(57)【要約】本発明は、放射線療法または化学療法を必要とすることなく、及びＧＶＨＤまたは移植片拒絶を発症することなく、生着を容易にし、レシピエントの免疫能を再構成する幹細胞移植の臨床的に適用可能な方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の対象について幹細胞生着を提供する方法であって、
前記対象を、標的組織内の内在性幹細胞に特異的に結合する作用物質（ｉ）及びＣＤ４７とＳＩＲＰαとの間の相互作用を遮断する作用物質（ｉｉ）と、標的内在性幹細胞を前記対象から破壊するための有効な量で、同時に接触させることと、
前記対象を、一過性免疫抑制を誘発する作用物質（ｉｉｉ）と接触させることと、
外来性幹細胞を含む細胞組成物を前記対象に、前記対象における（ｉ）及び（ｉｉ）の血清レベルを非毒性レベルまで低下させるために十分なウォッシュアウト期間の後で、導入することと
を含む移植前処置レジメンを有しており、
前記外来性幹細胞が、骨髄破壊的移植前処置の非存在下で生着する、方法。
【請求項２】
前記標的組織は骨髄であり、標的の幹細胞は造血幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記外来性幹細胞は、前記対象に対して、自家または同種である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記外来性幹細胞が、ｅｘ  ｖｉｖｏで遺伝子操作されている、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
標的組織内の内在性幹細胞に特異的に結合する前記作用物質は、ｃ−ｋｉｔに特異的なモノクローナル抗体である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ＣＤ４７とＳＩＲＰαとの間の相互作用を遮断する前記作用物質が、可溶性ＳＩＲＰαポリペプチド、ＣＤ４７に特異的な抗体、ＳＩＲＰαに特異的な抗体、及び可溶性ＣＤ４７ポリペプチドから選択される、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
一過性免疫抑制を誘発する前記作用物質が、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ活性を阻害する作用物質、ミコフェノール酸、シクロスポリンＡ、ラパマイシン、ＦＫ５０６、及びコルチコステロイドから選択される、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
一過性免疫抑制を誘発する前記作用物質は、ＣＤ４０Ｌに対して特異的な抗体である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
一過性免疫抑制を誘発する前記作用物質が、前記外来性幹細胞と同時に投与される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記対象は、免疫応答ヒトである、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記対象は、前記外来性幹細胞に対してハプロ一致である、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記外来性幹細胞が、全骨髄単核細胞の組成物として投与される、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
幹細胞は、レシピエントに適合したＭＨＣである、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記対象を、Ｔ細胞及びＮＫ細胞の一方または両方を枯渇させる作用物質（ｉｖ）と接触させることをさらに含み、前記作用物質（ｉｖ）が、前記外来性幹細胞の導入の前、及び任意選択で前記外来性幹細胞の導入と同時に投与される、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記対象は、前記外来性幹細胞に対してＨＬＡ不適合である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞組成物は、ＣＤ３４+ 発現に関して、骨髄、臍帯血、または末梢血から選択される造血幹細胞を含む、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞組成物は、少なくとも５０％ＣＤ３４+ 細胞を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞組成物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで多能性細胞から誘導される造血幹細胞を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞組成物は、レシピエントの体重ｋｇ当り少なくとも１０5 個のＣＤ３４+ 細胞を含む、請求項１４〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記作用物質（ｉｖ）は、Ｔ細胞及びＮＫ細胞を枯渇させる、請求項１４〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記作用物質（ｉｖ）は、ＣＤ２、ＣＤ５２、ＣＤ４５に特異的な抗体、または抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）から選択される抗体である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
Ｔ細胞を選択的に枯渇させる作用物質（ｉｖ）が、ＣＤ３、ＣＤ４、及びＣＤ８のうちの１つまたは複数に特異的な抗体から選択される、請求項１４〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
ＮＫ細胞を選択的に枯渇させる作用物質（ｉｖ）が、ＣＤ１２２及びＣＤ５６のうちの１つまたは複数に特異的な抗体から選択される、請求項１４〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
哺乳動物の対象について幹細胞生着を提供する方法であって、
ＨＬＡ適合またはＨＬＡ不適合対を決定するためにドナー及びレシピエントをＨＬＡタイピングすることと、
ＣＤ３４+ 造血幹及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）を含む前記ドナーから造血細胞を獲得することならびに任意選択で所望の表現型のＨＳＰＣを単離することと、
有効量のＨＳＰＣ細胞組成物を処方することと、
前記レシピエントに投与されるドナー細胞の数、前記ドナー細胞の純度、ドナーとレシピエントとの間の主要組織適合性の不適合度、及び前記レシピエントの免疫状態に基づいて、前記造血細胞の注入の前に前記レシピエントに対する非遺伝毒性移植前処置レジメンのための一式の作用物質を選択することと、
非遺伝毒性移植前処置のための前記一式の作用物質を投与することと、
前記造血細胞を注入することと、
造血幹細胞生着に関して前記レシピエントをモニタリングすることと
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
幹細胞は、その自己再生する及び分化細胞を生成する能力を通して、生物にある特定の組織を維持及び修復する手段を提供する。臨床的に、骨髄移植及び造血幹細胞移植は、血液細胞を生成する能力を患者に提供する手段として広く使用されており、通常この場合の患者は、高用量の化学療法または放射線療法により内在性幹細胞が枯渇している。
【０００２】
造血細胞移植（ＨＣＴ）は、一般的に、自家または同種造血細胞の静脈内注入を含み、その活性サブセットは造血幹細胞（ＨＳＣ）である。これらは、骨髄、末梢血、または臍帯血から採取され、その骨髄または免疫系が損傷しているまたは欠損している患者における造血機能を再建するために移植される。この手順は、白血病などの骨髄浸潤プロセスを排除するため、または先天性免疫不全症を矯正するための治療の一部としてしばしば行われる。
【０００３】
加えて、ＨＣＴは、癌患者が、骨髄が通常耐え得るよりも高用量の化学療法を受けることを可能にする。その後、骨髄機能は、髄を前もって採取した幹細胞と置き換えることによって回復する。その多くが宿主にとって有害である他の細胞が混ざっていない、富化または精製ＨＳＣ集団を移植することも可能である。
【０００４】
移植前処置（ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ）または移植前処置（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ）レジメンは、造血細胞移植（ＨＣＴ）において重要な要素である。成功した移植では、骨髄ニッチのクリアランスが、ドナー造血幹細胞（ＨＳＣ）を生着させるために達成されなければならない。移植前処置（ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ）レジメンは、移植された移植片の拒絶を防ぐ、及び移植が行われている疾患を根絶するために十分な免疫抑制も提供し得る。ニッチスペースをクリアにするための現行の方法は、放射線及び／または化学療法に依存しており、これはＢＭＴの潜在的な臨床的有用性を大きく制限する毒性有害作用を与える可能性がある。従来、骨髄破壊的移植前処置が行われている。
【０００５】
骨髄破壊的レジメンは、最大耐量まで放射線または特定の薬物の用量を漸増することにより開発された、放射線含有または放射線不含有レジメン、治療法として分類することができる。全身照射及びシクロホスファミドまたはブスルファン及びシクロホスファミドが、通常使用される骨髄破壊的療法である。これらのレジメンは、白血病などの進行性悪性腫瘍において特に使用される。しかしながら、このような処置は、患者に対する毒性という点で多くの不利益がある。
【０００６】
造血幹細胞を含む、幹細胞の生着のための改善された方法は、臨床上非常に重要である。本発明はこの必要性に取り組む。
【発明の概要】
【０００７】
レシピエントにおける、造血幹細胞を含むがこれらに限定されない幹細胞の長期多系列生着のための方法及び組成物を提供する。これは、レシピエントを移植前非骨髄破壊的、非遺伝毒性移植前処置レジメンを用いて処置すること、及び外来性幹細胞を含む有効量の細胞集団を投与することによる。移植前処置レジメンは、様々な目的のために内在性細胞集団に作用する作用物質の投与を含む。本方法は、血液障害を処置するための生着を可能にし、将来の臓器移植のためにレシピエントをドナーのＨＬＡ型に対して寛容化するために使用することもできる。
【０００８】
内在性幹細胞は、移植前処置レジメンにより枯渇させる。内在性幹細胞を枯渇させる作用物質には、ｃ−ｋｉｔに特異的な抗体及びＣＤ４７活性を遮断する作用物質が含まれるが、これらに限定されない。これらの作用物質は、投与後の外来性幹細胞を枯渇させる能力もあり、ゆえに、作用物質を投与した時点から外来性幹細胞を投与する時点までの「ウォッシュアウト」期間を必要とする。ウォッシュアウト期間は、内在性幹細胞を枯渇させる作用物質の血清レベルを、幹細胞の枯渇をもたらさない非毒性レベルまで低下させるために十分である。
【０００９】
いくつかの実施形態では、移植前処置レジメンに、細胞傷害性リンパ球の一過性免疫抑制を提供する少なくとも１つの作用物質が含まれる。様々な生物学的及び非骨髄破壊的医薬品がこの目的のために利用可能であり、それには、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ活性を阻害する作用物質、ミコフェノール酸、シクロスポリンＡ、ラパマイシン、ＦＫ５０６、コルチコステロイドなどが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、作用物質は、ＣＤ４０Ｌを阻害し、ＣＤ４０Ｌに対して特異的な抗体である。一過性免疫抑制剤は、外来性幹細胞が投与されるときに当該一過性免疫抑制剤が活性である限りにおいて、外来性幹細胞の前またはこれと同時に投与されることができる。
【００１０】
いくつかの実施形態では、移植前処置レジメンに、Ｔリンパ球及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のうちの一方または両方を枯渇させる少なくとも１つの作用物質が含まれる。Ｔ細胞を枯渇させる作用物質には、具体的には、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８に特異的な抗体などを含む作用物質が含まれるが、これらに限定されない。Ｔ細胞及びＮＫ細胞を枯渇させる作用物質には、ＣＤ２、ＣＤ５２、ＣＤ４５に特異的な抗体、抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）などを含む作用物質が含まれるが、これらに限定されない。ＮＫ細胞を枯渇させる作用物質には、具体的には、ＣＤ１２２、ＣＤ５６に特異的な抗体などを含む作用物質が含まれるが、これらに限定されない。枯渇作用物質（複数可）は、外来性幹細胞が投与されるときに標的細胞が枯渇している限りにおいて、外来性幹細胞の注入の前に投与されることができ、任意選択で注入後に活性である。
【００１１】
一実施形態では、移植前の非遺伝毒性移植前処置のための適切な一式の作用物質の選択及び投与のための方法を提供する。幹細胞の生着を成功させるための予め行われる移植前処置レジメンの要件が、ある特定のパラメータに従って変動することを本明細書中に示し、それには、レシピエントに投与されるドナー細胞の数、ドナー細胞の純度、ドナーとレシピエントとの間の主要組織適合性の不適合度、及びレシピエントの免疫状態が含まれる。個体に関して適切な一式の作用物質、及び作用物質の投与の時期を選択することで、移植の治療結果を最適化することができる。
【００１２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、ＨＬＡ適合またはＨＬＡ不適合対を決定するためにドナー及びレシピエントをＨＬＡタイピングする、ＣＤ３４+ 造血幹及び前駆細胞、これはＨＳＰＣと称してもよい、を含むドナーから造血細胞を獲得する、任意選択で所望の表現型のＨＳＰＣ、例えば、ＣＤ３４+ 細胞を単離し、有効量のＨＳＰＣを処方する、レシピエントに投与されるドナー細胞の数、ドナー細胞の純度、ドナーとレシピエントとの間の主要組織適合性の不適合度、及びレシピエントの免疫状態に基づいて、造血細胞の注入の前にレシピエントに対する非遺伝毒性移植前処置レジメンのための一式の作用物質を選択する、非遺伝毒性移植前処置のための一式の作用物質を投与する、造血細胞を注入する、ならびに、造血幹細胞生着に関してレシピエントをモニタリングするステップを含み得る。本明細書に記載の方法は、ＨＬＡ適合及びＨＬＡ不適合移植条件の両方、例えばＨＬＡ不適合及びハプロ不一致移植、ハプロ一致移植などに適用される。
【００１３】
いくつかの実施形態では、ＨＳＰＣは、ドナー造血細胞試料から得られる。いくつかの実施形態では、造血細胞試料は、骨髄である。いくつかの実施形態では、ＨＳＰＣは、臍帯血から得られる。いくつかの実施形態では、造血細胞試料は、ドナー動員末梢血からのアフェレシスにより得られる。いくつかの実施形態では、ＨＳＰＣは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成される。ＨＳＰＣドナーは、同種または自家であってよく、例えば、ＨＳＰＣは、再注入の前に、例えばｅｘ  ｖｉｖｏ  培養中に遺伝物質の導入または欠失により遺伝子操作されている。同種ドナーは、レシピエントに対してＭＨＣ適合であり得る。ドナーは、レシピエントに対してハプロ一致またはハプロ不一致であり得る。ドナーは、１つまたは複数のＭＨＣ遺伝子座にて不適合であってよく、例えば、ＭＨＣ適合に関して主要遺伝子座の１、２、３、４、５または６つで不適合であってよい。
【００１４】
ＨＳＰＣは、ＣＤ３４の発現のために造血細胞試料から任意選択で単離される。単離は、ＣＤ９０の発現のための選択をさらに含んでよい。精製されているＨＳＰＣは、集団内でＣＤ３４+ である細胞の割合（％）により定義して、少なくとも約４５％純粋であってよく、少なくとも約５０％純粋、少なくとも約６０％純粋、少なくとも約７０％純粋、少なくとも約８０％純粋、少なくとも約９０％純粋であってよい。有効量のＣＤ３４+ 細胞は、レシピエントの体重ｋｇ当り約１０5 〜約１０7 個のＣＤ３４+ 細胞であってよく、レシピエントの体重ｋｇ当り少なくとも約５×１０5 個のＣＤ３４+ 細胞、レシピエントの体重ｋｇ当り少なくとも約１０6 個のＣＤ３４+ 細胞、レシピエントの体重ｋｇ当り少なくとも約３×１０6 個のＣＤ３４+ 細胞、レシピエントの体重ｋｇ当り少なくとも約５×１０6 個のＣＤ３４+ 細胞であってよく、レシピエントの体重ｋｇ当り１０7 個のＣＤ３４+ 細胞またはそれ以上であってよい。注入剤中のＣＤ３４+ 細胞の用量、細胞の純度、及び、送達される細胞の総数、すなわち、両ＣＤ３４+ 細胞及びＣＤ３４- 細胞の総用量は、非遺伝毒性移植前処置作用物質の選択のための重要なパラメータである。
【００１５】
ＨＳＰＣ組成物と共に送達されるＣＤ３+ 細胞の最大数は、レシピエントの体重ｋｇ当り約１０6 個以下のＣＤ３+ 細胞、レシピエントの体重ｋｇ当り約５×１０5 個以下のＣＤ３+ 細胞、レシピエントの体重ｋｇ当り約３×１０5 個以下のＣＤ３+ 細胞、レシピエントの体重ｋｇ当り約１０4 個以下のＣＤ３+ 細胞であってよい。注入剤中のＣＤ３+ 細胞の数は、細胞傷害性リンパ球を阻害する作用物質の選択のためのパラメータであり得、ここで、ＣＤ３+ 細胞の数の増加は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８に特異的な抗体などを含むがこれらに限定されない、Ｔ細胞を破壊する１つまたは複数の作用物質の直前または注入時の投与を必要とし得る。
【００１６】
いくつかの実施形態では、移植は、骨髄破壊的移植前処置の非存在下で行われる。いくつかの実施形態では、レシピエントは、免疫応答性である。移植前の移植前処置レジメンの投与を必要に応じて繰り返して、所望のレベルの破壊を達成する。
【００１７】
いくつかの実施形態では、ＣＤ４７遮断は、可溶性ＳＩＲＰαポリペプチドを投与することにより達成され、これは高親和ＳＩＲＰα変異体ポリペプチドであってよい。他の実施形態では、ＳＩＲＰα及びＣＤ４７の一方または両方に特異的な抗体が投与される。
【００１８】
ドナー幹細胞を用いた移植の後、レシピエントは、ドナー細胞に関してキメラまたは混合キメラであってよい。本発明の方法は、標的組織の機能に関与する分化細胞を破壊する望ましくない効果ならびに他の組織（例えば、胃腸系、発毛の細胞）への望ましくない副作用を有する、ならびに二次性悪性腫瘍のリスクを増加させる、非選択的破壊法、例えば、放射線または化学療法の非存在下での有効な幹細胞生着を可能にする。
【００１９】
本発明の一実施形態では、幹細胞は、自家造血幹細胞、遺伝子改変造血幹細胞、及び同種造血幹細胞、通常は同種幹細胞、のうちの１つまたは複数である。係る幹細胞は、様々な血液障害、例えば、遺伝性障害、例えば再生不良性貧血、鎌状赤血球症、サラセミア、重症免疫不全症、骨髄不全状態、免疫不全症、ヘモグロビン異常症、白血病、リンパ腫、免疫寛容誘発、骨髄移植により処置可能な遺伝性障害及び他の血液障害などの処置において使用される。
【００２０】
本発明の方法は、患者における寛容、例えば、臓器移植における、例えば、ドナー組織に対する寛容、例えば、自己免疫疾患の処置の場合における、自己抗原に対する寛容などの誘発においても有用である。本発明の一実施形態では、患者において寛容を誘発するための方法であって、Ｔ細胞、及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含んでよいがこれらに限定されない細胞傷害性リンパ球の数または活性を低下させる、有効量の１つまたは一式の作用物質の投与と併用して行われる、ｃ−ｋｉｔに特異的な抗体及びＣＤ４７活性を遮断する作用物質を含むがこれらに限定されない、幹細胞を標的とする作用物質の投与を患者に行うことを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ活性を阻害する作用物質を含むがこれらに限定されない、細胞傷害性リンパ球の一過性免疫抑制を提供する、少なくとも１つの作用物質が含まれる。いくつかの実施形態では、作用物質は、ＣＤ４０Ｌに対して特異的な抗体である。いくつかの実施形態では、本方法は、遺伝毒性移植前処置の非存在下で実施される。移植前処置レジメンの後、レシピエントに有効量の造血幹及び前駆細胞を注入し、それにより、将来の臓器移植のためのドナー細胞に対する免疫寛容を提供する。
【００２１】
本発明は、添付の図面と組み合わせて閲読すると、以下の発明を実施するための形態から最もよく理解される。一般的慣習に従い、図面の様々な特徴の縮尺は正確ではないことが強調される。逆に、様々な特徴の寸法は、明瞭さのため、恣意的に拡大または縮小されている。図面には、以下の図が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１−１】ＡＣＫ２、クローン３、ＭＲ−１及びＣＤ１２２は、免疫応答性動物へのハプロ一致全骨髄の有効な生着を可能にすることを示す。図１Ａでは、３０ｅ６ＡＫＲ×Ｈｚ  Ｆ１全骨髄を回収し、各Ｂａｌｂ／ｃ×Ｃ５７ＢＬ／６レシピエントへと後眼窩移植した。キメリズムをＣＤ４５アレル間差異により決定した。図１Ｂでは、各抗体を、移植前処置のために印を付けた日に与えた。−８日目に、１００ｕｇのクローン３を与え、全てのその後日には、５００ｕｇのクローン３を与える。−６日目に、５００ｕｇのＡＣＫ２を与える。−１日目に、２５０ｕｇのＴｍ−ｂ１を与える。０日目に、５００ｕｇのＭＲ１を与える。
【図１−２】ＡＣＫ２、クローン３、ＭＲ−１及びＣＤ１２２は、免疫応答性動物へのハプロ一致全骨髄の有効な生着を可能にすることを示す。マウスは、各抗体の異なる組み合わせを使用して移植前処置した。総ドナーキメリズムを、１３週間にわたって、図１ＣではＴ細胞、図１ＤではＢ細胞、図１Ｅでは顆粒球、図１Ｆではキメリズムに加えて測定した。ＡＣＫ２＋クローン３＋ＭＲ１コホートにおけるアンキメラ（ｕｎｃｈｉｍｅｒｉｃ）マウスは、打ち切った。
【図２】抗体移植前処置マウスの１６週ドナーキメリズムを表し、コホート毎にキメラであるマウスの割合（％）ならびに総ドナー、Ｔ細胞、Ｂ細胞、及び顆粒球キメリズムの平均レベルを示す。ＡＣＫ２＋クローン３＋ＭＲ１コホートにおけるアンキメラマウスは、打ち切った。
【図３−１】ＮＫ細胞枯渇は、低細胞用量骨髄の生着に必要であることを示す。図３Ａでは、様々な量のＡＫＲ×Ｈｚ  Ｆ１全骨髄を回収し、各Ｂａｌｂ／ｃ×Ｃ５７ＢＬ／６レシピエントへと後眼窩移植した。キメリズムは、ＣＤ４５アレル間差異によって決定した。図３Ｂでは、各抗体を、移植前処置のために記を付けた日に与えた。−８日目に、１００ｕｇのクローン３を与え、全てのその後日には、５００ｕｇのクローン３を与える。−６日目に、５００ｕｇのＡＣＫ２を与える。−２日目に、２５０ｕｇのＴｍ−ｂ１を与える。０日目に、５００ｕｇのＭＲ１を与える。
【図３−２】ＮＫ細胞枯渇は、低細胞用量骨髄の生着に必要であることを示す。各群を、クローン３、ＡＣＫ２、及びＭＲ１を用いて最小限にて移植前処置した。ＣＤ１２２を、２つの注記したコホートにさらに加えた。よって、全４種の抗体を受けている。移植前処置マウスは、３０×１０6 、１０6 、３×１０6 または１０5 個の全骨髄のいずれかを受けた。総ドナーキメリズムを、第３週で、図３ＣではＴ細胞、図３ＤではＢ細胞、図３Ｅでは顆粒球、図３Ｆではキメリズムに加えて測定した。
【図４−１】モノクローナル抗体カクテルは、長期多系列造血再構成を誘発することができることを示す。図４Ａは、ＡＫＲＢ６Ｆ１ドナー及びＣＢ６Ｆ１レシピエントを使用するハプロ一致移植スキーマを示す。図４Ｂは、ドナー及びレシピエント株へのＭＨＣクラスＩのフローサイトメトリー分析を示す。図４Ｃは、移植前処置レジメンのための投与計画を示す。図４Ｄは、抗体移植前処置後の長期ＨＳＣコンパートメント（Ｌｉｎ−ｃ−ＫＩＴ＋Ｓｃａ１＋ＣＤ１５０＋Ｆｌｋ２−ＣＤ３４−）におけるドナーキメリズムを示す。
【図４−２】モノクローナル抗体カクテルは、長期多系列造血再構成を誘発することができることを示す。図４Ｅ〜Ｇは、抗体移植前処置が、ＷＢＭ移植後の長期多系列キメリズムを可能にすることを示す。
【図４−３】モノクローナル抗体カクテルは、長期多系列造血再構成を誘発することができることを示す。。図４Ｈは、０日目のＷＢＭ抗体移植前処置後のＣＢＣを示す。図４Ｉは、ＮＫ細胞枯渇を伴うまたは伴わない、様々なＷＢＭ用量での、キメラである動物の割合（％）を示す。
【図５−１】モノクローナル抗体カクテルは、低用量の精製ＨＳＣの長期多系列造血再構成を誘発することができることを示す。図５Ａは、移植のためのＬＳＫ及びｃ−ＫＩＴ＋細胞を算出及び単離するために使用した分類スキームを示す。図５Ｂは、様々な造血細胞移植後の顆粒球キメリズムを示す。図５Ｃは、ＬＳＫ抗体移植前処置のための投与計画を示す。
【図５−２】モノクローナル抗体カクテルは、低用量の精製ＨＳＣの長期多系列造血再構成を誘発することができることを示す。図５Ｄは、ＬＳＫ抗体移植前処置後の骨髄中の成熟免疫細胞集団存在量を示す。図５Ｅは、ＬＳＫ移植後の総末梢血ドナーキメリズムを示す。図５Ｆは、ＬＳＫ抗体カクテルの個々の成分を除外した後にキメラである動物の割合（％）を示す。
【図６−１】非遺伝毒性移植前処置レジメンを介した低用量ＬＳＫ移植は、ドナー組織に対する寛容を可能にすることを示す。図６Ａ及びＢは、ＷＢＭ（Ａ）及びＬＳＫ（Ｂ）移植後の末梢血中のドナー反応性宿主Ｔ細胞の存在量を示す。図６Ｃは、耳−心臓移植概要図を示す。図６Ｄは、ドナー心臓生存を示す。
【図６−２】非遺伝毒性移植前処置レジメンを介した低用量ＬＳＫ移植は、ドナー組織に対する寛容を可能にすることを示す。図６Ｅは、組織移植後の３４日の代表的な耳−心臓移植片の肉眼検査、Ｈ＆Ｅ、及びＩＦを示す。
【図７−１】造血幹細胞は、完全ＭＨＣ不適合である場合でも生着することができることを示す。図７Ａは、ＤＢＡ１／Ｊがドナーであり、ＣＢ６Ｆ１が宿主である、移植概略図を示す。図７Ｂは、８週間後のＷＢＭ及びＬＳＫ移植後のドナー生着の割合（％）を示す。図７Ｃは、移植された動物の全生存を示す。
【図７−２】造血幹細胞は、完全ＭＨＣ不適合である場合でも生着することができることを示す。図７Ｄは、内在性ＨＳＣを枯渇させ、一過性免疫抑制を、宿主Ｔ及びＮＫ細胞を標的とすることにより提供することができる全種抗体移植前処置レジメンの概説を示す。
【図８−１】図８Ａは、宿主とドナーとの間のＣＤ４５アレル間差異により末梢血キメリズムを決定する分類スキームを示す。
【図８−２】図８Ｂ〜Ｄは、ＷＢＭ移植後１６週の多系列末梢血キメリズムをＴ細胞（Ｂ）、Ｂ細胞（Ｃ）及び顆粒球（Ｄ）に関して示す。
【図９】モノクローナル抗体を使用した単独療法移植前処置後の末梢血ドナーキメリズムを示す。
【図１０】図１０Ａ〜Ｃは、移植を伴わずに移植前処置が完了した１日後の動物からの完全血球数（Ａ）、末梢血分集団（Ｂ）及び脾臓分集団（Ｃ）を示す。
【図１１】多様なＬＳＫ抗体移植前処置後の１６週末梢血キメリズムを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
幹細胞及び前駆細胞を含む細胞組成物の注入の前の、非遺伝毒性、非骨髄破壊的移植前処置を用いた処置による、対象における幹細胞の生着のための方法を提供する。
【００２４】
放射線療法もしくは化学療法を必要とすることなく、またはＧＶＨＤまたは移植片拒絶を発症することなく、生着を容易にし、レシピエントの免疫能を再構成する幹細胞移植の臨床的に適用可能な方法を提供することが本発明の目的である。ドナー幹細胞集団の特性及び用量、ならびにドナーとレシピエントとの間のＨＬＡ適合度に基づいて、適切な移植前処置レジメンを選択するためのガイドラインも提供する。
【００２５】
本発明の態様は、内在性幹細胞を標的とする作用物質、例えば、抗ｃ−ｋｉｔ抗体と、ＣＤ４７及びＳＩＲＰαの相互作用を遮断することにより内在性幹細胞の殺滅を亢進する作用物質の使用を、任意選択で一過性免疫抑制と組み合わせて、合わせることにより、造血幹細胞（ＨＳＣ）の有効な生着を容易にする内在性幹細胞ニッチの枯渇が達成されることの発見に基づき、任意選択で、Ｔ及び／またはＮＫ細胞を枯渇させる作用物質と組み合わせて、ドナー細胞の安全な生着を可能にする。具体的には、本発明は、内在性幹細胞のこの改善された選択的破壊を、外来性幹細胞のレシピエントへの投与と併用して組み合わせて、有効な、長期生着及び寛容をもたらす。
【００２６】
方法、装置及び製剤が当然変動し得るために、本発明が記載の特定の方法論、製品、装置及び因子に限定されないことを理解されたい。本明細書で使用される用語は、単に特定の実施形態を説明することを目的とするものであり、本発明の範囲を限定することを意図せず、これは添付の特許請求の範囲によってのみ限定され得ることも理解されたい。
【００２７】
本明細書において及び添付の特許請求の範囲において使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈に別段の明確な指定がない限り、複数形の指示物を含むことは留意されなければならない。したがって、例えば、「薬剤候補（ａ  ｄｒｕｇ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ）」に対する言及は、このような候補のうちの１つまたは混合物を指し、「本方法（ｔｈｅ  ｍｅｔｈｏｄ）」に対する言及は、当業者に公知の同等のステップ及び方法に対する言及を含み、他も同様である。
【００２８】
本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、別段の明確な指定がない限り、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で言及される公開物は全て、当該公開物において説明され及び現在説明されている本発明と関連して使用され得る装置、製剤及び方法を説明及び開示する目的のために、参照により本明細書に組み込まれる。
【００２９】
値の範囲が提供される場合、各介在値は、文脈に別段の明確な記載がない限り、下限単位の１０分の１まで、当該記載の範囲における当該範囲の上限と下限との間、及びその他の記載値または介在値が本発明内に包含されることを理解されたい。独立して、より小さな範囲に含まれることがあるこれらのより小さな範囲の上限値及び下限値は、記載の範囲において任意の具体的に除外される限界値に供される、本発明の範囲内に包含される。記載の範囲が両限界値のうちの一方または両方を含む場合、当該両限界値を含むもののうちのいずれか両方を除外する範囲も本発明に含まれる。
【００３０】
本発明の理解の徹底を期すために、以下の記述では細部にわたる詳細な説明を縷々行っている。しかしながら、本発明が、これらの具体的な詳細のうちの１つまたは複数を伴わずとも実施可能であることは当業者に明らかである。また、周知の特徴及び当業者に周知の手順は、本発明を不明瞭にすることを回避するために記載していない。
【００３１】
一般に、当該技術分野の範囲内のタンパク質合成、組換え細胞培養及びタンパク質単離の従来の方法、ならびに組換えＤＮＡ技術が本発明において使用される。係る技術は、文献において十分に説明されており、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｆｒｉｔｓｃｈ＆Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８２）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｒｕｓｓｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２００１）；Ｈａｒｌｏｗ，Ｌａｎｅ  ａｎｄ  Ｈａｒｌｏｗ，Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：Ｐｏｒｔａｂｌｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  Ｎｏ．１，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９９８）；及びＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；（１９８８）を参照されたい。
【００３２】
移植前処置レジメン。同種造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）を受ける患者は、ドナー幹細胞の生着を可能にするために、レシピエントの免疫系を抑制し、内在性幹細胞を枯渇させ得る、いわゆる移植前処置レジメンを用いて準備する。
【００３３】
従来の移植前処置レジメンの強度は、顕著に変動することができる。レジメンの記載は、遺伝毒性または非遺伝毒性レジメンを指すことができ、骨髄破壊的または非骨髄破壊的レジメンへの言及と重なり得る。例えば、参照により本明細書に具体的に組み込まれる、Ｂａｃｉｇａｌｕｐｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｂｉｏｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１５（１２）：１６２８−１６３３を参照されたい。
【００３４】
遺伝毒性レジメンは、少なくとも部分的に、ＤＮＡに対する直接または関節的な作用を有する作用物質の投与、突然変異の誘発、誤ったタイミングでの事象活性化、及び突然変異をもたらす直接的なＤＮＡ損傷を含む。遺伝毒性作用物質の例としては、放射線及びある特定の化学療法剤、例えば、アルキル化剤、挿入剤及びＤＮＡ複製に関与する酵素の阻害剤が挙げられる。本発明の方法は、非遺伝毒性であるので、係る作用物質の使用を除外する。
【００３５】
骨髄破壊的移植前処置レジメンは、投与から１〜３週間以内に重度の汎血球低下症及び骨髄破壊を生じると予想される作用物質の組み合わせである。汎血球低下症は、造血幹細胞注入によって造血が回復しない限り、長期間継続し、通常は不可逆的であり、大半の場合は致死性である。例としては、全身照射及び／またはアルキル化剤、フルダラビン、ジメチルブスルファン、エトポシド（ＶＰ１６）の投与などが挙げられる。遺伝毒性作用物質及び骨髄破壊的作用物質は、有意に重複する。
【００３６】
非骨髄破壊的移植前処置レジメンは、典型的に最小限の血球減少を引き起こし、初期毒性はほぼないが、のちに有効量のＨＳＰＣを投与したときに、ドナーリンパ造血幹細胞の生着をもたらすことになる程度まで免疫抑制性である。
【００３７】
本明細書に提供する移植前処置レジメンは、非遺伝毒性及び非骨髄破壊的であり、長期間継続する（ｌｏｇ−ｌａｓｔｉｎｇ）汎血球低下症を引き起こすことなく、生着を防止する内在性幹細胞の枯渇を標的とする作用物質を主に活用する。本方法は、遺伝毒性化学療法剤または放射線を活用しないが、いくつかの場合では、非遺伝毒性、標的免疫抑制剤、例えば、シクロスポリンＡ、コルチコステロイドなどを、一過性免疫抑制のために使用することができる。
【００３８】
本発明の方法における活性作用物質の「同時（ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔ）投与」は、作用物質が治療効果を同時に有することになる時点での試薬との投与を意味する。このような同時投与は、作用物質の同時の（同時（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ））（すなわち、同じ時点での）、前の、または後続の投与を必然的に含み得る。当業者であれば、本発明の特定の薬物及び組成物に関する投与の適切なタイミング、順序、及び投与量を決定することは困難ではない。
【００３９】
幹細胞マーカー。ヒト造血幹細胞の抗体媒介性破壊に関する例示的なマーカーには、ＣＤ３４、ＣＤ９０（ｔｈｙ−１）、ＣＤ５９、ＣＤ１１０（ｃ−ｍｐｌ）、ｃ−ｋｉｔ（ＣＤ−１１７）などが含まれる。中胚葉系幹細胞の破壊に有用なマーカーには、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、Ｔｈｙ−１、ＣＤ４４、ＶＬＡ−４α、ＬＦＡ−１β、ＨＳＡ、ＩＣＡＭ−１、ＣＤ４５、Ａａ４．１、Ｓｃａ−１などが含まれる。神経堤幹細胞は、低親和性神経成長因子受容体（ＬＮＧＦＲ）に特異的な抗体を用いて陽性選択され得る。神経幹／前駆細胞は、当該技術分野で記載されており、様々な治療プロトコルにおけるそれらの使用が広く議論されている。例えば、とりわけ、Ｕｃｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．９７（２６）：１４７２０−５。米国特許第６，６３８，５０１号、Ｂｊｏｒｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．；米国特許第６，５４１，２５５号、Ｓｎｙｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．；米国特許第６，４９８，０１８号、Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ；米国特許出願第２００２／００１２９０３号、Ｇｏｌｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．；Ｐａｌｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ４１１（６８３３）：４２−３；Ｐａｌｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．８（６）：３８９−４０４；Ｓｖｅｎｄｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１４８（１）：１３５−４６及びＳｈｉｈａｂｕｄｄｉｎ（１９９９）Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  Ｔｏｄａｙ．５（１１）：４７４−８０があり、これらはそれぞれ参照により本明細書に具体的に組み込まれる。ヒト間葉系幹細胞は、ＳＨ２（ＣＤ１０５）、ＳＨ３及びＳＨ４ならびにＳｔｒｏ−１などのマーカーを使用して破壊され得る。
【００４０】
本発明の一実施形態では、枯渇に関するマーカーは、ｃ−ｋｉｔ（ＣＤ１１７）である。ＣＤ１１７は、ＩＩＩ型受容体チロシンキナーゼであり、「スチール因子」または「ｃ−ｋｉｔリガンド」としても知られる、幹細胞因子（ある特定のタイプの細胞の増殖を誘発する物質）に結合する。この受容体が幹細胞因子（ＳＣＦ）に結合すると、その固有のチロシンキナーゼ活性を活性化する二量体を形成し、これが次にリン酸化し、細胞内でシグナルを伝播するシグナル伝達分子を活性化する。例えば、ヒトｒｅｆｓｅｑエントリＧｅｎｂａｎｋ  ＮＭ＿０００２２２、ＮＰ＿０００２１３を参照されたい。ＣＤ１１７は、骨髄内のある特定のタイプの造血（血液）前駆細胞を同定するために使用される重要な細胞表面マーカーである。造血幹細胞（ＨＳＣ）、多能性前駆細胞（ＭＰＰ）、及び共通骨髄前駆細胞（ＣＭＰ）は、高レベルのＣＤ１１７を発現する。ヒトＣＤ１１７と特異的に結合する多くの抗体が当該技術分野で公知であり、市販されており、これにはＳＲ１、２Ｂ８、ＡＣＫ２、ＹＢ５−Ｂ８、５７Ａ５、１０４Ｄ２などが含まれるがこれらに限定されない。関心対象となるのは、ヒト化形態のＳＲ１、ＡＭＧ１９１であり、これは米国特許第８，４３６，１５０号、及び同第７，９１５，３９１号に記載されており、アグリコシル化ＩｇＧ１ヒト化抗体である。
【００４１】
有効量の抗ＣＤ１１７抗体は、１つまたは複数の用量において投与してよく、単回用量を含み、これは移植の少なくとも約１週間前、移植の少なくとも約５日前、移植の少なくとも約３日前であってよい。投薬と移植との間の期間は、抗ＣＤ１１７抗体をレシピエントの循環から排除するために実質的に十分である。例えば、投与後のピーク血清レベルにおける低減は、通常はレベルがピークレベルから少なくとも約１０分の１、通常は少なくとも約１００分の１、１０００分の１、１０，０００分の１、またはそれ以下まで低減するために十分な時間である。ウォッシュアウト期間の後、通常は約３日、約２日、約１日以内、またはクリアランスのときに、空ニッチ「ウィンドウ」内でドナー幹細胞を導入することが好ましい。
【００４２】
いくつかの実施形態では、有効量の抗ＣＤ１１７抗体は、最大で約１０ｍｇ／ｋｇ、最大で約５ｍｇ／ｋｇ、最大で約１ｍｇ／ｋｇ、最大で約０．５ｍｇ／ｋｇ、最大で約０．１ｍｇ／ｋｇ、最大で約０．０５ｍｇ／ｋｇであり、用量は、特定の抗体及びレシピエントで変動し得る。
【００４３】
抗ＣＤ４７剤。本明細書で使用する場合、「抗ＣＤ４７剤」または「ＣＤ４７遮断を提供する薬剤」という用語は、ＳＩＲＰα（例えば、食細胞上にある）に対するＣＤ４７（例えば、標的細胞上にある）の結合を低下させる任意の作用物質を指す。好適な抗ＣＤ４７試薬の非限定例としては、高親和性ＳＩＲＰαポリペプチド、抗ＳＩＲＰα抗体を含むがこれらに限定されない、ＳＩＲＰα試薬、可溶性ＣＤ４７ポリペプチド、及び抗ＣＤ４７抗体または抗体フラグメントが挙げられる。いくつかの実施形態では、好適な抗ＣＤ４７剤（例えば、抗ＣＤ４７抗体、ＳＩＲＰα試薬など）は、ＣＤ４７と特異的に結合して、ＳＩＲＰαに対するＣＤ４７の結合を低下させる。
【００４４】
有効量の抗ＣＤ４７剤は、作用物質によって変動することができるが、一般的には最大で約５０ｍｇ／ｋｇ、最大で約４０ｍｇ／ｋｇ、最大で約３０ｍｇ／ｋｇ、最大で約２０ｍｇ／ｋｇ、最大で約１０ｍｇ／ｋｇ、最大で約５ｍｇ／ｋｇ、最大で約１ｍｇ／ｋｇ、最大で約０．５ｍｇ／ｋｇ、最大で約０．１ｍｇ／ｋｇ、最大で約０．０５ｍｇ／ｋｇの範囲であり得、用量は、特定の抗体及びレシピエントによって変動し得る。ＣＤ４７に結合する作用物質、例えば、可溶性ＳＩＲＰαポリペプチド及び抗ＣＤ４７抗体は、体内でＣＤ４７を発現する細胞が多いほど高い用量で投与され得る。
【００４５】
抗ＣＤ４７剤は、移植の１日または複数日前に投与されてよく、いくつかの実施形態では、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７またはより多くの日数、すなわち約１から７日間、約１から５日間、約１から３日間などの期間にわたって毎日投与される。抗ｃ−ｋｉｔ剤と同様に、ＣＤ４７を標的とすることは、注入後のドナー幹細胞に影響を及ぼす可能性があるため、造血細胞の注入前にウォッシュアウト期間が必要とされる。ウォッシュアウト期間は、ｃ−ｋｉｔ抗体を用いる場合よりも短くてよいが、典型的には少なくとも約２４時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間であり、最大で約１週間、最大で約５日間、最大で約３日間などであってよい。
【００４６】
いくつかの実施形態では、好適な抗ＣＤ４７剤（例えば、抗ＳＩＲＰα抗体、可溶性ＣＤ４７ポリペプチドなど）は、ＳＩＲＰαと特異的に結合して、ＳＩＲＰαに対するＣＤ４７の結合を低下させる。ＳＩＲＰαと結合する好適な抗ＣＤ４７剤は、（例えば、ＳＩＲＰαを発現する食細胞中で）ＳＩＲＰαを活性化しない。好適な抗ＣＤ４７剤の有効性は、当該作用物質をアッセイすることによって評価することができる。例示的なアッセイでは、標的細胞は、候補作用物質の存在下または非存在下でインキュベートされる。本発明の方法において使用する作用物質は、当該作用物質の非存在下での食作用と比較して、少なくとも５％（例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１２０％、少なくとも１４０％、少なくとも１６０％、少なくとも１８０％、少なくとも２００％、少なくとも５００％、少なくとも１０００％）食作用を上方制御する。同様に、ＳＩＲＰαのチロシンリン酸化のレベルに関するｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは、当該候補作用物質の非存在下で観察されるリン酸化と比較して、少なくとも５％（例えば、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％）リン酸化の低下を示す。
【００４７】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ４７剤は、結合の際にＣＤ４７を活性化しない。ＣＤ４７が活性化されると、アポトーシス（すなわち、プログラムされた細胞死）と類似の過程が生じ得る（Ｍａｎｎａ  ａｎｄ  Ｆｒａｚｉｅｒ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６４，１０２６−１０３６，Ｆｅｂ．１，２００４）。ゆえに、いくつかの実施形態では、抗ＣＤ４７剤は、ＣＤ４７発現細胞の細胞死を直接誘導しない。
【００４８】
ＳＩＲＰα試薬。ＳＩＲＰα試薬は、認識可能な親和性にてＣＤ４７と結合するために十分な、シグナル配列と膜貫通ドメインとの間に通常存在するＳＩＲＰα部分または結合活性を保有するそのフラグメントを含む。好適なＳＩＲＰα試薬は、天然タンパク質ＳＩＲＰαとＣＤ４７との間の相互作用を低下させる（例えば、遮断する、防ぐ、など）。ＳＩＲＰα試薬は通常、ＳＩＲＰαの少なくともｄ１ドメインを含む。
【００４９】
いくつかの実施形態では、対象の抗ＣＤ４７剤は、ＳＩＲＰα由来のポリペプチド及びその類似体（例えば、ＣＶ１−ｈｌｇＧ４、及びＣＶ１単量体）を含む「高親和性ＳＩＲＰα試薬」である。高親和性ＳＩＲＰα試薬は、参照により本明細書に具体的に組み込まれる国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１３／２１９３７に記載されている。高親和性ＳＩＲＰα試薬は、天然ＳＩＲＰαタンパク質の変異体である。親和性の亢進をもたらすアミノ酸の変化は、ｄ１ドメインに局在し、ゆえに、高親和性ＳＩＲＰα試薬は、ｄ１ドメイン内の野生型配列に対して少なくとも１個のアミノ酸の変化を有するヒトＳＩＲＰαのｄ１ドメインを含む。このような高親和性ＳＩＲＰα試薬は任意選択で、追加のアミノ酸配列、例えば、抗体Ｆｃ配列、天然タンパク質またはそのフラグメント、通常ｄ１ドメインと連続したフラグメントである、残基１５０〜３７４を含むがこれらに限定されない、ｄ１ドメイン以外の野生型ヒトＳＩＲＰαタンパク質の複数の部分などを含む。高親和性ＳＩＲＰα試薬は、単量体または多量体、すなわち、二量体、三量体、四量体などであり得る。いくつかの実施形態では、高親和性ＳＩＲＰα試薬は、可溶性であり、ここで、ポリペプチドは、ＳＩＲＰα膜貫通ドメインを欠失しており、野生型ＳＩＲＰα配列に対して少なくとも１個のアミノ酸の変化を含み、当該アミノ酸の変化は、ＣＤ４７に対するＳＩＲＰαポリペプチド結合の親和性を、例えば、脱離速度を少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、またはそれより大きく低減させることによって亢進する。
【００５０】
任意選択で、ＳＩＲＰα試薬は、例えば、第２のポリペプチドとフレームの中で融合した融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、第２のポリペプチドは、融合タンパク質の大きさを増大させることができ、例えば、それにより、融合タンパク質は、循環から迅速に除去されないことになる。いくつかの実施形態では、第２のポリペプチドは、免疫グロブリンＦｃ領域の一部または全体である。Ｆｃ領域は、「ｅａｔ  ｍｅ（食べてくれ）」シグナルを提供することによって食作用を支援し、このことが、高親和性ＳＩＲＰα試薬によって提供される「ｄｏｎ’ｔ  ｅａｔ  ｍｅ（食べないでくれ）」シグナルの遮断を亢進する。他の実施形態では、第２のポリペプチドは、大きさの増大、多量体化ドメイン、及び／または追加の結合もしくはＩｇ分子との相互作用を提供する、Ｆｃと実質的に類似している任意の好適なポリペプチドである。
【００５１】
抗ＣＤ４７抗体。いくつかの実施形態では、対象の抗ＣＤ４７剤は、ＣＤ４７（すなわち、抗ＣＤ４７抗体）と特異的に結合して、ある細胞（例えば、感染細胞）上のＣＤ４７と別の細胞（例えば、食細胞）上のＳＩＲＰαとの間の相互作用を低下させる抗体である。いくつかの実施形態では、好適な抗ＣＤ４７抗体は、結合の際にＣＤ４７を活性化しない。一部の抗ＣＤ４７抗体は、ＳＩＲＰαに対するＣＤ４７の結合を低下させず（それゆえ、本明細書では「抗ＣＤ４７剤」であるとはみなさない）、このような抗体は、「非遮断性抗ＣＤ４７抗体」と称することができる。「抗ＣＤ４７剤」である好適な抗ＣＤ４７抗体は、「ＣＤ４７遮断性抗体」と称することができる。好適な抗体の非限定例としては、クローンＢ６Ｈ１２、５Ｆ９、８Ｂ６、及びＣ３が挙げられる（例えば、参照により本明細書に具体的に組み込まれる、国際特許公開ＷＯ２０１１／１４３６２４において記載される）。好適な抗ＣＤ４７抗体には、係る抗体の完全ヒト版、ヒト化版またはキメラ版が含まれる。ヒト化抗体（例えば、ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４）は、その低い抗原性のために、ヒトにおけるｉｎ  ｖｉｖｏでの適用に特に有用である。同様に、イヌ化、ネコ化などの抗体は、それぞれイヌ、ネコ、及び他の種における適用に特に有用である。関心対象の抗体には、ヒト化抗体、またはイヌ化、ネコ化、ウマ化、ウシ化、ブタ化抗体など、及びこれらの変異体が含まれる。
【００５２】
抗ＳＩＲＰα抗体。いくつかの実施形態では、対象の抗ＣＤ４７剤は、ＳＩＲＰα（すなわち、抗ＳＩＲＰα抗体）と特異的に結合して、ある細胞（例えば、感染細胞）上のＣＤ４７と別の細胞（例えば、食細胞）上のＳＩＲＰαとの間の相互作用を低下させる抗体である。好適な抗ＳＩＲＰα抗体は、ＳＩＲＰαの活性化が食作用を阻害することになるため、ＳＩＲＰαを介するシグナル伝達を活性化することまたは刺激することなく、ＳＩＲＰαと結合することができる。代わりに、好適な抗ＳＩＲＰα抗体は、正常細胞よりも、感染細胞の優先的な食作用を促進する。他の細胞（非感染細胞）に対して高レベルのＣＤ４７を発現する細胞（例えば、感染細胞）は、優先的に食作用を受けることになる。ゆえに、好適な抗ＳＩＲＰα抗体は、ＳＩＲＰαと（食作用を阻害するために十分なシグナル伝達応答を活性化／刺激することなく）特異的に結合し、ＳＩＲＰαとＣＤ４７との間の相互作用を遮断する。好適な抗ＳＩＲＰα抗体には、係る抗体の完全なヒト版、ヒト化版またはキメラ版が含まれる。ヒト化抗体は、その低い抗原性のために、ヒトにおけるｉｎ  ｖｉｖｏでの適用に特に有用である。同様に、イヌ化、ネコ化などの抗体は、それぞれイヌ、ネコ、及び他の種における適用に特に有用である。関心対象の抗体には、ヒト化抗体、またはイヌ化、ネコ化、ウマ化、ウシ化、ブタ化抗体など、及びこれらの変異体が含まれる。
【００５３】
可溶性ＣＤ４７ポリペプチド。いくつかの実施形態では、対象の抗ＣＤ４７剤は、ＳＩＲＰαと特異的に結合して、ある細胞（例えば、感染細胞）上のＣＤ４７と別の細胞（例えば、食細胞）上のＳＩＲＰαとの間の相互作用を低下させる可溶性ＣＤ４７ポリペプチドである。好適な可溶性ＣＤ４７ポリペプチドは、ＳＩＲＰαの活性化が食作用を阻害することになるため、ＳＩＲＰαを介するシグナル伝達を活性化することまたは刺激することなく、ＳＩＲＰαと結合することができる。代わりに、好適な可溶性ＣＤ４７ポリペプチドは、非感染細胞よりも、感染細胞の優先的な食作用を促進する。正常な非標的細胞（正常細胞）に対して高レベルのＣＤ４７を発現する細胞（例えば、感染細胞）は、優先的に食作用を受けることになる。ゆえに、好適な可溶性ＣＤ４７ポリペプチドは、食作用を阻害するために十分なシグナル伝達応答を活性化／刺激することなく、ＳＩＲＰαと特異的に結合する。
【００５４】
いくつかの場合では、好適な可溶性ＣＤ４７ポリペプチドは、融合タンパク質であることができる（例えば、参照により本明細書に具体的に組み込まれる米国特許公開ＵＳ２０１００２３９５７９において構造的に説明される）。しかしながら、ＳＩＲＰαを活性化／刺激しない融合タンパク質のみが、本明細書に提供される方法に好適である。好適な可溶性ＣＤ４７ポリペプチドには、ＳＩＲＰαと特異的に結合でき、食作用を阻害するために十分なＳＩＲＰα活性を刺激することなくＣＤ４７とＳＩＲＰαとの間の相互作用を阻害することができる、変異体を含む任意のペプチドもしくはペプチドフラグメントまたは天然に存在するＣＤ４７配列（例えば、細胞外ドメイン配列または細胞外ドメイン変異体）も含まれる。
【００５５】
ある特定の実施形態では、可溶性ＣＤ４７ポリペプチドは、シグナルペプチドを含むＣＤ４７の細胞外ドメインを含み、それにより、ＣＤ４７の細胞外部分は典型的には、１４２アミノ酸長である。本明細書に記載の可溶性ＣＤ４７ポリペプチドには、アミノ酸配列を少なくとも６５％〜７５％、７５％〜８０％、８０〜８５％、８５％〜９０％、または９５％〜９９％（または６５％〜１００％間で具体的に列挙されていない任意のパーセント同一性）含むＣＤ４７細胞外ドメイン変異体も含まれ、当該変異体は、ＳＩＲＰαシグナル伝達を刺激することなく、ＳＩＲＰαに結合する能力を保有している。
【００５６】
ある特定の実施形態では、シグナルペプチドアミノ酸配列は、別のポリペプチド（例えば、免疫グロブリンまたはＣＴＬＡ４）から誘導されたシグナルペプチドアミノ酸配列と置換され得る。例えば、外側の細胞膜を通過する細胞表面ポリペプチドである完全長ＣＤ４７とは異なり、可溶性ＣＤ４７ポリペプチドは分泌される。したがって、可溶性ＣＤ４７ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドには、細胞から正常に分泌されるポリペプチドと会合するシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列が含まれ得る。
【００５７】
他の実施形態では、可溶性ＣＤ４７ポリペプチドは、シグナルペプチドを欠失しているＣＤ４７の細胞外ドメインを含む。本明細書に記載するように、シグナルペプチドは、分泌タンパク質または膜貫通タンパク質の細胞表面上に曝露されない、それはシグナルペプチドがタンパク質の転位中に開裂される、またはシグナルペプチドが外側の細胞膜に係留されたままであるからである（このようなペプチドは、シグナルアンカーとも称される）。ＣＤ４７のシグナルペプチド配列は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＣＤ４７ポリペプチド前駆細胞から開裂すると考えられている。
【００５８】
他の実施形態では、可溶性ＣＤ４７ポリペプチドは、ＣＤ４７細胞外ドメイン変異体を含む。係る可溶性ＣＤ４７ポリペプチドは、ＳＩＲＰαシグナル伝達を刺激することなくＳＩＲＰαに結合する能力を保持する。ＣＤ４７細胞外ドメイン変異体は、天然ＣＤ４７配列に対して、少なくとも６５％〜７５％、７５％〜８０％、８０〜８５％、８５％〜９０％、または９５％〜９９％同一であるアミノ酸配列を有し得る（記載の範囲のいずれか１つの間の任意のパーセント同一性を含む）。
【００５９】
一過性免疫抑制剤。一過性免疫抑制剤は、免疫細胞、特にＴリンパ球の活性を、短期間にわたって、通常はドナー細胞の投与の期間またはその少し前に遮断する。一過性免疫抑制、すなわち有効血清レベルの免疫抑制剤（複数可）は、少なくとも約３日間、少なくとも約１週間、少なくとも約２週間、少なくとも約３週間、少なくとも約４週間、少なくとも約５週間、少なくとも約６週間にわたって維持され得、最大で１カ月、最大で２カ月、最大で３カ月、最大で４カ月、最大で５カ月、最大で６カ月、またはそれ以上にわたって維持され得る。いくつかの実施形態では、単回用量の当該作用物質は、ドナー細胞に先立って、または同時に投与される。係る作用物質は、通常、免疫細胞集団の破壊を伴わずに抑制性である。当該作用物質の初回投与は、ドナー細胞の投与の約３日以内、約２日以内、約１日以内、または投与の時点でなされる。
【００６０】
一過性免疫抑制は、薬理学的免疫抑制剤の投与により達成することができ、それには、限定されないが、カルシニューリン阻害剤が含まれ、これは結合性タンパク質と組み合わせてカルシニューリン活性を阻害する。これには、例えば、タクロリムス、シクロスポリンＡなどが含まれる。シクロスポリン及びタクロリムスのレベルは両方とも注意深くモニターされなければならない。最初は、レベルを１０〜２０ｎｇ／ｍＬの範囲に保つことができるが、３カ月後、レベルは腎毒性のリスクを低下させるために低く（５〜１０ｎｇ／ｍＬ）保たれ得る。この目的のための他の薬理学的作用物質には、ステロイド、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル、及びシロリムスなどが含まれる。
【００６１】
いくつかの実施形態では、一過性免疫抑制剤は、ＣＤ４０とＣＤ４０リガンドとの相互作用を遮断する。ＣＤ４０は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上で認められる共刺激タンパク質であり、その活性化のために必要である。これらのＡＰＣには、食細胞（マクロファージ及び樹状細胞）及びＢ細胞が含まれる。ＣＤ４０は、ＴＮＦ受容体ファミリーの一部である。ＣＤ４０に関する主要な活性化シグナル伝達分子は、ＩＦＮγ及びＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）である。
【００６２】
「ＣＤ４０リガンド」（「ＣＤ４０Ｌ」、「ＣＤ１５４」とも称される）は、ＩＩ型膜貫通タンパク質である。ＣＤ４０Ｌは、当初、Ｔ細胞依存性Ｂ細胞活性化、増殖、及び分化のメディエーターとして機能する活性化Ｔリンパ球に限定されると考えられていた。ＣＤ４０Ｌの発現は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）遺伝子スーパーファミリーの免疫及び炎症の中心的なメディエーターとして機能的役割を果たす。ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ相互作用は、胸腺依存性の体液性免疫応答の発生に不可欠である。ＣＤ４０Ｌは、Ｔ細胞媒介性エフェクター機能及び適切な宿主防御に必要な一般的免疫応答などの生理学的プロセスを調節するが、炎症誘発性メディエーター、例えばサイトカイン、接着分子、及びマトリックス分解活性の発現も引き起こし、これらは全て慢性炎症性疾患、例えば、自己免疫障害、関節炎、アテローム性動脈硬化、及び癌の病理発生に関連する。
【００６３】
免疫反応の多くの態様を媒介するその重要な役割を考慮すると、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ経路は、移植拒絶の予防のための治療標的を提供する。抗ＣＤ４０Ｌ抗体を用いてＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌシグナル経路に干渉することは、動物モデル及び臨床使用における急性同種移植片拒絶及び同種抗体反応を防止するために有効であり得る。後続の研究は、いくつかのげっ歯類モデル（膵島、四肢、角膜及び骨髄）における移植片生存の延長に対する抗ＣＤ４０Ｌの有益な効果を実証している。
【００６４】
本明細書で使用する場合、「抗ＣＤ４０Ｌ剤」または「ＣＤ４０Ｌ遮断を提供する作用物質」という用語は、ＣＤ４０に対する（例えば、標的細胞上の）ＣＤ４０Ｌの結合を低下させる任意の作用物質を指す。好適な抗ＣＤ４０Ｌ試薬の非限定例としては、抗ＣＤ４０抗体、及び抗ＣＤ４０Ｌ抗体または抗体フラグメントが挙げられる。関心対象の作用物質は、抗体のフラグメント及び小分子を含むがこれらに限定されない。例えば、ＣＤＰ７６５７は、高親和性ＰＥＧ化一価Ｆａｂ’抗ＣＤ４０Ｌ抗体フラグメントである。有効量の抗体は、最大で約５０ｍｇ／ｋｇ、最大で約２５ｍｇ／ｋｇ、最大で約１０ｍｇ／ｋｇ、最大で約５ｍｇ／ｋｇ、最大で約１ｍｇ／ｋｇ、最大で約０．５ｍｇ／ｋｇ、またはそれ以下であり得、ここで用量は特定の抗体及びレシピエントで変動し得る。抗体に対する代替として、小分子阻害剤が、例えばＣｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．６０，８９０６−８９２２に記載されており、これは参照により本明細書に具体的に組み込まれる。
【００６５】
Ｔ細胞破壊。いくつかの移植状況に関しては、表１に概説するように、内在性Ｔ細胞も欠失させることが望ましい。いくつかの実施形態では、破壊的作用物質は、Ｔ細胞に特異的であり、他では、ＮＫ細胞にも作用する。Ｔ細胞を標的とする抗体には、例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ５２（ｃａｍｐａｔｈ）、ＣＤ４５に特異的な抗体、及びＡＴＧが含まれる。タイミングに関しては、Ｔ細胞枯渇剤は、ドナー細胞の投与の時点または少し前に活性であることが望ましい。枯渇剤の治療レベルは、ドナー細胞の投与後、少なくとも約３日間、少なくとも約１週間、少なくとも約２週間、少なくとも約３週間、少なくとも約４週間、少なくとも約５週間、少なくとも約６週間にわたって維持され得、最大で１カ月、最大で２カ月、最大で３カ月、最大で４カ月、最大で５カ月、最大で６カ月、またはそれ以上にわたって維持され得る。いくつかの実施形態では、ある用量の当該作用物質は、ドナー細胞の投与の約３日以内、約２日以内、約１日以内、または同時点で投与され、抗体によっては、注入の前に、数日間、例えば、２、３、４日間などにわたって毎日投与され得る。有効量の抗体は、最大で約５０ｍｇ／ｋｇ、最大で約２５ｍｇ／ｋｇ、最大で約１０ｍｇ／ｋｇ、最大で約５ｍｇ／ｋｇ、最大で約１ｍｇ／ｋｇ、最大で約０．５ｍｇ／ｋｇ、またはそれ以下、例えば最大で約１００μｇ／ｋｇ、最大で約５０μｇ／ｋｇ、最大で約１０μｇ／ｋｇ、最大で約１μｇ／ｋｇであってよく、この場合、用量は特定の抗体及びレシピエントで変動し得る。抗体に基づく治療法は、モノクローナル抗体（例えば、ムロモナブＣＤ３）またはポリクローナル抗体、抗ＣＤ２５抗体（例えば、バシリキシマブ、ダクリズマブ）などを使用し得る。抗体には、例えば、ＡＴＧ調製物、ＫＴ３、ＢＴＩ−３２２（登録商標）（米国特許第５，７３０，９７９号、その開示は参照により本明細書に組み込まれる）が含まれる。
【００６６】
テプリズマブを含む複数の抗ヒトＣＤ３ｍＡｂが臨床開発中であり、ＭＧＡ０３１は、ＯＫＴ３の相補性決定領域をヒトＩｇＧ１主鎖に移植することによって開発されたヒト化ＩｇＧ１抗体である。オテリキシズマブ（ＣｈＡｇｌｙＣＤ３、ＴＲＸ４、ＧＳＫ２１３６５２５）は、ラット抗体ＹＴＨ１２．５から誘導され、グリコシル化を避け、ゆえにＦｃＲ結合を阻害するために、γ１Ｆｃ部分内に単一突然変異を有するヒト化ＩｇＧ１である。ビシリズマブ（Ｎｕｖｉｏｎ、ＨｕＭ２９１）は、そのＦｃ領域内の２点突然変異によって非分裂促進性を得たヒト化ＩｇＧ２抗体である。フォラルマブ（２８Ｆ１１−ＡＥ；ＮＩ−０４０１）は、完全なヒト抗ＣＤ３ｍＡｂである。
【００６７】
Ｔ細胞及びＮＫ細胞の枯渇のために有用な作用物質は、抗ＣＤ５２抗体であり、例えば、臨床承認された抗体Ｃａｍｐａｔｈ（アレムツズマブ）が挙げられ、これは組換えＤＮＡにより誘導された、２１〜２８ｋＤ細胞表面糖タンパク質であるＣＤ５２に対するヒト化モノクローナル抗体である。Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈは、ヒト可変フレームワーク及び定常領域、ならびにマウス（ラット）モノクローナル抗体（Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｇ）由来の相補性決定領域を有するＩｇＧ１カッパ抗体である。Ｃａｍｐａｔｈは、例えば、現在承認されている臨床用量、例えば、約３〜約７日間の期間にわたって３０ｍｇの最大単回用量まで漸増させて投与され得る。
【００６８】
ＮＫ細胞破壊。いくつかの移植状況に関しては、表１に概説するように、内在性ＮＫ細胞も欠失させることが望ましい。上記に示すように、いくつかの作用物質は、Ｔ細胞及びＮＫ細胞の両方に作用する、例えば、ＣＤ２、ＣＤ５２に対する抗体などである。他の作用物質は、ＮＫ細胞に特異的であり、Ｔ細胞標的作用物質と組み合わせて投与され得る。ＮＫ細胞を選択的に標的とする抗体としては、例えば、ＣＤ１２２及びＣＤ５６に特異的な抗体が含まれる。
【００６９】
タイミングに関しては、ＮＫ細胞枯渇剤は、ドナー細胞の投与の時点または少し前に活性であることが望ましい。枯渇剤の治療レベルは、ドナー細胞の投与後、少なくとも約３日間、少なくとも約１週間、少なくとも約２週間、少なくとも約３週間、少なくとも約４週間、少なくとも約５週間、少なくとも約６週間にわたって維持され得、最大で１カ月、最大で２カ月、最大で３カ月、最大で４カ月、最大で５カ月、最大で６カ月、またはそれ以上にわたって維持され得る。いくつかの実施形態では、ある用量の当該作用物質は、ドナー細胞の投与の約３日以内、約２日以内、約１日以内、または同時点で投与され、抗体によっては、注入の前に、数日間、例えば、２、３、４日間などにわたって毎日投与され得る。有効量の抗体は、最大で約５０ｍｇ／ｋｇ、最大で約２５ｍｇ／ｋｇ、最大で約１０ｍｇ／ｋｇ、最大で約５ｍｇ／ｋｇ、最大で約１ｍｇ／ｋｇ、最大で約０．５ｍｇ／ｋｇ、またはそれ以下、例えば最大で約１００μｇ／ｋｇ、最大で約５０μｇ／ｋｇ、最大で約１０μｇ／ｋｇ、最大で約１μｇ／ｋｇであってよく、この場合、用量は特定の抗体及びレシピエントで変動し得る。
【００７０】
「ＣＤ１２２」（「インターロイキン−２受容体サブユニットベータ」、ＩＬ２ＲＢとも称される）は、Ｉ型膜タンパク質である。ＣＤ１２２は、インターロイキン２受容体（ＩＬ２Ｒ）のサブユニットであり、Ｔ細胞媒介性免疫応答に関与し、インターロイキン２に結合する能力に関して３つの形態で存在する。低親和性形態のＩＬ２Ｒは、アルファサブユニットの単量体であり、シグナル伝達に関与していない。中親和性形態は、アルファ／ベータサブユニットヘテロ二量体からなり、一方で高親和形態は、アルファ／ベータ／ガンマサブユニットヘテロ三量体からなる。中親和性及び高親和形態の受容体は両方とも、受容体媒介性エンドサイトーシス及びインターロイキン２からの分裂促進シグナルの伝達に関与している。代替プロモーターの使用は、同じタンパク質をコードする複数の転写物変異体をもたらす。
【００７１】
本明細書で使用する場合、「抗ＣＤ１２２剤」または「ＣＤ１２２遮断を提供する作用物質」という用語は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む、ＣＤ１２２陽性細胞を枯渇させる任意の作用物質を指す。好適な抗ＣＤ１２２試薬の非限定例としては、抗ＩＬ−２抗体、及び抗ＣＤ１２２抗体または抗体フラグメントが挙げられる。
【００７２】
ＣＤ５６を標的とする抗体は、臨床開発中であり、ＮＫ細胞枯渇に使用される。例えば、ＩＭＧＮ９０１は、細胞傷害性マイタンシノイドＤＭ１の選択的送達のために設計されているＣＤ５６標的抗体−薬物コンジュゲートであり、最大耐量（ＭＴＤ）は約７５ｍｇ／ｍ2 である。これは例えば、約１〜約６０ｍｇ／ｍ2 の用量で投与されてよい。
【００７３】
「主要組織適合性複合体抗原」（「ＭＨＣ」、「ヒト白血球型抗原」、ＨＬＡとも称される）は、これらの細胞に特有の抗原性同一性を付与する細胞表面上に発現されるタンパク質分子である。ＭＨＣ／ＨＬＡ抗原は、免疫エフェクター細胞と同一の起源の造血幹細胞（「自己」）から誘導されるものとして、または別の起源の造血再構成細胞（「非自己」）から誘導されるものとして、Ｔ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞によって認識される標的分子である。ＨＬＡ抗原の２つの主なクラスであるＨＬＡクラスＩ及びＨＬＡクラスＩＩが認識される。ＨＬＡクラスＩ抗原（ヒトではＡ、Ｂ及びＣ）は各細胞に「自己」として認識可能にさせ、一方、ＨＬＡクラスＩＩ抗原（ヒトではＤＲ、ＤＰ及びＤＱ）はリンパ球と抗原提示細胞との間の反応に関与する。両方とも移植臓器の拒絶に関係があるとされる。
【００７４】
ＨＬＡ遺伝子系の重要な態様は、その多型である。各遺伝子、ＭＨＣクラスＩ（Ａ、Ｂ及びＣ）及びＭＨＣクラスＩＩ（ＤＰ、ＤＱ及びＤＲ）は、異なるアレルに存在する。ＨＬＡアレルは数字及びサブスクリプトによって表される。例えば、２つの非血縁個体は、それぞれ、クラスＩ  ＨＬＡ−Ｂ、遺伝子Ｂ５及びＢｗ４１を有し得る。アレル遺伝子生成物は、α及び／またはβドメイン（複数可）において１つまたは複数のアミノ酸が異なる。特定の抗体または核酸試薬の大きなパネルは、クラスＩ及びクラスＩＩ分子を発現する白血球を使用して、個体のＨＬＡハプロタイプをタイピングするために使用される。ＨＬＡタイピングのために最も重要な遺伝子は、６つのＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩタンパク質であり、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−ＤＲの各々について２つのアレルがある。
【００７５】
ＨＬＡ遺伝子は、染色体位置６ｐ２１に存在する「スーパー遺伝子座」にクラスター形成され、これは６つの古典的移植ＨＬＡ遺伝子、及び免疫系の制御ならびにいくつかの他の基本的な分子及び細胞プロセスに重要な役割を有する少なくとも１３２個のタンパク質をコードする遺伝子をコードする。完全遺伝子座は、大体３．６Ｍｂ長であり、少なくとも２２４遺伝子座を有する。このクラスター形成の効果の１つは、「ハプロタイプ」、すなわち、一方の親から遺伝する、単一染色体上に存在するアレルのセットが、一群として遺伝する傾向にあることである。各親から遺伝したアレルのセットは、一部のアレルが互いに会合する傾向がある場合に、ハプロタイプを形成する。患者のハプロタイプを同定することは、適合するドナーを見出す確率を予測し、検索戦略の開発の一助となることができる。なぜならば、一部のアレル及びハプロタイプは他のものより一般的であり、異なった人種及び民族群において異なった頻度で分布されるからである。
【００７６】
本明細書で使用する場合、「ＨＬＡ適合」という用語は、全てのＨＬＡ抗原がドナーとレシピエントとの間で不適合でない、ドナーレシピエント対を言う。ＨＬＡ適合（すなわち、６つのアレルの全てが適合する）ドナー／レシピエント対は、不適合対（すなわち、６つのアレルのうちの少なくとも１つが不適合である）に比べて、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）のリスクが減少する。ＨＬＡハプロ一致は、１つの染色体が、少なくともＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−ＤＲで適合しており、染色体上のマイナー組織適合性遺伝子座で適合し得るが第二の染色体上で必ずしも適合しなくてよい、適合を指す。このようなドナーは、家族においてしばしば生じ、例えば、親は子に対してハプロ一致であり、同胞はハプロ一致である可能性がある。
【００７７】
本明細書で使用する場合、「ＨＬＡ不適合」という用語は、少なくとも１つのＨＬＡ抗原が、特にＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−ＤＲに関して、ドナーとレシピエントとの間で不適合である、ドナーレシピエント対を指す。いくつかの場合では、一方のハプロタイプは適合し、他方は不適合である。この状況は、生体または死体ドナーからの臓器で頻繁に認められる。ＨＬＡ不適合ドナー／レシピエント対は、完全に適合した対（すなわち、６つのアレルの全てが適合する）に比べて、ＧＶＨＤのリスクが増大する。
【００７８】
ＨＬＡアレルは、典型的には、詳細な様々なレベルで記載される。ほとんどの命名はＨＬＡ及び遺伝子座名で始まり、次いで＊及びアレルを指定するいくつかの数字（偶数）が続く。最初の２つの数字はアレル群を指定する。より古いタイピング法は、しばしば、アレルを完全に識別できず、このレベルに留まっていた。第３〜第４の数字は、同義のアレルを指定する。第５〜第６の数字は、遺伝子のコーディングフレーム内の任意の同義変異を示す。第７及び８の数字は、コーディング領域の外側の突然変異を識別する。Ｌ、Ｎ、ＱまたはＳなどの文字は、発現レベルまたはそれについて知られた他の非ゲノムデータを指定するためのアレル命名の後につくことがある。ゆえに、完全に記載されたアレルは、最大９つの数字長であり得、これにはＨＬＡ接頭辞及び遺伝子座表記は含まれない。
【００７９】
本明細書で使用する場合、「レシピエント」は、一般に同一種である別の個体（ドナー）からの臓器、組織または細胞が、移入されている個体である。本開示の目的のため、レシピエント及びドナーは、ＨＬＡ適合またはＨＬＡ不適合のいずれかである。
【００８０】
本明細書で使用する場合、「抗体」には、特定の抗原と免疫学的に反応する免疫グロブリン分子に対する言及が含まれ、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の両方が含まれる。当該用語には、キメラ抗体（例えば、ヒト化ネズミ抗体）及びヘテロ共役型抗体のような遺伝子操作した形態も含まれる。「抗体」という用語には、抗原結合能を有するフラグメント（例えば、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2 、Ｆａｂ、Ｆｖ及びｒＩｇＧを含む、抗体の抗原結合形態も含まれる。当該用語は、組換え一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）も指す。抗体という用語には、二価または二重特異性の分子、二重特異性抗体、三重特異性抗体、及び四重特異性抗体も含まれる。
【００８１】
内在性幹細胞破壊及び一過性免疫抑制のための抗体の選択は、選択性、親和性、細胞傷害性などを含む種々の基準に基づいてよい。抗体に「特異的に（または選択的に）結合する」という語句または「特異的に（または選択的に）〜と免疫反応する」という語句は、タンパク質またはペプチドを指すとき、タンパク質及び他の生物製剤の異種集団における当該タンパク質の存在を決定する結合反応を指す。ゆえに、指定のイムノアッセイ条件下では、指定の抗体は、特定のタンパク質配列に、バックグラウンドの少なくとも２倍、より典型的にはバックグラウンドの１０〜１００倍を超えて結合する。概して、本発明の抗体は、エフェクター細胞（ナチュラルキラー細胞またはマクロファージなど）の存在下で標的細胞の表面上にある抗原と結合する。エフェクター細胞上のＦｃ受容体は、結合した抗体を認識する。Ｆｃ受容体の架橋は、エフェクター細胞に、細胞溶解またはアポトーシスによって標的細胞を殺滅するようにシグナル伝達する。一実施形態では、当該誘導は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を介して達成される。代替の実施形態では、抗体は標的とされる細胞の増殖阻害において活性であり、破壊は成長因子のシグナル伝達に干渉することにより達成される、例えば、ｃ−ｋｉｔなどの成長因子受容体に特異的な抗体である。
【００８２】
特定の抗原と免疫学的に反応する抗体は、ファージもしくは類似のベクターにおける組換え抗体のライブラリの選択などの組換え法によって、または抗原を用いてもしくは抗原をコードするＤＮＡを用いて動物を免疫化することによって生成することができる。ポリクローナル抗体を調製する方法は、当業者に公知である。抗体は、代替としてモノクローナル抗体であってよい。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法を用いて調製され得る。ハイブリドーマ法では、適切な宿主動物は典型的には、免疫化剤を用いて免疫化されて、当該免疫化剤に特異的に結合する抗体を産生するまたは産生することができるリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫化され得る。次いで、リンパ球は、ポリエチレングリコールなどの好適な融合剤を使用して不死化細胞株と融合して、ハイブリドーマ細胞を形成する。
【００８３】
ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリを含む、当該技術分野で公知の種々の技術を用いて産生することができる。同様に、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を、内在性免疫グロブリン遺伝子が部分的にまたは完全に失活したトランスジェニック動物、例えばマウスへと導入することによって作成することができる。チャレンジの際に、遺伝子再編成、組み立て、及び抗体レパートリーを含む全ての点においてヒトにおいて見られるものと密接に類似している、ヒト抗体産生が観察される。
【００８４】
抗体は、種々のペプチダーゼを用いた消化によって産生されるいくつかの十分に特徴づけられたフラグメントとしても存在する。ゆえに、ペプシンは、ヒンジ領域内でジスルフィド連結下にある抗体を消化して、それ自体がジスルフィド結合によりＶH −ＣH1に接合した軽鎖であるＦａｂの二量体である、Ｆ（ａｂ’）2 を産生する。Ｆ（ａｂ）’2 を、マイルドな条件下で還元して、ヒンジ領域のジスルフィド連結を切断することにより、Ｆ（ａｂ’）2 二量体をＦａｂ’単量体へ変換し得る。Ｆａｂ’単量体は本質的に、ヒンジ領域部を有するＦａｂである。種々の抗体フラグメントがインタクト抗体の消化に関して定義されるが、当業者は、このようなフラグメントが化学的にまたは組換えＤＮＡ法を用いることによってのいずれかでデノボ合成され得ることを理解する。ゆえに、抗体という用語は、本明細書で使用する場合、抗体全体の修飾によって生成された抗体フラグメント、または組換えＤＮＡ法を用いてデノボ合成された抗体フラグメント（例えば、一本鎖Ｆｖ）またはファージディスプレイライブラリを用いて同定された抗体フラグメントも含む。
【００８５】
「ヒト化抗体」は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有する免疫グロブリン分子である。ヒト化抗体には、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、所望の特異性、親和性及び能力を有するマウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト種のＣＤＲ由来の残基（ドナー抗体）によって置き換えられたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）が含まれる。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。ヒト化抗体は、レシピエント抗体においても移入されたＣＤＲまたはフレームワーク配列においても認められない残基も含み得る。一般に、ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域の全部または実質的に全部が非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、フレームワーク（ＦＲ）領域の全部または実質的に全部がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のそれである、少なくとも１つ及び典型的には２つの可変ドメインの実質的に全部を含む。ヒト化抗体は、最適には、典型的にはヒト免疫グロブリンのものである、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部も含む。
【００８６】
破壊のための関心対象の抗体は、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）を誘導するその能力について検査されてよい。抗体関連ＡＤＣＣ活性は、溶解した細胞からの標識もしくは乳酸脱水素酵素の放出のいずれかの検出、または標的細胞生存の減少の検出（例えば、アネキシンアッセイ）によりモニター及び定量化することができる。アポトーシスに関するアッセイは、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介性ジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）アッセイによって実施されてよい（Ｌａｚｅｂｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ：３７１，３４６（１９９４）。細胞傷害性は、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄ．）製の細胞傷害性検出キットなどの、当該技術分野で公知の検出キットによって直接検出されてもよい。好ましくは、本発明の抗体は、標的細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、または８０％細胞傷害を誘発する。
【００８７】
いくつかの実施形態では、抗体は、エフェクター部分にコンジュゲートする。エフェクター部分は、放射性標識または蛍光標識などの標識部分を含む、任意の数の分子であることができるか、または細胞傷害性部分であることができる。細胞傷害性作用物質は多数多様で、細胞傷害性薬物または毒素もしくは係る毒素の活性フラグメントを含むがこれらに限定されない。好適な毒素及びその対応するフラグメントには、ジフテリアＡ鎖、外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、クルシン、クロチン、フェノマイシン、エノマイシン、サポリン、アウリスタチン−Ｅなどが含まれる。細胞傷害性作用物質は、放射性同位元素を抗体にコンジュゲートさせることによって作成された放射化学物質も含む。細胞傷害性部分を膜貫通タンパク質に標的化することは、標的領域における細胞傷害性部分の局在濃度の増加に役立つ。
【００８８】
幹細胞という用語は、本明細書では、自己複製、及び分化した後代を生成する能力の両方を有する哺乳動物細胞を指すために使用される（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｃｅｌｌ８８：２８７−２９８を参照されたい）。一般に、幹細胞は、非同調、または対称複製を受ける能力、つまり分裂後の二つの娘細胞が異なる表現型を有することができる広範な自己複製能力、有糸分裂静止形態にて存在する能力、及びそれらが存在する全ての組織のクローン再生、例えば全ての造血系列を再構成する造血幹細胞の能力の特性のうちの１つまたは複数を有する。
【００８９】
生着目的のために、造血幹細胞を含む組成物を、患者に投与する。このような方法は当該技術分野で周知である。幹細胞は、任意選択的に、必須ではないが、精製されている。幹細胞の精製及び後続の生着のための種々の方法が多数の報告で探求されており、それにはフローサイトメトリー；アイソレックスシステム（Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２８（１１）：１０２３−９；Ｐｒｉｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ４（２）：１３７−４５）；免疫磁気分離法（Ｐｒｉｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ４（２）：１４７−５５；Ｈａｎｄｇｒｅｔｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２９（９）：７３１−６；Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ．１２（３）：１７８−８８）などが含まれる。これらの参考文献はそれぞれ、特に造血幹細胞移植のための手順、細胞組成及び用量に関して、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。
【００９０】
造血幹細胞は、骨髄からまたは末梢血から回収することにより得ることができる。骨髄は、一般的に、ドナーが局所または全身麻酔下にある間に、後腸骨稜から吸引される。追加の骨髄は、前腸骨稜から得ることができる。キログラム当り１×１０8 及び２×１０8 個の骨髄単核細胞が、通常、それぞれ自家及び同種骨髄移植において生着を確立するために望ましいと考えられる。骨髄は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ；フィルグラスチム［Ｎｅｕｐｏｇｅｎ］）を用いてプライムして、幹細胞数を増やすことができる。本明細書に記載の目的のための「全骨髄」に対する言及は、一般に、特定の免疫細胞サブセットに関して選択されていない骨髄から誘導される単核細胞の組成物を指す。「分画骨髄」は、例えば、Ｔ細胞、例えば、ＣＤ８+ 細胞、ＣＤ５２+ 細胞、ＣＤ３+ 細胞などが枯渇している、ＣＤ３４+ 細胞について富化しているなどである場合がある。
【００９１】
造血幹細胞は、臍帯血からも得られる。臍帯血は、同種造血幹細胞移植のための造血幹細胞のほぼ無制限の供給源である。臍帯血バンク（ＣＢＢ）は、血縁者または非血縁者ＵＣＢＴのために設立され、４００，０００を超えるユニットが利用可能で、２０，０００を超える臍帯血移植が小児及び成人において実施されている。ＵＣＢ造血前駆細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏで長期再増殖する幹細胞を産生することができる原子幹細胞／前駆細胞に富化している。しかしながら、任意の単一ドナーから入手可能な細胞の数は、他の供給源と比較して、比較的少なくあり得る。
【００９２】
Ｇ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦなどのサイトカインによる骨髄から末梢血への幹細胞の動員は、造血幹細胞移植のためのアフェレシスによる末梢血前駆細胞収集の広範な適用をもたらしている。動員に使用されるＧ−ＣＳＦの用量は、１０μｇ／ｋｇ／日である。しかしながら、重度に前処置されている自家ドナーでは、最大で４０μｇ／ｋｇ／日の用量を与えることができる。モゾビルを、収集のために造血幹細胞を末梢血へと動員するためにＧ−ＣＳＦと併用してよい。
【００９３】
投与される幹細胞の用量は、注入される細胞組成物の所望の純度、及び細胞の供給源に依存し得る。現行のガイドラインでは、生着のために必要とされる最小用量は、自家及び同種移植に関して、１〜２×１０6 個のＣＤ３４+ 細胞／ｋｇ体重であると示されている。より高い用量に、例えば、３×１０6 、４×１０6 、５×１０6 、６×１０6 、７×１０6 、８×１０6 、９×１０6 、１０7 またはそれ以上を含むことができる。しばしば、用量は、利用可能な細胞の数によって制限される。典型的には、供給源に関わらず、用量は、存在するＣＤ３４+ 細胞の数により算出される。ＣＤ３４+ 細胞の数の割合（％）は、未分画骨髄または動員末梢血に関して低くあり得る。この場合、投与される細胞の総数は、遥かに高い。
【００９４】
ＣＤ３４+ 細胞は、ドナー造血細胞試料から、アフィニティー法により選択されてよく、これには磁気ビーズ選択、フローサイトメトリー、などを含むがこれらに限定されない。ＨＳＰＣ組成物は、集団内のＣＤ３４+ である細胞の割合（％）により定義して、少なくとも約５０％純粋であってよい、少なくとも約７５％純粋、少なくとも約８５％純粋、少なくとも約９５％純粋、またはそれ以上であってよい。好ましくは、ＨＳＰＣ組成物と共に送達されるＣＤ３+ 細胞の最大数は、レシピエントの体重ｋｇ当り約１０6 個以下のＣＤ３+ 細胞、レシピエントの体重ｋｇ当り約１０5 個以下のＣＤ３+ 細胞、レシピエントの体重ｋｇ当りの約１０4 個以下ＣＤ３+ 細胞である。あるいは、細胞集団は、ＣＤ３４及びＣＤ９０の発現に関してタンデムに選択されてよく、この細胞集団は高度に精製されていてよい、例えば、少なくとも約８５％ＣＤ３４+ ＣＤ９０+ 細胞、少なくとも約９０％ＣＤ３４+ ＣＤ９０+ 細胞、少なくとも約９５％ＣＤ３４+ ＣＤ９０+ 細胞であってよく、最大で約９９％ＣＤ３４+ ＣＤ９０+ 細胞またはそれ以上であってよい。あるいは、未処置骨髄または動員末梢血集団を使用する。
【００９５】
造血幹細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、例えば多能性胚性幹細胞、人工多能性細胞、などから生成することもできる。例えば、Ｓｕｇｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｎａｔｕｒｅ５４５：４３２−４３８を参照されたく、これは参照により本明細書に具体的に組み込まれ、造血前駆細胞の生成のためのプロトコルを詳述している。
【００９６】
採用される細胞は、新鮮なもの、凍結されたもの、または前培養されているものであってよい。これらは、胎児、新生児、成体などであってよい。造血幹細胞は、胎児の肝臓、骨髄、血液、特にＧ−ＣＳＦもしくはＧＭ−ＣＳＦ動員末梢血、または任意の他の従来の供給源から得てよい。生着のための細胞は、任意選択で、他の細胞から単離されており、幹細胞が造血または他の系列から分離される様式は、本明細書にとって重要でない。所望の場合、幹細胞に関連したエピトープ特性を示す一方で分化細胞に関連したマーカーを含まない細胞を選択的に単離することにより、幹細胞または前駆細胞の実質的に均質な集団が得られ得る。
【００９７】
細胞は、分化細胞において有用な遺伝子、例えば、個体における遺伝的欠損の修復、選択可能マーカーなど、または未分化ＥＳ細胞に対する選択において有用な遺伝子を導入するために、遺伝子改変され得る。細胞はまた、生存を増強する、増殖を制御するなどのために遺伝子改変され得る。細胞は、それらが関心対象の遺伝子を発現するように、好適なベクターを用いたトランスフェクションもしくは形質導入、相同組換え、または他の適切な技術によって遺伝子改変され得る。一実施形態では、細胞は、典型的には内在性プロモーター下で生じるものを超えてテロメラーゼ発現を増加させる異種プロモーター下で、テロメラーゼ触媒成分（ＴＥＲＴ）をコードする遺伝子を用いてトランスフェクションされる（国際特許出願ＷＯ９８／１４５９２を参照されたい）。他の実施形態では、より高い純度の所望の分化性細胞を提供するために、選択可能マーカーが導入される。細胞は、８〜１６時間にわたってベクター含有上清を使用して遺伝子改変され、次いで１〜２日間にわたって増殖培地へと交換され得る。遺伝子改変された細胞は、ピューロマイシン、Ｇ４１８、またはブラストサイジンなどの薬物選択剤を使用して選択され、次いで再培養される。
【００９８】
本発明の細胞を、組織再生に関与するその能力を増強するため、または治療遺伝子を投与部位に送達するために遺伝子改変することもできる。ベクターは、構成的、ｐａｎ特異的、分化細胞型において特に活性であるなどのプロモーターに操作可能に連結された、所望の遺伝子に関する公知のコード配列を使用して設計される。好適な誘導性プロモーターは、所望の標的細胞型、トランスフェクションされた細胞、またはその子孫のいずれかにおいて、活性化される。転写活性化によって、転写が、標的細胞中にて基礎レベルを超えて、少なくとも約１００倍、より通常では少なくとも約１０００倍増加されることが意図される。異なる細胞型において誘導される種々のプロモーターが公知である。
【００９９】
外来性遺伝子を標的哺乳類細胞中に移入するために有用な多くのベクターが利用可能である。ベクターは、エピソーマル、例えば、プラスミド、ウイルス由来ベクター、例えばサイトメガロウイルス、アデノウイルスなどであり得、または標的細胞ゲノムへと、相同組換えまたはランダム組み込みを通して組み込まれ得る、例えば、レトロウイルス由来ベクター、例えばＭＭＬＶ、ＨＩＶ−１、ＡＬＶなどであり得る。幹細胞の改変に関しては、レンチウイルスベクターが好ましい。レンチウイルスベクター、例えばＨＩＶまたはＦＩＶ  ｇａｇ  配列に基づくものが、非分裂性細胞、例えば、休止期のヒト幹細胞をトランスフェクトするために使用され得る。レトロウイルス及び好適なパッケージング細胞株の組み合わせもまた使用され得、この場合、カプシドタンパク質が、標的細胞を感染させるために有用となる。通常、細胞及びウイルスを、培養培地中で少なくとも約２４時間インキュベートする。次いで、細胞を、ある適用においては短期間、例えば２４〜７３時間、または少なくとも２週間、培養培地中で自然に増殖させ、分析前に、５週間またはそれ以上にわたって増殖させ得る。一般的に使用されるレトロウイルスベクターは、「欠損性」である、すなわち、増殖性感染のために必要とされるウイルスタンパク質を産生することができない。ベクターの複製は、パッケージング細胞株中における増殖を必要とする。ベクターは、例えば、Ｃｒｅ／Ｌｏｘなどのリコンビナーゼ系を使用して、後に除去されなければならない遺伝子を含んでよい、または、それらを発現する細胞は、例えばヘルペスウイルスＴＫ、ｂｃｌ−Ｘｓなどの選択毒性を可能にする遺伝子を含むことによって、破壊される。
【０１００】
キメリズムは、本明細書で使用する場合、別途示されない限り、通常、造血系のキメリズムを指す。個体が、完全キメラ、混合キメラ、または非キメラ生成物であるか否かは、当該技術分野で公知のように、移植片レシピエントからの造血細胞試料、例えば、末梢血、骨髄などの分析により決定される。分析は、任意の従来法のタイピングによりなされてよい。いくつかの実施形態では、全ての単核細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞、及びＣＤ１５＋好中球間のキメリズムの程度は、定期的にモニターされ、これには、マイクロサテライト分析用プローブを用いたＰＣＲを使用する。例えば、ドナー及び宿主起源の短い末端反復長内の多型を識別する市販のキットが入手可能である。自動リーダーは、人工ドナー及び宿主細胞混合物からの標準曲線に基づいてドナー型細胞の割合（％）を提供する。
【０１０１】
このような分析により移植後の任意の時点で９５％超のドナー細胞を所与の血液細胞系列中に呈する個体は、この移植患者群において完全ドナーキメリズムを有すると称される。混合キメリズムは、このような分析において１％超ドナーであるが９５％未満のドナーＤＮＡとして定義される。混合キメリズムを呈する個体は、キメリズムの発展に従ってさらに分類される可能性があり、混合キメリズムの改善は、少なくとも６カ月の期間にわたるドナー細胞の比率における継続的な増加と定義される。安定した混合キメリズムは、ドナー細胞が完全に喪失しない、経時的なレシピエント細胞の割合（％）の変動と定義される。
【０１０２】
本発明の目的に関する「患者」には、ヒトならびに、ペット及び実験動物、例えば、マウス、ラット、ウサギなどを含む他の動物、特に哺乳類の両方が含まれる。ゆえに、当該方法は、ヒト療法及び獣医学的適用の両方に適用可能である。一実施形態では、患者は、哺乳類、好ましくは霊長類である。他の実施形態では、患者はヒトである。
【０１０３】
追加の用語。「処置」、「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「処置する（ｔｒｅａｔ）」などの用語は、本明細書において一般的に、所望の薬理学的及び／または生理学的効果を得ることを指すために使用される。効果は、疾患もしくはその症状（複数可）の完全もしくは部分的予防という点で予防的であることができる、ならびに／または疾患及び／もしくは疾患に起因する副作用の部分的もしくは完全な安定化もしくは治癒という点で治療的であり得る。「処置」という用語は、哺乳類、特にヒトにおける疾患の任意の処置を包含し、（ａ）疾患もしくは症状に罹患する可能性があるがまだ罹患していると診断されていない対象において疾患及び／もしくは症状（複数可）が発生することを予防すること、（ｂ）疾患及び／もしくは症状（複数可）を阻害すること、すなわち、それらの発生を停止させること、または（ｃ）疾患症状（複数可）を軽減すること、すなわち、疾患及び／もしくは症状（複数可）の退縮を引き起こすことを含む。処置を必要とするものには、すでに負っている者（例えば、癌を有する、感染している者など）ならびに予防が望まれるもの（例えば、癌に対する感受性が増加しているもの、感染の可能性が増加しているもの、癌を有する疑いがあるもの、感染していると疑われるものなど）が含まれる。
【０１０４】
生着のための方法
本発明の方法は、レシピエントへの移植後の幹細胞の生着の改善を提供する。レシピエントは、免疫応答性であり得、移植は、骨髄破壊的移植前処置の非存在下、すなわち放射線及び／または化学療法薬の非存在下で行われ得る。レシピエントは、細胞及びＨＬＡ適合に従って選択される一式の作用物質の組み合わせ投与を用いて移植前処置される。作用物質の選択は、表１に示され、これは、最適化された移植前処置プロトコルのガイドラインを提供する。「＋」は、指定の作用物質、ＨＬＡ適合及び細胞源について、当該作用物質が含まれるべきであることを示す。「−」は、必須ではないが、任意選択で含まれることができることを示す。上記で開示するように、ある特定の作用物質は、Ｔ細胞及びＮＫ細胞の両方を枯渇させることができ、それゆえ両方に対して一つの作用物質のみが必要とされる。異なる作用物質に関するタイミング及び用量は、上記のとおりである。本発明の移植前処置レジメンは、内在性幹細胞を選択的に破壊し、内在性免疫反応の好適な選択された抑制を提供し、それにより適合しないレシピエントにおいても生着を可能にする。
【０１０５】
【表１】
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【０１０６】
移植前処置レジメンの後、外来性幹細胞を含む有効量の細胞組成物は、レシピエントに一過性免疫抑制の期間中に投与される。幹細胞は、自家、同種または異種であってよく、同種ハプロ一致幹細胞、不適合同種幹細胞、遺伝子操作された自家細胞などを含むがこれらに限定されない。
【０１０７】
ＨＳＰＣの注入は、臨床現場で行われる比較的単純なプロセスである。骨髄生成物は、一般に新鮮に使用され、中心静脈を通して、数時間にわたって注入される。自家生成物は、しばしば凍結保存される。その場合、臨床現場で解凍され、数分間にわたって迅速に注入される。ＰＢＭＣは、短かく一晩保存または凍結保存されてよい。
【０１０８】
ドナーがレシピエントに対して同種である場合、ドナー及びレシピエントのＨＬＡ型は、適合について検査されてよい、またはハプロ一致細胞が使用される。ＨＬＡハプロ一致ドナーは、ＣＤ３４またはＣＤ３４ＣＤ９０選択により操作されることができる。さらには、ＨＬＡハプロ一致ドナーは、他の適応症に関して現在広く使用されている（ＨＬＡ一致を超えている可能性がある）。ＨＬＡ適合検査に関して、従来、適合検査に関して重要な遺伝子座は、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、及びＨＬＡ−ＤＲである。ＨＬＡ−Ｃ及びＨＬＡ−ＤＱも現在、ドナーの妥当性を判断する際に考慮されるようになっている。完全適合同胞ドナーは、一般的に理想的なドナーであると考えられる。非血縁者ドナーに関しては、完全適合または単一の不適合が、大半の移植に関して許容可能と考えられるが、ある特定の状況においては、より大きな不適合も耐容される。好ましくは、適合検査は、血清学及び分子学の両方である。ドナーが臍帯血である場合、耐容可能なＨＬＡ不同性は遥かに大きく、６つのＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−ＤＲＢ１抗原のうちの３〜４つの適合が移植に十分である。免疫応答性ドナーＴ細胞は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）が発症し得る可能性を低下または排除するために、様々な方法を使用して除去され得る。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、手順の成功は、レシピエントの循環内での、宿主由来骨髄系細胞、例えば、ＣＤ１５+ 細胞の存在を決定することによりモニターされる。血中骨髄キメリズムは、骨髄系細胞の短期生存特性のために、真のＨＳＣ生着の指標である。ＨＣＴの約８週間後、本明細書に記載の方法は、測定可能及び持続レベルの血中骨髄キメリズム、例えば、少なくとも約１％ドナー型、ＣＤ１５+ 細胞、少なくとも約２％ドナー型、ＣＤ１５+ 細胞、少なくとも約４％ドナー型、ＣＤ１５+ 細胞、少なくとも約８％ドナー型、ＣＤ１５+ 細胞、またはそれ以上の、血中骨髄キメリズムを提供している。
【０１１０】
移植前処置作用物質は、骨髄破壊的放射線または化学療法の非存在下で提供されてよく、上述の特定の要件に従って投与される。いくつかの作用物質は、ＨＳＰＣの投与後に活性となるよう投与され、一方で他の作用物質はウォッシュアウト期間を必要とする。
【０１１１】
一過性免疫抑制剤は、活性化されたＴ細胞活性を、少なくとも１０分の一、少なくとも１００分の一、少なくとも１０００分の一、少なくとも１００，０００分の一またはそれ以下に低減する用量で提供される。有効量は、個体及び特定の作用物質に依存することになるが、作用物質が抗体である場合、用量は、少なくとも約５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約２５０μｇ／ｋｇ、少なくとも約５００μｇ／ｋｇ、少なくとも約７５０μｇ／ｋｇ、少なくとも約１ｍｇ／ｋｇ、及び最大で約２．５ｍｇ／ｋｇ、最大で約５ｍｇ／ｋｇ、最大で約７．５ｍｇ／ｋｇ、最大で約１０ｍｇ／ｋｇ、最大で約１５ｍｇ／ｋｇ、最大で約２５ｍｇ／ｋｇ、最大で約５０ｍｇ／ｋｇ、最大で約１００ｍｇ／ｋｇであり得る。
【０１１２】
移植前処置作用物質は、医薬組成物に製剤化される。正確な用量は、処置の目的に依存し、公知の技術を使用して当業者により確認可能である（例えば、Ａｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ（ｖｏｌｓ．１−３，１９９２），Ｄｅｋｋｅｒ，ＩＳＢＮ０８２４７７０８４６，０８２４７６９１８Ｘ，０８２４７１２６９２，０８２４７１６９８１；Ｌｌｏｙｄ，Ｔｈｅ  Ａｒｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇ（１９９９）；及びＰｉｃｋａｒ，Ｄｏｓａｇｅ  Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ（１９９９））。当該技術分野で公知のように、患者の状態、全身送達対局所送達、ならびに年齢、体重、全身健康状態、性別、食事、投与時間、薬物相互作用及び状態の重症度に関する調整が必要であり得、当業者により通常の実験を用いて確認可能である。
【０１１３】
作用物質の投与は、上述のように様々な方法においてなされることができ、経口、皮下、静脈内、鼻腔内、経皮、腹腔内、筋肉内、または眼内を含むがこれらに限定されない。抗体は、静脈内注射によって送達され得る。
【０１１４】
一実施形態では、医薬組成物は、水溶性形態であり、例えば薬学的に許容され得る塩として存在しており、これは酸付加塩及び塩基付加塩の両方を含むことが意図される。「薬学的に許容され得る酸付加塩」は、遊離塩基の生物学的有効性を保持しており、生物学的にも別の意味でも望ましくないものではない、無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸など、及び有機酸、例えば酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸などを用いて形成された塩を指す。「薬学的に許容され得る塩基付加塩」には、無機塩、例えばナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、アルミニウム塩などから誘導されたものが含まれる。特に有用なのは、アンモニウム、カリウム、ナトリウム、カルシウム、及びマグネシウム塩である。薬学的に許容され得る有機非毒性塩基から誘導された塩には、第一級、第二級、及び第三級アミン、天然に存在する置換アミンを含む置換アミン、環状アミン及び塩基性イオン交換樹脂、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、及びエタノールアミンが含まれる。
【０１１５】
医薬組成物は、キャリアタンパク質、例えば血清アルブミン、緩衝液、充填剤、例えば微結晶セルロース、ラクトース、トウモロコシ及び他のデンプン、結合剤、甘味料及び他の香味料、着色剤、及びポリエチレングリコールのうちの１つまたは複数も含み得る。
【０１１６】
医薬組成物は、投与方法に応じて様々な単位剤形で投与することができる。例えば、経口投与に好適な単位剤形には、粉剤、錠剤、丸剤、カプセル及びトローチ剤が含まれるがこれらに限定されない。本発明の組成物は、経口投与されるとき、消化から保護されるべきであることが認識される。これは典型的には、分子を組成物と複合体化させて、酸性及び酵素加水分解に対して耐性を与えることにより、またはリポソームもしくは保護バリアなどの適切な耐性キャリア中に分子をパッケージングすることのいずれかにより達成される。作用物質を消化から保護する手段は、当該分野で周知である。
【０１１７】
投与用組成物は、一般的に、薬学的に許容され得るキャリア、好ましくは水性キャリア中に溶解された抗体または他の作用物質を含む。様々な水性キャリア、例えば、緩衝食塩水などを使用することができる。これらの溶液は、滅菌されており、一般的に望ましくない物質を含まない。これらの組成物は、従来の、周知の滅菌技術により滅菌されてよい。組成物は、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、毒性調整剤など、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ナトリウム乳酸塩などのおおよその生理学的条件に必要とされる薬学的に許容され得る補助物質を含有してよい。これらの製剤中の活性剤の濃度は、広く変動することができ、選択された投与の特定の様式及び患者の要求に従って、液体量、粘度、体重など主に基づいて選択される（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１５ｔｈ  ｅｄ．，１９８０）及びＧｏｏｄｍａｎ＆Ｇｉｌｌｍａｎ、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｈａｒｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９６））。
【０１１８】
破壊的作用物質を含有する組成物、例えば、抗体、可溶性ＳＩＲＰαなどを、治療的処置のために投与することができる。組成物は、患者に、上述のように、標的とする内在性幹細胞を実質的に破壊するために十分な量で投与される。これを達成するために十分な量は、「治療有効量」と定義される。組成物の単回または複数回投与は、患者に必要とされ耐容される投与量及び頻度に応じて投与され得る。処置に必要とされる具体的な用量は、哺乳類の病状及び病歴、ならびに他の因子、例えば年齢、体重、性別、投与経路、有効性などに依存する。
【０１１９】
本発明の方法では、作用物質は、移植前の短期間の治療として投与される。通常、処置は、移植の少なくとも約１週間前、移植の少なくとも約５日前、移植の少なくとも約３日前に完了する。必要に応じてプロセスを繰り返してよく、例えば、ニッチをクリアにするために必要に応じて、２回、３回、４回、５回、またはそれ以上繰り返してよい。
【０１２０】
処置のための条件
幹細胞移植の適応症は、疾患のカテゴリーによって異なり、染色体異常、以前の治療に対する応答、患者の年齢及び全身状態、疾患状態（寛解対再発）、疾患特異的予後因子、好適な移植片供給源の利用可能性、紹介時期、ならびに移植時期などの因子に影響される。
【０１２１】
自家ＨＳＣＴは、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、急性骨髄性白血病、神経芽細胞腫、胚細胞腫瘍、自己免疫疾患−全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、全身性硬化症、アミロイドーシスなどの症状を処置するために現在使用されている。
【０１２２】
同種ＨＳＣＴは、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、骨髄増殖性障害、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、再生不良性貧血、真性赤血球無形成症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、ファンコニー貧血、サラセミアメジャー、鎌状赤血球貧血症、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、ウィスコット・オルドリッチ症候群、血球貪食症候群（ＨＬＨ）、先天性代謝異常−例えば、ムコ多糖症、ゴーシェ病、異染性白質ジストロフィー、副腎白質ジストロフィー、表皮水疱症、重症先天性好中球減少症、シュワッハマン・ダイアモンド症候群、ダイアモンド・ブラックファン貧血、白血球接着不全症などの障害を処置するために現在使用されている。
【０１２３】
本発明の実施形態は、遺伝性血液障害に罹患している患者への移植を含み、この場合正常な表現型の外来性幹細胞を当該患者へと移植する。このような疾患には、ヘモグロビン合成障害（ヘモグロビン異常症）により引き起こされる貧血の処置が含まれるが、これに限定されない。幹細胞は、正常表現型の同種幹細胞であり得る、または望ましくない遺伝子配列を欠失する、及び／もしくは遺伝的欠陥を矯正する遺伝子配列を導入するように遺伝子操作されている自家細胞であり得る。
【０１２４】
鎌状赤血球症には、ＨｂＳ症、鎌状赤血球性貧血、鎌状赤血球症（ｍｅｎｉｓｃｏｃｙｔｏｓｉｓ）が含まれる。慢性溶血性貧血は、ほとんど黒人においてのみ発生し、Ｈｂ  Ｓのホモ接合性遺伝によって引き起こされる鎌型ＲＢＣを特徴とする。ホモ接合体は、鎌状赤血球貧血症を有し、ヘテロ接合体は、貧血性はないが鎌状傾向（鎌状血症）がｉｎ  ｖｉｔｒｏで実証可能である。Ｈｂ  Ｓでは、バリンが、ベータ鎖の６番目のアミノ酸にてグルタミン酸と置換される。デオキシ−Ｈｂ  Ｓは、デオキシ−Ｈｂ  Ａよりも遥かに溶解性が低く、半固体ゲルの桿状タクトイドを形成し、それが原因となってＰＯ2 が低い部位でＲＢＣを鎌状にさせる。歪んで弾性に乏しいＲＢＣは血管内皮に付着し、小さな細動脈及び毛細血管を塞いで、閉塞及び梗塞を引き起こす。鎌状ＲＢＣは、循環の機械的外傷に耐えるには脆弱すぎるため、循環に入った後に溶血が生じる。ホモ接合体では、臨床的症状は貧血及び血管閉塞事象によって引き起こされ、組織の虚血及び梗塞を引き起こす。成長と発達とが損なわれ、感染に対する感受性が高まる。貧血は通常重症だが、患者によって大きく異なる。貧血は、脾臓内の鎌状赤血球の急性血球貯留によって小児で悪化することがある。
【０１２５】
サラセミアは、Ｈｂ合成障害及び無効な赤血球産生を特徴とする、慢性、遺伝性、小球性貧血の一群であり、特に地中海、アフリカ、及び東南アジア祖先の人によく見られる。サラセミアは、最も頻度の高い遺伝性溶血性疾患である。少なくとも１つのグロビンポリペプチド鎖（β、α、γ、δ）の産生の減少によって引き起こされるアンバランスなＨｂ合成から生じる。
【０１２６】
再生不良性貧血は、ＲＢＣ前駆体の喪失から生じ、幹細胞プールの異常または骨髄を支持する微小環境の障害のいずれかが原因となり、しばしば正常上限ＭＣＶ値を伴う。再生不良性貧血という用語は、一般には、白血球減少及び血小板減少を伴う骨髄の汎低形成を意味する。
【０１２７】
複合免疫不全は、Ｂ細胞系及びＴ細胞系の両方の先天性及び通常は遺伝性の欠失、リンパ系形成不全、及び胸腺形成異常を特徴とする一群の障害である。複合免疫不全症には、重症複合免疫不全症、スイス型無ガンマグロブリン血症、アデノシンデアミナーゼまたはヌクレオシドホスホリラーゼ欠損症との複合免疫不全症、及び免疫グロブリンとの複合免疫不全症（Ｎｅｚｅｌｏｆ症候群）が含まれる。ほとんどの患者は、鵞口瘡、肺炎、及び下痢による感染症の早期発症がある。処置しなければ、大半の患者は２歳までに死亡する。大半の患者は、Ｂ細胞及び免疫グロブリンが深刻に欠失している。リンパ球低下症、Ｔ細胞レベルが低いまたは存在しない、マイトジェンに対する増殖反応が乏しい、皮膚アネルギー、胸腺影が無い、及びリンパ組織の消失が特徴である。ニューモシスティス肺炎及び他の日和見感染症がよく見られる。
【実施例】
【０１２８】
実施例１
ハプロ一致造血幹細胞移植のための非遺伝毒性移植前処置レジメン
材料及び方法
マウス。全てのドナー及びレシピエントマウスは、８週齢から１２週齢とした。ドナーマウスは、Ｓｈｉｚｕｒｕ  ｌａｂによって飼育されたＡＫＲ×Ｈｚ  Ｆ１マウスとした。ＡＫＲ×Ｈｚ  Ｆ１マウスは、４５．１及び４５．２、ならびにＨ２Ｋｂ及びＨ２Ｋｋに関して二重陽性である。レシピエントマウスは、ＪＡＸからのＣＢ６Ｆ１とした。ＣＢ６Ｆ１マウスは、４５．２に関して単一陽性であり、Ｈ２Ｋｂ及びＨ２Ｋｄに関して二重陽性である。全ての手順は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認されていた。マウス株は、スタンフォード大学のＲｅｓｅａｒｃｈ  Ａｎｉｍａｌ  Ｆａｃｉｌｉｔｙで維持された。
【０１２９】
抗体。ｉｎ  ｖｉｖｏ移植前処置のための抗体は全て、Ｂｉｏ  Ｘ  Ｃｅｌｌから購入し、それには、抗ＣＤ４７（クローン３／クローンｍＩＡＰ４１０）、抗ＣＤ１１７（クローンＡＣＫ２）、抗ＣＤ４０Ｌ（クローンＭＲ−１）、及び抗ＣＤ１２２（クローンＴＭ−ｂ１）を含む。
【０１３０】
ＢＭ移植。レシピエントＣＢ６Ｆ１マウスに、１００ｕｇのプライム用量の抗ＣＤ４７を−８日目に腹腔内投与した。−６日目に、マウスに５００ｕｇの抗ＣＤ１１７を後眼窩注射した。抗ＣＤ１１７処置の前に、マウスに、ベナドリルを腹腔内注射した。−６日から−２日に、マウスに、さらに一日５００ｕｇの抗ＣＤ４７を腹腔内注射した。−２日に、マウスに、最大で２５０ｕｇの抗ＣＤ１２２を与えた。０日目に、５００ｕｇの抗ＣＤ４０Ｌを移植数時間前に与えた。
【０１３１】
移植のために、全骨髄を８〜１２週齢のＡＫＲ×Ｈｚマウスから回収した。全骨髄は、脛骨、大腿骨、臀部及び脊椎から採取する。赤血球を溶解し、残りの細胞を計数し、注射前に適切に再懸濁した。細胞は、後眼窩注射を用いて送達する。
【０１３２】
キメリズム確認。レシピエントマウスを、後眼窩穿刺を用いて周期的に採血して、ドナーキメリズムを測定する。血液は、ＣＤ４５．１、ＣＤ４５．２、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ１１ｂ、及びＧｒ−１に対する蛍光抗体で染色する。
【０１３３】
結果
図１Ａ〜１Ｆに示すように、ｃ−ｋｉｔ、ＣＤ４７、ＣＤ４０Ｌ及びＣＤ１２２に特異的な抗体と、上記のプロトコルとの組み合わせは、免疫応答性動物へのハプロ一致全骨髄の有効な生着を可能にした。コホート毎にキメラであるマウスの割合（％）ならびに総ドナー、Ｔ細胞、Ｂ細胞及び顆粒球キメリズムの平均レベルを図２に示す。図３に示すように、低用量の細胞では、抗ＣＤ１２２を用いたＮＫ細胞（ｃｅｌ）枯渇が必要とされる。
【０１３４】
実施例２
抗体移植前処置により、ＭＨＣ不適合造血幹細胞移植及び臓器移植片寛容を可能
患者の罹患血液系を造血細胞移植（ＨＣＴ）により入れ換えることは、白血病、自己免疫疾患及び免疫不全症を含む、血液及び免疫系の遺伝性障害を処置するまたは治癒することができる。ＨＣＴでは、患者の血液及び免疫系は、典型的には、毒性「移植前処置レジメン」（化学療法及び／または放射線）を使用して破壊され、次いで造血幹細胞（ＨＳＣ）を含有するドナー細胞と入れ換えられて、健常な血液系を再生する。ＨＣＴが基礎的な処置である一方で、その使用及び安全性は、移植片対宿主病（ドナーＴ細胞が混入していない精製ＨＳＣを移植することにより克服することができる）及び移植前処置レジメンにより引き起こされる致死毒性が、妨げとなっている。それゆえ、決定的な目標は、毒性化学療法または放射線の必要性を取り除いて、より特異的で、安全な作用物質（例えば、モノクローナル抗体）を用いて、ＨＣＴ移植前処置を達成することである。
【０１３５】
ここで本発明者らは、６種のモノクローナル抗体の組み合わせが、免疫応答性マウスの宿主ＨＳＣ、Ｔ細胞及びＮＫ細胞を安全かつ特異的に枯渇させ、外来（同種）ＨＳＣ生着を可能にすることができることを示す。生着したドナーＨＳＣは、ＭＨＣ遺伝子の半分（ハプロ一致）または全てのいずれかにて不適合であり、どちらの場合でも、宿主血液細胞と安定して共存するドナー血液及び免疫系を生成した。これらのキメラ免疫系は、機能的であり、これはＨＳＣドナー株心臓組織に対する寛容及び第三者心臓の拒絶より呈された。これらの研究は、精製ヒトＨＳＣ移植に対して再生医学のプラットフォームとして適用することができ、外来臓器移植ならびに多様な血液及び免疫系障害の処置を含む適用を容易にすることができる、抗体移植前処置を実証する。
【０１３６】
多くの遺伝性血液及び免疫系障害は、造血細胞移植（ＨＣＴ）により処置することができる。例としては、サラセミア、鎌状赤血球貧血症、ファンコニー貧血、遺伝性免疫不全症、自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症）、及び代謝性蓄積症が挙げられる。これらの疾患は、個体の血液系が、ＨＣＴ移植片中の移植された稀少な造血幹細胞（ＨＳＣ）から安定的に誘導される、健常な、移植された血液細胞と入れ替わったときに矯正されることができる。ドナー由来血液及び免疫系の再生後、ＨＣＴレシピエントは、ＨＳＣドナーからの臓器移植に免疫学的に寛容となる。血液系の任意の単一遺伝子または多遺伝子遺伝性障害が同種ＨＣＴによって治癒され得る一方で、非悪性血液学的または免疫学的障害の処置は、２０１５年にヨーロッパで報告された総ＨＣＴ症例の６％にしか満たない。
【０１３７】
非悪性血液障害を処置するためのＨＣＴの使用頻度が不当に低いことを克服する及びその範囲を拡大するために、２つの重要な課題である安全性の懸念及びドナーの利用可能性に取り組まないといけない。現在、同種ＨＣＴは、ドナー由来Ｔ細胞が混入することにより引き起こされる臨床的または亜臨床的な移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）をもたらす。しかしＧｖＨＤは、Ｔ細胞を欠く精製ＨＳＣを移植することにより克服することができる。さらには、ＨＣＴ移植前処置は、化学療法及び放射線を必要とし、これらは命を脅かす副作用を引き起こす可能性がある。
【０１３８】
遺伝性血液障害に関してＨＣＴが直面する別の課題は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ、あるいは主要組織適合性複合体［ＭＨＣ］として知られる）遺伝子座での完全適合ドナーに対する現在の必要性である。白人系アメリカ人の７５％は現在適合ドナーが存在する一方で、黒人系アメリカ人（現在適合しているのは１６〜１９％）または他の少数民族にとって完全適合ドナーを見つけることは顕著に困難である。ハプロ一致ドナー（ＨＬＡ遺伝子座の半分で適合する）を使用してＨＣＴを安全に行うことが可能であれば、これはドナーの利用可能性を有意に拡大することになり、理論的には、どの個体もＨＣＴをその親、子、または同胞の７５％から受けることができるようになる。最後に、完全ＨＬＡ不適合ＨＳＣを安全に移植することが可能であれば、これは飛躍的に利用可能ドナーのプールを開くことになり、レシピエントが同一ドナーから得た外来臓器または組織に免疫学的に寛容になり得るさらなる利益を伴う。これは、バイタル臓器移植に関する拒絶を防ぐために通常必要とされる生涯にわたる免疫抑制を伴わないＨＬＡ不適合臓器移植を可能にする。
【０１３９】
ＨＣＴの安全性は、毒性移植前処置レジメン（化学療法及び／または放射線）を、免疫系の構成要素を枯渇させるより特異的な作用物質、例えばモノクローナル抗体により置き換えたら、かなり改善する。以前の抗体移植前処置レジメンが、マイナー組織適合性抗原不適合ＨＳＣの移植を可能にする（例えば、特許公開ＷＯ２０１６／０３３２０１を参照されたい）一方で、抗体に基づく移植前処置を使用するＭＨＣ不適合ＨＳＣの移植は、以前に示されていない。
【０１４０】
ここで、本発明者らは、６種のモノクローナル抗体を使用する移植前処置により、野生型マウスが部分的に（ハプロ一致）または完全にＭＨＣ不適合であるＨＳＣを受けることが可能になり、それゆえ、化学療法または放射線に頼ることなく、血液系置換及びを不適合ドナー臓器に対する寛容の誘発を可能にすることを実証する。
【０１４１】
ハプロ一致移植実験に関しては、ＡＫＲ×Ｃ５７ＢＬ／６Ｆ1 （本明細書では、下記ＡＢ６Ｆ1 と称する）マウスを骨髄またはＨＳＣドナーとして使用し、ＢＡＬＢ／Ｃ×Ｃ５７ＢＬ／６Ｆ1 （ＣＢ６Ｆ1 ）（図４ａ）マウスをレシピエントとして機能させた。これらのマウス株は、Ｈ２b ハプロタイプでのみ適合し、Ｈ２k 及びＨ２d に関しては不適合である（すなわち、主要組織適合性複合体［ＭＨＣ］ハプロタイプの半分）（図４ｂ）。本発明者らは、従来の移植前処置をモノクローナル抗体（ｍＡｂ）で置き換えることができるか否かを決定しようとした。本発明者らは、免疫不全マウスは、同系ＨＳＣ生着を可能にするために抗Ｋｉｔ抗体を使用して移植前処置することができるが、免疫応答性マウスの同等の移植前処置は、抗Ｋｉｔ及び抗ＣＤ４７遮断性作用物質の二重投与を必要とすることを、以前に実証した。ＣＤ４７遮断は、マクロファージが抗体結合（オプソニン化）細胞、例えば抗ｃ−ＫＩＴ抗体によってオプソニン化されたＫＩＴ+ ＨＳＣを貪食することを可能にする。
【０１４２】
ＭＨＣ遺伝子座で不適合である同種ＨＳＣを生着させるために、外来の主要及びマイナー組織適合性抗原を発現するまたは「自己」ＭＨＣを欠く細胞を拒絶する、Ｔ細胞及びＮＫ細胞の両方を抑制するまたは排除する必要がある可能性がある。宿主ＮＫ細胞を排除するために、本発明者らは、ＣＤ１２２／Ｉｌ２Ｒβを（ヒト及びマウスＮＫ細胞発生を通して発現される）、抗ＣＤ１２２ｍＡｂ  Ｔｍ−β１を使用して標的化し、これらの細胞を枯渇させた。Ｔ細胞媒介性拒絶を予防するために、本発明者らは、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４としても知られる）を標的とし、これは活性化Ｔ細胞により発現される共刺激細胞表面分子であり、ＣＤ４０+ 抗原提示細胞とのそのシグナル伝達に必要とされる。ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ軸の干渉は、造血細胞及び皮膚移植片に対する寛容の誘導を助けることができ、重要なことに、ＣＤ４０Ｌが活性化Ｔ細胞上で上方制御されるため、全てのＴ細胞を枯渇させるわけではない。本発明者らは、ＣＤ４０Ｌを、抗ＣＤ４０Ｌ抗体ＭＲ１を使用して阻害した。
【０１４３】
マウスを、８日の期間にわたって（図４ｃ）４種のモノクローナル抗体を使用して処置し（抗ＣＤ１２２、抗ＣＤ４０Ｌ、抗Ｋｉｔ及び抗ＣＤ４７、本明細書では４種抗体移植前処置と称する）、次いで３０００万個の全骨髄（ＷＢＭ）細胞を移植した。キメリズムを、ＣＤ４５アレル間の差により周期的に測定し（図８ａ）、多系列の混合キメリズムが４種抗体移植前処置を受ける全動物において観察された（図８ｂ〜ｄ）。重要なことに、混合キメリズムは、長期ＨＳＣ（ＬＴ−ＨＳＣ）コンパートメントにおいても観察され（図４ｄ）、これは、ドナーキメリズムが、長期生存成熟免疫細胞の生着から生じたのではなく、ドナー幹細胞により活性に維持されていたことを示す。
【０１４４】
このカクテルの最低限必要な要素を同定するために、本発明者らは、各抗体を個別に検査し（図９）、次いで４種の抗体の様々な組み合わせとして検査した。３０００万個のＷＢＭ細胞が生着するために最低限必要なカクテルは、抗ＣＤ４７、抗ｃ−ＫＩＴ、及び抗ＣＤ４０Ｌであった（図４ｅ〜ｇ）。しかしながら、抗ＣＤ１２２を欠く群のマウスの７５％のみがキメラであった。完全４種抗体移植前処置を受ける群では、マウスの１００％がキメラであった。興味深いことに、両群からの生着した動物は、同様のレベルの多系列キメリズムを２０週間にわたって示した。加えて、４種抗体移植前処置は、移植前に顆粒球血球減少を誘発しなかった（図４ｈ）。
【０１４５】
本発明者らは、抗ＣＤ１２２の使用を調節しながら、ＷＢＭの用量を滴定することにより生着し得る最低用量のＷＢＭを検査した。移植された骨髄の量が減少するにつれて、キメラマウスの数は減少した（図４ｉ）。３００万個のＷＢＭ細胞では、抗ＣＤ１２２を用いないマウスの２０％がキメラである一方で、ＮＫ枯渇を伴うこの細胞用量群にて、マウスの８０％がキメラであった。
【０１４６】
ＧｖＨＤの可能性を排除するために、次に本発明者らは、富化ＨＳＣ集団（ＷＢＭに対立するものとして）を移植した。これらの実験では、ＨＳＣに関して高度に富化され、多能性前駆細胞（ＭＰＰ）細胞である、Ｌｉｎｅａｇｅ- Ｓｃａ１+ Ｋｉｔ+ （ＬＳＫ）細胞（図５ａ）を移植した。Ｋｉｔ富化及びＬＳＫ細胞は両方とも、３０００万個のＷＢＭ細胞中のその存在量に対応する量で投与された（図５ｂ）。３つのタイプの移植片は全て、被照射対照において完全な、長期多系列キメリズムを示した。驚くべきことに、４種抗体で移植前処置したマウスはＷＢＭによる長期生着に成功したが、Ｋｉｔ富化またはＬＳＫ移植によっては再構成されなかった（図５ｂ）。これは、富化ＨＳＣ集団が生着に成功するためには、追加の移植前処置抗体が必要とされる可能性があることを示す。
【０１４７】
ＬＳＫ生着を容易にするために、本発明者らは、抗ＣＤ４及び抗ＣＤ８枯渇抗体を使用してＴ細胞を排除することにより、追加の免疫抑制を提供することを試みた（図５ｃ）。４種抗体レジメ（ｒｅｇｉｍｅ）に対する抗ＣＤ４及び抗ＣＤ８抗体の追加は、末梢血、脾臓及び骨髄からＴ細胞を強く枯渇させた（図５ｄ及び図１０）。この６種抗体カクテルの使用は、６種抗体移植前処置（抗ＣＤ１２２、抗ＣＤ４０Ｌ、抗Ｋｉｔ、抗ＣＤ４７、抗ＣＤ４及び抗ＣＤ８ｍＡｂ）と称することにし、これは９０００個のＬＳＫ細胞を移植されたレシピエントにおける長期キメリズムを誘発した（図５ｅ）。この細胞投与量は、おおよそ３６０，０００個のＬＳＫ／ｋｇに対応し、マウスにおける同種移植片の前臨床試験及びヒトにおける自家移植片の臨床使用において見られるＨＳＣ用量を十分に下回る。要約すると、６種抗体移植前処置は、化学療法または放射線に頼ることなく、低用量の細胞、例えば、精製ＨＳＣをマウスに生着させることを可能にする。
【０１４８】
このカクテルの６種の要素が全て必要か否かを決定するために、本発明者らは、還元的プロセスを使用して、不必要な抗体を同定した。抗ＣＤ４０Ｌ、抗ＣＤ４、及び抗ＣＤ８の除去は、完全６種抗体移植前処置コホートと比較して、各コホート内でより少ないキメラ動物及びより低いキメリズムをもたらした（図５ｆ及び図１１）。しかしながら、抗ＣＤ１２２抗体の除去は、対照コホートと比較して、キメラ動物の割合（％）を有意に変化させなかった。４種抗体移植前処置レジメンの場合とは異なり、６種抗体移植前処置レジメンにおいては、Ｔ細胞がほぼ完全に枯渇するために喪失するＴ細胞活性化へのＮＫ依存性が原因となり、ＣＤ１２２の６種抗体移植前処置における必要性が低い可能性がある。
【０１４９】
重要なことに、６種抗体移植前処置とその後のＨＳＣ移植は、中枢性免疫学的寛容をドナー遺伝子株に誘発した。中枢性寛容は、ドナー細胞生着を可能にするための宿主免疫系の胸腺再教育を意味する。これらの動物における中枢性寛容を測定するために、本発明者らは、末梢血中のＶベータ６（Ｖｂ６）ＴＣＲ鎖の存在を測定した。Ｖｂ６は、ＡＫＲ株に存在する、Ｍｔｖ−７プロウイルスをコードするスーパー抗原に対して反応性である。それゆえ、ＡＢ６Ｆ1 ＨＳＣがＣＢ６Ｆ1 において共存するためには、ＣＢ６Ｆ1 内在性Ｖｂ６＋Ｔ細胞がクローン除去されなければならない。ＷＢＭ移植動物及びＬＳＫ移植動物の両方において、キメラ動物は、宿主Ｖｂ６＋Ｔ細胞の欠失を示した（図６ａ〜ｂ）。興味深いことに、抗Ｋｉｔ、抗ＣＤ４７、及び抗ＣＤ４０Ｌを用いて移植前処置したＷＢＭコホートでは、正常なＶｂ６＋Ｔ細胞頻度を有する唯一の動物もキメリズムを達成したことはなかった（図６ｂ）。
【０１５０】
驚くべきことに、本発明者らは、ＭＨＣ不適合ドナーＨＳＣを生着させた６種抗体移植前処置マウスが、同一のドナー株からの臓器に対して免疫学的に寛容であることを見出した。これに至るために、本発明者らは、ＨＳＣドナー（ＡＢ６Ｆ1 ）または第三者（ＤＢＡ／１Ｊ株、Ｈ２q に関してホモ接合である）新生仔からの心臓移植片を、ナイーブ及びＬＳＫ−抗体移植前処置キメラ動物の耳の耳介へと移植した（図６ｃ）。ナイーブ、移植前処置をしない、未移植マウスでは、両ＡＢ６Ｆ1 及びＤＢＡ１／Ｊ心臓が、急速に拒絶された（図６ｄ）。６種抗体移植前処置キメラマウスでは、ＤＢＡ１／Ｊ心臓は、１４日以内に拒絶され、一方で活性、拍動ＡＢ６Ｆ１心臓は少なくとも１１５日間持続した。代表的な耳−心臓移植片を、３４日目に回収し、免疫組織化学により分析した。肉眼検査では、ＡＢ６Ｆ１心臓は耳介内で確認できたが、ＤＢＡ／１Ｊ心臓はもはや認められなかった（図６ｅ）。Ｈ＆Ｅ分析により、免疫細胞を欠くトロポニン＋心臓組織がＡＢ６Ｆ１生着耳介に浸潤していることが示された。しかしながら、この時点までに、ＤＢＡ／１Ｊ心臓を含有する耳介内に心臓またはトロポニン＋組織はなかった（図６ｅ）。これは、それゆえ、ＭＨＣ不適合ドナーＨＳＣが、同一遺伝子ドナーからの心臓移植片に対する６種抗体移植前処置マウスの免疫学的寛容を誘発することができることを示す。
【０１５１】
最後に、本発明者らは、６種抗体移植前処置レジメンが、完全ＭＨＣ不適合ＨＳＣの生着の成功を可能にすることを実証した。本発明者らは、ＤＢＡ１／Ｊ（Ｈ２q ）マウスをドナーとして及びＣＢ６Ｆ1 （Ｈ２b/d ）宿主を使用した（図７ａ）。９０００個のＤＢＡ１／Ｊ  ＬＳＫ細胞を移植した後、本発明者らは、高いドナー−宿主キメリズムを８週目までに全ての６種抗体移植前処置ＣＢ６Ｆ1 マウスにおいて観察した（図７ｂ）。３００万個のＷＢＭ細胞のみを単独で移植されたマウスは、ドナーキメリズムの確立に失敗した（移植前処置の必要性を確認した）が、ＷＢＭを受けた４種抗体移植前処置マウスの４０％が、低レベルのキメリズムを達成した。ＷＢＭを移植した被照射ＣＢ６Ｆ1 マウスの８０％は、移植後９週までに死亡し（図７ｃ）、ＧｖＨＤによる可能性が高く、これはＬＳＫ移植では観察されなかった。
【０１５２】
要約すると、ここで本発明者らは、精製ＨＳＣを含む、半（ハプロ一致）及び完全ＭＨＣ不適合造血細胞組成物を、免疫応答性動物に移植する方法を開発した。重要なことに、これは化学療法及び／または放射線の使用を伴わずに、そして全てではないにしてもほとんどの他のタイプのＨＣＴ移植にて発生するＧｖＨＤを伴わずに、達成される。
【０１５３】
これらの知見は、例えば血液及び免疫系障害の処置のための、造血細胞移植の臨床使用に関連している。第一に、精製ＨＳＣ移植と組み合わせた、この抗体移植前処置レジメンは、化学療法／放射線の使用を不要にすること及びＧｖＨＤを排除することにより、血液及び免疫系置換の安全性を改善する。第二に、ハプロ一致、ＨＬＡ不適合ＨＳＣの移植を容易にすることにより、ドナープールが大いに増加し、たとえレシピエントの年齢または臨床状態が以前のプロトコル下でのＨＣＴを防いでいた場合でも、大半のレシピエントが適合を見つけられるようになる。例えば、ファンコニー貧血の患者は、ＤＮＡ損傷に対して高度に感受性であるため、それゆえ、従来の移植前処置レジメンは、このコホートに対して重大なリスクを有する。
【０１５４】
最後に、外来臓器に対する免疫学的寛容を誘発する能力は、救命臓器移植を必要とする全ての患者に機会を開く。特に、外来臓器移植を受ける患者の生涯にわたる免疫抑制を取り除く。具体的には、抗体移植前処置、ドナーＨＳＣ−移植動物における免疫系は、ドナー（しかし第三者ではない）心臓に対して寛容である。これらの部分的キメラ動物におけるドナー及び宿主Ｔ細胞の共存は、ＭＨＣ制限Ｔ細胞を、ドナー及び宿主組織の両方に提供することができる。
【０１５５】
今日、臓器、組織またはＨＳＣ移植のドナーは、生存しているまたは最近亡くなった人である。再生医学の目標は、多能性（胚性または人工多能性）幹細胞株をＨＳＣ及び他の必要とされる組織幹細胞（例えば神経、骨及び軟骨、または肝臓のもの）へと、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは大型動物宿主（例えば、ブタ）内にてｉｎ  ｖｉｖｏでのいずれかで分化させることである。これは、人類が他のためにＨＳＣ及び臓器を諦める必要性を軽減する。抗体移植前処置、その後の多能性幹細胞由来ＨＳＣ及び組織幹細胞の共移植は、長期免疫抑制に頼ることなく、患者に救命臓器を送達することができる。
【０１５６】
方法
動物。全ての実験は、Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｖｅ  Ｐａｎｅｌ  ｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅにより確立されたガイドラインに従って行った。ＡＫＲ×Ｃ５７ＢＬ／６Ｆ１ドナーを、交配し、室内飼育した。ＣＢ６Ｆ１及びＤＢＡ１／Ｊレシピエントは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。ＤＢＡ１／Ｊ妊娠雌は、Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから耳心臓移植片のために購入した。
【０１５７】
抗体。抗ＣＤ４７（ｍＩＡＰ４１０）、抗ｃ−ＫＩＴ（ＡＣＫ２）、抗ＣＤ１２２（Ｔｍ−β１）、抗ＣＤ４０Ｌ（ＭＲ１）、抗ＣＤ４（ＧＫ１．５）、及び抗ＣＤ８（ＹＴＳ１６９．４）は、ＢｉｏＸＣｅｌｌから購入した。抗ＣＤ４７を、１００μｇ用量として−８日目に腹腔内投与し、次いで５００μｇ用量を後続注射として、移植前処置プロセスを通して腹腔内注射した。後眼窩抗ｃ−ＫＩＴ及び腹腔内抗ＣＤ４０Ｌは、両方とも単回５００μｇボーラスとして投与した。抗ＣＤ１２２は、腹腔内に２５０μｇ用量として投与し、一方で抗ＣＤ４及び抗ＣＤ８は、１００μｇ腹腔内用量として投与した。抗ｃ−ＫＩＴ抗体を受けているマウスは、４００μｇのジフェンヒドラミンを腹腔内に注射の１５分前に投与した。抗ＣＤ２５（ＰＣ−６１．５．３）は、ＢｉｏＸＣｅｌｌから購入し、単回１００μｇ腹腔内注射として投与した。
【０１５８】
移植片調製及び移植。全骨髄を、ドナーマウス脛骨、大腿骨、臀部、及び脊椎から摘出した。骨を粉砕し、濾過し、続いて赤血球（ＲＢＣ）溶解を施した。ｃ−Ｋｉｔ富化移植に関しては、ＲＢＣ溶解全骨髄を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社製ＣＤ１１７マイクロビーズに製造業者の指示に従って結合させ、磁気分離後に回収した。ＬＳＫ細胞移植に関しては、ＲＢＣ溶解全骨髄を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社製Ｌｉｎｅａｇｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  Ｋｉｔカクテルに、製造業者の指示に従って結合させた。磁気分離カラムからの流出液を回収し、ＣＤ３ＰＥ（１７Ａ２）、ＣＤ４ＰＥ（ＧＫ１．５）、ＣＤ５ＰＥ（５３−７．３）、ＣＤ８ａＰＥ（５３−６．７）、Ｂ２２０ＰＥ（ＲＡ３−６Ｂ２）、Ｇｒ−１ＰＥ（ＲＢ６−８Ｃ５）、Ｍａｃ−１ＰＥ（Ｍ１／７０）、Ｔｅｒ１１９ＰＥ（ＴＥＲ１１９）、ＳＣＡ１Ｐｅ−Ｃｙ７（Ｄ７）、及びＣＤ１１７ＡＰＣ（２Ｂ８）の最適濃度の抗体を用いて２％ＦＢＳを含むＰＢＳ中で染色した。ＢＤ  Ａｒｉａで分類する直前に、ヨウ化プロピジウムを生存力染色として添加した。移植のための全ての細胞を、２％ＦＢＳを含むＰＢＳ中で所望の濃度にて再懸濁した。照射対照マウスは、移植の前に２回の線量の６．５Ｇｙを用いて致死的に照射した。全てのマウスは、イソフルランを使用して麻酔し、次いで、後眼窩注射を介して１００ｕＬの細胞懸濁液を移植した。
【０１５９】
末梢血キメリズム。マウスは、ＥＤＴＡ採血管へと後眼窩採血を介して周期的に採血した。次いで、血液を、１％デキストラン中で５ｍＭ  ＥＤＴＡと３７℃（Ｃ）で１時間インキュベートした。各管からの上清を抽出し、溶解し、次いで、ＣＤ３ＡＰＣ（１７Ａ２）、ＣＤ１９ＰＥ−Ｃｙ７（ｅｂｉｏ１０３）、Ｇｒ−１ＢＶ４２１（ＲＢ６−８Ｃ５）、Ｍａｃ−１ＡＰＣ−Ｃｙ７（Ｍ１／７０）、ＣＤ４５．１ＦＩＴＣ（Ａ２０）、及びＣＤ４５．２ＰＥ（１０４）の最適濃度の抗体で染色した。試料を、ＢＤ  Ｆｏｒｔｅｓｓａで分析し、ドナー対宿主キメリズムをＣＤ４５アレル間差異に基づいて識別した。
【０１６０】
耳−心臓移植片。新生仔マウスを、生後１〜２日で安楽死させ、その心臓を回収した。レシピエントマウスを、頭蓋骨近くの耳の背面に小さな切開を作成することにより調製した。その後、トロカールを使用して、切開部位から耳介の先端までトンネリングすることによりパウチを作製した。新生仔の心臓を、トロカールを用いてパウチの遠位端にて送達した。トンネルを、持ち上げた皮膚を真皮に優しく押し戻すことにより閉じた。心臓生存力を、解剖顕微鏡を通して移植片を可視化することにより鼓動に関してモニターした。
【０１６１】
参考文献
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【０１６２】
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Ｐａｌｃｈａｕｄｈｕｒｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｏｎ−ｇｅｎｏｔｏｘｉｃ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ  ｆｏｒ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１６；３４（７）：７３８−４５。
【０１６８】
Ｃｚｅｃｈｏｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｖｉａ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｂａｓｅｄ  ｃｌｅａｒａｎｃｅ  ｏｆ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｎｉｃｈｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００７；３１８（５８５４）：１２９６−９。
【０１６９】
Ｃｈｈａｂｒａ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｈｏｓｔｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｏｒ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．２０１６；８（３５１）：３５１ｒａ１０５。
【０１７０】
Ｒｕｇｇｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ  ｏｆ  ｄｏｎｏｒ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ａｌｌｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００２；２９５（５５６２）：２０９７−１００。
【０１７１】
Ｄｕｒｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｔｔｉｎｇ  ｅｄｇｅ：ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ＣＤ４０  ｌｉｇａｎｄ  ａｎｄ  ｄｏｎｏｒ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｈｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｈｉｍｅｒｉｓｍ  ａｎｄ  ｄｏｎｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｃｙｔｏｒｅｄｕｃｔｉｖｅ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００；１６５（１）：１−４。
【０１７２】
Ｗｅｋｅｒｌｅ  ｅｔ  ａｌ．Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｍａｃｒｏｃｈｉｍｅｒｉｓｍ  ａｎｄ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｃｙｔｏｒｅｄｕｃｔｉｖｅ  ｈｏｓｔ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２０００；６（４）：４６４−９。
【０１７３】
Ｍａｒｋｅｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｓｋｉｎ  ａｌｌｏｇｒａｆｔｓ  ｉｎ  ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｄｏｎｏｒ  ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  ＣＤ４０  ｌｉｇａｎｄ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．１９９７；６４（２）：３２９−３５。
【０１７４】
Ｓｈｉｚｕｒｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｏｖｅｒｃｏｍｉｎｇ  ｔｈｅ  ｂａｒｒｉｅｒｓ  ｏｆ  ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ．Ｂｉｏｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１９９６；２（１）：３−１４。
【０１７５】
Ｎｅｇｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈｌｙ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ＣＤ３４＋Ｔｈｙ−１＋ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．Ｂｉｏｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２０００；６（３）：２６２−７１。
【０１７６】
Ｔｓａｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ａｌｌｏｇｒａｆｔｓ  ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｓｕｐｅｒｉｏｒ  ｔｏ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００９；１０６（９）：３２８８−９３。
【０１７７】
本明細書中で引用した各刊行物は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７８】
本発明が、記載された特定の方法論、プロトコル、細胞株、動物種または属、及び試薬に限定されず、変更してよいことを理解されたい。本明細書で使用される用語は、単に特定の実施形態を説明することを目的とするものであり、本発明の範囲を限定することを意図せず、これは添付の特許請求の範囲によってのみ限定され得ることも理解されたい。
【０１７９】
本明細書で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎｄ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈に別段の明確な指定がない限り、複数形の指示物を含む。ゆえに、例えば、「細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」に対する言及は、係る細胞の複数形を含み、「培養物（ｔｈｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ）」に対する言及は、１つまたは複数の培養物及び当業者に周知のその等価物に対する言及を含み、他も同様である。本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、別段の明確な指定がない限り、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。
【０１８０】
相互参照
本出願は、２０１７年１月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／４５２，２１８号の優先権を主張し、この出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【図１−１】
2020505420.tif 000003
【図１−２】
2020505420.tif 000004
【図２】
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【図３−１】
2020505420.tif 000006
【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
2020505420.tif 000009
【図４−３】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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