(57)【要約】本発明は、医薬として使用するため、特にS. アウレウスのコロニー形成の防止における使用のための少なくとも1つのコリネバクテリウム種、スタフィロコッカス・パステウリ、所望によりスタフィロコッカス・エピデルミディスを含む医薬組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬として使用するための、少なくとも1つのコリネバクテリウム種（Corynebacterium sp.）およびスタフィロコッカス・パステウリ（Staphyloccocus pasteuri）を含む医薬組成物。
【請求項２】
少なくとも1つのコリネバクテリウム種が、C. アクコレンス（C. accolens）、C. プロピンクム（C. propinquum）、C. シュードジフセリチクム（C. pseudodiphtheriticum）、C. ストリアツム（C. striatum）、C. アミコラツム（C. amycolatum）、C. グルタミクム（C. glutamicum）、C. アウリムコスム（C. aurimucosum）、C. ツバークロステアリクム（C. tuberculostearicum）およびC. アファーメンタス（C. afermentans）より選択され、好ましくはC. アクコレンスおよび／またはC. プロピンクムである、請求項1に記載の医薬組成物。
【請求項３】
スタフィロコッカス・エピデルミディス（Staphylococcus epidermidis）をさらに含む、請求項1または2に記載の医薬として使用するための医薬組成物。
【請求項４】
用量当たり、少なくとも103CFUのコリネバクテリウム種、少なくとも103CFUのスタフィロコッカス・パステウリを含み、そして少なくとも103CFUのスタフィロコッカス・エピデルミディスを含んでもよい、請求項1〜3のいずれか一項に記載の医薬として使用するための医薬組成物。
【請求項５】
用量当たり合計少なくとも103細菌CFU、用量当たり、好ましくは少なくとも1.2×103、より好ましくは少なくとも1.4×103、さらにより好ましくは少なくとも3×103細菌CFUを含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の医薬として使用するための医薬組成物。
【請求項６】
コリネバクテリウム種対スタフィロコッカス・パステウリ対スタフィロコッカス・エピデルミディスの比は、1：0.01：0.01〜1：1：1の範囲に含まれる、請求項3〜5のいずれか一項に記載の医薬として使用するための医薬組成物。
【請求項７】
少なくとも1つの医薬的に許容される添加剤をさらに含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の医薬として使用するための医薬組成物。
【請求項８】
医薬的に許容される添加剤が、好ましくはペプトン、グリセロール、ラクトース、ゼラチン、グルコース、スクロース、トレハロース、デキストリン、マルトデキストリン、アドニールおよびグルタミン酸ナトリウムより選択される、少なくとも1つの凍結保護剤を含む、請求項7に記載の医薬として使用するための医薬組成物。
【請求項９】
組成物が、凍結乾燥またはフリーズドライされている、請求項1〜8のいずれか一項に記載の医薬として使用するための医薬組成物。
【請求項１０】
少なくとも1つの医薬的に許容されるゲル化剤をさらに含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の医薬として使用するための医薬組成物。
【請求項１１】
スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）による鼻腔内コロニー形成の防止における使用のための、請求項1または10のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
スタフィロコッカス・アウレウスが、メチシリン感受性スタフィロコッカス・アウレウスまたはメチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウスである、請求項11に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
請求項1〜9のいずれか一項に記載の医薬組成物、鼻腔内使用に適したゲルおよび経鼻投与のための手段を含む、キット。
【請求項１４】
少なくとも1つのコリネバクテリウム種およびスタフィロコッカス・パステウリを含み、そしてS. エピデルミディスをさらに含んでもよい、組成物。
【請求項１５】
組成物が、凍結乾燥またはフリーズドライされている、請求項14に記載の組成物。
【請求項１６】
S. アウレウスによるコロニー形成の防止における、請求項14または15に記載の組成物の使用。
【請求項１７】
請求項14または15に記載の組成物を投与することを含む、防止を必要とする対象体における、好ましくは鼻孔および／または皮膚における、S. アウレウスによるコロニー形成を防止する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）による細菌コロニー形成（colonization）の防止に関する。
【０００２】
本発明はまた、少なくとも1つのコリネバクテリウム種（Corynebacterium sp.）およびスタフィロコッカス種（Staphylococcus sp.）を含む組成物（例えば医薬組成物）および関連する方法に関するものであり、該組成物および方法は、スタフィロコッカス・アウレウスによる細菌コロニー形成の防止に特に関する。
【背景技術】
【０００３】
スタフィロコッカス・アウレウスは、ヒトにおける感染症の主要な原因である。皮膚および軟部組織の感染症、心内膜炎および敗血症を含む広範囲の病状の原因となる。S. アウレウスは、無症状で皮膚、粘膜および消化管にコロニー形成し得るが、無症状の保菌は、特に外科および透析患者における、内因性S. アウレウス感染症のリスクの増加に関連する。無症状キャリアはまた、S. アウレウスの伝染のための貯蔵所として働き、地域社会および病院環境の両方において感染のリスクを増加させる。実際、どんなときでも、人口の推定30％は、S. アウレウスのコロニー形成の主要部位である前鼻孔にS. アウレウスを保有する。
【０００４】
S. アウレウスによる伝染および感染のリスクを減少させるために、特に患者が極めて影響を受けやすい病院環境において、多くの保健所は、入院前に定期的に患者をスクリーニングすること、「鼻腔内除菌（nasal decolonization）」としても知られているS. アウレウスの鼻腔内保菌の排除を併用することを推奨する。したがって、適切な鼻腔内除菌方法は、S. アウレウスの伝染および感染を制限するのに重要である。
【０００５】
これまでに、抗生物質および／または消毒薬の局所適用、全身性抗生物質の使用、および鼻孔への人為的細菌コロニー形成を含む、鼻腔内除菌のために様々な方法が用いられてきた。しかしながら、局所的な抗生物質および消毒薬の処置方法は、有効性が低く、S. アウレウス株において消毒薬および抗生物質の耐性の急速な出現を引き起こした。全身性抗生物質の使用は、望ましくない副作用の存在と共に、抗生物質耐性株の急速な出現を同様に引き起こした。人為的細菌コロニー形成は、S. アウレウスと競合する細菌種および／または株の投与にある。特に、S. アウレウス株502Aによる鼻孔の人為的コロニー形成は、1960年代に、大流行中の新生児および再発感染患者において、より病原性のS. アウレウス株によるコロニー形成を防止するために用いられた。しかしながら、この方法は、株502A自体が一部のS. アウレウス感染の原因であり、死と関係しさえすることが分かった後、中止された。より最近では、いくつかの研究は、鼻孔におけるS. アウレウスコロニー形成に対する他の細菌種の影響を評価しており、様々なしばしば矛盾する結果が得られている。例えば、Uehara et al., 2000は、S. エピデルミディスが鼻孔からS. アウレウスを除去できないことを示している。対照的に、Iwase et al., 2010は、S. エピデルミディスがS. アウレウスの保菌を除去できることを報告している。同様に、Uehara et al., 2000は、コリネバクテリウムによる人為的コロニー形成がS. アウレウスの保菌を除去できることを示しているが、Yan et al., 2013は、鼻孔におけるコリネバクテリウム・アクコレンス（Corynebacterium accolens）の存在がS. アウレウスの保菌に関連することをより最近報告している。Yan et al., 2013はまた、C. アクコレンスがS. アウレウスの増殖を促進し得ることを示している。
【０００６】
抗生物質の局所投与の既知の欠点にもかかわらず、現在、鼻腔内除菌は、局所的に適用される抗生物質のムピロシンの使用に本質的に依存する。S. アウレウスのムピロシン耐性の発生を遅らせるために、処置は重篤な感染症に限定され、抗生物質は極めて短期間（例えば、蘇生または手術を受けている患者における5日間の処置過程）投与される。しかしながら、ムピロシンは繰返し適用されなければならないため、患者のコンプライアンスを達成することは困難であり得る。さらに、S. アウレウスの再コロニー形成は、処置後にしばしば生じ、これは、ムピロシンが長期処置効果をほとんど有しないことを示している。実際、ムピロシンの有効性は著しいが、半数もの患者は、処置開始5週間後に同じS. アウレウス株がコロニー形成したままである。さらに、S. アウレウスのコロニー形成が取り除かれた個体のムピロシン処置は、有害であり得て、キャリアになる可能性があり、処置の前に保菌についてスクリーニングする必要があることが報告されている（Wertheim et al., 2005）。
【０００７】
これら努力にもかかわらず、S. アウレウスの抗生物質耐性株は、リハビリテーションおよび長期ケア施設の患者の最大50％でこれまで検出されている。抗生物質耐性株のうち、メチシリン耐性S. アウレウス（MRSA）は最も一般的であるが、ムピロシン耐性MRSAの事例が報告されている。抗生物質耐性S. アウレウス（例えばMRSA）による感染は、メチシリン感受性S. アウレウス（MSSA）による感染と比較して、死亡率、罹患率、入院期間およびコストの増加に関連する。
【０００８】
結果として、皮膚および粘膜におけるS. アウレウスのコロニー形成を防止するための新規な製剤および方法が必要とされている。特に、鼻孔のS. アウレウスのコロニー形成を防止する新規な製剤および方法が必要とされている。また、長期間（例えば数週間または数か月間）、特に偶発的または外科的創傷の治癒期間投与できる新規な製剤および方法が必要とされている。この必要性は、整形外科および心臓手術に関連して、S. アウレウスのコロニー形成および／または感染がしばしば生じる、埋め込み型デバイスを有する患者ならびにリハビリテーションおよび長期ケア施設に居住する患者において特に重要である。S. アウレウスが抗生物質および消毒薬耐性を生じる傾向を考慮すると、これらの新規な製剤および方法は、抗生物質または消毒薬いずれかの使用に基づくべきでなく、特にMRSAの防止において機能すべきである。また、副作用をほとんど有さず、合理的コストで利用可能であるべきである。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、少なくとも1つのコリネバクテリウム種および少なくとも1つのスタフィロコッカス種を含む組成物、好ましくは少なくとも1つのコリネバクテリウム種および少なくともS. パステウリを含む組成物に関する。本発明による組成物は、それ自体が組成物の好ましい実施態様である医薬組成物に関して以下に記載する好ましい特徴のいずれかを含み得る。特に、組成物は、少なくとも1つのコリネバクテリウム種およびスタフィロコッカス・パステウリ（Staphylococcus pasteuri）を含み、ここで該少なくとも1つのコリネバクテリウム種は、C. アクコレンス（C. accolens）、C. プロピンクム（C. propinquum）、C. シュードジフセリチクム（C. pseudodiphtheriticum）、C. ストリアツム（C. striatum）、C. アミコラツム（C. amycolatum）、C. グルタミクム（C. glutamicum）、C. アウリムコスム（C. aurimucosum）、C. ツバークロステアリクム（C. tuberculostearicum）およびC. アファーメンタス（C. afermentans）より選択され、好ましくはC. アクコレンスおよび／またはC. プロピンクムである。好ましくは、組成物は、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Staphylococcus epidermidis）をさらに含む。好ましくは、組成物は、用量当たり、少なくとも103CFUのコリネバクテリウム種、少なくとも103CFUのスタフィロコッカス・パステウリ、所望により少なくとも103CFUのスタフィロコッカス・エピデルミディスを含む。好ましくは、組成物は、用量当たり合計少なくとも103細菌CFU、用量当たり、好ましくは少なくとも1.2×103、より好ましくは少なくとも1.4×103、さらにより好ましくは少なくとも3×103細菌CFUを含む。好ましくは、コリネバクテリウム種対スタフィロコッカス・パステウリ対スタフィロコッカス・エピデルミディスの比は、1：0.01：0.01〜1：1：1の範囲に含まれる。好ましくは、組成物は、少なくとも1つの添加剤、好ましくは医薬的に許容される添加剤をさらに含む。好ましくは、該少なくとも1つの添加剤は、好ましくはペプトン、グリセロール、ラクトース、ゼラチン、グルコース、スクロース、トレハロース、デキストリン、マルトデキストリン、アドニールおよびグルタミン酸ナトリウムより選択される、少なくとも1つの凍結保護剤を含み。好ましくは、組成物は、凍結乾燥またはフリーズドライされている。好ましくは、組成物は、少なくとも1つのゲル化剤、好ましくは医薬的に許容されるゲル化剤をさらに含む。
【００１０】
好ましくは、本発明は、少なくとも1つのコリネバクテリウム種および少なくとも1つのスタフィロコッカス種を含む医薬組成物、好ましくは少なくとも1つのコリネバクテリウム種および少なくともS. パステウリを含む医薬組成物に関する。該少なくとも1つのコリネバクテリウム種は、好ましくはC. アクコレンスおよびC. プロピンクムより選択されるか、またはC. アクコレンスおよびC. プロピンクムの両方を含む。本発明はまた、少なくとも1つのコリネバクテリウム種、S. パステウリ、および少なくとも1つの更なるスタフィロコッカス種、好ましくはS. エピデルミディスを含む医薬組成物に関する。したがって、特に好ましい実施態様によれば、本発明はまた、C. アクコレンスおよび／またはC. プロピンクム、S. パステウリおよびS. エピデルミディスを含む医薬組成物に関する。本発明はまた、医薬として、特にS. アウレウスのコロニー形成の防止における使用するための組成物に関する。実際、本発明者らは、驚くべきことに、少なくとも1つのコリネバクテリウム種とS. パステウリの組合せまたは少なくとも1つのコリネバクテリウム種とS. パステウリとS. エピデルミディスの組合せを含む組成物が、S. アウレウスのコロニー形成を防止できることを見出した。
【００１１】
発明者らが驚くべきことに、3つの細菌種であるC. アクコレンス、S. パステウリおよびS. エピデルミディスが個々に、S. アウレウス、C. アクコレンスおよびS. パステウリによるコロニー形成を阻止し、相乗効果が強く、S. アウレウスの増殖を95％超阻止することを示したこれらの細菌種の組合せは特に有利である。本発明者らはまた、驚くべきことに、C. プロピンクムなどの他のコリネバクテリウム種がS. アウレウス、C. プロピンクムおよびS. パステウリによるコロニー形成を同様に阻止し、相乗効果が特に強く、S. アウレウスの増殖を98％超阻止することを示した。さらに、C. アクコレンスは、特定の条件でS. パステウリが存在しないと増殖しないため、C. アクコレンスの増殖は、S. パステウリにより増強される。S. パステウリ、またはS. パステウリとS. エピデルミディス両方の存在は、バイオフィルムの確立を可能にすることにより、コリネバクテリウム種、例えばC. アクコレンスまたはC. プロピンクムの持続性を改善する。さらに、C. アクコレンスとS. エピデルミディスの組合せは、拮抗的な傾向を有し、S. エピデルミディス単独で見られるS. アウレウス増殖に対する阻害効果を減少させるが、3つすべての細菌種の組合せは、驚くべきことに、高い抗S. アウレウス活性を有し、S. アウレウスの増殖を95％超阻止する。S. エピデルミディスは、鼻腔細菌叢の必須コロニー形成菌であるため、好ましくは組合せ医薬に含まれる。S. エピデルミディスは、インビボで保護的細菌層を特に提供し、S. アウレウスの再確立の防止に寄与し得る。したがって、少なくとも1つのコリネバクテリウム種、S. パステウリおよびS. エピデルミディスを含む医薬組成物は、S. アウレウスのコロニー形成を防止し、特に有利である。
【００１２】
本発明の医薬組成物は、組成物が抗生物質または消毒薬の投与に基づくのではなく、少なくとも2つ、好ましくは3つの細菌種の投与に基づき、これにより更なるS. アウレウス耐性の出現のリスクを最小限にするため、有利である。有利には、該組成物は、現在の方法より長期間投与されることができる。有利には、本組成物は、患者において抗生物質耐性S. アウレウス、例えばMRSAによるコロニー形成を防止できる。本発明の組成物はまた、選択された細菌種のいずれも毒性を有しないため有利である。さらにより有利には、選択されたすべての細菌種は、通常、健常な対象体の鼻腔細菌叢および／または皮膚で検出される。
【００１３】
本発明の医薬組成物によるコロニー形成の防止は、コロニー形成が内因性感染および伝染の両方のリスクの増加に関連するため、特に有利である。したがって、S. アウレウスのコロニー形成を防止することは、S. アウレウス感染の総数を減少させる最も効果的な方法である。さらに、S. アウレウスを処置する現在の方法は、抗生物質耐性を増加させる可能性があるため、予防的使用には推奨されない。対照的に、本発明による医薬組成物は、対象体に予防的に投与されることができる。
【００１４】
用語「患者」または「対象体」は、年齢に関係なく、あらゆるヒト個体として定義される。好ましい実施態様において、対象体は、何らかの理由で入院している。より好ましい実施態様において、対象体は、心臓もしくは整形外科手術のために入院しているか、埋め込み型デバイスを有するか、またはリハビリテーションもしくは長期ケア施設に居住している。入院時に対象体にS. アウレウスがコロニー形成していない場合、本発明の医薬組成物は、その後のS. アウレウスによるコロニー形成を防止するために予防的に用いられ得る。
【００１５】
対象体は、成人または小児であり得る。用語「成人」は、本明細書において少なくとも16歳の個人を指す。用語「小児」は、0〜1歳の乳児、ならびに1〜8歳、8〜12歳および12〜16歳の小児を含む。用語「小児」は、生後28日までの新生児、および生後28〜364日の新生児期後乳児をさらに含む。組成物は、成人、または新生児を含む小児に投与され得る。本発明の医薬組成物は、抗生物質を用いる既存の処置方法が望ましくない副作用により小児において制限されるため、特に有利である。
【００１６】
医薬的に許容される組成物は、治療上有効であるのに十分な量の各細菌株を含む。非制限的例として、医薬組成物は、少なくとも102、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011または1012コロニー形成単位（CFU）の各細菌株、または合計少なくとも103、104、105、106、107、108、109、1010、1011または1012CFUの一緒に摂取される全細菌株を含み得る。各細菌株の量は同一である必要はない。各細菌株と他の1つ以上の株の量比はまた、医薬的に許容される組成物が治療上有効であるような量比である。非制限的例として、2つの株が医薬組成物に含まれる場合、1つの株と他の株の比は、1：0.01〜1：2の範囲、例えば1：0.02、1：0.04、1：0.2、1：0.4または1：1の比であり得る。非制限的例として、3つの株が医薬組成物に含まれる場合、1つの株と他の株各々の比は、1：0.01：0.01〜1：1：1の範囲、例えば1：0.02：0.02、1：0.1：0.1または1：0.2：0.2の比であり得る。
【００１７】
好ましい実施態様において、本発明の医薬組成物は、用量当たり、103〜1012CFUの少なくとも1つのコリネバクテリウム種、103〜1012CFUのS. パステウリ、所望により103〜1012CFUのS. エピデルミディスを含む。より好ましくは、組成物は、用量当たり、104〜1010CFUの少なくとも1つのコリネバクテリウム種、104〜1010CFUのS. パステウリ、所望により104〜1010CFUのS. エピデルミディスを含む。さらにより好ましくは、組成物は、用量当たり、105〜109CFUの少なくとも1つのコリネバクテリウム種、105〜109CFUのS. パステウリ、所望により105〜109CFUのS. エピデルミディスを含む。
【００１８】
好ましくは、本発明の組成物は、用量当たり、少なくとも103、104、105、106、107、108、109、1010、1011または1012CFU、好ましくは少なくとも1.2、1.4、2または3×103CFU、少なくとも5、5.02、5.04、5.2または5.4×103CFU、少なくとも1.02、1.04、1.2、1.4、1.5、2または3×104CFU、少なくとも5、5.02、5.04、5.2または5.4×104CFU、少なくとも1.02、1.04、1.2、1.4、1.5、2または3×105CFU、少なくとも1.02、1.04、1.2、1.4、2または3×106CFU、少なくとも1.02、1.04、1.2、1.4、2または3×107CFU、少なくとも1.02、1.04、1.2、1.4、2または3×108CFU、少なくとも1.02、1.04、1.2、1.4、2または3×109CFU、少なくとも1010CFU、少なくとも1.02、1.04、1.2、1.4、2または3×1010CFU、少なくとも1.02、1.04、1.2、1.4、2または3×1011CFU、または少なくとも1.02、1.04、1.2、1.4、2または3×1012CFUの合計細菌濃度を含む。
【００１９】
用語「用量」は、本明細書において所与の時間に投与される医薬組成物の量として定義される。好ましくは、投与される用量は、治療上有効である。用量は、本明細書において医薬組成物の重量、体積またはCFUに関して表され得る。
【００２０】
用語「コロニー形成単位」または「CFU」は、本明細書において、試料中の生存細菌数を示すために用いられる単位であって、1のコロニー形成単位が1つの生存細菌細胞に対応する単位として定義される。
【００２１】
本発明の医薬組成物において、少なくとも1つのコリネバクテリウム種対少なくとも1つのスタフィロコッカス種のCFU比（例えば、少なくとも1つのコリネバクテリウム種（好ましくはC. アクコレンス）：S. パステウリの比）は、好ましくは1：0.01〜1：2、より好ましくは1：0.01〜1：1の範囲に含まれる。本発明の医薬組成物において、少なくとも1つのコリネバクテリウム種対S. パステウリ対S. エピデルミディスのCFU比は、好ましくは1：0.01：0.01〜1：1：1の範囲に含まれる。有利には、少なくとも1つのコリネバクテリウム種（好ましくはC. アクコレンス）対S. パステウリ対S. エピデルミディスの比は、1：0.02：0.02〜1：1：1、好ましくは1：0.1：0.1〜1：1：1、さらにより好ましくは1：0.2：0.2〜1：1：1の範囲に含まれる。
【００２２】
非制限的例として、医薬組成物中における少なくとも1つのコリネバクテリウム種は、C. アクコレンス、C. プロピンクム、C. シュードジフセリチクム、C. ストリアツム、C. アミコラツム、C. グルタミクム、C. アウリムコスム、C. ツバークロステアリクムまたはC. アファーメンタスより選択され得る。上記の種は、特に鼻孔および／または皮膚から単離される。異なるコリネバクテリウム種の同様の効果は、特に実施例に示されている。いくつかの場合、2つ以上のコリネバクテリウム種が、医薬組成物に存在し得る。例えば、C. アクコレンスは、例えばC. プロピンクムなどの上記の1つ以上より選択される、少なくとも1つの他のコリネバクテリウム種と組み合され得る。
【００２３】
好ましい実施態様によれば、少なくとも1つのコリネバクテリウム種は、C. アクコレンス、C. プロピンクム、C. シュードジフセリチクム、C. ストリアツム、C. アミコラツム、C. グルタミクム、C. アウリムコスム、C. ツバークロステアリクムおよびC. アファーメンタスより選択される。より好ましい実施態様によれば、少なくとも1つのコリネバクテリウム種は、本明細書に記載の実施例のいずれかにしたがって、C. アクコレンスまたはC. プロピンクム、またはC. アクコレンスとC. プロピンクムの両方の組合せを含む。異なるC. アクコレンス株の同様の効果は、特に実施例に示されている。
【００２４】
医薬組成物に関連して、S. エピデルミディスのいずれかの株が、用いられ得る。非制限的例として、S. エピデルミディス株は、鼻孔から単離される株より選択され得る。
【００２５】
医薬組成物に関連して、S. パステウリ種のいずれかの株が、用いられ得る。異なるS. パステウリ株の同様の効果は、特に実施例に示されている。
【００２６】
医薬組成物は、S. アウレウスが検出されない場合であっても、好ましくは皮膚および／または鼻孔、より好ましくは鼻孔に予防的に投与され得る。あるいは、医薬組成物は、皮膚または鼻孔におけるS. アウレウスの検出および除去後に、投与され得る。あるいは、医薬組成物は、試験することなく、投与され得る。
【００２７】
組成物は、1日1回以上（例えば1、2、3または4回）対象体に投与され得て、連続した数日間（例えば例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10日間またはそれ以上）、数週間（例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10週間またはそれ以上）、または数か月間（例えば1、2、3、4、5、6カ月またはそれ以上）投与され得る。好ましい実施態様において、組成物は、好ましくは心臓または整形外科手術のために入院している対象体において、1日1〜3回、8〜12日間投与される。別の好ましい実施態様において、組成物は埋め込み型デバイスを有するかまたはリハビリテーションまたは長期ケア施設に居住する対象体において数週間または数か月間、または偶発的または外科的創傷の治癒期間投与される。特に好ましい実施態様において、組成物は、埋め込み型デバイスを有するか、リハビリテーションまたは長期ケア施設に居住するか、または偶発的または外科的創傷から治癒している対象体において、1日1〜3回、1〜4週間または1〜6カ月間投与される。さらにより好ましい実施態様において、組成物は、好ましくは1日1〜3回、入院期間、埋め込み型デバイスの存在期間、リハビリテーションまたは長期ケア施設での居住期間、または偶発的または外科的創傷の治癒期間投与される。
【００２８】
あるいは、組成物は、間欠的に（例えば隔日、2日毎または必要に応じて）または周期的に（例えば、連続して数日間投与した後、数日間投与しないまたは「中止」し、その終わりにサイクルを繰り返す）対象体に投与され得る。好ましい実施態様において、組成物は、8〜12日間投与され、その後一定期間中止される。
【００２９】
あるいは、組成物は、要求に応じて投与され得る。
【００３０】
投与後、保護効果が観察される場合、投与は必要に応じて繰り返され、該保護効果を維持し得る。組成物の投与後、S. アウレウスのコロニー形成が検出される場合、投与レジメンは繰り返されるべきである。
【００３１】
組成物の投与の期間および頻度は、一般的知識に基づいて当業者により適合され得る。特に、これらのパラメーターの適合は、S. アウレウスのコロニー形成が対象体の鼻孔および／または皮膚に存在しないことが望まれる時間の長さに依存し得る。例えば、S. アウレウスのコロニー形成が入院期間中存在しないことが望まれ得る。
【００３２】
本発明の好ましい実施態様において、医薬組成物は、少なくとも1つの医薬的に許容される添加剤をさらに含む。
【００３３】
用語「医薬的に許容される添加剤」は、医薬組成物に適合するが、患者において望ましくない副作用を生じず、一般的に無毒と考えられる成分または成分の組合せとして定義される。医薬的に許容される添加剤は、最も一般的には、組成物の投与の促進、製品の保存期間または有効性の増加、または組成物の溶解性または安定性の改善に関与する。医薬的に許容される添加剤は、一般的に、薬理学的に不活性であると考えられる。しかしながら、いくつかの場合、例えばS. アウレウスが処置部位（例えば投与部位）にコロニー形成するのをより困難にすることにより、添加剤自体も治療効果を有し得る。
【００３４】
医薬的に許容される添加剤またはキャリアは、先行技術で周知であり、組成物の所望のガレヌス製剤に基づいて当業者により適合され得る。ガレヌス製剤、投与方法および投与量は、必要に応じて、一般的な健康、年齢、体重、処置への耐性などを含む、患者処置に適応させるための広く受け入れられている基準に基づいてさらに決定され得る。
【００３５】
本発明の医薬組成物は、上皮（例えば皮膚）および／または粘膜へ局所的に投与され得る。好ましくは、本発明の医薬組成物は、鼻孔、副鼻腔へ、または腋窩、鼠径部、鼠径部および直腸周囲の領域に、または皮膚または粘膜のどこかに投与され得る。好ましい実施態様によれば、組成物は、鼻孔へ投与される。
【００３６】
本明細書で定義される用語「鼻孔」は、前鼻孔または外鼻孔および鼻腔の両方を含む。好ましくは、本発明の医薬組成物は、前鼻孔または外鼻孔へ投与される。
【００３７】
S. アウレウスは、ヒト体内の様々な部位にコロニー形成し得るが、その主な生態学的な適所は、前鼻孔であると認識されており、そこから他の組織または臓器広がり得る（Kluytmans et al., 1997）。皮膚（例えば前腕の皮膚）と同様に、前鼻孔は、毛、皮脂腺および汗腺を有する、皮膚のような完全に角質化した扁平上皮で覆われている。遺伝学的研究はさらに、これら2つの物理的に異なる適所からの微生物群が同一の組成パターンを共有することを示している（Yan et al., 2013）。したがって、S. アウレウスのコロニー形成は、皮膚および前鼻孔において同様であり、皮膚はさらに、これらの部位両方について優れた完全にアクセスできるモデルを表している。
【００３８】
有利には、本発明の組成物は、皮膚および／または粘膜への投与に適する任意の医薬製剤、例えばパッチ、ゲル、クリーム、ローション、軟膏（ointment）、フィルムまたは軟膏（salve）を含む。有利には、組成物の粘度およびテクスチャーは、用途または有効性（たとえば接触時間）を改善するために調節される。有利には、組成物は、有害作用を鼻腔上皮に引き起こさないようなものである。さらにより有利には、組成物のpHおよび／または浸透圧は、鼻腔と同様である。
【００３９】
鼻腔上皮のpHは、一般的に5.5〜7.5の範囲内であるため、本発明の医薬組成物は、有利にその範囲のpHを有する。
【００４０】
本発明の組成物に含まれる1つ以上の医薬的に許容される添加剤は、1つ以上の抗酸化剤、緩衝剤、充填物質、懸濁化剤、可溶化剤、凍結保護剤、マトリックス形成添加物、フィルム形成剤、湿潤剤、希釈剤、溶媒、可塑剤、油性/乳化/水性基剤、ゲル化剤、防腐剤、浸透圧調節剤、ビヒクルおよび安定化剤をさらに含み得る。
【００４１】
非制限的例として、本発明の組成物は、当業者に周知の少なくとも1つの医薬的に許容される添加剤またはキャリアを含み得る。該少なくとも1つの添加剤は、水、グリセリン、鉱油（例えばワセリン、パラフィン）、動物の油または脂肪（例えば蜜蝋または羊毛脂）、半固形炭化水素（油性）、または植物油（例えばココナッツ油、マンゴーバター、パーム油、ダイズ油、オリーブ油、シアバターおよびカカオバター）、グリセリド、キサンタンガム、ラクトース、デキストリン、マンニトール、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシプロピルメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ヒアルロン酸、デンプンベースの生分解性ポリマー、トラガカント、ペクチン、キチンおよびキトサン誘導体、カラギーナン、グアーガム、寒天、アルギン酸、ゼラチン、フィブリン、アルブミン、リン酸緩衝生理食塩水、ポリカルボフィル、水素添加パーム油、グリセリド、カルボマー934P、マクロゴール、メチルパラベン、ポリメタクリル酸グリセリル、シアノアクリレート、トリエタノールアミン、ソルビン酸、NaOH、カーボポール（例えばカーボポール974P）、ジアゾリジニル尿素、ポロキサマー184、ジメチコン、セルロースガム、乳酸、メチルパラベン、プロピルパラベン、ポリビニルピロリドン、ポリビニルピロリドン-酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリアルケニルポリエーテルと架橋したアクリル酸のホモおよびコポリマー、水酸化ナトリウム、塩化ナトリウムおよび塩化カリウムなどより選択され得る。
【００４２】
好ましい実施態様において、医薬的に許容される組成物は、ゲル、好ましくは生体付着性または粘膜付着性ゲルである。用語「ゲル」は、液体と相互作用して半固形物質を生じる粒子として定義される。用語「生体付着性ゲル」は、生体表面（例えば重層扁平上皮、例えば皮膚または前鼻孔）に付着するゲルとして定義される。用語「粘膜付着性ゲル」は、粘液被覆（例えば粘膜）に付着するとして定義される。
【００４３】
好ましい実施態様において、少なくとも1つの医薬的に許容される添加剤は、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、キトサンおよびその誘導体、例えばキチン、カラギーナンおよびその誘導体、アルギン酸およびその誘導体、ペクチンおよびその誘導体、ポリアルケニルポリエーテルと架橋したアクリル酸のホモおよびコポリマー、またはそれらの混合物より選択されるゲル化剤である。
【００４４】
浸透圧調節剤が存在する場合、該浸透圧調節剤は、好ましくは塩化カリウム、マンニトール、デキストロース、グリセリンまたは塩化ナトリウムより選択される。
【００４５】
好ましい実施態様において、医薬組成物は、少なくとも1つのゲル化剤および少なくとも1つの浸透圧調節剤を含む。好ましい実施態様において、塩化ナトリウムは、等張濃度で医薬組成物中に存在する。
【００４６】
ビヒクルが存在する場合、該ビヒクルは、好ましくは水、水混和性溶媒（例えばグリセリン）または非水混和性溶媒（例えば植物油）より選択される。
【００４７】
防腐剤が存在する場合、該防腐剤は、好ましくはベンジルアルコール、クレゾール、安息香酸、フェノール、パラベンおよびソルビン酸より選択される。
【００４８】
安定化剤が存在する場合、該安定化剤は、好ましくは界面活性剤、ポリマー、ポリオール、ポロキサマー、アルブミン、ゼラチン、トレハロース、タンパク質、糖、ポリビニルピロリドン、N-アセチル-トリプトファン（「NAT」））、カプリン酸（すなわちカプリン酸ナトリウム）、ポリソルベート（すなわちP80）、アミノ酸、および2価の金属カチオン、例えば亜鉛より選択される。
【００４９】
本発明の更なる態様によれば、細菌は、凍結乾燥またはフリーズドライされる。「凍結乾燥」は、減圧下での昇華により凍結細菌培養物から水を除去するための当業者に周知のプロセスである。一般的な方法は、"Lyophilization: Introduction and Basic Principles" (Jennings, 1999)に記載されている。該プロセスは、生存細菌を含む水性提供を提供する工程、凍結工程、一次乾燥（昇華）工程および二次乾燥（脱離）工程を含む。凍結乾燥される細菌は、該プロセスから得られる。
【００５０】
好ましいモードによれば、細菌は、凍結保護剤の存在下で凍結乾燥される。凍結保護剤は、細胞内もしくは細胞外または両方の組合せであり得る。好ましくは、該凍結保護剤は、ペプトン、グリセロール、ラクトース、ゼラチン、グルコース、スクロース、トレハロース、デキストリン、マルトデキストリン、アドニールおよびグルタミン酸ナトリウムより選択される。
【００５１】
好ましいモードによれば、細菌は、マトリックス形成添加物の存在下で凍結乾燥される。好ましくは、該マトリックス形成添加物は、マンニトールまたはスキムミルクである。
【００５２】
好ましくは、凍結乾燥された細菌は、冷蔵温度（例えば+3〜+6℃）または室温（例えば20〜25℃）にて保存される。
【００５３】
好ましくは、各細菌種は、別々に凍結乾燥される。第1の好ましい実施態様によれば、各凍結乾燥された細菌種は、使用直前に、少なくとも1つの医薬的に許容される添加剤で別々に再構成される。その後、再構成された細菌は、個々に投与されてもよく、または投与前に混合されてもよい。第2の好ましい実施態様によれば、すべての細菌種は、一緒に混合され、続いて凍結乾燥される。この好ましい実施態様において、凍結乾燥された細菌は、使用直前に、少なくとも1つの医薬的に許容される添加剤で一緒に再構成される。第3の好ましい実施態様によれば、すべての細菌種は、凍結乾燥前に一緒に混合される。この好ましい実施態様において、混合物は、使用直前に、少なくとも1つの医薬的に許容される添加剤で再構成される。
【００５４】
凍結乾燥された細菌組成物の「再構成」は、組成物を特定量の少なくとも1つの医薬的に許容される添加剤（例えば液体またはゲル）と接触させて、該添加剤が凍結乾燥物を水和するものとして定義される。好ましくは、混合物は、完全な水和を確実にするために、撹拌される（agitateまたはstir）。好ましくは、再構成は、17℃〜37℃の範囲内、より好ましくはatまたは室温（20℃〜25℃）を超える温度、さらにより好ましくは室温にて実施される。
【００５５】
好ましくは、組成物は、使用直前に再構成される。再構成された組成物がすぐに投与されない場合、再構成された組成物は、好ましくは、投与まで冷蔵される。再構成された組成物がすぐに投与されず、冷蔵されない場合、再構成された組成物は、好ましくは、再構成と同日に投与される。当業者は、一般的な知識に従って、適切な再構成および保存条件を容易に選択し得る。
【００５６】
第1の好ましい実施態様によれば、別々に再構成された細菌は、別々に順々に投与される。第2の好ましい実施態様によれば、別々に再構成された細菌は、同時適用のために投与前に混合される。第3の好ましい実施態様によれば、一緒に再構成された細菌は、同時に投与される。
【００５７】
あるいは、生存細菌は、およそ+4℃〜+8℃の間に含まれる温度（例えば数日間）、およそ-25℃〜-40℃の間に含まれる温度（例えば数週間）、またはおよそ-72℃〜-85℃の間に含まれる温度（例えば数年間）にて保存され得る。凍結乾燥された細菌はまた、+4℃〜+8℃の間に含まれる温度にて再構成後数日間保存され得る。これらの温度範囲の各々における適切な保存条件は、当業者に周知である。
【００５８】
本発明は、S. アウレウスのコロニー形成の防止における使用のための医薬組成物をさらに含む。該S. アウレウスのコロニー形成の防止における使用のための医薬組成物は、本明細書に記載の本発明の医薬組成物のすべての態様を含む。好ましくは、本発明は、より好ましくは前鼻孔への組成物の投与を含む、S. アウレウスによる鼻腔内コロニー形成の防止における使用のための、および／またはS. アウレウスによる皮膚コロニー形成の防止における使用のための医薬組成物を含む。S. アウレウスによる皮膚コロニー形成は、有利には、該コロニー形成への感受性が増加した対象体、例えばアトピー性皮膚炎などの湿疹を有するかまたは糖尿病を有する対象体において防止される。
【００５９】
好ましい実施態様において、本発明は、抗生物質耐性S. アウレウスによる皮膚コロニー形成の防止における使用のための、好ましくはメチシリン耐性S. アウレウスによる皮膚コロニー形成の防止における使用のための医薬組成物を含む。より好ましくは、医薬組成物は、メチシリン耐性S. アウレウスによる鼻腔内コロニー形成の防止において用いられる。用語「メチシリン耐性」は、メチシリンの殺菌効果に対する細胞株の感受性の欠如を示す。MRSA株は、更なる抗生物質（例えばペニシリン、バンコマイシン、ムピロシン、キノロン類など）に対する耐性を含み得る。あるいは、本発明の医薬組成物は、メチシリン感受性S. アウレウスによる鼻腔内コロニー形成の防止において用いられ得る。メチシリン感受性株は、メチシリンの殺菌効果に対して感受性であるが、他の抗生物質に対する耐性を含み得る。
【００６０】
用語「S. アウレウスによるコロニー形成（colonization by S. aureus）」は、検出可能な免疫応答を誘導しない、および／または組織に侵入しないか、またはその反対に組織損傷を引き起こす、体表面上のS. アウレウスの少なくとも1つの株の存在として定義される。あるいは、コロニー形成は、感染非存在下でのS. アウレウスの存在であると考えられ得る。いくつかの場合、コロニー形成は、一次的、間欠的、長期的、または永続的であり得る。特に、S. アウレウスによるコロニー形成は、鼻孔、副鼻腔、咽頭、消化管に、または腋窩、鼠径部、鼠径部および直腸周囲の領域に、創傷に、または皮膚または粘膜のどこかに生じ得る。S. アウレウスのコロニー形成は、後のS. アウレウス感染の危険因子である。
【００６１】
用語「S. アウレウスによる感染」は、検出可能な免疫応答および／または制御されていない細菌増殖の経験を含む、体表面上のS. アウレウスの少なくとも1つの株の存在として定義される。免疫応答は、特異的または非特異的（例えば発熱）であり得る。S. アウレウス感染は、皮膚軟部組織感染（SSTI）、例えば膿瘍、フルンクル、カーバンクル、ボイル、膿痂疹、細菌毛包炎（focculitis）または蜂巣炎、麦粒腫、発疹、ブドウ球菌性熱傷様皮膚症候群、壊死性筋膜炎、肺炎、創傷感染、心内膜炎、壊疽、髄膜炎、敗血症性関節炎、敗血症などを引き起こし得る。
【００６２】
用語「S. アウレウスによる鼻腔内コロニー形成」は、本明細書では、より具体的には、鼻孔におけるS. アウレウス細菌の存在として定義される。
【００６３】
用語「鼻腔内除菌」は、鼻孔からS. アウレウスを減少または根絶するための方法として定義される。完全な除菌は、少なくとも2週間連続して鼻孔においてS. アウレウスが検出されないこととして定義される。部分的除菌は、本明細書において、前の鼻孔におけるS. アウレウスのレベルと比較して、少なくとも2週間連続して鼻孔におけるS. アウレウスが少なくとも50％、好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、さらにより好ましくは少なくとも99％減少することにより定義される。
【００６４】
鼻孔におけるS. アウレウス細菌の存在は、前鼻孔から例えば鼻腔スワブにより試料を得ること、およびS. アウレウスを検出することを含む、当該技術分野で周知の方法により検出され得る。S. アウレウスは、種および／または株レベルで検出され得る。検出方法としては、例えば培養ベースの方法（例えば、発色性および／または血液寒天などの選択培地での試料の培養）および分子診断方法（例えば、PCR、リアルタイムPCR、リボタイピング、パルスフィールドゲル電気泳動、無作為増幅多型DNAシークエンシング、BOX-A1Rベースの反復遺伝子外パリンドロームPCR（BOX-PCR）、多座位シーケンスタイピング、全ゲノムシーケンシングなど）が挙げられる。
【００６５】
別の一態様によれば、本発明は、治療上有効な用量の本発明による医薬組成物を含む、防止を必要とするヒト対象体においてS. アウレウスのコロニー形成を防止する方法を含む。本明細書に記載のすべての態様の医薬組成物は、S. アウレウスのコロニー形成を防止する方法に含まれる。
【００６６】
本明細書で用いられる用語「防止すること」は、排他的に絶対的用語であることを意味しない。実際、本明細書で用いられる用語「防止」は、S. アウレウスによるコロニー形成の遅延、S. アウレウスのコロニー形成レベルの低下、またはS. アウレウスのコロニー形成頻度の低下であり得る。
【００６７】
本明細書で用いられる用語「治療上有効な用量」は、処置部位にてS. アウレウスのコロニー形成を、少なくとも部分的に、好ましくは完全に防止するのに十分な医薬組成物の量を指す。S. アウレウスのコロニー形成の防止に関連して、この用語は特に、S. アウレウスのコロニー形成を遅延するか、またはS. アウレウスのコロニー形成頻度を低下させるのに十分な量を指す。治療上有効な用量は、1回以上の投与で投与され得る。いくつかの場合、医薬組成物は、1対象体内の複数の部位にて（例えば皮膚および前鼻孔の両方）S. アウレウスのコロニー形成を防止するのに用いられ得る。この場合、治療上有効な用量は、適切な投与計画に従って各部位に投与される。
【００６８】
したがって、本発明は、本明細書に記載の様式に基づいてS. アウレウスによるコロニー形成を防止するための医薬組成物の使用を包含する。
【００６９】
第1態様によれば、S. アウレウスのコロニー形成を防止する方法は、コリネバクテリウム種対S. パステウリの比が1：0.1〜1：2の範囲に含まれるか、またはコリネバクテリウム種対S. パステウリ対S. エピデルミディスの比が1：0.01：0.01〜1：1：1の範囲に含まれる医薬組成物の投与を含む。第2態様によれば、S. アウレウスのコロニー形成を防止する方法は、用量当たり、少なくとも103CFUのコリネバクテリウム種、少なくとも103CFUのS. パステウリ、所望により少なくとも103CFUのS. エピデルミディスを有する医薬組成物の投与を含む。好ましくは、S. アウレウスのコロニー形成を防止する方法は、用量当たり、103〜1012CFUのコリネバクテリウム種、103〜1012CFUのS. パステウリ、所望により103〜1012CFUのS. エピデルミディスを有する医薬組成物の投与を含む。好ましい態様によれば、S. アウレウスのコロニー形成を防止する方法は、用量当たり、合計少なくとも103、好ましくは少なくとも1.2、1.4、2または3×103CFUを含む医薬組成物の投与を含む。好ましくは、該医薬組成物は、凍結乾燥またはフリーズドライされている。
【００７０】
好ましくは、S. アウレウスのコロニー形成を防止する方法は、少なくとも1つの医薬的に許容される添加剤をさらに含む医薬組成物の投与を含む。第1態様によれば、該少なくとも1つの医薬的に許容される添加剤は、好ましくはペプトン、グリセロール、ラクトース、ゼラチン、グルコース、スクロース、トレハロース、デキストリン、マルトデキストリン、アドニールおよびグルタミン酸ナトリウムより選択される、凍結保護剤である。第2態様によれば、該少なくとも1つの医薬的に許容される添加剤は、ゲル化剤である。該少なくとも1つの医薬的に許容される添加剤は、上記のものまたは当該技術分野で周知の添加剤より選択され得る。
【００７１】
好ましくは、S. アウレウスのコロニー形成を防止する方法は、前鼻孔および／または皮膚への医薬組成物の投与を含む。
【００７２】
好ましくは、本発明のS. アウレウスのコロニー形成を防止する方法は、S. アウレウスの鼻腔コロニー形成を防止する。好ましくは、本発明のS. アウレウスのコロニー形成を防止する方法は、MRSAまたはMSSAの鼻腔内または皮膚コロニー形成を防止する。
【００７３】
本発明の更なる対象は、対象体においてS. アウレウスによる鼻腔内または皮膚コロニー形成を防止するための方法であって、
a)S. アウレウスが鼻孔または皮膚に存在するかを決定すること；および
b)S. アウレウスが検出されない場合、該対象体へ本発明の医薬組成物を投与すること
を含む方法である。
【００７４】
本発明はまた、S. アウレウスによるコロニー形成を防止するための医薬の製造のための本発明による組成物の使用を含む。
【００７５】
本発明はまた、好ましくは鼻孔および／または皮膚における、S. アウレウスによるコロニー形成の防止における本明細書に記載の実施態様いずれかによる組成物の使用を含む。
【００７６】
本発明はまた、本明細書に記載の組成物を投与することを含む、それを必要とする対象体の、好ましくは鼻孔および／または皮膚において、S. アウレウスによるコロニー形成を防止するための方法を含む。
【００７７】
本明細書で提供される方法のいずれかの対象体は、該組成物の使用に関連して上記で特定されるあらゆる対象体であり得る。特に、該対象体は、心臓または整形外科手術のために入院している対象体、埋め込み型デバイスを有する対象体、リハビリテーションまたは長期ケア施設に居住する対象体、偶発的または外科的創傷を有する対象体、アトピー性皮膚炎などの湿疹を有する対象体、または糖尿病を有する対象体であり得る。
【００７８】
本発明は、本明細書に記載される組成物、好ましくは医薬組成物、鼻腔内使用に適したゲル、および経鼻投与のための手段を含むキットをさらなる目的として有する。
【００７９】
好ましくは、キットは、
a)C. アクコレンス、S. パステウリ、所望によりS. エピデルミディス、および少なくとも1つの医薬的に許容される添加剤を含む医薬組成物であって、該組成物が凍結乾燥製剤を有する組成物、
b)少なくとも1つの医薬的に許容される成分、
c)該組成物の経鼻投与のための手段、および
d)所望により、使用上の注意
を含む。
【００８０】
好ましくは、b)の少なくとも1つの医薬的に許容される成分は、該凍結乾燥物の再構成のための水溶液またはゲル化剤である。より好ましくは、b)の成分は、再構成のための水溶液および医薬的に許容されるゲル化剤の両方を含む。
【００８１】
コリネバクテリウム種は、キットにおいて、C. アクコレンス、C. シュードジフセリチクム、C. ストリアツム、C. アミコラツム、C. グルタミクム、C. アウリムコスム、C. ツバークロステアリクム、C. アファーメンタスおよび／またはC. プロピンクムより選択され得る。C. アクコレンスは特に、キットにおいて、少なくとも1つの他のコリネバクテリウム種、例えばC. プロピンクムと組み合され得る。好ましい実施態様によれば、C. アクコレンスは、キットにおいてC. プロピンクムに置き換えられる。
【００８２】
上皮または粘膜、好ましくは鼻孔に適用されるように組成物を分配するための手段もまた本明細書で提供される。用語「手段」は、局所（local、topical）適用のためのあらゆるデバイスとして定義される。好ましくは、医薬組成物を分配するための手段はまた、凍結乾燥された細菌が用いられるときに凍結乾燥された細菌を少なくとも1つの医薬的に許容される添加剤と混合する。
【００８３】
医薬組成物が1つの手段に多回用量として存在する場合、単回用量を測定するための特定の手段がさらに含まれ得る。一例として、単回用量は、ディスペンサーの1つまたは2つのくぼみと同等のものであり得る。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】S. パステウリまたはS. エピデルミディスとの共培養におけるC. アクコレンスの増殖を示す。C. アクコレンスAF2345の細菌増殖は、実施例2に記載の方法に従って、(A)S. パステウリAF2653または(B)S. エピデルミディスAF2302いずれかとの共培養において決定される。C. アクコレンスコロニーを、同倍率で、72時間(A)または7日間(B)後に観察した。S. パステウリおよびS. エピデルミディスのスポットを矢印で示す。C. アクコレンスコロニーは、S. パステウリとの共培養において肉眼で見ることができるが、S. パステウリスポットから離れるにつれて小さくなる。対照的に、C. アクコレンスコロニーは、S. パステウリとの共培養において、図1AにおけるS. パステウリから離れていても観察されたものより極めて小さく、肉眼で見ることができない。
【図２】C. アクコレンスと混合したバイオフィルムを示す。S. パステウリ、S. エピデルミディス、またはS. パステウリとS. エピデルミディス両方の存在下でのC. アクコレンスAF2345単独または単一もしくは混合バイオフィルムの一部としての細菌増殖を、実施例8に記載の方法に従って評価した。増殖は、S. パステウリ単独またはS. パステウリとS. エピデルミディス両方のいずれかの存在下で観察された。これら2つの条件間で増殖に有意差は生じなかった（p=0.0651）。
【図３】C. プロピンクムと混合したバイオフィルムを示す。S. パステウリ、S. エピデルミディス、またはS. パステウリとS. エピデルミディス両方でのC. プロピンクムAF1882単独または単一もしくは混合バイオフィルムの一部としての細菌増殖を、実施例8および9に記載の方法に従って評価した。増殖は、すべての条件で観察された。S. パステウリ単独またはS. パステウリとS. エピデルミディス両方いずれかと比較して、C. プロピンクム増殖に有意差は生じなかった（p=0.0748）。
【図４】C. アクコレンスをS. パステウリ、S. エピデルミディスまたはS. パステウリとS. エピデルミディス両方と共培養するときの細胞外マトリックスの産生を示す。TSBで満たした96ウェルプレートのウェル中で、細菌を単独でまたは様々な組合せで増殖させた。バイオフィルム形成を、37℃にて48時間インキュベート後、595nmにて可溶化クリスタルバイオレットで染色した細胞外マトリックスの光学密度を測定することにより推定した。細胞外マトリックスの産生は、C. アクコレンスをS. パステウリ、S. エピデルミディス、またはS. パステウリとS. エピデルミディス両方と共培養したとき、有意に増加した。C. アクコレンス/S. パステウリ/S. エピデルミディスの組合せで最大の効果が得られた（C. アクコレンス単独に対して約7.6倍の増加、S. パステウリ単独に対して12倍の増加、およびS. エピデルミディス単独に対して3.1倍の増加）。
【図５】重層扁平上皮のインビボモデルにおけるS. アウレウスのコロニー形成の防止を示す。(A)健常ボランティアの前腕の皮膚における親水コロイドパッチの写真を示す。パンチ穴（皮膚のウェルに対応する）に、細菌懸濁液を与え、ポリウレタン滅菌切開フィルムで覆い試験した。(B)C. アクコレンス、S. パステウリおよびS. エピデルミディス単独または組合せで各々2×106CFU/ウェルの用量にて播種したときの、S. アウレウス29213（皮膚のウェル当たり5×103CFU）の阻害を示す。S. アウレウス単独を陽性対照として播種した。[(閾値-CT)/閾値]の比を各試験条件についてプロットした。
【実施例】
【００８５】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施態様を示すために含まれる。以下の実施例および図面で説明または示されるすべての主題は、限定的な意味ではなく、例示的なものとして解釈されるべきである。以下の実施例は、当業者によって決定され得るあらゆる代替物、等価物および改変物を含む。
【００８６】
これらの実施例で用いられる代表的な細菌株を下記表Iに詳述する。実施例における使用のために選択される株（表1に記載）は、所与の種のすべての株を代表する特性を有する、参照株を含む。
【表１】
2020529463.tif 000002
【００８７】
実施例1：C. アクコレンスによるS. アウレウスの増殖のインビトロでの阻害
インビボでのS. アウレウスに対するC. アクコレンスの相反する影響する効果を記載する先行技術を考慮して、S. アウレウスの増殖に対する影響を最初にインビトロで評価した。
【００８８】
材料および方法
コロンビア5％ヒツジ血液寒天培地で35±2℃にて48時間培養して調製した、C. アクコレンスの1.0マクファーランド懸濁液250μlを、直径90mmの血液寒天プレートに塗布することで播種して、≒5×104CFU/cm2を得た。生理食塩水250μlを陰性対照として播種した。50mmの0.2μmトラックエッチフィルター1つをC. アクコレンス懸濁液の上に置いた。コロンビア5％ヒツジ血液寒天培地で35±2℃にて24時間培養して調製した、10μl中に100CFU、10CFUまたは1CFUの目標数を含有する、S. アウレウス懸濁液を、直径50mmのフィルターにスポットした。
【００８９】
35℃にて48時間インキュベート後、フィルター上のS. アウレウスコロニーを採取し、細菌を生理食塩水（2.5〜10mL）に再懸濁させた。その後、各コロニーに存在するS. アウレウスCFU数を、600nmにて光学密度（OD）を測定することにより決定した。C. アクコレンスの存在下でS. アウレウスの増殖阻害を定量するために、C. アクコレンス有りまたは無しのOD/コロニーを決定した。実験の各セットを少なくとも2回繰り返した。
【００９０】
結果
C. アクコレンスは、驚くべきことに、試験したC. アクコレンスおよびS. アウレウス株に応じて、S. アウレウスの増殖の27.78％〜51.93％の減少の原因であった（表II参照）。また、驚くべきことに、MRSA（S. アウレウスUSA300）およびMSSA（S. アウレウスAF3147およびAF2419）株両方の増殖を、有意に阻止した。増殖阻害率は、同じC. アクコレンス株の存在下で増殖させた異なるS. アウレウス株間で増殖阻害に有意差は見られなかったため、用いたC. アクコレンス株に依存すると考えられる。
【表２】
2020529463.tif 000003
【００９１】
実施例2：S. パステウリとの共培養におけるC. アクコレンスの増殖促進
次に、インビトロでC. アクコレンスおよびS. パステウリの相互作用を試験した。C. アクコレンスによる増殖に対するS. パステウリの影響を、S. パステウリは増殖できるが、C. アクコレンスは増殖できないプレートカウント寒天培地（PCA）を用いて試験した。S. エピデルミディスを対象種として用いた。
【００９２】
材料および方法
実施例1に記載のように調製した、C. アクコレンス（株AF2345）の0.5マクファーランド懸濁液の10-2希釈液500μlを、PCA培地に播種した。完全に乾燥後、コロンビア5％ヒツジ血液寒天培地で35±2℃にて24時間培養して調製した、S. パステウリ（株AF2653）またはS. エピデルミディス（株AF2302）の1.0マクファーランド懸濁液10μlを、プレートの中央にスポットした。滅菌生理食塩水10μlを陰性対照としてスポットした。35℃にて72時間インキュベート後、C. アクコレンスの増殖を決定した。肉眼で見ることができるコロニーの存在により増殖を決定した。
【００９３】
結果
72時間インキュベート後にC. アクコレンスの増殖は、S. パステウリスポットの周辺で検出され（図1A）、一方、形成不全コロニーは、S. エピデルミディススポット（図1B）または対照スポット（示していない）の周囲で検出された。S. パステウリスポットの周辺で検出されたC. アクコレンスコロニーは、肉眼で検出できず、一方、S. エピデルミディススポット周囲の形成不全コロニーは、拡大なしでは検出できなかった。より長時間のS. エピデルミディスとの共培養におけるC. アクコレンスのインキュベートは、プレートを合計7日間までインキュベートしたときでも、C. アクコレンス増殖をさらに改善しなかった。したがって、S. エピデルミディスとは対照的に、S. パステウリは、C. アクコレンスの増殖を促進する。
【００９４】
実施例3：インビトロでのS. パステウリと組み合わせたC. アクコレンスによるS. アウレウスの増殖の相乗的阻害
S. パステウリがC. アクコレンス増殖を促進するため、S. パステウリおよびC. アクコレンス単独またはその組合せの抗S/アウレウス活性を試験した。S. エピデルミディスの抗S. アウレウス活性もまた、単独またはC. アクコレンスとの組合せで試験した。
【００９５】
材料および方法
各株単独または組合せについて、コロンビア5％ヒツジ血液寒天培地で35±2℃にて（C. アクコレンス：48時間のインキュベート；S. パステウリ、S. エピデルミディス：24時間のインキュベート）培養して調製した1.0マクファーランド懸濁液250μlを、直径90mmの血液寒天プレートに塗布することで播種した（≒5×104CFU/cm2）。生理食塩水250μlを陰性対照として播種した。50mmの0.2μmトラックエッチフィルター1つをスポットの上に置いた。10μl中に100CFU、10CFUおよび1CFUの目標数を含有するS. アウレウスUSA300懸濁液を、直径50mmのフィルターにスポットした。その他の材料および方法は、実施例1に記載のとおりである。
【００９６】
結果
表IIIは、C. アクコレンスAF2345、S. パステウリAF2543およびS. エピデルミディスAF2302で得られた結果を示す。示すように、C. アクコレンスとS. パステウリの組合せは、各種単独より有意に阻害し、S. アウレウスの増殖を95％超阻止した。対照的に、C. アクコレンスとS. エピデルミディスの組合せは、相乗的でなく、拮抗する傾向さえあった（68.92％の平均S. アウレウス増殖阻害に対し、S. エピデルミディスAF2302単独では79.28％、p=0.0133）。
【表３】
2020529463.tif 000004
【００９７】
同じ条件でC. アクコレンスおよびS. パステウリ株の他の組合せを試験した。表IVに示すように、試験したすべての組合せは、S. アウレウス阻害を95％超阻止した。
【表４】
2020529463.tif 000005
【００９８】
実施例4：C. アクコレンスとS. パステウリの組合せの用量-効果関係
材料および方法
1/5段階希釈液を各株の1.0マクファーランド懸濁液から調製し、各細菌懸濁液250μlを、直径90mmの血液寒天プレートに塗布することで播種して、各株単独または組合せを、≒5×104、≒104、≒2×103、≒4×102および≒0.8×102CFU/cm2のプレート密度で得た。その他の材料および方法は、実施例3に記載のとおりである。
【００９９】
結果
表Vに示すように、C. アクコレンスとS. パステウリの組合せは、驚くべきことに、試験したすべての細菌密度で有意に相乗的であり、最も強い相乗効果は≒0.8×102CFU/cm2にて得られた。しかしながら、≒2×103CFU/cm2以上の密度のみ（例えば≒5×104CFU/cm2、≒104CFU/cm2および≒2×103CFU/cm2）が、細菌増殖を95％超阻止する抗S. アウレウス活性を示した。
【表５】
2020529463.tif 000006
【０１００】
実施例5：C. アクコレンスとS. パステウリとS. エピデルミディスの組合せの抗S. アウレウス活性
実施例3に示す先の結果を考慮して、S. エピデルミディスの添加が、S. アウレウスに対してS. パステウリとのC. アクコレンスの組合せに悪影響を及ぼしたかどうかを評価した。
【０１０１】
材料および方法
各株の組合せについて、コロンビア5％ヒツジ血液寒天培地で35±2℃にて（C. アクコレンス：48時間のインキュベート；S. パステウリ、S. エピデルミディス：24時間のインキュベート）培養して調製した1.0マクファーランド懸濁液250μlを、直径90mmの血液寒天プレートに塗布することで播種した（≒5×104CFU/cm2）；生理食塩水250μlを陰性対照として播種した。50mmの0.2μmトラックエッチフィルター1つをスポットの上に置いた。10μl中に100CFU、10CFUおよび1CFUの目標数を含有するS. アウレウスUSA300懸濁液を、直径50mmのフィルターにスポットした。その他の材料および方法は、実施例1に記載のとおりである。
【０１０２】
結果
表VIに示すように、同レベルのS. アウレウス増殖阻害が、C. アクコレンスAF2345/S. パステウリAF2653/S. エピデルミディスAF2302の組合せに対してC. アクコレンスAF2345/S. パステウリAF2653の組合せで得られた。
【表６】
2020529463.tif 000007
【０１０３】
実施例6：C. プロピンクムは、C. アクコレンス/S. パステウリおよびC. アクコレンス/S. パステウリ/S. エピデルミディスの組合せにおいてC. アクコレンスと置き換え得る
その後、コリネバクテリウムの他の種、例えばC. プロピンクムが、単独で、および／またはS. パステウリまたはS. パステウリおよびS. エピデルミディスとの組合せで、抗S. アウレウス活性も有するかどうかを試験した。
【０１０４】
材料および方法
材料および方法は、C. プロピンクムAF1882をC. アクコレンスAF2345に置き換えたことを除き、実施例3に記載のとおりである。
【０１０５】
結果
表VIIに示すように、C. プロピンクム/S. パステウリおよびC. プロピンクム/S. パステウリ/S. エピデルミディスの組合せは、いずれも相乗的であり、有意な抗S. アウレウス活性を有し、S. アウレウスの増殖を95％超阻止した。
【表７】
2020529463.tif 000008
【０１０６】
実施例7：コリネバクテリウム種：スタフィロコッカス種の様々な比における細菌組合せの抗S. アウレウス活性
コリネバクテリウム種：スタフィロコッカス種の様々な比の抗S. アウレウス活性もまた評価した。特に、C. アクコレンス：S. パステウリ：S. エピデルミディスの組合せまたはC. プロピンクム：S. パステウリ：S. エピデルミディスの組合せの様々な比を評価した。
【０１０７】
材料および方法
C. アクコレンスAF2345、C. プロピンクムAF1882、S. パステウリAF2653およびS. エピデルミディスAF2302の適切な希釈液を各株の2.0マクファーランド懸濁液から調製し、各細菌懸濁液25〜250μlを、直径90mmの血液寒天プレートに塗布することで共播種し、これにより、≒105、≒5×104、≒104、≒5×103および≒103CFU/cm2のC. アクコレンスAF2345またはC. プロピンクムAF1882と、S. パステウリAF2653とS. エピデルミディスAF2302を、1：1：1、1：0.2：0.2、1：0.1：0.1、1：0.02：0.02、1：0.01：0.01（コリネバクテリウム：S. パステウリ：S. エピデルミディス）の比で得た。その他の材料および方法は、実施例3に記載のとおりである。
【０１０８】
結果
表VIIIおよびIXは、それぞれC. アクコレンスおよびC. プロピンクムに基づく組合せで得られた結果を示す。
【０１０９】
表VIIIに示すように、C. アクコレンス：S. パステウリ：S. エピデルミディスの組合せは、驚くべきことに、密度≦104CFU/cm2における比1：0.01：0.01、密度≦5×103CFU/cm2における比1：0.02：0.02、および密度103CFU/cm2における比1：0.1：0.1を除き、試験したすべての密度および比で95％を超える抗S. アウレウス活性を有する。しかしながら、抗S. アウレウス活性は、試験したすべての濃度および密度で有意なままであった。実際、最も低い試験した濃度および密度（例えば密度103CFU/cm2における比1：0.01：0.01）でさえ、S. アウレウスの増殖を少なくとも74％阻害したままであった。比（例えば1：0.02：0.02まで）または密度（例えば5×103まで）いずれかの増加は、抗S. アウレウス活性を増加させ、S. アウレウスの増殖をそれぞれ約83％および85％阻止した。
【表８】
2020529463.tif 000009
【０１１０】
表IXに示すように、C. プロピンクムで得られた結果は、C. アクコレンスで得られた結果と同様であった。実際、C. プロピンクムを含む細菌組合せについての抗S. アウレウス活性はまた、驚くべきことに、密度≦5×103CFU/cm2における比1：0.01：0.01、および密度103CFU/cm2における比1：0.1：0.1および1：0.2：0.2を除き、試験したすべての密度および比で95％を超えた。C. アクコレンスとの組合せで見られるように、C. プロピンクムとの組合せの抗S. アウレウス活性は、試験したすべての濃度および密度で有意なままであり、実際、C. アクコレンスで見られたものより共通して高かった。実際、S. アウレウスの増殖は、最も低い試験した濃度および密度（例えば密度103CFU/cm2における比1：0.01：0.01）で、少なくとも81％阻止された。比（例えば1：0.02：0.02まで）または密度（例えば5×103まで）いずれかの増加は、抗S. アウレウス活性を増加させ、S. アウレウスの増殖をそれぞれ約89％および93％阻止した。
【表９】
2020529463.tif 000010
【０１１１】
実施例8：C. アクコレンスは、S. パステウリの存在下でバイオフィルムを形成する
C. アクコレンスは、複合培地を必要とし、トリプチケースソイブロス（TSB）は、その増殖を支援しない。ここでは、C. アクコレンスおよびS. パステウリが、C. アクコレンスが通常増殖できない条件下で、その増殖を支援する混合バイオフィルムを形成し得ることを示す。
【０１１２】
材料および方法
マクファーランド0.5の濁度の細菌懸濁液を、実施例3に記載のようにコロンビア5％ヒツジ血液寒天プレートで培養して調製した。C. アクコレンスAF2345の懸濁液50μl（約2×106CFU）を12個のウェルに分配し（A列）；1：100希釈液50μl（約2×104CFU）を12個のウェルに分配し（B列）；S. エピデルミディスAF2302の懸濁液50μl（約2×106CFU）をカラム1、2、3、7、8および9に分配し；S. パステウリAF2653の懸濁液50μl（約2×106CFU）をカラム4、5、6、7、8および9に分配した。カラム10、11および12は、100μlの培地に懸濁させたC. アクコレンスAF2345を含有する。
【０１１３】
プレートを遠心分離し、懸濁生理食塩水を除去し、100μlのTSを各ウェルに加えた。24時間インキュベート後、50μlの培地を除去し、新しいTSBで置き換えた。プレートを増殖について試験した。48時間後、プレートを観察し、培地を除去し、ウェルを通常、生理食塩水で2回洗浄した。生理食塩水200μlを各ウェルに加え、プレートを超音波槽に入れて、バイオフィルムを分散および再懸濁させた。各ウェルについて、5μl（1/40）を生理食塩水95μlに移した（1/800）。その後、この懸濁液5μlを、生理食塩水95μlを含有する新しいプレートに移した（1/16000）。その後、各懸濁液10μlを、ミュラーヒントン2寒天培地プレート、およびムピロシン（128μg/ml）を含むミュラーヒントン5％血中NAD濃縮脱フィブリン寒天培地プレートに加えた。
【０１１４】
24時間増殖後の細菌を2.2mlアンプルに懸濁させ、マクファーランドリーダーを用いて濁度を測定した。
【０１１５】
結果
C. アクコレンスの高いおよび低い接種（A列およびB列）から得られた結果は、定性的に同様であった。しかしながら、低い接種で24時間インキュベート後に得られた細菌密度は、マクファーランド濁度計を用いて定量するには低過ぎた。以下に示すデータは、試験したより高い接種（A列）から得られたものである。
【０１１６】
予想通り、C. アクコレンスは、TSBにおいて増殖せず、バイオフィルムを形成しない。対照的に、S. エピデルミディスおよびS. パステウリの両方は、TSBにおいてバイオフィルムを形成する（データは示していない）。驚くべきことに、C. アクコレンスは、S. パステウリのバイオフィルムまたはS. パステウリとS. エピデルミディス混合のバイオフィルム内で増殖できるが、S. エピデルミディス単独のバイオフィルム内では増殖しない（図2参照）。予想通り、TSBはC. アクコレンスの増殖を支援しないことが知られているため、TSBにおいてC. アクコレンスを含有する対照ウェルにおいて増殖は見られない。S. パステウリのバイオフィルムとS. エピデルミディスのバイオフィルムにおけるC. アクコレンスの増殖間の差は、有意である（p=0.0065）。S. パステウリのバイオフィルムおよびS. パステウリとS. エピデルミディス混合のバイオフィルムにおけるC. アクコレンスの増殖間の差は、統計学的有意に達しない（p=0.0651）。
【０１１７】
実施例9：混合バイオフィルムにおけるC. プロピンクムの増殖
実施例8に示す同じ実験を、C. アクコレンスをC. プロピンクムに置き換えて実施した。
【０１１８】
材料および方法
C. プロピンクムAF1882をC. アクコレンスAF2345に代えて試験したことを除き、実施例8に記載のように実験を実施した。
【０１１９】
結果
図3に示すように、C. プロピンクムは、TSBにおいて頑強なバイオフィルムを形成できる。それはまた、S. エピデルミディスおよびS. パステウリとの組合せで混合バイオフィルムを形成できる。S. エピデルミディス内の増殖は、S. パステウリを含有するバイオフィルムにおける増殖より有意に低い（p=0.019）。しかしながら、C. アクコレンスの場合と同様に、S. エピデルミディスの存在は、C. アクコレンス含有バイオフィルム内の増殖に悪影響を及ぼさない（C. プロピンクムとS. パステウリ対C. プロピンクムとS. パステウリおよびS. エピデルミディス、p=0.0748）。
【０１２０】
実施例10：C. アクコレンスをS. パステウリおよび／またはS. エピデルミディスと組み合わせることの、バイオフィルム形成に対する相乗効果
細菌増殖の定量（上記実施例8および9に示す）に加えて、単独で、またはS. パステウリ、S. エピデルミディスまたはS. パステウリとS. エピデルミディス両方との組合せで、増殖したC. アクコレンスのバイオフィルム形成を、インビトロでバイオフィルム形成の相対的に定量できる、クリスタルバイオレットを用いて細胞外マトリックスを染色することによりここで評価した。
【０１２１】
材料および方法
C. アクコレンスAF2345、S. パステウリAF2653およびS. エピデルミディスAF2302の1.0マクファーランド懸濁液を、実施例1に記載のようにトリプチケースソイブロス（TSB）で調製した。未希釈のC. アクコレンス懸濁液50μL、およびS. パステウリおよびS. エピデルミディス懸濁液の10-2希釈液50μLを、96ウェルプレートのウェルに、単独でまたは次の組合せで播種した：C. アクコレンス/S. パステウリ、C. アクコレンス/S. エピデルミディスおよびC. アクコレンス/S. パステウリ/S. エピデルミディス。量をウェル当たり200μLまでTSBで満たし、プレートを37℃にてインキュベートした。48時間インキュベート後に、ウェルを、蒸留水ですすぎ、風乾し、バイオフィルムを、蒸留水で調製した0.2％クリスタルバイオレット溶液200μLで染色した。ウェルを、蒸留水ですすぎ、風乾し、そして固定したクリスタルバイオレットを、蒸留水で調製した30％酢酸溶液200μLに溶解させた。溶解させたクリスタルバイオレット溶液100μLを、新しい96ウェルプレートに移し、バイオフィルムの細胞外マトリックスを、595nmにて懸濁液の光学密度を測定することにより定量した。
【０１２２】
結果
図4に示すように、C. アクコレンスをS. パステウリ、S. エピデルミディスまたはS. パステウリとS. エピデルミディス両方との組合せで増殖させたとき、各細菌種単独より有意に多くの細胞外マトリックスが産生した。細胞外マトリックス産生の増加は、C. アクコレンス/S. パステウリ/S. エピデルミディスの組合せで最も高かった。
【０１２３】
さらに、組み合わせた細菌により産生される細胞外マトリックスの量は、各種単独で産生される量を考慮して予想される相加効果より多かった。したがって、C. アクコレンスをS. パステウリおよび／またはS. エピデルミディスと共培養したとき、相乗効果が見られた。C. アクコレンスをS. パステウリとS. エピデルミディス両方と共培養したとき、効果は最大である。
【０１２４】
実施例11：再構成した凍結乾燥細菌がS. アウレウスのコロニー形成を防止する
最終製剤が凍結乾燥した細菌を含み得るため、このプロセスが、S. パステウリおよびS. エピデルミディスとの組合せでC. アクコレンスの能力を損なわず、インビトロでS. アウレウスの増殖を防止することを確認した。したがって、「新鮮な」細菌に対する再構成された凍結乾燥細菌の抗S. アウレウス活性を比較した。
【０１２５】
材料および方法
C. アクコレンスAF2345、S. パステウリAF2652およびS. エピデルミディスAF2302の細菌懸濁液を、凍結乾燥緩衝液中で、それぞれ1：1：1または1：0.1：0.1の比で組み合わせた。これらの懸濁液の一部（以下「新鮮な細菌」と称する）を、寒天培地プレートの表面に懸濁液300μLを塗布することで、103CFU/cm2、102CFU/cm2または101CFU/cm2の最終密度にて90mmのペトリ皿に接種するために用いた。滅菌水300μlを陰性対照として播種した。50mmの0.2μmトラックエッチフィルター1つを播種した表面の上に置き、10μl中に10および100CFUの目標数を含有するS. アウレウスUSA300懸濁液を、フィルター表面に3回スポットした。その他の材料および方法は、実施例3に記載のとおりである。調製した懸濁液の他の部分を、陰圧での2段階プロセス（一次乾燥：0℃以下の温度；二次乾燥：15℃）を用いて、棚式凍結乾燥機で凍結乾燥した。プロセスの最後に、真空下でバイアルを密封し、使用するまで暗所で4℃にて保存した。アッセイの日に、凍結乾燥ケーキを、滅菌水400μLに再懸濁させ、再構成した懸濁液を、新鮮な細菌懸濁液で用いたものと同じ条件および希釈に従って播種した。
【０１２６】
結果
下記表Xに示すように、S. アウレウスの増殖の阻害は、アッセイで試験した細菌密度または比にかかわらず、新鮮なまたは再構成された凍結乾燥C. アクコレンス/S. パステウリ/S. エピデルミディスの組合せを用いたときで同様であった（有意差は認められなかった）。
【表１０】
2020529463.tif 000011
【０１２７】
したがって、細菌の組合せ（この場合、C. アクコレンス、S. パステウリおよびS. エピデルミディス）の凍結乾燥は、細菌の組合せの抗S. アウレウス活性を損なわない。したがって、S. アウレウスのコロニー形成の防止は依然として成功し得る。
【０１２８】
実施例12：ヒト皮膚モデルにおけるインビボでのS. アウレウスのコロニー形成を防止するときに、C. アクコレンスをS. パステウリおよび／またはS. エピデルミディスと組み合わせる相乗効果
単独または組合せで製剤化したC. アクコレンス、S. パステウリおよびS. エピデルミディスの凍結乾燥株が、試験領域の外形をはっきり示すために穴を開けた親水コロイド滅菌パッチをテンプレートとして用いて、健常な個体の前腕の皮膚でS. アウレウスの増殖を阻止する能力を試験した（図5Aに示す）。実際、上記で示すように、前腕の皮膚は、部位間の構造および微生物群組成の類似性を考慮して、皮膚および前鼻孔両方の優れたモデルである。
【０１２９】
材料および方法
凍結乾燥したC. アクコレンス株AF2345、S. パステウリ株AF2652およびS. エピデルミディス株AF2302のバイアルを実施例11に記載のように調製した。等間隔に配置された直径4.5mmの9つの穴を、親水コロイド滅菌パッチに開け、各穴は、30μlの皮膚が底であるウェルを構成した。アッセイの日に、2つのパッチを、インフォームドコンセントした健常なヒトボランティアの前腕の内側の皮膚に適用した。凍結乾燥細菌ケーキを滅菌水に再懸濁させ、3×108CFU/mLの濃度に希釈した。
【０１３０】
C. アクコレンス、S. パステウリおよびS. エピデルミディスを、単独でまたは組合せで、皮膚ウェルに種当たり2×106CFU/ウェルの用量で加え、S. アウレウスを5×103CFU/ウェルの用量で加えた。その後、親水コロイドパッチおよび周囲の皮膚を、滅菌ポリウレタン接着性外科切開フィルムで覆った（図5A）。パッチを所定の位置に30時間置いた後、それを剥がし、各ウェルに対応する皮膚領域を湿らせたスワブでサンプリングして、S. アウレウスを定量した。スワブの頭部を、滅菌外科用はさみで切断し、滅菌容器に収容した。製造業者の手順に従って、Dneasy Blood and Tissue Kit（Qiagen）を用いてDNAを抽出した。Spa遺伝子を標的とするプライマーを用いて、CFX96 C1000 Touchリアルタイムシステム（Biorad）で定量リアルタイムPCR（qPCR）により、DNA抽出物を増幅させた。反応混合物を、1X Itaq Universal Probes supermix（Biorad）、各プライマー500nM、250nMプローブおよびDNAテンプレートを用いて、最終容量20μlで調製した。qPCRのために、最初の変性工程（95℃、5分）の後に、95℃15秒と60℃1分のサイクルを40回行った。40回の増幅サイクルを実施し、CTを決定した。結果を[(閾値-CT)/閾値]の比として表した。この比は、Spa DNAが増幅なしで検出可能である場合は1に達し、40サイクル増幅の最後にSpa DNAが検出されない場合0に達する。
【０１３１】
結果
図5Bは、C. アクコレンス、S. パステウリおよびS. エピデルミディスを、単独でおよび様々な組合せで一緒にインキュベートした後S. アウレウスのqPCRで得られた[(閾値-CT)/閾値]の比を示す。単独で投与された場合、いずれの種もS. アウレウスの増殖を阻止しなかった。対照的に、S. アウレウスの増殖の相乗的阻害が、本発明による、C. アクコレンス/S. パステウリの細菌組合せ（S. アウレウス単独の増殖と比較してS. アウレウス増殖は2.9倍減少）またはC. アクコレンス/S. パステウリ/S. エピデルミディスの組合せ（12.6倍減少）で見られた。
【０１３２】
ボランティアの皮膚の炎症、紅斑または変化が見られなかった。
【０１３３】
結論
まとめると、これらの実施例は、少なくとも1つのコリネバクテリウム種、例えばC. アクコレンスまたはC. プロピンクムと、S. パステウリ、所望によりS. エピデルミディスと組み合わせたとき、驚くべき相乗的抗S. アウレウス活性を示す。さらに、これらの結果は、S. パステウリが特に、コリネバクテリウム種、例えばC. アクコレンスの増殖を促進し、さらに、細胞外マトリックスの定量により示されるように共培養の場合相乗的にC. アクコレンスのバイオフィルム形成を促進することを示す。バイオフィルム形成は同様に、コリネバクテリウム種をS. パステウリとS. エピデルミディス両方と共に培養した場合相乗的に改善する。有利には、該細菌種を含む組成物を、さらに、再構成された組成物が新鮮な細菌と同じレベルでS. アウレウスのコロニー形成を防止するので、効果の損失無しに凍結乾燥および再構成できる。さらに、S. アウレウスの最も一般的な生態学的な適所（すなわち皮膚および前鼻孔）を表す、ヒト前腕の皮膚への組成物の投与は、インビボでS. アウレウスによるコロニー形成を極めて減少させる。
【０１３４】
これらの実施例は、少なくともC. アクコレンスまたはC. プロピンクムおよびS. パステウリ、好ましくはS. エピデルミディスもまた含む組成物が、MSSAおよびMRSA両方のS. アウレウスのコロニー形成の防止における使用のための、新規で予想外の極めて有利な組成物を表すという最初の証拠を提供する。
【０１３５】
（参考文献）
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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