(57)【要約】本開示は、部分的には、組換え成熟補体因子Ｉ（ＣＦＩ）タンパク質を含む組成物およびこれらの組成物を作製および使用する方法を提供する。一態様では、前記組換え成熟ＣＦＩタンパク質が、前記組成物の総ＣＦＩタンパク質含量の５０重量％超を占め、前記方法は、ａ．組換え前駆体ＣＦＩタンパク質と、フリンタンパク質またはその断片とを接触させるステップ；およびｂ．前記組換え前駆体ＣＦＩタンパク質を前記フリンタンパク質またはその断片と共に、所定の期間にわたってインキュベートすることにより、前記フリンタンパク質またはその断片が前記組換え前駆体ＣＦＩタンパク質をＲＲＫＲリンカー配列部位において、またはそれに隣接して切断して前記組換え成熟補体因子Ｉタンパク質を形成させるステップを含み得る。
2020511537.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え成熟補体因子Ｉ（ＣＦＩ）タンパク質を含む組成物であって、前記組成物中に含まれる前記組換え成熟ＣＦＩタンパク質が、前記組成物の総ＣＦＩタンパク質含量の約５０重量％超を占める、組成物。
【請求項２】
前記組換え成熟ＣＦＩタンパク質が、前記組成物の前記総ＣＦＩタンパク質含量の約６０重量％超を占める、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組換え成熟ＣＦＩタンパク質が、前記組成物の前記総ＣＦＩタンパク質含量の約７０重量％超を占める、請求項１または請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記組換え成熟ＣＦＩタンパク質が、前記組成物の前記総ＣＦＩタンパク質含量の約８０重量％超を占める、先行する請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
前記組換え成熟ＣＦＩタンパク質が、前記組成物の前記総ＣＦＩタンパク質含量の約９０重量％超を占める、先行する請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
前記組換え成熟ＣＦＩタンパク質が、前記組成物の前記総ＣＦＩタンパク質含量の約９５重量％超を占める、先行する請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
必要に応じて組換え前駆体補体因子Ｉタンパク質をさらに含み、前記組成物中の組換え成熟ＣＦＩ：組換え前駆体ＣＦＩの比が、５０：５０より大きく１００：０までである、先行する請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
組換え成熟補体因子Ｉ（ＣＦＩ）タンパク質と、必要に応じて、組換え前駆体補体因子Ｉタンパク質とを含む組成物であって、前記組成物中の組換え成熟ＣＦＩ：組換え前駆体ＣＦＩの比が５０：５０より大きく１００：０までである、組成物。
【請求項９】
前記組成物中の組換え成熟ＣＦＩ：組換え前駆体ＣＦＩの前記比が６０：４０〜１００：０である、請求項７または請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物中の組換え成熟ＣＦＩ：組換え前駆体ＣＦＩの前記比が７０：３０〜１００：０である、請求項７から９のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物中の組換え成熟ＣＦＩ：組換え前駆体ＣＦＩの前記比が８０：２０〜１００：０である、請求項７から１０のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２】
前記組成物中の組換え成熟ＣＦＩ：組換え前駆体ＣＦＩの前記比が９０：１０〜１００：０である、請求項７から１１のいずれかに記載の組成物。
【請求項１３】
前記組成物中の組換え成熟ＣＦＩ：組換え前駆体ＣＦＩの前記比が９５：０５〜１００：０である、請求項７から１２のいずれかに記載の組成物。
【請求項１４】
前記組換えＣＦＩタンパク質がヒトＣＦＩタンパク質である、先行する請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項１５】
前記組換え成熟ＣＦＩタンパク質が、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む第１のアミノ酸分子を含む、先行する請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項１６】
前記組換え成熟ＣＦＩタンパク質が、配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のアミノ酸分子を含む、請求項１から１４のいずれかに記載の組成物。
【請求項１７】
前記組換え成熟ＣＦＩタンパク質が、配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である第１のアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記組換え成熟ＣＦＩタンパク質が、配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む第１のアミノ酸分子を含む、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記組換え成熟ＣＦＩタンパク質が、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むさらなるアミノ酸分子を含み、第１のアミノ酸配列とさらなるアミノ酸配列がジスルフィド結合によって連結されている、先行する請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項２０】
前記組換え成熟ＣＦＩタンパク質が、配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むさらなるアミノ酸分子を含み、第１のアミノ酸配列とさらなるアミノ酸配列がジスルフィド結合によって連結されている、請求項１から１８のいずれかに記載の組成物。
【請求項２１】
前記組換え成熟ＣＦＩタンパク質が、配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記組換え成熟ＣＦＩタンパク質が、配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むさらなるアミノ酸分子を含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
フリンタンパク質を本質的に含まない、先行する請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項２４】
医薬組成物である、先行する請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項２５】
１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２６】
補体媒介性障害の処置における使用のための、先行する請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項２７】
Ｃ３ミオパチーの処置における使用のための、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２８】
加齢黄斑変性、アルツハイマー病、非定型的溶血性尿毒症性症候群、膜性増殖性糸球体腎炎２型（ＭＰＧＮ２）、アテローム性動脈硬化症（特に、加速性アテローム性動脈硬化症）および慢性心血管疾患から選択される補体媒介性障害の処置における使用のための、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２９】
組換え成熟補体因子Ｉ（ＣＦＩ）タンパク質を含む組成物を調製する方法であって、前記組換え成熟ＣＦＩタンパク質が、前記組成物の総ＣＦＩタンパク質含量の５０重量％超を占め、
ａ．組換え前駆体ＣＦＩタンパク質と、フリンタンパク質またはその断片とを接触させるステップ；および
ｂ．前記組換え前駆体ＣＦＩタンパク質を前記フリンタンパク質またはその断片と共に、所定の期間にわたってインキュベートすることにより、前記フリンタンパク質またはその断片が前記組換え前駆体ＣＦＩタンパク質をＲＲＫＲリンカー配列部位において、またはそれに隣接して切断して前記組換え成熟補体因子Ｉタンパク質を形成させるステップ
を含む方法。
【請求項３０】
前記組換え前駆体ＣＦＩタンパク質がヒト前駆体ＣＦＩタンパク質である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記組換え前駆体ＣＦＩタンパク質がタグを含む、請求項２９または請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記タグがＨｉｓタグである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ステップ（ａ）の前に前記組換え前駆体ＣＦＩタンパク質を発現させることをさらに含む、請求項２９から３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
真核細胞中で前記組換え前駆体ＣＦＩタンパク質を発現させることを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
原核細胞中で前記組換え前駆体ＣＦＩタンパク質を発現させることを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記原核細胞がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記真核細胞が昆虫、酵母または哺乳動物細胞から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
ステップ（ａ）の前に発現された前記組換え前駆体ＣＦＩタンパク質を単離することを含む、請求項２９から３８のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
ステップ（ａ）が、前記フリンタンパク質またはその断片を、前記発現された組換え前駆体ＣＦＩタンパク質を含む溶液に添加することを含む、請求項２９から３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
ステップ（ｂ）が、前記フリンタンパク質またはその断片を前記組換え前駆体ＣＦＩタンパク質と共に約２５℃〜約４２℃の間の温度でインキュベートすることを含む、請求項２９から４０のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
ステップ（ｂ）が、前記フリンタンパク質またはその断片を前記組換え前駆体ＣＦＩタンパク質と共に約３０℃〜約４２℃の間の温度でインキュベートすることを含む、請求項２９から４１のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
ステップ（ｂ）が、前記フリンタンパク質またはその断片を前記組換え前駆体ＣＦＩタンパク質と共に約３５℃〜約３８℃の間の温度でインキュベートすることを含む、請求項２９から４１のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
ステップ（ｂ）が、前記フリンタンパク質またはその断片を、前記組換え前駆体ＣＦＩタンパク質と共に、約５〜７の間のｐＨを有する溶液中でインキュベートすることを含む、請求項２９から４３のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
ステップ（ｂ）が、前記フリンタンパク質またはその断片を、前記組換え前駆体ＣＦＩタンパク質と共に、約５〜６の間のｐＨを有する溶液中でインキュベートすることを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記溶液がカルシウムイオンを含む、請求項４４または請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記溶液が約１ｍＭ〜約５ｍＭの間の濃度のカルシウムイオンを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記溶液がカリウムイオンをさらに含む、請求項４４から４７のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】
ステップ（ｂ）が、前記フリンタンパク質またはその断片を前記組換え前駆体ＣＦＩタンパク質と共に約５時間〜約４８時間の間にわたってインキュベートすることを含む、請求項２９から４８のいずれかに記載の方法。
【請求項５０】
ステップ（ｂ）が、前記フリンタンパク質またはその断片を、前記組換え前駆体ＣＦＩタンパク質と共に約８時間〜約２０時間の間にわたってインキュベートすることを含む、請求項２９から４９のいずれかに記載の方法。
【請求項５１】
前記フリンタンパク質またはその断片が、配列番号４に記載のアミノ酸配列またはその断片を含む、請求項２９から５０のいずれかに記載の方法。
【請求項５２】
前記フリンタンパク質断片が、配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質の少なくともアミノ酸残基１０８〜７１５を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記組換え成熟ＣＦＩタンパク質を単離することをさらに含む、請求項２９から５２のいずれかに記載の方法。
【請求項５４】
単離された前記組換え成熟ＣＦＩタンパク質を精製することをさらに含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記組換え前駆体ＣＦＩタンパク質が、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む、請求項２９から５３のいずれかに記載の方法。
【請求項５６】
前記組換え前駆体ＣＦＩタンパク質が、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む、請求項２９から５４のいずれかに記載の方法。
【請求項５７】
請求項２９から５６のいずれかに記載の方法から得ることができる組成物。
【請求項５８】
補体媒介性障害を処置する方法であって、
ａ．それを必要とする対象に治療有効量の請求項１から２８または請求項５７のいずれかに記載の組成物を投与するステップ
を含む方法。
【請求項５９】
Ｃ３ミオパチーを処置する方法である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
加齢黄斑変性、アルツハイマー病、非定型的溶血性尿毒症性症候群、膜性増殖性糸球体腎炎２型（ＭＰＧＮ２）、アテローム性動脈硬化症（特に、加速性アテローム性動脈硬化症）および慢性心血管疾患から選択される補体媒介性障害を処置する方法である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
加齢黄斑変性を処置する方法である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
請求項１から２８のいずれか一項に記載の組成物と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項６３】
実質的にパイロジェンフリーである、請求項６２に記載の医薬組成物。
【請求項６４】
無菌である、請求項６２または６３に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１７年３月１４日に出願された英国特許出願番号第１７０４０７１．８号に基づく優先権の利益を主張している。前述の出願は、その全体が参考として本明細書中に援用される。
【０００２】
技術分野
本発明の態様は、組換え成熟補体因子Ｉタンパク質、そのようなタンパク質を含む組成物ならびにその製造方法および使用方法に関する。また、組換え成熟補体因子Ｉタンパク質を含む組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、補体媒介性障害を処置する方法も、本明細書に含まれる。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
補体系は、互いに反応して病原体をオプソニン化し、感染と闘うのに役立つ一連の炎症応答を誘導する、多数の個別の血漿タンパク質を構成する自然免疫系の一部である。いくつかの補体タンパク質は、それ自体もタンパク質分解による切断によって活性化されるプロテアーゼである。補体系が感染に対して保護する方法は３つある。第１に、それは、病原体に共有結合する多数の活性化された補体タンパク質を生成し、補体の受容体を担持する食細胞による呑食のためにそれ自体をオプソニン化する。第２に、一部の補体タンパク質の小さい断片は、化学誘引物質として作用して、より多くの食細胞を補体活性化の部位に動員し、また、これらの食細胞を活性化する。第３に、終末補体成分は、細菌膜に小孔を作出することによってある特定の細菌を損傷する。
【０００４】
Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ阻害因子としても公知である補体因子Ｉは、補体カスケードを調節するのに必須であるセリンプロテイナーゼである。それは、いくつかの組織において発現されるが、主に肝臓の肝細胞によって発現される。コードされるプレプロタンパク質は、切断されて、重鎖と軽鎖の両方をもたらし、ジスルフィド結合によって連結して、ヘテロ二量体糖タンパク質を形成する。このヘテロ二量体は、補体成分Ｃ４ｂおよびＣ３ｂを切断し、不活化することができ、それは、Ｃ３およびＣ５転換酵素の集合を防止する。この遺伝子の欠陥は、化膿性感染に対する感受性と関連する常染色体劣性疾患である、補体因子Ｉ欠損症を引き起こす。
【０００５】
この遺伝子における変異は、急性腎不全、微小血管症性溶血性貧血および血小板減少症を特徴とする疾患である、非定型的溶血性尿毒症性症候群に対する素因と関連していた。最近、低レベルの循環ＣＦＩが、非常に稀なＣＦＩバリアント遺伝子を有する個体において同定され、これらの個体は、進行した加齢黄斑変性（ＡＭＤ）と関連し、ＡＭＤのリスクにおけるＣＦＩの役割を支持している（Kavanaghら、（２０１５年））。ＡＭＤは、５０歳を超える人々における視力喪失の最も一般的な原因であり、現在、処置選択肢はほとんどない。本研究は、これらの個体におけるＣＦＩ活性の増強は、いくらかの治療利益を有し得ることを示唆する。
【０００６】
現在、高いパーセンテージの組換え成熟ＣＦＩを含む組成物を生産するための努力は、ある程度しか成功していない。典型的には、先行技術の方法は、成熟ＣＦＩタンパク質を形成するためのプロ型の不完全な切断をもたらす。かくして、先行技術は、典型的には、有意な量の切断されていないプロ型タンパク質を含む組成物をもたらす。さらに、以前の努力は、血漿由来補体因子Ｉと比較して活性が低下した組成物をもたらしてきた。
【０００７】
したがって、本発明のある特定の実施形態の目的は、先行技術と関連する問題を少なくとも部分的に軽減することである。
【０００８】
本発明のある特定の実施形態の目的は、高濃度の組換え成熟補体因子Ｉを含む組成物を生産するための方法を提供することである。
【０００９】
ある特定の実施形態の目的は、補体媒介性障害の処置における使用のための組換え成熟補体因子Ｉを含む組成物を提供することである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
開示の要旨
別途定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業界における当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
【００１１】
本発明のある特定の態様は、単離された組換え成熟補体因子Ｉを提供する。
【００１２】
本明細書で使用される用語「単離された」とは、生物学的成分が天然に存在する生物の細胞中の他の生物学的成分、すなわち、他の染色体および染色体外ＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびにタンパク質から実質的に分離または精製された生物学的成分（核酸分子またはタンパク質など）を指す。「単離された」核酸およびタンパク質は、標準的な精製方法によって精製された核酸およびタンパク質を含む。この用語はまた、宿主細胞中での組換え発現によって調製された核酸およびタンパク質ならびに化学的に合成された核酸、タンパク質およびペプチドも包含する。
【００１３】
本発明者らは、例えば、組換え前駆体ＣＦＩタンパク質を含む他の細胞成分から実質的に単離された、単離された組換え成熟ＣＦＩタンパク質を生産する方法を考案したと考えられる。組換えＣＦＩタンパク質を生産する先行技術の方法は、組換え成熟ＣＦＩタンパク質が実質的に単離されていないような前駆体ＣＦＩタンパク質の不完全なプロセシングをもたらしたと考えられる。
【００１４】
本発明の第１の態様では、組換え成熟補体因子Ｉ（ＣＦＩ）タンパク質を含む組成物であって、組成物中に含まれる組換え成熟ＣＦＩタンパク質が組成物の総ＣＦＩタンパク質含量の約５０重量％超を占める、組成物が提供される。
【００１５】
かくして、本発明のある特定の実施形態は、組換え成熟補体因子Ｉ（ＣＦＩ）、組換え成熟補体因子Ｉを含む組成物およびそのようなタンパク質を得る方法に関する。
【００１６】
本明細書で使用される用語「タンパク質」は、「ペプチド」または「ポリペプチド」と互換的に使用することができ、ペプチジル結合によって連結された少なくとも２個の共有結合したアルファアミノ酸残基を意味する。タンパク質という用語は、精製された天然生成物、または組換えもしくは合成技術を使用して部分的もしくは全体的に生産することができる、化学的生成物を包含する。タンパク質という用語は、二量体もしくは他の多量体、融合タンパク質、タンパク質バリアント、またはその誘導体などの、１より多いポリペプチドの複合体を指してもよい。この用語はまた、改変されたタンパク質、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、ペグ化、ユビキチン化などによって改変されたタンパク質も含む。タンパク質は、核酸コドンによってコードされないアミノ酸を含んでもよい。
【００１７】
補体因子Ｉは、重要な補体調節因子である。それは、いくつかの組織中で発現されるが、主に肝臓の肝細胞によって発現される。ＣＦＩは、２個の鎖がジスルフィド結合によって互いに連結されたヘテロ二量体である。重鎖は、Ｉ因子モジュール、ＣＤ５ドメインおよび２個の低密度リポタンパク質受容体ドメイン（ＬＤＬｒ）を含有する。軽鎖は、Ｈｉｓ３８０、Ａｓｐ４３９およびＳｅｒ５２５の三組からなる活性部位である、セリンプロテアーゼドメインを含む。ＣＦＩ重鎖アミノ酸配列は、配列番号１に示され、ＣＦＩ軽鎖アミノ酸配列は、配列番号２に示される（図２）。
【００１８】
ＣＦＩが合成される場合、それは、最初は４個の残基のリンカーペプチド（ＲＲＫＲ）が重鎖を軽鎖に接続する、一本鎖前駆体（前駆体ＣＦＩタンパク質）として作製される。かくして、本明細書で使用される用語「前駆体ＣＦＩタンパク質」は、４個の残基のリンカーペプチド（ＲＲＫＲ）を含む一本鎖前駆体補体因子Ｉタンパク質を指すように使用される。適切には、前駆体ＣＦＩタンパク質は、実質的に不活性であり、本質的にはＣ３のＣ３ｂ不活化もｉＣ３ｂ分解活性も有しない。ある特定の実施形態では、組換え前駆体ＣＦＩタンパク質は、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む（図２）。
【００１９】
プロセシング中に、前駆体ＣＦＩタンパク質は、カルシウム依存的セリンエンドプロテアーゼであるフリンによって切断され、単一のジスルフィド結合によって互いに保持された完全長成熟ＦＩの重鎖および軽鎖を遊離する。このタンパク質は、本明細書では成熟ＣＦＩタンパク質と呼ばれる。
【００２０】
かくして、本明細書で使用される用語「成熟ＣＦＩタンパク質」とは、例えば、フリンによって、ＲＲＫＲリンカー配列において、またはそれに隣接して切断される、または切断されたＣＦＩタンパク質を指す。ある特定の実施形態では、成熟ＣＦＩタンパク質は、３１８位〜３２１位にＲＲＫＲリンカー配列を含む前駆体ＣＦＩタンパク質と比較してＲＲＫＲリンカー配列を欠く。他の実施形態では、成熟ＣＦＩタンパク質は、ＲＲＫＲリンカー配列に隣接して切断され、したがって、成熟ＣＦＩタンパク質は軽鎖と重鎖とを含み、その一方または両方はリンカー配列の１または複数のアミノ酸残基を含む。ある特定の実施形態では、組換え前駆体ＣＦＩタンパク質は、非ヒト哺乳動物のＣＦＩタンパク質である。
【００２１】
ある特定の実施形態では、成熟ＣＦＩタンパク質は、ジスルフィド結合を含み、組換え成熟ＣＦＩタンパク質は、ジスルフィド結合の還元時に重鎖と軽鎖に切断可能である。ある特定の実施形態では、成熟ＣＦＩタンパク質は、Ｉ因子モジュール、ＣＤ５モジュール、ＬＤＬｒモジュール、ＬＤＬｒモジュールを含む重鎖と、セリンプロテアーゼドメインを含む軽鎖とを含む。ある特定の実施形態では、成熟ＣＦＩタンパク質は、グリコシル化されている。
【００２２】
本明細書で使用される用語「組換え前駆体ＣＦＩタンパク質」は、組換え方法を使用して得られる上記の前駆体ＣＦＩタンパク質を指すように使用される。
【００２３】
本明細書で使用される用語「総ＣＦＩタンパク質含量」とは、単一の組成物中に存在する組換え成熟ＣＦＩタンパク質と、組換え前駆体ＣＦＩタンパク質との組合せの総含量を指す。
【００２４】
適切には、「組換え成熟ＣＦＩタンパク質」は、組換え発現によって作製される上記で定義された成熟ＣＦＩタンパク質である、すなわち、それは天然にも存在しないし、血漿にも由来しない。適切には、野生型成熟ＣＦＩタンパク質は、それぞれの鎖が、最大３ｋＤａの炭水化物を、８５ｋＤａの予測された分子量に加える合計６個のＮ結合グリコシル化部位をもたらすグリコシル化を受ける２個の鎖を含む。
【００２５】
組換え成熟ＣＦＩタンパク質は、天然に由来する、すなわち、血漿に由来する成熟ＣＦＩタンパク質と異なるグリコシル化パターンを有してもよい。
【００２６】
用語「組換え」および「組換え発現」は、当業界で周知である。本明細書で使用される用語「組換え発現」は、宿主生物中での外因性遺伝子の転写および翻訳に関する。外因性ＤＮＡとは、宿主細胞の外部を起源とする任意のデオキシリボ核酸を指す。外因性ＤＮＡを、宿主のゲノム中に組み込むか、または非組込みエレメントから発現させることができる。
【００２７】
組換えタンパク質は、組換え核酸から発現されるか、またはそれから発現させることができる任意のポリペプチドを含む。かくして、組換え成熟ＣＦＩタンパク質は、組換えＤＮＡ配列によって発現される。適切には、組換え成熟ＣＦＩタンパク質は、ＲＲＫＲリンカー配列において、またはそれに隣接して切断される発現後プロセシングを受けて、本明細書に記載のヘテロ二量体を遊離する。
【００２８】
ある特定の実施形態では、組換え成熟ＣＦＩタンパク質は、組成物の総ＣＦＩタンパク質含量の約６０重量％超を占める。ある特定の実施形態では、組換え成熟ＣＦＩタンパク質は、組成物の総ＣＦＩタンパク質含量の約７０重量％超を占める。一実施形態では、組換え成熟ＣＦＩタンパク質は、組成物の総ＣＦＩタンパク質含量の約８０重量％超を占める。
【００２９】
ある特定の実施形態では、組換え成熟ＣＦＩタンパク質は、組成物の総ＣＦＩタンパク質含量の約９０重量％超を占める。適切には、組換え成熟ＣＦＩタンパク質は、組成物の総ＣＦＩタンパク質含量の約９５重量％超を占める。
【００３０】
ある特定の実施形態では、組成物は、組換え前駆体補体因子Ｉタンパク質をさらに含み、組成物中の組換え成熟ＣＦＩ：組換え前駆体ＣＦＩの比は、５０：５０より大きく１００：０までである。
【００３１】
本発明の第２の態様では、組換え成熟補体因子Ｉ（ＣＦＩ）タンパク質と、必要に応じて、組換え前駆体補体因子Ｉタンパク質とを含む組成物であって、組成物中の組換え成熟ＣＦＩ：組換え前駆体ＣＦＩの比が５０：５０より大きく１００：０までである、組成物が提供される。
【００３２】
ある特定の実施形態では、組成物中の組換え成熟ＣＦＩ：組換え前駆体ＣＦＩの比は、６０：４０〜１００：０である。ある特定の実施形態では、組成物中の組換え成熟ＣＦＩ：組換え前駆体ＣＦＩの比は、７０：３０〜１００：０である。ある特定の実施形態では、組成物中の組換え成熟ＣＦＩ：組換え前駆体ＣＦＩの比は、８０：２０〜１００：０、例えば、約９０：１０〜１００：０、例えば、９５：０５〜１００：０である。
【００３３】
ある特定の実施形態では、組換えＣＦＩタンパク質は、ヒトＣＦＩタンパク質である。ある特定の実施形態では、組換え成熟ＣＦＩタンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む第１のアミノ酸分子を含む。ある特定の実施形態では、組換え成熟ＣＦＩタンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のアミノ酸分子を含む。適切には、配列同一性％は、配列番号１に記載のアミノ酸配列の全長にわたるものである。
【００３４】
ある特定の実施形態では、組換え成熟ＣＦＩタンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％または９４％同一である、第１のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、組換え成熟ＣＦＩタンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一、例えば、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である、アミノ酸配列を含む第１のアミノ酸分子を含む。
【００３５】
ある特定の実施形態では、組換え成熟ＣＦＩタンパク質は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むさらなるアミノ酸分子を含み、第１のアミノ酸配列とさらなるアミノ酸配列はジスルフィド結合によって連結されている。
【００３６】
ある特定の実施形態では、組換え成熟ＣＦＩタンパク質は、配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むさらなるアミノ酸分子を含み、第１のアミノ酸配列とさらなるアミノ酸配列は、ジスルフィド結合によって連結されている。ある特定の実施形態では、組換え成熟ＣＦＩタンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一、例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％または９４％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００３７】
ある特定の実施形態では、組換え成熟ＣＦＩタンパク質は、配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一、例えば、少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むさらなるアミノ酸分子を含む。
【００３８】
かくして、ある特定の実施形態では、配列中に小さい改変を有するタンパク質は、それらが機能的であるという条件で、同等に有用であり得る。２つまたはそれより多い核酸またはポリペプチドの文脈での用語「配列同一性」、「パーセント同一性」および「配列パーセント同一性」は、比較し、最大の一致のために整列させ（必要に応じて、ギャップを導入する）、配列同一性の一部として保存的アミノ酸置換を考慮しない場合、同じであるか、または同じである特定のパーセンテージのヌクレオチドもしくはアミノ酸残基を有する、２つまたはそれより多い配列またはサブ配列を指す。パーセント同一性を、配列比較ソフトウェアもしくはアルゴリズムを使用して、または目視によって測定することができる。様々なアルゴリズムおよびソフトウェアが当業界で公知であり、アミノ酸またはヌクレオチド配列のアラインメントを得るために使用することができる。
【００３９】
パーセント配列同一性を決定するための好適なプログラムとしては、例えば、米国政府のＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのＢＬＡＳＴのウェブサイト（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）から入手可能なプログラムのＢＬＡＳＴスイートが挙げられる。２つの配列間の比較を、ＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムのいずれかを使用して実行することができる。ＢＬＡＳＴＮは、核酸配列を比較するために使用されるが、ＢＬＡＳＴＰは、アミノ酸配列を比較するために使用される。ＤＮＡＳＴＡＲから入手可能な、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）またはＭｅｇＡｌｉｇｎは、配列を整列させるために使用することができるさらなる公共的に利用可能なソフトウェアプログラムである。当業者であれば、特定のアラインメントソフトウェアによる最大のアラインメントのための適切なパラメーターを決定することができる。ある特定の実施形態では、アラインメントソフトウェアのデフォルトパラメーターを使用する。
【００４０】
ある特定の実施形態では、組換え成熟ＣＦＩタンパク質は、参照配列と比較して１つまたは複数の変異を含むアミノ酸配列を含んでもよい。ある特定の実施形態では、参照配列は、配列番号１および２に示される通りである。ある特定の実施形態では、変異は、挿入、欠失、または置換であってもよい。
【００４１】
タンパク質の置換バリアントは、アミノ酸配列中の少なくとも１個のアミノ酸残基が除去され、異なるアミノ酸残基がその位置に挿入されたものである。本発明のある特定の実施形態の成熟組換えＣＦＩタンパク質は、保存的または非保存的置換を含有してもよい。
【００４２】
本明細書で使用される用語「保存的置換」は、１つまたは複数のアミノ酸残基への、類似する生化学的特性を有するアミノ酸残基からの置換に関する。典型的には、保存的置換は、得られるタンパク質の活性に対する影響がわずかであるか、または全くない。本明細書に記載のＣＦＩタンパク質のバリアントのスクリーニングを使用して、どのアミノ酸残基がアミノ酸残基置換を許容することができるかを同定することができる。一例では、改変されたタンパク質の関連する生物活性は、１つまたは複数の保存的アミノ酸残基置換が行われた場合のＣＦＩと比較して、２５％を超えて、好ましくは２０％を超えて、特に１０％を超えて減少しない。
【００４３】
ある特定の実施形態では、組成物は、フリンタンパク質またはその断片を本質的に含まない。フリンは、Ａｒｇ−Ｘ−Ｘ−Ａｒｇの最小切断部位でタンパク質をｉｎ  ｖｉｖｏで切断するスブチリシン様プロタンパク質転換酵素である。ヒトフリンタンパク質は、配列番号４に記載のアミノ酸配列を含む。
【００４４】
ある特定の実施形態では、組成物は医薬組成物である。医薬組成物は、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。医薬組成物のさらなる詳細は、本明細書に提供される。
【００４５】
本発明のさらなる態様では、組換え成熟補体因子Ｉ（ＣＦＩ）タンパク質を含む組成物を調製する方法であって、組換え成熟ＣＦＩタンパク質が、組成物の総ＣＦＩタンパク質含量の５０重量％超を占め、
ａ．組換え前駆体ＣＦＩタンパク質と、フリンタンパク質またはその断片とを接触させるステップ；および
ｂ．組換え前駆体ＣＦＩタンパク質をフリンタンパク質またはその断片と共に、所定の期間にわたってインキュベートすることにより、フリンタンパク質またはその断片が組換え前駆体ＣＦＩタンパク質をＲＲＫＲリンカー配列部位において、またはそれに隣接して切断して、組換え成熟補体因子Ｉタンパク質を形成させるステップ
を含む方法が提供される。
【００４６】
ある特定の実施形態では、組換え前駆体ＣＦＩタンパク質は、ヒト前駆体ＣＦＩタンパク質であり、組換え前駆体ＣＦＩタンパク質は、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、組換え前駆体ＣＦＩタンパク質は、本明細書に記載の通りである。
【００４７】
ある特定の実施形態では、組換え前駆体ＣＦＩタンパク質は、タグを含む。ある特定の実施形態では、タグはＨｉｓタグである。
【００４８】
ある特定の実施形態では、方法は、ステップ（ａ）の前に組換え前駆体ＣＦＩタンパク質を発現させることを含む。ある特定の実施形態では、方法は、真核細胞中で組換え前駆体ＣＦＩタンパク質を発現させることを含む。
【００４９】
ある特定の実施形態では、方法は、原核細胞中で組換え前駆体ＣＦＩタンパク質を発現させることを含む。適切には、原核細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉである。
【００５０】
ある特定の実施形態では、真核細胞は、昆虫、植物、酵母または哺乳動物細胞から選択される。
【００５１】
ＣＦＩタンパク質をコードするＤＮＡをクローニングするか、または発現させるための好適な宿主細胞としては、原核生物、酵母、または高等真核細胞が挙げられる。この目的のための好適な原核生物としては、グラム陰性またはグラム陽性生物、例えば、エスケリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、例えば、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ、および赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）などの腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、ならびにＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓなどの桿菌（Ｂａｃｉｌｌｉ）、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａなどのシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、およびストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）などの真正細菌が挙げられる。
【００５２】
原核生物に加えて、糸状菌または酵母などの真核微生物は、ＣＦＩをコードするベクターのための好適なクローニングまたは発現宿主であってもよい。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、または一般的なパン酵母は、下等真核宿主微生物の中でも最も一般的に使用されるものであるが、他のものも有用であり得る。
【００５３】
ある特定の実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物宿主細胞、例えば、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系（例えば、ＣＯＳ−７）；ヒト胚性腎細胞系（例えば、２９３もしくは２９３細胞）；ベビーハムスター腎細胞（例えば、ＢＨＫ）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ）、マウスセルトリ細胞（例えば、ＴＭ４）；サル腎細胞（例えば、ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎細胞（例えば、ＶＥＲＯ−７６）；ヒト子宮頸癌細胞（例えば、ＨＥＬＡ）；イヌ腎細胞（例えば、ＭＤＣＫ）；バッファローラット肝細胞（例えば、ＢＲＬ３Ａ）；ヒト肺細胞（例えば、Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（例えば、ＨｅｐＧ２）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）；ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞およびＦＳ４細胞である。ある特定の実施形態では、哺乳動物細胞は、ＣＨＯ細胞である。
【００５４】
抗体産生のために、宿主細胞を、上記の発現またはクローニングベクターで形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択するか、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために必要に応じて改変された従来の栄養培地中で培養する。
【００５５】
ある特定の実施形態では、方法は、細胞を、前駆体ＣＦＩタンパク質をコードする核酸分子で形質転換することを含む。適切には、方法は、細胞を、本明細書に記載の前駆体ＣＦＩタンパク質をコードするベクターで形質転換することを含む。
【００５６】
本明細書で使用される「核酸分子」または「核酸配列」とは、１つのヌクレオチド糖の３’位が、ホスホジエステル架橋によって次の５’位に連結されたヌクレオチドのポリマーを指す。直鎖状核酸鎖において、一方の末端は、典型的には、遊離５’リン酸基を有し、他方は遊離３’ヒドロキシル基を有する。核酸配列は、本明細書ではオリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチド、およびその断片または部分、ならびに一本鎖または二本鎖であってよく、センスまたはアンチセンス鎖であるゲノムまたは合成起源のＤＮＡまたはＲＮＡを指すように使用することができる。
【００５７】
本明細書で使用される用語「ベクター」は、複製起点を含有する核酸配列を意味する。ベクターは、ウイルスベクター、バクテリオファージ、細菌人工染色体または酵母人工染色体であってもよい。ベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターであってもよい。ベクターは、自己複製性染色体外ベクターであってよく、適切には、ＤＮＡプラスミドである。
【００５８】
適切には、ベクターは、プロモーターをさらに含んでもよい。本明細書で使用される用語「プロモーター」は、細胞中での核酸の発現をもたらす、活性化する、または増強することができる合成または天然由来の分子を意味する。プロモーターは、発現をさらに増強する、ならびに／またはその空間的発現および／もしくは時間的発現を変化させるための１つまたは複数の特異的転写調節配列を含んでもよい。プロモーターはまた、転写開始部位から数千塩基対も離れた場所に位置してもよい遠位のエンハンサーまたはリプレッサーエレメントを含んでもよい。プロモーターは、発現が起こる細胞、組織もしくは臓器に関して、または発現が起こる発生段階に関して、または生理的ストレス、病原体、金属イオン、もしくは誘導剤などの外部刺激に応答して、遺伝子成分の発現を構成的に、または示差的に調節することができる。
【００５９】
ある特定の実施形態では、方法は、ステップ（ａ）の前に、発現された組換え前駆体ＣＦＩタンパク質を単離することを含む。ある特定の実施形態では、ステップ（ａ）は、フリンタンパク質またはその断片を、発現された組換え前駆体ＣＦＩタンパク質を含む溶液に添加することを含む。
【００６０】
ある特定の実施形態では、ステップ（ｂ）は、フリンタンパク質またはその断片を組換え前駆体ＣＦＩタンパク質と共に約２５℃〜約４２℃の間の温度でインキュベートすることを含む。
【００６１】
ある特定の実施形態では、ステップ（ｂ）は、フリンタンパク質またはその断片を組換え前駆体ＣＦＩタンパク質と共に約３０℃〜約４２℃の間の温度でインキュベートすることを含む。
【００６２】
ある特定の実施形態では、ステップ（ｂ）は、フリンタンパク質またはその断片を、組換え前駆体ＣＦＩタンパク質と共に約３５℃〜約３８℃の間の温度でインキュベートすることを含む。
【００６３】
ある特定の実施形態では、ステップ（ｂ）は、フリンタンパク質またはその断片を組換え前駆体ＣＦＩタンパク質と共に、約５〜７の間のｐＨを有する溶液中でインキュベートすることを含む。
【００６４】
ある特定の実施形態では、ステップ（ｂ）は、フリンタンパク質またはその断片を組換え前駆体ＣＦＩタンパク質と共に、約５〜６の間のｐＨを有する溶液中でインキュベートすることを含む。
【００６５】
ある特定の実施形態では、溶液は、カルシウムイオンを含む。ある特定の実施形態では、溶液は、約１ｍＭ〜約５ｍＭの間の濃度のカルシウムイオンを含む。
【００６６】
ある特定の実施形態では、溶液は、カリウムイオンをさらに含む。
【００６７】
ある特定の実施形態では、ステップ（ｂ）は、フリンタンパク質またはその断片を組換え前駆体ＣＦＩタンパク質と共に約５時間〜約４８時間の間にわたってインキュベートすることを含む。
【００６８】
ある特定の実施形態では、ステップ（ｂ）は、フリンタンパク質またはその断片を組換え前駆体ＣＦＩタンパク質と共に約８時間〜約２０時間の間にわたってインキュベートすることを含む。
【００６９】
ある特定の実施形態では、フリンタンパク質は、ヒトフリンタンパク質またはその断片である。ある特定の実施形態では、フリンタンパク質は、成熟フリンタンパク質の断片である。適切には、フリンタンパク質は、膜貫通ドメインの前で終結するトランケートされたフリンタンパク質である。適切には、トランケートされたフリンタンパク質は、例えば、ＲＲＫＲリンカー配列で切断する、フリンの触媒活性に関与する、５９５〜７９１の位置に、またはその間の位置に少なくとも１つまたは複数のアミノ酸残基を含む。
【００７０】
ある特定の実施形態では、フリンタンパク質またはその断片は、グリコシル化されている。適切には、フリンタンパク質またはその断片は、Ａｓｎ３８７、Ａｓｎ４４０およびＡｓｎ５５３から選択される１つまたは複数のアミノ酸残基でグリコシル化されている。
【００７１】
ある特定の実施形態では、フリンタンパク質またはその断片は、６０ｋＤａまたはそれより大きい分子量を有する。適切には、フリンタンパク質またはその断片は、約６５〜８５ｋＤａの間の分子量を有する。ある特定の実施形態では、フリンタンパク質またはその断片は、タグ、例えば、Ｈｉｓタグを含む。
【００７２】
ある特定の実施形態では、フリンタンパク質またはその断片は、配列番号４に記載のアミノ酸配列またはその断片を含む。ある特定の実施形態では、フリンタンパク質断片は、配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質の少なくともアミノ酸残基１０８〜７１５を含む。
【００７３】
ある特定の実施形態では、フリンタンパク質は、配列番号４に記載の配列を有するタンパク質に対して少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するタンパク質である。適切には、配列同一性％は、配列番号４に記載のアミノ酸配列の全長にわたるものである。ある特定の実施形態では、フリンタンパク質は、配列番号４のアミノ酸残基１０８〜７１５からなる配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するタンパク質である。
【００７４】
ある特定の実施形態では、フリンタンパク質またはその断片は、哺乳動物細胞中で発現される。適切には、方法は、哺乳動物細胞中で発現されたフリンタンパク質またはその断片を得ることを含む。
【００７５】
ある特定の実施形態では、方法は、組換え成熟ＣＦＩタンパク質を単離することをさらに含む。ある特定の実施形態では、方法は、単離された組換え成熟ＣＦＩタンパク質を精製することをさらに含む。ある特定の実施形態では、組換え成熟ＣＦＩタンパク質は、本明細書に記載の通りである。
【００７６】
本発明のさらなる態様では、本明細書に記載の方法から得ることができる組成物が存在する。
【００７７】
本発明のさらなる態様では、補体媒介性障害の処置における使用のための本発明の態様による組成物が提供される。ある特定の実施形態では、組成物は、Ｃ３ミオパチーの処置における使用のためのものである。
【００７８】
ある特定の実施形態では、組成物は、補体媒介性障害の処置における使用のためのものである。ある特定の実施形態では、組成物は、補体因子Ｉ欠損症と関連する障害の処置における使用のためのものである。そのような障害は、重篤でしばしば再発する感染を特徴としてもよい。
【００７９】
本発明のさらなる態様では、補体媒介性障害を処置する方法であって、
ａ）それを必要とする対象に治療有効量の本明細書に記載の組成物を投与するステップ
を含む方法が提供される。
【００８０】
ある特定の実施形態では、方法は、Ｃ３ミオパチーを処置する方法である。
【００８１】
ある特定の実施形態では、組成物は、補体因子Ｉ欠損症と関連する障害の処置における使用のためのものである。そのような障害は、重篤でしばしば再発する感染を特徴としてもよい。
【００８２】
ある特定の実施形態では、補体媒介性障害は、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、アルツハイマー病、非定型的溶血性尿毒症性症候群（ａＨＵＳ）、膜性増殖性糸球体腎炎２型（ＭＰＧＮ２）、アテローム性動脈硬化症（特に、加速性アテローム性動脈硬化症）および慢性心血管疾患から選択される。
【００８３】
ある特定の実施形態では、組成物は、補体と関連する眼の状態、例えば、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、ブドウ膜炎、糖尿病および他の虚血関連網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、ｖｏｎ  Ｈｉｐｐｅｌ−Ｌｉｎｄａｕ病、眼のヒストプラスマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、角膜血管新生、および網膜血管新生の処置における使用のためのものである。
【００８４】
ある特定の実施形態では、組成物は、加齢黄斑変性の処置における使用のためのものである。加齢黄斑変性（ＡＭＤ）は、世界中の高齢者における失明の主因である。ＡＭＤは、良好な視力を担う眼の網膜の高度に特殊化された領域である、黄斑の変性および新生血管変化に起因する中心視力の進行的低下を特徴とする。ある特定の実施形態では、補体と関連する眼の状態の群は、非滲出型（ウェット型）および滲出型（ドライ型または萎縮型）ＡＭＤを含む加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、ならびに眼内炎を含む。
【００８５】
ＡＭＤは、黄斑の加齢変性であり、６０歳を超える個体における不可逆的な視力障害の主因である。２つの型のＡＭＤ、非滲出型（ドライ型）および滲出型（ウェット型）ＡＭＤが存在する。ドライ型、または非滲出型は、中心網膜（黄斑）の下にある網膜色素上皮（ＲＰＥ）の萎縮性および肥大性変化ならびにＲＰＥ上への沈着物（ドルーゼン）を含む。非滲出型ＡＭＤを有する患者は、脈絡膜新生血管膜（ＣＮＶＭ）と呼ばれる異常な血管が網膜の下で発達し、体液および血液を漏出し、最終的に網膜の中および下での失明に至る円盤状瘢痕を引き起こす、ウェット型、または滲出型のＡＭＤに進行し得る。通常は滲出型ＡＭＤの前兆である非滲出型ＡＭＤがより一般的である。非滲出型ＡＭＤの提示は多様である；硬性ドルーゼン、軟性ドルーゼン、ＲＰＥ地図状萎縮、および色素凝集が存在し得る。補体成分は、ＡＭＤにおいては初期にＲＰＥ上に沈着し、ドルーゼンの主な構成要素である。
【００８６】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、対象を処置するための使用のためのものである。「処置」は、有益なまたは所望の臨床結果を得るための手法である。本開示の目的のために、有益なまたは所望の臨床結果としては、限定されるものではないが、検出可能であるにしろ、検出不可能であるにしろ、症状の軽減、疾患の程度の縮小、疾患の安定化された（すなわち、悪化していない）状態、疾患進行の遅延または減速、疾患状態の改善または緩和、および寛解（部分的または全体的）が挙げられる。「処置」はまた、処置を受けていない場合の予想される生存と比較した生存の延長も意味してもよい。
【００８７】
「処置」は、障害の発達を防止する、または障害の病状を変化させる意図をもって実施される介入である。したがって、「処置」とは、ある特定の実施形態では、治療的処置と、予防的または防止的手段の両方を指す。処置を必要とする者は、既に障害を有する者ならびに障害を防止しようとする者を含む。処置とは、処置の非存在下と比較した場合、病状または症状の増大を阻害すること、または減少させることを意味し、必ずしも関連する状態の完全な停止を含むことを意味するものではない。
【００８８】
用語「患者」、「対象」および「個体」は、互換的に使用してもよく、ヒトまたは非ヒト哺乳動物を指す。適切には、対象はヒトである。
【００８９】
本明細書で使用される場合、タンパク質の「有効」量または「治療有効量」とは、非毒性的であるが、所望の効果を提供するのに十分なタンパク質の量を指す。「有効」である量は、個体の年齢および全身状態、投与の様式などに応じて、対象間で変化する。当業者であれば、日常的な実験を使用して、任意の個々の症例における適切な「有効」量を決定することができる。
【００９０】
有効用量および処置プロトコールを、実験動物において低用量から出発した後、効果をモニタリングしながら用量を増加させ、同様に用量レジメンを体系的に変化させる、従来の手段によって決定することができる。所与の対象に関する最適用量を決定する時に、医師はいくつかの因子を考慮に入れることができる。そのような考慮事項は当業者に公知である。
【００９１】
適切には、本明細書に記載の医薬組成物は、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤または担体を含有してもよい。一部の実施形態では、組成物は、実質的にパイロジェンフリーであるか、またはパイロジェンフリーである。一部の実施形態では、組成物は無菌である。
【００９２】
薬学的に許容される担体または賦形剤の選択を容易にするために、様々な参考文献が利用可能である。例えば、Remington's  Pharmaceutical  SciencesおよびUS  Pharmacopeia:  National  Formulary、Mack  Publishing  Company、Easton、PA  （１９８４年）；Hardmanら（２００１年）、Goodman  and  Gilman's  The  Pharmacological  Basis  of  Therapeutics、McGraw-Hill、New  York、NY；Gennaro（２０００年）、Remington:  The  Science  and  Practice  of  Pharmacy、Lippincott、Williams、およびWilkins、New  York、NY；Avisら（編）（１９９３年）；Pharmaceutical  Dosage  Forms:  Parenteral  Medications、Marcel  Dekker、NY；Liebermanら（編）（１９９０年）、Pharmaceutical  Dosage  Forms:  Tablets、Marcel  Dekker、New  York、NY；Liebermanら（編）（１９９０年）、Pharmaceutical  Dosage  Forms:  Disperse  Systems、Marcel  Dekker、NY；Weiner、Wang,  E、Int.  J.  Pharm.  １８５巻：１２９〜１８８頁（１９９９年）およびWang  W.  Int.  J.;Pharm.  ２０３巻：１〜６０頁（２０００年）、ならびにKotkoskie（２０００年）、Excipient  Toxicity  and  Safety、Marcel  Dekker、New  York、NYを参照されたい。
【００９３】
用語「薬学的に許容される塩」とは、本発明の実施形態のＣＦＩタンパク質の塩を指す。塩は、酸付加塩および塩基性塩などの薬学的に許容される塩を含む。酸付加塩の例としては、塩酸塩、クエン酸塩および酢酸塩が挙げられる。塩基性塩の例としては、カチオンがナトリウムおよびカリウムなどのアルカリ金属、カルシウムなどのアルカリ土類金属、ならびにアンモニウムイオン＋Ｎ（Ｒ３）３（Ｒ４）（式中、Ｒ３およびＲ４は独立に、必要に応じて置換されているＣ１〜６−アルキル、必要に応じて置換されているＣ２〜６−アルケニル、必要に応じて置換されているアリール、または必要に応じて置換されているヘテロアリールを指す）から選択される塩が挙げられる。
【００９４】
本開示の文脈における用語「溶媒和物」とは、溶質（例えば、タンパク質または本開示によるその薬学的に許容される塩）と、溶媒との間で形成される規定の化学量論の複合体を指す。これに関連する溶媒は、例えば、水、エタノールまたは別の薬学的に許容される、典型的には、限定されるものではないが、酢酸もしくは乳酸などの、低分子有機種であってもよい。問題の溶媒が水である場合、そのような溶媒和物は、通常は水和物と呼ばれる。
【００９５】
補体媒介性障害の処置における使用のための医薬組成物は、単位剤形中にあってもよい。そのような形態では、組成物は、適切な量の活性成分を含有する単位用量に分割される。単位剤形は、包装された調製物、個別量の調製物を含有する包装物、例えば、バイアルまたはアンプル中のパケット錠剤、カプセル、および粉末であってもよい。単位剤形はまた、カプセル、カシェ、もしくは錠剤自体であってもよいか、または適切な数のこれらの包装された形態のいずれかであってもよい。それを、単回用量の注射可能な形態、例えば、ペンの形態で提供することができる。ある特定の実施形態では、包装された形態は、使用のための指示を含むラベルまたは挿入物を含む。組成物を、投与の任意の好適な経路および手段のために製剤化することができる。薬学的に許容される担体または希釈剤としては、経口、直腸、経鼻、局所（頬および舌下を含む）、経膣または非経口（皮下、筋肉内、静脈内、皮内、および経皮を含む）投与にとって好適な製剤において使用されるものが挙げられる。製剤を、単位剤形中で都合良く提供し、薬学の分野で周知の方法のいずれかによって調製することができる。
【００９６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの使用
組換えＣＦＩタンパク質およびそのようなタンパク質を含む組成物の生物活性を、好適なバイオアッセイを使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定することができる。好適なバイオアッセイは、以下に詳細に記載され、タンパク質のＣＦＨへの結合を測定するために表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用すること、および他の関連する補体成分と相互作用する（例えば、Ｃ３ｂもしくはＣ３ｄに結合する、またはＣ３ｂ．Ｂｂの崩壊を誘導する）タンパク質に結合したＣＦＨの能力を測定することを含む。
【００９７】
ある特定の実施形態では、本発明の実施形態の組成物および／または組換え成熟ＣＦＩを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて使用して、ＣＦＩタンパク質の遺伝子バリアントを分析することができる。ある特定の実施形態では、利益を受ける可能性が最も高い者に治療を標的化するために、ＣＦＩの機能的に有意な稀な遺伝子バリアントの重要性が有利である。これは、野生型タンパク質と比較した組換え変異タンパク質のアッセイによって達成される。細胞株におけるＣＦＩの過剰発現は、不完全なプロセシングをもたらす。前駆体型のＦＩは活性ではないため、個々の細胞株における変化する速度のプロセシングは、結果の妥当性を低下させ得る。かくして、本発明のある特定の実施形態の組換え成熟ＣＦＩタンパク質を、そのようなアッセイにおいて使用することができる。
【００９８】
上記の実施形態のいずれかと関連して記載される特性が、異なる実施形態の間で互換的に適用可能であってよいことが当業者には明らかである。上記の実施形態は、本発明の様々な特性を説明するための例である。
【００９９】
本明細書の説明および特許請求の範囲を通して、単語「含む（comprise）」および「含有する（contain）」およびそれらの変形は、「限定されるものではないが、含む（including  but  not  limited  to）」を意味し、それらは他の成分、整数またはステップを排除する（および排除しない）ことを意図するものではない。本明細書の説明および特許請求の範囲を通して、文脈が別途必要としない限り、単数形は複数形を包含する。特に、不定冠詞が使用される場合、本明細書は、文脈が別途必要としない限り、複数形ならびに単数形を企図するものと理解されるべきである。
【０１００】
本発明の特定の態様、実施形態または実施例と関連して記載される特性、整数または特徴は、それと不適合でない限り、本明細書に記載の任意の他の態様、実施形態または実施例に適用可能であると理解されるべきである。本明細書（任意の添付の特許請求の範囲、要約書および図面を含む）に開示される全ての特性、および／またはそのように開示される任意の方法もしくはプロセスの全てのステップを、そのような特性および／またはステップのうちの少なくとも一部が相互に排他的である組合せを除いて、任意の組合せで組み合わせることができる。
【０１０１】
本発明は、任意の上記実施形態の詳細に限定されない。本発明は、本明細書（任意の添付の特許請求の範囲、要約書および図面を含む）に開示される特性の、任意の新しい１つ、もしくは任意の新しい組合せ、またはそのように開示される任意の方法もしくはプロセスのステップの任意の新しい１つ、もしくは任意の新しい組合せに拡張される。読者の注意は、本出願と関連して本明細書と同時に、またはその前に出願され、本明細書と共に公衆の閲覧に付された全ての文献および書類に向けられ、全てのそのような文献および書類の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０２】
本発明の実施形態を、添付の図面を参照して以下でさらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】図１は、補体系のある特定の態様の概観を示す。
【０１０４】
【図２−１】図２は、本明細書に記載されるタンパク質のアミノ酸配列を示す。特に、配列番号１は、成熟補体因子Ｉのヒト重鎖のアミノ酸配列である。配列番号２は、成熟補体因子Ｉのヒト軽鎖のアミノ酸配列である。配列番号３は、ヒト前駆体補体因子Ｉのアミノ酸配列である。配列番号４は、ヒトフリンタンパク質のアミノ酸配列である。配列番号７は、ヒト補体因子Ｉのリンカー配列のアミノ酸配列である。
【図２−２】図２は、本明細書に記載されるタンパク質のアミノ酸配列を示す。特に、配列番号１は、成熟補体因子Ｉのヒト重鎖のアミノ酸配列である。配列番号２は、成熟補体因子Ｉのヒト軽鎖のアミノ酸配列である。配列番号３は、ヒト前駆体補体因子Ｉのアミノ酸配列である。配列番号４は、ヒトフリンタンパク質のアミノ酸配列である。配列番号７は、ヒト補体因子Ｉのリンカー配列のアミノ酸配列である。
【０１０５】
【図３】図３は、ＷＴ  Ｉ因子（ＦＩ）のＡＫＴＡ精製を示す。ＦＩを、青色のトレースによって示されるように、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度を測定することによって検出した。緑色のトレースは、イミダゾール勾配を表す。赤色の丸は、ＦＩがカラムから溶出された点を強調する。この領域に対応する画分および周囲の画分の試料を、ウェスタンブロット上、還元条件下で泳動した。８８ｋＤａに単一のバンドがあり、これはプロ型のＦＩのみに対応する。
【０１０６】
【図４】図４は、哺乳動物細胞株における組換えヒトＦＩのプロセシングの図である。プロ−ＦＩは、分泌前にプロセシングを受ける。ＣＦＩが細胞株中で発現される場合、タンパク質の不完全なプロセシングは、インタクトなＲＲＫＲリンカーを有するプロ−ＦＩと、重鎖と軽鎖がジスルフィド結合によってのみ連結された成熟ＦＩとの両方の分泌をもたらす。
【０１０７】
【図５】図５は、ウェスタンブロット上でのＦＩの外見を示す。図は、異なる形態のＦＩが非還元型と還元型ウェスタンブロットの両方でどのように出現するかを示す。プロ−ＦＩは、還元および非還元条件下で８８ｋＤａに出現する。成熟ＦＩは、非還元条件では８８ｋＤａに出現するが、還元された場合、ジスルフィド結合の破壊のため、５０ｋＤＡに出現する。その２つの構成要素鎖に破壊されたＦＩは、還元および非還元条件の両方の下で常に５０ｋＤａに出現する。検出のために使用される抗体は、主に重鎖エピトープを検出するため、軽鎖はウェスタンブロット上で検出されないことが多い。
【０１０８】
【図６】図６は、酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）緩衝液中のプロ−ＦＩおよびＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）緩衝液中のプロ−ＦＩにフリンを添加する効果を示すためのウェスタンブロットを示す。全ての反応液は、１００ｍＭ緩衝液および５ｍＭ  ＣａＣｌ２の最終濃度を有していた。別途記述しない限り、全ての試料を３７℃で１５時間インキュベートした。レーン１は、インキュベートされていない、異なる緩衝液への交換前の精製されたプロ−ＦＩを含有する。レーン２は、酢酸ナトリウム緩衝液中にプロ−ＦＩのみを含有する。レーン３は、フリンと共に酢酸ナトリウム緩衝液中にプロ−ＦＩを含有する。レーン４は、ＨＥＰＥＳ緩衝液中にプロ−ＦＩのみを含有する。レーン３は、フリンと共にＨＥＰＥＳ緩衝液中にプロ−ＦＩを含有する。
【０１０９】
【図７】図７は、ＲＲＫＲリンカーでのプロ−ＦＩの完全な切断を達成するために必要とされるフリンの最小濃度を決定するためのウェスタンブロット（還元型および非還元型）を示す。全ての反応液は、１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５）および５ｍＭ  ＣａＣｌ２の最終濃度を有していた。レーン１は、プロ−ＦＩと緩衝液のみを含有する。レーン２は、レーン１における半分の濃度のフリンを含む緩衝液中にプロ−ＦＩを含有する。フリンの濃度は、レーン４、５および６においてさらに３回、二分される。非還元型ウェスタンブロットは、切断反応におけるＦＩの性質が切断されたＦＩであることを確認する。
【０１１０】
【図８】図８は、フリン効力に対するカルシウムイオンおよびカリウムイオンの濃度を変化させる効果を示すウェスタンブロット（還元型）を示す。全ての反応液は、以前の実験と比較して１／３２のフリンおよび１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５）緩衝液の最終濃度を有していた。全ての反応液を、３７℃で１６時間にわたってインキュベートした。第１のレーンは、５ｍＭ  ＣａＣｌ２を含有する緩衝液中にプロ−ＦＩを含有する。第２のレーンは、フリンと共に５ｍＭ  ＣａＣｌ２を含有する緩衝液中にプロ−ＣＦＩを含有する。第３のレーンは、１ｍＭ  ＣａＣｌ２を含有する緩衝液中にプロ−ＣＦＩを含有する。第４のレーンは、フリンと共に１ｍＭ  ＣａＣｌ２を含有する緩衝液中にプロ−ＦＩを含有する。下のウェスタンブロット中の４つのレーンも全て、２０ｍＭ  ＫＣｌを含有する。第１のレーンは、５ｍＭ  ＣａＣｌ２を含有する緩衝液中にプロ−ＦＩを含有する。第２のレーンは、フリンと共に５ｍＭ  ＣａＣｌ２を含有する緩衝液中にプロ−ＣＦＩを含有する。第３のレーンは、１ｍＭ  ＣａＣｌ２を含有する緩衝液中にプロ−ＣＦＩを含有する。第４のレーンは、フリンと共に１ｍＭ  ＣａＣｌ２を含有する緩衝液中にプロ−ＦＩを含有する。下のウェスタンブロット中の４つのレーンも全て、２０ｍＭ  ＫＣｌを含有する。
【０１１１】
【図９】図９は、成熟ＦＩと比較したプロ−ＦＩの活性を決定するためのＣ３ｂコファクターアッセイの結果を示す。全ての反応液を、３７℃で２０分インキュベートした。低い方のバンドの強度が低く、５０ｋＤａを超えるバンドの強度が高すぎるため、２つの別々の曝露を使用する。レーン１は、ｉＣ３ｂ（切断されたＣ３ｂ）、陽性対照を含有する。レーン２は、切断されていないＣ３ｂ、陰性対照を含有する。レーン３は、Ｃ３ｂおよび予めインキュベートされていないプロ−ＦＩを含有する。レーン４は、空である。レーン５は、Ｃ３ｂおよびプロ−ＦＩを含有する。レーン６は、フリンがＣ３ｂを切断しないことを証明するために、Ｃ３ｂおよびフリンのみを含有する。レーン７は、使用される抗体がフリンと交差反応しないことを証明するために、フリンのみを含有する。レーン８は、Ｃ３ｂ、プロ−ＦＩおよびフリン（したがって、切断されたＦＩ）を含有する。レーン１およびレーン８におけるα２バンドの出現は、Ｃ３ｂの切断がこれらのレーンのみにおいて起こったことを示唆するに過ぎない。したがって、このデータは、切断されたＦＩのみが活性を有し、プロ−ＦＩが不活性であることを示唆する。
【０１１２】
【図１０】図１０は、プロ−ＦＩの成熟ＦＩに対する活性を決定するためのウェスタンブロットを示す。プロ−ＣＦＩと切断されたＣＦＩの活性の間での妥当な比較を行うことができる、レーン４およびレーン７については同等の試料が利用可能であった。全ての反応液を、３７℃で２０分インキュベートした。レーン１は、切断されていないＣ３ｂ、陰性対照を含有する。レーン２は、Ｃ３ｂおよび予めインキュベートされていないプロ−ＦＩを含有する。レーン３は、空である。レーン４は、Ｃ３ｂおよびプロ−ＣＦＩを含有する。レーン５は、フリンがＣ３ｂを切断しないことを証明するために、Ｃ３ｂおよびフリンのみを含有する。レーン６は、使用される抗体がフリンと交差反応しないことを証明するために、フリンのみを含有する。レーン７は、Ｃ３ｂ、プロ−ＦＩおよびフリン（したがって、切断されたＦＩ）を含有する。
【実施例】
【０１１３】
方法および材料
突然変異誘発
組換えプロ−ＣＦＩ（プロ−ｒＣＦＩ）の発現のために使用されたｐＤＲ２  Ｅ１Ｆベクターは、Ｄｒ  Ｋｅｖｉｎ  Ｍａｒｃｈｂａｎｋ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）によって提供されたものであった。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）（カタログ番号２００５２３）を使用して部位特異的突然変異誘発を実施して、ｐＤＲ２  ＥＦ１中のＣＦＩ  ｃＤＮＡに６×ヒスチジンタグを付加して、ｐＤＲ２  ＥＦ１αを形成させた。突然変異誘発のために使用したプライマーを、表１に示す。完全長Ｍａｘｉｐｒｅｐ配列決定を行って、野生型と変異ベクターの両方の忠実性を確保した。
【表１】
2020511537.tif 000003
【０１１４】
細胞培養
チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）を、Ｌ−グルタミン（最終濃度４．５ｍＭ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ペニシリンおよびストレプトマイシン（それぞれ１００Ｕ／ｍｌ、Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ならびに１０％熱不活化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｂｉｏｓｅｒａ）を添加したＤＭＥＭ：Ｆ１２混合物（Ｌｏｎｚａ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｔｄ）中で維持した。ＣＨＯ細胞の一過的トランスフェクションを、ｊｅｔＰＥＩ  ＤＮＡトランスフェクションプロトコールを使用して実施した。
【０１１５】
細胞トランスフェクション
細胞を、血球計を用いて計数し、７５，０００細胞／ｍｌに希釈した。６ウェル培養プレートは、ウェルあたり添加された２ｍｌの細胞を有していた（ウェルあたり１５０，０００個の細胞）。プロ−ＣＦＩ  ｃＤＮＡをコードするＤＮＡ  ３μｇを、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）で１００μｌの容量中のＤＮＡの最終濃度に希釈した。６μＬのｊｅｔＰＥＩ試薬（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ）をＮａＣｌ中で、１００μｌの容量中の最終濃度に希釈した。ｊｅｔＰＥＩ溶液の全体を、ＤＮＡ溶液に添加し、この混合物を室温で３０分間インキュベートした。ウェルあたり２００μＬのｊｅｔＰＥＩ／ＤＮＡミックスを、血清を含有する培地１ｍｌ中の細胞に添加した。次いで、プレートを３７℃で２４時間インキュベートした。２４時間後、上清をフラスコから除去し、ニッケルプルダウンアッセイを使用してＣＦＩの発現についてチェックした。
【０１１６】
ニッケルプルダウン
ヒグロマイシンを、インキュベートした細胞に添加して、トランスフェクトされなかった細胞を除去した。次いで、限界希釈を使用して、単一のクローンを単離した。細胞の増殖をモニタリングし、細胞の単一のコロニーを含有するウェルを確立した。これらのものを別々のフラスコに移し、上清を除去して、ニッケル−セファロースビーズ（Ｎｉ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｅｘｃｅｌ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用するウェスタンブロット分析を実施して、ＦＩの最良の発現株を確立した。５０μＬのビーズスラリーをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に入れ、３００ｘｇで遠心分離して、ビーズを沈降させた後、ＰＢＳを除去した。次いで、１ｍｌの細胞培養上清をビーズに添加した。次いで、細胞培養上清とビーズのミックスを室温で２時間、くるくると回転させて、または４℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、試料を３００ｘｇで遠心分離し、Ｈｉｓタグ付きタンパク質に結合したはずであるペレットを動揺させないように上清を穏やかに除去した。次いで、ペレットを２０〜４０ｍＭのイミダゾールで洗浄して、非特異的に結合したタンパク質を除去した。洗浄後、試料を３００ｘｇでスピンし、上清を除去し、ペレットを残した。次いで、ペレット化したニッケルビーズおよび結合したタンパク質をウェスタンブロット分析にかけて、プロ−ＣＦＩの発現についてチェックした。
【０１１７】
従ったプロトコールは、以下の通りである：
１．１．５ｍｌのＶ底チューブを使用して、ＰＢＳ中で５０μｌアリコートのビーズスラリー（約２５μｌのビーズ＋２５μｌの２０％ＥｔＯＨ）を洗浄する（１ｍｌの上清をプルダウンするには、それぞれ５０μｌで十分である）
２．ビーズを３００ｘｇでスピンし、ＰＢＳを除去する
３．１ｍｌの上清を添加する
４．ＲＴで２時間、回転させて（または４度で一晩）インキュベートする
５．３００ｘｇでスピンし、上清を穏やかに除去する
６．２０〜４０ｍＭのイミダゾールで洗浄して、非特異的結合剤を除去する
７．３００ｘｇでスピンし、上清を穏やかに除去する
８．ＰＢＳで洗浄する
９．３００ｘｇでスピンし、上清を穏やかに除去し、約３５μｌのＰＢＳを残す
１０．緩衝液がビーズ間を占めるように、ウェスタンブロットのための関連容量のローディング緩衝液、約１０μｌの５×ローディング緩衝液を添加する
１１．通常通り沸騰させる
１２．３００ｘｇでスピンし、試料を除去し、約３５μｌをウェスタンブロット上にロードする
【０１１８】
タンパク質精製
ｒＣＦＩを発現する細胞の上清を収集し、１ｍｌのＨｉｓ−Ｔｒａｐカラムを使用してＡＫＴＡ精製装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）上で精製した。２０ｍＭリン酸塩中の０〜０．５Ｍのイミダゾール勾配を使用して、Ｈｉｓタグ付きプロ−ｒＣＦＩとＨｉｓ−Ｔｒａｐカラムとの相互作用を破壊し、溶出画分を収集した。ウェスタンブロットを行って、どの画分がプロ−ＣＦＩを含有するかを決定した。次いで、プロ−ｒＣＦＩを含有する画分を、一緒にプールした。
【０１１９】
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびウェスタンブロット分析
２５μＬの試験しようとする試料を、６．２５μＬの還元試料緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、３９０００）または非還元試料緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、３９００１）を含有する１．５ｍＬのチューブに添加した。全ての試料を９５℃で８分間加熱した後、１３，２００ｒｐｍの速度で２秒間遠心分離した。製造業者の指示書（Ｎｏｖｅｘ、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＥＣ６０７５ＢＯＸ）に従って、１０％トリス−グリシンゲルを作製した。準備が整うと、ゲルをＸＣｅｌｌ  ＳｕｒｅＬｏｃｋ  Ｍｉｎｉ−Ｃｅｌｌ（Ｎｏｖｅｘ、Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｅ１０００２）中に入れ、ミニセルの両区画に１×泳動緩衝液（２５ｍＭ  トリス塩基、１９２ｍＭグリシン、０．１％ＳＤＳ、脱イオン水、ｐＨ８．３）を充填した。２２μＬの試料を、ゲルの各ウェルにロードした。必要に応じて、１４μＬのＩ因子標準を、ゲルのウェルにロードし（Ｃｏｍｐｔｅｃｈ、Ａ１３８）、マーカーとして使用した。７μＬのＭＷラダー（Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｐ７７０８ｓ）を、各ゲルの少なくとも１つのウェルに添加した。ＸＣｅｌｌ  ＳｕｒｅＬｏｃｋ  Ｍｉｎｉ−ＣｅｌｌをＰｏｗｅｒｐａｃ（Ｂｉｏ−ｒａｄ、３００Ｖ、４００ｍＡ、７５Ｗ）に接続し、１９０ボルトで３５分間泳動した。泳動後、冷やした（４℃）１×トリス−グリシン転移緩衝液（１２ｍＭ  トリス塩基、９６ｍＭグリシン、ＤＩ水、ｐＨ８．３、２０％メタノール）を使用して、ゲルをニトロセルロース膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＬＣ２００１）上に転移させた。転移を、１００ボルトで６０分間動作する転移ブロッターによって実施した。転移が完了した後、膜を脱イオン水で簡単に洗浄した後、Ｐｏｎｃｅａｕ  Ｓ溶液（Ｓｉｇｍａ、Ｐ７１７０）で染色して、転移の成功を決定した。回転テーブル上に置いたトレー中で、膜を脱染色した。１×ＴＢＳＴ（５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）中の５％無脂肪ミルク粉末の溶液を使用して、全ての膜を、４℃で一晩、または室温で１時間ブロックした。以下の抗体を使用した。
【０１２０】
プロ−ＣＦＩおよび成熟ＣＦＩの検出のため：一次抗体、ヒツジポリクローナルＩ因子（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ａｂ８８４３）を、室温で１時間、２．３７μｇ／ｍｌの濃度で適用した。トリス緩衝食塩水ｔｗｅｅｎ（ＴＢＳＴ）緩衝液（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、トリス塩基１９ｍＭ、Ｔｗｅｅｎ）を用いて１０分間で３回、膜を洗浄した。二次抗体、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートしたヒツジＩｇＧに対するウサギポリクローナル二次抗体（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を、室温で１時間または４℃で一晩、２．３７μｇ／ｍｌの濃度で適用した。次いで、ＴＢＳＴ中で１０分間、ブロットを３回洗浄した。Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を、１分間、膜に適用した後、様々な時間にわたってＸ線フィルムに曝露した後、標準的なフィルム現像技術を使用してそれらを現像した。
【０１２１】
Ｃ３ｂおよびｉＣ３ｂの検出のため：一次抗体、ウサギポリクローナル抗Ｃ３抗体（Ａｂｃａｍ）を１：５０００の濃度で使用した後、ヤギ抗ウサギＩｇＧ  ＨＲＰ抗体を使用した。
【０１２２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのフリンによるプロ−ＣＦＩの切断
フリンによるプロ−ｒＣＦＩのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの切断を最適化するための実験を、本明細書に詳述されるように実行した。
【０１２３】
８．３ｍｌのベッドボリュームを有するＰＤ−１０脱塩カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、精製されたプロ−ｒＣＦＩを、溶出緩衝液から１×切断緩衝液（１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ５．２、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、および１ｍＭ  ＣａＣｌ２）に緩衝液交換した。
【０１２４】
フリンは、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから入手した。フリンタンパク質の特性を、表２に提供する。
【表２】
2020511537.tif 000004
【０１２５】
８．３ｍｌのベッドボリュームを有するＰＤ−１０脱塩カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、プロ−ｒＦＩを、溶出緩衝液から１×切断緩衝液（１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ５．２、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、および１ｍＭ  ＣａＣｌ２）に緩衝液交換した。
【０１２６】
フリン−ＲＤを使用する切断反応液を、以下の表３に詳述されるように作製した。
【表３】
2020511537.tif 000005
【０１２７】
切断反応液のｐＨの最適化
プロ−ＣＦＩの切断のための最適ｐＨを試験するために、異なるｐＨ値を有するいくつかの緩衝液を試験した。最初に、ＰＤ−ＭｉｄｉＴｒａｐ  Ｇ−２５カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、精製されたプロ−ｒＣＦＩを、溶出緩衝液から、ｐＨが異なる３つの緩衝液に交換した。合計１５ｍｌの、１００ｍＭ（酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０またはＨＥＰＥＳ、ｐＨ７またはトリス塩基ｐＨ９）である対応する緩衝液を使用して、カラムを平衡化させた。溶出緩衝液中の０．９３ｍｌのプロ−ｒＣＦＩをそれぞれのカラムに添加した後、１０００ｘｇで２分間遠心分離した。緩衝液交換が成功したかどうかを確立するために、それぞれのｐＨで交換した３０μＬのプロ−ｒＣＦＩを、以前に記載されたようにウェスタンブロット分析にかけた。反応ミックスの正確な量を、以下の表４に示す。
【表４】
2020511537.tif 000006
【０１２８】
次いで、対応する緩衝液中の３０μＬのプロ−ｒＣＦＩおよび２μＬのフリンを含有するフリン切断反応液を準備した。プロ−ｒＣＦＩを交換した緩衝液の濃度を確保するために、それぞれの対応する緩衝液の１Ｍストック溶液２μＬを試料に添加した後、試料を、脱イオン水で５０μＬにした。フリンを含まない対照反応液を、それぞれのｐＨ緩衝液について準備した。反応液を３７℃で１５時間インキュベートした。交換前の、精製されたプロ−ｒＣＦＩのインキュベートされない試料も準備した。それぞれの反応液の量を、表５に示す。
【表５】
2020511537.tif 000007
【０１２９】
インキュベーション後、試料を以前に記載されたようなウェスタンブロット分析にかけて、それぞれの構成バンドの検出により、プロ−ＣＦＩの成熟ＣＦＩへの転換レベルを評価した。
【０１３０】
プロ−ＣＦＩ切断に対するフリン濃度の効果の試験
プロ−ｒＣＦＩの比較的高い速度の切断に必要とされるフリンの最小量を試験するために、フリンの連続希釈液：１：２、１：４、１：８および１：１６を作製した。希釈されたフリンを、表６に示されるように準備された切断反応液のために使用した。試料を、３７℃で１６時間インキュベートした。
【表６】
2020511537.tif 000008
【０１３１】
インキュベーション後、試料を、以前に記載されたようなウェスタンブロット分析にかけた。
【０１３２】
プロ−ＣＦＩのフリン切断に対するイオン濃度の効果の試験
フリンによるプロ−ｒＣＦＩの切断に対するイオン濃度の効果を試験するために、異なるカリウムおよびカルシウム濃度を試験した。フリンを、元の濃度の１／３２に希釈した後、以下の表７に詳述されるような反応ミックス中で使用した。
【表７】
2020511537.tif 000009
【０１３３】
最適化されたプロ−ＣＦＩ消化反応容量
表８に詳述されるような反応ミックスを使用して、プロ−ｒＣＦＩ消化を実施した。プロ−ｒＣＦＩを、ｐＨ５の緩衝液（１００ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５）中で使用した。
【表８】
2020511537.tif 000010
【０１３４】
Ｃ３ｂ不活化アッセイ：プロ−ＣＦＩと成熟ＦＩとの比較
Ｃ３ｂ不活化アッセイを使用して、プロ−ｒＣＦＩと成熟ＣＦＩの活性を比較した。最適化において同定された条件（以前に詳述されたもの）を使用して、プロ−ｒＣＦＩの試料をフリンによって切断した。Ｃ３ｂ切断が、フリンによって切断されたが、同じ条件にかけたプロ−ｒＣＦＩに関して起こるかどうかを決定するために、３つの対照反応液：２×プロ−ＣＦＩのみ（インキュベートしたもの、およびインキュベートしていないもの）およびフリンのみ（インキュベートしたもの）を準備した。全てのインキュベートした試料は、３７℃で１６時間インキュベートした。
【０１３５】
２５μｌの反応液を、０．２μｇ／μｌのＣ３ｂの最終濃度となるように準備した（Ｃｏｍｐｔｅｃｈ）。ＣＦＨ（Ｃｏｍｐｔｅｃｈ）をコファクターとして使用し、それぞれの反応液は６６．６ｎｇ／μｌの最終ＣＦＨ濃度を含有していた。１０ｎｇ／μＬの最終濃度のＣ３ｂおよび血清ＣＦＩ（ｓＦＩ）（Ｃｏｍｐｔｅｃｈ）を含有する陽性対照（Ｃｏｍｐｔｅｃｈ）を作製した。切断されていないＣ３ｂのための陰性対照は、ＣＦＩを有さず、Ｃ３ｂのみを有していた。プロ−ｒＣＦＩのみ（インキュベートしたもの、およびインキュベートしていないもの）の２つのさらなる対照を準備し、また、以前に調製されたそれぞれの対応する反応液１０μＬを添加することにより、フリンのみの対照も準備した。ＣＦＨ、ＣＦＩまたはＣ３ｂが存在しないフリンのさらなる対照も作製した。反応液を、低塩緩衝液を使用して、２５μＬの最終容量にした。７つの反応液を、表９に詳述されるように作製した。
【表９】
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【０１３６】
それぞれの反応ミックスから、２０分で１０μＬのアリコートを取り出した。それぞれのアリコートを、等量の１×ｌａｅｍｅｌｌｉ緩衝液に添加し、Ｃ３ｂの検出について詳述された抗体を使用して以前に概略されたようにウェスタンブロット分析を実施した。ｒＣＦＩの活性を、Ｘ線画像の現像の際にα１およびα２バンドの生成および強度によって決定した。
【０１３７】
また、一部のゲル上での泳動は、Ｃ３ｂ切断生成物に関するマーカーとして作用する不活化された（切断された）Ｃ３ｂ（ｉＣ３Ｂ）の試料であった。
【０１３８】
結果および考察
Ｉ因子の精製
ｒＣＦＩを発現する細胞の上清を、本明細書に記載のように収集し、精製した。収集された画分を、還元条件下で、ポリアクリルアミドゲル上で泳動した後、ゲルのウェスタンブロッティングを行った。ｒＣＦＩの存在を、プロ−ｒＣＦＩ（切断されていない）のＭＷに対応する、８８ｋＤａの分子量のバンドによって確認した。これは、切断された成熟ＣＦＩから予想される５０ｋＤａの分子量に対応するバンドの非存在によってさらに確認される。ｒＣＦＩの濃度を、ＥＬＩＳＡ試験によって決定したところ、０．６ｎｇ／μＬであった。
【０１３９】
Ｉ因子切断の最適化
ある範囲の条件を試験することによって、３１８ＲＲＫＲ３２１切断部位の切断を最適化して、プロ−ｒＣＦＩの成熟ｒＣＦＩへの切断の最大レベルがｉｎ  ｖｉｔｒｏで達成されることを確保した。全ての試料を、還元および非還元条件でポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけて、成熟ｒＣＦＩと、タンパク質の分解に起因して解離し得る重鎖のみとの区別を可能にした。
【０１４０】
非還元条件下で、プロ−ｒＣＦＩと成熟ｒＣＦＩは両方とも、約８８ｋＤａのＭＷを有するはずである；プロ−ｒＣＦＩが還元された場合、それはＲＲＫＲリンカーの存在のため８８ｋＤａのままのはずである；成熟ｒＣＦＩは、２つの鎖の間のジスルフィド架橋が還元されるため、重鎖（５０ｋＤａ）と軽鎖（３７ｋＤａ）とに分離するはずである。検出のために使用される抗体は重鎖エピトープを主に検出するため、軽鎖はウェスタンブロット上で検出されないことが多い。図４は、哺乳動物細胞中でのＣＦＩのプロセシングをまとめたものであり、異なる形態に対する還元の効果を証明するものである。図５は、異なる形態のＣＦＩが、還元条件と非還元条件の両方の下で、ウェスタンブロット上にどのように出現するかを予想する図を提供する。
【０１４１】
フリンによるプロ−ｒＣＦＩの切断のためのｐＨの最適化
フリンと共にインキュベートした後、約８８および／または５０ｋＤａにバンドが存在しないことによって示されるように、反応をｐＨ７（レーン４および５）で実施した場合にプロ−ｒＣＦＩも成熟ｒＣＦＩも検出不可能であることを、図５Ａ（還元条件）および図５Ｂ（非還元条件）に示されるウェスタンブロットから見ることができる。反応をｐＨ５で実施した場合、図５Ａ中の約５０ｋＤａのバンドの存在および約８８ｋＤａのバンドの非存在は、全ての検出可能な量のプロ−ｒＣＦＩが成熟ＣＦＩ型に切断されたことを示している。
【０１４２】
プロ−ＣＦＩの切断のために、先行技術においては広いｐＨが提供されている。これらの実験は、反応のｐＨがプロ−ｒＣＦＩの成熟型への切断を最大化するのに役立ち得ることを示す。切断部位を露出するのに役立ち得るコンフォメーション変化のためタンパク質分解的切断の速度を増大させるには、わずかに酸性のｐＨが役立ち得ることが示唆された。ここでのデータは、高い速度の切断はｐＨ５で起こるが、他の反応条件および使用することができる反応物に応じて他のｐＨ値も高い速度の切断も可能にすることを示している。
【０１４３】
フリン濃度の最適化
低濃度のフリンでも、プロ−ＣＦＩの高い速度の切断を提供することができることを、図６Ａおよび図６Ｂから見ることができる。切断された成熟ｒＣＦＩに対応する約５０ｋＤａでの、還元条件（図６Ａ）で実施されたウェスタンブロットにおけるバンドの存在および切断されていないプロ−ＣＦＩに対応する約８８ｋＤａのバンドの非存在によって、これを見ることができる。フリンが１６の係数によって希釈された場合でも、比較的高い速度の切断が観察される。
【０１４４】
フリンによる切断は、プロ−ｒＣＦＩ対照に対応する図６Ａのレーン１に約５０ｋＤａのバンドが存在しないことによって確認される。タンパク質の分解が約５０ｋＤａに見られるバンドの原因であった場合、それは同様にプロ−ｒＣＦＩのみの対照について見られると予想される。
【０１４５】
イオン濃度の最適化
結果は、カリウムイオン濃度に関係なく、カルシウムイオンが切断の速度を増強することを示している。これは、レーン２の切断された成熟ｒＣＦＩに対応する約５０ｋＤａのバンドの存在によって図７Ａ中に見ることができる。より低いカルシウムイオン濃度（１ｍＭ  ＣａＣｌ２）で実施された切断反応の生成物を示し、あまり強くないレーン４の対応するバンドは、より高いカルシウムイオン濃度（５ｍＭ  ＣａＣｌ２）が切断速度を増大させることができることを示す。
【０１４６】
図８Ａおよび図８Ｂに示されるウェスタンブロットを比較した場合、図８Ｂのレーン２および４における切断された成熟ｒＣＦＩに対応するバンド（約５０ｋＤａ）が、図８Ａに見られるものよりも高い強度を有するという事実により、カリウムイオンの存在が、フリンによるプロ−ｒＣＦＩ切断の速度を増大させるのに役立ち得ることを見ることができる。
【０１４７】
しかし、より短いインキュベーション時間については、カリウムイオンの存在が、全てのプロ−ＣＦＩの成熟ＣＦＩへのより速い切断を可能にする切断反応の速度を上げるのに役立ち得ることがわかる。
【０１４８】
最適化試験の後、反応ミックスおよびフリンを使用するプロ−ＣＦＩの切断のための条件は、表１０に記載の通りであった。
【表１０】
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【０１４９】
最初にプロ−ｒＣＦＩを、１００ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５に交換した。試料を３７℃で１６時間インキュベートした。所与の反応条件を使用する場合、カリウムイオンが有する効果は無視できる程度であると考えられたため、カリウムイオンは反応には含有させなかった。
【０１５０】
Ｃ３ｂ不活化アッセイ：プロ−ｒＣＦＩと成熟ＣＦＩとの比較
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで切断された成熟ｒＣＦＩのｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を試験するために、Ｃ３ｂ不活化アッセイを実施した。ＣＦＩが活性成熟形態にある場合、それはα鎖の切断によってＣ３ｂをその不活性状態であるｉＣ３ｂに切断して、６８ｋＤａ（α１）および４６ｋＤａ（α２）の分子量を有する２つの鎖をもたらすと予想される。α２鎖は４３ｋＤａの最終分子量にさらに切断される。Ｃ３ｂの構造におけるこの変化を、ウェスタンブロットを使用してＣ３ｂ不活化反応の生成物を分析し、α鎖に対応するバンドの強度および出現と、α１およびα２鎖に対応するバンドの強度および出現とを比較することによって見ることができる。したがって、これは、Ｃ３ｂを切断する成熟ＣＦＩの活性へのアクセスを可能にする。
【０１５１】
対照実験（レーン２、３、４、５、６、および７）と比較した場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで切断された成熟ｒＣＦＩを含有する試料に対応するレーン８が、α１およびα２鎖に対応するバンドを含有する唯一の試料であることを、図９から見ることができる。これを、成熟ｓＣＦＩとのインキュベーションによって切断されたｉＣ３ｂについて見られるウェスタンブロットのバンドを比較することによって確認することができる。
【０１５２】
βおよびα１バンドの分離は、定義通り可能ではなかったため、２回目のウェスタンブロットを実施した。図１０は、βおよびα１バンドの分離を示すウェスタンブロット分析を示す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで切断されたｒＣＦＩの活性は、ｓＣＦＩと同等であると見ることができ、プロ−ＣＦＩのＣＦＩへの切断の量が比較的多いことを示している。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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