(57)【要約】本発明は、（ｉ）抗原結合ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）；（ｉｉ）第１の二量体化ドメインを含む膜テザリング成分（ＭＴＣ）；ならびに（ｉｉｉ）シグナル減弱ドメイン（ＳＤＤ）と、膜テザリング成分の第１の二量体化ドメインに特異的に結合する第２の二量体化ドメインとを含むシグナル減弱成分（ＳＤＣ）を含む、細胞を提供する。ＭＴＣとＳＤＣとの二量体化は、薬剤を用いて制御可能であり得、すなわち、薬剤を使用して、ＣＡＲ媒介性細胞シグナル伝達を制御することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）抗原結合ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）；
（ｉｉ）第１の二量体化ドメインを含む膜テザリング成分；および
（ｉｉｉ）シグナル減弱ドメイン（ＳＤＤ）と、前記膜テザリング成分の前記第１の二量体化ドメインに特異的に結合する第２の二量体化ドメインとを含むシグナル減弱成分（ＳＤＣ）
を含む、細胞。
【請求項２】
前記ＳＤＤが、前記ＣＡＲの前記細胞内シグナル伝達ドメインを阻害する、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
前記ＳＤＤが、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を脱リン酸化することができるホスファターゼドメインを含む、請求項２に記載の細胞。
【請求項４】
前記ＳＤＤが、ＣＤ１４８またはＣＤ４５のエンドドメインを含む、請求項３に記載の細胞。
【請求項５】
前記ＳＤＤが、ＳＨＰ−１またはＳＨＰ−２のホスファターゼドメインを含む、請求項３に記載の細胞。
【請求項６】
前記ＳＤＤが、免疫受容体チロシン阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む、請求項２に記載の細胞。
【請求項７】
前記ＳＤＤが、以下の阻害性受容体：ＰＤ１、ＢＴＬＡ、２Ｂ４、ＣＴＬＡ−４、ＧＰ４９Ｂ、Ｌａｉｒ−１、Ｐｉｒ−Ｂ、ＰＥＣＡＭ−１、ＣＤ２２、シグレック７、シグレック９、ＫＬＲＧ１、ＩＬＴ２、ＣＤ９４−ＮＫＧ２ＡおよびＣＤ５のうちの１つからのエンドドメインを含む、請求項６に記載の細胞。
【請求項８】
前記ＳＤＤが、Ｓｒｃプロテインキナーゼを阻害する、請求項２に記載の細胞。
【請求項９】
前記ＳＤＤが、Ｌｃｋを阻害する、請求項８に記載の細胞。
【請求項１０】
ＣＳＫのキナーゼドメインを含む、請求項８または９に記載の細胞。
【請求項１１】
前記ＳＤＤが、前記ＣＡＲの前記細胞内シグナル伝達ドメインの除去を引き起こす、請求項１に記載の細胞。
【請求項１２】
前記ＳＤＤが、プロテアーゼを含み、前記ＣＡＲが、プロテアーゼ切断部位を含む、請求項１１に記載の細胞。
【請求項１３】
前記ＳＤＤが、タバコエッチウイルスプロテアーゼ（ＴｅＶ）を含む、請求項１２に記載の細胞。
【請求項１４】
前記第１の二量体化ドメインと前記第２の二量体化ドメインとの結合が、薬剤の存在または非存在により制御可能である、先行するいずれかの請求項に記載の細胞。
【請求項１５】
前記第１の二量体化ドメインと前記第２の二量体化ドメインとの結合が、二量体化の化学的誘導剤（ＣＩＤ）の存在により誘導される、請求項１４に記載の細胞。
【請求項１６】
一方の二量体化ドメインが、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）を含み、他方の二量体化ドメインが、ｍＴＯＲのＦＲＢドメインを含み、前記ＣＩＤが、ラパマイシンまたはラパマイシンアナログである、請求項１５に記載の細胞。
【請求項１７】
前記第１の二量体化ドメインおよび前記第２の二量体化ドメインが、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）を含み、前記ＣＩＤが、ＦＫ１０１２である、請求項１５に記載の細胞。
【請求項１８】
前記第１の二量体化ドメインおよび前記第２の二量体化ドメインが、ＧｙｒＢを含み、前記ＣＩＤが、クーママイシンまたはその誘導体である、請求項１５に記載の細胞。
【請求項１９】
一方の二量体化ドメインが、ＧＡＩを含み、他方の二量体化ドメインが、ＧＩＤ１を含み、前記ＣＩＤが、ジベレリンまたはその誘導体である、請求項１５に記載の細胞。
【請求項２０】
前記薬剤が、前記第１の二量体化ドメインと前記第２の二量体化ドメインとの結合を破壊する、請求項１４に記載の細胞。
【請求項２１】
一方の二量体化ドメインが、Ｔｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）を含み、他方の二量体化ドメインが、ＴｅｔＲ相互作用タンパク質（ＴｉＰ）を含み、前記薬剤が、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリンまたはこれらのアナログである、請求項２０に記載の細胞。
【請求項２２】
前記膜テザリング成分が、膜貫通ドメインまたはミリストイル化配列を含む、先行するいずれかの請求項に記載の細胞。
【請求項２３】
（ｉ）先行するいずれかの請求項に定義されるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第１の核酸配列；
（ｉｉ）先行するいずれかの請求項に定義される膜テザリング成分（ＭＴＣ）をコードする第２の核酸配列；および
（ｉｉｉ）先行するいずれかの請求項に定義されるシグナル減弱成分（ＳＤＣ）をコードする第３の核酸配列
を含む、核酸構築物。
【請求項２４】
（ｉ）請求項１〜２２のいずれかに定義されるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第１の核酸配列；
（ｉｉ）請求項１〜２２のいずれかに定義される膜テザリング成分（ＭＴＣ）をコードする第２の核酸配列；および
（ｉｉ）請求項１〜２２のいずれかに定義されるシグナル減弱成分（ＳＤＣ）をコードする第３の核酸配列
を含む、核酸配列のキット。
【請求項２５】
請求項２３に記載の核酸構築物を含む、ベクター。
【請求項２６】
（ｉ）請求項１〜２２のいずれかに定義されるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を含む第１のベクター；
（ｉｉ）請求項１〜２２のいずれかに定義される膜テザリング成分（ＭＴＣ）をコードする核酸配列を含む第２のベクター；および
（ｉｉ）請求項１〜２２のいずれかに定義されるシグナル減弱成分（ＳＤＣ）をコードする核酸配列を含む第３のベクター
を含む、ベクターのキット。
【請求項２７】
請求項１〜２２のいずれかに記載の複数の細胞を含む、医薬組成物。
【請求項２８】
疾患の処置および／または予防において使用するための、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
請求項２７に記載の医薬組成物を被験体に投与するステップを含む、疾患を処置および／または予防するための方法。
【請求項３０】
（ｉ）細胞含有試料を単離するステップ；
（ｉｉ）請求項２３に記載の核酸構築物、請求項２４に記載の核酸配列のキット；請求項２５に記載のベクターまたは請求項２６に記載のベクターのキットで、前記細胞を形質導入またはトランスフェクトするステップ；および
（ｉｉｉ）（ｉｉ）からの前記細胞を被験体に投与するステップ
を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
被験体において請求項１〜２２のいずれかに記載の細胞の活性化を制御するための方法であって、第１の二量体化ドメインと第２の二量体化ドメインとの結合または解離を制御する薬剤を前記被験体に投与するステップを含む、方法。
【請求項３２】
請求項１〜２２のいずれかに記載の細胞を含む、被験体においてＣＡＲ関連毒性を処置するための方法であって、第１の結合ドメインと第２の結合ドメインとの結合を誘導する薬剤を前記被験体に投与するステップを含む、方法。
【請求項３３】
前記ＣＡＲ関連毒性が、サイトカイン放出症候群、マクロファージ活性化症候群、または神経毒性である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
疾患の処置および／または予防のための医薬の製造における、請求項２７に記載の医薬組成物の使用。
【請求項３５】
前記疾患ががんである、請求項２８に記載の使用のための医薬組成物、請求項２９または３０に記載の方法、あるいは請求項３４に記載の使用。
【請求項３６】
請求項１〜２２のいずれかに記載の細胞を製造するための方法であって、請求項２３に記載の核酸構築物、請求項２４に記載の核酸配列のキット；請求項２５に記載のベクターまたは請求項２６に記載のベクターのキットを細胞に導入するステップを含む、方法。
【請求項３７】
前記細胞が、被験体から単離された試料からのものである、請求項３６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
伝統的に、抗原特異的Ｔ細胞は、標的抗原に生来的に特異的な末梢血Ｔ細胞の選択的な拡大増殖により生成されてきた。しかしながら、ほとんどのがん抗原に特異的な多数のＴ細胞を選択および拡大増殖することは難しく、かなり多くの場合に不可能である。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のトランスジェニック発現は、末梢血Ｔ細胞のバルク集団のｅｘ  ｖｉｖｏウイルスベクター形質導入により任意の表面抗原に特異的な多数のＴ細胞の生成を可能とするので、組込みベクターを用いる遺伝子療法はこの問題に対して解決策を与える。
【０００３】
キメラ抗原受容体は、Ｔ細胞のエフェクター機能にモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の特異性をグラフトするタンパク質である。それらの通常の形態は、Ｔ細胞生存および活性化シグナルを伝達する複合エンドドメインにいずれも接続された抗原認識アミノ末端、スペーサー、膜貫通ドメインを有するＩ型膜貫通ドメインタンパク質の形態である（図１Ａを参照）。
【０００４】
これらの分子の最も一般的な形態は、スペーサーおよび膜貫通ドメインを介してシグナル伝達エンドドメインに融合した、標的抗原を認識するモノクローナル抗体に由来する単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の融合物である。そのような分子は、その標的のｓｃＦｖによる認識に応答してＴ細胞の活性化を結果としてもたらす。Ｔ細胞がそのようなＣＡＲを発現する場合、それらは、標的抗原を発現する標的細胞を認識して殺傷する。いくつものＣＡＲが腫瘍関連抗原に対して開発されており、そのようなＣＡＲ発現Ｔ細胞を使用する養子導入アプローチは現在、様々ながんの処置のための臨床試験が為されている。
【０００５】
多数の毒性がＣＡＲ研究から報告されており、追加の理論的な毒性が存在する。そのような毒性としては、マクロファージ活性化症候群（ＭＡＳ）および「オンターゲットオフ腫瘍」毒性、すなわち、正常組織上の標的抗原の認識を結果としてもたらすＣＡＲ  Ｔ細胞の持続した強い活性化により引き起こされる免疫学的毒性が挙げられる。
【０００６】
ＭＡＳは、Ｔ細胞の持続性の抗原に駆動される活性化および増殖により引き起こされると推定され、次いでＴ細胞は、多量の炎症性サイトカインを放出して、マクロファージの過剰活性化および免疫活性化のフィードフォワードサイクルに繋がる。血清ＩＬ−６における大きなスパイクは特徴的であり、症候群は、ＩＣＵへの入院を必要とする重篤な全身性の病気を結果としてもたらし得る。
【０００７】
オンターゲットオフ腫瘍毒性が他のＣＡＲと共に報告されており、例えば、腎細胞癌抗原ＣＡＩＸに対してＣＡＲを用いて処置された患者の群は、予想外で処置制限性の胆汁毒性を発症した。２人の死者がＣＡＲ研究と共に報告されており、１人の患者は、大用量の第三世代抗ＥＲＢＢ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の注入直後に起こった呼吸窮迫症候群により死亡し、さらなる患者は、異なる試験において、第二世代抗ＣＤ１９  ＣＡＲを用いたＣＬＬの処置後に起こった可能性があるサイトカインストーム後に死亡した。
【０００８】
これらの毒性は、詳細な動物研究または非ヒト霊長動物研究を以ってしても予測が非常に難しい。極めて重大なことに、小分子および生物学的製剤とは異なり、ＣＡＲ  Ｔ細胞は半減期を有さず、投与を中止して薬剤が破壊される／排出されることを待つことができない。ＣＡＲ  Ｔ細胞は自律的であり、生着および増殖し得る。したがって、毒性は進行性および電撃性であり得る。
【０００９】
自殺遺伝子は、それらを発現する細胞を条件的に破壊し得る遺伝学的に発現されるエレメントである。例としては、ガンシクロビルに対して細胞を感受性にする単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ；小分子ホモ二量体化因子（ｈｏｍｏｄｉｍｅｒｉｚｅｒ）およびＣＤ２０に対して細胞を感受性にする誘導性カスパーゼ９ならびにリツキシマブに対して細胞を感受性にするＲＱＲ８が挙げられる。
【００１０】
この技術は、ある特定の程度の安全性をＣＡＲ  Ｔ細胞療法に加えるが、制限がある。第一に、それは、全てのＣＡＲ  Ｔ細胞が自殺剤の添加により破壊される二元的アプローチである。加えて、薬物治療は、多くの場合、治療ウインドウを有する。自殺遺伝子を用いる場合、製造物の効力は、忍容できる毒性と共に有効性を達成できるように調整することができない。第二に、自殺遺伝子が上記される免疫毒性の一部を助けるかどうかが明確でなく、例えば、マクロファージ活性化症候群が誘発される時点までにはＣＡＲ  Ｔ細胞の永続はもはや必要でなくなっていることがあり、自殺遺伝子はもはや役に立たない。より急性のサイトカイン放出症候群の発生は恐らく、自殺遺伝子が働くには急速過ぎる。
【００１１】
したがって、上述した欠点を伴わない、ＣＡＲ  Ｔ細胞を制御するための代替的な機構の必要性が存在する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ａ）古典的なＣＡＲを示す概略図である。（ｂ）〜（ｄ）：ＣＡＲエンドドメインの異なる世代および順列：（ｂ）初期設計は、ＦｃεＲ１−γまたはＣＤ３ζエンドドメインを通じてＩＴＡＭシグナルのみを伝達するものであったが、後の設計は、同じ複合エンドドメインにおいて追加の（ｃ）１つまたは（ｄ）２つの共刺激シグナルを伝達するものであった。
【００１３】
【図２】ＣＡＲ、膜テザリング成分（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）（ＭＴＣ）およびシグナル減弱成分（ｓｉｇｎａｌ  ｄａｍｐｅｎｉｎｇ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）（ＳＤＣ）から作られたＣＡＲシグナル伝達システムの概略図である。この例では、ＣＡＲは、Ａ増殖誘導リガンド（Ａ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ−Ｉｎｄｕｃｉｎｇ  Ｌｉｇａｎｄ）（ＡＰＲＩＬ）に基づく抗原結合ドメイン；ヒンジスペーサー；ＣＤ２８膜貫通ドメイン；ＣＤ２８およびＯＸ４０共刺激ドメインならびにＣＤ３ゼータエンドドメインを含む（図２Ａ）。ＭＴＣは、Ｖ５タグおよびＣＤ２２からのＩｇドメイン５および６であるスペーサーを含む細胞外ドメイン；ＣＤ１９膜貫通ドメイン；細胞内リンカー、ならびにＦＲＢを含む第１の二量体化ドメインを有する。ＳＤＣは、第２の二量体化ドメインとしてのＦＫＢＰ１２と共に、シグナル減弱ドメイン（ＳＤＤ）としてＣＤ１４８またはＣＳＫキナーゼを含む（図２Ｂ）。
【００１４】
【図３】図２に示されるＣＡＲシグナル伝達システムの薬剤媒介性制御を示す概略図である。ラパマイシンの非存在下で、ＳＤＣは細胞内を自由に動き、ＣＡＲ媒介性細胞シグナル伝達に影響しない（左ボックス）。ラパマイシンの存在下で、ＦＲＢおよびＦＫＢＰ１２は二量体化し、ＳＤＣを細胞膜に運び、そこでＳＤＤはＣＡＲ媒介性細胞シグナル伝達を減弱させる（右ボックス）。
【００１５】
【図４】代替的なＣＡＲシグナル伝達システムの概略図であり、ＳＤＤの減弱効果は薬剤の添加により除去される。ＣＡＲは、図２に示したものと同じである（Ａを参照）。Ｂに示す構成では、ＭＴＣは、ミリストイル化配列；細胞内リンカー、およびＴｅｔＲＢを含む第１の二量体化ドメインを含み、ＳＤＣは、第２の二量体化ドメインとしてのＴｅｔ相互作用ペプチド（ＴｉＰ）と共に、シグナル減弱ドメイン（ＳＤＤ）としてＣＤ１４８またはＣＳＫキナーゼを含む。Ｃに示す構成では、ＭＴＣは、Ｖ５タグおよびＣＤ２２からのＩｇドメイン５および６であるスペーサーを含む細胞外ドメイン；ＣＤ１９膜貫通ドメイン；細胞内リンカー、ならびにＴｅｔＲＢを含む第１の二量体化ドメインを含み、ＳＤＣは、第２の二量体化ドメインとしてのＴｉＰと共に、シグナル減弱ドメイン（ＳＤＤ）としてＣＤ１４８またはＣＳＫキナーゼを含む。
【００１６】
【図５】図４Ｂに示すＣＡＲシグナル伝達システムの薬剤媒介性制御を示す概略図である。テトラサイクリンの非存在下で、ＴｅｔＲＢおよびＴｉＰは二量体化し、ＳＤＣは細胞膜にテザリングされ、そこでＳＤＤは、ＣＡＲ媒介性細胞シグナル伝達を減弱させる（左ボックス）。テトラサイクリンの存在下で、ＴｅｔはＴｅｔＲＢへの結合についてＴｉＰに打ち勝つため、ＳＤＣはＭＴＣから解離し、それによりＳＤＣはＣＡＲ媒介細胞に影響しない（右ボックス）。
【００１７】
【図６】図４Ｃに示すＣＡＲシグナル伝達システムの薬剤媒介性制御を示す概略図である。テトラサイクリンの非存在下で、ＴｅｔＲＢおよびＴｉＰは二量体化し、ＳＤＣは細胞膜にテザリングされ、そこでＳＤＤは、ＣＡＲ媒介性細胞シグナル伝達を減弱させる（左ボックス）。テトラサイクリンの存在下で、ＴｅｔはＴｅｔＲＢへの結合についてＴｉＰに打ち勝つため、ＳＤＣはＭＴＣから解離し、それによりＳＤＣはＣＡＲ媒介細胞に影響しない（右ボックス）。
【００１８】
【図７】（ａ）−即時Ｔ細胞活性化経路の図。Ｔ細胞受容体活性化はＩＴＡＭのリン酸化を結果としてもたらす。リン酸化されたＩＴＡＭはＺＡＰ７０  ＳＨ２ドメインにより認識される。認識されると、ＺＡＰ７０は膜近傍領域に動員され、その後にそのキナーゼドメインがＬＡＴをリン酸化する。リン酸化されたＬＡＴは、その後に、ＧＲＡＰ、ＧＲＢ２およびＰＬＣ−γのＳＨ２ドメインにより認識される。（ｂ）−即時Ｔ細胞阻害経路の図。ＰＤ１のような阻害性免疫受容体の活性化はＩＴＩＭドメインのリン酸化を結果としてもたらす。これらはＰＴＰＮ６のＳＨ２ドメインにより認識される。認識されると、ＰＴＰＮ６は膜近傍領域に動員され、その後にそのホスファターゼドメインがＩＴＡＭドメインを脱リン酸化して、免疫活性化を阻害する。
【００１９】
【図８】ＣＡＲおよびシグナル減弱成分（ＳＤＣ）から作られたＣＡＲシグナル伝達システムの概略図。この例では、ＣＡＲは、抗原結合ドメイン（ｓｃＦｖ）；ＣＤ８スペーサー；ＣＤ２８膜貫通ドメイン；ＦＲＢを含む第１の二量体化ドメイン；ＣＤ２８共刺激ドメインおよびＣＤ３ゼータエンドドメインを含む（図８Ｂ）。同等の「古典的」なＣＡＲ（図８Ａ）は第１の二量体化ドメインのＦＲＢを欠く。ＳＤＣは、第２の二量体化ドメインとしてのＦＫＢＰ１２と共に、シグナル減弱ドメイン（ＳＤＤ）としてＣＤ１４８またはＣＳＫキナーゼを含む（図８Ｂ）。
【００２０】
【図９】図８に示すＣＡＲシグナル伝達システムの薬剤媒介性制御を示す概略図である。ラパマイシンの非存在下で、ＳＤＣは細胞内を自由に動き、ＣＡＲ媒介性細胞シグナル伝達に影響しない（左ボックス）。ラパマイシンの存在下で、ＦＲＢおよびＦＫＢＰ１２は二量体化し、ＳＤＣを細胞膜に運び、そこでＳＤＤはＣＡＲ媒介性細胞シグナル伝達を減弱させる（右ボックス）。
【００２１】
【図１０】代替的なＣＡＲシグナル伝達システムの概略図であり、ＳＤＤの減弱効果は薬剤の添加により除去される。ＣＡＲは、第１の二量体化ドメインがＴｅｔＲＢを含むことを除いて図２に示したものと同じである（図１０Ｂ）。同等の「古典的」なＣＡＲ（図１０Ａ）は第１の二量体化ドメインのＴｅｔＲＢを欠く。ＳＤＣは、第２の二量体化ドメインとしてのＴｅｔ相互作用ペプチド（ＴｉＰ）と共に、シグナル減弱ドメイン（ＳＤＤ）としてＣＤ１４８またはＣＳＫキナーゼを含む。
【００２２】
【図１１】図１０に示すＣＡＲシグナル伝達システムの薬剤媒介性制御を示す概略図である。テトラサイクリンの非存在下で、ＴｅｔＲＢおよびＴｉＰは二量体化し、ＳＤＤはＣＡＲ媒介性細胞シグナル伝達を減弱させる（左ボックス）。テトラサイクリンの存在下で、ＴｅｔはＴｅｔＲＢへの結合についてＴｉＰに打ち勝つため、ＳＤＣはＣＡＲから解離し、それによりＳＤＣはＣＡＲ媒介細胞に影響しない（右ボックス）。
【００２３】
【図１２】キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ならびにシグナル減弱ドメイン（ＳＤＤ）および不安定化ドメインを含む膜にテザリングされたシグナル減弱成分（ＳＤＣ）から作られたＣＡＲシグナル伝達システムの概略図である。この例では、ＳＤＣは、ＣＤ２２からの２つのＩｇドメインを含むエクトドメイン；膜貫通ドメイン；ＣＤ１４８キナーゼを含むシグナル減弱（すなわち、阻害）ドメインおよび変異型のＦＲＢ（ＦＲＢｍｕｔ）を含む不安定化（destamilisation）ドメインを有する。ラパマイシンの非存在下で、ＳＤＣは不安定であり、発現されないかまたは破壊される。したがって、ＣＡＲ媒介性細胞シグナル伝達は影響されない。ラパマイシンの存在下で、ＳＤＣは安定化され、ＣＤ１４８は、ＣＡＲエンドドメイン中のＩＴＡＭを脱リン酸化することによりＣＡＲ媒介性細胞シグナル伝達を減弱させる。
【００２４】
【図１３】Ａ：抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲを単独で発現する（左チャート）または膜テザリング成分（ｖ５−ＣＤ２２（２Ｉｇ）−ＴＭ−ＦＲＢ）およびシグナル減弱成分（ＦＫＢＰ１２−ＣＤ１４８）と組み合わせて抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲを発現するＴ細胞による様々な濃度のラパマイシンの存在下での経時的なＢＣＭＡ＋ＳＫＯＶ３標的細胞の殺傷を比較するＩｎｃｕｃｙｔｅアッセイの結果である。ラパマイシンの存在下で、ＣＡＲ、膜テザリング成分およびシグナル減弱成分を発現するＴ細胞による標的細胞の殺傷は有意に阻害された。阻害は、ラパマイシンの濃度に応じて滴定可能であった。Ｂ：７２時間の時点におけるＡに提示されるデータの要約。ＣＡＲ、膜テザリング成分およびシグナル減弱成分を発現するＴ細胞による標的細胞の殺傷は、０．８２μＭより高いラパマイシンの試験した濃度において有意に阻害された。再び、阻害は、ラパマイシンの濃度と共に滴定可能であることが示される。
【００２５】
【図１４】抗ＣＤ１９  ＣＡＲを単独で発現する（左チャート）または膜テザリング成分（ｖ５−ＣＤ２２（２Ｉｇ）−ＴＭ−ＦＲＢ）およびシグナル減弱成分（ＦＫＢＰ１２−ＣＤ１４８）と組み合わせて抗ＣＤ１９  ＣＡＲを発現するＴ細胞による、ラパマイシンの非存在下（赤線）または１０μＭのラパマイシンの存在下（黒線）での経時的なＣＤ１９＋ＳＫＯＶ３標的細胞の殺傷を比較するＩｎｃｕｃｙｔｅアッセイの結果である。ラパマイシンの存在下で、ＣＡＲ、膜テザリング成分およびシグナル減弱成分を発現するＴ細胞による標的細胞の殺傷は有意に阻害された。５０時間の時点で、対照ＣＡＲは標的細胞をほぼ完全に殺傷した一方、減弱因子とＣＡＲを共発現するＴ細胞について、標的細胞の約５０％が生存していた。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２６】
本発明者らは、薬剤を用いて制御可能なＣＡＲシグナル伝達システムを開発した。シグナル伝達システムは、ＣＡＲ媒介性細胞シグナル伝達を阻害するシグナル減弱ドメインを含む。これは、薬剤の投与によりＣＡＲ媒介性細胞シグナル伝達を低減（または増大）させて、例えばＣＡＲ関連毒性の事象において、制御のための機構を提供できることを意味する。第１の態様では、本発明は、
（ｉ）抗原結合ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）；
（ｉｉ）第１の二量体化ドメインを含む膜テザリング成分；および
（ｉｉｉ）シグナル減弱ドメイン（ＳＤＤ）と、膜テザリング成分の第１の二量体化ドメインに特異的に結合する第２の二量体化ドメインとを含むシグナル減弱成分（ＳＤＣ）
を含む、細胞を提供する。
【００２７】
ＳＤＤは、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインを阻害し得る。
【００２８】
ＳＤＤは、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を脱リン酸化することができるホスファターゼドメインを含み得る。
【００２９】
ＳＤＤは、ＣＤ１４８またはＣＤ４５のエンドドメインを含み得る。
【００３０】
ＳＤＤは、ＳＨＰ−１またはＳＨＰ−２のホスファターゼドメインを含み得る。
【００３１】
ＳＤＤは、免疫受容体チロシン阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含み得る。
【００３２】
ＳＤＤは、以下の阻害性受容体：ＰＤ１、ＢＴＬＡ、２Ｂ４、ＣＴＬＡ−４、ＧＰ４９Ｂ、Ｌａｉｒ−１、Ｐｉｒ−Ｂ、ＰＥＣＡＭ−１、ＣＤ２２、シグレック７、シグレック９、ＫＬＲＧ１、ＩＬＴ２、ＣＤ９４−ＮＫＧ２ＡおよびＣＤ５のうちの１つからのエンドドメインを含み得る。
【００３３】
ＳＤＤは、Ｓｒｃプロテインキナーゼを阻害し得る。
【００３４】
ＳＤＤは、Ｌｃｋを阻害し得る。
【００３５】
ＳＤＤは、ＣＳＫのキナーゼドメインを含み得る。
【００３６】
ＳＤＤは、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインの除去を引き起こし得る。例えば、ＳＤＤは、プロテアーゼを含み得、ＣＡＲは、プロテアーゼ切断部位を含み得る。
【００３７】
ＳＤＤは、タバコエッチウイルスプロテアーゼ（ＴｅＶ）を含み得る。
【００３８】
第１および第２の二量体化ドメインの結合は、薬剤の存在または非存在により制御可能であり得る。
【００３９】
第１の実施形態では、第１および第２の二量体化ドメインの結合は、二量体化の化学的誘導剤（ＣＩＤ）の存在により誘導され得る。
【００４０】
これに関して、一方の二量体化ドメインは、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）を含み得、他方の二量体化ドメインは、ｍＴＯＲのＦＲＢドメインを含み得、ＣＩＤは、ラパマイシンまたはラパマイシンアナログであり得る。
【００４１】
あるいは、第１および第２の二量体化ドメインは、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）を含み得、ＣＩＤは、ＦＫ１０１２であり得る。
【００４２】
あるいは、第１および第２の二量体化ドメインは、ＧｙｒＢを含み得、ＣＩＤは、クーママイシンまたはその誘導体であり得る。
【００４３】
あるいは、一方の二量体化ドメインは、ＧＡＩを含み得、他方の二量体化ドメインは、ＧＩＤ１を含み得、ＣＩＤは、ジベレリンまたはその誘導体であり得る。
【００４４】
第２の実施形態では、薬剤の存在は、第１および第２の二量体化ドメインの結合を破壊する。
【００４５】
これに関して、一方の二量体化ドメインは、Ｔｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）を含み得、他方の二量体化ドメインは、ＴｅｔＲ相互作用タンパク質（ＴｉＰ）を含み得、薬剤は、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリンまたはこれらのアナログであり得る。
【００４６】
膜テザリング成分は、膜貫通ドメインまたはミリストイル化配列を含み得る。
【００４７】
第２の態様では、本発明は、
（ｉ）本発明の第１の態様に定義されるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第１の核酸配列；
（ｉｉ）本発明の第１の態様に定義される膜テザリング成分（ＭＴＣ）をコードする第２の核酸配列；および
（ｉｉｉ）本発明の第１の態様に定義されるシグナル減弱成分（ＳＤＣ）をコードする第３の核酸配列
を含む、核酸構築物を提供する。
【００４８】
第３の態様では、本発明は、
（ｉ）本発明の第１の態様に定義されるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第１の核酸配列；
（ｉｉ）本発明の第１の態様に定義される膜テザリング成分（ＭＴＣ）をコードする第２の核酸配列；および
（ｉｉ）本発明の第１の態様に定義されるシグナル減弱成分（ＳＤＣ）をコードする第３の核酸配列
を含む、核酸配列のキットを提供する。
【００４９】
第４の態様では、本発明は、本発明の第２の態様による核酸構築物を含む、ベクターを提供する。
【００５０】
第５の態様では、本発明は、
（ｉ）本発明の第１の態様に定義されるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を含む第１のベクター；
（ｉｉ）本発明の第１の態様に定義される膜テザリング成分（ＭＴＣ）をコードする核酸配列を含む第２のベクター；および
（ｉｉ）本発明の第１の態様に定義されるシグナル減弱成分（ＳＤＣ）をコードする核酸配列を含む第３のベクター
を含む、ベクターのキットを提供する。
【００５１】
第６の態様では、本発明は、本発明の第１の態様による複数の細胞を含む、医薬組成物を提供する。
【００５２】
第７の態様では、本発明は、疾患の処置および／または予防において使用するための、本発明の第６の態様による医薬組成物を提供する。
【００５３】
第７の態様では、本発明の第６の態様による医薬組成物を被験体に投与するステップを含む、疾患を処置および／または予防するための方法が提供される。
【００５４】
方法は、
（ｉ）細胞含有試料を単離するステップ；
（ｉｉ）本発明の第２の態様による核酸構築物、本発明の第３の態様による核酸配列のキット；本発明の第４の態様によるベクターまたは本発明の第５の態様によるベクターのキットで、細胞を形質導入またはトランスフェクトするステップ；および
（ｉｉｉ）（ｉｉ）からの細胞を被験体に投与するステップ
を含み得る。
【００５５】
第８の態様では、本発明は、第１および第２の二量体化ドメインの結合または解離を制御する薬剤を被験体に投与するステップを含む、被験体において本発明の第１の態様による細胞の活性化を制御するための方法を提供する。
【００５６】
第９の態様では、本発明は、第１および第２の結合ドメインの結合を誘導する薬剤を被験体に投与するステップを含む、本発明の第１の態様による細胞を含む被験体においてＣＡＲ関連毒性を処置するための方法を提供する。
【００５７】
ＣＡＲ関連毒性は、例えば、サイトカイン放出症候群、マクロファージ活性化症候群、または神経毒性であり得る。
【００５８】
第１０の態様では、本発明は、疾患の処置および／または予防のための医薬の製造における、本発明の第１の態様による医薬組成物の使用を提供する。
【００５９】
疾患は、がんであり得る。
【００６０】
第１１の態様では、本発明は、本発明の第２の態様による核酸構築物、本発明の第３の態様による核酸配列のキット；本発明の第４の態様によるベクター、または本発明の第５の態様によるベクターのキットを細胞に導入するステップを含む、本発明の第１の態様による細胞を製造するための方法を提供する。
【００６１】
細胞は、被験体から単離された試料からのものであり得る。
【００６２】
図８〜１１に示す本発明の「融合二量体化減弱因子（ｆｕｓｅｄ  ｄｉｍｅｒｉｓｉｎｇ  ｄａｍｐｅｎｅｒ）」の実施形態に関する本発明の追加の態様は、以下の番号付けされたパラグラフＡ１〜Ａ３４において要約される。
【００６３】
Ａ１．（ｉ）抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、第１の二量体化ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）；ならびに
（ｉｉ）シグナル減弱ドメイン（ＳＤＤ）と、ＣＡＲの第１の二量体化ドメインに特異的に結合する第２の二量体化ドメインとを含むシグナル減弱成分（ＳＤＣ）
を含む、細胞。
【００６４】
Ａ２．ＳＤＤが、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインを阻害する、パラグラフＡ１に記載の細胞。
【００６５】
Ａ３．ＳＤＤが、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を脱リン酸化することができるホスファターゼドメインを含む、パラグラフＡ２に記載の細胞。
【００６６】
Ａ４．ＳＤＤが、ＣＤ１４８またはＣＤ４５のエンドドメインを含む、パラグラフＡ３に記載の細胞。
【００６７】
Ａ５．ＳＤＤが、ＳＨＰ−１またはＳＨＰ−２のホスファターゼドメインを含む、パラグラフＡ３に記載の細胞。
【００６８】
Ａ６．ＳＤＤが、免疫受容体チロシン阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む、パラグラフＡ２に記載の細胞。
【００６９】
Ａ７．ＳＤＤが、以下の阻害性受容体：ＰＤ１、ＢＴＬＡ、２Ｂ４、ＣＴＬＡ−４、ＧＰ４９Ｂ、Ｌａｉｒ−１、Ｐｉｒ−Ｂ、ＰＥＣＡＭ−１、ＣＤ２２、シグレック７、シグレック９、ＫＬＲＧ１、ＩＬＴ２、ＣＤ９４−ＮＫＧ２ＡおよびＣＤ５のうちの１つからのエンドドメインを含む、パラグラフＡ６に記載の細胞。
【００７０】
Ａ８．ＳＤＤが、Ｓｒｃプロテインキナーゼを阻害する、パラグラフＡ２に記載の細胞。
【００７１】
Ａ９．ＳＤＤが、Ｌｃｋを阻害する、パラグラフＡ８に記載の細胞。
【００７２】
Ａ１０．ＣＳＫのキナーゼドメインを含む、パラグラフＡ８またはＡ９に記載の細胞。
【００７３】
Ａ１１．ＳＤＤが、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインの除去を引き起こす、パラグラフＡ１に記載の細胞。
【００７４】
Ａ１２．ＳＤＤが、プロテアーゼを含み、ＣＡＲが、プロテアーゼ切断部位を含む、パラグラフＡ１１に記載の細胞。
【００７５】
Ａ１３．ＳＤＤが、タバコエッチウイルスプロテアーゼ（ＴｅＶ）を含む、パラグラフＡ１２に記載の細胞。
【００７６】
Ａ１４．第１および第２の二量体化ドメインの結合が、薬剤の存在または非存在により制御可能である、任意の先行するパラグラフに記載の細胞。
【００７７】
Ａ１５．第１および第２の二量体化ドメインの結合が、二量体化の化学的誘導剤（ＣＩＤ）の存在により誘導される、パラグラフＡ１４に記載の細胞。
【００７８】
Ａ１６．一方の二量体化ドメインが、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）を含み、他方の二量体化ドメインが、ｍＴＯＲのＦＲＢドメインを含み、ＣＩＤが、ラパマイシンまたはラパマイシンアナログである、パラグラフＡ１５に記載の細胞。
【００７９】
Ａ１７．第１および第２の二量体化ドメインが、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）を含み、ＣＩＤが、ＦＫ１０１２である、パラグラフＡ１５に記載の細胞。
【００８０】
Ａ１８．第１および第２の二量体化ドメインが、ＧｙｒＢを含み、ＣＩＤが、クーママイシンまたはその誘導体である、パラグラフＡ１５に記載の細胞。
【００８１】
Ａ１９．一方の二量体化ドメインが、ＧＡＩを含み、他方の二量体化ドメインが、ＧＩＤ１を含み、ＣＩＤが、ジベレリンまたはその誘導体である、パラグラフＡ１５に記載の細胞。
【００８２】
Ａ２０．薬剤が、第１および第２の二量体化ドメインの結合を破壊する、パラグラフＡ１４に記載の細胞。
【００８３】
Ａ２１．一方の二量体化ドメインが、Ｔｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）を含み、他方の二量体化ドメインが、ＴｅｔＲ相互作用タンパク質（ＴｉＰ）を含み、薬剤が、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリンまたはこれらのアナログである、パラグラフＡ２０に記載の細胞。
【００８４】
Ａ２２．（ｉ）任意の先行するパラグラフに定義されるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第１の核酸配列；および
（ｉｉ）任意の先行するパラグラフに定義されるシグナル減弱成分（ＳＤＣ）をコードする第２の核酸配列
を含む、核酸構築物。
【００８５】
Ａ２３．以下の構造：
ＡｇＢＤ−ＴＭ−ＤＤ１−ｅｎｄｏ−ｃｏｅｘｐｒ−ＳＤＤ−ＤＤ２；
ＡｇＢＤ−ＴＭ−ｅｎｄｏ−ＤＤ１−ｃｏｅｘｐｒ−ＳＤＤ−ＤＤ２；
ＳＤＤ−ＤＤ２−ｃｏｅｘｐｒ−ＡｇＢＤ−ＴＭ−ＤＤ１−ｅｎｄｏ；
ＳＤＤ−ＤＤ２−ｃｏｅｘｐｒ−ＡｇＢＤ−ＴＭ−ｅｎｄｏ−ＤＤ１；
ＡｇＢＤ−ＴＭ−ＤＤ１−ｅｎｄｏ−ｃｏｅｘｐｒ−ＤＤ２−ＳＤＤ；
ＡｇＢＤ−ＴＭ−ｅｎｄｏ−ＤＤ１−ｃｏｅｘｐｒ−ＤＤ２−ＳＤＤ；
ＤＤ２−ＳＤＤ−ｃｏｅｘｐｒ−ＡｇＢＤ−ＴＭ−ＤＤ１−ｅｎｄｏ；および
ＤＤ２−ＳＤＤ−ｃｏｅｘｐｒ−ＡｇＢＤ−ＴＭ−ｅｎｄｏ−ＤＤ１のうちの１つを有し、
ＡｇＢＤは、ＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする配列であり、
ＴＭは、ＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする配列であり、
ＤＤ１は、第１の二量体化ドメインをコードする配列であり、
Ｅｎｄｏは、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインをコードする配列であり、
Ｃｏｅｘｐｒは、ＣＡＲおよびＳＤＣの共発現を可能とする配列であり、
ＳＤＤは、ＳＤＣのシグナル減弱ドメインをコードする配列であり、
ＤＤ２は、第２の二量体化ドメインをコードする配列である、
パラグラフ２２に記載の核酸構築物。
【００８６】
Ａ２４．（ｉ）パラグラフＡ１〜Ａ２１のいずれかに定義されるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第１の核酸配列；および
（ｉｉ）パラグラフＡ１〜Ａ２１のいずれかに定義されるシグナル減弱成分（ＳＤＣ）をコードする第２の核酸配列
を含む、核酸配列のキット。
【００８７】
Ａ２５．パラグラフＡ２２またはＡ２３に記載の核酸構築物を含む、ベクター。
【００８８】
Ａ２６．（ｉ）パラグラフＡ１〜Ａ２１のいずれかに定義されるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を含む第１のベクター；および
（ｉｉ）パラグラフＡ１〜Ａ２１のいずれかに定義されるシグナル減弱成分（ＳＤＣ）をコードする核酸配列を含む第２のベクター
を含む、ベクターのキット。
【００８９】
Ａ２７．パラグラフ１〜２０のいずれかに記載の複数の細胞を含む、医薬組成物。
【００９０】
Ａ２８．疾患の処置および／または予防において使用するための、パラグラフＡ２７に記載の医薬組成物。
【００９１】
Ａ２９．パラグラフＡ２７に記載の医薬組成物を被験体に投与するステップを含む、疾患を処置および／または予防するための方法。
【００９２】
Ａ３０．（ｉ）細胞含有試料を単離するステップ；
（ｉｉ）パラグラフＡ２２またはＡ２３に記載の核酸構築物、パラグラフＡ２４に記載の核酸配列のキット；パラグラフＡ２５に記載のベクターまたはパラグラフＡ２６に記載のベクターのキットで、細胞を形質導入またはトランスフェクトするステップ；および
（ｉｉｉ）（ｉｉ）からの細胞を被験体に投与するステップ
を含む、パラグラフ２８に記載の方法。
【００９３】
Ａ３１．第１および第２の二量体化ドメインの結合または解離を制御する薬剤を被験体に投与するステップを含む、被験体においてパラグラフＡ１〜Ａ２１のいずれかに記載の細胞の活性化を制御するための方法。
【００９４】
Ａ３２．疾患の処置および／または予防のための医薬の製造における、パラグラフＡ２７に記載の医薬組成物の使用。
【００９５】
Ａ３３．疾患ががんである、パラグラフＡ２８に記載の使用のための医薬組成物、パラグラフＡ２９またはＡ３０に記載の方法、あるいはパラグラフＡ３２に記載の使用。
【００９６】
Ａ３４．パラグラフＡ２２またはＡ２３に記載の核酸構築物、パラグラフＡ２４に記載の核酸配列のキット；パラグラフＡ２５に記載のベクターまたはパラグラフＡ２６に記載のベクターのキットを細胞に導入するステップを含む、パラグラフ１〜２０のいずれかに記載の細胞を製造するための方法。
【００９７】
Ａ３５．細胞が、被験体から単離された試料からのものである、パラグラフＡ３４に記載の方法。
【００９８】
図１２に示す本発明の「不安定化ドメイン減弱因子（ｄｅｓｔａｂｉｌｉｓａｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ  ｄａｍｐｅｎｅｒ）」の実施形態に関する本発明の追加の態様は、以下の番号付けされたパラグラフＢ１〜Ｂ２９に要約される。
【００９９】
Ｂ１．（ｉ）抗原結合ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）；ならびに
（ｉｉｉ）シグナル減弱ドメイン（ＳＤＤ）および不安定化ドメインを含む膜にテザリングされたシグナル減弱成分（ＳＤＣ）
を含む、細胞。
【０１００】
Ｂ２．ＳＤＤが、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインを阻害する、パラグラフＢ１に記載の細胞。
【０１０１】
Ｂ３．ＳＤＤが、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を脱リン酸化することができるホスファターゼドメインを含む、パラグラフＢ２に記載の細胞。
【０１０２】
Ｂ４．ＳＤＤが、ＣＤ１４８またはＣＤ４５のエンドドメインを含む、パラグラフＢ３に記載の細胞。
【０１０３】
Ｂ５．ＳＤＤが、ＳＨＰ−１またはＳＨＰ−２のホスファターゼドメインを含む、パラグラフＢ３に記載の細胞。
【０１０４】
Ｂ６．ＳＤＤが、免疫受容体チロシン阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む、パラグラフＢ２に記載の細胞。
【０１０５】
Ｂ７．ＳＤＤが、以下の阻害性受容体：ＰＤ１、ＢＴＬＡ、２Ｂ４、ＣＴＬＡ−４、ＧＰ４９Ｂ、Ｌａｉｒ−１、Ｐｉｒ−Ｂ、ＰＥＣＡＭ−１、ＣＤ２２、シグレック７、シグレック９、ＫＬＲＧ１、ＩＬＴ２、ＣＤ９４−ＮＫＧ２ＡおよびＣＤ５のうちの１つからのエンドドメインを含む、パラグラフＢ６に記載の細胞。
【０１０６】
Ｂ８．ＳＤＤが、Ｓｒｃプロテインキナーゼを阻害する、パラグラフＢ２に記載の細胞。
【０１０７】
Ｂ９．ＳＤＤが、Ｌｃｋを阻害する、パラグラフＢ８に記載の細胞。
【０１０８】
Ｂ１０．ＣＳＫのキナーゼドメインを含む、パラグラフＢ８またはＢ９に記載の細胞。
【０１０９】
Ｂ１１．ＳＤＤが、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインの除去を引き起こすパラグラフ１に記載の細胞。
【０１１０】
Ｂ１２．ＳＤＤが、プロテアーゼを含み、ＣＡＲが、プロテアーゼ切断部位を含む、パラグラフＢ１１に記載の細胞。
【０１１１】
Ｂ１３．ＳＤＤが、タバコエッチウイルスプロテアーゼ（ＴｅＶ）を含む、パラグラフＢ１２に記載の細胞。
【０１１２】
Ｂ１４．薬剤の存在下でＳＤＣのレベルが細胞膜において増加するように、不安定化ドメインが薬剤の存在により安定化される、任意の先行するパラグラフに記載の細胞。
【０１１３】
Ｂ１５．不安定化ドメインが、変異体ＦＲＢを含み、薬剤が、ラパマイシンである、パラグラフＢ１４に記載の細胞。
【０１１４】
Ｂ１６．膜にテザリングされたＳＤＣが、膜貫通ドメインまたはミリストイル化配列を含む、任意の先行するパラグラフに記載の細胞。
【０１１５】
Ｂ１７．（ｉ）任意の先行するパラグラフに定義されるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第１の核酸配列；および
（ｉｉ）任意の先行するパラグラフに定義される膜にテザリングされたシグナル減弱成分（ＳＤＣ）をコードする第２の核酸配列
を含む、核酸構築物。
【０１１６】
Ｂ１８．（ｉ）パラグラフＢ１〜Ｂ１６のいずれかに定義されるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第１の核酸配列；
（ｉｉ）パラグラフＢ１〜Ｂ１６のいずれかに定義される膜にテザリングされたシグナル減弱成分（ＳＤＣ）をコードする第２の核酸配列
を含む、核酸配列のキット。
【０１１７】
Ｂ１９．パラグラフＢ１７に記載の核酸構築物を含む、ベクター。
【０１１８】
Ｂ２０．（ｉ）パラグラフＢ１〜Ｂ１６のいずれかに定義されるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を含む第１のベクター；
（ｉｉ）パラグラフＢ１〜Ｂ１６のいずれかに定義される膜にテザリングされたシグナル減弱成分（ＳＤＣ）をコードする核酸配列を含む第２のベクター
を含む、ベクターのキット。
【０１１９】
Ｂ２１．パラグラフＢ１〜Ｂ１６のいずれかに記載の複数の細胞を含む、医薬組成物。
【０１２０】
Ｂ２２．疾患の処置および／または予防において使用するための、パラグラフＢ２１に記載の医薬組成物。
【０１２１】
Ｂ２３．パラグラフＢ２１に記載の医薬組成物を被験体に投与するステップを含む、疾患を処置および／または予防するための方法。
【０１２２】
Ｂ２４．（ｉ）細胞含有試料を単離するステップ；
（ｉｉ）パラグラフＢ１７に記載の核酸構築物、パラグラフＢ１８に記載の核酸配列のキット；パラグラフＢ１９に記載のベクターまたはパラグラフＢ２０に記載のベクターのキットで、細胞を形質導入またはトランスフェクトするステップ；および
（ｉｉｉ）（ｉｉ）からの細胞を被験体に投与するステップ
を含む、パラグラフＢ２３に記載の方法。
【０１２３】
Ｂ２５．不安定化ドメインを安定化させる薬剤を被験体に投与するステップを含む、被験体においてパラグラフＢ１〜Ｂ１６のいずれかに記載の細胞のＣＡＲ媒介性活性化を減弱させる方法。
【０１２４】
Ｂ２６．薬剤が、ラパマイシンである、パラグラフＢ２５に記載の方法。
【０１２５】
Ｂ２７．疾患の処置および／または予防のための医薬の製造における、パラグラフＢ２１に記載の医薬組成物の使用。
【０１２６】
Ｂ２８．疾患ががんである、パラグラフＢ２２に記載の使用のための医薬組成物、パラグラフＢ２３またはＢ２４に記載の方法、パラグラフＢ２７に記載の使用。
【０１２７】
Ｂ２９．パラグラフＢ１７に記載の核酸構築物、パラグラフＢ１８に記載の核酸配列のキット；パラグラフＢ１９に記載のベクターまたはパラグラフＢ２０に記載のベクターのキットを細胞に導入するステップを含む、パラグラフＢ１〜Ｂ１６のいずれかに記載の細胞を製造するための方法。
【０１２８】
Ｂ３０．細胞が、被験体から単離された試料からのものである、パラグラフＢ２９に記載の方法。
【発明を実施するための形態】
【０１２９】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
図１に図式的に示す古典的なＣＡＲは、キメラＩ型膜貫通タンパク質であり、細胞外抗原認識ドメイン（結合因子）を細胞内シグナル伝達ドメイン（エンドドメイン）に接続する。結合因子は、典型的に、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）に由来する単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であるが、抗体様抗原結合部位を含む他のフォーマットまたは標的抗原のリガンドに基づき得る。スペーサードメインは、膜から結合因子を単離し、好適な配向とさせるために必要なことがある。使用される一般的なスペーサードメインは、ＩｇＧ１のＦｃである。抗原に応じて、より小型のスペーサー、例えば、ＣＤ８αからのストーク（ｓｔａｌｋ）およびさらにはＩｇＧ１ヒンジ単独でさえも充分なことがある。膜貫通ドメインは、細胞膜中にタンパク質を係留し、スペーサーをエンドドメインに接続する。
【０１３０】
初期のＣＡＲ設計は、ＦｃεＲ１のγ鎖またはＣＤ３ζのいずれかの細胞内部分に由来するエンドドメインを有していた。結果として、これらの第一世代の受容体は免疫シグナル１を伝達し、これは同族標的細胞のＴ細胞殺傷を誘発するために充分であったが、増殖および生存するようにＴ細胞を完全に活性化させることはなかった。この制限を克服するために、複合エンドドメインが構築され、Ｔ細胞共刺激分子の細胞内部分のＣＤ３ζのそれへの融合は、抗原認識後に活性化シグナルおよび共刺激シグナルを同時に伝達することができる第二世代の受容体を結果としてもたらす。最も一般的に使用される共刺激ドメインは、ＣＤ２８のものである。これは、Ｔ細胞増殖を誘発する最も強力な共刺激シグナル、すなわち免疫シグナル２を与える。生存シグナルを伝達する密接に関連したＯＸ４０および４１ＢＢのようなＴＮＦ受容体ファミリーエンドドメインを含む一部の受容体もまた記載されている。活性化、増殖および生存シグナルを伝達することができるエンドドメインを有するよりいっそう強力な第三世代のＣＡＲが今では記載されている。
【０１３１】
例えばレトロウイルスベクターを使用して、ＣＡＲをコードする核酸をＴ細胞に移入することができる。このようにして、多数の抗原特異的なＴ細胞を養子細胞移入のために生成することができる。ＣＡＲが標的抗原に結合する時に、これは、それを発現するＴ細胞への活性化シグナルの伝達を結果としてもたらす。したがって、ＣＡＲは、Ｔ細胞の特異性および細胞傷害を、標的化された抗原を発現する細胞に方向付ける。
【０１３２】
抗原結合ドメイン
抗原結合ドメインは、抗原を認識する古典的なＣＡＲの部分である。
【０１３３】
抗体、抗体模倣物、およびＴ細胞受容体の抗原結合部位に基づくものなどの多数の抗原結合ドメインが当該技術分野において公知である。例えば、抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体に由来する単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）；標的抗原の天然リガンド；標的に対して充分な親和性を有するペプチド；ラクダ科動物のような単一ドメイン結合因子；Ｄａｒｐｉｎのような単一の人工的結合因子；またはＴ細胞受容体に由来する一本鎖を含み得る。
【０１３４】
以下の表１に示すように、様々な腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）が公知である。本発明において使用される抗原結合ドメインは、表１に指し示すようなＴＡＡに結合することができるドメインであり得る。
【表１Ａ−１】
2020520236.tif 000002
【表１Ａ−２】
2020520236.tif 000003
【０１３５】
抗原結合ドメインは、Ｂ細胞膜抗原（ＢＣＭＡ）ならびに膜貫通活性化因子およびカルシウムモジュレーターおよびシクロフィリンリガンド相互作用因子（ＴＡＣＩ）に結合する増殖誘導リガンド（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｌｉｇａｎｄ）（ＡＰＲＩＬ）を含み得る。ＡＰＲＩＬベースの抗原結合ドメインを含むＣＡＲはＷＯ２０１５／０５２５３８に記載されている。
【０１３６】
膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインは、膜を通過する古典的なＣＡＲの配列である。それは疎水性アルファヘリックスを含み得る。膜貫通ドメインは、ＣＤ２８に由来するものであってよく、これは良好な受容体安定性を与える。
【０１３７】
シグナルペプチド
ＣＡＲは、シグナルペプチドを含んでよく、それにより、Ｔ細胞のような細胞中で発現された時に、新生タンパク質は小胞体およびその後に細胞表面に方向付けられ、そこで発現される。
【０１３８】
シグナルペプチドのコアは、単一のアルファヘリックスを形成する傾向を有する疎水性アミノ酸の長いストレッチを含有し得る。シグナルペプチドは、アミノ酸の正に荷電した短いストレッチで始まることがあり、これは、トランスロケーションの間のポリペプチドの適切なトポロジーの強化を助ける。シグナルペプチドの終わりに、シグナルペプチダーゼにより認識されて切断されるアミノ酸のストレッチが典型的に存在する。シグナルペプチダーゼは、トランスロケーションの間またはその完了後のいずれかにおいて切断を行って、遊離のシグナルペプチドおよび成熟タンパク質を生成させ得る。次いで、遊離のシグナルペプチドは、特異的プロテアーゼにより消化される。
【０１３９】
スペーサードメイン
ＣＡＲは、抗原結合ドメインを膜貫通ドメインと接続するスペーサー配列を含み得る。柔軟なスペーサーは、抗原結合ドメインが異なる方向に配向して結合を促進することを可能とする。
【０１４０】
スペーサー配列は、例えば、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域、ＩｇＧ１ヒンジまたはヒトＣＤ８ストークまたはマウスＣＤ８ストークを含み得る。あるいは、スペーサーは、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域、ＩｇＧ１ヒンジまたはＣＤ８ストークと類似の長さおよび／またはドメインスペーシング特性を有する代替的なリンカー配列を含み得る。ヒトＩｇＧ１スペーサーは、Ｆｃ結合モチーフを除去するように変更され得る。
【０１４１】
細胞内シグナル伝達ドメイン
細胞内シグナル伝達ドメインは、古典的なＣＡＲのシグナル伝達部分である。
【０１４２】
最も一般的に使用されるシグナル伝達ドメイン成分は、３つのＩＴＡＭを含有するＣＤ３−ゼータエンドドメインのものである。これは、抗原が結合した後に活性化シグナルをＴ細胞に伝達する。ＣＤ３−ゼータは、完全にコンピテントな活性化シグナルを提供しないことがあり、追加の共刺激シグナル伝達が必要とされることがある。例えば、増殖／生存シグナルを伝達するためにキメラＣＤ２８およびＯＸ４０をＣＤ３−ゼータと共に使用することができ、または３つ全てを一緒に使用することができる（図１Ｂに示される）。
【０１４３】
ＣＡＲは、配列番号１、２もしくは３として示される配列または少なくとも８０％の配列同一性を有するその改変体を含み得る。
【化１】
2020520236.tif 000004
【化２】
2020520236.tif 000005
【０１４４】
改変体配列は、効果的な細胞内シグナル伝達ドメインを提供する限り、配列番号１、２または３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有し得る。
【０１４５】
膜テザリング成分（ＭＴＣ）
成分である膜テザリング成分はアンカーとして作用し、第１の二量体化ドメインおよびしたがってシグナル減弱成分を細胞膜の細胞内表面にテザリングさせる。
【０１４６】
膜テザリング成分は、シグナル減弱成分上の相反ドメイン（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ  ｄｏｍａｉｎ）と相互作用する第１のヘテロ二量体化ドメインを含む。
【０１４７】
膜テザリング成分は、膜局在化ドメインを含み得る。これは、第１の二量体化ドメインが形質膜の近位の位置において取り付けられまたは保持されることを引き起こす任意の配列であり得る。
【０１４８】
膜局在化ドメインは、新生ポリペプチドが最初にＥＲ膜に取り付けられることを引き起こす配列であり得るかまたは該配列を含み得る。膜材料はＥＲからゴルジに、そして最後に形質膜に「流れる」ので、タンパク質は、合成／トランスロケーションプロセスの終わりにおいて膜と会合したままとなる。
【０１４９】
膜局在化ドメインは、例えば、膜貫通配列、移行停止配列、ＧＰＩアンカーまたはミリストイル化／プレニル化／パルミトイル化部位を含み得る。
【０１５０】
あるいは、膜局在化ドメインは、膜テザリング成分を、例えば膜の近位の実体への結合により、細胞膜に位置するタンパク質または他の実体に方向付け得る。膜テザリング成分は、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３、ＣＤ４またはＣＤ８のような免疫シナプスに関与する分子に結合するドメインを含み得る。
【０１５１】
ミリストイル化は、ミリスチン酸に由来するミリストイル基がＮ末端グリシン残基のアルファ−アミノ基にアミド結合により共有結合する脂質化修飾である。ミリスチン酸は、ｎ−テトラデカン酸としても公知の１４炭素の飽和脂肪酸である。修飾は、翻訳と同時または翻訳後のいずれかにおいて付加され得る。Ｎ−ミリストイルトランスフェラーゼ（ＮＭＴ）は、細胞の細胞質においてミリスチン酸付加反応を触媒する。疎水性のミリストイル基は細胞膜中のリン脂質と相互作用するので、ミリストイル化は、それが取り付けられたタンパク質の膜標的化を引き起こす。
【０１５２】
本発明の膜テザリング成分は、ＮＭＴ酵素によりミリストイル化されることができる配列を含み得る。本発明の細胞の膜テザリング成分は、細胞中で発現された時にミリストイル基を含み得る。
【０１５３】
膜テザリング成分は、ＮＭＴ酵素により認識されるＮＨ２−Ｇ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｓ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８のようなコンセンサス配列を含み得る。
【０１５４】
パルミトイル化は、タンパク質のシステイン、より低い頻度ではセリンおよびスレオニン残基へのパルミチン酸のような脂肪酸の共有結合である。パルミトイル化は、タンパク質の疎水性を増進させ、膜会合を誘導するために使用され得る。プレニル化およびミリストイル化とは対照的に、パルミトイル化は、通常、可逆的である（パルミチン酸とタンパク質との結合は多くの場合にチオエステル結合であるため）。逆反応は、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼにより触媒される。
【０１５５】
Ｇタンパク質を介するシグナル伝達において、αサブユニットのパルミトイル化、γサブユニットのプレニル化、およびミリストイル化は、Ｇタンパク質がその受容体と相互作用できるようにＧタンパク質を形質膜の内側表面にテザリングさせることを伴う。
【０１５６】
膜テザリング成分は、パルミトイル化されることができる配列を含み得る。膜テザリング成分は、膜局在化を引き起こす細胞中で発現される時に追加の脂肪酸を含み得る。
【０１５７】
プレニル化（イソプレニル化または脂質化としても公知）は、タンパク質または化学的化合物への疎水性分子の付加である。プレニル基（３−メチル−ブタ−２−エン−１−イル）は、ＧＰＩアンカーのような脂質アンカーと類似して、細胞膜への取付けを促進する。
【０１５８】
タンパク質プレニル化は、標的タンパク質のＣ末端システインへのファルネシルまたはゲラニル−ゲラニル部分のいずれかの移行を伴う。細胞中でプレニル化を実行する３つの酵素があり、それらは、ファルネシルトランスフェラーゼ、ＣａａｘプロテアーゼおよびゲラニルゲラニルトランスフェラーゼＩである。
【０１５９】
膜テザリング成分は、プレニル化されることができる配列を含み得る。膜テザリング成分は、膜局在化を引き起こす細胞中で発現される時に１つまたは複数のプレニル基を含み得る。
【０１６０】
シグナル減弱成分
本発明の細胞のシグナル減弱成分（ＳＤＣ）は、シグナル減弱ドメイン（ＳＤＤ）および第２の二量体化ドメインを含む。第２の二量体化ドメインは、膜テザリング成分の第１の二量体化ドメインに特異的に結合する。
【０１６１】
シグナル減弱ドメインは、細胞膜の細胞内側に位置した時、およびしたがってＣＡＲエンドドメインの近位に位置した時にＣＡＲ媒介性細胞シグナル伝達を阻害する。
【０１６２】
シグナル減弱ドメインは、ＣＡＲ媒介性細胞シグナル伝達を完全に阻害し、ＣＡＲ媒介性細胞活性化を効果的に「遮断」することができる。あるいは、ＳＤＤは、部分的な阻害を引き起こし、ＣＡＲ媒介性細胞シグナル伝達を効果的に「低減」することができる。
【０１６３】
シグナル減弱ドメインの存在は、シグナル減弱ドメインの非存在下で起こるシグナル伝達の２分の１、５分の１、１０分の１、５０分の１、１００分の１、１，０００分の１または１０，０００分の１である、シグナル伝達成分を通じたシグナル伝達を結果としてもたらし得る。
【０１６４】
ＣＡＲ媒介性シグナル伝達は、当該技術分野において公知の様々な方法により決定され得る。そのような方法としては、例えば、特定のタンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）のレベル、ホスファチジルイノシトール４，５−ビスリン酸（biphosphate）（ＰＩＰ２）の分解、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）の活性化および細胞内カルシウムイオン濃度の上昇のアッセイといったシグナル伝達のアッセイが挙げられる。Ｔ細胞のクローン拡大増殖、細胞表面上の活性化マーカーの上方調節、エフェクター細胞への分化および細胞傷害またはサイトカイン（例えば、ＩＬ−２）分泌の誘導のような機能的なリードアウトもまた利用され得る。
【０１６５】
Ｔ細胞シグナル伝達の制御
Ｔ細胞活性化の最初のステップは、ＴＣＲによる標的細胞上のペプチドＭＨＣ複合体の認識である。この初期事象は、ＴＣＲ複合体中のＣＤ３−ゼータの細胞質テールとのＬｃｋキナーゼの密接な会合を引き起こす。次いで、Ｌｃｋは、ＣＤ３−ゼータの細胞質テール中の免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）をリン酸化し、ＺＡＰ７０の動員を可能とする。ＺＡＰ７０は、ＴＣＲの係合後のＴ細胞活性化において極めて重要な役割を果たすＳＨ２含有キナーゼである。ＺＡＰ７０中のタンデムなＳＨ２ドメインは、リン酸化されたＣＤ３に結合して、ＺＡＰ７０がリン酸化され、Ｌｃｋまたは他のＺＡＰ７０分子によりトランスで活性化されることを結果としてもたらす。次いで、活性のＺＡＰ７０は、下流の膜タンパク質、その中でも特に重要なものとして活性化Ｔ細胞のリンカー（ＬＡＴ）タンパク質をリン酸化することができる。ＬＡＴはスキャフォールドタンパク質であり、複数の残基におけるそのリン酸化により、ＬＡＴは、Ｇｒｂ２、ＰＬＣ−ｇおよびＧｒａｐなどのいくつもの他のＳＨ２ドメイン含有タンパク質と相互作用することができ、これらのタンパク質は、ＬＡＴにおけるリン酸化ペプチドを認識してＴ細胞活性化シグナルを下流に伝達し、最終的に一連のＴ細胞応答を結果としてもたらす。このプロセスは図７Ａに要約される。
【０１６６】
Ｔ細胞活性化は、速度論的分離またはＴ細胞：標的細胞シナプスにおける分子により制御される。基底状態において、Ｔ細胞膜上のシグナル伝達成分は動的なホメオスタシスにあり、それにより、脱リン酸化されたＩＴＡＭはリン酸化されたＩＴＡＭよりも有利に働く。これは、ｌｃｋのような膜にテザリングされたキナーゼに対して膜貫通ＣＤ４５／ＣＤ１４８ホスファターゼの活性がより大きいことに起因する。Ｔ細胞が同族抗原のＴ細胞受容体（またはＣＡＲ）認識を通じて標的細胞に係合した時に、緊密な免疫学的シナプスが形成される。Ｔ細胞および標的膜のこの密接な並置は、シナプスにフィットし得ないそれらの大きいエクトドメインに起因してＣＤ４５／ＣＤ１４８を除外する。ホスファターゼの非存在下において、シナプスにおける高濃度のＴ細胞受容体会合ＩＴＡＭおよびキナーゼの分離は、リン酸化されたＩＴＡＭが有利に働く状態に繋がる。ＺＡＰ７０は、リン酸化されたＩＴＡＭの閾値を認識し、Ｔ細胞活性化シグナルを伝播する。
【０１６７】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、２Ｂ４またはＢＴＬＡ１のような膜結合型免疫阻害受容体もまたＴ細胞活性化を阻害する。図７Ｂに図式的に示すように、ＰＤ１のような阻害性免疫受容体は、Ｔ細胞活性化プロセスの第１のステップを効果的に逆転させる。ＰＤ１は、ＳＨＰ−１またはＳＨＰ−２のＳＨ２ドメインにより認識されるＩＴＩＭをそのエンドドメイン中に有する。認識されると、ＳＨＰ−１および／またはＳＨＰ−２は膜近傍領域に動員され、その後にそのホスファターゼドメインは、ＩＴＡＭドメインを脱リン酸化して免疫活性化を阻害する。
【０１６８】
ホスファターゼ
シグナル減弱成分のシグナル減弱ドメインは、ＩＴＡＭを脱リン酸化することができるホスファターゼのようなホスファターゼを含み得る。
【０１６９】
シグナル減弱成分のシグナル減弱ドメインは、受容体様チロシンホスファターゼの一部または全体を含み得る。ホスファターゼは、ＰＬＣγ１および／またはＬＡＴのようなＴ細胞シグナル伝達に関与するエレメントのリン酸化および／または機能に干渉し得る。
【０１７０】
シグナル減弱ドメインは、ＣＤ１４８、ＣＤ４５、ＳＨＰ−１またはＳＨＰ−２のようなＴ細胞活性化の制御に関与する１つまたは複数のホスファターゼのホスファターゼドメインを含み得る。
【０１７１】
ＣＤ１４８
ＣＤ１４８は、ＰＬＣγ１およびＬＡＴのリン酸化および機能に干渉することによりＴＣＲシグナル伝達を負に調節する受容体様タンパク質チロシンホスファターゼである。
【０１７２】
ＣＤ１４８のエンドドメインを配列番号４に示す。
【化３】
2020520236.tif 000006
【０１７３】
ＣＤ４５
全ての造血細胞上に存在するＣＤ４５は、これもまたＰＬＣγ１をリン酸化することにより、シグナル伝達および機能的な応答を調節することができるタンパク質チロシンホスファターゼである。
【０１７４】
ＣＤ４５のエンドドメインを配列番号５に示す。
【化４】
2020520236.tif 000007
【０１７５】
ＳＨＰ１／ＳＨＰ２
Ｓｒｃ相同性領域２ドメイン含有ホスファターゼ−１（ＳＨＰ−１、ＰＴＰＮ６としても公知）は、タンパク質チロシンホスファターゼファミリーのメンバーである。
【０１７６】
ＳＨＰ−１のＮ末端領域は、ＰＴＰＮ６とその基質との相互作用を媒介する２つのタンデムなＳＨ２ドメインを含有する。Ｃ末端領域は、チロシン−タンパク質ホスファターゼドメインを含有する。
【０１７７】
ＳＨＰ−１は、ＰＤ１、ＰＤＣＤ１、ＢＴＬＡ４、ＬＩＬＲＢ１、ＬＡＩＲ１、ＣＴＬＡ４、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５、ＫＩＲ３ＤＬ１およびＫＩＲ３ＤＬ３のような多数の阻害性免疫受容体またはＩＴＩＭ含有受容体に結合してそれからのシグナルを伝播することができる。
【０１７８】
ヒトＳＨＰ−１タンパク質はＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ２９３５０を有する。
【０１７９】
ＳＨＰ−１のタンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）ドメインを配列番号６として以下に示す。
【化５】
2020520236.tif 000008
【化６】
2020520236.tif 000009
【０１８０】
ＳＨＰ−２
ＰＴＰＮ１１、ＰＴＰ−１ＤおよびＰＴＰ−２Ｃとしても公知のＳＨＰ−２は、タンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）ファミリーのメンバーである。ＰＴＰＮ６と同様に、ＳＨＰ−２は、そのＮ末端における２つのタンデムなＳＨ２ドメインおよびその後ろのタンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）ドメインからなるドメイン構造を有する。不活性状態において、Ｎ末端ＳＨ２ドメインは、ＰＴＰドメインに結合して活性部位への潜在的な基質の接近を遮断する。したがって、ＳＨＰ−２は自己阻害される。標的ホスホチロシル残基に結合すると、Ｎ末端ＳＨ２ドメインはＰＴＰドメインから解放され、自己阻害を緩和することにより酵素を触媒的に活性化させる。
【０１８１】
ヒトＳＨＰ−２は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ３５２３５−１を有する。
【０１８２】
ＳＨＰ−２のタンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）ドメインを配列番号７として以下に示す。
【化７】
2020520236.tif 000010
【０１８３】
シグナル減弱ドメインは、配列番号４、５、６もしくは７のホスファターゼドメインまたはその改変体を含み得る。改変体は、改変体配列がＣＡＲ媒介性細胞シグナル伝達を減弱させることができる限り、例えば、少なくとも８０、８５、９０、９５、９８または９９％の配列同一性を有し得る。改変体ホスファターゼは、１つまたは複数のＩＴＡＭを脱リン酸化することができるものであり得る。
【０１８４】
免疫調節分子からのエンドドメイン
シグナル減弱成分のシグナル減弱ドメインは、Ｔ細胞シグナル伝達を阻害する免疫調節分子のエンドドメインの全体または部分を含み得る。例えば、シグナル減弱ドメインは、Ｔ細胞活性化を阻害する免疫阻害受容体からのエンドドメインを含み得る。阻害性受容体は、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ  １、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＣＤ３３、ＣＤ３１、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＧＩＴＲまたはＨＶＥＭまたはシグレック−５、６、７、８、９、１０もしくは１１のようなＣＤ２８またはシグレックファミリーのメンバーであり得る。
【０１８５】
シグナル減弱ドメインは、１つまたは複数の免疫受容体チロシン阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含み得る。
【０１８６】
ＩＴＩＭは、免疫系の多くの阻害性受容体の細胞質テールにおいて見出されるアミノ酸の保存された配列（Ｓ／Ｉ／Ｖ／ＬｘＹｘｘＩ／Ｖ／Ｌ）である。ＩＴＩＭ含有阻害性受容体がそれらのリガンドと相互作用した後に、それらのＩＴＩＭモチーフはＳｒｃキナーゼの酵素によりリン酸化される。
【０１８７】
ＰＤ１、ＰＤＣＤ１、ＢＴＬＡ４、ＬＩＬＲＢ１、ＬＡＩＲ１、ＣＴＬＡ４、２Ｂ４、ＧＰ４９Ｂ、Ｐｉｒ−Ｂ、ＰＥＣＡＭ−１、ＣＤ２２、シグレック７、シグレック９、ＫＬＲＧ１、ＩＬＴ２、ＣＤ９４−ＮＫＧ２Ａ、ＣＤ５ならびにＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５、ＫＩＲ３ＤＬ１およびＫＩＲ３ＤＬ３などのキラー阻害受容体ファミリー（ＫＩＲ）のような免疫阻害性受容体は、ＩＴＩＭを含有する。
【０１８８】
シグナル減弱ドメインは、配列番号８〜２４として示す配列のうちの１つまたは複数を含み得る。
【化８】
2020520236.tif 000011
【化９】
2020520236.tif 000012
【化１０】
2020520236.tif 000013
【０１８９】
シグナル減弱ドメインは、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列番号８〜２４として示す配列のうちの１つの改変体を含み得る。改変体配列は、ＳＨＰ−１および／またはＳＨＰ−２を細胞膜に動員することが可能であり得る。改変体配列は、１つまたは複数のＩＴＩＭを含み得る。
【０１９０】
ＣＳＫエンドドメイン
タンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）は、細胞増殖、分化、有糸分裂サイクル、および発がん性形質転換などの様々な細胞プロセスを調節するシグナル伝達分子である。非受容体（または細胞質）ＰＴＫのＮ末端部分は、２つのタンデムなＳｒｃホモログ（ＳＨ２）ドメインを含有し、これらは、タンパク質ホスホチロシン結合ドメインとして作用し、このＰＴＫのその基質との相互作用を媒介する。チロシンプロテインキナーゼはプロテインキナーゼのサブクラスであり、リン酸基がタンパク質上のアミノ酸チロシンに取り付けられる。
【０１９１】
チロシン−プロテインキナーゼＣＳＫ（Ｃ末端Ｓｒｃキナーゼ）は、ＳＲＣ、ＨＣＫ、ＦＹＮ、ＬＹＮおよび特にＬＣＫのようなＳｒｃ−ファミリーキナーゼ（ＳＦＫ）のＣ末端に位置するチロシン残基をリン酸化する酵素である（ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ：Ｐ４１２４０［ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｐ４１２４０］）。ＣＳＫは主に、肺およびマクロファージの他にいくつもの他の組織において発現される。チロシン−キナーゼＣＳＫは主に細胞質中に存在するが、細胞間ジャンクションを作る脂質ラフト中にも見出される。
【０１９２】
ＣＳＫは、５０ｋＤａの分子量を有する非受容体チロシン−プロテインキナーゼである。ＣＳＫは、細胞増殖、分化、遊走および免疫応答の調節において重要な役割を果たす。ＣＳＫは、保存されたＣ末端テール部位におけるファミリーメンバーのリン酸化によりＳＦＫの活性を抑制することにより作用する。
【０１９３】
ＣＳＫは、そのＮ末端においてＳＨ３およびＳＨ２ドメインならびにそのＣ末端においてキナーゼドメインを含有する。一次構造内の機能ドメインのこの配置はＳＦＫのそれに類似しているが、ＣＳＫはＮ末端脂肪酸アシル化部位、活性化ループ中の自己リン酸化部位、およびＣ末端の負の調節部位を欠いており、これらの全ては、ＳＦＫタンパク質の間で保存され、それらの適切な調節のために極めて重要である。活性化ループ中の自己リン酸化の非存在は、ＣＳＫを区別する特徴である。ＣＳＫ構造の最も際立った特徴は、ＳＦＫにおける状況とは異なり、ＳＨ３およびＳＨ２ドメインの結合ポケットが外側に向かって配向しており、他の分子との分子間相互作用を可能とすることである。活性の分子において、ＳＨ２−キナーゼおよびＳＨ２−ＳＨ３リンカーは、活性のコンホメーションを安定化させるためにキナーゼドメインのＮ末端ローブに緊密に結合しており、ＳＨ２ドメインとキナーゼドメインとの間に直接的な連結が存在する。不活性の分子において、ＳＨ２ドメインは、キナーゼドメインへの連結を破壊するように回転している。
【０１９４】
他のキナーゼによりリン酸化されると、Ｓｒｃ−ファミリーメンバーは、ホスホチロシンテールとＳＨ２ドメインとの分子内相互作用において係合し、不活性のコンホメーションを結果としてもたらす。ＳＦＫを阻害するために、ＣＳＫは、膜貫通タンパク質または形質膜の近くに位置するアダプタータンパク質への結合を介して形質膜に動員され、最終的に、不活性のいくつものエフェクター分子をリン酸化し維持することによりＴ細胞受容体（ＴＣＲ）などの様々な表面受容体を通じたシグナル伝達を抑制する。
【０１９５】
Ｃｓｋは膜貫通ドメインおよび脂肪酸アシル修飾を欠いているので、大部分はサイトゾルに存在する一方、その基質ＳＦＫは、それらのＮ末端ミリステートおよびパルミテート部分を介して膜に係留される。したがって、ＳＦＫが活性化される膜へのＣＳＫのトランスロケーションは、ＣＳＫ調節の極めて重要なステップであると考えられている。これまで、例えば、カベオリン−１、パキシリン、Ｄａｂ２、ＶＥ−カドヘリン、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＲ、ＬＩＭＥ、およびＳＩＴ１といったいくつものスカフォールディングタンパク質が、ＣＳＫの膜アンカーの他に、内在性リン酸化タンパク質Ｃｂｐ／ＰＡＧ１（Ｃｓｋ結合タンパク質／スフィンゴ糖脂質に富む膜に会合したリン酸化タンパク質）として同定されてきた。Ｃｂｐは、そのＮ末端において単一の膜貫通ドメインおよび膜貫通ドメインのすぐＣ末端側において２つのパルミトイル修飾部位を有し、それを通じて、Ｃｂｐは排他的に脂質ラフトに局在する。
【０１９６】
ＣＳＫエンドドメインは、ＣＳＫの全て（配列番号２５）またはチロシンキナーゼドメイン（配列番号２６）のみを含み得る。
【化１１】
2020520236.tif 000014
【０１９７】
ＣＳＫエンドドメインは、改変体が、ＣＡＲの付近に置かれた時にＣＡＲによるＴ細胞シグナル伝達を阻害する能力を保持する限り、少なくとも８０％の配列同一性を有する配列番号２５もしくは２６として示す配列またはその部分の改変体を含み得る。
【０１９８】
細胞内シグナル伝達ドメインの除去
シグナル減弱ドメインは、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインの完全または部分的な除去を引き起こすことによりＣＡＲ媒介性のＣＡＲシグナル伝達を妨げ得るか、低減させ得るかまたは遮断し得る。
【０１９９】
例えば、ＳＤＤは、プロテアーゼを含み得、ＣＡＲは、例えば、膜貫通ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとの間に；または細胞内シグナル伝達ドメイン内に、プロテアーゼ切断部位を含み得、それにより、切断は、細胞内シグナル伝達ドメインの細胞シグナル伝達能力を低減させるかまたは除去する。
【０２００】
プロテアーゼドメイン
プロテアーゼドメインは、例えば、特定の認識配列において切断することができる任意のプロテアーゼであり得る。そのため、プロテアーゼドメインは、特定の標的配列における切断を介して単一の標的ポリペプチドを２つの別個のポリペプチドに分離することを可能とする任意のプロテアーゼであり得る。
【０２０１】
プロテアーゼドメインは、タバコエッチウイルス（ＴｅＶ）プロテアーゼドメインであり得る。
【０２０２】
ＴｅＶプロテアーゼは、キモトリプシン様プロテアーゼである高度に配列特異的なシステインプロテアーゼである。それは、その標的切断部位に非常に特異的であり、したがって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方において融合タンパク質の制御された切断のために頻繁に使用される。コンセンサスＴｅＶ切断部位は、ＥＮＬＹＦＱ＼Ｓ（「＼」は切断されるペプチド結合を表す）である。ヒト細胞のような哺乳動物細胞は、内因性のＴｅＶプロテアーゼを発現しない。
【０２０３】
ＴｅＶ切断認識部位を配列番号２７に示す。
【化１２】
2020520236.tif 000015
【０２０４】
ＴｅＶプロテアーゼドメインを配列番号２８に示す。
【化１３】
2020520236.tif 000016
【０２０５】
プロテアーゼドメインは、配列番号２８として示す配列、または配列が効果的なプロテアーゼ機能を提供する限り、少なくとも８０、８５、９０、９５、９８もしくは９９％の配列同一性を有するその改変体であり得るかまたはそれを含み得る。
【０２０６】
二量体化ドメイン
本発明の細胞において、膜テザリング成分は、第１の二量体化ドメインを含み、シグナル減弱成分は、第２の二量体化ドメインを含み、第１および第２の二量体化ドメインは、特異的に会合することができる。
【０２０７】
第１および第２の二量体化ドメインは、相互作用して細胞膜における膜テザリング成分およびシグナル減弱成分の共局在化を結果としてもたらすドメインの任意の組合せであり得る。
【０２０８】
第１および第２の二量体化ドメインは、互いと自発的に二量体化することができるものであり得る。この実施形態では、二量体化は、二量体化の「誘導因子」として作用するいかなる別個の分子を必要とすることなく、第１および第２のヘテロ二量体化ドメイン単独で起こる。
【０２０９】
自発的に二量体化することができる様々な二量体化ドメインが当該技術分野において公知であり、これには、ロイシンジッパー；二量体化およびドッキングドメイン（ＤＤＤ１）およびアンカリングドメイン（ＡＤ１）；細菌リボヌクレアーゼ（バルナーゼ）およびバルンスター（Ｂａｒｎｓｔａｒ）ペプチド；ならびにヒト膵臓リボヌクレアーゼおよびＳ−ペプチドが含まれる。これらの二量体化システムに関するさらなる詳細は、ＷＯ２０１６／１２４９３０に見出すことができる。
【０２１０】
薬剤に媒介される二量体化
第２の実施形態では、第１および第２の二量体化ドメインは、薬剤、すなわち、二量体化の「誘導因子」として作用する別個の分子の存在下でのみ二量体化することができる。
【０２１１】
マクロライドのラパマイシンおよびＦＫ５０６は、細胞タンパク質のヘテロ二量体化を誘導することにより作用する。各薬物は、ＦＫＢＰ１２タンパク質に対して高親和性で結合し、薬物−タンパク質複合体を生成し、これはその後にそれぞれｍＴＯＲ／ＦＲＡＰおよびカルシニューリンに結合して不活性化させる。ｍＴＯＲのＦＫＢＰ−ラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメインは、目的のタンパク質に融合することができる単離された８９アミノ酸のタンパク質部分として定義および適用されている。次いで、ラパマイシンは、ＦＫＢＰ１２またはＦＫＢＰ１２と融合したタンパク質へのＦＲＢの融合物の近似を誘導し得る。
【０２１２】
本発明の文脈において、二量体化ドメインの一方は、ＦＲＢまたはその改変体を含み得、他方の二量体化ドメインは、ＦＫＢＰ１２またはその改変体を含み得る。
【０２１３】
二量体化ドメインは、配列番号２９〜配列番号３３として示す配列の１つであり得るかまたは該配列を含み得る。
【化１４】
2020520236.tif 000017
【化１５】
2020520236.tif 000018
【０２１４】
改変体配列は、配列が効果的な二量体化システムを提供する限り、すなわち、配列が細胞膜における膜テザリング成分およびシグナル減弱成分の共局在化を促進する限り、配列番号２９〜３３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有し得る。
【０２１５】
配列番号３０として示す「野生型」ＦＲＢドメインは、ヒトｍＴＯＲのアミノ酸２０２５〜２１１４を含む。ヒトｍＴＯＲのアミノ酸ナンバリングシステムを使用して、ＦＲＢ配列は、以下の位置：２０９５、２０９８、２１０１の１つまたは複数においてアミノ酸置換を含み得る。
【０２１６】
改変体ＦＲＢは、位置２０９５、２０９８および２１０１において以下のアミノ酸のうちの１つを含み得る：
２０９５：Ｋ、Ｐ、ＴまたはＡ
２０９８：Ｔ、Ｌ、ＨまたはＦ
２１０１：ＷまたはＦ。
【０２１７】
Ｂａｙｌｅら（Chem  Bio；２００６年；１３巻；９９〜１０７頁）は、位置２０９５、２０９８および２１０１におけるアミノ酸にしたがって注釈された以下のＦＲＢ改変体を記載している（表１を参照）：ＫＴＷ、ＰＬＦ、ＫＬＷ、ＰＬＷ、ＴＬＷ、ＡＬＷ、ＰＴＦ、ＡＴＦ、ＴＴＦ、ＫＬＦ、ＰＬＦ、ＴＬＦ、ＡＬＦ、ＫＴＦ、ＫＨＦ、ＫＦＦ、ＫＬＦ。Ｂａｙｌｅらの表１および図５Ａに示されるように、これらの改変体は、異なる程度でラパマイシンおよびラパログに結合することができる。本発明の細胞のＭＴＣまたはＳＤＣは、これらのＦＲＢ改変体のうちの１つを含み得る。
【０２１８】
ラパマイシンが内因性ｍＴＯＲに結合してそれを不活性化することを防止するために、ＦＲＢと接触するラパマイシンの表面を改変することができる。「隆起した」（ｂｕｍｐｅｄ）ラパマイシンを収容する表面（burface）を形成するＦＲＢドメインの補償的な変異は、ＦＲＢ変異体との二量体化相互作用のみを回復させ、内因性のｍＴＯＲタンパク質に対しては回復させない。
【０２１９】
Ｂａｙｌｅら（上記）は、様々なラパマイシンアナログ、または「ラパログ」およびそれらの対応する改変されたＦＲＢ結合ドメインを記載している。例えば、それぞれについて各々の相補的な結合ドメインと組み合わせて図３に示すように、Ｃ−２０−メタアリルラパマイシン（methyllyrlrapamycin）（ＭａＲａｐ）、Ｃ１６（Ｓ）−ブチルスルホンアミドラパマイシン（Ｃ１６−ＢＳ−Ｒａｐ）およびＣ１６−（Ｓ）−７−メチルインドールラパマイシン（ＡＰ２１９７６／Ｃ１６−ＡｉＲａｐ）。他のラパマイシン／ラパログとしては、シロリムスおよびタクロリムスが挙げられる。
【０２２０】
薬剤に破壊される二量体化
第３の実施形態では、第１および第２の二量体化ドメインは、薬剤の非存在下でのみ二量体化することができる。この実施形態では、第１の二量体化ドメインと第２の二量体化ドメインとの二量体化は、薬剤の存在により破壊される。したがって、薬剤は、膜テザリング成分およびシグナル減弱成分が解離することを引き起こす。
【０２２１】
薬剤は、第１の二量体化ドメインと第２の二量体化ドメインとの結合より高い親和性において第１の二量体化ドメインまたは第２の二量体化ドメインに特異的に結合することができる分子、例えば小分子であり得る。
【０２２２】
例えば、結合システムは、ペプチド：ペプチド結合ドメインシステムに基づき得る。第１または第２の結合ドメインは、ペプチド結合ドメインを含み得、他の結合ドメインは、ペプチドより低い親和性でペプチド結合ドメインに結合するペプチド模倣体を含み得る。薬剤としてのペプチドの使用は、競合結合を通じたペプチド結合ドメインへのペプチド模倣体の結合を破壊する。ペプチド模倣体は、「野生型」ペプチドと類似のアミノ酸配列を有し得るが、ペプチド結合ドメインに対する結合親和性を低減させる１つまたは複数のアミノ酸変化を有し得る。
【０２２３】
この実施形態では、薬剤は、第１の結合ドメインと第２の結合ドメインとの間の親和性より少なくとも１０、２０、５０、１００、１０００または１００００倍高い親和性で第１の結合ドメインまたは第２の結合ドメインに結合し得る。
【０２２４】
タンパク質−タンパク質相互作用を破壊する小分子剤は、薬学的な目的のために長い間開発されてきた（Vassilevら；  Small-Molecule  Inhibitors  of  Protein-Protein  Interactions  ＩＳＢＮ：９７８−３−６４２−１７０８２−９により総説されている）。その相互作用が破壊されるタンパク質またはペプチド（またはこれらのタンパク質の関連する断片）は、第１および／または第２の二量体化ドメインとして使用することができ、小分子は、薬剤として使用され得る。
【０２２５】
小分子のような薬剤を使用してその相互作用が破壊可能なタンパク質／ペプチドのリストを表２に与える。これらの議論され得るタンパク質−タンパク質相互作用（ＰＰＩ）は、本発明の減弱可能なＣＡＲシステムにおいて使用され得る。これらのＰＰＩに関するさらなる情報は、Whiteら、２００８年（Expert  Rev.  Mol.  Med.  １０巻：ｅ８）から入手可能である。
【表２】
2020520236.tif 000019
【０２２６】
Ｔｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）システム
例えば、Ｔｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）、ＴｅｔＲ相互作用タンパク質（ＴｉＰ）、テトラサイクリンシステムといった、ペプチドの共局在化を制御するための他の小分子システムが当該技術分野において公知である。
【０２２７】
Ｔｅｔオペロンは、哺乳動物細胞において使用するために適応されてきた周知の生物学的オペロンである。ＴｅｔＲは、ホモ二量体としてテトラサイクリンに結合し、次いでＴｅｔＲ分子のＤＮＡ結合をモジュレートするコンホメーション変化を起こす。Klotzscheら（上記）は、ＴｅｔＲを活性化させるファージディスプレイ由来のペプチドを記載している。このタンパク質（ＴｅｔＲ相互作用タンパク質／ＴｉＰ）は、テトラサイクリン結合部位と重なり合うが同一ではないＴｅｔＲ中の結合部位を有する。したがって、ＴｉＰおよびテトラサイクリンは、ＴｅｔＲの結合について競合する。
【０２２８】
本発明の細胞において、膜テザリング成分の第１の二量体化ドメインは、ＴｅｔＲまたはＴｉＰであり得、シグナル減弱成分の第２の二量体化ドメインは、対応する相補的な結合パートナーであり得る。
【０２２９】
ＴｅｔＲおよびＴＩＰのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号３４または配列番号３５として以下に示す。
【化１６】
2020520236.tif 000020
【０２３０】
第１および第２の二量体化ドメインがＴｅｔＲまたはＴｉＰである場合、薬剤は、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリンまたはこれらのアナログであり得る。アナログは、ＴｅｔＲに特異的に結合する能力を保持するテトラサイクリン、ドキシサイクリンまたはミノサイクリンの改変体を指す。
【０２３１】
ストレプトアビジン結合エピトープ
第１または第２の二量体化ドメインは、１つまたは複数のストレプトアビジン結合エピトープを含み得る。他の結合ドメインは、ビオチン模倣体を含み得る。
【０２３２】
ストレプトアビジンは、細菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｉｄｉｎｉｉからの５２．８ｋＤａのタンパク質である。ストレプトアビジンホモ四量体は、約１０−１５Ｍの解離定数（Ｋｄ）を有してビオチン（ビタミンＢ７またはビタミンＨ）に対して非常に高い親和性を有する。ビオチン模倣体は、野生型ビオチンよりストレプトアビジンに対して低い親和性を有するため、ビオチン自体を、ストレプトアビジンドメインとビオチン模倣体ドメインとのヘテロ二量体化を破壊または防止するための薬剤として使用することができる。ビオチン模倣体は、例えば１ｎＭ〜１００ｕＭのＫｄでストレプトアビジンに結合し得る。
【０２３３】
「ビオチン模倣体」ドメインは、例えば、ストレプトアビジンに特異的に結合する短いペプチド配列（例えば、６〜２０、６〜１８、８〜１８または８〜１５アミノ酸）を含み得る。
【０２３４】
ビオチン模倣体は、表１に示すような配列を含み得る。
【表１Ｂ】
2020520236.tif 000021
【０２３５】
ビオチン模倣体は、以下の群：ＳｔｒｅｐｔａｇＩＩ、Ｆｌａｎｋｅｄｃｃｓｔｒｅｐｔａｇおよびｃｃｓｔｒｅｐｔａｇから選択され得る。
【０２３６】
ストレプトアビジンドメインは、配列番号４３として示す配列を有するストレプトアビジンまたはビオチンに結合する能力を保持するその断片もしくは改変体を含み得る。
【０２３７】
全長ストレプトアビジンは１５９アミノ酸を有する。１５９残基の全長タンパク質のＮおよびＣ末端はプロセシングされて、通常、残基１３〜１３９から構成されるより短い「コア」ストレプトアビジンを与え、ＮおよびＣ末端の除去が高いビオチン結合親和性のために必要である。
【０２３８】
「コア」ストレプトアビジン（残基１３〜１３９）の配列を配列番号４３として示す。
【化１７】
2020520236.tif 000022
【０２３９】
ストレプトアビジンは、生来、ホモ四量体として存在する。ストレプトアビジン単量体の二次構造は、フォールディングして逆平行ベータバレル三次構造を与える８つの逆平行βストランドから構成される。ビオチン結合部位は、各β−バレルの１つの末端に位置する。４つの同一のストレプトアビジン単量体（すなわち、４つの同一のβ−バレル）は会合して、ストレプトアビジンの四量体四次構造を与える。各バレル中のビオチン結合部位は、隣り合うサブユニットからの保存されたＴｒｐ１２０と共に、バレルの内側からの残基からなる。このようにして、各サブユニットは、隣り合うサブユニット上の結合部位に寄与するので、四量体はまた、機能的な二量体の二量体と考えることができる。
【０２４０】
ストレプトアビジンドメインは、ストレプトアビジン単量体、二量体または四量体から本質的になるものであり得る。
【０２４１】
改変体ストレプトアビジン配列は、配列番号４３またはその機能的な部分に対して少なくとも７０、８０、９０、９５または９９％の同一性を有し得る。改変体ストレプトアビジンは、ビオチン結合に関与する以下のアミノ酸のうちの１つまたは複数を含み得る：残基Ａｓｎ２３、Ｔｙｒ４３、Ｓｅｒ２７、Ｓｅｒ４５、Ａｓｎ４９、Ｓｅｒ８８、Ｔｈｒ９０およびＡｓｐ１２８。改変体ストレプトアビジンは、例えば、これらの残基の８つ全てを含み得る。改変体ストレプトアビジンが二量体または四量体として結合ドメイン中に存在する場合、それはまた、隣り合うサブユニットによるビオチン結合に関与するＴｒｐ１２０を含み得る。
【０２４２】
不安定化ドメイン
シグナル減弱成分はまた、不安定化ドメインを含む。タンパク質中の不安定化ドメインの存在は、タンパク質の安定性が小分子のような薬剤の存在に依存することを意味する。薬剤が存在する時にドメインは安定化され、タンパク質は正常なものとして発現される。薬剤の非存在下で、ドメインは不安定であり、タンパク質が不安定となることを引き起こし、それにより、それは崩壊し、かつ／または分解される。
【０２４３】
不安定化ドメインは、ＦＫ５０６−ラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメインの分解しやすい変異体を含み得る。例えば、Ｔ２０９８Ｌ点変異を有するＦＲＢは、ラパマイシンの非存在下で不安定であるが、ラパマイシンを加えた時に安定である。
【０２４４】
本発明のＳＤＣは、Stankunasら（２００７年；ChemBioChem、８巻：１１６２〜１１６９頁）に記載される変異体の１つのようなＦＲＢの分解しやすい変異体である不安定化ドメインを含み得る。
【０２４５】
不安定化ドメインは、配列番号５７として示すアミノ酸配列を含み得る。
【化１８】
2020520236.tif 000023
【０２４６】
発現されると分解されるＦＫＢＰ１２の変異体バージョンもまた記載されている（Banaszynskiら（２００６年）、Cell  １２６巻：９９５〜１００４頁）。不安定化ドメインに結合する合成リガンドの添加は、それを分解から保護し、不安定化ドメインを含むタンパク質が発現されることを可能とする。
【０２４７】
不安定化ドメインは、以下の点変異：Ｆ１５Ｓ、Ｖ２４Ａ、Ｈ２５Ｒ、Ｅ６０Ｇ、Ｌ１０６Ｐのうちの１つを有する配列番号５８として示すＦＫＢＰ１２  Ｆ３６Ｖ配列の変異体を含み得る。
【化１９】
2020520236.tif 000024
【０２４８】
不安定化ドメインは、配列番号５９として示すアミノ酸配列を有するＦＫＢＰ１２  Ｌ１０６Ｐを含み得る。
【化２０】
2020520236.tif 000025
【０２４９】
ＦＫＰＢ１２の変異体バージョンを安定化させるリガンドは、カルボン酸がモルホリン基で置き換えられたＳＬＦ＊の誘導体である。この分子は、モルホリン含有リガンドＳｈｉｅｌｄ−１（Ｓｈｌｄ１）として公知である（上記のBanaszynskiら（２００６年））。
【０２５０】
Ｅ．ｃｏｌｉジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｅｃＤＨＦＲ）の変異体もまた、分解されるように操作されており、この不安定化ドメインを目的のタンパク質に融合させた時に、融合したタンパク質にその不安定性が付与されて、融合タンパク質全体の迅速な分解を結果としてもたらすことが示されている（Iwamotoら（２０１０年）、１７巻：９８１〜９８８頁）。小分子リガンドのトリメトプリム（ＴＭＰ）は、迅速、可逆的、および用量依存的な様式で不安定化ドメインを安定化させ、ＴＭＰの非存在下でのタンパク質レベルはほとんど検出不能であることが示された。
【０２５１】
本発明のＳＤＣは、ＤＨＦＲ  Ｆ１０３Ｌ；Ｒ１２Ｙ／Ｙ１００ＩまたはＮ１８Ｔ／Ａ１９Ｖのような変異体ＤＨＦＲ配列を含み得る。
【０２５２】
核酸構築物
本発明は、上記に定義されるようなキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）；膜テザリング成分（ＭＴＣ）；およびシグナル減弱成分（ＳＤＣ）のうちの１つまたは複数をコードする核酸配列を提供する。
【０２５３】
ＣＡＲをコードする核酸配列は、以下の構造を有し得る：
ＡｇＢ−スペーサー−ＴＭ−ｅｎｄｏ
（ＡｇＢは、抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
スペーサーは、スペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ１は、膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
ｅｎｄｏは、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列である。）
【０２５４】
膜テザリング成分をコードする核酸は、以下の構造を有し得る：
ＭＬＤ−ＤＤ１；または
ＤＤ１−ＭＬＤ
（ＭＬＤは、膜局在化ドメインをコードする核酸配列であり；
ＤＤ１は、第１の二量体化ドメインをコードする核酸配列である。）
【０２５５】
シグナル減弱成分をコードする核酸配列は、以下の構造を有し得る：
ＳＤＤ−ＤＤ２；または
ＤＤ２−ＳＤＤ
（ＳＤＤは、シグナル減弱ドメインをコードする核酸配列であり；
ＤＤ２は、第２の二量体化ドメインをコードする核酸配列である。）
【０２５６】
本発明は、
（ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第１の核酸配列；
（ｉｉ）膜テザリング成分（ＭＴＣ）をコードする第２の核酸配列；および
（ｉｉｉ）シグナル減弱成分（ＳＤＣ）をコードする第３の核酸配列
を含む、核酸構築物を提供する。
【０２５７】
第１、第２および第３の核酸配列は、構築物中に任意の順序、すなわち：
ＣＡＲ−ＭＴＣ−ＳＤＣ；
ＣＡＲ−ＳＤＣ−ＭＴＣ；
ＭＴＣ−ＣＡＲ−ＳＤＣ；
ＭＴＣ−ＳＤＣ−ＣＡＲ；
ＳＤＣ−ＣＡＲ−ＭＴＣ；または
ＳＤＣ−ＭＴＣ−ＣＡＲ
で存在してよい。
【０２５８】
構築物中、核酸配列は、別個のポリペプチドとしてＣＡＲ、ＭＴＣおよびＳＤＣの共発現を可能とする配列により接続され得る。例えば、核酸は、成分のうちの２つの間の切断部位；または２つの切断部位をコードして、別個のポリペプチドとしての３つ全ての成分の製造を可能とし得る。切断部位は、複合ポリペプチドが製造された時に、いかなる外的な切断活性も必要とせずにそれが別個の成分に直ちに切断されるように、自己切断性であり得る。
【０２５９】
以下の配列：
【化２１】
2020520236.tif 000026
または
【化２２】
2020520236.tif 000027
のうちの１つを有し得る口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２ａ自己切断性ペプチドなどの様々な自己切断性部位が公知である。
【０２６０】
共発現配列は、内部リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）であり得る。共発現配列は、内部プロモーターであり得る。
【０２６１】
核酸構築物は、例えば、以下をコードし得る：
ＳＦＧｍＲ．Ｖ５＿タグ−ＣＤ２２（２Ｉｇ）−ＣＤ１９ｔｍ−ＲＬ−ＦＲＢ−２Ａ−ＦＫＢＰ１２−Ｌ−ＣＤ１４８ｅｎｄｏ−２Ａ−ＣＡＲ
（「ＳＦＧｍＲ」は、配列：
【化２３】
2020520236.tif 000028
を有するマウスＩｇカッパ鎖Ｖ−ＩＩＩ領域に由来するシグナルペプチドであり；
「Ｖ５＿タグ−」は、配列：
【化２４】
2020520236.tif 000029
を有するリンカー−Ｖ５タグ−リンカーであり；
「ＣＤ２２（２Ｉｇ）」は、配列：
【化２５】
2020520236.tif 000030
を有する、ヒトＣＤ２２からの２つの最も膜に近位のＩｇドメインであり；
「ＣＤ１９ｔｍ」は、配列：
【化２６】
2020520236.tif 000031
を有するＣＤ１９膜貫通配列および切断型ＣＤ１９エンドドメインを含む配列であり；
「ＲＬ」は、配列：
【化２７】
2020520236.tif 000032
を有する剛性リンカーであり；
「ＦＲＢ」は、配列：
【化２８】
2020520236.tif 000033
を有するＦＲＢドメインであり；
「２Ａ」は、配列：
【化２９】
2020520236.tif 000034
を有するＦＭＤＶ  ２Ａペプチドであり；
「ＦＫＢＰ１２」は、配列：
【化３０】
2020520236.tif 000035
を有するＦＫＢＰ１２ドメインであり；
「Ｌ」は、配列：
【化３１】
2020520236.tif 000036
を有するリンカーであり；
「ＣＤ１４８ｅｎｄｏ」は、配列：
【化３２】
2020520236.tif 000037
を有するＣＤ１４８エンドドメインであり；
「２Ａ」は、配列：
【化３３】
2020520236.tif 000038
を有するＦＭＤＶ  ２Ａペプチドであり；
「ＣＡＲ」は、ＣＤ２８−ゼータエンドドメインを有する第二世代抗ＣＤ１９  ＣＡＲであり、ＣＡＲは、配列：
【化３４】
2020520236.tif 000039
【化３５】
2020520236.tif 000040
を有する。）
【０２６２】
この構築物が細胞中で発現される場合、ＦＫＢＰ１２含有シグナル減弱成分とのＦＲＢ含有膜テザリング成分の二量体化を誘導するためにラパマイシンまたはそのアナログを使用して、ＣＡＲ媒介性細胞シグナル伝達の減弱を引き起こすことができる（図３を参照）。
【０２６３】
代替的な例として、核酸構築物は、以下をコードし得る：
ＳＦＧ．ＴＩＰ−Ｌ（１６ａａ）−ＣＤ１４８ｅｎｄｏ−２Ａ−Ｖ５−タグ−ＣＤ２２（２Ｉｇ）−ＣＤ１９ｔｍ−ＲＬ−ＴｅｔＲＢ−２Ａ−ＣＡＲ
（「ＳＦＧ」は、配列：
【化３６】
2020520236.tif 000041
を有するマウスＩｇカッパ鎖Ｖ−ＩＩＩ領域に由来するシグナルペプチドであり；
「ＴＩＰ」は、配列：
【化３７】
2020520236.tif 000042
を有するＴｅｔＲ相互作用ペプチドであり；
「Ｌ」は、配列：
【化３８】
2020520236.tif 000043
を有するリンカーであり；
「ＣＤ１４８ｅｎｄｏ」は、配列：
【化３９】
2020520236.tif 000044
を有するＣＤ１４８エンドドメインであり；
「２Ａ」は、配列：
【化４０】
2020520236.tif 000045
を有するＦＭＤＶ  ２Ａペプチドであり；
「Ｖ５＿タグ−」は、配列：
【化４１】
2020520236.tif 000046
を有するリンカー−Ｖ５タグ−リンカーであり；
「ＣＤ２２（２Ｉｇ）」は、配列：
【化４２】
2020520236.tif 000047
を有する、ヒトＣＤ２２からの２つの最も膜に近位のＩｇドメインであり；
「ＣＤ１９ｔｍ」は、配列：
【化４３】
2020520236.tif 000048
を有するＣＤ１９膜貫通配列および切断型ＣＤ１９エンドドメインを含む配列であり；
「ＲＬ」は、配列：
【化４４】
2020520236.tif 000049
を有する剛性リンカーであり；
ＴｅｔＲＢは、配列：
【化４５】
2020520236.tif 000050
を有するＴｅｔリプレッサーＢタンパク質であり；
「２Ａ」は、配列：
【化４６】
2020520236.tif 000051
を有するＦＭＤＶ  ２Ａペプチドであり；
「ＣＡＲ」は、ＣＤ２８−ゼータエンドドメインを有する第二世代抗ＣＤ１９  ＣＡＲであり、ＣＡＲは、配列：
【化４７】
2020520236.tif 000052
【化４８】
2020520236.tif 000053
を有する。）
【０２６４】
この構築物が細胞中で発現される場合、ＴｉＰ含有シグナル減弱成分とのＴｅｔＲＢ含有膜テザリング成分の二量体化を破壊するためにテトラサイクリンまたはそのアナログを使用することができる。これは、シグナル減弱ドメインの減弱効果からＣＡＲを解放し、すなわち、ＣＡＲ媒介性シグナル伝達が起こり得る（図４〜６を参照）。
【０２６５】
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、および「核酸」という用語は、互いに同義であることが意図される。
【０２６６】
多数の異なるポリヌクレオチドおよび核酸が、遺伝コードの縮重の結果として同じポリペプチドをコードできることが当業者により理解されるであろう。加えて、当業者は、常用の技術を使用して、ポリペプチドが発現される任意の特定の宿主生物のコドン使用を反映するように本明細書に記載されるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド配列に影響しないヌクレオチド置換を行ってもよいことが理解されるべきである。
【０２６７】
本発明による核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含み得る。それらは、一本鎖または二本鎖であり得る。それらはまた、それらの中に合成または修飾ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであり得る。オリゴヌクレオチドに対する多数の異なる種類の修飾が当該技術分野において公知である。これらとしては、メチルホスホネートおよびホスホロチオエート骨格、分子の３’および／または５’末端におけるアクリジンまたはポリリジン鎖の付加が挙げられる。本明細書に記載される使用の目的のために、ポリヌクレオチドは、当該技術分野において利用可能な任意の方法により修飾され得ることが理解されるべきである。そのような修飾は、目的のポリヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏでの活性または寿命を増進させるために実行され得る。
【０２６８】
ヌクレオチド配列に関する「改変体」、「ホモログ」または「誘導体」という用語は、配列の１つ（または複数）の核酸に対する任意の置換、バリエーション、修飾、置換え、欠失または付加を含む。
【０２６９】
本発明はまた、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第１の核酸配列；膜テザリング成分（ＭＴＣ）をコードする第２の核酸配列；およびシグナル減弱成分（ＳＤＣ）をコードする第３の核酸配列を含む、キットを提供する。
【０２７０】
ベクター
本発明はまた、本発明の１つまたは複数の核酸配列を含むベクター、またはベクターのキットを提供する。そのようなベクターは、宿主細胞が上記に定義されるようなＣＡＲ、ＭＴＣおよび／またはＳＤＣを発現するように宿主細胞中に核酸配列を導入するために使用され得る。
【０２７１】
ベクターは、例えば、プラスミドまたはウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクターもしくはレンチウイルスベクター、またはトランスポゾンベースのベクターまたは合成ｍＲＮＡであり得る。
【０２７２】
ベクターは、Ｔ細胞またはＮＫ細胞をトランスフェクトまたは形質導入することができるものであり得る。
【０２７３】
細胞
本発明は、減弱可能なＣＡＲシステムを含む細胞に関する。
【０２７４】
細胞は、本発明の核酸またはベクターを含み得る。
【０２７５】
細胞は、細胞溶解性免疫細胞のような免疫細胞であり得る。細胞溶解性免疫細胞は、細胞媒介性の免疫において中心的役割を果たすリンパ球の一種であるＴ細胞またはＴリンパ球であり得る。それらは、細胞表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の存在によりＢ細胞およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）のような他のリンパ球から区別され得る。以下に要約するように、様々な種類のＴ細胞が存在する。
【０２７６】
ヘルパーＴヘルパー細胞（ＴＨ細胞）は、形質細胞およびメモリーＢ細胞へのＢ細胞の成熟、ならびに細胞傷害性Ｔ細胞およびマクロファージの活性化などの免疫学的プロセスにおいて他の白血球を補助する。ＴＨ細胞は、それらの表面上にＣＤ４を発現する。ＴＨ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上のＭＨＣクラスＩＩ分子によりペプチド抗原を提示された時に活性化される。これらの細胞は、異なるサイトカインを分泌して異なる種類の免疫応答を促進するＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ３、ＴＨ１７、Ｔｈ９、またはＴＦＨなどのいくつものサブタイプのうちの１つに分化することができる。
【０２７７】
細胞溶解性Ｔ細胞（ＴＣ細胞、またはＣＴＬ）は、ウイルス感染した細胞および腫瘍細胞を破壊し、移植拒絶にも関与する。ＣＴＬは、それらの表面においてＣＤ８を発現する。これらの細胞は、全ての有核細胞の表面上に存在するＭＨＣクラスＩと関連付けられる抗原に結合することによりそれらの標的を認識する。制御性Ｔ細胞により分泌されるＩＬ−１０、アデノシンおよび他の分子を通じて、ＣＤ８＋細胞はアネルギー状態まで不活性化されることができ、それにより、実験的自己免疫性脳脊髄炎のような自己免疫疾患が予防される。
【０２７８】
メモリーＴ細胞は、感染が消散した後に長期間持続する抗原特異的Ｔ細胞のサブセットである。それらは、それらの同族抗原に再曝露されると多数のエフェクターＴ細胞に急速に拡大増殖し、したがって、過去の感染に対する「記憶」を有する免疫系を提供する。メモリーＴ細胞は、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ細胞）および２種類のエフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ細胞およびＴＥＭＲＡ細胞）という３つのサブタイプを含む。メモリー細胞は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋のいずれかであり得る。メモリーＴ細胞は、典型的に、細胞表面タンパク質ＣＤ４５ＲＯを発現する。
【０２７９】
かつてはサプレッサーＴ細胞として公知であった制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）は、免疫学的寛容の維持のために極めて重要である。それらの大きな役割は、免疫反応の終わりに向けてＴ細胞媒介性の免疫をシャットダウンすることおよび胸腺における陰性選択のプロセスを免れた自己反応性Ｔ細胞を抑制することである。
【０２８０】
天然に存在するＴｒｅｇ細胞および適応Ｔｒｅｇ細胞という２つの主要なクラスのＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞が記載されている。
【０２８１】
天然に存在するＴｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞としても公知）は、胸腺において生じ、ＴＳＬＰで活性化された骨髄性（ＣＤ１１ｃ＋）および形質細胞様（ＣＤ１２３＋）の両方の樹状細胞との発生するＴ細胞の相互作用に関連付けられている。天然に存在するＴｒｅｇ細胞は、ＦｏｘＰ３と呼ばれる細胞内分子の存在により他のＴ細胞から区別することができる。ＦＯＸＰ３遺伝子の変異は、制御性Ｔ細胞の発生を防止することがあり、致死性の自己免疫疾患ＩＰＥＸを引き起こし得る。
【０２８２】
適応Ｔｒｅｇ細胞（Ｔｒ１細胞またはＴｈ３細胞としても公知）は、正常な免疫応答の間に生じ得る。
【０２８３】
ナチュラルキラー細胞（またはＮＫ細胞）は、自然免疫系の部分を形成する細胞溶解性細胞の一種である。ＮＫ細胞は、ＭＨＣと独立した様式でウイルス感染した細胞からの先天的なシグナルに対する迅速な応答を提供する。
【０２８４】
ＮＫ細胞（先天的なリンパ系細胞の群に属する）は、大顆粒リンパ球（ＬＧＬ）として定義され、ＢおよびＴリンパ球を生成する共通のリンパ系前駆体から分化した３つ目の種類の細胞を構成する。ＮＫ細胞は、骨髄、リンパ節、脾臓、扁桃および胸腺において分化および成熟し、その後に循環に入ることが公知である。
【０２８５】
本発明のＣＡＲ発現細胞は、上記した細胞種のいずれかであり得る。
【０２８６】
ＴまたはＮＫ細胞のようなＣＡＲ発現細胞は、患者自身の末梢血から（ファーストパーティー）、またはドナー末梢血からの造血幹細胞移植の状況のいずれかで（セカンドパーティー）作製されるか、または繋がりのないドナーからの末梢血から（サードパーティー）ｅｘ  ｖｉｖｏで作製されるかのいずれであってもよい。
【０２８７】
あるいは、ＣＡＲ発現細胞は、誘導前駆細胞または胚性前駆細胞のＴ細胞へのｅｘ  ｖｉｖｏ分化に由来し得る。あるいは、溶解機能を保持し、治療剤として作用し得る不死化されたＴ細胞株が使用され得る。
【０２８８】
全てのこれらの実施形態では、ＣＡＲ細胞は、ウイルスベクターを用いる形質導入、ＤＮＡまたはＲＮＡを用いるトランスフェクションなどの多くの手段のうちの１つにより受容体成分およびシグナル伝達成分をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを導入することにより生成される。
【０２８９】
本発明のＣＡＲ細胞は、被験体からのｅｘ  ｖｉｖｏのＴまたはＮＫ細胞であり得る。ＴまたはＮＫ細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）試料からのものであり得る。ＴまたはＮＫ細胞は、本発明の第１の態様によるＣＡＲシステムを提供する分子をコードする核酸で形質導入される前に、例えば、抗ＣＤ３モノクローナル抗体を用いる処理により、活性化および／または拡大増殖され得る。
【０２９０】
本発明の細胞は、
（ｉ）上記にリストされる被験体または他の供給源からの細胞含有試料を単離するステップ；および
（ｉｉ）上記に定義されるような１つまたは複数の核酸配列または核酸構築物で、細胞を形質導入またはトランスフェクトするステップ
により製造され得る。
【０２９１】
次いで、細胞は、精製され、例えば、抗原結合ポリペプチドの抗原結合ドメインの発現に基づいて選択され得る。
【０２９２】
医薬組成物
本発明はまた、本発明の複数の細胞を含有する医薬組成物に関する。医薬組成物は、追加的に、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含み得る。医薬組成物は、必要に応じて、１つまたは複数のさらなる薬学的に活性のポリペプチドおよび／または化合物を含み得る。そのような処方物は、例えば、静脈内注入のために好適な形態であり得る。
【０２９３】
処置方法
本発明は、（例えば、上記されるような医薬組成物中の）本発明の細胞を被験体に投与するステップを含む、疾患を処置および／または予防するための方法を提供する。
【０２９４】
疾患を処置するための方法は、本発明の細胞の処置的使用に関する。これに関して、細胞は、疾患と関連付けられる少なくとも１つの症状を減少させ、低減させもしくは改善するためおよび／または疾患の進行を減速させ、低減させもしくは遮断するために既存の疾患または状態を有する被験体に投与され得る。
【０２９５】
疾患を予防するための方法は、本発明の細胞の予防的使用に関する。これに関して、細胞は、疾患の原因を予防しもしくは損なわせるためまたは疾患と関連付けられる少なくとも１つの症状の発症を低減もしくは予防するために疾患にまだかかっていない、かつ／または疾患のいかなる症状も示していない被験体に投与され得る。被験体は、疾患の素因を有し得るか、または疾患を発症するリスクがあると考えられる被験体であり得る。
【０２９６】
方法は、
（ｉ）細胞含有試料を単離するステップ；
（ｉｉ）そのような細胞を、本発明により提供される核酸配列またはベクターで形質導入またはトランスフェクトするステップ；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）からの細胞を被験体に投与するステップ
を伴い得る。
【０２９７】
疾患を処置するための本発明により提供される方法は、疾患の進行および任意の毒性の活性をモニターすることならびに薬剤を投与または除去してＣＡＲシグナル伝達を阻害し、それにより任意の有害な毒性効果を低減または減少させることを伴い得る。
【０２９８】
疾患を処置するための本発明により提供される方法は、疾患の進行をモニターすることおよび任意の毒性の活性をモニターすることならびに被験体に投与される薬剤の用量を調整して疾患進行および毒性の活性の許容されるレベルを提供することを伴い得る。
【０２９９】
疾患の進行をモニターすることは、疾患と関連付けられる症状を経時的に評価して、それらが低減／改善または増加／悪化しているかどうかを決定することを意味する。
【０３００】
本発明はまた、第１および第２の二量体化ドメインの結合または解離を制御する薬剤を被験体に投与するステップを含む、被験体において本発明の細胞の活性化を制御するための方法を提供する。
【０３０１】
本発明はまた、第１および第２の結合ドメインの結合を誘導する薬剤を被験体に投与するステップを含む、本発明の細胞を含む被験体においてＣＡＲ関連毒性を処置するための方法を提供する。
【０３０２】
毒性の活性は、本発明のＣＡＲ細胞の被験体への投与後の該細胞により引き起こされる有害効果に関する。毒性の活性としては、例えば、免疫学的毒性、胆汁毒性および呼吸窮迫症候群、サイトカイン放出症候群、マクロファージ活性化症候群、または神経毒性を挙げることができる。
【０３０３】
ＣＡＲを通じたシグナル伝達のレベルおよびしたがってＣＡＲ発現細胞の活性化のレベルは、存在する薬剤の量、または薬剤が存在する時間の量を変化させることにより調整され得る。
【０３０４】
薬剤がＳＤＣとＭＴＣとの二量体化を誘導する場合、ＣＡＲ細胞活性化のレベルは、被験体に投与される薬剤の用量を減少させることまたはその投与の頻度を減少させることにより増大し得る。反対に、ＣＡＲ細胞活性化のレベルは、薬剤の用量、または被験体への投与の頻度を増加させることにより低減され得る。
【０３０５】
薬剤がＳＤＣとＭＴＣとの二量体化を破壊する場合、ＣＡＲ細胞活性化のレベルは、被験体に投与される薬剤の用量を増加させることまたはその投与の頻度を増加させることにより増大し得る。反対に、ＣＡＲ細胞活性化のレベルは、薬剤の用量、または被験体への投与の頻度を減少させることにより低減され得る。
【０３０６】
より高レベルのＣＡＲ細胞活性化は、低減された疾患進行であるが、増加した毒性の活性と関連付けられる可能性がある一方、より低レベルのＣＡＲ細胞活性化は、増加した疾患進行であるが、低減された毒性の活性と関連付けられる可能性がある。
【０３０７】
本発明はまた、薬剤を被験体に投与するステップを含む、本発明の細胞を含む被験体において疾患を処置および／または予防するための方法を提供する。そのため、この方法は、好適な薬剤を本発明のＣＡＲ発現細胞を既に含む被験体に投与することを伴う。
【０３０８】
そのため、被験体に投与される薬剤の用量、または投与の頻度は、許容されるレベルの疾患進行および毒性の活性の両方を提供するために変更され得る。「許容される」と決定される疾患進行および毒性の活性の具体的なレベルは、具体的な状況にしたがって異なり、そのような基準に基づいて評価されるべきである。本発明は、この適切なレベルを達成するために細胞中のＣＡＲの活性化レベルを変化させる方法を提供する。
【０３０９】
薬剤は、医薬組成物の形態で投与され得る。医薬組成物は、追加的に、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含み得る。医薬組成物は、必要に応じて、１つまたは複数のさらなる薬学的に活性のポリペプチドおよび／または化合物を含み得る。そのような処方物は、例えば、静脈内注入のために好適な形態であり得る。
【０３１０】
本発明は、疾患の処置および／または予防において使用するための、本発明のＣＡＲ細胞を提供する。
【０３１１】
本発明はまた、疾患の処置および／または予防のための医薬の製造における、本発明のＣＡＲ細胞の使用に関する。
【０３１２】
本発明はまた、疾患の処置および／または予防において使用するための、本発明による細胞におけるＣＡＲ媒介性シグナル伝達を減弱させるための薬剤を提供する。
【０３１３】
本発明はまた、疾患の処置および／または予防において使用するための、本発明による細胞におけるＣＡＲ媒介性シグナル伝達の減弱を低減または除去するための薬剤を提供する。
【０３１４】
本発明はまた、本発明による細胞におけるＣＡＲ媒介性シグナル伝達の減弱において使用するための薬剤を提供する。
【０３１５】
本発明はまた、本発明による細胞におけるＣＡＲ媒介性シグナル伝達の減弱の低減または除去において使用するための薬剤を提供する。
【０３１６】
本発明の方法により処置および／または予防される疾患は、ウイルス感染症のような感染症であり得る。
【０３１７】
本発明の方法はまた、例えば、自己免疫疾患、アレルギーおよび移植片対宿主拒絶における、病原性免疫応答の制御のためのものであり得る。
【０３１８】
方法は、膀胱がん、乳がん、結腸がん、子宮内膜がん、腎臓がん（腎臓細胞）、白血病、肺がん、黒色腫、非ホジキンリンパ腫、膵臓がん、前立腺がんおよび甲状腺がんのようながん性疾患の処置のためのものであり得る。
【０３１９】
本発明をこれより実施例によりさらに説明し、実施例は、当業者による本発明の実行を補助するために役立つことを目的とし、いかなる意味でも本発明の範囲を限定することを意図しない。
【実施例】
【０３２０】
（実施例１  ラパ−オフ（Ｒａｐａ−Ｏｆｆ）減弱システムの機能性）
３シストロン性の構築物を、構造：
ＳＦＧｍＲ．Ｖ５＿タグ−ＣＤ２２（２Ｉｇ）−ＣＤ１９ｔｍ−ＲＬ−ＦＲＢ−２Ａ−ＦＫＢＰ１２−Ｌ−ＣＤ１４８ｅｎｄｏ−２Ａ−ＣＡＲ
を有する単一の転写物として発現させる。
【０３２１】
これは２Ａ部位において、ＦＫＢＰ１２含有シグナル減弱成分、膜貫通ドメインおよび細胞内ＦＲＢドメインを含む膜テザリング成分、ならびに抗ＣＤ１９第二世代ＣＡＲに自己切断する。
【０３２２】
構築物をＢＷ５細胞中で発現させる。ＳｕｐＴ１細胞（ＣＤ１９陰性）を操作してＣＤ１９陽性とし、可能な限り類似した標的陰性細胞株および標的陽性細胞株を得る。３人のドナーからの初代ヒトＴ細胞に２つのＣＡＲ構築物：（ｉ）「古典的」な抗ＣＤ１９  ＣＡＲ；（ｉｉ）上記した３シストロン性の「減弱可能」なＣＤ１９  ＣＡＲシステムを形質導入する。非形質導入Ｔ細胞および異なるＣＡＲ構築物を形質導入したＴ細胞を、異なる濃度のラパマイシンの存在下でＳｕｐＴ１細胞またはＳｕｐＴ１．ＣＤ１９細胞のいずれかを用いて１：１で攻撃する。上清を攻撃の４８時間後にサンプリングする。バックグラウンド（Ｔ細胞単独）、および最大（ＰＭＡ／イオノマイシンを用いて刺激したＴ細胞）からの上清もまたサンプリングする。ＥＬＩＳＡにより上清中のインターフェロン−ガンマを測定する。
【０３２３】
クロム放出アッセイを使用して標的細胞の殺傷もまた実証する。ＳｕｐＴ１およびＳｕｐＴ１．ＣＤ１９細胞に５１Ｃｒを負荷し、対照およびＴｅｔ−ＣＡＲ  Ｔ細胞と共にラパマイシンの存在下または非存在下で４時間インキュベートする。上清中の５１Ｃｒを計数することにより標的細胞の溶解を決定する。
【０３２４】
図３に示すように、ラパマイシンの非存在下での「ラパ−オフ」減弱システムにおいて、シグナル減弱成分は細胞質中を自由に拡散し、ＣＡＲ媒介性シグナル伝達が起こり得る。ラパマイシンの存在下で、シグナル減弱成分は膜テザリング成分と共に二量体化して、ＣＤ１４８をＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインと近接させ、細胞シグナル伝達を減弱させる。したがって、ＣＡＲ媒介性活性化は、ラパマイシンの存在により「低減」または「遮断」される。
【０３２５】
（実施例２  Ｔｅｔ−ＯＮ減弱システムの機能性）
３シストロン性の構築物を、構造：
ＳＦＧ．ＴＩＰ−Ｌ（１６ａａ）−ＣＤ１４８ｅｎｄｏ−２Ａ−Ｖ５−タグ−ＣＤ２２（２Ｉｇ）−ＣＤ１９ｔｍ−ＲＬ−ＴｅｔＲＢ−２Ａ−ＣＡＲ
を有する単一の転写物として発現させる。
【０３２６】
これは２Ａ部位において、ＴｉＰ含有シグナル減弱成分、膜貫通ドメインおよび細胞内ＴｅｔＲＢドメインを含む膜テザリング成分、ならびに抗ＣＤ１９第二世代ＣＡＲに自己切断する。
【０３２７】
構築物をＢＷ５細胞中で発現させ、次いで該細胞を、実施例１に記載した方法論を使用してテトラサイクリンの存在下または非存在下において、野生型ＳｕｐＴ１細胞またはＣＤ１９を発現するように操作したＳｕｐＴ１細胞を用いて攻撃する。
【０３２８】
図５および図６に示すように、テトラサイクリンの存在下での「Ｔｅｔ−ＯＮ」減弱システムにおいて、シグナル減弱成分は細胞質中を自由に拡散し、ＣＡＲ媒介性シグナル伝達が起こり得る。テトラサイクリンの非存在下で、シグナル減弱成分は膜テザリング成分と共に二量体化して、ＣＤ１４８をＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインと近接させ、細胞シグナル伝達を減弱させる。したがって、ＣＡＲ媒介性活性化は、テトラサイクリンの存在により「上昇」または「オン」にされる。
【０３２９】
（実施例３  抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲを有するラパ−オフ減弱システムの機能性）
３シストロン性の構築物を、構造：
ＳＦＧｍＲ．Ｖ５＿タグ−ＣＤ２２（２Ｉｇ）−ＴＭ−ＦＲＢ−２Ａ−ＦＫＢＰ１２−ＣＤ１４８ｅｎｄｏ−２Ａ−ＣＡＲ
を有する単一の転写物として発現させた。
【０３３０】
これは２Ａ部位において、ＦＫＢＰ１２含有シグナル減弱成分、膜貫通ドメインおよび細胞内ＦＲＢドメインを含む膜テザリング成分、ならびにＢＣＭＡの天然リガンドである増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）に基づく抗原結合部位を有する抗ＢＣＭＡ第三世代ＣＡＲに自己切断する。
【０３３１】
構築物をＢＷ５細胞中で発現させた。標的細胞として使用するために、ＢＣＭＡ陽性となるようにＳＫＯＶ３細胞を操作した。２人のドナーからの初代ヒトＴ細胞に２つのＣＡＲ構築物：（ｉ）「古典的」な抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ；（ｉｉ）上記した３シストロン性の「減弱可能」なＢＣＭＡ  ＣＡＲシステムを形質導入した。非形質導入Ｔ細胞および異なるＣＡＲ構築物を形質導入したＴ細胞を、異なる濃度のラパマイシンの存在下でＳＫＯＶ３＿ＢＣＭＡ細胞を用いて８：１で攻撃し、ｉｎｃｕｃｙｔｅアッセイを使用して標的細胞殺傷を調べた。結果を図１３に示す。
【０３３２】
ラパマイシンの存在下で、ＣＡＲ、膜テザリング成分およびシグナル減弱成分を発現するＴ細胞による標的細胞の殺傷は、有意に阻害されることが判明した。阻害は、ラパマイシンの濃度に応じて滴定可能であることが判明した。７２時間の時点において、ＣＡＲ、膜テザリング成分およびシグナル減弱成分を発現するＴ細胞による標的細胞の殺傷は、０．８２μＭより高いラパマイシンの試験した濃度において有意に阻害された（図１３Ｂ）。
【０３３３】
（実施例４  抗ＣＤ１９  ＣＡＲを有するラパ−オフ減弱システムの機能性）
３シストロン性の構築物を、構造：
ＳＦＧｍＲ．Ｖ５＿タグ−ＣＤ２２（２Ｉｇ）−ＴＭ−ＦＲＢ−２Ａ−ＦＫＢＰ１２−ＣＤ１４８ｅｎｄｏ−２Ａ−ＣＡＲ
を有する単一の転写物として発現させた。
【０３３４】
これは２Ａ部位において、ＦＫＢＰ１２含有シグナル減弱成分、膜貫通ドメインおよび細胞内ＦＲＢドメインを含む膜テザリング成分、ならびに抗体ｆｍｃ６３に基づく抗原結合部位を有する抗ＣＤ１９第二世代ＣＡＲに自己切断する。
【０３３５】
構築物をＢＷ５細胞中で発現させた。標的細胞として使用するために、ＣＤ１９陽性となるようにＳＫＯＶ３細胞を操作した。２人のドナーからの初代ヒトＴ細胞に２つのＣＡＲ構築物：（ｉ）「古典的」な抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ；（ｉｉ）上記した３シストロン性の「減弱可能」な抗ＣＤ１９  ＣＡＲシステムを形質導入した。非形質導入Ｔ細胞および異なるＣＡＲ構築物を形質導入したＴ細胞を、異なる濃度のラパマイシンの存在下でＳＫＯＶ３＿ＢＣＭＡ細胞を用いて４：１で攻撃し、ｉｎｃｕｃｙｔｅアッセイを使用して標的細胞殺傷を調べた。結果を図１４に示す。
【０３３６】
ラパマイシンの存在下で、ＣＡＲ、膜テザリング成分およびシグナル減弱成分を発現するＴ細胞による標的細胞の殺傷は、有意に阻害された。５０時間の時点において、対照ＣＡＲは標的細胞をほぼ完全に殺傷した一方、減弱因子と共にＣＡＲを共発現するＴ細胞について、標的細胞の約５０％が生存していた。
【０３３７】
本明細書において上記した全ての刊行物は、参照することにより本明細書に組み込まれる。本発明の記載した方法およびシステムの様々な改変およびバリエーションが、本発明の範囲および精神から離れることなく当業者に明らかとなるであろう。本発明を特定の好ましい実施形態と結び付けて記載してきたが、特許請求の範囲に記載の本発明は、そのような特定の実施形態に不当に限定されるべきでないことが理解されるべきである。実際、分子生物学または関連分野の当業者に自明である本発明を実行するための記載した態様の様々な改変は、以下の特許請求の範囲に含まれることが意図される。
【図１】
2020520236.tif 000054
【図２】
2020520236.tif 000055
【図３】
2020520236.tif 000056
【図４】
2020520236.tif 000057
【図５】
2020520236.tif 000058
【図６】
2020520236.tif 000059
【図７】
2020520236.tif 000060
【図８】
2020520236.tif 000061
【図９】
2020520236.tif 000062
【図１０】
2020520236.tif 000063
【図１１】
2020520236.tif 000064
【図１２】
2020520236.tif 000065
【図１３】
2020520236.tif 000066
【図１４】
2020520236.tif 000067
【配列表】
2020520236000001.app
【国際調査報告】
2020520236.tif 000068
2020520236.tif 000069
2020520236.tif 000070
2020520236.tif 000071