(57)【要約】  本発明は、膵臓前駆細胞の培養方法に関する。本方法は、細胞を、上皮成長因子（ＥＧＦ）、レチノイン酸（ＲＡ）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）の阻害剤、及び３Ｔ３−Ｊ２線維芽細胞フィーダー細胞と接触させることを含む。本発明の方法によって産生される細胞及び本方法において使用されるキットも提供される。
2020506679.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
膵臓前駆細胞を培養する方法であって、前記細胞を、
ａ．上皮成長因子（ＥＧＦ）、
ｂ．レチノイン酸（ＲＡ）、
ｃ．トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）シグナル伝達の阻害剤、及び
ｄ．３Ｔ３−Ｊ２線維芽細胞フィーダー細胞
と接触させることを含む、前記方法。
【請求項２】
トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）シグナル伝達の阻害剤が、アクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）受容体の阻害剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）受容体の阻害剤がＳＢ４３１５４２である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
膵臓前駆細胞をＢ２７サプリメントとさらに接触させる、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
膵臓前駆細胞をＮｏｔｃｈシグナル伝達の阻害剤とさらに接触させる、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の阻害剤がγ−セクレターゼ阻害剤である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
γ−セクレターゼ阻害剤がＤＡＰＴである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
膵臓前駆細胞をデキサメタゾン、線維芽細胞増殖因子１０（ＦＧＦ１０）、Ｎ２サプリメント、又はこれらの組合せとさらに接触させる、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
膵臓前駆細胞を、
ａ．約１ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、
ｂ．約１００ｎＭ〜約１０μＭのＲＡ、及び
ｃ．約１μＭ〜約１００μＭのＳＢ４３１５４２
と接触させる、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
膵臓前駆細胞を、
ａ．約１ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、
ｂ．約１ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ１０、
ｃ．約１００ｎＭ〜約１０μＭのＲＡ、
ｄ．約１ｎＭ〜約１００ｎＭのデキサメタゾン、
ｅ．約１００ｎＭ〜約１０μＭのＤＡＰＴ、
ｆ．約１μＭ〜約１００μＭのＳＢ４３１５４２、
ｇ．約１×のＢ２７サプリメント、及び
ｈ．約１×のＮ２サプリメント
と接触させる、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
膵臓前駆細胞を、
ａ．約５０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ、
ｂ．約５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ１０、
ｃ．約３μＭのＲＡ、
ｄ．約３０ｎＭのデキサメタゾン、
ｅ．約１μＭのＤＡＰＴ、
ｆ．約１０μＭのＳＢ４３１５４２、
ｇ．約１×のＢ２７サプリメント、及び
ｈ．約１×のＮ２サプリメント
と接触させる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
膵臓前駆細胞が膵臓前駆細胞集団である、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
膵臓前駆細胞集団が実質的にホモジーニアスである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
膵臓前駆細胞集団が、少なくとも６０％ホモジーニアスである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
膵臓前駆細胞集団が、少なくとも９９％ホモジーニアスである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
膵臓前駆細胞が、少なくとも５継代、少なくとも１０継代、少なくとも１５継代、又は少なくとも２０継代にわたり培養される、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
膵臓前駆細胞が幹細胞由来である、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
幹細胞がヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
幹細胞が人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
膵臓前駆細胞が、ＰＤＸ１、ＳＯＸ９、ＨＮＦ６、ＦＯＸＡ２、及びＧＡＴＡ６を発現する、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
膵臓前駆細胞がＳＯＸ２を発現しない、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれかに記載の方法に従って産生された細胞。
【請求項２３】
１又は２以上の細胞培養培地容器を使用説明書と共に含む、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法において使用されるキット。
【請求項２４】
３Ｔ３−Ｊ２フィーダー細胞をさらに含む、請求項２３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連技術の相互参照
本出願は、２０１７年１月１７日出願のシンガポール国出願第１０２０１７００３９０Ｑ号の優先権の利益を主張するものであり、この出願の内容は、すべての目的でその全体が参照により本明細書に援用される。
【０００２】
本発明は、バイオテクノロジーの分野にある。詳細には、本発明は、膵臓前駆細胞を培養する方法に関する。本発明はさらに、本明細書に記載する方法を実施する際に使用する培養培地及びキットに関する。
【背景技術】
【０００３】
成人の膵臓は、内分泌、腺房、及び腺管の三大系列を含む。内分泌区画は、ランゲルハンス島に存在し、グルカゴンを分泌する細胞、及びインスリンを分泌し、その機能不全は糖尿病につながるβ細胞を始めとする、正常血糖の維持に必要なホルモンを分泌する細胞からなる。腺房細胞は、消化酵素を産生し、腺管細胞と共に、膵外分泌部をなす。ヒト膵臓の発生は、カーネギー段階（ＣＳ）１２において、後方前腸から背側及び腹側膵芽が出現することで始まる。これらの未発達構造は、広範に増殖し、分枝形態形成を経た後、融合して膵原基をなす、多能性膵臓前駆体からなる。三大膵臓系列はそれぞれ、これらの前駆細胞から、一連の細胞運命決定及び形態学的変化に続いて派生する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Russ, H.A., Parent, A.V., Ringler, J.J., Hennings, T.G., Nair, G.G., Shveygert, M., Guo, T., Puri, S., Haataja, L., Cirulli, V., et al. (2015). Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro. EMBO J. 34, 1759-1772
【非特許文献２】Rezania, A., Bruin, J.E., Arora, P., Rubin, A., Batushansky, I., Asadi, A., O’Dwyer, S., Quiskamp, N., Mojibian, M., Albrecht, T., et al. (2014). Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nat. Biotechnol. 32, 1121-1133
【非特許文献３】Pagliuca, F.W., Millman, J.R., Gurtler, M., Segel, M., Van Dervort, A., Ryu, J.H., Peterson, Q.P., Greiner, D., and Melton, D.A. (2014). Generation of functional human pancreatic β cells in vitro. Cell 159, 428-439
【非特許文献４】Zhang, D., Jiang,W., Liu, M., Sui, X., Yin, X., Chen, S., Shi, Y., and Deng, H. (2009). Highly efficient differentiation of human ES cells and iPS cells into mature pancreatic insulin-producing cells. Cell Res. 19, 429-438
【非特許文献５】Micallef, S.J., Li, X., Schiesser, J.V., Hirst, C.E., Yu, Q.C., Lim, S.M., Nostro, M.C., Elliott, D.A., Sarangi, F., Harrison, L.C., Keller, G., Elefanty, A.G., Stanley, E.G., 2011. INS GFP/w human embryonic stem cells facilitate isolation of in vitro derived insulin-producing cells. Diabetologia 55, 694-706
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
マウスにおける一連の遺伝子研究の結果、膵臓発生を調節する数多くのシグナル伝達経路が特定され、それが、ヒト多能性幹細胞から膵臓前駆細胞、引き続いてｂ様細胞を生成するプロトコール開発のきっかけとなった。こうした研究の最終的な目標は、正常血糖を維持し、糖尿病を軽減しうる機能性β細胞を生成することである。しかし、そうしたプロトコールは、β細胞の全発生歴を再現しようと努める長々しい多段分化プロトコールに固有の変動性のせいもあって、技術的に難易度が高く、実施には費用がかかるため、往々にして分化効率は低い。こうした問題は、そのようなプロトコールが遺伝学的に多様な胚性幹細胞（ＥＳＣ）及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に適用される場合、深刻になる。したがって、上述の短所の１又は２以上を克服する、又は少なくとも改善する、膵臓細胞供給源としての、多能性細胞に代わる選択肢を開発することが求められている。そうした選択肢の長期の自己複製を支える方法及び培養条件を開発することも求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一態様では、膵臓前駆細胞を培養する方法であって、前記細胞を、ａ．上皮成長因子（ＥＧＦ）、ｂ．レチノイン酸（ＲＡ）、ｃ．トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）シグナル伝達の阻害剤、及びｄ．３Ｔ３−Ｊ２線維芽細胞フィーダー細胞と接触させることを含む方法が提供される。
【０００７】
一態様では、本明細書に記載する方法に従って産生された細胞が提供される。
【０００８】
一態様では、１又は２以上の細胞培養培地容器を使用説明書と共に含む、本明細書に記載する方法において使用されるキットが提供される。
【０００９】
定義
本明細書で使用するとき、用語「前駆細胞」とは、分化によって生じうる細胞に比べて高い発生能を有する、すなわち、より原始的な（例えば、発生経路又は過程のより早期の段階にある）細胞表現型を有する細胞を指す。多くの場合、前駆細胞は、顕著に又は非常に高い増殖能を有する。前駆細胞は、発生経路並びに細胞が発生及び分化する環境に応じて、発生能のより低いいくつもの別個の細胞、すなわち分化細胞型、又は単一の分化細胞型を生み出す場合がある。用語「膵臓前駆細胞」とは、膵臓系列のいくつもの別個の細胞を生み出すことのできる細胞を指す。膵臓前駆細胞は、多能性幹細胞に比べて、膵臓の分化した細胞に、発生的により近いと理解される。当業界で知られている様々な方法を使用して膵臓前駆体を得ることができるということは、一般に理解されるところとなる。一例では、膵臓前駆体は、実験手順の部に記載する方法に従って生成することができる。
【００１０】
本明細書で使用するとき、フィーダー細胞についての文脈における「３Ｔ３−Ｊ２」とは、Rheinwald JG, Green H. Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: the formation of keratinizing colonies from single cells. Cell. 1975 Nov;6(3):331-43及びAllen-Hoffmann BL, Rheinwald JG. Polycyclic aromatic hydrocarbon mutagenesis of human epidermal keratinocytes in culture.Proc Natl Acad Sci U S A. 1984 Dec;81(24):7802-6に記載されているとおりに得られるマウス胚性線維芽細胞細胞株を指す。
【００１１】
本明細書で使用するとき、シグナル伝達についての文脈における用語「阻害剤」とは、シグナル伝達経路の活性を妨げる分子又は化合物を指す。阻害剤は、シグナル伝達経路の１又は２以上のメンバー、その受容体又は下流エフェクターを妨げる場合がある。阻害剤は、シグナル伝達経路の１又は２以上のメンバー、受容体、又は下流エフェクターに結合して、生物学的機能を阻害することができる。
【００１２】
本明細書で使用するとき、語句「培養培地」とは、細胞の増殖を支えるのに使用される液体物質を指す。本発明が一部の実施形態に従って使用する培養培地は、塩、栄養素、無機質、ビタミン、アミノ酸、核酸、タンパク質、例えばサイトカイン、成長因子、ホルモンなどの物質の組合せを含みうる、液体をベースとする培地、例えば、水である場合がある。
【００１３】
本明細書で使用するとき、用語「胚性幹細胞」とは、胚の胚盤胞の内部細胞塊の自然発生多能性幹細胞を指す。このような細胞は、体細胞核移植から得られた胚盤胞の内部細胞塊からも同様に取得することができる。胚性幹細胞は、多能性であり、発生の間に、３つの主要な胚葉、すなわち、外胚葉、内胚葉、及び中胚葉のすべての派生物を生じさせる。言い換えると、胚性幹細胞は、特定の細胞型にとって十分かつ必要な刺激が与えられたとき、成人身体の２００を超える細胞型のそれぞれに発達しうる。胚性幹細胞は、胚体外膜又は胎盤には寄与しない、すなわち、全能性ではない。
【００１４】
本明細書で使用するとき、用語「人工多能性幹細胞」又はｉＰＳＣとは、その幹細胞が、３種すべての胚葉又は皮層、すなわち、外胚葉、内胚葉、及び中胚葉の組織に分化しうる細胞へと誘導された、又は改変された、すなわち、再プログラムされた分化成体細胞から産生されていることを意味する。産生されたｉＰＳＣは、自然界で見出されるような細胞には当てはまらない。
【００１５】
本明細書で使用するとき、用語「分化（differentiation）」とは、分化していない（unspecialized）（「コミットしていない（uncommitted）」）又はそれほど分化していない細胞が、例えば神経細胞や筋細胞などの分化した細胞の特徴を得る過程である。分化又は分化誘導細胞は、細胞系列内のより分化した（「コミットした」）位置に至った細胞である。分化の過程に適用されるとき、用語「コミット」とは、分化経路において、正常な状況下で、特定の細胞型又は細胞型サブセットへと分化し続けることになり、かつ、正常な状況下で、異なる細胞型へと分化したり、又はより低分化の細胞型に逆戻りしたりできない地点にまで進行した細胞を指す。脱分化とは、細胞が、細胞系列内のより分化（又はコミット）していない位置に逆戻りする過程を指す。本明細書で使用するとき、細胞の系列とは、細胞の遺伝、すなわち、どの細胞に由来するのか、またどんな細胞をもたらしうるのかを規定するものである。細胞の系列によって、発生及び分化の遺伝スキーム内に細胞が配置される。系列特異的マーカーとは、所望の系列の細胞の表現型と特異的に関連しており、コミットしていない細胞の所望の系列への分化を評価するのに使用することのできる特徴を指す。
【００１６】
本開示全体を通して、ある特定の実施形態は、範囲フォーマットで開示される場合がある。範囲フォーマットでの記載は、単に便宜と簡潔さのためになされると理解すべきであり、開示される範囲の範囲を頑なに限定するものと解釈すべきでない。したがって、範囲の記載によって、考えられるすべての下位範囲並びにその範囲内の個々の数値が詳細に開示されたとみなすべきである。例えば、１〜６などの範囲の記載によって、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などの下位範囲、並びにその範囲内の個々の数値、例えば、１、２、３、４、５、及び６が、詳細に開示されたとみなすべきである。これは、範囲の広さに関係なく適用される。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明について述べる前に、本発明は、記載する特定の実施形態に限定されず、そのため様々となりうることを理解されたい。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲においてのみ限定されるため、本明細書で使用する術語は、特定の実施形態について述べる目的のものに過ぎず、限定する意図はないことも理解されたい。
【００１８】
別段定義しない限り、本明細書で使用するすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の技術者が一般に理解しているのと同じ意味を有する。本開示の意図及び範囲内には変更形態及び変形形態が含まれると理解されるため、本発明の実施及び試行において、本明細書に記載するものと同様又は同等ないずれかの方法及び材料を使用してもよい。
【００１９】
本開示及び実施形態は、長期の自己複製を支える、膵臓前駆細胞の培養方法に関する。詳細には、本発明は、膵臓前駆体を培養下で維持及び拡大増殖するための諸因子の詳細な組合せの知識を提供する。
【００２０】
したがって、本発明は、膵臓前駆細胞を培養する方法であって、前記細胞を、ａ．上皮成長因子（ＥＧＦ）、ｂ．レチノイン酸（ＲＡ）、ｃ．トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）シグナル伝達の阻害剤、及びｄ．３Ｔ３−Ｊ２線維芽細胞フィーダー細胞と接触させることを含む方法を提供する。
【００２１】
一実施形態では、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）シグナル伝達の阻害剤は、アクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）の阻害剤である場合がある。特定されているＡＬＫが７種存在することは、一般に理解されるところとなる。ＡＬＫの阻害剤は、ＡＬＫ１〜ＡＬＫ７の１又は２以上を阻害する場合がある。阻害剤又はＡＬＫは、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、又はＡＬＫ７の１又は２以上を阻害しうることが有利である。
【００２２】
一実施形態では、ＡＬＫの阻害剤は、低分子である場合がある。好ましい実施形態では、ＡＬＫの阻害剤は、ＳＢ４３１５４２である場合がある。
【００２３】
一実施形態では、膵臓前駆細胞を１又は２以上の細胞培養サプリメントとさらに接触させる場合がある。細胞培養サプリメントを使用すると、細胞培養培地において血清の代用品となり、培養における細胞生存率及び増殖を向上させることができる。好ましい実施形態では、膵臓前駆体をＢ２７サプリメントとさらに接触させる。他の細胞培養サプリメント又は血清代替品を使用してもよいことは、一般に理解されるところとなる。細胞培養サプリメントの例としては、限定はしないが、２−メルカプトエタノール、アミノ酸溶液、ウシ血清アルブミン、コレステロールサプリメント、ＣＨＯサプリメント、グルタミン、GlutaMax、初代細胞サプリメント、ＨＡＴサプリメント、ＨＴサプリメント、インスリン、脂質サプリメント、ＭＥＭビタミン溶液、pluronic F68、血清代替品、ピルビン酸ナトリウム、幹細胞サプリメント、トランスフェリン、酵母溶液、ＩＴＳ−Ｘサプリメント、Ｎ２サプリメント、及びＧ５サプリメントが挙げられる。
【００２４】
一実施形態では、膵臓前駆細胞をＮｏｔｃｈシグナル伝達の阻害剤とさらに接触させる場合がある。好ましい実施形態では、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の阻害剤は、γ−セクレターゼ阻害剤である場合がある。γ−セクレターゼ阻害剤の例としては、限定はしないが、ＤＡＰＴ、ＲＯ４９２９０９７、セマガセスタット、Compound E、ガンマ−セクレターゼ阻害剤III、（Ｒ）−フルルビプロフェン、ガンマ−セクレターゼ阻害剤Ｉ、ＢＭＳ−７０８１６３、ＢＭＳ２９９８９７、ガンマ−セクレターゼ阻害剤XI、ＪＬＫ６、Compound W、ＭＫ−０７５２、ジベンザゼピン、ＬＹ４１１５７５、ＰＦ−０３０８４０１４、Ｌ−６８５，４５８、ガンマ−セクレターゼ阻害剤VII、Compound 34、ガンマ−セクレターゼ阻害剤XVIが挙げられる。
【００２５】
さらに好ましい実施形態では、γ−セクレターゼ阻害剤は、ＤＡＰＴである場合がある。
【００２６】
一実施形態では、膵臓前駆細胞を、デキサメタゾン、線維芽細胞増殖因子１０（ＦＧＦ１０）、Ｎ２サプリメント、又はこれらの組合せとさらに接触させる場合がある。
【００２７】
上皮成長因子（ＥＧＦ）は、約１ｎｇ／ｍＬ〜約２００ｎｇ／ｍＬ、又は約５ｎｇ／ｍＬ〜約１９５ｎｇ／ｍＬ、又は約１０ｎｇ／ｍＬ〜約１９０ｎｇ／ｍＬ、又は約１５ｎｇ／ｍＬ〜約１８５ｎｇ／ｍＬ、又は約２０ｎｇ／ｍＬ〜約１８０ｎｇ／ｍＬ、又は約２５ｎｇ／ｍＬ〜約１７５ｎｇ／ｍＬ、又は約３０ｎｇ／ｍＬ〜約１７０ｎｇ／ｍＬ、又は約３５ｎｇ／ｍＬ〜約１６５ｎｇ／ｍＬ、又は４０ｎｇ／ｍＬ〜約１６０ｎｇ／ｍＬ、又は約４５ｎｇ／ｍＬ〜約１５５ｎｇ／ｍＬ、又は約５０ｎｇ／ｍＬ〜約１５０ｎｇ／ｍＬ、又は約５５ｎｇ／ｍＬ〜約１４５ｎｇ／ｍＬ、又は約６０ｎｇ／ｍＬ〜約１４０ｎｇ／ｍＬ、又は約６５ｎｇ／ｍＬ〜約１３５ｎｇ／ｍＬ、又は約７０ｎｇ／ｍＬ〜約１３０ｎｇ／ｍＬ、又は約７５ｎｇ／ｍＬ〜約１２５ｎｇ／ｍＬ、又は約８０ｎｇ／ｍＬ〜約１２０ｎｇ／ｍＬ、又は約８５ｎｇ／ｍＬ〜約１１５ｎｇ／ｍＬ、又は約９０ｎｇ／ｍＬ〜約１１０ｎｇ／ｍＬ、又は約９５ｎｇ／ｍＬ〜約１０５ｎｇ／ｍＬ、又は約９５ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬの量で使用される場合がある。
【００２８】
好ましい実施形態では、ＥＧＦは、約５０ｎｇ／ｍＬの量で使用される場合がある。
【００２９】
線維芽細胞増殖因子１０（ＦＧＦ１０）は、約１ｎｇ／ｍＬ〜約２００ｎｇ／ｍＬ、又は約５ｎｇ／ｍＬ〜約１９５ｎｇ／ｍＬ、又は約１０ｎｇ／ｍＬ〜約１９０ｎｇ／ｍＬ、又は約１５ｎｇ／ｍＬ〜約１８５ｎｇ／ｍＬ、又は約２０ｎｇ／ｍＬ〜約１８０ｎｇ／ｍＬ、又は約２５ｎｇ／ｍＬ〜約１７５ｎｇ／ｍＬ、又は約３０ｎｇ／ｍＬ〜約１７０ｎｇ／ｍＬ、又は約３５ｎｇ／ｍＬ〜約１６５ｎｇ／ｍＬ、又は４０ｎｇ／ｍＬ〜約１６０ｎｇ／ｍＬ、又は約４５ｎｇ／ｍＬ〜約１５５ｎｇ／ｍＬ、又は約５０ｎｇ／ｍＬ〜約１５０ｎｇ／ｍＬ、又は約５５ｎｇ／ｍＬ〜約１４５ｎｇ／ｍＬ、又は約６０ｎｇ／ｍＬ〜約１４０ｎｇ／ｍＬ、又は約６５ｎｇ／ｍＬ〜約１３５ｎｇ／ｍＬ、又は約７０ｎｇ／ｍＬ〜約１３０ｎｇ／ｍＬ、又は約７５ｎｇ／ｍＬ〜約１２５ｎｇ／ｍＬ、又は約８０ｎｇ／ｍＬ〜約１２０ｎｇ／ｍＬ、又は約８５ｎｇ／ｍＬ〜約１１５ｎｇ／ｍＬ、又は約９０ｎｇ／ｍＬ〜約１１０ｎｇ／ｍＬ、又は約９５ｎｇ／ｍＬ〜約１０５ｎｇ／ｍＬ、又は約９５ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬの量で使用される場合がある。
【００３０】
好ましい実施形態では、ＦＧＦ１０は、約５０ｎｇ／ｍＬの量で使用される場合がある。
【００３１】
レチノイン酸（ＲＡ）は、約１００ｎＭ〜約１０μＭ、又は約２００ｎＭ〜約９μＭ、又は約３００ｎＭ〜約８μＭ、又は約４００ｎＭ〜約７μＭ、又は約５００ｎＭ〜約６μＭ、又は６００ｎＭ〜約５μＭ、又は約７００ｎＭ〜約４μＭ、又は約７００ｎＭ〜約３μＭ、又は約８００ｎＭ〜約２μＭ、又は約９００ｎＭ〜約１μＭの量で使用される場合がある。
【００３２】
好ましい実施形態では、ＲＡは、約３μＭの量で使用される場合がある。
【００３３】
デキサメタゾンは、約１ｎＭ〜約１００ｎＭ、又は約５ｎＭ〜約９５ｎＭ、又は約１０ｎＭ〜約９０ｎＭ、又は約１５ｎＭ〜約８５ｎＭ、又は約２０ｎＭ〜約８０ｎＭ、又は約２５ｎＭ〜約７５ｎＭ、又は約３０ｎＭ〜約７０ｎＭ、又は約３５ｎＭ〜約６５ｎＭ、又は４０ｎＭ〜約６０ｎＭ、又は約４５ｎＭ〜約５５ｎＭの量で使用される場合がある。
【００３４】
好ましい実施形態では、デキサメタゾンは、約３０ｎＭの量で使用される場合がある。
【００３５】
ＤＡＰＴは、約１００ｎＭ〜約１０μＭ、又は約２００ｎＭ〜約９μＭ、又は約３００ｎＭ〜約８μＭ、又は約４００ｎＭ〜約７μＭ、又は約５００ｎＭ〜約６μＭ、又は６００ｎＭ〜約５μＭ、又は約７００ｎＭ〜約４μＭ、又は約７００ｎＭ〜約３μＭ、又は約８００ｎＭ〜約２μＭ、又は約９００ｎＭ〜約１μＭの量で使用される場合がある。
【００３６】
好ましい実施形態では、ＤＡＰＴは、約１μＭの量で使用される場合がある。
【００３７】
ＳＢ４３１５４２は、約１μＭ〜約１００μＭ、又は約５μＭ〜約９５μＭ、又は約１０μＭ〜約９０μＭ、又は約１５μＭ〜約８５μＭ、又は約２０μＭ〜約８０μＭ、又は約２５μＭ〜約７５μＭ、又は約３０μＭ〜約７０μＭ、又は約３５μＭ〜約６５μＭ、又は約４０μＭ〜約６０μＭ、又は約４５μＭ〜約５５μＭ、又は約５０μＭの量で使用される場合がある。
【００３８】
好ましい実施形態では、ＳＢ４３１５４２は、約１０μＭの量で使用される場合がある。
【００３９】
細胞培養サプリメントに関して、細胞培養サプリメントが、濃縮された形（例えば、１０倍、５０倍、又は１００倍）で取得される場合があることは、一般に理解されるところとなる。したがって、細胞培養サプリメントを希釈し、約１×、２×、３×、４×、又は５×の最終濃度で使用する場合があることは理解されるところとなる。
【００４０】
好ましい実施形態では、Ｎ２７及びＢ２７は、１×の最終濃度で使用される場合がある。
【００４１】
したがって、一実施形態では、膵臓前駆細胞を、約１ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、約１００ｎＭ〜約１０μＭのＲＡ、及び約１μＭ〜約１００μＭのＳＢ４３１５４２と接触させる場合がある。
【００４２】
一実施形態では、膵臓前駆細胞を、約１ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、約１ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ１０、約１００ｎＭ〜約１０μＭのＲＡ、約１ｎＭ〜約１００ｎＭのデキサメタゾン、約１００ｎＭ〜約１０μＭのＤＡＰＴ、約１μＭ〜約１００μＭのＳＢ４３１５４２、約１×のＢ２７サプリメント、及び約１×のＮ２サプリメントと接触させる場合がある。
【００４３】
好ましい実施形態では、膵臓前駆細胞を、約５０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ、約５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ１０、約３μＭのＲＡ、約３０ｎＭのデキサメタゾン、約１μＭのＤＡＰＴ、約１０μＭのＳＢ４３１５４２、約１×のＢ２７サプリメント、及び約１×のＮ２サプリメントと接触させる。
【００４４】
一実施形態では、膵臓前駆細胞は、膵臓前駆細胞集団である場合がある。膵臓前駆細胞集団は、実質的にホモジーニアス（homogenous）である場合がある。本明細書で使用する、実質的にホモジーニアスであるとは、集団における細胞の大部分が膵臓前駆細胞であることを意味する。
【００４５】
膵臓前駆細胞集団は、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％ホモジーニアスである場合がある。好ましい実施形態では、膵臓前駆細胞集団は、９９％超ホモジーニアスである。
【００４６】
本発明の方法では、膵臓前駆細胞の長期の培養が可能になる。一実施形態では、膵臓前駆細胞は、少なくとも５継代、少なくとも１０継代、少なくとも１５継代、少なくとも２０継代、又は少なくとも３０継代にわたり培養される場合がある。
【００４７】
一実施形態では、膵臓前駆細胞は、幹細胞由来である場合がある。幹細胞は、胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞である場合がある。
【００４８】
一実施形態では、膵臓前駆細胞は、内胚葉及び膵臓系列のマーカーを発現する場合がある。一実施形態では、膵臓前駆細胞は、ＰＤＸ１、ＳＯＸ９、ＨＮＦ６、ＦＯＸＡ２、及びＧＡＴＡ６の１又は２以上を発現する場合がある。別の実施形態では、膵臓前駆細胞は、ＳＯＸ２を発現しない場合がある。
【００４９】
一実施形態では、膵臓前駆細胞を培養する方法によって、膵臓前駆細胞の分化が妨げられる。別の実施形態では、膵臓前駆細胞を培養する方法によって、膵臓前駆細胞の増殖が促進される。
【００５０】
本発明の別の態様では、本発明の方法によって産生された細胞が提供される。
【００５１】
本発明の別の態様では、１又は２以上の細胞培養培地容器を含む、本発明の方法において使用されるキットが提供される。細胞培養培地の諸成分は、１又は２以上の容器中に、個々に、又は組み合わされて提供される場合がある。一実施形態では、キットは、３Ｔ３−Ｊ２フィーダー細胞をさらに含む。
【００５２】
本明細書において実例として記載する開示は、本明細書で詳細に開示していないいずれかの要素、制限なしでも適切に実施される場合がある。したがって、例えば、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」などは、オープンに、限定なしに解釈されるものとする。加えて、本明細書で用いる用語及び表現は、限定でなく説明の用語として使用しており、そのような用語及び表現の使用には、示され、記載される特色又はその部分のいずれかの均等物を除外する意図はなく、請求項に係る本発明の範囲内で種々の変更形態が考えられると認識される。したがって、本発明について、好ましい実施形態及び取捨選択可能な特色によって詳細に開示してきたが、本明細書で開示する、その中で具体化された本発明の変更形態及び変形形態は、当業者によって利用されてもよいこと、並びにそのような変更形態及び変形形態は、本発明の範囲内にあるとみなされることを理解すべきである。
【００５３】
本開示について、本明細書に広く包括的に記載してきた。包括的な開示の範囲内にあるより厳密な種及び亜属分類もそれぞれ、本発明の一端をなす。これには、本発明の包括的な記述が含まれるが、その属からのいかなる素材も排除するという条件又は否定的限定が付き、削除された材料が本明細書において詳細に列挙されているか否かは関係ない。
【００５４】
他の実施形態は、以下の請求項及び非限定的な例の範囲内にある。加えて、本発明の特色及び態様が、マーカッシュ群によって記載されている場合では、当業者には、本発明が、それによって、マーカッシュ群の個々のいずれかのメンバー又はメンバーの亜群に関しても記載されているものと認識される。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
本発明は、非限定的な例及び添付の図面と併せて考察すると、詳細な説明に関してより深く理解される。
【００５６】
【図１】糖尿病及び健康な同胞（sibling）線維芽細胞からのｈｉＰＳＣ株の生成を示すものである。図１Ａは、数人の糖尿病同胞を抱える血族ヨルダン人家族の家系図を示す。すべての糖尿病同胞が、５才になる前に発病した。ＡＫ５及びＡＫ６個体から採取した皮膚生検材料を使用して、線維芽細胞を生成し、それからｈｉＰＳＣを誘導した。図１Ｂは、ＯＣＴ４発現の細胞内フローサイトメトリー分析を示し、図１Ｃは、ｈｉＰＳＣクローンであるＡＫ５−１１、ＡＫ６−１３、及びＡＫ６−８（示さない）について、確立された多能性マーカーについての免疫染色を示す。スケールバー、１００μｍ。
【図２】膵臓前駆細胞の定方向性分化及び多様なヒト多能性幹細胞株からの培養膵臓前駆（ｃＰＰ）細胞の生成を示すものである。図２Ａは、膵臓前駆体分化プロトコールの時間的経過を示す。これらの実験において、段階１は、最終日の処理を繰り返すことにより、製造者の指示による２日でなく、最終の３日に延長された。図２Ｂは、ｈＥＳ３  ＩＮＳ−ＧＦＰレポーターであるｈＥＳＣ及び社内のｈｉＰＳＣ株であるＡＫ５−１１及びＡＫ６−８を使用しての、分化８、１０、及び１５日目におけるＰＤＸ１及びＮＫＸ６−１の細胞内フローサイトメトリー分析を示す。個々の株が変動性の分化動態を示すとはいえ、ＰＤＸ１は、すべての場合においてＮＫＸ６−１の前に検出される。ゲートは、アイソタイプ対照抗体で染色された細胞を基準としている。図２Ｃは、分化１５日目におけるＰＤＸ１＋及び／又はＮＫＸ６−１＋の百分率を示す。各円は、２つのｈＥＳＣ株及び６つのｈｉＰＳＣ株を含む、３１回の独立した実験の１つを表す。縦の黒色のバーは、ＰＤＸ１＋（９５％）、ＮＫＸ６−１＋（８０％）、又はＰＤＸ１＋ＮＫＸ６−１＋（８０％）である細胞の百分率中央値を示す。図２Ｄは、６継代目のｃＰＰ細胞株から収穫したサンプルを使用してｑＲＴ−ＰＣＲによって測定された遺伝子発現を示す。本研究では、次の多能性細胞株：Ｈ９及びＨＥＳ３  ｈＥＳＣ、並びにＡＫ５−１１、ＡＫ６−８、及びＡＫ６−１３  ｈｉＰＳＣから誘導されたｃＰＰ細胞を分析した。Ｈ９及びＡＫ５−１１細胞株からは、２つの独立した系統を誘導した。Ｈ９  ｈＥＳＣのレベルに対して正規化した発現レベルを示し、ｌｏｇ２スケールでプロットした。誤差バーは、３回の技術的反復の標準誤差を表す。
【図３】ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣからのｃＰＰ細胞株の誘導を示すものである。図３Ａは、STEMdiff定方向性分化キットを使用して１５日間分化させた後に生成された膵臓前駆体（ＰＰｄ１５細胞）を、表示した増殖因子及びシグナル伝達阻害剤を添加した培地において、３Ｔ３−Ｊ２フィーダー細胞の層上に播き、拡大増殖させたことを示す。図３Ｂは、Ｈ９  ｈＥＳＣを使用しての、分化８、１０、及び１５日目におけるＰＤＸ１及びＮＫＸ６−１についての細胞内フローサイトメトリー分析を示す。図３Ｃは、凝集塊（左）及び単一細胞（右）として継代したｃＰＰ細胞の位相差像を示す。スケールバー、１００μｍ。図３Ｄは、ＰＰｄ１５細胞、並びに早期（６〜８）、中期（１１〜１３）、及び後期（１４〜１８）継代のｃＰＰ細胞から収穫したサンプルを使用してｑＲＴ−ＰＣＲによって測定された遺伝子発現を示す。細胞は、ＡＫ６−１３  ｈｉＰＳＣ及びＨ９  ｈＥＳＣの両方から誘導した。比較のために、胚体内胚葉（４日間のＳＴＥＭｄｉｆｆ分化後のＨ９  ｈＥＳＣ）における遺伝子発現を示す。値は、ｌｏｇ２スケールでプロットしており、誤差バーは、３回の技術的反復のＳＥを表す。ＮＤ、検出されず。図３Ｅは、ｃＰＰ細胞の鍵膵臓転写因子についての免疫蛍光染色を示す。スケールバー、１００μｍ。図３Ｆは、ｃＰＰ細胞のＰＤＸ１についての細胞内フローサイトメトリー分析を示す。灰色の点は、アイソタイプ対照抗体で染色された対照細胞を表す。ｃＰＰ細胞のＰＤＸ１についての細胞内フローサイトメトリー分析。灰色の点は、アイソタイプ対照抗体で染色された対照細胞を表す。
【図４】染色体計数及びＭ−ＦＩＳＨ分析によって、ｃＰＰ細胞が遺伝的に安定していることが明らかになることを示すものである。図４Ａは、多様な遺伝的背景からのｃＰＰ細胞の、異なる継代数における染色体計数を示す。示される値は、所与の染色体数を有するスプレッドの百分率であり、各ｃＰＰ株についての最頻値染色体カウントを強調表示した。最頻値（８０％を超える細胞に共通する）染色体数４６は、正常核型及び核型安定性の指標である。分析した６つのうち５つのｃＰＰ細胞株が、６を超える継代後、断片又は二動原体染色体の証拠なしに、最頻値染色体カウント４６を示しており、核型に関して安定しているとみなされる。Ｈ９系統＃１では、細胞は、継代されると、追加の同腕染色体を徐々に獲得した。その後、伝統的なＧバンド核型分析（データは示さず）によって、それが、ｈＥＳＣ培養物において一般的に観察される同腕染色体であるｉ（１２）（ｐ１０）［２０］であることがわかった。図４Ｂは、多色蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（Ｍ−ＦＩＳＨ）によって、染色体計数のみより有意に高い解像度で、染色体構造の異常の検出が可能になることを示す。２０継代目のＡＫ６−１３  ｃＰＰ細胞のＭ−ＦＩＳＨでは、分析した１９／２０のスプレッドにおいて異数性、転座、又は欠失が検出されなかった。単一染色体スプレッドの代表的な像を示す。
【図５】ＲＮＡ−ｓｅｑによるｃＰＰ細胞のトランスクリプトーム解析を示すものである。図５Ａは、３つの異なる遺伝的背景からのｃＰＰ細胞（Ｈ９、ＡＫ６−１３、及びＨＥＳ３）についての、早期（６〜８）、中期（１１〜１３）、及び後期（１８）継代時における遺伝子発現レベルの相関関係を示す。ＲＮＡ−ｓｅｑによって測定した、Ｌｏｇ２変換された遺伝子カウントを、各遺伝子についてプロットした。ｃＰＰサンプルにおける遺伝子カウントを、比較のために肝臓と対照させている。サンプルの各ペアについてのスピアマンの相関係数を、対応するプロット上に示す。熱色は、転写物の数を示す。遺伝子カウントは、ｃＰＰサンプル間には遺伝的背景又は継代数に関わらず、に強い相関があるが、肝臓とには相関がない。図５Ｂは、肝臓、肺、及び結腸サンプルにおいて特異的に発現した遺伝子の識別を示す。初期の膵臓発生と関連する遺伝子が、これらの組織によって特異的に発現することは通常見出されない。図５Ｃは、ｃＰＰ、ＰＰｄ１５、ＣＳ１６−１８  ＰＰ、及び肝臓サンプルについてのＺスコアの相関関係を示す。Ｚスコアは、インビトロ及びインビボ膵臓前駆体サンプル間には強い相関があるが、これらのサンプルと肝臓とには相関がない。
【図６】ＲＮＡ−ＳｅｑによるｃＰＰ細胞のトランスクリプトーム解析を示すものである。図６Ａは、インビトロ及びインビボ膵臓前駆体が似通った遺伝子発現パターンを示すことを示す、多様な成体及び胚性組織トランスクリプトーム間のユークリッド距離の階層的クラスタリングを示す。ユークリッド距離の算出には、Ｌｏｇ２変換された遺伝子カウント値を使用した。ここで使用したデータの供給元に関する詳細な情報については、表１を参照されたい。図６Ｂは、インビトロ及びインビボ膵臓前駆体による鍵内胚葉及び膵臓マーカーのｌｏｇ２変換された遺伝子発現レベルのヒートマップを示す。比較のために脳におけるレベルを示す。図６Ｃは、ｃＰＰ、ＰＰｄ１５、及びＣＳ１６−１８膵臓前駆体によって特異的に発現した遺伝子を示す。図６Ａに示した２５の組織全体にかけての各タンパク質コード遺伝子についての変異係数（ＣＶ）を、対応するＺスコアに対してプロットした。特異的に発現した遺伝子は、右側上方の四半分に配置され（ＣＶ＞１及びＺスコア＞１）、初期膵臓発生において十分に特徴付けられた役割を有する遺伝子を含む（ラベルを付けた）。カラースケールは、遺伝子の数を示す。ベン図は、ｃＰＰ、ＰＰｄ１５、及びＣＳ１６−１８膵臓前駆体によって特異的に発現した遺伝子の部分的な重複を示す。図６Ｄは、ｃＰＰ細胞に特異的に発現するすべての遺伝子（上）、又はｃＰＰ細胞に特異的に発現するがＰＰｄ１５若しくはＣＳ１６−１８膵臓前駆体には発現しない遺伝子（下）と関連する、生物学的プロセスの遺伝子オントロジー（ＧＯ）ターム（terms）を示す。５を超える遺伝子及び／又は０．０１未満の補正ｐ値と関連するＧＯタームだけを示す。図６Ｅは、出現頻度が高いＧＯタームである、有糸分裂組換え、ＤＮＡストランド伸長、テロメア維持、及びＤＮＡパッケージングと関連する遺伝子の発現レベルのヒートマップを示す。レベルは、３つの異なる遺伝的背景（Ｈ９、ＡＫ６−１３、及びＨＥＳ３）から誘導された個々のｃＰＰ及びＰＰｄ１５集団について、図６Ａに示した２５の異なる組織全体における最大検出値を基準として示す。図６Ｆは、ｃＰＰ及びＰＰｄ１５細胞におけるｑＲＴ−ＰＣＲによって測定された、選択されたテロメラーゼ経路遺伝子の発現を示す。誤差バーは、３回の技術的反復のＳＥを表す。
【図７】図７は、３Ｔ３フィーダー細胞層及び外因性シグナル伝達分子がｃＰＰ細胞の維持及び拡大増殖に必要であることを示すものである。図７Ａは、完全培地において、５×１０４、２．５×１０４、及び１．２５×１０４細胞／ｃｍ２の密度で播いた３Ｔ３フィーダー細胞上で７日間培養後のＨ９及びＡＫ６−１３  ｃＰＰ細胞の位相差像を示す。スケールバー、１００μｍ。図７Ｂは、図７Ａにおける培養物から収穫されたサンプルでのｑＲＴ−ＰＣＲによって測定された、内分泌（ＮＧＮ３及びＮＫＸ２−２）、腺管（ＫＲＴ１９及びＣＡ２）、及び腺房（ＣＰＡ１及びＡＭＹ２Ｂ）マーカー遺伝子についての遺伝子発現を示す。誤差バーは、３回の技術的反復のＳＥを表す。図７Ｃは、完全培地において個々の成分を省いて６日間培養後のｃＰＰ細胞の位相差像を示す。スケールバー、１００μｍ。図７Ｄは、（Ｃ）において収穫されたサンプルでのｑＲＴ−ＰＣＲによって測定されたＰＤＸ１及びＳＯＸ９発現を示す。誤差バーは、３回の技術的反復のＳＥを表す。図７Ｅは、ＰＤＸ１＋ＳＯＸ９＋ｃＰＰ細胞を増殖させるのに必要な因子のマイクロバイオリアクターアレイ（ＭＢＡ）スクリーニングを示す。すべての因子を次のレベル：ＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）、ＲＡ（３μＭ）、ＤＡＰＴ（１μＭ）、ＳＢ４３１５４２（１０μＭ）、及びＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍＬ）で含有する完全培地から、選択された因子（ＥＧＦ、ＲＡ、ＤＡＰＴ）を減量する又は除去することの影響。上部パネル：チャンバーあたりの合計核、並びにＰＤＸ１及びＳＯＸ９平均核強度に対する影響。下方パネル：チャンバーあたりのＰＤＸ１＋ＳＯＸ９＋細胞の合計数及びＰＤＸ１＋ＳＯＸ９＋細胞の百分率に対する影響。データは、所与の条件で処理したカラム内の１０のチャンバーの平均±ＳＥを表す。図７Ｆは、ｃＰＰ増殖を調節するシグナル伝達経路の成分：ＥＧＦ（ＥＧＦＲ）、ＦＧＦ１０（ＦＧＦＲ１〜４、６、及びＦＧＦＲＬ２）、ＲＡ（ＲＡＲＡ、ＲＡＲＢ、ＲＡＲＧ、ＲＸＲＡ、ＲＸＲＢ、及びＲＸＲＧ）、ＳＢ４３１５４２（ＡＣＶＲ１Ｂ［ＡＬＫ４］、ＴＧＦＢＲ１［ＡＬＫ５］、及びＡＣＶＲ１Ｃ［ＡＬＫ７］）、及びＤＡＰＴ（ＮＯＴＣＨ１〜４とそのリガンドＤＬＬ１、３、４、及びＪＡＧ１、２）のＲＮＡ−ｓｅｑ発現レベルのヒートマップを示す。レベルは、図６Ａに示した２５のすべての組織全体で観察されたレベルを基準として示す。
【図８】ｃＰＰ細胞を増殖させるのに必要な因子のマイクロバイオリアクターアレイ（ＭＢＡ）スクリーニングを示す。図８Ａは、MatrigelでコートされたＭＢＡに播き、定期的に栄養補給しながら２０時間付着させたＰＤＸ１＋ＳＯＸ９＋ｃＰＰ細胞の位相差像を示す。各ＭＢＡデバイスは、Ｓ４Ｄに示されるとおりに並べられた２７０のチャンバーを備える。スケールバー、１００μｍ。図８Ｂは、ＭＢＡスクリーニングに使用したプロトコールを示す。図８Ｃは、抗ＰＤＸ１（緑）及び抗ＳＯＸ９（赤）抗体で染色した、ＭＢＡデバイス（２７０培養チャンバー）の個々のチャンバーを示す。核の識別のためにHoechst 33342（示さず）を使用した。チャンバーは、種々のシグナル伝達環境にかけて観察される増殖速度及びタンパク質発現の範囲が示されるように選択した。スケールバー、１００μｍ。図８Ｄは、ＭＢＡにおける各チャンバーについての終点測定値を示す。上の概略図は、ＭＢＡの各カラムに適用される培地の組成（ＥＧＦ、ｎｇ／ｍＬ；ＲＡ、μＭ；ＤＡＰＴ、μＭ）を示す。細胞培養培地流は、上部（列１）から底部（列１０）へとカラムを下り、それによって、オートクリン因子は、カラムの底に向かって濃縮された。各カラムについての平均測定値を下に示す。ＱＣＦ：画像処理の際の品質管理問題のために目印を付けたデータ。値は、以前に記載したとおりの画像セグメント化アルゴリズムを使用して、Ｓ４Ｃにあるものなどの画像から抽出した。
【図９】インビトロ及びインビボでのｃＰＰ潜在能の試験を示すものである。図９Ａは、フィーダーを取り除いた１５継代目のＨ９  ｃＰＰ細胞を、Matrigel上に播き直し、内分泌、腺管、及び腺房系列への多系列分化を促進する、表示した因子に曝したことを示す。図９Ｂは、図９Ａにおける、３、６、及び１２日後の内分泌、外分泌、及び腺管遺伝子発現分析を示す。値は、未分化ｃＰＰ細胞（０日目）のレベルを基準として示す。誤差バーは、３回の技術的反復のＳＥを表す。図９Ｃは、（Russ, H.A., Parent, A.V., Ringler, J.J., Hennings, T.G., Nair, G.G., Shveygert, M., Guo, T., Puri, S., Haataja, L., Cirulli, V., et al. (2015). Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro. EMBO J. 34, 1759-1772）の変法を使用した、１０継代目のＡＫ６−１３  ｃＰＰ細胞のインスリン＋ｂ様細胞への定方向性分化を示す。図９Ｄは、４日後の分枝形態形成中の分化するスフェアの位相差像を示す。スケールバー、１００μｍ。図９Ｅは、４日目の細胞の細胞内フローサイトメトリー分析によって、およそ７０％がＮＫＸ６−１を再活性化し、ＰＤＸ１を維持することが示されていることを示す。図９Ｆは、４日目におけるＰＤＸ１及びＮＫＸ６−１免疫染色を示す。スケールバー、１００μｍ。図９Ｇは、９日目に、細胞の大多数がＮＫＸ２−２＋になり、それらの一定割合が一過性にＮＧＮ３＋になることを示す。スケールバー、１００μｍ。図９Ｈは、１６日目のスフェアの位相差像を示す。スケールバー、１００μｍ。図９Ｉは、およそ２０％の細胞が１６日目にＣペプチド＋になることを示す。図９Ｊは、１６日目のＣペプチド＋細胞がグルカゴンを同時発現しないことを示す。スケールバー、１００μｍ。図９Ｋは、図９Ｃの分化プロトコールから収穫された４、９、及び１６日目のｃＰＰ細胞のｑＲＴ−ＰＣＲによって測定された遺伝子発現を示す。レベルは、比較のために未分化ｃＰＰ細胞及びヒト膵島のレベルに関連して示す。誤差バーは、３回の技術的反復のＳＥを表す。図９Ｌは、移植されたｃＰＰ細胞の、内分泌（Ｃペプチド及びグルカゴン）、腺管（ケラチン１９）、及び腺房（トリプシン）系列のマーカーについての免疫染色を示す。スケールバー、１００μｍ。
【図１０】ｃＰＰベータ細胞分化の最適化を示すものである。図１０Ａは、公開されているベータ細胞分化プロトコールのＮＫＸ６−１誘導ステップのｃＰＰ細胞への適用を示す。本研究では、完全ｃＰＰ培地において２Ｄ単層、３Ｄmatrigel、及び３Ｄ懸濁液培養物を構築した後、細胞を、公開されているベータ細胞分化プロトコールに基づく成長因子レジーム（growth factor regimes）に曝した。各処理の終了時に、位相差像を撮影した。スケールバー、１００μｍ。図１０Ｂは、図１０Ａにおいて収穫したサンプルを使用してのｑＲＴ−ＰＣＲによって測定された遺伝子発現を示す。細胞を、３Ｄmatrigelプラットフォームを使用してRezania及びPagliuca分化レジーム（differentiation regimes）に曝したとき、ｑＲＴ−ＰＣＲ分析を実施するのに十分な材料を回収することができなかった。誤差バーは、３回の技術的反復の標準誤差を表す。図１０Ｃは、Russらの分化レジームのＮＫＸ６−１誘導ステップの最適化を示す。３Ｄ懸濁液プラットフォームを使用して分化を実施した。２回の成長因子処理の長さを様々にして、ＮＫＸ６−１発現を再活性化する細胞の百分率を最大化した。細胞内フローサイトメトリー分析によってＰＤＸ１及びＮＫＸ６−１を測定した。各条件について３回の独立した実験を示す。図１０Ｄは、図１０Ｃにおいて生成されたＰＤＸ１＋ＮＫＸ６−１＋細胞の百分率を示す。［実施例］
【００５７】
本発明の非限定的な例及び比較例について、詳細な実施例に即してより詳細に述べるが、実施例は、本発明の範囲を一切限定しないと解釈すべきである。
【００５８】
実験手順
ヒト多能性幹細胞培養及び分化
【００５９】
本研究では以下のｈＥＳＣ株を使用した。Ｈ９（ＷＡ０９）は、WiCell社から購入し、ＨＥＳ３（ＥＳ０３）は、ES Cell International Pte.社より提供され、ＨＥＳ−３  ＩＮＳＧＦＰ（レポーター株を含む）は、Stanley labから寄贈を受けた（Micallef, S.J., Li, X., Schiesser, J.V., Hirst, C.E., Yu, Q.C., Lim, S.M., Nostro, M.C., Elliott, D.A., Sarangi, F., Harrison, L.C., Keller, G., Elefanty, A.G., Stanley, E.G., 2011. INS GFP/w human embryonic stem cells facilitate isolation of in vitro derived insulin-producing cells. Diabetologia 55, 694-706）。本研究において使用したｈｉＰＳＣ株は、ヒト線維芽細胞から社内で誘導しており、ＡＫ５−１１、ＡＫ６−８、及びＡＫ６−１３と称する（図１）。多能性幹細胞は、Matrigelでコートされた組織培養プラスチックにおいて、ｍＴｅＳＲ１培地中で、予め記載したとおりに維持し、STEMdiff膵臓前駆体キット（STEMCELLTechnologies社、０５１２０）を、（１）細胞を１０６細胞／ウェルの密度で１２ウェルプレート（Corning社、３５３０４３）に最初に播き、（２）最終日の処理を繰り返すことにより、段階１を３日に延ばしたという変更を交えながら製造者の指示に従って使用して、膵臓前駆体へと分化させた。組織培養はすべて、３７℃の５％ＣＯ２中で実施した。
【００６０】
ｈｉＰＳＣの生成
パンチ皮膚生検によって線維芽細胞を取得し、ｈｉＰＳＣを生成するように再プログラムした。線維芽細胞は、CytoTune（商標）-iPS 2.0 Sendai再プログラミングキット（Thermo Fisher Scientific社、Ａ１６５１７）を製造者の指示に従って使用して再プログラムした。細胞を継代し、ウイルストランスフェクションから７日後に、照射されたマウス胚性フィーダー上に播いた。その後、１７〜２８日目にｈｉＰＳＣコロニーを選び取り、２０％のKnock Out血清代替品（Thermo Fisher Scientific社、１０８２８−０２８）、０．１ｍＭの２−メルカプトエタノール（Thermo Fisher Scientific社、２１９８５−０２３）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Thermo Fisher Scientific社、２５０３０）、０．２ｍＭのＮＥＡＡ（Thermo Fisher Scientific社、１１１４０−０５０）、及び５ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ（Peprotech社、１００−１８Ｂ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２（Sigma社、Ｄ６４２１）中で維持した。次の抗体：ＮＡＮＯＧ（R&D Systems社、ＡＦ１９９７、１：２００）、ＯＣＴ４（Santa Cruz社、１１１３５１、１：２００）、ＳＯＸ２（R&D Systems社  ＭＡＢ２０１８、１：２００）、ＳＳＥＡ３（Millipore社、ＭＡＢ４３０３、１：５０）、ＳＳＥＡ４（Millipore社、ＭＡＢ４３０４、１：２００）、ＴＲＡ−１−８１（Millipore社、ＭＡＢ４３８１、１：２００）、ＴＲＡ−１−６０（Millipore社、ＭＡＢ４３６０、１：２００）による染色を使用して、多能性を確認した（図１）。一次抗体は、ロバにおいて産生させたAlexa-フルオロフォア結合二次抗体（Thermo Fisher Scientific社、１：５００）によって認識させた。研究プロトコールは、シンガポール大学Institutional Review Boardによって承認された（ＮＵＳ  ＩＲＢ  １０−０５１）。本研究は、ヘルシンキ宣言に従って実施し、参加者から書面によるインフォームド・コンセントを得た。
【００６１】
培養膵臓前駆（ｃＰＰ）細胞の継代及び維持
Gentle cell dissociation reagent（STEMCELL Technologies社、０７１７４）を使用して、ｃＰＰ細胞を凝集塊として継代し、次いでそれを、１：６の分割比で、advanced DMEM/F12（Thermo Fisher Scientific社、２１６３４０１０）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Thermo Fisher Scientific社、２５０３０）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン（Thermo Fisher Scientific社、１５１４０１２２）、１×Ｎ２サプリメント（Thermo Fisher Scientific社、１７５０２−０４８）、１×Ｂ２７サプリメント（Thermo Fisher Scientific社、１７５０４−０４４）、３０ｎＭのデキサメタゾン（STEMCELL Technologies社、７２０９２）、５０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ（R&D Systems社、２３６−ＥＧ−２００）、５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ１０（Source Bioscience社、ＡＢＣ１４４）、３μＭのＲＡ（Sigma社、Ｒ２６２５）、１０μＭのＳＢ４３１５４２（Calbiochem社、６１６４６４）、及び１μＭのＤＡＰＴ（Sigma社、Ｄ５９４２）から構成される培地における３Ｔ３−Ｊ２フィーダー層（０．５×１０６〜１×１０６細胞／ｃｍ２）上に播いた。単一のｃＰＰ細胞を播く場合、最初の４８時間は完全培地に１０μＭのＹ２７６３２（Sigma社、Ｙ０５０３）を添加した。培地は、２〜３日毎に完全に補充した。
【００６２】
３Ｔ３−Ｊ２フィーダーの拡大増殖
３Ｔ３−Ｊ２フィーダー細胞（９継代目）を、組織培養プラスチック（０．１％のゼラチン（Sigma社、Ｇ２６２５）で３０分間コートしたもの）において、３Ｔ３−Ｊ２培養培地中で拡大増殖させ、０．２５％のトリプシン（Thermo Fisher Scientific社、２５２０００５６）で５分間処理することにより単一細胞として継代した。３Ｔ３−Ｊ２培養培地は、ＤＭＥＭ高グルコース（Thermo Fisher Scientific社、１１９６０）、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ、ＥＳ細胞適格化（ES cell qualified）、Thermo Fisher Scientific社、１６１４１０７９）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Thermo Fisher Scientific社、２５０３０）、及び１００Ｕ／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン（Thermo Fisher Scientific社、１５１４０１２２）から構成される。フィーダー細胞を、ガンマ線照射（２０グレイを３０分間）によって有糸分裂不活性化し、次いで培養培地＋ＤＭＳＯ中で凍結させた。個々のＦＢＳバッチを、３Ｔ３−Ｊ２細胞がｃＰＰ培養物を維持しうるように選択するが、一方、３Ｔ３−Ｊ２細胞は、１２継代目を超えて培養されることはなく、３．５〜５×１０３細胞／ｃｍ２で播き、１．３×１０４細胞／ｃｍ２を超えないようにすべきである。
【００６３】
３Ｔ３−Ｊ２フィーダーでコートされた培養容器の調製
解凍した３Ｔ３−Ｊ２細胞を、０．１％のゼラチン（Sigma社、Ｇ２６２５）で３０分間コートした組織培養プレート上に、０．５〜１×１０６細胞／ｃｍ２で播き、３Ｔ３−Ｊ２培養培地において最長で３日間、必要になるまで維持した。フィーダー密度を高めることで、コロニー形態は改善され、分化はブロックされるが、増殖速度は減速する結果となるため、最適な播種密度が、各フィーダーバッチについて経験的に決定されなければならず、増殖を著しく妨げずにコロニー形態を維持する能力に基づき評価される。フィーダーを含有する組織培養容器をＤＭＥＭで１回洗浄して残留ＦＢＳを除去した後、ｃＰＰ培養培地を加えた。
【００６４】
分裂中期スプレッド調製、染色体計数、及びＭ−ＦＩＳＨ核型分析
約７５〜８０％の集密度に増殖させた細胞を１００ｎｇ／ｍｌのコルセミド溶液（Gibco社、１５２１２０１２）で６時間処理し、トリプシン処理し、１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。細胞ペレットを７５ｍＭのＫＣｌに再懸濁し、３７℃の水浴中で１５分間インキュベートした。１／１０体積の３：１メタノール／酢酸を細胞に加えた後、１０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。次いで、細胞を３：１メタノール／酢酸溶液に再懸濁して固定化し、室温で３０分間インキュベートし、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、最後に固定液でもう１回洗浄した。細胞を、少ない体積の固定液に再懸濁し、きれいなスライドグラスに滴下し、風乾しておいた。多色ＦＩＳＨ（ＭＦＩＳＨ）を、製造者の指示に従って実施した（MetaSystems社）。Metafer画像処理プラットフォーム（MetaSystem社）を使用して、自動化された染色体スプレッドの取得を実行した。Ikaros及びFijiソフトウェアを使用して、スプレッドあたりの染色体数を求め、Ｍ−ＦＩＳＨ像を解析した。
【００６５】
遺伝子発現のＲＮＡ−Ｓｅｑ解析
RNeasyミニキット（QIAGEN社、カタログ番号７４１０４）を使用して、ｃＰＰ及びＰＰｄ１５培養物から収穫したサンプルから、ＲＮＡを単離した。ＲＮＡ抽出の前に、フィーダー除去マイクロビーズ（Miltenyi Biotec社、１３０−０９５−５３１）を使用して、３Ｔ３フィーダーのｃＰＰ細胞を除去した。ＲＮＡサンプルはすべて、ＲＮＡ完全性数（RNA integrity number）が９を超えていた。NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit（NEB社、Ｅ７５３０Ｌ）を使用してＲＮＡ−ｓｅｑライブラリーを生成し、Illumina HiSeq 2500システムで配列決定して、１００ｂｐのシングルエンド読取りデータを生成した。表１は、ＲＮＡ−ｓｅｑ遺伝子発現解析に使用した、これらについてのメタデータ及び公開されたデータセットを含む。
【００６６】
【表１】
2020506679.tif 000003
2020506679.tif 000004
【００６７】
ＲＮＡ−ｓｅｑ読取りデータアライメント、遺伝子カウント計算、正規化
SRA-toolkit（ｖ  ２．８．０）のfastq-dump関数を用いて生fastqファイルをダウンロードした。本研究では、リファレンスゲノムＧＲＣｈ３８及び対応する遺伝子アノテーションｇｔｆファイル（ＧＲＣｈ３８．８３）のソフトマスキングされたプライマリアセンブリに基づくインデックスを使用して、STAR（ｖ２．５．１ａ）によって読取りデータをマッピングした。両方とも、Ensembl FTPサイトから取得した。読取りデータオーバーハングを、インデックス生成については９９ｂｐに設定した。デフォルトマッピングパラメーターを保持したが、以下は例外とした。スプリアスジャンクションの数を減らすための「--outFilterType BySJout」、「--alignSJoverhangMin 10」アノテーションのないジャンクションのための最小読取りデータオーバーハング、「--alignSJDBoverhangMin 1」アノテーション付きジャンクションのための最小オーバーハング、より良好なアライメントを見出すことができない場合、（一対あたり）５％までの不適正塩基を許可するための「--outFilterMatchNminOverLread 0.95」、短いイントロンを許可するための「--alignIntronMin 20」、イントロンの長さに上限を設けるための「-- alignIntronMax 2000000」、最高スコアリングアライメントからのプライマリアライメントの選択をランダム化するための「--outMultimapperOrder Random」、既知の転写物に合わせてマッピングにバイアスをかけるための「--outFilterIntronMotifs RemoveNoncanonicalUnannotated」、及びキメラマッピング出力を抑制するための「--chimSegmentMin 0」。すべてのサンプルのマッピングされた読取りデータを、次いで、Ｒ（ｖ３．１．２）にあるパッケージ「Rsubread」（ｖ１．１６．１）により実行されるfeatureCountsを用い、合同で加工した。デフォルト設定を使用したが、以下は例外とした。ＳＴＡＲインデックスにあるものと同じｇｔｆアノテーションファイルを使用するための「annot.ext=GTFfile, isGTFAnnotationFile=TRUE, GTF.featureType=’exon’」、カウントを遺伝子レベルにまとめるための「useMetaFeatures=TRUE、GTF.attrType=’gene’」、重複遺伝子の計数を可能にするための「allowMultiOverlap=TRUE」、「isPairedEnd」をそれぞれのサンプルに適切であるように設定し、すべてのライブラリーがストランド特異的であるとは限らないため「strandSpecific=0」、及び最後に「countMultiMappingReads=TRUE」。得られるカウントテーブルを、edgeR（ｖ３．８．６）により実行されるようなＴＭＭ法を、デフォルト設定を使用して用いて正規化して、配列決定深さ及びカウント分布の明細を明らかにした。
【００６８】
生命情報科学解析
各組織タイプの各遺伝子についての正規化されたカウントを使用して、ＲＮＡ−ｓｅｑ遺伝子発現解析を行った。他の研究において記載されているサンプルについて技術的反復が利用可能である場合では、そうした読取りデータを整列化し、遺伝子カウントを別途求め、次いで、平均遺伝子カウントを算出した。さらに、別段記載しない限り、ｃＰＰ及びＰＰｄ１５細胞についての遺伝子カウントは、Ｈ９及びＨＥＳ３  ｈＥＳＣ並びにＡＫ６−１３  ｈｉＰＳＣから誘導された細胞から収穫した、３つの独立したサンプルの平均である。遺伝子発現プロファイルを包括的に比較するために、本発明者らは、少なくとも１つのサンプルにおいて５を超える正規化カウントで発現した６０，６７５のＥＮＳＥＭＢＬ遺伝子又は（明記する場合では）１９，８７５のＥＮＳＥＭＢＬタンパク質コード遺伝子を比較した。以下の解析はすべて、Ｒにおいて、別段記載しない限り基本パッケージを使用して行った。
【００６９】
ＲＮＡ−Ｓｅｑトランスクリプトームの階層的クラスタリング（図６Ａ）
ｌｏｇ２変換した包括的な遺伝子カウントのペア間のユークリッド距離を、Ｒの関数dist()を使用して算出し、その距離を、hclust()関数を使用して樹状図としてプロットした。
【００７０】
ヒートマップ（図６Ｂ、６Ｅ、及び６Ｆ）
ヒートマップは、関数heatmap.2()を使用してプロットした。
【００７１】
特異的に発現した遺伝子（図６Ｃ）
特異的に発現した遺伝子を、ＣＶ（変異係数）が１を超え、Ｚスコアが１を超えるものとして定義した。ＣＶは、すべてのサンプル、この場合では、前述の２３件の公開されている組織データベースに、ここに記載するｃＰＰ及びＰＰｄ１５遺伝子カウントを加えたもの全体について、平均値を標準偏差で割ったものであると定義される。Ｚスコアは、所望のサンプルにおける発現とすべてのサンプルについての平均の差を、すべてサンプルにかけての標準偏差で割ったものであると定義される。膵臓サンプルについてのＺスコアを算出するとき、他の膵臓サンプルは除外した。
【００７２】
遺伝子個体発生解析（図６Ｄ）
http://www.webgestalt.org/にあるウェブベースの遺伝子セット解析ツールキットを使用して、ｃＰＰ細胞に特異的に発現する遺伝子と関連する遺伝子個体発生（ＧＯ）タームを解析した。ｃＰＰ細胞についての変異係数及びＺスコア（上を参照されたい）の結果に従ってタンパク質コード遺伝子を順序づけ、上位２５０の遺伝子をエンリッチメント解析用に選択した。Over Representations Analysis（ＯＲＡ）ツールを使用して、こうした２５０の遺伝子全体での、生物学的プロセスのＧＯタームについてのエンリッチメント倍数（fold-enrichment）を、すべてのタンパク質コード遺伝子をリファレンスセットとして使用しながら算出し、対応するｐ値を、Benjamini-Hochberg多重検定補正によって補正した。ＧＯタームをエンリッチメント倍数に従って順序づけ、５未満の遺伝子及び／又は０．０１を超える補正ｐ値と関連するものを、出現頻度が高いセットから排除した。
【００７３】
多系列分化
単層分化培養物をここに記載するとおりに構築した。基本分化培地は、advanced DMEM/F12（Thermo Fisher Scientific社、２１６３４０１０）、２．５ｇ／３０ｍＬのＢＳＡ（Sigma社、Ａ９４１８）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Thermo Fisher Scientific社、２５０３０）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン（Thermo Fisher Scientific社、１５１４０１２２）、及び１×Ｂ２７サプリメント（Thermo Fisher Scientific社、１７５０４−０４４）からなる。サプリメントを次のとおりに加えた。１〜３日目（３μＭのＲＡ［Sigma社、Ｒ２６２５］、１μＭのＤＡＰＴ［Sigma社、Ｄ５９４２］、１００μＭのＢＮＺ［Sigma社、Ｂ４５６０］）、４、７、及び１０日目（３μＭのＲＡ、１６７ｎｇ／ｍＬのＫＡＡＤ−シクロパミン［Calbiochem社、２３９８０７］）。
【００７４】
インビトロ分化
分化培養物の構築
最初に、ｃＰＰ細胞を集密に培養して、フィーダー細胞を除去し、次いで、gentle cell dissociation reagentで処理して、単一細胞を生成した。単一細胞をｃＰＰ培養培地＋１０μＭのＹ２７６３２に再懸濁し、分化プラットフォームに従って播いた。３Ｄスフェア培養物を構築するには、２×１０６細胞を、超低接着６ウェルプレート（Corning社、３４７１）の各ウェルへと、２ｍＬの培地に播き、一晩ニューテーター（nutator）に載せておいた。通常、２４時間後に緻密なスフェアができる。３Ｄmatrigel培養物を構築するには、AggreWell 400プレート(Stemcell Technologies社、２７８４０）を製造者の指示に従って使用して、約２００細胞のスフェアを生成した。２４時間後、約１２００個のスフェアを、５００μＬの１：５希釈したｈＥＳＣ-qualified matrigel（Corning社、３５４２７７）に再懸濁し、２４ウェルプレートの各ウェルに入れた。プレートを３７℃で６０分間インキュベートして、培地を加える前に、matrigelの凝固を可能にした。２Ｄ単層培養物を構築するには、１：５０希釈したmatrigelでコートした組織培養プラスチック上に、細胞を６．６５×１０５細胞／ｃｍ２で播いた。
【００７５】
ＮＫＸ６−１誘導試験
分化培養物を、軽微な変更を加えた、最近公開されたいくつかのプロトコールに基づく、次のシグナル伝達レジーム（signaling regimes）で処理した（Pagliuca, F.W., Millman, J.R., Gurtler, M., Segel, M., Van Dervort, A., Ryu, J.H., Peterson, Q.P., Greiner, D., and Melton, D.A. (2014). Generation of functional human pancreatic β cells in vitro. Cell 159, 428-439、Rezania, A., Bruin, J.E., Arora, P., Rubin, A., Batushansky, I., Asadi, A., O’Dwyer, S., Quiskamp, N., Mojibian, M., Albrecht, T., et al. (2014). Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nat. Biotechnol. 32, 1121-1133、Russ, H.A., Parent, A.V., Ringler, J.J., Hennings, T.G., Nair, G.G., Shveygert, M., Guo, T., Puri, S., Haataja, L., Cirulli, V., et al. (2015). Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro. EMBO J. 34, 1759-1772、Zhang, D., Jiang,W., Liu, M., Sui, X., Yin, X., Chen, S., Shi, Y., and Deng, H. (2009). Highly efficient differentiation of human ES cells and iPS cells into mature pancreatic insulin-producing cells. Cell Res. 19, 429-438）。分化培地１は、ＭＣＤＢ１３１培地（Thermo Fisher Scientific社、１０３７２−０１）、２．５ｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウム（Lonza社、１７−６１３Ｅ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン、１０ｍＭのグルコース（VWR International社、１０１１７４Ｙ）、及び２％のウシ血清アルブミン（Sigma社、Ａ９４１８）からなる。分化培地２は、ＤＭＥＭ高グルコース、２ｍＭのＬ−グルタミン、及び１００Ｕ／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシンからなる。Pagliucaらによって記載されているＰＰ２誘導培地に基づく培地は、５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７（R&D Systems社、２５１−ＫＧ）、０．２５ｍＭのアスコルビン酸（Sigma社、Ａ４５４４）、１００ｎＭのＲＡ、０．２５μＭのＳＡＮＴ−１（Sigma社、Ｓ４５７２）、及び０．５％のＩＴＳ−Ｘ（Thermo Fisher Scientific社、５１５０００５６）を添加した分化培地１からなる。培地は、５日間毎日完全に補充した。Rezaniaらによって記載されている段階４の培地に基づく培地は、３００ｎＭのインドラクタムＶ（Stemcell Technologies社、７２３１２）及び２００ｎＭのＬＤＮ−１９３１８９（Stemcell Technologies社、７２１４２）でさらに補い、５日間毎日完全に補充した。Zhangらによって記載されている１３〜２０日目の培地に基づく培地は、１０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ、１０ｍＭのニコチンアミド（Sigma社、２４，０２０−６）、５０ｎｇ／ｍＬのエキセンディン４（Sigma社、Ｅ７１４４）、１０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４（R&D Systems社、３１４−ＢＰ）、及び１％のＩＴＳ−Ｘを添加した分化培地２からなる。培地は、５日間毎日完全に補充した。Russらによって記載されている７〜９日目の培地に基づく培地は、１×Ｂ２７サプリメント、５０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ、１μＭのＲＡ（最初の２４時間）、及び５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７（次の２４時間）を添加した分化培地２からなる。培地は、２日間毎日完全に補充した。
【００７６】
β細胞分化
分化スフェア培養物をここに記載するとおりに構築した。基本分化培地は、ＤＭＥＭ高グルコース、２ｍＭのＬ−グルタミン、及び１００Ｕ／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシンからなる。サプリメントを次のとおりに加えた。１〜４日目（１×Ｂ２７サプリメント、５０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ、１μＭのＲＡ［１〜２日目のみ］、５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７［３〜４日目のみ］）、５〜１０日目（１×Ｂ２７サプリメント、５００ｎＭのＬＤＮ−１９３１８９［STEMCELL Technologies社、７２１４２］、３０ｎＭのＴＰＢ［EMD Millipore社、５６５７４０］、１μＭのRepSox［STEMCELL Technologies社、７２３９２］、２５ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７）、及び１１〜１７日目（ＤＭＥＭ低グルコース［Thermo Fisher Scientific社、１２３２０−０３２］、２ｍＭのＬ−グルタミン、１×ＭＥＭ非必須アミノ酸［Thermo Fisher Scientific社、１１１４０−０５０］）。
【００７７】
移植アッセイ
ｃＰＰ細胞を集密に増殖させて、フィーダー細胞を置換及び除去し、次いで、gentle cell dissociation reagentで処理して、単一細胞を生成した。およそ３×１０６〜５×１０６細胞を、５０μＬの未希釈Matrigelに再懸濁し、８〜１２週齢の免疫不全（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウスの腎被膜下に注射した。２３〜２７週間後、移植を受けたマウスを安楽死させ、その腎臓を、切片にして免疫染色する前に凍結保存した。研究プロトコールは、シンガポール大学Institutional Review Board（ＮＵＳ  ＩＲＢ  １２−１８１）及びBiomedical Research Council IACUC委員会（１５１０４０）によって承認された。
【００７８】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ
RNeasy mini kit（Qiagen社、カタログ番号７４１０４）を使用してサンプルからＲＮＡを単離し、high-capacity reverse transcription kit及びランダムヘキサマープライマー（Applied Biosystems社、４３６８８１４、２０μＬの反応液あたり１μｇのＲＮＡ）を使用して逆転写させて、ｃＤＮＡを生成した。SYBR Select Mastermix（Applied Biosystems社、４４７２９０８）を使用して、定量的ＲＴ−ＰＣＲを実施した。ΔΔＣＴ法を使用してデータを解析し、各サンプルにおけるハウスキーピング遺伝子ＴＢＰの発現に対して正規化した。ｑＲＴ−ＰＣＲに使用したプライマーを表２に示す。
【００７９】
【表２】
2020506679.tif 000005
2020506679.tif 000006
【００８０】
免疫蛍光染色
免疫蛍光染色には、次の一次抗体を使用した。マウスモノクローナル抗ＰＤＸ１（R&D Systems社、ＭＡＢ２４１９、１：５０）、ウサギ抗ＳＯＸ９（Sigma社、ＨＰＡ００１７５８、１：２０００）、ウサギ抗ＨＮＦ６（ＯＮＥＣＵＴ１）（Santa Cruz社、ＳＣ１３０５０、１：１００）、ヤギ抗ＦＯＸＡ２（R&D Systems社、ＡＦ２４００、１：２００）、ウサギ抗ＧＡＴＡ６（Cell Signaling Technologies社、５８５１、１：１６００）、ヒツジ抗ＮＧＮ３（R&D Systems社、ＡＦ３４４４、１：２００）、マウス抗ＮＫＸ６−１（developmental studies hybridoma bank、Ｆ５５Ａ１２、１：８０）、マウスモノクローナル抗ＮＫＸ２−２（BD biosciences社、５６４７３１、１：４００）、マウスモノクローナル抗プロインスリンｃペプチド（Millipore社、０５−１１０９、１：１００）、ウサギモノクローナル抗グルカゴン（Cell Signaling Technologies社、８２３３、１：４００）、ラットモノクローナル抗ＫＲＴ１９（developmental studies hybridoma bank、ＴＲＯＭＡ−ＩＩＩ−ｓ、１：１０）、ヒツジ抗トリプシン（汎特異性（pan-specific））（R&D Systems社、ＡＦ３５８６、１：１３）。一次抗体は、ロバにおいて産生させたAlexa-フルオロフォア結合二次抗体（Thermo Fisher Scientific社、１：５００）によって認識させた。Olympus FV1000倒立共焦点顕微鏡を使用して画像を取得した。
【００８１】
移植腎臓の免疫蛍光染色
マウス腎臓を切断し、清浄にし、長軸方向に薄切し、Jung凍結用培地（Leica社、０２０１０８９２６）に包埋し、液体窒素中で凍結保存した。切片（６μｍ）を、ＡＰＥＳでコートされたスライドグラスに載せ、乾燥させ、室温にて１０分間、４％パラホルムアルデヒドで固定化した。ＰＢＳで１５分間３回洗浄した後、サンプルを、０．３％のTriton X-100を含有するＰＢＳで１０分間透過処理し、次いで、Rodent block M（Biocare medical社、ＲＢＭ９６１Ｈ）及びブロッキング緩衝液（ＰＢＳ＋２０％の正常ロバ血清＋１％のＢＳＡ＋０．３％のTriton X-100）中でそれぞれ１時間ブロックした。洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．１％のTween-20＋０．１％のＢＳＡ）で１５分間３回洗浄した後、サンプルを、ブロッキング緩衝液に希釈した一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。洗浄緩衝液で１５分間３回洗浄した後、サンプルを、ブロッキング緩衝液で１：５００希釈した二次抗体と共に室温で１時間インキュベートした。後続のステップはすべて、暗所で実施した。洗浄緩衝液で１回洗浄した後、サンプルを、ＰＢＳで希釈した２μｇ／ｍＬのHoechst-33342（Thermo Fisher Scientific社、６２２４９）と共に室温で２０分間インキュベートした。最後に、洗浄緩衝液で１５分間３回洗浄した後、サンプルをVectashield hard set mounting medium（Vector Laboratories社、Ｈ−１４００）で覆い、カバーグラスを被せ、シールした。
【００８２】
培養細胞の免疫蛍光染色
付着細胞をＰＢＳで２回洗浄し、次いで、室温にて２０分間４％パラホルムアルデヒドで固定化した。洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．１％のＢＳＡ）で３回洗浄した後、サンプルを、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ＋２０％の正常ロバ血清＋０．１％のＢＳＡ＋０．３％のTriton X-100）と共に室温で１時間インキュベートした。次いで、サンプルを、ブロッキング緩衝液で希釈した一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。洗浄緩衝液で１５分間３回洗浄した後、サンプルを、ブロッキング緩衝液で１：５００希釈した二次抗体と共に室温で１時間インキュベートした。後続のステップはすべて、暗所で実施した。洗浄緩衝液で１５分間３回洗浄した後、サンプルを、ＰＢＳで希釈した２μｇ／ｍＬのHoechst-33342（Thermo Fisher Scientific社、６２２４９）と共に室温で１５分間インキュベートした。最後に、サンプルをＰＢＳで１５分間２回洗浄し、画像処理した。
【００８３】
分化スフェアの免疫蛍光染色
分化スフェアをＰＢＳ＋２％の血清で１回洗浄し、次いで、室温にて３０分間４％パラホルムアルデヒドで固定化した。洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．１％のＢＳＡ＋０．１％のTween-20）で１５分間１回洗浄した後、サンプルを、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ＋２０％の正常ロバ血清＋１％のＢＳＡ＋０．３％のTriton X-100）中で６時間ブロックした。次いで、サンプルを、ブロッキング緩衝液で希釈した一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。洗浄緩衝液で１５分間２回洗浄した後、サンプルを、ブロッキング緩衝液で１：５００希釈した二次抗体と共に４℃で６時間インキュベートした。後続のステップはすべて、暗所で実施した。洗浄緩衝液で１５分間１回洗浄した後、サンプルを、ＰＢＳで希釈した２μｇ／ｍＬのHoechst-33342（Thermo Fisher Scientific社、６２２４９）と共に室温で１時間インキュベートした。最後に、スフェアをＰＢＳで３０分間２回洗浄し、Vectashield hard set mounting medium（Vector Laboratories、Ｈ−１４００）に再懸濁し、スライドグラスに載せ、カバーグラスを被せ、シールした。洗浄及びインキュベーションステップはすべて、１．５ｍＬのエッペンドルフチューブで実施した。
【００８４】
フローサイトメトリー
accutase（Thermo Fisher Scientific社、１４１９０）を使用して単一細胞を生成し、ＰＢＳ＋１％の血清で１回洗浄し、次いで、室温にて１０分間４％パラホルムアルデヒドで固定化した。細胞を、洗浄／透過処理緩衝液（BD社、５５４７２３）で１回洗浄し、次いで、１０６個までの細胞を、２５０μＬの洗浄／透過処理緩衝液で希釈した一次又はアイソタイプ対照抗体と共に、必要な長さの時間インキュベートした（抗体希釈及びインキュベーション時間については以下を参照されたい）。結合していない抗体について、細胞を、洗浄／透過処理緩衝液で１回洗浄し、次いで、洗浄／透過処理緩衝液で希釈した二次抗体と共に１５分間インキュベートした。２番目の抗体を染色する際は、細胞を洗浄／透過処理緩衝液で１回洗浄し、次いで、前述のインキュベーションステップにかけた。洗浄／透過処理緩衝液で１回洗浄した後、細胞をＰＢＳ＋１％の血清に再懸濁し、BD FACSCaliburフローサイトメーターを使用して解析した。すべてのステップを室温で実施し、細胞を、微量遠心機において６０００ｒｐｍで５分間遠心分離することによりペレット化した。
【００８５】
次の抗体を使用した。マウスモノクローナル抗ＰＤＸ１  ＰＥコンジュゲート（BD biosciences社、５６２１６１、１：５０、４５分）、マウスＩｇＧ１  ＰＥコンジュゲート（BD biosciences社、５５６６５０、１：５０、４５分）、マウスモノクローナル抗ＮＫＸ６．１（developmental studies hybridoma bank、Ｆ５５Ａ１２、１：２５、４５分）、ヤギ抗マウスＩｇＧ  ＡＰＣコンジュゲート（BD biosciences社、５５０８２８、１：４００、１５分）、マウスモノクローナル抗Ｏｃｔ３／４  Alexa Fluor 488コンジュゲート（BD biosciences社、５６０２５３、１：５、６０分）、マウスモノクローナル抗プロインスリンｃペプチド（Millipore社、０５−１１０９、１：１００、６０分）、抗マウスＩｇＧ  Alexa Fluor 488コンジュゲート（Thermo Fisher Scientific社、Ａ２１２０２、１：３００、３０分）。フローサイトメトリー実験はすべて、（直接結合させた一次抗体の場合では）フルオロフォアに結合させたアイソタイプ対照又はフルオロフォアに結合させた二次抗体だけで染色した細胞を使用してゲートした。
【００８６】
ｃＰＰ維持及び増殖のマイクロバイオリアクターアレイ（ＭＢＡ）スクリーニング
マイクロバイオリアクターアレイを使用して、外因性シグナル伝達分子の組合せがｃＰＰ細胞に与える効果をスクリーニングした。ＭＢＡでは、培養チャンバー上での培養培地の継続的な流動と組み合わされた、投入因子のコンビナトリアルな混合が実現される。ＭＢＡをオートクレーブで処理し、滅菌ＰＢＳで満たし、次いで、製造者の推奨濃度のｈＥＳＣ-qualified matrigelの１回の１ｍＬ注射によってコートした（２〜４時間、室温）。次いで、完全培地懸濁液中５×１０６／ｍＬのｃＰＰ細胞をＭＢＡ中に播き、表面密度を５０×１０６細胞／ｃｍ２とした。６時間毎に培地交換を行いながら、細胞を合計２０時間かけて付着させた。引き続いて、最初の３００μＬの充填ステップから開始した後、３日の合計培養時間にかけて、供給因子を３６μＬ／ｈで絶えず潅流させた。終点において、細胞をＰＢＳですすぎ、２％のＰＦＡ／ＰＢＳ溶液で３０分間固定化し、次いでＰＢＳですすぎ、ＰＢＳ＋２０％の正常ロバ血清＋０．１％のＢＳＡ＋０．３％のTriton X-100で３０分間ブロック／透過処理した。次いで、ＰＤＸ１（R&D Systems社、ＭＡＢ２４１９、１：２５）及びＳＯＸ９（Sigma社、ＨＰＡ００１７５８、１：１０００）に対する一次抗体をブロッキング緩衝液に希釈したものによって４℃で一晩細胞を標識した。次いで、細胞を０．１％のＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄し、Alexa-フルオロフォア結合二次抗体（Thermo Fisher Scientific社、１：５００希釈）及びHoechst 33342（２μｇ／ｍＬ）で１時間標識した。最後に、細胞をＰＢＳですすぎ、ＭＢＡ入口及び排出口を栓で塞いだ。次いで、ＭＢＡをマイクロプレートアダプターに載せ、画像処理した。次いで、ＰＤＸ１及びＳＯＸ９の核セグメント化及び核強度の定量化を以前に記載したのと同様に進めた。
【００８７】
受託番号
本研究において生成された一次ＲＮＡ−ｓｅｑデータセットは、ArrayExpressにおいて、ArrayExpress受託番号：Ｅ−ＭＴＡＢ−５７３１で入手可能である。
【００８８】
結果
ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣから誘導したｃＰＰ細胞の維持及び拡大増殖
成長因子及び低分子によって導かれる定方向性分化によって、多能性幹細胞からの多様な細胞型の生成は促進される。成熟β細胞を生成するように設計されたプロトコール（図２Ａ、Rezania, A., Bruin, J.E., Arora, P., Rubin, A., Batushansky, I., Asadi, A., O’Dwyer, S., Quiskamp, N., Mojibian, M., Albrecht, T., et al. (2014). Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nat. Biotechnol. 32, 1121-1133）の早期段階に基づく試薬を使用して、ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣから膵臓前駆体を産生した（図１）。この分化戦略によって、ＰＤＸ１に続いてＮＫＸ６−１の連続的な発現が誘導され、１５日後に、ＰＤＸ１＋ＮＫＸ６−１＋細胞の中央値は８０％となった（ＰＰｄ１５細胞、図３Ｂ及び２Ｃ）。しかし、多能性細胞からの定方向性分化の間にしばしば観察されるように、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６−１発現の動態は、細胞株によってまちまちとなった（図２Ｂ）。したがって、本研究は、培養物中のＰＰｄ１５細胞を捕捉し、同調させ、拡大増殖しようと努めた。
【００８９】
３Ｔ３−Ｊ２マウス胚性線維芽細胞株を使用して、内胚葉由来の腸幹細胞を始めとする、様々なヒト組織から誘導した前駆細胞を培養した。したがって、本研究では、適切な刺激が施されれば、膵臓前駆細胞も同様に拡大増殖できるかどうかを明らかにした。ＥＧＦＬ７、ＢＭＰ４、ニコチンアミド、ＬＩＦ、ＷＮＴ３Ａ、Ｒ−Ｓｐｏｎｄｉｎ−１、ホルスコリン（ｃＡＭＰアゴニスト）、ＧＳＫ３ｂ阻害（ＣＨＩＲ９９０２１）、並びにＢＭＰ（ＬＤＮ−１９３１８９）及びＳＨＨ（ＫＡＡＤ−シクロパミン）シグナル伝達の阻害剤を始めとする、膵臓発生を調節することが以前に示されている一連のシグナル伝達アゴニスト及び阻害剤を試した。最終的に、ＥＧＦと、レチノイン酸と、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β、ＳＢ４３１５４２）及びＮｏｔｃｈシグナル伝達の阻害剤（ＤＡＰＴ）の組合せが、膵臓前駆体の長期の自己複製を支えることがわかった（図３Ａ）。安定したｃＰＰ細胞株を樹立するために、これら因子の存在下で、３Ｔ３−Ｊ２フィーダー細胞の層上にＰＰｄ１５細胞を播き直した。その後、ｃＰＰ細胞は、クローン密度（clonal density）でもコロニーを形成することができたものの、１：６の平均分割比で凝集塊として週１回型通りに継代した（図３Ｃ）。これは、マウス胚性線維芽細胞の層上で培養したときにｈＥＳＣについて決まって観察された６１時間とほぼ同じ、培養下での約６５時間の倍加時間を示唆している。
【００９０】
本研究では、２種のｈＥＳＣ（Ｈ９及びＨＥＳ３）及び３種のｈｉＰＳＣ細胞株（in houseで誘導したＡＫ５−１１、ＡＫ６−８、及びＡＫ６−１３）を使用する４つの異なる遺伝的背景から、自己複製するｃＰＰ細胞株を生成することができ、こうした多様なｃＰＰ細胞は、ＰＤＸ１及びＳＯＸ９を始めとする主要な膵臓転写因子をコードする遺伝子を同等のレベルで発現した（図２Ｄ）。さらなる分析のために選択した２種のｃＰＰ細胞株（Ｈ９＃１及びＡＫ６−１３）は、これまでに２０継代より長く培養下で維持されて、２０週間で１０１８倍を超える拡大増殖が可能になっている。重要なことに、ｃＰＰ細胞は、増殖又は生存率の明らかな低下なしに凍結及び解凍することができ、ｃＰＰ細胞が、インスリンを分泌するβ細胞などの成熟膵臓細胞型へとさらに分化するための出発点として、多能性細胞に取って代わりうることが示唆される。
【００９１】
ｃＰＰ培養物が安定でホモジーニアスな細胞集団からなるかどうかを判定するために、鍵膵臓転写因子の発現を、ｍＲＮＡ及びタンパク質レベルで測定した。ＰＤＸ１及びＳＯＸ９を始めとする、膵芽細胞の数多くのマーカーの遺伝子発現が、培養下で長期間にわたって一定して保たれ、培養条件によって、膵臓前駆体の安定した集団が維持されることが示唆された（図３Ｄ）。
【００９２】
ｃＰＰ培養物がホモジーニアスな集団であるかどうかを判定するために、膵臓マーカーの選択について免疫染色を行い、それらのマーカーが、タンパク質レベルでほぼ遍在して発現することがわかった（図３Ｅ）。さらに、フローサイトメトリー分析によって、ｃＰＰ細胞のおよそ８５％がＰＤＸ１＋であったことが示された（図３Ｆ）。
【００９３】
しかし、ＮＫＸ６−１発現は、培養下で急速にダウンレギュレートされ、ＮＫＸ６−１タンパク質は、免疫染色によって検出されなかった。さらに、本発明者らは、７、１０、及び１５日目の分化培養物からｃＰＰ細胞株を樹立することもできており（データは示さず）、最も早期の時点は、ＮＫＸ６−１の発現より前であり、ｃＰＰ培養条件によって、ＮＫＸ６−１活性化より前の発生状態にある膵臓前駆体が安定化されることが示唆された。初期の内分泌前駆体を特徴付けるＮＧＮ３＋である細胞はごく少数であり、本発明者らの培養条件下では、前駆体段階で分化がブロックされたことが示唆された。最後に、染色体計数によって、６種のうち５種のｃＰＰ細胞が、４６本の染色体を有し、断片や二動原体染色体の存在などの構造変化の徴候もなかったことが示された（図４Ａ）。２０継代目のＡＫ６−１３株における多重蛍光インサイツハイブリダイゼーション（Ｍ−ＦＩＳＨ）分析によって、核型異常がないことが確認された（図４Ｂ）。まとめると、これらのデータから、ｃＰＰ培養条件によって、膵臓前駆体が、長期間にわたり安定して維持され、広範に拡大増殖しうる、ほぼホモジーニアスな集団として獲得されることが証明される。
【００９４】
トランスクリプトーム解析によって、ｃＰＰ細胞が、そのインビボ対応物と近縁関係にあることを証明する
次に、本研究は、３つの異なる遺伝的背景からのｃＰＰ株及びその樹立元であるＰＰｄ１５分化培養物について、ＲＮＡ−ｓｅｑによってトランスクリプトームワイド遺伝子カウントを明らかにした。初期、中期、及び後期継代のｃＰＰ細胞からもＲＮＡ−ｓｅｑのサンプルを採取した。遺伝子発現レベルは、異なるｃＰＰサンプル間で相互に強く関連しており、遺伝的背景も、培養下における時期も、ｃＰＰトランスクリプトームに有意な影響を及ぼさないことが示唆された（図５Ａ）。しかし、遺伝子発現に対するドナー特異的な影響を完全に排除するために、以下の解析では、Ｈ９及びＨＥＳ３  ｈＥＳＣ並びにＡＫ６−１３  ｈｉＰＳＣから誘導したｃＰＰ（早期継代）及びＰＰｄ１５細胞についての平均遺伝子カウントを使用した。
【００９５】
ｃＰＰ細胞がそのインビトロ及びインビボ対応物とどれだけ似通っているかを明らかにするために、ｃＰＰトランスクリプトームを、インビトロで分化させた膵臓前駆体（Cebola  ＰＰ）及びＣＳ１６−１８ヒト胚からの膵臓前駆体（ＣＳ１６−１８  ＰＰ）並びに成体及び胚性組織の多様な収集物の、公開されているトランスクリプトームと比較した。ｃＰＰ細胞は、非膵臓組織に比べて、ＰＰｄ１５及びCebola  ＰＰの両細胞と似通ったパターンの遺伝子発現を示した（図６Ａ）。さらに、ｃＰＰ、ＰＰｄ１５、及びCebola  ＰＰ細胞は、ＣＳ１６−１８のインビボ膵臓前駆体に酷似しており、４種すべての集団が、内胚葉及び膵臓発生と関連する遺伝子を同様のレベルで発現した（図６Ｂ）。しかし、予想したとおり、ｃＰＰ細胞は、後期段階の膵臓前駆体マーカーであるＮＫＸ６−１、ＰＴＦ１Ａ、及びＣＰＡ１を発現しない。総合すると、これらのデータから、ここに記載する培養条件によって、ｃＰＰ細胞が、定方向性分化によって生成された胚性ヒト膵臓及び膵臓前駆体の両方と近縁関係にある発生状態で維持されることが証明される。
【００９６】
ｃＰＰ細胞の転写同一性をさらに特徴付けるために、本研究は、ｃＰＰ細胞を他の系列と識別する遺伝子を特定しようと努めた。特異的に発現する遺伝子を、前述の２５組織のパネル全体にわたって可変的に発現し（変異係数が１を超え）、その発現がｃＰＰ細胞においてアップレギュレートされる（Ｚスコアが１を超える）ものであると定義した。ＰＤＸ１、ＳＯＸ９、ＭＮＸ１、ＲＦＸ６などの、申し分なく特徴付けられた数多くの膵臓前駆細胞マーカーを含む、合計で１，３６６の遺伝子が特定された（図６Ｃ）。この方法の妥当性を確認するために、本研究は、こうした遺伝子が、肝臓、結腸、及び肺を始めとする他の内胚葉派生物には発現しないことを証明した（図５Ｂ）。励まされることに、ｃＰＰ細胞に特異的に発現する遺伝子の８０％程度が、ＣＳ１６−１８膵臓前駆体及び／又はＰＰｄ１５細胞と共通していた。さらに、遺伝子Ｚスコアは、これら３種の膵臓細胞型間で高度に相関していたが、肝臓とは相関がなく（図５Ｃ）、ｃＰＰ細胞と他の膵臓前駆体の転写類似性がさらに証明された。
【００９７】
ｃＰＰに特異的な遺伝子の機能的役割を明らかにするため、本研究では、関連する遺伝子オントロジー（ＧＯ）タームを解析した。最も出現頻度が高い（enriched）タームは、内分泌膵臓発生と関連するものであった（図３Ｄ、上）。培養条件がｃＰＰ細胞の挙動にどのように影響を及ぼすかを明らかにするために、本研究では、ｃＰＰ細胞に発現するがＰＰｄ１５又はＣＳ１６−１８膵臓前駆細胞には発現しない遺伝子と関連するＧＯタームを分析した（図６Ｄ、下）。興味深いことに、最も出現頻度が高いタームは、細胞分裂及びテロメア維持の側面と関連するものであった。実際に、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）及び増殖性細胞核抗原（ＰＣＮＡ）をコードするものなどの、こうした出現頻度が高いタームと関連する遺伝子は、種々の遺伝的背景からのｃＰＰ細胞において、その派生元であるＰＰｄ１５集団に比べて、一貫してアップレギュレートされていた（図６Ｅ及び６Ｆ）。本発明者らは、フィーダーをベースとする培養系では、長期の自己複製に必要な遺伝子がアップレギュレートされながら、膵臓前駆体が安定した集団として維持されると結論付けた。
【００９８】
３Ｔ３−Ｊ２細胞のフィーダー層は、外因性シグナルによって増殖が促進されても、ｃＰＰ分化を妨げる
本研究では、次に、培養系の個々の構成要素、詳細には、照射された３Ｔ３−Ｊ２フィーダー細胞の層、ＥＧＦ、ＦＧＦ１０、及びレチノイン酸（ＲＡ）による刺激、並びにＴＧＦβ及びＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の阻害が果たす役割を調査した。フィーダー層の重要性を評価するため、ｃＰＰ細胞を、漸減する密度で播かれた３Ｔ３−Ｊ２細胞層上に継代培養し、完全ｃＰＰ培養培地において７日間維持した。フィーダー密度が下がっても、ｃＰＰ細胞は、急速に増殖し続けたが、その形態が急に変化し、連続的に継代することができなかった（図７Ａ）。腺管（ＫＲＴ１９及びＣＡ２）及び腺房（ＣＰＡ１及びＡＭＹ２Ｂ）分化のマーカーは、アップレギュレートされたものの、ＰＤＸ１及びＳＯＸ９のレベルは安定して保たれたことから、ｃＰＰ細胞が膵臓系列にコミットしていることが示唆された（図７Ｂ）。しかし、内分泌マーカー（ＮＧＮ３及びＮＫＸ２−２）のアップレギュレートは観察されず、腺管及び腺房系列の方へのさらなる分化をブロックするのに３Ｔ３−Ｊ２フィーダー細胞が必要となることが示唆された。
【００９９】
本発明者らの培養培地において成長因子及び低分子が果たす役割を立証するために、それぞれを個々に除去し、分化及び増殖に対する影響を評価した。ＥＧＦ又はＲＡを除外すると、ｃＰＰ拡大増殖が妨げられ、一方、ＴＧＦ−β阻害剤であるＳＢ４３１５４２を除去すると、コロニーがフィーダー層から分離した（図７Ｃ）。ＦＧＦ１０又はｇ−セクレターゼ阻害剤であるＤＡＰＴのいずれかを除去すると、短期間では、コロニーサイズ又は形態に有意な影響は及ばなかったが、何継代にもわたって培養培地から除去すると、生存率の顕著な低下につながった。興味深いことに、成長因子又はシグナル伝達阻害剤はいずれも、個別には、ＰＤＸ１又はＳＯＸ９発現の維持に必要とならなかった（図７Ｄ）。実のところ、ＲＡの除去が、実際にはＰＤＸ１発現を増大させていた。これらの結果から、本発明者らの培養培地に存在する成長因子及び阻害剤が、ｃＰＰ細胞の発生状態の維持というより、主として、ｃＰＰ細胞を分化させるのに必要となることが示唆される。
【０１００】
ｃＰＰ細胞の維持及び拡大増殖に対する外因性シグナル伝達分子の効果を定量化するために、本研究では、マイクロバイオリアクターアレイ（ＭＢＡ）スクリーニングプラットフォームを使用して、分化及び増殖を測定した。単一ｃＰＰ細胞を、Matrigelでコートされた培養チャンバーに、フィーダーなしで播き、ＥＧＦ、ＲＡ、及びＤＡＰＴのレベルを様々にした完全ｃＰＰ培養培地に３日間曝した（図８）。次いで、本研究は、画像セグメント化アルゴリズムを使用して、個々の核を特定し、ＰＤＸ１及びＳＯＸ９についての免疫蛍光染色を定量化し、それによって、種々の増殖因子レジームに曝した後の二重陽性細胞の百分率の決定を可能にした。３つの因子のいずれかのレベルを下げることで、細胞の合計数とＰＤＸ１＋ＳＯＸ９＋細胞の合計数は、両方とも減少した（図７Ｅ）。しかし、ＰＤＸ１／ＳＯＸ９の平均レベルも、ＰＤＸ１＋ＳＯＸ９＋細胞の百分率も、これらの因子のレベルに依存しておらず、これら因子が、主として分裂促進因子として作用することが示唆された。興味深いことに、細胞をより高濃度のオートクリンシグナルに曝したとき、特に、最大レベルのＥＧＦ、ＲＡ、及びＤＡＰＴを供給したとき、ＰＤＸ１＋ＳＯＸ９＋細胞の数及び百分率の増加が認められたが、全体的な増殖速度に変化はなかった（図８Ｄ）。したがって、内因性可溶性シグナル伝達分子に曝すことは、ＰＤＸ１及びＳＯＸ９を、増殖とは関係なく維持するのに必要である。
【０１０１】
総合すると、これらの知見から、ｃＰＰ細胞の自己複製は、ＥＧＦ、ＦＧＦ１０、及びＲＡ経路の活性化、並びにＮｏｔｃｈシグナル伝達の阻害に左右されることが証明される。実際に、ｃＰＰ細胞並びにそのインビトロ（ＰＰｄ１５）及びインビボ（ＣＳ１６−１８膵臓前駆体）同等物は、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＲＡ、及びＮｏｔｃｈシグナル伝達の複数の受容体、並びにＳＢ４３１５４２によって阻害されるＴＧＦβ受容体であるＡＬＫ４及びＡＬＫ５（ＡＣＶＲ１Ｂ及びＴＧＦＢＲ１によってそれぞれコードされる）を高レベルで発現した（図７Ｆ）。この知見と一致して、周囲の間充織によるＦＧＦ１０及びＲＡの産生は、マウス膵芽の拡大増殖に不可欠であり、ＥＧＦＲは、膵臓全域で発現して、膵島発生を調節する。細胞内Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、膵臓前駆体の拡大増殖を促進し、膵臓前駆体が内分泌細胞へとさらに分化するのを妨げる。したがって、ｇ−セクレターゼ阻害剤であるＤＡＰＴがｃＰＰ細胞の増殖を促進するという本研究の知見は、いささか意外である。しかし、ＦＧＦ１０は、膵臓上皮の発生においてＮｏｔｃｈ活性を促進することが示されており、ｃＰＰ細胞は、図６Ａに記載する２３組織を基準として中間レベルのＮｏｔｃｈエフェクターＨＥＳ１を発現する（データは示さず）。したがって、ｃＰＰ培養物に加えられる比較的低濃度のＤＡＰＴは、Ｎｏｔｃｈ活性を和らげる働きをする見込みが最も高く、並外れて高レベルのＮｏｔｃｈ活性は、実際には増殖を抑制しうることになる。
【０１０２】
ｃＰＰ細胞のインビトロ及びインビボでの膵臓細胞型への分化
膵臓前駆体の基準となる性質は、膵臓を構成する３つの系統のそれぞれ、及びその機能性派生物へと分化する能力である。当初、本研究は、ｃＰＰ細胞がインビトロで内分泌、腺管、及び腺房系統にコミットしうるかどうかを明らかにしようと努めた。膵臓の腺管及び腺房細胞の定方向性分化のための堅固なプロトコールがすでに開発されたため、ｃＰＰ細胞をフィーダーなしで播き直し、多系列分化を促進する最小限のシグナル伝達レジームに曝した（図９Ａ）。１２日間にかけて、内分泌（ＮＫＸ６−１、ＩＮＳ、及びＧＣＧ）、腺房（ＣＰＡ１、ＡＭＹ２Ｂ、及びＴＲＹＰ３）、及び腺管（ＳＯＸ９、ＫＲＴ１９、及びＣＡ２）マーカーのアップレギュレートが観察され、ｃＰＰ細胞が、インビトロで多系列の潜在能を保持することが証明された（図９Ｂ）。
【０１０３】
特に興味深いのは、グルコースレベルの上昇に反応してインスリンを分泌しうるｂ様細胞を生成する能力である。いくつかのグループが、特定のｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ細胞株のｂ様細胞への分化について述べるプロトコールをこの程発表した。ＮＧＮ３の発現より前のＮＫＸ６−１の活性化が、成熟した機能性β細胞の形成に不可欠であると考えられた。したがって、最も有望な４つのプロトコール（Pagliuca, F.W., Millman, J.R., Gurtler, M., Segel, M., Van Dervort, A., Ryu, J.H., Peterson, Q.P., Greiner, D., and Melton, D.A. (2014). Generation of functional human pancreatic β cells in vitro. Cell 159, 428-439、Rezania, A., Bruin, J.E., Arora, P., Rubin, A., Batushansky, I., Asadi, A., O’Dwyer, S., Quiskamp, N., Mojibian, M., Albrecht, T., et al. (2014). Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nat. Biotechnol. 32, 1121-1133、Russ, H.A., Parent, A.V., Ringler, J.J., Hennings, T.G., Nair, G.G., Shveygert, M., Guo, T., Puri, S., Haataja, L., Cirulli, V., et al. (2015). Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro. EMBO J. 34, 1759-1772、Zhang, D., Jiang,W., Liu, M., Sui, X., Yin, X., Chen, S., Shi, Y., and Deng, H. (2009). Highly efficient differentiation of human ES cells and iPS cells into mature pancreatic insulin-producing cells. Cell Res. 19, 429-438）を選択し、それらが低レベルのＮＧＮ３を維持しながらＮＫＸ６−１発現を誘発しうる能力を評価した。詳細には、ｃＰＰ細胞を単層又は凝集塊として培養し、次いで、ＮＫＸ６−１発現を誘発することが示されている欄の各分化プロトコールに曝した（図１０Ａ）。（Russ, H.A., Parent, A.V., Ringler, J.J., Hennings, T.G., Nair, G.G., Shveygert, M., Guo, T., Puri, S., Haataja, L., Cirulli, V., et al. (2015). Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro. EMBO J. 34, 1759-1772）に記載されているプロトコールでは、最高レベルのＮＫＸ６−１発現及びＮＧＮ３の最小限の活性化が生じ、単層と懸濁液の培養物で、非常に似通った反応が得られた（図１０Ｂ）。もとのプロトコールにおいて、細胞を凝集塊として分化させたとき、インスリンを分泌するｂ様細胞の生成が証明されていたため、本研究では、後続の実験に３Ｄ懸濁液プラットフォームを使用することを選択した。（Russ, H.A., Parent, A.V., Ringler, J.J., Hennings, T.G., Nair, G.G., Shveygert, M., Guo, T., Puri, S., Haataja, L., Cirulli, V., et al. (2015). Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro. EMBO J. 34, 1759-1772）のプロトコールを使用して、本研究は、ｃＰＰ細胞の４０％程度が、ＮＫＸ６−１を再活性化することを見出した。しかし最初の２つの処理のそれぞれの長さを２倍にすることで、もともと報告されている数と同様のほぼ７０％の二重陽性細胞の生成が可能になった（図９Ｅ、１０Ｃ、及び１０Ｄ）。興味深いことに、こうしたＰＤＸ１＋ＮＫＸ６−１＋細胞は、胚性膵臓の分枝形態形成を彷彿とさせる回旋状構造を生じた（図９Ｄ及び９Ｆ）。さらなる分化によって、内分泌マーカーであるＮＫＸ２−２及びＮＧＮ３の発現が誘発され、後者は、より少ない下位セットの細胞にあり、内分泌コミットの間のその一過性の発現が反映された（図９Ｇ）。最終的に、１６日後、（Russ, H.A., Parent, A.V., Ringler, J.J., Hennings, T.G., Nair, G.G., Shveygert, M., Guo, T., Puri, S., Haataja, L., Cirulli, V., et al. (2015). Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro. EMBO J. 34, 1759-1772）によって報告された２５％と同じような、２０％の細胞が、インスリン産生の代理であるＣペプチドを含有していた。極めて重大なことに、Ｃペプチド＋細胞は、細胞ホルモンであるグルカゴンを同時発現せず、こうした細胞が、グルコースレベルの上昇に反応してインスリンを分泌することのできない、プロトコールのより早期の世代によって産生されるポリホルモン陽性細胞とは異なることが示唆された。しかし、ＮＧＮ３レベルは、プロトコール終盤でも高いままとなり、ＩＮＳ  ｍＲＮＡレベルは、単離されたヒト膵島より有意に低く、プロトコールのさらなる最適化が必要であることが示唆された（図９Ｋ）。
【０１０４】
発生能についての最も厳しい試練は、前駆体がインビボで特定の系列へと分化しうるかどうかである。ｃＰＰ細胞の潜在能を評価するために、ｃＰＰ細胞を免疫不全マウスの腎被膜下に注射し、２３週間を超えた後、三大膵臓系列のマーカーについて免疫染色した。ｂ細胞マーカーであるＣペプチドを発現する広い面積の細胞、及び腺管マーカーであるケラチン１９（ＫＲＴ１９）を発現する広い面積の細胞を確認することができたが、本研究では、トリプシン＋腺房細胞又はグルカゴン＋内分泌細胞を見出すことはできなかった（図９Ｌ）。しかし、可能性として、腺房細胞は、自身が分泌する消化酵素を運び出すための腺管なしでは生存できないために、トリプシン＋細胞は、先行する研究でも、膵臓前駆体の移植後、滅多に観察されなかった。グルカゴンを発現する細胞がないことは、意外ではあるが、おそらく、グルカゴン＋ａ細胞になるのに必要な誘導シグナルが存在しない中での、デフォルトでのＣペプチド＋細胞の生成を反映している。
【０１０５】
Ｃペプチド＋細胞は、古典的な膵島様構造をなさなかったが、その代わりとして、他者らによって以前に観察されているとおり、相互に接続した一連の嚢胞性構造をなした。さらに、本研究では、移植してしまうと、前駆体集団の拡大増殖は観察されず、ｃＰＰ細胞が、インビボで増殖性のより低い細胞へと速やかに分化することが示唆された。したがって、評価した１２匹のマウスはいずれも、３００万個を超える細胞を各マウスに移植しているにもかかわらず、奇形腫形成を示さなかった。こうした知見から、ｃＰＰ細胞は、腺房細胞になりうるかどうかは確かめるべき点が残っているものの、内分泌及び腺管細胞へとインビボで分化する能力を保持することが証明される。さらに、奇形腫形成がないことから、ｃＰＰ細胞が、多能性幹細胞から直接分化させた細胞より安全な移植の選択肢となりうることが示唆される。
【０１０６】
考察
多能性幹細胞は、糖尿病の模擬実験及び治療のためのβ細胞の無限の供給源として提案されている。しかし、多様な患者由来のｈｉＰＳＣから機能性β細胞を型通りに生成することは、冗長な多段定方向性分化プロトコールに固有の変動性のためということもあり、依然として難題である。本研究では、ヒト多能性幹細胞から誘導された自己複製する膵臓前駆細胞を長期間培養するためのプラットフォームについて述べている。こうしたｃＰＰ細胞は、急速かつ長期にわたって拡大増殖させることができ、そのため、β細胞の好都合な代替供給源となる。さらに、ｃＰＰ細胞は、凍結ストックとして貯蔵及び輸送することができ、ｃＰＰ細胞は、増殖を損なうことなく、少なくとも２５継代にわたり培養されている。ｃＰＰ細胞は、インビトロで分化させたとき、膵臓内分泌、腺管、及び腺房細胞のマーカーを発現することが観察されており、それによって、ｃＰＰ細胞の多能性が示唆され、本研究では、（Russ, H.A., Parent, A.V., Ringler, J.J., Hennings, T.G., Nair, G.G., Shveygert, M., Guo, T., Puri, S., Haataja, L., Cirulli, V., et al. (2015). Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro. EMBO J. 34, 1759-1772）に記載されているβ細胞分化プロトコールの変法を使用して、約２０％ものＣペプチド＋細胞を生成することができた。発生能の決定的な試練は、細胞がインビボで特定の系統へと分化しうるかどうかであり、ｃＰＰ細胞は、インビボで腺房細胞になる能力を保持するかどうかは不確かであるとはいえ、免疫不全マウスの腎被膜下に移植されたとき、有意な数のケラチン１９＋腺管細胞及びＣペプチド＋ｂ様細胞を実際に生成する。
【０１０７】
インビトロで分化する細胞は、通常は、同調しない形で分化するため、培養は、時間と共に段々とより異時性になり、細胞を特定の系列に振り向けることのできる効率が低下する。したがって、多様な遺伝的背景から機能性β細胞を生成するための堅固なプロトコールの開発には、分化する前駆体を獲得し、同調させる能力が不可欠である。徹底的な分子特性決定によって、ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ両方から生成されたｃＰＰ培養物が、初期の膵臓転写因子を経時的に一貫して発現する安定した集団であることが明らかになった。ｃＰＰトランスクリプトームは、ＣＳ１６−１８膵臓の前駆細胞のものと近い関係にある。しかし、異なる発生段階にあるヒト胚と比較すると、ＰＤＸ１、ＳＯＸ９、ＦＯＸＡ２、及びＧＡＴＡ４／６の発現が活発であり、ＮＫＸ６−１及びＳＯＸ１７が存在しないことを根拠に、ｃＰＰ細胞は、ＣＳ１２とＣＳ１３の間の膵芽の細胞と最も酷似していることが示唆される。
【０１０８】
近年、いくつかのグループによって、ヒト内胚葉派生物を培養する方法が報告された。２件の別途の報告において、ｈＥＳＣ由来の胚体内胚葉が、フィーダー層上にて、適切な分裂促進シグナルの存在下で培養されると、連続的に継代され、拡大増殖しうることが示された。その後、別のグループによって、フィーダーなしの条件で前腸前駆細胞を培養できることが示された。しかし、成長が遅く、異なる株間で遺伝子発現が変動しうるため、その有用性は限られている。より最近では、再プログラムされた内胚葉細胞から誘導された膵臓前駆体を拡大増殖させ、継代することができたことが示された。しかし、こうした培養物は、高度に異質性であり、使用するシグナル伝達分子及び阻害剤の最小限の組合せが、異なる遺伝的背景からの細胞の培養に十分であるかどうかは明確でない。したがって、ここに記載する培養系は、遺伝的に多様なｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣから誘導された多能性膵臓前駆体の長期の自己複製を可能にする最初のものである。
【０１０９】
参考文献
1. Russ, H.A., Parent, A.V., Ringler, J.J., Hennings, T.G., Nair, G.G., Shveygert, M., Guo, T., Puri, S., Haataja, L., Cirulli, V., et al. (2015). Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro. EMBO J. 34, 1759-1772
2. Pagliuca, F.W., Millman, J.R., Gurtler, M., Segel, M., Van Dervort, A., Ryu, J.H., Peterson, Q.P., Greiner, D., and Melton, D.A. (2014). Generation of functional human pancreatic β cells in vitro. Cell 159, 428-439
3. Rezania, A., Bruin, J.E., Arora, P., Rubin, A., Batushansky, I., Asadi, A., O’Dwyer, S., Quiskamp, N., Mojibian, M., Albrecht, T., et al. (2014). Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nat. Biotechnol. 32, 1121-1133
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【図１−１】
2020506679.tif 000007
【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図７−５】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図９−５】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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