(57)【要約】  本発明は、次世代シークエンシングに基づき、マイクロサテライト座の安定性およびゲノム変化を同時に検出する方法（ｐｒｅｔｔｙＭＳＩ）、特に、結腸直腸癌患者の補助診断における該検出方法の使用、および対応するキットを提供する。前記のマイクロサテライト座は、表１に示されるような２２個のマイクロサテライト座、またはそのなかの任意の１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１個の遺伝子座の組み合わせから選択される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
表１に示される２２個のマイクロサテライト座またはそのなかの任意の１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１個の遺伝子座の組み合わせを含む、バイオマーカーの組み合わせ。
【請求項２】
表１に示される２２個のマイクロサテライト座である、請求項１に記載のバイオマーカーの組み合わせ。
【請求項３】
マイクロサテライト座と１種または複数種の遺伝子との組み合わせを含むバイオマーカーの組み合わせであって、
前記マイクロサテライト座は、表１に示される２２個のマイクロサテライト座、またはそのなかの任意の１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１個の遺伝子座の組み合わせを含み、
前記１種または複数種の遺伝子は、以下の３６個の遺伝子：ＢＲＡＦ、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＰＴＣＨ１、ＡＰＣＢＬＭ、ＢＭＰＲ１Ａ、ＣＨＥＫ２、ＥｐＣＡＭ、ＧＲＥＭ１、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＭＵＴＹＨ、ＰＭＳ２、ＰｅＯＬＤ１、ＰＯＬＥ、ＰＴＥＮ、ＳＭＡＤ４、ＳＴＫ１１、ＴＰ５３、ＡＫＴ１、ＡＴＭ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＤＨ１、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＫＩＴ、ＭＥＴ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＳＤＨＢ、ＳＤＨＣ、ＳＤＨＤからなる群から選択される任意の１種または複数種の遺伝子である、バイオマーカーの組み合わせ。
【請求項４】
前記マイクロサテライト座は、表１に示される２２個のマイクロサテライト座であり、および／または
前記１つまたは複数の遺伝子は、前記３６個の遺伝子である、請求項３に記載のバイオマーカーの組み合わせ。
【請求項５】
ＩＩ期の結腸直腸癌の予後評価および／または治療レジメンの選択、リンチ症候群（ＨＮＰＣＣ）の診断、予後評価および／または治療レジメンの選択のための遺伝子検査に使用され、
請求項１または２に記載のバイオマーカーの組み合わせを検出する検出試薬を含む、キット。
【請求項６】
結腸直腸癌の予後評価および／または治療レジメンの選択、結腸直腸癌の遺伝的感受性、および胃腸腫瘍の感受性を含む遺伝子検査を同時に行うために使用され、
請求項３または４に記載のバイオマーカーの組み合わせを検出する検出試薬を含む、キット。
【請求項７】
前記遺伝子検査は、家族性腺腫性ポリポーシス、散発性ＣＲＣ、リンチ症候群、および／または散発性ＭＳＩ＋ＣＲＣに対する遺伝子検査を含む、請求項６に記載のキット。
【請求項８】
前記検出試薬は、次世代シークエンシング（Ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ＮＧＳ）を実施するための試薬である、請求項５〜７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項９】
結腸直腸癌の予後評価および／または治療レジメンの選択、結腸直腸癌の遺伝的感受性、および胃腸腫瘍の感受性を含む遺伝子検査に使用されるキットの調製への、
請求項１〜４のいずれか一項に記載のバイオマーカーの組み合わせを検出する検出試薬の使用。
【請求項１０】
前記検出試薬は、次世代シークエンシングを実施するための試薬である、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記結腸直腸癌の予後評価および／または治療レジメンの選択のための遺伝子検査は、リンチ症候群（ＨＮＰＣＣ）の予後評価および／または治療レジメンの選択のための遺伝子検査である、請求項９に記載の使用。
【請求項１２】
（１）次世代シークエンシング法に基づき、複数の正常組織サンプル中の複数のマイクロサテライト座の多遺伝子標的キャプチャー（ｃａｐｔｕｒｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｐａｎｅｌ）検査を同時に行う工程；
（２）いずれかのマイクロサテライト座ｉについて、ＮＧＳデータに基づいて、その遺伝子座に対応する標的遺伝子型の異なる長さのシークエンシング断片をカバーするシークエンシング断片の読み取り（ｒｅａｄｓ）数を統計する工程、
標的遺伝子型は、正常組織サンプル中の該マイクロサテライト座の遺伝子型である；
（３）前記シークエンシング断片の数に従って、該マイクロサテライト座に対応する標的遺伝子型のカバー率を計算し、且つ該マイクロサテライト座の標準長さ分布参照セットを構築することにより、最も多くカバーされる１つまたは２つの長さタイプの平均カバー率ｍｅａｎ（ＮＴｉ）および標準偏差ｓｄ（ＮＴｉ）を計算する工程、
２番目に多くカバーされるシークエンシング断片の読み取り（ｒｅａｄｓ）数が最も多くカバーされる長さタイプのものの７５％未満である場合、最も多くカバーされる長さタイプのみが検討され、その平均カバー率および標準偏差を計算し、
２番目に多くカバーされるシークエンシング断片の読み取り（ｒｅａｄｓ）数が最も多くカバーされる長さタイプのものの７５％を超える場合、この両方の最もカバーされる長さタイプが検討され、この場合の平均カバー率は、２つの長さタイプの平均カバー率の合計である；
（４）結腸直腸癌サンプルについて、同様に前記の工程に従って決定された標的遺伝子型のカバー率を計算する工程、
カバー率が＜ｍｅａｎ（ＮＴｉ）−３ｓｄ（ＮＴｉ）である場合、該マイクロサテライト座は不安定なマイクロサテライト座であり、該マイクロサテライト座は、結腸直腸癌の予後評価および／または治療レジメンの選択のための遺伝子検査における候補マイクロサテライト座であると確認される；
を含み、次世代シークエンシングに基づき、結腸直腸癌の予後評価および／または治療レジメンの選択のための遺伝子検査に使用される候補マイクロサテライト座を決定する方法。
【請求項１３】
表１に示される前記２２個のマイクロサテライト座を含む、請求項１２に記載の方法に従って決定されるマイクロサテライト座。
【請求項１４】
前記結腸直腸癌の予後評価および／または治療レジメンの選択のための遺伝子検査は、リンチ症候群（ＨＮＰＣＣ）の予後評価および／または治療レジメンの選択のための遺伝子検査である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
（１）次世代シークエンシング法に基づき、結腸直腸癌サンプル中の複数のマイクロサテライト座の多遺伝子標的キャプチャー（ｃａｐｔｕｒｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｐａｎｅｌ）検査を同時に行う工程、
前記複数のマイクロサテライト座は、表１に示される２２個のマイクロサテライト座、またはそのなかの任意の１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１個の遺伝子座の組み合わせを含む；
（２）前記複数のマイクロサテライト座において、マイクロサテライト座に対応する標的遺伝子型をカバーするシークエンシング断片の読み取り（ｒｅａｄｓ）数が１０を超えるマイクロサテライト座の数は、ｎであり、標的遺伝子型は、正常組織サンプル中のマイクロサテライト座の遺伝子型であり、ｎ≧１５であり、ｎにおけるいずれかのマイクロサテライト座について、請求項１２に記載の方法でカバー率Ｔｉｊ＜ｍｅａｎ（ＮＴｉ）−３ｓｄ（ＮＴｉ）を満たすかどうかを判定することができ、マイクロサテライト座が表１に示される２２個のマイクロサテライト座である場合、表１のｍｅａｎ（ＮＴｉ）およびｓｄ（ＮＴｉ）に従って直接に計算を行う工程；
（３）前記の複数のマイクロサテライト座について、不安定なマイクロサテライト座の数が＞４０％＊ｎであれば、そのサンプルは高ＭＳＩサンプルであると判定され；数が１５％〜４０％＊ｎであれば、そのサンプルは低ＭＳＩサンプルであると判定され；数が＜１５％＊ｎであれば、そのサンプルはＭＳＳであると判定される工程；
を含み、次世代シークエンシングに基づき、結腸直腸癌サンプル中のマイクロサテライト座の安定性状態を判定する方法。
【請求項１６】
前記複数のマイクロサテライト座は、表１に示される２２個のマイクロサテライト座である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
（１）請求項１５に記載の複数のマイクロサテライト座と、以下の３６個の遺伝子：ＢＲＡＦ、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＰＴＣＨ１、ＡＰＣＢＬＭ、ＢＭＰＲ１Ａ、ＣＨＥＫ２、ＥｐＣＡＭ、ＧＲＥＭ１、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＭＵＴＹＨ、ＰＭＳ２、ＰＯＬＤ１、ＰＯＬＥ、ＰＴＥＮ、ＳＭＡＤ４、ＳＴＫ１１、ＴＰ５３、ＡＫＴ１、ＡＴＭ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＤＨ１、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＫＩＴ、ＭＥＴ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＳＤＨＢ、ＳＤＨＣ、ＳＤＨＤからなる群から選択される任意の１種または複数種の遺伝子とを同時に検出する工程；
（２）請求項１５に記載の方法に従って、前記サンプルのマイクロサテライト座の安定性状態を判定する工程；
（３）シークエンシングの結果に従って、前記１種または複数種の疾患関連遺伝子の検査の結果を得る工程；
（４）前記工程（２）、（３）の結果を組み合わせて、患者または家族の結腸直腸癌のリスク管理、治療および／または予後のレジメンに対する臨床指導を提供する工程；
を含み、次世代シークエンシングに基づき、患者の結腸直腸癌サンプル中の複数のマイクロサテライトの安定性および疾患関連遺伝子を同時に検出し、この患者または家族の結腸直腸癌のリスク管理、治療および／または予後のレジメンに対する臨床指導を提供する方法。
【請求項１８】
前記複数のマイクロサテライト座を検出する試薬を含む、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の方法に使用されるキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、次世代シークエンシングに基づき、マイクロサテライトの安定性および疾患関連遺伝子を同時に検出する方法に関する。また、本発明は、結腸直腸癌患者の補助診断、予後評価、または治療レジメンの選択における該検出方法の応用、ならびに対応するキットおよびキットの製造における検出試薬の応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
結腸直腸癌（Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ，ＣＲＣ）は、その発生率が中国の癌の中で３番目に高く、且つ癌による死因の５番目である。根治的切除後の５年生存率は約５０％であり、術後再発および転移は死亡の重要な原因である。初期の結腸直腸癌患者は通常外科的に切除することができるが、一旦転移すると、治療法は多くなく、５年生存率も満足のいくものではない。研究により、ゲノムの不安定性は結腸直腸癌の発症機序と密接に関連し、ゲノムの不安定性には染色体不安定性（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ，ＣＩ）およびマイクロサテライト不安定性（ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ，ＭＳＩ）が含まれることが判明された。そして、ＣＲＣの約８０〜８５％は、家族性腺腫性ポリポーシス（Ｆａｍｉｌｉａｌ  ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ  ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ、ＦＡＰ）（ＡＰＣ遺伝子生殖細胞系変異）および散発性ＣＲＣ（ＡＰＣ、Ｐ５３、ＤＣＣ、ＫＲＡＳなどの遺伝子変異）を含むＣＩＮとして現われ；ＣＲＣの他の１５〜２０％は、遺伝性非ポリポーシス結腸直腸癌（Ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ  Ｎｏｎｐｏｌｙｐｏｓｉｓ  Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ、ＨＮＰＣＣ、リンチ症候群とも称する）（ミスマッチ修復遺伝子生殖細胞系変異）および散発性ＭＳＩ（＋）ＣＲＣ（ミスマッチ修復遺伝子ＭＬＨ１遺伝子プロモーターメチル化）を含むＭＳＩとして現われる。
【０００３】
マイクロサテライトは、遺伝子に含まれる反復ＤＮＡ短配列または単一ヌクレオチド領域である。腫瘍細胞において、ＤＮＡメチル化または遺伝子突然変異によりミスマッチ修復遺伝子の欠失を引き起こすと、マイクロサテライト反復配列ミスマッチ（マイクロサテライト変異）が引き起こされ、その配列が短縮または延長され、それによってマイクロサテライト不安定性（ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ，ＭＳＩ）がもたらされる。ＭＳＩの不安定性の程度に応じて、高マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ−Ｈ）および低マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ−Ｌ）に分け、通常の条件下ではマイクロサテライト安定性（ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ、ＭＳＳ）と呼ばれる。
【０００４】
ＭＳＩは悪性腫瘍の発症に関与しており、結腸直腸癌、胃癌および子宮内膜癌と密接に関連していることが多数の研究により示されている。結腸直腸癌患者の約１５％がＭＳＩ現象を示し、そのなかの典型的な遺伝性非ポリポーシス性結腸直腸癌（ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ  ｎｏｎｐｏｌｙｐｏｓｉｓ  ｃｏｌｅｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ  、ＨＮＰＣＣ）患者の９０％以上がＭＳＩを示し、これは、ＭＳＩがＨＮＰＣＣ患者を検出する際の重要なマーカーとして使用できることを表す。ＭＳＳ（即ち、マイクロサテライト安定性）の結腸直腸癌と比較して、ＭＳＩを有する結腸直腸癌患者は、予後がより良好であり、また、両者の薬物応答性も異なり、これはＭＳＩが結腸直腸癌の予後の独立した予測因子として使用できることを示唆する。したがって、ＭＳＩ検査は結腸直腸癌患者にとって非常に重要である。
【０００５】
２０１６年最新版の全米総合癌情報ネットワーク（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｎｅｔｗｏｒｋ、ＮＣＣＮ、２０１６  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２）の結腸直腸癌治療ガイドラインは、はじめて「結腸直腸癌の既往歴のあるすべての患者は、ＭＭＲ（ミスマッチ修復）またはＭＳＩの検査を受けるべきである」と明確に述べている。それは、ＭＳＩ−Ｈ（即ち、高マイクロサテライト不安定性）のＩＩ期結腸直腸癌の予後は良好（単純手術５ｙ−ＯＳ率が８０％）であり、且つ５ＦＵ補助化学療法の恩恵を受けることができない（逆に有害である）ためである。また、ガイドラインは、はじめてＰＤ−１モノクローナル抗体ＰｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂおよびＮｉｖｏｌｕｍａｂを、ｄＭＭＲ／ＭＳＩ−Ｈ分子表現型を有するｍＣＲＣ末期治療に応用することを推奨し、末期結腸直腸癌におけるＭＭＲおよびＭＳＩの検出の重要性を十分に実証している。同時に、遺伝性結腸直腸癌に関連する遺伝子の数が多いため、２０１６年最新のＮＣＣＮ結腸直腸癌遺伝的リスク評価ガイドラインには、明らかな家族歴を有する患者およびその家族は、多遺伝子パネル（ｐａｎｅｌ）シークエンシングを使用し最初の検出を実施することを推奨している。
【０００６】
現在、中国の病院で実施されているＭＭＲ遺伝子検査は、免疫組織化学的検出に基づくタンパク質検査であり、通常、ＭＬＨ１とＭＳＨ２のみを含み、一部にはＭＳＨ６とＰＭＳ２も同時に含み、その陽性結果とＭＳＩ検査結果との一致率が少ない。わずかな病院はキャピラリー電気泳動法と組み合わせたＰＣＲ法によるＭＳＩ状態検出を行い、それらのほとんどは、外部委託検出である。この方法では、通常、５〜１１個の単一ヌクレオチド反復部位が選択され、その長さが約２５ｂｐであり、ＰＣＲ増幅後、キャピラリー電気泳動によってその長さ分布間隔を測定して、サンプルのマイクロサテライト（不）安定性状態を判定する。この方法は、現在のゴールドスタンダード検出方法であるが、実施するために追加のサンプルが必要であり、且つ状態判定のために対照として患者の正常組織が必要であるので、取り扱い性の観点から便利ではない。
【０００７】
従って、如何にして効率的で便利なＭＳＩ検出システムを確立すること、および結腸直腸癌を検出するための高感度で特異的なＭＳＩ遺伝子座を見つけることは、近年研究のホットスポットとなっている。さらに、サンプルのマイクロサテライト安定性状態と他の疾患関連遺伝子の状態とをどのようにして同時に検出できるかという問題も解決される必要がある。
【発明の概要】
【０００８】
本発明が解決しようとする技術的課題は、従来技術の欠点を克服し、次世代シークエンシングプラットフォームに基づくＭＳＩ検出方法を提供し、且つ該検出方法に基づいて結腸直腸癌を検出するための高感度で特異的なＭＳＩ遺伝子座を得ることである。この方法は、ｐｒｅｔｔｙＭＳＩ（Ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ  Ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｐｅａｋ  Ｒａｔｉｏ  Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  Ｔｕｍｏｒ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｏｎｌｙ）と命名され、対応する中国語名は「腫瘍組織のみを利用する次世代シークエンシングにおける標的ピーク高さ比に基づいてマイクロサテライト不安定性を検出する方法」である。さらに、本発明は、結腸直腸癌の予後評価および／または治療レジメンの選択に利用できる遺伝子検査において候補マイクロサテライト座を判定するための方法を確立する。さらに、本発明は、サンプル中の複数のマイクロサテライト座および複数の疾患関連遺伝子を同時に検出することを実現し、且つ検出されたサンプルについて予後、治療、および検査に関するより全面的な結論および提案を提供することができる。
【０００９】
本発明者らは、正常サンプルのマイクロサテライト座について、シークエンシング断片の読み取り（ｒｅａｄｓ）が高い確率でサンプルの遺伝子型に対応する１種または２種の反復配列長をカバーし；マイクロサテライト不安定性サンプルについて、そのマイクロサテライト座は、ＤＮＡの不正確な複製により多数の反復配列が拡大または縮小され、その結果、シークエンシング断片の読み取り（ｒｅａｄｓ）が正常サンプルの対応する遺伝子型をカバーする確率は明らかに低下することを見出した。本発明において、正常サンプルの対応する遺伝子型を標的遺伝子型と称する。実験のシークエンスキャプチャーおよびシークエンシングは必然的なエラー率があるため、異なるサンプルのシークエンシング断片の読み取り（ｒｅａｄｓ）が標的遺伝子型をカバーする確率は異なる。本発明者らは、マーカーマイクロサテライト座は、正常サンプルにおいて標的遺伝子型をカバーする確率が十分に安定であるが、マイクロサテライト不安定性サンプルにおいて標的遺伝子型をカバーする確率が正常値よりはるかに小さいことを見出した。この知見に基づいて、本発明者らは、２２個の遺伝子座（詳細については表１を参照）を選択し、さらに多数の正常組織サンプルにおいてその２２個の遺伝子座のカバー率ベクトルＲおよび標的遺伝子型のカバー率ＮＴからなるマイクロサテライト状態検出用の基礎長さ分布参照セットを構築した。
【００１０】
【表１】
2020505925.tif 000002
＊は、ＮＧＳおよびＰＣＲ技術によるマイクロサテライト検出に使用される５つのマーカー座位であり、それぞれはＢＡＴ−２６、ＮＲ−２４、ＢＡＴ−２５、ＮＲ−２２、ＮＲ−２１である。表に記載されているｍｅａｎとｓｄは、各遺伝子座の長さ分布参照セットによって得られる正常範囲の平均値と分散であり、標的遺伝子型のカバー率がｍｅａｎ−３ｓｄより小さければ、該遺伝子座はＭＳＩ遺伝子座であると判定され、ここで、該ｓｄの倍数である３は２２個の遺伝子座に適している。
【００１１】
本発明は、次世代シークエンシングのシーケンス特性に従って、次世代シークエンシングに適する新規なマイクロサテライト安定性の検出方法（ｐｒｅｔｔｙＭＳＩ）を開発した。ＰＣＲ電気泳動に基づくＭＳＩ検出のゴールドスタンダードと比較して、該検出方法は、正しいマッチング確率を有するうえに、より速くそしてより安価である。同時に、本発明の方法によれば、安定な正常サンプルのマイクロサテライト長さ分布参照セットが構築され、患者がマッチング用の正常サンプルを提供しなくても検出を完成することができ、これは実用の観点から非常に重要である。
【００１２】
さらに、本発明の方法は、ハイスループット次世代シークエンシング技術に基づき、一度にマルチサンプルの配列分析を行うことができ、また、遺伝子変異および染色体変異などのゲノム変化を検出しながらマイクロサテライト状態の検出を完了することができ、追加の実験操作は要らず、検出時間および患者検査の費用を大幅に節約する。本発明中の多遺伝子パネル（ｐａｎｅｌ）は、ＮＣＣＮ治療ガイドラインにおける結腸直腸癌の治療および予後と明確的に関連する遺伝子、ＮＣＣＮ治療ガイドラインにおける明確的な結腸直腸癌の遺伝的感受性遺伝子、および他の胃腸腫瘍に関連する遺伝子の全部エクソンをさらに検出する。具体的には、以下の３６個の遺伝子を含む：ＢＲＡＦ、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＰＴＣＨ１、ＡＰＣＢＬＭ、ＢＭＰＲ１Ａ、ＣＨＥＫ２、ＥｐＣＡＭ、ＧＲＥＭ１、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＭＵＴＹＨ、ＰＭＳ２、ＰＯＬＤ１、ＰＯＬＥ、ＰＴＥＮ、ＳＭＡＤ４、ＳＴＫ１１、ＴＰ５３、ＡＫＴ１、ＡＴＭ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＤＨ１、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＫＩＴ、ＭＥＴ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＳＤＨＢ、ＳＤＨＣ、ＳＤＨＤ。
【００１３】
本発明の技術構成は、具体的に以下の内容を含む。
【００１４】
一態様において、本発明は、表１に示されるような２２個のマイクロサテライト座、またはそのなかの任意の１５、１６、１７、１８、１９、２０或いは２１個の遺伝子座の組み合わせを含む、バイオマーカーの組み合わせに関する。好ましくは、前記バイオマーカーの組み合わせは、表１に示される２２個のマイクロサテライト座である。
【００１５】
他の態様において、本発明は、マイクロサテライト座と１種または複数種の遺伝子との組み合わせを含むバイオマーカーの組み合わせに関する。前記のマイクロサテライト座は、表１に示される２２個のマイクロサテライト座またはそのなかの任意の１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１個の遺伝子座の組み合わせを含む。ここで、前記の１種または複数種の遺伝子は、以下の３６個の遺伝子：ＢＲＡＦ、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＰＴＣＨ１、ＡＰＣＢＬＭ、ＢＭＰＲ１Ａ、ＣＨＥＫ２、ＥｐＣＡＭ、ＧＲＥＭ１、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＭＵＴＹＨ、ＰＭＳ２、ＰｅＯＬＤ１、ＰＯＬＥ、ＰＴＥＮ、ＳＭＡＤ４、ＳＴＫ１１、ＴＰ５３、ＡＫＴ１、ＡＴＭ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＤＨ１、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＫＩＴ、ＭＥＴ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＳＤＨＢ、ＳＤＨＣ、ＳＤＨＤからなる群から選択される任意の１種または複数種の遺伝子である。好ましくは、前記バイオマーカーの組み合わせにおいて、前記マイクロサテライト座が、表１に示される２２個のマイクロサテライト座であり、および／または前記１種または複数種の遺伝子は、前記３６個の遺伝子である。
【００１６】
他の態様において、本発明は、ＩＩ期の結腸直腸癌の予後評価および／または治療レジメンの選択、ならびにリンチ症候群（ＨＮＰＣＣ）の診断、予後評価および／または治療レジメンの選択のための遺伝子検査に使用されるキットに関する。前記キットは、前記マイクロサテライト座の組み合わせを検出する検出試薬を含む。
【００１７】
他の態様において、本発明は、結腸直腸癌の予後評価および／または治療レジメンの選択、結腸直腸癌の遺伝的感受性、および胃腸腫瘍の感受性を含む遺伝子検査を同時に行うために使用されるキットに関する。前記キットは、前記マイクロサテライト座と１種または複数種の遺伝子との組み合わせを検出する検出試薬を含む。好ましくは、前記遺伝子検査が、家族性腺腫性ポリポーシス、散発性ＣＲＣ、リンチ症候群、および／または散発性ＭＳＩ＋ＣＲＣに対する遺伝子検査を含む。好ましくは、前記検出試薬が、次世代シークエンシング（Ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、ＮＧＳ）を実施するための試薬である。
【００１８】
他の態様において、本発明は、結腸直腸癌の予後評価および／または治療レジメンの選択、結腸直腸癌の遺伝的感受性、および胃腸腫瘍の感受性を含む遺伝子検査に使用されるキットの調製への、前記バイオマーカーの組み合わせを検出する検出試薬の使用に関する。好ましくは、前記検出試薬は、次世代シークエンシングを実施するための試薬である。より好ましくは、前記結腸直腸癌の予後評価および／または治療レジメンの選択のための遺伝子検査は、リンチ症候群（ＨＮＰＣＣ）の予後評価および／または治療レジメンの選択のための遺伝子検査である。
【００１９】
他の態様において、本発明は、次世代シークエンシングに基づき、結腸直腸癌の予後評価および／または治療レジメンの選択のための遺伝子検査に使用される候補マイクロサテライト座を決定する方法に関する。この方法は以下の工程を含む。
（１）次世代シークエンシング法に基づき、複数の正常組織サンプル中の複数のマイクロサテライト座の多遺伝子標的キャプチャー（ｃａｐｔｕｒｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｐａｎｅｌ）検査を同時に行う；
（２）いずれかのマイクロサテライト座ｉについて、ＮＧＳデータに基づいて、その遺伝子座に対応する標的遺伝子型の異なる長さのシークエンシング断片をカバーするシークエンシング断片の読み取り（ｒｅａｄｓ）数を統計する。標的遺伝子型は、正常組織サンプル中の該マイクロサテライト座の遺伝子型である；
（３）前記シークエンシング断片の数に従って、該マイクロサテライト座に対応する標的遺伝子型のカバー率を計算し、且つ該マイクロサテライト座の標準長さ分布参照セットを構築することにより、最も多くカバーされる１つまたは２つの長さタイプの平均カバー率ｍｅａｎ（ＮＴｉ）および標準偏差ｓｄ（ＮＴｉ）を計算する。
【００２０】
ここで、２番目に多くカバーされるシークエンシング断片の読み取り（ｒｅａｄｓ）数が最も多くカバーされる長さタイプのものの７５％未満である場合、最も多くカバーされる長さタイプのみが検討され、その平均カバー率および標準偏差を計算する。
【００２１】
一方、２番目に多くカバーされるシークエンシング断片の読み取り（ｒｅａｄｓ）数が最も多くカバーされる長さタイプのものの７５％を超える場合、この両方の最もカバーされる長さタイプが検討され、この場合の平均カバー率は、２つの長さタイプの平均カバー率の合計である；
（４）結腸直腸癌サンプルについて、同様に前記の工程に従って決定された標的遺伝子型のカバー率を算出する。カバー率が＜ｍｅａｎ（ＮＴｉ）−３ｓｄ（ＮＴｉ）である場合、該マイクロサテライト座は不安定なマイクロサテライト座であり、該マイクロサテライト座は、結腸直腸癌の予後評価および／または治療レジメンの選択のための遺伝子検査における候補マイクロサテライト座であると確認される。
【００２２】
好ましくは、前記方法によって決定されるマイクロサテライト座は、表１に示される２２個のマイクロサテライト座、またはその中の１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１個の遺伝子座の組み合わせを含む。好ましくは、前記結腸直腸癌の予後評価および／または治療レジメンの選択のための遺伝子検査は、リンチ症候群（ＨＮＰＣＣ）の予後評価および／または治療レジメンの選択のための遺伝子検査である。
【００２３】
他の態様において、本発明は、次世代シークエンシングに基づき、結腸直腸癌サンプル中のマイクロサテライト座の安定性状態を判定する方法に関する。この方法は以下の工程を含む。
【００２４】
（１）次世代シークエンシングに基づき、多遺伝子パネル（ｐａｎｅｌ）、即ちマイクロサテライト座の組み合わせを検出する；
（２）次世代シークエンシングのデータに基づいて、遺伝子座の異なる長さの反復配列をカバーするシークエンシング断片の読み取り（ｒｅａｄｓ）数を統計する；
（３）カバー率を算出し、多数の正常サンプルにおけるその分布により、マイクロサテライト座の標準長さ分布参照セットを構築する；
（４）サンプルの各マイクロサテライト座について、工程（２）で異なる長さのシークエンシング断片の読み取り（ｒｅａｄｓ）数を統計し、工程（３）で標的遺伝子型のカバー率を算出する；
（５）算出されたカバー率を標準参照セットと比較し、マイクロサテライト座の安定性状態を判断し、不安定なマイクロサテライト座の割合から、サンプルのマイクロサテライト座の安定性状態を判断する。
【００２５】
前記の方法において、好ましくは、検出されるマイクロサテライト座は、表１に示される２２個のマイクロサテライト座を含む。前記の方法において、前記工程（５）における判断は、以下の通りである：不安定なマイクロサテライト座の数が＞４０％であれば、そのサンプルは高ＭＳＩサンプルであると判定される；数が１５％〜４０％であれば、そのサンプルは低ＭＳＩサンプルであると判定される。
【００２６】
好ましくは、前記の方法は以下の工程を含む。
【００２７】
（１）次世代シークエンシング法に基づき、サンプル中の複数のマイクロサテライト座の多遺伝子標的キャプチャー（ｃａｐｔｕｒｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｐａｎｅｌ）検査を同時に行う。前記複数のマイクロサテライト座は、表１に示される２２個のマイクロサテライト座、またはそのなかの任意の１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１個の遺伝子座の組み合わせを含む；
（２）前記複数のマイクロサテライト座において、マイクロサテライト座に対応する標的遺伝子型をカバーするシークエンシング断片の読み取り（ｒｅａｄｓ）数が１０を超えるマイクロサテライト座の数は、ｎであり、標的遺伝子型は、正常組織サンプル中のマイクロサテライト座の遺伝子型であり、ｎ≧１５である。ｎにおけるいずれかのマイクロサテライト座について、前記の方法でカバー率Ｔｉｊ＜ｍｅａｎ（ＮＴｉ）−３ｓｄ（ＮＴｉ）を満たすかどうかを判定することができる。マイクロサテライト座が表１に示される２２個のマイクロサテライト座である場合、表１のｍｅａｎ（ＮＴｉ）およびｓｄ（ＮＴｉ）に従って直接に計算を行うことができる；
（３）前記の複数のマイクロサテライト座について、不安定なマイクロサテライト座の数が＞４０％＊ｎであれば、そのサンプルは高ＭＳＩサンプルであると判定される。数が１５％〜４０％＊ｎであれば、そのサンプルは低ＭＳＩサンプルであると判定される。数が＜１５％＊ｎであれば、そのサンプルはＭＳＳであると判定される。
好ましくは、前記方法における前記複数のマイクロサテライト座は、表１に示される２２個のマイクロサテライト座である。
【００２８】
具体的には、下記の表８の統計結果を参照して、６５個のサンプルのうち、各サンプルにおいて十分にカバーされる遺伝子座の数は１５から２２の間に分布している。これらのうち最も一般的なものは、５つのＰＣＲ遺伝子座が十分にカバーされていないことで、それ以外にも、各サンプル間で３つの遺伝子座がランダムに十分にカバーされていない。しかしながら、上記のように、マイクロサテライト座に対応する標的遺伝子型をカバーするシークエンシング断片の読み取り（ｒｅａｄｓ）数が１０を超えるマイクロサテライト座は、遺伝子座の統計に含められる。
【００２９】
他の態様において、本発明は、結腸直腸癌サンプルに対してマイクロサテライト安定性と疾患関連遺伝子とを同時に検出する方法に関する。前記の方法において、次世代シークエンシングに基づき、マイクロサテライト座の検出に加えて、以下の３６個の遺伝子：ＢＲＡＦ、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＰＴＣＨ１、ＡＰＣＢＬＭ、ＢＭＰＲ１Ａ、ＣＨＥＫ２、ＥｐＣＡＭ、ＧＲＥＭ１、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＭＵＴＹＨ、ＰＭＳ２、ＰＯＬＤ１、ＰＯＬＥ、ＰＴＥＮ、ＳＭＡＤ４、ＳＴＫ１１、ＴＰ５３、ＡＫＴ１、ＡＴＭ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＤＨ１、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＫＩＴ、ＭＥＴ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＳＤＨＢ、ＳＤＨＣ、ＳＤＨＤからなる群から選択される任意の１種または複数種の遺伝子を同時に検出する。そして、マイクロサテライト座の安定性状態の結果と１種または複数種の遺伝子の検出の結果とを組み合わせて、サンプルの状態を判断する。
【００３０】
他の態様において、本発明は、マイクロサテライト座を検出する試薬および／または１種または複数種の遺伝子を検出する試薬を含む、上記のいずれかの方法に使用されるキットに関する。好ましくは、前記キットに含まれるキットは、次世代シークエンシングを実施するための試薬である。好ましくは、前記結腸直腸癌は、遺伝性非ポリポーシス結腸直腸癌（Ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ  Ｎｏｎｐｏｌｙｐｏｓｉｓ  Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ，ＨＮＰＣＣ,リンチ症候群とも称する）である。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、異なる種類のサンプルのＰＣＲ検出、および表１中のＭＳＩ−ＢＲ１で命名されたマイクロサテライト座の検出の結果を示すグラフである。（ａ）は、１つのＭＳＩ−Ｈの癌組織のサンプル（表７中のＲＳ１６０７５８６ＦＦＰに対応する）およびその対になった側癌性組織の（ａ−１）ＰＣＲ検出における９つのマーカー座位を示すグラフである。（ａ−２）は、マイクロサテライト座であるＭＳ−ＢＲ１の異なる反復長の配列をカバーするシークエンシング断片の読み取り（ｒｅａｄｓ）の数を示すヒストグラムである。（ｂ）は、１つのＭＳＳ癌組織サンプル（表７中のＲＳ１６０８８３９ＦＦＰに対応する）およびその対になった側癌性組織の（ｂ−１）ＰＣＲ検出における９つのマーカー座位を示すグラフである。（ｂ−２）は、マイクロサテライト座であるＭＳ−ＢＲ１の異なる反復長の配列をカバーするシークエンシング断片の読み取り（ｒｅａｄｓ）の数を示すヒストグラムである。横座標は反復長であり、縦座標はカバー範囲（シークエンシング断片数）である。
【図２】図２は、マイクロサテライト座であるＭＳＩ−ＢＲ２の長さ分布参照セットおよび判定基準を示す例示図である。
【図３】図３は、番号ＲＳ１６１１０１８ＦＦＰの癌組織サンプル（１、３、５行目）および側癌性組織サンプル（２、４、６行目）における２２個のマイクロサテライト座の検出結果を示すヒストグラムである。
【図４】図４は、番号ＲＳ１６０８８２３ＦＦＰの癌組織サンプル（１、３、５行目）および側癌性組織サンプル（２、４、６行目）における２２個のマイクロサテライト座の検出結果を示すヒストグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
以下、本発明を特定の実施例に基いてさらに具体的に説明する。
実施例
【００３３】
実施例に含まれる実験サンプルはすべて、中国の結腸直腸癌の診断および治療の分野における上位の三級甲等病院からのものであり、すべての実験サンプルは、ＩＨＣ陽性腫瘍および側癌性正常組織サンプルとして明確に診断された。実験に使用される機器、試薬、キット、および分析ソフトウェアは市販されている。
方法および手順
【００３４】
１．次世代シークエンシング法に基づき、多遺伝子パネル（ｐａｎｅｌ）検出を実施する。具体的な手順は、以下の通りである。
【００３５】
ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  ＦＦＰＥｔｉｓｓｕｅ  ｋｉｔを用いて腫瘍組織お側癌性正常組織のＤＮＡを抽出した。Ｑｕｂｉｔ  ３．０蛍光光度計のｄｓＤＮＡ  ＨＳ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔを用いて正確な定量を行った。次いで、超音波処理装置Ｃｏｖａｒｉｓ  Ｍ２２０を使用して、ＤＮＡを１８０〜２５０ｂｐの断片に物理的に断片化した後、末端修復、リン酸化、３’末端へのデオキシアデニンの付加、およびリンカーの連結を行った。次いで、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ常磁性ビーズを利用して、増幅リンカーに連結されたＤＮＡを精製し、そしてＰＣＲポリメラーゼを用いて予備増幅し、増幅産物を精製したものを、Ａｇｉｌｅｎｔからオーダーした多重ビオチン標識プローブセットとハイブリダイズさせた（該多遺伝子パネル（ｐａｎｅｌ）の設計は、３６個の遺伝子のエクソンおよび一部のイントロン領域配列を含む）。ハイブリダイズした断片を特異的に溶出し、ＰＣＲポリメラーゼによって濃縮、増幅した後、定量化および断片長分布の測定を行い、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンサーを用いて次世代シークエンシングを実施した。ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  ＦＦＰＥ  ｔｉｓｓｕｅ  ｋｉｔを用いて腫瘍組織および側癌性正常組織のＤＮＡを抽出した。Ｑｕｂｉｔ  ２．０蛍光光度計、ｄｓＤＮＡ  ＨＳ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔｓを用いて定量を行った。Ｃｏｖａｒｉｓ  Ｍ２２０でＤＮＡを断片化した後、末端修復、リン酸化およびリンカー連結を行った。Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ  ｋｉｔを使用して、長さ２００〜４００  ｂｐの断片を選択し、多遺伝子パネル（ｐａｎｅｌ）に含まれる３６個の遺伝子のエクソンおよび一部のイントロン領域配列に従って設計されたＡｇｉｌｅｎｔマルチプルキャプチャープローブとハイブリダイズさせた。ハイブリダイズした断片を磁気ビーズで精製し、ＰＣＲ増幅して、質量および長さを測定した後、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンサーを用いて次世代シークエンシングを実施した。測定した配列を、ＢＷＡバージョン０．７．１０を用いてヒトゲノム配列（バージョンｈｇ１９）と整列（アラインメント）し、それぞれＧＡＴＫ  ３．２、ＭｕＴｅｃｔおよびＶａｒＳｃａｎを用いて局所アラインメント最適化、突然変異応答（ｃａｌｌｉｎｇ）および注釈付け（ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ）を行った。なお、突然変異応答（ｃａｌｌｉｎｇ）については、ＶａｒＳｃａｎｆｐ  ｆｉｌｔｅｒは、カバー深さの１００ｘ以下の遺伝子座を除去し；挿入欠失（ｉｎｄｅｌ）および単一遺伝子座変異については、それぞれ少なくとも５つおよび８つの変異のシークエンシング断片の読み取り（ｒｅａｄｓ）が必要である。
【００３６】
２．マイクロサテライト不安定性の検出方法。その具体的な手順は、以下の通りである。
【００３７】
手順１：ＮＧＳデータに基づいて、遺伝子座の異なる長さの反復配列をカバーするシークエンシング断片の読み取り（ｒｅａｄｓ）数を統計する。各マイクロサテライト座について、まず、ヒトゲノムにおいてその位置情報および両末端の配列を検索し、両末端の配列で連結された１〜Ｌ−１０ｂｐの中間反復配列長さを有するすべての配列を検索辞書として構築した。ここで、Ｌは、シークエンシング断片の読み取り（ｒｅａｄｓ）の長さである。
【００３８】
手順２：カバー率を計算し、マイクロサテライト座の標準参照セットを構築する。
【００３９】
上記シークエンシング断片数に従って該マイクロサテライト座に対応する標的遺伝子型のカバー率を計算し、該マイクロサテライト座の標準長さ分布参照セットを構築する。それにより、最も多くカバーされる１つまたは２つの長さタイプの平均カバー率ｍｅａｎ（ＮＴｉ）および標準偏差ｓｄ（ＮＴｉ）を計算する。ここで、２番目に多くカバーされるシークエンシング断片の読み取り（ｒｅａｄｓ）数が最も多くカバーされる長さタイプのものの７５％未満である場合、最も多くカバーされる長さタイプのみが検討され、その平均カバー率および標準偏差を計算する。一方、２番目に多くカバーされるシークエンシング断片の読み取り（ｒｅａｄｓ）数が最も多くカバーされる長さタイプのものの７５％を超える場合、この両方の最もカバーされる長さタイプが検討され、この場合の平均カバー率は、２つの長さタイプの平均カバー率の合計である。
【００４０】
表１中のＭＳＩ−ＢＲ１と命名されたマイクロサテライト座を代表的な例として、該マイクロサテライトマイクロサイトの標準参照セットの構築方法を説明する。ＭＳＩ−ＢＲ０１マイクロサテライトは、第１染色体上のある一塩基のマイクロサテライト座（１４Ｔ、Ｔは反復塩基、１４は反復数）であり、その両末端の配列は、それぞれＡＴＴＣＣおよびＧＣＴＴＴであり、構築された検索辞書にはＡＴＴＣＣＴＧＣＴＴＴ（反復長：１）、ＡＴＴＣＣＴＴＧＣＴＴＴ（反復長：２）、ＡＴＴＣＣＴＴＴＧＣＴＴＴ（反復長：３）などを含む。癌サンプルのシークエンシング結果のファイルから、少なくとも１つの末端が遺伝子座付近の２ｋｂ以内に位置する対になるシークエンシング断片（ｒｅａｄ  ｐａｉｒｓ）を抽出し、それを該遺伝子座の検索辞書における配列と整列させた。検索辞書内の異なる長さの配列をカバーするシークエンシング断片の読み取り（ｒｅａｄｓ）数を統計し、遺伝子座のすべての長さタイプをカバーするシークエンシング断片の読み取り（ｒｅａｄｓ）数のヒストグラムを構築した。
【００４１】
図１に示されるように、ａ−２およびｂ−２部分は、それぞれ癌サンプルおよび側癌性サンプルにおけるＭＳＩ−ＢＲ１高マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ−Ｈ）およびＭＳＩ−ＢＲ１マイクロサテライト安定性（ＭＳＳ）の遺伝子座のヒストグラムである。図に示されるように、ＭＳＩ−Ｈ遺伝子座のヒストグラムは、癌サンプルと側癌性サンプルとの間で明らかな異なりがある。ａ−２の癌サンプルグラフおよびｂ−２の２つのグラフから、ＭＳＩ−ＢＲ１が選択可能なマイクロサテライト座であることは確認された。
【００４２】
図２に示されるように、それはマイクロサテライト座ＭＳＩ−ＢＲ２の長さ分布参照セットと判定基準を示す例示図である。横座標のｍｅａｎ−３ｓｄ線の左側の点は、ＭＳＩ−Ｈ癌組織サンプルの例であり、右側の三角形は、ＭＳＳ癌組織サンプルの例である。ここで、目標遺伝子型のカバー率は、参照セット内において正規分布に適合し、その平均カバー率０．９１、標準偏差０．０２は、上記手順２により得られる。
【００４３】
図３および図４に示されるように、それは２つの異なる番号の癌組織サンプル（１、３、５行目）および側癌性組織サンプル（２、４、６行目）における２２個のマイクロサテライト座の検出の結果のヒストグラムである。その結果は、それぞれＭＳＩ−ＨとＭＳＳである。ここで、横座標は、標的遺伝子型の長さタイプであり、縦座標は、標的遺伝子型のシークエンシング断片の読み取り（ｒｅａｄｓ）数である。
【００４４】
なお、同一遺伝子座の上下の対応は、観察の便宜上のものであり、実際の検出過程では、対照サンプルとしての側癌性組織は必要ではなく、癌組織サンプルの結果からカバー率Ｔｉｊ＜ｍｅａｎ（ＮＴｉ）−３ｓｄ（ＮＴｉ）を満たすかどうかを計算することのみで、該マイクロサテライト座が不安定なマイクロサテライト座であるかどうかを判定できる。
【００４５】
手順３：癌サンプルｊの各マイクロサテライトマーカー座位ｉについて、異なる長さのシークエンシング断片の読み取り（ｒｅａｄｓ）数を手順１により統計し、標的遺伝子型のカバー率（Ｔｉｊ）を手順２により計算する。
【００４６】
前記複数のマイクロサテライト座において、マイクロサテライト座に対応する標的遺伝子型をカバーするシークエンシング断片の読み取り（ｒｅａｄｓ）数が１０を超えるマイクロサテライト座の数は、ｎであり、標的遺伝子型は、正常組織サンプル中のマイクロサテライト座の遺伝子型であり、ｎ≧１５である。ｎにおけるいずれかのマイクロサテライト座について、前記方法でカバー率Ｔｉｊ＜ｍｅａｎ（ＮＴｉ）−３ｓｄ（ＮＴｉ）を満たすかどうかを判定することができる。マイクロサテライト座が表１に示される２２個のマイクロサテライト座である場合、表１のｍｅａｎ（ＮＴｉ）およびｓｄ（ＮＴｉ）に従って直接に計算を行うことができる。
【００４７】
手順４：表１に記載されたマイクロサテライト座のカバー率を順番に検出し、それらの対応する標準参照セットと比較して、手順３によりマイクロサテライト座の安定性を判定する。１つの癌サンプルについて、表１に記載されたマイクロサテライト座の状態を検出し、不安定なマイクロサテライト座の数が＞４０％＊ｎであれば、そのサンプルは高ＭＳＩサンプルであると判定され、数が１５％〜４０％＊ｎであれば、そのサンプルは低ＭＳＩサンプルであると判定され、その数が＜１５％＊ｎであれば、そのサンプルはＭＳＳであると判定される。
【００４８】
さらに、サンプル中に存在する可能性があるが参照セットに現れない遺伝子型（シークエンシング断片読み取り（ｒｅａｄｓ）は、新しい長さタイプを大量にカバーする）について、マイクロサテライト不安定性であると判定される遺伝子座に対して、最も多くカバーされる２つの長さタイプ（２番目に多くカバーされるシークエンシング断片の読み取り（ｒｅａｄｓ）数が最も高いピークの７５％未満である場合、最も高いピークに対応する長さタイプのみが検討される）について、該長さとヒトゲノム参照シーケンスの長さとの偏差が２ｂｐ未満である場合、該長さの配列も候補遺伝子型とし、手順２の参照セット構築方法に従って標準カバー率を計算し、正常サンプルの標的遺伝子型の比率ベクトルＮＴｉおよび癌サンプルのカバー率を再計算する。依然としてＴｉｊ＜ｍｅａｎ（ＮＴｉ）−３ｓｄ（ＮＴｉ）を満たす場合、該遺伝子座は、不安定なマイクロサテライト座であると判定され、そうでなければ、該遺伝子座は、ただ潜在的に不安定なマイクロサテライト座であると判定される。
【００４９】
３．実施例で使用される多遺伝子パネル（ｐａｎｅｌ）は、また、ＮＣＣＮ治療ガイドラインにおける結腸直腸癌の治療および予後と明確的に関連する遺伝子、ＮＣＣＮ遺伝子スクリーニングガイドラインにおける明確的な結腸直腸癌の遺伝的感受性遺伝子、および他の胃腸腫瘍に関連する遺伝子の全部エクソンの検出を含む。具体的には、以下の通りである：ＢＲＡＦ、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＰＴＣＨ１、  ＡＰＣＢＬＭ、ＢＭＰＲ１Ａ、ＣＨＥＫ２、ＥｐＣＡＭ、ＧＲＥＭ１、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＭＵＴＹＨ、ＰＭＳ２、ＰＯＬＤ１、ＰＯＬＥ、ＰＴＥＮ、ＳＭＡＤ４、ＳＴＫ１１、ＴＰ５３、ＡＫＴ１、ＡＴＭ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＤＨ１、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＫＩＴ、ＭＥＴ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＳＤＨＢ、ＳＤＨＣ、ＳＤＨＤ。
検出および検証の結果
【００５０】
実施例では、合計６５個のＩＨＣ陽性腫瘍および側癌性正常組織のサンプルを検査し、病院から得られたＩＨＣ結果と、マイクロサテライト不安定性およびＭＭＲ遺伝子変異の検出との関連性を検証した。検証結果を表７および８に示す。その結果に基づいて、以下の結論を導き出すことができる。
【００５１】
ＩＨＣ陽性患者において、ごく一部の患者（４４．６％）はマイクロサテライト不安定性を検出できた。言い換えれば、現在中国で実施されているＩＨＣ検出は、マイクロサテライト状態に対する感度が低い。
【００５２】
ＩＨＣ陽性でマイクロサテライト不安定性である患者のうち、合計４人の患者（１３．８％）は、病原性または潜在的に病原性として同定された生殖細胞系ＭＭＲ遺伝子の変異が検出され、リンチ症候群として診断され、リスク管理のために遺伝子検査の実施が推奨される；別の７人の患者（２４．１％）は、不明な生殖細胞系ＭＭＲ遺伝子の変異が検出され、診断のために、さらに家族歴および血縁者のシークエンシングの収集が必要であった。
【００５３】
すべての患者のうち、１人の患者は、潜在的にＡＰＣ病原性の生殖細胞系の変異が検出され、ＦＡＰ症候群患者である；１人の患者は、潜在的にＣＨＥＫ２病原性の生殖細胞系の変異が検出され、遺伝性結腸直腸癌患者である；リスク管理のために遺伝子検査の実施が推奨される；２人の患者は、それぞれＡＴＭおよびＭＵＴＹＨの不明な生殖細胞系の変異を検出し、診断のために、さらに家族歴および血縁者のシークエンシングの収集が必要であった。この結果は、複数の遺伝的感受性遺伝子を同時に検出することの重要性を実証した。
【００５４】
すべての患者のうち、４５人（６７．７％）の患者は、治療ガイドラインにける治療予後に明確的に関連する変異が検出され、その後の治療の基礎となった。
【００５５】
さらに、本発明者らは、次世代シークエンシングに基づくマイクロサテライト安定性検査の結果を検証するために、上記のサンプルに対して従来のＰＣＲゴールドスタンダード試験も同時に行った。ゴールドスタンダードＰＣＲ法では、ＮＲ−２１、ＢＡＴ−２６、ＮＲ−２７、ＢＡＴ−２５、ＮＲ−２４、およびＭＯＮＯ−２７の６つの単一ヌクレオチド反復部位と、ＰｅｎｔａＣ、ＰｅｎｔａＤ、Ａｍｅｌｏｇｅｎｉｎの３つの遺伝子座とを組み合わせて増幅し、ＡＢＩ  ３７３０ｘｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ＡｎａｌｙｚｅｒでＳＴＲ遺伝子座を検出した。ＰＣＲ法では、最終的に２９個のＭＳＩサンプルおよび３６個のＭＳＳサンプルを検出した。ＰＣＲ分析の結果と比較して、本発明のＭＳＩの検出精度は９６．５５％、特異度は１００％であることがわかった。１つのサンプルのみは、本発明の検出方法でＭＳＩ−Ｌと判定されたが、従来の方法でＭＳＩ−Ｈと判定された。解析の結果、このサンプルの腫瘍細胞の割合は比較的低い割合を占め、判定結果に影響を及ぼした。
【００５６】
ＰＣＲ検出基準は以下の表２の通りである。
【００５７】
【表２】
2020505925.tif 000003
【００５８】
上記の番号のサンプルについて、ＰＣＲ分析の結果は以下の通りである。
【００５９】
【表３】
2020505925.tif 000004
【００６０】
腫瘍ＭＳＩに対するＮＣＩ判定基準によると、このサンプルの腫瘍組織は高マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ−Ｈ）型である。
【００６１】
【表４】
2020505925.tif 000005
【００６２】
腫瘍ＭＳＩに対するＮＣＩ判定基準によると、このサンプルの腫瘍組織はマイクロサテライト安定性（ＭＳＳ）型である。
【００６３】
【表５】
2020505925.tif 000006
【００６４】
腫瘍ＭＳＩに対するＮＣＩ判定基準によると、このサンプルの腫瘍組織は高マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ−Ｈ）型である。
【００６５】
【表６】
2020505925.tif 000007
【００６６】
腫瘍ＭＳＩに対するＮＣＩ判定基準によると、このサンプルの腫瘍組織はマイクロサテライト安定性（ＭＳＳ）型である。
【００６７】
【表７−１】
2020505925.tif 000008
【表７−２】
2020505925.tif 000009
【表７−３】
2020505925.tif 000010
【表７−４】
2020505925.tif 000011
【表７−５】
2020505925.tif 000012
【００６８】
さらに、本発明者らは、６５個のサンプル中の２２個のマイクロサテライト座の分布を分析し、各サンプルにおいて上述の「マイクロサテライト座に対応する標的遺伝子型をカバーするシークエンシング断片の読み取り（ｒｅａｄｓ）数が１０を超えるマイクロサテライト座の数」を満たすマイクロサテライト座カバー数、６５個のサンプルにおける各マイクロサテライト座の分布、および各サンプルにおける各マイクロサテライト座の安定性の判定結果を、下記の表８に詳述する。ＮＡは、なしまたは条件を満たさないことを示す。
【００６９】
【表８−１】
2020505925.tif 000013
【表８−２】
2020505925.tif 000014
【表８−３】
2020505925.tif 000015
【表８−４】
2020505925.tif 000016
【表８−５】
2020505925.tif 000017
【表８−６】
2020505925.tif 000018
【図１】
2020505925.tif 000019
【図２】
2020505925.tif 000020
【図３】
2020505925.tif 000021
【図４】
2020505925.tif 000022
【手続補正書】
【提出日】令和1年7月30日(2019.7.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表１に示される２２個のマイクロサテライト座またはそのなかの任意の１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１個の遺伝子座の組み合わせを含む、バイオマーカーの組み合わせ。
【請求項２】
マイクロサテライト座と１種または複数種の遺伝子との組み合わせを含むバイオマーカーの組み合わせであって、
前記マイクロサテライト座は、表１に示される２２個のマイクロサテライト座、またはそのなかの任意の１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１個の遺伝子座の組み合わせを含み、
前記１種または複数種の遺伝子は、以下の３６個の遺伝子：ＢＲＡＦ、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＰＴＣＨ１、ＡＰＣＢＬＭ、ＢＭＰＲ１Ａ、ＣＨＥＫ２、ＥｐＣＡＭ、ＧＲＥＭ１、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＭＵＴＹＨ、ＰＭＳ２、ＰｅＯＬＤ１、ＰＯＬＥ、ＰＴＥＮ、ＳＭＡＤ４、ＳＴＫ１１、ＴＰ５３、ＡＫＴ１、ＡＴＭ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＤＨ１、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＫＩＴ、ＭＥＴ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＳＤＨＢ、ＳＤＨＣ、ＳＤＨＤからなる群から選択される任意の１種または複数種の遺伝子である、バイオマーカーの組み合わせ。
【請求項３】
前記マイクロサテライト座は、表１に示される２２個のマイクロサテライト座であり、および／または
前記１つまたは複数の遺伝子は、前記３６個の遺伝子である、請求項２に記載のバイオマーカーの組み合わせ。
【請求項４】
ＩＩ期の結腸直腸癌の予後評価および／または治療レジメンの選択、リンチ症候群（ＨＮＰＣＣ）の診断、予後評価および／または治療レジメンの選択のための遺伝子検査に使用され、
請求項１に記載のバイオマーカーの組み合わせを検出する検出試薬を含む、キット。
【請求項５】
結腸直腸癌の予後評価および／または治療レジメンの選択、結腸直腸癌の遺伝的感受性、および胃腸腫瘍の感受性を含む遺伝子検査を同時に行うために使用され、
請求項２または３に記載のバイオマーカーの組み合わせを検出する検出試薬を含む、キット。
【請求項６】
前記遺伝子検査は、家族性腺腫性ポリポーシス、散発性ＣＲＣ、リンチ症候群、および／または散発性ＭＳＩ＋ＣＲＣに対する遺伝子検査を含む、請求項５に記載のキット。
【請求項７】
前記検出試薬は、次世代シークエンシング（Ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ＮＧＳ）を実施するための試薬である、請求項４〜６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項８】
結腸直腸癌の予後評価および／または治療レジメンの選択、結腸直腸癌の遺伝的感受性、および胃腸腫瘍の感受性を含む遺伝子検査に使用されるキットの調製への、
請求項１〜３のいずれか一項に記載のバイオマーカーの組み合わせを検出する検出試薬の使用。
【請求項９】
前記検出試薬は、次世代シークエンシングを実施するための試薬である、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記結腸直腸癌の予後評価および／または治療レジメンの選択のための遺伝子検査は、リンチ症候群（ＨＮＰＣＣ）の予後評価および／または治療レジメンの選択のための遺伝子検査である、請求項８に記載の使用。
【請求項１１】
（１）次世代シークエンシング法に基づき、結腸直腸癌サンプル中の複数のマイクロサテライト座の多遺伝子標的キャプチャー（ｃａｐｔｕｒｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｐａｎｅｌ）検査を同時に行う工程、
前記複数のマイクロサテライト座は、表１に示される２２個のマイクロサテライト座、またはそのなかの任意の１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１個の遺伝子座の組み合わせを含む；
（２）前記複数のマイクロサテライト座において、マイクロサテライト座に対応する標的遺伝子型をカバーするシークエンシング断片の読み取り（ｒｅａｄｓ）数が１０を超えるマイクロサテライト座の数は、ｎであり、標的遺伝子型は、正常組織サンプル中のマイクロサテライト座の遺伝子型であり、ｎ≧１５であり、ｎにおけるいずれかのマイクロサテライト座について、ＮＧＳデータに基づいて、その遺伝子座に対応する標的遺伝子型の異なる長さのシークエンシング断片をカバーするシークエンシング断片の読み取り（ｒｅａｄｓ）数を統計し、標的遺伝子型は、正常組織サンプル中の該マイクロサテライト座の遺伝子型であり、
前記シークエンシング断片の数に従って、該マイクロサテライト座に対応する標的遺伝子型のカバー率を計算し、且つ該マイクロサテライト座の標準長さ分布参照セットを構築することにより、最も多くカバーされる１つまたは２つの長さタイプの平均カバー率ｍｅａｎ（ＮＴｉ）および標準偏差ｓｄ（ＮＴｉ）を計算し、
２番目に多くカバーされるシークエンシング断片の読み取り（ｒｅａｄｓ）数が最も多くカバーされる長さタイプのものの７５％未満である場合、最も多くカバーされる長さタイプのみが検討され、その平均カバー率および標準偏差を計算し、
２番目に多くカバーされるシークエンシング断片の読み取り（ｒｅａｄｓ）数が最も多くカバーされる長さタイプのものの７５％を超える場合、この両方の最もカバーされる長さタイプが検討され、この場合の平均カバー率は、２つの長さタイプの平均カバー率の合計であり、
該サンプルについて、同様に前記の工程に従って、決定された標的遺伝子型のカバー率を計算し、カバー率Ｔｉｊ＜ｍｅａｎ（ＮＴｉ）−３ｓｄ（ＮＴｉ）を満たすかどうかを判定し、マイクロサテライト座が表１に示される２２個のマイクロサテライト座である場合、表１のｍｅａｎ（ＮＴｉ）およびｓｄ（ＮＴｉ）に従って直接に計算を行い、カバー率が＜ｍｅａｎ（ＮＴｉ）−３ｓｄ（ＮＴｉ）である場合、該マイクロサテライト座は不安定なマイクロサテライト座である；
（３）前記の複数のマイクロサテライト座について、不安定なマイクロサテライト座の数が＞４０％であれば、そのサンプルは高ＭＳＩサンプルであると判定され；数が１５％〜４０％であれば、そのサンプルは低ＭＳＩサンプルであると判定され；数が＜１５％であれば、そのサンプルはＭＳＳであると判定される工程；
を含み、次世代シークエンシングに基づき、結腸直腸癌サンプル中のマイクロサテライト座の安定性状態を判定する方法。
【請求項１２】
前記複数のマイクロサテライト座は、表１に示される２２個のマイクロサテライト座である、請求項１１に記載の方法。
【国際調査報告】
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