(57)【要約】細胞死受容体５（ｄｅａｔｈ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ５；ＤＲ５）に特異的に結合してがん細胞死機能を有する抗体に関するものであって、具体的に、抗ＤＲ５抗体またはその抗原結合断片、および前記抗体または抗原結合断片のがんの予防または治療用途が提供される。前記抗ＤＲ５抗体またはその抗原結合断片は、ＤＲ５に対する親和度および安定性およびがん細胞死効果が改善なされたことを特徴とする。
2020513833.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ−ＣＤＲ１）、
配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ−ＣＤＲ２）、
配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ−ＣＤＲ３）、
配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ−ＣＤＲ１）、
配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ−ＣＤＲ２）、および
配列番号６のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ−ＣＤＲ３）
を含む、抗ＤＲ５（ｄｅａｔｈ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ５）抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
前記ポリペプチド（ＶＨ−ＣＤＲ３）が、配列番号７、配列番号８、および配列番号９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するものである、請求項１に記載の抗ＤＲ５抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３】
前記ポリペプチド（ＶＬ−ＣＤＲ２）が、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するものである、請求項１に記載の抗ＤＲ５抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４】
前記ポリペプチド（ＶＬ−ＣＤＲ３）が、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、および配列番号１６からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するものである、請求項１に記載の抗ＤＲ５抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５】
前記抗ＤＲ５抗体またはその抗原結合断片が、
配列番号１７〜配列番号３７からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；および
配列番号３８〜配列番号４９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域
を含むものである、請求項１に記載の抗ＤＲ５抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６】
前記抗ＤＲ５抗体またはその抗原結合断片が、ＤＲ５を発現するＴＲＡＩＬ（ＴＮＦ−ｒｅｌａｔｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｌｉｇａｎｄ）感受性がん細胞またはＤＲ５を発現するＴＲＡＩＬ抵抗性がん細胞の細胞死を誘導する活性を有するものである、請求項１に記載の抗ＤＲ５抗体またはその抗原結合断片。
【請求項７】
前記抗ＤＲ５抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１に記載の抗ＤＲ５抗体またはその抗原結合断片。
【請求項８】
前記抗原結合断片が、前記抗ＤＲ５抗体のｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２からなる群より選択されるものである、請求項１に記載の抗ＤＲ５抗体またはその抗原結合断片。
【請求項９】
前記抗ＤＲ５抗体が、マウス由来抗体、マウス−ヒトキメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である、請求項１に記載の抗ＤＲ５抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１０】
請求項１〜９のうちのいずれか一項の抗ＤＲ５抗体またはその抗原結合断片を含む、がんの予防または治療用医薬組成物。
【請求項１１】
前記がんが、血液がん、肺ガン、胃ガン、肝癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚黒色腫、子宮癌、卵巣ガン、直膓癌、大腸癌、結腸癌、乳癌、子宮肉腫、卵管癌腫、子宮内膜癌腫、子宮頸部癌腫、膣癌腫、外陰部癌腫、食道癌、喉頭癌、小腸がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、軟部組織の肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、慢性または急性白血病、幼年期の固形腫瘍、分化リンパ腫、膀胱癌、腎臓癌、腎臓細胞癌腫、腎盂癌腫、中枢神経原発リンパ腫、脊髄腫瘍、脳幹神経膠腫および脳下垂体腺腫からなる群より選択されるものである、請求項１０に記載のがんの予防または治療用医薬組成物。
【請求項１２】
前記組成物が、ＴＲＡＩＬ（ＴＮＦ−ｒｅｌａｔｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｌｉｇａｎｄ）をさらに含むものである、請求項１０に記載のがんの予防または治療用医薬組成物。
【請求項１３】
前記組成物が、抗ＤＲ５抗体またはその抗原結合断片とＴＲＡＩＬをそれぞれ別個の剤形で含むか、一つの剤形に共に含むものである、請求項１２に記載のがんの予防または治療用医薬組成物。
【請求項１４】
前記組成物が、アルキル化抗ガン剤、代謝拮抗性抗ガン剤、アントラサイクリン系抗ガン剤およびプロテアソーム阻害剤性抗ガン剤からなる群より選択される１種以上の抗ガン剤をさらに含むものである、請求項１０に記載のがんの予防または治療用医薬組成物。
【請求項１５】
前記抗ガン剤が、カルボプラチン（Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ゲムシタビン（Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎ）、ドキソルビシン（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）およびボルテゾミブ（Ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ）からなる群より選択される１種以上である、請求項１４に記載のがんの予防または治療用医薬組成物。
【請求項１６】
請求項１〜９のうちのいずれか一項に記載の抗ＤＲ５抗体またはその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド分子。
【請求項１７】
請求項１６のポリヌクレオチド分子を含む組換えベクター。
【請求項１８】
請求項１７の組換えベクターを含む組換え細胞。
【請求項１９】
請求項１６のポリヌクレオチド分子を発現させる工程を含む、抗ＤＲ５抗体またはその抗原結合断片の製造方法。
【請求項２０】
請求項１の抗ＤＲ５抗体またはその抗原結合断片を含む医薬組成物。
【請求項２１】
請求項１の抗ＤＲ５抗体またはその抗原結合断片を含む医薬組成物をがんの予防または治療を必要とする対象に投与する工程を含む、がんの予防または治療方法。
【請求項２２】
前記がんが、血液がん、肺ガン、胃ガン、肝癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚黒色腫、子宮癌、卵巣ガン、直膓癌、大腸癌、結腸癌、乳癌、子宮肉腫、卵管癌腫、子宮内膜癌腫、子宮頸部癌腫、膣癌腫、外陰部癌腫、食道癌、喉頭癌、小腸がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、軟部組織の肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、慢性または急性白血病、幼年期の固形腫瘍、分化リンパ腫、膀胱癌、腎臓癌、腎臓細胞癌腫、腎盂癌腫、中枢神経原発リンパ腫、脊髄腫瘍、脳幹神経膠腫および脳下垂体腺腫からなる群より選択されるものである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記対象にＴＲＡＩＬ（ＴＮＦ−ｒｅｌａｔｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｌｉｇａｎｄ）を投与する工程をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記対象に、アルキル化抗ガン剤、代謝拮抗性抗ガン剤、アントラサイクリン系抗ガン剤およびプロテアソーム阻害剤性抗ガン剤からなる群より選択される１種以上の抗ガン剤を投与する工程をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記抗ガン剤が、カルボプラチン（Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ゲムシタビン（Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎ）、ドキソルビシン（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）およびボルテゾミブ（Ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ）からなる群より選択される１種以上である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記対象に、アルキル化抗ガン剤、代謝拮抗性抗ガン剤、アントラサイクリン系抗ガン剤およびプロテアソーム阻害剤性抗ガン剤からなる群より選択される１種以上の抗ガン剤を投与する工程をさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗ガン剤が、カルボプラチン（Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ゲムシタビン（Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎ）、ドキソルビシン（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）およびボルテゾミブ（Ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ）からなる群より選択される１種以上である、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
細胞死受容体５（ｄｅａｔｈ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ５；ＤＲ５）に特異的に結合してがん細胞死機能を有する抗体に関するものであって、具体的に、抗ＤＲ５抗体またはその抗原結合断片、および前記抗体または抗原結合断片のがんの予防または治療用途に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
正常細胞には影響無くがん細胞選択的な細胞死を誘導するＴＮＦ−ｒｅｌａｔｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｌｉｇａｎｄ（ＴＲＡＩＬまたはＡｐｏ２Ｌ）とその受容体のうちの一つであるＤＲ５（ｄｅａｔｈ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ５）システムを通じた細胞死経路は、がん治療剤開発の重要な標的物質と思われている（Ａｓｈｋｅｎａｚｉなど、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ２：４２０、２００２）。
【０００３】
現在、ＤＲ５を標的とするがん細胞治療剤として組換えＴＲＡＩＬと細胞死受容体特異的な抗体が開発されている。
【０００４】
ＴＲＡＩＬの場合、細胞死シグナルを伝達するＤＲ４（Ｄｅａｔｈ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４、ＴＲＡＩＬ−Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １）、ＤＲ５（Ｄｅａｔｈ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２）だけでなく、細胞死シグナルを伝達しないＤｃＲ１（Ｄｅｃｏｙ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １、ＴＲＡＩＬ−Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３）、ＤｃＲ２（Ｄｅｃｏｙ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２、ＴＲＡＩＬ−Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４）にも全て結合してＤＲ５に対する特異性が低いという問題がある。また、組換えＴＲＡＩＬは安定性が劣り、正常細胞である星状細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ）、肝細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ）、角化細胞（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ）などにも細胞死を誘発する副作用がある（Ｊｏなど、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ６、５６４−５６７、２０００）。したがって、最近、副作用が少なくてがん細胞選択的な細胞死を誘導する抗ＤＲ５乃至抗ＤＲ４抗体開発が活発に研究されている。
【０００５】
細胞死受容体特異的な抗体に関連して、現在までジェネンテック（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、米国）とアムジェン（Ａｍｇｅｎ、米国）で開発した抗ＤＲ５抗体の細胞死活性を評価するための臨床が行われたことがある。ヒューマンゲノムサイエンシズ（ＨｕｍａｎＧｅｎｏｍｅＳｃｉｅｎｃｅｓ、米国）は抗ＤＲ５抗体であるＨＧＳ−ＥＴＲ２と抗ＤＲ４抗体であるＨＧＳ−ＥＴＲ１を用いて臨床２床を行ったことがあるが、現在開発が中断された状態であり、この他にもＡｐｏｍａｂ、Ｃｏｎａｔｕｍｕｍａｂ、ｔｉｇａｔｕｚｕｍａｂなどの抗ＤＲ５抗体の場合にも開発が中断された。
【０００６】
細胞死（ｃｅｌｌ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）は、大きく外因性細胞死経路（ｅｘｔｒｉｎｓｉｃ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｐａｔｈｗａｙ）と内因性細胞死経路（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｐａｔｈｗａｙ）を通じて発生する。大部分の化学療法薬剤と放射線治療がｐ５３を媒介する内因性細胞死経路を通じてがん細胞死を起こす反面、ＤＲ５に関連する細胞死はｐ５３−非依存的外因性経路と内因性経路を通じて誘導される（Ｔａｋｅｄａなど、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２６、３７４５−３７５７、２００７）。外因性細胞死経路で、ＴＲＡＩＬ乃至抗体はＤＲ５に結合してシグナル伝達複合体（ＤＩＳＣ：Ｄｅａｔｈ−Ｉｎｄｕｃｉｎｇ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｃｏｍｐｌｅｘ）を形成し、アダプター（Ａｄａｐｔｏｒ）タンパク質（ＦＡＤＤ）を通じてａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅａｓｅであるカスパーゼ（ｃａｓｐａｓｅ）−８、カスパーゼ−１０を活性化させる。カスパーゼ−８は下位プロテアーゼ（ｐｒｏｔｅａｓｅ）であるカスパーゼ−３、カスパーゼ−７などを活性化させると同時にミトコンドリアを通じた内因性細胞死を共に誘導する（Ｏｈｔｓｕｋａなど、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２２、２０３４−２０４４、２００３）。
【０００７】
ＴＲＡＩＬのがん治療用途開発の標的としての重要性が大きくなっている状況で、より効果的で強力なＴＲＡＩＬ関連標的物質の開発が要求されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
細胞死受容体５（ｄｅａｔｈ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ５；ＤＲ５）に特異的に結合して多様ながん細胞を効果的に死滅させる抗ＤＲ５抗体およびその用途を提供しようとする。
【０００９】
一例は、抗ＤＲ５抗体またはその抗原結合断片を提供する。
他の例は、前記抗ＤＲ５抗体および／またはその抗原結合断片を含むがんの予防または治療用医薬組成物を提供する。
【００１０】
他の例は、前記抗ＤＲ５抗体および／またはその抗原結合断片をがんの予防または治療を必要とする対象に投与する工程を含む、がんの予防または治療方法を提供する。
【００１１】
他の例は、前記抗ＤＲ５抗体および／またはその抗原結合断片の、がんの予防または治療に使用するための用途または抗がん剤製造に使用するための用途を提供する。
【００１２】
他の例は、前記抗ＤＲ５抗体またはその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド分子、前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクター、および前記組換えベクターを含む組換え細胞を提供する。
【００１３】
他の例は、前記ポリヌクレオチド分子を発現させる工程を含む抗ＤＲ５抗体またはその抗原結合断片の製造方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
細胞死受容体５（ｄｅａｔｈ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ５；ＤＲ５）に特異的に結合して多様ながん細胞を効果的に死滅させる抗ＤＲ５抗体、およびこれを含むがん予防または治療用組成物が提供される。
【００１５】
本明細書で提供される抗体は、ＴＲＡＩＬ（ＴＮＦ−ｒｅｌａｔｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｌｉｇａｎｄ）濃度と関係なく一定水準の抗原結合力を維持するＴＲＡＩＬ非競争的抗体であることを特徴とする。したがって、前記抗体は、既存に開発された抗体薬物より優れた効果を有する革新的な抗体新薬または診断剤として有用に開発できる。
【００１６】
細胞死受容体５（ｄｅａｔｈ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ５；ＤＲ５）は、ＴＲＡＩＬ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２（ＴＲＡＩＬＲ２）またはｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  １０Ｂ（ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ）とも称され、ＴＲＡＩＬに結合するＴＮＦ−受容体スーパーファミリー（ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ）の細胞表面受容体であり、細胞自滅死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）シグナルを伝達して細胞自滅死を媒介する。ＤＲ５は、カスパーゼ８、カスパーゼ１０、ＦＡＤＤ（Ｆａｓ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｉｔｈ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｏｍａｉｎ）、ＴＲＡＩＬなどと相互作用すると知られている。ＤＲ５は、哺乳動物に由来したものであってもよく、例えば、ヒトのＤＲ５（ｅ．ｇ．、ＮＣＢＩ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｑ６ＦＨ５８等）であってもよい。
【００１７】
一例は、ＤＲ５を特異的に認識するか、および／またはここに特異的に結合可能なポリペプチドを提供する。前記ポリペプチドは、配列番号１〜配列番号１６からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するものであってもよい。具体的に、前記ポリペプチドは、配列番号１、２、４、および７〜１６からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するものであってもよい。
【００１８】
本明細書で、タンパク質、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドがアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を有するとは、タンパク質、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドが前記配列を含むか、前記配列を必須的に含んでなるか、前記配列からなるものを全て意味するために使用できる。
【００１９】
これらポリペプチドは、抗ＤＲ５抗体の相補性決定部位（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）として使用可能である。
【００２０】
前記ポリペプチドおよびこれらの適用可能な相補性決定部位を下記の表１に整理した：
【表１】
2020513833.tif 000003
【００２１】
他の例で、前記ポリペプチドからなる群より選択される１種以上を含むＤＲ５標的ポリペプチド分子が提供される。前記ＤＲ５標的ポリペプチド分子は、ＤＲ５のリガンドであるＴＲＡＩＬと非競争的に作用してがん細胞死（例えば、がん細胞のアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ））を増進させることを特徴とする。
【００２２】
前記ＤＲ５標的ポリペプチド分子は、前述の抗ＤＲ５抗体の重鎖相補性決定部位、軽鎖相補性決定部位、またはこれらの組み合わせ；または前記重鎖相補性決定部位を含む重鎖可変領域、前記軽鎖相補性決定部位を含む軽鎖可変領域、またはこれらの組み合わせを含むものであってもよい。
【００２３】
前記ＤＲ５標的ポリペプチド分子は、これに限定されないが、抗ＤＲ５抗体、前記抗体の抗原結合断片、または抗ＤＲ５抗体類似体（抗体と類似の骨格と機能を有する構造体；例えば、ぺプチボディー、ナノボディー、など）、または多重結合抗体などの前駆体または構成部分（例えば、ＣＤＲ）として役割を果たすことができる。
【００２４】
用語“ぺプチボディー（ｐｅｐｔｉｄｅ＋ａｎｔｉｂｏｄｙ）”はペプチドと抗体のＦｃ部分などの不変部位の全部または一部が融合された融合タンパク質であって、抗体と類似の骨格と機能を有するタンパク質を意味する。ここで、前述の１種以上のペプチドが抗原結合部位（重鎖および／または軽鎖ＣＤＲまたは可変領域）として作用できる。
【００２５】
用語“ナノボディー”は単一−ドメイン抗体（ｓｉｎｇｌｅ−ｄｏｍａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）とも呼ばれ、抗体の単一可変ドメインをモノマー形態で含む抗体断片を意味し、完全な構造の抗体と同様に特定抗原に対して選択的に結合する特性を有する。ナノボディーの分子量は一般に約１２ｋＤａ〜約１５ｋＤａ程度であって、完全な抗体（二つの重鎖と二つの軽鎖を含む）の一般的な分子量（約１５０ｋＤａ〜約１６０ｋＤａ）と比較して非常に小さく、場合によってはＦａｂ断片やｓｃＦｖ断片より小さい。
【００２６】
用語“多重結合抗体”（二重結合抗体を含む意味である）は２つまたはそれ以上の相異なる抗原を認識および／または結合するか、同一な抗原の互いに異なる部位を認識および／または結合する抗体を意味するものであって、前記多重結合抗体中の一つの抗原結合部位が前述のポリペプチドを含むものであってもよい。
【００２７】
一例で、前記ポリペプチドからなる群より選択される１種以上を相補性決定部位として含む抗ＤＲ５抗体またはその抗原結合断片が提供される。本明細書で提供される抗ＤＲ５抗体はＤＲ５の作用剤（ａｇｏｎｉｓｔ）としての効能を有するものであって、細胞表面に個別的に存在するＤＲ５分子を集合させて細胞内で細胞死シグナルを生成および伝達させることによって細胞死を誘導する役割を果たす。
【００２８】
前記抗ＤＲ５抗体またはその抗原結合断片は、重鎖の相補性決定部位として、
配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ−ＣＤＲ１）、
配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ−ＣＤＲ２）、および
配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ−ＣＤＲ３）
からなる群より選択される一つ以上を含むものであってもよい。
【００２９】
前記配列番号３のアミノ酸配列は、下記一般式１のアミノ酸配列の通りである。
［一般式１］（配列番号３）
Ｄ−Ａ−Ｇ−Ｓ−Ｘ１−Ｃ−Ｇ−Ｘ２−Ｇ−Ｇ−Ｗ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｉ−Ｄ−Ｔ
Ｘ１は、ＧまたはＰであり、
Ｘ２は、ＳまたはＫである。
【００３０】
一具体例で、抗ＤＲ５抗体またはその抗原結合断片の重鎖ＣＤＲ３として使用可能な配列番号３のポリペプチドは、例えば、配列番号７、配列番号８、および配列番号９からなる群より選択される１種以上のアミノ酸配列を有するものであってもよい（下記記載されたアミノ酸配列中の下線を引いた太字部分は、配列番号７のアミノ酸配列から変形されたアミノ酸を示す）：
配列番号７：ＤＡＧＳＧＣＧＳＧＧＷＴＧＡＣＩＤＴ
配列番号８：ＤＡＧＳＰＣＧＳＧＧＷＴＧＡＣＩＤＴ
配列番号９：ＤＡＧＳＰＣＧＫＧＧＷＴＧＡＣＩＤＴ
他の例で、前記抗ＤＲ５抗体またはその抗原結合断片は、軽鎖の相補性決定部位として、
配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ−ＣＤＲ１）、
配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ−ＣＤＲ２）および
配列番号６のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ−ＣＤＲ３）
からなる群より選択される一つ以上を含むものであってもよい。
【００３１】
前記配列番号５と配列番号６のアミノ酸配列はそれぞれ、下記一般式２および一般式３のアミノ酸配列の通りである。
［一般式２］（配列番号５）
Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５
Ｘ３は、Ｒ、Ｌ、またはＫであり、
Ｘ４は、Ｐ、Ｍ、またはＡであり、
Ｘ５は、Ｓ、Ｐ、またはＫである；
［一般式３］（配列番号６）
Ｇ−Ｓ−Ｒ−Ｄ−Ｓ−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｇ−Ｘ９
Ｘ６は、Ｓ、Ａ、またはＤであり、
Ｘ７は、ＹまたはＧであり、
Ｘ８は、Ｖ、Ｍ、Ｇ、またはＡであり、
Ｘ９は、Ｉ、Ａ、Ｒ、またはＧである。
【００３２】
一具体例で、抗ＤＲ５抗体またはその抗原結合断片の軽鎖ＣＤＲ２として使用可能な配列番号５のポリペプチドは、例えば、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２からなる群より選択される１種以上のアミノ酸配列を有するものであってもよい（下記記載されたアミノ酸配列中の下線を引いた太字部分は、配列番号１０のアミノ酸配列から変形されたアミノ酸を示す）：
配列番号１０：ＮＮＮＮＲＰＳ
配列番号１１：ＮＮＮＮＬＭＰ
配列番号１２：ＮＮＮＮＫＡＫ
【００３３】
一具体例で、抗ＤＲ５抗体またはその抗原結合断片の軽鎖ＣＤＲ３として使用可能な配列番号６のポリペプチドは、例えば、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、および配列番号１６からなる群より選択される１種以上のアミノ酸配列を有するものであってもよい（下記記載されたアミノ酸配列中の下線を引いた太字部分は配列番号１３のアミノ酸配列から変形されたアミノ酸を示す）：
配列番号１３：ＧＳＲＤＳＳＹＶＧＩ
配列番号１４：ＧＳＲＤＳＡＧＭＧＡ
配列番号１５：ＧＳＲＤＳＤＧＧＧＲ
配列番号１６：ＧＳＲＤＳＳＧＡＧＧ
一具体例で、抗ＤＲ５抗体またはその抗原結合断片は、
配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ−ＣＤＲ１）、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ−ＣＤＲ２）、および配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ−ＣＤＲ３）からなる群より選択される一つ以上の重鎖相補性決定部位、または前記一つ以上の重鎖相補性決定部位を含む重鎖可変領域；
配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ−ＣＤＲ１）、配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ−ＣＤＲ２）、および配列番号６のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ−ＣＤＲ３）からなる群より選択される一つ以上の軽鎖相補性決定部位、または前記一つ以上の軽鎖相補性決定部位を含む軽鎖可変領域；
前記重鎖相補性決定部位と軽鎖相補性決定部位の組み合わせ；または
前記重鎖可変領域と軽鎖可変領域の組み合わせを含むものであってもよい。
【００３４】
具体的に、抗ＤＲ５抗体またはその抗原結合断片は、
配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ−ＣＤＲ１）、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ−ＣＤＲ２）、および配列番号７〜配列番号９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ−ＣＤＲ３）からなる群より選択される一つ以上の重鎖相補性決定部位、または前記一つ以上の重鎖相補性決定部位を含む重鎖可変領域；
配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ−ＣＤＲ１）、配列番号１０〜配列番号１２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ−ＣＤＲ２）、および配列番号１３〜配列番号１６からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ−ＣＤＲ３）からなる群より選択される一つ以上の軽鎖相補性決定部位または前記一つ以上の軽鎖相補性決定部位を含む軽鎖可変領域；
前記重鎖相補性決定部位と軽鎖相補性決定部位の組み合わせ；または
前記重鎖可変領域と軽鎖可変領域の組み合わせを含むものであってもよい。
【００３５】
一具体例で、前記抗ＤＲ５抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ−ＣＤＲ１）、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ−ＣＤＲ２）、および配列番号７〜配列番号９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ−ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域；および
配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ−ＣＤＲ１）、配列番号１０〜配列番号１２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ−ＣＤＲ２）、および配列番号１３〜配列番号１６からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ−ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域を含むものであってもよい。
【００３６】
一実施形態で、前記抗ＤＲ５抗体またはその抗原結合断片は、下記表２および３に組み合わせられた重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含むものであってもよい。
【表２】
2020513833.tif 000004
【表３】
2020513833.tif 000005
【００３７】
他の具体例で、前記重鎖相補性決定部位を含む重鎖可変領域、前記軽鎖相補性決定部位を含む軽鎖可変領域、またはこれらの組み合わせが提供される。例えば、前記重鎖可変領域は配列番号１７〜配列番号３７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むものであってもよく、軽鎖可変領域は配列番号３８〜配列番号４９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むものであってもよい。
【００３８】
したがって、前記抗ＤＲ５抗体またはその抗原結合断片は、
配列番号１７〜配列番号３７からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；
配列番号３８〜配列番号４９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；または
これらの組み合わせ
を含むものであってもよい。
【００３９】
一具体例で、前記抗ＤＲ５抗体は、動物由来抗体（例えば、マウス由来抗体）、キメラ抗体（例えば、マウス−ヒトキメラ抗体）、またはヒト化抗体であってもよい。前記抗体または抗原結合断片は、生体から分離されたものまたは非自然的に生産（ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）されたものであってもよい。前記抗体または抗原結合断片は、組換え的または合成的に生産されたものであってもよい。
【００４０】
他の例で、前記抗体は、ヒトを含む哺乳動物、鳥類などを含む任意の動物から由来（分離）したものであってもよい。例えば、前記抗体は、ヒト、マウス、ロバ、羊、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、馬、またはニワトリの抗体であってもよい。ここで、ヒト抗体はヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体であって、ヒト免疫グロブリンライブラリーから分離された抗体または一つ以上のヒト免疫グロブリンに対して形質移植され内在的免疫グロブリンは発現しない動物から分離された抗体を含む。
【００４１】
抗ＤＲ５抗体はモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であってもよく、例えば、モノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、当業界に広く知られた方法のとおりに製造できる。例えば、ファージディスプレイ（ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ）技法を用いて製造できる。または、抗ＤＲ５抗体は、マウス由来のモノクローナル抗体として製造できる。
【００４２】
前記抗ＤＲ５抗体またはその抗原結合断片において、先に定義した重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲ部位、または重鎖可変領域および軽鎖可変領域を除いた残りの部位は全てのサブタイプの免疫グロブリン（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、など）に由来したものであってもよく、例えば、前記全てのサブタイプの免疫グロブリンのフレームワーク部位、および／または軽鎖不変領域および／または重鎖不変領域に由来したものであってもよい。
【００４３】
完全な抗体（例えば、ＩｇＧタイプ）は２個の全長（ｆｕｌｌ  ｌｅｎｇｔｈ）軽鎖および２個の全長重鎖を有する構造であり、それぞれの軽鎖は重鎖と二硫化結合で連結されている。抗体の不変領域は重鎖不変領域と軽鎖不変領域に分けられ、重鎖不変領域はガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）およびイプシロン（ε）タイプを有し、サブクラスとしてガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）およびアルファ２（α２）を有する。軽鎖の不変領域はカッパ（κ）およびラムダ（λ）タイプを有する。
【００４４】
用語、“重鎖（ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ）”は、抗原に特異性を付与するために十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＨおよび３個の不変領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３とヒンジ（ｈｉｎｇｅ）を含む全長重鎖およびその断片を全て含む意味に解釈される。また、用語“軽鎖（ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ）”は、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＬおよび不変領域ドメインＣＬを含む全長軽鎖およびその断片を全て含む意味に解釈される。
【００４５】
用語、“相補性決定部位（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）”は、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の高可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ）のアミノ酸配列を意味する。重鎖および軽鎖はそれぞれ３個のＣＤＲを含むことができる（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３およびＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３）。前記ＣＤＲは、抗体が抗原またはエピトープに結合するにあたって主要な接触残基を提供することができる。一方、本明細書において、用語、“特異的に結合”または“特異的に認識”は、当業者に通常公知されている意味と同一なものであって、抗原および抗体が特異的に相互作用して免疫学的反応をすることを意味する。
【００４６】
用語、“抗原結合断片”は免疫グロブリン全体構造に対するその断片であって、抗原が結合できる部分を含むポリペプチドの一部を意味する。例えば、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２からなる群より選択される１種以上であってもよいが、これに限定されない。
【００４７】
前記抗原結合断片のうちのＦａｂは、軽鎖および重鎖の可変領域と軽鎖の不変領域および重鎖の最初の不変領域（ＣＨ１）を有する構造で、１個の抗原結合部位を有する。
【００４８】
Ｆａｂ’は、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ−末端に一つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ  ｒｅｇｉｏｎ）を有するという点でＦａｂと差がある。
【００４９】
Ｆ（ａｂ’）２抗体は、Ｆａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合を成しながら生成される。Ｆｖは重鎖可変部位および軽鎖可変部位のみを有している最小の抗体切れであって、Ｆｖ断片を生成する組換え技術は当業界に広く公知されている。
【００５０】
二本鎖Ｆｖ（ｔｗｏ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ）は非共有結合で重鎖可変部位と軽鎖可変部位が連結されており、一本鎖Ｆｖ（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ）は一般にペプチドリンカーを通じて重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域が共有結合で連結されるか、またはＣ−末端で直ちに連結されていて二本鎖Ｆｖのようにダイマーのような構造を成すことができる。
【００５１】
前記抗原結合断片は、タンパク質加水分解酵素を用いて得ることができ（例えば、全体抗体をパパインで制限切断すればＦａｂを得ることができ、ペプシンで切断すればＦ（ａｂ’）２断片を得ることができる）、遺伝子組換え技術を通じて製作することができる。
【００５２】
用語“ヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ  ｒｅｇｉｏｎ）”は抗体の重鎖に含まれている領域であって、ＣＨ１およびＣＨ２領域の間に存在し、抗体内抗原結合部位の柔軟性（ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ）を提供する機能を果たす領域を意味する。
【００５３】
他の例は、前記抗ＤＲ５抗体またはその抗原結合断片を有効性分として含むがんの予防および／または治療用医薬組成物を提供する。
【００５４】
他の例は、前記抗ＤＲ５抗体またはその抗原結合断片の医薬的有効量をがんの予防および／または治療を必要とする患者に投与する工程を含む、がんの予防および／または治療方法を提供する。前記がんの予防および／または治療方法は、前記投与工程以前にがんの予防および／または治療を必要とする患者を確認（例えば、治療対象の診断または選別）する工程をさらに含むことができる。
【００５５】
抗ＤＲ５抗体は、がんの予防または治療に有用に使用できる。前述のように、本明細書で提供される抗ＤＲ５抗体はＤＲ５の作用剤（ａｇｏｎｉｓｔ）としての機能を示すので、抗ＤＲ５抗体が効能（即ち、がん細胞死などの抗がん効能）を十分に発揮するために、適用対象がんは該当がん細胞がＤＲ５を発現するのが有利なことがある。また、前記がんは、ＴＲＡＩＬ感受性がんまたはＴＲＡＩＬ抵抗性がんであり得る。一例で、前記がんは具体的には、血液がん、肺ガン、胃ガン、肝癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚黒色腫、子宮癌、卵巣ガン、直膓癌、大腸癌、結腸癌、乳癌、子宮肉腫、卵管癌腫、子宮内膜癌腫、子宮頸部癌腫、膣癌腫、外陰部癌腫、食道癌、喉頭癌、小腸がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、軟部組織の肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、慢性または急性白血病、幼年期の固形腫瘍、分化リンパ腫、膀胱癌、腎臓癌、腎臓細胞癌腫、腎盂癌腫、中枢神経原発リンパ腫、脊髄腫瘍、脳幹部神経膠腫および脳下垂体腺腫などを含むが、これに限定されない。
【００５６】
一例で、前記抗ＤＲ５抗体またはその抗原結合断片をＴＲＡＩＬと併用することによって、抗ＤＲ５抗体またはその抗原結合断片のみを使用した場合と比較して、上昇した抗がん効果を得ることができ、ＴＲＡＩＬ感受性がんだけでなくＴＲＡＩＬ抵抗性がんに対しても抗がん効果を得ることができる（実施例１３参照）。
【００５７】
したがって、前記医薬組成物は、抗ＤＲ５抗体またはその抗原結合断片に加えて、ＴＲＡＩＬ（ＴＮＦ−ｒｅｌａｔｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｌｉｇａｎｄ）をさらに含むものであってもよい。
【００５８】
即ち、前記医薬組成物は、有効性分として、
（１）前記抗ＤＲ５抗体またはその抗原結合断片；および
（２）ＴＲＡＩＬ
を含むものであってもよい。
【００５９】
前記医薬組成物は、（１）前記抗ＤＲ５抗体またはその抗原結合断片と（２）ＴＲＡＩＬを一つの剤形に剤形化して含むか、それぞれ別個の剤形に剤形化して含むものであってもよい。
【００６０】
また、前記がんの予防および／または治療方法は、抗ＤＲ５抗体またはその抗原結合断片を投与する工程に加えて、ＴＲＡＩＬの医薬的有効量を投与する工程をさらに含んでもよい。
【００６１】
即ち、前記がんの予防および／または治療方法は、（１）前記抗ＤＲ５抗体またはその抗原結合断片の医薬的有効量および（２）ＴＲＡＩＬの医薬的有効量をがんの予防および／または治療を必要とする患者に併用投与する工程を含むものであってもよい。
【００６２】
前記併用投与する工程は、（１）前記抗ＤＲ５抗体またはその抗原結合断片の医薬的有効量および（２）ＴＲＡＩＬの医薬的有効量を一つの剤形に含ませて同時に投与するか、（１）前記抗ＤＲ５抗体またはその抗原結合断片の医薬的有効量および（２）ＴＲＡＩＬの医薬的有効量をそれぞれ別個の剤形に剤形化させて同時または順序に関係なく順次に投与して行うことができる。
【００６３】
前記ＴＲＡＩＬ（ＴＮＦ−ｒｅｌａｔｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｌｉｇａｎｄ）はＣＤ２５３（ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ２５３）またはＴＮＦＳＦ１０（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ（ｌｉｇａｎｄ）ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ、ｍｅｍｂｅｒ  １０）とも呼ばれ、細胞死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）過程を誘導するリガンドとしての機能を有するタンパク質であって、正常組織細胞で広く生産および分泌されるサイトカインのうちの一つである。一例で、前記ＴＲＡＩＬはヒト由来のものであってもよく、例えば、ＮＣＢＩ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＮＰ＿００１１７７８７１．１、ＮＰ＿００３８０１．１などで表現されるものであってもよいが、これに制限されるのではない。
【００６４】
細胞死経路を利用する抗ＤＲ５抗体またはその抗原結合断片（またはＴＲＡＩＬとの併用）は、カルボプラチン（Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）またはパクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）（Ｒｅｃｋａなど、Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ、８２、４４１−４４８、２０１３）、ゲムシタビン（Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎ）（Ｔｏｒｒｅｓなど、Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２（６）、９２５−９３２、２０１３）などの化学療法薬剤からなる群より選択される一つ以上と併用して使用されることによって、抗がん／抗腫瘍効果をより向上させることができる（実施例１５参照）。
【００６５】
がんの予防および／または治療のために前記抗ＤＲ５抗体またはその抗原結合断片またはこれを含む医薬組成物を単独で使用することはもちろん、手術、ホルモン治療、薬物治療および／または生物学的反応調節剤を使用する方法と併用して使用することができる。
【００６６】
一例で、前記医薬組成物は、抗ＤＲ５抗体またはその抗原結合断片（またはＴＲＡＩＬとの組み合わせ）と共に抗がん効果を有する公知の有効成分（化学療法薬剤）を１種以上さらに含有することができる。また、前記がんの予防および／または治療方法は、抗ＤＲ５抗体またはその抗原結合断片（またはＴＲＡＩＬとの組み合わせ）に加えて、抗がん効果を有する公知の有効成分（化学療法薬剤）を１種以上を共に投与する工程を含むことができる。
【００６７】
前記抗ＤＲ５抗体またはその抗原結合断片と共に使用できる化学療法薬剤は、カルボプラチン（Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ；Ｒｅｃｋａなど、Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ、８２、４４１−４４８、２０１３）などのアルキル化系抗ガン剤；ゲムシタビン（Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎ；Ｔｏｒｒｅｓなど、Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２（６）、９２５−９３２、２０１３）などの代謝拮抗剤系抗ガン剤；ドキソルビシン（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ；ＨＭ  Ａｍｍなど、Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ａｐｒｉｌ、９；４０３、２０１１）などのアントラサイクリン系抗ガン剤；ボルテゾミブ（Ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ；Ｓｈａｎｋｅｒ  Ａなど、Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ、Ｍａｙ  ７；１００（９）：６４９−６２、２００８）などのプロテアソーム阻害剤系抗ガン剤などからなる群より選択される１種以上であってもよいが、これに制限されるわけではない。
【００６８】
前記抗ＤＲ５抗体、抗原結合断片などの有効成分は、適切な投与のために、１種以上の医薬的に許容可能な担体と共に前記医薬組成物に含まれるか投与できる。前記医薬的に許容可能な担体は、食塩水、滅菌数、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール、またはこれら成分のうちの１成分以上を混合して使用することができ、必要によって抗酸化剤、緩衝液、制菌剤など他の通常の添加剤をさらに含んでもよい。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤および潤滑剤を付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができる。さらに、当分野の適正な方法および／またはＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（最新版）、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡに開示されている方法を用いて各疾患によって、または成分によって適切に製剤化することができる。
【００６９】
前記抗ＤＲ５抗体、抗原結合断片などの有効成分または医薬組成物は、経口または非経口で投与することができる。非経口投与の場合には静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、内皮投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与および直腸内投与などで投与することができる。経口投与時、タンパク質またはペプチドは消化されるため、経口用組成物は活性薬剤をコーティングするか胃での分解から保護されるように剤形化できる。また、前記組成物は、活性物質が標的細胞に移動できる任意の装置によって投与できる。
【００７０】
前記抗ＤＲ５抗体またはその抗原結合断片の医薬的有効量は、製剤化（剤形化）方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、飲食、投与時間、投与間隔、投与経路、排泄速度および反応感応性のような要因によって多様に処方できる。例えば、前記抗ＤＲ５抗体またはその抗原結合断片の１日投与量は、０．００１〜１０００ｍｇ／ｋｇ、具体的に０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ、より具体的に０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ、さらに具体的に０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ範囲であってもよいが、これに制限されるのではない。前記１日投与量は単位用量形態で一つの製剤に製剤化されるか、適切に分量して製剤化されるか、多用量容器内に入れて製造できる。前記医薬組成物は他の薬物と併用投与可能であり、その投与量、投与方法および他の薬物の種類は患者の状態によって適切に処方できる。
【００７１】
前記医薬的組成物は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液、シロップ剤または乳化液形態であるか、エキス剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤などの形態に剤形化でき、剤形化のために分散剤または安定化剤をさらに含んでもよい。
【００７２】
特に、前記抗ＤＲ５抗体またはその抗原結合断片を含む医薬組成物は抗体または抗原結合断片を含むので、免疫リポソームに剤形化できる。抗体を含むリポソームは、当業界に広く知られた方法によって製造できる。前記免疫リポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびポリエチレングリコール−誘導体化されたホスファチジルエタノールアミンを含む脂質組成物として逆相蒸発法によって製造できる。例えば、抗体のＦａｂ’断片は、ジスルフィド−交換反応を通じてリポソームに接合できる。
【００７３】
一方、前記抗ＤＲ５抗体またはその抗原結合断片はＤＲ５に特異的に結合するので、これを用いてＤＲ５の検出（即ち、存在有無および／または水準（濃度）測定）および／またはＤＲ５関連疾病（例えば、ＤＲ５の存在有無または濃度変化（正常群より濃度の増加または減少の特徴を有する疾病））の診断に使用することができる。
【００７４】
したがって、一例は、前記抗ＤＲ５抗体またはその抗原結合断片を含むＤＲ５検出用組成物を提供する。また他の例は、生物試料に前記抗ＤＲ５抗体またはその抗原結合断片を処理する工程；および抗原−抗体反応有無を確認する工程を含むＤＲ５検出方法を提供する。この時、抗原−抗体反応が確認されれば前記生物試料内にＤＲ５が存在すると判断することができ、抗原−抗体反応の程度を測定して生物試料内のＤＲ５の水準（濃度）を測定することができる。
【００７５】
前記生物試料は、患者（例えば、ヒトなどの哺乳動物から得られた細胞、組織、体液、またはこれらの培養物などからなる群より選択されるものであってもよい。正常試料は、ＤＲ５関連疾病を有していない患者（例えば、ヒトなどの哺乳動物）から得られた細胞、組織、体液、またはこれらの培養物などからなる群より選択されるものであってもよい。
【００７６】
前記抗原−抗体反応有無を確認する工程または抗原−抗体反応を測定する工程は、当業界に公知された多様な方法を通じて行うことができる。例えば、通常の酵素反応、蛍光、発光および／または放射線検出を通じて行うことができ、具体的に、免疫クロマトグラフィー（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、免疫組織化学染色（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、酵素結合免疫吸着分析（ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ：ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫測定法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＲＩＡ）、酵素免疫分析（ｅｎｚｙｍｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＥＩＡ）、蛍光免疫分析（Ｆｌｏｒｅｓｅｎｃｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＦＩＡ）、発光免疫分析（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＬＩＡ）、ウエスタンブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）などからなる群より選択される方法によって測定できるが、これに制限されるのではない。
【００７７】
他の例で、
前述の抗ＤＲ５抗体の重鎖相補性決定部位をコードするポリヌクレオチド、軽鎖相補性決定部位をコードするポリヌクレオチド、またはこれらの組み合わせ；重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド、軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド、またはこれらの組み合わせ；または重鎖をコードするポリヌクレオチド、軽鎖をコードするポリヌクレオチドまたはこれらの組み合わせ、
前記ポリヌクレオチドまたはこれらの組み合わせを含む組換えベクター、および
前記組換えベクターを含む組換え細胞が提供される。
【００７８】
一例で、前記組換えベクターは、抗ＤＲ５抗体の重鎖相補性決定部位および軽鎖相補性決定部位；重鎖可変領域および軽鎖可変領域；または重鎖および軽鎖をコードするそれぞれのポリヌクレオチドを別個のベクターにそれぞれ含むか一つのベクターに共に含むものであってもよい。
【００７９】
用語“ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）”は、宿主細胞で目的遺伝子を発現させるための手段を意味する。例えば、プラスミドベクター、コスミドベクターおよびバクテリオファージベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターおよびアデノ−連関ウイルスベクターのようなウイルスベクターを含む。前記組換えベクターとして使用できるベクターは、当業界でしばしば使用されるプラスミド（例えば、ｐＳＣ１０１、ｐＧＶ１１０６、ｐＡＣＹＣ１７７、ＣｏｌＥ１、ｐＫＴ２３０、ｐＭＥ２９０、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ８／９、ｐＵＣ６、ｐＢＤ９、ｐＨＣ７９、ｐＩＪ６１、ｐＬＡＦＲ１、ｐＨＶ１４、ｐＧＥＸシリーズ、ｐＥＴシリーズおよびｐＵＣ１９など）、ファージ（例えば、λｇｔ４λＢ、λ−Ｃｈａｒｏｎ、λΔｚ１およびＭ１３など）またはウイルス（例えば、ＳＶ４０など）を操作して製作できる。
【００８０】
前記組換えベクターで、前記タンパク質複合体をコーディングするポリヌクレオチドはプロモーターに作動的に連結され得る。用語“作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）”は、ヌクレオチド発現調節配列（例えば、プロモーター配列）と他のヌクレオチド配列の間の機能的な結合を意味する。前記調節配列は、“作動可能に連結（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）”されることによって、他のヌクレオチド配列の転写および／または解読を調節することができる。
【００８１】
前記組換えベクターは、典型的にクローニングのためのベクターまたは発現のためのベクターとして構築できる。前記発現用ベクターは、当業界で植物、動物または微生物で外来のタンパク質を発現するのに使用される通常のものを使用することができる。前記組換えベクターは、当業界に公知された多様な方法を通じて構築できる。
【００８２】
前記組換えベクターは、原核細胞または真核細胞を宿主にして構築できる。例えば、使用されるベクターが発現ベクターであり、原核細胞を宿主にする場合には、転写を行わせることができる強力なプロモーター（例えば、ｐＬλプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーターなど）、解読の開始のためのリボソーム結合部位および転写／解読終結配列を含むことが一般的である。真核細胞を宿主にする場合には、ベクターに含まれる真核細胞で作動する複製原点はｆ１複製原点、ＳＶ４０複製原点、ｐＭＢ１複製原点、アデノ複製原点、ＡＡＶ複製原点およびＢＢＶ複製原点などを含むが、これに限定されるのではない。また、哺乳動物細胞のゲノムに由来したプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルスに由来したプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーターおよびＨＳＶのｔｋプロモーター）が用いられ、転写終結配列としてポリアデニル化配列を一般に有する。
【００８３】
前記組換え細胞は、前記組換えベクターを適切な宿主細胞に導入させることによって得られたものであってもよい。前記宿主細胞は前記組換えベクターを安定的且つ連続的にクローニングまたは発現させることができる細胞として当業界に公知された如何なる宿主細胞も用いることができ、原核細胞としては、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、バチルスサブティリス、バチルスチューリンゲンシスのようなバチルス属菌株、そしてサルモネラティフィムリウム、セラチアマルセッセンスおよび多様なシュードモナス種のような腸内菌と菌株などがあり、真核細胞に形質切換させる場合には宿主細胞として、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、昆虫細胞、植物細胞および動物細胞、例えば、Ｓｐ２／０、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ）Ｋ１、ＣＨＯ  ＤＧ４４、ＰＥＲ．Ｃ６、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７、２９３、ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７、３Ｔ３、ＲＩＮ、ＭＤＣＫ細胞株などを用いることができるが、これに制限されるのではない。
【００８４】
前記ポリヌクレオチドまたはこれを含む組換えベクターの宿主細胞内への運搬（導入）は、当業界に広く知られた運搬方法を使用することができる。前記運搬方法は例えば、宿主細胞が原核細胞である場合、ＣａＣｌ２方法または電気穿孔方法などを使用することができ、宿主細胞が真核細胞である場合には、微細注入法、カルシウムホスフェート沈殿法、電気穿孔法、リポソーム−媒介形質感染法および遺伝子ボンバードメントなどを使用することができるが、これに限定しない。
【００８５】
前記形質転換された宿主細胞を選別する方法は、選択標識によって発現される表現型を用いて、当業界に広く知られた方法によって容易に実施できる。例えば、前記選択標識が特定抗生剤耐性遺伝子である場合には、前記抗生剤が含まれている培地で形質転換体を培養することによって形質転換体を容易に選別することができる。
【００８６】
他の例は、前記ポリヌクレオチドまたは組換えベクターを、例えば適切な宿主細胞で、発現させる工程を含む抗ＤＲ５抗体またはその抗原結合断片の製造方法を提供する。一例で、前記製造方法は、前記ポリヌクレオチドまたは組換えベクターを含む細胞を培養する工程；および任意に、生産された抗体を分離および／または精製する工程を含むものであってもよい。
【発明の効果】
【００８７】
本発明はＤＲ５に対する標的治療用抗ＤＲ５抗体を提供するものであって、本発明の抗体はＴＲＡＩＬ濃度と関係なく一定水準の抗原結合を維持するＴＲＡＩＬ非競争的抗体であるところ、既存の抗体薬物より優れた効果を有する革新的な抗体新薬または診断剤として有用に開発できる。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】抗体Ｄ０の結合速度および解離速度を分析した結合および解離センソグラムを示したものである。
【図２ａ−２ｆ】抗体Ｄ０およびＤＡ１〜ＤＡ３５のＤＲ５に対する結合力を対照群ＡＰと比較した実験結果グラフである。
【図３ａ−３ｂ】本発明による例示的な抗体のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析結果を示す。
【図４ａ−４ｈ】本発明による例示的な抗体のサイズ排除クロマトグラフィー（ｓｉｚｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＳＥＣ）分析結果を示すグラフである。
【図５】本発明による抗体の薬動学的指標値を算出した結果を示す。
【図６ａ−６ｒ】本発明による抗体が腫瘍細胞死活性を有することを示す結果である。
【図７ａ−７ｂ】異種移植動物モデルで本発明による抗体の腫瘍成長抑制効果を示す結果である。
【図８ａ−８ｂ】本発明による抗体がＴＲＡＩＬ非競争的にＤＲ５に結合することを示す実験結果である。
【図９ａ−９ｂ】本発明による抗体がＴＲＡＩＬと併用時に上昇效果があることを示す細胞死誘導実験結果である。
【図１０ａ−１０ｃ】本発明による抗体がアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）に細胞死を誘導することを示すカスパーゼ（Ｃａｓｐａｓｅ）活性測定結果である。
【図１１ａ−１１ｂ】抗体を一定濃度のゲムシタビンと併用処理時の細胞死活性を示す結果である。
【発明を実施するための形態】
【００８９】
以下、本発明の理解のために実施例を挙げて詳細に説明する。但し、下記の実施例は本発明の内容を例示するものに過ぎず、本発明の範囲が下記実施例に限定されるのではない。本発明の実施例は、当業界で平均的な知識を有する者に本発明をより完全に説明するために提供されるものである。
【実施例】
【００９０】
実施例１．ＤＲ５免疫およびｃＤＮＡライブラリー製作
ＤＲ５に特異的に結合する抗体を選別するために、動物免疫抗体ライブラリーを構築した。前記ライブラリーは、抗原を免疫した動物の免疫細胞からｍＲＮＡを得た後、抗体遺伝子のプライマー組み合わせを用いたＰＣＲを通じて抗体遺伝子を増幅させ、これをファージディスプレイベクターでクローニングして製作された。
【００９１】
具体的に、ホワイトレグホン種のニワトリ３匹にヒトＤＲ５（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、米国）を完全フロイントアジュバント（ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  ａｄｊｕｖａｎｔ）および不完全フロイント補強剤（Ｓｉｇｍａ、米国）と混合して３週間隔で５回皮下注射した。免疫した動物の血清を得た後、ＰＢＳＢ（３％ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝溶液）を用いて１：１００、１：５００、１：２５００および１：１２５００の濃度に希釈して保管した後、ヒトＤＲ５の結合有無を酵素免疫測定法で確認した。ＥＬＩＳＡプレートにヒトＤＲ５（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、米国）１ｕｇ／ｍｌを４℃で一晩コーティングした後、前記で希釈した血清を入れて２時間反応させた。ＰＢＳＴ（０．１％  ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）で３回洗浄した後、抗ニワトリ免疫グロブリン−ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅ  ｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）（１：３０００）を入れて１時間反応させた。ＰＢＳＴで３回洗浄した後、ＡＢＴＳ（Ｔｈｅｒｍｏ、米国）を入れて２０分間発色させた後、４０５ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダー（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ）で測定した。免疫前血清はＤＲ５と結合せず、ヒトＤＲ５に強く結合する血清を生産する動物を選別した。
【００９２】
最後の注射後５日後に、選別されたニワトリの骨髄、脾臓およびファブリキウス嚢組織を採取した。組織を１０ｍｌのＴＲＩ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｃｅｎｔｅｒ、米国）と混合してホモジナイザーで粉砕した後、２０ｍｌのＴＲＩ試薬を追加した後に遠心分離して上澄み液を得た。ここに１−ブロモ−３−クロロプロパン（１−ｂｒｏｍｏ−３−ｃｈｌｏｒｏｐｒｏｐａｎｅ、ＢＣＰ）３ｍｌを入れて遠心分離して上澄み液を得た。イソプロパノール１５ｍｌで全体ＲＮＡを沈殿させて得た。ランダムヘキサマー（ｒａｎｄｏｍ  ｈｅｘａｍｅｒ）をプライマーとして用いてスーパースクリプト転写システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）を用いて逆転写反応（６５℃で５分；４℃で５分；５０℃で５０分；８５℃で５分；および４℃）を行った。逆転写反応の結果物であるｃＤＮＡを含む反応液５ｕｌ（ｍｉｃｒｏｌｉｔｅｒ）を１％アガロースゲルに電気泳動して多様な長さのｃＤＮＡバンドを確認した。
【００９３】
実施例２．抗体ライブラリー製作
（２−１）免疫抗体遺伝子増幅
ニワトリ抗体の重鎖と軽鎖の可変領域であるＶＨとＶＬドメインを増幅するために次の通りＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、前記実施例１で製造したｃＤＮＡを鋳型にして、重鎖可変領域、軽鎖可変領域およびこれを連結したｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｖ）領域に合わせて考案された下記表４のプライマー組み合わせを用いた。ＶＨおよびＶＬそれぞれのｃＤＮＡライブラリー０．５ｕｌ、３０ｐｍｏｌｅ順方向プライマー、３０ｐｍｏｌｅ逆方向プライマー、１０ｘＰＣＲバッファー、２００ｕＭ  ｄＮＴＰｓおよび０．５ｕｌ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを混合して最終５０ｕｌを合わせた後、９４℃で５分反応させた後、９４℃で１５秒、５６℃で３０秒および７２℃で９０秒間反応させる過程を３０サイクル繰り返した。ＰＣＲ増幅された抗体ＤＮＡを１％アガロースゲルに電気泳動して増幅されたＤＮＡをそれぞれの大きさによって分離し、ゲル抽出キット（Ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ、米国）を用いて精製した。
【００９４】
ｓｃＦｖ  ＤＮＡを得るために、精製されたＶＨ５０ｎｇ、ＶＬ５０ｎｇ  ＤＮＡを鋳型にして３０ｐｍｏｌｅ順方向プライマー、３０ｐｍｏｌｅ逆方向プライマー、１０ｘ  ＰＣＲバッファー、２００ｕＭ  ｄＮＴＰｓおよび０．５ｕｌ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを混合して最終５０ｕｌを合わせた後、９４℃で５分反応させ、９４℃で３０秒、５６℃で３０秒、および７２℃で２分間反応させる過程を２０サイクル繰り返してＰＣＲを行った。前記ＰＣＲを通じて増幅されたＤＮＡを１％アガロースゲルに電気泳動してそれぞれの増幅されたＤＮＡを大きさによって分離し、ゲル抽出キット（Ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ、米国）を用いて精製した。
【００９５】
前記ＰＣＲ反応に使用されたプライマーを下記の表４に整理した：
【表４】
2020513833.tif 000006
【００９６】
（２−２）抗体ＤＮＡの制限酵素切断
前記で製造されたｓｃＦｖとファージミドベクターであるｐＣｏｍｂ３Ｘ（ｔｈｅ  Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ＣＡ、米国）を制限酵素ＳｆｉＩ（Ｒｏｃｈｅ、米国）で切断した。ｓｃＦｖをコーディングするＰＣＲ切片１０ｕｇ、３６０ｕｎｉｔｓ  ＳｆｉＩ（Ｒｏｃｈｅ、米国）、２０ｕｌ  １０ｘバッファーを入れて最終ボリュームが２００ｕｌになるようにして５０℃で一晩反応させた。また、ｐＣｏｍｂ３Ｘベクター２０ｕｇ、１２０ｕｎｉｔｓ  ＳｆｉＩおよび２０ｕｌ  １０ｘバッファーを入れて最終ボリュームが２００ｕｌになるようにして５０℃で一晩反応させた。前記制限酵素で切断したそれぞれの切片をアガロースゲルに電気泳動した後、ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、米国）を用いて精製した。
【００９７】
（２−３）抗体ＤＮＡのライゲーションおよびライブラリーの製造
ｓｃＦｖ切片をｐＣｏｍｂ３Ｘベクターに挿入するために、前記（２−２）で制限酵素ＳｆｉＩを用いて切断したｓｃＦｖをコーディングするＰＣＲ切片７００ｎｇおよびｐＣｏｍｂ３Ｘ  １．４ｕｇを混合し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）を添加して１６℃で一晩反応させた。前記ライゲーション混合物をエタノール沈降法で精製し、大腸菌ＥＲ２７３８（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ、米国）に電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）で形質転換させて４６ｕｇ／ｍｌカルベニシリンおよび７０ｕｇ／ｍｌカナマイシン下で培養して５×１０９ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙを有するライブラリーを製作して用いた。
【００９８】
実施例３．抗ＤＲ５  ｓｃＦｖを含むファージクローンの選別
前記実施例２で得られたｓｃＦｖの形態にランダム化された重鎖と軽鎖を有するライブラリーからヒトＤＲ５に結合する抗体を固体に支持されたＤＲ５を用いて選別した。
【００９９】
（３−１）ＤＲ５に結合する抗体選別
まず、マグネチックビーズにヒトＤＲ５（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、米国）１０ｕｇ（ｍｉｃｒｏｇｒａｍ）をコンジュゲーションさせた。前記実施例２で得られたｓｃＦｖ形態の抗体をファージのコートタンパク質ＰＩＩＩと融合してファージ表面に発現され得るように製作された抗体ライブラリーＤＮＡを大腸菌ＥＲ２７３８（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ）に電気穿孔法で形質転換させ、３７℃で培養後、ＶＣＳＭ１３ヘルパーファージ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、米国）を入れた後、４６ｕｇ／ｍｌカルベニシリンと７０ｕｇ／ｍｌカナマイシンを入れてＳＢ培地（３０ｇ／Ｌトリプトン、２０ｇ／Ｌ酵母抽出物、および１０ｇ／Ｌ  ＭＯＰＳ、ｐＨ７．０）で一晩培養した。前記で得られた大腸菌とファージを含む培養液を遠心分離して沈殿した大腸菌を除去した。上澄み液のみを回収した後、４０ｍｇ／ｍｌ  ポリエチレングリコール８０００と３０ｍｇ／ｍｌ  ＮａＣｌを添加し遠心分離してＰＥＧによって沈殿したファージを集めてＰＢＳで再懸濁した。マグネチックビーズにコンジュゲーションされたヒトＤＲ５とファージを常温で２時間反応させることによってＤＲ５に親和力を有するファージを結合させた後、これを０．５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄し、０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．２）溶液で溶出し２Ｍトリス溶液で中和させた。溶出されたファージは次のラウンドのパニング（ｐａｎｎｉｎｇ）のために大腸菌ＥＲ２７３８に感染させて一晩培養して増殖させた。このような過程を４回繰り返してパニング（ｐａｎｎｉｎｇ）を行った。反復的なパニング段階を通じて結合力の高いファージを蓄積した。４次パニング結果物のプレートから選別された個別クローンを９６ディープウエル（ｄｅｅｐ  ｗｅｌｌ）プレートで１００ｕｇ／ｍｌカルベニシリン、７０ｕｇ／ｍｌカナマイシンおよびＶＣＳＭ１３ヘルパーファージ（１：１０００）を入れ３７℃で一晩培養して抗体が発現されたファージの増殖を誘導した。前記で収得した培養液を遠心分離して得られた培地上澄み液内のファージとＴＲＡＩＬを予め結合させた後、これをＤＲ５がコーティングされているＥＬＩＳＡプレートに入れて３７℃で２時間培養し、ＨＲＰがコンジュゲーションされている抗Ｍ１３抗体を用いてＤＲ５に結合する抗体をＥＬＩＳＡで確認した。
【０１００】
（３−２）選別された抗体のシークエンシング
前記（３−１）の選別条件でヒトＤＲ５に陽性シグナルを示すクローンを有しているＥＲ２７３８をＳＢ培地で一晩培養した後、遠心分離して大腸菌を得る。ＤＮＡミニプレップキット（ジーンオール、韓国）を用いてプラスミドＤＮＡを得て塩基配列を分析した。塩基配列決定のために下記表５に示したようなシークエンシングプライマーを用いて分析した。
【表５】
2020513833.tif 000007
【０１０１】
実施例４．抗体最適化−ヒト化および親和度改善
動物免疫抗体ライブラリーから得られた抗体クローンのうちの親和度と活性に優れた母クローンＤ０（ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）を選別した後、この抗体のフレームワークをヒト抗体フレームワークに変換する過程を行った（Ｎｉｓｈｉｂｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、４３（２００６））。また、親和度改善のために重鎖および軽鎖領域のＣＤＲの配列をランダム化させ新たなファージライブラリーを製作した。前記実施例２のような方法で得られたファージライブラリーをマグネチックビーズに固定させたヒトＤＲ５  １０ｕｇと常温で２時間反応させた後、０．５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで５回洗浄した。洗浄後に結合されているファージを０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．２）溶液で溶出し、２Ｍトリス溶液で中和させた。２次パニング時にはマグネチックビーズにヒトＤＲ５  １ｕｇを固定してＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで１０回洗浄し、３次パニング時にはマグネチックビーズにヒトＤＲ５  ０．１ｕｇを固定してＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで２０回洗浄し選択圧力を増加させた。前述のようなヒト化および親和度向上方法以外に、母クローンの可変領域のフレームワーク配列で、人体免疫細胞で高い免疫性を示すと予測されるアミノ酸を置換させた脱免疫化変異体も製作した。前記のようにヒト化または脱免疫化過程を経た母クローンの変異クローンを“ＤＡ１〜ＤＡ３５”と命名した。
【０１０２】
前記Ｄ０およびＤＡ１〜ＤＡ３５クローンから得られた相補性決定部位および可変領域の配列を下記の表６〜９に整理した：
【表６】
2020513833.tif 000008
2020513833.tif 000009
【０１０３】
【表７】
2020513833.tif 000010
2020513833.tif 000011
【０１０４】
【表８】
2020513833.tif 000012
2020513833.tif 000013
2020513833.tif 000014
2020513833.tif 000015
2020513833.tif 000016
【０１０５】
【表９】
2020513833.tif 000017
2020513833.tif 000018
2020513833.tif 000019
2020513833.tif 000020
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【０１０６】
実施例５．抗体の生産
前記で得られた抗体の親和度測定および活性分析のために免疫グロブリン（ＩｇＧ）タンパク質を生産した。ｓｃＦｖを含むｐＣｏｍｂ３ｘから重鎖および軽鎖の可変領域と不変領域の切片を下記表１０のプライマー組み合わせを用いて実施例２のような条件のＰＣＲを通じて得た。
【０１０７】
各可変領域（Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｒｅｇｉｏｎ、ＶＨ〜ＶＬ）と不変領域（Ｃｏｎｓｔａｎｔ  Ｒｅｇｉｏｎ、ＣＨ〜Ｃｋ）を下記表１０のＨＣおよびＬＣプライマー組み合わせを用いてＰＣＲでそれぞれ重鎖と軽鎖を収得し、ｐｃＤＮＡＴＭ３．３−ＴＯＰＯ（Ｒ）ＴＡクローニングキットおよびｐＯｐｔｉＴＭＶＥＣ−ＴＯＰＯ（Ｒ）ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）を用いて哺乳類細胞発現プラスミドに移した。各ベクター（ｐｃＤＮＡＴＭ３．３−ＴＯＰＯ（Ｒ）ベクターとｐＯｐｔｉＴＭ  ＶＥＣ−ＴＯＰＯ（Ｒ）ベクター）１ｕｌと切片を２００ｍＭ  ＮａＣｌおよび１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２が含まれている緩衝液に総６ｕｌになるように添加して常温で５分間反応させた。ＤＨ５ａ大腸菌コンピテントセル（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ）に熱衝撃を加えて形質転換してコロニーを得た後、大量培養してプラスミドを得た。前記で製造されたプラスミドを用いてＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）に形質感染させた後、７日間培養して得た抗体をタンパク質Ａカラム（ＧＥ、米国）を使用して精製した。培養液をカラムにローディングして培養液中にある抗体（ＩｇＧ）をタンパク質Ａと結合させて２０ｍＭ  クエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．０）で溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを通じて軽鎖と重鎖のＳＤＳ−ＰＡＧＥを通じて軽鎖と重鎖の理論的計算値と一致する分子量と高い純度を確認した。
【表１０】
2020513833.tif 000022
【０１０８】
実施例６．ヒトＤＲ５に対する抗体の結合親和度分析
親和度を測定するためにヒトＤＲ５それぞれをカルボキシメチル化デキストリンバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＧＥ）を用いて製造者の指示によってカップリングした。結合および解離の速度測定のためにＩｇＧタンパク質を５ｎＭ、２．５ｎＭ、１．２５ｎＭ、０．６２５ｎＭ、０．３１３ｎＭおよび０．１５６ｎＭで２倍連続希釈して注入した。
【０１０９】
結合速度および解離速度は結合および解離センソグラム（ｓｅｎｓｏｇｒａｍ）で表示され、単純一対一ラングミュア結合モデル（ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｘ１００評価ソフトウェア、バージョン２．０）を使用して計算した。平衡解離定数（ＫＤ）は解離速度定数（Ｋｄ）を結合速度定数（Ｋａ）で割った値であって、実際値を計算した結果、ｎＭ以下に高い水準のＫＤ値を確認した。ＤＲ５に対する本発明の抗体Ｄ０およびＤＡ１〜ＤＡ３５の測定値を下記表１１に示し（抗体名を抗体が由来したクローン名で表記する）、代表的にＤ０のセンソグラムを図１に示した。
【表１１】
2020513833.tif 000023
2020513833.tif 000024
【０１１０】
実施例７．ヒトＤＲ５に対する抗体の結合力分析
本発明の抗体のヒトＤＲ５に対する結合力を酵素免疫測定法を用いて確認した。１０ｎｇ／ｍｌ濃度のヒトＤＲ５タンパク質を９６ウェル免疫プレート（Ｎｕｎｃ、米国）にウェル当り１５０ｕｌずつ分注し常温で１時間吸着させた。緩衝溶液で３回洗浄した後、順次に希釈した一定濃度（０．１〜２０００ｎｇ／ｍｌ）の抗体をウェル当り１５０ｕＬずつ処理し常温で１時間〜２時間反応させた。緩衝溶液で洗浄後、ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）が結合されている抗ヒト免疫グロブリンＦｃに対する抗体（Ｓｅｒｏｔｅｃ、米国）を１：２０，０００に希釈してウェル当り１５０ｕＬずつ分注し常温で１時間結合させた。洗浄後、ＴＭＢ（３，３’，５，５’−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ；Ｓｉｇｍａ、米国）溶液をウェル当り１００ｕＬずつ入れて３分〜１０分程度発色させた。反応が一定水準に到達すれば、１Ｎ硫酸（Ｈ２ＳＯ４）溶液で反応を終結させた。分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ、米国）を用いて４５０ｎｍで吸光度を測定して、その結果を図２ａ〜図２ｆに示した。本試験で特許ＰＣＴ−ＵＳ２００６−０３５７７（ＷＯ２００６−０８３９７１）に明示された抗ＤＲ５抗体配列を用いて合成した抗体ＡＰを対照抗体として用いた。図２ａ〜図２ｆで確認されるように、抗体Ｄ０およびＤＡ１〜ＤＡ３５は対照抗体ＡＰに比べて抗原結合力が高く観察された。
【０１１１】
実施例８．物理化学的特性分析
［８−１］抗体大きさ確認
本発明による抗体の大きさをＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析した。ＮｕＰＡＧＥ  ４−１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）を用いた。前記製造された抗ＤＲ５抗体（Ｄ０、ＤＡ１、ＤＡ４、ＤＡ１６、ＤＡ１８、ＤＡ２０、ＤＡ２３、ＤＡ２６、およびＤＡ２９）にＤＴＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）を処理して二硫化結合を除去した還元条件とＤＴＴを処理しない非還元条件でそれぞれＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行って全体抗体の軽鎖と重鎖の存在を確認した。前記得られた結果をそれぞれ図３ａ（非還元条件下での結果）および図３ｂ（還元条件下での結果）に示した。図３ａで確認されるように、非還元条件（Ｎｏｎ−Ｒｅｄｕｃｅｄ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）で分析した試料は、９８ｋＤａサイズマーカと１８８ｋＤａサイズマーカの間の位置で抗体全体大きさに該当するバンドの存在が確認された。また、図３ｂで確認されるように、還元条件（Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）の試料は４９ｋＤａサイズマーカと２８ｋＤａサイズマーカ付近でそれぞれ抗体の重鎖と軽鎖に該当する２つのバンドが確認された。このようにＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析を通じて全体抗体と抗体の重鎖および軽鎖に該当するバンドを確認した。
【０１１２】
［８−２］抗体純度確認
ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷｘｌカラム（Ｔｏｓｏｈ、日本）を用いたサイズ排除クロマトグラフィー（ｓｉｚｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＳＥＣ）で抗体の純度および凝集体（不純物の一種類であって、ｓｏｌｕｂｌｅ  ａｇｇｒｅｇａｔｅを指して称する）を分析して、その結果を図４ａ（対照抗体ＡＰ）、図４ｂ（Ｄ０）、図４ｃ（ＤＡ１）、図４ｄ（ＤＡ４）、図４ｅ（ＤＡ１５）、図４ｆ（ＤＡ２３）、図４ｇ（ＤＡ２６）、および図４ｈ（ＤＡ２９）にそれぞれ示した。１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．６）を移動相にして均一濃度溶離方法で分離して吸光度２８０ｎｍで分析した時、単量体のピーク面積が全体ピーク面積の９４％以上を占め、凝集体ピークの比率は６％未満で、大体的に９４％以上の高い純度を示した。
【０１１３】
実施例９．抗体の薬物動態学（Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ）
前記製造された抗体の生体内動態を調べてみるためにマウス血中半減期を評価した。抗体をヌードマウスの静脈を通じて１〜１０ｍｇ／ｋｇで投与し、投与開始時点を基準にして、走査後５分から１４日まで眼窩静脈採血を行った。採血はヘパリンが処理された毛細管を使用して行った。採取した血液から遠心分離して獲得された血漿（Ｐｌａｓｍａ）を一定濃度に希釈してＥＬＩＳＡ用サンプルとして使用した。１０ｎｇ／ｍｌの濃度に希釈したヒトＤＲ５  １００ｕｌを９６ウェル免疫プレート（Ｎｕｎｃ、米国）に入れて、冷蔵で１２時間〜１４時間吸着させた。０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０が含まれている緩衝溶液で３回洗浄した後、ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ、米国）が含まれている緩衝溶液で常温で１時間反応させた。緩衝溶液で３回洗浄し希釈された各マウス血漿試料と順次的希釈された標準物質を処理した後、２時間〜３時間常温で結合させた。緩衝溶液で３回洗浄し、ＨＲＰが付着された抗ヒト免疫グロブリンＦｃ−ＨＲＰ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ、米国）を１：２００００に希釈してウェル当り１００ｕＬずつ入れて常温で１時間結合させた。３回洗浄した後、ＴＭＢ（Ｓｉｇｍａ、米国）溶液を各ウェル当り１００ｕＬずつ入れて反応させた。反応が一定水準に到達すれば、０．２Ｎ硫酸溶液を用いて反応を終結した後、分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ、米国）を用いて４５０ｎｍで吸光度を測定した。測定された光学濃度（Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｄｅｎｓｉｔｙ、ＯＤ）値を基盤にして各血漿試料内抗体の濃度を計算し、ウィンノンリン（Ｗｉｎｎｏｎｌｉｎ  ｖｅｒ．６．２．０．４９５）を用いて薬物動態学的指標値を算出して、その結果を図５および下記の表１２に示した。
【表１２】
2020513833.tif 000025
【０１１４】
図５および表１２に示されているように、試験に使用された抗体（Ｄ０、ＤＡ２２およびＤＡ２３）全て、試験に使用されたマウスで６．６８日〜８．３７日の血中半減期を示した。
【０１１５】
実施例１０．抗体の腫瘍細胞死活性確認
前記製造された抗体の生物学的活性を試験管内細胞死分析法を用いて決定した。前記試験にはヒト大腸癌細胞株Ｃｏｌｏ２０５（ＡＴＣＣ、米国）とヒト膵臓癌細胞株Ｍｉａｐａｃａ−２（ＡＴＣＣ、米国）、ヒト肺ガン細胞株Ｈ２１２２（ＡＴＣＣ、米国）を用いた。
【０１１６】
それぞれの腫瘍細胞を１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ濃度になるように懸濁して、９６ウェル細胞培養プレートにウェル当り５０ｕｌの体積で分注し、定温湿式培養器で１６時間〜２４時間培養した。一定の濃度（０．０６〜６６，０００ｐＭ）の抗体を単独で処理（Ａｂ  ａｌｏｎｅ）するか、架橋結合抗体（抗ヒトＦｃ）（Ｓｅｒｏｔｅｃ、米国）と混合して処理（Ａｂ  ｌｉｎｋｅｄ）した。４８時間培養した後にウェル当り１０ｕｌのレザズリン溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）を入れて１時間〜２時間定温湿式培養器で反応させた。反応後、分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ）を使用して５９０ｎｍで放出される蛍光を判読した。培養培地処理群の相対的蛍光値（Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ  ＲＦＵ：Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｕｎｉｔ）に対する実験物質処理群の蛍光値（ｔｒｅａｔｅｄ  ＲＦＵ）の百分率で計算されるウェル当り相対的細胞生存率（Ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ（％）＝ｔｒｅａｔｅｄ  ＲＦＵ／Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ  ＲＦＵ×１００）を数値化して、その結果を図６ａ〜図６ｒに示した。比較のために、対照抗体ＡＰに対して前記と同一な試験を行った。
【０１１７】
図６ａ〜図６ｒで示したように、前記製作された抗体は、試験された３種のヒト癌細胞株で全てで優れた細胞死活性を示した。
【０１１８】
実施例１１．異種移植動物モデルで抗腫瘍活性評価
ヒト癌細胞株を移植したヌードマウスに抗体を投与して抗腫瘍活性を評価した。抗ＤＲ５ヒト癌細胞株としては、ヒト肺ガン細胞株Ｈ２１２２（ＡＴＣＣ、米国）とヒト膵臓癌細胞株Ｍｉａｐａｃａ−２（ＡＴＣＣ、米国）を用いた。腫瘍細胞２〜５百万個を６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（オリエントバイオ）の側面皮下に移植しカリパスを使用して腫瘍の体積を測定した。腫瘍の平均体積が１００〜３００ｍｍ３に到達した時、群を分離した後、分離された群によって前記製作された抗体（対照抗体ＡＰおよびＤ０抗体）を投与した。抗体投与は群分離当日から２８日〜５０日間０．０５〜２ｍｇ／ｋｇの用量で週１回間隔で総３回（投与開始当日、７日および１４日後）腹腔内注射し、投与開始後２８日〜５０日まで週２回腫瘍の体積を測定した。陰性対照群は緩衝溶液（ＰＢＳ）を投与した。
【０１１９】
前記得られた結果を図７ａ（Ｈ２１２２移植マウス結果）および７ｂ（Ｍｉａｐａｃａ−２移植マウス結果）に示した。図７ａおよび図７ｂに提示されたように、Ｄ０抗体が対照抗体ＡＰより優れた腫瘍抑制活性を示すのを確認した。
【０１２０】
実施例１２．ＴＲＡＩＬ非競争的結合確認
前記実施例３で選別された抗体の抗原結合特性を確認するために、ＴＲＡＩＬを用いた競争的酵素免疫測定法を行った。ＥＬＩＳＡプレートにヒトＤＲ５（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、米国）０．１ｕｇ／ｍｌを４℃でコーティングした後、０．０１ｎＭ〜１４４０ｎＭの抗体（Ｄ０、ＤＡ２０、ＤＡ２１、ＤＡ２１、ＤＡ２２、およびＤＡ２３）を０．０１〜４００ｎＭのＴＲＡＩＬタンパク質と共にプレートに２時間反応させた。ＰＢＳＴ（０．１％ウシ血清アルブミン、ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）で３回洗浄した後、ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅ  ｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）が結合された抗ヒト免疫グロブリンＦｃを入れて１時間反応させた。ＰＢＳＴで３回洗浄した後、ＡＢＴＳ（Ｔｈｅｒｍｏ、米国）を入れて２０分間発色させた後、反応が一定水準に到達すれば１Ｎ硫酸溶液で反応を終結した。分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ、米国）を用いて４０５ｎｍでの測定された吸光度を図８ａおよび図８ｂに示した。対照抗体としては、実施例（７−１）に明示された抗体ＡＰを使用した。
【０１２１】
図８ａおよび図８ｂで、ＴＲＡＩＬ濃度依存的に抗原結合が減少した対照抗体ＡＰとは異なり、Ｄ０、ＤＡ２０、ＤＡ２１、ＤＡ２１、ＤＡ２２、およびＤＡ２３抗体はＴＲＡＩＬ濃度と関係なく一定水準の抗原結合を維持することから、ＴＲＡＩＬと非競争的に結合するのが分かった。
【０１２２】
実施例１３．抗体のＴＲＡＩＬ併用効果確認
抗原結合部位による抗体の特性を分析するために、前記製作された抗体とＴＲＡＩＬタンパク質を併用処理した時の細胞死活性を分析した。試験にはヒト大腸癌細胞株Ｃｏｌｏ２０５（ＡＴＣＣ、米国）とヒト膵臓癌細胞株Ｍｉａｐａｃａ−２（ＡＴＣＣ、米国）を使用した。１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌに懸濁された腫瘍細胞を９６ウェル細胞培養プレートにウェル当り５０ｕｌずつ分注した後、定温湿式培養器で１６時間〜２４時間培養した。順次的濃度（０．１〜１００００ｎｇ／ｍｌ）に希釈した抗体と一定濃度（０．５、１、１０ｎｇ／ｍｌ）のＴＲＡＩＬタンパク質を９６ウェルプレートに組み合わせ処理した。４８時間〜７２時間定温湿式培養した後にウェル当り１０ｕｌのレザズリン溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）を入れて１時間〜２時間反応させた。反応が一定水準に到達すれば、分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ）を使用して５９０ｎｍで放出される蛍光を判読した。培養培地処理群の相対的蛍光値（Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ  ＲＦＵ：Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｕｎｉｔ）に対する実験物質処理群の蛍光値（ｔｒｅａｔｅｄ  ＲＦＵ）の百分率で計算されるウェル当り相対的細胞生存率（Ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ（％）＝ｔｒｅａｔｅｄ  ＲＦＵ／Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ  ＲＦＵ×１００）を数値化した。
【０１２３】
そのうちの代表的な結果を図９ａ（Ｃｏｌｏ２０５結果）および図９ｂ（Ｍｉａｐａｃａ−２結果）に示した。対照抗体としては、前述の抗体ＡＰを使用した。これは、対照抗体ＡＰがＴＲＡＩＬと類似の抗原結合部位を有することを提示した文献（Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ、１５、７５１−７６１、２００８）を根拠とする。
【０１２４】
図９ａおよび９ｂに示されているように、１０ｎｇ／ｍｌ程度の低濃度のＤ０抗体またはＤＡ２３を一定濃度のＴＲＡＩＬと共に処理した時、各物質を単独使用した時と比較して細胞死活性が増加して抗体とＴＲＡＩＬの併用効果が観察されたが、対照抗体ＡＰの場合、活性の増加が観察されなかった。
【０１２５】
実施例１４．細胞内カスパーゼ（ｃａｓｐａｓｅ）活性分析
前記製作された抗体の細胞死機序を糾明するためにカスパーゼ活性を測定した。カスパーゼ−３／７の活性を測定するためにＡｐｏ−ＯＮＥ（Ｒ）Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ｃａｓｐａｓｅ−３／７  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）を用いた。試験には、ヒト大腸癌細胞株Ｃｏｌｏ２０５（ＡＴＣＣ、米国）とヒト膵臓癌細胞株Ｍｉａｐａｃａ−２（ＡＴＣＣ、米国）、およびヒト肺ガン細胞株Ｈ２１２２（ＡＴＣＣ、米国）を用いた。１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌに懸濁したそれぞれの腫瘍細胞を９６ウェル細胞培養プレートにウェル当り５０ｕｌずつ分注した後、定温湿式培養器で１６時間〜２４時間培養した。一定の濃度（０．０１〜１００００ｎｇ／ｍｌ）の抗体を単独で処理するか（Ａｂ  ａｌｏｎｅ）、架橋結合抗体（抗ヒトＦｃ）（Ｓｅｒｏｔｅｃ、米国）と混合して処理（Ａｂ  ｌｉｎｋｅｄ）した後、４時間培養した。ウェル当り１００ｕｌのＡｐｏ−ＯＮＥ（Ｒ）Ｃａｓｐａｓｅ−３／７  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）を処理して、３時間〜１６時間定温湿式培養器で反応させた。反応が一定水準に到達した時、分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ）を使用して５２０ｎｍで放出される蛍光を判読した。培養培地処理群の蛍光値（Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ  ＲＦＵ：Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｕｎｉｔ）に対する実験物質処理群の蛍光値（ｔｒｅａｔｅｄ  ＲＦＵ）の倍数（Ｆｏｌｄ）でウェル当り相対的カスパーゼ活性（Ｃａｓｐａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ＝ｔｒｅａｔｅｄ  ＲＦＵ／Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ  ＲＦＵ）を数値化した。
【０１２６】
代表的な結果を図１０ａ（Ｃｏｌｏ２０５結果）、図１０ｂ（Ｈ２１２２結果）、および図１０ｃ（Ｍｉａｐａｃａ−２結果）に示した。対照抗体としては、前述の抗体ＡＰを同一な方式で処理した。
【０１２７】
図１０ａ〜図１０ｃに示されているように、抗体Ｄ０またはＤＡ２９を癌細胞株に処理した時、カスパーゼ−３／７の活性が増加するのを確認することによって、本発明の抗体の細胞死機序にアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）が関与されているのを確認することができた。
【０１２８】
実施例１５．抗体−薬物併用効果
前記製作された抗体とゲムシタビンを併用して処理した時の効果を試験管内腫瘍細胞死分析法で決定した。本試験は、膵臓癌細胞にゲムシタビンと抗ＤＲ５抗体を併用処理した時に腫瘍細胞死とカスパーゼ（ｃａｓｐａｓｅ）の活性が増加することを提示した文献（Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ  Ｓｕｒｇ．２００６  Ｎｏｖ；１０（９）：１２９１−３００）を根拠とする。
【０１２９】
ヒト膵臓癌細胞株Ｍｉａｐａｃａ−２（ＡＴＣＣ、米国）とＰａｎｃ−１（ＡＴＣＣ、米国）をそれぞれ１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌに懸濁して９６ウェル細胞培養プレートにウェル当り５０ｕｌの細胞懸濁液を入れ、定温湿式培養器で１６時間〜２４時間培養した。本発明の抗体Ｄ０を含む抗ＤＲ５抗体を一定濃度（３ｎＭ〜３００ｎＭ）のゲムシタビンと共に癌細胞株に処理した後、４８時間〜７２時間培養した。ウェル当り１０ｕｌのレザズリン溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）を入れて１時間〜３時間培養器で反応させた。反応が一定水準に到達した時、分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ）使用して５９０ｎｍで放出する蛍光を判読した。培養培地処理群の相対的蛍光値（Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ  ＲＦＵ：Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｕｎｉｔ）に対する実験物質処理群の蛍光値（ｔｒｅａｔｅｄ  ＲＦＵ）の百分率で計算されるウェル当り相対的細胞生存率（Ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ（％）＝ｔｒｅａｔｅｄ  ＲＦＵ／Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ  ＲＦＵ×１００）を数値化して、その代表的な結果を図１１ａ（Ｍｉａｐａｃａ−２結果）および図１１ｂ（Ｐａｎｃ−１結果）に示した。対照物質として前述の抗体ＡＰも同一な方式で処理した。
【０１３０】
図１１ａおよび図１１ｂに示されているように、抗体Ｄ０またはＤＡ２９をゲムシタビンと共に投与した時、各物質を単独使用した時に比べて細胞死活性が増加されることが分かった。
【０１３１】
以上に本発明の特定の部分を詳しく記述したところ、当業界の通常の知識を有する者において、このような具体的記述は単に好ましい実施例に過ぎず、これによって本発明の範囲が制限されるのではない点は明白である。したがって、本発明の実質的な範囲は添付された請求項とそれらの等価物によって定義されるといえる。
【図１】
2020513833.tif 000026
【図２ａ】
2020513833.tif 000027
【図２ｂ】
2020513833.tif 000028
【図２ｃ】
2020513833.tif 000029
【図２ｄ】
2020513833.tif 000030
【図２ｅ】
2020513833.tif 000031
【図２ｆ】
2020513833.tif 000032
【図３ａ】
2020513833.tif 000033
【図３ｂ】
2020513833.tif 000034
【図４ａ】
2020513833.tif 000035
【図４ｂ】
2020513833.tif 000036
【図４ｃ】
2020513833.tif 000037
【図４ｄ】
2020513833.tif 000038
【図４ｅ】
2020513833.tif 000039
【図４ｆ】
2020513833.tif 000040
【図４ｇ】
2020513833.tif 000041
【図４ｈ】
2020513833.tif 000042
【図５】
2020513833.tif 000043
【図６ａ】
2020513833.tif 000044
【図６ｂ】
2020513833.tif 000045
【図６ｃ】
2020513833.tif 000046
【図６ｄ】
2020513833.tif 000047
【図６ｅ】
2020513833.tif 000048
【図６ｆ】
2020513833.tif 000049
【図６ｇ】
2020513833.tif 000050
【図６ｈ】
2020513833.tif 000051
【図６ｉ】
2020513833.tif 000052
【図６ｊ】
2020513833.tif 000053
【図６ｋ】
2020513833.tif 000054
【図６ｌ】
2020513833.tif 000055
【図６ｍ】
2020513833.tif 000056
【図６ｎ】
2020513833.tif 000057
【図６ｏ】
2020513833.tif 000058
【図６ｐ】
2020513833.tif 000059
【図６ｑ】
2020513833.tif 000060
【図６ｒ】
2020513833.tif 000061
【図７ａ】
2020513833.tif 000062
【図７ｂ】
2020513833.tif 000063
【図８ａ】
2020513833.tif 000064
【図８ｂ】
2020513833.tif 000065
【図９ａ】
2020513833.tif 000066
【図９ｂ】
2020513833.tif 000067
【図１０ａ】
2020513833.tif 000068
【図１０ｂ】
2020513833.tif 000069
【図１０ｃ】
2020513833.tif 000070
【図１１ａ】
2020513833.tif 000071
【図１１ｂ】
2020513833.tif 000072
【配列表】
2020513833000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年11月21日(2019.11.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ−ＣＤＲ１）、
配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ−ＣＤＲ２）、
配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＨ−ＣＤＲ３）、
配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ−ＣＤＲ１）、
配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ−ＣＤＲ２）、および
配列番号６のアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＶＬ−ＣＤＲ３）
を含む、抗ＤＲ５（ｄｅａｔｈ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ５）抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
前記ポリペプチド（ＶＨ−ＣＤＲ３）が、配列番号７、配列番号８、および配列番号９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するものである、請求項１に記載の抗ＤＲ５抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３】
前記ポリペプチド（ＶＬ−ＣＤＲ２）が、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するものである、請求項１または２に記載の抗ＤＲ５抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４】
前記ポリペプチド（ＶＬ−ＣＤＲ３）が、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、および配列番号１６からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗ＤＲ５抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５】
前記抗ＤＲ５抗体またはその抗原結合断片が、
配列番号１７〜配列番号３７からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；および
配列番号３８〜配列番号４９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域
を含むものである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗ＤＲ５抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６】
前記抗ＤＲ５抗体またはその抗原結合断片が、ＤＲ５を発現するＴＲＡＩＬ（ＴＮＦ−ｒｅｌａｔｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｌｉｇａｎｄ）感受性がん細胞またはＤＲ５を発現するＴＲＡＩＬ抵抗性がん細胞の細胞死を誘導する活性を有するものである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗ＤＲ５抗体またはその抗原結合断片。
【請求項７】
前記抗ＤＲ５抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗ＤＲ５抗体またはその抗原結合断片。
【請求項８】
前記抗原結合断片が、前記抗ＤＲ５抗体のｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２からなる群より選択されるものである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗ＤＲ５抗体またはその抗原結合断片。
【請求項９】
前記抗ＤＲ５抗体が、マウス由来抗体、マウス−ヒトキメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗ＤＲ５抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１０】
請求項１〜９のうちのいずれか一項の抗ＤＲ５抗体またはその抗原結合断片を含む、がんの予防または治療用医薬組成物。
【請求項１１】
前記がんが、血液がん、肺ガン、胃ガン、肝癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚黒色腫、子宮癌、卵巣ガン、直膓癌、大腸癌、結腸癌、乳癌、子宮肉腫、卵管癌腫、子宮内膜癌腫、子宮頸部癌腫、膣癌腫、外陰部癌腫、食道癌、喉頭癌、小腸がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、軟部組織の肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、慢性または急性白血病、幼年期の固形腫瘍、分化リンパ腫、膀胱癌、腎臓癌、腎臓細胞癌腫、腎盂癌腫、中枢神経原発リンパ腫、脊髄腫瘍、脳幹神経膠腫および脳下垂体腺腫からなる群より選択されるものである、請求項１０に記載のがんの予防または治療用医薬組成物。
【請求項１２】
前記組成物が、ＴＲＡＩＬ（ＴＮＦ−ｒｅｌａｔｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｌｉｇａｎｄ）をさらに含むものである、請求項１０または１１に記載のがんの予防または治療用医薬組成物。
【請求項１３】
前記組成物が、抗ＤＲ５抗体またはその抗原結合断片とＴＲＡＩＬをそれぞれ別個の剤形で含むか、一つの剤形に共に含むものである、請求項１２に記載のがんの予防または治療用医薬組成物。
【請求項１４】
前記組成物が、アルキル化抗ガン剤、代謝拮抗性抗ガン剤、アントラサイクリン系抗ガン剤およびプロテアソーム阻害剤性抗ガン剤からなる群より選択される１種以上の抗ガン剤をさらに含むものである、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載のがんの予防または治療用医薬組成物。
【請求項１５】
前記抗ガン剤が、カルボプラチン（Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ゲムシタビン（Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎ）、ドキソルビシン（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）およびボルテゾミブ（Ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ）からなる群より選択される１種以上である、請求項１４に記載のがんの予防または治療用医薬組成物。
【請求項１６】
請求項１〜９のうちのいずれか一項に記載の抗ＤＲ５抗体またはその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド分子。
【請求項１７】
請求項１６のポリヌクレオチド分子を含む組換えベクター。
【請求項１８】
請求項１７の組換えベクターを含む組換え細胞。
【請求項１９】
請求項１６のポリヌクレオチド分子を発現させる工程を含む、抗ＤＲ５抗体またはその抗原結合断片の製造方法。
【国際調査報告】
2020513833.tif 000073
2020513833.tif 000074
2020513833.tif 000075
2020513833.tif 000076
2020513833.tif 000077
2020513833.tif 000078