(57)【要約】本発明は、概して、試料中のヒト葉酸受容体１を検出するための方法及びキットに関する。ヒト葉酸受容体１のペプチドが、さらに提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のヒト葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）を検出する方法であって、
（ａ）固体支持体と結合したイムノキャプチャ試薬を用いて前記葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）を捕捉することと、
（ｂ）前記固体支持体からＦＯＬＲ１を溶出することと、
（ｃ）前記溶出されたＦＯＬＲ１を消化することと、
（ｄ）前記消化されたＦＯＬＲ１に対して液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ／ＭＳ）の分析を実行することと、を含み、前記ＦＯＬＲ１が、少なくとも１つのシグネチャＦＯＬＲ１ペプチドのクロマトグラフィー分離及び質量分析応答をモニタリングすることにより検出される、前記方法。
【請求項２】
前記試料中の前記ＦＯＬＲ１のレベルが、前記ＬＣ／ＭＳの分析によって定量化される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試料中の前記ＦＯＬＲ１のレベルが、前記試料中の前記ＦＯＬＲ１のレベルをＦＯＬＲ１の基準レベルと比較することによって定量化される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記イムノキャプチャ試薬が、ＦＯＬＲ１と結合する抗体または抗原結合断片を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記抗体または抗原結合断片のＦＯＬＲ１との結合が、ＩＭＧＮ８５３のＦＯＬＲ１との結合によって競合的に阻害されない、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記抗体または抗原結合断片のＦＯＬＲ１との結合が、ｈｕＭｏｖ１９のＦＯＬＲ１との結合によって競合的に阻害されない、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記抗体または抗原結合断片のＦＯＬＲ１との結合が、第２の抗体または抗原結合断片のＦＯＬＲ１との結合によって競合的に阻害されず、前記第２の抗体または抗原結合断片が、配列番号５９の可変軽鎖（ＶＬ）相補性決定領域（ＣＤＲ）−１、配列番号６０のＶＬ  ＣＤＲ−２、配列番号６１のＶＬ  ＣＤＲ−３、配列番号６２の可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ−１、配列番号６４のＶＨ  ＣＤＲ−２、及び配列番号６５のＶＨ  ＣＤＲ−３を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記抗体または抗原結合断片のＦＯＬＲ１との結合が、第２の抗体または抗原結合断片のＦＯＬＲ１との結合によって競合的に阻害されず、前記第２の抗体または抗原結合断片が、配列番号５６の配列を有する可変重鎖（ＶＨ）、及び配列番号５７または配列番号５８の配列を有する可変軽鎖（ＶＬ）を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記抗体または抗原結合断片のＦＯＬＲ１との結合が、第２の抗体または抗原結合断片のＦＯＬＲ１との結合によって競合的に阻害されず、前記第２の抗体または抗原結合断片が、（ｉ）ＰＴＡ−１０７７２としてＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託されているプラスミドによってコードされる重鎖のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を含む重鎖、及び（ｉｉ）ＰＴＡ−１０７７４としてＡＴＣＣに寄託されているプラスミドによってコードされる軽鎖のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗体または抗原結合断片のＦＯＬＲ１との結合が、葉酸のＦＯＬＲ１との結合によって阻害されない、請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗体が、ｍｕＦＲ１−９である、請求項４に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体が、ｍｕＦＲ１−１３である、請求項４に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗体または抗原結合断片が、配列番号１の可変重鎖（ＶＨ）相補性決定領域（ＣＤＲ）−１、配列番号２のＶＨ  ＣＤＲ−２、配列番号３のＶＨ  ＣＤＲ−３、配列番号１３の可変軽鎖（ＶＬ）相補性決定領域（ＣＤＲ）−１、配列番号１４のＶＬ  ＣＤＲ−２、及び配列番号１５のＶＬ  ＣＤＲ−３を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗体または抗原結合断片が、配列番号４の可変重鎖（ＶＨ）相補性決定領域（ＣＤＲ）−１、配列番号５のＶＨ  ＣＤＲ−２、配列番号６のＶＨ  ＣＤＲ−３、配列番号１６の可変軽鎖（ＶＬ）相補性決定領域（ＣＤＲ）−１、配列番号１７のＶＬ  ＣＤＲ−２、及び配列番号１８のＶＬ  ＣＤＲ−３を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗体または抗原結合断片が、配列番号２５の配列と少なくとも９０％の同一性を有する可変重鎖（ＶＨ）、及び配列番号２９の配列と少なくとも９０％の同一性を有する可変軽鎖（ＶＬ）を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗体または抗原結合断片が、配列番号２５の配列と少なくとも９５％の同一性を有する可変重鎖（ＶＨ）、及び配列番号２９の配列と少なくとも９５％の同一性を有する可変軽鎖（ＶＬ）を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗体または抗原結合断片が、配列番号２６の配列と少なくとも９０％の同一性を有する可変重鎖（ＶＨ）、及び配列番号３０の配列と少なくとも９０％の同一性を有する可変軽鎖（ＶＬ）を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗体または抗原結合断片が、配列番号２６の配列と少なくとも９５％の同一性を有する可変重鎖（ＶＨ）、及び配列番号３０の配列と少なくとも９５％の同一性を有する可変軽鎖（ＶＬ）を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗体または抗原結合断片が、配列番号２５の配列を有する可変重鎖（ＶＨ）、及び配列番号２９の配列を有する可変軽鎖（ＶＬ）を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗体または抗原結合断片が、配列番号２６の配列を有する可変重鎖（ＶＨ）、及び配列番号３０の配列を有する可変軽鎖（ＶＬ）を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗体または抗原結合断片が、配列番号３３の配列を有する重鎖、及び配列番号３７の配列を有する軽鎖を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項２２】
前記抗体または抗原結合断片が、配列番号３４の配列を有する重鎖、及び配列番号３８の配列を有する軽鎖を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項２３】
前記抗体または抗原結合断片が、約１．０ｎＭ〜約１０ｎＭのＫｄでヒトＦＯＬＲ１と結合する、請求項４に記載の方法。
【請求項２４】
前記抗体または抗原結合断片が、約０．５ｎＭ〜約５ｎＭのＫｄでヒトＦＯＬＲ１と結合する、請求項４に記載の方法。
【請求項２５】
前記固体支持体が、質量分析イムノアッセイ（ＭＳＩＡ）マイクロカラムを含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記固体支持体が、磁気ビーズを含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
少なくとも１回の洗浄ステップが、前記固体支持体からＦＯＬＲ１を溶出する前に実行される、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
２回以上の洗浄ステップが、前記固体支持体からＦＯＬＲ１を溶出する前に実行される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記洗浄ステップが、前記固体支持体と結合した前記ＦＯＬＲ１を洗浄緩衝液、塩溶液、及び洗浄剤と接触させることを含む、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
ＦＯＬＲ１が、酸性溶液を用いて前記固体支持体から溶出される、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＦＯＬＲ１が、前記ＦＯＬＲ１を消化する前に、還元及びアルキル化される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ＦＯＬＲ１が、トリプシン／Ｌｙｓ−Ｃで消化される、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＦＯＬＲ１を消化することにより、配列番号４２の配列を含むペプチドが生成される、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＦＯＬＲ１を消化することにより、配列番号４３の配列を含むペプチドが生成される、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＦＯＬＲ１を消化することにより、配列番号４４の配列を含むペプチドが生成される、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＦＯＬＲ１を消化することにより、配列番号４５の配列を含むペプチドが生成される、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
ＦＯＬＲ１の少なくとも２つのシグネチャペプチドが選択され、前記ＬＣ／ＭＳの分析ステップでモニタリングされる、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
ＦＯＬＲ１の少なくとも３つのシグネチャペプチドが選択され、前記ＬＣ／ＭＳの分析ステップでモニタリングされる、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
ＦＯＬＲ１の少なくとも４つのシグネチャペプチドが選択され、前記ＬＣ／ＭＳの分析ステップでモニタリングされる、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記シグネチャペプチドが、
（ａ）配列番号４２の配列を含むペプチド、
（ｂ）配列番号４３の配列を含むペプチド、
（ｃ）配列番号４４の配列を含むペプチド、及び
（ｄ）配列番号４５の配列を含むペプチドを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記試料が、体液を含む、請求項１〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記体液が、血漿である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記体液が、血清である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記体液が、腹水である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
前記試料が、末梢血試料を含む、請求項１〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記試料が、がんを有する患者から取得される、請求項１〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記がんが、卵巣、脳、乳房、子宮、子宮内膜、膵臓、腎、肺癌、及び腹膜の癌からなる群から選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記がんが、卵巣癌である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
ＦＯＬＲ１を検出することが、前記試料中に存在するＩＭＧＮ８５３によって阻害されない、請求項１〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
ＦＯＬＲ１を検出することが、前記試料中に存在するｈｕＭｏｖ１９によって阻害されない、請求項１〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
ＦＯＬＲ１を検出することが、前記試料中に存在する抗体または抗原結合断片によって阻害されず、前記抗体または抗原結合断片が、配列番号５９の可変軽鎖（ＶＬ）相補性決定領域（ＣＤＲ）−１、配列番号６０のＶＬ  ＣＤＲ−２、配列番号６１のＶＬ  ＣＤＲ−３、配列番号６２の可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ−１、配列番号６４のＶＨ  ＣＤＲ−２、及び配列番号６５のＶＨ  ＣＤＲ−３を含む、請求項１〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
ＦＯＬＲ１を検出することが、前記試料中に存在する抗体または抗原結合断片によって阻害されず、前記抗体または抗原結合断片が、配列番号５６の配列を有する可変重鎖（ＶＨ）、及び配列番号５７または配列番号５８の配列を有する可変軽鎖（ＶＬ）を含む、請求項１〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
ＦＯＬＲ１を検出することが、前記試料中に存在する抗体または抗原結合断片によって阻害されず、前記抗体または抗原結合断片が、（ｉ）ＰＴＡ−１０７７２としてＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託されているプラスミドによってコードされる重鎖のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を含む重鎖、及び（ｉｉ）ＰＴＡ−１０７７４としてＡＴＣＣに寄託されているプラスミドによってコードされる軽鎖のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
ＦＯＬＲ１を検出することが、前記試料中に存在する葉酸によって阻害されない、請求項１〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
試料中の少なくとも０．５ｎｇ／ｍＬのＦＯＬＲ１を検出することができる、請求項１〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
試料中の少なくとも０．３ｎｇ／ｍＬのＦＯＬＲ１を検出することができる、請求項１〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
試料中の少なくとも０．２５ｎｇ／ｍＬのＦＯＬＲ１を検出することができる、請求項１〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
信号対雑音比が、少なくとも５である、請求項１〜５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
信号対雑音比が、少なくとも１０である、請求項１〜５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
ＦＯＬＲ１が、脱落ＦＯＬＲ１である、請求項１〜５９のいずれか１項記載の方法。
【請求項６１】
配列番号４２の配列からなる、ペプチド。
【請求項６２】
配列番号４３の配列からなる、ペプチド。
【請求項６３】
配列番号４４の配列からなる、ペプチド。
【請求項６４】
配列番号４５の配列からなる、ペプチド。
【請求項６５】
ＦＯＬＲ１と結合するイムノキャプチャ試薬、消化試薬、ならびに
（ａ）配列番号４２の配列を含むペプチド、
（ｂ）配列番号４３の配列を含むペプチド、
（ｃ）配列番号４４の配列を含むペプチド、及び
（ｄ）配列番号４５の配列を含むペプチドからなる群から選択される少なくとも１つのペプチドを含む、キット。
【請求項６６】
前記イムノキャプチャ試薬が、ＦＯＬＲ１と結合する抗体または抗原結合断片を含む、請求項６５に記載のキット。
【請求項６７】
前記抗体が、ｍｕＦＲ１−９である、請求項６６に記載のキット。
【請求項６８】
前記抗体が、ｍｕＦＲ１−１３である、請求項６６に記載のキット。
【請求項６９】
前記抗体または抗原結合断片が、配列番号１の可変重鎖（ＶＨ）相補性決定領域（ＣＤＲ）−１、配列番号２のＶＨ  ＣＤＲ−２、配列番号３のＶＨ  ＣＤＲ−３、配列番号１３の可変軽鎖（ＶＬ）相補性決定領域（ＣＤＲ）−１、配列番号１４のＶＬ  ＣＤＲ−２、及び配列番号１５のＶＬ  ＣＤＲ−３を含む、請求項６６に記載のキット。
【請求項７０】
前記抗体または抗原結合断片が、配列番号４の可変重鎖（ＶＨ）相補性決定領域（ＣＤＲ）−１、配列番号５のＶＨ  ＣＤＲ−２、配列番号６のＶＨ  ＣＤＲ−３、配列番号１６の可変軽鎖（ＶＬ）相補性決定領域（ＣＤＲ）−１、配列番号１７のＶＬ  ＣＤＲ−２、及び配列番号１８のＶＬ  ＣＤＲ−３を含む、請求６６に記載のキット。
【請求項７１】
前記抗体または抗原結合断片が、配列番号２５の配列と少なくとも９０％の同一性を有する可変重鎖（ＶＨ）、及び配列番号２９の配列と少なくとも９０％の同一性を有する可変軽鎖（ＶＬ）を含む、請求項６６に記載のキット。
【請求項７２】
前記抗体または抗原結合断片が、配列番号２５の配列と少なくとも９５％の同一性を有する可変重鎖（ＶＨ）、及び配列番号２９の配列と少なくとも９５％の同一性を有する可変軽鎖（ＶＬ）を含む、請求項６６に記載のキット。
【請求項７３】
前記抗体または抗原結合断片が、配列番号２６の配列と少なくとも９０％の同一性を有する可変重鎖（ＶＨ）、及び配列番号３０の配列と少なくとも９０％の同一性を有する可変軽鎖（ＶＬ）を含む、請求項６６に記載のキット。
【請求項７４】
前記抗体または抗原結合断片が、配列番号２６の配列と少なくとも９５％の同一性を有する可変重鎖（ＶＨ）、及び配列番号３０の配列と少なくとも９５％の同一性を有する可変軽鎖（ＶＬ）を含む、請求項６６に記載のキット。
【請求項７５】
前記抗体または抗原結合断片が、配列番号２５の配列を有する可変重鎖（ＶＨ）、及び配列番号２９の配列を有する可変軽鎖（ＶＬ）を含む、請求項６６に記載のキット。
【請求項７６】
前記抗体または抗原結合断片が、配列番号２６の配列を有する可変重鎖（ＶＨ）、及び配列番号３０の配列を有する可変軽鎖（ＶＬ）を含む、請求項６６に記載のキット。
【請求項７７】
前記抗体または抗原結合断片が、配列番号３３の配列を有する重鎖、及び配列番号３７の配列を有する軽鎖を含む、請求項６６に記載のキット。
【請求項７８】
前記抗体または抗原結合断片が、配列番号３４の配列を有する重鎖、及び配列番号３８の配列を有する軽鎖を含む、請求項６６に記載のキット。
【請求項７９】
前記抗体または抗原結合断片が、約１．０ｎＭ〜約１０ｎＭのＫｄでヒトＦＯＬＲ１と結合する、請求項６６に記載のキット。
【請求項８０】
前記抗体または抗原結合断片が、約０．５ｎＭ〜約５ｎＭのＫｄでヒトＦＯＬＲ１と結合する、請求項６６に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野は、概して、試料中のヒト葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）を検出するための方法及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
がんは、先進国における主要な死因の１つであり、米国だけで年間１００万人以上が、がんと診断され、５０万人が死亡する。全体として、３人に１人以上が生涯に何らかの形態のがんを発症するであろうと推定される。２００以上の異なる種類のがんが存在し、乳房、肺、結腸直腸、及び前立腺の４つが、全ての新規症例の半分を超えて占める（Ｊｅｍａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，ＣａｎｃｅｒＪ．Ｃｌｉｎ．５３：５−２６）。
【０００３】
葉酸受容体アルファまたは葉酸結合タンパク質としても知られる葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）は、細胞の細胞膜上に発現するＮグリコシル化タンパク質である。ＦＯＬＲ１は、葉酸及びいくつかの還元葉酸誘導体に対して高い親和性を有する。ＦＯＬＲ１は、細胞内へ生理的な葉酸である、５−メチルテトラヒドロ葉酸の送達を仲介する。
【０００４】
ＦＯＬＲ１は、大多数の卵巣がん、ならびに多くの子宮、子宮内膜、膵臓、腎、肺、及び乳癌で過剰発現しているが、正常組織でのＦＯＬＲ１の発現は、腎近位尿細管内の上皮細胞の頂端膜、肺の肺胞肺細胞、膀胱、精巣、脈絡叢、及び甲状腺に制限される（Ｗｅｉｔｍａｎ  ＳＤ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５２：３３９６−３４０１（１９９２）；Ａｎｔｏｎｙ  ＡＣ，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｎｕｔｒ  １６：５０１−５２１（１９９６）；Ｋａｌｌｉ  ＫＲ，ｅｔ  ａｌ．Ｇｙｎｅｃｏｌ  Ｏｎｃｏｌ  １０８：６１９−６２６（２００８））。ＦＯＬＲ１のこの発現パターンは、ＦＯＬＲ１に向けられるがん治療の所望される標的となる。
【０００５】
卵巣癌は通常、進行期まで無症状であるため、多くの場合、後期に診断され、現在利用可能な手法である、通常の外科的減量術後に化学療法剤で治療した場合に予後不良を有する（ｖｏｎ  Ｇｒｕｅｎｉｇｅｎ  Ｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  １１２：２２２１−２２２７（２００８）；Ａｙｈａｎ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  １９６：８１  ｅ８１−８６（２００７）；Ｈａｒｒｙ  ＶＮ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  Ｓｕｒｖ  ６４：５４８−５６０（２００９））。したがって、卵巣癌のための、より効果的な治療法に対する明らかに満たされていない医学的ニーズが存在する。
【０００６】
脱落ＦＯＬＲ１を検出するために使用される以前のアッセイのいくつかは、ＦＯＬＲ１に対して十分に特異的でない。例えば、いくつかのアッセイは、ＦＯＬＲ１及び他の葉酸受容体ファミリーメンバー（ＦＯＬＲ２、３、及び４）を識別しないか、または総ＦＢＰ（葉酸結合タンパク質）についての値を報告しない。さらに、いくつかのアッセイは、受容体から葉酸を解離するために、ヒトの試料（例えば、血漿）を軽酸洗浄ステップで前処理する必要がある。いくつかのアッセイ結果は、抗体療法及び診断用抗体間の競合効果により、不正確性をさらに有し得る。さらに、多くの市販キットは、従来のそれらの試薬、及びそれらのロット間の安定性の両方で信頼性がない。これらのキットの評価は、非常に複雑な結果を与えており、研究用途のみを目的としている。多くの場合に、「マトリックス効果」による偽陽性の可能性を低減するために、分析前にヒト試料を事前に希釈する必要がある。さらに、多くの現在のアッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡ系アッセイは、生理学的レベルでの脱落ＦＯＬＲ１における差異間を識別するのに十分な感度を提供せず、偽陽性の結果によって制限される。したがって、患者の試料中のＦＯＬＲ１を検出するための高感度、及び正確な方法についての明らかな必要性が存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｊｅｍａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，ＣａｎｃｅｒＪ．Ｃｌｉｎ．５３：５−２６
【非特許文献２】Ｗｅｉｔｍａｎ  ＳＤ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５２：３３９６−３４０１（１９９２）
【非特許文献３】Ａｎｔｏｎｙ  ＡＣ，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｎｕｔｒ  １６：５０１−５２１（１９９６）
【非特許文献４】Ｋａｌｌｉ  ＫＲ，ｅｔ  ａｌ．Ｇｙｎｅｃｏｌ  Ｏｎｃｏｌ  １０８：６１９−６２６（２００８）
【非特許文献５】ｖｏｎ  Ｇｒｕｅｎｉｇｅｎ  Ｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  １１２：２２２１−２２２７（２００８）
【非特許文献６】Ａｙｈａｎ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  １９６：８１  ｅ８１−８６（２００７）
【非特許文献７】Ｈａｒｒｙ  ＶＮ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  Ｓｕｒｖ  ６４：５４８−５６０（２００９））
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、試料中のＦＯＬＲ１を検出するための方法を提供し、例えば、試料中のヒトＦＯＬＲ１のレベルを定量化するために使用できる。
【０００９】
一実施形態において、試料中のヒト葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）を検出するための方法は、（ａ）固体支持体と結合したイムノキャプチャ試薬を用いて該葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）を捕捉することと、（ｂ）固体支持体からＦＯＬＲ１を溶出することと、（ｃ）溶出されたＦＯＬＲ１を消化することと、（ｄ）消化されたＦＯＬＲ１に対して液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ／ＭＳ）の分析を実行することと、を含み、該ＦＯＬＲ１は、少なくとも１つのシグネチャＦＯＬＲ１ペプチドのクロマトグラフィー分離及び質量分析応答をモニタリングすることにより検出される。
【００１０】
一実施形態において、試料中のＦＯＬＲ１のレベルは、ＬＣ／ＭＳ分析によって定量化される。一実施形態において、試料中のＦＯＬＲ１のレベルは、試料中のＦＯＬＲ１のレベルをＦＯＬＲ１の基準レベルと比較することによって定量化される。
【００１１】
一実施形態において、イムノキャプチャ試薬は、ＦＯＬＲ１と結合する抗体または抗原結合断片を含む。一実施形態において、抗体または抗原結合断片のＦＯＬＲ１との結合は、ＩＭＧＮ８５３のＦＯＬＲ１との結合によって競合的に阻害されない。一実施形態において、抗体または抗原結合断片のＦＯＬＲ１との結合は、ｈｕＭｏｖ１９のＦＯＬＲ１との結合によって競合的に阻害されない。一実施形態において、抗体または抗原結合断片のＦＯＬＲ１との結合は、第２の抗体または抗原結合断片のＦＯＬＲ１との結合によって競合的に阻害されず、第２の抗体または抗原結合断片は、配列番号５９の可変軽鎖（ＶＬ）相補性決定領域（ＣＤＲ）−１、配列番号６０のＶＬ  ＣＤＲ−２、配列番号６１のＶＬ  ＣＤＲ−３、配列番号６２の可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ−１、配列番号６４のＶＨ  ＣＤＲ−２、及び配列番号６５のＶＨ  ＣＤＲ−３を含む。一実施形態において、抗体または抗原結合断片のＦＯＬＲ１との結合は、第２の抗体または抗原結合断片のＦＯＬＲ１との結合によって競合的に阻害されず、第２の抗体または抗原結合断片は、配列番号５６の配列を有する可変重鎖（ＶＨ）、及び配列番号５７または配列番号５８の配列を有する可変軽鎖（ＶＬ）を含む。一実施形態において、抗体または抗原結合断片のＦＯＬＲ１との結合は、第２の抗体または抗原結合断片のＦＯＬＲ１との結合によって競合的に阻害されず、第２の抗体または抗原結合断片は、（ｉ）ＰＴＡ−１０７７２としてＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託されているプラスミドによってコードされる重鎖のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を含む重鎖、及び（ｉｉ）ＰＴＡ−１０７７４としてＡＴＣＣに寄託されているプラスミドによってコードされる軽鎖のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。一実施形態において、抗体または抗原結合断片のＦＯＬＲ１との結合は、葉酸のＦＯＬＲ１との結合によって阻害されない。
【００１２】
一実施形態において、抗体は、ｍｕＦＲ１−９である。一実施形態において、抗体は、ｍｕＦＲ１−１３である。一実施形態において、抗体または抗原結合断片は、配列番号１の可変重鎖（ＶＨ）相補性決定領域（ＣＤＲ）−１、配列番号２のＶＨ  ＣＤＲ−２、配列番号３のＶＨ  ＣＤＲ−３、配列番号１３の可変軽鎖（ＶＬ）相補性決定領域（ＣＤＲ）−１、配列番号１４のＶＬ  ＣＤＲ−２、及び配列番号１５のＶＬ  ＣＤＲ−３を含む。一実施形態において、抗体または抗原結合断片は、配列番号４の可変重鎖（ＶＨ）相補性決定領域（ＣＤＲ）−１、配列番号５のＶＨ  ＣＤＲ−２、配列番号６のＶＨ  ＣＤＲ−３、配列番号１６の可変軽鎖（ＶＬ）相補性決定領域（ＣＤＲ）−１、配列番号１７のＶＬ  ＣＤＲ−２、及び配列番号１８のＶＬ  ＣＤＲ−３を含む。
【００１３】
一実施形態において、抗体または抗原結合断片は、配列番号２５の配列と少なくとも９０％の同一性を有する可変重鎖（ＶＨ）、及び配列番号２９の配列と少なくとも９０％の同一性を有する可変軽鎖（ＶＬ）を含む。一実施形態において、抗体または抗原結合断片は、配列番号２５の配列と少なくとも９５％の同一性を有する可変重鎖（ＶＨ）、及び配列番号２９の配列と少なくとも９５％の同一性を有する可変軽鎖（ＶＬ）を含む。一実施形態において、抗体または抗原結合断片は、配列番号２６の配列と少なくとも９０％の同一性を有する可変重鎖（ＶＨ）、及び配列番号３０の配列と少なくとも９０％の同一性を有する可変軽鎖（ＶＬ）を含む。一実施形態において、抗体または抗原結合断片は、配列番号２６の配列と少なくとも９５％の同一性を有する可変重鎖（ＶＨ）、及び配列番号３０の配列と少なくとも９５％の同一性を有する可変軽鎖（ＶＬ）を含む。
【００１４】
一実施形態において、抗体または抗原結合断片は、配列番号２５の配列を有する可変重鎖（ＶＨ）、及び配列番号２９の配列を有する可変軽鎖（ＶＬ）を含む。一実施形態において、抗体または抗原結合断片は、配列番号２６の配列を有する可変重鎖（ＶＨ）、及び配列番号３０の配列を有する可変軽鎖（ＶＬ）を含む。一実施形態において、抗体または抗原結合断片は、配列番号３３の配列を有する重鎖、及び配列番号３７の配列を有する軽鎖を含む。一実施形態において、抗体または抗原結合断片は、配列番号３４の配列を有する重鎖、及び配列番号３８の配列を有する軽鎖を含む。
【００１５】
一実施形態において、抗体または抗原結合断片は、約１．０ｎＭ〜約１０ｎＭのＫｄでヒトＦＯＬＲ１と結合する。一実施形態において、抗体または抗原結合断片は、約０．５ｎＭ〜約５ｎＭのＫｄでヒトＦＯＬＲ１と結合する。
【００１６】
一実施形態において、固体支持体は、質量分析イムノアッセイ（ＭＳＩＡ）マイクロカラムを含む。一実施形態において、固体支持体は、磁気ビーズを含む。
【００１７】
一実施形態において、少なくとも１回の洗浄ステップが、固体支持体からＦＯＬＲ１を溶出する前に実行される。一実施形態において、２回以上の洗浄ステップが、固体支持体からＦＯＬＲ１を溶出する前に実行される。一実施形態において、洗浄ステップは、固体支持体と結合したＦＯＬＲ１を洗浄緩衝液、塩溶液、及び洗浄剤と接触させることを含む。一実施形態において、ＦＯＬＲ１は、酸性溶液を用いて固体支持体から溶出される。
【００１８】
一実施形態において、ＦＯＬＲ１は、ＦＯＬＲ１を消化する前に、還元及びアルキル化される。一実施形態において、ＦＯＬＲ１は、トリプシン／Ｌｙｓ−Ｃで消化される。一実施形態において、ＦＯＬＲ１を消化することにより、配列番号４２の配列を含むペプチドが生成される。一実施形態において、ＦＯＬＲ１を消化することにより、配列番号４３の配列を含むペプチドが生成される。一実施形態において、ＦＯＬＲ１を消化することにより、配列番号４４の配列を含むペプチドが生成される。一実施形態において、ＦＯＬＲ１を消化することにより、配列番号４５の配列を含むペプチドが生成される。
【００１９】
一実施形態において、ＦＯＬＲ１の少なくとも２つのシグネチャペプチドが選択され、ＬＣ／ＭＳの分析ステップでモニタリングされる。一実施形態において、ＦＯＬＲ１の少なくとも３つのシグネチャペプチドが選択され、ＬＣ／ＭＳの分析ステップでモニタリングされる。一実施形態において、ＦＯＬＲ１の少なくとも４つのシグネチャペプチドが選択され、ＬＣ／ＭＳの分析ステップでモニタリングされる。
【００２０】
一実施形態において、シグネチャペプチドは、（ａ）配列番号４２の配列を含むペプチド、（ｂ）配列番号４３の配列を含むペプチド、（ｃ）配列番号４４の配列を含むペプチド、及び（ｄ）配列番号４５の配列を含むペプチドを含む。
【００２１】
一実施形態において、試料は、体液を含む。一実施形態において、体液は、血漿である。一実施形態において、体液は、血清である。一実施形態において、体液は、腹水である。
【００２２】
一実施形態において、試料は、末梢血試料を含む。
【００２３】
一実施形態において、試料は、がんを有する患者から取得される。一実施形態において、がんは、卵巣、脳、乳房、子宮、子宮内膜、膵臓、腎、肺癌、及び腹膜の癌からなる群から選択される。一実施形態において、がんは、卵巣癌である。一実施形態において、ＦＯＬＲ１を検出することは、試料中に存在するＩＭＧＮ８５３によって阻害されない。一実施形態において、ＦＯＬＲ１を検出することが、試料中に存在するｈｕＭｏｖ１９によって阻害されない。
【００２４】
一実施形態において、ＦＯＬＲ１を検出することが、試料中に存在する抗体または抗原結合断片によって阻害されず、該抗体または抗原結合断片は、配列番号５９の可変軽鎖（ＶＬ）相補性決定領域（ＣＤＲ）−１、配列番号６０のＶＬ  ＣＤＲ−２、配列番号６１のＶＬ  ＣＤＲ−３、配列番号６２の可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ−１、配列番号６４のＶＨ  ＣＤＲ−２、及び配列番号６５のＶＨ  ＣＤＲ−３を含む。一実施形態において、ＦＯＬＲ１を検出することが、試料中に存在する抗体または抗原結合断片によって阻害されず、該抗体または抗原結合断片は、配列番号５６の配列を有する可変重鎖（ＶＨ）、及び配列番号５７または配列番号５８の配列を有する可変軽鎖（ＶＬ）を含む。一実施形態において、ＦＯＬＲ１を検出することが、試料中に存在する抗体または抗原結合断片によって阻害されず、該抗体または抗原結合断片は、（ｉ）ＰＴＡ−１０７７２としてＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託されているプラスミドによってコードされる重鎖のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を含む重鎖、及び（ｉｉ）ＰＴＡ−１０７７４としてＡＴＣＣに寄託されているプラスミドによってコードされる軽鎖のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【００２５】
一実施形態において、ＦＯＬＲ１を検出することが、試料中に存在する葉酸によって阻害されない。
【００２６】
一実施形態において、方法は、試料中の少なくとも０．５ｎｇ／ｍＬのＦＯＬＲ１を検出することができる。一実施形態において、方法は、試料中の少なくとも０．３ｎｇ／ｍＬのＦＯＬＲ１を検出することができる。一実施形態において、方法は、試料中の少なくとも０．２５ｎｇ／ｍＬのＦＯＬＲ１を検出することができる。
【００２７】
一実施形態において、信号対雑音比は、少なくとも５である。一実施形態において、信号対雑音比は、少なくとも１０である。
【００２８】
一実施形態において、ＦＯＬＲ１は、脱落ＦＯＬＲ１である。
【００２９】
本発明は、ＦＯＬＲ１の新規ペプチドをさらに提供する。一実施形態において、ペプチドは、配列番号４２の配列からなる。一実施形態において、ペプチドは、配列番号４３の配列からなる。一実施形態において、ペプチドは、配列番号４４の配列からなる。一実施形態において、ペプチドは、配列番号４５の配列からなる。
【００３０】
本発明は、試料中のＦＯＬＲ１を検出するためのキットをさらに提供する。一実施形態において、キットは、ＦＯＬＲ１と結合するイムノキャプチャ試薬、消化試薬、ならびにａ）配列番号４２の配列を含むペプチド、ｂ）配列番号４３の配列を含むペプチド、ｃ）配列番号４４の配列を含むペプチド、及びｄ）配列番号４５の配列を含むペプチドからなる群から選択される少なくとも１つのペプチドを含む。
【００３１】
一実施形態において、イムノキャプチャ試薬は、ＦＯＬＲ１と結合する抗体または抗原結合断片を含む。一実施形態において、抗体は、ｍｕＦＲ１−９である。一実施形態において、抗体は、ｍｕＦＲ１−１３である。
【００３２】
一実施形態において、抗体または抗原結合断片は、配列番号１の可変重鎖（ＶＨ）相補性決定領域（ＣＤＲ）−１、配列番号２のＶＨ  ＣＤＲ−２、配列番号３のＶＨ  ＣＤＲ−３、配列番号１３の可変軽鎖（ＶＬ）相補性決定領域（ＣＤＲ）−１、配列番号１４のＶＬ  ＣＤＲ−２、及び配列番号１５のＶＬ  ＣＤＲ−３を含む。一実施形態において、抗体または抗原結合断片は、配列番号４の可変重鎖（ＶＨ）相補性決定領域（ＣＤＲ）−１、配列番号５のＶＨ  ＣＤＲ−２、配列番号６のＶＨ  ＣＤＲ−３、配列番号１６の可変軽鎖（ＶＬ）相補性決定領域（ＣＤＲ）−１、配列番号１７のＶＬ  ＣＤＲ−２、及び配列番号１８のＶＬ  ＣＤＲ−３を含む。
【００３３】
一実施形態において、抗体または抗原結合断片は、配列番号２５の配列と少なくとも９０％の同一性を有する可変重鎖（ＶＨ）、及び配列番号２９の配列と少なくとも９０％の同一性を有する可変軽鎖（ＶＬ）を含む。一実施形態において、抗体または抗原結合断片は、配列番号２５の配列と少なくとも９５％の同一性を有する可変重鎖（ＶＨ）、及び配列番号２９の配列と少なくとも９５％の同一性を有する可変軽鎖（ＶＬ）を含む。一実施形態において、抗体または抗原結合断片は、配列番号２６の配列と少なくとも９０％の同一性を有する可変重鎖（ＶＨ）、及び配列番号３０の配列と少なくとも９０％の同一性を有する可変軽鎖（ＶＬ）を含む。一実施形態において、抗体または抗原結合断片は、配列番号２６の配列と少なくとも９５％の同一性を有する可変重鎖（ＶＨ）、及び配列番号３０の配列と少なくとも９５％の同一性を有する可変軽鎖（ＶＬ）を含む。
【００３４】
一実施形態において、抗体または抗原結合断片は、配列番号２５の配列を有する可変重鎖（ＶＨ）、及び配列番号２９の配列を有する可変軽鎖（ＶＬ）を含む。一実施形態において、抗体または抗原結合断片は、配列番号２６の配列を有する可変重鎖（ＶＨ）、及び配列番号３０の配列を有する可変軽鎖（ＶＬ）を含む。
【００３５】
一実施形態において、抗体または抗原結合断片は、配列番号３３の配列を有する重鎖、及び配列番号３７の配列を有する軽鎖を含む。一実施形態において、抗体または抗原結合断片は、配列番号３４の配列を有する重鎖、及び配列番号３８の配列を有する軽鎖を含む。
【００３６】
一実施形態において、抗体または抗原結合断片は、約１．０ｎＭ〜約１０ｎＭのＫｄでヒトＦＯＬＲ１と結合する。一実施形態において、抗体または抗原結合断片は、約０．５ｎＭ〜約５ｎＭのＫｄでヒトＦＯＬＲ１と結合する。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】ＦＯＬＲ１イムノキャプチャ−ＬＣ／ＭＳアッセイの概略図を示す。
【図２】０．３ｎｇ／ｍＬでの代替マトリックスにおける低レベルの可溶性ＦＯＬＲ１を含む試料から抽出されたイオンクロマトグラムを示す。
【図３】正常なヒト血漿試料から抽出されたイオンクロマトグラムを示す。
【図４】増加された可溶性ＦＯＬＲ１を伴う患者の服用前試料から抽出されたイオンクロマトグラムを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本発明は、患者試料中のヒト葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）を検出する新規方法を提供する。ＦＯＬＲ１の最初のイムノキャプチャステップが実行され、それに続いて、捕捉されたＦＯＬＲ１のペプチドへの消化、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ／ＭＳ）を介したペプチドの定量分析が実行される。抗ＦＯＬＲ１活性剤（例えば、ＩＭＧＮ８５３などの抗体ｈｕＭｏｖ１９を含む活性剤）のＦＯＬＲ１との結合を競合的に阻害しない抗体は、本発明のイムノキャプチャステップにおいて有用である。抗ＦＯＬＲ１活性剤の結合を競合的に阻害しない抗体は、抗ＦＯＬＲ１活性剤を用いて治療された患者からの試料中のＦＯＬＲ１（例えば、脱落ＦＯＬＲ１）を捕捉するのに特に有用である。本発明の方法により産生されるＦＯＬＲ１のペプチドがさらに開示される。そのようなペプチドは、ＬＣ／ＭＳによる患者試料のＦＯＬＲ１レベルの検出において有用である。ＦＯＬＲ１と結合する薬剤及びＦＯＬＲ１ペプチドを含むキットがさらに提供される。
【００３９】
Ｉ．定義
本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語及び語句を以下に定義する。
【００４０】
本明細書で使用される「ヒト葉酸受容体１」、「ＦＯＬＲ１」、または「葉酸受容体アルファ（ＦＲ−α）」という用語は、特に明記しない限り、任意の天然のヒトＦＯＬＲ１を指す。したがって、これらの用語の全ては、本明細書に示されるタンパク質または核酸配列のいずれかを指すことができる。「ＦＯＬＲ１」という用語は、「全長」の非プロセス型ＦＯＬＲ１だけでなく、細胞内でプロセシングされたＦＯＬＲ１のいずれもの形態を包括する。この用語は、ＦＯＬＲ１の天然に発生するバリアント、例えばスプライスバリアント（ＦＯＬＲ２、ＦＯＬＲ３、またはＦＯＬＲ４を包括するそれらのバリアントを除く）、対立遺伝子バリアント、及びアイソフォームをさらに包括する。本明細書に記載されるＦＯＬＲ１ポリペプチドは、ヒト組織型または別の源からなどの様々な源から単離するか、または組換え法もしくは合成法によって調製することができる。ＦＯＬＲ１配列の例には、ＮＣＢＩ参照番号Ｐ１５３２８、ＮＰ＿００１０９２２４２．１、ＡＡＸ２９２６８．１、ＡＡＸ３７１１９．１、ＮＰ＿０５７９３７．１、及びＮＰ＿０５７９３６．１が含まれるが、これらに限定されない。ヒトＦＯＬＲ１配列は、以下のとおりである：
ＭＡＱＲＭＴＴＱＬＬＬＬＬＶＷＶＡＶＶＧＥＡＱＴＲＩＡＷＡＲＴＥＬＬＮＶＣＭＮＡＫＨＨＫＥＫＰＧＰＥＤＫＬＨＥＱＣＲＰＷＲＫＮＡＣＣＳＴＮＴＳＱＥＡＨＫＤＶＳＹＬＹＲＦＮＷＮＨＣＧＥＭＡＰＡＣＫＲＨＦＩＱＤＴＣＬＹＥＣＳＰＮＬＧＰＷＩＱＱＶＤＱＳＷＲＫＥＲＶＬＮＶＰＬＣＫＥＤＣＥＱＷＷＥＤＣＲＴＳＹＴＣＫＳＮＷＨＫＧＷＮＷＴＳＧＦＮＫＣＡＶＧＡＡＣＱＰＦＨＦＹＦＰＴＰＴＶＬＣＮＥＩＷＴＨＳＹＫＶＳＮＹＳＲＧＳＧＲＣＩＱＭＷＦＤＰＡＱＧＮＰＮＥＥＶＡＲＦＹＡＡＡＭＳＧＡＧＰＷＡＡＷＰＦＬＬＳＬＡＬＭＬＬＷＬＬＳ（配列番号４１）。
【００４１】
「脱落抗原」及び「脱落ＦＯＬＲ１」（「ｓＦＯＬＲ１」または「ｓＦＲα」）という用語は、本明細書で互換的に使用される。これらの用語は、可溶性であり、かつ細胞に関連しないＦＯＬＲ１タンパク質を指す。いくつかの実施形態において、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）及びグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）リンカーが含まれる。一実施形態において、脱落ＦＯＬＲ１は、ＥＣＤのみを含む。ＦＯＬＲ１には、シグナルペプチド（アミノ酸１〜２４）、ＦＯＬＲ１タンパク質鎖（アミノ酸２５〜２３３または２３４）、及び切断可能なプロペプチド（アミノ酸２３５〜２５７）が含まれる。脱落ＦＯＬＲは、アミノ酸１〜２５７、１〜２３３、１〜２３４、２５〜２３３、２５〜２３４、またはその任意の他の断片を含むことができる。いくつかの実施形態において、シグナル配列は、切断される。他の実施形態において、ＥＣＤ及びＧＰＩ部分は、膜（例えば、可溶性脂質ラフト）にはめ込むことができる。一実施形態において、脱落ＦＯＬＲ１は、アミノ酸１〜２３３またはその断片を含むことができる。
【００４２】
「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子の可変領域内の少なくとも１つの抗原認識部位を介して、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、または上記の組み合わせなどの標的を認識し、特異的に結合する免疫グロブリン分子を意味する。本明細書で使用される「抗体」という用語は、抗体が所望される生物活性を示す限り、無傷のポリクローナル抗体、無傷のモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体を含む融合タンパク質、及び任意の他の修飾免疫グロブリン分子を包含する。抗体は、免疫グロブリンの５つの主要クラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ、またはそのサブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）のうちのいずれかであり得、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、及びミューと称されるそれらの重鎖定常ドメインの同一性に基づく。免疫グロブリンの異なるクラスは、異なる、及び周知であるサブユニット構造及び三次元配置を有する。抗体は、ネイキッドであり得るか、または毒素、放射性同位体などの他の分子と複合され得る。
【００４３】
「抗体断片」という用語は、無傷の抗体の一部を指す。「抗原結合断片」は、抗原と結合する無傷の抗体の一部を指す。抗原結合断片は、無傷の抗体の抗原決定可変領域を含むことができる。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片、直鎖状抗体、ならびに一本鎖抗体が含まれるが、これらに限定されない。
【００４４】
「抗ＦＯＬＲ１抗体」または「ＦＯＬＲ１と結合する抗体」という用語は、ＦＯＬＲ１を標的とする診断及び／または治療剤として有用である抗体のように、十分な親和性でＦＯＬＲ１と結合可能な抗体を指す（例えば、ｈｕＭｏｖ１９（Ｍ９３４６Ａ）抗体）。無関係な非ＦＯＬＲ１タンパク質との抗ＦＯＬＲ１抗体の結合の程度は、例えば放射イムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定される抗体のＦＯＬＲ１との結合の約１０％未満であり得る。
【００４５】
「ＩＭＧＮ８５３」（ミルベツキシマブソラブタンシンとしても知られる）という用語は、ｈｕＭｏｖ１９（Ｍ９３４６Ａ）抗体、スルホＳＰＤＢリンカー、及びＤＭ４メイタンシノイドを含む本明細書に記載される免疫複合体を指す。配列番号５６〜５８のポリペプチドは、ｈｕＭｏｖ１９（Ｍ９３４６Ａ）の重鎖の可変ドメイン、可変ドメイン軽鎖バージョン１．００、及びｈｕＭｏｖ１９の可変ドメイン軽鎖バージョン１．６０のそれぞれを含む。特定の実施形態において、ｈｕＭｏｖ１９（Ｍ９３４６Ａ）抗体は、可変重鎖配列の配列番号５６、及び可変軽鎖配列の配列番号５８（ｈｕＭｏｖ１９のバージョン１．６０）を含む、抗ＦＯＬＲ１抗体である。ＤＭ４は、Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（４−メルカプト−４−メチル−１−オキソペンチル）メイタンシンを指す。「スルホＳＰＤＢ」は、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホブタノエート）リンカーを指す。特定の実施形態において、ｈｕＭｏｖ１９（Ｍ９３４６Ａ）抗体は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託されているプラスミドによってコードされ、ブダペスト条約の条件の下で２０１０年４月７日、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ  ２０１１０に位置し、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１０７７２及びＰＴＡ−１０７７３または１０７７４を有する。以下の配列情報は、ｈｕＭｏｖ１９の相補性決定領域（ＣＤＲ）、可変重及び軽鎖、ならびに完全な重及び軽鎖を提供する：
ｈｕＭｏｖ１９可変重鎖（配列番号５６）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＶＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＦＭＮＷＶＫＱＳＰＧＱＳＬＥＷＩＧＲＩＨＰＹＤＧＤＴＦＹＮＱＫＦＱＧＫＡＴＬＴＶＤＫＳＳＮＴＡＨＭＥＬＬＳＬＴＳＥＤＦＡＶＹＹＣＴＲＹＤＧＳＲＡＭＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
ｈｕＭｏｖ１９可変軽鎖バージョン１．００（配列番号５７）
ＤＩＶＬＴＱＳＰＬＳＬＡＶＳＬＧＱＰＡＩＩＳＣＫＡＳＱＳＶＳＦＡＧＴＳＬＭＨＷＹＨＱＫＰＧＱＱＰＲＬＬＩＹＲＡＳＮＬＥＡＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＫＴＤＦＴＬＮＩＳＰＶＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＳＲＥＹＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲ
ｈｕＭｏｖ１９可変軽鎖バージョン１．６０（配列番号５８）
ＤＩＶＬＴＱＳＰＬＳＬＡＶＳＬＧＱＰＡＩＩＳＣＫＡＳＱＳＶＳＦＡＧＴＳＬＭＨＷＹＨＱＫＰＧＱＱＰＲＬＬＩＹＲＡＳＮＬＥＡＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＫＴＤＦＴＬＴＩＳＰＶＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＳＲＥＹＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲ
ｈｕＭｏｖ１９可変軽鎖ＣＤＲ１（配列番号５９）
ＫＡＳＱＳＶＳＦＡＧＴＳＬＭＨ
ｈｕＭｏｖ１９可変軽鎖ＣＤＲ２（配列番号６０）
ＲＡＳＮＬＥＡ
ｈｕＭｏｖ１９可変軽鎖ＣＤＲ３（配列番号６１）
ＱＱＳＲＥＹＰＹＴ
ｈｕＭｏｖ１９可変重鎖ＣＤＲ１（配列番号６２）
ＧＹＦＭＮ
ｈｕＭｏｖ１９可変重鎖ＣＤＲ２−Ｋａｂａｔ規定（配列番号６３）
ＲＩＨＰＹＤＧＤＴＦＹＮＱＫＦＱＧ
ｈｕＭｏｖ１９可変重鎖ＣＤＲ２−Ａｂｍ規定（配列番号６４）
ＲＩＨＰＹＤＧＤＴＦ
ｈｕＭｏｖ１９可変重鎖ＣＤＲ３（配列番号６５）
ＹＤＧＳＲＡＭＤＹ
ｈｕＭｏｖ１９重鎖アミノ酸配列（配列番号６６）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＶＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＦＭＮＷＶＫＱＳＰＧＱＳＬＥＷＩＧＲＩＨＰＹＤＧＤＴＦＹＮＱＫＦＱＧＫＡＴＬＴＶＤＫＳＳＮＴＡＨＭＥＬＬＳＬＴＳＥＤＦＡＶＹＹＣＴＲＹＤＧＳＲＡＭＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
ｈｕＭｏｖ１９軽鎖バージョン１．００アミノ酸配列（配列番号６７）
ＤＩＶＬＴＱＳＰＬＳＬＡＶＳＬＧＱＰＡＩＩＳＣＫＡＳＱＳＶＳＦＡＧＴＳＬＭＨＷＹＨＱＫＰＧＱＱＰＲＬＬＩＹＲＡＳＮＬＥＡＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＫＴＤＦＴＬＮＩＳＰＶＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＳＲＥＹＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
ｈｕＭｏｖ１９軽鎖バージョン１．６０アミノ酸配列（配列番号６８）
ＤＩＶＬＴＱＳＰＬＳＬＡＶＳＬＧＱＰＡＩＩＳＣＫＡＳＱＳＶＳＦＡＧＴＳＬＭＨＷＹＨＱＫＰＧＱＱＰＲＬＬＩＹＲＡＳＮＬＥＡＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＫＴＤＦＴＬＴＩＳＰＶＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＳＲＥＹＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
【００４６】
本明細書で使用される「免疫複合体」または「複合体」という用語は、細胞結合剤（すなわち、抗ＦＯＬＲ１抗体またはその断片）と連結され、一般式：Ｃ−Ｌ−Ａによって定義される化合物またはその誘導体を指し、Ｃ＝細胞毒素、Ｌ＝リンカー、及びＡ＝抗体またはその抗原結合断片、例えば、抗ＦＯＬＲ１抗体または抗体断片である。免疫複合体は、逆順における一般式：Ａ−Ｌ−Ｃによって定義することもできる。
【００４７】
「リンカー」は、化合物、通常は薬物（メイタンシノイドなど）を、安定した共有結合様式で細胞結合剤（抗ＦＯＬＲ１抗体またはその断片など）と結合することができる任意の化学部分である。リンカーは、化合物または抗体が活性を維持する条件下で、例えば、ジスルフィド結合切断に対して感受性または実質的に耐性であり得る。好適なリンカーは、当技術分野で周知であり、例えば、ジスルフィド基及びチオエーテル基を含む。
【００４８】
「モノクローナル」抗体またはその抗原結合断片は、単一の抗原決定基またはエピトープにおける高度に特異的な認識及び結合に関与する均一な抗体または抗原結合断片集団を指す。これは、通常、異なる抗原決定基に向けられる異なる抗体を含む、ポリクローナル抗体とは対照的である。「モノクローナル」抗体またはその抗原結合断片という用語は、無傷である完全長モノクローナル抗体、ならびに抗体断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなど）、一本鎖（ｓｃＦｖ）変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、及び抗原認識部位を含む他の修飾免疫グロブリン分子の両方を包括する。さらに、「モノクローナル」抗体またはその抗原結合断片は、ハイブリドーマ、ファージ選択、組換え発現、及びトランスジェニック動物を含むがこれらに限定されない任意の数の様式で作製された、かかる抗体及びその抗原結合断片を指す。
【００４９】
「ヒト化」抗体またはその抗原結合断片という用語は、特定の免疫グロブリン鎖、キメラ免疫グロブリン、または最小の非ヒト（例えば、ネズミ科）配列を含むその断片である非ヒト（例えば、ネズミ科）抗体または抗原結合断片の形態を指す。典型的には、ヒト化抗体またはその抗原結合断片は、相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、所望される特異性、親和性、及び能力を有する非ヒト種（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター）のＣＤＲからの残基で置き換えられたヒト免疫グロブリンである（「ＣＤＲグラフト」）（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６（１９８８））。いくつかの事例において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、所望される特異性、親和性、及び能力を有する非ヒト種からの抗体または断片の対応する残基で置き換えられる。ヒト化抗体またはその抗原結合断片は、Ｆｖフレームワーク領域において及び／または置き換えられた非ヒト残基内のいずれかの追加の残基の置換により、さらに修飾することができ、抗体または抗原結合断片の特異性、親和性、及び／または能力を洗練及び最適化する。一般に、ヒト化抗体またはその抗原結合断片は、ＦＲ領域の全てまたは実質的に全てが、ヒト免疫グロブリン共通配列のものであるのに対し、非ヒト免疫グロブリンに対応するＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てを含む少なくとも１つ、典型的には２つまたは３つの実質的に全ての可変ドメインを含むであろう。ヒト化抗体またはその抗原結合断片は、免疫グロブリン定常領域またはドメイン（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものをさらに含むことができる。ヒト化抗体を生成するために使用される方法の例は、米国特許第５，２２５，５３９号、Ｒｏｇｕｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９１（３）：９６９−９７３（１９９４）、及びＰｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．９（１０）：８９５−９０４（１９９６）に記載される。いくつかの実施形態において、「ヒト化抗体」は、再表面化抗体である。
【００５０】
抗体の「可変領域」は、抗体軽鎖の可変領域または抗体重鎖の可変領域の、単独または組み合わせのいずれかを指す。重及び軽鎖の可変領域は、超可変領域としても知られる３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）によって接続された４つのフレームワーク領域（ＦＲ）のそれぞれで構成される。各鎖におけるＣＤＲは、ＦＲにより近接して一緒に保持され、他の鎖のＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。ＣＤＲを決定するための少なくとも２つの手法が存在する：（１）異種間配列可変性に基づくアプローチ（すなわち、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，（５ｔｈ  ｅｄ．，１９９１，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｍｄ．），「Ｋａｂａｔ」）、及び（２）抗原−抗体複合体の結晶学的研究に基づくアプローチ（Ａｌ−ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７−９４８（１９９７））。さらに、これらの２つのアプローチの組み合わせは、ＣＤＲを決定するために当技術分野で時おり使用される。
【００５１】
可変ドメインにおける残基を参照する場合（およそ残基１〜１０７の軽鎖及び残基１〜１１３の重鎖）、Ｋａｂａｔ付番システムが一般的に使用される（例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ。（５ｔｈ  Ｅｄ．，１９９１，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）（「Ｋａｂａｔ」）。
【００５２】
Ｋａｂａｔのようなアミノ酸位置の付番は、Ｋａｂａｔらにおける抗体の編集の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインに使用される付番システムを指す（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．（５ｔｈ  Ｅｄ．，１９９１，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．），「Ｋａｂａｔ」）。この付番システムを使用すると、実際の直鎖状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲまたはＣＤＲの短縮または挿入に対応する、より少ないまたは追加のアミノ酸を含むことができる。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後に単一のアミノ酸挿入物（Ｋａｂａｔによる残基５２ａ）、及び重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入される残基（Ｋａｂａｔによる残基８２ａ、８２ｂ、８２ｃなど）を含むことができる。残基のＫａｂａｔ付番は、「標準的に」Ｋａｂａｔ付番される配列を伴う抗体の配列の相同性領域のアラインメントにより、所定の抗体について決定できる。Ｃｏｔｈｉａは、その代わりに、構造ループの位置を指す（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））。Ｋａｂａｔ付番規定を使用して付番された場合のＣｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲ−Ｈ１ループの終わりは、ループの長さに応じてＨ３２及びＨ３４の間で異なる（これは、Ｋａｂａｔ付番化案が挿入をＨ３５Ａ及びＨ３５Ｂに配置するためであり、３５Ａも３５Ｂも存在しない場合、ループは３２で終了し、３５Ａのみが存在する場合、ループは３３で終了し、３５Ａ及び３５Ｂの両方が存在する場合、ループは３４で終了する）。ＡｂＭ超可変領域は、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲ及びＣｈｏｔｈｉａ構造ループ間の妥協点を表し、Ｏｘｆｏｒｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアで使用される。
【表Ａ】
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【００５３】
「キメラ」抗体またはその抗原結合断片という用語は、アミノ酸配列が２つ以上の種に由来する、抗体またはその抗原結合断片を指す。一般的に、軽及び重鎖の両方の可変領域は、所望される特異性、親和性、及び能力を有する哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギなど）の１種に由来する抗体または抗原結合断片の可変領域に対応し、一方、定常領域は、その種における免疫応答の誘発を避けるために、別（通常はヒト）に由来する抗体または抗原結合断片の配列と相同である。
【００５４】
「エピトープ」または「抗原決定基」という用語は、本明細書で互換的に使用され、特定の抗体によって認識され、特異的に結合され得る抗原の部分を指す。抗原がポリペプチドである場合、エピトープは、タンパク質の三次折り畳みによって並置される隣接するアミノ酸及び非連続アミノ酸からの両方を形成し得る。隣接するアミノ酸から形成されるエピトープは通常、タンパク質の変性時に保持されるが、三次折り畳みによって形成されるエピトープは通常、タンパク質の変性時に欠失する。エピトープは、典型的には、ユニークな空間的高次構造において少なくとも３、より一般的には少なくとも５、または８〜１０のアミノ酸を含む。
【００５５】
「結合親和性」は、一般に、分子の単一結合部位（抗体など）と、その結合パートナー（抗原など）との間の非共有相互作用の合計の強度を指す。特に明記されない限り、本明細書で使用する「結合親和性」は、結合ペアのメンバー（例えば、抗体及び抗原）間の１：１相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。パートナーＹに対する分子Ｘの親和性は、一般に解離定数（Ｋｄ）によって表すことができる。親和性は、本明細書に記載されるものを含む、当技術分野で知られている一般的な方法によって測定できる。一般に、低親和性抗体は抗原にゆっくりと結合し、容易に解離する傾向がある一方で、高親和性抗体は一般に抗原により速く結合し、より長く結合したままになる傾向がある。結合親和性を測定する様々な方法が当技術分野で知られており、そのいずれも本発明の目的に使用することができる。特定の例示的な実施形態が本明細書に記載される。
【００５６】
結合親和性を指すために本明細書で使用される場合の「またはより良い」とは、分子とその結合パートナーとの間のより強い結合を指す。本明細書で使用される場合の「より良い」とは、より小さな数値のＫｄ値によって表される、より強い結合を指す。例えば、抗体は、「０．６ｎＭまたはより良い」抗原に対する親和性を有し、抗原に対する抗体の親和性は＜０．６ｎＭ、すなわち０．５９ｎＭ、０．５８ｎＭ、０．５７ｎＭなど、または０．６ｎＭ未満の任意の値である。一実施形態において、Ｋｄによって決定される抗体の親和性は、約１０−３〜約１０−１２Ｍ、約１０−６〜約１０−１１Ｍ、約１０−６〜約１０−１０Ｍ、約１０−６〜約１０−９Ｍ、約１０−６〜約１０−８Ｍ、または約１０−６〜約１０−７Ｍであろう。
【００５７】
抗体は、参照抗体のエピトープとの結合を、ある程度遮断する範囲でそのエピトープと優先的に結合する場合に、参照抗体の所定のエピトープとの結合を「競合的に阻害する」と言われる。競合的阻害は、例えば競合ＥＬＩＳＡアッセイなどの当技術分野で知られている任意の方法によって決定し得る。抗体は、参照抗体の所与のエピトープとの結合を競合的に少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％阻害すると言われ得る。
【００５８】
本明細書で使用される「実質的に類似」または「実質的に同じ」という語句は、２つの数値の間の十分に高い程度の類似性を示し（一般に、一方は本発明の抗体に関連し、他方は参照／比較抗体に関連する）、そのため、当業者は、２つの値の間の差が、該値（例えば、Ｋｄ値）によって測定される生物学的特性の状況下で生物学的及び／または統計的有意性が低いまたは無いと考えるであろう。該２つの値の間の差は、参照／比較抗体に対する値の機能として、約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満、または約１０％未満である。
【００５９】
「単離された」ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物は、自然界には見られない形態のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物である。単離されたポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物には、それらがもはや自然に見られる形態に至らない程度まで精製されているものが含まれる。いくつかの実施形態において、単離された抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物は実質的に純粋である。
【００６０】
本明細書で使用される「実質的に純粋」とは、少なくとも５０％純粋、少なくとも９０％純粋、少なくとも９５％純粋、少なくとも９８％純粋、または少なくとも９９％純粋である（すなわち、汚染物質を含まない）材料を指す。
【００６１】
ＦＯＬＲ１の「増加した発現」という用語は、参照試料、参照ＦＯＬＲ１レベル、または同じ対照から検出された以前のＦＯＬＲ１レベルと比較して、ＦＯＬＲ１発現レベルの上昇を含む試料を指す。したがって、例えば、患者試料における「増加したＦＯＬＲ１タンパク質レベル」は、非がん性参照試料におけるＦＯＬＲ１タンパク質レベルよりも高いＦＯＬＲ１タンパク質レベルを有することができる。患者試料における「増加したＦＯＬＲ１タンパク質レベル」は、例えば、がん性試料におけるＦＯＬＲ１タンパク質レベルに等しいＦＯＬＲ１タンパク質レベルを有することもできる。
【００６２】
「参照試料」を使用して、試験試料から本発明の方法で得られた結果を相関させ、比較することができる。参照試料は、細胞（例えば、細胞株、細胞ペレット）、体液、または組織である。「参照試料」におけるＦＯＬＲ１レベルは、ＦＯＬＲ１の絶対または相対量、量の範囲、最小及び／または最大量、平均値の量、及び／または中央値の量であり得る。「参照試料」は、試験試料と比較されるＦＯＬＲ１発現の基準としても機能する。「参照試料」は、同じ患者からの以前の試料または基準試料、正常な参照、または関連する患者集団からの参照を含むことができる。一般に、ＦＯＬＲ１レベルは、標準曲線の値として表される。標準曲線は、アッセイデータをプロットして試料中のＦＯＬＲ１の濃度を決定する定量的な方法である。一実施形態において、参照試料は、抗原標準精製ＦＯＬＲ１またはＦＯＬＲ１−Ｆｃである。本明細書に開示される検出方法は、試験試料中のＦＯＬＲ１の発現レベルと、「参照値」または「参照レベル」との比較を伴い得る。いくつかの実施形態において、参照値は、参照試料中のＦＯＬＲ１の発現レベルである。参照値は、所定の値であり得、かつ試験試料と並行して試験された基準試料（例えば、対照生体試料）から決定され得る。参照値は、中央値もしくは平均値などの単一のカットオフ値、または信頼区間などの値の範囲であり得る。参照値は、がんの素因がある個体、初期もしくは後期のがんを有する個体、男性及び／または女性の個体、またはがん治療を受けている個体など、個体の様々なサブグループに対して確立できる。正常な参照試料または値、及び陽性の参照試料または値の例は、本明細書で記載される。
【００６３】
本発明の「試料」または「生物試料」は、生体起源のものであり、特定の実施形態において、例えば、真核生物からのものである。好ましい実施形態において、試料は、ヒト試料であるが、動物試料もまた、本発明の実施に使用することができる。本発明で使用するための試料の非限定的な源としては、例えば、固形組織、生検吸引液（ｂｉｏｐｓｙ  ａｓｐｉｒａｔｅ）、腹水、流体抽出物（ｆｌｕｉｄｉｃ  ｅｘｔｒａｃｔ）、血液、血漿、血清、髄液、リンパ液、皮膚の外側部分（ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｓｅｃｔｉｏｎ）、気道、腸管、及び尿生殖路、涙、唾液、乳汁、腫瘍、器官、細胞培養物、及び／または細胞培養成分が含まれるが、これらに限定されない。本発明は、利用可能な物質の量が少ない、通常、腹水などの体液を含むがん試料にとって、特に有用である。本方法は、ＦＯＬＲ１の発現の態様または試料の状態を試験するのに使用することができ、異なるタイプの細胞または組織を比較すること、異なる発生段階を比較すること、ならびに疾患もしくは異常の存在及び／またはタイプを検出または決定することを含む。
【００６４】
本明細書で使用される場合、「キャプチャ試薬」という用語は、好適な条件下で、キャプチャ試薬−標的分子の複合体が、試料の残りから分離することができるように、試料中の標的分子に結合し、それを捕捉することが可能である試薬を指す。「イムノキャプチャ試薬」という用語は、好適な条件下で、キャプチャ試薬−標的分子複合体は、試料の残りから分離することができるように、試料中の標的分子に結合し、それを捕捉することが可能である免疫学的試薬を指す。一実施形態において、イムノキャプチャ試薬は、抗体または抗原結合断片である。一実施形態において、キャプチャ試薬またはイムノキャプチャ試薬は、固定化される。一実施形態において、キャプチャ試薬またはイムノキャプチャ試薬は、固体支持体上に固定化される。
【００６５】
本明細書で使用される場合、「検出可能な抗体」という用語は、検出手段によって増幅される標識を介して直接的に、または標識されている、例えば、別の抗体を介して間接的に検出されることが可能である抗体を指す。直接標識については、抗体は、典型的には、何らかの手段によって検出可能である部分に複合される。一実施形態において、検出可能な抗体は、ビオチン化抗体である。
【００６６】
「標識」という単語は、本明細書で使用されるとき、「標識された」抗体を生成するように抗体に直接または間接的に複合される検出可能な化合物または組成物を指す。標識は、それ自体で（例えば、放射性同位元素標識または蛍光標識）検出可能であることができ、酵素標識の場合、検出可能である基質の化合物または組成物の化学変化を触媒することができる。
【００６７】
「相関する」または「相関すること」は、どんな方法であれ、第１の分析の成績及び／または結果を第２の分析の成績及び／または結果と比較することを意味する。例えば、第２の分析を行うことにおいて第１の分析の結果を使用してもよく、第１の分析の結果を使用して第２の分析を行うべきであるかどうかを決定してもよく、及び／または第１の分析の結果を第２の分析の結果と比較してもよい。
【００６８】
「がん」及び「がん性」という用語は、細胞の集団が無秩序な細胞増殖を特徴とする、哺乳動物における生理学的な状態を指すまたは説明する。がんの例には、がん腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、及び白血病が含まれるが、これらに限定されない。そのようながんのさらに特定の例としては、肺の扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜の癌、肝細胞癌、消化器癌、膵臓癌、膠芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、直腸癌、直腸結腸癌、子宮内膜または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝臓癌、及び種々の型の頭頚部の癌が含まれる。がんは、ＦＯＬＲ１を発現するがんであり得る。
【００６９】
「腫瘍」及び「新生物」は、前がん性病変を含む良性（非がん性）または悪性（がん性）のいずれかの過剰な細胞の成長または増殖からもたらされた、いかなる組織の塊をも指す。
【００７０】
「がん細胞」、「腫瘍細胞」という用語、及び文法的等価物は、腫瘍細胞集団の大部分を含む非腫瘍形成性細胞及び腫瘍形成性幹細胞（がん幹細胞）の両方を含む、腫瘍または前がん病変に由来する全細胞集団を指す。本明細書で使用される場合、「腫瘍細胞」という用語は、再生し、分化する能力を欠くそれら腫瘍細胞を単に指して、それらの腫瘍細胞をがん幹細胞から区別する場合、「非腫瘍形成性の」という用語によって修飾されるであろう。
【００７１】
「対象」という用語は、特定の治療のレシピエントとなるヒト、非ヒト霊長類、齧歯類などを含むが、これらに限定されない、任意の動物（例えば、哺乳動物）を指す。典型的には、「対象」及び「患者」という用語は、ヒト対象に関連して、本明細書では同義的に使用される。
【００７２】
「薬学的製剤」という用語は、有効成分の生物学的活性を有効にするような形態であり、製剤が投与され得る対象にとって許容できない毒性である追加成分を含有しない調製物を指す。そのような製剤は、滅菌であり得る。
【００７３】
本明細書で開示されているような抗体の「有効量」は、具体的に言及される目的を実施するのに十分な量である。「有効量」は、定められた目的との関連で、経験的に、及び通例の方法で、決定することができる。
【００７４】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、本明細書では相互交換可能に使用されて、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは、直鎖状または分枝状であり得、それは、修飾されたアミノ酸を含むことができ、非アミノ酸によって中断することができる。その用語はまた、天然に修飾されている、または介入、例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または任意の他の操作もしくは修飾、例えば、標識成分による複合化によって修飾されているアミノ酸ポリマーも包含する。例えば、アミノ酸の１つ以上の類似体（例えば、非天然のアミノ酸などを含む）ならびに当該技術分野で既知の他の修飾を含有するポリペプチドもまた、定義の中に含められる。本発明のポリペプチドが抗体に基づくので、特定の実施形態において、ポリペプチドは、単鎖または会合した鎖として存在し得ることが理解される。いくつかの実施形態において、ポリペプチド、ペプチド、またはタンパク質は、天然に存在しない。いくつかの実施形態において、ポリペプチド、ペプチド、またはタンパク質は、他の天然に存在する成分から精製される。いくつかの実施形態において、ポリペプチド、ペプチド、またはタンパク質は、組換えで生成される。
【００７５】
２つ以上の核酸またはポリペプチドの文脈での「同一の」またはパーセント「同一性」という用語は、配列同一性の一部としていかなる保存的なアミノ酸置換も考慮せずに、最大の一致について比較し、（必要に応じてギャップを導入して）並べた場合、同じである２つ以上の配列もしくは部分配列、または同じであるヌクレオチドもしくはアミノ酸残基の特定された比率を有する２つ以上の配列もしくは部分配列を指す。パーセント同一性は、配列比較ソフトウェアまたはアルゴリズムを用いて、または目視検査によって測定することができる。アミノ酸配列またはヌクレオチド配列のアラインメントを得るのに使用することができる種々のアルゴリズム及びソフトウェアが当該技術分野で既知である。配列アラインメントアルゴリズムのそのような非限定的な例の１つは、Ｋａｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９０：５８７３−５８７７にて修飾されるように、Ｋａｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８７：２２６４−２２６８に記載されるアルゴリズムであり、ＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２）に組み入れられている。特定の実施形態において、ギャップのあるＢＬＡＳＴは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２に記載されるように使用することができる。ＢＬＡＳＴ−２、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２６６：４６０−４８０）、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）は、配列を並べるのに使用することができる追加の公的に利用可能なソフトウェアのプログラムである。特定の実施形態において、２つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、（例えば、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックス及び４０、５０、６０、７０、もしくは９０のギャップ加重及び１、２、３、４、５、もしくは６の長さ加重を用いた）ＧＣＧソフトウェアにおけるＧＡＰプログラムを用いて決定される。特定の代替的実施形態において、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（４８）：４４４−４５３（１９７０））のアルゴリズムを組み入れるＧＣＧソフトウェアパッケージにおけるＧＡＰプログラムを用いて、（例えば、Ｂｌｏｓｓｕｍ  ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックス、及び１６、１４、１２、１０、８、６、もしくは４のギャップ加重及び１、２、３、４、５の長さ加重を用いて）２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性を決定することができる。代替的に、特定の実施形態において、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列間でのパーセント同一性は、Ｍｙｅｒｓ及びＭｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ，４：１１−１７（１９８９））のアルゴリズムを用いて決定される。例えば、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）を用いて、かつ残基表、１２のギャップ長さペナルテ���及び４のギャップペナルティと共にＰＡＭ１２０を用いて、パーセント同一性を決定することができる。特定のアラインメントソフトウェアによる最大アラインメントのための適当なパラメータは、当業者によって決定することができる。特定の実施形態において、アラインメントソフトウェアの初期設定パラメータが、使用される。特定の実施形態において、第１のアミノ酸配列の第２の配列アミノ酸に対するパーセント同一性「Ｘ」は、１００×（Ｙ／Ｚ）として算出され、式中、Ｙは、第１及び第２の配列のアラインメント（目視検査または特定の配列アラインメントプログラムによって並べられた）において同一の一致としてスコア化されたアミノ酸残基の数であり、Ｚは、第２の配列における残基の総数である。第１の配列の長さが第２の配列よりも長い場合、第１の配列の第２の配列に対するパーセント同一性は、第２の配列の第１の配列に対するパーセント同一性よりも長いであろう。
【００７６】
非限定的な例として、任意の特定のポリヌクレオチドが参照配列に対してある特定の比率の配列同一性を有する（例えば、少なくとも８０％同一である、少なくとも８５％同一である、少なくとも９０％同一である、及びいくつかの実施形態において、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である）かどうかは、特定の実施形態において、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ  ５３７１１）を用いて決定することができる。Ｂｅｓｔｆｉｔは、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２  ４８９（１９８１）のローカル相同性アルゴリズムを用いて、２つの配列間の相同性の最良なセグメントを見出す。Ｂｅｓｔｆｉｔまたは任意の他の配列アラインメントプログラムを用いて、特定の配列が本発明による参照配列に対して、例えば、９５％同一性であるかどうかを決定する場合、パラメータは、同一性の割合が参照ヌクレオチド配列の完全長にわたって算出され、かつ参照配列におけるヌクレオチドの総数の５％までの相同性におけるギャップが許容されるように設定される。
【００７７】
いくつかの実施形態において、本発明の２つの核酸またはポリペプチドが、実質的に同一であり、これは、配列比較アルゴリズムを用いて、または目視検査によって測定するとき、最大の一致について比較し、並べた場合、それらが、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、及びいくつかの実施形態において、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の同一性を有することを意味する。特定の実施形態において、同一性は、長さ少なくとも約１０、約２０、約４０〜６０の残基またはその間の任意の整数値である配列の領域にわたって、または６０〜８０残基、少なくとも約９０〜１００残基より長い領域にわたって存在し、または配列は、例えば、ヌクレオチド配列のコーディング領域のような、比較される配列の完全長にわたって実質的に同一である。
【００７８】
「保存的なアミノ酸置換」は、あるアミノ酸残基が類似する側鎖を有するもう１つのアミノ酸残基で置き換えられるものである。塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で定義されている。例えば、フェニルアラニンのチロシンへの置換は、保存的置換である。特定の実施形態において、本発明のポリペプチド及び抗体の配列における保存的な置換は、アミノ酸配列を含有するポリペプチドまたは抗体の抗原（複数可）への、すなわち、ポリペプチドまたは抗体が結合するＦＯＬＲ１への結合を無効にしない。抗原結合を排除しないヌクレオチド及びアミノ酸の保存的置換を特定する方法は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：１１８０−１  １８７（１９９３）、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１２（１０）：８７９−８８４（１９９９）、及びＢｕｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：．４１２−４１７（１９９７）を参照のこと）。
【００７９】
本開示及び特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明瞭に指示しない限り、複数形を含む。
【００８０】
実施形態が「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という言語と共に本明細書に記載される箇所はどこでも、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」及び／または「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という点で記載される別の類似の実施形態も提供されることが理解される。
【００８１】
本明細書にて「Ａ及び／またはＢ」のような語句で使用される場合、「及び／または」という用語は、「Ａ及びＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」、ならびに「Ｂ」の両方を含むように意図されている。同様に、Ａ、Ｂ、及び／またはＣ」のような語句で使用される場合、「及び／または」という用語は、以下の実施形態：Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；及びＣ（単独）のそれぞれを包含するように意図されている。
【００８２】
ＩＩ．ＦＯＬＲ１結合剤
ヒトＦＯＬＲ１に特異的に結合する薬剤は、本発明の方法を実施するのに有用である。そのような薬剤は、本明細書では「ＦＯＬＲ１結合剤」と称される。本発明の方法を実施するのに有用であるＦＯＬＲ１結合剤は、例えば、ＷＯ２０１４／０３６４９５及びＷＯ２０１５／０３１８１５（これらは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）において記載されている。
【００８３】
ＦＯＬＲ１結合剤には、ｍｕＦＲ１−９、ｍｕＦＲ１−１３、ｍｕＦＲ１−５３、ｍｕＦＲ１−６２、ｍｕＦＲ１−６４、及びＦＯＬＲ１−２．１（「ＩＭＧＮ  ３５３．２−１」、「３５３．２−１」、「２．１」、または「ｍｕＦＲＩＨＣ２−１」としても称される）の重及び軽鎖ＣＤＲ配列を含む薬剤が含まれる。ＣＤＲ配列ｍｕＦＲ１−９、ｍｕＦＲ１−１３、ｍｕＦＲ１−５３、ｍｕＦＲ１−６２、ＦＯＬＲ１−２．１は、以下の表１及び２に記載される。
【表１】
2020532751.tif 000003
【表２】
2020532751.tif 000004
【００８４】
ＦＯＬＲ１結合分子は、ＣＤＲごとに最大４つ（すなわち、０、１、２、３、または４）の保存的アミノ酸置換を有するｍｕＦＲ１−９、ｍｕＦＲ１−１３、ｍｕＦＲ１−５３、ｍｕＦＲ１−６２、ｍｕＦＲ１−６４、またはＦＯＬＲ１−２．１（「ＩＭＧＮ  ３５３．２−１」、「３５３．２−１」、「２．１」、または「ｍｕＦＲＩＨＣ２−１」としても称される）のＣＤＲを含むＦＯＬＲ１と特異的に結合する、抗体または抗原結合断片であり得る。
【００８５】
ポリペプチドは、本明細書に記載される個々の可変軽鎖または可変重鎖のうちの１つを含むことができる。抗体及びポリペプチドは、可変軽鎖及び可変重鎖の両方を含むこともできる。ネズミ科ｍｕＦＲ１−９、ｍｕＦＲ１−１３、ｍｕＦＲ１−５３、ｍｕＦＲ１−６２、及びＦＯＬＲ１−２．１（「ＩＭＧＮ  ３５３．２−１」、「３５３．２−１」、「２．１」、または「ｍｕＦＲＩＨＣ２−１」としても称される）抗体の可変軽鎖及び可変重鎖配列は、以下の表３及び４に提供される。
【表３】
2020532751.tif 000005
【表４−１】
2020532751.tif 000006
【表４−２】
2020532751.tif 000007
【００８６】
（ａ）配列番号２５〜２８と少なくとも約９０％の配列同一性を有するポリペプチド、及び／または（ｂ）配列番号２９〜３２と少なくとも約９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、ポリペプチドがさらに提供される。特定の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号２５〜３２と少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。したがって、特定の実施形態において、ポリペプチドは、（ａ）配列番号２５〜２８と少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリペプチド、及び／または（ｂ）配列番号２９〜３２と少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。特定の実施形態において、ポリペプチドは、（ａ）配列番号２５〜２８のアミノ酸配列を有するポリペプチド、及び／または（ｂ）配列番号２９〜３２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。特定の実施形態において、ポリペプチドは抗体であり、及び／またはポリペプチドは、ＦＯＬＲ１と特異的に結合する。特定の実施形態において、ポリペプチドは、ＦＯＬＲ１と特異的に結合するネズミ科、キメラ、またはヒト化抗体である。特定の実施形態において、配列番号２５〜３２と特定の割合の配列同一性を有するポリペプチドは、保存的アミノ酸置換のみが配列番号２５〜３２と異なる。
【００８７】
ポリペプチドは、本明細書に記載される個々の軽鎖または重鎖のうちの１つを含むことができる。抗体及びポリペプチドは、軽鎖及び重鎖の両方を含むこともできる。ネズミ科ｍｕＦＲ１−９、ｍｕＦＲ１−１３、ｍｕＦＲ１−５３、ｍｕＦＲ１−６２、及びＦＯＬＲ１−２．１（「ＩＭＧＮ  ３５３．２−１」、「３５３．２−１」、「２．１」、または「ｍｕＦＲＩＨＣ２−１」としても称される）抗体の軽鎖及び可変鎖配列は、以下の表５及び６に提供される。特定の実施形態において、抗ＦＯＬＲ１抗体は、２０１３年４月１６日にＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマによって産生され、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２０１９７（「ＦＯＬＲ１−２．１」、さらに「ＩＭＧＮ  ３５３．２−１」、「３５３．２−１」、「２．１」、または「ｍｕＦＲＩＨＣ２−１」としても称される）を有する抗体である。
【表５−１】
2020532751.tif 000008
【表５−２】
2020532751.tif 000009
【表５−３】
2020532751.tif 000010
【表５−４】
2020532751.tif 000011
【表６−１】
2020532751.tif 000012
【表６−２】
2020532751.tif 000013
【００８８】
（ａ）配列番号３３〜３６と少なくとも約９０％の配列同一性を有するポリペプチド、及び／または（ｂ）配列番号３７〜４０と少なくとも約９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、ポリペプチドがさらに提供される。特定の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号３３〜４０と少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。したがって、特定の実施形態において、ポリペプチドは、（ａ）配列番号３３〜３６と少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリペプチド、及び／または（ｂ）配列番号３７〜４０と少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。特定の実施形態において、ポリペプチドは、（ａ）配列番号３３〜３６のアミノ酸配列を有するポリペプチド、及び／または（ｂ）配列番号３７〜４０のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。特定の実施形態において、ポリペプチドは抗体であり、及び／またはポリペプチドは、ＦＯＬＲ１と特異的に結合する。特定の実施形態において、ポリペプチドは、ＦＯＬＲ１と特異的に結合するネズミ科、キメラ、またはヒト化抗体である。特定の実施形態において、配列番号３３〜４０と特定の割合の配列同一性を有するポリペプチドは、保存的アミノ酸置換のみが配列番号３０〜４０と異なる。
【００８９】
特定の実施形態において、ポリペプチドは、ｈｕＭｏｖ１９のＦＯＬＲ１との結合によって競合的に阻害されない。特定の実施形態において、ポリペプチドは、ＩＭＧＮ８５３のＦＯＬＲ１との結合によって競合的に阻害されない。特定の実施形態において、ポリペプチドは、ｈｕＭｏｖ１９のＦＯＬＲ１との結合によって競合的に阻害されない。特定の実施形態において、ポリペプチドは、抗体または抗原結合断片のＦＯＬＲ１との結合によって競合的に阻害されず、該抗体または抗原結合断片は、配列番号５９の可変軽鎖（ＶＬ）相補性決定領域（ＣＤＲ）−１、配列番号６０のＶＬ  ＣＤＲ−２、配列番号６１のＶＬ  ＣＤＲ−３、配列番号６２の可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ−１、配列番号６４のＶＨ  ＣＤＲ−２、及び配列番号６５のＶＨ  ＣＤＲ−３を含む。特定の実施形態において、ポリペプチドは、抗体または抗原結合断片のＦＯＬＲ１との結合によって競合的に阻害されず、該抗体または抗原結合断片は、配列番号５６の配列を有する可変重鎖（ＶＨ）、及び配列番号５７または配列番号５８の配列を有する可変軽鎖（ＶＬ）を含む。特定の実施形態において、ポリペプチドは、抗体または抗原結合断片のＦＯＬＲ１との結合によって競合的に阻害されず、該抗体または抗原結合断片は、（ｉ）ＰＴＡ−１０７７２としてＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託されているプラスミドによってコードされる重鎖のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を含む重鎖、及び（ｉｉ）ＰＴＡ−１０７７４としてＡＴＣＣに寄託されているプラスミドによってコードされる軽鎖のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。特定の実施形態において、ポリペプチドは、葉酸のＦＯＬＲ１との結合によって阻害されない。
【００９０】
抗原に対する抗体の親和性または結合活性は、当該技術分野で周知の任意の好適な方法、例えば、サイトメトリー（フローサイトメトリーを含む）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）または放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）または速度論（例えば、表面プラズモン共鳴分光法（ＢＩＡＣＯＲＥ（商標））分析）を用いて実験的に決定することができる。直接結合アッセイならびに競合結合アッセイ方式を容易に採用することができる（例えば、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ，ｅｔ  ａｌ．，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，”  Ｉｎ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９８４）、Ｋｕｂｙ，Ｊａｎｉｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９２）、及び本明細書で記載される方法を参照のこと。特定の抗体−抗原の相互作用の測定された親和性は、異なる条件下（例えば、塩濃度、ｐＨ、温度）で測定される場合、変化し得る。したがって、親和性及び他の抗原−結合パラメータ（例えば、ＫＤまたはＫｄ、Ｋｏｎ、Ｋｏｆｆ）の測定は、抗体及び抗原の標準化した溶液及び本明細書で記載される緩衝液のような当該技術分野で既知であるような標準化した緩衝液で行う。
【００９１】
一態様において、結合アッセイは、表面上にＦＯＬＲ１抗原を発現している細胞にてサイトメトリー（例えば、フローサイトメトリー）を用いて行うことができる。例えば、１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液（２％正常ヤギ血清で補完したＲＰＭＩ−１６４０培地）にて試料当たり１×１０５個の細胞を用いて抗ＦＯＬＲ１抗体の濃度を変化させて、ＳＫＯＶ３などのＦＯＬＲ１陽性細胞を、インキュベートした。次いで、細胞をペレットにし、洗浄し、１００μＬのＦＩＴＣ複合化ヤギ抗マウスまたはヤギ抗ヒトのＩｇＧ抗体（例えば、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手可能である、ＦＡＣＳ緩衝液中で６μｇ／ｍＬ）と共に１時間インキュベートした。細胞を、再びペレットにし、ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、１％ホルムアミドを含有する２００μＬのＰＢＳに再懸濁させた。例えば、ＨＴＳマルチウェルサンプラーを伴ったＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメータを用いて試料を捕捉し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ  Ｐｒｏ（全てＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＵＳからの）を用いて分析した。各試料について、ＦＬ１の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を取り出し、半対数プロットにて抗体濃度に対してプロットして、結合曲線を生成した。Ｓ字用量反応曲線を結合曲線に当てはめ、例えば、初期設定パラメータのＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖ４（ＧｒａｐｈＰａｄ  ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）などのプログラムを用いてＥＣ５０値を算出する。各抗体についての見かけの解離定数「Ｋｄ」または「ＫＤ」についての評価基準としてＥＣ５０値を使用することができる。
【００９２】
Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５によって記載されたもののようなハイブリドーマ法を用いて、モノクローナル抗体を調製することができる。ハイブリドーマ法を用いて、マウス、ハムスター、または他の適当な宿主動物を上記のように免疫して、免疫抗原に特異的に結合する抗体のリンパ球による産生を引き出す。リンパ球もまた、インビトロで免疫することができる。免疫に続いて、リンパ球を単離し、例えば、ポリエチレングリコールを用いて好適な骨髄腫細胞株と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成し、次いで、それを融合しなかったリンパ球及び骨髄腫細胞から選別することができる。免疫沈降、免疫ブロットによって、またはインビトロの結合アッセイ（例えば、放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ））によって決定されるような選択された抗原に対して特異的に向けられたモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを、次いで、標準方法（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）を用いたインビトロの培養にて、または動物における腹水腫瘍としてインビボで増殖させることができる。次いで、ポリクローナル抗体について記載されるように、モノクローナル抗体を、培養培地または腹水液から精製することができる。
【００９３】
代替的に、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されるように、組換えＤＮＡ法を用いても、モノクローナル抗体を、作製することができる。例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子を特異的に増幅するオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲによって、モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドを、成熟Ｂ細胞またはハイブリドーマ細胞から単離し、従来の手順を用いてその配列を決定する。次いで、重鎖及び軽鎖をコードする単離されたポリヌクレオチドを、好適な発現ベクターにクローニングし、そうでなければ、免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または骨髄腫細胞にそれを形質移入すると、宿主細胞によってモノクローナル抗体が産生される。また、所望の種の組換えモノクローナル抗体またはその断片は、記載されるように所望の種のＣＤＲを発現するファージディスプレライブラリから単離することができる（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５４、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８、及びＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７）。
【００９４】
モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチド（複数可）をさらに修飾して、組換えＤＮＡ技術を用いて、組換えＤＮＡ法を用いた多数の異なる方法において代替抗体を生成することができる。いくつかの実施形態において、例えば、マウスモノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖の定常ドメインを、１）例えば、ヒト抗体のその領域に置換してキメラ抗体を生成することができるか、または２）非免疫グロブリンポリペプチドに置換して融合抗体を生成することができる。いくつかの実施形態において、定常領域を切り詰め、または取り除いて、モノクローナル抗体の所望の抗体断片を生成する。可変領域の部位特異的なまたは高密度の変異誘発を用いて、モノクローナル抗体の特異性、親和性などを最適化することができる。
【００９５】
いくつかの実施形態において、ヒトＦＯＬＲ１に対するモノクローナル抗体は、ヒト化抗体である。特定の実施形態において、そのような抗体を治療上用いて、ヒト対象に投与したときに、抗原性及びＨＡＭＡ（ヒト抗マウス抗体）反応を軽減する。
【００９６】
非ヒト抗体またはヒト抗体を操作する、ヒト化する、または表面再構成するための方法も使用することができ、それらは当該技術分野で周知である。ヒト化された、表面再構成した、または同様に操作された抗体は、非ヒトであるが、例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、または他の哺乳動物に限定されない、供給源に由来する１つ以上のアミノ酸残基を有し得る。これらの非ヒトのアミノ酸残基は、「移入」残基と称されることが多い残基によって置き換えられ、それは、典型的には、既知のヒト配列の「移入」の可変、定常、または他のドメインから選び取られる。
【００９７】
そのような移入された配列を用いて、免疫原性を減らすことができるか、または当該技術分野で周知のように結合、親和性、オン速度、オフ速度、結合活性、特異性、半減期、または任意の他の好適な特性を軽減する、向上させる、または修飾することができる。一般に、ＣＤＲ残基が直接、かつ最も実質的にＦＯＬＲ１結合に影響を及ぼすことに関与する。したがって、非ヒトまたはヒトのＣＤＲ配列の一部または全てが維持される一方で、可変領域及び定常領域の非ヒト配列は、ヒトのアミノ酸または他のアミノ酸で置き換えることができる。
【００９８】
抗原ＦＯＬＲ１に対する高い親和性及び他の好都合な生物特性を保持しながら、抗体はまた、任意でヒト化され、表面再構成され、操作されることもできるか、またはヒト抗体が操作されることもできる。この目標を達成するために、親配列、操作された配列、及びヒト化された配列の三次元モデルを用いた親配列及び種々の概念的なヒト化産物及び操作した産物の解析プロセスによって、ヒト化した（ヒトの）または操作した抗ＦＯＬＲ１抗体及び表面再構成した抗体を、任意で調製することができる。三次元の免疫グロブリンモデルは市販されており、当業者が精通している。選択された候補免疫グロブリン配列の考えられる三次元立体構造を説明し、表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示の調査によって、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性の高い役割の分析が可能になり、すなわち、候補免疫グロブリンのＦＯＬＲ１のような抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このように、フレームワーク（ＦＲ）残基を、選択し、所望の抗体の特徴、例えば、標的抗原（複数可）に対する増加した親和性が達成されるように共通配列及び移入配列と組み合わせることができる。
【００９９】
本明細書に開示される抗体のヒト化、表面再構成、または操作は、Ｗｉｎｔｅｒ（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３（１９８８）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４（１９８８））、Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）、Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１（１９８７）、Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：４２８５（１９９２）、Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３（１９９３）、Ｒｏｇｕｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９１（３）：９６９−９７３（１９９４）、Ｒｏｇｕｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．９（１０）：８９５−９０４（１９９６）、米国特許第５，６３９，６４１号、同第５，７２３，３２３号、同第５，９７６，８６２号、同第５，８２４，５１４号、同第５，８１７，４８３号、同第５，８１４，４７６号、同第５，７６３，１９２号、同第５，７２３，３２３号、同第５，７６６，８８６号、同第５，７１４，３５２号、同第６，２０４，０２３号、同第６，１８０，３７０号、同第５，６９３，７６２号、同第５，５３０，１０１号、同第５，５８５，０８９号、同第５，２２５，５３９号、同第４，８１６，５６７、ＰＣＴ／：ＵＳ９８／１６２８０、ＵＳ９６／１８９７８、ＵＳ９１／０９６３０、ＵＳ９１／０５９３９、ＵＳ９４／０１２３４、ＧＢ８９／０１３３４、ＧＢ９１／０１１３４、ＧＢ９２／０１７５５、ＷＯ９０／１４４４３、ＷＯ９０／１４４２４、ＷＯ９０／１４４３０、ＥＰ２２９２４６、７，５５７，１８９、７，５３８，１９５、及び７，３４２，１１０（当該出願の各々は、参照により本明細書に組み込まれ、その中で引用された参考文献を含む）にて記載されたものなどであるが、これらに限定されない、任意の既知の方法を用いて実施することができる。
【０１００】
本明細書に開示されているＦＯＬＲ１に特異的に結合する薬剤はまた、抗体断片も包含する。様々な技術は、抗体断片の作製で知られている。伝統的には、これらの断片は、無傷な抗体のタンパク分解消化を介して導き出される（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４：１０７−１１７、Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１）。特定の実施形態において、抗体断片は、組換えで作製される。Ｆａｂ、Ｆｖ、及びｓｃＦｖ抗体断片は全て、Ｅ．ｃｏｌｉまたは他の宿主細胞において発現され、それから分泌されるため、これらの断片の大量生産が可能になる。そのような抗体断片はまた、上で論じられる抗体ファージライブラリーから単離され得る。抗体断片はまた、米国特許第５，６４１，８７０号に記載される線状抗体であり得、例えば、単一特異性または二重特異性であり得る。抗体断片の作製についての他の技術は、技量のある実践者には明らかであろう。
【０１０１】
本発明の目的で、修飾された抗体は抗体のヒトＦＯＬＲ１のポリペプチドとの会合を提供する任意の型の可変領域を含むことができることが十分に理解されるべきである。この点で、可変領域は、所望の腫瘍関連抗原に対する液性免疫を備え、免疫グロブリンを生成するように誘導することができる任意の種類の哺乳動物を備えることができるか、またはそれに由来することができる。したがって、修飾された抗体の可変領域は、例えば、ヒト、マウス、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル、マカクなど）またはオオカミの起源のものであることができる。いくつかの実施形態において、修飾された免疫グロブリンの可変領域及び定常領域の両方がヒトである。他の実施形態において、適合する抗体（通常、非ヒト供給源に由来する）の可変領域が、結合特性を改善するか、または分子の免疫原性を減らすように操作され、または特に誂えられ得る。この点で、本発明で有用な可変領域は、ヒト化することができるか、またはさもなければ、移入されるアミノ酸配列の包含を介して変えることができる。
【０１０２】
特定の実施形態において、重鎖及び軽鎖の両方における可変ドメインは、１つ以上のＣＤＲの少なくとも部分的な置き換えによって、必要に応じて、部分的なフレームワーク領域の置き換え及び配列変化によって変えられる。ＣＤＲは、フレームワーク領域が由来する抗体と同じクラスまたはさらにサブクラスの抗体に由来することができるが、ＣＤＲは異なるクラスに由来し、特定の実施形態において、異なる種からの抗体に由来することが想定される。ドナーの可変領域からの完全なＣＤＲでＣＤＲの全てを置き換えて、１つの可変ドメインの抗原結合能を別に移すことが必要でなくてもよい。むしろ、抗原結合部位の活性を維持するのに必要である残基を移すことが必要であるに過ぎない可能性がある。米国特許第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号、及び同第５，６９３，７６２号に記載される説明を考えると、日常の実験を行うことによって、または試行錯誤の試験を行うことによって、低下した免疫原性を持つ機能的な抗体を得ることは、十分に当業者の力量の範囲内であろう。
【０１０３】
可変領域に対する変化にもかかわらず、当業者は、天然のまたは未変化の定常領域を含むほぼ同じ免疫原性の抗体と比較した場合、例えば、より高い腫瘍の局在化または低下した血清半減期などの所望の生化学的特徴を提供するように、定常領域ドメインの１つ以上の少なくとも一部が欠失しているか、またはさもなければ変化している抗体（例えば、完全長の抗体またはその免疫反応性の断片）を本発明の修飾された抗体が含むことを十分に理解するであろう。いくつかの実施形態において、修飾された抗体の定常領域は、ヒトの定常領域を含むであろう。本発明に適合する定常領域に対する修飾は、１つ以上のドメインにおいて１つ以上のアミノ酸の付加、欠失、または置換を含む。すなわち、本明細書で開示される修飾された抗体は、３つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、もしくはＣＨ３）のうちの１つ以上及び／または軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）に対する変化または修飾を含むことができる。いくつかの実施形態において、１つ以上のドメインを部分的にまたは全体的に欠失させる修飾された定常ドメインが、企図される。いくつかの実施形態において、修飾された抗体は、ＣＨ２ドメイン全体が取り除かれているドメイン欠失の構築物またはバリアント（ΔＣＨ２構築物）を含むであろう。いくつかの実施形態において、省略された定常領域ドメインは、存在しない定常領域によって通常付与される分子柔軟性の一部を提供する短いアミノ酸スペーサー（例えば、１０残基）によって置き換えられるであろう。
【０１０４】
特定の実施形態において、修飾された抗体がそれぞれの修飾された抗体のヒンジ領域にＣＨ３ドメインを直接融合させるように操作することができることが言及されるであろう。他の構築物では、ヒンジ領域と修飾されたＣＨ２及び／またはＣＨ３領域との間にペプチドスペーサーを提供することが望ましい可能性がある。例えば、ＣＨ２ドメインが欠失しており、残りのＣＨ３ドメイン（修飾されたまたは未修飾の）が５〜２０アミノ酸のスペーサーを伴ってヒンジ領域に連結される適合性の構築物が発現され得る。そのようなスペーサーを付加して、例えば、定常ドメインの調節要素が自由でアクセス可能なままであり、またはヒンジ領域が柔軟なままであることを保証することができる。しかしながら、アミノ酸スペーサーは、場合によっては、免疫原性であり、構築物に対する望ましくない免疫応答を引き出すことを明確に示し得ることが言及されるべきである。したがって、特定の実施形態において、構築物に付加される任意のスペーサーは、修飾された抗体の所望の生化学的な質を維持するように、相対的に非免疫原性であるか、またはさらに完全に省かれるであろう。
【０１０５】
定常領域ドメイン全体の欠失に加えて、本明細書に開示される抗体は、２、３のまたはさらには単一のアミノ酸の部分的な欠失または置換によって提供され得ることが十分に理解されるであろう。例えば、ＣＨ２ドメインの選択された領域における単一アミノ酸の変異は、Ｆｃ結合を実質的に減らすのに十分であり得、それによって腫瘍の局在化を増加させ得る。同様に、調節されるエフェクター機能（例えば、補体Ｃ１Ｑの結合）を制御する１つ以上の定常領域ドメインのその部分を単に欠失させることが望ましい可能性がある。定常領域のそのような部分的な欠失は、抗体の選択された特徴（血清の半減期）を改善し得る一方で、対象の定常領域に関連する他の望ましい機能は無傷のままである。さらに、上記について暗に示されるように、開示される抗体の定常領域は、得られる構築物のプロファイルを向上させる１つ以上のアミノ酸の変異または置換を介して修飾することができる。この点で、保存された結合部位（例えば、Ｆｃ結合）によって提供される活性を崩壊させることが可能である一方で、修飾された抗体の立体構造及び免疫原性プロファイルは維持される。特定の実施形態は、定常領域への１つ以上のアミノ酸の付加を含み得、例えば、エフェクター機能の増減のような望ましい特徴を向上させるか、またはさらなる細胞毒素もしくは炭水化物の連結を提供し得る。そのような実施形態において、選択された定常領域ドメインに由来する特定の配列を挿入するまたは反復することが望ましいことであり得る。
【０１０６】
本明細書に開示される抗体はまた、本明細書に記述されるキメラ抗体、ヒト化抗体、及びヒト抗体またはそれらの抗体断片に対して実質的に相同であるバリアント及び等価体を含む。これらは、例えば、保存的な置換変異、すなわち、類似のアミノ酸による１つ以上のアミノ酸の置換を含有することができる。例えば、保存的な置換は、例えば、別の酸性アミノ酸による酸性アミノ酸１つ、別の塩基性アミノ酸による塩基性アミノ酸１つ、または別の中性アミノ酸による中性アミノ酸１つのような同じ一般クラスの範囲内での別のアミノ酸によるアミノ酸の置換を指す。保存的なアミノ酸置換によって意図されるものは、当該技術分野で周知である。
【０１０７】
本明細書に開示されるＦＯＬＲ１結合剤は、ヒトＦＯＬＲ１に対する抗体を含む組換えポリペプチド、天然ポリペプチド、もしくは合成ポリペプチド、またはその断片であり得る。本発明の一部のアミノ酸配列は、タンパク質の構造または機能に有意に影響することなく変化し得ることが当該技術分野で認識されるであろう。本明細書に開示されるＦＯＬＲ１結合剤は、ヒト葉酸受容体タンパク質に対する抗体を含む組換えポリペプチド、天然ポリペプチド、もしくは合成ポリペプチド、またはその断片であり得る。そのような変異体には、欠失、挿入、逆位、反復、及び類型置換が含まれる。
【０１０８】
ポリペプチド及び類似体は、正常ではタンパク質の一部ではないさらなる化学部分を含有するようにさらに修飾することができる。これらの誘導体化された部分は、タンパク質の溶解性、生物学的半減期、または吸収を改善することができる。その部分はまた、タンパク質などの任意の妥当な副作用を軽減するまたは排除することができる。これらの部分の概説は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，２０ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（２０００）において見出すことができる。
【０１０９】
ＩＩＩ．検出の方法
本発明の方法は、試料中のＦＯＬＲ１を検出するための複数ステップのアプローチを提供する。特に、最初のイムノキャプチャステップは、試料中のＦＯＬＲ１を濃縮し、それに続いて、ＦＯＬＲ１のペプチドへの消化、及び液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ／ＭＳ）による分析のために実行される。ＬＣ／ＭＳによるペプチドの分析は、例えば、ＦＯＬＲ１を発現するがんに罹患している患者からの試料中のＦＯＬＲ１のレベルを含む、試料中に存在するＦＯＬＲ１のレベルを定量的に決定するのをさらに可能にする。いくつかの実施形態において、試料中のヒト葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）を検出する方法は、（ａ）固体支持体と結合したイムノキャプチャ試薬を用いて該葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）を捕捉することと、（ｂ）固体支持体からＦＯＬＲ１を溶出することと、（ｃ）溶出されたＦＯＬＲ１を消化することと、（ｄ）消化されたＦＯＬＲ１に対して液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ／ＭＳ）の分析を実行することと、を含み、該ＦＯＬＲ１は、少なくとも１つのシグネチャＦＯＬＲ１ペプチドのクロマトグラフィー分離及び質量分析応答をモニタリングすることにより検出される。ＦＯＬＲ１の検出のための他の既知の方法と比較して、本発明の方法は、増強した感度及び選択性の利点を提供する。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、ＦＯＬＲ１を含有する試料は、体液を含む。さらなる実施形態において、体液は、血漿、血清、または腹水であり得る。特定の実施形態において、試料は、血漿である。いくつかの実施形態において、試料は、末梢血試料を含む。いくつかの実施形態において、試料は、がんを有する患者から取得される。さらなる実施形態において、がんは、卵巣癌、肺癌、結腸直腸癌、膵臓癌、肝臓癌、乳癌、脳癌、腎臓癌、前立腺癌、消化管癌、黒色腫、子宮頸癌、膀胱癌、グリア芽腫、子宮内膜癌、腹膜の癌、及び頭頸部癌からなる群から選択される。特定の実施形態において、がんは、卵巣癌である。ある特定の実施形態において、がんは、子宮内膜癌である。特定の実施形態において、がんは、肺癌である。特定の実施形態において、肺がんは、非小細胞肺癌である。特定の実施形態において、非小細胞肺がんは、肺の腺癌である。
【０１１１】
ａ．イムノキャプチャ
初期のイムノキャプチャステップは、固体支持体と結合したイムノキャプチャ試薬を用いて試料において実行される。イムノキャプチャ試薬は、例えば、ＦＯＬＲ１と結合する抗体またはその抗原結合断片を含む、ＦＯＬＲ１と結合する任意の免疫学的試薬であってもよい。抗体または抗原結合断片が、イムノキャプチャ試薬として使用されるとき、抗体または抗原結合断片のＦＯＬＲ１との結合は、試料中のＩＭＧＮ８５３などの抗体ベースの活性剤のＦＯＬＲ１との結合によって競合的に阻害され得ない。さらに、抗体または抗原結合断片が、イムノキャプチャ試薬として使用されるとき、抗体または抗原結合断片のＦＯＬＲ１との結合は、試料中に存在する葉酸によって阻害され得ない。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、イムノキャプチャ試薬は、抗体ｍｕＦＲ１−９である。いくつかの実施形態において、イムノキャプチャ試薬は、抗体ｍｕＦＲ１−１３である。他の実施形態において、イムノキャプチャ試薬は、ｍｕＦＲ１−５３である。他の実施形態において、イムノキャプチャ試薬は、抗体ｍｕＦＲ１−６２である。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、イムノキャプチャ試薬は、配列番号１の可変重鎖（ＶＨ）相補性決定領域（ＣＤＲ）−１、配列番号２のＶＨ  ＣＤＲ−２、配列番号３のＶＨ  ＣＤＲ−３、配列番号１３の可変軽鎖（ＶＬ）相補性決定領域（ＣＤＲ）−１、配列番号１４のＶＬ  ＣＤＲ−２、及び配列番号１５のＶＬ  ＣＤＲ−３を含む、抗体または抗原結合断片である。いくつかの実施形態において、イムノキャプチャ試薬は、配列番号４のＶＨ  ＣＤＲ−１、配列番号５のＶＨ  ＣＤＲ−２、配列番号６のＶＨ  ＣＤＲ−３、配列番号１６のＶＬ  ＣＤＲ−１、配列番号１７のＶＬ  ＣＤＲ−２、及び配列番号１８のＶＬ  ＣＤＲ−３を含む、抗体または抗原結合断片である。いくつかの実施形態において、イムノキャプチャ試薬は、配列番号７のＶＨ  ＣＤＲ−１、配列番号８のＶＨ  ＣＤＲ−２、配列番号９のＶＨ  ＣＤＲ−３、配列番号１９のＶＬ  ＣＤＲ−１、配列番号２０のＶＬ  ＣＤＲ−２、及び配列番号２１のＶＬ  ＣＤＲ−３を含む、抗体または抗原結合断片である。いくつかの実施形態において、イムノキャプチャ試薬は、配列番号１０のＶＨ  ＣＤＲ−１、配列番号１１のＶＨ  ＣＤＲ−２、配列番号１２のＶＨ  ＣＤＲ−３、配列番号２２のＶＬ  ＣＤＲ−１、配列番号２３のＶＬ  ＣＤＲ−２、及び配列番号２４のＶＬ  ＣＤＲ−３を含む、抗体または抗原結合断片である。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、イムノキャプチャ試薬は、配列番号２５のＶＨ、及び配列番号２９のＶＬを含む、抗体または抗原結合断片である。いくつかの実施形態において、イムノキャプチャ試薬は、配列番号２６のＶＨ、及び配列番号３０のＶＬを含む、抗体または抗原結合断片である。いくつかの実施形態において、イムノキャプチャ試薬は、配列番号２７のＶＨ、及び配列番号３１のＶＬを含む、抗体または抗原結合断片である。いくつかの実施形態において、イムノキャプチャ試薬は、配列番号２８のＶＨ、及び配列番号３２のＶＬを含む、抗体または抗原結合断片である。いくつかの実施形態において、イムノキャプチャ試薬は、配列番号２５の配列と少なくとも９０％の同一性を有するＶＨ、及び配列番号２９の配列と少なくとも９０％の同一性を有するＶＬを含む、抗体または抗原結合断片である。いくつかの実施形態において、イムノキャプチャ試薬は、配列番号２５の配列と少なくとも９５％の同一性を有する可変重鎖（ＶＨ）、及び配列番号２９の配列と少なくとも９５％の同一性を有する可変軽鎖（ＶＬ）を含む、抗体または抗原結合断片である。いくつかの実施形態において、イムノキャプチャ試薬は、配列番号２６の配列と少なくとも９０％の同一性を有する可変重鎖（ＶＨ）、及び配列番号３０の配列と少なくとも９０％の同一性を有する可変軽鎖（ＶＬ）を含む、抗体または抗原結合断片である。いくつかの実施形態において、イムノキャプチャ試薬は、配列番号２６の配列と少なくとも９５％の同一性を有する可変重鎖（ＶＨ）、及び配列番号３０の配列と少なくとも９５％の同一性を有する可変軽鎖（ＶＬ）を含む、抗体または抗原結合断片である。いくつかの実施形態において、イムノキャプチャ試薬は、抗体または抗原結合断片を含む、抗体または抗原結合断片であり、配列番号２７の配列と少なくとも９０％の同一性を有する可変重鎖（ＶＨ）、及び配列番号３１の配列と少なくとも９０％の同一性を有する可変軽鎖（ＶＬ）を含む。いくつかの実施形態において、イムノキャプチャ試薬は、配列番号２７の配列と少なくとも９５％の同一性を有する可変重鎖（ＶＨ）、及び配列番号３１の配列と少なくとも９５％の同一性を有する可変軽鎖（ＶＬ）を含む、抗体または抗原結合断片である。いくつかの実施形態において、イムノキャプチャ試薬は、配列番号２８の配列と少なくとも９０％の同一性を有する可変重鎖（ＶＨ）、及び配列番号３２の配列と少なくとも９０％の同一性を有する可変軽鎖（ＶＬ）を含む、抗体または抗原結合断片である。いくつかの実施形態において、イムノキャプチャ試薬は、配列番号２８の配列と少なくとも９５％の同一性を有する可変重鎖（ＶＨ）、及び配列番号３２の配列と少なくとも９５％の同一性を有する可変軽鎖（ＶＬ）を含む、抗体または抗原結合断片である。
【０１１５】
一実施形態において、イムノキャプチャ試薬は、配列番号３３の配列を有する重鎖、及び配列番号３７の配列を有する軽鎖を含む、抗体または抗原結合断片である。別の実施形態において、イムノキャプチャ試薬は、配列番号３４の配列を有する重鎖、及び配列番号３８の配列を有する軽鎖を含む、抗体または抗原結合断片である。別の実施形態において、イムノキャプチャ試薬は、配列番号３５の配列を有する重鎖、及び配列番号３９の配列を有する軽鎖を含む、抗体または抗原結合断片である。別の実施形態において、イムノキャプチャ試薬は、配列番号３６の重鎖、及び配列番号４０の軽鎖を含む、抗体または抗原結合断片である。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、イムノキャプチャ試薬は、約１．０ｎＭ〜約１０ｎＭのＫｄでヒトＦＯＬＲ１と結合する、抗体または抗原結合断片である。他の実施形態において、イムノキャプチャ試薬は、約０．５ｎＭ〜約５ｎＭのＫｄでヒトＦＯＬＲ１と結合する、抗体または抗原結合断片である。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、イムノキャプチャ試薬は、ビオチン化される。いくつかの実施形態において、イムノキャプチャ試薬は、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用を介して固体支持体に結合される。いくつかの実施形態において、固体支持体は、質量分析イムノアッセイ（ＭＳＩＡ）マイクロカラムである。他の実施形態において、イムノキャプチャ試薬は、磁気ビーズを含む。
【０１１８】
初期のイムノキャプチャステップを実行するために、ＦＯＬＲ１を含有する試料は、固体支持体と結合したイムノキャプチャ試薬でインキュベートされる。洗浄ステップは、捕捉されたＦＯＬＲ１をさらに精製するために、イムノキャプチャステップ後に実行され得る。いくつかの実施形態において、１つ以上の洗浄ステップは、イムノキャプチャ試薬を用いた試料のインキュベーション後、及び捕捉されたＦＯＬＲ１の溶出前に実行される。いくつかの実施形態において、２つ以上の洗浄ステップは、捕捉されたＦＯＬＲ１の溶出前に実行される。いくつかの実施形態において、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０の洗浄ステップは、捕捉されたＦＯＬＲ１において実行される。いくつかの実施形態において、洗浄ステップは、捕捉されたＦＯＬＲ１を洗浄緩衝液と接触させることを含む。いくつかの実施形態において、洗浄緩衝液は、市販の洗浄緩衝液である。いくつかの実施形態において、洗浄ステップは、捕捉されたＦＯＬＲ１を塩溶液及び洗浄剤と接触させることを含む。いくつかの実施形態において、塩溶液は、４００ｍＭのＮａＣｌであり、洗浄剤は、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０である。
【０１１９】
イムノキャプチャ後、ＦＯＬＲ１は、溶出ステップを実行することによって固体支持体から放出される。いくつかの実施形態において、溶出ステップは、捕捉されたＦＯＬＲ１を酸性溶液と接触させることによって実行される。いくつかの実施形態において、酸性溶液は、市販の溶液である。いくつかの実施形態において、溶出液は、中和緩衝液の添加によって中性ｐＨにする。いくつかの実施形態において、中和緩衝液は、ｐＨ８で５００ｍＭの重炭酸アンモニウムである。いくつかの実施形態において、中和緩衝液は、市販の緩衝液である。
【０１２０】
ｂ．液体クロマトグラフィー−質量分析法
免疫捕捉及び溶出後、得られたＦＯＬＲ１タンパク質は、ペプチドに消化され、液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＬＣ／ＭＳ）によって分析される。いくつかの実施形態において、ＦＯＬＲ１を含有する溶液は、ＬＣ／ＭＳによる分析前に、還元及びアルキル化される。いくつかの実施形態において、ＦＯＬＲ１は、メタノールでアルキル化される。いくつかの実施形態において、ＦＯＬＲ１は、ＦＯＬＲ１をトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を含有する溶液と接触させることによって還元される。いくつかの実施形態において、１００ｍＭのＴＣＥＰを含有する溶液が、ＦＯＬＲ１を還元するために使用される。いくつかの実施形態において、システインブロッキング試薬を、アルキル化及び還元後に、ＦＯＬＲ１を含有する溶液に添加する。いくつかの実施形態において、システインブロッキング試薬は、ヨードアセトアミド（ＩＡＭ）である。いくつかの実施形態において、１００ｍＭのＩＡＭを含有する溶液を、ＦＯＬＲ１を含有する溶液に添加する。
【０１２１】
アルキル化及び還元後、ＦＯＬＲ１は、ペプチドに消化される。いくつかの実施形態において、ＦＯＬＲ１は、トリプシンで消化される。いくつかの実施形態において、ＦＯＬＲ１は、Ｌｙｓ−Ｃで消化される。いくつかの実施形態において、ＦＯＬＲ１は、トリプシン及びＬｙｓ−Ｃの混合物で消化される。いくつかの実施形態において、ＦＯＬＲ１は、ＦＯＬＲ１を、３０ｎｇ／μＬのトリプシン／Ｌｙｓ−Ｃを含有する５０ｍＭの重炭酸アンモニウム溶液と接触させることによって消化される。
【０１２２】
トリプシン／Ｌｙｓ−Ｃを用いたＦＯＬＲ１の消化は、ＬＣ／ＭＳによる試料の定量分析において有用なペプチドが生成される。いくつかの実施形態において、本発明の単離されたシグネチャペプチドは、ＦＯＬＲ１の消化産物で提供される。ＦＯＬＲ１の消化により生成されたシグネチャペプチドは、以下の表７に示される。
【表７】
2020532751.tif 000014
【０１２３】
ＦＯＬＲ１のペプチドへの消化後、ペプチドを含有する溶液は、ＬＣ／ＭＳ分析のために調製される。いくつかの実施形態において、ＬＣ／ＭＳ分析前に、界面活性剤を、ペプチドを含有する溶液に添加する。いくつかの実施形態において、界面活性剤は、質量分析法分析のために製剤化された市販の試薬である。いくつかの実施形態において、界面活性剤による反応を、１０％ギ酸を添加することによって反応停止させる。
【０１２４】
ＬＣ／ＭＳ分析のための試料の消化及び調製後、試料を、ＬＣ／ＭＳ装置に注入し、分析する。いくつかの実施形態において、ＦＯＬＲ１の少なくとも２つのシグネチャペプチドが選択され、ＬＣ／ＭＳの分析ステップでモニタリングされる。いくつかの実施形態において、ＦＯＬＲ１の少なくとも３つのシグネチャペプチドが選択され、ＬＣ／ＭＳの分析ステップでモニタリングされる。いくつかの実施形態において、ＦＯＬＲ１の少なくとも４つのシグネチャペプチドが選択され、ＬＣ／ＭＳの分析ステップでモニタリングされる。いくつかの実施形態において、選択され、ＬＣ／ＭＳのステップでモニタリングされた、少なくとも４つのシグネチャペプチドは、配列番号４２のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号４３のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号４４のアミノ酸配列を有するペプチド、及び配列番号４５のアミノ酸配列を有するペプチドを含む。いくつかの実施形態において、ＦＯＬＲ１レベルの定量的測定は、ＬＣ／ＭＳ分析によって提供される。さらなる実施形態において、試料中のＦＯＬＲ１のレベルは、試料中のＦＯＬＲ１のレベルをＦＯＬＲ１の基準レベルと比較することによって定量化される。ＬＣ／ＭＳ分析による分析の方法は、当該技術分野で公知であり、例えば、Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ．２０１５  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  １７；５：１６７３３、ｄｏｉ１０．１０３８／ｓｒｅｐ１６７３３に記載されている。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、試料中のＦＯＬＲ１の検出は、試料中のＩＭＧＮ８５３の存在によって阻害されない。いくつかの実施形態において、試料中のＦＯＬＲ１の検出は、試料中のｈｕＭｏｖ１９の存在によって阻害されない。いくつかの実施形態において、試料中のＦＯＬＲ１の検出は、試料中に存在する抗体または抗原結合断片の存在によって阻害されず、該抗体または抗原結合断片は、配列番号５９の可変軽鎖（ＶＬ）相補性決定領域（ＣＤＲ）−１、配列番号６０のＶＬ  ＣＤＲ−２、配列番号６１のＶＬ  ＣＤＲ−３、配列番号６２の可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ−１、配列番号６４のＶＨ  ＣＤＲ−２、及び配列番号６５のＶＨ  ＣＤＲ−３を含む。いくつかの実施形態において、試料中のＦＯＬＲ１の検出は、試料中に存在する抗体または抗原結合断片の存在によって阻害されず、該抗体または抗原結合断片は、配列番号５６の配列を有するＶＨ、及び配列番号５７または配列番号５８の配列を有するＶＬを含む。いくつかの実施形態において、ＦＯＬＲ１の検出は、試料中に存在する抗体または抗原結合断片の存在によって阻害されず、該抗体または抗原結合断片は、（ｉ）ＰＴＡ−１０７７２としてＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託されているプラスミドによってコードされる重鎖のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を含む重鎖、及び（ｉｉ）ＰＴＡ−１０７７４としてＡＴＣＣに寄託されているプラスミドによってコードされる軽鎖のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態において、試料中のＦＯＬＲ１の検出は、試料中の葉酸の存在によって阻害されない。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、少なくとも０．５ｎｇ／ｍＬのＦＯＲＬ１は、本発明の方法を実行することによって試料中で検出され得る。いくつかの実施形態において、少なくとも０．３ｎｇ／ｍＬのＦＯＬＲ１は、本発明の方法を実行することによって試料中で検出され得る。いくつかの実施形態において、少なくとも０．２５ｎｇ／ｍＬのＦＯＬＲ１は、本発明の方法を実行することによって試料中で検出され得る。いくつかの実施形態において、少なくとも０．２ｎｇ／ｍＬのＦＯＬＲ１は、本発明の方法を実行することによって試料中で検出され得る。いくつかの実施形態において、少なくとも０．１５ｎｇ／ｍＬのＦＯＬＲ１は、本発明の方法を実行することによって試料中で検出され得る。いくつかの実施形態において、少なくとも５の信号対雑音比は、本発明の方法を実行することによって観察される。いくつかの実施形態において、少なくとも６の信号対雑音比は、本発明の方法を実行することによって観察される。いくつかの実施形態において、少なくとも７の信号対雑音比は、本発明の方法を実行することによって観察される。いくつかの実施形態において、少なくとも８の信号対雑音比は、本発明の方法を実行することによって観察される。いくつかの実施形態において、少なくとも９の信号対雑音比は、本発明の方法を実行することによって観察される。いくつかの実施形態において、少なくとも１０の信号対雑音比は、本発明の方法を実行することによって観察される。
【０１２７】
ＩＶ．キット
便宜上、本発明のアッセイ方法は、キットの形態で提供され得る。そのようなキットは、（ａ）ＦＯＬＲ１と結合するイムノキャプチャ試薬であり得る第１の試薬、及び（ｂ）捕捉されたＦＯＬＲ１をペプチドに消化させることができる消化試薬の基本要素を含む包装された組み合わせである。このキットは、ＦＯＬＲ１に由来する少なくとも１つのペプチドをさらに含み得る。これらの基本要素は、上記及び以下の実施例において定義される。
【０１２８】
いくつかの実施形態において、イムノキャプチャ試薬は、ＦＯＬＲ１と結合する抗体または抗原結合断片を含む。さらなる実施形態において、イムノキャプチャ試薬は、配列番号１の可変重鎖（ＶＨ）相補性決定領域（ＣＤＲ）−１、配列番号２のＶＨ  ＣＤＲ−２、配列番号３のＶＨ  ＣＤＲ−３、配列番号１３の可変軽鎖（ＶＬ）相補性決定領域（ＣＤＲ）−１、配列番号１４のＶＬ  ＣＤＲ−２、及び配列番号１５のＶＬ  ＣＤＲ−３を含む、抗体または抗原結合断片である。他の実施形態において、イムノキャプチャ試薬は、配列番号４のＶＨ  ＣＤＲ−１、配列番号５のＶＨ  ＣＤＲ−２、配列番号６のＶＨ  ＣＤＲ−３、配列番号１６のＶＬ  ＣＤＲ−１、配列番号１７のＶＬ  ＣＤＲ−２、及び配列番号１８のＶＬ  ＣＤＲ−３を含む、抗体または抗原結合断片である。他の実施形態において、イムノキャプチャ試薬は、配列番号７のＶＨ  ＣＤＲ−１、配列番号８のＶＨ  ＣＤＲ−２、配列番号９のＶＨ  ＣＤＲ−３、配列番号１９のＶＬ  ＣＤＲ−１、配列番号２０のＶＬ  ＣＤＲ−２、及び配列番号２１のＶＬ  ＣＤＲ−３を含む、抗体または抗原結合断片である。他の実施形態において、イムノキャプチャ試薬は、配列番号１０のＶＨ  ＣＤＲ−１、配列番号１１のＶＨ  ＣＤＲ−２、配列番号１２のＶＨ  ＣＤＲ−３、配列番号２２のＶＬ  ＣＤＲ−１、配列番号２３のＶＬ  ＣＤＲ−２、及び配列番号２４のＶＬ  ＣＤＲ−３を含む、抗体または抗原結合断片である。
【０１２９】
いくつかの実施形態において、イムノキャプチャ試薬は、配列番号２５のＶＨ、及び配列番号２９のＶＬを含む、抗体または抗原結合断片である。他の実施形態において、イムノキャプチャ試薬は、配列番号２６のＶＨ、及び配列番号３０のＶＬを含む、抗体または抗原結合断片である。いくつかの実施形態において、イムノキャプチャ試薬は、配列番号２７のＶＨ、及び配列番号３１のＶＬを含む、抗体または抗原結合断片である。いくつかの実施形態において、イムノキャプチャ試薬は、配列番号２８のＶＨ、及び配列番号３２のＶＬを含む、抗体または抗原結合断片である。いくつかの実施形態において、イムノキャプチャ試薬は、配列番号２５〜２８のうちのいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有するＶＨを含む抗体を含む。いくつかの実施形態において、イムノキャプチャ試薬は、配列番号２５〜２８のうちのいずれか１つと少なくとも９５％の同一性を有するＶＨを含む抗体を含む。いくつかの実施形態において、イムノキャプチャ試薬は、配列番号２９〜３２のうちのいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有するＶＬを含む抗体を含む。いくつかの実施形態において、イムノキャプチャ試薬は、配列番号２９〜３２のうちのいずれか１つと少なくとも９５％の同一性を有するＶＬを含む抗体を含む。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、イムノキャプチャ試薬は、配列番号３３の配列を有する重鎖、及び配列番号３７の配列を有する軽鎖を含む、抗体または抗原結合断片である。他の実施形態において、イムノキャプチャ試薬は、配列番号３４の配列を有する重鎖、及び配列番号３８の配列を有する軽鎖を含む、抗体または抗原結合断片である。他の実施形態において、イムノキャプチャ試薬は、配列番号３５の配列を有する重鎖、及び配列番号３９の配列を有する軽鎖を含む、抗体または抗原結合断片である。他の実施形態において、イムノキャプチャ試薬は、配列番号３６の重鎖、及び配列番号４０の軽鎖を含む、抗体または抗原結合断片である。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、イムノキャプチャ試薬は、ｍｕＦＲ１−９である。他の実施形態において、イムノキャプチャ試薬は、ｍｕＦＲ１−１３である。いくつかの実施形態において、イムノキャプチャ試薬は、約１．０ｎＭ〜約１０ｎＭのＫｄでヒトＦＯＬＲ１と結合する、抗体または抗原結合断片である。他の実施形態において、イムノキャプチャ試薬は、約０．５ｎＭ〜約５ｎＭのＫｄでヒトＦＯＬＲ１と結合する、抗体または抗原結合断片である。いくつかの実施形態において、イムノキャプチャ試薬は、ビオチン化される。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、キットは、捕捉試薬のための固相支持体をさらに含み、それは、別個の要素として提供されることができ、またはその上に捕捉試薬がすでに固定化されている。したがって、キットにおける捕捉抗体は、固相支持体に固定化することができるか、またはそれらは、キットと共に含まれるもしくはキットとは別に提供されるそのような支持体に固定化することができる。いくつかの実施形態において、固相支持体は、質量分析イムノアッセイ（ＭＳＩＡ）マイクロカラムを含む。他の実施形態において、固相支持体は、磁気ビーズを含む。いくつかの実施形態において、固相支持体は、ストレプトアビジンでコーティングされる。いくつかの実施形態において、イムノキャプチャ試薬は、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用を介して固体支持体に結合される。
【０１３３】
いくつかの実施形態において、キットは、液体クロマトグラフィー−質量分析法分析における標準物質として使用することができる、少なくとも１つのＦＯＬＲ１ペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、キットは、配列番号４２の配列を含むペプチドを含む。いくつかの実施形態において、キットは、配列番号４３の配列を含むペプチドを含む。いくつかの実施形態において、キットは、配列番号４４の配列を含むペプチドを含む。いくつかの実施形態において、キットは、配列番号４５の配列を含むペプチドを含む。一実施形態において、キットは、液体クロマトグラフィー−質量分析法分析における標準物質として使用することができる、４つのシグネチャペプチドを含む。一実施形態におい、４つのシグネチャペプチドは、１）配列番号４２の配列を含むペプチド、２）配列番号４３の配列を含むペプチド、３）配列番号４４の配列を含むペプチド、及び４）配列番号４５の配列を含むペプチド、からなる。
【０１３４】
キットはまた、典型的には、アッセイを行うための取扱説明書、及び／または標準物質の役割を果たすＦＯＬＲ１タンパク質もしくはＦＯＬＲ１ペプチド、ならびに安定剤などの他の添加剤、洗浄及びインキュベーション緩衝液なども含有する。キットはまた、試料中のＦＯＬＲ１レベルの定量的測定についての取扱説明書を含むことができる。
【０１３５】
キットの構成成分は、所定の比で提供され、様々な試薬の相対量は、実質的にアッセイの感度を最大限にする、試薬の溶液中の濃度を提供するために好適に変化する。特に、試薬は、賦形剤を含む、通常、凍結乾燥された乾燥粉末として提供することができ、それは溶解の際、試験する試料と組み合わせるのに適切な濃度を有する試薬溶液を提供する。
【０１３６】
本開示の実施形態は、本開示の方法を詳細に説明する、以下の非限定的な実施例を参照することによってさらに定義することができる。材料及び方法の両方に対する多くの改変が、本開示の範囲から逸脱することなく実施され得ることが当業者に明らかである。
【実施例】
【０１３７】
本明細書で説明する実施例及び実施形態は、単に例示の目的のためであり、その観点での様々な改変または変更が当業者に示唆され、本出願の趣旨及び範囲内に含まれるべきであることが理解される。
【０１３８】
実施例１
ｓＦＲαイムノキャプチャ−ＬＣ／ＭＳアッセイ
ＥＬＩＳＡ系アッセイが開発され、ＷＯ２０１４／０３６４９５に記載されている。このアッセイは、ＦＯＬＲ１−Ｆｃ（ｈｕＦＯＬＲ１及びマウスＩｇＧ２Ａヒンジの融合ペプチド、ＣＨ２、ＣＨ３）、捕捉抗体としてｍｕＦＲ１−９、ならびにビオチン化ｍｕＦＲ１−１３でコーティングされたＥＬＩＳＡプレートを用いて実行された。アッセイは、基準が、高い信号対雑音比を有する再現可能な信号、ヒト血漿試料中の最小マトリックス効果、高再現性及び精密性、ならびに検出の最小限度である、組織的アプローチによって最適化された。選択された最適なＥＬＩＳＡ条件は、無視できる（ｎｅｇｌｉｂｉｂｌｅ）／低雑音を有するわずか２５ｎｇ／ｍＬのｓＦＲαの検出をもたらした。最適化条件にもかかわらず、このＥＬＩＳＡアッセイは、ｓＦＲαレベル及び病態の相関分析を可能にする、健常な対象におけるｓＦＲαレベルと卵巣癌患者におけるｓＦＲαレベルの分布の範囲を区別するのに十分な感度を提供しなかった。
【０１３９】
Ｋｕｒｏｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．２０１６  Ａｐｒｉｌ  １５；１３８（８）：１９９４−２００２において報告された２つの異なるヒトＦＲα特異的マウスモノクローナル抗体を用いたさらに近年のＥＬＩＳＡ系アッセイは、悪性卵巣腫瘍を有する疑いが臨床的にある患者の血清中のｓＦＲαのレベルを調査し、卵巣癌に対する診断マーカーとしてｓＦＲαを評価するために開発された。このＥＬＩＳＡアッセイは、２５０〜８０００ｐｇ／ｍＬのダイナミックレンジ、及び最低キャリブレータ（２５０ｐｇ／ｍＬ）に対する３．４の信号対雑音比を有した。このＥＬＩＳＡアッセイが、ｓＦＲα検出のより高感度のダイナミックレンジを提供したが、ＥＬＩＳＡ読み出しは、一般的には、４５０ｎｍで分光光度法で測定され、６２０ｎｍの吸光度で補正され、したがって、それほど選択的ではなく、さらに偽陽性結果を生成する可能性がある。
【０１４０】
感度及び選択性の両方の基準を満たした本発明のアッセイが、開発された。ＬＣ／ＭＳステップによるシグネチャペプチドの正確な測定は、一般的なＥＬＩＳＡ方法では提供されない第２のレベルの選択性を提供する。さらに、イムノキャプチャ−ＬＣ／ＭＳアッセイによって得られるｓＦＲαの検出の感度及び選択性はまた、このアッセイを、卵巣癌患者の予測及び／または予後バイオマーカーとしてｓＦＲαを探索する際に役立つ。
【０１４１】
図１に示すようにアッセイは、ビオチン化捕捉抗体（例えば、ｍｕＦＲ１−９またはｍｕＦＲ１−１３抗体などの本発明の抗体）溶液を、ストレプトアビジンをコーティングしたイムノキャプチャ培地（ＭＳＩＡマイクロカラムもしくは磁気ビーズ）でインキュベートするステップ、試料をイムノキャプチャ培地でインキュベートするステップ、複数の洗浄においてイムノキャプチャ培地を洗浄緩衝液、塩溶液、及び洗浄剤で洗浄するステップ、上清を廃棄するステップ、酸性溶液を用いてイムノキャプチャ培地からのｓＦＲαを放出するステップ、ならびにｓＦＲα溶液を中和し、続いて、還元及びアルキル化するステップを含む。次いで、試料を、トリプシン／Ｌｙｓ−Ｃで消化し、分析のためにＬＣ／ＭＳに注入する。ｓＦＲαの４つの異なるシグネチャペプチドが選択され、ＬＣ／ＭＳの分析ステップでモニタリングされた。具体的には、配列番号４２のペプチドは、タンパク質濃度を報告するために使用され、配列番号４３〜４５のペプチドは、確認のために使用された。
【０１４２】
試料調製中のアッセイ性能を改善する最適化ステップには、免疫捕捉効率を改善するための条件の変更、血漿マトリックスからの潜在的な干渉を除去するための洗浄手順、及び酵素消化効率を改善するための条件の変更が含まれる。ＬＣ／ＭＳ時の最適化ステップは、良好なクロマトグラフ分離及び質量分光反応を提供するシグネチャペプチド配列を特定することを含む。イムノキャプチャの自動化オプションは、ＭＳＩＡマイクロカラム技術及び磁気ビーズ処理で評価された。両方のオプションは、９６ウェルプレートの使用と互換性があり、試料スループットを大幅に改善し、同様の感度が両方の自動化プラットフォームで観察された。評価はまた、抗原枯渇血漿または代理マトリックスのいずれかを使用したアッセイでも実施された。
【０１４３】
作業アッセイパラメータは、次のとおりである：８．５時間のイムノキャプチャ及び酵素消化を含む試料処理、試料当たり１０分のＬＣ／ＭＳ分析、５％ＢＳＡ、ＰＢＳ（代替マトリックス、０．６５ｎｇ／ｍＬ〜４０．６３ｎｇ／ｍＬ）、０．３ｍＬの試料容量、ＬＬＯＱレベルの４つのシグネチャペプチドの１０超のＳ／Ｎ、ＬＬＯＱ（±２５％）を除く公称値の±２０％のＳＴＤ受け入れ基準、公称値の±２０％のＱＣ受け入れ基準。
【０１４４】
実施例２
ｓＦＲαイムノキャプチャ−ＬＣ／ＭＳアッセイを用いたヒト血漿試料のデータ分析
実験は、上記のパラメータを使用して、０．３ｎｇ／ｍＬの代替マトリックスに低レベルのｓＦＲαを含む試料中のｓＦＲαのレベルを測定するために設計された。図２に示すように、これらの実験の結果は、非常に低いレベルのｓＦＲαがイムノキャプチャ−ＬＣ／ＭＳアッセイによって測定することができることを示す。実験はまた、正常なヒト血漿試料中のｓＦＲαのレベルを測定するために設計された。図３に示すように、約０．５ｎｇ／ｍＬで見られるｓＦＲαの内因性レベルは、イムノキャプチャ−ＬＣ／ＭＳアッセイによって測定することができる。図４は、増加したｓＦＲαを伴う患者の服用前試料から抽出されたイオンクロマトグラムを示す。この実験の結果は、ｓＦＲαの増加したレベルを有する患者血漿試料が、正常なヒト血漿試料の内因性レベルの試料とは明らかに区別することができることを示す。
【０１４５】
実験は、血漿試料中のＦＲαを標的とする免疫複合体、ＩＭＧＮ８５３の存在下でのアッセイ耐性を試験するために設計された。ｓＦＲα  ＱＣ試料は、低、中、高レベルで血漿中に調製し、ＩＭＧＮ８５３を予測Ｃｍａｘ濃度でスパイクし、ＩＭＧＮ８５３なしで血漿中に調製したｓＦＲα  ＱＣ試料と比較した。ＱＣ試料のいずれのセットでも干渉は観察されず、試料の両方のセットには同様の応答を有する。
【０１４６】
これらの実験の結果は、本発明のイムノキャプチャ−ＬＣ／ＭＳアッセイが、感度が増加しており（０．３ｎｇ／ｍＬ、少なくとも１０の信号対雑音比、すなわち、当該技術分野でのＥＬＩＳＡアッセイよりも２倍感度が高い）、ＦＲαを標的とする免疫複合体の存在及び不存在下でのヒト血漿試料中のｓＦＲαを測定するための選択性を向上していることを示す。
【０１４７】
本明細書に引用される全ての刊行物、特許、特許出願、インターネットサイト、及び受入番号／データベース配列（ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列の両方を含む）は、各個々の刊行物、特許、特許出願、インターネットサイト、または受入番号／データベース配列が参照により組み込まれることが具体的かつ個々に示されているのと同程度に、全ての目的についてそれらの全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2020532751.tif 000020
2020532751.tif 000021
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