(57)【要約】神経保護、神経障害または神経損傷に対して保護するまたはそれらを軽減すること、緑内障を治療すること、加齢黄斑変性または他の遺伝性もしくは後天性網膜変性を治療すること、網膜組織修復を増強すること、先天性免疫細胞の活性化による網膜再生治療を増強すること、あるいは遺伝性もしくは後天性の網膜変性を治療することのような効果を引き起こすための非天然ペプチドおよびそれらのヒトまたは非ヒト動物対象における使用方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経保護、神経障害もしくは神経損傷に対して保護することまたはそれらを軽減すること、緑内障を治療すること、加齢黄斑変性または他の遺伝性もしくは後天性網膜変性を治療すること、網膜組織修復を増強すること、先天性免疫細胞の活性化による網膜再生治療を増強すること、あるいは遺伝性もしくは後天性の網膜変性を治療すること、から選択される効果をヒトまたは非ヒト動物対象に誘導するための方法において、前記方法は、
前記効果を引き起こすのに有効な量で、前記効果を引き起こす非天然ペプチドを対象に投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記ペプチドが、グリシニル−アルギニル−グリシニル−システイン酸−スレオニル−プロリンまたはそのフラグメント、同族体、誘導体、薬学的に許容される塩、水和物、異性体、多量体、環状形態、直鎖状形態、共役形態、誘導体もしくは他の修飾形態を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組成物が有効量の化合物１を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記組成物が有効量の化合物２を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記方法が、通常より高い眼内圧による視神経および網膜のうちの少なくとも一方の損傷に対して保護するかまたは同損傷を軽減させるために行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記方法が、緑内障、加齢黄斑変性症または網膜色素変性症のような他の遺伝性若しくは後天性の網膜変性に罹患している対象における視神経および網膜のうちの少なくとも一方の損傷に対する保護、同損傷の軽減あるいは損傷後の機能の回復のために行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記方法が、神経に対して外傷性の損傷または機械的損傷を受けた対象を治療するために行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記方法が、脳、脊髄、または末梢神経系に対して外傷性の損傷または機械的損傷を受けた対象を治療するために行われる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記方法が、脳への外傷または低酸素性傷害を受けた対象において行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記方法が、脊髄への外傷または低酸素性傷害を受けた対象において行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記方法が、眼科的または全身的である、神経障害性または神経変性性の疾患もしくは障害による神経損傷を保護または軽減するために行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記方法が、心停止、脳卒中、または低酸素性傷害の後の脳または他の神経系の損傷に対して保護するかまたはそれらを減少させるために行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記方法が、心停止、脳卒中、低酸素性傷害、または外傷の後の脳または他の神経系の損傷の減少後に機能を回復させるために行われる、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に生物学および医学の分野に関し、より詳細には、神経変性疾患または神経障害性疾患（例えば、緑内障、網膜色素変性症、遺伝性もしくは後天性網膜変性症、末梢神経障害、神経変性中枢神経系（ＣＮＳ）もしくは末梢障害）、低酸素性傷害（例えば、心停止もしくは脳卒中）或いは機械的損傷（例えば、外傷、脊髄損傷）に起因する神経損傷の治療に使用でき、並びに網膜および神経組織の修復を増強するのに有用で、免疫調節機能の改善による網膜および神経再生療法に対して有用である、神経保護ペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
３７ＣＦＲ１．７１（ｅ）に従い、本特許文書は著作権保護の対象となる資料を含み、本特許文書の所有者はすべての著作権を留保する。
外傷性神経損傷および低酸素性傷害に加えて、様々な疾患が神経変性作用または神経障害作用を引き起こすことが知られている。例えば、緑内障は、視神経乳頭の陥凹または「カッピング（ｃｕｐｐｉｎｇ）」、網膜神経節細胞の変性、およびその結果として生じる視野喪失を引き起こす視神経症である。眼圧上昇（ＩＯＰ）は緑内障の進行にとって主要な危険因子であるので、多くの治療戦略が眼圧の低下を目的としてきた。
【０００３】
最近の研究は、緑内障にて起こる神経変性は、中枢神経系（ＣＮＳ）のニューロンに対する外傷性損傷の後に起こるものと同様のプロセスに起因し得ることを示唆している。例えば、ＣＮＳ損傷後に、特定の神経毒性物質のレベルが細胞外液中で増加することが見られる。これらの毒性物質は、その後、一次外傷の結果として起こった機械的損傷に加えて、二次ニューロン損傷を引き起こすと考えられている。これらの神経毒性物質の作用を予防または減少させることができる薬物は、眼の神経保護剤としてのみならず、脳および脊髄を含む他の神経組織への傷害または外傷後の神経細胞死もしくは神経障害を減少させる上で有用な神経保護剤を開発するための候補であり得る。非特許文献１および非特許文献２を参照されたい。
【０００４】
本出願人は現在、多数のインテグリンを阻害し、そして眼に投与されると硝子体分解、後部硝子体網膜剥離（ＰＶＤ）を引き起こし、滲出型黄斑変性症（ＷＭＤ）、糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）および硝子体黄斑牽引（ＶＭＴ）などの眼疾患の治療に有用な合成オリゴペプチド（Ｌｕｍｉｎａｔｅ（登録商標）、Ａｌｌｅｇｒｏ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃｓ、ＬＬＣ）を開発している。本明細書中に記載されるように、本出願人は、この合成オリゴペプチドはまた、視神経変性のラットモデルにおいて神経保護効果を示し、そして上述のように、外傷性損傷に関連する二次ニューロン損傷のような他の種類の神経損傷または神経変性を予防または回復するためにも有効であり得ることを発見した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｙｏｌｅｓ，Ｅ．他、「２−アドレナリン受容体作動薬は視神経変性のラットモデルにおいて神経保護的である（ａ  ２−Ａｄｒｅｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ａｇｏｎｉｓｔｓ  Ａｒｅ  Ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｎ  ａ  Ｒａｔ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｏｐｔｉｃ  Ｎｅｒｖｅ  Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）」、Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ＆Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．４０，Ｎｏ．１，ｐｐ．６５−７３（１９９９年１月）
【非特許文献２】Ｎｅｕｆｅｌｄ，Ａ．Ｈ．他、「アミノグアニジンによる一酸化窒素シンターゼ２の阻害は慢性緑内障のラットモデルにおいて網膜神経節細胞の神経保護を提供する（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｉｔｒｉｃ−Ｏｘｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈａｓｅ  ２  ｂｙ  Ａｍｉｎｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ  Ｐｒｏｖｉｄｅｓ  Ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｔｉｎａｌ  Ｇａｎｇｌｉｏｎ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ａ  Ｒａｔ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｇｌａｕｃｏｍａ）」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９６（１９９９）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明に従って、ヒトまたは非ヒト動物の対象において、神経保護、神経障害もしくは神経損傷に対して保護すること（ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ）またはそれらを軽減すること（ｌｅｓｓｅｎｉｎｇ）、緑内障を治療すること、加齢黄斑変性または他の遺伝性もしくは後天性の網膜変性を治療すること、網膜組織修復を増強すること、先天性免疫細胞の活性化による網膜再生治療を増強すること、あるいは遺伝性または後天性の網膜変性を治療すること、から選択される効果を誘導するための方法が提供される。そのような方法は、そのような効果を引き起こすのに効果的な量で、そのような効果を引き起こす非天然ペプチドを対象に投与することを含む。
【０００７】
本発明に従って、ペプチドは、前記効果を引き起こすグリシニル−アルギニル−グリシニル−システイン酸−スレオニル−プロリン（Ｇｌｙｃｉｎｙｌ−Ａｒｇｉｎｙｌ−Ｇｌｙｃｉｎｙｌ−Ｃｙｓｔｅｉｃ−Ｔｈｒｅｏｎｙｌ−Ｐｒｏｌｉｎｅ）を含み、その任意のフラグメント、同族体、誘導体、薬学的に許容される塩、水和物、異性体、多量体、環状形態、直鎖状形態、共役形態、誘導体または他の修飾形態を含み得る。本発明の方法において使用可能な他の非天然ペプチドは、２０１７年６月１９日に出願された同時係属中の米国仮特許出願第６２／５２１，９８４号に記載の化合物のうちの特定のものを含んでいてもよく、同米国仮特許出願第６２／５２１，９８４号は、その開示全体が参照により本明細書中に明確に組み込まれる。
【０００８】
さらにまた本発明に従って、本発明の方法は、緑内障、加齢黄斑変性（ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｍａｃｕｌａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、萎縮型加齢黄斑変性（ｄｒｙ  ｍａｃｕｌａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、または網膜色素変性症のようなその他の遺伝性もしくは後天性の網膜変性に罹患した対象において、視神経および／または網膜への損傷に対する保護、視神経および／または網膜への損傷の軽減、あるいは視神経および／または網膜への損傷後の機能回復のために実施され得る。
【０００９】
さらにまた本発明に従って、同方法は、脳、脊髄、ＣＮＳまたは末梢神経系に対する外傷、機械的損傷または傷害（ｉｎｓｕｌｔ）（例えば、低酸素性または虚血性傷害）を患っている対象を治療するために実施することができる。
【００１０】
さらにまた本発明に従って、同方法は、心停止、脳卒中、低酸素性もしくは虚血性傷害、疾患、障害または外傷が含まれるがこれらに限定されない疾病、損傷、傷害のような神経または脳を損傷する事象の後に、脳または対象の神経系の他の部分の減弱した機能を治療または回復させるために実施することができる。
【００１１】
さらにまた本発明に従って、同方法は、眼であれ全身的であれ、神経障害性もしくは神経変性の疾患もしくは障害による神経損傷に対して保護するまたはそれらを軽減するために実施することができる。
【００１２】
本発明のさらなる態様および詳細は、以下に記載される詳細な説明および実施例を読むことによって理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】対照と比較したＬｕｍｉｎａｔｅでの処置を以下に記載する実施例１に記載されるように試験された、視野（ｆｉｅｌｄ）の数と比較した、各視野における神経節細胞の数を比較する棒グラフである。
【図２】対照と比較したＬｕｍｉｎａｔｅでの処置を以下に記載する実施例１に記載されるように、全視野における総細胞数を、Ｌｕｍｉｎａｔｅでの処置および対照における総細胞数と比較した棒グラフである。
【図３】以下の実施例２に記載されるように、対照および処置プレートにおける網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞数を比較する棒グラフである（凡例：Ｃｏｎｔ＝対照（ＢＳＳ）での処置、Ｌｕ＝Ｌｕｍｉｎａｔｅ（のみ）での処置、Ｈ２Ｏ２  １００μＭ＝過酸化物（のみ）での処置、；Ｌｕ  Ｈ２Ｏ２  １００μＭ＝Ｌｕｍｉｎａｔｅでの処置後に過酸化物で処置）。
【図４】以下の実施例３に記載されているように、対照および処置プレートにおける網膜ミュラー細胞数を比較する棒グラフである（凡例：Ｃｏｎｔ＝対照（ＢＳＳ）での処置、Ｌｕ＝Ｌｕｍｉｎａｔｅ（のみ）での処置、ＫＡ＝キアン酸（Ｋｉａｎｉｃ  Ａｃｉｄ）（のみ）での処置、ＫＡ−Ｌｕ  ５００μＭ＝Ｌｕｍｉｎａｔｅでの処置後にキアン酸で処置）。
【図５】以下の実施例４に記載されるように、対照または漸増用量の神経毒性薬カイニン酸で処置されたラットから採取された網膜組織の組織学的顕微鏡写真を示す。
【図６】以下の実施例５に記載されるように、対照および処置プレートにおける網膜神経細胞数を比較する棒グラフである（凡例：Ｃｏｎｔ＝対照（ＢＳＳ）での処置；Ｌｕ＝Ｌｕｍｉｎａｔｅ（のみでの）処置、ＫＡ  １００μＭ＝キアン酸（Ｋｉａｎｉｃ  Ａｃｉｄ）（のみでの）処置、Ｌｕ−ＫＡ  １０μＭ＝Ｌｕｍｉｎａｔｅでの処置後にキアン酸で処置）。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下の詳細な説明および実施例は、必ずしもすべてではないが、本発明の実施例または実施形態のいくつかを非網羅的に説明する目的で提供されており、それらは決して本発明の範囲を限定するものではない。
【００１５】
以下の詳細な説明およびそれが参照する添付の図面は、本発明のいくつかの実施例または実施形態（必ずしもすべてではないが）を説明することを意図している。説明した実施形態は、あらゆる点で例示的なものにすぎず、限定的なものではないと見なされるべきである。この詳細な説明および添付の図面の内容は、決して本発明の範囲を限定するものではない。
【００１６】
本出願人は、以下の化合物１の構造式を有する非天然ペプチドであるグリシニル−アルギニル−グリシニル−システイン酸−スレオニル−プロリンを含む化合物（ＡＬＧ−１００１またはＬｕｍｉｎａｔｅ（登録商標）（Ａｌｌｅｇｒｏ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃｓ，ＬＬＣ）とも呼ばれる）の安全性および神経保護効果を研究した。
【００１７】
【化１】
2020505365.tif 000002
【００１８】
環状形態の非天然ペプチドであるグリシニル−アルギニル−グリシニル−システイン酸−スレオニル−プロリンを、化合物２として以下に示す。
【００１９】
【化２】
2020505365.tif 000003
【００２０】
化合物１および２、ならびに他の関連化合物は、同時係属中の米国特許出願第１３／４６７，９９５号および第１４／６９６，２５０号に記載されており、これら各出願の開示の全ては参照により本明細書に明確に組み込まれる。
【実施例】
【００２１】
実施例１：眼圧が上昇したインビボラットモデルにおける眼神経保護
１０週齢の健康なウィスターラット（ｎ＝８）を、２６℃の一定温度にて、一定の明暗周期（それぞれ１４時間および１０時間）で、飼料を自由に摂取できる状態に維持した飼育施設で飼育した。ラットを５匹の動物からなるＬｕｍｉｎａｔｅ処置群（グループＡ）と３匹の動物からなる塩基性塩溶液（Ｂａｓｉｃ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（ＢＳＳ対照）処置群（グループＢ）に無作為に分けた。
【００２２】
グループＡの動物はそれぞれが、右眼に１．２８ｍｇ／２０μＬのＬｕｍｉｎａｔｅの１回の硝子体内注射を受けた。グループＢの動物はそれぞれが、２０μＬの平衡塩類溶液（ＢＳＳ）の１回の硝子体内注射を受けた。グループＡおよびグループＢの全ての動物の左眼には注射をせず、未処置対照として使用した。硝子体内注射は、１．０ｃｃの注射器に取り付けられた３０ゲージの針を使用して、鼻腔上象限の縁の２ｍｍ後方に投与した。水晶体または網膜の損傷を避けるように注意した。
【００２３】
注射による投与の２４時間後、塩酸ケタミン（２．５ｍｇ／ｍＬ）、ジアゼパム（２．０ｍｇ／ｍＬ）およびアトロピン（０．１ｍｇ／ｍＬ）の３．０ｍＬ／ｋｇの混合物を腹腔内注射することによってラットを麻酔した。次いで、視神経を露出させるために、眼を外側直筋の腹膜（ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ）結膜剥離に供した。次いで、視神経を絹縫合糸で６０分間結紮し、その間に各結紮眼の網膜に血流がないことを、Ｐｌａｎｏコンタクトレンズを用いた検査によって確認した。結紮糸を６０分後に除去し、網膜への血流の回復を、Ｐｌａｎｏコンタクトレンズを使用して、以前に結紮した各眼において確認した。
【００２４】
結紮糸を除去し、網膜血流が回復したことを確認した後、ラットを４８時間生存させた後、腹部大動脈および下大静脈を通して、１０％ホルムアルデヒドの２００ｍＬで灌流することによって屠殺した。
【００２５】
次いで、眼を摘出し、そして病理組織学的分析のために固定した。各眼からの網膜および視神経の標本を脱水し、パラフィンに包埋した。厚さ４ミクロン（μｍ）の水平切片を切断し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。光学顕微鏡下で、神経節細胞数を、鋸状縁（ｏｒａ  ｓｅｒｒａｔａ）から視神経まで、各眼の網膜の軸方向切片において計数した。また、各切片において、網膜の全長にわたるミリメートル当たりの神経節細胞の数を、この目的のために較正された測定スライドを用いてデジタル処理で計算した。
【００２６】
内網状層の測定は、スライドを視神経から４０ｍｍ×１ｍｍ以下の倍率で観察することによって実施した。
結果を統計分析に付した。各グループについての結果は平均±標準偏差として表し、グループの結果の間の統計的有意性は二元配置分散分析（２  ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）およびマン・ホイットニーのＵ検定によって評価した。＜０．０５の確率が有意であると見なされた。
【００２７】
以下の表１は、Ｌｕｍｉｎａｔｅ（登録商標）処置された５つの眼と、ＢＳＳ処置された３つの眼（対照）についての１視野当たり（ｐｅｒ  ｆｉｅｌｄ）の神経節細胞の数を示す。
【００２８】
【表１】
2020505365.tif 000004
【００２９】
以下の表２は、表１に記載のデータの二元配置分散分析を示す。グループＡはＡＬＧ１００１で処置した（ｒｅａｔｅｄ）眼からなり、グループＢはＢＳＳで処置した（対照）眼からなる。
【００３０】
【表２】
2020505365.tif 000005
【００３１】
表３は、表２に表示されたＡＮＯＶＡ分析の表形式の（ｔａｂｕｌａｒ）結果を示し、Ｌｕｍｉｎａｔｅ処置眼（グループＡ）とＢＳＳ処置（対照）眼（グループＢ）との間の統計的に有意な差（ｐ＜０．０００１）を示している。
【００３２】
【表３】
2020505365.tif 000006
【００３３】
図１は、Ｌｕｍｉｎａｔｅ処置と対照について試験した、各視野における神経節細胞の数対視野数（ｔｈｅ  ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  ｆｉｅｌｄｓ）の棒グラフであり、平均間の差を示している。
【００３４】
表４は、マン・ホイットニーＵ検定の表形式の結果を示し、これもまた、Ｌｕｍｉｎａｔｅ処置眼（グループＡ）とＢＳＳ処置（対照）眼（グループＢ）との間の統計的に有意な差（ｐ＜０．０００１）を示す。
【００３５】
【表４】
2020505365.tif 000007
【００３６】
図２は、マン・ホイットニーＵ検定を用いて、Ｌｕｍｉｎａｔｅ処置眼（グループＡ）とＢＳＳ処置（対照）眼（グループＢ）との間の視野あたりの神経節細胞数の平均を比較する棒グラフである。
【００３７】
実施例１のこれらのデータから、有効量のグリシニル−アルギニル−グリシニル−システイン酸−スレオニル−プロリンペプチド（Ｌｕｍｉｎａｔｅ）を含む製剤の硝子体内投与は、このＩＯＰ上昇ラットモデルにおいて有意な神経保護効果を有していたと結論づけられる。上記のように、この動物モデルにおける緑内障誘発性の眼の神経細胞損傷の陽性の結果は、眼の神経保護剤としての有用性を示すのみならず、脳や脊髄を含む他の神経組織への傷害や外傷後の神経細胞死または神経機能障害を軽減するのに有用な神経保護剤としての有用性も示す。
【００３８】
実施例２
網膜色素上皮（ＲＰＥ）におけるＬｕｍｉｎａｔｅのインビトロ神経保護効果
酸化ストレスの生理学的メディエーターである過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞においてアポトーシスを誘導することが知られている。
【００３９】
ＡＲＰＥ−１９細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび５０μｇ／ｍｌペニシリンを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中、５％ＣＯ２の雰囲気下で３７℃でインキュベートした。分化を誘導するために、ＡＲＰ−１９細胞を、１％ＦＢＳおよび抗生物質を補充した同じ培地中で２週間、ラミニン被覆トランスウェル中で培養した。次いで、ＲＰＥ細胞を単離し、そして約１５０μｌ〜２００μｌの細胞懸濁液のアリコートを、対照培地を含むペトリ皿に分配した。次いで細胞を使用前に３７℃で２４時間インキュベートした。
【００４０】
その後、以下に示すように、次の４つの別個の神経細胞皿を調製した。
Ａ）対照網膜ＲＰＥ細胞；
Ｂ）１．０ｍｇ／ｍｌのＡＬＧ−１００１（Ｌｕｍｉｎａｔｅ）と共にインキュベートした網膜ＲＰＥ細胞；
Ｃ）１００μＭの過酸化水素と共にインキュベートした網膜ＲＰＥ細胞；および
Ｄ）１．０ｍｇ／ｍｌのＡＬＧ−１００１（Ｌｕｍｉｎａｔｅ）と共に２４時間インキュベートした後、１００μＭの過酸化水素に暴露した網膜ＲＰＥ細胞。
【００４１】
暴露の８時間後、細胞数をノイバウエル・チャンバ（Ｎｅｕｂａｕｒ  Ｃｈａｍｂｅｒ）中でトリパンブルー排除アッセイを用いて測定した。図３は、プレートＡ、Ｂ、ＣおよびＤにおけるＲＰＥ細胞数を比較する棒グラフである。実施例２のこれらのデータは、過酸化水素単独で処置したプレート（プレートＣ）中のＲＰＥ細胞数が対照細胞数（プレートＡ）のわずか７８％であるという事実によって証明されるように、過酸化水素がＲＰＥ細胞に対して毒性であることを示す。しかしながら、過酸化水素暴露前にＡＬＧ−１００１（Ｌｕｍｉｎａｔｅ）で前処置したプレート（プレートＤ）中のＲＰＥ細胞数は対照細胞数（プレートＡ）の９０％であり、それによりＡＬＧ−１００１（Ｌｕｍｉｎａｔｅ）での前処置は、このインビトロモデルにおいて神経保護効果を有することが示された。
【００４２】
実施例３
網膜ミュラー細胞におけるＬｕｍｉｎａｔｅのインビトロ神経保護効果
ＣＤ１マウスを断頭によって安楽死させ、眼を迅速に摘出して抗生物質溶液を含むＤＭＥＭ補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）中に入れて、室温で一晩保存した。その後、無傷の眼球を、０．１％トリプシンおよび７０Ｕ／ｍｌコラゲナーゼを含有するＤＭＥＭ中、３７℃で６０分間インキュベートした。
【００４３】
インキュベートした材料を、１０％ウシ胎児血清を補充したＤＭＥＭを含有するペトリ皿に入れ、ＲＰＥ細胞なしで網膜を取り出して小さな凝集体（ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ）にし、３５ｍｍ培養皿に播種した。培地は６日間変更せず、その後３〜４日ごとに補充した。培養物を加湿インキュベーター内で５５％ＣＯ２／９５％Ｏ２中３７℃に維持した。
【００４４】
細胞増殖が半流動性に達したとき、培地を皿にピペットで入れることによって（８０％）網膜凝集体を除去した。精製した平坦細胞集団が得られるまで、この操作を３回繰り返した。２４時間後、細胞を実験条件にさらした。
【００４５】
以下のようにして、４つの別個のミュラー細胞皿を調製した：Ａ）対照ミュラー細胞；Ｂ）１．０ｍｇ／ｍｌのＡＬＧ−１００１（Ｌｕｍｉｎａｔｅ）と共にインキュベートしたミュラー細胞；Ｃ）５００μＭのカイニン酸と共にインキュベートしたミュラー細胞；およびＤ）５００μＭのカイニン酸に暴露する前に２４時間の間、１．０ｍｇ／ｍｌのＬｕｍｉｎａｔｅとインキュベートしたミュラー細胞。暴露の４８時間後、細胞数をノイバウエル・チャンバ中でトリパンブルー排除アッセイを用いて測定した。
【００４６】
図４は、プレートＡ、Ｂ、ＣおよびＤにおけるミュラー細胞数を比較する棒グラフである。これらのデータは、５００μＭのカイニン酸に暴露する前に２４時間の間、１．０ｍｇ／ｍｌのＬｕｍｉｎａｔｅと共にインキュベートしたプレート（プレートＤ）が他のプレート（Ａ、ＢまたはＣ）のいずれよりも高いミュラー細胞数を有し、Ｌｕｍｉｎａｔｅでの前処置なしでカイニン酸チャレンジを受けたプレート（プレートＣ）よりも実質的により多いミュラー細胞数であった。
【００４７】
暴露の４８時間後に、細胞数を、ノイバウエル・チャンバ中でトリパンブルー排除アッセイを用いて測定した。図４は、プレートＡ、Ｂ、ＣおよびＤにおけるミュラー細胞数を比較する棒グラフである。これらのデータは、５００μＭのカイニン酸に暴露する前に２４時間の間、１．０ｍｇ／ｍｌのＬｕｍｉｎａｔｅと共にインキュベートしたプレート（プレートＤ）が他のプレート（Ａ、ＢまたはＣ）のいずれよりも高いミュラー細胞数を有し、Ｌｕｍｉｎａｔｅでの前処置なしでカイニン酸チャレンジを受けたプレート（プレートＣ）よりも実質的により多いミュラー細胞数であった。
【００４８】
実施例４
カイニン酸のインビボ用量関連神経毒性作用
４匹のウィスターラットの右眼に、以下のように４種類の異なる溶液の２０μｌを硝子体内注射した：Ａ）対照としてのＢＳＳ溶液；Ｂ）０．５ｍＭのカイニン酸；Ｃ）５．０ｍＭのカイニン酸；およびＤ）５０．０ｍＭのカイニン酸。
【００４９】
ラットを処置の２４時間後に屠殺し、そして眼を組織病理学的検査のために調製した。図５は、４つの処置眼のそれぞれについての代表的な組織学的切片を示す。
結果は、カイニン酸の濃度が０．５ｍＭから、５．０ｍＭへ、５０．０ｍＭへ増加するにつれて、ウィスターラット網膜の変性があったことを明らかに実証している。これは、カイニン酸がインビトロにおいて用量に関連した網膜神経毒性を引き起こすことを確認するものであり、そして本特許出願の実施例２、３および５のようなインビトロでカイニン酸処置した網膜細胞を使用する試験の関連性を確認するものである。
【００５０】
実施例５
網膜神経細胞に対するＬｕｍｉｎａｔｅのインビトロ神経保護作用
ＣＤ１マウスを断頭により安楽死させ、眼を迅速に摘出して抗生物質溶液を含むＤＭＥＭ補体中に入れて、網膜を色素上皮から単離した。
【００５１】
単離した網膜を、２．５ｍｇ／ｍｌのパパインおよび０．１ｍｇ／ｍｌのシステインを含有するハンクス培地中にて、３０℃で１５分間インキュベートした。ハンクス培地をすすいだ後、１．９ｍＭのＣａＣｌ２、０．６ｍＭのＭｇＣｌ２および０．１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを補充した。
【００５２】
網膜を機械的に剥離させ、約１５０μｌ〜２００μｌの細胞懸濁液を、対照培地を含むペトリ皿に分配した。細胞形態により、双極細胞を顕微鏡下で同定した。細胞を使用前に６時間インキュベートした。
【００５３】
以下のようにして、４つの別個の神経細胞皿を調製した：Ａ）対照網膜神経細胞；Ｂ）１．０ｍｇ／ｍｌのＡＬＧ−１００１（Ｌｕｍｉｎａｔｅ）とインキュベートした網膜神経細胞；Ｃ）１００μＭのカイニン酸とインキュベートした網膜神経細胞；Ｄ）５００μＭのカイニン酸への暴露の前に２４時間の間、１．０ｍｇ／ｍｌのＬｕｍｉｎａｔｅと共にインキュベートした網膜神経細胞。
【００５４】
暴露の８時間後に、細胞数をノイバウエル・チャンバ中でトリパンブルー排除アッセイを用いて測定した。
図６は、プレートＡ、Ｂ、ＣおよびＤにおける網膜神経細胞数を比較する棒グラフである。これらのデータは、カイニン酸が網膜神経細胞に対して有毒であり、そしてＬｕｍｉｎａｔｅでの前処置がその毒性を実質的に減少させたことを示している。具体的には、１００μＭのカイニン酸のみで処置したプレート中の神経細胞数（プレートＣ）は、対照と比較して５８％であり、一方、５００μＭのカイニン酸への暴露前に２４時間の間、１．０ｍｇ／ｍｌのＬｕｍｉｎａｔｅと共にインキュベートしたプレート中の神経細胞数（プレートＤ）は対照の８０％であった。プレートＤがプレートＣの５倍のカイニン酸を受けたことを考えると、これらの結果は特に注目に値する。
【００５５】
実施例６
萎縮型ＡＭＤの治療におけるＬｕｍｉｎａｔｅに関するヒトの前向きオープンラベル試験
１．０ｍｇ／５０μＬの１回のＬｕｍｉｎａｔｅ硝子体内注射が、中等度からやや重度の萎縮型ＡＭＤを有する萎縮型ＡＭＤ対象の最良矯正視力（ＢＣＶＡ）の改善に何らかの効果があるかどうかを判定すること。
【００５６】
これは、中等度からやや重度の萎縮型ＡＭＤを有する７人のヒト対象において行われた前向き介入（ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎａｌ）、非盲検（ｏｐｅｎ  ｌａｂｅｌ）、ＩＲＢ承認のヒト臨床プルーフ・オブ・コンセプト試験である。
【００５７】
主な選択基準（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｃｒｉｔｅｒｉａ）は、ＯＣＴによる黄斑の中心１ｍｍに比較的無傷の光受容体およびＲＰＥ層を有する萎縮型黄斑変性症の眼を有する患者を含んだ。
【００５８】
対象のベースラインＢＣＶＡは２０／３０から２０／４００の間であり、網膜下液またはＣＮＶのエビデンスはなく、抗ＶＥＧＦ治療の病歴もなかった。
募集した全ての患者は、１．０ｍｇ／５０μＬのＬｕｍｉｎａｔｅのベースライン単回硝子体内注射を受け、毎月監視され、さらに、中心黄斑厚さ、ＯＣＴ、デジタルカラー写真および治療前後のＢＣＶＡが得られた。
【００５９】
ヒト患者における萎縮型ＡＭＤの治療におけるＬｕｍｉｎａｔｅについてのこの非盲検プルーフ・オブ・コンセプト試験の結果を以下の表５に要約する。
【００６０】
【表５】
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【００６１】
これらの結果は、この試験において、Ｌｕｍｉｎａｔｅで治療された対象のＢＣＶＡが２０文字まで改善したことを示す。
以上、本発明の特定の実施例または実施形態を参照しながら本発明を説明してきたが、本発明の意図した精神および範囲から逸脱することなく、説明した実施例および実施形態に対して様々な追加、削除、変更および修正を行うことができることは認識されるものである。例えば、一実施形態または一実施例の任意の要素、ステップ、部材、構成要素、組成物、反応物、部品または部分は、他に特定されない限り、またはそうすることによってその意図された用途に対してその実施形態または実施例を不適切にするものとはならない限り、別の実施形態または実施例に組み込むことが可能であるか、或いは別の実施形態または実施例とともに使用することが可能である。また、方法またはプロセスのステップが特定の順序で説明または列記されている場合、そのようなステップの順序は、他に特定されない限り、またはそうすることによってその意図された目的に対してその方法またはプロセスを不適切にするものとはならない限り、変更することが可能である。さらに、本明細書に記載の任意の発明または実施例の要素、ステップ、部材、構成要素、組成物、反応物、部品または部分は、そうでないことが明記されていない限り、任意の他の要素、ステップ、部材、構成要素、組成物、反応物、部品または部分が不在下或いは実質的な不在下で任意選択的に存在し得るか、或いは利用できる。すべての理に適う追加、削除、修正および変更は、記載された実施例および実施形態の均等物とみなされるべきであり、以下の特許請求の範囲の範囲内に含まれるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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