(57)【要約】  前駆細胞が胚体内胚葉に試験管内分化し、それがシグナル伝達経路の調節を介してヒト結腸オルガノイド（ＨＣＯ）へとさらに分化し得る方法が、本明細書に開示される。さらに、ＨＣＯ、およびＨＣＯの使用方法が開示され、例えばＨＣＯについて、大腸炎、結腸癌、ポリポーシス症候群、および／または過敏性腸症候群から選択される疾患に対して有望な治療薬の有効性および／または毒性を決定するために使用され得る使用され得る。  【選択図】図１Ｃ
2020501534.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト結腸オルガノイドの形成を誘導する方法であって、
ａ．胚体内胚葉（ＤＥ）をＦＧＦシグナル伝達経路活性化因子およびＷＮＴシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＣＨＩＲＯＮ／ＧＳＫ２阻害因子）と、前記ＤＥが中後腸スフェロイドを形成するのに十分な期間、接触させるステップと、
ｂ．ステップ（ａ）の前記中後腸スフェロイドをＢＭＰ活性化因子およびＥＧＦシグナル伝達経路活性化因子と、前記ヒト結腸オルガノイドを形成するのに十分な期間、接触させるステップとを含み、前記ヒト結腸オルガノイドがＳＡＴＢ２を発現する、方法。
【請求項２】
前記ＤＥが、胚性幹細胞、胚性生殖細胞、人工多能性幹細胞、中胚葉細胞、胚体内胚葉細胞、後部内胚葉細胞、後腸細胞またはこれらの組み合わせから選択される前駆細胞に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＦＧＦシグナル伝達経路活性化因子が、小分子ＦＧＦシグナル伝達経路活性化因子、タンパク質ベースのＦＧＦシグナル伝達経路活性化因子、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１５、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２、ＦＧＦ２３、またはこれらの組み合わせから選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＷＮＴシグナル伝達経路活性化因子が、タンパク質Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化因子、小分子Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化因子、好ましくは塩化リチウム、２−アミノ−４，６−二置換ピリミジン（ヘテロ）アリールピリミジン、ＩＱ１、ＱＳ１１、ＮＳＣ６６８０３６、ＤＣＡベータ−カテニン、２−アミノ−４−［３，４−（メチレンジオキシ）−ベンジル−アミノ］−６−（３−メトキシフェニル）ピリミジン、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１６、ＧＳＫ３阻害剤、好ましくはＣＨＩＲＯＮ、またはこれらの組み合わせから選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ＢＭＰ活性化因子が、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７、ＢＭＰ９、ＢＭＰ経路を活性化する小分子、ＢＭＰ経路を活性化するタンパク質、ノギン、ドルソモルフィン、ＬＤＮ１８９、ＤＭＨ−１、ベントロモフィン（ｖｅｎｔｒｏｍｏｐｈｉｎ）、およびこれらの組み合わせから選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ＤＥが中後腸スフェロイドを形成するのに十分な前記期間が、ステップ（ａ）の前記中後腸スフェロイドによるＣＤＸ２の発現によって決定される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記中後腸スフェロイドが、前記ヒト結腸オルガノイドを形成するのに十分な前記期間、前記ヒト結腸オルガノイドの細胞によるＳＡＴＢ２およびＣＤＸ２の発現による、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＨＣＯが結腸腸内分泌細胞（ＥＥＣ）の存在を特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＨＣＯが陰窩の存在を特徴とし、絨毛を実質的に含まない、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＨＣＯが結腸特異的杯細胞を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＨＣＯが、パネート細胞を実質的に含まない、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＨＣＯが結腸特異的ホルモンＩＮＳＬ５を分泌する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法によって得られるＨＣＯ。
【請求項１４】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のＨＣＯを、哺乳類、好ましくはげっ歯類、好ましくは免疫無防備状態のげっ歯類、好ましくは免疫無防備状態のマウスの腎被膜下に生着させることを含む、結腸組織を形成する方法。
【請求項１５】
大腸炎、結腸癌、ポリポーシス症候群、および／または過敏性腸症候群から選択される疾患に対して有望な治療薬の有効性および／または毒性を決定する方法であって、前記有望な治療薬を請求項１〜１２のいずれか１項に記載のＨＣＯと、前記有望な治療薬の有効性および／または毒性を決定するのに十分な期間、接触させることを含む、方法。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載のＨＣＯを含む免疫無防備状態のげっ歯類。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載のＨＣＯに由来する腸管結腸オルガノイド。
【請求項１８】
前記腸管オルガノイドが、免疫機能、神経支配、血管、絨毛、およびパネート細胞のうちの１つ以上を含まない、請求項１７に記載の腸管オルガノイド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その全体がすべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる２０１６年１２月５日に出願された米国仮特許出願番号第６２／４２９，９４８号の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
多能性幹細胞（ＰＳＣ）からの胃および小腸のオルガノイドの作製がヒト消化管（ＧＩ）の発生および疾患の研究に革命をもたらしたが、大腸オルガノイドを作製するための尽力は、一部後腸管発生の強固な理解の欠如により、後れを取っている。
【発明の概要】
【０００３】
前駆細胞が胚体内胚葉に試験管内分化し、それがシグナル伝達経路の調節を介してヒト結腸オルガノイド（ＨＣＯ）へとさらに分化し得る方法が、本明細書に開示される。さらに、ＨＣＯ、およびＨＣＯの使用方法が開示され、例えばＨＣＯについて、大腸炎、結腸癌、ポリポーシス症候群および／または過敏性腸症候群から選択される疾患に対して有望な治療薬の有効性および／または毒性を決定するために使用され得る使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
本出願書類には、カラーで作成された少なくとも１つの図面が含まれている。カラー図面（複数可）を含むこの特許または特許出願公開のコピーは、請求および手数料の支払いにより、官庁により提供されるであろう。
【０００５】
当業者は、以下に記載される図面が例示目的のみのためであることを理解するだろう。図面は、決して本教示の範囲を限定することを意図しない。
【０００６】
【図１】Ｂｍｐシグナル伝達は、マウスおよびカエルの胚におけるＳａｔｂ２の発現を調節する。（Ａ）発生中の後腸の周りの核染色を示す胎生８．５日のマウス胚の全載ｐＳｍａｄ１５８（赤色）およびＦｏｘａ２（緑色）染色（ｎ＝６）。（Ｂ）後腸中胚葉および内胚葉におけるｐＳｍａｄ１／５／８染色を示す（Ａ）の囲み領域からの光学組織薄片の挿入図（Ｄ：背側、Ｖ：腹側）。（Ｃ）頭褶期に単離され、ＤＭＨ−１を用いたＢｍｐ阻害の有無の下で２日間培養されたマウス胚の概略図。（Ｄ、Ｅ）培養４８時間後のＤＭＳＯ処置胚（０）およびＤＭＨ−１処置胚（Ｅ）の全載ｐＳｍａｄ１／５／８（赤色）およびＦｏｘａ２（緑色）染色。（Ｆ）ＤＭＳＯまたはＤＭＨ−１の中で培養した胚（１条件あたりｎ＝３の胚）におけるＣｄｘ２に対するｐＳｍａｄ１／５／８およびｐＳｍａｄ２／３染色の定量化（条件当たりｎ＝３胚）。（Ｇ〜Ｊ）ＤＭＳＯ（Ｇ、Ｈ）またはＤＭＨ−１（Ｉ、Ｊ）の中での２日間培養の後のマウス胚（各条件につきｎ＝６）のＣｄｘ２（緑色）、Ｓａｔｂ２（赤色）およびＦｏｘａ２（白色）の全載免疫染色。Ｈ〜Ｊにおける矢印は、卵黄茎のおおよその位置を指し示す（ＢＡ１、第１腕弓）。（Ｋ）ＤＭＳＯまたはＤＭＨ−１で処置したマウス胚におけるＳａｔｂ２発現の定量化。（Ｌ）Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ胚におけるＢｍｐ阻害の概略図。ＤＭＳＯ（Ｍ）またはＤＭＨ−１（Ｒ）で処置したＸｅｎｏｐｕｓ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ胚におけるＳａｔｂ２の原位置ハイブリッド形成。（Ｍ）および（Ｒ）における白色の点線は、切片の平面がその後の分析を使用したことを描写する。Ｍｘおよびｍｄ＝第１腕弓の上顎突起および下顎突起。Ｃｂａ＝尾側腕弓。ＤＭＳＯ（Ｎ〜Ｑ）またはＤＭＨ−１（Ｓ〜Ｖ）で処置したＸｅｎｏｐｕｓ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ胚からのＳａｔｂ２（赤色）、ｐＳｍａｄ１／５／８（緑色）、ＤＡＰＩ（青色）の免疫蛍光、および色相併合画像。スケールバーはＧ〜Ｈにおいては＝１００μＭ、他のパネルにおいてはすべて５０μ。両側ｔ検定について＊＊ｐ<０．０１および＊＊＊ｐ０．００１。
【図２】ＢＭＰ２はヒト腸管スフェロイドにおけるＳＡＴＢ２および後側ＨＯＸコードを誘導する。（Ａ）腸管スフェロイドパターン形成プロトコルの概略図。（Ｂ〜Ｄ）ノギン（Ｂ）、無処置（Ｃ）およびＢＭＰ２（Ｄ）で１２時間処置したスフェロイドのｐＳＭＡＤ１／５／８（赤色）染色によって測定したＢＭＰシグナル伝達レベル。（Ｅ）陰窩の頂部でのＢＭＰシグナル伝達の上昇を示す成体マウス結腸のｐＳｍａｄ１／５／８染色。（Ｆ〜Ｈ）ノギン（Ｆ）、無処置（Ｇ）およびＢＭＰ２（Ｈ）で７２時間処置したスフェロイドにおけるＳＡＴＢ２発現。（Ｉ）パターン形成後のＳＡＴＢ２＋ＣＤＨ１＋上皮の百分率の定量化。（Ｊ）新生スフェロイドおよび３日間のパターン形成後のスフェロイドの主成分分析。（Ｋ）ＢＭＰ処置スフェロイドとＮＯＧ処置スフェロイドとの間で差次的に発現した遺伝子の遺伝子オントロジー分析。（Ｌ）パターン形成前後のスフェロイドのＴＰＭ（１００万当たりの転写産物）値のグラフ。分析した試料は、パターン形成前のスフェロイド（ｎ＝２）、ならびにパターン形成３日後のノギン、対照およびＢＭＰ２で処置したスフェロイドとした（各群につきｎ＝４）。Ｉにおける定量化のために、少なくとも３回の実験由来の２０個のオルガノイドを試験した。エラーバーは標準偏差を表す。スケールバー＝５０ミクロン。＊＊＊＊両側ｔ検定によって決定されたｐｓ０．０００１。
【図３】部域パターン化形成は、長期間の試験管内培養後にヒト腸管オルガノイドにおいて維持される。（Ａ〜Ｄ）ノギン、対照、またはＢＭＰ２によるスフェロイドの最初の３日間の処置から結果的に生じた２８日齢オルガノイドの近位マーカーＯＮＥＣＵＴＩ（緑色）を用いた全載免疫蛍光およびＱＰＣＲ分析。ＣＤＸ２（赤色）およびＤＡＰＩ（青色）を用いた染色も使用して、上皮および間充織を検出した。（Ｅ〜Ｈ）ＩＦによっておよびＱＰＣＲによって検出された後側マーカーＳＡＴＢ２（赤色）の発現。（Ｉ〜Ｌ）ＩＦによるおよびＱＰＣＲによる汎杯細胞マーカーＭＵＣ２（赤色）の分析。（Ｍ〜Ｐ）ＩＦによる結腸特異的杯細胞マーカーＭＵＣ５Ｂ（赤色）の分析。ＭＵＣ５Ｂ＋細胞の数を（Ｐ）において定量した。（Ｑ〜Ｓ）オルガノイド全体と比較した、単離された間充織培養物におけるパターン形成マーカーの分析。ノギン、対照、またはＢＭＰ２で処置したオルガノイドに由来するオルガノイド全体におけるおよび間充織培養物におけるＣＤＨ１（Ｑ）、近位ＨＯＸ遺伝子ＨＯＸＤ３（Ｒ）、および遠位ＨＯＸ遺伝子ＨＯＸＡ１３（Ｓ）のＱＰＣＲ分析ＣＤＨ１は上皮細胞を含有するオルガノイド全体においてのみ観察された。エラーバーは平均の標準誤差を表す。ＩＦについては、各条件について少なくとも３回の異なる実験から最低１０個のオルガノイドを検討した。ＱＰＣＲについては、２つの別個の実験からの最低５つの生物学的複製物を検討した。スケールバー＝１００ミクロン。両側ｔ検定により決定された＊＊ｐ  ５  ０．０１および＊＊＊＊ｐ  ５  ０．０００１。
【図４】ＨＩＯではなくＨＣＯは、プロエンドクリン転写因子ニューロゲニン３の発現に応答して、結腸特異的腸内分泌細胞を生じた。（Ａ〜Ｂ）ＩＰＳＣ７２．３誘導性ＮＥＵＲＯＧ３株を作製するために使用されたドキシサイクリン誘導性ＮＥＵＲＯＧ３レンチウイルスコンストラクトの概略図、およびドキシサイクリン誘導プロトコル。ノギン（Ｃ、Ｆ）、未処置（Ｄ、Ｇ）またはＢＭＰ（Ｅ、Ｈ）を用いてパターン形成された３５日齢のオルガノイドのクロマグラニンＡ（緑色）、ＣＤＸ２（赤色）およびＩＮＳＬ５（白色）による全載染色。（Ｃ〜Ｅ）未処置オルガノイド（−Ｄｏｘ）および（Ｆ〜Ｈ）発現したＮＥＵＲＯＧ３を有するオルガノイド（＋Ｄｏｘ）。ＥおよびＨにおける挿入図は、ＩＮＳＬ５染色の拡大図を示す。（Ｉ、Ｊ）ＣＨＧＡによって測定されるような（Ｉ）、およびＩＮＳＬ５（Ｊ）発現についての、ＨＩＯおよびＨＣＯにおける腸内分泌細胞のＮＥＵＲＯＧ３誘導のＱＰＣＲ分析。データは、ノギン（ｎ＝３）、対照（ｎ＝３）またはＢＭＰ（ｎ＝６）処置オルガノイドを用いた２つの異なる実験の代表である。エラーバーは、平均の標準誤差を表す。スケールバー＝５０ミクロン。＊両側ｔ検定により決定されたｐ<０．０５。
【図５】ＨＩＯおよびＨＣＯは、生体内移植後の部域同一性を維持した。（Ａ〜Ｅ）ヒト空腸および結腸からの生検の、ならびにマウス腎被膜の真下に移植され生体内で８〜１０週間成長したノギン由来ＨＩＯ、対照ＨＩＯおよびＢＭＰ２由来ＨＣＯのＨ&Ｅ染色。同じ条件の試料を、近位腸管マーカーＧＡＴＡ４（Ｆ〜Ｊ）、遠位腸管マーカーＳＡＴＢ２（Ｋ−０）、パネート細胞マーカーＤＥＦＡＳ（Ｐ〜Ｔ）、および結腸特異的杯細胞マーカーＭＵＣ５Ｂ（Ｕ〜Ｙ）で染色した。ＧＡＴＡ４およびＳＡＴＢ２の二重染色は異なるチャネルにおいてだがパネルについては同じスライド上で行ったが（Ｆ〜０）、それらは個々の擬似色（赤色）画像として示されていることに留意されたい。ヒト生検についてはｎ＝２である。移植されたノギン処置オルガノイドについてはｎ＝１２、対照オルガノイドについてはｎ＝７、およびＢＭＰ２処置オルガノイドについてはｎ＝１６である。スケールバー＝５０ｐｍ。
【図６】生体内成長したオルガノイドは、部域特異的ホルモンを発現する。マウス腎被膜の真下で８〜１０週間成長したＨＩＯおよびＨＣＯにおける部域的に発現したホルモン（Ａ〜Ｄ）グレリン（ＧＨＲＬ）、モチリン（ＭＬＮ）、（Ｅ〜Ｈ）ＧＩＰ、（Ｉ〜Ｌ）ＧＬＰ−１、（Ｍ〜Ｐ）ＰＹＹおよび（Ｑ〜Ｔ）ＩＮＳＬ５の発現分析。近位濃縮ホルモンＧＨＲＬ、ＧＩＰおよびＭＬＮは、ノギンおよび対照ＨＩＯにおいて豊富であった（Ａ〜Ｈ）。遠位に濃縮されたホルモンＧＬＰ−１およびＰＹＹは、ＢＭＰ２由来のＨＣＯにおいて豊富であった（１〜０）。結腸特異的ホルモンＩＮＳＬ５はＨＣＯ（Ｑ〜Ｔ）にのみ存在していた。データは、１条件あたり最低５つの移植オルガノイドを代表している。（Ａ）および（Ｂ）の挿入図は、ＧＨＲＬおよびＭＬＮ二重陽性細胞を示す。（Ｄ、Ｈ、Ｌ、Ｐ、Ｔ）ＧＨＲＬ、ＭＬＮ、ＧＩＰ、ＧＬＰ１、ＰＹＹ、およびＩＮＳＬ５についてのＦＰＫＭ値は、ＲＮＡ配列データからである。ＦＰＫＭ値は、１条件あたり３つの生物学的複製物を表す。スケールバー＝３０ミクロン。
【図７】ＨＩＯおよびＨＣＯの全体的な転写分析ならびにヒト小腸および結腸との比較。（Ａ）移植したＨＩＯおよびＨＣＯと比較したヒトの成体および胎児の小腸および結腸の主成分分析。（Ｂ）ヒト成体小腸をＨＩＯと、およびヒト成体結腸をＨＣＯと比較する超幾何中項検査。（Ｃ）ＨＩＯおよびＨＣＯと比較して、ヒト小腸および結腸において差次的に発現した転写物を比較する４方向散布図。
【図８】Ｇａｔａ４およびＳａｔｂ２は、小腸および大腸の発生中の離散した部域境界を標識する。（Ａ）卵黄茎における発現境界を示す胎生９．５日マウス胚におけるＧａｔａ４（緑色）およびＳａｔｂ２（赤色）の全載染色（ｎ＝９）。（Ｂ）低Ｇａｔａ４発現および低Ｓａｔｂ２発現の移行帯を示す、胎生１１．５日小腸のＧａｔａ４およびＳａｔｂ２の発現ドメインを描写するモデル。（Ｃ  ¬Ｅ）卵黄茎におけるＧａｔａ４の後側境界とＳａｔｂ２の前側境界とを示す胎生１１．５日マウス胚におけるＧａｔａ４およびＳａｔｂ２の全載染色（ｎ＝３）。（Ｆ〜Ｈ）Ｓａｔｂ２発現の前側境界が維持されることを示す胎生１２．５日マウス胚におけるＳａｔｂ２およびＦｏｘａ２の全載染色（ｎ＝３）。（Ｉ）胎生１６．５日マウス胚から単離した近位腸におけるＧａｔａ４およびＳａｔｂ２の全載染色（ｎ＝６）。（Ｊ）胎生１６．５日マウス胚から単離した回腸および大腸におけるＧａｔａ４およびＳａｔｂ２の全載染色（ｎ＝６）。（Ｋ）ヒト空腸（ｎ＝２）および（Ｌ）結腸（ｎ＝２）の切片におけるＧＡＴＡ４およびＳＡＴＢ２の染色。スケールバー＝５０μＭ（Ｂ〜Ｄ）および１００  １Ａｍ（Ｅ〜Ｍ）。（Ｃ）および（Ｆ）における点線は、臍のおおよその位置を標識する。略語：ｙｓ：卵黄茎、ｃｂ：虫垂、ｔｚ：移行帯、ｍｘ：上顎、ｍｄ：第１腕弓の下顎部分、ｔｉ：回腸末端部、ｉｃｊ：回盲移行部。
【図９】ＳＡＴＢ２は、ＧＡＴＡ４陰性ヒト小腸および大腸において発現する。ＳＡＴＢ２発現が回腸および大腸全体に存在することを示す、ヒト成体十二指腸、小腸、虫垂、結腸および直腸におけるＳＡＴＢ２染色ヒト成体および胎児腸管試料からの公表されたＲＮＡ配列データからのＧＡＴＡ４およびＳＡＴＢ２の解析。プロットした試料は、ヒト成体十二指腸（ＨｕＳＩ＿Ｄｕｏ＿Ａ）、ヒト成体回腸〜十二指腸（ＨｕＳＩ＿Ｄｉｓｔ＿Ａ）、ヒト成体結腸（ＨｕＣｏｌｏｎ＿Ａ）およびヒト胎児小腸（ＨｕＳＩ＿Ｆ）を含む。（Ｃ）気液界面（ＡＬＩ）中で成長した十二指腸（Ｄｕｏ）、空腸（Ｊｅｊ）、回腸（Ｉｌｅ）、上行結腸（ＡＣ）、横行結腸（ＴＣ）および下行結腸由来の胎児腸管幹細胞に対してＷａｎｇら２０１５によって作成されたマイクロアレイデータからのＧＡＴＡ４およびＳＡＴＢ２の発現の解析分析）。ｒ２値はＥｘｃｅｌのＣＯＲＲＥＬ関数を用いて決定した。
【図１０】ＢＭＰは、後側ＨＯＸ遺伝子のＳＨＨ活性化を媒介する。（Ａ）後側ＨＯＸ遺伝子のＳＨＨ媒介活性化の従来モデル。（Ｂ）後側ＨＯＸ遺伝子のＳＨＨ媒介活性化および内胚葉ＨＯＸ遺伝子のＢＭＰ媒介活性化の新たなモデル。（Ｃ）ノギン、対照、平滑化アゴニスト（ＳＡＧ）、またはＢＭＰ２を用いた処置後のＨＯＸ因子のＱＰＣＲ分析。（Ｄ）ＳＡＧにより誘導されたＨＯＸ１３遺伝子のＢＭＰ４依存性活性化のモデル。（Ｅ）３日後の対照、５μＭのＳＡＧ、５μＭのＳＡＧ＋ＮＯＧおよびＢＭＰ２で処置したオルガノイド中のＨＯＸＡ１３のＱＰＣＲ分析。（Ｆ）外因性組換えヒトＢＭＰ２によって誘導されたＨＯＸ１３遺伝子のＳＨＨ非依存的活性化のモデル。（Ｇ）３日後の対照、ＢＭＰ、およびＢＭＰ＋シクロパミンで処置したオルガノイド中のＨＯＸＡ１３のＱＰＣＲ分析（１条件あたりｎ＝６）。
【図１１】拡張生体内培養は、杯細胞の成熟を可能にする。（Ａ）パターン形成され、次いで再パターン形成されたオルガノイドにおけるＣＤＸ２＋ＳＡＴＢ２＋細胞の百分率の定量。２８日齢オルガノイドにおけるＨＯＸＢ１３（Ｂ）およびＨＯＸＤ１３（Ｃ）のＱＰＣＲ分析。４４日齢のノギン、対照、およびＢＭＰで処置オルガノイドからのＣＤＨ１（緑色）、ＣＤＸ２（赤色）、およびＭＵＣ２（白色）による全載染色（Ｄ〜Ｆ）および（Ｇ〜１）横断切片染色。（Ｊ〜Ｌ）４４日齢のＢＭＰ２処置オルガノイドからの切片の染色。白色の矢印はムチン２を分泌する過程にあった杯細胞を指し示す。ＱＰＣＲについては、２つの別個の実験からの最低５個の生物学的複製物を検討した。ＩＦについては、１条件につき最低１０個のオルガノイドを検討した。スケールバー＝５０ｐｍ。
【図１２】オルガノイドのＢＭＰパターン形成は、試験管内および生体内で安定である。（Ａ）ノギン、対照、およびＢＭＰでパターン形成したオルガノイドのオルガノイド生着効率。移植されたパターン形成したオルガノイドにおけるＧＡＴＡ４＋ＣＤＸ２＋細胞（Ｂ）およびＳＡＴＢ２＋ＣＤＸ２＋細胞（Ｃ）の百分率の定量。移植されたオルガノイドにおけるＧＡＴＡ４（Ｄ）ＳＡＴＢ２（Ｅ）ＤＥＦＡＳ（Ｆ）およびＭＵＣＳＢ（Ｇ）のＲＮＡ配列データからのＦＰＫＭ値。（Ｈ〜Ｉ）ヒト空腸および結腸の生検（１部域当たりｎ＝２）および（Ｊ〜Ｌ）移植されたオルガノイド（１条件当たりｎ＝５）のＭＵＣ２（赤色）染色。スケールバー＝５０ミクロン。
【図１３】試験管内および生体内で成長したオルガノイドは、腸管前駆細胞を含有している。ノギン、対照、またはＢＭＰで処置したＨ９−ＬＧＲ５−ＧＦＰ由来オルガノイドからのＣＤＨ１およびＧＦＰの代表的な全載画像（Ａ、Ｆ、Ｋ）および組織薄片画像（Ｂ、Ｇ、Ｌ）。（Ｃ〜Ｅ）ノギン、（Ｈ〜Ｊ）対照、または（Ｍ〜Ｏ）ＢＭＰ２で処置したオルガノイドからの切片に関するＣＤＸ２染色（赤色）およびＳＯＸ９染色（緑色）。ＣＤＸ２およびＬＧＲ５−ＧＦＰ（Ｐ、Ｓ、Ｖ）、ＣＤＸ２およびＳＯＸ９（Ｑ、Ｔ、Ｗ）、ならびにＣＤＨ１およびＫＩ６７（Ｒ、Ｕ、Ｘ）を用いて染色した、ノギン、対照、またはＢＭＰで処置したＨ９−ＬＧＲ５−ＧＦＰオルガノイド由来の生体内オルガノイドの代表的な画像。（Ｙ〜Ａ‘）それぞれノギン、対照またはＢＭＰの移植片から誘導されたエンテロイドを示す立体顕微鏡写真。（Ｂ’〜Ｄ’）対照エンテロイド（２つの移植片からの１００個超のプールされたエンテロイド）およびＢＭＰ２で処置したコロノイド（１つの移植片からの５０個超のコロノイド）における近位および遠位の遺伝子のＱＰＣＲ分析。スケールバー＝５０μｍ。
【図１４】リボソームおよび免疫細胞のシグネチャは、移植されたオルガノイドと初代ヒト組織との間に差次的に発現する。（Ａ）パターン形成した移植されたオルガノイドならびにヒト成体および胎児の小腸および結腸の主成分分析。（Ｂ）移植片対ヒト初代組織において上方調節された遺伝子の遺伝子オントロジー分析。（Ｃ）ヒト初代組織対移植片において上方調節された遺伝子の遺伝子オントロジー分析。
【図１５】（Ａ）マトリゲル中での１５日間の成長後のＨＣＯの全載免疫蛍光染色。ＨＣＯ培養物を内皮マーカーＣＤ３１（緑色）および後腸上皮マーカーＣＤＸ２（赤色）について染色した。造血細胞マーカーＰＵ．１についても培養物を染色した（赤色の右側のパネル）。（Ｂ）造血前駆細胞アッセイの概略図。細胞をＨＣＯから収集し、遠心分離し、ギムザ・ライト染色を用いて染色するか、またはＭｅｔｈｏｃｕｌｔ培地中に播種して造血細胞の分化についてアッセイした。（Ｃ）マクロファージ、好中球、好塩基球および好酸球への分化と一致する形態学的特徴を有する、ギムザ・ライト染色した細胞の代表的な画像。（Ｄ）Ｍｅｔｈｏｃｕｌ中で１４日後に形成されたコロニーの代表的な画像。赤血球、マクロファージおよび顆粒球のコロニーは、ＨＣＯで誘導された細胞には存在したが、ノギン処置したＨＩＯで誘導された細胞には存在しなかった。
【図１６】（Ａ）ヒト結腸生検またはマトリゲル中で２８日間成長させたＨＣＯの免疫蛍光染色。マクロファージのマーカーであるＣＤ６８について染色を行った。（Ｂ）ＨＩＯおよびＨＣＯにおけるＣＤ１４およびＣＤ１６のＣＹＴＯＦ分析のプロット。わずかな百分率のＣＤ１４＋／ＣＤ１６＋細胞がＨＣＯ中に存在する（青色の正方形）が、ＨＩＯには存在しない。さらに、ＣＤ１６単一陽性細胞がＨＣＯ中に存在しており、このことは単球が培養物内で存在することを示唆した。（Ｃ）１４日齢および２８日齢のＨＩＯおよびＨＣＯから収集した上清のＬｕｍｉｎｅｘアレイ分析。ＩＬ６およびＩＬ８は、２８日齢のＨＣＯ（ＢＭＰ）においては検出されたが、ＨＩＯにおいては検出されなかった。（Ｄ）１４日齢および２８日齢のＨＩＯおよびＨＣＯから収集した上清のＬｕｍｉｎｅｘアレイ分析。マクロファージ特異的サイトカインＭＩＰ１ＡおよびＭＩＰ１Ｂは１４日齢および２８日齢のＨＣＯ（ＢＭＰ）においては検出されたが、１４日齢または２８日齢のＨＩＯにおいては検出されなかった。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
定義
特に明記しない限り、用語は当業者による従来の使用法に従って理解されるべきである。
【０００８】
「約」もしくは「およそ」という用語は、当業者による決定に従って、例えば、測定システムの制限の、その値がどのように測定され、または、決定されるかに依存する、特定の値に対して許容できる誤差範囲内にあることを意味する。例えば、「約」は、当該技術分野における実務に従って、１以上の標準偏差内であることを意味し得る。あるいは、「約」は、与えられた値の２０％まで、または１０％まで、または５％まで、または１％までの範囲であることを意味し得る。あるいは、特に生物系または生物学的プロセスに関して、この用語は、ある値の１０倍以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内であることを意味し得る。特定の値が本出願および特許請求の範囲に記載されている場合、特に明記しない限り、特定の値に対する許容可能な誤差範囲内を意味する「約」という用語を想定すべきである。
【０００９】
本明細書中で使用されるとき、用語「全能性（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞」（全能性（ｏｍｎｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞としても知られる）は、胚性細胞型および胚体外細胞型に分化することのできる幹細胞である。このような細胞は完全な生存可能な生物を構築することができる。これらの細胞は卵細胞と精子細胞の融合から産生される。受精卵の最初の数回の分裂によって産生された細胞も全能性である。
【００１０】
本明細書で使用されるとき、ＰＳ細胞としても一般的に知られている用語「多能性幹細胞（ＰＳＣ）」は、ほぼすべての細胞、すなわち、内胚葉（胃の内部の裏うち、消化管、肺）、中胚葉（筋肉、骨、血液、腎尿路生殖器）、および外胚葉（表皮組織および神経系）のうちのいずれかから誘導される細胞、へ分化することができるあらゆる細胞を包含する。ＰＳＣは、胚性幹細胞（胚性生殖細胞を含む）から誘導されるか、またはある特定の遺伝子の発現を強制することによって成体体細胞のような非多能性細胞の誘導を通じて得られる、全能性細胞の子孫であり得る。
【００１１】
本明細書で使用されるとき、用語「人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）」は、一般にｉＰＳ細胞とも略され、特定の遺伝子の「強制的な」発現を誘導することによって、成体体細胞などの通常は非多能性細胞から人工的に誘導される多能性幹細胞の一種を指す。
【００１２】
本明細書中で使用されるとき、用語「胚性幹細胞（ＥＳＣ）」はまた一般にＥＳ細胞とも略され、多能性であり、かつ初期胚である胚盤胞の内部細胞塊に由来する細胞を指す。本発明の目的のために、用語「ＥＳＣ」は、胚性生殖細胞も場合により包含するように広く使用される。
【００１３】
本明細書中で使用されるとき、用語「前駆細胞」は、１つ以上の前駆細胞がそれ自体を再生する能力または１つ以上の特殊化細胞型に分化する能力を獲得することになる、本明細書に記載の方法において使用され得る任意の細胞を包含する。いくつかの態様において、前駆細胞は多能性であるかまたは、多能性になる能力を有する。いくつかの態様において、前駆細胞は、多能性を獲得するために外来因子（例えば、成長因子）の処置に供される。いくつかの態様において、前駆細胞は、全能性（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ）（または全能性（ｏｍｎｉｐｏｔｅｎｔ））幹細胞、多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞（誘導型または非誘導型）、多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞、オリゴ能性幹細胞および単能性幹細胞であり得る。いくつかの態様において、前駆細胞は、胚、乳児、子供、または成体由来であり得る。いくつかの態様において、前駆細胞は、多能性が遺伝子操作またはタンパク質／ペプチド処置を介して付与されるような処置を受ける体細胞であり得る。
【００１４】
発生生物学において、細胞分化は、それほど特殊化されていない細胞がより特殊化された細胞型になる過程である。本明細書中で使用されるとき、用語「指向性分化」は、それほど特殊化されていない細胞が特定の特殊化された標的細胞型になるプロセスを指す。特殊化された標的細胞型の特異性は、初期細胞の運命を定義または変更するために使用できる任意の適用可能な方法によって決定することができる。例示的な方法としては、遺伝子操作、化学的処置、タンパク質処置、および核酸処置が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１５】
本明細書中で使用されるとき、用語「細胞構成素」は、個々の遺伝子、タンパク質、ｍＲＮＡ発現遺伝子、および／または何らかの他の種々の細胞成分もしくは、例えば、当業者によって生物学的実験において（例えば、マイクロアレイまたは免疫組織化学的特徴によって）典型的に測定されるタンパク質修飾度（例えば、リン酸化）のようなタンパク質活性である。生体系、一般的なヒトの疾患、ならびに遺伝子の発見および構造決定の基礎となる生化学的過程の複雑なネットワークに関する重要な発見は、現在、研究プロセスの一部としての細胞構成素の発生量のデータの適用に起因し得る。細胞構成素の発生量データは、バイオマーカーを同定し、疾患の亜型を識別し、および毒性の機序を同定するのに役立つことができる。
【００１６】
本明細書に記載されるように、方法およびシステムは、培養中の胚性腸管発生を模倣するための成長因子操作の時系列を用いて確立される。特に、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の両方のＰＳＣの腸管組織への試験管内分化を発生させるための方法およびシステムが確立されている。
【００１７】
多能性幹細胞（ＰＳＣ）からの胃および小腸のオルガノイドの作製は、研究であるヒトの消化管（ＧＩ）の発生および疾患に革命をもたらした。しかしながら、後腸管発達のしっかりした分子レベルでの理解に一部よるために、大腸オルガノイドを作製するための尽力は後れを取っていた。本明細書で、本発明者らは、臍帯の後側にある腸上皮が発生中および出生後を通じてＳａｔｂ２を発現することを発見した。本発明者らはさらに、ＢＭＰシグナル伝達がカエルおよびマウスの胚においてＳａｔｂ２＋ドメインを確立すること、ならびにＢＭＰシグナル伝達の短時間の活性化が後側のＨＯＸコードを活性化し、ヒトＰＳＣ由来腸管培養物を結腸オルガノイド（ＨＣＯ）へと向かわせるのに十分であることを発見した。試験管内で成長したＨＣＯは、結腸の同一性と一致するマーカー特性および独特の細胞型を有した。マウスへの移植後、ＨＣＯは、ヒト結腸の分子レベルの、細胞レベルのおよび形態学的な特性を有する組織を形成する形態形成および成熟を経験した。開示された結腸オルガノイドは、大腸炎および結腸癌の将来の研究において使用され得る。
【００１８】
一態様において、ヒト結腸オルガノイドの形成を誘導する方法が開示されている。この方法は、（ａ）胚体内胚葉（ＤＥ）をＦＧＦシグナル伝達経路活性化因子およびＷＮＴシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＣＨＩＲＯＮ／ＧＳＫ２阻害剤）と、該ＤＥが中後腸スフェロイドを形成するのに十分な期間接触させるステップと、（ｂ）ステップ（ａ）の中後腸スフェロイドをＢＭＰ活性化因子およびＥＧＦシグナル伝達経路活性化因子と、該ヒト結腸オルガノイドを形成するのに十分な期間接触させるステップとを含み得、ここで該ヒト結腸オルガノイドはＳＡＴＢ２を発現する。
【００１９】
一態様において、ＤＥは、胚性幹細胞、胚性生殖細胞、人工多能性幹細胞、中胚葉細胞、胚体内胚葉細胞、後部内胚葉細胞、後腸細胞、またはこれらの組み合わせから選択される前駆細胞に由来し得る。
【００２０】
一態様において、ＦＧＦシグナル伝達経路活性化因子は、小分子またはタンパク質ＦＧＦシグナル伝達経路活性化因子、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１５、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２、ＦＧＦ２３、またはこれらの組み合わせから選択され得る。ＷＮＴシグナル伝達経路活性化因子は、小分子またはタンパク質Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化因子、好ましくは塩化リチウム、２−アミノ−４，６−二置換ピリミジン（ヘテロ）アリールピリミジン、ＩＱ１、ＱＳ１１、ＮＳＣ６６８０３６、ＤＣＡベータ−カテニン、２−アミノ−４−［３，４−（メチレンジオキシ）−ベンジル−アミノ］−６−（３−メトキシフェニル）ピリミジン、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１６、ＧＳＫ３阻害剤、好ましくはＣＨＩＲＯＮ、またはこれらの組み合わせから選択され得る。一態様において、ＢＭＰ活性化因子は、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７、ＢＭＰ９、ＢＭＰ経路を活性化する小分子、ＢＭＰ経路を活性化するタンパク質から選択され得、以下、すなわち、ノギン、ドルソモルフィン、ＬＤＮ１８９、ＤＭＨ−１、ベントロモフィン（ｖｅｎｔｒｏｍｏｐｈｉｎ）、およびこれらの組み合わせを含み得る。
【００２１】
一態様において、該ＤＥが中後腸スフェロイドを形成するのに十分な期間は、ステップ（ａ）の該中後腸スフェロイドによるＣＤＸ２の発現によって決定され得る。このような測定は、ルーチン方法を用いる当業者の能力の範囲内である。
【００２２】
一態様において、中後腸スフェロイドがヒト結腸オルガノイドを形成するのに十分な期間は、該ヒト結腸オルガノイドの細胞によるＳＡＴＢ２およびＣＤＸ２の発現によって決定され、ＳＡＴＢ２およびＣＤＸ２が発現するとき、中後腸スフェロイドはヒト結腸オルガノイドをすでに形成している。このような測定は、先に列挙した遺伝子の発現が、ステップ（ａ）およびステップ（ｂ）が十分な期間行われたことを示すという点で、時間的測定の代わりに用いられ得る。
【００２３】
一態様において、本明細書に記載の方法によって得られるＨＣＯが開示される。本発明のＨＣＯは、様々な異なる方法で特徴付けられ得る。一態様において、ＨＣＯは、結腸腸内分泌細胞（ＥＥＣ）の存在を特徴とし得る。一態様において、ＨＣＯは、陰窩の存在を特徴とし得、絨毛が実質的にない。一態様において、ＨＣＯは、結腸特異的杯細胞の存在を特徴とし得る。一態様において、ＨＣＯは、パネート細胞を実質的に含まないことを特徴とし得る。一態様において、ＨＣＯは、結腸特異的ホルモンＩＮＳＬ５を分泌する能力を特徴とし得る。腸管オルガノイドは、免疫機能、神経支配、血管、絨毛、およびパネート細胞のうちの１つ以上を含まなくてもよい。
【００２４】
一態様において、結腸組織を形成する方法が開示され、ここに記載の本発明のＨＣＯは、哺乳類、好ましくはげっ歯類、好ましくは免疫無防備状態のげっ歯類、好ましくは免疫無防備状態のマウスの腎被膜下に生着し得る。
【００２５】
一態様において、本明細書に開示されるＨＣＯは、大腸炎、結腸癌、ポリポーシス症候群、および／または過敏性腸症候群から選択される疾患に対して有望な治療薬の有効性および／または毒性を決定するために使用され得る。該方法は、有望な治療薬を本明細書に記載のＨＣＯと、該有望な治療薬の有効性および／または毒性を決定するのに十分な期間、接触させるステップを含み得る。
【００２６】
一態様において、いずれかの先行請求項のＨＣＯに由来する腸管コロノイドが企図される。
【００２７】
いくつかの態様において、多能性であるかまたは多能性になるように誘導されることができる幹細胞が使用され得る。いくつかの態様において、多能性幹細胞は胚性幹細胞に由来し、それが今度は哺乳類初期胚の全能性細胞に由来し、試験管内での無限の未分化増殖が可能である。胚性幹細胞は、初期段階の胚である胚盤胞の内部細胞塊に由来する多能性幹細胞である。胚盤胞から胚性幹細胞を誘導するための方法は当技術分野において周知である。例えば、３つの細胞株（Ｈ１、Ｈ１３、およびＨ１４）は正常なＸＹ核型を有し、２つの細胞株（Ｈ７およびＨ９）は正常なＸＸ核型を有した。ヒト胚性幹細胞Ｈ９（Ｈ９−ｈＥＳＣ）は、本出願に記載の例示的な態様において使用されるが、本明細書に記載の方法およびシステムがいかなる幹細胞へも適用可能であることは当業者によって理解されるであろう。
【００２８】
本発明にしたがった態様において使用することができる追加の幹細胞には、米国国立幹細胞バンク（ＮＳＣＢ）、カリフォルニア大学サンフランシスコ校（ＵＣＳＦ）ヒト胚性幹細胞研究センターが主宰するデータベース、Ｗｉ細胞研究所ＷＩＳＣ細胞バンク、ウィスコンシン大学幹細胞再生医療センター（ＵＷ−ＳＣＲＭＣ）、Ｎｏｖｏｃｅｌｌ社（カリフォルニア州サンディエゴ市）、Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ  ＡＢ（スウェーデン国イェーテボリ市）、ＥＳ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｔｅ  Ｌｔｄ（シンガポール）、イスラエル工科大学Ｔｅｃｈｎｉｏｎ（イスラエル国、ハイファ市）、ならびにプリンストン大学およびペンシルバニア大学が主宰する幹細胞データベース、によって提供されているものか、またはそのデータベースに記載されているものを含むが、これらに限定されない。本発明にしたがった態様において使用することができる例示的な胚性幹細胞は、ＳＡ０１（ＳＡ００１）、ＳＡ０２（ＳＡ００２）、ＥＳ０１（ＨＥＳ−１）、ＥＳ０２（ＨＥＳ−２）、ＥＳ０３（ＨＥＳ−３）、ＥＳ０４（ＨＥＳ−４）、ＥＳ０５（ＨＥＳ−５）、ＥＳ０６（ＨＥＳ−６）、ＢＧ０１（ＢＧＮ−０１）、ＢＧ０２（ＢＧＮ−０２）、ＢＧ０３（ＢＧＮ−０３）、ＴＥ０３（Ｉ３）、ＴＥ０４（Ｉ４）、ＴＥ０６（Ｉ６）、ＵＣ０１（ＨＳＦ１）、ＵＣ０６（ＨＳＦ６）、ＷＡ０１（Ｈ１）、ＷＡ０７（Ｈ７）、ＷＡ０９（Ｈ９）、ＷＡ１３（Ｈ１３）、ＷＡ１４（Ｈ１４）を含むがこれに限定されない。
【００２９】
いくつかの態様において、幹細胞は追加的な特性を組み込むためにさらに改変される。例示的な改変細胞株には、Ｈ１  ＯＣＴ４−ＥＧＦＰ、Ｈ９  Ｃｒｅ−ＬｏｘＰ、Ｈ９  ｈＮａｎｏｇ−ｐＧＺ、Ｈ９  ｈＯｃｔ４−ｐＧＺ、Ｈ９  ｉｎＧＦＰｈＥＳ、およびＨ９  Ｓｙｎ−ＧＦＰが含まれるが、これらに限定されない。
【００３０】
胚性幹細胞についてのさらなる詳細は、例えば、Ｔｈｏｍｓｏｎら、１９９８、「Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓ」、  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２（５３９１）：１１４５−１１４７；Ａｎｄｒｅｗｓら、２００５、「Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ（ＥＳ）  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｅｍｂｒｙｏｎａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ（ＥＣ）  ｃｅｌｌｓ：  ｏｐｐｏｓｉｔｅ  ｓｉｄｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓａｍｅ  ｃｏｉｎ」、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｔｒａｎｓ  ３３：１５２６−１５３０；Ｍａｒｔｉｎ  １９８０、「Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０９（４４５８）：７６８−７７６；Ｅｖａｎｓ  ａｎｄ  Ｋａｕｆｍａｎ、１９８１、「Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｓ」、Ｎａｔｕｒｅ  ２９２（５８１９）：１５４−１５６；Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａら、２００５、「Ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｆｅｅｄｅｒ  ｃｅｌｌｓ」、Ｌａｎｃｅｔ  ３６５（９４７１）：１６３６−１６４１、において見出され得るが、それらの各記載は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００３１】
あるいは、多能性幹細胞は、有性生殖する生物の配偶子を生じる細胞である胚性生殖細胞（ＥＧＣ）に由来し得る。ＥＧＣは、胚性幹細胞の特性のうちの多くを有する後期胚の生殖腺隆起において認められる始原生殖細胞に由来し、胚性幹細胞の特性のうちの多くを有する。胚における始原生殖細胞は、成体において生殖配偶子（精子または卵子）を作製する幹細胞へと発達する。マウスおよびヒトにおいて、適切な条件下、組織培養中で胚性生殖細胞を成長させることが可能である。ＥＧＣおよびＥＳＣはいずれも多能性である。本発明の目的のために、用語「ＥＳＣ」は、時々、ＥＧＣを包含するために広範に使用される。
【００３２】
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）
いくつかの態様において、ｉＰＳＣは、成体線維芽細胞のような非多能性細胞へのある特定の幹細胞関連遺伝子のトランスフェクションによって誘導される。トランスフェクションは、レトロウイルスのようなウイルスベクターを介して達成され得る。トランスフェクトされた遺伝子はマスター転写調節因子Ｏｃｔ−３／４（Ｐｏｕｆ５１）およびＳｏｘ２を含むが、他の遺伝子が誘導の効率を高めることが示唆されている。３〜４週間後、少数のトランスフェクトされた細胞が多能性幹細胞と形態学的および生化学的に類似するようになり、通常は形態学的選択、倍加時間、またはレポーター遺伝子および抗生物質選択を通じて単離される。本明細書中で使用されるとき、ｉＰＳＣには、第一世代ｉＰＳＣ、マウスにおける第二世代ｉＰＳＣ、およびヒト人工多能性幹細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【００３３】
いくつかの態様において、非ウイルス系の技術を採用してｉＰＳＣを作製することができる。いくつかの態様において、アデノウイルスを用いて必要な４つの遺伝子をマウスの皮膚細胞および肝細胞のＤＮＡに輸送して、結果的に胚性幹細胞と同一の細胞を生じることができる。アデノウイルスはそれ自身の遺伝子のいずれも標的宿主に組み込まないので、腫瘍を作り出す危険性が排除される。いくつかの態様において、再プログラミングは、非常に低い効率ではあるが、いかなるウイルストランスフェクション系も用いることなくプラスミドを介して達成することができる。他の態様において、タンパク質の直接送達を使用してｉＰＳＣを作製し、したがってウイルスまたは遺伝子改変の必要性を排除する。いくつかの実施形態において、マウスｉＰＳＣ細胞の作製は、類似の方法論を使用して可能である：ポリアルギニンアンカーを介して細胞内に導かれる特定のタンパク質による細胞の反復処置は、多能性を誘導するのに十分であった。いくつかの態様において、多能性誘導遺伝子の発現は、低酸素条件下で体細胞をＦＧＦ２で処置することによっても上昇することができる。
【００３４】
胚性幹細胞に関するさらなる詳細は、Ｋａｊｉら、２００９、「Ｖｉｒｕｓ  ｆｒｅｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ  ａｎｄ  ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ  ｅｘｃｉｓｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒｓ」、Ｎａｔｕｒｅ  ４５８：７７１−７７５；Ｗｏｌｔｊｅｎら、２００９、「ｐｉｇｇｙＢａｃ  ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｓ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｔｏ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ」、Ｎａｔｕｒｅ  ４５８：７６６−７７０；Ｏｋｉｔａら、２００８、「Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｕｓｅ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｗｉｔｈｏｕｔ  Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２２（５９０３）：９４９−９５３；Ｓｔａｄｔｆｅｌｄら、２００８、「Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｗｉｔｈｏｕｔ  Ｖｉｒａｌ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２２（５９０３）：９４５−９４９；およびＺｈｏｕら、２００９、「Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ４（５）：３８１−３８４；において見出されることができ、それらの各記載は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００３５】
いくつかの態様において、例示的なｉＰＳ細胞株は、ｉＰＳ−ＤＦ１９−９、ｉＰＳ−ＤＦ１９−９、ｉＰＳ−ＤＦ４−３、ｉＰＳ−ＤＦ６−９、ｉＰＳ（包皮）、ｉＰＳ（ＩＭＲ９０）、およびｉＰＳ（ＩＭＲ９０）を含むが、これらに限定されない。
【００３６】
胚体内胚葉
本開示のＨＣＯは、胚体内胚葉（ＤＥ）と呼ばれる単純な細胞シートに由来し得る。前駆細胞から胚体内胚葉を誘導する方法は、Ｄ’Ａｒｍｏｕｒ  ｅｔら２００５およびＳｐｅｎｃｅらによって教示されているように、当該技術分野において周知である。前側ＤＥは前腸ならびに肝臓および膵臓を含むその関連器官を形成し、後側ＤＥは、小腸および大腸、ならびに腎尿路生殖器系の一部を形成する中腸ならびに後腸を形成する。マウス、ニワトリおよびカエルの胚を用いた研究は、原腸胚期のＤＥにおいて前後パターンを確立することがその後の前腸および後腸の発達の前提条件であることを示唆している。Ｗｎｔシグナル伝達経路およびＦＧＦシグナル伝達経路は、このプロセスにとって重要であると考えられており、後部内胚葉および後腸運命を促進するように、ならびに前部内胚葉および前腸運命を抑制するように作用する。後腸の単純な立方体上皮は、最初に擬似層状柱状上皮に発達し、次いで、極性のある柱状上皮と増殖性領域とを絨毛の基部に含有する絨毛に発達し、これは推定前駆細胞ドメインに対応する。
【００３７】
本発明者らは、本明細書において、試験管内でＤＥの腸管組織、特にヒト結腸組織への分化を定方向にするための頑強かつ効率的な方法を記載する。定方向分化は、ｉＰＳＣおよび／またはＤＥ細胞においてあり特定のシグナル伝達経路を選択的に活性化することによって達成され得る。
【００３８】
一般的に腸管発達に関する経路の追加的な詳細は、例えば、Ｓａｎｃｈｏら，２００４，"Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ，"Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０：６９５−７２３、Ｌｏｇａｎ  ａｎｄ  Ｎｕｓｓｅ，２００４，"Ｔｈｅ  Ｗｎｔ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ，"  Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０：７８１−８１０、Ｔａｉｐａｌｅ１  ａｎｄ  Ｂｅａｃｈｙ１，２００１，"Ｔｈｅ  Ｈｅｄｇｅｈｏｇ  ａｎｄ  Ｗｎｔ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ，"Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：３４９−３５４、Ｇｒｅｇｏｒｉｅｆｆ  ａｎｄ  Ｃｌｅｖｅｒｓ，２００５，"Ｗｎｔ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ：  ｆｒｏｍ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ  ｔｏ  ｃａｎｃｅｒ，"Ｇｅｎｅｓ  &  Ｄｅｖ．１９：８７７−８９０において認められ、これらの各々はその全体が本明細書によって参照により本明細書に組み込まれる。ＤＥの発達に関するシグナル伝達経路の機能についてのより多くの詳細は、例えば、Ｚｏｒｎ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，２００９，"Ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｏｒｇａｎ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，"Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２５：２２１−２５１、Ｄｅｓｓｉｍｏｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，"ＦＧＦ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｓ  ｎｅｃｅｓｓａｒｙ  ｆｏｒ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇ  ｇｕｔ  ｔｕｂｅ  ｄｏｍａｉｎｓ  ａｌｏｎｇ  ｔｈｅ  ａｎｔｅｒｉｏｒ−ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  ａｘｉｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ，"Ｍｅｃｈ  Ｄｅｖ  １２３：４２−５５、ＭｃＬｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，"Ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｗｎｔ／｛ｂｅｔａ｝−ｃａｔｅｎｉｎ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｌｉｖｅｒ  ａｎｄ  ｐａｎｃｒｅａｓ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，"Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３４：２２０７−２２１７、Ｗｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｍｅｌｔｏｎ，２０００，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２７：１５６３−１５７２、ｄｅ  Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，"Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ，"Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ６０（７）：１３２２−１３３２において認めることができ、それらの各々は、本明細書によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００３９】
多能性細胞（例えば、ｉＰＳＣまたはＥＳＣ）から胚体内胚葉を作製するための任意の方法が、本明細書に記載の方法に適用可能である。いくつかの態様において、多能性細胞は桑実胚から誘導される。いくつかの態様において、多能性幹細胞は幹細胞である。これらの方法で使用される幹細胞は、胚性幹細胞を含み得るが、これに限定されない。胚性幹細胞は、胚の内部細胞塊または胚の生殖巣堤に由来し得る。胚性幹細胞または生殖細胞は、ヒトを含む種々の哺乳動物種を含むがこれらに限定されない種々の動物種に由来し得る。いくつかの態様において、ヒト胚性幹細胞は胚体内胚葉を作出するために使用される。いくつかの態様において、ヒト胚性生殖細胞は胚体内胚葉を作出するために使用される。いくつかの態様において、ｉＰＳＣは胚体内胚葉を作出するために使用される。
【００４０】
いくつかの態様において、多能性幹細胞からＤＥ細胞への分化過程において１つ以上の成長因子が使用される。分化過程において使用される１つ以上の成長因子は、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーからの成長因子を含み得る。このような態様において、１つ以上の成長因子は、成長因子のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーのノーダル／アクチビンおよび／またはＢＭＰ部分群を含み得る。いくつかの態様において、１つ以上の成長因子は、ノーダル、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＢＭＰ４、Ｗｎｔ３ａ、またはこれらの成長因子のうちのいずれかの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの態様において、胚性幹細胞または生殖細胞およびｉＰＳＣは、１以上の成長因子で６時間以上、１２時間以上、１８時間以上、２４時間以上、３６時間以上、４８時間以上、６０時間以上、７２時間以上、８４時間以上、９６時間以上、１２０時間以上、１５０時間以上、１８０時間以上、または２４０時間以上処置される。いくつかの態様において、胚性幹細胞または生殖細胞およびｉＰＳＣは、１０ｎｇ／ｍｌ以上、２０ｎｇ／ｍｌ以上、５０ｎｇ／ｍｌ以上、７５ｎｇ／ｍｌ以上、１００ｎｇ／ｍｌ以上、１２０ｎｇ／ｍｌ以上、１５０ｎｇ／ｍｌ以上、２００ｎｇ／ｍｌ以上、５００ｎｇ／ｍｌ以上、１，０００ｎｇ／ｍｌ以上、１，２００ｎｇ／ｍｌ以上、１，５００ｎｇ／ｍｌ以上、２，０００ｎｇ／ｍｌ以上、５，０００ｎｇ／ｍｌ以上、７，０００ｎｇ／ｍｌ以上、１０，０００ｎｇ／ｍｌ以上、または１５，０００ｎｇ／ｍｌ以上の濃度の１以上の成長因子で処置される。いくつかの態様において、成長因子の濃度は処置を通して一定レベルで維持される。他の態様において、成長因子の濃度は処置の経過の間に変化する。いくつかの態様において、成長因子は、様々なＨｙＣｌｏｎｅ濃度のウシ胎仔セリン（ＦＢＳ）を含む培地中に懸濁される。当業者は、本明細書に記載された投与計画が、単独でまたは組み合わせで、何らかの既知の成長因子に適用可能であることを理解するであろう。２つ以上の成長因子が使用されるとき、各成長因子の濃度は独立して変動し得る。
【００４１】
いくつかの態様において、胚体内胚葉細胞に富む細胞集団が使用される。いくつかの態様において、胚体内胚葉細胞は単離されているか、または実質的に精製されている。いくつかの態様において、単離または実質的に精製された胚体内胚葉細胞は、ＯＣＴ４、ＡＦＰ、ＴＭ、ＳＰＡＲＣおよび／またはＳＯＸ７マーカーよりも高い程度までＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、および／またはＣＸＲＣ４マーカーを発現する。胚体内胚葉を有する細胞集団を濃縮するための方法も企図される。いくつかの態様において、胚体内胚葉細胞は、混合細胞集団において、胚体内胚葉細胞の表面上には存在するが他の細胞の表面上には存在しない分子に結合する試薬と細胞を接触させること、次いで試薬に結合した細胞を単離することによって、混合細胞集団から単離または実質的に精製することができる。ある特定の態様において、胚体内胚葉細胞の表面上に存在する細胞構成素はＣＸＣＲ４である。
【００４２】
本発明において使用することができるＤＥ細胞を取得または創出するための追加的な方法は、Ｄ’Ａｍｏｕｒらに対する米国特許第７，５１０，８７６号、Ｆｉｓｋらに対する米国特許第７，３２６，５７２号、Ｋｕｂｏ１  ｅｔら，２００４，"Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ  ｆｒｏｍ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ，"Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３１：１６５１−１６６２、Ｄ‘Ａｍｏｕｒら，２００５，"Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ，"Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３：１５３４−１５４１、およびＡｎｇら，１９９３，"Ｔｈｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ  ｌｉｎｅａｇｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ：  ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ＨＮＦ３／ｆｏｒｋｈｅａｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，"Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１９：１３０１−１３１５に記載の方法を含むが、当該方法に限定されず、これらの各々は、本明細書によりその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００４３】
胚体内胚葉から中／後腸スフェロイドへの移行
いくつかの態様において、ＤＥの後側化した内胚葉細胞はさらに１つ以上の特化細胞型に発達する。アクチビン誘導胚体内胚葉（ＤＥ）はさらに、ＦＧＦ／Ｗｎｔ誘導後側内胚葉早口、後腸の規格および形態形成、ならびに最終的には腸管成長、腸細胞、杯細胞、パネート細胞および腸内分泌細胞を含む機能的腸細胞型への細胞分化を促進した前腸培養系を受けることができる。いくつかの態様において、ヒトＰＳＣは、分泌細胞型、内分泌細胞型および吸収性細胞型を含み得る腸管上皮へと試験管内で分化するように効率的に定方向化される。成長因子のような分子は、特定の種類の腸管組織形成を促進するために何らかの発達期に添加され得ることは理解されるであろう。
【００４４】
ＥＳＣおよびｉＰＳＣなどのＰＳＣは、最初に胚体内胚葉（ＤＥ）、次に中／後腸上皮および間充織（例えば、後腸スフェロイド）、および次に腸管組織へと段階的または非段階的な様式で定方向分化を受ける。いくつかの態様において、胚体内胚葉細胞およびｈＥＳＣは、１つ以上の成長因子で処置される。
【００４５】
いくつかの態様において、可溶性ＦＧＦおよびＷｎｔリガンドを用いて、培養中の初期後腸規格を模倣して、定方向分化を通じて、ｉＰＳＣまたはＥＳＣから発達したＤＥを、すべての主要腸細胞型を効率的に生じさせる後腸上皮に変換する。ヒトにおいて、ＤＥの定方向分化は、腸管の発達にとって重要である特定のシグナル伝達経路を選択的に活性化することによって達成される。任意のＦＧＦリガンドと組み合わせて任意のＷｎｔシグナル伝達タンパク質の発現を変化させることが、本明細書に記載の定方向分化を生じさせることができることを、当業者は理解するであろう。
【００４６】
より多数の詳細は、例えば、Ｌｉｕ  ｅｔら，"Ａ  ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ａｇｏｎｉｓｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｗｎｔ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ，"Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ．４４（１３）：１９８７−１９９０（２００５）、Ｍｉｙａｂａｙａｓｈｉら，"Ｗｎｔ／ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ／ＣＢＰ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｍａｉｎｔａｉｎｓ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｍｕｒｉｎｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ，"Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１０４（１３）：５６６８−５６７３（２００７）、Ｚｈａｎｇら，"Ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｓｙｎｅｒｇｉｓｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｗｎｔ／ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ，"Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１０４（１８）：７４４４−７４４８（２００７）、Ｎｅｉｉｅｎｄａｍら，"Ａｎ  ＮＣＡＭ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ＦＧＦ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｇｏｎｉｓｔ，  ｔｈｅ  ＦＧＬ−ｐｅｐｔｉｄｅ，ｉｎｄｕｃｅｓ  ｎｅｕｒｉｔｅ  ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｒａｔ  ｎｅｕｒｏｎｓ，"Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．９１（４）：９２０−９３５（２００４）、Ｓｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ  ＰＤＺ  ｄｏｍａｉｎ，"Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４４（４７）：１５４９５−１５５０３（２００５）、Ｃｏｇｈｌａｎら，"Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ−３  ｍｏｄｕｌａｔｅ  ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ，"  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．７（１０）：７９３−８０３（２０００）、Ｃｏｇｈｌａｎら，"Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ−３  ｍｏｄｕｌａｔｅ  ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ，"Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ&Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７（１０）：７９３−８０３、およびＰａｉら，"Ｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｎｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｃｏｌｏｎ  ｃｅｌｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｉｎｖａｓｉｖｅｎｅｓｓ，"  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ．１５（５）：２１５６−２１６３（２００４）において認められ、これらの各々は、本明細書によりその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００４７】
いくつかの態様において、Ｗｎｔおよび／またはＦＧＦシグナル伝達経路に関連する細胞構成素を標的とするｓｉＲＮＡおよび／またはｓｈＲＮＡを使用して、これらの経路を活性化する。
【００４８】
Ｗｎｔシグナル伝達経路のモジュレーター／活性化因子には、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、およびＷｎｔ１６が含まれる。いくつかの態様において、経路の調節は、上述の経路を活性化する小分子モジュレーターもしくはタンパク質モジュレーター、または上述の経路を活性化するタンパク質の使用を通じてであり得る。例えば、Ｗｎｔ経路の小分子モジュレーターには、塩化リチウム、２−アミノ−４，６−二置換ピリミジン（ヘテロ）アリールピリミジン、ＩＱ１、ＱＳ１１、ＮＳＣ６６８０３６、ＤＣＡベータ−カテニン、２−アミノ−４−［３，４−（メチレンジオキシ）−ベンジル−アミノ］−６−（３−メトキシフェニル）ピリミジンが含まれるが、これらに限定されない。Ｗｎｔシグナル伝達の例示的な天然の阻害剤としては、Ｄｋｋ１、ＳＦＲＰタンパク質およびＦｒｚＢが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、外因性分子には、ＷＡＹ−３１６６０６、ＳＢ−２１６７６３、またはＢＩＯ（６−ブロモインジルビン−３’−オキシム）のような小分子が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、Ｗｎｔおよび／またはＦＧＦシグナル伝達経路に関連する細胞構成素を標的とするｓｉＲＮＡおよび／またはｓｈＲＮＡを使用して、これらの経路を活性化してもよい。標的細胞構成素がＳＦＲＰタンパク質、ＧＳＫ３、Ｄｋｋ１、およびＦｒｚＢを含むがこれらに限定されないことは当業者によって理解されるであろう。追加的なモジュレーターには、Ｗｎｔシグナル伝達経路を活性化するＧＳＫ３を阻害する分子またはタンパク質が含まれる。例示的なＧＳＫ３阻害剤としては、限定されないが、例えば、ＧＳＫ３βを阻害するＣｈｉｒｏｎ／ＣＨＩＲ９９０２１が挙げられる。当業者は、開示された方法を実施するのに適したＧＳＫ３阻害剤を認識するであろう。ＧＳＫ３阻害剤は、約１μＭ〜約１００μＭ、または約２μＭ〜約５０μＭ、または約３μＭ〜約２５μＭの量で投与されてもよい。当業者は、適切な量および期間を容易に認識するであろう。
【００４９】
線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）は、血管新生、創傷治癒、および胚発生に関与する増殖因子のファミリーである。いくつかの態様において、任意のＦＧＦをＷｎｔシグナル伝達経路由来のタンパク質とともに使用することができることは、当業者によって理解されるであろう。いくつかの態様において、可溶性ＦＧＦには、ＦＧＦ４、ＦＧＦ２、およびＦＧＦ３が含まれるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態において、ＦＧＦシグナル経路は、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１５、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２、およびＦＧＦ２３からなる群より選択される１つ以上の分子と前駆細胞を接触させることによって活性化される。いくつかの態様において、ＦＧＦシグナル伝達経路に関連する細胞成分を標的とするｓｉＲＮＡおよび／またはｓｈＲＮＡを用いてこれらの経路を活性化してもよい。ＷｎｔおよびＦＧＦシグナル伝達経路に関連して本明細書中に記載される方法および組成物が例として提供されることは当業者によって理解されるであろう。同様の方法および組成物は、本明細書に開示されている他のシグナル伝達経路へも適用可能である。
【００５０】
いくつかの態様において、ＤＥ培養物は、本明細書に記載のシグナル伝達経路の１つ以上のモジュレーターで６時間以上、１２時間以上、１８時間以上、２４時間以上、３６時間以上、４８時間以上、６０時間以上、７２時間以上、８４時間以上、９６時間以上、１２０時間以上、１５０時間以上、１８０時間以上、２００時間以上、２４０時間以上、２７０時間以上、３００時間以上、３５０時間以上、４００時間以上、５００時間以上、６００時間以上、７００時間以上、８００時間以上、９００時間以上、１，０００時間以上、１，２００時間以上、または１，５００時間以上処置される。
【００５１】
いくつかの態様において、ＤＥ培養物は、１０ｎｇ／ｍｌ以上、２０ｎｇ／ｍｌ以上、５０ｎｇ／ｍｌ以上、７５ｎｇ／ｍｌ以上、１００ｎｇ／ｍｌ以上、１２０ｎｇ／ｍｌ以上、１５０ｎｇ／ｍｌ以上、２００ｎｇ／ｍｌ以上、５００ｎｇ／ｍｌ以上、１，０００ｎｇ／ｍｌ以上、１，２００ｎｇ／ｍｌ以上、１，５００ｎｇ／ｍｌ以上、２，０００ｎｇ／ｍｌ以上、５０００ｎｇ／ｍｌ以上、７，０００ｎｇ／ｍｌ以上、１０，０００ｎｇ／ｍｌ以上、または１５，０００ｎｇ／ｍｌ以上の濃度の本明細書に記載のシグナル伝達経路の１つ以上のモジュレーターで処置される。いくつかの態様において、シグナル伝達分子の濃度は処置を通して一定に維持される。他の態様において、シグナル伝達経路のモジュレーターの濃度は処置の経過の間に変化する。いくつかの態様において、本発明にしたがったシグナル伝達分子は、ＤＭＥＭおよびウシ胎仔セリン（ＦＢＳ）を含む培地中に懸濁される。ＦＢＳは、２％以上、  ５％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、３０％以上、または５０％以上の濃度であり得る。当業者は、本明細書に記載された投与計画が、限定されるものではないがＷｎｔシグナル伝達経路およびＦＧＦシグナル伝達経路における任意の分子を含む、本明細書に記載のシグナル伝達経路の任意の既知のモジュレーターに、単独または組み合わせで適用可能であることを理解するであろう。
【００５２】
ＤＥ培養物を処置するために２つ以上のシグナル伝達分子が使用される態様において、シグナル伝達分子は同時にまたは別個に添加することができる。２つ以上の分子が使用されるとき、各々の濃度は独立して変わり得る。
【００５３】
ＣＤＸ２の発現は、ＤＥがＦＧＦシグナル伝達活性化因子およびＷｎｔシグナル伝達活性化因子、例えばＦＧＦ４およびＷｎｔ３ａとともに一定期間、例えば１２時間以上、１８時間以上、２４時間以上、３６時間以上、４８時間以上、６０時間以上、または９０時間以上インキュベートされた後に後腸形成の傾向を明らかにするために使用され得る。いくつかの態様において、ＣＤＸ２の長時間の発現によって測定される場合、安定した後部内胚葉表現型を達成するためには、より長い期間のインキュベーションが必要とされる。このような態様において、インキュベーションの期間は、６０時間以上，"７２時間以上、８４時間以上、９６時間以上、１０８時間以上、１２０時間以上、１４０時間以上、１６０時間以上、１８０時間以上、２００時間以上、２４０時間以上、または３００時間以上であり得る。
【００５４】
あるいは、いくつかの態様において、前腸マーカーであるＳｏｘ２、Ｐｄｘ１、Ｃｌｄｎ１８、およびアルブミンのような細胞構成素の非存在は、定方向後腸形成を明らかにするために使用することができる。いくつかの態様において、腸管転写因子ＣＤＸ２、ＫＬＦ５、およびＳＯＸ９を使用して腸管発達を表すことができる。いくつかの態様において、ＧＡＴＡ６タンパク質発現を使用して、腸発生を表すことができる。これらの態様において、インキュベーション期間は、１２時間以上、１８時間以上、２４時間以上、３６時間以上、４８時間以上、６０時間以上、または９０時間以上であり得る。あるいは、インキュベーション期間は、６０時間以上、７２時間以上、８４時間以上、９６時間以上、１０８時間以上、１２０時間以上、１４０時間以上、１６０時間以上、１８０時間以上、２００時間以上、２４０時間以上、または３００時間以上であり得る。
【００５５】
いくつかの態様において、細胞構成素の存在量データ、例えばタンパク質および／または遺伝子発現レベルは、関連シグナル伝達経路における一次抗体および／または二次抗体標的分子を用いた免疫組織化学によって決定される。他の態様において、細胞構成素の存在量データ、例えばタンパク質および／または遺伝子発現レベルは、マイクロアレイ分析によって決定される。
【００５６】
さらに代替的には、形態学的変化を用いて定方向分化の進行を表すことができる。いくつかの態様において、後腸スフェロイドは、さらなる成熟のために３次元培養条件にさらに供される。他の態様において、間充織細胞に囲まれた非常に複雑な上皮が後腸スフェロイド形成後に観察することができる。加えて、腸管オルガノイド、極性化した柱状上皮、杯細胞、または平滑筋細胞は、６日以上、７日以上、９日以上、１０日以上、１２日以上、１５日以上、２０日以上、２５日以上、２８日以上、３２日以上、３６日以上、４０日以上、４５日以上、５０日以上、または６０日以上観察することができる。
【００５７】
中／後腸スフェロイドから結腸オルガノイドへの移行
ＦＧＦおよびＷＮＴシグナル伝達に加えて、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、具体的にはＢＭＰ２およびＢＭＰ４は、後側／後腸の運命を促進し、前腸の運命を抑制することができることは同定されてきた。加えて、ＢＭＰシグナル伝達は、腸管の異なる部域型の形成を調節する。後腸期後のノギンによるＢＭＰの阻害は、近位腸管の運命（十二指腸／空腸）を促進する。後腸期後のＢＭＰシグナル伝達の活性化は、より遠位の腸管細胞運命（盲腸／結腸）を促進する。
【００５８】
ＢＭＰの活性化は、該ヒト結腸オルガノイドを形成するのに十分な時間、中／後腸スフェロイドをＢＭＰ活性化因子およびＥＧＦシグナル伝達経路活性化因子と接触させることによって実施することができる。インキュベーション期間の境界は、ヒト結腸オルガノイドがＳＡＴＢ２を発現する時点によって定義され得る。適切なＢＭＰ活性化因子およびＥＧＦシグナル伝達経路活性化因子は、当業者によって容易に理解されるであろう。適切なＢＭＰ活性化因子としては、例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７、ＢＭＰ９およびタンパク質もしくはベントロモフィン（ｖｅｎｔｒｏｍｏｐｈｉｎ）のような小分子アゴニスト（Ｇｅｎｔｈｅ  ｅｔ  ａｌ．２０１７）またはアゴニストとして役立つタンパク質が挙げられ得る。ＢＭＰ活性化因子およびＥＧＦシグナル伝達経路活性化因子は、中／後腸スフェロイドと約１日〜約３日間接触させることができる。ＢＭＰシグナル伝達は、最初の３日以内に活発になることがある。一態様において、ＢＭＰ活性化因子とＥＧＦシグナル伝達経路活性化因子との接触ステップは、２４時間〜約１０日、または約４８時間〜約９日、または約３日〜約８日、または約４日〜約８日、または約５日〜約７日である。適切なＥＧＦ活性化因子は、例えば、ＴＧＦアルファ、ＨＢ−ＥＧＦ、アンフィレグリン、エピゲン、ベータセルリンおよび、ｄｂ−ｃＡＭＰのような小分子を含み得る。ＥＧＦ活性化因子は、約１０ｎｇ／ｍＬ〜１０，０００ｎｇ／ＭＬの濃度で、約２４時間〜約１０日、または約４８時間〜約９日、または約３日〜約８日、または約４日〜約８日、または約５日〜約７日、中／後腸スフェロイドと接触させることができる。
【００５９】
中／後腸スフェロイドは、５ｎｇ／ｍｌ以上、２０ｎｇ／ｍｌ以上、５０ｎｇ／ｍｌ以上、７５ｎｇ／ｍｌ以上、１００ｎｇ／ｍｌ以上、１２０ｎｇ／ｍｌ以上、１５０ｎｇ／ｍｌ以上、２００ｎｇ／ｍｌ以上、５００ｎｇ／ｍｌ以上、１，０００ｎｇ／ｍｌ以上、１，２００ｎｇ／ｍｌ以上、１，５００ｎｇ／ｍｌ以上、２，０００ｎｇ／ｍｌ以上、５，０００ｎｇ／ｍｌ以上、７，０００ｎｇ／ｍｌ以上、１０，０００ｎｇ／ｍｌ以上、または１５，０００ｎｇ／ｍｌ以上の濃度のＢＭＰ活性化因子および／またはＥＧＦ活性化因子と、単独でまたは組み合わされて接触させることができる。いくつかの実施形態では、シグナル伝達分子の濃度は処置の間、一定に維持される。他の実施形態では、シグナル伝達経路の分子の濃度は、処置の過程で変化する。いくつかの実施形態において、本発明によるシグナル伝達分子は、ＤＭＥＭおよびウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含む培地に懸濁される。ＦＢＳは、２％以上、５％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、３０％以上、または５０％以上の濃度であり得る。当業者は、本明細書に記載の投与計画が本明細書に記載のシグナル伝達経路の任意の既知の分子に単独でまたは組み合わせで適用可能であることを理解するであろう。
【実施例】
【００６０】
以下の非限定的な例は、本明細書に開示された本発明の態様をさらに説明するために提供される。以下の例に開示された技術が、本発明の実施において十分に機能することが見出されたアプローチを表し、したがってその実施のための様式の例を構成するとみなすことができることは、当業者によって認識されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示に鑑みて、開示された具体的な態様において多くの変更を行うことができ、それでも本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく同様のまたは類似の結果を得ることができることを認識している。
【００６１】
消化管の上皮は、原腸形成の間に確立される一次胚葉のうちの１つである胚体内胚葉に由来する。腸管形態形成の過程は、胚体内胚葉を、前腸、中腸および後腸を有する原始腸管へと変換する。中腸は小腸および近位大腸を生じ、後腸は遠位大腸および直腸を生じる（Ｚｏｒｎ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，２００９）。小腸は３つのセグメントにさらに細分される。栄養素の吸収および鉄の取り込みに関与する十二指腸、栄養素の消化および吸収に関与する空腸、ならびに胆汁酸およびビタミンＢ１２の吸収に関与する回腸である（Ｊｅｅｊｅｅｂｈｏｙ，２００２）。大腸は盲腸、結腸および直腸に細分され、それらはすべて水および電解質の吸収に関与している（Ｊｅｅｊｅｅｂｈｏｙ，２００２）。近年の進歩は小腸の発達に焦点を当ててきたが（Ｆｉｎｋｂｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５、Ｓｐｅｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１、Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）、ヒトの大腸／結腸の発達についてはほとんど知られていない。さらに、消化（ＧＩ）管のこの領域に影響を及ぼす疾患である大腸炎、結腸癌、ポリポーシス症候群および過敏性腸症候群が広く認められている（Ｍｏｌｏｄｅｃｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２、Ｓｉｅｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４、ＺｂｕｋおよびＥｎｇ，２００７）。ポリープおよび腫瘍は小腸において優先的に形成され、結腸または直腸においてはまれに形成されるので、ポリポーシス症候群および腸癌の動物モデルは限られている（Ｈａｒａｍｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４、Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４、Ｍｏｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９９０）。
【００６２】
本発明者らは、小腸の胚発生に近似した定方向分化の段階を通じてヒト多能性幹細胞を腸管組織へと分化させることができる方法をすでに記載した。第一に、多能性幹細胞はアクチビンＡによる処置により胚体内胚葉へと分化する。高レベルのＷｎｔおよびＦＧＦへの胚体内胚葉の曝露は、中／後腸管スフェロイドへの形態形成を誘導する。一旦形成されると、これらの中腸／後腸スフェロイドは、腸管の成長に好ましい条件下、３次元培養で成長させるとき、生体内での小腸の発達に近い段階を経て移行し、ヒト腸管オルガノイド（ＨＩＯ）を形成する（Ｓｐｅｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。ＨＩＯは小腸の同一性を有し、小腸の生物学的性質をモデル化するために極めて有用であることが証明されている（Ｂｏｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４、Ｆｉｎｋｂｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５、Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４、Ｘｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。しかしながら、今まで、ＰＳＣ由来の大腸オルガノイドは開発されておらず、大腸における疾患の有病率を考えると、このようなシステムは、消化管のこの領域における発達および疾患の機序の調査を可能にするであろう。
【００６３】
大腸オルガノイドを作製する方法を開発するために、本発明者らは最初に、カエル、マウス、およびヒトにおける推定大腸上皮の明確なマーカーとしてＳａｔｂ２を同定した。Ｓａｔｂ２をマーカーとして使用すると、本発明者らは、後腹側発生におけるＢＭＰの既知の役割と一致する、カエルおよびマウスの後腸内胚葉の特定にＢＭＰシグナル伝達が必要とされることを示した（Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３、Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５、Ｓｈｅｒｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１、Ｔｉｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００２、Ｗｉｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。その上、３日間のＰＳＣ由来腸管培養におけるＢＭＰシグナル伝達の刺激は、後側ＨＯＸコードおよびＳＡＴＢ２発現結腸オルガノイドの形成を誘導するのに十分である。ヒト結腸オルガノイド（ＨＣＯ）は、大腸と一致するマーカー特性および細胞型を有していた。さらに、ＨＩＯではなく、ＨＣＯがＮＥＵＲＯＧ３の発現に応じて結腸腸内分泌細胞（ＥＥＣ）を形成し、このことはＨＣＯが結腸領域に機能的に関与していることを実証した。加えて、免疫無防備状態のマウスの腎被膜下に生着し、生体内で８〜１０週間成長したＨＣＯは、それらの部域的な同一性を維持し、結腸の形態学的性質を有する組織を形成し、結腸特異的細胞型を含有し、増殖および分化の領域を有し、平滑筋層を十分に形成した。生体内で成長したオルガノイドから誘導された腸管のエンテロイドおよびコロノイドは、部域的な同一性を維持していた。最後に、ＲＮＡ配列分析は、ＨＩＯおよびＨＣＯが実質的な成熟を経験し、それぞれ小腸および大腸の同一性と一致する部域的なマーカーを発現することを実証した。要約すると、本発明者らは、カエルおよびマウスにおいて進化的に保存されたＢＭＰ−ＨＯＸ経路を同定し、これを使用して後腸パターン形成およびヒト結腸オルガノイドの形成を定方向化した。
【００６４】
結果
ＳＡＴＢ２発現は、胚および成体の後部の腸の腸内胚葉を標識する。
【００６５】
中腸および後腸、推定上の小腸および大腸を確立する分子経路は、十分に定義されたマーカーが少数であることに一部より、ほとんど理解されていない。このことは、ヒトＰＳＣから部域的に異なる腸管オルガノイド、特に大腸オルガノイドへの分化を定方向化する能力を制限してきた。それゆえ、本発明者らは、マウス胚腸管の異なるドメインを区別するマーカーを同定し、これらを使用して初期腸をパターン形成するシグナル伝達経路を調査した。従来の報告と一致して、本発明者らは、胎生９．５日マウス胚において、Ｇａｔａ４が後部前腸から卵黄茎までの腸内胚葉を標識することを見出した（図８Ａ）（Ａｒｏｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４、Ｂａｔｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００８、Ｂｅｕｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００８ａ、Ｂｅｕｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００７ａ、Ｂｅｕｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７ｂ、Ｂｅｕｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０、Ｂｅｕｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００８ｂ、Ｂｏｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００７、Ｋｏｈｌｎｈｏｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６、Ｐａｔａｎｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２ａ、Ｐａｔａｎｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２ｂ、Ｓｈｅｒｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００９、Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。発生の後期（胎生１１．５日胚〜胎生１６．５日胚）において、Ｇａｔａ４は前腸を明確に標識し続けたが後腸は標識しなかった（図８Ｂ〜Ｄ、Ｉ〜Ｊ）。この発現ドメインは、マウス（非表示）およびヒト（図８Ｋ〜Ｌ）の両方において成体期までそのままである。
【００６６】
後部胎児腸のマーカーを同定するために、本発明者らは、結腸に多い遺伝子についてＧＮＣＰｒｏ（商標）、ＴｉＧＥＲおよびヒトタンパク質アトラスのような公共の発現データベースを調べ、有望な大腸マーカーとしてＳａｔｂ２を見出した。Ｓａｔｂ２は、ＣＵＴクラスのホメオボックス遺伝子のメンバーであり（Ｈｏｌｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）、これは核マトリックス付着領域を結合し、クロマチンリモデリングに関与している（Ｇｙｏｒｇｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。免疫染色は、Ｓａｔｂ２タンパク質が胎生９〜９．５日胚でマウス胚の後部内胚葉において最初に検出され、卵黄茎でＧａｔａ４との目立たない発現境界を形成し（図８Ａ）、このことはＳａｔｂ２＋ドメインが、すでに同定されているよりも幅広い発現ドメインである後部腸を標識することを示唆した（Ｄｏｂｒｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。Ｓａｔｂ２発現は、発生中（胎生１１．５〜１６．５日）（図８Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｊ）にマウス（非表示）およびヒト（図８Ｌ）における出生後結腸の後部腸内胚葉を標識し続けた。公表されたヒトプロテオームおよびＲＮＡ配列のデータを用いて、本発明者らは、ＧＡＴＡ４およびＳＡＴＢ２がそれぞれヒト胎児および成体の腸管の近位領域および遠位領域を区別して標識することを確認した（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０、Ｆａｇｅｒｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）（図９Ａ〜Ｃ）。これらのデータは、Ｇａｔａ４およびＳａｔｂ２の発現境界がマウスの発生の初期に確立され、マウスおよびヒトにおいて発生中の小腸および大腸の将来の境界を標識することを実証している。
【００６７】
胚後腸内胚葉におけるＳａｔｂ２発現にはＢＭＰシグナル伝達が必要とされる。
【００６８】
本発明者らは次に、胚において後部腸の運命を促進する経路を同定するためのマーカーとしてＳａｔｂ２を使用した。ゼブラフィッシュ、ゼノパス（Ｘｅｎｏｐｕｓ）、ニワトリおよびマウスの発生のいくつかの段階において内胚葉をパターン形成するうえでのその既知の役割を考慮して、本発明者らは最初に、ＢＭＰシグナル伝達が後部腸管において活発であるかどうかを決定した（Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３、Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５、Ｓｈｅｒｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１、Ｔｉｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００２、Ｗｉｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。本発明者らは、リン酸化Ｓｍａｄ１／５／８（ｐＳＭＡＤ１／５／８）によって測定されるように、ＢＭＰシグナル伝達が胎生８．５日マウス胚の後部腸管の内胚葉および中胚葉において非常に活発であることを観察した（図１Ａ〜Ｂ）。ＢＭＰシグナル伝達が後部腸管のパターン形成に必要とされるかどうかを決定するために、本発明者らは、ＢＭＰシグナル伝達阻害剤ＤＭＨ−１中で初期の前頭葉期マウス胚（胎生７．５日）を培養した（図１Ｃ）。ＤＭＨ−１処置の４８時間後、本発明者らは、ｐＳｍａｄ１／５／８レベルの有意な低減および後部腸管におけるＳａｔｂ２発現の喪失を観察した（図２Ｄ〜Ｋ）。加えて、Ｓａｔｂ２発現は、ゼブラフィッシュにおける先行研究と一致するＤＭＨ−１処置胚の第１腕弓において喪失された（Ｓｈｅｅｈａｎ−Ｒｏｏｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。ＤＭＨ−１は、ｐＳｍａｄ２／３レベルによって測定されるようにＴＧＦＩ３シグナル伝達に何ら影響を及ぼさなかった（図１Ｆ）。脊椎動物種にわたるＳａｔｂ２の進化的保存を考慮して（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）、本発明者らは、カエル胚の後腸におけるＳａｔｂ２発現にＢＭＰが必要とされるかどうかを調べた（図２Ｌ）。マウスと同様に、ＤＭＨ−１によるゼノパス（Ｘｅｎｏｐｕｓ）胚の処置（図１Ｍ〜Ｖ）、またはＢＭＰアンタゴニストであるノギンのトランスジェニック発現（非表示）は、後腸および上腕弓におけるＳａｔｂ２発現の喪失を結果的にもたらした。ＢＭＰシグナル伝達は、保存されたエンハンサーへのＳｍａｄ１／５の直接結合を介してマウス胚下顎のＳａｔｂ２発現を直接調節することが示されており（Ｂｏｎｉｌｌａ−Ｃｌａｕｄｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）、Ｓａｔｂ２も腸における直接的なＢＭＰ標的であり得ることを示唆している。まとめると、これらの結果は脊椎動物における保存された経路を明らかにし、それによって遠位回腸および大腸を生じる発達中の腸管の最後部領域を規定するためにＢＭＰシグナル伝達が必要とされる。
【００６９】
ＢＭＰシグナル伝達はヒト腸管培養における後部運命を促進する。
【００７０】
本発明者らは次に、ＢＭＰシグナル伝達が、すでに記載されたように（Ｓｐｅｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）ヒトＰＳＣ由来の新生ＣＤＸ２＋腸管スフェロイドを使用してヒトにおける後部腸管の運命を促進するために使用することができるかどうかを調べた。本発明者らは、ＢＭＰ阻害剤ノギンまたはＢＭＰ２をそれぞれ使用して、ＢＭＰシグナル伝達を阻害または活性化し（図２Ａ）、核ｐＳＭＡＤ１／５／８の蓄積によりＢＭＰシグナル伝達レベルを監視した。対照培養物は低レベルのｐＳＭＡＤ１／５／８タンパク質を有し、ノギンの添加はこの染色を消失させた（図２Ｂ〜Ｄ）。対照的に、ＢＭＰ２の添加は上皮細胞および中胚葉細胞の両方においてｐＳＭＡＤ１５８の迅速な蓄積を引き起こし、両方の細胞型がマウス胚において本発明者らが観察したものと同様のＢＭＰシグナルに応答することを示唆した（図１Ａ〜Ｂ）。ｐＳｍａｄ１／５／８染色の特異性は成体マウス結腸を用いて確認され、このことはすでに報告されたように（Ｈａｒｄｗｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００４、ｖａｎ  Ｄｏｐ  ｅｔ  ａｌ．，２００９、Ｗｈｉｓｓｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）、ｐＳｍａｄ１／５／８染色が上部陰窩の分化した区画に限定されることを示した。オルガノイドのさらなる分析は、３日間のＢＭＰ２処置がノギンおよび対照培養物と比較して、上皮において高レベルのＳＡＴＢ２タンパク質を誘導するのに十分であることを明らかにした（図２Ｆ〜Ｉ）。このことは、短いパルスのＢＭＰ活性がスフェロイド内胚葉を後部腸管の運命へとパターン形成するのに十分であることを示唆している。
【００７１】
ＢＭＰシグナル伝達は内胚葉の前後パターン形成を調節することが知られているが、哺乳類において前後軸に沿った位置的同一性を最終的に与える転写ネットワークについてはあまり知られていない。本発明者らは、ＢＭＰシグナル伝達が、発生中のヒト腸において後部ドメインをどのように確立するかを同定するために、ヒト腸管スフェロイドおよびＲＮＡ配列を使用した。主成分分析は、ＢＭＰで３日間処置した腸管スフェロイドが、ノギンおよび対照で処置したオルガノイドとは別にクラスター化したことが明らかになった（図２Ｊ）。遺伝子オントロジー期間（ＧＯ期間）の検討は、ＢＭＰシグナル伝達の調節が、器官形態形成、細胞間シグナル伝達、パターン指定およびＢＭＰシグナル伝達に対する細胞応答を含む複数の生物学的過程に影響することを明らかにした（図２Ｋ）。前後パターン形成の最も決定的な調節因子はＨＯＸ遺伝子であるので、本発明者らは、ＢＭＰ活性化が前側ＨＯＸ遺伝子の下方調節および後側ＨＯＸ遺伝子の上方調節を結果的にもたらすことを見出した（図２Ｌ）。特に本発明者らは、ＨＯＸ１０、１１、１２および１３群の複数のパラログのＢＭＰ媒介性増加を観察した。これらの結果は、ＢＭＰシグナル伝達がヒト腸管のパターン形成中に前後ｈｏｘコードを広く調節することを実証しており、遠位消化管が最初に特異化される機序を示唆している。
【００７２】
ＢＭＰシグナル伝達はＳＨＨの下流で作用して後部ＨＯＸコードを誘導する。
【００７３】
先行研究は、Ｓｏｎｉｃ  Ｈｅｄｇｅｈｏｇ（Ｓｈｈ）がニワトリ胚の後部腸パターン形成中にＢｍｐ４およびＨｏｘ１３発現の上流で作用することを示唆している（図１０Ａ）（Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。しかしながら、ＢＭＰとＨｏｘ１３との間の相対的な上位性の関連性（図１０Ｂ）は、中腸および後腸におけるＢｍｐ４過剰発現によって引き起こされる胚の致死性のために調べられなかった（Ｄｅ  Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５、Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。本発明者らは、後部腸管パターン形成中のＳＨＨ−ＢＭＰ−ＨＯＸ１３の上位性の関連性をより良好にモデル化するためにヒト腸管培養物を使用した。平滑化アゴニストＳＡＧを用いたヘッジホッグシグナル伝達の活性化は、ＢＭＰシグナル伝達標的遺伝子であるＭＳＸ２ならびに間充織ＨＯＸ因子であるＨＯＸＡ１３およびＨＯＸＤ１３の濃度依存的活性化をもたらした（図１０Ｃ）。しかしながら、これらの因子のＳＡＧ媒介活性化は、ＢＭＰ２によって媒介される活性化のほんの一部でしかなかった（図１０Ｃ）。本発明者らはさらに、ＨＨシグナル伝達がＨＯＸＡ１３を活性化する能力がＢＭＰに完全に依存することを示し（図１０Ｄ〜Ｅ）、ＢＭＰシグナル伝達がすでに報告されたようにＳＨＨの下流で機能することを確認した（Ｓｈｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５、Ｗａｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２、Ｗａｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９、Ｗａｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。ＢＭＰシグナル伝達がＨＨシグナル伝達の下流で後側ＨＯＸプログラムを活性化するのに十分であるかどうかはまだ決定されていない。それゆえ、本発明者らは、ＳＨＨ阻害剤であるシクロパミンの存在下でＢＭＰによるＨＯＸＡ１３誘導を検討し、ＳＨＨシグナル伝達が阻害されたときに、ＢＭＰ２がＨＯＸＡ１３を誘導するのに十分であることを見出した（図１０Ｆ〜Ｇ）。このことと一致して、ＢＭＰパターン形成中のＳＨＨシグナル伝達の活性化はＳＡＴＢ２発現を改善しなかった（図１１Ａ）。ゼノパス（Ｘｅｎｏｐｕｓ）における実験は、この機序が進化的に保存されていることを示唆しているＳＨＨとＢＭＰとの間のこの上位性の関連性を確認した（データ非表示）。まとめると、本発明者らのデータは、ＢＭＰシグナル伝達が後部ＨＯＸコードを活性化するのに十分であり、ＨＨシグナル伝達の下流でそのように活性化することを示唆している。
【００７４】
試験管内で培養されたＢＭＰ由来オルガノイドは遠位の同一性を維持する。
【００７５】
本発明者らは次に、３日間のＢＭＰ処置が２５日間のオルガノイドの長期培養後に、安定した部域的同一性を与えるのに十分であるかどうかを調べた（図３）。ＯＮＥＣＵＴ１（近位小腸のマーカー）のレベルは、ノギンおよび対照で処置したオルガノイドにおいて最も高く、ＢＭＰ２で処置したオルガノイドにおいては非存在であった（図３Ａ〜Ｄ）。逆に、ＳＡＴＢ２は、ノギンおよび対照で処置したオルガノイドの上皮においては非存在であったが、ＢＭＰ２で処置したオルガノイドのほぼすべてのＣＤＸ２＋上皮細胞においては広範に発現していた（図３Ｅ〜Ｈ、図１１Ａ）。重要なことに、ＢＭＰシグナル伝達の調節は、胚性幹細胞株Ｈ１およびＨ９ならびに人工多能性幹細胞株（ＩＰＳＣ  ５４．１およびＩＰＳＣ  ７２．３）を含む複数のヒトＰＳＣ株に対して同様の近位−遠位パターン形成効果を有した（後述）。本発明者らは、試験管内でＨＩＯに存在することが知られている他の細胞型の存在におそらく起因して、ノギンおよび対照のオルガノイドにおける非上皮ＳＡＴＢ２発現を頻繁に観察した（データ非表示）。後部上皮および間充織においてそれぞれ発現するＨＯＸＢ１３およびＨＯＸＤ１３の検討は、ＢＭＰ処置オルガノイドが試験管内での長期培養後に後部パターン形成を維持することをさらに明らかにした（図１１Ｂ〜Ｃ）。
【００７６】
杯細胞は、近位小腸から遠位大腸まで低から高への勾配で分布しており（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｐｉｎｅｉｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）、本発明者らは、杯細胞数が近位オルガノイドにおいてより低く、遠位オルガノイドにおいてより高いかどうか調べた。２８日目のＭＵＣ２染色の分析は、ＢＭＰ２処置オルガノイドが、より近位のノギン処置オルガノイドおよび対照オルガノイドと比較して、細胞内ＭＵＣ２によって可視化されるように多数の杯細胞を有することを明らかにし（図３Ｉ〜Ｌ）、このことは、まれにしか細胞内ＭＵＣ２染色を有していなかった。本発明者らはさらに、結腸における杯細胞のサブセットによって発現するが小腸内では発現しないマーカーＭＵＣ５Ｂを使用して、杯細胞の部域的同一性を確認した（ｖａｎ  Ｋｌｉｎｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。ＭＵＣ５Ｂ染色は、ノギンおよび対照で処置した２８日齢オルガノイドにおいては非存在であったが、ＢＭＰ２処置オルガノイドにおいては存在した（図４Ｍ〜Ｐ）。杯細胞の形態学的性質は、より加齢したオルガノイドにおいてより成熟し（図１１Ｄ〜Ｉ）、ここで、４４日齢のＢＭＰで処置したオルガノイドにおいて、本発明者らは、粘液をオルガノイドの内腔へと分泌する過程において杯細胞を観察した（図１１Ｊ〜Ｌ）。ＢＭＰ処置オルガノイドにおいて粘液分泌を観察することができることは、このオルガノイドのシステムが、粘液分泌および腸の病態生理学における粘液の役割を研究するのに有用であろうことを示唆している。
【００７７】
オルガノイドの部域的パターンは培養２８日後に安定しているが、本発明者らは初期のパターン形成が最初の３日間の処置後に完全に確立されたかどうかを調べたいと考えた。そうするために、本発明者らは、３日間のノギン処置をしたスフェロイドを３日間ＢＭＰ２含有培地に移し、逆に３日間のＢＭＰ処置したスフェロイドを３日間ノギン含有培地に移した。ノギンを用いて作製された近位オルガノイドは、ＢＭＰ２に応答してＳＡＴＢ２を発現せず、近位の運命が３日間のパターン形成後において安定していることを実証した（図１１Ａ）。逆の実験において、３日間のＢＭＰ２処置は、安定した遠位運命を誘導するのに十分であったが、オルガノイドのサブセットはノギン処置に応答してＳＡＴＢ２発現を喪失した（図１１Ａ）。３日間のＢＭＰ２処置は、試験管内および生体内で安定である結腸運命を誘導するのに十分であるが（図１２）、初期後部腸管において可塑性が残っている。このことは、妊娠中期ラット胚の結腸内胚葉が小腸内胚葉よりも部域的に可塑性であるという観察と一致する（Ｒａｔｉｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。
【００７８】
ＢＭＰシグナル伝達によるオルガノイド間充織のパターン形成。
【００７９】
ＢＭＰシグナル伝達の刺激はオルガノイド上皮に部域的同一性を与えたが、本発明者らは、パターン形成中のＢＭＰ２処置オルガノイドの非上皮区画におけるｐＳＭＡＤ１／５／８、および間充織において発現することが知られている後側ＨＯＸ因子の上方調節も観察した。間充織のパターン形成が安定しているか、それとも上皮から入力される持続したパターン形成を必要としたかを決定するために、本発明者らは、間葉細胞培養物を２〜３週間単離して増殖させ、それらを部域的ＨＯＸ遺伝子の発現について分析した。間葉系培養物はＥ−カドヘリン発現細胞を欠失しており、間充織から主として構成されていることを示唆した（図３Ｑ）。近位腸管間充織に多いＨＯＸＤ３の分析（Ｙａｈａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）は、ノギンおよび対照で処置したオルガノイドに由来する間充織が安定した近位同一性を有するのに対し、ＢＭＰ処置オルガノイドがＨＯＸＤ３の発現低下（図３Ｒ）および高レベルのＨＯＸＡ１３（図３Ｓ）を有しており、後者はヒト結腸線維芽細胞において発現し続ける（Ｈｉｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。まとめると、これらのデータは、ＢＭＰシグナル伝達の早期調節が上皮および間充織の両方をパターン形成すること、ならびに間充織パターン形成が上皮の非存在下でさえも安定であることを示唆している。
【００８０】
結腸腸内分泌細胞の誘導はＢＭＰ２処置オルガノイドに限られている。
【００８１】
いくつかのＥＣＣサブタイプの発生は、小腸および大腸の特定のセグメントに部域的に制限されている。例えば、タンパク質ＩＮＳＬ５の発現は結腸ＥＥＣに限定されている（Ｂｕｒｎｉｃｋａ−Ｔｕｒｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２、Ｔｈａｎａｓｕｐａｗａｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。結腸同一性の機能検査として、本発明者らは、結腸ＥＥＣマーカーであるＩＮＳＬ５の実験的誘導が、ＢＭＰ２処置遠位オルガノイドに限定されるかどうかを決定した。これを行うために、本発明者らは、すでに記載したように（ＭｃＣｒａｃｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７、ＭｃＣｒａｃｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）、ドキシサイクリン（ＤＯＸ）誘導性ＮＥＵＲＯＧ３発現カセットを有するｉＰＳＣ株を用いて前内分泌転写因子ＮＥＵＲＯＧ３を誘導発現させた（図４Ａ）。本発明者らは、培養物において６時間のＤＯＸパルスを行い、追加の７日間の後、ＣＨＧＡ陽性細胞によって測定されるようにＥＥＣの強い誘導を観察した（図４Ｂ〜Ｉ）。しかしながら、本発明者らは、ＢＭＰ２処置オルガノイド中のＩＮＳＬ５陽性細胞のみを観察し、これをＱＰＣＲ分析によって確認した（図４Ｃ〜Ｈ、Ｊ）。ＩＮＳＬ５発現細胞が結腸内にのみ存在することを考えると、本発明者らのデータは、ＢＭＰ２処置オルガノイドが結腸運命に機能的に関与していることを強く示唆している。ＳＡＴＢ２、ＭＵＣ５ＢおよびＨＯＸＡ１３のような遠位マーカーの発現ならびに結腸特異的ＥＣＣを作製する応答能は、ＢＭＰ２処置オルガノイドが結腸であり、したがってヒト結腸オルガノイド（ＨＣＯ）と称されるであろうという結論を支持する。
【００８２】
パターン形成したオルガノイドの部域的同一性は生体内で維持されている。
【００８３】
マウスおよびヒト胎児腸管の先行研究は、腸管の異なる部域の部域同一性および組織形態が免疫無防備状態マウスにおける同所性移植および成長の後で維持されていることを実証してきた（Ｄｕｌｕｃ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４、Ｓａｖｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。試験管内でパターン形成されたＨＩＯおよびＨＣＯが部域的同一性を維持し、小腸および大腸の組織へと成長するかどうかを決定するために、本発明者らは、ＨＩＯおよびＨＣＯをマウス腎被膜下に６〜１０週間移植し、本発明者らは、小腸組織へのＨＩＯ成熟における結果をすでに実証した（Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。本発明者らは、ノギンおよび対照ＨＩＯの生着がＨＣＯよりも効率的であることを観察した（図１２Ａ）。それらの部域的同一性と一致して、移植したＨＩＯおよびＨＣＯは、それぞれ形態的に小腸または大腸のいずれかに形態学的に似た成熟組織へと発達した（図５Ａ〜Ｅ）。ノギンおよび対照オルガノイドの上皮は、ヒト小腸に匹敵する、十分に定義された陰窩および長い絨毛を形成した。対照的に、ＢＭＰ２処置オルガノイドは、陰窩を含有していたが、結腸と同様に絨毛を欠失していた。
【００８４】
小腸または大腸のいずれかに対する形態学的類似性に加えて、移植されたＨＩＯおよびＨＣＯは異なる部域マーカーを発現し、部域的に豊富な細胞型を含有した。例えば、ノギンおよび対照ＨＩＯの上皮の大部分は、近位マーカーであるＧＡＴＡ４を発現し、大腸マーカーであるＳＡＴＢ２を発現しなかった（図５Ｆ〜Ｉ、Ｋ〜Ｎ、図１２Ｂ〜Ｅ）。逆に、ＨＣＯ上皮は、一様にＳＡＴＢ２＋であったがＧＡＴＡ４を発現しなかった（図５Ｊ、０、図１２Ｂ〜Ｅ）。加えて、ＤＥＦＡ５を発現するパネート細胞は、ノギンおよび対照ＨＩＯの陰窩に存在したが、ヒト結腸と同様に（Ｗｅｈｋａｍｐら、２００６）、ＨＣＯは非存在であった（図５Ｐ〜Ｔ、図１２Ｆ）。本発明者らはさらに、ＨＣＯの杯細胞のサブセットによって発現するがノギンまたは対照ＨＩＯにおいては検出できない結腸杯細胞マーカーであるＭＵＣ５Ｂ（ｖａｎ  Ｋｌｉｎｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）を用いてＨＣＯの結腸同一性を確認した（図５Ｕ〜Ｙ、図１２Ｇ）。加えて、ＭＵＣ２＋杯細胞の数は、ヒト結腸において見られる杯細胞の存在量と一致するＨＩＯと比較してＨＣＯにおいて非常に多かった（図１２Ｈ〜Ｌ）。パターン形成マーカー、ＭＵＣ５Ｂ発現杯細胞の存在、およびパネート細胞の非存在はすべて、移植されたＨＣＯが結腸上皮を有するという結論を支持する。
【００８５】
生体内で成熟したＨＩＯおよびＨＣＯは、部域的腸内分泌ホルモンを発現する。
【００８６】
消化管の異なる部域に認められる少なくとも１２の主要なＥＥＣサブタイプがあり、本発明者らは、部域的ＥＥＣの存在についてＨＩＯおよびＨＣＯを分析した。グレリンおよびモチリンは主として近位腸において認められ、対応してこれらのホルモンは主としてノギンおよび対照ＨＩＯにおいて発現したがＨＣＯでは発現しなかった（図６Ａ〜Ｄ）。同様に、小腸のＫ細胞においては認められるが結腸においては非存在であるＧＩＰは、ノギンおよび対照ＨＩＯにおいては認められたが、ＨＣＯにおいては認められなかった（図６Ｅ〜Ｈ）。次に、本発明者らは、結腸においてより豊富であるＧＬＰ−１およびＰＹＹの発現について分析することによって、ＨＣＯにおける遠位に濃縮されたＥＥＣの存在を検討した。本発明者らは、ＨＩＯにおけるよりもＨＣＯにおいてより多数のＧＬＰ−１細胞およびＰＹＹ細胞ならびに多量のプレプログルカゴンおよびＰＹＹの発現を観察した（図６１〜Ｐ）。加えて、本発明者らは、ＨＣＯにおいてのみ（図６Ｑ〜Ｔ）、結腸特異的ホルモンであるＩＮＳＬ５の発現を認めた（Ｂｕｒｎｉｃｋａ−Ｔｕｒｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２、Ｔｈａｎａｓｕｐａｗａｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。
【００８７】
試験管内および生体内でのＨＩＯおよびＨＣＯにおける幹細胞および前駆細胞の分析。
【００８８】
試験管内由来のＨＩＯおよびＨＣＯが幹細胞および前駆細胞のマーカーを発現するかどうかを決定するために、本発明者らは、すでに記載されているＨ９−ＢＡＣ−ＬＧＲ５−ｅＧＦＰトランスジェニック株（ＭｃＣｒａｃｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４、Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）を使用した。オルガノイドにおけるＬＧＲ５−ｅＧＦＰ発現の検討は、胎生１３．５日という早い時期にＬｇｒ５−ｅＧＦＰマウスにおける発現パターンと同様の広範な上皮ドメインにおける発現を明らかにした（Ｓｈｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）（図１３Ａ、Ｂ、Ｆ、Ｇ、Ｋ、Ｌ）。ＧＦＰ＋  ＥＰＣＡＭ−細胞の集団を明らかにした組織学的性質およびＦＡＣＳ分析によって決定されるように、ＧＦＰ発現はオルガノイドの上皮の外側でも明白であった（データ非表示）。加えて、本発明者らは、胎児および成体の腸における前駆細胞のマーカーであるＳＯＸ９の発現を検討し、それがＨＩＯおよびＨＣＯの両方の上皮において発現することを認めた（図１３Ｃ〜Ｅ、Ｈ〜Ｊ、Ｍ〜０）。これらのデータは、ＬＧＲ５−ｅＧＦＰおよびＳＯＸ９によって標識される胚性／胎児性腸管前駆細胞が試験管内でＨＩＯおよびＨＣＯに存在することを示唆している。
【００８９】
腸管発生の後期段階において、前駆細胞は発生中の絨毛の基部に限局されるようになり、そこで当該前駆細胞は最終的にＬｉｅｂｅｒｋｕｈｎの陰窩の腸幹細胞（ＩＳＣ）に寄与するであろう。本発明者らは試験管内で観察した前駆細胞がこのこの発生上の移行を経験するかどうかを決定するために、本発明者らは、ＨＩＯおよびＨＣＯを移植し、ＬＧＲ５−ｅＧＦＰ、ＳＯＸ９、およびＫＩ６７タンパク質を監視した。生体内でのオルガノイドの成熟に続いて、本発明者らは、ＬＧＲ５−ｅＧＦＰ、ＳＯＸ９、およびＫＩ６７を基部推定陰窩に限局して観察した（図１３Ｐ〜Ｘ）。加えて、ＳＯＸ９は、これらの細胞型におけるＳＯＸ９発現と一致して、ＨＩＯの絨毛において、および結腸上皮移植ＨＣＯのカフにおいて、ＥＥＣにおいても観察された。Ｓｏｘ９およびＬｇｒ５がマウスにおいてエンテロイドおよびコロノイドを形成することができる腸幹細胞および結腸幹細胞を標識することを考えると（Ｇｒａｃｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０、Ｒａｍａｌｉｎｇａｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）、移植したオルガノイドの上皮を単離して、エンテロイドおよびコロノイドを作製するために使用することができるかどうかを調べた。ＨＩＯおよびＨＣＯの両方が、成長し継代することができる上皮オルガノイドの培養物を生じた（図１３Ｙ〜Ａ’）。その上、ＨＣＯ由来上皮培養物は結腸マーカーであるＣＫＢ、ＦＸＹＤ３、ＳＡＴＢ２、およびＨＯＸＢ１３を発現したが、近位小腸マーカーであるＰＤＸ１またはＧＡＴＡ４を発現せず、部域的同一性が維持されていることを示唆した（図１３Ｂ’〜Ｄ’）。これらのデータは、生体内で成長したＨＩＯおよびＨＣＯが前駆細胞および幹細胞を含有していることを示唆している。
【００９０】
ＨＩＯとＨＣＯのグローバルな転写分析
ＨＩＯおよびＨＣＯの部域的同一性および成熟を広範に調べるために、本発明者らは、生体内で成長したＨＩＯおよびＨＣＯのＲＮＡ配列分析を実施し、それらをヒト胎児および成体の小腸および大腸の公表データセットと比較した。主成分分析は、成体および胎児の腸から単離された初代組織が主成分１（ＰＣ１）軸に沿ってまとまって密集することを明らかにし、これは試料間の累積的な変動の３６．５％を占めた（図１４Ａ）。ＧＯ分析は、この変動が初代組織においてのみ存在し、ＰＳＣ由来移植片には存在しない細胞型によるものであることを明らかにした。例えば、ヒトの初代組織には存在し、移植片には非存在である上位１０の生物学的過程のうち６つは免疫細胞と関連していた（図１４Ｂ〜Ｃ）。第２の主成分（ＰＣ２）は、累積変動の１７．７％を占め、成熟により試料を分離する（図７Ａ）。この成分は、移植されたオルガノイドがヒト胎児腸管および胎児結腸よりも成熟しているが、成体の結腸および腸管ほど成熟していないことを明らかにした。第３の主成分（ＰＣ３）は累積変動の６．７％を占め、部域的同一性により試料を分離し、ＨＣＯが結腸により類似しているのに対し、ＨＩＯは小腸と密集していることを示す（図７Ａ）。興味深いことに、ヒト胎児試料は部域同一性（小腸対結腸）に基づいて密集しておらず、これらの試料が消化管の指示された領域からはっきりと分離されていなかったかもしれないことを示唆した。
【００９１】
本発明者らは次に、ＨＩＯおよびＨＣＯが小腸および結腸の部域特異的遺伝子発現の類似パターンを共有する確率を決定するために超幾何平均検定を使用した（図７Ｂ）。結腸またはＢＭＰ２処置ＨＣＯと比較して、合計３４１個の転写産物が小腸においておよびノギン処置ＨＩＯにおいて発現し、その比率は偶然だけでは極めてありそうもない（Ｐ＝１．５×１０−１４３）。同様に、対照ＨＩＯにおいて上方調節されている遺伝子セットは、成体結腸と比較して成体小腸において上方調節されている遺伝子セットと非常に有意な程度の類似性を共有する（Ｐ＝２．５×１０−２０３）。逆に、ＨＣＯにおいて上方調節されている遺伝子セットは、小腸と比較して結腸において上方調節されている遺伝子が非常に豊富である（それぞれＰ＝４．１×１０−５３およびＰ＝６．０×１０７３）。この分析は、ＨＩＯパターン形成がヒト小腸に最も類似しており、ＨＣＯパターン形成が結腸であると結論付けた。ＨＩＯ（ＮＯＧおよび対照処置）およびＨＣＯの性質をさらに探究するために、本発明者らは差次的発現分析（成体小腸対成体結腸、ＨＩＯ対ＨＣＯ）を行った。本発明者らは、４方向散布図を作成し、結腸において上方調節された高い比率の遺伝子がＨＣＯにおいても上方調節され、小腸において上方調節された遺伝子の大部分がＨＩＯにおいても上方調節されていることも実証した（図７Ｃ、表１）。最後に、豊富な生物学的過程の分析は、成体の結腸および移植されたＨＣＯが非常に活発なＷｎｔシグナル伝達および類似のＨＯＸコードを有することを明らかにした（図７Ｄ）。まとめると、これらのデータは、本発明者らがＰＳＣをヒト結腸組織に区別するための確固たる方法を開発したことを示唆する。
【００９２】
表１遺伝子は成体小腸および結腸において上方調節され、これらはそれぞれＨＩＯおよびＨＣＯにおいても上方調節されている。第１列、ＮＯＧ  ＨＩＯ対ＨＣＯおよび成体小腸対成体結腸において一般に上方調節、第２列、対照ＨＩＯ対ＨＣＯおよび成体小腸対成体結腸において一般に上方調節、第３列、ＨＣＯ対ＮＯＧ  ＨＩＯおよび成体結腸対成体小腸において一般に上方調節、第４列、ＨＣＯ対対照ＨＩＯおよび成体結腸対成体小腸において一般に上方調節
【表１】
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【００９３】
考察
歴史的に、前腸、中腸、および後腸の分類は、前後の腸門脈の発達および腸間膜の血液供給源に基づいている（Ｕｐｐａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。中腸および後腸の代替的な定義が提案されてきており、中腸は臍よりも前側の部分に由来する腸の部分であり、後腸は臍よりも後側に由来する（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，１９１３、Ｓａｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。いずれの場合においても、解剖学的ランドマークへの歴史的な依存、ならびに前部、中部および後腸を区別するためのより精確な分子マーカーの欠如は、ＰＳＣからこれらの細胞／組織を試験管内で作製する方法を開発することを困難にしてきた。それゆえ、発達中の中腸部域と後腸部域を明確に区別するマーカーの同定が不可欠である。
【００９４】
本発明者らは、ＣＤＸ２、ＧＡＴＡ４、ＯＮＥＣＵＴ１およびＳＡＴＢ２の組み合わせを使用して、ゼノパス（Ｘｅｎｏｐｕｓ）、マウスおよびヒトにおける中腸および後腸の発生の初期段階で明確な分子レベルの境界が確立されることを同定した。興味深いことに、ＧＡＴＡ４およびＳＡＴＢ２発現ドメインは、マウスの卵黄茎／推定臍帯で境界を形成し、この境界は発生中全体において成体腸において維持される。ＧＡＴＡ４発現が臍よりも前側の腸を標識し、ＳＡＴＢ２発現が臍よりも後側のドメインを標識するという事実は、臍が中腸と後腸との間の境界であることを示唆している（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，１９１３、Ｓａｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。
【００９５】
ＨＩＯにおけるＯＮＥＣＵＴ１発現およびＳＡＴＢ２発現は、ＨＣＯが、それぞれ近位および遠位の同一性と一致していることであるが、ＧＡＴＡ４は、その胚発現を考えて予想されるであろうほど試験管内で近位ＨＩＯにおいて頑強に発現することはなかった（データ非表示）。対照的に、ＧＡＴＡ４は、ＨＩＯの生体内成熟後に患者の生検から作製されたエンテロイドにおいて強く発現した（データ非表示）。このことは、ＧＡＴＡ４の発現に関与する因子が培養条件において非存在であること、または生体内での成熟がＧＡＴＡ４の上皮発現に必要とされることを示唆し得る。このデータは、正常なワンカット因子発現を保持している腸Ｇａｔａ４ノックアウトマウスと一致して、高レベルのＧＡＴＡ４発現が腸の早期部域化には不要であり得ることも示唆している（Ｂａｔｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。加えて、ＢＭＰ処置オルガノイドの小さなサブセットは、ＣＤＸ２発現を喪失し、膀胱マーカーであるケラチン１３およびウロプラキン１ａの発現を活性化した（データ非表示）。尿路上皮組織は後腸／クロアカに由来するので、このことは後腸運命を有するＢＭＰオルガノイドと一致する（Ｇｅｏｒｇａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。
【００９６】
ＳＡＴＢ２は遠位回腸および大腸の発生を通して発現するが、ＳＡＴＢ２が遠位腸の発生に必要であるかどうかは知られていない。ＳＡＴＢ２の突然変異が２ｑ３２−ｑ３３欠失およびグラス症候群と関係する口蓋裂に関係づけられていることから、マウスノックアウト研究は頭蓋顔面および皮質ニューロンの発達に焦点を当ててきた（ＦｉｔｚＰａｔｒｉｃｋら，２００３）。しかし、ＳＡＴＢ２がヒトの結腸生理学的性質に役割を担っているかもしれないという間接的な証拠がある。ＳＡＴＢ２は、ゲノム規模会合試験において潰瘍性大腸炎感受性遺伝子として同定されている（ＭｃＧｏｖｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。加えて、ＳＡＴＢ２発現の喪失は大腸癌患者における予後不良に関連することが示されている（Ｅｂｅｒｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。ＨＣＯを用いた将来の研究は、発生中の結腸におけるＳＡＴＢ２標的の同定を可能にし得、このことは潰瘍性大腸炎および大腸癌の病理学への洞察を提供し得る。
【００９７】
モデル生物におけるいくつかの研究は、後腸発生の間の内胚葉のパターン形成におけるＢＭＰシグナル伝達経路を含意している（Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３、Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５、Ｓｈｅｒｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１、Ｔｉｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２、Ｗｉｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）。これと一致して、ＢＭＰの阻害はＷＮＴおよびＦＧＦが後部内胚葉の運命を促進する能力を無効にするので、本発明者らは、ヒト胚体内胚葉の後部パターン形成がＢＭＰシグナル伝達に依存することを実証した（ＭｃＣｒａｃｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。しかしながら、ＢＭＰシグナル伝達が腸の発生中に他の一時的に異なる役割を担うことは驚くことではない。例えば、近位−遠位部域ドメインの確立後、ＢＭＰシグナル伝達は腸および結腸において陰窩−絨毛軸を確立するように機能する（Ｌｉ、２００５）。したがって、パターン形成のための一時的な必要条件は、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）中腸において報告されているように、胚が多目的腸発生のために同じシグナル伝達経路を使用することを可能にする（Ｄｒｉｖｅｒ  ａｎｄ  Ｏｈｌｓｔｅｉｎ，２０１４、Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。ヒトの疾患の脈絡において、ＢＭＰＲ１Ａにおける突然変異は若年性ポリポーシス症候群患者のサブセットと関係している。ＨＣＯシステムは、開発初期の間にＢＭＰの下流にあるＨＯＸコードを同定するのに非常に適しており、ＢＭＰＲ１Ａ突然変異を有する過誤腫性ポリープがＨＯＸ遺伝子発現を変化させたかどうかを決定することは興味深くあり得る。
【００９８】
本発明者らは以前、小腸であるＨＩＯの試験管内定方向分化および生体内移植を報告した（Ｓｐｅｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１、Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。大腸に影響を及ぼす独特の生理学的性質および病理学的条件を考えると、結腸に特異的な病態生理学的問題を調べるために結腸モデル系を開発することが不可欠であった。発生上、この系は部域的同一性がどのように確立されているかについての基本的な質問を調査する機会を提供する。ＨＩＯおよびＨＣＯは、ＨＩＯ内のパネート細胞およびＨＣＯ内の結腸特異的杯細胞のような独特の細胞型を発達させる。その上、ＨＩＯおよびＨＣＯにはそれぞれ小腸および大腸が通常豊富な異なるセットのＥＥＣを有する。部域化したオルガノイドは、腸の異なる部域がどのようにして、部域化した幹細胞を生じるのかについての将来の研究のための基盤を提供するはずである。加えて、ＨＣＯの生成は、潰瘍性大腸炎および大腸癌のような結腸に影響を及ぼす疾患のモデル形成を可能にするであろう。
【００９９】
材料および方法
動物。８〜１６週齢の免疫不全ＮＯＤ−ＳＣＩＤ  ＩＬ−２Ｒｙｎｕ"（ＮＳＧ）マウスを移植実験に用いた（オハイオ州シンシナティ市のＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｍｏｕｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙから入手）。野生型マウスをマウス胎児腸管に関する研究に使用した。すべてのマウスは、シンシナティ子供病院医療センター（ＣＣＨＭＣ）の動物施設において飼育した。すべての実験は、ＣＣＨＭＣの施設内動物管理使用委員会の承認を得て行った。
【０１００】
カエルおよびマウスの胚におけるＢＭＰ阻害。ゼノパス・トロピカリス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）の胚培養および小分子処置をすでに記載されたように行った（Ｒａｎｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２、Ｒａｎｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。ＤＭＨ−１（Ｓｉｇｍａ  Ｄ８９４６）をＤＭＳＯ中に溶解し、２０ｐＭの終濃度で使用し、等濃度のＤＭＳＯビヒクルを同胞胚に使用した。分析したマーカーに対して同様の効果で阻害剤処置実験を２回繰り返した。ゼノパス（Ｘｅｎｏｐｕｓ）生体内原位置ハイブリッド形成分析のために、線状化全長ｃＤＮＡプラスミドテンプレート（Ｘ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ  ｓａｔｂ２はＡＴＣＣから購入し、クローン７７２０１９４、ＨｉｎＤＩＩＩ、プローブ用Ｔ７、Ｘ．ｌａｅｖｉｓ  ｓａｔｂ２は、コロラド大学ボルダー校のＴｙｌｅｒ  ＳｑｕａｒｅおよびＤａｎｉｅｌ  Ｍｅｄｅｉｒｏｓのための贈呈品であり、Ｘｂａｌ、Ｓｐ６はプローブ用）を用いてＤＩＧ標識アンチセンスＲＮＡプローブを作製した。プローブ合成および生体内原位置ハイブリッド形成プロトコルを記載した完全な詳細は、Ｘｅｎｂａｓｅ（ｈｆｔｐ：／／ｗｉｋｉ．ｘｅｎｂａｓｅ．ｏｒｑ／ｘｅｎｗｉｋｉ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ／Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）で入手可能である。
【０１０１】
マウス全胚培養のために、胎生７．５日胚を、ＨａｍのＦ１２培地とＮ−２補充物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する全胚培養ラット血清（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｓ）との１：１混合物中で培養した。容器をローラー培養装置（ＢＴＣ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、英国ケンブリッジ）上に置き、３７℃で２日間維持し、２０％の０２および５％ＣＯ２を通気した。ＤＭＳＯをビヒクル対照として用いて、５ｐＭのＤＭＨ−１を用いた処置によりＢＭＰシグナル伝達を阻害した。
【０１０２】
ヒト中腸／後腸スフェロイドの作製ヒト腸オルガノイドは、すでに記載されたように作製および維持した（Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。ヒト胚性幹細胞および人工多能性幹細胞を、マトリゲル（基底膜マトリックス（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））でコーティングした６ウェルＮｕｎｃｌｏｎ表面プレート（Ｎｕｎｃ）中、フィーダー非含有条件下で成長させ、ｍＴＥＳＲ１培地（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で維持した。胚体内胚葉（ＤＥ）の誘導のために、ヒトＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞をＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で継代し、マトリゲルでコーティングしたＮｕｎｃｌｏｎ表面２４ウェルプレートに１ウェルあたり１００，０００個の細胞密度で播種した。Ａｃｃｕｔａｓｅ分割細胞については、初日に１０ｐＭのＹ２７６３２化合物（Ｓｉｇｍａ）を培地に添加した。初日の後、培地をｍＴＥＳＲ１に交換し、細胞をさらに２４時間成長させた。次に、細胞を１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡで３日間、すでに記載されたように処置した（Ｓｐｅｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。次に、ＤＥを後腸誘導培地（ＲＰＭＩ１６４０、２ｍＭのＬ−グルタミン、２％脱補完ＦＢＳ、ペニシリン−ストレプトマイシンおよび１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ）で、中後腸スフェロイドの形成を誘導するための５００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ４（Ｒ&Ｄ）および３ｐＭのＣｈｉｒｏｎ９９０２１（Ｔｏｃｒｉｓ）とともに４日間処置した。
【０１０３】
ＨＩＯおよびＨＣＯへの中腸／後腸スフェロイドのパターン形成。スフェロイドを２４ウェルプレートから収集し、そしてマトリゲル（ＢＤ）中に播種した。近位のＨＩＯを作製するために、１００ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ（Ｒ&Ｄ）のみ、または１００ｎｇ／ｍＬノギン含有の１００ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ（Ｒ&Ｄ）を補充した腸成長培地（応用ＤＭＥＭ／Ｆ−１２、Ｎ２、Ｂ２７、１５ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、ペニシリン−ストレプトマイシン）でスフェロイドを覆った。ＨＣＯを作製するために、スフェロイドを１００ｎｇ／ｍＬのＥＧＦおよび１００ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ（Ｒ&Ｄ）で覆った。ＳＨＨ実験のために、１μＭのＳＡＧ（Ｔｏｃｒｉｓ）、５μＭのＳＡＧまたは２．５μＭのシクロパミン（Ｔｏｃｒｉｓ）を、ＲＮＡ試料を収集した後の最初の３日間、対照培地に添加した。すべてのパターン形成条件について、培地中にＥＧＦのみを維持しながら、培地を３日で交換した。次に、培地をその後週２回交換した。ＨＩＯおよびＨＣＯを１４日ごとに新鮮なマトリゲルに再播種した。
【０１０４】
ニューロゲニン３誘導株の作製。ドキシサイクリン誘導性ＮＥＵＲＯＧ３株を作製するために、本発明者らは、ＩＰＳＣ７２．３細胞にｐＩＮＣＵＤＥＲ２１  −  ＮＥＵＲＯＧ３レンチウイルスを形質導入し、２５０μｇ／ｍＬのＧ４１８を用いて選択した。ＩＰＳＣ７２．３細胞株および誘導性ＮＥＵＲＯＧ  ３の両方はすでに記載されている（ＭｃＣｒａｃｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。安定して形質導入された細胞を中／後腸スフェロイドに分化させ、次にＨＩＯまたはＨＣＯへとパターン形成した。スフェロイドを２８日間成長させ、０．５μｇ／ｍＬのドキシサイクリンで８時間刺激した。３５日後に、オルガノイドを収集し、ＱＰＣＲおよびＩＦによって分析した。
【０１０５】
オルガノイド間充織の成長２４ウェルプレートの底部に付着するオルガノイドからの間充織細胞は２次元で付着し成長する。間充織細胞をオルガノイドから増殖させるために、ＤＭＥＭ  １０％ＦＢＳ＋Ｌ−グルタミン＋ペニシリン−ストレプトマイシンをウェルに添加し、そこからオルガノイドを１４日後に収集した。ほぼ１００％のコンフルエンスに達するまで、培地を週２回、合計２〜３週間交換した。
【０１０６】
ヒト腸オルガノイドの移植ＮＳＧマウスを抗生物質含有餌（２７５ｐｐｍのスルファメトキサゾールおよび１，３６５ｐｐｍのトリメトプリム（試験食））で飼育した。手術の前後で食餌および水は自由に提供した。試験管内で２８日間成熟させた単一のＨＩＯをマトリゲルから取り出し、冷リン酸緩衝塩類溶液（ＤＰＢＳ；  Ｇｉｂｃｏ）で洗浄し、手術の１２時間前に精製Ｉ型コラーゲン（ラット尾部コラーゲン（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））に包埋して、凝固したゲルプラグの形成を可能にした。次に、これらのプラグを、１００ｎｇ／ｍＬのＥＧＦを補充した腸管成長培地（応用ＤＭＥＭ／Ｆ−１２、Ｂ２７、１５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、ペニシリン−ストレプトマイシン）（Ｒ&Ｄ）中で一晩、標準成長培地に入れた。次に、以前報告されたように（Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ．，２０１４）、ＨＩＯを腎被膜下に移植した。簡単に説明すると、マウスを２％吸入イソフルラン（Ｂｕｔｌｅｒ  Ｓｃｈｅｉｎ）で麻酔し、次にマウスの左側をイソプロピルアルコールおよびポビジン−ヨウ素で、無菌様式で準備した。腎臓を露出させるために小さな左後肋骨下切開部を作製した。莢膜下ポケットを作製した後、コラーゲン包埋ＨＩＯをポケットに入れた。次に、腎臓を腹膜腔に戻し、マウスにゾシン（１００ｍｇ／ｋｇ（Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．））の腹腔内洗浄をさっと与えた。皮膚を二重層で閉じ、マウスにＢｕｐｒｅｎｅｘ（０．０５ｍｇ／ｋｇ（Ｍｉｄｗｅｓｔ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｓｕｐｐｌｙ））を皮下注射した。生着後８〜１０週間で、マウスを次に人道的に安楽死させるか、またはさらなる実験に供した。
【０１０７】
組織加工、免疫蛍光および顕微鏡検査。組織の大きさに応じて、組織を氷上の４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中で１〜３時間固定した。オルガノイドおよび移植片生着物をＯＣＴで凍結した。ロバ血清（１×ＰＢＳ＋０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ中５％血清）を用いてＯＣＴ切片を３０分間ブロッキングし、１次抗体とともに４℃で一晩インキュベートした。次にスライドを１×ＰＢＳ＋０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘで３回洗浄し、ブロッキング緩衝液中にＤＡＰＩを含有する２次抗体中、室温で２時間インキュベートした。抗体およびそれぞれの希釈物のリストについては表２を参照されたい。次にスライドを１×ＰＢＳ＋０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘで２回洗浄したのに続いて１×ＰＢＳで最終洗浄を行った。次に、カバーガラスをＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ−Ｇ（登録商標）（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）を用いてマウントした。画像をＮｉｋｏｎ  Ａｌ焦点顕微鏡で捕捉し、Ｉｍａｒｉｓ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉｔｐｌａｎｅ）を用いて解析した。全載染色のために、組織を上述と同様に加工し、次にＭｕｒｒａｙの溶液で清澄化した。撮像は、Ｎｉｋｏｎ  Ａｌ共焦点顕微鏡を用いて行った。
【０１０８】
【表２】
2020501534.tif 000023
2020501534.tif 000024
【０１０９】
免疫蛍光画像の定量化胚全体の画像定量化は、画像を別々のチャネルに分割し、次いでＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）を用いて画素面積を測定することによって行った。画素面積を各チャネルについて決定し、チャネル間の比率を決定し、対照処置胚についての比率を１００として表した。試験管内および生体内で成長させたオルガノイドの定量化は、先に説明したように、切片上で行い、そこから画像を捕捉した。ＣＤＸ２、ＧＡＴＡ４およびＳＡＴＢ２陽性核の数は、ヒト生検試料を用いた較正後の［ｍａｒｌｓにおけるスポット関数を用いて定量化した。
【０１１０】
ＲＮＡの単離およびＱＰＣＲ製造元のプロトコルにより、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ（登録商標）ＲＮＡ抽出キット（Ｍａｃｈａｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）を用いてＲＮＡを抽出し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＶＩＬＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｃＤＮＡへと逆転写した。ＱＰＣＲプライマーは、ｑＰｒｉｍｅｒＤｅｐｏｔウェブ系ツール（ｐｒｉｍｅｒｄｅｐｏｔ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）を使用して設計した。プライマー配列を表３に列挙する。ＱＰＣＲは、Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ  ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ）およびＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）６  ＦｌｅｘリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して実施した。
【０１１１】
【表３】
2020501534.tif 000025
2020501534.tif 000026
【０１１２】
大腸マーカーとしてのＳＡＴＢ２の同定
大腸のマーカーを同定するために、本発明者らはまず、ＧＮＣＰｒｏ  ｈｔｔｐ：／／ｇｎｃｐｒｏ．ｓａｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍｉｇｎｃｐｒｏ／ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ＿ｇｒａｐｈｅｒｐｈｐを使用して、東京大学データベースに基づいて（他の組織と比較して）結腸において上方調節された転写因子を同定した。この検索に基づいて、ＳＡＴＢ２は結腸において６番目にランク付けされた遺伝子であった。ＳＡＴＢ２が結腸において実際に上方調節されていることを検証するために、本発明者らはＴｉＧＥＲデータベース（ｈｆｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏ．ｗｉｌｍｅｒ．ｉｈｕ．ｅｄｕ／ｔｉｇｅｒ／ｄｂ  ｇｅｎｅ／ＳＡＴＢ２−ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）を用いてＳＡＴＢ２発現を検索した。結腸におけるＳＡＴＢ２の発現をさらに確認するため、および多数の組織にわたるタンパク質発現を検討するために、本発明者らはＨｕｍａｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｔｌａｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｉｎａｔｌａｓ．ｏｒｇ／ｓｅａｒｃｈ／ｓａｔｂ２）を使用した。同様の手法を用いて大腸／結腸の他のマーカーを同定した。
【０１１３】
公共ＲＮＡ配列受入番号成体の小腸および大腸のＲＮＡ配列データは公共のデータベースＥ−ＭＴＡＢ−１７３３からダウンロードした。これらのデータセットは、上皮層と筋肉層を含む器官組織全体を表す。小腸試料の受入番号：ＥＲＲ３１５３４４、ＥＲＲ３１５３８１、ＥＲＲ３１５４０９、ＥＲＲ３１５４４２、ＥＲＲ３１５４６１。大腸試料の受入番号：ＥＲＲ３１５３４８、ＥＲＲ３１５３５７、ＥＲＲ３１５４８４。図９Ｂについて、加工されたＦＰＫＭデータは、ｈｔｔｐｓ：／／ｑｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｈｉｌｌｄｒ／Ｆｉｎｋｂｅｉｎｅｒ  ＳｔｅｍＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓ２０１５からダウンロードされた。これらのデータは、成体の十二指腸（ＥＲＳ３２６９９２、ＥＲＳ３２６９７６）およびＥ−ＭＴＡＢ−１７３３由来の先に列挙された小腸試料、およびＧＳＥ１８９２７由来のヒト胎児腸試料（器官全体も）を含む。ヒト胎児小腸についての受入番号は、ＧＳＭ１０５９５０８、ＧＳＭ１０５９５２１、ＧＳＭ１０５９４８６、ＧＳＭ１０５９５０７、ＧＳＭ１０５９５１７、ＧＳＭ１２２０５１９である。図９Ｃについては、データはＧＥＯ受入ＧＳＥ６６７４９プラットフォームＧＬＰ５１７５から得た。以下の試料、すなわち、ＧＳＭ１３８５１６０、ＧＳＭ１３８５１６１、ＧＳＭ１３８５１６２、ＧＳＭ１３８５１６３、ＧＳＭ１３８５１６４、ＧＳＭ１３８５１６５、ＧＳＭ１３８５１６６、ＧＳＭ１３８５１６７、ＧＳＭ１３８５１６８、ＧＳＭ１３８５１６９、ＧＳＭ１３８５１７０、ＧＳＭ１３８５１７１、ＧＳＭ１６１４６４６、ＧＳＭ１６１４６４６を使用した。試料の値は、ＧＥＯ２Ｒの「特性グラフ」機能を使用し、それらのＩＤ番号（それぞれ３０８６１００および２５９４０８９）によってＧＡＴＡ４およびＳＡＴＢ２を検索して決定した。
【０１１４】
ＲＮＡ配列の配列集合量の推定ＲＮＡライブラリー構築およびＲＮＡ配列決定は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２５００プラットフォームを使用して、シンシナティ子供病院ＤＮＡ配列決定コアによって行った。Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定実行の品質は、ＦａｓｔＱＣ第０．１０．１版ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂａｂｒａｈａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｆａｓｔｑｃを使用して品質問題（低品質のスコア、過剰に表現されたシーケンス、不適切なＧＣコンテンツなど）を示し得るデータの特色を識別して、各試料のＦＡＳＴＱデータを分析することによって評価した。ＱＣ分析では大きな問題は確認されなかった。本発明者らは、アラインメント、差次的発現分析、および分析後診断のためにソフトウェアパッケージＴｕｘｅｄｏ  Ｓｕｉｔｅを使用した。簡潔には、本発明者らは、ＴｏｐＨａｔ第２．０．１３版およびＢｏｗｔｉｅ第２．２．５版を使用して、参照トランスクリプトーム（ＵＣＳＣ  ｈｇ１９）に対する読み取りを整列させた（Ｌａｎｇｍｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。本発明者らは、読み取り整列の正確さを最大限にするための「−ｂ２−非常に感度が高い」、ならびに「−非網羅検索」および既知の転写産物に対して読み出されたマッピングを限定する「−非新規接合」を除いて、整列に既定値パラメータ設定を用いた。ＲＮＡ存在量の推定にはＣｕｆｆｌｉｎｋｓ第２．２．１版（Ｔｒａｐｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）を使用した。ＵＣＳＣ  ｈｇｌ９．ｆａを参照ゲノム配列として使用し、ＵＣＳＣ  ｈｇｌ９．ｇｔｆをトランスクリプトームアノテーションに使用した。本発明者らは、カフスリンクにおいて次のパラメータ、すなわち、１つを超える遺伝子座においてマッピングする読み取りのための発現計算を調整するための「−多重読み取り補正」、ならびに発現値の正規化のための「−比較可能なヒット−ノルム」および「−上位四分位数−ノルム」を適用した。正規化したＦＰＫＭ表はＣｕｆｆＮｏｒｍ関数を使用して作成した。ＲＮＡ配列集合および転写分析は、６４ビットのＤｅｂｉａｎ  Ｌｉｎｕｘ安定バージョン７．１０（「Ｗｈｅｅｚｙ」）プラットフォームを使用して行った。
【０１１５】
差次的発現分析
すべてのプロットと統計分析はＲバージョン３．３．１（２０１６−０６−２１）で行った。プロットはＲパッケージ’ｇｇｐｌｏｔ２’（Ｇｉｎｅｓｔｅｔ、２０１１）を用いて作成した。Ｒパッケージ’ＳｅｑＲｅｔｒｉｅｖｅｒ’’ＳｅｑＲｅｔｒｉｅｖｅｒ’バージョン０．６  ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｈｉｌｌｄｒ／ＳｅｑＲｅｔｒｉｅｙｅｒを使用して、Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓ出力の差次的発現分析および統計的検定を完了した。超幾何平均検定を用いて、Ｒパッケージ’ＧｅｎｅＯｖｅｒｌａｐ’ｈｔｔｐ：／／ｓｈｅｎｌａｂ−ｓｉｎａｉ．ｃｉｔｈｕｂ．ｉｏ／ｓｈｅｎｌａｂ−ｓｉｎａｉ／を使用して、群間で共有遺伝子発現シグネチャの相対量を評価した。完全なＲＮＡ配列ＦＡＳＴＱ加工パイプラインおよび解析スクリプトは、ｈｔｔｐｓ：／／ｑｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｈｉｌｌｄｒ／Ｍｕｎｅｒａ２０１６で入手可能である。
【０１１６】
参考文献
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【０１１７】
Ｂａｔｔｌｅ，Ｍ．Ａ．，Ｂｏｎｄｏｗ，Ｂ．Ｊ．，Ｉｖｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ａ．，Ａｄａｍｓ，Ｓ．Ｊ．，Ｊａｎｄａｃｅｋ，Ｒ．Ｊ．，Ｔｓｏ，Ｐ．，ａｎｄ  Ｄｕｎｃａｎ，Ｓ．Ａ．（２００８）．ＧＡＴＡ４  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｊｅｊｕｎａ！  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １３５，１６７６¬１６８６  ｅ１６７１．
【０１１８】
Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｂ．Ｅ．，Ｓｔａｍａｔｏｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓ，Ｊ．Ａ．，Ｃｏｓｔｅｌｌｏ，Ｊ．Ｆ．，Ｒｅｎ，Ｂ．，Ｍｉｌｏｓａｖｌｊｅｖｉｃ，Ａ．，Ｍｅｉｓｓｎｅｒ，Ａ．，Ｋｅｌｌｉｓ，Ｍ．，Ｍａｒｒａ，Ｍ．Ａ．，Ｂｅａｕｄｅｔ，Ａ．Ｌ．，Ｅｃｋｅｒ，Ｊ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）．Ｔｈｅ  ＮＩＨ  Ｒｏａｄｍａｐ  Ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２８，１０４５−１０４８．
【０１１９】
Ｂｅｕｌｉｎｇ，Ｅ．，Ｂｏｓｓｅ，Ｔ．，ａａｎ  ｄｅ  Ｋｅｒｋ，Ｄ．Ｊ．，Ｐｉａｓｅｃｋｙｊ，Ｃ．Ｍ．，Ｆｕｊｉｗａｒａ，Ｙ．，Ｋａｔｚ，Ｓ．Ｇ．，Ｏｒｋｉｎ，Ｓ．Ｈ．，Ｇｒａｎｄ，Ｒ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｋｒａｓｉｎｓｋｉ，Ｓ．Ｄ．（２００８ａ）．ＧＡＴＡ４  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｇｅｎｅ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｔｕｒｅ  ｍｏｕｓｅ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｆｒｉｅｎｄ  ｏｆ  ＧＡＴＡ  （ＦＯＧ）  ｃｏｆａｃｔｏｒｓ．Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ３２２，１７９−１８９．
【０１２０】
Ｂｅｕｌｉｎｇ，Ｅ．，Ｂｏｓｓｅ，Ｔ．，Ｂｕｃｋｎｅｒ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ  Ｋｒａｓｉｎｓｋｉ，Ｓ．Ｄ．（２００７ａ）．Ｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇａｔａ４  ａｎｄ  Ｈｎｆｌ  ａｌｐｈａ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｔｒａｃｔ  ｉｓ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｄｉｓｔａｌ  ｓｔｏｍａｃｈ  ａｎｄ  ｐｒｏｘｉｍａｌ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １３２，Ａ５８６−Ａ５８６．
【０１２１】
Ｂｅｕｌｉｎｇ，Ｅ．，Ｂｏｓｓｅ，Ｔ．，ｄｅ  Ｋｅｒｋ，Ｄ．Ａ．，Ｐｉａｓｅｃｋｙｊ，Ｃ．Ｍ．，Ｆｕｊｉｗａｒａ，Ｙ．，Ｏｒｋｉｎ，Ｓ．Ｈ．，ａｎｄ  Ｋｒａｓｉｎｓｋｉ，Ｓ．Ｄ．（２００７ｂ）．Ｆｏｇ  ｃｏｆａｃｔｏｒｓ  ｐａｒｔｉａｌｌｙ  ｍｅｄｉａｔｅ  Ｇａｔａ４  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｄｕｌｔ  ｍｏｕｓｅ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １３２，Ａ６９２−Ａ６９３．
【０１２２】
Ｂｅｕｌｉｎｇ，Ｅ．，Ｋｅｒｋｈｏｆ，Ｉ．Ｍ．，Ｎｉｃｋｓａ，Ｇ．Ａ．，Ｇｉｕｆｆｒｉｄａ，Ｍ．Ｊ．，Ｈａｙｗｏｏｄ，Ｊ．，ａａｎ  ｄｅ  Ｋｅｒｋ，Ｄ．Ｊ．，Ｐｉａｓｅｃｋｙｊ，Ｃ．Ｍ．，Ｐｕ，Ｗ．Ｔ．，Ｂｕｃｈｍｉｌｌｅｒ，Ｔ．Ｌ．，Ｄａｗｓｏｎ，Ｐ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）．Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  Ｇａｔａ４  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｂｉｌｅ  ａｃｉｄ  ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｘｉｍａｌ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ．Ｇｕｔ  ５９，８８８−８９５．
【０１２３】
Ｂｅｕｌｉｎｇ，Ｅ．，Ｋｅｒｋｈｏｆ，Ｉ．Ｍ．，Ｐｉａｓｅｃｋｙｊ，Ｃ．Ｍ．，Ｄａｗｓｏｎ，ＰＡ．，Ｐｕ，Ｗ．Ｔ．，Ｇｒａｎｄ，Ｒ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｋｒａｓｉｎｓｋｉ，Ｓ．Ｄ．（２００８ｂ）．Ｔｈｅ  ａｂｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ＧＡＴＡ４  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｉｓｔａｌ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  ｄｅｆｉｎｅｓ  ｔｈｅ  ｉｌｅａ！  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １３４，Ａ８３−Ａ８４．
【０１２４】
Ｂｏｎｉｌｌａ−Ｃｌａｕｄｉｏ，Ｍ．，Ｗａｎｇ，Ｊ．，Ｂａｉ，Ｙ．，Ｋｌｙｓｉｋ，Ｅ．，Ｓｅｌｅｖｅｒ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｍａｒｔｉｎ，Ｊ．Ｆ．（２０１２）．Ｂｍｐ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ａ  ｄｏｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｔｏ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｆａｃｉａｌ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３９，７０９−７１９．
【０１２５】
Ｂｏｓｓｅ，Ｔ．，Ｆｉａｌｋｏｖｉｃｈ，Ｊ．Ｊ．，Ｐｉａｓｅｃｋｙｊ，Ｃ．Ｍ．，Ｂｅｕｌｉｎｇ，Ｅ．，Ｂｒｏｅｋｍａｎ，Ｈ．，Ｇｒａｎｄ，Ｒ．Ｊ．，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，Ｒ．Ｋ．，ａｎｄ  Ｋｒａｓｉｎｓｋｉ，Ｓ．Ｄ．（２００７）．Ｇａｔａ４  ａｎｄ  Ｈｎｆｌａｌｐｈａ  ａｒｅ  ｐａｒｔｉａｌｌｙ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｇｅｎｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ  Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２９２，Ｇ１３０２−１３１４．
【０１２６】
Ｂｏｕｃｈｉ，Ｒ．，Ｆｏｏ，Ｋ．Ｓ．，Ｈｕａ，Ｈ．，Ｔｓｕｃｈｉｙａ，Ｋ．，Ｏｈｍｕｒａ，Ｙ．，Ｓａｎｄｏｖａｌ，Ｐ．Ｒ．，Ｒａｔｎｅｒ，Ｌ．Ｅ．，Ｅｇｌｉ，Ｄ．，Ｌｅｉｂｅｌ，Ｒ．Ｌ．，ａｎｄ  Ａｃｃｉｌｉ，Ｄ．（２０１４）．ＦＯＸＯ１  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｙｉｅｌｄｓ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｇｕｔ  ｏｒｇａｎｏｉｄ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ．Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ  ５，４２４２．
【０１２７】
Ｂｕｒｎｉｃｋａ−Ｔｕｒｅｋ，０．，Ｍｏｈａｍｅｄ，Ｂ．Ａ．，Ｓｈｉｒｎｅｓｈａｎ，Ｋ．，Ｔｈａｎａｓｕｐａｗａｔ，Ｔ．，Ｈｏｍｂａｃｈ−Ｋｌｏｎｉｓｃｈ，Ｓ．，Ｋｌｏｎｉｓｃｈ，Ｔ．，ａｎｄ  Ａｄｈａｍ，Ｉ．Ｍ．（２０１２）．ＩＮＳＬ５−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ａｎ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ  ａｎｄ  ａｎ  ｉｍｐａｉｒｅｄ  ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １５３，４６５５−４６６５．
【０１２８】
Ｄｅ  Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ，Ｐ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｊ．，Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ａ．Ｍ．，Ｄｏｙｌｅ，Ａ．Ｍ．，Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｃ．，Ｗｉｎｆｉｅｌｄ，Ｓ．，Ｆａｕｒｅ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｄ．Ｊ．（２００５）．Ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ｐｌａｙｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｒｏｌｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｔｒａｃｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ：  ａｎ  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎａｔｏｍｉｓｔｓ  ２３４，３１２−３２２．
【０１２９】
Ｄｏｂｒｅｖａ，Ｇ．，Ｃｈａｈｒｏｕｒ，Ｍ．，Ｄａｕｔｚｅｎｂｅｒｇ，Ｍ．，Ｃｈｉｒｉｖｅｌｌａ，Ｌ．，Ｋａｎｚｌｅｒ，Ｂ．，Ｆａｒｉｎａｓ，Ｉ．，Ｋａｒｓｅｎｔｙ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌ，Ｒ．（２００６）．ＳＡＴＢ２  ｉｓ  ａ  ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ  ｏｆ  ｃｒａｎｉｏｆａｃｉａｌ  ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ  １２５，９７１−９８６．
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Ｅｂｅｒｈａｒｄ，Ｊ．，Ｇａｂｅｒ，Ａ．，Ｗａｎｇｅｆｊｏｒｄ，Ｓ．，Ｎｏｄｉｎ，Ｂ．，Ｕｈｌｅｎ，Ｍ．，Ｅｒｉｃｓｏｎ  Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｊｉｒｓｔｒｏｍ，Ｋ．（２０１２）．Ａ  ｃｏｈｏｒｔ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  ｖａｌｕｅ  ｏｆ  ＳＡＴＢ２  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ．Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １０６，９３１−９３８．
【０１３３】
Ｆａｇｅｒｂｅｒｇ，Ｌ．，Ｈａｌｌｓｔｒｏｍ，Ｂ．Ｍ．，Ｏｋｓｖｏｌｄ，Ｐ．，Ｋａｍｐｆ，Ｃ．，Ｄｊｕｒｅｉｎｏｖｉｃ，Ｄ．，Ｏｄｅｂｅｒｇ，Ｊ．，Ｈａｂｕｋａ，Ｍ．，Ｔａｈｍａｓｅｂｐｏｏｒ，Ｓ．，Ｄａｎｉｅｌｓｓｏｎ，Ａ．，Ｅｄｌｕｎｄ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）．Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃｓ  ａｎｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｂａｓｅｄ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  １３，３９７−４０６．
【０１３４】
Ｆｉｎｋｂｅｉｎｅｒ，Ｓ．Ｒ．，Ｈｉｌｌ，Ｄ．Ｒ．，Ａｌｔｈｅｉｍ，Ｃ．Ｈ．，Ｄｅｄｈｉａ，Ｐ．Ｈ．，Ｔａｙｌｏｒ，Ｍ．Ｊ．，Ｔｓａｉ，Ｙ．Ｈ．，Ｃｈｉｎ，Ａ．Ｍ．，Ｍａｈｅ，Ｍ．Ｍ．，Ｗａｔｓｏｎ，Ｃ．Ｌ．，Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｊ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ−ｗｉｄｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｒｅｖｅａｌｓ  Ｈａｌｌｍａｒｋｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ．
【０１３５】
ＦｉｔｚＰａｔｒｉｃｋ，Ｄ．Ｒ．，Ｃａｒｒ，Ｉ．Ｍ．，ＭｃＬａｒｅｎ，Ｌ．，Ｌｅｅｋ，Ｊ．Ｐ．，Ｗｉｇｈｔｍａｎ，Ｐ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ，Ｋ．，Ｇａｕｔｉｅｒ，Ｐ．，ＭｃＧｉｌｌ，Ｎ．，Ｈａｙｗａｒｄ，Ｃ．，Ｆｉｒｔｈ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．（２００３）．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳＡＴＢ２  ａｓ  ｔｈｅ  ｃｌｅｆｔ  ｐａｌａｔｅ  ｇｅｎｅ  ｏｎ  ２ｑ３２−ｑ３３．Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  １２，２４９１−２５０１．
【０１３６】
Ｇｅｏｒｇａｓ，Ｋ．Ｍ．，Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，Ｊ．，Ｋｅａｓｔ，Ｊ．Ｒ．，Ｌａｒｋｉｎｓ，Ｃ．Ｅ．，ＭｃＨｕｇｈ，Ｋ．Ｍ．，Ｓｏｕｔｈａｒｄ−Ｓｍｉｔｈ，Ｅ．Ｍ．，Ｃｏｈｎ，Ｍ．Ｊ．，Ｂａｔｏｕｒｉｎａ，Ｅ．，Ｄａｎ，Ｈ．，Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｋ．，ｅｔ  ａ／．（２０１５）．Ａｎ  ｉｌｌｕｓｔｒａｔｅｄ  ａｎａｔｏｍｉｃａｌ  ｏｎｔｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｍｏｕｓｅ  ｌｏｗｅｒ  ｕｒｏｇｅｎｉｔａｌ  ｔｒａｃｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １４２，１８９３−１９０８．
【０１３７】
Ｇｉｎｅｓｔｅｔ，Ｃ．（２０１１）．ｇｇｐｌｏｔ２：  Ｅｌｅｇａｎｔ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  ｆｏｒ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｊ  Ｒ  Ｓｔａｔ  Ｓｏｃ  ａ  Ｓｔａｔ  １７４，２４５¬２４５．
【０１３８】
Ｇｒａｃｚ，Ａ．Ｄ．，Ｒａｍａｌｉｎｇａｍ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｍａｇｎｅｓｓ，Ｓ．Ｔ．（２０１０）．Ｓｏｘ９  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｍａｒｋｓ  ａ  ｓｕｂｓｅｔ  ｏｆ  ＣＤ２４−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｔｈａｔ  ｆｏｒｍ  ｏｒｇａｎｏｉｄｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ−Ｇａｓｔｒ  Ｌ  ２９８，Ｇ５９０−Ｇ６００．
【０１３９】
Ｇｕｏ，Ｚ．，Ｄｒｉｖｅｒ，Ｉ．，ａｎｄ  Ｏｈｌｓｔｅｉｎ，Ｂ．（２０１３）．Ｉｎｊｕｒｙ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ＢＭＰ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｉｄｇｕｔ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２０１，９４５−９６１．
【０１４０】
Ｇｙｏｒｇｙ，Ａ．Ｂ．，Ｓｚｅｍｅｓ，Ｍ．，ｄｅ  Ｊｕａｎ  Ｒｏｍｅｒｏ，Ｃ．，Ｔａｒａｂｙｋｉｎ，Ｖ．，ａｎｄ  Ａｇｏｓｔｏｎ，Ｄ．Ｖ．（２００８）．ＳＡＴＢ２  ｉｎｔｅｒａｃｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ−ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｉｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ  ｃｏｒｔｉｃａｌ  ｎｅｕｒｏｎｓ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２７，８６５−８７３．
【０１４１】
Ｈａｒａｍｉｓ，Ａ．Ｐ．Ｇ．，Ｂｅｇｔｈｅｌ，Ｈ．，ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｏｒｎ，Ｍ．，ｖａｎ  Ｅｓ，Ｊ．，Ｊｏｎｋｈｅｅｒ，Ｓ．，Ｏｆｆｅｒｈａｕｓ，Ｇ．Ｊ．Ａ．，ａｎｄ  Ｃｌｅｖｅｒｓ，Ｈ．（２００４）．Ｄｅ  ｎｏｖｏ  ｃｒｙｐｔ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｊｕｖｅｎｉｌｅ  ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ  ｏｎ  ＢＭＰ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０３，１６８４−１６８６．
【０１４２】
Ｈａｒｄｗｉｃｋ，Ｊ．Ｃ．，Ｖａｎ  Ｄｅｎ  Ｂｒｉｎｋ，Ｇ．Ｒ．，Ｂｌｅｕｍｉｎｇ，Ｓ．Ａ．，Ｂａｌｌｅｓｔｅｒ，Ｉ．，Ｖａｎ  Ｄｅｎ  Ｂｒａｎｄｅ，Ｊ．Ｍ．，Ｋｅｌｌｅｒ，Ｊ．Ｊ．，Ｏｆｆｅｒｈａｕｓ，Ｇ．Ｊ．，Ｖａｎ  Ｄｅｖｅｎｔｅｒ，Ｓ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｐｅｐｐｅｌｅｎｂｏｓｃｈ，Ｍ．Ｐ．（２００４）．Ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２  ｉｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｂｙ，ａｎｄ  ａｃｔｓ  ｕｐｏｎ，ｍａｔｕｒｅ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｏｌｏｎ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２６，１１１−１２１．
【０１４３】
Ｈｅ，Ｘ．Ｃ．，Ｚｈａｎｇ，Ｊ．Ｗ．，Ｔｏｎｇ，Ｗ．Ｇ．，Ｔａｗｆｉｋ，０．，Ｒｏｓｓ，Ｊ．，Ｓｃｏｖｉｌｌｅ，Ｄ．Ｈ．，Ｔｉａｎ，Ｑ．，Ｚｅｎｇ，Ｘ．，Ｈｅ，Ｘ．，Ｗｉｅｄｅｍａｎｎ，Ｌ．Ｍ．，ｅｔ  ａ／．（２００４）．ＢＭＰ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｗｎｔ−ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３６，１１１７−１１２１．
【０１４４】
Ｈｉｇｕｃｈｉ，Ｙ．，Ｋｏｊｉｍａ，Ｍ．，Ｉｓｈｉｉ，Ｇ．，Ａｏｙａｇｉ，Ｋ．，Ｓａｓａｋｉ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｏｃｈｉａｉ，Ａ．（２０１５）．Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  Ｈａｖｅ  Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ，Ｄｉｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ：  Ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．Ｐｌｏｓ  Ｏｎｅ  １０．
【０１４５】
Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｐ．Ｗ．Ｈ．，Ｂｏｏｔｈ，Ｈ．Ａ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｂｒｕｆｏｒｄ，Ｅ．Ａ．（２００７）．Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｌｌ  ｈｕｍａｎ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ  ｇｅｎｅｓ．Ｂｍｃ  Ｂｉｏｌ  ５．
【０１４６】
Ｊｅｅｊｅｅｂｈｏｙ，Ｋ．Ｎ．（２００２）．Ｓｈｏｒｔ  ｂｏｗｅｌ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ：  ａ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  ｍｅｄｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ．ＣＭＡＪ  １６６，１２９７−１３０２．
【０１４７】
Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｔ．Ｂ．（１９１３）．Ｅｘｔｒｏｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂｌａｄｄｅｒ，ｃｏｍｐｌｉｃａｔｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｏｐｅｎｉｎｇｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｓｕｒｆａｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｘｔｒｏｖｅｒｔｅｄ  Ａｒｅａ．Ｊ  Ａｎａｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ４８，８９−１０６．
【０１４８】
Ｋｏｈｌｎｈｏｆｅｒ，Ｂ．Ｍ．，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｃ．Ａ．，Ｗａｌｋｅｒ，Ｅ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｂａｔｔｌｅ，Ｍ．Ａ．（２０１６）．ＧＡＴＡ４  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ  ２，１８９−２０９．
【０１４９】
Ｋｕｍａｒ，Ｍ．，Ｊｏｒｄａｎ，Ｎ．，Ｍｅｌｔｏｎ，Ｄ．，ａｎｄ  Ｇｒａｐｉｎ−Ｂｏｔｔｏｎ，Ａ．（２００３）．Ｓｉｇｎａｌｓ  ｆｒｏｍ  ｌａｔｅｒａｌ  ｐｌａｔｅ  ｍｅｓｏｄｅｒｍ  ｉｎｓｔｒｕｃｔ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ  ｔｏｗａｒｄ  ａ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｆａｔｅ．Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２５９，１０９−１２２．
【０１５０】
Ｌａｎｇｍｅａｄ，Ｂ．，Ｔｒａｐｎｅｌｌ，Ｃ．，Ｐｏｐ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｓａｌｚｂｅｒｇ，Ｓ．Ｌ．（２００９）．Ｕｌｔｒａｆａｓｔ  ａｎｄ  ｍｅｍｏｒｙ−ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｈｏｒｔ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ  １０，Ｒ２５．
【０１５１】
Ｌｉ，Ｈ．，Ｃｏｇｈｌａｎ，Ａ．，Ｒｕａｎ，Ｊ．，Ｃｏｉｎ，Ｌ．Ｊ．，Ｈｅｒｉｃｈｅ，Ｊ．Ｋ．，Ｏｓｍｏｔｈｅｒｌｙ，Ｌ．，Ｌｉ，Ｒ．，Ｌｉｕ，Ｔ．，Ｚｈａｎｇ，Ｚ．，Ｂｏｌｕｎｄ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．（２００６）．ＴｒｅｅＦａｍ：  ａ  ｃｕｒａｔｅｄ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｔｒｅｅｓ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌ  ｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｉｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３４，Ｄ５７２−５８０．
【０１５２】
Ｌｉ，Ｌ．Ｈ．（２００５）．ＢＭＰ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａｎｔａｇｏｎｉｚｉｎｇ  Ｗｎｔ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２８，Ａ７０２−Ａ７０２．
【０１５３】
ＭｃＣｒａｃｋｅｎ，Ｋ．Ｗ．，Ａｉｈａｒａ，Ｅ．，Ｍａｒｔｉｎ，Ｂ．，Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｃ．Ｍ．，Ｂｒｏｄａ，Ｔ．，Ｔｒｅｇｕｉｅｒ，Ｊ．，Ｚｈａｎｇ，Ｘ．，Ｓｈａｎｎｏｎ，Ｊ．Ｍ．，Ｍｏｎｔｒｏｓｅ，Ｍ．Ｈ．，ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ｍ．（２０１７）．Ｗｎｔ／ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｆｕｎｄｕｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ５４１，１８２−１８７．
【０１５４】
ＭｃＣｒａｃｋｅｎ，Ｋ．Ｗ．，Ｃａｔａ，Ｅ．Ｍ．，Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｃ．Ｍ．，Ｓｉｎａｇｏｇａ，Ｋ．Ｌ．，Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ，Ｍ．，Ｒｏｃｋｉｃｈ，Ｂ．Ｅ．，Ｔｓａｉ，Ｙ．Ｈ．，Ｍａｙｈｅｗ，Ｃ．Ｎ．，Ｓｐｅｎｃｅ，Ｊ．Ｒ．，Ｚａｖｒｏｓ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）．Ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ−ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｏｒｇａｎｏｉｄｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ５１６，４００¬４０４．
【０１５５】
ＭｃＧｏｖｅｒｎ，Ｄ．Ｐ．，Ｇａｒｄｅｔ，Ａ．，Ｔｏｒｋｖｉｓｔ，Ｌ．，Ｇｏｙｅｔｔｅ，Ｐ．，Ｅｓｓｅｒｓ，Ｊ．，Ｔａｙｌｏｒ，Ｋ．Ｄ．，Ｎｅａｌｅ，Ｂ．Ｍ．，Ｏｎｇ，Ｒ．Ｔ．，Ｌａｇａｃｅ，Ｃ．，Ｌｉ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）．Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ  ｃｏｌｉｔｉｓ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｌｏｃｉ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ４２，３３２−３３７．
【０１５６】
Ｍｏｌｏｄｅｃｋｙ，ＮＡ．，Ｓｏｏｎ，Ｉ．Ｓ．，Ｒａｂｉ，Ｄ．Ｍ．，Ｇｈａｌｉ，Ｗ．Ａ．，Ｆｅｒｒｉｓ，Ｍ．，Ｃｈｅｒｎｏｆｆ，Ｇ．，Ｂｅｎｃｈｉｍｏｌ，Ｅ．Ｉ．，Ｐａｎａｃｃｉｏｎｅ，Ｒ．，Ｇｈｏｓｈ，Ｓ．，Ｂａｒｋｅｍａ，Ｈ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）．Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｗｉｔｈ  ｔｉｍｅ，ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｒｅｖｉｅｗ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １４２，４６−５４  ｅ４２；  ｑｕｉｚ  ｅ３０．
【０１５７】
Ｍｏｓｅｒ，Ａ．Ｒ．，Ｐｉｔｏｔ，Ｈ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｄｏｖｅ，Ｗ．Ｆ．（１９９０）．Ａ  Ｄｏｍｉｎａｎｔ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｔｈａｔ  Ｐｒｅｄｉｓｐｏｓｅｓ  ｔｏ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｎｅｏｐｌａｓｉａ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７，３２２−３２４．
【０１５８】
Ｐａｔａｎｋａｒ，Ｊ．，Ｏｂｒｏｗｓｋｙ，Ｓ．，Ｈｏｅｆｌｅｒ，Ｇ．，Ｂａｔｔｌｅ，Ｍ．，Ｋｒａｔｋｙ，Ｄ．，ａｎｄ  Ｌｅｖａｋ−Ｆｒａｎｋ，Ｓ．（２０１２ａ）．Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  Ｇａｔａ４  Ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｆｒｏｍ  Ｄｉｅｔ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｈｅｐａｔｉｃ  Ｓｔｅａｔｏｓｉｓ  ｂｙ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｎｇ  Ｄｅ  Ｎｏｖｏ  Ｌｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｇｌｕｃｏｎｅｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ．Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ  ５６，Ｓ４９６−Ｓ４９６．
【０１５９】
Ｐａｔａｎｋａｒ，Ｊ．Ｖ．，Ｏｂｒｏｗｓｋｙ，Ｓ．，Ｄｏｄｄａｐａｔｔａｒ，Ｐ．，Ｈｏｅｆｌｅｒ，Ｇ．，Ｂａｔｔｌｅ，Ｍ．，Ｌｅｖａｋ−Ｆｒａｎｋ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｋｒａｔｋｙ，Ｄ．（２０１２ｂ）．Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ＧＡＴＡ４  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｆｒｏｍ  ｄｉｅｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｓｔｅａｔｏｓｉｓ．Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ  ５７，１０６１−１０６８．
【０１６０】
Ｒａｍａｌｉｎｇａｍ，Ｓ．，Ｄａｕｇｈｔｒｉｄｇｅ，Ｇ．Ｗ．，Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｍ．Ｊ．，Ｇｒａｃｚ，Ａ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｍａｇｎｅｓｓ，Ｓ．Ｔ．（２０１２）．Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  Ｓｏｘ９  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｍａｒｋ  ｃｏｌｏｎ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｔｈａｔ  ｆｏｒｍ  ｃｏｌｏｎｏｉｄｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ  Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ３０２，Ｇ１０−２０．
【０１６１】
Ｒａｎｋｉｎ，Ｓ．Ａ．，Ｇａｌｌａｓ，Ａ．Ｌ．，Ｎｅｔｏ，Ａ．，Ｇｏｍｅｚ−Ｓｋａｒｍｅｔａ，Ｊ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｚｏｒｎ，Ａ．Ｍ．（２０１２）．Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｍｐ４  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒｓ  Ｏｓｒｌ  ａｎｄ  Ｏｓｒ２  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  Ｗｎｔ／ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｌｕｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｘｅｎｏｐｕｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３９，３０１０−３０２０．
【０１６２】
Ｒａｎｋｉｎ，Ｓ．Ａ．，Ｔｈｉ  Ｔｒａｎ，Ｈ．，Ｗｌｉｚｌａ，Ｍ．，Ｍａｎｃｉｎｉ，Ｐ．，Ｓｈｉｆｌｅｙ，Ｅ．Ｔ．，Ｂｌｏｏｒ，Ｓ．Ｄ．，Ｈａｎ，Ｌ．，Ｖｌｅｍｉｎｃｋｘ，Ｋ．，Ｗｅｒｔ，Ｓ．Ｅ．，ａｎｄ  Ｚｏｒｎ，Ａ．Ｍ．（２０１５）．Ａ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ：  ａｎ  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎａｔｏｍｉｓｔｓ  ２４４，６９−８５．
【０１６３】
Ｒａｔｉｎｅａｕ，Ｃ．，Ｄｕｌｕｃ，Ｉ．，Ｐｏｕｒｒｅｙｒｏｎ，Ｃ．，Ｋｅｄｉｎｇｅｒ，Ｍ．，Ｆｒｅｕｎｄ，Ｊ．Ｎ．，ａｎｄ  Ｒｏｃｈｅ，Ｃ．（２００３）．Ｅｎｄｏｄｅｒｍ−  ａｎｄ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｔｙｐｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  ｏｆ  ｒａｔ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ７１，１６３−１６９．
【０１６４】
Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｄ．Ｊ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｒ．Ｌ．，Ｂｕｒｋｅ，Ａ．Ｃ．，Ｎｅｌｓｏｎ，Ｃ．Ｅ．，Ｍｏｒｇａｎ，Ｂ．Ａ．，ａｎｄ  Ｔａｂｉｎ，Ｃ．（１９９５）．Ｓｏｎｉｃ  Ｈｅｄｇｅｈｏｇ  Ｉｓ  ａｎ  Ｅｎｄｏｄｅｒｍａｌ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｉｎｄｕｃｉｎｇ  Ｂｍｐ−４  ａｎｄ  Ｈｏｘ  Ｇｅｎｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｇｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｈｉｃｋ  Ｈｉｎｄｇｕｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２１，３１６３−３１７４．
【０１６５】
Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｐｉｎｅｉｒｏ，Ａ．Ｍ．，Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ，Ｊ．Ｈ．，Ｅｒｍｕｎｄ，Ａ．，Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ，Ｊ．Ｋ．，Ｓｃｈｕｔｔｅ，Ａ．，Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，Ｍ．Ｅ．，ａｎｄ  Ｈａｎｓｓｏｎ，Ｇ．Ｃ．（２０１３）．Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｍｕｃｕｓ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｓｔｏｍａｃｈ，ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ，ａｎｄ  ｃｏｌｏｎ．ＩＩ．Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｍｕｃｕｓ  ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ｒｅｖｅａｌｓ  Ｍｕｃ２  ａｎｄ  Ｍｕｃ５ａｃ  ａｃｃｏｍｐａｎｉｅｄ  ｂｙ  ａ  ｓｅｔ  ｏｆ  ｃｏｒｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ  Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ３０５，Ｇ３４８¬３５６．
【０１６６】
Ｓａｖｉｄｇｅ，Ｔ．Ｃ．，Ｍｏｒｅｙ，Ａ．Ｌ．，Ｆｅｒｇｕｓｏｎ，Ｄ．Ｊ．，Ｆｌｅｍｉｎｇ，Ｋ．Ａ．，Ｓｈｍａｋｏｖ，Ａ．Ｎ．，ａｎｄ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ａ．Ｄ．（１９９５）．Ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｉｎ  ａ  ｓｅｖｅｒｅ−ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  ｍｏｄｅｌ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ５８，３６１−３７１．
【０１６７】
Ｓａｖｉｎ，Ｔ．，Ｋｕｒｐｉｏｓ，Ｎ．Ａ．，Ｓｈｙｅｒ，Ａ．Ｅ．，Ｆｌｏｒｅｓｃｕ，Ｐ．，Ｌｉａｎｇ，Ｈ．，Ｍａｈａｄｅｖａｎ，Ｌ．，ａｎｄ  Ｔａｂｉｎ，Ｃ．Ｊ．（２０１１）．Ｏｎ  ｔｈｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｆｏｒｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｕｔ．Ｎａｔｕｒｅ  ４７６，５７−６２．
【０１６８】
Ｓｈｅｅｈａｎ−Ｒｏｏｎｅｙ，Ｋ．，Ｓｗａｒｔｚ，Ｍ．Ｅ．，Ｌｏｖｅｌｙ，Ｃ．Ｂ．，Ｄｉｘｏｎ，Ｍ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｅｂｅｒｈａｒｔ，Ｊ．Ｋ．（２０１３）．Ｂｍｐ  ａｎｄ  Ｓｈｈ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｍｅｄｉａｔｅ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｓａｔｂ２  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｈａｒｙｎｇｅａｌ  ａｒｃｈｅｓ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ８，ｅ５９５３３．
【０１６９】
Ｓｈｅｒｗｏｏｄ，Ｒ．Ｉ．，Ｃｈｅｎ，Ｔ．Ｙ．，ａｎｄ  Ｍｅｌｔｏｎ，Ｄ．Ａ．（２００９）．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  ｅｎｄｏｄｅｒｍａｌ  ｏｒｇａｎ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ：  ａｎ  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎａｔｏｍｉｓｔｓ  ２３８，２９−４２．
【０１７０】
Ｓｈｅｒｗｏｏｄ，Ｒ．Ｉ．，Ｍａｅｈｒ，Ｒ．，Ｍａｚｚｏｎｉ，Ｅ．Ｏ．，ａｎｄ  Ｍｅｌｔｏｎ，Ｄ．Ａ．（２０１１）．Ｗｎｔ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｅｓ  ａｎｄ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ．Ｍｅｃｈ  Ｄｅｖ  １２８，３８７−４００．
【０１７１】
Ｓｈｙｅｒ，Ａ．Ｅ．，Ｈｕｙｃｋｅ，Ｔ．Ｒ．，Ｌｅｅ，Ｃ．，Ｍａｈａｄｅｖａｎ，Ｌ．，ａｎｄ  Ｔａｂｉｎ，Ｃ．Ｊ．（２０１５）．Ｂｅｎｄｉｎｇ  ｇｒａｄｉｅｎｔｓ：  ｈｏｗ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｇｅｔｓ  ｉｔｓ  ｈｏｍｅ．Ｃｅｌｌ  １６１，５６９−５８０．
【０１７２】
Ｓｉｅｇｅｌ，Ｒ．，Ｄｅｓａｎｔｉｓ，Ｃ．，ａｎｄ  Ｊｅｍａｌ，Ａ．（２０１４）．Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，２０１４．ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  ６４，１０４−１１７．
【０１７３】
Ｓｐｅｎｃｅ，Ｊ．Ｒ．，Ｍａｙｈｅｗ，Ｃ．Ｎ．，Ｒａｎｋｉｎ，Ｓ．Ａ．，Ｋｕｈａｒ，Ｍ．Ｆ．，Ｖａｌｉａｎｃｅ，Ｊ．Ｅ．，Ｔｏｌｌｅ，Ｋ．，Ｈｏｓｋｉｎｓ，Ｅ．Ｅ．，Ｋａｌｉｎｉｃｈｅｎｋｏ，Ｖ．Ｖ．，Ｗｅｌｌｓ，Ｓｉ．，Ｚｏｒｎ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）．Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｔｏ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．Ｎａｔｕｒｅ  ４７０，１０５−１０９．
【０１７４】
Ｔｈａｎａｓｕｐａｗａｔ，Ｔ．，Ｈａｍｍｊｅ，Ｋ．，Ａｄｈａｍ，Ｉ．，Ｇｈｉａ，Ｊ．Ｅ．，Ｄｅｌ  Ｂｉｇｉｏ，Ｍ．Ｒ．，Ｋｒｃｅｋ，Ｊ．，Ｈｏａｎｇ−Ｖｕ，Ｃ．，Ｋｌｏｎｉｓｃｈ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｈｏｍｂａｃｈ−Ｋｌｏｎｉｓｃｈ，Ｓ．（２０１３）．ＩＮＳＬ５  ｉｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｅｎｔｅｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌａｒｇｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  ａｎｄ  ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｔｕｍｏｕｒｓ．Ｏｎｃｏｌ  Ｒｅｐ  ２９，１４９¬１５４．
【０１７５】
Ｔｉｓｏ，Ｎ．，Ｆｉｌｉｐｐｉ，Ａ．，Ｐａｕｌｓ，Ｓ．，Ｂｏｒｔｏｌｕｓｓｉ，Ｍ．，ａｎｄ  Ａｒｇｅｎｔｏｎ，Ｆ．（２００２）．ＢＭＰ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ａｎｔｅｒｏｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ  ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ  ｉｎ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ．Ｍｅｃｈ  Ｄｅｖ  １１８，２９−３７．
【０１７６】
Ｔｒａｐｎｅｌｌ，Ｃ．，Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ａ．，Ｇｏｆｆ，Ｌ．，Ｐｅｒｔｅａ，Ｇ．，Ｋｉｍ，Ｄ．，Ｋｅｌｌｅｙ，Ｄ．Ｒ．，Ｐｉｍｅｎｔｅｌ，Ｈ．，Ｓａｌｚｂｅｒｇ，Ｓ．Ｌ．，Ｒｉｎｎ，Ｊ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｐａｃｈｔｅｒ，Ｌ．（２０１２）．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＲＮＡ−ｓｅｑ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ＴｏｐＨａｔ  ａｎｄ  Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓ．Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ  ７，５６２−５７８．
【０１７７】
Ｕｐｐａｌ，Ｋ．，Ｔｕｂｂｓ，Ｒ．Ｓ．，Ｍａｔｕｓｚ，Ｐ．，Ｓｈａｆｆｅｒ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｌｏｕｋａｓ，Ｍ．（２０１１）．Ｍｅｃｋｅｌ’ｓ  ｄｉｖｅｒｔｉｃｕｌｕｍ：  ａ  ｒｅｖｉｅｗ．Ｃｌｉｎ  Ａｎａｔ  ２４，４１６−４２２．
【０１７８】
ｖａｎ  Ｄｏｐ，Ｗ．Ａ．，Ｕｈｍａｎｎ，Ａ．，Ｗｉｊｇｅｒｄｅ，Ｍ．，Ｓｌｅｄｄｅｎｓ−Ｌｉｎｋｅｌｓ，Ｅ．，Ｈｅｉｊｍａｎｓ，Ｊ．，Ｏｆｆｅｒｈａｕｓ，Ｇ．Ｊ．，Ｗｅｅｒｍａｎ，Ｍ．Ａ．Ｖ．，Ｂｏｅｃｋｘｓｔａｅｎｓ，Ｇ．Ｅ．，Ｈｏｍｍｅｓ，Ｄ．Ｗ．，Ｈａｒｄｗｉｃｋ，Ｊ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．（２００９）．Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｏｌｏｎｉｃ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ  Ｕｐｏｎ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｅｄｇｅｈｏｇ  Ｐａｔｈｗａｙ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １３６，２１９５−２２０３．
【０１７９】
ｖａｎ  Ｋｌｉｎｋｅｎ，Ｂ．Ｊ．，Ｄｅｋｋｅｒ，Ｊ．，ｖａｎ  Ｇｏｏｌ，Ｓ．Ａ．，ｖａｎ  Ｍａｒｉｅ，Ｊ．，Ｂｕｌｌｅｒ，Ｈ．Ａ．，ａｎｄ  Ｅｉｎｅｒｈａｎｄ，Ａ．Ｗ．（１９９８）．ＭＵＣＳＢ  ｉｓ  ｔｈｅ  ｐｒｏｍｉｎｅｎｔ  ｍｕｃｉｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｇａｌｌｂｌａｄｄｅｒ  ａｎｄ  ｉｓ  ａｌｓｏ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ａ  ｓｕｂｓｅｔ  ｏｆ  ｃｏｌｏｎｉｃ  ｇｏｂｌｅｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ２７４，Ｇ８７１−８７８．
【０１８０】
Ｗａｌｋｅｒ，Ｅ．Ｍ．，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｃ．Ａ．，ａｎｄ  Ｂａｔｔｌｅ，Ｍ．Ａ．（２０１４）．ＧＡＴＡ４  ａｎｄ  ＧＡＴＡ６  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｙｔｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ３９２，２８３−２９４．
【０１８１】
Ｗａｌｔｏｎ，Ｋ．Ｄ．，Ｋｏｌｔｅｒｕｄ，Ａ．，Ｃｚｅｒｗｉｎｓｋｉ，Ｍ．Ｊ．，Ｂｅｌｌ，Ｍ．Ｊ．，Ｐｒａｋａｓｈ，Ａ．，Ｋｕｓｈｗａｈａ，Ｊ．，Ｇｒｏｓｓｅ，Ａ．Ｓ．，Ｓｃｈｎｅｌｌ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｇｕｍｕｃｉｏ，Ｄ．Ｌ．（２０１２）．Ｈｅｄｇｅｈｏｇ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｃｌｕｓｔｅｒｓ  ｄｉｒｅｃｔ  ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ  ｏｆ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｖｉｌｌｉ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０９，１５８１７¬１５８２２．
【０１８２】
Ｗａｌｔｏｎ，Ｋ．Ｄ．，Ｋｏｌｔｅｒｕｄ，Ａ．，Ｇｒｏｓｓｅ，Ａ．Ｓ．，Ｈｕ，Ｃ．Ｂ．，Ｃｚｅｒｗｉｎｓｋｉ，Ｍ．，Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｎ．，ａｎｄ  Ｇｕｍｕｃｉｏ，Ｄ．Ｌ．（２００９）．Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｈｅｄｇｅｈｏｇ  ｓｉｇｎａｌｓ  ｄｉｒｅｃｔ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｖｉｌｌｕｓ  ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ＢＭＰ．Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ３３１，４８９−４８９．
【０１８３】
Ｗａｌｔｏｎ，Ｋ．Ｄ．，Ｗｈｉｄｄｅｎ，Ｍ．，Ｋｏｌｔｅｒｕｄ，Ａ．，Ｓｈｏｆｆｎｅｒ，Ｓ．Ｋ．，Ｃｚｅｒｗｉｎｓｋｉ，Ｍ．Ｊ．，Ｋｕｓｈｗａｈａ，Ｊ．，Ｐａｒｍａｒ，Ｎ．，Ｃｈａｎｄｈｒａｓｅｋｈａｒ，Ｄ．，Ｆｒｅｄｄｏ，Ａ．Ｍ．，Ｓｃｈｎｅｌｌ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１６）．Ｖｉｌｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ：  Ｂｍｐ  ｓｉｇｎａｌｓ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｖｉｌｌｕｓ  ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １４３，４２７−４３６．
【０１８４】
Ｗａｎｇ，Ｘ．，Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｙ．，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｌ．Ｈ．，Ｚｈａｎｇ，Ｔ．，Ｈｏｗｉｔｔ，Ｂ．Ｅ．，Ｆａｒｒｏｗ，Ｍ．Ａ．，Ｋｅｒｎ，Ｆ．，Ｎｉｎｇ，Ｇ．，Ｈｏｎｇ，Ｙ．，Ｋｈｏｒ，Ｃ．Ｃ．，ｅｔａｌ．（２０１５）．Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｒｏｕｎｄ  ｓｔａｔｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ５２２，１７３−１７８．
【０１８５】
Ｗａｔｓｏｎ，Ｃ．Ｌ．，Ｍａｈｅ，Ｍ．Ｍ．，Ｍｕｎｅｒａ，Ｊ．，Ｈｏｗｅｌｌ，Ｊ．Ｃ．，Ｓｕｎｄａｒａｍ，Ｎ．，Ｐｏｌｉｎｇ，Ｈ．Ｍ．，Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ，Ｊ．ｌ．，Ｖａｌｉａｎｃｅ，Ｊ．Ｅ．，Ｍａｙｈｅｗ，Ｃ．Ｎ．，Ｓｕｎ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）．Ａｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  ｕｓｉｎｇ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２０，１３１０−１３１４．
【０１８６】
Ｗｅｈｋａｍｐ，Ｊ．，Ｃｈｕ，Ｈ．，Ｓｈｅｎ，Ｂ．，Ｆｅａｔｈｅｒｓ，Ｒ．Ｗ．，Ｋａｙｓ，Ｒ．Ｊ．，Ｌｅｅ，Ｓ．Ｋ．，ａｎｄ  Ｂｅｖｉｎｓ，Ｃ．Ｌ．（２００６）．Ｐａｎｅｔｈ  ｃｅｌｌ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ：  ｔｏｐｏｇｒａｐｈｉｃａｌ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｔｉｓｓｕｅｓ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｆｔ  ５８０，５３４４−５３５０．
【０１８７】
Ｗｈｉｓｓｅｌｌ，Ｇ．，Ｍｏｎｔａｇｎｉ，Ｅ．，Ｍａｒｔｉｎｅｌｌｉ，Ｐ．，Ｈｅｒｎａｎｄｏ−Ｍｏｍｂｌｏｎａ，Ｘ．，Ｓｅｖｉｌｌａｎｏ，Ｍ．，Ｊｕｎｇ，Ｐ．，Ｃｏｒｔｉｎａ，Ｃ．，Ｃａｔｏｎ，Ａ．，Ａｂｕｌｉ，Ａ．，Ｃａｓｔｅｌｌｓ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）．Ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＧＡＴＡ６  ｅｎａｂｌｅｓ  ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ  ｏｆ  ｃｏｌｏｎ  ａｄｅｎｏｍａ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｎｇ  ＢＭＰ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １６，６９５−７０７．
【０１８８】
Ｗｉｌｌｓ，Ａ．，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｋ．，Ｋｈｏｋｈａ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｂａｋｅｒ，Ｊ．Ｃ．（２００８）．Ｂｍｐ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｓ  ｎｅｃｅｓｓａｒｙ  ａｎｄ  ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｆｏｒ  ｖｅｎｔｒｏｌａｔｅｒａｌ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｘｅｎｏｐｕｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ：  ａｎ  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎａｔｏｍｉｓｔｓ  ２３７，２１７７−２１８６．
【０１８９】
Ｘｕｅ，Ｘ．，Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｓ．，Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｅ．，Ｔａｙｌｏｒ，Ｍ．，Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，Ｅ．Ｍ．，Ｓｐｅｎｃｅ，Ｊ．Ｒ．，Ｈｕａｎｇ，Ｓ．，Ｇｒｅｅｎｓｏｎ，Ｊ．Ｋ．，ａｎｄ  Ｓｈａｈ，Ｙ．Ｍ．（２０１３）．Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ＰＡＳ  ｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ  ｔｏ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｃｏｌｉｔｉｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １４５，８３１−８４１．
【０１９０】
Ｙａｈａｇｉ，Ｎ．，Ｋｏｓａｋｉ，Ｒ．，Ｉｔｏ，Ｔ．，Ｍｉｔｓｕｈａｓｈｉ，Ｔ．，Ｓｈｉｍａｄａ，Ｈ．，Ｔｏｍｉｔａ，Ｍ．，Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｋｏｓａｋｉ，Ｋ．（２００４）．Ｐｏｓｉｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｏｘ  ｇｅｎｅｓ  ａｌｏｎｇ  ｔｈｅ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｔｒａｃｔ．Ｃｏｎｇｅｎｉｔ  Ａｎｏｍ  （Ｋｙｏｔｏ）  ４４，１８−２６．
【０１９１】
Ｚｂｕｋ，Ｋ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｅｎｇ，Ｃ．（２００７）．Ｈａｍａｒｔｏｍａｔｏｕｓ  ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ．Ｎａｔ  Ｃｌｉｎ  Ｐｒａｃｔ  Ｇａｓｔｒ  ４，４９２−５０２．
【０１９２】
Ｚｏｒｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ｍ．（２００９）．Ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｏｒｇａｎ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２５，２２１−２５１．
【０１９３】
他に指示がない限り、パーセンテージおよび割合はすべて重量で計算される。すべてのパーセンテージおよび割合は、特に指示がない限り、組成物全体を基準にして計算される。
【０１９４】
本明細書全体を通じて記載されているあらゆる最大数値限定には、それより小さいあらゆる数値限定が、そのようなより小さい数値限定が本明細書に明確に記載されているかのように含まれることを理解すべきである。本明細書全体を通じて記載されるあらゆる最小数値限定は、それよりも大きいあらゆる数値限定を、あたかもこうしたそれよりも大きい数値限定が本明細書に明確に記載されているかのように含む。本明細書全体を通じて記載されるあらゆる数値範囲は、こうしたより広い数値範囲内に入る、それよりも狭いあらゆる数値範囲を、あたかもこうしたそれよりも狭い数値範囲がすべて本明細書に明確に記載されているかのように含む。
【０１９５】
本明細書に開示した寸法および値は、列挙された正確な数値に厳密に限定されるものと理解されるべきではない。むしろ、特に指定されない限り、そのような各寸法は、列挙された値とその値の周辺の機能的に同等の範囲の両方を意味することが意図されている。例えば、「２０ｍｍ」として開示される寸法は、「約２０ｍｍ」を意味するものとする。
【０１９６】
相互参照されるまたは関連特許もしくは出願のいずれも含めた、本明細書に引用されているすべての文書は、明示的に除外される、または特に限定されない限り、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。いかなる文献の引用も、本明細書中で開示または特許請求される任意の発明に対する先行技術であるとはみなされず、あるいはそれを単独でまたは他の任意の参考文献（単数または複数）と組み合わせたときに、そのような発明すべてを教示、示唆、または開示するとはみなされない。さらに、本文書における用語の任意の意味または定義が、参照により組み込まれた文書内の同じ用語の意味または定義と矛盾する場合、本文書におけるその用語に割り当てられた意味または定義が適用されるものとする。
【０１９７】
本発明の特定の実施形態を例示し説明してきたが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく他の様々な変更および修正を加えることができることは当業者には明らかであろう。したがって、本発明の範囲内にあるそのようなすべての変更および修正を添付の特許請求の範囲で網羅することを意図している。
【０１９８】
【図１Ａ】
2020501534.tif 000027
【図１Ｂ】
2020501534.tif 000028
【図１Ｃ】
2020501534.tif 000029
【図２Ａ】
2020501534.tif 000030
【図２Ｂ】
2020501534.tif 000031
【図３Ａ】
2020501534.tif 000032
【図３Ｂ】
2020501534.tif 000033
【図４Ａ】
2020501534.tif 000034
【図４Ｂ】
2020501534.tif 000035
【図５】
2020501534.tif 000036
【図６】
2020501534.tif 000037
【図７Ａ】
2020501534.tif 000038
【図７Ｂ】
2020501534.tif 000039
【図８】
2020501534.tif 000040
【図９Ａ】
2020501534.tif 000041
【図９Ｂ】
2020501534.tif 000042
【図１０Ａ】
2020501534.tif 000043
【図１０Ｂ】
2020501534.tif 000044
【図１１Ａ】
2020501534.tif 000045
【図１１Ｂ】
2020501534.tif 000046
【図１２Ａ】
2020501534.tif 000047
【図１２Ｂ】
2020501534.tif 000048
【図１３Ａ】
2020501534.tif 000049
【図１３Ｂ】
2020501534.tif 000050
【図１３Ｃ】
2020501534.tif 000051
【図１４Ａ】
2020501534.tif 000052
【図１４Ｂ】
2020501534.tif 000053
【図１５Ａ】
2020501534.tif 000054
【図１５Ｂ】
2020501534.tif 000055
【図１６Ａ】
2020501534.tif 000056
【図１６Ｂ】
2020501534.tif 000057
【配列表】
2020501534000001.app
【国際調査報告】
2020501534.tif 000058
2020501534.tif 000059