(57)【要約】  本明細書では、リガンド誘導性遺伝子スイッチポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに宿主細胞内の、異種遺伝子およびインターロイキンの発現をモジュレートするための、遺伝子スイッチポリペプチドを含む系が開示される。本明細書で記載される組成物、方法、および系は、サイトカインおよび抗原結合性ポリペプチドを含むがこれらに限定されないポリペプチドの、リガンド依存性の発現を容易とする。
2020513777.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種遺伝子発現のリガンド誘導性制御のための、遺伝子スイッチポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組成物であって、前記遺伝子スイッチポリペプチドが、
ａ）第１の核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたＤＮＡ結合性ドメインを含む、第１の遺伝子スイッチポリペプチド、および
ｂ）第２の核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたトランス活性化ドメインを含む、第２の遺伝子スイッチポリペプチド
を含み、前記第１の遺伝子スイッチポリペプチドと、前記第２の遺伝子スイッチポリペプチドとが、リンカーにより連結されている、組成物。
【請求項２】
異種遺伝子発現のリガンド誘導性制御のための遺伝子スイッチ系をコードする、１または複数のポリヌクレオチドを含む組成物であって、前記遺伝子スイッチ系が、
ａ）トランス活性化ドメインを含む、第１の遺伝子スイッチポリペプチド；
ｂ）リガンド結合性ドメインへと融合させたＤＮＡ結合性ドメインを含む、第２の遺伝子スイッチポリペプチド；および
ｃ）少なくとも１つの異種遺伝子ポリペプチド
を含み、前記第１の遺伝子スイッチポリペプチド、前記第２の遺伝子スイッチポリペプチド、および前記異種遺伝子ポリペプチドのうちの１つが、ポリペプチドリンカーにより、前記第１の遺伝子スイッチポリペプチド、前記第２の遺伝子スイッチポリペプチド、および前記異種遺伝子ポリペプチドのうちの別の１つへと連結されており、前記ポリペプチドリンカーが、切断型リンカーまたはリボソームスキッピングリンカー配列を含む、組成物。
【請求項３】
前記ＤＮＡ結合性ドメインが、ＧＡＬ４（ＧＡＬ４  ＤＢＤ）、ＬｅｘＡ  ＤＢＤ、転写因子ＤＢＤ、ステロイド／甲状腺ホルモン核内受容体スーパーファミリーメンバーＤＢＤ、細菌ＬａｃＺ  ＤＢＤ、および酵母ＤＢＤのうちの少なくとも１つを含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＤＮＡ結合性ドメインが、配列番号１８４に示される配列を有する、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記トランス活性化ドメインが、ＶＰ１６トランス活性化ドメインおよびＢ４２酸性活性化因子トランス活性化ドメインのうちの少なくとも１つを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記トランス活性化ドメインが、配列番号１８１に示される配列を有する、請求項１から５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記第１の核内受容体リガンド結合性ドメイン、前記第２の核内受容体リガンド結合性ドメイン、および前記リガンド結合性ドメインのうちの少なくとも１つが、エクジソン受容体（ＥｃＲ）、ユビキタス受容体、オーファン受容体１、ＮＥＲ−１、ステロイドホルモン核内受容体１、レチノイドＸ受容体相互作用性タンパク質１５、肝臓Ｘ受容体β、ステロイドホルモン受容体様タンパク質、肝臓Ｘ受容体、肝臓Ｘ受容体α、ファルネソイドＸ受容体、受容体相互作用性タンパク質１４、およびファルネソール受容体のうちの少なくとも１つを含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記第１の核内受容体リガンド結合性ドメイン、前記第２の核内受容体リガンド結合性ドメイン、および前記リガンド結合性ドメインのうちの少なくとも１つが、配列番号１８５〜１８６のうちのいずれか１つに示される配列を有する、請求項１から７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記第１の遺伝子スイッチポリペプチドが、ＥｃＲ核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたＧＡＬ４  ＤＢＤを含み、前記第２の遺伝子スイッチポリペプチドが、レチノイド受容体Ｘ（ＲＸＲ）核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたＶＰ１６トランス活性化ドメインを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ＥｃＲ核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させた前記Ｇａｌ４  ＤＢＤが、配列番号１８５〜１８６または１８７〜１８８のうちのいずれか１つに示される配列を有し、前記レチノイド受容体Ｘ（ＲＸＲ）核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させた前記ＶＰ１６トランス活性化ドメインが、配列番号１８３に示される配列を有する、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記リンカーが、切断型リンカー、リボソームスキッピングリンカー配列、またはＩＲＥＳリンカーである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記リンカーが、ＩＲＥＳリンカーであり、前記ＩＲＥＳリンカーが、配列番号１８〜１９のうちのいずれか１つに示される配列を有する、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記リンカーが、切断型リンカーまたはリボソームスキッピングリンカー配列である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記切断型リンカーまたは前記リボソームスキッピングリンカー配列が、２Ａリンカー、ｐ２Ａリンカー、Ｔ２Ａリンカー、Ｆ２Ａリンカー、Ｅ２Ａリンカー、ＧＳＧ−２Ａリンカー、ＧＳＧリンカー、ＳＧＳＧリンカー、フューリンリンクリンカー変異体およびこれらの誘導体のうちの１または複数を含む、請求項２または１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記切断型リンカーまたは前記リボソームスキッピングリンカー配列が、配列番号１４６〜１６２のうちのいずれか１つに示される配列を有する、請求項２または１３に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ポリヌクレオチドまたは前記１または複数のポリヌクレオチドが、抗原結合性ポリペプチドをさらにコードする、請求項１から１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記抗原結合性ポリペプチドが、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）およびＴ細胞受容体のうちの少なくとも１つを含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記抗原結合性ポリペプチドが、ＣＡＲを含み、前記ＣＡＲが、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＢＣＭＡ、ＣＤ４４、α−葉酸受容体、ＣＡＩＸ、ＣＤ３０、ＲＯＲ１、ＣＥＡ、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４０、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、葉酸結合性タンパク質、ＧＤ２、ＧＤ３、ＩＬ−１３Ｒ−ａ２、ＫＤＲ、ＥＤＢ−Ｆ、メソテリン、ＣＤ２２、ＥＧＦＲ、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−１６、ＭＡＧＥ−Ａ１、ｈ５Ｔ４、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ−７２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ１２３、およびＶＥＧＦ−Ｒ２のうちの少なくとも１つに結合することが可能である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記抗原結合性ポリペプチドが、ＣＡＲを含み、前記ＣＡＲが、配列番号２１０〜２４４のうちのいずれか１つに示される配列を有する、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２０】
前記ポリヌクレオチドまたは前記１または複数のポリヌクレオチドが、細胞タグをさらにコードする、請求項１６から１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記細胞タグが、ＨＥＲ１切断型変異体またはＣＤ２０切断型変異体のうちの少なくとも１つを含む、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記細胞タグが、配列番号１８９〜２０２のうちのいずれか１つに示される配列を有する、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２３】
前記第１の遺伝子スイッチポリペプチド、前記第２の遺伝子スイッチポリペプチド、前記抗原結合性ポリペプチド、および前記細胞タグのうちの少なくとも１つの発現が、プロモーターによりモジュレートされ、前記プロモーターが、組織特異的プロモーターもしくはＥＦ１Ａプロモーター、またはこれらの機能的な変異体である、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２４】
前記プロモーターが、配列番号５８〜６０のうちのいずれか１つに示される配列を有するＥＦ１Ａプロモーター、またはこの機能的な変異体である、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記プロモーターが、組織特異的プロモーターであり、前記組織特異的プロモーターが、Ｔ細胞特異的応答エレメントを含む、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２６】
前記組織特異的プロモーターが、１または複数のＮＦＡＴ応答エレメントを含む、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記ＮＦＡＴ応答エレメントが、配列番号５１〜５７のうちのいずれか１つに示される配列を有する、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記組成物が、異種遺伝子ポリペプチドをコードする、第２のポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２９】
前記異種遺伝子ポリペプチドが、サイトカイン、細胞タグ、およびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のうちの少なくとも１つを含む、請求項２または２８に記載の組成物。
【請求項３０】
前記サイトカインは、１つのサイトカインを含み、前記サイトカインが、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、またはＩＬ−１５変異体の融合体のうちの少なくとも１つを含む、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
前記サイトカインが、分泌形態にある、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
前記サイトカインが、膜結合形態にある、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３３】
前記サイトカインが、配列番号２０３〜２０９のうちのいずれか１つに示される配列を有する、請求項３０から３２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３４】
前記少なくとも１つの異種遺伝子ポリペプチドの発現が、誘導性プロモーターによりモジュレートされる、請求項２および２８から３３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３５】
前記誘導性プロモーターが、配列番号４０〜６４のうちのいずれかにおいて示される配列を有する、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３６】
前記誘導性プロモーターが、前記第１の遺伝子スイッチポリペプチド、および前記第２の遺伝子スイッチポリペプチドのうちの少なくとも１つによりモジュレートされる、請求項３４または３５に記載の組成物。
【請求項３７】
請求項１に記載のポリヌクレオチド、または請求項２に記載の、１もしくは複数のポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つを含むベクター。
【請求項３８】
前記ベクターが、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、または非ウイルスベクターである、請求項３７に記載のベクター。
【請求項３９】
前記非ウイルスベクターが、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンである、請求項３８に記載のベクター。
【請求項４０】
エフェクター細胞内の異種遺伝子の発現を調節する方法であって、
前記エフェクター細胞へと、（ｉ）リガンド結合性ドメインへと融合させたＤＮＡ結合性ドメインを含む、第１の遺伝子スイッチポリペプチド、（ｉｉ）トランス活性化ドメインを含む、第２の遺伝子スイッチポリペプチド、（ｉｉｉ）前記異種遺伝子によりコードされる異種遺伝子ポリペプチド、ならびに（ｉｖ）切断型リンカー配列またはリボソームスキッピングリンカー配列を含むポリペプチドリンカーをコードする、１または複数のポリヌクレオチドを導入するステップであって、前記ポリペプチドリンカーが、前記第１の遺伝子スイッチポリペプチド、前記第２の遺伝子スイッチポリペプチド、および前記異種遺伝子ポリペプチドのうちの１つを、前記第１の遺伝子スイッチポリペプチド、前記第２の遺伝子スイッチポリペプチド、および前記異種遺伝子ポリペプチドのうちの別の１つへと連結する、ステップと；
前記エフェクター細胞を、前記異種遺伝子の発現を誘導するのに十分な量のリガンドと接触させるステップと
を含む方法。
【請求項４１】
前記１または複数のポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、抗原結合性ポリペプチドをさらにコードする、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記抗原結合性ポリペプチドが、標的細胞の、所定の細胞表面タンパク質に選択的に結合する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記標的細胞が、哺乳動物細胞である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記標的細胞が、腫瘍細胞である、請求項４２または４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記所定の細胞表面タンパク質が、腫瘍抗原である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記エフェクター細胞を、前記リガンドと接触させる前記ステップの前に、前記抗原結合性ポリペプチドが、前記標的細胞の、前記所定の細胞表面タンパク質に選択的に結合する、請求項４２から４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記エフェクター細胞を、前記リガンドと接触させる前記ステップの前に、少なくとも７日間にわたり、前記エフェクター細胞を、前記標的細胞の、前記所定の細胞表面タンパク質へと曝露する、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記抗原結合性ポリペプチドによる、前記所定の細胞表面タンパク質への結合が、前記エフェクター細胞を活性化させる、請求項４２から４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記抗原結合性ポリペプチドが、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）およびＴ細胞受容体のうちの少なくとも１つを含む、請求項３８から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記抗原結合性ポリペプチドが、ＣＡＲを含み、前記ＣＡＲが、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＢＣＭＡ、ＣＤ４４、α−葉酸受容体、ＣＡＩＸ、ＣＤ３０、ＲＯＲ１、ＣＥＡ、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４０、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、葉酸結合性タンパク質、ＧＤ２、ＧＤ３、ＩＬ−１３Ｒ−ａ２、ＫＤＲ、ＥＤＢ−Ｆ、メソテリン、ＣＤ２２、ＥＧＦＲ、ＭＵＣ−１、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＵＣ−１６、ｈ５Ｔ４、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ−７２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ１２３、およびＶＥＧＦ−Ｒ２のうちの少なくとも１つに結合することが可能である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記抗原結合性ポリペプチドが、ＣＡＲを含み、前記ＣＡＲが、配列番号２１０〜２４４のうちのいずれか１つに示される配列を有する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記異種遺伝子ポリペプチドが、前記抗原結合性ポリペプチドを含む、請求項３８から５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記１または複数のポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、細胞タグをさらにコードする、請求項３７から５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記細胞タグが、ＨＥＲ１切断型変異体およびＣＤ２０切断型変異体のうちの少なくとも１つを含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記細胞タグが、配列番号１８９〜２０２のうちのいずれか１つに示される配列を有する、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記異種遺伝子ポリペプチドが、前記細胞タグを含む、請求項５３から５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記１または複数のポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、サイトカインをさらにコードする、請求項３７から５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記サイトカインが、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、またはＩＬ−１５変異体の融合体のうちの少なくとも１つを含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記サイトカインが、分泌形態にある、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記サイトカインが、膜結合形態にある、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
前記サイトカインが、配列番号２０３〜２０９のうちのいずれか１つに示される配列を有する、請求項５７から６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記異種遺伝子ポリペプチドが、前記サイトカインを含む、請求項５７から６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記異種遺伝子ポリペプチドの発現が、誘導性プロモーターによりモジュレートされる、請求項３７から６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記誘導性プロモーターが、配列番号４０〜６４のうちのいずれか１つに示される配列を有する、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記ＤＮＡ結合性ドメインが、ＧＡＬ４（ＧＡＬ４  ＤＢＤ）、ＬｅｘＡ  ＤＢＤ、転写因子ＤＢＤ、ステロイド／甲状腺ホルモン核内受容体スーパーファミリーメンバーＤＢＤ、細菌ＬａｃＺ  ＤＢＤ、および酵母ＤＢＤのうちの少なくとも１つを含む、請求項３７から６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記ＤＮＡ結合性ドメインが、配列番号１８４に示される配列を有する、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
前記トランス活性化ドメインが、ＶＰ１６トランス活性化ドメインおよびＢ４２酸性活性化因子トランス活性化ドメインのうちの少なくとも１つを含む、請求項３７から６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記トランス活性化ドメインが、配列番号１８１に示される配列を有する、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記第１の遺伝子スイッチポリペプチドおよび第２の遺伝子スイッチポリペプチドのうちの少なくとも１つが、前記ＤＮＡ結合性ドメインに結合することが可能な応答エレメントをさらに含む、請求項３７から６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記リガンド結合性ドメインが、エクジソン受容体（ＥｃＲ）、ユビキタス受容体、オーファン受容体１、ＮＥＲ−１、ステロイドホルモン核内受容体１、レチノイドＸ受容体相互作用性タンパク質１５、肝臓Ｘ受容体β、ステロイドホルモン受容体様タンパク質、肝臓Ｘ受容体、肝臓Ｘ受容体α、ファルネソイドＸ受容体、受容体相互作用性タンパク質１４、およびファルネソール受容体のうちの少なくとも１つを含む、請求項３７から６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
前記リガンド結合性ドメインが、配列番号１８５〜１８６のうちのいずれか１つに示される配列を有する、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記第１の遺伝子スイッチポリペプチドが、ＥｃＲ核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたＧＡＬ４  ＤＢＤを含み、前記第２の遺伝子スイッチポリペプチドが、レチノイド受容体Ｘ（ＲＸＲ）核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたＶＰ１６トランス活性化ドメインを含む、請求項３７から７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
ＥｃＲへと融合させた前記Ｇａｌ４  ＤＢＤが、配列番号１８５〜１８６のうちのいずれか１つに示される配列を有し、前記レチノイド受容体Ｘ（ＲＸＲ）核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたＶＰ１６トランス活性化ドメインが、配列番号１８３に示される配列を有する、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記リガンドが、
（２Ｓ，３Ｒ，５Ｒ，９Ｒ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｒ）−１７−［（２Ｓ，３Ｒ）−３，６−ジヒドロキシ−６−メチルヘプタン−２−イル］−２，３，１４−トリヒドロキシ−１０，１３−ジメチル−２，３，４，５，９，１１，１２，１５，１６，１７−デカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−６−オン；
Ｎ’−（３，５−ジメチルベンゾイル）−Ｎ’−［（３Ｒ）−２，２−ジメチル−３−ヘキサニル］−２−エチル−３−メトキシベンゾヒドラジド；
５−メチル−２，３−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］ジオキシン−６−カルボン酸Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−Ｎ’−（１−エチル−２，２−ジメチル−プロピル）−ヒドラジド；
５−メチル−２，３−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］ジオキシン−６−カルボン酸Ｎ’−（３，５−ジメトキシ−４−メチル−ベンゾイル）−Ｎ’−（１−エチル−２，２−ジメチル−プロピル）−ヒドラジド；
５−メチル−２，３−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］ジオキシン−６−カルボン酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；
５−メチル−２，３−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］ジオキシン−６−カルボン酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメトキシ−４−メチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；
５−エチル−２，３−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］ジオキシン−６−カルボン酸Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−Ｎ’−（１−エチル−２，２−ジメチル−プロピル）−ヒドラジド；
５−エチル−２，３−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］ジオキシン−６−カルボン酸Ｎ’−（３，５−ジメトキシ−４−メチル−ベンゾイル）−Ｎ’−（１−エチル−２，２−ジメチル−プロピル）−ヒドラジド；
５−エチル−２，３−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］ジオキシン−６−カルボン酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；
５−エチル−２，３−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］ジオキシン−６−カルボン酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメトキシ−４−メチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；
３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−エチル−２，２−ジメチル−プロピル）−Ｎ’−（３−メトキシ−２−メチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；
３，５−ジメトキシ−４−メチル−安息香酸Ｎ−（１−エチル−２，２−ジメチル−プロピル）−Ｎ’−（３−メトキシ−２−メチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；
３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３−メトキシ−２−メチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；
３，５−ジメトキシ−４−メチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３−メトキシ−２−メチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；
３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−エチル−２，２−ジメチル−プロピル）−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド；
３，５−ジメトキシ−４−メチル−安息香酸Ｎ−（１−エチル−２，２−ジメチル−プロピル）−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド；
３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド；
３，５−ジメトキシ−４−メチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド；
２−メトキシ−ニコチン酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ペンチル）−Ｎ’−（４−エチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；
３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（２，２−ジメチル−１−フェニル−プロピル）−Ｎ’−（４−エチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；
３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ペンチル）−Ｎ’−（３−メトキシ−２−メチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；および
３，５−ジメトキシ−４−メチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ペンチル）−Ｎ’−（３−メトキシ−２−メチル−ベンゾイル）−ヒドラジド
のうちの少なくとも１つを含む、請求項３７から７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
前記異種遺伝子の前記発現が、前記リガンドの非存在下において、前記リガンドの存在下における発現と比較して低減されるか、または消失する、請求項３７から７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
前記異種遺伝子の前記発現が、さらなる量の前記リガンドを施すことにより回復する、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記第１の遺伝子スイッチポリペプチドおよび第２の遺伝子スイッチポリペプチドのうちの少なくとも１つの発現が、プロモーターによりモジュレートされ、前記プロモーターが、組織特異的プロモーターもしくはＥＦ１Ａプロモーター、またはこれらの機能的な変異体である、請求項３７から７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
前記プロモーターが、配列番号５８〜６０のうちのいずれか１つに示される配列を有するＥＦ１Ａプロモーター、またはこの機能的な変異体である、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記プロモーターが、組織特異的プロモーターであり、前記組織特異的プロモーターが、Ｔ細胞特異的応答エレメントを含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項８０】
前記組織特異的プロモーターが、１または複数のＮＦＡＴ応答エレメントを含む、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記ＮＦＡＴ応答エレメントが、配列番号５０〜５７のうちのいずれか１つに示される配列を有する、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記１または複数のポリヌクレオチドが、ベクター内に含まれる、請求項４０から８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
前記ベクターが、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、または非ウイルスベクターである、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記非ウイルスベクターが、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンである、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
１または複数の発現カセットを含む、異種遺伝子発現のリガンド誘導性制御のための遺伝子スイッチ系であって、前記１または複数の発現カセットが、
ａ）第１の核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたＤＮＡ結合性ドメインを含む、第１の遺伝子スイッチポリペプチドをコードする配列；
ｂ）第２の核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたトランス活性化ドメインを含む、第２の遺伝子スイッチポリペプチドをコードする配列
を含み、
前記第１の遺伝子スイッチポリペプチドと、前記第２の遺伝子スイッチポリペプチドとが、ポリペプチドリンカーにより連結されている、
遺伝子スイッチ系。
【請求項８６】
１または複数の発現カセットを含む、異種遺伝子発現のリガンド誘導性制御のための遺伝子スイッチ系であって、前記１または複数の発現カセットが、
ａ）トランス活性化ドメインを含む、第１の遺伝子スイッチポリペプチドをコードする配列；
ｂ）リガンド結合性ドメインへと融合させたＤＮＡ結合性ドメインを含む、第２の遺伝子スイッチポリペプチドをコードする配列；および
ｃ）異種遺伝子ポリペプチドをコードする配列
を含み、
前記リガンド結合性ドメインへと融合させた前記トランス活性化ドメイン、ＤＮＡ結合性ドメイン、および前記異種遺伝子ポリペプチドのうちの１つが、ポリペプチドリンカーにより、前記リガンド結合性ドメインへと融合させた前記トランス活性化ドメイン、ＤＮＡ結合性ドメイン、および前記異種遺伝子ポリペプチドのうちの別の１つへと連結されており、前記ポリペプチドリンカーが、切断型リンカー配列またはリボソームスキッピングリンカー配列を含む、
遺伝子スイッチ系。
【請求項８７】
前記１または複数の発現カセットが、異種遺伝子ポリペプチドをコードする配列をさらに含む、請求項８５に記載の遺伝子スイッチ系。
【請求項８８】
前記１または複数の発現カセットが、以下：
ａ）１または複数のリコンビナーゼ接合部位；および
ｂ）セリンリコンビナーゼをコードする配列
のうちの１または複数をさらに含む、請求項８５から８７のいずれか一項に記載の遺伝子スイッチ系。
【請求項８９】
前記１または複数の発現カセットが、以下：
ａ）非誘導性プロモーター；および
ｂ）誘導性プロモーター
のうちの１または複数をさらに含む、請求項８５から８８のいずれか一項に記載の遺伝子スイッチ系。
【請求項９０】
前記ＤＮＡ結合性ドメインが、配列番号１８４に示される配列を有する、請求項８５から８９のいずれか一項に記載の遺伝子スイッチ系。
【請求項９１】
前記トランス活性化ドメインが、配列番号１８１に示される配列を有する、請求項８５から９０のいずれか一項に記載の遺伝子スイッチ系。
【請求項９２】
前記第１の核内受容体リガンド結合ドメイン、および第２の核内受容体リガンド結合ドメイン、ならびに前記リガンド結合性ドメインのうちの少なくとも１つが、配列番号１８５〜１８６のうちのいずれか１つに示される配列を有する、請求項８５から９１のいずれか一項に記載の遺伝子スイッチ系。
【請求項９３】
前記非誘導性プロモーターが、配列番号４０〜６４のうちのいずれか１つに示される配列を有する、請求項８９に記載の遺伝子スイッチ系。
【請求項９４】
前記誘導性プロモーターが、配列番号４０〜６４のうちのいずれか１つに示される配列を有する、請求項８９に記載の遺伝子スイッチ系。
【請求項９５】
前記ポリペプチドリンカーが、配列番号１４６〜１６２のうちのいずれか１つに示される配列を有する、請求項８５に記載の遺伝子スイッチ系。
【請求項９６】
前記ポリペプチドリンカーが、配列番号１８〜１９および１４６〜１６２のうちのいずれか１つに示される配列を伴う切断型リンカー、リボソームスキッピングリンカー、またはＩＲＥＳリンカーである、請求項８６に記載の遺伝子スイッチ系。
【請求項９７】
前記１または複数の発現カセットが、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする配列を含む発現カセットを含み、前記キメラ抗原受容体の発現が、非誘導性プロモーターによりモジュレートされる、請求項８５に記載の遺伝子スイッチ系。
【請求項９８】
前記ＣＡＲが、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＢＣＭＡ、ＣＤ４４、α−葉酸受容体、ＣＡＩＸ、ＣＤ３０、ＲＯＲ１、ＣＥＡ、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４０、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、葉酸結合性タンパク質、ＧＤ２、ＧＤ３、ＩＬ−１３Ｒ−ａ２、ＫＤＲ、ＥＤＢ−Ｆ、メソテリン、ＣＤ２２、ＥＧＦＲ、ＭＵＣ−１、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＵＣ−１６、ｈ５Ｔ４、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ−７２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ１２３、およびＶＥＧＦ−Ｒ２のうちの少なくとも１つに結合することが可能である、請求項９７に記載の遺伝子スイッチ系。
【請求項９９】
前記非誘導性プロモーターが、ＥＦ１Ａまたはこれらの変異体を含む、請求項９７に記載の遺伝子スイッチ系。
【請求項１００】
前記発現カセットが、配列番号１３１に示される配列を有する、請求項９７に記載の遺伝子スイッチ系。
【請求項１０１】
前記発現カセットが、細胞タグをコードする配列をさらに含み、前記細胞タグが、リンカーにより、前記ＣＡＲへと連結されている、請求項９７に記載の遺伝子スイッチ系。
【請求項１０２】
前記細胞タグが、ＨＥＲ１切断型変異体およびＣＤ２０切断型変異体のうちの少なくとも１つを含む、請求項１０１に記載の遺伝子スイッチ系。
【請求項１０３】
前記発現カセットが、配列番号１３２に示される配列を有する、請求項１０２に記載の遺伝子スイッチ系。
【請求項１０４】
前記発現カセットが、前記第１の遺伝子スイッチポリペプチドをコードする前記配列および前記第２の遺伝子スイッチポリペプチドをコードする前記配列をさらに含み、前記第１の遺伝子スイッチポリペプチドおよび第２の遺伝子スイッチポリペプチドのうちの１つが、リンカーにより、前記ＣＡＲへと連結されている、請求項９７に記載の遺伝子スイッチ系。
【請求項１０５】
前記第１の遺伝子スイッチポリペプチドと、第２の遺伝子スイッチポリペプチドとが、前記ポリペプチドリンカーにより連結されており、前記ポリペプチドリンカーが、切断型リンカーである、請求項１０４に記載の遺伝子スイッチ系。
【請求項１０６】
前記発現カセットが、配列番号１３３に示される配列を有する、請求項１０５に記載の遺伝子スイッチ系。
【請求項１０７】
前記第１の遺伝子スイッチポリペプチドと、第２の遺伝子スイッチポリペプチドとが、前記ポリペプチドリンカーにより連結されており、前記ポリペプチドリンカーが、ＩＲＥＳリンカーである、請求項１０６に記載の遺伝子スイッチ系。
【請求項１０８】
前記発現カセットが、配列番号１３４に示される配列を有する、請求項１０７に記載の遺伝子スイッチ系。
【請求項１０９】
前記１または複数の発現カセットが、前記異種遺伝子ポリペプチドをコードする前記配列を含む発現カセットを含み、前記異種遺伝子ポリペプチドの発現が、誘導性プロモーターによりモジュレートされる、請求項８６または８７に記載の遺伝子スイッチ系。
【請求項１１０】
前記異種遺伝子ポリペプチドが、サイトカインを含む、請求項１０９に記載の遺伝子スイッチ系。
【請求項１１１】
前記サイトカインが、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、またはＩＬ−１５変異体の融合体のうちの少なくとも１つを含む、請求項１１０に記載の遺伝子スイッチ系。
【請求項１１２】
前記発現カセットが、配列番号１３５に示される配列を有する、請求項１０９に記載の遺伝子スイッチ系。
【請求項１１３】
前記発現カセットが、第２の異種遺伝子ポリペプチドをコードする配列を含み、前記第２の異種遺伝子ポリペプチドが、細胞タグを含む、請求項１０９に記載の遺伝子スイッチ系。
【請求項１１４】
前記細胞タグが、ＨＥＲ１切断型変異体およびＣＤ２０切断型変異体のうちの少なくとも１つを含む、請求項１１３に記載の遺伝子スイッチ系。
【請求項１１５】
前記細胞タグが、リンカーにより、前記サイトカインへと連結されている、請求項１１４に記載の遺伝子スイッチ系。
【請求項１１６】
前記発現カセットが、配列番号１３６に示される配列を有する、請求項１１５に記載の遺伝子スイッチ系。
【請求項１１７】
異種遺伝子を、宿主細胞内に組み込むための遺伝子スイッチ系であり、前記宿主細胞を、前記セリンリコンビナーゼ、および前記１または複数のリコンビナーゼ接合部位の存在下で、前記１または複数の発現カセットと接触させると、前記異種遺伝子が、前記宿主細胞内に組み込まれる、請求項８８に記載の遺伝子スイッチ系。
【請求項１１８】
前記系が、リガンドをさらに含み、前記宿主細胞を、前記リガンドと接触させると、前記異種遺伝子が、前記宿主細胞内で発現する、請求項１１７に記載の遺伝子スイッチ系。
【請求項１１９】
前記宿主細胞が、Ｔ細胞またはＮＫ細胞である、請求項１１７または１１８に記載の遺伝子スイッチ系。
【請求項１２０】
前記誘導性プロモーターが、前記トランス活性化ドメインにより活性化する、請求項８９に記載の遺伝子スイッチ系。
【請求項１２１】
１または複数のベクター内に含有される、請求項８５から１２０のいずれか一項に記載の遺伝子スイッチ系。
【請求項１２２】
１つのベクター内に含有される、請求項１２１に記載の遺伝子スイッチ系。
【請求項１２３】
請求項８５から８９のいずれか一項に記載の遺伝子スイッチ系の構成要素のうちの１または複数をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１２４】
請求項１２３に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１２５】
前記ベクターが、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、または非ウイルスベクターのうちのいずれか１つである、請求項１２４に記載のベクター。
【請求項１２６】
前記ベクターが、非ウイルスベクターであり、前記非ウイルスベクターが、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンである、請求項１２５に記載のベクター。
【請求項１２７】
第１の遺伝子スイッチポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
第２の遺伝子スイッチポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および
目的の遺伝子（ＧＯＩ）をコードするポリヌクレオチド
を含むポリヌクレオチド構築物であって、
前記ＧＯＩをコードする前記ポリヌクレオチドが、前記第１の遺伝子スイッチポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドと、前記第２の遺伝子スイッチポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドとの間に位置する、連続オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、前記ポリヌクレオチド構築物が、リンカーをコードするポリヌクレオチドをさらに含み、前記ＧＯＩが、前記リンカーにより、前記第１の遺伝子スイッチポリペプチドおよび第２の遺伝子スイッチポリペプチドの各々へと連結されている、
ポリヌクレオチド構築物。
【請求項１２８】
（ｉ）第１の核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたＤＮＡ結合性ドメインを含む、第１の遺伝子スイッチポリペプチドをコードする、第１の配列；および（ｉｉ）第２の核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたトランス活性化ドメインを含む、第２の遺伝子スイッチポリペプチドをコードする、第２の配列のうちの少なくとも１つを含み；
前記第１の配列および前記第２の配列のうちの少なくとも１つの発現が、１または複数のＮＦＡＴ応答エレメントによりモジュレートされる、
ポリヌクレオチド。
【請求項１２９】
操作細胞の増殖および／または生存を刺激する方法であって、
（ａ）細胞試料を、対象から得るステップと、
（ｂ）前記細胞試料の細胞に、１または複数のトランスポゾンを含む、１または複数のポリヌクレオチドをトランスフェクトするステップであって、前記１または複数のトランスポゾンが、
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴＣＲ、サイトカイン、１または複数の細胞タグ、前記サイトカインのリガンド誘導性制御のための遺伝子スイッチポリペプチド、および前記１または複数のポリヌクレオチドを、前記細胞のゲノムへと組み込んで、操作細胞の集団をもたらすのに有効なトランスポザーゼ
をコードする、ステップと
を含み、
前記遺伝子スイッチポリペプチドが、ｉ）第１の核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたＤＮＡ結合性ドメインを含む、第１の遺伝子スイッチポリペプチド、およびｉｉ）第２の核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたトランス活性化ドメインを含む、第２の遺伝子スイッチポリペプチドを含み、前記第１の遺伝子スイッチポリペプチドと、前記第２の遺伝子スイッチポリペプチドとが、リンカーにより連結されている、
方法。
【請求項１３０】
それを必要とする対象の、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける操作細胞の存続を増強する方法であって、
（ａ）細胞試料を、対象から得るステップと、
（ｂ）前記細胞試料の細胞に、１または複数のトランスポゾンを含む、１または複数のポリヌクレオチドをトランスフェクトするステップであって、前記１または複数のトランスポゾンが、
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴＣＲ、サイトカイン、１または複数の細胞タグ、前記サイトカインのリガンド誘導性制御のための遺伝子スイッチポリペプチド、および前記ＤＮＡを、前記細胞のゲノムへと組み込んで、操作細胞の集団をもたらすのに有効なトランスポザーゼ
をコードする、ステップと
を含み、
前記遺伝子スイッチポリペプチドが、ｉ）第１の核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたＤＮＡ結合性ドメインを含む、第１の遺伝子スイッチポリペプチド、およびｉｉ）第２の核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたトランス活性化ドメインを含む、第２の遺伝子スイッチポリペプチドを含み、前記第１の遺伝子スイッチポリペプチドと、前記第２の遺伝子スイッチポリペプチドとが、リンカーにより連結されている、
方法。
【請求項１３１】
前記細胞にトランスフェクトするステップが、前記細胞に電気穿孔することを含む、請求項１２９または１３０に記載の方法。
【請求項１３２】
前記１または複数のポリヌクレオチドのうちの、少なくとも１つのポリヌクレオチドが、前記遺伝子スイッチポリペプチドをコードし、前記少なくとも１つのポリヌクレオチドが、プロモーターによりモジュレートされ、前記プロモーターが、組織特異的プロモーターもしくはＥＦ１Ａプロモーター、またはこれらの機能的な変異体である、請求項１２９から１３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３３】
前記プロモーターが、配列番号５８〜６０のうちのいずれか１つに示される配列を有するＥＦ１Ａプロモーター、またはこの機能的な変異体である、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３４】
前記プロモーターが、組織特異的プロモーターであり、前記組織特異的プロモーターが、Ｔ細胞特異的応答エレメントを含む、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３５】
前記プロモーターが、組織特異的プロモーターであり、前記組織特異的プロモーターが、１または複数のＮＦＡＴ応答エレメントを含む、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３６】
前記ＮＦＡＴ応答エレメントが、配列番号５０〜５７のうちのいずれか１つに示される配列を有する、請求項１３５に記載の方法。
【請求項１３７】
前記サイトカインが、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、またはＩＬ−１５変異体の融合体のうちの少なくとも１つを含む、請求項１２９から１３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３８】
前記サイトカインが、分泌形態にある、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１３９】
前記サイトカインが、膜結合形態にある、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１４０】
前記サイトカインが、配列番号２０３〜２０９のうちのいずれか１つに示される配列を有する、請求項１３７から１３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４１】
前記細胞が、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｔ細胞、またはＴ細胞前駆細胞である、請求項１２９から１４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４２】
前記方法が、有効量の前記操作細胞を、それを必要とする対象へと投与するステップをさらに含む、請求項１２９から１４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４３】
投与する前記ステップが、前記対象に、前記操作細胞を、速やかに輸注することを含む、請求項１４２に記載の方法。
【請求項１４４】
前記方法が、有効量の前記リガンドを投与して、前記サイトカインの発現を誘導するステップをさらに含む、請求項１４２または１４３に記載の方法。
【請求項１４５】
前記リガンドが、ベレジメクスである、請求項１４４に記載の方法。
【請求項１４６】
前記ＣＡＲが、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＢＣＭＡ、ＣＤ４４、α−葉酸受容体、ＣＡＩＸ、ＣＤ３０、ＲＯＲ１、ＣＥＡ、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４０、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、葉酸結合性タンパク質、ＧＤ２、ＧＤ３、ＩＬ−１３Ｒ−ａ２、ＫＤＲ、ＥＤＢ−Ｆ、メソテリン、ＣＤ２２、ＥＧＦＲ、ＭＵＣ−１、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＵＣ−１６、ｈ５Ｔ４、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ−７２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ１２３、およびＶＥＧＦ−Ｒ２のうちの少なくとも１つに結合することが可能である、請求項１２９から１４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４７】
前記ＣＡＲが、前記ＣＤ１９に結合することが可能である、請求項１４６に記載の方法。
【請求項１４８】
前記ＣＡＲが、前記ＣＤ３３に結合することが可能である、請求項１４６に記載の方法。
【請求項１４９】
前記トランスポザーゼが、サケ科型Ｔｃ１様トランスポザーゼである、請求項１２９から１４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５０】
前記トランスポザーゼが、ＳＢ１１またはＳＢ１００ｘトランスポザーゼである、請求項１２９から１４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５１】
前記１または複数の細胞タグが、ＨＥＲ１切断型変異体およびＣＤ２０切断型変異体のうちの少なくとも１つを含む、請求項１２９から１５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５２】
前記１または複数の細胞タグが、配列番号１８９〜２０２のうちのいずれか１つに示される配列を有する、請求項１２９から１５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５３】
充実性腫瘍を伴う対象を処置する方法であって、
（ａ）細胞試料を、対象から得るステップと、
（ｂ）前記細胞試料の細胞に、１または複数のトランスポゾンを含む、１または複数のポリヌクレオチドをトランスフェクトするステップであって、前記１または複数のトランスポゾンが、
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴＣＲ、サイトカイン、１または複数の細胞タグ、前記サイトカインのリガンド誘導性制御のための遺伝子スイッチポリペプチド、および前記ＤＮＡを、前記細胞のゲノムへと組み込んで、操作細胞の集団をもたらすのに有効なトランスポザーゼ
をコードし、
前記遺伝子スイッチポリペプチドが、ｉ）第１の核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたＤＮＡ結合性ドメインを含む、第１の遺伝子スイッチポリペプチド、およびｉｉ）第２の核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたトランス活性化ドメインを含む、第２の遺伝子スイッチポリペプチドを含み、前記第１の遺伝子スイッチポリペプチドと、前記第２の遺伝子スイッチポリペプチドとが、リンカーにより連結されている、
ステップと、
（ｃ）操作細胞の前記集団を、前記対象へと投与するステップと
を含む方法。
【請求項１５４】
前記サイトカインが、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、またはＩＬ−１５変異体の融合体のうちの少なくとも１つを含む、請求項１５３に記載の方法。
【請求項１５５】
前記サイトカインが、ＩＬ−１２を含む、請求項１５４に記載の方法。
【請求項１５６】
前記１または複数のポリヌクレオチドのうちの、少なくとも１つのポリヌクレオチドが、前記遺伝子スイッチポリペプチドをコードし、前記少なくとも１つのポリヌクレオチドが、プロモーターによりモジュレートされ、前記プロモーターが、組織特異的プロモーターもしくはＥＦ１Ａプロモーター、またはこれらの機能的な変異体である、請求項１５３に記載の方法。
【請求項１５７】
前記プロモーターが、配列番号５８〜６０のうちのいずれか１つに示される配列を有するＥＦ１Ａプロモーター、またはこの機能的な変異体である、請求項１５６に記載の方法。
【請求項１５８】
前記プロモーターが、組織特異的プロモーターであり、前記組織特異的プロモーターが、Ｔ細胞特異的応答エレメントを含む、請求項１５６に記載の方法。
【請求項１５９】
前記プロモーターが、組織特異的プロモーターであり、前記組織特異的プロモーターが、１または複数のＮＦＡＴ応答エレメントを含む、請求項１５６に記載の方法。
【請求項１６０】
前記ＮＦＡＴ応答エレメントが、配列番号５０〜５７のうちのいずれか１つに示される配列を有する、請求項１５９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
【０００２】
本出願は、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、２０１７年１月１０日に出願された米国特許仮出願第６２／４４４，７７５号明細書、および２０１７年２月２８日に出願された米国特許仮出願第６２／４６４，９５８号明細書の利益を主張する。
【０００３】
配列表への参照
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットにおいて、電子的に提出され、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる配列表を含有する。２０１８年１月９日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、５０４７１＿７０６＿６０１＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられ、４２１，１６３バイトのサイズである。
【０００４】
参照による組込み
本明細書で言及される、全ての刊行物、特許、および特許出願は、各個別の刊行物、特許、または特許出願が、参照により具体的かつ個別に組み込まれることが指し示された場合と同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００５】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）およびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を使用する養子Ｔ細胞免疫療法は、腫瘍細胞の直接的な殺滅に成功することが示されている。この革新的な技術は、有望であるが、改変Ｔ細胞の、腫瘍保有個体への投与は、安全性問題、例えば、腫瘍溶解／サイトカイン放出症候群を伴わずにはなされていない。加えて、ＣＡＲまたはＴＣＲ単独の発現は、有効性について、十分ではない場合があり、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、またはＩＬ−２１など、サイトカインのさらなる発現も、このような処置の有効性を増大させるのに必要とされうる。しかし、これは、さらなる安全性問題をもたらしうる。したがって、患者への投与後において、目的の治療用遺伝子の発現に対する、完全な制御を得ることに関心がもたれる。
【発明の概要】
【０００６】
本明細書の、ある特定の実施形態では、遺伝子スイッチポリペプチドを含む、系、方法、または組成物、およびこれをコードするポリヌクレオチドが開示される。
【０００７】
本明細書では、異種遺伝子発現のリガンド誘導性制御のための、遺伝子スイッチポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組成物であって、前記遺伝子スイッチポリペプチドが、（ａ）第１の核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたＤＮＡ結合性ドメインを含む、第１の遺伝子スイッチポリペプチド；および（ｂ）第２の核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたトランス活性化ドメインを含む、第２の遺伝子スイッチポリペプチドを含み、前記第１の遺伝子スイッチポリペプチドと、前記第２の遺伝子スイッチポリペプチドとが、リンカーにより連結されている、組成物が提示される。
【０００８】
本明細書では、異種遺伝子発現のリガンド誘導性制御のための遺伝子スイッチ系をコードする、１または複数のポリヌクレオチドを含む組成物であって、前記遺伝子スイッチ系が、（ａ）トランス活性化ドメインを含む、第１の遺伝子スイッチポリペプチド；（ｂ）リガンド結合性ドメインへと融合させたＤＮＡ結合性ドメインを含む、第２の遺伝子スイッチポリペプチド；および（ｃ）少なくとも１つの異種遺伝子ポリペプチドを含み、前記第１の遺伝子スイッチポリペプチド、前記第２の遺伝子スイッチポリペプチド、および前記異種遺伝子ポリペプチドのうちの１つが、ポリペプチドリンカーにより、前記第１の遺伝子スイッチポリペプチド、前記第２の遺伝子スイッチポリペプチド、および前記異種遺伝子ポリペプチドのうちの別の１つへと連結されており、前記ポリペプチドリンカーが、切断型リンカーまたはリボソームスキッピングリンカー配列を含む、組成物が提示される。
【０００９】
一部の実施形態では、本明細書で提示される組成物のうちのいずれかのＤＮＡ結合性ドメインは、ＧＡＬ４（ＧＡＬ４  ＤＢＤ）、ＬｅｘＡＤＢＤ、転写因子ＤＢＤ、ステロイド／甲状腺ホルモン核内受容体スーパーファミリーメンバーＤＢＤ、細菌ＬａｃＺ  ＤＢＤ、および酵母ＤＢＤのうちの少なくとも１つを含む。一部の実施形態では、本明細書で提示される組成物のうちのいずれかのＤＮＡ結合性ドメインは、配列番号１８４に示される配列を有する。一部の実施形態では、本明細書で提示される組成物のうちのいずれかのトランス活性化ドメインは、ＶＰ１６トランス活性化ドメインおよびＢ４２酸性活性化因子トランス活性化ドメインのうちの少なくとも１つを含む。一部の実施形態では、本明細書で提示される組成物のうちのいずれかのトランス活性化ドメインは、配列番号１８１に示される配列を有する。
【００１０】
場合によって、本明細書で提示される組成物のうちのいずれかの、第１の核内受容体リガンド結合性ドメイン、第２の核内受容体リガンド結合性ドメイン、およびリガンド結合性ドメインのうちの少なくとも１つは、エクジソン受容体（ＥｃＲ）、ユビキタス受容体、オーファン受容体１、ＮＥＲ−１、ステロイドホルモン核内受容体１、レチノイドＸ受容体相互作用性タンパク質１５、肝臓Ｘ受容体β、ステロイドホルモン受容体様タンパク質、肝臓Ｘ受容体、肝臓Ｘ受容体α、ファルネソイドＸ受容体、受容体相互作用性タンパク質１４、およびファルネソール受容体のうちの少なくとも１つを含む。他の場合には、本明細書で提示される組成物のうちのいずれかの、第１の核内受容体リガンド結合性ドメイン、第２の核内受容体リガンド結合性ドメイン、およびリガンド結合性ドメインのうちの少なくとも１つは、配列番号１８５〜１８６のうちのいずれか１つに示される配列を有する。別の場合には、第１の遺伝子スイッチポリペプチドは、ＥｃＲ核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたＧＡＬ４  ＤＢＤを含み、前記第２の遺伝子スイッチポリペプチドは、レチノイド受容体Ｘ（ＲＸＲ）核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたＶＰ１６トランス活性化ドメインを含む。さらに別の場合には、ＥｃＲ核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたＧａｌ４  ＤＢＤは、配列番号１８５〜１８６または１８７〜１８８のうちのいずれか１つに示される配列を有し、レチノイド受容体Ｘ（ＲＸＲ）核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたＶＰ１６トランス活性化ドメインは、配列番号１８３に示される配列を有する。
【００１１】
場合によって、本明細書で提示される組成物のうちのいずれかのリンカーは、切断型リンカー、リボソームスキッピングリンカー配列、またはＩＲＥＳリンカーである。場合によって、リンカーは、ＩＲＥＳリンカーであり、配列番号１８〜１９のうちのいずれか１つに示される配列を有する。他の場合には、リンカーは、切断型リンカーまたはリボソームスキッピングリンカー配列である。一部の実施形態では、切断型リンカーまたはリボソームスキッピングリンカー配列は、２Ａリンカー、ｐ２Ａリンカー、Ｔ２Ａリンカー、Ｆ２Ａリンカー、Ｅ２Ａリンカー、ＧＳＧ−２Ａリンカー、ＧＳＧリンカー、ＳＧＳＧリンカー、フューリンリンクリンカー（furinlink linker）、ならびにこれらの変異体および誘導体のうちの１または複数を含む。他の実施形態では、切断型リンカーまたは前記リボソームスキッピングリンカー配列は、配列番号１４６〜１６２のうちのいずれか１つに示される配列を有する。
【００１２】
ある実施形態では、本明細書で提示される組成物のうちのいずれかの、ポリヌクレオチドまたは１または複数のポリヌクレオチドは、抗原結合性ポリペプチドをさらにコードする。別の実施形態では、本明細書で提示される組成物のうちのいずれかの、抗原結合性ポリペプチドは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）およびＴ細胞受容体のうちの少なくとも１つを含む。他の実施形態では、抗原結合性ポリペプチドは、ＣＡＲを含み、前記ＣＡＲは、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＢＣＭＡ、ＣＤ４４、α−葉酸受容体、ＣＡＩＸ、ＣＤ３０、ＲＯＲ１、ＣＥＡ、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４０、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、葉酸結合性タンパク質、ＧＤ２、ＧＤ３、ＩＬ−１３Ｒ−ａ２、ＫＤＲ、ＥＤＢ−Ｆ、メソテリン、ＣＤ２２、ＥＧＦＲ、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−１６、ＭＡＧＥ−Ａ１、ｈ５Ｔ４、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ−７２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ１２３、およびＶＥＧＦ−Ｒ２のうちの少なくとも１つに結合することが可能である。別の実施形態では、抗原結合性ポリペプチドは、ＣＡＲを含み、ＣＡＲは、配列番号２１０〜２４４のうちのいずれか１つに示される配列を有する。
【００１３】
他の実施形態では、本明細書で提示される組成物のうちのいずれかの、ポリヌクレオチドまたは１または複数のポリヌクレオチドは、細胞タグをさらにコードする。場合によって、細胞タグは、ＨＥＲ１切断型変異体またはＣＤ２０切断型変異体のうちの少なくとも１つを含む。他の場合には、細胞タグは、配列番号１８９〜２０２のうちのいずれか１つに示される配列を有する。
【００１４】
一部の実施形態では、本明細書で提示される組成物のうちのいずれかの、第１の遺伝子スイッチポリペプチド、第２の遺伝子スイッチポリペプチド、抗原結合性ポリペプチド、および細胞タグのうちの少なくとも１つの発現は、プロモーターによりモジュレートされ、プロモーターは、組織特異的プロモーターもしくはＥＦ１Ａプロモーター、またはこれらの機能的な変異体である。場合によって、プロモーターは、配列番号５８〜６０のうちのいずれか１つに示される配列を有するＥＦ１Ａプロモーター、またはこの機能的な変異体である。他の場合には、プロモーターは、Ｔ細胞特異的応答エレメントを含む、組織特異的プロモーターである。別の場合には、組織特異的プロモーターは、１または複数のＮＦＡＴ応答エレメントを含む。さらに別の場合には、ＮＦＡＴ応答エレメントは、配列番号５１〜５７のうちのいずれか１つに示される配列を有する。
【００１５】
一部の例では、本明細書で提示される組成物のうちのいずれかは、異種遺伝子ポリペプチドをコードする、第２のポリヌクレオチドをさらに含む。場合によって、異種遺伝子ポリペプチドは、サイトカイン、細胞タグ、およびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のうちの少なくとも１つを含む。場合によって、サイトカインは、１つのサイトカインを含み、前記サイトカインは、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、またはＩＬ−１５変異体の融合体のうちの少なくとも１つを含む。他の場合には、サイトカインは、分泌形態にある。別の場合には、サイトカインは、膜結合形態にある。さらに別の場合には、サイトカインは、配列番号２０３〜２０９のうちのいずれか１つに示される配列を有する。
【００１６】
ある実施形態では、本明細書で提示される組成物のうちのいずれかの、少なくとも１つの異種遺伝子ポリペプチドの発現は、誘導性プロモーターによりモジュレートされる。一部の実施形態では、誘導性プロモーターは、配列番号４０〜６４のうちのいずれかにおいて示される配列を有する。他の実施形態では、誘導性プロモーターは、第１の遺伝子スイッチポリペプチド、および第２の遺伝子スイッチポリペプチドのうちの少なくとも１つによりモジュレートされる。
【００１７】
本明細書ではまた、本明細書で提示される組成物のうちのいずれかのポリヌクレオチドを含むベクターも提示される。ある実施形態では、ベクターは、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、または非ウイルスベクターである。別の実施形態では、非ウイルスベクターは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンである。
【００１８】
本明細書では、エフェクター細胞内の異種遺伝子の発現を調節する方法であって、（ａ）前記エフェクター細胞へと、（ｉ）リガンド結合性ドメインへと融合させたＤＮＡ結合性ドメインを含む、第１の遺伝子スイッチポリペプチド、（ｉｉ）トランス活性化ドメインを含む、第２の遺伝子スイッチポリペプチド、（ｉｉｉ）前記異種遺伝子によりコードされる異種遺伝子ポリペプチド、ならびに（ｉｖ）切断型リンカー配列またはリボソームスキッピングリンカー配列を含むポリペプチドリンカーをコードする、１または複数のポリヌクレオチドを導入するステップであって、前記ポリペプチドリンカーが、前記第１の遺伝子スイッチポリペプチド、前記第２の遺伝子スイッチポリペプチド、および前記異種遺伝子ポリペプチドのうちの１つを、前記第１の遺伝子スイッチポリペプチド、前記第２の遺伝子スイッチポリペプチド、および前記異種遺伝子ポリペプチドのうちの別の１つへと連結する、ステップと；（ｂ）前記エフェクター細胞を、前記異種遺伝子の発現を誘導するのに十分な量のリガンドと接触させるステップとを含む方法が提示される。
【００１９】
ある例では、本明細書で提示されるエフェクター細胞内の、異種遺伝子の発現を調節する方法の、１または複数のポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、抗原結合性ポリペプチドをさらにコードする。場合によって、抗原結合性ポリペプチドは、標的細胞の所定の細胞表面タンパク質に選択的に結合する。場合によって、標的細胞は、哺乳動物細胞である。他の場合には、標的細胞は、腫瘍細胞である。
【００２０】
一部の実施形態では、本明細書で提示されるエフェクター細胞内の、異種遺伝子の発現を調節する方法の、所定の細胞表面タンパク質は、腫瘍抗原である。場合によって、エフェクター細胞を、リガンドと接触させるステップの前に、抗原結合性ポリペプチドは、標的細胞の、所定の細胞表面タンパク質に選択的に結合する。場合によって、エフェクター細胞を、リガンドと接触させるステップの前に、少なくとも７日間にわたり、エフェクター細胞を、標的細胞の、所定の細胞表面タンパク質へと曝露する。他の場合には、抗原結合性ポリペプチドによる、所定の細胞表面タンパク質への結合は、エフェクター細胞を活性化させる。一部の実施形態では、方法は、前記エフェクター細胞を、前記所定の細胞表面タンパク質を発現する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）と共培養するステップをさらに含み、前記ａＡＰＣの、前記所定の細胞表面タンパク質への、前記抗原結合性ポリペプチドの結合は、前記エフェクター細胞を活性化させる。一部の実施形態では、共培養するステップは、少なくとも７日間、１４日間、２１日間、または２８日間にわたる。場合によって、ａＡＰＣは、トランスジェニックＫ５６２細胞である。
【００２１】
他の実施形態では、本明細書で提示されるエフェクター細胞内の、異種遺伝子の発現を調節する方法における抗原結合性ポリペプチドは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）およびＴ細胞受容体のうちの少なくとも１つを含む。別の実施形態では、抗原結合性ポリペプチドは、ＣＡＲを含み、前記ＣＡＲは、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＢＣＭＡ、ＣＤ４４、α−葉酸受容体、ＣＡＩＸ、ＣＤ３０、ＲＯＲ１、ＣＥＡ、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４０、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、葉酸結合性タンパク質、ＧＤ２、ＧＤ３、ＩＬ−１３Ｒ−ａ２、ＫＤＲ、ＥＤＢ−Ｆ、メソテリン、ＣＤ２２、ＥＧＦＲ、ＭＵＣ−１、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＵＣ−１６、ｈ５Ｔ４、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ−７２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ１２３、およびＶＥＧＦ−Ｒ２のうちの少なくとも１つに結合することが可能である。さらに別の実施形態では、抗原結合性ポリペプチドは、配列番号２１０〜２４４のうちのいずれか１つに示される配列を有するＣＡＲを含む。一部の実施形態では、異種遺伝子ポリペプチドは、抗原結合性ポリペプチドを含む。
【００２２】
場合によって、本明細書で提示されるエフェクター細胞内の、異種遺伝子の発現を調節する方法における、１または複数のポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、細胞タグをさらにコードする。場合によって、細胞タグは、ＨＥＲ１切断型変異体およびＣＤ２０切断型変異体のうちの少なくとも１つを含む。他の場合には、細胞タグは、配列番号１８９〜２０２のうちのいずれか１つに示される配列を有する。場合によって、異種遺伝子ポリペプチドは、細胞タグを含む。
【００２３】
他の場合には、本明細書で提示されるエフェクター細胞内の、異種遺伝子の発現を調節する方法における、１または複数のポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、サイトカインをさらにコードする。場合によって、サイトカインは、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、またはＩＬ−１５変異体の融合体のうちの少なくとも１つを含む。ある実施形態では、サイトカインは、分泌形態にある。別の実施形態では、サイトカインは、膜結合形態にある。さらに別の実施形態では、サイトカインは、配列番号２０３〜２０９のうちのいずれか１つに示される配列を有する。他の実施形態では、異種遺伝子ポリペプチドは、前記サイトカインを含む。
【００２４】
ある実施形態では、本明細書で提示されるエフェクター細胞内の、異種遺伝子の発現を調節する方法における、異種遺伝子ポリペプチドの発現は、誘導性プロモーターによりモジュレートされる。ある特定の実施形態では、誘導性プロモーターは、配列番号４０〜６４のうちのいずれか１つに示される配列を有する。
【００２５】
別の実施形態では、本明細書で提示されるエフェクター細胞内の、異種遺伝子の発現を調節する方法におけるＤＮＡ結合性ドメインは、ＧＡＬ４（ＧＡＬ４  ＤＢＤ）、ＬｅｘＡＤＢＤ、転写因子ＤＢＤ、ステロイド／甲状腺ホルモン核内受容体スーパーファミリーメンバーＤＢＤ、細菌ＬａｃＺ  ＤＢＤ、および酵母ＤＢＤのうちの少なくとも１つを含む。さらに別の実施形態では、ＤＮＡ結合性ドメインは、配列番号１８４に示される配列を有する。
【００２６】
さらに別の実施形態では、本明細書で提示されるエフェクター細胞内の、異種遺伝子の発現を調節する方法におけるトランス活性化ドメインは、ＶＰ１６トランス活性化ドメイン、およびＢ４２酸性活性化因子トランス活性化ドメインのうちの少なくとも１つを含む。場合によって、トランス活性化ドメインは、配列番号１８１に示される配列を有する。他の実施形態では、前記第１の遺伝子スイッチポリペプチドおよび第２の遺伝子スイッチポリペプチドのうちの少なくとも１つは、前記ＤＮＡ結合性ドメインに結合することが可能な応答エレメントをさらに含む。
【００２７】
一部の実施形態では、本明細書で提示されるエフェクター細胞内の、異種遺伝子の発現を調節する方法におけるリガンド結合性ドメインは、エクジソン受容体（ＥｃＲ）、ユビキタス受容体、オーファン受容体１、ＮＥＲ−１、ステロイドホルモン核内受容体１、レチノイドＸ受容体相互作用性タンパク質１５、肝臓Ｘ受容体β、ステロイドホルモン受容体様タンパク質、肝臓Ｘ受容体、肝臓Ｘ受容体α、ファルネソイドＸ受容体、受容体相互作用性タンパク質１４、およびファルネソール受容体のうちの少なくとも１つを含む。ある特定の実施形態では、リガンド結合性ドメインは、配列番号１８５〜１８６のうちのいずれか１つに示される配列を有する。ある特定の実施形態では、第１の遺伝子スイッチポリペプチドは、ＥｃＲ核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたＧＡＬ４  ＤＢＤを含み、第２の遺伝子スイッチポリペプチドは、レチノイド受容体Ｘ（ＲＸＲ）核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたＶＰ１６トランス活性化ドメインを含む。一部の実施形態では、ＥｃＲへと融合させたＧａｌ４  ＤＢＤは、配列番号１８５〜１８６のうちのいずれか１つに示される配列を有し、レチノイド受容体Ｘ（ＲＸＲ）核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させた前記ＶＰ１６トランス活性化ドメインは、配列番号１８３に示される配列を有する。
【００２８】
ある特定の実施形態では、本明細書で提示されるエフェクター細胞内の、異種遺伝子の発現を調節する方法におけるリガンドは、（２Ｓ，３Ｒ，５Ｒ，９Ｒ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｒ）−１７−［（２Ｓ，３Ｒ）−３，６−ジヒドロキシ−６−メチルヘプタン−２−イル］−２，３，１４−トリヒドロキシ−１０，１３−ジメチル−２，３，４，５，９，１１，１２，１５，１６，１７−デカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−６−オン；Ｎ’−（３，５−ジメチルベンゾイル）−Ｎ’−［（３Ｒ）−２，２−ジメチル−３−ヘキサニル］−２−エチル−３−メトキシベンゾヒドラジド；５−メチル−２，３−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］ジオキシン−６−カルボン酸Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−Ｎ’−（１−エチル−２，２−ジメチル−プロピル）−ヒドラジド；５−メチル−２，３−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］ジオキシン−６−カルボン酸Ｎ’−（３，５−ジメトキシ−４−メチル−ベンゾイル）−Ｎ’−（１−エチル−２，２−ジメチル−プロピル）−ヒドラジド；５−メチル−２，３−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］ジオキシン−６−カルボン酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；５−メチル−２，３−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］ジオキシン−６−カルボン酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメトキシ−４−メチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；５−エチル−２，３−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］ジオキシン−６−カルボン酸Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−Ｎ’−（１−エチル−２，２−ジメチル−プロピル）−ヒドラジド；５−エチル−２，３−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］ジオキシン−６−カルボン酸Ｎ’−（３，５−ジメトキシ−４−メチル−ベンゾイル）−Ｎ’−（１−エチル−２，２−ジメチル−プロピル）−ヒドラジド；５−エチル−２，３−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］ジオキシン−６−カルボン酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；５−エチル−２，３−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］ジオキシン−６−カルボン酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメトキシ−４−メチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−エチル−２，２−ジメチル−プロピル）−Ｎ’−（３−メトキシ−２−メチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；３，５−ジメトキシ−４−メチル−安息香酸Ｎ−（１−エチル−２，２−ジメチル−プロピル）−Ｎ’−（３−メトキシ−２−メチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３−メトキシ−２−メチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；３，５−ジメトキシ−４−メチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３−メトキシ−２−メチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−エチル−２，２−ジメチル−プロピル）−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド；３，５−ジメトキシ−４−メチル−安息香酸Ｎ−（１−エチル−２，２−ジメチル−プロピル）−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド；３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド；３，５−ジメトキシ−４−メチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド；２−メトキシ−ニコチン酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ペンチル）−Ｎ’−（４−エチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（２，２−ジメチル−１−フェニル−プロピル）−Ｎ’−（４−エチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ペンチル）−Ｎ’−（３−メトキシ−２−メチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；および３，５−ジメトキシ−４−メチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ペンチル）−Ｎ’−（３−メトキシ−２−メチル−ベンゾイル）−ヒドラジドのうちの少なくとも１つを含む。
【００２９】
場合によって、本明細書で提示されるエフェクター細胞内の、異種遺伝子の発現を調節する方法における、異種遺伝子の発現は、リガンドの非存在下において、リガンドの存在下における発現と比較して低減されるか、または消失する。ある特定の場合には、前記異種遺伝子の発現は、さらなる量のリガンドを施すことにより回復する。
【００３０】
他の場合には、第１の遺伝子スイッチポリペプチドおよび第２の遺伝子スイッチポリペプチドのうちの少なくとも１つの発現は、本明細書で提示されるエフェクター細胞内の、異種遺伝子の発現を調節する方法におけるプロモーターによりモジュレートされ、前記プロモーターは、組織特異的プロモーターもしくはＥＦ１Ａプロモーター、またはこれらの機能的な変異体である。ある特定の場合には、プロモーターは、配列番号５８〜６０のうちのいずれか１つに示される配列を有するＥＦ１Ａプロモーター、またはこの機能的な変異体である。他の場合には、プロモーターは、組織特異的プロモーターであり、組織特異的プロモーターは、Ｔ細胞特異的応答エレメントを含む。別の場合には、組織特異的プロモーターは、１または複数のＮＦＡＴ応答エレメントを含む。さらに別の場合には、ＮＦＡＴ応答エレメントは、配列番号５０〜５７のうちのいずれか１つに示される配列を有する。
【００３１】
ある特定の場合には、本明細書で提示されるエフェクター細胞内の、異種遺伝子の発現を調節する方法の、１または複数のポリヌクレオチドは、ベクター内に含まれる。場合によって、ベクターは、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、または非ウイルスベクターである。ある特定の場合には、非ウイルスベクターは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンである。
【００３２】
本明細書では、１または複数の発現カセットを含む、異種遺伝子発現のリガンド誘導性制御のための遺伝子スイッチ系であって、前記１または複数の発現カセットが、（ａ）第１の核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたＤＮＡ結合性ドメインを含む、第１の遺伝子スイッチポリペプチドをコードする配列；および（ｂ）第２の核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたトランス活性化ドメインを含む、第２の遺伝子スイッチポリペプチドをコードする配列を含み、前記第１の遺伝子スイッチポリペプチドと、前記第２の遺伝子スイッチポリペプチドとが、ポリペプチドリンカーにより連結されている、遺伝子スイッチ系が提示される。
【００３３】
本明細書では、１または複数の発現カセットを含む、異種遺伝子発現のリガンド誘導性制御のための遺伝子スイッチ系であって、前記１または複数の発現カセットが、（ａ）トランス活性化ドメインを含む、第１の遺伝子スイッチポリペプチドをコードする配列；（ｂ）リガンド結合性ドメインへと融合させたＤＮＡ結合性ドメインを含む、第２の遺伝子スイッチポリペプチドをコードする配列；および（ｃ）異種遺伝子ポリペプチドをコードする配列を含み、前記リガンド結合性ドメインへと融合させた前記トランス活性化ドメイン、ＤＮＡ結合性ドメイン、および前記異種遺伝子ポリペプチドのうちの１つが、ポリペプチドリンカーにより、前記リガンド結合性ドメインへと融合させた前記トランス活性化ドメイン、ＤＮＡ結合性ドメイン、および前記異種遺伝子ポリペプチドのうちの別の１つへと連結されており、前記ポリペプチドリンカーが、切断型リンカー配列またはリボソームスキッピングリンカー配列を含む、遺伝子スイッチ系が提示される。
【００３４】
一部の実施形態では、本明細書で提示される遺伝子スイッチ系の、１または複数の発現カセットは、異種遺伝子ポリペプチドをコードする配列をさらに含む。一部の実施形態では、１または複数の発現カセットは、以下：（ａ）１または複数のリコンビナーゼ接合部位；および（ｂ）セリンリコンビナーゼをコードする配列の１または複数をさらに含む。他の実施形態では、１または複数の発現カセットは、以下：（ａ）非誘導性プロモーター；および（ｂ）誘導性プロモーターのうちの１または複数をさらに含む。
【００３５】
ある特定の実施形態では、本明細書で提示される遺伝子スイッチ系のＤＮＡ結合性ドメインは、配列番号１８４に示される配列を有する。他の実施形態では、本明細書で提示される遺伝子スイッチ系のトランス活性化ドメインは、配列番号１８１に示される配列を有する。別の実施形態では、第１の核内受容体リガンド結合ドメイン、および第２の核内受容体リガンド結合ドメイン、ならびにリガンド結合性ドメインのうちの少なくとも１つは、配列番号１８５〜１８６のうちのいずれか１つに示される配列を有する。ある特定の実施形態では、非誘導性プロモーターは、配列番号４０〜６４のうちのいずれか１つに示される配列を有する。ある特定の実施形態では、誘導性プロモーターは、配列番号４０〜６４のうちのいずれか１つに示される配列を有する。ある特定の実施形態では、ポリペプチドリンカーは、配列番号１４６〜１６２のうちのいずれか１つに示される配列を有する。一部の実施形態では、ポリペプチドリンカーは、配列番号１８〜１９および１４６〜１６２のうちのいずれか１つに示される配列を伴う切断型リンカー、リボソームスキッピングリンカー、またはＩＲＥＳリンカーである。
【００３６】
一部の例では、本明細書で提示される遺伝子スイッチ系の、１または複数の発現カセットは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする配列を含む発現カセットを含み、キメラ抗原受容体の発現は、非誘導性プロモーターによりモジュレートされる。ある特定の例では、ＣＡＲは、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＢＣＭＡ、ＣＤ４４、α−葉酸受容体、ＣＡＩＸ、ＣＤ３０、ＲＯＲ１、ＣＥＡ、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４０、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、葉酸結合性タンパク質、ＧＤ２、ＧＤ３、ＩＬ−１３Ｒ−ａ２、ＫＤＲ、ＥＤＢ−Ｆ、メソテリン、ＣＤ２２、ＥＧＦＲ、ＭＵＣ−１、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＵＣ−１６、ｈ５Ｔ４、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ−７２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ１２３、およびＶＥＧＦ−Ｒ２のうちの少なくとも１つに結合することが可能である。
【００３７】
他の例では、本明細書で提示される遺伝子スイッチ系の非誘導性プロモーターは、ＥＦ１Ａまたはこれらの変異体を含む。ある特定の場合には、発現カセットは、配列番号１３１に示される配列を有する。他の場合には、発現カセットは、細胞タグをコードする配列をさらに含み、細胞タグは、リンカーにより、ＣＡＲへと連結されている。場合によって、細胞タグは、ＨＥＲ１切断型変異体およびＣＤ２０切断型変異体のうちの少なくとも１つを含む。
【００３８】
別の例では、本明細書で提示される遺伝子スイッチ系の発現カセットは、配列番号１３２に示される配列を有する。一部の実施形態では、発現カセットは、第１の遺伝子スイッチポリペプチドをコードする配列および第２の遺伝子スイッチポリペプチドをコードする配列をさらに含み、第１の遺伝子スイッチポリペプチドおよび第２の遺伝子スイッチポリペプチドのうちの１つは、リンカーにより、ＣＡＲへと連結されている。
【００３９】
一部の実施形態では、本明細書で提示される遺伝子スイッチ系の第１の遺伝子スイッチポリペプチドと、第２の遺伝子スイッチポリペプチドとは、前記ポリペプチドリンカーにより連結されており、ポリペプチドリンカーは、切断型リンカーである。一部の実施形態では、発現カセットは、配列番号１３３に示される配列を有する。一部の実施形態では、第１の遺伝子スイッチポリペプチドと、第２の遺伝子スイッチポリペプチドとは、ポリペプチドリンカーにより連結されており、ポリペプチドリンカーは、ＩＲＥＳリンカーである。
【００４０】
ある特定の実施形態では、本明細書で提示される遺伝子スイッチ系の発現カセットは、配列番号１３４に示される配列を有する。他の実施形態では、１または複数の発現カセットは、異種遺伝子ポリペプチドをコードする配列を含む発現カセットを含み、前記異種遺伝子ポリペプチドの発現は、誘導性プロモーターによりモジュレートされる。他の実施形態では、異種遺伝子ポリペプチドは、サイトカインを含む。場合によって、サイトカインは、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、またはＩＬ−１５変異体の融合体のうちの少なくとも１つを含む。
【００４１】
別の実施形態では、本明細書で提示される遺伝子スイッチ系の発現カセットは、配列番号１３５に示される配列を有する。一部の実施形態では、発現カセットは、第２の異種遺伝子ポリペプチドをコードする配列を含み、第２の異種遺伝子ポリペプチドは、細胞タグを含む。ある特定の場合には、細胞タグは、ＨＥＲ１切断型変異体およびＣＤ２０切断型変異体のうちの少なくとも１つを含む。他の場合には、細胞タグは、リンカーにより、サイトカインへと連結されている。別の場合には、発現カセットは、配列番号１３６に示される配列を有する。
【００４２】
場合によって、本明細書で提示される遺伝子スイッチ系は、異種遺伝子を、宿主細胞内に組み込むための遺伝子スイッチ系であり、宿主細胞を、セリンリコンビナーゼ、および１または複数のリコンビナーゼ接合部位の存在下で、１または複数の発現カセットと接触させると、異種遺伝子は、宿主細胞内に組み込まれる。ある特定の場合には、遺伝子スイッチ系は、リガンドをさらに含み、宿主細胞を、リガンドと接触させると、異種遺伝子は、宿主細胞内で発現する。ある特定の場合には、宿主細胞は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞である。ある特定の場合には、１または複数のリコンビナーゼ接合部位は、ファージゲノム組換え接合部位（ａｔｔＰ）または細菌ゲノム組換え接合部位（ａｔｔＢ）を含みうる。場合によって、セリンリコンビナーゼは、ＳＦ３７０でありうる。
【００４３】
ある特定の場合には、本明細書で提示される遺伝子スイッチ系の誘導性プロモーターは、トランス活性化ドメインにより活性化する。ある特定の場合には、系は、１または複数のベクター内に含有される。ある特定の場合には、系は、１つのベクター内に含有される。
【００４４】
本明細書で提示される遺伝子スイッチ系の構成要素のうちの１または複数をコードするポリヌクレオチドが開示される。本明細書ではまた、本明細書で提示される遺伝子スイッチ系の構成要素のうちの１または複数をコードするポリヌクレオチド含むベクターも開示される。ある特定の場合には、ベクターは、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、または非ウイルスベクターのうちのいずれか１つである。ある特定の場合には、ベクターは、非ウイルスベクターであり、前記非ウイルスベクターは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンである。
【００４５】
本明細書では、第１の遺伝子スイッチポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、第２の遺伝子スイッチポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および目的の遺伝子（ＧＯＩ）をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド構築物であって、ＧＯＩをコードするポリヌクレオチドが、第１の遺伝子スイッチポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、第２の遺伝子スイッチポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとの間に位置する、連続オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、ポリヌクレオチド構築物が、リンカーをコードするポリヌクレオチドをさらに含み、前記ＧＯＩが、前記リンカーにより、前記第１の遺伝子スイッチポリペプチドおよび第２の遺伝子スイッチポリペプチドの各々へと連結されている、ポリヌクレオチド構築物が提示される。
【００４６】
本明細書では、（ｉ）第１の核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたＤＮＡ結合性ドメインを含む、第１の遺伝子スイッチポリペプチドをコードする、第１の配列；および（ｉｉ）第２の核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたトランス活性化ドメインを含む、第２の遺伝子スイッチポリペプチドをコードする、第２の配列のうちの少なくとも１つを含み；前記第１の配列および前記第２の配列のうちの少なくとも１つの発現が、１または複数のＮＦＡＴ応答エレメントによりモジュレートされる、ポリヌクレオチドが提示される。
【００４７】
本明細書では、操作細胞の増殖および／または生存を刺激する方法であって、（ａ）細胞試料を、対象から得るステップと、（ｂ）前記細胞試料の細胞に、１または複数のトランスポゾンを含む、１または複数のポリヌクレオチドをトランスフェクトするステップであって、前記１または複数のトランスポゾンが、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴＣＲ、サイトカイン、１または複数の細胞タグ、前記サイトカインのリガンド誘導性制御のための遺伝子スイッチポリペプチド、および前記１または複数のポリヌクレオチドを、前記細胞のゲノムへと組み込んで、操作細胞の集団をもたらすのに有効なトランスポザーゼをコードする、ステップとを含み、前記遺伝子スイッチポリペプチドが、ｉ）第１の核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたＤＮＡ結合性ドメインを含む、第１の遺伝子スイッチポリペプチド、およびｉｉ）第２の核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたトランス活性化ドメインを含む、第２の遺伝子スイッチポリペプチドを含み、前記第１の遺伝子スイッチポリペプチドと、前記第２の遺伝子スイッチポリペプチドとが、リンカーにより連結されている、方法が提示される。
【００４８】
本明細書では、それを必要とする対象の、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける操作細胞の存続を増強する方法であって、（ａ）細胞試料を、対象から得るステップと、（ｂ）前記細胞試料の細胞に、１または複数のトランスポゾンを含む、１または複数のポリヌクレオチドをトランスフェクトするステップであって、前記１または複数のトランスポゾンが、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴＣＲ、サイトカイン、１または複数の細胞タグ、前記サイトカインのリガンド誘導性制御のための遺伝子スイッチポリペプチド、およびＤＮＡを、前記細胞のゲノムへと組み込んで、操作細胞の集団をもたらすのに有効なトランスポザーゼをコードする、ステップとを含み、前記遺伝子スイッチポリペプチドが、ｉ）第１の核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたＤＮＡ結合性ドメインを含む、第１の遺伝子スイッチポリペプチド、およびｉｉ）第２の核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたトランス活性化ドメインを含む、第２の遺伝子スイッチポリペプチドを含み、前記第１の遺伝子スイッチポリペプチドと、前記第２の遺伝子スイッチポリペプチドとが、リンカーにより連結されている、方法が提示される。
【００４９】
一部の実施形態では、本明細書で提示される方法における、細胞にトランスフェクトするステップは、細胞に電気穿孔することを含む。ある特定の実施形態では、１または複数のポリヌクレオチドのうちの、少なくとも１つのポリヌクレオチドは、遺伝子スイッチポリペプチドをコードし、少なくとも１つのポリヌクレオチドは、プロモーターによりモジュレートされ、プロモーターは、組織特異的プロモーターもしくはＥＦ１Ａプロモーター、またはこれらの機能的な変異体である。ある特定の場合には、プロモーターは、配列番号５８〜６０のうちのいずれか１つに示される配列を有するＥＦ１Ａプロモーター、またはこの機能的な変異体である。ある特定の場合には、プロモーターは、組織特異的プロモーターであり、組織特異的プロモーターは、Ｔ細胞特異的応答エレメントを含む。ある特定の場合には、プロモーターは、組織特異的プロモーターであり、組織特異的プロモーターは、１または複数のＮＦＡＴ応答エレメントを含む。ある特定の場合には、ＮＦＡＴ応答エレメントは、配列番号５０〜５７のうちのいずれか１つに示される配列を有する。ある特定の場合には、サイトカインは、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、またはＩＬ−１５変異体の融合体のうちの少なくとも１つを含む。他の場合には、サイトカインは、分泌形態にある。別の場合には、サイトカインは、膜結合形態にある。さらに別の場合には、サイトカインは、配列番号２０３〜２０９のうちのいずれか１つに示される配列を有する。さらに別の場合には、細胞は、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｔ細胞、またはＴ細胞前駆細胞である。
【００５０】
他の場合には、本明細書で提示される方法は、有効量の操作細胞を、それを必要とする対象へと投与するステップをさらに含む。ある特定の場合には、投与するステップは、対象に、操作細胞を、速やかに輸注することを含む。ある特定の場合には、方法は、有効量のリガンドを投与して、サイトカインの発現を誘導するステップをさらに含む。ある特定の場合には、リガンドは、ベレジメクス（veledimex）である。場合によって、ＣＡＲは、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＢＣＭＡ、ＣＤ４４、α−葉酸受容体、ＣＡＩＸ、ＣＤ３０、ＲＯＲ１、ＣＥＡ、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４０、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、葉酸結合性タンパク質、ＧＤ２、ＧＤ３、ＩＬ−１３Ｒ−ａ２、ＫＤＲ、ＥＤＢ−Ｆ、メソテリン、ＣＤ２２、ＥＧＦＲ、ＭＵＣ−１、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＵＣ−１６、ｈ５Ｔ４、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ−７２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ１２３、およびＶＥＧＦ−Ｒ２のうちの少なくとも１つに結合することが可能である。ある特定の場合には、ＣＡＲは、ＣＤ１９に結合することが可能である。ある特定の場合には、ＣＡＲは、ＣＤ３３に結合することが可能である。ある特定の場合には、トランスポザーゼは、サケ科型Ｔｃ１様トランスポザーゼである。ある特定の場合には、トランスポザーゼは、ＳＢ１１またはＳＢ１００ｘトランスポザーゼである。ある特定の場合には、１または複数の細胞タグは、ＨＥＲ１切断型変異体およびＣＤ２０切断型変異体のうちの少なくとも１つを含む。ある特定の場合には、１または複数の細胞タグは、配列番号１８９〜２０２のうちのいずれか１つに示される配列を有する。
【００５１】
本明細書では、充実性腫瘍を伴う対象を処置する方法であって、（ａ）細胞試料を、対象から得るステップと、（ｂ）前記細胞試料の細胞に、１または複数のトランスポゾンを含む、１または複数のポリヌクレオチドをトランスフェクトするステップであって、前記１または複数のトランスポゾンが、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴＣＲ、サイトカイン、１または複数の細胞タグ、前記サイトカインのリガンド誘導性制御のための遺伝子スイッチポリペプチド、およびＤＮＡを、前記細胞のゲノムへと組み込んで、操作細胞の集団をもたらすのに有効なトランスポザーゼをコードし、前記遺伝子スイッチポリペプチドが、ｉ）第１の核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたＤＮＡ結合性ドメインを含む、第１の遺伝子スイッチポリペプチド、およびｉｉ）第２の核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたトランス活性化ドメインを含む、第２の遺伝子スイッチポリペプチドを含み、前記第１の遺伝子スイッチポリペプチドと、前記第２の遺伝子スイッチポリペプチドとが、リンカーにより連結されている、ステップと、（ｃ）操作細胞の前記集団を、前記対象へと投与するステップとを含む方法が提示される。
【００５２】
一部の実施形態では、処置する方法におけるサイトカインは、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、またはＩＬ−１５変異体の融合体のうちの少なくとも１つを含む。一部の実施形態では、サイトカインは、ＩＬ−１２を含む。一部の実施形態では、１または複数のポリヌクレオチドのうちの、少なくとも１つのポリヌクレオチドは、遺伝子スイッチポリペプチドをコードし、少なくとも１つのポリヌクレオチドは、プロモーターによりモジュレートされ、プロモーターは、組織特異的プロモーターもしくはＥＦ１Ａプロモーター、またはこれらの機能的な変異体である。一部の実施形態では、プロモーターは、配列番号５８〜６０のうちのいずれか１つに示される配列を有するＥＦ１Ａプロモーター、またはこの機能的な変異体である。ある特定の実施形態では、プロモーターは、組織特異的プロモーターであり、組織特異的プロモーターは、Ｔ細胞特異的応答エレメントを含む。一部の実施形態では、プロモーターは、組織特異的プロモーターであり、組織特異的プロモーターは、１または複数のＮＦＡＴ応答エレメントを含む。一部の実施形態では、ＮＦＡＴ応答エレメントは、配列番号５０〜５７のうちのいずれか１つに示される配列を有する。
【００５３】
また、操作エフェクター細胞も開示され、この場合、前記操作エフェクター細胞は、（ａ）標的細胞が発現する、所定の細胞表面タンパク質に選択的に結合する、操作受容体構築物をコードする、第１のポリヌクレオチド；（ｂ）１または複数の操作遺伝子スイッチポリペプチドをコードする、１または複数のポリヌクレオチドであって、前記操作遺伝子スイッチポリペプチドが、トランス活性化ドメイン、ＤＮＡ結合性ドメイン、およびリガンド結合性ドメインのうちの１または複数を含む、１または複数のポリヌクレオチド；ならびに（ｃ）前記操作遺伝子スイッチポリペプチドによりモジュレートされる、リガンド誘導性プロモーターの制御下にある異種遺伝子であって、サイトカインをコードする異種遺伝子を含む。
【００５４】
一部の実施形態では、標的細胞は、哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、標的細胞は、腫瘍細胞である。一部の実施形態では、細胞表面タンパク質は、前記腫瘍細胞の表面上で発現する。一部の実施形態では、細胞表面タンパク質は、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）内で発現する。一部の実施形態では、操作受容体構築物は、キメラ抗原受容体である。一部の実施形態では、キメラ抗原受容体は、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＢＣＭＡ、ＣＤ４４、α−葉酸受容体、ＣＡＩＸ、ＣＤ３０、ＲＯＲ１、ＣＥＡ、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４０、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、葉酸結合性タンパク質、ＧＤ２、ＧＤ３、ＩＬ−１３Ｒ−ａ２、ＫＤＲ、ＥＤＢ−Ｆ、メソテリン、ＣＤ２２、ＥＧＦＲ、ＭＵＣ−１、ＭＡＧＥ−Ａ１、ｈ５Ｔ４、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ−７２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ１２３、またはＶＥＧＦ−Ｒ２に結合する。一部の実施形態では、キメラ抗原受容体は、ＥＧＦＲｖＩＩＩに結合する。
【００５５】
一部の実施形態では、操作受容体構築物は、操作Ｔ細胞受容体である。一部の実施形態では、サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、またはＩＬ−１５とＩＬ−１５Ｒαとの融合体である。一部の実施形態では、サイトカインは、ＩＬ−１２である。一部の実施形態では、エフェクター細胞は、細胞タグを含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。一部の実施形態では、細胞タグは、切断型ＨＥＲ１変異体またはＣＤ２０切断型変異体である。一部の実施形態では、エフェクター細胞は、免疫エフェクター細胞である。一部の実施形態では、エフェクター細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、または腫瘍浸潤リンパ球である。一部の実施形態では、１または複数の操作遺伝子スイッチポリペプチドは、トランス活性化ドメイン、ＤＮＡ結合性ドメイン、およびリガンド結合性ドメインを含む。一部の実施形態では、１または複数の操作遺伝子スイッチポリペプチドは、核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させた前記ＤＮＡ結合性ドメインを含む、第１の遺伝子スイッチポリペプチド、および核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させた前記トランス活性化ドメインを含む、第２の遺伝子スイッチポリペプチドを含む。
【００５６】
一部の実施形態では、第１の遺伝子スイッチポリペプチドと、前記第２の遺伝子スイッチポリペプチドとは、ポリペプチドリンカーにより連結されている。一部の実施形態では、ポリペプチドリンカーは、切断型リンカー配列またはリボソームスキッピングリンカー配列である。一部の実施形態では、ポリペプチドリンカーは、２Ａ、Ｆ／Ｔ２Ａ、ＧＳＧ−２Ａ、ＧＳＧリンカー、ＳＧＳＧリンカー、フューリンリンク、ならびにこれらの変異体および誘導体のうちの１つを含む。一部の実施形態では、トランス活性化ドメインは、ＶＰ１６トランス活性化ドメインを含む。一部の実施形態では、１または複数の操作遺伝子スイッチポリペプチドは、エクジソン受容体（ＥｃＲ）、ユビキタス受容体、オーファン受容体１、ＮＥＲ−１、ステロイドホルモン核内受容体１、レチノイドＸ受容体相互作用性タンパク質１５、肝臓Ｘ受容体β、ステロイドホルモン受容体様タンパク質、肝臓Ｘ受容体、肝臓Ｘ受容体α、ファルネソイドＸ受容体、受容体相互作用性タンパク質１４、およびファルネソール受容体のうちの少なくとも１つを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合性ドメイン（ＤＢＤ）は、ＧＡＬ４（ＧＡＬ４  ＤＢＤ）、ＬｅｘＡＤＢＤ、転写因子ＤＢＤ、ステロイド／甲状腺ホルモン核内受容体スーパーファミリーメンバーＤＢＤ、細菌ＬａｃＺ  ＤＢＤ、および酵母ＤＢＤのうちの少なくとも１つを含む。
【００５７】
本明細書では、異種遺伝子の発現をモジュレートする方法であって、標的細胞を、本明細書で開示されるエフェクター細胞と接触させるステップを含む方法がさらに開示される。場合によって、モジュレートすることは、前記異種遺伝子の発現を増大または減少させることを含む。場合によって、発現は、前記リガンドの非存在下において、前記リガンドの存在下における発現と比較して低減されるか、または消失する。場合によって、発現は、さらなる量の前記リガンドを施すことにより蘇生する。
【００５８】
さらに、エフェクター細胞内の異種遺伝子の発現を調節する方法であって、前記エフェクター細胞へと、１または複数の操作遺伝子スイッチポリペプチド、操作受容体構築物、および前記異種遺伝子をコードするポリヌクレオチドを導入するステップであって、前記異種遺伝子が、誘導性プロモーターの制御下にある、ステップと；前記操作受容体構築物を介して、前記エフェクター細胞を活性化させるステップと；前記エフェクター細胞を活性化させる前記ステップの後で、前記１または複数の操作遺伝子スイッチポリペプチドを介して、前記異種遺伝子の発現を誘導するために、リガンドを、前記エフェクター細胞へと提示するステップとを含む方法も開示される。
【００５９】
場合によって、活性化させるステップは、エフェクター細胞を、抗原と接触させることを含む。場合によって、抗原は、腫瘍抗原である。場合によって、リガンドを、エフェクター細胞へと提示する前に、少なくとも７日間にわたり、エフェクター細胞を、腫瘍抗原へと曝露する。場合によって、エフェクター細胞を活性化させるステップは、エフェクター細胞を、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）と共培養することを含む。場合によって、共培養することは、少なくとも７日間、１４日間、２１日間、または２８日間にわたる。場合によって、ａＡＰＣは、トランスジェニックＫ５６２細胞である。場合によって、操作受容体構築物は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。場合によって、ＣＡＲは、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＢＣＭＡ、ＣＤ４４、α−葉酸受容体、ＣＡＩＸ、ＣＤ３０、ＲＯＲ１、ＣＥＡ、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４０、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、葉酸結合性タンパク質、ＧＤ２、ＧＤ３、ＩＬ−１３Ｒ−ａ２、ＫＤＲ、ＥＤＢ−Ｆ、メソテリン、ＣＤ２２、ＥＧＦＲ、ＭＵＣ−１、ＭＡＧＥ−Ａ１、ｈ５Ｔ４、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ−７２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ１２３、またはＶＥＧＦ−Ｒ２に結合する。場合によって、操作受容体構築物は、操作Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む。場合によって、エフェクター細胞は、エフェクター細胞を、ＴＣＲ結合性ポリペプチドと接触させることを含む。場合によって、ＴＣＲ結合性ポリペプチドは、ＴＣＲ結合性抗体またはこの断片を含む。場合によって、リガンドを、エフェクター細胞へと提示する前に、少なくとも７日間にわたり、エフェクター細胞を、ＴＣＲ結合性ポリペプチドへと曝露する。場合によって、ＴＣＲ結合性ポリペプチドは、ａＡＰＣを介して発現する。場合によって、異種遺伝子は、サイトカインをコードする。場合によって、サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、またはＩＬ−１５とＩＬ−１５Ｒαとの融合体である。場合によって、サイトカインは、ＩＬ−１２である。
【００６０】
場合によって、異種遺伝子は、少なくとも１つの細胞タグをコードする。場合によって、細胞タグは、ＨＥＲ１切断型変異体またはＣＤ２０切断型変異体である。場合によって、１または複数の遺伝子発現カセットは、細胞タグをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。場合によって、エフェクター細胞は、免疫エフェクター細胞である。場合によって、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、または腫瘍浸潤リンパ球である。場合によって、１または複数の操作遺伝子スイッチポリペプチドは、トランス活性化ドメイン、ＤＮＡ結合性ドメイン、およびリガンド結合性ドメインを含む。場合によって、リガンド結合性ドメインは、エクジソン受容体（ＥｃＲ）、ユビキタス受容体、オーファン受容体１、ＮＥＲ−１、ステロイドホルモン核内受容体１、レチノイドＸ受容体相互作用性タンパク質１５、肝臓Ｘ受容体β、ステロイドホルモン受容体様タンパク質、肝臓Ｘ受容体、肝臓Ｘ受容体α、ファルネソイドＸ受容体、受容体相互作用性タンパク質１４、およびファルネソール受容体のうちの少なくとも１つを含む。場合によって、ＤＮＡ結合性ドメインは、ＧＡＬ４（ＧＡＬ４  ＤＢＤ）、ＬｅｘＡＤＢＤ、転写因子ＤＢＤ、ステロイド／甲状腺ホルモン核内受容体スーパーファミリーメンバーＤＢＤ、細菌ＬａｃＺ  ＤＢＤ、および酵母ＤＢＤのうちの少なくとも１つを含む。場合によって、トランス活性化ドメインは、ＶＰ１６トランス活性化ドメインを含む。
【００６１】
場合によって、１または複数の操作遺伝子スイッチポリペプチドは、前記ＤＮＡ結合性ドメインに結合することが可能な応答エレメントをさらに含む。場合によって、１または複数の操作遺伝子スイッチポリペプチドは、ウルトラスピラクルタンパク質（ＵＳＰ）、レチノイド受容体Ｘ（ＲＸＲ）、またはこれらの機能的な断片および変異体のうちの少なくとも１つをさらに含み、前記これらの機能的な断片および変異体は、ＥｃＲに結合することが可能である。場合によって、１または複数の操作遺伝子スイッチポリペプチドは、１または複数のポリペプチドリンカーをさらに含む。場合によって、１または複数のポリペプチドリンカーは、２Ａ、ＧＳＧ−２Ａ、ＧＳＧリンカー、ＳＧＳＧリンカー、フューリンリンク、ならびにこれらの変異体および誘導体のうちの少なくとも１つをさらに含む。場合によって、リガンドは、（２Ｓ，３Ｒ，５Ｒ，９Ｒ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｒ）−１７−［（２Ｓ，３Ｒ）−３，６−ジヒドロキシ−６−メチルヘプタン−２−イル］−２，３，１４−トリヒドロキシ−１０，１３−ジメチル−２，３，４，５，９，１１，１２，１５，１６，１７−デカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−６−オン；Ｎ’−（３，５−ジメチルベンゾイル）−Ｎ’−［（３Ｒ）−２，２−ジメチル−３−ヘキサニル］−２−エチル−３−メトキシベンゾヒドラジド；５−メチル−２，３−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］ジオキシン−６−カルボン酸Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−Ｎ’−（１−エチル−２，２−ジメチル−プロピル）−ヒドラジド；５−メチル−２，３−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］ジオキシン−６−カルボン酸Ｎ’−（３，５−ジメトキシ−４−メチル−ベンゾイル）−Ｎ’−（１−エチル−２，２−ジメチル−プロピル）−ヒドラジド；５−メチル−２，３−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］ジオキシン−６−カルボン酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；５−メチル−２，３−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］ジオキシン−６−カルボン酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメトキシ−４−メチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；５−エチル−２，３−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］ジオキシン−６−カルボン酸Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−Ｎ’−（１−エチル−２，２−ジメチル−プロピル）−ヒドラジド；５−エチル−２，３−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］ジオキシン−６−カルボン酸Ｎ’−（３，５−ジメトキシ−４−メチル−ベンゾイル）−Ｎ’−（１−エチル−２，２−ジメチル−プロピル）−ヒドラジド；５−エチル−２，３−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］ジオキシン−６−カルボン酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；５−エチル−２，３−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］ジオキシン−６−カルボン酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメトキシ−４−メチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−エチル−２，２−ジメチル−プロピル）−Ｎ’−（３−メトキシ−２−メチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；３，５−ジメトキシ−４−メチル−安息香酸Ｎ−（１−エチル−２，２−ジメチル−プロピル）−Ｎ’−（３−メトキシ−２−メチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３−メトキシ−２−メチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；３，５−ジメトキシ−４−メチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３−メトキシ−２−メチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−エチル−２，２−ジメチル−プロピル）−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド；３，５−ジメトキシ−４−メチル−安息香酸Ｎ−（１−エチル−２，２−ジメチル−プロピル）−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド；３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド；３，５−ジメトキシ−４−メチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド；２−メトキシ−ニコチン酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ペンチル）−Ｎ’−（４−エチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（２，２−ジメチル−１−フェニル−プロピル）−Ｎ’−（４−エチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ペンチル）−Ｎ’−（３−メトキシ−２−メチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；および３，５−ジメトキシ−４−メチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ペンチル）−Ｎ’−（３−メトキシ−２−メチル−ベンゾイル）−ヒドラジドのうちの少なくとも１つを含む。
【００６２】
本明細書では、操作細胞内の異種遺伝子発現の、リガンド誘導性制御のためのポリヌクレオチドであって、（ａ）標的細胞が発現する、所定の細胞表面タンパク質に結合することが可能な、操作受容体構築物をコードする、第１の配列；および（ｂ）前記リガンドの存在に応答して、前記異種遺伝子へと連結されたプロモーターをモジュレートすることによる、前記異種遺伝子発現のリガンド誘導性制御のための、１または複数の操作遺伝子スイッチポリペプチドをコードする、第２の配列を含み、前記操作受容体構築物と、前記１または複数の操作遺伝子スイッチポリペプチドとが、ポリペプチドリンカーにより連結されている、ポリヌクレオチドがさらに開示される。
【００６３】
一部の実施形態では、ポリペプチドリンカーは、切断型リンカー配列を含む。一部の実施形態では、切断型リンカー配列は、Ｆ２Ａリンカーである。一部の実施形態では、１または複数の操作遺伝子スイッチポリペプチドは、核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたＤＮＡ結合性ドメインを含む、第１の遺伝子スイッチポリペプチド、および核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたトランス活性化ドメインを含む、第２の遺伝子スイッチポリペプチドを含む。一部の実施形態では、第１の遺伝子スイッチポリペプチドと、第２の遺伝子スイッチポリペプチドとは、リンカーにより連結されている。一部の実施形態では、リンカーは、切断型リンカー配列またはリボソームスキッピングリンカー配列である。一部の実施形態では、リンカーは、２Ａリンカー、ＧＳＧ−２Ａリンカー、ＧＳＧリンカー、ＳＧＳＧリンカー、フューリンリンク、ならびにこれらの変異体および誘導体である。一部の実施形態では、２Ａリンカーは、Ｆ２Ａリンカーである。一部の実施形態では、異種遺伝子は、サイトカインをコードする。一部の実施形態では、サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、またはＩＬ−１５とＩＬ−１５Ｒαとの融合体である。一部の実施形態では、サイトカインは、ＩＬ−１２である。一部の実施形態では、異種遺伝子は、少なくとも１つの細胞タグをコードする。一部の実施形態では、細胞タグは、ＨＥＲ１切断型変異体またはＣＤ２０切断型変異体である。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドを、操作細胞へと組み込む。
【００６４】
本明細書では、標的細胞の近傍の宿主細胞内で、サイトカインを発現させるための系であって、リガンドの存在下で、操作受容体構築物が、細胞表面タンパク質に結合すると、標的細胞の近傍の宿主細胞が、サイトカインを発現するように、（ａ）（ｉ）標的細胞内で発現する、所定の細胞表面タンパク質に選択的に結合する、操作受容体構築物；（ｉｉ）トランス活性化ドメイン、ＤＮＡ結合性ドメイン、およびリガンド結合性ドメインのうちの１または複数を含む操作遺伝子スイッチポリペプチド；ならびに（ｉｉｉ）操作遺伝子スイッチポリペプチドによりモジュレートされるプロモーターへと連結された、異種遺伝子から発現するサイトカインをコードする宿主細胞と；（ｂ）リガンドとを含む系がさらに開示される。
【００６５】
場合によって、操作受容体構築物は、キメラ抗原受容体を含む。場合によって、キメラ抗原受容体は、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＢＣＭＡ、ＣＤ４４、α−葉酸受容体、ＣＡＩＸ、ＣＤ３０、ＲＯＲ１、ＣＥＡ、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４０、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、葉酸結合性タンパク質、ＧＤ２、ＧＤ３、ＩＬ−１３Ｒ−ａ２、ＫＤＲ、ＥＤＢ−Ｆ、メソテリン、ＣＤ２２、ＥＧＦＲ、ＭＵＣ−１、ＭＡＧＥ−Ａ１、ｈ５Ｔ４、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ−７２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ１２３、またはＶＥＧＦ−Ｒ２に結合する。場合によって、キメラ抗原受容体は、ＥＧＦＲｖＩＩＩに結合する。場合によって、操作受容体構築物は、操作Ｔ細胞受容体を含む。場合によって、サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、またはＩＬ−１５とＩＬ−１５Ｒαとの融合体である。場合によって、サイトカインは、ＩＬ−１２である。場合によって、宿主細胞は、少なくとも１つの細胞タグをさらにコードする。場合によって、細胞タグは、ＨＥＲ１切断型変異体またはＣＤ２０切断型変異体である。
【００６６】
本明細書ではさらに、標的細胞の近傍の宿主細胞から、サイトカインを発現させる方法であって、リガンドの存在下で、本明細書で開示される系を、前記標的細胞と接触させるステップを含む方法も提示される。本明細書ではさらに、標的細胞の近傍の宿主細胞からの、サイトカインの発現をモジュレートする方法であって、リガンドの存在下で、本明細書で開示される系を、標的細胞と接触させるステップと、リガンドの量を調節するステップとを含む方法も提示される。場合によって、発現は、前記リガンドの非存在下で、前記リガンドの存在下における発現と比較して低減されるか、または消失する。場合によって、発現は、さらなる量の前記リガンドを施すことにより蘇生する。場合によって、宿主細胞は、動物細胞または哺乳動物細胞である。場合によって、哺乳動物細胞は、ヒト細胞である。場合によって、哺乳動物細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、または腫瘍浸潤リンパ球である。場合によって、標的細胞は、腫瘍細胞である。場合によって、系は、１または複数のベクター内に含有される。場合によって、各ベクターは、プラスミドを含む。場合によって、各ベクターは、発現プラスミドを含む。場合によって、各ベクターは、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、または非ウイルスベクターである。場合によって、非ウイルスベクターは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  ＢｅａｕｔｙトランスポザーゼおよびＳＢトランスポゾンを含む。
【００６７】
本明細書では、ＥＧＦＲｖＩＩＩへの結合のためのポリペプチドであって、配列番号２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、または２４４に示される配列に対する、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または９９．５％の同一性を有するポリペプチド配列を含むポリペプチドがさらに開示される。
【００６８】
場合によって、ポリペプチドは、操作エフェクター細胞内で発現する。場合によって、エフェクター細胞は、免疫エフェクター細胞である。場合によって、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、または腫瘍浸潤リンパ球である。場合によって、ポリペプチドは、抗体またはこの断片を含む。場合によって、ポリペプチドは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。場合によって、ＥＧＦＲｖＩＩＩは、前記抗体もしくはこの断片または前記ＣＡＲのｓｃＦｖ抗原結合性ドメインに結合する。場合によって、ポリペプチドは、野生型ＥＧＦＲと交差反応しない。
【００６９】
本明細書では、ａ）ＥＧＦＲｖＩＩＩに結合することが可能な、操作受容体構築物；ｂ）トランス活性化ドメインおよび核内受容体リガンド結合性ドメインを含む第１のポリペプチド；ならびにｃ）ＤＮＡ結合性ドメインおよび核内受容体リガンド結合性ドメインを含む第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、Ｆ／Ｔ２Ａリンカーが、操作受容体構築物、第１のポリペプチド、および第２のポリペプチドのうちの、少なくとも２つを連結する、ポリヌクレオチドがさらに開示される。
【００７０】
場合によって、Ｆ／Ｔ２Ａリンカーは、前記操作受容体構築物を、前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドのうちの少なくとも１つへと連結する。場合によって、Ｆ／Ｔ２Ａリンカーは、第１のポリペプチドを、前記第２のポリペプチドへと連結する。場合によって、ポリヌクレオチドは、ＩＲＥＳリンカーをさらにコードする。場合によって、ＩＲＥＳリンカーは、第１のポリペプチドを、第２のポリペプチドへと連結する。
【００７１】
本明細書では、本明細書で開示されるポリヌクレオチドを含むエフェクター細胞がさらに開示される。場合によって、エフェクター細胞は、前記第１のポリペプチドまたは前記第２のポリペプチドによりモジュレートされることが可能な、誘導性プロモーターへと連結された異種遺伝子をコードする。
【００７２】
本明細書では、ＥＧＦＲｖＩＩＩに結合することが可能なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、（ａ）ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合性領域；（ｂ）膜貫通領域；および（ｃ）膜貫通領域を、ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合性領域と連結するスペーサー領域を含み、スペーサー領域が、少なくとも１つの二量体化部位を含むストーク領域、およびストーク領域に対する、少なくとも７５％の配列同一性を伴う配列を含むストーク伸長領域を含む、ＣＡＲがさらに開示される。
【００７３】
本明細書では、（ａ）ＥＧＦＲｖＩＩＩ分子またはこの変異体に結合するのに有効な、操作エフェクター細胞の表面における、ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合性部分；（ｂ）トランス活性化ドメイン、ＤＮＡ結合性ドメイン、およびリガンド結合性ドメインのうちの１または複数を含む、操作遺伝子スイッチポリペプチド；ならびに（ｃ）サイトカインをコードする異種遺伝子であって、操作遺伝子スイッチポリペプチドによりモジュレートされる、プロモーターにより制御される異種遺伝子を含む、操作エフェクター細胞がさらに開示される。
【００７４】
本開示の特徴は、特に、付属の特許請求の範囲において明示されている。本開示の特徴および利点についてのよりよい理解は、本開示の原理が用いられる、例示的な実施形態を明示する、以下の詳細な記載および付属の図面を参照することにより得られるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】遺伝子改変Ｔ細胞へと適応させたＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）系についての概略的描示を示す図である。ＳＢトランスポゾン系、すなわち、ＳＢ１１、膜結合型ＩＬ−１５（ｍｂＩＬ−１５）、およびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現させるＤＮＡプラスミドを、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）へとトランスフェクトして、Ｔ細胞の特異性をリダイレクトする。デザイナーＡａＰＣ（ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｒｏｐａｇａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ）に接すると、組込み配列を安定的に発現するＴ細胞を、繁殖および拡大増殖させる。
【図２Ａ】多様なリガンド誘導性遺伝子スイッチベクター系の、多様な構造的構成要素を概略的に例示する図である。描示される、例示的なＣＡＲは、ＣＤ１９  ＣＡＲを含みうる。ＥＦ１Ａプロモーターは、例示的な構成的プロモーターである。
【図２Ｂ】図２Ａの説明が参照される。
【図２Ｃ】図２Ａの説明が参照される。
【図２Ｄ】図２Ａの説明が参照される。
【図３】リガンド誘導性遺伝子スイッチポリペプチドのための、複数のベクター系についての概略的例示を示す図である。
【図４】ベレジメクスリガンド（溶媒：ＤＭＳＯ）の存在下／非存在下におけるヌクレオフェクション後１日目において、本明細書で記載されるリガンド誘導性遺伝子スイッチベクター系をトランスフェクトされた細胞についての定量的フローサイトメトリー解析を描示する図である。構築物１、４、５、６、７、および９は、図２Ａ〜２Ｄに概略的に描示された構築物に対応する。
【図５】ベレジメクスリガンド（溶媒：ＤＭＳＯ）の存在下／非存在下におけるヌクレオフェクション後２１日目において、本明細書で記載されるリガンド誘導性遺伝子スイッチベクター系をトランスフェクトされ、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ陽性集団についてゲートをかけられた細胞についての定量的フローサイトメトリー解析を描示する図である。リガンドを、フローサイトメトリー解析の４８時間前に添加した。構築物１、４、５、６、および９は、図２Ａ〜２Ｄに概略的に描示された構築物に対応する。
【図６】ベレジメクスリガンド（溶媒：ＤＭＳＯ）の存在下／非存在下におけるヌクレオフェクション後２９日目において、本明細書で記載されるリガンド誘導性遺伝子スイッチベクター系をトランスフェクトされ、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ陽性集団についてゲートをかけられた細胞についての定量的フローサイトメトリー解析を描示する図である。ｍｂＩＬ−１５の発現は、リガンド追加後にオンになる。構築物１、４、５、６、７、および９は、図２Ａ〜２Ｄに概略的に描示された構築物に対応する。
【図７】ベレジメクスリガンド（溶媒：ＤＭＳＯ）の存在下／非存在下におけるヌクレオフェクション後３５日目において、本明細書で記載されるリガンド誘導性遺伝子スイッチベクター系をトランスフェクトされ、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ陽性集団についてゲートをかけられた細胞についての定量的フローサイトメトリー解析を示す図である。ｍｂＩＬ−１５の発現は、リガンド除去後にオフになる。構築物１、４、５、６、および９は、図２Ａ〜２Ｄに概略的に描示された構築物に対応する。
【図８】ベレジメクスリガンド（溶媒：ＤＭＳＯ）の存在下／非存在下におけるヌクレオフェクション後４０日目において、本明細書で記載されるリガンド誘導性遺伝子スイッチベクター系をトランスフェクトされ、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ陽性集団についてゲートをかけられた細胞についての定量的フローサイトメトリー解析を示す図である。ｍｂＩＬ−１５の発現は、リガンドの再導入後において、維持される。構築物１、４、５、６、および９は、図２Ａ〜２Ｄに概略的に描示された構築物に対応する。
【図９】ベレジメクスリガンド（溶媒：ＤＭＳＯ）の存在下／非存在下におけるヌクレオフェクション後４８日目において、本明細書で記載されるリガンド誘導性遺伝子スイッチベクター系をトランスフェクトされ、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ陽性集団についてゲートをかけられた細胞についての定量的フローサイトメトリー解析を示す図である。ｍｂＩＬ−１５の発現は、リガンドの再導入後において、連続的に維持される。構築物１、４、５、６、および９は、図２Ａ〜２Ｄに概略的に描示された構築物に対応する。
【図１０】ベレジメクスリガンド（溶媒：ＤＭＳＯ）の存在下／非存在下におけるヌクレオフェクション後５０日目において、本明細書で記載されるリガンド誘導性遺伝子スイッチベクター系をトランスフェクトされ、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ陽性集団についてゲートをかけられた細胞についての定量的フローサイトメトリー解析を示す図である。ｍｂＩＬ−１５の発現は、リガンドの再導入後において、連続的に維持される。構築物１、４、５、６、および９は、図２Ａ〜２Ｄに概略的に描示された構築物に対応する。
【図１１】本明細書で記載されるリガンドの存在下および非存在下における、ヌクレオフェクション後２９、３３、３５、および４０日目における、本明細書で記載されるリガンド誘導性遺伝子スイッチベクター系をトランスフェクトされた細胞内の、ｍｂＩＬ−１５発現についての定量的ＲＴ−ｑＰＣＲ解析であって、遺伝子スイッチによる、ｍｂＩＬ−１５の発現の、リガンド依存性の調節を裏付ける定量的ＲＴ−ｑＰＣＲ解析を示す図である。
【図１２】リガンド調節性ｍｂＩＬ−１５発現が、ＩＬ−２サイトカインおよびＩＬ−２１サイトカインの非存在下において、優先的なＣＡＲ−Ｔ細胞の生存を促進することを例示する、細胞生存アッセイからの結果を示す図である。
【図１３Ａ】本明細書で記載されるリガンド誘導性遺伝子スイッチベクター系をトランスフェクトされた細胞についての定量的フローサイトメトリー解析であって、ベレジメクスリガンドの用量反応を裏付ける解析を示す図である。図１３Ｄは、本明細書で記載されるリガンド誘導性遺伝子スイッチベクター系をトランスフェクトされた細胞についての定量的フローサイトメトリー解析であって、ベレジメクスリガンドの用量反応を裏付ける解析を示す。細胞に、ＦＳＣ／ＳＳＣ／ＬＩＶＥ／ＣＤ３＋についてゲートをかけた。試料は、１００ｎＭ、２５ｎＭ、６．２５ｎＭ、１．５６ｎＭ、０．４ｎＭ、および０ｎＭ（ＤＭＳＯ対照）のベレジメクスを伴う、２日間にわたるインキュベーションの後で採取した。
【図１３Ｂ】図１３Ａの説明が参照される。
【図１３Ｃ】図１３Ａの説明が参照される。
【図１３Ｄ】図１３Ａの説明が参照される。
【図１４】ベレジメクスリガンドの存在下／非存在下における、本明細書で記載されるリガンド誘導性遺伝子スイッチベクター系をトランスフェクトされた細胞内の、ｍｂ−ＩＬ−１５発現についてのウェスタンブロット解析を示す図である。
【図１５Ａ】本明細書で記載される、一般の、多様なリガンド誘導性遺伝子スイッチベクター系の、変動する構造的構成要素について概略的に描示する図である。概略図において、「ＰＲ」は、プロモーターを表し；「ＩＰ」とは、遺伝子転写のための遺伝子スイッチの、リガンド誘導性プロモーターであり；「５’ＵＴＲ」とは、５’側非翻訳領域（ｍＲＮＡへの転写のための）であり；「ＧＯＩ」、「ＧＯＩ−１」、「ＧＯＩ−２」とは、ｍＲＮＡだけ（例えば、ｓｉＲＮＡ）、またはｍＲＮＡおよびポリペプチドとして転写され、発現する、目的の遺伝子または第１のＧＯＩ（ＧＯＩ−１）および第２のＧＯＩ（ＧＯＩ−２）であり；「リンカー」とは、切断型リンカー配列またはリボソームスキッピングリンカー配列であり；「ＴＡＤ」とは、転写トランス活性化ドメイン（例えば、ヘルペスウイルスに由来するＶＰ１６  ＴＡＤであるがこれらに限定されない）であり；「ＬＢＤ」とは、核内受容体リガンド結合性ドメイン（例えば、脊椎動物種および非脊椎動物種に由来する、ＵＳＰドメイン、ＲＸＲドメイン、またはキメラ（例えば、ＵＳＰ／ＲＸＲキメラ）、および置換突然変異ＬＢＤドメインであるがこれらに限定されない）であり；「ＤＢＤ」とは、ＤＮＡ結合性ドメイン（例えば、Ｇａｌ４  ＤＢＤであるがこれらに限定されない）であり；「ＥｃＲ」とは、切断型ＥｃＲドメインおよび置換突然変異ＥｃＲドメイン（ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、ステロイド性リガンド（ポナステロンＡおよびムリステロンＡなど）および非ステロイド性リガンド（ジアシルヒドラジン、テブフェノジド、およびメトキシフェノジドなど）を含むステロイド性および／または非ステロイド性のリガンド（アゴニスト）の存在下で、活性の転写活性化複合体を形成する能力を付与するＥｃＲドメインなど）を含むエクジソン受容体リガンド結合性ドメインであり；「任意選択のＧＯＩ」とは、ｍＲＮＡまたはポリペプチドとして転写され、発現する、任意の、任意選択の、目的の遺伝子であり；「ＢＤポリＡ」とは、双方向性ポリアデノシンテール配列である。
【図１５Ｂ】図１５Ａの説明が参照される。
【図１６Ａ】本明細書で記載される、多様なリガンド誘導性遺伝子スイッチベクター系の、変動する構造的構成要素について概略的に描示する図である。
【図１６Ｂ】図１６Ａの説明が参照される。
【図１７】リコンビナーゼ接合部位を伴う、例示的なリガンド誘導性遺伝子スイッチベクター系についての概略的記載を示す図である。このような系は、リコンビナーゼ（セリンリコンビナーゼなど）を用いて、単一ベクターを、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）へと組み込みうる。
【図１８Ａ】図１８Ａは、１、８、および１５日目にわたり、ＣＡＲ陽性Ｔ細胞％について描示する表である。セリンリコンビナーゼ（ＳＦ３７０）媒介性組換えを使用して、ＣＡＲおよび遺伝子スイッチに制御されるｍｂＩＬ−１５（ＲＴＳ−ｍｂＩＬ１５）を、単一ベクターから発現させるように、このようなＴ細胞を改変した。図１８Ｂは、１５日目の、ベレジメクスの存在下および非存在下における、ｍｂＩｌ−１５発現の誘導について描示する。図はまた、２２日目の、ベレジメクスの除去時における、ｍｂＩＬ１５発現の喪失も裏付ける。図１８Ｃは、ＲＴＳ−ｍｂＩＬ１５構成的ＣＡＲ構築物についての例示的描示である。
【図１８Ｂ】図１８Ａの説明が参照される。
【図１８Ｃ】図１８Ａの説明が参照される。
【図１９Ａ】構成的プロモーターまたはＴ細胞特異的プロモーターの制御下にある、多様なリガンド誘導性遺伝子スイッチベクター系の、多様な構造的構成要素を概略的に例示する図である。
【図１９Ｂ】図１９Ａの説明が参照される。
【図２０Ａ】図２０Ａは、構成的プロモーターまたはＴ細胞特異的プロモーターの制御下にある、多様なリガンド誘導性遺伝子スイッチベクター系の、多様な構造的構成要素を概略的に例示する図である。図２０Ｂ〜２０Ｅは、本明細書で記載されるリガンド誘導性遺伝子スイッチベクター系をトランスフェクトされた細胞についての定量的フローサイトメトリー解析を示し、ｍｂＩＬ−１５の発現が、Ｔ細胞活性化（ＣｏｎＡの添加による）およびベレジメクスの存在に依存することを裏付ける。構築物１〜６は、図２０Ａに概略的に描示された構築物に対応する。
【図２０Ｂ】図２０Ａの説明が参照される。
【図２０Ｃ】図２０Ａの説明が参照される。
【図２０Ｄ】図２０Ａの説明が参照される。
【図２０Ｅ】図２０Ａの説明が参照される。
【図２１Ａ】ＩＬ−１２の多様な構成を描示する図である。
【図２１Ｂ】図２１Ａの説明が参照される。
【図２２】構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下にある、多様なリガンド誘導性遺伝子スイッチベクター系の、多様な構造的構成要素を概略的に例示する図である。
【図２３】構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または組織特異的プロモーター（ＰＲ）の制御下で、異なる形態のＩＬ−１２を発現させる、多様なリガンド誘導性遺伝子スイッチベクター系の、多様な構造的構成要素を概略的に例示する図である。ＩＬ−１２は、単鎖ＩＬ−１２として発現させることもでき、膜結合型ＩＬ−１２として発現させることもでき、ｐ３５ドメインおよびｐ４０ドメインの個別の発現により発現させることもできる。
【図２４Ａ】構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下にある、多様なリガンド誘導性遺伝子スイッチベクター系の、多様な構造的構成要素を概略的に例示する図である。
【図２４Ｂ】図２４Ａの説明が参照される。
【図２４Ｃ】図２４Ａの説明が参照される。
【図２４Ｄ】図２４Ａの説明が参照される。
【図２５Ａ】構成的プロモーター、誘導性プロモーター、またはＴ細胞特異的プロモーターの制御下にある、多様なリガンド誘導性遺伝子スイッチベクター系の、多様な構造的構成要素を概略的に例示する図である。
【図２５Ｂ】図２５Ａの説明が参照される。
【図２６】複数のドナーを使用する、ＡａＰＣとの共培養を介する、逐次的な刺激により、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて拡大増殖させたＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞内の、ＣＡＲの発現について描示する定量的フローサイトメトリー解析を示す図である。
【図２７】ベレジメクスリガンド（溶媒：ＤＭＳＯ）の存在下／非存在下で、本明細書で記載されるリガンド誘導性遺伝子スイッチベクター系をトランスフェクトされた細胞による、ＩＬ−１２の産生を示す図である。
【図２８Ａ】ＩＬ−１２の発現レベルについての解析を示す図である。図２８Ａは、細胞活性化の非存在下における、ベレジメクスリガンド（溶媒：ＤＭＳＯ）の存在下／非存在下で、本明細書で記載されるリガンド誘導性遺伝子スイッチベクター系をトランスフェクトされた細胞による、ＩＬ−１２の発現レベルを示す。図２８Ｂは、抗原特異的活性化に続く、ベレジメクスリガンド（溶媒：ＤＭＳＯ）の存在下／非存在下で、本明細書で記載されるリガンド誘導性遺伝子スイッチベクター系をトランスフェクトされた細胞による、ＩＬ−１２の発現レベルを示す。
【図２８Ｂ】図２８Ａの説明が参照される。
【図２９】本明細書で記載されるリガンド誘導性遺伝子スイッチベクター系をトランスフェクトされ、ａＡＰＣおよびベレジメクスリガンド（溶媒：ＤＭＳＯ）の存在下／非存在下で共培養された細胞内の、ＩＬ−１２の発現レベルについての解析を示す図である。
【図３０Ａ】ＩＬ−１２の発現レベルについての経時解析を示す図である。図３０Ａは、本明細書で記載されるリガンド誘導性遺伝子スイッチベクター系をトランスフェクトされ、ベレジメクスリガンド（溶媒：ＤＭＳＯ）の存在下／非存在下におけるＡａＰＣの非存在下で共培養された細胞による、ＩＬ−１２の発現レベルを示す。リガンドを、２４時間後において添加し、４８時間後において除去した。図３０Ｂは、本明細書で記載されるリガンド誘導性遺伝子スイッチベクター系をトランスフェクトされ、ベレジメクスリガンド（溶媒：ＤＭＳＯ）の存在下／非存在下におけるＡａＰＣの存在下で共培養された細胞による、ＩＬ−１２の発現レベルを示す。リガンドを、２４時間後において添加し、４８時間後において除去した。ＩＬ−１２の発現は、リガンドを添加した２４、４８、および１２０時間後に定量化した。
【図３０Ｂ】図３０Ａの説明が参照される。
【図３１Ａ】ＩＬ−１２の発現レベルについての解析を示す図である。図３１Ａは、本明細書で記載されるリガンド誘導性遺伝子スイッチベクター系をトランスフェクトされ、ベレジメクスを伴わない培地中の、ＡａＰＣとの共培養により、あらかじめ拡大増殖させた（サイクル１）細胞による、ベレジメクスおよびＡａＰＣの存在下／非存在下におけるＩＬ−１２の発現レベルを示す。図３１Ｂは、本明細書で記載されるリガンド誘導性遺伝子スイッチベクター系をトランスフェクトされ、培地中の、ＡａＰＣとの共培養により、あらかじめ拡大増殖させた（サイクル１）細胞による、ベレジメクスおよびＡａＰＣの存在下／非存在下におけるＩＬ−１２の産生を示す。
【図３１Ｂ】図３１Ａの説明が参照される。
【図３２】図３２Ａおよび３２Ｂは、ＩＬ−１２の発現レベルについての解析を示す図である。図３２Ａは、本明細書で記載されるリガンド誘導性遺伝子スイッチベクター系をトランスフェクトされた細胞による、ＩＬ−１２の産生を示す。ベレジメクスリガンドを、時点０において添加し、４８時間後の時点において除去し、１６８時間後の時点において、再度添加し、２１６時間後の時点において除去した。図３２Ｂは、フローサイトメトリー解析により、本明細書で記載されるリガンド誘導性遺伝子スイッチベクター系をトランスフェクトされた細胞内の、ＣＡＲの発現を示す。細胞に、ＣＤ３陽性集団について、ゲートをかけた。
【図３３】ベレジメクスの存在下、およびＡａＰＣの存在下（サイクル１）／非存在下（サイクル２）で、本明細書で記載されるリガンド誘導性遺伝子スイッチベクター系をトランスフェクトされた細胞による、ＩＬ−１２の発現レベルを示す図である。
【図３４】本明細書で記載されるリガンド誘導性遺伝子スイッチベクター系をトランスフェクトされた細胞による、ベレジメクス用量依存性のＩＬ−１２の発現を示す図である。
【図３５】本明細書で記載されるリガンド誘導性遺伝子スイッチベクター系のトランスフェクションを介して作出され、１：１のエフェクター対標的細胞比で、標的細胞と共に共培養されたＣＡＲ−Ｔ細胞による、ＩＦＮγの産生を示す図である。ＩＦＮγの産生は、ＣＡＲ−Ｔ細胞の、ＥＬ４標的細胞、ＥＬ４  ＥＧＦＲｖＩＩＩ標的細胞との共培養、ならびに標的細胞を伴わない（エフェクター単独）対照を使用して測定した。
【図３６Ａ】ＣＡＲ−Ｔ細胞の特異的細胞傷害作用を示す図である。図３６Ａは、本明細書で記載されるリガンド誘導性遺伝子スイッチベクター系のトランスフェクションを介して作出されたＣＡＲ−Ｔ細胞による、ＩＦＮγの産生を示す。エフェクターＣＡＲ−Ｔ細胞を、Ｕ８７ＭＧ、Ｕ８７ＭＧ−ＦＬｕｃ−ＧＦＰ、Ｕ８７ＭＧ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＦＬｕｃ−ＧＦＰ、Ｕ２５１ＭＧ、Ｕ２５１ＭＧ−ＦＬｕｃ−ＧＦＰ、およびＵ２５１ＭＧ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＦＬｕｃ−ＧＦＰの標的細胞と共に、１：１のエフェクター：標的細胞比で、培養物上清中のＩＦＮγ発現についての解析前２４時間にわたり共培養した。図３６Ｂは、本明細書で記載されるリガンド誘導性遺伝子スイッチベクター系のトランスフェクションを介して作出されたＣＡＲ−Ｔ細胞による、ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する神経膠芽腫細胞の溶解％を示す。エフェクターＣＡＲ−Ｔ細胞を、エフェクター：標的細胞比を変動させて、ＥＬ４、ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現するＥＬ４、Ｋ５６２、およびＥＧＦＲｖＩＩＩを発現するＫ５６２標的細胞系と共に共インキュベートした。
【図３６Ｂ】図３６Ａの説明が参照される。
【発明を実施するための形態】
【００７６】
発明の詳細な説明
以下の記載および例は、本開示の実施形態について、詳細に例示する。本開示は、本明細書で記載される特定の実施形態に限定されず、そのようなものとして、変動しうることを理解されたい。当業者は、本開示には、多数の変動および改変がなされ、これらは、その範囲内に包含されることを認識するであろう。
【００７７】
全ての用語は、それらが、当業者により理解される通りに理解されることを意図する。そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、本開示が関連する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。
【００７８】
本明細書で使用される節の小見出しは、構成上の目的だけのものであり、記載される主題を限定するものと見なすべきではない。
【００７９】
本開示の多様な特色は、単一の実施形態の文脈で記載しうるが、特色はまた、個別に提示される場合もあり、任意の適切な組合せで提示される場合もある。逆に、本明細書では、明確さのために、本開示を、個別の実施形態の文脈で記載しうるが、本開示はまた、単一の実施形態でも、実施することができる。
【００８０】
定義
以下の定義は、当技術分野における定義を補完し、本出願へと方向付けられ、いかなる関連または非関連の案件、例えば、共同所有される、いかなる特許または出願にも帰属しない。本明細書で記載される方法および材料と、同様または同等である、任意の方法および材料を、本開示の試験の実施において使用しうるが、本明細書では、好ましい材料および方法について記載する。したがって、本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態について記載することだけを目的とするものであり、限定的であることを意図するものではない。
【００８１】
本出願では、そうでないことが別段に言明されない限りにおいて、単数形の使用は、複数形を含む。本明細書で使用される通り、そうでないことが文脈により明確に指示されない限りにおいて、単数形の「ある（a）」、「ある（an）」、および「その」は、複数の指示対象を含むことに注意しなければならない。本出願では、そうでないことが言明されない限りにおいて、「または」の使用は、「および／または」を意味する。さらに、「〜を含むこと」という用語のほか、「〜を含む（include）」、「〜を含む（includes）」、および「含まれた」など、他の形態の使用は、限定的ではない。
【００８２】
本明細書における、「一部の実施形態」、「ある実施形態」、「一実施形態」、または「他の実施形態」への言及は、実施形態との関連で記載される、特定の特色、構造、または特徴が、本開示の、少なくとも一部の実施形態には含まれるが、全ての実施形態には、必ずしも含まれないことを意味する。
【００８３】
本明細書および特許請求の範囲で使用される「〜を含むこと（comprising）」（「〜を含む（comprise）」および「〜を含む（comprises）」など、「〜を含むこと（comprising）」の任意の形態）、「〜を有すること」（「〜を有する（have）」および「〜を有する（has）」など、「〜を有すること」の任意の形態）、「〜を含むこと（including）」（「〜を含む（include）」および「〜を含む（includes）」など、「〜を含むこと（including）」の任意の形態）、または「〜を含有すること」（「〜を含有する（contain）」および「〜を含有する（contains）」など、「〜を含有すること」の任意の形態）という語は、包含的またはオープンエンドであり、さらなる、列挙されていない要素または方法ステップを除外しない。本明細書で論じられる任意の実施形態は、本開示の任意の方法または組成物に関して実施することが可能であり、この逆も成り立つことが想定される。さらに、本開示の組成物を使用して、本開示の方法を達成することができる。
【００８４】
「約」または「およそ」という用語は、当業者により決定される、特定の値についての、許容可能な誤差範囲内であって、部分的に、値がどのようにして測定または決定されるのか、すなわち、測定系の限界に依存する誤差範囲内を意味する。例えば、「約」は、当技術分野における慣行に従い、１標準偏差または１標準偏差を超える範囲内を意味しうる。代替的に、「約」は、所与の値の、最大で２０％、例えば、最大で１０％、最大で５％、または最大で１％の範囲も意味しうる。別の例では、「約１０」の量は、１０および９〜１１の任意の量を含む。さらに別の例では、基準数値との関係における「約」という用語はまた、値±この値から１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％の範囲も含む。代替的に、特に、生物学的系または生物学的過程に関して、「約」という用語は、値の桁数内、好ましくは、５倍以内、より好ましくは２倍以内も意味しうる。特定の値を、本出願および特許請求の範囲において記載する場合、そうでないことが言明されない限りにおいて、特定の値について、許容可能な誤差範囲内を意味する「約」という用語を仮定すべきである。
【００８５】
本明細書で使用される「単離」という用語およびその文法的同等物は、その天然環境からの核酸の摘出を意味する。本明細書で使用される「精製」という用語およびその文法的同等物は、分子または組成物が、天然から摘出されたもの（ゲノムＤＮＡおよびｍＲＮＡを含む）であれ、合成されたもの（ｃＤＮＡを含む）であれ、かつ／または検査室条件下で増幅されたのであれ、純度が増大しており、この場合、「純度」とは、相対的用語であり、「絶対純度」ではないことを意味する。一方、核酸およびタンパク質は、希釈剤またはアジュバントと共に製剤化される場合があるが、実際的な目的では、単離されているものとしうることを理解されたい。例えば、核酸は、細胞への導入のために使用する場合、許容可能な担体または希釈剤と混合することが典型的である。本明細書で使用される「実質的に精製された」という用語およびその文法的同等物は、核酸、ポリペプチド、タンパク質、または他の化合物が、天然では会合する、ポリヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチド、および他の分子を本質的に含まない、すなわち、約５０％を超えて含まない、約７０％を超えて含まない、約９０％を超えて含まない、核酸配列、ポリペプチド、タンパク質または他の化合物を指す。
【００８６】
本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」とは、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドである、任意の長さのヌクレオチドまたは核酸のポリマー形態を指す。この用語は、分子の一次構造だけを指す。したがって、この用語は、二本鎖ＤＮＡおよび一本鎖ＤＮＡ、三重鎖ＤＮＡのほか、二本鎖ＲＮＡおよび一本鎖ＲＮＡも含む。この用語はまた、例えば、ポリヌクレオチドのメチル化および／またはキャッピングによる修飾形態、ならびにポリヌクレオチドの非修飾形態も含みうる。用語はまた、天然のものではないヌクレオチドまたは合成ヌクレオチドのほか、ヌクレオチド類似体を含む分子を含むことも意図する。
【００８７】
本明細書で使用される「ポリペプチド」、「ペプチド」、「タンパク質」、およびそれらの文法的同等物は、アミノ酸残基のポリマーを指す。「成熟タンパク質」とは、全長タンパク質であり、任意選択で、グリコシル化または所与の細胞内環境内のタンパク質に典型的な他の修飾を含むタンパク質である。本明細書で開示されるポリペプチドおよびタンパク質（これらの機能的部分および機能的変異体を含む）は、１または複数の、自然発生のアミノ酸の代わりに、合成アミノ酸を含みうる。当技術分野では、このような合成アミノ酸が公知であり、例えば、アミノシクロヘキサンカルボン酸、ノルロイシン、α−アミノｎ−デカン酸、ホモセリン、Ｓ−アセチルアミノメチルシステイン、ｔｒａｎｓ−３−ヒドロキシプロリンおよびｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシプロリン、４−アミノフェニルアラニン、４−ニトロフェニルアラニン、４−クロロフェニルアラニン、４−カルボキシフェニルアラニン、β−フェニルセリン、β−ヒドロキシフェニルアラニン、フェニルグリシン、α−ナフチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、シクロヘキシルグリシン、インドリン−２−カルボン酸、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、アミノマロン酸、アミノマロン酸モノアミド、Ｎ’−ベンジル−Ｎ’−メチルリシン、Ｎ’，Ｎ’−ジベンジルリシン、６−ヒドロキシリシン、オルニチン、α−アミノシクロペンタンカルボン酸、α−アミノシクロヘキサンカルボン酸、α−アミノシクロヘプタンカルボン酸、α−（２−アミノ−２−ノルボルナン）カルボン酸、α，γ−ジアミノ酪酸、α，β−ジアミノプロピオン酸、ホモフェニルアラニン、およびα−ｔｅｒｔ−ブチルグリシンを含む。本開示は、操作細胞内の、本明細書で記載されるポリペプチドの発現が、ポリペプチド構築物の、１または複数のアミノ酸の翻訳後修飾と関連しうることをさらに想定する。翻訳後修飾の非限定例は、リン酸化、アセチル化およびホルミル化を含むアシル化、グリコシル化（Ｎ連結型およびＯ連結型を含む）、アミド化、ヒドロキシル化、メチル化およびエチル化を含むアルキル化、ユビキチン化、ピロリドンカルボン酸の付加、ジスルフィド架橋の形成、硫酸化、ミリストイル化、パルミトイル化、イソプレニル化、ファルネシル化、ゲラニル化、グリピオン化、リポイル化、およびヨード化を含む。
【００８８】
核酸および／または核酸配列は、天然または人工で、共通の先祖核酸または先祖核酸配列に由来する場合、「相同」である。タンパク質および／またはタンパク質配列は、それらのコードＤＮＡが、天然または人工で、共通の先祖核酸または先祖核酸配列に由来する場合、相同である。相同な分子は、相同体と称する場合がある。例えば、本明細書で記載される、任意の天然タンパク質は、任意の利用可能な突然変異誘発法により修飾することができる。発現させると、この突然変異核酸は、元の核酸によりコードされるタンパク質と相同なポリペプチドをコードする。相同性は一般に、２つまたはこれを超える核酸またはタンパク質（またはこれらの配列）の間の配列同一性から推定される。相同性を確立するのに有用な配列の間の同一性の、正確な百分率は、問題の核酸およびタンパク質と共に変動するが、少なくとも２５％の配列同一性を使用して、相同性を確立する。高レベルの配列同一性、例えば、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、もしくは９９％、またはこれを超える配列同一性もまた、相同性を確立するのに使用することができる。本明細書では、配列同一性百分率を決定するための方法（例えば、デフォルトパラメータを使用する、ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＮ）について記載するが、これらは、一般に利用可能である。
【００８９】
ポリペプチドの、２つの核酸配列またはアミノ酸配列の文脈において、本明細書で使用される、「同一」または「配列同一性」という用語およびその文法的同等物は、指定された比較域にわたり、最大の照応関係についてアライメントされた場合に同じである、２つの配列内の残基を指す。本明細書で使用される「比較域」とは、少なくとも約２０、通例、約５０〜約２００、より通例では、約１００〜約１５０の連続する位置によるセグメントであって、２つの配列を、最適にアライメントした後で、その中の配列を、同じ数の、連続する位置による基準配列と比較しうるセグメントを指す。当技術分野では、比較のための配列アライメント法が周知である。比較のための最適な配列アライメントは、Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482 (1981)の局所相同性アルゴリズム；Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443 (1970)のアライメントアルゴリズム；Pearson and Lipman, Proc. Nat. Acad. Sci U.S.A., 85:2444 (1988)の類似性検索法；これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔｉｃｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ  Ｃａｌｉｆ．によるＰＣ／Ｇｅｎｅプログラム内のＣＬＵＳＴＡＬ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．、Ｕ．Ｓ．Ａ．における、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡを含むがこれらに限定されない）により行うことができ、ＣＬＵＳＴＡＬプログラムについては、Higgins and Sharp, Gene, 73:237-244 (1988)およびHiggins and Sharp, CABIOS, 5:151-153 (1989)、Corpet et al., Nucleic Acids Res., 16:10881-10890 (1988)、Huang et al., Computer Applications in the Biosciences, 8:155-165 (1992)、およびPearson et al., Methods in Molecular Biology, 24:307-331 (1994)により十分に記載されている。アライメントはまた、目視および手作業のアライメントにより実施されることも多い。実施形態の１つのクラスでは、本明細書のポリペプチドは、例えば、デフォルトパラメータを使用する、ＢＬＡＳＴＰ（もしくはＣＬＵＳＴＡＬ、または他の任意の利用可能なアライメントソフトウェア）により測定される通り、基準ポリペプチドまたはこの断片と少なくとも８０％、８５％、９０％、９８％の９９％、または１００％同一である。同様に、核酸はまた、出発核酸に照らして記載することもでき、例えば、それらは、例えば、デフォルトパラメータを使用する、ＢＬＡＳＴＮ（もしくはＣＬＵＳＴＡＬ、または他の任意の利用可能なアライメントソフトウェア）により測定される通り、基準核酸またはこの断片と５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９８％、９９％、または１００％同一でありうる。１つの分子が、大型の分子に対して、ある特定の百分率の配列同一性を有するという場合、これは、２つの分子が最適にアライメントされれば、小型の分子内の、前記百分率の残基は、２つの分子が最適にアライメントされた順序に従い、大型の分子内にマッチ残基を見出すことを意味する。
【００９０】
核酸配列またはアミノ酸配列に対して適用される「実質的に同一な」という用語およびその文法的同等物は、核酸配列またはアミノ酸配列が、上記で記載したプログラム、例えば、標準的なパラメータを使用するＢＬＡＳＴを使用する基準配列と比較して、少なくとも９０％の配列同一性、またはこれを超える配列同一性、少なくとも９５％、少なくとも９８％、および少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含むことを意味する。例えば、ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列のための）は、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列のために、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用する（Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1992)を参照されたい）。配列同一性百分率は、２つの最適にアライメントされた配列を、比較域にわたり比較することにより決定し、比較域内のポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適なアライメントのために、基準配列（付加または欠失を含まない）と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含みうる。百分率は、同一な核酸塩基またはアミノ酸残基が、両方の配列内で生じる位置の数を決定して、マッチさせた位置の数を求め、マッチさせた位置の数を、比較域内の位置の総数で除し、結果に、１００を乗じて、配列同一性百分率を求めることにより計算する。複数の実施形態では、実質的な同一性は、少なくとも約５０残基の長さの配列の領域にわたり、少なくとも約１００残基の領域にわたり存在し、複数の実施形態では、配列は、少なくとも約１５０残基にわたり、実質的に同一である。複数の実施形態では、配列は、コード領域の全長にわたり、実質的に同一である。
【００９１】
「トランスポゾン」または「転移性エレメント」（ＴＥ）とは、ゲノム内のその位置を変化させ、場合によって、突然変異を創出または保存し、細胞のゲノムサイズを変更する、ベクターＤＮＡ配列である。転移は、ＴＥの重複を結果としてもたらすことが多い。クラスＩのＴＥは、２段階でコピーされる：まず、クラスＩのＴＥは、ＤＮＡからＲＮＡへと転写され、次いで、産生されたＲＮＡは、ＤＮＡへと逆転写される。次いで、この、コピーされたＤＮＡは、ゲノム内の新たな位置へと挿入される。逆転写ステップは、ＴＥ自身によりコードされうる、逆転写酵素により触媒される。レトロトランスポゾンの特徴は、ＨＩＶなどのレトロウイルスと同様である。クラスＩＩのＴＥによるカットアンドペースト転移機構は、ＲＮＡ中間体を伴わない。転移は、いくつかのトランスポザーゼ酵素により触媒される。あるトランスポザーゼは、ＤＮＡ内の任意の標的部位に非特異的に結合するのに対し、他のトランスポザーゼは、特異的ＤＮＡ配列標的に結合する。トランスポザーゼは、標的部位において、互い違いの（staggered）切断をもたらす結果として、５’側または３’側における、一本鎖のＤＮＡ突出（粘着（sticky）末端）をもたらす。このステップは、ＤＮＡトランスポゾンを切り出し、次いで、ＤＮＡトランスポゾンは、新たな標的部位へとライゲーションされるが、この過程は、ギャップを埋めるＤＮＡポリメラーゼの活性と、糖リン酸骨格をつなぎ合わせるＤＮＡリガーゼの活性とを伴う。これは、標的部位の重複を結果としてもたらす。ＤＮＡトランスポゾンの挿入部位は、標的ＤＮＡ内が互い違いに切断され、ＤＮＡポリメラーゼにより埋められることにより創出されうる短い直接的なリピート、ならびにそれらに続く、トランスポザーゼによるＴＥの切出しに重要な一連の逆位リピートにより同定されうる。細胞周期のＳ期において、ドナー部位は既に複製されているが、標的部位はまだ複製されていない場合に転移が生じるとカットアンドペーストＴＥは重複される。転移は、クラスＩ  ＴＥおよびクラスＩＩ  ＴＥのいずれにおいても、「自律型」または「非自律型」として分類することができる。自律型ＴＥが、それ自身で移動しうるのに対し、非自律型ＴＥは、移動するのに、別のＴＥの存在を必要とする。これは、非自律型ＴＥが、トランスポザーゼ（クラスＩＩの場合）または逆転写酵素（クラスＩの場合）を欠くためであることが多い。
【００９２】
「トランスポザーゼ」とは、トランスポゾンの末端に結合し、カットアンドペースト機構または複製性転移機構による、トランスポゾンの、ゲノムの別の部分への移動を触媒する酵素を指す。一部の実施形態では、トランスポザーゼの触媒活性を用いて、遺伝子を、ベクターからゲノムへと移動させることができる。一部の実施形態では、トランスポザーゼの触媒活性を用いて、遺伝子を、ベクター（例えば、トランスポゾン）からゲノムへと移動させることができる。ある特定の実施形態では、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼは、ｍＲＮＡとして用意される。一部の態様では、ｍＲＮＡは、キャップおよびポリＡテールを含む。
【００９３】
本明細書で開示または想定される核酸配列およびベクターは、細胞へと、「トランスフェクション」、「形質転換」、「ヌクレオフェクション」または「形質導入」により導入することができる。本明細書で使用される「トランスフェクション」、「形質転換」、または「形質導入」とは、物理的方法または化学的方法を使用することによる、１または複数の外因性ポリヌクレオチドの、宿主細胞への導入を指す。当技術分野では、多くのトランスフェクション法が公知であり、例えば、リン酸カルシウムＤＮＡ共沈殿法（例えば、Murray E. J. (ed.), Methods in Molecular Biology, Vol. 7, Gene Transfer and Expression Protocols, Humana Press (1991)を参照されたい）；ＤＥＡＥ−デキストラン法；電気穿孔法；カチオン性リポソーム媒介性トランスフェクション法；タングステン粒子促進型遺伝子銃法（Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990));リン酸ストロンチウム共沈殿法（Brash et al., Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987)）；およびヌクレオフェクション（Trompeter et al., J. Immunol. Methods 274:245-256 (2003)）を含む。ファージベクターまたはウイルスベクターは、それらの多くが市販されている、適切なパッケージング細胞内で、感染性粒子を増殖させた後で、宿主細胞へと導入することができる。
【００９４】
本明細書で使用される「腫瘍抗原」とは、腫瘍細胞内で産生されるかまたは過剰発現する、任意の抗原性物質を指す。腫瘍抗原は、例えば、宿主における免疫応答を誘発しうる。代替的に、本開示の目的では、腫瘍抗原は、健常細胞および腫瘍細胞のいずれもが発現するが、ある特定の腫瘍型を同定するため、適切な治療標的であるタンパク質でありうる。複数の実施形態では、腫瘍抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＢＣＭＡ、ＣＤ４４、α−葉酸受容体、ＣＡＩＸ、ＣＤ３０、ＲＯＲ１、ＣＥＡ、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４０、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、葉酸結合性タンパク質、ＧＤ２、ＧＤ３、ＩＬ−１３Ｒ−ａ２、ＫＤＲ、ＥＤＢ−Ｆ、メソテリン、ＣＤ２２、ＥＧＦＲ、ＭＵＣ−１、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＵＣ１６、ｈ５Ｔ４、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ−７２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ１２３、またはＶＥＧＦ−Ｒ２である。一実施形態では、腫瘍抗原は、骨髄性悪性腫瘍、例えば、神経膠芽腫または多形性膠芽腫（ＧＢＭ）を処置するためのＣＡＲ  Ｔ細胞療法の標的である、ＥＧＦＲｖＩＩＩである。別の実施形態では、腫瘍抗原は、ＣＤ１９である。さらに別の実施形態では、腫瘍抗原は、ＣＤ３３である。
【００９５】
本明細書で使用される「エンハンサー」という用語は、例えば、それが作動可能に連結された核酸配列の転写を増大させるＤＮＡ配列を指す。エンハンサーは、核酸配列のコード領域から、何キロベースも離れて位置することが可能であり、調節因子の結合、ＤＮＡのメチル化パターン、またはＤＮＡ構造の変化を媒介しうる。当技術分野では、様々な異なる供給源に由来する、多数のエンハンサーが周知であり、クローニングされたポリヌクレオチドとして、またはクローニングされたポリヌクレオチド内で利用可能である（例えば、ＡＴＣＣなどの寄託先のほか、他の商業的供給源または個人的供給源から）。プロモーター（一般に使用されるＣＭＶプロモーターなど）を含む、多数のポリヌクレオチドはまた、エンハンサー配列も含む。エンハンサーは、コード配列の上流に位置する場合もあり、この中に位置する場合もあり、この下流に位置する場合もある。「Ｉｇエンハンサー」という用語は、免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座内にマップされるエンハンサー領域に由来するエンハンサーエレメント（このようなエンハンサーは、例えば、重鎖（ミュー）５’側エンハンサー、軽鎖（カッパ）５’側エンハンサー、カッパイントロンエンハンサーおよびミューイントロンエンハンサー、ならびに３’側エンハンサーを含む）を指す（一般に、Paul W. E. (ed), Fundamental Immunology, 3rd Edition, Raven Press, New York (1993), pages 353-363、および米国特許第５，８８５，８２７号明細書を参照されたい）。
【００９６】
本明細書で使用される「コード配列」とは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのセグメントを指す。領域または配列には、５’末端の近傍では、開始コドンが結合し、３’末端の近傍では、終止コドンが結合する。コード配列はまた、オープンリーディングフレームと称することもできる。
【００９７】
本明細書で使用される「作動可能に連結された」とは、ＤＮＡセグメントの、別のＤＮＡセグメントへの、物理的な連結および／または機能的な連結であって、セグメントが、それらの意図される方式で機能することを可能とするような連結を指す。遺伝子産物をコードするＤＮＡ配列は、それが、例えば、プロモーター、エンハンサー、および／またはサイレンサーなどの調節配列に、ＤＮＡ配列の転写のモジュレーションを、直接的または間接的に可能とする方式で連結されている場合に、調節配列に作動可能に連結されている。例えば、ＤＮＡ配列は、それが、プロモーターの転写開始部位に対して、下流において、転写開始部位に対して、適正なリーディングフレーム内で、プロモーターへとライゲーションされており、ＤＮＡ配列を通して、転写の伸長が進行することを可能とする場合に、プロモーターに作動可能に連結されている。エンハンサーまたはサイレンサーは、それが、それぞれ、ＤＮＡ配列の転写を増加または減少させるように、ＤＮＡ配列へとライゲーションされている場合に、遺伝子産物をコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結されている。エンハンサーおよびサイレンサーは、ＤＮＡ配列のコード領域の上流に位置する場合もあり、この下流に位置する場合もあり、この中に埋め込まれている場合もある。シグナル配列が、ポリペプチドの分泌に参与するプレタンパク質として発現する場合、シグナル配列のＤＮＡは、ポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結されている。ＤＮＡ配列の、調節配列への連結は、典型的に、適切な制限部位におけるライゲーションにより、または当業者に公知の制限エンドヌクレアーゼを使用して、配列内に挿入された、アダプターまたはリンカーを介して達せられる。
【００９８】
「転写調節因子」という用語は、ある特定の環境条件下で、プロモーター駆動性ＤＮＡ配列の転写を防止もしくは阻害するように作用する生化学的エレメント（例えば、リプレッサータンパク質または核阻害性タンパク質）、または、ある特定の環境条件下で、プロモーター駆動性ＤＮＡ配列の転写を可能とするか、もしくは刺激するように作用する生化学的エレメント（例えば、インデューサーまたはエンハンサー）を指す。
【００９９】
本明細書で使用される「〜を誘導する」、「誘導」という用語、およびその文法的同等物は、転写調節因子によりもたらされる、核酸配列の転写、プロモーターの活性、および／またはプロモーターの発現の、何らかの転写基礎レベルと比べた上昇を指す。
【０１００】
「標的」遺伝子または「異種」遺伝子または「目的の遺伝子（ＧＯＩ）」とは、遺伝子導入により宿主細胞へと導入される遺伝子を指す。例示的なＧＯＩは、本明細書で記載される、抗原結合性ポリペプチド、キメラ受容体、ＣＡＲ、ＴＣＲ、サイトカイン、および／または細胞タグを含みうる、抗原結合性ポリペプチドでありうる。
【０１０１】
本明細書で使用される「リコンビナーゼ」とは、規定された部位の間の部位特異的組換えを容易としうる酵素群であって、部位が、単一のＤＮＡ分子上で物理的に隔てられているか、または部位が、別個のＤＮＡ分子上に存在する、酵素群を指す。規定された組換え部位のＤＮＡ配列は、必ずしも同一ではない。組換えの開始は、タンパク質−ＤＮＡ間相互作用に依存し、酵素群内には、ファージの組込みおよび切出し（例えば、λインテグラーゼ、ΦＣ３１）、環状プラスミドの切断（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）（例えば、Ｔｎ３、ガンマデルタ、Ｃｒｅ、Ｆｌｐ）、代替的遺伝子の発現のためのＤＮＡの反転（例えば、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、Ｐｉｎ）、発生時における遺伝子（例えば、アナベナ属（Anabaena）による窒素固定遺伝子）のアセンブリ、および転移（例えば、ＩＳ６０７トランスポゾン）を触媒する、多数のタンパク質が存在する。大半の部位特異的リコンビナーゼは、進化的類縁性および機構的類縁性に基づき、２つのファミリーのうちの１つに収まる。これらは、λインテグラーゼファミリーまたはチロシンリコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅ、Ｆｌｐ、ＸｅｒＤ）、およびレゾルバーゼ／インテグラーゼファミリー、またはセリンリコンビナーゼファミリー（例えば、ΦＣ３１、ＴＰ９０１−１、Ｔｎ３、ガンマデルタ）である。
【０１０２】
「組換え接合部位」とは、本明細書で記載されるリコンビナーゼ酵素により認識される、特異的ポリヌクレオチド配列である。典型的に、１つの部位が、標的核酸（例えば、真核生物または原核生物の染色体またはエピソーム）内に存在し、別の部位が、標的組換え部位において統合される核酸上に存在する、２つの異なる部位（「相補的部位」と称する）が関与する。本明細書では、それぞれ、細菌標的およびファージドナーに由来する、接合（または組換え）部位を指す、「ａｔｔＢ」および「ａｔｔＰ」という用語が使用されるが、特定の酵素のための組換え部位は、異なる名称を有しうる。組換え部位は、典型的に、コア領域またはスペーサー領域により隔てられた、左側アームおよび右側アームを含む。したがって、ａｔｔＢ組換え部位は、ＢＯＢ’［配列中、ＢおよびＢ’は、それぞれ、左側アームおよび右側アームであり、Ｏは、コア領域である］からなる。同様に、ａｔｔＰとは、ＰＯＰ’［配列中、ＰおよびＰ’は、アームであり、Ｏは、ここでもまた、コア領域である］である。ａｔｔＢ部位と、ａｔｔＰ部位との組換え時、および標的における、同時の核酸の組込み時に、組み込まれるＤＮＡを挟む組換え部位を、「ａｔｔＬ」および「ａｔｔＲ」と称する。したがって、上記の用語法を使用する、ａｔｔＬ部位およびａｔｔＲ部位は、それぞれ、ＢＯＰ’およびＰＯＢ’からなる。本明細書における一部の表示では、「Ｏ」を省き、ａｔｔＢおよびａｔｔＰを、例えば、それぞれ、ＢＢ’およびＰＰ’と呼ぶ。
【０１０３】
遺伝子の発現のモジュレーション
遺伝子操作の分野では、遺伝子発現の精密な制御は、発生および他の生理学的過程について研究し、これを操作し、制御するための貴重なツールである。遺伝子発現は、多数の特異的なタンパク質間相互作用を伴う、複雑な生物学的過程である。緊密に調節された誘導性遺伝子発現系または「遺伝子スイッチ」は、遺伝子治療、細胞内の、大スケールのタンパク質の作製、細胞ベースのハイスループットのスクリーニングアッセイ、機能的なゲノミクス、ならびにトランスジェニック植物およびトランスジェニック動物における形質の調節など、多様な適用に有用である。しかし、治療のためには、調節され、局在化された発現が、オフターゲット作用を防止するのに重要である。本明細書では、必要とされる場合に、かつ、標的細胞の特異的近傍、または特異的位置において、サイトカインなど、異種遺伝子の発現を調節する手段が提示される。本明細書では、さらに、サイトカインなど、異種遺伝子の発現を調節する方法であって、例えば、サイトカインが、リガンド誘導性プロモーターの制御下にある方法が提示される。場合によって、方法は、リガンドの非存在下で、異種遺伝子発現の基礎レベルの低下または非存在を結果としてもたらす。さらなる実施形態では、リガンド誘導性プロモーターは、遺伝子スイッチのリガンド誘導性プロモーターである。本明細書では、さらに、サイトカインなど、異種遺伝子の、操作細胞からの発現を調節する方法が提示される。本明細書における操作細胞とは、その天然状態または内因性状態から改変された細胞である。操作細胞の例は、改変された（例えば、ポリヌクレオチドの、細胞へのトランスフェクションにより）、本明細書で記載される細胞である。場合によって、操作細胞は、操作免疫エフェクター細胞でありうる。１つの場合には、操作細胞は、Ｔ細胞である。別の場合には、操作細胞は、ＮＫ細胞である。１つの場合には、リガンドで異種遺伝子の発現を誘導する前に、操作細胞を活性化させる。別の場合には、細胞を抗原へと曝露することにより、操作細胞を活性化させる。抗原は、操作細胞が発現する抗原結合性ポリペプチドにより認識される抗原でありうる。抗原は、腫瘍抗原または感染性疾患抗原でありうる。１つの場合には、操作細胞は、このような抗原に結合する、抗原結合性ポリペプチドを含みうる。
【０１０４】
さらなる場合には、遺伝子スイッチのリガンド誘導性プロモーターの遺伝子スイッチ構成要素は、組織特異的プロモーターにより、さらに調節することができる。このような場合、遺伝子スイッチ構成要素は、組織特異的プロモーターが、例えば、活性化Ｔ細胞内または活性化ＮＫ細胞内で活性化する場合に限り発現する。
【０１０５】
ベクター
【０１０６】
「発現ベクター」または「ベクター」とは、細胞内のポリヌクレオチドの複製の自律的単位として挙動する（すなわち、それ自身の制御下における複製が可能である）か、または宿主細胞の染色体への挿入により複製が可能となる、任意の遺伝子エレメント、例えば、プラスミド、染色体、ウイルス、トランスポゾンであって、接合させたセグメントの複製および／または発現をもたらすように、それへと、別のポリヌクレオチドセグメントを接合させた遺伝子エレメントである。適切なベクターは、プラスミド、トランスポゾン、バクテリオファージ、およびコスミドを含むがこれらに限定されない。ベクターは、所望の宿主細胞中へのベクターのライゲーションまたは挿入を実施し、接合させたセグメントの発現を実施するのに必要なポリヌクレオチド配列を含有しうる。このような配列は、宿主生物に応じて異なり、転写を実施するプロモーター配列、転写を増加させるエンハンサー配列、リボソーム結合性部位の配列、および転写翻訳終結配列を含む。代替的に、発現ベクターは、ベクターの、宿主細胞のＤＮＡ配列へのライゲーションまたは組込みを伴わずに、その中でコードされる核酸配列の産物を、直接発現させることが可能でありうる。
【０１０７】
ベクターはまた、「選択用マーカー遺伝子」も含みうる。本明細書で使用される「選択用マーカー遺伝子」という用語は、核酸配列を発現する細胞を、対応する選択用薬剤の存在下で、これと順方向または逆方向に、特異的に選択することを可能とする核酸配列を指す。当技術分野では、適切な選択用マーカー遺伝子が公知であり、例えば、国際特許出願公開第１９９２／０８７９６号パンフレットおよび同第１９９４／２８１４３号パンフレット、Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 3567 (1980)、O’Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 1527 (1981)、Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 2072 (1981)、Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol., 150:1 (1981)、Santerre et al., Gene, 30: 147 (1984)、Kent et al., Science, 237: 901-903 (1987)、Wigler et al., Cell, 11: 223 (1977)、Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 48: 2026 (1962)、Lowy et al., Cell, 22: 817 (1980)、ならびに米国特許第５，１２２，４６４号明細書および同第５，７７０，３５９号明細書において記載されている。
【０１０８】
一部の実施形態では、ベクターは、宿主細胞内で複製することが可能であり、適切な選択的圧の存在下で、宿主細胞内のＤＮＡの染色体外セグメントとして存続する、「エピソーム発現ベクター」または「エピソーム」である（例えば、Conese et al., Gene Therapy, 11:1735-1742 (2004)を参照されたい）。代表的な、市販のエピソーム発現ベクターは、エプスタイン−バー核抗原１（ＥＢＮＡ１）およびエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）複製起点（ｏｒｉＰ）を用いるエピソームプラスミドを含むがこれらに限定されない。ベクターである、ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４、ｐＲＥＰ７、ならびにＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）製のｐｃＤＮＡ３．１およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（ＬａＪｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）製のｐＢＫ−ＣＭＶは、ＥＢＮＡ１およびｏｒｉＰの代わりに、Ｔ抗原およびＳＶ４０の複製起点を使用する、エピソームベクターの非限定的な例を表す。
【０１０９】
本明細書で使用される「遺伝子発現カセット」とは、ベクターの一部であり、ＥＦ１ａなどの構成的プロモーター、または誘導性プロモーター、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、およびポリＡエレメント、ならびに１または複数の目的の遺伝子（ＧＯＩ）を含有しうる。一実施形態では、ポリＡエレメントは、ＳＶ４０ｅポリＡ（配列番号６５）である。別の実施形態では、ポリＡエレメントは、双方向ａＣＡポリＡ（配列番号６６）である。さらに別の実施形態では、ポリＡは、ＰＡ２ポリＡ（配列番号６７）である。一部の態様では、遺伝子発現カセットは、核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたＤＮＡ結合性ドメイン、および／または核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたトランス活性化ドメインなどの、遺伝子スイッチ構成要素をさらに含みうる。ベクターは、１または複数の遺伝子発現カセットを含みうる。
【０１１０】
ベクターの修飾
本明細書で記載される方法および組成物に有用なポリヌクレオチドベクターは、「医薬品および医薬部外品の製造管理および品質管理の基準」（ＧＭＰ）に適合するベクターでありうる。例えば、ＧＭＰベクターは、非ＧＭＰベクターより純粋でありうる。場合によって、純度は、バイオバーデンにより測定することができる。例えば、バイオバーデンは、ベクター組成物中の、好気性細菌、嫌気性細菌、芽胞形成菌、真菌、またはこれらの組合せの存在または非存在でありうる。場合によって、純粋なベクターは、低内毒素または内毒素非含有でありうる。純度は、二本鎖プライマーウォーキングシーケンシングによってもまた測定することができる。プラスミドの同一性は、ベクターの純度を決定する源泉でありうる。本開示のＧＭＰベクターは、非ＧＭＰベクターより、１０％〜９９％純粋でありうる。ＧＭＰベクターは、バイオバーデン、内毒素、シーケンシング、またはこれらの組合せの存在により測定される通り、非ＧＭＰベクターより、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％純粋でありうる。
【０１１１】
場合によって、第１の遺伝子プログラムの終点におけるターミネーター配列を使用する。ターミネーター配列は、第２の遺伝子プログラムを開始する前に転写物が終結することを確実にしうる。例えば、発現ベクターは、転写の終結およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含有しうる。このような配列は、真核生物またはウイルスの、ＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’側非翻訳領域から入手可能であり、時に、３’側非翻訳領域からも入手可能である。これらの領域は、ｍＲＮＡの非翻訳部分内の、ポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含有しうる。発現ベクターを含む細胞を、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏの、所望のポリペプチドの発現をもたらす条件下で増殖させる。
【０１１２】
場合によって、スペーサー配列は、ベクター内のポリヌクレオチドによりコードされる、第１のポリペプチドの末端において使用することができる。他の場合には、スペーサー配列は、ベクター内の、第２の遺伝子の末端において使用することができる。スペーサー配列はまた、ベクター内で、第１の遺伝子および第２の遺伝子に後続して使用することもできる。
【０１１３】
これらのベクターを使用して、目的の遺伝子、または目的の遺伝子の部分によりコードされるポリペプチドを発現させることができる。遺伝子または遺伝子の部分は、ウイルス法または非ウイルス法の任意の方法を使用して挿入することができる。例えば、方法は、非ウイルスベースの技法でありうる。
【０１１４】
ＩＲＥＳエレメント
本明細書ではまた、本明細書で記載されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現および機能性を容易とする、ＩＲＥＳエレメントを含む構築物も開示される。本明細書で使用される「内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）」という用語は、内部リボソーム進入部位を意味することが意図されうる。ＩＲＥＳ配列を含むベクター内では、第１の遺伝子が、その独自の５’−ＵＴＲを伴う機構である、キャップ依存性のリボソーム走査により翻訳されうるのに対し、後続の遺伝子の翻訳は、リボソームの、ＩＲＥＳへの直接的な動員により、キャップ非依存的に達せられうる。ＩＲＥＳ配列は、真核リボソームが結合し、５’キャップ末端に結合せずに、翻訳を開始することを可能としうる。ＩＲＥＳ配列は、１つの転写物からの、複数の遺伝子の発現を可能としうる（Mountford and Smith 1995）。
【０１１５】
本明細書で使用される「キャップ（ＣＡＰ）」または「キャップ（ｃａｐ）」という用語は、一般に、真核生物ｍＲＮＡの５’末端へと、３’−５’連結された、７−メチルグアノシン（７ｍｅＧ−ｐｐｐ−Ｇ）である修飾ヌクレオチドであって、このｍＲＮＡからのタンパク質の発現時に、正常な翻訳開始経路内で必要とされるエレメントとして用いられる修飾ヌクレオチドを指す。
【０１１６】
ある特定の場合には、ＩＲＥＳ領域は、ピコルナウイルス、脳心筋炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスのＩＲＥＳ配列など、ウイルスに由来しうる。他の場合には、ＩＲＥＳ領域は、脳心筋炎ウイルスに由来しうる。本明細書で使用される「ＥＭＣＶ」または「脳心筋炎ウイルス」という用語は、ピコルナウイルス科（Picornaviridae）の属の、脳心筋炎ウイルス種の、任意のメンバーである単離株または株を指す。例は、ＥＭＣＶ−Ｒ（リュッカート）株ウイルス、コロンビアＳＫウイルスである。場合によって、真核開始因子４Ｇ、免疫グロブリン重鎖結合性タンパク質、ｃ−ｍｙｃがん原遺伝子、血管内皮増殖因子、線維芽細胞増殖因子１のＩＲＥＳ、またはこれらの任意の組合せまたは修飾など、細胞性ＩＲＥＳエレメントを使用することができる。場合によって、細胞性ＩＲＥＳは、ウイルスＩＲＥＳと比較した場合の、遺伝子発現の増大を有しうる。
【０１１７】
ウイルスのＩＲＥＳ配列、細胞性ＩＲＥＳ配列、またはこれらの組合せを、ベクター内で用いることができる。ＩＲＥＳは、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）またはポリオウイルス（ＰＶ）に由来しうる。場合によって、ＩＲＥＳエレメントは、ポリオウイルス（ＰＶ）、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、ブタテッショウウイルス１（ＰＴＶ−１）、愛知ウイルス（ＡｉＶ）、セネカバレーウイルス（ＳＶＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、豚コレラウイルス（ＣＳＦＶ）、ヒト免疫不全ウイルス２（ＨＩＶ−２）、ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ−１）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、マウス乳がんウイルス（ＭＭＴＶ）、潜伏期ヒトサイトメガロウイルス（ｐＵＬ１３８）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＮＡ−１）、ヘルペスウイルスマレック病（ＭＤＶＲＬＯＲＦ９）、ＳＶ４０ポリシストロニック１９Ｓ（ＳＶ４０１９Ｓ）、ムギクビレアブラムシ（Rhopalosiphum padi）ウイルス（ＲｈＰＶ）、クリケット麻痺ウイルス（ＣｒＰＶ）、ウスジロエダシャク（Ectropis obliqua）ピコルナ様ウイルス（ＥｏＰＶ）、チャバネアオカメムシ（Plautia stali）腸ウイルス（ＰＳＩＶ）、サシガメ属（Triatoma）ウイルス（ＴｒＶ）、ミツバチ麻痺病シシストウイルス（ＩＡＰＶ、ＫＢＶ）、ブラックカラン復帰ウイルス（ＢＲＶ）、テンジクアオイ属（Pelargonium）斑入りウイルス（ＰＦＢＶ）、ハイビスカス退緑斑ウイルス（ＨＣＲＳＶ）、アブラナ科感染トバモウイルス（ＣｒＴＭＶ）、ジャガイモ葉巻ウイルス（ＰＬＲＶ）、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）、ジアルジアウイルス（ＧＬＶ）、リーシュマニア属（Leishmania）ＲＮＡウイルス１（ＬＲＶ−１）、およびこれらの組合せまたは修飾からなる群から選択される。場合によって、ＩＲＥＳは、Ａｐａｆ−１、ＸＩＡＰ、ＨＩＡＰ２／ｃ−ＩＡＰ１、ＤＡＰ５、Ｂｃｌ−２、ｃ−ｍｙｃ、ＣＡＴ−１、ＩＮＲ、分化ＬＥＦ−１、ＰＤＧＦ２、ＨＩＦ−１ａ、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ２、ＢｉＰ、ＢＡＧ−１、ＣＩＲＰ、ｐ５３、ＳＨＭＴ１、ＰＩＴＳＬＲＥｐ５８、ＣＤＫ１、Ｒｐｒ、ｈｉｄ、ｈｓｐ７０、ｇｒｉｍ、ｓｋｌ、Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ、ｄＦｏｘＯ、ｄＩｎＲ、Ａｄｈ−Ａｄｈｒ、ＨＳＰ１０１、ＡＤＨ、ＵＲＥ−２，ＧＰＲ１、ＮＣＥ１０２、ＹＭＲ１８１ａ、ＭＳＮ１、ＢＯＩ１、ＦＬＯ８、ＧＩＣ１、およびこれらの任意の組合せまたは修飾からなる群から選択される。ＩＲＥＳエレメントを、２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の間に組み入れる場合、翻訳の開始は、第１のＯＲＦ内の、カノニカルの５’−ｍ７ＧｐｐｐＮキャップ依存性機構、およびＩＲＥＳエレメントの下流における、第２のＯＲＦ内の、キャップ非依存性の機構により生じうる。
【０１１８】
場合によって、遺伝子を、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）により連結することができる。ＩＲＥＳは、複数の遺伝子の、同時的な発現を可能としうる。例えば、ＩＲＥＳ配列は、単一のｍＲＮＡ転写物からの、複数のタンパク質の産生を許容しうる。リボソームは、ＩＲＥＳに、５’キャップ非依存的に結合し、翻訳を開始することが可能である。
【０１１９】
場合によって、ＩＲＥＳ配列は、５００塩基対でありうるか、またはほぼこの長さでありうる。ＩＲＥＳ配列は、３００塩基対〜１０００塩基対でありうる。例えば、ＩＲＥＳは、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、または１０００塩基対の長さでありうる。
【０１２０】
場合によって、ＩＲＥＳ配列を含む、ベクター内の下流遺伝子の発現を、低減することができる。例えば、ＩＲＥＳ配列に後続する遺伝子は、ＩＲＥＳ配列に先行する遺伝子に対して、発現が低減されうる。発現の低減は、先行する遺伝子に対する、１％〜９９％の低減でありうる。
【０１２１】
ある特定の実施形態では、ＩＲＥＳは、配列番号１８のヌクレオチド配列との、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、９９．５％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むＥＭＣＶ  ＩＲＥＳである。
【０１２２】
リンカー
また、本明細書で記載されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現および機能性を促進するリンカーを含む構築物も開示される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドリンカーは、本明細書で記載されるポリヌクレオチド内で用いることができる。ポリヌクレオチドリンカーは、本明細書で記載されるポリヌクレオチドを含むベクターと適合性である末端構造を創出するように付加されうる、所望の制限部位を含有する、ＤＮＡの二本鎖セグメントでありうる。場合によって、ポリヌクレオチドリンカーは、本明細書で記載されるポリヌクレオチドを含むベクターを修飾するために有用でありうる。例えば、ポリヌクレオチドリンカーを含む、ベクターの修飾は、複数のクローニング部位の変化、またはポリヒスチジンテールの付加でありうる。ポリヌクレオチドリンカーはまた、平滑末端インサートＤＮＡの末端を、制限酵素により切断され、粘着末端を伴うベクターへのクローニングに適応させるのに使用することもできる。ポリヌクレオチドリンカーの使用は、ベクターへの平滑末端ライゲーションより効率的な場合があり、後段の適用において、インサートを、ベクターから放出する方法をもたらしうる。場合によって、インサートは、治療適用に有用なポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列でありうる。場合によって、リンカーは、切断型リンカーでありうる。
【０１２３】
ポリヌクレオチドリンカーは、オリゴマーでありうる。ポリヌクレオチドリンカーは、ＤＮＡ二本鎖、ＤＮＡ一本鎖、またはこれらの組合せでありうる。場合によって、リンカーは、ＲＮＡでありうる。場合によって、ポリヌクレオチドリンカーは、Ｔ４リガーゼにより、本明細書で記載されるポリヌクレオチドを含むベクターへとライゲーションすることができる。ライゲーションを容易とするために、過剰量のポリヌクレオチドリンカーを、インサートおよびベクターを含む組成物へと添加することができる。場合によって、リンカーを導入する前に、インサートおよびベクターを前処理する。例えば、メチラーゼによる前処理により、インサートＤＮＡの望ましくない切断を防止することができる。
【０１２４】
ある特定の実施形態では、本明細書で記載されるポリヌクレオチドによりコードされる、２つまたはこれを超えるポリペプチドは、介在リンカーポリペプチドをコードする介在配列により隔てることができる。本明細書では、ポリヌクレオチドによりコードされる、２つまたはこれを超えるポリペプチドを隔てるアミノ酸配列を指す、「介在リンカーポリペプチド」という用語は、膜貫通ドメインを、細胞表面ポリペプチド（例えば、天然ポリペプチドの切断型変異体を含む）へと連結するように、本明細書で開示されるポリペプチド構築物内に、任意選択で組み入れられる、アミノ酸の配列を指す、「ペプチドリンカー」という用語と区別される。ある特定の場合には、介在リンカーは、易切断性介在リンカーポリペプチドである。一部の実施形態では、リンカーは、切断型グリンカーまたはリボソームスキッピングリンカーである。一部の実施形態では、切断型リンカーまたはリボソームスキッピングリンカー配列は、２Ａ、ＧＳＧ−２Ａ、ＧＳＧリンカー、ＳＧＳＧリンカー、フューリンリンク、ならびにこれらの変異体および誘導体からなる群から選択される。一部の実施形態では、２Ａリンカーは、ｐ２Ａリンカー、Ｔ２Ａリンカー、Ｆ２Ａリンカー、またはＥ２Ａリンカーである。一部の実施形態では、目的のポリペプチドは、易切断性介在リンカーポリペプチドにより連結された、融合タンパク質として発現する。ある特定の実施形態では、易切断性介在リンカーポリペプチドは、Ｆ／Ｔ２Ａ、Ｔ２Ａ、ｐ２Ａ、２Ａ、ＧＳＧ−ｐ２Ａ、ＧＳＧリンカー、およびフューリンリンク変異体のうちの、任意の１または複数でありうる。ある特定の実施形態では、リンカーポリペプチドは、下記の表に開示されたリンカーポリペプチドを含む。
【０１２５】
【表１−１】
2020513777.tif 000003
【０１２６】
【表１−２】
2020513777.tif 000004
【０１２７】
一部の実施形態では、介在リンカーポリペプチドは、ホイットローリンカー（配列番号１４６）、ＧＳＧリンカー（配列番号１４８）、ＳＧＳＧリンカー（配列番号１４９）、（Ｇ４Ｓ）３リンカー（配列番号１５０）、フューリン切断部位／フューリンリンク１（Furlink 1）（配列番号１５１）、Ｆｍｄｖリンカー（配列番号１５２）、トセア・アシグナ（Thosea asigna）ウイルス２Ａ領域（Ｔ２Ａ）（配列番号１５３）、フューリン−ＧＳＧ−Ｔ２Ａ（配列番号１５４）、フューリン−ＳＧＳＧ−Ｔ２Ａ（配列番号１５５）、ブタテッショウウイルス１２Ａ領域（Ｐ２Ａ）（配列番号１５６）、ＧＳＧ−Ｐ２Ａ（配列番号１５７）、Ａ型ウマ鼻炎ウイルス２Ａ領域（Ｅ２Ａ）（配列番号１５８）、または口蹄疫ウイルス２Ａ領域（Ｆ２Ａ）（配列番号１５９）のアミノ酸配列との、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、９９．５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。場合によって、介在リンカーポリペプチドは、リンカー（配列番号１４７、１６１、または１６２）のアミノ酸配列との、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、９９．５％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。場合によって、ウイルス２Ａ配列を使用することができる。２Ａエレメントは、５〜１００塩基対を有するＩＲＥＳより短くなりうる。場合によって、２Ａ配列は、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または１００ヌクレオチドの長さを有しうる。２Ａを連結された遺伝子は、単一のオープンリーディングフレーム内で発現させることができ、「自己切断」は、２ＡポリペプチドＣ末端の、最後の２つのアミノ酸であるＧ−Ｐ間で、共翻訳的に生じることが可能であり、等量の共発現タンパク質をもたらす。
【０１２８】
ウイルス２Ａ配列は、約２０アミノ酸でありうる。場合によって、ウイルス２Ａ配列は、コンセンサスモチーフである、Ａｓｐ−Ｖａｌ／Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏを含有しうる。コンセンサスモチーフ配列は、共翻訳的に作用しうる。例えば、グリシン残基とプロリン残基との、正常なペプチド結合の形成を防止することができ、これは、リボソームスキッピングおよび新生ポリペプチドの切断を結果としてもたらしうる。この効果は、等モルレベルで、複数の遺伝子をもたらしうる。
【０１２９】
２Ａペプチドは、単一のオープンリーディングフレーム内の、複数のタンパク質の、その後、リボソームスキッピング機構を介して、個別のポリペプチドへと切断されうる、ポリペプチドへの翻訳を可能としうる（Funston, Kallioinen et al. 2008）。一部の実施形態では、２Ａ配列は、Ｆ／Ｔ２Ａ、Ｔ２Ａ、ｐ２Ａ、２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｆ２Ａ、およびＢｍＣＰＶ２Ａ、ＢｍＩＦＶ２Ａ、ならびにこれらの任意の組合せを含みうる。
【０１３０】
場合によって、ベクターは、ＩＲＥＳ配列および２Ａリンカー配列を含みうる。他の場合には、２Ａペプチドと連結された、複数の遺伝子の発現は、２Ａペプチドに前置されたスペーサー配列（ＧＳＧ）により容易とすることができる。場合によって、構築物は、スペーサー、リンカー、アダプター、プロモーター、またはこれらの組合せを組み合わせうる。例えば、リンカーは、異なる２Ａペプチドと共に、スペーサー（ＳＧＳＧリンカーまたはＧＳＧリンカーまたはホイットローリンカー）およびフューリンリンカー（Ｒ−Ａ−Ｋ−Ｒ）切断部位を有しうる。スペーサーは、Ｉ−ＣｅｕＩでありうる。場合によって、リンカーは、操作することができる。例えば、リンカーは、疎水性などの化学的特徴を含むようにデザインすることができる。場合によって、少なくとも２つのリンカー配列は、同じタンパク質をもたらしうる。他の場合には、複数のリンカーを、ベクター内で使用することができる。例えば、目的の遺伝子は、図２および図３に示される通り、少なくとも２つのリンカーにより隔てることができる。
【０１３１】
ある特定の実施形態では、本明細書で記載されるポリヌクレオチドによりコードされる、２つまたはこれを超えるポリペプチドは、リンカーポリペプチドをコードする介在配列により隔てることができる。ある特定の場合には、リンカーは、易切断性リンカーである。一部の実施形態では、目的のポリペプチドは、易切断性介在リンカーポリペプチドにより連結された、融合タンパク質として発現する。ある特定の実施形態では、易切断性リンカーポリペプチドは、下記で記載されるフューリンリンク、ｆｍｄｖ、ｐ２ａ、ＧＳＧ−ｐ２ａ、および／またはｆｐ２ａのうちの、任意の１つまたは２つでありうる。場合によって、リンカーは、ＡＰＶＫＱＧＳＧ（配列番号１６１）である。
【０１３２】
ある特定の場合には、リンカーポリペプチドは、アミノ酸配列「ＲＡＫＲ」（配列番号１５１）を含みうる。ある特定の場合には、フューリンリンカーポリペプチドは、「ＣＧＴＧＣＡＡＡＧＣＧＴ」（配列番号６）または「ＡＧＡＧＣＴＡＡＧＡＧＧ」（配列番号９）を含むポリヌクレオチド配列によりコードされうる。
【０１３３】
一部の実施形態では、リンカーは、本明細書で記載されるポリヌクレオチド内で用いることができる。リンカーは、可撓性リンカー、非可撓性リンカー、ｉｎ  ｖｉｖｏ切断型リンカー、またはこれらの任意の組合せでありうる。場合によって、リンカーは、機能的ドメインを、併せて連結する（可撓性リンカーおよび非可撓性リンカーの場合のように）場合もあり、ｉｎ  ｖｉｖｏ切断型リンカーの場合のように、機能的ドメインを、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて放出する場合もある。
【０１３４】
リンカーは、生物学的活性を改善し、発現収率を増大させることから、所望の薬物動態を達成しうる。リンカーはまた、ヒドラゾン、ペプチド、ジスルフィド、またはチオエーテル（thioesther）も含みうる。
【０１３５】
場合によって、本明細書で記載されるリンカー配列は、可撓性リンカーを含みうる。可撓性リンカーは、接合されるドメインが、ある程度の移動または相互作用を必要とする場合に適用することができる。可撓性リンカーは、小型、非極性（例えば、Ｇｌｙ）、または極性（例えば、ＳｅｒまたはＴｈｒ）のアミノ酸から構成されうる。可撓性リンカーは、Ｇｌｙ残基およびＳｅｒ残基の連なりから主になる配列（「ＧＳ」リンカー）を有しうる。可撓性リンカーの例は、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎの配列（配列番号１５０）を有しうる。コピー数である「ｎ」を調整することにより、この例示的ＧＳリンカーの長さを最適化して、機能的ドメインの適切な分離を達成することもでき、必要なドメイン間相互作用を維持することもできる。ＧＳリンカーのほかに、他の可撓性リンカーも、組換え融合タンパク質に用いることができる。場合によって、可撓性リンカーはまた、ＧｌｙおよびＳｅｒなど、小型アミノ酸または極性アミノ酸に富む場合もあるが、可撓性を維持するように、ＴｈｒおよびＡｌａなど、さらなるアミノ酸を含有する場合もある。他の場合には、ＬｙｓおよびＧｌｕなどの極性アミノ酸を使用して、可溶性を改善することができる。
【０１３６】
本明細書で記載されるリンカー配列内に組み入れられる可撓性リンカーは、良好な可撓性および可溶性をもたらすように、ＧｌｙおよびＳｅｒなど、小型アミノ酸または極性アミノ酸に富む場合がある。可撓性リンカーは、ある特定の移動または相互作用が、融合タンパク質ドメインに所望される場合に適切でありうる。加えて、可撓性リンカーは、非可撓性構造を有さない場合もあるが、機能的ドメイン間の距離を保持する、受動的リンカーとして用いられる場合もある。可撓性リンカーの長さを調整して、適正なフォールディングを可能とすることもでき、融合タンパク質の最適な生物学的活性を可能とすることもできる。
【０１３７】
本明細書で記載されるリンカーは、場合によって、非可撓性リンカーをさらに含みうる。非可撓性リンカーを用いて、ポリペプチドのドメイン間で、一定の距離を維持することができる。非可撓性リンカーの例は、少数を挙げれば、アルファヘリックス形成リンカー、Ｐｒｏに富む配列、（ＸＰ）ｎ、Ｘ−Ｐｒｏ骨格、Ａ（ＥＡＡＡＫ）ｎＡ（ｎ＝２〜５）でありうる。非可撓性リンカーは、場合によって、αヘリックス構造を取ることにより、または複数のＰｒｏ残基を含有することにより、比較的剛直な構造を呈しうる。
【０１３８】
本明細書で記載されるリンカーは、場合によって、切断されうる。他の場合に、リンカーは、切断されない。切断されないリンカーは、ｉｎ  ｖｉｖｏ過程またはｅｘ  ｖｉｖｏ過程を通して１つの分子として作用するように、機能的ドメインを、共有結合的に、一体に接合しうる。リンカーはまた、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいても切断されうる。切断型リンカーは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、遊離の機能的ドメインを放出させるように導入することができる。切断型リンカーは、少数を挙げれば、還元試薬、プロテアーゼの存在により切断することができる。例えば、ジスルフィド結合の還元を用いて、切断型リンカーを作製することができる。ジスルフィドリンカーの場合、グルタチオンなど、チオールとのジスルフィド交換を介する切断イベントが、切断をもたらしうるであろう。他の場合には、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける、組換え融合タンパク質内のリンカーの切断はまた、ｉｎ  ｖｉｖｏの、病理学的状態（例えば、がんまたは炎症）下、特異的な細胞内または組織内で発現する場合もあり、ある特定の細胞区画内に拘束される場合もあるプロテアーゼによっても実行されうる。場合によって、切断型リンカーは、切断のターゲティングを可能としうる。例えば、多くのプロテアーゼの特異性は、拘束区画内のリンカーの緩徐な切断をもたらしうる。切断型リンカーはまた、ヒドラゾン、ペプチド、ジスルフィド、またはチオエーテルも含みうる。例えば、ヒドラゾンは、血清中の安定性を付与しうる。他の場合には、ヒドラゾンは、酸性区画内の切断を可能としうる。酸性区画は、最大で７のｐＨを有しうる。リンカーはまた、チオエーテルも含みうる。チオエーテルは、非還元性でありうる。チオエーテルは、細胞内タンパク質分解のためにデザインすることができる。
【０１３９】
ある特定の実施形態では、ｆｍｄｖリンカーポリペプチドは、配列番号１５２と、少なくとも約４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一でありうる配列を含む。ある特定の実施形態では、ｆｍｄｖリンカーポリペプチドは、２つまたはこれを超える融合タンパク質を連結する、単一のベクター内でコードされるリンカーのうちの１または複数である。ある特定の場合には、ｆｍｄｖリンカーポリペプチドは、ポリヌクレオチドのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の核酸配列によりコードされうる。場合によって、ｆｍｄｖをコードするＯＲＦは、配列番号７の配列を含むか、またはこれからなる。ある特定の実施形態では、ｆｍｄｖをコードするポリヌクレオチドは、配列番号７と、少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である。
【０１４０】
ある特定の場合には、リンカーポリペプチドは、「ｐ２ａ」リンカーでありうる。ある特定の実施形態では、ｐ２ａポリペプチドは、配列番号１５６と、少なくとも約４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一でありうる配列を含みうる。ある特定の実施形態では、ｐ２ａリンカーポリペプチドは、２つまたはこれを超える融合タンパク質を連結する、単一のベクター内でコードされるリンカーのうちの１または複数でありうる。場合によって、ｐ２ａリンカーポリペプチドは、ポリヌクレオチドのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の核酸配列によりコードされうる。ある特定の実施形態では、ｐ２ａをコードするＯＲＦは、配列番号１１の配列を含むか、またはこれからなる。ある特定の場合には、ｐ２ａをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１１と、少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるか、または少なくともほぼこれらの比率同一でありうる。
【０１４１】
場合によって、リンカーポリペプチドは、「ＧＳＧ−ｐ２ａ」リンカーでありうる。ある特定の実施形態では、ＧＳＧ−ｐ２ａリンカーポリペプチドは、配列番号１５７と、少なくとも約４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一でありうる配列を含みうる。ある特定の実施形態では、ＧＳＧ−ｐ２ａリンカーポリペプチドは、２つまたはこれを超える融合タンパク質を連結する、単一のベクター内でコードされるリンカーのうちの１または複数でありうる。場合によって、ＧＳＧ−ｐ２ａリンカーポリペプチドは、ポリヌクレオチドのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の核酸配列によりコードされうる。ＧＳＧ  ｐ２ａをコードするＯＲＦは、配列番号１２の配列を含みうる。場合によって、ＧＳＧ−ｐ２ａをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１２と、少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるか、または少なくともほぼこれらの比率同一でありうる。
【０１４２】
リンカーポリペプチドは、本明細書で提示される「ｆｐ２ａ」リンカーでありうる。ある特定の実施形態では、ｆｐ２ａリンカーポリペプチドは、配列番号１６０と、少なくとも約４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一でありうる配列を含みうる。ある特定の場合には、ｆｐ２ａリンカーポリペプチドは、２つまたはこれを超える融合タンパク質を連結する、単一のベクター内でコードされるリンカーのうちの１または複数でありうる。場合によって、ｆｐ２ａリンカーポリペプチドは、ポリヌクレオチドのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の核酸配列によりコードされうる。ある特定の実施形態では、ｆｐ２ａリンカーをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１５と、少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるか、または少なくともほぼこれらの比率同一でありうる。
【０１４３】
場合によって、リンカーは、操作することができる。例えば、リンカーは、疎水性などの化学的特徴を含むようにデザインすることができる。場合によって、少なくとも２つのリンカー配列は、同じタンパク質をもたらしうる。配列は、配列番号１４７、１６１、または１６２のポリペプチド配列と、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一でありうるか、またはほぼこれらの比率で同一でありうる。他の場合には、複数のリンカーを、ベクター内で使用することができる。例えば、本明細書で記載される、目的の遺伝子と、１または複数の遺伝子スイッチポリペプチド配列とは、図１５および図１６に示される通り、少なくとも２つのリンカーにより隔てることができる。場合によって、遺伝子は、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または最大で１０のリンカーにより隔てることができる。
【０１４４】
リンカーは、操作リンカーでありうる。リンカーをデザインする方法は、コンピュータ計算による方法でありうる。場合によって、コンピュータ計算による方法は、グラフ法を含みうる。コンピュータ計算法を使用して、データベースから導出された三次元ペプチド構造のライブラリーから、適切なペプチドを検索することができる。例えば、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）を使用して、リンカーの選択されたアミノ酸の間の間隔の距離を測ることができる。
【０１４５】
一部の実施形態では、フューリンポリペプチドおよび２Ａポリペプチドを含むポリペプチド構築物をコードするポリヌクレオチドが提供されるが、この場合、フューリンポリペプチドおよび２Ａポリペプチドが、少なくとも３つの疎水性アミノ酸を含むポリペプチドリンカーにより連結されている。場合によって、少なくとも３つの疎水性アミノ酸は、グリシン（Ｇｌｙ）（Ｇ）、アラニン（Ａｌａ）（Ａ）、バリン（Ｖａｌ）（Ｖ）、ロイシン（Ｌｅｕ）（Ｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）（Ｉ）、プロリン（Ｐｒｏ）（Ｐ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）（Ｆ）、メチオニン（Ｍｅｔ）（Ｍ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）（Ｗ）からなるリストから選択される。場合によって、ポリペプチドリンカーはまた、１または複数のＧＳリンカー配列、例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＳＧ）ｎ、（ＧＳＧ）ｎ（配列番号７８）、および（ＳＧＳＧ）ｎ（配列番号７９）［配列中、ｎは、０〜１５の任意の数でありうる］も含みうる。
【０１４６】
ポリペプチド構築物の発現の改善を得る方法であって、第１の機能的ポリペプチドおよび第２の機能的ポリペプチドを含む前記ポリペプチド構築物をコードするポリヌクレオチドを用意するステップであって、前記第１の機能的ポリペプチドと、第２の機能的ポリペプチドとが、配列ＡＰＶＫＱ（配列番号１６２）との、少なくとも６０％の同一性を伴う配列を含むリンカーポリペプチドにより連結されている、ステップと；宿主細胞内で、前記ポリヌクレオチドを発現させるステップであって、ポリペプチド構築物の発現の、配列ＡＰＶＫＱとの、少なくとも６０％の同一性を伴う配列を含むリンカーポリペプチドを有さない、対応するポリペプチド構築物と比較した改善を結果としてもたらすステップとを含む方法が提供される。
【０１４７】
プロモーター
【０１４８】
「プロモーター」とは、コード配列の転写を誘発する、ポリヌクレオチドの領域を指す。プロモーターは、ＤＮＡの、同じ鎖上の、遺伝子の転写開始部位の近傍であり、かつ、上流に（センス鎖の５’側領域に向かって）位置する。あるプロモーターが、細胞内の全ての状況において活性であるので、構成的であるのに対し、他のプロモーター、例えば、誘導性プロモーターは、特異的刺激に応答して調節され、活性となる。さらに他のプロモーターは、Ｔ細胞特異的プロモーターを含むがこれらに限定されない、組織特異的プロモーターまたは活性化プロモーターである。
【０１４９】
本明細書で使用される「プロモーター活性」という用語およびその文法的同等物は、その活性が測定されるプロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列の発現の程度を指す。プロモーター活性は、例えば、ノーザンブロット解析により、産生されるＲＮＡ転写物の量を決定することにより、直接的に測定することもでき、プロモーターに連結されたレポーター核酸配列など、連結された核酸配列によりコードされる産物の量を決定することにより、間接的に測定することもできる。
【０１５０】
本明細書で使用される「誘導性プロモーター」とは、転写調節因子、例えば、生物因子または非生物因子の存在または非存在により、活性へと誘導されるプロモーターを指す。誘導性プロモーターは、それらに作動可能に連結した遺伝子の発現が、生物または特に、組織の発生の、ある特定の段階において、オンまたはオフにされうるため、有用である。誘導性プロモーターの例は、アルコール調節性プロモーター、テトラサイクリン調節性プロモーター、ステロイド調節性プロモーター、金属調節性プロモーター、発症機序調節性プロモーター、温度調節性プロモーター、および光調節性プロモーターである。一実施形態では、誘導性プロモーターは、遺伝子スイッチの一部である。誘導性プロモーターは、遺伝子スイッチのリガンド誘導性プロモーターでありうる。場合によって、誘導性プロモーターは、ＲＨＥＯＳＷＩＴＣＨ（登録商標）遺伝子スイッチなど、低分子リガンド誘導性の、２つのポリペプチドによる、エクジソン受容体ベースの遺伝子スイッチでありうる。場合によって、遺伝子スイッチは、それらの各々が、参照によりその全体において組み込まれる、ＰＣＴ／米国出願第２００１／００９０５０号明細書（国際公開第２００１／０７０８１６号パンフレット）；米国特許第７，０９１，０３８号明細書；同第７，７７６，５８７号明細書；同第７，８０７，４１７号明細書；同第８，２０２，７１８号明細書；ＰＣＴ／米国出願第２００１／０３０６０８号明細書（国際公開第２００２／０２９０７５号パンフレット）；米国特許第８，１０５，８２５号明細書；同第８，１６８，４２６号明細書；ＰＣＴ／米国出願第２００２／００５２３５号明細書（国際公開第２００２／０６６６１３号パンフレット）；米国特許出願公開第１０／４６８，２００号明細書（米国公開第２０１２０１６７２３９号明細書）；ＰＣＴ／米国出願第２００２／００５７０６号明細書（国際公開第２００２／０６６６１４号パンフレット）；米国特許第７，５３１，３２６号明細書；同第８，２３６，５５６号明細書；同第８，５９８，４０９号明細書；ＰＣＴ／米国出願第２００２／００５０９０号明細書（国際公開第２００２／０６６６１２号パンフレット）；米国特許第８，７１５，９５９号明細書（米国公開第２００６０１００４１６号明細書）；ＰＣＴ／米国出願第２００２／００５２３４号明細書（国際公開第２００３／０２７２６６号パンフレット）；米国特許第７，６０１，５０８号明細書；同第７，８２９，６７６号明細書；同第７，９１９，２６９号明細書；同第８，０３０，０６７号明細書；ＰＣＴ／米国出願第２００２／００５７０８号明細書（国際公開第２００２／０６６６１５号パンフレット）；米国特許出願公開第１０／４６８，１９２号明細書（米国公開第２０１１０２１２５２８号明細書）；ＰＣＴ／米国出願第２００２／００５０２６号明細書（国際公開第２００３／０２７２８９号パンフレット）；米国特許第７，５６３，８７９号明細書；同第８，０２１，８７８号明細書；同第８，４９７，０９３号明細書；ＰＣＴ／米国出願第２００５／０１５０８９号明細書（国際公開第２００５／１０８６１７号パンフレット）；米国特許第７，９３５，５１０号明細書；同第８，０７６，４５４号明細書；ＰＣＴ／米国出願第２００８／０１１２７０号明細書（国際公開第２００９／０４５３７０号パンフレット）；米国特許出願公開第１２／２４１，０１８号明細書（米国公開第２００９０１３６４６５号明細書）；ＰＣＴ／米国出願第２００８／０１１５６３号明細書（国際公開第２００９／０４８５６０号パンフレット）；米国特許出願公開第１２／２４７，７３８号明細書（米国公開第２００９０１２３４４１号明細書）；ＰＣＴ／米国出願第２００９／００５５１０号明細書（国際公開第２０１０／０４２１８９号パンフレット）；米国特許出願公開第１３／１２３，１２９号明細書（米国公開第２０１１０２６８７６６号明細書）；ＰＣＴ／米国出願第２０１１／０２９６８２号明細書（国際公開第２０１１／１１９７７３号パンフレット）；米国特許出願公開第１３／６３６，４７３号明細書（米国公開第２０１３０１９５８００号明細書）；ＰＣＴ／米国出願第２０１２／０２７５１５号明細書（国際公開第２０１２／１２２０２５号パンフレット）；および米国特許第９，４０２，９１９号明細書において記載される、しかしながらこれらに限定されるわけではないが、これらに記載されている系のうちのいずれかの、エクジソンベースの受容体による構成要素から選択しうる。
【０１５１】
本明細書では、対象へと、少なくとも２つの機能的タンパク質またはこれらの部分；少なくとも１つのプロモーター；および少なくとも１つの操作組換え部位を含む、本明細書で記載されるポリペプチド配列をコードする、ポリヌクレオチドを含む、少なくとも１つの非ウイルスベクターを投与するステップを含み；前記少なくとも１つのプロモーターが、前記少なくとも２つの機能的タンパク質の発現を駆動する、方法が提示される。場合によって、少なくとも１つのプロモーターは、構成的プロモーターでありうる。場合によって、少なくとも１つのプロモーターは、組織特異的プロモーターでありうる。場合によって、少なくとも１つのプロモーターは、誘導性プロモーターでありうる。場合によって、誘導性プロモーターは、低分子リガンド誘導性の、２つのポリペプチドによる、エクジソン受容体ベースの遺伝子スイッチである。他の場合には、少なくとも１つのプロモーターが、誘導的であることが可能であり、少なくとも１つのプロモーターが、活性化特異的でありうる、プロモーターの組合せを用いることができる。
【０１５２】
誘導性プロモーターは、前記少なくとも２つの遺伝子の発現の、用量調節性制御のために、リガンドを用いる。場合によって、リガンドは、ｅｃｄｙステロイド、９−ｃｉｓ−レチノイン酸、レチノイン酸の合成類似体、Ｎ，Ｎ’−ジアシルヒドラジン、オキサゾリン、ジベンゾイルアルキルシアノヒドラジン、Ｎ−アルキル−Ｎ，Ｎ’−ジアロイルヒドラジン、Ｎ−アシル−Ｎ−アルキルカルボニルヒドラジン、Ｎ−アロイル−Ｎ−アルキル−Ｎ’−アロイルヒドラジン、アルニドケトン、３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシ−Ｎ−イソブチル−ベンズアミド、８−Ｏ−アセチルハルパジド、オキシステロール、２２（Ｒ）ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ）ヒドロキシコレステロール、２５−エポキシコレステロール、Ｔ０９０１３１７、５−アルファ−６−アルファ−エポキシコレステロール−３−スルフェート（sulfate）（ＥＣＨＳ）、７−ケトコレステロール−３−スルフェート（sulfate）、フラメゾール、胆汁酸、１，１−ビホスホネート（biphosphonate）エステル、若年性ホルモンＩＩＩ、ＲＧ−１１５８１９（３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−エチル−２，２−ジメチル−プロピル）−Ｎ’−（２−メチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド−）、ＲＧ−１１５９３２（（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド）、およびＲＧ−１１５８３０（３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド）、ならびにこれらの任意の組合せからなる群から選択することができる。
【０１５３】
一部の実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、非誘導性プロモーターである。場合によって、プロモーターは、組織特異的プロモーターでありうる。本明細書の「組織特異的」は、組織または細胞型のサブセット内の、遺伝子発現の調節を指す。場合によって、組織特異的プロモーターは、プロモーターが、生物の、ある特定の組織または細胞型における発現だけを駆動するように、空間的に調節することができる。他の場合には、組織特異的プロモーターは、プロモーターが、生物の発生時を含む時間にわたり、細胞型または組織における発現を、示差的に駆動するように、時間的に調節することができる。場合によって、組織特異的プロモーターは、空間的に、かつ、時間的に調節される。ある特定の実施形態では、組織特異的プロモーターは、ある特定の細胞型内で、構成的に、または特定の時点または細胞型の特定の段階において、間欠的に活性化する。例えば、組織特異的プロモーターは、Ｔ細胞またはＮＫ細胞など、特異的細胞が活性化する場合に活性化するプロモーターでありうる。Ｔ細胞は、様々な形で、例えば、ＭＨＣクラスＩＩ分子により、ペプチド抗原と共に提示される場合、または抗原結合性ポリペプチドを含む操作Ｔ細胞が、抗原と会合する場合に活性化しうる。１つの場合には、このような操作Ｔ細胞または操作ＮＫ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する。
【０１５４】
１つの場合には、少なくとも１つのプロモーターは、操作プロモーターまたはこの変異体である。本明細書で記載される通り、プロモーターは、ＩＬ−２に由来する最小プロモーター配列と、以下：配列番号５１など、活性化Ｔ細胞核内因子（ＮＦＡＴ）応答エレメント；ＮＦＩＬ２Ｄ応答エレメント、ＮＦｋＢ／ＴＣＦ応答エレメント、ＮＦ＿ＡＴ／ＮＦＩＬ２Ｂ応答エレメント、またはＮＦＩＬ２Ａ／ＯＣＴ応答エレメントのうちの１または複数とを組み込みうる。応答エレメントの例については、その全体において本明細書に組み込まれる、Mattila et al., EMBO J. 1990 December; 9(13): 4425-4433において記載されている。
【０１５５】
一部の実施形態では、少なくとも１つのプロモーターは、ＩＬ−２コアプロモーター（配列番号４０）を含む。一実施形態では、少なくとも１つのプロモーターは、ＩＬ−２最小プロモーター（配列番号４１）を含む。別の実施形態では、少なくとも１つのプロモーターは、ＩＬ−２エンハンサー／プロモーター変異体（配列番号４２〜４３）を含む。さらに別の実施形態では、少なくとも１つのプロモーターは、ＮＦ−κＢ結合部位（配列番号４４〜４６）を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのプロモーターは、（ＮＦ−κＢ）１−ＩＬ２プロモーター変異体（配列番号４７）を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのプロモーターは、（ＮＦ−κＢ）３−ＩＬ２プロモーター変異体（配列番号４８）を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのプロモーターは、（ＮＦ−κＢ）６−ＩＬ２プロモーター変異体（配列番号４９）を含む。一実施形態では、少なくとも１つのプロモーターは、１×ＮＦＡＴ応答エレメント−ＩＬ２プロモーター変異体（配列番号５０）を含む。別の実施形態では、少なくとも１つのプロモーターは、活性化Ｔ細胞核内因子（ＮＦＡＴ）応答エレメント（配列番号５１）を含む。さらに別の実施形態では、少なくとも１つのプロモーターは、６×ＮＦＡＴ応答エレメント−ＩＬ２プロモーター変異体（配列番号５２〜５５）を含む。さらに別の実施形態では、少なくとも１つのプロモーターは、３×ＮＦＡＴ応答エレメント−ＩＬ２プロモーター変異体（配列番号５６〜５７）を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのプロモーターは、ヒトＥＦ１Ａ１プロモーター変異体（配列番号５８〜５９）を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのプロモーターは、ヒトＥＦ１Ａ１プロモーター／エンハンサー（配列番号６０）を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのプロモーターは、ヒトＵＢＣプロモーター（配列番号６１）を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのプロモーターは、６部位ＧＡＬ４誘導性近位因子結合エレメント（ＰＦＢ）（配列番号６２）を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのプロモーターは、合成最小プロモーター１（誘導性プロモーター）（配列番号６３）を含む。ヒトＩＬ−２遺伝子および５’側フランキング領域は、配列番号９５のヌクレオチド配列を含む。
【０１５６】
本明細書で記載される、ＩＬ−１２発現のリガンド誘導性制御のための、遺伝子スイッチの使用は、例えば、発現の調節および治療指数の改善を可能とすることにより、ＩＬ−１２の安全性プロファイルを改善しうる。しかし、遺伝子スイッチを使用する、リガンド用量依存性のＩＬ−１２の発現のための条件は、活性化リガンド（例えば、ベレジメクス）の存在または非存在である。ある特定の実施形態では、誘導ＩＬ−１２発現に対する、さらなる条件付け制御も想定される。Ｔ細胞活性化特異的プロモーターの制御下にある遺伝子スイッチ構成要素が提供される。これは、遺伝子スイッチの制御下にある、トランス遺伝子の、ベレジメクス制御型発現に必要な遺伝子スイッチ構成要素の条件付け（例えば、Ｔ細胞の活性化）発現を結果としてもたらす。一部の実施形態では、これは、ベレジメクスが、存在し、Ｔ細胞が、活性化している場合における、腫瘍特異的Ｔ細胞による、ＩＬ−１２またはＩＬ−１５などのサイトカインの優先的な発現を結果としてもたらす。これは、遺伝子スイッチに制御される、トランス遺伝子発現の局在化レベルの上昇をもたらしうる。
【０１５７】
例えば、遺伝子スイッチ構成要素の、Ｔ細胞活性化特異的発現は、活性化Ｔ細胞核内因子（ＮＦＡＴ）応答エレメントを含むプロモーターにより制御することができる。ＮＦＡＴ転写因子は、エフェクターＴ細胞状態の、鍵となるモジュレーターである。ＮＦＡＴは、枯渇を漸進的に駆動する、早期転写チェックポイントである。ＮＦＡＴは、ＴＣＲの刺激後に、Ｔ細胞内で迅速に活性化し、適切な共刺激シグナル伝達により誘導されて、ＡＰ−１と共に、タンパク質複合体を形成し、エフェクター遺伝子およびＴ細胞機能を調節する。ＮＦＡＴ応答エレメントは、他の最小プロモーター配列（例えば、ＩＬ２最小プロモーター）と融合させて、Ｔ細胞の活性化に応答した、トランス遺伝子の発現を駆動することができる。
【０１５８】
活性化特異的プロモーターの他の例は、インターロイキン２（ＩＬ２）プロモーターおよびプログラム細胞死（ＰＤ）１（ＣＤ２７９）プロモーターを含むがこれらに限定されない。遺伝子スイッチ構成要素はまた、炎症促進性シグナル伝達経路のＮＦ−κＢなど、他の核内因子に対する結合性部位を、最小プロモーター配列（例えば、ＩＬ２）へと融合させることにより、免疫細胞の活性化時にも、条件付けで発現させることができる。
【０１５９】
一部の実施形態では、プロモーターは、ＮＦ−κＢ結合部位（配列番号４４〜４６）、活性化Ｔ細胞核内因子（ＮＦＡＴ）応答エレメント（配列番号５１）、６部位ＧＡＬ４誘導性近位因子結合エレメント（ＰＦＢ）（配列番号６２）、またはＲＰＬ６に基づく合成５’ＵＴＲ（配列番号６４）を含む。ある特定の実施形態では、プロモーターは、ＩＬ−２コアプロモーター、ＩＬ−２最小プロモーター、ＩＬ−２エンハンサー／プロモーター変異体、（ＮＦ−κＢ）１−ＩＬ２プロモーター変異体、（ＮＦ−κＢ）３−ＩＬ２プロモーター変異体、（ＮＦ−κＢ）６−ＩＬ２プロモーター変異体、１×ＮＦＡＴ応答エレメント−ＩＬ２プロモーター変異体、３×ＮＦＡＴ応答エレメント−ＩＬ２プロモーター変異体、６×ＮＦＡＴ応答エレメント−ＩＬ２プロモーター変異体、ヒトＥＥＦ１Ａ１プロモーター変異体、ヒトＥＥＦ１Ａ１プロモーター／エンハンサー、ヒトＵＢＣプロモーター、および合成最小プロモーター１のうちの、任意の１または複数でありうる。ある特定の実施形態では、プロモーターヌクレオチドは、下記の表に開示されたリンカーポリペプチドを含む。
【０１６０】
【表２−１】
2020513777.tif 000005
【０１６１】
【表２−２】
2020513777.tif 000006
【０１６２】
【表２−３】
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【０１６３】
【表２−４】
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【０１６４】
【表２−５】
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【０１６５】
遺伝子スイッチ
本明細書では、遺伝子スイッチポリペプチド、リガンド誘導性遺伝子スイッチポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびにこれらのポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドを組み込む方法および系が提示される。
【０１６６】
「遺伝子スイッチ（gene switch）」または「遺伝子スイッチ（genetic switch）」という用語は、プロモーターと関連する応答エレメントの組合せを指し、例えば、１または複数のリガンドの存在下で、応答エレメントおよびプロモーターを組み込んだ遺伝子の発現をモジュレートする、ＥｃＲベースの系を指す。緊密に調節された誘導性遺伝子発現系または遺伝子スイッチは、遺伝子治療、細胞内の、大スケールのタンパク質の作製、細胞ベースのハイスループットのスクリーニングアッセイ、機能的なゲノミクス、ならびにトランスジェニック植物およびトランスジェニック動物における形質の調節など、多様な適用に有用である。このような誘導性遺伝子発現系は、リガンド誘導性異種遺伝子発現系を含みうる。
【０１６７】
ＥｃＲベースの遺伝子スイッチの初期形は、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）ＥｃＲ（ＤｍＥｃＲ）ポリペプチドおよびマウス（Mus musculus）ＲＸＲ（ＭｍＲＸＲ）ポリペプチドを使用し、これらの受容体が、ステロイドであるポナステロンＡの存在下で、哺乳動物細胞系およびトランスジェニックマウスにおいて、レポーター遺伝子をトランス活性化させることを示した（Christopherson et al., 1992；No et al., 1996）。その後、Suhr et al., 1998は、非ステロイド系のエクジソンアゴニストであるテブフェノジドが、外因性ヘテロ二量体パートナーの非存在下で、カイコ（Bombyx mori）ＥｃＲ（ＢｍＥｃＲ）を介して、哺乳動物細胞内のレポーター遺伝子の、高レベルのトランス活性化を誘導することを示した。
【０１６８】
ＰＣＴ国際特許出願／米国出願第９７／０５３３０号明細書（国際公開第９７／３８１１７号パンフレット）およびＰＣＴ国際特許出願／米国出願第９９／０８３８１号明細書（国際公開第９９／５８１５５号パンフレット）は、外因性遺伝子の発現をモジュレートするための方法であって、外因性遺伝子およびエクジソン応答エレメントを含むＤＮＡ構築物が、それに対するリガンドの存在下で、かつ、任意選択で、サイレントパートナーとして作用することが可能な受容体の存在下で、エクジソン応答エレメントに結合して、遺伝子発現を誘導するエクジソン受容体を含む、第２のＤＮＡ構築物により活性化する方法について開示している。この例では、エクジソン受容体を、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）から単離した。典型的に、このような系は、最適の活性化をもたらすために、サイレントパートナー、好ましくはレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）の存在を必要とする。哺乳動物細胞内では、昆虫エクジソン受容体（ＥｃＲ）は、哺乳動物レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）と、ヘテロ二量体化し、これにより、標的遺伝子または異種遺伝子の発現を、リガンド依存的に調節するのに使用することが可能である。ＰＣＴ国際特許出願／米国出願第９８／１４２１５号明細書（国際公開第９９／０２６８３号パンフレット）は、カイコガであるカイコ（Bombyx mori）から単離されたエクジソン受容体が、外因性の二量体パートナーを必要とせずに、哺乳動物系内で機能的であることについて開示している。一部の実施形態では、ＲＸＲは、配列番号６９と、少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一なヌクレオチド、または配列番号１８２と、少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一なポリペプチドを含む。一部の実施形態では、遺伝子スイッチは、ＶＰ１６−リンカー−ＲｘＲを含み、ＶＰ１６−リンカー−ＲＸＲは、配列番号７０と、少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一なヌクレオチド、または配列番号１８３と、少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一なポリペプチドを含む。
【０１６９】
米国特許第６，２６５，１７３号明細書は、受容体のステロイド／甲状腺スーパーファミリーの多様なメンバーを、遺伝子発現系における使用のための、ＵＳＰの、少なくとも二量体化ドメインを含むキイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）ウルトラスピラクル受容体（ＵＳＰ）またはこの断片と組み合わせうることについて開示している。米国特許第５，８８０，３３３号明細書は、植物において使用された、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）のＥｃＲおよびウルトラスピラクル（ＵＳＰ）によるヘテロ二量体系であって、トランス活性化ドメインおよびＤＮＡ結合性ドメインが、２つの異なるハイブリッドタンパク質上に位置する、ヘテロ二量体系について開示している。これらの場合の各々では、トランス活性化ドメインおよびＤＮＡ結合性ドメイン（ＰＣＴ国際特許出願／米国出願第９８／１４２１５号明細書における通りに、天然のＥｃＲとして、またはＰＣＴ国際特許出願／米国出願第９７／０５３３０号明細書における通りに、修飾ＥｃＲとして）を、単一の分子へと組み込み、ＵＳＰまたはＲＸＲである、他のヘテロ二量体パートナーを、それらの天然状態において使用した。一部の実施形態では、遺伝子スイッチは、ＥｃＲリガンド結合性ドメイン−ＶＹ変異体を含み、ＥｃＲリガンド結合性ドメイン−ＶＹ変異体は、配列番号７２もしくは７３と、少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一なヌクレオチド、または配列番号１８５もしくは１８６と、少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一なポリペプチドを含む。他の実施形態では、遺伝子スイッチは、ＧＡＬ４−リンカー−ＥｃＲを含み、ＧＡＬ４−リンカー−ＥｃＲは、配列番号７４もしくは７５と、少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一なヌクレオチド、または配列番号１８７もしくは１８８と、少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一なポリペプチドを含む。
【０１７０】
ＰＣＴ国際特許出願／米国出願第０１／０９０５号明細書は、トランス活性化ドメインと、ＤＮＡ結合ドメインとを２つの異なるタンパク質上に置くことにより互いから隔てた、エクジソン受容体ベースの誘導性遺伝子発現系が、リガンドの非存在下で、バックグラウンド活性の大幅な低減を結果としてもたらし、リガンドの存在下で、バックグラウンドを上回る活性の著明な増大を結果としてもたらすことについて開示している。この２ハイブリッド系は、ＰＣＴ出願／米国出願第９７／０５３３０号明細書およびＰＣＴ出願／米国出願第９８／１４２１５号明細書の出願において開示されている、２つの系と比較して、著明に改善された誘導性遺伝子発現モジュレーション系である。２ハイブリッド系は、ＤＮＡ結合性ドメインが、遺伝子上のＤＮＡ結合性部位に結合すると、トランス活性化ドメインが、プロモーターを、より効果的に活性化させるように、相互作用タンパク質の対が、転写活性化ドメインを、ＤＮＡ結合性ドメインに対して、より好適な位置に置く能力を利用すると考えられる（例えば、米国特許第５，２８３，１７３号明細書を参照されたい）。２ハイブリッド遺伝子発現系は、核内受容体ポリペプチドへと融合させたＤＮＡ結合性ドメインをコードする、第１の遺伝子発現カセット、および異なる核内受容体ポリペプチドへと融合させたトランス活性化ドメインをコードする、第２の遺伝子発現カセットである、２つの遺伝子発現カセットを含む。リガンドの存在下では、第１のポリペプチドの、第２のポリペプチドとの相互作用を促進するコンフォメーション変化が誘導され、これにより、ＤＮＡ結合性ドメインと、トランス活性化ドメインとの二量体化が結果としてもたらされると考えられる。ＤＮＡ結合性ドメインおよびトランス活性化ドメインは、２つの異なる分子上に存在するので、リガンドの非存在下では、バックグラウンド活性が、大幅に低減される。
【０１７１】
別の驚くべき発見は、２ハイブリッド系のある特定の修飾がまた、ステロイド性リガンド、例えば、ポナステロンＡ（「ＰｏｎＡ」）またはムリステロンＡ（「ＭｕｒＡ」）と比較した場合に、非ステロイド性リガンド、例えば、ジアシルヒドラジンに対する感受性の改善ももたらすことであった。すなわち、ステロイドと比較した場合、非ステロイド性リガンドは、低リガンド濃度で、より大きな遺伝子転写活性をもたらした。さらに、２ハイブリッド系は、非修飾ＲＸＲを切り替えパートナーとして使用する場合に生じうる、ＲＸＲの過剰発現に起因する一部の副作用も回避する。好ましい２ハイブリッド系では、ＥｃＲまたはＲＸＲの、天然のＤＮＡ結合性ドメインおよびトランス活性化ドメインは除去され、結果として、これらのハイブリッド分子は、細胞内に存在する、他のステロイドホルモン受容体との相互作用の可能性を低下させ、これにより、副作用の低減を結果としてもたらす。
【０１７２】
エクジソン受容体（ＥｃＲ）とは、核内受容体スーパーファミリーのメンバーであり、サブファミリー１、群Ｈ（本明細書では、「群Ｈ核内受容体」と称する）へと分類される。各群のメンバーは、Ｅ（リガンド結合）ドメイン内で、４０〜６０％のアミノ酸同一性を共有する（Laudet et al., A Unified Nomenclature System for the Nuclear Receptor Subfamily, 1999; Cell 97: 161-163）。エクジソン受容体に加えて、この核内受容体サブファミリー１、群Ｈの他のメンバーは、ユビキタス受容体（ＵＲ）、オーファン受容体１（ＯＲ−１）、ステロイドホルモン核内受容体１（ＮＥＲ−１）、ＲＸＲ相互作用性タンパク質１５（ＲＩＰ−１５）、肝臓ｘ受容体β（ＬＸＲβ）、ステロイドホルモン受容体様タンパク質（ＲＬＤ−１）、肝臓ｘ受容体（ＬＸＲ）、肝臓ｘ受容体α（ＬＸＲα）、ファルネソイドｘ受容体（ＦＸＲ）、受容体相互作用性タンパク質１４（ＲＩＰ−１４）、およびファルネソール受容体（ＨＲＲ−１）を含む。
【０１７３】
場合によって、誘導性プロモーターは、Ｉｎｔｒｅｘｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製のＲＨＥＯＳＷＩＴＣＨ（登録商標）遺伝子スイッチなど、低分子リガンド誘導性の、２つのポリペプチドによる、エクジソン受容体ベースの遺伝子スイッチでありうる。場合によって、遺伝子スイッチは、それらの各々が、参照によりその全体において組み込まれる、ＰＣＴ／米国出願第２００１／００９０５０号明細書（国際公開第２００１／０７０８１６号パンフレット）；米国特許第７，０９１，０３８号明細書；同第７，７７６，５８７号明細書；同第７，８０７，４１７号明細書；同第８，２０２，７１８号明細書；ＰＣＴ／米国出願第２００１／０３０６０８号明細書（国際公開第２００２／０２９０７５号パンフレット）；米国特許第８，１０５，８２５号明細書；同第８，１６８，４２６号明細書；ＰＣＴ／米国出願第２００２／００５２３５号明細書（国際公開第２００２／０６６６１３号パンフレット）；米国特許出願公開第１０／４６８，２００号明細書（米国公開第２０１２０１６７２３９号明細書）；ＰＣＴ／米国出願第２００２／００５７０６号明細書（国際公開第２００２／０６６６１４号パンフレット）；米国特許第７，５３１，３２６号明細書；同第８，２３６，５５６号明細書；同第８，５９８，４０９号明細書；ＰＣＴ／米国出願第２００２／００５０９０号明細書（国際公開第２００２／０６６６１２号パンフレット）；米国特許第８，７１５，９５９号明細書（米国公開第２００６０１００４１６号明細書）；ＰＣＴ／米国出願第２００２／００５２３４号明細書（国際公開第２００３／０２７２６６号パンフレット）；米国特許第７，６０１，５０８号明細書；同第７，８２９，６７６号明細書；同第７，９１９，２６９号明細書；同第８，０３０，０６７号明細書；ＰＣＴ／米国出願第２００２／００５７０８号明細書（国際公開第２００２／０６６６１５号パンフレット）；米国特許出願公開第１０／４６８，１９２号明細書（米国公開第２０１１０２１２５２８号明細書）；ＰＣＴ／米国出願第２００２／００５０２６号明細書（国際公開第２００３／０２７２８９号パンフレット）；米国特許第７，５６３，８７９号明細書；同第８，０２１，８７８号明細書；同第８，４９７，０９３号明細書；ＰＣＴ／米国出願第２００５／０１５０８９号明細書（国際公開第２００５／１０８６１７号パンフレット）；米国特許第７，９３５，５１０号明細書；同第８，０７６，４５４号明細書；ＰＣＴ／米国出願第２００８／０１１２７０号明細書（国際公開第２００９／０４５３７０号パンフレット）；米国特許出願公開第１２／２４１，０１８号明細書（米国公開第２００９０１３６４６５号明細書）；ＰＣＴ／米国出願第２００８／０１１５６３号明細書（国際公開第２００９／０４８５６０号パンフレット）；米国特許出願公開第１２／２４７，７３８号明細書（米国公開第２００９０１２３４４１号明細書）；ＰＣＴ／米国出願第２００９／００５５１０号明細書（国際公開第２０１０／０４２１８９号パンフレット）；米国特許出願公開第１３／１２３，１２９号明細書（米国公開第２０１１０２６８７６６号明細書）；ＰＣＴ／米国出願第２０１１／０２９６８２号明細書（国際公���第２０１１／１１９７７３号パンフレット）；米国特許出願公開第１３／６３６，４７３号明細書（米国公開第２０１３０１９５８００号明細書）；ＰＣＴ／米国出願第２０１２／０２７５１５号明細書（国際公開第２０１２／１２２０２５号パンフレット）；および米国特許第９，４０２，９１９号明細書において記載されている系のうちのいずれかの、エクジソンベースの受容体による構成要素から選択しうるが、これらに限定されない。
【０１７４】
宿主細胞内の、異種遺伝子およびインターロイキンの発現をモジュレートするための系であって、本明細書で開示される遺伝子スイッチポリペプチドを発現させるポリヌクレオチドを含む系が提供される。構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下にある、非限定的な例示的リガンド誘導性遺伝子スイッチベクター系の、多様な構造的構成要素を、図２２に示す。
【０１７５】
一部の実施形態では、遺伝子スイッチベクター系の発現カセットは、ＸＯＮ−６４であり、配列番号１３１に示される配列を有する。一部の実施形態では、遺伝子スイッチベクター系の発現カセットは、ＸＯＮ−３０であり、配列番号１３２に示される配列を有する。一部の実施形態では、遺伝子スイッチベクター系の発現カセットは、ＸＯＮ−５９であり、配列番号１３３に示される配列を有する。一部の実施形態では、遺伝子スイッチベクター系の発現カセットは、ＸＯＮ−６０であり、配列番号１３４に示される配列を有する。一部の実施形態では、遺伝子スイッチベクター系の発現カセットは、ＸＯＮ−６１であり、配列番号１３５に示される配列を有する。一部の実施形態では、遺伝子スイッチベクター系の発現カセットは、ＸＯＮ−６２であり、配列番号１３６に示される配列を有する。
【０１７６】
一部の実施形態では、宿主細胞内の、異種遺伝子およびサイトカインの発現をモジュレートするための系であって、第１のポリペプチドをコードする、第１のポリヌクレオチドを含む、第１の遺伝子発現カセット；第２のポリペプチドをコードする、第２のポリヌクレオチドを含む、第２の遺伝子発現カセット；およびリガンドを含み、前記宿主細胞を、前記リガンドの存在下で、前記第１の遺伝子発現カセットおよび前記第２の遺伝子発現カセットと接触させると、前記異種遺伝子および前記サイトカインが、前記宿主細胞内で発現するように、前記第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドが、（ｉ）トランス活性化ドメイン；（ｉｉ）ＤＮＡ結合性ドメイン；および（ｉｉｉ）リガンド結合性ドメイン；（ｉｖ）前記異種遺伝子；ならびに（ｖｉ）前記サイトカインのうちの１または複数を含む系が提供される。場合によって、異種遺伝子は、本明細書で記載される抗原結合性ポリペプチドを含む。場合によって、抗原結合性ポリペプチドは、本明細書で記載されるＣＡＲ、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＢＣＭＡ、ＣＤ４４、α−葉酸受容体、ＣＡＩＸ、ＣＤ３０、ＲＯＲ１、ＣＥＡ、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４０、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、葉酸結合性タンパク質、ＧＤ２、ＧＤ３、ＩＬ−１３Ｒ−ａ２、ＫＤＲ、ＥＤＢ−Ｆ、メソテリン、ＣＤ２２、ＥＧＦＲ、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−１６、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＵＣ１６、ｈ５Ｔ４、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ−７２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ１２３、およびＶＥＧＦ−Ｒ２のうちの少なくとも１つに結合するＣＡＲでありうる。
【０１７７】
サイトカイン
本明細書では、遺伝子スイッチポリペプチドおよびサイトカイン、またはこれらの変異体もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチド、ならびにこれらを組み込む方法および系が提示される。サイトカインとは、細胞のシグナル伝達に関与する、約５〜２０ｋＤａの間の、小型タンパク質の類別である。一部の場合には、サイトカインは、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、コロニー刺激因子、または腫瘍壊死因子を含む。一部の実施形態では、ケモカインは、細胞の遊走を導く、化学誘引物質としての役割を果たし、４つのサブファミリー：ＣＸＣ、ＣＣ、ＣＸ３Ｃ、およびＸＣへと分類される。例示的なケモカインは、ＣＣサブファミリー：ＣＣＬ１、ＣＣＬ２（ＭＣＰ−１）、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９（またはＣＣＬ１０）、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、およびＣＣＬ２８；ＣＸＣサブファミリー：ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、およびＣＸＣＬ１７；ＸＣサブファミリー：ＸＣＬ１およびＸＣＬ２；ならびにＣＸ３ＣサブファミリーであるＣＸ３ＣＬ１に由来するケモカインを含む。
【０１７８】
インターフェロン（ＩＦＮ）は、Ｉ型インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−ε、ＩＦＮ−κ、およびＩＦＮ−ω）、ＩＩ型インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−γ）、およびＩＩＩ型インターフェロンを含む。一部の実施形態では、ＩＦＮ−αは、ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１３、ＩＦＮＡ１４、ＩＦＮＡ１６、ＩＦＮＡ１７、およびＩＦＮＡ２１を含む、約１３の亜型へとさらに分類される。
【０１７９】
インターロイキンは、白血球（leukocyte）または白血球（white blood cell）により発現され、Ｔリンパ球およびＢリンパ球ならびに造血細胞の発生および分化を促進する。例示的なインターロイキンは、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８（ＣＸＣＬ８）、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、ＩＬ−３３、ＩＬ−３５、およびＩＬ−３６を含む。
【０１８０】
一部の実施形態では、インターロイキンは、ｍｂＩＬ−１５を含む。一部の実施形態では、ｍｂＩＬ−１５は、本明細書で記載される改変エフェクター細胞を用いて共発現させることができる、膜結合型キメラＩＬ−１５である。一部の実施形態では、ｍｂＩＬ−１５は、全長ＩＬ−１５Ｒα、またはこれらの機能的な断片もしくは変異体とインフレームで融合させた、全長ＩＬ−１５（例えば、天然ＩＬ−１５ポリペプチド）、またはこれらの断片もしくは変異体を含む。場合によって、ＩＬ−１５を、ＩＬ−１５Ｒαへと、リンカーを介して、間接的に連結する。場合によって、ｍｂＩＬ−１５は、Hurton et al., “Tethered IL-15 augments antitumor activity and promotes a stem-cell memory subset in tumor-specific T cells,” PNAS 2016において記載されている通りである。
【０１８１】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）とは、アポトーシスをモジュレートするサイトカインの群である。一部の場合には、ＴＮＦファミリー内には、ＴＮＦα、リンホトキシンアルファ（ＬＴ−アルファ）、リンホトキシンベータ（ＬＴ−ベータ）、Ｔ細胞抗原であるｇｐ３９（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、ＦＡＳＬ、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、およびＴＮＦ放出型アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）を含むがこれらに限定されない、約１９のメンバーが存在する。
【０１８２】
コロニー刺激因子（ＣＳＦ）とは、造血幹細胞の表面上の受容体タンパク質と相互作用する、分泌糖タンパク質であって、その後、細胞の増殖および特異的種類の血液細胞への分化をモジュレートする分泌糖タンパク質である。一部の場合には、ＣＳＦは、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、またはプロメガポエチンを含む。
【０１８３】
一部の実施形態では、サイトカインは、本明細書で記載されるキメラ抗原受容体と共に共発現される膜結合型サイトカインである。
【０１８４】
一部の実施形態では、１または複数の本明細書で記載される方法は、サイトカインの投与をさらに含む。一部の場合には、サイトカインは、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、コロニー刺激因子、または腫瘍壊死因子を含む。一部の場合には、１または複数の本明細書で記載される方法は、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、コロニー刺激因子、または腫瘍壊死因子から選択されるサイトカインの投与をさらに含む。一部の場合には、１または複数の本明細書で記載される方法は、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＦＮγ、またはＴＮＦ−αから選択されるサイトカインの投与をさらに含む。
【０１８５】
場合によって、サイトカインは、少なくとも１つの、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホカイン、腫瘍壊死因子、またはこれらの変異体もしくは組合せを含む。場合によって、サイトカインは、インターロイキンである。場合によって、インターロイキンは、ＩＬ−１２、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ならびにこれらの機能的な変異体および断片のうちの少なくとも１つである。一部の実施形態では、サイトカインは、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、またはＩＬ−１５変異体の融合体のうちの少なくとも１つである。一実施形態では、サイトカインは、ＩＬ−１５の変異体（配列番号９０；配列番号２０３）である。一実施形態では、サイトカインは、ＩＬ−１５受容体アルファ（配列番号９１；配列番号２０４）を含む。一部の実施形態では、サイトカインは、膜結合型の場合もあり、分泌型の場合もある。他の実施形態では、サイトカインは、細胞内サイトカインでありうる。インターロイキンは、膜結合型ＩＬ−１５（ｍｂＩＬ−１５）、ＩＬ−１５とＩＬ−１５Ｒαとの融合体（配列番号９１；配列番号２０４）、またはＩＬ−１５変異体（配列番号９０；配列番号２０３）を含みうる。一部の実施形態では、ｍｂＩＬ−１５は、本明細書で記載される改変エフェクター細胞を用いて共発現させうる、膜結合型キメラＩＬ−１５である。一部の実施形態では、ｍｂＩＬ−１５は、全長ＩＬ−１５Ｒα、またはこの機能的な断片もしくは変異体とインフレームで融合させた全長ＩＬ−１５（例えば、天然ＩＬ−１５ポリペプチド）またはこの断片もしくは変異体を含む。場合によって、ＩＬ−１５は、リンカーを介して、ＩＬ−１５Ｒαへと間接的に連結される。一部の実施形態では、ｍｂＩＬ−１５は、シグナルペプチド（配列番号９２；配列番号２０５）を含む。場合によって、ｍｂＩＬ−１５は、Hurton et al., “Tethered IL-15 augments antitumor activity and promotes a stem-cell memory subset in tumor-specific T cells,” PNAS 2016において記載されている通りである。別の態様では、インターロイキンは、ＩＬ−１２を含みうる。一部の実施形態では、ＩＬ−１２は、単鎖ＩＬ−１２（ｓｃＩＬ−１２）、プロテアーゼ感受性ＩＬ−１２、不安定化ＩＬ−１２、膜結合型ＩＬ−１２、または挿入ＩＬ−１２でありうる。一部の実施形態では、ＩＬ−１２は、マウスＩＬ−１２サブユニットベータ（ｐ４０）（配列番号２０６）である。一部の実施形態では、ＩＬ−１２は、マウスのＩＬ−１２サブユニットアルファ（ｐ３５）（配列番号２０７）である。一部の実施形態では、ＩＬ−１２は、マウス単鎖ＩＬ−１２（ｐ４０−リンカー−ｐ３５）（配列番号９３；配列番号２０８）である。一部の実施形態では、ＩＬ−１２は、ヒト単鎖ＩＬ−１２（ｐ４０−リンカー−ｐ３５）（配列番号９４；配列番号２０９）である。ある特定の実施形態では、ＩＬ−１２は、単鎖ＩＬ−１２である。場合によって、ＩＬ−１２変異体は、それらの全てが、参照によりそれらの全体において組み込まれる、国際公開第２０１５／０９５２４９号パンフレット、国際公開第２０１６／０４８９０３号パンフレット、および国際公開第２０１７／０６２９５３号パンフレットにおいて記載されている通りである。
【０１８６】
本明細書では、遺伝子スイッチポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、前記遺伝子スイッチポリペプチドが、ａ）核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたＤＮＡ結合性ドメインを含む、第１の遺伝子スイッチポリペプチド、およびｂ）核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたトランス活性化ドメインを含む、第２の遺伝子スイッチポリペプチドを含み、第１の遺伝子スイッチポリペプチドと、第２の遺伝子スイッチポリペプチドとが、リンカーにより連結されている、ポリヌクレオチドが提示される。場合によって、リンカーは、本明細書で記載されるリンカー、例えば、ＧＳＧリンカー、フューリンリンク、Ｆ／Ｔ２Ａ、Ｔ２Ａ、ｐ２Ａ、ＧＳＧ−ｐ２Ａなどの２Ａリンカー、ならびにこれらの変異体および誘導体でありうる。他の場合には、リンカーは、ＩＲＥＳでありうる。一部の実施形態では、ＩＲＥＳは、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳまたは２×Ｒｂｍ３  ＩＲＥＳである。例示的なＩＲＥＳ配列は、配列番号１８および１９に見出すことができる。ある特定の場合には、２×Ｒｂｍ３  ＩＲＥＳをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１９と、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一でありうるか、または少なくともほぼこれらの比率で同一でありうる。ある特定の場合には、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１８と、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一でありうるか、または少なくともほぼこれらの比率で同一でありうる。
【０１８７】
場合によって、ＤＮＡ結合性ドメイン（ＤＢＤ）は、本明細書で記載されるＤＢＤ、例えば、ＧＡＬ４（ＧＡＬ４  ＤＢＤ）（配列番号７１；配列番号１８４）、ＬｅｘＡＤＢＤ、転写因子ＤＢＤ、ステロイド／甲状腺ホルモン核内受容体スーパーファミリーメンバーＤＢＤ、細菌ＬａｃＺ  ＤＢＤ、および酵母ＤＢＤのうちの少なくとも１つを含む。トランス活性化ドメインは、本明細書で記載されるトランス活性化ドメイン、例えば、ＶＰ１６トランス活性化ドメイン（配列番号６８；配列番号１８１）、ｐ５３トランス活性化ドメイン、およびＢ４２酸性活性化因子トランス活性化ドメインのうちの１つを含みうる。核内受容体リガンド結合性ドメインは、エクジソン受容体（ＥｃＲ）、ユビキタス受容体、オーファン受容体１、ＮＥＲ−１、ステロイドホルモン核内受容体１、レチノイドＸ受容体相互作用性タンパク質１５、肝臓Ｘ受容体β、ステロイドホルモン受容体様タンパク質、肝臓Ｘ受容体、肝臓Ｘ受容体α、ファルネソイドＸ受容体、受容体相互作用性タンパク質１４、およびファルネソール受容体のうちの少なくとも１つを含みうる。
【０１８８】
場合によって、ポリペプチドリンカーまたはリボソームスキッピング配列により連結された、遺伝子スイッチポリペプチドは、遺伝子発現に対する、用量依存性のリガンド誘導性制御の、リガンド誘導性遺伝子スイッチと比較した改善を呈するが、この場合、遺伝子スイッチポリペプチドは、ＩＲＥＳなど、非コード配列により連結されている。場合によって、２Ａリンカーにより連結された遺伝子スイッチポリペプチドは、異種遺伝子発現に対する、用量依存性のリガンド誘導性制御の、遺伝子スイッチと比較した改善を呈するが、この場合、前記遺伝子スイッチポリペプチドは、ＩＲＥＳにより隔てられている。
【０１８９】
本明細書で記載されるポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、操作細胞内で発現させることができる。本明細書では、操作細胞とは、その天然状態または内因性状態から改変された細胞である。操作細胞の例は、例えば、遺伝子スイッチポリペプチド、目的の遺伝子（ＧＯＩ）、細胞タグ、異種遺伝子、ならびに本明細書で記載される、他の任意のポリペプチドおよびポリヌクレオチドをコードするように改変された（例えば、ポリヌクレオチドの、細胞へのトランスフェクションにより）、本明細書で記載される細胞である。
【０１９０】
リガンド
一部の実施形態では、誘導性遺伝子スイッチの調節のために使用されるリガンドは、以下：Ｎ−［（１Ｒ）−１−（１，１−ジメチルエチル）ブチル］−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシベンゾイル）−３，５−ジメチルベンゾヒドラジド（ベレジメクスともまた称する）、（２Ｓ，３Ｒ，５Ｒ，９Ｒ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｒ）−１７−［（２Ｓ，３Ｒ）−３，６−ジヒドロキシ−６−メチルヘプタン−２−イル］−２，３，１４−トリヒドロキシ−１０，１３−ジメチル−２，３，４，５，９，１１，１２，１５，１６，１７−デカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−６−オン；Ｎ’−（３，５−ジメチルベンゾイル）−Ｎ’−［（３Ｒ）−２，２−ジメチル−３−ヘキサニル］−２−エチル−３−メトキシベンゾヒドラジド；５−メチル−２，３−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］ジオキシン−６−カルボン酸Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−Ｎ’−（１−エチル−２，２−ジメチル−プロピル）−ヒドラジド；５−メチル−２，３−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］ジオキシン−６−カルボン酸Ｎ’−（３，５−ジメトキシ−４−メチル−ベンゾイル）−Ｎ’−（１−エチル−２，２−ジメチル−プロピル）−ヒドラジド；５−メチル−２，３−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］ジオキシン−６−カルボン酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；５−メチル−２，３−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］ジオキシン−６−カルボン酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメトキシ−４−メチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；５−エチル−２，３−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］ジオキシン−６−カルボン酸Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−Ｎ’−（１−エチル−２，２−ジメチル−プロピル）−ヒドラジド；５−エチル−２，３−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］ジオキシン−６−カルボン酸Ｎ’−（３，５−ジメトキシ−４−メチル−ベンゾイル）−Ｎ’−（１−エチル−２，２−ジメチル−プロピル）−ヒドラジド；５−エチル−２，３−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］ジオキシン−６−カルボン酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；５−エチル−２，３−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］ジオキシン−６−カルボン酸Ｎ’−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３，５−ジメトキシ−４−メチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−エチル−２，２−ジメチル−プロピル）−Ｎ’−（３−メトキシ−２−メチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；３，５−ジメトキシ−４−メチル−安息香酸Ｎ−（１−エチル−２，２−ジメチル−プロピル）−Ｎ’−（３−メトキシ−２−メチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３−メトキシ−２−メチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；３，５−ジメトキシ−４−メチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（３−メトキシ−２−メチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−エチル−２，２−ジメチル−プロピル）−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド；３，５−ジメトキシ−４−メチル−安息香酸Ｎ−（１−エチル−２，２−ジメチル−プロピル）−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド；３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド；３，５−ジメトキシ−４−メチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド；２−メトキシ−ニコチン酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ペンチル）−Ｎ’−（４−エチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（２，２−ジメチル−１−フェニル−プロピル）−Ｎ’−（４−エチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ペンチル）−Ｎ’−（３−メトキシ−２−メチル−ベンゾイル）−ヒドラジド；および３，５−ジメトキシ−４−メチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ペンチル）−Ｎ’−（３−メトキシ−２−メチル−ベンゾイル）−ヒドラジドのうちのいずれかから選択しうるがこれらに限定されない。
【０１９１】
場合によって、エクジソン受容体ベースの誘導性遺伝子スイッチの、用量調節性制御のために使用されるリガンドは、エクジソン、２０−ヒドロキシエクジソン、ポナステロンＡ、ムリステロンＡなどのｅｃｄｙステロイド、９−ｃｉｓ−レチノイン酸、レチノイン酸の合成類似体、それらの各々が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，０１３，８３６号明細書；同第５，１１７，０５７号明細書；同第５，５３０，０２８号明細書；および同第５，３７８，７２６号明細書、ならびに米国出願公開第２００５／０２０９２８３号明細書および同第２００６／００２０１４６号明細書において開示されているＮ，Ｎ’−ジアシルヒドラジンなどのＮ，Ｎ’−ジアシルヒドラジン；米国出願公開第２００４／０１７１６５１号明細書において記載されているオキサゾリン；欧州出願第４６１，８０９号明細書において開示されているジベンゾイルアルキルシアノヒドラジンなどのジベンゾイルアルキルシアノヒドラジン；米国特許第５，２２５，４４３号明細書において開示されているＮ−アルキル−Ｎ，Ｎ’−ジアロイルヒドラジンなどのＮ−アルキル−Ｎ，Ｎ’−ジアロイルヒドラジン；欧州出願第２３４，９９４号明細書において開示されているＮ−アシル−Ｎ−アルキルカルボニルヒドラジンなどのＮ−アシル−Ｎ−アルキルカルボニルヒドラジン；米国特許第４，９８５，４６１号明細書において記載されているＮ−アロイル−Ｎ−アルキル−Ｎ’−アロイルヒドラジンなどのＮ−アロイル−Ｎ−アルキル−Ｎ’−アロイルヒドラジン；米国出願公開第２００４／００４９０３７号明細書において記載されているアルニドケトンなどのアルニドケトン；３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシ−Ｎ−イソブチル−ベンズアミド、８−Ｏ−アセチルハルパジド、オキシステロール、２２（Ｒ）ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ）ヒドロキシコレステロール、２５−エポキシコレステロール、Ｔ０９０１３１７、５−アルファ−６−アルファ−エポキシコレステロール−３−スルフェート（sulfate）（ＥＣＨＳ）、７−ケトコレステロール−３−スルフェート（sulfate）、フラメゾール、胆汁酸、１，１−ビホスホネート（biphosphonate）エステル、若年性ホルモンＩＩＩなどを含む、他の類似の材料のうちのいずれかから選択しうるがこれらに限定されない。本開示において有用なジアシルヒドラジンリガンドの例は、ＲＧ−１１５８１９（３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−エチル−２，２−ジメチル−プロピル）−Ｎ’−（２−メチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド）、ＲＧ−１１５９３２（（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド）、およびＲＧ−１１５８３０（３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド）を含む。例えば、それらのいずれもが参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、米国特許出願第１２／１５５，１１１号明細書およびＰＣＴ出願／米国出願第２００８／００６７５７号明細書を参照されたい。
【０１９２】
抗原結合性ポリペプチド
本明細書で開示されるポリペプチドおよびタンパク質（これらの機能的部分および機能的変異体を含む）は、１または複数の、天然アミノ酸の代わりに、合成アミノ酸を含みうる。当技術分野では、このような合成アミノ酸が公知であり、例えば、アミノシクロヘキサンカルボン酸、ノルロイシン、α−アミノｎ−デカン酸、ホモセリン、Ｓ−アセチルアミノメチル−システイン、ｔｒａｎｓ−３−ヒドロキシプロリンおよびｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシプロリン、４−アミノフェニルアラニン、４−ニトロフェニルアラニン、４−クロロフェニルアラニン、４−カルボキシフェニルアラニン、β−フェニルセリンβ−ヒドロキシフェニルアラニン、フェニルグリシン、α−ナフチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、シクロヘキシルグリシン、インドリン−２−カルボン酸、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、アミノマロン酸、アミノマロン酸モノアミド、Ｎ’−ベンジル−Ｎ’−メチル−リシン、Ｎ’，Ｎ’−ジベンジル−リシン、６−ヒドロキシリシン、オルニチン、α−アミノシクロペンタンカルボン酸、α−アミノシクロヘキサンカルボン酸、α−アミノシクロヘプタンカルボン酸、α−（２−アミノ−２−ノルボルナン）−カルボン酸、α，γ−ジアミノ酪酸、α，β−ジアミノプロピオン酸、ホモフェニルアラニン、およびα−ｔｅｒｔ−ブチルグリシンを含む。
【０１９３】
本明細書で使用される「抗体」とは、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を指す。本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、Ｂ細胞の単一のクローンにより産生され、同じエピトープに結合する抗体を指す。これに対し、「ポリクローナル抗体」とは、異なるＢ細胞により産生され、同じ抗原の異なるエピトープに結合する抗体の集団を指す。全抗体は、典型的に、４つのポリペプチド：重（Ｈ）鎖ポリペプチドの２つの同一なコピー、および軽（Ｌ）鎖ポリペプチドの２つの同一なコピーからなる。重鎖の各々は、１つのＮ末端の可変（ＶＨ）領域と、３つのＣ末端の定常（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）領域とを含有し、各軽鎖は、１つのＮ末端の可変（ＶＬ）領域と、１つのＣ末端の定常（ＣＬ）領域とを含有する。軽鎖および重鎖の各対の可変領域は、抗体の抗原結合性部位を形成する。ＶＨ領域と、ＶＬ領域とは、各領域が、それらの配列が比較的保存されている、４つのフレームワーク領域を含む、共通の一般的な構造を有する。フレームワーク領域は、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）により連結されている。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３として公知である、３つのＣＤＲは、抗原への結合の一因となる、抗体の「超可変領域」を形成する。
【０１９４】
「抗原認識部分」または「抗体認識ドメイン」とは、抗原に特異的に結合する分子または分子の部分を指す。一実施形態では、抗原認識部分は、抗体、抗体様分子、またはこれらの断片であり、抗原は、腫瘍抗原または感染性疾患抗原である。
【０１９５】
「抗体様分子」は、例えば、パートナーに選択的に結合することが可能な、Ｉｇスーパーファミリーのメンバーであるタンパク質でありうる。ＭＨＣ分子およびＴ細胞受容体は、このような分子である。一実施形態では、抗体様分子は、ＴＣＲである。一実施形態では、ＴＣＲは、そのＭＨＣへの結合アフィニティーを増大させるように改変されている。
【０１９６】
本明細書では、「抗体の断片」、「抗体断片」、「抗体の機能的断片」、および「抗原結合性部分」、またはそれらの文法的同等物という用語を、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の、１または複数の断片または部分を意味するように、互換的に使用する（一般に、Holliger et al., Nat. Biotech., 23(9):1126-1129 (2005)を参照されたい）。抗体断片は、例えば、１もしくは複数のＣＤＲ、可変領域（またはこの部分）、定常領域（またはこの部分）、またはこれらの組合せを含むことが所望される。抗体断片の例は、（ｉ）ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメイン、およびＣＨ１ドメインからなる一価断片である、Ｆａｂ断片；（ｉｉ）ストーク領域におけるジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片である、Ｆ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）抗体の単一のアームのＶＬドメインおよびＶＨドメインからなる、Ｆｖ断片；（ｉｖ）２つのドメインを、単一のポリペプチド鎖として合成することを可能とする合成リンカーにより接合された、Ｆｖ断片の２つのドメイン（すなわち、ＶＬおよびＶＨ）からなる一価分子である、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）（例えば、Bird et al., Science, 242: 423-426 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883 (1988); and Osbourn et al., Nat. Biotechnol., 16: 778 (1998)を参照されたい）；ならびに（ｖ）各ポリペプチド鎖が、同じポリペプチド鎖上のＶＨとＶＬとの間の対合を可能とするには短すぎるペプチドリンカーにより、ＶＬへと連結されたＶＨを含み、これにより、２つの機能的な抗原結合性部位を有する二量体分子を作出するように、異なるＶＨ−ＶＬポリペプチド鎖上の相補的ドメインの間の対合を駆動する、ポリペプチド鎖の二量体である、ダイアボディーを含むがこれらに限定されない。当技術分野では、抗体断片が公知であり、例えば、米国特許第８，６０３，９５０号明細書において、より詳細に記載されている。他の抗体断片は、重鎖抗体の可変断片（ＶＨＨ）を含みうる。
【０１９７】
ＣＡＲに関して使用される場合の「機能的部分」という用語は、本開示のＣＡＲの、任意の部分または断片であって、機能的部分がその一部であるＣＡＲ（親ＣＡＲ）の生物学的活性を保持する部分または断片を指す。親ＣＡＲをコードする核酸配列に関して、ＣＡＲの機能的部分をコードする核酸配列は、親ＣＡＲのうちの、例えば、約１０％、２５％、３０％、５０％、６８％、８０％、９０％、９５％、またはこれを超える親ＣＡＲを含むタンパク質をコードしうる。
【０１９８】
本明細書で使用される「機能的変異体」という用語は、基準ポリペプチドに対する、実質的または著明な配列同一性または配列類似性を有するポリペプチドまたはタンパク質を指し、それがその変異体である、基準ポリペプチドの生物学的活性を保持する。一部の実施形態では、機能的変異体は、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０カ所の保存的アミノ酸置換、またはほぼこれらの数の保存的アミノ酸置換を伴う基準タンパク質のアミノ酸配列を含む。機能的変異体は、例えば、本明細書で記載されるＣＡＲ（親ＣＡＲ）の変異体であって、標的細胞を、親ＣＡＲと同様の程度、これと同程度、またはこれより高い程度に認識する能力を保持する変異体を包含する。親ＣＡＲをコードする核酸配列に照らして、ＣＡＲの機能的変異体をコードする核酸配列は、親ＣＡＲをコードする核酸配列と、例えば、約１０％同一、約２５％同一、約３０％同一、約５０％同一、約６５％同一、約８０％同一、約９０％同一、約９５％同一、または約９９％同一でありうる。
【０１９９】
「保存的アミノ酸置換」または「保存的突然変異」という用語は、１つのアミノ酸の、共通の特性を伴う、別のアミノ酸による置き換えを指す。個別のアミノ酸の間の共通の特性を規定する、機能的な方式は、相同な生物の、対応するタンパク質の間の、アミノ酸変化の標準化頻度を解析することである（Schulz, G. E. and Schirmer, R. H., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York (1979)）。このような解析に従い、群内のアミノ酸が、互いと優先的に交換され、したがって、全体的なタンパク質構造に対するそれらの影響において、最も互いと相似する、アミノ酸群を規定することができる（Schulz, G. E. and Schirmer, R. H.、前出）。保存的突然変異の例は、上記の亜群内のアミノ酸のアミノ酸置換、例えば、正の電荷を維持しうるような、リシンによる、アルギニンの置換、およびこの逆の置換；負の電荷を維持しうるような、グルタミン酸による、アスパラギン酸の置換、およびこの逆の置換；遊離−ＯＨを維持しうるような、セリンによる、トレオニンの置換；ならびに遊離−ＮＨ２を維持しうるような、グルタミンによる、アスパラギンの置換を含む。代替的に、または加えて、機能的変異体は、少なくとも１つの非保存的アミノ酸置換を伴う、基準タンパク質のアミノ酸配列を含みうる。
【０２００】
「非保存的突然変異」という用語は、異なる群の間のアミノ酸置換、例えば、リシンによるトリプトファンの置換、またはフェニルアラニンによるセリンの置換などを伴う。この場合、非保存的アミノ酸置換は、機能的変異体の生物学的活性に干渉したり、これを阻害したりしないことが好ましい。非保存的アミノ酸置換は、機能的変異体の生物学的活性が、親ＣＡＲと比較して増大するように、機能的変異体の生物学的活性を増強しうる。
【０２０１】
一部の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲの抗原結合性部分は、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＢＣＭＡ、ＣＤ４４、α−葉酸受容体、ＣＡＩＸ、ＣＤ３０、ＲＯＲ１、ＣＥＡ、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４０、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、葉酸結合性タンパク質、ＧＤ２、ＧＤ３、ＩＬ−１３Ｒ−ａ２、ＫＤＲ、ＥＤＢ−Ｆ、メソテリン、ＣＤ２２、ＥＧＦＲ、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−１６、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＵＣ１６、ｈ５Ｔ４、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ−７２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ１２３、およびＶＥＧＦ−Ｒ２に特異的であるか、またはこれらに結合する。複数の実施形態では、抗原結合性ドメインは、標的抗原特異的なモノクローナル抗体の、可変ドメイン軽鎖（ＶＬ）および可変ドメイン重鎖（ＶＨ）であって、グリシン−セリンリンカーまたはホイットローリンカーなどの可撓性リンカーにより連結されたＶＬおよびＶＨを含む単鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）を含む。複数の実施形態では、ｓｃＦｖは、ヒト化ｓｃＦｖである。一部の実施形態では、抗原結合性部分は、例えば、Ｎ末端からＣ末端へと、ＶＨ−リンカー−ＶＬまたはＶＬ−リンカー−ＶＨと、方向性をもって連結されたＶＨおよびＶＬを含みうる。場合によって、抗原結合性ドメインは、標的のエピトープを認識する。本明細書の一部の実施形態では、抗原結合性ドメインが、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、またはｓｃＦｖを含む、ＣＡＲまたはＣＡＲ−Ｔ細胞が記載される。
【０２０２】
一実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲの抗原結合性部分は、ＣＤ１９に特異的である。一実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲの抗原結合性部分は、ＣＤ３３に特異的である。別の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲの抗原結合性部分は、ＢＣＭＡに特異的である。さらに別の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲの抗原結合性部分は、ＣＤ４４に特異的である。一部の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲの抗原結合性部分は、α−葉酸受容体に特異的である。一部の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲの抗原結合性部分は、ＣＡＩＸに特異的である。一実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲの抗原結合性部分は、ＣＤ３０に特異的である。一部の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲの抗原結合性部分は、ＲＯＲ１に特異的である。一実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲの抗原結合性部分は、ＣＥＡに特異的である。一部の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲの抗原結合性部分は、ＥＧＰ−２に特異的である。一実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲの抗原結合性部分は、ＥＧＰ−４０に特異的である。別の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲの抗原結合性部分は、ＨＥＲ２に特異的である。さらに別の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲの抗原結合性部分は、ＨＥＲ３に特異的である。さらに別の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲの抗原結合性部分は、葉酸結合性タンパク質に特異的である。一部の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲの抗原結合性部分は、ＧＤ２に特異的である。一部の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲの抗原結合性部分は、ＧＤ３に特異的である。一実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲの抗原結合性部分は、ＩＬ−１３Ｒ−ａ２に特異的である。一実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲの抗原結合性部分は、ＫＤＲに特異的である。一実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲの抗原結合性部分は、ＥＤＢ−Ｆに特異的である。別の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲの抗原結合性部分は、メソテリンに特異的である。さらに別の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲの抗原結合性部分は、ＣＤ２２に特異的である。一実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲの抗原結合性部分は、ＥＧＦＲに特異的である。一実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲの抗原結合性部分は、ＭＵＣ−１に特異的である。一実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲの抗原結合性部分は、ＭＵＣ−１６に特異的である。一実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲの抗原結合性部分は、ＭＡＧＥ−Ａ１に特異的である。一部の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲの抗原結合性部分は、ｈ５Ｔ４に特異的である。一部の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲの抗原結合性部分は、ＰＳＭＡに特異的である。別の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲの抗原結合性部分は、ＴＡＧ−７２に特異的である。さらなる一実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲの抗原結合性部分は、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的である。別の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲの抗原結合性部分は、ＣＤ１２３に特異的である。さらなる実施���態では、本明細書で記載されるＣＡＲの抗原結合性部分は、ＶＥＧＦ−Ｒ２に特異的である。
【０２０３】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
一部の実施形態では、本明細書では、細胞表面上で発現したキメラ受容体をコードする、ポリヌクレオチドが記載される。一部の場合には、キメラ受容体は、抗原、例えば、腫瘍関連抗原または腫瘍特異的抗原などの腫瘍抗原の認識およびこれへの結合を可能とする抗原結合性領域を含む。一部の場合には、抗原結合性領域は、抗体または結合性断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）３、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、ｄｓＦｖ、ダイアボディー、ミニボディー、およびナノボディーまたはこれらの結合性断片を含む。場合によって、抗原結合性領域は、ｓｃＦｖを含む。場合によって、キメラ受容体は、ｓｃＦｖ（例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ））を含む。一部の場合には、キメラ抗原受容体は、パターン認識受容体を含む。他の場合には、キメラ受容体は、操作Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む。
【０２０４】
本明細書で使用される、「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」、「人工Ｔ細胞受容体」、「キメラＴ細胞受容体」、または「キメラ免疫受容体」という用語は、外因性の特異性を、免疫エフェクター細胞へとグラフトする、操作受容体を指す。一部の場合には、ＣＡＲは、抗原結合性ドメイン、ストーク領域、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメイン（エンドドメイン）を含む細胞外ドメイン（エクトドメイン）を含む。一部の場合には、細胞内ドメインは、１または複数の細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含む。一部の場合には、本明細書で記載されるＣＡＲは、Ｔ細胞活性化のための、抗原結合性ドメイン、ストーク領域、膜貫通ドメイン、１または複数の共刺激ドメイン、およびシグナル伝達ドメインを含む。
【０２０５】
複数の実施形態では、本開示のＣＡＲは、そうでなければ、抗原結合性部分と称する、標的特異的結合エレメントを含む。複数の実施形態では、腫瘍細胞上の抗原に特異的に結合する、所望の抗原結合性部分を操作することにより、目的の腫瘍抗原をターゲティングするように、本開示のＣＡＲを操作する。本開示の文脈では、「腫瘍抗原」または「過剰増殖性障害抗原」または「過剰増殖性障害と関連する抗原」とは、がんなど、特異的な過剰増殖性障害に共通する抗原を指す。
【０２０６】
抗原結合性ドメインは、モノクローナル抗体の相補性決定領域、モノクローナル抗体の可変領域、および／またはこれらの抗原結合性断片を含みうる。相補性決定領域（ＣＤＲ）とは、抗原と相補的であり、したがって、受容体に、この特定の抗原に対するその特異性をもたらす、抗原受容体（例えば、免疫グロブリンおよびＴ細胞受容体）タンパク質の可変ドメイン内に見出される、短いアミノ酸配列である。抗原受容体の各ポリペプチド鎖は、３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）を含有しうる。一部の場合には、抗原結合性ドメインは、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、またはｓｃＦｖを含む。場合によって、抗原結合性ドメインは、ｓｃＦｖである。場合によって、抗原結合性ドメインは、Ｆａｂである。場合によって、抗原結合性ドメインは、Ｆａｂ’である。場合によって、抗原結合性ドメインは、Ｆ（ａｂ’）２である。場合によって、抗原結合性ドメインは、Ｆｖである。
【０２０７】
一部の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＢＣＭＡ、ＣＤ４４、α−葉酸受容体、ＣＡＩＸ、ＣＤ３０、ＲＯＲ１、ＣＥＡ、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４０、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、葉酸結合性タンパク質、ＧＤ２、ＧＤ３、ＩＬ−１３Ｒ−ａ２、ＫＤＲ、ＥＤＢ−Ｆ、メソテリン、ＣＤ２２、ＥＧＦＲ、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−１６、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＵＣ１６、ｈ５Ｔ４、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ−７２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ１２３、およびＶＥＧＦ−Ｒ２におけるエピトープに結合する抗原結合性ドメインを含む。一部の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＢＣＭＡ、ＣＤ４４、α−葉酸受容体、ＣＡＩＸ、ＣＤ３０、ＲＯＲ１、ＣＥＡ、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４０、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、葉酸結合性タンパク質、ＧＤ２、ＧＤ３、ＩＬ−１３Ｒ−ａ２、ＫＤＲ、ＥＤＢ−Ｆ、メソテリン、ＣＤ２２、ＥＧＦＲ、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−１６、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＵＣ１６、ｈ５Ｔ４、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ−７２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ１２３、およびＶＥＧＦ−Ｒ２上のエピトープに結合する抗原結合性ドメインを含む。一部の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、ＣＤ１９、ＣＤ３３、またはＥＧＦＲｖＩＩＩ上のエピトープに結合する抗原結合性ドメインを含む。一部の場合には、本明細書で記載されるＣＡＲは、ＣＤ１９上のエピトープに結合する抗原結合性ドメインを含む。場合によって、本明細書で記載されるＣＡＲは、ＣＤ３３上のエピトープに結合する抗原結合性ドメインを含む。さらなる実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲまたはキメラ受容体または抗原結合性ポリペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２、ミエリン希突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、ＭＡｄＣＡＭ１、ＳＤＦ１、またはＩＩ型コラーゲン上のエピトープに結合する、自己抗原結合性領域または抗原結合性領域を含む。
【０２０８】
別の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、ＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲである。「ＥＧＦＲｖＩＩＩ」、「ＥＧＦＲ変異体ＩＩＩ」、「ＩＩＩ型ＥＧＦＲ突然変異体」、「ＥＧＦＲ．Ｄ２−７」、または「ｄｅ２−７ＥＧＦＲ」とは、ヒト対象および非ヒト対象における、細胞外タンパク質リガンドである、表皮増殖因子（ＥＧＦ）ファミリーのメンバーに対する、膜貫通タンパク質すなわち受容体である、表皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ；ＥｒｂＢ−１；ＨＥＲ１）の突然変異形態である。ＥＧＦＲｖＩＩＩは、全長野生型ＥＧＦＲタンパク質の細胞外ドメイン内の、２６７アミノ酸の、インフレームにおける欠失を結果としてもたらす、野生型ＥＧＦＲ遺伝子の第２〜７エクソンの欠失により特徴づけられる。ＥＧＦＲｖＩＩＩはまた、融合体の接合部に挿入される、新規のグリシン残基も含有する。切断型受容体であるＥＧＦＲｖＩＩＩは、公知のＥＧＦＲリガンドに結合することが不可能であるが、構成的チロシンキナーゼ活性を示す。この構成的活性化は、その発がん促進効果にとって重要である。キナーゼ欠損ＥＧＦＲｖＩＩＩは、同様の発がん性の利点を付与することが不可能である。ＥＧＦＲｖＩＩＩは、神経膠芽腫（ＧＢＭ）内で、高度に発現することが可能であり、他の一部の充実性腫瘍型でも検出されうるが、正常組織では検出されえない。
【０２０９】
一部の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲの抗原結合性部分は、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的（ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲ）である。ＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲは、細胞表面上で発現すると、Ｔ細胞の特異性を、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩへとリダイレクトする。複数の実施形態では、抗原結合性ドメインは、標的抗原特異的な、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩモノクローナル抗体の、可変ドメイン軽鎖（ＶＬ）および可変ドメイン重鎖（ＶＨ）であって、グリシン−セリンリンカーまたはホイットローリンカーなどの可撓性リンカーにより連結されたＶＬおよびＶＨを含む単鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）を含む。複数の実施形態では、ｓｃＦｖは、マウスＭＲ１  ＩｇＧである。一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ｓｃＦｖクローンＭＲ１（配列番号１１５；配列番号２２９）、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ｓｃＦｖクローンＭＲ１−１（配列番号１１６；配列番号２３０）、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ｓｃＦｖクローンｈｕＭＲ１−１（配列番号１１７；配列番号２３１）、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ｓｃＦｖクローンｈｕＭＲ１−２（配列番号１１８；配列番号２３２）である。一部の実施形態では、抗原結合性部分は、例えば、Ｎ末端からＣ末端へと、ＶＨ−リンカー−ＶＬまたはＶＬ−リンカー−ＶＨと、方向性をもって連結されたＶＨおよびＶＬを含みうる。
【０２１０】
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号２２１のアミノ酸配列（抗ＥＧＦＲｖＩＩＩクローンであるＭＲ１のＶＬ）との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する、ＶＬポリペプチドを含む抗原結合性部分を含む。複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号２２０のアミノ酸配列（抗ＥＧＦＲｖＩＩＩクローンであるＭＲ１のＶＨ）との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する、ＶＨポリペプチドを含む抗原結合性部分を含む。複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号２２３のアミノ酸配列（抗ＥＧＦＲｖＩＩＩクローンであるＭＲ１−１のＶＬ）との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する、ＶＬポリペプチドを含む抗原結合性部分を含む。複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号２２２のアミノ酸配列（抗ＥＧＦＲｖＩＩＩクローンであるＭＲ１−１のＶＨ）との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する、ＶＨポリペプチドを含む抗原結合性部分を含む。
【０２１１】
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号２２５のアミノ酸配列（抗ＥＧＦＲｖＩＩＩクローンであるｈｕｍＭＲ１−１のＶＬ）との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する、ＶＬポリペプチドを含む抗原結合性部分を含む。複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号２２４のアミノ酸配列（抗ＥＧＦＲｖＩＩＩクローンであるｈｕｍＭＲ１−１のＶＨ）との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する、ＶＨポリペプチドを含む抗原結合性部分を含む。複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号２２７のアミノ酸配列（抗ＥＧＦＲｖＩＩＩクローンであるｈｕｍＭＲ１−２のＶＬ）との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する、ＶＬポリペプチドを含む抗原結合性部分を含む。複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号２２６のアミノ酸配列（抗ＥＧＦＲｖＩＩＩクローンであるｈｕｍＭＲ１−２のＶＨ）との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する、ＶＨポリペプチドを含む抗原結合性部分を含む。
【０２１２】
一実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、ＣＤ１９特異的ＣＡＲである。分化抗原群１９またはＢリンパ球抗原ＣＤ１９である「ＣＤ１９」とは、ヒトでは、ＣＤ１９遺伝子によりコードされるタンパク質である。ＣＤ１９遺伝子は、抗原受容体依存性の刺激に対する閾値を低下させるために、Ｂリンパ球の抗原受容体によりアセンブルされる、細胞表面分子をコードする。ＣＤ１９は、濾胞樹状細胞上およびＢ細胞上で発現する。実際、ＣＤ１９は、Ｂ細胞芽球への発生時には、認識可能な最早期のＢ系統細胞に由来するＢ細胞上に存在するが、形質細胞への成熟時に失われる。ＣＤ１９は主に、ＣＤ２１およびＣＤ８１と共に、Ｂ細胞共受容体として作用する。活性化すると、ＣＤ１９の細胞質テールは、リン酸化し、これは、Ｓｒｃファミリーキナーゼによる結合およびＰＩ−３キナーゼの動員をもたらす。Ｔ細胞上と同様に、いくつかの表面分子は、Ｂリンパ球上で、抗原受容体を形成し、複合体を形成する。（ほぼ）Ｂ細胞特異的である、ＣＤ１９リン糖タンパク質は、これらの分子のうちの１つである。他の表面分子は、ＣＤ２１およびＣＤ８１である。これらの表面免疫グロブリン（ｓＩｇ）関連分子は、シグナル伝達を容易とする。Ｂ細胞上では、外因性抗原を模倣する、抗免疫グロブリン抗体は、ＣＤ１９を、ｓＩｇに結合させ、ｓＩｇと共に内部化させる。逆過程は裏付けられていないことから、この受容体複合体の形成が、抗原誘導性であることが示唆される。この分子的会合は、化学的研究により確認されている。
【０２１３】
さらに別の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、ＣＤ３３特異的ＣＡＲである。Ｓｉｇｌｅｃ−３、シアル酸結合性Ｉｇ様レクチン３、ＳＩＧＬＥＣ３、ＳＩＧＬＥＣ−３、ｇｐ６７、またはｐ６７である、「ＣＤ３３」とは、６７ｋＤａの１回膜貫通糖タンパク質であり、シアル酸結合性免疫グロブリン様レクチン（Ｓｉｇｌｅｃｓ）スーパーファミリーのメンバーである。ＣＤ３３は、シアル酸への結合の一因となる、ＶセットのＩｇ様ドメインと、その細胞外ドメイン内の、Ｃ２セットのＩｇ様ドメインとにより特徴づけられる。ＣＤ３３  ｍＲＮＡの代替的スプライシングは、ＶセットのＩｇ様ドメインのほか、ＶセットのＩｇ様ドメインと、Ｃ２セットのＩｇ様ドメインとを連結するジスルフィド結合も欠く、短鎖アイソフォーム（ＣＤ３３ｍ）をもたらす。健常対象では、ＣＤ３３は主に、正常な複能性骨髄性前駆細胞上、単能性コロニー形成細胞上、単球上、および成熟しつつある顆粒球上に見出される、骨髄性分化抗原として発現する。ＣＤ３３は、８０％を超える骨髄性白血病細胞上で発現するが、正常な造血幹細胞上または成熟顆粒球上では発現しない（Andrews, R. et al., The L4F3 antigen is expressed by unipotent and multipotent colony-forming cells but not by their precursors, Blood, 68(5):1030-5 (1986)）。ＣＤ３３は、悪性骨髄細胞上、活性化Ｔ細胞上、および活性化ＮＫ細胞上で発現することが報告されており、ＡＭＬ患者の大多数における芽球の、少なくともサブセット上で見出される（Pollard, J. et al., Correlation of CD33 expression level with disease characteristics and response to gemtuzumab ozogamicin containing chemotherapy in childhood AML, Blood, 119(16):3705-11 (2012)）。ＡＭＬ芽球上の広範な発現に加えて、ＣＤ３３は、ＡＭＬの基底をなす幹細胞上でも発現しうる。
【０２１４】
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲの抗原結合性部分は、ＣＤ３３に特異的（ＣＤ３３  ＣＡＲ）である。ＣＤ３３特異的ＣＡＲは、細胞表面上で発現すると、Ｔ細胞の特異性を、ヒトＣＤ３３へとリダイレクトする。複数の実施形態では、抗原結合性ドメインは、標的抗原特異的な、抗ＣＤ３３モノクローナル抗体の、可変ドメイン軽鎖（ＶＬ）および可変ドメイン重鎖（ＶＨ）であって、グリシン−セリンリンカーまたはホイットローリンカーなどの可撓性リンカーにより連結されたＶＬおよびＶＨを含む単鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）を含む。複数の実施形態では、ｓｃＦｖは、Ｍ１９５、ｍ２Ｈ１２、ＤＲＢ２、および／またはＭｙ９−６である。複数の実施形態では、ｓｃＦｖは、ヒト化ｓｃＦｖ、例えば、ｈＭ１９５である。一部の実施形態では、抗原結合性部分は、例えば、Ｎ末端からＣ末端へと、ＶＨ−リンカー−ＶＬまたはＶＬ−リンカー−ＶＨと、方向性をもって連結されたＶＨおよびＶＬを含みうる。
一部の実施形態では、ＣＤ３３抗原結合性ドメインは、配列番号２１４のアミノ酸配列（ｈＭ１９５  ＶＬ）との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ＣＤ３３抗原結合性ドメインは、配列番号２１５のアミノ酸配列（ｈＭ１９５  ＶＨ）との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ＣＤ３３抗原結合性ドメインは、配列番号２１６のアミノ酸配列（リンカーを伴う、ｈＭ１９５  ｓｃＦｖ）との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む。
【０２１５】
一部の実施形態では、本明細書で記載されるポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび方法を、がんなどの過剰増殖性疾患、自己免疫疾患の処置、またはウイルス感染、細菌感染、または寄生虫感染など、感染の処置のために使用することができる。一部の態様では、抗原は、がん細胞内、自己免疫細胞内、またはウイルス、細菌、もしくは寄生虫に感染した細胞内で増大する抗原である。ターゲティングされうる病原体は、限定せずに述べると、マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）属、トリパノソーム、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ＨＳＶ、ＨＰＶ、ＲＳＶ、ＥＢＶ、ＣＭＶ、ＪＣウイルス、ＢＫウイルス、またはエボラ病原体を含む。自己免疫疾患は、移植片対宿主病、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、セリアック病、クローン病、シェーグレン症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性硬化症、視神経脊髄炎、強直性脊椎炎、１型糖尿病、円形脱毛症、血管炎、側頭動脈炎、水疱性類天疱瘡、乾癬、尋常性天疱瘡、または自己免疫性ブドウ膜炎を含みうる。
【０２１６】
ＣＡＲにより本質的に認識される病原体は、任意の種類の病原体でありうるが、一部の実施形態では、病原体は、真菌、細菌、またはウイルスである。例示的なウイルス性病原体は、アデノウイルス科（Adenoviridae）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＲＳ（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ）ウイルス（ＲＳＶ）、ＪＣウイルス、ＢＫウイルス、ＨＰＶ、ＨＳＶ、ＨＨＶファミリーのウイルス、肝炎ファミリーのウイルス、ピコルナウイルス科（Picornaviridae）、ヘルペスウイルス科（Herpesviridae）、ヘパドナウイルス科（Hepadnaviridae）、フラビウイルス科（Flaviviridae）、レトロウイルス科（Retroviridae）、オルトミクソウイルス科（Orthomyxoviridae）、パラミクソウイルス科（Paramyxoviridae）、パポバウイルス科（Papovaviridae）、ポリオーマウイルス属（Polyomavirus）、ラブドウイルス科（Rhabdoviridae）、およびトガウイルス科（Togaviridae）の病原体を含む。例示的な病原性ウイルスは、天然痘、インフルエンザ、耳下腺炎、麻疹、水痘、エボラ、および風疹を引き起こす。例示的な病原性真菌は、カンジダ属（Candida）、アスペルギルス属（Aspergillus）、クリプトコッカス属（Cryptococcus）、ヒストプラズマ属（Histoplasma）、ニューモシスチス属（Pneumocystis）、およびスタキボトリス属（Stachybotrys）を含む。例示的な病原性細菌は、ストレプトコッカス属（Streptococcus）、シュードモナス属（Pseudomonas）、赤痢菌属（Shigella)、カンピロバクター属（Campylobacter）、スタフィロコッカス属（Staphylococcus）、ヘリコバクター属（Helicobacter）、大腸菌（E. coli）、リケッチア属（Rickettsia）、バチルス属（Bacillus）、ボルデテラ属（Bordetella）、クラミジア属（Chlamydia）、スピロヘータ門（Spirochetes）、およびサルモネラ属（Salmonella）を含む。一部の実施形態では、病原体受容体であるデクチン１を使用して、アスペルギルス（Aspergillus）属など、真菌の細胞壁上の炭水化物構造を認識するＣＡＲを作出することができる。別の実施形態では、ウイルス決定基（例えば、ＣＭＶおよびエボラに由来する糖タンパク質）を認識する抗体に基づき、ウイルス感染およびウイルス病態を阻止するＣＡＲを作ることができる。
【０２１７】
一部の実施形態では、「スペーサー」、「スペーサー領域」、もしくは「スペーサードメイン」、または「ヒンジ」、「ヒンジ」領域、もしくは「ヒンジドメイン」という用語を包含する、「ストーク」、「ストーク領域」、または「ストークドメイン」を、抗原結合性ドメインを、膜貫通ドメインと連関させるのに使用する。一部の場合には、「ストークドメイン」または「ストーク領域」は、ポリペプチド鎖内で、膜貫通ドメインを、細胞外ドメインまたは細胞質ドメインへと連結するように機能する、任意のオリゴヌクレオチドまたはポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ストークドメインは、抗原結合性ドメインが、抗原認識を容易とするように、異なる方向を向くことを可能とするのに十分な程度に可撓性である。場合によって、ストーク領域は、ＩｇＧ１に由来するヒンジ領域を含む。代替的な場合に、ストーク領域は、免疫グロブリンのＣＨ２ＣＨ３領域と、任意選択で、ＣＤ３の一部とを含む。場合によって、ストーク領域は、国際公開第２０１６／０７３７５５号パンフレットにおいて記載されている、ＣＤ８αヒンジ領域（配列番号２９；配列番号１７０）、ＩｇＧ４−Ｆｃの１２アミノ酸のヒンジ領域（ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ）、またはＩｇＧ４ヒンジ領域を含む。
【０２１８】
一部の実施形態では、ストーク領域は、ＣＤ８アルファ２Ｘ（配列番号３０；配列番号１７１）、ＣＤ８アルファ３Ｘ（配列番号３１；配列番号１７２）、またはＣＤ８アルファ４Ｘ（配列番号３２；配列番号１７３）のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドのうちの少なくとも１つを含む。
【０２１９】
他の実施形態では、ＣＡＲの細胞外ドメインと、膜貫通ドメインとの間に、スペーサーが組み込まれる。スペーサーは、ストーク領域およびストーク伸長領域を含みうる。一実施形態では、スペーサーは、単一のストーク領域を含みうる。別の実施形態では、スペーサーは、ストーク領域およびストーク伸長領域を含みうる。例えば、スペーサーは、１つのストーク領域、および０、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０のストーク領域を含みうる。さらなる実施形態では、ストーク領域を、リンカーを介して、ストーク伸長領域へと連結することができる。
【０２２０】
膜貫通ドメインは、天然供給源に由来する場合もあり、組換え供給源に由来する場合もある。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合性タンパク質または膜貫通タンパク質に由来しうる。適切な膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体の、アルファ鎖、ベータ鎖、またはゼータ鎖の膜貫通領域を含む場合もあり、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ζ、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８アルファ、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、またはＣＤ１５４に由来する膜貫通領域を含む場合もある。代替的に、膜貫通ドメインは、合成の場合もあり、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を含みうる。一部の実施形態では、合成膜貫通ドメインの、一方または両方の末端では、フェニルアラニン、トリプトファン、およびバリンのトリプレットが見出される。任意選択で、一部の実施形態では、２〜１０アミノ酸の間の長さである、短いオリゴヌクレオチドリンカーまたはポリペプチドリンカーは、ＣＡＲの膜貫通ドメインと、細胞質シグナル伝達ドメインとの間の連結を形成しうる。一部の実施形態では、リンカーは、グリシン−セリンリンカーである。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α膜貫通ドメインまたはＣＤ３ζ膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α膜貫通ドメインを含む。他の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ３ζ膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態では、膜貫通領域は、ＣＤ８アルファ膜貫通ドメイン（配列番号１７４）のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドのうちの少なくとも１つを含む。一部の実施形態では、膜貫通領域は、ＣＤ２８膜貫通ドメイン（配列番号１７５）のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドのうちの少なくとも１つを含む。
【０２２１】
細胞内ドメインは、１または複数の共刺激ドメインを含みうる。例示的な共刺激ドメインは、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、またはこれらの断片もしくは組合せを含むがこれらに限定されない。場合によって、本明細書で記載されるＣＡＲは、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、またはこれらの断片もしくは組合せから選択される共刺激ドメインのうちの１もしくは複数、または２つもしくはこれを超えるものを含む。場合によって、本明細書で記載されるＣＡＲは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、またはこれらの断片もしくは組合せから選択される共刺激ドメインのうちの１もしくは複数、または２つもしくはこれを超えるものを含む。場合によって、本明細書で記載されるＣＡＲは、ＣＤ８、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、またはこれらの断片もしくは組合せから選択される共刺激ドメインのうちの１もしくは複数、または２つもしくはこれを超えるものを含む。場合によって、本明細書で記載されるＣＡＲは、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、またはこれらの断片もしくは組合せから選択される共刺激ドメインのうちの１もしくは複数、または２つもしくはこれを超えるものを含む。場合によって、本明細書で記載されるＣＡＲは、共刺激ドメインであるＣＤ２８および４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、またはこれらのそれぞれの断片を含む。場合によって、本明細書で記載されるＣＡＲは、共刺激ドメインであるＣＤ２８およびＯＸ４０（ＣＤ１３４）、またはこれらのそれぞれの断片を含む。場合によって、本明細書で記載されるＣＡＲは、共刺激ドメインであるＣＤ８およびＣＤ２８、またはこれらのそれぞれの断片を含む。場合によって、本明細書で記載されるＣＡＲは、共刺激ドメインであるＣＤ２８、またはこの断片を含む。場合によって、本明細書で記載されるＣＡＲは、共刺激ドメインである４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、またはこの断片を含む。場合によって、本明細書で記載されるＣＡＲは、共刺激ドメインであるＯＸ４０（ＣＤ１３４）、またはこの断片を含む。場合によって、本明細書で記載されるＣＡＲは、共刺激ドメインであるＣＤ８、またはこの断片を含む。
【０２２２】
本開示のＣＡＲの、細胞質ドメインとしてまた公知の細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲを入れた免疫細胞の正常エフェクター機能のうちの少なくとも１つの活性化の一因となる。「エフェクター機能」という用語は、細胞の特化機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞傷害活性の場合もあり、サイトカインの分泌を含むヘルパー活性の場合もある。したがって、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを伝達し、特化機能を実施するように、細胞を方向付ける、タンパク質の部分を指す。通常、細胞内シグナル伝達ドメインの全体が用いられうるが、多くの場合、鎖全体を使用することは必要でない。細胞内シグナル伝達ドメインの切断部分を使用し、エフェクター機能シグナルを伝達する限りにおいて、このような切断部分を、無傷鎖の代わりに使用することができる。したがって、細胞内シグナル伝達ドメインという用語とは、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な、細胞内シグナル伝達ドメインの、任意の切断部分を含むことが意図される。一部の実施形態では、細胞内ドメインは、Ｔ細胞活性化のためのシグナル伝達ドメインをさらに含む。場合によって、Ｔ細胞活性化のためのシグナル伝達ドメインは、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、またはＣＤ６６ｄに由来するドメインを含む。場合によって、Ｔ細胞活性化のためのシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζに由来するドメインを含む。
【０２２３】
一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８（配列番号１７６）、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン（配列番号１７７）、４−１ＢＢシグナル伝達ドメイン（配列番号１７８）、ＤＮＡＸ活性化タンパク質１０（ＤＡＰ１０）シグナル伝達ドメイン（配列番号１７９）、またはＤＮＡＸ活性化タンパク質１２（ＤＡＰ１２）シグナル伝達ドメイン（配列番号１８０）のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドのうちの少なくとも１つを含む。
【０２２４】
ＣＤ１９特異的ＣＡＲ
ＣＤ１９とは、免疫グロブリンスーパーファミリーの細胞表面糖タンパク質である。一部の場合には、ＣＤ１９は、膵臓がん、肝臓がん、および前立腺がんなど、充実性腫瘍内で検出されている。
【０２２５】
一部の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲの抗原結合性部分は、ＣＤ１９に特異的である。ＣＤ１９特異的ＣＡＲは、細胞表面上で発現すると、Ｔ細胞の特異性を、ヒトＣＤ１９へとリダイレクトする。複数の実施形態では、抗原結合性ドメインは、標的抗原特異的な、抗ＣＤ１９モノクローナル抗体の、可変ドメイン軽鎖（ＶＬ）および可変ドメイン重鎖（ＶＨ）であって、グリシン−セリンリンカーまたはホイットローリンカーなどの可撓性リンカーにより連結されたＶＬおよびＶＨを含む単鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）を含む。複数の実施形態では、ｓｃＦｖは、ＳＪ２５Ｃ１および／またはＦＭＣ６３である。複数の実施形態では、ｓｃＦｖは、ヒト化ｓｃＦｖである。一部の実施形態では、抗原結合性部分は、例えば、Ｎ末端からＣ末端へと、ＶＨ−リンカー−ＶＬまたはＶＬ−リンカー−ＶＨと、方向性をもって連結されたＶＨおよびＶＬを含みうる。
【０２２６】
一部の実施形態では、本明細書では、抗原結合性ドメインが、ＣＤ１９を結合するｓｃＦｖを含む、ＣＤ１９特異的ＣＡＲが記載される。一部の場合には、抗原結合性ドメインは、ＣＤ１９上のエピトープを認識する。
【０２２７】
一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、ＪＣＡＲ０１４、ＪＣＡＲ０１５、ＪＣＡＲ０１７、または１９−２８ｚ  ＣＡＲ（Ｊｕｎｏ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）によってもまた認識される、ＣＤ１９上のエピトープを認識する。一部の実施形態では、本明細書では、抗原結合性ドメインが、ＪＣＡＲ０１４、ＪＣＡＲ０１５、ＪＣＡＲ０１７、または１９−２８ｚ  ＣＡＲ（Ｊｕｎｏ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）によってもまた認識される、ＣＤ１９上のエピトープを認識する、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞が記載される。一部の場合には、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ８アルファ膜貫通ドメインまたはＣＤ３ζ膜貫通ドメインから選択される膜貫通ドメイン；ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、またはこれらの断片もしくは組合せから選択される、１または複数の共刺激ドメイン；およびＣＤ３ζに由来するシグナル伝達ドメインをさらに含む。
【０２２８】
一部の実施形態では、本明細書で記載されるＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ｓｃＦｖの抗原結合性ドメインを含み、抗原結合性ドメインは、ＪＣＡＲ０１４、ＪＣＡＲ０１５、ＪＣＡＲ０１７、または１９−２８ｚ  ＣＡＲ（Ｊｕｎｏ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）によってもまた認識される、ＣＤ１９上のエピトープを認識する。一部の場合には、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ８アルファ膜貫通ドメインまたはＣＤ３ζ膜貫通ドメインから選択される膜貫通ドメイン；ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、またはこれらの断片もしくは組合せから選択される、１または複数の共刺激ドメイン；およびＣＤ３ζに由来するシグナル伝達ドメインをさらに含む。
【０２２９】
一部の実施形態では、本明細書で記載されるＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、米国特許出願公開第２０１６０１５２７２３号明細書において記載されている抗ＣＤ１９抗体を含む。
【０２３０】
一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、ＫＴＥ−Ｃ１９（Ｋｉｔｅ  Ｐｈａｒｍａ，Ｉｎｃ．）によってもまた認識される、ＣＤ１９上のエピトープを認識する。一部の実施形態では、本明細書では、抗原結合性ドメインが、ＫＴＥ−Ｃ１９によってもまた認識される、ＣＤ１９上のエピトープを認識する、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞が記載される。一部の場合には、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ８アルファ膜貫通ドメインまたはＣＤ３ζ膜貫通ドメインから選択される膜貫通ドメイン；ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、またはこれらの断片もしくは組合せから選択される、１または複数の共刺激ドメイン；およびＣＤ３ζに由来するシグナル伝達ドメインをさらに含む。
【０２３１】
一部の実施形態では、本明細書で記載されるＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ｓｃＦｖの抗原結合性ドメインを含み、抗原結合性ドメインは、ＫＴＥ−Ｃ１９によってもまた認識される、ＣＤ１９上のエピトープを認識する。一部の場合には、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ８アルファ膜貫通ドメインまたはＣＤ３ζ膜貫通ドメインから選択される膜貫通ドメイン；ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、またはこれらの断片もしくは組合せから選択される、１または複数の共刺激ドメイン；およびＣＤ３ζに由来するシグナル伝達ドメインをさらに含む。
【０２３２】
一部の実施形態では、本明細書で記載されるＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、国際公開第２０１５１８７５２８号パンフレットにおいて記載されている抗ＣＤ１９抗体、またはこの断片もしくは誘導体を含む。
【０２３３】
一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、ＣＴＬ０１９（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）によってもまた認識される、ＣＤ１９上のエピトープを認識する。一部の実施形態では、本明細書では、抗原結合性ドメインが、ＣＴＬ０１９によってもまた認識される、ＣＤ１９上のエピトープを認識する、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞が記載される。一部の場合には、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ８アルファ膜貫通ドメインまたはＣＤ３ζ膜貫通ドメインから選択される膜貫通ドメイン；ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、またはこれらの断片もしくは組合せから選択される、１または複数の共刺激ドメイン；およびＣＤ３ζに由来するシグナル伝達ドメインをさらに含む。
【０２３４】
一部の実施形態では、本明細書で記載されるＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ｓｃＦｖの抗原結合性ドメインを含み、抗原結合性ドメインは、ＣＴＬ０１９によってもまた認識される、ＣＤ１９上のエピトープを認識する。一部の場合には、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ８アルファ膜貫通ドメインまたはＣＤ３ζ膜貫通ドメインから選択される膜貫通ドメイン；ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、またはこれらの断片もしくは組合せから選択される、１または複数の共刺激ドメイン；およびＣＤ３ζに由来するシグナル伝達ドメインをさらに含む。
【０２３５】
一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、ＵＣＡＲＴ１９（Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓ）によってもまた認識される、ＣＤ１９上のエピトープを認識する。一部の実施形態では、本明細書では、抗原結合性ドメインが、ＵＣＡＲＴ１９によってもまた認識される、ＣＤ１９上のエピトープを認識する、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞が記載される。一部の場合には、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ８アルファ膜貫通ドメインまたはＣＤ３ζ膜貫通ドメインから選択される膜貫通ドメイン；ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、またはこれらの断片もしくは組合せから選択される、１または複数の共刺激ドメイン；およびＣＤ３ζに由来するシグナル伝達ドメインをさらに含む。
【０２３６】
一部の実施形態では、本明細書で記載されるＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ｓｃＦｖの抗原結合性ドメインを含み、抗原結合性ドメインは、ＵＣＡＲＴ１９によってもまた認識される、ＣＤ１９上のエピトープを認識する。一部の場合には、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ８アルファ膜貫通ドメインまたはＣＤ３ζ膜貫通ドメインから選択される膜貫通ドメイン；ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、またはこれらの断片もしくは組合せから選択される、１または複数の共刺激ドメイン；およびＣＤ３ζに由来するシグナル伝達ドメインをさらに含む。
【０２３７】
一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、ＢＰＸ−４０１（Ｂｅｌｌｉｃｕｍ）によってもまた認識される、ＣＤ１９上のエピトープを認識する。一部の実施形態では、本明細書では、抗原結合性ドメインが、ＢＰＸ−４０１によってもまた認識される、ＣＤ１９上のエピトープを認識する、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞が記載される。一部の場合には、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ８アルファ膜貫通ドメインまたはＣＤ３ζ膜貫通ドメインから選択される膜貫通ドメイン；ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、またはこれらの断片もしくは組合せから選択される、１または複数の共刺激ドメイン；およびＣＤ３ζに由来するシグナル伝達ドメインをさらに含む。
【０２３８】
一部の実施形態では、本明細書で記載されるＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ｓｃＦｖの抗原結合性ドメインを含み、抗原結合性ドメインは、ＢＰＸ−４０１によってもまた認識される、ＣＤ１９上のエピトープを認識する。一部の場合には、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ８アルファ膜貫通ドメインまたはＣＤ３ζ膜貫通ドメインから選択される膜貫通ドメイン；ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、またはこれらの断片もしくは組合せから選択される、１または複数の共刺激ドメイン；およびＣＤ３ζに由来するシグナル伝達ドメインをさらに含む。
【０２３９】
場合によって、抗原結合性ドメインは、ブリナツモマブ（Ａｍｇｅｎ）、コルツキシマブ・ラブタンシン（ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ  Ｉｎｃ．／Ｓａｎｏｆｉ−ａｖｅｎｔｉｓ）、ＭＯＲ２０８（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ  ＡＧ／Ｘｅｎｃｏｒ  Ｉｎｃ．）、ＭＥＤＩ−５５１（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ）、デニンツズマブ・マホドチン（Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、Ｂ４（またはＤＩ−Ｂ４）（Ｍｅｒｃｋ  Ｓｅｒｏｎｏ）、タプリツモマブ・パプトックス（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、ＸｍＡｂ  ５８７１（Ａｍｇｅｎ／Ｘｅｎｃｏｒ，Ｉｎｃ．）、ＭＤＸ−１３４２（Ｍｅｄａｒｅｘ）またはＡＦＭ１１（Ａｆｆｉｍｅｄ）によってもまた認識される、ＣＤ１９上のエピトープを認識する。一部の場合には、ＣＤ１９特異的ＣＡＲは、ＣＤ８アルファ膜貫通ドメインまたはＣＤ３ζ膜貫通ドメインから選択される膜貫通ドメイン；ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、またはこれらの断片もしくは組合せから選択される、１または複数の共刺激ドメイン；およびＣＤ３ζに由来するシグナル伝達ドメインをさらに含む。
【０２４０】
一部の実施形態では、本明細書では、抗原結合性ドメインが、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、またはｓｃＦｖを含む、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞が記載される。一部の場合には、抗原結合性ドメインは、ＣＤ１９上のエピトープを認識する。場合によって、抗原結合性ドメインは、ブリナツモマブ（Ａｍｇｅｎ）、コルツキシマブ・ラブタンシン（ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ  Ｉｎｃ．／Ｓａｎｏｆｉ−ａｖｅｎｔｉｓ）、ＭＯＲ２０８（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ  ＡＧ／Ｘｅｎｃｏｒ  Ｉｎｃ．）、ＭＥＤＩ−５５１（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ）、デニンツズマブ・マホドチン（Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、Ｂ４（またはＤＩ−Ｂ４）（Ｍｅｒｃｋ  Ｓｅｒｏｎｏ）、タプリツモマブ・パプトックス（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、ＸｍＡｂ  ５８７１（Ａｍｇｅｎ／Ｘｅｎｃｏｒ，Ｉｎｃ．）、ＭＤＸ−１３４２（Ｍｅｄａｒｅｘ）またはＡＦＭ１１（Ａｆｆｉｍｅｄ）によってもまた認識される、ＣＤ１９上のエピトープを認識する。一部の場合には、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ８アルファ膜貫通ドメインまたはＣＤ３ζ膜貫通ドメインから選択される膜貫通ドメイン；ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、またはこれらの断片もしくは組合せから選択される、１または複数の共刺激ドメイン；およびＣＤ３ζに由来するシグナル伝達ドメインをさらに含む。
【０２４１】
場合によって、本明細書で記載されるＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ｓｃＦｖの抗原結合性ドメインを含み、抗原結合性ドメインは、ブリナツモマブ（Ａｍｇｅｎ）、コルツキシマブ・ラブタンシン（ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ  Ｉｎｃ．／Ｓａｎｏｆｉ−ａｖｅｎｔｉｓ）、ＭＯＲ２０８（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ  ＡＧ／Ｘｅｎｃｏｒ  Ｉｎｃ．）、ＭＥＤＩ−５５１（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ）、デニンツズマブ・マホドチン（Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、Ｂ４（またはＤＩ−Ｂ４）（Ｍｅｒｃｋ  Ｓｅｒｏｎｏ）、タプリツモマブ・パプトックス（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、ＸｍＡｂ  ５８７１（Ａｍｇｅｎ／Ｘｅｎｃｏｒ，Ｉｎｃ．）、ＭＤＸ−１３４２（Ｍｅｄａｒｅｘ）またはＡＦＭ１１（Ａｆｆｉｍｅｄ）によってもまた認識される、ＣＤ１９上のエピトープを認識する。一部の場合には、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ８アルファ膜貫通ドメインまたはＣＤ３ζ膜貫通ドメインから選択される膜貫通ドメイン；ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、またはこれらの断片もしくは組合せから選択される、１または複数の共刺激ドメイン；およびＣＤ３ζに由来するシグナル伝達ドメインをさらに含む。
【０２４２】
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号２１０のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ（ＣＤ１９−ＣＤ８α−ＣＤ２８−ＣＤ３ζ）を含む。複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号２１１のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ（シグナルペプチドを伴う、ＣＤ１９−ＣＤ８α−ＣＤ２８−ＣＤ３ζ）を含む。
【０２４３】
一部の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲの抗原結合性部分は、ＣＤ１９に特異的である。ＣＤ１９特異的ＣＡＲは、細胞表面上で発現すると、Ｔ細胞の特異性を、ヒトＣＤ１９へとリダイレクトする。複数の実施形態では、抗原結合性ドメインは、標的抗原特異的な、抗ＣＤ１９モノクローナル抗体の、可変ドメイン軽鎖（ＶＬ）および可変ドメイン重鎖（ＶＨ）であって、グリシン−セリンリンカーまたはホイットローリンカーなどの可撓性リンカーにより連結されたＶＬおよびＶＨを含む単鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）を含む。複数の実施形態では、ｓｃＦｖは、ホイットローリンカーを伴う、抗ＣＤ１９クローンである、ＦＭＣ６３  ｓｃＦｖ（配列番号２１３）である。複数の実施形態では、抗ＣＤ１９抗体は、抗ＣＤ１９モノクローナル抗体クローンであるＦＭＣ  ６３の可変重鎖（配列番号２１２）を含む。一部の実施形態では、抗原結合性部分は、例えば、Ｎ末端からＣ末端へと、ＶＨ−リンカー−ＶＬまたはＶＬ−リンカー−ＶＨと、方向性をもって連結されたＶＨおよびＶＬを含みうる。
【０２４４】
操作Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）
一部の実施形態では、本明細書で記載されるポリヌクレオチドによりコードされるキメラ受容体は、操作Ｔ細胞受容体を含む。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、Ｔ細胞の表面上で対合して、ヘテロ二量体の受容体を形成する、２つの鎖（αβまたはγδ）から構成される。一部の場合には、αβ  ＴＣＲは、体内の大半のＴ細胞上で発現し、特異的ＭＨＣ拘束抗原の認識に関与することが公知である。α鎖およびβ鎖の各々は、２つのドメイン：タンパク質を、細胞膜へとアンカリングし、ＣＤ３シグナル伝達装置の不変サブユニットと関連する定常ドメイン（Ｃ）と；相補性決定領域（ＣＤＲ）と称する、６回ループを介して、抗原認識を付与する可変ドメイン（Ｖ）とから構成される。一部の場合には、各Ｖドメインは、３つのＣＤＲ、例えば、ＣＤＲ３を超可変領域とする、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。これらのＣＤＲは、主要組織適合性複合体によりコードされるタンパク質に結合した抗原性ペプチドとの間で形成される複合体（ｐｅｐＭＨＣ）（例えば、ＨＬＡ−Ａ複合体、ＨＬＡ−Ｂ複合体、ＨＬＡ−Ｃ複合体、ＨＬＡ−ＤＰＡ１複合体、ＨＬＡ−ＤＰＢ１複合体、ＨＬＡ−ＤＱＡ１複合体、ＨＬＡ−ＤＱＢ１複合体、ＨＬＡ−ＤＲＡ複合体、またはＨＬＡ−ＤＲＢ１複合体）と相互作用する。一部の場合には、定常ドメインは、定常ドメインを、可変ドメインへと連結する接合領域をさらに含む。場合によって、ベータ鎖は、接合領域の一部を構成する、短い多様性領域をさらに含む。
【０２４５】
場合によって、このようなＴＣＲは、特異的腫瘍抗原、例えば、ＮＹ−ＥＳＯ、ＭａｇｅＡ３、Ｔｉｔｉｎと反応性である。他の場合には、このようなＴＣＲは、患者の腫瘍内で発現する、特異的ネオ抗原（すなわち、腫瘍が発現する、患者特異的な、体細胞性の、非同義突然変異）と反応性である。場合によって、操作ＴＣＲは、アフィニティー増強されうる。
【０２４６】
一部の実施形態では、ＴＣＲは、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（ＩＭＧＴ）によるＴＣＲ命名法を使用して記載され、ＩＭＧＴによる、ＴＣＲ配列についての公開データベースへとリンクする。例えば、それらのフレームワーク配列、ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、およびＣＤＲ３配列により識別される、いくつかの種類のアルファ鎖可変（Ｖα）領域と、いくつかの種類のベータ鎖可変（Ｖβ）領域とが存在しうる。このようにして、Ｖαの種類は、ＩＭＧＴ命名法では、固有のＴＲＡＶ数により言及されうる。例えば、「ＴＲＡＶ２１」は、固有のフレームワーク配列およびＣＤＲ１配列およびＣＤＲ２配列、ならびにＴＣＲから、ＴＣＲへと保存されるアミノ酸配列により、部分的に規定されるが、また、ＴＣＲから、ＴＣＲへと変動するアミノ酸配列も含むＣＤＲ３配列を有するＴＣＲＶα領域を規定する。同様に、「ＴＲＢＶ５−１」は、固有のフレームワーク配列およびＣＤＲ１配列およびＣＤＲ２配列を有するが、ＣＤＲ３配列は、部分的に規定されているに過ぎない、ＴＣＲＶβ領域を規定する。
【０２４７】
場合によって、ベータ鎖多様性領域は、ＩＭＧＴ命名法では、ＴＲＢＤという略号で言及される。
【０２４８】
一部の場合には、ＩＭＧＴ命名法により規定される固有の配列は、広く公知であり、ＴＣＲの分野に携わる者に閲覧可能である。例えば、これらは、ＩＭＧＴによる公開データベースおよび“T cell Receptor Factsbook”, (2001) LeFranc and LeFranc, Academic Press, ISBN 0-12-441352-8において見出すことができる。
【０２４９】
一部の実施形態では、αβヘテロ二量体ＴＣＲは、例えば、細胞質ドメインおよび膜貫通ドメインの両方を有する全長鎖としてトランスフェクトされる。場合によって、ＴＣＲは、例えば、国際公開第２００６／０００８３０号パンフレットにおいて記載されている、それぞれの定常ドメインの残基の間に導入されたジスルフィド結合を含有する。
【０２５０】
一部の場合には、本明細書で記載されるＴＣＲは、単鎖フォーマットである（例えば、国際公開第２００４／０３３６８５号パンフレットを参照されたい）。単鎖フォーマットは、Ｖα−Ｌ−Ｖβ型、Ｖβ−Ｌ−Ｖα型、Ｖα−Ｃα−Ｌ−Ｖβ型、Ｖα−Ｌ−Ｖβ−Ｃβ型、Ｖα−Ｃα−Ｌ−Ｖβ−Ｃβ型のαβ  ＴＣＲポリペプチド［フォーマット中、ＶαおよびＶβは、それぞれ、ＴＣＲα可変領域およびＴＣＲβ可変領域であり、ＣαおよびＣβは、それぞれ、ＴＣＲα定常領域およびＴＣＲβ定常領域であり、Ｌは、リンカー配列である］を含む。ある特定の実施形態では、本開示の単鎖ＴＣＲは、国際公開第２００４／０３３６８５号パンフレットにおいて記載されている、それぞれの定常ドメインの残基の間に導入されたジスルフィド結合を有しうる。
【０２５１】
本明細書で記載されるＴＣＲは、検出用標識、治療剤、またはＰＫ修飾部分と会合させることができる。
【０２５２】
診断を目的とする、例示的な検出用標識は、蛍光標識、放射性標識、酵素、核酸プローブ、および造影試薬を含むがこれらに限定されない。
【０２５３】
さらなる遺伝子エレメント
細胞療法は、ヒト疾患の処置のために、極めて有望であるが、細胞自体またはそれらのトランス遺伝子産物に由来する著明な毒性は、臨床的探索を妨げている。本明細書で記載される、複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲまたはＴＣＲを含む免疫エフェクター細胞であって、哺乳動物対象、例えば、ヒトへと輸注された細胞は、それらの使用から、毒性が生じる場合は、このような免疫エフェクター細胞の効果を調節するために、枯渇させることができる。したがって、ある特定の実施形態では、本明細書で記載される、特異的キメラ抗原受容体に加えて、第２の遺伝子もまた、本明細書で記載される、操作免疫エフェクター細胞へと導入することができる。第２の遺伝子は、実質的に、ＣＡＲもしくはＴＣＲまたは抗原結合性ポリペプチドを含有する細胞の枯渇を可能とする、「キルスイッチ」または「細胞タグ」である。ある特定の実施形態では、「キルスイッチ」とは、ＨＥＲ１の、少なくとも１つの抗体結合性エピトープまたはその機能的断片と、任意選択で、シグナルポリペプチド配列またはその断片とを含む、切断型ＨＥＲ１ペプチド（本明細書では、ＨＥＲ１ｔまたはＥＧＦＲｔと呼ぶ）である。
【０２５４】
ある特定の実施形態では、第２の遺伝子は、表皮増殖因子受容体（ＨＥＲ１）またはこの断片もしくは変異体である、ＨＥＲ１タグである。複数の実施形態では、第２の遺伝子は、切断型ヒト表皮増殖因子受容体１（例えば、ＨＥＲ１ｔ）（配列番号７６；配列番号１８９）である、ＨＥＲ１タグである。場合によって、第２の遺伝子は、ヒト表皮増殖因子受容体１の変異体である。場合によって、切断型ＨＥＲ１の変異体は、ＨＥＲ１ｔ１（配列番号７７；配列番号１９０）、ＨＥＲ１ｔ２（配列番号７８；配列番号１９１）、ＨＥＲ１ｔ３（配列番号７９；配列番号１９２）、ＨＥＲ１ｔ４（配列番号８０；配列番号１９３）、ＨＥＲ１ｔ５（配列番号８１；配列番号１９４）、ＨＥＲ１ｔ６（配列番号８２；配列番号１９５）、ＨＥＲ１ｔ７（配列番号８３；配列番号１９６）、ＨＥＲ１ｔ８（配列番号８４；配列番号１９７）、ＨＥＲ１ｔ９（配列番号８５；配列番号１９８）、ＨＥＲ１ｔ１０（配列番号８６；配列番号１９９）またはＨＥＲ１ｔ１１（配列番号８７；配列番号２００）である。複数の実施形態では、ＨＥＲ１、ＨＥＲ１ｔ、ＨＥＲ１ｔ１、ＨＥＲ１ｔ２、ＨＥＲ１ｔ３、ＨＥＲ１ｔ４、ＨＥＲ１ｔ５、ＨＥＲ１ｔ６、ＨＥＲ１ｔ７、ＨＥＲ１ｔ８、ＨＥＲ１ｔ９、ＨＥＲ１ｔ１０、およびＨＥＲ１ｔ１１のうちの少なくとも１つは、ＦＤＡにより承認されているセツキシマブ、またはＨＥＲ１、ＨＥＲ１ｔ、ＨＥＲ１ｔ１、ＨＥＲ１ｔ２、ＨＥＲ１ｔ３、ＨＥＲ１ｔ４、ＨＥＲ１ｔ５、ＨＥＲ１ｔ６、ＨＥＲ１ｔ７、ＨＥＲ１ｔ８、ＨＥＲ１ｔ９、ＨＥＲ１ｔ１０、および／もしくはＨＥＲ１ｔ１１を認識する任意の抗体の投与を介して、輸注されたＣＡＲ−Ｔ細胞の枯渇を可能とすることにより、安全性機構をもたらす。
【０２５５】
複数の実施形態では、ＨＥＲ１ｔ遺伝子は、配列番号７６の核酸配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。複数の実施形態では、ＨＥＲ１ｔ１遺伝子は、配列番号７７の核酸配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。複数の実施形態では、ＨＥＲ１ｔ２遺伝子は、配列番号７８の核酸配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。複数の実施形態では、ＨＥＲ１ｔ３遺伝子は、配列番号７９の核酸配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。複数の実施形態では、ＨＥＲ１ｔ４遺伝子は、配列番号８０の核酸配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。複数の実施形態では、ＨＥＲ１ｔ５遺伝子は、配列番号８１の核酸配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。複数の実施形態では、ＨＥＲ１ｔ６遺伝子は、配列番号８２の核酸配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。複数の実施形態では、ＨＥＲ１ｔ７遺伝子は、配列番号８３の核酸配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。複数の実施形態では、ＨＥＲ１ｔ８遺伝子は、配列番号８４の核酸配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。複数の実施形態では、ＨＥＲ１ｔ９遺伝子は、配列番号８５の核酸配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。複数の実施形態では、ＨＥＲ１ｔ１０遺伝子は、配列番号８６の核酸配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。複数の実施形態では、ＨＥＲ１ｔ１１遺伝子は、配列番号８７の核酸配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【０２５６】
切断型ＨＥＲ１配列、例えば、ＨＥＲ１ｔ、ＨＥＲ１ｔ１、ＨＥＲ１ｔ２、ＨＥＲ１ｔ３、ＨＥＲ１ｔ４、ＨＥＲ１ｔ５、ＨＥＲ１ｔ６、ＨＥＲ１ｔ７、ＨＥＲ１ｔ８、ＨＥＲ１ｔ９、ＨＥＲ１ｔ１０、および／またはＨＥＲ１ｔ１１は、セツキシマブの、受容体への結合を無傷に保ちながら、ＥＧＦリガンドへの結合、ＥＧＦＲのホモ二量体化およびヘテロ二量体化、ならびにＥＧＦＲ媒介性シグナル伝達の潜在的可能性を消失させる（Ferguson, K., 2008. A structure-based view of Epidermal Growth Factor Receptor regulation. Annu Rev Biophys, Volume 37, pp. 353-373）。
【０２５７】
さらなる実施形態では、本開示の、治療標的に特異的なキメラ抗原受容体に加えて、導入される第２の遺伝子は、ＨＥＲ１タグである。場合によって、ＨＥＲ１タグは、全長ＨＥＲ１ポリペプチド、または切断型ＨＥＲ１ポリペプチド（ＨＥＲ１ｔ１）、ＨＥＲ１ｔ２、ＨＥＲ１ｔ３、ＨＥＲ１ｔ４、ＨＥＲ１ｔ５、ＨＥＲ１ｔ６、ＨＥＲ１ｔ７、ＨＥＲ１ｔ８、ＨＥＲ１ｔ９、ＨＥＲ１ｔ１０、もしくはＨＥＲ１ｔ１１である。場合によって、ＨＥＲ１タグは、切断型ＨＥＲ１変異体である。場合によって、ＨＥＲ１タグ、例えば、ＨＥＲ１、ＨＥＲ１ｔ１、ＨＥＲ１ｔ２、ＨＥＲ１ｔ３、ＨＥＲ１ｔ４、ＨＥＲ１ｔ５、ＨＥＲ１ｔ６、ＨＥＲ１ｔ７、ＨＥＲ１ｔ８、ＨＥＲ１ｔ９、ＨＥＲ１ｔ１０、またはＨＥＲ１ｔ１１はまた、ＦＤＡにより承認されているリツキシマブ療法の投与を介して、輸注されたＣＡＲ−Ｔ細胞の枯渇を可能とすることにより、安全性機構も可能とする。ある特定の実施形態では、ＨＥＲ１タグは、配列番号１８９の配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチド配列を有する。ある特定の実施形態では、ＨＥＲ１タグは、ＨＥＲ１ｔ１タグであり、配列番号１９０の配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチド配列を有する。ある特定の実施形態では、ＨＥＲ１タグは、ＨＥＲ１ｔ２タグであり、配列番号１９１の配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチド配列を有する。ある特定の実施形態では、ＨＥＲ１タグは、ＨＥＲ１ｔ３タグであり、配列番号１９２の配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチド配列を有する。ある特定の実施形態では、ＨＥＲ１タグは、ＨＥＲ１ｔ４タグであり、配列番号１９３の配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチド配列を有する。ある特定の実施形態では、ＨＥＲ１タグは、ＨＥＲ１ｔ５タグであり、配列番号１９４の配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチド配列を有する。ある特定の実施形態では、ＨＥＲ１タグは、ＨＥＲ１ｔ６タグであり、配列番号１９５の配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチド配列を有する。ある特定の実施形態では、ＨＥＲ１タグは、ＨＥＲ１ｔ７タグであり、配列番号１９６の配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチド配列を有する。ある特定の実施形態では、ＨＥＲ１タグは、ＨＥＲ１ｔ８タグであり、配列番号１９７の配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチド配列を有する。ある特定の実施形態では、ＨＥＲ１タグは、ＨＥＲ１ｔ９タグであり、配列番号１９８の配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチド配列を有する。ある特定の実施形態では、ＨＥＲ１タグは、ＨＥＲ１ｔ１０タグであり、配列番号１９９の配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチド配列を有する。ある特定の実施形態では、ＨＥＲ１タグは、ＨＥＲ１ｔ１１タグであり、配列番号２００の配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチド配列を有する。
【０２５８】
ある特定の実施形態では、第２の遺伝子は、活性化グリコシル化リンタンパク質またはこの断片もしくは変異体である、ＣＤ２０タグ（配列番号８８；配列番号２０１）である。場合によって、第２の遺伝子は、切断型ＣＤ２０の変異体である、ＣＤ２０ｔ１（配列番号８９；配列番号２０２）である。複数の実施形態では、ＣＤ２０タグ、ＣＤ２０タグ（ＣＤ２０ｔ１）の変異体、またはＣＤ２０もしくはＣＤ２０ｔ１タグの断片は、ＣＤ２０を認識する抗体の投与を介して、輸注されたＣＡＲ−Ｔ細胞の枯渇を可能とすることにより、安全性機構をもたらす。複数の実施形態では、ＣＤ２０タグをコードする遺伝子は、配列番号８８の核酸配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。複数の実施形態では、ＣＤ２０ｔ１タグをコードする遺伝子は、配列番号８９の核酸配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【０２５９】
さらなる実施形態では、本開示の、治療標的に特異的なキメラ抗原受容体に加えて、導入される第２の遺伝子は、ＣＤ２０タグである。場合によって、ＣＤ２０タグは、全長ＣＤ２０ポリペプチドまたは切断型ＣＤ２０ポリペプチド（ＣＤ２０ｔ１）である。
【０２６０】
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲを含むＣＡＲベクターは、配列番号８８の核酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する核酸配列を含む全長ＣＤ２０タグをさらに含む。複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲを含むＣＡＲベクターは、配列番号８９の核酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する核酸配列を含む、ＣＤ２０タグの変異体（ＣＤ２０ｔ１）をさらに含む。
【０２６１】
複数の実施形態では、キルタグ、例えば、ＨＥＲ１ｔ、ＨＥＲ１ｔ１、ＨＥＲ１ｔ２、ＨＥＲ１ｔ３、ＨＥＲ１ｔ４、ＨＥＲ１ｔ５、ＨＥＲ１ｔ６、ＨＥＲ１ｔ７、ＨＥＲ１ｔ８、ＨＥＲ１ｔ９、ＨＥＲ１ｔ１０、またはＨＥＲ１ｔ１１をコードする遺伝子を、ＣＡＲまたはＴＣＲまたはサイトカインへと、インフレームの、例えば、トセア・アシグナ（Thosea asigna）ウイルス（Ｔ２Ａ）ペプチドであるがこれらに限定されない、自己切断型ペプチドを介して、遺伝子融合させる。複数の実施形態では、Ｔ２Ａペプチドは、配列番号１５３のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。他の実施形態では、キルタグ、例えば、ＨＥＲ１ｔ、ＨＥＲ１ｔ１、ＨＥＲ１ｔ２、ＨＥＲ１ｔ３、ＨＥＲ１ｔ４、ＨＥＲ１ｔ５、ＨＥＲ１ｔ６、ＨＥＲ１ｔ７、ＨＥＲ１ｔ８、ＨＥＲ１ｔ９、ＨＥＲ１ｔ１０、またはＨＥＲ１ｔ１１をコードする遺伝子を、サイトカインへと、３’末端において、インフレームの、例えば、トセア・アシグナ（Thosea asigna）ウイルス（Ｔ２Ａ）ペプチドであるがこれらに限定されない、自己切断型ペプチドを介して、遺伝子融合させる。
【０２６２】
複数の実施形態では、両方の遺伝子を、プラスミドへとクローニングする。他の実施形態では、細胞タグを、別個のレンチウイルスベクターへとクローニングする。他の実施形態では、細胞タグ遺伝子を、ＣＡＲ遺伝子とインフレームで、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンベクター骨格へとクローニングする。さらに他の実施形態では、ＨＥＲ１ｔ、ＨＥＲ１ｔ１、ＨＥＲ１ｔ２、ＨＥＲ１ｔ３、ＨＥＲ１ｔ４、ＨＥＲ１ｔ５、ＨＥＲ１ｔ６、ＨＥＲ１ｔ７、ＨＥＲ１ｔ８、ＨＥＲ１ｔ９、ＨＥＲ１ｔ１０、またはＨＥＲ１ｔ１１などの細胞タグを、複数のＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンベクターへとクローニングする。
【０２６３】
ある特定の実施形態では、細胞タグは、シグナルペプチド、例えば、ＧＭ−ＣＳＦＲαシグナルペプチドを有し、この場合、ＧＭ−ＣＳＦＲαシグナルペプチドは、配列番号１６３のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する。ある特定の実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号１６４のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一な配列を有するＩｇＫである。ある特定の実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号１６５のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する、ＩｇＥ配列である。ある特定の実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号１６６のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する、ＣＤ８α配列である。ある特定の実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号１６７のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する、ＴＶＢ２（Ｔ２１Ａ）配列である。ある特定の実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号１６８のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する、ＣＤ５２配列である。ある特定の実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号１６９のアミノ酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する、低アフィニティー神経増殖因子受容体（ＬＮＧＦＲ、ＴＮＦＲＳＦ１６）配列である。場合によって、シグナルペプチドは、ＧＭ−ＣＳＦＲα、ＩｇＫ、ＩｇＥ、ＣＤ８α、Ｔ２１Ａ、ＣＤ５２、低アフィニティー神経増殖因子受容体、ならびにこれらの変異体および断片から選択することができる。
【０２６４】
一部の実施形態では、細胞タグは、シグナルペプチド、例えば、ＧＭ−ＣＳＦＲαシグナルペプチドを有し、この場合、ＧＭ−ＣＳＦＲαシグナルペプチドは、配列番号２０または配列番号２１の核酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列からコードされる。一部の実施形態では、細胞タグは、シグナルペプチド、例えば、ＩｇＫシグナルペプチドを有し、この場合、ＩｇＫシグナルペプチドは、配列番号２２の核酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列からコードされる。一部の実施形態では、細胞タグは、シグナルペプチド、例えば、ＩｇＥシグナルペプチドを有し、この場合、ＩｇＫシグナルペプチドは、配列番号２３の核酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列からコードされる。一部の実施形態では、細胞タグは、シグナルペプチド、例えば、ＣＤ８αシグナルペプチドを有し、この場合、ＣＤ８αシグナルペプチドは、配列番号２４または配列番号２５の核酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列からコードされる。一部の実施形態では、細胞タグは、シグナルペプチド、例えば、ＴＶＢ２（Ｔ２１Ａ）シグナルペプチドを有し、この場合、ＴＶＢ２（Ｔ２１Ａ）シグナルペプチドは、配列番号２６の核酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列からコードされる。一部の実施形態では、細胞タグは、シグナルペプチド、例えば、ＣＤ５２シグナルペプチドを有し、この場合、ＣＤ５２シグナルペプチドは、配列番号２７の核酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列からコードされる。一部の実施形態では、細胞タグは、シグナルペプチド、例えば、低アフィニティー神経増殖因子受容体（ＬＮＧＦＲ、ＴＮＦＲＳＦ１６）シグナルペプチドを有し、この場合、低アフィニティー神経増殖因子受容体（ＬＮＧＦＲ、ＴＮＦＲＳＦ１６）シグナルペプチドは、配列番号２８の核酸配列との、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列からコードされる。
【０２６５】
シグナルペプチドは、新たに合成されるタンパク質またはポリペプチドのＮ末端に位置することが典型的なアミノ酸配列であって、タンパク質またはポリペプチドを、細胞表面へと方向付けるアミノ酸配列である。一部の実施形態では、シグナルペプチドは、細胞膜へと挿入される（例えば、膜貫通ドメインを介して）ポリペプチドを、細胞表面へと方向付ける。一部の実施形態では、本明細書で記載されるポリペプチド構築物は、シグナルペプチドと共に合成されるが、次いで、成熟ポリペプチド構築物が、シグナルペプチドのアミノ酸配列を欠くように、翻訳後プロセシングされて、シグナルペプチドを切断する。他の実施形態では、シグナルペプチド配列は、切断されず、成熟ポリペプチド構築物内に残存する。
【０２６６】
本開示は、ポリペプチド構築物を、細胞表面へと方向付け、かつ／またはトラフィッキングすることが可能な、任意の、公知または未知のシグナルペプチドを含むポリペプチド構築物を提示する。例えば、一部の実施形態では、ポリペプチド構築物は、ＧＭＣＳＦＲα、Ｉｇカッパ、免疫グロブリンＥ、ＣＤ８α、ＴＶＢ２（Ｔ２１Ａ）、ＣＤ５２、または低アフィニティー神経増殖因子受容体（ＬＮＧＦＲ、ＴＮＦＲＳＦ１６）のシグナルペプチドに対応するシグナル配列を含む。
【０２６７】
複数の実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号２０〜２８からなるリストから選択されるヌクレオチド配列との、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる。複数の実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号１６３〜１６９からなるリストから選択されるアミノ酸配列との、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０２６８】
改変エフェクター細胞
本明細書で開示される遺伝子スイッチポリペプチドにより調節される、１または複数の異種遺伝子または遺伝子を発現するように改変されたエフェクター細胞（免疫エフェクター細胞ともまた称する）が提供される。
【０２６９】
本明細書で使用される「Ｔ細胞」または「Ｔリンパ球」とは、細胞媒介性免疫において、中心的な役割を果たす、リンパ球の種類である。「Ｔ細胞」または「Ｔリンパ球」は、細胞表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の存在により、Ｂ細胞およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）など、他のリンパ球と区別されうる。
【０２７０】
一部の実施形態では、改変エフェクター細胞は、Ｔ細胞および／またはナチュラルキラー細胞を含む改変免疫細胞である。Ｔ細胞またはＴリンパ球は、細胞媒介性免疫に関与する白血球の亜型である。例示的なＴ細胞は、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ＴＨ１７細胞、ステムセルメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）、ナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞、エフェクターＴ細胞、調節性Ｔ細胞、またはナチュラルキラーＴ細胞を含む。
【０２７１】
「ヘルパーＴ細胞」（ＴＨ細胞）は、Ｂ細胞の、血漿細胞およびメモリーＢ細胞への成熟、ならびに細胞傷害性Ｔ細胞およびマクロファージの活性化を含む免疫過程において、他の白血球を支援する。場合によって、ＴＨ細胞は、細胞表面上のＣＤ４糖タンパク質の発現のために、ＣＤ４＋  Ｔ細胞として公知である。ヘルパーＴ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上で発現する、ＭＨＣクラスＩＩ分子により、ペプチド抗原を提示されると、活性化する。活性化すると、ヘルパーＴ細胞は、急速に分裂し、活性の免疫応答を調節するか、またはこれらを支援する、サイトカインと呼ばれる、小型のタンパク質を分泌する。これらの細胞は、ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ３、ＴＨ１７、ＴＨ９、またはＴＦＨを含む、いくつかの亜型であって、異なるサイトカインを分泌して、異なる種類の免疫応答を容易とする、いくつかの亜型のうちの１つへと分化しうる。ＡＰＣからのシグナル伝達は、Ｔ細胞を、特定の亜型へと方向付ける。
【０２７２】
「細胞傷害性Ｔ細胞」（ＴＣ細胞またはＣＴＬ）は、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞を破壊し、また、移植片拒絶にも関与している。これらの細胞はまた、それらの表面上において、ＣＤ８糖タンパク質を発現するので、ＣＤ８＋  Ｔ細胞としても公知である。これらの細胞は、全ての有核細胞の表面上に存在する、ＭＨＣクラスＩ分子と会合する抗原に結合することにより、それらの標的を認識する。調節性Ｔ細胞により分泌される、ＩＬ−１０、アデノシン、および他の分子を介して、ＣＤ８＋細胞は、アネルギー状態へと不活化される場合があり、これにより、自己免疫疾患を防止する。
【０２７３】
「メモリーＴ細胞」は、感染が消失した後で、長期にわたり存続する、抗原特異的Ｔ細胞のサブセットである。メモリーＴ細胞は、それらのコグネイト抗原へと再曝露されると、多数のエフェクターＴ細胞へと急速に拡大増殖し、これにより、免疫系に、過去の感染に対する「メモリー」をもたらす。メモリーＴ細胞は、亜型：ステムセルメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ細胞）および２種類のエフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ細胞およびＴＥＭＲＡ細胞）を含む。メモリー細胞は、ＣＤ４＋細胞の場合もあり、ＣＤ８＋細胞の場合もある。メモリーＴ細胞は、細胞表面タンパク質である、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＡ、および／またはＣＣＲ７を発現しうる。
【０２７４】
かつては、サプレッサーＴ細胞として公知であった、「調節性Ｔ細胞」（Ｔｒｅｇ細胞）は、免疫寛容の維持において役割を果たす。調節性Ｔ細胞の主要な役割は、Ｔ細胞媒介性免疫を遮断して、免疫反応を終了させ、胸腺内の陰性選択過程を回避した自己反応性Ｔ細胞を抑制することである。
【０２７５】
「ナチュラルキラーＴ細胞」（ＮＫＴ細胞）は、養子免疫系を、自然免疫系と橋渡しする。主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子により提示されるペプチド抗原を認識する従来のＴ細胞と異なり、ＮＫＴ細胞は、ＣＤ１ｄと呼ばれる分子により提示される糖脂質抗原を認識する。活性化すると、これらの細胞は、Ｔｈ細胞およびＴｃ細胞の両方に帰せられた機能（すなわち、サイトカインの産生および細胞溶解性／細胞殺滅分子の放出）を果たしうる。ＮＫＴ細胞はまた、一部の腫瘍細胞およびヘルペスウイルスに感染した細胞を認識し、これらを消失させることも可能である。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞とは、自然免疫系の、細胞傷害性リンパ球の種類である。場合によって、ＮＫ細胞は、ウイルス感染および／または腫瘍形成に対する、最前線の防御をもたらす。ＮＫ細胞は、感染細胞上またはがん性細胞上に提示されたＭＨＣを検出することが可能であり、サイトカイン放出を誘発し、その後、溶解およびアポトーシスを誘導する。ＮＫ細胞はさらに、抗体および／またはＭＨＣの非存在下で、ストレス細胞を検出することが可能であり、これにより、迅速な免疫応答を可能とする。
【０２７６】
改変エフェクター細胞の用量
一部の実施形態では、ある量の改変エフェクター細胞を、それを必要とする対象へと投与するが、量は、サイトカインと関連する傷害作用を誘導する有効性および潜在的可能性に基づき決定する。場合によって、改変エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変エフェクター細胞約１０５〜約１０９個を含む。場合によって、改変エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変エフェクター細胞約１０５〜約１０８個を含む。場合によって、改変エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変エフェクター細胞約１０５〜約１０７個を含む。場合によって、改変エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変エフェクター細胞約１０６〜約１０９個を含む。場合によって、改変エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変エフェクター細胞約１０６〜約１０８個を含む。場合によって、改変エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変エフェクター細胞約１０７〜約１０９個を含む。場合によって、改変エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変エフェクター細胞約１０５〜約１０６個を含む。場合によって、改変エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変エフェクター細胞約１０６〜約１０７個を含む。場合によって、改変エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変エフェクター細胞約１０７〜約１０８個を含む。場合によって、改変エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変エフェクター細胞約１０８〜約１０９個を含む。場合によって、改変エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変エフェクター細胞約１０９個を含む。場合によって、改変エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変エフェクター細胞約１０８個を含む。場合によって、改変エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変エフェクター細胞約１０７個を含む。場合によって、改変エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変エフェクター細胞約１０６個を含む。場合によって、改変エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変エフェクター細胞約１０５個を含む。
【０２７７】
一部の実施形態では、改変エフェクター細胞は、改変Ｔ細胞である。一部の場合には、改変Ｔ細胞は、ＣＡＲ−Ｔ細胞である。場合によって、ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０５〜約１０９個を含む。場合によって、ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０５〜約１０８個を含む。場合によって、ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０５〜約１０７個を含む。場合によって、ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０６〜約１０９個を含む。場合によって、ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０６〜約１０８個を含む。場合によって、ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０７〜約１０９個を含む。場合によって、ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０５〜約１０６個を含む。場合によって、ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０６〜約１０７個を含む。場合によって、ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０７〜約１０８個を含む。場合によって、ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０８〜約１０９個を含む。一部の場合には、ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０９個を含む。一部の場合には、ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０８個を含む。一部の場合には、ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０７個を含む。一部の場合には、ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０６個を含む。一部の場合には、ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０５個を含む。
【０２７８】
一部の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞である。場合によって、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０５〜約１０９個を含む。場合によって、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０５〜約１０８個を含む。場合によって、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０５〜約１０７個を含む。場合によって、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０６〜約１０９個を含む。場合によって、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０６〜約１０８個を含む。場合によって、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０７〜約１０９個を含む。場合によって、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０５〜約１０６個を含む。場合によって、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０６〜約１０７個を含む。場合によって、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０７〜約１０８個を含む。場合によって、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０８〜約１０９個を含む。場合によって、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０９個を含む。場合によって、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０８個を含む。場合によって、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０７個を含む。場合によって、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０６個を含む。場合によって、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０５個を含む。
【０２７９】
一部の実施形態では、改変Ｔ細胞は、操作ＴＣＲ  Ｔ−細胞である。場合によって、操作ＴＣＲ  Ｔ−細胞の量は、１ｋｇ当たりのＴＣＲ細胞約１０５〜約１０９個を含む。場合によって、操作ＴＣＲ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＴＣＲ細胞約１０５〜約１０８個を含む。場合によって、操作ＴＣＲ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＴＣＲ細胞約１０５〜約１０７個を含む。場合によって、操作ＴＣＲ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＴＣＲ細胞約１０６〜約１０９個を含む。場合によって、操作ＴＣＲ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＴＣＲ細胞約１０６〜約１０８個を含む。場合によって、操作ＴＣＲ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＴＣＲ細胞約１０７〜約１０９個を含む。場合によって、操作ＴＣＲ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＴＣＲ細胞約１０５〜約１０６個を含む。場合によって、操作ＴＣＲ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＴＣＲ細胞約１０６〜約１０７個を含む。場合によって、操作ＴＣＲ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＴＣＲ細胞約１０７〜約１０８個を含む。場合によって、操作ＴＣＲ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＴＣＲ細胞約１０８〜約１０９個を含む。一部の場合には、操作ＴＣＲ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＴＣＲ細胞約１０９個を含む。一部の場合には、操作ＴＣＲ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＴＣＲ細胞約１０８個を含む。一部の場合には、操作ＴＣＲ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＴＣＲ細胞約１０７個を含む。一部の場合には、操作ＴＣＲ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＴＣＲ細胞約１０６個を含む。一部の場合には、操作ＴＣＲ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＴＣＲ細胞約１０５個を含む。
【０２８０】
適応
一部の実施形態では、本明細書で記載されるポリヌクレオチドをコードする改変エフェクター細胞を、障害、例えば、がんまたは感染性疾患を有する対象へと投与する方法が開示される。場合によって、がんは、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＢＣＭＡ、ＣＤ４４、α−葉酸受容体、ＣＡＩＸ、ＣＤ３０、ＲＯＲ１、ＣＥＡ、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４０、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、葉酸結合性タンパク質、ＧＤ２、ＧＤ３、ＩＬ−１３Ｒ−ａ２、ＫＤＲ、ＥＤＢ−Ｆ、メソテリン、ＣＤ２２、ＥＧＦＲ、ＭＵＣ−１、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＵＣ１６、ｈ５Ｔ４、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ−７２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ１２３、またはＶＥＧＦ−Ｒ２の発現と関連するがんである。
【０２８１】
一部の実施形態では、本明細書で記載されるポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドをコードする改変エフェクター細胞を、ＣＤ１９の過剰発現と関連するがんを有する対象へと投与する方法が開示される。一部の実施形態では、本明細書では、改変エフェクター細胞を、ＣＤ３３の過剰発現と関連するがんを有する対象へと投与する方法が開示される。一部の実施形態では、本明細書では、改変エフェクター細胞を、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＢＣＭＡ、ＣＤ４４、α−葉酸受容体、ＣＡＩＸ、ＣＤ３０、ＲＯＲ１、ＣＥＡ、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４０、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、葉酸結合性タンパク質、ＧＤ２、ＧＤ３、ＩＬ−１３Ｒ−ａ２、ＫＤＲ、ＥＤＢ−Ｆ、メソテリン、ＣＤ２２、ＥＧＦＲ、ＭＵＣ−１、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＵＣ１６、ｈ５Ｔ４、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ−７２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ１２３またはＶＥＧＦ−Ｒ２の過剰発現と関連するがんを有する対象へと投与する方法が開示される。場合によって、がんは、転移性がんである。他の場合には、がんは、再発性がんまたは不応性がんである。
【０２８２】
場合によって、がんは、充実性腫瘍または血液悪性腫瘍である。一部の場合には、がんは、充実性腫瘍である。他の場合には、がんは、血液悪性腫瘍である。場合によって、がんは、転移性がんである。場合によって、がんは、再発性がんまたは不応性がんである。
【０２８３】
一部の場合には、がんは、充実性腫瘍である。例示的な充実性腫瘍は、肛門がん；虫垂がん；胆管がん（すなわち、胆管癌）；膀胱がん；脳腫瘍；乳がん；子宮頸がん；結腸がん；原発不明がん（ＣＵＰ）；食道がん；眼がん；卵管がん；消化器がん；腎臓がん；肝臓がん；肺がん；髄芽腫；黒色腫；口腔がん；卵巣がん；膵臓がん；上皮小体疾患；陰茎がん；下垂体腫瘍；前立腺がん；直腸がん；皮膚がん；胃がん；精巣がん；咽頭がん；甲状腺がん；子宮がん；膣がん；外陰がん；または神経膠芽腫を含むがこれらに限定されない。
【０２８４】
「神経膠芽腫」または「多形性膠芽腫」（ＧＢＭ）とは、侵襲性の神経上皮性脳がんである。ＧＢＭは、神経膠型細胞、星状細胞、希突起膠細胞前駆細胞、または神経幹細胞に由来しうる。神経膠芽腫の４つの亜型が同定されている。ＧＢＭの大部分である、古典的亜型は、表皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）遺伝子の追加のコピーを保有し、大半は、表皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）の、正常より高度な発現をもたらす。症例のサブセットでは、ＥＧＦＲの増幅は、遺伝子再編成により達せられるが、これらのうちで最も一般的なのは、ＥＧＦＲ変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）である。神経膠芽腫内で突然変異することが多い遺伝子である、ＴＰ５３（ｐ５３）は、古典的亜型では、突然変異しない。前神経亜型は、ＴＰ５３（ｐ５３）、および血小板由来増殖因子受容体Ａをコードする遺伝子であるＰＤＧＦＲＡ、およびイソクエン酸デヒドロゲナーゼ１をコードする遺伝子であるＩＤＨ１において、変更の比率が高い。間葉亜型は、ニューロフィブロミン１をコードする遺伝子であるＮＦ１内の、他の種類より、高比率の突然変異または他の変更、およびＥＧＦＲ遺伝子内の少数の変更、およびＥＧＦＲの低度の発現により特徴づけられる。神経亜型は、ＮＥＦＬ、ＧＡＢＲＡ１、ＳＹＴ１、およびＳＬＣ１２Ａ５など、ニューロンマーカーの発現により典型化された。神経膠芽腫内の、他の遺伝子変更も記載されており、それらの大部分は、２つの経路である、ＲＢおよびＰＩ３Ｋ／ＡＫＴにおいてクラスター化されている。神経膠芽腫は、これらの経路のうちの、それぞれ、６８〜７８％および８８％において、変更を有する。
【０２８５】
一部の場合には、がんは、血液悪性腫瘍である。場合によって、血液悪性腫瘍は、リンパ腫、白血病、骨髄腫、またはＢ細胞性悪性腫瘍を含む。場合によって、血液悪性腫瘍は、リンパ腫、白血病、または骨髄腫を含む。一部の場合には、例示的な血液悪性腫瘍は、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、高危険性ＣＬＬ、非ＣＬＬ／ＳＬＬ性リンパ腫、前リンパ球性白血病（ＰＬＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、ワルデンシュトロームマクログロブリン血症、多発性骨髄腫、節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、非バーキット高悪性度Ｂ細胞リンパ腫、縦隔原発Ｂ細胞リンパ腫（ＰＭＢＬ）、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、脾辺縁帯リンパ腫、形質細胞骨髄腫、形質細胞腫、縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、またはリンパ腫様肉芽腫症を含む。一部の実施形態では、血液悪性腫瘍は、骨髄性白血病を含む。一部の実施形態では、血液悪性腫瘍は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）または慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を含む。
【０２８６】
一部の場合には、本明細書では、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、高危険性ＣＬＬ、非ＣＬＬ／ＳＬＬ性リンパ腫、前リンパ球性白血病（ＰＬＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、ワルデンシュトロームマクログロブリン血症、多発性骨髄腫、節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、非バーキット高悪性度Ｂ細胞リンパ腫、縦隔原発Ｂ細胞リンパ腫（ＰＭＢＬ）、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、脾辺縁帯リンパ腫、形質細胞骨髄腫、形質細胞腫、縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、またはリンパ腫様肉芽腫症から選択される血液悪性腫瘍を有する対象へと、本明細書で記載される改変エフェクター細胞を投与する方法が開示される。一部の場合には、本明細書では、ＡＭＬまたはＣＭＬから選択される血液悪性腫瘍を有する対象へと、改変エフェクター細胞を投与する方法が開示される。
【０２８７】
他の場合には、本明細書では、感染性疾患に起因する感染を有する対象へと投与する方法が開示される。感染性疾患は、細菌感染、ウイルス感染、または真菌感染から生じる疾患でありうる。他の場合には、例示的ウイルス性病原体は、アデノウイルス科（Adenoviridae）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＲＳＶ（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ）、ＪＣウイルス、ＢＫウイルス、ＨＳＶ、ＨＨＶ科のウイルス、ピコルナウイルス科（Picornaviridae）、ヘルペスウイルス科（Herpesviridae）、ヘパドナウイルス科（Hepadnaviridae）、フラビウイルス科（Flaviviridae）、レトロウイルス科（Retroviridae）、オルトミクソウイルス科（Orthomyxoviridae）、パラミクソウイルス科（Paramyxoviridae）、パポバウイルス科（Papovaviridae）、ポリオーマウイルス属（Polyomavirus）、ラブドウイルス科（Rhabdoviridae）、およびトガウイルス科（Togaviridae）の病原体を含む。例示的な病原性ウイルスは、天然痘、インフルエンザ、流行性耳下腺炎、麻疹、水痘、エボラ熱、および風疹を引き起こす。例示的な病原性真菌は、カンジダ属（Candida）、アスペルギルス属（Aspergillus）、クリプトコッカス属（Cryptococcus）、ヒストプラズマ属（Histoplasma）、ニューモシスチス属（Pneumocystis）、およびスタキボトリス属（Stachybotrys）を含む。例示的な病原性細菌は、連鎖球菌属（Streptococcus）、シュードモナス属（Pseudomonas）、赤痢菌属（Shigella）、カンピロバクター属（Campylobacter）、ブドウ球菌属（Staphylococcus）、ヘリコバクター属（Helicobacter）、大腸菌（E. coli）、リケッチア属（Rickettsia）、バチルス属（Bacillus）、ボルデテラ属（Bordetella）、クラミジア属（Chlamydia）、スピロヘータ綱（Spirochetes）、およびサルモネラ属（Salmonella）を含む。
【０２８８】
ウイルスのベースの送達系
本開示はまた、本明細書で記載される核酸を挿入したウイルスのベースの系などの送達系も提供する。代表的なウイルス発現ベクターは、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベースのベクター（例えば、Ｃｒｕｃｅｌｌ，Ｉｎｃ．（Ｌｅｉｄｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から市販されている、アデノウイルスベースのＰｅｒ．Ｃ６系）、レンチウイルスベースのベクター（例えば、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）製の、レンチウイルスベースのｐＬＰＩ）、レトロウイルスベクター（例えば、ｐＣＦＢ−ＥＧＳＨを付加したｐＦＢ−ＥＲＶ）、およびヘルペスウイルスベースのベクターを含むがこれらに限定されない。ある実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。レンチウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクターは、トランス遺伝子の、娘細胞における、長期にわたる、安定的な組込みおよびその繁殖を可能とするので、長期にわたる遺伝子導入を達成するのに適するツールである。レンチウイルスベクターは、肝細胞などの非増殖性細胞に形質導入しうるという点で、マウス白血病ウイルスなど、がんレトロウイルスに由来するベクターに優る追加の利点を有する。レンチウイルスベクターはまた、低免疫原性という追加の利点も有する。さらなる実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクターである。さらなる実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターである。一般に、かつ、複数の実施形態では、適切なベクターは、少なくとも１つの生物において機能的な複製起点、プロモーター配列、好都合な制限エンドヌクレアーゼ部位、および１または複数の選択用マーカー（例えば、国際公開第０１／９６５８４号パンフレット、国際公開第０１／２９０５８号パンフレット、および米国特許第６，３２６，１９３号明細書）を含有する。
【０２８９】
さらなる適切なベクターは、宿主細胞のＤＮＡへと、ランダムに組み込まれる場合もあり、発現ベクターと、宿主細胞の染色体との特異的組換えを可能とする組換え部位を含む場合もある、組込み用発現ベクターを含む。このような組込み用発現ベクターは、宿主細胞の染色体の内因性発現制御配列を用いて、所望のタンパク質の発現をもたらしうる。部位特異的に組み込むベクターの例は、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）（例えば、ｐｃＤＮＡ（商標）５／ＦＲＴ）製のｆｌｐ−ｉｎ系、またはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（ＬａＪｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）製のｐＥｘｃｈａｎｇｅ−６  Ｃｏｒｅ  Ｖｅｃｔｏｒｓにおいて見出されうるｃｒｅ−ｌｏｘ系などのｃｒｅ−ｌｏｘ系の構成要素を含む。宿主細胞染色体へとランダムに組み込まれるベクターの例は、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）製のｐｃＤＮＡ３．１（Ｔ抗原の非存在下で導入される場合）、およびＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）製のｐＣＩまたはｐＦＮ１０Ａ（ＡＣＴ）ＦＬＥＸＩ（商標）を含む。さらなるプロモーターエレメント、例えば、エンハンサーは、転写開始の頻度を調節する。典型的に、プロモーターエレメントは、開始部位の３０〜１１０ｂｐ上流の領域内に位置するが、多数のプロモーターは、開始部位の下流にも、機能的なエレメントを含有することが近年示されている。エレメントが、互いに対して逆位であるか、または移動している場合にも、プロモーター機能が保存されるように、プロモーターエレメントの間のスペーシングは、柔軟であることが多い。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターでは、活性が減衰し始める前に、プロモーターエレメントの間のスペーシングが、５０ｂｐの距離まで増大する場合がある。個別のエレメントは、転写を活性化させるように、プロモーターに応じて、共作動的に機能する場合もあり、独立に機能する場合もあると考えられる。
【０２９０】
適切なプロモーターの１つの例は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即初期プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それへと作動的に連結された、任意のポリヌクレオチド配列の、高レベルの発現を駆動することが可能である、強力な構成的プロモーター配列である。
【０２９１】
適切なプロモーターの別の例は、ヒト伸長成長因子１アルファ１（ｈＥＦ１ａ１）である。複数の実施形態では、本開示のＣＡＲおよび／またはＴＣＲを含むベクター構築物は、ｈＥＦ１ａ１機能的変異体を含む。
【０２９２】
しかし、サルウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＬＴＲ（ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン−バーウイルス即初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーターのほか、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、およびクレアチンキナーゼプロモーターなどであるがこれらに限定されない、ヒト遺伝子プロモーターを含むがこれらに限定されない、他の構成的プロモーター配列もまた、使用することができる。さらに、本開示は、構成的プロモーターの使用に限定されないものとする。誘導性プロモーターもまた、本開示の一部として想定される。誘導性プロモーターの使用は、このような発現が所望される場合に、それが作動的に連結されたポリヌクレオチド配列の発現をオンにするか、または発現が所望されない場合に、発現をオフにすることが可能な分子スイッチをもたらす。誘導性プロモーターの例は、メタロチオネイン（methallothionine）プロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、およびテトラサイクリンプロモーターを含むがこれらに限定されない。
誘導性プロモーターの他の例は、本明細書で記載される、組織特異的プロモーターを含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、プロモーターは、ＮＦ−κＢ結合部位（配列番号４４〜４６）、活性化Ｔ細胞核内因子（ＮＦＡＴ）応答エレメント（配列番号５１）、６部位ＧＡＬ４誘導性近位因子結合エレメント（ＰＦＢ）（配列番号６２）、またはＲＰＬ６に基づく合成５’ＵＴＲ（配列番号６４）を含む。ある特定の実施形態では、プロモーターは、ＩＬ−２コアプロモーター、ＩＬ−２最小プロモーター、ＩＬ−２エンハンサー／プロモーター変異体、（ＮＦ−κＢ）１−ＩＬ２プロモーター変異体、（ＮＦ−κＢ）３−ＩＬ２プロモーター変異体、（ＮＦ−κＢ）６−ＩＬ２プロモーター変異体、１×ＮＦＡＴ応答エレメント−ＩＬ２プロモーター変異体、３×ＮＦＡＴ応答エレメント−ＩＬ２プロモーター変異体、６×ＮＦＡＴ応答エレメント−ＩＬ２プロモーター変異体、ヒトＥＥＦ１Ａ１プロモーター変異体、ヒトＥＥＦ１Ａ１プロモーター／エンハンサー、ヒトＵＢＣプロモーター、および合成最小プロモーター１のうちの、任意の１または複数でありうる。ある特定の実施形態では、プロモーターヌクレオチドは、表２に開示されているプロモーターヌクレオチドを含む。
【０２９３】
ＣＡＲもしくはＴＣＲポリペプチドまたはこの部分の発現を評価するために、細胞へと導入される発現ベクターはまた、ウイルスベクターを介してトランスフェクトまたは感染させることが求められる細胞集団からの、発現細胞の同定および選択を容易とする、選択用マーカー遺伝子もしくはレポーター遺伝子またはこれらの両方も含有しうる。他の態様では、選択用マーカーは、別個のＤＮＡ片上に保有され、共トランスフェクション手順で使用さる場合もある。選択用マーカーおよびレポーター遺伝子のいずれも、宿主細胞内の発現を可能とするように、適切な調節配列で挟むことができる。有用な選択用マーカーは、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）およびアンピシリン耐性遺伝子などの抗生剤耐性遺伝子を含む。一部の実施形態では、切断型表皮増殖因子受容体（ＨＥＲ１ｔ）タグを、選択用マーカー遺伝子として使用することができる。
【０２９４】
レポーター遺伝子を、トランスフェクトされた可能性がある細胞を同定し、調節配列の機能性について査定するために使用することができる。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエントの生物または組織において存在しないか、またはこれらにより発現せず、その発現が、何らかの、容易に検出可能な特性、例えば、酵素活性により顕在化されるポリペプチドをコードする遺伝子である。ＤＮＡを、レシピエント細胞へと導入した後の適切な時点において、レポーター遺伝子の発現についてアッセイする。適切なレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子、または緑色蛍光タンパク質遺伝子（例えば、Ui-Tei et al., FEBS Letters 479: 79-82 (2000)）を含むことができる。適切な発現系が周知であり、公知の技法を使用して調製することもでき、市販品を購入することもできる。一般に、最高レベルのレポーター遺伝子の発現を示す、最小の５’側フランキング領域を伴う構築物は、プロモーターとして同定される。このようなプロモーター領域は、レポーター遺伝子へと連結することができ、薬剤を、プロモーター駆動型転写をモジュレートする能力について査定するのに使用することができる。
【０２９５】
いくつかの実施形態では、ベクターは、トランス遺伝子の発現を駆動するｈＥＦ１ａ１プロモーター、転写を増強するウシ成長ホルモンポリＡ配列、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）のほか、ｐＦＵＧＷプラスミドに由来するＬＴＲ配列を含む。
【０２９６】
当技術分野では、遺伝子を細胞へと導入し発現させる方法が公知である。発現ベクターの文脈では、ベクターを、当技術分野における任意の方法により、宿主細胞、例えば、哺乳動物細胞、細菌細胞、酵母細胞、または昆虫細胞へと、たやすく導入することができる。例えば、発現ベクターは、宿主細胞へと、物理的手段により導入することもでき、化学的手段により導入することもでき、生物学的手段により導入することもできる。
【０２９７】
ポリヌクレオチドを、宿主細胞へと導入するための物理的方法は、リン酸カルシウム沈殿法、リポフェクション法、遺伝子銃法、マイクロインジェクション法、電気穿孔法などを含む。当技術分野では、ベクターおよび／または外因性核酸を含む細胞を作製するための方法が周知である。例えば、Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (2001))を参照されたい。複数の実施形態では、ポリヌクレオチドを、宿主細胞へと導入するための方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションまたはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）トランスフェクションである。
【０２９８】
目的のポリヌクレオチドを、宿主細胞へと導入するための生物学的方法は、ＤＮＡベクターおよびＲＮＡベクターの使用を含む。ウイルスベクターと、とりわけ、レトロウイルスベクターとは、遺伝子を、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞へと挿入するための、最も広く使用される方法となっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルスなどに由来しうる。例えば、米国特許第５，３５０，６７４号明細書および同第５，５８５，３６２号明細書を参照されたい。
【０２９９】
ポリヌクレオチドを、宿主細胞へと導入するための化学的手段は、高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油エマルジョン、ミセル、混合型ミセル、およびリポソームを含む脂質ベースの系などのコロイド分散系を含む。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおける、送達媒体としての使用のための、例示的なコロイド状系は、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。
【０３００】
ウイルス送達系を用いる場合、例示的な送達媒体は、リポソームである。核酸の、宿主細胞への導入（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｖｏにおける）のために、脂質製剤の使用が想定される。別の態様では、核酸は、脂質と会合させることができる。脂質と会合させた核酸は、リポソームの脂質二重層内に散在する、水性のリポソーム内部に封入することもでき、リポソームおよびオリゴヌクレオチドのいずれとも会合する連結分子を介して、リポソームへと接合させることもでき、リポソーム内に取り込むこともでき、リポソームと複合体化させることもでき、脂質を含有する溶液中に分散させることもでき、脂質と混合することもでき、脂質と組み合わせることもでき、脂質中の懸濁液として含有することもでき、ミセルと共に含有するかもしくは複合体化させることもでき、または他の形で脂質と会合させることもできる。脂質、脂質／ＤＮＡ、または脂質／発現ベクターに関連する組成物は、溶液中の、任意の特定の構造に限定されない。例えば、組成物は、ミセルとしての二重層構造内に存在する場合もあり、「コラプシング」構造を伴う二重層構造内に存在する場合もある。組成物はまた、単に、溶液中に散在させることもでき、おそらく、サイズまたは形状が均質ではない凝集物を形成しうる。脂質とは、天然脂質の場合もあり、合成脂質の場合もある、脂肪性物質である。例えば、脂質は、天然では、細胞質内で発生する脂肪性液滴のほか、長鎖脂肪族炭化水素、ならびに脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール、およびアルデヒドなど、それらの誘導体を含有する化合物のクラスを含む。
【０３０１】
使用に適する脂質は、市販元から購入することができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）は、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．から購入することができ、ジセチルリン酸（「ＤＣＰ」）は、Ｋ  ＆  Ｋ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎ．Ｙ．）から購入することができ、コレステロール（「Ｃｈｏｉ」）は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｂｅｈｒｉｎｇから購入することができ、ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）および他の脂質は、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、Ａｌａ．）から購入することができる。クロロホルムまたはクロロホルム／メタノール中の脂質原液は、約−２０℃で保存することができる。クロロホルムは、メタノールよりたやすく蒸発するので、唯一の溶媒として使用される。「リポソーム」とは、封入された脂質の二重層または脂凝集物の作出により形成される、様々な単一の脂質媒体および多層性脂質媒体を包含する、一般的な用語である。リポソームは、リン脂質二重層膜および内部の水性媒質を伴う小胞構造を有するものとして特徴づけることができる。多層性リポソームは、水性媒質により分離された複数の脂質層を有する。多層性リポソームは、リン脂質を、過剰量の水溶液中に懸濁させると、自発的に形成される。脂質成分は、閉止構造を形成する前に、自己転移を経、脂質二重層の間に、水および溶解させた溶質を取り込む（Ghosh et al., Glycobiology 5: 505-10 (1991)）。しかし、溶液中に通常の小胞構造と異なる構造を有する組成物もまた、包含される。例えば、脂質は、ミセル構造を取る場合もあり、脂質分子による不均質の凝集物として存在する場合もある。また、リポフェクタミン−核酸複合体も想定される。
【０３０２】
非ウイルスベースの送達系
場合によって、本明細書で記載されるＣＡＲおよび／またはＴＣＲを発現させるための遺伝子スイッチポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた、ＤＮＡ配列を、脊椎動物の染色体へと導入するための、合成ＤＮＡトランスポゾン系を指す、「Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）トランスポゾン系」など、非ウイルスベースの送達系を使用して、Ｔ細胞へと導入することもできる。ＳＢトランスポゾン系の、一部の例示的な実施形態については、例えば、米国特許第６，４８９，４５８号明細書、同第８，２２７，４３２号明細書、同第９，２２８，１８０号明細書、および国際公開第２０１６／１４５１４６号パンフレットにおいて記載されている。Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン系は、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）トランスポザーゼおよびＳＢトランスポゾンから構成される。複数の実施形態では、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン系は、ＳＢ１１トランスポゾン系、ＳＢ１００Ｘトランスポゾン系、またはＳＢ１１０トランスポゾン系、およびこれらの他の任意の変異体を含みうる。
【０３０３】
ＤＮＡトランスポゾンは、１つのＤＮＡ部位から、別のＤＮＡ部位へと、単純なカットアンドペースト方式で転座する。転移は、規定されたＤＮＡセグメントを、１つのＤＮＡ分子から切り出し、同じＤＮＡ分子内もしくはゲノム内、または異なるＤＮＡ分子内もしくはゲノム内の別の部位へと移動させる、正確な過程である。他のＴｃ１／ｍａｒｉｎｅｒ型トランスポザーゼと同様、ＳＢトランスポザーゼも、トランスポゾンを、レシピエントＤＮＡ配列内の、ＴＡジヌクレオチド塩基対へと挿入する。挿入部位は、同じＤＮＡ分子内の別の部位の場合もあり、別のＤＮＡ分子（または染色体）内の場合もある。ヒトゲノムを含む哺乳動物ゲノムには、約２億カ所のＴＡ部位が存在する。ＴＡ挿入部位は、トランスポゾン組込みの過程において、重複される。このＴＡ配列の重複は、転移の顕著な特徴であり、一部の実験では、機構を確認するのに使用される。トランスポザーゼは、トランスポゾン内でコードされる場合もあり、トランスポザーゼは、別の供給源、例えば、ＤＮＡ供給源またはｍＲＮＡ供給源により供給される場合もあり、この場合、トランスポゾンは、非自律型エレメントとなる。非自律型トランスポゾンは、挿入の後、独立では切出しおよび再挿入を行いえないため、遺伝子ツールとして最も有用である。ＳＢトランスポゾンは、脊椎動物のゲノムへの遺伝子の導入および遺伝子治療のための非ウイルスベクターとして使用することが想定されている。略述すると、Ｔ細胞を遺伝子改変するように、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）系（Hackett et al., Mol Ther 18:674-83, (2010)）を適合させた（Cooper et al., Blood 105:1622-31, (2005)）。これは、２つのステップ：（ｉ）Ｔ細胞の特異性をリダイレクトするためのＳＢトランスポゾン［すなわち、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）］およびＳＢトランスポザーゼを発現するＤＮＡプラスミドのエレクトロトランスファー（Jin et al., Gene Ther 18:849-56, (2011)、Kebriaei et al., Hum Gene Ther 23:444-50, (2012)）、ならびに（ｉｉ）Ｋ５６２細胞株に由来するデザイナー人工抗原提示細胞（ＡａＰＣ）（ＡａＰＣ（Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｐｒｏｐａｇａｔｉｎｇ  Ｃｅｌｌ）としてもまた公知である）に接する形での、組込み配列を安定的に発現するＴ細胞の繁殖および拡大増殖を伴った。一実施形態では、ＳＢトランスポゾン系は、ｔｄＩＬ−１５、ＩＬ−２１、および／またはキメラ抗原受容体をコードするコード配列を含む。このような系については、例えば、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、Singh et al., Cancer Res (8):68 (2008). April 15, 2008およびMaiti et al., J Immunother. 36(2): 112-123 (2013)において記載されている。
【０３０４】
一部の実施形態では、ＣＡＲまたはＴＣＲ、１または複数の遺伝子スイッチポリペプチド、およびｍｂＩＬ−１５をコードするポリヌクレオチドは、１または複数のＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン内でコードされ、ＳＢトランスポザーゼは、別個のベクター内でコードされる。複数の実施形態では、ＣＤ１９特異的ＣＡＲは、トランスポゾンＤＮＡプラスミドベクター内でコードされ、ｍｂ−ＩＬ１５は、第２のトランスポゾンＤＮＡプラスミドベクター内でコードされ、ＳＢトランスポザーゼは、第３のＤＮＡプラスミドベクター内でコードされる。一部の実施形態では、ｍｂＩＬ−１５は、細胞タグと共にコードされる。細胞タグの例は、切断型表皮増殖因子受容体タグ（ＨＥＲ１ｔ）、ＨＥＲ１ｔ１、ＨＥＲ１ｔ２、ＨＥＲ１ｔ３、ＨＥＲ１ｔ４、ＨＥＲ１ｔ５、ＨＥＲ１ｔ６、ＨＥＲ１ｔ７、ＨＥＲ１ｔ８、ＨＥＲ１ｔ９、ＨＥＲ１ｔ１０、ＨＥＲ１ｔ１１、ＣＤ２０およびＣＤ２０ｔ１、ＣＤ２０タグ、あるいは枯渇スイッチもしくはキルスイッチ、またはエンリッチメントマーカーとしての使用のための、他の任意の適切な細胞タグを含みうる。細胞タグを含む、非限定的な例示的遺伝子スイッチベクター系を、図２Ａ〜２Ｄ、図３、図１９Ａ〜１９Ｂ、図２０Ａ、図２２、図２４Ａ〜２４Ｄ、および図２５Ａ〜２５Ｂに例示する。
【０３０５】
一部の実施形態では、ＨＥＲ１ｔは、ＦＤＡにより承認されているセツキシマブ、またはＨＥＲ１ｔを認識する任意の抗体の投与を介して、輸注されたＣＡＲ−Ｔ細胞の枯渇を可能とすることにより、安全性機構をもたらす。一部の実施形態では、ＣＤ２０もまた、ＦＤＡにより承認されているリツキシマブ療法の投与を介して、輸注されたＣＡＲ−Ｔ細胞の枯渇を可能とすることにより、安全性機構を可能とする。
【０３０６】
外因性核酸を、宿主細胞へと導入するか、または細胞を、本開示の阻害剤へと、他の形で曝露するのに使用される方法にかかわらず、宿主細胞内の組換えＤＮＡ配列の存在を確認するために、様々なアッセイを実施することができる。このようなアッセイは、例えば、サザンブロット法およびノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲなど、当業者に周知の分子アッセイ；例えば、免疫学的手段（ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロット）、または薬剤を同定するための、本明細書で記載されるアッセイであって、本開示の範囲内に収まるアッセイにより、特定のペプチドの有無を検出するアッセイなどの「生化学的」アッセイを含む。
【０３０７】
複数の実施形態では、ＳＢ１１トランスポゾン系、ＳＢ１００Ｘトランスポゾン系、ＳＢ１１０トランスポゾン系、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン系（例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Wilson et al, “PiggyBac Transposon-mediated Gene Transfer in Human Cells,” Molecular Therapy 15:139-145 (2007)を参照されたい）、および／またはｐｉｇｇｙＢａｔトランスポゾン系（例えば、Mitra et al., “Functional characterization of piggyBat from the bat Myotis lucifugus unveils an active mammalian DNA transposon,” Proc. Natl. Acad. Sci USA 110:234-239 (2013)を参照されたい）を使用して、本明細書で説明される改変エフェクター細胞および他の遺伝子エレメントを、細胞へと送達する。さらなるトランスポザーゼおよびトランスポゾン系については、それらの各々が、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第６，４８９，４５８号明細書、同第６，６１３，７５２号明細書、同第７，１４８，２０３号明細書、同第７，９８５，７３９号明細書、同第８，２２７，４３２号明細書、同第９，２２８，１８０号明細書、米国特許公開第２０１１／０１１７０７２号明細書、Mates et al., Nat Genet, 41(6):753-61 (2009). doi: 10.1038/ng.343. Epub 2009 May 3, Gene Ther., 18(9):849-56 (2011). doi: 10.1038/gt.2011.40. Epub 2011 Mar 31 およびIvics et al., Cell. 91(4):501-10, (1997)において提示されている。
【０３０８】
さらなる適切な非ウイルス系は、宿主細胞のＤＮＡへと、ランダムに組み込まれる場合もあり、発現ベクターと、宿主細胞の染色体との特異的組換えを可能とする組換え部位を含む場合もある、組込み用発現ベクターを含みうる。トランス遺伝子の、所定の遺伝子座への組込みのターゲティングが、多くの適用に所望される目標である。まず、部位特異的リコンビナーゼの第１の組換え部位を、ゲノム部位に、ランダムに、または所定の位置に挿入する。続いて、細胞に、目的の遺伝子またはＤＮＡ、ならびに第２の組換え部位およびリコンビナーゼの供給源（リコンビナーゼを発現させる、発現プラスミド、ＲＮＡ、タンパク質、またはウイルス）を保有するプラスミドをトランスフェクトする。第１の組換え部位と第２の組換え部位との組換えは、プラスミドＤＮＡの組込みをもたらす。
【０３０９】
このような組込み用発現ベクターは、宿主細胞の染色体の内因性発現制御配列を用いて、所望のタンパク質の発現をもたらしうる。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチド上の配列であって、組込み部位を挟む配列と相同な配列の存在により、組込みのターゲティングを促進する。例えば、本明細書で記載されるドナーポリヌクレオチドを使用する、組込みのターゲティングは、従来のトランスフェクション法、例えば、相同組換えにより、遺伝子のノックアウトまたはノックインを創出するのに使用される技法に従い達成することができる。他の実施形態では、ドナーポリヌクレオチド上の配列であって、組込み部位を挟む配列と相同な配列の存在、および部位特異的リコンビナーゼの存在下で、細胞を、ドナーポリヌクレオチドと接触させることの両方により、組込みのターゲティングを促進する。部位特異的リコンビナーゼ、または、単に、リコンビナーゼとは、その適合性の組換え部位の間の、保存的な部位特異的組換えを触媒するポリペプチドを意味する。本明細書で使用される部位特異的リコンビナーゼは、天然ポリペプチドのほか、活性を保持する誘導体、変異体、および／または断片、ならびに天然ポリヌクレオチド、活性を保持するリコンビナーゼをコードする誘導体、変異体、および／または断片を含む。
【０３１０】
本明細書ではまた、１または複数の遺伝子発現カセットを含む、宿主細胞内において異種遺伝子を組み込むための系も提示される。場合によって、系は、第１のポリペプチド構築物をコードする、第１のポリヌクレオチドを含む、第１の遺伝子発現カセットを含む。他の場合には、系は、第２のポリペプチド構築物をコードする、第２のポリヌクレオチドを含む、第２の遺伝子発現カセットを含みうる。さらに他の場合には、系は、第３の遺伝子発現カセットを含みうる。一実施形態では、遺伝子発現カセットのうちの１つは、（ｉ）トランス活性化ドメイン；（ｉｉ）核内受容体リガンド結合性ドメイン；（ｉｉｉ）ＤＮＡ結合性ドメイン；、および（ｉｖ）エクジソン受容体結合性ドメインのうちの１または複数をコードする、遺伝子スイッチポリヌクレオチドを含みうる。別の実施形態では、系は、前記宿主細胞を、セリンリコンビナーゼの存在下で、少なくとも前記第１の遺伝子発現カセットと接触させると、前記異種遺伝子が、前記宿主細胞へと組み込まれるように、組換え接合部位およびセリンリコンビナーゼをさらに含む。
【０３１１】
場合によって、系は、前記宿主細胞を、前記リガンドの存在下で接触させると、前記異種遺伝子が、前記宿主細胞内で発現するように、リガンドをさらに含む。１つの場合には、系はまた、組換え接合部位も含む。場合によって、１つの組換え接合部位は、ファージゲノム組換え接合部位（ａｔｔＰ）または細菌ゲノム組換え接合部位（ａｔｔＢ）である。１つの場合には、宿主細胞は、真核細胞である。別の場合には、宿主細胞は、ヒト細胞である。さらなる場合には、宿主細胞は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞である。
【０３１２】
一実施形態では、上記で記載した系内の異種遺伝子は、ＣＡＲを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＢＣＭＡ、ＣＤ４４、α−葉酸受容体、ＣＡＩＸ、ＣＤ３０、ＲＯＲ１、ＣＥＡ、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４０、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、葉酸結合性タンパク質、ＧＤ２、ＧＤ３、ＩＬ−１３Ｒ−ａ２、ＫＤＲ、ＥＤＢ−Ｆ、メソテリン、ＣＤ２２、ＥＧＦＲ、ＭＵＣ−１、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＵＣ１６、ｈ５Ｔ４、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ−７２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ１２３、またはＶＥＧＦ−Ｒ２のうちの少なくとも１つに結合する。
【０３１３】
別の実施形態では、系は、サイトカインを含む異種遺伝子を含む。１つの場合には、サイトカインは、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、およびＩＬ−１５とＩＬ−１５Ｒαとの融合体のうちの少なくとも１つを含む。一実施形態では、系は、少なくとも１つの細胞タグを含む異種遺伝子を含む。１つの場合には、前記細胞タグは、ＨＥＲ１ｔおよびＣＤ２０のうちの少なくとも１つを含む。一部の実施形態では、ｍｂＩＬ−１５は、細胞タグと共にコードされる。細胞タグの例は、切断型表皮増殖因子受容体タグ（ＨＥＲ１ｔ）、ＣＤ２０タグ、あるいは枯渇スイッチもしくはキルスイッチ、またはエンリッチメントマーカーとしての使用のための、他の任意の適切な細胞タグを含みうる。細胞タグの例示的な配列は、下記の通りである。
【０３１４】
【表３−１】
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【０３１５】
【表３−２】
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【０３１６】
【表３−３】
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【０３１７】
【表３−４】
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【０３１８】
【表３−５】
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【０３１９】
【表３−６】
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【０３２０】
【表３−７】
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【０３２１】
【表３−８】
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【０３２２】
【表３−９】
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【０３２３】
【表３−１０】
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【０３２４】
【表３−１１】
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【０３２５】
【表３−１２】
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【０３２６】
【表３−１３】
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【０３２７】
【表３−１４】
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【０３２８】
さらなる実施形態では、前記遺伝子発現カセットのうちの少なくとも１つは、トランス活性化ドメインにより活性化するプロモーターをコードするポリヌクレオチドを含む。さらなる実施形態では、前記系は、１または複数のベクター内に含有される。１つの場合には、系は、１つのベクター内に含有される。１つの場合には、第１の遺伝子発現カセット、第２の遺伝子発現カセット、および組換え接合部位は、１つのベクター内に含有される。１つの場合には、第１の遺伝子発現カセット、第２の遺伝子発現カセット、第３の遺伝子発現カセット、および組換え接合部位は、１つのベクター内に含有される。別の場合には、セリンリコンビナーゼは、ＳＦ３７０である。他の場合には、セリンリコンビナーゼは、別個のベクター内にある。
【０３２９】
リコンビナーゼは、標的細胞へと、ターゲティングベクターの導入の前に導入することもでき、これと共時的に導入することもでき、この後で導入することもできる。リコンビナーゼは、例えば、リポソーム、粒子のコーティング、またはマイクロインジェクションを使用して、細胞へと、タンパク質として直接導入することができる。代替的に、適切な発現ベクターを使用して、リコンビナーゼをコードするＤＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡである、ポリヌクレオチドを、細胞へと導入することもできる。上記で記載したターゲティングベクターの構成要素は、目的のリコンビナーゼをコードする配列を含有する発現カセットの構築において有用である。しかし、リコンビナーゼの発現は、他の方式で、例えば、リコンビナーゼの発現を、調節可能なプロモーター（すなわち、その発現を選択的に誘導または抑制しうるプロモーター）の制御下に置くことにより調節することもできる。
【０３３０】
本開示の実施における使用のためのリコンビナーゼは、組換えにより作製することもでき、既に記載された通りに精製することもできる。所望のリコンビナーゼ活性を有するポリペプチドは、当技術分野で公知の方法であって、タンパク質の硫酸アンモニウム沈殿の方法、サイズ分画、アフィニティークロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、イオン交換クロマトグラフィー、ヘパリンアガロースアフィニティークロマトグラフィー（例えば、Thorpe & Smith, Proc. Nat. Acad. Sci. 95:5505-5510, 1998）を含むがこれらに限定されないタンパク質精製の方法により、所望の純度まで精製することができる。
【０３３１】
一実施形態では、リコンビナーゼを、任意の適切な方法による組換えが所望される組換え接合部位を含有する真核細胞へと導入することができる。当技術分野では、例えば、マイクロインジェクションまたは他の方法により、機能的タンパク質を、細胞へと導入する方法が周知である。精製リコンビナーゼタンパク質の導入は、タンパク質の一過性の存在、およびその機能を確保するが、これは、好ましい実施形態であることが多い。代替的に、リコンビナーゼをコードする遺伝子は、細胞を形質転換するのに使用される発現ベクターであって、リコンビナーゼをコードするポリヌクレオチドを、真核細胞内のポリヌクレオチドの発現を媒介するプロモーターに作動可能に連結した、発現ベクター内に含まれうる。リコンビナーゼポリペプチドはまた、リコンビナーゼポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡによっても、真核細胞へと導入することができる。リコンビナーゼは、核酸断片の、改変されるゲノムへの挿入に必要であるような時間の間だけ存在することが一般に好ましい。したがって、大半の発現ベクターと関連する永続性の欠如は、有害ではないと予測される。リコンビナーゼ遺伝子を、目的の外因性ポリヌクレオチドの導入の前に導入することもでき、これと同時に導入することもでき、この後で導入することもできる。一実施形態では、リコンビナーゼ遺伝子は、挿入されるポリヌクレオチドを保有するベクター内に存在し、リコンビナーゼ遺伝子はなお、ポリヌクレオチド内にも、組み入れることができる。他の実施形態では、リコンビナーゼ遺伝子を、トランスジェニックの真核生物へと導入する。リコンビナーゼを、構成的に、あるいは細胞特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、発生特異的プロモーター、細胞小器官特異的プロモーター、または低分子誘導性プロモーターもしくは低分子抑制性プロモーター下で発現させる、トランスジェニック細胞またはトランスジェニック動物を作製することができる。リコンビナーゼはまた、他のペプチド、タンパク質、核局在化シグナルペプチド、シグナルペプチド、または細胞小器官特異的シグナルペプチド（例えば、ミトコンドリア内またはクロロプラスト内の組換えを容易とする、ミトコンドリアまたはクロロプラストにおけるトランジットペプチド）との融合タンパク質としても発現させることができる。
【０３３２】
例えば、リコンビナーゼは、インテグラーゼファミリーまたはリゾルバーゼファミリーに由来しうる。リコンビナーゼのインテグラーゼファミリーは、１００を超えるメンバーを有し、例えば、ＦＬＰ、Ｃｒｅ、およびラムダインテグラーゼを含む。インテグラーゼファミリーはまた、チロシンファミリーまたはラムダインテグラーゼファミリーとも称し、ＤＮＡのホスホジエステル結合に対する求核攻撃のために、チロシンの触媒性ヒドロキシル基を使用する。典型的に、チロシンファミリーのメンバーはまず、ＤＮＡにニックを入れ、これにより、その後、二重鎖切断を形成する。チロシンファミリーインテグラーゼの例は、Ｃｒｅインテグラーゼ、ＦＬＰインテグラーゼ、ＳＳＶ１インテグラーゼ、およびラムダ（λ）インテグラーゼを含む。セリンリコンビナーゼファミリーとしてもまた公知の、リゾルバーゼファミリーでは、保存性セリン残基が、ＤＮＡ標的部位への共有結合性連結を形成する（Grindley, et al., (2006) Ann Rev Biochem 16:16）。
【０３３３】
一実施形態では、リコンビナーゼは、ＳＰβｃ２リコンビナーゼ、ＳＦ３７０．１リコンビナーゼ、Ｂｘｂ１リコンビナーゼ、Ａ１１８リコンビナーゼ、およびΦＲｖ１リコンビナーゼからなる群から選択されるリコンビナーゼをコードする核酸配列を含む、単離ポリヌクレオチド配列である。セリンリコンビナーゼの例については、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第９，０３４，６５２号明細書において詳細に記載されている。
【０３３４】
一実施形態では、部位特異的組換えのための方法は、第１の組換え部位および第２の組換え部位を用意するステップと、第１の組換え部位および第２の組換え部位を、原核細胞のリコンビナーゼポリペプチドと接触させる結果として、組換え部位の間の組換えをもたらすステップとを含み、リコンビナーゼポリペプチドは、第１の組換え部位と、第２の組換え部位との組換えを媒介することが可能であり、第１の組換え部位は、ａｔｔＰまたはａｔｔＢであり、第２の組換え部位は、ａｔｔＢまたはａｔｔＰであり、第１の組換え接合部位が、ａｔｔＢである場合、第２の組換え接合部位は、ａｔｔＰであり、第１の組換え接合部位が、ａｔｔＰである場合、第２の組換え接合部位は、ａｔｔＢであるという条件で、リコンビナーゼは、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）のファージリコンビナーゼ、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）のファージリコンビナーゼ、枯草菌（Bacillus subtilis）のファージリコンビナーゼ、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）のファージリコンビナーゼ、およびスメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）のファージリコンビナーゼからなる群から選択される。さらなる実施形態は、部位特異的リコンビナーゼの、ゲノムが改変される細胞への導入を提供する。一実施形態は、真核細胞内の部位特異的組換えを得るための方法であって、第１の組換え接合部位および第２の組換え接合部位を含む真核細胞を用意するステップと、第１の組換え接合部位および第２の組換え接合部位を、原核細胞のリコンビナーゼポリペプチドと接触させる結果として、組換え接合部位の間の組換えをもたらすステップとを含み、リコンビナーゼポリペプチドが、第１の組換え接合部位と、第２の組換え接合部位との組換えを媒介することが可能であり、第１の組換え接合部位が、ファージゲノムの組換え接合部位（ａｔｔＰ）、または細菌ゲノムの組換え接合部位（ａｔｔＢ）であり、第２の組換え接合部位が、ａｔｔＢまたはａｔｔＰであり、第１の組換え接合部位が、ａｔｔＢである場合、第２の組換え接合部位が、ａｔｔＰであり、第１の組換え接合部位が、ａｔｔＰである場合、第２の組換え接合部位が、ａｔｔＢであるという条件で、リコンビナーゼが、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）のファージリコンビナーゼ、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）のファージリコンビナーゼ、枯草菌（Bacillus subtilis）のファージリコンビナーゼ、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）のファージリコンビナーゼ、およびスメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）のファージリコンビナーゼからなる群から選択される、方法に関する。ある実施形態では、リコンビナーゼは、Ａ１１８リコンビナーゼ、ＳＦ３７０．１リコンビナーゼ、ＳＰβｃ２リコンビナーゼ、ΦＲｖ１リコンビナーゼ、およびＢｘｂ１リコンビナーゼからなる群から選択される。一実施形態では、組換えは、組込みを結果としてもたらす。
【０３３５】
免疫エフェクター細胞の供給源
ある特定の態様では、本明細書で記載される実施形態は、リダイレクトされた、抗原特異的免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはＮＫ  Ｔ細胞）を作り出し、かつ／またはこれを拡大増殖させる方法であって、細胞に、ＣＡＲをコードするＤＮＡ（またはＲＮＡ）構築物を含有する発現ベクターによりトランスフェクトし、次いで、任意選択で、細胞を、フィーダー細胞、組換え抗原、または受容体に対する抗体で刺激して、細胞を増殖させるステップを含む方法を含む。ある特定の態様では、ＣＡＲまたはＴＣＲを発現するように操作された細胞（または細胞集団）は、幹細胞、ｉＰＳ細胞、免疫エフェクター細胞、またはこれらの細胞の前駆細胞である。
【０３３６】
免疫エフェクター細胞の供給源は、同種供給源および自家供給源の両方を含みうる。場合によって、免疫エフェクター細胞は、幹細胞または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から分化させることもできる。したがって、実施形態に従い操作するための細胞は、臍帯血、末梢血、ヒト胚性幹細胞、またはｉＰＳＣから単離することができる。例えば、同種Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体を含むように（そして、任意選択で、機能的なＴＣＲを欠くように）改変することができる。一部の態様では、免疫エフェクター細胞は、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に由来するＴ細胞などの初代ヒトＴ細胞である。ＰＢＭＣは、末梢血から回収することもでき、Ｇ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）による刺激の後で、骨髄または臍帯血から回収することもできる。トランスフェクションまたは形質導入（例えば、ＣＡＲ発現構築物の）の後、細胞を、速やかに輸注することもでき、凍結保存することもできる。ある特定の態様では、トランスフェクションの後、細胞は、細胞への遺伝子導入後、約１、２、３、４、５日間またはこれを超える日数以内に、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、バルク集団として、数日間、数週間、または数カ月間にわたり繁殖させることができる。さらなる態様では、トランスフェクションの後、トランスフェクト細胞を、クローニングし、組み込まれるか、またはエピソーム内に維持された、単一の発現カセットまたはプラスミドの存在、およびキメラ抗原受容体の発現を裏付けるクローンを、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて拡大増殖させる。拡大増殖のために選択されたクローンは、抗原を発現する標的細胞を特異的に認識し、溶解させる能力を裏付ける。組換えＴ細胞は、ＩＬ−２または共通のガンマ鎖に結合する他のサイトカイン（例えば、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、および他のサイトカイン）を伴う刺激により拡大増殖させることができる。組換えＴ細胞は、人工抗原提示細胞を伴う刺激により拡大増殖させることができる。組換えＴ細胞は、人工抗原提示細胞に接する形で拡大増殖させることもでき、Ｔ細胞表面上のＣＤ３を架橋する、ＯＫＴ３などの抗体により拡大増殖させることもできる。組換えＴ細胞のサブセットは、磁気ビーズベースの単離法および／または蛍光活性化細胞分取技術の使用により、さらに選択することができ、ＡａＰＣと共にさらに培養することができる。さらなる態様では、遺伝子改変細胞は、凍結保存することができる。
【０３３７】
Ｔ細胞はまた、末梢血、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位に由来する組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍（腫瘍浸潤リンパ球）を含む、多数の供給源からも得ることができる。本開示の、ある特定の実施形態では、当技術分野において入手可能な、任意の数のＴ細胞株を使用することができる。本開示の、ある特定の実施形態では、Ｔ細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標）分離など、当業者に公知の、任意の数の技法を使用して、対象から回収された血液単位から得ることができる。複数の実施形態では、個体の循環血液に由来する細胞は、アフェレーシスにより得る。アフェレーシス生成物は、典型的に、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球、および血小板を含むリンパ球を含有する。一実施形態では、アフェレーシスにより回収された細胞を洗浄して、血漿画分を除去し、細胞を、その語における加工ステップのために、適切な緩衝液中または培地中に入れる。本開示の一実施形態では、細胞を、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄する。代替的な実施形態では、洗浄液は、カルシウムを欠き、マグネシウムを欠く場合もあり、全てではないが、多くの二価カチオンを欠く場合もある。カルシウムの非存在下における初期活性化ステップは、活性化の強化をもたらす。当業者がたやすく理解する通り、洗浄ステップは、製造元の指示書に従い、半自動式「フロースルー」型遠心分離機（例えば、Ｃｏｂｅ  ２９９１細胞プロセッサー、Ｂａｘｔｅｒ  ＣｙｔｏＭａｔｅ、またはＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｅｌｌ  Ｓａｖｅｒ  ５）を使用することなど、当業者に公知の方法により達することができる。洗浄の後、細胞を、例えば、Ｃａ２＋非含有ＰＢＳ、Ｍｇ２＋非含有ＰＢＳ、Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ  Ａ、または緩衝液を伴うかもしくは伴わない、他の生理食塩液溶液など、様々な生体適合性の緩衝液中に再懸濁させることができる。代替的に、アフェレーシス試料の、所望されない構成要素を除去し、細胞を、培養培地中に、直接再懸濁させることもできる。
【０３３８】
別の実施形態では、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（登録商標）勾配を介する遠心分離、または対向流遠心溶出により、赤血球を溶解させ、単球を枯渇させることにより、Ｔ細胞を、末梢血リンパ球から単離する。ＣＤ３＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、およびＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞など、Ｔ細胞の特異的亜集団も、陽性選択法または陰性選択法により、さらに単離することができる。例えば、一実施形態では、Ｔ細胞を、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ−４５０  ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｔなどの、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（すなわち、３×２８）コンジュゲートビーズを伴う、所望のＴ細胞陽性選択に十分な時間にわたるインキュベーションにより単離する。一実施形態では、時間は、約３０分間である。さらなる実施形態では、時間は、３０分間〜３６時間、またはこれより長い時間、およびこれらの間の任意の整数値の時間の範囲である。さらなる実施形態では、時間は、少なくとも１、２、３、４、５、または６時間である。さらに別の実施形態では、時間は、１０〜２４時間である。一実施形態では、インキュベーション時間は、２４時間である。白血病を伴う患者からのＴ細胞の単離ための、２４時間など、長いインキュベーション時間の使用は、細胞収率を増大させうる。腫瘍組織または免疫障害個体から、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を単離する状況など、Ｔ細胞が、他の細胞型と比較して少数である、任意の状況においては、より長いインキュベーション時間を使用してＴ細胞を単離することができる。さらに、長いインキュベーション時間の使用は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞の捕捉効率も増加させうる。したがって、単に、時間を短くするかまたは長くすることにより、Ｔ細胞を、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズに結合させることが可能となり、かつ／またはビーズの、Ｔ細胞に対する比（本明細書で、さらに記載される通り）を増加もしくは減少させることにより、Ｔ細胞の亜集団を、培養の開始時、もしくは工程中の他の時点において、優先的に、陽性もしくは陰性に選択することができる。加えて、ビーズ上または他の表面上の、抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８抗体の比を増加または減少させることにより、Ｔ細胞の亜集団を、培養の開始時、または他の所望の時点において、優先的に、陽性または陰性に選択することができる。当業者は、本開示の文脈では、複数ラウンドにわたる選択もまた、使用しうることを認識するであろう。ある特定の実施形態では、選択手順を実施し、「選択されなかった」細胞を、活性化工程および拡大増殖工程において使用することも所望でありうる。「選択されなかった」細胞はまた、さらなるラウンドにわたる選択にかけることもできる。
【０３３９】
陰性選択によるＴ細胞集団の濃縮は、陰性選択された細胞に固有の表面マーカーを指向する抗体の組合せにより達することができる。１つの方法は、陰性選択された細胞上に存在する細胞表面マーカーを指向する、モノクローナル抗体のカクテルを使用する、細胞分取および／または陰性の磁気免疫接着もしくはフローサイトメトリーを介する選択である。例えば、ＣＤ４＋細胞を、陰性選択により濃縮するために、モノクローナル抗体カクテルは、典型的に、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ−ＤＲ、およびＣＤ８に対する抗体を含む。ある特定の実施形態では、典型的に、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＧＩＴＲ＋、およびＦｏｘＰ３＋を発現する調節性Ｔ細胞を、濃縮または陽性選択することが所望でありうる。代替的に、ある特定の実施形態では、調節性Ｔ細胞を、抗ＣＤ２５コンジュゲートビーズまたは他の同様の選択法により枯渇させることができる。
【０３４０】
陽性選択または陰性選択により、所望の細胞集団を単離するために、細胞の濃度および表面（例えば、ビーズなどの粒子）を変動させることができる。ある特定の実施形態では、ビーズと細胞とを、併せて混合する容量を著明に減少させて（すなわち、細胞の濃度を増加させて）、細胞とビーズとの最大の接触を確保することが所望でありうる。例えば、一実施形態では、１ｍｌ当たりの細胞２０億個の濃度を使用する。一実施形態では、１ｍｌ当たりの細胞１０億個の濃度を使用する。さらなる実施形態では、１ｍｌ当たりの細胞１億個を超える濃度を使用する。さらなる実施形態では、１ｍｌ当たりの細胞１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万、または５０００万個の細胞濃度を使用する。さらに別の実施形態では、１ｍｌ当たりの細胞７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万、または１億個の細胞濃度を使用する。さらなる実施形態では、１ｍｌ当たりの細胞１億２５００万または１億５０００万個の濃度を使用しうる。高濃度の使用は、細胞の収量、細胞の活性化、および細胞の拡大増殖の増大を結果としてもたらしうる。さらに、高細胞濃度の使用は、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞、または多くの腫瘍細胞（すなわち、白血病性血液、腫瘍組織など）が存在する試料に由来する細胞など、目的の標的抗原の発現が低度でありうる細胞の、より効率的な捕捉を可能とする。このような細胞集団は、治療的価値を有する可能性があり、得ることが所望であろう。例えば、高細胞濃度の使用は、ＣＤ２８の発現が通常低度である、ＣＤ８＋Ｔ細胞の、より効率的な選択を可能とする。
【０３４１】
関連する実施形態では、低濃度の細胞を使用することが所望でありうる。Ｔ細胞と表面（例えば、ビーズなどの粒子）との混合物を、著明に希釈することにより、粒子と細胞との相互作用を最小化する。これは、粒子に結合する、高量の所望の抗原を発現する細胞を選択する。例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、高レベルのＣＤ２８を発現し、希釈濃度のＣＤ８＋Ｔ細胞より効率的に捕捉される。一実施形態では、使用される細胞濃度は、１ｍｌ当たりの細胞５×１０６個である。他の実施形態では、使用される濃度は、１ｍｌ当たりの細胞約１×１０５個〜１ｍｌ当たりの細胞１×１０６個、およびこれらの間の任意の整数値でありうる。
【０３４２】
他の実施形態では、細胞は、速度を変動させて、２〜１０℃または室温で、長さを変動させる時間にわたり、ロテーター上でインキュベートすることができる。
【０３４３】
刺激されるＴ細胞はまた、洗浄ステップの後で、凍結させることもできる。血漿および血小板を除去する洗浄ステップの後で、細胞を、凍結用溶液中に懸濁させることができる。当技術分野では、多くの凍結用溶液および凍結パラメータが公知であり、この文脈でも有用であろうが、１つの方法は、２０％のＤＭＳＯおよび８％のヒト血清アルブミンを含有するＰＢＳ、もしくは１０％のデキストラン４０および５％のデキストロース、２０％のヒト血清アルブミン、ならびに７．５％のＤＭＳＯを含有する培養培地、もしくは３１．２５％のＰｌａｓｍａｌｙｔｅ−Ａ、３１．２５％のデキストロース５％、０．４５％のＮａＣｌ、１０％のデキストラン４０および５％のデキストロース、２０％のヒト血清アルブミン、ならびに７．５％のＤＭＳＯ、または例えば、ＨｅｓｐａｎおよびＰｌａｓｍａｌｙｔｅ  Ａを含有する、他の適切な細胞凍結用培地の使用を伴い、次いで、細胞を、１分間当たり１℃の速度で、−８０℃へと凍結させ、液体窒素保管タンクの蒸気相中で保存する。制御型凍結の他の方法を使用しうるほか、−２０℃または液体窒素中における速やかな非制御型凍結も使用しうる。
【０３４４】
ある特定の実施形態では、凍結保存された細胞を、本明細書で記載される通りに、融解させ、洗浄し、本開示の方法を使用する活性化の前に、室温で、１時間にわたり休眠させる。
【０３４５】
本開示の文脈ではまた、本明細書で記載される、拡張細胞が必要とされうる時点より前の時期における、血液試料またはアフェレーシス生成物の、対象からの回収も想定される。したがって、拡大増殖させる細胞の供給源は、任意の必要な時点において回収することができ、Ｔ細胞など、所望の細胞を、本明細書で記載されるＴ細胞療法などのＴ細胞療法から利益を得る、任意の数の疾患または状態のためのＴ細胞療法におけるその後の使用のために、単離し、凍結させることができる。一実施形態では、血液試料またはアフェレーシスを、一般に、健常対象から採取する。ある特定の実施形態では、血液試料またはアフェレーシスを、一般に、疾患を発症する危険性があるが、疾患をいまだ発症していない健常対象から採取し、目的の細胞を、その後の使用のために単離し、凍結させる。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞を、その後の時点において、拡大増殖させ、凍結させ、使用することができる。ある特定の実施形態では、試料を、患者から、本明細書で記載される特定の疾患についての診断の直後であるが、任意の処置の前において回収する。さらなる実施形態では、細胞を、ナタリズマブ、エファリズマブ、抗ウイルス剤、化学療法、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸塩、およびＦＫ５０６などの免疫抑制剤、抗体、またはＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体、シトキサン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、および照射など、他の免疫除去剤などの薬剤による処置を含むがこれらに限定されない、任意の数の妥当な処置モダリティーの前に、対象に由来する血液試料またはアフェレーシスから単離する。これらの薬物は、カルシウム依存性ホスファターゼである、カルシニューリン（シクロスポリンおよびＦＫ５０６）を阻害するか、または、増殖因子誘導性シグナル伝達に重要なｐ７０Ｓ６キナーゼを阻害する（ラパマイシン）（Liu et al., Cell 66:807-815, (1991)、Henderson et al., Immun 73:316-321, (1991)、Bierer et al., Curr. Opin. Immun 5:763-773, (1993)）。さらなる実施形態では、細胞を、患者のために単離し、骨髄移植または幹細胞移植、フルダラビンなどの化学療法剤、外部ビーム放射線療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミド、またはＯＫＴ３もしくはＣＡＭＰＡＴＨなどの抗体を使用するＴ細胞除去療法を伴う（例えば、この前に、これと同時に、またはこの後で）その後の使用のために凍結させる。別の実施形態では、細胞を、あらかじめ単離し、ＣＤ２０と反応する薬剤、例えば、ＲｉｔｕｘａｎなどのＢ細胞除去療法の後における処置のためのその後の使用のために凍結させることができる。
【０３４６】
本開示の、さらなる実施形態では、Ｔ細胞を、処置後における患者から直接得る。この点で、ある特定のがん処置、特に、免疫系を損なう薬物による処置の後であって、患者が通常、処置から回復する期間中の、処置の直後である、処置の後において、得られるＴ細胞お品質は、最適でありうるか、またはｅｘ  ｖｉｖｏにおいて拡大増殖するそれらの能力について改善されうることが観察されている。同様に、本明細書で記載される方法を使用する、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける操作の後、これらの細胞は、生着の延長、およびｉｎ  ｖｉｖｏにおける拡大増殖に好ましい状態でありうる。したがって、本開示の文脈内では、この回復期において、Ｔ細胞、樹状細胞、または他の造血系列の細胞を含む血液細胞を回収することが想定される。さらに、ある特定の実施形態では、動員（例えば、ＧＭ−ＣＳＦによる動員）レジメンおよびコンディショニングレジメンを使用して、対象において、とりわけ、治療後における規定された時間窓において、特定の細胞型の再増殖、再循環、再生、および／またはぞうが好適となる条件を創出することができる。例示的な細胞型は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、および免疫系の他の細胞を含む。
【０３４７】
Ｔ細胞の活性化および拡大増殖
ある特定の実施形態では、本明細書で記載される、インターロイキン、ＣＡＲ、および／またはＴＣＲを発現させるための遺伝子スイッチポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むＴ細胞が提供される。所望のＣＡＲを発現するようにＴ細胞を遺伝子改変する前であれ後であれ、Ｔ細胞は、一般に、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号明細書；同第６，５３４，０５５号明細書；同第６，９０５，６８０号明細書；同第６，６９２，９６４号明細書；同第５，８５８，３５８号明細書；同第６，８８７，４６６号明細書；同第６，９０５，６８１号明細書；同第７，１４４，５７５号明細書；同第７，０６７，３１８号明細書；同第７，１７２，８６９号明細書；同第７，２３２，５６６号明細書；同第７，１７５，８４３号明細書；同第５，８８３，２２３号明細書；同第６，９０５，８７４号明細書；同第６，７９７，５１４号明細書；同第６，８６７，０４１号明細書；および米国特許出願公開第２００６０１２１００５号明細書において記載されている方法を使用して活性化させ、拡大増殖させることができる。
【０３４８】
「養子Ｔ細胞移入」とは、腫瘍特異的Ｔ細胞の単離およびｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおける拡大増殖であって、ワクチン接種単独または患者の天然の腫瘍応答により得られうる数の細胞より大きな数のＴ細胞を達成する、単離および拡大増殖を指す。次いで、それらの免疫系に、がんに攻撃し、これらを死滅させうるＴ細胞を介して、残りの腫瘍を圧倒する能力をもたらそうとする試みにおいて、がんを伴う患者へと、腫瘍特異的Ｔ細胞を輸注する。がん処置のための、養子Ｔ細胞療法の多くの形態であって、腫瘍浸潤リンパ球またはＴＩＬを培養する形態と、１つの特定のＴ細胞またはクローンを単離および拡大増殖させる形態とが使用されており、なお、腫瘍を強力に認識し、これらに攻撃するように操作されたＴ細胞を使用する形態も使用されている。一部の態様では、養子Ｔ細胞療法は、改変され、患者へと速やかに輸注され、これにより、抗原特異的Ｔ細胞の、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける拡大増殖が、患者の中で生じることを可能とする、操作された抗原特異的Ｔ細胞を含みうる。
【０３４９】
場合によって、本明細書で記載されるＴ細胞を、Ｔ細胞の表面上の共刺激分子を刺激する、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体と関連するシグナルおよびリガンドを刺激する薬剤を、それへと接合させた表面と接触させることにより活性化および／または拡大増殖させる。特に、Ｔ細胞集団は、本明細書で記載される通り、表面上に固定化させた、抗ＣＤ３抗体、もしくはこの抗原結合性断片、または抗ＣＤ２抗体との接触、あるいはカルシウムイオノフォアを伴う、タンパク質キナーゼＣ活性化因子（例えば、ブリオスタチン）との接触などにより刺激することができる。Ｔ細胞表面上のアクセサリー分子を共刺激するために、アクセサリー分子に結合するリガンドを使用する。例えば、Ｔ細胞の集団は、Ｔ細胞の増殖を刺激するために適切な条件下で、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体と接触させることができる。ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を刺激するには、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体と接触させることができる。抗ＣＤ２８抗体の例は、９．３、Ｂ−Ｔ３、ＸＲ−ＣＤ２８（Ｄｉａｃｌｏｎｅ、Ｂｅｓａｎｃｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）を含み、当技術分野で一般に公知の他の方法と同様に使用することができる（Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, (1998)、Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):13191328, (1999)、Garland et al., J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, (1999)）。
【０３５０】
ある特定の実施形態では、Ｔ細胞のための一次刺激シグナルおよび共刺激シグナルは、異なるプロトコールによりもたらされる。例えば、各シグナルをもたらす薬剤は、溶液中とする場合もあり、表面へとカップリングさせる場合もある。表面へとカップリングさせる場合、薬剤は、同じ表面へとカップリングさせることもでき（すなわち、「シス」構成）、別個の表面へとカップリングさせることもできる（すなわち、「トランス」構成）。代替的に、１つの薬剤を、表面へとカップリングさせ、他の薬剤を、溶液中とすることもできる。一実施形態では、共刺激シグナルをもたらす薬剤を、細胞表面に結合させ、一次活性化シグナルをもたらす薬剤を、溶液とするか、または表面へとカップリングさせる。ある特定の実施形態では、いずれの薬剤も、溶液中とする。別の実施形態では、薬剤は、可溶性形態であることが可能であり、次いで、Ｆｃ受容体もしくは抗体、または薬剤に結合する他の結合剤を発現する細胞などの表面へと架橋される。この点で、本開示における、Ｔ細胞の活性化および拡大増殖における使用のために想定される人工抗原提示細胞（ＡａＰＣ）については、例えば、米国特許出願公開第２００４０１０１５１９号明細書および同２００６００３４８１０号明細書を参照されたい。
【０３５１】
一実施形態では、２つの薬剤を、同じビーズ上に、すなわち、「シス」であるか、または別個のビーズへと、すなわち、「トランス」である、ビーズ上に固定化させる。例を目的として述べると、一次活性化シグナルをもたらす薬剤は、抗ＣＤ３抗体またはこの抗原結合性断片であり、共刺激シグナルをもたらす薬剤は、抗ＣＤ２８抗体またはこの抗原結合性断片であり、両方の薬剤を、等分子量で、同じビーズへと、共固定化させる。一実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞の拡大増殖およびＴ細胞の増殖のために、ビーズへと結合させた各抗体の、１：１の比を使用する。本開示のある特定の態様では、ビーズへと結合させた抗ＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比を、１：１の比を使用して観察される拡大増殖と比較した、Ｔ細胞の拡大増殖の増大が観察されるように使用する。特定の一実施形態では、１：１の比を使用して観察される拡大増殖と比較した、約１〜約３倍の増大が観察される。一実施形態では、ビーズへと結合させたＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比は、１００：１〜１：１００、およびこれらの間の全ての整数値の範囲である。本開示の一態様では、抗ＣＤ３抗体より多くの抗ＣＤ２８抗体を、粒子へと結合させる、すなわち、ＣＤ３：ＣＤ２８の比は、１未満である。本開示のある特定の実施形態では、抗ＣＤ２８抗体の、ビーズへと結合させた抗ＣＤ３に対する比は、２：１を超える。特定の一実施形態では、ビーズへと結合させたＣＤ３：ＣＤ２８の、１：１００の比を使用する。別の実施形態では、ビーズへと結合させたＣＤ３：ＣＤ２８の、１：７５の比を使用する。さらなる実施形態では、ビーズへと結合させたＣＤ３：ＣＤ２８の、１：５０の比を使用する。別の実施形態では、ビーズへと結合させたＣＤ３：ＣＤ２８の、１：３０の比を使用する。複数の実施形態では、ビーズへと結合させたＣＤ３：ＣＤ２８の、１：１０の比を使用する。別の実施形態では、ビーズへと結合させたＣＤ３：ＣＤ２８の、１：３の比を使用する。さらに別の実施形態では、ビーズへと結合させたＣＤ３：ＣＤ２８の、３：１の比を使用する。
【０３５２】
１：５００〜５００：１、およびこれらの間の任意の整数値である、粒子の、細胞に対する比を使用して、Ｔ細胞または他の標的細胞を刺激することができる。当業者がたやすく理解しうる通り、粒子の、細胞に対する比は、標的細胞と比べた粒子サイズに依存しうる。例えば、小型サイズのビーズが、少数の細胞だけに結合しうるのに対し、大型のビーズは、多くの細胞に結合しうるであろう。ある特定の実施形態では、細胞の、粒子に対する比は、１：１００〜１００：１、およびこれらの間の任意の整数値の範囲であり、さらなる実施形態では、比は、１：９〜９：１、およびこれらの間の任意の整数値を含み、これらもまた、Ｔ細胞を刺激するのに使用しうる。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８カップリング粒子の、Ｔ細胞に対する比であって、Ｔ細胞の刺激を結果としてもたらす比は、上記で言及した通り、変動しうるが、ある特定の値は、１：１００、１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、および１５：１を含み、１つの比は、Ｔ細胞あたり少なくとも１：１の粒子である。一実施形態では、１：１またはこれ未満の、粒子の、細胞に対する比を使用する。特定の一実施形態では、粒子：細胞比は、１：５である。さらなる実施形態では、粒子の、細胞に対する比は、刺激日に応じて変動しうる。例えば、一実施形態では、粒子の、細胞に対する比は、１日目には、１：１〜１０：１であり、さらなる粒子を、細胞へと、その後、最長１０日間にわたり、毎日または隔日で追加し、最終的な比を１：１〜１：１０とする（追加日における細胞カウントに基づく）。特定の一実施形態では、粒子の、細胞に対する比は、第１の刺激日には、１：１であり、第３の刺激日および第５の刺激日には、１：５へと調整される。別の実施形態では、粒子を、１日目における、１：１の最終比、ならびに第３の刺激日および第５の刺激日における１：５へと、毎日または隔日で追加する。別の実施形態では、粒子の、細胞に対する比は、第１の刺激日には、２：１であり、第３の刺激日および第５の刺激日には、１：１０へと調整される。別の実施形態では、粒子を、１日目における、１：１の最終比、ならびに第３の刺激日および第５の刺激日における１：１０へと、毎日または隔日で追加する。当業者は、様々な他の比も、本開示における使用に適しうることを理解するであろう。特に、比は、粒子のサイズ、ならびに細胞のサイズおよび種類に応じて変動するであろう。
【０３５３】
本開示のさらなる実施形態では、Ｔ細胞などの細胞を、薬剤コーティングビーズと組み合わせ、その後、ビーズと細胞とを分離し、次いで、細胞を培養する。代替的な実施形態では、培養の前に、薬剤コーティングビーズと、細胞とを分離せず、併せて培養する。さらなる実施形態では、ビーズおよび細胞を、まず、磁力などの力を適用することにより濃縮する結果として、細胞表面マーカーのライゲーションの増加をもたらし、これにより、細胞の刺激を誘導する
【０３５４】
例を目的として述べると、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８を接合させた常磁性ビーズ（３×２８ビーズ）を、Ｔ細胞に接触させることにより、細胞表面タンパク質をライゲーションさせることができる。一実施形態では、細胞（例えば、Ｔ細胞１０４〜１０９個）と、ビーズ（例えば、比を１：１とする、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ−４５０  ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｔ常磁性ビーズ、またはＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ製のＭＡＣＳ（登録商標）ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ）とを、緩衝液中、例えば、ＰＢＳ（カルシウムおよびマグネシウムなどの二価カチオンを伴わない）中で組み合わせる。ここでもまた、当業者は、任意の細胞濃度を使用しうることをたやすく理解することができる。例えば、標的細胞は、試料中で極めて稀であり、試料のうちの０．０１％だけを含む場合もあり、全試料（すなわち、１００％）が、目的の標的細胞を含む場合もある。したがって、任意の細胞数が、本開示の文脈内にある。ある特定の実施形態では、粒子と細胞とを、併せて混合する容量を著明に減少させて（すなわち、細胞の濃度を増大させて）、細胞と粒子との最大の接触を確保することが所望でありうる。例えば、一実施形態では、約１ｍｌ当たりの細胞２０億個の濃度を使用する。別の実施形態では、１ｍｌ当たりの細胞１億個を超える濃度を使用する。さらなる実施形態では、１ｍｌ当たりの細胞１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万、または５０００万個の細胞濃度を使用する。さらに別の実施形態では、１ｍｌ当たりの細胞７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万、または１億個の細胞濃度を使用する。さらなる実施形態では、１ｍｌ当たりの細胞１億２５００万または１億５０００万個の濃度を使用しうる。高濃度の使用は、細胞の収量、細胞の活性化、および細胞の拡大増殖の増大を結果としてもたらしうる。さらに、高細胞濃度の使用は、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞など、目的の標的抗原の発現が低度でありうる細胞の、より効率的な捕捉を可能とする。ある特定の実施形態では、このような細胞集団は、治療的価値を有する可能性があり、得ることが所望であろう。例えば、高細胞濃度の使用は、ＣＤ２８の発現が通常低度である、ＣＤ８＋Ｔ細胞の、より効率的な選択を可能とする。
【０３５５】
本開示の一実施形態では、混合物を、数時間（約３時間）〜約１４日間またはこれらの間の任意の整数値時間にわたり培養することができる。別の実施形態では、混合物を、２１日間にわたり培養することができる。本開示の一実施形態では、ビーズおよびＴ細胞を、併せて、約８日間にわたり培養する。別の実施形態では、ビーズおよびＴ細胞を、併せて、２〜３日間にわたり培養する。Ｔ細胞の培養期間が、６０日間またはこれを超えるように、数サイクルにわたる刺激もまた、所望でありうる。Ｔ細胞の培養に適切な条件は、増殖および生存に必要な因子であって、血清（例えば、ウシ胎仔血清またはヒト血清）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インスリン、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＴＧＦβ、およびＴＮＦ−アルファ、または当業者に公知である、細胞の増殖のための、他の任意の添加剤を含む因子を含有しうる、適切な培地（例えば、最小必須培地またはＲＰＭＩ培地１６４０、またはＸ−ｖｉｖｏ  １５（Ｌｏｎｚａ））を含む。細胞の増殖のための、他の添加剤は、界面活性剤、プラズマネート、およびＮ−アセチルシステインおよび２−メルカプトエタノールなどの還元剤を含むがこれらに限定されない。培地は、ＲＰＭＩ  １６４０、ＡＩＭ−Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、アルファ−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｘ−Ｖｉｖｏ  １５およびＸ−Ｖｉｖｏ  ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ、アミノ酸の添加、ピルビン酸ナトリウム、ならびにビタミン、無血清もしくは適量の血清（または血漿）の補充、または規定されたセットのホルモン、ならびに／あるいはＴ細胞の増殖および拡大増殖に十分な量のサイトカインを含みうる。抗生剤、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシンは、実験培養物に限り組み入れ、対象へと輸注される細胞培養物には組み入れない。標的細胞は、増殖を支援するのに必要な条件、例えば、適切な温度（例えば、３７℃）および雰囲気（例えば、空気＋５％のＣＯ２）下で維持する。
【０３５６】
変動させる刺激時間へと曝露されたＴ細胞は、異なる特徴を呈しうる。例えば、典型的な血液生成物またはアファレーシスされた末梢血単核細胞生成物は、細胞傷害性Ｔ細胞集団またはサプレッサーＴ細胞集団（ＴＣ、ＣＤ８＋）より多くのヘルパーＴ細胞集団（ＴＨ、ＣＤ４＋）を有する。ＣＤ３受容体およびＣＤ２８受容体を刺激することによる、ｅｘ  ｖｉｖｏにおけるＴ細胞の拡大増殖は、約８〜９日目の前には、主にＴＨ細胞からなるが、約８〜９日目の後では、ますます多くのＴＣ細胞の集団を含むＴ細胞の集団をもたらす。したがって、処置の目的に応じて、対象に、主にＴＨ細胞を含むＴ細胞集団を輸注することも、有利でありうる。同様に、ＴＣ細胞の抗原特異的サブセットを単離した場合、このサブセットを、より大きな程度で拡大増殖させることが有益でありうる。
【０３５７】
さらに、ＣＤ４マーカーおよびＣＤ８マーカーに加えて、他の表現型マーカーも、著明に変動するが、大部分は、細胞拡大増殖工程の経過中において、再現可能な形で変動する。したがって、このような再現性は、特殊な目的のためのＴ細胞生成物の活性化を調整する能力を可能とする。
【０３５８】
場合によって、実施形態の免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）を、ＡａＰＣ  （ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｒｏｐａｇａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ）と共に共培養して、細胞の拡大増殖を支援する。ＡａＰＣはまた、人工抗原提示細胞（ＡａＰＣ）と称することもできる。例えば、抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、実施形態の治療用組成物および細胞療法用生成物の調製において有用である。一態様では、ＡａＰＣは、トランスジェニックＫ５６２細胞でありうる。抗原提示系の調製および使用に関する、一般的な指針については、例えば、それらの各々が参照により組み込まれる、米国特許第６，２２５，０４２号明細書、同第６，３５５，４７９号明細書、同第６，３６２，００１号明細書、および同第６，７９０，６６２号明細書、米国特許出願公開第２００９／００１７０００号明細書および同第２００９／０００４１４２号明細書、ならびに国際公開第２００７／１０３００９号パンフレットを参照されたい。実施形態についてのなおさらなる態様では、トランスジェニックＣＡＲ細胞の培養は、ＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞の拡大増殖を刺激する、樹状細胞またはＡａＰＣ  （ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｒｏｐａｇａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ）の存在下で、トランスジェニックＣＡＲ細胞を培養することを含む。なおさらなる態様では、ＡａＰＣは、ＡａＰＣの表面上で発現したＣＡＲ結合性抗体またはこの断片を含む。他の実施形態では、ＡａＰＣは、ＡａＰＣの表面上で発現する、ＴＣＲ結合性ポリペプチドもしくはＴＣＲ結合性抗体またはこれらの断片を含む。ＡａＰＣは、場合によって、Ｔ細胞を活性化させるかまたは共刺激する、さらなる分子を含みうる。さらなる分子は、場合によって、膜結合型Ｃγサイトカインを含みうる。なおまださらなる態様では、ＡａＰＣは、不活化させているかもしくは照射されているか、または感染性物質について調べられ、これを含まないことが確認されている。なおさらなる態様では、ＡａＰＣの存在下におけるトランスジェニックＣＡＲ細胞の培養は、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、および／またはＩＬ−２などの可溶性サイトカインを含む培地中で、トランスジェニックＣＡＲ細胞を培養することを含む。細胞を、約１０：１〜約１：１０、約３：１〜約１：５、約１：１〜約１：３（免疫エフェクター細胞対ＡａＰＣ）、またはこの中で導出可能な任意の範囲の比で培養することができる。例えば、Ｔ細胞およびＡａＰＣの共培養は、約１：１、約１：２または約１：３の比でありうる。
【０３５９】
一態様では、ＡａＰＣは、ＣＤ１３７Ｌを発現しうる。他の態様では、ＡａＰＣは、ＣＤ１９、ＣＤ６４、ＣＤ８６、またはｍＩＬ１５をさらに発現しうる。ある特定の態様では、ＡａＰＣは、例えば、ＯＫＴ３および／またはＵＣＨＴ１など、少なくとも１つの抗ＣＤ３抗体クローンを発現しうる。一態様では、ＡａＰＣを処理して（例えば、照射するか、またはマイトマイシンＣで処理して）、それらの増殖可能性を消失させることができる。一態様では、ＡａＰＣは、感染性物質について調べられ、これを含まないことが確認されている場合がある。当技術分野では、このようなＡａＰＣを作製するための方法が公知である。一態様では、ＡａＰＣを伴うＣＡＲ改変Ｔ細胞集団の培養は、細胞を、約１０：１〜約１：１０、約３：１〜約１：５、約１：１〜約１：３（Ｔ細胞対ＡａＰＣ）、またはこの中で導出可能な任意の範囲の比で培養することを含みうる。例えば、Ｔ細胞およびＡａＰＣの共培養は、約１：１、約１：２または約１：３の比でありうる。一態様では、培養するステップは、アミノビスホスホネート（例えば、ゾレドロン酸）と共に培養することをさらに含みうる。
【０３６０】
さらなる態様では、ＣＡＲ−Ｔ細胞の集団を、７、１４、２１、２８、３５、４２日間、４９、５６、６３、または７０日間を超えない日数にわたり培養および／または刺激する。一部の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞の集団を、少なくとも０、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０日間、またはこれを超える期間にわたり培養および／または刺激する。一部の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞の集団を、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０日間、またはこれを超える期間にわたり培養および／または刺激する。一部の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞の集団を、少なくとも７、１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６、６３日間、またはこれを超える期間にわたり培養および／または刺激する。他の実施形態では、刺激は、ＣＡＲ−Ｔ細胞の、ＡａＰＣとの共培養であって、ＣＡＲ陽性Ｔ細胞の増殖を促進する共培養を含む。別の態様では、トランスジェニックＣＡＲ細胞の集団を、刺激１回、刺激２回、刺激３回、刺激４回、刺激５回、刺激５回、刺激６回、刺激７回、刺激８回、刺激９回、または刺激１０回を超えない回数にわたり刺激する。場合によって、トランスジェニック細胞を、ＡａＰＣの存在下にあるｅｘ  ｖｉｖｏでは培養しない。一部の特殊な場合には、実施形態の方法は、トランスフェクションステップおよび／または培養するステップの後で、細胞集団を、ＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）について濃縮するステップをさらに含む。濃縮するステップは、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）と、ＣＡＲを発現する細胞について分取することとを含みうる。さらなる態様では、ＣＡＲを発現する細胞について分取することは、ＣＡＲ結合性抗体の使用を含む。濃縮するステップはまた、ＣＤ５６＋細胞の枯渇も含みうる。実施形態についての、なおまださらなる態様では、方法は、トランスジェニックＣＡＲ細胞の集団についての凍結保存試料をさらに含む。
【０３６１】
場合によって、ＡａＰＣを、さらなるプロセシングを伴わずに、ペプチドの、ＭＨＣ分子との直接的な結合を可能とする、最適な長さのペプチドと共にインキュベートする。代替的に、細胞は、目的の抗原（すなわち、ＭＨＣ非依存型の抗原認識の場合）を発現しうる。さらに、場合によって、ＡＰＣは、特異的なＣＡＲポリペプチドまたは一般的なＣＡＲポリペプチド（例えば、ｕＡａＰＣ（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｒｏｐａｇａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ）に結合する抗体を発現しうる。このような方法については、参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１４／１９０２７３号パンフレットにおいて開示されている。ペプチド−ＭＨＣ分子または目的の抗原に加えて、ＡａＰＣ系はまた、少なくとも１つの外因性支援分子も含みうる。任意の適切な数および組合せの支援分子を利用することができる。支援分子は、共刺激分子および接着分子などの支援分子から選択することができる。例示的な共刺激分子は、ＣＤ７０およびＢ７．１（Ｂ７．１は、かつては、Ｂ７として公知であり、また、ＣＤ８０としても公知であった）を含み、これらは、とりわけ、Ｔ細胞の表面上のＣＤ２８分子および／またはＣＴＬＡ−４分子に結合し、これにより、例えば、Ｔ細胞の拡大増殖、Ｔｈ１の分化、短期的なＴ細胞の生存、およびインターロイキン（ＩＬ）２など、サイトカインの分泌に影響を及ぼす。接着分子は、セレクチンなどの炭水化物結合性糖タンパク質、インテグリンなどの膜貫通結合生糖タンパク質、カドヘリンなどのカルシウム依存性タンパク質、および例えば、細胞間または細胞−マトリックス間の接触を促進する、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）などの、１回膜貫通免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリータンパク質を含みうる。例示的な接着分子は、ＬＦＡ−３およびＩＣＡＭ−１などのＩＣＡＭ、を含む。共刺激分子および接着分子を含む、例示的な支援分子の選択、クローニング、調製、および発現に有用な技法、方法、および試薬については、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，２２５，０４２号明細書、同第６，３５５，４７９号明細書、および同第６，３６２，００１号明細書において例示されている。
【０３６２】
ＡａＰＣとなるように選択される細胞は、好ましくは、細胞内抗原プロセシング、細胞内ペプチドトラフィッキング、および／またはＭＨＣクラスＩ分子もしくはクラスＩＩ分子の細胞内ペプチドローディングを欠損させているか、あるいは。変温性（すなわち、哺乳動物細胞株より、温度刺激に対する感受性が小さい）であるか、あるいは欠損および変温特性の両方を有する。好ましくは、ＡａＰＣとなるように選択される細胞はまた、細胞へと導入される、外因性のＭＨＣクラスＩ分子またはクラスＩＩ分子、および支援分子の構成要素に対する、少なくとも１つの内因性対応物（例えば、内因性のＭＨＣクラスＩ分子もしくはクラスＩＩ分子、および／または上記で記載した内因性支援分子）を発現する能力も欠く。さらに、ＡａＰＣは、ＡａＰＣを作出するための、それらの改変の前に、細胞が保有していた欠損および変温特性を保持することが好ましい。例示的なＡａＰＣは、昆虫細胞株など、ＴＡＰ（ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）欠損細胞株を構成するか、またはこれに由来する。例示的な変温性昆虫細胞株は、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ２細胞株などのショウジョウバエ（Drosophila）属細胞株（例えば、Schneider 1972を参照されたい）である。Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ２細胞の調製、増殖、および培養のための例示的な方法は、米国特許第６，２２５，０４２号明細書、同第６，３５５，４７９号明細書、および同第６，３６２，００１号明細書において提示されている。
【０３６３】
一実施形態ではまた、ＡａＰＣを、凍結融解サイクルにもかける。例示的な凍結融解サイクルでは、凍結が、迅速に生じるように、ＡａＰＣを含有する、適切なレセプタクルを、適量の液体窒素、固体二酸化炭素（すなわち、ドライアイス）、または同様の低温材料と接触させることにより、ＡａＰＣを凍結させることができる。次いで、凍結させたＡＰＣを、ＡａＰＣの、低温材料からの摘出、および周囲の室温条件への曝露により、または微温水浴もしくは手の温熱を利用して、融解時間の短縮を促進する、促進融解工程により融解させる。加えて、融解の前に、ＡａＰＣを、凍結させ、長ｆ時間にわたり保存することができる。凍結させたＡａＰＣはまた、融解させ、次いで、さらなる使用の前に、凍結乾燥させることもできる。好ましくは、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、および他の保存剤など、凍結融解手順に有害な影響を及ぼしうる保存剤は、凍結融解サイクルを経るＡａＰＣを含有する培地には非含有とするか、またはこのような保存剤を本質的に欠く培地へのＡａＰＣの導入などにより、本質的に除去する。
【０３６４】
さらなる実施形態では、不活化の後で、細胞の増殖、複製、または核酸の発現が本質的に生じないように、異種核酸およびＡａＰＣに内因性の核酸を、架橋により不活化させることができる。一実施形態では、ＡａＰＣを、外因性ＭＨＣおよび支援分子の発現、このような分子の、ＡａＰＣ表面上の提示、ならびに提示されたＭＨＣ分子への、選択された、１または複数のペプチドのローディングの後の時点において不活化させる。したがって、このような、選択されたペプチドをロードした不活化ＡａＰＣは、増殖または複製が本質的に不可能とされているが、選択されたペプチドの提示機能は保持する。好ましくは、架橋はまた、ＡａＰＣの抗原提示細胞機能を、実質的に低下させずに、細菌およびウイルスなどの汚染微生物を本質的に含まない、ＡａＰＣももたらす。したがって、架橋は、ＡａＰＣを使用して開発される細胞療法製品の安全性に関する懸念を軽減する一助となる一方、重要なＡａＰＣ機能を維持する。架橋およびＡａＰＣに関する方法については、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００９００１７０００号明細書を参照されたい。
【０３６５】
ある特定の実施形態では、操作抗原提示細胞（ＡＰＣ）がさらに提供される。ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、免疫エフェクター細胞を繁殖させるのに、このような細胞を、例えば、上記で記載した通りに使用することができる。さらなる態様では、操作ＡＰＣ自体を、患者へと投与し、これにより、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける免疫エフェクター細胞の拡大増殖を刺激することができる。実施形態の操作ＡＰＣ自体を、治療剤として使用することができる。他の実施形態では、操作ＡＰＣを、標的抗原に特異的な内因性免疫エフェクター細胞の活性化を刺激し、かつ／または標的抗原に特異的な、養子導入された免疫エフェクター細胞の活性を増加させるか、もしくは存続を延長しうる治療剤として使用することができる。
【０３６６】
本明細書で使用される「操作ＡＰＣ」という用語は、少なくとも第１のトランス遺伝子を含み、第１のトランス遺伝子が、ＨＬＡをコードする細胞を指す。このような操作ＡＰＣは、抗原が、ＨＬＡと複合したＡＰＣの表面上に提示されるように、抗原の発現のための第２のトランス遺伝子をさらに含みうる。一部の態様では、操作ＡＰＣは、抗原を提示した細胞型（例えば、樹状細胞）でありうる。さらなる態様では、操作ＡＰＣは、Ｔ細胞またはＴ細胞の前駆細胞など、通常、抗原を提示しない細胞型（「Ｔ−ＡＰＣ」と称する）から作製することができる。したがって、一部の態様では、実施形態の操作ＡＰＣは、ＨＬＡが、標的抗原のエピトープと複合した操作ＡＰＣの表面上で発現するように、標的抗原をコードする第１のトランス遺伝子と、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）をコードする第２のトランス遺伝子とを含む。ある特定の具体的な態様では、操作ＡＰＣ内で発現するＨＬＡは、ＨＬＡ−Ａ２である。
【０３６７】
一部の態様では、実施形態の操作ＡＰＣは、共刺激分子をコードする、少なくとも第３のトランス遺伝子をさらに含みうる。共刺激分子は、膜結合型Ｃγサイトカインでありうる、共刺激サイトカインでありうる。ある特定の態様では、共刺激サイトカインは、膜結合型ＩＬ−１５などのＩＬ−１５である。一部のさらなる態様では、操作ＡＰＣは、編集（または欠失）遺伝子を含みうる。例えば、ＰＤ−１、ＬＩＭ−３、ＣＴＬＡ−４、またはＴＣＲなどの阻害性遺伝子は、遺伝子の発現を低減するかまたは消失させるように編集することができる。実施形態の操作ＡＰＣは、任意の目的の標的抗原をコードするトランス遺伝子をさらに含みうる。例えば、標的抗原は、感染性疾患抗原または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）でありうる。
【０３６８】
発現を調節する方法
一実施形態では、操作細胞内の異種遺伝子の発現を調節する方法が提供される。異種遺伝子発現のリガンド誘導性制御のための遺伝子スイッチポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、抗原結合性ポリペプチド、および異種遺伝子が提供される。場合によって、ポリヌクレオチドは、図１〜１６のうちのいずれか１つにおいて描示されている、１または複数の遺伝子発現カセット内にある。別の場合には、ポリヌクレオチドは、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターを介して、操作細胞へと組み込まれる。ウイルスベクターは、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはアデノウイルスベクターを含みうる。非ウイルスベクターは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンを含みうる。他の場合には、ポリヌクレオチドは、リコンビナーゼまたは遺伝子編集法を介して、操作細胞へと組み込まれる。リコンビナーゼの例は、本明細書で記載されるセリンリコンビナーゼである。遺伝子編集法の例は、ＣＲＩＳＰＲ系またはＡｒｇｎｏｎａｕｔｅ系を含みうる。本明細書における「ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集系」または「ＣＲＩＳＰＲ系」とは、ＤＮＡ配列の変化を、ゲノムの特異的領域へとターゲティングするための、任意のＲＮＡ誘導型のＣａｓタンパク質媒介性過程を指す。本明細書における「Ａｒｇｏｎａｕｔｅ遺伝子編集系」とは、ＤＮＡ配列の変化を、ゲノムの特異的領域へとターゲティングするための、任意の一本鎖ＤＮＡ誘導型のＡｒｇｏｎａｕｔｅエンドヌクレアーゼ媒介性過程を指す。
【０３６９】
場合によって、抗原結合性ポリペプチドは、抗原結合性ポリペプチドの場合もあり、リガンド結合性ポリペプチドの場合もある。例えば、抗原結合性ポリペプチドは、抗体またはこの断片、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、重鎖抗体の可変断片（ＶＨＨ）、ＣＡＲ、または操作ＴＣＲでありうる。さらなる例として述べると、リガンド結合性ポリペプチドは、受容体でありうる。ある特定の態様では、異種遺伝子は、サイトカインである。サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、またはＩＬ−１５とＩＬ−１５Ｒとの融合体（ｍｂＩＬ−１５）でありうる。ある特定の場合には、サイトカインは、ＩＬ−１２である。例えば、ＩＬ−１２は、単鎖ＩＬ−１２（ｓｃＩＬ−１２）、プロテアーゼ感受性ＩＬ−１２、不安定化ＩＬ−１２、膜結合型ＩＬ−１２、挿入ＩＬ−１２である。場合によって、異種遺伝子は、誘導性プロモーターの制御下にある。例えば、誘導性プロモーターは、遺伝子転写のための、遺伝子スイッチの、リガンド誘導性プロモーターである。
【０３７０】
ある特定の場合には、細胞は、操作細胞である。本明細書における操作細胞とは、その天然状態または内因性状態から改変された細胞である。操作細胞の例は、改変された（例えば、ポリヌクレオチドの、細胞へのトランスフェクションにより）、本明細書で記載される細胞である。場合によって、操作細胞は、操作免疫エフェクター細胞でありうる。
【０３７１】
本明細書では、異種遺伝子の発現を調節する方法であって、異種遺伝子が、リガンド誘導性プロモーターの制御下にある、方法が提示される。場合によって、方法は、リガンドの非存在下で、異種遺伝子発現の基礎レベルの低下または非存在を結果としてもたらす。１つの場合には、リガンドで異種遺伝子の発現を誘導する前に、操作細胞を活性化させる。別の場合には、細胞を抗原へと曝露することにより、操作細胞を活性化させる。抗原は、操作細胞が発現する、抗原結合性ポリペプチドにより認識される抗原でありうる。抗原は、腫瘍抗原または感染性疾患抗原でありうる。
【０３７２】
操作細胞は、抗原へと、少なくとも０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０日間にわたり曝露することができる。場合によって、操作細胞は、抗原へと、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４時間にわたり曝露することができる。
【０３７３】
別の場合には、遺伝子スイッチポリペプチドおよび目的の誘導性遺伝子を包含するベクター（本明細書の図２Ａ〜２Ｄ、図３、図１９Ａ〜１９Ｂ、図２０Ａ、図２２、図２４Ａ〜２４Ｄ、および図２５Ａ〜２５Ｂに記載される）により形質導入された免疫エフェクター細胞の集団を、少なくとも１回の刺激、２回の刺激、３回の刺激、または４回の刺激のための実施形態の操作ＡａＰＣと共に培養し、かつ／またはこれにより刺激する。場合によって、操作ＡａＰＣは、操作細胞上で発現する結合性ポリペプチドにより認識される抗原またはリガンドを含む。最終回の刺激の後、患者への輸注の前に、細胞を休眠させる。次いで、患者に、目的の遺伝子を活性化させ、発現させる、誘導性遺伝子スイッチによる調節のために使用される、適切な用量のリガンドを施す。一態様では、リガンドは、ベレジメクスである。別の態様では、ベレジメクスを、５ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、２０ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、６０ｍｇ、７０ｍｇ、８０ｍｇ、９０ｍｇ、または１００ｍｇで施す。さらなる態様では、低用量のベレジメクスを、例えば、０．５ｍｇ、１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、または２０ｍｇで施す。
【０３７４】
ＰＯＣ（ｐｏｉｎｔ−ｏｆ−ｃａｒｅ）
本開示の一実施形態では、本明細書で記載される免疫エフェクター細胞を、ＰＯＣ（ｐｏｉｎｔ−ｏｆ−ｃａｒｅ）施設で改変する。場合によって、ＰＯＣ（ｐｏｉｎｔ−ｏｆ−ｃａｒｅ）施設は、処置を必要とする対象の近隣の病院または機関（例えば、医療機関）にある。対象は、アファレーシスを受け、得られた末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、例えば、湿式分級により濃縮することができる。１つの場合には、ヒト血清アルブミンを含有する緩衝液を使用して、湿式分級工程を実施する。Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞は、本明細書で記載される選択法により単離することができる。１つの場合には、Ｔ細胞についての選択法は、Ｔ細胞上のＣＤ３およびＣＤ８に特異的なビーズを含む。１つの場合には、ビーズは、常磁性ビーズでありうる。採取された免疫エフェクター細胞は、改変の前に、任意の適切な低温保存用溶液中で低温保存することができる。免疫エフェクター細胞は、輸注に先立ち、最大で２４時間、３６時間、４８時間、７２時間、または９６時間にわたり融解させることができる。融解させた細胞は、改変の前に、細胞培養緩衝液、例えば、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充した細胞培養緩衝液（例えば、ＲＰＭＩ）、またはＩＬ−２およびＩＬ−２１を含む緩衝液に入れることができる。別の態様では、採取された免疫エフェクター細胞は、低温保存を必要とせずに、速やかに改変することができる。
【０３７５】
場合によって、キメラ受容体、１もしくは複数の細胞タグ、および／またはサイトカインを、免疫エフェクター細胞へと操作／導入することにより、免疫エフェクター細胞を改変し、次いで、対象へと、迅速に輸注する。場合によって、免疫エフェクター細胞の供給源は、同種供給源および自家供給源の両方を含みうる。１つの場合には、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞でありうる。１つの場合には、キメラ受容体は、ＣＡＲまたはＴＣＲでありうる。別の場合には、サイトカインは、ｍｂＩＬ−１５でありうる。１つの場合には、ｍｂＩＬ−１５は、配列番号１５のｍｂＩＬ−１５、またはこの変異体もしくは断片である。さらに別の場合には、ｍｂＩＬ−１５の発現は、本明細書で記載される、リガンド誘導性遺伝子スイッチ発現系によりモジュレートされる。例えば、ベレジメクスなどのリガンドを、対象へと送達して、ｍｂＩＬ−１５の発現をモジュレートすることができる。別の態様では、ベレジメクスを、５ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、２０ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、６０ｍｇ、７０ｍｇ、８０ｍｇ、９０ｍｇ、または１００ｍｇで施す。さらなる態様では、低用量のベレジメクスを、例えば、０．５ｍｇ、１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、または２０ｍｇで施す。一実施形態では、ベレジメクスを、改変免疫エフェクター細胞を輸注する０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１日前に、対象へと投与する。さらなる実施形態では、ベレジメクスを、改変免疫エフェクター細胞の輸注後、有効期間にわたり、約１２時間ごとに１回、約２４時間ごとに１回、約３６時間ごとに１回、または約４８時間ごとに１回、対象へと投与する。一実施形態では、ベレジメクス投与のための有効期間は、約７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０日間である。他の実施形態では、休薬期間後の休眠期間の後、または対象が、再発を被る場合に、ベレジメクスを再投与することができる。
【０３７６】
対象に対する副作用が観察されるか、または処置が必要とされない、ある特定の場合には、例えば、セツキシマブを介して、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける、改変免疫エフェクター細胞の、条件付けアブレーションのために、本明細書で記載される切断型表皮増殖因子受容体タグなどの細胞タグを含む細胞タグを活性化させることができる。
【０３７７】
一部の実施形態では、このような免疫エフェクター細胞を、図２Ａ〜２Ｄ、図３、図１９Ａ〜１９Ｂ、図２０Ａ、図２２、図２４Ａ〜２４Ｄ、および図２５Ａ〜２５Ｂに記載される構築物により、電気穿孔を介して改変する。１つの場合には、電気穿孔を、Ｌｏｎｚａ製のＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）電気穿孔器などの電気穿孔器により実施する。他の実施形態では、上述の構築物を含むベクターは、非ウイルスベクターまたはウイルスベクターである。１つの場合には、非ウイルスベクターは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン−トランスポザーゼ系を含む。１つの場合には、特異的配列を使用して、免疫エフェクター細胞に電気穿孔する。例えば、免疫エフェクター細胞に、１つのトランスポゾンに続く、トランスポザーゼをコードするＤＮＡに続く、第２のトランスポゾンを電気穿孔することができる。別の場合には、免疫エフェクター細胞に、全てのトランスポゾンと、トランスポザーゼとを、同時に電気穿孔することができる。別の場合には、免疫エフェクター細胞に、トランスポザーゼに続き、両方のトランスポゾンまたは１つのトランスポゾンを、同時に電気穿孔することができる。逐次的な電気穿孔を経ながら、免疫エフェクター細胞を、次の電気穿孔ステップの前に、ある時間にわたり、休眠させることができる。
【０３７８】
場合によって、改変免疫エフェクター細胞は、繁殖ステップおよび活性化ステップを経ない。場合によって、改変免疫エフェクター細胞は、インキュベーションステップまたは培養ステップ（例えば、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける繁殖）を経ない。ある特定の場合には、輸注の前に、改変免疫エフェクター細胞を、ＩＬ−２およびＩＬ２１を含む緩衝液に入れる。他の場合には、輸注の前に、改変免疫エフェクター細胞を、細胞培養緩衝液、例えば、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充した細胞培養緩衝液（例えば、ＲＰＭＩ）に入れるか、またはこの中で休眠させる。輸注の前に、改変免疫エフェクター細胞を、採取し、洗浄し、生理食塩緩衝液中で、対象への輸注のための調製物に製剤化することができる。
【０３７９】
１つの場合には、輸注の前に、対象を、リンパ枯渇させている。他の場合には、リンパ枯渇は、必要とされず、改変免疫エフェクター細胞は、対象へと、迅速に、輸注される。例示的なリンパ枯渇レジメンを、下記の表４および５に一覧する。
【０３８０】
【表４】
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【０３８１】
【表５】
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【０３８２】
さらなる場合には、対象は、最小リンパ枯渇を受ける。本明細書における最小リンパ枯渇とは、リンパ枯渇レジメン後１日、２日、または３日以内に対象に輸注しうるような、低減型リンパ枯渇プロトコールを指す。１つの場合には、低減型リンパ枯渇プロトコールは、低用量のフルダラビンおよび／またはシクロホスファミドを含みうる。別の場合には、低減型リンパ枯渇プロトコールは、短期間、例えば、１日間または２日間にわたるリンパ枯渇を含みうる。
【０３８３】
一実施形態では、キメラ受容体およびサイトカインを、免疫エフェクター細胞へと操作／導入することにより、免疫エフェクター細胞を改変し、次いで、対象へと、迅速に輸注する。他の場合には、キメラ受容体およびサイトカインを、細胞へと操作／導入することにより、免疫エフェクター細胞を改変し、次いで、少なくとも０、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３，２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０時間以内に、対象へと輸注する。他の場合には、キメラ受容体およびサイトカインを、免疫エフェクター細胞へと操作／導入することにより、免疫エフェクター細胞を改変し、次いで、０日間、＜１日間、＜２日間、＜３日間、＜４日間、＜５日間、＜６日間、または＜７日間以内に、対象へと輸注する。
【０３８４】
一部の実施形態では、ある量の改変エフェクター細胞を、それを必要とする対象へと投与し、その量を、有効性およびサイトカイン関連毒性を誘導する潜在的可能性に基づき決定する。別の実施形態では、改変エフェクター細胞は、ＣＡＲ＋細胞またはＴＣＲ＋細胞、およびＣＤ３＋細胞である。場合によって、改変エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変エフェクター細胞約１０４〜約１０９個を含む。場合によって、改変エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変エフェクター細胞約１０４〜約１０５個を含む。場合によって、改変エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変エフェクター細胞約１０５〜約１０６個を含む。場合によって、改変エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変エフェクター細胞約１０６〜約１０７個を含む。場合によって、改変エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変エフェクター細胞＞１０４個、かつ、≦約１０５個を含む。場合によって、改変エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変エフェクター細胞＞１０５個、かつ、≦約１０６個を含む。場合によって、改変エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変エフェクター細胞＞１０６個、かつ、≦約１０７個を含む。
【０３８５】
他の実施形態では、操作細胞の増殖および／または生存を刺激する方法は、細胞試料を、対象から得るステップと、細胞試料の細胞に、１または複数のトランスポゾンを含む、１または複数のポリヌクレオチドをトランスフェクトするステップとを含む。ある実施形態では、トランスポゾンは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴＣＲ、サイトカイン、１または複数の細胞タグ、サイトカインのリガンド誘導性制御のための遺伝子スイッチポリペプチド、および前記１または複数のポリヌクレオチドを、前記細胞のゲノムへと組み込んで、操作細胞の集団をもたらすのに有効なトランスポザーゼをコードする。ある実施形態では、遺伝子スイッチポリペプチドは、ｉ）第１の核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたＤＮＡ結合性ドメインを含む、第１の遺伝子スイッチポリペプチド、およびｉｉ）第２の核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたトランス活性化ドメインを含む、第２の遺伝子スイッチポリペプチドを含む。一部の実施形態では、第１の遺伝子スイッチポリペプチドと、第２の遺伝子スイッチポリペプチドとは、リンカーにより連結されている。１つの場合には、操作細胞の、対象への投与の前に、リンパ枯渇が必要とされない。
【０３８６】
１つの場合には、操作細胞を、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて繁殖させる方法は、細胞試料を、対象から得るステップと、細胞試料の細胞に、１または複数のトランスポゾンを含む、１または複数のポリヌクレオチドをトランスフェクトするステップとを含む。ある実施形態では、トランスポゾンは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴＣＲ、サイトカイン、１または複数の細胞タグ、サイトカインのリガンド誘導性制御のための遺伝子スイッチポリペプチド、および前記１または複数のポリヌクレオチドを、前記細胞のゲノムへと組み込んで、操作細胞の集団をもたらすのに有効なトランスポザーゼをコードする。ある実施形態では、遺伝子スイッチポリペプチドは、ｉ）第１の核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたＤＮＡ結合性ドメインを含む、第１の遺伝子スイッチポリペプチド、およびｉｉ）第２の核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたトランス活性化ドメインを含む、第２の遺伝子スイッチポリペプチドを含む。一部の実施形態では、第１の遺伝子スイッチポリペプチドと、第２の遺伝子スイッチポリペプチドとは、リンカーにより連結されている。１つの場合には、操作細胞の、対象への投与の前に、リンパ枯渇が必要とされない。
【０３８７】
別の実施形態では、それを必要とする対象の、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける操作細胞の存続を増強する方法は、細胞試料を、対象から得るステップと、細胞試料の細胞に、１または複数のトランスポゾンを含む、１または複数のポリヌクレオチドをトランスフェクトするステップとを含む。場合によって、トランスポゾンは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴＣＲ、サイトカイン、１または複数の細胞タグ、サイトカインのリガンド誘導性制御のための遺伝子スイッチポリペプチド、およびＤＮＡを、前記細胞のゲノムへと組み込んで、操作細胞の集団をもたらすのに有効なトランスポザーゼをコードする。場合によって、遺伝子スイッチポリペプチドは、ｉ）第１の核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたＤＮＡ結合性ドメインを含む、第１の遺伝子スイッチポリペプチド、およびｉｉ）第２の核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたトランス活性化ドメインを含む、第２の遺伝子スイッチポリペプチドを含み、第１の遺伝子スイッチポリペプチドと、第２の遺伝子スイッチポリペプチドとは、リンカーにより連結されている。１つの場合には、操作細胞の、対象への投与の前に、リンパ枯渇が必要とされない。
【０３８８】
別の実施形態では、充実性腫瘍を伴う対象を処置する方法は、細胞試料を、対象から得るステップと、試料の細胞に、１または複数のトランスポゾンを含む、１または複数のポリヌクレオチドをトランスフェクトするステップと、操作細胞の集団を、対象へと投与するステップとを含む。１つの場合には、操作細胞の、対象への投与の前に、リンパ枯渇が必要とされない。場合によって、１または複数のトランスポゾンは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴＣＲ、サイトカイン、１または複数の細胞タグ、サイトカインのリガンド誘導性制御のための遺伝子スイッチポリペプチド、およびＤＮＡを、細胞のゲノムへと組み込むのに有効なトランスポザーゼをコードする。場合によって、遺伝子スイッチポリペプチドは、ｉ）第１の核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたＤＮＡ結合性ドメインを含む、第１の遺伝子スイッチポリペプチド、およびｉｉ）第２の核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたトランス活性化ドメインを含む、第２の遺伝子スイッチポリペプチドを含み、第１の遺伝子スイッチポリペプチドと、第２の遺伝子スイッチポリペプチドとは、リンカーにより連結されている。場合によって、細胞は、電気穿孔を介してトランスフェクトされる。場合によって、遺伝子スイッチポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、プロモーターによりモジュレートされる。場合によって、プロモーターは、組織特異的プロモーターもしくはＥＦ１Ａプロモーター、またはこれらの機能的な変異体である。場合によって、組織特異的プロモーターは、Ｔ細胞特異的応答エレメントまたはＮＦＡＴ応答エレメントを含む。場合によって、サイトカインは、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα、またはＩＬ−１５変異体の融合体のうちの少なくとも１つを含む。場合によって、サイトカインは、分泌形態にある。場合によって、サイトカインは、膜結合形態にある。場合によって、細胞は、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｔ細胞、またはＴ細胞前駆細胞である。場合によって、細胞は、対象へと（例えば、対象に、操作細胞を輸注することにより）投与される。場合によって、方法は、有効量のリガンド（例えば、ベレジメクス）を投与して、サイトカインの発現を誘導するステップをさらに含む。場合によって、ＣＡＲは、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＢＣＭＡ、ＣＤ４４、α−葉酸受容体、ＣＡＩＸ、ＣＤ３０、ＲＯＲ１、ＣＥＡ、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４０、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、葉酸結合性タンパク質、ＧＤ２、ＧＤ３、ＩＬ−１３Ｒ−ａ２、ＫＤＲ、ＥＤＢ−Ｆ、メソテリン、ＣＤ２２、ＥＧＦＲ、ＭＵＣ−１、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＵＣ−１６、ｈ５Ｔ４、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ−７２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ１２３、およびＶＥＧＦ−Ｒ２のうちの少なくとも１つに結合することが可能である。場合によって、トランスポザーゼは、サケ科型Ｔｃ１様トランスポザーゼである。場合によって、トランスポザーゼは、ＳＢ１１またはＳＢ１００ｘトランスポザーゼである。場合によって、細胞タグは、ＨＥＲ１切断型変異体およびＣＤ２０切断型変異体のうちの少なくとも１つを含む。
【０３８９】
医薬組成物および投与量
一部の実施形態では、対象における投与のための、本明細書で開示されるポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含む組成物が開示される。場合によって、本明細書では、本明細書で開示されるポリヌクレオチドまたはポリペプチドをコードし、任意選択で、サイトカインおよび／またはさらなる治療剤を含有する、改変エフェクター細胞組成物が開示される。場合によって、本明細書にはまた、エフェクター細胞の改変のために、キメラ抗原受容体の発現を調節するための、遺伝子スイッチポリペプチドをコードするベクターも含まれる。
【０３９０】
一部の場合には、改変エフェクター細胞または遺伝子スイッチポリペプチドおよびキメラ抗原受容体をコードするベクターによる医薬組成物を、活性化合物の、薬学的に使用されうる調製物への加工を容易とする、賦形剤および補助剤を含む、１または複数の生理学的に許容される担体を使用する、常套的な形で製剤化する。適正な製剤は、選択される投与経路に依存する。本明細書で記載される医薬組成物の概要については、例えば、Remington: The Science and Practice ofPharmacy, Nineteenth Ed (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1995); Hoover, John E., Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania 1975; Liberman, H.A. and Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y., 1980; and Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Seventh Ed. (Lippincott Williams & Wilkins 1999)において見出される。
【０３９１】
医薬組成物は、任意選択で、例だけを目的として述べると、常套的な、混合工程、溶解工程、顆粒化工程、糖衣錠作製工程、微粒化工程、乳化工程、カプセル化工程、封入工程、または圧縮工程などによる、常套的な形で製造される。
【０３９２】
ある特定の実施形態では、組成物はまた、酢酸、ホウ酸、クエン酸、乳酸、リン酸、および塩酸などの酸；水酸化ナトリウム、リン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、およびトリス−ヒドロキシメチルアミノメタンなどの塩基を含む、１または複数のｐＨ調整剤または緩衝剤；ならびにクエン酸塩／デキストロース、炭酸水素ナトリウム、および塩化アンモニウムなどの緩衝液も含みうる。このような酸、塩基、および緩衝剤は、組成物のｐＨを、許容可能な範囲で維持するのに必要とされる量で組み入れられる。
【０３９３】
他の実施形態では、組成物はまた、組成物のオスモル濃度を、許容可能な範囲に収めるのに必要とされる量の、１または複数の塩も含みうる。このような塩は、ナトリウムカチオン、カリウムカチオン、またはアンモニウムカチオンと、塩化物アニオン、クエン酸アニオン、アスコルビン酸アニオン、ホウ酸アニオン、リン酸アニオン、重炭酸アニオン、硫酸アニオン、チオ硫酸アニオン、または亜硫酸水素アニオンとを有する塩を含み、適切な塩は、塩化ナトリウム塩、塩化カリウム塩、チオ硫酸ナトリウム塩、亜硫酸水素ナトリウム塩、および硫酸アンモニウム塩を含む。
【０３９４】
本明細書で記載される医薬組成物は、経口投与経路、非経口（例えば、静脈内、皮下、筋内、脳内、脳室内、関節内、腹腔内、または頭蓋内）投与経路、鼻腔内投与経路、口腔内投与経路、舌下投与経路、または直腸内投与経路を含むがこれらに限定されない、任意の適切な投与経路により投与される。一部の場合には、医薬組成物を、非経口（例えば、静脈内、皮下、筋内、脳内、脳室内、関節内、腹腔内、または頭蓋内）投与のために製剤化する。
【０３９５】
本明細書で記載される医薬組成物を、処置される個体による経口の服用のための、水性経口分散液、液体、ゲル、シロップ、エリキシル、スラリー、懸濁液など、固体経口剤形、エアゾール剤、制御放出製剤、即時融解製剤、発泡製剤、凍結乾燥製剤、錠剤、粉剤、丸剤、糖衣錠剤、カプセル剤、遅延放出製剤、持続放出製剤、パルス放出製剤、多粒子製剤、即時放出製剤と制御放出製剤との混合剤を含むがこれらに限定されない、任意の適切な剤形へと製剤化する。一部の実施形態では、医薬組成物を、カプセル剤へと製剤化する。一部の実施形態では、医薬組成物を、溶液（例えば、静脈内投与のための）へと製剤化する。場合によって、医薬組成物を、輸注液として製剤化する。場合によって、医薬組成物を、注射液として製剤化する。
【０３９６】
本明細書で記載される、固体の医薬の剤形は、任意選択で、本明細書で記載される化合物と、適合性の担体、結合剤、充填剤、懸濁剤、香味剤、甘味剤、崩壊剤、分散剤、界面活性剤、滑沢剤、着色剤、希釈剤、可溶化剤、湿潤剤、可塑化剤、安定化剤、浸透増強剤、保湿剤、消泡剤、抗酸化剤、防腐剤、または１もしくは複数のこれらの組合せなど、１または複数の薬学的に許容される添加剤とを含む。
【０３９７】
さらなる他の態様では、Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th Edition (2000)において記載されている手順など、標準的なコーティング手順を使用して、組成物の周囲に、薄膜コーティングを施す。一部の実施形態では、組成物を、粒子（例えば、カプセルによる投与のための）へと製剤化し、粒子の一部または全部をコーティングする。一部の実施形態では、組成物を、粒子（例えば、カプセルによる投与のための）へと製剤化し、粒子の一部または全部をマイクロカプセル化する。一部の実施形態では、組成物を、粒子（例えば、カプセルによる投与のための）へと製剤化し、粒子の一部または全部をマイクロカプセル化せず、アンコーティングする。
【０３９８】
ある特定の実施形態では、本明細書で提示される組成物はまた、微生物活性を阻害する、１または複数の保存剤も含みうる。適切な保存剤は、メルフェンおよびチオメルサールなどの水銀含有物質；安定化二酸化塩素；ならびに塩化ベンザルコニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、および塩化セチルピリジニウムなどの四級アンモニウム化合物を含む。
【０３９９】
本明細書で言及される「増殖性疾患」とは、細胞の過剰な増殖および細胞内マトリックスの過剰な代謝回転が、がんを含むいくつかの疾患の発症機序に著明に寄与する、という統一的概念が提示されていることを意味する。
【０４００】
本明細書で使用される「患者」または「対象」とは、生理学的状態、例えば、がんまたは自己免疫状態または感染症を伴うか、またはこれを有するかもしくは発症することが疑われると診断された哺乳動物対象を指す。一部の実施形態では、「患者」という用語は、がんを発症する可能性が平均より高い哺乳動物対象を指す。例示的な患者は、ヒト、類人猿、イヌ、ブタ、ウシ、ネコ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、齧歯動物、および本明細書で開示される療法から利益を得うる、他の哺乳動物でありうる。例示的なヒト患者は、男性および／または女性でありうる。
【０４０１】
本明細書では、「それを必要とする患者」または「それを必要とする対象」とは、例えば、がんなどの増殖性障害であるがこれらに限定されない、疾患または障害を伴うと診断されているか、またはこれを有することか疑われる患者とみなされる。場合によって、がんは、充実性腫瘍または血液悪性腫瘍である。場合によって、がんは、充実性腫瘍である。他の場合には、がんは、血液悪性腫瘍である。場合によって、がんは、転移性がんである。場合によって、がんは、再発性がんまたは不応性がんである。場合によって、がんは、充実性腫瘍である。例示的な充実性腫瘍は、肛門がん；虫垂がん；胆管がん（すなわち、胆管癌）；膀胱がん；脳腫瘍；乳がん；子宮頸がん；結腸がん；原発不明がん（ＣＵＰ）；食道がん；眼がん；卵管がん；消化器がん；腎臓がん；肝臓がん；肺がん；髄芽腫；黒色腫；口腔がん；卵巣がん；膵臓がん；副甲状腺疾患；陰茎がん；下垂体腫瘍；前立腺がん；直腸がん；皮膚がん；胃がん；精巣がん；咽頭がん；甲状腺がん；子宮がん；膣がん；外陰がん；または神経膠芽腫を含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、白血病は、例えば、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）でありうる。
【０４０２】
本明細書では、「〜を投与すること」とは、本開示の組成物を、患者に施すことを指す。例を目的として、限定せずに述べると、組成物の投与、例えば、注射は、静脈内（ｉ．ｖ．）注射、皮下（ｓ．ｃ．）注射、皮内（ｉ．ｄ．）注射、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射、または筋内（ｉ．ｍ．）注射により実施することができる。１または複数のこのような経路を利用することができる。非経口投与は、例えば、ボーラス注射による場合もあり、時間経過にわたる、漸次的な灌流による場合もある。代替的に、または共時的に、投与は、経口経路による投与でありうる。加えて、投与はまた、ボーラスまたは細胞ペレットのデポ手術による場合もあり、医療用デバイスの設置による場合もある。ある実施形態では、本開示の組成物は、本明細書で記載される核酸配列を発現する操作細胞もしくは宿主細胞、または本明細書で記載される、少なくとも１つの核酸配列を含むベクターを、増殖性障害を処置または防止するのに有効な量で含みうる。医薬組成物は、本明細書で記載される標的細胞集団を、１または複数の、薬学的または生理学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせて含みうる。このような組成物は、中性緩衝生理食塩液、リン酸緩衝生理食塩液などの緩衝液；グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールなどの炭水化物；タンパク質；ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸；抗酸化剤；ＥＤＴＡまたはグルタチオンなどのキレート剤；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；および保存剤を含みうる。
【０４０３】
本明細書で使用される「処置」、「〜を処置すること」という用語、およびそれらの文法的同等物は、所望の薬理学的効果および／または生理学的効果を得ることを指す。複数の実施形態では、効果は、治療的である、すなわち、効果は、疾患および／または疾患に帰せられうる有害症状を、部分的または完全に治癒させる。この目的で、本明細書で記載される方法は、本明細書で記載される核酸配列を発現する宿主細胞、または本明細書で記載される核酸配列を含むベクターを含む、「治療有効量」の組成物を投与するステップを含む。
【０４０４】
「治療有効量」、「治療的量」、「免疫学的有効量」、「抗腫瘍有効量」、「腫瘍阻害有効量」という用語、またはそれらの文法的同等物は、所望の治療結果を達成するのに必要な投与量において、必要な期間にわたり有効な量を指す。治療有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびに個体において所望の応答を誘発する、本明細書で記載される組成物の能力などの因子に従い変動しうる。投与される、本開示の組成物の正確な量は、患者（対象）の年齢、体重、腫瘍サイズ、感染または転移の程度、および状態の個別差を考慮して、医師により決定されうる。
【０４０５】
代替的に、本明細書で記載される、１または複数の組成物の、患者または対象への投与の、薬理学的効果および／または生理学的効果は、「予防的」な場合もある、すなわち、効果は、疾患またはその症状を、完全に、または部分的に予防する場合もある。
【０４０６】
「予防有効量」とは、所望の予防結果（例えば、疾患の発症の防止）を達成するのに必要な投与量において、必要な期間にわたり有効な量を指す。
【０４０７】
「消泡剤」は、加工時における発泡であって、水性分散液の凝固、薄膜完成品中の気泡を結果としてもたらすか、または、一般に、加工を損なう発泡を低減する。例示的な抗発泡剤は、シリコンエマルジョン（ｓｉｌｉｃｏｎ  ｅｍｕｌｓｉｏｎ）またはセスキオレイン酸（sesquoleate）ソルビタンを含む。
【０４０８】
「抗酸化剤」は、例えば、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、およびトコフェロールを含む。ある特定の実施形態では、抗酸化剤は、必要とされる場合、化学的安定性を増強する。
【０４０９】
本明細書で記載される製剤は、抗酸化剤、金属キレート化剤、チオールを含有する化合物、および他の一般的な安定化剤から利益を得る場合がある。このような安定化剤の例は、（ａ）約０．５％〜約２％ｗ／ｖのグリセロール、（ｂ）約０．１％〜約１％ｗ／ｖのメチオニン、（ｃ）約０．１％〜約２％ｗ／ｖのモノチオグリセロール、（ｄ）約１ｍＭ〜約１０ｍＭのＥＤＴＡ、（ｅ）約０．０１％〜約２％ｗ／ｖのアスコルビン酸、（ｆ）０．００３％〜約０．０２％ｗ／ｖのポリソルベート８０、（ｇ）０．００１％〜約０．０５％ｗ／ｖのポリソルベート２０、（ｈ）アルギニン、（ｉ）ヘパリン、（ｊ）硫酸デキストラン、（ｋ）シクロデキストリン、（ｌ）ポリ硫酸ペントサン、および他のヘパリノイド、（ｍ）マグネシウムおよび亜鉛などの二価カチオン、または（ｎ）これらの組合せを含むがこれらに限定されない。
【０４１０】
「結合剤」は、凝集性の性質を付与し、例えば、アルギン酸およびその塩；カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース（例えば、Ｍｅｔｈｏｃｅｌ（登録商標））、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース（例えば、Ｋｌｕｃｅｌ（登録商標））、エチルセルロース（例えば、Ｅｔｈｏｃｅｌ（登録商標））、および結晶セルロース（例えば、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標））などのセルロース誘導体；微晶質デキストロース；アミロース；ケイ酸マグネシウムアルミニウム；多糖酸；ベントナイト；ゼラチン；ポリビニルピロリドン／酢酸ビニルコポリマー；クロスポビドン；ポビドン；デンプン；アルファデンプン；トラガント、デキストリン、スクロース（例えば、Ｄｉｐａｃ（登録商標））、グルコース、デキストロース、糖蜜、マンニトール、ソルビトール、キシリトール（例えば、Ｘｙｌｉｔａｂ（登録商標））、およびラクトースなどの糖；アカシア、トラガント、ガッティガム、イサポールハスクの粘液、ポリビニルピロリドン（例えば、Ｐｏｌｙｖｉｄｏｎｅ（登録商標）ＣＬ、Ｋｏｌｌｉｄｏｎ（登録商標）ＣＬ、Ｐｏｌｙｐｌａｓｄｏｎｅ（登録商標）ＸＬ−１０）、カラマツ由来のアラビノガラクタン（arabogalactan）、Ｖｅｅｇｕｍ商標）、ポリエチレングリコール、蝋、アルギン酸ナトリウムなどの天然ガムまたは合成ガムを含む。
【０４１１】
「担体」または「担体材料」は、医薬中で一般に使用される任意の賦形剤を含み、イブルチニブおよび抗がん剤の化合物など、本明細書で開示される化合物との適合性、ならびに所望の剤形の放出プロファイル特性に基づき選択されるものとする。例示的な担体材料は、例えば、結合剤、懸濁剤、崩壊剤、充填剤、界面活性剤、可溶化剤、安定化剤、滑沢剤、保湿剤、希釈剤などを含む。「薬学的に適合性の担体材料」は、アカシア、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、グリセロリン酸カルシウム、カルシウム乳酸、マルトデキストリン、グリセリン、ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、コレステロール、コレステロールエステル、カゼイン酸ナトリウム、ダイズレシチン、タウロコール酸、ホスファチジルコリン、塩化ナトリウム、リン酸三カルシウム、リン酸二カリウム、セルロースおよびセルロースコンジュゲート、糖、ステアロイル乳酸ナトリウム、カラギーナン、モノグリセリド、ジグリセリド、アルファデンプンなどを含みうるがこれらに限定されない。例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Nineteenth Ed (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1995)、Hoover, John E., Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania 1975、Liberman, H.A. and Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y., 1980、およびPharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Seventh Ed. (Lippincott Williams & Wilkins1999)を参照されたい。
【０４１２】
「分散剤」および／または「粘性モジュレーティング剤」は、液体培地または顆粒化法またブレンド法を介して、薬物の拡散および均質性を制御する材料を含む。一部の実施形態では、これらの薬剤はまた、コーティングマトリックスまたはエローディングマトリックスの有効性も促進する。例示的な拡散促進剤／分散剤は、例えば、親水性ポリマー、電解質、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）６０またはＴｗｅｅｎ（登録商標）８０、ＰＥＧ、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ；市販品では、Ｐｌａｓｄｏｎｅ（登録商標）として公知である）、ａｎｄ例えば、ヒドロキシプロピルセルロース（例えば、ＨＰＣ、ＨＰＣ−ＳＬ、およびＨＰＣ−Ｌ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（例えば、ＨＰＭＣ  Ｋ１００、ＨＰＭＣ  Ｋ４Ｍ、ＨＰＭＣ  Ｋ１５Ｍ、およびＨＰＭＣ  Ｋ１００Ｍ）、カルボキシメチルセルロースナトリウム（carboxymethylcellulose sodium）、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ステアリン酸酢酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣＡＳ）、非晶質セルロースなど、炭水化物ベースの分散剤、ケイ酸マグネシウムアルミニウム、トリエタノールアミン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ビニルピロリドン／酢酸ビニルコポリマー（Ｓ６３０）、酸化エチレンおよびホルムアルデヒドを伴う、４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェノールポリマー（チロキサポールとしてもまた公知である）、ポロキサマー（例えば、酸化エチレンと、酸化プロピレンとのブロックコポリマーである、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ  Ｆ６８（登録商標）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ  Ｆ８８（登録商標）、およびＰｌｕｒｏｎｉｃｓ  Ｆ１０８（登録商標））；およびポロキサミン（例えば、酸化プロピレンおよび酸化エチレンの、エチレンジアミンへの逐次的付加から導出される四官能性ブロックコポリマーである、Ｐｏｌｏｘａｍｉｎｅ  ９０８（登録商標）（ＢＡＳＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）としてもまた公知のＴｅｔｒｏｎｉｃ  ９０８（登録商標））、ポリビニルピロリドンＫ１２、ポリビニルピロリドンＫ１７、ポリビニルピロリドンＫ２５、またはポリビニルピロリドンＫ３０、ポリビニルピロリドン／酢酸ビニルコポリマー（Ｓ−６３０）、ポリエチレングリコール（例えば、ポリエチレングリコールは、約３００〜約６０００、または約３３５０〜約４０００、または約７０００〜約５４００の分子量を有しうる）、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ポリソルベート８０、アルギン酸ナトリウム、例えば、トラガントガムおよびアカシアガム、グアルガムなどのガム、キサンタンガムを含むキサンタン、糖、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース誘導体、ポリソルベート８０、アルギン酸ナトリウム、モノラウリン酸ポリエトキシル化ソルビタン、ポビドン、カルボマー、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、アルギン酸塩、キトサン、およびこれらの組合せを含む。セルロースまたはトリエチルセルロースなどの可塑化剤もまた、分散剤として使用するこ��ができる。特に、リポソーム分散液中および自己乳化分散液中で有用な分散剤は、ジミリストイルホスファチジルコリン、鶏卵に由来する天然ホスファチジルコリン、鶏卵に由来する天然ホスファチジルグリセロール、コレステロール、およびイソプロピルミリスチン酸である。
【０４１３】
１または複数のエロージョン促進剤の、１または複数の拡散促進剤との組合せもまた、本組成物中で使用することができる。
【０４１４】
「希釈剤」という用語は、送達の前に、目的の化合物を希釈するのに使用される化合物を指す。希釈剤はまた、より安定的な環境をもたらしうるため、化合物を安定化させるのにも使用することができる。当技術分野では、緩衝液中に溶解させた塩（これはまた、ｐＨの制御または維持ももたらしうる）を、リン酸緩衝生理食塩液溶液を含むがこれらに限定されない希釈剤として用いる。ある特定の実施形態では、希釈剤は、組成物のバルクを増大させて、圧縮を容易とするか、またはカプセルの充填のための均質なブレンドに十分なバルクを創出する。このような化合物は、例えば、ラクトース、デンプン、マンニトール、ソルビトール、デキストロース、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）などの結晶セルロース；二塩基性リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム二水和物；リン酸三カルシウム、リン酸カルシウム；無水ラクトース、噴霧乾燥ラクトース；アルファデンプン、Ｄｉ−Ｐａｃ（登録商標）（Ａｍｓｔａｒ）などの圧縮糖；マンニトール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ステアリン酸酢酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、スクロースベースの希釈剤、粉砂糖；一塩基性硫酸カルシウム一水和物、硫酸カルシウム二水和物；乳酸カルシウム三水和物、デキストレート（dextrate）；加水分解シリアル固形、アミロース；粉末セルロース、炭酸カルシウム；グリシン、カオリン；マンニトール、塩化ナトリウム；イノシトール、ベントナイトなどを含む。
【０４１５】
「充填剤」は、ラクトース、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、二塩基性リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、結晶セルロース、セルロース  粉末、デキストロース、デキストレート（dextrate）、デキストラン、デンプン、アルファデンプン、スクロース、キシリトール、ラクチトール、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウム、ポリエチレングリコールなどの化合物を含む。
【０４１６】
「滑沢剤」および「流動促進剤」とは、材料の接着または摩擦を防止、低減、または阻害する化合物である。例示的な滑沢剤は、例えば、ステアリン酸、水酸化カルシウム、滑石、フマル酸ステアリルナトリウム、鉱物油などの炭化水素、または水素化ダイズ油（Ｓｔｅｒｏｔｅｘ（登録商標））などの水素化植物油、高脂肪酸、ならびにアルミニウム、カルシウム、マグネシウム、亜鉛など、それらのアルカリ金属塩およびアルカリ土類金属塩、ステアリン酸、ステアリン酸ナトリウム、グリセロール、滑石、蝋、Ｓｔｅａｒｏｗｅｔ（登録商標）、ホウ酸、安息香酸ナトリウム、ナトリウム酢酸、塩化ナトリウム、ロイシン、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ−４０００）、またはＣａｒｂｏｗａｘ（商標）などのメトキシポリエチレングリコール、ナトリウムオレイン酸、安息香酸ナトリウム、ベヘン酸グリセリル、ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸マグネシウムまたはラウリル硫酸ナトリウム、Ｓｙｌｏｉｄ（商標）、Ｃａｂ−Ｏ−Ｓｉｌ（登録商標）などのコロイド状シリカ、トウモロコシデンプンなどのデンプン、シリコーン油、界面活性剤などを含む。
【０４１７】
「可塑化剤」とは、マイクロカプセル化材料を軟化させるのに使用される化合物、またはマイクロカプセル化材料の脆性を低下させるフィルムコーティングである。適切な可塑化剤は、例えば、ＰＥＧ  ３００、ＰＥＧ  ４００、ＰＥＧ  ６００、ＰＥＧ  １４５０、ＰＥＧ  ３３５０、およびＰＥＧ  ８００などのポリエチレングリコール、ステアリン酸、プロピレングリコール、オレイン酸、トリエチルセルロース、およびトリアセチンを含む。一部の実施形態では、可塑化剤はまた、分散剤または保湿剤としても機能しうる。
【０４１８】
「可溶化剤」は、トリアセチン、クエン酸トリエチル、オレイン酸エチル、カプリル酸エチル、ラウリル硫酸ナトリウム、ナトリウムドクセート（doccusate）、ビタミンＥ  ＴＰＧＳ、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン、Ｎ−ヒドロキシエチルピロリドン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルシクロデキストリン、エタノール、ｎ−ブタノール、イソプロピルアルコール、コレステロール、胆汁塩、ポリエチレングリコール２００〜６００、グリコフロール、トランスクトール、プロピレングリコール、およびジメチルイソソルビドなどの化合物を含む。
【０４１９】
「安定化剤」は、任意の抗酸化薬剤、緩衝液、酸、保存剤などの化合物を含む。
【０４２０】
「懸濁剤」は、ポリビニルピロリドン、例えば、ポリビニルピロリドンＫ１２、ポリビニルピロリドンＫ１７、ポリビニルピロリドンＫ２５、またはポリビニルピロリドンＫ３０、ビニルピロリドン／酢酸ビニルコポリマー（Ｓ６３０）、ポリエチレングリコール（例えば、ポリエチレングリコールは、約３００〜約６０００、または約３３５０〜約４０００、または約７０００〜約５４００の分子量を有しうる）、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ステアリン酸酢酸ヒドロキシメチルセルロース、ポリソルベート８０、ヒドロキシエチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、例えば、トラガントガムおよびアカシアガム、グアルガムなどのガム、キサンタンガムを含むキサンタン、糖、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースなどのセルロース誘導体、ポリソルベート８０、アルギン酸ナトリウム、モノラウリン酸ポリエトキシル化ソルビタン、ポビドンなどの化合物を含む。
【０４２１】
「界面活性剤」は、ラウリル硫酸ナトリウム、ナトリウムドクセート（docusate）、Ｔｗｅｅｎ  ６０またはＴｗｅｅｎ  ８０、トリアセチン、ビタミンＥ  ＴＰＧＳ、モノオレイン酸ソルビタン、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、ポリソルベート（ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ）、ポロキサマー、胆汁塩、モノステアリン酸グリセリン、酸化エチレンと酸化プロピレンとのコポリマー、例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）（ＢＡＳＦ）などの化合物を含む。他の一部の界面活性剤は、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステルおよび植物油、例えば、ポリオキシエチレン（６０）水素化ヒマシ油；ならびにポリオキシエチレンアルキルエーテルおよびアルキルフェニルエーテル、例えば、オクトキシノール１０、オクトキシノール４０を含む。一部の実施形態では、界面活性剤は、物理的安定性を増強するか、または他の目的で、組み入れることができる。
【０４２２】
「粘性増強剤」は、例えば、メチルセルロース、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ステアリン酸酢酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボマー、ポリビニルアルコール、アルギン酸塩、アカシア、キトサン、およびこれらの組合せを含む。
【０４２３】
「保湿剤」は、オレイン酸、モノステアリン酸グリセリン、ソルビタンモノオレイン酸、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミン、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、ナトリウムドクセート（docusate）、オレイン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ナトリウムドクセート（doccusate）、トリアセチン、Ｔｗｅｅｎ  ８０、ビタミンＥ  ＴＰＧＳ、アンモニウム塩などの化合物を含む。
【０４２４】
キット／製品
本明細書の、ある特定の実施形態では、本明細書で記載される、１または複数の方法による使用のためのキットおよび製品が開示される。このようなキットは、バイアル、試験管など、１または複数の容器であって、容器の各々が、本明細書で記載される方法において使用される個別のエレメントのうち１つを含む容器を受容するように区画化されたキャリングケース、パッケージ、または容器を含む。適切な容器は、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、および試験管を含む。一実施形態では、容器は、ガラスまたはプラスチックなど、様々な材料から形成されている。
【０４２５】
本明細書で提示される製品は、パッケージング材料を含有する。医薬パッケージング材料の例は、ブリスターパック、ボトル、試験管、バッグ、容器、ボトル、ならびに選択される製剤と、意図される投与方式および処置方式とに適する、任意のパッケージング材料を含むがこれらに限定されない。
【０４２６】
例えば、容器は、本明細書で記載されるＣＡＲの発現を調節するための遺伝子スイッチポリペプチドをコードするＣＡＲ−Ｔ細胞（例えば、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞）と、任意選択で、加えて、本明細書で開示されるサイトカインおよび／または化学療法剤とを含む。このようなキットは、任意選択で、本明細書で記載される方法におけるその使用に関する記載または表示または指示書の内容確認を含む。
【０４２７】
キットは、典型的に、内容物を列挙する表示、および／または使用のための指示書、ならびに使用のための指示書を伴う添付文書を含む。典型的に、指示書のセットもまた、組み入れられると予想される。
【０４２８】
一部の実施形態では、表示は、容器上に貼付されているか、または容器に付随する。一実施形態では、表示を形成する文字、数、または他の記号が、容器自体へと接着されているか、鋳造されているか、またはエッチングされている場合、表示は容器上に貼付されており、表示はまた、容器を保持する、レセプタクルまたはキャリングケース内に、例えば、パッケージ添付文書として存在する場合、容器に付随する。一実施形態では、表示は、内容物が、具体的な治療適用に使用されるものであることを指し示すのに使用される。表示はまた、内容物の、本明細書で記載される方法などにおける使用のための指示も指し示す。
【実施例】
【０４２９】
これらの例は、例示的な目的だけで提示されるものであり、本明細書で提示される特許請求の範囲を限定しようとするものではない。
【０４３０】
[実施例１]
ＰＢＭＣへの、ＳＢ遺伝子スイッチ系のヌクレオフェクション
ＳＢトランスポゾン系、すなわち、ＳＢ１１、膜結合型ＩＬ−１５（ｍｂＩＬ−１５）、およびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現させる、多様なＤＮＡプラスミドを、ヌクレオフェクションを介して、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）へとトランスフェクトして、Ｔ細胞の特異性をリダイレクトした（図１）。
【０４３１】
０日目に、ＰＢＭＣ２０００万個を、合計で１５μｇのトランスポゾンおよび５μｇのトランスポザーゼ（ＳＢ１１）と混合した、Ａｍａｘａ  Ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｃｅｌｌ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（型番：ＶＰＡ−１００２；Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）１００μＬ中に再懸濁させ、電気穿孔した。
【０４３２】
翌日（１日目）、細胞をカウントし、フローサイトメトリーにより、ＣＡＲの発現を測定した。ＣＡＲ  Ｔ細胞を、γ照射（１００Ｇｙ）するか、またはマイトマイシンＣで処置した、１：１の比のＡａＰＣで刺激した。使用したＡａＰＣ細胞は、ＣＤ１９抗原を発現するＫ５６２−ＡａＰＣであった。培養物に、第１のラウンドの刺激には、ＩＬ−２１（３０ｎｇ／ｍｌ）だけを補充し、その後、残りの刺激には、組換えヒトＩＬ−２（５０ＩＵ／ｍｌ）およびＩＬ−２１（３０ｎｇ／ｍｌ）（Ｐｅｐｒｏ  Ｔｅｃｈ）を補充した。Ｔ細胞培養物を、７日間にわたり持続することが典型的な、各刺激サイクルの終了時に表現型解析した。プロテインＬまたはＣＤ１９特異的ＣＡＲを認識する抗イディオタイプ抗体を用いる、マルチパラメーターのフローサイトメトリーにより、培養物を、ＣＡＲ発現について、表現型解析した。培養物はまた、ＮＫ細胞（ＣＤ３ｎｅｇＣＤ５６＋集団として規定された）の増生についても、緊密にモニタリングし、百分率が、総細胞集団のうちの１０％を超えたら、製造元の指示書に従い、ＣＤ５６に特異的な磁気ビーズ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓおよび／またはＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、ＣＡＲ  Ｔ細胞培養物から摘出した。
【０４３３】
[実施例２]
ＳＢ遺伝子オン−オフスイッチ系についてのフローサイトメトリー解析
ＣＡＲを導入するＳＢ転移を使用して、ＣＤ１９特異的Ｔ細胞を、ＰＢまたはＵＣＢに由来する単核細胞（ＭＮＣ）から作出するのに続き、ＡａＰＣを添加して、ＣＡＲ依存的に、Ｔ細胞数を拡大増殖させた。
【０４３４】
多様なマーカーおよび目的の遺伝子の発現について評価するフローサイトメトリー解析のために、細胞を静かに再懸濁させ、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ計測器を伴うトリパンブルー除外法を使用して、細胞数および生存率を測定した。細胞直径サイズもまた、記録した。各試料につき、細胞５×１０５個ずつを、１０℃、３３０×ｇで、４分間にわたり、抗体染色のために採取した。採取された細胞は、ＨＢＳＳ中に１０％のヒトＡＢ血清と共に、氷上で、少なくとも１５分間にわたりインキュベートした。蛍光コンジュゲート抗体を含有する抗体カクテルは、ＨＢＳＳ＋０．１％のＢＳＡ＋２ｍＭのＥＤＴＡ中に、ＣＤ４（クローンＲＰＡ−Ｔ４）、ＣＤ８（クローンＳＫ１）、ＣＤ３（クローンＵＣＨＴ１）、ＣＤ５６、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ（抗イディオタイプ抗体）、ＩＬ−１５、およびＩＬ−１５Ｒａに特異的な抗体のうちの１または複数を含んだ。調製された抗体カクテルおよび関連するＦＭＯ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｎｕｓ  ｏｎｅ）／アイソタイプ対照を、添加して、細胞試料を染色し、次いで、試料を、氷上で、３０分間にわたりインキュベートした。次いで、試料を、ＦＡＣＳ緩衝液（ＨＢＳＳ＋０．５％のＢＳＡ＋２ｍＭのＥＤＴＡ）で洗浄し、氷上で、Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により、３０分間にわたり染色した。細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、次いで、４％のパラホルムアルデヒド溶液（ＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で固定した。全ての試料は、ＬＳＲ  ＩＩフローサイトメーター、Ｆｏｒｔｅｓｓａ  Ｘ−２０フローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、またはｉＱｕｅ  Ｓｃｒｅｅｎｅｒ  Ｐｌｕｓ（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ）にかけ、データは、ＦｌｏｗＪｏ  Ｖ１０（ＴｒｅｅＳｔａｒ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）またはｉＱｕｅ  Ｓｃｒｅｅｎｅｒソフトウェアを使用して解析した。
【０４３５】
リガンド（ベレジメクス）を使用して、発現を誘導するために、ＡａＰＣで刺激したＣＡＲ−Ｔ細胞を、１ｍｌ当たりの細胞１×１０６個で採取した。ベレジメクスまたはＤＭＳＯ（両方の培養物中のＤＭＳＯ濃度を一定に保つための）を、培養物へと添加した。ベレジメクスは、２０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、または記載されている濃度で使用した。次いで、細胞を、ベレジメクスまたはＤＭＳＯの存在下、３７℃で、２〜３日間にわたり培養した。培養の２〜３日後、各試料につき、細胞５×１０５個ずつを、１０℃、３３０×ｇで、４分間にわたり、抗体染色のために採取した。採取された細胞は、ＨＢＳＳ中に１０％のヒトＡＢ血清と共に、氷上で、少なくとも１５分間にわたりインキュベートした。蛍光コンジュゲート抗体を含有する抗体カクテルは、ＨＢＳＳ＋０．１％のＢＳＡ＋２ｍＭのＥＤＴＡ中に、ＣＤ４（クローンＲＰＡ−Ｔ４）、ＣＤ８（クローンＳＫ１）、ＣＤ３（クローンＵＣＨＴ１）、ＣＤ５６、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ（抗イディオタイプ抗体）、ＩＬ−１５、およびＩＬ−１５Ｒａに特異的な抗体のうちの１または複数を含んだ。調製された抗体カクテルおよび関連するアイソタイプ対照を、添加して、細胞試料を染色し、次いで、試料を、氷上で、３０分間にわたりインキュベートした。次いで、試料を、ＦＡＣＳ緩衝液（ＨＢＳＳ＋０．５％のＢＳＡ＋２ｍＭのＥＤＴＡ）で洗浄し、氷上で、Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により、３０分間にわたり染色した。細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、４％のパラホルムアルデヒド溶液（ＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で固定した。全ての試料は、ＬＳＲ  ＩＩフローサイトメーター、Ｆｏｒｔｅｓｓａ  Ｘ−２０フローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、またはｉＱｕｅ  Ｓｃｒｅｅｎｅｒ  Ｐｌｕｓ（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ）にかけ、データは、ＦｌｏｗＪｏ  Ｖ１０（ＴｒｅｅＳｔａｒ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）またはｉＱｕｅ  Ｓｃｒｅｅｎｅｒソフトウェアを使用して解析した。
【０４３６】
ベレジメクスのオン−オフ−オン実験のために、まず、ベレジメクスを、言及された濃度（典型的に、２０〜１００ｎＭの間の）で、細胞培養物へと、２〜３日間にわたり添加した。細胞のアリコートを採取し、上記で言及した通り、フローサイトメトリーにより、多様なタンパク質の発現（オン）について解析した。次いで、残りの細胞培養物を洗浄し、ベレジメクスを伴わない完全培地中に再懸濁させ、最大で５日間にわたり培養した。細胞のアリコートを採取し、上記で言及した通り、フローサイトメトリーにより、言及される時点において、発現（オフ）について解析した。次いで、残りの細胞培養物を洗浄しベレジメクスを含有する完全培地で再懸濁させて、標的遺伝子の発現をオンにした。培養の２〜３日後、細胞のアリコートを採取し、フローサイトメトリーにより、発現について解析した。
【０４３７】
[実施例３]
生存実験
ヌクレオフェクションを介して、ＲＴＳ膜結合型ＩＬ−１５（ＲＴＳ−ｍｂＩＬ−１５）、ＣＤ１９特異的キメラ抗原受容体（ＣＤ１９  ＣＡＲ）をコードする、複数のＳｌｅｅｐｉｎｇ  ＢｅａｕｔｙトランスポゾンＤＮＡプラスミド（デザイン９、図２）を、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  ＢｅａｕｔｙトランスポザーゼであるＳＢ１１をコードするプラスミドＤＮＡと共に、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）へとトランスフェクトした（図１）。０日目に、ＰＢＭＣ２０００万個を、合計で１５μｇのトランスポゾンおよび５μｇのトランスポザーゼと混合した、Ａｍａｘａ  Ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｃｅｌｌ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（型番：ＶＰＡ−１００２；Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）１００μＬ中に再懸濁させ、細胞へとヌクレオフェクトした。翌日（１日目）、細胞をカウントし、フローサイトメトリーを使用して、ＣＡＲの発現を測定した。細胞を、γ照射（１００Ｇｙ）するか、またはマイトマイシンＣで処置した、１：１の比のＫ５６２ベースのＡａＰＣであって、それらの表面上でＣＤ１９を発現するＡａＰＣで刺激した。培養物に、第１のラウンドの刺激には、ＩＬ−２１（３０ｎｇ／ｍｌ）だけを補充し、その後、残りの刺激には、組換えヒトＩＬ−２（５０ＩＵ／ｍｌ）およびＩＬ−２１（３０ｎｇ／ｍｌ）（Ｐｅｐｒｏ  Ｔｅｃｈ）を補充した。Ｔ細胞培養物を、７日間にわたり持続することが典型的な、各刺激サイクルの終了時に表現型解析した。マルチパラメーターのフローサイトメトリーにより、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞を検出する、抗イディオタイプ抗体染色を用いて、培養物を、ＣＡＲ発現について、表現型解析した。培養物はまた、ＮＫ細胞（ＣＤ３ｎｅｇＣＤ５６＋集団として規定された）の増生についても、緊密にモニタリングし、百分率が、総細胞集団のうちの１０％を超えたら、製造元の指示書に従い、ＣＤ５６に特異的な磁気ビーズ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓおよび／またはＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、ＣＡＲ  Ｔ細胞培養物から摘出した。
【０４３８】
培養培地から、サイトカイン（ＩＬ−２およびＩＬ−２１）を除去したときの、ＲＴＳ−ｍｂＩＬ−１５を共発現するＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の存続を測定するために、ＣＡＲ−Ｔ細胞を、採取し、６ウェルプレート内の、ＩＬ−２およびＩＬ−２１を伴うかまたは伴わない完全ＲＰＭＩ培地中に、１ｍｌ当たりの細胞１×１０６個の濃度で播種した。ベレジメクス（５０ｎＭの最終濃度）またはＤＭＳＯ対照を、培養培地へと添加した。培養培地は、２〜３日間ごとに交換し、低量の細胞アリコートを、フロー解析のために採取した。フローサイトメトリー解析を行って、培地に由来するサイトカインの存在下または非存在下における、培養物中の、ｍｂＩＬ−１５の発現を測定するほか、生細胞％も測定した。サイトカインの存在下および非存在下におけるＣＡＲ−Ｔ細胞の生存率を、図１２に示す。培養物中のサイトカインの非存在下では、ベレジメクスを、添加して、ｍｂＩＬ−１５発現を誘導した場合に、ＣＡＲ−Ｔ細胞の生存率の改善が見られた。ベレジメクスを添加しない（ｍｂＩＬ−１５発現を誘導しない）場合、細胞は、ｅｘ  ｖｉｖｏの培養物中で存続しなかった。
【０４３９】
[実施例４]
ウェスタンブロット法
ＰＢＭＣに、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ系のプラスミドをヌクレオフェクトして、構成的プロモーター下のＣＤ１９特異的ＣＡＲ（ＣＤ１９  ＣＡＲ単独）、またはいずれも構成的プロモーター下のＣＤ１９特異的ＣＡＲおよびｍｂＩＬ−１５（ＣＤ１９  ＣＡＲ＋構成的ｍｂＩＬ−１５）、または構成的プロモーター下のＣＤ１９特異的ＣＡＲおよびＲＴＳ−ｍｂＩＬ−１５（ＣＤ１９  ＣＡＲ＋ＲＴＳ−ｍｂＩＬ−１５）を発現させた。ヌクレオフェクトされた細胞を、実施例１で記載した通り、ＡａＰＣの存在下で培養した。
【０４４０】
４ラウンドにわたる刺激の後、細胞を、ベレジメクスの非存在（ＣＤ１９  ＣＡＲ単独、ＣＤ１９  ＣＡＲ＋構成的ｍｂＩＬ−１５、およびＣＤ１９  ＣＡＲ＋ＲＴＳ−ｍｂＩＬ−１５）下、または存在（ＣＤ１９  ＣＡＲ＋ＲＴＳ−ｍｂＩＬ−１５）下において、２〜３日間にわたり培養した。ウェスタンブロット解析のために、細胞溶解物を調製した。ＮｕＰＡＧＥ  １０％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルのレーン１つ当たり、約１０μｇの溶解物をロードした。ｉＢｌｏｔ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ｓｅｍｉ−ｄｒｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ装置を使用して、タンパク質を、ゲルから、フッ化ポリビニルピロリドン（ＰＶＤＦ）膜へと転写した。ＰＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ；１倍濃度のＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０）溶液中に５％（ｗ／ｖ）の粉乳溶液を使用して、膜をブロッキングし、ヤギ抗ヒトＩＬ−１５（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）一次抗体およびウサギ抗ヤギＩｇＧ  ＨＲＰ（ＫＰＬ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）二次抗体で染色した。増強化学発光（ＥＣＬ）検出のための、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（商標）Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた。
【０４４１】
Ｄｉｇｉｔａｌ  ＤａｒｋｒｏｏｍソフトウェアおよびＡｌｐｈａＶｉｅｗ（登録商標）ソフトウェア（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）を使用して、ウェスタンブロットの画像を、ＦｌｕｏｒＣｈｅｍ（商標）Ｅ  Ｉｍａｇｅｒ（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）システム上で捕捉した。図１４は、ウェスタンブロットの画像を示す。ベレジメクスが非存在（ＣＤ１９  ＣＡＲ＋ＲＴＳ−ｍｂＩＬ−１５）の場合、ｍｂＩＬ−１５発現は、ウェスタンブロットにより検出されなかったが、ベレジメクスを、培養物へと添加したところ、ｍｂＩＬ−１５の強力な発現が観察された。ＣＤ１９  ＣＡＲだけの陰性対照では、ｍｂＩＬ−１５の発現は、観察されなかった。ＣＤ１９  ＣＡＲ＋構成的ｍｂＩＬ−１５陽性対照では、ｍｂＩＬ−１５の発現が検出された。
【０４４２】
[実施例５]
Ｔ細胞の活性化、およびｍｂＩＬ−１５トランス遺伝子発現のリガンド特異的制御
Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンを、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ、細胞タグ、ならびに遺伝子スイッチにより制御されるｍｂＩＬ−１５を安定的に発現させるようにデザインした。遺伝子スイッチ構成要素（例えば、ＶＰ１６／ＲｘＲａｎｄＧａｌ４／ＥｃＲ）の一方または両方の発現は、Ｔ細胞活性化特異的プロモーターの制御下で実施した。この例では、最小ＩＬ−２プロモーター（ＮＦＡＴ６−ＩＬ２プロモーター）へと融合させた６×ＮＦＡＴ応答エレメントにより作出された、Ｔ細胞活性化依存性プロモーターを用いて、ｍｂＩＬ−１５の条件付け発現のための、遺伝子スイッチ構成要素−ＶＰ１６−ＲｘＲおよび／またはＧａｌ４−ＥｃＲ融合タンパク質の発現を駆動した。遺伝子スイッチの構成要素が、ＮＦＡＴ６−ＩＬ２プロモーターの制御下にある場合、ｍｂＩＬ−１５の発現は、２つの条件：１）Ｔ細胞が活性化していること、および２）活性化リガンドであるベレジメクスが存在することが満たされることを必要とする。図２０Ａに示される、ＳＢトランスポゾン構築物の組合せを、ＳＢ１１トランスポザーゼと共に、ドナーＴ細胞にトランスフェクトした。
【０４４３】
０日目に、Ｔ細胞１０００万〜２０００万個を、合計で１５μｇのトランスポゾンおよび５μｇのトランスポザーゼ（ＳＢ１１）と混合した、Ａｍａｘａ  Ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｃｅｌｌ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（型番：ＶＰＡ−１００２；Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）１００μＬ中に再懸濁させ、電気穿孔した。
【０４４４】
翌日（１日目）、細胞をカウントし、フローサイトメトリーにより、ＣＡＲの発現を測定した。ＣＡＲ−Ｔ細胞を、γ照射（１００Ｇｙ）するか、またはマイトマイシンＣで処置した、１：１の比のＡａＰＣを伴う７〜１０日間ごとに、最大で４サイクルの、逐次的な刺激ラウンドにより、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて選択的に拡大増殖させた。使用したＡａＰＣ細胞は、ＣＤ１９抗原を発現するＫ５６２−ＡａＰＣであった。培養物に、第１のラウンドの刺激には、ＩＬ−２１（３０ｎｇ／ｍｌ）だけを補充し、その後、残りの刺激には、組換えヒトＩＬ−２（５０ＩＵ／ｍｌ）およびＩＬ−２１（３０ｎｇ／ｍｌ）（Ｐｅｐｒｏ  Ｔｅｃｈ）を補充した。
【０４４５】
多様なマーカーおよび目的の遺伝子の発現について評価するフローサイトメトリー解析のために、細胞を静かに再懸濁させ、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ計測器を伴うトリパンブルー除外法を使用して、細胞数および生存率を測定した。細胞直径サイズもまた、記録した。各試料につき、細胞５×１０５個ずつを、１０℃、３３０×ｇで、４分間にわたり、抗体染色のために採取した。採取された細胞は、ＨＢＳＳ中に１０％のヒトＡＢ血清と共に、氷上で、少なくとも１５分間にわたりインキュベートした。蛍光コンジュゲート抗体を含有する抗体カクテルは、ＨＢＳＳ＋０．１％のＢＳＡ＋２ｍＭのＥＤＴＡ中に、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３、ＣＤ５６、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ（抗イディオタイプ抗体）、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−１５Ｒａに特異的な抗体のうちの１または複数を含んだ。調製された抗体カクテルおよび関連するＦＭＯ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｎｕｓ  ｏｎｅ）／アイソタイプ対照を、添加して、細胞試料を染色し、次いで、試料を、氷上で、３０分間にわたりインキュベートした。次いで、試料を、ＦＡＣＳ緩衝液（ＨＢＳＳ＋０．５％のＢＳＡ＋２ｍＭのＥＤＴＡ）で洗浄し、氷上で、Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により、３０分間にわたり染色した。細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、次いで、４％のパラホルムアルデヒド溶液（ＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で固定した。全ての試料は、ＬＳＲ  ＩＩフローサイトメーター、Ｆｏｒｔｅｓｓａ  Ｘ−２０フローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、またはｉＱｕｅ  Ｓｃｒｅｅｎｅｒ  Ｐｌｕｓ（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ）にかけ、データは、ＦｌｏｗＪｏ  Ｖ１０（ＴｒｅｅＳｔａｒ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）またはｉＱｕｅ  Ｓｃｒｅｅｎｅｒソフトウェアを使用して解析した。
【０４４６】
Ｔ細胞活性化の、ｍｂＩＬ−１５発現に対する影響について評価するため、細胞を、最終回のＡａＰＣ刺激後、少なくとも７日間にわたり、培養培地中に保持して、ベースラインの（刺激を伴わない場合の）発現レベルについて調べた。Ｔ細胞は、ベレジメクスまたはＤＭＳＯによる処置の前に、４８時間にわたる、異なる用量のＣｏｎＡ（１または５μｇ／ｍＬ）、または２４時間にわたる、ＰＭＡ／イオノマイシン使用して活性化させた。
【０４４７】
非活性化ＣＡＲ−Ｔ細胞または活性化ＣＡＲ−Ｔ細胞を、採取し、１００ｎＭのベレジメクスまたはＤＭＳＯ（両方の培養物中のＤＭＳＯ濃度を一定に保つための）を、培養物へと添加した。次いで、細胞を、ベレジメクスまたはＤＭＳＯの存在下、３７℃で、トランス遺伝子の発現を測定するフローサイトメトリー解析の前に、少なくとも２４時間にわたり培養した。ＣＡＲおよびｍｂＩＬ−１５の発現は、ベレジメクス（図２０Ｃ：１μｇ／ｍＬのＣｏｎＡ；５μｇ／ｍＬのＣｏｎＡ：図２０Ｄ、ＰＭＡ／イオノマイシン：図２０Ｅ）の存在下または非存在下における、休眠Ｔ細胞内（図２０Ｂ）、または活性化Ｔ細胞内で定量化した。
【０４４８】
図２０Ｂは、Ｔ細胞活性化の非存在下で、構成的プロモーター下における遺伝子スイッチ構成要素（例えば、ＶＰ１６／ＲｘＲおよびＧａｌ４／ＥｃＲ）の発現のための、トランスポゾンを保有するＣＡＲ−Ｔ細胞だけが、ベレジメクスを、培養物へと添加した場合に、ｍｂＩＬ−１５を発現することが可能であったことを示す。図２０Ｃ〜２０Ｅにおいて示される通り、ＮＦＡＴ６−ＩＬ−２プロモーター（構築物３、４、および６）下における、１または複数の遺伝子スイッチ構成要素の発現のためのトランスポゾンを保有するＣＡＲ−Ｔ細胞が、ベレジメクスを、培養物へと添加した場合に、ｍｂＩＬ−１５の発現を呈したことから、ＣＡＲ−Ｔ細胞による、ｍｂＩＬ−１５の誘導性発現のためには、２つの条件を満たさなければならないことが示される。さらに、固定濃度のベレジメクスの存在下における、ｍｂＩＬ−１５の発現レベルは、Ｔ細胞活性化のレベルと共に上昇した（図２０Ｃおよび図２０Ｄ）。ベレジメクスの非存在下では、全ての被験構築物組合せについて、極度に低レベルのｍｂＩＬ−１５発現が、フローサイトメトリーにより検出された。ベレジメクスの存在下では、ＣＡＲ＋  Ｔ細胞だけが、ｍｂＩＬ−１５を誘導することが可能であったことは、これらのリガンド誘導性スイッチ系のデザインと符合する。
【０４４９】
[実施例６]
遺伝子スイッチ系を使用する、ＩＬ−１２の発現
ＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＡＲ、細胞タグ、およびＲＴＳ−ＩＬ−１２を安定的に発現させるように、図２２に描示される通りに、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンをデザインした。トランスポゾンプラスミドを、既に記載されている通り、いくつかのドナーＴ細胞に電気穿孔した。ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＣＡＲ−Ｔ細胞を、γ照射するか、またはマイトマイシンＣで処置した、ＩＬ−２およびＩＬ−２１を補充した培地中に１：１の比のＡａＰＣであって、「フィーダー細胞」として用いられるＡａＰＣを伴う７〜１０日間ごとに、最大で４サイクルの、逐次的な刺激ラウンドにより、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて選択的に拡大増殖させた。使用したＡａＰＣ細胞は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗原を発現するＫ５６２−ＡａＰＣであった。図２６は、ＣＡＲ＋  Ｔ細胞を、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて選択的に拡大増殖させるときの、複数のドナーに由来するＴ細胞内の、ＣＡＲ発現について描示する。
【０４５０】
ベレジメクスオン−オフサイクリング実験：各オン−オフサイクルのために、まず、ベレジメクスを、既に言及された濃度（典型的に、２０〜１００ｎＭの間の）で、細胞培養物へと、２〜３日間にわたり添加した（オン）。細胞のアリコートを採取し、言及された時点において、フローサイトメトリーおよび／またはＥＬＩＳＡにより、多様なタンパク質の発現（オン）について解析した。次いで、残りの細胞培養物を洗浄し、ベレジメクスを伴わない（オフ）完全培地中に再懸濁させ、最大で５日間にわたり培養した。細胞のアリコートを採取し、上記で言及した通り、フローサイトメトリーおよび／またはＥＬＩＳＡにより、言及される時点において、発現（オフ）について解析した。ベレジメクスのオン−オフサイクルは、工程を繰り返すことにより、残りの細胞培養物に対して、再度繰り返すことができる。
【０４５１】
ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＣＡＲ−Ｔ細胞内の、ＩＬ−１２誘導についてアッセイするため、ヌクレオフェクションの２４時間後における汎Ｔ細胞を、ＩＬ−２１を含有する培地のＡａＰＣの存在下において、ＤＭＳＯ（対照）またはベレジメクスで処置した。ヌクレオフェクションの４８時間後、ＥＬＩＳＡにより、培養物上清を、ＩＬ−１２レベルについて解析した。
【０４５２】
図２７は、ベレジメクスによる処置が、ＣＡＲおよびＲＴＳ−ＩＬ−１２の両方を共発現する、ＳＢトランスポゾンをトランスフェクトされたＴ細胞による、ＩＬ−１２の発現を誘導したことを示す。しかし、ＲＴＳ−ＩＬ−１２を欠くＣＡＲ−Ｔ細胞は、培養物上清中に、ＩＬ−１２を産生しなかった。ＤＭＳＯ対照による処置は、低バックグラウンドレベルのＩＬ−１２誘導を示した。
【０４５３】
さらに、ＲＴＳ−ＩＬ−１２／ＣＡＲ−Ｔ細胞が、誘導性ＩＬ−１２を産生する能力を、抗原特異的刺激の存在下または非存在下において評価した。ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＣＡＲ／ＲＴＳ−ＩＬ−１２  Ｔ細胞を、ＥＧＦＲｖＩＩＩ＋ＡａＰＣを伴う、３回にわたる、逐次的な刺激ラウンドにより、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて拡大増殖させた。ベレジメクス（１００ｎＭ）またはＤＭＳＯ（対照）を、ＥＧＦＲｖＩＩＩ＋ＡａＰＣの非存在下（図２８Ａ）、または存在下（図２８Ｂ）において、ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＣＡＲ／ＲＴＳ−ＩＬ−１２  Ｔ細胞の培養物へと、培養物上清中のＩＬ−１２レベルの解析前の４８時間にわたり添加した。図２８Ａおよび図２８Ｂに示される通り、ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＣＡＲ／ＲＴＳ−ＩＬ−１２  Ｔ細胞が、ベレジメクス誘導性ＩＬ−１２を発現する能力は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗原特異的刺激の存在下では、大幅に増強されたが、ベレジメクスの非存在下におけるＩＬ−１２発現のバックグラウンドレベルは、低レベルであった。
【０４５４】
[実施例７]
ＲＴＳ遺伝子スイッチ系を使用する、ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲ発現細胞内の、ベレジメクスオン−オフサイクリング
ＩＬ−１２誘導性遺伝子を保有するＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＣＡＲ−Ｔ細胞に対するベレジメクスによる処置およびこの除去の繰り返しの効果を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの、抗原特異的Ｔ細胞活性化の存在下および非存在下の両方において、ＡａＰＣとの共培養により決定した。リガンド処置の第１のサイクル（オン−オフ）では、ＥＧＦＲｖＩＩＩ＋ＡａＰＣを伴う、４回にわたる、逐次的な刺激ラウンドにより、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて拡大増殖させたＣＡＲ−Ｔ細胞（１ｍｌ当たり１０６個）を、ＤＭＳＯまたはベレジメクスで処置し、ＩＬ−２１およびＩＬ−２を含有する培地中、ＡａＰＣの存在下または非存在下において培養した。処置の４８時間後、細胞を、完全に洗浄し、リガンドを除去し、新規の培養容器内の、ＩＬ−２１およびＩＬ−２を含有する培地中で、５日間にわたり培養した。次いで、処置後２４〜１２０時間の間に採取された培養物上清を、ＩＬ−１２およびＩＦＮγの発現について解析した。
【０４５５】
リガンド処置の第２のサイクル（オン−オフ）では、サイクル１において、ＡａＰＣの存在下で、ＤＭＳＯまたはベレジメクスにより処置された培養物からのＣＡＲ−Ｔ細胞を、ベレジメクスの除去（サイクル１における）の５日後に回収し、抗原特異的Ｔ細胞活性化の存在下および非存在下において、ＡａＰＣとの共培養により、ＤＭＳＯまたはベレジメクスを伴う、リガンド処置の第２のサイクルにかけた。処置の４８時間後、細胞を、完全に洗浄し、リガンドを除去し、新規の培養容器内の、ＩＬ−２１に加えて、ＩＬ−２を含有する培地中で、５日間にわたり培養した。次いで、処置後２４〜１２０時間の間に採取された培養物上清を、ＩＬ−１２およびＩＦＮγの発現について解析した。
【０４５６】
図２９Ａは、誘導性ＩＬ−１２構築物（ＸＯＮ−６１またはＸＯＮ−６２；配列番号１３５または１３６）もまた保有する、ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＣＡＲ−Ｔ細胞内の、ベレジメクスによる処置が、処置の４８時間後において、ＩＬ−１２発現の、培養物上清中のＤＭＳＯによる処置と比べて増大を結果としてもたらすことを示す。ＡａＰＣ媒介性抗原特異的刺激の存在下では、ＩＬ−１２誘導のレベルは、抗原特異的刺激の非存在下と比較して増強された。ベレジメクスの非存在下では、極めて低バックグラウンドレベルのＩＬ−１２発現が、抗原特異的刺激の存在下または非存在下において観察された。誘導性ＩＬ−１２を伴わないＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＣＡＲ−Ｔ細胞は、抗原特異的刺激の存在下または非存在下で、ＩＬ−１２を発現しなかった。
【０４５７】
ベレジメクス除去の、ＩＬ−１２発現に対する効果を、図３０Ａ（ＡａＰＣの非存在下で培養された細胞）および図３０Ｂ（ＡａＰＣの存在下で培養された細胞）に示す。ＡａＰＣ媒介性抗原特異的刺激の存在下および非存在下のいずれにおいても、処置の４８時間後におけるベレジメクスの除去は、ＩＬ−１２発現の低減を結果としてもたらした。ＩＬ−１２誘導のレベルは、抗原特異的刺激の非存在下（図３０Ａ）では、抗原特異的刺激の存在下（図３０Ｂ）と比較して、有意に低かった。しかし、ベレジメクスを除去したところ、ＩＬ−１２のレベルは、徐々に低減され、ベースラインへと戻ったことから、誘導的遺伝子発現の緊密な制御が示される。
【０４５８】
図３１Ａおよび図３１Ｂは、サイクル１中の薬剤の除去後の、ベレジメクスまたはＤＭＳＯによる、第２のサイクル中のリガンド処置の４８時間後における、培養物上清中のＩＬ−１２誘導のレベルを示す。サイクル１において、ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現ＡａＰＣの存在下で培養された、ＤＭＳＯまたはベレジメクスによる処置細胞を、サイクル２では、ＥＧＦＲｖＩＩＩ＋ＡａＰＣの存在下または非存在下において、ベレジメクス（またはＤＭＳＯ）で処置した。結果は、サイクル２において、ベレジメクスおよびＥＧＦＲｖＩＩＩ＋ＡａＰＣで処置された細胞が、サイクル１において、ベレジメクスおよびＥＧＦＲｖＩＩＩ＋ＡａＰＣで処置された場合、サイクル１中に、ＤＭＳＯおよびＥＧＦＲｖＩＩＩ＋ＡａＰＣで処置された細胞（図３１Ａ）と比べて、ＩＬ−１２誘導の増大（図３１Ｂ）を示すことを示す。ここでもまた、ベレジメクスの非存在下では、極めて低バックグラウンドレベルのＩＬ−１２発現が観察された。
【０４５９】
ベレジメクスにより、２サイクルにわたり処置したときの、ＲＴＳ−ＩＬ−１２発現の動態を、図３２Ａに捕捉する。誘導性ＩＬ−１２構築物（ＸＯＮ−６１またはＸＯＮ−６２；配列番号１３５または１３６）を保有するＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＣＡＲ−Ｔ細胞を、上記で記載した、２サイクルにわたるリガンド処置により、ベレジメクスの存在下または非存在下で、ＩＬ−１２発現を誘導する、それらの能力について査定した。本実施例におけるリガンド誘導性遺伝子スイッチベクターは、両方のトランスポゾンを発現する細胞だけが、遺伝子スイッチにより制御されるＩＬ−１２の発現が可能であるようにデザインする。ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲの発現は、図３４Ｂにおいて示される通り、リガンド処置のサイクル１の開始前における、Ｔ細胞内のフローサイトメトリーにより定量化した。細胞に、ＣＤ３についてゲートをかけた。
【０４６０】
図３２Ａに示される通り、これらのＣＡＲ−Ｔ細胞によるＩＬ−１２発現は、活性化因子リガンドである、ベレジメクスの添加または除去により、長期にわたる培養期間中、繰り返し、オンおよびオフにすることができる。ＩＬ−１２発現は、ベレジメクスを除去すると、ベースラインレベルへと低下し、ベレジメクスを添加すると、オンに戻った。データは、１例のドナーに由来する代表的データである。
【０４６１】
図３３は、ベレジメクスにより、２サイクルにわたり処置したときの、ＲＴＳ−ＩＬ−１２発現の動態の別の例を示す。誘導性ＩＬ−１２構築物（ＸＯＮ−６１またはＸＯＮ−６２；配列番号１３５または１３６）を保有するＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＣＡＲ−Ｔ細胞を、上記で記載した、２サイクルにわたるリガンド処置により、ベレジメクスの存在下または非存在下で、ＩＬ−１２発現を誘導する、それらの能力について査定した。この場合、第１の処置サイクルは、ＥＧＦＲｖＩＩＩ＋ＡａＰＣの存在下で実行し、第２のサイクルは、ＥＧＦＲｖＩＩＩ＋ＡａＰＣの非存在下で実行した。長期にわたる培養期間中に、処置および除去を繰り返すと、ベレジメクスが、ＥＧＦＲｖＩＩＩＣＡＲ−Ｔ細胞によるＩＬ−１２発現を調節しうることは、前出の知見と符合する。サイクル２における、ＡａＰＣ媒介性ＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的刺激の除去は、対応する、ＩＬ−１２レベルの低減をもたらす。データは、第２のドナーに由来する代表的データである。
【０４６２】
[実施例８]
ベレジメクスの用量反応
ＲＴＳ−ＩＬ−１２を伴うかまたは伴わないＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＣＡＲ  Ｔ細胞を、ＥＧＦＲｖＩＩＩ＋ＡａＰＣを伴う、３回にわたる、逐次的な刺激ラウンドにより、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて拡大増殖させた。次いで、用量を０ｎＭ（ＤＭＳＯ対照）〜１００ｎＭで変動させるベレジメクスにより、Ｔ細胞を処置した。ベレジメクス処置の４８時間後、培養物上清を採取し、ＥＬＩＳＡにより、ＩＬ−１２レベルについて解析した。全ての群におけるＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＣＡＲ発現を、フローサイトメトリーにより確認したところ、構成的プロモーターの制御下におけるＣＡＲ発現に関して予測される通り、ベレジメクスの用量を増大させた場合に安定した（データは示さない）。
【０４６３】
結果を、図３４に示す。結果は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＣＡＲ／ＲＴＳ−ＩＬ−１２  Ｔ細胞が、ＩＬ−１２を、ベレジメクス用量依存的に産生したことを示す。ＣＡＲおよびＩＬ−１２に加えて、細胞タグを発現させるトランスポゾンをトランスフェクトされた細胞では、所与のベレジメクス濃度に対して、細胞タグの発現を欠く細胞と比較して、低レベルのＩＬ−１２発現が観察された。ＲＴＳ−ＩＬ−１２を伴わないＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＩＬ−１２を発現しなかった。
【０４６４】
[実施例９]
ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＣＡＲ−Ｔ細胞の、ＥＧＦＲｖＩＩＩ＋標的細胞に対する、特異的細胞傷害作用
ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＣＡＲを発現するＴ細胞が、ＥＧＦＲｖＩＩＩ＋標的細胞に対して応答する能力について調べた。ＲＴＳ−ＩＬ−１２を伴うかまたは伴わないＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＣＡＲ  Ｔ細胞を、ＥＧＦＲｖＩＩＩ＋ＡａＰＣを伴う、４回にわたる、逐次的な刺激ラウンドにより、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて拡大増殖させた。これらのエフェクターＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＣＡＲ−Ｔ細胞は、２％のＦＢＳおよびＬ−グルタミンを含有するＲＰＭＩ中で、４８時間にわたり休眠させてから、ＥＧＦＲｖＩＩＩ＋標的細胞およびＥＧＦＲｖＩＩＩｎｅｇ標的細胞を、ベレジメクスの非存在下における、エフェクター対標的細胞比を１：１とする共培養にかけた。培養物上清を、培養の２４時間後に回収し、ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＣＡＲ−Ｔ細胞の特異性についての、機能的なリードアウトとしての、ＩＦＮγについて解析した。
【０４６５】
図３５は、標的細胞との共培養の２４時間後における、ＣＡＲ−Ｔ細胞による、ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗原特異的ＩＦＮγの産生を示す。ＥＧＦＲｖＩＩＩｎｅｇＥＬ４細胞系との共培養、またはエフェクターＣＡＲ−Ｔ細胞単独は、ＩＦＮγ発現を結果としてもたらさなかった。
【０４６６】
図３６Ａは、ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する神経膠芽腫標的細胞との共培養（ベレジメクスを伴わない）の２４時間後における培養物上清中のＩＦＮγを示す。結果は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ＋（Ｕ２５１ＭＧ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ−Ｆｌｕｃ−ＧＦＰおよびＵ８７ＭＧ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ−Ｆｌｕｃ−ＧＦＰ）神経膠芽腫標的細胞が、ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＣＡＲ  Ｔ細胞によるＩＦＮγ分泌を誘導したのに対し、ＥＧＦＲｖＩＩＩｎｅｇ標的細胞（Ｕ２５１ＭＧ、Ｕ２５１ＭＧ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ−Ｆｌｕｃ−ＧＦＰ、Ｕ８７ＭＧ、およびＵ８７ＭＧ−Ｆｌｕｃ−ＧＦＰ）、またはエフェクター細胞単独は、ＩＦＮγ分泌を誘導しなかったことを示す。
【０４６７】
ＥＧＦＲｖＩＩ−ＣＡＲ−Ｔ細胞の、ＥＧＦＲｖＩＩＩ＋およびＥＧＦＲｖＩＩＩｎｅｇ標的細胞に対する細胞傷害作用について、２時間にわたるユーロピウム放出アッセイにおいて調べた。ＤＥＬＦＩＡ  ＢＡＴＤＡ試薬（ＤＥＬＦＩＡ  ＥｕＴＤＡ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙアッセイ；Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して、標的細胞系を標識化した。ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＣＡＲ−Ｔエフェクター（Ｅ）細胞を、標識化標的（Ｔ）細胞と共に、ＲＰＭＩ−１６４０＋５％の熱不活化ＦＢＳ中に、３：１、１：１または０．３：１の（Ｅ：Ｔ）比で共培養した。２時間後、共培養物からの上清を採取し、ＤＥＬＦＩＡユーロピウムアッセイを添加して現像し、時間分解蛍光計測器上で読み取って、標的細胞に対する細胞傷害作用を測定した。実施例の実験からの結果を、図３６Ｂに描示する。
【０４６８】
図３６Ｂに示される通り、ＲＴＳ−ＩＬ−１２を伴うかまたは伴わないＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＣＡＲ−Ｔ細胞は、標的細胞に対する、ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗原特異的な、用量依存性の細胞傷害作用を示した。
【０４６９】
[実施例１０]
ＰＢＭＣへの、セリンリコンビナーゼ系のヌクレオフェクション
セリンリコンビナーゼ接合部位と、図１７に描示される遺伝子スイッチ系の構成要素とを含有する、多様なＤＮＡプラスミドを、ヌクレオフェクションを介して、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）へとトランスフェクトして、Ｔ細胞の特異性をリダイレクトした。具体的には、３つの単一ベクター：
（ｉ）ＣＡＲ：ＨＥＲ１ｔ＋構成的ｍｂＩＬ１５（陽性対照）
（ｉｉ）ＣＡＲ：ＨＥＲ１ｔ＋プロモーターを伴わないｍｂＩＬ１５（陰性対照）
（ｉｉｉ）ＣＡＲ：ＨＥＲ１ｔ＋ＲＴＳ：ｍｂＩＬ１５
を、セリンリコンビナーゼである、ＳＦ３７０の存在下および非存在下において調べた。ＣＡＲおよびｍｂＩＬ１５の発現は、毎週（１日目、８日目、１５日目、および２２日目）査定した。細胞のアリコートを、各フローの２４〜４８時間前に、ＤＭＳＯまたはベレジメクスで処置して、誘導性ｍｂＩＬ１５発現について評価した。ＡａＰＣクローン１を、ＣＡＲ＋細胞との、１：１の比で、毎週添加した。
【０４７０】
ＣＡＲ／ｍｂＩＬ１５ベクター構築物＋ＳＦ３７０リコンビナーゼを施される細胞だけが、拡大増殖することが観察され、全ての他の培養物は、同様のトランスフェクション効率にもかかわらず、１週間以内に、拡大増殖に失敗した。この結果は、被験構築物の、リコンビナーゼ媒介性の組込みを示す。ＨＥＲ１ｔの発現は、２２および２９日目だけにおいて査定されたが、ＣＡＲ発現（データは示さない）と相関する。
【０４７１】
トランスフェクションの２週間後、ベレジメクス処置（約４８時間）は、ｍｂＩＬ−１５発現の誘導と関連した。ベレジメクスの非存在下では、ｍｂＩＬ−１５発現は、陰性対照「プロモーターを伴わないｍｂＩＬ１５」試料の場合の範囲にある。ベレジメクスの除去は、ｍｂＩＬ１５発現の完全喪失と関連した。
【０４７２】
本明細書では、本開示の好ましい実施形態を示し、それらについて記載してきたが、当業者には、このような実施形態が、例だけを目的として提示されていることが明らかであろう。今や、本開示から逸脱しない限りにおいて、当業者は、多数の変更、変化、および代用に想到するであろう。本明細書で記載される実施形態、またはこれらの実施形態、もしくはその中で記載される態様のうちの１または複数の組合せに対する、多様な代替物を、本開示の実施において利用しうることを理解されたい。以下の特許請求の範囲は、本開示の範囲を規定するものであり、これらの特許請求の範囲の範囲内にある方法および構造、ならびにそれらの均等物は、その対象となることが意図される。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２０Ｅ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２４Ｄ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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