(57)【要約】本発明は、アミノグラムを有するペプチドの組成に関し：グリシン、ヒドロキシおよびプロリンは、組成物中のアミノ酸のモル量の合計に対する各量の比率が構成されるようなモル量である２０．０％〜２４．５％、６．０％〜１２．０％、それぞれ１０．６％〜１４．６％；１４００Ｄａよりも低い分子量のペプチドの量を含むペプチド組成物は、組成中のペプチドの量に対する前記量の比率が４０％未満である；組成物中の分子量およびペプチドの量を、排除クロマトグラフィーによって決定する。本発明は同様に、薬剤として使用するかかる組成物に関する。本発明はさらに、食品サプリメントとして使用するべきかかる組成物に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノグラムを有するペプチド組成物であって：
−  グリシンが、前記組成物中のアミノ酸のモル量の合計に対するこの量の比が２０．０％〜２４．５％であるようなモル量であり；
−  ヒドロキシプロリンが、前記組成物中のアミノ酸のモル量の合計に対するこの量の比が６．０％〜１２．０％であるようなモル量であり；
−  プロリンが、前記組成物中のアミノ酸のモル量の合計に対するこの量の比が１０．６％〜１４．６％であるようなモル量であり；
前記ペプチド組成物が、前記ペプチド組成物の各ペプチドがこのペプチドの見かけの分子量を表す保持時間で溶出される排除クロマトグラフィーによる解析の間に、１４００Ｄａ未満の見かけの分子量のペプチドに対応する曲線下面積値を有するペプチドの溶出曲線を有し、この面積値の前記曲線下総面積に対する比が４０％未満であるようにし；
前記分析を、以下に記載するように実施する：
○多孔度５μｍのシリカゲルから形成された固定相を含む寸法３００×７．８ｍｍの濾過カラムに；
○前記カラムを、４０℃の温度に保持し；
○移動相として、０．１体積％のトリフルオロ酢酸と（Ｂ）のアセトニトリルを含む超純水の生成した溶液（Ａ）を用い、Ａ／Ｂ体積比は、７５／２５であり；
○前記ゲル濾過カラムの上部に、前記ペプチド組成物を含む溶液の容量を導入し；
○前記カラム中の前記移動相の流量は、０．６ｍｌ／分であり；
○前記組成物の前記ペプチドを、２１４ｎｍの波長での吸光度によって検出する、
前記ペプチド組成物。
【請求項２】
前記組成物の各ペプチドが２００Ｄａ〜１２  ０００Ｄａの見かけの分子量を有することを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ペプチドが２５００Ｄａ〜３６００Ｄａの平均の見かけの分子量値を有することを特徴とする、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
陰イオン交換カラム上でのクロマトグラフィー分析により、ペプチド組成物の各ペプチドが、その電荷を表す保持時間でカラムから溶出され：
−  アニオン性ペプチドに対応するピーク下の面積値；
−  中性ペプチドに対応するピーク下の面積値および；
−  カチオン性ペプチドに対応するピーク下の面積値；
したがって、前記アニオン性ペプチドに対応する前記ピーク下のこの面積値の、前記アニオン性ペプチドに対応するピーク下の前記面積値、前記組成物の前記中性ペプチドおよび前記カチオン性ペプチドに対する比は、２７．０％〜４５％であり；
前記アニオン性ペプチドに対応する前記ピーク下の前記面積の値、前記カチオン性ペプチドに対応する前記ピーク下の前記面積の値、および前記中性ペプチドに対応する前記ピーク下の前記面積の値を、下記の条件下でのクロマトグラフィー分析により決定し：
○固定相として１０μｍの粒子径の第四級アンモニウム基で官能化した親水性アニオン交換樹脂を含む寸法１００×７．８ｍｍのクロマトグラフィーカラムを用い；
○前記カチオン性ペプチドおよび中性ペプチドの溶出のための第１の移動相として、ｐＨ８．３５の５ｍＭ水溶液Ｔｒｉｓ緩衝液（Ｃ）を、前記カラムの上部で分析するべき前記組成物の導入から開始して７分の継続時間にわたり、次いでｐＨ８．３５の５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５Ｍ  ＮａＣｌから形成される緩衝液（Ｄ）の体積の緩衝液（Ｃ）の体積に対する比が３０分間で０〜１００％まで直線的に増加するアニオン性ペプチドの溶出のための第２の移動相を使用し；
○カラム中の移動相の流量は、１ｍｌ／分であり；
○解析を、２５℃の温度で行い；ならびに
○カラム出口の波長２１４ｎｍの吸光度で検出する
ことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記ペプチドが、逆相液体クロマトグラフィー疎水性分析の間、１６分〜３６分の保持時間を有し；
前記疎水性分析を、以下の条件下で実施する：
○粒径５μｍ、多孔度３００Åのブチル基をグラフトしたシリカから生成した固定相を有する寸法２５０×４．６ｍｍのクロマトグラフィーカラムを用い；
○親水性ペプチドの溶出のための第１の移動相として、前記カラムの上部で分析するべき前記組成物の導入から開始して７分の継続時間にわたって超純水中の０．１％のトリフルオロ酢酸の溶液（Ｅ）、次いで、４０％アセトニトリルを含む水中の０．１％のトリフルオロ酢酸の溶液（Ｆ）の体積の、溶液（Ｅ）の体積に対する比が、３０分間で０〜４０％まで直線的に増加する、疎水性ペプチドの溶出のための第２の移動相を使用し；
○カラム中の移動相の流量は、０．６ｍｌ／分であり；
○解析を、４０℃の温度で行い；ならびに
○カラム出口の波長２１４ｎｍの吸光度によって検出する
ことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
液体状態であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
分割状態で固体であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
炭水化物を含まないことを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
脂肪を含まないことを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物の前記ペプチドが水溶性であることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物の前記ペプチドがパンガシウス科からの魚およびカワスズメ科からの魚から形成される群から選択される少なくとも１つの魚の皮膚からのコラーゲンの制御された酵素的加水分解から生じることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
医薬としての使用のための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
消化器疾患の処置における使用のための、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
腸カンジダ症の処置における使用のための、請求項１１または１２に記載の組成物。
【請求項１５】
消化器炎症の処置における使用のための、請求項１１または１２に記載の組成物。
【請求項１６】
腸内微生物叢の維持における使用のための、請求項１１または１２に記載の組成物。
【請求項１７】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物の、ヒト食品における使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、魚の皮膚（複数可）からのコラーゲンペプチドの組成物に関する。本発明は、特に、魚の皮膚（複数可）からのコラーゲンの酵素的加水分解によって得られるかかるペプチド組成物に関する。本発明はまた、薬剤としてのその使用のためのかかる組成物に関する。本発明は、したがって、ヒトまたは動物身体に影響を及ぼす疾患の治癒的または予防的処置のためのかかる組成物の使用に関する。本発明は、特に、ヒトもしくは動物における消化器カンジダ症の処置および／またはヒトもしくは動物における腸の炎症の処置における薬剤としてのその使用のためのかかる組成物に関する。本発明はまた、微生物叢刺激処置における薬剤としてのその使用のためのかかる組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１には、魚類、軟体動物または甲殻類の皮膚または骨格に由来するコラーゲンに富む出発物質のパパインによる加水分解によって得られるペプチド粉末が開示されている。得られたペプチド粉末において、３８％のペプチドは１０  ０００Ｄａ〜５０  ０００Ｄａの分子量を有する。特許文献１のペプチド組成は、広範囲の分子量、特に１０  ０００Ｄａより大きい分子量を有するペプチドの１０％より大きい割合を有する。特許文献１のペプチド組成は、ペプチドのサイズによって不均一であり、８０％〜９０％の間のみの水溶性ペプチドの画分を有する。１０，０００Ｄａを超える高分子量のペプチドのかかる粉末は、完全には水溶性ではない。それらはまた、消化管によって完全に吸収可能ではなく、したがってそれらの生物学的利用率に関する問題をもたらす。
【０００３】
また、特許文献１にはまた、非常に深い所に生息する魚から得られたかかるペプチド粉末の、競走馬の下肢の関節（膝、蹴爪および蹄）の腱の炎症の治癒的処置における使用が記載されている。かかる組成物を得ることは、問題である。それは、深海の魚類を除去する必要があるからである。さらに、かかる粉末は、その使用が関節の炎症の処置に制限される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】仏国特許２  ７２０  ０６７号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、したがって、これらの欠点を克服することを目的とする。
【０００６】
本発明は、温帯海域魚の皮膚（複数可）からのコラーゲンの酵素的加水分解から生じる新規なペプチド組成物を提案することを目的とし、前記ペプチドは、水溶性−すなわち、１００％水溶性−であり、消化管によって完全に吸収可能である。
【０００７】
本発明はまた、温帯海域魚の皮膚（複数可）からのコラーゲンの酵素的加水分解により生成する新規なペプチド組成物を提案することを目的とする。
【０００８】
本発明はまた、医薬として用いることが可能であるかかるペプチド組成物を提案することを目的とする。
【０００９】
本発明は、特に、医薬として用いることが可能である温帯海域魚の皮膚（複数可）からのコラーゲンの酵素的加水分解から生じるかかるペプチド組成物を提案することを目的とする。
【００１０】
本発明は、約１００〜数千ダルトンの狭い範囲にわたる前記ペプチドの見かけの分子量の分布を有する、すなわち、高い見かけの分子量のペプチドを除外し、低い見かけの分子量のペプチドの低い割合を有するかかるペプチド組成物を提案することを目的とする。
【００１１】
本発明は、腸カンジダ症の処置における医薬として用いることが可能であるかかるペプチド組成物を提案することを目的とする。
【００１２】
本発明はまた、炎症性消化器疾患、特に炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の処置における医薬として用いることが可能であるかかるペプチド組成物を提案することを目的とする。
【００１３】
本発明はまた、腸内フローラ（または微生物叢）の平衡および維持を促進するために用いることが可能であるかかるペプチド組成物を提案することを目的とする。
【００１４】
本発明はまた、温帯海域魚の皮膚（複数可）からのコラーゲンの酵素的加水分解から生じるかかるペプチド組成物の栄養補助食品としての使用を提案することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
この目的のために、本発明は、アミノグラムを有するペプチド組成物に関し、ここで：
−  グリシンは、組成物中のアミノ酸のモル量の合計に対するこの量の比が２０．０％〜２４．５％であるようなモル量であり；
−  ヒドロキシプロリンは、組成物中のアミノ酸のモル量の合計に対するこの量の比が６．０％〜１２．０％、特に７．０％〜１１．０％であるようなモル量であり；
−  プロリンは、組成物中のアミノ酸のモル量の合計に対するこの量の比が１０．６％〜１４．６％、特に１１．６％〜１３．６％、特に１２．１％〜１３．１％、好ましくは１２．６％のオーダーであるようなモル量であり；
ペプチド組成物が、ペプチド組成物の各ペプチドがこのペプチドの見かけの分子量を表す保持時間で溶出される排除クロマトグラフィーによる解析の間に、１４００Ｄａ未満の見かけの分子量のペプチドに対応する曲線下面積（すなわち、ペプチドの重量による量を表す面積値）を有するペプチドの溶出曲線（すなわち、クロマトグラムの溶出曲線）を有し、この面積値のこの曲線下総面積（組成物の全ペプチドに対応する）に対する比が４０％未満、特に３８％未満、好ましくは３０〜３８％、特に３０〜３５％であるようにし；
前記分析を、以下に記載するように実施する：
○多孔度５μｍのシリカゲルから形成された固定相を含む寸法３００×７．８ｍｍの濾過カラムに；
○カラムを、４０℃の温度に保持し；
○移動相として、０．１体積％のトリフルオロ酢酸と（Ｂ）のアセトニトリルを含む超純水の生成した溶液（Ａ）を用い、Ａ／Ｂ体積比は、７５／２５であり；
○ゲル濾過カラムの上部に、ペプチド組成物を含む溶液の容量を導入し；
○カラム中の移動相の流量は、０．６ｍｌ／分であり；
○組成物のペプチドを、２１４ｎｍの波長での吸光度によって検出する。
【００１６】
本文中、「アミノグラム」とは、ペプチド鎖（または結合）によって、ペプチドの配列またはペプチドの混合物のペプチドの配列を形成する遊離アミノ酸のリストを意味することを意図する。かかるアミノグラムは、ペプチドまたはペプチドの混合物を構成するアミノ酸の解析−特に全体的な解析または配列解析−によって得られる。
【００１７】
特に、本発明に従う組成物のペプチドを構成するアミノ酸の性質および量を、当業者にそれ自体公知の全体的分析の任意の方法によって決定する。特に、この分析を、基準ＩＳＯ  １３９０３：２００５に従って、アミノ酸分析器を用いて、または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）装置を用いた遊離および全アミノ酸のアッセイにより行う。ヒドロキシプロリンを、連続フロー分析および比色検出によってアッセイする。
【００１８】
本発明の組成物の全体的分析によって得られたアミノグラムは、温帯海域魚の皮膚からのコラーゲンのアミノ酸組成の代表である。本発明は、したがって、植物起源のシステインプロテアーゼ−特にクラスＥＣ  ３．４．２２．２からのプロテアーゼ−による温帯海域魚の皮膚からのコラーゲンの酵素的加水分解から生じるかかるペプチド組成物に関する。本発明者らは、かかるシステインプロテアーゼの使用により、水溶性であり−すなわち、１００％水溶性であり−、消化管によって完全に吸収可能であり、約１００〜数千ダルトンの狭い範囲にわたる見かけの分子量の分布を有し、すなわち、高い見かけの分子量のペプチドを除外し、また低い見かけの分子量のペプチドの低い割合を有するペプチドの組成物を得ることが可能になることを発見した。
【００１９】
さらに、本発明のペプチド組成物のペプチドの分離を、ペプチド組成物をシラノール基の高い表面密度を有する多孔性シリカゲル濾過カラム（ＢｉｏＳｅｐ−ＳＥＣ−Ｓ２０００，Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｌｅ  Ｐｅｃｋ、フランス）上での液体クロマトグラフィーによる分析的分離のステップに供することによって、それらの見かけの分子量の関数として行う。
【００２０】
移動相として、（Ａ）トリフルオロ酢酸（０．１体積％）を添加した超純水および（Ｂ）アセトニトリルを含む溶液（Ａ／Ｂ；７５／２５；ｖ／ｖ）を、用いる。ゲルろ過カラムを、解析中は４０℃の温度に保持する。固定相中の移動相の流量は、０．６ｍｌ／分である。ゲル濾過カラムの上部に導入した分析するべきペプチド組成物の体積は、２５μｌであり、検出を、２１４ｎｍの波長の吸光度により連続的に行う。クロマトグラムを得、各ピークを、ピークの最大吸光度値で決定した継続時間または保持時間値（分析するべき混合物のカラムの上部での導入に続いての分で表す）によって特徴づける。各ピークの最大吸光度値におけるこの保持時間値に対応する各ペプチドの見かけの分子量を、−上記と同じクロマトグラフィー条件下で−決定した見かけの分子量のペプチドの分析によって得られる所定の較正曲線によって決定する。例えば、かかる較正曲線を、これらの同じクロマトグラフィー条件下で、１００Ｄａ〜３０ｋＤａの間の既知の見かけの分子量を有する参照ペプチド／タンパク質の混合物を分析することによって作成する。
【００２１】
本発明のペプチド組成物のクロマトグラフィー分析の過程における２１４ｎｍでの吸光度の変化を表すクロマトグラムを用いて、１４００Ｄａ未満の見かけの分子量のペプチドの比率を、曲線下面積の値、すなわち、曲線全体の下の全面積の値、すなわち、曲線の各ピーク下の面積の合計の値に対する１４００Ｄａ未満の見かけの分子量のペプチドに対応する曲線下の面積の和の値、およびペプチド組成物の全ペプチドに対応する比率を評価することによって決定する。
【００２２】
本発明は、したがって、植物起源のシステインプロテアーゼによる温帯海域魚の皮膚からのコラーゲンの酵素的加水分解から生じるペプチドの組成物に関し、組成物の各ペプチドは、２〜数十、好ましくは２〜１００アミノ酸の数のアミノ酸を有する。
【００２３】
ある実施形態において、本発明の組成物は、グリシンが組成物中のアミノ酸のモル量の合計に対するこの量の比が２０．０％〜２２．４％、特に２０．０％〜２１．９％、特に２０．４％〜２１．４％であるようなモル量であるアミノグラムを有する。
【００２４】
いくつかの他の実施形態において、本発明の組成物は、グリシンが組成物中のアミノ酸のモル量の合計に対するこの量の比が２２．４％〜２４．９％、特に２２．９％〜２４．４％、特に２３．０％〜２４．０％であるようなモル量であるアミノグラムを有する。
【００２５】
ある実施形態において、本発明の組成物は、ヒドロキシプロリンが組成物中のアミノ酸のモル量の合計に対するこの量の比が７．０％〜９．０％、特に７．５％〜８．５％、好ましくは７．７％〜８．５％であるようなモル量であるアミノグラムを有する。
【００２６】
いくつかの他の実施形態において、本発明の組成物は、ヒドロキシプロリンが組成物中のアミノ酸のモル量の合計に対するこの量の比が９．５％〜１１．５％、特に１０．０％〜１１．０％、好ましくは１０．５％のオーダーであるようなモル量であるアミノグラムを有する。
【００２７】
ある実施形態において、本発明の組成物は、グルタミン酸が組成物中のアミノ酸のモル量の合計に対するこの量の比が８．０％〜１３．０％であるようなモル量であるアミノグラムを有する。
【００２８】
ある実施形態において、本発明の組成物は、グルタミン酸が組成物中のアミノ酸のモル量の合計に対するこの量の比が８．０％〜１０．０％、特に８．５％〜９．５％、好ましくは９．０％〜９．５％であるようなモル量であるアミノグラムを有する。
【００２９】
いくつかの他の実施形態において、本発明の組成物は、グルタミン酸が組成物中のアミノ酸のモル量の合計に対するこの量の比が１０．５％〜１２．５％、特に１１．０％〜１２．０％、好ましくは１１．６％のオーダーであるようなモル量であるアミノグラムを有する。
【００３０】
ある実施形態において、本発明の組成物は、アルギニンが組成物中のアミノ酸のモル量の計に対するこの量の比が６．９％〜１０．９％、特に７．９％〜９．９％、特に８．０％〜９．０％であるようなモル量であるアミノグラムを有する。
【００３１】
ある実施形態において、本発明の組成物は、アラニンが組成物中のアミノ酸のモル量の合計に対するこの量の比が７．３％〜１１．５％、特に８．０％〜１０．０％、特に８．１％〜９．６％であるようなモル量であるアミノグラムを有する。
【００３２】
ある実施形態において、本発明の組成物は、アスパラギン酸が組成物中のアミノ酸のモル量の合計に対するこの量の比が３．１％〜７．１％、特に４．１％〜６．１％、特に４．６％〜５．６％、好ましくは５．０％〜５．５％であるようなモル量であるアミノグラムを有する。
【００３３】
ある実施形態において、本発明の組成物は、リシンが組成物中のアミノ酸のモル量の合計に対するこの量の比が１．５％〜５．５％、特に２．５％〜４．５％、特に３．０％〜４．０％、好ましくは３．１％〜３．６％であるようなモル量であるアミノグラムを有する。
【００３４】
ある実施形態において、本発明の組成物は、セリンが組成物中のアミノ酸のモル量の合計に対するこの量の比が１．５％〜５．５％、特に２．５％〜４．５％、特に３．０％〜４．０％、好ましくは３．２％〜３．６％であるようなモル量であるアミノグラムを有する。
【００３５】
ある実施形態において、本発明の組成物は、トレオニンが組成物中のアミノ酸のモル量の合計に対するこの量の比が０．７％〜４．７％、特に１．７％〜３．７％、特に２．２％〜３．２％、好ましくは２．４％〜２．８％であるようなモル量であるアミノグラムを有する。
【００３６】
ある実施形態において、本発明の組成物は、ロイシンが組成物中のアミノ酸のモル量の合計に対するこの量の比が０．６％〜４．６％、特に１．６％〜３．６％、特に２．１％〜３．１％、好ましくは２．４％〜２．９％であるようなモル量であるアミノグラムを有する。
【００３７】
ある実施形態において、本発明の組成物は、フェニルアラニンが組成物中のアミノ酸のモル量の合計に対するこの量の比が０．３％〜４．３％、特に１．３％〜３．３％、特に１．８％〜２．８％、好ましくは１．８％〜２．４％であるようなモル量であるアミノグラムを有する。
【００３８】
ある実施形態において、本発明の組成物は、バリンが組成物中のアミノ酸のモル量の合計に対するこの量の比が０〜４．０％、特に１．０〜３．０％、特に１．５〜２．５％、好ましくは１．８〜２．５％であるようなモル量であるアミノグラムを有する。
【００３９】
ある実施形態において、本発明の組成物は、イソロイシンが組成物中のアミノ酸のモル量の合計に対するこの量の比が０〜３．５％、特に０．５％〜２．５％、特に０．９％〜２．０％、好ましくは０．９％〜１．６％であるようなモル量であるアミノグラムを有する。
【００４０】
ある実施形態において、本発明の組成物は、ヒドロキシリシンが組成物中のアミノ酸のモル量の合計に対するこの量の比が０〜３．５％、特に０．５〜２．５％、特に１．０〜２．０％、好ましくは１．５％のオーダーであるようなモル量であるアミノグラムを有する。
【００４１】
ある実施形態において、本発明の組成物は、ヒスチジンが組成物中のアミノ酸のモル量の合計に対するこの量の比が０〜３．３％、特に０〜２．３％、特に０．５〜１．５％であるようなモル量であるアミノグラムを有する。
【００４２】
ある実施形態において、本発明の組成物は、メチオニンが組成物中のアミノ酸のモル量の合計に対するこの量の比が０〜２．５％、特に０〜２．０％、特に０．５〜１．８％、好ましくは０．７〜１．６％であるようなモル量であるアミノグラムを有する。
【００４３】
ある実施形態において、本発明の組成物は、チロシンが組成物中のアミノ酸のモル量の合計に対するこの量の比が０〜１．５％、特に０〜１．０％、特に０〜０．９％、好ましくは０．２〜０．８％であるようなモル量であるアミノグラムを有する。
【００４４】
ある実施形態において、本発明の組成物は、システインおよびシスチンが組成物中のアミノ酸のモル量の合計に対するこの量の比が０〜２％、特に０〜１．０％、特に０〜０．５％、好ましくは０．０３％のオーダーであるようなモル量であるアミノグラムを有する。
【００４５】
本発明の組成物は、必須アミノ酸（リシン、メチオニン、フェニルアラニン、トレオニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンおよびヒスチジン）が一緒に１５％〜２０％であるアミノグラムを有する。
【００４６】
有利には、本発明によるいくつかの実施形態において、ペプチド組成物のペプチドの少なくとも９０％−特に少なくとも９５％は、１５，０００Ｄａ（ダルトン）未満、特に２００〜１５，０００Ｄａ、好ましくは２００Ｄａ〜１４，０００Ｄａ、特に２００Ｄａ〜１３，０００Ｄａの見かけの分子量を有する。有利には、本発明によるいくつかの実施形態において、組成物のペプチドの少なくとも９０％は、２００Ｄａ〜１２，０００Ｄａの見かけの分子量を有する。
【００４７】
本発明の組成物のペプチドは、見かけの分子量の厳密な分布を有し、約１００〜数千ダルトンの狭い範囲にわたり、すなわち、１００以上のアミノ酸を有し、また低い見かけの分子量のペプチドの低い割合を有する高い見かけの分子量のペプチドを除外する。
【００４８】
有利には、本発明に従ういくつかの実施形態において、組成物のペプチドは、２５００Ｄａ〜３６００Ｄａ、特に２７００Ｄａ〜３６００Ｄａの平均の見かけの分子量値を有する。本発明に従うペプチド組成物の各ペプチドによって組成物に対する重量寄与がなされるので、組成物のペプチドの平均の見かけの分子量値は、組成物中の各ペプチドの重量寄与を表す値による、各重量ペプチドの見かけの分子量の、重量値と称する各値の平均に対応する。組成物中の各ペプチドまたはペプチドの群の重量寄与を表す値を、組成物のすべてのペプチドに対応する曲線下の合計の面積の値に対する、前記ペプチドまたは前記ペプチドの群に対応する曲線下面積の値の百分率として表す。
【００４９】
実際には、クロマトグラムの同じピークに対応する一群のペプチドの重み付けされた見かけの分子量値は、クロマトグラムのこのピークの最上部（最大）で読み取られた見かけの分子量値に、クロマトグラムの曲線下の（合計の）面積に対するこのピークの曲線下面積の値の比を乗じたものに対応する。「曲線下面積」または「ピーク下面積」は、クロマトグラムのピークを追跡する曲線とクロマトグラムのベースラインとの間の空間の面積を意味することを意図する。特に、クロマトグラムのピークの一方の下の面積は、クロマトグラムの曲線の２つの最小値の間に広がり、クロマトグラムの曲線の最上部（または最大値）を包囲する。
【００５０】
いくつかの実施形態によれば、本発明のペプチド組成物は、ペプチド組成物の各ペプチドがこのペプチドの見かけの分子量を表す保持時間で溶出される排除クロマトグラフィーによるその解析中に、この曲線下面積の値（すなわち、ペプチドの重量による量を表す面積値）を有するペプチドの溶出を表す曲線（すなわち、クロマトグラム）を有し、１０，０００Ｄａより大きい−特に１０，０００Ｄａ〜５０，０００Ｄａの見かけの分子量のペプチドに相当し、したがってこの面積値対曲線下総面積（組成物の全ペプチドに対応する）の比は、１５％未満、特に１０％未満である。いくつかの特定の実施形態によると、この比率は、２．５％〜８．５％である。
【００５１】
他の特定の態様によれば、本発明のペプチド組成物は、高分子量のいかなるペプチドも欠いていてもよい。これらの他の特定の実施形態によると、本発明に従うペプチド組成物は、水溶性ペプチドから形成される。
【００５２】
いくつかの実施形態によれば、本発明のペプチド組成物は、その解析中に、ペプチド組成物の各ペプチドがこのペプチドの見かけの分子量を表す保持時間で溶出される排除クロマトグラフィーにより、１８００Ｄａ〜１０，０００Ｄａの見かけの分子量のペプチドに対応するこの曲線下面積の値（すなわち、ペプチドの重量による量を表す面積値）を有するペプチドの溶出を表す曲線（すなわち、クロマトグラム）を有し、したがってこの面積値の曲線下の総面積（組成物の全ペプチドに対応する）に対する比は、３５％より大きく−特に３５％〜７０％、特に４５％〜６５％である。いくつかの特定の実施形態によると、この比は、４９％〜５５％である。
【００５３】
いくつかの実施形態によれば、本発明に従うペプチド組成物は、ペプチド組成物の各ペプチドがこのペプチドの見かけの分子量を表す保持時間で溶出される排除クロマトグラフィーによるその分析の間に、６００Ｄａ〜１８００Ｄａの見かけの分子量のペプチドに対応するこの曲線下面積の値（すなわち、ペプチドの重量による量を表す面積値）を有するペプチドの溶出を表す曲線（すなわち、クロマトグラム）を有し、したがってこの面積値の曲線下の総面積（組成物の全ペプチドに対応する）に対する比は、１５％〜４５％−特に２０％〜４０％、特に２５％〜３５％である。いくつかの特定の実施形態によると、この比は、２７％〜３２％である。
【００５４】
いくつかの実施形態によれば、本発明のペプチド組成物は、その解析中に、ペプチド組成物の各ペプチドがこのペプチドの見かけの分子量を表す保持時間で溶出される排除クロマトグラフィーによるその分析の間に、６００Ｄａ未満の見かけの分子量のペプチドに対応するこの曲線下面積の値（すなわち、ペプチドの重量による量を表す面積値）を有するペプチドの溶出を表す曲線（すなわち、クロマトグラム）を有し、したがってこの面積値の曲線下の総面積（組成物の全ペプチドに対応する）に対する比は、１０％未満である。いくつかの特定の実施形態によると、この比は、８．５％〜１４．５％である。
【００５５】
有利には、本発明の組成物は、陰イオン交換カラム上でのクロマトグラフィー分析により、ペプチド組成物の各ペプチドが、その電荷を表す保持時間でカラムから溶出される。
−  アニオン性ペプチドに対応するピーク下の面積値；
−  中性ペプチドに対応するピーク下の面積値および；
−  カチオン性ペプチドに対応するピーク下の面積値；
したがって、アニオン性ペプチドに対応するピーク下のこの面積値の、アニオン性ペプチドに対応するピーク下の面積値、中性ペプチドおよびカチオン性ペプチドに対する組成物の面積値の合計との比は、２７．０％〜４５％、特に３０％〜４５％、特に３５％〜４３％、好ましくは３５％〜４０％であり；
アニオン性ペプチドに対応するピーク下面積の値、カチオン性ペプチドに対応するピーク下面積の値、および中性ペプチドに対応するピーク下面積の値を、下記の条件下でのクロマトグラフィー分析により決定する。
○固定相として１０μｍの粒子径の第四級アンモニウム基で官能化した親水性アニオン交換樹脂を含む寸法１００×７．８ｍｍのクロマトグラフィーカラムを用いる；
○カチオン性ペプチドおよび中性ペプチドの溶出のための第１の移動相として、ｐＨ８．３５の５ｍＭ水溶液Ｔｒｉｓ緩衝液（Ｃ）を、カラムの上部で分析するべき組成物の導入から開始して７分の継続時間にわたり、次いでｐＨ８．３５の５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５Ｍ  ＮａＣｌから形成される緩衝液（Ｄ）の体積の緩衝液（Ｃ）の体積に対する比が３０分間で０〜１００％まで直線的に増加するアニオン性ペプチドの溶出のための第２の移動相を使用する；
○カラム中の移動相の流量は、１ｍｌ／分である；
○解析を、２５℃の温度で行う；
○カラム出口の波長２１４ｎｍの吸光度で検出する。
【００５６】
有利には、本発明によれば、本発明に従う組成物のペプチドは、逆相液体クロマトグラフィー疎水性分析の間、１６分〜３６分の保持時間を有し；
上記疎水性分析を、以下の条件下で実施する：
○粒径５μｍ、多孔度３００Åのブチル基をグラフトしたシリカから生成した固定相を有する寸法２５０×４．６ｍｍのクロマトグラフィーカラムを用いる；
○親水性ペプチドの溶出のための第１の移動相として、カラムの上部で分析するべき組成物の導入から開始して７分の継続時間にわたって超純水中の０．１％のトリフルオロ酢酸の溶液（Ｅ）、次いで、４０％アセトニトリルを含む水中の０．１％（体積による）のトリフルオロ酢酸の溶液（Ｆ）の体積の、溶液（Ｅ）の体積に対する比が、３０分間で０〜４０％まで直線的に増加する、疎水性ペプチドの溶出のための第２の移動相を使用する；
○カラム中の移動相の流量は、０．６ｍｌ／分である；
○解析を、４０℃の温度で行う；
○カラム出口の波長２１４ｎｍの吸光度で検出する。
【００５７】
ある実施形態において、本発明に従う組成物は、１２％〜３８％のアセトニトリルの百分率に相当する保持時間で、上に述べたカラムから、および上に特定した条件下で溶出される、本質的に疎水性であるペプチドを含む。本発明の組成物のペプチドの保持時間の中央値は２６分であり、溶出液中の２５％のアセトニトリルの百分率に相当する。
【００５８】
有利には、本発明によれば、ペプチド組成物は液体状態である。それは、液体溶媒に溶解した、特に水性溶媒に溶解した本発明のペプチド組成物の溶液であってよい。
【００５９】
有利には、本発明によれば、ペプチド組成物は固体状態である。ペプチド組成物は、分割状態の固体の形態であってよい。それは、特に、少なくとも部分的に脱水された状態の固体であり得る。本発明のペプチド組成物は、粉末形態であってよい。
【００６０】
有利には、本発明によれば、ペプチド組成物は炭水化物を含まない。
【００６１】
有利には、本発明によれば、ペプチド組成物は脂肪を含まない。
【００６２】
有利には、本発明によれば、ペプチド組成物の固体は、重量比で９５％超、特に９９％超のコラーゲンペプチドを含む。したがって、ペプチド組成物は、ペプチド組成物の固体のコラーゲンペプチド対ペプチド組成物の固体の重量比が９５％より大きく、特に９９％より大きいような量のコラーゲンペプチドを有する。
【００６３】
遊離には、本発明によれば、組成物のペプチドは水溶性である。有利には、ペプチド組成物のペプチドは、１００％水溶性である。有利には、ペプチド組成物は、ハイドロコンパチブル（ｈｙｄｒｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）である。
【００６４】
有利には、本発明に従って、ペプチド組成物のペプチドは、パンガシディア科−特にパンガシウス  ヒポフタルムス（Ｐａｎｇａｓｉｕｓ  ｈｙｐｏｐｈｔａｌｍｕｓ）（またはパンガシノドン  ヒポフタルムス（Ｐａｎｇａｓｉａｎｏｄｏｎ  ｈｙｐｏｐｈｔａｌｍｕｓ））、パンガシウス  パンガシウス（Ｐａｎｇａｓｉｕｓ  ｐａｎｇａｓｉｕｓ）、パンガシウス  ボコルティ（Ｐａｎｇａｓｉｕｓ  ｂｏｃｏｕｒｔｉ）−からの、およびカワスズメ科−特にＯｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓ属、特にナイルティラピアまたはティラピア属からの魚から形成される群から選択される少なくとも１つの魚の皮膚からのコラーゲンの制御された酵素的加水分解から生じる。有利には、ペプチド組成物のペプチドは、温帯地域の温帯海域中に見出される少なくとも１つの魚の皮膚からのコラーゲンの制御された酵素的加水分解から生じる。
【００６５】
本発明はまた、ヒトまたは動物の身体についての治療的処置におけるかかるペプチド組成物の使用に及ぶ。本発明は、したがってまた、医薬としての使用のためのかかるペプチド組成物に及ぶ。本発明は、したがって、ヒトまたは動物の身体の少なくとも１つの疾患の予防的または根治的治療における医薬としてのその使用のためのかかるペプチド組成物に及ぶ。
【００６６】
本発明はまた、特に、以下の処置のうちの少なくとも１つにおける医薬としてのその使用のためのペプチド組成物に及ぶ：
−  消化器疾患の処置；
−  腸カンジダ症の処置；
−  消化器炎症の処置；
−  腸内微生物叢の維持。
【００６７】
本発明はまた、ヒト食品における本発明のペプチド組成物の任意の用途に及ぶ。いくつかの実施形態によれば、本発明はまた、医薬としての任意の用途を除いて、ヒト食品における本発明のペプチド組成物の任意の用途に及ぶ。特に、本発明の組成物を、有利には、栄養補助食品として使用する。
【００６８】
本発明はまた、以下のプロセスによって得られるペプチド組成物に及ぶ。
−  温帯海域魚の皮膚は、特にパンガシダ科から、および／またはチクリダ科から選択され、次いで；
−以下を連続して実施する。
・皮膚を洗浄する少なくとも１つのステップ、次いで；
・コラーゲンの少なくとも一部の皮膚からの抽出を可能にするのに適した、皮膚の酸またはアルカリ処理の少なくとも１つのステップ；
・植物起源の少なくとも１つのシステインプロテアーゼ−特にカリカパイア（Ｃａｒｉｃａ  ｐａｐａｉａ）の少なくとも１つのプロテアーゼによるコラーゲンの、少なくとも７５℃未満の温度での加水分解の少なくとも１つのステップ、次いで；
・ペプチド組成物を生成するために、コラーゲン加水分解物を各システインプロテアーゼの変性温度より高い温度に加熱することによる酵素的加水分解の中断。
【００６９】
有利には、本発明の方法において、皮膚の酸またはアルカリ処理のステップの後、コラーゲンの少なくとも１回の液体／固体抽出を、６０℃〜９８℃の温度にした水中で行う。有利には、本発明の方法において、分離のステップ、特に固体（および脂肪）を含む画分および抽出したコラーゲンを含む溶液を沈殿させることによって分離するステップを、次に実施し、次いで、抽出したコラーゲンを含む溶液を、例えば土上での濾過および／またはイオン交換樹脂上での脱塩によって、精製工程に供し、コラーゲンを含む精製した溶液を生成するのに適し、精製した溶液の固体は、少なくとも９９％、特に少なくとも９９．５％、特に少なくとも９９．８％のコラーゲンの重量比を含む。実質的に純粋なコラーゲンを含むコラーゲンの精製した溶液が、生成する。特に、コラーゲンのかかる精製した溶液は、実質的に無色に生成する。特に、エラスチンを実質的に−特に完全に−含まないコラーゲンのかかる精製した溶液が、生成する。精製した溶液を濃縮して、精製したコラーゲンゲルを生成し、精製したコラーゲンゲルを次いでコラーゲンの加水分解のステップに供する。
【００７０】
かかる方法により、実質的に無色である本発明のペプチド組成物を得ることが可能になる。かかる方法により、エラスチンを実質的に含まない本発明のペプチド組成物を得ることが可能になる。特に、それによって、ペプチド組成物の精製のクロマトグラフィーステップを何ら伴わずに、本発明によるかかるペプチド組成物を得ることが可能になる。
【００７１】
かかる方法において、有利には、本発明に従って、ペプチド組成物の濾過のその後のステップを実施する。有利には、ペプチド組成物の低温殺菌のステップをまた、少なくとも８５℃〜９０℃の低温殺菌温度で、少なくとも２分の継続時間にわたって行う。
【００７２】
かかる方法において、有利には、本発明に従って、ペプチド組成物を乾燥するステップを実施する。この乾燥ステップを、噴霧乾燥によって行い、したがって実質的に脱水し、粉末形態である本発明の組成物が生成する。
【００７３】
本発明は、したがって、以下の方法によって得られるペプチド組成物に及ぶ：
−  温帯海域魚の皮膚は、特にパンガシダ科から、および／またはチクリダ科から選択され、次いで；
−以下を連続して実施する。
・皮膚を洗浄する少なくとも１つのステップ、次いで；
・コラーゲンの少なくとも一部の皮膚からの抽出を可能にするのに適した、皮膚の酸処理の少なくとも１つのステップ、次いで；
・植物起源の少なくとも１つのシステインプロテアーゼ−特にカリカパイアの少なくとも１つのプロテアーゼによるコラーゲンの、７５℃未満の温度での加水分解の少なくとも１つのステップ、次いで；
・ペプチド組成物を生成するために、コラーゲン加水分解物を各システインプロテアーゼの変性温度より高い温度に加熱することによる酵素的加水分解の中断；
前記ペプチド組成物は、以下のアミノ酸の全体的分析を有する：
−  グリシンは、組成物中のアミノ酸のモル量の合計に対するこの量の比が２０．０％〜２４．５％であるようなモル量である；
−  ヒドロキシプロリンは、組成物中のアミノ酸のモル量の合計に対するこの量の比が６．０％〜１２．０％であるようなモル量である；
−  プロリンは、組成物中のアミノ酸のモル量の合計に対するこの量の比が１０．６％〜１４．６％であるようなモル量である；
ペプチド組成物が、ペプチド組成物の各ペプチドがこのペプチドの見かけの分子量を表す保持時間で溶出される排除クロマトグラフィーによる解析の間に、１４００Ｄａ未満の見かけの分子量のペプチドに対応する曲線下面積（すなわち、ペプチドの重量による量を表す面積値）を有するペプチドの溶出曲線（すなわち、クロマトグラムの溶出曲線）を有し、この面積値のこの曲線下総面積（組成物の全ペプチドに対応する）に対する比が４０％未満であるようにし；
前記分析を、以下に記載するように実施する：
○多孔度５μｍのシリカゲルから形成された固定相を含む寸法３００×７．８ｍｍの濾過カラムに；
○カラムを、４０℃の温度に保持し；
○移動相として、０．１体積％のトリフルオロ酢酸および（Ｂ）のアセトニトリルを含む超純水の生成した溶液（Ａ）を用い、Ａ／Ｂ体積比は、７５／２５であり；
○ゲル濾過カラムの上部に、ペプチド組成物を含む溶液の容量を導入し；
○カラム中の移動相の流量は、０．６ｍｌ／分であり；
○組成物のペプチドを、２１４ｎｍの波長での吸光度によって検出する。
【００７４】
本発明はまた、ペプチド組成物、例えば医薬としての使用のためのペプチド組成物、かかるペプチド組成物を得るための方法、および上記または下記の特性の全部または一部によって組み合わせて特性付けられる、上記ペプチド組成物を得るためのかかる方法によって得られるかかるペプチド組成物に関する。
【００７５】
本発明の他の目的、特徴、および利点は、非限定的に与えられ、添付の図面を参照する以下の説明を読むことによって明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】図１は、ゲル濾過による本発明のペプチド組成物の分析を表すクロマトグラムである。
【図２】図２は、陰イオン交換樹脂上での本発明のペプチド組成物のＨＰＬＣ分析を表すクロマトグラムである。
【図３】図３は、逆相クロマトグラフィーによる本発明のペプチド組成物の分析を表すクロマトグラムである。
【図４】図４は、結腸炎症がデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）によって誘発されたマウスの体重の変化を示すグラフ表示である。
【図５】図５は、ＥＬＩＳＡ法によるマウスの結腸におけるＩＬ−１βアッセイの結果のヒストグラムにおけるグラフ表示である。
【図６】図６は、ＥＬＩＳＡ法によるマウスの結腸におけるＩＬ−６アッセイの結果のヒストグラムにおけるグラフ表示である。
【図７】図７は、ＥＬＩＳＡ法によるマウスの結腸におけるＴＮＦ−αアッセイの結果のヒストグラムにおけるグラフ表示である。
【図８】図８は、ＥＬＩＳＡ法によるマウスの結腸におけるＴＧＦ−βアッセイの結果のヒストグラムにおけるグラフ表示である。
【図９】図９は、マウスの結腸における真菌叢のＰＣＲによるアッセイの結果のヒストグラムにおけるグラフ表示である。
【図１０】図１０は、マウスの結腸におけるサッカロミセス  セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＰＣＲによるアッセイの結果のヒストグラムにおけるグラフ表示である。
【図１１】図１１は、マウスの結腸における腸内細菌科のＰＣＲによるアッセイの結果のヒストグラムにおけるグラフ表示である。
【図１２】図１２は、マウスの結腸におけるファーミキューテス門のＰＣＲによるアッセイの結果のヒストグラムにおけるグラフ表示である。
【図１３】図１３は、マウスの結腸におけるバクテロイデス門のＰＣＲによるアッセイの結果のヒストグラムにおけるグラフ表示である。
【図１４】図１４は、マウスの結腸におけるフィーカリバクテリウム  プラウスニッツィのＰＣＲによるアッセイの結果のヒストグラムにおけるグラフ表示である。
【図１５】図１５は、マウスの結腸におけるラクトバチルス  ムリナス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｕｒｉｎｕｓ）のＰＣＲによるアッセイの結果のヒストグラムにおけるグラフ表示である。
【図１６】図１６は、マウスの結腸におけるＴＧＦ−βのメッセンジャーＲＮＡの定量的ＲＴ−ＰＣＲによる分析のヒストグラムにおけるグラフ表示である。
【図１７】図１７は、マウスの結腸における誘導性ＮＯシンターゼ（ｉＮＯＳ）のメッセンジャーＲＮＡの定量的ＲＴ−ＰＣＲによる分析のヒストグラムにおけるグラフ表示である。
【図１８】図１８は、マウスの結腸におけるＦｉｚｚ１のメッセンジャーＲＮＡの定量的ＲＴ−ＰＣＲによる分析のヒストグラムにおけるグラフ表示である。
【図１９】図１９は、マウスの結腸における５−ＬＯＸのメッセンジャーＲＮＡの定量的ＲＴ−ＰＣＲによる分析のヒストグラムにおけるグラフ表示である。
【図２０】図２０は、マウスの結腸における１２／１５−ＬＯＸのメッセンジャーＲＮＡの定量的ＲＴ−ＰＣＲによる分析のヒストグラムにおけるグラフ表示である。
【発明を実施するための形態】
【００７７】
本発明の組成物の調製方法
温帯海域魚の皮膚を、特にパンガシウス科の魚、特にパンガシウス  ヒポフタルムス（Ｐａｎｇａｓｉｕｓ  ｈｙｐｏｐｈｔａｌｍｕｓ）（またはパンガシアンドン  ヒポフタルムス（Ｐａｎｇａｓｉａｎｏｄｏｎ  ｈｙｐｏｐｈｔａｌｍｕｓ））、パンガシウス  パンガシウス（Ｐａｎｇａｓｉｕｓ  ｐａｎｇａｓｉｕｓ）、パンガシウス  ボコリチ（Ｐａｎｇａｓｉｕｓ  ｂｏｃｏｕｒｉｔｉ）、および／またはナマズもしくはカワスズメ科、特にＯｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓ属、特にナイルティラピアまたはＴｉｌａｐｉａ属から除去または購入する。
【００７８】
皮膚の洗浄、洗浄した皮膚の酸処理およびコラーゲンの抽出と精製のステップの連続を、実施する。こうして得られた魚の皮膚からコラーゲンを酵素的に加水分解するステップを、次いで実施して、本発明の組成物を生成する。このために、水を、７０℃〜７５℃の温度に加熱する。魚の皮膚からのコラーゲンの重量を、水中のコラーゲンの重量比が４５％であるように、撹拌しながら高温水中に徐々に注ぎ、溶液のｐＨを、ｐＨ６．０に調整する。ある量の植物起源のシステインプロテアーゼを、次いで再融解したコラーゲンの溶液に添加する。システインプロテアーゼとして、少なくとも１種のカリカパイアのプロテアーゼ、特に乾燥状態のリパイン（Ｌｙｐａｉｎｅ（登録商標）、ＬＹＶＥＮ、Ｃｏｌｌｏｍｂｅｌｌｅｓ、フランス）を、選択する。コラーゲンの重量に対するシステインプロテアーゼの重量比を、所望の加水分解条件に依存して適応させる。例えば、コラーゲンの重量に対するシステインプロテアーゼの重量比は、０．２％である。溶液の温度を、６５℃〜７０℃の値に保持し、コラーゲン加水分解物の粘度が加水分解時間とともに低下するという事実を考慮して、システインプロテアーゼの酵素活性を促進し、コラーゲン加水分解物の最適な流動性を維持するように適応させる。当該溶液を、この温度で４５分間程度の継続時間にわたって保持する。
【００７９】
酵素的加水分解反応を、コラーゲン加水分解物をシステインプロテアーゼの変性温度よりも高い温度、例えば８５℃〜９０℃の温度に２０分間加熱することによって停止する。魚皮膚からのコラーゲンの加水分解物を、任意にろ過のステップに、次いで、少なくとも８５℃〜９０℃の低温殺菌温度で少なくとも２分間の継続時間にわたって低温殺菌のステップに供する。
【００８０】
コラーゲンまたはコラーゲンペプチドの加水分解物を、次いで、所定の粒子サイズの粉末から形成される、本発明に従う組成物を生成するのに適した条件下で乾燥するステップに供する。
【００８１】
本発明の組成物のペプチドの構造的特徴
アミノ酸組成
本発明による温帯海域魚の皮膚からのコラーゲンの加水分解から生じるペプチドの組成物の特徴付けを、標準ＩＳＯ  １３９０３：２００５に従って、遊離アミノ酸および全アミノ酸をアミノ酸分析器を用いて、または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）装置を用いてアッセイすることによって行う。比較として、ベーリング海（アラスカ）の深海から採取した冷水魚（スケトウダラ）の皮膚からのコラーゲンの加水分解物のアミノ酸組成を、決定する。比較結果を、以下の表６に提示する。
【００８２】
【表１】
2020511399.tif 000003
表６
【００８３】
ペプチドの見かけの分子量の分布、ペプチドの極性、およびペプチドの疎水性による、本発明のペプチド組成物の特徴付けもまた、行う。
【００８４】
ペプチドの見かけの分子量の分析
本発明の組成物を構成するペプチドの見かけの分子量の分布を、固定相が５μｍの多孔性を有するシリカベースのゲル（ＢｉｏＳｅｐ−ＳＥＣ−Ｓ２０００、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｌｅ  Ｐｅｃｋ、フランス）からなる寸法３００×７．８ｍｍの液体クロマトグラフィーカラムでのゲル浸透によって分析する。ろ過カラムを、４０℃の温度に保持する。移動相は、（Ａ）トリフルオロ酢酸（０．１体積％）を加えた超純水および（Ｂ）アセトニトリルを含む混合物（Ａ／Ｂ；７５／２５；ｖ／ｖ）からなる。移動相の流量を、０．６ｍｌ／分に保持する。分析するべきペプチド組成物を含む溶液の容量は、２５μｌである。検出を、ゲル透過カラムの出口で、２１４ｎｍの波長での吸光度を測定することにより行う。並行して、保持時間の関数として見かけの分子量を決定するための検量線を、作成する。この検量線を作成するために、分子量１００Ｄａ〜３０ｋＤａの既知のペプチドを、選択する。既知の標準は、それぞれ見かけの分子量が１１５Ｄａ、３０７Ｄａ、１３．７ｋＤａおよび２８．２ｋＤａのプロリン、グルタチオン、リボヌクレアーゼＡおよびトリプシンである。
【００８５】
標準の見かけの分子量および分で表す保持時間を、以下の表１に示す：
【００８６】
【表２】
2020511399.tif 000004
表１
【００８７】
ペプチドは、それらの見かけの分子量の減少の関数としてカラムから連続的に溶出する。クロマトグラム上のピークに対応する、分析するべき組成物のペプチドの各ファミリーの保持時間値を、クロマトグラムの各ピークの最上部で読み取り、検量線との比較によって見かけの分子量値に換算する。ペプチドの各ファミリーの量の相対値は、クロマトグラムの各ピークに対応する曲線下面積の値に対応する。これらの値を、ペプチドの各ファミリーの面積値の合計に対する、ペプチドのファミリーに対応する曲線下面積の値の比によって表す。
【００８８】
図１に示すクロマトグラムのペプチドの各ファミリーに対応する保持時間（分）、対応する見かけの分子量（Ｄａ）および曲線下面積の百分率（曲線下の全面積の百分率として表す）の値を、下記の表２に示す。クロマトグラム上のピークに対応するペプチドの各群を、クロマトグラム上のこのピークの最大値に対応する見かけの分子量値によって同定する。
【００８９】
【表３】
2020511399.tif 000005
表２
【００９０】
本発明の組成物のペプチドの割合−クロマトグラムを図１に示し、その値を表２に示す−は、見かけの分子量が１４００Ｄａ未満である場合について、組成物の全ペプチドに対して３１．２％（値９８３Ｄａおよび３３３Ｄａを有する見かけの分子量）である。
【００９１】
本発明の組成物のペプチドの平均の見かけの分子量は、３４４２Ｄａであり、その見かけの分子量の値を、表２に示す。組成物のペプチドの平均の見かけの分子量を、クロマトグラム上の同じピークに対応する組成物のペプチドの各群に対応する重み付けした見かけの分子量の平均として定義する。クロマトグラム上の同じピークのペプチドの群の重み付けした見かけの分子量値は、ピークの最上部（最大）の見かけの分子量値に対応し、クロマトグラムの曲線下（総）面積に対する対応するピークの曲線下面積の値の比によって重み付けする。「曲線下面積」または「ピーク下面積」は、クロマトグラムのピークを追跡する曲線とクロマトグラムのベースラインとの間の空間の面積を意味することを意図する。特に、クロマトグラムのピークの一方の下の面積は、クロマトグラムの曲線の２つの最小値の間に広がり、クロマトグラムの曲線の最上部（または最大値）を包囲する。
【００９２】
一般化のために、以下の表３は、保持時間（分）、対応する見かけの分子量（Ｄａ）およびペプチドの各ファミリーについての曲線下面積の百分率の平均値を提示し、本発明に従う３つのペプチド組成物の別々の分析に対応する。
【００９３】
【表４】
2020511399.tif 000006
表３
【００９４】
本発明に従う組成物のペプチドの平均の比率−その値を表３に示す−および分子量が１４００Ｄａ未満である比率は、３５．２％（本質的には９８３Ｄａおよび３４０Ｄａの見かけの分子量に対応する）である。
【００９５】
構成ペプチドの極性の解析
見かけの分子量の分布を表２に示す本発明の組成物中のアニオン性ペプチドの割合、すなわちｐＨ８．３５で負電荷を有するペプチドの割合を、分析する。本発明の組成物中の中性および／またはカチオン性ペプチドの比率、すなわち、ｐＨ８．３５で全体的な中性電荷を有する、またはｐＨ８．３５で正電荷を有するペプチドの比率をまた、分析する。かかる分析を、イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により行い、そこでは固定相は、１０μｍの粒子径を有する陰イオン交換樹脂（水相ＨＰ−ＳＡＸ，Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ，Ｍｏｎｔｌｕｃｏｎ、フランス）である。イオン交換ＨＰＬＣクロマトグラフィーカラムの寸法は、１００×７．８ｍｍである。
【００９６】
ＨＰＬＣクロマトグラフィーカラムを、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）緩衝液中で、５ｍＭの水中濃度で、ｐＨを８．３５の値に調整して、イオン交換により調整する。
【００９７】
カラムの温度を、２５℃の温度に保持する。カラム内の移動相の流量は、１ｍｌ／分である。分析するべきペプチド組成物の試料を、その濃度が超純水での希釈によって２ｇ／ｌであるように調製する。分析するべきこの溶液の９０μｌの容積を、カラムの上部に導入する。検出を、２１４ｎｍの吸光度を連続的に測定することにより行う。
【００９８】
カラムの上部における試料の導入から開始して、移動相は、ｐＨ８．３５の５ｍＭトリス（溶液Ａ）から７分間の継続時間、次いで、５ｍＭトリス、５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．３５から形成される溶液Ｂが３０分間で溶液Ａ中で０から１００％まで直線的に増加する移動相からなる。溶出を、次いで溶液Ｂにより２分間維持する。
【００９９】
得られたクロマトグラムを、図２に示す。アニオン性ペプチドは、０．５Ｍ〜１．７ＭのＮａＣｌ濃度に相当する１０分〜１７．５分の保持時間でカラムを出る。分析を図２に示す本発明のペプチド組成物中のアニオン性ペプチドの比率は、３６．９％である。中性およびカチオン性ペプチドは、１分〜８分の保持時間でカラムを出る。分析を図２に示す本発明のペプチド組成物中の中性およびカチオン性ペプチドの比率は、５７．５％である。
【０１００】
一般化のために、この分析を、本発明に従う３つのペプチド組成物に関して再現する。本発明に従うこれらの組成物中のアニオン性ペプチドの平均比率は、２７．９％〜４２．５％であり、本発明に従うこれらの組成物中の中性およびカチオン性ペプチドの平均比率は、５７．５％〜７２．１％である。
【０１０１】
構成ペプチドの疎水性の分析
本発明の組成物の構成ペプチドの疎水性を、寸法２５０×４．６ｍｍのブチル基をグラフトしたシリカのカラム（Ｖｙｄａｃ  ２１４ＴＰ（商標）Ｃ４、Ｇｒａｃｅ，Ｅｐｅｒｎｏｎ、フランス）上での逆相液体クロマトグラフィーにより分析する。シリカの粒径は５μｍであり、その多孔度は３００Åである。
【０１０２】
カラムを、０．１％のトリフルオロ酢酸で酸性化した超純水中でコンディショニングする。カラムの温度を、４０℃の温度に保持する。カラム内の移動相の流量は、０．６ｍｌ／分である。分析するべきペプチド組成物の試料を、その濃度が超純水での希釈によって２ｇ／ｌであるように調製する。分析するべきこの溶液の１００μｌの容積を、カラムの上部に導入する。検出を、２１４ｎｍの吸光度を連続的に測定することにより行う。
【０１０３】
カラムの上部における試料の導入から開始して、移動相は、７分間の継続時間酸性化水（溶液Ａ）からなり、次いで０．１％（容量による）のトリフルオロ酢酸で酸性化し、４０％のアセトニトリルを含む水から生成した溶液Ｂが、３０分間で溶液Ａ中で０から１００％まで直線的に増加する移動相からなる。
【０１０４】
得られたクロマトグラムを、図３に示す。本発明の組成物のペプチドは、溶出液中の１２％〜３８％のアセトニトリルの百分率に相当する１６分〜３６分の保持時間でカラムを出る。本発明の組成物のペプチドの保持時間の中央値は２６分であり、溶出液中のアセトニトリルの百分率２５％に相当する。
【０１０５】
本発明の組成物の生物学的効果
カンジダ  アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）によるコロニー形成および消化器カンジダ症に対する効果
８週齢および２０〜２５ｇの重量の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて誘発された消化器カンジダ症に対する本発明の組成物の効果を、分析する。これらのマウスに、４ｇ／ｋｇ／日の量で本発明の組成物を２１日の継続期間にわたって給餌する。２１日目に、消化器カンジダ症を、各マウスに５×１０７の量の酵母細胞を強制的に与えることによって誘発する。誘導後２日（Ｄ２）〜７日（Ｄ７）の間に、マウスの糞便を採取し、酵母負荷量を発色媒体で評価する（ＣＦＵ／ｍｇ糞便）。結果を、消化器カンジダ症が誘発されるが、本発明の組成物で処置していないマウスに関して測定した値と比較して、以下の表４に示す。
【０１０６】
【表５】
2020511399.tif 000007
表４
【０１０７】
本発明の組成物によって、カンジダ  アルビカンスの負荷の減少が誘発される。
【０１０８】
本発明の抗炎症ペプチド組成物
炎症性１型マクロファージ（Ｍ１）受容体および／または抗炎症性２型マクロファージ（Ｍ２）受容体の発現の刺激について、温水魚の皮膚からのコラーゲンの酵素的加水分解から得られる本発明に係るペプチドの組成物による、および冷水魚の皮膚からのコラーゲンの酵素的加水分解から得られるペプチドの組成物（本発明外）による比較分析を、実施する。
【０１０９】
健康なヒト被験体からのマクロファージ／単球を、１００μｇ／ｍｌの培養培地の濃度で、前処理組成物（コラーゲンペプチドを含まない対照、本発明、本発明外、表７）の存在下で２４時間培養した。１型マクロファージの特性受容体（Ｍ１、炎症性）の発現および２型マクロファージの特性受容体（Ｍ２、抗炎症性）の発現に対するこの前処理の効果を、１００μＭの濃度のホルボールエステル（「１２−ミリステート−１３−アセテート−ホルボール、ＴＰＡ」）によって特異的に刺激した１型マクロファージの受容体による、または１００μｇ／ｍｌの濃度の非オプソニン化ザイモサン（ＮＯＺ）によって特異的に刺激した２型マクロファージの受容体による酸素フリーラジカル（活性酸素種、ＲＯＳ）の産生のレベルによって評価する。酸素フリーラジカルの産生のレベルを、６６μＭの濃度のルミノールの存在下で化学発光により測定する。以下の表７に提示する結果は、３つのアッセイで得られた平均値を表す。
【０１１０】
【表６】
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表７
【０１１１】
ＮＯＺおよびＴＰＡによって処理していない（誘発していない）マクロファージ／単球は、前処理の性質に依存して実質的に一定である酸素フリーラジカルの産生のレベルを有することが観察される（コラーゲンなし、本発明による、および本発明外）。
【０１１２】
本発明のペプチドの組成物で前処理した、すなわち、温水魚の皮膚からのコラーゲンの酵素的加水分解から得られるマクロファージ／単球は、ＮＯＺによって誘発された化学発光強度（５．０６×１０８ＡＵ）によって明らかにされる抗炎症性２型マクロファージ（Ｍ２）の受容体の発現が、本発明外のペプチドの組成物で前処理したマクロファージ／単球、すなわち、冷水魚の皮膚からのコラーゲンの酵素的加水分解（３．９１×１０８ＡＵ）から得られるマクロファージ／単球と比較して増加している。
【０１１３】
本発明のペプチドの組成物で前処理した、すなわち、温帯海域魚の皮膚からのコラーゲンの酵素的加水分解から得られるマクロファージ／単球は、本発明外のペプチドの組成物で前処理した、すなわち、冷水魚の皮膚からのコラーゲンの酵素的加水分解（１．４９×１０９ＡＵ）から得られるマクロファージ／単球と比較して、ＴＰＡによって誘発される化学発光強度（６．７５×１０８ＡＵ）によって明らかにされる炎症性１型マクロファージ（Ｍ１）の受容体の発現が低下している。
【０１１４】
本発明のペプチド組成物は、本発明外のペプチドの組成物と比較して抗炎症表現型を有し、すなわち、冷水魚の皮膚からのコラーゲンの酵素的加水分解から、抗炎症性２型マクロファージ（Ｍ２）の受容体の発現のレベルの増加により、および炎症性１型マクロファージ（Ｍ１）の受容体の発現のレベルの減少により生じる。
【０１１５】
温帯海域魚の皮から生じ、アミノグラムを有する、本発明のペプチドの組成物の調製：
−  グリシンは、組成物中のアミノ酸のモル量の合計に対するこの量の比が２０．０％〜２４．５％であるようなモル量である。
−  ヒドロキシプロリンは、組成物中のアミノ酸のモル量の合計に対するこの量の比が６．０％〜１２．０％であるようなモル量である。
−  プロリンは、組成物中のアミノ酸のモル量の合計に対するこの量の比が１０．６％〜１４．６％であるようなモル量である。
マウスモデルの結腸炎症アッセイにより確認されたかかる抗炎症表現型を有するが、これは冷水魚の皮膚から生じ、表６に記載されるアミノグラムを有するペプチドの組成物では見出されない。
【０１１６】
マウスモデルにおける結腸炎症
本発明のペプチド組成物の抗炎症作用を、体重減少および血性下痢によって特徴づけられるデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ、ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ＬＬＣ、カナダ）によって誘発される薬理学的炎症のマウスモデルにおいて例証する。
【０１１７】
ＤＳＳで処置したマウスの体重減少を制限する本発明のペプチド組成物の効果を、研究した。１０〜１１週齢および重量２０〜２５グラムの雌Ｃ５７ＢＬ／６実験マウスを、マウスの飲料水に１．５％（重量／体積）の量で溶解したＤＳＳで７日間（Ｄ１〜Ｄ７）処理した。これらのマウスをまた、０．１ｇ／ｋｇ／日；１ｇ／ｋｇ／日および４ｇ／ｋｇ／日の量で、１２日間（Ｄ１〜Ｄ１２）本発明の組成物で処理する。この量の本発明の組成物を、マウスの飲料水中に分注する。Ｄ１２に、マウスを安楽死させる。
【０１１８】
５つのバッチのマウスを調製し、各バッチは１０匹のマウスを含有する：
−  バッチ１をＤＳＳで７日間処理する；
−  バッチ２をＤＳＳで７日間、および０．１ｇ／ｋｇ／日の量で１２日間、本発明の組成物で処理する。
−  バッチ３をＤＳＳで７日間、および本発明の組成物で１ｇ／ｋｇ／日の量で１２日間処理する。
−  バッチ４をＤＳＳで７日間、および４ｇ／ｋｇ／日の量で１２日間、本発明の組成物で処理する。
−  バッチ５をＤＳＳで７日間、および０．１ｇ／ｋｇ／日の量の本発明でない加水分解したカゼインで１２日間処理する。
【０１１９】
並行して、対照を、ＤＳＳで処理せず、炎症が誘発されず、かつ本発明のペプチド組成物で処理していない５匹のマウスで実施する。
【０１２０】
１．体重の研究
各マウスの重量を毎日測定し、各バッチから各マウスが受けた重量減少を計算する。結果を図４に提示し、対照を空丸（○）によって表し、バッチ１を黒丸（●）によって表し、バッチ２を空四角（□）によって表し、バッチ３を黒四角（■）によって表し、バッチ４を空三角（△）によって表し、バッチ５を黒三角（▲）によって表す。０．１ｇ／ｋｇ／日（バッチ２、□）から、本発明の組成物によってマウスの体重減少が制限されることが観察される。この制限はまた、１ｇ／ｋｇ／日（バッチ３、■）および４ｇ／ｋｇ／日（バッチ４、Δ）について観察される。それは、加水分解したカゼイン（バッチ５、▲）での処理については観察されず、その体重減少はバッチ１（●）からのマウスの体重減少に匹敵する。
【０１２１】
本発明の組成物によって、マウスにおいてデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）によって誘発される炎症によって引き起こされる体重減少を制限すること、またはさらに実質的に完全に排除することが可能になる。本発明の組成物は、医薬として、特に結腸炎症の処置のために用いることができる。
【０１２２】
２．組織学
ＤＳＳ単独で処理したマウスからの結腸の横断組織切片によって、ヘマトキシリンおよびエオジンで二色染色した後に、粘膜および粘膜下における炎症細胞の有意な浸潤が示される。上皮の厚さは、減少する。上皮は、広範な潰瘍化を示す。ＤＳＳで、ならびに０．１ｇ／ｋｇ／日、１ｇ／ｋｇ／日および４ｇ／ｋｇ／日の量で本発明の組成物で処理したマウスからの結腸の横断組織切片は、ヘマトキシリンおよびエオジンで二色染色した後に、健康かつ機能的な上皮を代表する密に詰まったまっすぐな管状腺を示す。
【０１２３】
３．肉眼的スコア
各処置条件について、Ｗａｌｌａｃｅスケールに従って、糞便の外観、結腸の損傷した外観、結腸の重量および結腸の長さに関してＷａｌｌａｃｅスケールに従って作成した表記から肉眼的スコアを算出する（Ｅ．Ｓ．Ｋｉｍｂａｌｌ，Ｎ．Ｈ．Ｗａｌｌａｃｅ，Ｃ．Ｒ．Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｍ．Ｒ．Ｄ’ＡｎｄｒｅａおよびＰ．Ｊ．Ｈｏｒｎｂｙ；２００４；Ｎｅｕｒｏｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｍｏｔｉｌ；１６，８１１−８１８．Ｖａｎｉｌｌｏｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ  ａｔｔｅｎｕａｔｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｓｅｖｅｒｉｔｙ  ｉｎ  ｄｅｘｔｒａｎ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｓｏｄｉｕｍ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｏｌｉｔｉｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ）。炎症性の強い結腸ほど肉眼的スコアの値が高く、健康な結腸ほど肉眼的スコアの値が低い。
【０１２４】
バッチ１〜５からのマウスの肉眼的スコアの平均値および標準偏差を、以下の表５に示す。
【表７】
2020511399.tif 000009
表５
【０１２５】
肉眼的スコアの低下が観察され、これは本発明の組成物での処理によって誘発され、すなわち、本発明の組成物によって誘発される結腸の炎症状態の改善である。
【０１２６】
４．マウスにおける炎症促進性マーカーの発現の抑制
Ｄ１２に、マウスを安楽死させ、炎症促進性サイトカインの結腸における発現のレベルを、ＥＬＩＳＡ技法によりアッセイする：
【０１２７】
−  ＩＬ−１β：ＩＬ−１βのレベルを、ＥＬＩＳＡ技法により分析し、結腸１ミリグラム（ｍｇ）当たりのＩＬ−１βのピコグラム（ｐｇ）で表す。結果を図５に示し、最初の列（白色の列）は対照マウスに関して実施した解析に相当する。第２の列（斜線ハッチングを付した列）は、バッチ１からのマウスに関して実施した解析に相当する。第３の列（垂直のハッチングを付した列）は、バッチ４からのマウスに関して実施した解析に相当する。第４の列（水平のハッチングを付した列）は、バッチ３からのマウスに関して実施した解析に相当する。第５の列（灰色の列）は、バッチ２からのマウスに関して実施した解析に相当する。第６の列（黒色の列）は、バッチ５からのマウスに関して実施した解析に相当する。ＩＬ−１βの発現における統計学的に有意な（ｐ＜０．０５）減少が、０．１ｇ／ｋｇ／日、１ｇ／ｋｇ／日および４ｇ／ｋｇ／日の用量について本発明のペプチド組成物で処理したマウスの結腸において、炎症がＤＳＳによって誘発されたマウスの結腸と比較して、および炎症がＤＳＳによって誘発され、加水分解したカゼインで処理したマウスと比較して、観察される。この効果は、特に０．１ｇ／ｋｇ／日および１ｇ／ｋｇ／日の用量についての定量的ＲＴ−ＰＣＲによるＩＬ−１βメッセンジャーＲＮＡの分析によって確認された（ｐ＜０．０１）。
【０１２８】
−  ＩＬ６：ＩＬ６のレベルを、ＥＬＩＳＡ技法により分析し、結腸１ミリグラム（ｍｇ）当たりのＩＬ６のピコグラム（ｐｇ）で表す。結果を図６に示し、第１の列（白色の列）は、対照マウスに関して実施した解析に相当する。第２の列（斜線ハッチングを付した列）は、バッチ１からのマウスに関して実施した解析に相当する。第３の列（垂直のハッチングを付した列）は、バッチ４からのマウスに関して実施した解析に相当する。第４の列（水平のハッチングを付した列）は、バッチ３からのマウスに関して実施した解析に相当する。第５の列（灰色の列）は、バッチ２からのマウスに関して実施した解析に相当する。第６の列（黒色の列）は、バッチ５からのマウスに関して実施した解析に相当する。ＩＬ６の発現における統計学的に有意な減少が、０．１ｇ／ｋｇ／日（ｐ＜０．０１）、１ｇ／ｋｇ／日（ｐ＜０．０１）および４ｇ／ｋｇ／日（ｐ＜０．０５）の用量について本発明のペプチド組成物で処理したマウスの結腸において、炎症がＤＳＳによって誘発されたマウスの結腸と比較して、および炎症がＤＳＳによって誘発され、加水分解したカゼインで処理したマウスと比較して、観察される。この効果は、定量的ＲＴ−ＰＣＲによるＩＬ６メッセンジャーＲＮＡの解析によって確認された；
【０１２９】
−  ＴＮＦ−α：ＴＮＦ−αのレベルを、ＥＬＩＳＡ技法により分析し、結腸１ミリグラム（ｍｇ）当たりのＴＮＦ−αのピコグラム（ｐｇ）で表す。結果を図７に示し、第１の列（白色の列）は、対照マウスに関して実施した解析に相当する。第２の列（斜線ハッチングを付した列）は、バッチ１からのマウスに関して実施した解析に相当する。第３の列（垂直のハッチングを付した列）は、バッチ４からのマウスに関して実施した解析に相当する。第４の列（水平のハッチングを付した列）は、バッチ３からのマウスに関して実施した解析に相当する。第５の列（灰色の列）は、バッチ２からのマウスに関して実施した解析に相当する。第６の列（黒色の列）は、バッチ５からのマウスに関して実施した解析に相当する。ＴＮＦ−αの発現における統計学的に有意な減少が、０．１ｇ／ｋｇ／日（ｐ＜０．０５）、１ｇ／ｋｇ／日（ｐ＜０．０５）および４ｇ／ｋｇ／日（ｐ＜０．０５）の用量について本発明のペプチド組成物で処理したマウスの結腸において、炎症がＤＳＳによって誘発されたマウスの結腸と比較して、および炎症がＤＳＳによって誘発され、加水分解したカゼインで処理したマウスと比較して観察される。
【０１３０】
ＭＣＰ１のメッセンジャーＲＮＡの定量的ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応）による分析によって、特に、本発明に従うペプチド組成物の０．１ｇ／ｋｇ／日（ｐ＜０．０１）および１ｇ／ｋｇ／日（ｐ＜０．０５）の用量について、ＤＳＳによって誘発されるこれらのｍＲＮＡの統計学的に有意な減少が示される。
【０１３１】
誘導性ＮＯシンターゼ（ｉＮＯＳ）のメッセンジャーＲＮＡの定量的ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応）による分析を、図１７に示し、第１の列（白色の列）は、対照マウスに関して実施した解析に相当する。第２の列（斜線ハッチングを付した列）は、バッチ１からのマウスに関して実施した解析に相当する。第３の列（垂直のハッチングを付した列）は、バッチ４からのマウスに関して実施した解析に相当する。第４の列（水平のハッチングを付した列）は、バッチ３からのマウスに関して実施した解析に相当する。第５の列（灰色の列）は、バッチ２からのマウスに関して実施した解析に相当する。第６の列（黒色の列）は、バッチ５からのマウスに関して実施した解析に相当する。ＤＳＳによって誘発されたｉＮＯＳ  ｍＲＮＡの統計学的に有意な減少は、本発明のペプチド組成物の０．１ｇ／ｋｇ／日（ｐ＜０．０５）および１ｇ／ｋｇ／日（ｐ＜０．０５）の用量について観察される。
【０１３２】
５．マウスにおける抗炎症マーカーの発現の刺激
Ｄ１２に、マウスを安楽死させ、結腸における抗炎症マーカーの発現のレベルをアッセイする：
−  ＴＧＦ−β：ＴＧＦ−βのレベルを、ＥＬＩＳＡ技法により分析し、結腸１ミリグラム（ｍｇ）あたりのＴＧＦ−βのピコグラム（ｐｇ）で表す。結果を図８に示し、第１の列（白色の列）は、対照マウスに関して実施した解析に相当する。第２の列（斜線ハッチングを付した列）は、バッチ１からのマウスに関して実施した解析に相当する。第３の列（垂直のハッチングを付した列）は、バッチ４からのマウスに関して実施した解析に相当する。第４の列（水平のハッチングを付した列）は、バッチ３からのマウスに関して実施した解析に相当する。第５の列（灰色の列）は、バッチ２からのマウスに関して実施した解析に相当する。第６の列（黒色の列）は、バッチ５からのマウスに関して実施した解析に相当する。ＴＧＦ−βの発現の刺激は、炎症がＤＳＳによって誘発されるマウスの結腸と比較して、０．１ｇ／ｋｇ／日の用量について本発明のペプチド組成物で処理したマウスの結腸において観察される。この効果は、定量的ＲＴ−ＰＣＲによるＴＧＦ−βメッセンジャーＲＮＡの分析により、特に０．１ｇ／ｋｇ／日および１ｇ／ｋｇ／日の用量の本発明のペプチド組成物について確認された（図１６）。
【０１３３】
−  Ｆｉｚｚ１：Ｆｉｚｚ１は、抗炎症性Ｍ２マクロファージのマーカーである。Ｆｉｚｚ１のメッセンジャーＲＮＡの定量的ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応）による解析を、図１８に示し、第１の列（白色の列）は、対照マウスに関して実施した解析に相当する。第２の列（斜線ハッチングを付した列）は、バッチ１からのマウスに関して実施した解析に相当する。第３の列（垂直のハッチングを付した列）は、バッチ４からのマウスに関して実施した解析に相当する。第４の列（水平のハッチングを付した列）は、バッチ３からのマウスに関して実施した解析に相当する。第５の列（灰色の列）は、バッチ２からのマウスに関して実施した解析に相当する。第６の列（黒色の列）は、バッチ５からのマウスに関して実施した解析に相当する。ＤＳＳによって減少したＦｉｚｚ１メッセンジャーＲＮＡの統計学的に有意な増加は、本発明のペプチド組成物の０．１ｇ／ｋｇ／日（ｐ＜０．０５）、１ｇ／ｋｇ／日（ｐ＜０．０１）および４ｇ／ｋｇ／日（ｐ＜０．０５）の用量で観察される。
【０１３４】
−  ＤＳＳにより減少したＹｍ１メッセンジャーＲＮＡの統計学的に有意な増加がまた、０．１ｇ／ｋｇ／日の用量（ｐ＜０．０５）の本発明のペプチド組成物について観察された。
【０１３５】
６．結腸細菌叢−結腸微生物叢に対する本発明のペプチド組成物の効果
Ｄ１２に、マウスを安楽死させ、これらのマウスの結腸菌叢を、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）によって定量する。値を、細菌または真菌の総量に対して、およびβ−アクチンに対して標準化した。β−アクチンは、分析した結腸組織の量に対する標準化を可能にする参照遺伝子を構成する。特に、以下を定量する：
【０１３６】
−  ＩＴＳ１−２真菌リボソームＤＮＡの定量的増幅による総真菌叢。ＩＴＳ１−２真菌リボソームＤＮＡの量対β−アクチンＤＮＡの量の比Ｒを、図９に示し、第１の列（白色の列）は、対照マウスに関して実施したアッセイに相当する。第２の列（斜線ハッチングを付した列）は、バッチ１からのマウスに関して実施したアッセイに相当する。第３の列（垂直のハッチングを付した列）は、バッチ４からのマウスに関して実施したアッセイに相当する。第４の列（水平のハッチングを付した列）は、バッチ３からのマウスに関して実施したアッセイに相当する。第５の列（灰色の列）は、バッチ２からのマウスに関して実施したアッセイに相当する。第６の列（黒色の列）は、バッチ５からのマウスに関して実施したアッセイに相当する。本発明のペプチド組成物は、特に４ｇ／ｋｇ／日の用量で真菌叢を回復する。
【０１３７】
−  ２６ＳリボソームＤＮＡの定量的増幅による酵母サッカロミセス  セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）。２６ＳリボソームＤＮＡの量対β−アクチンＤＮＡの量の比Ｒを、図１０に示す。第１の列（白色の列）は、対照マウスに関して実施したアッセイに相当する。第２の列（斜線ハッチングを付した列）は、バッチ１からのマウスに関して実施したアッセイに相当する。第３の列（垂直のハッチングを付した列）は、バッチ４からのマウスに関して実施したアッセイに相当する。第４の列（水平のハッチングを付した列）は、バッチ３からのマウスに関して実施したアッセイに相当する。第５の列（灰色の列）は、バッチ２からのマウスに関して実施したアッセイに相当する。第６の列（黒色の列）は、バッチ５からのマウスに関して実施したアッセイに相当する。本発明のペプチド組成物は、０．１ｇ／ｋｇ／日（ｐ＜０．０５）、１ｇ／ｋｇ／日（ｐ＜０．０５）および４ｇ／ｋｇ／日（ｐ＜０．０５）の用量でサッカロミセス  セレビシエ菌叢を統計学的に有意に回復する。この場合、サッカロミセス  セレビシエは、抗炎症可能性を有する；
【０１３８】
−  １６ＳリボソームＤＮＡの定量的増幅による腸内細菌科叢。１６ＳリボソームＤＮＡの量対β−アクチンＤＮＡの量の比Ｒを、図１１に示す。第１の列（白色の列）は、対照マウスに関して実施したアッセイに相当する。第２の列（斜線ハッチングを付した列）は、バッチ１からのマウスに関して実施したアッセイに相当する。第３の列（灰色の列）は、バッチ２からのマウスに関して実施したアッセイに相当する。第４の列（黒色の列）は、バッチ５からのマウスに関して実施したアッセイに相当する。本発明のペプチド組成物によって、０．１ｇ／ｋｇ／日の濃度で、ＤＳＳによって誘発される腸内細菌科叢の減少が可能になる。腸内細菌科は、炎症誘発可能性と関連する；
【０１３９】
−門における多様性の解析を可能にする遺伝子の断片上の１６ＳリボソームＤＮＡの定量的増幅によるファーミキューテス菌叢。かかる１６ＳリボソームＤＮＡの量対β−アクチンＤＮＡの量の比Ｒを、図１２に示す。第１の列（白色の列）は、対照マウスに関して実施したアッセイに相当する。第２の列（斜線ハッチングを付した列）は、バッチ１からのマウスに関して実施したアッセイに相当する。第３の列（垂直のハッチングを付した列）は、バッチ４からのマウスに関して実施したアッセイに相当する。第４の列（水平のハッチングを付した列）は、バッチ３からのマウスに関して実施したアッセイに相当する。第５の列（灰色の列）は、バッチ２からのマウスに関して実施したアッセイに相当する。第６の列（黒色の列）は、バッチ５からのマウスに関して実施したアッセイに相当する。本発明のペプチド組成物によって、０．１ｇ／ｋｇ／日（ｐ＜０．０５）、１ｇ／ｋｇ／日（ｐ＜０．０５）および４ｇ／ｋｇ／日（ｐ＜０．０５）の濃度で、ＤＳＳによって誘発されるファーミキューテス菌叢の統計学的に有意な減少が誘発されるが、これらの同じ濃度で誘発されていないファーミキューテス菌叢の減少もまた誘発される。ファーミキューテス菌叢の増加は一般に、消化器炎症（ＩＢＤ、炎症性腸疾患）中に既知の方法で観察されることに注意すべきである；
【０１４０】
−  門における多様性の解析を可能にする遺伝子の断片上の１６ＳリボソームＤＮＡの定量的増幅によるバクテロイデス門菌叢。かかる１６ＳリボソームＤＮＡの量対βアクチンＤＮＡの量の比Ｒを、図１３に示す。第１の列（斜線ハッチングを付した列）は、バッチ１からのマウスに関して実施したアッセイに相当する。第２の列（垂直のハッチングを付した列）は、バッチ４からのマウスに関して実施したアッセイに相当する。第３の列（水平のハッチングを付した列）は、バッチ３からのマウスに関して実施したアッセイに相当する。第４の列（灰色の列）は、バッチ２からのマウスに関して実施したアッセイに相当する。第５の列（黒色の列）は、バッチ５からのマウスに関して実施したアッセイに相当する。本発明のペプチド組成物によって、０．１ｇ／ｋｇ／日（ｐ＜０．０５）、１ｇ／ｋｇ／日（ｐ＜０．０５）および４ｇ／ｋｇ／日（ｐ＜０．０５）の濃度で、ＤＳＳによって誘発されるバクテロイデス門菌叢の統計学的に有意な減少が誘発される。バクテロイデス門の増加は一般に、消化器炎症（ＩＢＤ）中に既知の様式で観察される；
【０１４１】
−  特異的ＤＮＡの定量的増幅によるフィーカリバクテリウム  プラウスニッツィ菌叢。かかる特異的ＤＮＡの量対β−アクチンＤＮＡの量の比Ｒを、図１４に示す。第１の列（白色の列）は、対照マウスに関して実施したアッセイに相当する。第２の列（斜線ハッチングを付した列）は、バッチ１からのマウスに関して実施したアッセイに相当する。第３の列（垂直のハッチングを付した列）は、バッチ４からのマウスに関して実施したアッセイに相当する。第４の列（水平のハッチングを付した列）は、バッチ３からのマウスに関して実施したアッセイに相当する。第５の列（灰色の列）は、バッチ２からのマウスに関して実施したアッセイに相当する。第６の列（黒色の列）は、バッチ５からのマウスに関して実施したアッセイに相当する。本発明のペプチド組成物によって、０．１ｇ／ｋｇ／日（ｐ＜０．０１）、１ｇ／ｋｇ／日（ｐ＜０．０１）および４ｇ／ｋｇ／日（ｐ＜０．０１）の濃度で、ＤＳＳによって破壊されたフィーカリバクテリウム  プラウスニッツィ菌叢の統計学的に有意な増加が誘発される。フィーカリバクテリウム  プラウスニッツィの増加は一般に、消化器炎症（ＩＢＤ）中に既知の様式で観察される。フィーカリバクテリウム  プラウスニッツィはまた、抗炎症特性を有するとされている；
【０１４２】
−  特異的ＤＮＡの定量的増幅によるラクトバチルス  ムリナス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｕｒｉｎｕｓ）菌叢。かかる特異的ＤＮＡの量対β−アクチンＤＮＡの量の比Ｒを、図１５に示し、第１の列（白色の列）は、対照マウスに関して実施したアッセイに相当する。第２の列（斜線ハッチングを付した列）は、バッチ１からのマウスに関して実施したアッセイに相当する。第３の列（垂直のハッチングを付した列）は、バッチ４からのマウスに関して実施したアッセイに相当する。第４の列（水平のハッチングを付した列）は、バッチ３からのマウスに関して実施したアッセイに相当する。第５の列（灰色の列）は、バッチ２からのマウスに関して実施したアッセイに相当する。第６の列（黒色の列）は、バッチ５からのマウスに関して実施したアッセイに相当する。本発明のペプチド組成物によって、０．１ｇ／ｋｇ／日、１ｇ／ｋｇ／日および４ｇ／ｋｇ／日の濃度でラクトバチルス  ムリナス菌叢の増加が誘発される（ｐ＜０．０５）。ラクトバチルス  ムリナスはまた、抗炎症特性を有するとされている。
【０１４３】
７．アラキドン酸の脂質代謝の酵素に対する本発明のペプチド組成物の効果：
−  ５−ＬＯＸ：酵素５−リポキシゲナーゼ（５−ＬＯＸ）のメッセンジャーＲＮＡの定量的ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応）による分析を、図１９に示し、第１の列（白色の列）は、対照マウスに関して実施した解析に相当する。第２の列（斜線ハッチングを付した列）は、バッチ１からのマウスに関して実施した解析に相当する。第３の列（垂直のハッチングを付した列）は、バッチ４からのマウスに関して実施した解析に相当する。第４の列（水平のハッチングを付した列）は、バッチ３からのマウスに関して実施した解析に相当する。第５の列（灰色の列）は、バッチ２からのマウスに関して実施した解析に相当する。第６の列（黒色の列）は、バッチ５からのマウスに関して実施した解析に相当する。５−ＬＯＸの発現の統計学的に有意な減少が、ＤＳＳにより誘発されない対照と相対して、０．１ｇ／ｋｇ／日（ｐ＜０．０１）および１ｇ／ｋｇ／日（ｐ＜０．０１）の本発明のペプチド組成物の用量について観察された。本発明のペプチド組成物は、５−ＬＯＸの発現に対して阻害効果を有し、炎症促進性脂質メディエーターの産生を促進する；
【０１４４】
−  １２／１５−ＬＯＸ：酵素１２／１５−リポキシゲナーゼ（１２／１５−ＬＯＸ）のメッセンジャーＲＮＡの定量的ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応）による分析を、図２０に示し、第１の列（白色の列）は、対照マウスに関して実施した解析に相当する。第２の列（斜線ハッチングを付した列）は、バッチ１からのマウスに関して実施した解析に相当する。第３の列（垂直のハッチングを付した列）は、バッチ４からのマウスに関して実施した解析に相当する。第４の列（水平のハッチングを付した列）は、バッチ３からのマウスに関して実施した解析に相当する。第５の列（灰色の列）は、バッチ２からのマウスに関して実施した解析に相当する。第６の列（黒色の列）は、バッチ５からのマウスに関して実施した解析に相当する。１２／１５−ＬＯＸの発現の統計学的に有意な増加が、ＤＳＳにより誘発されない対照と相対して、０．１ｇ／ｋｇ／日（ｐ＜０．０１）および１ｇ／ｋｇ／日（ｐ＜０．０１）の本発明のペプチド組成物の用量について観察された。
【０１４５】
本発明は、多数の変形実施形態および適用に従うことができることは、言うまでもない。特に、医薬としての種々の使用は、本発明の保護の範囲から逸脱することなく変化し得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年3月19日(2018.3.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノグラムを有するペプチド組成物であって：
−  グリシンが、前記組成物中のアミノ酸のモル量の合計に対するこの量の比が２０．０％〜２４．５％であるようなモル量であり；
−  ヒドロキシプロリンが、前記組成物中のアミノ酸のモル量の合計に対するこの量の比が６．０％〜１２．０％であるようなモル量であり；
−  プロリンが、前記組成物中のアミノ酸のモル量の合計に対するこの量の比が１０．６％〜１４．６％であるようなモル量であり；
前記ペプチド組成物が、前記ペプチド組成物の各ペプチドがこのペプチドの見かけの分子量を表す保持時間で溶出される排除クロマトグラフィーによる解析の間に、１４００Ｄａ未満の見かけの分子量のペプチドに対応する曲線下面積値を有するペプチドの溶出曲線を有し、この面積値の前記曲線下総面積に対する比が４０％未満であるようにし；
前記ペプチド組成物の前記ペプチドが２５００Ｄａ〜３６００Ｄａの見かけの分子量値を有し；
前記分析を、以下に記載するように実施する：
○多孔度５μｍのシリカゲルから形成された固定相を含む寸法３００×７．８ｍｍの濾過カラムに；
○前記カラムを、４０℃の温度に保持し；
○移動相として、０．１体積％のトリフルオロ酢酸と（Ｂ）のアセトニトリルを含む超純水の生成した溶液（Ａ）を用い、Ａ／Ｂ体積比は、７５／２５であり；
○前記ゲル濾過カラムの上部に、前記ペプチド組成物を含む溶液の容量を導入し；
○前記カラム中の前記移動相の流量は、０．６ｍｌ／分であり；
○前記組成物の前記ペプチドを、２１４ｎｍの波長での吸光度によって検出する、
前記ペプチド組成物。
【請求項２】
前記組成物の各ペプチドが２００Ｄａ〜１２  ０００Ｄａの見かけの分子量を有することを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
陰イオン交換カラム上でのクロマトグラフィー分析により、ペプチド組成物の各ペプチドが、その電荷を表す保持時間でカラムから溶出され：
−  アニオン性ペプチドに対応するピーク下の面積値；
−  中性ペプチドに対応するピーク下の面積値および；
−  カチオン性ペプチドに対応するピーク下の面積値；
したがって、前記アニオン性ペプチドに対応する前記ピーク下のこの面積値の、前記アニオン性ペプチドに対応するピーク下の前記面積値、前記組成物の前記中性ペプチドおよび前記カチオン性ペプチドに対する比は、２７．０％〜４５％であり；
前記アニオン性ペプチドに対応する前記ピーク下の前記面積の値、前記カチオン性ペプチドに対応する前記ピーク下の前記面積の値、および前記中性ペプチドに対応する前記ピーク下の前記面積の値を、下記の条件下でのクロマトグラフィー分析により決定し：
○固定相として１０μｍの粒子径の第四級アンモニウム基で官能化した親水性アニオン交換樹脂を含む寸法１００×７．８ｍｍのクロマトグラフィーカラムを用い；
○前記カチオン性ペプチドおよび中性ペプチドの溶出のための第１の移動相として、ｐＨ８．３５の５ｍＭ水溶液Ｔｒｉｓ緩衝液（Ｃ）を、前記カラムの上部で分析するべき前記組成物の導入から開始して７分の継続時間にわたり、次いでｐＨ８．３５の５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５Ｍ  ＮａＣｌから形成される緩衝液（Ｄ）の体積の緩衝液（Ｃ）の体積に対する比が３０分間で０〜１００％まで直線的に増加するアニオン性ペプチドの溶出のための第２の移動相を使用し；
○カラム中の移動相の流量は、１ｍｌ／分であり；
○解析を、２５℃の温度で行い；ならびに
○カラム出口の波長２１４ｎｍの吸光度で検出する
ことを特徴とする、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ペプチドが、逆相液体クロマトグラフィー疎水性分析の間、１６分〜３６分の保持時間を有し；
前記疎水性分析を、以下の条件下で実施する：
○粒径５μｍ、多孔度３００Åのブチル基をグラフトしたシリカから生成した固定相を有する寸法２５０×４．６ｍｍのクロマトグラフィーカラムを用い；
○親水性ペプチドの溶出のための第１の移動相として、前記カラムの上部で分析するべき前記組成物の導入から開始して７分の継続時間にわたって超純水中の０．１％のトリフルオロ酢酸の溶液（Ｅ）、次いで、４０％アセトニトリルを含む水中の０．１％のトリフルオロ酢酸の溶液（Ｆ）の体積の、溶液（Ｅ）の体積に対する比が、３０分間で０〜４０％まで直線的に増加する、疎水性ペプチドの溶出のための第２の移動相を使用し；
○カラム中の移動相の流量は、０．６ｍｌ／分であり；
○解析を、４０℃の温度で行い；ならびに
○カラム出口の波長２１４ｎｍの吸光度によって検出する
ことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
液体状態であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
分割状態で固体であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
炭水化物を含まないことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
脂肪を含まないことを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物の前記ペプチドが水溶性であることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物の前記ペプチドがパンガシウス科からの魚およびカワスズメ科からの魚から形成される群から選択される少なくとも１つの魚の皮膚からのコラーゲンの制御された酵素的加水分解から生じることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
医薬としての使用のための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
消化器疾患の処置における使用のための、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
腸カンジダ症の処置における使用のための、請求項１０または１１に記載の組成物。
【請求項１４】
消化器炎症の処置における使用のための、請求項１０または１１に記載の組成物。
【請求項１５】
腸内微生物叢の維持における使用のための、請求項１０または１１に記載の組成物。
【請求項１６】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物の、ヒト食品における使用。
【国際調査報告】
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