(57)【要約】本発明は、例えば対象からの、セルフリーＤＮＡのドナー特異的画分の量を評価するための方法および組成物に関する。 本明細書において提供される方法および組成物は、移植対象における状態、例えば移植臓器傷害（例えば細胞の傷害）、細胞性拒絶グレード、抗体媒介性拒絶、心臓同種移植片脈管障害、および／または心停止のリスクを決定するために用いることができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
移植対象からの試料を評価する方法であって、
（ａ）対象からの試料中のドナー特異的セルフリーＤＮＡ（ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡ）の量を決定すること、ここで、対象は、細胞性拒絶グレード（例えばＣＲ１、ＣＲ２もしくはそれより低い、ＣＲ１以上、またはＣＲ２もしくはそれより高い）を有するか、またはこれを有することが疑われる；ならびに
（ｂ）ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの量を報告および／または記録すること
を含む、前記方法。
【請求項２】
（ｃ）ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの量を、閾値ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡまたは少なくとも１つの前のＤＳ−ｃｆ−ＤＮＡ値と比較すること
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｄ）閾値ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの値および／または少なくとも１つの前のＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡ量と比較した、決定されたＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの量に基づいて、対象についての細胞性拒絶グレードを当てはめるか、またはリスクが増大しているものとして当てはめること
をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
移植対象を評価する方法であって、
（ａ）対象からの試料中のドナー特異的セルフリーＤＮＡ（ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡ）の量を得ること、ここで、対象は、細胞性拒絶グレード（例えばＣＲ１、ＣＲ２もしくはそれより低い、ＣＲ１以上、またはＣＲ２もしくはそれより高い）を有するか、またはこれを有することが疑われる；
（ｂ）ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの量を、閾値ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの値および／または少なくとも１つの前のＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡ量と比較すること；ならびに
（ｃ）閾値ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの値および／または少なくとも１つの前のＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡ量と比較した、決定されたＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの量に基づいて、対象のための処置またはモニタリングのレジメンを決定すること
を含む、前記方法。
【請求項５】
閾値ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの値および／または少なくとも１つの前のＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡ量と比較した、決定されたＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの量に基づいて、細胞性拒絶グレードを対象に当てはめることをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
対象が、細胞性拒絶グレード（例えばＣＲ０もしくはＣＲ１の、または例えばＣＲ２もしくはＣＲ３）有するか、またはこれを有することが疑われる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
対象が、細胞性拒絶グレード（例えばＣＲ１、ＣＲ２もしくはそれより低い、ＣＲ１以上、またはＣＲ２もしくはそれより高い）を有することが決定されている、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
対象が、細胞性拒絶グレード（例えばＣＲ０もしくはＣＲ１の、または例えばＣＲ２もしくはＣＲ３）を有することが決定されている、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
対象における移植拒絶を評価するために前に適用された１つ以上のさらなる検査により、対象が細胞性拒絶グレードを有することが決定されたか、または、対象における移植拒絶を評価するために１つ以上のさらなる検査を行うことをさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
閾値が、０．２である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
閾値が、０．３である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
閾値が、０．８である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの量が、０．１４、０．１５または０．２未満である場合に、ＣＲ０の細胞性拒絶グレードを対象に当てはめる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの量が、０．１４、０．１５または０．２より高いか、０．１４〜０．８、０．１５〜０．８または０．２〜０．８である場合に、ＣＲ１の細胞性拒絶グレードを対象に当てはめる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの量が、それぞれ０．８以上である場合に、ＣＲ２以上の細胞性拒絶グレードを対象に当てはめる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの量が、０．１４〜０．５、０．１５〜０．５、０．２〜０．５または０．３〜０．５である場合に、１つ以上のさらなる検査が示される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
移植対象からの試料を評価する方法であって、
（ａ）対象からの試料中のドナー特異的セルフリーＤＮＡ（ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡ）の量を決定すること、ここで、対象が、移植された臓器の状態または疾患を有するか、これを有することが疑われるか、またはこれを有するリスクがある；ならびに
（ｂ）ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの量を報告および／または記録すること
を含む、前記方法。
【請求項１８】
（ｃ）ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの量を閾値ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの値または少なくとも１つの前のＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡ値と比較すること
をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
閾値ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの値および／または少なくとも１つの前のＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡ量と比較した、決定されたＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの量に基づいて、状態または疾患が示されるか、または対象が増大したリスクを有する、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
移植対象を評価する方法であって、
（ａ）対象からの試料中のドナー特異的セルフリーＤＮＡ（ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡ）の量を得ること、ここで、対象が、移植された臓器の状態または疾患を有するか、これを有することが疑われるか、またはこれを有するリスクがある；
（ｂ）ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの量を、閾値ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの値および／または少なくとも１つの前のＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡ量と比較すること；ならびに
（ｃ）閾値ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの値および／または少なくとも１つの前のＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡ量と比較した、決定されたＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの量に基づいて、対象のための処置またはモニタリングのレジメンを決定すること
を含む、前記方法。
【請求項２１】
閾値ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの値および／または少なくとも１つの前のＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡ量と比較した、決定されたＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの量に基づいて、状態または疾患が示されるか、または対象が増大したリスクを有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
対象が、心臓同種移植片脈管障害を有するか、これを有することが疑われるか、またはこれを有するリスクがある、請求項１７〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
対象が、心停止を既に有しているか、これを有するリスクがある、請求項１７〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
対象が、心臓同種移植片脈管障害を有することが決定されているか、または心停止を既に有している、請求項１７〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
対象を評価するために前に適用された１つ以上のさらなる検査により、対象が心臓同種移植片脈管障害を有することが決定されたか、または、対象を評価するために１つ以上のさらなる検査を行うことをさらに含む、請求項１７〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
閾値が、０．２または０．３である、請求項１７〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの量が０．２または０．３と等しいかまたはこれより高い場合、心臓移植片脈管障害または心停止のリスクが示される、請求項１７〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
移植対象からの試料を評価する方法であって、
（ａ）対象からの試料中のドナー特異的セルフリーＤＮＡ（ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡ）の量を決定すること、ここで、対象は、抗体媒介性拒絶を有するか、またはこれを有することが疑われる；ならびに
（ｂ）ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの量を報告および／または記録すること
を含む、前記方法。
【請求項２９】
（ｃ）ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの量を閾値ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの値または少なくとも１つの前のＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡ値と比較すること
をさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
（ｄ）閾値ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの値および／または少なくとも１つの前のＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡ量と比較した、決定されたＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの量に基づいて、対象を、抗体媒介性拒絶を有する、またはリスクが増大しているものとして分類すること
をさらに含む、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
移植対象を評価する方法であって、
（ａ）対象からの試料中のドナー特異的セルフリーＤＮＡ（ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡ）の量を得ること、ここで、対象は、抗体媒介性拒絶を有するか、またはこれを有することが疑われる；
（ｂ）ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの量を、閾値ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの値および／または少なくとも１つの前のＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡ量と比較すること；ならびに
（ｃ）閾値ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの値および／または少なくとも１つの前のＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡ量と比較した、決定されたＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの量に基づいて、対象のための処置またはモニタリングのレジメンを決定すること
を含む、前記方法。
【請求項３２】
閾値ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの値および／または少なくとも１つの前のＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡ量と比較した、決定されたＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの量に基づいて、対象を、抗体媒介性拒絶を有するか、またはリスクが増大しているものとして分類することをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
対象が、抗体媒介性拒絶を有することが決定されている、請求項２８〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
対象における移植拒絶を評価するために前に適用された１つ以上のさらなる検査により、対象が抗体媒介性拒絶を有することが決定されたか、対象を評価するために１つ以上のさらなる検査を行うことをさらに含む、請求項２８〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
閾値が、０．２である、請求項２８〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの量が０．２よりも高い場合に、対象が抗体媒介性拒絶を有する、請求項２８〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
移植対象からの試料を評価する方法であって、
（ａ）対象からの試料中のドナー特異的セルフリーＤＮＡ（ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡ）の量を決定すること、ここで、対象は、移植臓器傷害を有するか、またはこれを有することが疑われる、ならびに
（ｂ）ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの量を報告および／または記録すること
を含む、前記方法。
【請求項３８】
（ｃ）ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの量を閾値ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの値または少なくとも１つの前のＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡ値と比較すること
をさらに含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
（ｄ）閾値ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの値および／または少なくとも１つの前のＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡ量と比較した、決定されたＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの量に基づいて、対象が移植臓器傷害を有するか否かを決定するか、またはリスクが増大しているものとして決定すること
をさらに含む、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４０】
対象が２４歳未満である、請求項３７〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
対象が１６歳未満である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
対象が体重３０ｋｇ未満である、請求項３７〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
対象が体重２０ｋｇ未満である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
移植対象を評価する方法であって、
（ａ）対象からの試料中のドナー特異的セルフリーＤＮＡ（ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡ）の量を得ること、ここで、対象は、移植臓器傷害を有するか、またはこれを有することが疑われる；
（ｂ）ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの量を、閾値ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの値および／または少なくとも１つの前のＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡ量と比較すること；ならびに
（ｃ）閾値ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの値および／または少なくとも１つの前のＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡ量と比較した、決定されたＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの量に基づいて、対象のための処置またはモニタリングのレジメンを決定すること
を含む、前記方法。
【請求項４５】
閾値ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの値および／または少なくとも１つの前のＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡ量と比較した、決定されたＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの量に基づいて、対象が移植臓器傷害を有するか否かを決定するか、またはリスクが増大しているものとして決定することをさらに含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
対象が２４歳未満である、請求項４４または４５に記載の方法。
【請求項４７】
対象が１６歳未満である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
対象が体重３０ｋｇ未満である、請求項４４〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
対象が体重２０ｋｇ未満である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
少なくとも１つの量が、移植臓器に対する傷害の１、５、１０または１５分後に対象から採取された試料において決定される、請求項３７〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
１つ以上のさらなる検査が、生検を含む、請求項１〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
生検が、心内膜心筋生検（ＥＭＢ）である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
量が、レポートにおいて提供される、請求項１〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
レポートにおいて量が提供され、レポートがまた、対象からの試料中のものであったＤＳ−ｃｆＤＮＡの少なくとも１つの前の量を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
量が、データベースにおいて記録される、請求項１〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
データベースがまた、対象からの試料中のものであったＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの少なくとも１つの前の量を含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの量が、
（ａ）複数の単一ヌクレオチドバリアント（ＳＮＶ）標的に対して、試料またはその一部に対して、少なくとも２組のプライマーペアにより、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）定量アッセイなどの増幅ベースの定量アッセイを行うこと、ここで、各々のプライマーペアは、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、ここで、少なくとも２組のプライマーペアの一方は、ＳＮＶ標的の一方のアレルと比較して、プライマー中に３’の最後から２番目にミスマッチを含むが、ＳＮＶ標的の他方のアレルと比較して３’の二重のミスマッチは含まず、ＳＮＶ標的の一方のアレルを特異的に増幅し、少なくとも２組のプライマーペアの他方は、ＳＮＶ標的の他方のアレルを特異的に増幅する、ならびに
（ｂ）結果に基づいてＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの量を評価すること
により決定されるかまたは得られる、請求項１〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
ドナーの遺伝子型が既知である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
ドナーの遺伝子型が不明である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの量が、
（ａ）複数の遺伝子座の各々のアレルを決定すること；
（ｂ）アレルの決定に基づいて、複数の遺伝子座から少なくとも１つのインフォーマティブな遺伝子座を選択すること；
（ｃ）複数の遺伝子座、対象の第１の核酸および対象にとってネイティブではない第２の核酸を含む核酸を同定すること；
（ｄ）統計学的分布を用いて、少なくとも１つのインフォーマティブな遺伝子座における第１のアレルの推定アレル頻度を計算すること；ならびに
（ｅ）推定アレル頻度に基づいて、ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの量を決定すること
により決定されるかまたは得られる、請求項１〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
ドナーの遺伝子型が既知である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
ドナーの遺伝子型が不明である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
少なくとも１つの量が、臓器移植の４、５、６、７または８日後に対象から採取される試料において決定される、請求項１〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
閾値より高いか、および／またはより早い時点からの量と比較して増大したＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの量が、増大したかまたは増大中のリスクを表す、請求項１〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
閾値より低いか、および／またはより早い時点からの量と比較して低下したＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの量が、低下したかまたは低下中のリスクを表す、請求項１〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
モニタリングレジメンを決定することが、対象において経時的にもしくはその後の時点においてＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの量を決定すること、またはかかるモニタリングを対象に提案することを含む、請求項１〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
対象が、毎日または１週間ごとに評価される、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
対象が、１ヵ月ごとまたは２ヵ月ごとに評価される、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
対象が、６ヵ月まで、８ヵ月まで、１０ヵ月まで、または１年までにわたり評価される、請求項１〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの量が、閾値またはより早い時点からの量と比較して高い場合、試料採取の間の時間が短縮される、請求項１〜６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡのさらなる量が、記録または報告される、請求項１〜７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
さらなる量が、レポートにおいて提供される、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
さらなる量が、データベースにおいて記録される、請求項７１または７２に記載の方法。
【請求項７４】
モニタリングレジメンを決定することが、対象における移植拒絶を評価するための１つ以上のさらなる検査を用いること、またはこの使用を提案することを含む、請求項１〜７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
１つ以上のさらなる検査が、生検を含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
生検が、心内膜心筋生検（ＥＭＢ）である、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの量が、本明細書において提供される閾値のいずれか１つと等しいかまたはこれより高い場合、１つ以上のさらなる検査が示される、請求項１〜７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
処置レジメンを決定することが、対象のための処置を選択または示唆することを含む、請求項１〜７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
処置レジメンを決定することが、対象を処置することを含む、請求項１〜７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
処置が、抗拒絶療法を含む、請求項１〜７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
処置が、心臓同種移植片脈管障害のための処置、例えば再移植、経皮的冠動脈形成術（ＰＣＩ）、冠動脈バイパス移植術（ＣＡＢＧ）、経心筋レーザー血行再建術またはヘパリン誘導型／媒介型体外ＬＤＬプラスマフェレーシス（ＨＥＬＰ）を含む、請求項１〜８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
心臓同種移植片脈管障害が示される場合、処置が、スタチン、降圧剤または抗サイトメガロウイルス（抗ＣＭＶ）剤による処置を含む、請求項１〜８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
降圧剤が、カルシウムチャネル遮断薬である、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
心停止のリスクの増大が示される場合、処置が、経皮的冠動脈形成術（冠動脈形成術）、冠動脈バイパス移植術、または植込み型除細動器（ＩＣＤ）の付加などの心停止のための処置を含む、請求項１〜８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
心停止のリスクの増大が示される場合、処置が、抗不整脈剤、不随意神経系遮断薬、または血圧の医薬を含む、請求項１〜８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
処置レジメンを決定することが、処置についての情報を対象に提供することを含む、請求項１〜８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
試料が、血液、血漿または血性試料である、請求項１〜８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
血液試料が血漿試料である、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
移植対象が心臓移植対象である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２０１７年６月２０日に出願された米国仮出願番号６２／５２２，５４７、２０１７年６月２０日に出願された米国仮出願番号６２／５２２，５５６、２０１７年６月２０日に出願された米国仮出願番号６２／５２２，５６０、２０１７年８月８日に出願された米国仮出願番号６２／５４２，７８７、２０１７年８月８日に出願された米国仮出願番号６２／５４２，７９０、２０１７年８月１７日に出願された米国仮出願番号６２／５４６，７９８、２０１７年８月１７日に出願された米国仮出願番号６２／５４６，８４８、２０１７年８月１７日に出願された米国仮出願番号６２／５４６，８７２、２０１７年１０月１２日に出願された米国仮出願番号６２／５７１，７０９、２０１７年１０月１２日に出願された米国仮出願番号６２／５７１，７１５、２０１７年１０月２４日に出願された米国仮出願番号６２／５７６，６４１、２０１８年２月２０日に出願された米国仮出願番号６２／６３２，９６０、および２０１８年４月５日に出願された米国仮出願番号６２／６５３，２６１に対する、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９下における優先権の利益を主張し、これらの各々の全内容は、本明細書において参照として組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
発明の分野
本発明は、移植対象からの試料中のドナー特異的核酸の量を評価するための方法および組成物に関する。かかる量は、移植の後の対象の特定の状態、例えば、移植された臓器の状態または疾患に関連するリスク、例えば、心臓同種移植片脈管障害もしくは心停止、細胞性拒絶グレードもしくは細胞性拒絶グレードに関連するリスク、抗体媒介性拒絶もしくは抗体媒介性拒絶に関連するリスク、または細胞の傷害などの移植臓器傷害、もしくは細胞の傷害などの移植臓器傷害に関連するリスクを評価するために用いることができる。本発明は、さらに、前述のものなどの多様な状態の評価のために、多重最適化ミスマッチ増幅（multiplexed optimized mismatch amplification：ＭＯＭＡ）および／または配列決定技術を用いて、ドナー特異的セルフリーデオキシリボ核酸の量を評価するための方法および組成物に関する。
【発明の概要】
【０００３】
発明の要旨
本開示は、少なくとも部分的に、臓器移植の後の対象における特定の状態、例えば、心臓同種移植片脈管障害、心停止、細胞性拒絶、細胞の傷害、および／または抗体媒介性拒絶のリスクを、対象のドナー特異的セルフリーＤＮＡレベルを用いて予測または評価することができるという驚くべき発見に基づく。試料中のドナー特異的セルフリーＤＮＡを定量するための多様な手段のいずれか１つを用いて、心臓同種移植片脈管障害、心停止、細胞性拒絶、抗体媒介性拒絶、移植臓器傷害に関連するリスク、および／またはこれらに関連するリスクを、経時的に、決定すること、ならびにこれらをモニタリングすることができる。
【０００４】
本明細書において提供されるのは、かかる決定に関する方法、組成物およびキットである。方法、組成物、またはキットは、それぞれ、本明細書において提供される方法、組成物、またはキットのいずれか１つであってよく、これは、例または図面のもののいずれか１つを含む。
提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法は、対象から試料を得ることをさらに含む。
【０００５】
一態様において、本明細書において提供される方法についての態様のいずれか１つは、提供される組成物、キットまたはレポートのいずれか１つについての態様であってよい。一態様において、本明細書において提供される組成物、キットまたはレポートについての態様のいずれか１つは、本明細書において提供される方法のいずれか１つについての態様であってよい。
一側面において、本明細書において提供される量の１つ以上を含む、レポートまたはデータベースが提供される。
【０００６】
一側面において、ＣＲ１以上の細胞性拒絶グレードなどの細胞性拒絶グレードまたはそのリスクを決定するための方法が提供される。いくつかの態様において、方法は、本明細書において提供される方法のいずれか１つである。一側面において、ＣＲ０、ＣＲ１、ＣＲ２またはＣＲ３の細胞性拒絶グレードまたはそのリスクを決定するための方法が提供される。別の側面において、移植対象を評価する（例えば対象が心臓同種移植片脈管障害または心停止を有するか、またはこれを有するリスクがあるか否かを決定する）ための方法が提供される。さらに別の側面において、抗体媒介性拒絶またはそのリスクを決定するための方法が提供される。さらなる態様において、移植臓器傷害（例えば細胞の傷害）またはそのリスクを評価するための方法が提供される。いくつかの態様において、方法は、本明細書において提供される方法のいずれか１つである。
【０００７】
一側面において、本明細書において提供される方法のいずれか１つが提供される。本明細書において提供される方法のいずれか１つの一態様において、本明細書において提供される状態、またはそのリスクのいずれか１つの指標である量は、本明細書において記載されるカットポイントのいずれか１つまたはその範囲である。本明細書において提供される方法のいずれか１つの一態様において、試料を得るための時間は、本明細書において記載される時間のいずれか１つである。本明細書において提供される方法のいずれか１つの一態様において、対象は、本明細書において記載される対象のいずれか１つである。
【０００８】
一側面において、全セルフリーＤＮＡおよび／もしくはドナー特異的セルフリーＤＮＡの量または本明細書において提供される分析の方法のいずれか１つに基づいて、対象を処置する、対象のための処置レジメンを決定する、または対象に対する処置についての情報を提供する方法が提供される。かかる方法のいずれか１つの一態様において、方法は、対象を処置するステップ、または対象に対する処置についての情報を提供するステップを含む。処置の方法のいずれか１つの一態様において、処置は、本明細書において提供される処置のいずれか１つであってよい。処置の方法のいずれか１つの一態様において、処置は、本明細書において提供される状態のいずれか１つのためのものである；その例は、本明細書において提供されるか、さもなければ当業者に公知である。
一側面において、本明細書において提供される方法のいずれか１つは、心臓移植対象などの移植対象を処置する方法であってよい。
【０００９】
添付の図面は、原寸において描写されることは意図されていない。図面は、単なる説明であり、本開示の実施可能用件のために必要とされるものではない。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、ＭＯＭＡプライマーの例示的な非限定的な図を提供する。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイにおいて、ＳＮＶ  Ａを含む配列の伸長が起こることが期待され、これはＳＮＶ  Ａの検出がもたらし、これはその後定量することができる。しかし、ＳＮＶ  Ｂの伸長は、二重ミスマッチに起因して起こらないと期待される。
【図２】図２は、再構築実験からの結果を示す。
【図３】図３は、ドナーの遺伝子型を予測するための期待値最大化の使用を示す。破線＝第１の反復（first iteration）、実線＝第２の反復（second iteration）、最終コール（Final call）＝１０％。
【図４】図４は、ドナーの遺伝子型を予測するための期待値最大化の使用を示す。最終コール（Final call）＝５％。再構築実験からの結果を示す。
【図５】図５は、ドナー遺伝子型を予測する能力を示す再構築実験データを提供する。データは、９５のＳＮＶ標的のセットにより作製した。
【００１１】
【図６】図６は、これによりいくつかの態様を作動させることができるコンピューターシステムの例を説明する。
【図７−１】図７は、細胞性グレード２（以上）の拒絶カットポイントの閾値（カットポイント）を決定するための異なる方法の感度および特異度を示すグラフを含む。方法１および方法２（上の行）は、移植患者からのドナー特異的セルフリーＤＮＡ（ｃｆ−ＤＮＡ）を用いて示す。
【図７−２】図７は、細胞性グレード２（以上）の拒絶カットポイントの閾値（カットポイント）を決定するための異なる方法の感度および特異度を示すグラフを含む。方法１および方法２（上の行）は、移植患者からのドナー特異的セルフリーＤＮＡ（ｃｆ−ＤＮＡ）を用いて示す。
【図８−１】図８は、ドナー特異的ｃｆ−ＤＮＡおよび２つの異なる方法を用いた、ＣＲ０およびＣＲ１（上の行）、ならびにＣＲ０およびＣＲ２（下の行）についての閾値（「カットポイント」）の実験による決定を示す。
【図８−２】図８は、ドナー特異的ｃｆ−ＤＮＡおよび２つの異なる方法を用いた、ＣＲ０およびＣＲ１（上の行）、ならびにＣＲ０およびＣＲ２（下の行）についての閾値（「カットポイント」）の実験による決定を示す。
【図９】図９は、ＭＯＭＡ（ドナー遺伝子型情報あり）を用いた、ＣＲ０についての閾値の実験による決定を示す。
【図１０】図１０は、ＭＯＭＡ（ドナー遺伝子型情報なし）を用いた、ＣＦ０についての閾値の実験による決定を示す。
【００１２】
【図１１】図１１は、異なる方法のＭＯＭＡ（ドナー遺伝子型情報ありおよびなし）の結果の比較を示す。
【図１２】図１２は、ドナー特異的ｃｆ−ＤＮＡおよびＭＯＭＡ（ドナー遺伝子型情報あり）を用いた、細胞性拒絶グレード２（ＣＲ２）についての閾値点の実験による決定を示す。
【図１３】図１３は、ドナー特異的ｃｆ−ＤＮＡおよびＭＯＭＡ（ドナー遺伝子型情報あり）を用いた、細胞性拒絶グレード２（ＣＲ２）についての閾値点の実験による決定を示す。各々の対象から得られた最後の試料を、分析のために用いた。
【図１４】図１４は、ドナー特異的ｃｆ−ＤＮＡおよびＭＯＭＡ（ドナー遺伝子型情報なし）を用いた、細胞性拒絶グレード２（ＣＲ２）についての閾値点の実験による決定を示す。
【図１５】図１５は、ドナー特異的ｃｆ−ＤＮＡおよびＭＯＭＡ（ドナー遺伝子型情報なし）を用いた、細胞性拒絶グレード２（ＣＲ２）についての閾値点の実験による決定を示す。各々の対象から得られた最後の試料を、分析のために用いた。
【００１３】
【図１６】図１６は、ドナー特異的ｃｆ−ＤＮＡおよびＭＯＭＡ（ドナー遺伝子型情報あり）を用いた、細胞性拒絶グレード２（ＣＲ２）についての閾値点の実験による決定を示す。機械的サポートを受けている対象からの試料は、分析から除外した。
【図１７】図１７は、ドナー特異的ｃｆ−ＤＮＡおよびＭＯＭＡ（ドナー遺伝子型情報なし）を用いた、細胞性拒絶グレード２（ＣＲ２）についての閾値点の実験による決定を示す。機械的サポートを受けている対象からの試料は、分析から除外した。
【図１８】図１８は、ドナー特異的ｃｆ−ＤＮＡおよびＭＯＭＡ（ドナー遺伝子型情報なし）を用いた、細胞性拒絶グレード２（ＣＲ２）についての閾値点の実験による決定を示す。
【図１９】図１９は、ドナー特異的ｃｆ−ＤＮＡおよびＭＯＭＡ（ドナー遺伝子型情報なし）を用いた、細胞性拒絶グレード２（ＣＲ２）についての閾値点の実験による決定を示す。機械的サポートを受けている対象からの試料は、分析から除外した。
【図２０】図２０は、ドナー特異的ｃｆ−ＤＮＡおよびＭＯＭＡ（ドナー遺伝子型情報あり）を用いた、細胞性拒絶グレード１（ＣＲ１）についての閾値点の実験による決定を示す。
【００１４】
【図２１】図２１は、ドナー特異的ｃｆ−ＤＮＡおよびＭＯＭＡ（ドナー遺伝子型情報あり）を用いた、細胞性拒絶グレード１（ＣＲ１）についての閾値点の実験による決定を示す。機械的サポートを受けている対象からの試料は、除外した。
【図２２】図２２は、ドナー特異的ｃｆ−ＤＮＡおよびＭＯＭＡ（ドナー遺伝子型情報あり）を用いた、細胞性拒絶グレード１（ＣＲ１）についての閾値点の実験による決定を示す。各々の対象から得られた最後の試料を、分析のために用いた。
【図２３】図２３は、ドナー特異的ｃｆ−ＤＮＡおよびＭＯＭＡ（ドナー遺伝子型情報なし）を用いた、細胞性拒絶グレード１（ＣＲ１）についての閾値点の実験による決定を示す。
【図２４】図２４は、ドナー特異的ｃｆ−ＤＮＡおよびＭＯＭＡ（ドナー遺伝子型情報なし）を用いた、細胞性拒絶グレード１（ＣＲ１）についての閾値点の実験による決定を示す。機械的サポートを受けている対象からの試料は、除外した。
【図２５】図２５は、ドナー特異的ｃｆ−ＤＮＡおよびＭＯＭＡ（ドナー遺伝子型情報なし）を用いた、細胞性拒絶グレード１（ＣＲ１）についての閾値点の実験による決定を示す。各々の対象から得られた最後の試料を、分析のために用いた。
【００１５】
【図２６】図２６は、ドナー特異的ｃｆ−ＤＮＡおよびＭＯＭＡ（ドナー遺伝子型情報あり）を用いた、細胞性拒絶グレード０（ＣＲ０）についての閾値点の実験による決定を示す。
【図２７】図２７は、ドナー特異的ｃｆ−ＤＮＡおよびＭＯＭＡ（ドナー遺伝子型情報あり）を用いた、細胞性拒絶グレード０（ＣＲ０）についての閾値点の実験による決定を示す。機械的サポートを受けている対象からの試料は、除外した。
【図２８】図２８は、ドナー特異的ｃｆ−ＤＮＡおよびＭＯＭＡ（ドナー遺伝子型情報あり）を用いた、細胞性拒絶グレード０（ＣＲ０）についての閾値点の実験による決定を示す。各々の対象から得られた最後の試料を、分析のために用いた。
【図２９】図２９は、ドナー特異的ｃｆ−ＤＮＡおよびＭＯＭＡ（ドナー遺伝子型情報なし）を用いた、細胞性拒絶グレード０（ＣＲ０）についての閾値点の実験による決定を示す。
【図３０】図３０は、ドナー特異的ｃｆ−ＤＮＡおよびＭＯＭＡ（ドナー遺伝子型情報なし）を用いた、細胞性拒絶グレード０（ＣＲ０）についての閾値点の実験による決定を示す。機械的サポートを受けている対象からの試料は、除外した。
【００１６】
【図３１】図３１は、ドナー特異的ｃｆ−ＤＮＡおよびＭＯＭＡ（ドナー遺伝子型情報なし）を用いた、細胞性拒絶グレード０（ＣＲ０）についての閾値点の実験による決定を示す。各々の対象から得られた最後の試料を、分析のために用いた。
【図３２−１】図３２は、実験により決定された抗体媒介性拒絶（グレード０対グレード１または２）についての閾値（カットポイント）を表す２つのグラフを示す。
【図３２−２】図３２は、実験により決定された抗体媒介性拒絶（グレード０対グレード１または２）についての閾値（カットポイント）を表す２つのグラフを示す。
【図３３】図３３は、ＭＯＭＡ（既知のドナー遺伝子型）を用いた、抗体媒介性拒絶についてのカットポイント（閾値）の実験による決定を示すグラフである。
【図３４】図３４は、ＭＯＭＡ（既知のドナー遺伝子型）を用い、機械的サポートを受けている対象からの試料を除外した、抗体媒介性拒絶についてのカットポイント（閾値）の実験による決定を示すグラフである。
【図３５】図３５は、ＭＯＭＡ（既知のドナー遺伝子型）および各々の対象からの最後の試料を用いた、抗体媒介性拒絶についてのカットポイント（閾値）の実験による決定を示すグラフである。
【００１７】
【図３６】図３６は、ＭＯＭＡ（ドナー遺伝子型不明）用いた、抗体媒介性拒絶についてのカットポイント（閾値）の実験による決定を示すグラフである。
【図３７】図３７は、ＭＯＭＡ（ドナー遺伝子型不明）用い、機械的サポートを受けている対象からの試料を除外した、抗体媒介性拒絶についてのカットポイント（閾値）の実験による決定を示すグラフである。
【図３８】図３８は、ＭＯＭＡ（ドナー遺伝子型不明）および各々の対象からの最後の試料を用いた、抗体媒介性拒絶についてのカットポイント（閾値）の実験による決定を示すグラフである。
【図３９−１】図３９は、２つの異なる方法（上の行）によるドナー特異的セルフリーＤＮＡ（ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡ）を用いた、心臓同種移植片脈管障害のカットポイント（閾値）の実験による決定を示す。
【図３９−２】図３９は、２つの異なる方法（上の行）によるドナー特異的セルフリーＤＮＡ（ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡ）を用いた、心臓同種移植片脈管障害のカットポイント（閾値）の実験による決定を示す。
【図４０−１】図４０は、２つの異なる方法（上の行）によるドナー特異的セルフリーＤＮＡ（ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡ）を用いた、心停止のカットポイント（閾値）の実験による決定を示す。
【図４０−２】図４０は、２つの異なる方法（上の行）によるドナー特異的セルフリーＤＮＡ（ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡ）を用いた、心停止のカットポイント（閾値）の実験による決定を示す。
【００１８】
【図４１】図４１は、２１４の試料を用いてＭＯＭＡ（ドナー遺伝子型情報あり）を用いた、移植片脈管障害についての閾値の実験による決定を示す。
【図４２】図４２は、機械的サポートを受けている対象からの試料を除外してＭＯＭＡ（ドナー遺伝子型情報あり）を用いた、移植片脈管障害についての閾値の実験による決定を示す。
【図４３】図４３は、２１４の試料を用いてＭＯＭＡ（ドナー遺伝子型情報なし）を用いた、移植片脈管障害についての閾値の実験による決定を示す。
【図４４】図４４は、機械的サポートを受けている対象からの試料を除外してＭＯＭＡ（ドナー遺伝子型情報なし）を用いた、移植片脈管障害についての閾値の実験による決定を示す。
【図４５】図４５は、各々の対象から得られた最後の試料（Ｎ＝７９）を用いてＭＯＭＡ（ドナー遺伝子型情報なし）を用いた、移植片脈管障害についての閾値の実験による決定を示す。
【００１９】
【図４６】図４６は、ＭＯＭＡ（ドナー遺伝子型情報なし）を用いた、移植片脈管障害についての閾値の実験による決定を示す。
【図４７】図４７は、ドナー特異的ｃｆ−ＤＮＡおよびＭＯＭＡ（ドナー遺伝子型あり）を用いた、心停止についての閾値の実験による決定を示す。
【図４８】図４８は、ドナー特異的ｃｆ−ＤＮＡおよびＭＯＭＡ（ドナー遺伝子型あり）を用いた、心停止についての閾値の実験による決定を示す。機械的サポートを受けている対象からの試料は、分析から除外した。
【図４９】図４９は、ドナー特異的ｃｆ−ＤＮＡおよびＭＯＭＡ（ドナー遺伝子型あり）を用い、各々の対象から得られた最後の試料を用いた、心停止についての閾値の実験による決定を示す。
【図５０】図５０は、ドナー特異的ｃｆ−ＤＮＡおよびＭＯＭＡ（既知のドナー遺伝子型なし）を用いた、心停止についての閾値の実験による決定を示す。
【００２０】
【図５１】図５１は、ドナー特異的ｃｆ−ＤＮＡおよびＭＯＭＡ（既知のドナー遺伝子型なし）を用いた、心停止についての閾値の実験による決定を示し、機械的サポートを受けている対象からの試料は、分析から除外した。
【図５２】図５２は、ドナー特異的ｃｆ−ＤＮＡおよびＭＯＭＡ（既知のドナー遺伝子型なし）を用いる、各々の対象から得られた最後の試料を用いての、心停止についての閾値の実験による決定を示す。
【図５３】図５３は、ドナー特異的ｃｆ−ＤＮＡおよびＭＯＭＡ（既知のドナー遺伝子型なし）を用いる、心停止についての閾値の実験による決定を示す。
【図５４】図５４は、ドナー特異的ｃｆ−ＤＮＡおよびＭＯＭＡ（既知のドナー遺伝子型なし）を用いる、心停止についての閾値の実験による決定を示す。機械的サポートを受けている対象からの試料を、分析から除外した。
【図５５】図５５は、プレ生検（pre-biopsy）およびポスト生検（post-biopsy）のドナー特異的画分（ＤＦ）セルフリーＤＮＡ（ｃｆ−ＤＮＡ）の％の増大を示す。
【００２１】
【図５６】図５６は、プレ生検およびポスト生検の血漿１ｍＬあたりのドナーゲノム当量（ＧＥ）の増大を示す。
【図５７】図５７は、全試料においてＭＯＭＡ（既知のドナー遺伝子型によるもの）を用いた、ＣＲ１／２／３およびＣＲ０の実験による識別を示す。
【図５８】図５８は、ＭＯＭＡ（既知のドナー遺伝子型によるもの）を用いた、ＣＲ１／２／３およびＣＲ０の実験による識別を示す。ＣＲ０を有する健常試料は、以下のいずれをも有さないものであった：死亡、心停止、ＭＣＳ、感染のための処置、ＡＭＲ１＆２、移植片脈管障害、およびがん。
【図５９】図５９は、対象１人あたり１つの試料を用いてＭＯＭＡ（既知のドナー遺伝子型によるもの）を用いた、ＣＲ１／２／３およびＣＲ０の実験による識別を示す。ＣＲ１／２／３群の第１の拒絶を試料として用い、「健常」群の各々のメンバーからの第１の試料を用いた。
【図６０】図６０は、血漿試料を用いてＭＯＭＡ（既知のドナー遺伝子型によるもの）を用いた、ＣＲ１／２／３およびＣＲ０の実験による識別を示す。ＣＲ０を有する健常試料は、以下のいずれをも有さないものであった：死亡、心停止、ＭＣＳ、感染のための処置、ＡＭＲ１＆２、移植片脈管障害、およびがん。
【００２２】
【図６１】図６１は、健常な対象（以下のいずれをも有さないもの：死亡、心停止、ＭＣＳ、感染のための処置、ＡＭＲ１＆２、移植片脈管障害、およびがん）からの全血試料を用いてＭＯＭＡ（既知のドナー遺伝子型によるもの）を用いた、ＣＲ１／２／３およびＣＲ０の実験による識別を示す。
【図６２】図６２は、全試料においてＭＯＭＡ（不明なドナー遺伝子型によるもの）を用いた、ＣＲ１／２／３およびＣＲ０の実験による識別を示す。
【図６３】図６３は、ＭＯＭＡ（不明なドナー遺伝子型によるもの）を用いた、ＣＲ１／２／３およびＣＲ０の実験による識別を示す。ＣＲ０を有する健常試料は、以下のいずれをも有さないものであった：死亡、心停止、ＭＣＳ、感染のための処置、ＡＭＲ１＆２、移植片脈管障害、およびがん。
【図６４】図６４は、ＭＯＭＡ（不明なドナー遺伝子型によるもの）を用い、対象１人あたり１つの試料を用いた、ＣＲ１／２／３およびＣＲ０の実験による識別を示す。ＣＲ１／２／３群の第１の拒絶を試料として用い、「健常」群の各々のメンバーからの第１の試料を用いた。
【図６５】図６５は、血漿試料を用いてＭＯＭＡ（不明なドナー遺伝子型によるもの）を用いた、ＣＲ１／２／３およびＣＲ０の実験による識別を示す。ＣＲ０を有する健常試料は、以下のいずれをも有さないものであった：死亡、心停止、ＭＣＳ、感染のための処置、ＡＭＲ１＆２、移植片脈管障害、およびがん。
【００２３】
【図６６】図６６は、全血試料を用いてＭＯＭＡ（不明なドナー遺伝子型によるもの）を用いた、ＣＲ１／２／３およびＣＲ０の実験による識別を示す。ＣＲ０を有する健常試料は、以下のいずれをも有さないものであった：死亡、心停止、ＭＣＳ、感染のための処置、ＡＭＲ１＆２、移植片脈管障害、およびがん。
【図６７】図６７は、ＭＯＭＡ（既知のドナー遺伝子型によるもの）を行った試料についてのデータ分布を説明する模式図である。ドナー画分について利用可能な１１３３の試料データが存在した。
【図６８】図６８は、ＭＯＭＡ（不明なドナー遺伝子型によるもの）を行った試料についてのデータ分布を説明する模式図である。ドナー画分について利用可能な１２０４の試料データが存在した。
【図６９】図６９は、方法１（既知のドナー遺伝子型によるもの；左のグラフ）により、および方法２（不明なドナー遺伝子型によるもの；右のグラフ）により、ＤＦ  ｃｆＤＮＡの、細胞性拒絶（ＣＲ）グレード（ＣＲ０対ＣＲ１またはＣＲ２）との関連を、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線により示す、２つのグラフを含む。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
発明の詳細な説明
ドナー特異的ｃｆ−ＤＮＡ（ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡ）またはドナー画分（ＤＦ）ｃｆ−ＤＮＡが、特定の状態、例えば、心臓同種移植片脈管障害、心停止、細胞性拒絶、移植臓器傷害（例えば細胞の傷害）、および抗体媒介性拒絶と相関し、これらの各々は、組み合わせて、または別々に、結果として、対象を評価および／またはモニタリングするために用いることができることを見出した。したがって、本開示の側面は、少なくとも部分的に、細胞性拒絶、抗体媒介性拒絶、移植臓器傷害（例えば細胞の傷害）、心臓同種移植片脈管障害および／または心停止、またはこれらに関連するリスクのグレードを評価または決定するために、試料中のＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡを定量する方法に関する。
【００２５】
本明細書において用いられる場合、「ドナー特異的核酸」とは、移植レシピエントにおいて見出すことができる、移植ドナーからのものである核酸を指す。かかる核酸は、好ましくは、セルフリーＤＮＡである。「セルフリーＤＮＡ」（またはｃｆ−ＤＮＡ）とは、細胞の外側、例えば対象の血液、血漿、血清、尿などにおいて存在するＤＮＡである。本明細書において用いられる場合、本明細書において提供される組成物および方法は、移植レシピエント中に見出すことができるドナーに特異的なセルフリーＤＮＡの量、またはドナー特異的セルフリーＤＮＡ（ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡ）を決定するために用いることができる。本明細書において用いられる場合、「移植」は、レシピエントの損傷を受けたかまたは欠損している臓器または組織を置き換えることを目的として、ドナーからレシピエントに臓器または組織を移動することを指す。本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つは、臓器または組織の移植を受けた対象からの試料に対して用いてもよい。いくつかの態様において、移植は、心臓移植である。
【００２６】
対象は、任意の年齢のものであってよい；しかし、いくつかの態様において、対象は、２４、２２、２０、１８、１６、１４、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１歳未満である。別の態様において、対象は、２４歳以上、例えば、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５または８０歳以上である。対象は、任意の体重のものであってよい；しかし、いくつかの態様において、対象は、３０ｋｇ未満、例えば、２８、２６、２４、２２、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１または１０ｋｇ未満である。一態様において、対象は、16歳未満である。他の態様において、対象は、３０ｋｇ以上、例えば、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００ｋｇ以上である。一態様において、対象は、体重２０ｋｇ未満である。
【００２７】
重要なことに、ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの量は、低いグレードの細胞性拒絶をも含む移植拒絶のグレードを評価または決定するために用いることができる。本明細書において提供される場合、ＣＲ２以下の細胞性拒絶グレードを有するか、またはこれを有することが疑われる対象を評価するために、方法のいずれか１つを用いることができる。また、本明細書において提供される場合、ＣＲ２以上の細胞性拒絶グレードを有するか、またはこれを有することが疑われる対象を評価するために、方法のいずれか１つを用いることができる。ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの量はまた、心臓同種移植片脈管障害および／または心停止、またはそのリスクを評価または決定するために、用いることができる。本明細書において提供される場合、方法のいずれか１つを、心臓同種移植片脈管障害および／または心停止を有するか、これを有することが疑われるか、またはこれを有するリスクがある対象を評価するために用いることができる。加えて、ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの量は、抗体媒介性拒絶を評価または決定するために、用いることができる。本明細書において提供される場合、方法のいずれか１つを、抗体媒介性拒絶を有するか、またはこれを有することが疑われる対象を評価するために用いることができる。ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの量はまた、移植臓器傷害、例えば細胞の傷害（生検の後のものなど）を評価または決定するために、用いることができる。本明細書において提供される場合、方法のいずれか１つを、移植臓器傷害を有するか、またはこれを有することが疑われる対象を評価するために、用いることができる。本明細書において用いられる場合、「有することが疑われる」とは、それにより対象が特定の状態、例えば特定の細胞性拒絶グレード、心臓同種移植片脈管障害、抗体媒介性拒絶、移植臓器傷害（例えば細胞の傷害）を有する可能性が存在すると医師が信じる対象を指す。
【００２８】
本明細書において提供される方法のいずれか１つの一態様において、対象は、本明細書において提供されるグレードのいずれか１つの細胞性拒絶を有するもの、または本明細書において提供される拒絶のグレードのいずれか１つを有する可能性が存在すると医師が信じるものであってよい。かかる対象は、細胞性拒絶グレードの症状（および／またはその不在）に基づいて、特定のグレードの細胞性拒絶を有することが疑われるものであってもよい。しかし、いくつかの態様において、対象は、１つ以上の他の検査により、例えば生検により、特定のグレードの拒絶を有すると決定されているものである。
【００２９】
本明細書において提供される方法のいずれか１つの一態様において、対象は、心臓同種移植片脈管障害および／または心停止を有するか、これを有したことがあるもの、あるいは、心臓同種移植片脈管障害および／または心停止を有する可能性が存在すると医師が信じるものであってよい。かかる対象は、症状（および／またはその不在）に基づいて、心臓同種移植片脈管障害および／または心停止を有することが疑われるか、またはその可能性があるものであってよい。しかし、いくつかの態様において、前述のものは、１つ以上の他の検査に基づくもの、例えば生検によるものであってもよい。
【００３０】
本明細書において提供される方法のいずれか１つの一態様において、対象は、抗体媒介性拒絶を有するもの、または、抗体媒介性拒絶を有する可能性が存在すると医師が考えるものであってよい。かかる対象は、抗体媒介性拒絶の症状（および／またはその不在）に基づいて、抗体媒介性拒絶を有することが疑われるものであってよい。しかし、いくつかの態様において、対象は、１つ以上の他の検査により、例えば生検により、抗体媒介性拒絶を有することが決定されたものである。
【００３１】
本明細書において提供される方法のいずれか１つの一態様において、対象は、本明細書において提供されるような移植された臓器に対する傷害を有するもの、または本明細書において提供されるような移植された臓器に対する傷害を有する可能性が存在すると医師が考えるものであってよい。かかる対象は、傷害の症状（および／またはその不在）に基づいて、移植臓器に対する傷害を有することが疑われるものであってもよい。しかし、いくつかの態様において、対象は、１つ以上の他の検査により、例えば生検により、またはさらなる生検により、移植された臓器に対する傷害を有することが決定されたものである。
いくつかの態様において、本明細書において提供される方法は、状態の悪化または改善について、かかる知見を確認するか、またはかかる対象をモニタリングするために用いることができる。
【００３２】
細胞性拒絶は、国際心肺移植学会（International Society for Heart and Lung Transplantation：ＩＳＨＬＴ）のグレード付けスキームに従うもののように、ＣＲ０、ＣＲ１、ＣＲ２またはＣＲ３として、グレードにより分類することができる。例示的なグレード付けスキームを、以下に提供する。
【表Ａ】
2020529193.tif 000003
【００３３】
対象は、ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの１つ以上の量を決定するかまたはこれを得ることにより、評価することができる。ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの量は、本明細書において別の場所で提供されるものなどの実験技術を用いて決定することができる。「得ること」とは、本明細書において用いられる場合、それによりそれぞれの情報または材料を得ることができる任意の方法を指す。したがって、それぞれの情報は、実験方法により得ることができる。それぞれの材料は、いくつかの態様において、多様な実験または研究方法を用いて作製、設計などを行うことができる。それぞれの情報または材料はまた、レポートなどの情報、または材料を与えられるかまたはこれを提供されることにより得ることができる。いくつかの態様において、材料は、商業的手段を通して（すなわち、購入することにより）与えられるかまたは提供されてもよい。
【００３４】
ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡなどのドナー特異的核酸の量を決定する能力、ならびに細胞性拒絶グレード、心臓同種移植片脈管障害、心停止、抗体媒介性拒絶、および移植臓器傷害（例えば細胞の傷害）との相関に起因して、本明細書において提供される方法および組成物は、本明細書において提供されるように対象を評価するために用いることができる。したがって、拒絶の状態を改善するかまたは悪化させるリスクを、かかる対象において決定することができる。「リスク」とは、本明細書において提供される場合、対象における任意の望ましくない状態の存在または不在または進行、またはかかる状態の存在または不在または進行の可能性の増大を指す。本明細書において提供される場合、「リスクの増大」とは、対象における任意の望ましくない状態の存在または進行、またはかかる状態の存在または進行の可能性の増大を指す。本明細書において提供される場合、「リスクの低下」とは、対象における任意の望ましくない状態または進行の不在、またはかかる状態の存在または進行（または不在または非進行の可能性の増大）の可能性の低下を指す。
【００３５】
本明細書において提供される場合、細胞性拒絶、心臓同種移植片脈管障害、心停止、抗体媒介性拒絶、および／または移植臓器傷害（例えば細胞性拒絶）状態の早期の検出またはモニタリングにより、処置を容易にして臨床成績を改善することができる。上述のとおり、提供される方法のいずれか１つは、本明細書において提供されるような対象に対して行うことができる。かかる方法は、対象を、処置と共に、または処置することなく、経時的にモニタリングするために用いることができる。さらに、かかる方法は、処置または治療の選択、投与および／またはモニタリングを補助することができる。したがって、本明細書において提供される方法は、処置またはモニタリングのレジメンを決定するために用いることができる。
【００３６】
「処置レジメンを決定すること」、本明細書において用いられる場合、臨床的に処置可能な拒絶を起こしている対象のための行為のコースの決定を指す。本明細書において提供される方法のいずれか１つの一態様において、処置レジメンを決定することは、適切な治療を決定することまたは対象に提供するべき適切な治療に関する情報を提供することを含む。本明細書において提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、決定することは、対象に対する適切な治療に関して適切な治療または情報を提供することを含む。本明細書において用いられる場合、処置または治療またはモニタリングに関する情報は、書面の形態または電子形態において提供されてもよい。いくつかの態様において、情報は、コンピューター可読の指示として提供されてもよい。いくつかの態様において、情報は、口頭で提供されてもよい。
【００３７】
治療は、例えば細胞性拒絶を処置するためのもの、例えば抗拒絶反応治療であってよい。抗拒絶反応治療として、例えば免疫抑制剤が挙げられる。免疫抑制剤として、これらに限定されないが、以下が挙げられる：副腎皮質ステロイド（例えば、プレドニゾロンまたはヒドロコルチゾン）、糖質コルチコイド、細胞分裂阻害剤、アルキル化剤（例えば、ナイトロジェンマスタード（シクロホスファミド）、ニトロソウレア、白金化合物、シクロホスファミド（Cytoxan））、代謝拮抗薬（例えば、メトトレキサートなどの葉酸アナログ、アザチオプリンおよびメルカプトプリンなどのプリン、ピリミジンアナログ、およびタンパク質合成阻害剤）、細胞傷害性抗生物質（例えば、ダクチノマイシン、アントラサイクリン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ミトラマイシン）、抗体（例えば、抗ＣＤ２０、抗ＩＬ−１、抗ＩＬ−２Ｒアルファ、抗Ｔ細胞または抗ＣＤ−３モノクローナルおよびポリクローナル、例えばAtgamおよびサイモグロブリン）、イムノフィリンに作用する薬物、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムス、インターフェロン、オピオイド、ＴＮＦ結合タンパク質、ミコフェノール酸、フィンゴリモドおよびミリオシン。いくつかの態様において、抗拒絶反応治療は、血液移植（blood transfer）または骨髄移植を含む。治療はまた、静脈内注射用流体（intravenous fluid）、抗生物質、外科的排膿法、早期目標指向型治療（early goal directed therapy：EGDT）、昇圧剤、ステロイド、活性化タンパク質Ｃ、ドロトレコギンアルファ（活性化型）、酸素および臓器不全のための適切なサポートを含んでもよい。これは、腎不全における血液透析、肺機能不全における人工呼吸、血液製剤の輸血、ならびに循環不全における薬物および輸液療法を含んでもよい。適切な栄養を確保すること（好ましくは経腸栄養により、しかし必要な場合には非経口栄養により）もまた、長期の疾病の間には特に含まれ得る。他の関連する治療は、インスリンならびに深部静脈血栓症および胃潰瘍を予防するための医薬を含んでもよい。他のかかる治療は、当業者には公知である。
【００３８】
治療は、例えば、抗体媒介性拒絶を処置するためのものであってよい。抗体媒介性拒絶治療として、例えば、免疫抑制剤、プラスマフェレーシス／血漿交換、免疫グロブリン静注、副腎皮質ステロイド、抗リンパ球抗体および脾摘出術が挙げられる。
【００３９】
心臓同種移植片脈管障害治療として、例えば、再移植、経皮的冠動脈形成術（ＰＣＩ）、冠動脈バイパス移植術（ＣＡＢＧ）、経心筋レーザー血行再建術および／またはヘパリン誘導性／媒介性体外ＬＤＬプラスマフェレーシス（ＨＥＬＰ）、ならびにスタチン、降圧剤、および／または抗サイトメガロウイルス（抗ＣＭＶ）剤の投与が挙げられる。
【００４０】
心停止が示される症例のための治療として、これらに限定されないが、経皮的冠動脈形成術（冠動脈形成術）、冠動脈バイパス形成術、または植込み型除細動器（ＩＣＤ）の付加が挙げられる。さらなる治療として、これらに限定されないが、抗不整脈剤、不随意神経系遮断薬または血圧の医薬が挙げられる。さらに、対象に、冠動脈カテーテルおよび／または心臓除細動器（cardioverter-defibrillator）を移植してもよい。
【００４１】
治療は、例えば、臓器傷害を処置するためのものであってよく、単独で、または抗拒絶療法などの移植合併症に関連する他の治療と組み合わせて用いてもよい。抗拒絶療法として、例えば、免疫抑制剤（上記）が挙げられる。
他のかかる治療は、当業者に公知である。
【００４２】
処置または治療の投与は、当該分野において公知の任意の方法により達成することができる（例えば、Harrison’s Principle of Internal Medicine, McGraw Hill Inc.を参照）。好ましくは、処置または治療の投与は、治療有効量において起こる。投与は、局所性または全身性であってよい。投与は、非経口（例えば、静脈内、皮下、または皮内）または経口であってよい。投与の様々な経路のための組成物は、当該分野において公知である（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences by E. W. Martinを参照）。
【００４３】
処置および臨床経過は、対象の細胞性拒絶グレードおよび／または関連する期待される結果により決定することができる。例えば、ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの量が０．８以上である場合、ＣＲ２以上の細胞性拒絶グレードが示され、対象は、上記のもののように、抗拒絶反応治療により処置されるか、またはそれに関連する情報を提供され得る。別の例として、ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの量が０．２または０．３と等しいかまたはこれらより高い場合、心臓同種移植片脈管障害および／または心停止が示され得、対象は、上記のもののように、治療により処置されるか、またはそれに関連する情報を提供され得る。いくつかの態様において、ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの量が０．２以上である場合、抗体媒介性拒絶が示され得、対象を上記のもののような抗拒絶療法により処置するか、または対象にそれらに関する情報を提供してもよい。
【００４４】
「モニタリングのレジメンを決定すること」とは、本明細書において用いられる場合、対象における状態を経時的にモニタリングするために行為のコースを決定することを指す。本明細書において提供される方法のいずれか１つの一態様において、モニタリングのレジメンを決定することは、経時的に、またはその後の時点において、対象におけるＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの量を決定するため、またはかかるモニタリングを対象に提案するための、行為の適切なコースを決定することを含む。このことは、臨床状態におけるバリエーションの測定を可能にし得るか、および／または、正常値または基線レベルの計算（ならびにそれらとの比較）を可能にし得る。本明細書において提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様においてモニタリングのレジメンを決定することは、対象から試料を得るタイミングおよび／もしくは頻度を決定すること、ならびに／またはＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの量を決定するかもしくはこれを得ることを含む。
【００４５】
本明細書において提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡは、移植手術の４日後には早くも、検出することができる。他の態様において、ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡは、移植の５、６、７または８日後、またはそれより後に定量してもよい。対象のＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡレベルをモニタリングするために、試料は、１ヵ月ごと、２ヵ月ごと、またはより頻繁な間隔において、６ヵ月まで、８ヵ月まで、１０ヵ月まで、１２ヵ月まで、またはそれより長くにわたり、採取してもよい。
【００４６】
移植臓器傷害の場合、本明細書において提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡレベルは、傷害の１分後には早くも検出することができる。他の態様において、ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡは、傷害の５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５または６０分後に定量してもよい。別の態様において、ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡは、傷害の１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０時間後に定量してもよい。対象のＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡレベルをモニタリングするために、試料は、１ヵ月ごと、２ヵ月ごと、またはより頻繁な間隔において、６ヵ月まで、８ヵ月まで、１０ヵ月まで、１２ヵ月まで、またはそれより長くにわたり、採取してもよい。
【００４７】
ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡのレベルの増大は、リスクの増大と相関することが見出されたことから、医師は、対象のＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡおよび／または全ｃｆ−ＤＮＡが複数の時点の間で増大することが見出される場合、より頻繁な試料採取を受けるべきであることを決定することができる。対象が、複数の時点の間で低下しているＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡのレベルを有することが見出される場合、医師は、より頻度が低い試料採取が十分であることを決定することができる。モニタリングのタイミングおよび／または頻度はまた、１つ以上の閾値との比較によっても決定することができる。例えば、ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの量が、０．１、０．２または０．３（または本明細書において提供される閾値のいずれか１つ）と等しいかまたはこれより高い、および／または増大中である場合、より頻繁な試料採取が必要であり得るが、一方、ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの量が、０．１、０．２または０．３（または本明細書において提供される閾値のいずれか１つ）より低く、および／または増大中ではない場合、より頻度が低い試料採取が必要とされ得る。一般に、より高いかまたは増大中のＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの量を有する対象は、より近いモニタリングおよびより頻繁な試料採取を必要とする。本明細書において提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、各々の量および時点は、レポートにおいて、またはデータベースにおいて、記録することができる。
【００４８】
本明細書において提供されるような値のいずれか１つ以上によるレポートがまた、一側面において提供される。レポートは、口頭、書面（またはハードコピー）、または電子形態におけるもの、例えば可視化または表示することができる形態におけるものであってよい。好ましくは、レポートは、試料中のドナー特異的な核酸の量を提供する。いくつかの態様において、レポートは、対象からの試料中のドナー特異的な核酸の量を経時的に提供してもよい。
【００４９】
いくつかの態様において、量は、データベース中にあるか、またはデータベース中に入力される。一側面において、かかる量および／または値を有するデータベースが提供される。量から、医師は、対象の処置またはモニタリングの必要性を評価することができる。したがって、本明細書において提供される方法のいずれか１つにおいて、方法は、１つより多くの時点において対象における核酸の量を評価することを含んでもよい。かかる評価は、本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つにより行うことができる。
【００５０】
本明細書において用いられる場合、「量」とは、任意の定量的値を指し、絶対量または相対量において示され得る。さらに、量は、合計量、頻度、比、パーセンテージなどであってもよい。本明細書において用いられる場合、「レベル」という用語は、「量」の代わりに用いることができるが、同じ型の値を指すことが意図される。一般に、別段に提供されない限り、本明細書において提供される量は、試料中の、合計に対して相対的なＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの比またはパーセンテージを表す。
【００５１】
いくつかの態様において、本明細書において提供される方法のいずれか１つは、リスクが増大または低下した対象を同定するために、ドナー特異的核酸の量を閾値と、または１つ以上の前の量と比較することを含んでもよい。本明細書において提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、閾値と、または１つ以上の前の量と比較してドナー特異的核酸の量が高い対象は、リスクが増大したものとして同定される。本明細書において提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、閾値と、または１つ以上の前の量と比較してドナー特異的核酸の量が低いか同様の対象は、リスクが低下したか増大していないものとして同定される。
【００５２】
「閾値」または「閾値」または「カットポイント」とは、本明細書において用いられる場合、状態の存在もしくは不在、またはリスクの存在もしくは不在の指標でとなる、任意の予め決定されたレベルまたはレベルの範囲を指す。閾値は、多様な形態をとってよい。それは、中央値または平均値などの単一のカットオフ値であってもよい。それは、例えば１つの規定群におけるリスクが、別の規定群におけるリスクの２倍となる場合などには、閾値は、比較群に基づいて確立してもよい。それは、例えば、検査集団を、等分に（または不等分に）群に、低リスク群、中リスク群および高リスク群に、または四分位に（最も低い四分位は、最も低いリスクを有する対象であり、最も高い四分位は、最も高いリスクを有する対象である）分ける場合には、閾値は、範囲であってもよい。閾値は、選択された特定の集団に依存し得る。例えば、見かけ上健常な集団は、異なる「正常」範囲を有するであろう。別の例として、閾値を、状態もしくはリスクが存在する前に、または処置の経過の後に、基線値から決定することができる。かかる基線は、それについて検査がなされているリスクまたは状態と相関しない、対象における正常または他の状態の指標となり得る。いくつかの態様において、閾値は、検査されている対象の基線値であってよい。したがって、選択された予め決定された値は、対象が該当するカテゴリーを考慮し得る。当業者は、慣用的な実験のみを用いて、適切な範囲およびカテゴリーを選択することができる。本明細書において提供される方法、レポート、データベースなどのいずれか１つの閾値は、本明細書において提供される閾値のいずれか１つ、例えば例または図面におけるものであってよい。
【００５３】
本明細書において提供される閾値は、対象にとっての細胞性拒絶グレードを決定するか、またはこれを対象に当てはめるために用いることができる。したがって、測定されたＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの量が０．２未満である場合、対象を、ＣＲ０の細胞性拒絶グレードに当てはめることができる。測定されたＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの量が、０．１５未満である場合、対象を、ＣＲ０の細胞性拒絶グレードに当てはめることができる。量が０．１５〜０．８である場合、対象を、ＣＲ１の細胞性拒絶グレードに当てはめることができる。量が０．１５〜０．８であるが０．８未満である場合、対象を、ＣＲ１の細胞性拒絶グレードに当てはめることができる。量が０．２〜０．８である場合、対象を、ＣＲ１の細胞性拒絶グレードに当てはめることができる。量が、０．２〜０．８であるが０．８未満である場合、対象を、ＣＲ１の細胞性拒絶グレード当てはめることができる。量が０．２５または０．３〜０．７５または０．８であるが０．７５または０．８未満である場合、場合、対象を、ＣＲ１の細胞性拒絶グレードに当てはめることができる。量が０．８または０．９以上である場合、対象を、ＣＲ２以上の細胞性拒絶グレードに当てはめることができる。拒絶グレードの指定は、本明細書において提供されるような比較のいずれか１つに基づいて、かかるグレードの他の指標を用いてまたはこれを用いずに、行うことができる。
【００５４】
本明細書において提供される閾値はまた、対象における心臓同種移植片脈管障害および／または心停止を決定するために用いることができる。したがって、測定されたＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの量が、０．２、０．３、０．４または０．５と等しいかまたはこれより高い場合、心臓同種移植片脈管障害および／または心停止が示され得る。評価または決定は、心臓同種移植片脈管障害および／または心停止の他の指標を用いて、またはこれを用いることなく、本明細書において提供されるような比較のいずれか１つに基づいて、行うことができる。
【００５５】
本明細書において提供される閾値はまた、対象における抗体媒介性拒絶またはこれに関連するリスクの存在または不在を決定するために用いることができる。したがって、測定されたＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの量が０．２未満である場合、対象が抗体媒介性拒絶を有しない可能性がある。量が０．２以上である場合、対象は、抗体媒介性拒絶を有する可能性がある。抗体媒介性拒絶の存在または不在の決定は、本明細書において提供されるような比較のいずれか１つに基づいて、かかる状態の他の指標を用いてまたはこれを用いずに、行うことができる。
【００５６】
本明細書において提供される閾値はまた、対象が移植臓器傷害を有するか否かを決定するために用いることができる。したがって、測定されたＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの量が閾値より低い場合、対象は、移植臓器傷害を有さない場合がある。量が閾値より高い場合、対象は、移植臓器傷害を有し得る。また、傷害は、いくつかの態様においては、対象における、例えば基線と相対的なＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの増加の倍率を、試験することにより、測定することができる。分析のために、傷害の前の時点において、第１の試料を採取してもよく、傷害の後1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60分以内、またはそれより後に、第２の試料を採取してもよい。２つの試料の間の増加の倍率を、決定することができる。増加の倍率が閾値よりも高い場合、それは、対象が、移植臓器傷害を有するか、またはこれを有するリスクがあることを示し得る；増加の倍率が閾値よりも低い場合、それは、対象が、移植臓器傷害を有さないか、またはこれを有するリスクがないことを示し得る。
【００５７】
閾値はまた、処置および／またはモニタリングの決定を行うための比較のために用いることができる。例えば、ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの量が、０．１、０．２または０．３と等しいかまたはこれより高い、および／または経時的に増加している場合、さらなるモニタリングが示され得る。さらなる例として、量が０．８以上である場合、対象の処置が示され得る。量が、例えば０．３〜０．５、０．３〜０．６または０．３〜０．７である場合、対象のさらなる検査（生検によるものなど）が示され得る。量が、本明細書において提供される閾値のいずれか１つと等しいかまたはこれより高い場合、対象のさらなる検査（生検によるものなど）が示され得る。
【００５８】
したがって、本明細書において提供される方法のいずれか１つは、対象を評価するためのさらなる検査、または対象にかかるさらなる検査を提案する（またはかかるさらなる検査についての情報を提供する）ステップをさらに含んでもよい。さらなる検査は、本明細書において提供される方法のいずれか１つであってよい。さらなる検査は、適宜、本明細書において提供されるかまたは当該分野において他に公知の他の方法のいずれか１つであってよい。
【００５９】
例示的な対象のためのさらなる検査として、これらに限定されないが、心エコー、冠動脈造影、血管内超音波検査（ＩＶＵＳ）、生検（例えば、心内膜心筋生検）、負荷心エコー、ＣＴ冠動脈造影、冠血流予備比評価（造影心エコー）、負荷心筋血流シンチグラフィー、ポジトロン断層撮影（ＰＥＴ）走査、ならびにＢＮＰおよび／またはトロポニンなどの血清バイオマーカーの測定が挙げられる。さらなる検査の型は、対象の状態の重篤度に依存し、十分に当業者の決定能力の範囲内である。
【００６０】
例示的なさらなる検査として、これらに限定されないが、ドナー特異的抗体（ＨＬＡ抗体）の存在、生検（例えば、腎生検、心内膜心筋生検）における陽性Ｃ４ｄ染色、および抗体により媒介される傷害の病理組織学的エビデンス（例えば、糸球体炎、尿細管周囲毛細血管炎、動脈炎）が挙げられる。本明細書において提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、他の検査は、移植レシピエントにおけるＢＮＰおよび／またはトロポニンのレベルの決定である。本明細書において提供される方法のいずれか１つの他の態様において、ＢＮＰおよび／またはトロポニンのレベルに加えての、またはこれに替えての他の検査は、心エコーである。さらなる検査の型は、状態、疑われる状態、またはその重篤度に依存し、十分に当業者の決定能力の範囲内である。
【００６１】
ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの量は、多数の方法により決定することができる。いくつかの態様において、かかる方法は、配列決定に基づく方法である。例えば、ｃｆ−ＤＮＡは、試料のＤＮＡを分析して複数の遺伝子座を同定することにより測定することができ、遺伝子座の各々のアレルを決定してもよく、決定されたアレルに基づいてインフォーマティブな遺伝子座を選択してもよい。本明細書において用いられる場合、「遺伝子座」とは、核酸中のヌクレオチドの位置、例えば、染色体上または遺伝子中のヌクレオチドの位置を指す。本明細書において用いられる場合、「インフォーマティブな遺伝子座」とは、対象の遺伝子型がメジャーアレルについてホモ接合型であり、一方、ドナーの遺伝子型がマイナーアレルについてホモ接合型またはヘテロ接合型である遺伝子座を指す。本明細書において用いられる場合、「マイナーアレル」とは、ある遺伝子座について核酸の集団において頻度がより低いアレルを指す。いくつかの態様において、マイナーアレルは、ドナーの核酸中での当該遺伝子座におけるヌクレオチド同一性である。一方、「メジャーアレル」とは、集団においてより頻繁なアレルを指す。いくつかの態様において、メジャーアレルは、対象の核酸中での当該遺伝子座におけるヌクレオチド同一性である。
【００６２】
いくつかの態様において、インフォーマティブな遺伝子座およびアレルは、対象の核酸およびドナーの核酸の前の遺伝子型判定に基づいて決定することができる。例えば、レシピエントおよびドナーの遺伝子型を比較して、インフォーマティブな遺伝子座を、あるヌクレオチド同一性についてレシピエントがホモ接合型であり、異なるヌクレオチド同一性についてドナーがヘテロ接合型またはホモ接合型である遺伝子座として同定することができる。遺伝子型判定のための方法は、当該分野において周知であり、本明細書においてさらに記載される。この例において、マイナーおよびメジャーアレルは、インフォーマティブな遺伝子座における各々のアレルの相対量を決定することにより同定してもよく、および／または、ドナーＤＮＡ（マイナーアレル）およびレシピエントＤＮＡ（メジャーアレル）中のインフォーマティブな遺伝子座におけるヌクレオチド同一性として同定してもよい。したがって、提供される方法は、レシピエントおよびドナーを遺伝子型判定するステップ、またはかかる遺伝子型を得るかまたはこれらを提供されるステップを、さらに含んでもよい。
【００６３】
インフォーマティブな遺伝子座における推定アレル頻度（推定されるマイナーアレル頻度など）を、次いで、好適な様式において計算することができる。いくつかの態様において、推定されるアレル頻度は、統計学的分布を用いてインフォーマティブな遺伝子座におけるアレル（マイナーアレルなど）のカウント数をモデリングすることに基づいて、計算することができる。例えば、推定されるアレル頻度は、二項分布を用いてアレルのリードカウント（read count）をモデリングすることにより、計算することができる。いくつかの態様において、かかる分布のピークが決定され、これは、ドナー特異的ｃｆ−ＤＮＡのパーセントの指標である。インフォーマティブな遺伝子座におけるマイナーアレルの頻度もまた、最尤法を用いて計算することができる。いくつかの態様において、マイナーアレル頻度（ＭＡＦ）は、対象の血漿ＤＮＡからの遺伝子型により計算することができ、インフォーマティブな遺伝子座についてのドナー遺伝子型は、期待値最大化を用いて推測することができる。いくつかの態様において、メジャーおよび／またはマイナーアレルについてのリードカウントは、アレル頻度を推定することに先立って訂正することができる。
【００６４】
ＤＮＡは、任意の好適な次世代のまたはハイスループットな配列決定および／または遺伝子型判定の技術を用いて分析することができる。次世代のおよびハイスループットな配列決定および／または遺伝子型判定の技術の例として、これらに限定されないが、大規模並列シグネチャー配列決定（massively parallel signature sequencing：MPSS）、ポロニーシークエンシング（polony sequencing）、４５４パイロシークエンシング、Illumina（Solexa）シークエンシング、SOLiDシークエンシング、イオン半導体シークエンシング、ＤＮＡナノボールシークエンシング、ヘリスコープ（heliscope）単分子シークエンシング、単分子リアルタイム（SMRT）シークエンシング、MassARRAY（登録商標）、およびDigital Analysis of Selected Regions（DANSR（商標））が挙げられる（例えば、 Stein RA（２００８年９月１日）、「Next-Generation Sequencing Update」、Genetic Engineering & Biotechnology News 28(15)；Quail, Michael; Smith, Miriam E; Coupland, Paul; Otto, Thomas D; Harris, Simon R; Connor, Thomas R; Bertoni, Anna; Swerdlow, Harold P; Gu, Yong（２０１２年１月１日）、「A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion torrent, pacific biosciences and illumina MiSeq sequencers」、BMC Genomics 13(1): 341；Liu, Lin; Li, Yinhu; Li, Siliang; Hu, Ni; He, Yimin; Pong, Ray; Lin, Danni; Lu, Lihua; Law, Maggie（２０１２年１月１日）、「Comparison of Next-Generation Sequencing Systems」、Journal of Biomedicine and Biotechnology 2012: 1-11；Qualitative and quantitative genotyping using single base primer extension coupled with matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry（MassARRAY（登録商標））、Methods Mol Biol. 2009;578:307-43; Chu T, Bunce K, Hogge WA, Peters DG. A novel approach toward the challenge of accurately quantifying fetal DNA in maternal plasma. Prenat Diagn 2010;30:1226-9；およびSuzuki N, Kamataki A, Yamaki J, Homma Y. Characterization of circulating DNA in healthy human plasma. Clinica chimica acta; International Journal of Clinical Chemistry 2008;387:55-8 を参照）。
【００６５】
一態様において、ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡを決定するための方法のいずれか１つは、米国公開番号２０１５−００８６４７７−Ａ１の方法のいずれか１つであってよく、かかる方法は、その全体において本明細書において参考として援用される。
ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡの量はまた、ＭＯＭＡアッセイにより決定することができる。一態様において、ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡを決定するための方法のいずれか１つは、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１６／１７６６６２Ａ１の方法のいずれか１つであってよく、かかる方法は、その全体において本明細書において参考として援用される。
【００６６】
ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡは、対象の遺伝子型とドナーの遺伝子型との間の配列同一性の差異を用いて決定することができる。かかる差異は、単一ヌクレオチドバリアント（ＳＮＶ）であってよい；しかし、本明細書においてＳＮＶが言及される場合は常に、レシピエント特異的核酸とドナー特異的核酸との間の配列同一性の任意の差異もまた、適用可能であると意図される。したがって、本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つは、配列同一性に差異が存在する場合には、レシピエント特異的核酸、対、ドナー特異的核酸に適用することができる。本明細書において用いられる場合、「単一ヌクレオチドバリアント」とは、好ましくはいくつかの態様においては単一のヌクレオチドにおいて、その中で配列変異性が存在する核酸配列を指す。これらのＳＮＶは、ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡに対して特異的な、またはこれを同定することができる、任意の変異を含む。ＳＮＶのいずれか１つ以上に対して、本明細書において提供されるようにプライマーを調製することができる。
【００６７】
その中で配列同一性の変異性が存在する核酸配列は、一般に、「標的」として言及される。本明細書において用いられる場合、「ＳＮＶ標的」とは、その中で、例えば単一のヌクレオチドにおいて、配列変異性が存在する核酸配列を指す。ＳＮＶ標的は、１つより多くのアレルを有し、好ましい態様において、ＳＮＶ標的は、両アレル型である。ドナー特異的核酸は、ＮＶ標的に対して特異的なプライマーを用いて増幅ベースの定量アッセイ、例えば定量ＰＣＲアッセイを行うことにより、極めて低いレベルにあってすら、定量することができる。いくつかの態様において、ドナー特異的核酸の量は、複数のＳＮＶ標的に対するプライマーを用いて増幅ベースの定量アッセイ、例えば定量ＰＣＲを試みることにより決定される。「複数のＳＮＶ標的」とは、各々の標的について少なくとも２つのアレルが存在する、１つより多くのＳＮＶ標的を指す。好ましくは、いくつかの態様において、各々のＳＮＶ標的が、両アレル型であることが期待され、ＳＮＶ標的の各々のアレルに対して特異的なプライマーペアを用いて各々のアレルの核酸を特異的に増幅し、ここで、特異的アレルの核酸が試料中に存在する場合には、増幅が起こる。本明細書において用いられる場合、１つのアレルは、標的配列のドナー特異的バージョンであってよく、別のアレルは、当該配列のレシピエント特異的バージョンである。
【００６８】
本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つの一態様において、ＳＮＶ標的に対する１つ以上のプライマーペアは、ＳＮＶ標的がインフォーマティブであろうという知識に基づいて（（例えばドナーの）遺伝子型の知識などにより）、予め選択することができる。かかる態様において、ドナーの遺伝子型は、既知であるか、または決定することができる。したがって、本明細書において提供される方法のいずれか１つは、ドナーを遺伝子型判定するステップ、またはドナーの遺伝子型を得るステップを含んでもよい。
【００６９】
本明細書において提供される方法のいずれか１つの他の態様においては、ドナーの遺伝子型が不明である。かかる場合の一態様においては、ドナー遺伝子型は、期待値最大化法により推測することができる。一例として、既知のレシピエント遺伝子型を用いて、レシピエントにおいてホモ接合型であると知られている標的を選択することができる。任意の混入物がドナー特異的核酸に起因し得、結果として生じるアッセイのコレクションは、三峰性分布；非インフォーマティブなアッセイ、半インフォーマティブなアッセイおよび完全にインフォーマティブなアッセイからなるであろう。十分な数のレシピエントホモ接合型アッセイにより、ドナーの完全インフォーマティブなアッセイの存在を推測することができる。
【００７０】
例えば、レシピエント遺伝子型がホモ接合型であり既知である場合、レシピエント遺伝子型と関連しない測定値（真にドナー−ホモ接合型であるもの）は、最も高いクラスターを有し、半予想値（half the guess）でしかない（半インフォーマティブ）ドナー−ヘテロ接合型であるものと比較して、予想値（guess）に等しい（完全インフォーマティブ）。次いで、確率分布をプロットし、期待値最大化アルゴリズム（ＥＭ）を用いてドナー遺伝子型を推測することができる。ＥＭアルゴリズムを用いて、本明細書において提供される方法のいずれか１つにおいて、ドナー遺伝子型頻度を推測することができる。したがって、ＥＭアルゴリズムは、全てのアッセイされたＳＮＶ標的において最も確率が高いドナー遺伝子型を推測するために用いてもよい。推測されたドナー遺伝子型を用いて、定量は、上で議論される全情報シナリオにおけるもののように進行することができる。ＥＭは、アッセイにおいて見出されるマイナーアレル比が三峰性分布に従う（レシピエント（Ａ）およびドナー（Ｂ）の各組み合わせ、すなわち、ＡＡ、ＡＢおよびＢＢについて１つずつ）という推定において始まり得る。全ての不明なドナー遺伝子型により、ほぼゼロのマイナーアレルを示す任意のアッセイは、ドナーＡＡ（すなわち、レシピエントアレル）であり、最高のものは、ドナーＢＢであるという知識からブートストラップすることが可能である。全てのドナー遺伝子型についての最初の予想値を記録してもよく、各々のクラスターの平均を計算することができる。ドナーＢＢアッセイの平均がドナーＡＢのものの２倍となるように強制することは、検索を制限する。アルゴリズムは、次いで、クラスターおよびビルトイン仮説に基づいて、予想されたドナー遺伝子型を再割り当てする。プロセスは、それ以上変更が行われなくなるまでは、反復性である。最終結果は、それらの測定されたバックグラウンドからの発散（divergence）を考慮して、最も確率が高いドナー遺伝子型のセットである。一般に、全ての標的が、モデルに該当する；結果は、最大化の後の群の間にあれば、除外することができる。
【００７１】
本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つの別の態様において、複数のＳＮＶ標的に対するプライマーペアを、少なくとも１つ（またはより多くの）がインフォーマティブであり得る可能性のために選択することができる。かかる態様において、本明細書において提供される方法のいずれか１つにおいて、ＳＮＶ標的のパネルに対するプライマーペアを用いる。いくつかの態様において、ＳＮＶ標的のパネルは、少なくとも３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５またはそれより多くの可能な標的のパネルである。
【００７２】
本明細書において用いられる場合、「インフォーマティブなＳＮＶ標的」とは、本明細書において提供されるようなプライマーによる増幅が起こるものであり、その結果は、インフォーマティブである。「インフォーマティブな結果」とは、本明細書において提供される場合、試料中のドナー特異的核酸のレベルを定量するために用いることができる結果である。いくつかの態様において、インフォーマティブな結果は、「コールなし（no call）」とみなされる結果、または誤ったコール結果を除外する。提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、インフォーマティブな結果から、標準曲線を用いて、アレルパーセンテージを計算することができる。提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、ドナー特異的核酸の量は、それぞれ、ドナー特異的核酸についてのインフォーマティブな結果の間の平均を表す。
【００７３】
ドナー特異的核酸の量は、メジャーおよびマイナーアレルの量、ならびにレシピエントの遺伝子型により決定することができる。いくつかの態様において。本明細書において提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、アレルは、対象の前の遺伝子型判定に基づいて、決定することができる。遺伝子型判定のための方法は、当該分野において周知である。かかる方法は、次世代、ハイブリダイゼーション、マイクロアレイ、他の分離技術またはＰＣＲアッセイなどの配列決定法を含む。本明細書において提供される方法のいずれか１つは、かかる遺伝子型を得るステップを含んでもよい。
【００７４】
ＭＯＭＡアッセイにおける使用のためのプライマーを得てもよく、本明細書において提供される方法のいずれか１つは、ＰＣＲアッセイなどの増幅ベースの定量アッセイを行うための１つ以上のプライマーペアを得るステップを含んでもよい。一般に、プライマーは、核酸の量を定量することにおけるそれらの使用を促進するユニークな特性を有する。例えば、プライマーペアのフォワードプライマーは、３’ヌクレオチド（例えば、最後から２番目の３’ヌクレオチド）においてミスマッチを有していてもよい。提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、このミスマッチは、３’ヌクレオチドにおけるものであるが、ＳＮＶの位置に隣接している。提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、ＳＮＶの位置に対して相対的なプライマーのミスマッチの配置を、図１において示す。一般に、かかるフォワードプライマーは、３’ミスマッチを有していても、ＰＣＲ反応などの増幅反応において増幅生成物を生成し（好適なリバースプライマーと組み合わせて）、それにより、それぞれのＳＮＶによる核酸の増幅と、結果としてその検出を可能にする。特定のＳＮＶが存在しない場合、かつＳＮＶ標的の他のアレルに関して二重ミスマッチが存在する場合、増幅生成物は、一般に、生成されないであろう。好ましくは、本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、各々のＳＮＶ標的に対して、それにより各々のアレルの特異的な増幅が他のアレルの増幅を伴うことなく起こり得るプライマーペアを得る。「特異的増幅」とは、別の核酸の実質的な増幅を伴わない、またはバックグラウンドもしくはノイズより高い別の核酸配列の増幅を伴わない、標的の特異的アレルの増幅を指す。いくつかの態様において、特異的な増幅は、特異的アレルの増幅のみをもたらす。
【００７５】
本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、両アレル型である各々のＳＮＶ標的に対して、２つのプライマーペアが存在し、各々が、２つのアレルのうちの一方に対して特異的であり、したがって、それが増幅すべきアレルに関して単一のミスマッチ、およびそれが増幅すべきではないアレル（これらのアレルの核酸が存在する場合）に関して二重ミスマッチを有する。本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、ミスマッチプライマーは、フォワードプライマーである。本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、各々のＳＮＶ標的に対する２つのプライマーペアのリバースプライマーは、同じである。
【００７６】
これらの概念は、本明細書において提供される方法および組成物のいずれか１つについて、プライマーペアの設計において用いることができる。フォワードおよびリバースプライマーは、鋳型の特異的な遺伝子座のフラグメントを増幅させるために、反対の鎖（例えばセンス鎖およびアンチセンス鎖）に結合するように設計されることが理解されるべきである。プライマーペアのフォワードおよびリバースプライマーは、例えば本開示によるＳＮＶ標的のアレルの存在を検出するために、任意の好適なサイズの核酸フラグメントを増幅するように設計することができる。本明細書において提供される方法のいずれか１つは、本明細書において記載されるような１つ以上のプライマーペアを得るための１つ以上のステップを含んでもよい。
【００７７】
本明細書において記載されるプライマーペアは、ＰＣＲアッセイなどの多重増幅ベースの定量アッセイにおいて用いてもよいことが理解されるべきである。したがって、本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、プライマーペアは、ＰＣＲ反応において他のプライマーペアと適合可能であるように設計される。例えば、プライマーペアは、ＰＣＲ反応において、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５などの他のプライマーペアと適合可能であるように、設計されてもよい。本明細書において用いられる場合、ＰＣＲ反応におけるプライマーペアは、それらが同じＰＣＲ反応においてそれらの標的を増幅することができる場合に、「適合可能である」。いくつかの態様において、プライマーペアは、当該プライマーペアが、同じＰＣＲ反応において多重化された場合に、それらの標的ＤＮＡを増幅することを、１％以下、２％以下、３％以下、４％以下、５％以下、１０％以下、１５％以下、２０％以下、２５％以下、３０％以下、３５％以下、４０％以下、４５％以下、５０％以下、または６０％以下、阻害される場合に、適合可能である。プライマーペアは、限定されないが、プライマーダイマーの形成および別のプライマーペアを妨害し得る鋳型上のオフターゲット部位への結合を含む多数の理由のために、適合可能ではない場合がある。したがって、本開示のプライマーペアは、他のプライマーペアとのダイマーの形成を防止するか、またはオフターゲット結合部位の数を限定するように設計されていてもよい。多重ＰＣＲアッセイにおける使用のためのプライマーを設計するための例示的な方法は、当該分野において公知であるか、本明細書において別段に記載される。
【００７８】
いくつかの態様において、本明細書において記載されるプライマーペアは、ドナー特異的核酸の量を定量するために、ＰＣＲアッセイなどの多重増幅ベースの定量アッセイにおいて用いられる。したがって、本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、プライマーペアは、潜在的に非二倍体であるゲノム領域を検出するために設計されたプライマーペアを除外して、二倍体であるゲノム領域を検出するために設計される。本明細書において提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、本開示により用いられるプライマーペアは、既知のコピー数が可変の領域であるリピートマスク領域（repeat-masked region）、または非二倍体であり得る他のゲノム領域を検出しない。
【００７９】
本明細書において提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、増幅ベースの定量的アッセイは、任意の定量的アッセイであって、それにより核酸が増幅され、核酸の量を決定することができるようなものである。かかるアッセイは、それにより、本明細書において記載されるようなＭＯＭＡプライマーにより核酸が増幅され、定量されるものを含む。かかるアッセイは、単純な増幅および検出、ハイブリダイゼーション技術、電気泳動などの分離技術、次世代配列決定法などを含む。
【００８０】
本明細書において提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、ＰＣＲは、定量ＰＣＲであり、これは、核酸の量を決定することができることを意味する。定量ＰＣＲとして、リアルタイムＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、TAQMAN（商標）などが挙げられる。本明細書において提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、ＰＣＲは、「リアルタイムＰＣＲ」である。かかるＰＣＲは、増幅プロセスがなお進行している間に、液相において反応動態学をモニタリングすることができるＰＣＲ反応を指す。従来のＰＣＲと対照的に、リアルタイムＰＣＲは、増幅反応において、リアルタイムで、同時に検出または定量する能力を提供する。特異的な色素からの蛍光強度の増大に基づいて、増幅がプラトーに達する前であっても、標的の濃度を決定することができる。
【００８１】
複数のプローブの使用は、単一プローブリアルタイムＰＣＲの能力を拡大することができる。多重リアルタイムＰＣＲは、複数のプローブベースのアッセイを用い、ここで、各々のアッセイがユニークな蛍光色素で標識された特異的プローブを有していてよく、これにより、各々のアッセイについて観察される色が異なるものとなる。リアルタイムＰＣＲ機器は、異なる色素から生成される蛍光を区別することができる。異なるプローブは、各々がユニークな発光スペクトルを有する異なる色素で標識することができる、スペクトルシグナルは、別々の光学素子により収集され、一連のフィルターセットを通過して、検出器のアレイにより収集される。行列代数により実験データをデコンボリューションする（deconvolute）ために、色素間のスペクトルのオーバーラップは、純粋な色素のスペクトルを用いて補正してもよい。
【００８２】
プローブは、本開示の方法のために、特に定量ステップを含む方法のために、有用であり得る。本明細書において提供される方法のいずれか１つは、ＰＣＲアッセイの実施においてプローブの使用を含んでもよく、一方、本明細書において提供される組成物またはキットのいずれか１つは、１つ以上のプローブを含んでもよい。重要なことに、本明細書において提供される方法のいずれか１つ以上のいくつかの態様において、ＰＣＲ定量アッセイの１つ以上または全てにおけるプローブは、ミスマッチプライマーと同じ鎖上にあり、反対の鎖上にはない。ＰＣＲ反応においてプローブをそのように組み込むことにおいて、さらなるアレル特異的な区別を提供することができることを見出した。
【００８３】
一例として、TAQMAN（商標）プローブは、FAM（商標）またはVIC（登録商標）色素標識を５’末端に、副溝結合剤（ＭＧＢ）非蛍光消光剤（ＮＦＱ）を３’末端に有する、加水分解プローブである。TAQMAN（商標）プローブの原理は、一般に、相補的プローブ結合領域へのハイブリダイゼーションおよびフルオロフォアベースの検出の間に二重標識TAQMAN（商標）プローブを切断するために、Taq（登録商標）ポリメラーゼの５’−３’エクソヌクレアーゼ活性に依存する。TAQMAN（商標）プローブは、定量ＰＣＲ反応の対数ステージの間の定量的測定における検出の特異度を増大することができる。
【００８４】
ＰＣＲ系は、一般に、そのシグナルが、反応におけるＰＣＲ生成物の量に対して直接比例して増大する、蛍光色素またはレポーターの検出および定量に依存する。例えば、最も単純かつ最も経済的な形式において、そのレポーターは、二本鎖ＤＮＡに特異的な色素SYBR（登録商標）Green（Molecular Probes）であってよい。SYBR（登録商標）Greenは、二本鎖ＤＮＡの副溝に結合する色素である。SYBR（登録商標）Green色素が二本鎖ＤＮＡに結合すると、蛍光強度が増大する。より多くの二本鎖アンプリコンが生成されるにつれ、SYBR（登録商標）Green 色素シグナルは増大するであろう。
【００８５】
本明細書において提供されるＰＣＲ条件は、本明細書において記載される方法のいずれか１つに従って機能するために、改変または最適化してもよいことが、理解されるべきである。典型的には、ＰＣＲ条件は、用いられる酵素、標的鋳型および／またはプライマーに基づく。いくつかの態様において、ＰＣＲ反応の１つ以上のコンポーネントが、改変または最適化される。最適化することができるＰＣＲ反応のコンポーネントの非限定的な例として、鋳型ＤＮＡ、プライマー（例えば、フォワードプライマーおよびリバースプライマー）、デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）、ポリメラーゼ、マグネシウム濃度、バッファー、プローブ（例えばリアルタイムＰＣＲを行う場合）、バッファー、および反応容積が挙げられる。
【００８６】
前述の態様のいずれかにおいて、熱安定性ポリメラーゼを含む任意のＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡヌクレオチドのＤＮＡ鎖への重合を触媒する酵素）を利用することができる。好適なポリメラーゼ酵素は、当業者には公知であり、E. coli ＤＮＡポリメラーゼ、E. coli ＤＮＡポリメラーゼＩのKlenowフラグメント、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ５  ＤＮＡポリメラーゼ、Klenowクラスのポリメラーゼ、Taqポリメラーゼ、Pfu ＤＮＡポリメラーゼ、Ventポリメラーゼ、バクテリオファージ29、REDTaq（商標）ゲノムＤＮＡポリメラーゼ、またはシーケナーゼを含む。例示的なポリメラーゼとして、これらに限定されないが、Bacillus stearothermophilusのpol I、Thermus aquaticus（Taq）pol I、Pyrccoccus furiosus（Pfu）、Pyrococcus woesei（Pwo）、Thermus flavus（Tfl）、Thermus thermophilus（Tth）、Thermus litoris（Tli）およびThermotoga maritime（Tma）が挙げられる。これらの酵素、これらの酵素の改変されたバージョン、および酵素の組み合わせは、Roche、Invitrogen、Qiagen、StratageneおよびApplied Biosystemsを含むベンダーから市販されている。代表的な酵素として、PHUSION（登録商標）（New England Biolabs、Ipswich、MA）、Hot MasterTaq（商標）（Eppendorf）、PHUSION（登録商標）Mpx（Finnzymes）、PyroStart（登録商標）（Fermentas）、KOD（EMD Biosciences）、Z-Taq（TAKARA）、およびCS3AC/LA（KlenTaq、University City、MO）が挙げられる。
【００８７】
塩およびバッファーは、当業者が精通しているものを含み、これは、それぞれ、ＭｇＣｌ２、ならびにＴｒｉｓ−ＨＣｌおよびＫＣｌを含むものを含む。典型的には、Taq ＤＮＡポリメラーゼにとって１．５〜２．０ｎＭのマグネシウムが最適であるが、最適マグネシウム濃度は、鋳型、バッファー、ＤＮＡおよびｄＮＴＰに依存し得る。なぜならば、各々が、マグネシウムをキレートする可能性を有するからである。マグネシウムの濃度［Ｍｇ２＋］が低すぎる場合、ＰＣＲ生成物が形成されない可能性がある。マグネシウム［Ｍｇ２＋］が高すぎる場合、望ましくないＰＣＲ生成物が観察される場合がある。いくつかの態様において、マグネシウム濃度は、マグネシウム濃度を０．１ｍＭまたは０．５ｍＭの増加において約５ｍＭまで補充することにより、最適化することができる。
【００８８】
本開示に従って用いられるバッファーは、界面活性剤、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ならびに当業者が精通している他のものなどの添加物を含んでもよい。ヌクレオチドは、一般に、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、およびデオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）などのデオキシリボヌクレオシド三リン酸であって、これらはまた、標的核酸の増幅のために適切な量で反応に添加される。いくつかの態様において、１つ以上のｄＮＴＰ（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）の濃度は、約１０μＭ〜約５００μＭであり、これは、ＰＣＲ反応において生成されるＰＣＲ生成物の長さおよび数に依存し得る。
【００８９】
いくつかの態様において、ＰＣＲ反応において用いられるプライマーの濃度を、改変または最適化してもよい。いくつかの態様において、ＰＣＲ反応中のプライマー（例えばフォワードまたはリバースプライマー）の濃度は、例えば、約０．０５μＭ〜約１μＭであってよい。特定の態様において、各々のプライマーの濃度は、約１ｎＭ〜約１μＭである。本開示に従うプライマーは、ＰＣＲ反応において同じまたは異なる濃度で用いてもよいことが、理解されるべきである。例えば、プライマーペアのフォワードプライマーを０．５μＭの濃度で用いてもよく、当該プライマーペアのリバースプライマーを０．１μＭで用いてもよい。プライマーの濃度は、これらに限定されないが、プライマーの長さ、ＧＣ含有量、純度、標的ＤＮＡとのミスマッチまたはプライマーダイマーを形成する可能性を含む要因に基づき得る。
【００９０】
いくつかの態様において、ＰＣＲ反応の熱プロフィールを、改変または最適化する。ＰＣＲの熱プロフィールの改変の非限定的な例として、変性の温度および持続時間、アニーリングの温度および持続時間、ならびに伸長時間が挙げられる。
ＰＣＲ反応溶液の温度は、変性状態、アニーリング状態、および伸長状態の間で、予め決定されたサイクルの数にわたり、連続的に周回され得る。実際の時間および温度は、酵素、プライマー、および標的に依存的であり得る。任意の所与の反応について、変性状態、ある態様においては、約７０℃〜約１００℃の範囲であり得る。加えて、アニーリングの温度および時間は、プライマーが標的核酸中の特定の遺伝子座に結合する特異度および効率に影響を及ぼし得、特定のＰＣＲ反応について重要であり得る。任意の所与の反応について、アニーリング状態は、ある態様においては、約２０℃〜約７５℃の範囲であり得る。いくつかの態様において、アニーリング状態は、約４６℃〜６４°Ｃであり得る。ある態様において、アニーリング状態は、室温（例えば、約２０℃〜約２５℃）において行うことができる。
【００９１】
伸長の温度および時間はまた、アレル生成物の収率に影響を及ぼし得る。所与の酵素について、伸長状態は、ある態様においては、約６０℃〜約７５℃の範囲であり得る。
ＰＣＲアッセイからのアレルの量の定量は、本明細書において提供されるように行うことができるか、別段に当業者には明らかであろう。一例として、一貫性および強力な定量のために、増幅のトレースを分析する。サイクルの閾値をインプット核酸（例えばＤＮＡ）の量に換算するために、内部標準を用いてもよい。アレルの量は、性能（performant）アッセイの平均として計算することができ、遺伝子型について補正することができる。
【００９２】
本明細書において提供される方法のいずれか１つは、対象から得られた試料からセルフリーＤＮＡ（例えばドナー特異的セルフリーＤＮＡ）などの核酸を抽出することを含んでもよい。かかる抽出は、当該分野において公知の任意の方法を用いて、または本明細書において別段に提供されるように、行うことができる（例えば、 Current Protocols in Molecular Biology 、最新版を参照、またはQIAamp循環用核酸キットまたは他の適切な市販のキット）。血液からセルフリーＤＮＡを単離するための例示的な方法を記載する。ＥＤＴＡまたはＤＴＡなどの抗凝固剤を含む血液を、対象から採取する。ｃｆ−ＤＮＡを含む血漿を、血液中に存在する細胞から分離する（例えば、遠心分離またはろ過により）。任意の残留する細胞を血漿から取り除くために、任意の二次的な分離を行ってもよい（例えば、第２の心分離またはろ過ステップ）。次いで、当該分野において公知の任意の方法を用いて、例えば市販のキット（Qiagenにより製造されるものなど）を用いて、ｃｆ−ＤＮＡを抽出する。ｃｆ−ＤＮＡを抽出するための他の例示的な方法は、当該分野において公知である（例えば、 Cell-Free Plasma DNA as a Predictor of Outcome in Severe Sepsis and Septic Shock. Clin. Chem. 2008, v. 54, p. 1000-1007；Prediction of MYCN Amplification in Neuroblastoma Using Serum DNA and Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction. JCO 2005, v. 23, p.5205-5210；Circulating Nucleic Acids in Blood of Healthy Male and Female Donors. Clin. Chem. 2005, v. 51, p.1317-1319；Use of Magnetic Beads for Plasma Cell-free DNA Extraction: Toward Automation of Plasma DNA Analysis for Molecular Diagnostics. Clin. Chem. 2003, v. 49, p. 1953-1955；Chiu RWK, Poon LLM, Lau TK, Leung TN, Wong EMC, Lo YMD. Effects of blood-processing protocols on fetal and total DNA quantification in maternal plasma. Clin Chem 2001;47:1607-1613；およびSwinkels et al.  Effects of Blood-Processing Protocols on Cell-free DNA Quantification in Plasma. Clinical Chemistry, 2003, vol. 49, no. 3, 525-526 を参照）。
【００９３】
本明細書において提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、プレ増幅ステップを行う。かかる増幅の例示的な方法は、以下のとおりであり、かかる方法は、本明細書において提供される方法のいずれか１つにおいて含まれ得る。約１５ｎｇのセルフリー血漿ＤＮＡを、Ｑ５  ＤＮＡポリメラーゼを用いて、約１３の標的により、ＰＣＲにおいて増幅し、ここで、プールされたプライマーは、合計で４ｕＭであった。試料は、約２５サイクルを経る。反応は、合計で２５ｕｌである。増幅後、試料を、AMPUREビーズクリーンアップ、ビーズ精製、または単純にExoSAP-IT（商標）またはZymoを含むいくつかのアプローチを用いて、クリーンアップしてもよい。
【００９４】
本明細書において用いられる場合、対象からの試料は、生物学的試料であってよい。かかる生物学的試料の例として、全血、血漿、血清、尿などが挙げられる。いくつかの態様において、さらなる核酸、例えば標準物の、試料への添加を行ってもよい。
別の側面において、本明細書において提供されるような１つ以上のプライマーペアを含む組成物およびキットが提供される。ＰＣＲアッセイなどのアッセイを行うための他の試薬もまた、組成物またはキット中に含まれていてもよい。
【００９５】
本発明の多様な側面は、単独で、組み合わせて、または前述のものにおいて記載される態様においては具体的には議論されていない多様な配置において用いてもよく、したがって、それらの適用において、前述の説明において記載される、または図面において説明されるコンポーネントの詳細および配置に限定されない。例えば、一態様において記載される側面は、他の態様において記載される側面と、任意の様式において組み合わせることができる。
また、本発明の態様は、そのうちの一例が提供されている１つ以上の方法として実行してもよい。方法の一部として行われる行為は、任意の好適な方法において指令することができる。したがって、説明されたものとは異なる順序において行為が行われる態様が構築されてもよく、これは、いくつかの行為を、それが説明的態様においては連続的な行為として示されるものであっても、同時に行うことを含んでもよい。
【００９６】
通常の用語、例えば「第１」、「第２」、「第３」などの、請求の範囲において請求項の要素を修飾するための使用は、それ自体によっては、１つの請求項の要素の、別の要素に対するいかなる優先順位、先行もしくは順序、または方法の行為が行われる時間的順序を暗示しない。かかる用語は、単に、ある名称を有する１つの請求項の要素を、（当該通常の用語の使用がなければ）同じ名称を有する別の要素と区別するための標識として用いられる。
本明細書において用いられる語法および用語法は、記載を目的とするものであり、限定するものとしてみなされるべきではない。「含むこと（including）」、「含むこと（comprising）」、「有すること（having）」、「含むこと（containing）」、「含むこと（involving）」、およびこれらのバリエーションの使用は、その後に列記される項目およびさらなる項目を包含することを意図される。
【００９７】
本発明のいくつかの態様を詳細に説明したことを考慮すれば、当業者には、多様な改変および改善が容易に想起されるであろう。かかる改変および改善は、本発明の精神および範囲の内であることが意図される。したがって、前述の記載は、単なる例であり、限定するものとして意図されるものではない。以下の記載は、本明細書において提供される方法の例を提供する。
【００９８】
例
例１−レシピエントおよびドナーの遺伝子型情報を用いるＭＯＭＡアッセイ
ＳＮＶ標的選択
本開示に従って多重化するための標的の同定は、以下のステップの１つ以上を含んでもよい。初めに、いくつかの人種対照集団において、高度にヘテロ接合型のＳＮＰをスクリーニングし（ハーディ・ワインベルグｐ＞０．２５）、既知の困難な領域を除外した。困難な領域として、患者において異常である可能性が高い症候性の領域、ならびに染色体のセントロメアおよびテロメアを含む低複雑度領域が挙げられる。所望される長さの標的フラグメントを、次いでコンピューターシミュレーションにより設計した。具体的には、各々のＳＮＰの７０ｂｐのウィンドウにわたる２つの２０〜２６ｂｐのプライマーを設計した。全ての候補プライマーを、次いで、ＢＬＡＳＴを用いてＧＣＲｈ３に対して問い合わせた。十分に特異的であることが見出されたプライマーを保持し、オフターゲットヒットについて（特にフラグメントの３’末端において）モニタリングした。オフターゲット候補ヒットを、サイズ選択を通るであろうペアワイズフラグメント作製について分析した。選択されたプライマーを、次いで、コンピューターシミュレーションによる多重化評価に供した。計算されたプライマーの融解温度およびグアニン−シトシンパーセンテージ（ＧＣ％）を用いて、中程度の範囲の配列についてフィルタリングした。反復遺伝子アルゴリズムおよびシミュレーションされたアニーリングを用いて、４００の標的について適合可能な候補プライマーを選択し、最終的に８００のプライマーの選択肢がもたらされた。８００のプライマーを作製し、共通の融解温度において共通の溶液中で、多重化能力について物理的に試験した。具体的には、プライマーを、多重スクリーンにおける一様な増幅および中程度の読み取り深度（read depth）ウィンドウに基づいてフィルタリングした。最上の性能の多重化ＳＮＰを用いるＭＯＭＡのために、４８のアッセイを設計した。各々のＳＮＰは、ＷＴ／ＭＵＴにおいて４つのミスマッチの選択において設計されたプローブを有した；１アッセイあたり８つのプローブが存在した。７０ｂｐの濃縮されたフラグメント中に新たなネステッドプライマーを設計した。最後に、既知のヘテロ接合型個体により、プライマーを実験的に増幅し、増幅効率を評価した（TAQMAN（商標）を用いて、８プローブ×４８アッセイを３部）。
【００９９】
各アッセイの演繹的遺伝子型判定のインフォーマティブ性
各々のアッセイされたＳＮＰにおいて既知のレシピエントおよびドナー遺伝子型を用いて、インフォーマティブなアッセイのサブセットを選択した。ドナーが任意の他の遺伝子型であるレシピエントホモ接合型部位を用いることができることに留意する。加えて、ドナー遺伝子型が不明である場合、それは、例えば血漿データの矛盾を用いることにより、推測することができる。遺伝子型はまた、配列決定、ＳＮＰマイクロアレイ、または既知の０％（クリーンな（clean）レシピエント）の試料に対するＭＯＭＡアッセイの適用を通して、学習することができる。
【０１００】
多重アッセイ性能のポストプロセッシング分析
患者特異的ＭＯＭＡプローブの偏りを、実験コホートの間で推定した。選択を、反復的に精密化して、最終的なドナーのパーセントのコールを行った。さらに、自動外れ値検出が、患者特異的な異常ゲノム領域を提供した。
再構築実験
既知の混合比により再構築された血漿試料を用いて、アッセイの感度および正確性を評価した。具体的には、１：１０、１：２０、１：１００、１：２００および１：１０００の比を評価した。
再構築実験の結果を、図２において示す。ホモ接合型レシピエントに対するホモ接合型ドナーが存在する１つの標的は、完全にインフォーマティブである（網掛けされたデータポイント）。ホモ接合型レシピエントに対するヘテロ接合型ドナーが存在する他の標的は、半インフォーマティブである（オープンなデータポイント）。
【０１０１】
例２−レシピエントの遺伝子型情報を用いるがドナーの遺伝子型情報を用いないＭＯＭＡアッセイ
ドナー遺伝子型情報なしで研究するために、インフォーマティブなアッセイを推測して、血漿試料中のドナー特異的セルフリーＤＮＡの定量を可能にするために、以下の手順を行うことができる。全アッセイを、完全な情報のシナリオにおいて性能について評価した。この手順は、したがって、各々のアッセイにおけるクリーンなＡＡ／ＡＢ／ＢＢ遺伝子型および各々の定量の不偏挙動を推測した。レシピエントの遺伝子型により、レシピエントにおいてホモ接合型であると知られるアッセイを選択した。任意の混入物が、ドナー核酸に起因し得、アッセイの集合は、非インフォーマティブ、半インフォーマティブおよび完全インフォーマティブなアッセイに対応する３つのアッセイのクラスターによる三峰性分布を作成した。十分な数のレシピエントホモ接合型アッセイにより、ドナーの完全にインフォーマティブなアッセイの存在を推測することができる。
【０１０２】
レシピエント遺伝子型がホモ接合型かつ既知である場合、レシピエントの遺伝子型ではない測定値が観察され、真にドナー−ホモ接合型であるプローブは、最も高いクラスターを有し、予想値に等しく、一方、ナーヘテロ接合型であるものは、予想値の半分となるであろう。確率分布を、プロットしてもよく、期待値最大化アルゴリズム（ＥＭ）を使用して、ドナー遺伝子型を推定してもよい。このようなものを用いて、本明細書において提供される方法のいずれか１つにおいて、ドナー遺伝子型頻度を推測することができる。したがって、ＥＭアルゴリズムを用いて、全てのアッセイされたＳＮＶ標的において最も確率が高いドナー遺伝子型を推定した。推測されたドナー遺伝子型により、定量は、完全な情報のシナリオにおけるもののように進行し得る。ＥＭは、あるアッセイにおいて見出されるマイナーアレル比は、全てのアッセイがレシピエントにおいて「ＡＡ」である（または一般性を失うことなく「ＢＢ」からはじき出された）と仮定して、三峰性分布（１つずつ、レシピエントおよびドナーの各々の組み合わせについて）に従うという推測から始まり得る。全ての不明なドナー遺伝子型により、ほぼゼロのマイナーアレルを示す任意のアッセイは、ドナーＡＡであるという知識からブートストラップすることが可能であり、最も高いものはドナーＢＢである。全てのドナー遺伝子型についての最初の予想値を記録し、各々のクラスターの平均を計算した。ドナーＢＢアッセイの平均がドナーＡＢのものの２倍になるように強制することにより、検索が制限される。次いで、アルゴリズムが、クラスターおよびビルトイン仮説に基づいて、予想されるドナー遺伝子型を再割り当てする。プロセスは、それ以上変更が行われなくなるまでは、反復性である。最終結果は、それらの測定されたバックグラウンドからの発散を考慮して、最も確率が高いドナー遺伝子型のセットである。一般に、全ての標的が、モデルに該当する；結果は、最大化の後の群の間にあれば、除外する（toss）ことができる。
【０１０３】
図３および４は、この様式において扱われる血漿試料からの例示的な結果を示す。ｘ軸は、レシピエントをホモ接合型であると見出した任意のアッセイについてのドナー％である。点の行は、個々のＰＣＲアッセイ結果を表す。最も下の円の行は、ドナー遺伝子型の最初の予想値を表し、いくつかはＡＡであり、いくつかはＡ／Ｂであり、いくつかはＢＢである。次いで、最初のアッセイにおいて中心となったベータ分布を表す実線の曲線を引き、これはホモ接合型（完全インフォーマティブ）であることが見出され、白色はヘテロ接合型（半インフォーマティブ）、黒い曲線は非インフォーマティブなアッセイの分布またはバックグラウンドノイズを表す。アッセイを再割り当てし、予想値を第２の行においてアップデートした。第２の行の曲線は、破線を用いる。変化が起こらなかったので、一番上の行が最終的な推定値である。白色の破線の曲線のピークを２倍すると、約１０％における、または点線の曲線の平均に等しい、最尤ドナー％のコールに対応する。
【０１０４】
２人の個体からのＤＮＡを用いた再構築実験（Recon1）を１０％、５％、１％、０．５％および０．１％において作成した。全てのミックスを、標的の多重ライブラリーにより増幅し、浄化し、次いでＭＯＭＡ法を用いて定量的に遺伝子型判定した。分析は、各個体の真の遺伝子型を知るために、彼らを遺伝子型判定することにより行った。メジャー個体の遺伝子型の前の知識を用いて（ホモ接合型部位を探して）、第２の個体が異なっていた場合、インフォーマティブな標的を決定し、インフォーマティブな標的を用いて画分（パーセンテージ）を計算するために用いた。次いで画分を計算した（黒色で表し、「遺伝子型あり」情報を表示する）。
【０１０５】
第２の再構築実験（Recon2）は、メジャーおよびマイナーの２個体を用いて開始し、これもまた１０％、５％、１％、０．５％および０．１％において作成した。全てのミックスを、標的の多重ライブラリーにより増幅し、浄化し、次いでＭＯＭＡ法を用いて定量的に遺伝子型判定した。分析は、各個体の真の遺伝子型を知るために、彼らを遺伝子型判定することにより行った。上記のように第２の個体の遺伝子型の前の知識を用いてインフォーマティブな標的を決定した。次いで画分を計算した（黒色で表し、「遺伝子型あり」情報を表示する）。
これらの再構築を、翌日再び実行した（Recon3）。
【０１０６】
同じ再構築試料（Recon 1、2、3）を、次いで、第１の個体（メジャーＤＮＡ寄与体）について利用可能な遺伝子型判定情報のみを用いて、再び分析した。第２の個体（マイナーＤＮＡ寄与体）からの遺伝子型判定情報は用いなかった。約３８〜４０の標的を用いて、遺伝子型判定を用いずに（ドナーなしでシミュレーションする）画分を計算した；をれらを、網掛け点として表す（図５）。レシピエントホモ接合型であった各々の標的が、一般に有用であることを見出した。円は、第１の推定値、二値化を示す；右側のものは、完全にインフォーマティブであると考えられ、左側のものはそうではない。上部に沿った三角形は、同じ標的であったが、最終的なインフォーマティブ性の決定のために、それらを色替えした。
【０１０７】
例３−ＭＯＭＡ  ｃｆ−ＤＮＡアッセイ
ＭＯＭＡ  ｃｆ−ＤＮＡアッセイの原理および手順
この例示的なアッセイは、移植レシピエントの血液試料中に存在するＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡのパーセンテージを決定するために設計される。この態様において、レシピエントの血液試料は、ＥＤＴＡ管中に収集し、遠心分離して、血漿およびバフィーコートを分離する。血漿およびバフィーコートは、２つの別々の１５ｍＬ円錐管中に等分して凍結することができる。血漿試料は、定量的遺伝子型判定（ｑＧＴ）のために用いることができ、一方、バフィーコートは、基本的なレシピエントの遺伝子型判定（ｂＧＴ）のために用いることができる。移植レシピエントの血液試料に加えて、ドナーからの廃棄された組織または血液試料の小片を、基本的な遺伝子型判定のために用いることができる。
【０１０８】
プロセス中の第１のステップは、血漿試料（ｑＧＴのために用いられる）からセルフリーＤＮＡを、バフィーコート、全血または組織試料（ｂＧＴのために用いられる）からゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）抽出することであってよい。ｃｆＤＮＡの合計量を、ｑＰＣＲにより決定して、標的濃度に対して正規化することができる。このプロセスは、ｃｆＤＮＡ定量として公知である。ｇＤＮＡは、ＵＶ分光光度法を用いて定量し、正規化することができる。１５ｎｇのＤＮＡが、一般に、正確かつ有効な結果を提供する。
【０１０９】
正規化された患者ＤＮＡは、例えば各々がＭＯＭＡ標的部位のうちの１つを含む領域を増幅する９６のプライマーペアを含む、高度に多重化されたライブラリーＰＣＲ増幅反応中へのインプットとして用いることができる。結果として生じるライブラリーは、ＭＯＭＡ標的プライマーおよびプローブ部位を有するＰＣＲアンプリコンからなるので、ｂＧＴまたはｑＧＴアッセイのいずれかのためのインプットとして用いることができる。このステップは、高度に特異的なｑＰＣＲ増幅の前に各々の標的のコピー数を増大させることにより、アッセイ全体の感度を改善することができる。対照および標準物質（calibrator）／標準（standard）を、患者の試料と共に多重ライブラリーにより増幅してもよい。ライブラリー増幅の後で、下流の増幅が妨げられることを防ぐために、酵素によるクリーンアップを行って過剰なプライマーおよび組み込まれなかったデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を取り除いてもよい。
【０１１０】
平行したワークフローにおいて、マスターミックスを調製して、３８４ウェルのＰＣＲプレートに移してもよい。増幅された試料、対照および標準物質／標準を、次いで、ライブラリー希釈バッファーで 、予め決定された容積および濃度まで希釈してもよい。希釈された試料および対照を、６ウェルのリザーバプレートに等分して、アコースティックリキッドハンドラー（acoustic liquid handler）を用いて３８４ウェルのＰＣＲプレートに移してもよい。次いで、プレートを密封して、リアルタイムＰＣＲ増幅および検出系に移動してもよい。
【０１１１】
ＭＯＭＡは、移植ドナーとレシピエントとの間で区別し得る可能性が高くそれらを高度にインフォーマティブにしている両アレル型ＳＮＰを標的とすることにより、基本的なおよび定量的な両方の遺伝子型判定分析を行うことができる。基本的な遺伝子型判定分析は、レシピエントおよびドナーを、各々の標的（例えばホモ接合型ＲＥＦ、ヘテロ接合型ＲＥＦおよびＶＡＲ、ならびにホモ接合型ＶＡＲ）において、３つの可能な遺伝子型で標識することができる。この情報は、マイナー種率（minor-species proportion）として知られる各々の標的についてのアレル比を定量するために、標準曲線と共に、定量的遺伝子型判定分析のために用いることができる。全てのインフォーマティブなおよび品質管理を通過したアレル比の中央値を、ＤＳ  ｃｆＤＮＡの％を決定するために用いることができる。
【０１１２】
例４−コンピューターにより実行される態様の例
いくつかの態様において、上記の診断技術は、対象について試料を（例えば経時的に）分析し、試料中の核酸（セルフリーＤＮＡなど）を測定し、試料中の核酸（セルフリーＤＮＡなど）を測定し、および試料のうちの１つ以上に基づいて結果（診断結果など）をもたらすために、１つ以上のソフトウェア設備を実行する１つ以上のコンピューター処理デバイスを介して、実装することができる。図６は、いくつかの態様が作動することができるコンピューターシステムの例を説明するが、態様は、図６において説明される型の系により作動することに限定されないことが、理解されるべきである。
【０１１３】
図６のコンピューターシステムは、対象８０２、および対象８０６から試料８０６を得ることができる医師８０４を含む。前述のものから理解されるであろうが、試料８０６は、対象８０２における核酸（セルフリーＤＮＡなど）の存在を測定するために用いてもよい、対象８０２についての生物材料の任意の好適な試料であってよく、これは、血液試料を含む。試料８０６を、分析デバイス８０８に提供することができ、当業者は前述のものから理解するであろうが、これが、核酸（セルフリーＤＮＡなど）の量（試料８０６および／または対象８０２におけるＤＳ核酸（ＤＳセルフリーＤＮＡなど）の量を含む）を決定する（推定することを含む）ために、試料８０８を分析する。説明を容易にするために、分析デバイス８０８を単一のデバイスとして表すが、分析デバイス８０８は任意の好適な形態をとってよく、いくつかの態様においては複数のデバイスとして実装されてもよいことが、理解されるべきである。試料８０６および／または対象８０２中の核酸（セルフリーＤＮＡなど）の量を決定するために、分析デバイス８０８は、上記の技術のいずれを行ってもよく、任意の特定の分析を行うことに限定されない。分析デバイス８０８は、ソフトウェアにおいて実装される分析設備を実行するための１つ以上のプロセッサーを含んでもよく、これは、他のハードウェアを作動させるプロセッサーを駆動して、他のハードウェアにより行われたタスクの結果を受け取って分析の全結果（これは試料８０６および／または対象８０２中の核酸（セルフリーＤＮＡなど）の量であってもよい）を決定することができる。分析設備は、デバイス８０８のメモリーなどの１つ以上のコンピューター可読ストレージ媒体中に記憶されていてもよい。他の態様において、本明細書において記載される試料を分析するための技術は、部分的にまたは完全に、Application Specific Integrated Circuits（ＡＳＩＣ）などの１つ以上の特別な目的のコンピューターコンポーネントにおいて、またはソフトウェア実装の代わりとなり得る任意の他の好適なコンピューターコンポーネントの形態を通して、実装してもよい。
【０１１４】
いくつかの態様において、医師８０４は、試料８０６を分析デバイス８０８に直接提供してもよく、および対象８０２から試料８０６を得ることに加えてデバイス８０８を操作してもよく、一方、他の態様においては、デバイス８０８は、医師８０４および対象８０２から地理的に離れて位置していてもよく、試料８０６は、分析デバイス８０８の位置に輸送されるか、別段に移されてもよい。試料８０６は、いくつかの態様においては、試料８０６および／または対象８０２について、試料８０６が得られた日付および／または時間についての識別子、または試料８０６を記載または同定する他の情報と一緒に（例えば、任意の好適なインターフェースを介して入力される）、分析デバイス８０８に提供することができる。
【０１１５】
分析デバイス８０８は、いくつかの態様において、試料８０６に対して行われた分析の結果を、コンピューター処理デバイス８１０に提供するように設計されていてもよい。デバイス８１０は、データストア８１０Ａを含んでもよく、これは、データベースまたは他の好適なデータストアとして実装することができる。コンピューター処理デバイス８１０は、いくつかの態様においては、１つ以上のサーバーとして実装してもよく、これは、１つ以上の物理的計算機および／またはクラウドサービスプロバイダーなどの分散コンピューティングプラットフォームの仮想計算機を含む。他の態様において、デバイス８１０は、デスクトップまたはラップトップのパーソナルコンピューター、スマートモバイルフォン、タブレットコンピューター、特別な目的のハードウェアデバイス、または他のコンピューター処理デバイスとして、実装してもよい。
【０１１６】
いくつかの態様において、分析デバイス８０８は、その分析の結果を、１つ以上の有線および／または無線の、ローカルおよび／または広域のコンピューターコミュニケーションネットワーク（インターネットを含む）を介して、デバイス８１０に伝達することができる。分析の結果は、任意の好適なプロトコルを用いて伝達することができ、試料８０６および／または対象８０２についての、試料８０６が得られた日付および／または時間についてのまたは試料８０６が得られた日付および／または時間についての識別子などの、試料８０６を記載または同定する情報と一緒に伝達することができる。
【０１１７】
コンピューター処理デバイス８１０は、ソフトウェアにおいて実装される診断設備を実行するための１つ以上のプロセッサーを含んでもよく、これは、本明細書において記載される診断技術を行うためのプロセッサーを駆動することができる。診断設備は、デバイス８１０のメモリーなどの１つ以上のコンピューター可読ストレージ媒体に記録されていてもよい。他の態様において、本明細書において記載される試料を分析するための技術は、部分的にまたは完全に、Application Specific Integrated Circuits（ＡＳＩＣ）などの１つ以上の特別な目的のコンピューターコンポーネントにおいて、またはソフトウェア実装の代わりとなり得る任意の他の好適なコンピューターコンポーネントの形態を通して、実装してもよい。
【０１１８】
診断設備は、分析の結果および試料８０６を記載または同定する情報を受け取ってもよく、その情報をデータストア８１０Ａにおいて記録してもよい。情報は、対象８０２についての前の試料に関する情報が先に受け取られており、診断設備により記録されている場合などにおいては、対象８０２についての他の情報と関連づけてデータストア８１０Ａにおいて記録することができる。複数の試料に関する情報は、対象８０２についての識別子などの共通の識別子を用いて、関連づけることができる。いくつかの場合において、データストア８１０Ａは、複数の異なる対象についての情報を含んでもよい。
【０１１９】
診断設備はまた、対象８０２についての診断を決定するために、ユーザーの入力により同定される特定の対象８０２についての１つ以上の試料８０６の分析の結果を分析するために、作動させることができる。診断は、対象８０２が特定の状態を有するか、これを有し得るか、または将来的にこれを発症し得るリスクの結論であってよい。診断設備は、特定の試料８０６について決定された核酸（セルフリーＤＮＡなど）の量を、１つ以上の閾値と比較することによるもの、または試料８０６について経時的に決定された核酸（セルフリーＤＮＡなど）の量の経時的な変化を、１つ以上の閾値などと比較することによるものを含む、上記の多様な例のいずれかを用いて、診断を決定することができる。例えば、診断設備は、１つ以上の試料８０６についての核酸（セルフリーＤＮＡなど）の量を１つの閾値と比較すること、および同じ試料８０６についての核酸（セルフリーＤＮＡなど）の量を別の閾値と比較することにより、対象８０２にとっての状態のリスクを決定することができる。閾値との比較に基づいて、診断設備は、対象８０２にとっての状態のリスクの指標である出力をもたらすことができる。
【０１２０】
前述のものから理解されるであろうが、いくつかの態様において、診断設備は、核酸（セルフリーＤＮＡなど）の量を比較することができる異なる閾値を用いて、設計することができる。異なる閾値は、例えば、異なる人口統計学的な群（年齢、性別、人種、経済的なクラス、既往歴における特定の手順／状態／その他の存在もしくは不在、または他の人口統計学的なカテゴリー）、異なる状態、および／または他のパラメーターもしくはパラメーターの組み合わせに対応し得る。かかる態様において、診断設備は、コンピューター処理デバイス８１０のメモリーにおいて記録された異なる閾値を用いて、それに対して核酸（セルフリーＤＮＡなど）の量を比較すべき閾値を選択するように設計することができる。選択は、したがって、人工統計学的群に基づいて閾値が異なる態様においては、対象８０２についての人工統計学的情報に基づいたものであってよく、これらの場合においては、対象８０２についての人工統計学的情報は、診断設備に提供されても、あるいは、対象８０２についての識別子を用いて、診断設備により（別のコンピューター処理デバイス、もしくはデータストア８１０Ａと同じであっても異なっていてもよいデータストアから、または任意の他の好適なソースから）検索されてもよい。選択は、さらに、または代替的に、リスクを決定すべき状態に基づいたものであってよく、診断設備は、リスクを決定する前に、入力として条件を受け取り、リスクの決定が基づく閾値を選択するために当該条件を用いてもよい。診断設備は、複数の閾値が支持される態様において、任意の特定の様式において閾値を選択することに限定されないことが、理解されるべきである。
【０１２１】
いくつかの態様において、診断設備は、対象８０２についてのリスクの診断および／または診断のための基礎を含むユーザーインターフェースをユーザーに提示するために出力するように設計することができる。診断についての基礎は、例えば、対象８０２についての１つ以上の試料８０６において検出された核酸（セルフリーＤＮＡなど）の量を含んでもよい。いくつかの態様において、ユーザーインターフェースは、上で議論された結果、値、量、グラフなどの例のうちのいずれを含んでもよい。それらは、経時的な結果、値、量などを含んでもよい。例えば、いくつかの態様において、ユーザーインターフェースは、本明細書において提供される図面のいずれか１つにおいて示されるものと類似のグラフを取り込んでもよい。かかる場合において、いくつかの場合においては、グラフの異なる領域がグラフにおいて提示されるデータの分析からもたらされ得る異なる診断にどのように対応し得るかをユーザーに示すために、グラフに注釈をつけてもよい。例えば、グラフ表示されたデータを分析を決定するために比較することができる閾値を、グラフ上に組付け（impose）してもよい。
【０１２２】
グラフ（特に線および／または網掛けを有するもの）を含むユーザーインターフェースは、ユーザーに、核酸（セルフリーＤＮＡなど）の量に基づいて対象８０２のリスクを決定するために、他のユーザーインターフェースを通して提供され得るものよりもはるかにより直観的であり、かつレビューがより早いインターフェースを提供する。しかし、態様は、任意の特定のユーザーインターフェースにより実装されることに限定されないことが、理解されるべきである。
【０１２３】
いくつかの態様において、診断設備は、診断またはユーザーインターフェースを、対象８０２および／または医師（医師８０４または別の医師であってよい）により操作され得る１つ以上の他のコンピューター処理デバイス８１４（デバイス８１４Ａ、８１４Ｂを含む）に出力することができる。診断設備は、診断および／またはユーザーインターフェースを、ネットワーク８１２を介してデバイス８１４に伝達することができる。
【０１２４】
本明細書において記載される原理に従って作動する技術は、任意の好適な様式において実装することができる。上の議論に含まれるのは、核酸（セルフリーＤＮＡなど）の量の分析に基づいて状態のリスクを決定する多様なプロセスのステップおよび行為を示す、一連のフローチャートである。上で議論されるプロセッシングおよび決定のブロックは、これらの多様なプロセスを実行するアルゴリズム中に含まれ得るステップおよび行為を代表する。これらのプロセスに由来するアルゴリズムは、統合されたソフトウェアとして実装することができ、１つ以上の専用プロセッサーまたは多目的プロセッサーの操作を指揮することは、デジタル信号処理（ＤＳＰ）回路または特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）などの機能的に等価な回路として実装してもよく、または任意の他の好適な様式において実装してもよい。態様が、任意の特定のシンタックス、または任意の特定の回路もしくは任意の特定のプログラミング言語の作動、またはプログラミング言語の型に限定されないことが、理解されるべきである。むしろ、当業者は、本明細書において記載される技術の型を行う特定の装置のプロセッシングを実施するために、回路を製造するため、またはコンピューターソフトウェアアルゴリズムを実装するために、上の記載を使用することができる。本明細書において別段に示されない限り、上記のステップおよび／または行為の特定の配列は、実装することができるアルゴリズムの単なる説明であって、本明細書において記載される原理の実装および態様において異なっていてもよいことが、理解されるべきである。
【０１２５】
したがって、いくつかの態様において、本明細書において記載される技術は、アプリケーションソフトウェア、システムソフトウェア、ファームウェア、ミドルウェア、埋め込みコード、または任意の他の好適な型のコンピューターコードを含むソフトウェアとして実装された、コンピューターにより実行可能な指示において、具体化することができる。かかるコンピューターにより実行可能な指示は、多数の好適なプログラミング言語および／またはプログラミングもしくはスクリプトツールのうちのいずれかを用いて記述することができ、また、フレームワークまたは仮想計算機上で実行される、実行可能なマシン原語コードまたは中間コードとしてコンパイルすることができる。
【０１２６】
本明細書において記載される技術をコンピューターにより実行可能な指示として具体化する場合、これらのコンピューターにより実行可能な指示は、任意の好適な様式において実装することができ、これは、これらの技術に従って作動するアルゴリズムの実行を完了するために、各々が１つ以上の作動を提供する多数の機能設備を含む。「機能設備」は、インスタンス化されている場合であっても、１つ以上のコンピューターと統合されてこれにより実行される場合、当該１つ以上のコンピューターに特定の演算子（operational role）を実行させる、コンピューターシステムの構造的コンポーネントである。機能設備は、全ソフトウェアエレメントの一部であってもよい。例えば、機能設備は、プロセスの関数として、別個のプロセスとして、または任意の他の好適なプロセッシングの単位として、実装することができる。本明細書において記載される技術が複数の機能設備として実装される場合、各々の機能設備は、それ自体の方法において実装することができる；全てが同じ方法で実装される必要はない。加えて、これらの機能設備は、適宜、並行しておよび／または連続的に実行することができ、それらが実行中のコンピューター上の共用メモリーを用いて、メッセージパッシングプロトコルを用いて、または任意の他の好適な方法において、互いに情報を受け渡すことができる。
【０１２７】
一般に、機能設備は、特定のタスクを行う、または特定の抽象データ型を実装する、ルーチン、プログラム、オブジェクト、コンポーネント、データ構造などを含む。典型的には、機能設備の機能性は、それらが作動する系において所望されるように、組み合わせるかまたは分散させることができる。いくつかの実装において、本明細書における技術を実施する１つ以上の機能設備は、一緒になって、完全なソフトウェアパッケージを形成することができる。これらの機能設備は、代替的態様において、他の無関係な機能設備および／またはプロセスと相互作用するように、ソフトウェアプログラムアプリケーションを実装するために、適応させることができる。
【０１２８】
いくつかの例示的な機能設備は、１つ以上のタスクを実施するために、本明細書において記載してきた。しかし、記載されるタスクの機能設備および部門は、単に、本明細書において記載される例示的な技術を実装することができる機能設備の型を説明するものであって、態様は、任意の特定の機能設備の数、部門、または型において実装されることに限定されないことが、理解されるべきである。いくつかの実装において、全ての機能性は、単一の機能設備において実装することができる。また、いくつかの実装において、本明細書において記載される機能設備のうちのいくつかは、他のものと共に、またはこれらとは別に（すなわち、単一の単位として、または別々の単位として）実装してもよく、あるいはこれらの機能設備のうちのいくつかは、実装されなくともよいことが、理解されるべきである。
【０１２９】
本明細書において記載される技術を実装する（１つ以上の機能設備として、または任意の他の様式において実装される場合）、コンピューターにより実行可能な指示は、いくつかの態様において、媒体に機能性を提供するために、１つ以上のコンピューター可読媒体上でコード化されていてもよい。コンピューター可読媒体として、ハードディスクドライブなどの磁気媒体、コンパクトディスク（ＣＤ）もしくはデジタルバーサタイルディスク（ＤＶＤ）などの光学媒体、永続的もしくは非永続的ソリッドステートメモリー（例えば、フラッシュメモリー、磁気ＲＡＭなど）、または任意の他の好適なストレージ媒体が挙げられる。かかるコンピューター可読媒体は、任意の好適な様式において実装することができ、これは、コンピューター処理デバイスの一部としてのもの、またはスタンドアローンの別のストレージ媒体としてのものを含む。本明細書において用いられる場合、「コンピューター可読媒体」（また「コンピューター可読ストレージ媒体」とも称される）とは、有体ストレージ媒体を指す。有体ストレージ媒体は、非一過性であり、少なくとも１つの物理的な構造的コンポーネントを有する。「コンピューター可読媒体」において、本明細書において用いられる場合、少なくとも１つの物理的な構造的コンポーネントは、情報が埋め込まれた媒体を作成するプロセス、その上に情報を記録するプロセス、または情報を有する媒体をコード化する任意の他のプロセスの間に、何らかの方法において変更することができる、少なくとも１つの物理的特性を有する。例えば、コンピューター可読媒体の物理的構造の一部の磁化状態は、記録プロセスの間に変更することができる。
【０１３０】
全てではないがいくつかの、技術がコンピューターにより実行可能な指示として具体化され得る実装において、これらの指示は、任意の好適なコンピューターシステムにおいて作動する１つ以上の好適なコンピューター処理デバイス上で実行することができ、これは、図６の例示的なコンピューターシステムを含むか、または１つ以上のコンピューター処理デバイス（または１つ以上のコンピューター処理デバイスの１つ以上のプロセッサー）を、コンピューターにより実行可能な指示を実行するようにプログラムすることができる。コンピューター処理デバイスまたはプロセッサーは、コンピューター処理デバイスまたはプロセッサーにアクセス可能な様式において、例えばデータストア（例えば、オンチップキャッシュまたは命令レジスター、バスを介してアクセス可能なコンピューター可読ストレージ媒体など）において、指示が記録される場合、指示を実行するようにプログラムすることができる。これらのコンピューターにより実行可能な指示を含む機能設備は、単一の多目的のプログラム可能なデジタルコンピューター処理デバイス、処理能力を共有して本明細書において記載される技術を共同で実施する２つ以上の多目的コンピューター処理デバイスの同調系、本明細書において記載される技術を実行することに特化した単一コンピューター処理デバイスまたはコンピューター処理デバイスの同調系（共同設置されているか、または地理的に分散したもの）、本明細書において記載される技術を実施するための１つ以上のField-Programmable Gate Array（ＦＰＧＡ）、または任意の他の好適な系と統合されて、その作動を指揮することができる。
【０１３１】
回路および／またはコンピューターにより実行可能な指示において技術が実装される態様を記載してきた。いくつかの態様は、少なくとも１つの例が提供されている方法の形態におけるものであってよいことが、理解されるべきである。方法の一部として行われる行為は、任意の好適な方法において順序付けることができる。したがって、説明されたものと異なる順序において行為が行われる態様を構築することができ、これは、説明的態様においては連続的な行為として示されたものであっても、いくつかの行為が同時に行われることを含んでもよい。前述のデバイス、系、態様、方法、技術、アルゴリズム、媒体、ハードウェア、ソフトウェア、インターフェース、プロセッサー、ディスプレイ、ネットワーク、入力、出力、またはこれらの任意の組み合わせを含む前述のもののいずれか１つは、本明細書において他の側面において提供される。
【０１３２】
例５−ドナー特異的セルフリーＤＮＡ（ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡ）の細胞性拒絶グレードとの相関
ＭＯＭＡアッセイを用いて、移植レシピエントのドナー特異的ｃｆ−ＤＮＡを定量し、かかるアッセイについての例示的なステップは、本明細書において提供される。図６７および６８は、既知の遺伝子型によるＭＯＭＡ（図６７）および不明なドナー遺伝子型によるＭＯＭＡ（図６８）についてのデータ分布を示す。例示的な図７〜３１および５７〜６６において示されるとおり、細胞性拒絶のグレードおよび／またはそれに付随するリスクを予測することができるように、閾値（「カットポイント」）値を、実験により決定した。また、いくつかの結果を、表にして、以下の表１〜２４において示す。
表１．既知のドナー遺伝子型を用いる方法および不明なドナー遺伝子型を用いる方法を用いた統計学的試験
【表１−１】
2020529193.tif 000004
【表１−２】
2020529193.tif 000005
【０１３３】
表２．実験により決定されたＣＲ０カットポイントを用いたクロス集計（既知のドナー遺伝子型を用いるＭＯＭＡ）
【表２】
2020529193.tif 000006
【０１３４】
表３．実験により決定されたＣＲ０カットポイントを用いたクロス集計（不明なドナー遺伝子型を用いるＭＯＭＡ）
【表３】
2020529193.tif 000007
【０１３５】
表４．実験により決定されたＣＲ１カットポイントを用いたクロス集計（不明なドナー遺伝子型を用いるＭＯＭＡ）
【表４】
2020529193.tif 000008
【０１３６】
表５．実験により決定されたＣＲ２カットポイントを用いたクロス集計（既知のドナー遺伝子型を用いるＭＯＭＡ）
【表５】
2020529193.tif 000009
【０１３７】
表６．実験により決定されたＣＲ２カットポイントを用いたクロス集計（不明なドナー遺伝子型を用いるＭＯＭＡ）
【表６】
2020529193.tif 000010
【０１３８】
表７．ＣＲ１／２／３対ＣＲ０（既知のドナー遺伝子型を用いるＭＯＭＡ）
（「健常ではない」試料を含む）
【表７】
2020529193.tif 000011
【０１３９】
表８．ＣＲ１／２／３対ＣＲ０（既知のドナー遺伝子型を用いるＭＯＭＡ）−健常（以下のいずれでもない：死亡、心停止、ＭＣＳ、感染のための処置、ＡＭＲ１＆２、移植片脈管障害、がん）
【表８】
2020529193.tif 000012
【０１４０】
表９．ＣＲ１／２／３対ＣＲ０（既知のドナー遺伝子型を用いるＭＯＭＡ−１試料／対象）
ＣＲ１／２／３群において、用いた試料は、第１の拒絶からのものであった；ＣＲ０群において、それは、採取された第１の試料であった。
【表９】
2020529193.tif 000013
【０１４１】
表１０．ＣＲ１／２／３対ＣＲ０（血漿を用いる、既知のドナー遺伝子型を用いるＭＯＭＡ）−健常（以下のいずれでもない：死亡、心停止、ＭＣＳ、感染のための処置、ＡＭＲ１＆２、移植片脈管障害、がん）
【表１０】
2020529193.tif 000014
【０１４２】
表１１．ＣＲ１／２／３対ＣＲ０（全血を用いる、既知のドナー遺伝子型を用いるＭＯＭＡ）−健常（以下のいずれでもない：死亡、心停止、ＭＣＳ、感染のための処置、ＡＭＲ１＆２、移植片脈管障害、がん）
【表１１】
2020529193.tif 000015
【０１４３】
表１２．既知のドナー遺伝子型を用いるＭＯＭＡについてのクロス集計（全血および血漿）
【表１２−１】
2020529193.tif 000016
【表１２−２】
2020529193.tif 000017
【０１４４】
表１３．既知のドナー遺伝子型を用いるＭＯＭＡについてのクロス集計（血漿）
【表１３】
2020529193.tif 000018
【０１４５】
表１４．既知のドナー遺伝子型を用いるＭＯＭＡについてのクロス集計（全血）
【表１４】
2020529193.tif 000019
【０１４６】
表１５．ＣＲ１／２／３対ＣＲ０（不明なドナー遺伝子型を用いるＭＯＭＡ）
（「健常ではない」試料を含む）
【表１５】
2020529193.tif 000020
【０１４７】
表１６．ＣＲ１／２／３対ＣＲ０（不明なドナー遺伝子型を用いるＭＯＭＡ）−健常（以下のいずれでもない：死亡、心停止、ＭＣＳ、感染のための処置、ＡＭＲ１＆２、移植片脈管障害、がん）
【表１６】
2020529193.tif 000021
【０１４８】
表１７．ＣＲ１／２／３対ＣＲ０（不明なドナー遺伝子型を用いるＭＯＭＡ−１試料／対象）
ＣＲ１／２／３群において、用いた試料は、第１の拒絶からのものであった；ＣＲ０群において、それは、採取された第１の試料であった。
【表１７】
2020529193.tif 000022
【０１４９】
表１８．ＣＲ１／２／３対ＣＲ０（血漿を用いる、不明なドナー遺伝子型を用いるＭＯＭＡ）−健常（以下のいずれでもない：死亡、心停止、ＭＣＳ、感染のための処置、ＡＭＲ１＆２、移植片脈管障害、がん）
【表１８】
2020529193.tif 000023
【０１５０】
表１９．ＣＲ１／２／３対ＣＲ０（全血を用いる、不明なドナー遺伝子型を用いるＭＯＭＡ）−健常（以下のいずれでもない：死亡、心停止、ＭＣＳ、感染のための処置、ＡＭＲ１＆２、移植片脈管障害、がん）
【表１９】
2020529193.tif 000024
【０１５１】
表２０．不明なドナー遺伝子型を用いるＭＯＭＡについてのクロス集計（全血および血漿）
【表２０−１】
2020529193.tif 000025
【表２０−２】
2020529193.tif 000026
【０１５２】
表２１．不明なドナー遺伝子型を用いるＭＯＭＡについてのクロス集計（血漿）
【表２１】
2020529193.tif 000027
【０１５３】
表２２．不明なドナー遺伝子型を用いるＭＯＭＡについてのクロス集計（全血）
【表２２】
2020529193.tif 000028
【０１５４】
表２３．拒絶間での既知のドナー遺伝子型を用いるＭＯＭＡ（移植後７日、拒絶のための処置後１４日は除外した）
【表２３】
2020529193.tif 000029
拒絶間でのＷＢ＋血漿：
ＣＲ０対ＣＲ２：ｐ＝０．０４（ＣＲ２がＣＲ０より高い）；ＣＲ１対ＣＲ２：ｐ＝０．０１（ＣＲ２がＣＲ１より高い）；ＣＲ０対ＣＲ１：ｐ＝０．３９；
拒絶間での全血：
ＣＲ０対ＣＲ２：ｐ＝０．１６；ＣＲ１対ＣＲ２：ｐ＝０．０４（ＣＲ２がＣＲ１より高い）；ＣＲ０対ＣＲ１  ｐ＝０．１１
拒絶間での血漿：ＣＲ０対ＣＲ１：ｐ＜０．０００１（ＣＲ１がＣＲ０より高い）
【０１５５】
表２４．拒絶間での不明なドナー遺伝子型を用いるＭＯＭＡ（移植後７日、拒絶のための処置後１４日は除外した）
【表２４】
2020529193.tif 000030
拒絶間でのＷＢ＋血漿：
ＣＲ０対ＣＲ２：ｐ＝０．０５；ＣＲ１対ＣＲ２：ｐ＝０．０８；
ＣＲ０対ＣＲ１：ｐ＝０．８３；
拒絶間での全血：
ＣＲ０対ＣＲ２：ｐ＝０．２０；ＣＲ１対ＣＲ２：ｐ＝０．１４（ＣＲ２がＣＲ１より高い）；ＣＲ０対ＣＲ１：ｐ＝０．６２
拒絶間での血漿：ＣＲ０対ＣＲ１：ｐ＜０．０００１（ＣＲ１がＣＲ０より高い）
【０１５６】
例６−心臓移植後の非侵襲性の指標としてのドナー特異的セルフリーＤＮＡ
目的
心臓移植レシピエントのサーベイランスのための現在の至適基準は、心内膜心筋生検（ＥＭＢ）であり、これは、小児を一定の傷害のリスクに曝し、妥当なスクリーニングの頻度を限定し、雑駁なプロセスとして拒絶が起こることから感度が本質的に限定される。侵襲性サーベイランス生検の必要性に取って代わるために、循環中のドナー特異的セルフリーＤＮＡ（ＤＳ  ｃｆＤＮＡ）の正確な定量に基づく、小児および成人の心臓移植レシピエントのための非侵襲性の診断スクリーニングツールを開発した。
【０１５７】
方法
ウィスコンシン州小児病院（Children’s Hospital of Wisconsin：ＣＨＷ）において追跡された全ての心臓移植レシピエントを、この盲検研究において参加するように招待した。３〜１０ミリリットル（ｍｌ）の抗凝固剤処置された血液を採取して、以下の臨床シナリオにおいてｃｆ−ＤＮＡの循環レベルを評価した：移植後の第１、４、７および２８日、任意のＥＭＢの前２４時間以内、拒絶のための処置の開始後の第１、４、７および２８日。試料は、すぐにコード化し、匿名化し、MyTAI（心臓）検査（TAI diagnostics, Milwaukee, WI）を用いる処理のために研究室に送達された。臨床、研究室、心臓生検、脈管障害、カテーテル処置、および心エコーデータを、全て、試料採取の時点で記録した。全生検レポートのうちの病理学レポートを見直し、2004 International Society for Heart and Lung Transplantation（ＩＳＨＬＴ）グレードを記録した。感染のための処置、拒絶のための処置、心停止、心臓再移植、機械的循環サポートの開始、および死亡を含む全ての重要なイベントの日付および時間を記録した。ターゲティングされたアプローチを用いてドナー特異的（ｄｓ）セルフリーＤＮＡ（ｃｆ−ＤＮＡ）を定量し、ドナー遺伝子型を用いる（方法１）、およびドナー遺伝子型を用いない（方法２）２つの別々の方法を用いて、関連する生検および脈管障害の結果と比較した。
【０１５８】
結果
成人および小児の両方の８７人のユニークな移植レシピエント対象からの合計で１５８の試料が、ＱＣ基準を通り、分析のために利用可能であった。１個体は、最初の移植の後および再移植の後の両方の研究に参加し、２つのユニークなドナー／レシピエントが一致しないＤＮＡを考慮して、２人のユニークな対象として分析した。移植時の患者の平均年齢は、７．９＋／−７．５歳（０．０３〜２４．２歳の範囲）であった。採血時の平均年齢は、１２．７＋／−８．１歳（０．０８〜３０．２歳の範囲）であった。５９．６％（５１／８７）の対象は男性であり、６５．５％（５７／８７）は白人であった。移植から採血までの平均時間は、４．８＋／−４．２年であった。１３４の生検はグレードＣＲ０であり、２１の生検はグレードＣＲ１であり、３つの生検は、グレードＣＲ２であった。平均のドナー特異的ｃｆ−ＤＮＡ画分は、グレードＣＲ０生検に関連する試料においては０．１１％（ＩＱＲ：０．０６〜０．２１％）、グレードＣＲ１に関連する試料においては０．３７％（ＩＱＲ：０．１５〜０．７２％）、グレードＣＲ２に関連する試料においては０．９７％（ＩＱＲ：０．８８〜１．０６％）であった（ｐ＝０．０２７）。関連するＲＯＣ曲線に基づいてグレードＣＲ２の拒絶を除外するための経験的最適カットポイントは、０．８７％［９５％ＣＩ：０．７８〜０．９７％（ｐ＝０．００９）］であった。曲線下面積は、０．９７であった。感度は１００％であり、特異度は９３％であった。
【０１５９】
別の例として、ドナー遺伝子型なしで、平均ドナーｃｆ−ＤＮＡ画分は、グレードＣＲ０生検に関連する試料においては０．２５％（ＩＱＲ：０．１７〜０．３９％）、グレードＣＲ１生検に関連する試料においては０．８９％（ＩＱＲ：０．４４〜５．３５％）、グレードＣＲ２生検に関連する試料においては１．２２％（ＩＱＲ：１．０４〜５．１８％）であった（ｐ＜０．００１）。関連するＲＯＣ曲線に基づいてグレードＣＲ２の拒絶を除外するための経験的最適カットポイントは、０．８９％［９５％ＣＩ：０．４６〜１．７０％  （ｐ＝０．７２５）］であった。曲線下面積は、０．９５であった。感度は１００％であり、特異度は８９％であった。
【０１６０】
結論
ドナー特異的ｃｆ−ＤＮＡの定量のためのターゲティングされたハイスループットアッセイが、心臓移植レシピエントにおける急性細胞性拒絶サーベイランスについて、優れた感度を有することを見出した。驚くべきことに、CR0、CR1およびCR2に関連する生検の間で、ドナー特異的ｃｆ−ＤＮＡの段階的増加が観察され、このことは、拒絶グレードの増大に伴う漸進的な同種移植片傷害を示唆している。
【０１６１】
例７−ドナー特異的セルフリーＤＮＡ（ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡ）の心臓同種移植片脈管障害との相関
ＭＯＭＡを用いて移植レシピエント（ｎ＝２７３）のドナー特異的ｃｆ−ＤＮＡを定量した。図３９において示されるとおり、心臓同種移植片脈管障害（移植片脈管障害）についての閾値（「カットポイント」）値を、２つの異なる方法を用いて、既知のドナー遺伝子型により（方法１）、および不明なドナー遺伝子型により（方法２）、実験により決定した。加えて、全セルフリーＤＮＡを試験し、閾値を実験により決定した。さらに、以下の表２５は、さらなる統計学を示す。
【０１６２】
図４１〜４６においてさらなる例が提供される。全試料集団（Ｎ＝２１４）を用いて、ドナー遺伝子型が既知の場合（図４１）および不明の場合（図４３）の、実験的な閾値を決定した。機械的サポートを受けている対象をデータから除外した後に、同じ閾値が決定された。結果を、図４２および図４４において示す。図４５は、各々の対象からの最後の試料のみを用いる場合の結果を示す（Ｎ＝７９）（ドナー遺伝子型が不明であった場合）。
表２５．移植片脈管障害の統計学
【表２５】
2020529193.tif 000031
【０１６３】
例８−ドナー特異的セルフリーＤＮＡ（ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡ）の心停止との相関
同様に、ＭＯＭＡを用いて移植レシピエント（ｎ＝７１〜７７）のドナー特異的ｃｆ−ＤＮＡを定量した。図４０において示されるとおり、心停止についての閾値（「カットポイント」）値を、２つの異なる方法を用いて実験により決定した。さらに、以下の表２６は、さらなる統計学を示す。
表２６．心停止の統計学
【表２６】
2020529193.tif 000032
【０１６４】
図４７〜５２は、異なる方法を用いて見出された心停止についての閾値（カットポイント）の実験による決定を示す。図４７〜４９は、３つの集団：全試料集団（図４７）、機械的サポートを受けている対象を除く全試料集団（図４８）、および各々の対象から得られた最後の試料（図４９）において、ＭＯＭＡを用いて（既知のドナー遺伝子型により）得られた閾値を示す。図５０〜５２は、３つの集団：全試料集団（図５０）、機械的サポートを受けている対象を除く全試料集団（図５１）、および各々の対象から得られた最後の試料（図５２）において、ＭＯＭＡを用いて（不明なドナー遺伝子型により）得られた閾値を示す。試験のための統計学を、表２７において表す。
表２７．心停止の統計学−不明なドナー遺伝子型を用いるＭＯＭＡ
【表２７】
2020529193.tif 000033
【０１６５】
図５３および５４は、さらなる結果を示す。図５３において、試料の全集団（Ｎ＝２１４）を用いた。図５４は、集団が、機械的サポートを受けていなかった対象からの試料に限定された場合の結果を示す。研究の他の結果を、以下の表２８において示す。
表２８．心停止の統計学−不明なドナー遺伝子型による、かつ上界なしのＭＯＭＡ
【表２８】
2020529193.tif 000034
【０１６６】
例９−心臓移植後の非侵襲性の指標としてのドナー特異的セルフリーＤＮＡ
目的
心臓移植レシピエントのサーベイランスのための現在の至適基準は、心内膜心筋生検（ＥＭＢ）であり、これは、小児を、一定の傷害のリスクに曝し、妥当なスクリーニングの頻度を限定し、雑駁なプロセスとして拒絶が起こることから感度が本質的に限定される。侵襲性サーベイランス生検の必要性に取って代わるために、循環中のドナー特異的セルフリーＤＮＡ（ＤＳ  ｃｆＤＮＡ）の正確な定量に基づく、小児および成人の心臓移植レシピエントのための非侵襲性の診断スクリーニングツールを開発した。
【０１６７】
方法
ウィスコンシン州小児病院（Children’s Hospital of Wisconsin：ＣＨＷ）において追跡された全ての心臓移植レシピエントを、この盲検研究において参加するように招待した。３〜１０ミリリットル（ｍｌ）の抗凝固剤処置された血液を採取して、以下の臨床シナリオにおいてｃｆ−ＤＮＡの循環レベルを評価した：移植後の第１、４、７および２８日、任意のＥＭＢの前２４時間以内、拒絶のための処置の開始後の第１、４、７および２８日。試料は、すぐにコード化し、匿名化し、MyTAI（心臓）検査（TAI diagnostics, Milwaukee, WI）を用いる処理のために研究室に送達された。臨床、研究室、心臓生検、脈管障害、カテーテル処置、および心エコーデータを、全て、試料採取の時点で記録した。全生検レポートのうちの病理学レポートを見直し、2004 International Society for Heart and Lung Transplantation（ＩＳＨＬＴ）グレードを記録した。感染のための処置、拒絶のための処置、心停止、心臓再移植、機械的循環サポートの開始、および死亡を含む全ての重要なイベントの日付および時間を記録した。ターゲティングされたアプローチを用いてドナー特異的（ｄｓ）セルフリーＤＮＡ（ｃｆ−ＤＮＡ）を定量し、ドナー遺伝子型を用いる（方法１）、およびドナー遺伝子型を用いない（方法２）２つの別々の方法を用いて、関連する生検および脈管障害の結果と比較した。
【０１６８】
結果
心臓同種移植片脈管障害
ＱＣ基準を通った成人および小児の両方の８７人のユニークな移植レシピエント対象からの合計で１５８の試料が、分析のために利用可能であった。１個体は、最初の移植の後および再移植の後の両方の研究に参加し、２つのユニークなドナー／レシピエントが一致しないＤＮＡを考慮して、２人のユニークな対象として分析した。移植時の患者の平均年齢は、７．９＋／−７．５歳（０．０３〜２４．２歳の範囲）であった。採血時の平均年齢は、１２．７＋／−８．１歳（０．０８〜３０．２歳の範囲）であった。５９．６％（５１／８７）の対象は男性であり、６５．５％（５７／８７）は白人であった。移植から採血までの平均時間は、４．８＋／−４．２年であった。
【０１６９】
１１６の血液試料を、選択的冠動脈造影の前２４時間以内に収集した。これらのうち１２は、２０１０  ＩＳＨＬＴグレーディングシステムにより定義されるような移植片脈管障害を示し、１０４は、移植片脈管障害を示さなかった。脈管障害に関連する試料の中でのドナー特異的ｃｆ−ＤＮＡ画分の比較をまとめた。平均のドナー特異的画分は、ＣＡＶと関連していない試料については０．０９％（ＩＱＲ  ０．０６〜０．２０％）、ＣＡＶに関連する試料については０．５２％（ＩＱＲ  ０．３３〜０．８８％）であった（ｐ＝０．０２９）。ＣＡＶを除外するための経験的最適カットポイントは、０．１９％［９５％ＣＩ  ０．０９〜０．３８％（ｐ＜０．００１）］であった。
【０１７０】
別の例として、１１６の血液試料を、選択的冠動脈造影の前２４時間以内に収集した。これらのうち１１は、２０１０  ＩＳＨＬＴグレーディングシステムにより定義されるような移植片脈管障害を示し（Mehra et al., J Heart Lung Transplant 29, 717-727（2010））、９９は、移植片脈管障害を示さなかった。脈管障害に関連する試料の中でのドナー特異的ｃｆ−ＤＮＡ画分の比較を、表２９においてまとめる。
【０１７１】
ＭＯＭＡを用いて、平均ドナー画分は、ドナー遺伝子型を用いて、ＣＡＶと関連しない試料については０．０９％（ＩＱＲ  ０．０６〜０．２０％）、ＣＡＶに関連する試料については０．４７％（ＩＱＲ  ０．２７〜０．７１％）であった（ｐ＝０．０５）（ Mehra, M.R., et al. International Society for Heart and Lung Transplantation working formulation of a standardized nomenclature for cardiac allograft vasculopathy-2010. J Heart Lung Transplant 29, 717-727（2010）。 ＣＡＶを除外するための経験的最適カットポイントは、０．１９％であった［９５％ＣＩ；０．０９〜０．３８％（ｐ＜０．００１）］。
ドナー遺伝子型なしでは、平均ドナー画分は、ＣＡＶと関連しない試料については０．２７％（ＩＱＲ  ０．１６〜０．５４％）、ＣＡＶに関連する試料については０．５５％（ＩＱＲ  ０．３８〜１．２２％）であった（ｐ＝０．０５７）。ＣＡＶを除外するための経験的最適カットポイントは、０．３７％であった［９５％ＣＩ：０．２４〜０．５７％（ｐ＜０．００１）］。
【０１７２】
さらに別の分析において、選択的冠動脈造影の前２４時間以内に、６６の対象から１１６の血液試料を採取した。１１の試料は心臓同種移植片脈管障害（ＣＡＶ）を示し（７つがグレード１、２つがグレード２、および３つがグレード３）、１０５は、ＣＡＶを示さなかった。方法１（既知のドナー遺伝子型によるもの）を用いて、ＤＦは、ＣＡＶに関連しない試料については０．０９％（ＩＱＲ：０．０６％〜０．２０％）、ＣＡＶに関連する試料については０．４７％（ＩＱＲ：０．２７％〜０．７１％）であった（ｐ＝０．０５）。方法２（不明なドナー遺伝子型によるもの）により、ＤＦは、ＣＡＶに関連しない試料については０．２７％（ＩＱＲ：０．１６％〜０．５２％）、ＣＡＶに関連する試料については０．５５％（ＩＱＲ：０．３８％〜１．２２％）であった（ｐ＝０．０５７）。
表２９．ドナー画分および冠動脈移植片脈管障害
【表２９】
2020529193.tif 000035
【０１７３】
急性細胞性拒絶
別の分析において、心内膜心筋生検（ＥＭＢ）の前の８８の対象からの血液試料を得た。ドナー画分（ＤＦ）を、循環中の全レシピエントｃｆＤＮＡのうちのパーセンテージとして報告した。採血時の平均年齢は、１２．７±８．１歳であった（０．１〜３０．２歳の範囲）。基本的な心臓診断は、４２．０％において心筋症、５６．８％において先天性心疾患であった。対象のうちの合計５９．０％は、男性であり、６９．３％（８８中６１）はコーカサス人種であった。１５８の生検関連試料（そのうち１４８は、無症候性のサーベイランス生検であった）のうち、１３４は、細胞性拒絶グレード０（ＣＲ０）に、２１は細胞性拒絶グレード１（ＣＲ１）、３は細胞性拒絶グレード２（ＣＲ２）に、０は、細胞性拒絶グレード３（ＣＲ３）に関連していた。
【０１７４】
方法１（既知のドナー遺伝子型によるもの）を用いた場合、ＤＦは、拒絶グレード間で増大した：ＣＲ０に関連する試料においては０．１１％（四分位数間範囲［ＩＱＲ］：０．０６％〜０．２１％）、ＣＲ１に関連する試料においては０．３７％（ＩＱＲ：０．１５％〜０．７２％）、およびＣＲ２に関連する試料においては０．９７％（ＩＱＲ：０．８８％〜１．０６％）。ＣＲ０（０．１１％；ＩＱＲ：０．０６％〜０．２１％）を、ＣＲ１またはＣＲ２（０．４８％；ＩＱＲ：０．１９％〜０．８９％）と比較して、ｐ＝０．０２。
【０１７５】
方法２（不明なドナー遺伝子型によるもの）を用いた場合、ＤＦはまた、拒絶グレード間で増大した：ＣＲ０に関連する試料においては０．２５％（ＩＱＲ：０．１７％〜０．３９％）、ＣＲ１に関連する試料においては０．８９％（ＩＱＲ：０．４４％〜５．３５％）、およびＣＲ２に関連する試料においては１．２２％（ＩＱＲ：１．０４％〜５．１８％）。ＣＲ０（０．２５％；ＩＱＲ：０．１９％〜０．３９％）を、ＣＲ１またはＣＲ２（１．０５％；ＩＱＲ：０．４７％〜５．２６％）と比較して、ｐ＜０．００１。最適カットポイントによる受信者動作特性曲線を決定し、これを図６９において提示する。
【０１７６】
特定されたカットポイントにおける急性細胞性拒絶および心臓同種移植片脈管障害の関連
特定されたＤＦカットポイントにおける急性細胞性拒絶および心臓同種移植片脈管障害の関連を分析した（表３０）。全１４０の試料を、方法１（既知のドナー遺伝子型によるもの）により、０．２％のＤＦカットポイントにおいて分析し、ＣＲ０をＣＲ１およびＣＲ２と比較した（ｐ＝０．００２２）。全１５８の試料を、方法２（不明なドナー遺伝子型によるもの）により、０．２％のＤＦカットポイントにおいて分析し、ＣＲ０を、ＣＲ１およびＣＲ２と比較した（ｐ＝０．０１４１）。０．２％のＤＦカットポイントにおいて脈管障害に関連する１０２の試料を、方法１（既知のドナー遺伝子型によるもの）を用いて分析した；７つの試料は、ＣＡＶについて真に陽性であり、１つの試料は、偽陰性であり、７０は真に陰性であり、２４は偽陽性であった（ｐ＜０．００１）。方法２（不明なドナー遺伝子型によるもの）を用いて、１１６の試料を、０．２％のＤＦカットポイントにおいて分析した、１１の試料は、ＣＡＶについて真に陽性であり、０は偽陰性であり、３８は真に陰性であり、６７は偽陽性であった（ｐ＝０．０１５）。
【０１７７】
表３０．２つの特定のカットポイント（０．２％および０．８％）におけるＤＦ  ｃｆＤＮＡと細胞性拒絶（ＣＲ）および心臓同種移植片脈管障害（ＣＡＶ）との関連
【表３０】
2020529193.tif 000036
【０１７８】
結論
ドナー特異的ｃｆ−ＤＮＡの定量のためのターゲティングされたハイスループットアッセイの使用は、心臓移植レシピエントにおけるサーベイランスのために、および心臓移植レシピエントにおける急性細胞性拒絶の存在を除外するために、精巧な感度を有することを見出した。ＤＦは、ＣＲ０に関連する生検からＣＲ１〜ＣＲ２に関連する生検へと増大し、このことは、ドナーの臓器に対する進行性の傷害を検出するその能力を示唆している。加えて、ドナー特異的画分の著しい増加は、冠動脈移植片脈管障害の形態における急性特発性拒絶および慢性拒絶を含む顕著な同種移植片傷害に相関する。これらの知見は、診療においてＤＦの正確な定量が可能であること、および両方のアッセイ方法の間での結果において観察される類似（既知のドナー遺伝子型によるもの、または不明なドナー遺伝子型によるもの）は、遺伝子型判定のために利用可能でない場合においてすら、定量における正確性が保存されることを示すことを示唆する。
【０１７９】
例１０−ドナー特異的セルフリーＤＮＡ（ＤＳ  ｃｆ−ＤＮＡ）の抗体媒介性拒絶との相関
ＭＯＭＡを用いて、移植レシピエント（ｎ＝１４２）のドナー特異的ｃｆ−ＤＮＡを定量した。図３２において示されるとおり、抗体媒介性拒絶グレード０ならびにグレード１および２についての閾値（「カットポイント」）値を、実験により決定した。
閾値（カットポイント）の決定のさらなる例を、図３３〜３８において示す。図３３および３６は、２１４の試料を用いた、既知のドナー遺伝子型（図３３）および不明なドナー遺伝子型（図３６）による、閾値の決定を示す。機械的サポートを用いる集団を除外して、同じ試料を分析し、結果を、図３４および３７において示す。各々の対象からの最後の試料（ｎ＝７９）のみを検査することにより、ドナー遺伝子型が既知の場合は０．２５（図３５）、ドナー遺伝子型が不明の場合、０．１６（図３８）のカットポイントを得た。
【０１８０】
別の例において、平均のドナー特異的画分は、ドナー遺伝子型が既知である場合、グレードｐＡＭＲ０と関連する試料については０．１２％（ＩＱＲ：０．０７〜０．２９％）であり、グレードｐＡＭＲ１または２と関連する試料については０．２６％（ＩＱＲ：０．０９〜０．３３％）であった（ｐ＝０．９０５）。ドナー遺伝子型が不明である場合、平均ドナー画分は、グレードｐＡＭＲ０と関連する試料については０．２９％（ＩＱＲ：０．１８〜０．６１％）であり、グレードｐＡＭＲ１または２と関連する試料については０．３９（ＩＱＲ：０．１２〜０．４４％）であった（ｐ＝０．９６９）。関連するＲＯＣ曲線に基づいてｐＡＭＲ１または２を除外するための経験的最適カットポイントは、０．３８％であった［９５％ＣＩ：０．１９〜０．７４％（ｐ＝０．００５）］。
表３１．ドナー画分および抗体媒介性拒絶
【表３１】
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【０１８１】
例１１−心内膜心筋生検は定量可能な細胞傷害を誘導する
２１人の無症候性の患者から、対にした血液試料を採血したプレおよびポストサーベイランス生検（ｂｘ）。myTAI-HEART（商標）検査（TAI Diagnostics（Wauwatosa, WI）製の定量的遺伝子型判定アッセイの商標）を用いて定量的ＤＦ  ｃｆＤＮＡを決定した。既知の移植片脈管障害、がん、機械的循環サポート、またはグレード＞１を有する任意の細胞性拒絶を有する患者を除外して、１７の試料のペアが利用可能であった。生検鉗子サイズおよび採取されたｂｘ試料の数を記録し、分析した。
【０１８２】
ドナー画分（ＤＦ）は、０．０２％のプレｂｘ〜１１．１％のポストｂｘの範囲であり、０．４３％の中央値を有した。ＤＦは、一貫してポストｂｘを増大させ、８．２×（範囲１．５×〜２１３×）の中央値の増大を有した。患者の年齢は、４〜３２歳（中央値、１２歳）の範囲であった。患者の体重は、１７〜９０ｋｇ（中央値、４９ｋｇ）の範囲であった。年齢および体重の両方は、独立して、ＤＦの変化と関連している（ｐ＜０．０１）。１６歳以下の年齢でのＰｔｓは、２．７×の平均ＤＦ増大を有する２４歳以上のｐｔｓに対して、２４×の平均のＤＦ増大を有した。年齢および体重は相関するので、採血時の体重によって類似の効果が観察された。ＤＦの変化は、生検鉗子サイズと相関しなかった（ｐ＝０．４）。ｂｘと第２の採血との間の時間は、１〜３６分間の範囲であり、ＤＦの増大とは相関しなかった。ｂｘの直後に採血された試料は、より遅延した試料よりも劇的なＤＦの増大を有した。このことは、ｃｆＤＮＡの短い半減期と一致する；５つの最速のもの（平均２分）は、１９．８×の平均ＤＦ増大を有するのに対して、５つの最遅のもの（平均７．６分）は、僅か４．１×を示した。最初のＤＦは、ｂｘ前の臓器の健康の指標である。高いＤＦ（＞０．９％）プレ生検を有する患者は、ポストｂｘでより少ないＤＦ増大を示した（ｐ＜０．０１）。データを図５５において示す。
【０１８３】
別の分析において、ｄｓ−ｃｆＤＮＡの量は、ドナーのゲノム当量（ＧＥ）として報告され、これは、プレ生検の１．９（中央値、１２）〜ポスト生検の１２００（中央値、１３６）の範囲であった。対になった試料を、図５６において示す。ｄｓ−ｃｆＤＮＡのＧＥは、全患者においてポスト生検を増大させ（ｐ＜０．０２）、８．２×（範囲、０．３４×〜３４５×）の中央値の増大を有した。患者の年齢は、４〜３２歳（中央値、１２歳）の範囲であった。患者の体重は、１７〜９０ｋｇ（中央値、４９ｋｇ）の範囲であった。年齢および体重の両方が、ＧＥの変化と関連した（ｐ＜０．０１）。１７歳未満の患者は、１．１×の平均ＧＥ増大を示した２３歳より上の患者と比較して２９×の平均ＧＥの増大を有した。年齢と体重とは相関することが見出されたので、採血時の体重によっても類似の効果が観察された。ＧＥの変化は、生検鉗子サイズとは相関しなかった（ｐ＝４）。生検と第２の採血との間の時間は、１〜３６分の範囲であり、時間の延長は、全セルフリーＤＮＡの増加と相関した（ｐ＝０．０３７）。ＧＥにおける最初のｄｓ−ｃｆＤＮＡは、生検前の臓器の健常の指標である。高いＧＥ（＞２０、ｎ＝４）プレ生検を有する患者は、ポスト生検でより低いＧＥ増大を示した（ｐ＜０．０１）。
【０１８４】
標準的な心内膜心筋生検は、移植された心臓に対して顕著かつ測定可能な傷害を誘導し、これは患者の身体サイズおよびプレ生検でのｄｓ−ｃｆＤＮＡのレベルにより強力に影響を受けることを見出した。生検と採血との間の時間の延長は、全セルフリーＤＮＡの増加と相関した。このことは、心臓傷害のマーカーとしてのｄｓ−ｃｆＤＮＡの感度のエビデンスとして役立つ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２−１】
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【図３２−２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９−１】
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【図３９−２】
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【図４０−１】
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【図４０−２】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【国際調査報告】
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