(57)【要約】  野生型ＮｉｃＡ２およびＮＯＸ酵素と比較したニコチン分解活性の増加および／または免疫原性の減少を示すニコチン分解酵素変異体、変異体を含む組成物、ならびにそれらを使用する方法を記載する。
2020506709.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載の野生型ＮｉｃＡ２酵素のアミノ酸配列の変異体であるアミノ酸配列を含むニコチン分解酵素変異体であって、前記変異体配列が、前記野生型ＮｉｃＡ２酵素と比較して、前記変異体のニコチン分解活性を増加させる、および／または免疫原性を減少させる、配列番号１に対する少なくとも１つの置換、付加、または欠失を有する、ニコチン分解酵素変異体。
【請求項２】
前記変異体が、前記野生型ＮｉｃＡ２酵素と比較したニコチン分解活性の増加を示す、請求項１に記載の変異体。
【請求項３】
前記変異体配列が、置換Ｗ４２７Ｒ、Ｗ４２７Ｈ、Ｗ４２７Ｌ、Ｗ４２７Ｑ、Ｗ４２７Ｅ、Ｗ４２７Ｓ、またはＷ４２７Ｍを含む、請求項２に記載の変異体。
【請求項４】
前記変異体配列が、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、および配列番号１３５から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の変異体。
【請求項５】
前記変異体配列が、配列番号１の９１、１０４、１０６、１０７、２１７、２５０、３４０、３５５、３６６、３８１、４２７、４６２、および４６３から選択されるアミノ酸位置に少なくとも１つの置換を含む、請求項２に記載の変異体。
【請求項６】
前記変異体配列が、配列番号１の９１、１０４、１０６、１０７、２１７、２５０、３４０、３５５、３６６、３８１、４２７、４６２、および４６３から選択される２つ以上のアミノ酸位置に少なくとも２つの置換を含む、請求項２に記載の変異体。
【請求項７】
前記変異体配列が、配列番号１の９１、１０４、１０６、１０７、２１７、２５０、３４０、３５５、３６６、３８１、４２７、４６２、および４６３から選択される３つ以上のアミノ酸位置に少なくとも３つの置換を含む、請求項２に記載の変異体。
【請求項８】
前記変異体が、配列番号１の７４、７７、７８、８０、２６２〜２６６、３０３、３０４、３０６、３１０、３７４、３７７、３７８、３８２、３８３、４５０〜４５２、および４５７から選択されるアミノ酸位置に少なくとも１つの置換をさらに含む、請求項５〜７のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項９】
前記変異体が、アミノ酸位置２６２または２６３に置換を含む、請求項８に記載の変異体。
【請求項１０】
前記変異体が、アミノ酸位置２６２および２６３に置換を含む、請求項８に記載の変異体。
【請求項１１】
前記変異体配列が、Ｒ９１Ａ、Ｒ９１Ｑ、Ｒ９１Ｆ、Ｒ９１Ｇ、Ｒ９１Ｔ、Ｒ９１Ｌ、Ｒ９１Ｓ、およびＲ９１Ｎから選択される置換を含む、請求項２に記載の変異体。
【請求項１２】
前記変異体配列が、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、および配列番号１２９から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の変異体。
【請求項１３】
前記変異体配列が、Ｔ２５０Ｐ、Ｔ２５０Ｇ、Ｔ２５０Ｌ、Ｔ２５０Ｒ、およびＴ２５０Ｖから選択される置換を含む、請求項２に記載の変異体。
【請求項１４】
前記変異体配列が、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、および配列番号１３６から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の変異体。
【請求項１５】
前記変異体配列が、Ｋ３４０Ｐ、Ｋ３４０Ｉ、Ｋ３４０Ｖ、Ｋ３４０Ｄ、およびＫ３４０Ｅから選択される置換を含む、請求項２に記載の変異体。
【請求項１６】
前記変異体配列が、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、および配列番号２５から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の変異体。
【請求項１７】
前記変異体配列が、Ｑ３６６Ｋ、Ｑ３６６Ｅ、Ｑ３６６Ｖ、Ｑ３６６Ｌ、Ｑ３６６Ｉ、およびＱ３６６Ｙから選択される置換を含む、請求項２に記載の変異体。
【請求項１８】
前記変異体配列が、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、および配列番号１３０から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の変異体。
【請求項１９】
前記変異体配列が、Ｔ３８１Ｐ、Ｔ３８１Ｉ、Ｔ３８１Ｖ、Ｔ３８１Ｑ、Ｔ３８１Ｎ、Ｔ３８１Ｌ、およびＴ３８１Ｍから選択される置換を含む、請求項２に記載の変異体。
【請求項２０】
前記変異体配列が、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、および配列番号１３１から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の変異体。
【請求項２１】
前記変異体配列が、Ｎ４６２Ｍ、Ｎ４６２Ｌ、Ｎ４６２Ｙ、Ｎ４６２Ｓ、Ｎ４６２Ｆ、Ｎ４６２Ｇ、Ｎ４６２Ｅ、およびＮ４６２Ａから選択される置換を含む、請求項２に記載の変異体。
【請求項２２】
前記変異体配列が、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号１３２、および配列番号１３３から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の変異体。
【請求項２３】
前記変異体配列が、Ｉ４６３Ｆ、Ｉ４６３Ｙ、Ｉ４６３Ａ、Ｉ４６３Ｖ、およびＩ４６３Ｌから選択される置換を含む、請求項２に記載の変異体。
【請求項２４】
前記変異体配列が、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、および配列番号５０から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の変異体。
【請求項２５】
前記変異体配列が、Ｌ２１７Ｑ、Ｌ２１７Ｇ、Ｌ２１７Ｅ、Ｌ２１７Ｉ、Ｌ２１７Ｃ、およびＬ２１７Ｓから選択される置換を含む、請求項２に記載の変異体。
【請求項２６】
前記変異体配列が、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、および配列番号５６から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の変異体。
【請求項２７】
前記変異体配列が、Ａ１０７Ｈ、Ａ１０７Ｐ、Ａ１０７Ｒ、Ａ１０７Ｋ、およびＡ１０７Ｔから選択される置換を含む、請求項２に記載の変異体。
【請求項２８】
前記変異体配列が、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１３４、配列番号１４２、および配列番号１４３から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の変異体。
【請求項２９】
前記変異体配列が、Ｆ３５５ＣおよびＦ３５５Ｖから選択される置換を含む、請求項２に記載の変異体。
【請求項３０】
前記変異体配列が、配列番号１２７および配列番号１２８から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の変異体。
【請求項３１】
前記変異体配列が、（ｉ）Ｗ４２７ＱおよびＩ２６２Ａ、（ｉｉ）Ｗ４２７Ｑ、Ｉ２６２Ｔ、およびＮ２６３Ｒ、（ｉｉｉ）Ｗ４２７ＨおよびＮ４６２Ｆ、ならびに（ｉｖ）Ｗ４２７ＬおよびＮ４６２Ｍから選択される置換を含む、請求項２に記載の変異体。
【請求項３２】
前記変異体配列が、配列番号６２、配列番号６３、配列番号１３７、および配列番号１３８から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の変異体。
【請求項３３】
前記変異体配列が、Ｆ１０４Ｌから選択される置換を含む、請求項２に記載の変異体。
【請求項３４】
前記変異体配列が、配列番号１４０を含む、請求項２に記載の変異体。
【請求項３５】
前記変異体配列が、Ｇ１０６Ｓから選択される置換を含む、請求項２に記載の変異体。
【請求項３６】
前記変異体配列が、配列番号１４１を含む、請求項２に記載の変異体。
【請求項３７】
前記変異体のニコチン分解活性が、前記野生型ＮｉｃＡ２酵素のニコチン分解活性の少なくとも３００％である、請求項２に記載の変異体。
【請求項３８】
前記変異体のニコチン分解活性が、前記野生型ＮｉｃＡ２酵素のニコチン分解活性の少なくとも４００％である、請求項２に記載の変異体。
【請求項３９】
前記変異体のニコチン分解活性が、前記野生型ＮｉｃＡ２酵素のニコチン分解活性の少なくとも２００％である、請求項２に記載の変異体。
【請求項４０】
前記変異体が、前記野生型ＮｉｃＡ２酵素と比較した免疫原性の減少を示す、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項４１】
前記野生型ＮｉｃＡ２酵素と比較した免疫原性が７５％以上減少される、請求項４０に記載の変異体。
【請求項４２】
前記変異体配列が、配列番号１のアミノ酸１０〜３２、６８〜９４、１８９〜２２５、２４８〜２８５、２９６〜３２７、３３６〜３９１、および４３５〜４５９から選択される領域内の免疫原性Ｔ細胞エピトープ中に少なくとも１つの置換、付加、または欠失を含む、請求項４０または４１に記載の変異体。
【請求項４３】
前記変異体配列が、配列番号１のアミノ酸１６〜２４、７３〜８１、２５８〜２６６、３０２〜３１０、３７３〜３８１、および４４７〜４５５から選択される免疫原性Ｔ細胞エピトープ中に少なくとも１つの置換、付加、または欠失を含む、請求項４０〜４２のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項４４】
前記変異体配列が、
（ａ）配列番号１のアミノ酸残基７４、７７、７８、もしくは８０、
（ｂ）配列番号１のアミノ酸残基２６２、２６３、２６４、もしくは２６６、
（ｃ）配列番号１のアミノ酸残基３０３、３０４、３０６、もしくは３１０、
（ｄ）配列番号１のアミノ酸残基３７４、３７７、３７８、３８２、もしくは３８３、および／または
（ｅ）配列番号１のアミノ酸残基４５０、４５１、４５２、もしくは４５７、から選択される位置に、少なくとも１つの置換、付加、または欠失を含む、請求項４０〜４３のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項４５】
前記変異体配列が、
（ａ）Ｌ７４ＮおよびＹ７７Ｒ、
（ｂ）Ｌ７４ＮおよびＹ７７Ｋ、
（ｃ）Ｌ７４ＱおよびＹ７７Ｒ、
（ｄ）Ｌ７４ＱおよびＹ７７Ｎ、
（ｅ）Ｌ７４ＮおよびＹ７７Ｑ、
（ｆ）Ｌ７４ＮおよびＹ７７Ｈ、
（ｇ）Ｌ７４ＮおよびＬ８０Ｈ、
（ｈ）Ｌ８０Ｆ、
（ｉ）Ｙ７７Ｒ、ならびに
（ｊ）Ｒ７８Ｑ、から選択される少なくとも１つの置換または置換の組み合わせを含む、請求項４０〜４４のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項４６】
前記変異体配列が、
（ａ）Ｉ２６２ＡおよびＡ２６４Ｑ、
（ｂ）Ｉ２６２ＫおよびＬ２６６Ｄ、
（ｃ）Ｉ２６２Ｔ、
（ｄ）Ｉ２６２Ｓ、
（ｅ）Ｉ２６２ＤおよびＬ２６６Ｋ、
（ｆ）Ｉ２６２Ａ、
（ｇ）Ｉ２６２ＴおよびＡ２６４Ｌ、
（ｈ）Ｉ２６２ＴおよびＮ２６３Ｒ、
（ｉ）Ｍ２６５Ｈ、ならびに
（ｊ）Ｉ２６２ＡおよびＡ２６４Ｎ、から選択される少なくとも１つの置換または置換の組み合わせを含む、請求項４０〜４４のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項４７】
前記変異体配列が、
（ａ）Ｖ３０３Ｔ、Ｖ３０４Ｎ、およびＭ３０６Ｉ、
（ｂ）Ｖ３０４ＡおよびＭ３０６Ｑ、
（ｃ）Ｖ３０４Ａ、Ｍ３０６Ｎ、
（ｄ）Ｖ３０４Ａ、
（ｅ）Ｖ３０４ＡおよびＭ３０６Ｈ、
（ｆ）Ｖ３０４ＮおよびＭ３０６Ｈ、
（ｇ）Ｖ３０４ＱおよびＭ３０６Ｈ、
（ｈ）Ｖ３０４Ｎ、Ｍ３０６Ｉ、
（ｉ）Ｖ３０４ＴおよびＭ３０６Ｉ、ならびに（ｊ）Ｍ３０６ＩおよびＬ３１０Ｒから選択される少なくとも１つの置換または置換の組み合わせを含む、請求項４０〜４４のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項４８】
前記変異体配列が、
（ａ）Ｌ３７４ＱおよびＩ３７７Ｓ、
（ｂ）Ｌ３７４ＡおよびＩ３７７Ａ、
（ｃ）Ｌ３７４ＱおよびＩ３７７Ａ、
（ｄ）Ｌ３７４ＮおよびＩ３７７Ａ、
（ｅ）Ｌ３７４ＮおよびＩ３８２Ｑ、
（ｆ）Ｉ３７７ＡおよびＩ３８２Ｔ、
（ｇ）Ｉ３７７ＡおよびＬ３７８Ｎ、
（ｈ）Ｉ３７７ＴおよびＩ３８２Ｔ、
（ｉ）Ｉ３７７Ｔ、ならびに
（ｊ）Ｌ３７４ＮおよびＡ３８３Ｑから選択される少なくとも１つの置換または置換の組み合わせを含む、請求項４０〜４４のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項４９】
前記変異体配列が、
（ａ）Ｉ４４８ＱおよびＦ４５０Ｓ、
（ｂ）Ｉ４４８ＥおよびＦ４５０Ｎ、
（ｃ）Ｉ４４８ＡおよびＦ４５０Ｎ、
（ｄ）Ｉ４４８ＱおよびＦ４５０Ｑ、
（ｅ）Ｉ４４８ＴおよびＦ４５０Ｑ、
（ｆ）Ｉ４４８ＥおよびＦ４５０Ｌ、
（ｇ）Ｔ４５５Ｋ、
（ｈ）Ｌ４４９ＨおよびＦ４５０Ａ、
（ｉ）Ｆ４５０Ａ、ならびに
（ｊ）Ｉ４４８ＡおよびＦ４５０Ｙから選択される少なくとも１つの置換または置換の組み合わせを含む、請求項４０〜４４のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項５０】
前記変異体が、
（ａ）Ｉ２６２Ｔ、
（ｂ）Ｉ２６２Ｓ、
（ｃ）Ｉ２６２Ａ、
（ｄ）Ｉ２６２ＴおよびＡ２６４Ｌ、ならびに
（ｅ）Ｉ２６２ＴおよびＮ２６３Ｒから選択される少なくとも１つの置換または置換の組み合わせを含む、請求項４０〜４４のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項５１】
配列番号１の少なくともアミノ酸１〜３８の欠失をさらに含む、請求項１〜５０のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項５２】
配列番号１のアミノ酸１〜５０の欠失をさらに含む、請求項１〜５０のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項５３】
配列番号５７に記載の野生型ＮＯＸ酵素のアミノ酸配列の変異体であるアミノ酸配列を含むニコチン分解酵素変異体であって、前記変異体配列が、前記野生型ＮＯＸ酵素と比較して、前記変異体のニコチン分解活性を増加させる、および／または免疫原性を減少させる、配列番号５７に対する少なくとも１つの置換、付加、または欠失を有する、ニコチン分解酵素変異体。
【請求項５４】
前記変異体が、前記野生型ＮＯＸ酵素と比較したニコチン分解活性の増加を示す、請求項５３に記載の変異体。
【請求項５５】
前記変異体配列が、配列番号５７の位置４２３に置換を含む、請求項５３に記載の変異体。
【請求項５６】
前記変異体配列が、Ｗ４２３Ａ、Ｗ４２３Ｓ、Ｗ４２３Ｅ、およびＷ４２３Ｈから選択される置換を含む、請求項５５に記載の変異体。
【請求項５７】
前記変異体配列が、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、および配列番号６１から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項５５に記載の変異体。
【請求項５８】
前記変異体のニコチン分解活性が、前記野生型ＮＯＸ酵素のニコチン分解活性の少なくとも２００％である、請求項５４に記載の変異体。
【請求項５９】
前記変異体のニコチン分解活性が、前記野生型ＮｉｃＡ２酵素のニコチン分解活性の少なくとも２００％である、請求項５４に記載の変異体。
【請求項６０】
前記変異体が、前記野生型ＮＯＸ酵素と比較した免疫原性の減少を示す、請求項５３に記載の変異体。
【請求項６１】
前記野生型ＮｉｃＡ２酵素と比較した免疫原性が、７５％以上減少する、請求項５３に記載の変異体。
【請求項６２】
前記変異体が長時間作用型変異体である、請求項１〜６１のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項６３】
前記変異体が、アルブミン結合ペプチド、アルブミン結合タンパク質ドメイン、ヒト血清アルブミン、または不活性ポリペプチドに融合された前記変異体を含む、長時間作用型変異体である、請求項１〜６２のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項６４】
前記変異体が、組み換えＰＥＧ（ＸＴＥＮ）、ホモアミノ酸ポリマー（ＨＡＰ）、プロリン−アラニンセリンポリマー（ＰＡＳ）、またはエラスチン様ペプチド（ＥＬＰ）から選択される不活性ポリペプチドに融合された前記変異体を含む、長時間作用型変異体である、請求項１〜６３のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項６５】
前記変異体がＰＥＧ化されている、請求項１〜６３のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項６６】
請求項１〜６５のいずれか一項に記載のニコチン分解酵素変異体と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
【請求項６７】
注射または注入用に処方された、請求項６６に記載の組成物。
【請求項６８】
経口投与用に処方された、請求項６６に記載の組成物。
【請求項６９】
前記変異体が、Ｈｉｓタグをさらに含む、請求項１〜６５のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項７０】
前記Ｈｉｓタグが、配列番号１３９のアミノ酸配列を含む、請求項６９に記載の変異体。
【請求項７１】
ニコチン嗜癖を治療する、または禁煙を促進する方法であって、治療有効量の請求項１〜６５のいずれか一項に記載のニコチン分解酵素変異体または請求項６６〜６８のいずれか一項に記載の医薬組成物を、それを必要とする哺乳動物対象に投与することを含む、方法。
【請求項７２】
前記哺乳動物対象がヒト対象である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記ニコチン嗜癖が、タバコ製品および電子タバコから選択されるニコチン製品の消費と関連している、請求項７１に記載の方法。
【請求項７４】
ニコチン嗜癖を治療するか、または禁煙を促進するための、請求項１〜６５のいずれか一項に記載のニコチン分解酵素変異体または請求項６６〜６８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７５】
ニコチン嗜癖を治療する、または禁煙を促進するための薬剤の製造における、請求項１〜６５のいずれか一項に記載のニコチン分解酵素変異体または請求項６６〜６８のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項７６】
ニコチン中毒またはニコチン毒性を治療する方法であって、治療有効量の請求項１〜６５のいずれか一項に記載のニコチン分解酵素変異体または請求項６６〜６８のいずれか一項に記載の医薬組成物を、それを必要とする哺乳動物対象に投与することを含む、方法。
【請求項７７】
前記哺乳動物対象がヒト対象である、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記ヒト対象が子供である、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
ニコチン中毒またはニコチン毒性を治療するための、請求項１〜６５のいずれか一項に記載のニコチン分解酵素変異体または請求項６６〜６８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８０】
ニコチン中毒またはニコチン毒性の治療用の薬剤の製造における、請求項１〜６５のいずれか一項に記載のニコチン分解酵素変異体または請求項６６〜６８のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、米国特許法第１１９（ｅ）条の下、２０１７年２月３日に出願された、米国仮特許出願第６２／４５４，３３１号および２０１７年７月２１日に出願された、米国仮特許出願第６２／５３５，５０７号に対する優先権を主張し、それらの全体的な内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、概して、ニコチン嗜癖またはニコチン中毒を治療する分野に関する。野生型ＮｉｃＡ２酵素と比較したニコチン分解活性の増加および／または免疫原性の減少を示すニコチン分解酵素変異体、それらを含む組成物、ならびにそれらを使用する方法を記載する。
【背景技術】
【０００３】
以下の考察は、読者が本開示を理解するのを助けるために提供されており、それに対する先行技術を記載または構成することは認められていない。
【０００４】
喫煙は世界的な医療問題である。世界保健機関（ＷＨＯ）は、今日、世界中で１３億人の喫煙者がおり、毎年約５００万人のタバコ関連死があると推定している。現在の喫煙パターンが続くと、喫煙により、２０２０年までに毎年約１０００万人の死亡が生じるであろう。米国疾病管理センター（ＣＤＣ）によると、タバコの使用は、米国で唯一の主要な予防可能な死因であり、毎年約４３８，０００人が死亡している。加えて、喫煙により、健康に関連した年間の経済的費用が約１，５７０億ドル生じていると推定されている。ＣＤＣは、米国の４，５００万人の成人喫煙者のうち、７０％が禁煙を希望しているが、禁煙を試みる人のうち、１年後に禁煙を継続しているのは５％未満であると推定している。
【０００５】
喫煙を辞めるのが困難である理由の１つは、タバコおよび他のタバコ製品のニコチン嗜癖である。ニコチンは、体内に吸入されるとすぐに血流に入り、続いて血液脳関門を通過することによって脳に到達する小分子である。脳内に入ると、ニコチンはニコチン性受容体に結合し、その結果、ドーパミンなどの興奮剤が放出され、報酬システムが活性化され、喫煙者に積極的で快い強化経験がもたらされ、これが嗜癖につながる。
【０００６】
喫煙および他のタバコの使用に関連した有害な健康への影響に加えて、ニコチンの摂取または吸入が多すぎることに起因するニコチン中毒も、もう１つのニコチン関連の健康問題である。ニコチンのＬＤ５０は、ラットで５０ｍｇ／ｋｇ、マウスで３ｍｇ／ｋｇである。３０〜６０ｍｇ（０．５〜１．０ｍｇ／ｋｇ）の低用量でも、成人のヒトにとって致命的である場合があり、一方、子供は１本のタバコの摂取後に健康を損なう可能性があり、それ以上の摂取は子供を深刻な病気にする可能性がある。他方で、致死量はヒト成人で５００ｍｇ以上（１．０〜７．１ｍｇ／ｋｇ）もの高さであり得ることを示唆している証拠もいくつかある。いずれの場合も、ニコチンガムもしくはパッチを誤って噛んだり、または電子タバコの「電子液体」を摂取したりした子供には、通常、急性ニコチン中毒が起こる。まれに、子供がタバコを摂取した後に健康を損なうことも知られている。米国だけで毎月数百件の急性ニコチン中毒が報告されている。
【０００７】
典型的には、ニコチン中毒の初期治療は、胃腸吸収を減少させることを試みるための活性炭の投与を含み得るが、さらなる治療は、ニコチン中毒から生じる症状に対処し得る。
【０００８】
禁煙のための野生型ＮｉｃＡ２酵素の使用が提案されている（例えば、Ｘｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３７：１０１３６−３９（２０１５）を参照のこと）。それにもかかわらず、ニコチン嗜癖を治療するための追加の薬剤、組成物、および方法、ならびにニコチン中毒を治療するための薬剤、組成物、および方法が依然として必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｘｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３７：１０１３６−３９（２０１５）
【発明の概要】
【００１０】
野生型ＮｉｃＡ２酵素と比較したニコチン分解活性の増加および／または免疫原性の減少を示すニコチン分解酵素変異体、それらを含む組成物、ならびにそれらを使用する方法を本明細書に記載する。
【００１１】
いくつかの実施形態では、ニコチン分解酵素変異体は、配列番号１に記載の野生型ＮｉｃＡ２酵素のアミノ酸配列の変異体であるアミノ酸配列を含み、変異体配列は、野生型ＮｉｃＡ２酵素と比較して、変異体のニコチン分解活性を増加させ、および／または免疫原性を減少させる、配列番号１に対する少なくとも１つの置換、付加、または欠失を有する。
【００１２】
いくつかの実施形態では、変異体は、野生型ＮｉｃＡ２酵素と比較したニコチン分解活性の増加を示す。いくつかの実施形態では、野生型ＮｉｃＡ２配列の変異体は、異なる位置に、置換ＡＦ１０４Ｌ、Ｇ１０６Ｓ、Ａ１０７Ｈ、Ａ１０７Ｐ、１０７Ｒ、Ａ１０７Ｋ、Ａ１０７Ｔ、Ｆ３５５Ｃ、Ｆ３５５Ｖ、Ｗ４２７Ｑ、Ｗ４２７Ｅ、Ｗ４２７Ｓ、Ｗ４２７Ｍ、Ｗ４２７Ｈ、Ｗ４２７Ｌ、Ｗ４２７Ｒ、Ｒ９１Ａ、Ｒ９１Ｑ、Ｒ９１Ｆ、Ｒ９１Ｇ、Ｒ９１Ｔ、Ｒ９１Ｌ、Ｒ９１Ｓ、Ｒ９１Ｎ、Ｔ２５０Ｇ、Ｔ２５０Ｌ、Ｔ２５０Ｒ、Ｔ２５０Ｖ、Ｔ２５０Ｐ、Ｋ３４０Ｐ、Ｋ３４０Ｉ、Ｋ３４０Ｖ、Ｋ３４０Ｄ、Ｋ３４０Ｅ、Ｑ３６６Ｋ、Ｑ３６６Ｅ、Ｑ３６６Ｖ、Ｑ３６６Ｌ、Ｑ３６６Ｉ、Ｑ３６６Ｙ、Ｔ３８１Ｐ、Ｔ３８１Ｉ、Ｔ３８１Ｖ、Ｔ３８１Ｑ、Ｔ３８１Ｎ、Ｔ３８１Ｌ、Ｔ３８１Ｍ、Ｎ４６２Ｌ、Ｎ４６２Ｙ、Ｎ４６２Ｓ、Ｎ４６２Ｆ、Ｎ４６２Ｇ、Ｎ４６２Ｅ、Ｎ４６２Ａ、Ｎ４６２Ｍ、Ｉ４６３Ｆ、Ｉ４６３Ｙ、Ｉ４６３Ａ、Ｉ４６３Ｖ、Ｉ４６３Ｌ、Ｌ２１７Ｑ、Ｌ２１７Ｇ、Ｌ２１７Ｅ、Ｌ２１７Ｉ、Ｌ２１７Ｃ、もしくはＬ２１７Ｓ、またはそれらの任意の２つ以上を含む。いくつかの実施形態では、変異体配列は、配列番号５〜５６のうちのいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体のニコチン分解活性は、野生型ＮｉｃＡ２酵素のニコチン分解活性の少なくとも２００％、少なくとも３００％、または少なくとも４００％である。いくつかの実施形態では、変異体配列は、配列番号１のアミノ酸位置９１、１０４、１０６、１０７、２１７、２５０、３４０、３５５、３６６、３８１、４２７、４６２、または４６３に、少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つの置換（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、変異体は、ペプチドのＮ末端に１〜５２個のアミノ酸の欠失を有し得る。例えば、配列番号１に由来する変異体は、ペプチドのＮ末端から５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５１、または５２個のアミノ酸の欠失を含み得る。いくつかの実施形態では、変異体は、追加的または代替的に、Ｃ末端残基の欠失など、ペプチドのＣ末端から１つ以上のアミノ酸の欠失を有し得る。
【００１３】
追加的または代替的に、いくつかの実施形態では、ＮｉｃＡ２変異体は、野生型ＮｉｃＡ２酵素と比較した免疫原性の減少を示す。いくつかの実施形態では、野生型ＮｉｃＡ２酵素と比較した免疫原性は、７５％以上減少する。いくつかの実施形態では、変異体配列は、配列番号１のアミノ酸１０〜３２、６８〜９４、１８９〜２２５、２４８〜２８５、２９６〜３２７、３３６〜３９１、または４３５〜４５９から選択される領域内の免疫原性Ｔ細胞エピトープ中に、少なくとも１つの置換、付加、または欠失を含む。いくつかの実施形態では、変異体配列は、配列番号１のアミノ酸１６〜２４、７３〜８１、２５８〜２６６、３０２〜３１０、３７３〜３８１、または４４７〜４５５から選択される免疫原性Ｔ細胞エピトープ中に、少なくとも１つの置換、付加、または欠失を含む。いくつかの実施形態では、変異体配列は、（ａ）配列番号１のアミノ酸残基７４、７７、７８、もしくは８０、（ｂ）配列番号１のアミノ酸残基２６２、２６３、２６４、もしくは２６６、（ｃ）配列番号１のアミノ酸残基３０３、３０４、３０６、もしくは３１０、（ｄ）配列番号１のアミノ酸残基３７４、３７７、３７８、３８２、もしくは３８３、および／または（ｅ）配列番号１のアミノ酸残基４５０、４５１、４５２、もしくは４５７から選択される位置に、少なくとも１つの置換、付加、または欠失を含む。いくつかの実施形態では、変異体配列は、表３のエピトープＢについて列挙されたものから選択される少なくとも１つの置換または置換の組み合わせを含む。追加的または代替的に、いくつかの実施形態では、変異体配列は、表３のエピトープ１について列挙されたものから選択される少なくとも１つの置換または置換の組み合わせを含む。追加的または代替的に、いくつかの実施形態では、変異体配列は、表３のエピトープ２について列挙されたものから選択される少なくとも１つの置換または置換の組み合わせを含む。追加的または代替的に、いくつかの実施形態では、変異体配列は、表３のエピトープ３について列挙されたものから選択される少なくとも１つの置換または置換の組み合わせを含む。追加的または代替的に、いくつかの実施形態では、変異体配列は、表３のエピトープ４について列挙されたものから選択される少なくとも１つの置換または置換の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、変異体は、（ａ）Ｉ２６２Ｔ、（ｂ）Ｉ２６２Ｓ、（ｃ）Ｉ２６２Ａ、（ｄ）Ｉ２６２ＴおよびＡ２６４Ｌ、ならびに／または（ｅ）Ｉ２６２ＴおよびＮ２６３Ｒから選択される少なくとも１つの置換または置換の組み合わせを含む。
【００１４】
追加的または代替的に、いくつかの実施形態では、変異体は、アミノ酸位置７４、７７、７８、８０、２６２〜２６６、３０３、３０４、３０６、３１０、３７４、３７７、３７８、３８２、３８３、４５０〜４５２、または４５７に少なくとも１つの置換をさらに含み得る。例えば、変異体は、アミノ酸位置２６２もしくは２６３に置換を含み得るか、または変異体は、アミノ酸位置２６２および２６３に置換を含み得る。いくつかの実施形態では、置換は、Ｉ２６２Ａ、Ｉ２６２Ｔ、および／またはＮ２６３Ｒであり得る。例えば、いくつかの実施形態では、変異体配列は、配列番号６２または６３のアミノ酸配列を含む。
【００１５】
いくつかの実施形態では、ニコチン分解酵素変異体は、配列番号５７に記載の野生型ＮＯＸ酵素のアミノ酸配列の変異体であるアミノ酸配列を含み、変異体配列は、野生型ＮＯＸ酵素または野生型ＮｉｃＡ２と比較して、変異体のニコチン分解活性を増加させる、および／または免疫原性を減少させる、配列番号５７に対する少なくとも１つの置換、付加、または欠失を有する。
【００１６】
いくつかの実施形態では、野生型ＮＯＸ配列の変異体は、配列番号５７の位置４２３に置換を含む。例えば、変異体配列は、置換Ｗ４２３Ａ、Ｗ４２３Ｓ、Ｗ４２３Ｅ、またはＷ４２３Ｈを含み得る。いくつかの実施形態では、変異体配列は、配列番号５８〜６１のうちのいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＮＯＸ変異体のニコチン分解活性は、野生型ＮｉｃＡ２酵素のニコチン分解活性の少なくとも２００％である。いくつかの実施形態では、ＮＯＸ変異体のニコチン分解活性は、野生型ＮＯＸ酵素のニコチン分解活性の少なくとも２００％である。
【００１７】
追加的または代替的に、いくつかの実施形態では、ＮＯＸ変異体は、野生型ＮＯＸ酵素または野生型ＮｉｃＡ２酵素と比較した免疫原性の減少を示す。いくつかの実施形態では、野生型ＮＯＸまたはＮｉｃＡ２酵素と比較した免疫原性は、７５％以上減少する。
【００１８】
追加的または代替的に、いくつかの実施形態では、変異体は、配列番号１もしくは５７の少なくともアミノ酸１〜３８、または配列番号１もしくは５７のアミノ酸１〜５０、または配列番号１もしくは５７のアミノ酸１〜５１、または配列番号１もしくは５７のアミノ酸１〜５２アミノ酸の欠失をさらに含む。いくつかの実施形態では、変異体は、配列番号１３９のアミノ酸配列を含むＨｉｓタグなどのＨｉｓタグをさらに含み得る。追加的または代替的に、いくつかの実施形態では、変異体は、野生型配列のＳ４８２に対応する残基の欠失など、１つ以上のＣ末端アミノ酸の欠失を含む。
【００１９】
実施形態のうちのいずれにおいても、変異体は、変異体がアルブミン結合ペプチド、アルブミン結合タンパク質ドメイン、ヒト血清アルブミン、または組み換えＰＥＧ（ＸＴＥＮ（登録商標））、ホモアミノ酸ポリマー（ＨＡＰ）、プロリン−アラニンセリンポリマー（ＰＡＳ）、もしくはエラスチン様ペプチド（ＥＬＰ）などの不活性ポリペプチドに接合されるような、長時間作用型変異体であり得る。特定の実施形態では、長時間作用型変異体は、ポリエチレングリコールに接合されている（すなわち、変異体はＰＥＧ化されている）。
【００２０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、注射または注入用に処方される。いくつかの実施形態では、組成物は、経口投与用に処方される。
【００２１】
いくつかの実施形態では、治療有効量の本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体または組成物を、それを必要とする哺乳動物対象に投与することを含む、ニコチン嗜癖を治療するか、または禁煙を促進する方法を提供する。いくつかの実施形態では、哺乳動物対象は、ヒト対象である。いくつかの実施形態では、ニコチン嗜癖は、タバコ製品および電子タバコから選択されるニコチン製品の摂取に関連している。
【００２２】
いくつかの実施形態では、治療有効量の本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体または組成物を、それを必要とする哺乳動物対象に投与することを含む、ニコチン中毒を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、哺乳動物対象は、ヒト対象、またはより具体的には、ヒト子供である。いくつかの実施形態では、ニコチン中毒は、タバコ製品および電子タバコから選択されるニコチン製品の消費と関連している。
【００２３】
ニコチン嗜癖の治療または禁煙の促進に使用するための、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体および組成物も提供する。
【００２４】
ニコチン嗜癖の治療または禁煙の促進のための薬剤の製造における、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体および組成物の使用も提供する。
【００２５】
前述の一般的な記載および以下の詳細な記載は、例示的かつ説明的なものであり、本発明のさらなる説明を提供することを企図している。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】野生型ＮｉｃＡ２（配列番号１）およびＮｉｃＡ２Δ５０（配列番号２）のＨｉｓタグ付きバージョンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。レーン１：ＭＷマーカー（Ｂｌｕｅ  Ｐｌｕｓ２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、レーン２：野生型ＮｉｃＡ２（配列番号１）、およびレーン３：ＮｉｃＡ２Δ５０（配列番号２）。
【図２】野生型ＮｉｃＡ２とエピトープ中に本明細書に記載される変異型ニコチン分解酵素とを比較したニコチン分解活性アッセイの結果を示す。アッセイは、８０ｎＭの最終濃度の精製タンパク質を使用した。
【図３】ＮｉｃＡ２結晶構造中の活性部位周辺の残基を示す（Ｔａｒａｒｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．５５：６５９５−９８（２０１６）から適応される）。シェル１は、濃い灰色で示され、シェル２は、薄い灰色で示される。第１および第２のシェルを構成する残基を表２に示す。
【図４Ａ】野生型ＮｉｃＡ２と比較して免疫原性の可能性を減少させると予測された、エピトープＢ（図４Ｅ）、１（図４Ａ）、２（図４Ｂ）、３（図４Ｃ）、および４（図４Ｄ）（表３に列挙されるような）の突然変異を有する特異的ＮｉｃＡ２変異体の相対活性を示す。
【図４Ｂ】野生型ＮｉｃＡ２と比較して免疫原性の可能性を減少させると予測された、エピトープＢ（図４Ｅ）、１（図４Ａ）、２（図４Ｂ）、３（図４Ｃ）、および４（図４Ｄ）（表３に列挙されるような）の突然変異を有する特異的ＮｉｃＡ２変異体の相対活性を示す。
【図４Ｃ】野生型ＮｉｃＡ２と比較して免疫原性の可能性を減少させると予測された、エピトープＢ（図４Ｅ）、１（図４Ａ）、２（図４Ｂ）、３（図４Ｃ）、および４（図４Ｄ）（表３に列挙されるような）の突然変異を有する特異的ＮｉｃＡ２変異体の相対活性を示す。
【図４Ｄ】野生型ＮｉｃＡ２と比較して免疫原性の可能性を減少させると予測された、エピトープＢ（図４Ｅ）、１（図４Ａ）、２（図４Ｂ）、３（図４Ｃ）、および４（図４Ｄ）（表３に列挙されるような）の突然変異を有する特異的ＮｉｃＡ２変異体の相対活性を示す。
【図４Ｅ】野生型ＮｉｃＡ２と比較して免疫原性の可能性を減少させると予測された、エピトープＢ（図４Ｅ）、１（図４Ａ）、２（図４Ｂ）、３（図４Ｃ）、および４（図４Ｄ）（表３に列挙されるような）の突然変異を有する特異的ＮｉｃＡ２変異体の相対活性を示す。
【図５】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を使用したＮｉｃＡ２のランダムＰＥＧ化を示す。これらの結果は、モル過剰のＰＥＧ化試薬およびＰＥＧ鎖長の増加によってＰＥＧ化を増加させることができることを示す。
【図６】ＰＥＧ化ＮｉｃＡ２を投与された動物の血清中で、ＰＥＧ化がＮｉｃＡ２の薬物動態（ＰＫ）特性を増強することを示す。
【図７】ＰＥＧ化によりＮｉｃＡ２上の潜在的な免疫原性エピトープがマスキングされ得ることを示す。
【図８】免疫原性の遺伝子組み換えＨＬＡ−ＤＲ４マウスモデルにおいて、ＰＥＧ化がＮｉｃＡ２特異的抗体の力価を減少させ得ることを示す。ＮｉｃＡ２のＰＥＧ化が、遺伝子組み換えＤＲ４マウスにおける平均ＮｉｃＡ２特異的抗体力価の有意な（≧１０倍）減少をもたらし（それぞれ、ＮｉｃＡ２−ＰＥＧ１、−ＰＥＧ２、および−ＰＥＧ３群からの４、２、および２匹の動物が、検出限界（ＬＯＤ）未満の力価を有した）、これは臨床設定におけるより低い免疫原性の可能性を示唆している。
【図９】ＰＥＧ化が、ヒトＴ細胞増殖応答、およびＮｉｃＡ２への曝露によって媒介されるサイトカインＴＮＦγの放出を弱めることを示す。ＮｉｃＡ２のＰＥＧ化が、平均Ｔ細胞増殖刺激指数（左パネル）ならびにＩＦＮγ分泌レベル（右パネル）の有意な減少をもたらした。３≧（破線）の増加は、有意な増加および肯定的な反応と見なされる。
【図１０】ＰＥＧ化ＮｉｃＡ２酵素が血清中で完全なニコチン分解活性を保持することを示す。ＰＥＧ化は、ラット血清中のニコチンを分解するＮｉｃＡ２の能力を妨げなかった。
【図１１】Ａ１０７Ｒ置換を有するＮｉｃＡ２変異体が、野生型ＮｉｃＡ２と比較して、低ニコチン濃度で血清中の活性を増加させることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
野生型ＮｉｃＡ２またはＮＯＸ酵素と比較したニコチン分解活性の増加および／または免疫原性の減少を示すニコチン分解酵素変異体、それらを含む組成物、ならびにニコチン嗜癖を治療するための方法およびニコチン中止（例えば、禁煙）を促進するための方法であって、それらを必要とする対象における方法を含む、それらを使用する方法を本明細書に記載する。
【００２８】
Ｉ．定義
本明細書で使用される場合、単数形「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、互換的に使用され、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、複数形も含み、ならびに各意味に該当することを企図している。また、本明細書で使用される場合、「および／または」は、列挙される項目のうちの１つ以上のありとあらゆる可能な配列および組み合せを指し、それらを包含する。
【００２９】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、当業者に理解され、使用される文脈に応じてある程度変化するであろう。当業者に明確ではない用語が使用されている場合、使用される文脈を考慮して、「約」は、特定の用語のプラスまたはマイナス１０％までを意味する。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「治療有効量」および「治療レベル」という語句は、ニコチン分解酵素が、そのような治療、すなわち対象におけるニコチンを分解すること、および／またはニコチン嗜癖を治療すること、および／または禁煙を促進すること、ならびに／またはニコチン中毒を治療することを必要とする対象に投与される特定の薬理学的効果を提供する、対象におけるニコチン分解酵素投薬量もしくは血漿濃度を意味する。そのような投薬量が当業者によって治療有効量であると見なされている場合であっても、治療有効量または治療レベルのニコチン分解酵素は、所与の対象のニコチン嗜癖の治療または禁煙の促進に常に有効であるとは限らないことが強調される。単に便宜上、例示的な量を以下に提供する。
【００３１】
当業者は、特定の対象を治療するために必要とされるような標準的な実践に従って、そのような量を調節することができる。治療有効量は、投与経路および剤形、対象の年齢および体重、ならびに／またはニコチン嗜癖の程度、対象によって一般に消費／摂取されるニコチンの量、および／または治療時の対象の血漿内ニコチンレベル、および／または治療時に脳内に局在するニコチン量を含む、対象の状態に基づいて変化し得る。
【００３２】
ニコチン嗜癖または禁煙に関して本明細書で使用される場合、「治療」または「治療すること」という用語は、ニコチン離脱の１つ以上の症状もしくは効果を減少、改善、もしくは排除すること、対象によって消費されるタバコの数もしくはニコチンの量を減少させること、ならびに／または対象の血漿内ニコチンレベルを減少させること、および／もしくは対象の特定の組織（例えば、脳／中枢神経系、心臓および血管系など）に局在するニコチンの量を減少させることのうちの１つ以上を指す。
【００３３】
ニコチン中毒に関して本明細書で使用される場合、「治療」もしくは「治療すること」という用語は、ニコチンの１つ以上の症状もしくは効果を減少、改善、もしくは排除すること、および／または対象の血漿内ニコチンレベルを減少させること、ならびに／または対象の特定の組織に局在する（例えば、脳／中枢神経系、心臓および血管系など）ニコチンの量を減少させることを指す。
【００３４】
「個体」、「対象」、および「患者」という用語は、本明細書において互換的に使用され、任意の個々の哺乳動物対象、例えば、ウシ、イヌ、ネコ、ウマ、またはヒトを指す。
【００３５】
本明細書で使用される場合、ＦＤＡ指針に従って、「子供」は、０歳〜約１９歳のヒト対象を指す。たとえ対象が１９歳を超えて治療を続けていたとしても、子供は約１９歳になる前に一連の治療を始める対象であり得る。
【００３６】
ＩＩ．ニコチン、ニコチン嗜癖、およびニコチン毒性
ニコチンは、タバコおよびナス科の他のメンバーを含む、数種類の植物によって作られる窒素含有化学物質である。ヒト、哺乳動物、その他のほとんどの種類の動物はニコチンに曝露されると、心拍数、心筋の酸素消費量、および一回拍出量が増加する。ニコチンの消費は、注意力の高まり、多幸感、およびリラックスしているという感覚にも関連している。しかしながら、ニコチンは中毒性が高い。
【００３７】
脳内のニコチン性アセチルコリン受容体に結合することによって、ニコチンは、その精神活性作用を引き出し、様々な脳構造におけるいくつかの神経伝達物質のレベルを上昇させる。ニコチンは、骨格筋よりも脳内のニコチン受容体に対して高い親和性を示すが、有毒量では収縮および呼吸麻痺を引き起こす可能性がある。ニコチンの選択性は、これらの受容体サブタイプの特定のアミノ酸の違いによるものと考えられている。ニコチンの構造は以下の式Ｉに示される。
【化１】
2020506709.tif 000003
【００３８】
ニコチンを定期的に摂取し、その後突然停止する人々には、欲求、空虚感、不安感、鬱病、苛立ち、過敏性、および不注意を含み得る、禁断症状が起こる。全米心臓協会は、ニコチン（タバコの喫煙による）は、中止するのが最も困難な物質のうちの１つであり、少なくともヘロインと同じくらい困難であると述べている。
【００３９】
ニコチン中毒は、個人が刻みタバコ、タバコ、ニコチンガム、パッチ、もしくは電子タバコの「電子液体」（例えば、電子タバコおよび他の気化装置で使用されるニコチン含有液体）またはタバコもしくはタバコ抽出物を含む他の製品、あるいはニコチンを含む他の製品、供給品、もしくは中間体を摂取した場合に生じ得る。実際、最近の研究は、電子タバコへの曝露によるニコチン中毒の発生率が、２０１２年１月〜２０１５年４月の間に１４９２．９％増加したことを示した（Ｋａｍｂｏｊ  ｅｔ  ａｌ．ＰＥＤＩＡＴＲＩＣＳ  １３７（６）：ｅ２０１６００４１（２０１６））。曝露はタバコの煙の吸入（直接的または間接的のいずれか）を通して起こる可能性があるが、ニコチン中毒またはニコチン過剰摂取は、より一般的には、対象（典型的には子供）が、例えばニコチンガムを噛むかもしくは摂取し、タバコもしくは他のタバコ葉製品を摂取し、ニコチンパッチを摂取し、または電子液体を摂取することによって、ニコチンを摂取するときに生じる。加えて、ニコチンは皮膚から吸収される可能性があるため、ニコチン中毒は、毒性レベルのニコチンが皮膚と直接接触することによって生じる可能性がある。
【００４０】
ニコチン中毒は、神経学的症状（痙攣、昏睡、鬱病、錯乱、失神、頭痛）、心血管症状（急速な心拍、高血圧）、呼吸器症状（呼吸困難、急速な呼吸）、消化器症状（唾液分泌の増加、腹部痙攣、嘔吐）、および筋骨格症状（筋痙攣、脱力感）、ならびに死をもたらす可能性がある。
【００４１】
ＩＩＩ．ニコチン分解酵素変異体
それぞれ、配列番号１もしくは配列番号５７に記載の野生型ＮｉｃＡ２もしくはＮＯＸ酵素のアミノ酸配列の変異体であるアミノ酸配列を含むニコチン分解酵素変異体であって、変異体配列が、それぞれ、野生型ＮｉｃＡ２もしくはＮＯＸ酵素と比較して、変異体のニコチン分解活性を増加させる、および／または免疫原性を減少させる、配列番号１もしくは配列番号５７に対する少なくとも１つの置換、付加、または欠失を有する、ニコチン分解酵素変異体を本明細書に記載する。
【００４２】
ＮｉｃＡ２（ニコチンオキシドレダクターゼ、ＰＰＳ＿４０８１、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＥＪ１４６２０．１）は、シュードモナス・プチダＳ１６株から単離された。例えば、Ｔａｎｇ  ｅｔ．ａｌ．，ＰＬＯＳ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ，９（１０）：ｅ１００３９２３（２０１３）を参照されたい。ＮｉｃＡ２の活性は、Ｓ１６によるニコチン分解の最初の重要な工程であり、ニコチンのＮ−メチルミオスミンへの酸化を触媒する。それは、ニコチンを分解する役割を担うシュードモナス・プチダＳ１６代謝カスケードの必須酵素であると報告されている。野生型ＮｉｃＡ２酵素の構造分析は、Ｔａｒａｒｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．５５：６５９５−９８（２０１６）に報告されている。
【００４３】
ＮＯＸ（ニコチンアミンオキシダーゼ、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＧＨ６８９７９．１）は、シュードモナス種ＨＺＮ６から単離された（例えば、Ｑｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７８，２１５４−２１６０（２０１２）、Ｑｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７９，２１６４−２１７１（２０１３）を参照のこと）。ＮＯＸは、８３％のアミノ酸同一性で、ＮｉｃＡ２と密接に関連している。ＮＯＸは、ＮｉｃＡ２のような触媒活性を持ち、ニコチンをＮ−メチルミオスミンに分解することが報告された。
【００４４】
本開示は、活性の改善および／または免疫原性の減少を有する野生型ＮｉｃＡ２およびＮＯＸの変異体を提供する。いくつかの実施形態では、本開示される変異体は、野生型ＮｉｃＡ２もしくはＮＯＸの約８０、約８５、約９０、約９５、約９６、約９７、約９８、または約９９パーセントのアミノ酸同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、本開示される変異体は、野生型ＮｉｃＡ２もしくはＮＯＸと約８０、約８５、約９０、約９５、約９６、約９７、約９８、または約９９パーセントの相同性を共有し得る。例えば、いくつかの実施形態では、本開示される変異体は、ＮｉｃＡ２とＮＯＸとの間で保存されているアミノ酸残基を含み得る。
【００４５】
野生型ＮｉｃＡ２、野生型ＮＯＸ、およびそれらの例示的な変異体のアミノ酸配列を以下の表１に記載する。本開示される変異体は、Ｃ末端にリンカーおよびＨｉｓタグ（ＧＧＧＧＳＧＳＧＨＨＨＨＨＨ、配列番号１３９）を用いて生成され、これをその後除去した。Ｈｉｓタグは、変異体の精製を補助するために使用されたが、Ｈｉｓタグを必要としない他の精製手段または精製方法もまた使用され得る。
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
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【表１−７】
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【表１−８】
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【表１−９】
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【表１−１０】
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【表１−１１】
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【表１−１２】
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【表１−１３】
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【表１−１４】
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【表１−１５】
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【表１−１６】
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【表１−１７】
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【表１−１８】
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【表１−１９】
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【表１−２０】
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【表１−２１】
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【表１−２２】
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【表１−２３】
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【表１−２４】
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【表１−２５】
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【００４６】
上記のように、ニコチン分解酵素変異体は、野生型ＮｉｃＡ２酵素と比較したニコチン分解活性の増加および／または免疫原性の減少を示し得る。変異体は、１つ以上の欠失、付加、または置換を含む、野生型ＮｉｃＡ２のアミノ酸配列に対する１つ以上の突然変異を含み得る。置換変異は、「保存的」または「非保存的」であり得る。「保存的」とは、同じアミノ酸ファミリー内の置換を指し、「非保存的」とは、アミノ酸ファミリー全体にわたる置換を指す。アミノ酸のファミリーならびにそれに対する「保存的」および「非保存的」置換は当該技術分野において知られている。例えば、天然に存在するアミノ酸は、以下の４つのファミリーに分けることができ、それらのファミリー内で保存的置換が起こり、一方、異なるファミリーにわたって非保存的置換が起こる。
１）塩基性側鎖を有するアミノ酸：リジン、アルギニン、ヒスチジン。
２）酸性側鎖を有するアミノ酸：アスパラギン酸、グルタミン酸
３）非荷電極性側鎖を有するアミノ酸：アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン。
４）非極性側鎖を有するアミノ酸：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、システイン。
【００４７】
いくつかの実施形態では、ニコチン分解酵素変異体は、そのニコチン分解活性に関連する野生型ＮｉｃＡ２酵素の活性部位に、表２に列挙され、図３の構造に示される位置における１つ以上の保存的置換、非保存的置換、付加、または欠失など、配列番号１のアミノ酸残基９０〜９３、９５、１０２〜１０９、１１３、１１６、１３０、１３２、１３８、１５５、１５９、２１０、２１３〜２１５、２１７〜２２０、２３４、２４５、２４６、２４８〜２５１、２５３、２５４、２５８、３３４、３３６、３３９〜３４２、３５３、３５５、３６３〜３６７、３７８〜３８２、４１５〜４１８、４２３〜４２９、４５９〜４６３、４６５、または４６６などの１つ以上の突然変異を含む。表２で同定されたシェル１残基は空洞表面を構成し、一方、シェル２残基はシェル１と接触する（図３を参照のこと）。例えば、いくつかの実施形態では、本開示されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１のアミノ酸位置９１、１０４、１０６、１０７、２１７、２５０、３４０、３５５、３６６、３８１、４２７、４６２、または４６３に少なくとも１つの置換を含み得る。いくつかの実施形態では、変異体は、１、２、または３つ以上の置換を含み得る。
【表２−１】
2020506709.tif 000029
【表２−２】
2020506709.tif 000030
【００４８】
いくつかの実施形態では、ニコチン分解酵素変異体は、１つ以上の保存的置換、非保存的置換、追加、または欠失などの、配列番号５７のアミノ酸残基４２３での突然変異など、そのニコチン分解活性に関連する野生型ＮＯＸ酵素に対する１つ以上の突然変異を含む。例えば、いくつかの実施形態では、変異体は、置換Ｗ４２３Ａ、Ｗ４２３Ｓ、Ｗ４２３Ｅ、またはＷ４２３Ｈを含み得る。
【００４９】
いくつかの実施形態では、ニコチン分解活性を増加させるか、または酵素の触媒活性を増加させる少なくとも１つの突然変異が変異体に導入され、変異体がより迅速および／またはより効率的にニコチンを分解することを可能にする。いくつかの実施形態では、そのような突然変異は、ｋｃａｔの増加、ＫＭの低下、ｋｃａｔ／ＫＭの増加、および／またはＶｍａｘの増加を含むがこれらに限定されない、酵素性能の様々な尺度を改善し得る。したがって、いくつかの実施形態では、変異体は、野生型ＮｉｃＡ２もしくは野生型ＮＯＸ酵素の活性部位に、および／または芳香族ケージに、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個以上の突然変異を含み得、野生型ＮｉｃＡ２酵素と比較して、ｋｃａｔの増加、ＫＭの低下、ｋｃａｔ／ｋＭの増加、および／またはＶｍａｘの増加によって測定されるようなニコチン分解活性の増加を示す。
【００５０】
いくつかの実施形態では、ニコチン分解酵素変異体は、配列番号１の位置４２７のトリプトファンおよび位置４６２のアスパラギンによって形成される野生型ＮｉｃＡ２酵素の芳香族ケージに、１つ以上の保存的置換、非保存的置換、付加、または欠失など、これらの位置のうちの１つ以上における突然変異などの１つ以上の突然変異を含む。したがって、いくつかの実施形態では、ニコチン分解活性を増加させる突然変異は、配列番号１の位置４２７もしくは４６２のうちの１つ以上における保存的置換、非保存的置換、付加または欠失など、配列番号１の位置４２７もしくは４６２のうちの１つ以上にある。
【００５１】
いくつかの実施形態では、位置４２７における突然変異は置換Ｗ４２７Ｑであり、ここで配列番号１の位置４２７（芳香族ケージの）におけるトリプトファン（Ｗ）は、グルタミン（Ｑ）で置換されている。配列番号５のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。これは、非極性の芳香族アミノ酸が極性の非荷電アミノ酸で置換されている非保存的置換である。一般に、酵素の活性部位への非保存的置換は、酵素を機能不全または不作用にすると予想されるが、驚くべきことに、この変異体は、野生型ＮｉｃＡ２酵素と比較した酵素分解活性の有意な増加を示す。
【００５２】
いくつかの実施形態では、位置４２７の突然変異は置換Ｗ４２７Ｅであり、ここで配列番号１の位置４２７のトリプトファン（Ｗ）は、グルタミン酸（Ｅ）で置換されている。配列番号６のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、突然変異は置換Ｗ４２７Ｓであり、ここで配列番号１の位置４２７のトリプトファン（Ｗ）は、セリン（Ｓ）で置換されている。配列番号７のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、突然変異は置換Ｗ４２７Ｍであり、ここで配列番号１の位置４２７のトリプトファン（Ｗ）は、メチオニン（Ｍ）で置換されている。配列番号８のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、突然変異は置換Ｗ４２７Ｒであり、ここで配列番号１の位置４２７のトリプトファン（Ｗ）は、アルギニン（Ｒ）で置換されている。配列番号１３５のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、突然変異は置換Ｗ４２７Ｈであり、ここで配列番号１の位置４２７のトリプトファン（Ｗ）は、ヒスチジン（Ｈ）で置換されている。配列番号１３７のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、突然変異は置換Ｗ４２７Ｍであり、ここで配列番号１の位置４２７のトリプトファン（Ｗ）は、ロイシン（Ｌ）で置換されている。配列番号１３８のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。
【００５３】
いくつかの実施形態では、ニコチン分解酵素変異体は、１つ以上の保存的置換、非保存的置換、付加、または欠失などの、配列番号１の位置９１のアルギニン（Ｒ）における突然変異を含む、１つ以上の突然変異を含む。したがって、いくつかの実施形態では、ニコチン分解活性を増加させる突然変異は、配列番号１の位置９１、１０４、１０６、１０７、２１７、２５０、３４０、３５５、３６６、３８１、４２７、４６２、もしくは４６３のうちの１つ以上における、保存的置換、非保存的置換、付加、もしくは欠失など、配列番号１の位置９１、１０４、１０６、１０７、２１７、２５０、３４０、３５５、３６６、３８１、４２７、４６２、もしくは４６３のうちの１つ以上にある。
【００５４】
いくつかの実施形態では、位置９１の突然変異は置換Ｒ９１Ａであり、ここで配列番号１の位置９１のアルギニン（Ｒ）は、アラニン（Ａ）で置換されている。配列番号９のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、位置９１の突然変異は置換Ｒ９１Ｑであり、ここで配列番号１の位置９１のアルギニン（Ｒ）は、グルタミン（Ｑ）で置換されている。配列番号１０および１２９のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、位置９１の突然変異は置換Ｒ９１Ｆであり、ここで配列番号１の位置９１のアルギニン（Ｒ）は、フェニルアラニン（Ｆ）で置換されている。配列番号１１のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、位置９１の突然変異は置換Ｒ９１Ｇであり、ここで配列番号１の位置９１のアルギニン（Ｒ）は、グリシン（Ｇ）で置換されている。配列番号１２のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、位置９１の突然変異は置換Ｒ９１Ｔであり、ここで配列番号１の位置９１のアルギニン（Ｒ）は、トレオニン（Ｔ）で置換されている。配列番号１３のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、位置９１の突然変異は置換Ｒ９１Ｌであり、ここで配列番号１の位置９１のアルギニン（Ｒ）は、ロイシン（Ｌ）で置換されている。配列番号１４のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、位置９１の突然変異は置換Ｒ９１Ｓであり、ここで配列番号１の位置９１のアルギニン（Ｒ）は、セリン（Ｓ）で置換されている。配列番号１５のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、位置９１の突然変異は置換Ｒ９１Ｎであり、ここで配列番号１の位置９１のアルギニン（Ｒ）は、アスパラギン（Ｎ）で置換されている。配列番号１６のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。
【００５５】
いくつかの実施形態では、ニコチン分解酵素変異体は、１つ以上の保存的置換、非保存的置換、付加、または欠失などの、配列番号１の位置２５０のスレオニン（Ｔ）における突然変異を含む、１つ以上の突然変異を含む。したがって、いくつかの実施形態では、ニコチン分解活性を増加させる突然変異は、配列番号１の位置９１、１０４、１０６、１０７、２１７、２５０、３４０、３５５、３６６、３８１、４２７、４６２、もしくは４６３のうちの１つ以上における、保存的置換、非保存的置換、付加、もしくは欠失など、配列番号１の位置９１、１０４、１０６、１０７、２１７、２５０、３４０、３５５、３６６、３８１、４２７、４６２、もしくは４６３のうちの１つ以上にある。
【００５６】
いくつかの実施形態では、位置２５０の突然変異は置換Ｔ２５０Ｇであり、ここで配列番号１の位置２５０のトレオニン（Ｔ）は、グリシン（Ｇ）で置換されている。配列番号１７のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、位置２５０の突然変異は置換Ｔ２５０Ｌであり、ここで配列番号１の位置２５０のトレオニン（Ｔ）は、ロイシン（Ｌ）で置換されている。配列番号１８のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、位置２５０の突然変異は置換Ｔ２５０Ｒであり、ここで配列番号１の位置２５０のトレオニン（Ｔ）は、アルギニン（Ｒ）で置換されている。配列番号１９のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、位置２５０の突然変異は置換Ｔ２５０Ｖであり、ここで配列番号１の位置２５０のトレオニン（Ｔ）は、バリン（Ｖ）で置換されている。配列番号２０のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、位置２５０の突然変異は置換Ｔ２５０Ｐであり、ここで配列番号１の位置２５０のトレオニン（Ｔ）は、プロリン（Ｐ）で置換されている。配列番号１３６のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。
【００５７】
いくつかの実施形態では、ニコチン分解酵素変異体は、１つ以上の保存的置換、非保存的置換、付加、または欠失などの、配列番号１の位置３４０のリジン（Ｋ）における突然変異を含む、１つ以上の突然変異を含む。したがって、いくつかの実施形態では、ニコチン分解活性を増加させる突然変異は、配列番号１の位置９１、１０４、１０６、１０７、２１７、２５０、３４０、３５５、３６６、３８１、４２７、４６２、もしくは４６３のうちの１つ以上における、保存的置換、非保存的置換、付加、もしくは欠失など、配列番号１の位置９１、１０４、１０６、１０７、２１７、２５０、３４０、３５５、３６６、３８１、４２７、４６２、もしくは４６３のうちの１つ以上にある。
【００５８】
いくつかの実施形態では、位置３４０の突然変異は置換Ｋ３４０Ｐであり、ここで配列番号１の位置３４０のリジン（Ｋ）は、プロリン（Ｐ）で置換されている。配列番号２１のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、位置３４０の突然変異は置換Ｋ３４０Ｉであり、ここで配列番号１の位置３４０のリジン（Ｋ）は、イソロイシン（Ｉ）で置換されている。配列番号２２のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、位置３４０の突然変異は置換Ｋ３４０Ｖであり、ここで配列番号１の位置３４０のリジン（Ｋ）は、バリン（Ｖ）で置換されている。配列番号２３のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、位置３４０の突然変異は置換Ｋ３４０Ｄであり、ここで配列番号１の位置３４０のリジン（Ｋ）は、アスパラギン酸（Ｄ）で置換されている。配列番号２４のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、位置３４０の突然変異は置換Ｋ３４０Ｅであり、ここで配列番号１の位置３４０のリジン（Ｋ）は、グルタミン酸（Ｅ）で置換されている。配列番号２５のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。
【００５９】
いくつかの実施形態では、ニコチン分解酵素変異体は、１つ以上の保存的置換、非保存的置換、付加、または欠失などの、配列番号１の位置３６６のグルタミン（Ｑ）における突然変異を含む、１つ以上の突然変異を含む。したがって、いくつかの実施形態では、ニコチン分解活性を増加させる突然変異は、配列番号１の位置９１、１０４、１０６、１０７、２１７、２５０、３４０、３５５、３６６、３８１、４２７、４６２、もしくは４６３のうちの１つ以上における、保存的置換、非保存的置換、付加、もしくは欠失など、配列番号１の位置９１、１０４、１０６、１０７、２１７、２５０、３４０、３５５、３６６、３８１、４２７、４６２、もしくは４６３のうちの１つ以上にある。
【００６０】
いくつかの実施形態では、位置３６６の突然変異は置換Ｑ３６６Ｋであり、ここで配列番号１の位置３６６のグルタミン（Ｑ）は、リジン（Ｋ）で置換されている。配列番号２６および１３０のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、位置３６６の突然変異は置換Ｑ３６６Ｅであり、ここで配列番号１の位置３６６のグルタミン（Ｑ）は、グルタミン酸（Ｅ）で置換されている。配列番号２７のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、位置３６６の突然変異は置換Ｑ３６６Ｖであり、ここで配列番号１の位置３６６のグルタミン（Ｑ）は、バリン（Ｖ）で置換されている。配列番号２８のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、位置３６６の突然変異は置換Ｑ３６６Ｌであり、ここで配列番号１の位置３６６のグルタミン（Ｑ）は、ロイシン（Ｌ）で置換されている。配列番号２９のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、位置３６６の突然変異は置換Ｑ３６６Ｉであり、ここで配列番号１の位置３６６のグルタミン（Ｑ）は、イソロイシン（Ｉ）で置換されている。配列番号３０のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、位置３６６の突然変異は置換Ｑ３６６Ｙであり、ここで配列番号１の位置３６６のグルタミン（Ｑ）は、チロシン（Ｙ）で置換されている。配列番号３１のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。
【００６１】
いくつかの実施形態では、ニコチン分解酵素変異体は、１つ以上の保存的置換、非保存的置換、付加、または欠失などの、配列番号１の位置３８１のスレオニン（Ｔ）における突然変異を含む、１つ以上の突然変異を含む。したがって、いくつかの実施形態では、ニコチン分解活性を増加させる突然変異は、配列番号１の位置９１、１０４、１０６、１０７、２１７、２５０、３４０、３５５、３６６、３８１、４２７、４６２、もしくは４６３のうちの１つ以上における、保存的置換、非保存的置換、付加、もしくは欠失など、配列番号１の位置９１、１０４、１０６、１０７、２１７、２５０、３４０、３５５、３６６、３８１、４２７、４６２、もしくは４６３のうちの１つ以上にある。
【００６２】
いくつかの実施形態では、位置３８１の突然変異は置換Ｔ３８１Ｐであり、ここで配列番号１の位置３８１のトレオニン（Ｔ）は、プロリン（Ｐ）で置換されている。配列番号３２のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、位置３８１の突然変異は置換Ｔ３８１Ｉであり、ここで配列番号１の位置３８１のトレオニン（Ｔ）は、イソロイシン（Ｉ）で置換されている。配列番号３３のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、位置３８１の突然変異は置換Ｔ３８１Ｖであり、ここで配列番号１の位置３８１のトレオニン（Ｔ）は、バリン（Ｖ）で置換されている。配列番号３４および１３１のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、位置３８１の突然変異は置換Ｔ３８１Ｑであり、ここで配列番号１の位置３８１のトレオニン（Ｔ）は、グルタミン（Ｑ）で置換されている。配列番号３５のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、位置３８１の変異は置換Ｔ３８１Ｎであり、ここで配列番号１の位置３８１のトレオニン（Ｔ）は、アスパラギン（Ｎ）で置換されている。配列番号３６のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、位置３８１の突然変異は置換Ｔ３８１Ｌであり、ここで配列番号１の位置３８１のトレオニン（Ｔ）は、ロイシン（Ｌ）で置換されている。配列番号３７のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、位置３８１の変異は置換Ｔ３８１Ｍであり、ここで配列番号１の位置３８１のトレオニン（Ｔ）は、メチオニン（Ｍ）で置換されている。配列番号３８のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。
【００６３】
いくつかの実施形態では、ニコチン分解酵素変異体は、１つ以上の保存的置換、非保存的置換、付加、または欠失などの、配列番号１の位置４６２のアスパラギン（Ｎ）における突然変異を含む、１つ以上の突然変異を含む。したがって、いくつかの実施形態では、ニコチン分解活性を増加させる突然変異は、配列番号１の位置９１、１０４、１０６、１０７、２１７、２５０、３４０、３５５、３６６、３８１、４２７、４６２、もしくは４６３のうちの１つ以上における、保存的置換、非保存的置換、付加、もしくは欠失など、配列番号１の位置９１、１０４、１０６、１０７、２１７、２５０、３４０、３５５、３６６、３８１、４２７、４６２、もしくは４６３のうちの１つ以上にある。
【００６４】
いくつかの実施形態では、位置４６２の突然変異は置換Ｎ４６２Ｌであり、ここで配列番号１の位置４６２のアスパラギン（Ｎ）は、ロイシン（Ｌ）で置換されている。配列番号３９および１３２のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、位置４６２の突然変異は置換Ｎ４６２Ｙであり、ここで配列番号１の位置４６２のアスパラギン（Ｎ）は、チロシン（Ｙ）で置換されている。配列番号４０および１３３のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、位置４６２の突然変異は置換Ｎ４６２Ｓであり、ここで配列番号１の位置４６２のアスパラギン（Ｎ）は、セリン（Ｓ）で置換されている。配列番号４１のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、位置４６２の突然変異は置換Ｎ４６２Ｆであり、ここで配列番号１の位置４６２のアスパラギン（Ｎ）は、フェニルアラニン（Ｆ）で置換されている。配列番号４２および１３７のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、位置４６２の突然変異は置換Ｎ４６２Ｇであり、ここで配列番号１の位置４６２のアスパラギン（Ｎ）は、グリシン（Ｇ）で置換されている。配列番号４３のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、位置４６２の突然変異は置換Ｎ４６２Ｅであり、ここで配列番号１の位置４６２のアスパラギン（Ｎ）は、グルタミン酸（Ｅ）で置換されている。配列番号４４のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、位置４６２の突然変異は置換Ｎ４６２Ａであり、ここで配列番号１の位置４６２のアスパラギン（Ｎ）は、アラニン（Ａ）で置換されている。配列番号４５のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、位置４６２の突然変異は置換Ｎ４６２Ｍであり、ここで配列番号１の位置４６２のアスパラギン（Ｎ）は、メチオニン（Ｍ）で置換されている。配列番号１３８のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。
【００６５】
いくつかの実施形態では、ニコチン分解酵素変異体は、１つ以上の保存的置換、非保存的置換、付加、または欠失などの、配列番号１の位置４６３のイソロイシン（Ｉ）における突然変異を含む、１つ以上の突然変異を含む。したがって、いくつかの実施形態では、ニコチン分解活性を増加させる突然変異は、配列番号１の位置９１、１０４、１０６、１０７、２１７、２５０、３４０、３５５、３６６、３８１、４２７、４６２、もしくは４６３のうちの１つ以上における、保存的置換、非保存的置換、付加、もしくは欠失など、配列番号１の位置９１、１０４、１０６、１０７、２１７、２５０、３４０、３５５、３６６、３８１、４２７、４６２、もしくは４６３のうちの１つ以上にある。
【００６６】
いくつかの実施形態では、位置４６３の突然変異は置換Ｉ４６３Ｆであり、ここで配列番号１の位置４６３のイソロイシン（Ｉ）は、フェニルアラニン（Ｆ）で置換されている。配列番号４６のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、位置４６３の突然変異は置換Ｉ４６３Ｙであり、ここで配列番号１の位置４６３のイソロイシン（Ｉ）は、チロシン（Ｙ）で置換されている。配列番号４７のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、位置４６３の突然変異は置換Ｉ４６３Ａであり、ここで配列番号１の位置４６３のイソロイシン（Ｉ）は、アラニン（Ａ）で置換されている。配列番号４８のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、位置４６３の突然変異は置換Ｉ４６３Ｖであり、ここで配列番号１の位置４６３のイソロイシン（Ｉ）は、バリン（Ｖ）で置換されている。配列番号４９のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、位置４６３の突然変異は置換Ｉ４６３Ｌであり、ここで配列番号１の位置４６３のイソロイシン（Ｉ）は、ロイシン（Ｌ）で置換されている。配列番号５０のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。
【００６７】
いくつかの実施形態では、ニコチン分解酵素変異体は、１つ以上の保存的置換、非保存的置換、付加、または欠失などの、配列番号１の位置２１７のロイシン（Ｌ）における突然変異を含む、１つ以上の突然変異を含む。したがって、いくつかの実施形態では、ニコチン分解活性を増加させる突然変異は、配列番号１の位置９１、２１７、２５０、３４０、３６６、３８１、４２７、４６２、もしくは４６３のうちの１つ以上における、保存的置換、非保存的置換、付加、もしくは欠失など、配列番号１の位置９１、１０４、１０６、１０７、２１７、２５０、３４０、３５５、３６６、３８１、４２７、４６２、もしくは４６３のうちの１つ以上にある。
【００６８】
いくつかの実施形態では、位置２１７の突然変異は置換Ｌ２１７Ｑであり、ここで配列番号１の位置２１７のロイシン（Ｌ）は、グルタミン（Ｑ）で置換されている。配列番号５１のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、位置２１７の突然変異は置換Ｌ２１７Ｇであり、ここで配列番号１の位置２１７のロイシン（Ｌ）は、グリシン（Ｇ）で置換されている。配列番号５２のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、位置２１７の突然変異は置換Ｌ２１７Ｅであり、ここで配列番号１の位置２１７のロイシン（Ｌ）は、グルタミン酸（Ｅ）で置換されている。配列番号５３のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、位置２１７の突然変異は置換Ｌ２１７Ｉであり、ここで配列番号１の位置２１７のロイシン（Ｌ）は、イソロイシン（Ｉ）で置換されている。配列番号５４のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、位置２１７の突然変異は置換Ｌ２１７Ｃであり、ここで配列番号１の位置２１７のロイシン（Ｌ）は、システイン（Ｃ）で置換されている。配列番号５５のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、位置２１７の突然変異は置換Ｌ２１７Ｓであり、ここで配列番号１の位置２１７のロイシン（Ｌ）は、セリン（Ｓ）で置換されている。配列番号５６のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。
【００６９】
いくつかの実施形態では、ニコチン分解酵素変異体は、１つ以上の保存的置換、非保存的置換、付加、または欠失などの、配列番号１の位置１０７のアラニン（Ａ）における突然変異を含む、１つ以上の突然変異を含む。したがって、いくつかの実施形態では、ニコチン分解活性を増加させる突然変異は、配列番号１の位置９１、１０４、１０６、１０７、２１７、２５０、３４０、３５５、３６６、３８１、４２７、４６２、もしくは４６３のうちの１つ以上における、保存的置換、非保存的置換、付加、もしくは欠失など、配列番号１の位置９１、１０４、１０６、１０７、２１７、２５０、３４０、３５５、３６６、３８１、４２７、４６２、もしくは４６３のうちの１つ以上にある。
【００７０】
いくつかの実施形態では、位置１０７の突然変異は置換Ａ１０７Ｒであり、ここで配列番号１の位置１０７のアラニン（Ａ）は、アルギニン（Ｒ）で置換されている。配列番号１２４または１３４のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、位置１０７の突然変異は置換Ａ１０７Ｋであり、ここで配列番号１の位置１０７のアラニン（Ａ）は、リジン（Ｋ）で置換されている。配列番号１２５のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、位置１０７の突然変異は置換Ａ１０７Ｔであり、ここで配列番号１の位置１０７のアラニン（Ａ）は、チロシン（Ｔ）で置換されている。配列番号１２６のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、位置１０７の変異は置換Ａ１０７Ｈであり、ここで配列番号１の位置１０７のアラニン（Ａ）は、ヒスチジン（Ｈ）で置換されている。配列番号１４２のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、位置１０７の突然変異は置換Ａ１０７Ｐであり、ここで配列番号１の位置１０７のアラニン（Ａ）は、プロリン（Ｐ）で置換されている。配列番号１４３のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。
【００７１】
いくつかの実施形態では、ニコチン分解酵素変異体は、１つ以上の保存的置換、非保存的置換、付加、または欠失などの、配列番号１の位置３５５のフェニルアラニン（Ｆ）における突然変異を含む、１つ以上の突然変異を含む。したがって、いくつかの実施形態では、ニコチン分解活性を増加させる突然変異は、配列番号１の位置９１、１０４、１０６、１０７、２１７、２５０、３４０、３５５、３６６、３８１、４２７、４６２、もしくは４６３のうちの１つ以上における、保存的置換、非保存的置換、付加、もしくは欠失など、配列番号１の位置９１、１０４、１０６、１０７、２１７、２５０、３４０、３５５、３６６、３８１、４２７、４６２、もしくは４６３のうちの１つ以上にある。
【００７２】
いくつかの実施形態では、位置３５５の突然変異は置換Ｆ３５５Ｃであり、ここで配列番号１の位置３５５のフェニルアラニン（Ｆ）は、システイン（Ｃ）で置換されている。配列番号１２７のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、位置３５５の突然変異は置換Ｆ３５５Ｖであり、ここで配列番号１の位置３５５のフェニルアラニン（Ｆ）は、バリン（Ｖ）で置換されている。配列番号１２８のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。
【００７３】
いくつかの実施形態では、ニコチン分解酵素変異体は、１つ以上の保存的置換、非保存的置換、付加、または欠失などの、配列番号１の位置１０４のフェニルアラニン（Ｆ）における突然変異を含む、１つ以上の突然変異を含む。したがって、いくつかの実施形態では、ニコチン分解活性を増加させる突然変異は、配列番号１の位置９１、１０４、１０６、１０７、２１７、２５０、３４０、３５５、３６６、３８１、４２７、４６２、もしくは４６３のうちの１つ以上における、保存的置換、非保存的置換、付加、もしくは欠失など、配列番号１の位置９１、１０４、１０６、１０７、２１７、２５０、３４０、３５５、３６６、３８１、４２７、４６２、もしくは４６３のうちの１つ以上にある。
【００７４】
いくつかの実施形態では、位置１０４の突然変異は置換Ｆ１０４Ｌであり、ここで配列番号１の位置１０４のフェニルアラニン（Ｆ）は、ロイシン（Ｌ）で置換されている。配列番号１４０のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。
【００７５】
いくつかの実施形態では、ニコチン分解酵素変異体は、１つ以上の保存的置換、非保存的置換、付加、または欠失などの、配列番号１の位置１０６のグリシン（Ｇ）における突然変異を含む、１つ以上の突然変異を含む。したがって、いくつかの実施形態では、ニコチン分解活性を増加させる突然変異は、配列番号１の位置９１、１０４、１０６、１０７、２１７、２５０、３４０、３５５、３６６、３８１、４２７、４６２、もしくは４６３のうちの１つ以上における、保存的置換、非保存的置換、付加、もしくは欠失など、配列番号１の位置９１、１０４、１０６、１０７、２１７、２５０、３４０、３５５、３６６、３８１、４２７、４６２、もしくは４６３のうちの１つ以上にある。
【００７６】
いくつかの実施形態では、位置１０６の変異は置換Ｇ１０６Ｓであり、ここで配列番号１の位置１０６のグリシン（Ｇ）は、セリン（Ｓ）で置換されている。配列番号１４１のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。
【００７７】
いくつかの実施形態では、ニコチン分解酵素変異体は、配列番号１に対する１、２、または３つ以上の突然変異を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ニコチン分解酵素は、１つ以上の保存的置換、非保存的置換、付加、または欠失などの、配列番号１の位置４２７のトリプトファン（Ｗ）における突然変異、位置２６２のイソロイシン（Ｉ）における突然変異、および位置２６３のアスパラギン（Ｎ）における突然変異を含み得る。したがって、いくつかの実施形態では、ニコチン分解活性を増加させる少なくとも１つの突然変異は、配列番号１の位置１０７、３５５、２６２、２６３、２１７、９１、４６３、３８１、３６６、３４０、２５０、４２７、もしくは４６２のうちの１つ以上における保存的置換、非保存的置換、付加、もしくは欠失などの、配列番号１の位置１０７、３５５、２６２、２６３、２１７、９１、４６３、３８１、３６６、３４０、２５０、４２７、もしくは４６２のうちの１、２、もしくは３つ以上にある。
【００７８】
いくつかの態様では、突然変異は、配列番号１の位置４２７のトリプトファン（Ｗ）がグルタミン（Ｑ）で置換され、配列番号１の位置２６２のイソロイシン（Ｉ）がアラニン（Ａ）で置換されている場合など、Ｗ４２７ＱおよびＩ２６２Ａの二置換である。配列番号６２のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、突然変異は、配列番号１の位置４２７のトリプトファン（Ｗ）がヒスチジン（Ｈ）で置換され、配列番号１の位置４６２のアスパラギン（Ｎ）がフェニルアラニン（Ｆ）で置換されている場合など、Ｗ４２７ＨおよびＮ４６２Ｆの二置換である。配列番号１３７のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、突然変異は、配列番号１の位置４２７のトリプトファン（Ｗ）がロイシン（Ｌ）で置換され、配列番号１の位置４６２のアスパラギン（Ｎ）がメチオニン（Ｍ）で置換されている場合など、Ｗ４２７ＬおよびＮ４６２Ｍの二置換である。配列番号１３８のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、突然変異は、配列番号１の位置４２７のトリプトファン（Ｗ）がグルタミン（Ｑ）で置換され、配列番号１の位置２６２のイソロイシン（Ｉ）がトレオニン（Ｔ）で置換され、配列番号１の位置２６３のアスパラギン（Ｎ）がアルギニン（Ｒ）で置換されている場合など、Ｗ４２７Ｑ、Ｉ２６２Ｔ、およびＮ２６３Ｒの三置換である。配列番号６３のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。
【００７９】
いくつかの実施形態では、ニコチン分解酵素変異体は、１つ以上の保存的置換、非保存的置換、付加、または欠失などの、配列番号５７の位置４２３のトリプトファン（Ｗ）における突然変異を含む、１つ以上の突然変異を含む。したがって、いくつかの実施形態では、ニコチン分解活性を増加させる突然変異は、配列番号５７の位置４２３のうちの１つ以上における保存的置換、非保存的置換、付加、または欠失など、配列番号５７の４２３を含む位置のうちの１つ以上にある。
【００８０】
いくつかの実施形態では、位置４２３の突然変異は置換Ｗ４２３Ａであり、ここで配列番号５７の位置４２３のトリプトファン（Ｗ）は、アラニン（Ａ）で置換されている。配列番号５８のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、位置４２３の突然変異は置換Ｗ４２３Ｓであり、ここで配列番号５７の位置４２３のトリプトファン（Ｗ）は、セリン（Ｓ）で置換されている。配列番号５９のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、位置４２３の突然変異は置換Ｗ４２３Ｅであり、ここで配列番号５７の位置４２３のトリプトファン（Ｗ）は、グルタミン酸（Ｅ）で置換されている。配列番号６０のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、位置４２３の突然変異は置換Ｗ４２３Ｈであり、ここで配列番号５７の位置４２３のトリプトファン（Ｗ）は、ヒスチジン（Ｈ）で置換されている。配列番号６１のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。
【００８１】
追加的または代替的に、いくつかの実施形態では、ニコチン分解酵素変異体は、これらの領域のうちの１つ以上における１つ以上の保存的置換、非保存的置換、付加、もしくは欠失などの、配列番号１の位置１６〜２４、７３〜８１、２５８〜２６６、３０２〜３１０、３７３〜３８１、もしくは４４７〜４５５から選択される免疫原性Ｔ細胞エピトープ内の１つ以上の突然変異など、配列番号１の位置１０〜３２、６８〜９４、１８９〜２２５、２４８〜２８５、２９６〜３２７、３３６〜３９１、もしくは４３５〜４５９から選択される領域内の免疫原性Ｔ細胞エピトープ内の１つ以上の突然変異など、免疫原性Ｔ細胞エピトープ中に１つ以上の突然変異を含む。したがって、いくつかの実施形態では、変異体は、１、２、３、４、５、６、または７つの免疫原性Ｔ細胞エピトープ中に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個以上の突然変異を含み得る。いくつかの実施形態では、そのような変異体は、哺乳動物対象に投与されたときに免疫原性の低下を示す。
【００８２】
いくつかの実施形態では、ニコチン分解酵素変異体は、すべての配列およびそれらの組み合わせを含む、配列番号１の７４、７７、７８、８０、２６２〜２６６、３０３、３０４、３０６、３１０、３７４、３７７、３７８、３８２、３８３、４５０〜４５２、または４５７から選択される１つ以上の位置における免疫原性Ｔ細胞エピトープ中の突然変異を含む。例えば、変異体は、エピトープＢ中の例示的な突然変異のうちの１つ以上、エピトープ１中の例示的な突然変異のうちの１つ以上、エピトープ２中の例示的な突然変異のうちの１つ以上、エピトープ３中の例示的な突然変異のうちの１つ以上、および／またはエピトープ４中の例示的な突然変異のうちの１つ以上を含む、以下に記載の突然変異のうちの任意の１つ以上を含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、ニコチン分解酵素は、配列番号１の位置２６２および／または２６３に、Ｉ２６２Ａ置換もしくはＩ２６２Ｔ／Ｎ２６３Ｒ置換などのアミノ酸置換を有し得る。
【表３】
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【００８３】
追加的または代替的に、いくつかの実施形態では、ニコチン分解酵素変異体は、配列番号１または配列番号５７の１〜５２個のアミノ酸残基のＮ末端欠失を含む。例えば、いくつかの実施形態では、変異体は、配列番号１または配列番号５７のアミノ酸残基１〜１６、１〜２５、１〜３８、１〜５０、１〜５１、または１〜５２のＮ末端欠失を含む。したがって、本開示される変異体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、または５２個の連続するアミノ酸のＮ末端欠失を含み得る。
【００８４】
いくつかの実施形態では、本開示される変異体は、追加的または代替的に、ペプチドのＣ末端に欠失を含み得る。例えば、本開示される変異体は、ペプチドのＣ末端に１つ以上のアミノ酸の欠失を含み得る。例えば、ＮｉｃＡ２変異体では、野生型配列のＳ４８２に対応するアミノ酸を欠失させることができる。
【００８５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、野生型ＮｉｃＡ２酵素（配列番号１）、または配列番号１の最大５２個のＮ末端アミノ酸残基の欠失を有するそのＮ末端欠失変異体と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【００８６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号５であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号５の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【００８７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号６であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号６の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【００８８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号７であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号７の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【００８９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号８であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号８の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【００９０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号９であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号９の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【００９１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１０であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１０の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【００９２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１１であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１１の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【００９３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１２であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１２の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【００９４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１３であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１３の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【００９５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１４であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１４の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【００９６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１５であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１５の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【００９７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１６であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１６の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【００９８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１７であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１７の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【００９９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１８であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１８の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【０１００】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１９であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１９の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号２０であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号２０の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号２１であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号２１の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号２２であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号２２の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号２３であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号２３の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号２４であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号２４の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号２５であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号２５の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号２６であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号２６の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号２７であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号２７の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号２８であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号２８の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号２９であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号２９の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号３０であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号３０の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号３１であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号３１の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号３２であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号３２の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号３３であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号３３の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号３４であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号３４の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号３５であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号３５の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号３６であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号３６の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号３７であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号３７の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号３８であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号３８の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号３９であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号３９の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号４０であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号４０の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号４１であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号４１の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号４２であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号４２の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号４３であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号４３の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号４４であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号４４の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号４５であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号４５の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号４６であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号４６の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号４７であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号４７の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号４８であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号４８の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号４９であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号４９の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号５０であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号５０の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号５１であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号５１の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号５２であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号５２の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号５３であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号５３の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号５４であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号５４の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号５５であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号５５の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号５６であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号５６の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号５７であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号５７の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号５８であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号５８の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号５９であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号５９の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号６０であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号６０の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号６１であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号６１の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号６２であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号６２の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号６３であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号６３の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１２４であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１２４の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１２５であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１２５の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１２６であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１２６の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１２７であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１２７の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１２８であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１２８の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１２９であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１２９の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１３０であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１３０の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１３１であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１３１の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１３２であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１３２の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１３３であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１３３の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１３４であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１３４の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１３５であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１３５の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１３６であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１３６の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１３７であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１３７の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１３８であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１３８の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１４０であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１４０の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１４１であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１４１の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１４２であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１４２の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１４３であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１４３の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される変異体は、ＡＭＰＬＥＸ（登録商標）Ｒｅｄアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）などのアッセイによって判定される場合、野生型ＮｉｃＡ２またはＮＯＸ酵素と比較したニコチン分解活性の増加を示し、そのため、その活性は、野生型ＮｉｃＡ２またはＮＯＸ酵素の活性よりも、少なくとも約１１０％、約１２０％、約１３０％、約１４０％、約１５０％、約１６０％、約１７０％、約１８０％、約１９０％、約２００％、約２１０％、約２２０％、約２３０％、約２４０％、約２５０％、約２６０％、約２７０％、約２８０％、約２９０％、約３００％、約３１０％、約３２０％、約３３０％、約３４０％、約３５０％、約３６０％、約３７０％、約３８０％、約３９０％、約４００％、約４１０％、約４２０％、約４３０％、約４４０％、約４５０％、約４６０％、約４７０％、約４８０％、約４９０％、約５００％、約５５０％、約６００％、約６５０％、約７００％、約７５０％、約８００％、約８５０％、約９００％、約９５０％、約１０００％、約１１００％、約１２００％、約１３００％、約１４００％、約１５００％、約１６００％、約１７００％、約１８００％、約１９００％、約２０００％、約２２５０％、約２５００％、約２７５０％、約３０００％、約３２５０％、約３５００％、約３７５０％、約４０００％、約４２５０％、約４５００％、約４７５０％、または約５０００％以上である。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される変異体は、緩衝液またはラット血清のいずれか中に３７℃で固定濃度の酵素とインキュベートし、固定時点でＭｅＯＨと混合することによって活性をクエンチした後に、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ；Ｈｉｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．：Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒａｔｓ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｎｉｃｏｔｉｎｅ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｔｏ  ｂｒａｉｎ．Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１４３，，１５０−１５７，１９９９）を使用して残留ニコチン濃度を測定するアッセイによって判定される場合、野生型ＮｉｃＡ２またはＮＯＸ酵素と比較したニコチン分解活性の増加を示し、そのため、その活性は、野生型ＮｉｃＡ２またはＮＯＸ酵素の活性よりも、少なくとも約１１０％、約１２０％、約１３０％、約１４０％、１５０％、約１６０％、約１７０％、約１８０％、約１９０％、約２００％、約２１０％、約２２０％、約２３０％、約２４０％、約２５０％、約２６０％、約２７０％、約２８０％、約２９０％、約３００％、約３１０％、約３２０％、約３３０％、約３４０％、約３５０％、約３６０％、約３７０％、約３８０％、約３９０％、約４００％、約４１０％、約４２０％、約４３０％、約４４０％、約４５０％、約４６０％、約４７０％、約４８０％、約４９０％、約５００％、約５５０％、約６００％、約６５０％、約７００％、約７５０％、約８００％、約８５０％、約９００％、約９５０％、約１０００％、約１１００％、約１２００％、約１３００％、約１４００％、１５００％、約１６００％、約１７００％、約１８００％、約１９００％、約２０００％、約２２５０％、約２５００％、約２７５０％、約３０００％、約３２５０％、約３５００％、約３７５０、約４０００％、約４２５０％、約４５００％、約４７５０％、または約５０００％以上である。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される変異体は、野生型ＮｉｃＡ２またはＮＯＸと比較して、哺乳動物対象において免疫原性の低下を示し、そのため、それは、野生型ＮｉｃＡ２またはＮＯＸ酵素よりも、少なくとも約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％未満、免疫原性が低い。別段特定されない限り、本明細書で使用される野生型ＮｉｃＡ２またはＮＯＸ酵素と比較した場合の「免疫原性の低下」とは、インシリコアプローチ、インビトロアッセイ、インビボ研究（例えば、遺伝子組み換え動物を使用する）、ヒトＴ細胞を使用したエクスビボ研究、またはヒト対象を用いた臨床研究のうちの１つ以上によって示される、免疫原性の低下を指す。
【０１６７】
ＩＶ．医薬組成物
本明細書に開示されるニコチン分解酵素変異体は、以下により詳細に考察されるように、所定の投与経路を介した標的対象（すなわち、ヒトまたは他の哺乳動物）への投与に好適な医薬組成物に処方することができる。
【０１６８】
医薬組成物は、本明細書に記載される１つ以上の変異体および薬学的に許容される担体または希釈剤を含み得る。
【０１６９】
組成物は、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内、経口、経鼻、肺内、眼内、膣内、または直腸内投与用に処方され得る。いくつかの実施形態では、組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、リポソーム製剤などのように、静脈内、皮下、腹腔内、または筋肉内投与用に処方される。医薬組成物は、当該技術分野で知られている技術を使用して、即時放出組成物、持続放出組成物、遅延放出組成物などであるように処方され得る。
【０１７０】
様々な剤形のための薬学的に許容される担体が当該技術分野において知られている。例えば、固形製剤用の賦形剤、潤滑剤、結合剤、および崩壊剤が知られており、液体製剤用の溶媒、可溶化剤、懸濁剤、等張化剤、緩衝剤、および無痛化剤が知られている。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、１つ以上の防腐剤、酸化防止剤、着色剤、甘味料／着香料、吸着剤、湿潤剤などの１つ以上の追加の成分を含む。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、組成物は注射または注入による投与用に処方される。いくつかの実施形態では、組成物は経口投与用に処方される。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、ニコチン分解酵素変異体は、インビボ（投与後）でのその半減期を延長するために修飾されている、長時間作用型変異体である。ペプチドの循環半減期を延長するための様々な技術が当該技術分野において知られている。例えば、いくつかの実施形態では、変異体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または半減期を引き延ばす類似のポリマーに接合されている。以下の実施例３でさらに詳細に考察されるように、本開示されるニコチン分解酵素変異体へのＰＥＧの接合は、変異体の薬物動態学的特性を改善することができる。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化は、変異体の１つ以上の免疫原性エピトープをマスキングすること、変異体特異的抗体力価を低下させること、ならびにＴ細胞増殖および／またはサイトカイン応答を弱めることから選択される１つ以上の効果を有する。追加的または代替的に、いくつかの実施形態では、変異体をＰＥＧに接合しても、ニコチン分解酵素変異体の酵素活性を低下させないか、または酵素活性を有意に低下させないか、あるいは酵素活性を排除しない。
【０１７３】
下記の実施例に例示されるように、ＰＥＧ鎖の長さおよび構造（すなわち、直鎖状対分岐状）を選択し、変化させて、異なる特性に影響を与え、これらを付与し、または促進することができる。ＰＥＧは、以下の実施例に例示されているものを含む、ＰＥＧをタンパク質に接合するための既知の方法によって変異体に接合され得る。本明細書に記載される変異体のうちのいずれも、配列番号２〜５６、５８〜６３、または１２４〜１３４のうちのいずれかによって定義されるか、またはこれを含む変異体を含めて、ＰＥＧ化することができる。本開示される酵素変異体にＰＥＧを接合する目的のために、ＰＥＧポリマーのサイズまたは長さは変化し得る。例えば、本開示される酵素変異体に接合された直鎖状ＰＥＧは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ｋＤａなど、１〜５０ｋＤａ、５〜４０ｋＤａ、または１０〜２０ｋＤａの範囲であり得る。加えて、ＰＥＧポリマーは、２０、４０、６０、または８０ｋＤａなど、２０〜８０ｋＤａの範囲のサイズで分岐していてもよい。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、変異体は、アルブミン結合ペプチド、アルブミン結合タンパク質ドメイン、ヒト血清アルブミン、または不活性ポリペプチドと融合される。ペプチドの循環半減期を増加させるために使用されてきた例示的な不活性ポリペプチドとしては、ＸＴＥＮ（登録商標）（組み換えＰＥＧまたは「ｒＰＥＧ」としても知られる）、ホモアミノ酸ポリマー（ＨＡＰ、ＨＡＰ化）、プロリン−アラニンセリンポリマー（ＰＡＳ、ＰＡＳ化）、またはエラスチン様ペプチド（ＥＬＰ、ＥＬＰ化）が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、「に融合される」とは、直接のまたはリンカーを介した遺伝子融合を含み、別段特定されない限り、複数のドメインを含む単一のポリペプチドをもたらす。
【０１７５】
Ｖ．ニコチン嗜癖の治療方法または禁煙の促進方法
上記のように、本明細書に記載される変異体は、ニコチン嗜癖の治療および／もしくは禁煙（または他のタバコ製品の使用の中止）の促進または喫煙の再開（または他のタバコ製品の消費）の防止方法であって、それを必要とする哺乳動物対象における方法に有用である。（便宜上、以下の考察において、これらの方法は、ニコチン中毒の治療または禁煙の促進と総称される。）いくつかの実施形態では、対象は、ニコチン嗜癖であるか、あるい喫煙をやめるかまたは喫煙もしくは他のニコチン製品の消費の自制を維持すること、または喫煙もしくは他のニコチン製品の消費の再発を防止することを望んでいる、ヒト対象である。
【０１７６】
本方法は、概して、治療有効量の本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体（またはそれらを含む医薬組成物）を対象に投与することを伴う。しかしながら、いくつかの実施形態では、本方法は、インビボで変異体を発現する構築物中にニコチン分解酵素変異体をコードする核酸を投与することを含む。例えば、そのような実施形態では、核酸は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）遺伝子導入ベクターなどの好適なベクター中に提供され得る。そのような方法での使用に好適な他の例示的なベクターは、当該技術分野において知られている。例えば、Ｌｕｋａｓｈｅｖ  ａｎｄ  Ｚａｍｙａｔｎｉｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，８１（７）：７００−８（２０１６）を参照されたい。例示的なベクターは、１つ以上のエンハンサー（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー）、プロモーター（例えば、ニワトリβ−アクチンプロモーター）、および／または発現カセットの特性を増強する他の要素を含み得る。好適なベクターを作製する方法およびインビボで発現ベクターを使用する一般的な方法は当該技術分野において知られている。例えば、（Ｈｉｃｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．，４（１４０）：１４０ｒａ８７（２０１２）を参照のこと）を参照されたい。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、ニコチン嗜癖または禁煙の促進のための治療を必要とする対象は、喫煙タバコ、噛みタバコ、電子タバコ、および／または他のニコチン送達デバイスなどのニコチン製品を消費するヒト対象である。そのような対象は、ニコチンに身体的に嗜癖する、および／またはニコチン製品を消費することに心理的に嗜癖していても、またはしていなくてもよい。禁煙治療を必要とする典型的な対象は、１０未満、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、または４０本以上（または他のタバコ製品もしくはニコチン製品の同等の使用）を含む、１日当たり少なくとも約５、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０本以上のタバコなど、１日に少なくとも１本以上のタバコを喫煙するなど、タバコもしくは他のニコチン製品を毎日喫煙または使用する。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、治療有効量のニコチン分解酵素変異体は、血漿内ニコチンレベルを低下させるため、脳内に局在するニコチンレベルを低下させるため、またはその両方に有効な量である。
【０１７９】
ニコチンは、血液脳関門を通過した後、その重要な効果のうちの多くを発揮する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法および使用は、ニコチンが血液脳関門を通過するのを減少させるか、または防止する。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体の投与は、対象の血流中を循環するニコチンを分解し、それによってニコチンが血液脳関門を通過するのを減少させるか、または防止する。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、脳に由来するニコチンの生理学的および心理的効果を減少させるか、または防止する。対象はこれらの効果の減少または中止を経験するので、彼／彼女はニコチン製品を消費したいという欲求を失うであろう。追加的または代替的に、本開示されるニコチン分解酵素変異体は、末梢神経系を刺激するニコチンの能力に影響を及ぼすことによって効果を発揮し得る。
【０１８０】
投与されるニコチン分解酵素の具体的な量は、対象の年齢および／もしくは体重、定期的に摂取される（例えば、喫煙される、噛まれる、または吸入される）ニコチンの量、ならびに／または治療時の対象の脳もしくは血漿中のニコチンレベルのうちの１つ以上に依存し得る。いくつかの実施形態では、変異体は、約０．０１〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１８ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１６ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ〜約１４ｍｇ／ｋｇ、または約５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態では、変異体は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ、約０．０３ｍｇ／ｋｇ、約０．０４ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．０６ｍｇ／ｋｇ、約０．０７ｍｇ／ｋｇ、約０．０８ｍｇ／ｋｇ、約０．０９ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．３、約０．４ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．６ｍｇ／ｋｇ、約０．７ｍｇ／ｋｇ、約０．８ｍｇ／ｋｇ、約０．９ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約３．５ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約４．５ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約５．５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約６．５ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約７．５ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約８．５ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ、約９．５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１０．５ｍｇ／ｋｇ、約１２ｍｇ／ｋｇ、約１２．５ｍｇ／ｋｇ、約１３ｍｇ／ｋｇ、約１３．５ｍｇ／ｋｇ、約１４ｍｇ／ｋｇ、約１４．５ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ、約１５．５ｍｇ／ｋｇ、約１６ｍｇ／ｋｇ、約１６．５ｍｇ／ｋｇ、約１７ｍｇ／ｋｇ、約１７．５ｍｇ／ｋｇ、約１８ｍｇ／ｋｇ、約１８．５ｍｇ／ｋｇ、約１９ｍｇ／ｋｇ、約１９．５ｍｇ／ｋｇ、または約２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態では、変異体は、約０．５ｍｇ、約１ｍｇ、約２．５ｍｇ、約５ｍｇ、約１０ｍｇ、約１５ｍｇ、約２０ｍｇ、約２５ｍｇ、約５０ｍｇ、約７５ｍｇ、約１００ｍｇ、約１５０ｍｇ、約２００ｍｇ、約２５０ｍｇ、約３００ｍｇ、約３５０ｍｇ、約４００ｍｇ、約４５０ｍｇ、約５００ｍｇ、約５５０ｍｇ、約６００、約６５０ｍｇ、７００ｍｇ、約７５０ｍｇ、約８００ｍｇ、約８５０ｍｇ、約９００ｍｇ、約９５０ｍｇ、約１０００ｍｇ、約１０５０ｍｇ、約１１００ｍｇ、約１１５０ｍｇ、約１２００ｍｇ、約１２５０ｍｇ、約１３００ｍｇ、約１３５０ｍｇ、約１４００ｍｇ、約１４５０ｍｇ、約１５００ｍｇ、約１５５０ｍｇ、約１６００ｍｇ、約１６５０ｍｇ、約１７００ｍｇ、約１７５０ｍｇ、約１８００ｍｇ、約１８５０ｍｇ、約１９００ｍｇ、約１９５０ｍｇ、約２０００ｍｇ、約２０５０ｍｇ、約２１００、約２１５０ｍｇ、約２２００ｍｇ、約２２５０ｍｇ、約２３００ｍｇ、約２３５０ｍｇ、約２４００ｍｇ、約２４５０ｍｇ、または約２５００ｍｇの用量で投与される。１つ超の変異体が投与される場合、投与される変異体の総量は前述の指針に従っている場合がある。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、本方法は、単一用量のニコチン分解酵素変異体（複数可）（またはそれを含む組成物）を投与することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、ニコチン嗜癖の症状もしくは効果が減少、改善、または排除されるまで、または対象が喫煙もしくは別様にニコチンの摂取を中止するまでの所定の期間など、反復用量を投与することを含む。いくつかの実施形態では、徴候／症状／効果が持続する場合、または対象がニコチン欲求を続けているか、もしくはそれらを新たに経験している場合は、追加の用量の変異体（複数可）を用いて治療を繰り返す。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、本方法は、ニコチン分解酵素変異体（複数可）（またはそれを含む組成物）を１日３回以上、１日２回、または１日１回投与することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、ニコチン分解酵素変異体（複数可）（またはそれを含む組成物）を、隔日に１回、週に３回、週に２回、週に１回、隔週に１回、３週毎に１回、月に１回、またはそれ未満頻繁に投与することを含む。そのような実施形態では、ニコチン分解酵素変異体は、上記に記載されるような長時間作用型ニコチン分解酵素変異体であり得る。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、治療は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、もしくは２１日間以上、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、もしくは１８週以上、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２か月以上、または１、２、もしくは３年以上、あるいは対象がニコチン欲求もしくは他のニコチン離脱症状を経験しなくなるまで、または喫煙もしくは他のタバコ製品の使用を中止するまで、継続し得る。
【０１８４】
ＶＩ．ニコチン中毒の治療方法
本開示されるニコチン分解酵素変異体を使用して、ニコチン中毒、ニコチン過剰摂取、またはニコチン毒性を治療することができる。便宜上、これらの方法は、本明細書ではニコチン中毒の治療と総称される。いくつかの態様では、本明細書に記載されるニコチン中毒を治療する方法は、本明細書に開示されるニコチン分解酵素変異体またはそれを含む医薬組成物を、それを必要とする哺乳動物対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、毒性量のニコチンを摂取または消費した対象にニコチン分解酵素変異体を投与することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、ニコチン分解酵素変異体と、活性炭もしくは他の薬剤などのニコチン中毒の治療に有用な他の化合物との両方を投与することを含み得る。そのような実施形態では、酵素変異体および第２の化合物（例えば、活性炭）は、同じまたは異なる組成物から、順次または同時に投与されることができる。したがって、治療は、ニコチン中毒の症状および／または効果に対処するために活性炭および／または他の支持療法を施すことを含み得る。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、治療有効量のニコチン分解酵素変異体は、ニコチン中毒もしくは過剰摂取の１つ以上の症状もしくは効果を減少、改善、または排除するのに有効である。投与される具体的な量は、対象の年齢および／もしくは体重、摂取されたと考えられるニコチンの量、ならびに／または治療時の対象の血漿中のニコチンレベル、および／もしくは治療時の対象の脳内ニコチンレベルのうちの１つ以上に依存し得る。いくつかの実施形態では、ニコチン中毒の治療を受けている対象は成人であり、いくつかの実施形態では、対象は子供（すなわち、１９歳未満）である。いくつかの実施形態では、治療有効量のニコチン分解酵素変異体は、血漿内ニコチンレベルを低下させるため、および／または対象の特定の組織（例えば、脳／中枢神経系、心臓および血管系など）に局在するニコチンの量を減少させるために有効な量である。特定の実施形態では、治療有効量のニコチン分解酵素変異体は、血漿内ニコチンレベルを低下させるため、脳内に局在するニコチンレベルを低下させるため、またはその両方に有効な量である。
【０１８６】
投与されるニコチン分解酵素の具体的な量は、対象の年齢および／もしくは体重、急激に摂取されたニコチンの量、ならびに／または治療時の対象の脳もしくは血漿内のニコチンレベルのうちの１つ以上に依存し得る。いくつかの実施形態では、変異体は、約０．０１〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１８ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１６ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ〜約１４ｍｇ／ｋｇ、または約５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態では、変異体は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ、約０．０３ｍｇ／ｋｇ、約０．０４ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．０６ｍｇ／ｋｇ、約０．０７ｍｇ／ｋｇ、約０．０８ｍｇ／ｋｇ、約０．０９ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．３、約０．４ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．６ｍｇ／ｋｇ、約０．７ｍｇ／ｋｇ、約０．８ｍｇ／ｋｇ、約０．９ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約３．５ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約４．５ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約５．５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約６．５ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約７．５ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約８．５ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ、約９．５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１０．５ｍｇ／ｋｇ、約１２ｍｇ／ｋｇ、約１２．５ｍｇ／ｋｇ、約１３ｍｇ／ｋｇ、約１３．５ｍｇ／ｋｇ、約１４ｍｇ／ｋｇ、約１４．５ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ、約１５．５ｍｇ／ｋｇ、約１６ｍｇ／ｋｇ、約１６．５ｍｇ／ｋｇ、約１７ｍｇ／ｋｇ、約１７．５ｍｇ／ｋｇ、約１８ｍｇ／ｋｇ、約１８．５ｍｇ／ｋｇ、約１９ｍｇ／ｋｇ、約１９．５ｍｇ／ｋｇ、または約２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態では、変異体は、約０．５ｍｇ、約１ｍｇ、約２．５ｍｇ、約５ｍｇ、約１０ｍｇ、約１５ｍｇ、約２０ｍｇ、約２５ｍｇ、約５０ｍｇ、約７５ｍｇ、約１００ｍｇ、約１５０ｍｇ、約２００ｍｇ、約２５０ｍｇ、約３００ｍｇ、約３５０ｍｇ、約４００ｍｇ、約４５０ｍｇ、約５００ｍｇ、約５５０ｍｇ、約６００、約６５０ｍｇ、７００ｍｇ、約７５０ｍｇ、約８００ｍｇ、約８５０ｍｇ、約９００ｍｇ、約９５０ｍｇ、約１０００ｍｇ、約１０５０ｍｇ、約１１００ｍｇ、約１１５０ｍｇ、約１２００ｍｇ、約１２５０ｍｇ、約１３００ｍｇ、約１３５０ｍｇ、約１４００ｍｇ、約１４５０ｍｇ、約１５００ｍｇ、約１５５０ｍｇ、約１６００ｍｇ、約１６５０ｍｇ、約１７００ｍｇ、約１７５０ｍｇ、約１８００ｍｇ、約１８５０ｍｇ、約１９００ｍｇ、約１９５０ｍｇ、約２０００ｍｇ、約２０５０ｍｇ、約２１００、約２１５０ｍｇ、約２２００ｍｇ、約２２５０ｍｇ、約２３００ｍｇ、約２３５０ｍｇ、約２４００ｍｇ、約２４５０ｍｇ、または約２５００ｍｇの用量で投与される。１つ超の変異体が投与される場合、投与される変異体の総量は前述の指針に従っている場合がある。
【０１８７】
ニコチン中毒は嘔吐に関連しているため、非経口投与経路を使用してもよい。さらに、静脈内投与は、腹腔内投与よりも有効であり得る。したがって、ニコチン中毒を治療する方法のいくつかの実施形態では、ニコチン分解酵素変異体（複数可）（またはそれを含む組成物）が静脈内投与される。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、本方法は、単一用量のニコチン分解酵素変異体（複数可）（またはそれを含む組成物）を投与することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、所定の期間、またはニコチン中毒もしくは毒性の症状もしくは効果が減少、改善、もしくは排除されるまで、または対象が喫煙もしくは別様にニコチンの摂取を中止するまでなど、反復用量を投与することを含む。いくつかの実施形態では、徴候／症状／効果が持続する場合、追加の用量の変異体（複数可）を用いて治療を繰り返す。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、治療は、過剰摂取後１〜３日間、または１〜５日間、あるいは１、２、３、４、もしくは５日間など、過剰摂取後１日以上継続してもよい。いくつかの実施形態では、対象がニコチン中毒もしくは毒性のいかなる症状も、もはや経験しなくなるまで、または対象の血漿および／もしくは脳内のニコチンレベルが十分に安全なレベルまで低下するまで、治療を続けてもよい。いくつかの実施形態では、ニコチン分解酵素変異体は、上記に記載されるような長時間作用型ニコチン分解酵素変異体であり得る。
【０１９０】
当業者であれば、本開示が目的を実行し、言及された目的および利点、ならびにそれに固有のものを得るために上手く適合されていることを容易に認識するであろう。その中の改変および他の用途は当業者には思い浮かぶであろう。これらの改変は本開示の趣旨の範囲内に包含される。以下の実施例は本発明を例示するために与えられる。しかしながら、本発明はこれらの実施例の特定の条件または詳細に限定されないことが理解されるべきである。
【実施例】
【０１９１】
実施例１−ニコチン分解酵素変異体の開発および試験
Ｃ末端Ｈｉｓ６−タグを有する野生型（ｗｔ）ＮｉｃＡ２アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＥＪ１４６２０．１）のＥ．ｃｏｌｉ発現用に最適化されたコドンである合成遺伝子（ＧｅｎｅＡｒｔ／ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎによるカスタムＤＮＡ合成）を、ｐＥＴ−２２ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＮｄｅＩ−ＸｈｏＩ部位にクローニングし、発現プラスミドをＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。この構築物から発現された予測野生型ＮｉｃＡ２アミノ酸配列を表１に示す（配列番号１）。
【０１９２】
サイズの不均一性は、配列番号１をコードする構築物から発現されたタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって同定され、製造者のプロトコルに従ってＣｏｂａｌｔ  ＴＡＬＯＮ（商標）Ｈｉｓ−Ｔａｇ精製樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によって精製された（図１、４９ｋＤａマーカー周辺の主要なバンドおよび小さいバンド）。タンパク質がＨｉｓタグを介して精製されたので、不均一性はＮ末端にあると推測された。オンライン検索ツールＰＲＥＤ−ＴＡＴ（ｃｏｍｐｇｅｎ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ＰＲＥＤ−ＴＡＴ；Ｐａｎｔｅｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔａｔ  ａｎｄ  Ｓｅｃ  ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｈｉｄｄｅｎ  Ｍａｒｋｏｖ  Ｍｏｄｅｌｓ，２０１０  ＢＩＯＩＮＦＯＲＭＡＴＩＣＳ）を利用して、配列番号１の位置３７のアラニン（Ａ）残基に続く、関連する切断部位を有する推定ＴＡＴリーダー切断部位を同定した。
【０１９３】
非必須細菌配列（配列番号１の位置１６〜２４の特定のインシリコ予測Ｔ細胞エピトープ配列を含む）を排除するため、免疫原性リスクを低下させるため、ならびに推定Ｎ末端開裂部位および関連する生成物の不均一性を排除するための試みにおいて、最初の５０個のＮ末端残基（ＮｉｃＡ２Δ５０、配列番号２）を除去する欠失構築物を作製した。
【０１９４】
この領域は触媒活性を損なうことなく潜在的に欠失され得ると考えられ、その結果、ＮｉｃＡ２Δ５０（配列番号２）をＥ．ｃｏｌｉ中で発現させ、上記に記載されるように精製した。図１に見られるように、精製されたＮｉｃＡ２Δ５０（配列番号２）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって均一に見える。
【０１９５】
Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄアッセイ（Ｒｅｓｚｋａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ａｍｐｌｅｘ  ｒｅｄ／ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ａｓｓａｙ：Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅｓ，ＡＮＡＬＹＴＩＣＡＬ  ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ３４２：３２７−３３７（２００５））を使用して、精製タンパク質に対する酵素活性の分析を行った。簡単に言うと、ＮｉｃＡ２によるニコチンの酸化は、Ｈ２Ｏ２の作成をもたらし、これは無色のＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ試薬のその赤色蛍光生成物、ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）によるレゾルフィンへの変換と結び付けられる。アッセイは、本質的に、１０μＭの最終アッセイ濃度までＳ−ニコチン（Ｓｉｇｍａ）を添加したことを除いて、アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ、Ｃａｔ＃Ａ２２１８８）の供給者によって推奨されるように行われた。アッセイは、黒色の半分の面積の平底９６ウェルアッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃａｔ＃３９９３）中の１００μＬ／ウェルの総容量で行われた。５５５ｎｍでの設定Ｅｘ；５９０ｎｍでのＥｍを使用してＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ２マルチモードマイクロプレートプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）中に蛍光の発生を検出し、ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏデータ進化パッケージ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）中の各時点について無酵素対照由来の値を差し引くために「プレートブランク」ウェルを用いる。活性は、並行して実行された野生型ＮｉｃＡ２酵素と比較した時間の関数としてプロットされた蛍光の増加の相対勾配として発現された。
【０１９６】
Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄアッセイは、精製ＮｉｃＡ２Δ５０タンパク質が野生型ＮｉｃＡ２と比較して２３％の活性の低下を示すことを明らかにした（図２および表４）。２つのより短い欠失構築物（ＮｉｃＡ２Δｄ２５（配列番号３）およびＮｉｃＡ２Δ３８（配列番号４））を作成して試験したが、野生型酵素と比較して、同様に活性の低下を示した。要約すると、３つすべての欠失突然変異体が、野生型と比較した活性の低下を示した（表５）。
【表４】
2020506709.tif 000032
【表５−１】
2020506709.tif 000033
【表５−２】
2020506709.tif 000034
【表５−３】
2020506709.tif 000035
【０１９７】
したがって、少なくとも野生型と同等のニコチン分解活性を示すであろうＮｉｃＡ２Δ５０変異体を設計および同定することが決定された。ＮＯＸ変異体も同様に、さらなる試験のために同定された。
【０１９８】
Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ  ４．５（Ｄａｓｓａｕｌｔ  Ｓｙｓｔｅｍｅｓ、ＢＩＯＶＩＡ  Ｃｏｒｐ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）を使用して、ＮｉｃＡ２タンパク質を可視化し、活性部位残基を判定した。構造の検査、ＦＡＤの位置、および重要な推定活性部位残基の報告に基づいて（Ｔａｒａｒｉｎａ  ｅｔ  ａｌ，２０１６）、推定された活性部位の空洞を定義した。側鎖および骨格原子の両方を含む、この空洞の露出表面を構成するすべての残基を、シェル１残基として分類した（表２）。定義されたシェル１残基に基づいて、シェル１と同様に直接接触している残基をシェル２と定義した（表２）。残基の位置を構造の手動検査によって確認した。
【０１９９】
【化２】
2020506709.tif 000036
これを制限酵素ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで消化し、その断片をＮｉｃＡ２Δ５０の発現のために使用された発現プラスミド中の対応する独自の部位にクローニングした。
【０２００】
得られたライブラリーは、シェル１コドンＷ４２７（表２）のＮＮＫランダム化を有し、当該位置にすべての可能な２０個のアミノ酸を有する変異体をコードする３２員ライブラリー（ＤＮＡ／コドンレベルで）をもたらした。ライブラリーをＢＬ２１ゴールド（ＤＥ３）に形質転換し、単一コロニーを拾い上げ、カルベニシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地中の９６ウェルプレート中で一晩増殖させた。一晩のＬＢ培養物を、４７５μｌの自動誘導マジック培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）＋カルベニシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有する新しい９６ディープウェルプレートに希釈し、激しく振盪しながら室温で１８時間増殖させた。４０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離によって、細菌をプレート中で回収し、ペレットを−８０℃で凍結した。１ｍｌ当たり１ＫＵのｒ−リゾチーム（Ｎｏｖａｇｅｎ）を含有する１００μｌの室温Ｂｕｇ  Ｂｕｓｔｅｒ  ＨＴ試薬（Ｎｏｖａｇｅｎ）に溶解し、振盪プラットフォーム上で室温で２０分間インキュベートすることによって、ペレットを溶解した。Ｂｕｇ  Ｂｕｓｔｅｒ  ＨＴ試薬で１：１（容量：容量）に希釈し、４℃で２０分間４４００ｒｐｍで遠心分離することによって不溶性細胞片を除去することによって、清澄化した溶解物を調製した。２５μｌの清澄化した溶解物を新しい９６ウェルプレートに移し、ＰＢＳ中の２％ミルク中で１：１（容量：容量）に希釈した。希釈した溶解物を、ウェル当たり５０μｌのＰＢＳ中のアッセイプレート（５μｇ／ｍｌの抗Ｈｉｓタグ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で４℃で一晩コーティングされた黒色９６ウェルハーフエリア高結合プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ））に移し、次に、４％ミルク（ＰＢＳ中に）で室温で２時間ブロッキングし、室温で３時間穏やかに振盪しながらインキュベートして、モル過剰の発現されたＨｉｓタグ化酵素による固定化抗Ｈｉｓ  ｍＡｂの飽和を確実にした。この工程は、本質的に、増殖、誘導条件、固有の発現レベルなどの違いによってもたらされる濃度の任意の違いを標準化し、その後の工程で一貫した量の酵素が各ウェルの活性についてアッセイされることを確実にする。これはまた、変異体の活性を正確に測定し、比較するために、個々のウェル中の酵素の定量化の必要性をなくす。プレートをＰＢＳＴで６回、Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ試薬緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ）で１回洗浄して、未結合の物質を除去した。１０μＭのＳ−ニコチンを含む５０μｌのＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ溶液（上記に記載されるような）を各ウェルに添加し、経時的に蛍光の発生をモニターすることによって、酵素アッセイを行った。
【０２０１】
９６ウェルアッセイプレート１枚から、最高のアッセイ活性（野生型ＮｉｃＡ２を発現する、含まれたコロニーからの値と比較して、すべてが高められている）を有する１０個の変異体を、一晩ＬＢ培養でマスタープレートから単離し、プラスミドＤＮＡを調製し、配列決定した。配列決定により、Ｗ４２７からＱ、Ｅ、Ｓ、およびＭへの単一の突然変異をもたらすＮｉｃＡ２Δ５０（配列番号２）と比較した配列変化が明らかになり、それぞれ、配列番号５、６、７、および８が得られた。加えて、配列番号１の位置９１、２１７、４６３、３８１、３６６、３４０、２５０、４２７、または４６２に突然変異を有するさらなる変異体、ならびに配列番号５７の位置４２３に突然変異を有するＮＯＸの変異体もまた、設計およびスクリーニングされた。Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄスクリーニングアッセイにおいて同定された変異体の活性のリスト（上記に記載されるように再アッセイされた各変異体の８つの個々のコロニーについての平均）を表５に示す。
【０２０２】
変異体ＮｉｃＡ２Δ５０Ｗ４２７Ｑ（配列番号５）を、上記に記載されるように発現させ、精製した。活性アッセイは、上記に記載されるようなＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄアッセイを使用して、精製野生型ＮｉｃＡ２およびＮｉｃＡ２Δ５０と並行して行った。図２および表４に示されるように、野生型ＮｉｃＡ２酵素と比較して約２５０％の活性（２．５倍の増加）を示すＮｉｃＡ２Δ５０Ｗ４２７Ｑ変異体と共に、驚くべきことにＷ４２７Ｑ変異が「回復」しただけでなく、実際に活性が有意に増加した。精製タンパク質を使用して得られたこのデータは、スクリーニングアッセイフォーマットにおいて作成されたデータと一致している（表５）。
【０２０３】
クエリー配列としてＮｉｃＡ２を使用したタンパク質ＢＬＡＳＴ相同性検索により、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＨＺＮ６からＮＯＸ、ニコチンアミンオキシダーゼ（Ｑｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７８，２１５４−２１６０（２０１２）、Ｑｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７９，２１６４−２１７１（２０１３））を、８３％の同一性を有する最も近い相対物として得た。Ｃ末端Ｈｉｓ６−タグを有する野生型（ｗｔ）ＮＯＸアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＧＨ６８９７９．１）のＥ．ｃｏｌｉ発現のために最適化された合成遺伝子（ＧｅｎｅＡｒｔ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによるカスタム合成）コドンを、ｐＥＴ−２２ｂ（＋）のＮｄｅＩ−ＸｈｏＩ部位へとクローニングし、発現プラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。この構築物から発現される予測野生型ＮＯＸアミノ酸配列を表１に示す（配列番号５７）。ＮＯＸを精製し、Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ活性アッセイにおいてアッセイした。この酵素は、野生型ＮｉｃＡ２と比較して２０％の活性の減少ではあるが、確かにニコチン分解およびＨ２Ｏ２形成と一致する活性を示した（表５）。Ｗ４２７に突然変異を有する改善されたＮｉｃＡ２変異体を同定することは、ＮＯＸの相同なＷ４２３位置のＮＮＫランダム化ライブラリーの作成およびスクリーニングを促進した。キットの説明書に従って、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ）、上記に記載されるｐＥＴ２２発現ベクター中のＮＯＸをコードするＤＮＡテンプレート、およびＮＮＫプライマーＮＯＸ−Ｗ４２３ＮＮＫ（表６、配列番号６５）を使用して、ライブラリーが作成された。形質転換をプレーティングし、３７℃で一晩インキュベートした後、８つのランダムコロニーをライブラリーＱＣについて配列決定し、残りのコロニーを寒天プレートから掻き取り、ＤＮＡミニプレップ用にプールした。次に、このＤＮＡをＢＬ２１（ＤＥ３）発現株に形質転換し、上記のＮｉｃＡ２Δ５０Ｗ４２７ＮＮＫライブラリーについて記載されるように、個々のクローンをスクリーニングした。このライブラリーをスクリーニングすることにより、野生型ＮｉｃＡ２に対して２〜４．５倍改善された活性を有する４つの変異体：ＮＯＸＷ４２３Ａ、Ｓ、Ｅ、およびＨを同定した（表５）。興味深いことに、これらすべての変異体が野生型ＮｉｃＡ２と比較して活性が増加していることを考えると、これらは潜在的に、生物療法の開発のための同等に良好な出発点である可能性があり、ＮｉｃＡ２中に統制された有益な突然変異（例えば、表５に開示されるすべての突然変異）がまた、ＮＯＸ骨格中の相同位置において有益であり得る。
【０２０４】
ＮｉｃＡ２位置Ｗ４２７における改善された変異体の同定に成功したことを前提として、他の活性部位（シェル１）位置：Ｒ９１、Ｔ２５０、Ｋ３４０、Ｑ３６６、Ｔ３８１、Ｎ４６２、Ｉ４６３Ｆ、ならびに第２のシェル残基Ｌ２１７について、ＮｉｃＡ２Δ５０骨格における類似の「ＮＮＫライブラリー」が作成された。キットの説明書に従って、ＱＵＩＫＣＨＡＮＧＥ（商標）部位特異的突然変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ）、ｐＥＴ２２発現ベクター中のＮｉｃＡ２Δ５０をコードするＤＮＡテンプレート、およびそれぞれ表６の配列番号６６〜７３に列挙されるＮＮＫプライマーを使用して、これらの後のライブラリーを作成した。表５に示されるように、上記に記載されるようなこれらのライブラリーのスクリーニングは、Δ５０Ｎ末端欠失を有するにもかかわらず、野生型ＮｉｃＡ２（配列番号５〜５６）に対して活性の１〜６．５倍の範囲の改善を有する変異体の同定をもたらした。興味深いことに、Ｌ２１７が第２のシェル残基であるとしても（表３）、野生型に対して１．７〜２．８倍の活性の増加を与える６つの置換がこの位置で同定された（表５）。
【表６】
2020506709.tif 000037
【０２０５】
表２に列挙される追加の活性部位位置をカバーするために、全長ＮｉｃＡ２の以下の位置：ＰＨＥ１０４、ＧＬＹ１０５、ＧＬＹ１０６、ＡＬＡ１０７、ＴＲＰ１０８、ＴＹＲ２１４、ＴＹＲ２１８、ＧＬＵ２４９、ＰＨＥ３５５、ＴＲＰ３６４、ＴＲＰ４１７、ＡＬＡ４２６、およびＡＬＡ４６１において、すべての単一アミノ酸（ａａ）置換（変異体当たり１つの突然変異）を探索する、Ｒｅｖｏｌｖｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｉｒｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏｓ  Ｏｎｅ，７：ｅ５２０３１（２０１２））によって、カスタム総合飽和突然変異誘発（ＣＳＭ）ライブラリーが供給された。
【０２０６】
先に記載されるようなＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄスクリーニングアッセイにおけるこのライブラリーのスクリーニングは、改善された変異体ＮｉｃＡ２Ａ１０７Ｒ、ＮｉｃＡ２Ａ１０７Ｋ、ＮｉｃＡ２Ａ１０７Ｔ、およびＮｉｃＡ２Ｆ３５５Ｃの同定をもたらす（表５、配列番号１２４〜１２７）。
【０２０７】
より大きなライブラリーサイズを通してより効率的にスクリーニングするために、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）選別プロトコルを実施した。ＮｉｃＡ２変異体を含有するライブラリーを、ベクターｐＥＴ２２ｂにクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）株に形質転換した。細胞をＬＢ＋１００μｇ／ｍＬのアンピシリンにインキュベートし、ＯＤ６００が０．６〜０．８に到達するまで３７℃で増殖させた。１ｍＭのＩＰＴＧを用いて発現を誘導し、培養物を１８℃に移し、一晩発現させた。翌日、細胞を５×ＰＢＳ＋１ｍＭのＥＤＴＡで洗浄して、細胞をニコチンに浸透させた後、５μＭのジヒドロローダミン１２３（ＤＨＲ１２３）、ＮｉｃＡ２によって放出される過酸化水素との反応時に蛍光になる酸化還元感受性色素、および５ｍＭのニコチンを含有する同じ緩衝液に再懸濁した。細胞懸濁液を清潔な滅菌フラスコに移し、振盪しながら室温でインキュベートした。２時間後、細胞を５×ＰＢＳ＋１ｍＭのＥＤＴＡで洗浄し、ＦＩＴＣチャンネルを使用してＦＡＣＳによって選別し、ＤＨＲ１２３蛍光を定量化した。回収された細胞をＬＢ＋１００μｇ／ｍＬアンピシリン中に再増殖させ、必要に応じてプロトコルを繰り返した。
【０２０８】
推定ＮｉｃＡ２活性について濃縮されたＣＳＭライブラリーの１ラウンドの選別から生じる出力からのクローンの配列決定により、変異体ＮｉｃＡ２Ｗ４２７Ｒ、ＮｉｃＡ２Ｔ２５０Ｐ、ＮｉｃＡ２Ｗ４２７Ｈ、Ｎ４６２Ｆ、およびＮｉｃＡ２Ｗ４２７Ｌ、Ｎ４６２Ｍ（それぞれ、配列番号１３５〜１３８）が得られた。
【０２０９】
改善された変異体ＮｉｃＡ２Δ５０Ｒ９１Ｑ、ＮｉｃＡ２Δ５０Ｑ３６６Ｋ、ＮｉｃＡ２Δ５０Ｔ３８１Ｖ、およびＮｉｃＡ２Δ５０Ｎ４６２Ｙの結果に基づいて、全長ＮｉｃＡ２に同じ突然変異を導入し、（その結果、それぞれ、配列番号１２９、１３０、１３１、１３３を有するＮｉｃＡ２Ｒ９１Ｑ、ＮｉｃＡ２Ｑ３６６Ｋ、ＮｉｃＡ２Ｔ３８１Ｖ、およびＮｉｃＡ２Ｎ４６２Ｙを生じる）、および以前に記載されるようなＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄアッセイで活性を評価した。表５に示されるように、これらすべての例示的な突然変異は、全長酵素において活性増強をもたらした。それに対応して、ＮｉｃＡ２Δ５０Ａ１０７Ｒ変異体（配列番号１３４）において、ＮｉｃＡ２Ａ１０７Ｒ変異体（配列番号１２４）の高い活性が保持されていた。結果として、全長ＮｉｃＡ２およびＮｉｃＡ２Δ５０、ＮｉｃＡ２Δ２５、ＮｉｃＡ２Δ３８などの欠失変異体の両方、または少なくとも最初の５０個のＮｉｃＡ２のＮ末端残基までを含む任意の同様の欠失、あるいはこれが全長野生型ＮｉｃＡ２の少なくとも２０％の酵素活性を有することを条件とした任意のＮもしくはＣ末端欠失変異体の文脈において、表５に列挙されるすべての突然変異が活性を改善すると予想される。
【０２１０】
部位特異的突然変異誘発によって、表５から選択される複数の残基に突然変異を有する特異的変異体を作成することができ、上記に記載されるように、表５から選択される複数の位置における複数の突然変異からなるライブラリーを作成して、スクリーニングすることができる。これらの試みは、表５に列挙される個々の単一の突然変異のうちのいずれよりも高い酵素活性を有する同じ分子中のいくつかの位置に突然変異を有する変異体の同定を可能にし得る。
【０２１１】
配列番号２〜４を有する変異体を用いて、活性に対して中程度の効果のみで最初のエピトープを欠失させることが可能であり、活性のこの減少は、表５に列挙される突然変異によって軽減または克服され得ることを示した。
【０２１２】
免疫原性エピトープを判定するために、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ  ４．５（Ｄａｓｓａｕｌｔ  Ｓｙｓｔｅｍｅｓ，ＢＩＯＶＩＡ  Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）上で、ＮｉｃＡ２タンパク質の構造座標を調べた。Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏに実装された予測部位飽和突然変異誘発プロトコルを使用して、ＭＨＣ対立遺伝子ＤＲＢ１＊０４０１に対するＴ細胞エピトープスキャニング（Ｉｍｍｕｎｅ  Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ，ＩＥＤＢ，ｉｅｄｂ．ｏｒｇ）を介して潜在的エピトープとしてフラグが立てられたＮｉｃＡ２配列の領域を評価し、突然変異エネルギーを評価した。予測された免疫原性を低下させる変化を見出すために、以前に定義された各領域における好ましいスコア付け突然変異を、ＭＨＣ対立遺伝子ＤＲＢ１＊０４０１に対する新たなラウンドのＩＥＤＢ  Ｔ細胞エピトープ予測と相互参照した。Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏの推定構造変化の視覚化および手動評価によって、可能性のある突然変異の最終的な選択を確認した。表３は、ニコチン分解活性および安定性を実質的に保持しながら、免疫原性を低下させると予測された免疫原性Ｔ細胞エピトープ中に例示的な変異を記載する（上記に記載されるようなインシリコスコア付けに基づいて）。
【０２１３】
制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳａｃＩＩで消化された合成二本鎖ＤＮＡ断片（配列番号７４〜８３、表７）を、野生型ＮｉｃＡ２（配列番号１）の発現のために使用される発現プラスミド中の対応する独自の部位にクローニングすることによって、エピトープ１についての突然変異に基づく１０個の変異体を作成した。以下にさらに詳細に考察されるように、他の例示的なエピトープ変異体の核酸配列を配列番号８４〜１１３に示す。
【表７−１】
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【表７−２】
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【表７−３】
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【表７−４】
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【表７−５】
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【表７−６】
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【表７−７】
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【表７−８】
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【０２１４】
個々の構築物の連結を、並行してＢＬ２１ゴールド（ＤＥ３）に形質転換し、各形質転換からの８つの単一コロニーを拾い上げ、カルベニシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地中の９６ウェルプレート中で一晩増殖させた。Ｗ４２７ＮＮＫライブラリーのスクリーニングについて、上記に記載されるように各変異体の８つの個々のクローンのスクリーニングを行い、図４Ａ〜Ｅに見られるように、潜在的なまれな異常値を排除した後の平均としてアッセイ値を報告した（８つの総クローンのうちのわずか１つ、典型的には、クローニングされた合成ＤＮＡ内への挿入または突然変異を伴わずに、クローンから生じる）。野生型ＮｉｃＡ２酵素の活性の≧９０％のアッセイ値を有する５つの変異体が同定され、これら５つの変異体（Ｉ２６２Ｔ、Ｉ２６２Ｓ、Ｉ２６２Ａ、Ｉ２６２Ｔ＆Ａ２６４Ｌ、およびＩ２６２Ｔ＆Ｎ２６３Ｒ、図４を参照のこと）は、野生型と類似の酵素活性を有し、インシリコ予測に基づいて、免疫原性の可能性がより低いと予測される。
【０２１５】
表３に記載の４つの他のエピトープ中の突然変異に基づく変異体を調製し、上記に記載されるように評価した。エピトープＢについては、制限酵素ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化された合成二本鎖ＤＮＡ断片（配列番号８４〜９３、表７）を、エピトープ２については、ＳａｃＩＩ−ＣｌａＩで消化されたＤＮＡ断片（配列番号９４〜１０３、表７）を、エピトープ３については、ＳａｃＩＩ−ＣｌａＩで切断されたＤＮＡ断片（配列番号１０２〜１１３、表７）を、およびエピトープ４については、ＣｌａＩ−ＸｈｏＩで切断されたＤＮＡ断片（配列番号１１４〜１２３、表７）を、野生型ＮｉｃＡ２（配列番号１）の発現のために使用される発現プラスミド中の対応する独自の部位にクローニングすることによって、変異体を作成した。各連結および形質転換からの８つのランダムコロニーを上記に記載されるように試験した。図４Ａ〜Ｅに見られるように、それぞれ、エピトープＢ、２、および３からの野生型ＮｉｃＡ２酵素の活性の≧９０％のアッセイ値を有する、２、４、および７つの変異体を同定し、これらの変異体（Ｌ７４Ｎ＆Ｙ７７Ｒ、Ｒ７８Ｑ、Ｖ３０４Ａ＆Ｍ３０６Ｑ、Ｖ３９４Ａ、Ｖ３０４Ｔ＆Ｍ３０６Ｉ、Ｍ３０６Ｉ＆Ｌ３１０Ｒ、Ｌ３７４Ｑ＆Ｉ３７７Ｓ、Ｌ３７４Ａ＆Ｉ３７７Ａ、Ｌ３７４Ｎ＆Ｉ３８２Ｑ、Ｉ３７７Ａ＆Ｉ３８２Ｔ、Ｉ３７７ＴおよびＩ３８２Ｔ、Ｉ３７７Ｔ、およびＬ３７４Ｎ＆Ａ３８３Ｑ、図４を参照のこと）が、野生型と同様の酵素活性を有し、インシリコ予測に基づいて、より低い免疫原性の可能性を有すると予測される。興味深いことに、エピトープ４について提案された変異体のうちのいずれも、野生型ＮｉｃＡ２と比較して４０％を超える活性を示さなかった（図４Ｄを参照のこと）。この実施例において同定された突然変異（各エピトープから１つの突然変異）は、ｄ５０Ｗ４２７Ｑ骨格に導入され得るか、または表５に記載される他の同定された単一変異変異体のうちのいずれか、もしくは表５に列挙される突然変異の組み合わせから生じる任意の数の突然変異と組み合わされて、野生型ＮｉｃＡ２以上の良好な酵素活性を有する単一の脱免疫化酵素変異体を生成し得る。
【０２１６】
ＴＡＴリーダー配列内の最初のエピトープの欠失を組み合わせ、図４に同定された変異体を使用してエピトープ１を変異させ、かつ活性増強突然変異Ｗ４２７Ｑ：ＮｉｃＡ２Δ５０Ｗ４２７Ｑ、Ｉ２６２Ａ（配列番号６２）およびＮｉｃＡ２Δ５０Ｗ４２７Ｑ、Ｉ２６２Ｔ、Ｎ２６３Ｒ（配列番号６３）を含む、２つの変異体を作成した。これらの変異体を精製し、上記に記載されるようにＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄアッセイにおいて酵素活性を評価した。表４に見られるように、両方の変異体が、免疫原性を低下させる可能性がある変化を有するにもかかわらず、野生型を超える活性の増加を有する。
【０２１７】
実施例２−ＮｉｃＡ２  ＭＨＣＩＩエピトープの同定
８つの最も一般的なＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子（Ｃａｎｔｏｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  １０８：１２７２−１２７７（２０１１）；ＤＲＢ１＊０１０１、ＤＲＢ１＊１５０１、ＤＲＢ１＊１３０１、ＤＲＢ１＊１１０１、ＤＲＢ１＊０８０１、ＤＲＢ１＊０７０１、ＤＲＢ１＊０４０１、およびＤＲＢ１＊０３０１）に基づいて、ＮｉｃＡ２  ＭＨＣＩＩエピトープのインシリコ検索を行った。免疫エピトープデータベース（Ｖｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，４３：Ｄ４０５−Ｄ４１２（２０１５））および百分位数コンセンサスランク法を使用して検索を行い、ＮｉｃＡ２の予測される免疫原性の可能性を評価した。重なり合っている各１５量体ＮｉｃＡ２ペプチドについての百分位数コンセンサススコアを、８つすべてのＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子にわたって平均した。次に、全体的な平均化結合スコアと比較して、ＭＨＣＩＩへのより厳密に予測された結合において、＞１の標準偏差であったすべてのＮｉｃＡ２配列を選択することによって、ＮｉｃＡ２の免疫原性の可能性を判定した。この方法は、免疫原性が高いと予測される、配列番号１の残基１０〜３２、６８〜９４、１８９〜２２５、２４８〜２８５、２９６〜３２７、３３６〜３９１、および４３５〜４５９を反映するＮｉｃＡ２配列の４５％にわたって、８つの連続した配列を明らかにした（表１に灰色で強調表示される）。
【０２１８】
ＤＲＢ１＊０４０１対立遺伝子のみを使用したより狭い検索をインシリコで行った。この検索により、表１の配列番号１に下線を引いた６つの最高ランクの免疫原性Ｔ細胞エピトープが得られた。
【０２１９】
実施例３−ニコチン分解酵素のＰＥＧ化
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をＮｉｃＡ２ならびにＮＯＸおよび本開示されるＮＯＸ変異体などの他のニコチン分解酵素に接合するためのプロトコルを開発し、活性および半減期に対するＰＥＧ化の効果を判定するための実験を行った。
【０２２０】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、モル過剰のＰＥＧ化試薬およびＰＥＧ鎖長が増加するにつれて、ＰＥＧ化度が増加することを示した。５ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で、≧２時間、氷上でｐＨ７．６の１００ｍＭのＮａ３ＰＯ４中の７〜２０倍のモル過剰の１０もしくは２０ｋＤａのＮＨＳ−ＰＥＧ試薬（Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＭＥ−１００ＴＳもしくはＭＥ−２００ＴＳ、ＮＯＦ  Ａｍｅｒｉｃａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して、野生型（ｗｔ）ＮｉｃＡ２のランダムＰＥＧ化を行った。５０ｋＤａの分画を有するＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５遠心フィルターユニットを使用して、未接合のＰＥＧ試薬の排除を行った。２μｇのタンパク質に対応する試料を、ＭＯＰＳランニング緩衝液中で泳動するＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに装荷し、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ  ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して染色した。図５に見られるように、ＰＥＧ化度は、ＰＥＧ化試薬の過剰モル比を制御することによって制御することができた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって残留未接合タンパク質が検出されなかった調製物ＮｉｃＡ２−ＰＥＧ１、−ＰＥＧ２、および−ＰＥＧ３を、さらなる分析のために選択した。
【０２２１】
ＰＥＧ化がＮｉｃＡ２の薬物動態（ＰＫ）特性を増強し得るかどうかを判定するために、血清濃度を、ラットへの静脈内（ｉ．ｖ．）投与後の時間の関数として判定した（５ｍｇ／ｍＬ、Ｎ＝４、２Ｍ＋２Ｆ）。これらの実験からのデータを図６に示す。簡単に言うと、ＭａｘｉＳｏｒｐ  ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）を、抗Ｈｉｓタグ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で一晩コーティングし、これは、ＮｉｃＡ２およびＰＥＧ化ＮｉｃＡ２タンパク質上のＣ末端Ｈｉｓタグに結合することができた。プレートを、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の１％の脱脂粉乳（ＮＦＤＭ）で約１時間ブロッキングした。ＰＢＳ＋０．１％のＴｗｅｅｎ−２０中の１％のＮＦＤＭ中のＮｉｃＡ２およびＮｉｃＡ２−ＰＥＧ１−３標準および血清試料の希釈物をプレートに添加し、室温で２時間インキュベートした。未結合物質を洗い流した後（すべての洗浄工程をＰＢＳ＋０．１％のＴｗｅｅｎ−２０中で行った）、ウサギ抗ＮｉｃＡ２ポリクローナル一次検出抗体を、１時間のインキュベーションのためにウェルに添加した。洗浄工程に続いて、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）接合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｆｃ）（ＫＰＬ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を添加した。プレートを洗浄し、残っている結合複合体を、ＴＭＢ基質（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン、ＫＰＬ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）で検出した。いったん酸で停止されると、プレートを分光光度計で４５０ｎｍで読み取り、データをＳｏｆｔＭａｘ（登録商標）Ｐｒｏ、バージョン５．４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で分析した。
【０２２２】
ＰＥＧ化によりＮｉｃＡ２上のエピトープがマスキングされるかどうかを判定するために、追加の実験を行った。ＰＥＧ化されていないか、またはＰＥＧ化されたＮｉｃＡ２の調製物のＰＢＳ中での連続希釈物を、上記に記載されるＰＫ実験における血清濃度の測定に使用されるものと同じサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイで試験し（図６）、信号（Ａ４５０）を、濃度の関数としてプロットした。ＰＥＧ化度（ＰＥＧ化されていない分子と比較して１．０のＡ４５０を得るために必要とされる約１０００倍高い濃度のＮｉｃＡ２−ＰＥＧ２および−ＰＥＧ３）の増加と共に、アッセイ感度が劇的に低下し、検出抗体試薬によって認識されるエピトープが、ＰＥＧ化された分子においてより接近しにくいことを示す。これらの結果を図７に示す。
【０２２３】
免疫原性の遺伝子組み換えＨＬＡ−ＤＲ４マウスモデルにおいて、ＰＥＧ化はＮｉｃＡ２特異的抗体の力価を減少させることが示された。具体的には、ヒトＤＲ４遺伝子組み換えマウスにおけるフロイント不完全アジュバントにおける皮下（ｓ．ｃ．）注射の１０日後のＮｉｃＡ２特異的抗体力価の減少（Ｎ＝６、３Ｍ＋３Ｆ、Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を調べた。このマウスモデルは、ヒトＨＬＡ−ＤＲＡおよびＨＬＡ−ＤＲＢ＊０４０１（ＤＲ４スーパータイプの代表）の抗原結合ドメインを有するハイブリッドＭＨＣクラスＩＩ分子を保有し、内因性マウスＭＨＣクラスＩＩ分子を発現しない。力価を、ＮｉｃＡ２コーティングプレートを使用したＥＬＩＳＡにおいてＯＤ４５０＝０．５を達成するための血清希釈度として定義し、ヤギα−マウスＩｇＧ−γ−ＨＲＰによって検出した。試験された最低血清希釈度は５０倍であった（検出限界（ＬＯＤ）、図８に破線で示す）。ＮｉｃＡ２のＰＥＧ化は、遺伝子組み換えＤＲ４マウスにおいて平均ＮｉｃＡ２特異的抗体力価の有意な≧１０倍の減少をもたらし（図８、それぞれＮｉｃＡ２−ＰＥＧ１、−ＰＥＧ２、および−ＰＥＧ３群からの４、２、および２匹の動物が、ＬＯＤ未満の力価を有した）、これは、ＰＥＧ化変異体が臨床設定においてより低い免疫原性を示し得ることを示している。
【０２２４】
図９に示されるように、ＰＥＧ化は、ＮｉｃＡ２への曝露によって媒介されるヒトＴ細胞増殖応答およびサイトカインＴＮＦγ放出を弱めることも観察された。ＮｉｃＡ２のＰＥＧ化は、平均Ｔ細胞増殖刺激指数の有意な減少（図９、左パネル）ならびにＩＦＮγ分泌レベルの減少（図９、右パネル）をもたらした（５人の健康なボランティアからの独立した実験）。陽性対照：フィトヘマアグルチニン（ＰＨＡ）。ベースライン応答（ＰＢＭＣ）と比較した、３つの試験濃度でのＮｉｃＡ２およびＮｉｃＡ２−ＰＥＧ２についての、Ｔ細胞増殖応答刺激指数（ＳＩ、３Ｈ−チミジン取り込みによって測定される）（左）およびＩＦＮγ分泌レベルの増加倍数（フローサイトメトリーおよびＣｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（右）によって測定される）について、５つの独立した実験についての試験結果を示す。３≧（破線）の増加は、有意な増加および肯定的な反応と見なされる。
【０２２５】
図１０に示されるように、ＰＥＧ化酵素は血清中で完全なニコチン分解活性を保持していることも示された。３７℃で予めインキュベートされた４０ｎｇ／ｍＬのＳ−ニコチン（２５０ｎＭ、これは典型的な喫煙者において観察される血漿レベルに等しい）を含有するラット血清中に、野生型ＮｉｃＡ２またはＮｉｃＡ２−ＰＥＧ２を、０．０７５ｍｇ／ｍＬの最終濃度まで添加した。試料を様々な時点で回収し、直ちに、メタノールの添加および急速混合によって、酵素活性をクエンチした。残留ニコチンレベルを、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）によって判定した。ＧＣアッセイのＬＯＤは、破線によって示される２ｎｇ／ｍＬであった。ＰＥＧ化は、ニコチンを分解するＮｉｃＡ２の能力を妨げるとは思われなかった。
【０２２６】
実施例４−血清中のニコチン分解活性
アッセイ緩衝液およびＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄアッセイの高い（１０μＭ）ニコチン濃度（実施例１で考察されている、例えば、表４および５を参照のこと）だけでなく、典型的な喫煙者に遭遇したものとより関連性のある血清濃度でも活性が改善されたことを確認するために、Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄアッセイ（ＮｉｃＡ２Ａ１０７Ｒ）からの例示的な代表的変異体を、緩衝液ではなく血清を利用するアッセイ（図１０に示されるデータを得るために使用されるものと同じアッセイ）で評価した。
【０２２７】
簡単に言うと、４０／ｎｇ／ｍｌのＳ−（−）−ニコチン（２５０ｎＭ）を含有するラット血清中に、０．０７５ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで、ＮｉｃＡ２Ａ１０７Ｒを添加した。図１１に見られるように、変異型ＮｉｃＡ２Ａ１０７Ｒは、喫煙者に見られるであろう血清濃度で、野生型ＮｉｃＡ２と比較したこれらの条件下でのニコチン分解活性の増加を有する。
【０２２８】
実施例５−ニコチン中毒の治療
ｂａｌｂ／ｃマウスにおける最大致死量以下のニコチン用量は、腹腔内に２ｍｇ／ｋｇであると判定された。ニコチンの作用は用量依存的であり、鎮静作用、挙尾、震え、頻呼吸、背湾姿勢、急激な脚の動き、暴走、立ち直り反応の喪失、および間代性／強直性発作を含んだ。この実験では、本開示される酵素変異体がニコチン中毒または毒性を治療することができることを示すために、野生型ＮｉｃＡ２を概念実証として使用した。
【０２２９】
７〜８週齢のｂａｌｂ／ｃマウス（各群についてＮ＝５）を、７７５ｍｇ／ｋｇの野生型ＮｉｃＡ２または陰性対照（両方ともｉ．ｖ．）で事前治療した。２ｍｇ／ｋｇの致死量以下の用量でのニコチン投与の１５分前。５分かけて、発作およびニコチン中毒または毒性の表現型の徴候について、マウスをモニターし、表８の基準に従ってスコア付けし、ここで、３未満のスコアは発作がなかったことを示す。４または５のスコアを有する動物の割合を判定することによって、発作に対する感受性を演算した。
【表８】
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【０２３０】
下記の表９に示されるように、未治療のマウスはすべて重度の発作を示したが、ＮｉｃＡ２で事前治療されたマウスはいずれも発作を示さなかった。したがって、これらの結果は、本開示されるニコチン分解酵素変異体を使用して、ニコチン中毒を治療することができることを示している。
【表９】
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【０２３１】
より低用量の野生型ＮｉｃＡ２（７０ｍｇ／ｋｇおよび１４０ｍｇ／ｋｇ）を使用したラット発作モデル（ラットはマウスよりもニコチンに対する耐性が高いので、腹腔内へのチャレンジ用量の４ｍｇ／ｋｇのニコチンを使用する）における同様の実験は、有効ではなかった。したがって、酵素の用量は、有効な治療を提供するために重要であり得る。
【０２３２】
マウス実験で首尾よく使用されている７７５ｍｇ／ｋｇの用量は、ヒトにとって実用的な用量ではない。しかしながら、上記に示されるように、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、野生型酵素よりも高いニコチン分解活性を有する。したがって、本明細書に開示される酵素変異体は、ヒトにおける使用に好適な用量でニコチン中毒に対して有効であると考えられる。
【０２３３】
実施例６−ニコチン嗜癖の治療および／または禁煙の促進
この実施例は、本明細書に記載される変異体を使用して、ヒト成人におけるニコチン嗜癖を治療する方法および／または禁煙を促進する方法を例示する。
【０２３４】
タバコを定期的に喫煙するが中止したい成人のヒト対象に、ニコチン分解酵素変異体（例えば、ＮｉｃＡ２Δ５０Ｗ４２７Ｑ、配列番号５、またはその長時間作用型）を含む治療有効量の医薬組成物を経口投与するか、または静脈内もしくは皮下注射によって投与する。対象は、血漿中を循環するニコチンレベル、ならびに頭痛、過敏性、不安、および不眠などのニコチン離脱に関連する徴候および症状の存在および／または重症度、ならびに所与の日に喫煙したタバコの数について評価される。対象は、血漿中を循環するニコチンレベルが標的（減少）レベルに到達するまで、および／またはニコチン離脱の１つ以上の徴候／症状が減少、改善、もしくは排除されるまで、および／または対象がニコチン製品の消費レベルを低下させるまで（例えば、１日当たりのタバコの喫煙量を減らす）、ならびに／または対象がニコチン製品の消費を中止するまで（例えば、喫煙をやめる）、反復投与で治療される。
【０２３５】
実施例７−ニコチン分解酵素変異体による小児患者の治療
この実施例は、小児患者におけるニコチン中毒の治療においてニコチン分解酵素変異体を使用する方法を例示する。
【０２３６】
ニコチンを摂取したことがある、またはその疑いがあることが知られている子供に、ニコチン分解酵素変異体を含む治療有効量の医薬組成物を、静脈内、筋肉内、または皮下注射によって投与する。子供は、発作、昏睡、息切れ、および心拍数の上昇を含むがこれらに限定されない、ニコチン中毒に関連する徴候および症状の存在および／または重症度について評価され、子供は、１つ以上の徴候／症状が減少、改善、または排除されるまで治療される。任意選択的に、徴候／症状が持続する場合、および／またはニコチンの血漿／脳内レベルが上昇したままである場合は、別の用量の医薬組成物を投与する。
＊  ＊  ＊  ＊  ＊
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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