(57)【要約】本発明は、ヒト上皮成長因子受容体３（ＨＥＲ３）のドメインＩＩＩおよびドメインＩＶによって形成される立体構造エピトープに特異的に結合する抗原結合タンパク質、およびこのタンパク質と結合について競合する抗原結合タンパク質、ならびにこれらを含む融合タンパク質または複合体を提供する。本発明はまた、前記抗原結合タンパク質をコードする配列を含む核酸分子、該核酸を含むベクター、ならびに抗原結合タンパク質、融合タンパク質、核酸またはベクターを含む細胞および医薬品を提供する。本発明はまた、薬物としての使用のための、抗原結合タンパク質、融合タンパク質もしくは複合体、核酸、ベクター、細胞または医薬品を提供する。本発明はさらに、治療有効量の抗原結合タンパク質、融合タンパク質もしくは複合体、核酸、ベクター、細胞または医薬品を投与することを含む、腫瘍増殖を阻害し、またはがんを処置する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト上皮成長因子受容体３（ＨＥＲ３）のドメインＩＩＩおよびドメインＩＶによって形成される立体構造エピトープに特異的に結合する抗原結合タンパク質。
【請求項２】
立体構造エピトープが、配列番号１記載のＨＥＲ３のドメインＩＩＩの３２９〜５３１位のアミノ酸および配列番号１記載のＨＥＲ３のドメインＩＶの５３２〜５８７位のアミノ酸によって形成されている、請求項１記載の抗原結合タンパク質。
【請求項３】
請求項１または２に記載の抗原結合タンパク質とＨＥＲ３への結合について競合する抗原結合タンパク質。
【請求項４】
（ａ）ＨＥＲ３発現細胞と１５ｎＭ未満のＥＣ５０値で結合する；および／または
（ｂ）単量体ＨＥＲ３と１００ｎＭ未満のＫＤで結合する；および／または
（ｃ）ヘレグリン誘導性ＨＥＲ３リン酸化を１０ｎＭ未満のＩＣ５０値で阻害する、請求項１〜３のいずれかに記載の抗原結合タンパク質。
【請求項５】
（ｉ）ＨＥＲ３のそのリガンドへの結合を阻害し、（ｉｉ）受容体活性化および／またはシグナル伝達を阻害し、（ｉｉｉ）ＨＥＲ３のインターナリゼーションを誘導し、（ｉｖ）細胞増殖を阻害し、かつ／または（ｖ）腫瘍増殖を阻害する、請求項１〜４のいずれかに記載の抗原結合タンパク質。
【請求項６】
以下からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれかに記載の抗原結合タンパク質
ａ）抗体またはその抗原結合フラグメント、
ｂ）抗体様タンパク質、および
ｃ）ペプチド模倣物。
【請求項７】
単一特異性、二重特異性または多特異性である、請求項１〜６のいずれかに記載の抗原結合タンパク質。
【請求項８】
以下を含む、請求項１〜７のいずれかに記載の抗原結合タンパク質
（ａ）配列番号２記載の３２〜３７位のアミノ酸を含むＣＤＲＨ１および１アミノ酸交換を含むその変異体、配列番号２記載の５２〜６９位のアミノ酸を含むＣＤＲＨ２および１アミノ酸交換を含むその変異体、ならびに配列番号２記載の１０２〜１１２位のアミノ酸を含むＣＤＲＨ３および１アミノ酸交換を含むその変異体、および／または、
（ｂ）配列番号３記載の２３〜３３位のアミノ酸を含むＣＤＲＬ１および１アミノ酸交換を含むその変異体、配列番号３記載の４９〜５５位のアミノ酸を含むＣＤＲＬ２および１アミノ酸交換を含むその変異体、ならびに配列番号３記載の８８〜９８位のアミノ酸を含むＣＤＲＬ３および１アミノ酸交換を含むその変異体。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載の抗原結合タンパク質を含み、少なくとも１つの薬学的に活性な部分をさらに含む、融合タンパク質。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の抗原結合タンパク質、または請求項１８記載の融合タンパク質をコードする核酸。
【請求項１１】
請求項１０記載の核酸を含む組換えベクター。
【請求項１２】
請求項１０記載の核酸または請求項１１記載のベクターを含む組換え宿主細胞。
【請求項１３】
請求項１〜８のいずれかに記載の抗原結合タンパク質、請求項９記載の融合タンパク質、請求項１０記載の核酸、または請求項１１記載のベクターを含み、薬学的に許容され得る担体、希釈剤、賦形剤、充填剤、結合剤、潤滑剤、流動促進剤、崩壊剤、吸着剤および／または保存剤のうち１つ以上をさらに含む医薬組成物。
【請求項１４】
医学的使用のための（特に腫瘍増殖を阻害し、またはがんを処置するための）、請求項１〜８のいずれかに記載の抗原結合タンパク質、請求項９記載の融合タンパク質、請求項１０記載の核酸、請求項１１記載のベクター、請求項１２記載の組換え宿主細胞、または請求項１３記載の医薬組成物。
【請求項１５】
治療有効量の請求項１〜８のいずれかに記載の抗原結合タンパク質、請求項９記載の融合タンパク質、請求項１０記載の核酸、請求項１１記載のベクター、請求項１２記載の組換え宿主細胞、または請求項１３記載の医薬組成物を、それを必要とする患者（特に、腫瘍増殖もしくはがんに罹患し、または腫瘍増殖もしくはがんが発生するリスクがある患者）に投与することを含む、腫瘍増殖を阻害し、またはがんを処置する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト上皮成長因子受容体３（ＨＥＲ３）のドメインＩＩＩおよびドメインＩＶによって形成される立体構造エピトープに特異的に結合する抗原結合タンパク質、およびこのタンパク質と結合について競合する抗原結合タンパク質、ならびにこれらを含む融合タンパク質または複合体を提供する。本発明はまた、前記抗原結合タンパク質をコードする配列を含む核酸分子、該核酸分子を含むベクター、ならびに抗原結合タンパク質、融合タンパク質、核酸またはベクターを含む細胞および医薬品を提供する。本発明はまた、薬物としての使用のための抗原結合タンパク質、融合タンパク質もしくは複合体、核酸、ベクター、細胞または医薬品を提供する。本発明はさらに、治療有効量の抗原結合タンパク質、融合タンパク質もしくは複合体、核酸、ベクター、細胞または医薬品を投与することを含む、腫瘍増殖を阻害し、またはがんを処置する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
ＥｒｂＢファミリーメンバーの複雑なシグナル伝達ネットワークは、正常なヒト組織において厳密に調節されている。しかしながら、受容体の過剰発現によるＥｒｂＢファミリーメンバーの調節異常、変異による受容体機能の変化、またはリガンドによる異常な刺激が、がんの発生および進行にしばしば関連している。ＥＧＦＲは、大腸がん、卵巣がん、頭頸部扁平上皮がんおよび他のがん種においてしばしば過剰発現し、ＥＧＦＲの過剰発現は予後不良に関連している。ＨＥＲ２はヒト乳がんと特に関連しており、ここでＨＥＲ２は最大で３０％増幅および／または過剰発現されている。ＨＥＲ３もまた、ＨＥＲ２の存在下で発がん性シグナル伝達を促進する結腸がんおよび胃がんのうち約１１％において変異していることが以前に示されている(Jaiswal et al., 2013, Oncogenic ErbB3 mutations in human cancers. Cancer Cell 23, 603-617)。さらに、ＨＥＲ３は、ＥｒｂＢ標的治療に対する耐性機構の原因であると報告されているＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路を強力に活性化するため、特別な関心を集めた(Holbro et al., 2003, The ErbB2/ErbB3 heterodimer functions as an oncogenic unit: ErbB2 requires ErbB3 to drive breast tumor cell proliferation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:8933-8938)。がんの発生におけるＨＥＲ４の役割は議論の的となっているが、ますます多くの研究が、ＨＥＲ４が（特に獲得耐性に関して）腫瘍形成と関連していることを明らかにしている(Canfield et al., 2014, Receptor tyrosine kinase ErbB4 mediates acquired resistance to ErbB2 inhibitors in breast cancer cells. Cell Cycle 14: 648-655)。
【０００３】
発がん性変異が（例えば、結腸がんおよび胃がんの約１１％において）ＨＥＲ３に同定されている(Jaiswal et al., 2013)。これらの変異は、リガンド非依存的な様式で結腸上皮細胞および乳房上皮細胞を形質転換することが示された(Jaiswal et al., 2013, Oncogenic ErbB3 mutations in human cancers. Cancer Cell 23, 603-617)。細胞外領域における変異はドメインＩ、ＩＩおよびＩＩＩに局在化しており、ドメインＩＩに多くのホットスポット（Ａ２３２Ｖ、Ｐ２６２Ｈ／Ｓ、Ｇ２８４Ｒ、Ｄ２９７Ｙ、Ｇ３２５Ｒ）があり、ドメインＩに１つ（Ｖ１０４Ｍ）あり、ドメインＩＩＩに１つ（Ｔ３５５Ａ／Ｉ）ある(Gaborit et al. 2015, Emerging anti-cancer antibodies and combination therapies targeting HER3/ErbB3. Hum. Vaccin. Immunother. 12: 576-592)。
【０００４】
ＥｒｂＢファミリーメンバーは抗体で標的化され得る。これらの抗体はリガンド結合および／または受容体二量体化を阻害し得る。さらに、抗体は受容体の架橋によって受容体のインターナリゼーションおよび分解を誘導し得る(Friedman et al., 2005, Synergistic down-regulation of receptor tyrosine kinases by combinations of mAbs: implications for cancer therapy. Proc. Natl. Acad.Sci. USA 102:1915-1920; Roepstorff et al., 2008, Endocytic downregulation of ErbB receptors: mechanims and relevance in cancer. Histochem Cell Biol. 129:563-578; Moody et al., 2015, receptor crosslinking: a general method to trigger internalization and lysosomal targeting of therapeutic receptor:ligand complexes. Mol. Therapy 23:1888-1898)。さらに、Ｆｃ部分を含む抗体は、エフェクター機能（抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）など）を介してがん細胞の死滅を媒介し得る。抗体はまた、細胞傷害性物質のがん細胞への送達システムとして使用され得る。腫瘍形成の増殖および治療に対する耐性の発生に関与するヘテロ二量体化パートナーとしてのその新たな役割のために、ＨＥＲ３は抗体療法の標的となっている。ＨＥＲ３に対する様々な抗体が開発されており(Gaborit et al. 2015, Emerging anti-cancer antibodies and combination therapies targeting HER3/ErbB3. Hum. Vaccin. Immunother. 12: 576-592; Dey et al. 2015, A critical role of HER3 in HER2-amplified and non-amplified breast cancers: function of a kinase-dead RTK. Am. J. Transl. Res. 7: 733-750; Aurisicchio et al. 2012, The promise of anti-ErbB3 monoclonals as new cancer therapeutics. Oncotarget 3, 744-758; Baselga & Swain 2009, Novel anticancer targets: revisiting ErbB2 and discovering ErbB3. Nat. Rev. Cancer 9: 463-475; Gala & Chandariapaty 2014, Molecular pathways: HER3 targeted therapy. Clin. Cancer Res. 20: 1410-1416; Kol et al. 2014, HER3, serious parnter in crime: therapeutic approaches and potential bomarkers for effect of HER3-targeting. Pharmacol. Ther. 143: 1-11; Zhang et al. 2016, HER3/ErbB3, an emering cancer therapeutic target. Acta Biochim. Biophys. Sin. 48: 39-48)、これらのいくつかはリガンド結合に関与するドメインＩまたはドメインＩＩＩのいずれかに対する抗体であり、その他は受容体二量体化に関与するドメインＩＩおよび／またはドメインＩＶに対する抗体である。ある抗体ＫＴＮ３３７９はドメインＩＩとドメインＩＩＩとの間に結合し、受容体を不活性な立体構造に固定することが記述された(Lee et al., 2015, Inhibition of ErbB3 by a monoclonal antibody that locks the extracellular domain in an inactive configuration. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 112: 13225-13230)。
【０００５】
しかしながら、これらの抗体によって標的とされたドメインは１以上の発がん性変異を含み得るため、これらは野生型ＨＥＲ３に対して、またはそれぞれの抗体によって標的とされた位置以外の別の位置が変異している発がん性変異ＨＥＲ３に対して反応性でない場合がある。したがって、野生型ＨＥＲ３および変異ＨＥＲ３の両方と反応する拮抗分子が当分野において必要とされている。さらに、リガンド非依存的およびリガンド依存的なＨＥＲ３活性化を阻害するために、ヘテロ二量体化およびリガンド結合を阻害するようにＨＥＲ３と結合する拮抗分子が必要とされている。
【０００６】
上記の問題を解決するために、本発明者らは、ドメインＩＩＩおよびＩＶによって形成されるＨＥＲ３上の特有のエピトープ（これはヒトＨＥＲ３とマウスＨＥＲ３との間で保存されている）を認識するヒト抗ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）抗体３−４３を同定した。この抗体は、０．１ｎＭ未満のＥＣ５０値を有するＩｇＧ分子としてＨＥＲ３発現腫瘍細胞に結合し、リガンド非依存的およびリガンド依存的な受容体活性化ならびに下流のシグナル伝達を効率的に阻害し、迅速で効率的な受容体インターナリゼーションおよび分解を導く。
【発明の概要】
【０００７】
第１の態様において、本発明は、ヒト上皮成長因子受容体３（ＨＥＲ３）のドメインＩＩＩおよびドメインＩＶによって形成される立体構造エピトープに特異的に結合する抗原結合タンパク質を提供する。
第２の態様において、本発明は、第１の態様の抗原結合タンパク質と競合する抗原結合タンパク質を提供する。
第３の態様において、本発明は、第１または第２の態様の抗原結合タンパク質を含む融合タンパク質または複合体を提供する。
第４の態様において、本発明は、第１もしくは第２の態様の抗原結合タンパク質、または第３の態様の融合タンパク質をコードする配列を含む核酸分子を提供する。
第５の態様において、本発明は、第４の態様の核酸を含むベクターを提供する。
【０００８】
第６の態様において、本発明は、第１もしくは第２の態様の抗原結合タンパク質、第３の態様の融合タンパク質、第４の態様の核酸、または第５の態様のベクターを含む細胞を提供する。
第７の態様において、本発明は、第１もしくは第２の態様の抗原結合タンパク質、第３の態様の融合タンパク質、第４の態様の核酸、または第５の態様のベクターを含む医薬組成物を提供する。
第８の態様において、本発明は、薬物としての使用のための、第１もしくは第２の態様の抗原結合タンパク質、第３の態様の融合タンパク質もしくは複合体、第４の態様の核酸、第５の態様のベクター、第６の態様の細胞、または第７の態様の医薬品を提供する。
【０００９】
第９の態様において、本発明は、治療有効量の第１もしくは第２の態様の抗原結合タンパク質、第３の態様の融合タンパク質もしくは複合体、第４の態様の核酸、第５の態様のベクター、第６の態様の細胞、または第７の態様の医薬品を投与することを含む、腫瘍増殖を阻害し、またはがんを処置する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１：ＩｇＧ３−４３の生化学的特徴および結合研究。Ａ）還元条件（Ｒ）および非還元条件（ＮＲ）下での（クマシー染色した）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。Ｂ）ＩｇＧ３−４３のＨＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィー。Ｃ）ＨＥＲ３との結合をＥＬＩＳＡで分析した。ＨＥＲ３の細胞外ドメインのＦｃ融合タンパク質を抗原として用いた。データを３回の独立した実験の平均値±Ｓ．Ｄ．として表す。Ｄ）水晶振動子マイクロバランス実験をAttanaシステムを用いて行った。ＩｇＧ３−４３をカルボキシルチップ上に固定化し、ＨＥＲ３のｈｉｓタグ付き細胞外ドメインの結合による重量の増加または減少を表す振動数変化を測定した。
【００１１】
【図２】図２：エピトープマッピングおよびマウスＨＥＲ３との交差反応性。Ａ）エピトープマッピング：ＨＥＲ３細胞外ドメインの切断型をコードする配列をＩｇＧ１のＦｃ部分の配列と融合させた。得られたコンストラクトをＨＥＫ２９３細胞中に遺伝子導入および発現させ、タンパク質をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを介して上清から精製した。Ｆｃ融合タンパク質をＥＬＩＳＡアッセイにおいて抗原として用い、結合したＩｇＧ３−４３をＨＲＰ標識抗Ｆａｂ抗体で検出した。Ｂ）ヒトＦｃ領域と融合させたヒトおよびマウスＨＥＲ３の細胞外領域を用いた、３−４３とヒトおよびマウスＨＥＲ３との交差反応性。ｓｃＦｖ３−４３と固定化されたＨＥＲ３−融合タンパク質との結合を抗Ｈｉｓタグ抗体で検出した。
【００１２】
【図３】ＩｇＧ３−４３とＨＥＲ３発現腫瘍細胞株との結合。（示されているように）様々な腫瘍細胞株を様々な濃度のＩｇＧ３−４３と共にインキュベートし、結合した抗体をＰＥ標識二次抗体で検出した。細胞をMiltenyi MACSquantを用いて分析した。ＥＣ５０値をｎ＝１〜３の実験から計算した。
【００１３】
【図４】図４：ＩｇＧ３−４３は、ＨＥＲ３発現細胞との結合についてＨＲＧと競合する。Ｈｉｓタグ付き組換えヒトヘレグリンβ１の結合を、ＰＥ標識抗Ｈｉｓ抗体を介するフローサイトメトリーによって測定した。過剰量のＩｇＧ３−４３とのプレインキュベーションは、信号を６０％を超えて強力に減少させたが、抗ＥＧＦＲ抗体セツキシマブは同様の効果を示さなかった。
【００１４】
【図５】図５：ＩｇＧ３−４３はＨＥＲ３のＨＲＧ誘導性リン酸化および下流の標的を阻害する。図中に示す細胞を、実験当日にセミコンフルエント(semi confluent)となるように６ウェルプレートに播種した。接着後、細胞を一晩血清飢餓させ、１００ｎＭ ＩｇＧ３−４３もしくは対照（リツキシマブ）ＩｇＧ（Ａ、Ｂ、Ｃ）と共に、または様々な濃度のＩｇＧ３−４３もしくはＩｇＧ３Ｍ６（Ｄ、Ｅ）と共に１時間インキュベートした。ＩｇＧ処理された細胞およびＩｇＧで処理されていない細胞を５０ｎｇ／ｍｌヒトヘレグリンβ１で刺激した。次いで、細胞をプロテアーゼ阻害剤を含むＲＩＰＡ緩衝液で溶解し、細胞溶解物を図中に示す抗体を用いてウェスタンブロットによって解析した。
【００１５】
【図６】図６：ＩｇＧ３−４３はがん細胞中にインターナライズされ、細胞内ＨＥＲ３レベルの減少を導く。Ａ）ＭＣＦ−７細胞を１００ｎＭ ＩｇＧ３−４３と共に図中に示す時間インキュベートし、ＨＥＲ３レベルをウェスタンブロットで解析した。ＨＥＲ３の信号は、５分間のインキュベーション時間後に既に見られる減少を伴って急速に減少した。Ｂ）Ｃｙ５標識されたＩｇＧ３−４３をＭＣＦ−７細胞と共に３７℃で図中に示す時間インキュベートした。細胞膜をコンカナバリンＡで染色し、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定した。処理された細胞および対照細胞の像をスピニングディスク顕微鏡で取得した。青色：Ｄａｐｉでの核染色；緑色：ＣｏｎＡでの膜染色；紫色：Ｃｙ５標識されたＩｇＧ３−４３。
【００１６】
【図７】図７：ＩｇＧ３−４３はインビトロ(in vitro)においてＨＲＧ介在性がん細胞増殖を減少させる。ＮＣＩ−Ｎ８７細胞（Ａ）、ＢＴ−４７４細胞（Ｂ）およびＭＣＦ−７細胞（Ｃ）を９６ウェルプレートに低密度で播種し、一晩接着させ、低い（０．２％）血清濃度下において１０μｇのＩｇＧ３−４３または対照としてリツキシマブを伴う１０ｎｇ／ｍｌヘレグリンの存在下で１週間インキュベートした。Ｄ）ＦａＤｕ細胞は自己分泌の様式でヘレグリンを産生することが知られており、ＦａＤｕ細胞に周囲のヘレグリン非存在下における同一の増殖アッセイを行った。ＩｇＧ３−４３の滴定は、低ナノモル濃度においてでさえ強力な増殖阻害効果を明らかにした。
【００１７】
【図８】図８：ＩｇＧ３−４３はＳＣＩＤマウスにおいて皮下異種移植ＦａＤｕ腫瘍モデルの増殖を阻害する。マウスを、腫瘍が約１００ｍｍ３のサイズに達した際に図中に示す投与量で処理した（３週間における週に２回の注射、図中の線参照）。Ａ）生存期間のカプラン・マイヤーブロット。Ｂ）４２日目における腫瘍体積。Ｃ）〜Ｆ）ＰＢＳ（Ｃ）、３０μｇのＩｇＧ３−４３（Ｄ）、１００μｇのＩｇＧ３−４３（Ｅ）または３００μｇのＩｇＧ３−４３（Ｆ）で処理されたマウスにおける個々の腫瘍の増殖。
【００１８】
【図９】図９：ｓｃＤｂ ｈｕ２２５ｘ３−４３−Ｆｃの生化学的特徴。Ａ）ｓｃＤｂ−Ｆｃ融合タンパク質における可変ドメインおよび定常ドメインの模式的な配置。Ｂ）還元条件（レーン１〜３）および非還元条件（レーン４〜６）下におけるセツキシマブ（レーン１、４）、ＩｇＧ３−４３（レーン２、５）およびｓｃＤｂ ｈｕ２２５ｘ３−４３−Ｆｃ（レーン３、６）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（１０％ＰＡＡ、クマシー染色）。Ｃ）二量体ｓｃＤｂ−Ｆｃ融合タンパク質の模式的構造。Ｄ）セツキシマブ、ＩｇＧ３−４３およびｓｃＤｂ ｈｕ２２５ｘ３−４３−Ｆｃのサイズ排除クロマトグラフィー。
【００１９】
【図１０】図１０：ｓｃＤｂ ｈｕ２２５ｘ３−４３−Ｆｃの結合研究。Ａ）セツキシマブおよびＩｇＧ３−４３と比較した、ｓｃＤｂ ｈｕ２２５ｘ３−４３−Ｆｃの固定化された受容体−ＥＣＤタンパク質（０．２μｇ／ウェル）との結合をＥＬＩＳＡで分析した。抗体をＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）抗体で検出した。４５０ｎｍでの光学密度を測定した。データを３回の独立した実験の平均値±Ｓ．Ｄ．で表す。Ｂ）ＦａＤｕ細胞との結合をフローサイトメトリーによって分析した。全ての抗体をＰＥ標識抗ヒトＦｃ抗体で検出した。データを３回の独立した実験の平均値±Ｓ．Ｄ．で表す。
【００２０】
【図１１】図１１：ＭＣＦ−７細胞におけるＨＥＲ３シグナル伝達の阻害。（ＲＰＭＩ１６４０、０．２％血清中で増殖させた）細胞を３７℃、１時間での併用処理のために、７５ｎＭの親ＩｇＧ分子またはｓｃＤｂ−Ｆｃ分子、および３７．５ｎＭの各親抗体で処理した。無関係なＩｇＧ１を対照として使用した。細胞を、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含むＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＮａＦ、２０ｍＭ βグリセロリン酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＮＰ−４０、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ、０．２５％ＤＯＣ、０．１％ＳＤＳ）を用いて４℃で溶解させる前に、３７℃においてヘレグリン（５０ｎｇ／ｍｌ）で１５分間刺激した。細胞溶解物を、ＨＥＲ３、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＨＥＲ３（Ｔｙｒ１２８９）、Ａｋｔ、ｐｈｏｓｐｈｏ−Ａｋｔ（Ｔｈｒ３０８）、Ｅｒｋ１／２、ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｅｒｋ１／２（Ｔｈｒ２０２／２０４）およびαチューブリンに対する抗体を用いて免疫ブロット法によって解析した。示されているデータは、２つの独立した実験の代表である。
【００２１】
【図１２】図１２：種々のＥｒｂＢ過剰発現細胞株における受容体リン酸化の阻害。種々の細胞株（Ａ、ＭＣＦ−７；Ｂ、Ａ−４３１；Ｃ、ＮＣＩ−Ｎ８７；Ｄ、ＳＫ−ＢＲ−３；Ｅ、ＦａＤｕ；Ｆ、Ａ５４９）を、ヘレグリン（５０ｎｇ／ｍｌ）またはＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）での１５分間の刺激の前に、５０ｎＭセツキシマブ、ＩｇＧ３−４３またはｓｃＤｂ ｈｕ２２５ｘ３−４３−Ｆｃで３７℃において１時間処理した。細胞をプロテアーゼ阻害剤カクテルを含むＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＮａＦ、２０ｍＭ βグリセロリン酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＮＰ−４０、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ、０．２５％ＤＯＣ、０．１％ＳＤＳ）を用いて溶解し、細胞溶解物を、ＥＧＦＲ、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＥＧＦＲ（Ｔｙｒ１０６８）、ＨＥＲ３、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＨＥＲ３（Ｔｙｒ１２８９）およびαチューブリンに対する抗体を用いて免疫ブロット法によって解析した。
【００２２】
【図１３】図１３：ＦａＤｕ細胞における受容体リン酸化の阻害。細胞を、ヘレグリン（５０ｎｇ／ｍｌ）での刺激の前に、セツキシマブと組み合わせたｓｃＤｂ ｈｕ２２５ｘ３−４３−ＦｃおよびＩｇＧ３−４３の段階希釈物で３７℃において１時間処理した。細胞をプロテアーゼ阻害剤カクテルを含むＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＮａＦ、２０ｍＭ βグリセロリン酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＮＰ−４０、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ、０．２５％ＤＯＣ、０．１％ＳＤＳ）を用いて溶解し、溶解物を、ＨＥＲ３、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＨＥＲ３（Ｔｙｒ１２８９）およびαチューブリンに対する抗体を用いて免疫ブロット法によって解析した。ｐｈｏｓｐｈｏ−ＨＥＲ３のレベルをローディングコントロールのαチューブリンに対して定量化し、抗体を含まない対照に対して正規化した。示されているデータは、平均値±ＳＤを表すエラーバーを伴う、少なくとも２回の独立した実験の代表である。Ａ、定量化されたデータ。Ｂ、代表的な画像。
【００２３】
【図１４】図１４：ｓｃＤｂ ２−３５ｘ３−４３−Ｆｃの生化学的特徴。Ａ）還元条件（Ｒ）および非還元条件（ＮＲ）下におけるｓｃＤｂ ２−３５ｘ３−４３−ＦｃのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（１０％ＰＡＡ、クマシー染色）。Ｂ）ｓｃＤｂ ２−３５ｘ３−４３−Ｆｃのサイズ排除クロマトグラフィー。
【００２４】
【図１５】図１５：ｓｃＤｂ ２−３５ｘ３−４３−Ｆｃの結合研究。ＩｇＧ２−３５およびＩｇＧ３−４３と比較した、ｓｃＤｂ ２−３５ｘ３−４３−Ｆｃの固定化された受容体−ＥＣＤタンパク質（０．２μｇ／ウェル）との結合をＥＬＩＳＡで分析した。抗体をＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）抗体で検出した。４５０ｎｍでの光学密度を測定した。データを３回の独立した実験の平均値±Ｓ．Ｄ．で表す。
【００２５】
【図１６】図１６：ｓｃＦｖ３−４３−Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬの生物学的特徴。Ａ）還元条件（Ｒ）および非還元条件（ＮＲ）下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（１０％ＰＡＡ、クマシー染色）。Ｂ）ｓｃＦｖ−３−４３−Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬのサイズ排除クロマトグラフィー。
【００２６】
【図１７】図１７：ｓｃＦｖ３−４３−Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬの結合研究。ＨＥＲ３（Ａ）およびヒトＴＲＩＬ−Ｒ２（Ｂ）との結合をＥＬＩＳＡによって分析した。ＨＥＲ３またはヒトＴＲＩＬ−Ｒ２の細胞外ドメインのＦｃ融合タンパク質を抗原として用いた。４５０ｎｍでの光学密度を測定した。Ｃｏｌｏ２０５（Ｃ）およびＨＣＴ−１１６細胞（Ｄ）との結合をフローサイトメトリーによって分析した。データを少なくとも３回の独立した実験の平均値±Ｓ．Ｄ．として表す。
【００２７】
【図１８】図１８：非標的コンストラクトと比較した細胞死の誘導。ｓｃＦｖ３−４３−Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬの細胞死の誘導を、対応する非標的融合タンパク質Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬと比較して分析した。Ｃｏｌｏ２０５を培地またはボルテゾミブ（６５０ｎＭ）と共にプレインキュベートし、細胞をＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスのために感作した後におけるＣｏｌｏ２０５に対する効果を調べた。ｓｃＦｖ３−４３−Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬの標的効果を確認するため、２００倍モル過剰のｓｃＦｖ３−４３−Ｆｃの存在下においてさらに実験を行った。データを３回の独立した実験の平均値±Ｓ．Ｄ．として表す。
【００２８】
【図１９】図１９：ｓｃＤｂ ３−４３ｘＣＤ３の生化学的特徴、結合およびＩＬ−２アッセイ。Ａ）ｓｃＤｂコンストラクトにおける可変ドメインおよび定常ドメインの模式的な配置。Ｂ）ｓｃＤｂコンストラクトの模式的構造。Ｃ）還元条件（１）および非還元条件（２）下におけるｓｃＤｂ ３−４３ｘＣＤ３のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（１２％ＰＡＡ、クマシー染色）。Ｄ）ｓｃＤｂ ３−４３ｘＣＤ３のサイズ排除クロマトグラフィー。Ｅ）ｓｃＤｂ ３−４３ｘＣＤ３の結合を、ＨＥＲ３の細胞外ドメインのＦｃ融合タンパク質を抗原として用いてＥＬＩＳＡによって分析した。タンパク質をＨＲＰ標識抗Ｈｉｓ抗体で検出した。４５０ｎｍでの光学密度を測定した。ＦおよびＧ）ＨＥＲ３発現ＭＣＦ−７細胞（Ｆ）およびＣＤ３発現Ｊｕｒｋａｔ細胞（Ｇ）との結合をフローサイトメトリーによって分析した。結合したタンパク質をＰＥ標識抗Ｈｉｓ抗体で検出した。Ｈ）ＨＥＲ３発現Ｃｏｌｏ２０５細胞と結合したｓｃＤｂ ３−４３ｘＣＤ３によって活性化されたＰＢＭＣのＩＬ−２放出。上清中のＩＬ−２の濃度を製造者によって供給された説明書（ヒトＩＬ−２キット、R&D）に従ってＥＬＩＳＡによって決定した。データを平均値±Ｓ．Ｄ．として表す。
【００２９】
【図２０】図２０：三価の二重特異性ｓｃＤｂ３−４３ｘＣＤ３−ｓｃＦｖ３−４３融合タンパク質の生化学的特徴および結合。Ａ）ｓｃＤｂ−ｓｃＦｖコンストラクトにおける可変ドメインの模式的な配置および構造。Ｂ）還元条件（１）および非還元条件（２）下におけるｓｃＤｂ３−４３ｘＣＤ３−ｓｃＦｖ３−４３のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（１０％ＰＡＡ、クマシー染色）。Ｃ）ｓｃＤｂ３−４３ｘＣＤ３−ｓｃＦｖ３−４３のサイズ排除クロマトグラフィー。Ｄ）ｓｃＤｂ３−４３ｘＣＤ３−ｓｃＦｖ３−４３の結合を、ＨＥＲ３の細胞外ドメインのＦｃ融合タンパク質を抗原として用いてＥＬＩＳＡによって分析した。タンパク質をＨＲＰ標識抗Ｈｉｓ抗体で検出した。ｓｃＤｂ３−４３ｘＣＤ３の結合を（ＨＥＲ３に対する）一価の対照として使用した。４５０ｎｍでの光学密度を測定した。Ｅ）およびＦ）ＨＥＲ３発現ＭＣＦ−７細胞（Ｅ）およびＣＤ３発現Ｊｕｒｋａｔ細胞（Ｆ）との結合をフローサイトメトリーによって分析した。結合したタンパク質をＰＥ標識抗Ｈｉｓ抗体で検出した。データを平均値±Ｓ．Ｄ．として表す。
【００３０】
【図２１】図２１：ＨＥＲ２およびＨＥＲ３を標的とする二重特異性ｓｃＤｂ ４Ｄ５ｘ３−４３−Ｆｃの特徴。Ａ）還元条件（１）および非還元条件（２）下におけるｓｃＤｂ ４Ｄ５ｘ３−４３−ＦｃのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（１０％ＰＡＡ、クマシー染色）。Ｂ）ｓｃＤｂ ４Ｄ５ｘ３−４３−Ｆｃのサイズ排除クロマトグラフィー。Ｃ）ｓｃＤｂ ４Ｄ５ｘ３−４３−Ｆｃの結合を、ＨＥＲ２またはＨＥＲ３の細胞外ドメインのＨｉｓタグ付きタンパク質を抗原として用いてＥＬＩＳＡによって分析した。結合したタンパク質をＨＲＰ標識抗ヒトＦｃ抗体で検出した。４５０ｎｍでの光学密度を測定した。Ｄ）ＨＥＲ２およびＨＥＲ３発現ＦａＤｕ細胞との結合をフローサイトメトリーによって分析した。結合したタンパク質をＰＥ標識抗ヒトＦｃ抗体で検出した。データを平均値±Ｓ．Ｄ．として表す。
【００３１】
【図２２】図２２：ＩｇＧ３−４３はＳＫＢＲ３およびＢＴ４７４のリガンド非依存的なコロニー形成を阻害する。Ａ）ＩｇＧ３−４３（５０ｎＭ）と共に１２日間インキュベートしたＳＫＢＲ３およびＢＴ４７４を用いたコロニー形成アッセイ。未処理細胞（ｃｏｎ）およびトラスツズマブで処理した細胞（ＨＥＲ２に対するＴｒａｓ．）をさらなる対照として含めた。３通りの実験を示す。Ｂ）Ａ）に記述されるようにインキュベートされたＳＫＢＲ３細胞およびＢＴ４７４細胞の形成されたコロニーの定量化。
【００３２】
【図２３】図２３：Ｄｂ３−４３ｘｈｕ２２５−Ｉｇの生化学的特徴および結合。Ａ）Ｄｂ３−４３ｘｈｕ２２５−Ｉｇ融合タンパク質の軽鎖および重鎖の模式図。Ｂ）Ｄｂ３−４３ｘｈｕ２２５−Ｉｇ融合タンパク質におけるドメインの模式的構造。Ｃ）還元条件（１）および非還元条件（２）下におけるＤｂ３−４３ｘｈｕ２２５−Ｉｇ融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（１０％ＰＡＡ、クマシー染色）（Ｍ：マーカー）。Ｄ）Ｄｂ３−４３ｘｈｕ２２５−Ｉｇ融合タンパク質のサイズ排除クロマトグラフィー。Ｅ）四価の二重特異性Ｄｂ３−４３ｘｈｕ２２５−Ｉｇの結合を、ＥＧＦＲまたはＨＥＲ３の細胞外ドメインのＨｉｓタグ付き融合タンパク質を抗原として用いてＥＬＩＳＡによって分析した。結合したタンパク質をＨＲＰ標識抗ヒトＦｃ抗体で検出した。親抗体（セツキシマブおよび３−４３−ＩｇＧ）を対照として用いた。４５０ｎｍでの光学密度を測定した。Ｆ）二重特異性Ｄｂ３−４３ｘｈｕ２２５−Ｉｇ融合タンパク質の同時結合を、ＥＧＦＲの細胞外ドメインのＦｃ融合タンパク質を第１の抗原として用いてＥＬＩＳＡによって分析した。Ｄｂ３−４３ｘｈｕ２２５−Ｉｇの段階希釈物をウェルに添加した。最後に、第２の抗原であるＨＥＲ３−Ｈｉｓをウェルに添加した。結合したＨＥＲ３−ＨｉｓをＨＲＰ標識抗Ｈｉｓ抗体を用いて検出した。４５０ｎｍでの光学密度を測定した。Ｇ）Ｄｂ３−４３ｘｈｕ２２５−Ｉｇの細胞への結合をフローサイトメトリーによって分析した。種々の腫瘍細胞株（ＭＣＦ−７、ＳＫＢＲ−３およびＦａＤｕ）を、二重特異性Ｄｂ３−４３ｘｈｕ２２５−Ｉｇまたは親のモノクローナル抗体（セツキシマブおよび３−４３−ＩｇＧ）の段階希釈物と共にインキュベートした。結合した抗体をＰＥ標識抗ヒトＦｃ二次抗体によって検出した。細胞をMiltenyi MACSquantを用いて分析した。
【００３３】
【図２４】図２４：ＳＷＩＳＳマウスにおけるＤｂ３−４３ｘｈｕ２２５−Ｉｇの薬物動態。Ｄｂ３−４３ｘｈｕ２２５−Ｉｇの薬物動態プロファイルを雌性ＳＷＩＳＳマウス（３匹のマウス）において決定した。２５μｇのタンパク質を尾静脈に静脈内注射した。図に示す時間間隔後に採取された血清試料の濃度を、ＥＧＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質またはＨＥＲ３−Ｆｃ融合タンパク質のいずれかを被覆抗原として用いてＥＬＩＳＡによって決定した。結合したＤｂ３−４３ｘｈｕ２２５−Ｉｇ分子を、ＨＲＰ標識抗ヒトＦａｂ抗体を用いて検出した。
【００３４】
【図２５】図２５：ＨＥＲ３を標的とするｓｃＦｖ３−４３−Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬ融合タンパク質。Ａ）メラノーマ細胞のＨＥＲ３発現をフローサイトメトリーによって分析し、ＱＩＦＩＫＩＴによって定量化した。Ｂ）ｓｃＦｖ３−４３−Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬポリペプチドの模式的な組成。Ｃ）二量体ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬ融合タンパク質の模式的な組成。Ｄ）ｓｃＦｖ３−４３−Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬ融合タンパク質のＨＥＲ３陽性細胞株Ａ３７５への結合をフローサイトメトリーによって評価した。細胞に結合したタンパク質を抗ヒトＩｇＧ（γ鎖特異的）Ｒ−ＰＥによって検出した。ＥＣ５０値を点線として示す。ＥＣ５０値の有意性を、各細胞株に対するＦｃ−ｓｃＴＲＡＩＬのＥＣ５０値と比較して計算した。Ｅ）ｓｃＦｖ３−４３−Ｆｃ（阻害剤）を用いた競合阻害を細胞株Ａ３７５上で行った。細胞をタンパク質（１０ｎＭ）で処理する前に２００ｘモル過剰の阻害剤で処理した。細胞に結合したタンパク質を抗ヒトＴＲＡＩＬ−ＰＥによって検出した。
【００３５】
【図２６】図２６：ボルテゾミブ（ＢＺＢ）の存在下または非存在下におけるＨＥＲ３を標的とするｓｃＦｖ３−４３−Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬの細胞死誘導および細胞表面上のＨＥＲ３抗原密度の定量分析。細胞死誘導アッセイのために、細胞を培地またはボルテゾミブと共に３０分間プレインキュベートした後、ｓｃＦｖ３−４３−Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬの段階希釈物で１６時間処理した。細胞生存率をクリスタルバイオレット染色によって分析した。統計分析のために、ｓｃＦｖ３−４３−Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬのＥＣ５０値をＦｃ−ｓｃＴＲＡＩＬと比較した。標的効果が有意である場合に、ＥＣ５０値を点線で示す。ＨＥＲ３の抗原密度をＱＩＦＩＫＩＴを用いて決定した。したがって、細胞を、細胞死誘導アッセイで使用した濃度と同じ濃度のボルテゾミブで処理した。統計分析を対応のないｔ検定（両側、ｐ＜０．０５＊、ｐ＜０．０１＊＊、ｐ＜０．００１＊＊＊、ｐ＞０．０５ｎｓ）を用いて行った。
【００３６】
【図２７】図２７：ｓｃＦｖ３−４３−Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬおよびＦｃ−ｓｃＴＲＡＩＬのインビボ(in vivo)活性、忍容性およびＰＫ。Ａ）確立されたＣｏｌｏ２０５腫瘍を有するＮＭＲＩヌードマウス（群毎に６匹のマウス）を０．２ナノモルのタンパク質（０．４ナノモルのｓｃＴＲＡＩＬ単位に対応する；静脈内）またはＰＢＳで週に２回、３週間（１４、１８、２１、２５、２８、３２日目）処理した。処理を点線で示す。Ｂ）４７日目における種々の処理群の腫瘍体積の統計分析を一元配置分散分析およびその後のＴｕｋｅｙの事後検定（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；ｎｓ、Ｐ＞０．０５）によって行った。これらの分子のＣ）ＡＬＴ活性およびＤ）血清濃度を、最後の処理（３２日目）の４および２４時間後に決定した。
【００３７】
【図２８】図２８：ｓｃＤｂｈｕ２２５ｘ３−４３−Ｆｃの生化学的特徴および結合。Ａ）ｓｃＤｂｈｕ２２５ｘ３−４３−Ｆｃ融合タンパク質の模式図。Ｂ）ｓｃＤｂｈｕ２２５ｘ３−４３−Ｆｃ融合タンパク質におけるドメインの模式的構造。Ｃ）還元条件（１）および非還元条件（２）下におけるｓｃＤｂｈｕ２２５ｘ３−４３−Ｆｃ融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（１０％ＰＡＡ；クマシー染色）（Ｍ：マーカー）。Ｄ）ｓｃＤｂｈｕ２２５ｘ３−４３−Ｆｃ融合タンパク質のサイズ排除クロマトグラフィー。Ｅ）四価の二重特異性ｓｃＤｂｈｕ２２５ｘ３−４３−Ｆｃ融合タンパク質の結合を、ＥＧＦＲまたはＨＥＲ３の細胞外ドメインのＨｉｓタグ付き組換えタンパク質を抗原として用いてＥＬＩＳＡによって分析した。結合したタンパク質をＨＲＰ標識抗ヒトＦｃ抗体で検出した。親抗体（ｈｕ２２５−ＩｇＧおよび３−４３−ＩｇＧ）を対照として用いた。４５０ｎｍでの光学密度を測定した。
【００３８】
【図２９】図２９：ＦａＤｕ細胞における受容体シグナル伝達阻害。細胞を、５０ｎＭのＩｇＧ ｈｕ２２５、ＩｇＧ ３−４３、ＩｇＧ ｈｕ２２５およびＩｇＧ ３−４３の組合せ、ｓｃＤｂｈｕ２２５ｘ３−４３−Ｆｃ（ＧＧＧＧＳ）、またはＤｂ３−４３ｘｈｕ２２５−Ｉｇで１時間処理した後、３７℃においてヘレグリン（５０ｎｇ／ｍｌ）で１５分間刺激した。細胞を、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含むＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＮａＦ、２０ｍＭ βグリセロリン酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＮＰ−４０、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ、０．２５％ＤＯＣ、０．１％ＳＤＳ）を用いて溶解し、溶解物をＥＧＦＲ、ｐｈｏｓｐｈｏｒ−ＥＧＦＲ（Ｔｙｒ１０６８）、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＨＥＲ２（Ｔｙｒ１２２１／１２２２）、ＨＥＲ３、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＨＥＲ３（Ｔｙｒ１２８９）、Ａｋｔ、ｐｈｏｓｐｈｏｒ−Ａｋｔ（Ｔｈｒ３０８）、Ｅｒｋ、ｐｈｏｓｐｈｏｒ−Ｅｒｋ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）およびαチューブリンに対する抗体を用いて免疫ブロット法によって解析した。αチューブリン１、ｐＨＥＲ３、ＥＧＦＲ、ＡｋｔおよびＥｒｋは膜１上にあり、αチューブリン２、ＨＥＲ３、ｐＥＧＦＲ、ｐＨＥＲ２、ｐＡｋｔおよびｐＥｒｋは膜２上にあった。
【００３９】
【図３０】図３０：ｓｃＤｂｈｕ２２５ｘ３−４３−ＦｃまたはＤｂ３−４３ｘｈｕ２２５−Ｉｇを用いた増殖アッセイ。ＳＷ６２０細胞、ＨＣＴ１１６細胞およびＬｏＶｏ細胞を２次元増殖アッセイ（Ａ）および３次元増殖アッセイ（Ｂ）に用いた。９６ウェルプレート形式において、２０００細胞／ウェルを１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ培地中（３Ｄ培養のための１：２のマトリゲル：コラーゲン混合物、ＲＰＭＩまたはＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ＋２％マトリゲル）で２４時間培養した。その後、培地を飢餓培地（０．２％ＦＣＳおよび１％Ｐ／Ｓを含むＲＰＭＩ培地）に交換した。２４時間の培養後に、細胞を、ＭＥＫ阻害剤（ＡＺＤ６２４４、セルメチニブ；ＨＲＧ非刺激：ＳＷ６２０に５ｎＭ、ＨＣＴ１１６に４５ｎＭ、ＬｏＶｏに３５ｎＭ；ＨＲＧ刺激：ＳＷ６２０に１０ｎＭ、ＨＣＴ１１６に３００ｎＭ、ＬｏＶｏに２５０ｎＭ）の存在下または非存在下のいずれかにおいて、種々の抗体（セツキシマブ、３−４３−ＩｇＧ：５０ｎＭ単独または各５０ｎＭの組合せ；ｓｃＤｂｈｕ２２５ｘ３−４３−Ｆｃ、Ｄｂ３−４３ｘｈｕ２２５−Ｉｇ：５０ｎＭ）で処理した。１時間のインキュベーション後、細胞をヘレグリン（６ｎｇ／ウェル）で刺激するか、または未刺激のまま保持した。細胞の播種後８日目に、プレートを、発光を測定するＣｅｌｌｔｉｔｅｒＧｌｏ ２．０キット（Ａ）（ウェル毎に２５μｌのＣｅｌｌｔｉｔｅｒＧｌｏ ２．０を混合した２５μｌの飢餓培地）、またはＣｅｌｌｔｉｔｅｒＧｌｏ ３Ｄキット（Ｂ）（ウェル毎に２５μｌのＣｅｌｌｔｉｔｅｒＧｌｏ ３Ｄを混合した２５μｌの飢餓培地）のいずれかを用いて分析した。（抗体、ＡＺＤ６２２４４およびＨＲＧを含まない）未処理細胞の発光を１００％に設定した；平均値±ＳＤ、ｎ＝２。
【００４０】
【図３１】図３１：ｓｃＤｂ４Ｄ５ｘ３−４３−ＬＬの生化学的特徴および生物活性。Ａ）ｓｃＤｂ４Ｄ５ｘ３−４３−ＬＬ融合タンパク質の模式図。Ｂ）ｓｃＤｂ４Ｄ５ｘ３−４３−ＬＬ融合タンパク質におけるドメインの模式的構造。Ｃ）還元条件（１）および非還元条件（２）下におけるｓｃＤｂ４Ｄ５ｘ３−４３−ＬＬ融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（１２％ＰＡＡ、クマシー染色）（Ｍ：マーカー）。Ｄ）ｓｃＤｂ４Ｄ５ｘ３−４３−ＬＬ融合タンパク質のサイズ排除クロマトグラフィー。Ｅ）二価の二重特異性ｓｃＤｂ４Ｄ５ｘ３−４３−ＬＬ融合タンパク質の結合を、ＨＥＲ２またはＨＥＲ３の細胞外ドメインのＦｃ融合タンパク質を抗原として用いてＥＬＩＳＡによって分析した。結合したタンパク質をＨＲＰ標識抗Ｈｉｓ抗体で検出した。親抗体（トラスツズマブおよび３−４３−ＩｇＧ）を対照として使用した。４５０ｎｍでの光学密度を測定した。
【００４１】
【図３２】図３２：ＭＣＦ−７細胞における受容体シグナル伝達阻害。細胞を、５０ｎＭのトラスツズマブ、ＩｇＧ ３−４３、トラスツズマブおよびＩｇＧ ３−４３の組合せ、ｓｃＤｂ４Ｄ５ｘ３−４３−ＬＬ−ＦｃまたはｓｃＤｂ４Ｄ５ｘ３−４３−ＬＬで１時間処理した後、３７℃においてヘレグリン（５０ｎｇ／ｍｌ）で１５分間刺激した。細胞を、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含むＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＮａＦ、２０ｍＭ βグリセロリン酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＮＰ−４０、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ、０．２５％ ＤＯＣ、０．１％ＳＤＳ）を用いて溶解し、溶解物をＥＧＦＲ、ｐｈｏｓｐｈｏｒ−ＥＧＦＲ（Ｔｙｒ１０６８）、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＨＥＲ２（Ｔｙｒ１２２１／１２２２）、ＨＥＲ３、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＨＥＲ３（Ｔｙｒ１２８９）、Ａｋｔ、ｐｈｏｓｐｈｏｒ−Ａｋｔ（Ｔｈｒ３０８）、Ｅｒｋ、ｐｈｏｓｐｈｏｒ−Ｅｒｋ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）およびαチューブリンに対する抗体を用いて免疫ブロット法によって解析した。αチューブリン１、ｐＨＥＲ３、ＨＥＲ２、ＡｋｔおよびＥｒｋは膜１上にあり、αチューブリン２、ＨＥＲ３、ｐＨＥＲ２、ｐＡｋｔおよびｐＥｒｋは膜２上にあった。
【００４２】
【図３３】図３３：ＨＥＲ３およびＣＤ３に対する二重特異性多価抗体の生化学的特徴および生物活性。（Ａ＋Ｂ）二価（ｓｃＤｂ３−４３ｘｈｕＵ３）、三価（ｓｃＤｂ３−４３ｘｈｕＵ３−ｓｃＦｖ３−４３）または四価（ｓｃＦｖ３−４３−ｓｃＤｂ３−４３ｘｈｕＵ３−ｓｃＦｖ３−４３）の二重特異性融合タンパク質の模式図（Ａ）および模式的構造（Ｂ）。（Ｃ＋Ｄ）種々の二重特異性融合タンパク質のＣＤ３陽性細胞株Ｊｕｒｋａｔ（Ｃ）およびＨＥＲ３陽性細胞株ＭＣＦ−７（Ｄ）との結合をフローサイトメトリーによって分析した。二重特異性抗体の段階希釈物を細胞と共に４℃で１時間インキュベートした。結合した抗体をＰＥ標識抗ヒトＦｃ二次抗体によって検出した。細胞をMiltenyi MACSquantを用いて分析した。Ｅ）ＨＥＲ３発現ＭＣＦ−７細胞に結合した二重特異性多価抗体によって活性化されたＰＢＭＣのＩＬ−２放出。２４時間後に、上清中のＩＬ−２の濃度を製造者によって供給された説明書（ヒトＩＬ−２キット、R&D）に従ってＥＬＩＳＡによって決定した。Ｆ）ヒトＰＢＭＣを添加する前に、二重特異性多価抗体を滴定し、標的細胞としてのＭＣＦ７と共に１時間インキュベートした。４８時間のインキュベーション後に、細胞生存率をＭＴＴアッセイによって決定した。さらに、ＰＢＭＣを添加することなく、二重特異性多価抗体を標的細胞としてのＭＣＦ７上に滴定し、インキュベートした。４８時間のインキュベーション後に、細胞生存率をＭＴＴアッセイによって決定し、各タンパク質について灰色の記号および点線で示した。
【００４３】
【図３４】図３４：変異ＨＥＲ３−Ｆｃ融合タンパク質の分析および３−４３−ＩｇＧへの結合分析。Ａ）還元条件下における精製したＨＥＲ３−Ｆｃ変異体（１、Ｔ３３５Ａ；２、Ｔ３８９Ｉ；３、Ｍ４０６Ｋ；４、Ｒ４５３Ｈ；５、Ｙ４６４Ｃ；６、Ｄ４９２Ｈ；７、Ｋ４９８Ｉ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。ゲルをクマシーブルーで染色した。Ｂ）ＩｇＧ３−４３の固定化された野生型ＨＥＲ３−ＦｃおよびＨＥＲ３−Ｆｃ変異体との結合を、１００ｎＭのＩｇＧ３−４３を用いて西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ヒトＦａｂ抗体で検出し、野生型ＨＥＲ３−Ｆｃ融合タンパク質について得られた信号に対して正規化した。ＳＥＣ分析によって凝集体形成することが明らかとなったため、Ｙ４６４Ｃ変異体を含めなかった。ヒトＨＥＲ３のドメインＩに対する３Ｍ６−ＩｇＧを陽性対照として含めた。
【００４４】
配列表−フリーテキスト情報
配列番号１：Ｈｅｒ３のアミノ酸配列（Ｅｘｐａｓｙエントリー番号：Ｐ２１８６０）
配列番号２：ＩｇＧ３−４３の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列
配列番号３：ＩｇＧ３−４３の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列
配列番号４：ＩｇＧ３−４３の重鎖のアミノ酸配列
配列番号５：ＩｇＧ３−４３の軽鎖のアミノ酸配列
【００４５】
配列番号６：ｓｃＦｖ３−４３のアミノ酸配列
配列番号７：ＰｅｌＢリーダー − ｓｃＦｖ ３−４３ − ｃ−ｍｙｃ − ｈｉｓのアミノ酸配列
配列番号８：ＩｇＫリーダー − ｓｃＤｂ ｈｕ２２５ｘ３−４３−Ｆｃのアミノ酸配列
配列番号９：ＩｇＫリーダー − ２−３５ｘ３−４３ｓｃＤｂ−Ｆｃのアミノ酸配列
配列番号１０：ＩｇＫリーダー − ｓｃＤｂ ４Ｄ５ｘ３−４３−ＬＬ−Ｆｃのアミノ酸配列
配列番号１１：ＩｇＫリーダー − ＦＬＡＧ − リンカー − ｓｃＦｖ３−４３−Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬのアミノ酸配列
配列番号１２：ＩｇＫリーダー − ｓｃＤｂ ３−４３ｘＣＤ３ − Ｈｉｓのアミノ酸配列
配列番号１３：ＩｇＫリーダー − ｓｃＤｂ ３−４３ｘＣＤ３−ｓｃＦｖ ３−４３ − Ｈｉｓのアミノ酸配列
【００４６】
配列番号１４：ペプチドリンカー１のアミノ酸配列：ＧＧＧＧＳ
配列番号１５：ペプチドリンカー２のアミノ酸配列：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
配列番号１６：ペプチドリンカー３のアミノ酸配列：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
配列番号１７：ペプチドリンカー４のアミノ酸配列：ＧＳＬＧＧＳＧＧ
配列番号１８：ペプチドリンカー５のアミノ酸配列：ＧＧＧＳＧＧＧＴ
配列番号１９：ペプチドリンカー６のアミノ酸配列：ＧＧＧＳＧＧＧＴＧＳ
配列番号２０：ペプチドリンカー７のアミノ酸配列：ＧＧＧＳＧＧＧＴＧＳＧＧ
配列番号２１：ペプチドリンカー８のアミノ酸配列：ＧＧＧＧＳＧＧＲＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
配列番号２２：ペプチドリンカー９のアミノ酸配列：ＧＧＧＳＧＧＧＳ
配列番号２３：ペプチドリンカー１０のアミノ酸配列：ＥＦＴＲＧ
配列番号２４：ペプチドリンカー１１のアミノ酸配列：ＡＡＡ
【００４７】
配列番号２５：ＦＬＡＧタグのアミノ酸配列
配列番号２６：Ｈｉｓタグのアミノ酸配列
配列番号２７：Ｍｙｃタグのアミノ酸配列
配列番号２８：ＰｅｌＢリーダー配列のアミノ酸配列
配列番号２９：ＩｇＫリーダー配列のアミノ酸配列
配列番号３０：ＩＬ−２リーダー配列のアミノ酸配列
【００４８】
配列番号３１：ＶＨ３−４３ｘＶＬｈｕ２２５−ＣＬのアミノ酸配列
配列番号３２：ＶＨｈｕ２２５ｘＶＬｈｕ３−４３−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３のアミノ酸配列
配列番号３３：ｓｃＤｂｈｕ２２５ｘ３−４３−Ｆｃ（ＧＧＧＧＳ）のアミノ酸配列
配列番号３４：ｓｃＤｂ４Ｄ５ｘ３−４３−ＬＬのアミノ酸配列
配列番号３５：ｓｃＦｖ３−４３−ｓｃＤｂ３−４３ｘｈｕＵ３−ｓｃＦｖ３−４３のアミノ酸配列
【発明を実施するための形態】
【００４９】
本発明を以下で詳細に記述する前に、本明細書に記述される特定の方法論、プロトコルおよび試薬は様々であり得るため、本発明はこれらに限定されないことが理解されるはずである。本明細書で使用される用語は特定の実施態様を記述するためのものにすぎず、本発明の範囲を限定することを意図していないことが理解されるはずであり、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲のみによって限定される。他に定義されない限り、本明細書で使用されるあらゆる技術用語および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【００５０】
好ましくは、本明細書で使用される用語は、"A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. and Kolbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerlandに記載されているように定義される。
【００５１】
複数の文書が本明細書の文章のあらゆる箇所で引用される。本明細書で引用される各文書（あらゆる特許、特許出願、科学的刊行物、製造者の仕様書、説明書、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号配列提出書（submission）などを含む）は上記または下記に関わらず、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。本明細書のいかなる記載も、本発明が先行発明によるこのような開示に先行する権利を有しないことを承認するものと解釈されるべきではない。
【００５２】
定義
単語「含む」およびその変化形（「含んでいる」など）は、記載されている整数もしくは工程または整数もしくは工程の群を包含するが、いかなる他の整数もしくは工程または整数もしくは工程の群も除外しないことを示唆することが理解される。
【００５３】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は文脈上明らかな他の指示がない限り、複数の指示対象を含む。
【００５４】
濃度、量および他の数値データは本明細書において、「範囲」の形式で表現または提示され得る。このような範囲の形式は単に簡便さおよび簡潔さのために使用され、したがって範囲の限界として明確に記載された数値だけでなく、その範囲内に包含されるあらゆる個々の数値または部分範囲もまた、各数値および部分範囲が明確に記載されているように含まれると柔軟に解釈されるべきであることが理解されるはずである。実例として、「１５０ｍｇ〜６００ｍｇ」の数値範囲は、１５０ｍｇ〜６００ｍｇという明確に記載された値だけでなく、指定された範囲内の個々の値および部分範囲も含むと解釈されるはずである。したがって、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、…５８０、５９０、６００ｍｇなどの個々の値、および１５０〜２００、１５０〜２５０、２５０〜３００、３５０〜６００などの部分範囲は、この数値範囲に含まれる。これと同一の原理が単一の数値のみを記載している範囲に適用される。さらに、このような解釈は範囲の幅または記載されている特徴にかかわらず適用されるべきである。
【００５５】
数値に関連して使用される場合、用語「約」は、示された数値よりも５％小さい下限を有し、示された数値よりも５％大きい上限を有する範囲内の数値を包含することを意味する。
【００５６】
用語「核酸」および「核酸分子」は本明細書において同義的に使用され、デオキシリボヌクレオチド塩基もしくはリボヌクレオチド塩基またはその両方の一本鎖または二本鎖のオリゴマーまたはポリマーとして理解される。ヌクレオチドモノマーは、核酸塩基、五炭糖（限定されないが、リボースまたは２’−デオキシリボースなど）および１〜３つのリン酸基から構成される。通常、核酸は個々のヌクレオチドモノマー間のホスホジエステル結合を介して形成される。本発明の文脈において、核酸という用語は、限定されないがリボ核酸（ＲＮＡ）分子およびデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子を含み、他の結合を含む核酸の合成型（例えば、Nielsen et al. (Science 254:1497-1500, 1991)に記述されるペプチド核酸）を含む。通常、核酸は一本鎖分子または二本鎖分子であり、天然に存在するヌクレオチドから構成される。核酸の一本鎖の描写は相補鎖の配列を（少なくとも部分的に）規定する。核酸は一本鎖もしくは二本鎖であり得、または二本鎖配列および一本鎖配列の両方の部分を含み得る。例示される二本鎖核酸分子は３’または５’オーバーハングを有し得、そのようなものとして、その全長にわたって完全に二本鎖であることは必要とされず、または想定されない。核酸は、生物学的合成法、生化学的合成法もしくは化学的合成法、または当分野で公知のあらゆる方法（限定されないが、増幅法およびＲＮＡの逆転写法を含む）によって取得され得る。核酸という用語は、染色体もしくは染色体セグメント、ベクター（例えば発現ベクター）、発現カセット、ネイキッドＤＮＡもしくはＲＮＡポリマー、プライマー、プローブ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、組換えＤＮＡ、ｃＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）または低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含む。核酸は、例えば一本鎖、二本鎖または三本鎖であり得、いかなる特定の長さにも限定されない。他の指示がない限り、ある核酸配列は、明確に示されている任意の配列に加えて、相補的配列を含むか、またはコードする。
【００５７】
核酸は、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ（特に、細胞中に見出され得るＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅ）によって分解され得る。したがって、核酸を分解に対して安定化するために修飾することは有利であり得、これにより高濃度の核酸が細胞中に長期間にわたって維持されることが保証され得る。通常、このような安定化は、１以上のヌクレオチド間リン基(internucleotide phosphorus group)を導入すること、または１以上のヌクレオチド間非リンを導入することによって得られ得る。したがって、核酸は、天然に存在しないヌクレオチド、および／または天然に存在するヌクレオチドへの修飾、および／または分子の骨格への変化から構成され得る。核酸における修飾されたヌクレオチド間リン酸ラジカルおよび／または非リン架橋には、限定されないが、メチルホスホン酸、ホスホロチオエート、ホスホルアミダート、ホスホロジチオエートおよび／またはリン酸エステルが含まれ、非リンヌクレオチド間類似体には、限定されないが、シロキサン架橋、カーボネート架橋、カルボキシメチルエステル、アセトアミダート架橋および／またはチオエーテル架橋が含まれる。ヌクレオチド修飾のさらなる例には、限定されないが：連結またはエキソヌクレアーゼ分解／ポリメラーゼ伸長の防止をそれぞれ可能にする５’または３’ヌクレオチドのリン酸化；共有結合および近似的共有結合(near covalent attachment)のためのアミノ、チオール、アルキンまたはビオチニル修飾；フルオロフォアおよび消光剤；ならびに修飾塩基（デオキシイノシン（ｄＩ）、５−ブロモ−デオキシウリジン（５−ブロモ−ｄＵ）、デオキシウリジン、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、逆位ｄＴ、逆位ジデオキシＴ、ジデオキシシチジン（ｄｄＣ）、５−メチルデオキシシチジン（５−メチルｄＣ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、５−ニトロインドール、イソｄＣおよびイソｄＧ塩基、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ塩基、ヒドロキシメチルｄＣ、５−ヒドロキシブチニル−２’−デオキシウリジン(5-hydroxybutynl-2’-deoxyuridine)、８−アザ−７−デアザグアノシンおよびフッ素修飾塩基など）が含まれる。したがって、核酸は人工核酸であり得、これは限定されないが、ポリアミドもしくはペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルフォリノおよびロックド核酸（ＬＮＡ）、ならびにグリコール核酸（ＧＮＡ）およびトレオース核酸（ＴＮＡ）を含む。
【００５８】
核酸は、別の核酸配列と機能的な関係において配置されている場合、「動作可能に連結」されている。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは配列の転写に影響を与える場合、コード配列に動作可能に連結されている；または、リボソーム結合部位は翻訳を促進するように配置されている場合、コード配列に動作可能に連結されている。
【００５９】
本発明の文脈において、用語「オリゴヌクレオチド」は、最大で約５０ヌクレオチド（例えば２〜約５０ヌクレオチド長）の核酸配列を指す。
【００６０】
本発明の文脈において使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、約５０ヌクレオチド長よりも長い核酸（例えば５１以上のヌクレオチド長）を指す。
【００６１】
オリゴヌクレオチドおよびポリペプチドはあらゆる適切な方法（限定されないが、既存の配列もしくは天然配列の単離、ＤＮＡ複製もしくは増幅、逆転写、適切な配列のクローニングおよび制限消化、または（Narang et al. (Meth. Enzymol. 68:90-99, 1979)のホスホトリエステル法；Brown et al. (Meth. Enzymol. 68:109-151, 1979)のホスホジエステル法；Beaucage et al. (Tetrahedron Lett. 22:1859-1862, 1981)のジエチルホスホロアミダート法；Matteucci et al. (J. Am. Chem. Soc. 103:3185-3191, 1981)のトリエステル法；自動合成法；もしくは米国特許第4,458,066号の固相担体法、または当業者に公知の他の方法などの方法による）直接的な化学合成を含む）によって調製される。
【００６２】
本明細書において、用語「ベクター」は、細胞に導入でき、またはその中に含まれるタンパク質および／または核酸を細胞に導入できるタンパク質もしくはポリヌクレオチドまたはそれらの混合物を指す。ベクターの例には、限定されないが、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルスまたは人工染色体が含まれる。特に、ベクターは、対象の遺伝子産物（例えば、外来ＤＮＡまたは異種ＤＮＡなど）を適切な宿主細胞に輸送するために使用される。ベクターは、宿主細胞におけるベクターの自己複製を促進する「レプリコン」ポリヌクレオチド配列を含み得る。外来ＤＮＡは異種ＤＮＡとして定義され、これは宿主細胞において天然に見出されないＤＮＡであり、この宿主細胞は例えばベクター分子を複製し、選択可能またはスクリーニング可能なマーカーをコードし、または導入遺伝子をコードしている。宿主細胞に存在する場合、ベクターは宿主染色体ＤＮＡとは独立に、または宿主染色体ＤＮＡと同時に複製し得、ベクターおよびその挿入されたＤＮＡのいくつかのコピーが作成され得る。さらにベクターは、挿入されたＤＮＡのｍＲＮＡ分子への転写を可能にし、またはさもなければ挿入されたＤＮＡの複数のコピーのＲＮＡへの複製を生じるのに必要な要素を含み得る。ベクターはさらに、対象の遺伝子の発現を調節する「発現制御配列」を包含し得る。通常、発現制御配列はポリペプチドまたはポリヌクレオチド（限定されないが、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、インスレーターまたはリプレッサーなど）である。１以上の対象の遺伝子産物をコードする２以上のポリヌクレオチドを含むベクターにおいて、発現は１以上の発現制御配列によって共にまたは別々に制御され得る。より具体的には、ベクター上に含まれる各ポリヌクレオチドは別々の発現制御配列によって制御されてもよく、ベクター上に含まれる全てのポリヌクレオチドは単一の発現制御配列によって制御されてもよい。単一の発現制御配列によって制御される単一のベクター上に含まれるポリヌクレオチドは、オープンリーディングフレームを形成し得る。いくつかの発現ベクターは、発現したｍＲＮＡの半減期を増加させ、かつ／またはｍＲＮＡのタンパク質分子への翻訳を可能にする、挿入されたＤＮＡに隣接する配列要素をさらに含む。したがって、挿入されたＤＮＡによってコードされるｍＲＮＡおよびポリペプチドの多数の分子が迅速に合成され得る。
【００６３】
用語「アミノ酸」は一般に、未置換もしくは置換されたアミノ基、未置換もしくは置換されたカルボキシ基、および１以上の側鎖もしくは基、またはあらゆるこれらの基の類似体を含むあらゆるモノマー単位を指す。例示的な側鎖には、例えば、チオール、セレノ、スルホニル、アルキル、アリール、アシル、ケト、アジド、ヒドロキシル、ヒドラジン、シアノ、ハロ、ヒドラジド、アルケニル、アルキニル、エーテル、ホウ酸塩、ボロン酸塩、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、エステル、チオ酸、ヒドロキシルアミン、またはこれらの基のあらゆる組合せが含まれる。他の代表的なアミノ酸には、限定されないが、光活性化可能な架橋剤を含むアミノ酸、金属結合アミノ酸、スピン標識アミノ酸、蛍光アミノ酸、金属含有アミノ酸、新規官能基を有するアミノ酸、他の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用しているアミノ酸、光ケージされたアミノ酸および／または光異性化可能なアミノ酸、放射性アミノ酸、ビオチンまたはビオチン類似体を含むアミノ酸、グリコシル化アミノ酸、他の炭水化物で修飾されたアミノ酸、ポリエチレングリコールまたはポリエーテルを含むアミノ酸、重原子置換アミノ酸、化学的に切断可能なアミノ酸および／または光切断可能なアミノ酸、炭素結合糖(carbon-linked sugar)含有アミノ酸、レドックス活性アミノ酸、アミノチオ酸含有アミノ酸、ならびに１以上の毒性成分を含むアミノ酸が含まれる。本明細書において、用語「アミノ酸」は、以下の２０種の天然または遺伝的にコードされたアルファアミノ酸を含む：アラニン（ＡｌａまたはＡ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）、グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）、グリシン（ＧｌｙまたはＧ）、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、リジン（ＬｙｓまたはＫ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、スレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）、およびバリン（ＶａｌまたはＶ）。「Ｘ」残基が定義されていない場合、これらは「任意のアミノ酸」として定義されるべきである。これら２０種の天然アミノ酸の構造は、例えばStryer et al., Biochemistry, 5th ed., Freeman and Company (2002)に示されている。さらなるアミノ酸（セレノシステインおよびピロリジンなど）が遺伝的にコードされ得る（Stadtman (1996) "Selenocysteine," Annu Rev Biochem. 65:83-100およびIbba et al. (2002) "Genetic code: introducing pyrrolysine," Curr Biol. 12(13):R464-R466）。用語「アミノ酸」はまた、非天然アミノ酸、（例えば修飾された側鎖および／または骨格を有する）修飾アミノ酸、およびアミノ酸類似体を含む。例えば、Zhang et al. (2004) "Selective incorporation of 5-hydroxytryptophan into proteins in mammalian cells," Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101(24):8882-8887, Anderson et al. (2004) "An expanded genetic code with a functional quadruplet codon" Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101(20):7566-7571, Ikeda et al. (2003) "Synthesis of a novel histidine analogue and its efficient incorporation into a protein in vivo," Protein Eng. Des. Sel. 16(9):699-706, Chin et al. (2003) "An Expanded Eukaryotic Genetic Code," Science 301(5635):964-967, James et al. (2001) "Kinetic characterization of ribonuclease S mutants containing photoisomerizable phenylazophenylalanine residues," Protein Eng. Des. Sel. 14(12):983-991, Kohrer et al. (2001) "Import of amber and ochre suppressor tRNAs into mammalian cells: A general approach to site-specific insertion of amino acid analogues into proteins," Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98(25):14310-14315, Bacher et al. (2001) "Selection and Characterization of Escherichia coli Variants Capable of Growth on an Otherwise Toxic Tryptophan Analogue," J. Bacteriol. 183(18):5414-5425, Hamano-Takaku et al. (2000) "A Mutant Escherichia coli Tyrosyl-tRNA Synthetase Utilizes the Unnatural Amino Acid Azatyrosine More Efficiently than Tyrosine," J. Biol. Chem. 275(51):40324-40328, およびBudisa et al. (2001) "Proteins with {beta}-(thienopyrrolyl) alanines as alternative chromophores and pharmaceutically active amino acids," Protein Sci. 10(7):1281-1292参照。アミノ酸は併合され、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質になり得る。
【００６４】
本発明の文脈において、用語「ペプチド」は、ペプチド結合によって連結したアミノ酸の短いポリマーを指す。これはタンパク質と同一の化学結合（ペプチド結合）を有するが、一般に長さがより短い。最も短いペプチドはジペプチドであり、単一のペプチド結合によって結合した２つのアミノ酸からなる。トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチドなども存在し得る。通常、ペプチドは最大で８、１０、１２、１５、１８または２０アミノ酸長を有する。ペプチドは環状ペプチドでない限り、アミノ末端およびカルボキシ末端を有する。
【００６５】
本発明の文脈において、用語「ポリペプチド」はペプチド結合によって互いに結合したアミノ酸の単一の直鎖を指し、典型的に少なくとも約２１個のアミノ酸を含む。ポリペプチドは２以上の鎖から構成されるタンパク質の１つの鎖であり得、またはタンパク質が１つの鎖から構成される場合、タンパク質自体であり得る。
【００６６】
本発明の文脈において、タンパク質またはポリペプチドの「一次構造」は、ポリペプチド鎖のアミノ酸配列である。タンパク質の「二次構造」は、タンパク質の局所セグメントの一般的な３次元形状である。しかしながら、これは、三次構造が考慮される３次元空間における具体的な原子配置を記述しない。タンパク質において、二次構造は、骨格のアミド基とカルボキシ基との間の水素結合のパターンによって規定される。タンパク質の「三次構造」は、原子座標によって決定されるタンパク質の３次元構造である。「四次構造」は、マルチサブユニット複合体における複数のフォールドされた、またはコイル状のタンパク質分子またはポリペプチド分子の配置である。
【００６７】
本明細書における用語「フォールディング」または「タンパク質フォールディング」は、タンパク質がその３次元形状または立体構造をとるプロセスを指す（すなわち、これによりタンパク質は非共有結合性相互作用（限定されないが、水素結合、金属配位、疎水性力、ファンデルワールス力、π−π相互作用、および／または静電効果など）を介して特定の３次元形状を形成するように導かれる）。したがって、用語「フォールドされたタンパク質」は、その３次元形状（その二次構造、三次構造または四次構造など）のタンパク質を指す。
【００６８】
本明細書における用語「フラグメント」は、天然に存在するフラグメント（例えばスプライスバリアント）および人工的に作成されたフラグメント（特に遺伝子工学の手段によって取得されたフラグメント）を指す。通常、フラグメントは親のポリペプチドと比較して、そのＮ末端および／またはそのＣ末端および／または内部（好ましくはそのＮ末端、そのＮおよびＣ末端、またはそのＣ末端）において、最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０または３００アミノ酸の欠失を有する。
【００６９】
抗原決定基としても知られる「エピトープ」は、免疫系（具体的には抗体、Ｂ細胞またはＴ細胞）によって認識される高分子のセグメントである。そのようなエピトープは、抗体またはその抗原結合フラグメントに結合できる高分子の一部またはセグメントである。この文脈において、用語「結合」は好ましくは特異的結合に関する。本発明の文脈において、用語「エピトープ」は、免疫系によって認識されるタンパク質またはポリタンパク質のセグメントを指す。エピトープは通常、分子（アミノ酸または糖側鎖など）の化学的に活性な表面の基からなり、通常、特定の三次元構造の特徴および特定の電荷の特徴を有する。立体構造エピトープおよび非立体構造エピトープは、変性溶媒の存在下において立体構造エピトープへの結合は失われるが、非立体構造エピトープへの結合は失われない点で区別される。
【００７０】
本明細書において、「立体構造エピトープ」は、直鎖高分子（例えばポリペプチド）の３次元構造によって形成される、直鎖高分子のエピトープを指す。本願の文脈において、「立体構造エピトープ」は、「不連続エピトープ」（すなわち、高分子の一次配列（例えばポリペプチドのアミノ酸配列）における少なくとも２つの別々の領域から形成される高分子（例えばポリペプチド）上の立体構造エピトープ）である。換言すれば、エピトープが、本発明の結合部分（例えば抗体またはその抗原結合フラグメント）が同時に結合する一次配列中の少なくとも２つの別々の領域（これらは、本発明の結合部分が結合しない一次配列中のさらなる１つの領域によって分断されている）からなる場合、エピトープは本発明の文脈において「立体構造エピトープ」とみなされる。特に、このような「立体構造エピトープ」はポリペプチド上に存在し、一次配列中の２つの別々の領域は、本発明の結合部分（例えば抗体またはその抗原結合フラグメント）が結合する２つの別々のアミノ酸配列であり、これらの少なくとも２つの別々のアミノ酸配列は、本発明の結合部分が結合しない一次配列中のさらなる１つのアミノ酸配列によって分断されている。特に、分断しているアミノ酸配列は、結合部分が結合しない２以上のアミノ酸を含む連続したアミノ酸配列である。本発明の結合部分が結合する少なくとも２つの別々のアミノ酸配列は、その長さに関して特に限定されない。前記少なくとも２つの別々のアミノ酸配列内のアミノ酸の総数が、結合部分と立体構造エピトープとの間の特異的結合をもたらすのに十分大きい限り、このような別々のアミノ酸配列は単一のアミノ酸のみからなっていてもよい。
【００７１】
「パラトープ」は、エピトープを認識する抗体の一部である。本発明の文脈において、「パラトープ」は、エピトープを認識する本明細書に記載される結合部分（例えば抗体またはその抗原結合フラグメント）の一部である。
【００７２】
本発明の文脈において、「ペプチドリンカー」は、複合体の２つの部分または成分（例えば２つのペプチドまたはタンパク質）を立体的に分離するアミノ酸配列を指す。通常、このようなリンカーは１〜１００アミノ酸からなり、これは最小で少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０アミノ酸長、および最大で少なくとも１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６または１５アミノ酸長またはそれ未満を有する。本発明におけるペプチドリンカーの示される好ましい最小長および最大長は（そのような組合せが数学的意味を持つ場合に）組み合わされ得る（例えばこのようなリンカーは１〜１５または１２〜４０または２５〜７５または１〜１００アミノ酸からなり得る）。ペプチドリンカーはまた、連結されている２つの部分の間に柔軟性を与え得る。このような柔軟性は一般に、アミノ酸が小さい場合に増加する。したがって、柔軟なペプチドリンカーは、小さなアミノ酸（特にグリシンおよび／またはアラニン、および／または親水性アミノ酸（セリン、スレオニン、アスパラギンおよびグルタミンなど））の含有量の増加を含む。好ましくは、ペプチドリンカーのアミノ酸のうち２０％、３０％、４０％、５０％、６０％またはそれ以上が小さなアミノ酸である。
【００７３】
本明細書における用語「変異体」は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドが由来するポリペプチドまたはポリヌクレオチドと比較して、その長さまたは配列における１以上の変化により異なっているポリペプチドまたはポリヌクレオチドとして理解されるはずである。ポリペプチド変異体またはポリヌクレオチド変異体が由来するポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、親のポリペプチドまたはポリヌクレオチドとしても知られる。用語「変異体」は親分子の「フラグメント」または「誘導体」を含む。通常、「フラグメント」は親分子よりも長さまたはサイズが小さく、「誘導体」は親分子と比較してその配列において１以上の差異を示す。限定されないが、翻訳後修飾タンパク質(例えばグリコシル化、ビオチニル化、リン酸化、ユビキチン化、パルミトイル化、またはタンパク分解により切断されたタンパク質）および修飾核酸（メチル化ＤＮＡなど）などの修飾分子もまた包含される。種々の分子の混合物（限定されないが、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドなど）もまた、用語「変異体」に包含される。通常、変異体は（好ましくは遺伝子工学の手段によって）人工的に作成されるが、親のタンパク質またはポリヌクレオチドは野生型タンパク質もしくはポリヌクレオチドまたはその共通配列である。しかしながら、天然に存在する変異体もまた、本明細書における用語「変異体」に包含されることが理解されるはずである。さらに、本発明に使用できる変異体はまた、親分子の少なくとも１つの生物活性を示す（すなわち機能的に活性である）場合、親分子のホモログ、オルソログもしくはパラログ、または人工的に作成された変異体に由来し得る。
【００７４】
特に、用語「ペプチド変異体」、「ポリペプチド変異体」、「タンパク質変異体」は、それが由来するペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質と比較して、アミノ酸配列における１以上の変化によって異なっているペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質として理解されるはずである。ペプチド変異体、ポリペプチド変異体またはタンパク質変異体が由来するペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、親ペプチド、親ポリペプチドまたは親タンパク質としても知られている。さらに、本発明に使用できる変異体はまた、親ペプチド、親ポリペプチドまたは親タンパク質の少なくとも１つの生物活性を示す場合、親ペプチド、親ポリペプチドまたは親タンパク質のホモログ、オルソログもしくはパラログ、または人工的に作成された変異体に由来し得る。アミノ酸配列の変化は、アミノ酸交換、挿入、欠失、Ｎ末端切断もしくはＣ末端切断、またはこれらの変化のあらゆる組合せであり得、これは１つまたはいくつかの部位において生じ得る。ペプチド変異体、ポリペプチド変異体またはタンパク質変異体は、アミノ酸配列において最大で２００個（最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００個）の変化（すなわち、交換、挿入、欠失、Ｎ末端切断および／またはＣ末端切断）の総数を示し得る。アミノ酸交換は保存的および／または非保存的であり得る。あるいは、またはさらに、本明細書における「変異体」は、由来する親ペプチド、親ポリペプチドまたは親タンパク質とのある程度の配列同一性によって特徴付けられ得る。より正確には、本発明の文脈におけるペプチド変異体、ポリペプチド変異体またはタンパク質変異体は、その親ペプチド、親ポリペプチドまたは親タンパク質と少なくとも８０％の配列同一性を示す。ペプチド変異体、ポリペプチド変異体またはタンパク質変異体の配列同一性は、２０、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００またはそれ以上のアミノ酸の連続した区間にわたる。
【００７５】
「配列同一性の割合」は、比較窓を通して最適にアラインされた２つの配列を比較することによって決定され、ここで比較窓における配列の部分は、２つの配列の最適なアラインメントのために基準配列（これは付加または欠失を含まない）と比較して付加または欠失（すなわちギャップ）を含み得る。割合は、一致した位置の数を得るために両方の配列において同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が生じている位置の数を決定し、一致した位置の数を比較の窓における位置の総数で割り、結果に１００を掛けて配列同一性の割合を得ることによって算出される。
【００７６】
２以上の核酸配列またはポリペプチド配列の文脈における用語「同一」は、同一である（すなわち、ヌクレオチドまたはアミノ酸の同一の配列を含む）２以上の配列または部分配列を指す。比較窓、または以下の配列比較アルゴリズムのうち１つを用いて、もしくは手動のアラインメントおよび目視検査によって測定される指定された領域にわたって最大の一致のために比較およびアラインされた場合に、配列が特定の割合の同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基（例えば、特定の領域にわたって少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性）を有する場合、互いに「実質的に同一」である。これらの定義はまた、テスト配列の相補体を指す。したがって、用語「少なくとも８０％の配列同一性」はポリペプチドおよびポリヌクレオチドの配列比較に関して、本明細書のあらゆる箇所で使用される。この表現は好ましくは、各基準ポリペプチドまたは各基準ポリヌクレオチドとの少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を指す。
【００７７】
用語「配列比較」は、ある配列を基準配列として、テスト配列と比較させるプロセスを指す。配列比較アルゴリズムを用いる場合、テスト配列および基準配列をコンピュータに入力し、必要であれば部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムパラメータを指定する。初期設定のプログラムパラメータが一般的に使用され、または代替のパラメータが指定され得る。配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて基準配列に対するテスト配列の配列同一性または類似性の割合を計算する。２つの配列を比較し、基準配列が配列同一性の割合を計算すべき配列と比較して特定されていない場合、具体的な他の指示がなければ、配列同一性は比較される２つの配列のうちより長い配列を基準として計算されるべきである。
【００７８】
配列アラインメントにおいて、用語「比較窓」は、同数の位置を有する配列の連続した位置の基準区間と比較される、配列の連続した位置の区間を指す。選択される連続した位置の数は、１０〜１０００個の範囲であり得る（すなわち、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、または１０００個の連続した位置を含み得る）。通常、連続した位置の数は、約２０〜８００個の連続した位置、約２０〜６００個の連続した位置、約５０〜４００個の連続した位置、約５０〜約２００個の連続した位置、約１００〜約１５０個の連続した位置である。
【００７９】
比較のために配列をアラインメントする方法は当分野で周知である。例えば、Smith and Waterman (Adv. Appl. Math. 2:482, 1970)の局所相同性アルゴリズム、Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443, 1970)の相同性アラインメントアルゴリズム、Pearson and Lipman (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988)の類似性検索の方法、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実施（例えば、the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）、または手動のアラインメントおよび目視検査（例えばAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995 supplement)参照）によって、比較のための配列の最適なアラインメントが行われ得る。配列同一性の割合および配列類似性の割合を決定するのに適したアルゴリズムはＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらはそれぞれAltschul et al. (Nuc. Acids Res. 25:3389-402, 1977)およびAltschul et al. (J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990)に記述されている。ＢＬＡＳＴ解析を実行するためのソフトウェアは、国立生物工学情報センター(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)によって公開されている。このアルゴリズムは、検索配列中の長さＷの短い文字列を同定することによって高いスコアの配列対（ＨＳＰ）を最初に同定することを含み、これはデータベース配列中の同じ長さの文字列とアラインさせた場合に、ある正の閾値スコアＴに一致するか、またはこれを満たす。Ｔは近傍文字列スコア閾値(neighborhood word score threshold)と呼ばれる（Altschul et al.、上記）。これらの最初の近傍文字列ヒットは、これらを含むより長いＨＳＰを見出すための検索を開始するためのシードとして働く。文字列ヒットは、累積アラインメントスコアが増加され得る限り、各配列に沿って両方向に伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列について、パラメータＭ（一致する残基の対についての報酬スコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基についてのペナルティスコア；常に＜０）を用いて計算される。アミノ酸配列については、スコアマトリックスを用いて累積スコアが計算される。各方向における文字列ヒットの伸長は、以下の場合に停止する：累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Ｘ低下する場合；１以上の陰性スコア残基アラインメントの蓄積により、累積スコアが０以下になる場合；またはいずれかの配列の末端に達した場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。（ヌクレオチド配列用の）ＢＬＡＳＴＮプログラムは、文字列長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両鎖の比較を初期設定として使用する。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、文字列長３、期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアマトリックス(Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, 1989参照)アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を初期設定として使用する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計解析を実行する（例えば、Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-87, 1993参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される１つの類似性の尺度は最小和確率(smallest sum probability)（Ｐ（Ｎ））であり、���れは、２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列間の一致が偶然によって起こる確率の指標を与える。例えば、テスト核酸と基準核酸との比較における最小和確率が約０．２未満、典型的には約０．０１未満、より典型的には約０．００１未満である場合、核酸は基準配列と類似しているとみなされる。
【００８０】
アミノ酸が化学的に関連するアミノ酸に置換される、準保存的アミノ酸置換および特に保存的アミノ酸置換が好ましい。典型的な置換は、脂肪族アミノ酸間、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸間、酸性残基を有するアミノ酸間、アミド誘導体間、塩基性残基を有するアミノ酸間または芳香族残基を有するアミノ酸間の置換である。典型的な準保存的置換および保存的置換は以下である。
【表１】
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【００８１】
Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｖ、ＷまたはＹからＣへの交換は、新たなシステインが遊離チオールとして残る場合、準保存的である。さらに、当業者は、立体的に嵩高い位置におけるグリシンを置換すべきでなく、αヘリックス構造またはβシート構造を有するタンパク質の部分にＰを導入すべきでないことを認識している。
【００８２】
ＥＧＦ受容体ファミリーは４種のメンバーＥＧＦＲ（ｅｒｂＢ１、ＨＥＲ１）、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ＥｒｂＢ３（ＨＥＲ３）およびＥｒｂＢ４（ＨＥＲ４）を含む。受容体は、４つのドメイン（Ｉ〜ＩＶ）から構成される細胞外領域、膜貫通領域、ならびにチロシンキナーゼドメインおよびチロシン残基を含むカルボキシ末端鎖から構成される細胞内領域からなる(Baselga & Swain 2009, Novel anticancer targets: revisiting ErbB2 and discovering ErbB3. Nat. Rev. Cancer 9: 463-475)。細胞外ドメインＩおよびＩＩＩはリガンド結合に関与し、ドメインＩＩおよびＩＶは受容体の二量体化に関与している。ドメインＩＩは二量体化ループ（いわゆる二量体化アーム）を介して受容体−受容体接触を仲介する(Garrett et al., 2002, Combination of antibody that inhibits ligand-independent HER3 dimerization and a p110 alpha inhibitor potently blocks PI3K signaling and growth of HER2+ breast cancers. Cancer Res. 73: 6013-6023)。ＥＧＦリガンドファミリーに属する様々なリガンドが受容体に結合し得る。ＥＧＦ、形質転換増殖因子−α（ＴＧＦ−α）およびアンフィレグリンはＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ１に特異的に結合する。ベータセルリン（ＢＴＣ）、ヘパリン結合ＥＧＦ（ＨＢ−ＥＧＦ）およびエピレグリン（ＥＰＲ）は二重特異性を示し、ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ１およびＥｒｂＢ４の両方に結合する。ニューレグリン（ＮＲＧ）は、ＥｒｂＢ３およびＥｒｂＢ４（ＮＲＧ−１およびＮＲＧ−２）またはＥｒｂＢ４のみ（ＮＲＧ−３およびＮＲＧ−４）に結合するそれらの能力に基づいて２つのサブグループを形成する。いずれのリガンドもＥｒｂＢ２に結合しないが、ＥｒｂＢ２は他のあらゆるＥｒｂＢ受容体の好ましい二量体化パートナーである。ＥｒｂＢ３はキナーゼ活性を損なっており、ＥｒｂＢ受容体ファミリーの別のメンバーと二量体化する場合にのみシグナル伝達能を獲得する。ＥｒｂＢ受容体へのリガンド結合は大きな立体構造変化を誘導し、これは受容体ホモ二量体およびヘテロ二量体の形成ならびに内在性キナーゼドメインの活性化を導き、細胞質側末端における特定のチロシン残基のリン酸化をもたらす。これらのリン酸化された残基は、細胞内シグナル伝達分子のドッキング部位として働く。リガンドはリン酸化されたチロシン残基を確定させ、したがって補充されたシグナル伝達分子を確定させる。ＥｒｂＢの活性化によって刺激され得る３つの主要な経路：マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）経路、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）−ＡＫＴ経路、およびヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ−ＳＴＡＴ）経路。これらの経路は全て、細胞代謝、増殖および生存の調節に関与している(Hervent & De Keulenaer, 2012, Molecular mechanisms of cardiotoxicity induced by ErbB receptor inhibitor cancer therapeutics. Int. J. Mol. Sci. 13: 12268-12286)。
【００８３】
タグ（またはマーカーまたは標識）は、別の物質または物質の複合体の存在を示すことができるあらゆる種類の物質である。マーカーは、検出される物質に結合し、または該物質中に導入される物質であり得る。検出可能なマーカーは、例えば、タンパク質、酵素反応産物、二次メッセンジャー、ＤＮＡ、分子の相互作用などを検出するために、分子生物学およびバイオテクノロジーにおいて使用される。適切なタグまたは標識の例には、フルオロフォア、発色団、放射性標識、金属コロイド、酵素、または化学発光分子もしくは生物発光分子が含まれる。本発明の文脈において、適切なタグは好ましくはタンパク質タグであり、そのペプチド配列は組換えタンパク質中または上に遺伝的に移植される。タンパク質タグは、例えば、アフィニティータグ、可溶化タグ、クロマトグラフィータグ、エピトープタグまたは蛍光タグを包含し得る。
【００８４】
「アフィニティータグ」は、タンパク質をその未精製の生物学的供給源からアフィニティー技術を用いて精製できるように、タンパク質に付加される。これらには、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）が含まれる。ポリ（Ｈｉｓ）タグは、金属マトリックスに結合する広く使用されているタンパク質タグである。
【００８５】
「可溶化タグ」は、特にシャペロン欠損種において発現される組換えタンパク質のために使用され、タンパク質の適切なフォールディングを補助し、それらを沈殿しないようにする。これらにはチオレドキシン（ＴＲＸ）およびポリ（ＮＡＮＰ）が含まれる。いくつかのアフィニティータグ（ＭＢＰおよびＧＳＴなど）は、可溶化剤として二重の役割を有する。
【００８６】
「クロマトグラフィータグ」はタンパク質のクロマトグラフ特性を変化させ、特定の分離技術にわたって異なる分解能を与えるために使用される。しばしば、これらはポリアニオン性アミノ酸（ＦＬＡＧ−タグなど）からなる。
【００８７】
「エピトープタグ」は、高親和性抗体が多くの異なる種において確実に産生され得るために選択される短いペプチド配列である。これらは通常ウイルス遺伝子に由来し、これはその高い免疫反応性を説明する。エピトープタグには、Ｖ５タグ、ＭｙｃタグおよびＨＡタグが含まれる。これらのタグは、ウエスタンブロッティング法、免疫蛍光法および免疫沈降実験に特に有用であるが、抗体精製にも使用される。
【００８８】
「蛍光タグ」はタンパク質の視覚的読み取りを与えるために使用される。ＧＦＰおよびその変異体は最も一般的に使用されている蛍光タグである。ＧＦＰのより高度な応用には、（フォールドされている場合は蛍光性であるが、フォールドされていない場合は非蛍光性である）フォールディングレポーターとしての使用が含まれる。フルオロフォアのさらなる例には、フルオレセイン、ローダミンおよびスルホインドシアニン色素Ｃｙ５が含まれる。
【００８９】
本明細書において、用語「抗原結合タンパク質」は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分（すなわち、抗原に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子）を指す。例えば、標的分子または標的エピトープに特異的に結合するファージディスプレイを含む技術によって選択された免疫グロブリン様タンパク質もまた含まれる。抗原結合タンパク質（例えば、抗体またはその免疫学的に機能的なフラグメント）の結合および／または特異性の評価において、（例えば、インビトロでの競合結合アッセイにおいて測定されるように）過剰量の抗体がリガンドに結合している結合パートナーの量を少なくとも約１〜２０、２０〜３０％、３０〜４０％、４０〜５０％、５０〜６０％、６０〜７０％、７０〜８０％、８０〜８５％、８５〜９０％、９０〜９５％、９５〜９７％、９７〜９８％、９８〜９９％またはそれ以上減少させる場合、抗体またはフラグメントはリガンドとその結合パートナーとの結合を実質的に阻害し得る。中和能力はＩＣ５０値またはＥＣ５０値に関して記述され得る。
【００９０】
「ＩＣ５０」値は、物質の５０％阻害濃度(half maximal inhibitory concentration)を指し、したがって特定の生物学的機能または生化学的機能の阻害における物質の有効性の尺度である。この値は通常、モル濃度として表される。薬物のＩＣ５０は、用量反応曲線を作成し、試験する物質の阻害効果を種々の濃度において調べることによって、機能的拮抗アッセイにおいて決定され得る。あるいは、競合結合アッセイはＩＣ５０値を決定するために実行され得る。通常、抑制性抗体は、５０ｎＭ〜１ｐＭ（すなわち、５０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、９００ｐＭ、８００ｐＭ、７００ｐＭ、６００ｐＭ、５００ｐＭ、４００ｐＭ、３００ｐＭ、２００ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭ、１ｐＭ）のＩＣ５０値を示す。
【００９１】
「ＥＣ５０」値は、物質の５０％効果濃度(half maximal effective concentration)を指し、したがって、ベースラインと特定の曝露時間後の最大値の中間の反応を誘導する前記物質の濃度の尺度である。これは薬物の効力の尺度として一般に使用される。したがって、段階的用量反応曲線のＥＣ５０は、最大効果の５０％が観察される物質の濃度を表す。計数的(quantal)用量反応曲線のＥＣ５０は、特定の曝露期間後に集団の５０％が反応を示す化合物の濃度を表す。通常、抑制性抗体は、５０ｎＭ〜１ｐＭ（すなわち、５０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、９００ｐＭ、８００ｐＭ、７００ｐＭ、６００ｐＭ、５００ｐＭ、４００ｐＭ、３００ｐＭ、２００ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭ、または１ｐＭ）のＥＣ５０値を示す。
【００９２】
本発明における用語「結合」は、好ましくは特異的結合に関する。用語「結合親和性」は一般に、分子（例えば抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば標的または抗原）との間の非共有結合性相互作用の合計の強度を指す。他の指示がない限り、本明細書において「結合親和性」は、結合対（例えば抗体および抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのパートナーＹに対する親和性は、一般に解離定数（Ｋｄ）によって表され得る。「特異的結合」は、結合部分（例えば抗体）が標的（エピトープなど）により強く結合し、これが別の標的との結合と比較して特異的であることを意味する。結合部分が第２の標的についての解離定数（Ｋｄ）よりも低い解離定数で第１の標的と結合する場合、結合部分は第２の標的と比較して、第１の標的により強く結合する。結合部分が特異的に結合する標的についての解離定数（Ｋｄ）は、結合部分が特異的に結合しない標的についての解離定数（Ｋｄ）よりも、１０倍を超えて、好ましくは２０倍を超えて、より好ましくは５０倍を超えて、さらにより好ましくは１００倍、２００倍、５００倍または１０００倍を超えて小さい。
【００９３】
したがって、（「Ｍ」と省略されることがある「ｍｏｌ／Ｌ」において測定される）用語「Ｋｄ」は、結合部分（例えば抗体またはそのフラグメント）と標的分子（例えば抗原またはそのエピトープ）との間の特定の相互作用の解離平衡定数を指すことが意図される。親和性は当分野で公知の一般的な方法によって測定され得、これは限定されないが、表面プラズモン共鳴に基づくアッセイ（ＢＩＡｃｏｒｅアッセイなど）；水晶振動子マイクロバランスアッセイ（例えばＡｔｔａｎａアッセイ）；酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）；および競合アッセイ（例えばＲＩＡ）を含む。低親和性抗体は一般に、抗原に遅く結合し、容易に解離する傾向があり、高親和性抗体は抗原により迅速に結合し、より長期間結合し続ける傾向がある。結合親和性を測定する様々な方法が当分野で公知であり、これらのあらゆる方法が本発明の目的のために使用され得る。
【００９４】
通常、抗体はその標的に十分な結合親和性（例えば、５００ｎＭ〜１ｐＭ（すなわち、５００ｎＭ、４５０ｎＭ、４００ｎＭ、３５０ｎＭ、３００ｎＭ、２５０ｎＭ、２００ｎＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、９００ｐＭ、８００ｐＭ、７００ｐＭ、６００ｐＭ、５００ｐＭ、４００ｐＭ、３００ｐＭ、２００ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭ、または１ｐＭ）のＫｄ値）を伴って結合する。
【００９５】
同一のエピトープに対して競合する抗原結合タンパク質（例えば、中和抗原結合タンパク質または中和抗体）の文脈において使用される場合、用語「競合する」は、テストされる抗原結合タンパク質（例えば、抗体またはその免疫学的に機能的なフラグメント）が、基準抗原結合タンパク質（例えば、リガンドまたは基準抗体）と共通の抗原との特異的結合を妨げ、または阻害する（例えば減少させる）アッセイによって決定された、抗原結合タンパク質間の競合を意味する。多数の種類の競合結合アッセイが、ある抗原結合タンパク質が別の抗原結合タンパク質と競合するか否かを決定するのに使用され得る（例えば：固相直接または間接ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相直接または間接酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（例えば、Stahli et al., 1983, Methods in Enzymology .2:242-253参照）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（例えば、Kirkland et al., 1986, J. Immunol. 137:3614-3619参照）；固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ（例えば、Harlow and Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press参照）；Ｉ−１２５標識を用いた固相直接標識ＲＩＡ（例えば、Morel et al., 1988, Molec. Jmmunol. 25:7-15参照）；固相直接ビオチンアビジンＥＩＡ（例えば、Cheung, et al., 1990, Virology 176:546-552参照）；および直接標識ＲＩＡ(Moldenhauer et al., 1990, Scand. J Immunol. 32:77-82)）。通常、このようなアッセイは、これらの非標識テスト抗原結合タンパク質および標識基準抗原結合タンパク質のいずれかを有する固相表面または細胞に結合した精製抗原の使用を含む。競合阻害は、テスト抗原結合タンパク質の存在下において、固相表面または細胞に結合した標識の量を決定することによって測定される。通常、テスト抗原結合タンパク質は過剰に存在する。競合アッセイによって同定された抗原結合タンパク質（競合する抗原結合タンパク質）は、基準抗原結合タンパク質と同一のエピトープに結合する抗原結合タンパク質、および基準抗原結合タンパク質によって結合されるエピトープと立体障害が生じるほど十分近位にある隣接エピトープに結合する抗原結合タンパク質を含む。競合結合を決定する方法に関するさらなる詳細が本明細書の実施例において提供される。通常、競合する抗原結合タンパク質が過剰に存在する場合、これは基準抗原結合タンパク質と共通抗原との特異的結合を少なくとも４０〜４５％、４５〜５０％、５０〜５５％、５５〜６０％、６０〜６５％、６５〜７０％、７０〜７５％、または７５％以上阻害する（例えば減少させる）。例えば、結合は、少なくとも８０〜８５％、８５〜９０％、９０〜９５％、９５〜９７％、または９７％以上阻害される。
【００９６】
本明細書における用語「免疫グロブリン（Ｉｇ）」は、免疫グロブリンスーパーファミリーの免疫を与える糖タンパク質を指す。「表面免疫グロブリン」はその膜貫通領域によってエフェクター細胞の膜に付着し、限定されないが、Ｂ細胞受容体、Ｔ細胞受容体、クラスＩおよびＩＩ主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）タンパク質、β２ミクログロブリン(β２Ｍ)、ＣＤ３、ＣＤ４およびＣＤ８などの分子を包含する。
【００９７】
通常、本明細書における用語「抗体」は膜貫通領域を持たない分泌型免疫グロブリンを指し、したがって血流および体腔に放出され得る。ヒト抗体はそれらが有する重鎖に基づいて種々のアイソタイプに分類される。ギリシャ文字で示される５種類のヒトＩｇ重鎖が存在する；α、γ、δ、εおよびμ。現在の重鎖の種類は抗体のクラスを規定する（すなわち、これらの鎖はそれぞれＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ抗体において見出され、それぞれが異なる役割を果たし、異なる種類の抗原に対して適切な免疫応答を導く）。別々の重鎖はサイズおよび構成が異なり、約４５０アミノ酸を含み得る(Janeway et al. (2001) Immunobiology, Garland Science)。ＩｇＡは粘膜領域（腸、気道および尿生殖路など）ならびに唾液、涙液および母乳において見出され、病原体の定着を防ぐ(Underdown & Schiff (1986) Annu. Rev. Immunol. 4:389-417)。ＩｇＤは、抗原に曝露されたことがないＢ細胞上の抗原受容体として主に機能し、好塩基球および肥満細胞を活性化して抗菌因子を産生することに関与している(Geisberger et al. (2006) Immunology 118:429-437; Chen et al. (2009) Nat. Immunol. 10:889-898)。ＩｇＥは、肥満細胞および好塩基球からのヒスタミンの放出をもたらす、アレルゲンとの結合によるアレルギー反応に関与している。ＩｇＥはまた、寄生虫に対する保護にも関与している(Pier et al. (2004) Immunology, Infection, and Immunity, ASM Press)。ＩｇＧは侵入病原体に対する抗体に基づく免疫の大部分を提供し、胎盤を通過して胎児に受動免疫を与えることができる唯一の抗体アイソタイプである(Pier et al. (2004) Immunology, Infection, and Immunity, ASM Press)。ヒトには４種のＩｇＧサブクラス（ＩｇＧ１、２、３および４）が存在し、これらは血清中の存在量の順に命名され、ＩｇＧ１が最も豊富であり（約６６％）、次いでＩｇＧ２（約２３％）、ＩｇＧ３（約７％）およびＩｇＧ４（約４％）である。種々のＩｇＧクラスの生物学的プロファイルはそれぞれのヒンジ領域の構造によって決定される。ＩｇＭは、単量体型および非常に高い結合活性を持つ分泌される五量体型においてＢ細胞の表面上に発現する。ＩｇＭは、十分なＩｇＧが産生される前に、Ｂ細胞媒介性（体液性）免疫の初期段階において病原体を排除することに関与している(Geisberger et al. (2006) Immunology 118:429-437)。抗体は単量体として見出されるだけでなく、２つのＩｇ単位の二量体（例えばＩｇＡ）、４つのＩｇ単位の四量体（例えば硬骨魚のＩｇＭ）、または５つのＩｇ単位の五量体（例えば哺乳類ＩｇＭ）を形成することも知られている。抗体は通常、ジスルフィド結合によって連結した２つの同一の重鎖および２つの同一の軽鎖を含む４つのポリペプチド鎖から構成され、「Ｙ」字型の高分子のようである。各鎖は多くの免疫グロブリンドメインを含み、そのうちのいくつかは定常ドメインであり、その他は可変ドメインである。免疫グロブリンドメインは、２つのβシートに配置された７〜９個の逆平行β鎖間の２層のサンドイッチからなっている。通常、抗体の重鎖は４つのＩｇドメインを含み、そのうち３つは定常ドメイン（ＣＨドメイン：ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）であり、１つは可変ドメイン（ＶＨ）である。軽鎖は通常、１つの定常Ｉｇドメイン（ＣＬ）および１つの可変Ｉｇドメイン（ＶＬ）を含む。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、より保存された領域（フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる）が散在している、超可変領域（相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる）にさらに細分され得る。各ＶＨおよびＶＬは３つのＣＤＲおよび４つのＦＲで構成され、これらはアミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順番で配置される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫グロブリンの宿主組織または因子（免疫系の様々な細胞（例えばエフェクター細胞）および古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む）との結合を仲介し得る。
【００９８】
本明細書において、抗体の用語「抗原結合フラグメント」（または単に「結合部分」）は、抗原に特異的に結合する能力を保持している抗体の１以上のフラグメントを指す。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体のフラグメントによって果たされ得ることが示されている。
【００９９】
本明細書において、「ヒト抗体」はヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来の可変領域および定常領域を有する抗体を含む。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基（例えば、インビトロにおけるランダム変異もしくは部位特異的変異、またはインビボにおける体細胞変異によって導入される変異）を含み得る。本発明のヒト抗体は、ヒト免疫グロブリンライブラリーから、または（例えばKucherlapati & Jakobovitsによって米国特許第５，９３９，５９８号に記載される）内在性免疫グロブリンを発現しない、１以上のヒト免疫グロブリンを遺伝子導入した動物から単離される抗体を含む。
【０１００】
本明細書における用語「モノクローナル抗体」は、単一分子組成の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性および親和性を示す。ある実施態様において、モノクローナル抗体は、不死化細胞と融合した、非ヒト動物（例えばマウス）から得られたＢ細胞を含むハイブリドーマによって産生される。
【０１０１】
本明細書において、用語「組換え抗体」は、組換え手段によって調製、発現、作成または単離されたあらゆる抗体（（ａ）免疫グロブリン遺伝子に関してトランスジェニックもしくはトランスクロモソーマル(transchromosomal)である動物（例えばマウス）またはそれから調製されるハイブリドーマから単離された抗体、（ｂ）抗体を発現するように形質転換された宿主細胞（例えばトランスフェクトーマ(transfectoma)）から単離された抗体、（ｃ）組換えコンビナトリアル抗体ライブラリーから単離された抗体、および（ｄ）免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む他のあらゆる手段によって調製、発現、作成または単離された抗体など）を含む。
【０１０２】
用語「キメラ抗体」は、重鎖および軽鎖の各アミノ酸配列の一部が、特定の種由来の抗体または特定のクラスに属する抗体の対応する配列に対して相同であり、該鎖の残りのセグメントが別の種またはクラスの対応する配列に対して相同である抗体を指す。通常、軽鎖および重鎖の両方の可変領域は、哺乳類のある種に由来する抗体の可変領域を模倣しており、定常部分は別の種に由来する抗体の配列に対して相同である。このようなキメラ型の１つの明らかな利点は、その可変領域が、非ヒト宿主生物から容易に入手可能なＢ細胞またはハイブリドーマを用いた現在公知の供給源から、例えばヒト細胞調製物由来の定常領域と組み合わせて都合良く取得できることである。可変領域は調製し易いという利点を有しており、その特異性は供給源によって影響されない。ヒトの定常領域は、非ヒト供給源由来の定常領域よりも、抗体を注入した場合にヒト対象からの免疫応答を誘発する可能性が低い。しかしながら、この定義はこの特定の例に限定されない。
【０１０３】
用語「ヒト化抗体」は、非ヒト種由来の免疫グロブリンに実質的に由来する抗原結合部位を有する分子を指し、ここでこの分子の残りの免疫グロブリン構造はヒト免疫グロブリンの構造および／または配列に基づく。抗原結合部位は、定常ドメイン上に融合された完全な可変ドメイン、または可変ドメインにおける適切なフレームワーク領域上に移植された相補性決定領域（ＣＤＲ）のみのいずれかを含み得る。抗原結合部位は野生型であってもよく、または１以上のアミノ酸置換によって修飾されていてもよい（例えば、ヒト免疫グロブリンにより類似するように修飾されていてもよい）。いくつかの形態のヒト化抗体は全てのＣＤＲ配列を保存している（例えば、マウス抗体由来の６つのＣＤＲを全て含むヒト化マウス抗体）。他の形態は、元の抗体に対して変更された１以上のＣＤＲを有する。
【０１０４】
Almagro & Fransson, 2008（この内容は参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）によって概説されるように、抗体をヒト化する種々の方法が当業者に公知である。Almagro & Franssonによる総説を以下に簡潔に要約する。Almagro & Franssonは、理論的手法と経験的手法とを区別している。理論的手法は、改変した抗体の僅かな変異体を作成し、対象の結合または他のあらゆる性質を評価することを特徴とする。設計された変異体が期待される結果をもたらさない場合、設計および結合評価の新たなサイクルが開始される。理論的手法は、ＣＤＲグラフティング、リサーフェシング(Resurfacing)、超ヒト化(Superhumanization)およびヒトストリング含有量最適化（Human String Content Optimization）を含む。対照的に、経験的手法は、ヒト化変異体の大規模ライブラリの作成、および濃縮技術またはハイスループットスクリーニングを用いた最良のクローンの選択に基づく。したがって、経験的手法は、抗体変異体の広大な空間全体にわたって探索できる、信頼性のある選択および／またはスクリーニングシステムに依存している。インビトロでのディスプレイ技術（ファージディスプレイおよびリボソームディスプレイなど）はこれらの要求を満たし、当業者に周知である。経験的手法は、ＦＲライブラリー、誘導選択(Guided selection)、フレームワークシャッフリング(Framework-shuffling)およびヒューマニアリング(Humaneering)を含む。
【０１０５】
「二価抗体」は２つの抗原結合部位を含む。二価抗体は単一特異性または二重特異性であり得る。二価抗体が単一特異性である場合、抗体の２つの結合部位は同一の抗原特異性を有する。「二重特異性」または「二機能性」抗原結合タンパク質または抗体は、２つの異なる抗原結合部位を有するハイブリッド抗原結合タンパク質またはハイブリッド抗体である。二重特異性抗原結合タンパク質または二重特異性抗体の２つの結合部位は、同一の抗原上または異なる抗原上のいずれかに存在する２つの異なるエピトープに結合する。二重特異性抗原結合タンパク質または二重特異性抗体は、多特異性抗原結合タンパク質または多特異性抗体の一種であり、様々な方法（限定されないが、ハイブリドーマの融合、ＩｇＧもしくはＩｇＧフラグメント（Ｆａｂ’など）の化学結合、または遺伝的手段による方法を含む）によって作成され得る。例えば、Songsivilai and Lachmann, 1990, Clin. Exp. lmmunol. 79:315-321; Kostelny et al., 1992, J. lmmunol. 148:1547-1553; Kontermann, 2014, MAbs 4:182-197参照。
【０１０６】
「三機能性抗体」は、異なる抗原を標的とする２つの結合部位、およびアクセサリー細胞（例えば、単球／マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞または他の細胞）上のＦｃ受容体に結合できる無傷のＦｃ部分を含む二重特異性抗体の一種である。例えば、三機能性抗体はがん細胞の表面上のエピトープを標的とする結合部位を含み得、第２の結合部位はＴ細胞の表面（例えばＣＤ３）上のエピトープを標的とし得、Ｆｃ部分はマクロファージの表面上のＦｃ受容体に結合し得る。したがって、このような三機能性抗体はＴ細胞およびマクロファージを腫瘍細胞に連結でき、これは腫瘍細胞の破壊を導く。
【０１０７】
抗体のパパイン消化は、それぞれが単一の抗原結合部位を有する「Ｆａｂフラグメント」（「Ｆａｂ部分」または「Ｆａｂ領域」とも呼ばれる）と呼ばれる２つの同一の抗原結合フラグメント、およびその名前が容易に結晶化する能力を反映している残りの「Ｆｅフラグメント」（「Ｆｅ部分」または「Ｆｅ領域」とも呼ばれる）を生成する。ヒトＩｇＧ Ｆｅ領域の結晶構造が決定されている(Deisenhofer (1981) Biochemistry 20:2361-2370)。ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＤアイソタイプにおいて、Ｆｅ領域は２つの同一のタンパク質フラグメントから構成され、これらは抗体の２つの重鎖のＣＨ２およびＣＨ３ドメインに由来する；ＩｇＭおよびＩｇＥアイソタイプにおいて、Ｆｅ領域は各ポリペプチド鎖における３つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ２〜４）を含む。さらに、より小さな免疫グロブリン分子が天然に存在し、または人工的に作成されている。用語「Ｆａｂ’フラグメント」はＩｇ分子のヒンジ領域をさらに含むＦａｂフラグメントを指し、「Ｆ（ａｂ’）２フラグメント」は、化学的に結合されているか、またはジスルフィド結合によって連結されているかのいずれかである２つのＦａｂ’フラグメントを含むことが理解される。「単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）」(Desmyter et al. (1996) Nat. Structure Biol. 3:803-811)および「ナノボディ」は単一のＶＨドメインのみを含むが、「単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）」フラグメントは、軽鎖可変ドメインと短いリンカーペプチドを介して連結された重鎖可変ドメインを含む(Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5879-5883)。二価単鎖可変フラグメント（ｄｉ−ｓｃＦｖ）は、２つのｓｃＦｖ（ｓｃＦｖＡ−ｓｃＦｖＢ）を連結することによって設計され得る。これは２つのＶＨ領域および２つのＶＬ領域を含む単一のペプチド鎖を作成することによって行われ得、「タンデムｓｃＦｖ」（ＶＨＡ−ＶＬＡ−ＶＨＢ−ＶＬＢ）を生じる。別の可能性は、２つの可変領域が共にフォールドするには短すぎるリンカーを含むｓｃＦｖの作成であり、これはｓｃＦｖが二量体化することを強いる。通常、５残基長のリンカーがこれらの二量体を生成するのに使用される。この種類は「ダイアボディ(diabody)」として知られる。ＶＨドメインとＶＬドメインとの間のさらに短いリンカー（１または２アミノ酸）は、単一特異性三量体（いわゆる「トリアボディ」または「トリボディ(tribady)」）の形成を導く。二重特異性ダイアボディは、それぞれＶＨＡ−ＶＬＢおよびＶＨＢ−ＶＬＡまたはＶＬＡ−ＶＨＢおよびＶＬＢ−ＶＨＡの配置を有する鎖を発現することによって形成される。単鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）は、１２〜２０アミノ酸（好ましくは１４アミノ酸）のリンカーペプチド（Ｐ）によって連結されたＶＨＡ−ＶＬＢおよびＶＨＢ−ＶＬＡフラグメント（ＶＨＡ−ＶＬＢ−Ｐ−ＶＨＢ−ＶＬＡ）を含む。「二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）」は、異なる抗体の２つのＳｃＦｖからなる融合タンパク質であり、ｓｃＦｖのうち一方がＣＤ３受容体を介してＴ細胞に結合し、他方は腫瘍特異的分子を介して腫瘍細胞に結合する(Kufer et al. (2004) Trends Biotechnol. 22:238-244)。二重親和性再標的化分子(Dual affinity retargeting molecule)（「ＤＡＲＴ」分子）は、Ｃ末端ジスルフィド架橋によってさらに安定化されたダイアボディである。二価単鎖可変フラグメントは１以上のホモまたはヘテロ二量体化ドメインと連結され得、四価、六価、八価の分子またはさらに高い価数の分子を作成し得る。１以上のホモまたはヘテロ二量体化ドメインを介して連結された単鎖可変フラグメントのそれぞれの特異性に依存して、得られた二量体タンパク質または多量体タンパク質は二重、三重、四重またはそれ以上の特異性を有する。
【０１０８】
本明細書に記述される抗体は好ましくは単離されている。本明細書において、「単離抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指すことが意図される。さらに、単離抗体は他の細胞性物質および／または化学物質を実質的に含まなくてもよい。本発明のある実施態様において、「単離された」モノクローナル抗体の組合せは、種々の特異性を有し、明確に規定された組成で組み合わされた抗体に関する。
【０１０９】
本明細書において、用語「抗体様タンパク質」は、標的分子に特異的に結合するように（例えばループの変異によって）設計されているタンパク質を指す。通常、このような抗体様タンパク質は、両端がタンパク質骨格と結合している少なくとも１つの可変ペプチドループを含む。この二重の構造的制約は、抗体様タンパク質の結合親和性を抗体の結合親和性に匹敵するレベルまで大幅に増加させる。可変ペプチドループの長さは通常、１０〜２０アミノ酸からなる。骨格タンパク質は、良好な溶解特性を有するあらゆるタンパク質であり得る。好ましくは、骨格タンパク質は小さい球状タンパク質である。抗体様タンパク質は、アフィボディ(affibody)、アンチカリン(anticalin)、および設計されたアンキリンリピートタンパク質（概説に関してはBinz H.K. et al. (2005) Engineering novel binding proteins from nonimmunoglobulin domains. Nat. Biotechnol. 23(10):1257-1268参照）を含むがこれらに限定されない。抗体様タンパク質は、変異体の大規模ライブラリー由来であってもよく（例えば大規模ファージディスプレイライブラリーからパニング(panned)されてもよい）、通常の抗体と同様に単離されてもよい。また、抗体様結合タンパク質は、球状タンパク質の表面露出残基のコンビナトリアル変異によって取得され得る。抗体様タンパク質は「ペプチドアプタマー」と呼ばれることもある。
【０１１０】
本明細書において、「ペプチド模倣物」は、ペプチドを模倣するように設計された小さいタンパク質様の鎖である。ペプチド模倣物は通常、分子の性質を変化させるための既存のペプチドの修飾によって生じる。例えば、ペプチド模倣物は、分子の安定性または生物活性を変化させる修飾によって生じ得る。これは既存のペプチドからの薬物様化合物の開発に関与し得る。これらの修飾は天然に存在しないペプチドへの変化（骨格の変化および非天然アミノ酸の組込みなど）を含む。
【０１１１】
用語「標的」は、抗原結合タンパク質が結合できる分子または分子の一部を指す。ある実施態様において、標的は１以上のエピトープを有し得る。ある実施態様において、標的は抗原である。語句「抗原結合タンパク質」における「抗原」の使用は、抗原を含むタンパク質配列が抗体によって結合され得ることを単に意味する。この文脈において、タンパク質が外来性であること、またはタンパク質が免疫応答を誘導できることは必要とされない。
【０１１２】
用語「組換え体」は、組換え法によって意図的に修飾されているアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を指す。本明細書における用語「組換え核酸」は、インビトロで形成される（例えばエンドヌクレアーゼによってさらに操作され、天然には通常見出されない核酸分子を形成する）核酸を指す。例示的な組換え核酸は、直鎖状のｃＤＮＡ、および通常連結されていないＤＮＡ分子を連結することによってインビトロで形成されたベクターを含む。組換え核酸が作製され、宿主細胞中に導入されると、組換え核酸は非組換え的に（すなわち、インビトロでの操作ではなくインビボでの宿主細胞の細胞機構を用いて）複製する。したがって、組換えで作製された核酸は、その後非組み換え的に複製され得る。「組換えタンパク質」は、組み換え技術を用いて（例えば、上記で示された組換え核酸の発現によって）作製されたタンパク質である。本明細書における用語「組換えベクター」は当業者に公知のあらゆるベクターを含み、プラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクター（ラムダファージなど）、ウイルスベクター（アデノウイルスまたはバキュロウイルスベクターなど）、または人工染色体ベクター（細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、またはＰ１人工染色体（ＰＡＣ）など）を含む。前記ベクターは発現ベクターおよびクローニングベクターを含む。発現ベクターはプラスミドベクターおよびウイルスベクターを含み、一般に所望のコード配列、および特定の宿主生物（例えば、細菌、酵母、植物、昆虫または哺乳類）またはインビトロでの発現系において動作可能に結合されたコード配列の発現に必要な適切なＤＮＡ配列を含む。クローニングベクターは通常、特定の所望のＤＮＡフラグメントを設計および増幅するのに使用され、所望のＤＮＡフラグメントの発現に必要とされる機能的配列を持たない場合がある。
【０１１３】
用語「宿主細胞」は、ベクター（例えばプラスミドまたはウイルス）を保有する細胞を指す。このような宿主細胞は、原核細胞（例えば細菌細胞）または真核細胞（例えば真菌、植物または動物細胞）のいずれかであり得る。宿主細胞には、単細胞原核生物および単細胞真核生物（例えば、細菌、酵母および放線菌）の両方、ならびに細胞培養で増殖させる場合には高次植物または動物由来の単細胞が含まれる。本明細書において、「組換え宿主細胞」は、対象のポリペプチドフラグメント（すなわち、本発明におけるウイルスＰＡサブユニットのフラグメントまたはその変異体）をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を指す。このポリヌクレオチドは宿主細胞の内部で見出され得、（ｉ）それ自体が自由に分散してい得るか、（ｉｉ）組換えベクターに組み込まれてい得るか、または（ｉｉｉ）宿主細胞ゲノムもしくはミトコンドリアＤＮＡに組み込まれてい得る。組換え細胞は、対象のポリヌクレオチドの発現のために、または本発明のポリヌクレオチドもしくは組換えベクターの増幅のために使用され得る。用語「組換え宿主細胞」は、本発明のポリヌクレオチドまたは組換えベクターで形質転換、遺伝子導入、または感染させた元の細胞の子孫を含む。組換え宿主細胞は、細菌細胞（大腸菌細胞など）、酵母細胞（出芽酵母またはピキア・パストリスなど）、植物細胞、昆虫細胞（ＳＦ９もしくはＨｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞など）または哺乳動物細胞であり得る。哺乳類細胞の好ましい例は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、アフリカミドリザル(green African monkey)腎臓（ＣＯＳ）細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞、およびＨＥＬＡ細胞などである。
【０１１４】
用語「個体」、「対象」または「患者」は本明細書において互換的に使用され、本発明から恩恵を受け得るあらゆる哺乳類、爬虫類または鳥類を指す。特に、個体は、実験動物（例えば、マウス、ラットまたはウサギ）、家畜（例えば、モルモット、ウサギ、ウマ、ロバ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ニワトリ、アヒル、ラクダ、ネコ、イヌ、カメ、ヘビまたはトカゲ）、または霊長類（チンパンジー、ボノボ、ゴリラおよびヒトを含む）からなる群から選択される。特に「個体」はヒトである。
【０１１５】
用語「疾患」および「障害」は本明細書において互換的に使用され、異常状態（特に病気または傷害などの異常な病状）を指し、組織、臓器または個体はもはやその機能を効率的に果たすことができない。通常、必ずではないが、疾患は、そのような疾患の存在を示す特定の症状または徴候に関連している。したがって、そのような症状または徴候の存在は、疾患に罹患した組織、臓器または個体を示し得る。これらの症状または徴候の変化は、そのような疾患の進行を示し得る。疾患の進行は通常、疾患の「悪化」または「改善」を示し得るそのような症状または徴候の増加または減少によって特徴付けられる。疾患の「悪化」は、組織、臓器または生物がその機能を効率的に果たす能力の減少によって特徴付けられ、疾患の「改善」は、組織、臓器または個体がその機能を効率的に果たす能力の増加によって通常特徴付けられる。疾患が「発生するリスク」がある組織、臓器または個体は健常状態にあるが、疾患が発生する可能性を示す。通常、疾患が発生するリスクは、そのような疾患の早期または弱い徴候または症状に関連する。そのような場合、疾患の発症は未だ処置によって予防され得る。疾患の例には、限定されないが、感染症、外傷性疾患、炎症性疾患、皮膚疾患、内分泌疾患、腸疾患、神経障害、関節疾患、遺伝性障害、自己免疫疾患、および様々な種類のがんが含まれる。 
【０１１６】
「腫瘍」は、急速で無制限な細胞増殖によって増殖し、新たな増殖を開始させる刺激が止まった後も成長し続ける異常な細胞または組織の群を意味する。腫瘍は、正常組織による構造的機構および機能的協調の部分的または完全な欠如を示し、通常、良性または悪性のいずれかであり得る明確な組織の塊を形成する。
【０１１７】
「転移」は、身体の元の部位から別の部分へのがん細胞の拡散を意味する。転移の形成は非常に複雑なプロセスであり、原発腫瘍からの悪性細胞の解離、細胞外マトリクスの浸潤、体腔および血管に進入するための内皮基底膜の浸透、ならびに血液によって輸送された後における標的臓器の浸潤に依存する。最終的に、標的部位における新たな腫瘍の増殖は血管新生に依存する。腫瘍細胞または腫瘍成分は残存して転移能を発達させ得るため、腫瘍の転移は多くの場合、原発腫瘍の除去後にさえ起こる。ある実施態様において、本発明における用語「転移」は、原発腫瘍および局所リンパ節系から離れた転移に関する「遠隔転移」に関する。
【０１１８】
疾患または障害の「症状」は、そのような疾患または障害を有する組織、臓器または生物に顕著な疾患または障害の影響であり、限定されないが、組織、臓器または個体の疼痛、衰弱、圧痛、緊張、硬直およびけいれん、ならびに特定の指標（バイオマーカーまたは分子マーカーなど）の存在、非存在、増加、減少を含む。本明細書における用語「疾患」および「障害」は異常状態（特に病気または傷害などの異常な病状）を指し、組織、臓器または個体はもはやその機能を効率的に果たすことができない。通常、必ずではないが、疾患または障害は、そのような疾患または障害の存在を示す特定の症状または徴候に関連している。疾患または障害は限定されないが、自己免疫疾患、アレルギー性疾患、がんの種類の疾患、皮膚疾患、内分泌疾患、血液の疾患および障害、眼の疾患および障害、遺伝性障害、炎症性疾患、感染症、腸疾患、神経障害および精神疾患を含む。例示的ながんの種類の疾患には、限定されないが、基底細胞がん、膀胱がん、骨がん、脳腫瘍、乳がん、バーキットリンパ腫、子宮頸がん、結腸がん、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、食道がん、網膜芽細胞腫、胃がん、消化管間質腫瘍、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、カポジ肉腫、白血病、リンパ腫、黒色腫、中咽頭がん、卵巣がん、膵がん、胸膜肺芽腫、前立腺がん、咽喉がん、甲状腺がんおよび尿道がんが含まれる。
【０１１９】
本明細書において、疾患または障害の「処置する」、「処置している」、「処置」または「治療」は、以下のうち１つ以上を達成することを意味する：（ａ）障害の重症度を減少させること；（ｂ）処置される障害に特徴的な症状の発症を制限または予防すること；（ｃ）処置される障害に特徴的な症状の悪化を抑制すること；（ｄ）以前に障害を有していた個体における障害の再発を制限または予防すること；および（ｅ）以前に障害の症状を示した個体における症状の再発を制限または予防すること。したがって、治療効果を有する成分は上記で指定された効果（ａ）〜（ｅ）のうち１つ以上を達成することによって、疾患または障害の症状を処置する。
【０１２０】
本明細書において、疾患または障害の「予防する」、「予防している」、「予防」または「予防法」は、そのような疾患または障害が患者に生じることを予防することを意味する。
【０１２１】
「薬学的に許容され得る」とは、連邦政府もしくは州政府の監督官庁によって承認されていること、または米国薬局方もしくは動物（特にヒト）における使用のための一般的に認められた他の薬局方に記載されていることを意味する。
【０１２２】
本明細書における用語「薬学的に活性な部分」は、高分子または複合体（すなわち、ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはその複合体）の一部または部分を指すことが理解され、これは薬理効果（限定されないが、予防効果、治療効果および／または診断効果を含む）を媒介する。薬学的に活性な部分は通常、生物学的医薬品および／または化学的医薬品（例えば、リガンド、エフェクター分子、半減期延長モジュールおよび造影分子）を含む。用語「リガンド」は別の分子と複合体を形成し、特定の生物学的機能を果たす化学物質または生物学的物質を指す。リガンドには、限定されないが、基質、阻害剤および活性化剤（抗原結合分子、足場タンパク質、天然リガンド、リガンド結合受容体フラグメントおよびアプタマーなど）が含まれる。用語「エフェクター分子」は通常、タンパク質に結合し、それによりタンパク質の活性を変化させる小分子、ペプチドまたはポリペプチドを指す。エフェクター分子には、限定されないが、サイトカイン、ケモカイン、免疫（共）刺激分子、免疫抑制分子、デスリガンド、アポトーシス誘導タンパク質、キナーゼ、プロドラッグ変換酵素、ＲＮａｓｅ、アゴニスト抗体またはアゴニスト抗体フラグメント、アンタゴニスト抗体またはアンタゴニスト抗体フラグメント、毒素、増殖因子、ホルモン、凝固因子、線維素溶解性タンパク質、これらを模倣するペプチド、およびそれらのフラグメント、融合タンパク質または誘導体が含まれる。「半減期延長モジュール」は半減期（例えば、化学物質または生物学的物質の「血漿半減期」または「血清半減期」）を延長する。造影分子は特定の標的分子に結合し、それにより分子の位置の可視化を可能にする分子である。
【０１２３】
用語「医薬品」、「薬剤」および「薬物」は本明細書において互換的に使用され、疾患または障害の同定、予防または処置のために使用される物質および／または物質の組合せを指す。
【０１２４】
用語「調製物」および「組成物」は、担体として封入材料を含む活性化合物の製剤を含むことが意図され、これは他の担体を含むか、または含まない活性成分が担体によって包まれ、したがって活性化合物に関連しているカプセルを提供する。
【０１２５】
「化学的医薬品」は通常、障害または疾患の予防、処置または診断に有効な人工的に合成された化学化合物を指すことが理解される。
【０１２６】
「生物製剤」は通常、生物工学的手段を用いて製造され、予防、治療および／またはインビボでの診断の目的のために使用される医薬を指すことが理解される。生物製剤には、限定されないが、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質および核酸(例えばＤＮＡ、ＲＮＡまたはそのハイブリッド)が含まれる。承認されている治療用生物製剤には、限定されないが、ホルモン（例えば、インスリン、ｈＧＨ、ＦＳＨ、グルカゴン様ペプチド１、副甲状腺ホルモン、カルシトニン、ルトロピン、グルカゴン）、増殖因子（例えば、エリスロポエチン、Ｇ−ＣＳＦ／ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＧＦ−１）、インターフェロン（例えばＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ）、インターロイキン（例えばＩＬ−２、ＩＬ−１１、ＩＬ−１Ｒａ）、凝固因子（例えば第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第ＶＩＩａ因子、トロンビン）、血栓溶解剤および抗凝固剤（例えばｔ−ＰＡ、ヒルジン、活性化プロテインＣ）、酵素（例えばα−グルコシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、イズロン酸−２−スルファターゼ、ガラクトシダーゼ、尿酸オキシダーゼ、ＤＮａｓｅ）、抗体および抗体フラグメントなどの抗原結合分子（例えばＩｇＧ、Ｆａｂ）、ならびにそれらの融合タンパク質（例えばＴＮＦＲ２−Ｆｃ、ＴＭＰ−Ｆｃ、ＣＴＬＡ−４−Ｆｃ、ＩＬ−１Ｒ−Ｆｃ、ＬＦＡ−３−Ｆｃ、ＩＬ−２−ＤＴ）が含まれる。
【０１２７】
用語「活性成分」は、生物学的に活性な（すなわち、医薬的価値を与える）医薬品組成物または製剤中の物質を指す。医薬組成物は、互いに組み合わせて、または独立に作用し得る１以上の活性成分を含み得る。活性成分は、中性または塩の形態として製剤化され得る。薬学的に許容され得る塩には、遊離アミノ基で形成される塩（限定されないが、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸および酒石酸などに由来する塩など）および遊離カルボキシル基で形成される塩（限定されないが、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジンおよびプロカインなどに由来する塩など）が含まれる。
【０１２８】
本明細書における用語「担体」は、治療有効成分と共に投与される薬理学的に不活性な物質（限定されないが、希釈剤、賦形剤、界面活性剤、安定剤、生理的緩衝液または溶剤など）を指す。このような医薬担体は液体または固体であり得る。液体担体は限定されないが、水および油（限定されないが、ピーナッツ油、大豆油、鉱物油およびゴマ油などの石油起源、動物起源、植物起源または合成起源の油を含む）中の生理食塩水などの滅菌液を含む。生理食塩水、水性デキストロースおよびグリセロール溶液もまた、（特に注射用溶液のために）液体担体として利用され得る。生理食塩水は、医薬組成物を静脈内投与する場合に好ましい担体である。適切な医薬担体の例は、E. W. Martin による"Remington's Pharmaceutical Sciences"に記載されている。
【０１２９】
適切な医薬品「賦形剤」には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水およびエタノールなどが含まれる。
【０１３０】
「界面活性剤」には、アニオン性、カチオン性、および非イオン性界面活性剤（限定されないが、デオキシコール酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００およびポリソルベート（ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート６５およびポリソルベート８０など）など）が含まれる。
【０１３１】
「安定剤」には、限定されないが、マンニトール、スクロース、トレハロース、アルブミンならびにプロテアーゼおよび／またはヌクレアーゼアンタゴニストが含まれる。
【０１３２】
「生理的緩衝液」には、限定されないが、塩化ナトリウム溶液、脱塩水、ならびに適切な有機または無機緩衝溶液（限定されないが、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ｔｒｉｓ緩衝液(トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン)、ＨＥＰＥＳ緩衝液([４ (２ ヒドロキシエチル)ピペラジノ]エタンスルホン酸)またはＭＯＰＳ緩衝液(３ モルホリノ−１ プロパンスルホン酸)など）が含まれる。一般に、各緩衝液の選択は所望する緩衝液モル濃度に依存する。例えば、リン酸緩衝液は注射液および輸液に適している。
【０１３３】
用語「アジュバント」は、組成物の活性成分に対する免疫応答を、細胞レベルまたは液性レベルのいずれかにおいて増大、刺激、活性化、増強または調節する物質を指す（例えば、免疫アジュバントは実際の抗原に対する免疫系の応答を刺激するが、それ自体は免疫学的効果を有さない）。このようなアジュバントの例には、限定されないが、無機アジュバント（例えばリン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウムなどの無機金属塩）、有機アジュバント（例えばサポニンまたはスクアレン）、油性アジュバント（例えばフロイント完全アジュバントおよびフロイント不完全アジュバント）、サイトカイン（例えばＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＧＭ−ＣＦＳおよびＩＮＦ−γ）、粒子アジュバント（例えば、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）、リポソームまたは生分解性マイクロスフェア）、ビロソーム、細菌アジュバント（例えば、モノホスホリルリピドＡまたはムラミルペプチド）、合成アジュバント（例えば、非イオン性ブロックコポリマー、ムラミルペプチド類似体または合成リピドＡ）または合成ポリヌクレオチドアジュバント（例えばポリアルギニンまたはポリリジン）が含まれる。
【０１３４】
「有効量」または「治療有効量」は、意図される目的を達成するのに十分な治療物質の量である。所定の治療物質の有効量は、治療物質の性質、投与経路、治療物質を投与される動物のサイズおよび種、ならびに投与目的などの要因によって変動する。各場合の個体の有効量は、当分野で確立された方法に従って当業者により経験的に決定され得る。
【０１３５】
実施態様
第１の態様において、本発明は、ヒト上皮成長因子受容体３（ＨＥＲ３）のドメインＩＩＩおよびドメインＩＶによって形成される立体構造エピトープに特異的に結合する抗原結合タンパク質を提供する。語句「ドメインＩＩＩおよびドメインＩＶによって形成される立体構造エピトープ」は、ドメインＩＩＩの少なくとも１つのアミノ酸およびドメインＩＶの少なくとも１つのアミノ酸が抗原結合タンパク質によって結合されることを意味する。したがって、ドメインＩＩＩおよびＩＶの全てのアミノ酸が立体構造エピトープの一部であることを示唆するのではなく、両ドメイン内のアミノ酸が結合されることを示唆する。通常、抗体のエピトープは１２〜２０アミノ酸を含み、したがって特定の実施態様において、ドメインＩＩＩの１〜１９アミノ酸およびドメインＩＶの１〜１９アミノ酸が抗原結合タンパク質によって結合され、好ましくはドメインＩＩＩの３〜１７アミノ酸およびドメインＩＶの３〜１７アミノ酸が抗原結合タンパク質によって結合される。それぞれの場合において、結合されるエピトープは１２〜２０アミノ酸を含むことが好ましい。
【０１３６】
ある実施態様において、立体構造エピトープは、ＨＥＲ３の完全なドメインＩＩＩおよび完全なドメインＩＶによって形成される。代替の実施態様において、立体構造エピトープは、ＨＥＲ３の完全なドメインＩＩＩおよびドメインＩＶのフラグメントによって形成される。代替の実施態様において、立体構造エピトープは、ＨＥＲ３のドメインＩＩＩのフラグメントおよび完全なドメインＩＶによって形成される。代替の実施態様において、立体構造エピトープは、ＨＥＲ３のドメインＩＩＩのフラグメントおよびドメインＩＶのフラグメントによって形成される。
【０１３７】
特定の実施態様において、ドメインＩＩＩは、配列番号１記載のＨＥＲ３の３２９〜５３１位のアミノ酸からなる。
【０１３８】
特定の実施態様において、ドメインＩＶのフラグメントは、配列番号１記載のＨＥＲ３の５３２〜５８７位のアミノ酸を含むか、またはからなる。
【０１３９】
特定の実施態様において、ドメインＩＶは、配列番号１記載のＨＥＲ３の５３２〜６４３位のアミノ酸からなる。
【０１４０】
したがって、特定の実施態様において、本発明は、ＨＥＲ３のドメインＩＩＩおよびドメインＩＶによって形成される立体構造エピトープに特異的に結合する抗原結合タンパク質を提供し、ここでドメインＩＩＩは配列番号１記載のＨＥＲ３の３２９〜５３１位のアミノ酸からなり、ドメインＩＶのフラグメントは配列番号１記載のＨＥＲ３の５３２〜５８７位のアミノ酸を含むか、またはからなる。
【０１４１】
特定の実施態様において、本発明は、ＨＥＲ３のドメインＩＩＩおよびドメインＩＶによって形成される立体構造エピトープに特異的に結合する抗原結合タンパク質を提供し、ここでドメインＩＩＩは配列番号１記載のＨＥＲ３の３２９〜５３１位のアミノ酸からなり、ドメインＩＶは配列番号１記載のＨＥＲ３の５３２〜６４３位のアミノ酸からなる。
【０１４２】
第２の態様において、本発明は、本発明の第１の態様の抗原結合タンパク質と、ＨＥＲ３との結合について競合する抗原結合タンパク質を提供する。
【０１４３】
特定の実施態様において、本発明は、ヒト上皮成長因子受容体３（ＨＥＲ３）のドメインＩＩＩおよびドメインＩＶによって形成される立体構造エピトープに特異的に結合する抗原結合タンパク質と競合する抗原結合タンパク質を提供する。
【０１４４】
ある実施態様において、立体構造エピトープは、ＨＥＲ３の完全なドメインＩＩＩおよび完全なドメインＩＶによって形成される。代替の実施態様において、立体構造エピトープは、ＨＥＲ３の完全なドメインＩＩＩおよびドメインＩＶのフラグメントによって形成される。代替の実施態様において、立体構造エピトープは、ＨＥＲ３のドメインＩＩＩのフラグメントおよび完全なドメインＩＶによって形成される。代替の実施態様において、立体構造エピトープは、ＨＥＲ３のドメインＩＩＩのフラグメントおよびドメインＩＶのフラグメントによって形成される。
【０１４５】
特定の実施態様において、ドメインＩＩＩは、配列番号１記載のＨＥＲ３の３２９〜５３１位のアミノ酸からなる。
【０１４６】
特定の実施態様において、ドメインＩＶのフラグメントは、配列番号１記載のＨＥＲ３の５３２〜５８７位のアミノ酸を含むか、またはからなる。
【０１４７】
特定の実施態様において、ドメインＩＶは、配列番号１記載のＨＥＲ３の５３２〜６４３位のアミノ酸からなる。
【０１４８】
したがって、特定の実施態様において、本発明は、ＨＥＲ３のドメインＩＩＩおよびドメインＩＶによって形成される立体構造エピトープに特異的に結合する抗原結合タンパク質に競合する抗原結合タンパク質を提供し、ここでドメインＩＩＩは配列番号１記載のＨＥＲ３の３２９〜５３１位のアミノ酸からなり、ドメインＩＶのフラグメントは配列番号１記載のＨＥＲ３の５３２〜５８７位のアミノ酸を含むか、またはからなる。
【０１４９】
特定の実施態様において、本発明は、ＨＥＲ３のドメインＩＩＩおよびドメインＩＶによって形成される立体構造エピトープに特異的に結合する抗原結合タンパク質に競合する抗原結合タンパク質を提供し、ここでドメインＩＩＩは配列番号１記載のＨＥＲ３の３２９〜５３１位のアミノ酸からなり、ドメインＩＶは配列番号１記載のＨＥＲ３の５３２〜６４３位のアミノ酸からなる。
【０１５０】
特定の実施態様において、第２の態様の前記抗原結合タンパク質は、第１の態様の抗原結合タンパク質と、ＨＥＲ３のドメインＩＩＩおよびドメインＩＶによって形成される立体構造エピトープとの結合について競合する。
【０１５１】
特定の実施態様において。第２の態様の前記抗原結合タンパク質は、ＨＥＲ３のドメインＩＩＩおよびドメインＩＶによって形成される立体構造エピトープとの結合について、第１の態様の抗原結合タンパク質よりも高いエピトープとの親和性を示すことによって競合する。
【０１５２】
さらなる実施態様において、第２の態様の抗原結合タンパク質は、ＨＥＲ３のドメインＩＩＩおよびドメインＩＶによって形成される立体構造エピトープとの結合について、第１の態様の抗原結合タンパク質の結合を立体的に妨げることによって競合する。ある実施態様において、第２の態様の抗原結合タンパク質は、第１の態様の抗原結合タンパク質がＨＥＲ３のドメインＩＩＩおよびドメインＩＶによって形成される立体構造エピトープに結合できないように、同一のエピトープまたは隣接エピトープに結合することによって第１の態様の抗原結合タンパク質との結合を立体的に妨げる。
【０１５３】
本発明の第１または第２の態様の特定の実施態様において、抗原結合タンパク質は以下の特徴のうち１つ以上を示す：
【０１５４】
（ａ）抗原結合タンパク質は、（特にＨＥＲ３発現細胞に対するフローサイトメトリーによって分析される）１５ｎＭ未満のＥＣ５０値でＨＥＲ３に結合する。特に、抗原結合タンパク質は、１０ｎＭ未満、５ｎＭ未満、１ｎＭ未満、５００ｐＭ未満、１００ｐＭ未満、５０ｐＭ未満または３０ｐＭ未満のＥＣ５０値でＨＥＲ３に結合する。
【０１５５】
（ｂ）抗原結合タンパク質は、（特に、水晶振動子マイクロバランス測定、表面プラズモン共鳴、光干渉法（Ｏｃｔｅｔ）または競合ＥＬＩＳＡによって分析される）１００ｎＭ未満のＫＤで単量体ＨＥＲ３に結合する。特に、抗原結合タンパク質は、５０ｎＭ未満、３０ｎＭ未満または２０ｎＭ未満のＫＤ値で単量体ＨＥＲ３に結合する。
【０１５６】
（ｃ）抗原結合タンパク質は、１０ｎＭ未満のＩＣ５０値でヘレグリン誘導性ＨＥＲ３リン酸化を阻害する。特に、抗原結合タンパク質は、５ｎＭ未満、１ｎＭ未満、５００ｐＭ未満、３００ｐＭ未満、２００ｐＭ未満または１００ｐＭ未満のＩＣ５０値でヘレグリン誘導性ＨＥＲ３リン酸化を阻害する。特に、抗原結合タンパク質は、８０ｐＭのＩＣ５０値でヘレグリン誘導性ＨＥＲ３リン酸化を阻害する。
【０１５７】
したがって、本発明の第１または第２の態様の特定の実施態様において、抗原結合タンパク質は：
（ａ）（ＨＥＲ３発現細胞に対するフローサイトメトリーによって分析される）１５ｎＭ未満（特に、１０ｎＭ未満、５ｎＭ未満、１ｎＭ未満、５００ｐＭ未満、１００ｐＭ未満、５０ｐＭ未満または３０ｐＭ未満）のＥＣ５０値でＨＥＲ３に結合する；および／または
（ｂ）（水晶振動子マイクロバランス測定によって分析される）１００ｎＭ未満（特に、５０ｎＭ未満、３０ｎＭ未満または２０ｎＭ未満）のＫＤ値で単量体ＨＥＲ３に結合する；および／または
（ｃ）１０ｎＭ未満のＩＣ５０値（特に、５ｎＭ未満、１ｎＭ未満、５００ｐＭ未満、３００ｐＭ未満、２００ｐＭ未満または１００ｐＭ未満のＩＣ５０値、特に８０ｐＭのＩＣ５０値）でヘレグリン誘導性ＨＥＲ３リン酸化を阻害する。
【０１５８】
本発明の第１または第２の態様の特定の実施態様において、抗原結合タンパク質は以下のうち１つ以上を阻害する：
（ｉ）ＨＥＲ３のそのリガンドへの結合、
（ｉｉ）受容体の活性化および／またはシグナル伝達、
（ｉｉｉ）ＨＥＲ３インターナリゼーションを誘導する、
（ｉｖ）細胞増殖を阻害する、および／または
（ｖ）腫瘍増殖を阻害する。
【０１５９】
本発明の第１または第２の態様の特定の実施態様において、抗原結合タンパク質は以下からなる群から選択される：
ａ）抗体またはその抗原結合フラグメント、
ｂ）抗体様タンパク質、および
ｃ）ペプチド模倣物。
【０１６０】
本発明の第１または第２の態様の特定の実施態様において、抗原結合タンパク質は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、一価抗体、二重特異性抗体、ヘテロコンジュゲート抗体（heteroconjugate antibody）、多特異性抗体、脱免疫化抗体(deimmunized antibody)、キメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体（特にヒトＩｇＧ１抗体）からなる群から選択される抗体である。
【０１６１】
特定の実施態様において、抗体の抗原結合フラグメントは、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆｖフラグメント、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、単一ドメイン抗体、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体、および単一ドメイン抗体（ＶＨ、ＶＬ、ＶＨＨ、ナノボディ、ＶＮＡＲ）からなる群から選択される。
【０１６２】
特定の実施態様において、抗体様タンパク質は、リポタンパク質関連凝固阻害因子（ＬＡＣＩ−Ｄ１）；ａｆｆｉｌｉｎ（例えば、ヒトγＢクリスタリン(crystalline)またはヒトユビキチン）；シスタチン；スルホロブス・アシドカルダリウス由来のＳａｃ７Ｄ；リポカリンおよびリポカリン由来のアンチカリン；設計されたアンキリンリピートドメイン（ＤＡＲＰｉｎ）；ＦｙｎのＳＨ３ドメイン；プロテアーゼ阻害剤のクニッツ(Kunits)ドメイン；モノボディ(monobody)（例えばフィブロネクチンの１０番目のＩＩＩ型ドメイン）；アドネクチン(adnectin)；システインノットミニタンパク質；アトリマー；エビボディ(evibody)（例えばＣＴＬＡ４に基づく結合剤）；アフィボディ（例えば、黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡのＺドメイン由来の３ヘリックスバンドル；トランスボディ(Trans-body)（例えばヒトトランスフェリン）；テトラネクチン（例えば、単量体または三量体ヒトＣ型レクチンドメイン）；ミクロボディ（例えばトリプシンインヒビターＩＩ）；ａｆｆｉｌｉｎ；アルマジロリピートタンパク質からなる群から選択される。
【０１６３】
本発明の第１または第２の態様の特定の実施態様において、抗原結合タンパク質は、単一特異性、二重特異性または多特異性である。特定の実施態様において、二重特異性または多特異性抗原結合タンパク質は、第２の細胞標的に特異的に結合する。特定の実施態様において、第２の細胞標的は、免疫細胞の表面上に発現されるタンパク質（好ましくはＣＤ３）、腫瘍細胞の表面上に発現されるタンパク質（特に成長受容体（特に上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）、ヒト上皮成長因子受容体（ＨＥＲ４）、インスリン様成長因子１−受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）、肝細胞成長因子受容体（ＨＧＦＲ、ｃ−ＭＥＴ）およびそれらの誘導体、特にＥＧＦＲまたはＨＥＲ２）の細胞外領域）からなる群から選択される。
【０１６４】
本発明の第１または第２の態様の特定の実施態様において、抗原結合タンパク質は三価または四価である。特定の実施態様において、抗原結合タンパク質は、特にＦｃ受容体、胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）または補体系によって結合されるエフェクタードメインを含む。特定の実施態様において、Ｆｃドメインは、Ｆｃガンマ受容体（特にＣＤ１６、ＣＤ３２および／またはＣＤ６４）によって結合されるドメインである。特定の実施態様において、Ｆｃドメインは、補体系を（特に補体系のＣ１ｑに結合することによって）活性化するドメインである。
【０１６５】
本発明の好ましい実施態様において、抗原結合タンパク質は二価である。他の指示がない限り、以下の抗原結合タンパク質の実施態様における配置は、左側のＮ末端から右側のＣ末端に記載される。抗原結合タンパク質は二価かつ二重特異性であることがさらに好ましい。さらに好ましい実施態様において、二価かつ二重特異性の抗原結合タンパク質はダイアボディである。二重特異性ダイアボディは２つの鎖を含み、各鎖は異なる抗体由来のＶＨおよびＶＬドメインを含む。２つの可変ドメインＶＨおよびＶＬは３〜５残基の短いリンカーによって好ましくは連結されている。
【０１６６】
ダイアボディは２つの鎖のダイアボディ（Ｄｂ）または単鎖のダイアボディ（ｓｃＤｂ）であり得る。２つの鎖のダイアボディのために、２つの鎖はＶＨＡ−ＶＬＢおよびＶＨＢ−ＶＬＡまたはＶＬＡ−ＶＨＢおよびＶＬＢ−ＶＨＡの配置を有し得、ここでＡおよびＢは２つの異なる特異性を表す。単鎖ダイアボディのために、第１の鎖ＶＨＡ−ＶＬＢまたはＶＬＡ−ＶＨＢ、および第２の鎖ＶＨＢ−ＶＬＡまたはＶＬＢ−ＶＨＡが共有結合されている。好ましくは、第１の鎖および第２の鎖は１０〜１５アミノ酸長のペプチドリンカーによって連結されている。好ましくは、二重特異性ダイアボディはｓｃＤｂである。好ましくは、抗原結合タンパク質は、（ＶＨＡ−ＶＬＢ−ＶＨＢ−ＶＬＡ）ｓｃＤｂの配置を有する。特に好ましい実施態様において、抗原結合タンパク質は配列番号１２または配列番号３４のアミノ酸配列を含むか、またはからなる。
【０１６７】
さらに好ましい実施態様において、抗原結合タンパク質は、１以上のｓｃＦｖ（好ましくは１つまたは２つのｓｃＦｖ）と連結した二重特異性Ｄｂまたは二重特異性ｓｃＤｂであり、好ましくは二重特異性ｓｃＤｂである。２以上のｓｃＦｖが直列に連結されてもよい。ｓｃＦｖは、（好ましくは、約１０〜２５アミノ酸のペプチドリンカーで連結された）同じ抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含む。ｓｃＦｖはＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨの配置を有し得る。好ましくは、１以上のｓｃＦｖは、二重特異性Ｄｂまたは二重特異性ｓｃＤｂの一方または両方の特異性を有する。したがって、ｓｃＦｖは、好ましくはＶＨＡ−ＶＬＡもしくはＶＬＡ−ＶＨＡの配置を有し、または好ましくはＶＨＢ−ＶＬＢもしくはＶＬＢ−ＶＨＢの配置を有する。さらなる好ましい実施態様において、１以上のｓｃＦｖは、二重特異性Ｄｂまたは二重特異性ｓｃＤｂの特異性とは異なる特異性を有し得る。したがって、１以上のｓｃＦｖは、ＶＨＣ−ＶＬＣもしくはＶＬＣ−ＶＨＣ、またはＶＨＤ−ＶＬＤもしくはＶＬＤ−ＶＨＤの配置などを有し得る。好ましい実施態様において、抗原結合タンパク質は、二重特異性三価抗原結合タンパク質である。好ましくは、抗原結合タンパク質は、（ＶＨＡ−ＶＬＢ−ＶＨＢ−ＶＬＡ）ｓｃＤｂ−（ＶＨＡ−ＶＬＡ）ｓｃＦｖの配置を有する。特に好ましい実施態様において、抗原結合タンパク質は配列番号１３のアミノ酸配列を含むか、またはからなる。好ましい実施態様において、抗原結合タンパク質は二重特異性四価抗原結合タンパク質である。好ましい実施態様において、抗原結合タンパク質は、（ＶＨＡ−ＶＬＡ）ｓｃＦｖ−（ＶＨＡ−ＶＬＢ−ＶＨＢ−ＶＬＡ）ｓｃＤｂ−（ＶＨＡ−ＶＬＡ）ｓｃＦｖの配置を有する。特に好ましい実施態様において、抗原結合タンパク質は配列番号３５のアミノ酸配列を含むか、またはからなる。
【０１６８】
さらに好ましい実施態様において、抗原結合タンパク質は、それぞれがＦｃ領域に連結されている二重特異性Ｄｂまたは二重特異性ｓｃＤｂ（好ましくは二重特異性ｓｃＤｂ）から構成され、ここでＦｃ領域はホモ二量体化ドメインとして働く。好ましい実施態様において、抗原結合タンパク質は、２つの配置（ＶＨＡ−ＶＬＢ−ＶＨＢ−ＶＬＡ）ｓｃＤｂ−Ｆｃの部分を含む。２つの部分は共有結合的または非共有結合的に結合されてい得る。特に好ましい実施態様において、抗原結合タンパク質は、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、または配列番号３３のアミノ酸配列を含むか、またはからなる２つの部分を含む。
【０１６９】
二重特異性抗原結合タンパク質のさらに好ましい実施態様において、第２の特異性の追加のＶＨドメインおよびＶＬドメインがそれぞれ軽鎖および重鎖に連結され、ここで重鎖のＦｃ領域は二量体化ドメインとして働く。異なる特異性の２つのＶＨドメインおよび２つのＶＬドメインがそれぞれ軽鎖および重鎖に様々な組合せで連結され得、種々の配置をもたらし得る。抗原結合タンパク質の好ましい実施態様において、軽鎖はＶＨＡ−ＶＨＢ−ＣＬｋの配置を有し、重鎖はＶＬＡ−ＶＬＢ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３の配置を有する。特定の構成は、ＶＨドメインおよびＶＬドメインのクロスオーバー対合(crossover pairing)を可能にする。好ましい実施態様において、軽鎖はＶＨＡ−ＶＬＢ−ＣＬｋの配置を有し、重鎖はＶＨＢ−ＶＬＡ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３の配置を有する。好ましい実施態様において、軽鎖はＶＬＡ−ＶＬＢ−ＣＬｋの配置を有し、重鎖はＶＨＢ−ＶＨＡ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３の配置を有する。特に好ましい実施態様において、抗原結合タンパク質は、配列番号３１の鎖および配列番号３２の鎖を含む。
【０１７０】
上記の各例において、文字「Ａ」、「Ｂ」、「Ｃ」および「Ｄ」は、本発明の抗原結合タンパク質の抗原特異性を表す。本発明の各抗原結合タンパク質内の「Ａ」、「Ｂ」、「Ｃ」および「Ｄ」のうち少なくとも１つは、ヒト上皮成長因子受容体３（ＨＥＲ３）のドメインＩＩＩおよびドメインＩＶによって形成される立体構造エピトープに特異的に結合する。他の特異性は同一であってもよく、または異なっていてもよい。好ましい第２の特異性およびさらなる特異性を以下に概説する。
【０１７１】
二重特異性抗体のさらなる例は、Brinkmann U & Kontermann RE, MABS, 2017, 9(2), 182-212に記載され、本明細書に具体的に組み込まれる。
【０１７２】
特定の実施態様において、本発明の抗原結合タンパク質は多量体化ドメインを含む。好ましい例は、二量体化ドメイン、三量体化ドメインまたは四量体化ドメインである。２つのタンパク質鎖が互いに結合している場合、それぞれのタンパク質鎖は他のタンパク質内の少なくとも１つの二量体化ドメインに結合できる少なくとも１つの二量体化ドメインを含む。したがって、抗原結合タンパク質が３つのタンパク質鎖を含む場合、それぞれのタンパク質鎖は、それぞれの他の三量体化ドメインに相互作用できる少なくとも１つの三量体化ドメインを含む。特定の実施態様において、二量体化ドメインは、ＩｇＭ（ＭＨＤ２）またはＩｇＥ（ＥＨＤ２）の重鎖ドメイン２（ＣＨ２）、免疫グロブリンＦｃ領域、ＩｇＧまたはＩｇＡの重鎖ドメイン３（ＣＨ３）、ＩｇＭまたはＩｇＥの重鎖ドメイン４（ＣＨ４）、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、ロイシンジッパーモチーフ、バルナーゼ−バルスター二量体、ミニ抗体、およびＺＩＰミニ抗体からなる群から選択される；三量体化ドメインは、テネイシンＣ（ＴＮＣ）、コラーゲンＸＶＩＩＩのＣ末端非コラーゲン性ドメイン（ＮＣ１）の三量体化領域、Ｆａｂ３様分子、およびＴｒｉＢｉミニボディからなる群から選択される；または四量体化ドメインは、ｐ５３の四量体化ドメイン、統制タンパク質４(general control protein 4)（ＧＣＮ４）の四量体化ドメイン、ＶＡＳＰ（血管拡張因子刺激リン酸化タンパク質）の四量体化ドメイン、タンデムダイアボディ、およびジダイアボディ(di-diabody)からなる群から選択される。いくつかの実施態様において、特に、異なる抗原特異性を持つ２つのタンパク質鎖が使用されるべきである場合、ヘテロ二量体化ドメインの使用が好ましい。
【０１７３】
本発明の第１または第２の態様の特定の実施態様において、抗原結合タンパク質はＡＤＣＣが改善された重鎖配列を含む。
【０１７４】
本発明の第１または第２の態様の特定の実施態様において、抗原結合タンパク質は以下を含む：
（ａ）配列番号２記載の３２〜３７位のアミノ酸を含むＣＤＲＨ１および１つのアミノ酸交換を含むその変異体、配列番号２記載の５２〜６９位のアミノ酸を含むＣＤＲＨ２および１つのアミノ酸交換を含むその変異体、ならびに配列番号２記載の１０２〜１１２位のアミノ酸を含むＣＤＲＨ３および１つのアミノ酸交換を含むその変異体、および／または
（ｂ）配列番号３記載の２３〜３３位のアミノ酸を含むＣＤＲＬ１および１つのアミノ酸交換を含むその変異体、配列番号３記載の４９〜５５位のアミノ酸を含むＣＤＲＬ２および１つのアミノ酸交換を含むその変異体、ならびに配列番号３記載の８８〜９８位のアミノ酸を含むＣＤＲＬ３および１つのアミノ酸交換を含むその変異体。
【０１７５】
本発明の第１または第２の態様の特定の実施態様において、抗原結合タンパク質は以下を含む：
（ａ）配列番号２記載の１〜３１位のアミノ酸を含むＦＲＨ１および少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を含むその変異体、３８〜５１位のアミノ酸を含むＦＲＨ２および少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を含むその変異体、７０〜１０１位のアミノ酸を含むＦＲＨ３および少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を含むその変異体、ならびに１１３〜１２３位のアミノ酸を含むＦＲＨ４および少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を含むその変異体、および／または
（ｂ）配列番号３記載の１〜２２位のアミノ酸を含むＦＲＬ１および少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を含むその変異体、配列番号３記載の３４〜４８位のアミノ酸を含むＦＲＬ２および少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を含むその変異体、配列番号３記載の５６〜８７位のアミノ酸を含むＦＲＬ３および少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を含むその変異体、ならびに配列番号３記載の９９〜１０９位のアミノ酸を含むＦＲＬ４および少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を含むその変異体。
【０１７６】
本発明の第１または第２の態様の特定の実施態様において、抗原結合タンパク質は以下を含む：
（ａ）配列番号２記載の３２〜３７位のアミノ酸からなるＣＤＲＨ１および１つのアミノ酸交換を含むその変異体、配列番号２記載の５２〜６９位のアミノ酸からなるＣＤＲＨ２および１つのアミノ酸交換を含むその変異体、配列番号２記載の１０２〜１１２位のアミノ酸からなるＣＤＲＨ３および１つのアミノ酸交換を含むその変異体、配列番号２記載の１〜３１位のアミノ酸からなるＦＲＨ１および少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を含むその変異体、配列番号２記載の３８〜５１位のアミノ酸を含むＦＲＨ２および少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を含むその変異体、配列番号２記載の７０〜１０１位のアミノ酸を含むＦＲＨ３および少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を含むその変異体、ならびに配列番号２記載の１１３〜１２３位のアミノ酸を含むＦＲＨ４および少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を含むその変異体を含む重鎖
（ｂ）配列番号３記載の２３〜３３位のアミノ酸からなるＣＤＲＬ１および１つのアミノ酸交換を含むその変異体、配列番号３記載の４９〜５５位のアミノ酸を含むＣＤＲＬ２および１つのアミノ酸交換を含むその変異体、配列番号３記載の８８〜９８位のアミノ酸を含むＣＤＲＬ３および１つのアミノ酸交換を含むその変異体、配列番号３記載の１〜２２位のアミノ酸を含むＦＲＬ１および少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を含むその変異体、配列番号３記載の３４〜４８位のアミノ酸を含むＦＲＬ２および少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を含むその変異体、配列番号３記載の５６〜８７位のアミノ酸を含むＦＲＬ３および少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を含むその変異体、ならびに配列番号３記載の９９〜１０９位のアミノ酸を含むＦＲＬ４および少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を含むその変異体を含む軽鎖。
【０１７７】
本発明の第１または第２の態様の特定の実施態様において、抗原結合タンパク質は、配列番号２記載の１〜１２３位のアミノ酸、または配列番号２記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するその変異体における重鎖を含む可変ドメインを含む。
【０１７８】
本発明の第１または第２の態様の特定の実施態様において、抗原結合タンパク質は、配列番号３記載の１〜１０９位のアミノ酸、または配列番号３記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するその変異体における軽鎖を含む可変ドメインを含む。
【０１７９】
本発明の第１または第２の態様の特定の実施態様において、抗原結合タンパク質は、配列番号２記載の１〜１２３位のアミノ酸における重鎖、および配列番号３記載の１〜１０９位のアミノ酸または配列番号３記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するその変異体における軽鎖を含む可変ドメインを含む。
【０１８０】
本発明の第１または第２の態様の特定の実施態様において、抗原結合タンパク質は、配列番号４記載の１〜４５３位のアミノ酸、または配列番号４記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するその変異体を含むか、またはからなる重鎖を含む。
【０１８１】
本発明の第１または第２の態様の特定の実施態様において、抗原結合タンパク質は、配列番号５記載の１〜２１５位のアミノ酸、または配列番号５記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するその変異体を含むか、またはからなる軽鎖を含む。
【０１８２】
本発明の第１または第２の態様の特定の実施態様において、抗原結合タンパク質は、配列番号４記載の１〜４５３位のアミノ酸、または配列番号４記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するその変異体を含むか、またはからなる重鎖、および配列番号５記載の１〜２１５位のアミノ酸、または配列番号５記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するその変異体を含むか、またはからなる軽鎖を含む。
【０１８３】
特定の実施態様において、抗原結合タンパク質はリンカー（特にペプチドリンカー）をさらに含む。特定の実施態様において、ペプチドリンカーは、５〜４０アミノ酸長（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０アミノ酸長）、特に５〜２０アミノ酸長（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０アミノ酸長）、特に８〜１５アミノ酸長（すなわち、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５アミノ酸長）である。
【０１８４】
可動性ペプチドリンカーが特に好ましい。可動性リンカーは、アミノ酸鎖の回転または屈曲を妨げる嵩高い側鎖を持たないアミノ酸から構成される。可動性リンカーは、好ましくはＧ、Ｓ、Ｔ、およびＡ残基を含む。特定の実施態様において、可動性リンカーペプチドのアミノ酸の少なくとも５０％は、Ｇ、Ｓ、ＴおよびＡからなる群から選択されるアミノ酸からなる。特定の実施態様において、リンカーのアミノ酸の少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％は、Ｇ、Ｓ、ＴおよびＡからなる群から選択されるアミノ酸からなる。多数のペプチドリンカーが当分野において記述されている(Robinson & Sauer, 1998; Volkel et al., 2001; Kavoosi et al., 2007; Watanabe et al., 2011)。特定の実施態様において、ペプチドリンカーは限定されないが、リンカーペプチド１：ＧＧＧＧＳ（配列番号１４）、リンカーペプチド２：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１５）、リンカーペプチド３：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１６）、リンカーペプチド４：ＧＳＬＧＧＳＧＧ（配列番号１７）、リンカーペプチド５：ＧＧＧＳＧＧＧＴ（配列番号１８）、リンカーペプチド６：ＧＧＧＳＧＧＧＴＧＳ（配列番号１９）、リンカーペプチド７：ＧＧＧＳＧＧＧＴＧＳＧＧ（配列番号２０）、リンカーペプチド８：ＧＧＧＧＳＧＧＲＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２１）、リンカーペプチド９：ＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号２２）、リンカーペプチド１０：ＥＦＴＲＧ（配列番号２３）、およびリンカーペプチド１１：ＡＡＡ（配列番号２４）またはその多量体、誘導体およびフラグメントを含む。
【０１８５】
本発明の第１または第２の態様の特定の実施態様において、抗原結合タンパク質は、抗原結合タンパク質は、配列番号２記載の１〜１２３位のアミノ酸における重鎖、配列番号３記載の１〜１０９位のアミノ酸、またはアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性をその変異体における軽鎖、およびペプチドリンカー（特に配列番号１６記載のペプチドリンカー）を含む可変ドメインを含む。
【０１８６】
特定の実施態様において、ペプチドリンカーは可変ドメインの重鎖と軽鎖との間に位置している。
【０１８７】
本発明の第１または第２の態様の特定の実施態様において、抗原結合タンパク質は配列番号６記載のｓｃＦｖを含むか、またはからなる。
【０１８８】
さらに好ましい実施態様において、１以上のリンカーは１以上の切断部位（すなわち、リンカー配列が１以上のペプチド結合の切断によって化学的または酵素的に切断され得る１以上の配列領域）を含む。酵素的切断はタンパク質分解酵素によって達成され得、これは限定されないが、制限エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型または人工制限酵素）およびエンドまたはエキソペプチダーゼまたはプロテアーゼ（例えば、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ）を含む。特に好ましい実施態様において、１以上の切断部位は１以上のエンドペプチダーゼ切断部位（すなわち、配列がエンドペプチダーゼ（限定されないが、トリプシン、ペプシン、エラスターゼ、トロンビン、コラゲナーゼ、フーリン、サーモリシン、エンドペプチダーゼＶ８、および／またはカテプシンなど）によって切断される、または切断可能である切断部位）を含む。
【０１８９】
本発明の第１または第２の態様の特定の実施態様において、抗原結合タンパク質は１以上のタグをさらに含む。特定の実施態様において、１以上のタグは、アフィニティータグ、可溶化タグ、クロマトグラフィータグ、エピトープタグおよび蛍光タグからなる群から選択される。特定の実施態様において、タグは、ＦＬＡＧタグ（配列番号２５）、Ｈｉｓタグ（配列番号２６）およびＭｙｃタグ（配列番号２７）から選択される。
【０１９０】
本発明の第１または第２の態様の特定の実施態様において、抗原結合タンパク質はリーダー配列をさらに含む。特定の実施態様において、リーダー配列は、細菌発現のための（特に配列番号２８記載の）ＰｅｌＢリーダー配列、哺乳類細胞における発現のための（特に配列番号２９記載の）ＩｇＫリーダー配列またはＩＬ−２リーダー配列（配列番号３０）であり得る。
【０１９１】
本発明の第１または第２の態様の特定の実施態様において、抗原結合タンパク質は、配列番号６記載のｓｃＦｖ、ＭｙｃタグおよびＨｉｓタグを含む。本発明の第１または第２の態様の特定の実施態様において、抗原結合タンパク質は、配列番号７記載の２３〜３１０位のアミノ酸を含むか、またはからなる。
【０１９２】
本発明の第１または第２の態様の特定の実施態様において、抗原結合タンパク質は、配列番号６記載のｓｃＦｖ、Ｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグおよびリーダー配列（特に、ＰｅｌＢ、ＩｇＧＫまたはＩＬ−２リーダー配列）を含む。特定の実施態様において、抗原結合タンパク質は、配列番号７記載の１〜３１０位のアミノ酸を含むか、またはからなる。
【０１９３】
本発明の第１または第２の態様のある実施態様において、抗原結合タンパク質は、ＨＥＲ３のドメインＩＩＩおよびドメインＩＶによって形成される立体構造エピトープおよびＥＧＦＲに対する二重特異性抗原結合タンパク質である。特定の実施態様において、抗原結合タンパク質は単鎖ダイアボディであり、ここである抗原結合部位は、上記で詳述されているＨＥＲ３のドメインＩＩＩおよびドメインＩＶによって形成される立体構造エピトープに対する部位であり、第２の抗原結合部位はＥＧＦＲに対する部位である。特定の実施態様において、ＥＧＦＲに対する第２の抗原結合部位は、ＥＧＦＲ特異性ヒト化抗体ｈｕ２２５（すなわち、Ｃ２２５（セツキシマブ、アービタックス）のヒト化型）に由来している。さらなる実施態様において、抗原結合タンパク質は三機能性であり、Ｆｃドメイン（特にＦｃガンマ受容体（特にＣＤ１６、ＣＤ３２および／またはＣＤ６４）によって認識されるＦｃドメイン）をさらに含む。特定の実施態様において、抗原結合タンパク質は配列番号８記載の２３〜７３８位のアミノ酸におけるアミノ酸配列を含むか、またはからなる。さらなる実施態様において、抗原結合タンパク質はリーダー配列（特にＩｇＫリーダー配列）をさらに含む。特定の実施態様において、抗原結合タンパク質は配列番号８記載の１〜７３８位のアミノ酸におけるアミノ酸配列を含むか、またはからなる。
【０１９４】
本発明の第１または第２の態様のある実施態様において、抗原結合タンパク質は、ＨＥＲ３のドメインＩＩＩおよびドメインＩＶによって形成される立体構造エピトープおよびＨＥＲ２に対する二重特異性抗原結合タンパク質である。特定の実施態様において、抗原結合タンパク質は単鎖ダイアボディであり、ここである抗原結合部位は、上記で詳述されているＨＥＲ３のドメインＩＩＩおよびドメインＩＶによって形成される立体構造エピトープに対する部位であり、第２の抗原結合部位はＨＥＲ２に対する部位である。特定の実施態様において、第２の抗原結合部位はＨＥＲ２特異性ヒト化抗体２−３５に由来している。さらなる実施態様において、抗原結合タンパク質は三機能性であり、Ｆｃドメイン（特にＦｃガンマ受容体（特にＣＤ１６、ＣＤ３２および／またはＣＤ６４）によって認識されるＦｃドメイン）をさらに含む。特定の実施態様において、抗原結合タンパク質は配列番号９記載の２３〜７４４位のアミノ酸におけるアミノ酸配列を含むか、またはからなる。さらなる実施態様において、抗原結合タンパク質はリーダー配列（特にＩｇＫリーダー配列）をさらに含む。特定の実施態様において、抗原結合タンパク質は配列番号９記載の１〜７４４位のアミノ酸におけるアミノ酸配列を含むか、またはからなる。
【０１９５】
本発明の第１または第２の態様のある実施態様において、抗原結合タンパク質は、ＨＥＲ３のドメインＩＩＩおよびドメインＩＶによって形成される立体構造エピトープおよびＨＥＲ２に対する二重特異性抗原結合タンパク質を含む。特定の実施態様において、抗原結合タンパク質は単鎖ダイアボディであり、ここである抗原結合部位は、上記で詳述されているＨＥＲ３のドメインＩＩＩおよびドメインＩＶによって形成される立体構造エピトープに対する部位であり、第２の抗原結合部位はＨＥＲ２に対する部位である。特定の実施態様において、ＨＥＲ２に対する第２の抗原結合部位はＨＥＲ２特異性抗体４Ｄ５（トラスツズマブ、ハーセプチン）に由来している。さらなる実施態様において、抗原結合タンパク質は三機能性であり、Ｆｃドメイン（特にＦｃガンマ受容体（特にＣＤ１６、ＣＤ３２および／またはＣＤ６４）によって認識されるＦｃドメイン）をさらに含む。特定の実施態様において、抗原結合タンパク質は配列番号１０記載の２３〜４７７位のアミノ酸におけるアミノ酸配列を含むか、またはからなる。さらなる実施態様において、抗原結合タンパク質はリーダー配列（特にＩｇＫリーダー配列）をさらに含む。特定の実施態様において、抗原結合タンパク質は配列番号１０記載の１〜４７７位のアミノ酸におけるアミノ酸配列を含むか、またはからなる。
【０１９６】
本発明の第１または第２の態様のある実施態様において、抗原結合タンパク質は、ＨＥＲ３のドメインＩＩＩおよびドメインＩＶによって形成される立体構造エピトープに対する抗原結合部位を含み、単鎖ＴＲＡＩＬ（ｓｃＴＲＡＩＬ）ドメインをさらに含む。特定の実施態様において、抗原結合タンパク質は、上記で詳述されているＨＥＲ３のドメインＩＩＩおよびドメインＩＶによって形成される立体構造エピトープに対する抗原結合部位を含む。特定の実施態様において、抗原結合タンパク質は、（特に配列番号６に記載の）ｓｃＦｖ３−４３をさらに含む。特定の実施態様において、抗原結合タンパク質はＦｌａｇタグをさらに含む。特定の実施態様において、抗原結合タンパク質は、配列番号１１の２３〜１０２０位のアミノ酸におけるアミノ酸配列を含むか、またはからなる。さらなる実施態様において、抗原結合タンパク質はリーダー配列（特にＩｇＫリーダー配列）をさらに含む。特定の実施態様において、抗原結合タンパク質は配列番号１１の１〜１０２０位のアミノ酸におけるアミノ酸配列を含むか、またはからなる。
【０１９７】
本発明の第１または第２の態様のある実施態様において、抗原結合タンパク質は、ＨＥＲ３のドメインＩＩＩおよびドメインＩＶによって形成される立体構造エピトープおよびＣＤ３に対する二重特異性抗原結合部位を含む。特定の実施態様において、抗原結合タンパク質は単鎖ダイアボディであり、ここである抗原結合部位は、上記で詳述されているＨＥＲ３のドメインＩＩＩおよびドメインＩＶによって形成される立体構造エピトープに対する部位であり、第２の抗原結合部位はＣＤ３に対する部位である。特定の実施態様において、ＣＤ３に対する第２の抗原結合部位はＣＤ３特異性ヒト化型のＵＣＨＴ１に由来している。特定の実施態様において、抗原結合タンパク質はＨｉｓタグをさらに含む。特定の実施態様において、抗原結合タンパク質は配列番号１２の２３〜５１５位のアミノ酸におけるアミノ酸配列を含むか、またはからなる。さらなる実施態様において、抗原結合タンパク質はリーダー配列（特にＩｇＫリーダー配列）をさらに含む。特定の実施態様において、抗原結合タンパク質は配列番号１２の１〜５１５位のアミノ酸におけるアミノ酸配列を含むか、またはからなる。
【０１９８】
特定の実施態様において、抗原結合タンパク質は（特に配列番号６記載の）ｓｃＦｖ３−４３をさらに含む。特定の実施態様において、抗原結合タンパク質は、配列番号１３の２３〜７７６位のアミノ酸におけるアミノ酸配列を含むか、またはからなる。さらなる実施態様において、抗原結合タンパク質はリーダー配列（特にＩｇＫリーダー配列）をさらに含む。特定の実施態様において、抗原結合タンパク質は配列番号１３の１〜７７６位のアミノ酸におけるアミノ酸配列を含むか、またはからなる。
【０１９９】
特定の実施態様において、抗原結合タンパク質は、配列番号６、配列番号７の２３〜３１０位のアミノ酸、配列番号８の２３〜７３８位のアミノ酸、配列番号９の２３〜７２４位のアミノ酸、配列番号１０の２３〜７４４位のアミノ酸、配列番号１１の２３〜１０２０位のアミノ酸、配列番号１２の２３〜５１５位のアミノ酸、および配列番号１３の２３〜７７６位のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはからなる。
【０２００】
特定の実施態様において、抗原結合タンパク質は、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはからなる。
【０２０１】
特にＣＤＲ、超可変領域および可変領域の配列は、ＨＥＲ３に結合する能力を失うことなく修飾され得ることが当業者に理解される。例えば、ＣＤＲ領域は、本明細書に記載される領域と同一であるか、または高度に相同であるかのいずれかである。「高度に相同である」とは、ＣＤＲ内に１〜５個、好ましくは１〜４個（１〜３個または１もしくは２個など）の置換、欠失または付加がなされてい得ることが想定される。さらに、超可変領域および可変領域は、本明細書に具体的に開示される領域との実質的な相同性を示すように修飾され得る。
【０２０２】
さらに、本発明において、本明細書に記載のアミノ酸配列（特にヒト重鎖定常領域のアミノ酸配列）を修飾し、該配列を所望のアロタイプ（例えばコーカサス人集団において見出されるアロタイプ）に適合させることが望まれ得る。
【０２０３】
本発明は、抗体の機能的性質または薬物動態の性質を変化させるために、Ｆｃ領域に変化がなされた抗体をさらに含む。このような変化は、Ｃ１ｑ結合およびＣＤＣまたはＦｃγＲ結合およびＡＤＣＣの減少または増加をもたらし得る。例えば、置換は重鎖定常領域の１以上のアミノ酸残基において行われ得、これにより修飾抗体と比較して抗原に結合する能力を保持しながらエフェクター機能の変化を生じ得る（米国特許第５，６２４，８２１号および米国特許第５，６４８，２６０号参照）。
【０２０４】
抗体のインビボにおける半減期は、該分子が無傷のＣＨ２ドメインまたは無傷のＩｇ Ｆｃドメインを含まないようにＩｇ定常ドメインまたはＩｇ様定常ドメインのサルベージ受容体エピトープを修飾することによって改善され得る（米国特許第６，１２１，０２２号および米国特許第６，１９４，５５１号参照）。インビボにおける半減期は、Ｆｃ領域に変異を起こすことによって（例えば、２５２位のロイシンをスレオニンに置換することによって、２５４位のセリンをスレオニンに置換することによって、または２５６位のフェニルアラニンをスレオニンに置換することによって）さらに増加され得る（米国特許第６，２７７，３７５号参照）。
【０２０５】
さらに、抗体の糖鎖付加パターンは、抗体のエフェクター機能を変化させるために修飾され得る。例えば、抗体は、Ｆｃ受容体に対するＦｃ領域の親和性を増強させ、次いでＮＫ細胞の存在下において抗体のＡＤＣＣの増大をもたらすために、Ｆｃ領域の２９７位のＡｓｎに通常結合しているフコース単位を付加しないトランスフェクトーマにおいて発現され得る（Shield et al. (2002) JBC, 277: 26733参照）。さらに、ガラクトシル化の修飾がＣＤＣを修飾するために行われ得る。
【０２０６】
したがって、本発明の第１または第２の態様の特定の実施態様において、変異体は所定のアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を示す。特定の実施態様において、変異体は所定のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％または９８％の配列同一性を示す。
【０２０７】
第３の態様において、本発明は、上記で詳述された本発明の第１および／または第２の態様における抗原結合タンパク質を含み、少なくとも１つの薬剤活性部分をさらに含む融合タンパク質を提供する。
【０２０８】
特定の実施態様において、少なくとも１つの薬剤活性部分は化学的医薬品または生物製剤である。少なくとも１つの薬剤活性部分が生物製剤である、ある実施態様において、このような生物製剤はペプチド、ポリペプチド、タンパク質および／または核酸（例えばＤＮＡ、ＲＮＡまたはそのハイブリッド）であることが好ましい。特定の実施態様において、このような生物製剤は、ホルモン（例えば、インスリン、ｈＧＨ、ＦＳＨ、グルカゴン様ペプチド１、副甲状腺ホルモン、カルシトニン、ルトロピン、グルカゴン）；増殖因子（例えば、エリスロポエチン、トロンボポエチン、Ｇ−ＣＳＦ／ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＧＦ−１）；インターフェロン（例えばＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ）およびインターロイキン（例えばＩＬ−２、ＩＬ−１１、ＩＬ−１Ｒａ）などのサイトカイン（例えば、ＴＮＦ、ＴＲＡＩＬ、ＦａｓＬ、ＴＧＦ−β）；共刺激および免疫刺激リガンド（例えば、４−１ＢＢＬ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２７Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、ＧＩＴＲＬ、ＬＩＧＨＴ）；凝固因子（例えば第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第ＶＩＩａ因子、トロンビン）；血栓溶解剤および抗凝固剤（例えばｔ−ＰＡ、ヒルジン、活性化プロテインＣ）；酵素（例えばα−グルコシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、イズロン酸−２−スルファターゼ、ガラクトシダーゼ、尿酸オキシダーゼ、ＤＮａｓｅ）；抗体および抗体フラグメントなどの抗原結合分子（例えばＩｇＧ、Ｆａｂ、Ｆｃ）；ならびにそれらの融合タンパク質（例えばＴＮＦＲ２−Ｆｃ、ＴＭＰ−Ｆｃ、ＣＴＬＡ−４−Ｆｃ、ＩＬ−１Ｒ−Ｆｃ、ＬＦＡ−３−Ｆｃ、ＩＬ−２−ＤＴ）からなる群から選択される。
【０２０９】
特定の実施態様において、少なくとも１つの薬剤活性部分は、リガンド、エフェクター分子、半減期延長モジュールおよび造影分子からなる群から選択される。
【０２１０】
特定の実施態様において、リガンドは別の分子と複合体を形成し、特定の生物学的機能を果たすあらゆる化学物質または生物学的物質（基質、阻害剤および活性化剤など）である。特に、リガンドには、限定されないが、抗原結合分子、足場タンパク質、天然リガンド（例えば、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ、ＥＰＯ、ＴＰＯ、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ、ＴＲＡＩＬ）、リガンド結合受容体フラグメント（例えば、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＶＥＧＦＲ、ＣＴＬＡ−４、ＬＦＡ−３、ＢＲ３、ＣＤ９５Ｒ、ＩＬ−１Ｒ、ＦＧＦＲ１）およびアプタマー（例えば、抗トロンビン、抗ＦＩＸａ、抗Ｃ３ｂ、抗ＶＥＧＦ、抗ＣＤ４０Ｌ）が含まれる。足場タンパク質は重要なシグナル伝達経路の制御因子であり、限定されないが、ＫＳＲ、ＭＥＫＫ１、ＢＣＬ−１０、ＭＡＰＫ、ＡＨＮＡＫ−１、ＨＯＭＥＲ、Ｐｅｌｌｉｎｏ、ＮＬＲＰ、ＤＬＧ１、スピノフィリン、植物ＦＬＵ制御タンパク質を含む。
【０２１１】
特定の実施態様において、抗原結合分子は、抗体フラグメント、Ｆａｂフラグメント（ＩｇＭまたはＩｇＥ由来のＦａｂフラグメントを除く）、Ｆａｂ’フラグメント（ＩｇＭまたはＩｇＥ由来のＦａｂ’フラグメントを除く）、重鎖抗体、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、重鎖抗体の可変ドメイン、ＶＨＨ、ナノボディ、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、タンデムｓｃＦｖ、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢＩＴＥ）、ダイアボディ、単鎖ダイアボディ、ＤＡＲＴ分子、トリプルボディ(triple body)、ナノ抗体、代替足場タンパク質（例えばＤＡＲＰｉｎ、アンチカリン、アフィボディ分子、ミクロボディ、モノボディ、フィノマー(Fynomer)、アドネクチン、テトラネクチン、クニッツドメイン、Ａｆｆｉｌｉｎ、アビマー(Avimer)）およびそれらの融合タンパク質からなる群から選択される。抗原結合分子は、薬学的に関連する抗原（すなわち、疾患または疾患もしくは障害の症状を予防、診断および／または処置するのに適した抗原）に結合することが好ましい。好ましい実施態様において、疾患はがんの種類の疾患である。好ましくは、抗原結合分子は腫瘍関連抗原（限定されないが、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ４、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＣＡ−１２５、上皮性腫瘍抗原（ＥＴＡ）、チロシナーゼ、黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）、ｒａｓおよびｐ５３の異常産物、エストロゲン受容体、５−アルファ−レダクターゼ、プロスタグランジンエンドペルオキシド合成酵素２、ＶＥＧＦＲ、インテグリン受容体ファミリー、線維芽細胞活性化タンパク質、ガレクチン、ＥｐＣＡＭ、ＣＥＡ、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ、ＣＤ２、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７１、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、クローディン、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＤＧＦＲ、ＩＧＦ１−Ｒ、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＴＡＧ−７２、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、葉酸受容体、Ｌｅｙ、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡならびにｕＰＡＲなど）を認識する。好ましい実施態様において、抗原結合分子はＩｇＭまたはＩｇＥ由来のＦａｂまたはＦｃフラグメントではないことが想定される。
【０２１２】
特定の実施態様において、抗原結合分子はｓｃＦｖ（好ましくは、抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖまたは抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖ）である。
【０２１３】
特定の実施態様において、エフェクター分子（すなわち、タンパク質に結合し、それによりタンパク質の活性を変化させる小分子、ペプチドまたはポリペプチド）には、限定されないが、サイトカイン、ケモカイン、免疫（共）刺激分子、免疫抑制分子、デスリガンド、アポトーシス誘導タンパク質、酵素（例えばキナーゼ）、プロドラッグ変換酵素、ＲＮａｓｅ、アゴニスト抗体またはアゴニスト抗体フラグメント、アンタゴニスト抗体またはアンタゴニスト抗体フラグメント、毒素、増殖因子、ホルモン、凝固因子、線維素溶解性タンパク質、これらを模倣するペプチド、およびそれらのフラグメント、融合タンパク質または誘導体が含まれる。
【０２１４】
特定の実施態様において、サイトカインはインターロイキンおよび／またはインターフェロンである。インターロイキン（ＩＬ）には、限定されないが、インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイキン−６、インターロイキン−７、インターロイキン−８、インターロイキン−９、インターロイキン−１０、インターロイキン−１１、インターロイキン１２、インターロイキン−１３、インターロイキン−１４、インターロイキン−１５、インターロイキン−１６、インターロイキン−１７、インターロイキン−１８、インターロイキン−１９、インターロイキン−２０、インターロイキン−２１、インターロイキン−２２、インターロイキン−２３、インターロイキン−２４、インターロイキン−２５、インターロイキン−２６、インターロイキン−２７、インターロイキン−２８、インターロイキン−２９、インターロイキン−３０、インターロイキン−３１、インターロイキン−３２、インターロイキン−３３、インターロイキン−３４およびインターロイキン−３５が含まれる。インターフェロン（ＩＦＮ）には、限定されないが、Ｉ型インターフェロン（例えばＩＦＮ−α、ＩＦＮ−βおよびＩＦＮ−ω）、ＩＩ型インターフェロン（例えばＩＦＮ−γ）およびＩＩＩ型インターフェロンが含まれる。特に、インターフェロンＡ１、インターフェロンＡ２、インターフェロンＡ４、インターフェロンＡ５、インターフェロンＡ６、インターフェロンＡ７、インターフェロンＡ８、インターフェロンＡ１０、インターフェロンＡ１３、インターフェロンＡ１４、インターフェロンＡ１６、インターフェロンＡ１７、インターフェロンＡ２１、インターフェロンＢ１、ＴＮＦ、ＴＲＡＩＬおよびＦａｓＬが含まれる。
【０２１５】
特定の実施態様において、ケモカインには、限定されないが、ＣＣケモカイン、ＣＸＣケモカイン、ＣケモカインおよびＣＸ３Ｃケモカインが含まれる。特に、ケモカインには、限定されないが、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９／ＣＣＬ１０、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ１７、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２およびＣＸ３ＣＬ１が含まれる。
【０２１６】
特定の実施態様において、免疫（共）刺激タンパク質には、限定されないが、Ｂ７.１、Ｂ７.２、４−１ＢＢＬ、ＬＩＧＨＴ、ＩＣＯＳＬ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０ＬおよびＣＤ７０が含まれる。
【０２１７】
免疫抑制タンパク質は、ＩＬ１−Ｒａ、ＩＬ−１０、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２からなる群から選択され得る。毒素は、シュードモナス外毒素Ａ、ジフテリア毒素およびリシンからなる群から選択され得る。
【０２１８】
特定の実施態様において、アポトーシス誘導タンパク質は、Ｂｉｄ、Ｂｉｋ、ＰｕｍａおよびＢｉｍ、ならびにアポトーシス促進性サイトカイン（デスリガンド）（限定されないが、ＴＮＦ、ｓｃＴＮＦ、ＴＲＡＩＬ、ｓｃＴＲＡＩＬおよびＦａｓＬなど）からなる群から選択され得る。特定の実施態様において、サイトカインはＴＮＦである。さらなる実施態様において、サイトカインはＴＲＡＩＬまたはｓｃＴＲＡＩＬである。
【０２１９】
特定の実施態様において、酵素は、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼからなる群から選択され得る。キナーゼには、限定されないが、ＡＧＣキナーゼ（ＰＫＡ、ＰＫＣおよびＰＫＧなど）、ＣａＭキナーゼ（カルシウム／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼおよびセリン／スレオニンタンパク質キナーゼ（例えばＤＡＰＫ２）など）、ＣＫ１（カゼインキナーゼ１群など）、ＣＭＧＣ（ＣＤＫ、ＭＡＰＫ、ＧＳＫ３およびＣＬＫキナーゼなど）、ＳＴＥ（酵母ステライル７、ステライル１１およびステライル２０キナーゼのホモログなど）、チロシンキナーゼ（ＴＫ）、チロシンキナーゼ様群のキナーゼ（ＴＫＬ）、受容体関連チロシンキナーゼ、ＭＡＰキナーゼおよびヒスチジンキナーゼが含まれる。
【０２２０】
プロドラッグ変換酵素は、エステラーゼ（限定されないが、アセチルエステラーゼ、チオールエステルヒドロラーゼ、リン酸モノエステルヒドロラーゼ、リン酸ジエステルヒドロラーゼ、三リン酸モノエステルヒドロラーゼ、硫酸エステルヒドロラーゼ（スルファターゼ）、二リン酸モノエステルヒドロラーゼおよびリン酸三エステルヒドロラーゼなど）；ホスファターゼ（限定されないが、チロシン特異的ホスファターゼ、セリン／スレオニン特異的ホスファターゼ、二重特異性ホスファターゼ、ヒスチジンホスファターゼおよび脂質ホスファターゼなど）；およびレダクターゼ（限定されないが、５−アルファレダクターゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、メトヘモグロビンレダクターゼ、リボヌクレオチドレダクターゼ、チオレドキシンレダクターゼ、大腸菌ニトロレダクターゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼおよびカルボキシペプチダーゼＧ２、シトシンデアミナーゼ、ニトロレダクターゼ、チミジンキナーゼなど）からなる群から選択され得る。
【０２２１】
ＲＮａｓｅは、（特に、ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＲＮａｓｅ Ｉ、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ、ＲＮａｓｅ Ｌ、ＲＮａｓｅ Ｐ、ＲＮａｓｅ ＰｈｙＭ、ＲＮａｓｅ Ｔ１、ＲＮａｓｅ Ｔ２、ＲＮａｓｅ Ｕ２、ＲＮａｓｅ Ｖ１およびＲＮａｓｅ Ｖからなる群から選択される）エンドリボヌクレアーゼ、およびエキソリボヌクレアーゼ（限定されないが、ポリヌクレオチドホスホリラーゼ（ＰＮＰａｓｅ）、ＲＮａｓｅ ＰＨ、ＲＮａｓｅ ＩＩ、ＲＮａｓｅ Ｒ、ＲＮａｓｅ Ｄ、ＲＮａｓｅ Ｔ、オリゴリボヌクレアーゼ、エキソリボヌクレアーゼＩおよびエキソリボヌクレアーゼＩＩなど）を含む。
【０２２２】
アゴニスト抗体またはアゴニスト抗体フラグメントは、組織、臓器または個体において（例えば、ＴＲＡＩＬ受容体、抗グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子ファミリー受容体（ＧＩＴＲ）およびＣＤ４０に対して）作用（限定されないが、受容体シグナル伝達、遺伝子発現、タンパク質合成およびタンパク質分解など）を生じるものを含む。アゴニスト抗体またはアゴニスト抗体フラグメントは、受容体分子の活性部位またはアロステリック部位に結合することによって作用し、それにより特異的反応を引き起こす。
【０２２３】
アンタゴニスト抗体またはアンタゴニスト抗体フラグメントは、アゴニストの作用を遮断するものを含む。通常、アンタゴニスト抗体またはアンタゴニスト抗体フラグメントは、受容体分子の活性部位またはアロステリック部位に結合することによって作用し、または受容体（例えば抗ＣＴＬＡ−４、抗ＴＮＦＲ１、抗ＶＥＧＦＲ、抗ＰＤＧＦＲ、抗ＥＧＦＲ、抗Ｈｅｒ２）の活性の制御に通常関与しない特有の結合部位と相互作用する。通常、アンタゴニスト抗体またはアンタゴニスト抗体フラグメントは、構造的に規定された結合部位においてアゴニストと競合し、またはアゴニストがその結合によって通常生じる作用を生じることができない様式でアゴニストの結合部位を変化させる。
【０２２４】
特定の実施態様において、増殖因子は、アドレノメデュリン(ＡＭ)、アンジオポエチン(Ａｎｇ)、自己分泌型細胞運動刺激因子、骨形成タンパク質(ＢＭＰ)、脳由来神経栄養因子(ＢＤＮＦ)、上皮細胞増殖因子(ＥＧＦ)、エリスロポエチン(ＥＰＯ)、線維芽細胞増殖因子(ＦＧＦ)、グリア細胞由来神経栄養因子(ＧＤＮＦ)、顆粒球コロニー刺激因子(Ｇ−ＣＳＦ)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(ＧＭ−ＣＳＦ)、増殖分化因子−９(ＧＤＦ９)、肝細胞増殖因子(ＨＧＦ)、肝がん由来増殖因子(ＨＤＧＦ)、インシュリン様増殖因子(ＩＧＦ)、遊走刺激因子ミオスタチン(ＧＤＦ−８)、神経成長因子(ＮＧＦ)および他のニューロトロフィン、血小板由来増殖因子(ＰＤＧＦ)、トロンボポエチン(ＴＰＯ)、トランスフォーミング増殖因子アルファ(ＴＧＦ−α)、トランスフォーミング増殖因子ベータ(ＴＧＦ−β)、血管内皮細胞増殖因子(ＶＥＧＦ)、Ｗｎｔシグナル伝達経路および胎盤増殖因子(ＰｌＧＦ)からなる群から選択され得る。
【０２２５】
特定の実施態様において、凝固因子は、トロンビン、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子および第ＸＩＩＩ因子ならびにそれらの活性フラグメントからなる群から選択され得る。
【０２２６】
特定の実施態様において、線維素溶解性タンパク質は、プラスミン、ウロキナーゼ、プラスミノーゲン、α２−抗プラスミン、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）およびプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−１（ＰＡＩ−１）からなる群から選択され得る。
【０２２７】
模倣ペプチドおよびタンパク質は、他のペプチドまたはタンパク質（特に本明細書において上記または下記で指定されたペプチドまたはタンパク質）の活性を模倣するペプチドおよびタンパク質（特に、トロンボポエチン模倣ペプチド、エリスロポエチン模倣ペプチド）を含む。
【０２２８】
さらなる実施態様において、半減期延長モジュールは、本発明のポリペプチドの半減期（例えば「血漿半減期」または「血清半減期」）を変化させる化学物質または生物学的物質である。特に、半減期延長モジュールは、免疫グロブリン結合ドメイン（ＩｇＢＤ）、アルブミン、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）、ペプチド、小分子、脂肪酸、抗体フラグメント、単一ドメイン抗体、ＶＨＨ、足場タンパク質および長期循環血漿タンパク質に対する親和性を示す天然リガンドからなる群から選択され、これらはいずれも任意にペグ化、ＨＥＳ化(HESylate)、ポリシアル酸化、Ｎ−グリコシル化、Ｏ−グリコシル化され、またはＰＥＧ模倣したポリペプチドである。好ましくは、ＩｇＢＤはＩｇ分子のあらゆるドメイン（すなわち、Ｉｇ分子の可変ドメインＶＨまたはＶＬおよび／または定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４および／またはＣＬ）に結合し得る。ＩＧＢＤは、限定されないが、黄色ブドウ球菌のプロテインＡ（ＳｐＡ）、連鎖球菌プロテインＧ（ＳｐＧ）、ペプトストレプトコッカス・マグヌス由来のプロテインＬ（ＰｐＬ）、大腸菌由来のプロテインＥｉｂ、ブドウ球菌由来のプロテインＳｂｉ、ならびに連鎖球菌プロテインＭＡＧ、ＭＩＧ、Ｈ、ＭおよびＺＡＧに由来するドメインを含む。
【０２２９】
さらなる実施態様において、造影分子は特定の標的分子に結合し、それによりその分子の位置の可視化を可能にする分子である。特に、造影分子は、生物発光試薬、化学発光試薬、蛍光造影剤、光増感剤、キレート試薬および放射性部分からなる群から選択される。
【０２３０】
造影分子には、生物発光試薬、化学発光試薬および蛍光造影剤（限定されないが、ウミシイタケおよび／またはメトリディア・ロンガ(Metridia Longa)由来のルシフェラーゼ、過シュウ酸塩(peroxalate)、ポリメチン（例えばＣｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７などのシアニン色素）、スクアライン誘導体、フタロシアニン、ポルフィリン誘導体およびＢＯＤＩＰＹ類似体（ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ ＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ ６５０／６６５）など）、ならびに蛍光タンパク質（限定されないが、ＧＦＰ、ＥＧＰＦ、ＣＦＰ、ＢＦＰ、ＹＦＰ、ＤｓＲＥＤなど）が含まれる(Chudakov et al. (2010) Physiol. Rev. 90:1103-1163)。
【０２３１】
キレート試薬は、少なくとも１つの金属イオン（限定されないが、カルシウム、マグネシウム、鉄、アルミニウム、亜鉛、銅、ヒ素、鉛、タリウムおよび水銀イオンなど）をキレート化により結合できる。このようなキレート試薬は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸（カルシウム二ナトリウムベルサンテ(calcium disodium versante)）（ＣａＮａ２−ＥＤＴＡ）、ジメルカプロール（ＢＡＬ）、ジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）、ジメルカプトプロパンスルホン酸塩（ＤＭＰＳ）、フェリチン、デフェロキサミンおよびデフェラシロクス、デフェリプロン（１，２−ジメチル−３−ヒドロキシル−４−ピリジノン）、ＤＯＴＡ、ＤＴＰＡ、ＤＡＤＴ、ＤＡＤＳ、ＤＯ３Ａ、Ｎ２Ｓ２ＭＡＭＡ、トリアミドチオール(Triamidethiol)、ホスホネート、有機ガドリニウム錯体、ペニシラミンおよびテトラサイクリンファミリーの抗生物質を含み得る。
【０２３２】
特定の実施態様において、放射性部分は放射性核種を含む。放射性部分は、Ｆ、Ｂｒ、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｇａ、Ａｓ、Ｚｒ、Ｐ、Ｃ、Ｓ、Ｈ、Ｉ、Ｉｎ、Ｌｕ、Ｃｕ、Ｒｈ、Ｂｉ、Ａｔ、Ｙ、Ｒｅ、Ａｃ、ＴｃまたはＨｇ原子の同位体であり得る。放射性部分は本発明のポリペプチドを放射性標識し、その検出を（例えばヒト体内において）可能にし、それを診断手法（放射免疫検出法：ＲＡＩＤ）に有用なものとするだけでなく、治療応用（放射免疫療法：ＲＡＩＴ）にも適したものとする。
【０２３３】
光増感剤は、特定の波長の光で励起された後、発光またはフリーラジカルおよび一重項酸素の形成が可能な化学物質である。光増感剤は、例えば光線力学療法のために使用される。好ましい実施態様において、光増感剤には、限定されないが、ポルフィリンファミリー、テキサフィリンファミリー、クロリンファミリーおよびフタロシアニンファミリーの化合物（特にＨｐＤ、ＡＬＡ、Ｍ−ＡＬＡ、ベルテポルフィン、ルテキサフィリン(Lutexaphyrin)、テモポルフィン、タラポルフィン、ＨＰＰＨ、フタロシアニンおよびナフタロシアニンを含む）が含まれる。
【０２３４】
第４の態様において、本発明は、本発明の第１または第２の態様の抗原結合タンパク質、および／または本発明の第３の態様の融合タンパク質をコードする配列を含む核酸分子を提供する。特定の実施態様において、このような核酸分子はＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子を含む。
【０２３５】
第５の態様において、本発明は、本発明の第４の態様の核酸分子を含むベクターを提供する。特定の実施態様において、ベクターは、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルスおよび／または人工染色体からなる群から選択される。
【０２３６】
第６の態様において、本発明は、本発明の第１または第２の態様の抗原結合タンパク質、本発明の第３の態様の融合タンパク質、本発明の第４の態様の核酸、および／または本発明の第５の態様のベクターを含む組換え宿主細胞を提供する。特定の実施態様において、宿主細胞はＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、ＢＨＫまたはＰｅｒＣ６細胞である。
【０２３７】
第７の態様において、本発明は、本発明の第１または第２の態様の抗原結合タンパク質、本発明の第３の態様の融合タンパク質、本発明の第４の態様の核酸、および／または本発明の第５の態様のベクターを含み、薬学的に許容され得る担体、希釈剤、賦形剤、充填剤、結合剤、潤滑剤、流動促進剤、崩壊剤、吸着剤および／または保存剤のうち１つ以上をさらに含む医薬組成物を提供する。
【０２３８】
特定の実施態様において、第７の態様の組成物は、患者への適切な投与のための形態を提供するために、適切な量の担体および／または賦形剤と共に治療有効量の活性成分（すなわち、好ましくは精製された形態における、本発明の第１または第２の態様の抗原結合タンパク質、本発明の第３の態様の融合タンパク質、本発明の第４の態様の核酸、および／または本発明の第５の態様のベクター）を含む。製剤は投与方法に適しているべきである。
【０２３９】
医薬組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉末および徐放性製剤などの形態を取り得る。医薬組成物は、トリグリセリドなどの伝統的な結合剤および担体と共に坐薬として処方され得る。
【０２４０】
本発明の医薬組成物を調製するために、薬学的に許容される担体は固体または液体のいずれかであり得る。固形組成物には、粉末、錠剤、丸剤、カプセル剤、ロゼンジ、カシェ剤、坐薬および分散性顆粒剤が含まれる。固形賦形剤は１以上の物質であり得、これはまた希釈剤、香味剤、結合剤、保存剤、錠剤崩壊剤または封入材料としても作用し得る。粉末において、賦形剤は好ましくは微粉固体であり、これは本発明の微粉化された阻害剤と混合される。錠剤において、活性成分は必要とされる結合特性を有する担体と適切な比率で混合され、所望の形状およびサイズに圧縮される。適切な賦形剤は、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、デンプン、ゼラチン、トラガント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、低融点ワックスおよびカカオバターなどである。坐薬を調製するために、低融点ワックス（脂肪酸グリセリドまたはカカオバターの混合物など）を最初に融解し、活性成分を撹拌などによってその中に均一に分散させる。次に、融解した均一な混合物を都合のよいサイズの型に注ぎ、冷却し、それにより固化させる。錠剤、粉末、カプセル剤、丸剤、カシェ剤およびロゼンジは、経口投与に適した固体投与形態として使用され得る。
【０２４１】
液状組成物には、溶液、懸濁液および乳濁液（例えば、水、生理食塩水、水性デキストロース、グリセロール溶液または水／プロピレングリコール溶液）が含まれる。非経口注射（例えば静脈内、動脈内、骨内注入、筋肉内、皮下、腹腔内、皮内および髄腔内注射）のために、液体製剤は、溶液（例えば水溶性ポリエチレングリコール溶液）中で製剤化され得る。医薬組成物が静脈内投与される場合、生理食塩水が好ましい担体である。
【０２４２】
特定の実施態様において、医薬組成物は単位投与形態である。このような形態において、組成物は適切な量の活性成分を含む単位投与量に細分され得る。単位投与量形態はパッケージ化された組成物（パッケージ化された錠剤、カプセル剤およびバイアルまたはアンプル中の粉末など）であり得、パッケージは個別の量の組成物を含む。また、単位投与量形態はカプセル剤、注射用バイアル、錠剤、カシェ剤またはロゼンジ自体であり得、またはパッケージ化された形態におけるこれらのうち適切な数のいずれかであり得る。
【０２４３】
所望の場合、組成物は、少量の湿潤剤もしくは乳化剤またはｐＨ緩衝剤を含み得る。
【０２４４】
さらに、このような医薬組成物はまた、他の薬理活性物質（限定されないが、アジュバントおよび／またはさらなる活性成分など）を含み得る。本発明の文脈におけるアジュバントには、限定されないが、無機アジュバント、有機アジュバント、油性アジュバント、サイトカイン、粒子アジュバント、ビロソーム、細菌アジュバント、合成アジュバントまたは合成ポリヌクレオチドアジュバントが含まれる。
【０２４５】
第８の態様において、本発明は、医薬における使用のための、本発明の第１または第２の態様の抗原結合タンパク質、本発明の第３の態様の融合タンパク質、本発明の第４の態様の核酸、本発明の第５の態様のベクター、または本発明の第７の態様の医薬組成物を提供する。特定の実施態様において、医薬における使用は、障害または疾患の予防、処置または診断（特に増殖性障害または増殖性疾患の予防、処置または診断）における使用である。
【０２４６】
特定の実施態様において、本発明の第１または第２の態様の抗原結合タンパク質、本発明の第３の態様の融合タンパク質、本発明の第４の態様の核酸、本発明の第５の態様のベクター、または本発明の第７の態様の医薬組成物は、腫瘍増殖を阻害し、またはがんを処置するのに使用される。
【０２４７】
増殖性障害または増殖性疾患には、限定されないが、基底細胞がん、膀胱がん、骨がん、脳腫瘍、乳がん、バーキットリンパ腫、子宮頸がん、結腸がん、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、食道がん、網膜芽細胞腫、胃がん、消化管間質腫瘍、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、カポジ肉腫、白血病、リンパ腫、黒色腫、中咽頭がん、卵巣がん、膵がん、胸膜肺芽腫、前立腺がん、咽喉がん、甲状腺がんおよび尿道がんが含まれる。
【０２４８】
第９の態様において、本発明は、治療有効量の本発明の第１または第２の態様の抗原結合タンパク質、本発明の第３の態様の融合タンパク質、本発明の第４の態様の核酸、本発明の第５の態様のベクター、または本発明の第７の態様の医薬組成物をそれを必要とする患者に投与することを含む、腫瘍増殖を阻害し、またはがんを処置する方法を提供する。
【０２４９】
本発明のあらゆる態様の実施において、上述の医薬組成物または結合部分（例えば抗体またはその抗原結合フラグメント）は、患者に十分なレベルの結合部分を提供する当分野で確立された任意の経路によって患者に投与され得る。これは全身投与または局所投与され得る。このような投与は、非経口的、経粘膜的に（例えば経口的、経鼻的、直腸内、膣内、舌下、粘膜下、経皮的、または吸入によって）なされ得る。好ましくは、投与は（例えば静脈内注射または腹腔内注射による）非経口投与であり、限定されないが、動脈内投与、筋肉内投与、皮内投与および皮下投与を含む。本発明の医薬組成物が局所投与される場合、医薬組成物は処置される臓器または組織（例えば腫瘍に罹患した臓器）に直接注射され得る。
【０２５０】
経口投与に適した医薬組成物は、カプセル剤もしくは錠剤として；粉末もしくは顆粒剤として；（水性液体または非水性液体における）溶液、シロップもしくは懸濁液として；食用フォームもしくはホイップとして；または乳濁液として提供され得る。錠剤または硬ゼラチンカプセルは、ラクトース、デンプンまたはその誘導体、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム、ステアリン酸またはその塩を含み得る。軟ゼラチンカプセルは、植物油、ワックス、脂肪、半固体または液体ポリオールなどを含み得る。溶液およびシロップは、水、ポリオールおよび糖を含み得る。
【０２５１】
経口投与を意図した活性物質は、消化管における活性物質の崩壊および／または吸収を遅延させる物質でコーティングされ得、または該物質と混合され得る（例えば、モノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリンが使用され得る）。したがって、活性物質の徐放が長時間にわたって達成され得、必要に応じて活性物質は胃内における分解から保護され得る。経口投与のための医薬組成物は、特定のｐＨまたは酵素条件によって特定の胃腸の位置における活性物質の放出を促進するように処方され得る。
【０２５２】
経皮投与に適した医薬組成物は、レシピエントの表皮と長期間密接に接触したままにすることが意図される個別のパッチとして提供され得る。局所投与に適した医薬組成物は、軟膏、クリーム、懸濁液、ローション、粉末、溶液、ペースト、ゲル、噴霧剤、エアロゾルまたは油として提供され得る。皮膚、口、眼または他の外部組織への局所投与のために、好ましくは局所用の軟膏またはクリームが使用される。軟膏において処方される場合、活性成分はパラフィン系軟膏基剤または水混和性軟膏基剤のいずれかと共に利用され得る。あるいは、活性成分は、水中油型基剤または油中水型基剤と共にクリームにおいて処方され得る。眼への局所投与に適した医薬組成物は点眼剤を含む。これらの組成物において、活性成分は適切な担体（例えば水性溶媒）に溶解または懸濁され得る。口における局所投与に適した医薬組成物には、ロゼンジ、トローチおよび口腔洗浄剤が含まれる。
【０２５３】
経鼻投与に適した医薬組成物は、（好ましくは２０〜５００ミクロンの範囲の粒子径を有する）粉末などの固体担体を含み得る。粉末は、嗅ぎタバコを吸う様式で（すなわち、鼻の近くに保持された粉末の容器からの鼻を介した急速な吸入によって）投与され得る。あるいは、経鼻投与に適した組成物は液体担体（例えば鼻腔用噴霧剤または点鼻剤）を含み得る。これらの組成物は活性成分の水溶液または油剤を含み得る。吸入による投与のための組成物は特別に適応された装置（限定されないが、加圧エアロゾル、噴霧器または吸入器を含む）中に供給され得、これは所定の投与量の活性成分を提供するように構築されてい得る。好ましい実施態様において、本発明の医薬組成物は鼻腔を介して肺に投与される。
【０２５４】
直腸内投与に適した医薬組成物は、坐薬または注腸剤として提供され得る。膣内投与に適した医薬組成物は、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォームまたは噴霧剤の製剤として提供され得る。
【０２５５】
非経口投与に適した医薬組成物は水性および非水性の無菌の注射用溶液または懸濁液を含み、これは抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および組成物を対象のレシピエントの血液と実質的に等張にする溶質を含み得る。このような組成物中に存在し得る他の成分には、例えば、水、アルコール、ポリオール、グリセリンおよび植物油が含まれる。非経口投与に適した組成物は、単位投与量または複数投与量の容器（例えば密封されたアンプルおよびバイアル）中に示され得、使用直前に無菌液体担体（例えば注射用無菌生理食塩水）の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）条件で保存され得る。即時の注射溶液および懸濁液は、無菌の粉末、顆粒および錠剤から調製され得る。
【０２５６】
好ましい実施態様において、組成物は、ヒトへの静脈内投与に適した医薬組成物として日常的な手順に従って処方される。通常、静脈内投与用の組成物は、無菌の等張水性緩衝液中の溶液である。必要に応じて、組成物は、可溶化剤、および注射部位における疼痛を緩和するための局所麻酔薬（リドカインなど）を含み得る。一般に、成分は別々に、または単位投与形態中に混合して（例えば、活性物質の量を示す密封容器（アンプルまたは小袋(sachette)など）中における凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として）供給される。組成物が注入によって投与される場合、組成物は無菌の医薬品グレードの水または生理食塩水を含む注入ボトルを用いて分注され得る。組成物が注射によって投与される場合、成分が投与前に混合され得るように、無菌生理食塩水のアンプルが提供され得る。
【０２５７】
別の実施態様において、例えば、化学誘引の阻害剤が制御放出システムにおいて送達され得る。例えば、阻害剤は、静脈内注入、埋込み型浸透圧ポンプ、経皮パッチ、リポソームまたは他の投与方法を用いて投与され得る。ある実施態様において、ポンプが使用され得る（Sefton (1987) CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 201; Buchwald et al. (1980) Surgery 88:507; Saudek et al. (1989) N. Eng. J. Med. 321: 574参照）。別の実施態様において、化合物は、小胞（特にリポソーム）において送達され得る(Langer (1990) Science 249:1527-1533; Treat et al. (1989) in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, N.Y., 353-365; WO 91/04014; U.S. 4,704,355参照)。別の実施態様において、ポリマー材料が使用され得る(Medical Applications of Controlled Release (1974) Langer and Wise (eds.), CRC Press: Boca Raton, Fla.; Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, (1984) Smolen and Ball (eds.), Wiley: N.Y.; Ranger and Peppas (1953) J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23: 61参照; Levy et al. (1985) Science 228:190; During et al. (1989) Ann. Neurol. 25: 351; Howard et al. (1989) J. Neurosurg. 71: 105も参照)。
【０２５８】
さらなる別の実施態様において、制御放出システムは治療標的（すなわち標的細胞、標的組織または標的臓器）の近くに配置され得、したがって全身投与の用量のほんの一部を必要とし得る（例えば、Goodson (1984) 115-138 in Medical Applications of Controlled Release, vol. 2参照）。他の制御放出システムが、Langerによる総説（1990, Science 249: 1527-1533）において議論されている。
【０２５９】
具体的な実施態様において、本発明の医薬組成物を、処置を必要とする領域に局所投与することが望まれ得る；これは例えば、限定されないが、注射、カテーテル、坐薬、埋込み剤を用いた手術中の局所注入、（例えば手術後に創傷被覆材と組み合わせた）局所適用によって達成され得、ここで前記埋込み剤は、多孔質物質、非多孔質物質またはゼラチン質物質（シラスティック膜などの膜または繊維を含む）である。
【０２６０】
好ましい有効量の選択は、当業者に公知のいくつかの因子の考慮に基づいて当業者によって決定される。このような因子は医薬組成物の特定の形態（例えばポリペプチドまたはベクター）およびその薬物動態パラメータ（バイオアベイラビリティ、代謝および半減期など）を含み、これらは医薬化合物についての規制認可を取得するのに通常利用される通常の開発手順中に確立される。用量を考慮する際のさらなる因子には、予防および／または処置される病状もしくは疾患、または正常な個体において達成される利益、患者の体重、投与経路、投与が急性であるかまたは慢性であるか、併用薬、および投与される医薬品の有効性に影響を与えることが周知である他の因子が含まれる。したがって、正確な投与量は、施術者の判断および各患者の状況に従って（例えば、標準的な臨床技術に従って、個々の患者の状態および免疫状態に依存して）決定されるべきである。
【０２６１】
以下の実施例は本発明の単なる説明であり、いかなる方法においても添付の特許請求の範囲によって示される本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【０２６２】
実施例１：抗ＨＥＲ３抗体３−４３の結合およびエピトープ特異性
真核生物発現のために最適化された３−４３可変ドメイン配列を含む完全ヒトＩｇＧ１分子（ＩｇＧ３−４３）をクローン化し、懸濁培養に適応したＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞中に発現させた。タンパク質を、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって一過性にトランスフェクトした細胞の上清から精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析およびサイズ排除クロマトグラフィーにより、タンパク質の完全性を確認した。精製したＩｇＧ３−４３のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、非還元条件下において無傷のＩｇＧ（約１５０ｋＤａ）の分子量を伴う単一のバンド、ならびに非還元条件下において重鎖（５０ｋＤａ）および軽鎖（２５ｋＤａ）に対応する２つのバンドを示した（図１Ａ）。サイズ排除クロマトグラフィーにより、ＩｇＧ３−４３の純度を確認した（図１Ｂ）。ＩｇＧ３−４３の抗原結合を、ヒトＨＥＲ３の細胞外ドメイン（ａａ２７〜５９９）を含む固定化されたＨＥＲ３−Ｆｃ融合物を用いてＥＬＩＳＡにおいて分析した。ＨＥＲ３−Ｆｃ融合タンパク質をＰＢＳ中、３μｇ／ｍｌにおいてポリスチレンマイクロタイタープレート上にコーティングした。残存している結合部位をＰＢＳ、２％スキムミルク（ＭＰＢＳ）で遮断した。次いでプレートをＭＰＢＳ中のＩｇＧ３−４３の段階希釈物と共にインキュベートした。洗浄後、結合した抗体をＨＲＰ標識抗ヒトＦｃ抗体および基質としてのＴＭＢ、Ｈ２Ｏ２を用いて検出した。ＩｇＧ３−４３は、サブナノモル濃度範囲のＥＣ５０値（０．４±０．２ｎＭ）を有するＨＥＲ３への特異的かつ濃度依存的な結合を示した（図１Ｃ）。ＩｇＧ３−４３の単量体受容体ＨＥＲ３に対する親和性を、Attana 200 cell装置を用いて水晶振動子マイクロバランス測定によって決定した。ＩｇＧ３−４３を、約９０Ｈｚの振動数変化をもたらす密度において低非特異的結合のカルボキシルチップの表面上にアミン結合によって固定化した。測定を、ＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ）ｐＨ７．４の２５μｌ／分の流速で２５℃において行った。結合の再生を、３Ｍ ＭｇＣｌ２を用いて１５分間、２回行った。２回の測定毎に、緩衝液の注入を行い、ベースラインを決定し、次いでベースラインを隣接する測定値から差し引いた。可溶性Ｈｉｓタグ付きＨＥＲ３を２．５〜２０ｎＭの濃度で、ＰＢＳＴにおける２倍希釈系列において無作為な順番で注入した（図１Ｄ）。１１ｎＭのＫｄ値が決定された（表１）。
【０２６３】
実施例２：抗ＨＥＲ３抗体３−４３のエピトープマッピングおよび交差反応性
抗体のエピトープを特定するために、ヒトＨＥＲ３細胞外ドメイン（ＤＩＩ〜ＤＩＶ ａａ２０８〜６４３、ＤＩＩＩ〜ＤＩＶ ａａ３２９〜６４３、ＤＩＶ ａａ５３２〜６４３）の完全長型（ａａ２０〜６４３）および切断型をクローン化し、トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞においてＦｃ融合タンパク質として産生させた。プロテインＡクロマトグラフィーで精製した融合タンパク質の非還元条件および還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、融合タンパク質の正確なサイズおよび二量体会合が確認された。ＩｇＧ３−４３が種々のドメイン欠失ＨＥＲ３融合タンパク質に結合する能力を、ＥＬＩＳＡおよび非還元条件下での免疫ブロット実験において評価した（図２Ａに要約されている）。ＥＬＩＳＡのために、ＨＥＲ３−Ｆｃ融合タンパク質をＰＢＳ中、１０μｇ／ｍｌにおいてポリスチレンマイクロタイタープレート上にコーティングした。残存している結合部位をＰＢＳ、２％スキムミルク（ＭＰＢＳ）で遮断した。次いでプレートをＭＰＢＳ中のＩｇＧ３−４３の段階希釈物と共にインキュベートした。洗浄後、結合した抗体をＨＲＰ標識抗ヒトＦａｂ抗体および基質としてのＴＭＢ、Ｈ２Ｏ２を用いて検出した。結合は、完全長ＨＥＲ３−Ｆｃ融合タンパク質（ａａ２０〜６４３）ならびにＤＩＩ〜ＤＩＶ（ａａ２０８〜６４３）ＦｃおよびＤＩＩＩ〜ＤＩＶ（ａａ３２９〜６４３）Ｆｃ融合タンパク質について検出されたが、ＤＩＶ−Ｆｃ（ａａ５３２〜６４３）とは検出されなかった。この知見は、ＩｇＧ３−４３のエピトープがＨＥＲ３のドメインＩＩＩに存在することを示す。ＤＩＩＩの一部およびＤＩＶ全体を含むフラグメント（ａａ３５９〜６４３、３９５〜６４３、４５８〜６４３）は結合を示さず、これはＤＩＩＩドメイン全体が抗体結合に必要とされることを示す。驚くべきことに、ＤＩ〜ＤＩＩＩ（ａａ２０〜５３１；ＤＩＶを持たない）またはＤＩ〜ＤＩＩおよびＤＩＩＩの短い部分（ａａ２０〜３５８）を含むＦｃ融合タンパク質をテストしても結合は観察されなかった。この知見は、ＤＩＶもまた抗体結合に必要であることを示す。ＤＩ〜ＤＩＩＩプラスＤＩＶの一部（ａａ２０〜５８７、２０〜５５０）を含むフラグメントのテストは、３−４３とａａ２０〜５８７との結合を示したが、ａａ２０〜５５０との結合は示さず、これらはエピトープが少なくともａａ３２８〜５８７内に存在し、少なくともａａ３２８〜５８７を必要とすることを示した。これはａａ３２９〜５８７から構成されるフラグメントを用いて確認され、このフラグメントはＥＬＩＳＡにおいて結合を示した。対照的に、ａａ３５９〜５８７またはａａ３２９〜５５０から構成されるフラグメントは結合を示さず、したがってエピトープがａａ３２９〜５８７内に存在し、ａａ３２９〜５８７を必要とすることが確認された。
【０２６４】
ＩｇＧ３−４３は、変性および還元されたＨＥＲ３−Ｆｃ融合タンパク質を免疫ブロット実験において検出できなかったが、変性しているが還元されていないフラグメントとの結合が見出され、これはＩｇＧ３−４３のエピトープが還元に敏感である（すなわち、ジスルフィド結合によって安定化されている）ことを示した。さらに、本発明者らは、ヒトおよびマウスＨＥＲ３−Ｆｃ融合タンパク質との結合をＥＬＩＳＡにおいて分析した（図２Ｂ）。両方のＨＥＲ３−Ｆｃ融合タンパク質との結合が検出され、これはＩｇＧ３−４３がＨＥＲ３と交差反応性であり、したがってＩｇＧ３−４３のエピトープはこれら２つの種において保存されていることを示した。
【０２６５】
実施例３：抗ＨＥＲ３抗体３−４３のＨＥＲ３発現腫瘍細胞株への結合
フローサイトメトリー研究を、ＨＥＲ３発現ＭＣＦ−７、ＦａＤｕ、ＢＴ４７４、Ａ４３１、ＮＣＩ−Ｎ８７およびＡ５４９細胞を用いて行った（図３）。細胞を３７℃で短時間トリプシン処理した。トリプシンをＦＣＳ含有培地でクエンチし、遠心分離により除去し、プローブ毎に２００，０００個の細胞を播種した。次いで、細胞を様々な濃度のＩｇＧ３−４３と共に少なくとも１時間４℃でインキュベートした。洗浄をＰＢＡ（１ｘ ＰＢＳ中の２％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３）を用いて２回行った。マウス由来のＰＥ標識抗ヒトＦｃ抗体をさらに１時間インキュベートし、結合した抗体分子を可視化した。さらなる２回の洗浄工程後、蛍光をＭＡＣＳＱｕａｎｔ（登録商標） Ａｎａｌｙｚｅｒ １０を用いて測定し、無染色細胞に対する蛍光強度の中央値をＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて計算した。これらの実験は、２６〜７４ｐＭの範囲の驚くほど低いＥＣ５０値を有するＩｇＧ３−４３の細胞受容体への結合を示した。
【０２６６】
実施例４：ＩｇＧ３−４３はヘレグリンリガンド結合を阻害する
組換えｈｉｓタグ付きヒトＨＲＧ−β１をＭＣＦ−７細胞と共にインキュベートし、結合したタンパク質をＰＥ標識抗ｈｉｓ抗体によって検出した。過剰量のＩｇＧ３−４３（３μＭ）とのプレインキュベーションは、細胞の蛍光強度を著しく減少させ、これはＨＲＧ結合の遮断を示した。一方、陰性対照としてのセツキシマブとのプレインキュベーションは同様の効果をもたらさなかった（図４）
【０２６７】
実施例５：抗ＨＥＲ３抗体３−４３によるヘレグリン誘導性ＨＥＲ３リン酸化およびシグナル伝達の阻害
ＩｇＧ３−４３を、ＨＥＲ３のＨＲＧ誘導性リン酸化を妨げる能力についてさらに分析した。セミコンフルエントの細胞をＩｇＧ３−４３と共に１時間インキュベートし、その後ＨＲＧ（５０ｎｇ／ｍｌ）で１５分間刺激した。細胞溶解物のウェスタンブロット解析は、種々の細胞株（ＭＣＦ−７、ＢＴ−４７４、ＮＣＩ−Ｎ８７、Ａ４３１、Ａ５４９、ＦａＤｕ）におけるＨＥＲ３リン酸化の効率的な遮断ならびにＨＲＧ誘導性ＥｒｋおよびＡｋｔリン酸化の抑制を明らかにした（図５）。ＩｇＧ３−４３の滴定はさらに、ＨＲＧ誘導性ＨＥＲ３リン酸化の遮断のための低ピコモル濃度範囲のＩＣ５０値を明らかにした。バンドの密度をＦｕｓｉｏｎ Ｓｏｌｏ Ｓソフトウェア（Vilber）を用いて分析し、チューブリンローディング対照に対する相対値を用いてＩＣ５０値を計算した。ＭＣＦ−７細胞について、８０ｐＭのＩＣ５０値が決定された。ＭＣＦ−７細胞上における抗ＨＥＲ３ ＩｇＧ ３Ｍ６（これはセリバンツマブと同一の可変ドメインを含む）との比較は、ＩｇＧ３−４３の優れた活性を示した。ここで、３Ｍ６はＨＥＲ３リン酸化を２７０ｐＭのＩＣ５０値で阻害した。
【０２６８】
実施例６：抗ＨＥＲ３抗体３−４３によって誘導されるＨＥＲ３インターナリゼーション
ＩｇＧ３−４３のインキュベーション後における細胞のＨＥＲ３発現レベルおよびＩｇＧの局在化をそれぞれウェスタンブロットおよび免疫蛍光顕微鏡によって分析した。ウェスタンブロット解析のために、ＭＣＦ−７細胞を２日前に６ウェルプレートに播種し、実験当日にセミコンフルエントにした。細胞を一晩血清飢餓させ、１００ｎＭ ＩｇＧ３−４３と共に図中に示す時間インキュベートした。ＨＥＲ３レベルをウェスタンブロットによって解析した。バンドの密度をＦｕｓｉｏｎ Ｓｏｌｏ Ｓソフトウェア（Vilber）を用いて分析した。値をチューブリンローディング対照との相対化によってローディング差について補正し、未処理プローブの相対値に対して正規化した。ＩｇＧ３−４３はＭＣＦ−７細胞中のＨＥＲ３レベルの減少を迅速に導く（図６）。さらに、Ｃｙ５標識ＩｇＧ３−４３は共焦点顕微鏡によって示されるように、ＭＣＦ−７細胞中に迅速にインターナライズされた（データ示さず）。１時間後、ＩｇＧ３−４３の強い細胞内蓄積が検出可能であった。
【０２６９】
実施例７：抗ＨＥＲ３ ＩｇＧ３−４３による細胞増殖の阻害
ＩｇＧ３−４３を、インビトロにおいて腫瘍細胞増殖を減少させる能力に関して、さらに評価した。この効果をモニターするために、様々なヒトがん細胞株（ＭＣＦ−７、ＢＴ−４７４、ＮＣＩ−Ｎ８７、ＦａＤｕ）を９６ウェルプレートに低密度で播種し、一晩接着させ、その後低い血清濃度下でＩｇＧ３−４３または対照としての他の抗体と共にインキュベートした。１週間のインキュベーション後において、増殖を測定した。全４種の細胞株について、対照抗体と比較した増殖の減少が観察された（図７）。ＦａＤｕについて、２７３ｐＭのＩＣ５０値がこれらの条件下で決定された。
【０２７０】
実施例８：ＩｇＧ３−４３はＳＣＩＤマウスにおいて皮下異種移植ＦａＤｕ腫瘍の増殖を効率的に阻害する
ＩｇＧ３−４３の抗腫瘍活性をＳＣＩＤマウスの皮下ＦａＤｕ異種移植モデルにおいてテストした。５ｘ１０６個の細胞をマウスの両方の側腹部に注射し、腫瘍が約８０ｍｍ３の体積に達した際（腫瘍細胞接種の１４日後）に処理を開始した。マウスは、静脈内注射を３週間、３０、１００および３００μｇの用量（陰性対照としてＰＢＳを含む）で週に２回受けた。抗腫瘍効果が、ＩｇＧ３−４３の全３種の投与量のレジメンについて生存率の増加（より高い２種の濃度についてのみ生存率の中央値が増加した）および有意な腫瘍増殖の阻害を伴って観察された（図８）。
【０２７１】
実施例９：ＥＧＦＲおよびＨＥＲ３を標的とする二重特異性単鎖ダイアボディ−Ｆｃ融合タンパク質は、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ３の活性化の強力な阻害を誘導する
本発明者らは、ｈｕ２２５（Ｃ２２５（セツキシマブ、アービタックス）のヒト化型）および３−４３の抗体部分を含む、単鎖ダイアボディ−Ｆｃの形式におけるＥＧＦＲおよびＨＥＲ３を標的とする二重特異性抗体を作製した（図９Ａ、Ｃ）。ｓｃＤｂ−Ｆｃ融合タンパク質をＨＥＫ２９３−６Ｅ浮遊細胞において産生させ、プロテインＡアフィニティー精製によって細胞培養上清から精製した。ｓｃＤｂ ｈｕ２２５ｘ３−４３−ＦｃのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、作製物の単量体および二量体会合に対応する、還元条件下における約８２ｋＤａの見かけの分子量の単一のバンド、および非還元条件下における約２００ｋＤａの見かけの分子量の単一のバンドが明らかとなった（図９Ｂ）。対照的に、セツキシマブおよびＩｇＧ３−４３は、還元条件下において重鎖および軽鎖を示す２つのバンドを示した。純度をサイズ排除クロマトグラフィーによって確認した（図９Ｃ）。ｓｃＤｂ−Ｆｃのその抗原との結合活性およびＥｒｂＢ受容体を発現する細胞との結合活性をそれぞれＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリーによって評価した。ＥＬＩＳＡ分析は、親抗体とＥＧＦＲおよびＨＥＲ３の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）との結合活性がｓｃＤｂ−Ｆｃ形式において保持されていることを明らかにした（図１０Ａ参照）。ｓｃＤｂ−Ｆｃ分子および親抗体はそれらの対応する抗原に、サブモル濃度範囲の類似のＥＣ５０値で結合していた（表３）。フローサイトメトリー分析は、セツキシマブおよびｓｃＤｂ ｈｕ２２５ｘ３−４３−ＦｃはＦａＤｕ細胞に０．２ｎＭのＥＣ５０値で結合したが、ＩｇＧ３−４３は０．００６ｎＭのＥＣ５０値で結合したことを示した（図１０Ｂ）。
【０２７２】
次に、ＭＣＦ−７細胞においてシグナル伝達阻害アッセイを行い、受容体活性化がｓｃＤｂ ｈｕ２２５ｘ３−４３−Ｆｃでの処理によって阻害されるか否かを決定した（図１１）。ヘレグリンはＨＥＲ３リン酸化ならびに下流のエフェクターＡｋｔおよびＥｒｋ１／２の活性化を誘導した。ＩｇＧ３−４３ならびにＩｇＧ３−４３およびセツキシマブの組合せでの前処理は、ＨＥＲ３リン酸化ならびにＡｋｔおよびＥｒｋ１／２の活性化を効率的に遮断し、ＨＥＲ３を分解した。ｓｃＤｂ ｈｕ２２５ｘ３−４３−Ｆｃでの処理はまた、ＨＥＲ３シグナル伝達の強力な阻害を示し、ＨＥＲ３分解をもたらした。また、シグナル伝達阻害アッセイを他のＥｒｂＢ過剰発現細胞株（Ａ−４３１、Ａ５４９、ＦａＤｕ、ＮＣＩ−Ｎ８７、ＳＫ−ＢＲ−３）において行い、ＥＧＦで刺激したＥＧＦＲの阻害をさらに評価した（図１２Ａ〜Ｆ）。二重特異性ｓｃＤｂ ｈｕ２２５ｘ３−４３−ＦｃならびにセツキシマブおよびＩｇＧ３−４３の組合せは、全ての細胞株においてＥＧＦ存在下におけるＥＧＦＲのリン酸化およびヘレグリン存在下におけるＨＥＲ３のリン酸化の両方を阻害した。ｓｃＤｂ−Ｆｃと親抗体との間のＨＥＲ３シグナル伝達阻害における差異の可能性をさらに調べるため、シグナル伝達阻害アッセイを、ヘレグリン存在下におけるＦａＤｕ細胞において抗体の段階希釈物を用いて行った（図１３参照）。ｓｃＤｂ−ＦｃはＨＥＲ３リン酸化を０．００８ｎＭのＩＣ５０値で阻害したが、ＩｇＧ３−４３およびセツキシマブの組合せはＨＥＲ３リン酸化を０．０８１ｎＭのＩＣ５０値で遮断し、これは、二重特異性抗体が単一特異性親抗体の組合せと比較してＨＥＲ３リン酸化の優れた阻害活性を有することを示した。
【０２７３】
実施例１０：抗体２−３５および３−４３に由来するＨＥＲ２およびＨＥＲ３を標的とする二重特異性単鎖ダイアボディ−Ｆｃ融合タンパク質
本発明者らは、抗体２−３５および３−４３の抗体部分を含む、単鎖ダイアボディ−Ｆｃの形式におけるＨＥＲ２およびＨＥＲ３を標的とする二重特異性抗体を作製した。２−３５部分をファージディスプレイによって同定した。２−３５部分はＨＥＲ２の細胞外ドメインに特異的である。ｓｃＤｂ−Ｆｃ融合タンパク質をＨＥＫ２９３−６Ｅ浮遊細胞において産生させ、プロテインＡアフィニティー精製によって細胞培養上清から精製した。ｓｃＤｂ ２−３５ｘ３−４３−ＦｃのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、還元条件下における約８２ｋＤａの見かけの分子量の単一のバンド、および非還元条件下における約２００ｋＤａの見かけの分子量の単一のバンドが明らかとなった（図１４Ａ参照）。純度をサイズ排除クロマトグラフィーによって確認した（図１４Ｂ参照）。親抗体ＩｇＧ２−３５およびＩｇＧ３−４３と比較した、ｓｃＤｂ−ＦｃのＨＥＲ２およびＨＥＲ３の細胞外ドメインとの結合をＥＬＩＳＡによって決定した。ＥＬＩＳＡ分析は、親抗体のＨＥＲ２およびＨＥＲ３のＥＣＤタンパク質への結合活性がｓｃＤｂ−Ｆｃ形式において保持されていることを明らかにした（図１５参照）。ｓｃＤｂ ２−３５ｘ３−４３−ＦｃおよびＩｇＧ２−３５はＨＥＲ２−ＥＣＤに約１．５ｎＭのＥＣ５０値で結合し、二重特異性抗体はＨＥＲ３−ＥＣＤと０．２４ｎＭのＥＣ５０値で結合し、ＩｇＧ３−４３はＨＥＲ３−ＥＣＤと０．３３ｎＭのＥＣ５０値で結合した。ＭＣＦ−７細胞におけるシグナル伝達阻害アッセイは、ＩｇＧ２−３５がＨＥＲ３リン酸化をわずかに減少させたことを示したが、これはＨＥＲ２とのＨＥＲ３のヘテロ二量体化の阻害による可能性がある（図１１参照）。二重特異性抗体の形式における２−３５部分および３−４３部分の組合せは、ＨＥＲ３シグナル伝達の強力な阻害を示した。これらの結果は、ｓｃＤｂ ２−３５ｘ３−４３−Ｆｃが代償性シグナル伝達軸(compensatory signaling axis)を遮断し、したがって腫瘍回避を防ぐさらなる候補となり得ることを示す。
【０２７４】
実施例１１：抗ＨＥＲ３ ｓｃＴＲＡＩＬ融合タンパク質は、標的依存性細胞毒性を仲介する
ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）は、がん細胞に対するその選択的毒性のために有望なエフェクター分子であると考えられる。単鎖型のＴＲＡＩＬをヒトＩｇＧ１ Ｆｃ部分のＣ末端と融合させて（Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬ）二量体会合を誘導し、これは抗腫瘍効果を大きく増加させた。生物活性をさらに改善するために、ｓｃＦｖ３−４３のＮ末端をＦｃ部分と融合させ、ｓｃＦｖ３−４３−Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬを作製した。融合タンパク質を安定にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞において産生させ、抗ＦＬＡＧアフィニティークロマトグラフィーによって上清から精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析およびサイズ排除クロマトグラフィーにより、タンパク質の純度および完全性を確認した（図１６参照）。
【０２７５】
新たなｓｃＦｖ３−４３−Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬ融合タンパク質を、対応する標的抗原およびヒトＴＲＡＩＬ−Ｒ２に結合する能力に関してＥＬＩＳＡおよび無傷のＣｏｌｏ２０５およびＨＣＴ−１１６細胞を用いたフローサイトメトリーによって評価した。抗原結合およびＴＲＡＩＬ受容体結合を、対応する細胞外ドメインのＦｃ融合タンパク質を用いてＥＬＩＳＡにおいて分析した。ｓｃＦｖ３−４３−Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬは、サブナノモル濃度範囲のＥＣ５０値を有するＨＥＲ３への特異的かつ濃度依存的な結合を示した（図１７Ａ、表４参照）。さらなるＥＬＩＳＡ研究は、２．８４ｎＭのＥＣ５０値を有するヒトＴＲＡＩＬ−Ｒ２との強力な結合を明らかにした（図Ｍ２Ｂ、表Ｍ１参照）。したがって、ｓｃＦｖ３−４３との融合はＴＲＡＩＬ−Ｒ２結合を妨げない。ＥＬＩＳＡの結果を、抗原およびＴＲＡＩＬ受容体発現Ｃｏｌｏ２０５およびＨＣＴ−１１６細胞を用いたフローサイトメトリー研究によって確認した（図１７Ｃ、Ｄ参照）。これらのデータは、ｓｃＦｖ３−４３−Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬが、精製および細胞表面に発現したＨＥＲ３およびＴＲＡＩＬ−Ｒ２への結合に関して完全な機能性を有することを示す。
【０２７６】
ｓｃＦｖ３−４３−Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬの細胞死誘導をＣｏｌｏ２０５細胞を用いて分析し、非標的化Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬと比較した。処理の１日前に、５０，０００個のＣｏｌｏ２０５細胞／ウェルを９６ウェルプレートに播種した。細胞を感作物質ボルテゾミブ（６５０ｎＭ）または培地で３０分間前処理した後、細胞を融合タンパク質の段階希釈物で１６時間インキュベートした。細胞死をクリスタルバイオレット染色によって分析した。ｓｃＦｖ３−４３−Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬはＣｏｌｏ２０５に対して細胞死の強力な誘導を示し、これはボルテゾミブ存在下においてさらに増強できた（図１８参照）。非標的化Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬとの比較は、ボルテゾミブ非存在下および存在下におけるｓｃＦｖ３−４３−Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬのより良い効果を明らかにした（図１８、表５参照）。この優位性がｓｃＦｖ３−４３標的化部分によって生じることを確認するために、対応する遮断抗体ｓｃＦｖ３−４３−Ｆｃ（２００倍モル過剰）を前処理の細胞に添加し、実験を繰り返した。遮断抗体の存在下において、ｓｃＦｖ３−４３−Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬの効果は、非標的化Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬの効果のレベルまで減少した（図１８、表５参照）。これにより、抗腫瘍効果を改善する細胞毒性融合タンパク質の標的化についての３−４３抗体部分の適合性が確認された。
【０２７７】
実施例１２：Ｔ細胞再標的化のための抗ＨＥＲ３ｘ抗ＣＤ３二重特異性抗体
二重特異性ｓｃＤｂ分子を、抗ＨＥＲ３ ３−４３の結合部位を抗ヒトＣＤ３抗体ＵＣＨＴ１のヒト化型と組み合わせることによって作製した。したがって、ｓｃＤｂ ３−４３ｘＣＤ３は、ＨＥＲ３のための１つの結合部位およびＣＤ３のための１つの結合部位を示す（図１９ＡおよびＢ）。ｓｃＤｂ ３−４３ｘＣＤ３をＨＥＫ２９３細胞において産生させ、ＩＭＡＣで精製した。ｓｃＤｂ ３−４３ｘＣＤ３のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、還元条件下における約５５ｋＤａの見かけの分子量の単一のバンド、および非還元条件下における約５０ｋＤａの見かけの分子量の単一のバンドが明らかとなった（図１９Ｃ）。サイズ排除クロマトグラフィーにより、約５０ｋＤａの見かけの分子量を有するタンパク質（流体力学半径：２．９６ｎｍ）の純度および完全性が確認された（図１９Ｄ）。
【０２７８】
新たなｓｃＤｂ作製物の結合を、ＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリーによって評価した。ｓｃＤｂ ３−４３ｘＣＤ３の抗原結合を、ＥＬＩＳＡにおいてヒトＨＥＲ３の細胞外ドメイン（ａａ２７〜５９９）を含む固定化されたＨＥＲ３−Ｆｃ融合物を用いて分析した。ＨＥＲ３−Ｆｃ融合タンパク質をＰＢＳ中、２μｇ／ｍｌにおいてポリスチレンマイクロタイタープレート上にコーティングした。残存している結合部位をＰＢＳ、２％スキムミルク（ＭＰＢＳ）で遮断した。次いでプレートをＭＰＢＳ中のｓｃＤｂ ３−４３ｘＣＤ３の段階希釈物と共にインキュベートした。洗浄後、結合した抗体をＨＲＰ標識抗Ｈｉｓ抗体および基質としてのＴＭＢ、Ｈ２Ｏ２を用いて検出した。ｓｃＤｂ ３−４３ｘＣＤ３は、より低いナノモル濃度範囲のＥＣ５０値（３．３ｎＭ）を有するＨＥＲ３への特異的かつ濃度依存的な結合を示した（図１９Ｅ）。
【０２７９】
フローサイトメトリー研究を、ＨＥＲ３発現ＭＣＦ−７（図１９Ｆ）およびＣＤ３発現Ｊｕｒｋａｔ（図１９Ｇ）を用いて行った。接着性ＭＣＦ−７について、細胞を３７℃で短時間トリプシン処理し、トリプシンをＦＣＳ含有培地でクエンチし、遠心分離により除去した。ＭＣＦ−７およびＪｕｒｋａｔの両方について、１ウェル当たり１００，０００個の細胞を播種し、ＰＢＡ（１ｘ ＰＢＳ中の２％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３）中のｓｃＤｂ ３−４３ｘＣＤ３の滴定と共に４℃で１時間インキュベートした。洗浄をＰＢＡで２回行った。結合したタンパク質を、４℃でさらに１時間インキュベートしたＰＥ標識抗Ｈｉｓ抗体を用いて検出した。洗浄後、蛍光をＭＡＣＳＱｕａｎｔ（登録商標） Ａｎａｌｙｚｅｒ １０を用いて測定した。（無染色細胞に対する）相対的な蛍光強度の中央値をＭＡＣＳＱｕａｎｔ（登録商標）ソフトウェアを用いて計算した。ＭＣＦ−７について１．１ｎＭのＥＣ５０値およびＪｕｒｋａｔについて３．１ｎＭのＥＣ５０値を有しており、両方の抗原結合部位についてより低いナノモル濃度範囲における類似の結合活性が観察された（図１９ＦおよびＧ）。
【０２８０】
Ｔ細胞の活性化を、ＩＬ−２放出アッセイにおいてＨＥＲ３発現Ｃｏｌｏ２０５細胞およびＰＢＭＣを用いて分析した。処理の１日前に、１ウェル当たり２０，０００個のＣｏｌｏ２０５細胞を９６ウェルプレートに播種した。培地を除去し、ｓｃＤｂ ３−４３ｘＣＤ３の滴定を伴って新鮮な培地に置換した。室温での１時間のインキュベーション後に、１ウェル当たり２００，０００個のＰＢＭＣを添加し、３７℃でさらに２４時間インキュベートした。上清を回収し、ＩＬ−２の濃度を製造者によって供給された説明書に従ってＥＬＩＳＡ（ヒトＩＬ−２キット、R&D）によって決定した。ｓｃＤｂ ３−４３ｘＣＤ３は、０．３ｎＭのＥＣ５０値を有するサブナノモル濃度範囲においてＩＬ−２の用量依存的な放出（Ｔ細胞の活性化）を示した（図１９Ｈ）。
【０２８１】
実施例１３：Ｔ細胞再標的化のための三価の二重特異性抗ＨＥＲ３ｘ抗ＣＤ３二重特異性抗体
三価の二重特異性ｓｃＤｂ３−４３ｘＣＤ３−ｓｃＦｖ３４３（ｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ）分子を、ＨＥＲ３（３−４３）およびＣＤ３（ＵＣＨＴ１のヒト化型）に特異的なｓｃＤｂ分子を抗ＨＥＲ３特異的ｓｃＦｖ（３−４３）と組み合わせることによって作製した。したがって、ｓｃＤｂ−ｓｃＦｖは、ＨＥＲ３に対する２つの結合部位およびＣＤ３に対する１つの結合部位を示す（図２０Ａ）。ｓｃＤｂ−ｓｃＦｖをＨＥＫ２９３Ｅ細胞において産生させ、ＩＭＡＣで精製した。ｓｃＤｂ−ｓｃＦｖのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、還元条件下における約８０ｋＤａの見かけの分子量の単一のバンド、および非還元条件下における約７５ｋＤａの見かけの分子量の単一のバンドが明らかとなった（図２０Ｂ）。サイズ排除クロマトグラフィーにより、約６２ｋＤａの見かけの分子量を有するタンパク質（流体力学半径：３．８３ｎｍ）の純度および完全性が確認された（図２０Ｃ）。
【０２８２】
ｓｃＤｂ−ｓｃＦｖの抗原結合を、ＥＬＩＳＡにおいてヒトＨＥＲ３の細胞外ドメイン（ａａ２７〜５９９）を含む固定化されたＨＥＲ３−Ｆｃ融合物を用いて分析した。ＨＥＲ３−Ｆｃ融合タンパク質をＰＢＳ中、２μｇ／ｍｌにおいてポリスチレンマイクロタイタープレート上にコーティングした。残存している結合部位をＰＢＳ、２％スキムミルク（ＭＰＢＳ）で遮断した。次いでプレートをＭＰＢＳ中のｓｃＤｂ−ｓｃＦｖおよび対照としての二価および二重特異性ｓｃＤｂ３−４３ｘＣＤ３の段階希釈物と共にインキュベートした。洗浄後、結合した抗体をＨＲＰ標識抗Ｈｉｓ抗体および基質としてのＴＭＢ、Ｈ２Ｏ２を用いて検出した。ｓｃＤｂ−ｓｃＦｖは、サブナノモル濃度範囲のＥＣ５０値（０．８１ｎＭ）を有するＨＥＲ３への特異的かつ濃度依存的な結合を示し、ｓｃＤｂ３−４３ｘＣＤ３は低ナノモル濃度範囲のＥＣ５０値（４．８７ｎＭ）を示した（図２０Ｄ）。
【０２８３】
フローサイトメトリー研究を、ＨＥＲ３発現ＭＣＦ−７（図２０Ｅ）およびＣＤ３発現Ｊｕｒｋａｔ（図２０Ｆ）を用いて行った。接着性ＭＣＦ−７について、細胞を３７℃で短時間トリプシン処理し、トリプシンをＦＣＳ含有培地でクエンチし、遠心分離により除去した。ＭＣＦ−７およびＪｕｒｋａｔの両方について、１ウェル当たり１００，０００個の細胞を播種し、ＰＢＡ（１ｘ ＰＢＳ中の２％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３）中のｓｃＤｂ−ｓｃＦｖの滴定と共に４℃で１時間インキュベートした。洗浄をＰＢＡで２回行った。結合したタンパク質を、４℃でさらに１時間インキュベートしたＰＥ標識抗Ｈｉｓ抗体を用いて検出した。洗浄後、蛍光をＭＡＣＳＱｕａｎｔ（登録商標） Ａｎａｌｙｚｅｒ １０を用いて測定した。（無染色細胞に対する）相対的な蛍光強度の中央値をＭＡＣＳＱｕａｎｔ（登録商標）ソフトウェアを用いて計算した。ＭＣＦ−７細胞との結合は３１．６ｐＭのＥＣ５０値を有するピコモル濃度範囲において観察され、これはＩｇＧ３−４３分子全体の結合特性と同等であり、Ｊｕｒｋａｔ細胞との結合は１３．２ｎＭのＥＣ５０値を有するナノモル濃度範囲において観察された（図２０ＥおよびＦ）。
【０２８４】
実施例１４：抗体４Ｄ５および３−４３に由来するＨＥＲ２およびＨＥＲ３を標的とする二重特異性単鎖ダイアボディ−Ｆｃ融合タンパク質
本発明者らは、４Ｄ５（トラスツズマブ、ハーセプチン）および３−４３の抗体部分を含む、単鎖ダイアボディ−Ｆｃの形式におけるＨＥＲ２およびＨＥＲ３を標的とする二重特異性抗体を作製した（図２１）。ｓｃＤｂ−Ｆｃ融合タンパク質をＨＥＫ２９３−６Ｅ浮遊細胞において産生させ、プロテインＡアフィニティー精製およびその後のＦＰＬＣ ＳＥＣによって細胞培養上清から精製した。ｓｃＤｂ ４Ｄ５ｘ３−４３−ＦｃのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、作製物の単量体および二量体ポリペプチド鎖に対応する、還元条件下における約８５ｋＤａの見かけの分子量の単一のバンド、および非還元条件下における約２００ｋＤａの見かけの分子量の単一のバンドが明らかとなった（図２１Ａ）。約１７５ｋＤａの見かけの分子量を用いて、純度および完全性をサイズ排除クロマトグラフィーによって確認した（図２１Ｂ）。ｓｃＤｂ ４Ｄ５ｘ３−４３−Ｆｃの抗原結合を、ＥＬＩＳＡにおいてヒトＨＥＲ２またはＨＥＲ３の細胞外ドメインを含む固定化されたＨＥＲ２−ＨｉｓまたはＨＥＲ３−Ｈｉｓを用いて分析した。抗原をＰＢＳ中、２μｇ／ｍｌにおいてポリスチレンマイクロタイタープレート上にコーティングした。残存している結合部位をＰＢＳ、２％スキムミルク（ＭＰＢＳ）で遮断した。次いでプレートをＭＰＢＳ中のｓｃＤｂ−Ｆｃ融合タンパク質の段階希釈物と共にインキュベートした。洗浄後、結合した抗体をＨＲＰ標識抗ヒトＦｃ抗体および基質としてのＴＭＢ、Ｈ２Ｏ２を用いて検出した。ＥＬＩＳＡ分析により、ＨＥＲ２−Ｈｉｓについて２．５ｎＭのＥＣ５０値およびＨＥＲ３−Ｈｉｓについて１．９ｎＭのＥＣ５０値を有するｓｃＤｂ ４Ｄ５ｘ３−４３−Ｆｃ融合タンパク質のナノモル濃度範囲における結合が明らかとなった（図２１Ｃ参照）。
【０２８５】
フローサイトメトリー研究を、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３発現ＦａＤｕ細胞を用いて行った（図２１Ｄ）。ＦａＤｕ細胞を３７℃で短時間トリプシン処理し、トリプシンをＦＣＳ含有培地でクエンチし、遠心分離により除去した。１ウェル当たり１００，０００個の細胞を播種し、ＰＢＡ（１ｘ ＰＢＳ中の２％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３）中のｓｃＤｂ−Ｆｃの滴定と共に４℃で１時間インキュベートした。洗浄をＰＢＡで２回行った。結合したタンパク質を、４℃でさらに１時間インキュベートしたＰＥ標識抗ヒトＦｃ抗体を用いて検出した。洗浄後、蛍光をＭＡＣＳＱｕａｎｔ（登録商標） Ａｎａｌｙｚｅｒ １０を用いて測定した。（無染色細胞に対する）相対的な蛍光強度の中央値をＭＡＣＳＱｕａｎｔ（登録商標）ソフトウェアを用いて計算した。ＦａＤｕ細胞との結合は２．９ｎＭのＥＣ５０値を伴ってナノモル濃度範囲において観察され、これはＥＬＩＳＡ分析から得られた結合特性と同等であった。
【０２８６】
実施例１５：ＩｇＧ３−４３と共にインキュベートされたＳＫＢＲ３およびＢＴ４７４腫瘍細胞のリガンド非依存的なコロニー形成の阻害
ＳＫＢＲ３およびＢＴ４７４は高レベルのＨＥＲ２を発現し、したがってリガンド非依存的な様式で増殖し得る。ＩｇＧ３−４３が細胞増殖のマーカーとしてのコロニー形成を阻害する可能性を、これら２種の細胞株に対して分析した（図２２）。細胞（１ウェル当たり１，０００個の細胞）を１２ウェルプレートのＲＰＭＩ培地中に播種した。翌日、細胞を、２％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ培地中において５０ｎＭの濃度の抗体（ＩｇＧ３−４３またはトラスツズマブ）と共にインキュベートした。７日後に培地を除去し、同濃度の抗体を含む新鮮な培地を添加した。１２日目において、細胞をＨｉｓｔｏｆｉｘを用いて室温で１０分間固定し、細胞をクリスタルバイオレットで１０分間染色した（図２２Ａ）。未処理細胞（ｃｏｎ）を陰性対照として含めた。全てのインキュベーションを３通り行った。ＨＥＲ２に対するトラスツズマブを陽性対照として含めた。コロニー形成の強力な阻害が、ＩｇＧ３−４３およびトラスツズマブについて両細胞株に対して観察された（図２２Ｂ）。これらの知見は、ＨＥＲ３がヘレグリン非存在下においてでさえＨＥＲ２とシグナル伝達能を有するヘテロ二量体を形成し、これはＩｇＧ３−４３によって阻害できることを示す。
【０２８７】
実施例１６：ＥＧＦＲ（ｈｕ２２５）およびＨＥＲ３（３−４３）を標的とする四価の二重特異性ダイアボディ−Ｉｇ融合タンパク質（Ｄｂ−Ｉｇ）
四価の二重特異性Ｄｂ３−４３ｘｈｕ２２５−Ｉｇ分子を、ＥＧＦＲ（ｈｕ２２５；Ｃ２２５（セツキシマブ、アービタックス）のヒト化型）およびＨＥＲ３（３−４３）に特異的なＤｂ分子をＩｇＧ抗体の定常ドメインと組み合わせることによって作製した。したがって、Ｄｂ３−４３ｘｈｕ２２５−Ｉｇ分子は、２種のポリペプチドＶＨ３−４３ｘＶＬｈｕ２２５−ＣＬ（軽鎖、配列番号３１）およびＶＨｈｕ２２５ｘＶＬｈｕ３−４３−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３（重鎖、配列番号３２）からなる（図２３Ａ）。二重特異性Ｄｂ３−４３ｘｈｕ２２５−Ｉｇは、ＥＧＦＲに対する２つの抗原結合部位およびＨＥＲ３に対する２つの抗原結合部位を示す（図２３Ｂ）。遺伝子導入試薬としてポリエチレンイミンを用いて軽鎖または重鎖のいずれかをコードする２つのプラスミドを同時投与した後、一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞においてＤｂ３−４３ｘｈｕ２２５−Ｉｇを発現させた。細胞培養上清中に分泌されたタンパク質をＣＨ１−ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、還元条件下における重鎖および軽鎖に対応する約６５ｋＤａおよび３５ｋＤａの２つのバンド、ならびに非還元条件下における二重特異性Ｄｂ−Ｉｇ分子に対応する約２２０ｋＤａの１つの主要なバンドが明らかとなった（図２３Ｃ）。サイズ排除クロマトグラフィーにより、Ｄｂ３−４３ｘｈｕ２２５−Ｉｇ分子の完全性および均一性が確認された（図２３Ｄ）。Ｄｂ３−４３ｘｈｕ２２５−Ｉｇおよび単一特異性親抗体（セツキシマブ（抗ＥＧＦＲ）および３−４３−ＩｇＧ（抗ＨＥＲ３））の、ＥＧＦＲ（ａａ２０〜６４３）およびＨＥＲ３（ａａ２７〜５９９）の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）との結合をＥＬＩＳＡによって決定した。Ｈｉｓタグ付きＥＧＦＲまたはＨＥＲ３融合タンパク質をＰＢＳ中に希釈した２μｇ／ｍｌの濃度においてポリスチレンマイクロタイタープレート上にコーティングした。残存している結合部位をＰＢＳ、２％スキムミルク（ＭＰＢＳ）で遮断した。次いでプレートを二重特異性Ｄｂ３−４３ｘｈｕ２２５−Ｉｇまたは単一特異性親抗体の段階希釈物と共にインキュベートした。洗浄後、結合した抗体をＨＲＰ標識抗ヒトＦｃ抗体および基質としてのＴＭＢ、Ｈ２Ｏ２を用いて検出した。ＥＬＩＳＡ分析は、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ３の細胞外ドメインに対する親抗体の結合活性がＤｂ−Ｉｇ形式において保持されていることを明らかにした。四価の二重特異性Ｄｂ３−４３ｘｈｕ２２５−Ｉｇは、サブナノモル濃度範囲のＥＣ５０値（ＥＧＦＲについて０．１９ｎＭ；ＨＥＲ３について０．２６ｎＭ）を有するＥＧＦＲおよびＨＥＲ３への濃度依存的な結合を示した（図２３Ｅ）。親抗体は対応する抗原に類似のＥＣ５０値で結合した（表６）。両方の抗原（ＥＧＦＲおよびＨＥＲ３）への同時結合が第２の結合のＥＬＩＳＡ分析によって確認された。第１の抗原として、ＥＧＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質をＰＢＳ中、２μｇ／ｍｌにおいてポリスチレンマイクロタイタープレート上にコーティングした。残存している結合部位をＰＢＳ、２％スキムミルク（ＭＰＢＳ）で遮断した。次いでプレートをＭＰＢＳで希釈さ��た二重特異性Ｄｂ３−４３ｘｈｕ２２５−Ｉｇの段階希釈物と共にインキュベートした。洗浄後、第２の抗原ＨＥＲ３−Ｈｉｓ（ヘキサヒスチジルタグとＣ末端において融合したＨＥＲ３の細胞外ドメイン（ａａ２７〜５９９）；ＭＰＢＳで３００ｎＭに希釈した）をプレートに添加した。洗浄後、結合したＨＥＲ３−Ｈｉｓ（第２の抗原）をＨＲＰ標識抗Ｈｉｓタグ抗体および基質としてのＴＭＢ、Ｈ２Ｏ２を用いて検出した。Ｄｂ３−４３ｘｈｕ２２５−ＩｇとコーティングされたＨＥＲ３−Ｆｃとの結合に類似して、第２の抗原は、サブナノモル濃度範囲のＥＣ５０値（０．８５ｎＭ）で濃度依存的な様式において二重特異性Ｄｂ３−４３ｘｈｕ２２５−Ｉｇに結合された（図２３Ｆ）。したがって、この結果は、Ｄｂ−Ｉｇ分子内の両方の抗原結合部位のアクセスしやすさが制限されていないことを示す。
【０２８８】
さらに、Ｄｂ３−４３ｘｈｕ２２５−Ｉｇおよび親のモノクローナル抗体（セツキシマブおよび３−４３−ＩｇＧ）の、ＥＧＦＲおよび／またはＨＥＲ３発現細胞（ＭＣＦ−７、ＳＫＢＲ−３およびＦａＤｕ）への結合研究をフローサイトメトリーによって分析した（図２３Ｇ）。接着細胞をＰＢＳで洗浄し、３７℃で短時間トリプシン処理した。トリプシンをＦＣＳ含有培地でクエンチし、遠心分離により除去した（５００ｘｇ、５分間）。１ウェル当たり１００，０００個の細胞を播種し、ＰＢＡ（２％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３を含むＰＢＳ）で希釈したＤｂ３−４３ｘｈｕ２２５−Ｉｇまたは親のモノクローナル抗体の段階希釈物と共に４℃で１時間インキュベートした。細胞をＰＢＡを用いて２回洗浄した。結合した抗体を、ＰＥ標識抗ヒトＦｃ二次抗体（これは４℃でさらに１時間インキュベートされた）を用いて検出した。洗浄後、蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）をＭｉｌｌｔｅｎｙｉ ＭＡＣＳＱｕａｎｔ（登録商標） Ａｎａｌｙｚｅｒ １０を用いて測定した。（無染色細胞に対する）相対的なＭＦＩをＭＡＣＳＱｕａｎｔ（登録商標）ソフトウェアおよびＥｘｃｅｌによって計算した。ＨＥＲ３陽性ＭＣＦ−７細胞株について、二重特異性Ｄｂ３−４３ｘｈｕ２２５−Ｉｇは０．０５４ｎＭのＥＣ５０値を伴ってサブナノモル濃度範囲において結合した。親の抗ＨＥＲ３ ３−４３−ＩｇＧは類似のＥＣ５０値（０．０２１ｎＭ）で結合したため、親の抗ＨＥＲ３抗体の結合活性はＤｂ−Ｉｇ形式において保持されている。ＭＣＦ−７細胞との結合は、抗ＥＧＦＲ抗体であるセツキシマブについて観察されなかった。類似の範囲においてＥＧＦＲおよびＨＥＲ３を発現する細胞株ＳＫＢＲ−３に関して、二重特異性Ｄｂ３−４３ｘｈｕ２２５−Ｉｇ分子は０．０４７ｎＭのＥＣ５０値で結合し、これは両方の親抗体セツキシマブ（０．０３１ｎＭ）および３−４３−ＩｇＧ（０．０２２ｎＭ）の結合に類似していた。ＦａＤｕとの結合に関して、Ｄｂ３−４３ｘｈｕ２２５−Ｉｇは０．１４ｎＭのＥＣ５０値で結合した。親の抗ＥＧＦＲ抗体セツキシマブは類似のＥＣ５０値（０．１３ｎＭ）で細胞に結合したため、親抗体セツキシマブの結合活性もまた、Ｄｂ−Ｉｇ形式において保持されている。ＦａＤｕ細胞は非常に多量のＥＧＦＲおよび比較的少量のＨＥＲ３を発現するため、Ｄｂ３−４３ｘｈｕ２２５−Ｉｇは細胞のｈｕ２２５部分に優先的に結合した可能性が最も高い。しかしながら、親の抗ＨＥＲ３ ３−４３−ＩｇＧはまた、比較的低い蛍光信号を伴って０．００３ｎＭのＥＣ５０値で細胞に結合した（図２３Ｇ、表１）
【０２８９】
四価の二重特異性Ｄｂ３−４３ｘｈｕ２２５−Ｉｇ分子の薬物動態プロファイルを、ＳＷＩＳＳマウスにおいて分析した。２５μｇのタンパク質を１００μｌの無菌ＰＢＳで希釈し、尾部に静脈内注射した。種々の時点（３分、３０分、１時間、２時間、６時間、１日、３日および７日）後において、血液試料を尾部から採取し、氷上で１０分間インキュベートした。血餅を遠心（１６，０００ｘ ｇ、２０分間、４℃）し、血清試料を−２０℃で保存した。タンパク質血清濃度をＥＬＩＳＡによって決定した。ＥＧＦＲ−ＦｃまたはＨＥＲ３−Ｆｃ融合タンパク質をＰＢＳで希釈した２μｇ／ｍｌの濃度においてポリスチレンマイクロタイタープレート上にコーティングした。残存している結合部位をＰＢＳ、２％スキムミルク（ＭＰＢＳ）で遮断した。次いでプレートをＭＰＢＳで希釈した血清と共にインキュベートした。洗浄後、結合した抗体をＨＲＰ標識抗ヒトＦａｂ抗体および基質としてのＴＭＢ、Ｈ２Ｏ２を用いて検出した。Ｄｂ３−４３ｘｈｕ２２５−Ｉｇ分子の血清濃度を、精製した融合タンパク質の検量線から内挿した（図２４）。コーティングされた抗原としてＥＧＦＲ−ＦｃまたはＨＥＲ３−Ｆｃ融合タンパク質のいずれかを用いたＤｂ３−４３ｘｈｕ２２５−Ｉｇの血清濃度について、差異は観察されなかった。二重特異性Ｄｂ３−４３ｘｈｕ２２５−Ｉｇ分子は、約２．７時間の初期の半減期および８７〜９２時間の範囲の末期の半減期を有していた。
【０２９０】
実施例１７：抗ＨＥＲ３ ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬ融合タンパク質は、様々なメラノーマ細胞株に対してインビトロにおいて標的依存性細胞毒性を仲介する
メラノーマ細胞株のパネルをＨＥＲ３の発現についてフローサイトメトリーによってスクリーニングし、これはＱＩＦＩＫＩＴ(Dako)を用いて定量化された（図２５Ａ）。分析されたほとんどのメラノーマ細胞株は、様々な程度でＨＥＲ３発現を示した。中程度のＨＥＲ３発現を有するＡ３７５を、抗ＨＥＲ３ ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬ融合タンパク質の結合を分析するために選択した（実施例１１；図２５Ｂ、Ｃ参照）。ｓｃＦｖ３−４３−Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬのＨＥＲ３陽性細胞株Ａ３７５への結合をフローサイトメトリーによって分析した。１．１９±０．３１ｎＭのＥＣ５０値を有するｓｃＦｖ３−４３−Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬの濃度依存的な結合が観察された（図２５Ｄ）。ｓｃＦｖ３−４３−Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬのｓｃＦｖ３−４３−Ｆｃ融合タンパク質との競合阻害を行い、標的化の形式における結合の改善が３−４３結合ドメインに起因することを検証した（図２５Ｅ）。したがって、ｓｃＦｖ３−４３−Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬの結合ドメインは２００倍モル過剰のｓｃＦｖ３−４３−Ｆｃ（阻害剤）で遮断された。ｓｃＦｖ３−４３−Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬの結合は阻害剤存在下において非標的化タンパク質のレベルまで減少したが、Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬ自体の結合は影響されなかった。この結果により、ＴＲＡＩＬ融合タンパク質の標的化部分（ｓｃＦｖ３−４３）がＨＥＲ３陽性細胞への結合を増加させることが確認された。
【０２９１】
次に、抗ＨＥＲ３ ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬ融合タンパク質を、ボルテゾミブの存在下または非存在下における種々のメラノーマ細胞株の死滅についてインビトロで分析した（図２６）。処理の１日前に、３０，０００〜６０，０００個の細胞／ウェルを９６ウェルプレートに播種した。ボルテゾミブとの併用処理のために、５０ｎｇ／ｍｌのボルテゾミブで３０分間前処理したＡ３７５を除いて、細胞を２５０ｎｇ／ｍｌ（６５０ｎＭ）のボルテゾミブで前処理した。次いで、細胞を融合タンパク質の段階希釈物と共に１６時間インキュベートした。細胞生存率をクリスタルバイオレット染色で分析した。
【０２９２】
ボルテゾミブ非存在下において、ｓｃＦｖ３−４３−Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬは、Ｗ７９３（４．２５ｐＭのＥＣ５０値）、ＭＷ１３６６（４８．２ｐＭのＥＣ５０値）およびＷＭ３５（４．９６ｐＭのＥＣ５０値）に対する細胞死の強い誘導、ならびにＡ３７５、ＭｅｌＪｕｓｏおよびＭｅＷｏに対する細胞死の（５０％死滅に達していない）部分的な誘導を示した（図２６参照）。一方、ボルテゾミブの添加はテストした全てのメラノーマ細胞株を感作させ、これらは０．１７〜４．６３ｐＭのＥＣ５０値を伴う死滅を示した（図２６）。非標的化Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬと比較して、ボルテゾミブ非存在下および存在下の両方においてＥＣ５０値は減少した（表７）。さらに、細胞生存率アッセイで用いたメラノーマ細胞のＨＥＲ３発現をボルテゾミブ非存在下または存在下において、ＱＩＦＩＫＩＴ(Dako)を用いてフローサイトメトリーによって分析した。ボルテゾミブでの処理は、メラノーマ細胞によるＨＥＲ３の発現に対して全くまたはわずかな効果しか与えなかった（図２６）。
【０２９３】
実施例１８：抗ＨＥＲ３ ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬ融合タンパク質は強力な抗腫瘍活性を示し、インビボのＣｏｌｏ２０５異種移植腫瘍モデルにおいて良好な耐容性を示す
ｓｃＦｖ３−４３−Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬ融合タンパク質（実施例１１参照）を、腫瘍を有するマウスにおいて、その抗腫瘍活性、安全性および薬物動態プロファイルについて評価した。（１００μｌ ＤＰＢＳ中の）３ｘ１０６個のＣｏｌｏ２０５細胞を雌性ＮＭＲＩヌードマウスの左側腹部および右側腹部に皮下注射した。腫瘍の長さ（ａ）および幅（ｂ）をノギスで測定し、腫瘍体積（Ｖ＝ａ ｘ ｂ２／２）を計算することによって腫瘍増殖をモニターした。腫瘍が約１００ｍｍ３のサイズに達した際に処理を開始した。（１５０μｌ ＤＰＢＳ中の）融合タンパク質を静脈内注射した。対照の動物は各１５０μｌ ＤＰＢＳの注射を受けた。マウス（９または１１週齢、各群当たり６匹のマウス）を３週間、０．２ｎｍｏｌタンパク質（０．４ｎｍｏｌ ｓｃＴＲＡＩＬ単位）で週に２回（１４、１８、２１、２５、２８、３２日目）処理した。血液試料を、最後の処理の４時間および２４時間後に採取し、タンパク質濃度およびＡＬＴレベルを分析した。
【０２９４】
ｓｃＦｖ３−４３−Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬおよび非標的化Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬでの処理について完全な腫瘍寛解が観察された。腫瘍寛解は、ｓｃＦｖ３−４３−Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬで処理された動物について約１００日間のモニタリング期間にわたって安定しており、Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬについて実験の終わりにごくわずかな再増殖が検出された（図２７Ａ、Ｂ）。最後の処理の４時間および２４時間後における血清中のＡＬＴ活性が未処理群またはＰＢＳ処理群と比較して類似していたため、ＴＲＡＩＬ融合タンパク質処理群について肝臓の毒性効果は観察されなかった（図２７Ｃ）。タンパク質の血清濃度を、最後の処理の４時間および２４時間後に決定した（図２７Ｄ）。ｓｃＦｖ３−４３−Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬとＦｃ−ｓｃＴＲＡＩＬとの間で差異は観察されなかった。
【０２９５】
実施例１９：ＥＧＦＲおよびＨＥＲ３を標的とするＧ４Ｓリンカーを含む二重特異性単鎖ダイアボディ−Ｆｃ融合タンパク質
ＥＧＦＲおよびＨＥＲ３を標的とする二重特異性単鎖ダイアボディ−Ｆｃ融合タンパク質のＶＬ３−４３とＶＨ３−４３を連結するリンカーＬ２を配列ＧＧＧＧＳＧＧＲＡＳＧＧＧＧＳ（配列番号２１）からＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１６）に改変した（図２８Ａ、Ｂ）。改変したｓｃＤｂ−Ｆｃ融合タンパク質をＨＥＫ２９３−６Ｅ浮遊細胞において産生させ、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーおよび高速タンパク質液体クロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製した。精製したｓｃＤｂｈｕ２２５ｘ３−４３−ＦｃのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、分子の単量体および二量体会合に対応する、還元条件下における約８２ｋＤａの見かけの分子量の単一のバンド、および非還元条件下における約２００ｋＤａの見かけの分子量の単一のバンドが明らかとなった（図２８Ｃ）。純度をサイズ排除クロマトグラフィーによって確認した（図２８Ｄ）。ｓｃＤｂ−ＦｃとＥＧＦＲ（ａａ２０〜６４３）およびＨＥＲ３（ａａ２７〜５９９）のＨｉｓタグ付き細胞外ドメインとの結合を、ＥＬＩＳＡによって親抗体（ｈｕ２２５−Ｉｇおよび３−４３−ＩｇＧ）と比較して評価した。ＥＧＦＲ−ＨｉｓまたはＨＥＲ３−Ｈｉｓ融合タンパク質を、ＰＢＳで希釈した２μｇ／ｍｌの濃度においてポリスチレンマイクロタイタープレート上にコーティングした。残存している結合部位をＰＢＳ、２％スキムミルク（ＭＰＢＳ）で遮断した。次いでプレートを二重特異性ｓｃＤｂ−Ｆｃまたは単一特異性親抗体の段階希釈物と共にインキュベートした。洗浄後、結合した抗体をＨＲＰ標識抗ヒトＦｃ抗体および基質としてのＴＭＢ、Ｈ２Ｏ２を用いて検出した。ＥＬＩＳＡ分析は、親抗体とＥＧＦＲおよびＨＥＲ３の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）との結合活性が改変されたｓｃＤｂ−Ｆｃ形式において保持されていることを明らかにした（図２８Ｅ参照）。ｓｃＤｂ−Ｆｃ分子は、ＥＧＦＲに０．１６ｎＭのＥＣ５０値で結合し、ＨＥＲ３に０．２０ｎＭのＥＣ５０値で結合した。親抗体は、対応する抗原にサブナノモル濃度範囲における類似のＥＣ５０値（ｈｕ２２５−ＩｇＧ：０．２０ｎＭ；３−４３−ＩｇＧ：０．５４ｎＭ）で結合した。
【０２９６】
実施例２０：ＥＧＦＲおよびＨＥＲ３を標的とする二重特異性ダイアボディ−Ｉｇ（Ｄｂ−Ｉｇ）と二重特異性単鎖ダイアボディ−Ｆｃ融合タンパク質との比較
ＥＧＦＲおよびＨＥＲ３を標的とする２種の形式の四価の二重特異性抗体、単鎖ダイアボディ−Ｆｃ（ｓｃＤｂ−Ｆｃ）（実施例１９参照）およびダイアボディ−Ｉｇ（Ｄｂ−Ｉｇ）（実施例１６）を、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＡｋｔおよびＥｒｋの阻害活性について分析した。ＦａＤｕ細胞を用いてシグナル阻害アッセイを行った。細胞を、５０ｎＭの親抗体（単独または組合せ（５０ｎＭの各抗体））、二重特異性抗体（ｓｃＤｂｈｕ２２５ｘ３−４３−Ｆｃ（ＧＧＧＧＳ）配列番号３３、Ｄｂ３−４３ｘｈｕ２２５−Ｉｇ）で１時間処理した後、ヘレグリン（５０ｎｇ／ｍｌ）で３７℃で１５分間刺激した。細胞を、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含むＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＮａＦ、２０ｍＭ βグリセロリン酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＮＰ−４０、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ、０．２５％ ＤＯＣ、０．１％ＳＤＳ）を用いて溶解し、溶解物を免疫ブロット法によって解析した。ＨＥＲ２およびＨＥＲ３のリン酸化はヘレグリン刺激非存在下において二重特異性抗体および３−４３−ＩｇＧによって阻害されたが、受容体リン酸化はヘレグリン存在下において、３−４３−ＩｇＧと比較して両方の二重特異性抗体によってより効率的に阻害された。さらに、二重特異性抗体は、ヘレグリン非存在下および存在下においてＡｋｔおよびＥｒｋのリン酸化を効率的に阻害した（図２９）。
【０２９７】
次に、結腸がん細胞株（ＳＷ６２０、ＨＣＴ１１６、およびＬｏＶｏ）における増殖アッセイを、２つの異なる二重特異性抗体の形式または親抗体（ｈｕ２２５−ＩｇＧおよび３−４３−ＩｇＧ）を単独または組合せで用いて行った。細胞を２次元培養または３次元培養のいずれかにおいて増殖させた。２０００個の細胞／ウェルを９６ウェルプレート（３次元培養用：１：２のマトリゲル：コラーゲン混合物、ＲＰＭＩまたはＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ＋２％マトリゲル）に播種した。２４時間後に培地を捨て、飢餓培地（ＲＰＭＩまたはＤＭＥＭ＋０．２％ＦＣＳ＋１％Ｐ／Ｓ）を加えた。さらに２４時間のインキュベーション後、細胞を、ＭＥＫ阻害剤（ＡＺＤ６２４４、セルメチニブ）および／または抗体（５０ｎＭ、組合せ：各５０ｎＭ）を用いて／用いずに処理した。１時間後、細胞をＨＲＧ（６ｎｇ／ウェル）で刺激するか、または未刺激のまま保持した。細胞の播種後８日目に、アッセイをＣｅｌｌｔｉｔｅｒＧｌｏ ３Ｄキット（ウェル毎に２５μｌのＣｅｌｌｔｉｔｅｒＧｌｏ２．０を混合した２５μｌの飢餓培地）で展開し、発光をプレートリーダー(tecan infinite)で測定した。ＳＷ６２０およびＨＣＴ１１６細胞では、増殖においてわずかな差異のみが全ての抗体で観察された。しかしながら、細胞をヘレグリン存在下でＭＥＫ阻害剤と組み合わせて処理した場合、二重特異性抗体は他の抗体と比較して増殖効果の減少を示した。ＨＲＧの未刺激ＬｏＶｏ細胞では、ＭＥＫ阻害剤の存在下または非存在下のいずれにおいても、３次元培養における両方の二重特異性抗体およびｈｕ２２５−ＩｇＧまたは両方の親抗体の組み合わせについて、増殖効果の著しい減少が観察された。ＨＲＧ刺激後、二重特異性抗体のみがＭＥＫ阻害剤存在下または非存在下のいずれにおいても細胞の増殖を効率的に減少させることができた。
【０２９８】
実施例２１：ＨＥＲ２およびＨＥＲ３を標的とする二価の二重特異性単鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）
二重特異性ｓｃＤｂ分子を、抗ＨＥＲ３ ３−４３の結合部位をヒト化抗ＨＥＲ２抗体４Ｄ５（トラスツズマブ）の結合部位と組み合わせることによって作製した。ｓｃＤｂ４Ｄ５ｘ３−４３−ＬＬは、ＨＥＲ３に対する１つの結合部位およびＨＥＲ２に対する１つの結合部位を示す（図３１ＡおよびＢ）。ＶＬ３−４３をＶＨ３−４３と連結するリンカー（Ｌ２）は、２０アミノ酸（ＧＧＧＧＳＧＧＲＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、配列番号２１）からなる。ｓｃＤｂ４Ｄ５ｘ３−４３−ＬＬ（配列番号３４）をＨＥＫ２９３Ｅ浮遊細胞において産生させ、ＩＭＡＣおよび高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）によって精製した。精製したｓｃＤｂ４Ｄ５ｘ３−４３−ＬＬのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、還元条件下における約５３ｋＤａの見かけの分子量の単一のバンド、および非還元条件下における約５０ｋＤａの見かけの分子量の単一のバンドが明らかとなった（図３１Ｃ）。タンパク質の純度および完全性をサイズ排除クロマトグラフィーによって確認した（図３１Ｄ）。
【０２９９】
親抗体（トラスツズマブおよび３−４３ＩｇＧ）と比較したｓｃＤｂ４Ｄ５ｘ３−４３−ＬＬの結合を、ヒトＨＥＲ２（ａａ２３〜６５２）またはＨＥＲ３（ａａ２７〜５９９）の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含む固定化されたＨＥＲ２−ＦｃまたはＨＥＲ３−Ｆｃ融合タンパク質を用いてＥＬＩＳＡによって評価した。ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質をＰＢＳ中、２μｇ／ｍｌにおいてポリスチレンマイクロタイタープレート上にコーティングした。残存している結合部位をＰＢＳ、２％スキムミルク（ＭＰＢＳ）で遮断した。次いでプレートをＭＰＢＳ中のｓｃＤｂ４Ｄ５ｘ３−４３−ＬＬまたは親抗体の段階希釈物と共にインキュベートした。洗浄後、結合した抗体を、ｓｃＤｂ４Ｄ５ｘ３−４３−ＬＬの場合にＨＲＰ標識抗Ｈｉｓ抗体、またはＨＲＰ標識抗ヒトＦａｂ抗体のいずれかおよび基質としてのＴＭＢ、Ｈ２Ｏ２を用いて検出した。ｓｃＤｂ４Ｄ５ｘ３−４３−ＬＬは、低いナノモル濃度範囲のＥＣ５０値（ＨＥＲ２：１．５４ｎＭ；ＨＥＲ３：０．９３ｎＭ）を有するＨＥＲ２およびＨＥＲ３への濃度依存的な結合を示した（図３１Ｅ）。親抗体は各抗原への結合（ＨＥＲ２に対するトラスツズマブ：０．８０ｎＭ；ＨＥＲ３に対する３−４３−ＩｇＧ：０．２７ｎＭ）を示し、したがってｓｃＤｂ４Ｄ５ｘ３−４３−ＬＬタンパク質の結合は保持されている。
【０３００】
ＭＣＦ−７細胞においてシグナル阻害アッセイを行い、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＡｋｔおよびＥｒｋの受容体活性化が、単独処理または併用処理のいずれかとしての親抗体と比較して、二重特異性ｓｃＤｂ４Ｄ５ｘ３−４３−ＬＬ分子での処理によって阻害されるか否かを決定した。さらに、この実験において四価の二重特異性ｓｃＤｂ４Ｄ５ｘ３−４３−Ｆｃ融合タンパク質を使用し、受容体のリン酸化を決定した。細胞を、５０ｎＭの親抗体（単独または組合せ（５０ｎＭの各抗体））または二重特異性ｓｃＤｂ４Ｄ５ｘ３−４３−ＬＬで１時間処理した後、ヘレグリン（５０ｎｇ／ｍｌ）で３７℃で１５分間刺激した。細胞を、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含むＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＮａＦ、２０ｍＭ βグリセロリン酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＮＰ−４０、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ、０．２５％ ＤＯＣ、０．１％ＳＤＳ）を用いて溶解し、溶解物を免疫ブロット法によって解析した。ＨＲＧ未刺激細胞について、二価の二重特異性ｓｃＤｂ４Ｄ５ｘ３−４３−ＬＬ分子のみがＨＥＲ２、ＡｋｔおよびＥｒｋのリン酸化の減少を示し、単独処理または併用処理としての親抗体についてＡｋｔの活性化が観察された。さらに、Ｅｒｋの活性化が、二重特異性であるが四価のｓｃＤｂ４Ｄ５ｘ３−４３−Ｆｃ融合タンパク質について検出された（図３２）。類似の結果がＨＲＧ刺激細胞において観察された。さらに、二価の二重特異性ｓｃＤｂ４Ｄ５ｘ３−４３分子のみが、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＡｋｔおよびＥｒｋのリン酸化の効率的な減少を示した。
【０３０１】
実施例２２：Ｔ細胞再標的化のための種々の価数を有する抗ＨＥＲ３ｘ抗ＣＤ３二重特異性抗体
本発明者らは、一方でヒトＣＤ３（ＵＣＨＴ１のヒト化型）に一価で結合し、他方でＨＥＲ３に、ｓｃＤｂ３−４３ｈｕＵ３（実施例１２も参照）として一価、ｓｃＤｂ３−４３ｘｈｕＵ３−ｓｃＦｖ３−４３（実施例１３も参照）として二価、またはｓｃＦｖ３−４３−ｓｃＤｂ３−４３ｘｈｕＵ３−ｓｃＦｖ３−４３（配列番号３５、図３３Ａ、Ｂ）として三価のいずれかで結合する二重特異性抗体を作製した。二重特異性多価抗体をＨＥＫ２９３細胞において産生させ、ＩＭＡＣで精製した。三価（ｓｃＤｂ３−４３ｘｈｕＵ３−ｓｃＦｖ３−４３）および四価（ｓｃＦｖ３−４３−ｓｃＤｂ３−４３ｘｈｕＵ３−ｓｃＦｖ３−４３）の抗体を高速タンパク質液体クロマトグラフィーによってさらに精製し、これは抗体の１つの均一な集団をもたらした。
【０３０２】
二重特異性抗体の結合を、ＣＤ３発現Ｊｕｒｋａｔ細胞（図３３Ｃ）およびＨＥＲ３発現ＭＣＦ−７細胞（図３３Ｄ）を用いてフローサイトメトリーによって分析した。接着性ＭＣＦ−７について、細胞を３７℃で短時間トリプシン処理し、トリプシンをＦＣＳ含有培地でクエンチし、遠心分離により除去した。ＪｕｒｋａｔおよびＭＣＦ−７の両方の細胞株について、１ウェル当たり１００，０００個の細胞を播種し、ＰＢＡ（１ｘ ＰＢＳ中の２％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３）中の種々の二重特異性多価抗体の滴定と共に４℃で１時間インキュベートした。洗浄をＰＢＡで２回行った。結合したタンパク質を、４℃でさらに１時間インキュベートしたＰＥ標識抗Ｈｉｓ抗体を用いて検出した。洗浄後、蛍光をＭＡＣＳＱｕａｎｔ（登録商標） Ａｎａｌｙｚｅｒ １０を用いて測定した。（無染色細胞に対する）相対的な蛍光強度の中央値をＭＡＣＳＱｕａｎｔ（登録商標）ソフトウェアを用いて計算した。全３種の抗体について、ＣＤ３陽性Ｊｕｒｋａｔ細胞との結合が濃度依存的な様式で観察され、これはナノモル濃度範囲における類似のＥＣ５０値（ｓｃＤｂ３−４３ｘｈｕＵ３：２．４ｎＭ；ｓｃＤｂ３−４３ｘｈｕＵ３−ｓｃＦｖ３−４３：４．２ｎＭ；ｓｃＦｖ３−４３−ｓｃＤｂ３−４３ｘｈｕＵ３−ｓｃＦｖ３−４３：５．２ｎＭ）をもたらした。ＭＣＦ−７細胞との結合もまた濃度依存的な様式で観察されたが、二重特異性抗体の結合はＨＥＲ３結合の価数に依存していた。一価のＨＥＲ３結合剤（ｓｃＤｂ３−４３ｘｈｕＵ３）のＥＣ５０値は１．１ｎＭと決定されたが、二価および三価のＨＥＲ３結合剤は、ｓｃＤｂ３−４３ｘｈｕＵ３−ｓｃＦｖ３−４３について３１．４ｐＭ、およびｓｃＦｖ３−４３−ｓｃＤｂ３−４３ｘｈｕＵ３−ｓｃＦｖ３−４３について１７．３ｐＭのＥＣ５０値を伴うピコモル濃度範囲の結合を示した。
【０３０３】
Ｔ細胞の活性化を、ＩＬ−２放出アッセイにおいてＨＥＲ３発現ＭＣＦ−７細胞およびヒトＰＢＭＣを用いて分析した。処理の１日前に、１ウェル当たり２０，０００個のＭＣＦ−７細胞を９６ウェルプレートに播種した。培地を除去し、種々の二重特異性抗体の滴定を伴って新鮮な培地に置換した。室温での１時間のインキュベーション後に、１ウェル当たり２００，０００個のＰＢＭＣを添加し、３７℃でさらに２４時間インキュベートした。上清を回収し、ＩＬ−２の濃度を製造者によって供給された説明書に従ってＥＬＩＳＡ（ヒトＩＬ−２キット、R&D）によって決定した。全３種の二重特異性抗体は、０．４８ｎＭ（ｓｃＤｂ３−４３ｘｈｕＵ３）、０．２９ｎＭ（ｓｃＤｂ３−４３ｘｈｕＵ３−ｓｃＦｖ３−４３）および０．２２ｎＭ（ｓｃＦｖ３−４３−ｓｃＤｂ３−４３ｘｈｕＵ３−ｓｃＦｖ３−４３）のＥＣ５０値を伴うサブナノモル濃度範囲におけるＩＬ−２の用量依存的な放出（Ｔ細胞の活性化）を示した（図３３Ｅ）。
【０３０４】
種々の二重特異性抗体による標的細胞の死滅を、ＨＥＲ３発現ＭＣＦ−７細胞およびヒトＰＢＭＣを用いて分析した。処理の１日前に、１ウェル当たり２０，０００個のＭＣＦ−７細胞を９６ウェルプレートに播種した。培地を除去し、種々の二重特異性多価抗体の滴定を伴って新鮮な培地に置換した。室温での１時間のインキュベーション後に、１ウェル当たり２００，０００個のＰＢＭＣを添加し、３７℃でさらに４８時間インキュベートした。細胞生存率をＭＴＴアッセイにより測定した。全３種の二重特異性抗体は、８４ｐＭ（ｓｃＤｂ３−４３ｘｈｕＵ３）、３４ｐＭ（ｓｃＤｂ３−４３ｘｈｕＵ３−ｓｃＦｖ３−４３）および３２ｐＭ（ｓｃＦｖ３−４３−ｓｃＤｂ３−４３ｘｈｕＵ３−ｓｃＦｖ３−４３）のＥＣ５０値を伴うピコモル濃度範囲におけるＭＣＦ−７細胞の用量依存的な死滅を示した（図３３Ｆ；黒色の線）。ＰＢＭＣ非存在下において、ＭＣＦ−７細胞の細胞生存率の減少は観察されなかった（図３３Ｆ；灰色の線）。
【０３０５】
実施例２３：ＩｇＧ３−４３はドメインＩＩＩおよびＩＶが変異したＨＥＲ３−Ｆｃ融合タンパク質に結合する
ドメインＩＩＩおよびＩＶにおけるＨＥＲ３体細胞変異体を、Ｑ５（登録商標）部位特異的変異誘発キット（ＮＥＢ）によってクローン化した。１つのホットスポット変異体（Ｔ３３５Ａ）に加えて、ドメインＩＩＩおよびＩＶにおける他の６つの変異体（Ｔ３８９Ｉ、Ｍ４０６Ｋ、Ｒ４５３Ｈ、Ｙ４６４Ｃ、Ｄ４９２Ｈ、Ｋ４９８Ｉ）をＨＥＲ３−Ｆｃ融合タンパク質として発現し、これらを一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞において産生させ、プロテインＡクロマトグラフィーによって精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、タンパク質の純度を確認し、還元条件下における約１４０ｋＤａの単一のバンドが示された（図３４Ａ）。３−４３−ＩｇＧが種々の変異したＨＥＲ３−Ｆｃ融合タンパク質に結合する能力をＥＬＩＳＡで分析し、野生型（変異していない）ＨＥＲ３−Ｆｃ融合タンパク質との結合と比較した。種々のＨＥＲ３−Ｆｃ融合タンパク質をＰＢＳで希釈した２μｇ／ｍｌの濃度においてポリスチレンマイクロタイタープレート上にコーティングした。残存している結合部位をＰＢＳ、２％スキムミルク（ＭＰＢＳ）で遮断した。次いでプレートを抗ＨＥＲ３抗体３−４３−ＩｇＧおよび３Ｍ６−ＩｇＧの段階希釈物と共にインキュベートした。洗浄後、結合した抗体をＨＲＰ標識抗ヒトＦａｂ抗体および基質としてのＴＭＢ、Ｈ２Ｏ２を用いて検出した。ＩｇＧ３−４３は、ホットスポット変異体Ｔ３３５Ａを含む全てのテストされた変異体との結合を示した。ＨＥＲ３のドメインＩに結合するＩｇＧ ３Ｍ６を陽性対照として含め、これは野生型ＨＥＲ３−Ｆｃについて観察された信号と同様に１００ｎＭにおいて結合を示した。ＩｇＧ３−４３はＨＥＲ３の全ての変異型に結合でき、いくつかの変異体では固定化されたＨＥＲ３−Ｆｃ変異体を用いたＥＬＩＳＡにおいて飽和結合の減少が観察されたが、ＥＣ５０値は全てのＨＥＲ３変異体について類似の範囲内（０．１〜０．３ｎＭ）であった。
【０３０６】
表：
表１：一価および二価の親和性。ＫＤをＡｔｔａｎａシステムを用いて測定した。
【表２】
2020501509.tif 000003
【０３０７】
表２：ＩｇＧ３−４３の細胞結合特性。表中に示される細胞との結合のＥＣ５０値をフローサイトメトリーによって評価した。
【表３】
2020501509.tif 000004
【０３０８】
表３：ｓｃＤｂ ｈｕ２２５ｘ３−４３−Ｆｃの結合特性。ＥＧＦＲ−ＥＣＤおよびＨＥＲ３−ＥＣＤタンパク質との結合のＥＣ５０値［ｎＭ二量体］をＥＬＩＳＡによって決定した。ＦａＤｕ細胞との結合のＥＣ５０値［ｎＭ二量体］をフローサイトメトリーによって評価した。
【表４】
2020501509.tif 000005
【０３０９】
表４：ｓｃＦｖ３−４３−Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬの結合特性。ＨＥＲ３およびヒトＴＲＡＩＬ−Ｒ２との結合のＥＣ５０値［ｎＭ単量体］をＥＬＩＳＡによって決定した。ＨＥＲ３の細胞外ドメインまたはヒトＴＲＡＩＬ−Ｒ２のＦｃ融合タンパク質を抗原として用いた。
【表５】
2020501509.tif 000006
【０３１０】
表５：ｓｃＦｖ３−４３−Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬによる細胞死誘導。Ｃｏｌｏ２０５に対する細胞死誘導のＥＣ５０値［ｎＭ単量体］を、ボルテゾミブ（６５０ｎＭ）非存在下および存在下、ならびに遮断抗体（２００倍モル過剰）の非存在下および存在下において決定した。ｓｃＦｖ３−４３−Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬの効果を非標的化Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬ融合タンパク質と比較した。
【表６】
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【０３１１】
表６：Ｄｂ３−４３ｘｈｕ２２５−Ｉｇの結合特性。ＥＧＦＲおよびＨＥＲ３融合タンパク質の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）との結合のＥＣ５０値［ｎＭ］をＥＬＩＳＡによって決定した。ＭＣＦ−７、ＳＫＢＲ−３およびＦａＤｕ細胞との結合のＥＣ５０値［ｎＭ］をフローサイトメトリーによって評価した。
【表７】
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【０３１２】
表７：ボルテゾミブ（ＢＴＢ）存在下または非存在下におけるｓｃＦｖ３−４３−Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬおよびＦｃ−ｓｃＴＲＡＩＬの細胞死誘導アッセイのＥＣ５０値。細胞をタンパク質単独またはボルテゾミブとの組合せで１６時間処理した後、ＥＣ５０値［ｐＭ］を決定した。−、５０％未満の細胞死；平均値±ＳＤ。
【表８】
2020501509.tif 000009
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2020501509.tif 000044
2020501509.tif 000045
2020501509.tif 000046