３、ＡＣＳＬ１、Ｐ２ＲＸ５、ＴＰＳＴ１、ＴＢＣ１Ｄ８、ＡＰＢＡ２、ＳＥＳＮ１、ＲＮＡＳＥ１、ＡＢＬＩＭ３、ＲＮＡＳＥ６、ＢＬＭ、ＫＩＦ１３Ｂ、ＤＮＭＢＰ、ＳＡＰ３０、ＳＦＭＢＴ１、ＴＭＥＭ２、ＨＳＰＨ１、ＭＥＴＴＬ７Ａ、ＨＳＰＡ１Ｂ、ＳＬＣ２５Ａ３７、ＶＩＰＲ１、ＦＡＲ２、ＨＳＰＡ６、ＰＨＣ２、ＰＥＬＩ１、ＰＯＬＲ１Ｅ、ＳＰＯＮ２、ＧＦＯＤ１、ＳＰＲＹ１、ＮＤＦＩＰ１、ＭＡＮ２Ａ２、ＩＳＧ２０、ＲＡＢ３１を含み、遺伝子特性スコアの増加が、グルココルチコイドに対する応答を示す、を含む方法を含む。
【００３７】
グルココルチコイド遺伝子特性のインビボ評価
グルココルチコイド（ＧＣ）特性がインビトロでグルココルチコイド受容体（ＧＲ）アゴニスト活性を正確に捕捉したため、インビボでのＧＣ遺伝子特性の挙動を試験した。正常健常ボランティア（ＮＨＶ）に、プラセボ、１０ｍｇ  プレドニゾロン、または１５０もしくは３００ｍｇ  ＧＲモジュレーターＢＭＳ−７９１８２６を投与した。血液を投与前および投与４時間後に採取し、ＲＮＡをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ遺伝子発現プロファイリングにより分析した。プレドニゾロンを投与された参加者についてのＧＣ特性スコアは、投与前およびプラセボと比較して４時間の時点で有意に上昇された（図３Ａ）。ＢＭＳ−７９１８２６を投与された参加者についての特性スコアは、投与前レベルおよびプラセボを与えられた参加者よりも高かったが、プレドニゾロングループにおける参加者よりも低かった。ＧＣ遺伝子特性応答の動力学に対処するために、異なる用量のプレドニゾロンを投与されたＮＨＶからの全血ＲＮＡプロフィールを分析した。ＧＣ遺伝子特性スコアは、用量依存的に増加し、投与４時間後でピークであった（図３Ｂ）。最も高い用量のプレドニゾロンを除く全てについて、ＧＣ遺伝子特性スコアは、投与８時間後までにベースラインレベルに戻った。特性スコアは、投与４８時間後までに全てのグループにおいてベースラインレベルであった。
【００３８】
複合グルココルチコイド遺伝子特性スコアは、グルココルチコイド投与に対するインビボ応答の高感度の尺度である。
【００３９】
本願発明は、プレドニゾロンに対するヒトの応答を決定する方法であって、プレドニゾロンを該ヒトに投与すること、投与４時間後のプレドニゾロンを投与されたヒトから血液を採取すること、回収された血液からＲＮＡを単離すること、単離されたＲＮＡの遺伝子発現をプロファイリングすること、および投与後の遺伝子特性スコアをコントロール遺伝子特性スコアと比較すること、ここで、遺伝子特性が、遺伝子ＥＣＨＤＣ３、ＡＣＳＬ１、Ｐ２ＲＸ５、ＴＰＳＴ１、ＴＢＣ１Ｄ８、ＡＰＢＡ２、ＳＥＳＮ１、ＲＮＡＳＥ１、ＡＢＬＩＭ３、ＲＮＡＳＥ６、ＢＬＭ、ＫＩＦ１３Ｂ、ＤＮＭＢＰ、ＳＡＰ３０、ＳＦＭＢＴ１、ＴＭＥＭ２、ＨＳＰＨ１、ＭＥＴＴＬ７Ａ、ＨＳＰＡ１Ｂ、ＳＬＣ２５Ａ３７、ＶＩＰＲ１、ＦＡＲ２、ＨＳＰＡ６、ＰＨＣ２、ＰＥＬＩ１、ＰＯＬＲ１Ｅ、ＳＰＯＮ２、ＧＦＯＤ１、ＳＰＲＹ１、ＮＤＦＩＰ１、ＭＡＮ２Ａ２、ＩＳＧ２０、ＲＡＢ３１を含み、遺伝子特性スコアの増加が、プレドニゾロンに対する応答を示す、を含む方法を含む。
【００４０】
グルココルチコイド遺伝子特性と報告されたグルココルチコイド使用との関係
グルココルチコイド特性が処置状態に基づいて患者間で区別できるか否かを決定するために、ＳＬＥまたはＲＡを有する患者の断面コホートにおける特性の発現を分析した。正常健常コントロールまたは他の標準治療薬物で処置された患者のいずれかと比較して、グルココルチコイドを処方されたＳＬＥまたはＲＡを有する患者は、上昇した特性スコアを有した（図４Ａ）。グルココルチコイド特性が上昇されたとき、特性スコアにおいて有意な患者間変動性があった。ＳＬＥにおけるアバタセプトのフェーズＩＩ試験からのベースラインサンプルを、グルココルチコイド遺伝子特性の発現について分析した（Fleishaker DL, et.al., BMC Musculoskelet Disord 2016;17:29）（図４Ｂ）。グルココルチコイド遺伝子特性スコアは、高用量（＞３０ｍｇ）、中用量（１０−３０ｍｇ）および低用量（＜１０ｍｇ）に分類されるとき、報告されたプレドニゾン用量と概ねよく一致した。しかしながら、全てのグループにてグルココルチコイド遺伝子特性スコアにおいて有意な患者間変動性が再びあった。これは、いくつかの患者においてステロイド耐性またはいくつかの患者でコンプライアンス問題を反映している可能性がある。
【００４１】
グルココルチコイド遺伝子特性と他の薬力学的終点との相関関係
グルココルチコイドは、骨髄から好中球のデマージネイション(demargination)またはリンパ器官におけるリンパ球集団の隔離を介する白血球サブセットの再分布を引き起こすことが知られている（Merayo-Chalico J, et.al., Hum Immunol 2016;77:921-6; Spies CM, et.al., Arthritis Res Ther 2014;16 Suppl 2:S3）。グルココルチコイド特性がこれらの薬力学的終点と相関しているか否かを決定するために、ＳＬＥおよびＲＡ患者の末梢血を、ＣＤ４＋  Ｔ細胞、ＣＤ８＋  Ｔ細胞、およびＣＤ１９＋  Ｂ細胞について試験した。グルココルチコイド特性の発現は、ＳＬＥ患者（図５Ａ）およびＲＡ患者（図５Ｂ）の末梢血におけるこれらのサブセットのパーセンテージと負に相関していた。アバタセプト  ＳＬＥ試験において、グルココルチコイド特性スコアは、好中球数と正に相関していた（図５Ｃ）。
【００４２】
したがって、グルココルチコイド遺伝子特性の発現は、ＳＬＥおよびＲＡ患者の両方においてグルココルチコイドの知られている生物学と相関する。
【００４３】
グルココルチコイド遺伝子特性の精密化
６４メンバーの遺伝子特性のさらなる精密化は、クリニックにおける実施を容易にするであろう。６４の上方調節される遺伝子のリストが、健常男性コホート２試験においてプレドニゾロン  対  プレドニゾロンにおけるプラセボで投与された患者を比較して、＜０．０５のＦＤＲ調節  ｐ値で１．５倍以上まで誘導された上方調節される遺伝子に精密化された。リストは、アバタセプト  ＳＬＥ試験において検出可能な発現についてさらに検索条件を追加された。最初の６４遺伝子のうち、１８（ＦＫＢＰ５、ＥＣＨＤＣ３、ＩＬ１Ｒ２、ＺＢＴＢ１６、ＩＲＳ２、ＩＲＡＫ３、ＡＣＳＬ１、ＤＵＳＰ１、ＰＨＣ２、ＴＬＲ２、ＴＳＣ２２Ｄ３、ＳＬＡ、ＣＲＩＳＰＬＤ２、ＭＡＮ２Ａ２、ＦＡＲ２、ＣＥＢＰＤ、ＳＰＴＬＣ２、ＨＳＰＡ６）はこれらの基準を満たす。リストからの上位３つの遺伝子（ＦＫＢＰ５、ＥＣＨＤＣ３およびＩＬ１Ｒ２）、上位６つの遺伝子（ＦＫＢＰ５、ＥＣＨＤＣ３  ＩＬ１Ｒ２、ＺＢＴＢ１６、ＩＲＳ２、ＩＲＡＫ３）および上位８つの遺伝子（ＦＫＢＰ５、ＥＣＨＤＣ３、ＩＬ１Ｒ２、ＺＢＴＢ１６、ＩＲＳ２、ＩＲＡＫ３、ＡＣＳＬ１、ＤＵＳＰ１）を、次に、ｓｓＧＳＥＡスコアを計算するために使用した。
【表１】
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【００４４】
この短縮された特性にて部分的なＧＲアゴニストの健常男性コホート２試験におけるプレドニゾロンの分析を、６４の遺伝子特性の挙動を完全に捕捉した（図６Ａ）。６４の上方調節される遺伝子で生成された特性と同様に、８の遺伝子特性は、これらの化合物のインビボ投与後の部分的なアゴニストおよびプレドニゾロンの転写活性化可能性を正確に反映した。８の遺伝子特性はまた、アバタセプトＳＬＥ試験から末梢血好中球数と正に相関しており、６４の遺伝子リストで生成された相関関係と同様のｐ値であった（図６Ｂ）。我々は、これらの８の遺伝子についての定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）アッセイが、簡単な全血回収で実施されることができるグルココルチコイド薬力学的活性の高感度なバイオマーカーであろうと結論付ける。
【００４５】
本願発明は、プレドニゾロンに対するヒトの応答を決定する方法であって、プレドニゾロンを該ヒトに投与すること、投与４時間後のプレドニゾロンを投与されたヒトから血液を採取すること、回収された血液からＲＮＡを単離すること、単離されたＲＮＡの遺伝子発現をプロファイリングすること、および投与後の遺伝子特性をコントロール遺伝子特性と比較すること、ここで、遺伝子特性が、遺伝子ＦＫＢＰ５、ＥＣＨＤＣ３、ＩＬ１Ｒ２、ＺＢＴＢ１６、ＩＲＳ２、ＩＲＡＫ３、ＡＣＳＬ１、ＤＵＳＰ１を含み、遺伝子特性スコアの増加が、プレドニゾロンに対する応答を示す、を含む方法を含む。
【００４６】
本願発明は、プレドニゾロンに対するヒトの応答を決定する方法であって、プレドニゾロンを該ヒトに投与すること、投与４時間後のプレドニゾロンを投与されたヒトから血液を採取すること、回収された血液からＲＮＡを単離すること、単離されたＲＮＡの遺伝子発現をプロファイリングすること、および投与後の遺伝子特性をコントロール遺伝子特性と比較すること、ここで、遺伝子特性が、遺伝子ＦＫＢＰ５、ＥＣＨＤＣ３、ＩＬ１Ｒ２、ＺＢＴＢ１６、ＩＲＳ２、ＩＲＡＫ３、ＡＣＳＬ１、ＤＵＳＰ１、ＰＨＣ２、ＴＬＲ２、ＴＳＣ２２Ｄ３、ＳＬＡ、ＣＲＩＳＰＬＤ２、ＭＡＮ２Ａ２、ＦＡＲ２、ＣＥＢＰＤ、ＳＰＴＬＣ２、ＨＳＰＡ６を含み、遺伝子特性スコアの増加が、プレドニゾロンに対する応答を示す、を含む方法を含む。
【００４７】
本願発明は、プレドニゾロンに対するヒトの応答を決定する方法であって、プレドニゾロンを該ヒトに投与すること、投与４時間後のプレドニゾロンを投与されたヒトから血液を採取すること、回収された血液からＲＮＡを単離すること、単離されたＲＮＡの遺伝子発現をプロファイリングすること、および投与後の遺伝子特性をコントロール遺伝子特性と比較すること、ここで、遺伝子特性が、遺伝子ＦＫＢＰ５、ＥＣＨＤＣ３、ＩＬ１Ｒ２を含み、遺伝子特性の増加が、プレドニゾロンに対する応答を示す、を含む方法を含む。
【００４８】
本願発明は、プレドニゾロンに対するヒトの応答を決定する方法であって、プレドニゾロンを該ヒトに投与すること、投与４時間後のプレドニゾロンを投与されたヒトから血液を採取すること、回収された血液からＲＮＡを単離すること、単離されたＲＮＡの遺伝子発現をプロファイリングすること、および投与後の遺伝子特性をコントロール遺伝子特性と比較すること、ここで、遺伝子特性が、遺伝子ＦＫＢＰ５、ＥＣＨＤＣ３、ＩＬ１Ｒ２、ＺＢＴＢ１６、ＩＲＳ２、ＩＲＡＫ３を含み、遺伝子特性スコアの増加が、プレドニゾロンに対する応答を示す、を含む方法を含む。
【００４９】
結論
グルココルチコイドは、強力な抗炎症活性によって多くの自己免疫性および炎症性疾患に対する処置の主力のままである。しかしながら、慢性的な使用は、毒性効果のリスクの増加と関連している。グルココルチコイドに対する臨床反応におけるこのリスクおよび有意な患者間変動性を考慮すると、適切な用量選択を容易にする高感度な客観的な薬力学が必要である。
【００５０】
本願発明のグルココルチコイド遺伝子特性は、ＮＨＶに由来するＰＢＭＣを使用してインビトロでの発現プロファイリング実験に基づいて開発された。下方調節される遺伝子よりもむしろ、グルココルチコイド処置により誘導される遺伝子が、ドナーにわたって大きな動的な範囲のために焦点が当てられた。ｓｓＧＳＥＡアルゴリズムを使用して、個々のサンプルまたは患者に適用することができる複合スコアを生成した。このアルゴリズムは、いくつかの観察に基づいて、グルココルチコイド依存性転写応答を高感度に検出するように見えた。グルココルチコイド特性スコアは、完全なおよび部分的なＧＲアゴニストの経口投与後に得られたサンプルを使用して、インビトロでの全血プロファイリング試験およびインビボ試験の両方からの総合的な部分的なＧＲアゴニストの転写活性化の可能性を正確に反映した。特性スコアはまた、インビトロおよびインビボの両方でグルココルチコイドに対する用量応答を捕捉した。
【００５１】
本願発明の方法が、ＳＬＥおよびＲＡを有する患者の断面コホートからのサンプルに適用されたとき、グルココルチコイド特性スコアは、他の非グルココルチコイド標準治療薬物と比較して、グルココルチコイドを使用する患者においてより高かった。アバタセプトＳＬＥ試験からのベースラインサンプルにおいて、ステロイド用量が増加されるとき、グルココルチコイド特性スコアは、漸進的に増加した。
【００５２】
本願発明のグルココルチコイド遺伝子特性は、臨床診療の一環としてのみだけでなく、臨床試験におけるステロイドの潜在的な交絡効果を決定するための手助けとしてもまた有用性を有する。アバタセプトＳＬＥ試験からのベースラインサンプルにおいて、グルココルチコイド遺伝子特性スコアは、報告されたステロイド用量と一般的に相関している。しかしながら、各投与グループ内の有意な患者間変動性が観察された。本願発明の方法は、患者がグルココルチコイドに対して耐性であるか、または試験プロトコールに準拠していないか否かを決定するために使用することができる。
【００５３】
グルココルチコイドの強力な抗炎症効果を考慮すると、試験は、しばしば、グルココルチコイドを漸減するか、または中止さえする必要性を含む。本願発明のグルココルチコイド遺伝子特性は、プロトコールへのコンプライアンスを評価するための客観的な方法を提供する。８の遺伝子特性スコアの計算は、全血回収物を使用するｑＰＣＲまたは他のプラットフォームで容易に実施することができる。要約すれば、本願発明の遺伝子特性は、処方される多くの適応において、グルココルチコイドに対する応答をモニターするための幅広い有用性を有する。
【実施例】
【００５４】
実施例１
グルココルチコイド調節遺伝子の同定
Ｆｉｃｏｌｌ勾配遠心分離を使用して、１０人の独立したドナーの血液からリンパ球を単離した。９６ウェル平底ブロックプレート（Qiagen, Hilden, Germany）の５００万リンパ球／ウェルで５００μｌアッセイ培地（以下を有するＲＰＭＩ−１６４０、ＧｌｕｔａＭＡＸ、１０％  木炭処理ウシ胎児血清；Gibco Laboratories, Gaithersburg, MD, USA）中で、細胞を培養した。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）ビヒクルまたは１μＭ  プレドニゾロンのいずれかで６時間、細胞を培養した。６時間後、細胞をペレット化し、１ｍｌ  核酸精製溶解溶液（Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）をカルシウムおよびマグネシウムを含まないリン酸緩衝食塩水（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）で１：２希釈された溶液に再懸濁した。細胞を溶解バッファー中で室温で１０分インキュベートし、次に−８０℃で保存した。製造業者の指示にしたがってＱｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  単離キットを使用して、ＲＮＡを単離した。
【００５５】
全血のプロファイリングのために、４人の正常健常ボランティアからの抗凝固剤クエン酸デキストロース溶液Ａを含む全血を、ＤＭＳＯビヒクル、２００ｎＭ  プレドニゾロン、１μＭ  プレドニゾロン、５μＭ  プレドニゾロン、５μＭ  ＧＲモジュレーターＢＭＳ−７９１８２６、または１０μＭ  ＢＭＳ−７７６５３２のいずれかで５時間培養し、次にＰＡＸｇｅｎｅチューブに移した。全ＲＮＡを単離し、次に、ＤＮａｓｅ  Ｉで処理し、Qiagen RNeasy MinElute Cleanup Kitを使用して浄化した。ＲＮＡ濃度をＮａｎｏＤｒｏｐ（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）を使用して決定し、Ｅｘｐｅｒｉｏｎ  電気泳動システム（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA）を使用してＲＮＡ品質を評価した。全ての標的標識化試薬は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（West Sacramento, CA, USA）から購入した。
【００５６】
Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むオリゴ−ｄＴプライマーでの逆転写およびcDNA Synthesis System（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）を使用する二本鎖変換を介して、１μｇの全ＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを合成した。ビオチン標識化ｃＲＮＡは、ｃＤＮＡから生成され、９６ウェルプレートにおいて９６シングルＨＧ−Ｕ１３３ＡアレイからなるHuman Genome HT_HG-U133Aプレート（Affymetrix, Sunnyvale, CA, USA）を調べるために使用した。全てのｃＤＮＡおよびｃＲＮＡ標的調製ステップは、AffymetrixからのCaliper GeneChip Array Stationで処理した。アレイハイブリダイゼーション、洗浄、およびスキャンは、製造業者の推奨にしたがって行った。
【００５７】
遺伝子特性開発およびスコア化
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ａｒｒａｙ  ＳｔａｔｉｏｎからのＣＥＬファイルを、Ｒの「Ａｆｆｙ」パッケージ（version 3.2.1; 16）を使用するRobust Multi-Array Average (RMA)アルゴリズム（Gautier I, et.al., Bioinformatics 2004;20:307-15）およびＢｒａｉｎＡｒｒａｙ（version 18.0.0; Dai M, et.al., Nucleic Acids Res 2005;33:e175）からのカスタムＣＤＦファイルを備えたＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ（Gentleman RC, et.al. Genome Biol. 2004, 5 (10):R80）を使用して処理および正規化した。Ａｒｒａｙ  Ｓｔｕｄｉｏ（OmicSoft, Cary, NC, USA）においてモデレートｔ−検定（Ritchie ME, et.al., Nucleic Acids Res 2015;43:e47）を使用して、差次的遺伝子発現分析を実行し、プレドニゾロン処置  対  コントロールサンプルにおける遺伝子発現レベルを比較した。ｐ値を、誤検出率とも呼ばれる複数のテスト補正方法を使用して調整した（FDR, Benjamini Y, et.al., J. Royal Statistical Soc., Series B 1995; 57:289）。実験にわたって＜０．０５の調整されたｐ値で少なくとも２倍上方調節または下方調節された遺伝子を、ＧＣ遺伝子特性として報告した。
【００５８】
ＧＣ遺伝子特性の濃縮レベルにより個々のサンプルをスコア化するために、我々は、単一サンプルの遺伝子セット濃縮分析（ｓｓＧＳＥＡ）アルゴリズム（Barbie DA, et.al., Nature 2009;462:108-12）を適応して複合スコアを生成した。これは、ＲのGene Set Variation Analysisパッケージ（version 3.4.0, Hanzelmann S, et.al., BMC Bioinformatics 2013;14:7）を使用して実行された。濃縮スコアがトランスクリプトーム内のＧＣ遺伝子の可能なランキングの最低から最高までを表す−１および１間になるようにアルゴリズムを修正した。
【００５９】
哺乳動物  ２−ハイブリッド分析
全長ヒトペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γコアクチベーター−１アルファ（ＰＧＣ１α）または全長ヒト転写メディエーター／中間因子２（ＴＩＦ２）のいずれかをコードする配列を、ベクターｐＭ（Clontech, Mountain View, CA, USA）におけるＧＡＬ４  ＤＮＡ−結合ドメインと共にフレームにおいてクローニングした。全長ヒトＧＲを、ベクターｐＶＰ１６（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）におけるＶＰ１６活性化ドメインと共にフレームにおいてクローニングした。ヒトＳＫ−Ｎ−ＭＣ神経芽腫細胞（American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）を、これらのプラスミドおよびＧＡＬ４依存性ルシフェラーゼレポーター（pGF-luc; Promega, Madison, WI, USA）と共トランスフェクトした。形質転換体を、２００ｎＭ  デキサメタゾン、または異なる濃度のプレドニゾロン、ＧＲモジュレーター  ＢＭＳ−７９１８２６またはＢＭＳ−７７６５３２のいずれかで刺激した。ルシフェラーゼ活性を、トランスフェクションの４８時間後に測定した。
【００６０】
クロマチン免疫沈降
クロマチン免疫沈降のために、Ａ５４９細胞を、１０％  木炭処理ウシ胎児血清を有するＲＰＭＩにおいて、ＤＭＳＯ、１μＭ  プレドニゾロン、１μＭ  ＧＲモジュレーター  ＢＭＳ−７９１８２６、または２μＭ  ＢＭＳ−７７６５３２のいずれかで１時間培養した。細胞をホルムアルデヒドで固定し、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を使用して特定のプロモーター配列に対するＧＲおよびＴＩＦ２補充の分析についてActive Motif(Carlsbad, CA, USA)に送った。
【００６１】
患者コホート
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）およびリウマチ性関節炎（ＲＡ）断面コホート
２０１４年および２０１５年においてNorthwell Health (Great Neck, NY, USA)で定期訪問中のＳＬＥを有する８６人の患者から末梢血を得た。患者は、ヒドロキシクロロキン、ミコフェノール酸モフェチル、グルココルチコイド、および／またはベリムマブを含む一般的なＳＬＥまたは狼瘡腎炎のための標準療法を受けた。患者特性は、次のとおりであった：年齢、４５±１４歳（平均±ＳＤ）；女性、８５％；ＳＬＥ疾患活動性指数２０００スコア（ＳＬＥＤＡＩ−２Ｋ）、３．７±３．２（平均±ＳＤ）；狼瘡腎炎の病歴、４３％；疾患の期間、１５±１３年（平均±ＳＤ）。
【００６２】
ＲＡコホートについて、２０１４年および２０１５年においてＢｒｉｇｈａｍおよびＷｏｍｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡまたはＮｏｒｔｈｗｅｌｌ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｇｒｅａｔ  Ｎｅｃｋ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋのいずれかで定期訪問中の８４人の患者から血液を得た。患者は、メトトレキサート、ヒドロキシクロロキン、トファシチニブ、アバタセプト、抗腫瘍壊死因子生物製剤、トシリズマブ、グルココルチコイド、および／または非ステロイド系抗炎症剤を含むＲＡのための標準療法を受けた。患者特性は、次のとおりであった：年齢、５７±１４歳（平均±ＳＤ）；女性、７７％；リウマチ性関節炎スコアに関して２０１０年米国リウマチ学会の基準、７．８±１．６（平均±ＳＤ）；疾患の期間、１７±１０年（平均±ＳＤ）。血液のＰＡＸｇｅｎｅチューブを、各訪問時に、ヘパリン処理した血液を回収した。血液を一晩輸送し、蛍光活性化細胞選別分析のために到着時に処理した。血液のＰＡＸｇｅｎｅチューブをまた、年齢および性別がマッチした正常健常ボランティア（Bristol-Myers Squibb, Princeton, NJ, USA）から回収した。ＲＮＡを血液のＰＡＸｇｅｎｅチューブから単離し、上記プロトコールを使用してＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ２１９遺伝子アッセイを調べるために使用した。
【００６３】
アバタセプトＳＬＥ臨床コホート（ＮＣＴ００１１９６７８）
ベースラインＰＡＸｇｅｎｅ回収物および全血球数を、ＡまたはＢのイギリス諸島狼瘡評価グループ（British Isles Lupus Assessment Group）（ＢＩＬＡＧ）スコアの基準を満たすＳＬＥを有する１４４人の成人から得た。ベースラインでの集団は、多発性関節炎を有する患者の５３％、円板状狼瘡を有する３５％、および漿膜炎を有する１２％からなった。全体として、患者の８７％はプレドニゾンであり、５０％はヒドロキシクロロキンであり、４１％は免疫抑制性（メトトレキサート、アザチオプリン、またはミコフェノール酸モフェチル）であった。
【００６４】
健常男性コホート１（ＮＣＴ０３１９６５５７）におけるプレドニゾロン
５、１０または３０ｍｇ  プレドニゾロンの１日用量を７日間受けるように、男性の正常健常ボランティアをランダムに割り当てた（６参加者／グループ）。２人の参加者はプラセボを受けた。ＰＡＸｇｅｎｅチューブを、投与前および投与２、４、８、４８、１４４、および２１６時間後に回収した。
【００６５】
健常男性コホート２（ＮＣＴ０３１９８０１３）におけるプレドニゾロン
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−４００溶液のプラセボ（４参加者）；ＰＥＧ−４００溶液としてのＧＲモジュレーター  ＢＭＳ−７９１８２６の単回１日経口用量（１５０または３００ｍｇ）（６参加者／用量）；または１０ｍｇ  プレドニゾロン（４参加者）の単回１日用量のいずれかを連続３日間で受けるように、男性の正常健常ボランティアをランダムに割り当てた。ＰＡＸｇｅｎｅチューブを、投与前および１日目の投与４時間後に回収した。
【００６６】
末梢血の表現型
ヘパリン化全血を抗体のあらかじめ混合されたカクテルで染色し、次に溶解および固定した。ＳＬＥパネルのために使用される抗体は、ＣＤ３−ｅＦ４５０（ｃｌｏｎｅ  ＯＫＴ３；  ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）、ＣＤ４−ＰＥ−Ｃｙ７（クローンＯＫＴ４；  ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）、ＣＤ８−ＡＰＣ−Ｈ７（クローンＳＫ１；  ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）、およびＣＤ１９−ＢＶ４２１（クローンＨＩＢ１９；  ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を含んだ。
【００６７】
ＲＡパネルのために使用される抗体は、ＣＤ１９−ＢＶ４２１、ＣＤ３−Ａｘ７００（クローンＯＫＴ３；  ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ４−Ｐｅｒｃｐ−Ｃｙ５．５（クローンＲＰＡ−Ｔ４；  ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、およびＣＤ８−Ｂｖ７８５（クローンＲＰＡ−Ｔ８；  ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を含んだ。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【国際調査報告】
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