(57)【要約】  本明細書では、核酸配列におけるエピジェネティック修飾の検出のためのシステム及び方法が提供される。本明細書に記載されるシステム及び方法は、エピジェネティック修飾の検出における実質的に偏りのないアプローチを提供し得る。本明細書に記載されるシステム及び方法は、エピジェネティック修飾と結合される標識又は部分を有する配列を増幅するシステム及び方法と比較して、エピジェネティック修飾の検出において実質的に偏りのないアプローチを提供し得る。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．標識を核酸配列のエピジェネティック修飾された塩基と結合させることで、標識された核酸配列を形成させることと、
ｂ．実質的に相補的な鎖を前記標識された核酸配列にハイブリダイズさせることと、
ｃ．前記標識された核酸配列が実質的に存在しない反応において前記実質的に相補的な鎖を増幅させることと、
を含む方法。
【請求項２】
ａ．実質的に相補的な鎖をエピジェネティック修飾された塩基を含む核酸配列にハイブリダイズさせることと、
ｂ．標識を前記核酸配列のエピジェネティック修飾された塩基と結合させることで、標識された核酸配列を形成させることと、
ｃ．前記標識された核酸配列が実質的に存在しない反応において前記実質的に相補的な鎖を増幅させることと、
を含む方法。
【請求項３】
前記標識は、基材と結合されている、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記基材は、ビーズを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ビーズは、磁性ビーズである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記基材は、アレイを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記実質的に相補的な鎖は、前記標識された核酸配列より長さが短い、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記実質的に相補的な鎖は、前記増幅前に伸長される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ハイブリダイズさせることは、少なくとも２つの実質的に相補的な鎖を前記標識された核酸配列にハイブリダイズさせることを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも２つの実質的に相補的な鎖をライゲーションさせることを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記標識された核酸配列は、アダプター配列を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ハイブリダイズさせることは、前記実質的に相補的な鎖の少なくとも一部分を前記アダプター配列にハイブリダイズさせることを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記核酸配列は、第１のバーコードを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記核酸配列は、第２のバーコードを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１のバーコードはユニークなバーコードであり、かつ前記第２のバーコードはサンプルバーコードである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記核酸配列のエピジェネティック修飾された塩基は、ヒドロキシメチル化された塩基（ｈｍＢ）である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ｈｍＢは、５−ヒドロキシメチル化された塩基（５−ｈｍＢ）である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記５−ｈｍＢは、５−ヒドロキシメチル化されたシトシン（５−ｈｍＣ）である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記核酸配列のエピジェネティック修飾された塩基は、メチル化された塩基、ヒドロキシメチル化された塩基、ホルミル化された塩基若しくはカルボン酸含有塩基又はそれらの塩を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記核酸配列又は前記標識された核酸配列の少なくとも一部分は、二本鎖である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記標識は、単結合、二重結合又は三重結合により前記エピジェネティック修飾された塩基と結合される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記実質的に相補的な鎖を前記標識された核酸配列から分離させることを含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記核酸配列は、前記核酸配列の少なくとも約２０個の塩基当たり、少なくとも約１個〜約３個、約１個〜約５個、約１個〜約１０個、約１個〜約１５個又は約１個〜約２０個のエピジェネティック修飾された塩基を含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記核酸配列は、前記核酸配列の少なくとも約２０個の塩基当たり、少なくとも約１個、５個、１０個、１５個又は２０個のエピジェネティック修飾された塩基を含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記実質的に相補的な鎖の塩基の少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％は、前記標識された核酸配列と塩基対を形成する、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記実質的に相補的な鎖は、前記核酸配列とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
核酸配列は、シトシングアニン（ＣＧ）サイト、シトシンリン酸グアニン（ＣｐＧ）アイランド又はそれらの組み合わせを含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記核酸配列は、セルフリーＤＮＡを含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記核酸配列は、ｃＤＮＡ配列を含む、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
増幅された産物をシーケンシングすることを含む、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記核酸配列は、試料に由来する、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記試料は、被験体に由来する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記被験体は、ヒトである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記試料は、口腔試料、唾液試料、血液試料、血漿試料、生殖試料、粘液試料、脳脊髄液試料、組織試料又はそれらの任意の組み合わせを含む、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
結果を得ることを含む、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記結果を参照と比較することを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
通信媒体を介して前記結果を通信することを含む、請求項３５又は３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記被験体は、病態を有すると診断されている、請求項３２〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記被験体を、病態を有すると診断することを含む、請求項３２〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記被験体を、病態を発症する可能性を有すると診断することを含む、請求項３２〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記診断は、前記結果と前記参照とを比較することに基づく、請求項３９又は４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記診断は、少なくとも部分的に以前の診断を確認する、請求項３８又は３９に記載の方法。
【請求項４３】
前記病態は、癌である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
前記被験体のための治療を選択することを含む、請求項３９又は４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記被験体を治療することを含む、請求項３９〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記治療は、外科手術、化学療法、放射線療法、免疫療法、標的療法、ホルモン療法、幹細胞移植及び精密医療を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記結合、前記ハイブリダイズ及び前記増幅を異なる時点で繰り返すことを含む、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記被験体は、ヒトである、請求項３２に記載の方法。
【請求項４９】
前記標識は、糖を含む、請求項１〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記糖は、グルコースを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記グルコースは、変性されている、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記標識は、酵素の補助により前記エピジェネティック修飾された塩基と結合される、請求項１〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記酵素は、二本鎖である前記核酸配列の一部分について選択的である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記標識は、二本鎖である前記核酸配列の一部分で前記エピジェネティック修飾された塩基と選択的に結合される、請求項１〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記標識は、前記核酸配列の一部分について選択的である、請求項１〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記部分は、二本鎖である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
前記実質的に相補的な鎖は、エピジェネティック修飾された塩基を実質的に有しない、請求項１〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記実質的に相補的な鎖は、エピジェネティック修飾された塩基を有しない、請求項１〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記増幅は複数の核酸鎖をもたらし、それらの複数の核酸鎖の約２％未満は、エピジェネティック修飾された塩基を含む、請求項１〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記核酸配列は、複数のエピジェネティック修飾された塩基を含み、かつ前記実質的に相補的な鎖は、前記複数のエピジェネティック修飾された塩基の約２％未満を含む、請求項１〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記実質的に相補的な鎖は、エピジェネティック修飾された塩基を含む、請求項１〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
使用説明書と、容器と、（ｉ）エピジェネティック修飾された核酸配列と結合し、かつ（ｉｉ）基材と結合するように構成された標識と、基材と結合されたコントロール核酸配列と、前記標識と結合するように構成された基材とを含むキット。
【請求項６３】
核酸配列において複数のエピジェネティック修飾された残基の存在を検出することを含む方法であって、前記複数のエピジェネティック修飾された残基は、少なくとも２個のエピジェネティック修飾された残基を含み、かつ検出の感度は、前記複数のエピジェネティック修飾された残基におけるエピジェネティック修飾された残基の数の増加に伴って実質的に一定のままである、方法。
【請求項６４】
前記少なくとも２個のエピジェネティック修飾された残基は、少なくとも４個のエピジェネティック修飾された残基である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記検出の感度は、前記複数のエピジェネティック修飾された残基の少なくとも約９０％の存在を検出することを含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
前記検出の感度は、前記複数のエピジェネティック修飾された残基の各々のエピジェネティック修飾された残基の存在を検出することを含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
核酸配列を濃縮させることを含む方法であって、前記核酸配列は、（ｉ）複数のエピジェネティック修飾された残基及び（ｉｉ）配列長を含み、前記複数のエピジェネティック修飾された残基は、少なくとも２個のエピジェネティック修飾された残基を含み、前記濃縮は、少なくとも４サイクルの増幅を含み、それにより複数のシーケンスリードが生成され、前記複数のシーケンスリードの約９０％は、前記配列長の少なくとも約９０％を保持する、方法。
【請求項６８】
前記少なくとも２個のエピジェネティック修飾された残基は、少なくとも４個のエピジェネティック修飾された残基である、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記少なくとも４サイクルの増幅は、少なくとも８サイクルの増幅である、請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
前記核酸配列は、セルフリーＤＮＡを含む、請求項６３〜６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
前記核酸配列は、ｃＤＮＡ配列を含む、請求項６３〜６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記複数のエピジェネティック修飾された残基のうちの１つのエピジェネティック修飾された残基は、ヒドロキシメチル化された塩基（ｈｍＢ）である、請求項６３〜６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
前記ｈｍＢは、５−ヒドロキシメチル化された塩基（５−ｈｍＢ）である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記５−ｈｍＢは、５−ヒドロキシメチル化されたシトシン（５−ｈｍＣ）である、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記複数のエピジェネティック修飾された残基のうちの１つのエピジェネティック修飾された残基は、メチル化された塩基、ヒドロキシメチル化された塩基、ホルミル化された塩基若しくはカルボン酸含有塩基又はそれらの塩を含む、請求項６３〜６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
前記核酸配列の少なくとも一部分は、二本鎖である、請求項６３〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記核酸配列は、シトシングアニン（ＣＧ）サイト、シトシンリン酸グアニン（ＣｐＧ）アイランド又はそれらの組み合わせを含む、請求項６３〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
複数のエピジェネティック修飾された残基を含む核酸配列を濃縮させて、複数のシーケンスリードを生成させることを含む方法であって、前記濃縮から生成された前記複数のシーケンシングリードの少なくとも約９０％は、ゲノムの約１％〜約５０％に由来する、方法。
【請求項７９】
前記生成された複数のシーケンシングリードの少なくとも約９０％は、ゲノムの約１％〜約２０％に由来する、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記複数のシーケンシングリードの長さは、少なくとも約１０塩基対である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８１】
前記複数のエピジェネティック修飾された残基は、少なくとも約２個のエピジェネティック修飾された残基である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８２】
前記複数のエピジェネティック修飾された残基は、少なくとも約６個のエピジェネティック修飾された残基である、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
標識は、前記複数のエピジェネティック修飾された残基のうちの１つのエピジェネティック修飾された残基と結合される、請求項６３〜８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
前記標識は、単結合、二重結合又は三重結合により前記エピジェネティック修飾された残基と結合される、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記核酸配列は、前記核酸配列の少なくとも約２０個の塩基当たり、少なくとも約１個〜約３個、約１個〜約５個、約１個〜約１０個、約１個〜約１５個又は約１個〜約２０個のエピジェネティック修飾された残基を含む、請求項６３〜８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
前記核酸配列は、前記核酸配列の少なくとも約２０個の塩基当たり、少なくとも約１個、５個、１０個、１５個又は２０個のエピジェネティック修飾された残基を含む、請求項６３〜８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
前記核酸配列は、セルフリーＤＮＡを含む、請求項７８〜８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
前記核酸配列は、ｃＤＮＡ配列を含む、請求項７８〜８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
前記核酸配列は、試料に由来する、請求項６３〜８８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９０】
前記試料は、被験体から得られる、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記被験体は、ヒトである、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記試料は、口腔試料、唾液試料、血液試料、血漿試料、生殖試料、粘液試料、脳脊髄液試料、組織試料又はそれらの任意の組み合わせを含む、請求項９０又は９１に記載の方法。
【請求項９３】
結果を得ることを更に含む、請求項６３〜９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９４】
前記結果を参照と比較することを更に含む、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
通信媒体を介して前記結果を通信することを更に含む、請求項９３又は９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記被験体は、病態を有すると診断されている、請求項９４又は９５に記載の方法。
【請求項９７】
前記被験体を、病態を有すると診断することを更に含む、請求項９４又は９５に記載の方法。
【請求項９８】
前記被験体を、病態を発症する可能性を有すると診断することを更に含む、請求項９４又は９５に記載の方法。
【請求項９９】
前記診断は、前記結果と前記参照とを比較することに基づく、請求項９７又は９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記診断は、少なくとも部分的に以前の診断を確認する、請求項９８又は９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記病態は、癌である、請求項９６に記載の方法。
【請求項１０２】
前記被験体のための治療を選択することを更に含む、請求項９６又は１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記被験体を治療することを更に含む、請求項９７〜１０２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０４】
前記治療は、外科手術、化学療法、放射線療法、免疫療法、標的療法、ホルモン療法、幹細胞移植及び精密医療を含む、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記標識は、糖を含む、請求項８３又は８４に記載の方法。
【請求項１０６】
前記糖は、グルコースを含む、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
前記グルコースは、変性されている、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
前記標識は、酵素の補助により前記エピジェネティック修飾された残基と結合される、請求項８３又は８４に記載の方法。
【請求項１０９】
前記酵素は、二本鎖である前記核酸配列の一部分について選択的である、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
前記標識は、二本鎖である前記核酸配列の一部分で前記エピジェネティック修飾された残基と選択的に結合される、請求項８３又は８４に記載の方法。
【請求項１１１】
前記標識は、前記核酸配列の一部分について選択的である、請求項８３又は８４に記載の方法。
【請求項１１２】
前記部分は、二本鎖である、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
セルフリー試料を癌について良性又は悪性として特定する方法であって、前記セルフリー試料を次世代シーケンシングによりアッセイして核酸配列を特定することを含み、前記核酸配列における５−ヒドロキシメチルシトシン（５−ｈｍＣ）の存在により、前記セルフリー試料を癌について悪性として特定する、方法。
【請求項１１４】
前記セルフリー試料は、前記癌を有する被験体又は前記癌を有すると疑われる被験体から得られる、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
前記被験体のための治療を前記５−ｈｍＣの存在に基づいて選択することを更に含む、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
前記５−ｈｍＣの存在は、前記セルフリー試料における５−ｈｍＣのレベルを含む、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１７】
前記核酸配列は、シトシングアニン（ＣＧ）サイト、シトシンリン酸グアニン（ＣｐＧ）アイランド又はそれらの組み合わせを含む、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１８】
結果を前記５−ｈｍＣの存在に基づいて得ることを更に含む、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１９】
通信媒体を介して前記結果を通信することを更に含む、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
標識は、前記核酸配列のエピジェネティック修飾された塩基と結合される、請求項１１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、２０１７年５月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／５０７，０３５号及び２０１８年３月５日に出願された米国仮特許出願第６２／６３８，５２８号の利益を主張し、それらの全体が引用することにより本明細書の一部をなす。
【背景技術】
【０００２】
メチル化状態を調べ、メチル化状態の変化を監視する新たな方法を開発することは重要である。
【発明の概要】
【０００３】
本明細書に記載されるシステム及び方法は、エピジェネティック修飾の検出における実質的に偏りのないアプローチを提供し得る。この方法は、メチル化状態を検出又は監視する分野において、特にエピジェネティック修飾と結合する標識又は部分を有する配列を増幅させるシステム及び方法と比較して改善をもたらし得る。
【０００４】
参照による引用
本明細書中の全ての刊行物、特許及び特許出願は個々の刊行物、特許又は特許出願が各々具体的かつ個別に引用することにより本明細書の一部をなすと示されているのと同じ程度に、引用することにより本明細書の一部をなす。引用することにより本明細書の一部をなす刊行物及び特許又は特許出願が、本明細書に含まれる開示と矛盾する限りにおいては、本明細書は、そのような一切の矛盾材料に取って代わるか又はそのような一切の矛盾材料に優先するものと解釈される。
【０００５】
本明細書の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲に具体的に記載されている。本明細書の特徴及び利点のより良い理解は、本明細書の原理が利用される例示的な実施形態を説明する以下の詳細な説明及び添付の図面（本明細書では「図」（"figure" and "FIG."）とも）を参照することにより成されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】本明細書で提供される方法を実行するようにプログラムされ得るか又はその他には構成され得るコンピュータ制御システムを示す図である。
【図２】本明細書に詳説される５−ヒドロキシメチルシトシン（５−ｈｍＣ）プルダウン・ラベル・コピー・エンリッチ（Pulldown Label Copy Enrich）（ＨＭＣＰ＿ＬＣＥ）法の１つの例を示す図である。
【図３】本明細書に詳説される５−ｈｍＣプルダウン・コピー・ラベル・エンリッチ（Pulldown Copy Label Enrich）（ＨＭＣＰ＿ＣＬＥ）法の１つの例を示す図である。
【図４】本明細書に詳説される５−ｈｍＣプルダウン・ラベル・ランダムプライム・エンリッチ（Pulldown Label Random prime Enrich）（ＨＭＣＰ＿ＬＲＥ）法の１つの例を示す図である。
【図５】本明細書に詳説される５−ｈｍＣプルダウン・ランダムプライム・ラベル・エンリッチ（ＨＭＣＰ＿ＲＬＥ）法の１つの例を示す図である。
【図６】本明細書に詳説される５−ｈｍＣプルダウン・ラベル・ローサイスペシフィック・エンリッチ（Pulldown Label Loci Specific Enrich）（ＨＭＣＰ＿ＬＬＳＥ）法の１つの例を示す図である。
【図７】本明細書に詳説される５−ｈｍＣプルダウン・ローサイスペシフィック・ラベル・エンリッチ（Pulldown Loci Specific Label Enrich）（ＨＭＣＰ＿ＬＳＬＥ）法の１つの例を示す図である。
【図８】図８Ａ及び図８Ｂは、種々のＴ４ファージのβ−グルコシルトランスフェラーゼ（Ｔ４−ＢＧＴ）バッファーを使用する６個の５−ｈｍＣのバンドシフトアッセイを示す図である。
【図９】コピー・ラベル・エンリッチ（Copy Label Enrich）（ＣＬＥ）法と５−ｈｍＣプルダウン（5-hmC pulldown）（ＨＭＣＰ）法（「標準ＨＭＣＰ」又は「ｓｔｄ」とも呼ばれる）との間での詳説されたシーケンシングメトリクスの比較を示す図である。
【図１０】ヒトゲノムの１８キロベース（ｋＢ）領域及びプルダウンされたリードのアラインメントのＩｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｖｉｅｗｅｒ（ＩＧＶ）のスクリーンショットを示す図である。
【図１１】ゲノム領域のＩＧＶのスクリーンショットを示す図である。
【図１２】高密度ＣｐＧを有するヒトゲノムの領域のＩＧＶのスクリーンショットを示す図である。
【図１３】図１３Ａ及び図１３Ｂは、コピー・ラベル・エンリッチ（ＣＬＥ）法と５−ｈｍＣプルダウン（ＨＭＣＰ）法とのメトリクス一覧の比較を示す図である。
【図１４】配列番号１〜配列番号８を示す図である。
【図１５】配列番号９〜配列番号１６を示す図である。
【図１６】本明細書に開示される方法及びシステムの図である。
【図１７】定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）による６個の５−ｈｍＣ／２個の５−ｈｍＣの濃縮比のＨＭＣＰ（ｘ軸上に「ＨＭＣＰ」と示される）の方法とＣＬＥ（ｘ軸上に「ＣＬＥ−ＨＭＣＰ」と示される）の方法との間での比較を示す図である。
【図１８】遺伝子間領域にマッピングするリードに対する遺伝子内部にマッピングするリードの比率の、ＨＭＣＰ（図の凡例に「ＨＭＣＰ」と示される）の方法とＣＬＥ（図の凡例に「ＣＬＥ＿ＨＭＣＰ」と示される）の方法との間での比較を示す図である。
【図１９】ゲノムのカバーされたパーセンテージのＨＭＣＰ（「ｖ１ＨＭＣＰ」と示される）法とＣＬＥ（「ｖ２ＨＭＣＰ」と示される）法との間での比較を示す図である。
【図２０】β−アクチン（ＡＣＴＢ）遺伝子座での正常な結腸組織及び結腸腫瘍組織から抽出された全ゲノムＤＮＡ（ｗｇＤＮＡ）においてＨＭＣＰ（「Ｖ１」と示される）法とＣＬＥ（「Ｖ２」と示される）法とを比較するＩＧＶのスクリーンショットを示す図である。ＨＭＣＰ法により分析された正常な試料は「Ｖ１正常」と表示される。ＣＬＥ法により分析された正常な試料は「Ｖ２正常」と表示される。ＨＭＣＰ法により分析された腫瘍試料は「Ｖ１腫瘍」と表示される。ＣＬＥ法により分析された腫瘍試料は「Ｖ２腫瘍」と表示される。
【図２１】ＮａＣＣ２遺伝子座の始まりでの正常な結腸組織及び結腸腫瘍組織から抽出された全ゲノムＤＮＡ（ｗｇＤＮＡ）においてＨＭＣＰ（「Ｖ１」と示される）法とＣＬＥ（「Ｖ２」と示される）法とを比較するＩＧＶのスクリーンショットを示す図である。ＨＭＣＰ法により分析された正常な試料は「Ｖ１正常」と表示される。ＣＬＥ法により分析された正常な試料は「Ｖ２正常」と表示される。ＨＭＣＰ法により分析された腫瘍試料は「Ｖ１腫瘍」と表示される。ＣＬＥ法により分析された腫瘍試料は「Ｖ２腫瘍」と表示される。
【図２２】ＤＬＬ１遺伝子及び６番染色体上の隣接遺伝子座の正常な結腸組織及び結腸腫瘍組織から抽出された全ゲノムＤＮＡ（ｗｇＤＮＡ）においてＨＭＣＰ（「Ｖ１」と示される）法とＣＬＥ（「Ｖ２」と示される）法とを比較するＩＧＶのスクリーンショットを示す図である。ＨＭＣＰ法により分析された正常な試料は「Ｖ１正常」と表示される。ＣＬＥ法により分析された正常な試料は「Ｖ２正常」と表示される。ＨＭＣＰ法により分析された腫瘍試料は「Ｖ１腫瘍」と表示される。ＣＬＥ法により分析された腫瘍試料は「Ｖ２腫瘍」と表示される。
【図２３】９番染色体上の領域の正常な結腸組織及び結腸腫瘍組織から抽出された全ゲノムＤＮＡ（ｗｇＤＮＡ）においてＨＭＣＰ（「Ｖ１」と示される）法とＣＬＥ（「Ｖ２」と示される）法とを比較するＩＧＶのスクリーンショットを示す図である。ＨＭＣＰ法により分析された正常な試料は「Ｖ１正常」と表示される。ＣＬＥ法により分析された正常な試料は「Ｖ２正常」と表示される。ＨＭＣＰ法により分析された腫瘍試料は「Ｖ１腫瘍」と表示される。ＣＬＥ法により分析された腫瘍試料は「Ｖ２腫瘍」と表示される。
【図２４】低密度ＣｐＧ分布を有する９番染色体の領域の正常な結腸組織及び結腸腫瘍組織から抽出された全ゲノムＤＮＡ（ｗｇＤＮＡ）においてＨＭＣＰ（「Ｖ１」と示される）法とＣＬＥ（「Ｖ２」と示される）法とを比較するＩＧＶのスクリーンショットを示す図である。ＨＭＣＰ法により分析された正常な試料は「Ｖ１正常」と表示される。ＣＬＥ法により分析された正常な試料は「Ｖ２正常」と表示される。ＨＭＣＰ法により分析された腫瘍試料は「Ｖ１腫瘍」と表示される。ＣＬＥ法により分析された腫瘍試料は「Ｖ２腫瘍」と表示される。
【図２５】ＣｐＧアイランド間に大きなギャップが存在するヒト１７番染色体遺伝子の７８５塩基対（ｂｐ）領域の正常な結腸組織及び結腸腫瘍組織から抽出された全ゲノムＤＮＡ（ｗｇＤＮＡ）においてＨＭＣＰ（「Ｖ１」と示される）法とＣＬＥ（「Ｖ２」と示される）法とを比較するＩＧＶのスクリーンショットを示す図である。ＨＭＣＰ法により分析された正常な試料は「Ｖ１正常」と表示される。ＣＬＥ法により分析された正常な試料は「Ｖ２正常」と表示される。ＨＭＣＰ法により分析された腫瘍試料は「Ｖ１腫瘍」と表示される。ＣＬＥ法により分析された腫瘍試料は「Ｖ２腫瘍」と表示される。
【図２６】約１％小脳という低いレベルでＮＡ１２８７８由来のピークのコンテキストにおいて検出され得る脳特異的５−ｈｍＣピークのＩＧＶのスクリーンショットを示す図である。
【図２７】血漿ＤＮＡを使用するＨＭＣＰ（「ＨＭＣＰ−ｖ１」と示される）法とＣＬＥ（「ＨＭＣＰ−ｖ２」と示される）法との散布図比較を示す図である。
【図２８】種々のＣｐＧ密度にわたるＨＭＣＰとトゥルーメチル・ホール・ゲノム（TrueMethyl Whole Genome）（ＴＭＷＧ）との間の相関を強調するＩＧＶのスクリーンショットを示す図である。
【図２９】ＨＭＣＰ（「ＨＭＣＰ−ｖ１」と示される）法とＣＬＥ（「ＨＭＣＰ−ｖ２」と示される）法との間のヒートマップにおけるマッピングされた百万リード当たりのキロベース当たりのリード（ＲＰＫＭ）値の比較を示す図である。
【図３０】ＮＡ１２８７８末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）細胞系統のｇＤＮＡのバックグラウンドへの小脳組織ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）のタイトレーションからの試料についての遺伝子内部にわたるリードカウントの類似性のレベルを示す多次元尺度構成法（ＭＤＳ）プロットを示す図である。
【図３１Ａ】ＴＭＷＧの５−ｈｍＣの％（２５．０１％〜９９．９９％）及びＨＭＣＰの遺伝子内部のＲＰＫＭのＣＬＥ（「ＨＭＣＰ−ｖ２」と示される）法を使用するＱ−Ｑプロットを示す図である。
【図３１Ｂ】ＴＭＷＧの５−ｈｍＣの％（２５．０１％〜９９．９９％）及びＨＭＣＰの遺伝子内部のＲＰＫＭのＣＬＥ（「ＨＭＣＰ−ｖ２」と示される）法を使用するＱ−Ｑプロットを示す図である。
【図３１Ｃ】ＴＭＷＧの５−ｈｍＣの％（２５．０１％〜９９．９９％）及びＨＭＣＰの遺伝子内部のＲＰＫＭのＨＭＣＰ（「ＨＭＣＰ−ｖ１」と示される）法を使用するＱ−Ｑプロットを示す図である。
【図３２Ａ】ＨＭＣＰ法についてのシーケンスリードの濃縮を示す図である。
【図３２Ｂ】ＣＬＥ法についてのシーケンスリードの濃縮を示す図である。ＣＬＥ法は、図３２Ａに示されるＨＭＣＰ法と比較してより高いプルダウン効率を示す。
【図３３】ヒトゲノムの３３１１個の機能的領域についてのＭＤＳプロットを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
様々な実施形態が本明細書に示され説明されているが、そのような実施形態が例として提供されるにすぎないことは、当業者には明らかであろう。本明細書の実施形態の様々な代替実施形態を使用することができると理解されるべきである。
【０００８】
概略
本明細書に説明されている方法は、標識を核酸配列のエピジェネティック修飾された塩基と結合させることで、標識された核酸配列を形成させることと、実質的に相補的な鎖を前記標識された核酸配列にハイブリダイズさせることと、前記標識された核酸配列が実質的に存在しない反応において前記実質的に相補的な鎖を増幅させることとを含み得る。該方法の１つ以上の個々の要素を、特定の順序で実施する必要はない。例えば、標識の結合は、ハイブリダイズの後に行ってもよい。所与の方法の１つ以上の個々の要素は、本明細書に記載されるのと異なる順序で実施してもよい。
【０００９】
方法の変形形態１
図２は、本明細書に詳説される５−ｈｍＣプルダウン・ラベル・コピー・エンリッチ（ＨＭＣＰ＿ＬＣＥ）法の１つの例を示す。ＨＭＣＰ＿ＬＣＥ法の利点は、（ａ）ＨＭＣＰ法若しくは糖、抗体、タンパク質、これらのいずれかの断片、標識若しくはそれらの任意の組み合わせが核酸のエピジェネティック修飾された塩基と結合され得る方法等のその他の方法と比較して改善された分解能、（ｂ）ＨＭＣＰ法若しくは糖、抗体、タンパク質、これらのいずれかの断片、標識若しくはそれらの任意の組み合わせが核酸のエピジェネティック修飾された塩基と結合され得る方法等のその他の方法と比較した５−ｈｍＣ密度の偏りの減少、又は（ｃ）それらの任意の組み合わせを提供し得る。
【００１０】
この図２の例においては、第１の要素２０１により、オリゴヌクレオチド断片のライブラリー等の複数の二本鎖断片２０２が調製され得る。複数の二本鎖断片は、セルフリーＤＮＡを含み得る。複数の二本鎖断片は、一方又は両方の鎖上に１つ以上のエピジェネティック修飾を含み得る。第２の要素２０３により、標識（例えばアジド−グルコース標識）は、複数の二本鎖断片からの少なくとも１つのオリゴヌクレオチド断片と結合されて、修飾オリゴヌクレオチド断片２０４が形成され得る。標識は、修飾オリゴヌクレオチド断片の１つ以上の塩基に存在するエピジェネティック修飾と結合し得る。第３の要素２０５により、修飾オリゴヌクレオチド断片が分離されて、１つ以上の一本鎖の修飾オリゴヌクレオチド断片２０６が形成され得る。第４の要素２０７により、実質的に相補的な鎖等の相補鎖が、一本鎖の修飾オリゴヌクレオチド断片にハイブリダイズされて、標識されたキメラライブラリー等の修飾オリゴヌクレオチド断片２０８が形成され得る。相補鎖は、標識及びエピジェネティック修飾の一方又は両方を欠如し得る。第５の要素２１０により、基材とも結合し得る標識２０９が、修飾オリゴヌクレオチド断片と結合され得る。標識２０９は、エピジェネティック修飾又はエピジェネティック修飾と予め結合された標識に結合し得る。標識２０９は、相補鎖に直接的に結合し得ない。相補鎖は、基材と修飾オリゴヌクレオチド断片との間の相互作用を介して基材と間接的に結合し得る。相補鎖と対向鎖との間の結合は、分断可能な結合等で、分断可能であり得る。第６の要素２１１により、１つ以上の相補鎖を基材から除去又は分離又は洗出させた（例えば、相補鎖と対向鎖との間の結合を分断させた）後に、相補鎖を基材と結合したままの修飾オリゴヌクレオチド断片から分離させることによって、試料は１つ以上の相補鎖２１２について濃縮され得る。第７の要素２１３により、濃縮された相補鎖が修飾オリゴヌクレオチド断片の不存在下で増幅されて、相補鎖の１つ以上の娘鎖２１４が形成され得る。
【００１１】
図２において、ライブラリーは、二本鎖オリゴヌクレオチド断片又は一本鎖オリゴヌクレオチド断片を含み得る。オリゴヌクレオチド断片は、ＤＮＡ又はＲＮＡであり得る。ライブラリーは、次世代（ＮＧＳ）ライブラリーであり得る。ライブラリーは、（ａ）断片の片端若しくは両端に、（ｂ）二本鎖オリゴヌクレオチド断片の一方若しくは両方の鎖に、又は（ｃ）それらの組み合わせにアダプター（例えばＮＧＳアダプター）を有するオリゴヌクレオチド断片を含み得る。アダプターにより、そのオリゴヌクレオチド断片は、試料又はライブラリー中のその他のオリゴヌクレオチド断片から一意に特定され得る。アダプターは、二本鎖ＤＮＡに特異的又は選択的であり得る。
【００１２】
図２において、標識は、オリゴヌクレオチド断片の１つの塩基に存在するエピジェネティック修飾（例えば、５−ｈｍＣ）又は或る種のエピジェネティック修飾と結合され得る。標識は、二本鎖オリゴヌクレオチド断片の一方又は両方の鎖に存在する複数のエピジェネティック修飾と結合され得る。標識は、或る種のエピジェネティック修飾（例えば、５−ｈｍＣ）と結合され得る。標識は、或る種のエピジェネティック修飾（例えば、５−ｈｍＣ）について選択的であり得る。標識は、二本鎖オリゴヌクレオチド断片について選択的であり得て、一本鎖断片を標識し得ない。標識は、一本鎖オリゴヌクレオチド断片について選択的であり得る。標識は、酵素等を用いてエピジェネティック修飾と結合（例えば、エピジェネティック修飾へ結合）され得る。β−グルコシルトランスフェラーゼ（ｂＧＴ）等の酵素は、二本鎖オリゴヌクレオチド断片について選択的であり得る。標識は、クリックケミストリーによってエピジェネティック修飾と結合され得る。標識は、アジド−糖、例えばアジド−グルコースであり得る。
【００１３】
図２において、二本鎖オリゴヌクレオチド断片は、変性による分離等で分離されて、一本鎖断片を形成し得る。相補鎖は、一本鎖オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分にハイブリダイズし得る。相補鎖は、プライマー、例えばアダプター（例えば、ＮＧＳアダプター）に相補的であり得るプライマーであり得る。相補鎖は、実質的に相補的な鎖、例えばオリゴヌクレオチド断片の全長に沿って実質的に相補的な鎖であり得る。実質的に相補的な鎖は、（ａ）親オリゴヌクレオチド断片中に存在し得る標識、（ｂ）親オリゴヌクレオチド断片中に存在し得るエピジェネティック修飾、又は（ｃ）それらの組み合わせを欠如し得る。実質的に相補的な鎖は、ＤＮＡ伸長又はｃＤＮＡ伸長により親オリゴヌクレオチド断片にハイブリダイズし得る。
【００１４】
図２において、親オリゴヌクレオチド断片及び実質的に相補的な鎖は、基材と間接的に結合され得る。基材への結合は、親オリゴヌクレオチド断片におけるエピジェネティック修飾と結合された標識を介して行われ得る。実質的に相補的な鎖は、標識及び／又はエピジェネティック修飾を一切有し得ない。標識と基材との間の結合は、分断され得る。
【００１５】
図２において、エピジェネティック修飾を含むオリゴヌクレオチド断片は、あらゆるエピジェネティック修飾又は或る種のエピジェネティック修飾を有しないオリゴヌクレオチド断片から分離され得る。分離は、エピジェネティック修飾又は或る種のエピジェネティック修飾を有しないあらゆる断片が除去され得るように、標識を基材と結合させることにより行われ得る。除去は、洗浄、例えば基材のストリンジェントな洗浄によって行われ得る。エピジェネティック修飾又は或る種のエピジェネティック修飾を欠如しているオリゴヌクレオチド断片の除去の後に、実質的に相補的な鎖は、親オリゴヌクレオチド断片鎖から分離され得る。親オリゴヌクレオチド断片鎖は、基材と結合したままとなり得る。親オリゴヌクレオチド断片鎖及び基材は破棄され得る。実質的に相補的な鎖は、親オリゴヌクレオチド断片鎖を有し得ない反応容器中で増幅され得る。
【００１６】
方法の変形形態２
図３は、本明細書に詳説される５−ｈｍＣプルダウン・コピー・ラベル・エンリッチ（ＨＭＣＰ＿ＣＬＥ）法の１つの例を示す。幾つかの場合において、ＨＭＣＰ＿ＣＬＥ法は、（ａ）ＨＭＣＰ法若しくは糖、抗体、タンパク質、これらのいずれかの断片、標識若しくはそれらの任意の組み合わせが核酸のエピジェネティック修飾された塩基と結合され得る方法等のその他の方法と比較して改善された分解能、（ｂ）ＨＭＣＰ法若しくは糖、抗体、タンパク質、これらのいずれかの断片、標識若しくはそれらの任意の組み合わせが核酸のエピジェネティック修飾された塩基と結合され得る方法等のその他の方法と比較した５−ｈｍＣ密度の偏りの減少、又は（ｃ）それらの任意の組み合わせを提供し得る。
【００１７】
この図３の例においては、第１の要素３０１により、ライブラリー等の複数の二本鎖オリゴヌクレオチド断片３０２が調製され得る。二本鎖オリゴヌクレオチド断片は、セルフリーＤＮＡを含み得る。二本鎖オリゴヌクレオチド断片は、一方又は両方の鎖の１つ以上の塩基にエピジェネティック修飾を有し得る。第２の要素３０３により、複数の二本鎖オリゴヌクレオチド断片の鎖が分離されて、１つ以上の一本鎖のオリゴヌクレオチド断片３０４が形成され得る。１つ以上の一本鎖オリゴヌクレオチド断片は、エピジェネティック修飾を有する１つ以上の塩基を含み得る。第３の要素３０５により、実質的に相補的な鎖等の相補鎖が、少なくとも１つの一本鎖オリゴヌクレオチド断片にハイブリダイズされて、修飾オリゴヌクレオチド断片３０６が形成され得る。相補鎖は、対向する一本鎖オリゴヌクレオチド断片中に存在するエピジェネティック修飾を実質的に有し得ない。第４の要素３０７により、標識（例えば、アジド−グルコース標識）が、修飾オリゴヌクレオチド断片と結合されて、標識されたキメラライブラリー等の標識された修飾オリゴヌクレオチド断片３０８が形成され得る。標識は、修飾オリゴヌクレオチド断片に存在するエピジェネティック修飾と結合し得る。標識は、エピジェネティック修飾を欠如し得る実質的に相補的な鎖と結合され得ない。第５の要素３１０により、基材とも結合し得る標識３０９が、修飾オリゴヌクレオチド断片と結合され得る。標識３０９は、相補鎖に直接的に結合し得ない。相補鎖は、基材と修飾オリゴヌクレオチド断片との間の相互作用を介して基材と間接的に結合し得る。相補鎖と対向鎖との間の結合は、分断可能な結合等で、分断可能であり得る。第６の要素３１１により、１つ以上の相補鎖を基材から除去又は分離又は洗出させることによって（例えば、相補鎖と対向鎖との間の結合を分断することにより）、試料は１つ以上の相補鎖３１２について濃縮され得る。分離に際して、修飾オリゴヌクレオチド断片は、基材と結合したままとなり得る。幾つかの場合において、試料の１つ以上の相補鎖についての濃縮は、基材のストリンジェントな洗浄等の基材の洗浄を含み得る。洗浄は、１つ以上の非共有結合された断片、１つ以上の非特異的に物理吸着された断片又はそれらの組み合わせを除去し得る。洗浄は、修飾オリゴヌクレオチド断片と基材との間の結合を分断又は変化させ得ず、こうして試料は相補鎖について濃縮され得る。第７の要素３１３により、相補鎖が修飾オリゴヌクレオチド断片の不存在下で増幅されて、相補鎖の１つ以上の娘鎖３１４が形成され得る。
【００１８】
図３において、ライブラリーは、二本鎖オリゴヌクレオチド断片又は一本鎖オリゴヌクレオチド断片を含み得る。オリゴヌクレオチド断片は、ＤＮＡ又はＲＮＡであり得る。ライブラリーは、次世代（ＮＧＳ）ライブラリーであり得る。ライブラリーは、（ａ）断片の片端若しくは両端に、（ｂ）二本鎖オリゴヌクレオチド断片の一方若しくは両方の鎖に、又は（ｃ）それらの組み合わせにアダプター（例えばＮＧＳアダプター）を有するオリゴヌクレオチド断片を含み得る。アダプターにより、そのオリゴヌクレオチド断片は、試料又はライブラリー中のその他のオリゴヌクレオチド断片から一意に特定され得る。アダプターは、二本鎖ＤＮＡに特異的又は選択的であり得る。
【００１９】
図３において、二本鎖オリゴヌクレオチド断片は、変性による分離等で分離されて、一本鎖断片を形成し得る。相補鎖は、一本鎖オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分にハイブリダイズし得る。相補鎖は、プライマー、例えばアダプター（例えば、ＮＧＳアダプター）に相補的であり得るプライマーであり得る。相補鎖は、実質的に相補的な鎖、例えばオリゴヌクレオチド断片の全長に沿って実質的に相補的な鎖であり得る。実質的に相補的な鎖は、親オリゴヌクレオチド断片中に存在し得るエピジェネティック修飾を欠如し得る。実質的に相補的な鎖は、ｃＤＮＡ伸長により親オリゴヌクレオチド断片にハイブリダイズし得る。
【００２０】
図３において、標識は、親オリゴヌクレオチド断片の１つの塩基に存在するエピジェネティック修飾（例えば、５−ｈｍＣ）又は或る種のエピジェネティック修飾と結合され得る。標識は、親オリゴヌクレオチド断片に存在する複数のエピジェネティック修飾と結合され得る。標識は、或る種のエピジェネティック修飾（例えば、５−ｈｍＣ）と結合され得る。標識は、或る種のエピジェネティック修飾（例えば、５−ｈｍＣ）について選択的であり得る。標識は、二本鎖断片について選択的であり得て、一本鎖断片を標識し得ない。標識は、一本鎖断片について選択的であり得る。標識は、酵素等を用いて親鎖のエピジェネティック修飾と結合（例えば、親鎖のエピジェネティック修飾へ結合）され得る。β−グルコシルトランスフェラーゼ（ｂＧＴ）等の酵素は、二本鎖オリゴヌクレオチド断片について選択的であり得る。標識は、クリックケミストリーによってエピジェネティック修飾と結合され得る。標識は、アジド−糖、例えばアジド−グルコースであり得る。
【００２１】
図３において、親オリゴヌクレオチド断片及び実質的に相補的な鎖は、基材と間接的に結合され得る。基材への結合は、親オリゴヌクレオチド断片におけるエピジェネティック修飾と結合された標識を介して行われ得る。実質的に相補的な鎖は、標識及び／又はエピジェネティック修飾を一切有し得ない。標識と基材との間の結合は、分断され得る。
【００２２】
図３において、エピジェネティック修飾を含むオリゴヌクレオチド断片は、あらゆるエピジェネティック修飾又は或る種のエピジェネティック修飾を有しないオリゴヌクレオチド断片から分離され得る。分離は、エピジェネティック修飾又は或る種のエピジェネティック修飾を有しないあらゆる断片が除去され得るように、標識を基材と結合させることにより行われ得る。除去は、洗浄、例えば基材のストリンジェントな洗浄によって行われ得る。エピジェネティック修飾又は或る種のエピジェネティック修飾を欠如しているオリゴヌクレオチド断片の除去の後に、実質的に相補的な鎖は、親オリゴヌクレオチド断片鎖から分離され得る。親オリゴヌクレオチド断片鎖は、基材と結合したままとなり得る。親オリゴヌクレオチド断片鎖及び基材は破棄され得る。実質的に相補的な鎖は、親オリゴヌクレオチド断片鎖を有し得ない反応容器中で増幅され得る。
【００２３】
方法の変形形態３
図４は、本明細書に詳説される５−ｈｍＣプルダウン・ラベル・ランダムプライム・エンリッチ（ＨＭＣＰ＿ＬＲＥ）法の１つの例を示す。幾つかの場合において、ＨＭＣＰ＿ＬＲＥ法は、（ａ）ＨＭＣＰ法若しくは糖、抗体、タンパク質、これらのいずれかの断片、標識若しくはそれらの任意の組み合わせが核酸のエピジェネティック修飾された塩基と結合され得る方法等のその他の方法と比較して改善された分解能、（ｂ）ＨＭＣＰ法若しくは糖、抗体、タンパク質、これらのいずれかの断片、標識若しくはそれらの任意の組み合わせが核酸のエピジェネティック修飾された塩基と結合され得る方法等のその他の方法と比較した５−ｈｍＣ密度の偏りの減少、（ｃ）ＨＭＣＰ法若しくは糖、抗体、タンパク質、これらのいずれかの断片、標識若しくはそれらの任意の組み合わせが核酸のエピジェネティック修飾された塩基と結合され得る方法等のその他の方法と比較して実質的に改善された低インプット量でのロバストネス、又は（ｄ）それらの任意の組み合わせを提供し得る。
【００２４】
この図４の例においては、第１の要素４０１により、標識（例えば、アジド−グルコース標識）は、二本鎖オリゴヌクレオチド断片と結合されて、修飾オリゴヌクレオチド断片４０２が得られ得る。二本鎖オリゴヌクレオチドは、セルフリーＤＮＡを含み得る。標識は、二本鎖オリゴヌクレオチド断片の一方又は両方の鎖の塩基に存在するエピジェネティック修飾又は或る種のエピジェネティック修飾と結合されて、修飾オリゴヌクレオチド断片４０２が形成され得る。第２の要素４０３により、修飾オリゴヌクレオチド断片の鎖が分離されて、１つ以上の一本鎖の修飾オリゴヌクレオチド断片が形成され、次いで相補鎖、例えば実質的に相補的な鎖が一本鎖の修飾オリゴヌクレオチド断片の少なくとも１つにハイブリダイズされることで、相補鎖を有する二本鎖の修飾オリゴヌクレオチド断片４０４及び標識を有する修飾オリゴヌクレオチド断片が形成され得る。相補鎖は、標識を欠如し、エピジェネティック修飾を欠如し得る。第３の要素４０５により、アダプターが、二本鎖の修飾オリゴヌクレオチド断片（例えば二本鎖の修飾オリゴヌクレオチド断片の一方又は両方の鎖の片端又は両端）に結合されて、標識されたキメラライブラリー等の１つ以上のアダプターを有する二本鎖の修飾オリゴヌクレオチド断片４０６が形成され得る。第４の要素４０８により、基材とも結合し得る標識４０７が修飾オリゴヌクレオチド断片と結合され得る。標識４０８は、エピジェネティック修飾又はエピジェネティック修飾と予め結合された標識に結合し得る。標識４０８は、相補鎖に直接的に結合し得ない。相補鎖は、基材と修飾オリゴヌクレオチド断片との間の相互作用を介して基材と間接的に結合し得る。相補鎖と対向鎖との間の相互作用は、分断可能な結合等で、分断可能であり得る。第５の要素４０９により、基材と結合される標識を欠如する１つ以上の相補鎖を基材から除去又は分離又は洗出させた（例えば、相補鎖と対向鎖との間の結合を分断させた）後に、基材と結合したままの修飾オリゴヌクレオチド断片から相補鎖を分離させることによって、試料は１つ以上の相補鎖４１０について濃縮され得る。第６の要素４１１により、相補鎖が修飾オリゴヌクレオチド断片の不存在下で増幅されて、相補鎖の１つ以上の娘鎖４１２が形成され得る。
【００２５】
図４において、標識は、親オリゴヌクレオチド断片の１つの塩基に存在するエピジェネティック修飾（例えば、５−ｈｍＣ）と結合し得る。標識は、親オリゴヌクレオチド断片に存在する複数のエピジェネティック修飾と結合され得る。標識は、或る種のエピジェネティック修飾（例えば、５−ｈｍＣ）と結合され得る。標識は、或る種のエピジェネティック修飾（例えば、５−ｈｍＣ）について選択的であり得る。標識は、二本鎖断片について選択的であり得て、一本鎖断片を標識し得ない。標識は、一本鎖断片について選択的であり得る。標識は、酵素等を用いて親鎖のエピジェネティック修飾と結合（例えば、親鎖のエピジェネティック修飾へ結合）され得る。β−グルコシルトランスフェラーゼ（ｂＧＴ）等の酵素は、二本鎖オリゴヌクレオチド断片について選択的であり得る。標識は、クリックケミストリーによってエピジェネティック修飾と結合され得る。標識は、アジド−糖、例えばアジド−グルコースであり得る。
【００２６】
図４においては、標識の位置は、ｄｓＤＮＡ親断片における５−ｈｍＣの存在／不存在により決定され得る。標識は、β−グルコシルトランスフェラーゼ（βＧＴ）によってＵＤＰ−６−アジド−グルコース（ＵＤＰ−Ｎ３−ｇｌｃ）から５−ｈｍＣに転移されたアジド−グルコースであり得る。標識化は、精製された循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）抽出物において直接的に実施され得る。ｃｔＤＮＡが標識化の前に一連のライブラリー前処理を経ていなくてよいことが利点であり得る。ＮＧＳ前処理の後にあり得る場合より多くの材料が標識化で存在し得る可能性が高く（効率の改善）、より多くの代表的な試料に標識化が引き起こされる。
【００２７】
幾つかの場合において、ハイブリダイズは、（ｉ）プライミング（例えば、ランダムプライミング）、（ｉｉ）ライゲーション（例えば、アダプターライゲーション）又は（ｉｉｉ）それらの組み合わせを含み得る。例えば、図４において、ランダムプライミングは、アジド標識された二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）二本鎖をオリゴマープール（ここで、プール中の各オリゴは、「ＮＧＳアダプター」テールに結合された縮重Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、Ｎ９、Ｎ１０又はそれ以上の「ヘッド」を含み得る）、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、クレノウ）及びデオキシリボースを含む天然のヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）のミックスの存在下で所与のバッファー中でインキュベートして、単独の伸長反応を３７℃で規定の時間（例えば、１０分）にわたり実施することによって実施され得る。縮重プライマー「ヘッド」は、ランダムに鋳型ＤＮＡをプライミングし得て、親鎖の各々について多重コピーを作製し得る。鎖置換ポリメラーゼを使用する場合に、鋳型鎖の３’末端に最も近いプライマーであるランダムプライマーが伸長し、その他のコピーを置換することで、娘コピーの末端に３’Ａ−オーバーハングを有する長い二本鎖のキメラ産物がもたらされ得る。ランダムプライミングは、１）ＮＧＳ特異的アダプター配列を導入し、２）修飾親鎖の修飾不含のコピー（娘鎖）を作製することによって一度で２つの要素を達成することができる。
【００２８】
図４においては、アダプターライゲーションは、一方にアダプター付与された（mono-adapted）キメラ標識二本鎖鋳型を、所与のバッファー中で３’Ｔオーバーハング及び５’ＰＯ４末端を有するＮＧＳプラットフォーム特異的アダプター（フォーク型アダプター、線状二本鎖アダプター、ヘアピンアダプター又はそれらの組み合わせ）、ｄｓＤＮＡリガーゼ（例えば、Ｔ４リガーゼ）及び必要な補因子（例えば、Ｍｇ２＋、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））と一緒に２０℃で規定の期間（例えば、１５分）にわたりインキュベートすることにより行われ得る。一方にアダプター付与されたキメラ標識二本鎖のＡオーバーハングは、アダプターのＴオーバーハングと合致し得て、ライゲーション効率を促進し得る。各二本鎖の片端（娘鎖の３’末端により形成される）だけにアダプター付与され得る。成功を収めたライゲーション産物は、一重にアダプター付与されたアジド標識親鎖（５’アダプター付与）及び二重にアダプター付与された非修飾娘鎖（３’末端及び５’末端の両方）を有し得る。幾つかの場合において、そのような「ライブラリー」の増幅では、ボトムストランドだけが、アダプター特異的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーによって増幅可能であり得る。
【００２９】
図４においては、磁性ビーズ結合は、標識されたキメラ次世代シーケンシング（ＮＧＳ）ライブラリー断片の選択的な濃縮を可能にし得る。これは、直接的に（すなわち、アジド−グルコース標識とジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）マグビーズとの間のシャープレスのアジド−アルキン環化付加反応（ＣＬＩＣＫ）ケミストリーによって）又は間接的に（すなわち、ジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）ビオチンリンカーのシャープレスのアジド−アルキン環化付加反応（ＣＬＩＣＫ）の後に、生成物をストレプトアビジン−マグビーズにコンジュゲートさせることによって）達成され得る。幾つかの場合において、アジド標識断片（すなわち、５−ｈｍＣ含有）だけが、マグビーズに結合し得る。アジド標識された断片は、磁性ビーズ等のビーズに固定化され得る。幾つかの場合において、この相互作用は、キメラＮＧＳライブラリー二本鎖の標識親鎖を介してのみ起こり得る。コピーされた相補物はアジド標識され得ないため、相補的な二本鎖間の水素結合相互作用によりビーズに固定化され得る。この水素結合相互作用は、非共有結合的であり得るので、それは後続の工程で分断され活用され得る。
【００３０】
図４においては、ストリンジェントな洗浄による濃縮は、濃縮過程の信号対雑音比を最大にするために必須であり得る。キメラＮＧＳライブラリーが固定化されたビーズは、ストリンジェントに洗浄（例えば、特定のバッファー、温和な熱、温和な変性剤等）されて、それらの表面に非特異的に物理吸着された非共有結合ＮＧＳライブラリー断片が選択的に除去され得る。幾つかの場合において、そのような種類の断片は、最終シーケンシング結果にノイズを引き起こし得る。ビーズ表面に共有結合したキメラＮＧＳライブラリー断片が、濃縮において選択され得る（すなわち、本来含まれていた５−ｈｍＣを挿入し得るシグナル）。ストリンジェントな洗浄の後に、娘鎖は、ビーズから溶出され（例えば、熱、高いｐＨ、低イオン強度のバッファー等）、ＰＣＲ反応に進められ得る。幾つかの場合において、ビーズに固定化されたフラクションは破棄され得る。幾つかの場合において、これらの娘鎖は、ビーズに固定化された標識鎖の正確な相補物であり得る。しかしながら、それらはエピジェネティック修飾を一切含み得ないため、「５−ｈｍＣ密度」増幅の偏りを有し得ない。これらの溶出された娘鎖の増幅は、２つの理由、すなわち１）分解能の改善（より高い信号対雑音比）及び２）表現の改善（選択の偏りの低下）から既存の方法論よりも優れた結果を与え得る。
【００３１】
本明細書に記載される方法及びシステムは、核酸がエピジェネティックに標識付けされ得る程度をより一層表し得る結果を提供し得る。幾つかの場合において、該方法及びシステムは、エピジェネティック修飾を特定する他の方法より優れている場合がある。その他の特定方法としては、ＨＭＣＰ法又は糖、タンパク質、抗体若しくはこれらのいずれかの断片をエピジェネティック修飾と結合させ、糖、タンパク質、抗体若しくはそれらの断片の存在を検出することを含む方法が挙げられ得る。幾つかの場合において、核酸配列、例えば高密度のエピジェネティック修飾を含む断片は、エピジェネティック修飾を特定するその他の方法を使用して検出され得ない。本発明の方法及びシステムの偏りのないアプローチは、偏りのない検出をもたらす短い断片等の核酸配列の高密度のエピジェネティック修飾の検出を提供する。
【００３２】
図４においては、娘鎖のＰＣＲ増幅が行われ得る。幾つかの場合において、ＰＣＲは、増幅鋳型として溶出された娘鎖だけを使用して標準的なプロトコル及び手順を用いて使用され得る。幾つかの場合において、ＰＣＲサイクル数の最小化は、複製物を最小化し得る。幾つかの場合において、アダプター配列内のＵＭＩコードの使用は、ダウンストリーム分析の間の定量化を補助し得る。幾つかの場合において、濃縮された断片のゲノムワイドライブラリーは、シーケンシングの準備ができている場合がある。
【００３３】
方法の変形形態４
図５は、本明細書に詳説される５−ｈｍＣプルダウン・ランダムプライム・ラベル・エンリッチ（ＨＭＣＰ＿ＲＬＥ）法の１つの例を示す。幾つかの場合において、ＨＭＣＰ＿ＲＬＥ法は、（ａ）ＨＭＣＰ法若しくは糖、抗体、タンパク質、これらのいずれかの断片、標識若しくはそれらの任意の組み合わせが核酸のエピジェネティック修飾された塩基と結合され得る方法等のその他の方法と比較して改善された分解能、（ｂ）ＨＭＣＰ法若しくは糖、抗体、タンパク質、これらのいずれかの断片、標識若しくはそれらの任意の組み合わせが核酸のエピジェネティック修飾された塩基と結合され得る方法等のその他の方法と比較した５−ｈｍＣ密度の偏りの減少、（ｃ）ＨＭＣＰ法若しくは糖、抗体、タンパク質、これらのいずれかの断片、標識若しくはそれらの任意の組み合わせが核酸のエピジェネティック修飾された塩基と結合され得る方法等のその他の方法と比較して実質的に改善された低インプット量でのロバストネス、又は（ｄ）それらの任意の組み合わせを提供し得る。
【００３４】
図５は、幾つかの場合においてプライミング（例えば、ランダムプライミング）及びライゲーション（例えば、アダプターライゲーション）が、図５に示されるように標識化前に行われ得て、幾つかの場合においてプライミング及びライゲーションが、図４に示されるように標識化後に行われ得ることを除いて、図４の方法と類似している。
【００３５】
図５に示されるように、第１の要素５０１により、（ｉ）二本鎖オリゴヌクレオチド断片、例えばセルフリーＤＮＡ断片（一方又は両方の鎖における１つ以上の塩基に１つ以上のエピジェネティック修飾を有する）の鎖が分離され、（ｉｉ）ランダムプライミングを開始させることで、一本鎖オリゴヌクレオチド断片の少なくとも１つに相補的な鎖、例えば実質的に相補的な鎖が形成され得る。ランダムプライミングは、二本鎖の修飾オリゴヌクレオチド断片５０２を形成し得る。ランダムプライミングにより形成される相補鎖は、エピジェネティック修飾を有し得ないか又はエピジェネティック修飾を実質的に有し得ない。第２の要素５０３により、アダプターが、二本鎖の修飾オリゴヌクレオチド断片（例えば二本鎖の修飾オリゴヌクレオチド断片の一方又は両方の鎖の片端又は両端）に結合されて、１つ以上のアダプターを有する二本鎖の修飾オリゴヌクレオチド断片５０４が形成され得る。第３の要素５０５により、標識（例えば、アジド−グルコース標識）が、二本鎖の修飾オリゴヌクレオチド断片と結合されて、標識されたキメラライブラリー等の標識された断片５０６を得ることができる。標識が、二本鎖オリゴヌクレオチド断片の１つの塩基に存在するエピジェネティック修飾又は或る種のエピジェネティック修飾と結合することで、標識された断片５０６が形成され得る。第４の要素５０８により、基材とも結合し得る標識５０７が、二本鎖の修飾オリゴヌクレオチド断片と結合され得る。標識５０７は、相補鎖に直接的に結合し得ない。相補鎖は、基材と修飾オリゴヌクレオチド断片との間の相互作用を介して基材と間接的に結合し得る。相補鎖と対向鎖との間の相互作用は、分断可能な結合等で、分断可能であり得る。第５の要素５０９により、基材と結合される標識を欠如する１つ以上の相補鎖を基材から除去又は分離又は洗出させることによって（例えば、相補鎖と対向鎖との間の相互作用を分断することにより）、試料は１つ以上の相補鎖５１０について濃縮され得る。分離に際して、修飾オリゴヌクレオチド断片は、基材と結合したままとなり得る。第６の要素５１１により、相補鎖が修飾オリゴヌクレオチド断片の不存在下で増幅されて、相補鎖の１つ以上の娘鎖５１２が形成され得る。
【００３６】
方法の変形形態５
図６は、本明細書に詳説される５−ｈｍＣプルダウン・ラベル・ローサイスペシフィック・エンリッチ（ＨＭＣＰ＿ＬＬＳＥ）法の１つの例を示す。幾つかの場合において、ＨＭＣＰ＿ＬＬＳＥ法は、（ａ）ＨＭＣＰ法若しくは糖、抗体、タンパク質、これらのいずれかの断片、標識若しくはそれらの任意の組み合わせが核酸のエピジェネティック修飾された塩基と結合され得る方法等のその他の方法と比較して改善された分解能、（ｂ）ＨＭＣＰ法若しくは糖、抗体、タンパク質、これらのいずれかの断片、標識若しくはそれらの任意の組み合わせが核酸のエピジェネティック修飾された塩基と結合され得る方法等のその他の方法と比較した５−ｈｍＣ密度の偏りの減少、（ｃ）ＨＭＣＰ法若しくは糖、抗体、タンパク質、これらのいずれかの断片、標識若しくはそれらの任意の組み合わせが核酸のエピジェネティック修飾された塩基と結合され得る方法等のその他の方法と比較して実質的に改善された低インプット量でのロバストネス、（ｄ）ＨＭＣＰ法若しくは糖、抗体、タンパク質、これらのいずれかの断片、標識若しくはそれらの任意の組み合わせが核酸のエピジェネティック修飾された塩基と結合され得る方法等のその他の方法と比較して５−ｈｍＣ濃縮されたＤＮＡの標的化領域、又は（ｅ）それらの任意の組み合わせを提供し得る。
【００３７】
図６に示されるように、第１の要素６０１により、標識（例えば、アジド−グルコース標識）が、セルフリーＤＮＡ断片等の二本鎖オリゴヌクレオチド断片と結合されて、標識された断片６０２を得ることができる。標識は、二本鎖オリゴヌクレオチド断片の１つ以上の塩基に存在するエピジェネティック修飾又は或る種のエピジェネティック修飾と結合することで、標識された断片６０２が形成され得る。第２の要素６０３により、（ｉ）標識された断片の鎖が分離され、（ｉｉ）遺伝子座特異的プライミングを開始させることで、一本鎖オリゴヌクレオチド断片の少なくとも１つに相補的な鎖、例えば実質的に相補的な鎖が形成され得る。遺伝子座特異的プライミングにより、親鎖のエピジェネティック修飾と結合される標識を有する二本鎖の修飾オリゴヌクレオチド断片６０４が形成され得る。相補鎖は、エピジェネティック修飾及び結合される標識の両方を有し得ない。第３の要素６０５により、アダプターが、二本鎖の修飾オリゴヌクレオチド断片（例えば二本鎖の修飾オリゴヌクレオチド断片の一方又は両方の鎖の片端又は両端）に結合されて、標識された遺伝子座で濃縮されたキメラライブラリー等の１つ以上のアダプターを有する二本鎖の修飾オリゴヌクレオチド断片６０６が形成され得る。第４の要素６０８により、基材とも結合し得る標識６０７が、二本鎖の修飾オリゴヌクレオチド断片と結合され得る。標識６０７は、相補鎖に直接的に結合し得ない。相補鎖は、基材と修飾オリゴヌクレオチド断片との間の相互作用を介して基材と間接的に結合し得る。相補鎖と対向鎖との間の相互作用は、分断可能な結合等で、分断可能であり得る。第５の要素６０９により、基材と結合される標識を欠如する１つ以上の相補鎖を基材から除去又は分離又は洗出させることによって（例えば、相補鎖と対向鎖との間の結合を分断することにより）、試料は１つ以上の相補鎖６１０について濃縮され得る。分離に際して、対向鎖は、基材と結合したままとなり得る。第６の要素６１１により、修飾オリゴヌクレオチド断片の不存在下で相補鎖が増幅されて、相補鎖の１つ以上の娘鎖６１２が形成され得る。
【００３８】
この例においては、５−ｈｍＣを含む二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）断片の両方の鎖は、β−グルコシルトランスフェラーゼ（βＧＴ）及びＵＤＰ−６−アジド−グルコース（ＵＤＰ−Ｎ３−ｇｌｃ）を使用して標識され得る。この工程は、ｄｓＤＮＡ選択的であり得る（βＧＴは、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）においては働き得ない）。標識の位置は、ｄｓＤＮＡ親断片における５−ｈｍＣの存在／不存在により決定され得る。標識は、βＧＴによってＵＤＰ−Ｎ３−ｇｌｃから５−ｈｍＣに転移されたアジド−グルコースであり得る。標識化は、精製された循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）抽出物において直接的に実施され得る。この利点は、ｃｔＤＮＡが標識化の前に一連のライブラリー前処理工程を経ていなくてよいことであり得る。こうして、ＮＧＳ前処理の後にあり得る場合より多くの材料が標識化で存在し得る可能性が高く（効率の改善）、より多くの代表的な試料に標識化が引き起こされ得る。
【００３９】
幾つかの場合において、ハイブリダイズは、（ｉ）プライミング（例えば、遺伝子座特異的プライミング）、（ｉｉ）ライゲーション（例えば、アダプターライゲーション）又は（ｉｉｉ）それらの組み合わせを含み得る。例えば、図６において、遺伝子座特異的プライミングは、アジド標識されたｄｓＤＮＡ二本鎖をオリゴマープール（ここで、プール中の各オリゴは、「ＮＧＳアダプター」テールに結合された遺伝子座特異的「ヘッド」を含み得る）、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、クレノウ）及び天然のｄＮＴＰミックスの存在下で所与のバッファー中でインキュベートし、単独の伸長反応を３７℃で規定の時間（例えば、１０分）にわたり実施することによって実施され得る。遺伝子座特異的ヘッドは、特定の規定の対象領域（ＲＯＩ）と相補的であるように設計され得る。アニーリングされた遺伝子座特異的プライマーからの伸長は、娘コピーの末端にＡオーバーハングをもたらし得る。ランダムプライミングは、１）ＮＧＳ特異的アダプター配列を遺伝子座特異的に導入し得ること、及び２）修飾親鎖の修飾不含のコピー（娘鎖）を作製し得ることによって一度で２つの要素を達成することができる。
【００４０】
図６においては、標識された遺伝子座の一方にアダプター付与されたキメラ二本鎖鋳型は、所与のバッファー中で３’Ｔオーバーハング及び５’ＰＯ４末端を有するＮＧＳプラットフォーム特異的アダプター（図解は、フォーク型アダプターを示すが、線状二本鎖アダプター又はヘアピンアダプターが代用され得る）、ｄｓＤＮＡリガーゼ（例えば、Ｔ４リガーゼ）及び必要な補因子（例えば、Ｍｇ２＋、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））と一緒に２０℃で規定の期間（例えば、１５分）にわたりインキュベートされ得る。一方にアダプター付与されたキメラ標識二本鎖のＡオーバーハングは、アダプターのＴオーバーハングと合致し得て、ライゲーション効率を促進する。幾つかの場合において、各二本鎖の片端（娘鎖の３’末端により形成される）だけにアダプター付与され得る。成功を収めたライゲーション産物は、一重にアダプター付与されたアジド標識親鎖（５’アダプター付与）及び二重にアダプター付与された非修飾娘鎖（３’末端及び５’末端の両方）を有し得る。この「ライブラリー」が増幅される場合に、ボトムストランドだけが、アダプター特異的ＰＣＲプライマーを用いて増幅可能であり得る場合がある。
【００４１】
図６においては、アダプターライゲーションの後に、基材による娘鎖の濃縮が使用され得て、それに引き続きエピジェネティック修飾を実質的に有し得ない娘鎖のＰＣＲ増幅が行われる。
【００４２】
方法の変形形態６
図７は、本明細書に詳説される５−ｈｍＣプルダウン・ローサイスペシフィック・ラベル・エンリッチ（ＨＭＣＰ＿ＬＳＬＥ）法の１つの例を示す。幾つかの場合において、ＨＭＣＰ＿ＬＳＬＥ法は、（ａ）ＨＭＣＰ法若しくは糖、抗体、タンパク質、これらのいずれかの断片、標識若しくはそれらの任意の組み合わせが核酸のエピジェネティック修飾された塩基と結合され得る方法等のその他の方法と比較して改善された分解能、（ｂ）ＨＭＣＰ法若しくは糖、抗体、タンパク質、これらのいずれかの断片、標識若しくはそれらの任意の組み合わせが核酸のエピジェネティック修飾された塩基と結合され得る方法等のその他の方法と比較した５−ｈｍＣ密度の偏りの減少、（ｃ）ＨＭＣＰ法若しくは糖、抗体、タンパク質、これらのいずれかの断片、標識若しくはそれらの任意の組み合わせが核酸のエピジェネティック修飾された塩基と結合され得る方法等のその他の方法と比較して実質的に改善された低インプット量でのロバストネス、（ｄ）ＨＭＣＰ法若しくは糖、抗体、タンパク質、これらのいずれかの断片、標識若しくはそれらの任意の組み合わせが核酸のエピジェネティック修飾された塩基と結合され得る方法等のその他の方法と比較して５−ｈｍＣ濃縮されたＤＮＡの標的化領域、又は（ｅ）それらの任意の組み合わせを提供し得る。
【００４３】
図７は、幾つかの場合においてプライミング（例えば、遺伝子座特異的プライミング）及びライゲーション（例えば、アダプターライゲーション）が図７に示されるように標識化前に行われ得て、幾つかの場合においてプライミング及びライゲーションが図６に示されるように標識化後に行われ得ることを除いて、図６の方法と類似している。
【００４４】
図７に示されるように、第１の要素７０１により、（ｉ）二本鎖オリゴヌクレオチド断片、例えばセルフリーＤＮＡ断片の鎖が分離され、（ｉｉ）遺伝子座特異的プライミングを開始させることで、一本鎖親鎖の少なくとも１つに相補的な鎖、例えば実質的に相補的な鎖が形成され得る。遺伝子座特異的プライミングにより、二本鎖の修飾オリゴヌクレオチド断片７０２が形成され得る。二本鎖オリゴヌクレオチド断片は、一方又は両方の鎖の１つ以上の塩基に１つ以上のエピジェネティック修飾を有し得る。遺伝子座特異的プライミングにより形成される相補鎖、例えば実質的に相補的な鎖は、エピジェネティック修飾を有し得ない。第２の要素７０３により、アダプターが、二本鎖の修飾オリゴヌクレオチド断片（例えば二本鎖の修飾オリゴヌクレオチド断片の一方又は両方の鎖の片端又は両端）に結合されて、１つ以上のアダプターを有する二本鎖の修飾オリゴヌクレオチド断片７０４が形成され得る。第３の要素７０５により、標識（例えば、アジド−グルコース標識）が、二本鎖の修飾オリゴヌクレオチド断片と結合されることで、標識されたキメラライブラリー等の標識された断片７０６を得ることができる。標識は、二本鎖の修飾オリゴヌクレオチド断片の１つの塩基に存在するエピジェネティック修飾又は或る種のエピジェネティック修飾と結合されて、標識された断片７０６が形成され得る。第４の要素７０８により、基材とも結合し得る標識７０７が、二本鎖の修飾オリゴヌクレオチド断片と結合され得る。標識７０７は、相補鎖に直接的に結合し得ない。相補鎖は、基材と修飾オリゴヌクレオチド断片との間の相互作用を介して基材と間接的に結合し得る。相補鎖と対向鎖との間の結合は、分断可能な結合等で、分断可能であり得る。第５の要素７０９により、基材と結合される標識を欠如する１つ以上の相補鎖を基材から除去又は分離又は洗出させることによって（例えば、相補鎖と対向鎖との間の結合を分断することにより）、試料は１つ以上の相補鎖７１０について濃縮され得る。分離に際して、対向鎖は、基材と結合したままとなり得る。第６の要素７１１により、相補鎖が親鎖の不存在下で増幅されて、相補鎖の１つ以上の娘鎖７１２が形成され得る。
【００４５】
ＨＭＣＰ法は、本明細書では「標準」法と呼ばれ得る。ＨＭＣＰ法は、本明細書ではＨＭＣＰ、ＨＭＣＰ−ｖ１、ＨＭＣＰｖ１、ＨＭＣＰ、ｖ１ＨＭＣＰ、ｖ１  ＨＭＣＰ又はＶ１と呼ばれ得る。ＣＬＥ法は、本明細書ではＨＭＣＰ＿ＣＬＥ、ＨＭＣＰ−ｖ２、ＨＭＣＰｖ２、ＣＬＥ−ＨＭＣＰ、ｖ２ＨＭＣＰ、ｖ２  ＨＭＣＰ又はＶ２と呼ばれ得る。
【００４６】
ＣＬＥ、ＨＭＣＰ＿ＬＣＥ、ＨＭＣＰ＿ＣＬＥ、ＨＭＣＰ＿ＬＲＥ、ＨＭＣＰ＿ＲＬＥ、ＨＭＣＰ＿ＬＬＳＥ、ＨＭＣＰ＿ＬＳＬＥを含む本明細書に記載される方法のいずれかについて、所与の方法の１つ以上の個々の要素は、本明細書に記載される順序で実施され得る。幾つかの場合において、所与の方法の１つ以上の個々の要素は、本明細書に記載される特定の順序で実施する必要はない。幾つかの場合において、所与の方法の１つ以上の個々の要素は、本明細書に記載されるのと異なる順序で実施され得る。
【００４７】
幾つかの場合において、相補鎖は、実質的に相補的な鎖であり得るか又は核酸配列の一部分に実質的に相補的であり得る部分を含み得る。
【００４８】
ハイブリダイズは、少なくとも２つの相補鎖を核酸配列の少なくとも２つの部分にハイブリダイズさせることを含み得る。ハイブリダイズは、相補鎖の少なくとも１つの部分を核酸配列のアダプター配列にハイブリダイズさせることを含み得る。ハイブリダイズは、ｃＤＮＡ伸長等の伸長を含み得る。ハイブリダイズは、遺伝子座特異的プライミング又はランダムプライミング等のプライミングを含み得る。ハイブリダイズは、アダプターライゲーション等のライゲーションを含み得る。ハイブリダイズは、プライマーを核酸配列にハイブリダイズさせ、プライマーから伸長させて、相補鎖を形成することを含み得る。ハイブリダイズは、相補鎖を得て、その相補鎖を核酸配列にハイブリダイズさせることを含み得る。
【００４９】
標識は、核酸配列のエピジェネティック修飾された塩基と結合され得る。標識は、ハイブリダイズする前にエピジェネティック修飾された塩基と結合され得る。標識は、ハイブリダイズした後にエピジェネティック修飾された塩基と結合され得る。
【００５０】
この方法は、核酸配列が実質的に存在し得ない反応において相補鎖を増幅させることを含み得る。増幅は、核酸配列及び相補鎖を、例えば標識によって基材と結合させることを含み得る。増幅は、核酸配列及び相補鎖と結合され得る基材の洗浄、例えばストリンジェントな洗浄を含み得る。増幅は、相補鎖を基材から溶出させて、その上に核酸配列が残ることを含み得る。増幅は、相補鎖を増幅させることを含み得る。
【００５１】
エピジェネティック修飾は、ＤＮＡメチル化を含み得る。ＤＮＡメチル化は、高メチル化又は低メチル化を含み得る。ＤＮＡメチル化は、５−メチルシトシン（５−ｍＣ）、４−メチルシトシン、６−メチルアデニン又はそれらの組み合わせ等のＤＮＡ塩基の修飾を含み得る。
【００５２】
定義
本明細書で使用される場合に、単数形（"a", "an", and "the"）は、文脈上特に明記されていない限り、複数形の指示を含む。本明細書における「又は」への言及は、別段の定めがない限り、「及び／又は」を包含することを意図し得る。
【００５３】
本明細書で使用される場合に、「約」という用語は、参照される数値表示±参照される数値表示の１５％を意味し得る。
【００５４】
本明細書で使用される「断片」という用語は、配列の一部分、すなわち全長配列よりも短いものであり得るサブセットであり得る。断片は、遺伝子の一部分であり得る。断片は、ペプチド又はタンパク質の一部分であり得る。断片は、アミノ酸配列の一部分であり得る。断片は、オリゴヌクレオチド配列の一部分であり得る。断片は、約２０アミノ酸長、３０アミノ酸長、４０アミノ酸長、５０アミノ酸長未満であり得る。断片は、約２０オリゴヌクレオチド長、３０オリゴヌクレオチド長、４０オリゴヌクレオチド長、５０オリゴヌクレオチド長未満であり得る。
【００５５】
本明細書で使用される「相同性」という用語は、最適な比較目的のために配列をアラインメントさせることにより決定され得る２つ以上のヌクレオチド又はアミノ酸配列間の「相同性」又は「パーセント相同性」の計算であり得る（例えば、ギャップは、最初の配列の配列中に導入され得る）。次いで、対応する位置のヌクレオチドを比較することができ、２つの配列間のパーセント同一性は、配列によって共有される同一位置の数の関数（すなわち、％相同性＝（同一位置の数／位置の合計数）×１００）であり得る。例えば、第１の配列中の位置は、第２の配列中の対応する位置と同じヌクレオチドによって占有され得て、その際、それらの分子は、その位置で同一である。２つの配列間のパーセント相同性は、２つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要があるギャップの数及び各ギャップの長さを考慮してそれらの配列によって共有される同一位置の数の関数であり得る。幾つかの実施形態では、比較目的のためにアラインメントされた配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９５％であり得る。ＢＬＡＳＴ（商標）検索は、２つの配列間の相同性を決定し得る。２つの配列は、遺伝子、ヌクレオチド配列、タンパク質配列、ペプチド配列、アミノ酸配列又はそれらの断片であり得る。２つの配列の実際の比較は、よく知られる方法によって、例えば数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。そのような数学的アルゴリズムの非限定的な例は、Karlin, S. and Altschul, S., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90- 5873-5877 (1993)に記載され得る。そのようなアルゴリズムは、Altschul, S. et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-3402 (1997)に記載されるようなＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）へと導入され得る。ＢＬＡＳＴ及びギャップ付きＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合に、それぞれのプログラム（例えば、ＮＢＬＡＳＴ）のあらゆる関連パラメーターが使用され得る。例えば、配列比較のためのパラメーターは、スコア＝１００、ワード長＝１２で設定することができる又は変更することができる（例えば、Ｗ＝５又はＷ＝２０）。その他の例としては、Myers and Miller, CABIOS (1989)のアルゴリズム、ＡＤＶＡＮＣＥ、ＡＤＡＭ、ＢＬＡＴ及びＦＡＳＴＡが挙げられる。別の実施形態では、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、例えばＧＣＧソフトウェアパッケージ（Accelrys社、英国、ケンブリッジ）におけるＧＡＰプログラムを使用して達成することができる。
【００５６】
本明細書で使用される「エピジェネティック修飾」という用語は、核酸塩基の任意の共有結合的修飾であり得る。幾つかの場合において、共有結合的修飾は、（ｉ）核酸配列の１つ以上の塩基へのメチル基、ヒドロキシメチル基、炭素原子、酸素原子若しくはそれらの組み合わせの付加、（ｉｉ）核酸配列と結合される分子の酸化状態、例えば酸素原子の変化、又は（ｉｉｉ）それらの組み合わせを含み得る。共有結合的修飾は、任意の塩基に、例えばシトシン、チミン、ウラシル、アデニン、グアニン又はそれらの任意の組み合わせに存在し得る。幾つかの場合において、エピジェネティック修飾は、酸化又は還元を含み得る。核酸配列は、１つ以上のエピジェネティック修飾された塩基を含み得る。エピジェネティック修飾された塩基は、任意の塩基、例えばシトシン、ウラシル、チミン、アデニン又はグアニンを含み得る。エピジェネティック修飾された塩基は、メチル化された塩基、ヒドロキシメチル化された塩基、ホルミル化された塩基若しくはカルボン酸含有塩基又はそれらの塩を含み得る。エピジェネティック修飾された塩基は、５−メチル化された塩基、例えば５−メチル化されたシトシン（５−ｍＣ）を含み得る。エピジェネティック修飾された塩基は、５−ヒドロキシメチル化された塩基、例えば５−ヒドロキシメチル化されたシトシン（５−ｈｍＣ）を含み得る。エピジェネティック修飾された塩基は、５−ホルミル化された塩基、例えば５−ホルミル化されたシトシン（５−ｆＣ）を含み得る。エピジェネティック修飾された塩基は、５−カルボキシル化された塩基又はその塩、例えば５−カルボキシル化されたシトシン（５−ｃａＣ）を含み得る。幾つかの場合において、エピジェネティック修飾された塩基は、活性化基のメチルトランスフェラーゼに基づく転移（ｍＴＡＧ）を含み得る。
【００５７】
エピジェネティック修飾された塩基は、プリンの１つ以上の塩基（例えば構造１）又はピリミジンの１つ以上の塩基（例えば構造２）を含み得る。エピジェネティック修飾は、任意の位置の１つ以上に存在し得る。例えば、エピジェネティック修飾は、構造１に示される位置１、位置２、位置３、位置４、位置５、位置６、位置７、位置８、位置９を含むプリンの１つ以上の位置に存在し得る。幾つかの場合において、エピジェネティック修飾は、構造２に示される位置１、位置２、位置３、位置４、位置５、位置６を含むピリミジンの１つ以上の位置に存在し得る。
【００５８】
【化１】
2020520243.tif 000003
【００５９】
【化２】
2020520243.tif 000004
【００６０】
核酸配列は、１つのエピジェネティック修飾された塩基を含み得る。核酸配列は、複数のエピジェネティック修飾された塩基を含み得る。核酸配列は、ＣＧサイト、ＣｐＧアイランド又はそれらの組み合わせ内に位置するエピジェネティック修飾された塩基を含み得る。核酸配列は、異なるエピジェネティック修飾された塩基、例えばメチル化された塩基、ヒドロキシメチル化された塩基、ホルミル化された塩基、カルボン酸含有塩基又はそれらの塩、これらのいずれかを複数、又はそれらの組み合わせを含み得る。
【００６１】
本明細書で使用される「糖」という用語は糖であり得る。糖は、グルコース、フルクトース、ガラクトース又はそれらの組み合わせを含み得る。糖は、スクロース、マルトース、ラクトース又はそれらの組み合わせ等の二糖類を含み得る。糖は、単糖類、オリゴ糖類、又は多糖類を含み得る。糖は、修飾された糖を含み得る。糖は、修飾された糖がエピジェネティック修飾された塩基、例えば５−メチル化されたシトシン又は５−ヒドロキシメチル化されたシトシンと結合するように修飾され得る。糖は、修飾されたグルコースを含み得る。糖は、グルコース、グルコース誘導体、ゲンチオビオース分子、又はそれらの任意の組み合わせであり得る。糖は、ウリジン二リン酸グルコースを含み得る。糖は、検出可能な部分、例えば放射性部分、蛍光性部分、燐光性部分、化学発光性部分、又はそれらの任意の組み合わせで修飾され得る。糖は、クリックケミストリーのための基と結合され得る。糖は、アジド基、例えばＮ３基と結合され得る。糖は、クリックケミストリー反応を使用することによりエピジェネティック修飾された塩基と結合され得る。
【００６２】
本明細書で使用される「バーコード」という用語は、ポリヌクレオチドの明白な特定を可能にするポリヌクレオチドにより含まれる天然若しくは合成の核酸配列、及び上記バーコード配列を有するポリヌクレオチドにより含まれるその他の配列に関連し得る。理論的に可能な様々なバーコード配列の数は、バーコード配列の長さに直接依存し得る。例えば、ランダムに集成されたアデニン、チミジン、グアノシン及びシチジンのヌクレオチドを有するＤＮＡバーコードが使用される場合に、可能なバーコード配列の理論的最大数は、１０ヌクレオチドの長さの場合には１０４８５７６通りであり得て、１５ヌクレオチドの長さの場合には１０７３７４１８２４通りであり得る。ユニークな試料識別子又はバーコードは、完全に無秩序であってよく（例えば、ＤＮＡについてはＡ、Ｃ、Ｇ及びＴのランダマー又はＲＮＡについてはＡ、Ｃ、Ｇ及びＵのランダマー）、又はそれらは共有配列の幾つかの領域を有してもよい。例えば、各末端での共有領域は、ライゲーション事象において配列の偏りを減らし得る。幾つかの場合において、共有領域は、約若しくは少なくとも約１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個又は２０個の共通の塩基対であり得る。幾つかの場合において、共有領域は、最大約１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個又は２０個の共通の塩基対であり得る。多様性を高めるために、バーコードの組み合わせを加えることができる。
【００６３】
バーコードは、被験体、試料（例えば無細胞試料）、核酸配列（例えば１つ以上のエピジェネティック修飾された塩基を有する配列）又はそれらの任意の組み合わせを一意に特定し得る。バーコードは、核酸配列又は相補鎖と結合され得る。核酸配列は、単一のバーコードを含み得る。核酸配列は、１つ以上のバーコード、例えば第１のバーコード及び第２のバーコードを含み得る。幾つかの場合において、第１のバーコードは第２のバーコードと異なる。幾つかの場合において、複数のバーコードの各バーコードは、ユニークなバーコードであり得る。幾つかの場合において、バーコードは、試料識別バーコードを含み得る。例えば、第１のバーコードはユニークなバーコードを含み得て、第２のバーコードは、試料識別バーコードを含み得る。
【００６４】
本明細書で使用される「アダプター」という用語は、既知の又は未知の配列を有する核酸であり得る。アダプターは、核酸（例えば、標的核酸）の３’末端、５’末端又は両末端に結合され得る。アダプターは、既知の配列及び／又は未知の配列を含み得る。アダプターは、二本鎖又は一本鎖であり得る。幾つかの場合において、アダプターは、バーコード（例えば、ユニークな識別子配列）を含み得る。幾つかの場合において、アダプターは、増幅アダプターであり得る。増幅アダプターは、標的核酸に結合し、標的核酸の増幅を補助し得る。例えば、増幅アダプターは、プライマー結合部位、ユニークな識別子配列、ユニークでない識別子配列、及び基材上に標的核酸を固定化するための配列のうち１つ以上を含み得る。増幅アダプターと結合された標的核酸は、基材上に固定化され得る。増幅プライマーは、アダプターにハイブリダイズし得て、増幅反応における鋳型として標的核酸を使用して伸長され得る。幾つかの場合において、アダプター中のユニークな識別子を使用して、アンプリコンを標識することができる。幾つかの場合において、アダプターは、シーケンシングアダプターであり得る。シーケンシングアダプターは、標的核酸に結合し、標的核酸のシーケンシングを補助し得る。例えば、シーケンシングアダプターは、シーケンシングプライマー結合部位、ユニークな識別子配列、ユニークでない識別子配列、及び基材上に標的核酸を固定化するための配列のうち１つ以上を含み得る。シーケンシングアダプターと結合された標的核酸は、シーケンサーにおいて基材上に固定化され得る。シーケンシングプライマーは、アダプターにハイブリダイズし得て、シーケンシング反応における鋳型として標的核酸を使用して伸長され得る。幾つかの場合において、アダプター中のユニークな識別子を使用して、異なる標的配列のシーケンスリードを標識することができ、こうして複数の標的核酸の高スループットシーケンシングが可能となる。幾つかの例においては、アダプター配列（例えば、二本鎖又は一本鎖オリゴヌクレオチド）は、核酸配列の片端又は両端にライゲーションされ得る。核酸配列は、１つ以上のエピジェネティック修飾された塩基を含み得る。核酸配列は、セルフリーＤＮＡ試料等の試料由来であり得る。核酸配列は、被験体から得られる試料由来であり得る。核酸配列は、二本鎖部分、一本鎖部分又はそれらの組み合わせを含み得る。幾つかの場合において、アダプターは、ユニバーサルプライマー等のプライマーを認識し得るか又は該プライマーと相補的であり得る。幾つかの場合において、アダプターは、シーケンシング法に特異的であり得る。幾つかの場合において、アダプターは、核酸配列又は相補鎖と結合され得る。
【００６５】
本明細書で使用される「核酸配列」という用語は、ＤＮＡ又はＲＮＡを含み得る。幾つかの場合において、核酸配列は、複数のヌクレオチドを含み得る。幾つかの場合において、核酸配列は、人工核酸類似体を含み得る。幾つかの場合において、ＤＮＡを含む核酸配列は、セルフリーＤＮＡ、ｃＤＮＡ、胎児ＤＮＡ又は母体ＤＮＡを含み得る。幾つかの場合において、核酸配列は、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡを含み得る。
【００６６】
本明細書で使用される「実質的に相補的な鎖」という用語は、核酸配列の塩基と塩基対を形成する約７０％〜１００％の塩基を含み得る。この塩基対形成のパーセントは、核酸配列のＵＶ吸収により測定され得る。幾つかの場合において、実質的に相補的な鎖は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で核酸配列の少なくとも一部分にハイブリダイズされ得る。
【００６７】
本明細書で使用される「エピジェネティック修飾された塩基を実質的に有しない」という用語は、エピジェネティック修飾された塩基を有しない相補鎖又は核酸配列の複数のエピジェネティック修飾された塩基の約０．０００００１％〜約５％を有する相補鎖を含み得る。
【００６８】
幾つかの場合において、実質的に相補的な鎖は、共有結合的修飾を実質的に有し得ない。幾つかの場合において、実質的に相補的な鎖は、（ｉ）メチル基、ヒドロキシメチル基、炭素原子、酸素原子若しくはそれらの任意の組み合わせ、（ｉｉ）実質的に相補的な鎖と結合される分子の酸化状態の変化、又は（ｉｉｉ）それらの組み合わせを実質的に有し得ない。
【００６９】
幾つかの場合において、実質的に相補的な鎖は、エピジェネティック修飾された塩基を実質的に有し得ない。幾つかの場合において、実質的に相補的な鎖は、エピジェネティック修飾された塩基を有し得ない。幾つかの場合において、実質的に相補的な鎖は、増幅され得る。実質的に相補的な鎖の増幅された産物は、複数のエピジェネティック修飾された塩基を含み得る。幾つかの場合において、増幅された産物の約９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．０１％、０．００１％、０．０００１％、０．００００１％又は０．０００００１％未満は、エピジェネティック修飾された塩基を含む。幾つかの場合において、パーセントは、重量基準であり得る。幾つかの場合において、パーセントは、塩基数基準であり得る。幾つかの場合において、実質的に相補的な鎖の増幅された産物の約５％未満は、エピジェネティック修飾された塩基を含む。幾つかの場合において、実質的に相補的な鎖の増幅された産物の約４％未満は、エピジェネティック修飾された塩基を含む。幾つかの場合において、実質的に相補的な鎖の増幅された産物の約３％未満は、エピジェネティック修飾された塩基を含む。幾つかの場合において、実質的に相補的な鎖の増幅された産物の約２％未満は、エピジェネティック修飾された塩基を含む。幾つかの場合において、実質的に相補的な鎖の増幅された産物の約１％未満は、エピジェネティック修飾された塩基を含む。
【００７０】
幾つかの場合において、実質的に相補的な鎖の増幅された産物の約０．０００００１％〜約１０％は、エピジェネティック修飾された塩基を含む。幾つかの場合において、実質的に相補的な鎖の増幅された産物の約０．０００００１％〜約５％は、エピジェネティック修飾された塩基を含む。幾つかの場合において、実質的に相補的な鎖の増幅された産物の約０．０００００１％〜約４％は、エピジェネティック修飾された塩基を含む。幾つかの場合において、実質的に相補的な鎖の増幅された産物の約０．０００００１％〜約１％は、エピジェネティック修飾された塩基を含む。幾つかの場合において、実質的に相補的な鎖の増幅された産物の約０．０００００１％〜約０．０１％は、エピジェネティック修飾された塩基を含む。幾つかの場合において、実質的に相補的な鎖の増幅された産物の約０．０００００１％〜約０．００１％は、エピジェネティック修飾された塩基を含む。幾つかの場合において、実質的に相補的な鎖の増幅された産物の約０．０００００１％〜約０．０００１％は、エピジェネティック修飾された塩基を含む。幾つかの場合において、実質的に相補的な鎖の増幅された産物の約１％〜約１０％は、エピジェネティック修飾された塩基を含む。
【００７１】
核酸配列は、複数のエピジェネティック修飾された塩基を含み得る。幾つかの場合において、核酸の少なくとも一部分に実質的に相補的であり得る鎖は、核酸配列の複数のエピジェネティック修飾された塩基の約９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．０１％、０．００１％、０．０００１％、０．００００１％又は０．０００００１％未満を含み得る。幾つかの場合において、パーセントは、重量基準であり得る。幾つかの場合において、パーセントは、塩基数基準であり得る。幾つかの場合において、核酸配列の複数のエピジェネティック修飾された塩基の約５％未満は、実質的に相補的な鎖中に存在し得る。幾つかの場合において、核酸配列の複数のエピジェネティック修飾された塩基の約４％未満は、実質的に相補的な鎖中に存在し得る。幾つかの場合において、核酸配列の複数のエピジェネティック修飾された塩基の約３％未満は、実質的に相補的な鎖中に存在し得る。幾つかの場合において、核酸配列の複数のエピジェネティック修飾された塩基の約２％未満は、実質的に相補的な鎖中に存在し得る。幾つかの場合において、核酸配列の複数のエピジェネティック修飾された塩基の約１％未満は、実質的に相補的な鎖中に存在し得る。
【００７２】
幾つかの場合において、核酸配列の複数のエピジェネティック修飾された塩基の約０％は、実質的に相補的な鎖中に存在し得る。幾つかの場合において、核酸配列の複数のエピジェネティック修飾された塩基の約０．０００００１％〜約１０％は、実質的に相補的な鎖中に存在し得る。幾つかの場合において、核酸配列の複数のエピジェネティック修飾された塩基の約０．０００００１％〜約５％は、実質的に相補的な鎖中に存在し得る。幾つかの場合において、核酸配列の複数のエピジェネティック修飾された塩基の約０．０００００１％〜約４％は、実質的に相補的な鎖中に存在し得る。幾つかの場合において、核酸配列の複数のエピジェネティック修飾された塩基の約０．０００００１％〜約１％は、実質的に相補的な鎖中に存在し得る。幾つかの場合において、核酸配列の複数のエピジェネティック修飾された塩基の約０．０００００１％〜約０．１％は、実質的に相補的な鎖中に存在し得る。幾つかの場合において、核酸配列の複数のエピジェネティック修飾された塩基の約０．０００００１％〜約０．０１％は、実質的に相補的な鎖中に存在し得る。幾つかの場合において、核酸配列の複数のエピジェネティック修飾された塩基の約０．０００００１％〜約０．００１％は、実質的に相補的な鎖中に存在し得る。幾つかの場合において、核酸配列の複数のエピジェネティック修飾された塩基の約１％〜約１０％は、実質的に相補的な鎖中に存在し得る。
【００７３】
幾つかの場合において、実質的に相補的な鎖は、核酸配列のエピジェネティック修飾された塩基とは異なり得るエピジェネティック修飾された塩基を含み得る。
【００７４】
本明細書で使用される「標識」という用語は、（ａ）基材と結合され得る成分、（ｂ）エピジェネティック修飾された塩基と結合され得る成分又は（ｃ）それらの組み合わせであり得る。標識は、単結合、二重結合、三重結合、金属関連結合又はイオンペアリングによってエピジェネティック修飾された塩基と結合され得る。標識は、磁性金属、例えば鉄、ニッケル、コバルト、アルミニウム又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。標識は、酵素の補助によりエピジェネティック修飾された塩基と結合され得る。標識は、（ａ）ビオチン−ストレプトアビジン結合、（ｂ）磁性結合、（ｃ）抗体−抗原結合又は（ｄ）それらの任意の組み合わせを介して基材と結合され得る。標識は、核酸配列の一部分に選択的であり得る。標識は、一本鎖部分と比較して核酸配列の二本鎖部分と選択的に結合し得る。標識は、非修飾塩基を有する部分と比較してエピジェネティック修飾された塩基を有する核酸配列の部分と選択的に結合し得る。標識は、或る種のエピジェネティック修飾された塩基と選択的に結合し得て、例えば５−メチル化されたシトシン（５−ｍＣ）と比較して５−ヒドロキシメチル化されたシトシン（５−ｈｍＣ）と選択的に結合する。標識は、グルコース等の糖を含み得る。グルコースは、変性グルコースを含み得る。標識は、１つより多い糖、例えば２つ以上の糖を含み得る。標識は、変性糖、例えば変性グルコースを含み得る。標識は、ウリジン二リン酸グルコース（ＵＤＰＧ）を含み得る。標識は、検出可能な標識、例えば放射性標識、蛍光性標識、化学発光性標識、燐光性標識、赤外標識、可視的標識、化学反応性標識（例えばアジド系標識）又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。幾つかの場合において、標識は、放射性標識との反応を介した発色団の導入により得られる標識であり得る。標識は、タンパク質、ペプチド又はポリペプチドを含み得る。幾つかの場合において、標識は、抗体又はその部分を含み得る。標識は、タグ、例えばＦＬＡＧタグを含み得る。標識は、ビオチン又はアビジン、例えばストレプトアビジンを含み得る。標識は、核酸配列を含み得る。標識は、基材を含み得る。幾つかの場合において、異なるエピジェネティック修飾を一意に標識するために異なる標識が使用され得る。例えば、第１の標識はメチル化された塩基に結合され得て、第２の標識はヒドロキシメチル化された塩基に結合され得る。
【００７５】
幾つかの場合において、タグは、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＡｖｉＴａｇ、カルモジュリンタグ、ポリグルタメートタグ、ＦＬＡＧタグ、ヒトインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｍｙｃタグ、Ｓタグ、ストレプトアビジン結合ペプチド（ＳＢＰ）タグ、Ｓｏｆｔａｇ  １、Ｓｔｒｅｐタグ、ＴＣタグ、Ｖ５タグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ、Ｉｓｏｐｅｐｔａｇ、ＳｐｙＴａｇ、ビオチンカルボキシルキャリアータンパク質（ＢＣＣＰ）タグ、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）タグ、ＨａｌｏＴａｇ、チオレドキシンタグ、Ｔ７タグ、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）タグ、ｃ−Ｍｙｃタグ、Ｔｒｘタグ、Ｈｓｖタグ、ＣＢＤタグ、Ｄｓｂタグ、ｐｅｌＢ／ｏｍｐＴ、ＫＳＩ、ＶＳＶ−Ｇタグ、３−Ｇａｌタグ又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。タグは、融合タグ、共有結合ペプチドタグ、タンパク質タグ、ペプチドタグ、親和性タグ、エピトープタグ、可溶化タグ又はそれらの任意の組み合わせであり得る。タグは、組み換えタンパク質を含み得る。タグは、タンパク質又はタンパク質断片と結合し得る。ＦＬＡＧタグは、ＤＹＫＤＤＤＤＫを含む配列又はその一部分を含み得て、ここで、Ｄはアスパラギン酸であり得て、Ｙはチロシンであり得て、Ｋはリジンであり得る。
【００７６】
標識は、基材と可逆的に結合され得る。標識は、基材と不可逆的に結合され得る。標識は、エピジェネティック修飾された塩基と可逆的に結合され得る。標識は、エピジェネティック修飾された塩基と不可逆的に結合され得る。標識は、基材、エピジェネティック修飾された塩基又はそれらの組み合わせへの結合によって結合され得る。標識は、単結合、二重結合又は三重結合によって基材へと結合され得る。標識は、単結合、二重結合又は三重結合によってエピジェネティック修飾された塩基へと結合され得る。
【００７７】
本明細書で使用される「クリックケミストリー」という用語は、以下の（ａ）高収率、（ｂ）広範囲、（ｃ）クロマトグラフィーを用いずに除去され得る副生成物のみの生成、（ｄ）立体特異的、（ｅ）実施が簡単、（ｆ）簡単に除去可能な又は温和な溶剤中での実施の少なくとも１つを有する反応を含み得る。幾つかの場合において、クリックケミストリーは、タグ付け、例えば核酸配列又は相補鎖のタグ付けを含む。幾つかの場合において、クリックケミストリーにより、核酸配列は標識と結合され得る。クリックケミストリーは、［３＋２］環化付加反応、チオール−エン反応、ディールス・アルダー反応、逆電子要求型ディールス・アルダー反応、［４＋１］環化付加、求核置換、カルボニル化学様の尿素の形成、炭素−炭素二重結合への付加又はそれらの任意の組み合わせを有する反応を含み得る。幾つかの場合において、［３＋２］環化付加は、ヒュスゲン１，３−双極子環化付加を含み得る。幾つかの場合において、［４＋１］環化付加は、イソニトリルとテトラジンとの間の環化付加を含み得る。クリックケミストリーは、銅（Ｉ）触媒アジド−アルキン環化付加（ＣｕＡＡＣ）、歪み促進型アジド−アルキン環化付加（ＳＰＡＡＣ）、歪み促進型アルキン−ニトロン環化付加（ＳＰＡＮＣ）又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。
【００７８】
本明細書で使用される「部分」という用語は、反応を補助又は触媒し得る成分であり得る。幾つかの場合において、部分は、酵素又はその触媒活性断片を含み得る。幾つかの場合において、部分は、抗体又はその断片を含み得る。幾つかの場合において、部分は、タンパク質、ペプチド又はポリペプチドを含み得る。幾つかの場合において、部分は、補酵素等の補因子を含み得る。幾つかの場合において、部分は、酵素、タンパク質若しくはその部分、抗体若しくはその部分、補因子又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。幾つかの場合において、酵素等の部分は、標識とエピジェネティック修飾された塩基との結合を補助し得る。酵素等の部分により、一本鎖オリゴヌクレオチド断片に存在するエピジェネティック修飾された塩基と比較して、標識は二本鎖オリゴヌクレオチド断片に存在するエピジェネティック修飾された塩基と選択的に結合され得る。酵素等の部分により、二本鎖オリゴヌクレオチド断片に存在するエピジェネティック修飾された塩基と比較して、標識は一本鎖オリゴヌクレオチド断片に存在するエピジェネティック修飾された塩基と選択的に結合され得る。酵素は、トランスフェラーゼを含み得る。酵素は、グルコシルトランスフェラーゼを含み得る。酵素は、（ａ）α−グルコシルトランスフェラーゼ、（ｂ）β−グルコシルトランスフェラーゼ、（ｃ）β−グルコシル−α−グルコシルトランスフェラーゼ、（ｄ）Ｊ−グルコシルトランスフェラーゼ又は（ｅ）それらの任意の組み合わせを含み得る。酵素等の部分は、遺伝的に突然変異された部分等の改変された部分を含み得る。改変された部分は、標識とエピジェネティック修飾された塩基との結合を増強するように改変され得る。改変された部分は、ａ）特異的な標識とエピジェネティック修飾された塩基との結合、ｂ）標識と特異的なエピジェネティック修飾された塩基との結合又はｃ）それらの組み合わせを選択的に補助するように改変され得る。
【００７９】
幾つかの場合において、部分は、核酸配列、相補鎖又はそれらの組み合わせの１つ以上の塩基へのメチル基の転移を触媒し得る。幾つかの場合において、部分は、メチルトランスフェラーゼを含み得る。幾つかの場合において、酵素は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１（ＤＮＭＴ１）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３様（ＤＮＭＴ３Ｌ）、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ、ｔＲＮＡアスパラギン酸メチルトランスフェラーゼ（ＴＲＤＭＴ１）、ＤＮＭＴ３、それらの任意の触媒活性断片又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。
【００８０】
幾つかの場合において、部分は、エピジェネティック修飾における変化、例えばメチル化された塩基のヒドロキシメチル化された塩基への変換を触媒し得る。幾つかの場合において、酵素は、ジオキシゲナーゼを含み得る。幾つかの場合において、酵素は、テンイレブントランスロケーション（ten-eleven translocation）（ＴＥＴ）ファミリーの酵素を含み得る。幾つかの場合において、酵素は、ＴＥＴ１、ＴＥＴ２、ＴＥＴ３、ＣＸＸＣフィンガータンパク質４（ＣＸＸＣ４）、それらの任意の触媒活性断片又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。
【００８１】
幾つかの場合において、部分は、酸化的反応、例えば酸化的脱カルボキシル化を触媒し得る。幾つかの場合において、酵素は、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＤＨ）ファミリーの酵素を含み得る。幾つかの場合において、酵素は、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ［ＮＡＤ］サブユニットアルファ（ＩＤＨ３Ａ）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ［ＮＡＤ］サブユニットベータ（ＩＤＨ３Ｂ）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ［ＮＡＤ］サブユニットガンマ（ＩＤＨ３Ｇ）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ１（ＩＤＨ１）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ２（ＩＤＨ２）、それらの任意の触媒活性断片又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。
【００８２】
核酸配列又は相補鎖の塩基は、自発的に又は部分を核酸配列の一部分に接触させることによって脱アミノ化され得る。例えば、塩基は脱アミノ化され得る。幾つかの場合において、塩基、メチル化された塩基、ヒドロキシメチル化された塩基、ホルミル化された塩基、カルボキシル化された塩基又はそれらの任意の組み合わせは、脱アミノ化され得る。幾つかの場合において、メチル化されたシトシンは、脱アミノ化され得る。脱アミノ化は、単一の塩基又は塩基の任意の組み合わせに選択的に生じ得る。脱アミノ化は、自発的に生じ得る。脱アミノ化は、部分を核酸配列の一部分に接触させることにより生じ得る。部分としては、酵素、例えばデアミナーゼ、例えばアデノシンデアミナーゼ、グアニンデアミナーゼ又はシチジンデアミナーゼが挙げられ得る。デアミナーゼは、活性化誘導型シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）、保存されたシチジンデアミナーゼ（ＣＤＡ）、アポリポタンパク質Ｂ  ｍＲＮＡ編集酵素触媒ポリペプチド１（ＡＰＯＢＥＣ１）、アポリポタンパク質Ｂ  ｍＲＮＡ編集酵素触媒ポリペプチド様３Ｈ（ＡＰＯＢＥＣ３Ａ−Ｈ）、アポリポタンパク質Ｂ  ｍＲＮＡ編集酵素触媒ポリペプチド様３Ｇ（ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ）等を含み得る。バイサルファイトシーケンシングは、核酸配列又は相補鎖の１つ以上の塩基を脱アミノ化し得る。
【００８３】
本明細書で使用される「シーケンシング」という用語は、バイサルファイトフリーシーケンシング、バイサルファイトシーケンシング、ＴＥＴ支援型バイサルファイト（ＴＡＢ）シーケンシング、ＡＣＥシーケンシング、高スループットシーケンシング、マキサム・ギルバートシーケンシング、超並列シグネチャシーケンシング、ポロニーシーケンシング、４５４パイロシーケンシング、サンガーシーケンシング、イルミナシーケンシング、ＳＯＬｉＤシーケンシング、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ半導体シーケンシング、ＤＮＡナノボールシーケンシング、Ｈｅｌｉｓｃｏｐｅ単一分子シーケンシング、単一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）シーケンシング、ナノポアＤＮＡシーケンシング、ショットガンシーケンシング、ＲＮＡシーケンシング、Ｅｎｉｇｍａシーケンシング又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。
【００８４】
幾つかの場合において、方法は、シーケンシングを含み得る。シーケンシングとしては、バイサルファイトシーケンシング又はバイサルファイトフリーシーケンシングが挙げられ得る。幾つかの場合において、方法は、核酸配列又は相補鎖又はそれらの組み合わせの１つ以上の塩基を酸化させることを含み得る。幾つかの場合において、方法は、少なくとも１つのエピジェネティック修飾を含む核酸配列について選択的に濃縮させることを含み得る。
【００８５】
本明細書で使用される「基材」という用語は、実体（例えば、標識、官能基、エピジェネティック修飾、エピジェネティック修飾と結合される標識又は機能性部分、親鎖と結合される標識又は機能的部分）が結合され得る表面であり得る。幾つかの場合において、実体は、基材（例えば担体）に固定化され得る。幾つかの場合において、実体は、基材（例えば担体）に可逆的又は不可逆的に結合され得る。幾つかの場合において、実体は、標識を含み得る。そのような場合には、標識は、核酸配列とも結合し得る。幾つかの場合において、実体は、標識、核酸配列、糖、酵素又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。基材は、１つのビーズを含み得る。基材は、複数のビーズを含み得る。基材は、ビーズのアレイを含み得る。基材は、アレイ、例えばウェルのアレイ又はビーズのアレイを含み得る。基材（例えば、固体担体）は、カラム、例えば充填カラム、サイズ排除カラム、磁性カラム又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。基材は、膜を含み得る。基材は、ビーズ、キャピラリー、プレート、膜、ウェハ、ウェル、これらのいずれかを複数、これらのいずれかのアレイ又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。基材（例えば担体）は、対象となる核酸配列と基材とを結合させることによって、対象となる核酸配列の正の選択をすることができる。基材は、試料のその他の核酸配列と基材とを結合させることによって、対象となる核酸配列について負の選択をすることができる。
【００８６】
ビーズは、１つ以上のビーズを含み得る。ビーズは、ビーズのアレイを含み得る。ビーズは、基材と結合され得る。ビーズは、標識と結合され得る。ビーズは、標識を基材と結合させ得る。ビーズは、基材、標識、核酸配列又はそれらの任意の組み合わせと結合され得る。ビーズは、ポリマー、金属又はそれらの組み合わせを含み得る。ビーズは、ハイドロゲル、シリカゲル、ガラス、樹脂、金属、金属合金、プラスチック、セルロース、アガロース、磁性材料又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。
【００８７】
本開示は、基材及び基材の作製方法を提供する。担体又は基材の性質及び形状は、アレイのタイプ（例えば、１次元、２次元又は３次元）を含む様々な要因に依存し得る。一般的に、基材は、核酸をハイブリダイズ及び／又は変性させるために使用される条件下で溶融しないか又はその他には実質的に分解しないあらゆる材料から構成され得る。基材は、１つ以上の離散した領域及び／又は離散した領域内の離散した位置で実体（例えば、親オリゴヌクレオチド断片上のエピジェネティック修飾と結合される標識）の結合を可能にするあらゆる材料から構成され得る。基材は、基材から実体（例えば、親オリゴヌクレオチド断片上のエピジェネティック修飾と結合される標識）を取り除くことなく洗浄又は物理的若しくは化学的な操作が可能であるあらゆる材料から構成され得る。
【００８８】
基材は、実体を組織化された高密度な形式で固体表面上に移行させた後に、その実体をそこに結合させることによって作製され得る。本発明の基材の作製技術としては、限定されるものではないが、フォトリソグラフィー、インクジェット及び接触印刷、液体分注及び圧電工学が挙げられる。アレイのパターン及び寸法は、各々の特定の用途によって決定されるべきである。各々の実体のスポットのサイズは、利用者によって容易に制御することができる。固体基材の作製方法は、実体を離散した位置に接触又は結合させることを含み得る。
【００８９】
基材は、アレイの使用目的に応じて、単純なものから複雑なものまでの様々な構成を取り得る。このように、基材は、矩形又は円盤形の構成等の全面スライド又はプレートの構成を有し得る。標準的なマイクロプレート構成が使用され得る。幾つかの実施形態では、表面は、平滑若しくは実質的に平坦であり得るか、又は凹部若しくは凸部等の不規則性を有し得る。幾つかの場合において、基材は、約１０ミリメートル（ｍｍ）〜２００ｍｍ、４０ｍｍ〜１５０ｍｍ又は７５ｍｍ〜１２５ｍｍの長さ、約１０ｍｍ〜２００ｍｍ、２０ｍｍ〜１２０ｍｍ又は２５ｍｍ〜８０ｍｍの幅、及び約０．０１ｍｍ〜５．０ｍｍ、０．１ｍｍ〜２ｍｍ又は０．２ｍｍ〜１ｍｍの厚さを有する矩形の断面形状を有し得る。
【００９０】
担体は有機又は無機でもよく、金属（例えば銅又は銀）又は非金属でもよく、ポリマー又は非ポリマーでもよく、導体、半導体又は不導体（絶縁体）でもよく、反射性又は非反射性でもよく、多孔質又は非多孔質等でもよい。上述の基材は、金属、金属酸化物、半導体、ポリマー（特に、編まれた、編まれていない、成型された、押出成形された、鋳造されたもの等を含む任意の好適な形態の有機のポリマー）、ケイ素、酸化ケイ素、及びそれらの複合体を含む任意の好適な材料から構成することができる。
【００９１】
本発明における基材（例えば、固体基材）としての使用に適した多くの材料（例えば、ポリマー）が当該技術分野で記載されている。基材としての使用に適した材料としては、ポリカーボネート、金、ケイ素、酸化ケイ素、酸窒化ケイ素、インジウム、酸化タンタル、酸化ニオブ、チタン、酸化チタン、白金、イリジウム、酸化インジウムスズ、ダイヤモンド若しくはダイヤモンドライクフィルム、アクリル、スチレン−メチルメタクリレートコポリマー、エチレン／アクリル酸、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン（ＡＢＳ）、ＡＢＳ／ポリカーボネート、ＡＢＳ／ポリスルホン、ＡＢＳ／ポリ塩化ビニル、エチレンプロピレン、エチレン酢酸ビニル（ＥＶＡ）、ニトロセルロース、ナイロン（ナイロン６、ナイロン６／６、ナイロン６／６−６、ナイロン６／９、ナイロン６／１０、ナイロン６／１２、ナイロン１１及びナイロン１２を含む）、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリアクリレート、ポリカーボネート、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）、ポリ（エチレン）（ＰＥ）（低密度、線状低密度、高密度、架橋及び超高分子量グレードを含む）、ポリ（プロピレン）（ＰＰ）、ポリ（ブタジエン）（ＰＢ）のシス及びトランス異性体、ポリ（イソプレン）のシス及びトランス異性体、ポリエチレンテレフタレート）（ＰＥＴ）、ポリプロピレンホモポリマー、ポリプロピレンコポリマー、ポリスチレン（ＰＳ）（汎用及び耐衝撃性グレードを含む）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリ（イプシロン−カプロラクトン）（ＰＥＣＬ又はＰＣＬ）、ポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）及びそのホモログ、ポリ（メチルアクリレート）及びそのホモログ、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）、ポリオルトエステル、ポリ（無水物）、ナイロン、ポリイミド、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリブタジエン（ＰＢ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリアクリルアミド及びそのホモログ、例えばポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、フッ素化ポリアクリレート（ＰＦＯＡ）、ポリ（エチレン−ブチレン）（ＰＥＢ）、ポリ（スチレン−アクリロニトリル）（ＳＡＮ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）及びその誘導体、ポリオレフィンプラストマー、フッ素化エチレン−プロピレン（ＦＥＰ）、エチレン−テトラフルオロエチレン（ＥＴＦＥ）、パーフルオロアルコキシエチレン（ＰＦＡ）、ポリフッ化ビニル（ＰＶＦ）、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリクロロトリフルオロエチレン（ＰＣＴＦＥ）、ポリエチレン−クロロトリフルオロエチレン（ＥＣＴＦＥ）、スチレンマレイン酸無水物（ＳＭＡ）、金属酸化物、ガラス、酸化ケイ素又は他の無機若しくは半導体材料（例えば窒化ケイ素）、化合物半導体（例えばヒ化ガリウム及びヒ化インジウムガリウム）、並びにそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９２】
よく知られた基材の例としては、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、ガラス、天然及び修飾セルロース（例えばニトロセルロース）、ポリアクリルアミド、アガロース、及びマグネタイトが挙げられる。幾つかの場合において、溶剤に対する優れた耐薬品性、機械的安定性、低い固有蛍光特性及び容易な機能化の柔軟性のため、基材はシリカ又はガラスであり得る。一実施形態では、基材は、ガラス、特にニトロセルロースで被覆されたガラス、より具体的にはニトロセルロース被覆されたスライド（例えば、ＦＡＳＴスライド）である。
【００９３】
基材は、表面の特性を所望のように変性する役割を果たす１つ以上の異なる化合物の層又は被覆で変性され得る。例えば、基材は、基材の表面の全体又は一部に被覆材料を更に含み得る。幾つかの実施形態では、被覆材料は、基材に対する実体（例えば官能基）の親和性を高める。例えば、被覆材料は、ニトロセルロース、シラン、チオール、ジスルフィド又はポリマーであり得る。材料がチオールである場合に、基材は、金被覆された表面を含み得て、及び／又はチオールは、疎水性部分及び親水性部分を含む。被覆材料がシランである場合に、基材はガラスを含み、シランは、例えばヒドロキシル基、カルボキシル基、ホスフェート基、グリシドキシ基、スルホネート基、イソシアナト基、チオール基又はアミノ基を含む末端部分を呈し得る。代替的な実施形態では、被覆材料は、共有結合されたリンカー部分を有する誘導体化された単層又は多層であり得る。例えば、単層被覆は、基材に化学的結合又は物理化学的結合を生ずるチオール基（例えば、チオアルキル酸（例えば、１６−メルカプトヘキサデカン酸）、チオアルキルアルコール、チオアルキルアミン及びハロゲン含有チオアルキル化合物からなる群から選択されるチオアルキル）、ジスルフィド基又はシラン基を有し得る。基材への単層の結合は、非共有結合的相互作用又は共有結合反応によっても達成され得る。
【００９４】
基材への結合後に、被覆は、少なくとも１つの官能基を含み得る。単層被覆上の官能基の例としては、限定されるものではないが、カルボキシル基、イソシアネート基、ハロゲン基、アミン基又はヒドロキシル基が挙げられる。一実施形態では、被覆上のこれらの反応性官能基は、標準的な化学的技術により活性化されて、単層被覆上の対応する活性化された官能基となり得る（例えば、カルボキシル基から無水物又は酸ハロゲン化物への変換等）。末端アミノ基への共有結合のための基材上の被覆の例示的な活性化された官能基としては、無水物、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル又はその他の通常の活性化されたエステル若しくは酸ハロゲン化物が挙げられる。基材上の被覆の例示的な活性化された官能基としては、末端ヒドロキシル基との結合のための無水物誘導体、リンカー化合物の酸化された糖残基上への結合のためのヒドラジン誘導体、又はリンカー化合物のチオール基への共有結合のためのマレイミド誘導体が挙げられる。誘導体化された被覆を製造するために、被覆上の少なくとも１つの末端カルボキシル基は、無水物基へと活性化され、その後、例えばリンカー化合物と反応し得る。代替的には、被覆上の官能基は、被覆上の反応性アミノ基への共有結合のために活性化された官能基（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、酸ハロゲン化物、無水物及びイソシアネート）を有するリンカーと反応し得る。
【００９５】
基材は、リンカー（例えば、実体を基材へと間接的に結合させるために）を含み得る。一実施形態では、リンカーは、１つの末端官能基、スペーサー領域及び実体付着領域を有する。活性化被覆上の官能基と反応するための末端官能基としては、ハロゲン、アミノ、ヒドロキシル、又はチオール基が挙げられる。幾つかの場合において、末端官能基は、カルボン酸、ハロゲン、アミン、チオール、アルケン、アクリレート、無水物、エステル、ハロゲン化酸、イソシアネート、ヒドラジン、マレイミド及びヒドロキシル基からなる群から選択される。スペーサー領域としては、ポリエーテル、ポリペプチド、ポリアミド、ポリアミン、ポリエステル、多糖、ポリオール、多価荷電種又はそれらの任意の他の組み合わせが挙げられ得るが、これらに限定されない。例示的なスペーサー領域としては、エチレングリコール、ペプチド、グリセロール、エタノールアミン、セリン、イノシトールのポリマー等が挙げられる。スペーサー領域は親水性の性質でもよい。スペーサー領域は疎水性の性質でもよい。幾つかの場合において、スペーサーはｎ個のオキシエチレン基（ここでｎは２〜２５である）を有し得る。幾つかの場合において、実体に付着するリンカーの領域は、疎水性又は両親媒性の直鎖又は分岐鎖アルキル、アルキニル、アルケニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアルキル、ヘテロアルキニル、ヘテロアルケニル、ヘテロアリール、又はヘテロアリールアルキルであり得る。幾つかの場合において、実体に付着するリンカーの領域は、Ｃ１０〜Ｃ２５直鎖状又は分岐鎖状のアルキル又はヘテロアルキルの疎水性尾部を含み得る。幾つかの場合において、リンカーは、一方の端部の末端官能基と、スペーサーと、実体付着領域と、もう一方の端部の親水性基とを含む。リンカーの一方の端部の親水性基は、単一の基又は多数の親水性基の直鎖若しくは分岐鎖であり得る（例えば、単一のヒドロキシル基又は多数のエチレングリコール単位の鎖）。
【００９６】
幾つかの実施形態では、担体は平坦であり得る。幾つかの場合において、担体は球状であり得る。幾つかの場合において、担体はビーズであり得る。幾つかの場合において、担体は磁性であり得る。幾つかの場合において、磁性基材は、マグネタイト、マグヘマイト、ＦｅＰｔ、ＳｒＦｅ、鉄、コバルト、ニッケル、二酸化クロム、フェライト又はそれらの混合物を含み得る。幾つかの場合において、担体は非磁性であり得る。幾つかの実施形態では、非磁性基材は、ポリマー、金属、ガラス、合金、鉱物又はそれらの混合物を含み得る。幾つかの場合において、非磁性材料は、磁性基材の周りの被覆であり得る。幾つかの場合において、磁性材料は、磁性材料の連続相中に分布し得る。幾つかの実施形態では、基材は、磁性材料及び非磁性材料を含む。幾つかの場合において、基材は、磁性材料と非磁性材料との組み合わせを含み得る。幾つかの実施形態では、磁性材料は、基材の全組成の少なくとも約５重量％、１０重量％、２０重量％、３０重量％、４０重量％、５０重量％、６０重量％、７０重量％又は約８０重量％である。幾つかの実施形態では、ビーズサイズは、約１００ミクロンから約９００ミクロンまでのオーダーで極めて大きくてよく、又は幾つかの場合において最大約３ｍｍの直径であってもよい。他の実施形態では、ビーズサイズは、約１ミクロンから約１５０ミクロンまでのオーダーであり得る。本発明のビーズの平均粒径は、約２μｍからおよそ数ミリメートルまでの範囲内であり得て、例えば約２μｍ、４μｍ、６μｍ、８μｍ、１０μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、６０μｍ、７０μｍ、８０μｍ、９０μｍ、１００μｍ、１５０μｍ、２００μｍ、３００μｍ又は５００μｍの下限と、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、６０μｍ、７０μｍ、８０μｍ、９０μｍ、１００μｍ、１５０μｍ、２００μｍ、３００μｍ、５００μｍ、７５０μｍ、１ｍｍ、２ｍｍ又は３ｍｍの上限とを有する範囲内の直径であり得る。
【００９７】
本明細書で使用される「組織」という用語は、任意の組織試料であり得る。組織は、疾患又は病態を伴うと疑われる組織又はそれが確認された組織であり得る。組織は、実質的に健康、実質的に良性、又はその他には実質的に疾患若しくは病態を有しない試料であり得る。組織は被験体から除去された組織、例えば生検組織、切除組織、吸引物（例えば細針吸引物）、組織洗浄液、細胞診検体、体液、又はそれらの任意の組み合わせでもよい。組織は、癌細胞、腫瘍細胞、非癌細胞又はそれらの組み合わせを含み得る。組織は、脳組織、脳脊髄組織、脳脊髄液、乳房組織、膀胱組織、腎臓組織、肝臓組織、結腸組織、甲状腺組織、子宮頸組織、前立腺組織、肺組織、心臓組織、筋肉組織、膵臓組織、肛門組織、胆管組織、骨組織、子宮組織、卵巣組織、子宮内膜組織、膣組織、外陰部組織、胃組織、眼組織、鼻組織、副鼻腔組織、陰茎組織、唾液腺組織、腸組織、胆嚢組織、消化器組織、膀胱組織、脳組織、脊髄組織、血液試料又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。組織は、遺伝子修飾され得る試料であり得る。
【００９８】
本明細書で使用される「被験体」という用語は、任意の動物又は生きている生物であり得る。動物は、哺乳動物、例えばヒト、非ヒト霊長類、齧歯類、例えばマウス及びラット、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ウサギ等であり得る。動物は、魚、は虫類等であり得る。動物は、新生児、乳児、青年期又は成体の動物であり得る。ヒトは、約１歳、２歳、５歳、１０歳、２０歳、３０歳、４０歳、５０歳、６０歳、６５歳、７０歳、７５歳又は約８０歳を超える年齢であり得る。被験体は、癌等の病態又は疾患を有するか又はそれを有すると疑われている被験体であり得る。被験体は、患者、例えば病態又は疾患の治療を受けている患者、例えば癌患者であり得る。被験体は、癌等の病態又は疾患を発症するリスクの素因を有し得る。被験体は、癌患者等で、病態又は疾患からの寛解中であり得る。被験体は健康であり得る。
【００９９】
本明細書で使用される「マッピングされた百万リード当たりのキロベース当たりのリード（ＲＰＫＭ）」という用語は、全リード長及び／又はシーケンシングリードの数について標準化することによりシーケンシングデータ（例えば、ＲＮＡシーケンシングデータ）から遺伝子発現を定量化する方法であり得る。幾つかの場合において、ＲＰＫＭは、試料のシーケンシング深度における差について補正し得る。幾つかの場合において、ＲＰＫＭは、遺伝子長における差について補正し得る。幾つかの場合において、ＲＰＫＭは、試料のシーケンシング深度及び遺伝子長の両方における差について補正し得る。ＲＰＫＭは、遺伝子カバレッジ値の比較のためにデータを標準化する方法であり得る。幾つかの場合において、ＲＰＫＭは、ｎｕｍＲｅａｄｓ／（（ｇｅｎｅＬｅｎｇｔｈ／１０００）×（ｔｏｔａｌＮｕｍＲｅａｄｓ／１００００００））として定義され得て、ここで、ｎｕｍＲｅａｄｓは、遺伝子配列にマッピングされたリードの数であり得て、ｇｅｎｅＬｅｎｔｈは、遺伝子配列の長さであり得て、ｔｏｔａｌＮｕｍＲｅａｄｓは、試料のマッピングされたリードの総数であり得る。
【０１００】
実質的に相補的な鎖は、核酸配列の一部分にハイブリダイズされ得る。実質的に相補的な鎖は、核酸配列と実質的に同じ長さであり得る。実質的に相補的な鎖は、核酸配列の長さの少なくとも約９９％、９５％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、３％、２％、１％であり得る長さを含み得る。実質的に相補的な鎖は、核酸配列と比較して長さが短い、長い、又は同じであり得る。
【０１０１】
実質的に相補的な鎖は、核酸配列の少なくとも一部分にハイブリダイズされ得る。幾つかの場合において、２つの実質的に相補的な鎖は、核酸配列の部分にハイブリダイズされ得る。幾つかの場合において、２つの実質的に相補的な鎖は、ライゲーションされ得る。幾つかの場合において、３つ以上の実質的に相補的な鎖は、核酸配列の部分にハイブリダイズされ得る。幾つかの場合において、３つ以上の実質的に相補的な鎖は、ライゲーションされ得る。幾つかの場合において、実質的に相補的な鎖は、アダプター配列を含み得る核酸配列の一部分にハイブリダイズされ得る。実質的に相補的な鎖は、伸長され得る、例えば増幅前に伸長され得る。
【０１０２】
核酸配列は、シトシングアニン（ＣＧ）サイト、シトシンリン酸グアニン（ＣｐＧ）アイランド、これらのいずれかの一部分又はそれらの組み合わせを含み得る。ＣｐＧアイランドは、１つ以上のＣＧサイトを含み得る。核酸配列は、１つ以上のＣＧサイト又はその部分を含み得る。核酸配列は、高密度ＣＧサイト、高密度ＣｐＧアイランド又はそれらの組み合わせを含み得る。核酸配列は、複数のＣＧサイト又はその部分を含み得る。核酸配列は、１つ以上のＣｐＧアイランド又はその部分を含み得る。核酸配列は、複数のＣｐＧアイランド又はその部分を含み得る。ＣＧサイト、ＣｐＧアイランド、その一部分又はこれらのいずれかを含む核酸配列の１つ以上の塩基は、エピジェネティック修飾された塩基、例えばメチル化された塩基又はヒドロキシメチル化された塩基を含み得る。ＣＧサイト、ＣｐＧアイランド、その一部分又はこれらのいずれかを含む核酸配列の１つ以上のシトシンは、エピジェネティック修飾されたシトシン、例えばメチル化されたシトシン又はヒドロキシメチル化されたシトシンを含み得る。ＣｐＧアイランド（又はＣＧアイランド）は、高頻度のＣＧサイトを有する領域であり得る。ＣｐＧアイランドは、少なくとも約２００塩基対（ｂｐ）及び約５０％を上回り得るＧＣパーセントと、約６０％を上回り得る観察対期待のＣｐＧ比とを有する核酸配列の領域であり得る。「観察対期待のＣｐＧ比」は、観察が、
（ＣｐＧの数）
として計算され得て、期待が、
（Ｃの数×Ｇの数）／配列の長さ
として計算され得るか、又は期待が、
（（Ｃの数＋Ｇの数）／２）２／配列の長さ
として計算され得る場合に求められ得る。
【０１０３】
幾つかの場合において、ＣｐＧアイランドは、少なくとも約２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、６０ｂｐ、７０ｂｐ、８０ｂｐ、９０ｂｐ、１００ｂｐ、１１０ｂｐ、１２０ｂｐ、１３０ｂｐ、１４０ｂｐ、１５０ｂｐ、１６０ｂｐ、１７０ｂｐ、１８０ｂｐ、１９０ｂｐ、２００ｂｐ、２２５ｂｐ、２５０ｂｐ、３００ｂｐ、３５０ｂｐ、４００ｂｐ、４５０ｂｐ、５００ｂｐ、５５０ｂｐ、６００ｂｐを有する核酸配列の領域であり得る。幾つかの場合において、ＣｐＧアイランドは、約２０ｂｐ〜約６００ｂｐを有する核酸配列の領域であり得る。幾つかの場合において、ＣｐＧアイランドは、約２０ｂｐ〜約５００ｂｐを有する核酸配列の領域であり得る。幾つかの場合において、ＣｐＧアイランドは、約１０ｂｐ〜約５００ｂｐを有する核酸配列の領域であり得る。幾つかの場合において、ＣｐＧアイランドは、約１０ｂｐ〜約３００ｂｐを有する核酸配列の領域であり得る。幾つかの場合において、ＣｐＧアイランドは、約２０ｂｐ〜約２００ｂｐを有する核酸配列の領域であり得る。
【０１０４】
幾つかの場合において、ＣｐＧアイランドにおけるＧＣパーセントは、約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％超又はそれより高い場合がある。幾つかの場合において、ＣｐＧアイランドにおけるＧＣパーセントは、約５０％〜約９５％であり得る。幾つかの場合において、ＣｐＧアイランドにおけるＧＣパーセントは、約５０％〜約９９％であり得る。幾つかの場合において、ＣｐＧアイランドにおけるＧＣパーセントは、約５５％〜約８５％であり得る。幾つかの場合において、ＣｐＧアイランドにおけるＧＣパーセントは、約６０％〜約９９％であり得る。幾つかの場合において、ＣｐＧアイランドにおけるＧＣパーセントは、約７０％〜約９９％であり得る。
【０１０５】
本明細書で使用される「エピジェネティック修飾の密度」という用語は、エピジェネティック修飾を有する配列内の塩基の数又はパーセントであり得る。エピジェネティック修飾は、メチル化されたシトシン、ヒドロキシメチル化されたシトシン、カルボキシル化されたシトシン、ホルミル化されたシトシン又はその他のエピジェネティック修飾であり得る。幾つかの場合において、６個の５−ｈｍＣを有する配列は、高密度のエピジェネティック修飾を有する配列に相当し得る。幾つかの場合において、２個の５−ｈｍＣを有する配列は、低密度のエピジェネティック修飾を有する配列に相当し得る。低密度のエピジェネティック修飾は、配列の１０塩基対（ｂｐ）、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐのセグメント当たりに５、４、３又は２未満のＣＧサイトを有する配列を含み得る。高密度のエピジェネティック修飾は、配列の１０ｂｐ、１５ｂｐ、３０ｂｐ、３５ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐのセグメント当たりに２、３、４、５、６、７、８、９、１０超のＣＧサイトを有する配列を含み得る。高密度のエピジェネティック修飾は、複数のＣｐＧアイランド又はＣＧサイトを有する配列を含み得る。高密度のエピジェネティック修飾は、配列当たりに少なくとも５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個又はそれより多くのＣｐＧアイランド又はＣＧサイトを有する配列を含み得る。
【０１０６】
本明細書で使用される場合に、「セルフリー」という用語は、身体から試料を得る前に核酸配列が体内に現れた場合の核酸配列の状態を指す。例えば、試料中の循環セルフリー核酸配列は、人体の血流中に循環するセルフリー核酸配列として生じ得る。それに対して、固形組織、例えば生検材料から抽出される核酸配列は、一般的に「セルフリー」であるとはみなされない。幾つかの場合において、セルフリーＤＮＡは、胎児ＤＮＡ、母体ＤＮＡ又はそれらの組み合わせを含み得る。幾つかの場合において、セルフリーＤＮＡは、血漿中に放出されるＤＮＡ断片を含み得る。幾つかの場合において、セルフリーＤＮＡは、循環腫瘍ＤＮＡを含み得る。幾つかの場合において、セルフリーＤＮＡは、組織起源、疾患又は病態の指標となる循環ＤＮＡを含み得る。セルフリー核酸配列は、血液試料から単離され得る。セルフリー核酸配列は、血漿試料から単離され得る。セルフリー核酸配列は、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を含み得る。幾つかの場合において、１つ以上のｃＤＮＡは、ｃＤＮＡライブラリーを形成し得る。
【０１０７】
幾つかの場合において、核酸配列を含むｃＤＮＡライブラリー等の核酸配列は、二本鎖であり得る。幾つかの場合において、核酸配列は、実質的に相補的な鎖が核酸配列の少なくとも一部分にハイブリダイズされ得る場合等に、二本鎖であり得る。幾つかの場合において、核酸配列の一部分は、プライマーが核酸配列の一部分にハイブリダイズされ得る場合等に、二本鎖であり得る。
【０１０８】
核酸配列は、試料由来であり得る。試料は、被験体から単離され得る。被験体は、ヒト被験体であり得る。試料は、口腔試料、唾液試料、血液試料、血漿試料、生殖試料（例えば卵子又は精子）、粘液試料、脳脊髄液試料、組織試料、生検組織、外科的切除試料、細針吸引試料又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。幾つかの場合において、試料は、血液試料を含み得る。幾つかの場合において、試料は、口腔試料を含み得る。
【０１０９】
幾つかの場合において、被験体は、本明細書に記載される方法の実施前に疾患又は病態の診断を予め受けている被験体であり得る。被験体は、癌等の疾患の陽性の診断を予め受けている被験体であり得る。被験体は、癌等の疾患の未確定診断又は包括的診断を予め受けている被験体であり得る。被験体は、それを必要とする被験体、例えば確定的な診断又は治療処置計画の選択を必要とする被験体であり得る。
【０１１０】
幾つかの場合において、被験体は、本明細書に記載される方法の実施前に疾患又は病態の診断を予め受けていない被験体であり得る。幾つかの場合において、被験体は、疾患又は病態を有すると、例えば疾患又は病態の１つ以上の症状を有すると疑われる被験体であり得る。幾つかの場合において、被験体は、疾患又は病態を発症するリスクの指標であり得るバイオマーカー又は遺伝的指標を有する被験体等の、疾患又は病態を発症するリスクがある被験体であり得る。幾つかの場合において、疾患又は病態は、癌を含み得る。
【０１１１】
幾つかの場合において、本明細書に記載される方法は、結果を得ることを含み得る。方法は、結果を得て、その結果を報告することを含み得る。結果は、利用者、医療専門家、被験者又はそれらの任意の組み合わせに報告され得る。結果は、通信媒体を介して報告され得る。通信媒体には、記入された報告書又は印刷された報告書が含まれ得る。通信媒体には、視覚ディスプレイ、例えばグラフィカルユーザーインターフェースが含まれ得る。通信媒体は、コンピュータ、タブレットデバイス、携帯電話又はその他の電子デバイスにより提供される結果を含み得る。結果は、疾患若しくは病態の診断又は疾患若しくは病態の不存在の確認を含み得る。結果は、疾患又は病態を有するという被験体の診断を含み得る。結果は、疾患又は病態の不存在の確認を含み得る。結果は、被験体が疾患又は病態を発症する可能性又はリスクを含み得る。幾つかの場合において、疾患又は病態は、癌を含み得る。結果は、被験体の死亡率の予測、被験体の生物学的年齢の決定又はそれらの組み合わせを含み得る。死亡率の予測又は生物学的年齢の決定は、エピジェネティック修飾の存在、シーケンシング情報又はそれらの任意の組み合わせを基礎とし得る。疾患若しくは病態の可能性の予測又は疾患若しくは病態の診断等の結果は、エピジェネティック修飾の存在、シーケンシング情報又はそれらの組み合わせを基礎とし得る。エピジェネティック修飾の存在には、エピジェネティック修飾のパターン、特定のエピジェネティック修飾の存在、エピジェネティック修飾のレベル又はそれらの任意の組み合わせが含まれ得る。
【０１１２】
本明細書に記載される方法は、結果と参照とを比較することを含み得る。参照は、複数の参照を含み得る。参照は、複数の結果を含むデータベースを含み得る。参照は、コントロール試料を含み得る。参照は、ポジティブコントロール試料、ネガティブコントロール試料又はそれらの組み合わせを含み得る。参照試料等の参照は、被験体から又は異なる起源、例えば異なる被験体から得られ得る。診断は、結果と参照とを比較することを含み得る。幾つかの場合において、診断を含む結果は、以前の診断を少なくとも部分的に確認し得る。
【０１１３】
診断
本明細書に記載の方法から得られる１つ以上の結果は、以下の、診断精度の可能性、被験者において病態が存在する可能性、被験者が病態を発症する可能性、特定の治療が成功する可能性又はそれらの任意の組み合わせの１つ以上の指標となる１つ以上の定量的な値を提供し得る。本明細書に記載される方法は、病態の発症の危険性又は可能性を予測し得る。本明細書に記載される方法は、病態の発症の早期診断指標であり得る。本明細書に記載される方法は、病態の診断又は存在を確認し得る。本明細書に記載される方法は、病態の進行を監視し得る。本明細書に記載される方法は、被験体における病態の治療の効力を監視し得る。
【０１１４】
本明細書に記載される方法を使用する分析のために得られる試料は、被験体から得ることができる。被験体は、病態の症状を一切有しなくてもよい。被験体は、１つ以上の病態の症状を有し得る。被験体は、病態の発症のリスク、例えば遺伝的リスクがある被験体であり得る。被験体は、陽性の診断を予め受けている被験体であり得る。被験体は、診断試験からの未確定の結果を予め受けている被験体であり得る。被験体は、現在治療を受けている被験体であり得る。
【０１１５】
病態を有する被験体又は病態を有すると疑われる被験体のための治療の進め方を診断及び／又は提案、選択、指定、推奨又はその他には決定する方法を、本明細書に記載の方法と組み合わせて使用することができる。これらの技術としては、細胞学的分析若しくは組織学的分類、分子プロファイリング、血液検査、遺伝子分析、超音波分析、ＭＲＩ結果、ＣＴスキャン結果、その他のイメージングスキャン、ホルモンサイトカイン若しくは血球レベルの測定、又はそれらの任意の組み合わせが挙げられ得る。本明細書に記載される方法は、少なくとも１つのその他の種類の診断法を含み得る。本明細書に記載される方法は、少なくとも２つのその他の診断法を含み得る。
【０１１６】
幾つかの実施形態において、本発明の方法は、試料を得た後にその試料を本発明の１つ以上の方法により分析する前に、秒、分、時間、日、週、月、年又はそれより長いような時間にわたる試料の貯蔵を提供する。幾つかの場合において、被験体から得られた試料は、試料の種々の部分が、限定されるものではないが、本明細書に記載される方法の任意の組合せ、貯蔵、バイサルファイト処理、増幅、シーケンシング、標識化、細胞学的分析、妥当性試験、核酸抽出、分子プロファイリング又はそれらの組み合わせを含む異なる後続の方法又はプロセスに供されるように、貯蔵又は更なる分析の工程の前に小分けされる。
【０１１７】
幾つかの場合において、試料の一部は貯蔵され得るが、上記試料の別の部分は更に操作される。そのような操作としては、限定されるものではないが、本明細書に記載される任意の方法、バイサルファイト処理、シーケンシング、増幅、標識化、選択的濃縮、分子プロファイリング、細胞学的染色、核酸（ＲＮＡ又はＤＮＡ）抽出、検出又は定量化、遺伝子発現産物（ＲＮＡ又はタンパク質）抽出、検出又は定量化、固定化及び検査が挙げられ得る。試料は、貯蔵前又は貯蔵の間に当該技術分野で知られる任意の方法によって、例えばグルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド又はメタノールを使用して固定化され得る。他の場合には、試料を得て貯蔵して、貯蔵工程後に更なる分析のために、試料の種々の部分が種々の後続の方法に供されるように小分けされる。
【０１１８】
治療
本明細書に記載される方法は、被験体を治療することを含み得る。幾つかの場合において、治療は、外科手術、化学療法、放射線療法、免疫療法、標的療法、ホルモン療法、幹細胞移植、精密医療（precision medicine）、又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。幾つかの場合において、治療は、被験体の病態を更に監視することを含み得る。幾つかの場合において、疾患又は病態と診断された被験体は、疾患又は病態を治療するための処置を受けてもよい。幾つかの場合において、疾患又は病態を発症する可能性又は危険性の確定を受けた被験体は、予防的処置等の処置を受けてもよい。被験体に対する治療は、疾患又は病態の陽性を確定する診断等の方法の結果に基づいて選択され得る。結果は、結果に基づく被験体に対する推奨される治療等の１つ以上の治療を含み得る。治療は、単一の治療を含み得る。治療は、反復的治療を含み得る。治療は、被験体の残りの寿命にわたる反復的治療を含み得る。治療は、毎日の治療を含み得る。治療は、週２回の治療を含み得る。治療は、結果に基づいて選択され得る。
【０１１９】
幾つかの実施形態において、被験体に対する治療は、外科手術（例えば、組織切除）、栄養管理体制（nutrition regime）、身体活動、放射線治療、化学療法、免疫療法、医薬組成物、細胞移植、輸血、又はそれらの任意の組み合わせであり得る。
【０１２０】
アッセイすること及び比較すること等の本明細書に記載される方法は、腫瘍切除等の被験体の罹患組織に対する手術前に実施され得る。本明細書に記載される方法は、被験体が癌又は腫瘍診断等の陽性疾患診断を有するのに先立って実施され得る。本明細書に記載される方法は、癌又は腫瘍等の病態又は疾患を有する疑いがある被験体に対して実施され得る。本明細書に記載される方法は、陽性癌診断又は陽性腫瘍診断等の陽性疾患診断を受けた被験体に対して実施され得る。本明細書に記載される方法は、事前の治療管理体制を受けた被験体に対して実施されてもよく、ここで、事前の治療管理体制は、癌又は腫瘍等の疾患又は病態を排除するのに効果がなかった。組織試料は、本明細書に記載される方法を実施する前に、被験体から入手され得る。組織試料は、生検、細針吸引（fine needle aspiration）、採血、外科手術切除、又はそれらの任意の組み合わせ中に入手され得る。
【０１２１】
被験体の組織試料をアッセイすることは、１つ以上の時点で実施され得る。別々の組織試料は、１つ以上の時点それぞれでアッセイするために被験体から入手され得る。１つ以上の時点でアッセイすることは、同じ組織試料に対して実施され得る。１つ以上の時点でアッセイすることは、薬物の有効性の評価、疾患治療管理体制の長期的経過、又はそれらの組み合わせを提供し得る。１つ以上の時点それぞれで、組織試料は、同じ参照と比較されてもよい。組織試料は、１つ以上の時点それぞれで、異なる参照と比較されてもよい。１つ以上の時点は、同じであってもよい。１つ以上の時点は、異なってもよい。１つ以上の時点は、薬物投与前の少なくとも１つの時点、薬物投与後の少なくとも１つの時点、陽性疾患診断前の少なくとも１つの時点、疾患寛解診断後の少なくとも１つの時点、疾患治療管理体制中の少なくとも１つの時点、又はそれらの組み合わせを含み得る。
【０１２２】
本明細書に記載される方法は、特定の病態の診断に、また初期診断後の特定の治療の有効性を監視するのに、又は特定の病態の進行を監視するのに使用され得る。本明細書に記載される方法は、予防的方策として特定の病態を発症する危険性がある被験体を監視するのに使用され得る。本明細書に記載される方法は、特定の治療の診断に、及び／又は特定の治療の有効性を監視するのに、単独で使用され得る。本明細書に記載される方法は、診断又は監視に関する他のアッセイ（例えば、細胞学的解析又は分子プロファイリング）と組み合わせて使用され得る。
【０１２３】
被験体は、本明細書に開示される方法を使用して監視され得る。例えば、被験体は、癌又は遺伝性障害等の病態と診断され得る。この初期診断は、本明細書に記載される方法の使用を包含してもよく、又は包含しなくてもよい。被験体は、腫瘍の外科的切除又は化学療法等の治療を処方されてもよい。治療の結果は、治療の有効性を検出するように、本明細書に記載される方法によって継続的に監視され得る。別の例では、被験体は、良性腫瘍又は前癌性の病巣若しくは結節と診断されてもよく、腫瘍、結節、又は病巣は、腫瘍又は病巣の病態の如何なる変化も検出するように、本明細書に記載される方法によって継続的に監視され得る。
【０１２４】
本明細書に記載される方法はまた、被験体へ投与する前に、特定の治療の潜在的な有効性を確認するのに使用され得る。例えば、被験体は、癌と診断され得る。本明細書に記載される方法は、癌の悪性度に関与することが知られている特定の核酸配列上の１つ以上のエピジェネティックな残基の存在を示し得る。更なる試料は、当該技術分野で既知の方法を使用して、被験体から入手されて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養され得る。続いて、各種阻害剤又は薬物の適用は、成長阻害に関して試験され得る。本明細書に記載される方法はまた、例えば、関係のある経路の下流の標的に対するこれらの阻害剤の影響を監視するのに使用され得る。
【０１２５】
幾つかの実施形態において、本明細書に記載される方法は、病態（例えば、疑わしい腫瘍）の診断用の新たなマーカーを同定するための；腫瘍細胞、細胞系統、組織若しくは生物等の試料に対する薬物若しくは候補薬物の影響を監視するための；又は疾患の予防若しくは阻害（例えば、腫瘍形成及び／又は腫瘍抑制）に関する新たな経路を明らかにするための研究ツールとして使用され得る。
【０１２６】
範囲及び数
幾つかの場合において、オリゴヌクレオチド断片は、１つ以上のエピジェネティックに修飾された塩基、例えば（ａ）１つ以上のエピジェネティックに修飾されたシトシン、（ｂ）１つ以上のエピジェネティックに修飾されたウラシル、（ｃ）１つ以上のエピジェネティックに修飾されたチミン、（ｄ）１つ以上のエピジェネティックに修飾されたグアニン、（ｅ）１つ以上のエピジェネティックに修飾されたアデニン、又は（ｆ）それらの任意の組み合わせを含み得る。
【０１２７】
核酸配列は、１つ以上のエピジェネティックに修飾された塩基を含み得る。例えば、核酸配列は、核酸配列の約２０個の塩基対につき、少なくとも約１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、又はそれ以上のエピジェネティックに修飾された塩基を含み得る。核酸配列は、核酸配列の約２０個の塩基対につき、約１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、又は２０個のエピジェネティックに修飾された塩基を含み得る。
【０１２８】
核酸配列は、１つ以上のエピジェネティックに修飾された塩基を含み得る。例えば、核酸配列の総塩基の約４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％は、エピジェネティックに修飾された塩基を含み得る。幾つかの場合において、核酸配列の総塩基の少なくとも約４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％は、エピジェネティックに修飾された塩基を含み得る。幾つかの場合において、核酸配列の総塩基の約４％〜約１０％は、エピジェネティックに修飾された塩基を含み得る。幾つかの場合において、核酸配列の総塩基の約４％〜約６％は、エピジェネティックに修飾された塩基を含み得る。幾つかの場合において、核酸配列の総塩基の約４％〜約２０％は、エピジェネティックに修飾された塩基を含み得る。幾つかの場合において、核酸配列の総塩基の約４％〜約３０％は、エピジェネティックに修飾された塩基を含み得る。幾つかの場合において、核酸配列の総塩基の約３％〜約３０％は、エピジェネティックに修飾された塩基を含み得る。幾つかの場合において、核酸配列の総塩基の約３０％〜約９０％は、エピジェネティックに修飾された塩基を含み得る。幾つかの場合において、核酸配列の総塩基の約４０％〜約９０％は、エピジェネティックに修飾された塩基を含み得る。幾つかの場合において、核酸配列の総塩基の約５０％〜約９０％は、エピジェネティックに修飾された塩基を含み得る。幾つかの場合において、核酸配列の総塩基の約６０％〜約９０％は、エピジェネティックに修飾された塩基を含み得る。
【０１２９】
核酸配列（幾つかの場合において、複数のエピジェネティックに修飾された残基を含む）は、濃縮されてもよい。核酸配列の濃縮は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ループ介在等温増幅、核酸配列ベースの増幅、鎖置換増幅、多置換増幅、ローリングサークル増幅法、リガーゼ連鎖反応、ヘリカーゼ依存性増幅、分枝増幅法（ramification amplification method）、又はそれらの任意の組み合わせによる増幅等の増幅を含み得る。
【０１３０】
幾つかの場合において、増幅は、少なくとも２サイクルの増幅を含み得る。増幅は、少なくとも３サイクルの増幅を含み得る。増幅は、少なくとも４サイクルの増幅を含み得る。増幅は、少なくとも５サイクルの増幅を含み得る。増幅は、少なくとも６サイクルの増幅を含み得る。増幅は、少なくとも７サイクルの増幅を含み得る。増幅は、少なくとも８サイクルの増幅を含み得る。増幅は、少なくとも９サイクルの増幅を含み得る。増幅は、少なくとも１０サイクルの増幅を含み得る。増幅は、少なくとも１１サイクルの増幅を含み得る。増幅は、少なくとも１２サイクルの増幅を含み得る。増幅は、少なくとも１３サイクルの増幅を含み得る。増幅は、少なくとも１４サイクルの増幅を含み得る。増幅は、少なくとも１５サイクルの増幅を含み得る。増幅は、少なくとも２０サイクルの増幅を含み得る。増幅は、少なくとも２５サイクルの増幅を含み得る。増幅は、少なくとも３０サイクルの増幅を含み得る。
【０１３１】
幾つかの場合において、一定数のサイクルの増幅は、元の配列長の割合を保持する複数のシーケンスリードを生じる。幾つかの場合において、約９０％の複数のシーケンスリードは、配列長の少なくとも約９０％を保持する。幾つかの場合において、約８０％の複数のシーケンスリードは、配列長の少なくとも約９０％を保持する。幾つかの場合において、約７５％の複数のシーケンスリードは、配列長の少なくとも約９０％を保持する。幾つかの場合において、約９５％の複数のシーケンスリードは、配列長の少なくとも約９０％を保持する。幾つかの場合において、約８５％の複数のシーケンスリードは、配列長の少なくとも約９０％を保持する。
【０１３２】
幾つかの場合において、約９０％の複数のシーケンスリードは、配列長の少なくとも約８５％を保持する。幾つかの場合において、約８０％の複数のシーケンスリードは、配列長の少なくとも約８５％を保持する。幾つかの場合において、約７５％の複数のシーケンスリードは、配列長の少なくとも約８５％を保持する。幾つかの場合において、約９５％の複数のシーケンスリードは、配列長の少なくとも約８５％を保持する。幾つかの場合において、約８５％の複数のシーケンスリードは、配列長の少なくとも約８５％を保持する。
【０１３３】
幾つかの場合において、約９０％の複数のシーケンスリードは、配列長の少なくとも約８０％を保持する。幾つかの場合において、約８０％の複数のシーケンスリードは、配列長の少なくとも約８０％を保持する。幾つかの場合において、約７５％の複数のシーケンスリードは、配列長の少なくとも約８０％を保持する。幾つかの場合において、約９５％の複数のシーケンスリードは、配列長の少なくとも約８０％を保持する。幾つかの場合において、約８５％の複数のシーケンスリードは、配列長の少なくとも約８０％を保持する。
【０１３４】
幾つかの場合において、実質的に相補的な鎖の塩基の一部は、核酸配列と塩基対形成し得る。幾つかの場合において、実質的に相補的な鎖の塩基の少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９８％は、核酸配列と塩基対形成し得る。幾つかの場合において、実質的に相補的な鎖の塩基の少なくとも約７０％は、核酸配列と塩基対形成し得る。幾つかの場合において、実質的に相補的な鎖の塩基の少なくとも約８０％は、核酸配列と塩基対形成し得る。幾つかの場合において、実質的に相補的な鎖の塩基の少なくとも約９０％は、核酸配列と塩基対形成し得る。幾つかの場合において、実質的に相補的な鎖の塩基の少なくとも約９５％は、核酸配列と塩基対形成し得る。幾つかの場合において、実質的に相補的な鎖の塩基の少なくとも約９８％は、核酸配列と塩基対形成し得る。幾つかの場合において、実質的に相補的な鎖の塩基の約７０％〜１００％は、核酸配列と塩基対形成し得る。幾つかの場合において、実質的に相補的な鎖の塩基の約７５％〜１００％は、核酸配列と塩基対形成し得る。幾つかの場合において、実質的に相補的な鎖の塩基の約８０％〜１００％は、核酸配列と塩基対形成し得る。幾つかの場合において、実質的に相補的な鎖の塩基の約８５％〜１００％は、核酸配列と塩基対形成し得る。幾つかの場合において、実質的に相補的な鎖の塩基の約９０％〜１００％は、核酸配列と塩基対形成し得る。幾つかの場合において、実質的に相補的な鎖は、実質的に高いハイブリダイゼーション温度、ハイブリダイゼーションバッファー中の実質的に低い塩含有量、又はそれらの組み合わせ等の実質的にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、核酸配列にハイブリダイズされ得る。
【０１３５】
幾つかの場合において、核酸配列の塩基の少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％は、エピジェネティックに修飾された塩基を含み得る。幾つかの場合において、核酸配列の塩基の少なくとも約１％は、エピジェネティックに修飾された塩基を含み得る。幾つかの場合において、核酸配列の塩基の少なくとも約２％は、エピジェネティックに修飾された塩基を含み得る。幾つかの場合において、核酸配列の塩基の少なくとも約３％は、エピジェネティックに修飾された塩基を含み得る。幾つかの場合において、核酸配列の塩基の少なくとも約４％は、エピジェネティックに修飾された塩基を含み得る。幾つかの場合において、核酸配列の塩基の少なくとも約５％は、エピジェネティックに修飾された塩基を含み得る。幾つかの場合において、核酸配列の塩基の少なくとも約１０％は、エピジェネティックに修飾された塩基を含み得る。幾つかの場合において、核酸配列の塩基の約１０％〜約１００％は、エピジェネティックに修飾された塩基を含み得る。幾つかの場合において、核酸配列の塩基の約１０％〜約９０％は、エピジェネティックに修飾された塩基を含み得る。幾つかの場合において、核酸配列の塩基の約５％〜約１００％は、エピジェネティックに修飾された塩基を含み得る。幾つかの場合において、核酸配列の塩基の約４％〜約１００％は、エピジェネティックに修飾された塩基を含み得る。幾つかの場合において、核酸配列の塩基の約３％〜約１００％は、エピジェネティックに修飾された塩基を含み得る。
【０１３６】
幾つかの場合において、核酸配列は、核酸配列の少なくとも約２０個の塩基につき、少なくとも約１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個又は２０個のエピジェネティックに修飾された塩基を含む。幾つかの場合において、核酸配列は、核酸配列の少なくとも約２０個の塩基につき、少なくとも約１個のエピジェネティックに修飾された塩基を含む。幾つかの場合において、核酸配列は、核酸配列の少なくとも約２０個の塩基につき、少なくとも約２個のエピジェネティックに修飾された塩基を含む。幾つかの場合において、核酸配列は、核酸配列の少なくとも約２０個の塩基につき、少なくとも約３個のエピジェネティックに修飾された塩基を含む。幾つかの場合において、核酸配列は、核酸配列の少なくとも約２０個の塩基につき、少なくとも約４個のエピジェネティックに修飾された塩基を含む。幾つかの場合において、核酸配列は、核酸配列の少なくとも約２０個の塩基につき、少なくとも約５個のエピジェネティックに修飾された塩基を含む。幾つかの場合において、核酸配列は、核酸配列の少なくとも約２０個の塩基につき、少なくとも約１０個のエピジェネティックに修飾された塩基を含む。幾つかの場合において、核酸配列は、核酸配列の少なくとも約２０個の塩基につき、約１個〜約１０個のエピジェネティックに修飾された塩基を含む。幾つかの場合において、核酸配列は、核酸配列の少なくとも約２０個の塩基につき、少なくとも約３個〜約１０個のエピジェネティックに修飾された塩基を含む。幾つかの場合において、核酸配列は、核酸配列の少なくとも約２０個の塩基につき、少なくとも約４個〜約１０個のエピジェネティックに修飾された塩基を含む。幾つかの場合において、核酸配列は、核酸配列の少なくとも約２０個の塩基につき、少なくとも約５個〜約１０個のエピジェネティックに修飾された塩基を含む。
【０１３７】
幾つかの場合において、核酸配列は、核酸配列の少なくとも約２０個の塩基につき、少なくとも約１個〜約３個のエピジェネティックに修飾された塩基を含む。幾つかの場合において、核酸配列は、核酸配列の少なくとも約２０個の塩基につき、少なくとも約１個〜約４個のエピジェネティックに修飾された塩基を含む。幾つかの場合において、核酸配列は、核酸配列の少なくとも約２０個の塩基につき、少なくとも約１個〜約５個のエピジェネティックに修飾された塩基を含む。幾つかの場合において、核酸配列は、核酸配列の少なくとも約２０個の塩基につき、少なくとも約１個〜約８個のエピジェネティックに修飾された塩基を含む。幾つかの場合において、核酸配列は、核酸配列の少なくとも約２０個の塩基につき、少なくとも約１個〜約１０個のエピジェネティックに修飾された塩基を含む。幾つかの場合において、核酸配列は、核酸配列の少なくとも約２０個の塩基につき、少なくとも約１個〜約１５個のエピジェネティックに修飾された塩基を含む。幾つかの場合において、核酸配列は、核酸配列の少なくとも約２０個の塩基につき、少なくとも約１個〜約２０個のエピジェネティックに修飾された塩基を含む。
【０１３８】
試料
被験体から入手される試料は、組織、細胞、細胞断片、細胞小器官、核酸、遺伝子、遺伝子断片、発現産物、遺伝子発現産物、遺伝子発現産物断片又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。試料は、異種又は同種であり得る。試料は、血液、尿、脳脊髄液、精液、唾液、痰、便、リンパ液、組織、粘液、又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。試料は、組織特異的な試料、例えば、生殖組織（例えば、精子又は卵子）、甲状腺、皮膚、心臓、肺、腎臓、乳房、膵臓、肝臓、筋肉、平滑筋、膀胱、胆嚢、結腸、腸、脳、食道、前立腺、又はそれらの任意の組み合わせから入手される試料であり得る。
【０１３９】
本開示の試料は、例えば、細針吸引（ＦＮＡ）、コア針生検、吸引式生検、切開生検、切除生検、コア生検、パンチ生検、薄片生検、皮膚生検、又はそれらの任意の組み合わせ等の各種方法によって入手され得る。
【０１４０】
試料は、ヘルスケア（又は医療）従事者又はロボット等の別の個体又は実体によって、被験体から入手され得る。医療従事者としては、医師、看護師、医療技術者等が挙げられ得る。幾つかの場合において、医師は、腫瘍専門医、外科医、又は内分泌学者等の専門家であり得る。医療技術者は、細菌学者、瀉血専門医、放射線科医、呼吸器科医等の専門家であり得る。医療従事者は、実験用に試料を被験体から入手してもよく、又は試料の提出のために、被験体を実験センター又は研究室に差し向けてもよい。医療従事者は、実験センター又は研究室に、試料に対して実施するのに適切な試験又はアッセイ、例えば、遺伝子配列データ、遺伝子発現レベル、配列変異体データ、又はそれらの任意の組み合わせを決定することを含む、本開示の方法を示し得る。
【０１４１】
幾つかの場合において、医療従事者は、病態若しくは疾患の初期診断又は初期の試料獲得に関与する必要はない。或いは、被験体等の個体は、店頭のキットの使用により試料を入手してもよい。キットは、本明細書に記載されるように試料を入手するための収集ユニット又はデバイス、試料解析の前に試料を保管するための保管ユニット、及びキットの使用説明書を含有し得る。
【０１４２】
エピジェネティック修飾は、経時的に監視され得る。経時的にエピジェネティック修飾を監視することは、エピジェネティック修飾の存在、エピジェネティック修飾のレベル、エピジェネティック修飾のパターンの変化を監視することを含み得る。監視することは、治療薬の有効性を監視すること、疾患の進行を監視すること、疾患の退行を監視すること、疾患を発症する危険性又は可能性を監視すること、死亡率の予測若しくは生物学的年齢を監視すること、又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。試料は、ａ）手術前に、ｂ）手術後に、ｃ）疾患診断後に、ｄ）疾患の寛解若しくは治癒後の日常的なスクリーニング中に、ｅ）被験体が、疾患を有する疑いがあり得る場合に、ｆ）日常的な来院若しくは臨床スクリーン中に、ｇ）医療従事者の要求後に、又はそれらの任意の組み合わせで入手され得る。多重試料は、別々の時間に、例えば、疾患に対する治療が始まる前及び治療が終了した後に、時間的経過にわたる被験体の監視時に同じ被験体から入手することができる。被験体における疾患の進行、退行、又は寛解の非存在又は存在を監視するために、多重試料は、別々の時間に被験体から入手することができる。
【０１４３】
病態又は疾患
病態又は疾患は、本明細書中に開示する場合、癌、神経障害、又は自己免疫疾患を含み得る。
【０１４４】
幾つかの実施形態では、疾患又は病態は神経障害を含み得る。幾つかの場合において、神経障害は、後天性てんかん性失語症、急性散在性脳脊髄炎、副腎白質ジストロフィー、脳梁欠損症、失認、アイカルディ症候群、アレキサンダー病、アルパース病、交代性片麻痺、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（例えば運動ニューロン病）、無脳症、アンジェルマン症候群、血管腫症、無酸素症、失語症、失行症、くも膜のう胞、くも膜炎、アーノルド・キアリ奇形、動静脈奇形、アスペルガー症候群、毛細血管拡張性運動失調症、注意欠陥多動性障害、自閉症、聴覚情報処理障害、自律神経機能不全、背中の痛み、バッテン病、ベーチェット病、ベル麻痺、良性本態性眼瞼痙攣、良性局所性筋萎縮症、良性頭蓋内圧亢進、両側前頭頭頂多小脳回症、ビンスワンガー病、眼瞼痙攣、ブロッホ・サルツバーガー症候群、腕神経叢損傷、脳膿瘍、脳外傷、脳損傷、脳癌、ブラウン・セカール症候群、カナバン病、手根管症候群（ＣＴＳ）、カウザルギー、中枢性疼痛症候群、橋中心髄鞘崩壊症、中心核ミオパチー、頭部障害、脳動脈瘤、脳動脈硬化、脳萎縮、脳性巨人症、脳性麻痺、シャルコー・マリー・トゥース病、キアリ奇形、舞踏運動、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）、慢性疼痛、慢性局所疼痛症候群、コフィン・ローリー症候群、遷延性植物状態を含む昏睡、先天性顔面両側麻痺、大脳皮質基底核変性症、頭蓋動脈炎、頭蓋骨縫合早期癒合症、クロイツフェルト・ヤコブ病、累積外傷性障害、クッシング症候群、巨細胞性封入体病（ＣＩＢＤ）、サイトメガロウイルス感染症、ダンディー・ウォーカー症候群、ダウン症、ドモルシア症候群、デジェリンクルンプケ麻痺、デジェリンソッタス病、睡眠相後退症候群、認知症、皮膚筋炎、神経性発達性協調運動障害、糖尿病性神経障害、びまん性硬化症、自律神経失調症、算数障害、書字障害、識字障害、ジストニア、早期乳児てんかん性脳症、エンプティセラ症候群、脳炎、脳瘤、三叉神経領域血管腫症、便失禁、てんかん、エルプ麻痺、肢端紅痛症、本態性振戦、ファブリー病、ファール症候群、失神、家族性痙性対麻痺、熱性痙攣、フィッシャー症候群、フリードライヒ運動失調症、ＦＡＲＴ症候群、ゴーシェ病、ゲルストマン症候群、巨細胞性動脈炎、巨細胞性封入体症、グロボイド細胞白質ジストロフィー、異所性灰白質、ギランバレー症候群、ＨＴＬＶ−１関連脊髄症、ハラーフォルデン・シュパッツ症候群、頭部外傷、頭痛、片側顔面痙攣、遺伝性痙性対麻痺、多発神経炎型遺伝性運動失調症、耳帯状疱疹、帯状疱疹、平山症候群、全前脳胞症、ハンチントン病、水無脳症、水頭症、副腎皮質機能亢進症、低酸素症、免疫介在性脳脊髄炎、封入体筋炎、色素失調症、乳児フィタン酸蓄積症、乳児レフサム病、乳児痙攣、炎症性ミオパチー、頭蓋内嚢胞、頭蓋内圧亢進、ジュベール症候群、カーンズ・セイヤー症候群、ケネディ病、キンスボーン症候群、クリッペル・ファイル症候群、クラッベ病、クーゲルベルグ−ウェランダー病、クールー病、ラフォラ病、ランバート・イートン筋無力症症候群、ランドウ・クレフナー症候群、延髄外側（ワレンベルグ）症候群、学習障害、リー病、レノックス・ガストー症候群、レッシュ・ナイハン症候群、ロイコジストロフィー、レヴィ小体型認知症、滑脳症、閉じ込め症候群、ルー・ゲーリック病、腰部椎間板症、ライム病−神経後遺症、マシャド・ジョセフ病（脊髄小脳失調症３型）、巨大頭蓋症、メープルシロップ尿症、巨脳症、メルカーソン・ローゼンタール症候群、メニエール病、髄膜炎、メンケス病、異染性ロイコジストロフィー、小頭症、片頭痛、ミラーフィッシャー症候群、軽度脳卒中、ミトコンドリアミオパチー、メビウス症候群、若年性一側上肢筋萎縮症、運動ニューロン病、運動能力障害、もやもや病、ムコ多糖症、多発梗塞性認知症、多巣性運動ニューロパチー、多発性硬化症、多系統萎縮症、筋ジストロフィー、筋痛性脳脊髄炎、重症筋無力症、骨髄性びまん性硬化症、乳児ミオクロニー脳症、ミオクローヌス、ミオパチー、筋細管ミオパチー、先天性ミオトニア、睡眠発作、神経線維腫、悪性症候群、ＡＩＤＳの神経症状、狼瘡の神経後遺症、神経ミオトニー、神経セロイドリポフスチン症、神経細胞移動障害、ニーマン・ピック病、非２４時間睡眠覚醒症候群、非言語性学習、オサリバンマクロード症候群、後頭神経痛、潜在性二分脊椎、大田原症候群、オリーブ橋小脳萎縮症、オプソクローヌス・ミオクローヌス症候群、視神経炎、起立性低血圧、乱用症候群、反復視、錯知覚、パーキンソン病、先天性パラミオトニア、腫瘍随伴症、発作、パリーロンバーグ症候群、ロンバーグ症候群、ペリツェウス・メルツバッヘル病、周期性四肢麻痺、末梢性ニューロパチー、遷延性植物状態、広汎性発達障害、光くしゃみ反射、フィタン酸蓄積症、ピック病、神経圧迫、下垂体腫瘍、ＰＭＧ、ポリオ、多小脳回症、多発性筋炎、孔脳症、ポリオ後症候群、治療後神経障害（ＰＨＮ）、感染後脳脊髄炎、体位性低血圧、プラダー・ウィリー症候群、原発性側索硬化症、プリオン病、ロンバーグ症候群としても知られる進行性顔面半側萎縮症、進行性多巣性白質脳症、進行性硬化性ポリオグラフィー、進行性核上性麻痺、脳偽腫瘍、ラムゼイ・ハント症候群（Ｉ型及びＩＩ型）、ラスムッセン脳炎、反射性交感神経性ジストロフィー、レフサム病、反復運動障害、反復運動過多損傷、レストレスレッグス症候群、レトロウイルス関連脊髄症、レット症候群、ライ症候群、ロンバーグ症候群、狂犬病、舞踏病、サンドホフ病、統合失調症、シルダー病、裂脳症、感覚統合障害、中隔視神経形成異常症、揺さぶられっ子症候群、帯状疱疹、シャイ・ドレーガー症候群、シェーグレン症候群、睡眠時無呼吸症候群、アフリカ睡眠病、満腹時くしゃみ、ソトス症候群、痙縮、二分脊椎、脊髄損傷、脊髄腫瘍、脊髄性筋萎縮症、脊髄狭窄症、スティール−リチャードソン−オルゼウスキー症候群、例えば進行性核上性麻痺、脊髄小脳失調症、スティッフパーソン症候群、脳卒中、スタージ・ウェーバー症候群、亜急性硬化性全脳炎、皮質下動脈硬化性脳症、脳表ヘモジデリン沈着症、シデンハム舞踏運動、失神、共感覚、脊髄空洞症、遅発性ジスキネジア、テイ＝サックス病、巨細胞性動脈炎、脊椎分裂症候群、トムセン病、胸郭出口症候群、三叉神経痛、トッド麻痺、トゥレット症候群、一過性脳虚血発作、伝達性海綿状脳症、横断性脊髄炎、外傷性脳損傷、振戦、三叉神経痛、熱帯性痙性麻痺、トリパノソーマ症、結節性硬化症、側頭動脈炎を含む血管炎、フォン・ヒッペル・リンドウ病（ＶＨＬ）、急性散在性脳脊髄炎（ＶＥ）、ワレンベルク症候群、ウェルドニッヒ−ホフマン病、ウエスト症候群、むち打ち症、ウィリアムズ症候群、ウィルソン病、Ｘ連鎖性球脊髄性筋萎縮症及びツェルウェガー症候群を含み得る。神経学的病態は運動障害、例えば多系統萎縮症（ＭＳＡ）を含み得る。
【０１４５】
幾つかの場合において、疾患又は病態は自己免疫疾患を含み得る。幾つかの場合において、自己免疫疾患は、急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、急性壊死性出血性白質脳炎、アディソン病、無ガンマグロブリン血症、アレルギー性喘息、アレルギー性リウマチ、円形脱毛症、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性自律神経失調症、自己免疫性肝炎、自己免疫性高脂血症、自己免疫性免疫不全、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性心筋炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、自己免疫性甲状腺疾患、軸索性及びニューロン性ニューロパチー、バロー病、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、キャッスルマン病、セリアックスプルー（非熱帯性）、シャーガス病、慢性疲労症候群、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）、慢性再発性多巣性骨髄炎（ＣＲＭＯ）、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡／良性粘膜類天疱瘡、クローン病、コーガン症候群、寒冷凝集素症、先天性房室ブロック、コクサッキー心筋炎、ＣＲＥＳＴ病、本態性混合性クリオグロブリン血症、脱髄性ニューロパチー、皮膚筋炎、デビック病（視神経脊髄炎）、円板状エリテマトーデス、ドレスラー症候群、子宮内膜症、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、実験的アレルギー性脳脊髄炎、エヴァンズ症候群、線維筋痛症、線維化性肺胞炎、巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギランバレー症候群、橋本脳炎、橋本病、溶血性貧血、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、妊娠性疱疹、低ガンマグロブリン血症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎障害、免疫抑制リポタンパク質、封入体筋炎、インスリン依存型糖尿病（１型）、間質性膀胱炎、若年性リウマチ、若年性糖尿病、川崎症候群、ランバート・イートン症候群、白血球破砕性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質結膜炎、線状ＩｇＡ病（ＬＡＤ）、狼瘡（ＳＬＥ）、ライム病、メニエール病、顕微鏡的多発血管炎、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、モーレン潰瘍、ムッハ・ハーベルマン病、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、睡眠発作、視神経脊髄（デビック病）、好中球減少症、眼部瘢痕性類天疱瘡、視神経炎、回帰性リウマチ、ＰＡＮＤＡＳ（小児自己免疫性溶連菌関連性精神神経障害）、腫瘍随伴小脳変性、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、パリーロンバーグ症候群、パーソネイジ・ターナー症候群、扁平部炎（辺縁部ぶどう膜炎）、天疱瘡、末梢性ニューロパチー、静脈周囲脳脊髄炎、悪性貧血、ＰＯＥＭＳ症候群、ポリ結節性多発動脈炎、Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩ型多腺性自己免疫症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎、心筋梗塞後症候群、心膜切開術後症候群、プロゲステロン皮膚炎、原発性胆汁性胆管炎、原発性硬化性胆管炎、乾癬、乾癬性関節炎、特発性肺線維症、壊疽性膿皮症、赤芽球癆、レイノー現象、反射性交感神経性ジストロフィー、ライター症候群、再発性多発軟骨炎、レストレスレッグス症候群、後腹膜線維症、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、精子及び睾丸自己免疫、スティフパーソン症候群、亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）、交感性眼炎、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、血小板減少性紫斑病（ＴＰＰ）、トロサ・ハント症候群、横断性脊髄炎、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織病（ＵＣＴＤ）、ぶどう膜炎、血管炎、水疱性皮膚病、尋常性白斑又はウェゲナー肉芽腫症又は慢性活動性肝炎、原発性胆汁性胆管炎、拡張型心筋症、心筋炎、自己免疫性ポリエンドクリン症候群Ｉ型（ＡＰＳ−Ｉ）、嚢胞性線維症脈管炎、後天性副甲状腺機能低下症、虚血性心疾患、落葉状天疱瘡、尋常性天疱瘡、ラスムッセン脳炎、自己免疫性胃炎、インスリン低血糖症候群（平田病）、Ｂ型インスリン抵抗、表皮肥厚、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、悪性貧血、治療抵抗性ライム関節炎、多発性神経障害、脱髄疾患、アトピー性皮膚炎、自己免疫性甲状腺機能低下症、尋常性白斑、甲状腺眼症、自己免疫性セリアック病、ＡＣＴＨ欠乏、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、全身性強皮症、進行性全身性強皮症、限局性強皮症、原発性抗リン脂質抗体症候群、慢性突発性蕁麻疹、結合組織症候群、壊死性半月体形成性糸球体腎炎（ＮＣＧＮ）、全身性血管炎、レイノー病、慢性肝疾患、内臓リューシマニア症、自己免疫性Ｃ１欠乏、膜性増殖性糸球体腎炎（ＭＰＧＮ）、凝固時間の延長、免疫不全、アテローム硬化症、ニューロパチー、腫瘍随伴性天疱瘡、腫瘍随伴性スティフマン症候群、腫瘍随伴性脳脊髄炎、亜急性自律神経ニューロパチー、癌随伴網膜症、腫瘍随伴性オプソクローヌス・ミオクローヌス失調、下位運動ニューロン症候群及びランバート・イートン筋無力症症候群を含み得る。
【０１４６】
幾つかの場合において、疾患又は病態はＡＩＤＳ、炭疽病、ボツリヌス症、ブルセラ症、軟性下疳、クラミジア感染症、コレラ、コクシジオイデス症、クリプトスポリジウム症、サイクロスポラ症、ジフテリア、エーリキア症、アルボウイルス脳炎、腸管出血性大腸菌感染症、ジアルジア症、淋病、デング熱、インフルエンザ菌、ハンセン病（Hansen's disease (Leprosy)）、ハンタウイルス肺症候群、溶血性尿毒症症候群、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ヒト免疫不全ウイルス、レジオネラ症、リステリア症、ライム病、マラリア、麻疹、髄膜炎菌感染症、流行性耳下腺炎、百日咳（pertussis (whooping cough)）、ペスト、急性灰白髄炎、オウム病、Ｑ熱、狂犬病、ロッキー山紅斑熱、風疹、先天性風疹症候群（ＳＡＲＳ）、赤痢、天然痘、溶連菌感染症（侵襲性Ａ群）、溶連菌毒素ショック症候群、溶連菌肺炎、梅毒、破傷風、毒素ショック症候群、旋毛虫症、結核、野兎病、腸チフス、バンコマイシン中度耐性黄色ブドウ球菌、水痘、黄熱、変異クロイツフェルト・ヤコブ病（ｖＣＪＤ）、エボラ出血熱、エキノコックス症、ヘンドラウイルス感染症、ヒトサル痘、インフルエンザＡ、Ｈ５Ｎ１、ラッサ熱、マールブルグ熱、ニパウイルス、オニョンニョン熱、リフトレバー熱、ベネズエラウマ脳炎及び西ナイルウイルスを含み得る。
【０１４７】
幾つかの場合において、疾患又は病態は癌を含み得る。幾つかの場合において、癌は甲状腺癌、副腎皮質癌、肛門癌、再生不良性貧血、胆管癌、膀胱癌、骨癌、骨転移、中枢神経系（ＣＮＳ）癌、末梢神経系（ＰＮＳ）癌、乳癌、キャッスルマン病、子宮頸癌、小児非ホジキンリンパ腫、リンパ腫、結腸及び直腸癌、子宮体癌、食道癌、ユーイング腫瘍（例えばユーイング肉腫）、眼癌、胆嚢癌、消化器カルチノイド腫瘍、胃腸間質腫瘍、妊娠性絨毛疾患、有毛細胞性白血病、ホジキン病、カポジ肉腫、腎臓癌、咽頭及び下咽頭癌、急性リンパ性白血病、急性骨髄白血病、小児白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄白血病、肝臓癌、肺癌、肺カルチノイド腫瘍、非ホジキンリンパ腫、男性乳癌、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性障害、鼻腔及び副鼻腔癌、上咽頭癌、神経芽細胞腫、口腔及び中咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、陰茎癌、下垂体腫瘍、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、肉腫（成人軟組織癌）、黒色腫皮膚癌、非黒色腫皮膚癌、胃癌、精巣癌、胸腺癌、子宮癌（例えば子宮肉腫）、膣癌、外陰癌、又はワルデンストレームマクログロブリン血症を含み得る。
【０１４８】
本明細書に開示される病態又は疾患としては、過剰増殖性障害が挙げられ得る。悪性過剰増殖性障害は、低リスク群及び中〜高リスク群等のリスク群に分類することができる。過剰増殖性障害としては、癌、過形成又は新生物が挙げられ得るが、これらに限定され得ない。幾つかの場合において、過剰増殖性癌は、乳腺の管組織における乳管癌、髄様癌、粘液癌、管状癌及び炎症性乳癌等の乳癌；卵巣における腺癌及び卵巣から腹腔へと転移した腺癌等の上皮性卵巣腫瘍を含む卵巣癌；子宮癌；扁平上皮癌及び腺癌を含む頸部上皮における腺癌等の子宮頸癌；以下の腺癌又は骨へと転移した腺癌から選択される前立腺癌；膵管組織における類上皮性癌及び膵管における腺癌等の膵癌；膀胱における移行上皮癌、尿路上皮癌（移行上皮癌）、膀胱に沿って並ぶ尿路上皮細胞の腫瘍、扁平上皮癌、腺癌、及び小細胞癌等の膀胱癌；急性骨髄白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄白血病、有毛細胞性白血病、骨髄異形成、骨髄増殖性障害、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、肥満細胞症、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、及び骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）等の白血病；骨癌；非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）（扁平上皮癌、腺癌、及び大細胞未分化癌腫に分類され得る）及び小細胞肺癌等の肺癌；基底細胞癌、黒色腫、扁平上皮癌及び扁平上皮癌へと進行することがある皮膚状態であり得る日光角化症等の皮膚癌；眼網膜芽細胞腫；皮膚又は眼内（眼）黒色腫；原発性肝臓癌（肝臓において開始する癌）；腎臓癌；びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞免疫芽細胞リンパ腫及び小型非切れ込み核細胞リンパ腫等の自己免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）関連リンパ腫；カポジ肉腫；Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、及び肝細胞癌；ヒトＴリンパ好性ウイルス１型（ＨＴＬＶ−１）及び成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫；並びにヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）及び子宮頸癌を含むウイルスに誘導される癌；原発性脳腫瘍（神経膠腫（星状細胞腫、退形成性星状細胞腫、又は神経膠芽腫多形膠芽細胞腫）を含む）、乏突起神経膠腫、上衣腫、髄膜腫、リンパ腫、神経鞘腫、及び髄芽腫等の中枢神経系（ＣＮＳ）癌；聴神経腫瘍及び悪性末梢神経鞘腫瘍（ＭＰＮＳＴ）（神経線維腫及び神経鞘腫を含む）、悪性線維性細胞腫、悪性線維性組織球腫、悪性髄膜腫、悪性中皮腫、及び悪性ミューラー管混合腫瘍等の末梢神経系（ＰＮＳ）癌；下咽頭癌、喉頭癌、上咽頭癌、及び中咽頭癌等の口腔及び中咽頭癌；リンパ腫、胃間質腫瘍、及びカルチノイド腫瘍等の胃癌；胚細胞腫瘍（ＧＣＴ）（セミノーマ、非セミノーマ、及び性腺間質腫瘍（ライディッヒ細胞腫及びセルトリ細胞腫瘍を含む）を含む）等の精巣癌；胸腺腫、胸腺癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫カルチノイド又はカルチノイド腫瘍等の胸腺癌；直腸癌；並びに結腸癌であり得る。幾つかの場合では、本開示の方法により層別化され、分類され、特性化され、又は診断される疾患としては、甲状腺障害、例えば濾胞状腺腫、ヒュルトレ細胞腺腫、リンパ性甲状腺炎、及び甲状腺機能亢進症を含む良性甲状腺障害が挙げられるが、これらに限定され得ない。幾つかの場合では、本開示の方法により層別化され、分類され、特性化され、又は診断される疾患としては、悪性甲状腺障害、例えば濾胞状腺癌、乳頭状甲状腺癌腫の濾胞性変性、髄様癌及び乳頭癌が挙げられるが、これらに限定され得ない。
【０１４９】
本開示の病態又は疾患は、遺伝性障害を含み得る。遺伝性障害は、遺伝子又は染色体の異常によって引き起こされる病気であり得る。遺伝性障害は、単一遺伝子障害並びに多因子及び多遺伝子生（複合性）障害の２つのカテゴリーに分類することができる。単一遺伝子障害は、単一の突然変異遺伝子の結果であり得る。単一遺伝子障害の遺伝は、常染色体優性遺伝、常染色体劣性遺伝、Ｘ連鎖優性遺伝、Ｘ連鎖劣性遺伝、Ｙ連鎖遺伝及びミトコンドリア遺伝を含み得るが、これらに限定されない。ヒトが常染色体優性障害を患うには、遺伝子のただ１つの突然変異コピーが必要とされ得る。常染色体優性タイプの障害の例としては、ハンチントン病、神経線維腫症１、マルファン症候群、遺伝性非ポリポーシス大腸癌、又は遺伝性多発性外骨腫が挙げられ得るが、これらに限定され得ない。常染色体劣性障害において、被験体が常染色体劣性障害を患うには、遺伝子の２つのコピーが突然変異されなくてはならない。このタイプの障害の例としては、嚢胞性線維症、鎌状赤血球症（同様に、部分的鎌状赤血球症も）、テイ＝サックス病、ニーマン・ピック病、又は脊髄性筋委縮症が挙げられ得るが、これらに限定され得ない。Ｘ連鎖低リン血症性くる病等のＸ連鎖優性障害は、Ｘ染色体上の遺伝子の突然変異によって引き起こされる。レット症候群、２型色素失調症及びアイカルディ症候群等の幾つかのＸ連鎖優性状態は、致命的であり得る。Ｘ連鎖劣性障害もまた、Ｘ染色体上の遺伝子の突然変異によって引き起こされる。このタイプの障害の例としては、血友病Ａ、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、赤緑色盲、筋ジストロフィー及びアンドロゲン性脱毛症が挙げられ得るが、これらに限定されない。Ｙ連鎖障害は、Ｙ染色体上の突然変異によって引き起こされる。例としては、男性不妊症及び耳介多毛症が挙げられ得るが、これらに限定されない。母性遺伝子しても知られているミトコンドリア遺伝の遺伝性障害は、レーベル遺伝子性視神経症等で、ミトコンドリアＤＮＡの遺伝子に適用され得る。
【０１５０】
遺伝性障害はまた、複合性、多因子性又は多遺伝子性であり得る。多遺伝子性遺伝性障害は、生活様式及び環境要因と組み合わせて、同義遺伝子の影響と関連付けることができる。複合性遺伝性障害は、家族でクラスター形成し得るが、遺伝の明確なパターンを有さない。多因子性又は多遺伝子性障害としては、心疾患、糖尿病、喘息、自閉症、多発性硬化症等の自己免疫疾患、癌、繊毛関連疾患、口蓋裂、高血圧症、炎症性腸疾患、精神遅滞又は肥満が挙げられ得る。
【０１５１】
他の遺伝性障害として、１ｐ３６欠失症候群、２１−ヒドロキシラーゼ欠失、２２ｑ１１．２欠失症候群、セルロプラスミン欠損症、軟骨無発生症２型、軟骨無形成症、急性間欠性ポルフィリン症、アデニロコハク酸リアーゼ欠損症、副腎白質ジストロフィー、アレキサンダー病、アルカプトン尿症、α−１アンチトリプシン欠乏症、アルストレム症候群、アルツハイマー病（１型、２型、３型、及び４型）、エナメル質形成不全症、筋萎縮性側索硬化症、筋萎縮性側索硬化症２型、筋萎縮性側索硬化症４型、筋萎縮性側索硬化症４型、アンドロジェン不応症候群、貧血、アンジェルマン症候群、アペール症候群、毛細血管拡張性運動失調症、ベア−スティーブンソン症候群、ベンジャミン症候群、βサラセミア、ビオチニダーゼ欠損症、バート−ホッグ−デュベ症候群、膀胱癌、ブルーム症候群、骨疾患、乳癌、屈曲肢異形成症、カナバン病、癌、セリアック病、慢性肉芽腫性障害（ＣＧＤ）、シャルコー・マリー・トゥース病、シャルコー・マリー・トゥース病１型、シャルコー・マリー・トゥース病４型、シャルコー・マリー・トゥース病２型、シャルコー・マリー・トゥース病４型、コケイン症候群、コフィン・ローリー症候群、ＩＩ型及びＸＩ型コラーゲン異常症、結腸直腸癌、先天性精管欠損症、先天性両側精管欠損症、先天性糖尿病、先天性骨髄性ポルフィリン症、先天性心疾患、先天性甲状腺機能低下症、結合組織病、カウデン症候群、ネコ鳴き症候群、クローン病、線維性狭窄、クルーゾン症候群、黒色表皮症を伴うクルーゾン症候群、嚢胞性線維症、ド・グルーシー症候群、神経変性疾患、デント病、発達障害、ディ・ジョージ症候群、Ｖ型遠位型脊髄性筋萎縮症、ダウン症候群、小人症、エーラス・ダンロス症候群、多発性関節弛緩型エーラス・ダンロス症候群、古典型エーラス・ダンロス症候群、皮膚脆弱型エーラス・ダンロス症候群、後側彎型エーラス・ダンロス症候群、血管型エーラス・ダンロス症候群、赤芽球増殖性プロトポルフィリン症、ファブリー病、顔面損傷及び障害、第Ｖ因子ライデン血友病、家族性腺腫性ポリポーシス、家族性自律神経失調症、ファンコニ貧血、ＦＧ症候群、脆弱Ｘ症候群、フリードライヒ運動失調症、フリードライヒ運動失調症、Ｇ６ＰＤ欠損症、ガラクトース血症、ゴーシェ病（１型、２型、及び３型）、遺伝性脳障害、グリシン脳症、ヘモクロマトーシス２型、ヘモクロマトーシス４型、道化師様魚鱗癬、頭部及び脳奇形、聴覚障害及び難聴、小児の聴覚の問題、ヘモクロマトーシス（新生児、２型及び３型）、血友病、肝性骨髄性ポルフィリン症、遺伝性コプロポルフィリン症、遺伝性多発性外骨腫、遺伝性圧脆弱性ニューロパチー、遺伝性非ポリポーシス結腸直腸癌、ホモシスチン尿症、ハンチントン病、ハッチンソン・ギルフォード・プロジェリア症候群、原発性高シュウ酸尿症、高フェニルアラニン血症、軟骨低発生症、軟骨低形成症、ｉｄｉｃ１５、色素失調症、乳児ゴーシェ病、乳児発症型遺伝性痙攣麻痺、不妊、ジャクソン・ワイス症候群、ジュベール症候群、若年性原発性側索硬化症、ケネディ病、クラインフェルター症候群、クニースト異形成症、クラッベ病、学習障害、レッシュ・ナイハン症候群、白質萎縮症、リ・フラウメニ症候群、リポタ��パクリパーゼ欠損症、家族性男性生殖器障害、マルファン症候群、マッキューン・オルブライト症候群、マクラウド症候群、家族性地中海熱、メンケス病、メンケス症候群、代謝障害、βグロブリン型メトヘモグロビン血症、メトヘモグロビン血症、先天性メトヘモグロビン血症、メチルマロン酸尿症、ミクロ症候群、小頭症、運動障害、モワット・ウィルソン症候群、ムコ多糖症（ＭＰＳＩ）、ムエンケ症候群、筋ジストロフィー、デュシェンヌ型及びベッカー型筋ジストロフィー、デュシェンヌ型及びベッカー型筋ジストロフィー、筋強直性ジストロフィー、筋強直性ジストロフィー１型及び２型、新生児ヘモクロマトーシス、神経線維腫、神経線維腫１、神経線維腫２、神経線維腫Ｉ型、神経線維腫ＩＩ型、神経学的障害、神経筋障害、ニーマン・ピック病、非ケトーシス型高グリシン血症、非症候性難聴、常染色体劣性非症候性難聴、ヌーナン症候群、骨形成不全症（Ｉ型及びＩＩＩ型）、耳・脊椎・巨大骨端異形成症、パントテン酸キナーゼ関連神経変性症、パトー症候群（１３トリソミー）、ペンレッド症候群、ポイツ・ジェガース症候群、ファイファー症候群、フェニルケトン尿症、ポルフィリン症、晩発性皮膚ポルフィリン症、プラダー・ウィリー症候群、原発性肺高血圧症、プリオン病、早老症、プロピオン酸血症、プロテインＣ欠乏症、プロテインＳ欠乏症、シュード−ゴーシェ病、弾力繊維性仮性黄色腫、網膜障害、網膜芽細胞腫、網膜芽細胞腫ＦＡフリードライヒ運動失調症、レット症候群、ルビンシュタイン・テイビ症候群、サンドホフ病、感覚性及び自律神経性ニューロパチーＩＩＩ型、鎌状赤血球貧血症、骨格筋再生、皮膚色素障害、スミス・レムリ・オピッツ症候群、発話及びコミュニケーション障害、脊髄性筋萎縮症、球脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳失調症、（ストラドウィック型）脊椎骨端骨幹端異形成症、先天性脊椎骨端骨幹端異形成症、スティックラー症候群、スティックラー症候群ＣＯＬ２Ａ１、テイ＝サックス病、テトラヒドロビオプテリン欠乏症、致死性骨異形成症、糖尿病及び感音性難聴を伴うチアミン反応性巨赤芽球性貧血症候群、甲状腺疾患、トゥレット症候群、トリーチャーコリンズ症候群、トリプルＸ症候群、結節性硬化症、ターナー症候群、アッシャー症候群、異型ポルフィリン症、フォン・ヒッペル・リンドウ病、ワールデンブルグ症候群、ワイセンバッハー・ツウェイミュラー症候群、ウィルソン病、ウォルフヒルシュホーン症候群、色素性乾皮症、Ｘ連鎖重症複合免疫不全症、Ｘ連鎖鉄芽球性貧血、又はＸ連鎖球脊髄性筋萎縮症が挙げられ得るが、これらに限定され得ない。
【０１５２】
キット
キットは、ラベル、基材（例えば、固体担体）、コントロール核酸配列、容器、酵素若しくはその断片、使用説明書、又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。コントロール核酸配列は、基材と結合されてもよい。コントロール核酸配列は、基材と結合されなくてもよく、キットは、コントロール核酸配列と基材とを結合させるための説明書を含み得る。
【０１５３】
キットは、全ての組織試料又は疾患タイプに関する一般的なキットであり得る。キットは、血漿試料、血液試料、血清試料、口腔試料、又は尿試料等の特定の組織試料に関する特定のキットであり得る。キットは、癌等の特定の疾患に関する特定のキットであり得る。
【０１５４】
キットは、参照のデータベース又は方法の結果をコンピュータ処理する解析ソフトウェアの定期的な更新情報を提供し得る。キットは、参照との比較等の方法の１つ以上の態様を自動化するソフトウェアを提供して、結果を提供し得るか、又は医療従事者によって報告若しくは表示若しくはダウンロードされてもよく、及び／又はデータベースに入力されてもよい結果の概要を提供し得る。結果又は結果の概要は、被験体に対する治療オプションの推奨及び疾患又は病態の危険性の発生を含む、本明細書中に開示する結果のいずれかを含み得る。
【０１５５】
キットは、試料を被験体から入手するためのユニット又はデバイス（例えば、アスピレーターに連結された針を有するデバイス）を提供し得る。
【０１５６】
キットは、本明細書に開示されるような方法を実施するための説明書を提供してもよく、ハイブリダイズすること、シーケンシング、増幅、結合、伸長、又はそれらの組み合わせに必要なバッファー及び試薬を全て含んでもよい。キットは、結果を解析するための説明書を含み得る。
【０１５７】
キットの情報材料は、印刷物、例えば、印刷されたテキスト、描画、及び／又は写真、例えば、ラベル又は印刷されたシートを含み得る。情報材料は、点字、コンピュータ可読材料、ビデオ録画、又は録音を含み得る。幾つかの場合において、キットの情報材料は、連絡先情報、例えば、実際の住所、メールアドレス、ウェブサイト、又は電話番号を含む場合があり、ここで、キットのユーザーは、本明細書に記載される化合物及び／又は本明細書に記載される方法におけるその使用に関する実質的な情報を入手することができる。情報材料は、任意のフォーマットの組み合わせで提供され得る。
【０１５８】
キットは、繊維ベースのパッケージ、ボール紙パッケージ、又はポリマーパッケージ、例えば、発砲スチロール箱等のパッケージを含み得る。パッケージは、内部と外部との間で異なった温度を実質的に維持するように設計され得る。幾つかの場合において、パッケージは、予め選択した温度で予め選択した時間、キットの１個以上の構成成分を維持する断熱特性を提供し得る。キットは、本明細書に記載される化合物（複数の場合もある）を含有する組成物用の１個以上の容器を含み得る。幾つかの実施形態において、キットは、別々の容器（例えば、キットの２個の構成成分用の２個の別々の容器）、１個以上の構成成分用の仕切り又は区画、及び情報材料を含有し得る。例えば、キット構成成分は、瓶、バイアル、又はシリンジ内に含有されてもよく、情報材料は、プラスチックスリーブ又はポケット内に含有されてもよい。他の実施形態において、キットの別々の構成成分は、単一の分割されていない容器内に含有されてもよい。例えば、キット構成成分は、ラベルの形態で情報材料が添付された瓶、バイアル又はシリンジ内に含有され得る。幾つかの実施形態において、キットは、複数（例えば、多く）の個々の容器を含んでもよく、それぞれが、本明細書に記載される構成成分の１個以上の単位投薬形態（例えば、本明細書に記載される投薬形態）を含有する。例えば、キットは、複数のシリンジ、アンプル、ホイルパケット、又はブリスターパックを含んでもよく、それぞれが、本明細書に記載されるキット構成成分の単一の単位用量を含有する。キットの容器は、気密性であり、防水性であり（例えば、水分の変化又は蒸発に対して不浸透性）、及び／又は遮光性であり得る。キットは、構成成分の投与に適したデバイス、例えば、シリンジ、吸入器（inhalant）、ピペット、鉗子、計量スプーン、スポイト（例えば、点眼器）、スワブ（例えば、綿スワブ又は木製スワブ）、又は任意のかかる送達デバイスを含んでもよい。好ましい実施形態において、デバイスは、医療移植片デバイスであってもよく、例えば、外科的挿入用にパッケージングされてもよい。
【０１５９】
基礎研究事業、疾患診断事業、分子プロファイリング事業、医薬事業、又は患者のヘルスケアと関連付けられる任意の他の事業は、本明細書に記載される方法を実施するためのキットを提供し得る。
【０１６０】
コンピュータ制御システム
本開示は、本開示の方法を実行するようにプログラムされたコンピュータ制御システムを提供する。図１は、配列ライブラリー、シーケンサー、ＰＣＲ機、オリゴヌクレオチドをシーケンシングするか、又は増幅するように設定される装置、基材、又はそれらの任意の組み合わせと連動するようにプログラムされるか、又はそうでなければそのように設定されるコンピュータシステム１０１を示す。コンピュータシステム１０１は、例えば、洗浄数、使用されるバッファーのタイプ等の洗浄の条件等の本開示の基材濃縮の各種態様を調節することができる。コンピュータシステム１０１は、バッファーのタイプ、温度、又はインキュベーションの期間等の増幅条件、標識条件、シーケンシング条件を調節することができる。コンピュータシステム１０１は、ユーザーの電子デバイス又は電子デバイスに対して遠隔で位置付けられるコンピュータシステムであってもよい。電子デバイスは、モバイル電子デバイスであってもよい。
【０１６１】
コンピュータシステム１０１は、中央処理装置（ＣＰＵ、本明細書中ではまた「プロセッサ」及び「コンピュータプロセッサ」）１０５を含み、中央処理装置１０５は、シングルコア若しくはマルチコアプロセッサ、又は並列処理用の複数のプロセッサであり得る。また、コンピュータシステム１０１は、メモリ又はメモリ場所１１０（例えば、ランダムアクセスメモリ、リードオンリメモリ、フラッシュメモリ）、電子記憶装置１１５（例えば、ハードディスク）、１個以上の他のシステムと通信するための通信インターフェース１２０（例えば、ネットワークアダプター）、及びキャッシュ、他のメモリ、データ記憶及び／又は電子表示アダプター等の周辺デバイス１２５を含み得る。マザーボード等の、メモリ１１０、記憶装置１１５、インターフェース１２０及び周辺デバイス１２５は、コミュニケーションバス（実線）を通じてＣＰＵ１０５と通信し得る。記憶装置１１５は、データを記憶するためのデータ記憶装置（又はデータレポジトリ）であり得る。コンピュータシステム１０１は、通信インターフェース１２０の助力を受けて、コンピュータネットワーク（「ネットワーク」）１３０に作動可能なように連結され得る。ネットワーク１３０は、インターネット、インターネット及び／又はエクストラネット、又はインターネットと通信しているイントラネット及び／又はエクストラネットであり得る。ネットワーク１３０は、幾つかの場合において、テレコミュニケーション及び／又はデータネットワークである。ネットワーク１３０は、１個以上のコンピュータサーバーを含むことができ、１個以上のコンピュータサーバーは、クラウドコンピューティング等の分散コンピューティングを可能にし得る。ネットワーク１３０は、幾つかの場合において、コンピュータシステム１０１の助力を受けて、ピアツーピアネットワークを実行することができ、ピアツーピアネットワークは、コンピュータシステム１０１に連結されたデバイスが、クライアント又はサーバーとして働くことを可能にし得る。
【０１６２】
ＣＰＵ１０５は、一連の機械可読命令を実行することができ、一連の機械可読命令は、プログラム又はソフトウェアに実現され得る。命令は、メモリ１１０等のメモリ場所に記憶されてもよい。命令は、ＣＰＵ１０５に誘導されてもよく、続いて、本開示の方法を実行するように、ＣＰＵ１０５をプログラムすることができるか、又はそうでなければＣＰＵ１０５を構成することができる。ＣＰＵ１０５によって実施される操作の例は、フェッチ、デコード、実行、及びライトバックを含み得る。
【０１６３】
ＣＰＵ１０５は、集積回路等の回路の一部であり得る。システム１０１の１個以上の他の構成要素は、回路に含まれてもよい。幾つかの場合において、回路は、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）である。
【０１６４】
記憶装置１１５は、ドライバー、ライブラリー、及び保存プログラム等のファイルを記憶することができる。記憶装置１１５は、ユーザーデータ、例えば、ユーザーの好み及びユーザープログラムを記憶することができる。コンピュータシステム１０１は、幾つかの場合において、例えば、イントラネット又はインターネットを通じてコンピュータシステム１０１と通信しているリモートサーバー上に位置付けられるコンピュータシステム１０１の外部にある１個以上の更なるデータ記憶装置を含むことができる。
【０１６５】
コンピュータシステム１０１は、ネットワーク１３０を通じて１個以上のリモートコンピュータシステムと通信し得る。例えば、コンピュータシステム１０１は、ユーザーのリモートコンピュータシステムと通信し得る。リモートコンピュータシステムの例としては、パーソナルコンピュータ（例えば、ポータブルＰＣ）、スレート若しくはタブレットＰＣ（例えば、Ａｐｐｌｅ（登録商標）ｉＰａｄ、Ｓａｍｓｕｎｇ（登録商標）Ｇａｌａｘｙ  Ｔａｂ）、電話、スマートフォン（例えば、Ａｐｐｌｅ（登録商標）ｉＰｈｏｎｅ、Ａｎｄｒｏｉｄが使えるデバイス、Ｂｌａｃｋｂｅｒｒｙ（登録商標））、又は携帯型情報端末が挙げられる。ユーザーは、ネットワーク１３０を介してコンピュータシステム１１０１にアクセスすることができる。
【０１６６】
本明細書に記載されるような方法は、例えば、メモリ１１０又は電子記憶装置１１５上等のコンピュータシステム１０１の電子記憶場所上に記憶された機械（例えば、コンピュータプロセッサ）実行可能コードを用いて実行され得る。機械実行可能コード又は機械可読コードは、ソフトウェアの形態で提供され得る。使用中、コードは、プロセッサ１０５によって実行され得る。幾つかの場合において、コードは、記憶装置１１５から検索されて、プロセッサ１０５によってすぐにアクセスするためにメモリ１１０上に記憶され得る。幾つかの状況において、電子記憶装置１１５は、除外されてもよく、機械実行可能命令は、メモリ１１０上に記憶される。
【０１６７】
コードは、プリコンパイルされて、コードを実行するように適合されたプロセッサを有する機械を用いて使用するように構成され得るか、又はランタイム中にコンパイルされ得る。コードが、プリコンパイルされた様式で、又はコンパイルされたままの様式として実行するのを可能にするように選択され得るプログラミング言語で、コードは供給され得る。
【０１６８】
コンピュータシステム１０１等の本明細書で提供されるシステム及び方法の態様は、プログラミングにおいて実現され得る。技術の各種態様は、通常、或るタイプの機械可読媒体上に保有されるか、若しくはそれに実装される機械（又はプロセッサ）実行可能コード及び／又は関連データの形態の「製品」又は「製造品」と考えられ得る。機械実行可能コードは、メモリ（例えば、リードオンリメモリ、ランダムアクセスメモリ、フラッシュメモリ）又はハードディスク等の電子記憶装置上に記憶され得る。「記憶」型媒体は、コンピュータの有形メモリ、プロセッサ等、又は各種半導体メモリ、テープドライブ、ディスクドライブ等のそれらの関連モジュールのいずれか又は全てを含むことができ、如何なるときにも非一時的な記憶をソフトウェアプログラミングに提供し得る。ソフトウェアの全て又は一部は、時には、インターネット又は様々な他のテレコミュニケーションネットワークを通じて通信され得る。例えば、かかる通信は、或るコンピュータ又はプロセッサから、別のコンピュータ又はプロセッサへ、例えば、管理サーバー又はホストコンピュータから、アプリケーションサーバーのコンピュータプラットフォームへ、ソフトウェアのローディングを可能にし得る。したがって、ソフトウェアエレメントを担い得る別のタイプの媒体は、有線及び光地上通信ネットワークを通じて、また各種エアリンクで、例えばローカルデバイス間の物理インターフェースにより使用される光波、電波及び電磁波を含む。有線又は無線リンク、光リンク等のかかる波を運搬する物理的エレメントはまた、ソフトウェアを担う媒体とみなされ得る。本明細書で使用される場合に、非一時的な有形「記憶」媒体に制限されない限りは、コンピュータ又は機械「可読媒体」等の用語は、実行に関してプロセッサに命令を与えることに関与する任意の媒体を指す。
【０１６９】
したがって、コンピュータ実行可能コード等の機械可読媒体は、有形記憶媒体、搬送波媒体又は物理的伝送媒体を含むが、これらに限定されない多くの形態を取り得る。不揮発性記憶媒体としては、例えば、図面に示されるデータベース等を実行するのに使用され得るような、任意のコンピュータ（複数の場合もある）等における記憶デバイスのいずれか等の光ディスク又は磁気ディスクが挙げられる。揮発性記憶媒体としては、かかるコンピュータプラットフォームのメインメモリ等のダイナミックメモリが挙げられる。有形伝送媒体としては、コンピュータシステム内のバスを含むワイヤを含む同軸ケーブル、銅線及び光ファイバーが挙げられる。搬送波伝送媒体は、電気信号若しくは電磁信号、又は無線周波数（ＲＦ）及び赤外（ＩＲ）データ通信中に発生されるもの等の音波若しくは光波の形態を取り得る。したがって、コンピュータ可読媒体の一般的な形態としては、例えば、フロッピーディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、任意の他の磁気媒体、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ若しくはＤＶＤ−ＲＯＭ、任意の他の光媒体、パンチカード、紙テープ、ホールのパターンを有する任意の他の物理的記憶媒体、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＰＲＯＭ及びＥＰＲＯＭ、ＦＬＡＳＨ−ＥＰＲＯＭ、任意の他のメモリチップ若しくはカートリッジ、搬送波輸送データ若しくは命令、かかる搬送波を輸送するケーブル若しくはリンク、又はコンピュータがプログラミングコード及び／又はデータを読み取り得る任意の他の媒体が挙げられる。コンピュータ可読媒体のこれらの形態の多くは、実行用のプロセッサに、１個以上の命令の１個以上のシーケンスを伝送することに関与され得る。
【０１７０】
コンピュータシステム１０１は、例えば、１個以上の結果（これまでの実験からの中間の結果又は達成された結果）、１個以上のユーザーインプット、ライブラリー若しくはデータベースからの参照値、又はそれらの組み合わせを提供するユーザーインターフェース（ＵＩ）１４０を含む電子ディスプレイ１３５を含み得るか、又は電子ディスプレイ１３５と通信し得る。ＵＩの例としては、グラフィカルユーザーインターフェース（ＧＵＩ）及びウェブベースのユーザーインターフェースが挙げられるが、限定されない。
【０１７１】
本開示の方法及びシステムは、１個以上のアルゴリズムを用いて実行され得る。アルゴリズムは、中央処理装置１０５による実行時に、ソフトウェアを用いて実行され得る。アルゴリズムは、例えば、管理された学習により最適化された条件を決定して、バッファータイプ、バッファー濃度、温度、インキュベーション期間等の条件を最適化することができる。条件は、オリゴヌクレオチド断片、例えば特定数のエピジェネティック修飾又は特定の配列長を有するオリゴヌクレオチド断片に関して最適化され得る。
【０１７２】
実施形態
本開示の態様は、方法を提供する。幾つかの場合において、方法は、（ａ）標識を核酸配列のエピジェネティック修飾された塩基と結合させることで、標識された核酸配列を形成させることと、（ｂ）実質的に相補的な鎖を前記標識された核酸配列にハイブリダイズさせることと、（ｃ）前記標識された核酸配列が実質的に存在し得ない反応において前記実質的に相補的な鎖を増幅させることとを含み得る。
【０１７３】
本開示の別の態様は、方法を提供する。幾つかの場合において、方法は、（ａ）実質的に相補的な鎖をエピジェネティック修飾された塩基を含む核酸配列にハイブリダイズさせることと、（ｂ）標識を前記核酸配列のエピジェネティック修飾された塩基と結合させることで、標識された核酸配列を形成させることと、（ｃ）前記標識された核酸配列が実質的に存在し得ない反応において前記実質的に相補的な鎖を増幅させることとを含み得る。
【０１７４】
幾つかの場合において、前記標識は、基材と結合され得る。幾つかの場合において、前記基材は、ビーズを含み得る。幾つかの場合において、前記ビーズは、磁性ビーズであり得る。幾つかの場合において、前記基材は、アレイを含み得る。
【０１７５】
幾つかの場合において、前記実質的に相補的な鎖は、前記標識された核酸配列より長さが短いものであり得る。幾つかの場合において、前記実質的に相補的な鎖は、前記増幅前に伸長され得る。幾つかの場合において、前記ハイブリダイズさせることは、少なくとも２つの実質的に相補的な鎖を前記標識された核酸配列にハイブリダイズさせることを含み得る。幾つかの場合において、方法は、前記少なくとも２つの実質的に相補的な鎖をライゲーションさせることを含み得る。
【０１７６】
幾つかの場合において、前記標識された核酸配列は、アダプター配列を含み得る。幾つかの場合において、ハイブリダイズさせることは、前記実質的に相補的な鎖の少なくとも一部分を前記アダプター配列にハイブリダイズさせることを含み得る。幾つかの場合において、前記核酸配列は、第１のバーコードを含み得る。幾つかの場合において、前記核酸配列は、第２のバーコードを含み得る。幾つかの場合において、前記第１のバーコードはユニークなバーコードであり得て、かつ前記第２のバーコードはサンプルバーコードであり得る。
【０１７７】
幾つかの場合において、前記核酸配列のエピジェネティック修飾された塩基は、ヒドロキシメチル化された塩基（ｈｍＢ）であり得る。幾つかの場合において、前記ｈｍＢは、５−ヒドロキシメチル化された塩基（５−ｈｍＢ）であり得る。幾つかの場合において、前記５−ｈｍＢは、５−ヒドロキシメチル化されたシトシン（５−ｈｍＣ）であり得る。幾つかの場合において、前記核酸配列のエピジェネティック修飾された塩基は、メチル化された塩基、ヒドロキシメチル化された塩基、ホルミル化された塩基若しくはカルボン酸含有塩基又はそれらの塩を含み得る。幾つかの場合において、前記核酸配列又は前記標識された核酸配列の少なくとも一部分は、二本鎖であり得る。幾つかの場合において、前記標識は、単結合、二重結合又は三重結合により前記エピジェネティック修飾された塩基と結合され得る。
【０１７８】
幾つかの場合において、方法は、前記実質的に相補的な鎖を前記標識された核酸配列から分離させることを含み得る。幾つかの場合において、前記核酸配列は、前記核酸配列の少なくとも約２０個の塩基当たり、少なくとも約１個〜約３個、約１個〜約５個、約１個〜約１０個、約１個〜約１５個又は約１個〜約２０個のエピジェネティック修飾された塩基を含み得る。幾つかの場合において、前記核酸配列は、前記核酸配列の少なくとも約２０個の塩基当たり、少なくとも約１個、５個、１０個、１５個又は２０個のエピジェネティック修飾された塩基を含み得る。幾つかの場合において、前記実質的に相補的な鎖の塩基の少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％は、前記標識された核酸配列と塩基対を形成し得る。幾つかの場合において、前記実質的に相補的な鎖は、前記核酸配列とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし得る。
【０１７９】
幾つかの場合において、核酸配列は、シトシングアニン（ＣＧ）サイト、シトシンリン酸グアニン（ＣｐＧ）アイランド又はそれらの組み合わせを含み得る。幾つかの場合において、前記核酸配列は、セルフリーＤＮＡを含み得る。幾つかの場合において、前記核酸配列は、ｃＤＮＡ配列を含み得る。幾つかの場合において、方法は、増幅された産物をシーケンシングすることを含み得る。
【０１８０】
幾つかの場合において、前記核酸配列は、試料に由来し得る。幾つかの場合において、前記試料は、被験体に由来し得る。幾つかの場合において、前記被験体は、ヒトであり得る。幾つかの場合において、前記試料は、口腔試料、唾液試料、血液試料、血漿試料、生殖試料、粘液試料、脳脊髄液試料、組織試料又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。
【０１８１】
幾つかの場合において、方法は、結果を得ることを含み得る。幾つかの場合において、方法は、前記結果を参照と比較することを含み得る。幾つかの場合において、方法は、通信媒体を介して前記結果を通信することを含み得る。
【０１８２】
幾つかの場合において、前記被験体は、病態を有すると診断されていてもよい。幾つかの場合において、方法は、前記被験体を、病態を有すると診断することを含み得る。幾つかの場合において、方法は、前記被験体を、病態を発症する可能性を有すると診断することを含み得る。幾つかの場合において、前記診断は、前記結果と前記参照とを比較することに基づき得る。幾つかの場合において、前記診断は、少なくとも部分的に以前の診断を確認し得る。幾つかの場合において、前記病態は、癌であり得る。
【０１８３】
幾つかの場合において、方法は、前記被験体のための治療を選択することを含み得る。幾つかの場合において、方法は、前記被験体を治療することを含み得る。幾つかの場合において、前記治療は、外科手術、化学療法、放射線療法、免疫療法、標的療法、ホルモン療法、幹細胞移植及び精密医療を含み得る。幾つかの場合において、方法は、前記結合、前記ハイブリダイズ及び前記増幅を異なる時点で繰り返すことを含み得る。
【０１８４】
幾つかの場合において、前記被験体は、ヒトであり得る。幾つかの場合において、前記標識は、糖を含み得る。幾つかの場合において、前記糖は、グルコースを含み得る。幾つかの場合において、前記グルコースは、変性されていてもよい。
【０１８５】
幾つかの場合において、前記標識は、酵素の補助により前記エピジェネティック修飾された塩基と結合され得る。幾つかの場合において、前記酵素は、二本鎖である前記核酸配列の一部分について選択的であり得る。幾つかの場合において、前記標識は、二本鎖である前記核酸配列の一部分で前記エピジェネティック修飾された塩基と選択的に結合され得る。幾つかの場合において、前記標識は、前記核酸配列の一部分について選択的であり得る。幾つかの場合において、前記部分は、二本鎖であり得る。
【０１８６】
幾つかの場合において、前記実質的に相補的な鎖は、エピジェネティック修飾された塩基を実質的に有し得ない。幾つかの場合において、実質的に相補的な鎖は、エピジェネティック修飾された塩基を有し得ない。幾つかの場合において、前記増幅は複数の核酸鎖をもたらし得る。幾つかの場合において、それらの複数の核酸鎖の約２％未満は、エピジェネティック修飾された塩基を含み得る。幾つかの場合において、前記核酸配列は、複数のエピジェネティック修飾された塩基を含み得る。幾つかの場合において、前記実質的に相補的な鎖は、前記複数のエピジェネティック修飾された塩基の約２％未満を含み得る。幾つかの場合において、前記実質的に相補的な鎖は、エピジェネティック修飾された塩基を含み得る。
【０１８７】
本開示の別の態様は、キットを提供する。幾つかの場合において、キットは、使用説明書と、容器と、（ｉ）エピジェネティック修飾された核酸配列と結合し、かつ（ｉｉ）基材と結合するように構成された標識と、基材と結合されたコントロール核酸配列と、前記標識と結合するように構成された基材とを含み得る。
【０１８８】
本開示の別の態様は、方法を提供する。幾つかの場合において、方法は、（ａ）標識を核酸配列のエピジェネティック修飾された塩基と結合させることで、標識された核酸配列を形成させることと、（ｂ）実質的に相補的な鎖を前記標識された核酸配列にハイブリダイズさせることと、（ｃ）前記標識された核酸配列が実質的に存在しない反応において前記実質的に相補的な鎖を増幅させることとを含み得る。
【０１８９】
本開示の別の態様は、方法を提供する。幾つかの場合において、方法は、（ａ）実質的に相補的な鎖をエピジェネティック修飾された塩基を含む核酸配列にハイブリダイズさせることと、（ｂ）標識を前記核酸配列のエピジェネティック修飾された塩基と結合させることで、標識された核酸配列を形成させることと、（ｃ）前記標識された核酸配列が実質的に存在しない反応において前記実質的に相補的な鎖を増幅させることとを含み得る。
【０１９０】
幾つかの場合において、前記標識は、基材と結合され得る。幾つかの場合において、前記基材は、ビーズを含み得る。幾つかの場合において、前記ビーズは、磁性ビーズであり得る。幾つかの場合において、前記基材は、アレイを含み得る。
【０１９１】
幾つかの場合において、前記実質的に相補的な鎖は、前記標識された核酸配列より長さが短いものであり得る。幾つかの場合において、前記実質的に相補的な鎖は、前記増幅前に伸長され得る。幾つかの場合において、前記ハイブリダイズさせることは、少なくとも２つの実質的に相補的な鎖を前記標識された核酸配列にハイブリダイズさせることを含み得る。幾つかの場合において、方法は、前記少なくとも２つの実質的に相補的な鎖をライゲーションさせることを含み得る。幾つかの場合において、前記標識された核酸配列は、アダプター配列を含み得る。幾つかの場合において、ハイブリダイズさせることは、前記実質的に相補的な鎖の少なくとも一部分を前記アダプター配列にハイブリダイズさせることを含み得る。
【０１９２】
幾つかの場合において、前記核酸配列は、第１のバーコードを含み得る。幾つかの場合において、前記核酸配列は、第２のバーコードを含み得る。幾つかの場合において、前記第１のバーコードはユニークなバーコードであり得て、かつ前記第２のバーコードはサンプルバーコードである。
【０１９３】
幾つかの場合において、前記核酸配列の前記エピジェネティック修飾された塩基は、ヒドロキシメチル化された塩基（ｈｍＢ）であり得る。幾つかの場合において、前記ｈｍＢは、５−ヒドロキシメチル化された塩基（５−ｈｍＢ）であり得る。幾つかの場合において、前記５−ｈｍＢは、５−ヒドロキシメチル化されたシトシン（５−ｈｍＣ）であり得る。幾つかの場合において、前記核酸配列の前記エピジェネティック修飾された塩基は、メチル化された塩基、ヒドロキシメチル化された塩基、ホルミル化された塩基若しくはカルボン酸含有塩基又はそれらの塩を含み得る。幾つかの場合において、前記核酸配列又は前記標識された核酸配列の少なくとも一部分は、二本鎖であり得る。幾つかの場合において、前記標識は、単結合、二重結合又は三重結合により前記エピジェネティック修飾された塩基と結合され得る。幾つかの場合において、方法は、前記実質的に相補的な鎖を前記標識された核酸配列から分離させることを含み得る。
【０１９４】
幾つかの場合において、前記核酸配列は、前記核酸配列の少なくとも約２０個の塩基当たり、少なくとも約１個〜約３個、約１個〜約５個、約１個〜約１０個、約１個〜約１５個又は約１個〜約２０個のエピジェネティック修飾された塩基を含み得る。幾つかの場合において、前記核酸配列は、前記核酸配列の少なくとも約２０個の塩基当たり、少なくとも約１個、５個、１０個、１５個又は２０個のエピジェネティック修飾された塩基を含み得る。幾つかの場合において、前記実質的に相補的な鎖の塩基の少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％は、前記標識された核酸配列と塩基対を形成し得る。幾つかの場合において、前記実質的に相補的な鎖は、前記核酸配列とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし得る。
【０１９５】
幾つかの場合において、核酸配列は、シトシングアニン（ＣＧ）サイト、シトシンリン酸グアニン（ＣｐＧ）アイランド又はそれらの組み合わせを含み得る。幾つかの場合において、前記核酸配列は、セルフリーＤＮＡを含み得る。幾つかの場合において、前記核酸配列は、ｃＤＮＡ配列を含み得る。幾つかの場合において、方法は、増幅された産物をシーケンシングすることを含み得る。
【０１９６】
幾つかの場合において、前記核酸配列は、試料に由来し得る。幾つかの場合において、前記試料は、被験体に由来し得る。幾つかの場合において、前記被験体は、ヒトであり得る。幾つかの場合において、前記試料は、口腔試料、唾液試料、血液試料、血漿試料、生殖試料、粘液試料、脳脊髄液試料、組織試料又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。
【０１９７】
幾つかの場合において、方法は、結果を得ることを含み得る。幾つかの場合において、方法は、前記結果を参照と比較することを含み得る。幾つかの場合において、方法は、通信媒体を介して前記結果を通信することを含み得る。
【０１９８】
幾つかの場合において、前記被験体は、病態を有すると診断されていてもよい。幾つかの場合において、方法は、前記被験体を、病態を有すると診断することを含み得る。幾つかの場合において、方法は、前記被験体を、病態を発症する可能性を有すると診断することを含み得る。幾つかの場合において、前記診断は、前記結果と前記参照とを比較することに基づき得る。幾つかの場合において、前記診断は、少なくとも部分的に以前の診断を確認し得る。幾つかの場合において、前記病態は、癌であり得る。
【０１９９】
幾つかの場合において、方法は、前記被験体のための治療を選択することを含み得る。幾つかの場合において、方法は、前記被験体を治療することを含み得る。幾つかの場合において、前記治療は、外科手術、化学療法、放射線療法、免疫療法、標的療法、ホルモン療法、幹細胞移植及び精密医療を含み得る。幾つかの場合において、方法は、前記結合、前記ハイブリダイズ及び前記増幅を異なる時点で繰り返すことを含み得る。幾つかの場合において、前記被験体は、ヒトであり得る。
【０２００】
幾つかの場合において、前記標識は、糖を含み得る。幾つかの場合において、前記糖は、グルコースを含み得る。幾つかの場合において、前記グルコースは、変性されていてもよい。幾つかの場合において、前記標識は、酵素の補助により前記エピジェネティック修飾された塩基と結合され得る。幾つかの場合において、前記酵素は、二本鎖である前記核酸配列の一部分について選択的であり得る。幾つかの場合において、前記標識は、二本鎖である前記核酸配列の一部分で前記エピジェネティック修飾された塩基と選択的に結合され得る。幾つかの場合において、前記標識は、前記核酸配列の一部分について選択的であり得る。幾つかの場合において、前記部分は、二本鎖であり得る。
【０２０１】
本開示の別の態様は、キットを提供する。幾つかの場合において、キットは、使用説明書と、容器と、（ｉ）エピジェネティック修飾された核酸配列と結合し、かつ（ｉｉ）基材と結合するように構成された標識と、基材と結合されたコントロール核酸配列と、前記標識と結合するように構成された基材とを含み得る。
【０２０２】
幾つかの場合において、前記実質的に相補的な鎖は、エピジェネティック修飾された塩基を実質的に有し得ない。幾つかの場合において、前記実質的に相補的な鎖は、エピジェネティック修飾された塩基を有し得ない。幾つかの場合において、前記増幅は複数の核酸鎖をもたらし得て、それらの複数の核酸鎖の約２％未満は、エピジェネティック修飾された塩基を含み得る。幾つかの場合において、前記核酸配列は、複数のエピジェネティック修飾された塩基を含み得て、かつ前記実質的に相補的な鎖は、前記複数のエピジェネティック修飾された塩基の約２％未満を含み得る。幾つかの場合において、前記実質的に相補的な鎖は、エピジェネティック修飾された塩基を含み得る。
【０２０３】
本開示の別の態様は、方法を提供する。幾つかの場合において、方法は、核酸配列において複数のエピジェネティック修飾された残基の存在を検出することを含み得て、前記複数のエピジェネティック修飾された残基は、少なくとも２個のエピジェネティック修飾された残基を含み、かつ検出の感度は、前記複数のエピジェネティック修飾された残基におけるエピジェネティック修飾された残基の数の増加に伴って実質的に一定のままである。
【０２０４】
幾つかの場合において、前記少なくとも２個のエピジェネティック修飾された残基は、少なくとも４個のエピジェネティック修飾された残基であり得る。幾つかの場合において、前記検出の感度は、前記複数のエピジェネティック修飾された残基の少なくとも約９０％の存在を検出することを含み得る。幾つかの場合において、前記検出の感度は、前記複数のエピジェネティック修飾された残基の各々のエピジェネティック修飾された残基の存在を検出することを含み得る。
【０２０５】
本開示の別の態様は、方法を提供する。幾つかの場合において、方法は、核酸配列を濃縮させることを含み得て、前記核酸配列は、（ｉ）複数のエピジェネティック修飾された残基及び（ｉｉ）配列長を含み、前記複数のエピジェネティック修飾された残基は、少なくとも２個のエピジェネティック修飾された残基を含み、前記濃縮は、少なくとも４サイクルの増幅を含み、それにより複数のシーケンスリードが生成され、前記複数のシーケンスリードの約９０％は、前記配列長の少なくとも約９０％を保持する。
【０２０６】
幾つかの場合において、前記少なくとも２個のエピジェネティック修飾された残基は、少なくとも４個のエピジェネティック修飾された残基であり得る。幾つかの場合において、前記少なくとも４サイクルの増幅は、少なくとも８サイクルの増幅であり得る。
【０２０７】
幾つかの場合において、前記核酸配列は、セルフリーＤＮＡを含み得る。幾つかの場合において、前記核酸配列は、ｃＤＮＡ配列を含み得る。
【０２０８】
幾つかの場合において、前記複数のエピジェネティック修飾された残基のうちの１つのエピジェネティック修飾された残基は、ヒドロキシメチル化された塩基（ｈｍＢ）であり得る。幾つかの場合において、前記ｈｍＢは、５−ヒドロキシメチル化された塩基（５−ｈｍＢ）であり得る。幾つかの場合において、前記５−ｈｍＢは、５−ヒドロキシメチル化されたシトシン（５−ｈｍＣ）であり得る。幾つかの場合において、前記複数のエピジェネティック修飾された残基のうちの１つのエピジェネティック修飾された残基は、メチル化された塩基、ヒドロキシメチル化された塩基、ホルミル化された塩基若しくはカルボン酸含有塩基又はそれらの塩を含み得る。
【０２０９】
幾つかの場合において、前記核酸配列の少なくとも一部分は、二本鎖であり得る。幾つかの場合において、前記核酸配列は、シトシングアニン（ＣＧ）サイト、シトシンリン酸グアニン（ＣｐＧ）アイランド又はそれらの組み合わせを含み得る。
【０２１０】
本開示の別の態様は、方法を提供する。幾つかの場合において、方法は、複数のエピジェネティック修飾された残基を含む核酸配列を濃縮させて、複数のシーケンスリードを生成させることを含み得て、前記濃縮から生成された前記複数のシーケンシングリードの少なくとも約９０％は、ゲノムの約１％〜約５０％に由来する。
【０２１１】
幾つかの場合において、前記生成された複数のシーケンシングリードの少なくとも約９０％は、ゲノムの約１％〜約２０％に由来し得る。幾つかの場合において、前記複数のシーケンシングリードの長さは、少なくとも約１０塩基対であり得る。幾つかの場合において、前記複数のエピジェネティック修飾された残基は、少なくとも約２個のエピジェネティック修飾された残基であり得る。幾つかの場合において、前記複数のエピジェネティック修飾された残基は、少なくとも約６個のエピジェネティック修飾された残基であり得る。
【０２１２】
幾つかの場合において、標識は、前記複数のエピジェネティック修飾された残基のうちの１つのエピジェネティック修飾された残基と結合され得る。幾つかの場合において、前記標識は、単結合、二重結合又は三重結合により前記エピジェネティック修飾された残基と結合され得る。
【０２１３】
幾つかの場合において、前記核酸配列は、前記核酸配列の少なくとも約２０個の塩基当たり、少なくとも約１個〜約３個、約１個〜約５個、約１個〜約１０個、約１個〜約１５個又は約１個〜約２０個のエピジェネティック修飾された残基を含み得る。幾つかの場合において、前記核酸配列は、前記核酸配列の少なくとも約２０個の塩基当たり、少なくとも約１個、５個、１０個、１５個又は２０個のエピジェネティック修飾された残基を含み得る。
【０２１４】
幾つかの場合において、前記核酸配列は、セルフリーＤＮＡを含み得る。幾つかの場合において、前記核酸配列は、ｃＤＮＡ配列を含み得る。幾つかの場合において、前記核酸配列は、試料に由来し得る。幾つかの場合において、前記試料は、被験体から得られ得る。幾つかの場合において、前記被験体は、ヒトであり得る。幾つかの場合において、前記試料は、口腔試料、唾液試料、血液試料、血漿試料、生殖試料、粘液試料、脳脊髄液試料、組織試料又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。
【０２１５】
幾つかの場合において、方法は、結果を得ることを更に含み得る。幾つかの場合において、方法は、前記結果を参照と比較することを更に含み得る。幾つかの場合において、方法は、通信媒体を介して前記結果を通信することを更に含み得る。
【０２１６】
幾つかの場合において、前記被験体は、病態を有すると診断されていてもよい。幾つかの場合において、方法は、前記被験体を、病態を有すると診断することを更に含み得る。幾つかの場合において、方法は、前記被験体を、病態を発症する可能性を有すると診断することを更に含み得る。幾つかの場合において、前記診断は、前記結果と前記参照とを比較することに基づき得る。幾つかの場合において、前記診断は、少なくとも部分的に以前の診断を確認し得る。幾つかの場合において、前記病態は、癌であり得る。
【０２１７】
幾つかの場合において、方法は、前記被験体のための治療を選択することを更に含み得る。幾つかの場合において、方法は、前記被験体を治療することを更に含み得る。幾つかの場合において、前記治療は、外科手術、化学療法、放射線療法、免疫療法、標的療法、ホルモン療法、幹細胞移植及び精密医療を含み得る。
【０２１８】
幾つかの場合において、前記標識は、糖を含み得る。幾つかの場合において、前記糖は、グルコースを含み得る。幾つかの場合において、前記グルコースは、変性されていてもよい。幾つかの場合において、前記標識は、酵素の補助により前記エピジェネティック修飾された残基と結合され得る。幾つかの場合において、前記酵素は、二本鎖である前記核酸配列の一部分について選択的であり得る。幾つかの場合において、前記標識は、二本鎖である前記核酸配列の一部分で前記エピジェネティック修飾された残基と選択的に結合され得る。幾つかの場合において、前記標識は、前記核酸配列の一部分について選択的であり得る。幾つかの場合において、前記部分は、二本鎖であり得る。
【０２１９】
本開示の別の態様は、方法を提供する。幾つかの場合において、方法は、前記セルフリー試料を次世代シーケンシングによりアッセイして核酸配列を特定することを含み得て、前記核酸配列における５−ヒドロキシメチルシトシン（５−ｈｍＣ）の存在により、前記セルフリー試料を癌について悪性として特定する。幾つかの場合において、前記セルフリー試料は、前記癌を有する被験体又は前記癌を有すると疑われる被験体から得られ得る。幾つかの場合において、方法は、前記被験体のための治療を５−ｈｍＣの存在に基づいて選択することを更に含み得る。幾つかの場合において、前記５−ｈｍＣの存在は、前記セルフリー試料における５−ｈｍＣのレベルを含み得る。幾つかの場合において、前記核酸配列は、シトシングアニン（ＣＧ）サイト、シトシンリン酸グアニン（ＣｐＧ）アイランド又はそれらの組み合わせを含み得る。幾つかの場合において、方法は、結果を前記５−ｈｍＣの存在に基づいて得ることを更に含み得る。幾つかの場合において、方法は、通信媒体を介して前記結果を通信することを更に含み得る。幾つかの場合において、標識は、前記核酸配列のエピジェネティック修飾された塩基と結合され得る。
【実施例】
【０２２０】
実施例１：診断方法
被験体は、癌を有する疑いがあり得る。核酸配列を含む試料は、血漿試料、血清試料、血液試料、尿試料、口腔試料の少なくとも１つによって、被験体から入手され得る。核酸配列は、試料から単離され得る。核酸配列上に存在するエピジェネティック修飾は、Ｔ４ファージベータ−グルコシルトランスフェラーゼ（Ｔ４−ＢＧＴ）を用いたＵＤＰ−６−Ｎ３−Ｇｌｕで、及び／又はクリックケミストリーで標識され得る。実質的に相補的な鎖を、エピジェネティック修飾を含む核酸配列の一部にハイブリダイズし得る。エピジェネティック修飾を含む標識された核酸配列が基材に結合され得るように、核酸配列を基材と接触させ得る。基材を、洗浄バッファーで洗浄し得る。実質的に相補的な鎖を、基材に結合され得る核酸配列と分離し得る。実質的に相補的な鎖を、核酸配列の非存在下で増幅させ得る。癌と関連付けられるエピジェネティック修飾の存在が、被験体から入手した試料中に存在すると確認され得る場合に、被験体は、癌を有すると診断され得る。
【０２２１】
実施例２：ｈｍＣ標識
図８Ａ及び図８Ｂは、異なるＴ４ファージベータ−グルコシルトランスフェラーゼ（Ｔ４−ＢＧＴ）バッファーを使用した、６個の５−ｈｍＣのバンドシフトアッセイを示す。バッファーＡは、室温で保管される２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ８）を含み得る。バッファーＡは、およそ８週経っている場合がある（「古い」バッファーＡ）か、又は作り立ての場合がある（「新鮮な」バッファーＡ）。市販のＴｈｅｒｍｏ  ＢＧＴバッファー又は「Ｅｐｉ」バッファーもまた試験され得る。ＮＥＢバッファー１及びＮＥＢバッファー４もまた試験され得る。ＤＮＡ  ５０ナノグラム（ｎｇ）又は１００ｎｇの試料を、６個の５−ｈｍＣ残基に関して標識し得る。図８Ａ及び図８Ｂに示すように、鋳型（例えば、合成鋳型）中のエピジェネティック修飾塩基（例えば、５−ｈｍＣ塩基）を標識する効率は、使用する反応バッファーに応じて多様であり得る。図８Ａ及び図８Ｂにおいて、６個の５−ｈｍＣ残基を含有する１００−ｍｅｒ合成鋳型を使用して、「古い」バッファーＡは、より高い効率及び離散したバンドシフトで標識する他のバッファーと比較した場合、最も効率悪く（最も顕著なスメアを伴う最も顕著でないバンドシフト）標識し得る。「新鮮な」バッファーＡは、より良好な標識を提供し得るが、完了まで進まない場合がある（例えば、ＤＮＡ  １００ｎｇを用いた場合）。Ｔｈｅｒｍｏ「Ｅｐｉ」バッファー又はＮＥＢバッファー１若しくはＮＥＢバッファー４を用いた標識は、ＤＮＡ試料５０ｎｇ及び１００ｎｇを用いて完了まで進み得る。
【０２２２】
実施例３：シーケンシングメトリクス
図９は、５−ｈｍＣプルダウン（ＨＭＣＰ）法とコピー・ラベル・エンリッチ（ＣＬＥ）法との間での詳細なシーケンシングメトリクスの比較を示す。図９の「Ａ」は、ＣＬＥ法が、より特異的なプルダウンと一致し得るデータである遺伝子内部対遺伝子間領域のリードの比の増加を提供し得ることを示す。図９の「Ｂ」は、ＣＬＥが、より少ないオフターゲットのリードを強調する場合があり、またよりきれいなバックグラウンドを示し得るデータであるカバレッジにおけるより多くのギャップを提供し得ることを示す。図９の「Ｃ」は、ＣＬＥ法が、非常の少ないミトコンドリアリード（例えば、メチル化又はヒドロキシメチル化され得ないｍｔＤＮＡ）を有し得ること、したがって、これは、オフターゲットの効果に代わるものであり得ることを示す。ＣＬＥ法は、この手段によってＨＭＣＰ法よりも優れている可能性がある。図９の「Ｄ」は、ＣＬＥが、それぞれ、２個の５−ｈｍＣ残基及び６個の５−ｈｍＣ残基を含有するコントロール鋳型からのほぼ同数のリードを有し得ることを示す。ＨＭＣＰ法では、数桁の差が存在し得る可能性があり、例えば、６個の５−ｈｍＣ残基を含有する鋳型は、ほとんど検出され得ない。図９の「Ｅ」は、２個の５−ｈｍＣ残基を含有する鋳型が、ＣＬＥ法及びＨＭＣＰ法の両方で同様のレベルで検出され得ることを示す。図９の「Ｆ」は、スパイクコントロール回収の比（ｈｍＣ：Ｃ／ｍＣ）が、ＣＬＥ法において遥かに高い可能性があることを示し、全体的な特異性の改善を示している。
【０２２３】
実施例４：Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｖｉｅｗｅｒ（ＩＧＶ）スクリーンショット
図１０は、ヒトゲノムの１８ｋｂ領域及びプルダウンされたリードのアラインメントのＩｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｖｉｅｗｅｒ（ＩＧＶ）スクリーンショットを示す。ＣＬＥ法からのリードは、より大きくより離散したピーク及び任意のＣｐＧを欠如するおよそ１キロベース（ｋｂ）の領域（図１０では、「ＣｐＧなし」と注釈）におけるより少ないリードを示し得る。図１０のＩＧＶスクリーンショットからのデータにより、ＨＭＣＰ法と比較して、ＣＬＥ法を用いた場合に、よりきれいなバックグラウンドが示唆され得る。図１１は、種々のゲノム領域の別のＩＧＶスクリーンショットを示し、ＣＬＥ法が、ＨＭＣＰ法よりも効率的に高密度のＣｐＧを有する脳全ゲノムＤＮＡ（ｗｇＤＮＡ）の領域をブルダウンすることができることを強調し得る。図１１の第１のピーク（図中で「１」と注釈）は、４００塩基対（ｂｐ）領域における１９個のＣｐＧであり、ＨＭＣＰ法と比較した場合に、ＣＬＥ法における濃縮の増強を示し得る。図１１の第２のピーク（図中で「２」と注釈）は、４００ｂｐ領域における９個のＣｐＧであり、ＣＬＥ法及びＨＭＣＰ法の両方に関して、類似した濃縮を示し得る。図１２は、高密度のＣｐＧを有するヒトゲノムの領域の更なるＩＧＶスクリーンショットを示し、ＣＬＥ法が、ＨＭＣＰ法では全く検出され得ない強力なピークを検出することができることを示し得る。例えば、脳組織試料におけるカリウム電位依存性チャネルサブファミリーＪメンバー９（ＫＣＮＪ９）濃縮発現及び５００塩基対（ｂｐ）領域におけるおよそ３６個のＣｐＧにおいて、図１２の注釈矢印によって示されるように、ＨＭＣＰ法と比較して、ＣＬＥ法において、優れた濃縮が示され得る。ＨＭＣＰ法からの検出のこの欠如は、ＰＣＲによるライブラリー濃縮等のポリメラーゼ反応におけるポリメラーゼの処理能力を阻害する密集した５−ｈｍＣ残基に起因し得る。
【０２２４】
実施例５：比較の概要基準
図１３Ａ及び図１３Ｂは、ＨＭＣＰ法と比較したＣＬＥ法から概要基準を示し、図１３Ａにおけるａ）遺伝子内部対遺伝子間領域の比、ｂ）ミトコンドリアリード、ｃ）２個の５−ｈｍＣ対ｍＣｐＧの比、及び図１３Ｂに示されるような２つの異なるプロトコルにわたる２個の５−ｈｍＣ及び６個の５−ｈｍＣコントロール鋳型の相対的回収のグラフ表示を比較している。ＨＭＣＰ法を用いた場合に、２個の５−ｈｍＣに関しておよそ２倍の優れた濃縮が観察され得る（図１３Ｂ）。ＣＬＥ法を用いた場合に、６個の５−ｈｍＣに関しておよそ１８倍の有意に増加した濃縮が観察され得る（図１３Ｂ）。
【０２２５】
実施例６：ＨＭＣＰ法
ＤＮＡ試料作製
Bioo Scientific社のＮｅｘｔＰｒｅｐ−Ｍａｇ  ｃｆＤＮＡ単離キット説明書に従って、セルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を血漿から抽出し得る。ホルマリン固定されたパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）抽出を使用する場合、適切なキットを選択して、キットプロトコルに従い得る。組織由来のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を断片化し得る。適切な量のｇＤＮＡ（１００ｎｇ〜２０００ｎｇ）を、低ＴＥバッファー中に希釈し得て、ミクロＴＵＢＥ−５０においてＣｏｖａｒｉｓで１５０塩基対（ｂｐ）に剪断し得る。ＤＮＡは、Ｑｕｂｉｔによって定量化され、ＱＣは、Ｂｉｏａｎａｌｙｓｅｒによって定量化されて、サイズ分布を調べ得る。コントロールは、０．１％ｗ／ｗでスパイクされ得る（断片化したｇＤＮＡ又はｃｆＤＮＡ  １０ナノグラム（ｎｇ）に関して、コントロールはそれぞれ１０ｐｇ）。
【０２２６】
プルダウン前のＤＮＡライブラリー作製
ＫＡＰＡ  Ｈｙｐｅｒ  Ｐｒｅｐキットに従う。
【０２２７】
末端修復及びＡ−テーリング
末端修復及びＡ−テーリング反応はそれぞれ、チューブ中で構築され得る。
【０２２８】
【表１】
2020520243.tif 000005
【０２２９】
チューブをボルテックスし、遠心沈殿させ、氷に戻し得る。チューブは、以下に概要するようにプログラムされたサーモサイクラーにおいてインキュベートされ得る。
【０２３０】
【表２】
2020520243.tif 000006
【０２３１】
アダプターライゲーション
Bioo Scientific社からのＤＮＡバーコード化アダプター（ＮＥＸＴｆｌｅｘ  ＤＮＡ  Ｂａｒｃｏｄｅｓ−２４）をライゲーションに使用し得る。アダプターを、使用するＤＮＡの量に従って希釈し得る：１ｎｇに関しては０．３μＭ、１０ｎｇに関しては３μＭ、１００ｎｇに関しては１５μＭ。末端修復及びＡ−テーリングが実施され得る同じチューブ（複数の場合もある）において、アダプターライゲーション反応はそれぞれ、下記の通りに構築され得る。
【０２３２】
【表３】
2020520243.tif 000007
【０２３３】
チューブを十分に混合し、短期間遠心分離し得る。チューブを、２０℃で４５分（ｍｉｎ）間インキュベートし得る。
【０２３４】
ライゲーション後の精製
同じチューブ（複数の場合もある）において、下記を組み合わせることによって、０．８×ビーズベースの精製が実施され得る。
【０２３５】
【表４】
2020520243.tif 000008
【０２３６】
チューブ（複数の場合もある）は、ボルテックスすることによって十分に混合して、室温で１０分間インキュベートされ得て、その結果、ＤＮＡは、ビーズに結合し得る。チューブ（複数の場合もある）は、液体が透明になり得るまで、磁石上に配置され得る（ビーズが捕捉され得るように）。上清を除去して、廃棄し得る。チューブの底部にある残留液体は、回転チューブをポッピングし（popping）、続いて、チューブを数秒間、磁石に戻して、残留液体を除去して、廃棄することによって、収集され得る。チューブ（複数の場合もある）を磁石上に維持し、８０％エタノール２００μＬを添加し得る。チューブ（複数の場合もある）を、磁石上で、室温でおよそ３０秒間インキュベートし得る。エタノールを除去して、廃棄し得る。チューブ（複数の場合もある）を磁石上に維持し、８０％エタノール２００μＬを添加し得る。チューブ（複数の場合もある）を、磁石上で、室温でおよそ３０秒間インキュベートし得る。エタノールを除去して、廃棄し得る。ビーズを、室温で３分〜５分間（又は、エタノールが全て、蒸発するまで）乾燥させ得る。ＡＭＰｕｒｅビーズを、Ｈ２Ｏ  ２０μＬ中に完全に再懸濁し得る。チューブ（複数の場合もある）を、室温で５分間インキュベートして、ＤＮＡをビーズから溶出させ得る。チューブ（複数の場合もある）を磁石上に配置して、ビーズを捕捉し、液体が透明になり得るまでインキュベートし得る。透明な上清を新たなチューブ（複数の場合もある）に移し得る。インプットライブラリー増幅用に、１μＬを維持し得る。１８μＬを新鮮なチューブ（複数の場合もある）に移し、５−ｈｍＣ標識反応及びクリックケミストリーへと進み得る。
【０２３７】
インプットライブラリー増幅及び精製
増幅
本明細書に開示されるプルダウン前のライブラリー１μｌを、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）９μｌと混合し、この１０倍希釈したライブラリー２μｌを、ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ  Ｈｏｔｓｔａｒｔ  ＤＮＡポリメラーゼを使用して５０μＬ中での増幅に使用し得る。
【０２３８】
ライブラリー増幅反応はそれぞれ、下記の通りに構築され得る。
【０２３９】
【表５】
2020520243.tif 000009
【０２４０】
チューブを十分に混合し、短期間遠心分離し得る。下記のサイクリングプロトコルが、増幅に利用され得る。
【０２４１】
【表６】
2020520243.tif 000010
【０２４２】
増幅後の精製
ＡＭＰｕｒｅビーズ５０μＬを、パラグラフ［０２２２］からのＰＣＲ反応物５０μＬに添加し、ボルテックスして、混合して、室温で１０分間（ｍｉｎ）インキュベートし得る。チューブ（複数の場合もある）は、液体が透明になり得るまで、磁石上に配置されて、ビーズを捕捉し得る。上清を除去して、廃棄し得る。
【０２４３】
チューブ（複数の場合もある）を磁石上に維持し、８０％エタノール２００μＬを添加し得る。チューブ（複数の場合もある）を、磁石上で、室温でおよそ３０秒間インキュベートし得る。エタノールを除去して、廃棄し得る。チューブ（複数の場合もある）を、磁石上で維持し、８０％エタノール２００μＬを添加し得る。チューブ（複数の場合もある）を、磁石上で、室温でおよそ３０秒間インキュベートし得る。エタノールを除去して、廃棄し得る。ビーズを、室温で３分〜５分間（又は、エタノールが全て、蒸発するまで）乾燥させ得る。ＡＭＰｕｒｅビーズを、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１０μＬ中に完全に再懸濁し得る。チューブ（複数の場合もある）を、室温で５分間インキュベートして、ＤＮＡをビーズから溶出させ得る。チューブ（複数の場合もある）を磁石上に配置して、ビーズを捕捉し、液体が透明になり得るまでインキュベートし得る。透明な上清を新たなチューブ（複数の場合もある）に移し得る。試料を−２０℃で保管し得る。Ｑｕｂｉｔ及びＢｉｏａｎａｌｙｓｅｒを利用して、ライブラリーを定量化し得る。
【０２４４】
５−ｈｍＣ標識反応及びクリックケミストリー
標識反応はそれぞれ、下記の通りにチューブ内で構築され得る。
【０２４５】
【表７】
2020520243.tif 000011
【０２４６】
チューブを十分に混合して、短期間遠心分離して、Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒにおいて、３７℃で３０分間インキュベートし得る。２０ｍＭ  ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ビオチン１μＬを、反応の最後に各チューブに添加し得る。チューブを十分に混合して、短期間遠心分離して、Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒにおいて、３７℃で２時間（ｈｒｓ）インキュベートし得る。１０ｍｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ  １μＬを反応混合物に添加し得る。
【０２４７】
プルダウン前のＭｉｃｒｏ  Ｂｉｏ−Ｓｐｉｎ  Ｐ３０カラム精製
Ｍｉｃｒｏ  Ｂｉｏ−Ｓｐｉｎ  Ｐ３０カラムを数回反転させて、沈殿したゲルを再懸濁させて、泡を全て除去し得る。先端部分を折って外して、２．０ｍｌ容の収集チューブ内にカラムを配置させ得る。最上部のキャップを除去し得る。過剰な充填用バッファーを、重力によって、ゲル床の最上部に流し得る（約２分）。流したバッファーを廃棄して、続いて、カラムを２．０ｍｌ容のチューブへ戻して配置させ得る。１０００ｇで２分間、遠心分離を行い、残存する充填用バッファーを除去し得る。バッファーを廃棄し得る。ビーズブロッキングバッファー１（ＢＢＢ１）のバッファー５００μＬをカラムに適用して、１０００ｇで２分間遠心分離して、収集チューブからのバッファーを廃棄し得る。ＢＢＢ１バッファーを更に５００μＬ、カラムに適用し、バッファーを、重力によって、約２分間流して、バッファーを収集チューブに廃棄し得て、続いて、１０００ｇで２分間遠心分離して、バッファーを収集チューブから廃棄し得る。カラムを、新たな１．５ｍｌ容のＤＮＡ低結合エッペンドルフチューブに配置し得る。パラグラフ［０２２６］からの反応混合物を、カラムの中心にロードして、１０００ｇで４分間遠心分離して、ＤＮＡ（およそ４０μＬ）を収集し得る。
【０２４８】
親和性プルダウン
Ｍ−２７０ストレプトアビジンビーズを、サケ精子ＤＮＡでブロックし得る。バイアル内のビーズをボルテックスして、再懸濁し、所要容量（ｘ＝処理される試料の数の２０％過剰）のビーズを、１．５ｍｌ容のエッペンドルフチューブに移し得る。ビーズを、ＢＢＢ１バッファー５００μＬで洗浄して、再懸濁し得る。チューブを磁石上に１分間配置させ、上清を廃棄し得る。総計３回の洗浄のために、ビーズの洗浄を２度繰り返し得る。ビーズを、ＢＢＢ１バッファー中の１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ  ５００μｌ（１０ｍｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ５μｌを、ＢＢＢ１バッファー４９５μｌに添加）中に再懸濁して、混合しながら、室温で３０分間、インキュベートし得る。ビーズの洗浄を２度繰り返し得る。チューブの底部にある残留液体を収集し得て、続いて、チューブを数秒間、磁石に戻し得る。残留バッファーを除去して、廃棄し得る。同量のＢＢＢ１バッファー中のビーズを、バイアルから採取した磁気ビーズの初期容量として再懸濁し得る。ブロックされたＭ−２７０ストレプトアビジンビーズ１μＬを、パラグラフ［０２２７］からの反応混合物に添加して、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒにおいて、１３００ｒｐｍで、室温で３０分間インキュベートし得る。チューブを、磁気スタンド上におよそ１分間配置させて、上清を除去して、廃棄し得る。
【０２４９】
プルダウン後のストレプトアビジンビーズの洗浄
ＢＢＢ１  ２００μＬを、パラグラフ［０２２９］からのチューブ（複数の場合もある）に添加して、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒにおいて、１分当たり１５００回転（ｒｐｍ）で、室温で５分間インキュベートし得る。チューブを、磁気スタンド上におよそ２分間配置させて、上清を除去して、廃棄し得る。洗浄を２度繰り返し得る。ＢＢＢ２  ２００μＬを添加して、チューブを、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒにおいて、１５００ｒｐｍで、室温で５分間インキュベートし得る。チューブを、磁気スタンド上におよそ２分間配置させて、上清を除去して、廃棄し得る。洗浄を２度繰り返し得る。ＢＢＢ３  ２００μＬを添加して、チューブを、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒにおいて、１５００ｒｐｍで、室温で５分間インキュベートし得る。チューブを、磁気スタンド上におよそ２分間配置させて、上清を除去して、廃棄し得る。洗浄を２度繰り返し得る。ＢＢＢ４  ２００μＬを添加して、チューブを、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒにおいて、１５００ｒｐｍで、５５℃で５分間インキュベートし得る。チューブを、磁気スタンド上におよそ２分間配置させて、上清を除去して、廃棄し得る。洗浄を２度繰り返し得る。Ｈ２Ｏ  ５０μＬを使用した最終洗浄は、ビーズを乱すことなく実施し得る。ポップスピンを実施して、残留バッファーを除去し得る。ビーズを、Ｈ２Ｏ  ２０μＬ中に再懸濁して、ビーズ懸濁液を、０．２ｍｌのＰＣＲストリップチューブに移し得る。
【０２５０】
ＰＣＲによるＨＭＣＰライブラリー濃縮
ライブラリー増幅反応はそれぞれ、下記の通りに構築され得る。
【０２５１】
【表８】
2020520243.tif 000012
【０２５２】
チューブを十分に混合し、短期間遠心分離して、下記のサイクリングプロトコルを使用して増幅し得る。
【０２５３】
【表９】
2020520243.tif 000013
【０２５４】
チューブ（複数の場合もある）は、液体が透明になり得るまで、磁石上に配置されて、ビーズを捕捉し得る。上清を、新鮮なチューブ（複数の場合もある）に移し得る。ＰＣＲ反応物５０μＬに、ＡＭＰｕｒｅビーズ５０μＬを添加し、ボルテックスして、混合して、室温で１０分間、インキュベートし得る。チューブを短期間遠心分離し、磁気ラックを使用して、ビーズを、室温で５分間沈殿させ得る。上清を慎重に除去して、ビーズを乱すことなく８０％エタノール２００μＬで２度洗浄し得る。ビーズを、乾燥するまで（５分〜１０分）、蓋を開けた状態で磁気ラック上に放置し得る。１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１０μＬをビーズに添加して、室温で５分間、インキュベートし得る。上清を新鮮なチューブに収集し得る。Ｑｕｂｉｔ及びＢｉｏａｎａｌｙｓｅｒを用いて、ライブラリーを定量化し得る。
【０２５５】
バッファー作製
１０×グルコシル化バッファー（１０×β−ＧＴバッファー）（１ｍＬ）：
５００μＬ  １Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）
２５０μＬ  １Ｍ  ＭｇＣｌ２（１Ｍ）
２５０μＬ  Ｈ２Ｏ
【０２５６】
ＢＢＢ１：ビーズブロッキングバッファー１（１００ｍＬ）
５００μＬ  １Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）
１００μＬ  ０．５Ｍ  ＥＤＴＡ
２０ｍｌ  ５Ｍ  ＮａＣｌ
２００μＬ  Ｔｗｅｅｎ２０
７９．２ｍＬ  Ｈ２Ｏ
【０２５７】
ＢＢＢ２：ビーズブロッキングバッファー２（１００ｍｌ）：
５００μｌ  １Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）
１００μｌ  ０．５Ｍ  ＥＤＴＡ
２００μｌ  Ｔｗｅｅｎ２０
９９．２ｍｌ  Ｈ２Ｏ
【０２５８】
ＢＢＢ３：ビーズブロッキングバッファー３（１００ｍｌ）：
５００μｌ  １Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ９）
１００μｌ  ０．５Ｍ  ＥＤＴＡ
２０ｍｌ  ５Ｍ  ＮａＣｌ
２００μｌ  Ｔｗｅｅｎ２０
７９．２ｍｌ  Ｈ２Ｏ
【０２５９】
ＢＢＢ４：ビーズブロッキングバッファー４（１００ｍｌ）：
５００μｌ  １Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ９）
１００μｌ  ０．５Ｍ  ＥＤＴＡ
２００μｌ  Ｔｗｅｅｎ２０
９９．２ｍｌ  Ｈ２Ｏ
【０２６０】
実施例７：ＨＭＣＰ  ＣＬＥ法（図３における１つの実施形態で概略的に示される）
ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）の１５０ｂｐへの剪断
ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を低ＴＥバッファーで希釈して、ミクロＴＵＢＥ−５０においてＣｏｖａｒｉｓで１５０塩基対（ｂｐ）に剪断し得る。幾つかの場合において、精製したセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）は、剪断せずに使用することができる。
【０２６１】
ライブラリー作製
ライブラリー作製は、Bioo Scientific社からのＤＮＡバーコード化アダプター（２４−ｐｌｅｘ）を使用して、ＫＡＰＡ  Ｈｙｐｅｒ  Ｐｒｅｐキットプロトコルに従い得る。アダプターを、使用するインプットＤＮＡに基づいて希釈し得る：１ｎｇに関しては０．３μＭ、１０ｎｇに関しては３μＭ、１００ｎｇに関しては１５μＭ。ＤＮＡの最終精製に関して、溶出は、水１２μｌ中で行われ得る。幾つかの場合において、スパイクインコントロール（spike-in control）を用いてもよい。かかる場合、スパイクインコントロールは、ライブラリー作製前の重量に基づいて０．１重量（ｗ／ｗ）％で行われ得る（各コントロール５−Ｃ、５−ｍＣ、及び５−ｈｍＣ  １０ピコグラム（ｐｇ）；５−ｈｍＣコントロールは、２個の５−ｈｍＣ又は６個の５−ｈｍＣのいずれかを含有し得る）。
【０２６２】
プライマー伸長
ａ．ＮＥＸＴｆｌｅｘプライマーを、適合されるＤＮＡにアニーリングする。
ＤＮＡ（ライブラリー作製からの）      １２μｌ
１０×ＮＥＢバッファー４              ２μｌ
１０ｍＭ  ｄＮＴＰ                    ２μｌ
１０μＭ  ＮＥＸＴｆｌｅｘプライマー  ２μｌ
１８μｌ
９５℃で３分間
１４℃まで、１秒当たり−０．１℃
【０２６３】
ｂ．クレノウ伸長
クレノウエキソ−（５Ｕ／μｌ）２μｌを添加する
３７℃で３０分間
７５℃で２０分間
【０２６４】
５−ｈｍＣ標識反応及びクリックケミストリー
ａ．５−ｈｍＣの標識化
伸長されたＤＮＡ（上記ｂ．からの）        ２０μｌ
水                                        ２．５μｌ
１０×ＮＥＢバッファー４                  ０．５μｌ
２．５ｍＭ  ＵＤＰ−６−Ｎ３−Ｇｌｕ      １μｌ
Ｔ４β−ＧＴ（５Ｕ／μｌ）                １μｌ
２５μｌ
３７℃で３０分間インキュベートする。
【０２６５】
ＵＤＰ−６−Ｎ３−Ｇｌｕ又はβＧＴなしのネガティブコントロールが包含され得る。
【０２６６】
ｂ．クリック反応
２０ｍＭ  ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ビオチン１μｌを反応物に添加して、３７℃で２時間インキュベートする。
１０ｍｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ  １μｌを、インキュベーションの最後に添加する。
【０２６７】
標識化後の精製及び親和性プルダウン
ＭｉｃｒｏスピンＰ３０カラムにおいて、ビーズブロッキングバッファー１（ＢＢＢ１）５００μｌで２度、バッファー交換を行い得る（毎回、１０００ｇで２分間回転させる）。上記ｂ．からの反応混合物を、カラムの中心にロードして、１０００ｇで４分（ｍｉｎ）間、遠心分離して、ＤＮＡ低結合エッペンドルフチューブ内にＤＮＡを収集し得る。
【０２６８】
Ｍ２７０ストレプトアビジンビーズを作製し得る。Ａ）Ｍ−２７０  １０μｌをＢＢＢ１  ５００μｌ中で２度洗浄し得る。Ｂ）ビーズを、回転板上で、室温で３０分間、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡを含有するＢＢＢ１  ５００μｌ中でブロックし得る。Ｃ）ビーズを、ＢＢＢ１  ５００μｌ中で２度洗浄し得る。Ｄ）ビーズを、ＢＢＢ１  １０μｌ中に再懸濁し得る。ブロックされたＭ−２７０ストレプトアビジンビーズ１μｌを、パラグラフ［０２４７］からの精製ＤＮＡに添加して、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒにおいて、１分当たり１３００回転（ｒｐｍ）で、２２℃で３０分間インキュベートし得る。
【０２６９】
ビーズ洗浄
ビーズを、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒにおいて、１５００ｒｐｍで、２２℃で５分間、ビーズブロッキングバッファー１（ＢＢＢ１）２００μｌ中で洗浄して、総計３回の洗浄のために、洗浄を繰り返し得る。続いて、ビーズを、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒにおいて、１５００ｒｐｍで、２２℃で５分間、ＢＢＢ２  ２００μｌ中で洗浄して、総計３回の洗浄のために、洗浄を繰り返し得る。次に、ビーズを、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒにおいて、１５００ｒｐｍで、２２℃で５分間、ＢＢＢ３  ２００μｌ中で洗浄して、総計３回の洗浄のために、洗浄を繰り返し得る。続いて、ビーズを、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒにおいて、１５００ｒｐｍで、５５℃で５分間、ＢＢＢ４  ２００μｌ中で洗浄して、総計３回の洗浄のために、洗浄を繰り返し得る。Ｈ２Ｏ  ５０μＬを用いた最終洗浄は、混合することなく行われ得る。水洗液を除去し得る。０．１Ｎ  ＮａＯＨ  ２０μｌをビーズに添加して、ビーズを再懸濁させて、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒにおいて、１３００ｒｐｍで、２２℃で１０分間、インキュベートし得る。磁石を使用して、ＮａＯＨ上清を、ビーズから除去して、新たなチューブへピペッティングし得る。即座に、ＮａＯＨ上清を、０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）１０μｌで中和し得る。ＰＣＲによるライブラリー濃縮へと続く。
【０２７０】
ＰＣＲによるライブラリー濃縮
ａ．ＰＣＲを設定する
ＤＮＡ（ビーズ洗浄後からの）                  ３０μｌ
５×ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉバッファー              １０μｌ
１０ｍＭ  ｄＮＴＰ                            １．５μｌ
１０μＭ  ＮＥＸＴｆｌｅｘプライマーミックス    ４μｌ
ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ                              １μｌ
Ｈ２Ｏ                                        ３．５μｌ
５０μｌ
【０２７１】
インプットＤＮＡ（濃縮なし）もまた増幅させることができる。ライブラリーを１０倍希釈して、ＰＣＲにおいて２μｌを使用し得る。
【０２７２】
ＰＣＲプログラム
９５℃で３分間
９８℃で２０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間を１２サイクル
７２℃で５分間
４℃で保管
【０２７３】
ｂ．増幅産物を、１×ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズを使用して精製して、ＤＮＡを、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１０μｌ中に溶出し得る。
【０２７４】
ライブラリーＱＣ及びシーケンシング
Ｑｕｂｉｔ及びＢｉｏａｎａｌｙｓｅｒ解析
【０２７５】
バッファー
ＢＢＢ１：ビーズブロッキングバッファー１（１００ｍｌ）：
５００μｌ  １Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）
１００μｌ  ０．５Ｍ  ＥＤＴＡ
２０ｍｌ  ５Ｍ  ＮａＣｌ
２００μｌ  Ｔｗｅｅｎ２０
７９．２ｍｌ  Ｈ２Ｏ
【０２７６】
ＢＢＢ２：ビーズブロッキングバッファー２（１００ｍｌ）：
５００μｌ  １Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）
１００μｌ  ０．５Ｍ  ＥＤＴＡ
２００μｌ  Ｔｗｅｅｎ２０
９９．２ｍｌ  Ｈ２Ｏ
【０２７７】
ＢＢＢ３：ビーズブロッキングバッファー３（１００ｍｌ）：
５００μｌ  １Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ９）
１００μｌ  ０．５Ｍ  ＥＤＴＡ
２０ｍｌ  ５Ｍ  ＮａＣｌ
２００μｌ  Ｔｗｅｅｎ２０
７９．２ｍｌ  Ｈ２Ｏ
【０２７８】
ＢＢＢ４：ビーズブロッキングバッファー４（１００ｍｌ）：
５００μｌ  １Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ９）
１００μｌ  ０．５Ｍ  ＥＤＴＡ
２００μｌ  Ｔｗｅｅｎ２０
９９．２ｍｌ  Ｈ２Ｏ
【０２７９】
図１４及び図１５は、種々のスパイクインコントロールの例を示す。スパイクインコントロールは、本明細書に記載されるような任意の方法で用いられ得る。例えば、図１４に示されるスパイクインコントロール等のスパイクインコントロールは、ＨＭＣＰ＿ＣＬＥ法で用いられ得る。幾つかの場合において、図１５に示されるスパイクインコントロール等のスパイクインコントロールは、ＨＭＣＰ法で用いられ得る。スパイクインコントロールは、システイン（Ｃ）残基が、ＰＣＲ又はシーケンシング反応等の反応において５−メチル化シトシン（５−ｍＣ）又は５−ヒドロキシメチル化シトシン（５−ｈｍＣ）で置き換えられ得る配列であり得る。図１４の配列において灰色で強調されるシトシン塩基は、５−ｍＣ又は５−ｈｍＣで置き換えられ得るシトシン残基を表し得る。図１５はまた、２ｈｍＣ、２ｍＣ、２Ｃ、及び６ｈｍＣに関するＰＣＲプライマー対の例を示す。
【０２８０】
幾つかの場合において、図１６に示されるように、試料２１０２は、ヒト被験体等の被験体２１０１から入手され得る。試料２１０２は、アッセイの実施等の本明細書に記載されるような１つ以上の方法に付され得る。幾つかの場合において、アッセイは、ハイブリダイゼーション、増幅、シーケンシング、標識、塩基のエピジェネティック修飾、又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。方法からの１個以上の結果は、プロセッサ２１０４にインプットされ得る。試料識別、被験体識別、試料タイプ、参照、又は他の情報等の１個以上のインプットパラメーターは、プロセッサ２１０４にインプットされ得る。プロセッサが、診断、又は治療に関する推奨等の結果をもたらし得るように、アッセイからの１個以上のメトリクスは、プロセッサ２１０４にインプットされ得る。プロセッサは、結果、インプットパラメーター、メトリクス、参照、又はそれらの任意の組み合わせを、視覚的表示又はグラフィカルユーザーインターフェース等のディスプレイ２１０５に送信し得る。プロセッサ２１０４は、（ｉ）結果、インプットパラメーター、メトリクス、若しくはそれらの任意の組み合わせをサーバー２１０７に送信し得るか、（ｉｉ）結果、インプットパラメーター、メトリクス、若しくはそれらの任意の組み合わせをサーバー２１０７から受信し得るか、又は（ｉｉｉ）それらの組み合わせであり得る。
【０２８１】
実施例８：各種アウトプットメトリクスを使用した、ＨＭＣＰ法及びＣＬＥ法の比較
図１７は、ＨＭＣＰ法とＣＬＥ法との間の定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）による６個の５−ｈｍＣ／２個の５−ｈｍＣの濃縮比の比較を示す。ＣＬＥ法は、ＨＭＣＰ法と比較した場合に、好適にも、高密度の５−ヒドロキシメチル化シトシン（５−ｈｍＣ）を有する領域を有する配列に対するＰＣＲの偏りを軽減し得る。例えば、少なくとも約４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個又はそれ以上の５−ｈｍＣを有する配列は、高密度領域であり得る。幾つかの場合において、４個、６個、８個、１０個、１２個、１６個、１８個、２０個、２４個、４８個又はそれ以上の塩基につき少なくとも約４個の５−ｈｍＣを有する配列は、高密度領域であり得る。図１７において、ｑＰＣＲを利用して、２個の５−ｈｍＣ及び６個の５−ｈｍＣのスパイクインコントロールの特定の濃縮を定量化し得る。図１７は、ＣＬＥ法を用いた２個の５−ｈｍＣ及び６個の５−ｈｍＣの同等の濃縮を示す。幾つかの場合において、ＣＬＥ法は、２個の５−ｈｍＣと比較した場合、６個の５−ｈｍＣの少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又はそれ以上の濃縮を提供し得る。幾つかの場合において、ＣＬＥ法は、２個の５−ｈｍＣと比較した場合、６個の５−ｈｍＣの約８０％〜１００％の濃縮を提供し得る。幾つかの場合において、ＣＬＥ法は、２個の５−ｈｍＣと比較した場合、６個の５−ｈｍＣの約９０％〜１００％の濃縮を提供し得る。幾つかの場合において、ＣＬＥ法は、２個の５−ｈｍＣと比較した場合、６個の５−ｈｍＣの約９５％〜１００％の濃縮を提供し得る。
【０２８２】
対比して、図１７は、ＨＭＣＰ法に関しては、２個の５−ｈｍＣと比較した場合、６個の５−ｈｍＣの約１０％のみの濃縮を示す。幾つかの場合において、ＨＭＣＰ法は、２個の５−ｈｍＣと比較した場合、６個の５−ｈｍＣの約３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％未満又はそれより低い濃縮を提供し得る。幾つかの場合において、ＨＭＣＰ法は、２個の５−ｈｍＣと比較した場合、６個の５−ｈｍＣの約１％〜約１０％の濃縮を提供し得る。幾つかの場合において、ＨＭＣＰ法は、２個の５−ｈｍＣと比較した場合、６個の５−ｈｍＣの約１％〜約５％の濃縮を提供し得る。幾つかの場合において、ＨＭＣＰ法は、２個の５−ｈｍＣと比較した場合、６個の５−ｈｍＣの約１％〜約２０％の濃縮を提供し得る。
【０２８３】
図１８は、ＨＭＣＰ法とＣＬＥ法との間の遺伝子間領域に位置するリードに対する、遺伝子内部に位置するリードの比の比較を示す。遺伝子間領域に位置するリードに対する、遺伝子内部に位置するリードの量の比は、所与の方法における５−ｈｍＣの濃縮のレベルを反映し得る。図１８に示されるように、ＣＬＥ法は、組織ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、例えば、結腸腫瘍組織及び正常な結腸組織において、ＨＭＣＰ法よりも優れている。同様に、ＣＬＥ法は、図１８においてＲＡＮ０６２、ＲＮＡ４０６、ＲＮＡ５８６、及びＲＡＮ０９６として同定される４個の異なるセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）試料において、ＨＭＣＰ法よりも優れている。
【０２８４】
図１９は、ＨＭＣＰ法とＣＬＥ法との間でのカバーされるゲノムのパーセントの比較を示す。幾つかの場合において、５−ｈｍＣは、比較的稀な修飾であり得る。幾つかの場合において、ゲノムの大領域が、この修飾に欠けている可能性がある。したがって、所与の方法は、シーケンシングされたリードが、ｈｇ３８等の参照アッセンブリーの後にマッピングされる場合、カバーされていないゲノムの相当な領域を残し得る。例えば、結腸腫瘍組織及び正常な結腸組織からの剪断された全ゲノムＤＮＡ（ｗｇＤＮＡ）１０ナノグラム（ｎｇ）を、ＨＭＣＰ法及びＣＬＥ法を使用して解析する。マッピングされたリードによってカバーされるゲノムのパーセントを、図１９のヒストグラムに示す。例えば、図１９に示されるように、ＨＭＣＰ法が使用される場合の約５５％〜約６５％と比較して、ＣＬＥ法が使用される場合、ゲノムの約８％〜約２０％がカバーされ得る。図１９において「インプット」を表す棒は、如何なる濃縮の非存在下で、どのようにリードがゲノムにかかってくるかに関する。幾つかの場合において、これにより、ＨＭＣＰ法は通常、インプットに類似して、検出可能なバックグラウンドカバレッジを残し得るのに対して、これは、ＣＬＥ法が使用される場合に、有効に低減され得ることが示され得る。
【０２８５】
幾つかの場合において、ＣＬＥ法が使用される場合、ゲノムの約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、又は３０％未満がカバーされ得る。幾つかの場合において、ＣＬＥ法が使用される場合、ゲノムの約１％〜約３０％がカバーされ得る。幾つかの場合において、ＣＬＥ法が使用される場合、ゲノムの約１％〜約２０％がカバーされ得る。幾つかの場合において、ＣＬＥ法が使用される場合、ゲノムの約１％〜約１５％がカバーされ得る。幾つかの場合において、ＣＬＥ法が使用される場合、ゲノムの約１％〜約１０％がカバーされ得る。幾つかの場合において、ＣＬＥ法が使用される場合、ゲノムの約５％〜約２５％がカバーされ得る。
【０２８６】
幾つかの場合において、ＨＭＣＰ法が使用される場合、ゲノムの約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、又は９０％超がカバーされ得る。幾つかの場合において、ＨＭＣＰ法が使用される場合、ゲノムの約５０％〜約８５％がカバーされ得る。幾つかの場合において、ＨＭＣＰ法が使用される場合、ゲノムの約５０％〜約８０％がカバーされ得る。幾つかの場合において、ＨＭＣＰ法が使用される場合、ゲノムの約５０％〜約７０％がカバーされ得る。幾つかの場合において、ＨＭＣＰ法が使用される場合、ゲノムの約６０％〜約８０％がカバーされ得る。幾つかの場合において、ＨＭＣＰ法が使用される場合、ゲノムの約６０％〜約９０％がカバーされ得る。
【０２８７】
図２０〜図２５において、特定の遺伝子座で種々の方法の効果を強調し得る例に関して、類似のＩｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｖｉｅｗｅｒ（ＩＧＶ）スクリーンショットを検査する。図２０〜図２５におけるデータは、正常な結腸組織及び結腸腫瘍組織から抽出される全ゲノムＤＮＡ（ｗｇＤＮＡ）に関してＨＭＣＰ法及びＣＬＥ法を比較するＩＧＶスクリーンショットから得られる。また、任意の濃縮／プルダウン工程の非存在下でのリードの分布を示す各ＤＮＡ供給源に関するインプット試料が示される。幾つかの場合において、腫瘍細胞ＤＮＡは、相当する正常組織よりも著しく低い５−ｈｍＣを有する場合があり、これは、展開される方法に関わらず、ゲノムのほとんどの表示において反映され得る。別記しない限り、図２０〜図２５のデータは全て、０個〜５０個のリードの縦軸方向のスケーリングを用いたＩｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｖｉｅｗｅｒ（ＩＧＶ）プロットである。データは、１５０塩基対（ｂｐ）の断片サイズに剪断されて、ＨＭＣＰ法又はＣＬＥ法に従って処理される関連するインプットＤＮＡ  １０ナノグラム（ｎｇ）を用いて作成される。
【０２８８】
図２０は、ベータ−アクチン（ＡＣＴＢ）遺伝子座でＨＭＣＰ法及びＣＬＥ法を比較するＩＧＶスクリーンショットを示す。この例では、腫瘍ＤＮＡにおける５−ｈｍＣピーク（点線の四角）は、正常組織よりも明白である場合があり、これは、使用する方法に関わらず観察され得る。実線の四角において、隣接するＦＸＢＬ１８遺伝子の開始時の５−ｈｍＣの欠如は、ＨＭＣＰ法よりもＣＬＥ法において遥かに明確であり得る。後者は、シグナル：ノイズ比を低減し得るインプットに類似したレベルで、バックグラウンドリードを有し得る。
【０２８９】
図２１は、ＮａＣＣ２遺伝子座の開始時に、ＨＭＣＰ法及びＣＬＥ法を比較するＩＧＶスクリーンショットを示す。図２１において、縦軸は、各パネルにおいて１５０個のリードに再設定されている。図２１において、ＮＡＣＣ２遺伝子座の開始が示される。この遺伝子は、ＭＤＭ２を介してｐ５３を安定化する転写コリプレッサーをコードする。ＣＬＥ法は、健常な結腸全ゲノムＤＮＡ（ｗｇＤＮＡ）（実線の四角）における第１のエクソンにある大きなピークを含む遺伝子全体にわたる差次的な５−ｈｍＣの程度を示す。ＨＭＣＰ法は、このレベルの精度（granularity）を明らかにすることはできず、代わりに、遺伝子にわたるより均一の分布を実証する。腫瘍ＤＮＡにおけるこの遺伝子の５−ｈｍＣの損失は、悪性形質転換に寄与している可能性がある転写制御の損失、又は悪性形質転換の結果を反映し得る。ＣＬＥ法は、ＨＭＣＰ法が強調しないようなこの特定のゲノム領域において腫瘍ＤＮＡと正常ＤＮＡとの間の差を強調する。幾つかの場合において、ＣＬＥ法は、ＨＭＣＰ法よりも優れている場合があり、遺伝子全体にわたって１個以上のエピジェネティック修飾の分布のより高レベルの精度を提供する。
【０２９０】
図２２は、６番染色体上のＤＬＬ１遺伝子及び隣接する遺伝子座のＨＭＣＰ法及びＣＬＥ法を比較するＩＧＶスクリーンショットを示す。点線の四角で囲まれた領域において、ＣｐＧモチーフは非常に少なく、したがって、限局的な過剰ヒドロキシメチル化と関連付けられない限りは、この領域では、リードは、ほとんど期待されない可能性がある。ＣＬＥ法は、この領域において、事実上リードを示さないのに対して、ＨＭＣＰ法は、カバレッジの「インプット」レベルに類似するリードの散乱を有する。
【０２９１】
図２３は、より高い解像度で、９番染色体上の領域のＨＭＣＰ法及びＣＬＥ法を比較するＩＧＶスクリーンショットを示す。ここで、ＣｐＧ低密度の領域（点線の四角）は、ＣＬＥ法が使用される場合、ＨＭＣＰ法と比較して、遥かに少ないバックグラウンドリードを誘引し得る。実線の四角におけるより強力な５−ｈｍＣピークは、両方の方法で獲得される。
【０２９２】
図２４は、低密度のＣｐＧ分布を有するＣｈｒ９の別の領域のＨＭＣＰ法及びＣＬＥ法を比較するＩＧＶスクリーンショットを示す。さらに、ＣＬＥ法は、好適には、「インプット様」カバレッジを付与するＨＭＣＰ法とは異なり、この領域ではリードを回収しない。図２４において、縦軸は、１５個のリードに対して縮尺して、低レベルのカバレッジを強調する。
【０２９３】
図２５は、ヒトＣｈｒ１７の７８５ｂｐ領域のＨＭＣＰ法及びＣＬＥ法を比較するＩＧＶスクリーンショットを示し、ここで、ＣｐＧアイランド間に大きなギャップが存在する（およそ７５０塩基対（ｂｐ）；ＣｐＧモチーフは、最下の横軸のトラックにおける２つのドットを特徴とする（「ｃｄ」と標識される））。縦軸は、これらのパネルにおいて０〜１０に設定される。ＣｐＧモチーフの非存在に起因して、リードがプルダウンされ得ないこの領域では、ＨＭＣＰ法は、インプット試料に類似したレベルのカバレッジを有するリードをプルダウンするのに対して、ＣＬＥ法は、好適には、腫瘍又は健常な組織に対して実質的にリードをプルダウンしない。
【０２９４】
図２６は、約１％小脳という低いレベルでＮＡ１２８７８由来のピークのコンテキストにおいて検出され得る脳特異的５−ｈｍＣピークのＩＧＶのスクリーンショットを示す。ＣＬＥ法は、好適的には、無関係の細胞系統由来の全ゲノムＤＮＡ（ｗｇＤＮＡ）試料（ＮＡ１２８７８）へスパイクされた微量の小脳ＤＮＡを検出し得る。参照データセットは、小脳ＤＮＡ約１０ナノグラム（ｎｇ）（１００％小脳）を使用して、二重反復で作成される。量を減少させた小脳ＤＮＡを、ＮＡ１２８７８  ｗｇＤＮＡ約１０ｎｇへスパイクして、ＣＬＥ法を使用して、５−ｈｍＣでプルダウンする。図２６のＩＧＶスクリーンショットは、脳特異的５−ｈｍＣピーク（点線の四角）が、約１％小脳（１０ｎｇ中に１００ピコグラム（ｐｇ））程度と低いレベルでＮＡ１２８７８由来のピーク（例えば、実線の四角で示されるピーク）のコンテキストで検出され得ることを示す。
【０２９５】
図２７は、血漿ＤＮＡを使用したＨＭＣＰ法及びＣＬＥ法の散布図の比較を示す。同じ生物学的試料を、標準的なＨＭＣＰ法（ＲＰＫＭ１）又はＣＬＥ法（ＲＰＫＭ２）で解析し得る。ＣＬＥ法は、好適には、標準的なＨＭＣＰ法（黒色）よりも実質的に幅広い振幅（点線）を有し得る。図２７は、各ポイントが、プルダウン実験における各遺伝子に関するマッピングされた百万リード当たりのキロベース当たりのリード（ＲＰＫＭ）値のｌｏｇ２を表す平滑な散布図を示す。ＣＬＥ法（ｙ軸）は、同じ組の遺伝子にわたるＨＭＣＰ法（ｘ軸）の振幅と比較した場合に、より幅広い振幅（より広範囲のダイナミックレンジ）を有する。ＣＬＥ法におけるより広範囲のダイナミックレンジは、下限にあるバックグラウンド及び／又は上限にあるシグナル飽和によって制限され得る方法であるＨＭＣＰ法のより狭いレンジを上回る改善が見られ得る。
【０２９６】
図２８は、種々のＣｐＧ密度にわたるＨＭＣＰ法とトゥルーメチル・ホール・ゲノム（ＴＭＷＧ）との間の相関関係を強調するＩＧＶスクリーンショットを示す。ＩＧＶスクリーンショットは、種々のＣｐＧ密度全体のＨＭＣＰ法（上から３つまでのトラック）とトゥルーメチル・ホール・ゲノム（ＴＭＷＧ）との間の相関関係を強調する。ヒトゲノムの２００キロベース（Ｋｂ）領域における最下のパネルは、遺伝子のＨＯＸクラスター（最下のトラック）に相当する。ＣＬＥ法（上から２つまでのトラック）は、ＨＭＣＰ法（第３のトラック）よりも鋭くてきれいなピークを示す。最高のＣＬＥピークは、トゥルーメチル・ホール・ゲノム（最下のトラック）からの５−ｈｍＣの最高の％に相当し、高いピークは、ＴＭＷＧにおいて、より低い％の５−ｈｍＣでＣｐＧに関して比較的低い場合がある。
【０２９７】
図２９は、ＨＭＣＰ法とＣＬＥ法との間のヒートマップに関するマッピングされた百万リード当たりのキロベース当たりのリード（ＲＰＫＭ）値の比較を示す。トゥルーメチル・ホール・ゲノムＢＳ／ｏｘＢＳ  ＭＬＭＬサブトラクション（小脳）における約８０％〜１００％の５−ｈｍＣからのウィンドウに関するＲＰＫＭ値（調節されたリード数）。ヒートマップは、種々の条件（暗くて高いＲＰＫＭ値／明るくて低いＲＰＫＭ値）にわたるＲＰＫＭを示す。ＣＬＥ法は、ＨＭＣＰ法よりも、またトゥルーメチル・ホール・ゲノム（小脳）における高い５−ｈｍＣに相当する領域に関するインプット（プルダウンなし）ヌル状態に対してより高いＲＰＫＭを有する。
【０２９８】
図３０は、多次元尺度構成法（ＭＤＳ）プロットを示す。ＭＤＳプロットは、出発材料約１０ナノグラム（ｎｇ）又は約１００ｎｇを用いた、ＮＡ１２８７８末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）細胞系統ｇＤＮＡのバックグラウンドへの小脳組織ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）のタイトレーションからの試料、並びに組織正常結腸試料及び腫瘍結腸試料についての遺伝子内部にわたるリード数の類似性レベルを示す。ＣＬＥ法のタイトレーション（高密度の最上列及び中央の点線列）は、約１０ｎｇ（ｂ）及び約５ｎｇ（ｃ）から、約１ｎｇ（ｄ）及び約０．５ｎｇ（ｅ）へと、さらに約０．１ｎｇ（ｆ）及び約０．０１ｎｇ（ｇ）へと、純粋な小脳試料（ａ）との類似性の指数関数的減衰を示し、約０．０１ｎｇ（ｇ）が、純粋なＮＡ１２８７８（ｈ）に最も近い。ＨＭＣＰ法で使用される同じ材料は、純粋な試料（最下の点線）との類似性の一致をあまり示さない。ＭＤＳ次元２（ｙ軸）は、組織によって試料を分類し、ｙ軸に沿って小脳と分離された結腸試料／ＮＡ１２８７８試料を示す。
【０２９９】
図３１Ａ〜図３１Ｃは、ＴＭＷＧ％５−ｈｍＣ（２５．０１％〜９９．９９％）及びＨＭＣＰ遺伝子内部ＲＰＫＭのＱ−Ｑプロットを示す。図３１Ａは、ＴＭＷＧにおいて％を増加させた５−ｈｍＣと一致する高いＲＰＫＭ値（ログスケール）を用いたＣＬＥ法を示す。図３１Ｂは、約０．５ｎｇ小脳を用いたＣＬＥ法を示し、％を増加させた５−ｈｍＣと良好な一致を示すが、全体的なＲＰＫＭ（ログスケール）は減少する。図３１Ｃは、約０．５ｎｇ小脳を用いたＨＭＣＰ法を示し、ＴＭＷＧに対するＲＰＫＭ（ログスケール）のより平坦な一致を示す。
【０３００】
図３２Ａ及び図３２Ｂは、ＨＭＣＰ法及びＣＬＥ法に関するシーケンスリード濃縮の比較を示す。図３２Ａ及び図３２Ｂに示されるように、濃縮されているより高い割合のシーケンシングされたリードによって決定されるように、ＣＬＥ法のプルダウン効率は、好適には、ＨＭＣＰ法よりも高い。曲線は、或る割合のリードが、濃縮外で費やされる（図３２Ａ、破線〜点線）ＨＭＣＰ法（図３２Ａ）と比較して、ゲノムの約２０％（図３２Ｂ、点線）でシーケンシングリードを濃縮するＣＬＥ法（図３２Ｂ）を示す。
【０３０１】
図３３は、ヒトゲノムの３３１１個の機能的領域に関する多次元尺度構成法（ＭＤＳ）プロットを示す。この図は、ＣＬＥ法（ｖ２、三角）が、ＨＭＣＰ法（ｖ１、丸）と比較した場合に、結腸直腸癌ｃｆＤＮＡ試料（ＣＲＣ、黒丸）と、健常なボランティアセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）試料（ＨＶ、灰色丸）とのより良好な分離を提供することを明示する。ｇｅｎｅｈａｎｃｅｒデータベース（ＥＮＣＯＤＥ、Ｅｎｓｅｍｂｌ、ＦＡＮＴＯＭ及びＶＩＳＴＡのデータセットの比較）によって注解されるように、ヒトゲノムの３３１１個の機能的領域を使用して、ＭＤＳプロットが行われる。
【０３０２】
ＭＤＳプロットは、二次元空間において、データセット中の試料間の類似性を可視化する方法であり得る。各ポイントは、１個の試料を表し得て、それは、その臨床的識別子及び使用される方法（例えば、ＨＭＣＰ法又はＣＬＥ法）によって標識され得る。プロットは、最上の様々な特徴のプルダウン：インプットのＲＰＫＭ比に基づき得る。距離行列として表されるユークリッド距離は、データの変動に基づいて、試料間で算出され得る。このアプローチを使用して、ＭＤＳプロット上のポイントの座標を創出し得る。幾つかの場合において、ＭＤＳプロット上で互いに近い場合がある２つのポイントは、互いに遠い場合がある２つのポイントよりも、それらのＲＰＫＭ濃縮プロファイルにおいて、より密接に関連され得る。
【０３０３】
好ましい実施形態を本明細書中に図示及び記載してきたが、かかる実施形態は、単なる例の目的で提供されることは、当業者に明らかである。本開示は、本明細書内に提供される具体例によって限定されると意図されない。本開示は、上述の明細書を参照して記載されてきたが、本明細書中の実施形態の説明及び図解は、限定的な意味で解釈されると意図されない。さらに、本明細書に記載される態様は全て、様々な条件及び変数に依存する本明細書に記載される特定の描写、形態又は相対的比率に限定されないことが理解されよう。本明細書に記載される実施形態に対する様々な代替物が用いられ得ることが理解されるべきである。したがって、本開示はまた、任意のかかる代替形態、変更形態、変動形態又は等価形態を網羅すると意図される。添付の特許請求の範囲は、本開示の範囲を規定し、これらの特許請求の範囲及びその等価体の範囲内の方法及び構造が、本開示により網羅されると意図される。
【図１】
2020520243.tif 000014
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３１Ｃ】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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