(57)【要約】【課題】【解決手段】光呼吸特性が改変された植物が、本明細書に提示されている。グリコール酸および／またはグリセリン酸を往復させることに関与する輸送タンパク質の破壊は、結果として、光合成速度の低下、植物成長の低下、ならびに遺伝子発現および光合成代謝産物プロファイルの変化を生じさせる。そのような破壊は、また、代替の光呼吸酵素経路の成分を発現する遺伝子の導入と組み合わされて、光合成効率を増加させる。【選択図】図１
2020511960.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリコール酸を葉緑体の少なくとも一部分から輸送する植物の能力の喪失または低下を含み、かつ前記植物の葉緑体の少なくとも一部分内でグリコール酸をエネルギーへ変換する能力の獲得を含む、１つ以上の遺伝子改変を含む遺伝子改変植物。
【請求項２】
前記葉緑体グリコール酸輸送能力の喪失は、配列番号６と少なくとも７０％配列同一性、少なくとも７５％配列同一性、少なくとも８０％配列同一性、少なくとも８５％配列同一性、少なくとも９０％配列同一性、または少なくとも９５％配列同一性を有する内因性タンパク質のレベルの低下、活性の低下、活性の部分的喪失、または活性の完全な喪失を含む、請求項１の植物。
【請求項３】
前記葉緑体グリコール酸輸送能力の喪失は、配列番号４６と少なくとも９５％同一のＲＮＡ分子の発現により誘導されるＲＮＡ干渉を含む、請求項１または請求項２の植物。
【請求項４】
前記葉緑体内でグリコール酸をエネルギーへ変換する能力の獲得は、葉緑体におけるトランスジェニックリンゴ酸シンターゼおよびトランスジェニックグリコール酸デヒドロゲナーゼの産生を含む、請求項１〜３のいずれか一項の植物。
【請求項５】
前記リンゴ酸シンターゼは、配列番号４３のアミノ酸残基４１〜６０７と少なくとも９５％同一である、請求項４の植物。
【請求項６】
前記グリコール酸デヒドロゲナーゼは、配列番号４５のアミノ酸残基４１〜１１３６と少なくとも９５％同一である、請求項４または請求項５の植物。
【請求項７】
前記リンゴ酸シンターゼは、配列番号４３を含み、
前記グリコール酸デヒドロゲナーゼは、配列番号４５を含む、
請求項４の植物。
【請求項８】
前記葉緑体グリコール酸輸送能力の喪失は、配列番号３と少なくとも９５％同一性を有するタンパク質の産生の欠如、および配列番号６と少なくとも９５％同一性を有するタンパク質の産生の欠如を含み、
前記葉緑体内でグリコール酸をエネルギーへ変換する能力の獲得は、配列番号４３と少なくとも９５％同一性を有するタンパク質の産生、および配列番号４５と少なくとも９５％同一性を有するタンパク質の産生を含む、請求項１の植物。
【請求項９】
前記植物は、イネ、ダイズ、ジャガイモ、ササゲ、オオムギ、コムギ、およびキャッサバからなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項の植物。
【請求項１０】
ａ．グリコール酸を植物の葉緑体の少なくとも一部分から輸送する能力の喪失を含む遺伝子改変を植物に導入する工程と、
ｂ．葉緑体内でグリコール酸をエネルギーへ変換する能力の獲得を含む遺伝子改変を植物に導入し、それにより植物の成長または生産性を増加させる工程と、
を含む、成長または生産性が増加した植物を作製する方法。
【請求項１１】
前記植物の葉緑体の少なくとも一部分からグリコール酸を輸送する能力の喪失は、
配列番号３と少なくとも９５％同一性を有する内因性タンパク質のレベルの低下、活性の低下、活性の部分的喪失、もしくは活性の完全な喪失を含み、
また、配列番号６と少なくとも９５％同一性を有した第２の内因性タンパク質のレベルの低下、活性の低下、活性の部分的喪失、もしくは活性の完全な喪失を含み、
またはその両方を含む、
請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記葉緑体グリコール酸輸送能力の喪失は、配列番号４６と少なくとも９５％同一のＲＮＡ分子の発現によりＲＮＡ干渉を誘導することを含む、請求項１０または請求項１１の方法。
【請求項１３】
前記葉緑体内でグリコール酸をエネルギーへ変換する能力の獲得は、葉緑体におけるトランスジェニックリンゴ酸シンターゼおよびトランスジェニックグリコール酸デヒドロゲナーゼの産生を含む、請求項１０〜１２のいずれか一項の方法。
【請求項１４】
前記リンゴ酸シンターゼは、配列番号４３のアミノ酸残基４１〜６０７と少なくとも９５％同一であり、
前記グリコール酸デヒドロゲナーゼは、配列番号４５のアミノ酸残基４１〜１１３６と少なくとも９５％同一である、
請求項１３の方法。
【請求項１５】
前記リンゴ酸シンターゼは、配列番号４３を含み、
前記グリコール酸デヒドロゲナーゼは、配列番号４５を含む、
請求項１３の方法。
【請求項１６】
前記葉緑体グリコール酸輸送能力の喪失は、配列番号３と少なくとも９５％同一性を有するタンパク質の産生の欠如、配列番号６と少なくとも９５％同一性を有するタンパク質の産生の欠如、または両方に起因し、
前記葉緑体内でグリコール酸をエネルギーへ変換する能力の獲得は、配列番号４３と少なくとも９５％同一性を有するタンパク質の産生、および配列番号４５と少なくとも９５％同一性を有するタンパク質の産生を含む、
請求項１３の方法。
【請求項１７】
前記植物は、イネ、ダイズ、ジャガイモ、ササゲ、オオムギ、コムギ、およびキャッサバからなる群から選択される、請求項１０〜１６のいずれか一項の方法。
【請求項１８】
リンゴ酸シンターゼをコードする第１の異種ポリヌクレオチドと、
グリコール酸デヒドロゲナーゼをコードする第２の異種ポリヌクレオチドと、
を含む遺伝子改変植物であって、
リンゴ酸シンターゼおよびグリコール酸デヒドロゲナーゼは、植物の葉緑体に局在する、植物。
【請求項１９】
前記植物の葉緑体内でグリコール酸をエネルギーへ変換する、請求項１８の植物。
【請求項２０】
前記リンゴ酸シンターゼは、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ  ｍａｘｉｍａ由来である、請求項１８または請求項１９の植物。
【請求項２１】
前記リンゴ酸シンターゼは、配列番号４３のアミノ酸残基４１〜６０７と少なくとも９５％同一である、請求項１８〜２０のいずれか一項の植物。
【請求項２２】
前記グリコール酸デヒドロゲナーゼは、Ｃｈｌａｄｙｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ由来である、請求項１８〜２１のいずれか一項の植物。
【請求項２３】
前記グリコール酸デヒドロゲナーゼは、配列番号４５のアミノ酸残基４１〜１１３６と少なくとも９５％同一である、請求項１８〜２２のいずれか一項の植物。
【請求項２４】
前記第１の異種ポリヌクレオチドは、配列番号４３のアミノ酸配列をコードし、
前記第２の異種ポリヌクレオチドは、配列番号４５のアミノ酸配列をコードする、
請求項１８〜２３のいずれか一項の植物。
【請求項２５】
前記植物の葉緑体において、１つ以上の内因性グリコール酸輸送タンパク質のレベルの低下、活性の低下、活性の部分的喪失、または活性の完全な喪失をさらに含む、請求項１８〜２４のいずれか一項の植物。
【請求項２６】
前記植物の葉緑体からのグリコール酸輸送の低下または喪失を有する、請求項２５の植物。
【請求項２７】
前記１つ以上のグリコール酸輸送タンパク質は、ＰＬＧＧ１およびＢＡＳＳ６を含む、請求項２５または請求項２６の植物。
【請求項２８】
前記１つ以上のグリコール酸輸送タンパク質のうちの少なくとも１つは、配列番号６と少なくとも７０％配列同一性、少なくとも７５％配列同一性、少なくとも８０％配列同一性、少なくとも８５％配列同一性、または少なくとも９０％配列同一性を有する、請求項２５〜２７のいずれか一項の植物。
【請求項２９】
前記１つ以上のグリコール酸輸送タンパク質のうちの少なくとも１つは、配列番号６と少なくとも９５％配列同一性を有する、請求項２８の植物。
【請求項３０】
グリコール酸輸送タンパク質の発現を阻害するＲＮＡ分子をコードする異種ポリヌクレオチドを含む、請求項２５〜２９のいずれか一項の植物。
【請求項３１】
前記１つ以上のグリコール酸輸送タンパク質のうちの少なくとも１つのレベルの低下、活性の低下、活性の部分的喪失、または活性の完全な喪失は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、ＴＡＬＥＮ、Ｚｎ−フィンガーヌクレアーゼ、およびＲＮＡｉからなる群から選択される技術を用い生じさせられる、請求項２５〜２９のいずれか一項の植物。
【請求項３２】
前記ＲＮＡ分子は、配列番号４６と少なくとも９５％同一である、請求項３０の植物。
【請求項３３】
イネ、ダイズ、ジャガイモ、ササゲ、オオムギ、コムギ、およびキャッサバからなる群から選択される、請求項１８〜３２のいずれか一項の植物。
【請求項３４】
リンゴ酸シンターゼをコードする第１の異種ポリヌクレオチドと、
グリコール酸デヒドロゲナーゼをコードする第２の異種ポリヌクレオチドと、
を含む遺伝子改変植物であって、
リンゴ酸シンターゼおよびグリコール酸デヒドロゲナーゼは、植物の葉緑体に局在する、植物。
【請求項３５】
配列番号４３と少なくとも９５％同一性を有する第１のポリペプチドをコードする第１の異種ポリヌクレオチドと、
配列番号４５と少なくとも９５％同一性を有する第２のポリペプチドをコードする第２の異種ポリヌクレオチドと、
を含み、
第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、植物の葉緑体に局在する、遺伝子改変植物。
【請求項３６】
リンゴ酸シンターゼをコードする第１の異種ポリヌクレオチドおよびグリコール酸デヒドロゲナーゼをコードする第２の異種ポリヌクレオチドを植物へ導入することを含む、成長または生産性が増加した植物を作製する方法であって、
リンゴ酸シンターゼおよびグリコール酸デヒドロゲナーゼは、植物の葉緑体に局在し、
植物は、葉緑体内でグリコール酸をエネルギーへ変換する能力の増加を有し、それにより植物の成長または生産性を増加させる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
この特許出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）により、米国仮出願第６２／４６７，９９３号の優先権を主張し、その仮出願は、２０１７年３月７日に出願され、参照により本明細書に組み入れられている。
【０００２】
本開示は、光呼吸特性が改変された植物を提供する。グリコール酸および／またはグリセリン酸を往復させることに関与する輸送タンパク質の破壊は、結果として、光合成速度の低下、植物成長の低下、ならびに遺伝子発現および光合成代謝物プロファイルの変化を生じさせる。そのような破壊は、代替光呼吸酵素経路の成分を発現する遺伝子の導入と組み合わされた場合、光合成効率を増加させる。
【背景技術】
【０００３】
リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ（ＲｕｂｉｓＣＯ）は、リブロース−１，５−ビスリン酸（ＲｕＢＰ）のＣＯ２との固定を触媒して、２分子の３−ホスホグリセリン酸（３−ＰＧＡ）を生成する。しかしながら、２５℃および現在のＣＯ２レベルでは、Ｃ３光合成代謝を有する植物におけるＲｕｂｉｓＣＯ触媒活性の約２５％は、二酸化炭素ではなく、競合する基質である酸素との固定であり、それは、ＲｕＢＰの、１分子の３−ＰＧＡと１分子の２−ホスホグリコール酸（２−ＰＧ）への変換を生じさせる（Ｂｏｗｅｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈ．Ｒｅｓ．Ｃｏ（１９７１）４５：７１６〜２２；Ｏｇｒｅｎ  ａｎｄ  Ｂｏｗｅｓ、Ｎａｔｕｒｅ−Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌ．（１９７１）２３０：１５９〜６０；Ｌｏｒｉｍｅｒ，Ｇ．Ｈ．、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８１）３２：３４９〜８３；Ｏｇｒｅｎ，Ｗ．Ｌ．、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８４）３５：４１５〜４２；Ｓｈａｒｋｅｙ，Ｔ．Ｄ．、Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ  Ｐｌａｎｔａｒｕｍ（１９８８）７３：１４７〜５２）。葉緑体ストロマにおける２−ＰＧ蓄積は、トリオースリン酸イソメラーゼおよびホスホフルクトキナーゼを阻害し、それにより、ＲｕＢＰ再生能力を低減させ得る（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｌ．Ｅ．、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ（１９７１）２３５：２３７〜４４；Ｋｅｌｌｙ  ａｎｄ  Ｌａｔｚｋｏ、Ｆｅｂｓ  Ｌｅｔｔ（１９７６）６８：５５〜５８）。２−ＰＧは、２−ホスホグリコール酸ホスファターゼにより迅速に脱リン酸されるが、生成されたグリコール酸もまた、葉緑体における光合成の速度を抑制し得、細胞にとって毒性であると考えられている（Ｋｅｌｌｙ  ａｎｄ  Ｌａｔｚｋｏ、ｓｕｐｒａ；ＧｏｎｚａｌｅｚＭｏｒｏら、Ｊ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９９７）１５０：３８８〜９４）。葉緑体、ペルオキシソーム、ミトコンドリア、およびサイトゾルにおけるステップを含むＣ２光呼吸経路を通して、２−ＰＧ／グリコール酸による光合成の阻害が防止され、低下した炭素の部分的回復が達成される（Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ  ａｎｄ  Ｏｇｒｅｎ、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ（１９７９）６３：１５２；Ｅｉｓｅｎｈｕｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．（２０１３）６７６〜８５）。光呼吸は、２分子の２−ＰＧを１分子の３−ＰＧＡへ変換し、１分子のＣＯ２を放出する。
【０００４】
加えて、光呼吸サイクルは、ミトコンドリアにおいて、ＡＴＰを利用し、グリシンのセリンへの変換の副産物として、アンモニア（ＮＨ３）を生成する。その後、植物は、還元当量ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを用いてそのＮＨ３をリサイクルする。結果として、現在の大気ＣＯ２濃度下での光呼吸は、地域の成長期温度に依存して、季節性Ｃ３光合成効率に対する約１５〜５０％の低減（ｄｒａｇ）を生じさせる（Ｏｇｒｅｎ、ｓｕｐｒａ；Ｐｅｔｅｒｈａｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｈｏｔｏｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  Ｂｏｏｋ（２０１０）、２０１３０）。光呼吸による収量の損失は、ＵＳ中西部のダイズおよびコムギ生産だけで、１年あたり合計約１５０兆カロリーにのぼり（Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．（２０１６）１０７〜２９）、米およびジャガイモなどの他の主なＣ３作物にも同様の負の影響を生じさせる（Ｓｈａｒｋｅｙ，Ｔ．Ｄ．ｓｕｐｒａ、Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．（２０１０）６１：２３５〜６１）。
【０００５】
光呼吸は、Ｃ３植物にとって必須であるが、固定された二酸化炭素およびエネルギーを大量に費やすことで行われる。光呼吸は、光合成の最初の酵素であるリブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）が、二酸化炭素の代わりに酸素と反応した時、開始され、毒性化合物のグリコール酸を生成し、その後、そのグリコール酸は光呼吸によりリサイクルされる。光呼吸は、林冠および地域的スケールでモデル化して、現在および未来の大気下におけるそのコストを決定することができる。地域的スケールモデルにより、光呼吸は、現在、ＵＳダイズおよびコムギ収量を３６％および２０％減少させることが明らかにされている。この光呼吸による損失のわずかな改善でさえも、ＵＳのみで年間１億ドルの価値があり得、光呼吸は、作物収量を向上させるための標的過程になり得る（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．２０１６  ６７：１０７〜２９）。合成生物学の進歩により、より少ないエネルギーを用いて葉緑体においてグリコール酸を代謝する酵素を導入すること、および光呼吸のＣＯ２生成の場所をミトコンドリアから葉緑体へ移動させ、それにより、Ｒｕｂｉｓｃｏによる迅速な再固定を可能にすることにより、天然経路を短絡させることを意図する、植物葉緑体へのいくつかの新規な経路の導入が可能になっている（Ｋｅｂｅｉｓｈら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２００７）２５：５９３〜５９９；ＭａｕｒｉｎｏおよびＰｅｔｅｒｈａｎｓｅｌ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ（２０１０）１３：２４９〜２５６）。
【０００６】
光呼吸に関与する可溶性酵素は、過去４０年に渡って十分研究されており、光呼吸代謝を司る生化学および遺伝学に関する多くの情報がもたらされている（Ｐｅｔｅｒｈａｎｓｅｌら、ｓｕｐｒａ；Ｔｉｍｍ  ａｎｄ  Ｂａｕｗｅ、Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．（２０１３）１５：７３７〜４７）。対照的に、光呼吸における炭素のリサイクリングに関与する少なくとも２５個の提唱された輸送ステップがあるにも関わらず、少数のトランスポーターのみが光呼吸に関与することが実証されている（Ｅｉｓｅｎｈｕｔ  ｅｔ  ａｌ．、ｓｕｐｒａ）。重要なことに、光呼吸は、窒素サイクルおよびアミノ酸生合成を含む複数の他の代謝経路と相互作用する高フラックス経路である（Ｆｅｒｎｉｅ  ｅｔ  ａｌ、Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．（２０１３）１５：７４８〜５３）。
【０００７】
光呼吸に関与することが同定された最初のトランスポーターは、葉緑体ジカルボン酸トランスポーターＤｉＴ１およびＤｉＴ２であった（Ｗｏｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９８７）８４：６２４〜３２）。ＤｉＴ２．１における単一の点変異、およびその後の生化学的特徴づけにより、ＤｉＴ２は、葉緑体内包膜に位置するグルタミン酸／リンゴ酸トランスポーターであることが明らかにされた（Ｒｅｎｎｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．（２００３）３５：３１６〜３１）。ＤｉＴ１のアンチセンス抑制は、環境ＣＯ２下での成長の減少および二酸化炭素濃度（［ＣＯ２］）の上昇による補完の古典的光呼吸変異表現型を示し、葉緑体における２−オキソグルタル酸輸送の減少に起因する硝酸再同化作用の低下を生させた（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒｅｉｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．（２００６）４５：２０６〜２４）。合わせると、ＤｉＴ１およびＤｉＴ２は、光呼吸代謝におけるグリシン脱炭酸反応から放出されたアンモニアの適切な再固定に必要である。
【０００８】
最近では、同時発現分析を用いて、光呼吸に関与している可能性のある他のトランスポーターが同定された（Ｂｏｒｄｙｃｈ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．（２０１３）１５：６８６〜９３）。同時発現分析は、正常なグリシンデカルボキシラーゼ（ＧＤＣ）活性および分裂組織成長に必要とされるミトコンドリアトランスポーターＡ  ＢＯＵＴ  ＤＥ  ＳＯＵＦＦＬＥ（ＢＯＵ）を同定し、そのトランスポーターにおけるヌル変異体は、上昇した［ＣＯ２］による補完の光呼吸変異表現型を示す（Ｅｉｓｅｎｈｕｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．（２０１３）７３：８３６〜４９）。現在、同定されている、グリコール酸から直接誘導された炭素を輸送する唯一の光呼吸経路トランスポーターは、色素体グリコール酸／グリセリン酸輸送体タンパク質、ＰＬＧＧ１である。Ｐｌｇｇ１は、光呼吸に関与する多くの酵素と同時発現する（Ｐｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２０１３）１１０：３１８５〜９０）。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａにおけるＰｌｇｇ１  Ｔ−ＤＮＡノックアウト系列（ｐｌｇｇ１−１）は、光呼吸経路における最初と最後の輸送ステップ、すなわち、グリコール酸の葉緑体からのエクスポートおよびグリセリン酸の葉緑体へのインポートにおけるＰＬＧＧ１の役割を明らかにしている（Ｐｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．、ｓｕｐｒａ）。ＰＬＧＧ１の分子同定よりほぼ３０年前、グリセリン酸のインポートと同時に起こるグリコール酸のエクスポートが、精製されたホウレンソウ葉緑体において実証された（Ｈｏｗｉｔｚ  ａｎｄ  ＭｃＣａｒｔｙ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８５）２４：３６４５〜５０；ＨｏｗｉｔｚおよびＭｃＣａｒｔｙ、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９８６）８０：３９０〜９５；Ｈｏｗｉｔｚ  ａｎｄ  ＭｃＣａｒｔｙ、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９９１）９６：１０６０〜６９；Ｙｏｕｎｇ  ａｎｄ  ＭｃＣａｒｔｙ、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９９３）１０１：７９３〜９９）。加えて、ＰＬＧＧ１は、プロテオミクス研究において葉緑体タンパク質として同定され、当初はプログラム細胞死に関与すると考えられたが、最新の証拠により、その表現型は、光呼吸中間体の蓄積に関連づけられていることが示唆されている（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｅｗ  Ｐｈｙｔｏｌ．（２０１２）１９３：８１〜９５；Ｐｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．、上記）。しかしながら、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｐｌｇｇ１−１系列は、微小光条件下で測定された場合、野生型と比較して、ＣＯ２同化作用の量子効率の差または光呼吸ＣＯ２補償点の変化を示さないことが示された（Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｈｏｔｏｓｙｎ  Ｒｅｓ．（２０１６）１２９：９３〜１０３）。組み合わせると、これらのデータにより、ＰＬＧＧ１タンパク質は、光呼吸代謝に関与することが示され、さらにグリコール酸が葉緑体を出て行くための追加の経路も示唆し、また、光呼吸経路において表現型からトランスポーターを同定することの困難さを示している（Ｈｏｄｇｅｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔ．（２０１６）３０１５〜２６）。
【０００９】
遺伝的アプローチと同時発現アプローチの両方は、光呼吸代謝に関与する遺伝子を同定することに成功しているが、光呼吸中間体のフラックスに関与するトランスポーターの多くは、未知のままである。同時発現分析の代替アプローチは、葉緑体内包膜プロテオミクス研究からの葉緑体内膜トランスポーター候補を同定し、クロロフィル蛍光を用いて、その候補遺伝子のｔＤＮＡ挿入変異体を光呼吸変異表現型についてスクリーニングすることである（Ｂａｄｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｆｕｎｃｔ．Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．（２００９）３６：８６７〜７３；Ｓｕｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、（２００９）３７：Ｄ９６９〜Ｄ９７４）。光呼吸欠損変異体は、低ＣＯ２レベル下で照明に曝された時の光化学系ＩＩ（ＰＳＩＩ）の機能障害に起因するＦｖ／Ｆｍクロロフィル蛍光の低下を示す（Ｋｏｚａｋｉ  ａｎｄ  Ｔａｋｅｂａ、Ｎａｔｕｒｅ（１９９６）３８４：５５７〜６０；Ｗｉｎｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｈｉｌｏｓｏｐｈ．Ｔｒａｎｓ．Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃ．Ｂ−Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．（２０００）３５５：１５１７〜２９；Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．（２００７）１４４：４８７〜９４）。
【００１０】
推定トランスポーター様葉緑体内包膜タンパク質を標的にする順遺伝学と組み合わせてのこのハイスループット蛍光に基づいたアプローチを用いることは、光呼吸代謝物輸送に重要な追加の遺伝子を同定できる可能性を有する。ナトリウム胆汁酸シンポーターは、哺乳動物の肝臓において胆汁酸トランスポーターとして最初に同定された輸送タンパク質のファミリーである。さらなる分析により、トランスポーターのＢＡＳＳファミリーは、ピルビン酸、ステロイド、および生体異物などの非胆汁酸有機化合物を含む幅広い範囲の基質特異性を示すことが示された（Ｆｕｒｕｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ（２０１１）４７６：４７２〜７５；Ｃｌａｒｏ  ｄａ  Ｓｉｌｖａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ．Ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｍｅｄ．（２０１３）３４：２５２〜６９）。胆汁酸は植物においては生成されないが、ＢＡＳＳファミリー遺伝子は、単子葉植物と双子葉植物の両方に存在する（Ｇｉｇｏｌａｓｈｖｉｌｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ（２００９）２１：１８１３〜２９；Ｓａｗａｄａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｌａｎｔ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．（２００９）５０：１５７９〜８６；Ｆｕｒｕｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．、ｓｕｐｒａ）。
【００１１】
本明細書に詳述されているように、光呼吸に関与するグリコール酸トランスポーターとしてのナトリウム胆汁酸シンポーター６タンパク質（ＢＡＳＳ６）が同定された。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおけるｂａｓｓ６ノックアウトＴ−ＤＮＡ系列（ｂａｓｓ６−１およびｂａｓｓ６−２）の分析により、Ｂａｓｓ６の欠損は、光呼吸変異体表現型、ならびに光呼吸代謝中間体のグリシンおよびグリコール酸の蓄積を生じさせることが明らかになった。加えて、葉緑体包膜に局在したＢＡＳＳ６タンパク質、およびグリコール酸を輸送するＢＡＳＳ６の能力が、酵母相補性と輸送分析の組合せを通して実証された。ｂａｓｓ６−ｐｌｇｇ１二重変異体は、相加的発育異常を示した。
【００１２】
本発明者らの発見により、葉緑体包膜に位置した２つのグリコール酸トランスポーターを介するグリコール酸の葉緑体からの迅速なエクスポートに起因して、光呼吸短絡またはバイパス経路はあまり効果的ではなかったことが明らかにされた。ＰＬＧＧ１（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（２０１３）１１０（８）：３１８５〜９０）は、葉緑体包膜のグリコール酸をグリセリン酸に交換する、色素体グリコール酸グリセリン酸輸送体である。ＰＬＧＧ１はグリセリン酸のインポートを全面的に担当するが、ＢＡＳＳ６およびＰＬＧＧ１は、葉緑体からのグリコール酸のエクスポートを分担する。したがって、ＢＡＳＳ６およびＰＬＧＧ１の組み合わされた活性は、グリコール酸の合成光呼吸バイパス経路と競合し、それにより、光合成効率および植物成長／収量を向上させることにおけるバイパスの有効性を制限する。
【００１３】
光呼吸におけるＲｕＢｉｓＣＯ酸素化反応およびグリシン変換の毒性副産物（それぞれ、グリコール酸およびアンモニア）は、３つのオルガネラ：葉緑体、ペルオキシソーム、およびミトコンドリアの間で、高エネルギーの要求と固定炭素の純損失を伴って、再固定され、使用可能な生成物へと変換される（Ｂａｕｗｅ、  ｅｔ  ａｌ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．（２０１０）１５：３３０〜６）。いくつかの光合成藻類、光合成細菌、および光合成植物は、炭素濃縮機構（ＣＣＭ）およびＣ４光合成を介して光呼吸のストレスを低下させる方法を進化させている（Ｐｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔ．（２０１３）６４：７５３〜６８）。代替として、代替代謝経路を用いて光呼吸をバイパスすることは、より効率的に、エネルギー要求を低下させ、かつその過程で失われた炭素を再捕獲できる可能性がある（Ｂｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔ．（２０１６）６７：２９７７〜８８）。３つの異なる光呼吸バイパスが、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、Ｃａｍｅｌｉｎａ  ｓａｔｉｖａ、およびジャガイモなどの植物において実証されている（Ｄａｌａｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｆｕｅｌｓ（２０１５）８；Ｋｅｂｅｉｓｈ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００７）５９３〜９；Ｍａｉｅｒら、Ｆｒｏｎｔ．Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．（２０１２）３：１２；Ｎｏｌｋｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．（２０１４）１２：７３４〜４２）。いくつかの変形を含むこれらのバイパスは、植物生産性の向上を示したが、農業条件下におけるそれらの有効性は実証されておらず、農家の圃場において光呼吸へのバイパスを完全に最適化するための試みは、現在行われていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
これらの懸念に対処するために、葉緑体グリコール酸エクスポート能力に欠ける植物、およびそれらを作製するための方法、加えて、光合成効率を増加させるための１つまたは複数の代替光呼吸バイパス経路を含有する植物が本明細書に提示されている。その２つのアプローチの組合せが、結果として、さらなる効率性を生じさせる。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
グリコール酸を葉緑体の少なくとも一部分から輸送する植物の能力の喪失または低下させ、かつ植物の葉緑体の少なくとも一部分内でグリコール酸をエネルギーへ変換する能力を獲得させる、１つ以上の遺伝子改変を含む遺伝子改変植物が本明細書に提供される。一つの実施形態において、葉緑体グリコール酸輸送能力の喪失は、配列番号６と少なくとも７０％同一性を有する機能性タンパク質の産生の欠如に起因する。他の実施形態において、葉緑体グリコール酸輸送能力の喪失は、配列番号４６と少なくとも９５％同一のＲＮＡ分子の発現によるＲＮＡ干渉を誘導することを含む。さらなる他の実施形態において、葉緑体内でグリコール酸をエネルギーへ変換する能力の獲得は、葉緑体におけるトランスジェニックリンゴ酸シンターゼおよびトランスジェニックグリコール酸デヒドロゲナーゼの産生を含む。特定の実施形態において、リンゴ酸シンターゼは、配列番号４３のアミノ酸残基４１〜６０７と少なくとも９５％同一であり、グリコール酸デヒドロゲナーゼは、配列番号４５のアミノ酸残基４１〜１１３６と少なくとも９５％同一である。特定の実施形態において、リンゴ酸シンターゼは配列番号４３を含み、グリコール酸デヒドロゲナーゼは配列番号４５を含む。別の具体的な実施形態において、葉緑体グリコール酸輸送能力の喪失は、配列番号３と少なくとも９５％同一性を有するタンパク質の産生の欠如、および配列番号６と少なくとも９５％同一性を有するタンパク質の産生の欠如を含み、葉緑体内でグリコール酸をエネルギーへ変換する能力の獲得は、配列番号４３と少なくとも９５％同一性を有するタンパク質の産生、および配列番号４５と少なくとも９５％同一性を有するタンパク質の産生を含む。遺伝子改変植物は、任意のＣ３植物であり得る。例えば、いくつかの実施形態において、本開示の植物は、イネ、ダイズ、ジャガイモ、ササゲ、オオムギ、コムギ、またはキャッサバである。
【００１６】
ａ）グリコール酸を植物の葉緑体の少なくとも一部分から輸送する能力の喪失を含む遺伝子改変を植物に導入すること、およびｂ）葉緑体内でグリコール酸をエネルギーへ変換する能力の獲得を含む遺伝子改変を植物に導入し、それにより植物の成長または生産性を増加させることにより、成長または生産性が増加した植物を作製する方法もまた本明細書に開示されている。いくつかの実施形態において、グリコール酸を植物の葉緑体の少なくとも一部分から輸送する能力の喪失は、配列番号３と少なくとも９５％同一性を有する機能性タンパク質の産生の欠如、配列番号６と少なくとも９５％同一性を有する機能性タンパク質の産生の欠如、またはその両方を含む。さらなる追加の実施形態において、葉緑体内でグリコール酸をエネルギーへ変換する能力の獲得は、葉緑体におけるトランスジェニックリンゴ酸シンターゼおよびトランスジェニックグリコール酸デヒドロゲナーゼの産生を含む。いくつかの実施形態において、リンゴ酸シンターゼは、配列番号４３のアミノ酸残基４１〜６０７と少なくとも９５％同一であり、グリコール酸デヒドロゲナーゼは、配列番号４５のアミノ酸残基４１〜１１３６と少なくとも９５％同一である。特定の実施形態において、リンゴ酸シンターゼは配列番号４３を含み、グリコール酸デヒドロゲナーゼは配列番号４５を含む。具体的な実施形態によれば、葉緑体グリコール酸輸送能力の喪失は、配列番号３と少なくとも９５％同一性を有するタンパク質の産生の欠如、配列番号６と少なくとも９５％同一性を有するタンパク質の産生の欠如、またはその両方を含み、葉緑体内でグリコール酸をエネルギーへ変換する能力の獲得は、配列番号４３と少なくとも９５％同一性を有するタンパク質の産生、および配列番号４５と少なくとも９５％同一性を有するタンパク質の産生を含む。任意のＣ３植物が本開示の方法と共に用いられ得る。いくつかの実施形態において、植物は、イネ、ダイズ、ジャガイモ、ササゲ、オオムギ、コムギ、またはキャッサバである。
【００１７】
本明細書に提供された追加の実施形態は、リンゴ酸シンターゼをコードする第１の異種ポリヌクレオチドと、グリコール酸デヒドロゲナーゼをコードする第２の異種ポリヌクレオチドと、を含む遺伝子改変植物であって、リンゴ酸シンターゼおよびグリコール酸デヒドロゲナーゼは、植物の葉緑体に局在する、遺伝子改変植物である。好ましい実施形態において、植物は、植物の葉緑体内でグリコール酸をエネルギーへ変換する。いくつかの実施形態において、リンゴ酸シンターゼは、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ  ｍａｘｉｍａを含む、本明細書に提供される任意の供給源に由来する。具体的な実施形態において、リンゴ酸シンターゼは、配列番号４３のアミノ酸残基４１〜６０７と少なくとも９５％同一である。さらなる実施形態において、これらの植物のいずれかは、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉを含む、本明細書に提供される任意の供給源から選択された生物体由来のグリコール酸デヒドロゲナーゼを発現する。特定の実施形態において、グリコール酸デヒドロゲナーゼは、配列番号４５のアミノ酸残基４１〜１１３６と少なくとも９５％同一である。具体的な実施形態において、第１の異種ポリヌクレオチドは配列番号４３のアミノ酸配列をコードし、第２の異種ポリヌクレオチドは配列番号４５のアミノ酸配列をコードする。いくつかの実施形態において、植物は、植物の葉緑体における１つ以上の内因性グリコール酸輸送タンパク質の、レベルの低下、活性の低下、活性の部分的喪失、または活性の完全な喪失をさらに含む。いくつかの実施形態において、植物は、植物の葉緑体からのグリコール酸輸送の低下または喪失を有する。特定の実施形態において、１つ以上のグリコール酸輸送タンパク質は、ＰＬＧＧ１およびＢＡＳＳ６を含む。さらなる実施形態において、１つ以上のグリコール酸輸送タンパク質は、配列番号６と少なくとも７０％配列同一性、少なくとも７５％配列同一性、少なくとも８０％配列同一性、少なくとも８５％配列同一性、少なくとも９０％配列同一性、または少なくとも９５％配列同一性を有する。さらなる実施形態において、１つ以上のグリコール酸輸送タンパク質のうちの少なくとも１つは、配列番号３と少なくとも７０％配列同一性、少なくとも７５％配列同一性、少なくとも８０％配列同一性、少なくとも８５％配列同一性、または少なくとも９０％配列同一性を有した。他の実施形態において、１つ以上のグリコール酸輸送タンパク質のうちの少なくとも１つは、配列番号３との少なくとも９５％配列同一性を有した。いくつかの実施形態において、植物は、グリコール酸輸送タンパク質をコードするＤＮＡ分子の変異を含む。追加の実施形態において、植物は、配列番号４６と少なくとも９５％同一であるＲＮＡ分子など、グリコール酸輸送タンパク質の発現を阻害するＲＮＡ分子をコードする異種ポリヌクレオチドを含む。さらなる実施形態において、１つ以上のグリコール酸輸送タンパク質のうちの少なくとも１つのレベルの低下、活性の低下、活性の部分的喪失、または活性の完全な喪失を、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、ＴＡＬＥＮ、Ｚｎ−フィンガーヌクレアーゼ、およびＲＮＡｉからなる群から選択される技術を用いて発生させた。
【００１８】
本開示の別の態様は、遺伝子改変植物であり、植物は、配列番号４３と少なくとも９５％同一性を有する第１のポリペプチドをコードする第１の異種ポリヌクレオチド、および配列番号４５と少なくとも９５％同一性を有する第２のポリペプチドをコードする第２の異種ポリヌクレオチドを含み、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドが、植物の葉緑体に局在している。追加の実施形態において、植物は、配列番号３と少なくとも９５％同一性を有する第３のポリペプチドのレベルの低下または活性の低下、および配列番号６と少なくとも９５％同一性を有する第４のポリペプチドのレベルの低下または活性の低下をさらに含む。例示的な植物には、イネ、ダイズ、ジャガイモ、ササゲ、オオムギ、コムギ、およびキャッサバが挙げられる。
【００１９】
本開示の追加の態様は、リンゴ酸シンターゼをコードする第１の異種ポリヌクレオチド、およびグリコール酸デヒドロゲナーゼをコードする第２の異種ポリヌクレオチドを植物へ導入することを含む、成長または生産性が増加した植物を育成する方法であって、リンゴ酸シンターゼおよびグリコール酸デヒドロゲナーゼが植物の葉緑体に局在し、植物は、葉緑体内でグリコール酸をエネルギーへ変換する能力が上昇しており、それにより植物の成長または生産性を増加させる、方法を提供する。いくつかの実施形態において、この方法は、また、植物に遺伝子改変を導入する工程を有し、その植物は、その植物の葉緑体の少なくとも一部分からグリコール酸を輸送する能力の低下を有する。追加の実施形態において、リンゴ酸シンターゼは、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ  ｍａｘｉｍａを含む、本明細書に提供された生物体に由来する。具体的な実施形態において、リンゴ酸シンターゼは、配列番号４３のアミノ酸残基４１〜６０７と少なくとも９５％同一である。さらなる実施形態において、グリコール酸デヒドロゲナーゼは、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉを含む、本明細書に提供された生物体に由来する。具体的な実施形態において、グリコール酸デヒドロゲナーゼは、配列番号４５のアミノ酸残基４１〜１１３６と少なくとも９５％同一である。特定の実施形態において、リンゴ酸シンターゼは配列番号４３のアミノ酸配列を含み、グリコール酸デヒドロゲナーゼは配列番号４５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、植物へ遺伝子改変を導入する工程は、植物の葉緑体における１つ以上の内因性グリコール酸輸送タンパク質のレベルの低下、活性の低下、活性の部分的喪失、または活性の完全な喪失を引き起こす。この方法論のいくつかの実施形態において、１つまたは複数の内因性グリコール酸輸送タンパク質のうちの少なくとも１つのレベルの低下、活性の低下、活性の部分的喪失、または活性の完全な喪失は、内因性グリコール酸輸送タンパク質をコードした内因性ＤＮＡ分子へ変異を導入することを含む。追加の実施形態において、１つ以上の内因性グリコール酸輸送タンパク質のうちの少なくとも１つのレベルの低下、活性の低下、活性の部分的喪失、または活性の完全な喪失は、内因性グリコール酸輸送タンパク質の発現を阻害するＲＮＡ分子をコードする異種ポリヌクレオチドを導入することを含み、例えば、ＲＮＡ分子は、配列番号４６と少なくとも９５％同一である。具体的な実施形態において、１つ以上の内因性グリコール酸輸送タンパク質のうちの少なくとも１つは、ＰＬＧＧ１またはＢＡＳＳ６である。いくつかの実施形態において、１つ以上の内因性グリコール酸輸送タンパク質のうちの少なくとも１つは、配列番号６と少なくとも７０％配列同一性、少なくとも７５％配列同一性、少なくとも８０％配列同一性、少なくとも８５％配列同一性、または少なくとも９０％配列同一性を有する。特定の実施形態において、１つ以上の内因性グリコール酸輸送タンパク質のうちの少なくとも１つは、配列番号６と少なくとも９５％配列同一性を有する。他の実施形態において、１つ以上の内因性グリコール酸輸送タンパク質のうちの少なくとも１つは、配列番号３と少��くとも７０％配列同一性、少なくとも７５％配列同一性、少なくとも８０％配列同一性、少なくとも８５％配列同一性、または少なくとも９０％配列同一性を有する。特定の実施形態において、１つ以上の内因性グリコール酸輸送タンパク質のうちの少なくとも１つは、配列番号３と少なくとも９５％配列同一性を有する。具体的な実施形態において、１つ以上の内因性グリコール酸輸送タンパク質は、配列番号６と少なくとも９５％同一性を有する第１のグリコール酸輸送タンパク質、および配列番号３と少なくとも９５％同一性を有する第２のグリコール酸輸送タンパク質である。特定の実施形態において、植物は、イネ、ダイズ、ジャガイモ、ササゲ、オオムギ、コムギ、またはキャッサバである。
【００２０】
参照による組み入れ
この明細書で言及された全ての刊行物、特許、および特許出願は、あたかも各個々の刊行物、特許、または特許出願が、具体的かつ個々に示されて参照により組み入れられているのと同じ程度で、参照により本明細書に組み入れられている。
【００２１】
特許出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を含むこの特許または特許出願刊行物の複写は、依頼および必要な料金の支払いによって特許庁により提供される。
【００２２】
本開示の新規な特徴は、特許請求の範囲において具体的に示されている。本開示の特徴および利点は、以下の詳細な説明および添付の図面において言及されている。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】光呼吸Ｃ２サイクルの図である。
【図２】環境ＣＯ２（グロースチャンバーにおいて２５０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１光強度で、８時間明期／１６時間暗期サイクル（２２℃／１８℃）で、８週間  ４００ｐｐｍ  ＣＯ２）で成長した野生型Ａ．ｔｈａｌｉａｎａと比較した、代表的なｂａｓｓ６変異体およびｐｌｇｇ１変異体の写真である。
【図３】２４時間の低いＣＯ２および一定照明後のＦｖ／Ｆｍの変化を示す、野生型Ａ．ｔｈａｌｉａｎａと比較した、代表的なｂａｓｓ６変異体およびｐｌｇｇ１変異体の写真である。数値は、３つの複製実験からの１２個の植物の平均を表す。
【図４Ａ−４Ｂ】異なるＣＯ２濃度における、野生型Ａ．ｔｈａｌｉａｎａと比較した、ｂａｓｓ６−１変異体およびｐｌｇｇ１−１変異体の相対的成長速度を示すグラフである。図４Ａにおいて、誤差バーは、標準偏差を示し、アスタリスク（＊）は、ＣＯ２処理間の有意差を示す。二重アスタリスク（＊＊）は、Ｔ−ＤＮＡ系列とＷＴの間での成長速度の有意な変化を示す。統計的差は、ＳｔｕｄｅｎｔのＴ検定ｐ＜０．０５に基づいている。
【図５】Ｂａｓｓ６を欠損するＡ．ｔｈａｌｉａｎａ変異体における同化作用（Ａ）、内部ＣＯ２濃度（Ｃｉ）、および気孔伝導度（ｇｓ）の低下を示すグラフである。光合成測定は、４００ｐｐｍ  ＣＯ２および飽和光（１０００μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１）における、示された系統、同化作用（Ａ）、内部ＣＯ２濃度（Ｃｉ）、および気孔伝導度（ｇｓ）について記録された。文字は、ＡＮＯＶＡ分析Ｎ＝３に基づいた統計的差を示す。
【図６Ａ−６Ｂ】相加的光呼吸表現型効果を示す、ｂａｓｓ６、ｐｌｇｇ１の二重変異体Ａ．ｔｈａｌｉａｎａの分析を示す図である。図６Ａは、代表的な野生型、ｂａｓｓ６、ｐｌｇｇ１、および二重変異体ｂａｓｓ６、ｐｌｇｇ１の成長およびクロロフィル蛍光におけるＦｖ／Ｆｍ変化を示す写真を提供する。その写真は、２０００ｐｐｍ  ＣＯ２において４週間、その後、環境ＣＯ２へシフトされて５日間、成長した、示された植物を表す。Ｆｖ／Ｆｍ画像は、葉上の葉緑体病変の形成によるクロロフィル蛍光の変化を示す。画像は５つの反復を代表する。図６Ｂは、これらの植物における葉緑体病変形成の程度を示すグラフを提供する。葉病変サイズのｃｍ２での面積は、写真ソフトウェア（Ａｄｏｂｅ）を用いて測定されたピクセル密度に基づいている。
【図７】ＧＦＰタグ付きＰＬＧＧ１（パネルＤ〜Ｆ）およびＧＦＰタグ付きＢＡＳＳ６（パネルＧ〜Ｉ）の葉緑体包膜への局在化を示す、単離されたＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａプロトプラストの共焦点顕微鏡画像である。これらの画像は、４つの連続した平面の最大投影図であり、ＰＬＧＧ１とＢＡＳＳ６の両方が葉緑体包膜に局在し（矢じり）、そこでそれらがストロミュール（星印の付いた矢じり）を形成することを示している。全てのプロトプラストは、また、不図示のＰ１９およびｍＣｈｅｒｒｙタグ付きＥＲマーカーを発現している。スケールバー：１０μｍである。パネルＪ〜Ｌは、３５ｓプロモーターから発現するＢａｓｓ６−ｅＧＦＰを一過性に発現させるＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉組織の光シート画像を提供する。矢印は、クロロフィル自己蛍光に関連していないＧＦＰ蛍光を示す。星印の付いた矢印は、クロロフィル包膜と関連したＧＦＰ蛍光を示す。スケールバー：５０μｍである。全てのパネルにおいて、ＧＦＰシグナルは緑色で示されており、葉緑体自己蛍光は、マゼンタ色で示されている。
【図８Ａ−８Ｂ】相加的光呼吸表現型効果を示す、ｂａｓｓ６、ｐｌｇｇ１の二重変異体Ａ．ｔｈａｌｉａｎａの分析を示す図である。図８Ａは、２０００ｐｐｍ  ＣＯ２（濃い灰色バー）または４００ｐｐｍ  ＣＯ２（薄い灰色バー）のいずれかにおける、示されたＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  Ｔ−ＤＮＡ系列の相対的成長速度を示すグラフである。誤差バーは、３つの生物学的複製あたり少なくとも５つの植物の標準偏差を示す。アスタリスク（＊）は、ＣＯ２処理間の有意差を示す。二重アスタリスク（＊＊）は、Ｔ−ＤＮＡ系列とＷＴの間での成長速度の有意な変化を示す。統計的差は、ＳｔｕｄｅｎｔのＴ検定ｐ＜０．０５に基づいている。図８Ｂは、示された系統についての、示されたＣＯ２濃度および飽和光（１０００μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１）において記録された光合成測定値のグラフである。文字は、ＡＮＯＶＡ分析およびＴｕｋｅｙのｐｏｓｔ−ｈｏｃ検定からの有意差を表す。誤差バーは標準偏差を示す。
【図９】上昇したＣＯ２において６週間成長した、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ野生型、ｂａｓｓ６、ｐｌｇｇ１、および二重変異体ｂａｓｓ６、ｐｌｇｇ１植物における様々な光呼吸中間体の蓄積を示すグラフである。黒色バーは２０００ｐｐｍ  ＣＯ２を示し、灰色バーは１５０ｐｐｍ  ＣＯ２を示す。Ｘ軸の数値は、内部標準に基づく、示された光呼吸代謝物の相対的差を表す。誤差バーは平均値の標準誤差を示す。文字は、ＡＮＯＶＡ分析；Ｎ＝３に基づいた統計的差を示す。
【図１０】Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ野生型、ｂａｓｓ６、ｐｌｇｇ１、および二重変異体ｂａｓｓ６、ｐｌｇｇ１での、グリコール酸代謝におけるＢＡＳＳ６およびＰＬＧＧ１の役割を実証するグラフである。示された植物系列は、上昇したＣＯ２（２０００ｐｐｍ）で４週間、その後、環境大気（４００ｐｐｍ  ＣＯ２）へシフトされて２４時間成長した。８時間の明期サイクルの終わりに、組織を、時間０として収集した。その後の各時点は、暗期の間での試料収集であった。Ｘ軸数値は、内部標準に基づく、示された光呼吸代謝物の相対的差を表す。誤差バーは平均値の標準誤差を示す。アスタリスクは、ＷＴ対照をＴ−ＤＮＡ系列と比較するＡＮＯＶＡ分析；Ｎ＝３に基づいた統計的差を示す。
【図１１】Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ  ＰＬＧＧ１またはＢＡＳＳ６を発現する様々な酵母系統の写真であり、両方のタンパク質のグリコール酸を輸送する能力を示す写真である。
【図１２】Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ  ＰＬＧＧ１またはＢＡＳＳ６を発現する様々な酵母系統の、放射標識されたグリコール酸を取り込む能力を示すグラフである。誤差バーは標準偏差を示し、文字は、ＡＮＯＶＡ分析；Ｎ＝３に基づいた統計的差を示す。
【図１３】ＢＡＳＳ６およびＰＬＧＧ１の発現を制御する遺伝的調節機構の一部を実証するグラフである。葉組織におけるＢａｓｓ６およびＰｌｇｇ１の発現は、ｐｌｇｇ１−１変異体およびｂａｓｓ６−１変異体において、ｑＲＴ−ＰＣＲ分析により決定された。左のパネルにおいて、誤差バーは、それぞれ３つの技術的複製を含む３つの生物学的複製からの平均値の標準誤差を示す。アスタリスクは有意な変化（ｐ＜０．０５）を示す。示されたＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓトランスジェニック系列の相対的成長速度が右のパネルに示されている。誤差バーは、３つの生物学的複製あたり少なくとも５つの植物の標準偏差を示す。アスタリスク（＊）は、環境大気条件下で成長したトランスジェニック系列間の有意差を示す。統計的差はＳｔｕｄｅｎｔのＴ検定に基づいている。
【図１４】光呼吸バイパスへの合成生物学アプローチを示す図である。３つの光呼吸バイパス設計のモデルである。バイパス１（オレンジ色）は、Ｅ．ｃｏｌｉグリコール酸経路由来の５つの遺伝子である、３つの遺伝子である、ＤＥＦグリコール酸デヒドロゲナーゼと、グリオキシル酸カルボリガーゼと、タルトロン酸セミアルデヒドレダクターゼとを用いて、グリコール酸をグリセリン酸へ変換する。バイパス２（赤色／紫色）は、３つの遺伝子である、グリコール酸オキシダーゼと、リンゴ酸シンターゼと、グリコール酸オキシダーゼにより生成された過酸化水素を除去するためのカタラーゼとを利用する。バイパス３（青色／紫色）は、２つの遺伝子である、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｄｒｔｉｉグリコール酸デヒドロゲナーゼとＣｕｃｕｒｂｉｔａ  ｍａｘｉｍａリンゴ酸シンターゼとを用いる。
【図１５Ａ−１５Ｂ】図１５Ａは、２４時間の低いＣＯ２および一定照明の後、Ｆｖ’／Ｆｍ’の変化による光呼吸バイパスの向上についての蛍光に基づいたスクリーニングにおける日齢９日間のトランスジェニックタバコ系列の代表的な写真である。図１５Ｂは、グリコール酸／グリセリン酸トランスポーターＰＬＧＧ１を標的にするＲＮＡｉ有りおよび無しでの、３つのバイパス構築物設計の、合計した値を示す図である。誤差バーはＳＥＭを示す。＊は、一元配置ＡＮＯＶＡ  Ｐ≦０．０５に基づいた、ＷＴと比較しての統計的差を示す。
【図１６Ａ−１６Ｂ】バイパス３系列の遺伝子発現およびタンパク質分析を示す図である。図１６Ａは、バイパス３における２つの導入遺伝子、およびＲＮＡｉ構築物の標的遺伝子ＰＬＧＧ１のｑＲＴ−ＰＣＲ分析である。図１６Ｂは、示された標的遺伝子に対して産生されたカスタム抗体を用いたウェスタンブロット分析である。ＲｂｃＳ対照（１．５μｇ）を除き、レーンあたりタンパク質の３μｇ負荷である。矢印（→）は、分子量に基づいく、検出されたタンパク質を示す。誤差バーはＳＥＭを示す。＊は、一元配置ＡＮＯＶＡ  Ｐ≦０．０５に基づいた、ＷＴと比較しての統計的差を示す。
【図１７Ａ−１７Ｂ】バイパス１および２の遺伝子発現分析を示す図である。図１７Ａは、バイパス１の、示された導入遺伝子、およびＲＮＡｉについて標的にされた天然ＰＬＧＧ１のｑＲＴ−ＰＣＲ分析である。グリコール酸デヒドロゲナーゼサブユニットＤ、Ｅ、Ｆ（ＧＤＨ）、タルトロン酸セミアルデヒドレダクターゼ（ＴＳＲ）、グリオキシル酸カルボリガーゼ（ＧＣＬ）、色素体グリコール酸／グリセリン酸トランスポーター（ＰＬＧＧ１）である。図１７Ｂは、バイパス２の、示された導入遺伝子、およびＲＮＡｉについて標的にされた天然ＰＬＧＧ１のｑＲＴ−ＰＣＲ分析である。グリコール酸オキシダーゼ（ＧＯ）、カタラーゼ（ＣＡＴ）、リンゴ酸シンターゼ（ＭＳ）である。誤差バーはＳＥＭを示す。
【図１８Ａ−１８Ｂ】圃場試験の茎の高さおよびバイオマスを示す図である。図１８Ａは、発芽から７週間後に記録された測定に基づいた茎の高さの分析である。誤差バーは、ＳＤを示し、＊は、一元配置ＡＮＯＶＡ  Ｎ＝８に基づいた有意性を示す。図１８Ｂは、ＰＬＧＧ１  ＲＮＡｉモジュール有りおよび無しにおける、ＷＴ対照と比較した、組み合わされた茎、葉、および全体の乾燥重量バイオマスにおけるパーセント差である。誤差バーはＳＥＭを示す。＊は、一元配置ＡＮＯＶＡ  Ｎ＝８に基づいた有意性を示す。
【図１９Ａ−１９Ｃ】圃場試験の光合成効率を示す図である。図１９Ａは、示された［ＣＯ２］における、利用可能な光応答曲線に基づいた同化作用の線形回帰、およびＣＯ２同化の飽和速度により決定されたバイパス１の、組み合わされた光合成の見かけの量子効率（Φａ）である。図１９Ｂは、示された［ＣＯ２］における、利用可能な光応答曲線に基づいた同化作用の線形回帰により決定されたバイパス２の、総合した、光合成の見かけの量子効率（Φａ）、およびＣＯ２の飽和同化速度。図１９Ｃ：示された［ＣＯ２］における、利用可能な光応答曲線に基づいた同化作用の線形回帰、およびＣＯ２同化の飽和速度により決定されたバイパス３の、組み合わされた光合成の見かけの量子効率（Φａ）である。誤差バーはＳＥＭを示し、＊は、一元配置ＡＮＯＶＡ  Ｐ≦０．０５に基づいた有意性を示す。
【図２０Ａ−２０Ｄ】温室条件で試験された光合成効率を示す図である。図２０Ａは、組み合わされたＲｕｂｉｓｃｏカルボキシル化の最大速度（Ｖｃｍａｘ）である。図２０Ｂは、組み合わされた電子伝達の最大速度（Ｊｍａｘ）である。カルボキシル化および電子伝達の最大速度は、ＰＳ−Ｆｉｔモデルを用いて、変化するＣＯ２濃度下での光合成応答からモデル化されている。図２０Ｃは、一般的な切片方法および傾き回帰を用いて計算された、組み合わされた見かけのＣＯ２補償点：ガンマ星（Γ＊）である。図２０Ｄは、内部［ＣＯ２］（Ｃｉ）に基づいたＣＯ２同化作用である。誤差バーはＳＥＭを示す。＊は、一元配置ＡＮＯＶＡに基づいた、ＷＴと比較しての統計的差を示す。Ｐ値が示されている。
【図２１Ａ−２１Ｅ】２０１７年圃場試験からの植物生産性および光合成効率を示す図である。図２１Ａは、ＰＬＧＧ１  ＲＮＡｉモジュール有りおよび無しにおける、バイパス３について、ＷＴ対照と比較した、組み合わされた葉（左のバー）、茎（真ん中のバー）、および全体（右のバー）のバイオマスにおけるパーセント差である。文字は、二元配置ＡＮＯＶＡ  Ｐ≦０．０５に基づいた統計的差を示す。図２１Ｂは、示された系列についての、組み合わされた全体の蓄積された葉デンプンである。図２１Ｃは、利用可能な光応答曲線に基づいた同化作用の線形回帰により決定された、組み合わされた光合成の見かけの量子効率（Φａ）である。図２１Ｄは、光合成の日周分析に基づいた、組み合わされたＣＯ２の蓄積同化作用（Ａ’）である。図２１Ｅは、日周光合成に基づいた同化作用から決定された、組み合わされた電子伝達に用いられた蓄積電子である。誤差バーはＳＤを示し、Ｐ値はＡＮＯＶＡ分析に基づいて示されている。
【図２２】ＲＮＡｉによるＰＬＧＧ１のノックダウンは、上昇したＣＯ２から環境大気へのシフト後、Ｆｖ’／Ｆｍ’を増加するように導かれることを示す図である。同じＴ０形質転換事象由来の導入遺伝子ネガティブ植物と比較した、ＰＬＧＧ１  ＲＮＡｉモジュールのみを発現する５つのトランスジェニックポジティブ植物の組み合わされた値である。Ｆｖ’／Ｆｍ’は、上昇したＣＯ２から環境大気への移行から３日後に測定された。誤差バーは標準偏差を示す。
【図２３】温室条件下における光呼吸バイパスはバイオマスの増加させることを示す図である。示された植物系列の全体の乾燥重量バイオマスにおける％差である。ＥＶ、空ベクター；ＡＰ１、バイパス１；ＡＰ２、バイパス２；ＡＰ３、バイパス３である。＊は、一元配置ＡＮＯＶＡに基づいた統計的差を示す。誤差バーはＳＥＭである。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
光呼吸は、ＲｕｂｉｓＣＯ酸素化反応の生成物である毒性代謝物２−ホスホグリコール酸をリサイクルする、エネルギー大量消費工程である。光呼吸経路は、葉緑体、ペルオキシソーム、サイトゾル、およびミトコンドリアを含め、高度に区画化されている（図１）。光呼吸に関与する可溶性酵素は十分特徴づけられているが、光呼吸に関与する膜トランスポーターは今までほとんど同定されていない。光呼吸条件下で、ナトリウム胆汁酸シンポーターＢａｓｓ６を標的にするＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  Ｔ−ＤＮＡ挿入は、光合成を阻害し、上昇したＣＯ２において救出される環境大気低成長表現型を生させた。加えて、代謝物分析および酵母におけるグリコール酸輸送の遺伝的相補性により、ＢＡＳＳ６が、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ葉緑体からのグリコール酸の光呼吸エクスポートにおけるその関与と一致するグリコール酸輸送の能力があることが示された。Ｂａｓｓ６およびグリコール酸／グリセリン酸トランスポーターＰｌｇｇ１を含む二重ノックアウトＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ系列（ｂａｓｓ６−１−ｐｌｇｇ１−１）は、いずれかの単一の変異単独と比較して、相加的発育異常、グリコール酸蓄積の増加、光合成速度の低下をもたらした。そのデータは、ＢＡＳＳ６が、グリコール酸の葉緑体内包膜に局在したトランスポーターであり、Ｂａｓｓ６の外因性発現が光呼吸変異体表現型を補完し得ることを示している。Ｃ３植物の葉緑体からのグリコール酸エクスポートを担うトランスポーターを知ることは、よりエネルギー効率が高い光呼吸経路を導入し、それにより、光合成効率を向上させるための戦略を設計するにおいて重要な情報である。
【００２５】
光呼吸をバイパスすることができる複数の可能性のある設計を用いて、コンピュータモデリングは、圃場条件下で植物を栽培するためにその利益を最大にするためには、最適化された非天然遺伝子の発現およびバイパス経路を通るフラックスが必要とされることを示唆している。加えて、天然の光呼吸経路を低下または閉鎖させることは、植物における光呼吸バイパス経路を発現させることの利益をさらに増加させるだろう。本発明者らは、葉緑体からのグリコール酸の輸送を低下させると同時に、異なる光呼吸バイパス戦略を発現する遺伝子構築物のライブラリーを作製する合成生物学アプローチを用いることは、光呼吸バイパスの利益を知る上での手掛かりとなり、作物生産性を増加させる植物系列を成し遂げる精鋭を設計するために用いることができると仮定した（図１４）。
【００２６】
したがって、バイパス経路の発現と組み合わせた、ＰＬＧＧ１タンパク質産生のＲＮＡｉノックダウンをもたらす組換えｄｓＲＮＡ（配列番号４６）を含有する植物もまた本明細書に提示される。ノックダウン系統またはノックアウト系統のいずれも、そのような系統間で類似した結果を示すデータを考慮すれば、同様に機能することが予想される。したがって、いくつかの実施形態において、機能性ＰＬＧＧ１タンパク質を含まない植物は、バイパス３タンパク質（Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ由来のリンゴ酸シンターゼおよびグリコール酸デヒドロゲナーゼ）と組み合わされて、光合成効率が増加した植物を生じさせる。他の実施形態は、バイパス３タンパク質を発現し、かつ機能性ＢＡＳＳ６タンパク質を欠損する植物を提供する。バイパス３タンパク質を発現し、かつ（ノックアウトまたはノックダウンを介して）機能性ＢＡＳＳ６タンパク質と機能性ＰＬＧＧ１タンパク質の両方を欠損するトランスジェニック植物が本明細書でさらに企図される。
【００２７】
本開示の好ましい実施形態が、本明細書に示され、かつ説明されている。そのような実施形態が、例としてのみ提供されることは当業者には明らかである。多数の変形、変更、および置換が、本開示から逸脱することなく、当業者によって考えられ得る。本明細書に説明された本開示の実施形態の様々な代替が、本開示を実行することにおいて用いられ得る。含まれる特許請求の範囲が、本開示の範囲を定義すること、ならびにこれらの特許請求の範囲の範囲内の方法および構造およびそれらの均等物がそれらにより包含されることが、意図される。
【００２８】
本明細書で用いられる技術的および科学的用語は、他に規定がない限り、本開示が関連する分野の当業者により一般的に理解されている意味を有する。当業者に知られた様々な材料および方法論が本明細書で参照される。組換えＤＮＡ技術の一般的な原理を示す標準参考文献には、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎ．Ｙ．、１９８９；Ｋａｕｆｍａｎら編、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ」、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、１９９５；およびＭｃＰｈｅｒｓｏｎ編、「Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９９１が挙げられる。本開示の選択された態様に有用な真菌遺伝学の一般的な方法論および原理を教示する標準参考文献には、Ｓｈｅｒｍａｎら、「Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８６、およびＧｕｔｈｒｉｅら、「Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１が挙げられる。
【００２９】
当業者に知られた任意の適切な材料および／または方法が、本開示を行うことにおいて利用することができる。本開示を実行するための材料および／または方法が記載されている。以下の説明および実施例において参照される材料、試薬などは、特に断りのない限り、商業的供給源から入手できる。
【００３０】
本明細書および特許請求の範囲で用いられる場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」の使用は、文脈が明らかに他に指示しない限り、複数形の表示を含む。
【００３１】
本明細書で用いられる場合、単離された、精製された、または生物学的に純粋なという用語は、その言及された材料がその天然状態において通常伴う成分を実質的または本質的に含まない材料を指す。
【００３２】
用語「約」は、挙げられた値のプラスまたはマイナス１０パーセントとして定義される。例えば、約１．０ｇは、具体的に示されようが示されまいが、０．９ｇ〜１．１ｇおよびその範囲内の全ての値を意味する。
【００３３】
用語「遺伝子」は、ＲＮＡもしくはポリペプチドまたはそれらの前駆体を産生することに関与するＤＮＡ配列を指す。ポリペプチドまたはＲＮＡは、完全長コード配列により、またはエクソン配列などの、コード配列のイントロンにより中断された部分により、コードされ得る。
【００３４】
用語「プライマー」は、プライマー伸長が開始される条件下に置かれた時、合成の開始点として作用する能力があるオリゴヌクレオチドを指す。オリゴヌクレオチド「プライマー」は、精製された制限消化物においてのように天然で存在する場合もあるし、または合成的に作製される場合もある。
【００３５】
プライマーは、鋳型の特定の配列の鎖と「実質的に相補的」であるように選択される。プライマーは、プライマー伸長が起こるために鋳型鎖とハイブリダイズするのに十分に相補的でなければならない。プライマー配列は、鋳型の正確な配列を反映する必要はない。例えば、非相補性ヌクレオチド断片が、プライマー配列の残りがその鎖と実質的に相補的であるように、プライマーの５’末端に付着してよい。プライマー配列が、ハイブリダイズし、それによりプライマーの伸長産物の合成のための鋳型プライマー複合体を形成するのに、鋳型の配列と十分相補的であるという条件で、非相補的塩基またはそれより長い配列がプライマー中に散在し得る。
【００３６】
この開示の目的のために、パーセンテージとして表される、２つの関係したヌクレオチドまたはアミノ酸配列の「配列同一性」は、その２つの最適に整列された配列における、同一残基を有する位置の数（×１００）を、比較される位置の数で割ったものを指す。ギャップ、すなわち、ある残基が一方の配列に存在するが、他方において存在しない整列における位置が、非同一残基を有する位置としてみなされる。２つの配列の整列は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムにより実施される（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、（１９７０）４８：３、４４３〜５３）。コンピュータ援用配列整列は、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．１（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、ＵＳＡ）の一部であるＧＡＰなどの標準ソフトウェアプログラムを用いて、５０のギャップ生成ペナルティおよび３のギャップ伸長ペナルティを有するデフォルトスコアリングマトリックスを使用して、便利に実施することができる。
【００３７】
２つ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の関連における用語「同一の」またはパーセント「同一性」およびそれらの文法的変形は、配列比較アルゴリズムを用いて、または手作業での整列および目視検査により測定された指定領域に渡る最大一致のために比較および整列された時、同じである、または（それぞれ）同じである特定のパーセンテージのヌクレオチドもしくはアミノ酸を有する（例えば、８０％、８５％同一性、９０％同一性、９９％、または１００％同一性）、２つ以上の配列または部分配列を指す。
【００３８】
２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの関連における句「高パーセント同一の」または「高パーセント同一性」、およびそれらの文法的変形は、配列比較アルゴリズムを用いて、または目視検査により測定された、最大一致のために比較および整列された時、少なくとも約８０％同一性、少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％ヌクレオチドまたはアミノ酸同一性を有する２つ以上の配列または部分配列を指す。例示的な実施形態において、高パーセント同一性は、少なくとも約１６ヌクレオチド長またはアミノ酸長である配列の領域にわたって存在する。別の例示的な実施形態において、高パーセント同一性は、少なくとも約５０ヌクレオチド長またはアミノ酸長である配列の領域にわたって存在する。なお別の例示的な実施形態において、高パーセント同一性は、少なくとも約１００ヌクレオチド長またはアミノ酸長である配列の領域にわたって存在する。一つの例示的な実施形態において、配列は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の全長にわたって高パーセント同一である。
【００３９】
用語「ＢＡＳＳ６」ならびにその大文字表記およびイタリック体表記は、本明細書に記載される植物遺伝子およびタンパク質を指す。いくつかの実施形態において、この用語は、本明細書に記載されるＡ．ｔｈａｌｉａｎａ遺伝子およびタンパク質を指す場合がある。他の実施形態において、この用語は、任意のＣ３植物の遺伝子およびタンパク質の１つ以上のホモログまたはオルソログを指す場合もある。いくつかの実施形態において、この用語は、任意のＣ３植物の遺伝子およびタンパク質の１つ以上パラログを指す場合もある。いくつかの実施形態において、Ｃ３植物は、イネ、ダイズ、ジャガイモ、ササゲ、オオムギ、コムギ、またはキャッサバである。配列番号１は、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ  ＢＡＳＳ６遺伝子のゲノム配列を提供する。配列番号２は、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ  ＢＡＳＳ６遺伝子のｃＤＮＡ配列を提供する。配列番号３は、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ  Ｂａｓｓ６タンパク質を提供する。全てイタリック体での小文字で示された場合、その遺伝子／タンパク質の変異体（例えば、ノックアウト）バージョンが意図される。Ａ．ｔｈａｌｉａｎａにおいて、変異体バージョンは、単一の遺伝子／タンパク質であり得る。他のＣ３植物において、変異体バージョンは、その遺伝子／タンパク質のうちの１つ、いくつか、または全てのホモログ、オルソログ、および／もしくはパラログであり得る。
【００４０】
用語「ＰＬＧＧ１」ならびにその大文字表記およびイタリック体表記は、本明細書に記載される植物遺伝子およびタンパク質を指す。いくつかの実施形態において、この用語は、本明細書に記載されるＡ．ｔｈａｌｉａｎａ遺伝子およびタンパク質を指す場合がある。他の実施形態において、この用語は、任意のＣ３植物の遺伝子およびタンパク質の１つ以上のホモログまたはオルソログを指す場合もある。いくつかの実施形態において、この用語は、任意のＣ３植物の遺伝子およびタンパク質の１つ以上のパラログを指す場合もある。いくつかの実施形態において、Ｃ３植物は、イネ、ダイズ、ジャガイモ、ササゲ、オオムギ、コムギ、またはキャッサバである。配列番号４は、ＰＬＧＧ１遺伝子のＡ．ｔｈａｌｉａｎａゲノム配列を提供する。配列番号５は、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ  ＰＬＧＧ１遺伝子のｃＤＮＡ配列を提供する。配列番号６は、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ  Ｐｌｇｇ１タンパク質を提供する。全てイタリック体での小文字で示された場合、その遺伝子／タンパク質の変異体（例えば、ノックアウト）バージョンが意図される。Ａ．ｔｈａｌｉａｎａにおいて、変異体バージョンは、単一の遺伝子／タンパク質であり得る。他のＣ３植物において、変異体バージョンは、その遺伝子／タンパク質のうちの１つ、いくつか、または全てのホモログ、オルソログ、および／もしくはパラログであり得る。配列番号４６は、本発明のいくつかのトランスジェニック植物におけるｄｓＲＮＡの産生を介するＲＮＡｉノックダウンに利用される、ＰＬＧＧ１コード配列の一部分を提供する。
【００４１】
具体的に他に指示がない限り、用語「ＣｍＭＳ」または「ＭＳ」は、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ  ｍａｘｉｍａリンゴ酸シンターゼ遺伝子およびタンパク質を指す。配列番号４３は、ｒｕｂｉｓｃｏ小サブユニットシグナルペプチド（アミノ酸残基１〜４０）と融合したリンゴ酸シンターゼタンパク質（アミノ酸残基４１〜６０７）を提供する。配列番号４２は、シグナルペプチドを有するこのタンパク質をコードするＤＮＡ配列を提供し、本明細書に記載されるバイパス３植物を作製するために用いられる。配列番号４３と９５％以上の同一性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、および代替シグナルペプチド配列を利用するタンパク質などの、これらの核酸配列およびタンパク質配列の変種が含まれる。
【００４２】
用語「ＣｒＧＤＨ」または「ＧＤＨ」は、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉグリコール酸デヒドロゲナーゼ遺伝子およびタンパク質を指す。配列番号４５は、ｒｕｂｉｓｃｏ小サブユニットシグナルペプチド（アミノ酸残基１〜４０）と融合したリンゴ酸シンターゼ（アミノ酸残基４１〜１１３６）を提供する。配列番号４４は、シグナルペプチドを有するこのタンパク質をコードするＤＮＡ配列を提供し、本明細書に記載されるバイパス３植物を作製するために用いられる。配列番号４５と９５％以上の同一性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、および代替シグナルペプチド配列を利用するタンパク質などの、これらの核酸配列およびタンパク質配列の変種が含まれる。
【００４３】
本明細書で用いられる用語「バイパス」は、組換え植物細胞へ導入され、それにより発現したトランスジェニック酵素経路を指す。３つのバイパス経路１、２、および３は、表１に示されている。これらは、下記の実施例部分にさらに詳述されている。
【００４４】
【表１】
2020511960.tif 000003
【００４５】
「ｄｓＲＮＡ」は、選択された標的遺伝子のセンス部分およびアンチセンス部分（または遺伝子サイレンシングが起こり得るようにそれとの高配列同一性を有する配列）を含む二本鎖ＲＮＡ、加えて、ＲＮアーゼまたはダイサー活性によりそれから形成された任意のより小さい二本鎖ＲＮＡを指す。そのようなｄｓＲＮＡは、一本鎖ＲＮＡの部分を含み得るが、少なくとも１９ヌクレオチドの二本鎖ＲＮＡを含む。本開示の一つの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、標的にされた遺伝子のセンス配列とアンチセンス配列の間にループまたはスペーサー配列を含有するヘアピンＲＮＡを含み、好ましくは、そのようなヘアピンＲＮＡスペーサー領域は、イントロン、特に、ｒｏｌＡ遺伝子イントロン（Ｐａｎｄｏｌｆｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．、２００３、ＢｉｏＭｅｄＣｅｎｔｒａｌ（ＢＭＣ）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３：７（ｗｗｗ．ｂｉｏｍｅｄｃｅｎｔｒａｌ．ｃｏｍ／１４７２−６７５０／３／７））、ｐＨｅｌｌｓｇａｔｅ  １１または１２由来の二重配向イントロン（ＷＯ０２／０５９２９４ならびにそれにおける配列番号２５および１５参照）またはｐｄｋイントロン（Ｆｌａｖｅｒｉａ  ｔｒｉｎｅｒｖｉａピルビン酸オルトリン酸ジキナーゼイントロン２、ＷＯ９９／５３０５０参照）を含む。配列番号４６は、本開示のいくつかの実施形態においてノックダウンＰＬＧＧ１作製に利用されたＲＮＡ配列を提供する。
【００４６】
表１に提供された酵素名、グリコール酸カルボリガーゼ、２−ヒドロキシ−３−オキソプロピオン酸レダクターゼ、タルトロン酸セミアルデヒドレダクターゼ、グリコール酸デヒドロゲナーゼサブユニットＤ、Ｅ、およびＦ、グリコール酸オキシダーゼ、リンゴ酸シンターゼ、カタラーゼＨＰＩＩ、ならびにグリコール酸デヒドロゲナーゼは、提供された酵素および配列により例示された酵素のカテゴリーを指す。これらの用語は、これらの酵素のホモログ、および同じ反応を触媒することができる酵素を含む。
【００４７】
本明細書で用いられる用語「成長を増加させる」および「生産性を増加させる」、ならびにそれらの文法的変形は、所定の時点における植物の成長速度もしくはサイズの増加、または同じ種の非改変植物と比較した遺伝子改変植物の光合成効率の増強を指す。
【００４８】
分子生物学的方法
単離された核酸は、構造が、任意の天然に存在する核酸の構造と同一ではない核酸である。したがって、その用語は、例えば、（ａ）天然に存在するゲノムＤＮＡ分子の部分の配列を有するが、それが天然で存在する生物体のゲノムにおいてその分子のその部分に隣接するどちらのコードまたは非コード配列にも隣接していないＤＮＡ；（ｂ）ベクターへ、または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡへ、結果として生じた分子がいかなる天然に存在するベクターまたはゲノムＤＮＡとも同一ではないような様式で組み込まれた核酸；（ｃ）ｃＤＮＡ、ゲノム断片、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により産生された断片、または制限断片などの別個の分子；ならびに（ｄ）ハイブリッド遺伝子の部分である組換えヌクレオチド配列、すなわち、融合タンパク質をコードする遺伝子、を包含する。この定義から具体的に排除されるのは、（ｉ）ＤＮＡ分子、（ｉｉ）形質転換またはトランスフェクションされた細胞の混合物、および（ｉｉｉ）細胞クローンの混合物に存在する核酸であり、例えば、これらは、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリーなどのＤＮＡライブラリーに存在している。
【００４９】
組換え核酸という用語は、遺伝子工学技術により、または化学合成により、ポリヌクレオチドの単離された部分の人工的操作により達成された配列の、２そうでなければ分離している２つの部分の組合せにより生成されるポリヌクレオチドを指す。そうすることによって、所望の機能のポリヌクレオチド部分を一つに連結して、所望の機能の組合せを生じさせ得る。
【００５０】
本明細書に開示された開示のいくつかの実施形態を実行することにおいて、１つ以上の標的タンパク質（例えば、ＢＡＳＳ６またはＰＬＧＧ１）の機能的発現を妨げる、および／または導入された遺伝子の発現を可能にする遺伝要素を導入するために、宿主細胞の組換え系統のゲノムＤＮＡ、葉緑体ＤＮＡ、またはミトコンドリアＤＮＡを変更することが有用であり得る。好ましい実施形態において、そのような宿主細胞は植物細胞である。
【００５１】
標的タンパク質の機能的発現、または標的タンパク質の発現の低下もしくは活性の低下を妨げることを意図された改変は、標的遺伝子座のオープンリーディングフレーム、標的遺伝子座のプロモーターなどの転写制御因子、およびオープンリーディングフレームの５’側または３’側に位置した任意の他の制御核酸配列を非限定的に含む、標的遺伝子の全部または一部分の欠失と、オープンリーディングフレームにおける中途での停止コドンの挿入と、翻訳の中途での終結をもたらすリーディングフレームをシフトする挿入または欠失と、を含む、標的タンパク質をコードするＤＮＡまたは遺伝子の変異を含み得る。そのような欠失変異は、当業者に知られた任意の技術を用いて達成することができる。標的タンパク質のレベルの低下または標的タンパク質の活性の低下は、また、標的タンパク質をコードするＤＮＡまたは遺伝子における点変異または挿入で達成され得る。開示されたヌクレオチド配列および遺伝子の変異、挿入、および欠失変種は、当業者によく知られている方法により容易に調製することができる。標的タンパク質のレベルの低下および／または活性の低下を達成するために用いられる技術には、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、ＴＡＬＥＮ、およびＺｎ−フィンガーヌクレアーゼが挙げられ得る。本明細書に開示された特定のものと機能が同等である変異、挿入、および欠失変異を生じさせることは、十分、当業者の能力の範囲内である。加えて、機能性タンパク質産生へのそのような改変は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、または当技術分野において知られた他の技術により媒介されるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）などのタンパク質「ノックダウン」アプローチを介して達成することができる。標的タンパク質の発現を阻害するＲＮＡ分子は、そのタンパク質をコードする遺伝子の発現を低下させることができ、またはそのタンパク質の翻訳を低下させ得る。
【００５２】
組換え核酸が、特定の配列の発現、クローニング、または複製のために意図される場合、宿主細胞への導入のために調製されたＤＮＡ構築物は、典型的には、所望のポリペプチドをコードする意図されたＤＮＡ断片を含む、宿主により認識される複製系（すなわち、ベクター）を含み、そのポリペプチドをコードする部分に作動可能に連結された転写および翻訳開始制御配列もまた含み得る。加えて、そのような構築物は、細胞局在化シグナル（例えば、葉緑体局在化シグナル）を含み得る。好ましい実施形態において、そのようなＤＮＡ構築物は、宿主細胞のゲノムＤＮＡ、葉緑体ＤＮＡ、またはミトコンドリアＤＮＡへ導入される。
【００５３】
いくつかの実施形態において、１つ以上の導入された遺伝子の発現を誘導するために、一体化されていない発現系を用いることができる。発現系（発現ベクター）は、例えば、複製開始点または自己複製配列（ＡＲＳ）、ならびに発現調節配列、プロモーター、エンハンサー、および、例えば、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、転写終結配列、およびｍＲＮＡ安定化配列などの必要なプロセシング情報部位を含み得る。必要に応じて、同じ種または関連種の分泌されたポリペプチド由来のシグナルペプチドもまた、含めることができ、タンパク質が、細胞膜、細胞壁を横断するおよび／もしくはそれらに留まる、または細胞から分泌されることを可能にする。
【００５４】
本明細書に開示された本開示の方法論を実行することにおいて有用な選択マーカーは、ポジティブ選択マーカーであり得る。典型的には、ポジティブ選択は、遺伝子改変細胞が、関心の組換えポリヌクレオチドが細胞内に存在している時のみ、毒性物質の存在下で生存できる場合を指す。ネガティブ選択マーカーおよびスクリーニングマーカーもまた当技術分野においてよく知られており、本開示により企図される。当業者は、入手可能な任意の関連マーカーが、本明細書に開示された本発明を実行することにおいて利用され得ることを認識している。
【００５５】
本開示の組換え系統のスクリーニングおよび分子分析は、核酸ハイブリダイゼーション技術を利用して実施することができる。ハイブリダイゼーション手順は、本明細書に教示されているように、有用であるのに十分な本制御配列との相同性を有する、本明細書に記載された技術を用いて変更されたものなどのポリヌクレオチドを同定するために有用である。特定のハイブリダイゼーション技術は本開示に必須ではない。ハイブリダイゼーション技術が進歩したため、それらは、当業者によって容易に適用され得る。ハイブリダイゼーションプローブは、当業者に知られた任意の適切な標識で標識することができる。例えば、温度および塩濃度などの、ハイブリダイゼーション条件および洗浄条件は、変更されて、検出閾値のストリンジェンシーを変化させることができる。ハイブリダイゼーション条件に関するさらなるガイダンスについて、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、（１９８９）下記参照、またはＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＮＹ、Ｎ．Ｙ．を参照。
【００５６】
加えて、遺伝子改変系統のスクリーニングおよび分子分析、そして所望の単離された核酸の作製は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて実施することができる。ＰＣＲは、核酸配列の反復性の、酵素的な、プライムされる合成である。この手順はよく知られており、当業者に一般的に用いられている（Ｍｕｌｌｉｓ、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、および第４，８００，１５９号；Ｓａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．、（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１３５０〜１３５４参照）。ＰＣＲは、標的配列の逆ストランドにハイブリダイズする２つのオリゴヌクレオチドプライマーが隣接する関心対象となるＤＮＡ断片の酵素的増幅に基づいている。プライマーは、３’末端がお互いの方を向くように配向される。鋳型の熱変性、プライマーのそれらの相補配列へのアニーリング、およびアニールしたプライマーのＤＮＡポリメラーゼでの伸長の繰り返されるサイクルは、結果として、ＰＣＲプライマーの５’末端により定義されるセグメントの増幅を生させる。各プライマーの伸長産物は、他のプライマーの鋳型としての役割を果たすことができるため、各サイクルは、その前のサイクルで産生されたＤＮＡ鋳型の量を本質的に倍加する。これは、特定の標的断片の、数時間で数百万倍までの指数関数的蓄積を生させる。好熱性細菌Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓから単離されるＴａｑポリメラーゼなどの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いることにより、増幅工程は完全に自動化することができる。用いることができる他の酵素は、当業者に知られている。
【００５７】
本開示の核酸およびタンパク質は、また、具体的に開示された配列のホモログを包含することができる。相同性（例えば、配列同一性）は、５０％〜１００％であり得る。場合によっては、そのような相同性は、８０％より高く、８５％より高く、９０％より高く、または９５％より高い。配列の任意の意図される使用に必要とされる相同性または同一性の程度は、当業者により容易に同定される。本明細書で用いられる場合、２つの核酸のパーセント配列同一性は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４〜２２６８により開示され、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３〜５８７７においてのように変更されたものなど、当技術分野において知られたアルゴリズムを用いて決定される。そのようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０２〜４１０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムへ組み入れられている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて実施されて、所望のパーセント配列同一性を有するヌクレオチド配列が得られる。比較を目的としたギャップド整列を得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２に記載されているようなギャップドＢＬＡＳＴが用いられる。ＢＬＡＳＴおよびギャップドＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（ＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータが用いられる。ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照。
【００５８】
好ましい宿主細胞は、植物細胞である。本関連における組換え宿主細胞は、単離された核酸分子を含有するように、正常では宿主細胞内に存在し、かつ機能的な１つ以上の欠失した、もしくは非機能的な遺伝子を含有するように、または少なくとも１つの組換えタンパク質を産生する１つ以上の遺伝子を含有するように、遺伝子変更されている宿主細胞である。本開示のタンパク質をコードする核酸は、特定の細胞型に適切である当技術分野において知られた任意の手段により導入することができ、その手段には、非限定的に、形質転換、リポフェクション、エレクトロポレーション、または当業者により知られた任意の他の方法論が挙げられる。
【００５９】
トランスジェニック植物および植物細胞（ｔ−ｄｎａおよび葉緑体発現）
本開示の一つの実施形態は、１つ以上の変更された植物遺伝子および／または導入された遺伝子を含む植物または植物細胞を提供する。例えば、本開示は、葉緑体局在化輸送タンパク質ＢＡＳＳ６および／またはＰＬＧＧ１をコードする遺伝子の機能的発現を欠損するトランスジェニック植物を提供する。加えて、本明細書に提供されるいくつかの植物または植物細胞は、また、細菌由来、植物由来、および藻類由来の遺伝子によりコードされる酵素などの非天然遺伝子を発現する。あるいは、本明細書に提供されるいくつかの植物または植物細胞は、産生されたタンパク質が、それが天然では局在していないオルガネラ（例えば、葉緑体）または他の細胞内コンパートメントに局在するように天然遺伝子を発現することができる。他の遺伝要素（例えば、ＰＬＧＧ１タンパク質産生のノックダウンを生じさせるｄｓＲＮＡ）の発現もまた企図され、本明細書に記載される。
【００６０】
遺伝子改変された単子葉および双子葉の植物細胞の形質転換および作製は、当技術分野においてよく知られている。例えば、Ｗｅｉｓｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２２：４２１〜４７７（１９８８）；米国特許第５，６７９，５５８号；Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｇａｒｔｌａｎｄ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．（１９９５）；およびＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｃｔａ  Ｈｏｒｔ．４６１：４０１〜４０８（１９９８）参照。方法の選択は、形質転換される植物の型、特定の適用、および／または所望の結果によって異なる。適切な形質転換技術は、熟練した実行者により容易に選択される。
【００６１】
細胞ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡおよびオルガネラＤＮＡ）を欠失させ、挿入し、または変更するための当技術分野において知られた任意の方法論が、本明細書に開示された本発明を実行することにおいて用いることができる。例えば、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓにおける、標的遺伝子の欠失または挿入のための遺伝子構築物を含有する非武装Ｔｉプラスミドを用いて、植物細胞を形質転換することができ、その後、形質転換された植物は、当技術分野において、例えば、ＥＰ０１１６７１８、ＥＰ０２７０８２２、ＰＣＴ公開ＷＯ８４／０２９１３および公開された欧州特許出願（「ＥＰ」）０２４２２４６号に記載された手順を用いて形質転換植物細胞から再生することができる。Ｔｉプラスミドベクターはそれぞれ、ＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡの境界配列間に、または右境界配列の左側に少なくとも位置する、その遺伝子を含有する。もちろん、他の型のベクターを用いて、直接的遺伝子移入（例えば、ＥＰ０２３３２４７に記載される）、花粉媒介型形質転換（例えば、ＥＰ０２７０３５６、ＰＣＴ公開ＷＯ８５／０１８５６、および米国特許第４，６８４，６１１号に記載される）、植物ＲＮＡウイルス媒介型形質転換（例えば、ＥＰ００６７５５３および米国特許第４，４０７，９５６号に記載される）、リポソーム媒介型形質転換（例えば、米国特許第４，５３６，４７５号に記載される）、ならびに他の方法、例えば、トウモロコシ（例えば、米国特許第６，１４０，５５３号；Ｆｒｏｍｍ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９０）８、８３３〜８３９）；Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍ  ｅｔ  ａｌ．、Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、（１９９０）２、６０３〜６１８）およびイネ（Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、（１９８９）３３８、２７４〜２７６；Ｄａｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、（１９９０）８、７３６〜７４０）の特定の系列を形質転換するための方法、および単子葉植物を一般的に形質転換するための方法（ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０９６９６）などの手順を使用して、植物細胞を形質転換することができる。ワタの形質転換について、ＰＣＴ特許公開ＷＯ００／７１７３３に記載された方法を用いることができる。大豆の形質転換について、当技術分野において知られた方法、例えば、Ｈｉｎｃｈｅｅ  ｅｔ  ａｌ．、（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、（１９８８）６、９１５）およびＣｈｒｉｓｔｏｕ  ｅｔ  ａｌ．、（Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、（１９９０）８、１４５）またはＷＯ００／４２２０７の方法が参照される。
【００６２】
本開示のいくつかの実施形態において、１つ以上の遺伝子は、宿主植物細胞から「ノックアウト」されている。典型的には、これは、標的遺伝子の全ての機能的コピー（例えば、標的遺伝子のコピー数に依存して、２個以上のコピー）の欠失を意味する。標的遺伝子または対立遺伝子が機能性タンパク質を産生することができなくなるような天然配列のいかなる変更も、用語「ノックアウト」に含まれる。そのような変更には、ミスセンス変異、ナンセンス変異、停止コドン変異、挿入変異、欠失変異、フレームシフト変異、およびスプライス部位変異が挙げられるが、それらに限定されない。
【００６３】
本開示のトランスジェニック植物は、通常の植物育種方式において、同じ特性を有するより多くのトランスジェニック植物を生産するために、または同じもしくは関連した植物種の他の変種に遺伝子改変を導入するために用いることができる。形質転換植物から得られる種子は、好ましくは、染色体またはオルガネラＤＮＡにおいて安定な挿入物として遺伝子改変を含有する。本開示による遺伝子改変を含む植物には、本開示の遺伝子改変を含む植物の台木を含むまたは由来する植物、例えば、果樹または観賞植物が挙げられる。そのため、形質転換植物または植物部分上に挿入された任意の非トランスジェニックの接木植物部分は本開示に含まれる。
【００６４】
発現ベクターまたは発現カセット内のいずれでも、導入された遺伝子の発現を生じさせる導入された遺伝要素は、典型的には、植物発現可能プロモーターを利用する。本明細書で用いられる「植物発現可能プロモーター」は、植物細胞において本開示の遺伝子改変の発現を保証するプロモーターを指す。植物における構成的発現を命令するプロモーターの例は当技術分野において知られており、それには、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、例えば、分離株ＣＭ  １８４１（Ｇａｒｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、（１９８１）９、２８７１〜２８８７）、ＣａｂｂＢ−Ｓ（Ｆｒａｎｃｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｅｌｌ（１９８０）２１、２８５−２９４）およびＣａｂｂＢ−ＪＩ（Ｈｕｌｌ  ａｎｄ  Ｈｏｗｅｌｌ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、（１９８７）８６、４８２〜４９３）の強力な構成的３５Ｓプロモーター（「３５Ｓプロモーター」）；ユビキチンファミリー由来のプロモーター（例えば、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、（１９９２）１８、６７５〜６８９のトウモロコシユビキチンプロモーター）、ｇｏｓ２プロモーター（ｄｅ  Ｐａｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊ（１９９２）２、８３４〜８４４）、エミュープロモーター（Ｌａｓｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｔｈｅｏｒ  Ａｐｐｌ  Ｇｅｎｅｔ、（１９９０）８１、５８１〜５８８）、Ａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊ、（１９９６）１０、１０７）により記載されたプロモーターなどのアクチンプロモーター、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、（１９９１）３、１１５５〜１１６５）により記載されたイネアクチンプロモーター；キャッサバ静脈モザイクウイルスプロモーター（ＷＯ９７／４８８１９、Ｖｅｒｄａｇｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、（１９９８）３７、１０５５〜１０６７）、サブタレニアンクローバースタントウイルス由来のプロモーターのｐＰＬＥＸシリーズ（ＷＯ９６／０６９３２、特に、Ｓ４またはＳ７プロモーター）、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター、例えば、ｐＡｄｈ１Ｓ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ０４０４９、Ｘ００５８１）、ならびに、それぞれ、Ｔ−ＤＮＡの１’および２’遺伝子の発現を駆動するＴＲ１’プロモーターおよびＴＲ２’プロモーター（それぞれ、「ＴＲ１’プロモーター」および「ＴＲ２’プロモーター」）（）（Ｖｅｌｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、ＥＭＢＯ  Ｊ、（１９８４）３、２７２３〜２７３０）が挙げられる。
【００６５】
あるいは、植物発現可能プロモーターは、組織特異的プロモーター、すなわち、植物のいくつかの細胞または組織、例えば、緑色組織におけるより高いレベルの発現を命令するプロモーター（例えば、ＰＥＰカルボキシラーゼのプロモーター）であり得る。植物ＰＥＰカルボキシラーゼプロモーター（Ｐａｔｈｉｒａｎａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｌａｎｔ  Ｊ、（１９９７）１２：２９３〜３０４）は、維管束組織における発現のための強力なプロモーターであると記載されており、本開示の一つの実施形態において有用である。あるいは、植物発現可能プロモーターは、また、エンドウマメ細胞壁インベルターゼ遺伝子のプロモーターなどの傷害誘導性プロモーターであり得る（Ｚｈａｎｇｅｔ  ａｌ．、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ、（１９９６）１１２：１１１１〜１１１７）。本明細書で用いられる「傷害誘導性」プロモーターは、機械的にまたは昆虫摂食によるいずれかでの植物の傷害により、プロモーターの調節下でのコード配列の発現が、そのような植物において有意に増加することを意味する。これらの植物発現可能プロモーターは、エンハンサー要素と組み合わせることができ、エンハンサー要素は、ミニマルプロモーター要素と組み合わせることができ、または望まれる発現プロファイルを保証するために反復した要素を含み得る。
【００６６】
いくつかの実施形態において、植物細胞において発現を増加させるために用いることができる遺伝要素を利用することができる。例えば、導入された遺伝子の５’末端もしくは３’末端の、または導入された遺伝子のコード配列中のイントロン、例えば、ｈｓｐ７０イントロンである。他のそのような遺伝要素には、プロモーターエンハンサー要素、２重または３重のプロモーター領域、別の導入遺伝子とは異なるまたは内因性（植物宿主）遺伝子リーダー配列とは異なる５’リーダー配列、同じ植物に用いられた別の導入遺伝子とは異なるまたは内因性（植物宿主）トレーラー配列とは異なる３’トレーラー配列が挙げられるが、それらに限定されない。
【００６７】
本開示の導入された遺伝子は、その挿入された遺伝子部分が、適切な３’末端転写制御シグナル（すなわち、転写産物形成シグナルおよびポリアデニル化シグナル）の上流（すなわち、５’側）にあるように宿主細胞ＤＮＡにおいて挿入することができる。これは、好ましくは、植物細胞ゲノム（核または葉緑体）にその遺伝子を挿入することにより達成される。好ましいポリアデニル化シグナルおよび転写産物形成シグナルには、形質転換植物細胞において３’−非翻訳ＤＮＡ配列として働く、ノパリンシンターゼ遺伝子のシグナル（Ｄｅｐｉｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ  Ａｐｐｌ  Ｇｅｎ、（１９８２）１、５６１〜５７３）、オクトピンシンターゼ遺伝子のシグナル（Ｇｉｅｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、ＥＭＢＯ  Ｊ、（１９８４）３：８３５〜８４５）、ＳＣＳＶまたはリンゴ酸酵素ターミネーター（Ｓｃｈｕｎｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｌａｎｔ  Ｆｕｎｃｔ  Ｂｉｏｌ、（２００３）３０：４５３〜４６０）、およびＴ−ＤＮＡ遺伝子７（Ｖｅｌｔｅｎ  ａｎｄ  Ｓｃｈｅｌｌ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、（１９８５）１３、６９８１〜６９９８）が挙げられる。
【００６８】
タンパク質ホモログ
本明細書に開示された特定のタンパク質の様々なホモログは、欠失もしくはノックダウンアプローチのための標的にすること、またはバイパス経路を生み出すために利用することができることは、当業者により理解される。以下は、本明細書に開示された実施形態を実行するために利用することができる、この開示に提供された特定のタンパク質の、非限定的で、例示的なタンパク質ホモログである。
【００６９】
ＢＡＳＳ６ホモログには、以下（種およびアクセッション番号）の：Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ（ＮＰ＿５６７６７１．１）、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ（ＣＡＡ１６５６９．１）、Ａ．ｌｙｒａｔａ（ＸＰ＿００２８６７７４６．１）、Ｅｕｔｒｅｍａ  ｓａｌｓｕｇｉｎｅｕｍ（ＸＰ＿００６４１３６１２．１）、Ｃａｐｓｅｌｌａ  ｒｕｂｅｌｌａ（ＸＰ＿００６２８２６３３．１）、Ｃａｍｅｌｉｎａ  ｓａｔｉｖａ（ＸＰ＿０１０４３３９８２．１）、Ｃａｍｅｌｉｎａ  ｓａｔｉｖａ（ＸＰ＿０１０４４８８２２．１）、Ａｒａｂｉｓ  ａｌｐｉｎｅ（ＫＦＫ３９２５６．１）、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ  ｖａｒ．ｏｌｅｒａｃｅａ（ＸＰ＿０１３５９３３７７．１）、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ（ＸＰ＿０１３７３７６１３．１）、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ（ＸＰ＿００９１３７２８８．１）、およびＲａｐｈａｎｕｓ  ｓａｔｉｖｕｓ（ＸＰ＿０１８４８４１０８．１）が挙げられる。
【００７０】
ＰＬＧＧ１ホモログには、以下（種およびアクセッション番号）の：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ（ＮＰ＿５６４３８８．１）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ（ＡＡＭ６５１８１．１）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｌｙｒａｔａ（ＸＰ＿０２０８６８６７１．１）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｌｙｒａｔａ（ＥＦＨ６９９５７．１）、Ｃａｐｓｅｌｌａ  ｒｕｂｅｌｌａ（ＸＰ＿００６３０７２６２．１）、Ｃａｍｅｌｉｎａ  ｓａｔｉｖａ（ＸＰ＿０１０４７８６２６．１）、Ｃａｍｅｌｉｎａ  ｓａｔｉｖａ（ＸＰ＿０１０４６１０２７．１）、Ｃａｍｅｌｉｎａ  ｓａｔｉｖａ（ＸＰ＿０１０４９９７５３．１）、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ（ＸＰ＿０１３７３３８２６．１）、Ｒａｐｈａｎｕｓ  ｓａｔｉｖｕｓ（ＸＰ＿０１８４５７６６１．１）、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ  ｖａｒ．ｏｌｅｒａｃｅａ（ＸＰ＿０１３５８７０８８．１）、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ（ＸＰ＿０１３７３１４９８．１）、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ（ＸＰ＿００９１１４９１９．１）、Ｅｕｔｒｅｍａ  ｓａｌｓｕｇｉｎｅｕｍ（ＸＰ＿００６４１５２５５．１）、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ  ｖａｒ．ｏｌｅｒａｃｅａ（ＸＰ＿０１３５８７３０５．１）、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ（ＸＰ＿０２２５５９２４９．１）、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ（ＣＤＹ３５５４０．１）、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ（ＸＰ＿００９１４５２１１．１）、Ｒａｐｈａｎｕｓ  ｓａｔｉｖｕｓ（ＸＰ＿０１８４８６６８０．１）、Ａｒａｂｉｓ  ａｌｐｉｎｅ（ＫＦＫ４４９６９．１）、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ（ＣＤＹ５９２０６．１）、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ（ＸＰ＿０１３７３１４９１．１）、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ（ＣＤＹ２２５８３．１）、Ｔａｒｅｎａｙａ  ｈａｓｓｌｅｒｉａｎａ（ＸＰ＿０１０５１８９２５．１）、Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ（ＸＰ＿００２５１９００４．１）、Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ（ＸＰ＿０２１６５２３４９．１）、Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ（ＸＰ＿００６４７１４５４．１）、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ（ＸＰ＿０２２５７５２４３．１）、およびＪｕｇｌａｎｓ  ｒｅｇｉａ（ＸＰ＿０１８８４３９０１．１）が挙げられる。
【００７１】
リンゴ酸シンターゼホモログには、以下（種およびアクセッション番号）の：Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ  ｍａｘｉｍａ（ＸＰ＿０２３０００７９２．１）、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ  ｐｅｐｏ（ＸＰ＿０２３５１９７０１．１）、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ  ｍｏｓｃｈａｔａ（ＸＰ＿０２２９２３６２４．１）、Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ（ＸＰ＿０２２１３７５３８．１）、Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ（ＸＰ＿００４１５２５１９．１）、Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｍｅｌｏ（ＸＰ＿００８４３９５０５．１）、Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ（ＥＯＹ２２４１８．１）、Ｊｕｇｌａｎｓ  ｒｅｇｉａ（ＸＰ＿０１８８２１９８６．１）、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｇｒａｎｄｉｓ（ＸＰ＿０１００３７４４７．１）、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｇｒａｎｄｉｓ（ＫＣＷ４９１６５．１）、Ｈｅｒｒａｎｉａ  ｕｍｂｒａｔｉｃａ（ＸＰ＿０２１２８６６２５．１）、Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ（ＸＰ＿００７０３７９１７．２）、Ａｒａｃｈｉｓ  ｄｕｒａｎｅｎｓｉｓ（ＸＰ＿０２０９９７２５５．１）、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ（ＰＰＲ８７６１６．１）、Ｐｒｕｎｕｓ  ａｖｉｕｍ（ＸＰ＿０２１８００９６４．１）、Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ（ＸＰ＿００２２７９４５２．１）、Ｑｕｅｒｃｕｓ  ｓｕｂｅｒ（ＸＰ＿０２３９０１５３０．１）、Ｑｕｅｒｃｕｓ  ｓｕｂｅｒ（ＰＯＦ２０４９４．１）、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｒａｉｍｏｎｄｉｉ（ＸＰ＿０１２４６８３７８．１）、Ｃｅｐｈａｌｏｔｕｓ  ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒｉｓ（ＧＡＶ６８２４４．１）、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ（ＰＰＤ７６６８０．１）、Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ｂａｃｃａｔｕｍ（ＰＨＴ５３７０３．１）、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ（ＸＰ＿０１６４６４４６４．１）、Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ｃｈｉｎｅｎｓｅ（ＰＨＵ２３６６２．１）、Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ（ＸＰ＿００２５１１２２５．１）、Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ａｎｎｕｕｍ（ＸＰ＿０１６５６３８０６．１）、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ａｒｂｏｒｅｔｕｍ（ＸＰ＿０１７６０４７８８．１）、Ｃｉｔｒｕｓ  ｃｌｅｍｅｎｔｉｎａ（ＸＰ＿００６４４００６０．１）、Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ（ＸＰ＿０１３４４４７２０．１）、Ｄｕｒｉｏ  ｚｉｂｅｔｈｉｎｕｓ（ＸＰ＿０２２７３７４５５．１）、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ  ｐｒｅｔｅｎｓｅ（ＰＮＹ１３２３７．１）、Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ（ＡＣＪ８５７４０．１）、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔｏｍｅｎｔｏｓｉｆｏｒｍｉｓ（ＸＰ＿００９５９５６３２．１）、Ｃｉｔｒｕｓ  ｕｎｓｈｉｕ（ＧＡＹ５１０２３．１）、Ｐｒｕｎｕｓ  ｍｕｍｅ（ＸＰ＿００８２３９４３２．１）、Ｐｒｕｎｕｓ  ｓｉｂｉｒｉｃａ（ＡＩＵ６４８５１．１）、Ｐｒｕｎｕｓ  ｐｅｒｓｉｃａ（ＸＰ＿０２０４２０４７１．１）、Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ（ＸＰ＿００４２３６３４５．１）、Ｐａｒａｓｐｏｎｉａ  ａｎｄｅｒｓｏｎｉｉ（ＰＯＮ６４１７６．１）、Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ（ＮＰ＿００１３１０６４６．１）、Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ（ＸＰ＿００６４７６９９１．１）、Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ（ＮＰ＿００１３４７２４０．１）、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ａｔｔｅｎｕａｔｅ（ＸＰ＿０１９２６１３７９．１）、Ｄａｕｃｕｓ  ｃａｒｏｔａ  ｓｕｂｓｐ．Ｓａｔｉｖｕｓ（ＸＰ＿０１７２５０３４５．１）、Ａｑｕｉｌｅｇｉａ  ｃｏｅｒｕｌｅａ（ＰＩＡ３３６５７．１）、Ｔｒｅｍａ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ（ＰＯＮ９５６５２．１）、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ（ＸＰ＿０２２０３８９８３．１）、Ｍａｃｌｅａｙａ  ｃｏｒｄａｔａ（ＯＶＡ１７５５８．１）、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ（ＸＰ＿００９７７６６３５．１）、Ｊａｔｒｏｐｈａ  ｃｕｒｃａｓ（ＸＰ＿０１２０７９８８４．１）、Ｌｕｐｉｎｕｓ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｓ（ＸＰ＿０１９４６３０６５．１）、Ｖｉｇｎａ  ａｎｇｕｌａｒｉｓ（ＸＰ＿０１７４２５０６２．１）、Ｓｏｌａｎｕｍ  ｐｅｎｎｅｌｌｉｉ（ＸＰ＿０１５０７０９７３．１）、Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｓｏｊａ（ＫＨＮ１４０８８．１）、Ｔａｒｅｎａｙａ  ｈａｓｓｌｅｒｉａｎａ（ＸＰ＿０１０５５５５３７．１）、Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ（ＸＰ＿０１０３１９０６４．１）、Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ（ＸＰ＿００６３５１４８６．１）、Ｓｏｌａｎｕｍ  ｐｅｎｎｅｌｌｉｉ（ＸＰ＿０１５０７０９７２．１）、Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ（ＸＰ＿００６３５１４８５．１）、Ｃｉｃｅｒ  ａｒｉｅｔｉｎｕｍ（ＸＰ＿００４５１０７０８．１）、Ｖｉｇｎａ  ｒａｄｉａｔａ  ｖａｒ．ｒａｄｉａｔｅ（ＸＰ＿０２２６３９２０１．１）、Ｌａｃｔｕｃａ  ｓａｔｉｖａ（ＸＰ＿０２３７３２７３１．１）、Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｅｕｐｈｒａｔｉｃａ（ＸＰ＿０１１０２４０６７．１）、Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ（ＰＮＴ０１２４８．１）、Ｃａｒｉｃａ  ｐａｐａｙａ（ＸＰ＿０２１９０９０２３．１）、Ｃａｊａｎｕｓ  ｃａｊａｎ（ＸＰ＿０２０２１６３８５．１）、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ（ＸＰ＿０１６４３５５６６．１）、Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａ  ｖａｒ．ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ（ＸＰ＿０２２８７８４３５．１）、Ｍａｌｕｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ（ＸＰ＿００８３７４２７２．１）、Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａ  ｖａｒ．ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ（ＸＰ＿０２２８７８４３６．１）、Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ（ＸＰ＿０２１６８１０２３．１）、Ｍｏｒｕｓ  ｎｏｔａｂｉｌｉｓ（ＸＰ＿０１０１０３０９９．１）、Ｐｕｎｉｃａ  ｇｒａｎａｔｕｍ（ＯＷＭ９０５８１．１）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ（ＮＰ＿１９６００６．１）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｌｙｒａｔａ（ＸＰ＿００２８７３１１９．１）、Ｉｐｏｍｏｅａ  ｎｉｌ（ＸＰ＿０１９１９８８２９．１）、Ｅｒｙｔｈｒａｎｔｈｅ  ｇｕｔｔａｔａ（ＸＰ＿０１２８５４６７３．１）、Ｅｕｔｒｅｍａ  ｓａｌｓｕｇｉｎｅｕｍ（ＸＰ＿００６３９８８４５．１）、Ｃａｍｅｌｉｎａ  ｓａｔｉｖａ（ＸＰ＿０１０４９０８７９．１）、Ｓｅｓａｍｕｍ  ｉｎｄｉｃｕｍ（ＸＰ＿０１１０７３０１０．１）、Ｚｉｚｉｐｈｕｓ  ｊｕｊｕｂｅ（ＸＰ＿０１５８７８７６５．１）、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ（ＸＰ＿００９１２５５２４．１）、Ｆｒａｇａｒｉａ  ｖｅｓｃａ  ｓｕｂｓｐ．Ｖｅｓｃａ（ＸＰ＿００４２９７５４８．１）、Ｃａｍｅｌｉｎａ  ｓａｔｉｖａ（ＸＰ＿０１０４２３６５６．１）、Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ（ＸＰ＿００３５２５６８５．１）、Ｃａｐｓｅｌｌａ  ｒｕｂｅｌｌａ（ＸＰ＿００６２８６６２６．１）、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ（ＸＰ＿０１３７２０２７３．１）、Ｒａｐｈａｎｕｓ  ｓａｔｉｖｕｓ（ＸＰ＿０１８４６８６８２．１）、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ（ＣＤＹ１４１７０．１）、Ａｒａｂｉｓ  ａｌｐｉｎｅ（ＫＦＫ２４８４８．１）、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ  ｖａｒ．ｏｌｅｒａｃｅａ（ＸＰ＿０１３６２１１０５．１）、Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ（ＸＰ＿００６３５１４８７．１）、Ｄｏｒｃｏｃｅｒａｓ  ｈｙｇｒｏｍｅｔｒｉｃｕｍ（ＫＺＶ２１７４４．１）、Ｃｏｒｃｈｏｒｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｒｉｓ（ＯＭＯ８４００６．１）、Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ（ＯＡＹ３０７２４．１）、およびＢｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ（ＣＡＡ７３７９３．１）が挙げられる。
【００７２】
グリコール酸ヒドロゲナーゼホモログには、以下（種およびアクセッション番号）の：Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ（ＸＰ＿００１６９５３８１．１）、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ（ＡＢＧ３６９３２．１）、Ｖｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉ  ｆ．ｎａｇａｒｉｅｎｓｉｓ（ＸＰ＿００２９４６４５９．１）、Ｇｏｎｉｕｍ  ｐｅｃｔｏｒａｌ（ＫＸＺ４６７４６．１）、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｅｕｓｔｉｇｍａ（ＧＡＸ７７２８９．１）、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ（ＸＰ＿００５８５２２１６．１）、Ｃｏｃｃｏｍｙｘａ  ｓｕｂｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ（ＸＰ＿００５６４８７２５．１）、Ｍｉｃｒｏｍｏｎａｓ  ｃｏｍｍｏｄｅ（ＸＰ＿００２５０６４４６．１）、Ａｕｘｅｎｏｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ（ＸＰ＿０１１３９９１５６．１）、Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ  ｔａｕｒｉ（ＸＰ＿００３０７４３６２．２）、Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｃｉｍａｒｉｎｕｓ（ＸＰ＿００１４１５８６２．１）、Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ  ｔａｕｒｉ（ＯＵＳ４２６５０．１）、Ｂａｔｈｙｃｏｃｃｕｓ  ｐｒａｓｉｎｏｓ（ＸＰ＿００７５１１４３９．１）、Ｍｉｃｒｏｍｏｎａｓ  ｐｕｓｉｌｌａ（ＸＰ＿００３０６３１５３．１）、Ｃｈｒｙｓｏｃｈｒｏｍｕｌｉｎａ  ｓｐ．（ＫＯＯ３３６０３．１）、およびＧｕｉｌｌａｒｄｉａ  ｔｈｅｔａ（ＸＰ＿００５８２７９１９．１）が挙げられる。
【００７３】
本発明を一般的に説明してきたが、本発明は、ある特定の具体的な実施例を参照することにより、より良く理解され、その実施例は、本発明をさらに例示するために本明細書に含まれるものであり、特許請求の範囲により定義される本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例１】
【００７４】
材料および方法
植物材料および成長条件
Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ  Ｃｏｌｕｍｂｉａ（Ｃｏｌ−０）を野生型参照として用いた。Ｓａｌｋ＿０３５６９Ｃ（ｐｌｇｇ１−１）、ＣＳ８５９７４７（ｂａｓｓ６−１）、およびＳａｌｋ＿０５２９０３Ｃ（ｂａｓｓ６−２）を、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ（ａｂｒｃ．ｏｓｕ．ｅｄｕ）から入手した。植物を、ＬＣ１  Ｓｕｎｓｈｉｎｅ  Ｍｉｘを用いるグロースチャンバー（Ｃｏｎｖｉｒｏｎ、ＵＳＡ）において、上昇したＣＯ２（２０００ｐｐｍ  ＣＯ２）または環境ＣＯ２（４００ｐｐｍ  ＣＯ２）のいずれかで、８時間明期／１６時間暗期のサイクル（２２℃／１８℃）、２５０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１  ＰＡＲ、および６５％相対湿度（ＲＨ）で成長させた。
【００７５】
クロロフィル蛍光測定
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物を、環境大気条件下で成長させ、クロロフィル蛍光測定の前に、（Ｂａｄｇｅｒら  ｅｔ  ａｌ．２００９）と同様に、低ＣＯ２条件、一定照明下で、２４時間、密封された透明のプラスチック容器へ移した。クロロフィル蛍光測定を、以前に記載したように（Ｏｘｂｏｒｏｕｇｈ  ａｎｄ  Ｂａｋｅｒ、Ｐｌａｎｔ、Ｃｅｌｌ  ＆  Ｅｎｖｉｒｏｎ．（１９９７）２０：１４７３〜８３；Ｂａｄｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、ｓｕｐｒａ）行った。簡単に述べれば、週齢４週間の植物の１５分間の暗順応後、ＣＦ  Ｉｍａｇｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａ（ｗｗｗ．ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａ．ｃｏ．ｕｋ）を用いてＦｖ／Ｆｍ画像を取得した。最大フラッシュ強度は、８００ミリ秒間の６８００μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１であった。各個々の植物について、画像値を、各位置を定義するｆｌｕｏｒｉｍａｇｅｒソフトウェアプログラム内でコロニーを検出することにより、取得した。
【００７６】
クローニング
全ての発現ベクターを表２に記載した。プロモーターおよびオープンリーディングフレームを、Ｔｈｅ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（ＴＡＩＲ）から得られた配列に基づいて合成した。制限部位および相同性の４塩基対領域を、植物合成生物学における一般的なシンタックスに従って設計した（Ｐａｔｒｏｎら、Ｎｅｗ  Ｐｈｙｔｏｌ．（２０１５）２０８：１３〜１９）。次に、構築物を、Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅクローニングプロトコールを用いて集め、その後、バイナリーベクター（ＥＣ５０５０５）へサブクローニングした（Ｗｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（２０１２）３：３８〜４３；Ｅｎｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、ＡＣＳ  Ｓｙｎｔｈ．Ｂｉｏｌ．（２０１４）３：８３９〜４３；Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ  ａｎｄ  Ｗｅｒｎｅｒ、Ｇｌｙｃｏ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ａ．Ｃａｓｔｉｌｈｏ編（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）２６９〜８４ページ（２０１５）；Ｐａｔｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、ｓｕｐｒａ）。安定的形質転換について、バイナリーベクターを、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  Ｃ５８Ｃ１へエレクトロポレーションにより形質転換し、その後、Ｃｏｌ−０野生型系統、ｐｌｇｇ１−１またはｂａｓｓ６−１  Ｔ−ＤＮＡ挿入系列へフローラルディップにより形質転換した（Ｃｌｏｕｇｈ  ａｎｄ  Ｂｅｎｔ、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．（１９９８）１６：７３５〜４３）。形質転換系列を、ＢＡＳＴＡ抵抗性に基づいて選択し、遺伝子挿入を、ＰＣＲ分析により検証した。一過性発現について、上記のように、ＣａＭＶ３５ｓプロモーターにより駆動され、Ｃ末端ＧＦＰ融合を有する構築物を設計した。
【００７７】
【表２】
2020511960.tif 000004
【００７８】
単離されたプロトプラストにおける一過性発現研究について、ＢＡＳＳ６−ＧＦＰ構築物を以下のようにクローニングした。ｍＧＦＰ６（Ｈａｓｅｌｏｆｆ，Ｊ．、Ｍｅｔｈｏｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（１９９９）５８：１３９〜５１）、６ｘＨＩＳ、およびＭＹＣを含有するＣ末端タグと共に、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ  Ｂａｓｓ６（ＡＴ４Ｇ２２８４０）のコード配列が、ＧＥＮＥＷＩＺ  Ｉｎｃ．により合成され、それを、改変型ｇａｔｅｗａｙ適合性ｐＵＣ５７プラスミドに挿入し、そこからｐＭＤＣ３２中に組み換えた。ＡｔＰＬＧＧ１−ＧＦＰ構築物は、以前に発表された（Ｒｏｌｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．、Ｆｒｏｎｔ．Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．（２０１６）７：１８５）。
【００７９】
Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａのＡｇｒｏ浸潤および顕微鏡観察
成長および浸潤実験は（Ｒｏｌｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．、上記）に記載されている。簡単に述べれば、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ＧＶ３１０１（ｐＭＰ９０）を、関心対象となるプラスミドで形質転換し、リファンピシン（５０μｇ／ｍｌ）およびカナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地中で成長させた。培養物を、２８〜３０℃のインキュベータ内で約２４時間、成長させ、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの葉の形質転換に用いた。Ｐ１９を含有する細菌（ＯＤ６００＝０．３）を、関心対象となるプラスミドおよび／またはＥＲコンパートメントマーカー（ＯＤ６００＝０．５）（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ａｂｒｃ．ｏｓｕ．ｅｄｕ）からのプラスミドＣＤ３−９５９（Ｎｅｌｓｏｎら、２００７））を含有する細菌と混合した。細胞を、２１５０  ｘ  ｇで８分間、遠心分離し、再懸濁した（１０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ５．６、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および１５０μＭアセトシリンゴン）。細胞を室温で２時間、インキュベートし、週齢３〜４週間のＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの葉へ浸潤させた。
【００８０】
プロトプラスト調製物を、以前に記載されているように完成させた（Ｒｏｌｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．、ｓｕｐｒａ）。浸潤から２日後、浸潤された葉の４ｃｍ２区域を、小刀で切り取り、５ｍｌシリンジに移し、それに２ｍｌの消化溶液を添加し、穏やかな減圧を手作業で加えた。浸潤溶液および葉組織を、２ｍｌ  Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブへ移し、室温で１時間、インキュベートした。葉のデブリを除去し、溶液を画像化溶液（０．４Ｍマンニトール、２０ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ５．６、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１％［ｗ／ｖ］ＢＳＡ）と交換する前に、プロトプラストを沈降させた。
【００８１】
プロトプラストを、正立Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ７８０共焦点レーザー走査顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）、４０×水浸対物レンズ（ＮＡ＝１．１）およびＺｅｎ  ２０１１ソフトウェアパッケージ（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）を用いて観察し、画像化した。ＧＦＰおよびクロロフィルを４８８ｎｍで励起し、それぞれ、４９９〜５３４ｎｍおよび６３０〜７３５ｎｍで記録した。別個のトラックにおいて、ｍＣｈｅｒｒｙを５６１ｎｍで励起し、５７９〜６３３ｎｍで記録した（本研究においては示さず）。
【００８２】
記載される浸潤された葉組織からスライスされた葉組織全体を、４０×対物レンズ（ＮＡ＝１．０）、Ｚｅｎ  ｌｉｇｈｔ  ｓｈｅｅｔソフトウェアパッケージ（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）を用いるＬｉｇｈｔ  ｓｈｅｅｔ  Ｚ１（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＩＮＣ．Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）顕微鏡を用いて、可視化した。ＧＦＰおよびクロロフィルを４８８ｎｍで励起し、発光選択を、それぞれ、５０５〜５４５ｎｍおよび６６０ｎｍで記録した。
【００８３】
代謝プロファイリング
代謝産物分析について、約４０ｍｇの新鮮な葉組織を液体窒素中で凍結させ、粉砕し、その後、５００μＬの１００％メタノールで抽出した。次に、試料を、Ｕｒｂａｎａ−ＣｈａｍｐａｉｇｎにおけるＭｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｒｏｙ  Ｊ．Ｃａｒｖｅｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｌｌｉｎｏｉｓへ提出し、その後、そこで、以下の：イソプロパノール：アセトニトリル：水（３：３：２  ｖ／ｖ）、およびクロロホルム：メタノール（２：２  ｖ／ｖ）の２つの追加の抽出が実施された。Ａｇｉｌｅｎｔ  ７８９０ガスクロマトグラフ、Ａｇｉｌｅｎｔ  ５９７５質量選択検出器、およびＨＰ  ７６８３ＢオートサンプラーからなるＧＣ−ＭＳシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｉｎｃ．、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて、代謝産物を分析した。ガスクロマトグラフィを、ＺＢ−５ＭＳ（６０ｍ×０．３２ｍｍ  Ｉ．Ｄ．および０．２５ｕｍフィルム厚さ）キャピラリーカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、ＣＡ、ＵＳＡ）で実施した。入口およびＭＳインターフェイス温度は２５０℃であり、イオン源温度を２３０℃に調整した。１μＬのアリコートを、１０：１のスプリット比で注射した。ヘリウムキャリアガスを、２ｍｌ／分の一定流速に保った。温度プログラムは以下の：５分間の７０℃での等温加熱、続いて、３１０℃まで５℃／分のオーブン温度上昇、および３１０℃での最終の１０分間であった。質量分析計を、陽電子衝撃モード（ＥＩ）において、６９．９ｅＶイオン化エネルギー、ｍ／ｚ  ３０〜８００スキャン範囲で操作した。全てのクロマトグラムピークのスペクトルを、電子衝撃質量スペクトルライブラリーＮＩＳＴ０８（ＮＩＳＴ、ＭＤ、ＵＳＡ）、Ｗ８Ｎ０８（Ｐａｌｉｓａｄｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＮＹ、ＵＳＡ）、および特注のデータベース（４６４個の固有の代謝産物）と比較した。全ての既知の人工ピークを同定し、除去した。試料間での比較を可能にするために、全てのデータを、各クロマトグラムおよび試料湿重量において内部標準に対して標準化した。全てのクロマトグラムピークのスペクトルを、ＡＭＤＩＳ  ２．７１（ＮＩＳＴ、ＭＤ、ＵＳＡ）プログラムを用いて評価した。代謝産物濃度を、１グラム湿重量あたりの内部標準に対する濃度（すなわち、ヘントリアコンタン酸のピーク面積で割った、標的化合物ピーク面積：Ｎｉ＝Ｘｉ＊Ｘ−１ＩＳ）として報告した。計器変動は、５％の標準合格限界内であった。
【００８４】
光合成測定
上昇した［ＣＯ２］で成長した日齢３０〜４０日間のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物の最も若い完全展開した葉を、ガス交換による光合成の分析に用いた。ガス交換測定を、マニュアル（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ、ＵＳＡ）に概略が述べられているように、ガスケット漏れを補正した２ｃｍ２蛍光測定ヘッドを有するＬｉ−ＣＯＲ  ６４００ＸＴを用いて実施した。２５℃の葉温度および飽和光（１０００μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１）において、示されたＣＯ２濃度においてＡ、ｇｓ、およびＣｉ測定値を得た。環境ＣＯ２下での順化後、上記で述べられた同じ温度および光条件下、ＣＯ２の範囲（５０〜２０００ｐｐｍ）においてＡＣｉ曲線を測定した。Ｖｃ  Ｍａｘ、ＪＭａｘ  Ｒｄ、およびｇｓを、ＡＣｉデータおよびＰｓＦｉｔモデルを用いて決定した（Ｂｅｒｎａｃｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ（２００３）２６：１４１９〜１４３０）。
【００８５】
ＲＴ−ＰＣＲ
８時間／１６時間の昼夜サイクル下、１８０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１  ＰＡＲおよび２２℃／１８℃温度状態、６５％ＲＨにおいて成長した週齢４週間のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物の、植物ＲＮｅａｓｙ抽出キットおよびＱｕａｎｔｉｔｅｃ逆転写キット（ＱＩＡＧＥＮ  ＵＳＡ）を用いて抽出されたＲＮＡから、ｃＤＮＡを作製した。それぞれ３つの技術的複製を含む３つの生物学的複製を、全ての試料に用いた。Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ  ｃｏｎｎｅｃｔリアルタイムＰＣＲシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＳＡ）を用いて試料を分析し、転写産物における相対的変化を、ビオラキサンチンデエポキシダーゼ（ＶＤＥ）、Ｐｌｇｇ１、およびＢａｓｓ６の転写産物へ方向づけられたプライマーを用いるΔΔＣｔ方法を用いて決定した。ｃＤＮＡを、ＳＳＯ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて増幅し、プライマー配列は表３に記載されている。
【００８６】
【表３】
2020511960.tif 000005
【００８７】
酵母相補性およびグリコール酸取り込み
酵母プラスミドを、以前記載されているように（Ｓｏｕｔｈ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２０１０）２８５：５９５〜６０７）、構築した。簡単に述べれば、ＲＮＡをＣｏｌ−０野生型Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓから取得し、ＲＮｅａｓｙ抽出キットおよびＱｕａｎｔｉｔｅｃ逆転写キット（ＱＩＡＧＥＮ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によりｃＤＮＡへ変換した。葉緑体局在化シグナル（１〜２４）無しの完全長Ｂａｓｓ６およびＰｌｇｇ１のＣＤＳ配列を、表３に記載されたプライマーを用いるＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ産物を、ｐＲＳ４１５−ＡＤＨ１ベクター（ＡＴＣＣ、ＶＡ  ＵＳＡ）へＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限部位を用いてクローニングした。酵母形質転換を、以前記載されているように、ＢＹ４７４１  ｍａｔ  ａ野生型およびａｄｙ２Δ系統（ＧＥ  Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）を用いて実施した（Ｓｏｕｔｈ  ｅｔ  ａｌ．、ｓｕｐｒａ；Ｓｏｕｔｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２０１３）１１０：Ｅ１０１６〜Ｅ１０２５）。
【００８８】
ａｄｙ２Δ系統の相補を、炭素源としてグリコール酸を用いて成長分析を比較することにより実施した。野生型、およびＢａｓｓ６、Ｐｌｇｇ１、または空ベクターの発現プラスミドで形質転換されたａｄｙ２Δ系統を、ロイシンを欠く合成完全培地（ＳＣ−Ｌｅｕ）中の５０ｍＬ培養物において、０．６から０．８の間のＯＤ６００の光学密度に達するまで成長させ、その後、細胞を水中で２回、洗浄し、水中で再懸濁した。炭素源として２％グルコース、乳酸塩、またはグリコール酸塩を含有するＳＣ−Ｌｅｕプレート上でスポットアッセイを実施した。０．１のＯＤ６００から開始した５つの１０倍段階希釈溶液を用いて、５μＬスポットをプレート上に滴下した。その後、プレートを３０℃でインキュベートした。プレートの写真を、１日目（グルコース）、２日目（乳酸塩）、７日目（グリコール酸塩）に撮影した。
【００８９】
グリコール酸取り込み測定を、以前記載したグリセロール取り込み（Ｏｌｉｖｅｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．（１９９６）１４２：１４７〜５３）と同様に実施した。酵母系統を、３０℃、ＳＣ−Ｌｅｕ中５０ｍＬ培養物において、０．６から０．８の間のＯＤ６００の光学密度に達するまで、成長させた。細胞を収集し、水で２回、洗浄し、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／クエン酸バッファーｐＨ５．０中、３０ｍｇ／ｍｌの乾燥重量の濃度で再懸濁した。２５℃での２分間のインキュベーション後、５０ｍＣｉ／ｍｍｏｌ（３．７＊１０３［Ｂｑ］合計）［１４Ｃ］−グリコール酸（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ＭＯ  ＵＳＡ）の１μＬ水溶液を含有する（ＳＣ−Ｌｅｕ／グリコール酸塩）の１５０μＬ添加で反応を開始した。１０分後、５ｍＬの氷冷水の添加により反応を停止させた。その後、反応混合物を、ガラス繊維フィルター（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＵＳＡ）で濾過し、５ｍＬの氷冷水で３回、洗浄した。［１４Ｃ］−グリコール酸塩取り込みを、フィルターおよび４ｍＬのシンチレーション液（ＲＰＩ  Ｂｉｏ−ｓａｆｅ  ＩＩ）を用いるシンチレーションにより、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｔｒｉ−Ｃａｒｂ液体シンチレーションカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＵＳＡ）を用いて測定した。
【００９０】
統計解析
全ての実験は少なくとも３つの生物学的複製を有し、データは平均値を示す。相対的成長分析およびｍＲＮＡレベルの相対的変化は、標準偏差およびｓｔｕｄｅｎｔのＴ検定を用いた有意性を含む。代謝産物分析および光合成測定値を、Ｐ＜０．０５の有意性閾値での一元配置ＡＮＯＶＡ（遺伝子型）または二元配置ＡＮＯＶＡ（ＣＯ２処理による遺伝子型）のいずれかにより解析した。全てのＡＮＯＶＡの後にＴｕｋｅｙのｐｏｓｔ−ｈｏｃ検定を行い、統計ソフトウェア（ＯｒｉｇｉｎＰｒｏ  ９．１、ＯｒｉｇｉｎＬａｂ、ＭＡ  ＵＳＡ）を用いて決定した。
【実施例２】
【００９１】
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｂａｓｓ６変異体表現型の分析
推定葉緑体内膜タンパク質ＢＡＳＳ６の発現を欠損する、遺伝子Ａｔ４ｇ２２８４０を標的にする２つの独立したＴ−ＤＮＡ挿入系列を分析した。ＢＡＳＳ６が光呼吸に関与するかどうかを決定するために、２つのＴ−ＤＮＡ系列（ｂａｓｓ６−１およびｂａｓｓ６−２）を、環境ＣＯ２（４００ｐｐｍ）条件下で成長させた。野生型対照と比較して、両方のｂａｓｓ６変異体系列は、光呼吸に関与するグリコール酸／グリセリン酸トランスポーター変異体ｐｌｇｇ１−１と類似して、より小さいロゼットのサイズを示した（図２−環境ＣＯ２（グロースチャンバー内で、８週間、４００ｐｐｍ  ＣＯ２  ８時間明期／１６時間暗期のサイクル（２２℃／１８℃）、２５０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１光強度）で成長した、ＷＴと比較した、ｂａｓｓ６およびｐｌｇｇ１変異体の代表的な写真）。低濃度のＣＯ２下での光呼吸変異体の照明は、光化学系ＩＩへの光損傷に起因した可能性がある、暗順応したＦｖ／Ｆｍクロロフィル蛍光の低下を生じた（Ｂａｄｇｅｒｅｔ  ａｌ．、ｓｕｐｒａ）。ｐｌｇｇ１−１系列とｂａｓｓ６−１系列のどちらも、一定照明下での２４時間後、野生型と比較して、Ｆｖ／Ｆｍの有意な低下を示したが、低［ＣＯ２］処理前にはＦｖ／Ｆｍの低下は観察されなかった（図３）。光呼吸変異体表現型を検証するために、ｂａｓｓ６−１変異体の成長分析を、低いＣＯ２、環境ＣＯ２、および上昇したＣＯ２において実施した。古典的な光呼吸変異体表現型と一致して、ｂａｓｓ６−１変異体とｐｌｇｇ１−１変異体のどちらも、１２５ｐｐｍ  ＣＯ２において成長しなかった（図４Ｂ）。環境ＣＯ２条件下では、ｂａｓｓ６−１  Ｔ−ＤＮＡ系列とｐｌｇｇ１−１  Ｔ−ＤＮＡ系列のどちらも、野生型対照と比較して、遅い成長の表現型を示した（図４Ａおよび４Ｂ）。重要なことに、その遅い成長表現型は、高い［ＣＯ２］条件で成長した時、ｂａｓｓ６−１変異体とｐｌｇｇ１−１変異体のどちらにおいても野生型表現型へと回復された（図４Ａおよび４Ｂ）。
【００９２】
光呼吸経路における変異体は、野生型またはほぼ野生型の成長のために高レベルのＣＯ２を必要とする場合が多く、それは、ＲｕｂｉｓＣＯ酸素化反応が非常に低いレベルに抑制されている状態である（Ｔｉｍｍ  ａｎｄ  Ｂａｕｗｅ、ｓｕｐｒａ）。環境［ＣＯ２］において、光呼吸変異体は、一般的に、炭素同化作用（Ａ）、Ｒｕｂｉｓｃｏ  Ｖｃ  ｍａｘ、およびＪｍａｘのパラメータの低下により特徴づけられる光合成の低下を示す。以前の報告（Ｐｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．、ｓｕｐｒａ；Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｈｏｔｏｓｙｎ  Ｒｅｓ．（２０１６）１２９：９３〜１０３）と同様に、ｐｌｇｇ１−１は、野生型と比較してより低い光合成速度を示した（図５）。ｂａｓｓ６−１植物もまた、ＷＴと比較して、環境［ＣＯ２］において光合成のわずかな低下を示し、内部ＣＯ２濃度（Ｃｉ）も気孔伝導度（ｇｓ）も検出可能な変化はなかった（図５）。ｂａｓｓ６−１系列およびｐｌｇｇ１−１系列の光合成への生化学的制限を評価するために、葉内の細胞内［ＣＯ２］（Ｃｉ）における炭素同化作用（Ａ）の応答を調べた。一点光合成測定値と一致して、ｂａｓｓ６−１とｐｌｇｇ１−１のどちらも、Ｖｃ  ｍａｘおよびＪｍａｘ値を減少させた（表３）。表４について、文字は、ＡＮＯＶＡ解析ｐ≦０．５に基づいた統計的差を示す。ＶｃＭａｘは、Ｒｕｂｉｓｃｏにより許容される最大カルボキシル化速度；Ｊ  Ｍａｘｈｓ、光合成電子伝達の最大速度；Ｒｄは、日呼吸；ｇｓは、気孔伝導度である。ｂａｓｓ６−１系列における光合成速度の低下は、ｐｌｇｇ１−１変異体においてと同じではなく、ｂａｓｓ６−１対ｐｌｇｇ１−１変異体植物の比較によるロゼットのサイズおよび成長速度と一致している（図２および図４Ａを図５および表４と比較する）。
【００９３】
【表４】
2020511960.tif 000006
【００９４】
ｐｌｇｇ１−１の以前の特徴づけにより、ｐｌｇｇ１−１変異体は、高レベルのＣＯ２で成長し、その後、環境大気にシフトされた場合、それらの葉に葉緑体病変が発生することが示された（Ｐｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．、ｓｕｐｒａ）。クロロフィル蛍光Ｆｖ／Ｆｍ検出を用いて、葉緑体病変は、環境大気条件における３日後に、検出可能である。以前の研究に一致して、ｐｌｇｇ１−１変異体は、環境大気へのシフト後、葉上に病変が発生する（図６Ａ）。ｂａｓｓ６−１変異体単独は、移動後３日目、または長くも７日目における環境ＣＯ２へのシフト後、葉に観察可能な葉緑体病変を発生させないが（図６Ａ）、ｂａｓｓ６−１とｐｌｇｇ１−１交雑種のホモ接合性Ｆ３世代は、相加的光呼吸変異体表現型と一致して、ｐｌｇｇ１−１系列単独と比較して、より重度に葉緑体病変が発生する（図６Ａおよび図６Ｂ）。ｂａｓｓ６、ｐｌｇｇ１の二重変異体における葉緑体病変の重症度の倍加の観察により、本発明者らは、相加的発育異常および光合成速度のさらなる低下もあると仮定した。予想された通り、Ｆ３二重変異体植物において観察された成長表現型は、さらなる減少を示し、光合成速度の低下は、ＰＬＧＧ１機能とＢＡＳＳ６機能の両方が欠損する場合、相加的であると思われる（図８Ａおよび図８Ｂ）。
【実施例３】
【００９５】
ＢＡＳＳ６タンパク質は葉緑体包膜に局在する
以前の研究は、ＢＡＳＳ６タンパク質が葉緑体包膜に局在することを示唆しているが、細胞内位置予測プログラムは、ＢＡＳＳ６のミトコンドリア局在をより強く支持した（Ｇｉｇｏｌａｓｈｖｉｌｉ  ｅｔ  ａｌ．、ｓｕｐｒａ）。ＢＡＳＳ６タンパク質の局在化を決定するために、ＢＡＳＳ６−ＧＦＰ融合タンパク質の一過性発現を、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａにおけるプロトプラストと葉組織全体の両方において分析した。クロロフィル自己蛍光を用いて、葉緑体を同定した（図７、パネルＢ、Ｅ、Ｈ、およびＫ）。ＢＡＳＳ６−ＧＦＰシグナルは、既知のグリコール酸／グリセリン酸トランスポーターＰＬＧＧ１（図７、パネルＤ〜Ｆ）と同様に、葉緑体自己蛍光を囲み（図７、パネルＧ〜Ｉ）、ＢＡＳＳ６が葉緑体包膜に局在していることを示している。さらに、ＢＡＳＳ６−ＧＦＰまたはＰＬＧＧ１−ＧＦＰのいずれの発現も、形が葉緑体内包膜に局在したタンパク質の典型であるストロミュール（図７、パネルＤ〜Ｉにおける星印の付いた矢じり）の形成を誘導した（Ｂｒｅｕｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．、（２０１２）３：７）。葉組織全体からの光シート顕微鏡法実験は、また、葉緑体包膜および追加の非葉緑体領域への局在化を示したが、これは一過性過剰発現に起因した可能性がある（図７、パネルＪ〜Ｌ）。追加の対照として、ＧＦＰ対照タンパク質を、ＢＡＳＳ６−ＧＦＰと比較し、ＢＡＳＳ６が、サイトゾルに局在しないことを示した。
【実施例４】
【００９６】
ｂａｓｓ６−１代謝産物プロファイルの分析
ＲｕｂｉｓＣＯ酸素化速度が相当にある場合、光呼吸に欠陥を有する変異体植物は、光呼吸経路内に様々な代謝産物中間体を蓄積する。光呼吸経路においてＢＡＳＳ６の輸送ステップを同定するのを助けるために、高い（２０００ｐｐｍ）または低い（１５０ｐｐｍ）［ＣＯ２］のいずれかに曝された葉組織において代謝産物プロファイルを分析した。高い［ＣＯ２］条件下での野生型対照と比較して、ｂａｓｓ６−１系列は、アミノ酸セリンの増加を示し、一方、以前に報告されたｐｌｇｇ１−１系列は、高いＣＯ２濃度においてさえも、グリコール酸、グリシン、およびグリセリン酸などの複数の光呼吸中間体を蓄積した（図９）。葉が低レベルのＣＯ２に曝されてＲｕｂｉｓＣＯ酸素化速度を増加させた場合、ｂａｓｓ６−１におけるグリシンおよびグリコール酸のレベルは、野生型と比較して、有意に増加した（図９）。比較として、ｂａｓｓ６−１は、葉が低レベルのＣＯ２に曝された場合、ｐｌｇｇ１−１植物と同様のグリシンレベルを蓄積した（図９）。
【００９７】
ＢＡＳＳ６およびＰＬＧＧ１の組み合わされた欠損が光呼吸中間体のレベルの相加的増加をもたらすかどうかを決定するために、ｐｌｇｇ１−１系列とｂａｓｓ６−１系列の間のホモ接合性Ｆ３交雑種を、野生型およびそれぞれの単一変異体と比較した。Ｆ３二重変異体は、野生型および単一変異体系列と比較して、グリコール酸蓄積の有意な増加、およびｐｌｇｇ１−１単一変異体と類似したグリセリン酸などの他の中間体の増加を示す（図９）。代謝産物プロファイルデータは、ＢＡＳＳ６機能の喪失が、光呼吸代謝産物の蓄積を生じ得ることを示している。加えて、ＢＡＳＳ６機能とＰＬＧＧ１機能の両方の喪失は、グリコール酸蓄積のさらなる増加を生させる。低いＣＯ２条件に曝された場合の光呼吸代謝産物の蓄積は、遅い成長表現型、および光呼吸代謝におけるＢＡＳＳ６の役割と一致している。
【００９８】
光呼吸は光依存性経路である。ｐｌｇｇ１−１  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ系列の代謝産物分析により、葉緑体におけるグリコール酸エクスポートとグリセリン酸インポートの両方の障害と一致して、グリコール酸、グリシン、セリン、およびグリセリン酸の光依存性蓄積が示された（Ｐｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．、ｓｕｐｒａ）。環境大気下での夜の間、ｐｌｇｇ１−１変異体におけるグリコール酸およびグリシンのレベルは、野生型レベルに戻り、グリセリン酸の有意な低下があった（Ｐｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．、ｓｕｐｒａ）。野生型およびｐｌｇｇ１−１と比較して、ｂａｓｓ６−１植物およびＦ３二重変異体植物におけるグリコール酸、グリセリン酸、およびグリシンのレベルの変化を決定するために、高い［ＣＯ２］から環境大気へのシフト後、成長光周期の終わりにおける明から暗への移行直後に、代謝産物分析を実施した。ｐｌｇｇ１−１変異体は、明期の終了後、グリコール酸レベルの低下を示す（図１０）。ｂａｓｓ６−１植物の代謝産物プロファイルにより、明期の終了時点におけるグリコール酸およびグリセリン酸の蓄積が示され、それらは、１０分以内に有意に低下した（図１０）。グリコール酸の蓄積は、ｐｌｇｇ１−１植物と比較して、Ｆ３−ｂａｓｓ６、ｐｌｇｇ１二重変異体において有意に増加したが、Ｆ３変異体におけるグリシンおよびグリセリン酸レベルは、ｐｌｇｇ１−１変異体と非常に類似した。ＢＡＳＳ６の葉緑体内包膜への局在化とこれらを合わせて考えると、ＰＬＧＧ１およびＢＡＳＳ６は共に、グリコール酸の葉緑体からのエクスポートを担うことが強く暗示している。
【実施例５】
【００９９】
ＢＡＳＳ６およびＰＬＧＧ１は、グリコール酸を炭素源とした、酵母の成長を救出する
酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて既知のグリコール酸トランスポーターはないが、酢酸トランスポーターＡＤＹ２は、酢酸とグリコール酸の両方を輸送することが知られているＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｙｊｃＧと相同である（Ｇｉｍｅｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、（２００３）１８５：６４４８〜５５）。したがって、本発明者らは、ＢＡＳＳ６とＰＬＧＧ１の両方を発現する酵母ベクターを作製し、それらを、野生型ＢＹ４７４１と同質遺伝子的ａｄｙ２Δ系統の両方において発現させた。成長を測定するスポットアッセイにより、空ベクターのみを発現するａｄｙ２Δ系列は、グリコール酸を唯一の炭素源として成長することはできないことを示した（図１１）。予想された通り、ａｄｙ２Δ酵母系統におけるＰＬＧＧ１の発現は、唯一の炭素源としてグリコール酸を用いて、成長を野生型のレベルまで戻して救出した（図１１）。Ｂａｓｓ６遺伝子の発現もまた、ａｄｙ２Δ系統において成長を救出し、ＢＡＳＳ６がグリコール酸輸送を補完し得るという証拠を示した（図１１）。炭素源としてグルコースおよび乳酸を用いる対照は、酵母におけるＢＡＳＳ６およびＰＬＧＧ１の発現が成長にネガティブには影響しないこと、およびａｄｙ２Δ系統が両方の炭素源を利用できることを示している（図１１）。
【０１００】
ＢＡＳＳ６およびＰＬＧＧ１がグリコール酸を炭素源とした成長について酵母を補完し得るという所見に基づいて、本発明者らは、両方のタンパク質の輸送能力を決定しようとした。酵母で発現したＢＡＳＳ６およびＰＬＧＧ１の輸送特性を試験するために、本発明者らは、［１４Ｃ］−グリコール酸を用いる取り込み実験を実施した。［１４Ｃ］−グリコール酸を、クエンチングおよびシンチレーションカウンティングの前の１０分間、インキュベートした。ＰＬＧＧ１タンパク質の発現は、野生型とａｄｙ２Δ系統の両方においてグリコール酸の取り込み能力の増加を示し、ＢＡＳＳ６タンパク質の発現も同様であった（図１２）。データより、酵母で発現したＢＡＳＳ６とＰＬＧＧ１のどちらも、グリコール酸取り込み欠損ａｄｙ２Δ変異体において成長の救出をもたらす膜貫通グリコール酸輸送を促進することが示されている（図１２）。
【実施例６】
【０１０１】
遺伝子発現への効果
ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおけるＢａｓｓ６またはＰｌｇｇ１のいずれかの欠損は、環境またはより低い［ＣＯ２］大気において、野生型と比較して成長速度が低下した光呼吸変異体表現型をもたらす（図２）。加えて、ＢＡＳＳ６およびＰＬＧＧ１の発現を欠損する二重変異体植物は、植物の成長する能力をさらに低下させた（図６Ａ）。ＢＡＳＳ６またはＰＬＧＧ１のいずれかの欠損は光呼吸表現型を生じさせたが、いずれのＴ−ＤＮＡ挿入系列も、多数の他の光呼吸変異体に関して見られたように、環境大気において成長した場合、致死性ではなかった。これは、輸送過程における重複性、および１つの遺伝子の欠損の別の遺伝子発現の増加による補完によるものであり得た。Ｂａｓｓ６またはＰｌｇｇ１の欠損が他の遺伝子の発現の変化を生じるかどうかを試験するために、リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）実験を実施した。ｐｌｇｇ１−１系列において、野生型と比較して、Ｂａｓｓ６発現における検出可能な差はなかった（図１３）。しかしながら、Ｐｌｇｇ１の発現は、ｂａｓｓ６−１系列において野生型に対して４．８倍増加し、Ｐｌｇｇ１発現が、ＢＡＳＳ６の欠損により引き起こされた代謝変化を補完するように顕著に増加したことを示唆している（図１３）。Ｐｌｇｇ１発現がｂａｓｓ６−１植物において増加したことを決定した後、Ｐｌｇｇ１発現の変化が、ｐｌｇｇ１−１と比較してｂａｓｓ６−１においてそれほど重篤ではない表現型が観察されることの理由であると仮定した。このことにより、Ｂａｓｓ６またはＰｌｇｇ１のいずれかの発現が、単一変異体のそれぞれの遅い成長表現型を潜在的に補完し得るかどうかを試験することに至った。
【０１０２】
また、ｐｌｇｇ１−１系列表現型またはｂａｓｓ６−１系列表現型のいずれかが別の変異によるという可能性を除外するために、Ｐｌｇｇ１およびＢａｓｓ６を、また、ｐｌｇｇ１−１系列およびｂａｓｓ６−１系列へ、それらの天然プロモーターの調節下に形質転換させた。Ｂａｓｓ６のそれ自体のプロモーターの調節下またはＰｌｇｇ１プロモーターの調節下でのＢａｓｓ６の発現は、ｂａｓｓ６−１系列における成長速度表現型を救出し、ＢＡＳＳ６の欠損が、光呼吸表現型の原因であることを確認した（図１３）。加えて、Ｐｌｇｇ１のそれ自体のプロモーターの調節下での発現は、その光呼吸表現型を救出する（図１３）。しかしながら、Ｐｌｇｇ１の発現プラスミドのｂａｓｓ６−１系列へ形質転換することは、ｂａｓｓ６−１変異体と比較して、成長速度の有意な変化を示さなかった（図１３）。これは、ＰＬＧＧ１の多すぎる発現は、植物成長にネガティブな影響を生じさせ得ること、および内因性Ｐｌｇｇ１遺伝子の発現が野生型と比較してすでに増加していることの事実によるものであり得る（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、ｓｕｐｒａ；図１３）。興味をそそることに、Ｂａｓｓ６のその天然プロモーターの調節下での発現は、空ベクターと比較して、ｐｌｇｇ１−１系列の成長速度を若干増加させたが、野生型レベルまで戻すところまで完全には救出されなかった（図１３）。
【実施例７】
【０１０３】
植物成長および収量を増加させるための合成バイパス経路を通してのグリコール酸フラックスの増強
植物材料
Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ｃ．ｖ．「Ｐｅｔｉｔｅ  Ｈａｖａｎａ」を、標準方法論を用いたＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ媒介性形質転換を用いて（Ｇｌｏｗａｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ．、（２０１６）３９：９０８〜１７）、形質転換し、１８個のバイナリープラスミドが、表５に記載および列挙されているように、構築された。以下の：（ＴＳＲ）タルトロン酸セミアルデヒドレダクターゼ、（Ｓｐｍ）トウモロコシサプレッサー−ミュテータ−転位可能エレメントプロモーター（Ｍａｉｚｅ  Ｓｕｐｒｅｓｓｏｒ−ｍｕｔａｔｏｒ  ｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、（ＲｂｃＳ）Ｒｕｂｉｓｃｏ小サブユニットプロモーターおよびシグナルペプチド、（Ｏｃｓ）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍオパインシンターゼ、（ＧｄＤ）Ｅ．ｃｏｌｉグリコール酸デヒドロゲナーゼサブユニットＤ、（Ａｃｔ２）アクチン２プロモーターおよびターミネーター、（３５ｓ）カリフラワーモザイクウイルス３５ｓプロモーターおよびターミネーター、（Ｐｇｍ）ホスホグルコムターゼシグナルペプチド、（ＧｄＥ）Ｅ．ｃｏｌｉグリコール酸デヒドロゲナーゼサブユニットＥ、（ＧｄＦ）Ｅ．ｃｏｌｉグリコール酸デヒドロゲナーゼサブユニットＦ、（Ｇｃｌ）グリオキシル酸カルボリガーゼ、（ＧＯ）グリコール酸オキシダーゼ、（ＭＳ）リンゴ酸シンターゼ、（Ｃａｔ）カタラーゼ、（Ｎｏｓ）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍノピン（Ｎｏｐｉｎｅ）シンターゼプロモーターおよびターミネーター、（２×３５Ｓ）二重３５ｓプロモーター、（Ｕｂｉ）ユビキチンプロモーターが略語として表で利用されている。
【０１０４】
以前に報告されているように（Ｋｅｂｅｉｓｈ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００７）２５：５９３〜９９；Ｍａｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｆｒｏｎｔ．Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．、（２０１２））、バイパス経路１遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉに由来し、バイパス経路２遺伝子は、植物およびＥ．ｃｏｌｉ供給源に由来した。本発明者らは、グリコール酸デヒドロゲナーゼについてＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉに由来した遺伝子（配列番号４４）およびリンゴ酸シンターゼについてＣｕｃｕｒｂｉｔａ  ｍａｘｉｍａに由来した遺伝子（配列番号４２）を利用する異なる経路であるバイパス経路３を開発した。これらの遺伝子と共に、本発明者らは、Ｓｏｌゲノミクスネットワーク（ｓｏｌｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｎｅｔ）から引き出された３００ｂｐのエクソン配列（配列番号４６）を用いて設計されたＡ．ｔｈａｌｉａｎａ由来の色素体グリコール酸／グリセリン酸トランスポーターＰＬＧＧ１を標的にするＲＮＡｉモジュールを開発した。全てのバイナリープラスミドは、植物形質転換についての選択マーカーとしてＢＡＳＴＡ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ（ｂａｒ）遺伝子を含有した。最低限１０個の独立したＴ０形質転換が発生し、Ｔ１子孫を産生した。Ｔ−ＤＮＡコピー数を、デジタルｄｒｏｐｌｅｔ  ＰＣＲ分析によるか、またはｑＲＴ−ＰＣＲ分析（ｉＤＮＡ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｎｏｒｗｉｃｈ  ＵＫ）を通してかのいずれかで、Ｔ１上で決定した。これらの結果から、最低限５個の独立した形質転換事象を選択して、自家受粉させ、Ｔ２子孫を産生した。各形質転換事象について単一インサートホモ接合性系列を検証するために、再び、コピー数分析を実施した。
【０１０５】
【表５】
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【０１０６】
クロロフィル蛍光測定
タバコ種子を、管理環境チャンバー（Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｃｈａｍｂｅｒｓ、Ｃｈａｇｒｉｎ  Ｆａｌｌｓ、Ｏｈｉｏ、ＵＳＡ）内、１４時間昼（２５℃）／１０時間夜（２２℃）および５００μｍｏｌ  ｍ−２  ｓ−１の光強度で、必須ビタミンを含むムラシゲスクーク（ＭＳ）プレート上、環境大気下で発芽させた。発芽から８日後、実生プレートを、管理環境グロースチャンバー内の特注で組み立てられた低ＣＯ２チャンバーへ移した。光レベルを、２４時間、１２００μｍｏｌ  ｍ−２  ｓ−１へ増加させ、ＣＯ２濃度を３５μｂａｒ未満に維持した。Ｆｖ’／Ｆｍ’を、ＣＦ  Ｉｍａｇｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａ（ｗｗｗ．ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａ．ｃｏ．ｕｋ）を用いて各プレート上で決定した。最大フラッシュ強度は、８００ミリ秒間、６８００μｍｏｌ・ｍ−２  ｓ−１であった。以前に記載されているように（Ｓｏｕｔｈ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ（２０１７）２９：８０８〜８２３；Ｂａｄｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｆｕｎｃｔ．Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．（２００９）３６：８６７〜７３；Ｓｃｈｍｉｄｔ  ＆  Ｄｅｌａｎｅｙ、Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（２０１０）２８３：２３３〜４１）、各位置を定義するｆｌｕｏｒｉｍａｇｅｒソフトウェアプログラム内でコロニーを検出することにより、各個々の植物について画像値を得た。
【０１０７】
遺伝子発現およびタンパク質検出
植物を、下に記載された温室または圃場条件下で成長させた。５つの葉片を、系列あたり３つの植物から採取した（２．９ｃｍ２、約１００ｍｇ）。ＲＮＡおよびタンパク質を、同じ葉試料からＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  ＲＮＡ／タンパク質キット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ  ＧｍｂＨ  ＆  Ｃｏ．ＫＧ、Ｄｕｒｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて抽出した。ｃＤＮＡを、抽出されたＲＮＡからＱｕａｎｔｉｎｏｖａ逆転写酵素キット（ＱＩＡＧＥＮ、ＵＳＡ）を用いて作製した。それぞれ３つの技術的複製を含む最低限３つの生物学的複製を、全試料について用いた。遺伝子発現を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ  ｃｏｎｎｅｃｔリアルタイムＰＣＲシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＳＡ）を用いて分析した。転写産物の相対的変化を、導入遺伝子転写産物および標準対照遺伝子としてのＬ２５遺伝子へ方向づけられたプライマーを用いてΔΔＣｔ方法を用いて決定した（Ｂｒｏｏｋｓ  ａｎｄ  Ｆａｒｑｕｈａｒ、Ｐｌａｎｔａ（１９８５）１６５：３９７〜４０６）。ｃＤＮＡを、ＳＳＯ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）および表６に記載されたプライマー配列を用いて増幅した。
【０１０８】
【表６】
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【０１０９】
バイパス３からの総タンパク質、または液体窒素中で粉砕され、植物プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えた溶解バッファー（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．６、３００ｍＭスクロース、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中で再懸濁された凍結葉材料からの総タンパク質を、上記のＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎタンパク質／ＲＮＡキットを用いて抽出した。タンパク質を、タンパク質定量アッセイ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ  ＧｍｂＨ  ＆  Ｃｏ．ＫＧ、Ｄｕｒｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて定量した。レーンあたり３μｇのタンパク質を負荷し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分離した。ＰＡＧＥゲルをＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＳＡ）にＢｉｏ−Ｒａｄ  ｓｅｍｉ−ｄｒｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｓｙｓｔｅｍを用いて転写した。６％ミルクＴＢＳ−Ｔ溶液中でのブロッキング後、膜を、リンゴ酸シンターゼ（ＭＳ）およびＰＬＧＧ１（Ａｇｒｉｓｅｒａ、Ｖａｎｎａｓ、Ｓｗｅｄｅｎ）およびグリコール酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、ＵＳＡ）に対して産生されたカスタム抗体でインキュベートした。タンパク質負荷対照として、Ｒｕｂｉｓｃｏの大サブユニット（ＲｂｃＬ）に対して産生された市販の抗体を用いた（Ａｇｒｉｓｅｒａ、Ｖａｎｎａｓ、Ｓｗｅｄｅｎ）。その後の洗浄および抗ウサギ二次抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＵＳＡ）とのインキュベーション後、化学発光を、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＬＡＳ４０１０スキャナ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＵＳＡ）を用いて検出した。
【０１１０】
成長分析（温室）
光呼吸の３つのバイパスが成長能力および成長速度の増加を生させるかどうかを決定するために、茎の高さおよび乾燥重量バイオマスを決定した。単一インサートＴ２種子を、ＬＣ１  ｓｕｎｓｈｉｎｅ  ｍｉｘ（Ｓｕｎ  Ｇｒｏ  ２０２  Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ、Ａｇａｗａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）上で発芽させた。発芽から１０日後、実生を、徐放性肥料（Ｏｓｍｏｃｏｔｅ  Ｐｌｕｓ  １５／９／１２、Ｔｈｅ  Ｓｃｏｔｔｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ  ＬＬＣ、Ｍａｒｙｓｖｉｌｌｅ、ＯＨ、ＵＳＡ）を追加したＬＣ１  ｓｕｎｓｈｉｎｅ  ｍｉｘを含む４Ｌのポット（４００Ｃ、Ｈｕｍｍｅｒｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｅａｒｔｈ  Ｃｉｔｙ、ＭＯ、ＵＳＡ）に移した。ポットを温室内でランダム化し、各灌水前に位置を変化させた。温室内の光強度を、量子センサー（ＬＩ−１９０Ｒ、ＬＩ−ＣＯＲ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、Ｎｅｂｒａｓｋａ、ＵＳＡ）を用いて測定した。大気温度、相対湿度、および［ＣＯ２］を、複合型温度湿度センサー（ＨＭＰ６０−Ｌ、Ｖａｉｓａｌａ  Ｏｙｊ、Ｈｅｌｓｉｎｋｉ、Ｆｉｎｌａｎｄ）、および赤外線ガスアナライザ（ＳＢＡ−５、ＰＰｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｍｅｓｂｕｒｙ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いて測定した。全ての気候データを、データロガー（ＣＲ１０００、Ｃａｍｐｂｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ、ＵＳＡ）を用いて記録した。利用された温室成長条件は、文献（Ｋｒｏｍｄｉｊｋ  ｅｔ  ａｌ．、ｓｕｐｒａ）に以前報告されたものと同様であった。地上バイオマスを、茎の高さの決定後７週間目に採取し、２週間、乾燥させ、乾燥重量を各画分について決定した。
【０１１１】
２０１６年圃場実験
概念実験の立証として、各光呼吸バイパスデザインの効果を、イリノイ州中央において２０１６年期についての圃場条件下で評価した。バイパス３の５つの独立した形質転換事象、バイパス１の４つの事象、およびＷＴと比較して貧弱な性能により、バイパス２のたった２つの独立した形質転換を、２つの野生型（ＷＴ）および２つの空ベクター（ＥＶ）対照と共に、ランダム化されたブロックデザインに植えた。以前記載されているように（Ｋｒｏｍｄｉｊｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１６）３５４：８５７〜６１）、ホモ接合性単一インサートＴ２種子を、ｓｏｉｌ  ｍｉｘ（Ｓｕｎ  Ｇｒｏ  ２０２  Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ、Ａｇａｗａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を含有するポットにおいて２０１６年５月１４日に発芽させ、７日間、成長させて、その後、浮きトレイに移した。植物を、Ｕｎｉｖｅｒｓｔｉｙ  ｏｆ  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｆａｒｍ圃場ステーション（４０．１１°Ｎ、８８．２１  ２６１°Ｗ、Ｕｒｂａｎａ、ＩＬ、ＵＳＡ）へ、その圃場を記載されているように（Ｋｒｏｍｄｉｊｋ  ｅｔ  ａｌ．、ｓｕｐｒａ）準備した後、２０１６年６月６日に移植した。各ブロックは、３０ｃｍの間隔をあけた６×６であった。ブロックあたり内側の１６個の植物は、ＷＴ境栽に囲まれた、示されたトランスジェニック植物系列であった。ＷＴ植物の追加の２列の境栽がその実験を囲んだ。プロット内に置かれた６つの給水塔から必要に応じて灌水が提供された。光強度、大気温度、および降水量を含む気象データを、記載される２０１６年圃場季節について測定した（データ未呈示）。
【０１１２】
環境４００μｂａｒおよび低い１００μｂａｒ  ＣＯ２濃度における光合成の光飽和レベルを含む光合成の見かけの量子効率（Φａ）を、圃場への移植から１４〜２０日後、最も若い完全展開した葉において測定した。Φａを、示された［ＣＯ２］における光レベルに応答した同化作用測定値から決定した。ガス交換測定を、マニュアル（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ、ＵＳＡ）に概略が述べられているように、ガスケット漏れを補正した２ｃｍ２蛍光測定キュベットを有するＬＩ−ＣＯＲ  ６４００ＸＴを用いて実施した。ＣＯ２同化作用の測定を、１２００、３８０、１２０、６５、４０、３０、２５、１８、および１０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１の光強度において行い、同化作用を、各光レベルにおいて最低限１２０秒後に、記録した。Φａを、低い光レベルにおける同化作用の初期応答の傾きから計算した。同化作用の飽和レベル（Ａｓａｔ）を、示された［ＣＯ２］における１２００μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１測定値から決定した。茎の高さ、葉および茎のバイオマスを、定植後７週間目にプロットあたり８つの植物について決定した。茎の高さを評価した後、地上バイオマスを採取し、葉および茎の画分へ分けた。植物材料を、バイオマス測定の前に最低限２週間、乾燥させた。
【０１１３】
２０１７年圃場実験
農業条件下でのバイパス３の植物生産性への効果のより正確な評価を得るために、繰り返しランダム化されるブロック設計を、２０１７年圃場期に用いた。圃場プロットは、ブロックあたり７個のランダム化される６×６プロットを有する、５つの複製ブロックからなった。中央の１６個の植物は、ＷＴ境栽に囲まれた、試験されるトランスジェニック系列またはＷＴであった。３５個のプロット全体は、境栽としてのＷＴの追加の列により囲まれた。同じ収穫期からの単一インサートホモ接合性系列は、ＬＣ１  ｓｕｎｓｈｉｎｅ  ｍｉｘ上に蒔かれ、７日間、発芽した。７日後、上記のように、実生を浮きトレイへ移植した。浮きトレイへの移植から１４日後、植物を、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ、Ｕｒｂａｎａ、ＩＬ  ＵＳＡのＥｎｅｒｇｙ  ｆａｒｍ圃場ステーションへ、２０１７年６月２１日に移植した。灌水を必要に応じて、並列細流灌漑（滴下ライン）を用いて提供した。光強度、大気温度、および降水量を含む気象データを、２０１７年圃場期について記録した。Φａを決定するための光合成測定を２０１７年７月２〜５日、実施し、それと共に、同時期の間、最も若い完全展開した葉において光合成色素を採取した。
【０１１４】
Φａを、以前記載されているように（Ｋｒｏｍｄｉｊｋ  ｅｔ  ａｌ．、ｓｕｐｒａ）、実施した。簡単に述べれば、ガス交換測定を、上記のように、２ｃｍ２蛍光測定キュベットを有するＬＩ−ＣＯＲ  ６４００ＸＴを用いて実施した。光に対するＣＯ２同化作用応答の測定を、夜明け前に開始し、０、１０、１８、２５、３０、４０、６５、１２０、３８０、１２００、および２０００μｍｏｌ  ｍｏｌ−１の光強度において実施した。光合成の日周測定を、７月１４日、夜明け前から開始して実施し、ブロックあたり２つの植物について２時間ごとに測定した。光レベルおよび温度を、ＬＩ−ＣＯＲ  ６４００上のＰＡＲセンサーを用いた入射光レベルおよび内蔵温度センサーに基づいて、測定前に決定した。ＣＯ２濃度を、４００ｐｐｍに維持した。日周測定を夕暮れ後まで続けた。発芽後４９日目、プロットあたり８つの植物を、全ての５つの複製ブロックから採取した。地上バイオマスを、葉および茎画分へ分け、バイオマス測定の前に２週間、乾燥させた。デンプン分析について、７月１４日に収集された１０ｍｇの葉材料を液体窒素中で凍結させ、処理まで−８０℃で保存した。デンプンを、Ｅｎｚｙｃｈｒｏｍデンプンアッセイキット（ｂｉｏａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてアッセイした。比色測定を、Ｂｉｏｔｅｋ  ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ  Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ、ＵＳＡ）において実施した。
【０１１５】
ガス交換
ＣＯ２用量応答から正味光合成同化速度を決定するために、週齢７週間のＮ．ｔａｂａｃｕｍ植物の底面から５番目の葉を、ＬＩ−ＣＯＲ  ６８００赤外線ガスアナライザ（Ｌｉ−Ｃｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ、ＵＳＡ）の蛍光キュベットへクランプし、葉温度を２５℃に管理し、光強度を１５００μｍｏｌ  ｍ−２  ｓ−１に設定した。定常状態に達するように葉を４００μｍｏｌ  ｍｏｌ−１で気候順化した。応答曲線のＣＯ２濃度を、４００、２００、１００、５０、３０、４００、６００、８００、１０００、１５００、２０００μｍｏｌ  ｍｏｌ−１に設定し、同化作用が定常状態に達した時に、測定値をとった。カルボキシル化の最大速度（Ｖｃｍａｘ）、最大電子伝達速度（Ｊｍａｘ）、およびミトコンドリア呼吸速度を決定するために、収集されたＣＯ２応答曲線から無限葉肉伝導度を想定した温度補正を有する葉光合成のモデルを用いた。Γ＊およびＲｄ測定を、一般的な交差方法を用い、ガス交換を、蛍光チャンバーを使用するＬＩ−ＣＯＲ  ６８００（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて実施した。Γ＊を、様々な亜飽和照射量下での光合成のＣＯ２応答を測定することにより、一般的な交差方法を用いて測定した。一般的な交差は、Ｃｉ＊およびＲｄのより正確かつ一貫した値を生じるために、傾き切片回帰を用いて決定した（Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ．（２０１６）３９：１１９８〜１２０３）。植物を、光合成が定常に達するまで、１５０μＢａｒ  ＣＯ２において、２５０μｍｏｌ  ｍ−２  ｓ−１光下で気候順化させ、１５０、１２０、９０、７０、５０、および３０μＢａｒ  ＣＯ２において２５０、１６５、１２０、８０、および５０μｍｏｌ  ｍ−２  ｓ−１の照射量下で測定した。以前報告されているように（Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、ｓｕｐｒａ）、ｘ交点を、Γ＊に変換した。
【０１１６】
統計解析
全ての統計解析を、Ｏｒｉｇｉｎ  ｐｒｏ  ２０１６（バージョン９．３．２２６、Ｏｒｉｇｉｎ  ｌａｂ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いて実施した。Ｆｖ’／Ｆｍ’測定について、各プレートは、最低限１０個の実生を含有し、データは平均値を示す。有意性を、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）により評価した。遺伝子発現の相対変化を、温室または圃場のいずれかで成長した試料からの生物学的複製あたり３つの技術的複製に関して、一元配置ＡＮＯＶＡにより解析した。温室バイオマスおよび茎の高さ実験を、最低限８つの生物学的複製に関して、一元配置ＡＮＯＶＡにより解析した。２０１６年圃場期からのバイオマスおよび茎の高さ実験を、８つの生物学的複製に関して、一元配置ＡＮＯＶＡにより解析した。２０１７年圃場期からのバイオマスデータを、ブロックあたり遺伝子型につき８つの生物学的複製に関して、二元配置ＡＮＯＶＡ（遺伝子型×ブロック）により解析した。温室光合成測定値を、測定あたり３つの生物学的に関して、一元配置ＡＮＯＶＡにより解析し、圃場光合成測定値を、プロットあたり２つの植物複製および５つのランダム化された複製ブロックに関して二元配置ＡＮＯＶＡにより解析した。図に示されているように、全てのＡＮＯＶＡ検定を、Ｐ＜０．０５またはそれ未満で実施した。全てのＡＮＯＶＡ解析の後に、平均値比較のためにＴｕｋｅｙのｐｏｓｔ−ｈｏｃ検定を行った。
【０１１７】
結果および分析
Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍを、５つの遺伝子を発現する３つの異なる光呼吸バイパスデザインで形質転換した（図１４、表５）。バイパス１およびバイパス２は、文献において以前報告された。しかしながら、新しく開発されたバイパス３は、グリコール酸オキシダーゼの代わりにＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉグリコール酸デヒドロゲナーゼ（配列番号４５）を利用して、設計され、グリコール酸デヒドロゲナーゼは、有益なことに、グリコール酸からグリオキシル酸への変換中の副産物としての過酸化水素を生成しない（Ａｂｏｌｅｍｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２０１４）７９：２５〜３０）。
【０１１８】
単一遺伝子挿入の試験と違って、多重遺伝子構築物は、デザインされた経路を通ってフラックスを最適化するために遺伝子発現の協調の増加を必要とし得る。光呼吸バイパスの効力を最適化するプロモーター遺伝子の組合せの先験的知識を知らずに、本発明者らは、報告された光呼吸バイパス設計についての複数のプロモーター遺伝子組合せを利用し、バイパス１の５つのイテレーション、バイパス２の３つのイテレーション、およびバイパス３の単一のイテレーションを作製した（表５）。光呼吸バイパス遺伝子の発現に加えて、長いヘアピンＲＮＡｉ構築物（配列番号４６）を設計し、バイパス経路を通ってのフラックスを増加させる目的で、葉緑体グリコール酸／グリセリン酸トランスポーターＰＬＧＧ１の発現を低下させるために、多重遺伝子構築物のライブラリーに加えた（図１４、表５）。全体で、設計された１８個の独立した構築物のうちの１７個が、成功裏に形質転換され、ＰＬＧＧ１トランスポーターを標的にするＲＮＡｉモジュールの包含有りまたは無しで、バイパス１、２、および３の機能を試験するために、それらを調べた。
【０１１９】
光呼吸ストレスが誘発した光化学系ＩＩへの損傷は、光におけるＰＳＩＩの最大作動効率（すなわち、Ｆｖ’／Ｆｍ’）の減少によりクロロフィル蛍光を用いて可視化することができる（Ｓｏｕｔｈ  ｅｔ  ａｌ．、ｓｕｐｒａ；Ｂａｄｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、ｓｕｐｒａ）。見かけの光呼吸効率の指標として蛍光におけるこれらの変化を用いて、各光呼吸バイパスデザインを、高い光強度（１２００μｍｏｌ  ｍ−２  ｓ−１）およびほぼゼロ濃度のＣＯ２における２４時間の成長後に、スクリーニングし、野生型（ＷＴ）および空ベクター（ＥＶ）対照と比較した（図１５Ａおよび１５Ｂ）。全体として、バイパス１およびバイパス３のバージョンで形質転換された植物は、ＷＴおよびＥＴ対照と比較して見かけの光呼吸効率の向上を示した（図１５Ｂ）。この最初のスクリーニングから見かけの光呼吸効率の増強を実証した系列を、温室と圃場の両方の設定におけるさらなる特徴づけのために各設計から選択した。
【０１２０】
多重遺伝子構築物設計の最初の評価の間およびその後、多くの表現型が、独立した挿入または準最適に設計されたプロモーター遺伝子組合せかのいずれかに起因して、貧弱な表現型を示し、複数の挿入事象が同じ有害な表現型を有した。
【０１２１】
スクリーニングの成功の後、光呼吸バイパス経路の遺伝子発現を、温室および圃場試験においてさらに試験された各構築物について検証した（図１６Ａならびに図１７Ａおよび１７Ｂ）。各構築物デザインの最低限３つの独立した形質転換を、温室条件下で評価した。本発明者らは、全ての３つのバイパスデザインにおいて乾燥重量バイオマスの増加を観察し、他の植物種における以前報告された所見（Ｄａｌａｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｆｕｅｌｓ（２０１５）８；Ｋｅｂｅｉｓｈ  ｅｔ  ａｌ．、ｓｕｐｒａ；Ｍａｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、ｓｕｐｒａ；Ｎｏｌｋｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．（２０１４）１２：７３４〜４２；Ａｈｍａｄ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｒｅｐ．（２０１６）１０：２６９〜７６）と同様に、光呼吸バイパスの成功を示唆した。全体として、温室条件下で、新規なバイパス３由来の植物は、バイパス１および２系列由来の植物よりバイオマスにおける予想外に大きい差を示し、本発明者らは、ＰＬＧＧ１を標的にするＲＮＡｉモジュールが存在する場合、バイパス３においてさらなる増強を観察し、全体のバイオマスは、ＷＴに対して多くも２３％、ならびにバイパス１および２系列それぞれと比較して、１３％および７％増加した（図２３）。圃場条件下で試験された場合、ＰＬＧＧ１を標的にするＲＮＡｉを有するバイパス３は、再び、ＷＴ対照と比較して多くも２７％、全体の乾燥重量バイオマスの最も有意な増加を示した（図１８Ｂ）。
【０１２２】
その後、温室試験からの有望な系列を、２０１６年、単一ブロックのレプリケート菜園実験において、農業条件下で光合成効率および植物生産性の増加について試験した。本発明者らは、バイパス設計を有する植物が、天然光呼吸経路を通る代謝フラックスの減少に起因して、光合成の量子効率（Φａ）の増加を示すだろうと仮定した。全体として、本発明者らは、ＰＬＧＧ１トランスポーターを標的にするＲＮＡｉモジュールを含有するものを含む、全てのバイパス系列由来の植物においてΦａの増加を観察した（図１９Ａ〜１９Ｃ）。本発明者らは。また、光呼吸ストレス（すなわち、低い［ＣＯ２］）条件下での性能を測定し、バイパス３系列由来の植物が、光合成の光飽和時速度および量子効率の増加を生じたことを見出し、再び、これは、バイパスデザインの成功に関連した光呼吸ストレスの軽減を示している。
【０１２３】
蛍光スクリーニング、温室研究と２０１６年の圃場期研究を合わせると、バイパス３は、全体の植物成長においてＷＴ、ＥＶ、ならびにバイパス１および２の性能を上回ることができたことが示され、この設計は、さらなる特徴づけのために進められた。バイパス３デザインを、特注作製された抗体を用いて、ＣｒＧＤＨおよびＭＳの存在、加えて、ＰＬＧＧ１タンパク質の低下を確認するためにウェスタンブロット分析で確認した（図１６Ｂ）。本発明者らは、さらに、温室条件下での植物内での光呼吸バイパス３の生理的影響を特徴づけた。本発明者らは、カルボキシル化の最大速度（Ｖｃｍａｘ）およびＲｕＢＰ律速の電子伝達の速度（Ｊｍａｘ）を、内部ＣＯ２濃度（Ｃｉ）に基づいて光合成速度（Ａ）をモデル化することにより、決定した。バイパス３は、ＰＬＧＧ１  ＲＮＡｉモジュール有りと無しのどちらにおいても、ＶｃｍａｘおよびＪｍａｘの増加を示し、光呼吸ストレスが最も高い、より低い［ＣＯ２］におけるより効率的な光合成を示唆した（図２０Ａ、２０Ｂ、２０Ｄ）。本発明者らは、光呼吸バイパスが、光合成補償点、または光合成に利用可能な内部［ＣＯ２］が昼間の呼吸で生成されるＣＯ２と等しい点を低くするだろうと仮定した。実際、本発明者らは、本発明者らのバイパス３植物において、ＷＴ対照と比較して、より低いΓ＊測定値を観察し、光呼吸バイパスが、おそらく、導入された経路における脱炭酸ステップ後に予想される葉緑体内のＣＯ２の濃度の増加に起因して、より低い［ＣＯ２］値において光合成効率を増加させることを示唆した（図１４）。
【０１２４】
バイパス３が農業条件下でどのように機能するかをより正確に評価するために、より大きい複製ブロック設計を、２０１７年圃場期の間において用いた。ＰＬＧＧ１を標的にするＲＮＡｉモジュール有りおよび無しの３つの独立した形質転換バイパス系列を含む、５つのランダム化された複製ブロックを試験した。２０１７年圃場期の間、本発明者らは、葉、茎、および全体の乾燥重量バイオマス、真昼のデンプン含有量、光合成の見かけの量子効率（Φａ）を評価した。全体として、バイパス３は、全体の乾燥重量バイオマスの２５％増加（２２％葉、４４％茎）を示し、ＰＬＧＧ１  ＲＮＡｉ有りのバイパス３は、全体の乾燥重量バイオマスの４１％増加（３３％葉、５０％茎）を示した（図２１Ａ）。加えて、バイパス３設計におけるＰＬＧＧ１  ＲＮＡｉモジュールの包含は、バイパス３単独と比較して、葉および全体の乾燥重量バイオマスの有意な増加を示した（図２１Ａ）。真昼のデンプン総含有量は、ＷＴ対照と比較して、両方のバイパス３設計において、それぞれ、およそ７０％および４２％上昇した（図２１Ｂ）。光合成の見かけの量子効率は、両方のバイパス設計において増加し、バイパス３単独において有意に増加した（図２１Ｃ）。
【０１２５】
両方のバイパス３設計における光合成の量子効率の増加および補償点の減少に関して、本発明者らは、明期を通しての正味の光合成総量が、ＷＴ対照と比較して高く、その結果としてバイオマスの増加が観察されたと仮定した（図１８Ｂおよび図２１Ａ）。これを決定するために、本発明者らは、総合した、ＣＯ２の日周同化作用を測定し、ＷＴと比較して、両方のバイパスデザインにおける正味の同化作用総量（Ａ’）、および光合成へ使用された電子の総数（Ｊ’）の有意な増加を観察した（図２１Ｄおよび図２１Ｅ）。
【０１２６】
全体として、本発明者らの合成生物学アプローチは、本発明者らが、複数の光呼吸バイパス設計を設計し、構築し、試験し、異なるプロモーター遺伝子組合せを比較することを可能にした。加えて、これは、最終結果が明瞭には予測できない農業関連条件下で、光呼吸バイパスの効果を記載する初めての研究であった。最初のものであり、かつ現在、最も多く報告されたデザインであったバイパス１設計は、実際、植物成長および乾燥重量バイオマスの向上を示している（図１８Ｂ）。比較すると、バイパス１は、バイパス３より驚くほど生産性が低く、温室と圃場の両方の設定においてＰＬＧＧ１  ＲＮＡｉモジュールが加えられた場合、バイパス１を適所に有することによる向上は、低下した（図１８Ａおよび１８Ｂ）。これらのデータは、天然の光呼吸経路を通してのフラックスの低下がある場合、すなわち、ＰＬＧＧ１発現がサイレンシングの標的にされた、またはノックアウト系統において発現していない場合、バイパス１代謝経路が、グリコール酸を効果的に変換することができないことを示唆している。バイパス２は、植物生産性において最も低い向上を示し、多くのトランスジェニック系列は、発育不良および黄葉を生じた。副産物としての過酸化水素の生成およびカタラーゼの非最適化発現（それは、以前、示唆されていた）は、バイパス２表現型の原因である可能性が高い（Ｍａｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、ｓｕｐｒａ）。
【０１２７】
Ｃ．ｍａｘｉｍａリンゴ酸シンターゼおよびＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉグリコール酸デヒドロゲナーゼ酵素を含有する光呼吸バイパス３は、植物バイオマスを有意に増加させ、文献において以前報告された、可能性のあるバイパス経路に対して、光合成効率の驚くべき向上を実証した。加えて、結果としてＰＬＧＧ１ノックアウト系統と同様の効果を生じさせるＰＬＧＧ１葉緑体グリコール酸グリセリン酸トランスポーターの発現を低下させるＲＮＡｉモジュールの包含（図２２）は、バイパス３単独と比較して収穫後の乾燥重量バイオマスを有意に増加させた（図１８Ｂ）。
【０１２８】
本発明は、例証された実施形態の詳細を参照して記載されているが、これらの詳細は、添付の特許請求の範囲において定義されているような本発明の範囲を限定することを意図するものではない。排他的な権利または特権が主張されている本発明の実施形態は、以下のように定義される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２１Ｄ】
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【図２１Ｅ】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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