(57)【要約】  本発明は、メチリビウムLD3、ハイドロゲノファーガLD1、及び/又はマイコバクテリウムLD6から選択される1つ又は複数の株を含む細菌コンソーシアムを使用してMTBE、TBA、及び/又はHCHOを分解するための手段及び方法を提供する。
2020504998.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
LMG P-27480として寄託されたメチリビウム株LD3を含む単離された細菌コンソーシアムであって、配列番号1の16S rRNA配列の存在を特徴とし、メチルターシャリーブチルエーテル(MTBE)分解コンソーシアムである、細菌コンソーシアム。
【請求項２】
LMG P-27479として寄託されたハイドロゲノファーガ株ハイドロゲノファーガLD1を更に含み、配列番号2の16S rRNA配列の存在を特徴とする、請求項1に記載の細菌コンソーシアム。
【請求項３】
LMG P-27498として寄託されたマイコバクテリウム株マイコバクテリウムLD6を更に含み、配列番号3の16S rRNA配列の存在を特徴とする、請求項1又は2に記載の細菌コンソーシアム。
【請求項４】
コンソーシアム中のメチリビウムLD3、ハイドロゲノファーガLD1、及び/又はマイコバクテリウムLD6の相対濃度が、約1〜60/40〜99/0.005〜10(%/%/%)であり、及び/又はメチリビウム株LD3が、104〜108細胞/mlの間の濃度で存在し、ハイドロゲノファーガ株ハイドロゲノファーガLD1が、106〜109細胞/mlの間の濃度で存在し、寄託されたマイコバクテリウム株マイコバクテリウムLD6が、102〜106細胞/mlの間の濃度で存在する、請求項3に記載の細菌コンソーシアム。
【請求項５】
前記メチリビウムLD3、ハイドロゲノファーガLD1、及び/又はマイコバクテリウムLD6株を含み、前記コンソーシアムのMTBE分解速度が、少なくとも1時間当たり細胞乾燥質量1g当たり10mg MTBEである、請求項3又は4に記載の細菌コンソーシアム。
【請求項６】
LMG P-27909として寄託されている、請求項3から5のいずれか一項に記載の細菌コンソーシアム。
【請求項７】
メチルターシャリーブチルエーテル(MTBE)、tert-ブタノール(TBA)、ホルムアルデヒド(HCHO)、及び/又はBTEXで汚染された培地中の、MTBE、TBA、及び/又はHCHOを分解するための、請求項1から5のいずれか一項に記載の細菌コンソーシアムの使用。
【請求項８】
メチルターシャリーブチルエーテル(MTBE)、tert-ブタノール(TBA)、及び/又はホルムアルデヒド(HCHO)で汚染された培地中の、MTBE、TBA、及び/又はHCHOを分解するための方法であって、
(i)請求項1から5のいずれか一項に記載のコンソーシアムを用意する工程と、
(ii)前記微生物、組成物、又はコンソーシアムで汚染された培地を処理して、前記汚染の少なくとも一部を分解する工程と
を含む、方法。
【請求項９】
処理が、バイオリアクター中又はin situで、汚染された培地へのコンソーシアムの添加によって行われる、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
104から109CFUの間の細胞数を有するコンソーシアムが添加される、請求項8又は9に記載の方法。
【請求項１１】
コンソーシアム中のメチリビウムLD3、ハイドロゲノファーガLD1、及び/又はマイコバクテリウムLD6の相対濃度が、約1〜60/40〜99/0.005〜10(%/%/%)である、請求項8から10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
培地中のMTBE、TBA、及び/又はHCHOの濃度を決定すること、及び/又は培地中のMTBE、TBA、及び/又はHCHOの分解速度を決定することを更に含む、請求項8から11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
汚染された培地が、汚染土壌、汚染スラッジ、汚染堆積物、汚染浚渫土砂、汚染化学廃棄物、汚染流体、及び汚染水からなる群から選択される、請求項8から12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
試料中のLMG P-27480として寄託されたメチリビウムLD3微生物、LMG P-27479として寄託されたハイドロゲノファーガLD1微生物、及び/又はLMG P-27498として寄託されたマイコバクテリウムLD6微生物の存在を検出するための方法であって、それぞれ前記試料中の配列番号1、配列番号2、又は配列番号3に対応する配列の存在を同定する工程であって、同定は、任意選択で、前記試料を、配列番号1、配列番号2、又は配列番号3に特異的にハイブリダイズできるプライマー又はプローブと接触させること、又は配列番号1、配列番号2、又は配列番号3に特異的な配列を増幅する工程によってなされる、工程と、前記試料中のLMG P-27480として寄託されたメチリビウムLD3微生物、LMG P-27479として寄託されたハイドロゲノファーガLD1微生物、及び/又はLMG P-27498として寄託されたマイコバクテリウムLD6微生物の存在を示すハイブリダイゼーションシグナル又は増幅産物の存在を決定する工程とを含む、方法。
【請求項１５】
配列番号1の16S RNA配列の存在を特徴とし、LMG P-27480として寄託された株メチリビウムLD3である、単離されたメチルターシャリーブチルエーテル(MTBE)分解メチリビウム株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メチルターシャリーブチルエーテル(MTBE)、tert-ブチルアルコール(TBA)、及び/又はホルムアルデヒド(HCHO)分解において使用する細菌コンソーシアム、並びにその適用に関する。
【背景技術】
【０００２】
メチルターシャリーブチルエーテル(MTBE)で汚染された地下水は、難解で世界的な環境問題である。MTBEは合成の車両用燃料添加剤であり、鉛フリーのガソリンにおいてオクタン価を高めるテトラエチル鉛の代用品として主に使用されている。ガソリン中でのMTBEの使用の更なる利点は、酸素を含有するガソリンで走る車の排気ガスの質の改善である。しかしながら、ガソリン中のMTBEの存在は、MTBEによる地下水の汚染をもたらしており、その主な理由は地下のガソリン貯蔵タンクの漏出である。MTBEは、地下水中での溶解度が高いことから、地下水中でのMTBE濃度は比較的高くなる可能性がある。MTBE分解における中間生成物で、tert-ブタノール又はターシャリーブチルアルコールとも呼ばれるtert-ブチルアルコール(TBA)、及びBTEX化合物(ベンゼン、トルエン、エチルベンゼン、及びキシレン)は、MTBE汚染に付随してみられることが多い。地表下でのMTBEの高い移動度、その扱いにくさ、水中でのMTBEの味覚及び臭気閾値の低さから、地下水中のMTBEの存在は飲料水供給に脅威をもたらす。国が定める閾値濃度を超すMTBEレベルを含む汚染プルームが大量にあることから、効率的な修復技術が必要であることは明らかである。MTBEで汚染された地下水を処理するために、バイオレメディエーションは、MTBE及びTBA汚染の処理効率が低い物理的方法に対する有益な代案とみなされる。
【０００３】
現在までのところ、唯一の炭素供給源及びエネルギー源としてMTBE及び/又はTBAを利用する能力を有する純粋又は無菌培養、及び混合培養は、限られた数しか知られていない。ほとんどの混合培養は、研究はされているものの、組成は不明で、MTBE及び/又はTBA分解に寄与する細菌は同定されていない。MTBEの生物学的分解は、他の多くの汚染物質の分解と同様、幾つかの困難が課題となっている。ほとんどの純粋培養物は、MTBEでは非常にゆっくりとしか増殖せず、一部の細菌はMTBEを分解する能力を容易に失い、一部の株は特異的な増殖添加剤の添加を必要とする。
【０００４】
Moreels等(2004年; FEMS Microbiology Ecology 49(1): 121〜128頁)は、汚染及び非汚染の土壌及び帯水層からの試料のMTBEを生分解する能力を比較した。Bastiaans等(2013年; Proc. Aquarehab、Sec. Eur. Symp. 70〜75頁)、及びDebor等(2010年、dissertation KULeuven)は、地下水の汚染物質の生分解における使用に好適であるとされる細菌M-コンソーシアムに言及している。しかしながら、このM-コンソーシアムは、実現可能な方法で開示されておらず、この教示に基づき再現することができない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Moreels等、2004年; FEMS Microbiology Ecology 49(1): 121〜128頁
【非特許文献２】Bastiaans等、2013年; Proc. Aquarehab、Sec. Eur. Symp. 70〜75頁
【非特許文献３】Debor等(2010年、dissertation KULeuven)
【非特許文献４】Altschul等(1990) J.Mol. Biol. 215:403〜410頁
【非特許文献５】National Center for Biotechnology Information(www.ncbi.nlm.nih.gov/)
【非特許文献６】Ludwig等、2004年、Nucleic Acids Research 32(4):1363〜1371頁
【非特許文献７】Sambrook等、2001年、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第3版、laboratory press、Cold Spring Harbor、N.Y.
【非特許文献８】El-Fantroussi等、1999年、Appl.Env. Microbiol. 65:982〜988頁
【非特許文献９】Muyzer等、1993年、Appl. Environ. Microbiol. 59:695〜700頁
【非特許文献１０】Lane、1991年、Nucleic Acids techniques in Bacterial Systematics、115〜147頁、John Wiley&Sons出版、Chichester
【非特許文献１１】Versalovic等、1991年、Nucl. Acids Res. 19:6823〜6831頁
【非特許文献１２】Versalovic等、1994年、Meth. Mol. Cell. Biol. 5:25〜40頁
【非特許文献１３】Mo等、1997年、Apppl. Microbiol. Biotechnol. 47:69〜72頁
【非特許文献１４】Lowry等、1951年、Journal of Biological Chemistry (193)、265〜275頁
【非特許文献１５】Hendrickx等、2006年、FEMS Microbiology Ecology 55: 262〜273頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、MTBE、TBA、及び/又はHCHO-分解無菌培養物を含むコンソーシアム、これらを使用するための方法、並びにこれらを同定するための手段を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本明細書に記載のコンソーシアムは、MTBE、TBA、及び/又はHCHOを分解する優れた能力を有し、これを使用してMTBE除染が成功している。より具体的には、MTBEが制限されている又は過剰であることによって本発明のコンソーシアムの増殖能力、並びにMTBE、TBA、及び/又はHCHO分解能力は限定されないため、本発明のコンソーシアムは、低濃度でも高濃度でも存在するMTBEを分解することができる。本明細書に記載のコンソーシアムは、低栄養素濃度でも比較的高いMTBE及びTBA分解速度を有し、広範囲の境界条件(例えば低温)で適用することができる。更に、本発明のコンソーシアムを使用する場合、生物学的分解は中間生成物の蓄積無しに完了する。
【０００８】
既述のコンソーシアムとは対照的に、本発明のコンソーシアムは非常に安定しており、数年間継代培養した場合、又は異なる環境条件に移された場合でも、それらのMTBE分解能力を保持する。
【０００９】
第1の態様において、本出願は、メチルターシャリーブチルエーテル(MTBE)分解株であるメチリビウム(Methylibium)株LD3を含む単離された細菌コンソーシアムを提供する。細菌株メチリビウムLD3は、LMG P-27480として寄託されており、配列番号1の16S rRNA配列の存在を特徴とする。メチリビウム株LD3を含むコンソーシアムは、MTBE、並びにその分解産物であるTBA、HIBA、及びホルムアルデヒドの分解において非常に有効であることが明らかにされている。
【００１０】
更に、特定の他の株と組み合わせてメチリビウムLD3株を含むコンソーシアムでは、MTBE分解効率が更に改善されることが明らかにされている。したがって、特定の実施形態において、本明細書に記載のコンソーシアムは、更にハイドロゲノファーガ(Hydrogenophaga)株ハイドロゲノファーガLD1、及び/又はマイコバクテリウム(Mycobacterium)株マイコバクテリウムLD6を含む。ハイドロゲノファーガ株ハイドロゲノファーガLD1は、LMG P-27479として寄託されており、配列番号2の16S rRNA配列の存在を特徴とする。マイコバクテリウム株マイコバクテリウムLD6は、LMG P-27498として寄託されており、配列番号3の16S rRNA配列の存在を特徴とする。特定の実施形態において、本明細書に記載のコンソーシアムは、メチリビウムLD3、ハイドロゲノファーガLD1、及びマイコバクテリウムLD6を含み、LMG P-27478及びLMG 27909として寄託されたコンソーシアム(M-コンソーシアム)に対応する。本発明のコンソーシアムの更なる特定の実施形態において、メチリビウムLD3、ハイドロゲノファーガLD1、及びマイコバクテリウムLD6は、それぞれ1〜60%、40〜99%、及び0.005〜10%の間の比で、更に具体的には、それぞれ1〜55%、45〜99%、及び0.005〜2%の間の比で存在する。本発明のコンソーシアムの特定の実施形態において、メチリビウムLD3、ハイドロゲノファーガLD1、及びマイコバクテリウムLD6は、それぞれ102から108細胞/mlの間、例えば、それぞれ、1ml当たり104〜108コピーの間のメチリビウムLD3、1ml当たり106〜109コピーの間のハイドロゲノファーガLD1、及び1ml当たり102〜106コピーの間のマイコバクテリウムLD6で存在する。本発明のコンソーシアムの特定の実施形態において、メチリビウムLD3、ハイドロゲノファーガLD1、及びマイコバクテリウムLD6は、約1〜55/45〜99/0.005〜2(%/%/%)の相対存在度で、例えば、4.5/95.5/0.03、51.3/48.7/0.005、47.6/52.4/0.008、2.1/97.9/0.006、7.3/92.6/0.02、36.3/63.6/0.07、1.3/98.4/0.3、又は13.9/86/0.02の相対存在度で存在する。
【００１１】
特定の実施形態において、MTBEの分解中及び分解後に担体材料上で測定されたメチリビウムLD3、ハイドロゲノファーガLD1、及び/又はマイコバクテリウムLD6の相対濃度は、q-PCRで決定した場合、それぞれ0.01〜99.98%、0.01〜99.98%、及び0.01〜34%である。特定の実施形態において、実際の地下水を用いる非滅菌条件下で、MTBEの分解中及び分解後に担体材料上で測定されたコンソーシアム中のメチリビウムLD3、ハイドロゲノファーガLD1、及び/又はマイコバクテリウムLD6の相対濃度は、q-PCRで決定した場合、それぞれ0.1〜86%、0.1〜10%、<0.1〜7%であり、特異的プローブを使用するFISH分析(蛍光in situハイブリダイゼーション)によって決定した場合、それぞれ0.1〜57%、<0.1〜23%、及び<0.1〜35%である。
【００１２】
本明細書に記載の細菌株及びコンソーシアムは、メチルターシャリーブチルエーテル(MTBE)、tert-ブタノール(TBA)、ヒドロキシイソ酪酸(HIBA)、ホルムアルデヒド(HCHO)、及び/又はBTEXで汚染された培地中の、MTBE、TBA、HIBA、HCHO、及び/又はBTEX化合物の分解に特に好都合である。
【００１３】
特定の実施形態において、メチリビウムLD3、ハイドロゲノファーガLD1及び/又はマイコバクテリウムLD6株を含む本明細書に記載の細菌コンソーシアムでは、最大で1時間当たりバイオマス乾燥質量1g当たりMTBE10〜64mgのMTBE分解速度、及び/又は1時間当たりバイオマス乾燥質量1g当たりTBA30〜80mgのTBA分解速度が認められる。
【００１４】
したがって、更なる態様は、本明細書に記載の細菌株及び/又はコンソーシアムを利用して、メチルターシャリーブチルエーテル(MTBE)、tert-ブタノール(TBA)、ヒドロキシイソ酪酸(HIBA)、及び/又はホルムアルデヒド(HCHO)で汚染された培地中の、MTBE、TBA、HIBA、及び/又はHCHOを分解するための方法を提供する。特定の実施形態において、このような方法は、(i)本明細書に記載したようなコンソーシアムを用意する工程と、(ii)汚染された培地を前記コンソーシアムによって処理して、前記汚染の少なくとも一部を分解する工程とを含む。特定の実施形態において、処理工程は、バイオリアクター中又はin situで、汚染された培地へのコンソーシアムの添加によって行われる。in situの汚染された培地は、約10℃、具体的には5℃から15℃の間、具体的には7℃から13℃の間の温度でありうる。
【００１５】
本発明の方法の特定の実施形態において、コンソーシアムは、102から108細胞/mlの間の細胞数で汚染された培地に添加される。特定の実施形態において、本方法は、上記のようなメチリビウムLD3、ハイドロゲノファーガLD1、及び/又はマイコバクテリウムLD6の相対濃度を有するコンソーシアムを用意することを含む。本発明の特定の実施形態によれば、本方法は、培地中のMTBE、TBA、HIBA、及び/又はHCHOの濃度を決定することを含み、及び/又は培地中のMTBE、TBA、HIBA、及び/又はHCHOの分解速度を決定することを含む。
【００１６】
本発明の特定の実施形態において、汚染された培地は、汚染土壌、汚染スラッジ、汚染堆積物、汚染浚渫土砂、汚染化学廃棄物、汚染流体、及び汚染水からなる群から選択される。
【００１７】
更なる態様において、本発明は、試料中のメチリビウムLD3、ハイドロゲノファーガLD1、及び/又はマイコバクテリウムLD6微生物の存在を検出するための方法であって、それぞれ前記試料中の配列番号1(図3)、配列番号2(図4)、又は配列番号3(図5)に対応する配列の存在を同定する工程を含む、方法を提供する。特定の実施形態において、これらの方法は、前記試料を、配列番号1、配列番号2、又は配列番号3に特異的にハイブリダイズできるプライマー又はプローブと接触させること、又は配列番号1、配列番号2、又は配列番号3に特異的な配列を増幅すること、及び試料中のメチリビウムLD3、ハイドロゲノファーガLD1、及び/又はマイコバクテリウムLD6それぞれの存在を示すハイブリダイゼーションシグナル又は増幅産物の存在を特定することを含む。
【００１８】
また更なる態様において、本発明は、MTBE、TBA、HIBA、及び/又はHCHOの分解での使用に特に興味深い、単離された細菌株を提供する。より具体的には、本発明は、単離されたMTBE、TBA、HIBA、及びホルムアルデヒド分解メチリビウム株を提供する。これは、配列番号1の16S RNA配列の存在を特徴とし、且つ/又はLMG P-27480として寄託された株メチリビウムLD3に対応する。更なる実施形態において、本発明は、単離されたtert-ブタノール(TBA)分解ハイドロゲノファーガ株を提供する。これは、配列番号2の16S RNA配列の存在を特徴とし、且つ/又はLMG P-27479として寄託された株ハイドロゲノファーガLD1に対応する。本発明は、更に、単離されたホルムアルデヒド(HCHO)分解マイコバクテリウム株を提供する。これは、配列番号3の16S RNA配列の存在を特徴とし、且つ/又はLMG P-27498として寄託された株マイコバクテリウムLD6に対応する。前記単離された株は、MTBE、TBA、HIBA、ホルムアルデヒド、及び/又はHCHOの分解において使用することができる。
【００１９】
また更なる態様において、本発明は、本明細書に記載の細菌株及びコンソーシアムの検出において興味深い、単離された核酸配列を提供する。より具体的には、本発明は、本明細書に記載の細菌株に特異的な16S RNA配列に対応する、配列番号1、配列番号2、又は配列番号3で表された配列を含む又はからなる単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００２０】
本発明を、単に例証とみなされるものであり、決して本発明の範囲を限定するものではない下記の図によって例示する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ】本明細書で想定した実施形態によるM-コンソーシアムによる、50mg/LのMTBE(a)、TBA(b)、HIBA(c)、又はHCHO(d)に対する増殖及び分解を示すグラフである。
【図１Ｂ】本明細書で想定した実施形態によるM-コンソーシアムによる、50mg/LのMTBE(a)、TBA(b)、HIBA(c)、又はHCHO(d)に対する増殖及び分解を示すグラフである。
【図２Ａ】唯一の炭素源としてMTBEを数回再添加した、最少無機培地中の実験室規模条件における長時間にわたるMTBEを分解するM-コンソーシアムの安定性を示すグラフである。
【図２Ｂ】唯一の炭素源としてMTBEを数回再添加した、最少無機培地中の実験室規模条件における長時間にわたるMTBEを分解するM-コンソーシアムの安定性を示すグラフである。
【図２Ｃ】唯一の炭素源としてMTBEを数回再添加した、最少無機培地中の実験室規模条件における長時間にわたるMTBEを分解するM-コンソーシアムの安定性を示すグラフである。
【図３】メチリビウム属の一種LD3の16S rRNAの配列である。
【図４】ハイドロゲノファーガ属の一種LD1の16S rRNAの配列である。
【図５】マイコバクテリウム属の一種LD6の16S rRNAの配列である。
【図６ａ】M-コンソーシアムから単離された純粋な細菌株によるMTBE、TBA、又はHCHOの分解、及び対応する増殖を示すグラフである。矢印は、MTBE、TBA、又はHCHO基質の添加時を示す。増殖は、OD660測定によってモニタリングした。
【図６ｂ】M-コンソーシアムから単離された純粋な細菌株によるMTBE、TBA、又はHCHOの分解、及び対応する増殖を示すグラフである。矢印は、MTBE、TBA、又はHCHO基質の添加時を示す。増殖は、OD660測定によってモニタリングした。
【図６ｃ】M-コンソーシアムから単離された純粋な細菌株によるMTBE、TBA、又はHCHOの分解、及び対応する増殖を示すグラフである。矢印は、MTBE、TBA、又はHCHO基質の添加時を示す。増殖は、OD660測定によってモニタリングした。
【図６ｄ】M-コンソーシアムから単離された純粋な細菌株によるMTBE、TBA、又はHCHOの分解、及び対応する増殖を示すグラフである。矢印は、MTBE、TBA、又はHCHO基質の添加時を示す。増殖は、OD660測定によってモニタリングした。
【図７】メチリビウム属の一種LD3、ハイドロゲノファーガ属の一種LD1、マイコバクテリウム属の一種LD6の16S rRNA遺伝子を標的とする特異的プライマーを使用した定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)によって決定した、経時的に得たM-コンソーシアムの様々な増殖培養物におけるメチリビウム属の一種LD3、ハイドロゲノファーガ属の一種LD1、マイコバクテリウム属の一種LD6の絶対存在量を示すグラフである。
【図８】実際の汚染物由来の帯水層物質及び地下水を含む非滅菌環境のマトリックスにおける、M-コンソーシアムの安定したMTBE-分解特性を示すグラフである。矢印は、MTBEの添加時を示す。
【図９】M-コンソーシアムを接種した担体材料を充填したカラム(L=50cm)を50cm/日の速度で通過する間の、(地下)水からのMTBE及びベンゼンの除去を示すグラフである。
【図１０】ポンプ、管類、及び4つのサンプリング点を示す、本明細書で想定される特定の実施形態による例示的な反応器の構成を示す概略図である。
【図１１】担体材料として膨張性クレイを含有し、M-コンソーシアムを接種し、MTBEを含有する地下水を供給した7Lバイオリアクターシステムにおける、実行HRT、測定されたMTBE濃度、及び算出されたMTBE除去速度(a)及び溶存酸素濃度(b)を示すグラフである。バッチ稼働期間(灰色部分)、連続稼働期の開始、及び栄養素添加(N/P、2.5mg/LのK2HPO4.3H20及びKNO3)の開始を示す。
【図１２】M-コンソーシアムを接種したパイロット規模のバイオリアクター(300L)の流入水及び流出水中の、TBA濃度(μg/L)の経時的(日)な進展を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
特に明記しない限り、技術及び科学用語を含む本発明の開示において使用されるすべての用語は、本発明が属する技術分野の技術者によって一般的に理解される意味を有する。更なるガイダンスに、本発明の教示をよりよく理解するために、用語の定義を含む。
【００２３】
本明細書において使用される場合、単数形「a」、「an」、及び「the」は、文脈で特に明確な指示がない限り、単数及び複数の両方の指示対象を含む。
【００２４】
「含むこと(comprising)」、「含む(comprises)」、及び「構成する(comprised of)」という用語は、本明細書において使用される場合、「含む( including)」、「含む(includes)」、又は「含有すること」、「含有する」と同義であり、包括的又は非制限的であり、追加の、非記載の部材、要素、又は方法工程を除外しない。特定の要素又は工程を含むような実施形態に言及がなされた場合、これによって、実施形態はまた、列挙された要素又は工程から本質的になると想定されることを意味する。
【００２５】
端点による数値範囲の列記は、それぞれの範囲内に包含されるすべての数及び分数、並びに記載された端点を含む。
【００２６】
「単離された」という用語は、ある物質の本来の状態においてみられるその物質に通常は付随する化合物を、実質的に又は本質的に含まない物質を指す。例えば、「単離された」という用語は、コンソーシアムが、MTBE、TBA、HIBA、及び/又はHCHOを含む培地又は試料から「単離されている」「分離されている」又は「精製されている」ということを指してもよい。或いは、この用語はまた、コンソーシアムが、本発明のコンソーシアムに存在するがその自然環境に一般的に存在する微生物以外の微生物から単離されているということも指してよい。
【００２７】
「細菌コンソーシアム」は、共通の目的を達成するための共通の活性に関与するという目的をもつ、2種以上の細菌種の共同体である。「MTBE」という用語は、メチルターシャリーブチルエーテル、及びメチルターシャリーブチルエーテル様化合物を指す。「TBA」という用語は、tert-ブチルアルコールを指す。「HCHO」という用語は、ホルムアルデヒドを指す。「HIBA」という用語は、ヒドロキシイソ酪酸を指す。BTEXという用語は、単環芳香族ベンゼン、トルエン、キシレン、及びエチルベンゼンを指す。
【００２８】
第1の態様において、本発明は、メチルターシャリーブチルエーテル(MTBE)分解コンソーシアムである、単離された細菌コンソーシアムを提供する。実際に、MTBE、TBA、HIBA、及び/又はHCHOの分解のための細菌コンソーシアムで使用される場合に、特に興味深い細菌株が同定されている。
【００２９】
より具体的には、細菌株メチリビウム株LD3が、MTBE、TBA、HIBA、及びホルムアルデヒドを効率的に分解できることが明らかにされている。メチリビウム株LD3は、(VITO NV社の社長という立場の)Dirk Fransaerによって、2013年2月28日に、Laboratorium voor Microbiologie、Universiteit Gent (UGent) K.L. Ledeganckstraat 35、B-9000 GentのBelgian co-ordinated collections of Micro-organismsに、LMG P-27480として寄託された。細菌株メチリビウム株LD3は、配列番号1の16S rRNA配列(図2)が存在することを更に特徴とする。メチリビウム株LD3を含むコンソーシアムは、上記のように、MTBEを分解することにおいて非常に有効であることが明らかにされている。
【００３０】
本発明の細菌コンソーシアムのMTBE分解能力は、1つ若しくは複数のTBA分解株、及び/又は1つ若しくは複数のHCHO分解株の存在によって更に改善されることが更に明らかにされている。したがって、本明細書に記載の単離された細菌コンソーシアムは、メチリビウム株LD3に加えて、TBA分解細菌株、より具体的にはハイドロゲノファーガ種からの株、最も具体的にはハイドロゲノファーガ株ハイドロゲノファーガLD1を更に含んでもよい。この最後の株は、(VITO NV社の社長という立場の)Dirk Fransaerによって、2013年2月28日に、Laboratorium voor Microbiologie、Universiteit Gent (UGent) K.L. Ledeganckstraat 35、B-9000 GentのBelgian co-ordinated collections of Micro-organismsに、LMG P-27479として寄託された。細菌株ハイドロゲノファーガLD1は、配列番号2の16S rRNA配列(図3)が存在することを更に特徴とする。
【００３１】
同様に、本明細書に記載の単離された細菌コンソーシアムは、メチリビウム株LD3に加えて、HCHO分解細菌株、より具体的にはマイコバクテリウム種からの株、最も具体的にはマイコバクテリウムLD6を更に含んでもよい。株マイコバクテリウムLD6は、(VITO NV社の社長という立場の)Dirk Fransaerによって、2013年3月29日に、Laboratorium voor Microbiologie、Universiteit Gent (UGent) K.L. Ledeganckstraat 35、B-9000 GentのBelgian co-ordinated collections of Micro-organismsに、LMG P-27480として寄託された。細菌株マイコバクテリウムLD6は、配列番号3の16S rRNA配列(図4)が存在することを更に特徴とする。
【００３２】
本発明のコンソーシアムは、メチリビウムLD3以外の生物、すなわちハイドロゲノファーガLD1及び/又はマイコバクテリウムLD6を更に含んでもよい。実際に、MTBE分解の効率を更に向上させるために、且つ/又は他の汚染産物の補完的な分解を得るために、本発明のコンソーシアム中に他の株を存在させうることが想定されうる。これは、例えば、混合廃水流の処理において利益となりうる。したがって、特定の実施形態において、本明細書に記載のコンソーシアムは、所与の汚染物質又はそれらの分解中間生成物に対する異なる特異性を有する生物を含んでもよい。例えば、コンソーシアムは、本発明のMTBE、TBA、HIBA、及び/若しくはHCHOを分解するメチリビウム属の種、並びに/又はTBAを分解するハイドロゲノファーガ属の種以外のプロテオバクテリアを含んでもよい。それらの例としては、サーモモナス属(Thermomonas)の種、ラルストニア属(Ralstonia)の種、ハイフォミクロビウム属(Hyphomycrobium)の種、シュードモナス属(Pseudomonas)の種、及びスフィンゴモナス属(Sphingomas)の種が挙げられるが、それだけに限定されない。
【００３３】
追加的に又は別法として、本発明の細菌コンソーシアムは、MTBE、TBA、及び/又はHCHOの分解において有用であることが示されている他の株を含んでもよい。それらの例としては、細菌、例えばメチリビウム・ペトロレイフィルム(Methylibium petroleiphilum)PM1、メチリビウム属の一種UC1、メチリビウム属の一種R8、マイコバクテリウム・アウストロアフリカヌム(Mycobacterium austroafricanum)IFP2012、マイコバクテリウム・アウストロアフリカヌムIFP2015、マイコバクテリウム属の一種UC3、アクインコラ・テルチアリカルボニス(Aquincola tertiaricarbonis)L108、ハイドロゲノファーガ・フラバ(Hydrogenophaga flava)ENV735、ロドコッカス・ルーバー(Rhodococcus ruber)I-1889、ロドコッカス・アエセリヴォランス(Rhodococcus aetherivorans)10bc312、バリオボラックス・パラドクサス(Variovorax paradoxus)CL-8、及びCIP I-2052株等が挙げられるが、それだけに限定されない。
【００３４】
追加的に又は別法として、本発明のコンソーシアムは、増殖成分、化学的添加剤、担体材料、及び/又は防腐剤を更に含んでもよい。M-コンソーシアムは、MTBE含有(すなわち10mg/ml)の標準無機培地(WXP培地)中で規定通り培養される。したがって、増殖成分の例としては、炭素源等、WXP培地中に存在する又は添加される成分が挙げられる。防腐剤の更なる一例としてはグリセロールが挙げられるが、それだけに限定されない。担体の例としては、膨張性クレイ、バイオチップ、ココナッツ殻、ガラスビーズ、ポリスチロール顆粒、スポンジ等が挙げられるが、それだけに限定されない。
【００３５】
上記に詳述したように、本発明の細菌コンソーシアムが、具体的にはMTBEの分解において、より具体的には汚染された培地中のMTBE、TBA、HIBA、及びHCHOの分解において有効であることが明らかとなった。MTBE、TBA、HIBA、及びHCHOの存在は、当業者に既知である技術を用いて測定することができる。使用可能と思われる方法を、本出願において開示する実施例の中で説明する。具体的な分解速度を算出するために、様々な方法を用いることができる。分解速度は、nmol MTBE/日/細胞として表してもよいが、本出願においては、mg MTBE/g DW(乾燥質量)時、及びmg MTBE/L時を使用するのが好ましい。特定の実施形態において、本発明の細菌コンソーシアムは、10〜64mg MTBE/g DW(乾燥質量)時の間のMTBE分解速度でMTBEを分解すること、及び/又は30から80mg TBA/g DW(乾燥質量)時の間のTBA分解速度でTBAを分解することができる。
【００３６】
MTBE分解速度に加えて、本発明の細菌コンソーシアムは更に、増殖速度、バイオマス収量、及び一過性のTBA蓄積によって特徴付けしてもよい。分解の速度論は、増殖速度及びMTBE分解速度によって決定する。本発明の特定の実施形態において、細菌コンソーシアムは、関連するバイオマスの生産を伴って、MTBE、TBA、HIBA、及びBTEXを、MTBE/TBAの>120mg/L、BTEXの80mg/Lの開始濃度で分解し、MTBE、TBA、及びBTEXを、ガスクロマトグラフィー質量分析(GC-MS)の検出限界未満の濃度まで、すなわち2μg/L MTBE、65μg/L TBA、及び0.5μg/L BTEXまで分解することができる。MTBE分解速度の算出もまた、本出願において開示した実施例の中で例証する。
【００３７】
更なる態様によると、本出願は、MTBE、TBA、及び/又はHCHOで汚染された培地中のメチルターシャリーブチルエーテル(MTBE)、tert-ブチルアルコール(TBA)、及び/又はホルムアルデヒド(HCHO)を分解するための方法を提供する。
【００３８】
特定の実施形態において、MTBE、より具体的にはMTBE、TBA、及び/又はHCHOを分解するための方法は、本明細書に記載の単離された微生物及び/又はコンソーシアムを用いて汚染された培地を処理する工程を含む。
【００３９】
本明細書に想定されるように、処理は、ex situ又はin situで行ってもよい。特定の実施形態において、培地は地下水である。
【００４０】
汚染された培地を、本明細書に記載の単離された細菌及び/又はコンソーシアムと接触させる様々な実際的な方法が想定される。例えば、地下水中のMTBEの生分解は、微生物及び/又はコンソーシアムを接種したバイオリアクター中の地下水をポンプで汲み出し、処理することによって、又は地表下の土壌である汚染された培地に微生物及び/又はコンソーシアムを添加することによって実施されうる。
【００４１】
一般的に、当業者に既知の様々なバイオリアクターが本発明の方法において使用されうる。メンブレンリアクター、標準的な連続撹拌型タンク反応器、及び活性スラッジシステム等の、浮遊増殖型リアクターが使用されうる。別法として、膜固定型反応器、例えば流動床反応器、又は支持体固定型反応器等もまた、必要に応じて使用されうる。別法として、又は補完的に、細菌をバイオバリア、バイオフィルター、及び/又はバイオパイル中に閉じ込めることができる。このようなバイオバリア、バイオフィルター、及びバイオパイルは、当業者によって一般的に使用されて、例えば汚染源と前記汚染の下流にある地下水との間に配置される場合、汚染の拡散を予防する。
【００４２】
現在のところ、ほんの一握りの研究が、MTBEで汚染された地下水を処理するバイオリアクターの開発について述べている。
【００４３】
本発明の単離された微生物及び/又は細菌コンソーシアムは、本発明の方法の中で、MTBE、TBA、及び/又はHCHOで汚染された培地中のメチルターシャリーブチルエーテル(MTBE)、tert-ブチルアルコール(TBA)、及び/又はホルムアルデヒド(HCHO)を分解するために使用される。「分解する」という用語は、MTBE、TBA、及び/又はHCHO汚染の最終濃度が開始濃度と比較して低減することを意味する。特定の実施形態において、分解後は、最終濃度は当局が設定した規制限度に達する又はより低い。汚染物質の最終濃度はもはや検出できないことがより好ましい。地下水中のMTBE及びTBAの濃度は、比較的高いことがある(例えば、830mg/Lを超えるほどのMTBE、及び78mgを超えるほどのTBAが報告されている)。ただし、一般的には、地下水濃度はおよそ0.5〜50mg/Lである。ベルギーを含む一部の国では、地下水中のMTBEに対して規制限度を採用している。地下水に関する介入レベルは、ベルギーでは300μg/L MTBE、ドイツ及びスイスでは200μg/L MTBE、並びにオランダでは9.4μg/L MTBEとすると決められている。ただし、浄化レベルはより低いことが好ましい。したがって、特定の実施形態によると、本明細書に記載の方法は、300μg/L以下まで、より具体的には200μg/L以下まで、最も具体的には100μg/L未満まで低減するようなMTBEの分解を含む。特定の実施形態において、本明細書に記載の方法は、確実に浄化レベルを100μg/L MTBEまでにする。
【００４４】
TBAは、MTBE分解の安定した中間生成物であり、MTBE汚染に付随して、すなわち4.10〜4から78mg/Lの様々な濃度でみられることが多い。ベルギーでは、地下水では660μg/Lより低いレベルが推奨されている。BTEX化合物(ベンゼン、トルエン、エチルベンゼン、及びキシレン)は、MTBE汚染地下水中の周知の共汚染物である。BTEXは、ガソリン中に約18% v/vで存在し、欧州の地下水には0.2〜147mg/Lの濃度で存在することが報告されている。したがって、特定の実施形態において、本発明の方法は、TBAを700μg/L未満まで低減する分解を保証する。
【００４５】
発明者等は、本発明の微生物及び/又はコンソーシアムが、in situバイオオーグメンテーションに典型的な境界条件(低温及び低溶存酸素濃度)、並びにex situバイオレメディエーションのためのバイオリアクター条件(室温、中性pH、高溶存酸素濃度、及び低栄養素濃度)を含む、幅広い境界条件においてMTBE及びTBAの生分解に適用されることを明らかにした。発明者等は、MTBE(5mg/L MTBE)を含むMTBE汚染地下水をポンプで汲み出して処理するためにパイロット規模のバイオリアクターを使用する場合、地下水中で100μg/L MTBEの再浸透限界未満までMTBEを除去するのに十分な最短水理学的滞留時間は1.6時間であることを明らかにした。より低いMTBE濃度(<1mg/L)では、100μg/L MTBEの排出限度未満まで効率的に除去でき、この場合、水理学的滞留時間を1時間まで低減できることも実証した。更に、TBA(6mg/L)では、検出限界未満まで効率的に除去できたことを実証した。
【００４６】
本発明の方法において、使用する単離された微生物及び/又はコンソーシアムの細胞の密度は様々であってもよい。特定の実施形態において、102から108CFU/mlの間、より好ましくは105から107CFU/mlの間の細胞数を有するコンソーシアムが添加される。帯水層マトリックスでは、使用する単離された微生物及び/又はコンソーシアムは、106CFU/g帯水層であることが好ましいが、より少ない接種物でも分解を開始することができる。バイオリアクターの適用では、使用する単離された微生物及び/又はコンソーシアムは、好ましくは103から108CFU/g担体材料の間であることを想定する。
【００４７】
特定の実施形態において、MTBE、TBA、及び/又はHCHOの分解のための本発明の方法は、汚染された培地を本明細書に記載のようなコンソーシアムと接触させることによって実施される。より具体的には、コンソーシアムは、メチリビウムLD3、ハイドロゲノファーガLD1、及びマイコバクテリウムLD6を含む。コンソーシアム中のこれらの株の相対濃度は様々であってもよい。特定の実施形態において、汚染された培地の処理に使用されるコンソーシアム中のメチリビウムLD3、ハイドロゲノファーガLD1、及び/又はマイコバクテリウムLD6の絶対濃度は、それぞれ、1ml当たり104〜108コピー、106〜109コピー/ml、及び102〜106コピー/mlの間である。本発明のコンソーシアムの特定の実施形態において、メチリビウムLD3、ハイドロゲノファーガLD1、及びマイコバクテリウムLD6は、1〜60/40〜99/0.005〜10(%/%/%)の間の相対存在度で、より具体的には1〜55/45〜99/0.005〜2の間、例えば4.5/95.5/0.03、51.3/48.7/0.005、47.6/52.4/0.008、2.1/97.9/0.006、7.3/92.6/0.02、36.3/63.6/0.07、1.3/98.4/0.3、及び13.9/86/0.02等の相対存在度で、又は特定の実施形態において、それぞれ18〜25%、72〜78%、及び1〜2%の間の相対存在度で存在する。特定の実施形態によると、MTBE、TBA、HIBA、及び/又はHCHOの分解のための方法は、MTBE、TBA、HIBA、及び/又はHCHOの分解を判定することを更に含む。したがって、本発明の方法の特定の実施形態において、培地中のMTBE、TBA、HIBA、及び/又はHCHOの濃度、及び/又は培地中のMTBE、TBA、HIBA、及び/又はHCHOの分解速度が決定される、追加の工程を導入してもよい。MTBE、TBA、HIBA、及び/又はHCHOの濃度を決定するための方法、及び/又はMTBE、TBA、HIBA、及び/又はHCHOの分解速度を計算するための方法は、前述の部分に、また本出願の実施例に記載する。
【００４８】
本明細書に提供された方法は、汚染された培地中のMTBE、TBA、HIBA、及び/又はHCHOの分解に関する。「培地」という用語は、本明細書において使用される場合、土壌、帯水層、スラッジ、堆積物、浚渫土砂、化学廃棄物、及び水等のその他の流体が含まれることを意味するが、それだけに限定されない。「土壌」とは、不等厚の、主に無機成分の層からなる天然物であり、テクスチャー、構造、硬度、色、化学的、生物学的、及びその他の物理的特徴において、親物質とは異なっている。土壌は、間隙で満たされた構造を形成しており、固体、水、及び空気(気体)の混合物と考えられうる。「帯水層」は、水理学的勾配の影響下で地下水が流れている飽和帯由来の土壌物質を指す。「スラッジ」は、工業廃水又は下水処理プロセスから出された残留半固体物質を指す。「スラッジ」はまた、通常の飲料水処理、及び数多くのその他の工業プロセスから得られた安定した懸濁物を指してもよい。「浚渫土砂」は、材料(砂、砂利、土等)を掘り起こす浚渫活動中に洗い流されるか分別される物質である。「化学廃棄物」は、(多くは大工場で産出された)有害化学物質から作られた廃棄物である。本状況において、廃棄物は、エーテル誘導体、具体的にはMTBE、TBA、及び/又はHCHO、で汚染された廃棄物である燃料廃棄物を指してもよい。「流体」は、適用された剪断応力の下で絶えず変形する(流れる)実体である。流体は、物質の相のサブセットであり、液体、気体、プラズマ、及びある程度、プラスチック性固体を含む。本出願によると、流体は、水、具体的には地下水又は飲料水であってもよい。
【００４９】
特定の実施形態において、本発明の方法は、本明細書に記載の単離された細菌株のうちの1つ又は複数の使用を含む。本発明のMTBE、TBA、及び/又はHCHOで汚染された培地中のMTBE、TBA、及び/又はHCHOを分解するための方法のこれらの実施形態において、本発明の株を、同時に、一部逐次に、又は逐次に、汚染された培地へ添加してもよい。本状況において、単離された株を、同じ物理的空間(例えばバイオリアクター)の中で培地と接触させる、又は逐次的に配置したバイオリアクターの中で培地と接触させてもよい。
【００５０】
特定の実施形態において、本発明の方法は、MTBE、TBA、HIBA、及び/又はHCHO以外の他の汚染物質の除去と組み合わせる。これによって、幾つかの実施形態において、本明細書に記載の方法によって保証されるMTBE、TBA、HIBAの除去、及び/又はCHCOの除去の効率が高まりうる。したがって、特定の実施形態において、本発明の方法は、汚染された培地からの鉄の除去と組み合わされる。特定の実施形態において、本発明の方法は、地下水からの鉄の除去と組み合わせて使用される。鉄除去のために、培地を、好ましくは酸化装置及び砂ろ過を含む鉄除去装置を使用して、前処理又は後処理工程において処理してもよい。
【００５１】
また本明細書で想定される更なる態様は、本明細書に記載の細菌株及びコンソーシアムの同定のための方法に関する。これらは、単独で、又は本明細書に記載のMTBE、TBA、HIBA、及び/又はHCHOの分解のための方法と組み合わせて用いてもよい。実際に、特定の実施形態において、本発明の細菌株及び/又はコンソーシアムの存在について細菌培養物をチェックすることは興味深いものでありうる。
【００５２】
一般的には、(複合)混合物又は組成物中に存在する細菌は、多様な分析方法又は技術を使用して同定することができる。例えば、前記同定のための方法は、前記細菌の代謝能力(すなわち、抗生物質耐性、複合発酵等)に基づいてもよいし、それらの発現プロファイル(すなわち、特異的な膜、又は細胞内タンパク質等の発現)に基づいてもよいし、及び/又は特異的な細胞性成分の存在(すなわち、特異的なポリヌクレオチド配列、又は特異的な内部タンパク質等の存在)に基づいていてもよい。
【００５３】
これらの方法はすべて、単独で、又は必要に応じて組み合わせて用いてもよい。この場合、適用される方法に関係なく、参照株を使用してもよい。特定の実施形態において、メチリビウムLD3、ハイドロゲノファーガLD1、及び/又はマイコバクテリウムLD6、又はこれらの株のうちの1つ又は複数を含む本明細書に記載のコンソーシアムの同定ための方法は、参照株又はコンソーシアムとして、LMG P-27480、LMG P-27479、LMG P-27498、及び/又はLMG P-27478若しくはLMG P-27909として寄託された株の使用を含んでもよい。例えば、本明細書に記載のような細菌を、唯一の炭素源としてMTBE、TBA、及び/又はHCHOを含有する選択培地を使用して同定してもよい。追加的に又は別法として、特異的抗体を使用して特異的な膜タンパク質の存在を可視化することができる。加えて、細菌は、例えばPAGEを使用するタンパク質フィンガープリント法によって同定することができる。他の別法は、ハイブリダイゼーション、増幅、及び/又は配列決定技術を使用するポリヌクレオチド分析であってもよい。適用する方法に関係なく、当業者は、分析する試料の種類及び量に対して検出手段を適合させることができる。
【００５４】
本発明によると、本明細書で使用される細菌株はまた、16S rRNA遺伝子PCR-変性剤濃度勾配ゲル電気泳動(PCR-DGGE)を使用して同定してもよい。追加的に又は別法として、蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)を、おそらくPCR-DGGEと組み合わせて適用してもよい。更に、FISHは、混合細菌培養物中の特定の細菌細胞の速やかな検出及び相対存在度の決定を可能にし、MTBE分解種間の相互作用を調べるのに使用できる。特定の実施形態において、メチリビウムLD3株、ハイドロゲノファーガLD1、及び/又はマイコバクテリウムLD6の同定ための方法は、株特異的16S rRNA配列の同定を含む。
【００５５】
したがって、本発明は更に、試料中のメチリビウムLD3、ハイドロゲノファーガLD1、及び/又はマイコバクテリウムLD6微生物の存在を検出するための方法であって、それぞれ前記試料中の配列番号1、配列番号2、又は配列番号3に対応する配列の存在を同定する工程を含む、方法に関する。「試料」という用語は、本明細書において使用される場合、標本、又は少量の調査物質、すなわち少量のMTBE、TBA、及び/又はHCHOでおそらく汚染されている培地を指す。上記で指摘したように、配列番号1、配列番号2、及び/又は配列番号3に対応する配列を同定するために、16S rRNA特異的プライマーを使用し、PCR-DGGE分析を実施して、試料中に存在する細菌の16S rRNA配列を増幅させてもよい。このようにして、得られた16S rRNA遺伝子DGGEフィンガープリント又はシグネチャーは、試料中に存在する細菌を同定するために使用されうる、16S rRNA遺伝子プロファイルの主要バンドを指し示すことができる。これによって、1つの単離物又は幾つかの単離物を同定することができる。別法として、又は上記の工程と組み合わせて、細菌の16S rRNA配列をクローニング及び/又は配列決定して、それらのポリヌクレオチド組成を決定してもよい。得られたポリヌクレオチド配列は、細菌を同定するため、また、おそらくそれらの系統発生学的関係を分析するために、アラインメント研究において使用されうる。配列比較のために、典型的には、1つの配列が、試験配列が比較される参照配列として働く。配列アラインメントの方法は、当技術分野では周知である。好ましくは、核酸配列比較には、BLASTアルゴリズムを使用する。BLASTアルゴリズムを使用して、配列同一性及び配列類似性を決定してもよく、使用できるアルゴリズムの例は、Altschul等(1990) J.Mol. Biol. 215:403〜410頁に記載されている。BLAST分析実行用ソフトウェアは、National Center for Biotechnology Information(www.ncbi.nlm.nih.gov/)より公的に利用可能である。ARBを使用して、手作業によるアラインメントの点検及び補正、また系統発生学的分析を実施してもよい(Ludwig等、2004年、Nucleic Acids Research 32(4):1363〜1371頁)。配列番号1、配列番号2、及び/又は配列番号3で表された16S rRNA配列と公的データベースにある16S rRNA配列との多重配列アラインメントの分析によって、広範な又は限られた細菌種の品種の16S rRNA遺伝子のセグメントを増幅すること(又はハイブリダイズすること)ができるオリゴヌクレオチドプライマー(及びプローブ)の設計が可能になる。
【００５６】
具体的には、本出願によると、試料中のメチリビウムLD3、ハイドロゲノファーガLD1、及び/又はマイコバクテリウムLD6微生物の存在を検出するための本発明の方法は、前記試料を配列番号1、配列番号2、又は配列番号3に特異的にハイブリダイズできるプライマー又はプローブと接触させる工程、又は配列番号1、配列番号2、又は配列番号3に特異的な配列を増幅する工程、及び試料中のメチリビウムLD3、ハイドロゲノファーガLD1、及び/又はマイコバクテリウムLD6の存在を示すハイブリダイゼーションシグナル又は増幅産物の存在を決定する工程を含んでもよい。DNA抽出、ハイブリダイゼーション、増幅、配列決定、及び配列比較を実施する方法は、当業者に周知であり、特定の条件によって容易に改変できる。使用するプローブ又はプライマーは、放射標識されていても、蛍光性でも、又は酵素に結合されていてもよい。
【００５７】
好ましくは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、プローブ及び/又はプライマーを本発明の株に存在するポリヌクレオチドにハイブリダイゼーションさせる。具体的には、ストリンジェントな条件下で、プローブ又はプライマーを配列番号1、配列番号2、又は配列番号3によって表された配列にハイブリダイゼーションさせる。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、約65℃で、例えば6×SSC、0.5%SDS、5×デンハルト溶液、及び100μg/ml変性非特異的DNAの溶液、又は任意のその他の等しいイオン強度の溶液中で、また、65℃で洗浄工程を実施した後に、例えば最大0.2×SSC及び0.1%SDSの溶液、又は等しいイオン強度の溶液中で、2つの一本鎖DNA分子の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件と定義してもよい。ただし、ハイブリダイズする配列のサイズ、そのGC含量、及び例えば、Sambrook等、2001年(Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第3版、laboratory press、Cold Spring Harbor、N.Y.)によって記載されているプロトコールに従った、任意のその他のパラメーターに応じて、ストリンジェントな条件は当業者が改変してもよい。プローブ及び/又はプライマーは、10ヌクレオチドより長い、好ましくは20ヌクレオチドより長い、更により好ましくは50ヌクレオチドより長い「ヌクレオチド断片」であってもよい。プライマー及び/又はプローブの配列は、配列番号1、配列番号2、又は配列番号3で表された配列であるか、又は配列番号1、配列番号2、又は配列番号3で表された配列に完全に相補的である。
【００５８】
本発明は、配列番号1、配列番号2、又は配列番号3で表された配列を含む又はからなる単離されたポリヌクレオチド配列に更に関する。ヌクレオチド配列に言及するこの文脈で使用される「単離された」又は「精製された」という用語は、その自然環境においては通常存在するその他の化合物、これだけに限定されないが例えば他のDNA配列等を、実質的に又は本質的に含まない物質を指す。ポリヌクレオチドの純度は、典型的にはポリアクリルアミドゲル電気泳動等の分析技術を使用して決定される。「単離された」又は「精製された」という用語は、ある核酸配列が電気泳動ゲル中に1本のバンドを生じることを意味する。具体的には、核酸が、少なくとも85%の純度、より好ましくは少なくとも95%の純度、最も好ましくは少なくとも99%の純度であることを意味する。「核酸」又は「ポリヌクレオチド」という用語は、一本鎖又は二本鎖型いずれかの、デオキシリボヌクレオシド又はリボヌクレオシド、及びそれらの重合体を指す。この用語は、既知の類似体、又は修飾された骨格残基若しくは結合を含有する核酸を包含する。このような類似体の例としては、ホスホロチオエート、ホスホロアミド酸、メチルホスホン酸、キラル-メチルホスホン酸、2-O-メチルリボヌクレオチド、ペプチド-核酸(PNA)含まれるが、これらに限定しない。特定の核酸配列はまた、その保存的に改変されたバリアント(例えば縮重コドン置換)、及び相補的配列、並びに明確に指定した配列を包含してもよい。上記のような特定の実施形態において、単離された核酸は、本明細書に記載の細菌株の検出での使用に好適である。
【００５９】
加えて、本発明は、試料中のメチリビウムLD3、ハイドロゲノファーガLD1、及び/若しくはマイコバクテリウムLD6株、又は前記株のうちの1つ又は複数を含むコンソーシアムの存在を検出し、同定するためのキットに関する。特定の実施形態において、本発明によるキットは、配列番号1、配列番号2、及び/又は配列番号3に特異的にハイブリダイゼーションすることができるか、配列番号1、配列番号2、及び/又は配列番号3に特異的な配列を増幅するかの、1つ又は複数のプライマーペア又はプローブを含む。本発明はまた、本発明の細菌の培地又は試料中の存在を同定するための、また、必要に応じて、このような微生物を単離するための、コンソーシアムに特異的なプローブ及び/又はプライマー、方法、並びにバイオセンサーに関する。
【００６０】
また更なる態様において、本発明は、MTBE、TBA、及び/又はHCHOの分解において有用な単離された細菌株を提供する。
【００６１】
したがって、本発明はまた、LMG P-27480として寄託された株メチリビウムLD3に対応する、単離されたメチルターシャリーブチルエーテル(MTBE)分解メチリビウム株に関する。この株は、配列番号1の16S rRNA配列の存在を特徴とする。
【００６２】
本発明は更に、配列番号2の16S rRNA配列の存在を特徴とする、LMG P-27479として寄託された株ハイドロゲノファーガLD1に対応する、単離されたTBA分解株を提供する。
【００６３】
本発明は更に、配列番号3の16S rRNA配列の存在を特徴とする、LMG P-27498として寄託された単離されたHCHO分解株マイコバクテリウムLD6を提供する。
【００６４】
本発明による単離された株は、異種のポリヌクレオチド配列を含むように更に遺伝子改変されてもよい。異種のポリヌクレオチドを含む細菌は、組換え細菌と呼ばれる。「異種の」という用語は、自然の細胞又は微生物ではみられない配列を指す。例えば、組換え細菌は、MTBE、TBA、HCHO、又はその他の(エーテル)燃料汚染物質の分解に寄与する(又は増進させる)異種の配列を含んでもよい。特定の実施形態において、異種のDNA配列は、プロモーター制御下の遺伝子を含む。追加的に又は別法として、本発明による組換え細菌は、レポーター遺伝子、耐性遺伝子、及び/又は感受性遺伝子を含んでもよい。レポーター及び/又は耐性遺伝子は、株の検出に使用されうる。例えば、異種遺伝子は、培地に添加した場合、本発明の株の同定に役立ちうる。好適なレポーター遺伝子には、当技術分野で既知の任意のレポータータンパク質、例えばルシフェラーゼ等の生物発光タンパク質、又はペルオキシダーゼ若しくはベータ-ガラクトシダーゼ等の酵素が含まれる。このようなレポーター遺伝子の発現を明らかにする手段は、当業者には既知である。追加的に又は別法として、感受性遺伝子は、環境における組換え細菌の制御不能の拡散を防止するために、例えば感受性遺伝子を保有する細菌を選択的に殺すこととなる生成物を添加することによって使用してもよい。
【００６５】
ここで、本発明を下記の非限定的な例により更に例証する。
【実施例】
【００６６】
(実施例1)
M-コンソーシアムのMTBE分解特性の安定性
M-コンソーシアムは、純酸素及びMTBEを定期的に供給し、新鮮な無機培地(WXP、pH7.1)へ随時、移入することによって、土壌試料から富化した。標準WXP培地(pH7.1)は、8.8g/L Na2HPO4.2H20、3g/L KH2PO4、1g/L (NH4)2S04、0.2g/L MgCl2.6H20、0.1g/L Ca(NO3)2.4H20、4mg/L Na-EDTA、1.5mg/L FeCl2、50μg/L MnCl2.4H20、20μg/L CoCl2.6H20、15μg/L NaMoO4.2H20、10μg/L ZnCl2、KBr及びKI、5μg/L CuSO4及びH3BO3、並びに2.5μg/L LiCl、SnCl2.2H20及びBaCl2を含有した。
【００６７】
M-コンソーシアム培養物のMTBE-分解能力の安定性は、土壌を含まない培養物5mlを、120mlのWXP培地、1.3gの酵母エキス(0.1%)、及び8μgのMTBEを含有する滅菌250mlバイアルに移入することによって評価した。このフラスコをブチルゴム栓で密封し、回転台(100rpm)上でインキュベートした。インキュベーション条件は、pH7.1、溶存酸素10mg/L、及び30℃であった。この培養物に8μgのMTBEを、10μLハミルトンガラス製シリンジ(Hamilton社、Bonaduz、Switzerland)を使用してバイアルのブチルゴム栓を通して定期的に注入した。純酸素(10〜30ml)もまた、ブチルゴム栓を通してシリンジによって定期的に添加した。MTBE(50mg/L、HPLCグレード、Sigma-Aldrich社、Bornem、Belgium)及びTBA(分析グレード、Merck社、Darmstadt、Germany)濃度を、DSQ質量分光計(Thermo Electron Corporation社)を取り付け、HP-VOCカラム(長さ30m、内径0.20mm、及び膜厚1.12μm、Agilent technologies社、Diegem、Belgium)及びスプリット/スプリットレス注入を備えたTrace CC Ultraガスクロマトグラフ(Thermo Electron Corporation社、Cambridgeshire、United Kingdom)を使用したCC-MSによって、2g/L NaN3(反応停止用)を供給した試料5mLのヘッドスペース分析を行って測定した。校正は、内標準としてd6-ベンゼン、d10-エチルベンゼン、及びジブチルエーテルを使用して、0〜5000μg/Lの範囲で実施した。検出限界は、2μg/L MTBE、及び65μg/Lであった。pHは、pH電極(Hanna Instruments社、IJsselstein、The Netherlands)を使用して測定し、溶存酸素濃度は、電極(Si Strathkelvin instruments社、Namen、Belgium)を通過する流れを利用して測定した。
【００６８】
図1は、1日目にM-コンソーシアムを接種したフラスコにおけるMTBE濃度の進展を表しており、350日を超える間、MTBEの各注入が、TBAが蓄積することなく完全に分解されたことを示している。酸素濃度は10mg/lから1mg/Lの間を上下したのに対し、pHはpH7.1からpH6.7に軽微に低下した。
【００６９】
M-コンソーシアムは、純酸素及びMTBEを定期的に供給し、新鮮な無機培地(WXP、pH7.1)へ随時、移入することによって、10年を超える間、維持されていた。このM-コンソーシアム保存培養物を、標準無機培地(WXP)0.5Lを満たした、1Lボトルのようなガラス容器中で通常通り増殖させた。このフラスコをブチルゴム栓で密封し、水平回転台(100rpm)上でインキュベートした。インキュベーション条件は、pH7.1、溶存酸素10mg/L、及び20℃であった。この培養物に、40から50mg/LのMTBE、及び純酸素60mLを、バイアルのブチルゴム栓を通して定期的に注入した。
【００７０】
(実施例2)
M-コンソーシアムを用いた分解試験及び速度定数の算出
増殖速度及びバイオマス収量を記録し、時間の関数における微生物群集構造の変化を調べるために、M-コンソーシアムと開始濃度50mg/LのMTBE、TBA、HIBA、又はHCHOとの並行培養を設定した。M-コンソーシアム培養物は、保存液から、50mg/L MTBE、TBA、HIBA、又はHCHOのいずれかを含むWXPを含有した3つ組のバッチフラスコへ移した(実施例1を参照されたい)。MTBEは、TBA及びHCHOへ変換でき、HIBA(2-ヒドロキシイソ酪酸)は、TBAの分解物である。各炭素源について、MTBE、TBA、HIBA、及びHCHO、並びにバイオマス濃度の進展を、基質濃度が検出限界以下になるでまで、時間の関数において測定した。有毒対照(2g/L NaN3)は、全試験条件に含んだ。
【００７１】
MTBE、TBA、pH、及び酸素は、実施例1に記載したように測定した。HIBA(98%、Acros Organics社、Geel、Belgium)は、細胞非含有試料の溶液中で、Alltech OA 1000有機酸カラムとUV-VIS検出器(Hitachi L-4250、Merck社)とを備えたHPLC(1200シリーズ、Alltech Technologies社、Lokeren、Belgium)を使用して、214nmで、17.5mMのKH2PO4及び1N H2S04(pH2.5)を担体として使用して、0.8mL/分で、2mg/Lの検出限界で、測定した。HCHO(37%、約10%メタノール含有、分析グレード、Merck社)は、3回同じ方法で測定した0〜60mg/L HCHO溶液の検量線に基づき、細胞非含有試料中で測定した。検出限界は0.2mg/L HCHOであった。バイオマス濃度は、分光光度計(Amersham Pharmacia Biotech社、Roosendaal、The Netherlands)を用いて660nm波長での吸光度(OD660)として測定した。吸光度は、0.001〜0.5OD660範囲の揮発性浮遊固形物の関数における様々な独立した3つ組のOD660測定値に基づく、1OD660=390.14+/-3.79mg DW/L(R2=0.95)の相関を用いて、バイオマスの乾燥質量(DW)へ変換した。
【００７２】
比のバイオマス増殖速度(1/時)は、時間の関数として、測定されたバイオマス濃度(mg DW/L)の自然対数の線形回帰分析により算出し、これにより、指数関数的な増殖、及び最大の比のバイオマス増殖速度を推定した。バイオマス収量(mg DW/mg炭素源)は、測定されたバイオマス濃度の上昇(mg DW/L)の、測定された炭素源濃度(mg/L)の低下に対する比を用いて決定した。3つ組みの実験の平均値及び95%信頼範囲は、Excelを使用して算出した。
【００７３】
結果:M-コンソーシアムは、炭素及びエネルギーの唯一の供給源としての50mg/L MTBE、TBA、HIBA、及びHCHO上で増殖した(図2及びTable 1(表1))。一過性のTBAの増加がMTBE分解中に測定された。HIBA又はHCHOの蓄積は、MTBE上で増殖させた培養物中では測定されなかった(データは示していない)。M-コンソーシアムは、TBA及びHIBA上では1日に満たないバイオマス倍加時間で増殖したのに対し、MTBE及びHCHO上での増殖はより遅く、約1.5日の倍加時間であった。MTBE及びTBA上でのバイオマス収量がそれぞれ0.5mg DW/mg MTBE及び0.6mg DW/mg TBAであったのに対し、HIBA及びHCHOに対する収量はより低く、すなわち、それぞれ0.28mg DW/mg HIBA及び0.12mg DW/mg HCHOであった(Table 1(表1))。50mg/L HCHOの1回の注入が分解された後は、吸光度の上昇は測定されなった(図2(d))。したがって、HCHO上での増殖速度及びバイオマス収量は、75日中の50mg/L HCHOの7回の注入に対して増殖した富化培養物の増殖に基づいて算出した。
【００７４】
【表１】
2020504998.tif 000003
【００７５】
(実施例3)
MTBE/TBAを分解するM-コンソーシアムにおいて重要な生物の同定
実施例1と並行して、M-コンソーシアムの同じ2つの培養物を、50mg/L MTBE、TBA、HIBA、又はHCHOのいずれかを含む液体WXP中で、75日間増殖させた。培養物の増殖を毎日モニタリングし、試料毎にpH及び溶存酸素濃度を測定した。必要に応じて、溶液中の飽和条件を回復させるために、ヘッドスペース中に純酸素を供給した。培養物は、炭素源又は中間生成物、すなわちMTBE、TBA、HCHO、若しくはHIBAの蓄積を定期的にチェックした。これらの化合物が枯渇した時に、新たな炭素源を添加した。75日後、培養物を細菌株の単離のためにプレーティングし(実施例4を参照されたい)、分子分析に基づく16S rRNA遺伝子分析のために細胞からDNAを抽出した。
【００７６】
DNAを様々なM-コンソーシアム培養物から抽出し、TE緩衝液(10mM This、1mM EDTA、pH8.0、HClを含む)中に溶解した。細菌16S rRNA遺伝子の一部(El-Fantroussi等、1999年、Appl.Env. Microbiol. 65:982〜988頁)を増幅するために、PCR混合液を、10×緩衝液溶液5μL、dNTP溶液4μI、Taqポリメラーゼ(TaKaRa Bio社、Shiga、Japan)0.25μL、0.25μLのプライマー518R、0.5μLのプライマーGC-63F、DNA抽出物1μL、及びPCR水39μLから構成した。PCRはT3 Thermocycler(Biometra社、Goettingen、Germany)中で実施した。まず、PCR産物を1時間のアガロースゲル電気泳動(1.5%(w/v)、85V)によって分析し、0.01%GeIRed(v/v)(VWR社、Leuven、Belgium)で染色し、画像ソフトウェアを備えたデジタルカメラシステム(Image Master VDS & Liscap Image Capture 1.0、Pharmacia Biotech社)を使用して、UV光下で撮影した。次いで、このPCR産物を、Ingeny phorU-2DGGE装置(Ingeny International社、Goes、The Netherlands)を使用して、Muyzer等(1993年、Appl. Environ. Microbiol. 59:695〜700頁)によって記載されているように、35%から65%の変性剤濃度勾配の1×Tris-酢酸-EDTA緩衝液中8%ポリアクリルアミドゲル(BioRad社、Nazareth、Belgium)を使用して、DGGEによって分析した。ゲルは、60℃、120Vで15時間泳動し、0.01%GelRed(v/v)(VWR社、Leuven、Belgium)で染色し、上記のように撮影した。
【００７７】
16S rRNA遺伝子は、Lane(1991年、Nucleic Acids techniques in Bacterial Systematics、115〜147頁、John Wiley&Sons出版、Chichester)による特異的プライマーを使用して増幅させ、クローニングした。この16S rRNA遺伝子断片を、製造業者(Invitrogen社、Carlsbad、USA)の使用説明書に従ってTOPO TAクローニングキットを使用して、pCR2.1-TOPO  ベクターへクローニングした。単一コロニーの挿入をプライマーM13F/M13R(Invitrogen社)を使用して分析した後、プライマーGC63F/518Rを使用して、部分的な細菌16S rRNA遺伝子のフィンガープリントのPCR-DGGE分析を行った。
プラスミドDNAは、製造業者(Qiagen社、Venlo、The Netherlands)の使用説明書に従ってQiagen Plasmid Midiキットを使用して、選択したクローンから抽出した。配列決定は、BCCM/LMG Bacteria Collection(27〜1492配列、Ghent、Belgium)によって、又はVIB Genetic Service Facility(部分配列、Wilrijk、Belgium)によって行った。M-コンソーシアムから検索した16S rRNA遺伝子配列とGenBankヌクレオチド配列データベースから検索した16S rRNA遺伝子配列との比較は、BLASTを使用して実施した。コンソーシアムのほぼ全長の16S rRNA遺伝子配列及び最も近傍のアラインメントには、ARB-silvaを使用した。アラインメントの手作業による点検及び補正、並びに系統発生学的分析は、ARBを使用して実施した。
【００７８】
結果:単離された16S rRNA遺伝子のクローニング及び配列決定を用いて、M-コンソーシアム中に存在する16S rRNA遺伝子プールを分析した。これは、MTBE上で増殖させた培養物では2年間にわたって4回実施したのに対し、TBA、HIBA、及びHCHO上での培養物では、これは1回実施した。異なるDGGEプロファイルを示す7つの異なる16S rRNA遺伝子配列(<80%配列類似性)が、MTBE、TBA、HIBA、又はHCHOいずれかの上で増殖させた培養物から回収された。
【００７９】
全部で64個のクローンが、MTBE上で増殖する培養物から回収された。これらのクローンのうち、52個は、MTBE上で増殖させた培養物のDGGE群集プロファイルに記録された主要バンドF/G/Hに対応するバンド1本を有する16S rRNA遺伝子プロファイルを示した。これらのクローンのうちの5個を配列決定した。5つの配列はすべて同一であり、ハイドロゲノファーガ属に属する細菌、すなわちハイドロゲノファーガ属の一種Rs71の16S rRNA遺伝子配列と最も高い類似性を示した。この配列を表すクローンをクローンMTBE1と呼んだ。
【００８０】
クローンMTBE2と表された16S rRNA配列は、未発表の未培養の細菌(GenBank受託番号EF664640、未発表)の16S rRNA遺伝子配列に最も高い類似性を示した。クローンMTBE3から回収された16S rRNA配列は、サーモモナス属の一種ROi19の16S rRNA遺伝子配列に類似の16S rRNA遺伝子配列を有した。クローンMTBE2及びMTRE3は、みたところ、MTBE上で増殖させた培養物の群集DGGEプロファイルの主要バンドではないようであった。
【００８１】
TBA上で増殖させた培養物からは、18個のクローンが回収された。これらのクローンはすべて、MTBE上で増殖させた培養物由来のクローンMTBE1と同じDGGEプロファイルを示し、配列決定をした2つのクローンは、同一の16S rRNA遺伝子配列を有した。これらの配列を表すクローンをクローンTBA1と呼んだ。
【００８２】
2つのクローン(HIBA1及びHIBA2)の細菌16S rRNA遺伝子配列は、互いにほぼ同一で(99%)、ラルストニア属に属する細菌、すなわちラルストニア属の一種K401の16S rRNA遺伝子配列に最も高い類似性を示した。
【００８３】
HCHO上で増殖させた培養物からは、クローンHCHO1、HCHO2、HCHO3、及びHCHO4によって表される4つの配列が回収された。クローンHCHO3及びHCHO4は、それぞれ、HIBA上で増殖させた培養物から回収されたクローンHIBA1及びクローンHIBA2に同一であった。クローンHCHO1及びクローンHCHO2はどちらも、部分的な16S rRNA遺伝子配列に基づく、未発表のα-プロテオバクテリアに関連していた(Table 2(表2))。
【００８４】
(実施例4)
M-コンソーシアムからの純粋な細菌株の単離
2つの手法を用いて、コンソーシアムから純粋な細菌株を単離した。一方で、実施例3に記載したように、50mg/L MTBE、TBA、HIBA、又はHCHOいずれかの上で、75日間、富化させたM-コンソーシアムを段階希釈したR2A培地(15g/L寒天)上へプレーティングした。R2A培地(pH7.0)は、0.5g/Lプロテアーゼペプトン、酵母エキス、カゼイン加水分解物、D+グルコース及びデンプン、0.3g/Lピルビン酸ナトリウム及びK2HPO4、並びに0.1g/L MgSO4.7H2Oを含有した。寒天プレートは、コロニーを採取し分析する前に少なくとも21日間、20℃でインキュベートした。他方、飽和MTBE若しくはTBA雰囲気を用いて、又は50mg/L TBA、HCHO、若しくはHIBAの寒天中濃度で、唯一の炭素源としてMTBE、TBA、HCHO、又はHIBAを含有するWXP無機培地寒天プレート上にM-コンソーシアムをプレーティングし、プレートを29℃で少なくとも48日間インキュベートすることによって単離物を得た。単一コロニーを採取し、R2A培地上に移すことによって精製した。16S rRNA遺伝子フィンガープリントは、実施例3に記載したように、PCR-DGGEで決定した。単離物は、10-2M MgSO4中で4℃で保管して、グリセロール(15%v/v)及び0.85%(w/v)NaCl中で-20℃で保管した。これらは、使用前に、R2Aプレート上で、純度と正しいPCR-DGGEプロファイルとをチェックした。純粋培養物のDNA中に存在するゲノムの反復配列を標的とするプライマーを用いるPCRを使用して、細菌ゲノムのフィンガープリントを得た。使用したプライマーは、Versalovic等(1991年、Nucl. Acids Res. 19:6823〜6831頁)、及びVersalovic等(1994年、Meth. Mol. Cell. Biol. 5:25〜40頁)による、BOX A1R、REP2、及びREP1R、又はERIC2及びERIC-1Rであった。PCR産物を、180Vで4時間、1%(w/v)アガロースゲルで分析し、前述のように撮影した。
【００８５】
MTBE上で増殖させたM-コンソーシアムのR2Aプレート上へのプレーティングによって、4つの単離物(LD1、LD4、LD5、及びLD7)が得られた。単離物LD1及び単離物LD4は、R2A寒天プレート上でそれぞれ明黄色及び暗黄色のコロニーを形成した。単離物LD5は、周縁部及び中心が特徴的な赤色である明るい白色コロニーを形成した。単離物LD7は、R2A培地上で明るい白色コロニーを形成した。単離物LD2及びLD3は、48日間MTBE及びTBA雰囲気下でインキュベートしたWXPプレートを使用して、MTBE上で増殖させた培養物から単離されたが、炭素源のないWXPプレートからも採取された。これらの株は、MTBE有り無し両方のWXP寒天プレート、及びR2Aプレートでゆっくりと増殖し、すべてのプレート上で白色(LD2)及び黄色(LD3)コロニーを形成した。単離物LD6は、50mg/L HCHOを含有するWXPプレート上で単離された。この細菌は、MTBE、TBA、又はHIBAを含有するWXPプレート上では存在しなかった。単離物LD6は、R2A上では周縁部が不均整な白色コロニーを形成した。MTBE上で増殖させた培養物から単離されたこれらの細胞株の他には、R2Aプレート及びWXP寒天プレートを用いてTBA、HIBA、又はHCHO上で増殖させた培養物から単離できた細菌株はなかった。単離物LD4はMTBE上で増殖させた培養物中でのみ認められ、HCHO上で増殖させた培養物は単離物LD2及びLD6のみ含有していた。
【００８６】
試験中、時間の関数において、プレーティングに基づくM-コンソーシアムの細菌種の組成を変更した。初めのうちは、単離物LD4及びLD5がMTBE培養物から増殖させたプレートを占め、比較的低い程度で単離物LD7及びLD1が認められた。試験の終了時(2年後)には、単離物LD3及びLD1がM-コンソーシアム中で選択的に富化されており、R2Aプレート上で最も多数認められた。
【００８７】
DNAを、液体R2A中で一晩-増殖させた単離物の培養物の沈渣から抽出し、実施例3に記載したように処理した。単離物から増幅させた16S rRNA遺伝子の配列決定から、単離物LD1及びLD5は、群集16S rRNA遺伝子プールの中で、それぞれ、以前にMTBE及びTBA上で増殖させた培養物から得られたクローンMTBE1及びMTBE3によって表される単離物であることがわかった。個々のクローン及び単離物の同一の16S rRNA遺伝子は、同一の16S rRNA遺伝子DGGEプロファイルによって確認した(データは示していない)。ほぼ全長の16S rRNA遺伝子配列に基づき、単離物LD1及びLD5は、それぞれハイドロゲノファーガ種及びサーモモナス種と同定された。単離物LD7の16S rRNA遺伝子は配列決定しなかったが、細菌16S rRNA遺伝子PCR-DGGEプロファイリングによって、単離物LD7はクローンHIBA1及びHIBA2と関連付けることができた(データは示していない)。ラルストニア属の種のゲノムが4つのrRNA遺伝子コピーを含有するという情報は、単離物LD7はラルストニア属の株であるという仮説を支持する。単離物LD4の16S rRNA遺伝子配列は決定しなかった。メチリビウム属の一種LD3のBOX、ERIC、及びREPゲノムフィンガープリントを、MTBE及びTBAを分解するPM1について作製したこれらのゲノムフィンガープリントと比較した(データは示していない)。これらの結果から、これらの株は異なるゲノムプロファイルを有すること、したがって単離物メチリビウム属の一種LD3とM.ペトロレイフィルムPM1とは、メチリビウム属の異なる細菌株であることが示された。
【００８８】
メチリビウム属の一種LD3、ハイドロゲノファーガ属の一種LD1、及びマイコバクテリウム属の一種LD6の16S rRNA遺伝子の配列は、それぞれ図3〜図5に示す。
【００８９】
寄託:メチリビウムLD3、ハイドロゲノファーガLD1、及び/又はマイコバクテリウムLD6株は、VITOの代表であるDirk Fransaerによって、2013年2月28日及び3月29日(LD6について)に、Belgian Co-ordinated Collections of Micro-organisms (BCCM/LMG) Department of Molecular Biology、Ghent University、K.L.Ledeganckstraat 35、9000 Gent、Belgiumによるブタペスト条約の下の寄託として寄託され、それぞれ寄託番号LMG P-27480、LMG P-27479、及びLMG P-27498が付与された。M-コンソーシアムは、2013年10月3日に、VITOの代表であるDirk Fransaerによって、Belgian Co-ordinated Collections of Micro-organisms (BCCM/LMG) Department of Molecular Biology、Ghent University、K.L.Ledeganckstraat 35、9000 Gent、Belgiumによるブタペスト条約の下の寄託として寄託され、寄託番号LMG P-27909とされた。
【００９０】
(実施例5)
M-コンソーシアムから単離された純粋培養物の分解能力
ラルストニア属の一種LD7以外のすべての得られた単離物について、無機培地中での50mg/L MTBE、TBA、HIBA、及び20又は50mg/L HCHOの分解による増殖を評価した。単離物を液体R2A上で増殖させ、10-2MgSO4で2回洗浄し、コンソーシアムに関する上記のように(実施例2)、1Lボトル中で、50mg/L MTBE、50mg/L TBA、50mg/L HIBA、及び20又は50mg/L HCHOの分解を試験した。
【００９１】
単離されたメチリビウム属の一種LD3は、50mg/L MTBE(図6a)、TBA(図6b)、及びHIBA上、及び20mg/L HCHOを分解し、その上で増殖したが、50mg/L HCHO上ではしなかった。ハイドロゲノファーガ属の一種LD1は、50mg/L TBA(図6c)及びHIBA上で、また20mg/L HCHOを分解し、その上で増殖したが、50mg/L MTBE又はHCHO上ではしなかった。マイコバクテリウム属の一種LD6は、20から80mg/L HCHO(図6d)を分解し、その上で増殖したが、MTBE、TBA、又はHIBA上ではしなかった。ただし、メチリビウム属の一種LD3は、約0.12の吸光度で、MTBE分解中の増殖を止めた。この培養物中のTBA濃度が、全実験期間を通して0.06mg/Lの検出限界未満にとどまっていたのに対し、HCHO濃度は、実験終了時には0.42mg/Lまで軽微に増加していた。その他の単離物は、どの被験化合物上でも増殖しなかったか、又はどの被験化合物も分解しなかった。ハイドロゲノファーガ属の一種LD1及びマイコバクテリウム属の一種LD6は、0.01%(w/v)酵母エキス(YE)を混合した50mg/L MTBEとのインキュベーションによるMTBEの共代謝分解を、又はハイドロゲノファーガ属の一種LD1は50mg/L TBAを混合した50mg/L MTBE、若しくはマイコバクテリウム属の一種LD6は50mg/L HCHOを混合した50mg/L MTBEとのインキュベーションによるMTBEの共代謝分解を追加的に試験した。培養物はMTBEを分解しなかったのに対し、酵母エキス、並びにTBA及びHCHOの各炭素源は迅速に除去された。
【００９２】
(実施例6)
M-コンソーシアム中の主要単離物の相対存在量
図3〜図5に表した16S rRNA遺伝子配列に基づき、特異的なqPCRプライマーを開発し、これを使用して、M-コンソーシアム培養物中のメチリビウム属の一種LD3、ハイドロゲノファーガ属の一種LD1、及びマイコバクテリウム属の一種LD6の存在量を決定した。また、図7には、8つの異なるM-コンソーシアム保存培養物(実施例1を参照されたい)についての結果を示す。検討したM-コンソーシアム培養物中のメチリビウムLD3、ハイドロゲノファーガLD1、及びマイコバクテリウムLD6の絶対濃度は、それぞれ、1ml当たり104〜108コピー、106〜109コピー/ml、及び102〜106コピー/mlの間のであった。
【００９３】
(実施例7)
汚染土壌及び地下水からの汚染物質除去のための接種菌液としてのM-コンソーシアム。
バッチ式分解実験を、MTBEによる汚染場所からの帯水層物質(75g)、及びMo等(1997年、Apppl. Microbiol. Biotechnol. 47:69〜72頁)により記載されている無機培地(145ml)を含む密封した120ml血清バイアル中で、好気性条件下で設定した。150μLの純粋なMTBEを隔壁を介して注入し、15mg/Lの最終濃度とした。この培養物を20℃でインキュベートした。非生物対照中及び試験バイアル中のMTBE濃度の進展を、pH及び溶存酸素濃度とともに時間内に追跡した(実施例1を参照されたい)。しかしながら、2年を超える実験期間を通して、MTBEの分解は得られなかった(図8)。インキュベーションの約500日後、M-コンソーシアムの2.6 108生細胞を一部の試験バイアルに添加した。接種菌液の添加後、MTBE濃度は、2、3週間の内に15mg/lから10μg/l(図8)未満まで低下したのに対し、非接種条件では、MTBE濃度の低下は認められなかった。接種したバッチの試験は、M-コンソーシアムを追加添加する必要がなく、1年を超える間、MTBEの再添加物の分解を継続した。この結果は、現場ではMTBE分解を妨げている阻害因子はないが、むしろ好適な微生物を欠くことを示している。また、様々なタイプの土壌(砂、ローム性砂等)を含む同様の試験において、M-コンソーシアムを、MTBE-分解を刺激する接種菌液として使用することにも成功した。
【００９４】
連続システムでの接種菌液としてのM-コンソーシアムを評価するために、プレキシガラスカラム(直径4cm、長さ50cm)を様々な担体材料(パーライト、帯水層物質、ろ過砂、及びポリマービーズ(beat))で満たし、M-コンソーシアムを接種した(±6 1010cfu/カラム)。対照として非接種カラムを同時に設定した。MTBE(10〜40mg/l)のみで、又はBTEX化合物(5mg/lベンゼン)と組み合わせてMTBEで汚染された人工地下水(希釈した最少無機培地)を、下から上にカラムを通して汲み上げた。カラム中の水理学的滞留時間(HRT)は、充填する物質によって1〜2日であった。カラムに沿って、サンプリングポイントが入口(カラムの底)から様々な間隔にあり、これは、汚染物質濃度プロファイル、並びにカラムに沿った溶存酸素濃度(DO)及びpHの進展の決定を可能にした。追加の酸素は、過酸化水素の希釈溶液により、シリンジポンプを用いて好気性カラム(流れの中で、入口から15cmで)システムに添加した(最終濃度<0.01%)。ベンゼンの大部分は、接種及び非接種カラム中で迅速に分解された。これに対して、MTBEは、M-コンソーシアムが存在する場合の水からだけ除去された(図9、ろ過砂)。一般的に、ベンゼンの存在下では、図2.Cに示すように、MTBE-分解の遅延がみられた。この遅延の間に、BTEX化合物は、利用可能な酸素を消費しながら分解した。BTEX化合物が分解され、十分な酸素が残存する又は添加されると、MTBE-分解は開始した。TBAの有意な蓄積はみられなかった。
【００９５】
11カ月間稼働させた後、13個すべてのカラムを解体した。カラムの様々な分画中のバイオマスを、タンパク質濃度を測定して定量化した。細胞タンパク質を、0.5MのNaOH中に、100°Cで10分間可溶化し、Lowry等の方法(1951年、Journal of Biological Chemistry (193)、265〜275頁)によって分光光度的に定量分析した。標準物質は、0.5MのNaOH中ウシ血漿γ-グロブリンで調製した。全DNAを様々な分画から抽出し(Hendrickx等、2006年、FEMS Microbiology Ecology 55: 262〜273頁)、微生物群集の多様性を、一般的な真正細菌プライマーを用いて増幅させた16S rRNA-遺伝子断片(63〜518)の変性剤濃度勾配ゲル電気泳動(DGGE)によって評価した。カラムの入口付近、及び酸素添加ポイント付近で(150mm)、最も高い量のバイオマスが認められた(図3)。接種したカラム中のタンパク質濃度は対照カラムより有意に高いが、後者のカラムでも量の増加が検出された。これは、何カ月も半無菌状態で稼働した結果、カラムが微生物で汚染されたということによって説明することができる。PCR-DGGE DNAフィンガープリントに基づくと、接種したMTBE/TBA分解コンソーシアムは、ほとんどの担体材料の中で明確に可視化できた。非接種の対照では、コンソーシアムは検出されなかった。
【００９６】
(実施例8)
M-コンソーシアムを接種した固定床反応器を使用した、MTBE汚染地下水のバイオレメディエーション
反応器の構成の概略図を図10に示す。これは例示的な構成を説明しているが、当業者によってこの他の構成が開発されうることは理解されるであろう。この反応器は、PVCコネクタ及びPVC管からなり、高さ63cm、総容積7Lで、再循環ループを含んでいる。約1.5kgの膨張性クレイ粒子(ECP、4から5mm、Argex社、Zwijndrecht、Belgium)を、M-コンソーシアムの固定化のための担体材料として使用した。反応器の細孔容積は3.8Lであった。反応器は、上向流の固定床反応器として稼働させ、流入水を含有する1000Lキュビテナーから蠕動ポンプ(Watson Marlow社、Cornwall、England)を使用して供給された(図10)。使用した流入水は、ガソリンスタンドの汚染場所由来の地下水からなり、除鉄装置の流出口でサンプリングした。使用の前に、pHをpH7.5に調整し、MTBEを最終濃度5mg/Lに達するように添加した。地下水は、蠕動ポンプを使用して、担体材料の上方から反応器基底へ、流入速度の10倍から20倍の速度で再循環させた。純酸素を使用して、酸素を再循環ループの地下水に添加した。流入水サンプリングポイント及び反応器注入口の直前に、シリンジポンプを使用して、栄養素溶液(K2HP04.3H20及びKNO3、pH7)を200〜400μL/時で流入水に添加して、質量(2.5mg/L K2HPO4.3H20及びKNO3)に基づく、流入水中の100/10/10のC/N/P比を得た。反応器は、4カ所のサンプリングポイント、すなわち、流入水、流出水、及び2カ所の異なる高さでの反応器内の水をサンプリングするためのサンプリングポイントを備えた(図10)。反応器は、ルアーロックチップ型10mLガラスシリンジを使用して、異なるサンプリングポイントで定期的にサンプリングした。すべての試料は、MTBE、TBA、及びBTEX濃度について、また、温度、pH、及び溶存酸素濃度について分析した(上記を参照されたい)。
【００９７】
反応器は130日間稼働させた。実行HRTの関数において、流入水中、反応器中、及び流出水中のMTBE濃度を図11にまとめた。反応器の流入水のpHは6.9から8.0の間であり、流出水では、生物学的活性によって6.8から7.4の間のpHまで下がった(データは示していない)。流入水は、鉄除去システムにおける酸化方法の違いによって、7から23mg/Lの間のDO濃度を含有した。流出水中のDO濃度は、2から19mg/Lの間のであった(図11(b))。反応器中の地下水の温度は、17から22℃の間であった(データは示していない)。MTBE除去速度は、水理学的滞留時間(時)で割った除去されたMTBE量(mg/L)として算出し、図11(a)に示した。1日目に、1.4×106cfuのM-コンソーシアム/g ECPを反応器に添加した。はじめに、反応器を、添加した細胞を担体材料に付着させるバッチ条件下で14日間稼働させた。反応器に接種した後、直ちに、反応器中でMTBE除去を測定した。7日目に、反応器中のMTBE濃度が2μg/Lの検出限界未満であった場合、5mg/L MTBE及び栄養素を反応器に添加した。14日目に、6.4時間のHRTで連続稼働モードを実行し、17日目にMTBEの除去を記録した。MTBEの流出水濃度は約2mg/Lで、77%のMTBE除去率に相当し、これは栄養素の制限が原因であった。流出水中のTBA濃度は、65μg/Lの検出限界未満であった(データは示していない)。25日間を通して、除去効率の変化は認められなかった。42日目に、栄養素の連続投与を取り入れたところ、49日目以降からMTBE除去率が77%から99%を超えるまで増加した(図11(a))。そのように、6.4時間のHRTで、0.01〜0.03mg/LのMTBE流出水濃度が、0.065から0.08mg/Lまでの検出限界未満の範囲の流出水中TBA濃度とともに得られた、(データは示していない)。すべてのHRTで定常状態条件を少なくとも3日間保つことができ、すなわち、6時間の実行HRTで、最小限の12細孔容積が得られた。53日目から流入水及び栄養素の流速を上げ始めることによって、59日間かけて実行HRTを6.4時間から0.7時間まで徐々に低下させた。この期間中、2から5mg/Lの間で変動していたMTBE流入水濃度は、6.4から1.6時間のHRTで、流出水中で0.1mg/L MTBEの排出限界未満の濃度まで除去された。これらの適応期の間、MTBE及びTBAの最大流出水濃度は、それぞれ0.4mg/L及び0.1mg/Lであった。1.6時間の実行HRTでは、MTBEの完全な除去が回復されるまで(0.043mg/L MTBEの流出水濃度)必要とされた応答時間は3日だけであった。これら条件下では、MTBE流出水濃度は1μg/Lと低く、99.98%以上のMTBE除去率が記録された。0.6時間のHRTでは、流出水MTBE濃度は、2.3から3.8mg/Lの間まで上昇した。しかし、TBA流出水濃度は、この期間の間、ピークは0.14mg/L TBAの1つで、依然として検出限界未満であった。したがって、MTBEについて、排出限界未満までの全MTBE除去を意味する最短HRTは、1.6時間であった。完全なMTBE除去を意味する、記録された最高MTBE除去速度は、2.5mg MTBE/L  時であり、104日目に、1.6時間の実行HRTで測定した(図11b)。本バイオリアクターは、MTBE濃度の急上昇後、迅速に回復し、MTBEの除去は純粋に生物学的であることが証明された。
【００９８】
(実施例9)
M-コンソーシアムを接種したパイロットバイオリアクターシステムにおけるMTBE/TBA汚染された地下水の処理
M-コンソーシアムを接種したバイオリアクターのパイロット規模での性能を、図10に示したシステムをスケールアップしたものである300Lのプロトタイプバイオリアクターを使用して評価した。これは、MTBE/TBA含有水を、M-コンソーシアムを接種した担体材料の床を通して底から上部へ汲み上げる上向流のバイオリアクターに関する。このバイオリアクターを、主にポリスチロール顆粒(PSG、Sarstedt社、Numbrecht、Germany)を用いて部分浮遊床システムとして稼働させた。(1)バイオリアクターの均質性を向上させるために、また、(2)バイオリアクターへ酸素を供給するために、水再循環ループによって、水の一部を反応器の上部から底部へ返送した。処理水の排出口は、反応器の上部に設けた。また、酸素の添加の他に、連続的な栄養素(Nitrogen & phosphor社)投与システム、及びpH補正システムを組み込んで、細菌活性のためにより至適な条件を創出した。本バイオリアクターは、(1)除鉄装置、(2)流入水及び流出水タンクに連結したバイオリアクター、並びに(3)仕上げ用活性炭ろ過からなる、可動式処理システム中に組み込まれた。
【００９９】
M-コンソーシアムを、実験室で、唯一の炭素源としてMTBEを使用した培地WXP(実施例1を参照されたい)で培養した。M-コンソーシアム4L(>8.2 108細胞/ml、細胞当たり16S RNA-遺伝子1コピーと推定)を、現場外でバイオリアクターシステムにアップロードした。システムの反応性は、人為的に8mg/L MTBE及び4mg/L TBAで汚染した地下水を用いて、1カ月の再循環式稼働と、その後の1カ月の連続稼働(水理学的滞留時間=10時間)の間に実証した。効率的な除去(>97%)が認められた(結果は示していない)。
【０１００】
次に、パイロット規模の接種済みのバイオリアクター(300L)を、実際の汚染場所に輸送して、現場の状況下で、5カ月の試験期間の間、その性能を評価した。試験場所は、300〜5000μg/L MTBE及び3500〜10000μg/L TBAを含有し、パイロットシステム用流入水として使用した地下水が汲み上げられた産業用地(化学物質倉庫)であった。図12に、パイロットシステムの流入水、及びバイオリアクターの流出水中の(GAC工程前の)TBA濃度の経時的評価を示す。MTBE及びTBAはいずれも、低流速(50L/時、HRT=6時間)で稼働させたパイロットシステムによって、効率的に除去されていることがわかった(100μg/L未満)(Table 2(表2)。MTBE濃度は、4,500μg/Lに達するほどの濃度から110μg/L未満の濃度まで低減した(>97%除去)。10,000μg/Lに達するほどのTBA濃度は、180μg/L未満に低減した(>98%除去)。仕上げ工程としてシステムに含まれた活性炭ろ過によって、流出水濃度は更に、100μg/L未満、ほとんど検出限界未満に低減した。地下水中の溶存鉄の濃度が高かったのは、短い時間により高い流速(100l/時間、HRT=3時間)でのみ実行されたことが理由であった。多くの非理想的であるが現実的な状況(pHのフラクチュエーション、30℃以上の温度上昇、非稼働期間、流れのフラクチュエーション等)を本システムに適用したにもかかわらず、本システムは、速やかに適合し、再接種の必要なく活性を残存させた。
【０１０１】
【表２】
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【０１０２】
図3〜図5に表した16S rRNA遺伝子配列に基づき、特異的なqPCRプライマー及びFISHプライマーを開発し、これを使用して、パイロット処理システム中のメチリビウム属の一種LD3、ハイドロゲノファーガ属の一種LD1、及びマイコバクテリウム属の一種LD6の存在量を決定した。FISHに基づき、M-コンソーシアム由来のこれらの3種の単離物は、バイオリアクターの流出水中の全細菌の25%であった。バイオリアクターからのスラッジ中及び担体材料上では、これはそれぞれ、平均20%(5カ所のデータポイント)及び26%(3カ所のデータポイント)であった。除鉄装置中では、全細菌のうちの31%が、M-コンソーシアム中の主要な生物と結びつけられた。q-PCR分析に基づき、メチリビウム属の一種LD3、ハイドロゲノファーガ属の一種LD1、及びマイコバクテリウム属の一種LD6の総和は、バイオリアクターの流出水中で平均1.4×104細胞/ml(6カ所のデータポイント)、バイオリアクターからのスラッジ中で9 106細胞/g(4カ所のデータポイント)、担体材料上で3.5 107細胞/g(2カ所のデータポイント)であると定量化された。バイオリアクター中では、メチリビウム属の株が全試験期間中ずっと優性であったが、ハイドロゲノファーガ属及びマイコバクテリウム属の種もまた、様々なサンプリング時間で存在が認められた(Table 3(表3))。
【０１０３】
【表３】
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【受託番号】
【０１０４】
Belgian co-ordinated collection of Micro-organisms LMG P-27480
Belgian co-ordinated collection of Micro-organisms LMG P-27479
Belgian co-ordinated collection of Micro-organisms LMG P-27498
Belgian co-ordinated collection of Micro-organisms LMG P-27909
Belgian co-ordinated collection of Micro-organisms LMG P-27478
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図６ｄ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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