(57)【要約】ジルコニウム−８９（８９Ｚｒ）で標識された超小型でアミノ化されたｃＲＧＤＹコンジュゲートナノ粒子を含むナノプローブおよびその使用方法を本明細書中に記載する。提供する組成物は、腎臓でクリアランス可能であり、血液循環半減時間が適切であり、腫瘍への能動的ターゲティング能が高く、主に腎臓でクリアランスされ、肝臓蓄積が低く、腫瘍対バックグラウンド比が高い。記載のナノプローブは、全身を標的としたがんの画像化（または処置）のためのヒト被験体に対する「ターゲットまたはクリア」トレーサとしての高い潜在性を示す。
2020520953.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ化ナノ粒子から作製されたナノプローブであって、前記ナノプローブが、以下：
ナノ粒子；
前記ナノ粒子にコンジュゲートしたターゲティング剤（例えば、抗体フラグメント、例えば、ターゲティングペプチド（例えば、ｃＲＧＤまたはそのアナログ）、例えば、小タンパク質（例えば、ＶＥＧＦ１２１））；および
放射性標識
を含み、
ここで、前記ナノ粒子が、前記ターゲティング剤および／または前記放射性標識とのコンジュゲーションまたは会合前にアミン官能化されており、
ここで、前記ナノ粒子が、２０ナノメートル以下の直径を有する、ナノプローブ。
【請求項２】
前記ナノ粒子が超小型ナノ粒子を含む、請求項１に記載のナノプローブ。
【請求項３】
前記放射性標識が８９Ｚｒを含む、前記請求項のいずれか１項に記載のナノプローブ。
【請求項４】
前記放射性標識が前記ナノ粒子に会合している、前記請求項のいずれか１項に記載のナノプローブ。
【請求項５】
前記ターゲティング剤が、リンカーを介して前記ナノ粒子に共有結合または非共有結合しているか、前記ナノ粒子に直接共有結合または非共有結合しているか、前記ナノ粒子または前記ナノ粒子を囲む組成物と会合している、請求項１に記載のナノプローブ。
【請求項６】
前記ナノ粒子が有機ポリマーでコーティングされている、前記請求項のいずれか１項に記載のナノプローブ。
【請求項７】
前記有機ポリマーがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む、請求項６に記載のナノプローブ。
【請求項８】
前記ターゲティング剤が、ターゲティングペプチド（例えば、ＲＧＤ、例えば、ｃＲＧＤ、例えば、ＲＧＤのアナログ、例えば、αＭＳＨ、例えば、本質的に免疫調節性および抗炎症性であることが公知の任意のペプチド）を含む、前記請求項のいずれか１項に記載のナノプローブ。
【請求項９】
前記ターゲティングペプチドが、アルギニルグリシルアスパラギン酸（ＲＧＤ）、環状アルギニルグリシルアスパラギン酸（ｃＲＧＤ）、ＲＧＤのアナログ、α−メラノサイト刺激ホルモン（αＭＳＨ）、および本質的に免疫調節性および抗炎症性であることが公知の任意のペプチドからなる群から選択されるメンバーを含む、請求項８に記載のナノプローブ。
【請求項１０】
前記ターゲティング剤が抗体フラグメントを含み、ここで、前記抗体フラグメントが約５ｋＤａ〜約２５ｋＤａの範囲である、前記請求項のいずれか１項に記載のナノプローブ。
【請求項１１】
前記ターゲティング剤が抗体フラグメントを含み、ここで、前記抗体フラグメントが約２０ｋＤａ〜約４５ｋＤａである、前記請求項のいずれか１項に記載のナノプローブ。
【請求項１２】
前記ターゲティング剤が抗体フラグメントを含み、ここで、前記抗体フラグメントが約４０ｋＤａ〜約８０ｋＤａである、前記請求項のいずれか１項に記載のナノプローブ。
【請求項１３】
前記ナノ粒子がシリカを含む、前記請求項のいずれか１項に記載のナノプローブ。
【請求項１４】
前記ナノ粒子が、シリカベースのコアおよび前記コアの少なくとも一部を囲むシリカシェルを含む、前記請求項のいずれか１項に記載のナノプローブ。
【請求項１５】
前記ナノ粒子が、前記コア内に蛍光化合物を含む、前記請求項のいずれか１項に記載のナノプローブ。
【請求項１６】
前記ターゲティング剤が小タンパク質を含み、ここで、前記小タンパク質がＶＥＧＦ１２１を含む、前記請求項のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項１７】
前記ターゲティング剤が抗体フラグメントを含み、ここで、前記抗体フラグメントが、組換え抗体フラグメント（ｆＡｂ）、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、および単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）フラグメントからなる組から選択されるメンバーである、前記請求項のいずれか１項に記載のナノプローブ。
【請求項１８】
前記ターゲティング剤が抗体フラグメントを含み、ここで、前記抗体フラグメントが単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である、請求項１７に記載のナノプローブ。
【請求項１９】
前記ターゲティング剤が抗体フラグメントを含み、ここで、前記抗体フラグメントが単一ドメイン（ｓｄＡｂ）フラグメントである、請求項１７に記載のナノプローブ。
【請求項２０】
前記ナノ粒子（単一ナノ粒子）は、１〜１０のターゲティング剤が結合している、前記請求項のいずれか１項に記載のナノプローブ。
【請求項２１】
前記ターゲティング剤が、ＰＥＧ部分を介して前記ナノ粒子にコンジュゲートされている、前記請求項のいずれか１項に記載のナノプローブ。
【請求項２２】
前記ナノ粒子は、１５ナノメートル以下の直径を有する、前記請求項のいずれか１項に記載のナノプローブ。
【請求項２３】
前記ナノ粒子は、１ｎｍ〜２０ｎｍの範囲の直径を有する、前記請求項のいずれか１項に記載のナノプローブ。
【請求項２４】
前記ターゲティング剤が、抗ＣＥＡｓｃＦｖ、抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ、抗ＶＥＧＦ−Ａ、抗ＶＥＧＦ−Ｒ、および抗ＴＮＦ−αからなる組から選択されるメンバーを含む、前記請求項のいずれか１項に記載のナノプローブ。
【請求項２５】
前記ナノプローブが、１つまたは複数のイメージング剤を含む、前記請求項のいずれか１項に記載のナノプローブ。
【請求項２６】
前記１つまたは複数のイメージング剤が、ＰＥＴトレーサまたはＳＰＥＣＴトレーサを含む、請求項２５に記載のナノプローブ。
【請求項２７】
前記ＰＥＴトレーサまたはＳＰＥＣＴトレーサが、８９Ｚｒ、６４Ｃｕ、［１８Ｆ］フルオロデオキシグルコース、１７７Ｌｕ、２２５Ａｔ、および９０Ｙからなる群から選択されるメンバーを含む、請求項２６に記載のナノプローブ。
【請求項２８】
前記１つまたは複数のイメージング剤がフルオロフォアを含む、請求項２５〜２７のいずれか１項に記載のナノプローブ。
【請求項２９】
治療剤をさらに含む、前記請求項のいずれか１項に記載のナノプローブ。
【請求項３０】
前記治療剤が化学療法薬を含む、請求項２９に記載のナノプローブ。
【請求項３１】
前記化学療法薬が、ソラフェニブ、パクリタキセル、ドセタキセル、ＭＥＫ１６２、エトポシド、ラパチニブ、ニロチニブ、クリゾチニブ、フルベストラント、ベムラフェニブ、ベキソロテン、および／またはカンプトテシンからなる群から選択されるメンバーを含む、請求項３０に記載のナノプローブ。
【請求項３２】
前記治療剤がチェックポイントインヒビターを含む、請求項２９に記載のナノプローブ。
【請求項３３】
キレート剤がデスフェロキサミン（ＤＦＯ）を含む、前記請求項のいずれか１項に記載のナノプローブ。
【請求項３４】
前記キレート剤が、１，４，８，１１−テトラアザビシクロ［６．６．２］ヘキサデカン−４，１１−ジイル）二酢酸（ＣＢ−ＴＥ２Ａ）；デスフェロキサミン（ＤＦＯ）；ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）；１，４，７，１０−テトラアザシクロテトラデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）；エチレングリコールビス（２−アミノエチル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）；１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−１，４，８，１１−四酢酸（ＴＥＴＡ）；エチレンビス−（２−４ヒドロキシ−フェニルグリシン）（ＥＨＰＧ）；５−Ｃｌ−ＥＨＰＧ；５Ｂｒ−ＥＨＰＧ；５−Ｍｅ−ＥＨＰＧ；５ｔ−Ｂｕ−ＥＨＰＧ；５−ｓｅｃ−Ｂｕ−ＥＨＰＧ；ベンゾジエチレントリアミン五酢酸（ベンゾ−ＤＴＰＡ）；ジベンゾ−ＤＴＰＡ；フェニル−ＤＴＰＡ、ジフェニル−ＤＴＰＡ；ベンジル−ＤＴＰＡ；ジベンジルＤＴＰＡ；ビス−２（ヒドロキシベンジル）−エチレン−ジアミン二酢酸（ＨＢＥＤ）およびその誘導体；Ａｃ−ＤＯＴＡ；ベンゾ−ＤＯＴＡ；ジベンゾ−ＤＯＴＡ；１，４，７−トリアザシクロノナンΝ，Ν’，Ν’’−三酢酸（ＮＯＴＡ）；ベンゾ−ＮＯＴＡ；ベンゾ−ＴＥＴＡ、ベンゾ−ＤＯＴＭＡ（ここで、ＤＯＴＭＡは、１，４，７，１０−テトラアザシクロテトラデカン−１，４，７，１０−テトラ（メチル四酢酸）である）、ベンゾ−ＴＥＴＭＡ（ここで、ＴＥＴＭＡは、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−１，４，８，１１−（メチル四酢酸）である）；１，３−プロピレンジアミン四酢酸（ＰＤＴＡ）の誘導体；トリエチレンテトラミン六酢酸（ＴＴＨＡ）；１，５，１０−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−トリス（２，３−ジヒドロキシベンゾイル）−トリカテコラート（ＬＩＣＡＭ）の誘導体；および１，３，５−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−トリス（２，３−ジヒドロキシベンゾイル）アミノメチルベンゼン（ＭＥＣＡＭ）、および他の金属キレート剤からなる群から選択されるメンバーを含む、前記請求項のいずれか１項に記載のナノプローブ。
【請求項３５】
前記ナノプローブがｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットを含む、前記請求項のいずれか１項に記載のナノプローブ。
【請求項３６】
前記ナノプローブがｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−［８９Ｚｒ］Ｃ’ドットを含む、前記請求項のいずれか１項に記載のナノプローブ。
【請求項３７】
前記ナノプローブがＮＨ２−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットを含む、前記請求項のいずれか１項に記載のナノプローブ。
【請求項３８】
前記ナノプローブがＤＦＯ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットを含む、請求項３７に記載のナノプローブ。
【請求項３９】
前記ナノプローブが８９Ｚｒ−ＤＦＯ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットを含む、請求項３８に記載のナノプローブ。
【請求項４０】
請求項１〜３９のいずれか１項に記載のアミノ化ナノ粒子から作製されたナノプローブをキレート剤なしで放射性標識する方法であって、
前記ナノ粒子を前記放射性標識と接触させて第１の溶液を生成させる、接触させる工程；
前記第１の溶液を移動相溶媒と接触させ、それにより、キレート剤を含まない放射性標識されたナノ粒子を生成する、接触させる工程
を含む、方法。
【請求項４１】
遊離放射性標識が前記移動相溶媒と錯体を形成する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記接触させる工程の前に前記ナノ粒子をアミノ化する工程をさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
請求項１〜３９のいずれか１項に記載のアミノ化ナノ粒子から作製されたナノプローブのキレート剤ベースの放射性標識方法であって、
前記ナノ粒子をキレート剤と接触させて、中間体組成物を生成させる、接触させる工程；
前記中間体組成物を移動相溶液と接触させる工程；および
前記中間体組成物を放射性標識（例えば、８９Ｚｒ）と（例えば、室温で、例えば、約ｐＨ７で）接触させる工程
を含む、方法。
【請求項４４】
非特異的に結合した放射性標識（例えば、８９Ｚｒ）を除去する工程をさらに含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記接触させる工程の前に前記ナノ粒子をアミノ化する工程をさらに含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
疾患または状態を処置する方法であって、
請求項１〜３９のいずれか１項に記載のアミノ化ナノ粒子から作製されたナノプローブ
を含む組成物を被験体に投与することを含み、
ここで、前記放射性標識が、前記ナノ粒子にコンジュゲートした治療用放射性標識である、方法。
【請求項４７】
免疫療法を施行することを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記免疫療法が、請求項１〜３９のいずれか１項に記載のナノプローブを含む医薬組成物を被験体に投与することを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
アミノ化ナノ粒子から作製されたナノプローブ（例えば、放射性コンジュゲート、例えば、ナノコンジュゲート）であって、以下：
ナノ粒子（例えば、超小型ナノ粒子、例えば、シリカ系ナノ粒子、例えば、Ｃ’ドット（例えば、ＮＨ２−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドット））；
前記ナノ粒子に（例えば、直接または間接的に）コンジュゲートしたターゲティング剤（例えば、抗体フラグメント、例えば、ターゲティングペプチド（例えば、ｃＲＧＤまたはそのアナログ））；および
放射性標識（例えば、８９Ｚｒ）（例えば、ここで、前記放射性標識が、前記ナノ粒子と会合している（例えば、リンカーを介して前記ナノ粒子に共有結合または非共有結合しているか、前記ナノ粒子に直接共有結合または非共有結合しているか、前記ナノ粒子または前記ナノ粒子を囲む組成物と、例えば、ファンデルワールス力によって会合している）（例えば、キレート剤なし（例えば、ここで、前記ナノプローブはキレート剤を含まない））（例えば、キレート剤あり））
を含み、
ここで、前記ナノ粒子が、前記ターゲティング剤および／または前記放射性標識とのコンジュゲーションまたは会合前にアミン官能化されており、
ここで、前記ナノ粒子が、２０ナノメートル以下の直径（例えば、平均直径）（例えば、水溶液、例えば、食塩溶液中にて動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定した場合）を有する（例えば、ここで、前記ナノ粒子の平均直径は、１〜２０ｎｍ、例えば、１〜１５ｎｍ、例えば、１〜１０ｎｍ、例えば、１〜８ｎｍ、例えば、４〜１０ｎｍ、例えば、４〜８ｎｍである）（例えば、ここで、前記ナノプローブは、５０ｎｍ以下、例えば、４０ｎｍ以下、例えば、３０ｎｍ以下、例えば、２０ｎｍ以下、例えば、１５ｎｍ以下、例えば、１０ｎｍ以下の平均直径を有する）、
被験体における疾患および／または状態を処置する方法であって、ここで、前記処置する方法が、前記被験体へ前記組成物を送達することを含む方法において使用するための、ナノプローブ。
【請求項５０】
アミノ化ナノ粒子から作製されたナノプローブ（例えば、放射性コンジュゲート、例えば、ナノコンジュゲート）であって、以下：
ナノ粒子（例えば、超小型ナノ粒子、例えば、シリカ系ナノ粒子、例えば、Ｃ’ドット（例えば、ＮＨ２−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドット））；
前記ナノ粒子に（例えば、直接または間接的に）コンジュゲートしたターゲティング剤（例えば、抗体フラグメント、例えば、ターゲティングペプチド（例えば、ｃＲＧＤまたはそのアナログ））；および
放射性標識（例えば、８９Ｚｒ）（例えば、ここで、前記放射性標識が、前記ナノ粒子と会合している（例えば、リンカーを介して前記ナノ粒子に共有結合または非共有結合しているか、前記ナノ粒子に直接共有結合または非共有結合しているか、前記ナノ粒子または前記ナノ粒子を囲む組成物と、例えば、ファンデルワールス力によって会合している）（例えば、キレート剤なし（例えば、ここで、前記ナノプローブはキレート剤を含まない））（例えば、キレート剤あり））
を含み、
ここで、前記ナノ粒子が、前記ターゲティング剤および／または前記放射性標識とのコンジュゲーションまたは会合前にアミン官能化されており、
ここで、前記ナノ粒子が、２０ナノメートル以下の直径（例えば、平均直径）（例えば、水溶液、例えば、食塩溶液中にて動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定した場合）を有する（例えば、ここで、前記ナノ粒子の平均直径は、１〜２０ｎｍ、例えば、１〜１５ｎｍ、例えば、１〜１０ｎｍ、例えば、１〜８ｎｍ、例えば、４〜１０ｎｍ、例えば、４〜８ｎｍである）（例えば、ここで、前記ナノプローブは、５０ｎｍ以下、例えば、４０ｎｍ以下、例えば、３０ｎｍ以下、例えば、２０ｎｍ以下、例えば、１５ｎｍ以下、例えば、１０ｎｍ以下の平均直径を有する）、
被験体における疾患および／または状態をモニタリングする方法であって、ここで、前記モニタリングする方法が、前記被験体へ前記組成物を送達することを含む方法において使用するための、ナノプローブ。
【請求項５１】
アミノ化ナノ粒子から作製されたナノプローブ（例えば、放射性コンジュゲート、例えば、ナノコンジュゲート）であって、以下：
ナノ粒子（例えば、超小型ナノ粒子、例えば、シリカ系ナノ粒子、例えば、Ｃ’ドット（例えば、ＮＨ２−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドット））；
前記ナノ粒子に（例えば、直接または間接的に）コンジュゲートしたターゲティング剤（例えば、抗体フラグメント、例えば、ターゲティングペプチド（例えば、ｃＲＧＤまたはそのアナログ））；および
放射性標識（例えば、８９Ｚｒ）（例えば、ここで、前記放射性標識が、前記ナノ粒子と会合している（例えば、リンカーを介して前記ナノ粒子に共有結合または非共有結合しているか、前記ナノ粒子に直接共有結合または非共有結合しているか、前記ナノ粒子または前記ナノ粒子を囲む組成物と、例えば、ファンデルワールス力によって会合している）（例えば、キレート剤なし（例えば、ここで、前記ナノプローブはキレート剤を含まない））（例えば、キレート剤あり））
を含み、
ここで、前記ナノ粒子が、前記ターゲティング剤および／または前記放射性標識とのコンジュゲーションまたは会合前にアミン官能化されており、
ここで、前記ナノ粒子が、２０ナノメートル以下の直径（例えば、平均直径）（例えば、水溶液、例えば、食塩溶液中にて動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定した場合）を有する（例えば、ここで、前記ナノ粒子の平均直径は、１〜２０ｎｍ、例えば、１〜１５ｎｍ、例えば、１〜１０ｎｍ、例えば、１〜８ｎｍ、例えば、４〜１０ｎｍ、例えば、４〜８ｎｍである）（例えば、ここで、前記ナノプローブは、５０ｎｍ以下、例えば、４０ｎｍ以下、例えば、３０ｎｍ以下、例えば、２０ｎｍ以下、例えば、１５ｎｍ以下、例えば、１０ｎｍ以下の平均直径を有する）、
（ａ）被験体における疾患および／または状態を処置する方法において、または（ｂ）被験体における疾患および／または状態をモニタリングする方法であって、ここで、前記モニタリングする方法が前記被験体へ前記組成物を送達することを含む方法において使用するための、ナノプローブ。
【請求項５２】
アミノ化ナノ粒子から作製されたナノプローブ（例えば、放射性コンジュゲート、例えば、ナノコンジュゲート）であって、以下：
ナノ粒子（例えば、超小型ナノ粒子、例えば、シリカ系ナノ粒子、例えば、Ｃ’ドット（例えば、ＮＨ２−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドット））；
前記ナノ粒子に（例えば、直接または間接的に）コンジュゲートしたターゲティング剤（例えば、抗体フラグメント、例えば、ターゲティングペプチド（例えば、ｃＲＧＤまたはそのアナログ））；および
放射性標識（例えば、８９Ｚｒ）（例えば、ここで、前記放射性標識が、前記ナノ粒子と会合している（例えば、リンカーを介して前記ナノ粒子に共有結合または非共有結合しているか、前記ナノ粒子に直接共有結合または非共有結合しているか、前記ナノ粒子または前記ナノ粒子を囲む組成物と、例えば、ファンデルワールス力によって会合している）（例えば、キレート剤なし（例えば、ここで、前記ナノプローブはキレート剤を含まない））（例えば、キレート剤あり））
を含み、
ここで、前記ナノ粒子が、前記ターゲティング剤および／または前記放射性標識とのコンジュゲーションまたは会合前にアミン官能化されており、
ここで、前記ナノ粒子が、２０ナノメートル以下の直径（例えば、平均直径）（例えば、水溶液、例えば、食塩溶液中にて動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定した場合）を有する（例えば、ここで、前記ナノ粒子の平均直径は、１〜２０ｎｍ、例えば、１〜１５ｎｍ、例えば、１〜１０ｎｍ、例えば、１〜８ｎｍ、例えば、４〜１０ｎｍ、例えば、４〜８ｎｍである）（例えば、ここで、前記ナノプローブは、５０ｎｍ以下、例えば、４０ｎｍ以下、例えば、３０ｎｍ以下、例えば、２０ｎｍ以下、例えば、１５ｎｍ以下、例えば、１０ｎｍ以下の平均直径を有する）、
治療で用いるための、ナノプローブ。
【請求項５３】
アミノ化ナノ粒子から作製されたナノプローブ（例えば、放射性コンジュゲート、例えば、ナノコンジュゲート）であって、以下：
ナノ粒子（例えば、超小型ナノ粒子、例えば、シリカ系ナノ粒子、例えば、Ｃ’ドット（例えば、ＮＨ２−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドット））；
前記ナノ粒子に（例えば、直接または間接的に）コンジュゲートしたターゲティング剤（例えば、抗体フラグメント、例えば、ターゲティングペプチド（例えば、ｃＲＧＤまたはそのアナログ））；および
放射性標識（例えば、８９Ｚｒ）（例えば、ここで、前記放射性標識が、前記ナノ粒子と会合している（例えば、リンカーを介して前記ナノ粒子に共有結合または非共有結合しているか、前記ナノ粒子に直接共有結合または非共有結合しているか、前記ナノ粒子または前記ナノ粒子を囲む組成物と、例えば、ファンデルワールス力によって会合している）（例えば、キレート剤なし（例えば、ここで、前記ナノプローブはキレート剤を含まない））（例えば、キレート剤あり））
を含み、
ここで、前記ナノ粒子が、前記ターゲティング剤および／または前記放射性標識とのコンジュゲーションまたは会合前にアミン官能化されており、
ここで、前記ナノ粒子が、２０ナノメートル以下の直径（例えば、平均直径）（例えば、水溶液、例えば、食塩溶液中にて動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定した場合）を有する（例えば、ここで、前記ナノ粒子の平均直径は、１〜２０ｎｍ、例えば、１〜１５ｎｍ、例えば、１〜１０ｎｍ、例えば、１〜８ｎｍ、例えば、４〜１０ｎｍ、例えば、４〜８ｎｍである）（例えば、ここで、前記ナノプローブは、５０ｎｍ以下、例えば、４０ｎｍ以下、例えば、３０ｎｍ以下、例えば、２０ｎｍ以下、例えば、１５ｎｍ以下、例えば、１０ｎｍ以下の平均直径を有する）、
疾患または状態のモニタリングに使用するための、ナノプローブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年５月２５日に出願された米国出願連続番号第６２／５１０，８５９号の利益を主張し、その開示は、その内容全体について本明細書中で参考として援用される。
発明の分野
【０００２】
本発明は、一般に、例えば、がんおよび他の疾患の検出、防止、および／または処置に有用なナノ粒子、放射性標識、およびターゲティング剤（例えば、抗体、例えば、ターゲティングリガンド）を含むナノプローブ（例えば、直径２０ナノメートル未満）に関する。
政府の資金提供
【０００３】
本発明を、国立衛生研究所によって授与された助成金番号ＣＡ１６１２８０およびＣＡ１９９０８１の下で政府支援を受けて実施した。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
背景
全身投与後に目的の標的に能動的に局在し、かつ細網内皮系（ＲＥＳ）への非特異的蓄積が少ない「ターゲットまたはクリア（ｔａｒｇｅｔ−ｏｒ−ｃｌｅａｒ）」多機能ナノプラットフォームは、ナノ医療分野における大きな課題の１つであり続けている。
【０００５】
過去３０年にわたり、小動物において種々のタイプの固体（または無機系）ナノ材料の前臨床結果が得られているにもかかわらず、これらのナノ材料のうちでファーストインヒューマン治験に進められているのはごくわずかしかない。ナノ粒子製造の困難さ、規制上の障壁、臨床試験費用の急騰、試験デザインの複雑さの増加、ｉｎ  ｖｉｖｏでの能動的ターゲティング有効性が限定的であること、および肝臓蓄積率の高さ（すなわち、投与した粒子の３０〜９９％が血流に由来する）が、既存のナノ材料のほとんどが取り組む必要がある主な障壁の例である。流体力学（ＨＤ）サイズが１０ｎｍを超えるナノ材料については、ステルスポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））での保護および腫瘍ホーミングリガンド（例えば、ペプチドまたは抗体）を使用した機能付与にもかかわらず、主に細網内皮系（ＲＥＳ）（すなわち、肝臓および脾臓）に取り込まれること、腫瘍対肝臓の放射能濃度比が１未満であること、および腫瘍対バックグラウンド（例えば、血液または筋肉）比が比較的低いことが依然としてよく認められる。ＲＥＳ取り込みの高さは、肝臓からの肝胆クリアランス速度が極度に遅くかつ一般に予測不可能であるために、長期間のｉｎ  ｖｉｖｏ毒性の懸念も引き起こし、その結果、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）による臨床試験用の新医薬品（Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ  Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇ）（ＩＮＤ）の承認が遅延する。
【０００６】
ナノ医薬に必要な性質の例には、１）製造プロセスが容易で低コストであること、２）疾患（例えば、がん）部位への能動的ターゲティング有効性（ａｃｔｉｖｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｅｆｆｉｃａｃｙ）が高く、オフターゲティング率が低いこと（例えば、ＲＥＳまたは他の健康な臓器への非特異的取り込みが低いこと）、３）診断または処置のためにがん内にナノ医薬を十分に蓄積することが確実である適切な（および調整可能な）血液循環半減期、４）好ましい安全プロフィールが保証されるように主に腎臓でクリアランスされること、５）臨床に関連する画像化技術（複数可）（例えば、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）、単一光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）、および光学的画像化）によって全身を非侵襲性に追跡すること、および６）処置のために十分な治療剤（例えば、小分子薬物、一重項酸素、インヒビター、放射線、熱）をがん細胞に特異的に送達させることが含まれる。
【０００７】
１０ｎｍを超えるサイズの固体ナノ材料はその１０ｎｍ未満のサイズの対応物と比較して薬物負荷能が有意に増強されるという利点を保持するが、腫瘍ターゲティング有効性の低さおよび高オフターゲット（例えば、用量制限毒性に関連する肝臓蓄積）が依然としてかかる材料の臨床移行の妨げであり得る。
【０００８】
迅速な腎クリアランス、比較的短い血液循環半減時間（数分〜数時間の範囲）、および低ＲＥＳ取り込み（およそ５％ＩＤ／ｇまたはそれ未満）は、超小型の（１０ｎｍ未満）腎臓でクリアランス可能なナノ粒子の決定的な生物学的特徴を表す。かかるプラットフォームの血液循環半減時間（１０時間超まで）を改善するための適切なＰＥＧ化技術が開発されているにもかかわらず、能動的腫瘍ターゲティング能を保持しながら大量の腎クリアランスを促進する様式で生理化学的性質（表面リガンド数が含まれる）を正確に制御することを可能にすることが、本分野における長きにわたる重要な課題である。
【０００９】
がんおよび他の疾患の検出、防止、および／または処置のために使用することができるプラットフォームが依然として必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
概要
ターゲティングリガンドおよび放射性標識（例えば、ジルコニウム−８９（８９Ｚｒ））の結合による超小型のアミノ化ナノ粒子から作製されたナノプローブ、ならびにその使用方法を本明細書中に記載する。提供する組成物は、腎臓でクリアランス可能であり、血液循環半減期が適切であり、腫瘍への能動的ターゲティング能が高く、主に腎臓でクリアランスされ、肝臓蓄積が低く、腫瘍対バックグラウンド比が高い。記載のナノプローブは、全身を標的としたがんの画像化（または処置）のためのヒト被験体に対する「ターゲットまたはクリア」トレーサとしての高い潜在性を示す。
【００１１】
特に、本開示は、ナノ粒子の生物学的性質が、どのようにして種々の放射性標識ストラテジーを使用したジルコニウム−８９（８９Ｚｒ、ｔ１／２＝７８．４時間）などの放射性金属のコンジュゲーションによって影響を受けるのかについて記載している。例えば、表面アミノ化インテグリンターゲティング超小型ナノ粒子（例えば、Ｃ’ドット（ｄｏｔ））への８９Ｚｒの結合により、好ましいＰＫおよびクリアランスプロフィールが得られ、ならびに、黒色腫モデルにおいて、生物学的コントロールと比較して、有効な腎糸球体濾過サイズカットオフ未満（１０ｎｍ未満）の粒径を維持しながら標的とした腫瘍の取り込みおよび標的対バックグラウンド比が有意に改善される。放射性標識ストラテジーを使用して開発したナノプローブを、その放射線安定性および血漿滞留半減時間に関して特徴づけた。記載のナノプローブは、ヒトにおける分子標的にされたがんの画像化の増強に適切な放射線生物学的性質を提供する。
【００１２】
かかる小型のシリカ系ナノ粒子のシラノール密度の低下およびそれに伴う曲率半径の低下、ならびに表面上の利用可能な官能基数の低下にもかかわらず、ナノ粒子を診断および／または治療で適用できるように、放射性標識およびターゲティングリガンドを結合させて、観察された性質をもたらすことが可能であることがわかる。かかる小型ナノ粒子の場合でさえもキレート剤なしでの標識を実施することができることがわかる。
【００１３】
１つの態様では、本発明は、アミノ化ナノ粒子から作製されたナノプローブ（例えば、放射性コンジュゲート（ｒａｄｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）、例えば、ナノコンジュゲート）であって、前述のナノプローブが、以下：ナノ粒子（例えば、超小型ナノ粒子、例えば、シリカ系ナノ粒子、例えば、Ｃ’ドット（例えば、ＮＨ２−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドット））；前述のナノ粒子に（例えば、直接または間接的に）コンジュゲートしたターゲティング剤（例えば、抗体フラグメント、例えば、ターゲティングペプチド（例えば、ｃＲＧＤまたはそのアナログ）、例えば、小タンパク質（例えば、ＶＥＧＦ１２１））；および放射性標識を含み、ここで、前述のナノ粒子が、前述のターゲティング剤および／または前述の放射性標識とのコンジュゲーションまたは会合前にアミン官能化されており、ここで、前述のナノ粒子が、２０ナノメートル以下の直径（例えば、平均直径）（例えば、水溶液、例えば、食塩溶液中にて動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定した場合）を有する（例えば、ここで、前述のナノ粒子の平均直径は、１〜２０ｎｍ、例えば、１〜１５ｎｍ、例えば、１〜１０ｎｍ、例えば、１〜８ｎｍ、例えば、４〜１０ｎｍ、例えば、４〜８ｎｍである）（例えば、ここで、前述のナノプローブは、５０ｎｍ以下、例えば、４０ｎｍ以下、例えば、３０ｎｍ以下、例えば、２０ｎｍ以下、例えば、１５ｎｍ以下、例えば、１０ｎｍ以下の平均直径を有する）、ナノプローブに関する。
【００１４】
一定の実施形態では、ナノ粒子は、超小型ナノ粒子を含む。
【００１５】
一定の実施形態では、放射性標識は８９Ｚｒを含む。一定の実施形態では、放射性標識は、ナノ粒子と会合している（例えば、リンカーを介して前述のナノ粒子に共有結合または非共有結合しているか、前述のナノ粒子に直接共有結合または非共有結合しているか、前述のナノ粒子または前述のナノ粒子を囲む組成物と、例えば、ファンデルワールス力によって会合している）（例えば、キレート剤なし（例えば、ここで、ナノプローブはキレート剤を含まない））（例えば、キレート剤あり））。
【００１６】
一定の実施形態では、ターゲティング剤は、リンカーを介して前述のナノ粒子に共有結合または非共有結合しているか、前述のナノ粒子に直接共有結合または非共有結合しているか、前述のナノ粒子または前述のナノ粒子を囲む組成物と、例えば、ファンデルワールス力によって会合している。
【００１７】
一定の実施形態では、ナノ粒子は、有機ポリマーでコーティングされている。一定の実施形態では、有機ポリマーはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。
【００１８】
一定の実施形態では、ターゲティング剤は、ターゲティングペプチド（例えば、ＲＧＤ、例えば、ｃＲＧＤ、例えば、ＲＧＤのアナログ、例えば、αＭＳＨ、例えば、本質的に免疫調節性および抗炎症性であることが公知の任意のペプチド）を含む。一定の実施形態では、ターゲティングペプチドは、アルギニルグリシルアスパラギン酸（ＲＧＤ）、環状アルギニルグリシルアスパラギン酸（ｃＲＧＤ）、ＲＧＤのアナログ、α−メラノサイト刺激ホルモン（αＭＳＨ）、および本質的に免疫調節性および抗炎症性であることが公知の任意のペプチドからなる群から選択されるメンバーを含む。一定の実施形態では、ターゲティング剤は抗体フラグメントを含み、ここで、抗体フラグメントは、約５ｋＤａ〜約２５ｋＤａの範囲である（例えば、約１０ｋＤａ〜約２０ｋＤａ、例えば、約１５ｋＤａ）（例えば、ここで、抗体フラグメントは、機能的単一ドメイン抗体フラグメントを含む）。一定の実施形態では、ターゲティング剤は抗体フラグメントを含み、ここで、抗体フラグメントは、約２０ｋＤａ〜約４５ｋＤａ（例えば、約２５ｋＤａ〜約３０ｋＤａ）である（例えば、ここで、抗体フラグメントは機能的単鎖抗体フラグメントを含む）。一定の実施形態では、ターゲティング剤は抗体フラグメントを含み、ここで、抗体フラグメントは約４０ｋＤａ〜約８０ｋＤａ（例えば、約５０ｋＤａ〜約７０ｋＤａ、例えば、約６０ｋＤａ）である（例えば、ここで、抗体フラグメントは機能的ｆａｂフラグメントを含む）。
【００１９】
一定の実施形態では、ナノ粒子はシリカを含む。一定の実施形態では、ナノ粒子は、シリカベースのコアおよび前述のコアの少なくとも一部を囲むシリカシェルを含む。一定の実施形態では、ナノ粒子は、前述のコア内に蛍光化合物（例えば、Ｃｙ５）を含む。
【００２０】
一定の実施形態では、ターゲティング剤は小タンパク質を含み、ここで、前述の小タンパク質はＶＥＧＦ１２１を含む。
【００２１】
一定の実施形態では、ターゲティング剤は抗体フラグメントを含み、ここで、前述の抗体フラグメントは、組換え抗体フラグメント（ｆＡｂ）、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、および単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）フラグメントからなる組から選択されるメンバーである。一定の実施形態では、ターゲティング剤は抗体フラグメントを含み、ここで、前述の抗体フラグメントは単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。一定の実施形態では、ターゲティング剤は抗体フラグメントを含み、ここで、前述の抗体フラグメントは単一ドメイン（ｓｄＡｂ）フラグメントである。
【００２２】
一定の実施形態では、ナノ粒子（単一ナノ粒子）は、それに結合している１〜１０のターゲティング剤を有する（例えば、ここで、特定の種のナノ粒子群のナノ粒子あたりのターゲティング剤の平均数は、１〜８の範囲内、例えば、１〜７、例えば、１〜５、例えば、１〜４、例えば、１〜３、例えば、１〜２以内である）（例えば、ここで、ナノ粒子あたりのターゲティング剤の数は、例えば、ナノプローブが腎臓でクリアランスされ得る、例えば、ここで、ナノプローブが診断に役立つように、抗体フラグメントのサイズに応じて選択され、そして／または、例えば、ここで、ナノ粒子あたりのターゲティング剤の数は、ナノ粒子に結合することが可能な抗体フラグメントの数に応じて、そして／またはナノプローブが腎臓でクリアランスされないように（または腎クリアランスが阻害されるように）、例えば、ここで、ナノプローブはセラノスティックまたは治療に役立つように選択される）。
【００２３】
一定の実施形態では、ターゲティング剤は、ＰＥＧ部分を介してナノ粒子にコンジュゲートされている。
【００２４】
一定の実施形態では、ナノ粒子は、１５ナノメートル以下（例えば、１３ナノメートル以下、例えば、１０ナノメートル以下）の直径（例えば、平均直径）を有する。一定の実施形態では、ナノ粒子は、１ｎｍ〜２０ｎｍの範囲（例えば、２ｎｍ〜１５ｎｍ、例えば、５ｎｍ〜１５ｎｍ、例えば、１ｎｍ〜１０ｎｍ、例えば、２ｎｍ〜１０ｎｍ、例えば、５ｎｍ〜１０ｎｍ）の直径（例えば、平均直径）を有する。
【００２５】
一定の実施形態では、ターゲティング剤は、抗ＣＥＡｓｃＦｖ、抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ、抗ＶＥＧＦ−Ａ、抗ＶＥＧＦ−Ｒ、および抗ＴＮＦ−α（例えば、ＰＥＧ化）からなる組から選択されるメンバーを含む。
【００２６】
一定の実施形態では、ナノプローブは、１つまたは複数のイメージング剤を、（例えば、ナノ粒子内に、ナノ粒子に結合して、および／またはターゲティング剤に結合して）含む。一定の実施形態では、１つまたは複数のイメージング剤は、ＰＥＴトレーサまたはＳＰＥＣＴトレーサを含む。一定の実施形態では、ＰＥＴトレーサまたはＳＰＥＣＴトレーサは、８９Ｚｒ、６４Ｃｕ、［１８Ｆ］フルオロデオキシグルコース、１７７Ｌｕ、２２５Ａｔ、および９０Ｙからなる群から選択されるメンバーを含む。一定の実施形態では、１つまたは複数のイメージング剤は、フルオロフォア（例えば、シアニン）を含む。
【００２７】
一定の実施形態では、ナノプローブは、治療剤を含む（例えば、ここで、治療剤は、ナノ粒子、またはターゲティング剤、またはナノ粒子およびターゲティング剤の両方に結合しており、例えば、結合は、共有結合性または非共有結合性である）。一定の実施形態では、治療剤は、化学療法薬を含む。一定の実施形態では、化学療法薬は、ソラフェニブ、パクリタキセル、ドセタキセル、ＭＥＫ１６２、エトポシド、ラパチニブ、ニロチニブ、クリゾチニブ、フルベストラント、ベムラフェニブ、ベキソロテン、および／またはカンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｔｅｃｉｎ）からなる群から選択されるメンバーを含む。一定の実施形態では、治療剤は、チェックポイントインヒビターを含む（例えば、ここで、チェックポイントインヒビターのクラスおよび／または種は、微小環境の変化に基づいて選択され、例えば、ここで、変化は、（例えば、併用療法のため、例えば、放射線療法のための）第１の治療薬（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）の投与により引き起こされる）（例えば、ここで、変化は、免疫細胞プロフィールのマッピングによって決定される）。
【００２８】
一定の実施形態では、キレート剤は、デスフェロキサミン（ｄｅｓｆｅｒｏｘａｍｉｎｅ）（ＤＦＯ）を含む。一定の実施形態では、キレート剤は、１，４，８，１１−テトラアザビシクロ［６．６．２］ヘキサデカン−４，１１−ジイル）二酢酸（ＣＢ−ＴＥ２Ａ）；デスフェロキサミン（ＤＦＯ）；ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）；１，４，７，１０−テトラアザシクロテトラデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）；エチレンジアミン四酢酸（ｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）（ＥＤＴＡ）；エチレングリコールビス（２−アミノエチル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）；１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−１，４，８，１１−四酢酸（ＴＥＴＡ）；エチレンビス−（２−４ヒドロキシ−フェニルグリシン）（ＥＨＰＧ）；５−Ｃｌ−ＥＨＰＧ；５Ｂｒ−ＥＨＰＧ；５−Ｍｅ−ＥＨＰＧ；５ｔ−Ｂｕ−ＥＨＰＧ；５−ｓｅｃ−Ｂｕ−ＥＨＰＧ；ベンゾジエチレントリアミン五酢酸（ベンゾ−ＤＴＰＡ）；ジベンゾ−ＤＴＰＡ；フェニル−ＤＴＰＡ、ジフェニル−ＤＴＰＡ；ベンジル−ＤＴＰＡ；ジベンジルＤＴＰＡ；ビス−２（ヒドロキシベンジル）−エチレン−ジアミン二酢酸（ＨＢＥＤ）およびその誘導体；Ａｃ−ＤＯＴＡ；ベンゾ−ＤＯＴＡ；ジベンゾ−ＤＯＴＡ；１，４，７−トリアザシクロノナンΝ，Ν’，Ν’’−三酢酸（ＮＯＴＡ）；ベンゾ−ＮＯＴＡ；ベンゾ−ＴＥＴＡ、ベンゾ−ＤＯＴＭＡ（ここで、ＤＯＴＭＡは、１，４，７，１０−テトラアザシクロテトラデカン−１，４，７，１０−テトラ（メチル四酢酸）である）、ベンゾ−ＴＥＴＭＡ（ここで、ＴＥＴＭＡは、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−１，４，８，１１−（メチル四酢酸）である）；１，３−プロピレンジアミン四酢酸（ＰＤＴＡ）の誘導体；トリエチレンテトラミン六酢酸（ＴＴＨＡ）；１，５，１０−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−トリス（２，３−ジヒドロキシベンゾイル）−トリカテコラート（ＬＩＣＡＭ）の誘導体；および１，３，５−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−トリス（２，３−ジヒドロキシベンゾイル）アミノメチルベンゼン（ＭＥＣＡＭ）、および他の金属キレート剤からなる群から選択されるメンバーを含む。
【００２９】
一定の実施形態では、ナノプローブは、ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットを含む。一定の実施形態では、ナノプローブは、ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−［８９Ｚｒ］Ｃ’ドットを含む。一定の実施形態では、ナノプローブは、ＮＨ２−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットを含む。一定の実施形態では、ナノプローブは、ＤＦＯ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットを含む。一定の実施形態では、ナノプローブは、８９Ｚｒ−ＤＦＯ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットを含む。
【００３０】
別の態様では、本発明は、アミノ化ナノ粒子から作製されたナノプローブをキレート剤なしで放射性標識（例えば、８９Ｚｒ標識）する方法であって、前述のナノ粒子を放射性標識（例えば、７５℃の８９Ｚｒ−オキサラートを含むＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８））と接触させて第１の溶液を生成する、接触させる工程；前述の第１の溶液を移動相溶媒（例えば、ＥＤＴＡ、例えば、ＰＢＳ）と接触させ、それにより、キレート剤を含まない放射性標識されたナノ粒子を生成する、接触させる工程を含む方法に関する。
【００３１】
一定の実施形態では、遊離放射性標識は、移動相溶媒と錯体を形成する。
【００３２】
一定の実施形態では、前述の方法は、前述の接触させる工程の前にナノ粒子をアミノ化する工程を含む。
【００３３】
別の態様では、本発明は、請求項１〜３９のいずれか１項に記載のアミノ化ナノ粒子から作製されたナノプローブのキレート剤ベースの放射性標識（例えば、８９Ｚｒ標識）方法であって、前述のナノ粒子をキレート剤（例えば、ＤＦＯ−ＮＣＳ）と（例えば、約ｐＨ８〜約ｐＨ９で）接触させて、中間体組成物を生成させる、接触させる工程（例えば、１ナノ粒子：２０キレート剤のモル比で）（例えば、室温で、例えば、約ｐＨ８〜約ｐＨ９で）；前述の中間体組成物を移動相溶液（例えば、ＰＢＳ）と接触させる工程；および前述の中間体組成物を放射性標識（例えば、８９Ｚｒ）と（例えば、室温で、例えば、約ｐＨ７で）接触させる工程を含む方法に関する。
【００３４】
一定の実施形態では、前述の方法は、非特異的に結合した放射性標識（例えば、８９Ｚｒ）を除去する工程を含む。一定の実施形態では、前述の方法は、前述の接触させる工程の前にナノ粒子をアミノ化する工程を含む。
【００３５】
別の態様では、本発明は、疾患または状態を処置する方法であって、アミノ化ナノ粒子から作製されたナノプローブを含む組成物（例えば、医薬組成物）を被験体に投与することを含み、ここで、前述の放射性標識が、ナノ粒子にコンジュゲートした（例えば、リンカーを介して前述のナノ粒子に共有結合または非共有結合しているか、前述のナノ粒子に直接共有結合または非共有結合しているか、前述のナノ粒子または前述のナノ粒子を囲む組成物と、例えば、ファンデルワールス力によって会合している）治療用放射性標識である方法に関する。
【００３６】
一定の実施形態では、前述の方法は、免疫療法を施行することを含む。一定の実施形態では、免疫療法は、ナノプローブを含む医薬組成物を被験体に投与することを含む。
【００３７】
別の態様では、本発明は、アミノ化ナノ粒子から作製されたナノプローブ（例えば、放射性コンジュゲート、例えば、ナノコンジュゲート）であって、以下：ナノ粒子（例えば、超小型ナノ粒子、例えば、シリカ系ナノ粒子、例えば、Ｃ’ドット（例えば、ＮＨ２−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドット））；前述のナノ粒子に（例えば、直接または間接的に）コンジュゲートしたターゲティング剤（例えば、抗体フラグメント、例えば、ターゲティングペプチド（例えば、ｃＲＧＤまたはそのアナログ））；および放射性標識（例えば、８９Ｚｒ）（例えば、ここで、前述の放射性標識が、前述のナノ粒子と会合している（例えば、リンカーを介して前述のナノ粒子に共有結合または非共有結合しているか、前述のナノ粒子に直接共有結合または非共有結合しているか、前述のナノ粒子または前述のナノ粒子を囲む組成物と、例えば、ファンデルワールス力によって会合している）（例えば、キレート剤なし（例えば、ここで、ナノプローブはキレート剤を含まない））（例えば、キレート剤あり））を含み、ここで、前述のナノ粒子が、前述のターゲティング剤および／または前述の放射性標識とのコンジュゲーションまたは会合前にアミン官能化されており、ここで、前述のナノ粒子が、２０ナノメートル以下の直径（例えば、平均直径）（例えば、水溶液、例えば、食塩溶液中にて動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定した場合）を有する（例えば、ここで、前述のナノ粒子の平均直径は、１〜２０ｎｍ、例えば、１〜１５ｎｍ、例えば、１〜１０ｎｍ、例えば、１〜８ｎｍ、例えば、４〜１０ｎｍ、例えば、４〜８ｎｍである）（例えば、ここで、前述のナノプローブは、５０ｎｍ以下、例えば、４０ｎｍ以下、例えば、３０ｎｍ以下、例えば、２０ｎｍ以下、例えば、１５ｎｍ以下、例えば、１０ｎｍ以下の平均直径を有する）、被験体における疾患および／または状態を処置する方法であって、ここで、前述の処置する方法が、前述の被験体へ前述の組成物を送達することを含む方法において使用するための、ナノプローブに関する。
【００３８】
別の態様では、本発明は、アミノ化ナノ粒子から作製されたナノプローブ（例えば、放射性コンジュゲート、例えば、ナノコンジュゲート）であって、以下：ナノ粒子（例えば、超小型ナノ粒子、例えば、シリカ系ナノ粒子、例えば、Ｃ’ドット（例えば、ＮＨ２−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドット））；前述のナノ粒子に（例えば、直接または間接的に）コンジュゲートしたターゲティング剤（例えば、抗体フラグメント、例えば、ターゲティングペプチド（例えば、ｃＲＧＤまたはそのアナログ））；および放射性標識（例えば、８９Ｚｒ）（例えば、ここで、前述の放射性標識が、前述のナノ粒子と会合している（例えば、リンカーを介して前述のナノ粒子に共有結合または非共有結合しているか、前述のナノ粒子に直接共有結合または非共有結合しているか、前述のナノ粒子または前述のナノ粒子を囲む組成物と、例えば、ファンデルワールス力によって会合している）（例えば、キレート剤なし（例えば、ここで、ナノプローブはキレート剤を含まない））（例えば、キレート剤あり））を含み、ここで、前述のナノ粒子が、前述のターゲティング剤および／または前述の放射性標識とのコンジュゲーションまたは会合前にアミン官能化されており、ここで、前述のナノ粒子が、２０ナノメートル以下の直径（例えば、平均直径）（例えば、水溶液、例えば、食塩溶液中にて動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定した場合）を有する（例えば、ここで、前述のナノ粒子の平均直径は、１〜２０ｎｍ、例えば、１〜１５ｎｍ、例えば、１〜１０ｎｍ、例えば、１〜８ｎｍ、例えば、４〜１０ｎｍ、例えば、４〜８ｎｍである）（例えば、ここで、前述のナノプローブは、５０ｎｍ以下、例えば、４０ｎｍ以下、例えば、３０ｎｍ以下、例えば、２０ｎｍ以下、例えば、１５ｎｍ以下、例えば、１０ｎｍ以下の平均直径を有する）、被験体における疾患および／または状態をモニタリングする方法であって、ここで、前述のモニタリングする方法が、前述の被験体へ前述の組成物を送達することを含む方法において使用するための、ナノプローブに関する。
【００３９】
別の態様では、本発明は、アミノ化ナノ粒子から作製されたナノプローブ（例えば、放射性コンジュゲート、例えば、ナノコンジュゲート）であって、以下：ナノ粒子（例えば、超小型ナノ粒子、例えば、シリカ系ナノ粒子、例えば、Ｃ’ドット（例えば、ＮＨ２−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドット））；前述のナノ粒子に（例えば、直接または間接的に）コンジュゲートしたターゲティング剤（例えば、抗体フラグメント、例えば、ターゲティングペプチド（例えば、ｃＲＧＤまたはそのアナログ））；および放射性標識（例えば、８９Ｚｒ）（例えば、ここで、前述の放射性標識が、前述のナノ粒子と会合している（例えば、リンカーを介して前述のナノ粒子に共有結合または非共有結合しているか、前述のナノ粒子に直接共有結合または非共有結合しているか、前述のナノ粒子または前述のナノ粒子を囲む組成物と、例えば、ファンデルワールス力によって会合している）（例えば、キレート剤なし（例えば、ここで、ナノプローブはキレート剤を含まない））（例えば、キレート剤あり））を含み、ここで、前述のナノ粒子が、前述のターゲティング剤および／または前述の放射性標識とのコンジュゲーションまたは会合前にアミン官能化されており、ここで、前述のナノ粒子が、２０ナノメートル以下の直径（例えば、平均直径）（例えば、水溶液、例えば、食塩溶液中にて動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定した場合）を有する（例えば、ここで、前述のナノ粒子の平均直径は、１〜２０ｎｍ、例えば、１〜１５ｎｍ、例えば、１〜１０ｎｍ、例えば、１〜８ｎｍ、例えば、４〜１０ｎｍ、例えば、４〜８ｎｍである）（例えば、ここで、前述のナノプローブは、５０ｎｍ以下、例えば、４０ｎｍ以下、例えば、３０ｎｍ以下、例えば、２０ｎｍ以下、例えば、１５ｎｍ以下、例えば、１０ｎｍ以下の平均直径を有する）、（ａ）被験体における疾患および／または状態を処置する方法において、または（ｂ）被験体における疾患および／または状態をモニタリングする方法でであって、ここで、前述のモニタリングする方法が、前述の被験体へ前述の組成物を送達することを含む方法において使用するための、ナノプローブに関する。
【００４０】
別の態様では、本発明は、アミノ化ナノ粒子から作製されたナノプローブ（例えば、放射性コンジュゲート、例えば、ナノコンジュゲート）であって、以下：ナノ粒子（例えば、超小型ナノ粒子、例えば、シリカ系ナノ粒子、例えば、Ｃ’ドット（例えば、ＮＨ２−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドット））；前述のナノ粒子に（例えば、直接または間接的に）コンジュゲートしたターゲティング剤（例えば、抗体フラグメント、例えば、ターゲティングペプチド（例えば、ｃＲＧＤまたはそのアナログ））；および放射性標識（例えば、８９Ｚｒ）（例えば、ここで、前述の放射性標識が、前述のナノ粒子と会合している（例えば、リンカーを介して前述のナノ粒子に共有結合または非共有結合しているか、前述のナノ粒子に直接共有結合または非共有結合しているか、前述のナノ粒子または前述のナノ粒子を囲む組成物と、例えば、ファンデルワールス力によって会合している）（例えば、キレート剤なし（例えば、ここで、ナノプローブはキレート剤を含まない））（例えば、キレート剤あり））を含み、ここで、前述のナノ粒子が、前述のターゲティング剤および／または前述の放射性標識とのコンジュゲーションまたは会合前にアミン官能化されており、ここで、前述のナノ粒子が、２０ナノメートル以下の直径（例えば、平均直径）（例えば、水溶液、例えば、食塩溶液中にて動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定した場合）を有する（例えば、ここで、前述のナノ粒子の平均直径は、１〜２０ｎｍ、例えば、１〜１５ｎｍ、例えば、１〜１０ｎｍ、例えば、１〜８ｎｍ、例えば、４〜１０ｎｍ、例えば、４〜８ｎｍである）（例えば、ここで、前述のナノプローブは、５０ｎｍ以下、例えば、４０ｎｍ以下、例えば、３０ｎｍ以下、例えば、２０ｎｍ以下、例えば、１５ｎｍ以下、例えば、１０ｎｍ以下の平均直径を有する）、治療で使用するための、ナノプローブに関する。
【００４１】
別の態様では、本発明は、アミノ化ナノ粒子から作製されたナノプローブ（例えば、放射性コンジュゲート、例えば、ナノコンジュゲート）であって、以下：ナノ粒子（例えば、超小型ナノ粒子、例えば、シリカ系ナノ粒子、例えば、Ｃ’ドット（例えば、ＮＨ２−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドット））；前述のナノ粒子に（例えば、直接または間接的に）コンジュゲートしたターゲティング剤（例えば、抗体フラグメント、例えば、ターゲティングペプチド（例えば、ｃＲＧＤまたはそのアナログ））；および放射性標識（例えば、８９Ｚｒ）（例えば、ここで、前述の放射性標識が、前述のナノ粒子と会合している（例えば、リンカーを介して前述のナノ粒子に共有結合または非共有結合しているか、前述のナノ粒子に直接共有結合または非共有結合しているか、前述のナノ粒子または前述のナノ粒子を囲む組成物と、例えば、ファンデルワールス力によって会合している）（例えば、キレート剤なし（例えば、ここで、ナノプローブはキレート剤を含まない））（例えば、キレート剤あり））を含み、ここで、前述のナノ粒子が、前述のターゲティング剤および／または前述の放射性標識とのコンジュゲーションまたは会合前にアミン官能化されており、ここで、前述のナノ粒子が、２０ナノメートル以下の直径（例えば、平均直径）（例えば、水溶液、例えば、食塩溶液中にて動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定した場合）を有する（例えば、ここで、前述のナノ粒子の平均直径は、１〜２０ｎｍ、例えば、１〜１５ｎｍ、例えば、１〜１０ｎｍ、例えば、１〜８ｎｍ、例えば、４〜１０ｎｍ、例えば、４〜８ｎｍである）（例えば、ここで、前述のナノプローブは、５０ｎｍ以下、例えば、４０ｎｍ以下、例えば、３０ｎｍ以下、例えば、２０ｎｍ以下、例えば、１５ｎｍ以下、例えば、１０ｎｍ以下の平均直径を有する）、疾患または状態のモニタリングに使用するための、ナノプローブに関する。
【００４２】
本発明の１つの態様を含む実施形態の要素（例えば、方法）を、本発明の別の態様を含む実施形態（例えば、システム）に適用することができ、その逆も同じである。
定義
【００４３】
本開示をより容易に理解するために、一定の用語を以下に最初に定義する。以下の用語および他の用語についてのさらなる定義を、本明細書全体に記載する。
【００４４】
本出願では、別段の記載がない限り、「または」の使用は「および／または」を意味する。本出願で使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」およびこの用語のバリエーション（「含むこと」（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）および「含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）など）は、他の添加物、成分、整数、または工程を排除することを意図しない。本出願で使用される場合、用語「約」および「およそ」は、均等物として使用する。約／およそを用いてまたは用いずに本出願で使用した任意の数値は、関連分野の当業者によって認識される任意の通常の変動（ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎ）を包含することを意味する。一定の実施形態では、用語「およそ」または「約」は、別段の記載がない限り、または文脈から明らかでない限り、記述した参照値の２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ未満以内に、いずれかの方向（数値を超えるか数値未満）で入る値の範囲を指す（かかる数が可能な値の１００％を超える場合を除く）。
【００４５】
「投与」：用語「投与」は、被験体内への物質の導入を指す。一般に、任意の投与経路を利用することができる（例えば、非経口（例えば、静脈内）、経口、局所、皮下、腹膜、動脈内、吸入、膣、直腸、鼻腔、脳脊髄液への導入、または身体区画への点滴注入が含まれる）。一定の実施形態では、投与は経口である。さらにまたはあるいは、一定の実施形態では、投与は非経口である。一定の実施形態では、投与は静脈内である。
【００４６】
「抗体」：本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、特定の標的抗原に特異的に結合するのに十分な標準的免疫グロブリン配列エレメントを含むポリペプチドを指す。本質的に産生されたままのインタクトな抗体は、２つの同一の重鎖ポリペプチド（各々が約５０ｋＤ）および２つの同一の軽鎖ポリペプチド（各々が約２５ｋＤ）から構成され、これらが、一般に「Ｙ型」と呼ばれる構造に相互に会合しているおよそ１５０ｋＤの四量体の作用因子である。各重鎖は、少なくとも４つのドメイン（各々が約１１０アミノ酸長）から構成される−アミノ末端可変（ＶＨ）ドメイン（Ｙ構造の先端に位置している）、これに、以下の３つの定常ドメインが続く：ＣＨ１、ＣＨ２、およびカルボキシ末端ＣＨ３（Ｙの基部の底部に位置する）。「スイッチ」として公知の短い領域が、重鎖の可変領域と定常領域とを接続している。「ヒンジ」は、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを抗体の残部と接続している。このヒンジ領域内の２つのジスルフィド結合が、インタクトな抗体内の２つの重鎖ポリペプチドを相互に接続している。各軽鎖は、２つのドメインから構成される−アミノ末端可変（ＶＬ）ドメイン、これにカルボキシ末端定常（ＣＬ）ドメインが続き、これらが相互に別の「スイッチ」によって分離されている。インタクトな抗体四量体は、２つの重鎖−軽鎖二量体から構成され、ここで、重鎖および軽鎖は、単一のジスルフィド結合によって相互に連結しており；２つの他のジスルフィド結合は、重鎖ヒンジ領域を相互に接続しており、その結果、二量体が相互に接続し、四量体が形成される。天然に産生された抗体はまた、典型的にはＣＨ２ドメイン上でグリコシル化されている。天然の抗体内の各ドメインは、２つのβシート（例えば、３本鎖シート、４本鎖シート、または５本鎖シート）が相互に対して圧縮された逆平行βバレルに詰め込まれて形成された「免疫グロブリン折り畳み」を特徴とする構造を有する。各可変ドメインは、「相補性決定領域」として公知の３つの超可変ループ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）およびいくらか不変の４つの「フレームワーク」領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４）を含む。天然の抗体が折り畳まれるとき、ＦＲ領域はβシートを形成して各ドメインのための構造的フレームワークを提供し、重鎖および軽鎖の両方由来のＣＤＲループ領域は、三次元空間にまとまり、その結果、Ｙ構造の先端に位置する単一の超可変抗原結合部位が作製される。天然に存在する抗体のＦｃ領域は、補体系のエレメントに結合し、エフェクター細胞（例えば、細胞傷害性を媒介するエフェクター細胞が含まれる）上の受容体にも結合する。Ｆｃ受容体に対するＦｃ領域の親和性および／または他の結合特性を、グリコシル化または他の修飾によって調整することができる。一定の実施形態では、本発明にしたがって産生および／または利用される抗体には、グリコシル化Ｆｃドメイン（修飾または操作されたかかるグリコシル化を有するＦｃドメインが含まれる）が含まれる。本発明のために、一定の実施形態では、天然の抗体で見出される十分な免疫グロブリンドメイン配列を含む任意のポリペプチドまたはポリペプチドの複合体を、かかるポリペプチドが天然に産生されることや（例えば、抗原に対して反応する生物によって生成される）、組換え操作、化学合成、または他の人為的システムもしくは方法論によって産生されることと無関係に、「抗体」と称し、そして／または「抗体」として使用することができる。一定の実施形態では、抗体はポリクローナル抗体であり；一定の実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。一定の実施形態では、抗体は、マウス、ウサギ、霊長類、またはヒト抗体の特徴を示す定常領域配列を有する。一定の実施形態では、抗体配列エレメントは、当該分野で公知のように、ヒト化されているか、霊長類化されているか、またはキメラなどである。さらに、本明細書中で使用される用語「抗体」は、適切な実施形態では（別段の記載がない限り、または文脈から明らかでない限り）、代替提示において抗体の構造および機能の特徴を利用するための任意の当該分野で公知であるか開発された構築物または形式を指し得る。例えば、実施形態において、本発明にしたがって利用される抗体は、インタクトなＩｇＧ、ＩｇＥ、およびＩｇＭ、二重特異性または多重特異性の抗体（例えば、Ｚｙｂｏｄｙ（登録商標）など）、単鎖Ｆｖ、ポリペプチド−Ｆｃ融合物、Ｆａｂ、ラクダ抗体、マスク抗体（例えば、Ｐｒｏｂｏｄｙ（登録商標））、小モジュラー免疫薬（「ＳＭＩＰ（商標）」）、単鎖またはタンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ（登録商標））、ＶＨＨ、Ａｎｔｉｃａｌｉｎ（登録商標）、Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）、ミニボディ、ＢｉＴＥ（登録商標）、アンキリン反復タンパク質またはＤＡＲＰＩＮ（登録商標）、Ａｖｉｍｅｒ（登録商標）、ＤＡＲＴ、ＴＣＲ様抗体、Ａｄｎｅｃｔｉｎ（登録商標）、Ａｆｆｉｌｉｎ（登録商標）、Ｔｒａｎｓ−ｂｏｄｙ（登録商標）、Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）、ＴｒｉｍｅｒＸ（登録商標）、ＭｉｃｒｏＰｒｏｔｅｉｎ、Ｆｙｎｏｍｅｒ（登録商標）、Ｃｅｎｔｙｒｉｎ（登録商標）、およびＫＡＬＢＩＴＯＲ（登録商標）から選択されるが、これらに限定されない形式の抗体である。一定の実施形態では、抗体は、天然で産生される場合には有するであろう共有結合性修飾（例えば、グリカンの結合）を欠如していてもよい。一定の実施形態では、抗体は、共有結合性修飾（例えば、グリカン、ペイロード（例えば検出可能部分、治療用部分、触媒性部分など）、または他のペンダント基（例えば、ポリ−エチレングリコールなど）の結合）を含んでよい。
【００４７】
「抗体フラグメント」：本明細書中で使用される場合、「抗体フラグメント」には、インタクトな抗体の一部（例えば、抗体の抗原結合領域または可変領域など）が含まれる。抗体フラグメントの例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント；トリアボディ；テトラボディ；線状抗体；単鎖抗体分子；および抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体が含まれる。例えば、抗体フラグメントには、単離されたフラグメント、重鎖および軽鎖の可変領域からなる「Ｆｖ」フラグメント、軽鎖可変領域および重鎖可変領域がペプチドリンカーによって接続された組換え単鎖ポリペプチド分子（「ＳｃＦｖタンパク質」）、ならびに、超可変領域を模倣しているアミノ酸残基からなる最小認識単位が含まれる。多数の実施形態では、抗体フラグメントは、このフラグメントの親抗体の十分な配列を含み、親抗体が結合する抗原と同一の抗原に結合するフラグメントである；一定の実施形態では、フラグメントは、親抗体と類似の親和性で抗原に結合し、そして／または親抗体と抗原への結合について競合する。抗体の抗原結合フラグメントの例には、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、Ｆｖフラグメント、ｄｓＦｖダイアボディ、ｄＡｂフラグメント、Ｆｄ’フラグメント、Ｆｄフラグメント、および単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）領域が含まれるが、これらに限定されない。抗体の抗原結合フラグメントを、任意の手段によって産生することができる。例えば、抗体の抗原結合フラグメントを、インタクトな抗体の断片化によって酵素的または化学的に産生することができ、そして／または部分的な抗体配列をコードする遺伝子から組換えによって産生することができる。あるいはまたはさらに、抗体の抗原結合フラグメントを、全部または部分的に合成によって産生することができる。抗体の抗原結合フラグメントは、必要に応じて、単鎖抗体フラグメントを含み得る。あるいはまたはさらに、抗体の抗原結合フラグメントは、例えば、ジスルフィド結合によって共に連結される複数の鎖を含み得る。抗体の抗原結合フラグメントは、必要に応じて、多分子複合体を含み得る。機能的単一ドメイン抗体フラグメントは、約５ｋＤａ〜約２５ｋＤａの範囲、例えば、約１０ｋＤａ〜約２０ｋＤａ、例えば、約１５ｋＤａである；機能的単鎖フラグメントは、約１０ｋＤａ〜約５０ｋＤａ、例えば、約２０ｋＤａ〜約４５ｋＤａ、例えば、約２５ｋＤａ〜約３０ｋＤａである；および機能的ｆａｂフラグメントは、約４０ｋＤａ〜約８０ｋＤａ、例えば、約５０ｋＤａ〜約７０ｋＤａ、例えば、約６０ｋＤａである。
【００４８】
「会合した」：本明細書中で使用される場合、用語「会合した」は、典型的には、２つまたはそれを超える実体が、直接または間接的に（例えば、連結剤としての機能を果たす１つまたは複数のさらなる実体を介して）相互に物理的に近接して、実体が、関連する条件下（例えば、生理学的条件下）で物理的に近接したままになるように十分に安定している構造を形成していることを指す。一定の実施形態では、会合した部分は、相互に共有結合性に連結している。一定の実施形態では、会合した実体は、非共有結合性に連結している。一定の実施形態では、会合した実体は、特異的な非共有結合性相互作用（例えば、使用される状況においてリガンドの相互作用パートナーと他の存在する実体とを判別する相互作用を担うリガンドと間の相互作用、例えば、例えば、ストレプトアビジン／アビジン相互作用、抗体／抗原相互作用などによって）によって相互に連結している。あるいはまたはさらに、より弱い非共有結合性相互作用の数が十分であれば、部分が会合を維持するのに十分な安定性を提供することができる。例示的な非共有結合性相互作用には、静電相互作用、水素結合、親和性、金属配位、物理的吸着、ホスト・ゲスト相互作用、疎水性相互作用、πスタッキング相互作用、ファンデルワールス相互作用、磁気相互作用、静電相互作用、双極子−双極子相互作用などが含まれるが、これらに限定されない。
【００４９】
「生体適合性」：用語「生体適合性」は、本明細書中で使用される場合、ｉｎ  ｖｉｖｏで実質的に有害反応を誘発しない材料を説明することを意図する。一定の実施形態では、材料は、細胞に対して有毒でない場合、「生体適合性」である。一定の実施形態では、材料は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞への添加による細胞死が２０％またはそれ未満であり、そして／またはｉｎ  ｖｉｖｏでの投与により炎症も他のかかる有害作用も誘導しない場合、「生体適合性」である。一定の実施形態では、材料は生分解性である。
【００５０】
「生分解性」：本明細書中で使用される場合、「生分解性」材料は、細胞に導入されると、細胞機構（例えば、酵素分解）または加水分解によって、細胞に対して有意な有毒作用がなく細胞が再利用するか破棄することができる成分に分解される材料である。一定の実施形態では、生分解性材料の破壊によって生成された成分は、ｉｎ  ｖｉｖｏで炎症および／または他の有害作用を誘導しない。一定の実施形態では、生分解性材料は酵素分解される。あるいはまたはさらに、一定の実施形態では、生分解性材料は加水分解によって分解される。一定の実施形態では、生分解性ポリマー材料は、その成分ポリマーに分解される。一定の実施形態では、生分解性材料（例えば、生分解性ポリマー材料が含まれる）の分解には、エステル結合の加水分解が含まれる。一定の実施形態では、材料（例えば、生分解性ポリマー材料が含まれる）の分解には、ウレタン結合の切断が含まれる。
【００５１】
「がん」：本明細書中で使用される場合、用語「がん」は、細胞が相対的に異常な、無制御の、および／または自律的な成長を示し、その結果、細胞が細胞増殖制御の有意な喪失を特徴とする異常に上昇した増殖速度および／または異常な成長表現型を示す疾患、障害、または状態を指す。一定の実施形態では、がんを、１つまたは複数の腫瘍によって特徴づけることができる。当業者は、種々のタイプのがん（例えば、副腎皮質癌、星状細胞腫、基底細胞癌、カルチノイド、心臓の癌、胆管癌、脊索腫、慢性骨髄増殖性新生物、頭蓋咽頭腫、非浸潤性乳管癌（ｄｕｃｔａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｉｎ  ｓｉｔｕ）、上衣腫、眼内黒色腫、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、妊娠性絨毛疾患（ｇｅｓｔａｔｉｏｎａｌ  ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ）、神経膠腫、組織球増殖症、白血病（例えば、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、毛様細胞白血病、骨髄性白血病（ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、骨髄性白血病（ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ））、リンパ腫（例えば、バーキットリンパ腫（非ホジキンリンパ腫）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、菌状息肉症、セザリー症候群、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫）、黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫、骨髄腫（例えば、多発性骨髄腫）、骨髄異形成症候群、乳頭腫症、傍神経節腫、クロム親和性細胞腫（ｐｈｅｏｃｈｒｏｍａｃｙｔｏｍａ）、胸膜肺芽腫、網膜芽細胞腫、肉腫（例えば、ユーイング肉腫、カポジ肉腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、子宮肉腫、血管性肉腫）、ウィルムス腫瘍、および／または副腎皮質、肛門、虫垂、胆管、膀胱、骨、脳、乳房、気管支、中枢神経系、子宮頸部、結腸、子宮内膜、食道、眼、ファロピウス管、胆嚢、胃腸管、生殖細胞、頭頸部、心臓、腸、腎臓（例えば、ウィルムス腫瘍）、喉頭、肝臓、肺（例えば、非小細胞肺がん、小細胞肺がん）、口、鼻腔、口腔、卵巣、膵臓、直腸、皮膚、胃、精巣、のど、甲状腺、陰茎、咽頭、腹膜、下垂体、前立腺、直腸、唾液腺、尿管、尿道、子宮、膣、もしくは外陰部のがんが含まれる）を承知している。
【００５２】
「担体」：本明細書中で使用される場合、「担体」は、化合物と共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。かかる薬学的担体は、水および油（ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、およびゴマ油などの石油、動物、植物に由来するか、合成の油が含まれる）などの滅菌液であり得る。水または水溶液  食塩溶液ならびにデキストロースおよびグリセロールの水溶液を、特に注射液剤のための担体として使用することが好ましい。適切な薬学的担体は、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”  ｂｙ  Ｅ．Ｗ．  Ｍａｒｔｉｎに記載されている。
【００５３】
「イメージング剤」：本明細書中で使用される場合、「イメージング剤」は、結合している作用因子（例えば、ポリサッカリドナノ粒子）の検出を容易にする任意の元素、分子、官能基、化合物、そのフラグメントまたは部分を指す。イメージング剤の例には、以下が含まれるが、これらに限定されない：種々のリガンド、放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１８Ｆ、１９Ｆ、３２Ｐ、３５Ｓ、１３５Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１３１Ｉ、６４Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、１８７Ｒｅ、１１１Ｉｎ、９０Ｙ、９９ｍＴｃ、１７７Ｌｕ、８９Ｚｒなど）、蛍光色素（蛍光色素の具体例については、以下を参照のこと）、化学発光剤（例えば、例えば、アクリジニウム（ａｃｒｉｄｉｎｕｍ）エステル、および安定化ジオキセタンなど）、生物発光剤、スペクトル的に分解可能な無機蛍光半導体であるナノ結晶（すなわち、量子ドット）、金属ナノ粒子（例えば、金、銀、銅、白金など）、ナノクラスター、常磁性金属イオン、酵素（酵素の具体例については、以下を参照のこと）、比色標識（例えば、例えば、色素およびコロイド金など）、ビオチン、ジゴキシゲニン（ｄｉｏｘｉｇｅｎｉｎ）、ハプテン、および抗血清またはモノクローナル抗体が利用可能なタンパク質。放射性核種を、例えば、クリック化学によって結合することができる。一定の実施形態では、抗体フラグメントを、アジドを含むように修飾する。一定の実施形態では、ポリマーコーティングしたナノ粒子の表面を、ジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）を含むように修飾する。一定の実施形態では、ＤＢＣＯ官能化ナノ粒子を、アミノ化ナノ粒子をＤＢＣＯ−ＮＨＳエステルと反応させることによって予め合成し、その後にクリック化学官能化した（例えば、アジド官能化した）抗体フラグメントにコンジュゲートする。
【００５４】
「タンパク質」：本明細書中で使用される場合、用語「タンパク質」は、ポリペプチド（すなわち、少なくとも３〜５アミノ酸がペプチド結合によって相互に連結した紐状の物質）を指す。タンパク質には、アミノ酸以外の部分を含んでよく（例えば、糖タンパク質、プロテオグリカンなどであり得る）、そして／または、別段、プロセシングまたは修飾されていてよい。一定の実施形態では、「タンパク質」は、細胞によって産生され、そして／または細胞内で活性な完全なポリペプチドであり得る（シグナル配列を含むか含まない）；一定の実施形態では、「タンパク質」は、細胞によって産生され、そして／または細胞内で活性なポリペプチドなどの特徴的部分であるか、特徴的部分を含む。一定の実施形態では、タンパク質は、１つを超えるポリペプチド鎖を含む。例えば、ポリペプチド鎖を、１つまたは複数のジスルフィド結合によって連結することができるか、他の手段によって会合することができる。一定の実施形態では、本明細書中に記載のタンパク質またはポリペプチドは、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、またはこれらの両方を含んでよく、そして／または当該分野で公知の種々のアミノ酸修飾物またはアナログのうちのいずれかを含んでよい。有用な修飾には、例えば、末端のアセチル化、アミド化、メチル化などが含まれる。一定の実施形態では、タンパク質またはポリペプチドは、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、合成アミノ酸、および／またはその組み合わせを含んでよい。一定の実施形態では、タンパク質は、抗体、抗体ポリペプチド、抗体フラグメント、生物学的に活性なその一部、および／またはその特徴的部分であるか、これらを含む。一定の実施形態では、タンパク質は、小タンパク質である（例えば、ここで、小タンパク質は２０ｋＤａ未満であり、例えば、ここで、小タンパク質は、好ましくは、１５ｋＤａ未満であり、例えば、ここで、小タンパク質は、好ましくは、１２ｋＤａまたはそれ未満である）。
【００５５】
「医薬組成物」：本明細書中で使用される場合、用語「医薬組成物」は、１つまたは複数の薬学的に許容され得る担体と共に製剤化された活性薬剤を指す。一定の実施形態では、活性薬剤は、関連する集団に投与したときに統計的に有意な確率で所定の治療効果を達成する治療レジメンでの投与に適切な単位投薬量で存在する。一定の実施形態では、医薬組成物を、以下：経口投与（例えば、水薬（水性液剤もしくは非水性液剤または懸濁剤）、錠剤、例えば、頬側、舌下、および全身に吸収させるための錠剤、ボーラス、粉剤・散剤（ｐｏｗｄｅｒ）、顆粒剤、舌に適用するためのパスタ剤）；非経口投与（例えば、滅菌液剤または懸濁剤としての皮下、筋肉内、静脈内、または硬膜外注射、または徐放製剤による）のための；局所適用（例えば、クリーム剤、軟膏剤、もしくは制御放出パッチ剤、または皮膚、肺、または口腔に適用される噴霧剤として）；膣内または直腸内（例えば、ペッサリー剤、クリーム剤、またはフォーム剤として）；舌下；眼；経皮；または鼻、肺、および他の粘膜表面への投与のために適用される固体または液体形態を含む固体または液体形態における投与のために特別に製剤化することができる。
【００５６】
「実質的に」：本明細書中で使用される場合、用語「実質的に」および文法上の均等物は、目的の特徴または性質の全てまたはほぼ全ての範囲または程度を示す定性的条件を指す。当業者は、生物学的および化学的な現象が完結し、そして／または完結に向かうことや、決定的な結果を達成したり回避したりすることは、あったとしても稀であると理解する。
【００５７】
「被験体」：本明細書中で使用される場合、用語「被験体」には、ヒトおよび哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ネコ、イヌ、およびウマ）が含まれる。多数の実施形態では、被験体は、哺乳動物、特に霊長類、特にヒトである。一定の実施形態では、被験体は、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ヤギ、乳牛、およびブタなど）；家禽類（例えば、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、およびシチメンチョウなど）；および飼いならされた動物、特に、イヌおよびネコなどのペットである。一定の実施形態では（例えば、特に研究の文脈において）、被験体は、例えば、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター）、ウサギ、霊長類、またはブタ（近交系ブタなど）などである。
【００５８】
「治療剤」：本明細書中で使用される場合、句「治療剤」は、被験体に投与したときに治療効果を有し、そして／または所望の生物学的および／または薬理学的効果を誘発する任意の薬剤を指す。
（０００１）
「治療有効量」：本明細書中で使用される場合、所望の効果が得られる投与量を意味する。一定の実施形態では、この用語は、疾患、障害、および／または状態に罹患しているか、罹患しやすい集団に治療投与レジメンにしたがって投与したときに、疾患、障害、および／または状態を処置するのに十分な量を指す。一定の実施形態では、治療有効量は、疾患、障害、および／または状態の発病率および／または重症度を低下させ、そして／または疾患、障害、および／または状態の１つまたは複数の症状の発症を遅延させる量である。当業者は、用語「治療有効量」が特定の個体において実際に首尾よい処置が達成される必要のないことを認識する。むしろ、治療有効量は、かかる処置を必要とする患者に投与したときに有意な数の被験体において特に望ましい薬理学的応答が得られる量であり得る。一定の実施形態では、治療有効量への参照は、１つまたは複数の特異的組織（例えば、疾患、障害、または状態に影響を受ける組織）または体液（例えば、血液、唾液、血清、汗、涙、尿など）中で測定される量を指し得る。当業者は、一定の実施形態では、治療有効量の特定の薬剤または療法（ｔｈｅｒａｐｙ）を、単回用量で製剤化および／または投与することができると認識する。一定の実施形態では、治療に有効な薬剤を、複数の用量、例えば、投与レジメンの一部として製剤化および／または投与することができる。
【００５９】
「処置」：本明細書中で使用される場合、用語「処置」（「処置する（ｔｒｅａｔ）」または「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」も）は、特定の疾患、障害、および／または状態を部分的または完全に緩和し、改善し、回復させ、抑制し、その発症を遅延させ、その重症度を低下させ、そして／または１つまたは複数の症状、特徴、および／または原因の発生率を低下させる物質の任意の投与を指す。かかる処置は、関連する疾患、障害、および／もしくは状態の徴候を示さない被験体ならびに／または疾患、障害、および／もしくは状態の初期徴候のみを示す被験体の処置であり得る。あるいはまたはさらに、かかる処置は、関連する疾患、障害、および／または状態の１つまたは複数の確立された徴候を示す被験体の処置であり得る。一定の実施形態では、処置は、関連する疾患、障害、および／または状態に罹患していると診断されている被験体の処置であり得る。一定の実施形態では、処置は、関連する疾患、障害、および／または状態の発症リスクの増加と統計的に相関する１つまたは複数の感受性因子を有することが既知の被験体の処置であり得る。
【００６０】
図面を、制限ではなく例示を目的として本明細書中に示す。
【００６１】
本開示の前述のおよび他の目的、態様、特徴、および利点は、添付の図面を用いて以下の説明を参照することによってより明白かつよりよく理解されるようになる：
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１−１】図１Ａ〜１Ｆは、ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットおよびＮＨ２−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットの特徴を描写するプロットを示す。ＧＰＣエルグラム（図１Ａ）、フィットしたＦＣＳ相関曲線（図１Ｂ）、およびＰＥＧ−Ｃ’ドットと比較したｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットの紫外可視吸光度スペクトル（図１Ｃ）。ＧＰＣエルグラム（図１Ｄ）、フィットしたＦＣＳ相関曲線（図１Ｅ）、およびＰＥＧ−Ｃ’ドットと比較したアミン官能化ＮＨ２−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットの紫外可視吸光度スペクトル（図１Ｆ）。
【図１−２】同上。
【００６３】
【図２−１】図２Ａ〜２Ｆは、キレート剤なしでのおよびキレート剤ベースの８９Ｚｒ放射性標識研究を描写するグラフである。
【００６４】
図２Ａは、ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットの濃度依存性キレート剤なしでの８９Ｚｒ標識を示すグラフである。標識温度を７５℃に設定し；標識ｐＨを８に設定し；Ｃ’ドット（ｎｍｏｌ）対８９Ｚｒ（ｍＣｉ）比は、ゼロから７．５ｎｍｏｌ／ｍＣｉまでの範囲であった。
【００６５】
図２Ｂは、ｐＨ依存性キレート剤なしでの８９Ｚｒ標識を示すグラフである。標識温度：７５℃；Ｃ’ドット対８９Ｚｒ比：７．５ｎｍｏｌ／ｍＣｉ；標識ｐＨ範囲：２〜９。
【００６６】
図２Ｃは、温度依存性キレート剤なしでの８９Ｚｒ標識を示すグラフである。標識ｐＨ：８；Ｃ’ドット対８９Ｚｒ比：７．５ｎｍｏｌ／ｍＣｉ；標識温度範囲：２５℃〜７５℃。
【００６７】
【図２−２】図２Ｄは、通常のＰＥＧ化手順を用いたＣ’ドットとさらに小シラン分子（例えば、ジエトキシジメチルシラン）で修飾した粒子との間のキレート剤なしでの８９Ｚｒ標識比較を示すグラフである。標識温度：７５℃；標識ｐＨ：８；Ｃ’ドット対８９Ｚｒ比：７．５ｎｍｏｌ／ｍＣｉ。
【００６８】
図２Ｅは、ＤＦＯ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットの濃度依存性キレート剤ベースの８９Ｚｒ標識を示すグラフである。標識温度：３７℃；標識ｐＨ：７．５；Ｃ’ドット対８９Ｚｒ比の範囲：ゼロから０．７５ｎｍｏｌ／ｍＣｉまで。
【００６９】
図２Ｆは、多様な粒子対ＤＦＯ−ＮＣＳ比で合成したＤＦＯ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドット粒子あたりのｎａｔＺｒ数のマイクロ波プラズマ−原子発光分光計（ＭＰ−ＡＥＳ）試験を示すグラフである。
【００７０】
【図３】図３Ａ〜３Ｄは、キレート剤なしでおよびキレート剤ベースの８９Ｚｒ標識Ｃ’ドットの性質の比較を描写するグラフである。（図３Ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび（図３Ｂ）ｉｎ  ｖｉｖｏでの放射線安定性、ならびに（図３Ｃ）キレート剤なしで８９Ｚｒ標識ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットおよび（図３Ｄ）キレート剤ベースの８９Ｚｒ標識ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットについての血液循環半減時間（＊＊ｐ＜０．００５）。
【００７１】
【図４−１】図４Ａ〜４Ｄは、キレート剤なしでおよびキレート剤ベースの８９Ｚｒ標識Ｃ’ドットについてのマウスにおける動的ＰＥＴ画像化の結果の比較を描写する画像およびグラフを示す。（図４Ａ）キレート剤なしでの８９Ｚｒ標識ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットおよび（図４Ｂ）キレート剤ベースの８９Ｚｒ標識ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドット。（図４Ｃ）キレート剤なしでの８９Ｚｒ標識ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−［８９Ｚｒ］Ｃ’ドットおよび（図４Ｄ）キレート剤ベースの８９Ｚｒ標識８９Ｚｒ−ＤＦＯ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットをｉ．ｖ．注射したマウスにおける主要臓器（すなわち、心臓、膀胱、肝臓、筋肉、および腎臓）についての最初の６０分間の時間−放射能曲線。（図４Ａ）および（図４Ｂ）中の全ての画像は、冠状最大強度投影法（ＭＩＰ）陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）画像である。
【図４−２】同上。
【００７２】
【図５−１】図５Ａ〜５Ｃは、キレート剤なしでのおよびキレート剤ベースの８９Ｚｒ標識Ｃ’ドットについてのマウスにおける生体内分布研究を描写するグラフである。健康なマウス（ｎ＝３）における（図５Ａ）キレート剤なしでの８９Ｚｒ標識ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−［８９Ｚｒ］Ｃ’ドットおよび（図５Ｂ）キレート剤ベースの８９Ｚｒ標識８９Ｚｒ−ＤＦＯ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドット。（図５Ｃ）８９Ｚｒ標識ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットを注射したマウスにおける時間依存性骨取り込みの比較（＊＊ｐ＜０．００５）。
【図５−２】同上。
【図５−３】同上。
【００７３】
【図６−１】図６Ａ〜６Ｊは、マウスのｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍を標的とした冠状ＰＥＴ画像およびその解析を描写する画像およびグラフである。（図６Ａ）Ｍ２１担癌マウス（ｎ＝３）におけるｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−［８９Ｚｒ］Ｃ’ドット（キレート剤なしでの標識）、（図６Ｂ）Ｍ２１担癌マウス（ｎ＝３）における８９Ｚｒ−ＤＦＯ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドット（キレート剤ベースの標識）、および（図６Ｃ）Ｍ２１Ｌ担癌マウス（ｎ＝３）における８９Ｚｒ−ＤＦＯ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドット（キレート剤ベースの標識）を注射したマウス。２時間および７２時間のＭＩＰ画像は、粒子の血液半減時間の延長、注射２時間後の膀胱への粒子の腎クリアランス、および注射７２時間後の骨および関節への取り込みが明らかになったことを示す。（図６Ｄ）Ｍ２１異種移植片におけるキレート剤なしでの８９Ｚｒ標識ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−［８９Ｚｒ］Ｃ’ドット、（図６Ｅ）Ｍ２１異種移植片におけるキレート剤ベースの８９Ｚｒ標識８９Ｚｒ−ＤＦＯ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドット、および（図６Ｆ）Ｍ２１−Ｌ異種移植片におけるキレート剤ベースの８９Ｚｒ標識８９Ｚｒ−ＤＦＯ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットを示す時間−放射能曲線。３群間での（図６Ｇ）腫瘍取り込み、（図６Ｈ）腫瘍対血液比、（図６Ｉ）腫瘍対肝臓比、および（図６Ｊ）腫瘍対筋肉比の比較。群あたりＮ＝３。
【図６−２】同上。
【００７４】
【図７】図７は、ＭＰ−ＡＥＳを使用したＭａｌ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットあたりのｎａｔＺｒ数の評価を描写するグラフである。
【００７５】
【図８】図８Ａは、４時間および２４時間の注射後時点での８９Ｚｒ−ＤＦＯ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドット（ＧＳＨリンカーを使用）のＰＥＴ画像化を描写する画像である。赤色矢印で腸取り込みをマークしている。ＧＳＨ：グルタチオン。
【００７６】
図８Ｂは、０．５、２４、および４８時間の注射後時点での８９Ｚｒ−ＤＦＯ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドット（リンカーとしてＡＰＴＥＳを使用）のＰＥＴ画像化を描写する画像である。ＡＰＴＥＳ：（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン。
【００７７】
【図９】図９Ａおよび９Ｂは、（図９Ａ）キレート剤なしでの８９Ｚｒ標識ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドット、（図９Ｂ）キレート剤ベースの８９Ｚｒ標識ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットの代表的なＰＤ−１０溶出プロフィールを描写するプロットである。
【００７８】
【図１０】図１０は、種々の注射後の時点でのマウス血漿における８９Ｚｒ標識ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットの取り込みを描写するグラフである（ｎ＝３）。
【００７９】
【図１１】図１１は、マウスの骨および関節における同位体の迅速かつ保持された取り込みを示す、代表的な健康なマウスにおける遊離８９Ｚｒ−オキサラートのＭＩＰ画像を描写する画像である。
【００８０】
【図１２−１】図１２Ａ〜１２Ｂは、（図１２Ａ）ＥＤＴＡ負荷なしでおよび（図１２Ｂ）一晩ＥＤＴＡ負荷して、ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−［８９Ｚｒ］Ｃ’ドットを注射したマウスにおける骨取り込みの相違を示すＰＥＴスクリーニング研究を描写する画像である。
【００８１】
【図１２−２】図１２Ｃは、代表的なマウスについての生体内分布の結果を描写するプロットを示す。ほんの約２０％の骨の取り込みの低下が観察された。ＥＤＴＡ負荷条件は、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、３７℃、および６５０ｒｐｍでの一晩の振盪であった。
【００８２】
【図１３】図１３は、注射後３日目および７日目におけるキレート剤なしでの８９Ｚｒ標識ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットの時間依存性の変化を示す生体内分布の結果を、骨中取り込みの顕著な保持ならびに肝臓、脾臓、および腎臓中の取り込みの低下と共に描写するグラフを示す（ｎ＝３）。
【００８３】
【図１４】図１４Ａおよび１４Ｂは、種々の注射後の時点で（図１４Ａ）キレート剤なしでのおよび（図１４Ｂ）キレート剤ベースの８９Ｚｒ標識ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットを注射された担癌マウスの冠状ＭＩＰ  ＰＥＴ画像を示す画像である。腫瘍を黄色の矢印でマークしている。骨および関節の取り込みを、白色の矢印でマークしている。
【００８４】
【図１５】図１５は、注射２４時間後のＭ２１およびＭ２１−Ｌ担癌マウスにおける８９Ｚｒ標識ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットのｅｘ  ｖｉｖｏ生体内分布研究（ｎ＝３）を示すプロットである。
【００８５】
【図１６】図１６Ａおよび１６Ｂは、本発明の例示的な実施形態にしたがったｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットの８９Ｚｒ−放射性標識ストラテジーを示す概略図である。
【００８６】
図１６Ａは、以下の本発明の例示的な実施形態にしたがったキレート剤なしのストラテジーを示す概略図である：（１）ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドット由来の表面および／または内部脱プロトン化シラノール基（−Ｓｉ−Ｏ−）が７５℃、ｐＨ８での８９Ｚｒ（ハードルイス酸）の標識を成功させるための固有の酸素ドナー（またはハードルイス塩基）として機能し、（２）ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−［８９Ｚｒ］Ｃ’ドットを形成する。
【００８７】
図１６Ｂは、以下の本発明の例示的な実施形態にしたがったキレート剤ベースのストラテジーを示す概略図である：ＤＦＯ−ＮＣＳをＣ’ドットのシリカ表面上のアミン基と反応させることによってＤＦＯキレート剤をアミン官能化ＮＨ２−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドット表面にコンジュゲートし；合成されたとき、次いで、（４）ＤＦＯ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットを８９Ｚｒにて３７℃、ｐＨ７で標識して、（５）８９Ｚｒ−ＤＦＯ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットを形成する。両方のストラテジーのキレート化された放射性金属の分子構造を、右側に３Ｄおよび２Ｄでレンダリングする。３Ｄレンダリングにおけるケイ素、酸素、炭素、窒素、硫黄、水素、およびジルコニウムの原子を、それぞれ、紫色、赤色、灰色、青色、黄色、白色、および薄緑色に着色している。
【００８８】
【図１７】図１７は、本発明の例示的な実施形態にしたがったワンポット合成技術を使用して作製したｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットおよび／またはＮＨ２−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットの合成を示す概略図である。ｃＲＧＤＹ−Ｃ’ドットを、アミン―シランと接触させてアミン―ｃＲＤＧＹ−Ｃ’ドットを作製する。次いで、アミン−ｃＲＤＧＹ−Ｃ’ドットを、同じ「ポット」内でＤＦＯ−ＮＣＳと接触させ、ＤＦＯ−ｃＲＧＤＹ−Ｃ’ドットを生成する。
【発明を実施するための形態】
【００８９】
詳細な説明
本記載を通して、組成物が、特定の成分を有する、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、または含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）と記載される場合、または、方法が、特定の工程を有する、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、または含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）と記載される場合、さらに、列挙した成分から本質的になるか、列挙した成分からなる本発明の組成物が存在すること、および、列挙した処理工程から本質的になるか、列挙した処理工程からなる本発明による方法が存在することが意図される。
【００９０】
本発明が実行可能であり続ける限り、工程の順序または一定の行為を実施するための順序は重要でないと理解されるべきである。さらに、２つまたはそれを超える工程または行為を同時に行うことができる。
【００９１】
例えば、背景の節中の任意の刊行物の本明細書中の言及は、前述の刊行物が本明細書中に示したクレームのいずれかに関する先行技術としての役割を果たすことを自認するものではない。背景の節は、本発明を明確にすることを目的として示されており、任意のクレームに関する先行技術を記載していることを意味しない。
【００９２】
（ｉ）表面の化学的性質の微調整後に得られる好ましい前臨床および臨床の薬物動態学的プロフィールのための放射性ナノプローブの種々の表面放射性標識ストラテジーを本明細書中に記載する。本開示は、これらのナノプローブ（例えば、放射性コンジュゲート）の生物学的性質が、異なる放射性標識ストラテジーを使用したジルコニウム−８９（８９Ｚｒ、ｔ１／２＝７８．４時間）などの放射性金属のコンジュゲーションによってどのようにして影響を受けるのかについて記載している。種々の放射性標識ストラテジーによる表面アミノ化インテグリンターゲティング超小型ナノ粒子（例えば、Ｃ’ドット）への８９Ｚｒの結合により、好ましいＰＫおよびクリアランスプロフィールが得られる。さらに、放射性標識ストラテジーにより、黒色腫モデルにおいて、生物学的コントロールと比較して、有効な腎糸球体濾過サイズカットオフ未満（１０ｎｍ未満）の粒径を維持しながら、標的とした腫瘍の取り込みおよび標的対バックグラウンド比が有意に改善される。ナノプローブを、その放射線安定性および血漿滞留半減時間についても特徴づけた。記載の８９Ｚｒ標識超小型のハイブリッド有機−無機粒子トレーサは、ヒトにおける分子標的にされたがんの画像化の増強に適切な放射線生物学的性質を提供する。
【００９３】
一定の実施形態では、ナノプローブは、Ｂｒａｄｂｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ．の国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１６／２６４３４号「ＮＡＮＯＰＡＲＴＩＣＬＥ  ＩＭＭＵＮＯＣＯＮＪＵＧＡＴＥＳ」（その内容全体が本明細書中で参考として援用される）に記載されている。一定の実施形態では、ナノプローブは、Ｂｒａｄｂｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許出願公開第２０１５／０３４３０９１Ａ１号「ＮＡＮＯＰＡＲＴＩＣＬＥ  ＤＲＵＧ  ＣＯＮＪＵＧＡＴＥＳ」（その内容全体が本明細書中で参考として援用される）に記載されている。一定の実施形態では、ナノプローブおよび放射性標識法は、Ｃｈｅｎ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．“Ｔａｒｇｅｔ−ｏｒ−Ｃｌｅａｒ  Ｚｉｒｃｏｎｉｕｍ−８９  Ｌａｂｅｌｅｄ  Ｓｉｌｉｃａ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｃａｎｃｅｒ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｕｐｔａｋｅ  ｉｎ  Ｍｅｌａｎｏｍａ：Ａ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ．”Ｃｈｅｍ  Ｍａｔｅｒ  ２９，８２６９−８２８１（２０１７）、Ｍａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．“Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｕｌｔｒａｓｍａｌｌ  Ｓｕｂ−１０ｎｍ  Ｌｉｇａｎｄ−Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｃｏｒｅ−Ｓｈｅｌｌ  Ｓｉｌｉｃａ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  Ｗａｔｅｒ．”Ｃｈｅｍ  Ｍａｔｅｒ  ２７，４１１９−４１３３（２０１５）、およびＭａ，Ｋ．＆  Ｗｉｅｓｎｅｒ，Ｕ．“Ｍｏｄｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  Ｐｏｓｔ−ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｂｙ  Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  Ｅｎａｂｌｉｎｇ  Ｐｅｎｔａ−Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｕｌｔｒａｓｍａｌｌ  Ｏｒｇａｎｉｃ−Ｓｉｌｉｃａ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．”  Ｃｈｅｍ  Ｍａｔｅｒ  ２９，６８４０−６８５５（２０１７）（その内容全体が本明細書中で参考として援用される）に記載されている。
【００９４】
迅速な腎クリアランス、比較的短い血液循環半減時間（数分から数時間までの範囲）、および低ＲＥＳ取り込み（およそ５％ＩＤ／ｇまたはそれ未満）は、超小型の（１０ｎｍ未満）腎臓でクリアランス可能なナノ粒子の典型的な生物学的特徴である（表１）。表１は、１０ｎｍ未満の腎臓で排出されるナノ粒子のｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍（能動的／受動的）ターゲティングのまとめを示す。例えば、ヨウ素−１２４（１２４Ｉ、ｔ１／２＝１００．２時間）で標識したｃＲＧＤＹ−Ｃドット−ＰＥＧ  ＰＥＴ／光学デュアルモダリティプローブは、現在、第２Ａ相治験中である（ＮＣＴ０１２６６０９６、ＮＣＴ０２１０６５９８）。
【表１−１】
2020520953.tif 000003
【表１−２】
2020520953.tif 000004
［ａ］  コア−シェルタイプのＱＤまたはＣｄＳｅ／ＺｎＳ−Ｃｙｓベースのナノ粒子を、ＧＰＩ（前立腺特異的膜抗原陽性前立腺がん細胞を標的にする小分子リガンド）とコンジュゲートした。ナノ粒子を、ｅｘ  ｖｉｖｏ生体内分布研究のために９９ｍＴｃで放射性標識した。肝臓および腎臓内の取り込みを、％ＩＤ／ｇとして示す。体重約２５ｇの６〜８週齢ヌードマウスについて、肝臓および腎臓の重量は、それぞれ、およそ１．５ｇおよび０．１７ｇである。表面保護のためにＰＥＧ化を利用しなかった。肝臓および腎臓取り込みを、注射４時間後に測定した；腫瘍取り込みデータは、入手不可能であった。
［ｂ］  ＱＤは、ｃＲＧＤペプチドとコンジュゲートし、９９ｍＴｃで放射性標識したコア−シェル構造化ＣｄＳｅ／ＺｎＳ−Ｃｙｓナノ粒子である。肝臓および腎臓取り込みを、％ＩＤ／ｇとして示す。体重約２５ｇの６〜８週齢ヌードマウスについて、肝臓および腎臓の重量は、それぞれ、およそ１．５ｇおよび０．１７ｇである。表面保護のためにＰＥＧ化を利用しなかった。肝臓および腎臓取り込みを、注射４時間後に測定した；腫瘍取り込みデータは、入手不可能であった。
［ｃ］  ［１９８Ａｕ］Ａｕ−ＧＳＨ（１９８Ａｕ：Ｔ１／２約２．７日）は、ＳＰＥＣＴ−ＣＴ画像化のために使用される内因性に放射性標識したナノ粒子であり、近赤外光（約８００ｎｍ）を放射する。ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍ターゲティングデータは示さない。
［ｄ］  Ａｕ−ＰＥＧ１ｋを、分子量１ｋＤａのチオール化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の存在下でＨＡｕＣｌ４を加熱還元することによって合成する。最大腫瘍取り込みは、誘導結合プラズマ質量分析に基づいて、注射１２時間後に約８％ＩＤ／ｇであると評価され、これは、注射４８時間後に５０％まで減少した。
［ｅ］  ｉｎ  ｖｉｖｏデュアルモダリティで腫瘍を標的にした画像化のために、１２４Ｉ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃドットを放射性標識し、ターゲティングリガンド（ｃＲＧＤＹ）とコンジュゲートした８。これは、ファースト・イン・ヒューマン治験のためにＦＤＡ臨床試験用新医薬品（ＩＮＤ）の承認を受けている今までに類を見ない無機粒子でもある。
［ｆ］  ［６４Ｃｕ］ＣｕＳ−ＰＶＰは、内因性に６４Ｃｕ標識され、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）でキャッピングされたＣｕＳナノ粒子である。ナノ粒子を、ＰＥＴ画像化および光熱療法のために使用することができる。腫瘍取り込みは、４Ｔ１担癌マウスにおいて注射２時間後に３．６％ＩＤ／ｇでピークになった。しかし、注射２４時間後までに約９５％の腫瘍蓄積が消失し、腫瘍取り込みが約０．２％ＩＤ／ｇとなった。
［ｇ］ ６４Ｃｕ−ＮＯＴＡ−Ａｕを、ＮＯＴＡキレート剤のＡｕ−ＧＳＨナノ粒子へのコンジュゲーション、その後の動的ＰＥＴ画像化のための６４Ｃｕでの標識によって合成する。驚いたことに、血液循環半減時間は、１０分未満であると評価され、これはＡｕ−ＧＳＨナノ粒子（１０時間超）より有意に短かった。
【００９５】
物理的半減期が１２４Ｉの半減期と類似するので、ジルコニウム−８９（８９Ｚｒ、ｔ１／２＝７８．４時間）は、現時点で前臨床試験および治験において広く使用されている陽電子放出放射性同位体である（表２）。表２は、一般的に使用されているＰＥＴ同位体の崩壊特性のまとめを示す。
【表２】
2020520953.tif 000005
【００９６】
さらに、８９Ｚｒは、平均β＋エネルギーが遥かに低く（３９６ｋｅＶ対８２０ｋｅＶ）、ＰＥＴ空間分解能を改善することができる。細胞中の取り込み後に典型的には脱ハロゲン化されることが公知の１２４Ｉと対照的に、８９Ｚｒは内在化後に細胞内に安定に残留することが報告されており、それにより、腫瘍内の実際のナノプローブ取り込みをより正確に評価されることに加えて、標的にされる粒子の蓄積および標的対バックグラウンド比を向上させる８９Ｚｒの潜在力を強調している。
【００９７】
本明細書中に記載のように、放射性核種を１２４Ｉから８９Ｚｒへ広げるためには、本明細書中に記載の放射性標識ストラテジーによって表面放射性金属（例えば、８９Ｚｒ）を超小型ナノ粒子（Ｃ’ドット）に結合させるためのキレート剤ベースのおよびキレート剤なしでの放射性標識ストラテジーの調査および比較が必要であった。それにより、（１）より大きなサイズの（多孔質および非多孔質）シリカ粒子に以前に適用されていたキレート剤なしでの放射性標識手順を１０ｎｍ未満の粒径に首尾よく拡大することができるかどうか、および（２）得られた８９Ｚｒ標識されたペプチド−官能化Ｃ’ドット（またはｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドット）およびＰＥＧ−官能化Ｃ’ドット（またはｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドット）により、十分に確立されたインテグリン発現黒色腫モデルにおいて腎排泄を容易にする１０ｎｍ未満のサイズを維持しながら高い標的化取り込みおよび標的対バックグラウンド比が得られるかどうかが決定された。
【００９８】
例えば、現在まで、シリカベースのキレート剤なしでの８９Ｚｒ放射性標識は、十分なシラノール基密度（１０５／粒子超）を得るために直径１００ｎｍを超えるナノ粒子にもっぱら焦点を合わせていた。表面および内部のシラノール基密度を有意に低下させるために、超小型（６〜７ｎｍ）でＰＥＧ化されたシリカナノ粒子のキレート剤なしでの８９Ｚｒ標識を利用できることが本明細書中に記載されている。
【００９９】
いかなる理論にも拘束されることを望まないが、これらの所見の結果は、ルテチウム−１７７などの治療用放射性標識に代えて診断用放射性標識を用いることにより標的化放射線療法のプラットフォームの開発をインフォームすることができる。例えば、本明細書中で記載される場合、開発当時のＣ’ドットプラットフォームのクリアランス特性を保持するための粒径を維持しながら小さな粒径（顕著に低下した曲率半径）に適用される表面官能化ストラテジーを利用することにより、治療用同位体（Ｌｕ−１７７またはＹ−９０など）の代わりに診断用同位体を使用することが可能である。提供したアミノ化Ｃ’ドットプラットフォームはまた、放射性標識のためのＤＦＯを超えた他の適切なキレート剤（例えば、ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡ、ＤＴＰＡ）のコンジュゲーションを容易にする。
【０１００】
キレート剤なしのストラテジーを、高温での各粒子の表面上および各粒子内の内因性脱プロトン化シラノール基（例えば、−Ｓｉ−Ｏ−）の８９Ｚｒ標識によって行った（７５℃、ｐＨ８、図１６Ａ）。選択したキレート剤（例えば、ＤＦＯ−ＮＣＳ）の表面密度を、腎クリアランス特性を維持しながら比放射能および放射化学収率を最大にするように慎重に制御することによって、キレート剤ベースの８９Ｚｒ標識技術（３７℃、ｐＨ７．５）も開発した（図１６Ｂ）。ナノプローブを、その放射線安定性、薬物動態、放射線量測定特性、能動的腫瘍ターゲティング、およびＰＥＴ画像化による標的対バックグラウンド比に関して広範に特徴づけた。本発明者らが知る限りにおいて、これは、今までに類を見ないデュアルモダリティ画像化のための８９Ｚｒ標識された、腎臓でクリアランス可能な標的化有機−無機ハイブリッド粒子である。その好ましい生物学的性質（血液循環半減時間の延長（約１５時間）、高腫瘍ターゲティング取り込み（１０％ＩＤ／ｇ超）、腎クリアランス（１〜２日以内に６０％ＩＤ超）、低肝臓蓄積（約５％ＩＤ／ｇ）、および高い腫瘍対バックグラウンド比（腫瘍：筋肉では９超；腫瘍：肝臓では２超）が含まれる）に基づいて、このプラットフォームは、がん（例えば、黒色腫）患者におけるがん特異的検出および位置特定のための診断用画像化ツールならびに疾患処置のための標的化放射線治療プローブとしての機能を果たす。
【０１０１】
一定の実施形態では、ナノ粒子は、シリカ、ポリマー（例えば、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸））（ＰＬＧＡ））、生体物質（ｂｉｏｌｏｇｉｃ）（例えば、タンパク質担体）、および／または金属（例えば、金、鉄）を含む。一定の実施形態では、ナノ粒子は、Ｂｒａｄｂｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許出願公開第２０１３／００３９８４８Ａ１号（本明細書中で参考として援用される）に記載の「Ｃドット」である。
【０１０２】
一定の実施形態では、ナノ粒子は球形である。一定の実施形態では、ナノ粒子は非球形である。一定の実施形態では、ナノ粒子は、金属／半金属／非金属、金属／半金属／非金属の酸化物、硫化物、炭化物、窒化物、リポソーム、半導体、および／またはその組み合わせからなる群から選択される材料であるか、これらを含む。一定の実施形態では、金属は、金、銀、銅、および／またはその組み合わせからなる群から選択される。
【０１０３】
ナノ粒子は、金属／半金属／非金属の酸化物（シリカ（ＳｉＯ２）、チタニア（ＴｉＯ２）、アルミナ（Ａｌ２Ｏ３）、ジルコニア（ＺｒＯ２）、ゲルマニア（ＧｅＯ２）、五酸化タンタル（Ｔａ２Ｏ５）、ＮｂＯ２などが含まれる）、および／または非酸化物（金属／半金属／非金属のホウ化物、炭化物、硫化物、および窒化物（チタンおよびその組み合わせ（Ｔｉ、ＴｉＢ２、ＴｉＣ、ＴｉＮなど）など）が含まれる）を含み得る。
【０１０４】
ナノ粒子は、１つまたは複数のポリマー、例えば、２１Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１７７．２６００の下で米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によってヒトへの使用が承認されている１つまたは複数のポリマー（ポリエステル（例えば、ポリ乳酸、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、ポリカプロラクトン、ポリバレロラクトン、ポリ（１，３−ジオキサン−２−オン））；ポリ酸無水物（例えば、ポリ（セバシン酸無水物））；ポリエーテル（例えば、ポリエチレングリコール）；ポリウレタン；ポリメタクリラート；ポリアクリラート；ポリシアノアクリラート；ＰＥＧとポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）とのコポリマーが含まれるが、これらに限定されない）を含み得る。
【０１０５】
ナノ粒子は、１つまたは複数の分解性ポリマー、例えば、一定のポリエステル、ポリ酸無水物、ポリオルソエステル、ポリホスファゼン、ポリホスホエステル、一定のポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフマラート（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｆｕｍｅｒａｔｅ）、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリ（アミノ酸）、ポリアセタール、ポリエーテル、生分解性ポリシアノアクリラート、生分解性ポリウレタン、およびポリサッカリドを含み得る。例えば、使用することができる特異的な生分解性ポリマーには、ポリリジン、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）（ＰＬＣ）、およびポリ（グリコリド−ｃｏ−カプロラクトン）（ＰＧＣ）が含まれるが、これらに限定されない。別の例示的な分解性ポリマーは、本出願による使用に適切であり得るポリ（β−アミノエステル）である。
【０１０６】
一定の実施形態では、ナノ粒子は、１つまたは複数の官能基を有するか、有するように修飾することができる。かかる官能基（ナノ粒子内またはナノ粒子表面上）を、任意の剤（例えば、検出可能な実体、ターゲティング実体、治療用実体、またはＰＥＧ）との会合のために使用することができる。表面官能性を導入または改変することによる表面電荷の変化に加えて、異なる官能基の導入により、リンカー（例えば、（切断可能または（生）分解性）ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ＰＬＧＡなどであるが、これらに限定されない）、ターゲティング／ホーミング剤、および／またはその組み合わせのコンジュゲートが可能である。
【０１０７】
一定の実施形態では、ナノ粒子は、１つまたは複数のターゲティングリガンド（小分子（例えば、フォラート、色素など）、アプタマー（例えば、Ａ１０、ＡＳ１４１１）、ポリサッカリド、生体小分子（例えば、葉酸、ガラクトース、ビスホスホネート、ビオチン）、オリゴヌクレオチド、および／またはタンパク質（例えば、（ポリ）ペプチド（例えば、αＭＳＨ、ＲＧＤ、オクトレオチド、ＡＰペプチド、上皮成長因子、クロロトキシン、トランスフェリンなど）、抗体、抗体フラグメント、タンパク質など）などであるが、これらに限定されない）を含む（例えば、ナノ粒子に結合する）。一定の実施形態では、ナノ粒子は、１つまたは複数のコントラスト剤／イメージング剤（例えば、蛍光色素、（キレート化）放射性同位体（ＳＰＥＣＴ、ＰＥＴ）、ＭＲ−活性剤、ＣＴ−剤）、および／または治療剤（例えば、小分子薬物（例えば、チェックポイントインヒビター）、治療用（ポリ）ペプチド、治療用抗体、（キレート化）放射性同位体など）を含む。
【０１０８】
一定の実施形態では、ナノ粒子への結合のためのチェックポイントインヒビターのクラスおよび／または種の選択は、被験体に施される最初の治療の選択に依存する（例えば、ナノ粒子および結合したチェックポイントインヒビターを含むナノプローブの投与前に第１の薬物および／または第１の治療（例えば、放射線）が施される併用療法として）。チェックポイントインヒビターのクラスおよび／または種を、どのようにして最初の治療が組織微小環境を変化させるかに基づいてさらにまたは代替的に選択することができる。微小環境の変化を、例えば、免疫細胞プロフィールのマッピングによって決定することができる。さらに、分類アプローチを使用して、特定の治療で認められた微小環境の観察された変化に基づいてインヒビターを分類することができる。
【０１０９】
一定の実施形態では、イメージング剤としてＰＥＴ（陽電子放出断層撮影）トレーサを使用する。一定の実施形態では、ＰＥＴトレーサは、８９Ｚｒ、６４Ｃｕ、［１８Ｆ］フルオロデオキシグルコースを含む。一定の実施形態では、ナノ粒子には、これらのおよび／または他の放射性標識が含まれる。
【０１１０】
一定の実施形態では、ナノ粒子は、１つまたは複数のフルオロフォアを含む。フルオロフォアは、蛍光色素、蛍光色素消光分子、任意の有機または無機の色素、金属キレート、または任意の蛍光酵素基質（プロテアーゼ活性化可能な酵素基質が含まれる）を含む。一定の実施形態では、フルオロフォアは、長鎖炭素親和性シアニンを含む。他の実施形態では、フルオロフォアは、ＤｉＩ、ＤｉＲ、およびＤｉＤなどを含む。蛍光色素は、遠赤色光蛍光色素および近赤外光蛍光色素（ＮＩＲＦ）を含む。蛍光色素には、カルボシアニン蛍光色素およびインドシアニン蛍光色素が含まれるが、これらに限定されない。一定の実施形態では、イメージング剤は、市販の蛍光色素（Ｃｙ５．５、Ｃｙ５、およびＣｙ７（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）；ＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ６６０、ＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ６８０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０、およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７９０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；ＶｉｖｏＴａｇ６８０、ＶｉｖｏＴａｇ−Ｓ６８０、およびＶｉｖｏＴａｇ−Ｓ７５０（ＶｉｓＥｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ）；Ｄｙ６７７、Ｄｙ６８２、Ｄｙ７５２、およびＤｙ７８０（Ｄｙｏｍｉｃｓ）；ＤｙＬｉｇｈｔ５４７、ＤｙＬｉｇｈｔ６４７（Ｐｉｅｒｃｅ）；ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０、およびＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０（ＡｎａＳｐｅｃ）；ＩＲＤｙｅ  ８００ＣＷ、ＩＲＤｙｅ  ８００ＲＳ、およびＩＲＤｙｅ  ７００ＤＸ（Ｌｉ−Ｃｏｒ）；ならびにＡＤＳ７８０ＷＳ、ＡＤＳ８３０ＷＳ、およびＡＤＳ８３２ＷＳ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｙｅ  Ｓｏｕｒｃｅ）およびＫｏｄａｋ  Ｘ−ＳＩＧＨＴ  ６５０、Ｋｏｄａｋ  Ｘ−ＳＩＧＨＴ  ６９１、Ｋｏｄａｋ  Ｘ−ＳＩＧＨＴ  ７５１（Ｃａｒｅｓｔｒｅａｍ  Ｈｅａｌｔｈ）が含まれるが、これらに限定されない）を含む。
【０１１１】
一定の実施形態では、ナノ粒子は、例えば、目的のがん組織／細胞をターゲティングするための１つまたは複数のターゲティングリガンドを含む（例えば、結合している）。
【０１１２】
一定の実施形態では、ナノ粒子は、１〜２０の個別の（例えば、同一のタイプまたは異なるタイプの）ターゲティング部分を含み、ここで、前述のターゲティング部分は、腫瘍細胞上の受容体に結合する（例えば、ここで、ナノ粒子の平均直径は、１５ｎｍ以下、例えば、１０ｎｍ以下、例えば、約５ｎｍ〜約７ｎｍ、例えば、約６ｎｍである）。一定の実施形態では、１〜２０のターゲティング部分は、α−メラノサイト刺激ホルモン（αＭＳＨ）を含む。一定の実施形態では、ナノ粒子は、ターゲティング部分（例えば、αＭＳＨ）を含む。一定の実施形態では、診断用ナノ粒子は、その物理的および／または化学的性質（例えば、表面化学、表面電荷、直径、形状、リガンド数）に関して、腎臓でクリアランス可能なように最適化されている。一定の実施形態では、セラノスティックナノ粒子は、その物理的および／または化学的性質（例えば、表面化学、表面電荷、直径、形状、リガンド数）に関して、腎臓でクリアランス可能なように（例えば、画像化または他の診断への適用のため）、または腎臓でクリアランスされないように（例えば、治療および／またはセラノスティックへの適用のため）最適化されている。
【０１１３】
処置することができるがんには、例えば、前立腺がん、乳がん、睾丸がん、子宮頸がん、肺がん、結腸がん、骨のがん、神経膠腫、膠芽細胞腫、多発性骨髄腫、肉腫、小細胞癌、黒色腫、腎がん、肝臓がん、頭頸部がん、食道がん、甲状腺がん、リンパ腫、膵臓（例えば、ＢｘＰＣ３）、肺（例えば、Ｈ１６５０）、および／または白血病が含まれる。さらに、記載の組成物を、病理学的血管新生（腫瘍新血管形成が含まれる）を処置するために使用することができる。ヒト腫瘍の成長および転移の発生は、血管のｄｅ  ｎｏｖｏ形成に依存する。新規の血管の形成は、例えば、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦ−Ｒによって厳重に調節されている。
【０１１４】
一定の実施形態では、ナノ粒子は、治療剤、例えば、薬物部分（例えば、化学療法薬）および／または治療用放射性同位体を含む。本明細書中で使用される場合、「治療剤」は、被験体に投与したときに治療効果を有し、そして／または所望の生物学的効果および／または薬理学的効果を誘発する任意の薬剤を指す。
【０１１５】
ナノ粒子の表面化学、コーティングの均一性（コーティングが存在する場合）、表面電荷、組成、濃度、投与頻度、形状、および／またはサイズを、所望の治療効果が得られるように調整することができる。
【０１１６】
一定の実施形態では、ナノプローブは、キレート剤、例えば、１，４，８，１１−テトラアザビシクロ［６．６．２］ヘキサデカン−４，１１−ジイル）二酢酸（ＣＢ−ＴＥ２Ａ）；デスフェロキサミン（ＤＦＯ）；ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）；１，４，７，１０−テトラアザシクロテトラデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）；エチレングリコールビス（２−アミノエチル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）；１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−１，４，８，１１−四酢酸（ＴＥＴＡ）；エチレンビス−（２−４ヒドロキシ−フェニルグリシン）（ＥＨＰＧ）；５−Ｃｌ−ＥＨＰＧ；５Ｂｒ−ＥＨＰＧ；５−Ｍｅ−ＥＨＰＧ；５ｔ−Ｂｕ−ＥＨＰＧ；５−ｓｅｃ−Ｂｕ−ＥＨＰＧ；ベンゾジエチレントリアミン五酢酸（ベンゾ−ＤＴＰＡ）；ジベンゾ−ＤＴＰＡ；フェニル−ＤＴＰＡ、ジフェニル−ＤＴＰＡ；ベンジル−ＤＴＰＡ；ジベンジルＤＴＰＡ；ビス−２（ヒドロキシベンジル）−エチレン−ジアミン二酢酸（ＨＢＥＤ）およびその誘導体；Ａｃ−ＤＯＴＡ；ベンゾ−ＤＯＴＡ；ジベンゾ−ＤＯＴＡ；１，４，７−トリアザシクロノナンΝ，Ν’，Ν’’−三酢酸（ＮＯＴＡ）；ベンゾ−ＮＯＴＡ；ベンゾ−ＴＥＴＡ、ベンゾ−ＤＯＴＭＡ（ここで、ＤＯＴＭＡは、１，４，７，１０−テトラアザシクロテトラデカン−１，４，７，１０−テトラ（メチル四酢酸）である）、ベンゾ−ＴＥＴＭＡ（ここで、ＴＥＴＭＡは、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−１，４，８，１１−（メチル四酢酸）である）；１，３−プロピレンジアミン四酢酸（ＰＤＴＡ）の誘導体；トリエチレンテトラミン六酢酸（ＴＴＨＡ）；１，５，１０−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−トリス（２，３−ジヒドロキシベンゾイル）−トリカテコラート（ＬＩＣＡＭ）の誘導体；および１，３，５−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−トリス（２，３−ジヒドロキシベンゾイル）アミノメチルベンゼン（ＭＥＣＡＭ）、または他の金属キレート剤を含む。
【０１１７】
一定の実施形態では、ナノコンジュゲートは、１つを超えるキレート剤を含む。
【０１１８】
一定の実施形態では、放射性同位体−キレート剤ペアは、８９Ｚｒ−ＤＦＯである。一定の実施形態では、放射性同位体−キレート剤ペアは、１７７Ｌｕ−ＤＯＴＡである。一定の実施形態では、放射性同位体−キレート剤ペアは、２２５Ａｃ−ＤＯＴＡである。
【実施例】
【０１１９】
実験例
ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットのキレート剤なしでのジルコニウム−８９放射性標識
ナノ粒子ベースのキレート剤なしでの放射性標識は、ここ数年の間に、特に、適切なキレート剤を現在利用できない放射性同位体（例えば、ヒ素−７２［７２Ａｓ、ｔ１／２＝２６時間］、ゲルマニウム−６９［６９Ｇｅ、ｔ１／２＝３９．１時間］）、およびチタン−４５［４５Ｔｉ、ｔ１／２＝３．８時間］３６）のための内因性放射性標識技術として出現した。
【０１２０】
さらなる表面修飾工程の導入によって粒子の流体力学半径を増加させることができ、次いで、腎クリアランスを低減または消失させ、その一方、高い肝臓への取り込みを促進し得るので、超小型の腎クリアランス可能なナノ粒子のためのキレート剤なしでの放射性標識技術の開発は特に関心が寄せられている。各ナノ粒子の表面上（または内側の）の内因性のシラノール基（−Ｓｉ−ＯＨ）の存在により、シリカは、種々の放射性金属（８９Ｚｒが含まれる）を使用して首尾の良いキレート剤なしで標識するための最も多用途のナノプラットフォームのうちの１つであることが知られている。
【０１２１】
いかなる理論にも拘束されることを望まないが、標識機序は、ハードルイス酸（すなわち、８９Ｚｒ４＋の放射性金属）とハードルイス塩基（例えば、シリカ表面由来の脱プロトン化シラノール基（−Ｓｉ−Ｏ−））との間の強力な相互作用に起因すると考えられる。シラン−ＰＥＧを使用した表面ＰＥＧ化工程後に表面シラノール基の大部分がクエンチされるが、各微小孔性Ｃ’ドット由来の内部シラノール基が依然としてキレート剤なしでの８９Ｚｒ標識のために利用できると仮定された。
【０１２２】
そのために、ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットを、キレート剤なしのストラテジーによって８９Ｚｒ４＋を使用して放射性標識した。Ｃ’ドットを合成した。近赤外蛍光Ｃｙ５色素を、Ｃ’ドットのシリカマトリックスに共有結合封入し（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ）、それにより、Ｃ’ドットに蛍光特性を付与した；次いで、がんターゲティングｃＲＧＤＹペプチドを、ＰＥＧ化中にＣ’ドットの外面に共有結合で付着させ、能動的腫瘍ターゲティングを可能にした。得られたｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットを、精製し、品質分析に供した（図１Ａ〜１Ｆ）。精製したｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットのＧＰＣエルグラムは、９分あたりに単一のピークを示し、これは、Ｃ’ドットナノ粒子に対応していた（図１Ａ）。ピークは、単一のガウス分布に十分に適合し、これにより、純度が１００％で粒径分布が狭いことが示唆された（図１Ａ）。精製されたｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットの平均流体力学直径は、ＦＣＳによって測定したところおよそ６．４ｎｍ（図１Ｂ）であり、ＴＥＭの所見と一致した（図１Ａ）。粒径に加えて、ＦＣＳから粒子濃度も得られ、この粒子濃度を使用して、粒子（色素、ターゲティングペプチド、および８９Ｚｒ放射性同位体が含まれる）あたりの官能基数を評価した。精製したｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットの紫外可視スペクトルは、６５０ｎｍあたりの波長で強力な吸収を示し、この吸収はＣｙ５蛍光色素の吸収極大に対応していた（図１Ｃ）。ｃＲＧＤＹ表面修飾がないＣ’ドット（ＰＥＧ−Ｃ’ドット）と比較すると、ｃＲＧＤＹペプチド上のチロシン残基に帰せられるさらなる吸収ピークが２７５ｎｍあたりの波長で同定された（図１Ｃ）。紫外可視スペクトルから計算されたＣｙ５およびｃＲＧＤＹの濃度をＦＣＳによって測定されたＣ’ドット濃度で割ることにより、Ｃ’ドットあたりのＣｙ５およびｃＲＧＤＹの数が、それぞれおよそ１．６および２０であると評価された。
【０１２３】
放射性標識手順のために、４ｎｍｏｌの精製されたｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットを、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８）中の１ｍＣｉの８９Ｚｒ−オキサラートと７５℃で混合した。放射化学収率を、放射ＴＬＣ（ｒａｄｉｏ−ＴＬＣ）によってモニタリングした。結果は、最初の１時間以内に、５０％を超える８９Ｚｒ標識収率が達成されることを示した。４時間の放射性標識期間にわたって合計約７５％の８９Ｚｒが粒子に首尾よく結合した（図２Ａ）。標識プロセスは、粒子濃度に依存していた：粒子対８９Ｚｒ（ｎｍｏｌ対ｍＣｉ）比が高いほど、８９Ｚｒ標識収率が高くなった（図２Ａ）。キレート剤なしで８９Ｚｒ標識ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドット（ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−［８９Ｚｒ］Ｃ’ドットと示す）の比放射能は、１００〜５００Ｃｉ／ｍｍｏｌの範囲であることが見出された。
【０１２４】
脱プロトン化シラノール基は、シリカナノ粒子のキレート剤なしでの８９Ｚｒ標識において極めて重要な役割を果たす。ｐＨがシリカの等電点（ｐＨ約２〜３）未満であるとき、Ｃ’ドットの表面シラノール基がプロトン化され、それにより、正電荷の８９Ｚｒとのキレート化には不適切になる。これは、ｐＨ２および７５℃での標識収率が１％未満であるという事実によって明らかであった（図２Ｂ）。キレート剤なしでの８９Ｚｒ標識はまた、温度依存性であることが証明され、標識温度が高いほど８９Ｚｒ標識が速くなった（図２Ｃ）。標識のためのｐＨおよび温度の範囲は、それぞれ、ｐＨ８〜９および５０〜７５℃であることが推奨された。
【０１２５】
脱プロトン化シラノール基の特異的８９Ｚｒ標識をさらに証明するために、ＰＥＧ化後のＣ’ドット表面上の残存シラノール基を、ジエトキシジメチルシランの添加によってクエンチした。得られた修飾ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットは、反応性シラノール基の表面密度がより低くなり、それにより、キレート剤なしでの放射性標識効率が低下した。実際に、この場合において、８９Ｚｒ標識収率のおよそ２５％の低下が観察された（図２Ｄ）。８９Ｚｒ−オキサラートの平均比放射能が約８３３Ｃｉ／ｍｍｏｌの放射化学的純度９９．９％超のジルコニウムであることを考慮すると、ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−［８９Ｚｒ］Ｃ’ドットについてｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットあたり約０．１４〜０．６３８９Ｚｒと評価された（表３）。粒子あたりのＺｒ原子数を、種々の比における非放射能のＺｒ（またはｎａｔＺｒ）での標識によってさらに増加させることができる。図８Ａおよび８Ｂに示すように、モル比１〜１０でｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットをｎａｔＺｒで標識することによってｎａｔＺｒ密度２．２７±０．０８を得ることができる。現在まで、シリカベースのキレート剤なしでの８９Ｚｒ放射性標識は、十分なシラノール基密度（１０５／粒子超）を得るために直径１００ｎｍを超えるナノ粒子にもっぱら焦点を合わせていた。このデータは、表面および内部のシラノール基密度が有意に低下した超小型の（例えば、６〜７ｎｍ）ＰＥＧ化されたシリカナノ粒子のキレート剤なしでの８９Ｚｒ標識が最初に成功した例を示す。
【０１２６】
表３は、キレート剤なしでの放射性標識法のためのＣ’ドットあたりの８９Ｚｒ数の評価を示す。
【表３】
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ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットのキレート剤ベースのジルコニウム−８９放射性標識
【０１２７】
キレート剤ベースの８９Ｚｒ標識を果たすために、ｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−デフェロキサミン（ＤＦＯ−ＮＣＳ、６つの酸素ドナーを提供する）を使用した。最初の試みにおいて、リンカーとしてグルタチオン（ＧＳＨ）を導入し、ＤＦＯ−ＮＣＳコンジュゲーションのためにＣ’ドット表面上のマレイミド基を第一級アミン基に変換することによってＤＦＯキレート剤をマレイミド官能化Ｃ’ドット（ｍａｌ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドット）に結合させた。得られたＧＳＨ修飾ドットを、ＰＤ−１０カラムを使用して最初に精製し、次いで、ＧＨＳアミン基を介してＤＦＯ−ＮＣＳキレート剤とコンジュゲートし、それにより、８９Ｚｒ標識のためのＤＦＯ−ｃＲＧＤＹ  Ｃ’ドットを得た。高い標識収率（８０％超）が得られたが、スクリーニングＰＥＴ研究で全てにおいて８９Ｚｒ−ＤＦＯ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットの高い腸取り込みが観察された（図８Ａ）。いかなる理論にも拘束されることを望まないが、この取り込みは、粒子からの８９Ｚｒ−ＤＦＯ−ＧＳＨの脱離に起因し得る。注射２４時間後に目に見える骨取り込みは認められず、これは、放射性コンジュゲートからの遊離８９Ｚｒの脱離がないことを示していた（図８Ａ）。
【０１２８】
この問題を解決するために、最近開発された挿入によるＰＥＧ化後表面修飾（ＰＰＳＭＩ）方法を使用して、第一級アミン基をＣ’ドット表面に直接結合させた。そのためには、Ｃ’ドットのＰＥＧ化後、アミノ−シラン分子を反応物にさらに添加し、ＰＥＧ層に挿入して、下部のシリカ表面に結合させた。得られたＮＨ２−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットは、ＰＥＧ層下のシリカ表面上に反応性アミン基を含み、例えば、ＮＣＳ官能化ＤＦＯキレート剤をさらにコンジュゲートすることが可能であった。精製後、ＮＨ２−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットは、アミン官能化されていないｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットに類似する良好な製品品質を示した（図１Ｄ〜１Ｅ）。精製されたＮＨ２−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットの平均直径は、およそ６．５ｎｍであった。Ｃ’ドットあたりのＣｙ５およびｃＲＧＤＹペプチドの数は、それぞれ、およそ１．５および１８であると評価された（図１Ｄ〜１Ｅ）。次いで、精製されたＮＨ２−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットを、粒子とＤＦＯ−ＮＣＳとの間の反応モル比１：２０を使用してＤＦＯ−ＮＣＳとコンジュゲートし、その後にＰＤ−１０カラムを使用して精製して、未反応のＤＦＯ−ＮＣＳを除去した。得られたＤＦＯ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットへの８９Ｚｒ−オキサラートの標識を、３７℃で６０分間行った。粒子対８９Ｚｒ比０．４ｎｍｏｌ／１ｍＣｉを使用してほぼ１００％の標識収率が達成された（図２Ｅ）。比放射能は、１３００〜４３００Ｃｉ／ｍｍｏｌの範囲であると評価され、これは、キレート剤なしでの方法を使用して合成した試料の比放射能より有意に高かった。最終８９Ｚｒ−ＤＦＯ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドット生成物において、Ｃ’ドットあたり約１．５９〜５．１４８９Ｚｒと評価された（表４）。粒子あたり利用できるＤＦＯ数を評価するために、合成されたＤＦＯ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットを、最初にｎａｔＺｒで標識し、次いで、マイクロ波プラズマ−原子発光分光法（ＭＰ−ＡＥＳ）を使用してｎａｔＺｒを定量した。結果により、粒子対ＤＦＯ比１：１０の比で合成したＤＦＯ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドット粒子について、Ｃ’ドットあたり平均３．４２±０．１３ｎａｔＺｒ、および１：３０では４．７６±０．１３であることが明らかとなった（図２Ｆ）。いかなる理論にも拘束されることを望まないが、標識中に過剰なｎａｔＺｒを使用し、ＥＤＴＡとのキレート化によって未反応ｎａｔＺｒを除去したので、Ｃ’ドットあたりのｎａｔＺｒ数（約３〜５）は、ＤＦＯ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットあたりの利用できるＤＦＯ数に等しいはずである。引き続くパイロットＰＥＴ画像化研究では、開発当時の８９Ｚｒ−ＤＦＯ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットを使用することによって腸取り込みが有意に低下したことを示した（図８Ｂ）。
【０１２９】
表４は、キレート剤ベースの放射性標識方法についてのＣ’ドットあたりの８９Ｚｒ数の評価を示す。
【表４】
2020520953.tif 000007
８９Ｚｒ標識ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットの放射線安定性および血液循環半減時間
【０１３０】
次に、２つの８９Ｚｒ標識ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットのｉｎ  ｖｉｔｒｏ安定性、ｉｎ  ｖｉｖｏ放射線安定性、および血液循環半減期を調査した。ＰＥＴでは放射性同位体のみが検出されるが、ナノ粒子は検出されないので、放射線安定性が高い放射性標識されたナノ粒子の開発は重要である。両方の８９Ｚｒ標識ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットを合成し、ＰＤ−１０カラムを使用して精製した。図９Ａおよび９Ｂは、ＰＤ−１０カラムにおける両方の８９Ｚｒ標識ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットの代表的な溶出プロフィールを示す。２．５ｍＬから４．０ｍＬまでの画分を、引き続く研究のために回収した。
【０１３１】
結果は、室温で一週間にわたるリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の安定性が両方の８９Ｚｒ標識ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットで類似していることを示した。８９Ｚｒ−ＤＦＯ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットは、９５％超の純度では１週間後でさえもわずかにより良好な安定性を示し、一方、ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−［８９Ｚｒ］Ｃ’ドットの純度は９０％未満であった（図３Ａ）。マウス血漿中のインタクトな８９Ｚｒ標識ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットの百分率の測定後に、ｉｎ  ｖｉｖｏでの放射線安定性の有意差が認められた。図３Ｂに示すように、放射ＴＬＣに基づいて、注射４８時間後のマウス血漿中のインタクトな８９Ｚｒ−ＤＦＯ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットは９８％超と評価され、一方、ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−［８９Ｚｒ］Ｃ’ドットを注射したマウスについては７５％未満であり、これは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−［８９Ｚｒ］Ｃ’ドットの循環中の遊離８９Ｚｒの離脱を示す。ｉｎ  ｖｉｖｏ生体内分布および骨取り込みの相違についてのさらなる考察を、以下の節に示す。
【０１３２】
血液循環半減時間を評価するために、８９Ｚｒ標識ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットを静脈内（ｉ．ｖ．）注射したマウス由来の血液を、種々の注射後の時点で試料採取し、ガンマカウンティングによってアッセイした（ｎ＝３）。血液取り込み値を、グラムあたりの注射線量の百分率（％ＩＤ／ｇ）に変換し、２−コンパートメントモデルに適合させた。図３Ｃおよび３Ｄに示すように、結果は、約１５時間というかなり等しいｉｎ  ｖｉｖｏ血液循環半減時間を示唆し、この半減時間は、旧世代の放射性ヨウ素標識粒子について以前に公開されたものより高かった（表１）。
８９Ｚｒ標識ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットを使用した動的ＰＥＴ画像化
【０１３３】
ＰＥＴは、種々のタイプの放射性標識プローブの薬物動態（ＰＫ）をｉｎ  ｖｉｖｏで非侵襲性かつ高感度に定量的に追跡するのに適切な分子イメージング様式である。組織透過深度に制限されるので、光学的画像化がｉｎ  ｖｉｖｏでの全身スクリーニングおよび組織内の粒子分布の定量には一般に適切でないことが周知である。特に初期の注射後期間での全身に注射されたＣ’ドットの分布および迅速な腎クリアランスを追跡するために、代表的なマウス（２つの８９Ｚｒ標識ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットプローブのうちの１つを注射した各マウス）において６０分間の動的ＰＥＴ画像化研究を行った。図４Ａおよび４Ｂに示すように、最大輝度投影法（ＭＩＰ）画像は、ｉ．ｖ．注射直後のマウス心臓において８９Ｚｒ標識ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットの顕著な放射能を示す。両方の場合において心臓の放射能の漸減が認められ、全放射能濃度は、ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−［８９Ｚｒ］Ｃ’ドットを注射したマウスについては注射６０分後に２０．５％ＩＤ／ｇであり（図４Ｃ）、８９Ｚｒ−ＤＦＯ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットを注射したマウスについては１９．３％ＩＤ／ｇである（図４Ｄ）と評価された。肝臓取り込みについて類似の傾向が認められ、両方のプローブの注射６０分後の取り込み値は約６．５％ＩＤ／ｇと評価された。注射５分後という早期に有意な腎臓および膀胱取り込みが認められ、この取り込みはＭＩＰ画像および時間−放射能曲線の両方で認められ、両方の８９Ｚｒ標識ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットプローブの腎クリアランス能が明確に強調された。
ｉｎ  ｖｉｖｏ薬物動態学的および放射線量測定研究。
【０１３４】
種々の注射後の時点でマウスを屠殺し、目的の臓器を採取し、秤量し、アッセイする（すなわち、５、２４、および７２時間、表５および６、図５Ａ〜５Ｃ）ことによって、主要臓器内の両方の８９Ｚｒ標識ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットの取り込みを調査するための詳細な生体内分布研究を行った。
【０１３５】
表５は、種々の注射後時点でｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−［８９Ｚｒ］Ｃ’ドットを注射したマウスの臓器取り込みを示す。
【表５】
2020520953.tif 000008
【０１３６】
表６は、種々の注射後時点で８９Ｚｒ−ＤＦＯ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットを注射したマウスの臓器取り込みを示す。
【表６】
2020520953.tif 000009
【０１３７】
動的ＰＥＴ画像化研究で明らかなように（図４Ａ〜４Ｄ）、生体内分布研究により、血液区画中の両方の８９Ｚｒ標識ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットプローブの有意な放射能が確認された（図５Ａおよび５Ｂ）。血漿放射能濃度は、全血の２倍であった（図１０）。早期注射後時点での尿取り込みはマウスごとに変動し、１０％ＩＤ／ｇ未満から２０％ＩＤ／ｇ超の範囲であった。合計で６０〜７０％ＩＤの８９Ｚｒ標識ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットプローブが、本研究において注射７２時間後以内にクリアランスされた。通常は顕著な肝臓取り込み（例えば、３０〜９９％ＩＤ）が明らかな１０ｎｍを超えるサイズのナノ粒子についての代表的所見とは対照的に、両方の８９Ｚｒ標識ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットプローブは、肝臓取り込みが有意に低かった（５％ＩＤ／ｇ未満または２〜５％ＩＤ）。興味深いことに、超小型量子ドットまたはＡｕナノ粒子などの別の腎クリアランス可能な粒子と比較したとき、８９Ｚｒ標識ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットはまた、注射後の早期の時点での有意に低い腎臓取り込みを示した（１／５〜１／１０）（例えば、図５Ａ〜５Ｃに示すように、２〜４％ＩＤ／ｇ）。
【０１３８】
２つの８９Ｚｒ標識ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットプローブの間で全骨取り込みの顕著な相違が認められた。ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−［８９Ｚｒ］Ｃ’ドットについて、それぞれ、ｉ．ｖ．注射の２４時間および７２時間後の時点で、値は５および１０％ＩＤ／ｇを超えて増加し始めた（図５Ｃに示す、ｐ＜０．００５）。かかる高骨取り込みは、ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−［８９Ｚｒ］Ｃ’ドットプローブの骨髄蓄積を反映しない可能性があるが、むしろ、ｉｎ  ｖｉｖｏでの比較的低い放射線安定性に起因してｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−［８９Ｚｒ］Ｃ’ドットからの遊離８９Ｚｒ４＋の脱離が進行中であることを示す（図３Ｂ）。図１０に示すように、遊離８９Ｚｒ４＋は、骨無機質内に容易に固着し得る骨親和性カチオンである。骨取り込みの経時変化のモニタリングはまた、８９Ｚｒ標識ナノプローブのｉｎ  ｖｉｖｏ安定性を研究するための最良の方法のうちの１つと証明された。注射前にＥＤＴＡ負荷を使用してｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−［８９Ｚｒ］Ｃ’ドットからあまり十分にキレート化されなかった表面８９Ｚｒを除去することによってｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−［８９Ｚｒ］Ｃ’ドットの骨取り込みを低下させる試みにより、骨取り込みを最小にする効果がわずかしかないことが証明された。一晩のＥＤＴＡ負荷（条件：１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、３７℃、６５０ｒｐｍで振盪、図１２Ｃ）後でさえも骨取り込みの減少は、たった約２０％であった。図１２Ｂ中のＰＥＴ画像化では、さらなるＥＤＴＡ負荷プロセスに供したｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−［８９Ｚｒ］Ｃ’ドットの明白かつ持続的な骨および関節の取り込みが明らかである。さらに、マウス骨からの８９Ｚｒのクリアランスは、ゆっくりであり、１週間後に有意な減少にないことが見出された（図１３）。骨中の放射性８９Ｚｒ４＋の蓄積が過剰に保持されるとこの区画（特に、放射線感受性組織）への放射線量が増加し得るので、臨床移行が妨害される可能性がある。
【０１３９】
７０ｋｇの標準人における平均臓器吸収線量および実効線量を評価するために、両方の８９Ｚｒ標識ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットプローブの線量測定値の計算を、図５Ａ〜５Ｃに示す生体内分布データに基づいて、ＯＬＩＮＤＡコンピュータプログラム（ｍＳｖ／ＭＢｑで示した線量が得られる）を使用して行った。表７は、両方の８９Ｚｒ標識ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットプローブについてのヒトにおける推定組織吸収線量を比較している。表７は、ＯＬＩＮＤＡ線量測定プログラムを使用して評価した７０ｋｇ標準人における８９Ｚｒ標識ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットの放射線量測定を示す。
【表７−１】
2020520953.tif 000010
【表７−２】
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【０１４０】
赤色髄におけるキレート剤なしでの８９Ｚｒ標識ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットについての吸収線量（０．０８４ｍＳｖ／ＭＢｑ）は、キレート剤ベースのｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−［８９Ｚｒ］Ｃ’ドットについての吸収線量（０．０６２ｍＳｖ／ＭＢｑ）と比較したときにわずかに高かった。ヒト肝臓における両方の８９Ｚｒ標識ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットプローブについての吸収線量は約０．１ｍＳｖ／ＭＢｑと評価され、これは、８９Ｚｒ−ＤＦＯ−トラスツズマブについての以前に評価された値（肝臓取り込みは約１２％ＩＤであり、肝臓における平均評価吸収線量は１．５４ｍＳｖ／ＭＢｑであった）のわずか１／１０であった。小動物研究において有意により高い骨取り込みが認められたにもかかわらず、７０ｋｇ標準人における放射線量測定での評価は、キレート剤なしでの８９Ｚｒ標識ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−［８９Ｚｒ］Ｃ’ドット生成物について、全身線量および実効線量の両方がわずかしか増加しない（２０％未満）ことを示した。まとめると、ｉｎ  ｖｉｖｏ薬物動態学研究において、注射から最初の２４時間後以内の８９Ｚｒ標識ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットプローブの腎クリアランスおよび血液循環の延長が確認された。全ての主要臓器、特に肝臓、脾臓、および腎臓は、研究期間を通して取り込みが非常に小さかった（５％ＩＤ／ｇ未満）。キレート剤なしでの８９Ｚｒ標識ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットプローブとキレート剤ベースの８９Ｚｒ標識ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットプローブとの間の大きな違いは、注射２４時間後の前者のｉｎ  ｖｉｖｏ放射線安定性がより低く、骨取り込みが有意により高い（２〜４倍）ことである。しかし、放射線量測定分析は、両方の８９Ｚｒ標識ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットプローブについて好ましい全身線量および実効線量を示し、十分に特徴づけられたインテグリンαｖβ３を発現するヒト黒色腫異種移植片モデルにおける両方の放射性標識されたナノプローブのｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍特異的ターゲティングの調査が奨励される。
ＰＥＴ画像化によるｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍ターゲティング
【０１４１】
本明細書中に記載のように、細網内皮系（ＲＥＳ）への低い非特異的蓄積を維持しながら全身投与後に目的の標的に能動的に局在する「ターゲットまたはクリア」多機能ナノ粒子プラットフォームをデザインすることは、ナノ医薬分野における大きな課題の１つであり続けている。表１は、腎クリアランスおよびｉｎ  ｖｉｖｏ能動的腫瘍ターゲティング能力の両方を示す超小型ナノ粒子の現在の研究状況を列挙している。
【０１４２】
図６Ａ〜６Ｊに示すように、［８９Ｚｒ］ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドット（図６Ａ）および８９Ｚｒ−ＤＦＯ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドット（図６Ｂ、６Ｃ）を注射したマウスについての２時間の最大輝度投影法（ＭＩＰ）画像において、有意な膀胱放射能が認められた。心臓取り込みが高く（約２０％ＩＤ／ｇ）、これは、血液区画中の８９Ｚｒ標識ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットの循環を明確に示していた。図６Ｄ〜６Ｆに示す時間−放射能曲線は、血中の８９Ｚｒ標識ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットのクリアランスを示し、取り込み値は注射２４時間および７２時間後でそれぞれ約５〜６％ＩＤ／ｇおよび１〜２％ＩＤ／ｇと評価された。ＲＥＳ臓器（例えば、肝臓）による８９Ｚｒ標識ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットのクリアランスは、注射２時間後にたった５〜６％ＩＤ／ｇであると評価され、３日後に４〜５％ＩＤ／ｇまでわずかに減少した；これらの値は、１０ｎｍを超える粒子について以前に報告された値より顕著に低い。脾臓取り込みは、３日間の経過にわたって肝臓取り込みで見出された取り込みのたった半分であることが見出された。筋肉取り込みは、約１％ＩＤ／ｇの低さであることが見出された。いかなる理論にも拘束されることを望まないが、かかる主要な腎クリアランス、有意に低下したＲＥＳ取り込み、筋肉における非常に低いバックグラウンド放射能レベル、および約１５時間という適切な血液循環半減時間は、従って有意に増強された腫瘍対バックグラウンド比が達成可能であることを示唆している。
【０１４３】
図６Ａ〜６Ｂに示すように、ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−［８９Ｚｒ］Ｃ’ドット（図６Ａ、１０．１±２．１％ＩＤ／ｇ）および８９Ｚｒ−ＤＦＯ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドット（図６Ｂ、１０．５±４．０％ＩＤ／ｇ）の両方を注射したマウスにおいて、注射２時間後に高いＭ２１（αｖβ３陽性）腫瘍取り込みが認められた。腫瘍取り込みは、注射２４時間後にピークとなり、それぞれ約１０．７±１．３％ＩＤ／ｇおよび１２．０±１．４％ＩＤ／ｇまでさらに僅かに増加した（図６Ｇ）。１２４Ｉで標識した第１世代のＣドット（ｃＲＧＤＹリガンド密度：約６）（最大Ｍ２１腫瘍取り込み：注射４時間後に約２％ＩＤ／ｇ）と比較したとき、腫瘍取り込みは５倍超に増強したと評価された。両方のタイプの８９Ｚｒ標識ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットを注射したＭ２１担癌マウスにおいて、７２時間の試験期間にわたって粒子放射能の（低いウォッシュアウト率のみでの）保持が認められた（図６Ｄおよび６Ｅ）。キレート剤なしで８９Ｚｒ標識ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットを注射したマウスは、遊離８９Ｚｒの脱離ならびに骨、関節、および脊椎内へのその蓄積を示し（図６Ａ、１４Ａ〜１４Ｂ）、一方で、８９Ｚｒ−ＤＦＯ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットを注射したマウスにおいて骨および関節内への取り込みが有意に低下した（図６Ｂ、１４Ａ〜１４Ｂ）。
【０１４４】
８９Ｚｒ標識ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットの標的特異性をさらに証明するために、８９Ｚｒ−ＤＦＯ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットの注射後にＭ２１−Ｌ担癌マウス（αｖβ３陰性）において対照研究を行った。図６Ｃ、６Ｆ、および１５に示すように、主要臓器（膀胱、心臓、肝臓、および筋肉など）における所見は類似の粒子分布を示し、Ｍ２１−Ｌ腫瘍中の取り込みが有意に低かった（平均２〜３％ＩＤ／ｇ）。ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−［８９Ｚｒ］Ｃ’ドットまたは８９Ｚｒ−ＤＦＯ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットのいずれかを注射したマウスについて、腫瘍取り込みの絶対値や腫瘍対臓器比に有意差は認められなかった（図６Ｇ〜６Ｊ、１５）。８９Ｚｒ−ＤＦＯ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットを注射したマウスについて、注射７２時間後に最も高い腫瘍対血液比および腫瘍対筋肉比は、それぞれ６．４±２．６および９．６±２．５であると評価され、これは、Ｍ２１−Ｌ担癌マウスにおける対応する比（腫瘍対血液：１．５±０．６；腫瘍対筋肉：２．８±０．７、図６Ｈおよび６Ｊ）の３〜４倍である。最後に、高い腫瘍取り込みおよび低いＲＥＳ蓄積に基づいて、ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−［８９Ｚｒ］Ｃ’ドットまたは８９Ｚｒ−ＤＦＯ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットを注射したＭ２１担癌マウスにおいて約２（または２を超える）またはそれより高い腫瘍対肝臓比が認められ（図６Ｉ）、これは、８９Ｚｒ標識ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットプローブと他の腫瘍ターゲティングナノ粒子とが区別される固有の特徴の１つである。まとめると、αｖβ３インテグリンを発現する黒色腫異種移植片モデルにおける８９Ｚｒ標識ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットの腎クリアランスおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの特異的な能動的ターゲティングが証明された。
【０１４５】
超小型の腎クリアランス可能なｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットの放射性標識における課題に取り組むために、２つの８９Ｚｒ−放射性標識ストラテジーを開発し、その生物学的特性および線量測定特性に基づいて比較した。両方のナノプローブについて類似のｉｎ  ｖｉｔｒｏ放射線安定性が認められたが、キレート剤ベースの放射性標識は、ｉｎ  ｖｉｖｏ放射線安定性がキレート剤なしでの調製物よりも有意に高いことが示された。ＰＫ研究およびＰＥＴ画像化評価の両方により、両方の生成物についての腎クリアランス、低ＲＥＳ蓄積、腫瘍取り込みの増強、および高い標的対バックグラウンド比が、αｖβ３インテグリンを発現する黒色腫異種移植片モデルにおいて非侵襲性に観察された。これら全てにより、全身を標的としたがんの画像化（または処置）のためのこれらの新規の「ターゲットまたはクリア」の８９Ｚｒ標識ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットトレーサがヒト被験体へ良好に移行可能であることが示唆される。
ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットおよびアミン官能化ＮＨ２−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットの合成、精製、および特徴づけ
【０１４６】
ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットの合成は、公知のプロトコール（例えば、米国特許出願公開第２０１４０２４８２１０Ａ１号として公開された米国特許出願第１４／２１５，８７９号（その内容全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）に従い、一方で、ＮＨ２−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットの合成には、挿入によるＰＥＧ化後表面修飾アプローチ（Ｍａ，Ｋ．；Ｗｉｅｓｎｅｒ，Ｕ．，Ｍｏｄｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  Ｐｏｓｔ−ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｂｙ  Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  Ｅｎａｂｌｉｎｇ  Ｐｅｎｔａ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｕｌｔｒａｓｍａｌｌ  Ｏｒｇａｎｉｃ−Ｓｉｌｉｃａ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１７、提出中（その内容全体が本明細書中で参考として援用される））を使用した。ＰＥＧ化後のＮＨ２−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドット上の残存シラノール基を、強い撹拌下での濃度７．３ｍＭの合成物へのジエトキシジメチルシラン（ＤＥＤＭＳ）の付加によってさらに末端処理した。反応溶液を室温で一晩強く撹拌し、その後に粒子を精製した。アミノ化粒子の残りの合成は、ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットと類似のプロトコールにしたがった。異なるＣ’ドットのための精製方法および特徴づけ方法（ＧＰＣ精製、ならびにＴＥＭ、ＦＣＳ、および紫外可視での測定が含まれる）は、本明細書中に記載されている。
ＤＦＯ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃｙ５−Ｃ’ドットのワンポット合成
【０１４７】
さらに、例えば、図１７に示すように、ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットおよび／またはＮＨ２−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットを、ワンポット合成技術を使用して合成することができる。化学分野で、ワンポット合成技術は、化学反応の効率を改善することができる。例えば、１つまたは複数の反応物を、たった１つの反応器中での連続的な化学反応に供し、それにより、化学反応効率を改善する。図１７中の概略図に示すように、ｃＲＧＤＹ−Ｃ’ドットをアミン−シランと接触させてアミン−ｃＲＧＤＹ−Ｃ’ドットを作製する。次いで、アミン−ｃＲＧＤＹ−Ｃ’ドットを同一の「ポット」中でＤＦＯ−ＮＣＳと接触させて、ＤＦＯ−ｃＲＧＤＹ−Ｃ’ドットを生成する。
【０１４８】
ＤＦＯ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃｙ５−Ｃ’ドットを、ワンポット水系合成プロトコールを使用して生成した（例えば、図１７に示す）。１７．２μｍｏｌのＮＨＳエステル／マレイミド官能化ヘテロ官能性ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（ｍａｌ−ＰＥＧ−ＮＨＳと呼ばれる）を、７４．５μＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に最初に溶解し、次いで、１５．５μｍｏｌの（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン（アミン−シラン）と窒素下の室温で混合した。次いで、反応混合物を、窒素下の室温で２日間静置して、ＮＨＳエステル−アミン反応を介してｍａｌ−ＰＥＧ−ＮＨＳをアミン−シランとコンジュゲートし、それにより、ｍａｌ−ＰＥＧ−シランコンジュゲートが形成された。その後に、１８．９μｍｏｌのシクロ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ）ペプチド（ｃＲＧＤＹ）を９００μＬ  ＤＭＳＯに溶解し、次いで、ｍａｌ−ＰＥＧ−シランの反応溶液中に窒素下の室温で添加した。次いで、反応混合物を窒素下の室温で一晩静置して、チオール−エン反応によってｃＲＧＤＹペプチドのシステイン残基上のチオール基とｍａｌ−ＰＥＧ−シランをさらにコンジュゲートし、それにより、ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−シランコンジュゲートを形成した。同時に、１．３μｍｏｌのマレイミド官能化Ｃｙ５色素（Ｃｙ５−ｍａｌ）を１００μＬ  ＤＭＳＯに最初に溶解し、次いで、２８．４μｍｏｌの（３−メルカプトプロピル）トリメトキシシラン（チオール−シラン）と混合して、チオール−エン反応によってＣｙ５−ｍａｌをチオール−シランとコンジュゲートし、それよりＣｙ５−シランコンジュゲートを形成した。
【０１４９】
次の工程では、２０４μＬのテトラメチルオルトシリケート（ＴＭＯＳ液体）および前の工程で調製した全てのＣｙ５−シランコンジュゲートを、３０ｍＬの水酸化アンモニウム水溶液（水酸化アンモニウム濃度は０．００６Ｍであった）中に強く撹拌しながら室温で添加した。反応溶液を室温で一晩強く撹拌して、シラン加水分解および縮合を介してシリカナノ粒子を生成し、ここで、Ｃｙ５色素が共有結合封入された。次に、前の工程で調製したｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−シランコンジュゲートを、反応混合物中に強く撹拌しながら室温で添加し、その後に３００μＬのシラン官能化一官能性ＰＥＧ（ＰＥＧ−シラン液体）を添加した。その後に、反応溶液を、室温で一晩強く撹拌した。次いで、反応溶液を８０℃で一晩静置して、シラン縮合を介したシリカナノ粒子表面へのＰＥＧ−シランおよびｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−シランの共有結合をさらに強化した。反応溶液の室温への冷却後、シリカナノ粒子を十分にＰＥＧ化し、それにより、ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃｙ５−Ｃ’ドットが形成された。
【０１５０】
次に、８．６μｍｏｌの（３−アミノプロピル）トリメトキシシラン（アミン−シラン）を、ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃｙ５−Ｃ’ドットの反応溶液中に室温で強く撹拌しながらさらに添加した。次いで、反応溶液を室温で一晩強く撹拌して、シランの加水分解および縮合を介してアミン−シラン分子をＰＥＧ層下のｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃｙ５−Ｃ’ドットのシリカ表面上の残存シラノール基にさらに共有結合で付着させた。その後に、１７μｍｏｌのＮ−クロロスクシンイミド官能化デフェロキサミン（ＤＦＯ−ＮＣＳ）を７５０μＬ  ＤＭＳＯに最初に溶解し、次いで、反応溶液中に室温で強く撹拌しながら添加した。次いで、反応溶液を室温で一晩強く撹拌して、ＮＣＳ−アミン反応を介してＣ’ドットのＰＥＧ層下のアミン基にＤＦＯ−ＮＣＳを共有結合で付着させ、その結果、粒子あたりおよそ４分子のＤＦＯが得られた。ＤＦＯ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃｙ５−Ｃ’ドットをＧＰＣによって精製し、滅菌シリンジフィルターで濾過し、４℃で保存した。次いで、ＤＦＯ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃｙ５−Ｃ’ドットを、８９Ｚｒで放射性標識し、それにより、８９Ｚｒ−ＤＦＯ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃｙ５−Ｃ’ドットが形成された。
【０１５１】
官能化アミノ化ナノ粒子の作製方法のさらなる説明は、２０１７年５月１９日出願のＷｉｅｓｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許出願第６２／５０８，７０３号（その内容全体が本明細書中で参考として援用される）に記載されている。
８９Ｚｒ−オキサラート生成。
【０１５２】
８９Ｚｒを、Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｓｌｏａｎ  Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  ＣｅｎｔｅｒにてＴＲ１９／９サイクロトロン（Ｅｂｃｏ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）で８９Ｙ（ｐ，ｎ）８９Ｚｒ反応によって生成し、精製して、ジルコニウムの比放射能が５．２８〜１３．４３ｍＣｉ／μｇ（４７０〜１１９５Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の８９Ｚｒを得た。ＣＲＣ−１５Ｒ  Ｄｏｓｅ  Ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ（Ｃａｐｉｎｔｅｃ）を使用して、放射能を測定した。放射能の定量のために、実験試料を、自動Ｗｉｚａｒｄ２γ−カウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）でカウントした。全てのｉｎ  ｖｉｖｏ実験を、Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｓｌｏａｎ  Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認されたプロトコール（プロトコール番号８６−０２−０２０）にしたがって行った。放射ＴＬＣを使用して、全ての８９Ｚｒ標識ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットの純度が９５％超であることが確認された。
ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットのキレート剤なしでの８９Ｚｒ放射性標識。
【０１５３】
ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットのキレート剤なしでの８９Ｚｒ標識のために、４ｎｍｏｌのｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドット（マレイミド基で表面を官能化）を、１ｍＣｉの８９Ｚｒ−オキサラートを含むＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８）と７５℃で混合した。ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットの放射性標識収率を、サリチル酸浸透インスタント薄層クロマトグラフィペーパー（ＩＴＬＣＳＡ）（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してモニタリングし、Ｗｉｎｓｃａｎ  放射ＴＬＣソフトウェア（Ｂｉｏｓｃａｎ  Ｉｎｃ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ）を使用したＢｉｏｓｃａｎ  ＡＲ−２０００  放射ＴＬＣプレートリーダーまたは自動Ｗｉｚａｒｄ２γ−カウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）のいずれかで解析した。インキュベーション後、５μＬアリコートを抜き取り、５０μＬのＥＤＴＡ（５０ｍＭ、ｐＨ５〜６）と混合後、移動相溶媒としてＥＤＴＡ（５０ｍＭ、ｐＨ５〜６）を使用したＩＴＬＣによって分析した。遊離８９Ｚｒは即時にＥＤＴＡと錯体を形成し、溶媒を用いて溶出され、一方で、８９Ｚｒ標識ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットは元のままであった。より正確な定量のために、ストリップを半分に切断し、９０９ｋｅＶでのγ線放射を、較正γ−カウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）にて８００〜１０００ｋｅＶの動的エネルギーウィンドウを使用してカウントした。ｐＨ、濃度、および温度依存性のｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットのキレート剤なしでの標識を研究する場合に、類似の手順を採用した。キレート剤なしでの８９Ｚｒ標識ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットの比放射能は、１００〜５００Ｃｉ／ｍｍｏｌの範囲であることが見出された。
ＤＦＯ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットの合成およびキレート剤ベースの８９Ｚｒ標識
【０１５４】
キレート剤ベースの８９Ｚｒ標識技術を、アミン官能化ＮＨ２−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットをＤＦＯ−ＮＣＳ（モル比は１：２０であった）と室温、ｐＨ８〜９、および６４０ｒｐｍで振盪しながら１〜２時間反応させることによって採用した。次いで、合成されたＤＦＯ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットを、移動相としてリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を使用して粒子をＰＤ−１０カラムに通過させることによって精製した。キレート剤ベースの８９Ｚｒ標識のために、次いで、０．２〜０．７５ｎｍｏｌのＤＦＯ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットを、１ｍＣｉの８９Ｚｒ−オキサラートを含むＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８）と３７℃で６０分間混合し；最終標識ｐＨを７〜７．５に維持した。標識収率を、本明細書中に記載のようにモニタリングした。ＥＤＴＡ負荷プロセスを導入して、任意の非特異的に結合した８９Ｚｒを除去した。次いで、合成した８９Ｚｒ−ＤＦＯ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットを、ＰＤ−１０カラムを使用して精製した。最終放射化学的純度を、ＩＴＬＣを使用して測定した。比放射能は、１３００〜４３００Ｃｉ／ｍｍｏｌの範囲であることが見出された。
ＤＦＯ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットあたりのｎａｔＺｒ数のＭＰ−ＡＥＳ定量
【０１５５】
ＤＦＯ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットあたりのｎａｔＺｒ数を定量するために、０．７５ｎｍｏｌのＤＦＯ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットを、過剰なｎａｔＺｒＣｌ４（１５ｎｍｏｌ）と３７℃で６０分間混合した。最終標識ｐＨを、７〜７．５に維持した。標識後、混合物をＥＤＴＡと合わせ、３０分超インキュベートして、任意の非特異的ｎａｔＺｒＣｌ４を排除した。次いで、試料をＰＤ−１０カラムで精製した。次いで、標識されたｎａｔＺｒの総量を、マイクロ波プラズマ−原子発光分光法（ＭＰ−ＡＥＳ）を使用して測定した。ＤＦＯ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットあたりのｎａｔＺｒ数を、以下の式によって計算した：
【数１】
2020520953.tif 000012
【０１５６】
いかなる理論にも拘束されることを望まないが、過剰なｎａｔＺｒＣｌ４を標識のために使用したので、ｎａｔＺｒ−ＤＦＯ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットあたりのｎａｔＺｒ数は、ＤＦＯ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットあたりの利用できるＤＦＯ数にほぼ等しいはずである。
血液循環半減時間の評価。
【０１５７】
両方の８９Ｚｒ標識ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットプローブの血液循環半減時間を評価するために、健康なマウス（ｎ＝３）に、放射性粒子を静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。種々の注射後時点で採血し、これらの放射性試料を、自動Ｗｉｚａｒｄ２γ−カウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用してカウントした。血液取り込み値を、グラムあたりの注射線量の百分率（％ＩＤ／ｇ）として示し、２−コンパートメントモデルに適合させた。
ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ放射線安定性研究。
【０１５８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ放射線安定性を研究するために、両方のキレート剤なしでの８９Ｚｒ標識ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットおよびキレート剤ベースの８９Ｚｒ標識ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットを、ＰＢＳ（１×）中にて室温で保持した。放射化学的純度を、合成終了（ＥＯＳ）から種々の時点でＩＴＬＣによって１週間にわたって測定した。ｉｎ  ｖｉｖｏ放射線安定性のために、健康なマウスに、約２００μＣｉ（約７．４ＭＢｑ）のキレート剤なしでの（またはキレート剤ベースの）８９Ｚｒ標識ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットを注射した。全血を注射２、２４、および４８時間後に回収し、血漿画分を、８０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって赤血球から単離した。次いで、インタクトな８９Ｚｒ標識ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットの百分率を、Ｗｉｎｓｃａｎ  放射ＴＬＣソフトウェア（Ｂｉｏｓｃａｎ  Ｉｎｃ．、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＤＣ）を使用してＢｉｏｓｃａｎ  ＡＲ−２０００  放射ＴＬＣプレートリーダーで分析したプレートを用いＩＴＬＣを使用して測定した。
動物モデルおよび腫瘍接種：
【０１５９】
全ての動物実験を、Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｓｌｏａｎ−Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒの施設内動物管理使用委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認されたプロトコールに従って行い、動物福祉のためのＮＩＨガイドラインを遵守した。Ｍ２１およびＭ２１−Ｌ異種移植片を、等量の細胞（約５×１０６細胞／１００μＬ）の共注射（ｃｏ−ｉｎｊｅｃｔｉｎｇ）によって生成し、雌無胸腺ｎｕ／ｎｕマウス（６〜８週齢、Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ  Ｉｎｃ．）の後肢にＭａｔｒｉｇｅｌを皮下注射した。２００ｍｍ３の平均腫瘍容積を、全ての研究のために使用した。
線量測定。
【０１６０】
各組織から得られた時間−放射能曲線を解析的に積分して（放射能崩壊を説明する）、対応する累積放射能を得た。次いで、臓器吸収線量を、累積放射能に非透過性放射線（陽電子）についての８９Ｚｒ平衡線量定数を掛け、かかる照射の完全な局所吸収を想定し、そして透過性放射線（すなわち、γ線）の寄与を無視することによって計算した。マウスとヒト（７０ｋｇ標準人を想定）との間の総体重および臓器質量の相違を考慮することによって、マウスの正常な臓器累積放射能をヒトの正常な臓器累積放射能に変換した。ヒト正常臓器累積放射能の計算値をＯＬＩＮＤＡ線量測定プログラムに入力して、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｄｏｓｉｍｅｔｒｙ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅの形式を使用して標準ヒト臓器吸収線量を計算した。このヒト線量測定モデルは、「正常な」（すなわち、腫瘍のない）解剖学的モデルである。
ｉｎ  ｖｉｖｏ静的ＰＥＴ、動的ＰＥＴ画像化、およびｅｘ  ｖｉｖｏ生体内分布研究。
【０１６１】
静的ＰＥＴ画像化のために、担癌マウス（ｎ＝３）に、２００〜３００μＣｉ（７．４〜１１．１ＭＢｑ）のＰＥＧ−ｃＲＧＤＹ−［８９Ｚｒ］Ｃ’ドットまたは８９Ｚｒ−ＤＦＯ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットをｉ．ｖ．注射した。ＰＥＴ画像化を、小動物用ＰＥＴスキャナ（Ｆｏｃｕｓ１２０  ｍｉｃｒｏＰＥＴ；Ｃｏｎｃｏｒｄｅ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）にて、注射２、２４、４８、および７２時間後に行った。ＰＥＴデータの画像再構成および関心領域解析を、ＩＲＷソフトウェアを使用して行い、結果を％ＩＤ／ｇで示した。
【０１６２】
動的ＰＥＴスキャニングのために、健康なマウスに、約４００μＣｉ（約１４．８ＭＢｑ）のＣ’ドット−ＰＥＧ−ｃＲＧＤＹ−［８９Ｚｒ］Ｃ’ドットまたは８９Ｚｒ−ＤＦＯ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットをｉ．ｖ．注射した。小動物用ＰＥＴスキャナ（Ｆｏｃｕｓ１２０  ｍｉｃｒｏＰＥＴ；Ｃｏｎｃｏｒｄｅ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）にて６０分間の動的スキャンを行い、４６フレームに分割した：１２×５秒、６×１０秒、６×３０秒、１０×６０秒、６×１５０秒、５×３００秒。画像再構成および関心領域（ＲＯＩ）の解析を、ＩＲＷソフトウェアを使用して行い、％ＩＤ／ｇで示した。
【０１６３】
生体内分布研究のために、担癌（ｎ＝３）マウスに、約１００μＣｉ（約３．７ＭＢｑ）のＣ’ドット−ＰＥＧ−ｃＲＧＤＹ−［８９Ｚｒ］Ｃ’ドットまたは８９Ｚｒ−ＤＦＯ−ｃＲＧＤＹ−ＰＥＧ−Ｃ’ドットを注射した。主な実質内臓器中の蓄積放射能を、自動Ｗｉｚａｒｄ２γ−カウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して２４時間でアッセイし、％ＩＤ／ｇ（平均±ＳＤ）で示した。
統計学。
【０１６４】
３回反復に基づいた２標本ｔ検定を使用して全ての比較を行った。濃度および時間のプロフィールを、プロフィール下の計算された面積に基づいて比較した。
ＶＥＧＦＲ過剰発現がんをターゲティングするための８９Ｚｒ−ＤＦＯ−ＶＥＧＦ１２１−ＰＥＧ−Ｃｙ５−Ｃ’ドットの合成
【０１６５】
第１の工程として、本明細書中に記載の方法を使用してＰＥＧ−ＮＨ２−Ｃｙ５−Ｃ’ドットと呼ばれるアミノ化Ｃ’ドットを合成する。テトラメチルオルトシリケート（ＴＭＯＳ）およびシラン官能化Ｃｙ５蛍光色素を、水酸化アンモニウム溶液（ｐＨ約８．５、室温（ＲＴ））に、強く撹拌しながら（６００ｒｐｍ）添加する。１日後、（３−アミノプロピル）トリメトキシシラン（ＡＰＴＭＳ）およびモル質量がおよそ５００（６〜９エチレングリコール単位）の単官能性ＰＥＧ−シランを、反応物にＲＴにて強力な撹拌条件下（６００ｒｐｍ）で順次添加し、次いで、撹拌せずに８０℃で維持する。合成されたＰＥＧ−ＮＨ２−Ｃｙ５−Ｃ’ドットを回収し（ＲＴへの冷却後）、ゲル浸透クロマトグラフィ（ＧＰＣ）によって精製し、スピン濾過によって脱イオン（ＤＩ）水に移す；引き続いて、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）分析によって粒径および濃度を決定する。
【０１６６】
次に、ＰＥＧ−ＮＨ２−Ｃｙ５−Ｃ’ドットを、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）の緩衝液で希釈する。ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ＮＨＳエステル（ＤＭＳＯ中）を反応混合物に添加し、振盪下にて（６４０ｒｐｍ）ＲＴで１時間反応させる。ＤＢＣＯ表面密度を、ＰＥＧ−ＮＨ２−Ｃｙ５−Ｃ’ドットとＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ＮＨＳエステルとの間の反応比を変更することによって制御することができる。次いで、ＤＦＯ−ＮＣＳ（ＤＭＳＯ中）を添加し、Ｃ’ドットへのＤＦＯの表面コンジュゲーションを促進するために、反応ｐＨを８〜９に調整する（反応時間は約２時間）。ＰＥＧ−ＮＨ２−Ｃｙ５−Ｃ’ドットのＤＦＯ−ＮＣＳに対する反応比１：２０により、Ｃ’ドットあたり少なくとも３〜４個のＤＦＯのコンジュゲーションがもたらされる。次いで、合成時のＤＦＯ−ＤＢＣＯ−ＰＥＧ−Ｃｙ５−Ｃ’ドットを、移動相としてＰＢＳを使用して粒子をＰＤ−１０カラムに通過させることによって精製して、未反応のＤＢＣＯ分子およびＤＦＯ分子を除去する。
【０１６７】
ＶＥＧＦ１２１ターゲティングリガンドを結合させるために、２．５ｎｍｏｌのアジド含有ＶＥＧＦ１２１を、ＤＦＯ−ＤＢＣＯ−ＰＥＧ−Ｃｙ５−Ｃ’ドット（５μＭ）の１００μＬ  ＰＢＳ溶液中に添加する。ＶＥＧＦ１２１は約１２ｋＤａである。粒子あたりのＶＥＧＦ１２１数を、ＤＦＯ−ＤＢＣＯ−ＰＥＧ−Ｃｙ５−Ｃ’ドットの使用される反応比または濃度を変化させることによって正確に調整することができる。混合物を、室温（ＲＴ）で２４時間連続的に振盪する。遊離ＶＥＧＦ１２１リガンドを、ＧＰＣ精製によって除去する。次いで、精製したＤＦＯ−ＶＥＧＦ１２１−ＰＥＧ−Ｃｙ５−Ｃ’ドットイムノコンジュゲートを、フローサイトメトリーおよび８９Ｚｒ放射性標識研究のためにＰＢＳに懸濁する。
【０１６８】
あるいは、ＤＦＯ−ＶＥＧＦ１２１−ＰＥＧ−Ｃｙ５−Ｃ’ドットを、予め合成したアミノ化ＤＢＣＯ−ＰＥＧ−Ｃｙ５−Ｃ’ドットをＤＦＯおよびＶＥＧＦ１２１で官能化することによって合成することもできる。
【０１６９】
８９Ｚｒ標識のために、０．７５ｎｍｏｌのＤＦＯ−ＶＥＧＦ１２１−ＰＥＧ−Ｃｙ５−Ｃ’ドットを、１ｍＣｉの８９Ｚｒ−オキサラートを含むＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８）と３７℃で６０分間混合することができる；最終標識ｐＨを７〜７．５に維持した。ＥＤＴＡ負荷プロセスを導入して、混合物を３７℃で３０〜６０分間インキュベートすることによって任意の非特異的に結合した８９Ｚｒを除去する。最終８９Ｚｒ標識収率は、７０〜８０％の範囲である。合成時の８９Ｚｒ−ＤＦＯ−ＶＥＧＦ１２１−ＰＥＧ−Ｃｙ５−Ｃ’ドットを、ＰＤ−１０カラムを使用して精製することができる。放射化学的純度は、９９％超と評価され（放射ＴＬＣを使用することによって）、比放射能は約１０００Ｃｉ／ｍｍｏｌである。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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