(57)【要約】本発明は、イミダゾキノリン系トル様受容体７又は８アゴニスト及びオイルを含むオイル層を含むナノエマルジョン、及びそのアジュバント及びワクチンへの用途に関し、本発明によれば、難溶性のイミダゾキノリン系物質を分散媒介体物質を利用してオイルに溶解させ、該オイル溶液を容易でかつ再現性よく水溶性に分散させることができるナノエマルジョン形態のワクチンアジュバントを提供することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
イミダゾキノリン系トル様受容体７又は８アゴニスト及びオイルを含むオイル層を含むナノエマルジョン。
【請求項２】
前記イミダゾキノリン系トル様受容体７又は８アゴニストは、ナノサイズのオイル層の内部に分散していることを特徴とする請求項１に記載のナノエマルジョン。
【請求項３】
前記界面活性剤、及び免疫活性化物質よりなる群から選ばれる一つ以上が、前記オイル層の外部にコートされていることを特徴とする請求項２に記載のナノエマルジョン。
【請求項４】
前記イミダゾキノリン系トル様受容体７又は８アゴニストは、イミキモド（Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ）、レシキモド（Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ）、ダクトリシブ（Ｄａｃｔｏｌｉｓｉｂ）、ガルジキモド（Ｇａｒｄｉｑｕｉｍｏｄ）、スマニロール（Ｓｕｍａｎｉｒｏｌｅ）、モトリモド（ｍｏｔｏｌｉｍｏｄ）、及びこれらの類似体（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）よりなる群から選ばれることを特徴とする請求項１に記載のナノエマルジョン。
【請求項５】
前記オイルは、魚類由来オイル、動物性由来オイル、植物性由来オイル、トコフェロール、ミネラルオイル、及びキャスターオイルよりなる群から選ばれることを特徴とする請求項１に記載のナノエマルジョン。
【請求項６】
前記動物性由来オイルは、スクアレンであり、植物性由来オイルは、オレイン酸であることを特徴とする請求項５に記載のナノエマルジョン。
【請求項７】
前記イミダゾキノリン系トル様受容体７又は８アゴニストとオイルは、０．１：１００乃至１：５０の重量比で含まれることを特徴とする請求項１に記載のナノエマルジョン。
【請求項８】
前記イミダゾキノリン系トル様受容体７又は８アゴニストとオイルとの間に親油性相互作用を助ける媒介体物質をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載のナノエマルジョン。
【請求項９】
前記媒介体物質は、ミリストオレイン酸、パルミトレイン酸、サピエン酸（Ｓａｐｉｅｎｉｃ  ａｃｉｄ）、オレイン酸、エライジン酸（Ｅｌａｉｄｉｃ  ａｃｉｄ）、バクセン酸（Ｖａｃｃｅｎｉｃ  ａｃｉｄ）、リノール酸、リノールエライジン酸（Ｌｉｎｏｅｌａｉｄｉｃ  ａｃｉｄ）、アルファ−リノール酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸（Ｅｉｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、エルカ酸（Ｅｒｕｃｉｃ  ａｃｉｄ）、ドコサヘキサエン酸（Ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、カプリル酸（Ｃａｐｒｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）、カプリン酸（Ｃａｐｒｉｃ  ａｃｉｄ）、ラウリン酸（Ｌａｕｒｉｃ  ａｃｉｄ）、ミリスチン酸（Ｍｙｒｉｓｔｉｃ  ａｃｉｄ）、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸（Ａｒａｃｈｉｄｉｃ  ａｃｉｄ）、ベヘン酸（Ｂｅｈｅｎｉｃ  ａｃｉｄ）、リグノセリン酸（Ｌｉｇｎｏｃｅｒｉｃ  ａｃｉｄ）、及びセロチン酸（Ｃｅｒｏｔｉｃ  ａｃｉｄ）よりなる群から選ばれることを特徴とする請求項８に記載のナノエマルジョン。
【請求項１０】
前記媒介体物質は、前記イミダゾキノリン系トル様受容体７又は８アゴニストと０．１：１０乃至１０：０．１の重量比で含まれることを特徴とする請求項８に記載のナノエマルジョン。
【請求項１１】
前記界面活性剤は、ポリソルベート２０及びポリソルベート８０を含むポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ）；
エチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）及びブチレンオキシド（ＢＯ）のうち一つ以上を含むコポリマー；
トリトンＸ−１００及びｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノールを含むオクトキシノール；
（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール；
ホスファチジルコリン（レシチン）ホスファチジルエタノールアニリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリン及びカルジオリピンを含むホスホリピッド；
ノニルフェノールエトキシレート；
トリエチレングリコールモノラウリルエーテルを含むラウリル、セチル及びオレイルアルコールに由来するポリオキシエチレン脂肪酸エーテル；及び
ソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ８５）及びソルビタンモノラウレートを含むソルビタンエステル（ＳＰＡＮ）
よりなる群から選ばれることを特徴とする請求項３に記載のナノエマルジョン。
【請求項１２】
前記免疫活性化物質は、トル様受容体アゴニスト（ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｇｏｎｉｓｔ、ＴＬＲ）、サポニン、抗ウイルス性ペプチド、インフラマソームインデューサー（ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ  ｉｎｄｕｃｅｒ）、ＮＯＤリガンド（ＮＯＤ  ｌｉｇａｎｄ）、ＣＤＳリガンド（ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ  ＤＮＡ  ｓｅｎｓｏｒ  ｌｉｇａｎｄ）、ＳＴＩＮＧ（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｇｅｎｅｓ）リガンド、及びカチオン性脂質（ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｉｄｓ）よりなる群から選ばれることを特徴とする請求項３に記載のナノエマルジョン。
【請求項１３】
請求項１乃至１２のいずれかに記載のナノエマルジョンを含むアジュバント組成物。
【請求項１４】
請求項１３に記載のアジュバント組成物、及び抗原を含むワクチン組成物。
【請求項１５】
前記抗原は、タンパク質、組み換えタンパク質、糖タンパク質、遺伝子、ペプチド、多糖類、脂質多糖類、ポリヌクレオチド、細胞、及びウイルスよりなる群から選ばれることを特徴とする請求項１４に記載のワクチン組成物。
【請求項１６】
ａ）イミダゾキノリン系トル様受容体７又は８アゴニストをオイルに溶解させて、オイル溶液を製造する段階と；
ｂ）界面活性化剤及び免疫活性化物質よりなる群から選ばれる一つ以上を、前記オイル溶液と混合する段階と；
ｃ）前記段階ｂ）で収得した混合溶液を水溶液に分散する段階と；を含むナノエマルジョンの製造方法。
【請求項１７】
前記オイル溶液の製造段階でイミダゾキノリン系トル様受容体７又は８アゴニストとオイルとの間に親油性相互作用を助ける媒介体物質をオイルにさらに溶解させることを特徴とする請求項１６に記載のナノエマルジョンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イミダゾキノリン系トル様受容体７又は８アゴニスト及びオイルを含むオイル層を含むナノエマルジョン、及びそのアジュバント及びワクチンへの用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
ワクチンアジュバントは、免疫増強補助剤であって、免疫細胞を活性化させて感染性疾患の予防／治療ワクチン及び抗癌治療において重要な役割をする。従来のワクチンにおいてアジュバントとして使用される免疫補助剤であるアルミニウム塩（ａｌｕｍｉｎｕｍ  ｓａｌｔ，ａｌｕｍ）やスクアレンナノエマルジョン（ｓｑｕａｌｅｎｅ−ｂａｓｅｄ  ｎａｎｏｅｍｕｌｓｉｏｎ、ＭＦ５９、ＡＳ０３、ＡＦ０３など）は、抗体反応に寄与する体液性免疫反応（ｈｕｍｏｒａｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ）の向上を誘導するのに効果的であるが、ウイルス及び癌抗原に対する細胞性免疫反応（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ）を誘導する効能には限界があるという致命的な短所がある。そのため、ナノエマルジョン基盤アジュバントは、インフルエンザ予防ワクチンにのみその利用が制限的である。
【０００３】
最近には、Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、ＨＩＶ、Ｍａｌａｒｉａ、Ｚｏｓｔｅｒ及び癌ワクチンなどでは、体液性免疫及び細胞性免疫効果を同時に効果的に誘導できるワクチンアジュバントの開発が要求されている。細胞性免疫を誘導するために、多様なトル様受容体リガンドなどが使用されている。一例として、ＧＳＫでは、ａｌｕｍとトル様受容体４（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４）のリガンドであるＭＰＬＡを混合したＡＳＯ４アジュバントを製造して、子宮頸癌ワクチンとして商用化した例がある。また、スクアレンナノエマルジョンの外部にＭＰＬＡとサポニン系であるＱＳ２１をコートしたＡＳ０２を開発し、臨床試験中にある。一方、韓国特許登録第１０−１５７７９５５号は、負電荷性高分子及びトル様受容体アゴニスト（ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｇｏｎｉｓｔ）の複合体、及びコラゲン系物質又はゼラチン系物質を含むアジュバント組成物を開示し、このようなアジュバント組成物は、温度変化によって多段階相転移特性を有することを開示している。一方、細胞性免疫反応を誘導する免疫補助剤として知られたイミダゾキノリン（Ｉｍｉｄａｚｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ）系薬物（例えば、Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ（イミキモド）、Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ（レシキモド）、Ｄａｃｔｏｌｉｓｉｂ（ダクトリシブ）、Ｇａｒｄｉｑｕｉｍｏｄ（ガルジキモド）、Ｓｕｍａｎｉｒｏｌｅ（スマニロール）など）は、トル様受容体７又は８リガンドであって、ワクチンアジュバントとして有用な特性を持っている。
【０００４】
しかしながら、イミダゾキノリン系物質は、その分子構造に起因して水溶液に分散するのに多くの困難がある。特に、イミキモド（Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ、Ｒ８３７）は、ＤＭＳＯを除いた大部分の有機溶剤にも溶解しないので、多様な剤形への製造に多くの限界がある。このような理由によって、イミキモドは、多様な界面活性化剤を混合したクリーム形態の剤形（製品名：３Ｍ社のＡｌｄａｒａ(R)）で商用化されているのが現状である。そして、塩形態（例えば、ＨＣｌ）のイミダゾキノリン系薬物は、水溶液に可溶化され得るが、薬物が全身に吸収されて多くの毒性効果及び副作用を招くので、ワクチンアジュバント形態として適していないという問題点があった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、水溶液に可溶化されにくいイミダゾキノリン系トル様受容体７又は８アゴニストを分散媒介体物質を使用してオイルに溶解させ、該オイル混合物をナノエマルジョン形態で製造することによって、難溶性のイミダゾキノリン系の免疫学的特性及びオイル基盤ナノエマルジョンの免疫学的特性を同時に有する免疫活性化物質を開発し、体液性免疫だけでなく、細胞性免疫を向上させるアジュバント及びワクチン用途に使用することができることを知見して、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、イミダゾキノリン系トル様受容体７又は８アゴニスト及びオイルを含むオイル層を含むナノエマルジョンを提供する。
【０００７】
そして、前記イミダゾキノリン系トル様受容体７又は８アゴニストは、ナノサイズのオイル層の内部に分散しているものであってもよい。
【０００８】
また、前記界面活性剤、及び免疫活性化物質よりなる群から選ばれる一つ以上が前記オイル層の外部にコートされていてもよい。
【０００９】
また、前記イミダゾキノリン系トル様受容体７又は８アゴニストは、イミキモド（Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ）、レシキモド（Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ）、ダクトリシブ（Ｄａｃｔｏｌｉｓｉｂ）、ガルジキモド（Ｇａｒｄｉｑｕｉｍｏｄ）、スマニロール（Ｓｕｍａｎｉｒｏｌｅ）、モトリモド（ｍｏｔｏｌｉｍｏｄ）、３Ｍ社の３Ｍ−０５２，Ｓ−３４２４０，８５２，８５４−Ａ、及びこれらの類似体（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）よりなる群から選ばれもよい。
【００１０】
そして、前記オイルは、魚類由来オイル、動物性由来オイル、植物性由来オイル、トコフェロール、ミネラルオイル、及びキャスターオイルよりなる群から選ばれる。
【００１１】
また、前記イミダゾキノリン系トル様受容体７又は８アゴニストとオイルは、０．１：１００乃至１：５０の重量比で含まれ得る。
【００１２】
一方、前記イミダゾキノリン系トル様受容体７又は８アゴニストとオイルとの間に親油性相互作用を助ける媒介体物質をさらに含むことができる。
【００１３】
そして、前記媒介体物質は、ミリストオレイン酸、パルミトレイン酸、サピエン酸（Ｓａｐｉｅｎｉｃ  ａｃｉｄ）、オレイン酸、エライジン酸（Ｅｌａｉｄｉｃ  ａｃｉｄ）、バクセン酸（Ｖａｃｃｅｎｉｃ  ａｃｉｄ）、リノール酸、リノールエライジン酸（Ｌｉｎｏｅｌａｉｄｉｃ  ａｃｉｄ）、アルファ−リノール酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸（Ｅｉｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、エルカ酸（Ｅｒｕｃｉｃ  ａｃｉｄ）、ドコサヘキサエン酸（Ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、カプリル酸（Ｃａｐｒｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）、カプリン酸（Ｃａｐｒｉｃ  ａｃｉｄ）、ラウリン酸（Ｌａｕｒｉｃ  ａｃｉｄ）、ミリスチン酸（Ｍｙｒｉｓｔｉｃ  ａｃｉｄ）、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸（Ａｒａｃｈｉｄｉｃ  ａｃｉｄ）、ベヘン酸（Ｂｅｈｅｎｉｃ  ａｃｉｄ）、リグノセリン酸（Ｌｉｇｎｏｃｅｒｉｃ  ａｃｉｄ）、及びセロチン酸（Ｃｅｒｏｔｉｃ  ａｃｉｄ）よりなる群から選ばれる。
【００１４】
また、前記媒介体物質は、前記イミダゾキノリン系トル様受容体７又は８アゴニストと０．１：１０乃至１０：０．１の重量比で含まれ得る。
【００１５】
そして、前記界面活性剤は、ポリソルベート２０及びポリソルベート８０を含むポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ）；エチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）及びブチレンオキシド（ＢＯ）のうち一つ以上を含むコポリマー；トリトンＸ−１００及びｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノールを含むオクトキシノール；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール；ホスファチジルコリン（レシチン）ホスファチジルエタノールアニリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリン及びカルジオリピンを含むホスホリピッド；ノニルフェノールエトキシレート；トリエチレングリコールモノラウリルエーテルを含むラウリル、セチル及びオレイルアルコールに由来するポリオキシエチレン脂肪酸エーテル；及びソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ８５）及びソルビタンモノラウレートを含むソルビタンエステル（ＳＰＡＮ）よりなる群から選ばれる。
【００１６】
そして、前記免疫活性化物質は、トル様受容体アゴニスト（ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｇｏｎｉｓｔ，ＴＬＲ）、サポニン、抗ウイルス性ペプチド、インフラマソームインデューサー（ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ  ｉｎｄｕｃｅｒ）、ＮＯＤリガンド（ＮＯＤ  ｌｉｇａｎｄ）、ＣＤＳリガンド（ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ  ＤＮＡ  ｓｅｎｓｏｒ  ｌｉｇａｎｄ）、ＳＴＩＮＧ（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｇｅｎｅｓ）リガンド、及びカチオン性脂質（ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｉｄｓ）よりなる群から選ばれる。
【００１７】
本発明の他の様態によれば、前記ナノエマルジョンを含むアジュバント組成物が提供される。
【００１８】
本発明の他の様態によれば、体液性免疫だけでなく、細胞性免疫を高めるアジュバント組成物、及び抗原を含むワクチン組成物が提供される。
【００１９】
本発明のさらに他の様態によれば、ａ）イミダゾキノリン系トル様受容体７又は８アゴニストをオイルに溶解させてオイル溶液を製造する段階と；ｂ）界面活性化剤及び免疫活性化物質よりなる群から選ばれる一つ以上を、前記オイル溶液と混合する段階と；ｃ）前記ｂ段階で収得した混合溶液を水溶液に分散する段階と；を含むナノエマルジョンの製造方法が提供される。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によるイミダゾキノリン系トル様受容体７又は８アゴニスト及びオイルを含むオイル層を含むナノエマルジョンは、感染性疾患の予防、治療ワクチン及び免疫抗癌治療において重要な役割をする免疫細胞の活性化に使用されるエマルジョン形態のワクチンアジュバントを提供することができ、また、分散媒介体物質を利用してイミダゾキノリン系物質をスクアレンのようなオイルに安定に分散させ、このように製造されたオイル層を最終的にエマルジョン形態で製造することによって、大部分の有機溶媒と水溶液に難溶性であるイミダゾキノリン系物質を利用したワクチンアジュバントを提供することができる。
【００２１】
一方、本発明のナノエマルジョン形態のアジュバントは、抗原と結合されてワクチンとして使用されるとき、体液性免疫及び細胞性免疫を同時に格別に向上させることができるという効果を有する。
【００２２】
また、本発明によるイミダゾキノリン系トル様受容体７又は８アゴニスト及びオイルを含むオイル層を含むナノエマルジョンは、親油性のイミダゾキノリン系トル様受容体アゴニストがナノエマルジョンの内部であるオイル層から水溶液層に徐放性放出（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ）挙動特性を示すので、体内でゆっくり放出されることによって、細胞性免疫効果を高めながらも、全身毒性の問題を解決することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、本発明の一具現例によるイミダゾキノリン系トル様受容体アゴニスト、分散媒介体物質、オイル、界面活性剤及び免疫活性化物質成分から構成されたナノエマルジョンアジュバント組成物の構造を示す概略図である。
【００２４】
【図２ａ】図２ａは、本発明の一実施例によるナノエマルジョン（ＮＥ）とイミダゾキノリン系トル様受容体アゴニストを含むナノエマルジョン（ＮＥ−ＩＱ）のサイズ及びサイズ分布を測定したデータであって、ＤＬＳ（Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）測定データである。
【００２５】
【図２ｂ】図２ｂは、本発明の一実施例によるナノエマルジョン（ＮＥ）とイミダゾキノリン系トル様受容体アゴニストを含むナノエマルジョン（ＮＥ−ＩＱ）のサイズ及びサイズ分布を測定したデータであって、ＴＥＭ（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）イメージ（ＮＥ−ＩＱ）である。
【００２６】
【図３】図３は、本発明の一実施例によるＮＥ−ＩＱの免疫細胞（ＢＭＤＣ：ｂｏｎｅ−ｍａｒｒｏｗ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ，ＢＭＭＣ：ｂｏｎｅ−ｍａｒｒｏｗ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｅｌｌ）内伝達及び分布を示すもの（ＮＥ−ＩＱ（ＤＩＤ）、Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ（ＦＩＴＣ））であって、ａは、ＢＭＤＣ、ｂは、ＢＭＭＣに関するものである。
【００２７】
【図４】図４は、発明の一実施例によるＮＥ−ＩＱの処理後に、免疫細胞の成熟度と関連したサイトカインの発現量のイミキモド（Ｒ８３７）の濃度依存度を示すものであって、ａは、ＢＭＤＣ、ｂは、ＢＭＭＣに関するグラフである。
【００２８】
【図５】図５は、本発明の一実施例によるＮＥ−ＩＱの処理後に、免疫細胞の成熟度と関連した表面マーカー発現率生存率のＲ８３７の濃度依存度を示すものであって、ａは、ＢＭＤＣ、ｂは、ＢＭＭＣに関するグラフである。
【００２９】
【図６】図６は、本発明の一実施例によるＮＥ−ＩＱの処理後に、２４、４８時間後に免疫細胞の生存率に及ぼす影響を示すものであって、ａは、ＢＭＤＣ、ｂは、ＢＭＭＣに関するグラフである。
【００３０】
【図７】図７は、ＮＥ−ＩＱを筋肉注射後に、発現するＴｙｐｅ  Ｉ  ｉｎｔｅｆｅｒｏｎの一種類であるＩＦＮ−ａｌｐｈａの発現量を示すものである。
【００３１】
【図８】図８は、本発明の一実施例によるＯＶＡ（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）抗原に対するＮＥ及びＮＥ−ＩＱの酵素免疫測定−ＩｇＧ  ｔｉｔｅｒ（３、６、９週）を示すものである。
【００３２】
【図９】図９は、本発明の一実施例によるＯＶＡ（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）抗原に対するＮＥ及びＮＥ−ＩＱの酵素免疫測定−ＩｇＧ１  ｔｉｔｅｒ（３、６、９週）を示すものである。
【００３３】
【図１０】図１０は、本発明の一実施例によるＯＶＡ（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）抗原に対するＮＥ及びＮＥ−ＩＱの酵素免疫測定−ＩｇＧ２ａ  ｔｉｔｅｒ（３、６、９週）を示すものである。
【００３４】
【図１１】図１１は、本発明の一実施例によるＯＶＡ（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）抗原に対するＮＥ及びＮＥ−ＩＱの酵素免疫測定−ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１  ｒａｔｉｏ（３、６、９週）を示すものである。
【００３５】
【図１２】図１２は、ＮＥ−ＩＱを筋肉注射後に、活性化するＣＴＬ免疫反応を測定するためのＩｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｓｃｈｅｄｕｌｅを示すものである。
【００３６】
【図１３】図１３は、本発明の一実施例によるＯＶＡ（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）抗原に対するＮＥ及びＮＥ−ＩＱの細胞性免疫誘導効果（Ｔ細胞活性化によるＩＦＮ−ｇａｍｍａ分泌）を示すものである。
【００３７】
【図１４】図１４は、Ｂ１６Ｆ１０癌細胞移植したマウスにＮＥ−ＩＱをｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎした後に癌細胞の成長を測定した結果である。
【００３８】
【図１５】図１５は、Ｂ１６Ｆ１０癌細胞移植したマウスにＮＥ−ＩＱをｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎした後に、ＣＤ３（＋）ＣＤ４（＋）Ｔ細胞の活性化を測定した結果である。
【００３９】
【図１６】図１６は、Ｂ１６Ｆ１０癌細胞移植したマウスにＮＥ−ＩＱをｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎした後に、ＣＤ３（＋）ＣＤ８（＋）Ｔ細胞の活性化を測定した結果である。
【００４０】
【図１７】図１７は、Ｂ１６Ｆ１０癌細胞移植したマウスにＮＥ−ＩＱをｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎした後に、ＣＤ４（＋）ＩＦＮ−ｇａｍｍａ（＋）細胞の活性化を測定した結果である。
【００４１】
【図１８】図１８は、Ｂ１６Ｆ１０癌細胞移植したマウスにＮＥ−ＩＱをｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎした後に、ＣＤ８（＋）ＩＦＮ−ｇａｍｍａ（＋）細胞の活性化を測定した結果である。
【００４２】
【図１９】図１９は、Ｂ１６Ｆ１０−ＯＶＡ癌細胞移植したマウスに、ＮＥ−ＩＱとオボアルブミン抗原からなるワクチンを投与した後に、抗原特異的に癌細胞の成長が抑制されることを確認した結果である。
【００４３】
【図２０】図２０は、ＥＧ７−ＯＶＡ癌細胞移植したマウスにＮＥ−ＩＱをｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎした後に癌細胞の成長に及ぼす影響を測定した結果である。
【００４４】
【図２１】図２１は、本発明の一実施例によるＯＶＡ（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）抗原に対するＮＥ−ＩＱ系のワクチンアジュバント組成物の細胞性免疫誘導効果（Ｔ細胞活性化によるＩＦＮ−ｇａｍｍａ分泌）を示すものである。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
以下、添付の図面を参照して本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者が容易に実施できるように本発明の具現例及び実施例を詳細に説明する。しかしながら、本発明は、いろいろな異なる形態で具現され得、ここで説明する具現例及び実施例に限定されない。
【００４６】
本発明の明細書全体において、任意の部材が他の部材「上に」位置しているというとき、これは、任意の部材が他の部材に接している場合だけでなく、二つの部材の間にさらに他の部材が存在する場合も含む。本発明の明細書全体において、任意の部分が或る構成要素を「含む」というとき、これは、特に反対される記載がない限り、他の構成要素を除くものではなく、他の構成要素をさらに含むことができることを意味する。本発明の明細書全体において使用される程度の用語「約」、「実質的に」などは、言及された意味に固有な製造及び物質許容誤差が提示されるとき、その数値で又はその数値に近接した意味として使用され、本発明の理解を助けるために、正確であるか又は絶対的な数値が言及された開示内容を非良心的な侵害者が不当に利用するのを防止するために使用される。本発明の明細書全体において使用される用語「〜（する）段階」又は「〜の段階」は、「〜のための段階」を意味しない。
【００４７】
本発明の明細書全体において、マーカッシュ形式の表現に含まれた「これらの組合せ」の用語は、マーカッシュ形式の表現に記載された構成要素よりなる群から選ばれる一つ以上の混合又は組合せを意味するものであって、前記構成要素よりなる群から選ばれる一つ以上を含むことを意味する。
【００４８】
本発明は、イミダゾキノリン系トル様受容体７又は８アゴニスト及びオイルを含むオイル層を含むナノエマルジョンを提供する。
【００４９】
前記ナノエマルジョンにおいて前記イミダゾキノリン系トル様受容体７又は８アゴニストは、ナノサイズのオイル層の内部に分散されており、エマルジョンの外部に界面活性剤、免疫活性化物質又はこれらの組合せがコートされた形態であってもよい（図１）。
【００５０】
図１は、本発明のナノエマルジョンの概略図であって、オイル層の内部にイミダゾキノリン系トル様受容体７又は８アゴニストが分散しており、表面に界面活性剤及び／又は免疫活性化物質がコートされている球形の形態である。ナノエマルジョンのサイズは、約５０乃至５００ｎｍ、例えば、約５０乃至３００ｎｍ、約５０乃至１００ｎｍ、約７０乃至５００ｎｍ、約１００乃至５００ｎｍ又は約１００乃至２００ｎｍであってもよい。
【００５１】
前記ナノエマルジョンは、ａ）イミダゾキノリン系トル様受容体７又は８アゴニストをオイルに溶解させて、オイル溶液を製造する段階と；ｂ）界面活性化剤及び免疫活性化物質よりなる群から選ばれる一つ以上を、前記オイル溶液と混合する段階と；ｃ）前記段階ｂ）で収得した混合溶液を水溶液に分散する段階と；を含んで製造され得る。
【００５２】
前記でイミダゾキノリン系トル様受容体７又は８アゴニストは、親油性相互作用を助ける媒介体物質と共にオイルに溶解されてものであってもよい。
【００５３】
前記免疫活性化物質は、前記ナノエマルジョンの製造過程で界面活性化剤と混合して使用されるか、又はナノエマルジョンを製造した後に、表面に追加的に付着され得る。
【００５４】
前記イミダゾキノリン系トル様受容体７又は８アゴニストとオイルは、０．１：１００乃至１：５０の重量比、例えば、１：２０の重量比で含まれ得る。
【００５５】
前記イミダゾキノリン系トル様受容体７又は８アゴニストは、免疫活性化物質として、イミキモド（Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ）、レシキモド（Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ）、ダクトリシブ（Ｄａｃｔｏｌｉｓｉｂ）、ガルジキモド（Ｇａｒｄｉｑｕｉｍｏｄ）、スマニロール（Ｓｕｍａｎｉｒｏｌｅ）、モトリモド（ｍｏｔｏｌｉｍｏｄ）、３Ｍ社の３Ｍ−０５２、Ｓ−３４２４０、８５２、８５４−Ａ、及びこれらの類似体（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）よりなる群から選ばれるものであってもよく、例えば、イミキモドであってもよい。。
【００５６】
前記オイルは、魚類由来オイル、動物性由来オイル、植物性由来オイル、トコフェロール、ミネラルオイル、キャスターオイル及びこれらの組合せよりなる群から選ばれたものであってもよい。前記魚類オイルは、代謝可能なオイルであれば、制限なしに使用することができ、例えば、タラ肝油、サメ肝油、鯨油などを含む。前記サメ肝油は、スクアレン、２、６、１０、１５、１９、２３−ヘキサメチル−２、６、１０、１４、１８、２２−テトラコサヘキサエンとして知られた分子、不飽和テルペンを含有し、スクアレン、スクアランに対する飽和類似体も含むことができる。スクアレン及びスクアレンを含む魚類オイルは、市販の供給源から容易に利用可能であるか、又は当業界に公知となった方法で獲得され得る。前記動物性由来オイルは、ラード、獣脂（ｔａｌｌｏｗ）オイル、牛脂などを含むことができる。前記植物性由来オイルは、堅果、種子、穀物などに由来するオイルであってもよく、例えば、ピーナッツオイル、大豆オイル、ココナッツオイル、及びオリーブオイルなどを含むことができる。前記トコフェロールは、ビタミンＥが含有されたトコフェロールであってもよい。多様なトコフェロールが存在するが（α、β、γ、δ、ε又はξ）、一般的にα−トコフェロールが使用され、例えば、ＤＬ−α−トコフェロールが使用され得る。
【００５７】
前記イミダゾキノリン系トル様受容体７又は８アゴニストは、難溶性であって、オイルとの親油性相互作用を助ける媒介体物質によりオイル内に可溶化されて分散され得る。前記媒介体物質は、例えば、ミリストオレイン酸、パルミトレイン酸、サピエン酸（Ｓａｐｉｅｎｉｃ  ａｃｉｄ）、オレイン酸、エライジン酸（Ｅｌａｉｄｉｃ  ａｃｉｄ）、バクセン酸（Ｖａｃｃｅｎｉｃ  ａｃｉｄ）、リノール酸、リノールエライジン酸（Ｌｉｎｏｅｌａｉｄｉｃ  ａｃｉｄ）、アルファ−リノール酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸（Ｅｉｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、エルカ酸（Ｅｒｕｃｉｃ  ａｃｉｄ）、ドコサヘキサエン酸（Ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、カプリル酸（Ｃａｐｒｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）、カプリン酸（Ｃａｐｒｉｃ  ａｃｉｄ）、ラウリン酸（Ｌａｕｒｉｃ  ａｃｉｄ）、ミリスチン酸（Ｍｙｒｉｓｔｉｃ  ａｃｉｄ）、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸（Ａｒａｃｈｉｄｉｃ  ａｃｉｄ）、ベヘン酸（Ｂｅｈｅｎｉｃ  ａｃｉｄ）、リグノセリン酸（Ｌｉｇｎｏｃｅｒｉｃ  ａｃｉｄ）、セロチン酸（Ｃｅｒｏｔｉｃ  ａｃｉｄ）及びこれらの組合せよりなる群から選ばれたものであってもよい。前記媒介体物質は、前記イミダゾキノリン系トル様受容体７又は８アゴニストとオイルと０．１：１０乃至１０：０．１の重量比、例えば、１：５乃至５：１の重量比で使用され得る。
【００５８】
前記界面活性剤は、ナノエマルジョンの外部にコートされてナノエマルジョンが水溶液内に分散され得るようにするものであって、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ）、特にポリソルベート２０及びポリソルベート８０；エチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）、及び／又はブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー；オクトキシノール（例えば、トリトンＸ−１００、又はｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；ホスホリピッド（リン脂質成分）として、ホスファチジルコリン（レシチン）ホスファチジルエタノールアニリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリン及びカルジオリピン；ＴｅｒｇｉｔｏｌTM ＮＰシリーズのようなノニルフェノールエトキシレート；トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ  ３０）のようなラウリル、セチル及びオレイルアルコール（Ｂｒｉｊ界面活性剤として知られた）に由来するポリオキシエチレン脂肪酸エーテル；及びソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ８５）及びソルビタンモノラウレートのようなソルビタンエステル（一般的にＳＰＡＮとして知られている）を単独で使用したり、２種以上の界面活性剤を組み合わせて一緒に使用することができる。
【００５９】
例えば、前記界面活性剤は、これらの界面活性剤の混合物、例えばＴｗｅｅｎ  ８０／Ｓｐａｎ  ８５混合物が利用され得、ポリオキシエチレンソルビタンエステル及びオクトキシノールの組合せが使用され得る。他の有用な組合せは、ラウレス９、ポリオキシエチレンソルビタンエステル及び／又はオクトキシノールを含むことができる。前記界面活性剤は、全体ナノエマルジョンの総重量に対して０．００１乃至２０％の重量で使用され得、例えば、０．０１乃至１％、０．００１乃至０．１％、０．００５乃至０．０２％；０．１乃至２０％、０．１乃至１０％、０．１乃至１％又は約０．５％の重量で使用され得る。
【００６０】
前記ナノエマルジョンの外部にコートされる更なる免疫活性化物質は、樹枝状細胞、Ｔ細胞及びＢ細胞の増殖と分化、活性を刺激する役割をし、これに伴い、活性化したＴ細胞は、細胞毒性Ｔ細胞に分化を促進させ、インターフェロン−ガンマのようなサイトカインの分泌によって細胞性免疫反応に関与する。前記更なる免疫活性化物質は、例えば、トル様受容体アゴニスト（ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｇｏｎｉｓｔ、ＴＬＲ）、サポニン、抗ウイルス性ペプチド、インフラマソームインデューサー（ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ  ｉｎｄｕｃｅｒ）、ＮＯＤリガンド（ＮＯＤ  ｌｉｇａｎｄ）、ＣＤＳリガンド（ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ  ＤＮＡ  ｓｅｎｓｏｒ  ｌｉｇａｎｄ）、ＳＴＩＮＧ（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｇｅｎｅｓ）リガンド、カチオン性脂質（ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｉｄｓ）、及びこれらの組合せよりなる群から選ばれる物質を含むものであってもよいが、これらに制限されない。
【００６１】
前記トル様受容体アゴニストは、天然トル様受容体アゴニスト又は合成トル様受容体アゴニストであってもよい。
【００６２】
前記免疫活性化物質は、一つ又は二つ以上のトル様受容体アゴニストの組合せを含むことができ、例えば、ＣＬ４０１（デュアルＴＬＲ２及びＴＬＲ７アゴニスト）又はＣＬ４２９（デュアルＴＬＲ２及びＮＯＤ２アゴニスト）単独又はこれらの組合せを含むものであってもよいが、これらに制限されない。
【００６３】
前記トル様受容体アゴニストは、ＴＬＲ−１を通じて信号伝達反応を惹起させることができるものであってもよく、例えば、トリ−アシル化した脂質ペプチド（ＬＰ）；フェノール−可溶性モジュリン（ｍｏｄｕｌｉｎ）；マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）脂質ペプチド；Ｓ−（２、３−ビス（パルミトイルオキシ）−（２−ＲＳ）−プロピル）−Ｎ−パルミトイル−（Ｒ）−Ｃｙｓ−（Ｓ）−Ｓｅｒ−（Ｓ）−Ｌｙｓ（４）−ＯＨ；ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｉ）からのバクテリア脂質ペプチド；ＯｓｐＡ脂質ペプチドのアセチル化したアミノ末端を模倣するトリヒドロクロリド（Ｐａｍ３Ｃｙｓ）脂質ペプチド；及びこれらの組合せよりなる群から選ばれる一つ以上の物質を含むものであってもよいが、これらに制限されない。
【００６４】
前記トル様受容体アゴニストは、ＴＬＲ−２アゴニストを含むものであってもよく、例えば、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−Ｌｉｐを含むことができるが、これに制限されない。
【００６５】
前記トル様アゴニストは、ＴＬＲ−３アゴニストを含むものであってもよく、例えば、ポリアイシ系としてＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、Ｐｏｌｙ（ＩＣＬＣ）、Ｐｏｌｙ（ＩＣ１２Ｕ）、Ａｍｐｌｉｇｅｎなどを含むことができるが、これらに制限されない。
【００６６】
前記トル様アゴニストは、ＴＬＲ−４アゴニストを含むものであってもよく、例えば、シゲラフレキシネル（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）外膜タンパク質製造物、ＡＧＰ、ＣＲＸ−５２７、ＭＰＬＡ、ＰＨＡＤ、３Ｄ−ＰＨＡＤ、ＧＬＡ、及びこれらの組合せよりなる群から選ばれる一つ以上の物質を含むものであってもよいが、これらに制限されない。
【００６７】
前記トル様アゴニストは、ＴＬＲ−５アゴニストを含むものであってもよく、例えば、フラジェリン（ｆｌａｇｅｌｌｉｎ）又はその断片を含むことができるが、これらに制限されない。
【００６８】
前記トル様アゴニストは、ＴＬＲ−７アゴニスト又はＴＬＲ−８アゴニストを含むものであってもよく、例えば、イミキモド、Ｒ８３７、レシキモド、又はＲ８４８のようなイミダゾキノリン分子；ＶＴＸ−２３３７；ＣＲＸ６４２；リン脂質基又はホスホノ脂質基に共有的に結合されたイミダゾキノリン；及びこれらの組合せよりなる群から選ばれる一つ以上の物質を含むものであってもよいが、これらに制限されない。
【００６９】
前記トル様アゴニストは、ＴＬＲ−９アゴニストを含むものであってもよく、例えば、免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含むものであってもよいが、これに制限されない。
【００７０】
前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、一つ以上のＣｐＧモチーフを含むものであってもよいが、これに制限されない。
【００７１】
前記サポニンは、ＱＳ２１、Ｑｕｉｌ  Ａ、ＱＳ７、ＱＳ１７、β−エスキン、ジギトニン及びこれらの組合せよりなる群から選ばれたものであってもよいが、これらに制限されない。
【００７２】
前記抗ウイルス性ペプチドは、ケイエルケイ（ＫＬＫ）を含むものであってもよいが、これに制限されない。
【００７３】
前記インフラマソームインデューサーは、ＴＤＢ（ｔｒｅｈａｌｏｓｅ−６、６−ｄｉｂｅｈｅｎａｔｅ）であってもよいが、これに制限されない。
【００７４】
前記ＮＯＤリガンドは、Ｍ−ＴｒｉＬＹＳ（ＮＯＤ２アゴニスト−合成ムラミルトリペプチド）又はＮＯＤ２アゴニスト（Ｎ−ｇｌｙｃｏｌｙｌａｔｅｄ  ｍｕｒａｍｙｌｄｉｐｅｐｔｉｄ）であってもよいが、これらに制限されない。
【００７５】
前記ＣＤＳリガンドは、Ｐｏｌｙ（ｄＡ：ｄＴ）であってもよいが、これに制限されない。
【００７６】
前記ＳＴＩＮＧリガンドは、ｃＧＡＭＰ、ｄｉ−ＡＭＰ、又はｄｉ−ＧＭＰであってもよいが、これらに制限されない。
【００７７】
前記免疫活性化物質は、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−Ｌｉｐ、ポリアイシ（Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、ＣＲＸ−５２７、ＭＰＬＡ（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ  ｌｉｐｉｄ  Ａ）、フラジェリン（ｆｌａｇｅｌｌｉｎ）、イミキモド、レシキモド、ＣｐＧ、ＱＳ２１、Ｍ−ＴｒｉＬｙｓ（ＭｕｒＮＡｃ−Ａｌａ−Ｄ−ｉｓｏＧｌｎ−Ｌｙｓ）、ＴＤＢ（ｔｒｅｈａｌｏｓｅ−６、６−ｄｉｂｅｈｅｎａｔｅ）、８８３７、Ｐｏｌｙ（ｄＡ：ｄＴ）、ｃＧＡＭＰ、及びこれらの組合せよりなる群から選ばれる一つ以上の物質を含むことができるが、これらに制限されない。
【００７８】
前記カチオン性脂質は、ＤＣ−コレステロール（３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅ）−ｃａｒｂａｍｏｙｌ］ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ＤＤＡ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ）、ＤＯＴＡＰ（１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−３−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ−ｐｒｏｐａｎｅ）、ＤＯＴＭＡ（１，２−ｄｉ−Ｏ−ｏｃｔａｄｅｃｅｎｙｌ−３−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｐｒｏｐａｎｅ）、ＥＰＣ（１，２−ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）、ＭＶＬ５（Ｎ１−［２−（（１Ｓ）−１−［（３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ａｍｉｎｏ］−４−［ｄｉ（３−ａｍｉｎｏ−ｐｒｏｐｙｌ）ａｍｉｎｏ］ｂｕｔｙｌｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）ｅｔｈｙｌ］−３、４−ｄｉ［ｏｌｅｙｌｏｘｙ］−ｂｅｎｚａｍｉｄｅ）、ＤＯＤＡＰ（ｌｉｐｉｄｓ１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ−ｐｒｏｐａｎｅ）、及びこれらの組合せよりなる群から選ばれる物質を含むものであってもよいが、これらに制限されない。
【００７９】
また、本発明は、前記本発明によるナノエマルジョンを含むアジュバント組成物及び前記本発明によるアジュバント組成物及び抗原を含むワクチン組成物を提供する。
【００８０】
前記抗原は、タンパク質、組み換えタンパク質、糖タンパク質、遺伝子、ペプチド、多糖類、脂質多糖類、ポリヌクレオチド、細胞、ウイルス及びこれらの組合せよりなる群から選ばれたものであってもよい。前記タンパク質は、例えば、オボアルブミン、ペプチド、組み換えタンパク質、サブユニット（ｓｕｂｕｎｉｔ）、スプリット（ｓｐｌｉｔ）タンパク質抗原を含むことができる。前記遺伝子は、ＤＮＡ又はｍＲＮＡ抗原を含むことができ、前記ペプチドは、癌細胞又はウイルスに特異的ペプチド抗原を含むことができる。前記細胞は、例えば、樹枝状細胞、癌細胞及び癌細胞由来ライセートを含むことができ、前記ウイルスは、例えば、インフルエンザ、高病原性インフルエンザを含むことができる。
【００８１】
前記アジュバント組成物又はワクチン組成物は、薬学的に有効な量のナノエマルジョン及び／又は抗原以外に一つ以上の薬学的に許容される担体又は希釈剤を含むことができる。
【００８２】
前記で「薬学的に有効な量」とは、前記生理活性成分が動物又はヒトに投与されて目的とする生理学的又は薬理学的活性を示すのに十分な量をいう。しかし、前記薬学的に有効な量は、症状の程度、患者の年齢、体重、健康状態、性別、投与経路及び治療期間などによって適切に変化することができる。
【００８３】
また、前記で「薬学的に許容される」とは、生理学的に許容され、ヒトに投与されるとき、通常、胃腸障害、めまいのようなアレルギー反応又はこれと類似した反応を起こさないことをいう。前記担体、賦形剤及び希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアゴム、アルギネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシ安息香酸、プロピルヒドロキシ安息香酸、タルク、マグネシウムステアレート及び鉱物油が挙げられる。また、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤及び防腐剤などをさらに含むことができる。
【００８４】
また、本発明の組成物は、哺乳動物に投与された後、活性成分の迅速、遅速又は遅延された放出を提供できるように当業界に公知となった方法を使用して剤形化され得、経口又は非経口投与のための多様な形態で剤形化され得る。剤形は、粉末、顆粒、錠剤、エマルジョン、シロップ、エアゾール、軟質又は硬質ゼラチンカプセル、滅菌注射溶液、滅菌粉末の形態であってもよい。
【００８５】
本発明による組成物は、経口、経皮、皮下、静脈又は筋肉を含む様々な経路を通じて投与され得、活性成分の投与量は、投与経路、患者の年齢、性別、体重及び患者の重症度などの様々な因子によって適切に選択され得る。また、本発明の組成物は、目的とする効果を上昇させることができる公知の化合物とも併用して投与することができる。
【００８６】
本発明の利点及び特徴、そしてそれらを達成する方法は、詳細に後述されている実施例を参照すれば明確になるだろう。以下、本発明を実施例によって詳細に説明することとする。しかし、これらの実施例は、本発明を具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００８７】
実施例１．イミキモド（Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ）（Ｒ８３７）を含むスクアレン溶液の製造
イミキモド（ＴＣＩ、東京、日本）２０ｍｇをオレイン酸（シグマアルドリッチ、米国）１００ｍｇに超音波分散機（ｂａｔｈ  ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）（Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｂｒａｎｓｏｎｉｃ（登録商標）ＭＨ  Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  Ｂａｔｈ  ５８００、Ｅｍｅｒｓｏｎ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）を利用して溶液が透明になるまで室温で溶解させた。その後、スクアレン（Ｓｑｕａｌｅｎｅ）（５％ｖ／ｖ、シグマアルドリッチ、米国）１ｍＬを入れた後、均一なスクアレン（Ｓｑｕａｌｅｎｅ）溶液を得るために、ミキサー器（Ｖｏｒｔｅｘ−Ｇｅｎｉｅ  ２、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、ＵＳＡ）を利用して撹拌させた。
【００８８】
実施例２．イミキモドを含むスクアレンナノエマルジョン（ＮＥ−ＩＱ）の製造及び特性化
実施例１のように製造されたイミキモドを含むスクアレン（５％ｖ／ｖ、シグマアルドリッチ、米国）、Ｔｗｅｅｎ  ８０（０．５％ｖ／ｖ、シグマアルドリッチ、米国）及びＳｐａｎ  ８５（０．５％ｖ／ｖ、シグマアルドリッチ、米国）をリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ、０．００６７Ｍ  ＰＯ４）２ｍＬに溶解させた後、超音波分散機（Ｔｉｐ  ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）を利用して１分間リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）に完全に分散するように解きほぐした。その後、回転器（ｔｕｂｅ  ｒｅｖｏｌｖｅ）を使用して約２時間撹拌した後、使用前まで４℃冷蔵庫に保管した。エマルジョン（ｅｍｕｌｓｉｏｎ）のサイズは、ＤＬＳ（Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ、大塚、日本）を通じて分析した。ＤＬＳ（Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ、大塚、日本）測定結果、直径が１０６．１６±５．４と１４８．５４±１８．５ｍであることを確認した（図２、表１）。
【００８９】
【表１】
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【００９０】
実施例３．ＮＥ−ＩＱの免疫細胞内流入及び細胞内位置の確認
骨髄由来樹枝状細胞（Ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ、ＢＭＤＣｓ）と骨髄由来マクロファージ（Ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｅｌｌｓ、ＢＭＭＣｓ）に２４時間の間イミキモド（Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ）（Ｒ８３７）を含むスクアレン（Ｓｑｕａｌｅｎｅ）を処理した後、蛍光顕微鏡を利用して評価した。図３の蛍光イメージから分かるように、ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ（緑色）とＤＩＤ（赤色）は、細胞内同じ位置に存在し、重なっていること（Ｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）になることを確認した。これを通じて、イミキモドを含むスクアレンナノエマルジョン（ＮＥ−ＩＱ）が細胞内流入後にエンドソーム（ｅｎｄｏｓｏｍｅ）及びリソソーム（ｌｙｓｏｓｏｍｅ）に位置することが分かった。
【００９１】
実施例４．ＮＥ−ＩＱのＢＭＤＣｓとＢＭＭＣｓへの細胞活性効果の評価
ＮＥ−ＩＱが骨髄由来樹枝状細胞（Ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ、ＢＭＤＣｓ）と骨髄由来マクロファージ（Ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ、ＢＭＭＣｓ）の活性化に及ぼす影響は、前駆炎症サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−２）の分泌量をＥＬＩＳＡ実験方法を利用して分析した。
【００９２】
図４においてＮＥ−ＩＱを処理した場合、Ｔｈ１反応を誘導するＩＬ−６とＩＬ−１２の分泌が増加することを確認し、細胞死滅と腫瘍生成抑制を誘導するＴＮＦ−αと炎症性サイトカインＩＬ−１βの分泌量も、イミキモド（Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ）（Ｒ８３７）を含まない場合より明確に増加することを確認することができた。
【００９３】
また、試料をＢＭＤＣｓとＢＭＭＣｓに処理して成熟するにつれて発現するＣＤ４０、８０、８６を標識した結果、ＮＥ−ＩＱを処理した場合、いずれも発現量が増加したことが確認された（図５）。これを通じて、イミキモドの刺激を通じて樹枝状細胞とマクロファージの成熟度を誘導することを確認することができた。
【００９４】
実施例５．ＮＥ−ＩＱのＢＭＤＣｓとＢＭＭＣｓへの細胞増殖効果の評価
骨髄由来樹枝状細胞（Ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ、ＢＭＤＣｓ）と骨髄由来マクロファージ（Ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ、ＢＭＭＣｓ）にＮＥ−ＩＱを処理した後、細胞増殖率を評価した。図６の増殖率の評価には、ミトコンドリアの活性を測定するＭＴＳ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）分析が使用された。ＮＥ−ＩＱを処理した場合、２４時間、４８時間がいずれも二種類の免疫細胞においてイミキモドを含まない場合より１０倍以上明確に増加することを確認することができた。
【００９５】
実施例６．ＮＥ−ＩＱのＩＦＮ−α生成能力の評価
マウス実験では、Ｃ５７ＢＬ／６（ｆｅｍａｌｅ  ５〜６週齢、オリエント）マウスを使用し、オボアルブミン（ＯＶＡ）１０μｇ、そしてイミキモド（Ｒ８３７）２５μｇが一匹の分量で５０μＬに溶解して使用された。マウスにワクチンを注入するにつれて２４時間後に筋肉（Ｍｕｓｃｌｅ）部位とリンパ節（Ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ）部位でのＩＦＮ−αの分泌量をＥＬＩＳＡ実験方法を通じて分析した。ＮＥ−ＩＱを処理した実験群が、他の対照群（ＮＥ及びＡｌｕｍアジュバント使用対照群）よりサイトカイン分泌量が増加することを確認した（図７）。イミキモド（Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ）（Ｒ８３７）は、トル様受容体７の刺激を通じてインターフェロン（ＩＦＮ）サイトカインの分泌を増加させるものと知られている。
【００９６】
実施例７．ＮＥ−ＩＱアジュバントが含まれたワクチンの抗体形成能力及び細胞媒介Ｔ細胞活性化効果の確認
マウス実験では、Ｃ５７ＢＬ／６（ｆｅｍａｌｅ  ５〜６週齢、オリエント）マウスを使用し、オボアルブミン（ＯＶＡ）１００μｇ、そしてイミキモド（Ｒ８３７）４５．５μｇが一匹の分量で、前記実施例２のように製造されたＮＥ−ＩＱを１００μＬに溶解して使用した。マウスにワクチンを注入するにつれて体液性免疫反応が増加することを酵素免疫測定法でそれぞれ分析した。体液性免疫反応は、総３回の接種を行い、ワクチン接種が終わった後、３週間隔でマウスで眼窩採血を実施して、免疫グロブリンとＩｇＧとＩｇＧ亜型であるＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａの生成量を対照群と比較した（図８：ＩｇＧ、図９：ＩｇＧ１、図１０：ＩｇＧ２ａ生成量）。
【００９７】
その結果、抗体生成量は、ワクチンを接種した場合、全部で増加したことを確認し、特にイミキモドが含まれたＮＥ−ＩＱをアジュバントとして使用したワクチンでの効果が最も高く現れることを観察した。特に細胞性免疫向上程度を示すＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１値がＮＥ−ＩＱをアジュバントとして使用した実験群において最も高い値を示すことが分かった（図１１）。その理由は、ＮＥ内部にローディングされたイミキモドの役割のためと見られる。
【００９８】
細胞性免疫誘導効果を検証するために、図１２のような日程でｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎし、最後の注入後７日後にマウスから脾臓を摘出して、単一細胞を得た後、ＰＢＳを使用して洗浄し、遠心分離（１５００ｒｐｍ、５分）を施行した。ＯＶＡ  ｐｅｐｔｉｄｅを利用してｒｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎさせた後、Ｔ細胞の表面分子であるＣＤ８で細胞内部のＩＦＮ−ｇａｍｍａ確認した結果、対照群に比べてＮＥ−ＩＱがｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎされたグループにおいてＩＦＮ−ｇａｍｍａを分泌するＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を促進することを確認した（図１３）。
【００９９】
実施例８．ＮＥ−ＩＱの癌細胞増殖抑制効果の評価
Ｃ５７ＢＬ／６マウス黒色腫モデルを利用してＮＥ−ＩＱを癌細胞（ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）に投与した後、腫瘍治癒能力を確認した。６週齢のマウス雌性５匹の右側大腿部に１×１０５黒色腫細胞（Ｂ１６Ｆ１０）を皮下注射で注入し、５日後に３日間隔で５回１００μｌずつ注入し、対照群にはＰＢＳを注入した。次に、癌細胞の投与後１９日間１週間に２〜３回ずつ腫瘍のサイズ（Ｔｕｍｏｒ  ｖｏｌｕｍｅ）を測定した。その結果、癌細胞の注入後、ＮＥ−ＩＱを投与した場合、対照群に比べて腫瘍細胞の増殖が顕著に抑制されることを観察することができた（図１４）。
【０１００】
最後の注入後、３日後に、癌細胞部位でのＴ細胞の浸透率を確認した結果、ＮＥ−ＩＱを投与した場合に、対照群に比べてＣＤ４  Ｔ細胞とＣＤ８  Ｔ細胞の浸透率が増加することを確認することができた（図１５、図１６）。
【０１０１】
これは、癌細胞を殺すことができるＴ細胞を増加させて癌を抑制する役割をする。最後の注入後、７日後にマウスから脾臓を摘出して、単一細胞を得た後、ＰＢＳを使用して洗浄し、遠心分離（１５００ｒｐｍ、５分）を施行した。Ｂ１６Ｆ１０のｌｙｓａｔｅを利用してｒｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎさせた後、Ｔ細胞の表面分子であるＣＤ８とＣＤ４で細胞内部のＩＦＮ−ｇａｍｍａを確認した結果、対照群に比べて、ＮＥ−ＩＱを投与したグループにおいてＩＦＮ−ｇａｍｍａを分泌するＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を促進することを確認した（図１７、図１８）。また、オボアルブミン（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ、ＯＶＡ）のペプチドを発現する黒色腫モデル（Ｂ１６Ｆ１０−ＯＶＡ）を利用して、ＮＥ−ＩＱとオボアルブミン抗原からなるワクチンを図１２のような方法で投与した後に、抗原特異的に癌細胞を抑制することを確認することができた（図１９）。さらに他の腫瘍モデルを利用してもＮＥ−ＩＱの癌細胞増殖抑制効果を確認した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスＯＶＡ抗原を発現するリンパ腫モデル（ＥＧ７−ＯＶＡ）を利用してＮＥ−ＩＱを癌細胞（ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）に投与した後、腫瘍治癒能力を確認した。６週齢のマウス雌性５匹の右側大腿部に１×１０５リンパ腫細胞（ＥＧ７−ＯＶＡ）を皮下注射で注入し、５日後に３日間隔で５回１００μｌずつ注入し、対照群には、ＰＢＳを注入した。次に、癌細胞の投与後、１９日間１週間に２〜３回ずつ腫瘍のサイズ（Ｔｕｍｏｒ  ｖｏｌｕｍｅ）を測定した。その結果、癌細胞の注入後、ＮＥ−ＩＱを投与した場合に、対照群に比べて腫瘍細胞の増殖が顕著に抑制されることを観察することができた（図２０）。
【０１０２】
実施例９．ＮＥ−ＩＱに一つ以上の更なる免疫活性化物質を含むナノエマルジョンの製造
ＮＥ−ＩＱナノエマルジョンにＭＰＬＡ、ＤＤＡ、ＱＳ２１など一つ以上の更なる免疫活性化物質を含むナノエマルジョンを下記表２のような組成で製造した。
【０１０３】
【表２】
2020506938.tif 000004
【０１０４】
実施例９−１．ＮＥ−ＩＱ−１アジュバント製造：ＮＥ−ＩＱ＋ＤＤＡ＋ＭＰＬＡ
ＤＯＰＣ（１，２−Ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ、１  ｍｇ／ｍＬ、シグマアルドリッチ、米国）、ＤＤＡ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ、１ｍｇ／ｍＬ、シグマアルドリッチ、米国）、コレステロール（Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ０．２５ｍｇ／ｍＬ、シグマアルドリッチ、米国）、ＭＰＬＡ［ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ  ｌｉｐｉｄ  ａ、０．２ｍｇ／ｍＬ及びアヴァンティポーラリピッド（ａｖａｎｔｉ  ｐｏｌａｒ  ｌｉｐｉｄｓ、米国）］をエタノール（ｅｔｈａｎｏｌ）１ｍＬに溶解させた。前記溶液を丸いフラスコに移した後、回転濃縮機（ｒｏｔａｒｙ  ｅｖａｐｏｒａｔｏｒ）を利用して前記エタノールを完全に蒸発させて、薄い脂質膜（ｔｈｉｎ−ｆｉｌｍ）形態を形成した。次に、前記実施例１及び２で使用された方法と同じ製造方法を利用してイミキモド（Ｒ８３７）が含まれたナノエマルジョンを製造するものの、スクアレンの代わりにミネラルオイル（２．５％ｖ／ｖ、シグマアルドリッチ、米国）を使用した。前記ミネラルオイルが含まれた溶液とＴｗｅｅｎ（１％ｖ／ｖ）が含まれたリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ、０．００６７Ｍ  ＰＯ４）２ｍＬを添加した後、撹拌機（ｓｔｉｒｒｅｒ）を利用して６０℃で３０分間６００ｒｐｍ速度で脂質（ｌｉｐｉｄ）膜を溶液に分散させた。前記分散溶液を４ｍＬのガラス瓶（ｖｉａｌ）に移した後、超音波分散機（Ｔｉｐ  ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）を利用して１分間リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）に脂質（ｌｉｐｉｄ）膜が完全に分散するように解きほぐした。次に、回転機（ｔｕｂｅ  ｒｅｖｏｌｖｅ）を使用して約２時間撹拌した後、使用前まで４℃冷蔵庫に保管した。
【０１０５】
実施例９−２．ＮＥ−ＩＱ−２アジュバント製造：ＮＥ−ＩＱ＋ＭＰＬＡ＋ＱＳ２１
【０１０６】
ＤＯＰＣ（１，２−Ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ、１ｍｇ／ｍＬ、シグマアルドリッチ、米国）、ＭＰＬＡ［０．２ｍｇ／ｍＬ、アヴァンティポーラリピッド（ａｖａｎｔｉ  ｐｏｌａｒ  ｌｉｐｉｄｓ、米国）］、サポニン（ＱＳ２１、０．２ｍｇ／ｍＬ）、コレステロール（Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ０．２５ｍｇ／ｍＬ、シグマアルドリッチ、米国）をエタノール（ｅｔｈａｎｏｌ）１ｍＬに溶解させた。前記溶液を丸いフラスコに移した後、回転濃縮機（ｒｏｔａｒｙ  ｅｖａｐｏｒａｔｏｒ）を利用して前記エタノールを完全に蒸発させて、薄い脂質膜（ｔｈｉｎ−ｆｉｌｍ）形態を形成した。次に、実施例１で使用されたイミキモド（Ｒ８３７）とオレイン酸の代わりに、レシキモド（Ｒ８４８）とリノール酸（シグマアルドリッチ、米国）を使用してレシキモドが分散したスクアレンオイル溶液を製造し、前記実施例２で使用された方法と同じ方法を利用して、ＮＥ−ＩＱ（ＭＰＬＡ＋ＱＳ２１）アジュバントを製造した。
【０１０７】
実施例９−３．ＮＥ−ＩＱ−３アジュバント製造：ＮＥ−ＩＱ＋Ｐａｍ３Ｃｙｓ−Ｌｉｐ＋ＱＳ２１
ＤＯＰＣ（１，２−Ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ、１ｍｇ／ｍＬ、シグマアルドリッチ、米国）、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−Ｌｉｐ（０．２ｍｇ／ｍＬ、Ｉｎｖｉｖｏ  Ｇｅｎ、米国）、ＱＳ２１（ＱＳ２１、０．２ｍｇ／ｍＬ）をエタノール１ｍＬに溶解させた。前記溶液を丸いフラスコに移した後、回転濃縮機(rotary evaporator)を利用してエタノールを完全に蒸発させて薄い脂質膜形態を形成した。次に、実施例３と同じ方法を使用してＮＥ−ＩＱ（Ｐａｍ３Ｃｙｓ−Ｌｉｐ＋ＱＳ２１）アジュバントを製造した。
【０１０８】
実施例９−４．ＮＥ−ＩＱ−４アジュバント製造：ＮＥ−ＩＱ＋ＤＤＡ＋ＳＴＩＮＧ（ｃｙｃｌｉｃ  ＤＮＡ））
ＤＯＰＣ（１，２−Ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ、１ｍｇ／ｍＬ、シグマアルドリッチ、米国）、ＤＤＡ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ、１ｍｇ／ｍＬ、シグマアルドリッチ、米国）、ｃ−ｄｉ−ＡＭＰ（２ｍｇ、Ｉｎｖｉｖｏ  Ｇｅｎ、サンディエゴ、米国）、コレステロール（０．２５ｍｇ／ｍＬ、シグマアルドリッチ、米国）をエタノール１ｍＬに溶解させた。前記溶液を丸いフラスコに移した後、回転濃縮機を利用してエタノールを完全に蒸発させて薄い脂質膜形態を形成した。次に、実施例３と同じ方法を使用してＮＥ−ＩＱ（ＤＤＡ＋ＳＴＩＮＧ（ｃｙｃｌｉｃ  ＤＮＡ））を製造した。
【０１０９】
実施例９−５．ＮＥ−ＩＱ−５アジュバント製造：ＮＥ−ＩＱ＋ＤＤＡ＋Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）
ＤＯＰＣ（１，２−Ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ、１ｍｇ／ｍＬ、シグマアルドリッチ、米国）、ＤＤＡ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ、１ｍｇ／ｍＬ、シグマアルドリッチ、米国）、コレステロール（０．２５ｍｇ／ｍＬ、シグマアルドリッチ、米国）をエタノール１ｍＬに溶解させた。前記溶液を丸いフラスコに移した後、回転濃縮機を利用してエタノールを完全に蒸発させて、薄い脂質膜形態を形成した。次に、スクアレンの代わりに大豆オイルを使用したことを除いて、実施例１と同じ製造方法を利用して製造されたＲ８３７を含む大豆オイル（２．５％ｖ／ｖ、シグマアルドリッチ、米国）とＴｗｅｅｎ（１％ｖ／ｖ）が含まれたリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ、０．００６７Ｍ  ＰＯ４）２ｍＬを添加した後、撹拌機（ｓｔｉｒｒｅｒ）を利用して６０℃で３０分間６００ｒｐｍ速度で脂質（ｌｉｐｉｄ）膜を溶液に分散させた。分散した溶液を４ｍＬガラス瓶（ｖｉａｌ）に移した後、超音波分散機（Ｔｉｐ  ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）を利用して１分間リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）に脂質（ｌｉｐｉｄ）膜が完全に分散するように解きほぐした。最後に、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（２ｍｇ／ｍＬ．インビボジェン、米国）をリン酸緩衝溶液（０．００６７Ｍ  ＰＯ４）に溶かした後、ナノエマルジョンと１：１の体積比率で混ぜて、約２時間撹拌後、使用前まで４℃冷蔵庫に保管した。
【０１１０】
実施例９−６．ＮＥ−ＩＱ−６アジュバント製造：ＮＥ−ＩＱ＋ＤＤＡ＋ＣＬ４０１
ＤＯＰＣ（１，２−Ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ、１ｍｇ／ｍＬ、シグマアルドリッチ、米国）、ＤＤＡ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ、１ｍｇ／ｍＬ、シグマアルドリッチ、米国）、コレステロール（０．２５ｍｇ／ｍＬ、シグマアルドリッチ、米国）をエタノール１ｍＬに溶解させた。溶液を丸いフラスコに移した後、回転濃縮機を利用してエタノールを完全に蒸発させて、薄い脂質膜形態を形成した。次に、実施例１のように製造されたＲ８３７を含むスクアレン（２．５％ｖ／ｖ、シグマアルドリッチ、米国）とＴｗｅｅｎ（１％ｖ／ｖ）が含まれたリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ、０．００６７Ｍ  ＰＯ４）２ｍＬを添加した後、撹拌機（ｓｔｉｒｒｅｒ）を利用して６０℃で３０分間６００ｒｐｍ速度で脂質（ｌｉｐｉｄ）膜を溶液に分散させた。分散した溶液を４ｍＬガラス瓶（ｖｉａｌ）に移した後、超音波分散機（Ｔｉｐ  ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）を利用して１分間リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）に脂質（ｌｉｐｉｄ）膜が完全に分散するように解きほぐした。最後に、ＣＬ４０１（２ｍｇ、Ｉｎｖｉｖｏ  Ｇｅｎ、サンディエゴ、米国）をリン酸緩衝溶液（０．００６７Ｍ  ＰＯ４）に溶かした後、ナノリポソームと１：１：１の体積比率で混ぜて、約２時間撹拌後、使用前まで４℃冷蔵庫に保管した。
【０１１１】
実施例９−７．ＮＥ−ＩＱ−７アジュバント製造：ＮＥ−ＩＱ＋ＤＤＡ  ７＋  ＣＬ４２９
ＤＯＰＣ（１，２−Ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ、１ｍｇ／ｍＬ、シグマアルドリッチ、米国）、ＤＤＡ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ、１ｍｇ／ｍＬ、シグマアルドリッチ、米国）、コレステロール（０．２５ｍｇ／ｍＬ、シグマアルドリッチ、米国）をエタノール１ｍＬに溶解させた。溶液を丸いフラスコに移した後、回転濃縮機を利用してエタノールを完全に蒸発させて、薄い脂質膜形態を形成した。の次に、実施例１で製造されたＲ８３７を含むスクアレン（２．５％ｖ／ｖ、シグマアルドリッチ、米国）とＴｗｅｅｎ（１％ｖ／ｖ）が含まれたリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ、０．００６７Ｍ  ＰＯ４）２ｍＬを添加した後、撹拌機（ｓｔｉｒｒｅｒ）を利用して６０℃で３０分間６００ｒｐｍ速度で脂質（ｌｉｐｉｄ）膜を溶液に分散させた。分散した溶液を４ｍＬガラス瓶（ｖｉａｌ）に移した後、超音波分散機（Ｔｉｐ  ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）を利用して１分間リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）に脂質（ｌｉｐｉｄ）膜が完全に分散するように解きほぐした。最後に、ＣＬ４２９（２ｍｇ、Ｉｎｖｉｖｏ  Ｇｅｎ、サンディエゴ、米国）をリン酸緩衝溶液（０．００６７Ｍ  ＰＯ４）に溶かした後、ナノリポソームと１：１の体積比率で混ぜて、約２時間撹拌後、使用前まで４℃冷蔵庫に保管した。
【０１１２】
実施例９−８．ＮＥ−ＩＱ−８アジュバント製造：ＮＥ−ＩＱ＋ＤＤＡ＋ＣｐＧ
ＤＯＰＣ（１，２−Ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ、１ｍｇ／ｍＬ、シグマアルドリッチ、米国）、ＤＤＡ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ、１ｍｇ／ｍＬ、シグマアルドリッチ、米国）、コレステロール（０．２５ｍｇ／ｍＬ、シグマアルドリッチ、米国）をエタノール１ｍＬに溶解させた。溶液を丸いフラスコに移した後、回転濃縮機を利用してエタノールを完全に蒸発させて、薄い脂質膜形態を形成した。次に、前記実施例１で製造されたＲ８３７を含むスクアレン（２．５％ｖ／ｖ、シグマアルドリッチ、米国）とＴｗｅｅｎ（１％ｖ／ｖ）が含まれたリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ、０．００６７Ｍ  ＰＯ４）２ｍＬを入れた後、撹拌機（ｓｔｉｒｒｅｒ）を利用して６０℃で３０分間６００ｒｐｍ速度で脂質（ｌｉｐｉｄ）膜を溶液に分散させた。分散した溶液を４ｍＬガラス瓶（ｖｉａｌ）に移した後、超音波分散機（Ｔｉｐ  ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）を利用して１分間リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）に脂質（ｌｉｐｉｄ）が完全に分散するように解きほぐした。最後に、ＣｐＧ（２ｍｇ／ｍＬ、インビボジェン、米国）をリン酸緩衝溶液（０．００６７Ｍ  ＰＯ４）に溶かした後、ナノエマルジョンと１：１の体積比率で混ぜて、約２時間撹拌後、使用前まで４℃冷蔵庫に保管した。
【０１１３】
実施例１０：ＮＥ−ＩＱ系ナノエマルジョンの細胞媒介Ｔ細胞反応の確認
前記表２に記載されたような実施例９−１乃至９−８によって製造されたＮＥ−ＩＱ系のワクチンアジュバント組成物に対するＴ細胞の細胞性免疫反応を実施例７のような方法を利用して測定し、その結果を図２１に示した。 追加的な免疫活性化物質が導入されるにつれて、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）の分泌量が急激に向上することを確認することができた。
【０１１４】
本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明が本発明の本質的な特性から外れない範囲で変形された形態で具現され得ることを理解することができる。したがって、開示された実施例は、限定的な観点でなく、説明的な観点で考慮されなければならない。本発明の範囲は、前述した説明でなく、特許請求範囲に示されており、それと同等な範囲内にあるすべての差異点は、本発明に含まれたものと解すべきである。
【産業上の利用可能性】
【０１１５】
本発明によるイミダゾキノリン系トル様受容体７又は８アゴニスト及びオイルを含むオイル層を含むナノエマルジョンは、感染性疾患の予防、治療ワクチン及び免疫抗癌治療において重要な役割をする免疫細胞の活性化に使用されるエマルジョン形態のワクチンアジュバントを提供することができ、また、分散媒介体物質を利用してイミダゾキノリン系物質をスクアレンのようなオイルに安定に分散させ、このように製造されたオイル層を最終的にエマルジョン形態で製造することによって、大部分の有機溶媒と水溶液に難溶性であるイミダゾキノリン系物質を利用したワクチンアジュバントを提供することができる。一方、本発明のナノエマルジョン形態のアジュバントは、抗原と結合されてワクチンとして使用されるとき、体液性免疫及び細胞性免疫を同時に格別に向上させることができるという効果を有する。そして、本発明によるイミダゾキノリン系トル様受容体７又は８アゴニスト及びオイルを含むオイル層を含むナノエマルジョンは、親油性であるイミダゾキノリン系トル様受容体アゴニストがナノエマルジョンの内部であるオイル層から水溶液層に徐放性放出（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ）挙動特性を示すので、体内でゆっくり放出されることによって、細胞性免疫効果を高めながらも、全身毒性の問題を解決することができる。
【図１】
2020506938.tif 000005
【図２ａ】
2020506938.tif 000006
【図２ｂ】
2020506938.tif 000007
【図３】
2020506938.tif 000008
【図４】
2020506938.tif 000009
【図５】
2020506938.tif 000010
【図６】
2020506938.tif 000011
【図７】
2020506938.tif 000012
【図８】
2020506938.tif 000013
【図９】
2020506938.tif 000014
【図１０】
2020506938.tif 000015
【図１１】
2020506938.tif 000016
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
2020506938.tif 000019
【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際調査報告】
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