(57)【要約】  目的の分子を試料ウェル中にローディングする方法が提供される。いくつかの態様において、目的の分子を試料ウェル中にローディングする方法は、目的の分子を、試料ウェル中に、クラウディング剤および／または凝縮剤の存在下でローディングすることを伴う。いくつか態様において、シークエンシング用鋳型を、試料ウェル中にローディングする方法が提供される。
2020513749.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的の分子を試料ウェル中にローディングする方法であって、
目的の分子を含む試料を、複数の試料ウェルを含む基材の表面に接触させる工程；および
前記試料を、前記試料中において前記目的の分子を他の成分に対して排除するクラウディング剤と接触させる工程
を含む、方法。
【請求項２】
前記目的の分子がシークエンシング用鋳型を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記シークエンシング用鋳型が、少なくとも１種のハイブリダイズしたプライマー／重合酵素複合体を有する核酸分子を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記クラウディング剤が多糖である、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記多糖がセルロース化合物である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記セルロース化合物がメチルセルロースである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記セルロース化合物が、エチルセルロース、エチルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、およびカルボキシメチルセルロースからなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記クラウディング剤がポリエーテル化合物である、請求項１乃至７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ポリエーテル化合物が、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、パラホルムアルデヒド、ポリテトラメチレングリコール、およびポリフェニルエーテルからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記クラウディング剤がポリアミド化合物である、請求項１乃至９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ポリアミド化合物が、直鎖状ポリビニルピロリドンおよび環状ポリビニルピロリドンからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記クラウディング剤がフィルムとして提供される、請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記フィルムが、架橋したゲルまたは脱水された溶液から選択される材料である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記クラウディング剤が、溶液として提供される、請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記溶液中の前記クラウディング剤の濃度が約０．６重量％である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記溶液中の前記クラウディング剤の濃度が約０．９重量％である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記溶液中の前記クラウディング剤の濃度が約２．０重量％である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記溶液中の前記クラウディング剤の濃度が約２．３重量％である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記溶液中の前記クラウディング剤の濃度が、約０．１重量％から約１．０重量％の間、約１．０重量％から約２．０重量％の間、約２．０重量％から約３．０重量％の間、約３．０重量％から約４．０重量％の間、または約４．０重量％から約５．０重量％の間である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記溶液中の前記クラウディング剤の濃度が、約５．０重量％から約６．０重量％の間、約６．０重量％から約７．０重量％の間、約７．０重量％から約８．０重量％の間、約８．０重量％から約９．０重量％の間、または約９．０重量％から約１０重量％の間である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記溶液中の前記クラウディング剤の濃度が、約１０重量％から約１１重量％の間、約１１重量％から約１２重量％の間、約１２重量％から約１３重量％の間、約１３重量％から約１４重量％の間、または約１４重量％から約１５重量％の間である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
前記試料を、前記クラウディング剤と接触させる前に、前記表面に接触させる、前記、請求項１乃至２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記試料を、前記表面に接触させる前に、前記クラウディング剤と接触させる、請求項１乃至２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記試料を、前記表面に接触させ、ほぼ同時に前記クラウディング剤と接触させる、請求項１乃至２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記試料が、前記表面に接触したときに前記クラウディング剤と接触する、請求項１乃至２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記試料を、前記目的の分子の広がった体積を縮小するように構成された凝縮剤と接触させる工程をさらに含む、請求項１乃至２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記凝縮剤が、前記試料中でポリカチオン性であるポリカチオンを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ポリカチオンが、スペルミン、スペルミジン、ポリリシン、ポリアルギニン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、プトレシン、およびプロタミンから選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記試料を、前記凝縮剤と接触させる前に、前記表面に接触させる凝縮剤、請求項２６乃至２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記試料を、前記表面に接触させる前に、凝縮剤と接触させる、請求項１乃至２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記試料を、前記表面に接触させ、ほぼ同時に凝縮剤と接触させる、請求項１乃至２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記試料が、前記表面に接触したときに、凝縮剤と接触する、請求項１乃至２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記複数の試料ウェルの各試料ウェルが、前記基材の表面に対して遠位の底部表面を備える、請求項１乃至３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記底部表面が、目的の分子と結合するように構成された少なくとも１つのカップリング基を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記少なくとも１種のカップリング基が、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、レクチンタンパク質、またはＳＮＡＰ−タグからなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記少なくとも１種のカップリング基が反応性の化学基である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記反応性の化学基が、アミン基、アジド基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アルキル基、またはスルフヒドリル基からなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記核酸分子が、約１ｋｂから約５ｋｂの間、約５ｋｂから約１０ｋｂの間、約１０ｋｂから約１５ｋｂの間、約１５ｋｂから約２０ｋｂの間、または約２０ｋｂから約２５ｋｂの間である、請求項１乃至３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記核酸分子が、約２５ｋｂから約５０ｋｂの間、約５０ｋｂから約１００ｋｂの間、約１００ｋｂから約２５０ｋｂの間、約２５０ｋｂから約５００ｋｂ、または約５００ｋｂから約１０００ｋｂの間である、請求項１乃至３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
重合酵素がＤＮＡポリメラーゼである、請求項１乃至３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記基材が、一体化されたデバイスである、請求項１乃至４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記試料をシール材と接触させる工程をさらに含む、請求項１乃至４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記シール材が鉱物油を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記シール材が、被酸化性物質および触媒を含む酸素除去シール材を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記被酸化性物質が、少なくとも１つのエチレン結合を含む有機化合物である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記有機化合物がアスコルビル基を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記有機化合物がアスコルビン酸の脂肪酸エステルである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記有機化合物がトコフェロール化合物である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記触媒が、遷移金属および対イオンを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項５０】
前記遷移金属が、スカンジウム、チタン、バナジウム、クロム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル、銅、亜鉛、ランタン、およびセリウムからなる群から選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記遷移金属が銅である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記対イオンが、ハロゲン化物イオン、硫酸イオン、亜硫酸イオン、硫化物イオン、硝酸イオン、亜硝酸イオン、酢酸イオン、アセチルアセトンイオン、過塩素酸イオン、水酸化物イオン、メトキシドイオン、およびエトキシドイオンからなる群から選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
前記対イオンが、ラウリン酸イオン、ミリスチン酸イオン、パルミチン酸イオン、ステアリン酸イオン、オレイン酸イオン、およびリノール酸イオンからなる群から選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５４】
前記試料を次世代シークエンシング技法にかける工程をさらに含む、請求項１乃至５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記試料ウェルが、約９５ｎｍから約１５０ｎｍの間、約１５０ｎｍから約３５０ｎｍの間、約２００ｎｍから約３２５ｎｍの間、約２５０ｎｍから約３００ｎｍの間の深さを有する、請求項１乃至５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
前記試料ウェルが、約２７０ｎｍの深さを有する、請求項１乃至５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記試料ウェルが、約９５ｎｍから約１５０ｎｍの間、約１５０ｎｍから約３５０ｎｍの間、約２００ｎｍから約３２５ｎｍの間、約２５０ｎｍから約３００ｎｍの間の深さを有する、請求項１乃至５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
前記試料ウェルが、底部表面に対して遠位の上部開口部を有する、請求項１乃至５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
前記上部開口部が、約５０ｎｍから約１５０ｎｍの間、約１００ｎｍから約１５０ｎｍの間、約１００ｎｍから約２００ｎｍの間、約１５０ｎｍから約２５０ｎｍの間の直径を有する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記上部開口部が約１２０ｎｍの直径を有する、請求項５９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、概して、生物学的および／または化学的試料を分析するための調製方法および組成物を対象とする。
【背景技術】
【０００２】
次世代のシークエンシング技術における進歩は、単一分子の分析を大量に並行して実施することを可能にした。これらの技法は、生命科学の研究の展望を、特にゲノム科学および医学的診断に関して根本的に変化させた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
生物学的試料に固有の複雑さにより、従来の単一分子技術を使用する手間のかかるおよび時間のかかる試料調製プロトコルが通常必要になる。その上、これらの反応が実施される試料ウェルの例外的に小さいサイズにより、分析され得る分子のサイズが制限され得る。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本明細書で開示された技術の態様は、分析のために目的の分子を調製する方法に関する。いくつかの実施形態では、シークエンシング分析のための試料（例えば核酸試料）を調製するために有用な方法および組成物が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載された技法は、目的の分子を含む試料を試料ウェル中にローディングする方法に関する。いくつかの態様において、本開示は、試料を基材の表面に接触させることを伴う、目的の分子を含む試料を試料ウェル中にローディングする方法を提供する。いくつかの実施形態では、目的の分子はシークエンシング用鋳型を含む。いくつかの実施形態では、シークエンシング用鋳型は、少なくとも１つのハイブリダイズしたプライマー／重合酵素複合体を有する核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、基材は、集積化デバイスである。いくつかの実施形態では、基材の表面は複数の試料ウェルを備える。いくつかの実施形態では、方法は、試料をクラウディング剤と接触させることをさらに伴う。いくつかの実施形態では、クラウディング剤は、目的の分子を排除する。いくつかの実施形態では、クラウディング剤は、目的の分子（例えば、シークエンシング用鋳型）を、溶媒分子（例えば、水）および／または他の反応成分（例えば、塩、緩衝液、ヌクレオチドなど）に対して選択的に排除する。いくつかの実施形態では、クラウディング剤は、体積排除剤である。
【０００５】
いくつかの実施形態では、クラウディング剤は多糖である。いくつかの実施形態では、多糖はセルロース化合物である。いくつかの実施形態では、セルロース化合物は、メチルセルロースである。いくつかの実施形態では、セルロース化合物は、エチルセルロース、エチルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、およびカルボキシメチルセルロースから選択される。いくつかの実施形態では、クラウディング剤はポリエーテル化合物である。いくつかの実施形態では、ポリエーテル化合物は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、パラホルムアルデヒド、ポリテトラメチレングリコール、およびポリフェニルエーテルから選択される。いくつかの実施形態では、クラウディング剤は、ポリアミドである。いくつかの実施形態では、ポリアミドは、直鎖状ポリビニルピロリドンおよび環状ポリビニルピロリドンから選択される。
【０００６】
いくつかの実施形態では、クラウディング剤は、フィルムとして提供される。いくつかの実施形態では、前記フィルムは、架橋したゲルまたは脱水された溶液から選択される材料である。いくつかの実施形態では、フィルムは、ポリアクリルアミド、デキストラン、アガロース、またはそれらのいくつかの組合せまたはバリアントを含む。いくつかの実施形態では、フィルムは、スラリーとして提供される。いくつかの実施形態では、フィルムは粒子として提供される。
【０００７】
いくつかの実施形態では、クラウディング剤（例えば、メチルセルロース）は、溶液として提供される。いくつかの実施形態では、溶液中におけるクラウディング剤の濃度は、約２．０重量％である。いくつかの実施形態では、溶液におけるクラウディング剤の濃度は、約２．３重量％である。いくつかの実施形態では、溶液中におけるクラウディング剤の濃度は、約０．１重量％から約１．０重量％の間、約１．０重量％から約２．０重量％の間、約２．０重量％から約３．０重量％の間、約３．０重量％から約４．０重量％、または約４．０重量％から約５．０重量％の間である。いくつかの実施形態では、溶液中におけるクラウディング剤の濃度は、約５．０重量％から約６．０重量％の間、約６．０重量％から約７．０重量％の間、約７．０重量％から約８．０重量％の間、約８．０重量％から約９．０重量％、または約９．０重量％から約１０重量％の間である。いくつかの実施形態では、溶液中におけるクラウディング剤の濃度は、約１０重量％から約１１重量％の間、約１１重量％から約１２重量％の間、約１２重量％から約１３重量％の間、約１３重量％から約１４重量％の間、または約１４重量％から約１５重量％の間である。
【０００８】
いくつかの実施形態では、クラウディング剤の溶解性は、温度、ｐＨ、塩、および／または他の要因に依存する。いくつかの実施形態では、クラウディング剤は、懸濁液で（例えばコロイド状懸濁液）提供される。いくつかの実施形態では、懸濁液中におけるクラウディング剤の濃度は、クラウディング剤溶液について、およそ上で記載された任意の重量％または重量範囲である。
【０００９】
いくつかの実施形態では、試料は、クラウディング剤と接触する前に表面に接触する。いくつかの実施形態では、試料は、表面に接触する前にクラウディング剤と接触する。いくつかの実施形態では、試料は、表面に接触してほぼ同時にクラウディング剤と接触する。いくつかの実施形態では、試料は、表面に接触したときにクラウディング剤と接触する。
【００１０】
いくつかの実施形態では、目的の分子を含む試料を、集積化デバイス（例えば、複数の試料ウェルを備えるシークエンシングチップ）の表面に接触させて、クラウディング剤の層（例えば、クラウディング剤を含む溶液）を試料の上部表面に適用する。
【００１１】
いくつかの実施形態では、目的の分子を含む第１の溶液を集積化デバイスの表面に接触させて、集積化デバイスの表面に第１の体積を形成させる。いくつかの実施形態では、クラウディング剤を含む第２の溶液を、第１の体積の表面に接触させて、第２の体積を第１の体積の表面に形成させる。いくつかの実施形態では、クラウディング剤は、目的の分子を、第１の体積の溶媒分子に対して優先的に第２の体積から排除する。いくつかの実施形態では、第１の溶液は、１種または複数の試薬成分（例えば、緩衝液、塩、標識されたヌクレオチド）を含む。いくつかの実施形態では、クラウディング剤は、目的の分子を、第１の体積の１種または複数の試薬成分に対して優先的に第２の体積から排除する。
【００１２】
いくつかの実施形態では、複数の試料ウェルのそれぞれは、基材の表面に対して遠位の底部表面を含む。いくつかの実施形態では、底部表面は、目的の分子と結合するように構成されたカップリング基を含む。いくつかの実施形態では、底部表面は、シークエンシング用鋳型と結合するように構成されたカップリング基を含む（例えば、重合酵素と、またはシークエンシング用鋳型上で重合酵素により結合した核酸とカップリングすることにより）。いくつかの実施形態では、クラウディング剤は、目的の分子を底部表面方向に向かわせて、それにより目的の分子は、少なくとも１つのカップリング基を通じて底部表面に結合する。いくつかの実施形態では、カップリング基は、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、レクチンタンパク質、またはＳＮＡＰ−タグから選択される。いくつかの実施形態では、カップリング基は、反応性の化学基である。いくつかの実施形態では、反応性の化学基は、アミン基、アジド基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アルキル基、またはスルフヒドリル基から選択される。
【００１３】
いくつかの実施形態では、試料は、核酸鋳型、重合酵素、核酸鋳型に対して相補性のプライマー、およびシークエンシング反応のために適当な１種または複数の試薬成分を含む。いくつかの実施形態では、重合酵素およびプライマーは、核酸鋳型上に少なくとも１つのハイブリダイズした複合体を形成する。いくつかの実施形態では、試料は、１種または複数のヌクレオチド（例えば、標識されたヌクレオチド）、１種または複数の緩衝剤、１種または複数の塩、１種または複数の還元剤、および１種または複数の界面活性剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、試料は、金属カチオン（例えば、マグネシウムイオン）をさらに含む。いくつかの実施形態では、金属カチオンが試料に添加されてシークエンシング反応を開始させる。
【００１４】
いくつかの実施形態では、核酸分子は、約１ｋｂから約５ｋｂの間、約５ｋｂから約１０ｋｂの間、約１０ｋｂから約１５ｋｂの間、約１５ｋｂから約２０ｋｂ、または約２０ｋｂから約２５ｋｂの間である。いくつかの実施形態では、核酸分子は、約２５ｋｂから約５０ｋｂの間、約５０ｋｂから約１００ｋｂの間、約１００ｋｂから約２５０ｋｂの間、約２５０ｋｂから約５００ｋｂの間、または約５００ｋｂから約１０００ｋｂの間である。
【００１５】
いくつかの実施形態では、重合酵素は、ＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、ファイ２９ＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｍ２ＹＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、ヒツジキンバエ（Ｌｕｃｉｌｉａ  ｃｕｐｒｉｎａ）のＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、重合化剤はキメラおよび／または改変されたＤＮＡポリメラーゼである。
【００１６】
いくつかの実施形態では、凝縮剤を目的の分子（例えば、シークエンシング用鋳型）と接触させる。いくつかの実施形態では、凝縮剤を、クラウディング剤の添加前に、目的の分子と接触させる。いくつかの実施形態では、シークエンシング用鋳型を集積化デバイスの表面に接触させる前に、凝縮剤をシークエンシング用鋳型に添加する。いくつかの実施形態では、凝縮剤およびシークエンシング剤を、集積化デバイスの表面に、ほぼ同時に接触させる。いくつかの実施形態では、集積化デバイスの表面は、シークエンシング用鋳型が集積化デバイスの表面に接触する前に、凝縮剤を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、試料をシール材と接触させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、シール材は、鉱物油を含む。いくつかの実施形態では、シール材は、被酸化性物質および触媒を含む酸素除去シール材を含む。いくつかの実施形態では、被酸化性物質は、少なくとも１つのエチレン結合を含む有機化合物である。いくつかの実施形態では、有機化合物はアスコルビル基を含む。いくつかの実施形態では、有機化合物は、アスコルビル酸エステルである。いくつかの実施形態では、有機化合物は、アスコルビン酸の脂肪酸エステルである。いくつかの実施形態では、有機化合物は、トコフェロール化合物である。いくつかの実施形態では、触媒は、遷移金属および対イオンを含む。いくつかの実施形態では、遷移金属は、スカンジウム、チタン、バナジウム、クロム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル、銅、亜鉛、ランタン、セリウム、プラセオジム、ネオジム、プロメチウム、サマリウム、ユウロピウム、ガドリニウム、テルビウム、ジスプロシウム、ホルミウム、エルビウム、ツリウム、イッテルビウム、およびルテチウムから選択される。いくつかの実施形態では、遷移金属は銅である。いくつかの実施形態では、対イオンは、ハロゲン化物イオン（例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、硫酸イオン、亜硫酸イオン、硫化物イオン、硝酸イオン、亜硝酸イオン、酢酸イオン、アセチルアセトンイオン、過塩素酸イオン、水酸化物イオン、メトキシドイオン、およびエトキシドイオンから選択される。いくつかの実施形態では、対イオンは、ラウリン酸イオン、ミリスチン酸イオン、パルミチン酸イオン、ステアリン酸イオン、オレイン酸イオンおよびリノール酸イオンから選択される。
【００１８】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、目的の分子（例えば、シークエンシング用鋳型）を次世代シークエンシング技法にかけることをさらに含む。
当業者は、本明細書に記載される図は、例示目的に限定されるものと理解する。いくつかの事例に、本発明の様々な態様が、本発明の理解を容易にするために、誇張されるかまたは拡張されて示されることもあることが理解されるべきである。図面では、似通った参照記号は、様々な図を通して、似通った特色、機能的に類似のおよび／または構造的に類似の要素を一般的に指す。図面は、必ずしも一定縮尺ではなくて、むしろ教示の原理を例示することに強調を置いている。図面は、本発明の教示の範囲を、いかなる意味でも限定することを意図されない。
【００１９】
図面と共に検討すれば、本発明の特色および長所は、下記の詳細な説明からより明らかになるであろう。
図面を参照して実施形態を説明する際に、方向の参照（「上」、「下」、「上部」、「下部」、「左」、「右」、「水平」、「垂直」、等）が使用され得る。そのような参照は、読者が正しい配向で図面を認識するのに役立つように意図されているに過ぎない。これらの方向の参照は、具体的なデバイスの好ましいまたは唯一の配向を記載することを意図していない。デバイスは、他の配向で具体化することもできる。
【００２０】
詳細な説明から明らかなように、図（例えば、図１〜１０）に描かれた例および本出願全体にわたる例示の目的のためのさらなる記載は、非限定的実施形態について記載しており、いくつかの場合には、例示をより明確にする目的で、あるプロセスを簡易化するかまたは特色もしくは工程を省略していることもある。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】試料ウェルを示す断面図。
【図２】複数の試料ウェルを有する集積化デバイスの断面図。
【図３Ａ】クラウディング剤の非存在下において複数の試料ウェルを有する集積化デバイス上に試料を導入した後における、試料ウェル中にローディングされた目的の分子を含む試料を示す断面図。
【図３Ｂ】クラウディング剤の存在下において複数の試料ウェルを有する集積化デバイス上に試料の導入した後における、試料ウェル中にローディングされた目的の分子を含む試料を示す断面図。
【図４】目的の分子を有する試料中におけるクラウディング剤の効果の例を示す図。
【図５】目的の分子を有する試料中における凝縮剤の効果の例を示す図。
【図６Ａ】目的の分子を含む試料が、試料を集積化デバイス中に導入することにより、試料ウェル中にローディングされるプロセスを示す図。
【図６Ｂ】目的の分子を含む試料が、クラウディング剤を試料中に添加することにより、試料ウェル中にローディングされるプロセスを示す図。
【図６Ｃ】目的の分子を含む試料が、クラウディング剤が目的の分子を、集積化デバイスの試料ウェル中に押しやることを可能にすることにより、試料ウェル中にローディングされるプロセスを示す図。
【図６Ｄ】クラウディング剤を含む過剰体積の除去後に、集積化デバイスの試料ウェル中にローディングされた目的の分子を示す断面図。
【図６Ｅ】反応の開始後の図６Ｄの集積化デバイスを示す図。
【図６Ｆ】酸素除去シール材の添加後の図６Ｅの集積化デバイスを示す図。
【図７Ａ】クラウディング剤を使用してローディングされた試料を使用して実施されるリアルタイムのシークエンシング反応の読取りを示す図。
【図７Ｂ】クラウディング剤を使用してローディングされた試料を使用して実施されるリアルタイムのシークエンシング反応の結果を示す図。
【図８】試料ウェル中に拡散によりローディングされた核酸試料（上部）、および試料ウェル中にクラウディング剤の存在下でローディングされた核酸試料（下部）のＤＮＡ蛍光染色の画像表示を示す図。
【図９】試料ウェル中に拡散によりローディングされた核酸試料（左）および試料ウェル中にクラウディング剤の存在下でローディングされた核酸試料（右）のＤＮＡ蛍光撮像を示す図。
【図１０】固体状態のクラウディング剤のための概念実証を証明した実験の仕組みを示す図。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
他の態様の中で、本開示は、目的の分子を試料ウェル中にローディングする方法および組成物を提供する。いくつかの態様において、本明細書に記載された技法は、目的の分子を含む試料を、（例えば、集積化デバイスの表面に対して遠位の底部表面を有する試料ウェルを備える集積化デバイス中の）試料ウェルを備える固体の支持体の表面に接触させることを伴う。いくつかの実施形態では、試料は、目的の分子を、試料ウェルの底部表面の方に向かわせるクラウディング剤と接触させることができる。いくつかの実施形態では、試料ウェルの底部表面は、目的の分子と結合するように構成されたカップリング基を含む。このようにして、目的の分子は、カップリング基を通じて試料ウェルの底表面に結合することができる。いくつかの実施形態では、試料は、目的の分子に、凝縮剤の非存在におけるその構造に対して凝縮された構造をとらせる凝縮剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、目的の分子は、シークエンシング用鋳型を含む。
【００２３】
いくつかの態様において、本明細書に記載された方法および組成物は、試料中における個々の分子または粒子の検出を可能にする技法において有用であり得る。個々の分子は、例として、アミノ酸、ポリペプチド、ヌクレオチド、および／または核酸であることもあるが、これらに限定されない。例えば、いくつかの実施形態では、本開示で提供される方法および組成物は、単一分子の核酸シークエンシング技術と合わせて使用することができる。単一分子の核酸シークエンシングは、鋳型核酸に対して相補性の核酸分子の伸長を、リアルタイムでモニタリングすることにより、単一鋳型の核酸分子の配列の決定を可能にする。
【００２４】
ある技法では、単一分子の核酸シークエンシングは、複数の試料ウェルのそれぞれの中の単一のシークエンシング用鋳型を単離することにより実施される。しかしながら、多くの用途において、試料体積の合計に対するこれらの試料ウェルの体積の合計は、かなり小さい。それに加えて、単一の試料ウェル中における複数の鋳型を最小化するために要する試料中シークエンシング用鋳型の濃度がしばしば非常に低いので、シークエンシング用鋳型を試料ウェル中にローディングする速度が、首尾よくローディングされて十分に活性のある複合体の量を厳しく制限し得る。本発明者らは、これらのおよび他の制限が、シークエンシング用鋳型のローディングプロセスの一部として特定の試薬を利用することにより克服され得ることを認識して認めた。
【００２５】
したがって、シークエンシング用鋳型の調製およびシークエンシング用鋳型のローディングの実行を改善する必要性を認識して、本発明者らは、シークエンシング用鋳型がバルク体積（ｂｕｌｋ  ｖｏｌｕｍｅ）から除外されて試料ウェル中に押しやられるように、試料のバルク体積を効果的に縮小させるためにクラウディング剤を使用する技法を開発した。本発明者らは、本明細書に記載されたクラウディング剤が、シークエンシング用鋳型サイズに関して前に言及した考察を超える長所を提供することをさらに認識して認めた。
【００２６】
いくつかの実施形態では、本開示は、目的の分子を有する試料を集積化デバイスの表面に接触させることにより、目的の分子を試料ウェル中にローディングする方法を提供する。いくつかの実施形態では、集積化デバイスは、試料ウェルを備える。例えば、図１は、本出願のいくつかの非限定的実施形態による集積化デバイス１００が備える試料ウェル１０８の断面図である。試料ウェル１０８は、集積化デバイスの試料ウェル１０８の底部表面１１２に対して遠位の表面１１０に小さい体積または領域を備えることもできる。試料ウェル１０８は、目的の分子を含む試料１９１を受け入れるように構成することができて、目的の分子は試料ウェル１０８の底部表面１１２に保持され得る。試料ウェル１０８の底部表面１１２は、持続時間の間少なくとも一時的に目的の分子１９１に結合する１つまたは複数のカップリング基を含む。試料ウェル１０８の底部表面１１２は、目的の分子１９１が、試料ウェル１０８の側壁１９０よりもむしろ底部表面に付着する選択性を提供する１種または複数の材料を有することができる。いくつかの実施形態では、試料ウェル１０８の底部表面１１２および側壁１９０は、本明細書に記載された技法または当技術分野において知られた方法を使用して調製（例えば、不動態化、官能化など）することができる。
【００２７】
いくつかの実施形態では、目的の分子１９１を、試料ウェル１０８の底部表面１１２に対して遠位の上部開口を通じて試料ウェル１０８内に配置させることができる。上部開口は、周囲光または迷光が試料ウェル１０８内の目的の分子１９１を照らすのを低減するように構成されていてもよい。上部開口は、集積化デバイスの表面１１０で測定するとＷＡの幅を有することができて、それは、５０ｎｍおよび３００ｎｍの範囲、またはその範囲内の任意の値または値の範囲である。試料ウェル１０８は、底部表面１１２と、上部被覆金属板１１８および金属層１２２の間の界面１２７との間の深さｄＷを有することができる。深さｄＷは、底部表面１１２に位置する目的の分子と金属層１２２との間に適当な距離を提供することができる。深さｄＷは、目的の分子１９１と結合したマーカーの光子放出事象のタイミング（例えば寿命）に強く影響し得る。したがって、深さｄＷは、試料ウェル１０８中の異なるマーカーの間を、異なるマーカーの個々の寿命と関連するタイミング特性に基づいて識別することを可能にする。いくつかの実施形態では、試料ウェル１０８の深さｄＷは、受ける励起エネルギーの量に対して強く影響し得る。深さｄＷは、５０ｎｍから３５０ｎｍの範囲内、またはその範囲内の任意の値または値の範囲にあることができる。いくつかの実施形態では、深さｄＷは、９５ｎｍから１５０ｎｍの間である。いくつかの実施形態では、深さｄＷは、１５０ｎｍから３５０ｎｍの間である。いくつかの実施形態では、深さｄＷは、２００ｎｍから３２５ｎｍの間である。いくつかの実施形態では、深さｄＷは、２５０ｎｍから３００ｎｍの間である。いくつかの実施形態では、深さｄＷはほぼ２７０ｎｍである。
【００２８】
様々な実施形態において、試料ウェル１０８は、導波管１１６から励起エネルギーを受けるように配置され得る。導波管１１６は、導波管から一過性に減衰する光学モードを提供するように構成され得る。いくつかの実施形態では、このモードのエバネセント場の範囲が、試料ウェル１０８と少なくとも部分的に重なり合うこともある。このようにして、試料ウェル１０８内の目的の分子１９１は、光学モードのエバネセント場を通じて励起エネルギーを受ける。
【００２９】
集積化デバイス１００は、上部被覆金属板１１８の上に金属層１２２を含むことができる。金属層１２２は、試料ウェル中の試料により放出される放出エネルギーに対する反射器として作用することができて、放出エネルギーを、集積化デバイスのセンサーに向けて反射することにより放出エネルギーの検出を改善することができる。金属層１２２は、試料ウェル内で生ずるものでない光子に基づく背景シグナルを低下させるように作用し得る。金属層１２２は、１層または複数の副層を含むこともできる。金属層の層として使用されるために適当な材料の例は、アルミニウム、銅、チタン、および窒化チタンを含むことができる。図１に示したように、金属層１２２は、第１の副層１２４、第２の副層１２６、および第３の副層１２８を含む。第１の副層の厚さは、３０ｎｍから１６５ｎｍの範囲内、またはその範囲内の任意の値または値の範囲であることができる。第２の副層の厚さは、５ｎｍから１００ｎｍの範囲内、またはその範囲内の任意の値または値の範囲であることができる。いくつかの実施形態では、第２の副層の厚さはほぼ１０ｎｍであることができる。第３の副層は、５ｎｍから１００ｎｍの範囲内の厚さ、またはその範囲内の任意の値または値の範囲を有することができる。いくつかの実施形態では、第３の副層はほぼ３０ｎｍの厚さを有することができる。
【００３０】
試料ウェル１０８は、側壁１９０の側壁スペーサーで少なくとも部分的に覆われた１つまたは複数の側壁を有してもよい。側壁スペーサーの組成は、側壁１９０が、目的の分子１９１とのある型の相互作用を可能にするように構成されるようなものであってもよい。いくつかの実施形態では、側壁スペーサーは、試料ウェル１０８の側壁を不動態化して、側壁１９０に付着する目的の分子１９１の量を低下させるように構成された組成を有することができる。試料ウェルの側壁のみをスペーサーでコーティングすることにより、試料ウェル１０８の異なるエリアで目的の分子１９１との異なる型の相互作用を提供することができる。側壁スペーサーは、３ｎｍから３０ｎｍの範囲内、またはその範囲内の任意の値もしくは値の範囲内の厚さを有することができる。いくつかの実施形態では、側壁スペーサーは、ほぼ１０ｎｍの厚さを有することができる。側壁スペーサーを形成するために使用される適当な材料の例は、ＴｉＯ２、ＴｉＮ、ＴｉＯＮ、ＴａＮ、Ｔａ２Ｏ５、Ｚｒ２Ｏ５、およびＨｆＯ２を含む。いくつかの実施形態では、試料ウェルの構造は、側壁にスペーサー材料のない導波管１１６に直近の底部表面１１２を有することができる。底部表面と側壁スペーサーの間の距離は、２０ｎｍから５０ｎｍの範囲内、またはその範囲内の任意の値または値の範囲であることができる。このようにして、試料ウェルの底部表面１１２は、導波管１１６により近く、したがって、励起エネルギーのカップリングを改善して、励起エネルギーの光学損失に対する金属の積重ねの強い影響を低下させる。
【００３１】
いくつかの実施形態により、集積化デバイスは、試料ウェルを備えることができる。いくつかの実施形態では、集積化デバイスは、複数の試料ウェル、または試料ウェルの「アレイ」を備える。例えば、図２は、複数の試料ウェルを備える集積化デバイス２００の断面図を描く。示されるように、集積化デバイス２００は、導波管２１６と金属層２２２の間に上部被覆金属板２１８を備えており、そこで上部被覆金属板２１８が、導波管２１６と金属層２２２とを最大距離ｈｃだけ離す。上部被覆金属板２１８は、ｈｃ未満の寸法を有する１つまたは複数の領域を有し、１つまたは複数の試料ウェルを備えることができる。そのような領域は、集積化デバイスの１つまたは複数の試料ウェルを備える適当なサイズおよび形状のアレイと考えることもできる。集積化デバイス２００は、アレイ２２０を備え、そこで上部被覆金属板２１８が導波管２１６と金属層２２２とをｈｃ未満の距離だけ離す。アレイ２２０は、図２で示した図に垂直な面に、任意の適当なサイズ、および所望の数の試料ウェルを含む形状のエリアを有することができる。いくつかの実施形態では、アレイ２２０は、方形の形状（例えば、正方形）を有することができる。アレイ２２０は、２０８１、２０８２、２０８３、２０８４、２０８５、および２０８６を含む複数の試料ウェルを有することができる。図２は６個の試料ウェルを描いているが、適用はこの箇所に限定されず、任意の適当な数の試料ウェルが、アレイに形成され得る。アレイは、任意の適当なサイズまたは形状を有することができる。いくつかの実施形態では、アレイは、トレンチ領域にある。
【００３２】
本明細書に記載された技法の態様は、試料を集積化デバイスの表面に接触させることを伴う。図２に示したように、集積化デバイス２００は、凹んだ集積化デバイスの表面２１０１に形成され得るアレイ２２０内の複数の試料ウェルを含有する。したがって、いくつかの実施形態では、試料を、集積化デバイスのアレイにおける集積化デバイスの凹んだ表面２１０１に接触させることができる。さらなる他の実施形態では、試料を、集積化デバイスの凹んだ領域でない（例えば、トレンチ領域でない）表面に接触させることができる。例えば、図２に描かれたように、試料を、集積化デバイスの表面２１０２に接触させることもできる。図２は集積化デバイスの凹んだ領域（例えば、浴槽）に複数の試料ウェルを描いているが、集積化デバイスは、さらに凹んだ領域を含まない複数の試料ウェルも備えることができることが認められるべきである。
【００３３】
集積化デバイス２００は、上部被覆金属板２１８の上に金属層２２２を含むことができる。金属層２２２は、試料ウェル中の試料により放出された放出エネルギーに対する反射器として作用することができて、放出エネルギーを、集積化デバイスのセンサーに向けて反射することにより、放出エネルギーの検出を改善することができる。金属層２２２は、試料ウェル内で生じたものでない光子に基づく背景シグナルを低下させるように作用することができる。金属層２２２は、１つまたは複数の副層を備えることができる。金属層として使用される適当な材料の例は、アルミニウム、チタン、および窒化チタンを含む。金属層２２２は、上部被覆金属板２１８のエッチングされた部分に対応する１つまたは複数の不連続性を有して試料ウェル２０８１、２０８２、２０８３、２０８４、２０８５、および２０８６を形成することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載された型の複数の凹んだ領域（例えば、トレンチ領域）は、集積化デバイス中に形成されて、例えば、導波管２１６および金属層２２２に伝わる光学モードの相互作用に基づく光学損失を低減することができる。いくつかの実施形態では、集積化デバイスは、単一試料ウェルのための凹んだ領域を含むことができる。集積化デバイスは、上部被覆金属板中に複数の凹んだ領域を有することができて、そこで、凹んだ各領域は１つの試料ウェルに対応する。
【００３４】
ある技法では、単一の試料ウェルが、単一の目的の分子（例えば、単一のシークエンシング用鋳型）を含むことが好ましい。したがって、いくつかの実施形態では、試料ウェルのアレイを含む集積化デバイス中に、試料を導入することにより、例えば、シークエンシング用鋳型を含む試料を試料ウェル中にローディングする場合、集積化デバイスが高濃度のシークエンシング用鋳型で過飽和状態になることを避けるように、注意を払うべきである。そのような実施形態では、シークエンシング用鋳型の希薄な濃度を有する試料を使用して試料ウェルにローディングすることがしばしば得策である。
【００３５】
理論に束縛されることは望まないが、試料ウェルのアレイにわたるシークエンシング用鋳型の希薄な濃度の試料分布は、ポアッソン分布により最もよくモデル化されると仮定する。この離散的確率分布は、アレイ中の試料ウェルのほぼ３７％が１分子のシークエンシング用鋳型を含有して、残りのウェルは、ゼロかまたは複数のシークエンシング用鋳型のいずれかを含有することを予測する。実際には、試料ウェルのアレイにわたって３７％の単一の占有を達成することは、任意の数の化学的および／または機械的変数により複雑にされ得る。本発明者らは、本明細書に記載された技法、例えば、クラウディング剤を用いるローディングは、試料ウェルのアレイにわたって単一占有のパーセンテージを有利に増大させることを認識して認めた。
【００３６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載された方法および組成物は、ポアッソン統計により予測される量に匹敵してほぼ同じかまたはそれを超える、試料ウェルのアレイ中における目的の分子の単一占有を達成することができる。したがって、理論に束縛されることは望まないが、本出願の方法および組成物は、非ランダム機構により進行するローディング技法で使用することができて、それはランダム分布を非対称にしてポアッソン分布を超える単一のローディングされた試料ウェルのパーセンテージを生ずる。例えば、いくつかの実施形態では、本開示の方法および組成物は、アレイの試料ウェルのほぼ２０％、ほぼ２５％、ほぼ３０％、ほぼ３５％、ほぼ３７％、ほぼ４０％、ほぼ４５％、ほぼ５０％、ほぼ６０％、ほぼ７０％、ほぼ８０％、ほぼ９０％、ほぼ９５％、ほぼ９９％、またはほぼ１００％における目的の分子の単一占有を達成することができる。しかしながら、いくつかの実施形態では、本開示の方法および組成物は、目的の分子がポアッソン統計により予測される分布（例えば、単一占有の）で試料ウェルのアレイを占有する率を増大させるために有用である。
【００３７】
他の態様の中で、本明細書に記載された技法は、目的の分子を試料ウェル中にローディングするためのクラウディング剤の使用に関する。本明細書に記載されたように、クラウディング剤は、目的の分子（例えば、シークエンシング用鋳型）を試料のバルク溶媒から効果的に排除することができる。この効果の例は、図３Ａおよび３Ｂに描かれているが、これらに限定されない。図３Ａに示したように、複数の試料ウェルを備えるアレイ３２０を有する集積化デバイス３００１を、目的の分子３９０１を有する試料３４０１と接触させることができる。いくつかの実施形態では、本開示の方法は、目的の分子を極端に小さい体積の試料ウェル中にローディングするために有用である。例えば、いくつかの実施形態では、集積化デバイスおよびその中の全ての試料ウェル中におけるアレイの容量（例えば、トレンチ領域における）は約２０×１０−６Ｌであり、各試料ウェルは約３×１０−１８Ｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、集積化デバイスにおけるアレイ（例えば、トレンチ領域における）は、５１２，０００個の試料ウェルを含有する。したがって、いくつかの実施形態では、１つのアレイ中の全ての試料ウェルの体積の合計は、試料の容量のほぼ０．０００００７６８％を占める。図３Ａに描かれたように、クラウディング剤の非存在下でローディングされた目的の分子３９０１を有し、試料３４０１のバルク体積３４２１中において目的の分子３９０１の理論的に均一な分布を有する試料３４０１は、ほんの一部の試料ウェルにおいて首尾よくローディングされる目的の分子３９１１を受け入れることができるであろう。
【００３８】
図３Ｂは、首尾よくローディングされる試料に関するクラウディング剤の効果を示す。複数の試料ウェルを備えるアレイを有する集積化デバイス３００２は、目的の分子３９０２を有する試料３４０２と接触させることができる。試料３４０２は、クラウディング剤３５０をさらに含むことができる。示されるように、クラウディング剤３５０が含まれると、目的の分子３９０２を試料３４０２のバルク体積３４２２から排除する体積排除効果を生ずることができて、それは目的の分子３９０２を試料ウェル中に押しやる。結果として、試料ウェルのはるかに大きいパーセンテージが、首尾よくローディングされる目的の分子３９１２を受け入れることができる。したがって、いくつかの実施形態では、クラウディング剤は、集積化デバイスの表面における目的の分子の濃度を効果的に増大させる熱力学的推進力を生ずることができる。いくつかの実施形態では、クラウディング剤は、目的の分子の試料ウェル中への移動を加速する速度効果を有することによりローディング時間を短縮することができる。
【００３９】
本発明者らは、本明細書に記載されたクラウディング剤は、目的の分子、例えば、シークエンシング用鋳型が、単一分子のシークエンシングで使用される従来の試料ウェルよりも深い試料ウェル中に（例えば、１５０ｎｍを超える、２００ｎｍを超える、２５０ｎｍを超えるなど）ローディングされることを可能にすることをさらに認識して認めた。例えば、いくつかの実施形態では、目的の分子は、試料ウェルの底部表面で試料ウェルと結合する。いくつかの実施形態では、底部表面は、試料ウェルを備える集積化デバイスの表面に対して遠位にあり、底部表面と集積化デバイスの表面との間の距離は、試料ウェルの深さに近い。いくつかの実施形態では、より深い試料ウェルは、光学成分を利用する技法と有利に組み合わせることができる。
【００４０】
いくつかの実施形態では、単一分子シークエンシングは、光学システムおよびセンサーの使用を含む。例えば、いくつかの実施形態では、シークエンシング反応は、集積化デバイス上で光を試料ウェル中に向かわせて、試料ウェルから放出された光を検出することにより、リアルタイムでモニターされる。いくつかの実施形態では、光を試料ウェル中に向かわせる光源は、試料ウェルの底にまたはその下に位置して、光検出器は、試料ウェルからの放出（例えば、シークエンシング反応と関連する１種または複数の成分または事象と関係する放出）を検出するために使用される。そのような実施形態では、光は、集積化デバイスの表面でまたはその近くで１つまたは複数の機構と相互作用して、シークエンシング反応をモニターする能力に不利に影響し得る。いくつかの実施形態では、これらの障害（例えば、背景ノイズ、光学損失）は、試料ウェルの深さを増大させることにより低減または排除され得る。
【００４１】
しかしながら、試料ウェルの深さが増大するにつれて、試料ウェルの底部表面と集積化デバイスの表面との間の増大した距離は、目的の分子が底部表面に達する（例えば、その結果として底部表面に結合する）ために拡散しなければならない、より遠い距離を必然的に創り出す。したがって、増大した試料ウェルの深さにより提供される長所は、ローディングの有効度（例えば、試料ウェルのアレイにわたって高い単一占有を達成する）に関して、いくらかの制限を必然的に伴い得る。本発明者らは、本明細書に記載された技法、例えば、クラウディング剤を用いるローディングは、増強されていない拡散のみによるローディングと比較して、深い試料ウェル中への目的の分子（例えば、シークエンシング用鋳型）のローディングのために優れていることを認識して認めた。
【００４２】
クラウディング剤
本明細書で使用する「クラウディング剤」は、分子のクラウディングを増強する、または容易にすることを可能にする化合物または分子である。いかなる特定の機構によっても束縛されることは望まないが、クラウディング剤は、他の高分子のために利用され得る溶媒の体積を低減することが示唆される。この排除体積効果が、クラウディング剤との立体的反発などの非特異的相互作用の結果として高分子に接近可能な体積を制限する。したがって、いくつかの実施形態では、クラウディング剤は、「体積排除因子」または「体積排除剤」と称されることがある。いくつかの実施形態では、クラウディング剤は、同じ溶液中の他の成分に関して不活性である。例えば、いくつかの実施形態では、クラウディング剤は、全試料体積の一部分から溶液中の他の成分を上記部分から排除することなく、または溶液中の他の成分を上記部分に保持して、目的の分子を選択的に排除する。いくつかの実施形態では、クラウディング剤は、親水性化合物である。いくつかの実施形態では、クラウディング剤は、同じ溶液中で起こる反応に干渉しない。クラウディング剤は、本明細書に記載された方法および組成物で様々な仕方により、例えば、図４に示されたように機能すると考えられる。
【００４３】
図４は、試料中におけるクラウディング剤の目的の分子に対する効果の例を一般的に示す。パネル４００１および４００２は、それぞれ目的の分子４９１および作用物質４５０を有する試料を描いている。示されるように、パネル４００１における作用物質４５０１は、パネル４００２における作用物質４５０２と比較して、試料全体にわたって比較的分散している。したがって、パネル４００１は、目的の分子４９１が、作用物質４５０１によってまだ占有されていないバルク体積４４２１に自由に接近することができる試料の簡略化された例を示す。比較すると、パネル４００２中の作用物質４５０２は、間隙体積４４４（陰影をつけた領域）が形成されるように関連していることが示されている。示されるように、目的の分子４９１のサイズが間隙体積４４４を超える場合には、この領域は、目的の分子４９１にとって接近不能になる。結果として、パネル４００２の試料中における接近可能なバルク体積４４２２の量は、パネル４００２の試料中における接近可能なバルク体積４４２１の量未満である。目的の分子４９１の試料中の体積からの排除に関係するこの効果は、体積排除と称することができる。しかしながら、体積排除効果は、分子のクラウディング効果を向上させることができて、逆も真であることが認められるべきである。
【００４４】
図４は、試料ウェルに関して排除体積効果の例をさらに示す。パネル４０１１および４０１２は、目的の分子４９１と結合するように構成されたカップリング基４９３を含む底部表面を有する試料ウェルを、それぞれ描いている。さらに、パネル４０１１および４０１２のそれぞれは、目的の分子を含む試料４９１と接触した試料ウェルを描いている。パネル４０１２で示された試料は、クラウディング剤４５０をさらに含む。示されるように、クラウディング剤４５０は、目的の分子４９１に接近し得るバルク体積４４２の量を減少させる。目的の分子４９１に接近不能のクラウディング剤４５０の間隙体積４４４の結果として、目的の分子は、試料ウェルの上部開口の方向に熱力学的に押しやられる。いくつかの実施形態では、パネル４０１２に示されるように、クラウディング剤４５０は、試料の一部分を拘束して、目的の分子４９１に接近可能なバルク体積４４２を減少させる絡まった構造を形成するポリマー分子を含むことができる。理論に束縛されることは望まないが、試料中のクラウディング剤４５０により形成される構造は、クラウディング剤４５０が試料ウェルに進入し得る程度を制限すると仮定される。その結果として、間隙体積４４４は、試料ウェル外の領域を占有して、底部表面に対して遠位の試料ウェルの上部開口における目的の分子の濃度を効果的に増大させる。試料ウェルの上部開口で増大した目的の分子４９１の局所濃度は、目的の分子４９１が、カップリング基４９３を通じて底部表面に結合するより大きい確率を生ずることができる。
【００４５】
したがって、いくつかの実施形態では、クラウディング剤は、目的の分子を、溶媒分子および／または溶液中の他の成分に対して選択的に排除する。いくつかの実施形態では、目的の分子を含む溶液を、集積化デバイスの表面に接触させて、その結果、目的の分子が、集積化デバイスの表面で第１の体積を占有する。いくつかの実施形態では、クラウディング剤を含む溶液を、第１の体積の表面に接触させて、その結果、クラウディング剤が第１の体積の表面で第２の体積を占有する。クラウディング剤が、目的の分子を、溶媒分子および／または他の成分に対して選択的に排除する場合、目的の分子は、第２の体積から排除されるが、第１の体積の溶媒および／または他の成分は排除されない。結果として、この選択的排除は、第２の体積における増大と同時に第１の体積を減少させる。いくつかの実施形態では、第１の体積中の他の成分（例えば、塩、緩衝液など）は、クラウディング剤により占有されている第２の体積が接近可能である程度で変化することができることが認められるべきである。例えば、クラウディング剤の相対サイズ、電荷、および他の化学的および物理的性質および成分は、成分がクラウディング剤により選択的に排除され得るかまたは優先的に保持され得る程度に影響し得る。目的の分子は、反応成分（例えば、シークエンシング用鋳型）を含み得るので、目的の分子を安定化するために必要であり得る溶液中の他の成分をクラウディング剤が優先的に保持しないことは重要である（例えば、緩衝剤、還元剤など）。
【００４６】
いくつかの実施形態では、クラウディング剤は、水を引きつけて水以外の分子を凝集させる。いくつかの実施形態では、クラウディング剤は、溶液中の水に結合および／または拘束して溶液中の高分子を排除する。いくつかの実施形態では、クラウディング剤は、目的の分子を排除する。いくつかの実施形態では、クラウディング剤は、シークエンシング用鋳型を排除する。いくつかの実施形態では、クラウディング剤は、試料ウェル中の利用可能な体積を限定する。いくつかの実施形態では、クラウディング剤は、試料ウェル中の目的の分子の単一保有を助長する。いくつかの実施形態では、クラウディング剤は、シークエンシング用鋳型などの目的の分子を圧縮して、より大きいシークエンシング用鋳型が試料ウェル中にローディングされることを可能にする。いくつかの実施形態では、クラウディング剤は、相分離を助長する。いくつかの実施形態では、クラウディング剤は、ランダムにコイル化したポリマーを含む。いくつかの実施形態では、クラウディング剤は、汚染物質（例えば、細胞残渣）を排除して、目的の分子をローディングする前に必要な試料精製を制限または不要化する。例えば、いくつかの実施形態では、クラウディング剤は、不純な試料の希薄な成分（例えば、血、尿、溶解した細胞など）がクラウディング剤の非存在下でローディングされた不純な試料よりも効果的にローディングされることを可能にする。いくつかの実施形態では、クラウディング剤は、浸透圧を働かせる。いくつかの実施形態では、クラウディング剤は、目的の分子の深い試料ウェル中へのローディングを容易にする。いくつかの実施形態では、クラウディング剤は、試料ウェルのより速いローディングを助長する。例えば、いくつかの実施形態では、クラウディング剤は、試料ウェルを備える集積化デバイス上で試料をインキュベートするために必要な時間を減少させる。
【００４７】
クラウディング剤は当技術分野において知られており、インビトロで細胞内の高分子のクラウディングの効果をシミュレートするために以前より使用されている（例えば、トクリら（Ｔｏｋｕｒｉｋｉ、Ｎ．、ｅｔ  ａｌ．）（２００４）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．１３（１）：１２５−１３３；クズネツオーヴァ、Ｉ．Ｍ．ら（Ｋｕｚｎｅｔｓｏｖａ、Ｉ．Ｍ．、ｅｔ  ａｌ．）（２０１４）  Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．１５：２３０９０−２３１４０；フィリップ、Ｙ．ら（Ｐｈｉｌｌｉｐ、Ｙ．、ｅｔ  ａｌ．）（２００９）  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．９７（３）：８７５−８８５；バト、Ｒ．ら（Ｂｈａｔ、Ｒ．、ｅｔ  ａｌ．）（１９９２）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．１：１１３３−１１４３；クリスチャンセン、Ａ．ら（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ、Ａ．、ｅｔ  ａｌ．）（２０１３）  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｖ．５（２）：１３７−１４５；オーミラー、Ｗ．Ｍ．ら（Ａｕｍｉｌｌｅｒ、Ｗ．Ｍ．、ｅｔ  ａｌ．）（２０１４）  Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ１１８（３６）：１０６２４−１０６３２を参照されたい；これらのそれぞれの内容は、参照により本明細書に援用する）。
【００４８】
いくつかの実施形態では、クラウディング剤は、それが、試料ウェル中に移動することと反対に、試料の貯蔵所に（例えば、優先的に）とどまるように選択される。いくつかの実施形態では、このことは、試料成分（例えば、ＤＮＡ−ポリメラーゼ複合体）の試料ウェル中へのローディングを推進する熱力学的推進力を助長する。いくつかの実施形態では、Ｆｉｃｏｌｌまたは直鎖状ポリビニルピロリドンなどのより低い粘度のクラウディング剤は、より高い粘性剤と比較して高い移動性および劣った局在化を有して、より高い粘性剤ほど効果的ではない。しかしながら、より低い増粘剤は、いくつかの状況で有用なこともある。
【００４９】
いくつかの実施形態では、クラウディング剤は、１ｍＰａ・ｓ以上（例えば、約１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０ｍＰａ・ｓ、以上または中間範囲の粘度）の粘度を有するクラウディング剤溶液を使用して適用される。いくつかの実施形態で、６３，０００Ｄａのメチルセルロースの２．７％の組成物は、ほぼ６．９ｍＰａ・ｓの粘度を有する。いくつかの実施形態では、クラウディング剤をピペットで移すために有用な粘度は、１，０００ｍＰａ・ｓから１５，０００ｍＰａ・ｓの間であり得る。しかしながら、いくつかの実施形態では、作用物質の粘度の上方の範囲は、実用的なピペット操作の考慮により制限され得る。例えば、約１２，０００ｍＰａ・ｓ以上の粘度を有する溶液は、ピペット操作が困難であり得、いくつかの実施形態では、クラウディング剤溶液は、１２，０００ｍＰａ・ｓ以下の粘度を有する濃度で添加される。
【００５０】
いくつかの実施形態では、より低い粘度を有するより小さい（例えば、より短い）作用物質は、ローディング組成物において同様の粘度を達成するために、より大きい（例えば、より長い）作用物質よりも高い濃度で適用され得る。しかしながら、いくつかの実施形態では、より短い分子は、効率的でないクラウディング剤であり、試料貯蔵所から試料ウェル中により容易に移動することもできる。
【００５１】
いくつかの実施形態では、クラウディング剤の調製物の粘度は、ｍＰａ・ｓ＝（％×０．７４７＋１）８（例えば、ダウ社（Ｄｏｗ）のメトセル（Ｍｅｔｈｏｃｅｌ）、セルロースエーテルについて）などの粘度−濃度方程式に基づいて計算することができる。
【００５２】
いくつかの実施形態では、クラウディング剤の形状およびサイズは、その効力に強く影響し得る。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ／ポリメラーゼ複合体の排除は、類似のサイズのクラウディング剤（例えば、２から３倍小さい〜２から３倍大きい範囲のクラウディング剤）を使用すると特に効果的である。いくつかの実施形態では、絡まりを助長する形状、より高い粘度を有するクラウディング剤溶液が有用である。
【００５３】
いくつかの実施形態では、クラウディング剤は、水溶性の高分子材料である。いくつかの実施形態では、生体適合性の天然または合成ポリマーを広く含む適当な高分子の材料は、混合物中で他の試薬と特異的に相互作用することがない。いくつかの実施形態では、クラウディング剤は、不活性ポリペプチドまたは不活性核酸などの不活性高分子である。いくつかの実施形態では、クラウディング剤は、直鎖状ポリマーである。
【００５４】
いくつかの実施形態では、クラウディング剤は多糖である。いくつかの実施形態では、クラウディング剤はセルロース分子である。いくつかの実施形態では、クラウディング剤はメチルセルロースである。いくつかの実施形態では、クラウディング剤は、エチルセルロース、エチルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ならびにそれらの誘導体および組合せからなる群から選択されるセルロース分子である。いくつかの実施形態では、クラウディング剤はＦｉｃｏｌｌポリマーである。
【００５５】
いくつかの実施形態では、クラウディング剤、例えばセルロースのクラウディング剤（例えば、６３，０００のＭｅｔｈｏｃｅｌ  ＭＣ）は、５０，０００から５００，０００Ｄａ（例えば、約５０から１００ｋＤａ、１００から２００ｋＤａ、２００から３００ｋＤａ、３００から４００ｋＤａ、４００から５００ｋＤａまたはそれより高い）の平均分子量を有する。いくつかの実施形態では、本明細書において使用する「平均分子量」は、溶液中のクラウディング剤の数平均分子量（Ｍｎ）を指す。いくつかの実施形態では、セルロースクラウディング剤は、５０，０００から５００，０００Ｄａの数平均分子量を有する。いくつかの実施形態では、セルロースクラウディング剤の数平均分子量はほぼ６３ｋＤａである。いくつかの実施形態では、セルロースクラウディング剤の数平均分子量は、約２０ｋＤａから１２０ｋＤａの間、約２６ｋＤａから１１０ｋＤａの間、約４１ｋＤａから８６ｋＤａの間、約５０ｋＤａから７５ｋＤａの間、または約６０ｋＤａから７０ｋＤａの間である。
【００５６】
平均分子量は、いくつかの実施形態では、メーカーのスペックにより決定することができる。いくつかの実施形態では、セルロースのクラウディング剤の平均分子量は、見かけの粘度と特定のセルロース化合物の分子量または鎖長との間の比例関係に基づいて計算または概算することができる。この比例性を考慮して、既知の参照値は、既知の濃度のセルロースの水溶液の見かけの粘度を既知の温度で測定することにより、平均分子量を決定することに使用することができる。例えば、いくつかの実施形態では、Ｍｅｔｈｏｃｅｌセルロース組成物の平均分子量は、セルロースの２％（ｗ／ｖ）溶液について２０℃で粘度値を測定して（例えば、ＡＳＴＭモノグラフＤ１３４７およびＤ２３６３で発布された測定方法を使用して）、その測定値を、メーカーにより提供された既知の値（例えば、メトセル  セルロースエーテル  テクニカルハンドブック（ＭＥＴＨＯＣＥＬ  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｅｔｈｅｒｓ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ）（ダウ・ケミカル社（Ｔｈｅ  ＤＯＷ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ））；方式（Ｆｏｒｍ）  Ｎｏ．１９２−０１０６２−０９０２  ＡＭＳ、２００２年９月発行に記載されている）と比較することにより得ることができる。
【００５７】
いくつかの実施形態では、クラウディング剤はポリエーテル化合物である。いくつかの実施形態では、クラウディング剤は、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ２０，０００以上を含むＰＥＧ２００以上）、ポリプロピレングリコール、パラホルムアルデヒド、ポリテトラメチレングリコール、ポリフェニルエーテル、およびそれらの誘導体および組合せからなる群から選択されるポリエーテル化合物である。いくつかの実施形態では、クラウディング剤は、ウシ血漿アルブミン、グリコーゲン、デキストラン、およびそれらの誘導体および組合せからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、クラウディング剤はポリアミドである。いくつかの実施形態では、クラウディング剤は、環状ポリアミド（例えば、ポリビニルピロリドン）である。
【００５８】
いくつかの実施形態では、クラウディング剤は、溶液として提供される。いくつかの実施形態では、溶液中のクラウディング剤の濃度は約０．６重量％である。いくつかの実施形態では、溶液中のクラウディング剤の濃度は約０．９重量％である。いくつかの実施形態では、溶液中に添加されるクラウディング剤の濃度は約１．８重量％である。いくつかの実施形態では、溶液中のクラウディング剤の濃度は約２．０重量％である。いくつかの実施形態では、溶液中のクラウディング剤の濃度は約２．３重量％である。いくつかの実施形態では、クラウディング剤は、溶液中に、約０．１重量％から約１．０重量％の間、約１．０重量％から約２．０重量％の間、約２．０重量％から約３．０重量％の間、約３．０重量％から約４．０重量％の間、約４．０重量％から約５．０重量％の間、約５．０重量％から約６．０重量％の間、約６．０重量％から約７．０重量％の間、約７．０重量％から約８．０重量％の間、約８．０重量％から約９．０重量％の間、約９．０重量％から約１０．０重量％の間、約１０．０重量％から約１５．０重量％の間、約１０重量％から約１１重量％の間、約１１重量％から約１２重量％の間、約１２重量％から約１３重量％の間、約１３重量％から約１４重量％の間、または約１４重量％から約１５重量％の間、約１５．０重量％から約２０．０重量％の間で、またはそれを超えて存在する。
【００５９】
いくつかの実施形態では、クラウディング剤の溶液は、試料溶液の体積と同じオーダーの大きさ（例えば、１から３倍小さい〜１から３倍大きい）の体積で添加される（例えば、ローディング緩衝液中で）。いくつかの実施形態では、クラウディング剤（例えば、Ｍｅｔｈｏｃｅｌ  ＭＣ）の２．７％の溶液が、ローディング緩衝液中でほぼ等しい体積の試料にピペットで添加される。いくつかの実施形態では、クラウディング剤の１．８％の溶液が、ローディング緩衝液中でほぼ等しい体積の試料にピペットで添加される。いくつかの実施形態では、クラウディング剤の１．２％の溶液が、ローディング緩衝液中でほぼ等しい体積の試料にピペットで添加される。いくつかの実施形態では、クラウディング剤の０．９％の溶液が、ローディング緩衝液中でほぼ等しい体積の試料にピペットで添加される。いくつかの実施形態では、クラウディング剤の０．６％の溶液が、ローディング緩衝液中でほぼ等しい体積の試料にピペットで添加される。
【００６０】
いくつかの実施形態では、クラウディング剤溶液は、混合せずに試料溶液に入れられる。しかしながら、その溶液も、いくつかの実施形態では混合され得る。
いくつかの実施形態では、クラウディング剤は、（例えば、試料貯蔵所に）試料溶液と直接接触して入れることができるゲルの形態（例えば、親水性ゲル）で提供される。ゲルは、ピペット操作の考慮により限定されずに適用することができて（例えば、ゲルのプラグの形態で）、より高い濃度および粘度のクラウディング剤がゲルの形態で使用され得る。
【００６１】
いくつかの実施形態では、クラウディング剤は、固体状態で提供される。例えば、いくつかの実施形態では、クラウディング剤は、フィルムとして提供される。いくつかの実施形態では、クラウディング剤は、繊維状の材料、膜状の材料、接着性材料、複合体材料、ラミネート材料、またはそれらのいくつかの組合せとして提供されることもある。いくつかの実施形態では、フィルムは、本明細書に記載された方法および組成物で使用されるために適当な合成および／または天然材料を含むことができる。いくつかの実施形態では、フィルムは、架橋したゲルまたは脱水された溶液から選択される材料である。いくつかの実施形態では、ポリアクリルアミド、デキストラン、アガロース、またはそれらのいくつかの組合せもしくはバリアントを含むフィルムである。いくつかの実施形態では、固体状態のクラウディング剤（例えば、フィルム）は、目的の分子（例えば、シークエンシング用鋳型）を優先的に排除しながら、試料のバルク体積中の水を有利に取り込む。したがって、本明細書で提供される方法で、任意のそのような適当な作用物質が、固体状態クラウディング剤として使用され得ることが認められるべきである。
【００６２】
凝縮剤
本明細書において使用する、「凝縮剤」とは、目的の分子と組み合わされると、目的の分子に、凝縮剤の非存在下におけるその構造に対して凝縮された構造をとらせる任意の天然または合成化合物を指す。例えば、所定の試料において、目的の分子は、凝縮剤の存在下で、凝縮剤を欠く同じ試料よりも小さい体積を占める。したがって、いくつかの実施形態では、凝縮剤は、試料中における目的の分子の占有体積を減少させる。いくつかの実施形態では、凝縮剤は目的の分子と相互作用して、その結果、該分子は試料中でより小さい分率の全体積を占有する圧縮された構造をとる。いくつかの実施形態では、凝縮剤は、目的の分子と相互作用して、該分子の広がった体積を縮小させる。凝縮剤を導入することにより、該分子は、凝縮剤が非存在の場合よりも小さい広がりの体積を有することができて、該分子は、そのより小さい広がりの体積のゆえに、試料をより容易にウェル中にローディングすることができる。いくつかの実施形態では、凝縮剤は、同じ溶液中の他の成分に対して不活性である。いくつかの実施形態では、凝縮剤は、同じ溶液中で起こる反応に干渉しない。
【００６３】
図５は、目的の分子を有する試料中における凝縮剤の効果の例を一般的に示す。例えば、スキーム５００は、目的の分子５９１が凝縮剤５３０と接触するプロセスを描いている。目的の分子５９１１は、半径ｒ１の球によって近似される初期体積Ｖ１を占有するものとして示されている。凝縮剤５３０と接触した後、凝縮された目的の分子５９１２は、半径ｒ２の球によって近似される凝縮された体積Ｖ２を占有するものとして示されている。いくつかの実施形態では、初期体積Ｖ１および凝縮された体積Ｖ２は、目的の分子５９１１および凝縮された目的の分子５９１２の体積の広がりを、それぞれ指す。したがって、いくつかの実施形態では、凝縮剤５３０は、目的の分子５９１が溶液中で占有する、分子の広がった体積と考えることができる体積を縮小させるように構成されている。凝縮剤を導入することにより、目的の分子は、凝縮剤が非存在の場合よりも小さい体積の広がりを有することができて、該分子は、そのより小さい体積の広がりのゆえに、試料ウェル中により容易にローディングされ得る。
【００６４】
図５は、目的の分子を試料ウェル中にローディングすることに関して、凝縮剤の使用の例をさらに示す。パネル５０１１および５０１２は、それぞれ目的の分子５９１と結合するように構成されたカップリング基５９３を含む底部表面を有する試料ウェルを描いている。さらに、パネル５０１１および５０１２は、目的の分子を含む試料５９１と接触した試料ウェルをそれぞれ描いている。パネル５０１１に描かれた試料は、凝縮剤と接触しなかった目的の分子５９１１を含むが、パネル５０１２に描かれた試料は、凝縮剤と接触して凝縮された目的の分子５９１２を含む。示されるように、凝縮された目的の分子５９１２は、パネル５０１１に示された目的の分子５９１１と比較して凝縮された体積を占有する。したがって、凝縮された目的の分子５９１２により占有される減少した体積は、目的の分子５９１がカップリング基５９３を通じて底部表面に結合する確率の増大を生じ得る。いくつかの実施形態では、凝縮剤は、比較的小さい体積（例えば、単一分子の占有のために適当な体積、例えば、単一分子シークエンシングのために使用されるアレイの試料ウェルなど）の容量を有する試料ウェル中で比較的大きい体積を占有する目的の分子５９１をローディングすることが望ましい場合に、有利に利用することができる。いくつかの実施形態では、凝縮剤は、本明細書に記載されたクラウディング剤との組合せでさらに利用することができる。そのような実施において、試料の接近可能なバルク体積を減少させるクラウディング剤の正味の効果、および各目的の分子により占有される体積を減少させるクラウディング剤は、ポアッソン統計により予測される値に近似しているかまたはそれを超える試料ウェルの単一占有を生ずる。
【００６５】
いくつかの実施形態では、凝縮剤は核酸凝縮剤である。核酸凝縮剤は、体積排除および電荷スクリーニングを含むが、これらに限定されない様々な機構により核酸を圧縮することができる。核酸を凝縮する作用物質の能力を評価するアッセイは、例えば、ＷＯ／１９９６／０２１０３６に記載されているように、当技術分野において既知であり、関係のあるその内容は、その全体で参照により本明細書に援用される。いくつかの実施形態では、核酸凝縮剤は、核酸と静電的電荷−電荷相互作用を通じて相互作用して核酸構造の折りたたみ（例えば、核酸凝縮）を誘発する。いくつかの実施形態では、凝縮剤は、以下の１つまたは複数の結果として核酸を凝縮させることができる：らせん構造のセグメントを一緒にする浸透圧を働かせる（例えば、分子のクラウディング効果）；核酸セグメント間の反発する相互作用を減少させる（例えば、ホスフェートの電荷を中和することにより）；および核酸セグメント間の引きつける相互作用を増大させる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡセグメント間の引きつける相互作用が、多価カチオン性に荷電した凝縮剤により誘発され得る。
【００６６】
いくつかの実施形態では、凝縮剤はポリカチオンを含む。本明細書において使用する、ポリカチオンは、複数の正に荷電した部位を有する化合物を一般的に指す。いくつかの実施形態では、ポリカチオンは、目的の分子を含む試料中に存在するときにはポリカチオン性である。例えば、いくつかの実施形態では、目的の分子を含む試料における条件（例えば、ｐＨ、緩衝能力、イオン強度）は、凝縮剤が試料中でポリカチオン性であるようなものである。いくつかの実施形態では、ポリカチオンは、生理学的ｐＨ（例えば、ｐＨ≒７．４）でポリカチオン性である。いくつかの実施形態では、ポリカチオンは、正に荷電したモノマーユニットのポリマーであるが、いくつかの正に荷電していないユニットが、ポリマー中に存在することもある。ポリカチオンの例には、いくつかの実施形態では、スペルミン、スペルミジン、およびプトレシンなどのポリアミンが含まれる。いくつかの実施形態では、ポリカチオンは、ポリヒスチジン、ポリリシン、ポリアルギニン、およびポリオルニチンなどのポリアミノ酸を含む。他の塩基性ペプチドおよび小さい塩基性タンパク質は、ポリカチオン性凝縮剤（例えば、ヒストン、プロタミン）としての使用をさらに考慮される。アミノ酸で構成されるポリカチオンとして、Ｌ−またはＤ−型のいずれも使用され得る。塩基性アミノ酸は、リシン、アルギニン、アミノ酸類似体、例えばオルニチンおよびカナリン、改変された塩基性アミノ酸、例えばホモアルギニン、および陽性電荷を担持するように改変された他の改変されたアミノ酸、例えばグアジニノバリネート、およびアミノエチルシステインを含む。ポリカチオンの追加の例として、ポリアンモニウム（例えば、ポリブレン（臭化ヘキサジメトリン））、脂質（例えば、ＤＯＴＡＰ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥ、ＤＯＧＳ／ＤＯＰＥ、およびＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ）が含まれる。
【００６７】
酸素除去シール材
さらなる他の態様で、本開示は、酸素に感受性のあるシステムを保護するために、および試料の完全性を維持するために有用な方法および組成物を提供する。生物学的反応および／または化学反応は、外環境との相互作用にしばしば感受性があり得て、例えば、蒸発しやすく、外環境における酸素および／または他の分子に感受性がある。シール材は、外環境との有害な相互作用から感受性のある反応を保護するために、以前から使用されてきた。例えば、鉱物油は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅中に試料を覆うためにしばしば使用される。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載されたローディングおよびシークエンシングの方法は、シークエンシング反応をシール材（例えば、鉱物油）で覆うことをさらに含む。本発明者らは、本明細書に記載されたシークエンシング反応のための追加の保護効果を与えるために、従来のシール材に替えてまたはそれに加えて、ある組成物が使用され得ることを認識して認めた。例えば、いくつかの実施形態では、酸素除去シール材を試料と接触させることができる。
【００６８】
本開示の態様は、単一分子のシークエンシング技術に関する。いくつかの実施形態では、単一分子のシークエンシングは、光学システムの使用を含む。そのような実施形態では、光学システムは、シークエンシング反応の１種または複数の成分に対して直接または間接的に分解性であり得る励起エネルギーの使用を伴うことができる。例えば、いくつかの実施形態では、励起エネルギーは、シークエンシング反応における重合酵素の活性を損ない得る反応性酸素種を発生し得る。本発明者らは、酸素除去シール材が、反応性酸素種の存在を最小化して、一方で従来のシール材（例えば、鉱物油）と同じ多くの長所を提供することを認識して認めた。
【００６９】
いくつかの実施形態では、酸素除去シール材は、被酸化性物質および触媒を含む。本明細書において使用する「被酸化性物質」は、酸化され得る任意の作用物質である。いくつかの実施形態では、被酸化性物質の酸化は、触媒により媒介されおよび／または加速される。したがって、いくつかの実施形態では、酸素除去は、触媒により触媒される反応または反応のシリーズにおける被酸化性物質の酸化を通じて進行する。いくつかの実施形態では、酸素除去シール材は、好ましくは、シークエンシング反応に関して非阻害（例えば、不活性）である。シークエンシング反応および試薬は、酸素除去成分から相分離により保護される（例えば、除去剤は油相に隔離されてとどまり、水性のシークエンシング試薬から分離されて安全に保たれる）。
【００７０】
いくつかの実施形態では、被酸化性物質は有機化合物である。いくつかの実施形態では、被酸化性物質は、少なくとも１つのエチレン結合を備える。本明細書において使用する「エチレン結合」は、炭素−炭素二重結合である。いくつかの実施形態では、エチレン結合は、置換されていてもよくまたは非置換でもよい。いくつかの実施形態では、エチレン結合は、末端の結合であることもまたは内部の結合であることもある。いくつかの実施形態では、エチレン結合は、環構造内に含有される。例えば、いくつかの実施形態では、エチレン結合が、５員環または６員環（例えば、ペントース環またはヘキソース環）により含まれていることもある。いくつかの実施形態では、上記有機化合物は、酸素含有部分を含むこともできる。例えば、酸素含有部分は、エステル、カルボン酸、アルデヒド、エーテル、ケトン、アルコール、過酸化物、および／またはヒドロペルオキシドを含むことができるが、これらに限定されない。
【００７１】
いくつかの実施形態では、本発明で提供される酸素除去シール材の被酸化性物質は、アスコルビン酸およびイソアスコルビン酸（遊離酸、塩および誘導体として）、亜硫酸のアルカリ金属塩、アルカリ性土類金属塩、またはアンモニウム塩またはそれらの混合物を含むと考えられる。いくつかの実施形態では、被酸化性物質は、水に不溶性のアスコルビン酸である。いくつかの実施形態では、被酸化性物質は、アスコルビン酸およびイソアスコルビン酸を、有機酸のアルカリ金属塩、アルカリ性土類金属塩などのイオン性金属塩、エステル、または他の誘導体化されたアスコルビン酸として、シール材に導入することにより形成される。いくつかの実施形態では、酸素除去剤のアスコルビン酸および／またはイソアスコルビン酸成分は、他の既知の還元剤、例えば、第２のアスコルビン酸またはイソアスコルビン酸、タンニン、亜硫酸塩等で補完されてもよい。いくつかの実施形態で、アスコルビン酸は、Ｃ１０〜Ｃ２２脂肪酸エステルと共に炭化水素鎖中で完全飽和したまたは不飽和を含有してもよいＣ６〜Ｃ２２脂肪酸エステルまたはジエステルの形態であることができる。いくつかの実施形態で、アスコルビン酸エステルは、例えば、ラウリル酸アスコルビル、ミリスチン酸アスコルビル、パルミチン酸アスコルビル、ステアリン酸アスコルビル等であることができる。
【００７２】
いくつかの実施形態では、除去剤はあまり可溶性ではない。いくつかの実施形態では、除去剤は、油で提供される（例えば、飽和と５０％の飽和の間の油で）。いくつかの実施形態では、除去剤（例えば、油で）は、シークエンシングまたは他の反応に干渉し得る程度に下層の水性相中に分配されることを避けるために、その溶解性に基づいて選択される（および／または適当な濃度で提供される）。
【００７３】
本明細書に記載されたように、いくつかの実施形態では、酸素除去シール材は触媒を含む。広範囲の触媒は、本明細書に記載された技法で作用すると考えられる。適当な触媒は金属イオンを含み、それは少なくとも２つの酸化状態の間で容易に相互交換することができる。いくつかの実施形態では、触媒は遷移金属である。例えば、いくつかの実施形態では、遷移金属は、周期表の第１の、第２の、または第３の遷移系列から選択することができる。適当な金属は、マンガンＩＩまたはＩＩＩ、鉄ＩＩまたはＩＩＩ、コバルトＩＩまたはＩＩＩ、ニッケルＩＩまたはＩＩＩ、銅ＩまたはＩＩ、ロジウムＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶ、およびルテニウムを含むが、これらに限定されない。金属の酸化状態は、導入時には必ずしも活性形態のものであるとは限らないことが認められるべきである。いくつかの実施形態では、遷移金属は、スカンジウム、チタン、バナジウム、クロム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル、銅、および亜鉛から選択される。例えば、いくつかの実施形態では、触媒は銅を含む。いくつかの実施形態では、遷移金属は、ランタニド金属（例えば、ランタン、セリウム、プラセオジム、ネオジム、プロメチウム、サマリウム、ユウロピウム、ガドリニウム、テルビウム、ジスプロシウム、ホルミウム、エルビウム、ツリウム、イッテルビウム、またはルテチウム）である。
【００７４】
いくつかの実施形態では、触媒は、塩の形態にある金属、例えば、金属イオンおよび対イオンを含む。金属イオンと錯体化し得る任意の適当な荷電化合物は、本明細書に記載された酸素除去シール材において使用され得ると考えられる。いくつかの実施形態で、対イオンは、ハロゲン化物イオン、硫酸イオン、亜硫酸イオン、硫化物イオン、硝酸イオン、亜硝酸イオン、酢酸イオン、アセチルアセトンイオン、過塩素酸イオン、水酸化物イオン、メトキシドイオン、およびエトキシドイオンからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、対イオンは、ラウリン酸イオン、ミリスチン酸イオン、パルミチン酸イオン、ステアリン酸イオン、オレイン酸イオン、およびリノール酸イオンからなる群から選択される。
【００７５】
いくつかの実施形態では、本発明で提供される酸素除去シール材の触媒は、水溶解性が限定されるかまたは水溶解性がない酸化触媒を含むと考えられる。いくつかの実施形態では、触媒は、実質的に水不溶性の有機または無機遷移金属化合物の形態で提供される。いくつかの実施形態では、触媒は、遷移金属がイオン結合または共有結合によって他の元素または基と結合している塩または化合物の形態であることができる。いくつかの実施形態では、触媒は、キレート剤、錯体、または有機カルボキシル脂肪酸塩の形態であってもよい。いくつかの実施形態では、遷移金属化合物は、その最高の酸化状態で遷移金属を有する化合物である。いくつかの実施形態では、酸素除去シール材は、銅錯体およびアスコルビル脂肪酸エステルを含む。
【００７６】
試料のローディング
いくつかの態様で、本開示は、目的の分子（例えば、シークエンシング用鋳型）を試料ウェル中にローディングするために有用な方法および組成物に関する。例えば、いくつかの実施形態で、本開示は、試料を、試料ウェルを備える集積化デバイスの表面に導入することにより、目的の分子を含む試料を試料ウェル中にローディングするために有用な方法および組成物を提供する。試料を集積化デバイスの表面に接触させることによる試料のローディングは、任意の数の適当な方法により実施することができる。いくつかの実施形態では、目的の分子を含む試料は、実施者によって、例えば、ピペット、ディスペンサー、または任意の適当な流体移送デバイス／システムによる、デバイスへの試料の添加によりローディングされる。いくつかの実施形態では、目的の分子を含む試料は、自動化された手段（例えば、ロボットのデバイス／システム）によるデバイスへの試料の添加によりローディングされる。いくつかの実施形態では、目的の分子を含む試料は、１つまたは複数の微小流体チャンネルを通じて、試料をデバイスに添加することによりローディングされる。
【００７７】
いくつかの実施形態では、目的の分子は、分子を集積化デバイスに送達するために一般的に使用される方法により、集積化デバイス（例えば、試料ウェル、アレイを備える集積化デバイス）に送達することができる。例えば、送達方法は、目的の分子を流体中に懸濁して、得られた懸濁液を集積化デバイスの試料ウェル中に流し入れることを含むことができる。この方法は、関係のある懸濁液を集積化デバイスの１つまたは複数の領域に単にピペットで移す方法、または、電気信号または圧力に基づく流体の流動などのより活性な流動方法を含むことができる。いくつかの実施形態では、目的の分子を含む試料が、集積化デバイスの選択される領域中に、例えば、特定の目的の分子が集積化デバイスの特定の領域で分析されることになる領域中に流し込まれる。これは、遮蔽技法（直接流体の流動に対して遮蔽を適用する）により、またはインクジェット印刷方法を含む電気信号もしくは圧に基づく流体の流動などの活性流動方法により達成することができる。インクジェットおよび核酸および関係する試薬をアレイに送達する他の送達方法は、例えば、キンメルおよびオリバー（Ｋｉｍｍｅｌ  ａｎｄ  Ｏｌｉｖｅｒ）（編）（２００６）  ＤＮＡマイクロアレイ、パートＡ：アレイプラットホームおよび湿潤−ベンチプロトコル（ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  Ｐａｒｔ  Ａ：Ａｒｒａｙ  Ｐｌａｔｆｏｒｍｓ  ＆  Ｗｅｔ−Ｂｅｎｃｈ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）、Ｖｏｌｕｍｅ  ４１０（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、ＩＳＢＮ−１０：０１２１８２８１５８；リー（Ｌｅｅ）（２００２）  マイクロドロップジェネレーション（Ｍｉｃｒｏｄｒｏｐ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）ナノおよびマイクロサイエンス、エンジニアリング、技術および医学（Ｎａｎｏ−ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  ＩＳＢＮ−１０：０８４９３１５５９Ｘ；およびヘラー（Ｈｅｌｌｅｒ）（２００２）「ＤＮＡマイクロアレイ技術：デバイス、システム、および応用」（ＤＮＡ  ＭＩＣＲＯＡＲＲＡＹ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：  Ｄｅｖｉｃｅｓ、  Ｓｙｓｔｅｍｓ、  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）  Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ４：１２９−１５３に見出される。いくつかの実施形態では、微小流体の流動は、目的の分子送達のために使用することができる。集積化デバイスの領域は、関係のある懸濁液を集積化デバイスの正しい領域中に単にピペットで移すことによる送達の選択的標的であることもできる。
【００７８】
いくつかの実施形態では、試料を、試料ウェルを備える集積化デバイスに導入することにより、目的の分子を含む試料を試料ウェル中にローディングする方法は、１回または複数の洗浄工程を含むことができる。例えば、いくつかの実施形態では、集積化デバイスは、試料を集積化デバイスに導入する前またはその後で（例えば、目的の分子を含む試料を集積化デバイスの試料ウェル中にローディングする前および／または後）１回または複数回洗浄することができる。いくつかの実施形態では、集積化デバイスは、ローディングされるべき試料中の目的の分子を懸濁するために使用された同じ溶液または緩衝液で洗浄される。いくつかの実施形態では、集積化デバイスは、ノニオン界面活性剤（例えばツイーン２０）で洗浄される。いくつかの実施形態では、洗浄工程は、洗浄溶液を集積化デバイス上でインキュベートすることを可能にするインキュベーション期間を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されたローディング方法は、洗浄工程を実施することなく実行することもできる。
【００７９】
いくつかの態様において、本開示は、目的の分子を集積化デバイスの表面に接触させる工程、および目的の分子をクラウディング剤および／または凝縮剤と接触させる工程を含む、目的の分子（例えば、シークエンシング用鋳型）を試料ウェル中にローディングする方法を提供する。いくつかの実施形態では、接触させる工程は、任意の適当な順序で実行され得ることが認められるべきである。例えば、いくつかの実施形態では、目的の分子を、クラウディング剤および／または凝縮剤と接触させる前に、表面に接触させる。いくつかの実施形態では、クラウディング剤および／または凝縮剤と接触させる前に、目的の分子を、集積化デバイスと接触させ（例えば、ローディングして）続いてインキュベーション期間を設ける。いくつかの実施形態では、凝縮剤は、そのようなインキュベーション期間の間、試料中に存在する。いくつかの実施形態では、目的の分子を集積化デバイスと接触させた（例えば、ローディングした）後、直ちにまたはほぼ間もなく、クラウディング剤および／または凝縮剤を、集積化デバイスと接触させる（例えば、ローディングする）。いくつかの実施形態では、集積化デバイスと接触する前に、試料はクラウディング剤および／または凝縮剤を含む。
【００８０】
試料を集積化デバイスの表面に接触させる実施形態の一例が、図６Ａ〜６Ｃに描かれている。図６Ａで示されるように、目的の分子６９０を含む試料６４０を、複数の試料ウェルを有する集積化デバイスと接触させる。図６Ｂは、試料６４０に添加されたクラウディング剤６５０を含む層６６０を描いている。いくつかの実施形態では、層６６０は、本明細書に記載された期間、試料６４０とインキュベートされる。いくつかの実施形態では、インキュベーション期間に、クラウディング剤６５０が、試料６４０中のバルク体積（例えば、水）を取り込んで目的の分子６９０を排除することを可能になる。図６Ｃは、インキュベーション期間に続いて起こるこの体積排除効果を示しており、この期間中に、目的の分子６９０が試料ウェル中に押しやられて、それにより試料ウェルは、首尾よくローディングされた目的の分子６９１を受け入れる、より高い確率を有する。
【００８１】
さらなる他の実施形態では、目的の分子を表面に接触させる前にクラウディング剤と接触させる。例えば、いくつかの実施形態では、目的の分子およびクラウディング剤を、集積化デバイスと接触させる（例えば、ローディングする）前に混合してもよい。そのような実施形態では、目的の分子およびクラウディング剤を混合して、ある期間平衡化させることができる。いくつかの実施形態では、目的の分子およびクラウディング剤を、集積化デバイスと接触させる（例えば、ローディングする）直前またはほぼ直前に混合する。さらなる他の実施形態で、目的の分子を、表面に接触させて、ほぼ同時にクラウディング剤と接触させる。例えば、いくつかの実施形態では、目的の分子およびクラウディング剤を、ほぼ同時に集積化デバイスと接触させ（例えば、ローディングする）、その結果、該２成分が集積化デバイスの表面で混合される。さらなる他の実施形態では、目的の分子は、表面に接触したときにクラウディング剤と接触する。例えば、いくつかの実施形態では、クラウディング剤を、目的の分子の前に、集積化デバイスと接触させる（例えば、ローディングする）。そのような実施形態では、（例えば、目的の分子を集積化デバイス上へ導入することによる）目的の分子のローディングの前に、クラウディング剤を、集積化デバイスと接触させ（例えば、ローディングして）続いてインキュベーション期間を設けることができる。
【００８２】
本明細書に記載されたように、クラウディング剤は、目的の分子の試料ウェル中へのローディングを一般的に容易にする。いくつかの実施形態では、クラウディング剤は、目的の分子の試料ウェルの底部表面への連結を助長する。したがって、いくつかの実施形態では、シークエンシング反応の開始前に、集積化デバイス上で目的の分子−クラウディング剤混合物をインキュベートすることが望ましいこともある。いくつかの実施形態では、目的の分子−クラウディング剤混合物は、シークエンシング反応の開始の前にほぼ１分からほぼ５分間、ほぼ５分からほぼ１０分間、ほぼ１０分からほぼ２０分間、ほぼ２０分からほぼ３０分間、ほぼ３０分からほぼ４０分間、ほぼ４０分からほぼ５０分間、ほぼ５０分からほぼ６０分間、またはほぼ６０分からほぼ９０分間、集積化デバイス上でインキュベートされる。
【００８３】
インキュベーション期間に続いて、いくつかの実施形態では、過剰体積が、集積化デバイスから除去され得る。いくつかの実施形態では、過剰体積は、クラウディング剤および／または試料ウェルに連結されなかった任意の目的の分子を含む。例えば、図６Ｃに描かれた目的の分子のローディングの成功に続いて、図６Ｄは、クラウディング剤および試料ウェル中へのローディングに成功しなかった目的の分子を含む過剰体積の除去後の集積化デバイスを描いている。
【００８４】
いくつかの実施形態では、集積化デバイスの表面は、過剰体積の除去に続いて１回または複数回洗浄される。本明細書に記載されたように、いくつかの実施形態では、目的の分子は、本開示に記載された任意の適当な技法により開始され得る反応（例えば、シークエンシング反応）に関与することができる。例えば、図６Ｄに描かれた過剰体積の除去に続いて、図６Ｅは、活性な目的の分子６９２を生ずる反応を開始する要素６５２を含む調製物６７０の添加を描いている。いくつかの実施形態では、集積化デバイスの表面は、反応の開始に先立って１回または複数回洗浄される。いくつかの実施形態では、集積化デバイスの表面は、目的の分子を懸濁するために使用された溶液で１回または複数回洗浄される。いくつかの実施形態では、集積化デバイスの表面は、反応を開始させるために使用された溶液で１回または複数回洗浄される。いくつかの実施形態では、シークエンシング反応は、任意選択の除去および／または洗浄工程に続いて、本明細書の他の箇所で記載された開始の任意の適当な手段により開始される。例えば、いくつかの実施形態では、目的の分子は、シークエンシング反応に関与するシークエンシング用鋳型を含む。そのような実施形態では、シークエンシング用鋳型は、シークエンシング反応のために有利に「下準備」され得る。いくつかの実施形態では、シークエンシング用鋳型を含む試料は、シークエンシング反応を開始させるために必要な大部分のまたは１種を除く全ての成分を有する。したがって、シークエンシング反応は、適当な時に、試料への必要な成分の添加により開始することができる。いくつかの実施形態では、シークエンシング反応は、試料へのｄＮＴＰの添加により開始される。いくつかの実施形態では、シークエンシング反応は、試料への金属カチオン（例えば、マグネシウムイオン）の添加により開始される。いくつかの実施形態では、試料中における阻害剤の存在は、シークエンシング反応の開始を妨げる。そのような実施形態では、反応は、阻害剤の除去により、例えば、阻害剤を希釈して除去することにより（例えば、緩衝液の交換により）開始することができる。したがって、試料を、シークエンシング反応の開始の前に、集積化デバイスの表面に接触させる（例えば、ローディングする）ことが好ましいこともある。
【００８５】
いくつかの実施形態では、開始された反応を覆うために、シール材が試料に添加される。いくつかの実施形態では、シール材は、酸素除去シール材である。例えば、図６Ｅで示されるように反応の開始に続いて、図６Ｆは、試料に添加された酸素除去シール材６５４を含む層６８０を描いている。適当な酸素除去シール材の性質、説明、および例は本明細書に記載されている。
【００８６】
試料調製
いくつかの態様において、本開示は、分析のための試料を得ることと試料を分析することとの間の工程およびプロセスにおける改善に一般的に関する。例えば、いくつかの実施形態では、本開示は、シークエンシングのための試料を得ることと試料からシークエンシングの情報を得ることとの間の工程およびプロセスにおける改善に関する。いくつかの実施形態では、試料は核酸の試料を含む。いくつかの態様において、シークエンシングのための試料を調製する工程は、試料をシークエンシング分析にかける前に、１種または複数の物理的および／または化学的改変を、試料（例えば、生物学的試料、化学的試料、核酸試料、タンパク質試料）に行う工程を一般的に伴う。いくつかの実施形態では、シークエンシングのための試料を調製する工程は、シークエンシング用鋳型の生成を伴う。
【００８７】
本明細書において使用する、「シークエンシング用鋳型」とは、分析（例えば、シークエンシング分析）の対象である分子である。いくつかの実施形態では、シークエンシング用鋳型は、核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、「標的」または「鋳型」核酸と称される。いくつかの実施形態では、核酸分子は、少なくとも１種のハイブリダイズしたプライマー／重合酵素複合体を含む。例えば、いくつかの実施形態では、核酸分子を、核酸分子の一部と相補性であるシークエンシングプライマーと、シークエンシングプライマーが核酸分子にアニーリングするように接触させる。このプライミングの位置が、重合酵素（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼ）が、核酸分子とカップリングしてハイブリダイズしたプライマー／重合酵素複合体を形成することができる部位を生じさせる。したがって、いくつかの実施形態では、少なくとも１つのハイブリダイズしたプライマー／重合酵素を含むシークエンシング用鋳型は、「シークエンシング用鋳型複合体」と称することができる。
【００８８】
本明細書において使用する用語「核酸」は、１つまたは複数の核酸サブユニットを含む分子を一般的に指す。核酸は、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、およびウラシル（Ｕ）、またはそれらのバリアントから選択される１種または複数のサブユニットを含むことができる。いくつかの例において、核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）、またはそれらの誘導体である。核酸は、一本鎖または二本鎖であることができる。核酸は、環状であってもよい。いくつかの実施形態では、核酸は、ヌクレオチドの任意のポリマーを一般的に指す。
【００８９】
本明細書において使用する用語「ヌクレオチド」は、核酸サブユニットを一般的に指し、それはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、またはＵ、またはそれらのバリアントもしくは類似体を含むことができる。ヌクレオチドは、成長する核酸鎖中に組み込まれ得る任意のサブユニットを含むことができる。そのようなサブユニットは、Ａ、Ｃ、Ｇ、ＴもしくはＵ、または、１種もしくは複数の相補性Ａ、Ｃ、Ｇ、ＴもしくはＵに特異的な、またはプリン（例えば、ＡもしくはＧ、またはそれらのバリアントもしくは類似体）もしくはピリミジン（例えば、Ｃ、Ｔ、もしくはＵ、またはそれらのバリアントもしくは類似体）に相補性の、任意の他のサブユニットであることができる。サブユニットは、個々の核酸塩基または塩基の群（例えば、ＡＡ、ＴＡ、ＡＴ、ＧＣ、ＣＧ、ＣＴ、ＴＣ、ＧＴ、ＴＧ、ＡＣ、ＣＡ、またはウラシル−それらの相方）が解読されることを可能にすることができる。ヌクレオチドは、１つまたは複数のホスフェート基を含むことができる。ヌクレオチドは、メチル化された核酸塩基を含むことができる。例えば、メチル化されたヌクレオチドは、核酸塩基と連結した１つまたは複数のメチル基（例えば、核酸塩基の環と直接連結している、核酸塩基の環の置換基と連結している）を含むヌクレオチドであることができる。典型的なメチル化された核酸塩基は、１−メチルチミン、１−メチルウラシル、３−メチルウラシル、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、１−メチルアデニン、２−メチルアデニン、７−メチルアデニン、Ｎ６−メチルアデニン、Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデニン、１−メチルグアニン、７−メチルグアニン、Ｎ２−メチルグアニン、およびＮ２，Ｎ２−ジメチルグアニンを含む。
【００９０】
本明細書において使用する用語「プライマー」は、核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド）を一般的に指し、それらはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、および／またはＵ、またはそれらのバリアントもしくは類似体を含む配列を含むことができる。プライマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、またはそれらのバリアントもしくは類似体を含む合成オリゴヌクレオチドであることができる。プライマーは、そのヌクレオチド配列が、標的または鋳型核酸と相補性であるように設計されることが可能であり、またはプライマーはランダムなヌクレオチド配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、プライマーは、尾部（例えば、ポリＡ尾部、インデックスアダプター、分子バーコードなど）を含むことができる。いくつかの実施形態では、プライマーは、５から１５塩基、１０から２０塩基、１５から２５塩基、２０から３０塩基、２５から３５塩基、３０から４０塩基、３５から４５塩基、４０から５０塩基、４５から５５塩基、５０から６０塩基、５５から６５塩基、６０から７０塩基、６５から７５塩基、７０から８０塩基、７５から８５塩基、８０から９０塩基、８５から９５塩基、９０から１００塩基、９５から１０５塩基、１００から１５０塩基、１２５から１７５塩基、１５０から２００塩基、または２００を超える塩基を含むことができる。
【００９１】
いくつかの実施形態では、標的核酸を含む試料は、対象（例えば、ヒトまたは他の対象）から得られた生物学的試料から抽出することができる。いくつかの実施形態では、対象は患者であってもよい。いくつかの実施形態では、標的核酸は、診断の、予後の、および／または治療の目的のために検出および／またはシークエンシングすることもできる。いくつかの実施形態では、シークエンシングアッセイについての情報は、疾患または状態の診断、予後、および／または処置を助けるために有用であり得る。いくつかの実施形態では、対象は、疾患（例えば癌）などの健康状態を有すると疑われていることもある。いくつかの実施形態では、対象は、疾患のための処置を受けていてもよい。
【００９２】
いくつかの実施形態では、生物学的試料は、対象の体液または組織、例えば、呼気、唾液、尿、血液（例えば、全血または血漿）、糞便、または他の体液または生検試料などから抽出することができる。いくつかの例では、１種または複数の核酸分子が、対象の体液または組織から抽出される。１種または複数の核酸は、対象の組織の一部などの対象から得られた、または全血などの対象の細胞を含まない体液から得られた１種または複数の細胞から抽出され得る。
【００９３】
生物学的試料は、検出のための調製で処理することができる（例えば、シークエンシング）。そのような処理は、生物学的試料からの生体分子（例えば、核酸分子）の単離および／または精製、および生体分子のより多くのコピーの生成を含むことができる。いくつかの例で、１種または複数の核酸分子が、対象の体液または組織から単離されおよび精製されて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの核酸増幅により増幅される。次に、１種または複数の核酸分子またはそれらのサブユニットを、シークエンシングなどで識別することができる。しかしながら、いくつかの実施形態では、核酸試料は、増幅を必要とせずに評価することができる（例えば、シークエンシングされる）。
【００９４】
本出願に記載されたように、シークエンシングは、鋳型に相補性または似通った別の生体分子を合成して、例えば鋳型核酸分子と相補性の核酸分子を合成して、ヌクレオチドの組込みを時間とともに識別することによる鋳型の生体分子（例えば、核酸分子）の個々のサブユニットの決定（例えば、合成によるシークエンシング（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）を含む。代替として、シークエンシングは、生体分子の個々のサブユニットの直接識別を含むことができる。
【００９５】
シークエンシングの間に、生体分子の個々のサブユニットを示すシグナルは、メモリーに捕集されてリアルタイムでまたはより後の時点で処理されて、生体分子の配列を決定することができる。そのような処理は、そのシグナルと個々のサブユニットの識別を可能にする参照シグナルとの比較を含むことができて、いくつかの場合に読み取りを生ずる。読み取りは、より大きい配列または領域を識別するために使用することができる十分な長さの配列（例えば、少なくとも約３０、５０、１００塩基対（ｂｐ）またはそれを超える）であることもできて、例えば、染色体またはゲノム領域または遺伝子上の位置にアラインすることができる。
【００９６】
配列の読み取りは、対象のゲノムのより長い領域を再構築するために使用することができる（例えば、アライメントにより）。読み取りは、染色体の領域、染色体全体、またはゲノム全体を再構築するために使用することができる。配列の読み取りまたはそのような読み取りから生成されたより大きい配列は、対象のゲノムを分析するために、例えばバリアントまたは多型を識別するために使用することができる。バリアントの例は、タンデムＳＮＰを含む一塩基多型（ＳＮＰ）、インデルまたは欠失挿入多型（ＤＩＰ）とも称される小規模の多塩基欠失または挿入、多塩基多型（ＭＮＰ）、ショートタンデムリピート（ＳＴＲ）、微小欠失を含む欠失、微小挿入を含む挿入、遺伝子重複、逆位、転座、増殖（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ）、複合多部位バリアント、コピー数多型（ＣＮＶ）を含む構造変異を含むが、これらに限定されない。ゲノム配列は、バリアントの組合せを含むことができる。例えば、ゲノム配列は、１つまたは複数のＳＮＰおよび１つまたは複数のＣＮＶの組合せを包括することができる。
【００９７】
用語「ゲノム」は、生物体の遺伝情報の全体を一般的に指す。ゲノムは、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかでコードされ得る。ゲノムは、タンパク質をコードするコード領域ならびに非コード領域を含むことができる。ゲノムは、生物体中で全ての染色体の配列を一緒に含むことができる。例えば、ヒトゲノムは、合計で４６個の染色体を有する。これらの全ての配列は、一緒になってヒトゲノムを構成する。いくつかの実施形態では、全ゲノムの配列が決定される。しかしながら、いくつかの実施形態では、ゲノムのサブセット（例えば、１個または２から３個の染色体、またはそれらの領域）または１個または２から３個の遺伝子（またはそれらの断片）についての配列情報が、診断の、予後の、および／または治療的適用のために十分である。
【００９８】
いくつかの実施形態は、検体中の単一分子を検出することによる診断のための試験を対象とすることもできるが、本発明者らは、本開示の方法および組成物が、ポリペプチド（例えば、タンパク質）のシークエンシングまたは１種もしくは複数の核酸セグメント、例えば、遺伝子の核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）のシークエンシングを実施するために使用され得ることも認識した。
【００９９】
シークエンシング
いくつかの実施形態では、本出願の態様は、生体試料のアッセイ法と関連する方法で使用可能である。典型的な実施形態では、本願明細書で提供される方法は、試料中の１つもしくは複数の核酸もしくはポリペプチドの配列を決定し、および／または試料中の１つもしくは複数の核酸もしくはポリペプチドバリアント（例えば、目的とする遺伝子内の１つまたは複数の突然変異）の有無を決定するのに使用される技法において有用である。いくつかの実施形態では、核酸配列情報を提供するため、または診断上、予後上、および／または治療上の目的で、目的とする１つまたは複数の核酸の有無を決定するために、患者試料（例えば、ヒト患者試料）上でテストが実施可能である。いくつかの例では、診断テストには、例えば対象の生体試料中の無細胞ＤＮＡ分子および／または発現産物（例えば、ＲＮＡ）をシークエンシングすることにより、対象の生体試料中の核酸分子をシークエンシングすることが含まれ得る。例えば、本開示は、それぞれの内容を本願明細書に援用する同時係属中の米国特許出願第１４／５４３，８６５号、同第１４／５４３，８６７号、同第１４／５４３，８８８号、同第１４／８２１，６５６号、同第１４／８２１，６８６号、同第１４／８２１，６８８号、同第１５／１６１，０６７号、同第１５／１６１，０８８号、同第１５／１６１，１２５号、同第１５／２５５，２４５号、同第１５／２５５，３０３号、同第１５／２５５，６２４号、同第１５／２６１，６９７号、同第１５／２６１，７２４号、同第６２／２８９，０１９号、同第６２／２９６，５４６号、同第６２／３１０，３９８号、同第６２／３３９，７９０号、同第６２／３４３，９９７号、同第６２／３４４，１２３号、および同第６２／４２６，１４４号に記載されている技術において有利に利用され得る方法および組成物を提供する。
【０１００】
本出願のいくつかの態様は、生物学的ポリマー、例えば核酸およびタンパク質等をシークエンシングする能力を有する技法において有用である。いくつかの実施形態では、本出願に記載されている方法および組成物は、核酸またはタンパク質中に組み込まれる一連のヌクレオチドまたはアミノ酸モノマーを識別する技術（例えば、一連の標識されたヌクレオチドまたはアミノ酸モノマーの組み込みについて、そのタイムコースを検出することによる）において使用可能である。いくつかの実施形態では、本出願に記載されている方法および組成物は、重合酵素により合成される鋳型依存性核酸シークエンシング反応生成物に組み込まれる一連のヌクレオチドを識別する技法に組込み可能である。
【０１０１】
シークエンシング期間中に、重合酵素は、標的核酸分子（例えば、シークエンシング用鋳型の核酸分子）のプライミング位置にカップリングする（例えば、連結する）ことができる。プライミング位置は、標的核酸分子の一部分に対して相補的なプライマーを含み得る。代替案として、プライミング位置は、標的核酸分子の二本鎖セグメント内に提供されるギャップまたはニックである。ギャップまたはニックは、長さが０から少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、または４０個のヌクレオチドであり得る。ニックは、二本鎖配列の一方の鎖に切れ目を設けることができ、この切れ目は重合酵素、例えば鎖置換型ポリメラーゼ酵素等に対してプライミング位置を提供し得る。
【０１０２】
場合によっては、シークエンシングプライマーが、固体支持体に対して固定化されても、またされなくてもよい標的核酸分子に対してアニーリングされ得る。固体支持体は、例えば、核酸のシークエンシングで使用される集積化デバイス上の試料ウェルを含み得る。いくつかの実施形態では、シークエンシングプライマーは、固体支持体に固定化可能であり、また標的核酸分子のハイブリダイゼーションも標的核酸分子を固体支持体に固定化する。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは固体支持体に固定化され、そして可溶性プライマーおよび標的核酸がポリメラーゼと接触する。ただし、いくつかの実施形態では、ポリメラーゼ、標的核酸、およびプライマーを含む複合体が溶液中で形成され、そして該複合体は固体支持体に固定化される（例えば、ポリメラーゼ、プライマー、および／または標的核酸の固定化により）。いくつかの実施形態では、試料ウェル中の成分のいずれも、固体支持体に固定化されない。例えば、いくつかの実施形態では、ポリメラーゼ、標的核酸、およびプライマーを含む複合体が溶液中で形成され、そして該複合体は固体支持体に固定化されない。
【０１０３】
適切な条件下では、アニーリングされたプライマー／標的核酸と接触しているポリメラーゼ酵素が、１つまたは複数のヌクレオチドをプライマー上に付加するまたは組み込むことができ、そしてヌクレオチドは、５’→３’方向、鋳型依存的にプライマーに付加され得る。プライマー上へのそのようなヌクレオチドの組み込み（例えば、ポリメラーゼの作用による）は、プライマー伸長反応と一般的に呼ばれる場合がある。各ヌクレオチドは、核酸伸長反応期間中に検出および識別可能であり（例えば、その発光寿命および／またはその他の特性に基づき）、ならびに伸長したプライマー、したがって新規合成された核酸分子の配列に組み込まれた各ヌクレオチドを決定するのに使用可能である検出可能なタグと関連付けることができる。新規合成された核酸分子の配列相補性により、標的核酸分子の配列も決定可能である。場合によっては、標的核酸分子に対するシークエンシングプライマーのアニーリング、およびシークエンシングプライマーへのヌクレオチドの組み込みは、類似した反応条件（例えば、同一のまたは類似した反応温度）、または異なる反応条件（例えば、異なる反応温度）において生じ得る。いくつかの実施形態では、合成法によるシークエンシングには、標的核酸分子の集団（例えば、標的核酸のコピー）の存在、および／または標的核酸の集団を実現するために標的核酸を増幅させる工程が含まれ得る。ただし、いくつかの実施形態では、合成によるシークエンシングが、評価対象となる各反応内の単一分子の配列を決定するのに使用される（および核酸増幅法は、シークエンシング用の標的鋳型を調製することを必要としない）。いくつかの実施形態では、本出願の態様に基づき、複数の単一分子シークエンシング反応が並行して実施される（例えば、単一の集積化デバイス上で）。例えば、いくつかの実施形態では、複数の単一分子シークエンシング反応が、集積化デバイス上の別個の反応チャンバー内でそれぞれ実施される。
【０１０４】
複数の実施形態で、約１０塩基対（ｂｐ）、５０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、１０００ｂｐ、１０，０００ｂｐ、２０，０００ｂｐ、３０，０００ｂｐ、４０，０００ｂｐ、５０，０００ｂｐ、または１００，０００ｂｐと等しいかまたはそれを超える長さを有する核酸分子を含むシークエンシング用鋳型をローディングすることができる。いくつかの実施形態では、単一分子のシークエンシングで使用される標的核酸分子は、試料ウェルの底または側壁などの固体の支持体に固定化されたまたは取り付けられたシークエンシング反応の少なくとも１つの追加の成分（例えば、ＤＮＡポリメラーゼなどの重合酵素、およびシークエンシングプライマー）を含有する試料ウェルに添加または固定化された一本鎖の標的核酸鋳型である。標的核酸分子またはポリメラーゼは、試料ウェルの底部表面または側壁などの試料壁に直接またはリンカーを通じて取り付けることができる。試料ウェルは、例えば、適当な緩衝液、共同因子、酵素（例えば、ポリメラーゼ）およびデオキシリボヌクレオシドポリリン酸、例えば、検出可能な部分（例えば、発光性タグ）を任意選択で含んでいてもよい、デオキシアデノシントリホスフェート（ｄＡＴＰ）、デオキシシチジントリホスフェート（ｄＣＴＰ）、デオキシグアノシントリホスフェート（ｄＧＴＰ）、デオキシウリジントリホスフェート（ｄＵＴＰ）およびデオキシチミジントリホスフェート（ｄＴＴＰ）ｄＮＴＰを含むデオキシリボヌクレオシドトリホスフェートなどのプライマー伸長反応による核酸合成のために必要とされる任意の他の試薬を含有することもできる。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、一本鎖の標的核酸鋳型を、シークエンシングプライマー、ｄＮＴＰ、ポリメラーゼ、および核酸合成のために必要な他の試薬と接触させることができる。いくつかの実施形態では、全ての適当なｄＮＴＰを、一本鎖の標的核酸鋳型と同時と接触させることができて（例えば、全てのｄＮＴＰが同時に存在する）、その結果ｄＮＴＰの組込みが連続的に起こり得る。他の実施形態では、ｄＮＴＰを、一本鎖の標的核酸鋳型と順次接触させることができて、その場合、一本鎖の標的核酸鋳型がそれぞれ適当なｄＮＴＰと別々に接触し、一本鎖の標的核酸鋳型の異なるｄＮＴＰとの接触の間に洗浄工程がある。一本鎖の標的核酸鋳型を、各ｄＮＴＰと別々と接触させた後洗浄する、そのようなサイクルを、識別されるべき一本鎖の標的核酸鋳型の各逐次的な塩基位置のために繰り返すことができる。いくつかの実施形態では、シークエンシングプライマーが一本鎖の標的核酸鋳型にアニーリングして、ポリメラーゼが引き続いてｄＮＴＰ（または他のデオキシリボヌクレオシドポリホスフェート）を、一本鎖の標的核酸鋳型に基づいてプライマーに組み込む。
【０１０６】
ポリメラーゼ
本明細書において使用する用語「ポリメラーゼ」および「重合酵素」は、重合反応を触媒することができる任意の酵素を一般的に指す。ポリメラーゼの例は核酸ポリメラーゼ、トランスクリプターゼまたはリガーゼを含むが、これらに限定されない。ポリメラーゼは重合酵素であることができる。
【０１０７】
単一分子の核酸伸長を対象とする（例えば、核酸シークエンシングのため）実施形態では、標的核酸分子と相補性の核酸を合成することができる任意のポリメラーゼを使用することができる。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、および／またはそれらの突然変異体または１種または複数の変化した形態であってもよい。
【０１０８】
ポリメラーゼの例には、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、熱安定性ポリメラーゼ、野生型ポリメラーゼ、改変されたポリメラーゼ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ７ＤＮＡのポリメラーゼ、バクテリオファージＴ４のＤＮＡポリメラーゼ、φ２９（ファイ２９）のＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｔｌｉポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、Ｐｗｏポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（登録商標）ポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ（商標）ポリメラーゼ、Ｅｘ  Ｔａｑ（商標）ポリメラーゼ、ＬＡ  Ｔａｑ（商標）ポリメラーゼ、Ｓｓｏポリメラーゼ、Ｐｏｃポリメラーゼ、Ｐａｂポリメラーゼ、Ｍｔｈポリメラーゼ、ＥＳ４ポリメラーゼ、Ｔｒｕポリメラーゼ、Ｔａｃポリメラーゼ、Ｔｎｅポリメラーゼ、Ｔｍａポリメラーゼ、Ｔｃａポリメラーゼ、Ｔｉｈポリメラーゼ、Ｔｆｉポリメラーゼ、Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｂｒポリメラーゼ、Ｔｆｌポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｐｆｕｔｕｒｂｏ（登録商標）ポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ（商標）ポリメラーゼ、Ｐｗｏポリメラーゼ、ＫＯＤポリメラーゼ、Ｂｓｔポリメラーゼ、Ｓａｃポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗ断片、３’から５’のエキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ、およびそれらのバリアント、改変された生成物および誘導体が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、単一サブユニットのポリメラーゼである。ポリメラーゼの追加の例には、Ｍ２Ｙポリメラーゼ、ヒツジキンバ（Ｌｕｃｉｌｉａ  ｃｕｐｒｉｎａ）のポリメラーゼ、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）のポリメラーゼ、桿菌ファージ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｈａｇｅ）ＶＭＹ２２のポリメラーゼ、桿菌ファージＧＡ−１のポリメラーゼ、放線菌ファージ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｐｈａｇｅ）ＡＶ−１のポリメラーゼ、カンジダタス・モランバクテリア（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｍｏｒａｎｂａｃｔｅｒｉａ）のポリメラーゼ、桿菌ファージＭＧ−Ｂ１のポリメラーゼ、エガセラ属種（Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ  ｓｐ．）のポリメラーゼ、ストレプトコッカス・ファージ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｈａｇｅ）ＣＰ−７のポリメラーゼ、バクテロイデス属種（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｐ．）のポリメラーゼ、およびトラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）のポリメラーゼが含まれる。ＤＮＡポリメラーゼおよびそれらの性質の例は、就中、ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，コーンバーグ（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ）およびベイカー（Ｂａｋｅｒ）、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（１９９１）に詳細に記載されているが、これらに限定されない。
【０１０９】
標的核酸と相補性ｄＮＴＰの核酸塩基間の塩基対が形成されると、ポリメラーゼが、ｄＮＴＰを、新しく合成された鎖の３’ヒドロキシル末端とｄＮＴＰのαホスフェートの間にリン酸ジエステル結合を形成することにより、新しく合成される核酸鎖中に組込む。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、処理能力が高いポリメラーゼである。しかしながら、いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、処理能力が低下したポリメラーゼである。ポリメラーゼの処理能力とは、核酸鋳型を放さずにｄＮＴＰを核酸鋳型に引き続いて組み込むポリメラーゼの能力を一般的に指す。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性および／または３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の低いポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、改変されて（例えば、アミノ酸置換により）対応する野生型ポリメラーゼと比較して、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性および／または３’−５’活性が低下している。ＤＮＡポリメラーゼのさらなる例には、９°Ｎｍ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（ニューイングランドバイオラブ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ））、およびＫｌｅｎｏｗエキソポリメラーゼのＰ６８０Ｇ突然変異体（タスケら（Ｔｕｓｋｅ  ｅｔ  ａｌ．）（２０００）ＪＢＣ２７５（３１）：２３７５９−２３７６８）が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、処理能力が低下したポリメラーゼは、ヌクレオチドリピート（例えば、２個以上の連続する同じ種類の塩基）の１つまたは複数のストレッチを含有するシークエンシング用鋳型に対して向上した正確さを提供する。
【０１１１】
ＲＮＡの単一分子の伸長を対象とする（例えば、ＲＮＡシークエンシングのため）実施形態では、ＲＮＡ鋳型から相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成することができる任意の逆転写酵素を使用することができる。そのような実施形態では、逆転写酵素は、ｃＤＮＡが、ＲＮＡ鋳型にアニーリングされた逆転写プライマーにｄＮＴＰを組み込むことにより、ＲＮＡ鋳型から合成することができることにおいて、ポリメラーゼと類似の様式で機能することができる。次に、ｃＤＮＡは、シークエンシング反応およびその決定された配列に関与することができる。次にｃＤＮＡの決定配列は、配列相補性により、元のＲＮＡ鋳型の配列を決定するために使用することができる。逆転写酵素の例には、モロニーマウスの白血病ウイルスの逆転写酵素（Ｍ−ＭＬＶ）、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）の逆転写酵素、ヒト免疫不全ウイルスの逆転写酵素（ＨＩＶ−１）およびテロメラーゼ逆転写酵素が含まれる。
【０１１２】
異なる型の核酸に対する処理能力、エキソヌクレアーゼ活性、相対親和性、または核酸ポリメラーゼの他の性質は、対応する野生型ポリメラーゼに対する突然変異または他の改変によって当業者により向上または低下させることができる。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼを含む試料は、試料を本明細書に記載された集積化デバイスの表面に接触させることにより、試料ウェル中にローディングすることができる。
【０１１３】
試料ウェル
いくつかの態様において、本開示は、集積化デバイスにより備えられた試料ウェル中に試料をローディングする方法を提供する。本明細書において使用する「集積化デバイス」とは、ベース機器とインターフェイスで接続することができるデバイスである。いくつかの実施形態では、集積化デバイスは、１つまたは複数の試料ウェルおよび／またはセンサーを備えることができる。いくつかの実施形態では、集積化デバイスは、光を発するかまたは検出するベース機器とインターフェイスで接続できてもよい。そのような実施形態では、集積化デバイスは、１つまたは複数の試料ウェルを備えることができて、そのそれぞれは導波管を含む。
【０１１４】
本明細書に記載された型の集積化デバイスは、目的の分子をその中に受け入れるように構成された１つまたは複数の試料ウェルを備えることができる。いくつかの実施形態では、試料ウェルは、底の表面などの試料ウェルの表面に配置され得る目的の分子を受け入れる。いくつかの実施形態では、試料ウェルは、集積化デバイス内に形成されて、そこで、試料ウェルの底部表面は、それが形成された集積化デバイスの表面に対して遠位にある。いくつかの実施形態では、目的の分子が配置されるべき底部表面は、目的の分子を所望のレベルの励起エネルギーで励起するように構成された導波管から距離を有していてもよい。いくつかの実施形態では、試料ウェルは、導波管に関して、導波管に沿って伝播する光学モードのエバネセント場が目的の分子と重なるように、位置することができる。
【０１１５】
試料ウェルは、集積化デバイスの表面に上部開口を有することができて、目的の分子は、そこを通って試料ウェル中に入れられる。上部開口のサイズは、ローディングされる試料中の目的の分子（例えば、シークエンシング用鋳型）のサイズなどの様々な要因に依存し得る。いくつかの実施形態では、上部開口のサイズは、試料ウェルを備える集積化デバイスが利用される機器または装置に依存することもある。例えば、試料ウェルの内部からの光を検出するデバイスでは、背景シグナルが迷光から生じ得る。目的の分子が試料ウェル中に配置されて励起エネルギーで励起されたときに、背景シグナルは放出エネルギーにおける望ましくない変動の原因となり、したがって測定のノイズとなり得る。そのような変動を制限するために、上部開口のサイズは、背景シグナルの少なくとも一部を遮断するように構成することができる。
【０１１６】
試料ウェルの体積は、いくつかの実施において約１０−２１リットルから約１０−１５リットルの間であることができる。試料ウェルが小さい体積を有するので、検査対象の検体内において目的の分子が天然の環境で見出される濃度と類似の濃度に濃縮されているとしても、単一試料事象（例えば、単一分子事象）の検出は可能であり得る。例えば、マイクロモル濃度の目的の分子が、集積化デバイスと接触して配置される検体中に存在し得るが、任意の所定時には、ピクセルレベルで約１個のみの目的の分子（または単一分子事象）が試料ウェル内にあり得る。
【０１１７】
統計的に、いくつかの試料ウェルが、目的の分子を含有しないこともあり、いくつかは２個以上の目的の分子を含有することもある。しかしながら、かなりの数の試料ウェルが単一の目的の分子を含有することができて（例えば、一部の実施形態では少なくとも３０％）、その結果、単一分子の分析を多数の試料ウェルについて並行して実施することができる。単一分子または単一試料事象が各試料ウェルで分析され得るので、集積化デバイスは、そうでなければアンサンブル平均では気づかれずに終わる個々の事象を検出することを可能にする。
【０１１８】
試料ウェルの官能化
ある実施形態で、本明細書に記載された技法は、分子を試料ウェル中にローディングすることに関するもので、その場合、分子は試料ウェルの標的体積（例えば、反応体積）に閉じ込められる。いくつかの実施形態では、標的体積は試料ウェル内の領域である。ある実施形態では、試料ウェルは、第１の材料および複数の金属または金属酸化物層によって形成された側壁を含む底部表面を備える。いくつかの実施形態では、第１の材料は、透明な材料またはガラスである。いくつかの実施形態では、底部表面は平坦である。いくつかの実施形態では、底部表面が、湾曲したウェルである。いくつかの実施形態では、底部表面は、複数の金属または金属酸化物層により形成された側壁より下の側壁の部分を含む。いくつかの実施形態では、第１の材料は溶融シリカまたは二酸化ケイ素である。いくつかの実施形態では、複数の層は、金属（例えば、Ａｌ、Ｔｉ）または金属酸化物（例えば、Ａｌ２Ｏ３、ＴｉＯ２、ＴｉＮ）をそれぞれ含む。
【０１１９】
１個または複数の分子または複合体（例えば、シークエンシング用鋳型）が底部表面に固定化されている実施形態では、底部表面を官能化して１個または複数の分子または複合体の連結を可能にすることが望ましいこともある。ある実施形態では、底部表面は透明なガラスを備える。ある実施形態では、底部表面は融合シリカまたは二酸化ケイ素を備える。いくつかの実施形態では、底部表面は、シランで官能化されている。いくつかの実施形態では、底部表面は、イオンで荷電したポリマーで官能化されている。いくつかの実施形態では、イオンで荷電したポリマーは、ポリ（リシン）を含む。いくつかの実施形態では、底部表面は、ポリ（リシン）−グラフト−ポリ（エチレングリコール）で官能化されている。いくつかの実施形態では、底部表面は、ビオチン化ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で官能化されている。
【０１２０】
ある実施形態では、底部表面は、ニトロドーパ基を含むコーティングで官能化されている。ある実施形態では、コーティングは式：
【０１２１】
【化１】
2020513749.tif 000003
（式中、ＲＮは、任意選択で置換されていてもよいアルキル鎖であり、および
【０１２２】
【化２】
2020513749.tif 000004
は、水素または表面に対する連結点である）の基を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮは、ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮはポリ（リシン）またはポリ（エチレングリコール）を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮは、ビオチン化ポリ（エチレングリコール）を含む。いくつかの実施形態では、コーティングは、リシンモノマーを含むポリ（リシン）のコポリマーを含み、その場合リシンモノマーは、ＰＥＧ、ビオチン化ＰＥＧ、ニトロドーパ基、ホスホネート基、またはシランを独立に含む。ある実施形態では、コーティングは、式：
【０１２３】
【化３】
2020513749.tif 000005
のポリマー（Ｐ）を含む。
いくつかの実施形態では、Ｘは、−ＯＭｅ、ビオチン基、ホスホネート、またはシランである。いくつかの実施形態では、ｉ、ｊ、ｋ、およびｌのそれぞれは、独立に０から１００の間に含まれる整数である。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、底部表面は、アルキル鎖を含むシランで官能化されている。いくつかの実施形態では、底部表面は、任意選択で置換されていてもよいアルキル鎖を含むシランで官能化されている。いくつかの実施形態では、底部表面は、ポリ（エチレングリコール）鎖を含むシランで官能化されている。いくつかの実施形態では、底部表面は、カップリング基を含むシランで官能化されている。例えばカップリング基は、アミン基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、スルフヒドリル基、金属、キレート剤などの化学部分を含むことができる。あるいは、それらは、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、レクチン、ＳＮＡＰ−ｔａｇ（商標）または基質、それ故、会合性または結合性ペプチドまたはタンパク質、抗体または抗体断片、核酸または核酸類似物などの特定の結合要素を含むことができる。それに加えて、またはあるいは、カップリング基は、目的の分子とカップリングまたは結合するために使用される追加の基をカップリングするために使用することができて、追加の基は、いくつかの場合に、化学官能基および特定の結合要素の両方を含むことができる。例として、カップリング基、例えばビオチンは、基材表面上に積層されることが可能で、所定のエリアで選択的に活性化され得る。次に、中間結合剤、例えばストレプトアビジンが、第１のカップリング基とカップリングされ得る。この特定の例ではビオチン化されているであろう目的の分子が、次にストレプトアビジンとカップリングされる。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、底部表面はビオチンを含むシランまたはそれらの類似物で官能化されている。いくつかの実施形態では、底部表面は、ビオチンを含むポリ（エチレン）グリコール鎖を含むシランで官能化されている。ある実施形態では、底部表面は、シランの混合物で官能化されており、その場合少なくとも１つの型のシランはビオチン含み、少なくとも１つの型のシランはビオチンを含まない。いくつかの実施形態では、上記混合物は、ビオチンを含まないシランよりも約１０倍少ない、約２５倍少ない、約５０倍少ない、約１００倍少ない、約２５０倍少ない、約５００倍少ない、または約１０００倍少ないビオチン化シランを含む。
【０１２６】
ポリメラーゼ複合体は、該複合体を、官能化された表面に結合混合物中で露出することにより、底部表面に固定化することができる。いくつかの実施形態では、結合混合物は、１種または複数の塩を含む。いくつかの実施形態では、塩は酢酸カリウムを含む。いくつかの実施形態では、塩は、塩化カルシウムを含む。いくつかの実施形態では、塩は、約１ｍＭと約１０ｍＭの間の濃度で存在する。いくつかの実施形態では、塩は、約１０ｍＭから約５０ｍＭの間の濃度で存在する。いくつかの実施形態では、塩は、約５０ｍＭから約１００ｍＭの間の濃度で存在する。いくつかの実施形態では、塩は、約１００ｍＭから約２５０ｍＭの間の濃度で存在する。いくつかの実施形態では、酢酸カリウムの濃度は約７５ｍＭである。いくつかの実施形態では、塩化カルシウムの濃度は約１０ｍＭである。いくつかの実施形態では、結合混合物は還元剤を含む。いくつかの実施形態では、還元剤は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む。いくつかの実施形態では、還元剤は、約１ｍＭから約２０ｍＭの間の濃度で存在する。いくつかの実施形態では、ジチオスレイトールの濃度は約５ｍＭである。いくつかの実施形態では、結合混合物は緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、緩衝液はＭＯＰＳを含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、約１０ｍＭから約１００ｍＭの間の濃度で存在する。いくつかの実施形態では、ＭＯＰＳの濃度は約５０ｍＭである。いくつかの実施形態では、緩衝液は約５．５から約６．５の間のｐＨで存在する。いくつかの実施形態では、緩衝液は、約６．５から約７．５の間のｐＨで存在する。いくつかの実施形態では、緩衝液は、約７．５から約８．５の間のｐＨで存在する。いくつかの実施形態では、結合混合物は、デオキシヌクレオチドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）を含む。いくつかの実施形態では、デオキシヌクレオチドトリホスフェートは、２５０ｎＭから１０μＭの間の濃度で存在する。いくつかの実施形態では、ｄＮＴＰの濃度は約２μＭである。いくつかの実施形態では、結合混合物は界面活性剤を含む。いくつかの実施形態では、界面活性剤はツイーン界面活性剤（例えばツイーン２０）である。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、約０．０１％から約０．１％の間の体積パーセントで存在する。いくつかの実施形態では、ツイーンの体積パーセントは約０．０３％である。
【０１２７】
実施例１：メチルセルロース試料のローディング
２重量％のＭＥＴＨＯＣＥＬ溶液を、標準溶解プロトコル（メチルセルロース、Ｓｉｇｍａ  Ｍ０３８７、２％および２０℃で約１，５００ｍＰａ・ｓ、約６３，０００Ｄａ）に従って、脱イオン水中で作製した。シークエンシング用鋳型複合体（ポリメラーゼ／プライマー／鋳型複合体）のローディング中に使用するために、２％のＭＥＴＨＯＣＥＬ溶液を、結合緩衝液（５００ｍＭ  ＭＯＰＳ  ｐＨ７．５、７５０ｍＭ酢酸カリウム、１００ｍＭ  ＤＴＴ、２０ｍＭ酢酸カルシウム、２０μＭ  ＮＴＰ（各）、０．１％ｗ／ｗツイーン２０）の１０×溶液と９：１で混合した。その結果生じた緩衝液中１．８％のポリマー溶液は、１×結合緩衝液（５０ｍＭ  ＭＯＰＳ  ｐＨ７．５、７５ｍＭ酢酸カリウム、１０ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍＭ酢酸カルシウム、２μＭ  ＮＴＰ（各）、０．０１％ｗ／ｗツイーン２０）中のシークエンシング用鋳型複合体のローディング溶液と同じイオン性組成物を含有する。
【０１２８】
ツイーン２０（０．１％）の溶液を、深さ２７０ｎｍの試料ウェルを有するシークエンシングチップ（例えば、集積化デバイス）に添加して、１０分間インキュベートした。ツイーン２０を除去したら、シークエンシングチップを１×結合緩衝液で洗浄した後、３０μＬの結合緩衝液を集積化デバイスに添加した。シークエンシング用鋳型複合体を含有する溶液を、集積化デバイスに添加して、最終の濃度を２５０〜１０００ｐＭにしてよく混合した。混合された溶液を、結合緩衝液中１．８％のメチルセルロース溶液で重層した。その後シークエンシングチップを３０〜６０分間室温でインキュベートした。このインキュベーション期間は、シークエンシング用鋳型複合体のポリメラーゼ−ストレプトアビジン融合体がシークエンシングチップのビオチンでコートされた試料ウェルに固定化されることをおそらく可能にする。
【０１２９】
インキュベーション期間の後、溶液をシークエンシングチップから除去した。シークエンシングチップを結合緩衝液で３回洗浄した後、反応緩衝液（６５ｍＭ  ＭＯＰＳ  ｐＨ７．７、１２０ｍＭ酢酸カリウム、２０ｍＭ酢酸マグネシウム、１０ｍＭ  ＤＴＴ、８ｍＭプロトカテク酸、６ｍＭ  ４−ニトロベンジルアルコール、１×プロトカテクエート３，４−ジオキシゲナーゼ）で１回洗浄した。最終的に、ある量の反応緩衝液をシークエンシングチップに添加して等体積の鉱物油で覆った。シークエンシング反応を、係属中の米国特許出願第１４／８２１，６５６号、第１５／２６１，６９７号、第１５／２６１，７２４号および第１５／１６１，１２５号に記載されている方法を使用して、リアルタイムでモニターした。代表的シークエンシング反応は、強度および時間トレースにより描いて図７Ａに示した。この反応で、９．１ｋｂの二重らせんＤＮＡ鋳型を、１．２ｋｂを超える読取り長さにわたってシークエンシングした（図７Ｂ）。
【０１３０】
大きい鋳型のローディングに対するメチルセルロースの効果を評価するために、２つのシークエンシングチップに同じ９．１ｋｂの鋳型ＤＮＡをそれぞれローディングして、１つは２％メチルセルロースの重層を使用し（上に記載したように）、１つは重層をしなかった。両方のチップに鋳型を６６０ｐＭで１時間ローディングした。複数の組込みの形跡をメチルセルロースがローディングされたチップから検出したが、一方、重層のない集積化デバイスでは、シークエンシング活性は検出されなかった。次に、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ、蛍光性ＤＮＡ結合色素を、シークエンシングチップのそれぞれに添加した。撮像結果を図８に描いてあり、それはＤＮＡ染色における劇的な差を示す。メチルセルロースがローディングされたチップ上の試料ウェルのほぼ３０％は鮮やかに染色されて、ＤＮＡ鋳型の存在を示したが、それに対して、メチルセルロース重層のない集積化デバイスでは染色は観察されなかった。
【０１３１】
類似の実験で、２つのさらなるシークエンシングチップに、同じ５．４ｋｂの鋳型ＤＮＡをそれぞれローディングして、１つは２．７％メチルセルロースの重層を使用して、１つは拡散のみによりローディングした。両方のチップに、２．５ｎＭのＤＮＡ鋳型を１．５時間ローディングした。次にＳＹＢＲ  ＧＯＬＤをシークエンシングチップのそれぞれに添加した。撮像結果を図９に描いてあり、それはＤＮＡ染色における劇的な差を示す。ほぼ２５個の試料ウェルに、メチルセルロースチップ中の単一鋳型をローディングして拡散のみによりローディングされたほぼ１３個の試料ウェルと比較した。
【０１３２】
実施例２：固体状態のクラウディング剤
図１０は、固体状態のクラウディング剤としてアガロースの可能性を評価するために使用した実験のセットアップを描いた図である。示されるように、スクリューのナットの上の約４ｍｍ部分が、集積化デバイスのバルク試料ウェル（例えば、アレイの例えば凹んだ領域、または、ローディングされる試料のバルク体積を保持する他の容器）に挿入され得るボディを表す。３つの状態が、アガロースがクラウディング剤として作用するプロセスを示すために描かれている。「アガロースなし」のスクリューはいかなるクラウディング剤も含まないボディである。「乾燥アガロース」のスクリューは、乾燥したアガロースでコートされたボディを示す。図１０で見ることができるように、乾燥したアガロースはスクリューのネジ溝をほぼ満たす。「水和したアガロース」のスクリューは、試料がローディングされた集積化デバイスのバルク試料ウェル中に挿入された後における、乾燥したアガロースのボディを表す。ボディ上のアガロースコーティングの膨潤がバルク試料ウェル中における水によるアガロースの再水和を示し、その効果はバルク溶液中におけるシークエンシング用鋳型の増大した濃度を生ずるであろう。
【０１３３】
同等物および範囲
いくつかの発明的実施形態を、本願明細書に記載および例示してきたが、当業者は、機能を実施するための、ならびに／あるいは本願明細書に記載する結果および／または１つもしくは複数の長所を取得するための様々なその他の手段および／または構造について容易に思いつくであろうが、そのような変更および／または改変のそれぞれは、本願明細書に記載する発明的実施形態の範囲内にあるとみなされる。より一般的には、当業者は、本願明細書に記載するすべてのパラメーター、寸法、材料、および構成は典型的なものとして意図されており、実際のパラメーター、寸法、材料、および／または構成は特定の用途または発明の教示が使用される用途に依存することを容易に認めるであろう。当業者は、ルーチン的な実験を超える実験を用いなくても、本願明細書に記載する具体的な発明的実施形態と同等の多くの実施形態を認識し、または確認することができるであろう。したがって、上記実施形態は例示目的に限定して提示されており、また別途、特別に記載および特許請求されない限り、添付の特許請求の範囲およびその同等物の範囲内で、発明的実施形態は実践可能であるものと理解されるべきである。本開示の発明的実施形態は、本願明細書に記載する個々の特色、システム、物品、材料、キット、および／または方法それぞれを対象とする。さらに、２つ以上のそのような特性、システム、物品、材料、キット、および／または方法の任意の組み合わせは、そのような特性、システム、物品、材料、キット、および／または方法が相互に矛盾しなければ、本開示の発明の範囲内に含まれる。
【０１３４】
すべての定義は、本願明細書で定義されおよび使用される通りであり、辞書の定義、援用する文書の定義、および／または定義された用語の通常の意味に対して制御上優先するものと理解すべきである。
【０１３５】
本願明細書に開示するすべての参考資料、特許、および特許出願は、そのそれぞれについて引用された主題に関して援用され、場合によっては文書全体を包含し得る。
不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本願明細書および特許請求の範囲において使用する場合、明確に反示されない限り、「少なくとも１つ」を意味するものと理解すべきである。
【０１３６】
慣用句「および／または」は、本願明細書および特許請求の範囲において使用する場合、そのように結びつけられた複数の要素の「いずれかまたは両方」、すなわち、ある場合には結合的に存在し、またその他の場合には非結合的に存在する要素を意味するものと理解されるべきである。「および／または」を用いてリスト化される複数の要素は、同様に、すなわちそのように結びつけられた複数の要素の「１つまたは複数」として解釈すべきである。「および／または」の句より特に識別される要素以外のその他の要素が、特に識別された要素と関連するまたは関連しないに関わらず任意選択で存在する可能性がある。したがって、非限定的な例として、「Ａおよび／またはＢ」との記載は、非制限的言語、例えば「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等と連携して使用される場合、１つの実施形態ではＡのみ（任意選択でＢ以外の要素を含む）；別の実施形態ではＢのみ（任意選択でＡ以外の要素を含む）；なおも別の実施形態ではＡとＢの両方（任意選択でその他の要素を含む）等を意味し得る。
【０１３７】
本願明細書および特許請求の範囲において使用する場合、「または（ｏｒ）」は、上記で定義したような「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」と同一の意味を有するものと理解すべきである。例えば、リスト内で品目を分離する際に、「または」あるいは「および／または」は包括的である、すなわちいくつかの要素または要素のリストの少なくとも１つ（ただし２つ以上も含む）、および任意選択で追加のリスト化されない品目の包括であると解釈されるものとする。明確に反示される用語に限り、例えば「〜のうちの１つのみ（ｏｎｌｙ  ｏｎｅ  ｏｆ）」または「〜のうちのまさに１つ（ｅｘａｃｔｌｙ  ｏｎｅ  ｏｆ）」等、あるいは特許請求の範囲で使用される際の「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｏｆ）」は、いくつかの要素または要素のリストのうちのまさに１つの要素の包括を指す。一般的に、用語「または（ｏｒ）」は、本願明細書で使用する場合、排他性の用語、例えば「いずれか（ｅｉｔｈｅｒ）」、「〜のうちの１つ（ｏｎｅ  ｏｆ）」、「〜のうちの１つのみ（ｏｎｌｙ  ｏｎｅ  ｏｆ）」、または「〜のうちのまさに１つ（ｅｘａｃｔｌｙ  ｏｎｅ  ｏｆ）」等が先行する場合に限り、排他的な代替的用語（すなわち、「一方または他方、ただし両方ではない（ｏｎｅ  ｏｒ  ｔｈｅ  ｏｔｈｅｒ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｂｏｔｈ）」）を示すと解釈するものとする。「〜から本質的になる（Ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、特許請求の範囲で使用されるとき、特許法の分野で使用されるその通常の意味を有するものとする。
【０１３８】
本願明細書および特許請求の範囲において使用する場合、１つまたは複数の要素のリストを参照する際の慣用句「少なくとも１つ」とは、要素のリスト内の任意の１つまたは複数の要素から選択される少なくとも１つの要素を意味するものと理解すべきであるが、しかし要素のリスト内に特にリスト化されているあらゆる要素それぞれの少なくとも１つを必ずしも含む必要はなく、また要素のリスト内の要素の任意の組み合わせを排除するものでもない。この定義は、慣用句「少なくとも１つ」が指す要素のリスト内で特に識別された要素以外の要素が、そのような特に識別された要素に関連する、しないに関わらず任意選択で存在し得ることも可能にする。したがって、非限定的な例として、「ＡおよびＢのうちの少なくとも１つ」（または同じく「ＡまたはＢのうちの少なくとも１つ」、または同じく「Ａおよび／またはＢのうちの少なくとも１つ」）とは、１つの実施形態では、Ａは少なくとも１つであり、任意選択で２つ以上を含み、Ｂは存在しない（任意選択でＢ以外の要素を含む）こと；別の実施形態では、Ｂは少なくとも１つであり、任意選択で２つ以上を含み、Ａは存在しない（任意選択でＡ以外の要素を含む）こと；さらに別の実施形態では、Ａは少なくとも１つであり、任意選択で２つ以上を含み、Ｂは少なくとも１つであり、任意選択で２つ以上を含む（任意選択でその他の要素を含む）こと等を指す。
【０１３９】
明確に反示されない限り、２つ以上の工程または行為が含まれる本願で特許請求された任意の方法において、方法の工程または行為の順序は、該方法の工程または行為が列挙された順序に必ずしも限定されないものと、やはり理解されるべきである。
【０１４０】
特許請求の範囲、ならびに上記明細書において、すべての移行句、例えば「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「〜を担持する（ｃａｒｒｙｉｎｇ）」、「〜を有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「〜を含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「〜を伴う（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、「〜を保持する（ｈｏｌｄｉｎｇ）」、「〜から構成される（ｃｏｍｐｏｓｅｄ  ｏｆ）」等は非制限的である、すなわち、〜を含むが、これらに限定されない、を意味するものと理解される。移行句「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」および「〜から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」に限り、特許審査手順の米国特許オフィスマニュアル（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｏｆｆｉｃｅ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｅｘａｍｉｎｉｎｇ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）、セクション２１１１．０３に規定するように、それぞれ限定的または半限定的な移行句であるものとする。非制限的な移行句（例えば、「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」）を使用する本文書に記載されている実施形態も、代替的実施形態においては、非制限的移行句により記載される特色「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」および「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」ものとやはりみなされるものと認められるべきである。例えば、開示が「ＡおよびＢを含む組成物」と記載する場合、該開示は、代替的実施形態、「ＡおよびＢからなる組成物」および「ＡおよびＢから本質的になる組成物」についても検討の対象とする。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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