(57)【要約】本発明は、シャープ（Ｓｃｈａａｐ）アダマンチリデン・ジオキセタンプローブに基づいたターンオン型ジオキセタン系化学発光プローブであって、該プローブはプロテアーゼの検出もしくはイメージング、より詳細には、存在を検出、またはそのレベルを測定することができるプローブ、および組成物ならびにその使用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式ＩａまたはＩｂの化合物であって、
【化１】
2020520981.tif 000030
式中、
Ｒ１は、直鎖もしくは分岐鎖（Ｃ１〜Ｃ１８）アルキル、または（Ｃ３〜Ｃ７）シクロアルキルから選択され；
Ｒ２およびＲ３は、各々独立して、分岐鎖（Ｃ３〜Ｃ１８）アルキルもしくは（Ｃ３〜Ｃ７）シクロアルキルから選択されるか、またはＲ２およびＲ３はこれらが結合している炭素原子と一緒になって縮合環、スピロ環もしくは架橋環もしくは多環式環を形成し；
Ｒ４は、式：
【化２】
2020520981.tif 000031
の基であり；
Ｒ５はＨまたは−Ｏ−Ｒ４基に対してオルト位もしくはパラ位のいずれかで結合したハロゲンであり；
Ａは−Ｏ−Ｒ４基に対してオルト位もしくはパラ位のいずれかで結合した式−ＣＨ＝ＣＨ−Ｅのπ＊アクセプター基であり、Ｅは−ＣＮ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ（Ｃ１〜Ｃ１８）アルキル、４−ピリジニル、メチルピリジニウム−４−イル、３，３−ジメチル−３Ｈ−インドリル、または１，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドール−１−イウム−２−イルであり；
Ｐｅｐ１は、少なくとも２個のアミノ酸残基からなるプロテアーゼ切断可能ペプチド部分であり、そのカルボン酸基を介して前記アニリン基と結合しており、前記ペプチド部分は保護されていてもよく、そのアミノ基によりポリエチレングリコール（ＰＥＧ）含有基と結合していてもよく；
Ｌは存在しないか、またはＰｅｐ１のカルボン酸基もしくはアミノ基のいずれかによりＰｅｐ１とアミド結合を介して結合したリンカーであり；
Ｐｅｐ２は存在しないか、またはそのアミノ基もしくはカルボン酸基によりアミド結合を介して、もしくはそのチオール基のいずれかによりＬと結合した細胞透過性ペプチド部分であり、
但し、ＬおよびＰｅｐ２は、両方共に、存在しないか、または存在し、Ｐｅｐ１が保護されているかもしくはＰＥＧ含有基と結合している場合、ＬおよびＰｅｐ２は存在しない、化合物。
【請求項２】
Ｒ１は、直鎖または分岐鎖（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ２およびＲ３はこれらが結合している炭素原子と一緒になって縮合環、スピロ環もしくは架橋環もしくは多環式環を形成する、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ２およびＲ３はこれらが結合している炭素原子と一緒になってアダマンチルを形成する、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ５は、−Ｏ−Ｒ４基に対してオルト位もしくはパラ位のいずれかで結合したハロゲンである、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
Ａは−Ｏ−Ｒ４基に対してオルト位に結合した−ＣＨ＝ＣＨ−Ｅであり、Ｅは−ＣＮ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、４−ピリジニル、メチルピリジニウム−４−イル、３，３−ジメチル−３Ｈ−インドリル、または１，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドール−１−イウム−２−イルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
Ｅは、−ＣＮ、−ＣＯＯＨ、または−ＣＯＯ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルである、請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ１は、直鎖または分岐鎖（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルであり；
Ｒ２およびＲ３はこれらが結合している炭素原子と一緒になって縮合環、スピロ環もしくは架橋環もしくは多環式環を形成し；
Ｒ５は、−Ｏ−Ｒ４基に対してオルト位に結合したハロゲンであり；
Ａは、−Ｏ−Ｒ４基に対してオルト位に結合した−ＣＨ＝ＣＨ−Ｅであり、Ｅは、−ＣＮ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ（Ｃ１〜Ｃ8）アルキル、４−ピリジニル、メチルピリジニウム−４−イル、３，３−ジメチル−３Ｈ−インドリル、または１，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドール−１−イウム−２−イルである、
請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
Ｒ１はメチルであり；Ｒ２およびＲ３はこれらが結合している炭素原子と一緒になってアダマンチルを形成し；Ｒ５は−Ｏ−Ｒ４基に対してオルト位に結合したハロゲンであり；Ｅは−ＣＮ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルである、請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｅは、−ＣＮ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＣＨ３、または−ＣＯＯＣ（ＣＨ３）３である、請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｐｅｐ１は、アミノ酸配列Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｎｌｅ、Ａｌａ−Ａｌａ−ＡｓｎまたはＨｉｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎを含むまたはからなるペプチド部分であり、前記アミノ酸配列は（ｉ）それぞれ、シトルリン、リジン、グリシン、ノルロイシン、アスパラギンまたはグルタミンのカルボン酸基を介して前記アニリン基と結合し；（ｉｉ）そのアミノ基において保護されていてもよく、アミド結合を介して前記アミノ基によりＰＥＧ含有基と結合していてもよい、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１２】
前記ＰＥＧ含有基は、式：
【化３】
2020520981.tif 000032
（式中、ｎは１〜２２７の整数である。）
である、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１３】
Ｐｅｐ１は、それぞれ、シトルリン、リジン、グリシン、ノルロイシン、アスパラギンまたはグルタミンのカルボン酸基を介して前記アニリン基と結合された配列Ｖａｌ−Ｃｉ
ｔ、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｎｌｅ、Ａｌａ−Ａｌａ−ＡｓｎまたはＨｉｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎのペプチド部分であり、それぞれ、バリン、フェニルアラニン、グリシン、グリシン、アラニンまたはヒスチジンのαアミノ基においてアミノ保護基により保護されている、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１４】
Ｐｅｐ１は、それぞれ、シトルリン、リジン、グリシン、ノルロイシン、アスパラギンまたはグルタミンのカルボン酸基を介して前記アニリン基と結合された配列Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｎｌｅ、Ａｌａ−Ａｌａ−ＡｓｎまたはＨｉｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎのペプチド部分であり、それぞれ、バリン、フェニルアラニン、グリシン、グリシン、アラニンまたはヒスチジンのαアミノ基を介して式：
【化４】
2020520981.tif 000033
（式中、ｎは１〜２２７の整数である。）
のＰＥＧ含有基と結合している、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１５】
Ｐｅｐ１は、それぞれ、シトルリン、リジン、グリシン、ノルロイシン、アスパラギンまたはグルタミンのカルボン酸基を介して前記アニリン基と結合したアミノ酸配列Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｎｌｅ、Ａｌａ−Ａｌａ−ＡｓｎまたはＨｉｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎを含むまたはからなるペプチド部分であり；ＬはＰｅｐ１のカルボン酸基またはアミノ基のいずれかによりアミド結合を介してＰｅｐ１と結合したリンカーであり；Ｐｅｐ２はそのチオール基によりＬと結合したペプチド部分である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１６】
Ｌは、Ｐｅｐ１のアミノ基によりアミド結合を介してＰｅｐ１と結合した式：
【化５】
2020520981.tif 000034
（式中、ｍは１〜２０の整数である。）
のリンカーであり、Ｌのアルキレン鎖は１つ以上の−Ｏ−基が割り込んでいてもよく；
Ｐｅｐ２は前記システイン残基のチオール基によりＬと結合した配列Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓのペプチド部分である、
請求項１５に記載の化合物。
【請求項１７】
Ｒ１はメチルであり；Ｒ２およびＲ３はこれらが結合している炭素原子と一緒になってアダマンチルを形成し；Ｒ５は−Ｏ−Ｒ４基に対してオルト位に結合したＣｌであり；Ａは−Ｏ−Ｒ４基に対してオルト位に結合した−ＣＨ＝ＣＨ−Ｅであり；Ｅは−ＣＯＯＣＨ３または−ＣＮであり；
（ｉ）Ｐｅｐ１は、シトルリンのカルボン酸基を介して前記アニリン基と結合した配列Ｖａｌ−Ｃｉｔのペプチド部分であり、バリンのアミノ基においてカルボキシベンジルに
より保護されており；
（ｉｉ）Ｐｅｐ１は、グルタミンのカルボン酸基を介して前記アニリン基と結合した配列Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎのペプチド部分であり、ヒスチジンのαアミノ基においてＮ-モルホリンカルボニルにより保護されており；
（ｉｉｉ）Ｐｅｐ１は、シトルリンのカルボン酸基を介して前記アニリン基と結合した配列Ｖａｌ−Ｃｉｔのペプチド部分であり、バリンのアミノ基を介して式：
【化６】
2020520981.tif 000035
（式中、ｎは１７である。）
のＰＥＧ含有基と結合しているか；または
（ｉｖ）Ｐｅｐ１は、それぞれ、シトルリンもしくはグルタミンのカルボン酸基を介して前記アニリン基と結合した配列Ｖａｌ−ＣｉｔもしくはＨｉｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎのペプチド部分であり；Ｌは、それぞれ、バリンもしくはヒスチジンのαアミノ基によりアミド結合を介してＰｅｐ１と結合した式：
【化７】
2020520981.tif 000036
（式中、ｍは５の整数である。）
のリンカーであり、Ｐｅｐ２は前記システイン残基のチオール基によりＬと結合した配列Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓのペプチド部分である、
請求項１に記載の化合物。
【請求項１８】
表２の化合物Ｉｂ−１ａ、Ｉｂ−１ｂ、Ｉｂ−２ａ、Ｉｂ−２ｂ、Ｉｂ−３ａ、Ｉｂ−３ｂ、Ｉｂ−４ａ、Ｉｂ−４ｂ、Ｉｂ−５ａ、またはＩｂ−５ｂから選択される、請求項１７に記載の化合物。
【請求項１９】
請求項１〜１８に記載の化合物および担体を含む組成物。
【請求項２０】
請求項１７または１８に記載の化合物を含む、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
診断またはイメージングにおいてインビボで使用するための、請求項１９または２０に記載の組成物。
【請求項２２】
診断またはイメージングにおいてインビボで使用するための、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２３】
サンプル中のプロテアーゼの存在の決定方法、またはそのレベルの測定方法であって、前記方法は：
（ｉ）Ｐｅｐ１が前記プロテアーゼにより切断可能な基である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の化合物と、または前記化合物を含む組成物と、前記サンプルとを接触させて、これにより前記化合物を、前記サンプル中に存在する場合に前記プロテアーゼにより発光性化学種に加水分解すること、および
（ｉｉ）前記発光性化学種の化学発光を検出すること、
を含む、方法。
【請求項２４】
前記サンプルは生体サンプルである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記生体サンプルは体液、体液系溶液、または組織生検サンプルである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記プロテアーゼは、カテプシンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ１、Ｌ２、Ｏ、Ｓ、ＷおよびＺなどのカテプシン、レグマイン、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、またはメタロプロテアーゼである、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテアーゼ、および組成を検出可能なジオキセタン系化学発光プローブ、ならびにその使用を提供する。
【０００２】
略語：ＡＣＮ、アセトニトリル；ＤＣＭ、ジクロロメタン；ＤＩＰＥＡ、ジイソプロピルエチルアミン；ＤＭＦ、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド；ＥＥＤＱ、Ｎ−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン；Ｅｔ２Ｏ、ジエチルエーテル；Ｅｔ３Ｎ、トリエチルアミン；ＥｔＯＡｃ、酢酸エチル；ＨＢＴＵ、ヘキサフルオロリン酸２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム；ＨＰＬＣ、高圧液体クロマトグラフィー；Ｋ２ＣＯ３、炭酸カリウム；ＭｅＯＨ、メチルアルコール；Ｎａ２Ｓ２Ｏ３、チオ硫酸ナトリウム；Ｎａ２ＳＯ４、硫酸ナトリウム；ＮＨ４Ｃｌ、塩化アンモニウム；ＰＡＢＡ、ｐ−アミノ安息香酸；ＰＥＧ、ポリエチレングリコール；ＲＬＵ、相対光量単位；ＲＰ−ＨＰＬＣ、逆相高圧液体クロマトグラフィー；ＴＦＡ、トリフルオロ酢酸；ＴＩＰＳ、トリイソプロピルシラン；ＴＬＣ、薄層クロマトグラフィー；ＴＭＳ−Ｃｌ、塩化トリメチルシリル；７ＨＣ、７−ヒドロキシクマリン。
【背景技術】
【０００３】
プロテアーゼは、ペプチド結合の加水分解によってタンパク質異化反応を行う酵素の分類である。プロテアーゼは、多くの生物学的過程において基本的役割を有し、がん、関節炎、神経変性疾患および心血管障害を含む多種多様な病態に関連する。病気におけるプロテアーゼが関与する強い証拠から、プロテアーゼはイメージングおよび創薬において重要な役割を果たす。例えば、乳がん、頚部がん、結腸がん、結腸直腸がん、胃がん、頭頸部がん、肝がん、肺がん、メラノーマ、卵巣がん、膵がん、前立腺がん、および甲状腺がんを含む多くの異なるがんタイプにおける病態下細胞外および細胞周囲マトリクスにおいて過剰発現されるので、カテプシンＢ、リソソームシステインプロテアーゼは非常に重要である。このように、概してプロテアーゼ活性、および特にカテプシンＢ活性に重点を置いて、分子イメージングおよび医用画像技術の開発に多くの努力が注がれてきた。ほとんどの開発は、蛍光イメージングに向けられた光学イメージングを中心に展開してきた。
【０００４】
蛍光イメージングは高感度モニターを可能とするが、大部分は低い信号対雑音比をもたらす自己蛍光のせいで欠点を有する。蛍光ベースアッセイと異なり、化学発光アッセイは光励起を必要とせず、付加感度および信号対雑音比が増大する結果を得る。
【０００５】
公知の化学発光プローブの中でも、シャープ（Ｓｃｈａａｐ）のアダマンチリデン・ジオキセタンプローブ（スキーム１、構造Ｉ）は、これらを多くの化学条件および生体条件に適合させる安定なジオキセタン部分を有するので、最高の適応性を有する。スキーム１に示されているように、シャープのアダマンチリデン・ジオキセタン系化学発光プローブ（構造Ｉ）は、プローブのフェノール部分をマスクするために使用される検体応答性保護基を備える。対象検体により保護基が脱離すると、不安定なフェノレート−ジオキセタン化学種ＩＩを生成し、これは化学励起過程により分解して励起中間体安息香酸エステルＩＩＩおよびアダマンタノンを生成する。励起中間体は、青色光フォトンの発光によりその基底状態（安息香酸エステルＩＶ）に減衰する。
【０００６】
スキーム１：シャープのアダマンチリデン・ジオキセタンの化学発光活性経路
【化１】
2020520981.tif 000002
【０００７】
Ｒｉｃｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）は、ジオキセタン発光団のフェノールをマスクするプロテアーゼ（ペニシリンｇ−アミダーゼまたはカスパーゼ３）応答基質を有するターンオン型化学発光プローブを以前に開発した。これらのプローブは、卓越した信号対雑音比を示すが、二段階アッセイを要するので、プロテアーゼの生細胞イメージングを妨げる。先ず、プロテアーゼは生理的ｐＨ（７．４）において保護基を切断し、それから、混合物をｐＨ１２．３の緩衝液に添加することにより、化学励起過程が起こる。
【０００８】
国際公開第２０１７／１３０１９１号は、シャープのアダマンチリデン・ジオキセタンプローブに基づいた化学発光プローブを開示しており、化学発光は直接的モードにより増幅され、より詳細には、シャープのアダマンチリデン・ジオキセタンプローブは、安息香酸エステル化学種の発光性を増大するようにアクリレートおよびアクリロニトリル電子求引基などのπ＊アクセプター基を有するフェノール環のオルト位において置換される（スキーム２）。この刊行物に示されているように、開示された化学発光プローブは、顕著な化学発光強度で生理的条件下同時に起こる酵素加水分解および化学励起過程を可能とする。
【０００９】
スキーム２：π＊アクセプター基を有するフェノール環のオルト位にシャープのアダマンチリデン・ジオキセタンプローブを置換することにより得られた直接的化学発光モード
【化２】
2020520981.tif 000003
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、国際公開第２０１７／１３０１９１号に開示されたものに基づき、酵素分解時に化学発光シグナルを発光することができるジオキセタン発光団を示すプロテアーゼ切断可能な基質を用いて構築されたターンオン型ジオキセタン系化学発光プローブを提供する。開示されたプローブは、プローブを水性条件下で使用することを可能とする、強力な化学発光シグナルを与えるドナーアクセプタ対をもたらす、発光団のｐＫａを変化させる種々のハロゲン、および電子求引基を用いて適合することができるジオキセタン発光団を含む。
【００１１】
より詳細には、１つの態様では、本発明は、式ＩａまたはＩｂの化合物を提供する：
【化３】
2020520981.tif 000004
式中、
Ｒ１は、直鎖もしくは分岐鎖（Ｃ１〜Ｃ１８）アルキル、または（Ｃ３〜Ｃ７）シクロアルキルから選択され；
Ｒ２およびＲ３は、各々独立して、分岐鎖（Ｃ３〜Ｃ１８）アルキルもしくは（Ｃ３〜Ｃ７）シクロアルキルから選択されるか、またはＲ２およびＲ３はこれらが結合している炭素原子と一緒になって縮合環、スピロ環もしくは架橋環もしくは多環式環を形成し；
Ｒ４は、式：
【化４】
2020520981.tif 000005
の基であり；
Ｒ５はＨまたは−Ｏ−Ｒ４基に対してオルト位もしくはパラ位のいずれかで結合したハロゲンであり；
Ａは−Ｏ−Ｒ４基に対してオルト位もしくはパラ位のいずれかで結合した式−ＣＨ＝ＣＨ−Ｅのπ＊アクセプター基であり、Ｅは−ＣＮ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ（Ｃ１〜Ｃ１８）アルキル、４−ピリジニル、メチルピリジニウム−４−イル、３，３−ジメチル−３Ｈ−インドリル、または１，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドール−１−イウム−２−イルであり；
Ｐｅｐ１は、少なくとも２個のアミノ酸残基からなるプロテアーゼ切断可能ペプチド部分であり、そのカルボン酸基を介して前記アニリン基と結合しており、前記ペプチド部分は保護されていてもよく、そのアミノ基によりＰＥＧ含有基と、例えば、アミド結合を介して結合していてもよく；
Ｌは存在しないか、またはＰｅｐ１のカルボン酸基もしくはアミノ基のいずれかによりＰｅｐ１とアミド結合を介して結合したリンカーであり；
Ｐｅｐ２は存在しないか、またはそのアミノ基もしくはカルボン酸基によりアミド結合を介して、もしくはそのチオール基のいずれかによりＬと結合した細胞透過性ペプチド部分であり、
但し、ＬおよびＰｅｐ２は、両方共に、存在しないか、または存在し、Ｐｅｐ１が保護されているかもしくはＰＥＧ含有基と結合している場合、ＬおよびＰｅｐ２は存在しない。
【００１２】
別の態様では、本発明は、本明細書に開示されているジオキセタン系化学発光プローブ、すなわち、上記定義された式Ｉａ／Ｉｂの化合物、および担体、例えば、薬学的に許容可能な担体を含む組成物、例えば、医薬組成物を提供する。本発明の化合物および組成物を、インビトロおよびインビボの両方で、カテプシン、レグマイン、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、およびメタロプロテアーゼなどのプロテアーゼのイメージング／検出のために使用することができる。
【００１３】
したがって、更なる態様では、本発明は、インビボでの診断またはイメージングにおける使用のための、より詳細には、インビボでプロテアーゼの存在の決定、またはそのレベルの測定のための、本明細書に開示されているジオキセタン系化学発光プローブ、すなわ
ち、上記定義された式Ｉａ／Ｉｂの化合物、または前記化合物を含む医薬組成物に関する。
【００１４】
さらに別の態様では、本発明は、サンプル、例えば、体液、体液系溶液もしくは組織生検サンプルなどの生体サンプル中のプロテアーゼの存在の決定方法、またはそのレベルの測定方法であって、前記方法は（ｉ）Ｐｅｐ１が前記プロテアーゼにより切断可能な基である、上記定義された式Ｉａ／Ｉｂのジオキセタン系化学発光プローブ、または前記化合物を含む組成物と、前記サンプルとを接触させて、これにより前記化合物を、前記サンプル中に存在する場合に前記プロテアーゼにより発光性化学種に加水分解すること、および（ｉｉ）前記発光性化学種の化学発光を検出すること、を含む、方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｃは、室温においてカテプシンＢ  ２．５Ｕ／ｍＬの存在下活性緩衝液（ｐＨ７．４、１０％ＤＭＳＯ）中プローブ１、２、３および４［１μＭ］の化学発光反応速度プロファイルを示し、図１Ａの挿入図は、プローブ１の反応速度プロファイルに着目している。
【図１Ｂ】図１Ａ〜１Ｃは、室温においてカテプシンＢ  ２．５Ｕ／ｍＬの存在下活性緩衝液（ｐＨ７．４、１０％ＤＭＳＯ）中プローブ１、２、３および４［１μＭ］の化学発光反応速度プロファイルを示し、図１Ｂは、各プローブから発光された全光を示す。
【図１Ｃ】図１Ａ〜１Ｃは、室温においてカテプシンＢ  ２．５Ｕ／ｍＬの存在下活性緩衝液（ｐＨ７．４、１０％ＤＭＳＯ）中プローブ１、２、３および４［１μＭ］の化学発光反応速度プロファイルを示し、図１Ｃは、各プローブにより得られた最大シグナルを示す。
【図２】カテプシンＢ  ２．５Ｕ／ｍＬを含む活性緩衝液（ｐＨ７．４、１０％ＤＭＳＯ）中のプローブ４［１０μＭ］の酵素分解の化学発光反応速度プロファイルおよびＨＰＬＣ分析を示す。
【図３】Ｒａｗ２６４．７、ＣＴ２６腫瘍細胞、および３Ｔ３正常細胞におけるカテプシンＢ活性の透過光および化学発光イメージングを示す。プローブ３またはプローブ４（５μＭ）のいずれかを含む細胞培養培地と３０分のインキュベーション後に画像を得たが、６０×対物レンズを使用して２０分の露光量でＬＶ２００オリンパス顕微鏡を用いて撮影した。プローブ３とインキュベートしたＲａｗ２４６．７細胞の化学発光顕微鏡画像および透過光画像（それぞれ、ａおよびｂ）；プローブ４とインキュベートしたＲａｗ２４６．７細胞の化学発光顕微鏡画像および透過光画像（それぞれ、ｃおよびｄ）；プローブ３とインキュベートしたＣＴ２６細胞の化学発光顕微鏡画像および透過光画像（それぞれ、ｅおよびｆ）；プローブ４とインキュベートしたＣＴ２６細胞の化学発光顕微鏡画像および透過光画像（それぞれ、ｇおよびｈ）；プローブ３とインキュベートした３Ｔ３細胞の化学発光顕微鏡画像および透過光画像（それぞれ、ｉおよびｊ）；プローブ４とインキュベートした３Ｔ３細胞の化学発光顕微鏡画像および透過光画像（それぞれ、ｋおよびｌ）。
【図４】プローブ４の信号対雑音比の値および対数目盛における種々のカテプシンＢ濃度に対してプロットしたＺ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡ−７ＨＣを示す。
【図５】室温におけるＰＳＡ  １０ｍｇ／ｍＬの存在下トリス緩衝液（ｐＨ７．８、１０％ＤＭＳＯ）中のプローブ５［１０μＭ］の化学発光反応速度プロファイルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
１つの態様では、本発明は、ターンオン型ジオキセタン系化学発光プローブ、より詳細には、上記定義されている式ＩａまたはＩｂの化合物を提供する。
【００１７】
用語「アルキル」は、通常、例えば、１〜１８個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖炭化水素ラジカルを意味し、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソアミル、２，２−ジメチルプロピル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、ｎ−ノニル、ｎ−デシル、ｎ−ウンデシル、ｎ−ドデシル、ｎ−トリデシル、ｎ−テトラデシル、ｎ−ペンタデシル、ｎ−ヘキサデシルなどが挙げられる。好ましくは（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル基、より好ましくは、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル基、最も好ましくはメチル、エチル、およびイソプロピルである。
【００１８】
用語「アルキレン」は、アルキルから水素を取り除いた後に誘導される直鎖または分岐鎖二価炭化水素ラジカルを表す。アルキレンの例としては、メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン、２−メチルプロピレン、ペンチレン、２−メチルブチレン、ヘキシレン、２−メチルペンチレン、３−メチルペンチレン、２，３−ジメチルブチレン、ヘプチレン、オクチレン、ｎ−トリデカニレン、ｎ−テトラデカニレン、ｎ−ペンタデカニレン、ｎ−ヘキサデカニレン、ｎ−ヘプタデカニレン、ｎ−オクタデカニレン、ｎ−ノナデカニレン、イコサニレン、ヘンイコサニレン、ドコサニレン、トリコサニレン、テトラコサニレン、ペンタコサニレンなどが挙げられるが、これらに限定されない。用語「アルキレン鎖」は、式ＣｎＨ２ｎ＋２の直鎖炭化水素から２つの水素原子を取り除いた後に誘導される式−（ＣＨ２）ｎ−の基を表す。
【００１９】
用語「シクロアルキル」は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルなど、例えば３〜７個の炭素原子を有し、例えば、１つ以上のアルキル基によって置換されていてもよい単環式または二環式飽和炭化水素基を意味する。
【００２０】
本明細書で使用されるとき、用語「ハロゲン」はハロゲンを表し、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードが挙げられるが、好ましくはフルオロまたはクロロである。
【００２１】
本明細書で使用されるとき、用語「アミノ酸」は、アミンおよびカルボン酸官能基の両方を含む有機化合物を表し、天然または非天然アミノ酸のいずれかであってよい。タンパク質における天然の２２アミノ酸は、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、アルギニン（Ａｒｇ）、バリン（Ｖａｌ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、セリン（Ｓｅｒ）、アラニン（Ａｌａ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、グリシン（Ｇｌｙ）、プロリン（Ｐｒｏ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、リジン（Ｌｙｓ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、システイン（Ｃｙｓ）、セレノシステイン（Ｓｅｃ）、およびピロリシン（Ｐｙｌ）である。他のアミノ酸の非限定的例としては、シトルリン（Ｃｉｔ）、ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）、ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、アミノアジピン酸、β−アラニン、１−ナフチルアラニン、３−（１−ナフチル）アラニン、３−（２−ナフチル）アラニン、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、３−（アミノメチル）安息香酸、ｐ−エチニルフェニルアラニン、ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニン、ｍ−エチニルフェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−ヨードフェニルアラニン、ｐ−アジドフェニルアラニン、ｐ−アセチルフェニルアラニン、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、アジドノルロイシン、６−エチニルトリプトファン、５−エチニルトリプトファン、３−（６−クロロインドリル）アラニン、３−（６−ブロモインドリル）アラニン、３−（５−ブロモインドリル）アラニン、アジドホモアラニン、ｐ−クロロフェニルアラニン、α−アミノカプリル酸、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｎ−アセチルガラクトサミン−α−スレオニン、およびＮ−アセチルガラクトサミン−α−セリンが挙げられる。
【００２２】
本明細書で使用されるとき、用語「アミノ酸残基」は、そのアミノ酸から水素原子を取り除いた後のアミノ酸残基、例えば、そのα−アミノ基または存在する場合側鎖アミノ基、およびそのカルボン酸基から−ＯＨ基を取り除いた後のアミノ酸残基、例えば、そのα−カルボン酸基または存在する場合側鎖カルボン酸基を表す。
【００２３】
用語「ペプチド」は、アミノ酸モノマー（残基）の短鎖、例えば、ペプチド結合、すなわち、１つのアミノ酸のカルボン酸基が別のアミノ基と反応した場合に生成される共有結合により結合した２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２以上のアミノ酸残基からなる短鎖を表す。本明細書で使用されるとき、用語「ペプチド部分」は、カルボン酸基、すなわち、その末端もしくは側鎖カルボン酸基のいずれかから水素原子、および／またはアミノ基、すなわち、その末端もしくは側鎖アミノ基のいずれかから水素原子を取り除いた後の、本明細書で定義されたペプチドの部分を表す。
【００２４】
本明細書で使用されるとき、用語「ペプチド結合」または「アミド結合」は、１つの分子のカルボン酸基が他の分子のアミノ基と反応して水分子を遊離させる場合に、２つの分子、例えば、２つのアミノ酸の間で生成された共有結合−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−を表す。
【００２５】
本明細書で使用されるとき、用語「アミノ保護基」は、当技術分野で公知のいずれものアミノ保護基を表す。当業者は、どの保護基がアミノ基の保護に有用であり得るかを容易に決定することができ、標準的方法は当技術分野において公知であり、文献に記載されている。例えば、適切な保護基は、Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｗｕｔｓ，“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ７，１９９１に記載されている。好ましいアミノ保護基としては、カルボベンジルオキシ（カルボキシベンジル、Ｃｂｚ）、Ｎ−モルホリンカルボニル、ｐ−メトキシベンジルカルボニル、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、アセチル、ベンジル、カルバメート基、ｐ−メトキシベンジル（ＰＭＢ）、３，４−ジメトキシベンジル（ＤＭＰＭ）、ｐ−メトキシフェニル（ＰＭＰ）、およびトシル基が挙げられる。
【００２６】
本明細書で使用されるとき、用語「π＊アクセプター基」は、電子を受けることができるπ＊アクセプター系を含む基、より詳細には、式−ＣＨ＝ＣＨ−Ｅの基であって、Ｅは−ＣＮ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ（Ｃ１〜Ｃ１８）アルキル、好ましくは−ＣＯＯ（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、より好ましくは−ＣＯＯ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、４−ピリジニル、メチルピリジニウム−４−イル、３，３−ジメチル−３Ｈ−インドリル、または１，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドール−１−イウム−２−イルである、基を表す（表１も参照）。
【００２７】
【表１】
2020520981.tif 000006
【００２８】
特定の実施形態では、本発明は、Ｒ１は直鎖または分岐鎖（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、好ましくは（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、より好ましくはメチル、エチル、もしくはイソプロピルである、式Ｉａまたは式Ｉｂの化合物を提供する。
【００２９】
特定の実施形態では、本発明は、Ｒ２およびＲ３は、各々独立して、分岐鎖（Ｃ３〜Ｃ１８）アルキルもしくは（Ｃ３〜Ｃ７）シクロアルキルである、式Ｉａまたは式Ｉｂの化合物を提供する。他の実施形態では、Ｒ２およびＲ３はこれらが結合する炭素原子と一緒になって縮合環、スピロ環または架橋多環式環を形成する。特定の実施形態では、Ｒ２およびＲ３はこれらが結合する炭素原子と一緒になってアダマンチルを形成する。
【００３０】
特定の実施形態では、本発明は、Ｒ５は−Ｏ−Ｒ４基に対してオルト位に結合したハロゲン、例えば、ＣｌもしくはＦである、式Ｉａまたは式Ｉｂの化合物を提供する。
【００３１】
特定の実施形態では、本発明は、Ａは−Ｏ−Ｒ４基に対してオルト位に結合した−ＣＨ＝ＣＨ−Ｅであり、Ｅは−ＣＮ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、例えば、−ＣＯＯＣＨ３、−ＣＯＯＣ２Ｈ５、−ＣＯＯＣ３Ｈ７、−ＣＯＯＣＨ（ＣＨ３）２、もしくは−ＣＯＯＣ（ＣＨ３）３などの−ＣＯＯ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、４−ピリジル、メチルピリジニウム−４−イル、３，３−ジメチル−３Ｈ−インドリル、もしくは１，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドール−１−イウム−２−イルである、式Ｉａまたは式Ｉｂの化合物を提供する。特定のかかる実施形態では、Ｅは、−ＣＮ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＣＨ３、−ＣＯＯＣ２Ｈ５、−ＣＯＯＣ３Ｈ７、−ＣＯＯＣＨ（ＣＨ３）２、または−ＣＯＯＣ（ＣＨ３）３である。
【００３２】
特定の実施形態では、本発明は、Ｒ１は直鎖または分岐鎖（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、好ましくは（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、より好ましくはメチル、エチル、もしくはイソプロピルであり；Ｒ２およびＲ３はこれらが結合する炭素原子と一緒になって縮合環、スピロ環または架橋多環式環を形成し；Ｒ５は−Ｏ−Ｒ４基に対してオルト位に結合したハロゲンであり；Ａは−Ｏ−Ｒ４基に対してオルト位に結合した−ＣＨ＝ＣＨ−Ｅであり、Ｅは−ＣＮ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、４−ピリジル、メチルピリジニウム−４−イル、３，３−ジメチル−３Ｈ−インドリル、もしくは１，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドール−１−イウム−２−イルである、式Ｉａまたは式Ｉｂの化合物を提供する。特定のかかる実施形態は、Ｒ１はメチルであり；Ｒ２およびＲ３はこれらが結合する炭素原子と一緒になってアダマンチルを形成し；Ｒ５は−Ｏ−Ｒ４基に対してオルト位に結合したハロゲンであり；Ｅは、−ＣＮ、−ＣＯＯＨ、もしくは−ＣＯＯＣＨ３、−ＣＯＯＣ２Ｈ５、−ＣＯＯＣ３Ｈ７、−ＣＯＯＣＨ（ＣＨ３）２、もしくは−ＣＯＯＣ（ＣＨ３）３などの−ＣＯＯ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルである、ものである。より特定のかかる実施形態は、Ｅは、−ＣＮ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＣＨ３、または−ＣＯＯＣ（ＣＨ３）３である、すなわち、Ａは、−Ｏ−Ｒ４基に対してオルト位に結合した、それぞれ、アクリロニトリル、アクリル酸、アクリル酸メチルまたはアクリル酸ｔｅｒｔ−ブチル置換基である、ものである。
【００３３】
上記のように、本発明の化学発光プローブは、プロテアーゼ（「ペプチダーゼ」または「プロテイナーゼ」とも呼ぶ）切断可能なペプチド部分（本明細書では、Ｒ４基の部分であるＰｅｐ１として特定される）、すなわち、プロテアーゼにより切断可能である修飾されていてもよいアミノ酸配列の部分、すなわち、ペプチド結合の加水分解によりタンパク質分解（タンパク異化）を行うことができる酵素を有し、対象の特定のプロテアーゼによる前記切断可能な基の除去は化学励起過程により分解する不安定なフェノレート・ジオキセタン化学種を生成して励起された中間体を生成し、次いで、これは発光によりその基底状態へ減衰する。
【００３４】
本明細書全体にわたって言うプロテアーゼは、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、またはメタロプロテアーゼ、すなわち、その触媒機構が金属（通常、亜鉛）を含むプロテアーゼ酵素などのいずれかのプロテアーゼであってよい。
【００３５】
特定の実施形態では、本明細書において言うプロテアーゼは、カテプシンＡまたはＧ（セリンプロテアーゼ）；カテプシンＢ、Ｃ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｌ１、Ｌ２、Ｏ、Ｓ、ＷまたはＺ（システインプロテアーゼ）；およびカテプシンＤまたはＥ（アスパルチルプロテアーゼ）などのカテプシンである。
【００３６】
特定の特にかかる実施形態では、式Ｉａ／Ｉｂの化学発光プローブはカテプシンＢの存在、より詳細には、カテプシンＢ、前がん病変および様々な病態、ならびにがん、例えば、腫瘍内皮細胞およびリソソームでの多くの他の腫瘍細胞における過剰発現される細胞内タンパク質分解に関連するリソソームシステインプロテアーゼの過剰発現を検出することを目的とする（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。カテプシンＢ切断可能ペプチドとしては、アミノ酸配列Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、もしくはＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙを含む、またはからなるペプチド（かかるペプチドは、それぞれ、シトルリン、リジンまたはグリシンのカルボン酸基を介してＲ４のアニリン基と結合する）が挙げられるが、これに限定されない。
【００３７】
他の特定のかかる実施形態では、式Ｉａ／Ｉｂの化学発光プローブはカテプシンＫの存在、より詳細には、カテプシンＫ、破骨細胞において主に発現され骨腫瘍において細胞外で過剰発現される骨再形成および骨吸収に関連するリソソームシステインプロテアーゼの過剰発現を検出することを目的とする（Ｓｅｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。カテプシンＫ切断可能ペプチドとしては、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｎｌｅを含むペプチド（かかるペプチドはノルロイシンのカルボン酸基を介してＲ４のアニリン基と結合する）が挙げられるが、これに限定されない。
【００３８】
特定の実施形態では、本明細書において言うプロテアーゼはレグマイン、腫瘍細胞において過剰発現されるリソソーム酵素であり（Ｓｔｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）、式Ｉａ／Ｉｂの化学発光プローブはプレグマインの存在、より詳細には、前記プロテアーゼの過剰発現を検出することを目的とする。レグマイン切断可能ペプチドとしては、アミノ酸配列Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎを含むペプチド（かかるペプチドはアスパラギンのカルボン酸基を介してＲ４のアニリン基と結合する）が挙げられるが、これに限定されない。
【００３９】
特定の実施形態では、本明細書において言うプロテアーゼはＰＳＡ（カリクレイン３としても知られている）、前立腺の上皮細胞によって分泌され前立腺がんまたは他の前立腺障害のマーカーとして使用されるカリクレイン関連プロテアーゼファミリーのメンバーであり、式Ｉａ／Ｉｂの化学発光プローブは前記プロテアーゼの存在、より詳細には発現を検出することを目的とする。ＰＳＡ切断可能ペプチドとしては、アミノ酸配列Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ（かかるペプチドはグルタミンのカルボン酸基を介してＲ４のアニリン基と結合する）を含むペプチドが挙げられるが、これに限定されない。
【００４０】
特定の実施形態では、本明細書において言うプロテアーゼはマトリクスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、すなわち、細胞外マトリクスの全タンパク質をまとめて加水分解することができ、したがって、組織形態形成および組織修復などの生理的過程において重要な役割を果たすＺｎ依存性エンドペプチダーゼのファミリーメンバーである。ＭＭＰは、基底膜および間質の基底膜の腫瘍細胞浸潤、血管透過、ならびに転移を促進することによるが
ん進行に対する重要な寄与因子でもある。多くの研究から、例えば、ＭＭＰ９は前転移ニッチの形成に重要であり、血管内皮増殖因子のバイオアベイラビリティの調節による腫瘍血管新生において異なる役割を有することが分かった。臨床的に、ＭＭＰ９のレベル上昇は、広範な範囲のがんタイプにおける腫瘍攻撃性、ステージおよび予後不良と相関する。ＭＭＰ２に関してデータが公表されている。
【００４１】
特定の実施形態では、本発明は、上記実施形態のいずれか１つに定義された式ＩａまたはＩｂの化合物であって、Ｐｅｐ１はアミノ酸配列Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｎｌｅ、Ａｌａ−Ａｌａ−ＡｓｎまたはＨｉｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎを含むまたはからなるプロテアーゼ切断可能なペプチド部分であり、前記アミノ酸配列は、それぞれ、シトルリン、リジン、グリシン、ノルロイシン、アスパラギンまたはグルタミンのカルボン酸基を介してＲ４のアニリン基と結合し；そのアミノ基において保護されていてもよく、アミド結合を介して前記アミノ基によりＰＥＧ含有基、例えば、式：
【化５】
2020520981.tif 000007
（式中、ｎは１〜２２７の整数である。）
のＰＥＧ含有基と結合していてもよい、化合物を提供する。
【００４２】
特定の特にかかる実施形態では、Ｐｅｐ１は、それぞれ、シトルリン、リジン、グリシン、ノルロイシン、アスパラギンまたはグルタミンのカルボン酸基を介して前記アニリン基と結合された配列Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｎｌｅ、Ａｌａ−Ａｌａ−ＡｓｎまたはＨｉｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎのプロテアーゼ切断可能なペプチド部分であり、それぞれ、バリン、フェニルアラニン、グリシン、グリシン、アラニンまたはヒスチジンのαアミノ基においてアミノ保護基、例えば、カルボキシベンジルもしくはＮ−モルホリンカルボニルにより保護されている。
【００４３】
他の特にかかる実施形態では、Ｐｅｐ１は、それぞれ、シトルリン、リジン、グリシン、ノルロイシン、アスパラギンまたはグルタミンのカルボン酸基を介して前記アニリン基と結合された配列Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｎｌｅ、Ａｌａ−Ａｌａ−ＡｓｎまたはＨｉｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎのプロテアーゼ切断可能なペプチド部分であり、それぞれ、バリン、フェニルアラニン、グリシン、グリシン、アラニンまたはヒスチジンのαアミノ基を介して式：
【化６】
2020520981.tif 000008
（式中、ｎは１〜２２７の整数である。）
のＰＥＧ含有基と結合している。
【００４４】
特定の実施形態では、本発明は、上記実施形態のいずれか１つに定義された式ＩａまたはＩｂの化合物であって、Ｐｅｐ１は、それぞれ、シトルリン、リジン、グリシン、ノル
ロイシン、アスパラギンまたはグルタミンのカルボン酸基を介して前記アニリン基と結合したアミノ酸配列Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｎｌｅ、Ａｌａ−Ａｌａ−ＡｓｎまたはＨｉｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎを含むまたはからなるペプチド部分であり；ＬはＰｅｐ１のカルボン酸基またはアミノ基のいずれかによりアミド結合を介してＰｅｐ１と結合したリンカーであり；Ｐｅｐ２はそのチオール基によりＬと結合した細胞透過性および可溶性ペプチド部分である、化合物を提供する。特定のかかる実施形態では、Ｌは、Ｐｅｐ１のアミノ基によりアミド結合を介してＰｅｐ１と結合した式：
【化７】
2020520981.tif 000009
（式中、ｍは１〜２０の整数である。）
のリンカーであり、Ｌのアルキレン鎖は１つ以上の−Ｏ−基が割り込んでいてもよく；Ｐｅｐ２はそのシステイン残基のチオール基によりＬと結合した細胞透過性および可溶性ペプチド部分、例えば、配列Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓのペプチド部分である。
【００４５】
特定の実施形態では、本明細書に開示されている化合物は、式ＩａまたはＩｂの化合物であり、Ｒ１はメチルであり；Ｒ２およびＲ３はこれらが結合する炭素原子と一緒になってアダマンチルを形成し；Ｒ５は−Ｏ−Ｒ４基に対してオルト位に結合したＣｌであり；Ａは−Ｏ−Ｒ４基に対してオルト位に結合した−ＣＨ＝ＣＨ−Ｅであり；Ｅは−ＣＯＯＣＨ３または−ＣＮであり；（ｉ）Ｐｅｐ１はシトルリンのカルボン酸基を介してアニリン基と結合した配列Ｖａｌ−Ｃｉｔのペプチド部分であり、バリンのアミノ基においてカルボキシベンジルにより保護されており（例えば、表２の化合物Ｉｂ−１ａおよびＩｂ−１ｂ）；（ｉｉ）Ｐｅｐ１はグルタミンのカルボン酸基を介してアニリン基と結合した配列Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎのペプチド部分であり、ヒスチジンのαアミノ基においてＮ−モルホリンカルボニルにより保護されており（例えば、表２の化合物Ｉｂ−２ａおよびＩｂ−２ｂ）；（ｉｉｉ）Ｐｅｐ１はシトルリンのカルボン酸基を介してアニリン基と結合された配列Ｖａｌ−Ｃｉｔのペプチド部分であり、バリンのアミノ基を介して式：
【化８】
2020520981.tif 000010
（式中、ｎは１７である（例えば、表２の化合物Ｉｂ−３ａおよび３ｂ−１ｂ）。）
のＰＥＧ含有基と結合している；かまたは（ｉｖ）Ｐｅｐ１は、それぞれ、シトルリンもしくはグルタミンのカルボン酸基を介して前記アニリン基と結合した配列Ｖａｌ−ＣｉｔもしくはＨｉｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎのペプチド部分であり；Ｌは、それぞれ、バリンまたはヒスチジンのαアミノ基によりアミド結合を介してＰｅｐ１と結合した式：
【化９】
2020520981.tif 000011
（式中、ｍは５の整数である。）
のリンカーであり；Ｐｅｐ２はシステイン残基のチオール基によりＬと結合した配列Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓのペプチド部分である（例えば、表２の化合物Ｉｂ−４ａ、Ｉｂ−４ｂ、Ｉｂ−５ａおよびＩｂ−５ｂ）。
【００４６】
【表２−１】
2020520981.tif 000012
【表２−２】
2020520981.tif 000013
【表２−３】
2020520981.tif 000014
【００４７】
別の態様では、本発明は、本明細書に開示されているジオキセタン系化学発光プローブ、すなわち、上記実施形態のいずれか１つに定義された式Ｉａ／Ｉｂの化合物、および担体を含む組成物を提供する。特定のかかる組成物は、前記化学発光プローブおよび薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物である。
【００４８】
特定の実施形態では、本発明の組成物は、表２に記載されているものから選択される式Ｉａ／Ｉｂの化学発光プローブを含む。
【００４９】
式Ｉａ／Ｉｂの化学発光プローブを、診断および／またはインビボイメージング、より詳細には、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、またはメタロプロテアーゼなどのプロテアーゼの存在、またはそのレベルの測定に使用してよい。かかるプロテアーゼの例としては、カテプシンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ１、Ｌ２、Ｏ、Ｓ、ＷおよびＺなどのカテプシン、レグマイン、ＰＳＡが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５０】
したがって、更なる態様では、本発明は、（ｉ）上記実施形態のいずれか１つに定義された式Ｉａ／Ｉｂのジオキセタン系化学発光プローブ；または診断もしくはイメージングにおけるインビボでの使用、すなわち、インビボで上記定義されたプロテアーゼの存在の決定、もしくはそのレベルの測定のための前記化学発光プローブを含む医薬組成物に関する。
【００５１】
換言すれば、本発明は、必要とする個体の上記定義されたプロテアーゼの存在の決定方法、またはそのレベルの測定方法であって、前記方法は、（ｉ）上記実施形態のいずれか１つに定義された式Ｉａ／Ｉｂの化合物、または前記化合物を含む組成物を前記個体に投与して、それにより、前記化合物を前記個体中に存在する場合に前記プロテアーゼにより発光性化学種に加水分解すること；および（ｉｉ）前記発光性化学種の化学発光を検出すること、を含む、方法に関する。本発明によれば、化学発光プローブを、前記個体の全身、または前記特定の期間における前記プロテアーゼの存在の決定、またはそのレベルの測定をするために、全身的または局所的に、例えば、前記個体の特定の器官に投与することができる。
【００５２】
さらに別の態様では、本発明は、サンプル中、すなわち、インビトロでのプロテアーゼの存在の決定方法、またはそのレベルの測定方法であって、前記方法は、（ｉ）Ｐｅｐ１が前記プロテアーゼにより切断可能な基である上記実施形態のいずれか１つに定義された式Ｉａ／Ｉｂの化合物、または前記化合物を含む組成物と前記サンプルとを接触させて、それにより、前記サンプル中に存在する場合に前記プロテアーゼにより前記化合物を発光性化学種に加水分解すること；および（ｉｉ）前記発光性化学種の化学発光を検出すること、を含む、方法に関する。
【００５３】
この方法により分析されるサンプルは、いずれものサンプル、例えば、生体サンプルであってよい。本明細書で使用されるとき、用語「生体サンプル」は、組織生検サンプル；羊水、水様液、ガラス体液、胆汁、血清、母乳、脳脊髄液、耳垢（cerumen）（耳垢（earwax））、内リンパ、外リンパ、膣液（female ejaculate）、胃液、粘液、腹水、唾液、皮脂（皮膚の脂）、精液、汗、涙、膣分泌物、嘔吐物および尿などの体液；または体液系液、すなわち、体液が溶解している水溶液を表す。
【００５４】
本発明による医薬組成物を、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎに記載された従来技術によって製造してよい：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，１９ｔｈ  Ｅｄ．，１９９５。組成物を、例えば、活性薬剤、すなわち、本明細書に開示されているジオキセタン系化学発光プローブを液体担体、微細固体担体、または両方中に均質に充分に混合し、次いで、必要に応じて、生成物を所望の配合物に仕上げることにより製造することができる。組成物は、液体でも、固体でも、半固体の形態であってもよく、薬学的に許容可能なフィラー、担体、希釈剤またはアジュバント、および他の不活性成分ならびに賦形剤をさらに含んでもよい。１つの実施形態では、本発明の医薬組成物は、ナノ粒子として製剤する。
【００５５】
本発明による医薬組成物を、適切な投与経路、例えば、静脈内、動脈内、胸膜内、気管
内、腹腔内、筋肉内もしくは皮下投与などの非経口投与、局所投与、経口または腸内投与、または吸入用に製剤することができる。特定の実施形態では、かかる組成物を、静脈内もしくは腹腔内投与用、または皮下投与用に製剤する。
【００５６】
本発明の医薬組成物は、適切な分散剤、湿潤剤または懸濁剤を用いて公知の技術により製剤してよい滅菌注射可能な水性または油性懸濁剤の形態であってよい。滅菌注射製剤は、無毒性非経口可能な希釈剤または溶媒中の滅菌注射液剤または懸濁剤であってもよい。使用してよい許容可能な媒体および溶媒としては、例えば、水、リンゲル液および等張性塩化ナトリウム液が挙げられる。
【００５７】
本発明のプローブの化学発光を、当技術分野で公知のいずれもの技術または手順を利用して検出することができる。
【００５８】
光学分子イメージングは、腫瘍境界検出において高感度および特異性を提供する有望な技術である。さらに、現在の臨床応用は、光学分子イメージングは精密な手順を行う外科医を導くための強力な手術中のツールであり、したがって、根治的切除および生存率改善を可能とすることを立証した。蛍光ガイド下低侵襲外科治療のための臨床的に承認された装置の例は、ダヴィンチサージカルシステム（ｄａ  Ｖｉｎｃｉ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ）である（Ｈａｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。この装置は、患者内側の明瞭かつ拡大して表示するための３Ｄ  ＨＤ視覚システムを特徴とし、外科医が従来の腹腔鏡検査と同様な少数の小さな開口部により複雑かつルーチン的手順を行うことを可能とする。加えて、次のシステムは、乳がん、肝転移およびバイパス移植手術のための手術において既に適用されている：Ｔｈｅ  Ｈａｍａｍａｔｓｕ’ｓ  Ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ  Ｅｙｅ（ＰＤＥ（商標）），Ａｒｔｅｍｉｓ（商標）およびＮｏｖａｄａｑ  ＳＰＹ（商標）（Ｎｏｖａｄａｑ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，カナダ、トロント）（Ｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。いくつかの現在の手術中ＮＩＲ蛍光分子イメージングシステムを臨床治験において評価した；Ｆｌｕｏｂｅａｍ（登録商標）、ＦＬＡＲＥ（商標）およびＧＸＭＩ  Ｎａｖｉｇａｔｏｒ。これらは、イメージ評価を改善し、検出深さを増大する操作の簡便さにおいて重要な役割を果たした（Ｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。
【００５９】
近年、ＩＲ範囲での光学蛍光イメージングのためのカメラおよびレーザーの開発において大きな進歩があった（Ｍｉｅｏｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｔｒｏｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。同時に、心拍出量、肝機能および肝血流の決定ならびに眼の血管造影のためのメチレンブルーおよびＩＣＧなどの低ＭＷ有機染料の大きな臨床用途がある。２０１５年、手中に微小循環を可視化するためのＦＤＡ承認を得た蛍光イメージングシステム、Ｘｉｒａｌｉｔｅ（登録商標）（炎症および灌流関連障害用）。
【００６０】
本発明を、次の非限定的実施例によって例証する。
【実施例】
【００６１】
実験
一般方法 
無水条件を要する全反応をアルゴン雰囲気下で行った。特に指定されない限り、全反応を室温で行った。化学薬品および溶媒は、Ａ．Ｒ．グレードであったか、あるいは標準的方法により精製したかのいずれかである。ＴＬＣ：シリカゲルプレートＭｅｒｃｋ  ６０Ｆ２５４：ＵＶ光照射により化合物を可視化した。カラムクロマトグラフィー（ＦＣ）：シリカゲルＭｅｒｃｋ  ６０（粒径０．０４０〜０．０６３ｍｍ）、括弧内は溶離液。ＲＰ−ＨＰＬＣ：Ｃ１８  ５μ、２５０×４．６ｍｍ、括弧内は溶離液。分取ＲＰ−ＨＰＬＣ：Ｃ１８  ５μ、２５０×２１ｍｍ、括弧内は溶離液。１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを、Ｂ
ｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅを用いて４００ＭＨｚで測定した。１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを、Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅを用いて１００ＭＨｚで測定した。化学シフトを、残溶媒に対してδ目盛のｐｐｍで報告した（ＣＤＣｌ３：１Ｈ−ＮＭＲに関してδ＝７．２６および１３Ｃ−ＮＭＲに関して７７．１６、ＤＭＳＯ−ｄ６：１Ｈ−ＮＭＲに関してδ＝２．５０および１３Ｃ−ＮＭＲに関して３９．５２）。質量スペクトルを、Ｗａｔｅｒｓ
Ｘｅｖｏ  ＴＱＤで測定した。化学発光を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  ｉ３ｘで記録した。円および溶媒を含む全ても一般試薬を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。光化学反応のための光照射：ＬＥＤ  ＰＡＲ３８ランプ（１９Ｗ、３０００Ｋ）。
【００６２】
プローブ１の合成
化合物１ｂ。スキーム３に示されているように、化合物１ａ（Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）（３００ｍｇ、０．５８ｍｍｏｌ、１当量）をＡＣＮ  ７ｍＬに溶解し、０℃まで冷却した。ヨウ化ナトリウム（２６４ｍｇ、１．７６ｍｍｏｌ、３当量）を添加し、次いで、ＴＭＳ−Ｃｌ（２２２μＬ、１．７６ｍｍｏｌ、３当量）を直ぐに添加した。反応物を放置して室温まで温めてＴＬＣ（ＭｅＯＨ：ＤＣＭ  １０：９０）によってモニターした。完了次第、反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、飽和Ｎａ２Ｓ２Ｏ３、次いで塩水で洗浄した。有機層を分離し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、減圧下溶媒を蒸発させてオフホワイト固体の化合物１ｂ（２４５ｍｇ、収率６７％）を得た。化合物をさらに精製しないで反応させた。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ  Ｃ２６Ｈ３４ＩＮ５Ｏ５の計算値：６２３．１６；実測値：６２４．４［Ｍ＋Ｈ」＋。
【００６３】
スキーム３：化合物１ｂの合成
【化１０】
2020520981.tif 000015
【００６４】
プローブ１。スキーム４に示されているように、化合物１ｂ（６９ｍｇ、０．１１５ｍｍｏｌ、１当量）および化合物１ｃ（Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）（３７ｍｇ、０．１２７ｍｍｏｌ、１．１当量）をＤＭＦ  ０．５ｍＬに溶解し、Ｋ２ＣＯ３（３５ｍｇ、０．２５３ｍｍｏｌ、２．２当量）を添加した。反応をＴＬＣ（ＭｅＯＨ：ＤＣＭ
１０：９０）によりモニターした。完了次第、反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、飽和ＮＨ４Ｃｌで洗浄した。有機層を分離し、塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過して、溶媒を減圧下蒸発させた。粗生成物をさらに精製しないで反応させた。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ  Ｃ４４Ｈ５４ＣｌＮ５Ｏ７の計算値：７９９．３７；実測値：８００．５［Ｍ＋Ｈ」＋。
【００６５】
粗生成物をＤＣＭ  ５ｍＬおよびＤＭＦ数滴（溶解性を向上させるため）中に溶解した。数ミリグラムのメチレンブルーを添加し、黄色光を照射しながら、溶液全体に酸素をバブリングした。反応をＲＰ−ＨＰＬＣ（水中ＡＣＮ  ５０〜１００％、２０分）によりモニターした。完了次第、反応混合物を減圧下蒸発することにより濃縮し、粗生成物を分取ＲＰ−ＨＰＬＣ（水中ＡＣＮ  ５０〜１００％、２０分）により精製して白色固体のプローブ１（２０ｍｇ、収率２１％）を得た。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ  Ｃ４４Ｈ５４ＣｌＮ
５Ｏ９の計算値：８３１．３６；実測値：８５４．５［Ｍ＋Ｎａ」＋。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）  δ  １０．０７（ｓ，１Ｈ），８．１０（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．６０（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），７．５４（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ），７．４４（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．４１−７．２５（ｍ，７Ｈ），５．９７（ｓ，１Ｈ），５．７４（ｓ，１Ｈ），５．４１（ｓ，２Ｈ），５．１６（ｑ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ，２Ｈ），５．０２（ｓ，２Ｈ），４．４０（ｄｄ，Ｊ＝１３．４，７．９Ｈｚ，１Ｈ），３．９５−３．８６（ｍ，１Ｈ），３．０７（ｓ，３Ｈ），３．０５−２．９７（ｍ，１Ｈ），２．９２（ｄｄ，Ｊ＝１３．０，６．１Ｈｚ，１Ｈ），２．８５（ｓ，１Ｈ），２．２４（ｄ，Ｊ＝１２．８Ｈｚ，１Ｈ），２．０３−１．８６（ｍ，２Ｈ），１．７５−１．４９（ｍ，９Ｈ），１．３７（ｄｄ，Ｊ＝３７．８，８．８Ｈｚ，３Ｈ），１．２８−１．１２（ｍ，４Ｈ），０．８６（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ），０．８２（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）  δ  １７１．７７，１７１．１７，１５９．４２，１５６．６８，１５５．０７，１３９．２７，１３７．６２，１３２．８４，１３１．６０，１２８．８７，１２８．２９，１２８．１７，１２５．０５，１２０．７０，１１９．５５，１１６．５５，１１２．０２，９５．７７，７０．８５，６５．９２，６０．５９，５３．５８，４９．７５，３６．４６，３３．７６，３３．４８，３２．２５，３１．６２，３１．３１，３０．９０，３０．００，２７．３１，２６．０５，２５．７２，１９．７４，１８．６８。
【００６６】
スキーム４：化学発光プローブ１の合成
【化１１】
2020520981.tif 000016
【００６７】
プローブ２の合成
化合物２ｂ。スキーム５に示されているように、化合物１ｂ（５０ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ、１当量）および化合物１ｃ（Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）（３４ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ、１．１当量）をＤＭＦ  ０．５ｍＬに溶解し、Ｋ２ＣＯ３（２４ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ、２．２当量）を添加した。反応をＴＬＣ（ＭｅＯＨ：ＤＣＭ  １０：９０）によりモニターした。完了次第、反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、飽和ＮＨ４Ｃｌで洗浄した。有機層を分離し、塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過して、溶媒を減圧下蒸発させた。粗生成物をカラムクロマトグラフィーによりシリカゲル（ＭｅＯＨ：ＤＣＭ  １０：９０）で精製して黄色がかった固体の化合物２ｂ（２９ｍｇ、収率４１％）を得た。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ  Ｃ４８Ｈ５８ＣｌＮ５Ｏ９の計算値：８８３．３９；実測値：８８４．８［Ｍ＋Ｈ」＋。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）  δ  ７．８３（ｄ，Ｊ＝１６．２Ｈｚ，１Ｈ），７．５３（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），７．３５（ｔ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，３Ｈ），７．３０−７．１８（ｍ，５Ｈ），７．００（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），６．３６（ｄ，Ｊ＝１６．２Ｈｚ，１Ｈ），５．０２（ｑ，Ｊ＝１２．３Ｈｚ，３Ｈ），４．８７（ｄ，Ｊ＝３．１Ｈｚ，２Ｈ），４．４９（ｄｄ，Ｊ＝８．８，４．９Ｈｚ，１Ｈ），３．９６（ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，１Ｈ），３．７１（ｓ，３Ｈ），３．２５（ｓ，３Ｈ），３．２２−２．９８（ｍ，４Ｈ），２．０６−１．９４（ｍ，３Ｈ），１．９２−１．８０（ｍ，６Ｈ），１．８０−１．７０（ｍ，５Ｈ），１．７０−１．５６（ｍ，５Ｈ），１．４６（ｓ，３Ｈ），０．８８（ｄ，Ｊ＝６
．７Ｈｚ，３Ｈ），０．８４（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）  δ  １７２．５５，１７０．３７，１６７．５０，１５７．００，１５３．６９，１３９．２９，１３９．０４，１３８．３２，１３８．２６，１３８．２０，１３８．１２，１３６．１７，１３２．７８，１３１．８３，１２９．６１，１２８．５１，１２８．１８，１２７．８８，１２５．１５，１１９．９１，１１９．７４，７５．８２，６７．０７，６０．４８，５７．２６，５３．１６，５１．８４，３９．１３，３８．５９，３６．９９，３２．９４，３１．００，２９．７２，２９．２９，２８．３１，２５．９９，１９．１７，１７．７９。
【００６８】
スキーム５：化合物２ｂの合成
【化１２】
2020520981.tif 000017
【００６９】
プローブ２。スキーム６に示されているように、化合物２ｂ（２０ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）をＤＣＭ  ５ｍＬおよびＤＭＦ数滴（溶解性を向上させるため）中に溶解した。数ミリグラムのメチレンブルーを添加し、黄色光を照射しながら、溶液全体に酸素をバブリングした。反応をＲＰ−ＨＰＬＣ（水中ＡＣＮ  ５０〜１００％、２０分）によりモニターした。完了次第、反応混合物を減圧下蒸発することにより濃縮し、粗生成物を分取ＲＰ−ＨＰＬＣ（水中ＡＣＮ  ５０〜１００％、２０分）により精製して白色固体のプローブ２（８ｍｇ、収率４０％）を得た。ＭＳ（ＥＳ−）：ｍ／ｚ  Ｃ４８Ｈ５８ＣｌＮ５Ｏ１１の計算値：９１５．３８；実測値：９５０．６［Ｍ＋Ｃｌ」−。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）  δ  １０．０９（ｓ，１Ｈ），８．１１（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．９４（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．７７（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．７１（ｄ，Ｊ＝１６．２Ｈｚ，１Ｈ），７．６０（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），７．３７−７．２７（ｍ，６Ｈ），６．６７（ｄ，Ｊ＝１６．２Ｈｚ，１Ｈ），５．９８（ｓ，１Ｈ），５．４２（ｓ，１Ｈ），５．０２（ｓ，２Ｈ），４．９２−４．８５（ｍ，２Ｈ），４．４１（ｄｄ，Ｊ＝１３．４，８．０Ｈｚ，１Ｈ），３．９６−３．８５（ｍ，１Ｈ），３．７１（ｓ，３Ｈ），３．１０（ｓ，３Ｈ），２．９８（ｄ，Ｊ＝２３．１Ｈｚ，２Ｈ），２．８７（ｓ，１Ｈ），２．２２（ｄ，Ｊ＝１２．４Ｈｚ，１Ｈ），１．９６（ｄｄ，Ｊ＝１３．５，６．７Ｈｚ，１Ｈ），１．８９（ｓ，１Ｈ），１．７７−１．４８（ｍ，１１Ｈ），１．４９−１．１１（ｍ，７Ｈ），０．８６（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ），０．８２（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）  δ  １７１．７９，１７１．２２，１６６．７３，１５９．４３，１５６．６９，１５４．２３，１３９．８６，１３７．９０，１３７．６２，１３４．８５，１
３１．７９，１３０．７３，１３０．２０，１２８．８７，１２８．３０，１２８．１９，１２７．３９，１２６．５６，１２１．７７，１１９．３９，１１１．７２，９５．９５，７６．２６，６５．９３，６０．５９，５３．６０，５２．２４，４９．９５，３９．８３，３９．６２，３９．４１，３６．３９，３３．８１，３３．５９，３２．３６，３２．１８，３１．６１，３１．３８，３０．９１，３０．００，２７．３１，２６．０３，２５．６９，１９．７３，１８．６８。
【００７０】
スキーム６：化学発光プローブ２の合成
【化１３】
2020520981.tif 000018
【００７１】
Ｚ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡ−７ＨＣの合成
スキーム７に示されているように、化合物１ｂ（４０ｍｇ、０．０６４ｍｍｏｌ、１当量）および７−ヒドロキシクマリン（１２ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ、１．１当量）をＤＭＦ  ０．５ｍＬに溶解し、Ｋ２ＣＯ３（２０ｍｇ、０．１４１ｍｍｏｌ、２．２当量）を添加した。反応をＴＬＣ（ＭｅＯＨ：ＤＣＭ  １０：９０）によりモニターした。完了次第、反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、飽和ＮＨ４Ｃｌで洗浄した。有機層を分離し、塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過して、溶媒を減圧下蒸発させた。粗生成物をカラムクロマトグラフィーによりシリカゲル（ＭｅＯＨ：ＤＣＭ  １０：９０）で精製して黄色がかった固体のＺ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡ−７ＨＣ（２９ｍｇ、収率７１％）を得た。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ  Ｃ３５Ｈ３９Ｎ５Ｏ８の計算値：６５７．２８；実測値：６８０．５２［Ｍ＋Ｎａ」＋。
【００７２】
スキーム７：Ｚ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡ−７ＨＣの合成
【化１４】
2020520981.tif 000019
【００７３】
プローブ３の合成
化合物３ｂ。スキーム８に示されているように、化合物３ａ（Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）（１００ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ、１当量）をＡＣＮ  ７ｍＬに溶解し、０℃まで冷却した。ヨウ化ナトリウム（９０ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ、３当量）を添加し、次いで、ＴＭＳ−Ｃｌ（７８μＬ、０．６ｍｍｏｌ、３当量）を直ぐに添加した。反応物を放置して室温まで温めてＴＬＣ（ＭｅＯＨ：ＤＣＭ  １０：９０）によってモニターした。完了次第、反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、飽和Ｎａ２Ｓ２Ｏ３、次いで塩水で洗浄した。有機層を分離し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、減圧下溶媒を蒸発させて黄色がかった固体の化合物３ｂ（１０８ｍｇ、収率７６％）を得た。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ  Ｃ３３Ｈ３８ＩＮ５Ｏ５の計算値：７１１．１９；実測値：７１２．５［Ｍ＋Ｈ」＋。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）  δ  １０．１０（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），８．１３（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１Ｈ），７．８７（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），７．７３（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），７．５９（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．５２（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），７．４６−７．２５（ｍ，４Ｈ），７．２１（ｓ，１Ｈ），４．７０（ｓ，１Ｈ），４．６０（ｓ，１Ｈ），４．４１（ｓ，２Ｈ），４．３４−４．１５（ｍ，４Ｈ），３．９４−３．８９（ｍ，２Ｈ），３．００（ｓ，１Ｈ），２．９４（ｓ，１Ｈ），１．９７（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１Ｈ），１．６７（ｓ，１Ｈ），１．５９（ｓ，１Ｈ），１．５０−１．２６（ｍ，２Ｈ），１．２１（ｓ，１Ｈ），０．８６（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ），０．８４（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）  δ  １７１．８４，１７１．２３，１５９．４６，１５６．６５，１４４．４３，１４４．３０，１４１．２３，１３９．５０，１３２．９６，１３０．０６，１２８．１８，１２７．６１，１２５．９０，１２０．６４，１２０．１１，１１９．６４，１１８．０９，６６．２０，６３．１１，６０．５７，５７．２５，５３．６４，４７．２１，４６．７１，３９．８３，３９．６３，３９．４２，３０．９７，２９．９３，２９．５３，２７．２９，１９．７５，１８．８２。
【００７４】
スキーム８：化合物３ｂの合成
【化１５】
2020520981.tif 000020
【００７５】
化合物３ｃ。スキーム９に示されているように、アルゴン雰囲気下、化合物２ａ（１２０ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ、１．２当量）を無水ＤＭＦに溶解し、０℃まで冷却した。ヨウ化ナトリウム（１１．２ｍｇ、０．２８、１．１当量）を添加し、反応物を放置して室温まで温めた。１５分間の撹拌後、化合物３ｂ（１８４ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ、１当量）を添加し、反応をＴＬＣ（ＭｅＯＨ：ＤＣＭ  １０：９０）によりモニターした。完了次第、減圧下溶媒を除去した。得られた油状物をＥｔＯＡｃ  ２ｍＬで沈殿させて、次いで、Ｅｔ２Ｏ（７ｍＬ）を用いて１０分間トリチュレートした。それから、混合物を真空ろ過によりろ過し、固体物を乾燥してオフホワイト固体の化合物３ｃ（２３６ｍｇ、６８％）を得た。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ  Ｃ５５Ｈ６２ＣｌＮ５Ｏ９の計算値：９７１．４２；実測値：９７２．７［Ｍ＋Ｈ」＋。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）  δ  １０．１０（ｓ，１Ｈ），８．１３（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），７．８７（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），７．７７（ｄｄ，Ｊ＝８．３，４．４Ｈｚ，２Ｈ），７．７２（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，２Ｈ），７．６０（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），７．４１（ｄｄ，Ｊ＝１７．４，８．５Ｈｚ，３Ｈ），７．３１（ｔ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，４Ｈ），７．０９（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），６．６４（ｄ，Ｊ＝１６．２Ｈｚ，１Ｈ），５．９８−５．９５（ｍ，１Ｈ），５．４０（ｓ，２Ｈ），４．９２（ｄｄ，Ｊ＝１５．０Ｈｚ，２Ｈ），４．４１（ｓ，１Ｈ），４．３１−４．１８（ｍ，３Ｈ），３．９６−３．８６（ｍ，１Ｈ），３．７０（ｓ，３Ｈ），３．３６（ｄｄ，Ｊ＝１４．０，７．０Ｈｚ，１Ｈ），３．２０（ｓ，３Ｈ），３．１７（ｓ，１Ｈ），３．０７−２．９７（ｍ，１Ｈ），２．９７−２．８６（ｍ，１Ｈ），２．０３−１．８２（ｍ，６Ｈ），１．８０−１．５０（ｍ，９Ｈ），１．５０−１．２７（ｍ，２Ｈ），１．０７（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，１Ｈ），０．８７（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ），０．８４（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）  δ  １７１．８２，１７１．２１，１６６．９５，１５９．４１，１５６．６４，１５３．５４，１４４．４４，１４４．３１，１４１．２３，１３９．８６，１３８．４１，１３７．９０，１３０．９２，１３０．７５，１３０．１０，１２９．８７，１２９．２６，１２８．１７，１２７．６０，１２６．３９，１２５．９１，１２０．６３，１１９．３３，７６．０３，６６．２１，６５．４６，６０．５７，５７．０６，５３．６３，５２．１６，４７．２１，３８．９５，３８．６３，３６．９８，３２．９３，３０．９９，３０．００，２９．５５，２８．０９，２７．３４，１９．７５，１８．８０，１５．７０。
【００７６】
スキーム９：化合物３ｃの合成
【化１６】
2020520981.tif 000021
【００７７】
化合物３ｄ。スキーム１０に示されているように、化合物３ｃ（２２０ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ、１当量）をＤＭＦ（６ｍＬ）に溶解し、ジエチルアミン（２ｍＬ）を添加した。反応をＲＰ−ＨＰＬＣ（水中ＡＣＮ  ５０〜１００％、２０分）によりモニターした。完了次第、減圧下溶媒を除去した。得られた油状物をＥｔＯＡｃ  １．５ｍＬで沈殿させて、次いで、Ｅｔ２Ｏ（２０ｍＬ）を用いて１０分間トリチュレートした。それから、混合物を真空ろ過によりろ過し、固体物を乾燥してオフホワイト固体の化合物３ｄ（１４０ｍｇ、８２％）を得た。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ  Ｃ４０Ｈ５２ＣｌＮ５Ｏ７の計算値：７４９．３６；実測値：７５０．６［Ｍ＋Ｈ」＋。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）  δ  １０．１８（ｓ，１Ｈ），８．２３（ｓ，１Ｈ），７．８１−７．７１（ｍ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ，２Ｈ），７．６０（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），７．３３（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），７．１０（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），６．６３（ｄ，Ｊ＝１６．１Ｈｚ，１Ｈ），５．９８（ｓ，１Ｈ），５．４２（ｓ，２Ｈ），４．９３（ｄｄ，Ｊ＝３０．５，９．９Ｈｚ，２Ｈ），４．４７（ｓ，１Ｈ），３．７１（ｓ，３Ｈ），３．２０（ｓ，３Ｈ），３．１７（ｓ，１Ｈ），３．１３（ｄ，Ｊ＝４．７Ｈｚ，１Ｈ），３．０５−２．９７（ｍ，１Ｈ），２．９７−２．８８（ｍ，１Ｈ），１．９４−１．８５（ｍ，Ｊ＝２４．５Ｈｚ，６Ｈ），１．７８−１．５５（ｍ，９Ｈ），１．４６−１．３２（ｍ，３Ｈ），１．２２（ｓ，２Ｈ），０．８８（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ），０．８０（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）  δ
１７３．８２，１７１．２４，１６６．９６，１５９．４３，１５３．５５，１３９．８７，１３９．７２，１３８．４２，１３７．９１，１３１．０１，１３０．７７，１３０．１１，１２９．８８，１２９．２６，１２８．１９，１２６．４０，１２０．５８，１１９．４１，７６．０２，５９．７２，５７．０６，５３．１７，５２．１６，４０．０４，３９．８３，３９．６２，３９．４１，３８．９６，３８．６３，３６．９８，３２．９２，３１．６２，３０．４６，２９．５５，２８．０８，２７．２６，２２．６０，１９．８５，１７．６１，１４．５０。
【００７８】
スキーム１０：化合物３ｄの合成
【化１７】
2020520981.tif 000022
【００７９】
化合物３ｅ。スキーム１１に示されているように、アルゴン雰囲気下、ｍＰＥＧ７８０（１００ｍｇ、０．１２８ｍｍｏｌ、１当量）を無水ＤＣＭに溶解し、０℃まで冷却した。Ｅｔ３Ｎ（３６μＬ、０．２５６ｍｍｏｌ、２当量）およびクロロギ酸ｐ−ニトロフェニル（ＰＮＰ−Ｃｌ、５２ｍｇ、０．２５６ｍｍｏｌ、２当量）を添加し、反応物を放置して室温まで温めた。反応をＴＬＣ（ＭｅＯＨ：ＤＣＭ  １０：９０）によりモニターした。完了次第、反応混合物をＤＣＭで希釈し、飽和ＮＨ４Ｃｌで洗浄した。有機層を分離し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過して、溶媒を減圧下蒸発させた。粗生成物をカラムクロマトグラフィーによりシリカゲル（ＭｅＯＨ：ＤＣＭ  ２０：８０）で精製して白色〜黄色がかった固体の化合物３ｅ（１０１ｍｇ、収率８３％）を得た。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ  Ｃ４２Ｈ７５ＮＯ２２の計算値：９４６．０４；実測値：９４６．８。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）  δ  ８．２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８Ｈｚ），７．３２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８Ｈｚ），４．４１−４．３３（ｍ，２Ｈ），３．７７−３．７２（ｍ，２Ｈ），３．６４−３．６０（ｍ，６Ｈ），３．５６−３．５８（ｍ，５６Ｈ），３．４６−３．４８（ｍ，２Ｈ），３．３０（ｓ，３Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）  δ  １５５．５４，１５２．４９，１４５．３８，１２５．３２，１２１．８６，７１．９２，７０．６９，７０．５５，６８．６２，６８．３３，５９．０２。
【００８０】
スキーム１１：化合物３ｅの合成
【化１８】
2020520981.tif 000023
【００８１】
プローブ３。スキーム１２に示されているように、化合物３ｄ（１０ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ、１当量）および化合物３ｅ（１９ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ、１．５当量）をＤＭＦに溶解し、Ｅｔ３Ｎ数滴を添加した。反応を５０℃で一夜加熱した。反応をＲＰ−ＨＰＬＣ（水中ＡＣＮ  ３０〜１００％、２０分）によりモニターした。完了次第、反応混合物を減圧下蒸発することにより濃縮し、粗生成物をさらに精製しないで次工程に使用した。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ  Ｃ７６Ｈ１２２ＣｌＮ５Ｏ２６の計算値：１５５７．２５
；実測値：７９０．４［（Ｍ＋Ｎａ）／２」＋。
【００８２】
スキーム１２：化学発光プローブ３の合成
【化１９】
2020520981.tif 000024
【００８３】
粗生成物（１２ｍｇ、０．００８ｍｍｏｌ）をＤＣＭ  ５ｍＬに溶解した。数ミリグラムのメチレンブルーを添加し、黄色光を照射しながら、溶液全体に酸素をバブリングした。反応をＲＰ−ＨＰＬＣ（水中ＡＣＮ  ３０〜１００％、２０分）によりモニターした。完了次第、反応混合物を減圧下蒸発することにより濃縮し、粗生成物を分取ＲＰ−ＨＰＬＣ（水中ＡＣＮ  ３０〜１００％、２０分）により精製して白色固体のプローブ３（６ｍｇ、収率２９％、２工程）を得た。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ  Ｃ７６Ｈ１２２ＣｌＮ５Ｏ２８の計算値：１５８７．８０；実測値：１５８９．０［Ｍ＋Ｈ」＋。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）  δ  １０．０６（ｓ，１Ｈ），８．０５（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．９４（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．７７（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．７４−７．６８（ｍ，１Ｈ），７．６０（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），７．３２（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），７．２３（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．６７（ｄ，Ｊ＝１６．１Ｈｚ，２Ｈ），５．９５（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，１Ｈ），５．３９（ｓ，２Ｈ），４．８８（ｔ，Ｊ＝１１．６Ｈｚ，２Ｈ），４．４１（ｄ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，２Ｈ），４．０５（ｓ，２Ｈ），３．８８（ｄ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ，２Ｈ），３．７１（ｓ，３Ｈ），３．７０（ｓ，１Ｈ），３．５６（ｄ，Ｊ＝４．５Ｈｚ，６Ｈ），３．４９（ｓ，５６Ｈ），３．４１（ｄｄ，Ｊ＝５．８，３．５Ｈｚ，２Ｈ），３．２２（ｓ，３Ｈ），３．１１（ｓ，３Ｈ），３．０７−２．９０（ｍ，２Ｈ），２．８７（ｓ，１Ｈ），２．２８−２．１１（ｍ，２Ｈ），２．０１−１．８３（ｍ，３Ｈ），１．６４（ｄｄ，Ｊ＝４８．９，１３．１Ｈｚ，９Ｈ），１．３９（ｄｄ，Ｊ＝５２．０，１２．３Ｈｚ，５Ｈ），１．２２（ｓ，２Ｈ），０．８６（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ），０．８２（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）  δ  １７１．８０，１７１．２４，１６９．８６，１６９．８０，１６８．９１，１６６．７６，１６４．３４，１５９．４５，１５６．７８，１５４．２９，１５２．２０，１３９．９４，１３７．９０，１３４．９１，１３３．９６，１３３．６５，１３１．８３，１３１．４１，１３０．８５，１３０．２０，１２９．００，１２７．３８，１２６．６０，１２３．７６，１２１．７７，１１９．４６，１１６．８０，１１１．８０，１１１．７７，９６．０６，７６．１８，７１．８６，７０．３６，７０．１６，６９．３９，６４．
０６，６０．５３，５８．６２，５３．５４，５３．２９，５２．２７，４９．９４，４０．７４，４０．５４，４０．３３，４０．１２，３９．９１，３９．７０，３９．４９，３６．４６，３６．４０，３３．８８，３３．７８，３３．６５，３２．４２，３２．２３，３１．７７，３１．４４，３０．９４，３０．０７，２９．５７，２９．２１，２７．３４，２６．０８，２５．７９，２２．６６，１９．７７，１８．７０。
【００８４】
プローブ４の合成
化合物４ｂ。スキーム１３に示されているように、化合物３ｄ（１０ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ、１当量）および化合物４ａ（Ｉｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）をＤＭＦ（０．５ｍＬ）に溶解し、Ｅｔ３Ｎ数滴を添加した。反応をＲＰ−ＨＰＬＣ（水中ＡＣＮ
３０〜１００％、２０分）によりモニターした。完了次第、減圧下反応混合物を濃縮した。粗生成物をさらに精製しないでさらに反応させた。粗生成物および数ミリグラムのメチレンブルーをＤＣＭ  ５ｍＬおよびＤＭＦ数滴（溶解性を向上させるため）に溶解した。黄色光を照射しながら、酸素を溶液全体にバブリングした。反応をＲＰ−ＨＰＬＣ（水中ＡＣＮ  ３０〜１００％、２０分）によりモニターした。完了次第、反応混合物を減圧下蒸発させることにより濃縮した。粗生成物を分取ＲＰ−ＨＰＬＣ（水中ＡＣＮ  ３０〜１００％、２０分）により精製して白色固体の化合物４ｂ（１１ｍｇ、収率７６％）を得た。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ  Ｃ５０Ｈ６３ＣｌＮ６Ｏ１２の計算値：９７４．４２；実測値：９７５．８［Ｍ＋Ｈ」＋。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）  δ  １０．０２（ｓ，１Ｈ），８．０９（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．９４（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．７８（ｔ，Ｊ＝９．４Ｈｚ，２Ｈ），７．７０（ｄ，Ｊ＝１６．２Ｈｚ，１Ｈ），７．６０（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），７．３２（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），６．９８（ｓ，２Ｈ），６．６７（ｄ，Ｊ＝１６．２Ｈｚ，１Ｈ），５．９７（ｓ，１Ｈ），５．４０（ｓ，２Ｈ），４．９５−４．８０（ｍ，２Ｈ），４．３７（ｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ），４．２６−４．１０（ｍ，１Ｈ），３．７１（ｓ，３Ｈ），３．３５（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ），３．１０（ｓ，３Ｈ），３．０６−２．９７（ｍ，１Ｈ），２．９７−２．８９（ｍ，１Ｈ），２．８７（ｓ，１Ｈ），２．２９−２．０２（ｍ，３Ｈ），１．９９−１．８５（ｍ，２Ｈ），１．７９−１．５２（ｍ，９Ｈ），１．４７（ｄｄ，Ｊ＝１４．３，７．９Ｈｚ，６Ｈ），１．３２（ｄ，Ｊ＝１１．３Ｈｚ，２Ｈ），１．１８（ｄｄ，Ｊ＝１７．９，１０．０Ｈｚ，３Ｈ），０．８４（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ），０．８０（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）  δ  １７２．８０，１７１．６１，１７１．２２，１６６．７４，１５９．４３，１５４．２５，１３９．８９，１３７．９０，１３４．９９，１３０．１９，１２７．４０，１２１．７９，１１９．３７，１１１．７２，９５．９６，７６．２７，５８．０７，５３．６３，５２．２４，４９．９６，３９．８３，３９．６２，３９．４２，３７．５４，３６．３９，３５．４５，３３．５８，３２．１８，３１．３８，３０．９３，２９．８２，２８．３０，２７．３６，２６．３１，２６．０２，２５．６９，２５．４４，１９．７８，１８．７２。
【００８５】
スキーム１３：化合物４ｂの合成
【化２０】
2020520981.tif 000025
【００８６】
ＣＧＫＲＫ。ペプチドＣＧＫＲＫ（Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ）を、Ｆｍｏｃ−固相ペプチド合成により合成した。Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）ワング樹脂を、３０分間ＤＭＦ中でかき混ぜた。２０％ピペリジンでＦｍｏｃ脱保護を行った（１５分）後、ＤＩＰＥＡ（６当量）およびＤＭＦの混合物中、次のアミノ酸（４当量）をＨＢＴＵ（４当量）と結合させた（３０分）。配列が完了するまでこれらの２工程を反復した。最終的に、システインのＦｍｏｃ脱保護を完了し、ＣＧＫＲＫ配列をＴＦＡ／ＴＩＰＳ／Ｈ２Ｏ（９０／５／５）溶液を用いて樹脂から切断した。ペプチドを沈殿させて、冷ジエチルエーテル溶液で洗浄し、凍結乾燥した。白色沈殿物として生成物を得た。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ  Ｃ２３Ｈ４６Ｎ１０Ｏ６Ｓの計算値：５９０．３３；実測値：５９１．３［Ｍ＋Ｈ」＋。
【００８７】
プローブ４。スキーム１４に示されているように、化合物４ｂ（７ｍｇ、０．００７ｍｍｏｌ、１当量）およびＣＧＫＲＫペプチド（７．５ｍｇ、０．００８ｍｍｏｌ、１．１当量）をＤＭＦに溶解し、Ｅｔ３Ｎ数滴を添加した。反応をＲＰ−ＨＰＬＣ（水中ＡＣＮ
３０〜１００％、２０分）によりモニターした。完了次第、反応混合物を減圧下蒸発させることにより濃縮した。粗生成物を分取ＲＰ−ＨＰＬＣ（水中ＡＣＮ  ３０〜１００％、２０分）により精製して白色固体のプローブ４（８ｍｇ、収率６８％）を得た。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ  Ｃ７３Ｈ１０９ＣｌＮ１６Ｏ１８Ｓの計算値：１５６６．２６；実測値：７８４．１［（Ｍ＋Ｈ）／２」＋。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）  δ  １０．０６（ｓ，１Ｈ），８．８８−８．７４（ｍ，１Ｈ），８．３６（ｓ，２Ｈ），８．２３−８．０６（ｍ，４Ｈ），７．９３（ｔ，Ｊ＝１２．１Ｈｚ，１Ｈ），７．８５−７．７４（ｍ，９Ｈ），７．７１（ｄ，Ｊ＝１６．２Ｈｚ，１Ｈ），７．６０（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），７．３３（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，３Ｈ），６．７０−６．６５（ｍ，１Ｈ），６．０５（ｓ，１Ｈ），４．９３−４．８３（ｍ，２Ｈ），４．４６−４．０２（ｍ，１３Ｈ），３．８５（ｓ，２Ｈ），３．７１（ｓ，３Ｈ），３．３３（ｄｄ，Ｊ＝１４．４，７．３Ｈｚ，２Ｈ），３．２４−２．９０（ｍ，８Ｈ），２．８７（ｓ，１Ｈ），２．７１（ｄｄ，Ｊ＝１３．８，９．６Ｈｚ，４Ｈ），２．５２（ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，１Ｈ），２．２８−２．０４（ｍ，２Ｈ），２．０１−１．８６（ｍ，１Ｈ），１．７６−１．４０（ｍ，２８Ｈ），１．３７−１．２６（ｍ，６Ｈ），１．２３−１．１１（ｍ，３Ｈ），０．８５（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ），０．８１（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈ
ｚ，３Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）  δ  １７７．３５，１７５．４１，１７３．８４，１７２．７６，１７１．９５，１７１．８５，１７１．２３，１６８．３５，１６７．８２，１６６．７４，１５９．５３，１５９．１２，１５８．８０，１５７．３４，１５４．２４，１３９．８８，１３７．８９，１３４．８５，１３１．７７，１３０．７２，１３０．１９，１２８．８７，１２７．３９，１２６．５７，１２１．７７，１１９．３７，１１８．７８，１１５．８３，１１１．７１，９５．９５，７６．２６，５７．９９，５３．６３，５２．６７，５２．５５，５２．２４，４９．９５，４２．５２，４０．０２，３９．８１，３９．６１，３９．４０，３９．２１，３９．０９，３８．７１，３６．３９，３５．４５，３３．８１，３３．５９，３２．１９，３１．６０，３１．３８，３０．９９，３０．８８，２９．８４，２７．３５，２７．１１，２６．３６，２６．０２，２５．６９，２５．４５，２２．８５，２２．７６，１９．７８，１８．７０。
【００８８】
スキーム１４：化学発光プローブ４の合成
【化２１】
2020520981.tif 000026
【００８９】
分光分析データ
活性緩衝液は：リン酸緩衝液０．１Ｍ、５５ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭグルタチオンを含有した。全分光分析測定を３回反復して行った。検出限界算出のためのブランク測定を１０回反復した。検出限界（ＬＯＤ）をこのように算出した：
ＬＯＤ＝Ｍｅａｎｂｌａｎｋ＋３×ＳＤ
式中のＳＤは標準偏差。
【００９０】
化学発光顕微鏡イメージング 
化学発光画像を、ＥＭＣＣＤカメラ（浜松ホトニクスＣ９１００−１３）を取り付けたオリンパスＬＶ２００倒立顕微鏡を用いて得た。ＲＡＷ２６４．７アベルソンマウス白血病ウイルス誘発腫瘍細胞、ＣＴ２６ＣＬ２５結腸がん細胞およびＮＩＨ３Ｔ３マウス線維芽（コントロール）細胞を、３７℃、２４時間、３５ｍｍガラス底ペトリ皿上で増殖させた。細胞培養培地を、５μＭのプローブＭＲ３−１２８またはＭＲ３−１３１を含むＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（登録商標）生細胞イメージング溶液へ変更した。３７℃で更に２０分間、細胞をインキュベートした。化学発光の可視化のため、画像を露光時間２０分で記録した。
【００９１】
画像をＩｍａｇｅＪソフトウェアにインポートした。画像可視化のため、ローリングボールフィルター（２０ピクセル半径）を適用して画像の輝度およびコントラストを調整した。
【００９２】
試験１．プローブ２〜４はカテプシンＢの検出に有効である
この試験では、プローブ１、２、３および４として本明細書で同定された４つのプローブを実験項に記載されているように合成した。プローブ１はカテプシンＢ不安定保護基を有する従来のシャープアダマンチリデン・ジオキセタン系であり、一方、プローブ２は長いπ系および電子求引基を付加して構築した。このドナーアクセプタ対デザインは、生理的条件下発光団の発光を増大させて、酵素活性を用いた一段階アッセイ、および生細胞イメージングのための良好な発光団の役割をすることを可能とする。水中溶解性および細胞に侵入するプローブの可能性を向上させるために、本発明者らはプローブ３および４も合成した。プローブ３では、Ｎ−カルボキシベンジル（Ｃｂｚ）付加物を中程度の長さのＰＥＧに置き換えた。ＰＥＧは、水可溶性であり、結合分子の薬物速度論的特性を改良し、ＦＤＡ承認されているので、生体に適用可能な系の構築物において広く利用されている。
【００９３】
プローブ４では、リンカーを付加し、ＣＧＫＲＫ（Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ）ペプチドと結合した。ＣＧＫＲＫペプチドは複数の塩基性残基を含む。高含有率の塩基性残基はペプチドの内部移行、ＣＧＫＲＫを効果的細胞透過性にすることおよびペプチドの可溶化の間で共通した特徴である。ペンタペプチドを、トランスジェニックマウス表皮がんでのスクリーニングにおいて先ず同定した。小分子がＣＧＫＲＫペプチドと結合する場合、結合体を大部分の標的腫瘍細胞に内在化させるが、正常細胞に取り込まない。これは、活性化された内皮細胞および腫瘍細胞の表面上のＣＧＫＲＫを認識するｐ３２受容体の過剰発現のためである。ＣＧＫＲＫはカテプシンＢを過剰発現するがんとほとんど相関する複数のタイプのがんによって認識されるので、本発明者らは、プローブ４を使用する場合に生がん細胞における細胞取り込みの増加を見たかった。
【００９４】
次に、プローブの化学発光を、カテプシンＢの添加の有無で、時間の関数として測定した。化学発光シグナルおよびその相対的全光子放出の反応速度プロファイルを、それぞれ、図１Ａおよび１Ｂに示している。プローブは、カテプシンＢの添加次第、特徴的化学発光反応速度プロファイルを示し、最初に極大点までシグナル上昇した後、終結するまでゆっくり減少する。プローブ１からプローブ２、３および４まで化学発光シグナルの特徴的増加がある。プローブ１は、付加されたドナーアクセプタ対を有しないことから予測されていたように、極めて弱い発光（図１Ａ、挿入図）を生じた。それ以降、化学発光シグナル増加パターンが見られ、これは付加物の変更および水性媒体中の改良されたプローブ溶解性と相関する。発明者らが求める次の細胞イメージングのためのプローブを評価するために、各プローブによって得られる最大シグナルも調査し、この調査はより高い感度と解像度の最高点をもたらす（図１Ｃ）。種々のプローブの最大シグナルは、プローブ４の最大シグナルより見劣り、更なる研究のために有力な選択を導く。カテプシンＢの非存在下ではプローブから発光は観察されなかった。
【００９５】
酵素分解およびプローブの化学発光シグナル間の関連性を確認するため、ＨＰＬＣを使用してプローブ４の酵素分解を追跡した。ＨＰＬＣ分析は、プローブ４の迅速な酵素分解およびアニリンリンカーの超高速１，６−脱離を示している。ＨＰＬＣおよび化学発光データの比較は、化学発光最大シグナル、および酵素切断の終結の間の強い相関関係を示している。さらに、化学発光減衰および化学励起過程間の関係性は明らかである（非マスク化フェノレートの安息香酸エステルへの分解の反応速度によって見られるように）。さらに、これは、安息香酸エステルのその基底状態（発光を伴う）への減衰の効率および迅速性を示している。
【００９６】
細胞外カテプシンＢでの化学発光反応速度論による最初のスクリーニング後、プローブ３および４を細胞イメージング評価のために選択した。これらのプローブはカテプシンＢとのインキュベーション時に最大発光を示すので、これらのプローブを選択した。化学発光シグナルの局在化および定量化に適した顕微鏡（ＬＶ２００）を用いてイメージングを行った。Ｒａｗ２６４．７、ＣＴ２６腫瘍細胞、および３Ｔ３正常細胞を、プローブ３またはプローブ４のいずれかとインキュベートし、ＬＶ２００を用いてイメージングした。図３に示されているように、プローブ４とのインキュベーションは、化学発光シグナルによりイメージングされたＲａｗ２４６．７およびＣＴ２６がん細胞をもたらしたが、３Ｔ３細胞については、化学発光シグナルは観察されなかった。これは、Ｒａｗ２４６．７およびＣＴ２６細胞はカテプシンＢを過剰発現することが分かったが、正常組織細胞のマウス線維芽３Ｔ３細胞は有意により低レベルのカテプシンＢを産生するという事実と関連している。このように、プローブ４は正常組織からがん細胞を識別することができると結論することができる。一方では、プローブ３とのインキュベーションは、いずれのタイプの細胞も化学発光シグナルを示さなかった。これは、プローブ４と比較した場合にプローブ３のより低い溶解性（インビトロ実験から結論することができる）による、またはプローブ４の細胞内側に被包する性能に付加し得る腫瘍ホーミングペプチドの欠如によるものであり得る。
【００９７】
プローブ４のカテプシンＢを検出する感度を測定し、従来の７−ヒドロキシクマリン系蛍光プローブ（Ｚ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡ−７ＨＣ）と比較した。２つの検出方法間の比較を直接的に観察するため、種々のカテプシンＢ濃度を用いた信号対雑音比を、対数目盛を用いて酵素濃度に対してプロットした（図４）。著しいことに、プローブ４は、７６．２９μＵ／ｍＬの検出限界（ＬＯＤ）値を示したが、Ｚ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡ−７ＨＣは１．２５Ｕ／ｍＬのＬＯＤ値でカテプシンＢを検出した。この優れた感度（１６，０００倍超）は、診断アッセイに関する蛍光に対する化学発光モダリティの利点を明確に示している。
【００９８】
試験２．前立腺特異抗原の検出用途のためのプローブ５
プローブ５（ＰＳＡプローブ）の合成
化合物５ａ。スキーム１５に示されているように、Ｆｍｏｃ−グルタミン（Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ）（３８０ｍｇ、１．０３ｍｍｏｌ、１当量）およびｐ−アミノベンジルアルコール（１３３ｍｇ、１．０８ｍｍｏｌ、１．０５当量）をＴＨＦ（７ｍＬ）に溶解し、ＥＥＤＱ（２６６．３ｍｇ、１．０８、１．０５当量）を添加した。１６時間後、混合物を３０℃で蒸発乾固させて、残渣をエーテル（１５ｍＬ）でトリチュレートした。得られたオフホワイト固体生成物をろ過によって集め、エーテルで洗浄し、真空乾燥した（４６７ｍｇ、９６％）。
【００９９】
化合物５ｂ。スキーム１５に示されているように、化合物５ａ（２５０ｍｇ、０．５２５ｍｍｏｌ、１当量）をＡＣＮ  ７ｍＬに溶解し、０℃まで冷却した。ヨウ化ナトリウム（２３７．５ｍｇ、１．５８５ｍｍｏｌ、３当量）を添加し、次いで、ＴＭＳ−Ｃｌ（２００μｌ、１．５８５ｍｍｏｌ、３当量）を直ぐに添加した。反応物を放置して室温まで温めてＴＬＣ（ＭｅＯＨ：ＤＣＭ  ５：９５）によってモニターした。完了次第、反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、飽和Ｎａ２Ｓ２Ｏ３、次いで塩水で洗浄した。有機層を分離し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、減圧下溶媒を蒸発させてオフホワイト固体の化合物１ｂ（２４８ｍｇ、収率８１％）を得た。
【０１００】
スキーム１５：化合物５ｂの合成
【化２２】
2020520981.tif 000027
【０１０１】
化合物５ｃ。スキーム１６に示されているように、アルゴン雰囲気下、化合物２ａ（１００ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ、１．２当量）を無水ＤＭＦに溶解し、０℃まで冷却した。ヨウ化ナトリウム（９．２３ｍｇ、０．２３、１．１当量）を添加し、反応物を放置して室温まで温めた。１５分間の撹拌後、化合物５ｂ（１２３ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ、１当量）を添加し、反応をＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ）によりモニターした。完了次第、減圧下溶媒を除去した。得られた油状物をＥｔＯＡｃ  １．５ｍＬで沈殿させて、次いで、Ｅｔ２Ｏ（５ｍＬ）を用いて１０分間トリチュレートした。それから、混合物を真空ろ過によりろ過し、固体物を乾燥してオフホワイト固体の化合物５ｃ（１６３ｍｇ、９２％）を得た。ＭＳ（ＥＳ−）：ｍ／ｚ  Ｃ４９Ｈ５０ＣｌＮ３Ｏ８の計算値：８４３．３３；実測値：８７８．６４［Ｍ＋Ｃｌ」−。
【０１０２】
化合物５ｄ。スキーム１６に示されているように、化合物５ａ（１１０ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）をＤＣＭ  ５ｍＬに溶解した。数ミリグラムのメチレンブルーを添加し、黄色光を照射しながら、溶液全体に酸素をバブリングした。反応をＲＰ−ＨＰＬＣ（水中ＡＣＮ  ７０〜１００％、２０分）によりモニターした。完了次第、反応混合物を減圧下蒸発することにより濃縮し、粗生成物を分取ＲＰ−ＨＰＬＣ（水中ＡＣＮ  ７０〜１００％、２０分）により精製して白色固体の化合物５ｄ（７２ｍｇ、収率６４％）を得た。
【０１０３】
化合物５ｅ。スキーム１６に示されているように、化合物５ｄ（３０ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（８ｍＬ）に溶解し、ピペリジン（２ｍＬ）を添加した。反応をＲＰ−ＨＰＬＣ（水中ＡＣＮ  ５０〜１００％、２０分）によりモニターした。完了次第、減圧下溶媒を除去した。得られた油状物をＥｔＯＡｃ  １．５ｍＬで沈殿させて、次いで、Ｅｔ２Ｏ（２０ｍＬ）を用いて１０分間トリチュレートした。それから、混合物を真空ろ過によりろ過し、固体物を乾燥してオフホワイト固体の化合物５ｅ（２２ｍｇ、定量的）を得た。
【０１０４】
スキーム１６：化合物５ｅの合成
【化２３】
2020520981.tif 000028
【０１０５】
Ｍｕ−ＨＳＳＫＬ。ペプチドＭｕ−ＨＳＳＫＬ（モルホリノ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ）をＦｍｏｃ−固相ペプチド合成により合成した。Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ワング樹脂を、３０分間ＤＭＦ中でかき混ぜた。２０％ピペリジンでＦｍｏｃ脱保護を行った（１５分）後、ＤＩＰＥＡ（６当量）およびＤＭＦの混合物中、次のアミノ酸（４当量）をＨＢＴＵ（４当量）と結合させた（３０分）。配列が完了するまでこれらの二工程を反復した。最終的に、ＨｉｓのＦｍｏｃ脱保護を完結し、ＨＳＳＫＬ配列を塩化４−モルホリンカルボニルと結合した。後で、ペプチドを、ＴＦＡ／ＴＩＰＳ／Ｈ２Ｏ（９０／５／５）溶液を用いて樹脂から切断した。ペプチドを沈殿させて、冷ジエチルエーテル溶液で洗浄し、凍結乾燥した。白色沈殿物として生成物を得た。ＭＳ（ＥＳ−）：ｍ／ｚ  Ｃ２９Ｈ４９Ｎ９Ｏ１０の計算値：６８３．３６；実測値：６８２．６［Ｍ−Ｈ」−。
【０１０６】
化合物５ｆ。スキーム１７に示されているように、Ｍｕ−ＨＳＳＫＬ（１７５ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ、１当量）をＤＭＦ（３ｍＬ）に溶解し、Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ（１２９ｍｇ、０．３８ｍｍｏｌ、１．５当量）およびＤＩＰＥＡ（１３４μｌ、０．６６ｍｍｏｌ、３当量）を添加した。反応をＲＰ−ＨＰＬＣ（水中ＡＣＮ  １０〜９０％、２０分）によりモニターした。完了次第、反応混合物を減圧下蒸発することにより濃縮し、粗生成物を分取ＲＰ−ＨＰＬＣ（水中ＡＣＮ  １０〜９０％、４０分）により精製して白色固体の化合物５ｆ（１６２ｍｇ、収率７０％）を得た。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ  Ｃ４４Ｈ５９Ｎ９Ｏ１２の計算値：９０５．４３；実測値：９０６．７［Ｍ＋Ｈ」＋。
【０１０７】
化合物５ｇ。スキーム１７に示されているように、化合物５ｆ（１０ｍｇ、０．０１１４ｍｍｏｌ、１当量）をＤＭＦ（３ｍＬ）に溶解し、ＨＢＴＵ（４．８ｍｇ、０．０１２５ｍｍｏｌ、１．１当量）およびＤＩＰＥＡ（４μｌ、０．０２８ｍｍｏｌ、２当量）を添加した。１５分後、化合物５ｅ（１．８３ｍｇ、０．０２８ｍｍｏｌ、２当量）を添加した。反応をＲＰ−ＨＰＬＣ（水中ＡＣＮ  １０〜９０％、２０分）によりモニターした。完了次第、反応混合物を減圧下蒸発することにより濃縮し、粗生成物を分取ＲＰ−ＨＰＬＣ（水中ＡＣＮ  １０〜９０％、２０分）により精製して白色固体の化合物５ｇ（１８ｍｇ、収率８２％）を得た。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ  Ｃ７８Ｈ９７ＣｌＮ１２Ｏ１９の計算値：１５４０．６７；実測値：１５４１．８［Ｍ＋Ｈ」＋。
【０１０８】
プローブ５。スキーム１７に示されているように、化合物５ｇ（９ｍｇ、０．００５７ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１ｍＬ）中の２０％ピペリジンに溶解した。反応をＲＰ−ＨＰＬＣ（水中ＡＣＮ  １０〜９０％、２０分）によりモニターした。完了次第、減圧下溶媒を除去した。得られた油状物を沈殿させて、冷ジエチルエーテル溶液で洗浄し、凍結乾燥した。オフホワイトの沈殿物（７ｍｇ、定量的）として生成物を得た。ＭＳ（ＥＳ＋）：ｍ／ｚ  Ｃ６３Ｈ８７ＣｌＮ１２Ｏ１７の計算値：１３１８．６０；実測値：１３１９．８［Ｍ＋Ｈ」＋。
【０１０９】
この試験では、保護基としてＰＳＡ切断可能ペプチド（ＨＳＳＫＬＱ、ヒスチジン−セリン−セリン−リジン−ロイシン−グルタミン）、および安定かつ溶解性を増大させると想定される４−モルホリンカルボニルキャップを含むプローブ５として本明細書で同定された種々の化学発光プローブを合成した。プローブは、長いπ系および電子求引基を付加した従来のシャープアダマンチリデン・ジオキセタン系である。このドナーアクセプタ対デザインは、生理的条件下発光団の発光を増大させて、酵素活性を用いた一段階アッセイ、および生細胞イメージングのための良好な発光団の役割をすることを可能とする。
【０１１０】
図５は、室温におけるＰＳＡ  １０ｍｇ／ｍＬの存在下トリス緩衝液（ｐＨ７．８、１０％ＤＭＳＯ）中のプローブ５［１０μＭ］の化学発光反応速度プロファイルを示す。
【０１１１】
スキーム１７：プローブ５の合成
【化２４】
2020520981.tif 000029
【０１１２】
参考文献 
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【図１Ａ】
2020520981.tif 000037
【図１Ｂ】
2020520981.tif 000038
【図１Ｃ】
2020520981.tif 000039
【図２】
2020520981.tif 000040
【図３】
2020520981.tif 000041
【図４】
2020520981.tif 000042
【図５】
2020520981.tif 000043
【国際調査報告】
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2020520981.tif 000045
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