(57)【要約】  本発明は、ウイルスベクターＡＡＶ／ＩＧＦ２−ＡおよびＡＡＶ／ＩＧＦ２における２つの分子の発現に関する。図１１/１９のインビボモデルに示されるように、ハンチントン病などのタンパク質ミスフォールディング関連疾患の改善における関連方法およびその使用に関する。【選択図】図３／１９
2020501613.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えウイルスゲノムを含み、
前記組換えウイルスゲノムは、発現カセットを含み、
前記発現カセットは、目的のポリヌクレオチド、Ｉｇｆ２またはＩｇｆ２−ＨＡに動作可能に結合された神経組織の特異的転写の調節領域を含むことを特徴とするアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）。
【請求項２】
前記ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、および偽型ＡＡＶを含む群から選択される請求項１に記載のアデノ随伴ウイルス。
【請求項３】
前記調節領域は、とりわけ、ＣＡＧ、ＣＭＶ、ｂ―グロビン、ＣＢＡ、ｅｌＦアルファ、ＰＧＫを含む群から選択されるプロモーター領域を含む請求項１および２に記載のアデノ随伴ウイルス。
【請求項４】
前記群から選択される前記プロモーター領域は、ＣＡＧである請求項３に記載のアデノ随伴ウイルス。
【請求項５】
とりわけ、ＨＡ、ＦＬＡＧ、ＧＦＰ、ＨｉｓおよびＭｙｃの群から選択される免疫応答部位のコード領域を含む請求項１および２に記載のアデノ随伴ウイルス。
【請求項６】
免疫応答部位の前記コード領域は、ＨＡである請求項５に記載のアデノ随伴ウイルス。
【請求項７】
前記アデノ随伴ウイルスの前記血清型は、各血清型の指向を与えられた導入遺伝子を発現する細胞型の特異性を提供する請求項２に記載のアデノ随伴ウイルス。
【請求項８】
前記アデノ随伴ウイルスの前記血清型のタイプは、神経系細胞に対してより高い親和性を有する請求項８に記載のアデノ随伴ウイルス。
【請求項９】
前記アデノ随伴ウイルスの前記血清型の前記タイプは、番号２のものおよび／または偽型ウイルス２／２である請求項２に記載のアデノ随伴ウイルス。
【請求項１０】
前記発現カセットは、転写後調節領域を含む請求項１ないし９のいずれか一項に記載のアデノ随伴ウイルス。
【請求項１１】
前記転写後調節領域は、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素（ＷＰＲＥ）である請求項１０に記載のアデノ随伴ウイルス。
【請求項１２】
前記アデノ随伴ウイルスの前記ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３およびＡＡＶ４、好ましくはＡＡＶ２に由来するＩＴＲである請求項１ないし１１のいずれか一項に記載のアデノ随伴ウイルス。
【請求項１３】
転写される標的配列は、Ｉｇｆ２またはＩｇｆ２−ＨＡを含む請求項１ないし１２のいずれか一項に記載のアデノ随伴ウイルス。
【請求項１４】
前記転写される標的配列は、Ｉｇｆ２である請求項１３に記載のアデノ随伴ウイルス。
【請求項１５】
前記転写される標的配列は、Ｉｇｆ２−ＨＡである請求項１３に記載のアデノ随伴ウイルス。
【請求項１６】
前記目的のポリヌクレオチドは、ＩＧＦ２またはＩＧＦ２−ＨＡを含む前記群内のタンパク質をコードし、ニューロン神経細胞または非ニューロン神経細胞と、または、それらに近接して全身的に、および細胞内または細胞外で作用する請求項１ないし１５のいずれかに記載のアデノ随伴ウイルス。
【請求項１７】
前記目的のポリヌクレオチドは、ＩＧＦ２タンパク質をコードする請求項１６に記載のアデノ随伴ウイルス。
【請求項１８】
前記目的のポリヌクレオチドは、ＩＧＦ２−ＨＡタンパク質をコードする請求項１６に記載のアデノ随伴ウイルス。
【請求項１９】
前記目的のポリヌクレオチドは、神経細胞に作用する請求項１６に記載のアデノ随伴ウイルス。
【請求項２０】
請求項１ないし１９のいずれかに記載のアデノ随伴ウイルスと、薬学的に許容される賦形剤と、を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項２１】
組成物１ｍｌ当たり１０９〜１０１３ゲノムコピー（ＧＣ）の範囲の用量の前記ウイルスを含む請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
哺乳動物におけるハンチントン病の予防または治療用の薬物の調製に有用であることを特徴とする請求項２０に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２３】
哺乳動物における、ハンチントン病の予防または治療用の薬物の調製に有用である請求項１に記載のアデノ随伴ウイルスの使用。
【請求項２４】
前記哺乳動物は、ヒトである請求項２３に記載のアデノ随伴ウイルスの使用。
【請求項２５】
前記アデノ随伴ウイルスまたは前記医薬組成物は、全身的または局所的に投与される請求項２３に記載のアデノ随伴ウイルスの使用。
【請求項２６】
前記アデノ随伴ウイルスまたは前記医薬組成物は、神経組織における前記目的のポリヌクレオチドの前記発現を必要とする請求項２３に記載のアデノ随伴ウイルスの使用。
【請求項２７】
請求項１に記載のアデノ随伴ウイルスを有するアプリケーションの治療方法であって、前記方法は、
ａ．請求項１ないし２０のいずれかに記載の前記アデノ随伴ウイルスと前記神経細胞を接触させる工程と、
ｂ．前記神経細胞における前記ウイルスを発現させる工程と、
を含むことを特徴とするアデノ随伴ウイルスを有するアプリケーションの治療方法。
【請求項２８】
投与経路は、血液脳関門を通過するウイルスの経路であり、とりわけ、脳室内、脳内、および／または髄腔内直接注射による鼻経路を含む請求項２７に記載のアデノ随伴ウイルスを用いたアプリケーションの治療方法。
【請求項２９】
アデノ随伴ウイルスのＩＴＲが隣接する発現カセットを含み、
前記発現カセットは、プロモーター、免疫応答のためのコード領域、および目的のポリヌクレオチド、Ｉｇｆ２またはＩｇｆ２―ＨＡを含むことを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項３０】
前記プロモーター領域は、とりわけ、ＣＡＧ、ＣＭＶ、ｂ−グロビン、ＣＢＡ、ｅｌＦアルファ、ＰＧＫを含む群から選択される請求項２９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３１】
前記群から選択される前記プロモーター領域は、ＣＡＧである請求項３０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３２】
ＨＡ、ＦＬＡＧ、ＧＦＰ、Ｈｉｓ及びＭｙｃの群から選択される免疫応答部位のコード領域を含む請求項２９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３３】
ＨＡ型免疫応答部位用の前記コード領域を含む請求項３２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３４】
神経組織の転写の前記調節領域は、プロモーター領域を含む請求項２９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３５】
神経組織の前記転写の前記調節領域は、とりわけ、ＣＡＧ、ＣＭＶ、ｂ−グロビン、ＣＢＡ、ｅｌＦアルファを含む群から選択されるプロモーター領域を含む請求項３４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３６】
神経組織の前記転写の前記調節領域は、ＣＡＧプロモーター領域を含む請求項３６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３７】
前記発現カセットは、転写後調節領域をさらに含む請求項３０ないし３６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３８】
前記転写後調節領域は、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素（ＷＰＲＥ）である請求項３７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３９】
前記転写される標的配列は、Ｉｇｆ２およびＩｇｆ２−ＨＡ配列を含む請求項２９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４０】
前記転写される標的配列は、Ｉｇｆ２である請求項４１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４１】
前記転写される標的配列は、Ｉｇｆ２−ＨＡである請求項３９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４２】
前記目的のポリヌクレオチドは、ＩＧＦ２およびＩＧＦ２−ＨＡを含む前記群内のタンパク質をコードし、神経細胞に近接してまたは神経細胞と共に全身的に作用する請求項２９ないし４１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４３】
前記目的のポリヌクレオチドは、ＩＧＦ２タンパク質をコードする請求項４２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４４】
前記目的のポリヌクレオチドは、ＩＧＦ２−ＨＡタンパク質をコードする請求項４２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４５】
前記目的のポリヌクレオチドは、神経細胞に近接してまたは神経細胞と共に全身的に作用し、前記皮質および前記線条体の細胞に特異的である請求項２９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４６】
アデノ随伴ベクターの配列と、前記アデノ随伴ウイルスのＩＴＲに隣接する発現カセットとを含み、
前記発現カセットは、プロモーター、免疫応答のためのコード領域、および目的のポリヌクレオチドを含み、
これらは、国際寄託生物寄託機関に寄託され、国際寄託生物寄託機関であるチリの微生物遺伝資源コレクション（ＣＣｈＲＧＭ）に、寄託番号ＲＧＭ２３３５およびＲＧＭ２３３６を有して寄託されたプラスミドで形質転換された大腸菌株に含まれることを特徴とするプラスミド。
【請求項４７】
請求項２９ないし４５のいずれか一項に記載の前記ウイルスゲノムを含むことを特徴とするアデノ随伴ウイルス。
【請求項４８】
ａ．ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質、およびＡＡＶがその複製に依存するウイルスタンパク質を、請求項３０ないし４６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む細胞に提供する工程と、
ｂ．前記ＡＡＶの集合に適した条件下で前記細胞を維持する工程と、
ｃ．前記細胞によって産生された前記アデノ随伴ウイルスベクターを精製する工程と、
を含むことを特徴とするアデノ随伴ウイルスを取得する方法。
【請求項４９】
前記ＡＡＶは、アデノウイルスに由来する複製に依存する請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記アデノ随伴ウイルスの前記Ｃａｐタンパク質および前記Ｒｅｐタンパク質は、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、および偽型ＡＡＶから選択されるＡＡＶに由来する請求項４８および４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記アデノ随伴ウイルスの前記Ｃａｐタンパク質および前記Ｒｅｐタンパク質は、血清型ＡＡＶ２に由来する請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
ハンチントン病を有する哺乳動物患者におけるＩＧＦ２の生理学的濃度を平準化するための薬物の調製に有用である請求項１に記載のアデノ随伴ウイルスの使用。
【請求項５３】
哺乳動物は、ヒトである請求項５２に記載のアデノ随伴ウイルスの使用。
【請求項５４】
前記アデノ随伴ウイルスまたは前記医薬組成物は、全身的または局所的に投与される請求項５２に記載のアデノ随伴ウイルスの使用。
【請求項５５】
前記アデノ随伴ウイルスまたは前記医薬組成物は、前記神経組織における前記目的のポリヌクレオチドの前記発現を必要とする請求項５２に記載のアデノ随伴ウイルスの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、中枢神経系（ＣＮＳ）の細胞において、好ましくは、運動認知制御、神経劣化の回復および改善の領域において、ＩＧＦ２増殖因子を過剰発現するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の使用によって、特に、タンパク質フォールディングの過程において、医学の分野で適用される。
【背景技術】
【０００２】
ＣＮＳ疾患、特に、変性神経疾患に関連する疾患に関する科学的研究は、近年、非常に興味深いものとなっている。ハンチントン病などのタンパク質ミスフォールディングに関連する疾患の治療は、タンパク質ミスフォールディングの結果として、神経の死によって引き起こされる症状を軽減するためのアロパシー療法（抗精神病薬および抗鬱剤）を用いたアプローチを有する。しかし、これは退化を遅らせるものでも、すでに引き起こしたダメージを元に戻すためのものではない。
【０００３】
ハンチントン病（ＨＤ）に関して、その遺伝的原因は、２０年以上前に発見された。しかしながら、神経機能障害および細胞死をもたらすメカニズムは、特定され始めたばかりである。
【０００４】
これらのメカニズムの特定の間に、プロテオスタシスネットワークの一般的な変化は、ＨＤの妊娠における重要な病理学的事象であることが示唆されている。小胞体（ＥＲ）のストレスの出現が際立っている。この細胞小器官において、折りたたまれていないタンパク質応答（ＵＰＲ）、ＥＲストレス下で細胞の運命を制御する反応シグナルの活性化を担うタンパク質が存在する。
【０００５】
ＨＤは、認知機能低下によって、第一段階で特徴付けられる神経変性疾患であり、より高度な段階での運動制御の障害とともに、性格を変化させる。これは、日常生活の課題の遂行を妨げ、患者の早死につながる。タンパク質レベルでは、この疾患は、ハンチンチンタンパク質内のグルタミンの３５回以上の繰り返しの拡大によって特徴付けられている。そして、支配的な毒性機能をそれに与えている。これは、変異ハンチンチン（ｍＨｔｔ）の進行性蓄積および線条体におけるニューロン喪失の発生をもたらす。ｍＨｔｔが神経機能に及ぼす影響のメカニズムについてはまだ議論されているが、種々の文献は、タンパク質恒常性に対する全体的な変化（１）がＥＲ、ＥＲおよびゴルジにおける小胞輸送、軸索輸送およびオートファジーにおける障害（６）に関連するタンパク質分解の変化を含む病因（２-５）に寄与していることを示唆している。これら全ての事象は、細胞のタンパク質負荷を増加させ、ＥＲにおけるそれらの正しいフォールディングおよび成熟を妨害し、慢性ＥＲストレスおよび神経機能不全を生じさせる（７）。ＥＲストレスは、折り畳まれていないタンパク質応答（ＵＰＲ）の活性化を誘発する。これは、第一に、プロテオスタシスを回復するための細胞適応を媒介することを可能にするシグナル伝達経路である。
【０００６】
しかし、慢性的なＥＲストレスは、細胞死や神経変性を誘発する。ＥＲストレスは、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、およびパーキンソン病（ＰＤ）を含むいくつかの神経変性疾患に関連していることに注意することが重要である（７−９）。このシグナル伝達の範囲内で、最も保護されている分枝は、プロテオスタシスネットワークの異なる側面に関与する一群の遺伝子の発現を制御する結合タンパク質１のＸ−ボックス転写因子（ＸＢＰ１）によって制御される（１０）。ＨＤを有するマウスモデルにおけるニューロン中のＸＢＰ１の欠失が神経保護効果を有することは、以前に実証された（５）。一般に、動物は、ニューロン生存の改善およびより良い運動能力と関連して、疾患の発症に対してより耐性があった。この表現型は、おそらくオートファジーの正の調節による、ｍＨｔｔレベルの劇的な減少によって説明された（５）。ＡＬＳ（１１）とＰＤ（１２）のモデルでも、同様の観察結果が得られた。
【０００７】
これらのタンパク質ミスフォールディング疾患の治療の探索において、ＩＧＦ２と呼ばれるインスリン様成長因子ＩＩが同定されている。その機能は、胎児成長の生物学的および分子的メカニズムに関与しているだけでなく、いくつかの癌性腫瘍に関与している。
【０００８】
ＩＧＦ２は、いくつかのモデルにおいて、興味深い神経保護活性を有する分泌型増殖因子である。要約すると、最近のいくつかの研究は、一般に、ＩＧＦが神経変性疾患の治療のための可能なターゲットであることを示唆している。特に、それは、神経剤としてのそれらの機能および神経保護効果を考慮している（１３）。事実、ＡＤおよびＡＬＳの前臨床モデルにおけるＩＧＦ１の送達は、遺伝子治療を用いることによって、病理学的特徴を弱める（１４−１６）。ＩＧＦ１およびインスリンとは対照的に、ＩＧＦ２は、ほとんど研究されていない。ごく少数の最近の報告が、ＩＧＦ２の神経保護的役割を示唆している。それは、ＡＤモデルにおけるアミロイド斑および認知障害を減少させる（１７、１８）。同様に、ＡＬＳにおいて、ＩＧＦ２は、疾患に対して抵抗力のある運動ニューロンにおいて差次的に発現される。そして、遺伝子治療によるその過剰発現は、その進行を遅らせる（１９）。さらに、ヒトにおいて、ＩＧＦ２レベルは、ＡＤ患者の海馬において減少し（１７、２０）、そしてまた、ＣＳＦサンプルにおいて変化を示す（２１、２２）。
【０００９】
しかしながら、ＩＧＦ２をＨＤと結び付けた機能的研究はない。
【００１０】
一般に、ＵＰＲのシグナル伝達と、成長因子のシグナル伝達との間のダイナミクスは、プロテオスタシスネットワークと神経生理学を調節する生存シグナルとを結び付ける新しいアプローチを想定している（２３）。これらの理由から、ＩＧＦ２は、疾患の進行をモニターするためのバイオマーカーとしてのその潜在的な使用に加えて、その治療のための新しい治療経路を提供することができるＨＤに照らして、研究のための興味深い候補を表す。
【００１１】
ＩＧＦ２を含む融合タンパク質がリソソームタンパク質に関連する疾患の治療のために提示されている国際出願ＷＯ２０１４／０８５６２１を有する文書ＣＬ３５１０―２０１４には、ＨＤを治療するための遺伝子治療についての言及がない。
【００１２】
また、第２の文書、ＥＳ ２４４２２４２ Ａ１がある。これは、異なる成長因子を含む、血液から抽出された抽出物に基づく組成物について言及する。ＨＤを治療するための遺伝子治療のいずれにも言及していない。
【００１３】
そのため、ＩＧＦ２遺伝子とＨＤの治療を結び付けた遺伝子治療を用いた文献はない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
一般に、本発明は、遺伝子治療薬、治療法、識別装置、およびハンチントン病を治療するための使用を生み出すことを目的とする。具体的な技術目標または解決すべき問題は以下に示される。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の第１の態様は、脳、好ましくは、線条体および皮質におけるＩＧＦ２および／またはＩＧＦ２／ＨＡの過剰発現を可能にするウイルスを使用することによって、好ましくはヒトにおけるハンチントン病を改善または治療する方法に関する。
【００１６】
本発明の第２の態様は、ハンチントン病を改善または治療するための治療的処置方法を提供する。この方法は、静脈内投与および／または腹腔内投与および／または頭蓋内投与および／または髄内投与および／または鼻腔内投与および／または神経内投与および／または患者もしくは対象の血液脳関門を通過することによってウイルスを脳に導入する任意の経路を含む。このウイルスは、個体あたり１６から１３０ウイルス単位の用量範囲で、ＩＧＦ２および／またはＩＧＦ２／ＨＡのニューロン過剰発現を誘発する。
【００１７】
本発明の第３の態様は、静脈内組成物および／または腹腔内組成物および／または頭蓋内組成物および／または髄内組成物および／または鼻腔内組成物および／または神経内医薬組成物および／または以前に提示されたような用量範囲で、ＩＧＦ２および／またはＩＧＦ２／ＨＡのニューロン過剰発現を脳に（好ましくは海馬に）誘発し、血液脳関門を横断するウイルスを送達する任意の形態である。また、第３の態様は、ハンチントン病を有するヒト患者の長期記憶の最適化および改善に使用するための薬学的に許容されるビヒクルである。
【００１８】
本発明の第４の態様は、ＩＧＦ２および／またはＩＧＦ２／ＨＡのニューロン過剰発現を誘発するウイルスおよびそのタンパク質誘導体化合物の使用である。それは、ハンチントン病の寛解に有用な薬物を調製するのに役立つ。
【００１９】
本発明の第５の態様は、同じウイルス配列を有するアデノ随伴型（ＡＡＶ）のウイルスおよび表ＩＩおよび表ＩＩＩに記載のヌクレオチド配列を有するインサートまたはその変異体のいずれかである。これらは、国際寄託機関、寄託番号ＲＧＭ２３３６およびＲＧＭ２３３５を有する微生物遺伝資源のチリコレクション（ＣＣｈＲＧＭ）に寄託されたプラスミドで形質転換された大腸菌株に含まれる。ＩＧＦ２および／またはＩＧＦ２／ＨＡ増殖因子は、それぞれ、主に線条体と皮質に過剰発現される。
【００２０】
本発明の第６の態様は、ウイルスの核酸フラグメントを有するプラスミドと、表ＩＩおよびＩＩＩに記載され、国際寄託機関、微生物遺伝資源のチリコレクション（ＣＣｈＲＧＭ）に寄託されたプラスミドで形質転換された大腸菌株に含まれるようなヌクレオチド配列を有するインサートとである。これは、寄託番号ＲＧＭ２３３６およびＲＧＭ２３３５および／またはこのフラグメントのいずれかの変異体を有し、それぞれＩＧＦ２および／またはＩＧＦ２／ＨＡ増殖因子をそれぞれコードし、過剰発現する。
【００２１】
本発明の第７の態様は、ハンチントン病を診断する方法を提供することである。
【００２２】
以下の発明の第８の態様は、ＩＧＦ２および／またはＩＧＦ２／ＨＡおよびそのタンパク質誘導体化合物の過剰発現を誘導するウイルスの使用である。それは、ハンチントン病患者の生理学的レベルの安定化に有用な薬物を調製するのに役立つ。
【００２３】
本特許はまた、ウイルスの核酸フラグメントを有するプラスミドの配列、ならびに表ＩＶ、Ｖ、およびＶＩＩに記載のヌクレオチド配列を有するインサート、あるいはこのフラグメントの任意の変異体を表す。これらは、ＩＧＦ２および／またはＩＧＦ２／ＨＡ増殖因子をコードおよび過剰発現する。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
微生物の寄託
プラスミドｐＡＡＶ−ＩＧＦ２−ＨＡおよびｐＡＡＶ−ＩＧＦ２は、国際寄託機関、チリの微生物遺伝資源のコレクション（ＣＣｈＲＧＭ）に寄託されたプラスミドで形質転換された、大腸菌の株に含まれ、２０１６年に国際寄託機関に寄託された。これは、それぞれＲＧＭ２３３５およびＲＧＭ２３３６の寄託番号を有する。
【００２５】
当然のことながら、本発明は、本明細書に記載の特定の方法論、化合物、材料、製造技術、使用および用途に限定されるものではないことが理解されるべきである。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、本発明の観点および可能性を限定することを意図するものではないことが理解されるべきである。
【００２６】
本明細書、添付の特許請求の範囲、および本文全体で使用されているように、文脈上明らかに別段の指示がない限り、単数形は複数の指示対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「使用または方法」への言及は、１つまたは複数の使用または方法への言及を含み、当業者（当技術分野）に公知の等価物を含む。同様に、さらなる例として、「工程」、「ステージ」、または「モード」への言及は、１つまたは複数の工程、ステージ、またはモードへの言及を含む。これは、黙示的および／または代替のサブ工程、サブステージまたはサブモードを含む。
【００２７】
使用されるすべての接続詞は、それほど限定的ではなく、より包括的な可能な意味で理解されなければならない。例えば、文脈や文章が明示的にそれを要求している、またはそれを述べている場合を除き、接続詞「または」は、その正統的な論理的意味で理解されるべきであり、除外する「または」として理解されるべきではない。記載された構造、材料、および／または要素は、無限の列挙が避けられるように、機能的に同等のものも参照していることを理解されたい。
【００２８】
近似や概念を表すのに使用される表現は、文脈が異なる読み方を表現していない限り、それらの本質的な意味で理解されるべきである。
【００２９】
本明細書で使用されるすべての技術的および／または科学的な名称および用語は、異なる意味が明確に表現されている場合を除いて、当業者によって与えられる通常の意味を有する。
【００３０】
方法、技術、要素、化合物および組成物が記載されているが、既に記載されたものと類似および／または同等の方法、技術、要素、化合物および組成物は、本発明の実施および／または試験において使用されることができるか、好ましい。
【００３１】
全ての特許および他の刊行物は、例えば、本発明に関して有用であり得る前記刊行物に記載された方法論を記載するおよび／または知らせる目的で、参照として含まれる。
【００３２】
本明細書に含まれる刊行物は、本出願の出願日より前の開示についてのみ提供されている。
【００３３】
この点に関して、著者および／または発明者が権利を与えられていないこと、または、前記刊行物が他の以前の刊行物より前の日付であることは、承認または容認、拒絶または排除として、または、他の何らかの理由によって、解釈されるべきではない。
【００３４】
本発明は、局所投与した場合、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４または任意の血清型、ハイブリッド、ならびに遺伝子の脳への移入を効率的に媒介することができるアデノ随伴ウイルス、好ましくはＡＡＶ２、好ましくはＡＡＶ２／２、好ましくは線条体および皮質（皮質）に基づくベクターを記載する。（図１０／１９、１１／１９および１２／１９）。
【００３５】
これらのベクターの全身投与はまた、脳ならびに線条体および皮質の両方に効率的な遺伝子伝達をもたらす。ベクターＡＡＶ２およびＡＡＶ２／２によって媒介される遺伝子の伝達はより効率的であるが、全身投与の場合の伝達は、脳または線条体および皮質のみに限定されない。本発明は、成長因子ＩＧＦ２の発現をコードする遺伝子を有するベクターＡＡＶ２およびＡＡＶ２／２が、脳内、特に、線条体および皮質内の目的の因子群において、応答の生成を可能にすることを示す。特に、Ｉｇｆ２遺伝子がＣＡＧプロモーターの制御下にある発現カセットを含むＡＡＶ２／２ベクターの局所投与は、インビボでのハンチントン病の治療における改善を得る。（図１１／１９と１２／１９）。
【００３６】
Ｉ．一般的な用語および表現の定義
【００３７】
本明細書中で使用されるように、用語「アデノ随伴ウイルス」、「ＡＡＶウイルス」、「ＡＡＶビリオン」、「ＡＡＶウイルス粒子」、および「ＡＡＶ粒子」は、交換可能であり、少なくとも１つのＡＡＶキャプシドタンパク質（好ましくは、特定のＡＡＶ血清型のすべてのキャプシドタンパク質による）およびキャプシド形成されたＡＡＶゲノムのポリヌクレオチドから構成されるウイルス粒子をいう。粒子がＡＡＶ逆方向末端反復配列に隣接する異種ポリヌクレオチド（すなわち、哺乳動物細胞に送達される導入遺伝子などの野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を含む場合、典型的には、どちらかが「ＡＡＶベクター粒子」または「ＡＡＶベクター」と呼ばれる。ＡＡＶは、パルボウイルス科のデペンドウイルス属に属するウイルスを指す。ＡＡＶゲノムは、約４．７キロベースの長さであり、ポジティブセンスまたはネガティブセンスのいずれかである一本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）から構成される。ゲノムは、ＤＮＡ鎖の両端に逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）と、２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）：ＲＥＰおよびＣＡＰ（レプリカーゼおよびキャプシド）とを含む。ＲＥＰフレームは、ＡＡＶライフサイクルに必要とされるＲＥＰタンパク質（ＲＥＰ７８、ＲＥＰ６８、ＲＥＰ５２およびＲＥＰ４０）をコードする４つの重複遺伝子からなる。ＣＡＰフレームは、２０個のキャプシドタンパク質配列：ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３の重複ヌクレオチドを含む。これらは、図１５／１９に示されるように、互いに相互作用して、正二十面体対称性を有するキャプシドを形成する（３０）。
【００３８】
本明細書中で使用される場合、用語「アデノ随伴ウイルスＩＴＲ」または「ＡＡＶ ＩＴＲ」とは、アデノ随伴ウイルスゲノムのＤＮＡ鎖の両端に反復して存在する逆方向末端をいう。ＩＴＲ配列は、ＡＡＶゲノムの効率的な増殖に必要とされる。これらの配列の別の性質は、フォークを形成するそれらの能力である。この特徴は、その複製に寄与する。これは、ＤＮＡの第二鎖とは別に、一次合成を可能にする。野生型ＡＡＶ ＤＮＡの宿主細胞ゲノムへの組込みおよびその救済、ならびに、その完全なアセンブリの生成と組み合わせたＡＡＶ ＤＮＡの効率的なキャプシド形成の両方にＩＴＲが必要であることも証明されている（２５）。
【００３９】
本発明で使用される場合、用語「ＡＡＶ２」および「ＡＡＶ２／２」は、アデノ随伴ウイルスの血清型２を指す。これは、以下のウェブサイト上にある受入番号ジェンバンクＪ０１９０１．１に定義されるようなゲノム配列を有する。
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/J01901.1
【００４０】
今日までに特徴付けられている１１個の血清型から、最も特徴付けられそして最も頻繁に使用されるものは、ＡＡＶ２である。異なる血清型間の違いは、それらの細胞向性によって決定される。ＡＡＶ２は、中枢神経系の細胞を感染させるための最も高い「親和性」を有するものの一つである。
【００４１】
本発明で使用されるように、用語「ＡＡＶベクター」はさらに、ＡＡＶ末端反復（ＩＴＲ）配列に隣接する１つ以上の目的のポリヌクレオチド（または導入遺伝子）を含むベクターを指す。前記ＡＡＶベクターは、それらがＲＥＰおよびＣＡＰ遺伝子をコードし、発現するベクター（すなわち、ＡＡＶタンパク質ＲＥＰおよびＣＡＰ）でトランスフェクトされている宿主細胞中に存在する場合、複製および感染性ウイルス粒子にパッケージングされる。宿主細胞は、Ｅ４またはｆ６アデノウイルスリーディングフレームのタンパク質をコードし、発現するベクターでトランスフェクトされている。ＡＡＶベクターがより大きなポリヌクレオチド（例えば、染色体、または、クローニングもしくはトランスフェクションに使用されるプラスミドなどの他のベクター）に組み込まれる場合、そのＡＡＶベクターは、通常「プロベクター」と呼ばれる。プロベクターは、ＡＡＶのパッケージング機能およびＥ４またはｆ６によって提供される必要な補助機能の存在下で、複製およびキャプシド形成によって「救済」される。
【００４２】
本発明で使用されるように、用語「ＣＡＰ遺伝子」または「ＡＡＶ ＣＡＰ遺伝子」は、ＣＡＰタンパク質をコードする遺伝子を指す。本明細書で使用される用語「ＣＡＰタンパク質」は、野生型ＡＡＶ（ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３）のＣＡＰタンパク質の少なくとも１つの機能的活性の活性を有するポリペプチドを指す。ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３タンパク質の機能的活性の例は、キャプシドの形成を誘発する能力、一本鎖ＤＮＡの蓄積を促進すること、キャプシド中のＡＡＶ ＤＮＡのパッケージングを促進すること（すなわちキャプシド化）、細胞受容体に結合すること、およびビリオンの宿主への侵入を促進することを含む。
【００４３】
本発明で使用されるように、用語「キャプシド」は、ウイルスゲノムがパッケージングされている構造を指す。キャプシドは、ＣＡＰタンパク質の構造サブユニットを有するオリゴマー構造からなる。例えば、ＡＡＶは、３つのキャプシドタンパク質：ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の相互作用によって形成された二十面体キャプシドを有する。
【００４４】
本明細書で使用されるように、用語「細胞組成物」は、本発明の細胞と、少なくとも１つの他の成分とを含む複合型材料を指す。組成物は、単一製剤として製剤化されることもできるし、または各成分の別々の製剤として提供することもできる。これは、併用製剤として、組み合わせ使用のために組み合わせられる。組成物は、各成分が個別に処方され、包装されているパーツキットである。
【００４５】
本発明で使用されるように、用語「構成的プロモーター」は、プロモーターを指す。このプロモーターの活性は、細胞の環境条件および外部条件をほとんどまたは全く考慮せずに、生命体のいたるところで、または、ほとんどの実験段階の間、比較的一定レベルに維持される。
【００４６】
本明細書中で使用される場合、用語「発現カセット」とは、核酸の一連の特定の要素を有し、組換えまたは合成によって生成される核酸の構築物をいう。これは、標的細胞において、特定の核酸の転写を可能にする。
【００４７】
本明細書中で使用される場合、用語「ヘルパー機能を提供する遺伝子」とは、ＡＡＶが複製に依存している機能（すなわち、「ヘルパー機能」）を実行するポリペプチドをコードする遺伝子をいう。補助機能は、ＡＡＶ複製に必要な機能を含む。これは、ＡＡＶ遺伝子転写の活性化、ＡＡＶ ｍＲＮＡの特異的スプライシング工程、ＡＡＶ ＤＮＡの複製、ＣＡＰ生成物の合成、およびＡＡＶキャプシドの集合に関与するフラグメントを含む。アクセサリーウイルス機能は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、およびワクシニアウイルスなどの任意の公知のヘルパーウイルスに由来する。補助機能としては、限定されないが、ＷＨＶレンチウイルスが挙げられる。
【００４８】
本明細書中で使用される場合、用語「局所的に投与される」とは、本発明のポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチド、および／または薬学的組成物が特定の部位またはその近くで、被験体に投与されることを意味する。
【００４９】
本明細書において、用語「薬学的に許容される担体」、「薬学的に許容される希釈剤」、「薬学的に許容される賦形剤」または「薬学的に許容されるビヒクル」は、交換可能であり、無毒性、半固体または液体充填剤、希釈剤またはカプセル化材料、または任意の従来型のための補助配合物を指す。薬学的に許容される担体は、投与量および濃度で使用される受容体に対して本質的に無毒である。そしてそれは、製剤の他の成分と適合性がある。薬学的に許容されるビヒクルの数および性質は、所望の投与形態に依存する。薬学的に許容される担体は、公知であり、当該分野で周知の方法により調製される。（２４）
【００５０】
本明細書中で使用される場合、用語「プロモーター」は、核酸をいう。その核酸は、１つ以上のポリヌクレオチドの転写を制御するように働き、ポリヌクレオチド配列の上流に位置し、そして、ＤＮＡ依存性ＲＮＡ−ポリメラーゼ結合部位、転写開始部位、および他の任意のＤＮＡ配列（転写因子結合部位、リプレッサー、アクチベータータンパク質結合部位、ならびにプロモーターからの転写量を調節するために当技術分野で直接的または間接的に知られている他の任意のヌクレオチド配列を含むがこれらに限定されない）の存在によって、構造的に同定される。「組織特異的」プロモーターは、ある種の分化細胞または組織においてのみ活性化される。
【００５１】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドをそれぞれ含む、核酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかをいう。核酸は、二本鎖、一本鎖であってもよく、または二本鎖もしくは一本鎖配列のいずれかの部分を含む。用語「ポリヌクレオチド」は、特に限定されないが、ポリペプチドをコードする能力を有する核酸配列、および細胞の内因性ポリヌクレオチドに部分的または全体的に相補的な核酸配列、またはそれらと処置される対象を含む。その結果、その転写後に、それは、内在性ポリヌクレオチドの発現をハイブリダイズしそしてその発現を阻害することができるＲＮＡ分子（例えば、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ）を生成する。
【００５２】
本明細書において、用語「ストランド」は、連続したヌクレオチドの配列（修飾天然ヌクレオチドまたは非天然ヌクレオチドを含むか含まない）を指す。２本以上のストランドは、別々の分子であるか、またはその一部を形成することができ、または例えばポリエチレングリコールなどのリンカーなどのカップリングによって共有結合的に相互接続して、分子を形成することができる。少なくとも１つの鎖は、標的ＲＮＡに対して十分に相補的な領域を含み得る。
【００５３】
本明細書中で使用される場合、用語「組換えウイルスゲノム」は、野生型ＡＡＶゲノムにおける発現に対して、外来性の少なくとも１つのポリヌクレオチドカセットが挿入されているＡＡＶゲノムをいう。
【００５４】
本明細書中で使用される場合、用語「ｒｅｐ遺伝子」または「ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子」は、Ｒｅｐタンパク質をコードする遺伝子をいう。本明細書で使用される用語「Ｒｅｐタンパク質」は、ＡＡＶ天然ｒｅｐタンパク質（例えば、Ｒｅｐ４０、５２、６８、７８）の少なくとも１つの機能的活性を有するポリペプチドを指す。Ｒｅｐタンパク質（例えばＲｅｐ４０、５２、６８、７８）の「機能的活性」は、タンパク質の生理学的機能に関連する任意の活性（認識、結合、およびＡＡＶ ＤＮＡ複製起点の切断によるＤＮＡ複製の促進を含む）、ならびにＤＮＡヘリカーゼ活性である。さらなる機能としては、ＡＡＶ（または他の異種）転写プロモーターの調節、および宿主染色体へのＡＡＶ ＤＮＡの部位特異的組み込みが挙げられる。
【００５５】
本明細書中で使用される場合、用語「被験体」は、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、チンパンジーまたは他のサルおよびサルの種）、動物（例えば、鳥、魚、牛、羊、豚、山羊、馬）、哺乳動物（例：犬や猫）、実験動物（例えば、マウス、ラット、サイレント遺伝子を持つマウス（ノックアウトマウス）、遺伝子を過剰発現するマウス（トランスジェニックマウス）およびモルモットなどの齧歯動物）などの個体、植物、哺乳動物または動物をいう。この用語は、特定の年齢や性別を表すものではない。用語「被験体」は、胚および胎児を含む。
【００５６】
本明細書中で使用される場合、用語「全身投与される」および「全身投与」は、本発明のポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチド、または薬学的組成物が非局所化形態で被験体に投与されることを意味する。本発明のポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチド、または医薬組成物の全身投与は、被験体の体中のさまざまな器官または組織に到達するか、または、被験体の新たな特定の組織または器官に到達することができる。例えば、本発明の医薬組成物の静脈内投与は、被験体中の複数の組織または器官における形質導入をもたらす。本発明に関して、それはまた、全身的に作用する本発明のポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチドまたは医薬組成物が、ニューロン神経細胞とまたはそれに近接して、または、非ニューロン神経細胞とまたはそれに近接して、細胞内または細胞外で作用することを意味する。
【００５７】
本明細書中で使用される場合、用語「形質導入」は、外来ヌクレオチドの配列がウイルスによって細胞内に導入されるプロセスをいう。
【００５８】
本明細書中で使用される場合、用語「トランスフェクション」は、レシピエント真核細胞へのＤＮＡの導入をいう。
【００５９】
本明細書中で使用される場合、用語「ベクター」は、宿主細胞において、１つ以上の目的のポリヌクレオチドを送達することができ、そして場合により発現することができる構築物をいう。ベクターの例としては、特に限定されないが、ウイルスベクター、ＤＮＡまたは裸のＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミドまたはファージベクター、カチオン性縮合剤と会合したＲＮＡまたはＤＮＡ発現ベクター、リポソームに封入されたＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、およびプロデューサー細胞などの真核細胞などが挙げられる。ベクターは、安定であり、自己複製する。使用できるベクターの種類に関して、制限はない。ベクターは、増殖に適し、ポリヌクレオチド、遺伝子構築物、または様々な異種生物に組み込まれた発現ベクターを得るのに適したクローニングベクターである。適切なベクターには、原核生物発現ベクター、ファージおよびシャトルベクター、ならびにウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ならびにレトロウイルスおよびレンチウイルス）に基づく真核生物発現ベクター、ならびに非ウイルスベクターが含まれる。
【００６０】
本明細書中で使用される場合、用語「ＤＡＲＰＰ」は、ｍＨｔｔの発現によって影響を受ける主要なニューロンである中型有棘ニューロン（ＭＳＮ）のマーカーとして使用されるドーパミン調節リンタンパク質である。その発現は、生存能力マーカーとして用いられる。
【００６１】
本明細書中で使用される用語ＩＧＦ２は、それ自体がＩＧＦ２ポリペプチドを指すが、ＨＡエピトープに結合した変異体も指す。
【００６２】
本発明の方法および組成物、例えば、インサートＩＧＦ２−ＨＡまたは単にＩＧＦ２を有するＡＡＶの方法および組成物は、本発明に記載の任意の投与量および／または製剤と共に、ならびに、本発明に記載の任意の投与経路で使用される。
【００６３】
用語「ハンチントン病の改善」は、本発明で定義されるように、精神医学的、行動的、および運動的症状の改善、ならびに、異なる種および／または対象におけるハンチンチン凝集体の減少を指す。
【００６４】
用語「ｃＤＮＡ」または「相補的ＤＮＡ」は、それがＲＴ―ＰＣＲによって合成されるＲＮＡに完全に相補的なＤＮＡ配列を指す。
【００６５】
本明細書中で使用される場合、用語「相補的」は、安定で特異的な結合が化合物と標的ＲＮＡ分子との間で生じる十分な程度の相補性を示すために使用される。特異的結合は、特異的結合が望まれる条件下、すなわち、インビボアッセイまたは治療的処置の場合における生理学的条件下、あるいはアッセイが行われた条件下のインビトロアッセイの場合における生理学的条件下で、非標的配列へのオリゴマー化合物の非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性を必要とする。
【００６６】
リガンド
【００６７】
薬理学的性質を含むウイルスの性質は、例えば、リガンドの導入によって、影響を受け、調整される。さらに、ウイルス剤の薬理学的性質は、薬剤およびウイルスの製剤中にリガンドを組み込むことによって増強される。
【００６８】
リガンドは、例えばウイルス剤に結合するリガンド、または、例えばリガンド結合モノマーサブユニットのビヒクルとの結合体もしくは製剤添加物として使用することができるリガンドなど、多種多様な実在物に結合することができる。実施例は、リガンド結合モノマーサブユニットの文脈で以下に記載されるが、それは単に好ましいものであり、実在物は他の点でウイルスと結合される。
【００６９】
リガンドは、それが組み込まれているウイルス剤の分布、方向、または寿命を変える。好ましい実施形態では、リガンドは、例えば、この配位子が存在しない種と比較して、選択された標的、例えば、分子、細胞、または細胞型、コンパートメント、例えば、細胞または器官コンパートメント、組織、または身体の領域に対してより優れた親和性を提供する。
【００７０】
リガンドは、本発明の場合、ウイルスの標的分子の輸送、ハイブリダイゼーション、および特異性を改善することができる。
【００７１】
リガンドは、一般に、例えば、個体における分子の吸収を改善するために治療修飾剤、例えば、分布を監視するための診断化合物またはレポーターグループ、架橋剤、免疫反応に対する耐性を付与する部分、および、天然または異常な核酸塩基を含む。
【００７２】
一般的な例としては、親油性分子、脂質、レクチン（例えば、ヘシゲニン、ジオスゲニン）、テルペン（例えば、トリテルペン、例えば、サルササポゲニン、フレデリン、エピフリデラノール誘導体化リトコール酸）、ビタミン、炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、合成ポリマー［例えば、オリゴ乳酸１５量体］および天然ポリマー［例えば、低分子量および中分子量を有する］、イヌリン、シクロデキストリン、またはヒアルロン酸）、タンパク質、タンパク質結合剤、インテグリン標的分子、ポリカチオン、ペプチド、ポリアミン、およびペプチド模倣物などが挙げられる。他の例には、上皮細胞またはトランスフェリンなどの葉酸受容体リガンドが含まれる。
【００７３】
リガンドは、合成ポリマー、例えば、合成ポリアミノ酸などの天然の組換え合成形態で示される分子である。ポリアミノ酸の例には、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）、ポリ−Ｌ−アスパラギン酸、ポリ−Ｌ−グルタミン酸、スチレン−無水マレイン酸コポリマー、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）コポリマー、ジビニルエーテル−無水マレイン酸、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＭＰＡ）コポリマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−エチルアクリル酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマー、またはポリホスファジンなどが含まれる。ポリアミンの例には、ポリエチレンイミン、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、シュードペプチド−ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性部分、例えば、チオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの第四級塩、またはアルファヘリックスペプチドなどが含まれる。
【００７４】
リガンドはまた、標的化グループ、例えば、細胞または組織への標的化剤、例えば、チロトロピン、メラノトロピン、界面活性剤プロテインＡ、ムチン炭水化物、グリコシル化ポリアミノ酸、ビスホスホネート、ポリグルタメート、ポリアスパラギン酸、またはＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチド、またはＲＧＤペプチド模倣物を含む。
【００７５】
リガンドは、タンパク質、例えば、糖タンパク、リポタンパク質、例えば、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）またはアルブミン、例えば、血清アルブミン、またはペプチド、例えば、コリガンドに対して特異的親和性を有する分子、または抗体、例えば、特定の細胞型に結合する抗体などである。リガンドは、ホルモンおよびホルモン受容体も含む。それらはまた、補因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、多価マンノース、または多価フコースなどの非ペプチド種を含む。
【００７６】
リガンドは、基質、例えば、細胞の細胞骨格を変化させることにより、例えば、微小管、マイクロフィラメント、および／または細胞のフィラメント中間体を変化させることにより、例えば、細胞内のウイルス剤の吸収を増大させることができる薬剤である。
【００７７】
一態様では、リガンドは、脂質、または脂質ベースの分子である。この脂質またはこの脂質ベースの分子は、好ましくは、乳清タンパク質、例えば、血清アルブミンに結合される。
【００７８】
別の実施形態では、以前に命名されたものに、ウイルスが詰め込まれる。
【００７９】
ウイルスの注射用溶液は、必要な濃度のウイルスをＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）で希釈することによって調製される。その処方は、以下の通りである。
【００８０】
ＰＢＳ １倍
１．以下の物質を含む８００ｍｌの蒸留水にウイルス用量を溶解する。
８ｇのＮａＣｌ
０．２ｇのＫＣｌ
１．４４ｇのＮａ２ＨＰＯ４
０．２４ｇのＫＨ２ＰＯ４
２．ＨＣｌでｐＨを７．４に調整する。
３．追加の蒸留水Ｈ２Ｏを用いて容量を１Ｌに調整する。
４．滅菌してオートクレーブに入れる。
【００８１】
デザインと選択
【００８２】
ハンチンチンの変異型の発現を制御することは、ハンチントン病を改善または治療するための鍵となる。
【００８３】
細胞内には、誤って折り畳まれたタンパク質を分解することができるいくつかのメカニズムがある。これは、ＥＲおよびオートファジーに関連する分解を含む。しかしながら、特定のタンパク質を選択的に分解することは非常に難しい。それにもかかわらず、今日までに行われた研究は、ＩＧＦ２が何らかの方法でハンチンチンの発現を減少させることができ、従って、その毒性機能を減少させることを示している。
【００８４】
局所タンパク質合成の調節を必要とすることに加えて、ハンチントン病の寛解または治療は、様々な膜受容体およびイオンチャネルの合成および輸送、カルシウムシグナル伝達の増加、膜の合成、およびタンパク質複合体の集合を含む分泌経路における他の側面を含む。しかしながら、ＩＧＦ２の独特の機能は、線条体および皮質において、優先的に見つかったが、排他的には見つからなかった。
【００８５】
本明細書に記載の適用例は、ＩＧＦ２がｍＨｔｔの発現を減少させ、ニューロンの生存能力を増加させるという証拠を提供する。これは、ハンチントン病の発症を遅らせる。
【００８６】
治療としてのその使用の生物医学的範囲を分析するとき、効果的かつ革新的な方法がハンチントン病を改善または治療するために提供された。この技術の使用は、その用途において驚くべき結果を生み出している。
【００８７】
実験的には、ＨＤとの関連でＩＧＦ２を過剰発現させると、ポリグルタミンペプチドの凝集体、ならびに変異型ハンチンチンが劇的に減少することが報告されている。加えて、神経保護効果が観察され、中型有棘ニューロンの生存率が増加した。
【００８８】
ＨＤモデルを用いた以前の研究は、ＣＮＳニューロンにおける転写因子ＸＢＰ１の欠乏がこの疾患において神経保護効果を有し、凝集体の量を減少させ、そして、ニューロン生存能力を改善すると結論付けた。（これは、用途の例で見られる）。
【００８９】
神経系のＸＢＰ１欠損を有する動物で観察された保護効果の根底にある可能性のあるメカニズムを定義するために、グローバルプロファイル分析は、ハンチントンモデルＹＡＣ １２８を使用するＨＤの状況において、ＸＢＰ１欠損マウスの線条体および大脳皮質を含む、５３匹の動物の遺伝子発現に関して行われた。この研究から、図１／１９に見られるように、ＩＧＦ２が遺伝子として得られた。その発現は、ＸＢＰ１欠失によって最も影響を受けた。さらに、これは、ＸＢＰ１欠損マウスのｍＲＮＡが配列決定された、並行して行われた研究と一致した唯一のものであった。
【００９０】
これらの結果は、ｑＰＣＲ（定量的ＰＣＲ）によって、ＸＢＰ１欠損マウスの脳の異なる領域におけるＩｇｆ２のレベルを測定することによって確認された。図２／１９にそれぞれ示すように、内因性レベルのＩｇｆ２ ｍＲＮＡが皮質および線条体において有意に増加することが観察された。これらのデータは、ＩＧＦ２が何らかの方法で、ＸＢＰ１ ＫＯマウスで観察された防御に関与していることを示している。
【００９１】
ＨＤへのＩＧＦ２の寄与を研究するために、ニューロ２ａ細胞において、ＧＦＰと融合したポリＱ７９ペプチドを一時的に発現する細胞モデルにおいてその活性を調べた。ニューロ２ａ細胞におけるＩＧＦ２とポリＱ７９−ＧＦＰの同時発現は、蛍光画像、ウエスタンブロットおよびフィルタートラップを含む３つの異なる方法論の評価、大きなサイズの凝集体を評価することを可能にする技術（図３／１９、４／１９、５／１９）に従って、タンパク質封入体および凝集体の数を劇的に減少させた。
【００９２】
次に、観察された効果が分泌されたＩＧＦ２またはその細胞内蓄積によるものであるかどうかを試験した。したがって、ペプチドポリＱ７９またはｍＨＴＴＱ８５−ＧＦＰは、ＩＧＦ２を豊富に含む培地の存在下で、ニューロ２ａ細胞に発現された。一貫して、ＩＧＦ２は、ポリＱと、ｍＨｔｔとの凝集体を減少させた（図６／１９および７／１９）。
【００９３】
一方、ＩＧＦ２が既存のｍＨｔｔ凝集体を「元に戻す」ことができたかどうかを決定した。この目的のために、ポリＱ７９−ＧＦＰまたはＧＦＰ−ｍＨＴＴＱ８５を既に発現するニューロ２ａ細胞をＩＧＦ２リッチ培地で処理した。以前の実験シナリオで観察されたように、ＩＧＦ２は、両方の実験パラメーターにおいて、タンパク質凝集体を有意に減少させた（図８／１９、９／１９）。
【００９４】
全体として、以前に得られた結果は、細胞培養アッセイにおいて、強力な抗凝集効果を実証している。
【００９５】
現在の開発の自然な継続は、ＡＡＶ２／２型のアデノ随伴ウイルスを用いた、インビボでの予備実験の実施である（２６）。このウイルスの配列内で、ＨＡエピトープで標識されたＩＧＦ２のバージョンは、ペプチドの発現をよりよく検出するためにクローニングされた。第一のアプローチでは、ｍＨｔｔを発現するウイルス粒子をＩＧＦ２の存在下または非存在下で注射した。２週間後、これらの動物の線条体を分析したところ、図１０／１９に示すように、変異型ハンチンチン発現レベルの低下が観察された。
【００９６】
より生理学的なアプローチでは、変異型ヒトハンチンチンを発現するトランスジェニック動物（ＹＡＣ１２８モデル）を治療した。１〜２日齢の新生児動物にＡＡＶ−ＩＧＦ２／ＨＡを脳室内注射した。６ヶ月後、動物を屠殺して、組織を得た。ＡＡＶで処置した後、図１１／１９に示すように、対照条件に対して、ＩＧＦ２／ＨＡを注射した動物において、ｍＨｔｔ発現の顕著な減少が観察された。同様に、成人も治療された。これらの動物に３ヶ月齢でＡＡＶ−ＩＧＦ２／ＨＡを注射し、６ヶ月齢で屠殺して組織を得た。図１２／１９に見られるように、ＩＧＦ２／ＨＡによる処置は、対照条件と比較して、ｍＨｔｔ発現レベルを減少させた。
【００９７】
また、前記研究内で、図１３／１９に示すように、ＩＧＦ２で修飾されたＡＡＶに曝露されたＨＤを有するマウスにおいて、運動改善を検証するためにいくつかの研究が行われた。
【００９８】
一方、ＨＤ患者および対照個体からの尾状核／被殻のタンパク質抽出物中のＩＧＦ２レベルを測定する実験を行った。結果は、ＨＤ患者では、ＩＧＦ２の含有量がほとんど発現されないことを示した。これは、病理学の発達において、その意味を示唆している。この特許で提案されていることによれば、図１９／１９に示すように、本特許は、ＩＧＦ２の生理学的レベルの回復も達成し、疾患の症状を改善すると我々は考えている。
【００９９】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の発生に関して、それは、目的のポリヌクレオチドに作動可能に結合された海馬組織−特異的転写調節領域を含む発現カセットを含むウイルス組換えゲノムを含む。
【０１００】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、一般に、４２個の血清型に対応し、パルボウイルスに由来する。一般に、異なるＡＡＶ血清型は、アミノ酸および核酸レベルで有意な相同性を有するゲノム配列である。それらは、同一の遺伝機能を提供し、機能的および物理的用語において本質的に同一の振動を提供し、そして、それらの複製および集合は実際上同じメカニズムを使用する。
【０１０１】
特に、表Ｉに示すように、アクセス番号Ｊ０１９０１．１を有するＡＡＶ血清型２／２（ＡＡＶ２／２）を本発明において使用した。
【０１０２】
本発明によるＡＡＶゲノムは、シス５’アクチュエータおよび３’で逆方向末端反復配列、ならびに発現カセットを含む。ＩＴＲまたはＬＴＲ配列は、１４１塩基対の長さである。好ましくは、ＬＴＲの全配列は分子中で使用され、そして配列のわずかな修飾のみが許容される。本発明の好ましい態様において、ＡＡＶ組換えゲノムは、５’および３’ＡＡＶ ＬＴＲを含む。
【０１０３】
一方、ＩＴＲは、他のＡＡＶ血清型に由来する。
【０１０４】
本発明のＡＡＶは、任意の血清型のキャプシドを含む。特に、本発明においては、血清型２由来のキャプシドが好ましい。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、本発明の方法で使用するためのＡＡＶキャップは、ＡＡＶキャップの１つまたはそのコード核酸の突然変異誘発（すなわち挿入、欠失、または置換）によって生成される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶキャップは、前記ＡＡＶキャップと同様に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％以上である。
【０１０６】
いくつかの態様において、ＡＡＶキャップは、キメラである。それは、２、３、４、またはそれ以上の前記ＡＡＶキャップのドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶキャップは、単量体ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３のモザイクであり、２つまたは３つの異なるＡＡＶまたは組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）に由来する。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ組成物は、２つ以上の前述のＣＡＰＳを含む。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ組成物に使用するためのＡＡＶ ＣＡＰは、異種配列または他の修飾を含むように設計されている。例えば、選択的標的化または免疫回避を付与するペプチドまたはタンパク質配列は、遺伝子操作によってＣａｐタンパク質に修飾される。あるいは、またはさらに、キャップは、ｒＡＡＶの表面が特定の化学修飾物（例えば、ポリエチレングリコールなど）を示すように、化学修飾されることができる。これは、免疫回避を容易にすることができる。Ｃａｐタンパク質は、（例えば、その天然の結合受容体を除去するために、または免疫原性エピトープを隠すために）変異誘発されることもできる。
【０１０８】
一実施形態では、ＡＡＶベクターは、以下の表から選択されるマウス起源のＩｇｆ２またはＩｇｆ２−ＨＡ配列を付加したプロモーターを含む。表ＩＶ（Ｉｇｆ２）および表Ｖ（Ｉｇｆ２−ＨＡ）、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０１０５１４．３、ＮＭ＿００１１２２７３６．２、ＮＭ＿００１１２２７３７．２、ＮＭ＿００１３１５４８８．１、およびＮＭ＿００１３１５４８９．１。これらは、転写変異体１、２、３、４、および５に対応しており、そのタンパク質産物が同一であり、表に示される配列によってコードされる。
【０１０９】
一実施形態では、ＡＡＶベクターは、以下の表から選択されるヒト起源のＩｇｆ２またはＩｇｆ２−ＨＡ配列を付加したプロモーターを含む。表ＶＩＩ（ヒトＩｇｆ２）、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０００６１２．５、ＮＭ＿００１００７１３９．５、ＮＭ＿００１１２７５９８．２、ＮＭ＿００１２９１８６１．２、およびＮＭ＿００１２９１８６２．２。これらは、転写変異体１、２、３、４および５に対応しており、これらのタンパク質産物は同一であり、表に表される配列によってコードされる。
【０１１０】
一実施形態では、ＡＡＶベクターは、表ＩＶから選択される、少なくとも１つのＩｇｆ２配列を付加した真核生物発現プロモーターを含み、表ＩＩに示すような配列を得る。
【０１１１】
一実施形態では、ＡＡＶベクターは、表Ｖから選択される少なくとも１つのＩｇｆ２―ｈａ配列を付加した真核生物発現プロモーターを含み、表ＩＩＩに示されるような配列を得る。
【０１１２】
一実施形態では、ＡＡＶベクターは、少なくとも１つのヒトＩｇｆ２配列を付加した真核生物発現プロモーターを含む。これは、表ＶＩＩから選択される。
【０１１３】
一実施形態では、ＡＡＶベクターは、前述のリスト、表ＩＩおよび表ＩＩＩから選択される配列に対して、８５％の相同性を有する少なくとも１つの配列を付加したプロモーターを含有する。
【０１１４】
一実施形態では、ＡＡＶベクターは、前述の表から選択される配列に対して、７０％の相同性を有する少なくとも１つの配列を付加したプロモーターを含む。
【０１１５】
一実施形態では、ＡＡＶベクターは、前述の表から選択される配列と機能的に等価である少なくとも１つの配列を付加したプロモーターを含む。
【０１１６】
転写調節領域は、プロモーター、および必要に応じてエンハンサー領域を含む。好ましくは、プロモーターは、真核生物遺伝子発現プロモーターであり、以下のリストから選択される。とりわけ、ＣＡＧ（ＣＡＧは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時型エンハンサーエレメント、プロモーター、第１エクソン、およびニワトリベータアクチン遺伝子の第１イントロンに対応する配列を含むプロモーター、ならびに、ウサギベータグロビン遺伝子のスプライシング受容体である）、ＣＭＶ、ｂグロビン、ＣＢＡ、ｅｌＦアルファなどがある。エンハンサーは、神経組織に特異的である必要はない。
【０１１７】
一実施形態では、プロモーターは、特異的であり、サイトメガロウイルスまたはＣＭＶプロモーターである。
【０１１８】
一実施形態では、プロモーターは、特異的であり、ｂ−グロビンである。
一実施形態では、プロモーターは、特異的であり、ＣＡＧである。
一実施形態では、プロモーターは、特異的であり、ｅｌＦアルファとしても知られているヒト伸長因子−１アルファである。
【０１１９】
別の実施形態では、本発明のＡＡＶの一部を形成する発現カセットは、転写後調節領域をさらに含む。好ましい実施形態では、転写後調節領域は、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後領域（ＷＰＲＥ）または機能的変異体およびそのフラグメント、ならびにＰＰＴ―ＣＴＳまたは機能的変異体およびそのフラグメント自体である。特定の実施形態では、転写後調節領域は、ＷＰＲＥである。
【０１２０】
本発明によるＡＡＶの一部を形成する発現カセットは、「目的のポリヌクレオチド」を含む。好ましい態様において、目的のポリヌクレオチドは、全身的に作用するタンパク質をコードする。別の実施形態では、目的のポリヌクレオチドは、ニューロン内で作用するタンパク質をコードする。好ましい実施形態では、前記ニューロン内で作用するタンパク質は、ＩＧＦ２であり、細胞内位置が異なるその任意のアイソフォーム、および任意のエピトープで標識された任意のアイソフォームを含む。
【０１２１】
ＡＡＶベクターのパッケージングサイズ制限は、野生型ＡＡＶゲノムのサイズに制限される。これは、ＡＡＶ血清型に従ってサイズが異なる（すなわち、４０８７〜４７６７の間）。例えば、野生型ＡＡＶ−２は、およそ４．７ｋＢのゲノムサイズを有する。いくつかの実施形態において、組換えＲＮＡベクターのクローニング能力は制限され、所望のコード配列は、４．８キロベースのウイルスゲノムの完全な置換を含む。したがって、いくつかの場合、大型の遺伝子は、標準的な組換えＡＡＶベクターでの使用には適していない。当業者であれば、限られたコード化能力を克服するための選択肢が利用可能であることを理解する。例えば、２つのゲノムのＡＡＶ ＩＲＴは、ハイブリダイズして、ヘッドトゥテイルコンカテマーを形成する。これは、ベクターの容量をほぼ２倍にする。スプライス部位の挿入は、転写後のＩＴＲの除去を可能にする。限定されたクローニング容量を克服するための他の選択肢は、当業者には明らかである。
【０１２２】
投与経路
【０１２３】
ウイルスの投与経路は、血液脳関門を通過して、標的ニューロンに感染する。
この目的を達成するために、２つの投与経路が本発明において定義されている。
【０１２４】
これらの経路の最初のものは鼻（２７）である。通常、鼻経路で投与された薬は、血液を全身循環に進入させることができ、脳に直接浸透させることができ、または、場合によっては両方の経路をたどることができる。しかしながら、これらの経路のそれぞれを通る薬物の流れを制御する要因の多くは、完全には定義されていない。一般に、鼻腔内に投与された薬物が移動することができる３つの経路がある。これらの経路（２７）は、鼻粘膜（２８）を介した体循環への直接進入、ニューロンを介した軸索輸送による嗅球への進入、および脳への直接進入（２９）を含む。様々なモデル基質に対するこれらの経路のそれぞれの役割を裏付ける証拠を、異なる種類のウイルスについて以下に要約する。
【０１２５】
2020501613.tif 000003
【０１２６】
この表は、本質的に網羅的なものであることを意図していない。むしろ、さまざまなクラスの溶質のいくつかは、１つ以上の経路をたどることを示しているものを強調することを意図している。
【０１２７】
ＣＮＳ細胞への他の投与経路は（２８）は、次のことを含む。
眼の硝子体液のような流動性空間への直接注射、あるいは、脈絡叢、上衣／髄膜層への送達のために、そこからこれらの層内に広がるプロセスを介して隣接する脳への、異なる経路（脳室内または髄腔内（＊＊））を経由した脳脊髄液への直接注射、一時的な浸透圧または薬理学的破壊と組み合わされた動脈内注射によって血液脳関門または血液腫瘍関門を通過する経路などである。
【０１２８】
用語（＊＊）髄腔内（intra + teca、「鞘内」）は、鞘内の解剖学的空間または潜在的な空間、最も一般的には、脳のくも膜または脊髄に発生するまたは導入されるものを指す形容詞である。
【０１２９】
線量計算
Ulusoy et al（２９）によると、ベクターの滴定は、１０１０〜１０１２ ｇｃ／ｍｌの試験用量で、１ ｍｌあたり１０９〜１０１３コピーのゲノム（ＣＧ）の範囲を必要とする。他方、滴定するためのベクターの希釈率がどのようなものであっても、それらは、１０１１ ｇｃ／ｍｌの低い中程度の範囲を持たなければならない。これは、毒性の消失をもたらす。
【０１３０】
ヒトへの投与量
ヒトにおける用量範囲は、１０９〜１０３０ウイルス単位／体重ｋｇの範囲にある。これは、この範囲を異なる年齢群における適用に制限することなく、または年齢または病理学によって改変された分布量を伴う。
【０１３１】
物質の最大濃度またはレベルは、実験または観察により見出され、定義された暴露条件下で、標的生物の、形態、機能的能力、成長、発達または寿命に検出可能な有害な変化を引き起こさず、同一の種および系統の通常の（対照）生物で観察されるものと区別できる。
【０１３２】
適用方法
先端直径が約６０〜８０ミクロンのガラスキャピラリーを備えた５μｌハミルトンシリンジを用いて、ｒＡＡＶ２ベクターを線条体に両側注射した。適切な濃度のウイルス粒子を含有する２マイクロリットルの緩衝液を０．４μｌ／分の速度で注入した。注射をしてから５分後に針をゆっくり抜く。
【図面の簡単な説明】
【０１３３】
図１／１９
この図は、優れた遺伝子のセットを表す。その遺伝子の発現は、ＨＤとの関連でＸＢＰ１欠損動物において行われた遺伝子発現の研究において変動した。ＩｇＦ２、Ｍｍｐ１４、Ｌｒｐ４、およびＵｈｒｆのレベルは、ＸＢＰ１欠損同腹子および対照動物において、ヒト変異ハンチンチン（ＹＡＣ１２８）を有するトランスジェニックマウスにおいて、皮質および線条体の両方の異なる群において変化した。
Ｉｇｆ２遺伝子の上方調節は、皮質および線条体の両方において明らかに見られる。
【０１３４】
図２／１９
図１／１９に示された研究において得られた結果は、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって確認された。この図は、左側に皮質の結果を、右側に線条体の結果を示し、それらの脳におけるＸＢＰ１欠損マウスモデルにおけるＩｇｆ２ ｍＲＮＡの上方調節を示している。この技術により、内因性Ｉｇｆ２ ｍＲＮＡレベルがＸＢＰ１欠損動物の皮質および線条体において有意に増加することが観察された。
全てのインビボ実験について、ｎ＝５、ｔ−スチューデント＊＊ｐ＜０．０５を用いた。
【０１３５】
図３／１９
この図は、ハンチントン病のニューロ２ａ細胞モデルにおいて、ＩＧＦ２の発現がｍＨＴＴ凝集体のレベルをどのように低下させるかを示している。
特に、ニューロ２ａ細胞をポリＱ７９−ＥＧＦＰおよびＩＧＦ２または対照用のベクターで一過性にトランスフェクトした。続いて、ポリＱの凝集体を評価し、定量した。
この図は、トランスフェクションの２４および４８時間後の、蛍光顕微鏡による写真およびその右側に蛍光の定量化を表す。
全てのインビボ実験について、ｎ＝３、ｔ−スチューデント＊＊＊ｐ＜０．００１を使用した。
【０１３６】
図４／１９
この図は、ハンチントン病についてのニューロ２ａ細胞モデルにおいて、ＩＧＦ２発現がどのようにポリＱペプチド凝集体のレベルを低下させるかを示す。
特に、ニューロ２ａ細胞をポリＱ７９−ＥＧＦＰおよびＩＧＦ２または対照用のベクターで一過性にトランスフェクトした。続いて、ポリＱの凝集体を評価し、定量した。
この図は、トランスフェクションの２４および４８時間後のウエスタンブロットの写真およびその右側に定量化を示す。
全てのインビボ実験について、ｎ＝３、ｔ−スチューデント＊＊＊ｐ＜０．００１を使用した。
【０１３７】
図５／１９
この図は、ハンチントン病についてのニューロ２ａ細胞モデルにおいて、ＩＧＦ２発現がどのようにポリＱペプチド凝集体のレベルを低下させるかを示す。
特に、ニューロ２ａ細胞をポリＱ７９−ＥＧＦＰおよびＩＧＦ２または対照用のベクターで一過性にトランスフェクトした。続いて、ポリＱの凝集体を評価し、定量した。
この図は、トランスフェクションの２４および４８時間後のフィルタートラップの写真およびその右側に定量化を示す。
全てのインビボ実験について、ｎ＝３、ｔ−スチューデント＊＊＊ｐ＜０．００１を使用した。
【０１３８】
図６／１９
この図は、ハンチントン病のニューロ２ａ細胞モデルにおいて、ＩＧＦ２の発現がｍＨＴＴ凝集体のレベルをどのように低下させるかを示す。
特に、ニューロ２ａ細胞を、ＩＧＦ２富化培地または対照の存在下で、ポリＱ７９−ＥＧＦＰ、ｍＨＴＴＱ８５−ＧＦＰ用のベクターで一過性にトランスフェクトした。タンパク質凝集を２４時間後に評価および定量した。
この図は、トランスフェクションの２４時間後の蛍光顕微鏡による写真およびその右側にその蛍光の定量化を示す。
全てのインビトロ実験について、ｎ＝３、ｔ−スチューデント＊＊＊ｐ＜０．００１を使用した。
【０１３９】
図７／１９
この図は、ハンチントン病のニューロ２ａ細胞モデルにおいて、ＩＧＦ２の発現がｍＨＴＴ凝集体のレベルをどのように低下させるかを示す。
特に、ニューロ２ａ細胞を、ＩＧＦ２富化培地または対照の存在下で、ポリＱ７９−ＥＧＦＰ、ｍＨＴＴＱ８５−ＧＦＰ用のベクターで一過性にトランスフェクトした。タンパク質凝集を２４時間後に評価および定量した。
この図は、トランスフェクションの２４時間後のウエスタンブロットによる写真およびその右側に定量化を示す。
全てのインビトロ実験について、ｎ＝３、ｔ−スチューデント＊＊＊ｐ＜０．００１を使用した。
【０１４０】
図８／１９
この図は、ハンチントン病のニューロ２ａ細胞モデルにおいて、ＩＧＦ２の発現がｍＨＴＴ凝集体のレベルをどのように低下させるかを示す。
特に、ＩＧＦ２がポリＱまたはｍＨＴＴＱ８５−ＧＦＰの以前に形成された含有物を減少させることができたかどうかを試験するために、検出可能な含有物を発現する細胞をＩＧＦ２富化培地または対照で処理した。タンパク質凝集体を２４時間後に評価および定量した。
この図は、トランスフェクションの２４時間後のウエスタンブロットによる写真およびその右側に定量化を示す。
全てのインビトロ実験について、ｎ＝３、ｔ−スチューデント＊＊＊ｐ＜０．００１を使用した。
【０１４１】
図９／１９
この図は、ハンチントン病のニューロ２ａ細胞モデルにおいて、ＩＧＦ２の発現がｍＨＴＴ凝集体のレベルをどのように低下させるかを示す。
特に、ＩＧＦ２がポリＱまたはｍＨＴＴＱ８５−ＧＦＰの以前に形成された含有物を減少させることができたかどうかを試験するために、検出可能な含有物を発現する細胞をＩＧＦ２富化培地または対照で処理した。タンパク質凝集を２４時間後に評価および定量した。
この図は、トランスフェクションの２４時間後のフィルタートラップの写真およびその右側に定量化を示す。
全てのインビトロ実験について、ｎ＝３、ｔ−スチューデント＊＊＊ｐ＜０．００１を使用した。
【０１４２】
図１０／１９
この図は、ハンチントン病のＹＡＣ１２８マウスモデルにおいて、ＩＧＦ２の発現がｍＨＴＴ凝集体のレベルをどのように低下させるかを示す。
特に、野生動物を、ＩＧＦ２−ＨＡを有するｍＨｔｔのフラグメントまたは対照を発現するＡＡＶと共に、線状体に定位固定法で同時注射した。ｍＨＴＴのタンパク質凝集体を評価し、２週間後に定量した。
この図は、形質導入の２週間後のウエスタンブロットの写真およびその右側に定量化を示す。
全てのインビボ実験について、ｎ＝５、ｔ−スチューデント＊＊ｐ＜０．０５を用いた。
【０１４３】
図１１／１９
この図は、ＡＡＶウイルスからのＩＧＦ２発現がハンチントン病のＹＡＣ１２８マウスモデルにおいてポリＱ凝集体のレベルをどのように減少させるかを示す。
特に、ＩＧＦ２を発現するＡＡＶまたは対照を９０日齢の成体ＹＡＣ１２８マウスの線条体に注射した。注射の３ヶ月後に、ｍＨｔｔ凝集体ならびにＤＡＲＰＰ−３２のレベルを線条体ニューロンの生存能力の反映として評価した。
インビトロで観察されたものと同様の様式で、ｍＨｔｔ発現の減少およびＤＡＲＰＰレベルの増加があった。このタンパク質は、主にハンチントン病によって影響を受けたニューロンの生存率の代表である。したがって、ＤＡＲＰＰが多ければ多いほど、神経細胞死は少なくなると結論付けられる。
全てのインビボ実験について、ｎ＝５、ｔ−スチューデント＊＊ｐ＜０．０５を用いた。
【０１４４】
図１２／１９
この図は、ＡＡＶウイルスからのＩＧＦ２発現がハンチントン病のＹＡＣ１２８マウスモデルにおいてポリＱ凝集体のレベルをどのように減少させるかを示す。
特に、ＩＧＦ２を発現するＡＡＶまたは対照を、１または２日齢のＹＡＣ１２８新生児動物に脳室内注射した。ｍＨｔｔの凝集レベルを注射の６ヶ月後に評価した。インビトロで観察されたものと同様の方法で、ｍＨｔｔ発現の減少が見られた。
【０１４５】
図１３／１９
この図は、ハンチントン病のＹＡＣ１２８マウスモデルにおけるＩＧＦ２の発現が、この疾患によって生じる運動障害をどのようにして是正するかを示している。
特に、運動試験は、ＡＡＶ−ＩＧＦ２／ＨＡまたはＡＡＶ−対照を定位固定により両側注射したＹＡＣ１２８マウスで実施された。記録は、２週間ごとに、２ヶ月間にわたって記録された。この図は、ＡＡＶ２／ＩＧＦ２−ＨＡの影響下でのロータロッド試験に対する経時的挙動グラフを示す。
【０１４６】
図１４／１９
上の図は、新生児マウスの注射位置を示す。
下の図は、成体マウスの線条体にＡＡＶを脳内注射した位置を示す。
【０１４７】
図１５／１９
本図は、ＡＡＶゲノムのスキームを示す。
ＲＥＰ：ＡＡＶ複製メカニズムに関与する遺伝子。
ＶＰ：キャプシド形成と集合に関与する遺伝子。
ＩＴＲ：ＬＴＲ、逆方向末端反復配列と同等である。
【０１４８】
図１６／１９
この図は、表ＩＩに従って、以下の具体的な説明と共に、ＩＧＦ２−ＨＡインサートを有するＡＡＶウイルスベクターを示す。
【０１４９】
図１７／１９
この図は、表ＩＩＩに従って、以下の具体的な説明と共に、ＩＧＦ２インサートを有するＡＡＶウイルスベクターを示す。
【０１５０】
図１８／１９
この図は、生成されたウイルス構築物の発現の確認を示す。この目的のために、ＨＥＫ細胞を異なる構築物でトランスフェクトし、トランスフェクションの２４時間後、ＷＢによって評価されたタンパク質を抗ＩＧＦ２抗体および抗ＨＡ抗体を用いて抽出した。
最後に、プラスミドｐＡＡＶ−ＩＧＦ２およびｐＡＡＶ−ＩＧＦ２−ＨＡをそれぞれトランスフェクトした細胞において、ＩＧＦ２（１７ｋＤａ）およびＩＧＦ２−ＨＡ（１８ｋＤａ）について予想される分子量のバンドが検出された。
【０１５１】
図１９／１９
この図は、ＨＤを有する患者および対照個体を有する患者におけるＩＧＦ２のタンパク質レベルを示す。ＨＤを有する患者では、ＩＧＦ２はほとんど発現されず、病理学の発達への関与を示唆していることが見出された。
左側の図は、ＩＧＦ２についてのウエスタンブロットを有し、右側の図は、ＨＤの患者におけるそのブランドの定量化およびその低い位置のマークを示す。
【実施例】
【０１５２】
実験テスト１
若年成体ＷＴマウスのモデルにおいて、インビボ実験を行った。ＲＦＰおよびＡＡＶ／ＩＧＦ２−ＨＡまたは対照に結合したヒトｍＨｔｔの大きなフラグメント（５８８ｂｉｓ）を発現するＡＡＶ形質転換ウイルスを、脳定位法によって線条体に同時注入した（図１４／１８）。
２週間後、動物を屠殺して、線条体を解剖した。以前のインビトロの結果から予想されるように、ＩＧＦ２投与後に、ｍＨｔｔ凝集体の明らかな減少が観察された（図１０／１８）。
【０１５３】
実験テスト２
ＩＧＦ２治療の有効性を評価するために、それ自身のプロモーターの下で、ヒトｍＨｔｔを発現するより生理学的なモデルを使用した。
この実験的戦略において、ＡＡＶ−ＩＧＦ２による処理は、変異体ハンチンチンのレベルを有意に減少させることが実証された。さらに、ＤＡＲＰＰ３２レベルの増加によって示されるように、より大きなニューロン生存率が観察された（図１１／１８）。
特に、対照と比較して、定位手術により線条体に注射されたＩＧＦ２−ＨＡを発現するＡＡＶが凝集体を減少させる効果を達成し、それにより、ニューロン生存率を改善するかどうかを試験した。
３ヶ月後、ｍＨｔｔ発現およびＤＡＲＰＰ−３２タンパク質発現レベルを評価し、定量した。
ｍＨｔｔ発現の減少およびＤＡＲＰＰレベルの増加がはっきりと観察された。このタンパク質は、ハンチントン病によって主に影響を受けたニューロンの生存率の代表である。したがって、ＤＡＲＰＰが多いほど、神経細胞死は少ないと結論付けられた。
全てのインビボ実験について、少なくとも１つのｎ＝４、ｔ−スチューデント＊＊ｐ＜０．０５を用いた。
【０１５４】
実験テスト３
この実験では、ＡＡＶ−ＩＧＦ２−ＨＡによる治療が、疾患によって引き起こされる運動障害を是正することができるかどうかを研究することを目的とした（図１３／１８）。この目的のために、動物は、ＡＡＶ−ＩＧＦ２−ＨＡまたはＡＡＶ対照と共に、線条体に定位固定法で両側注射された。
３ヶ月間および２週間ごとに、それらは疾患の進行を定量化するために、この運動試験を受けた。ＡＡＶ−ＩＧＦ２−ＨＡで処置した動物は、ＡＡＶ対照で処置したそれらの同胞種よりも優れた運動活性を示すことが観察された。
全てのインビボ実験について、ｎ＝５、ｔ−スチューデント＊＊ｐ＜０．０５を用いた。
【０１５５】
材料および方法
細胞培養
ニューロ２ａ細胞は、マウス神経芽細胞腫に由来し、細胞モデルとして広く使用されている。細胞は、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌグルタミンペニシリン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ中、５％ＣＯ２雰囲気、３７℃で維持された。細胞は、Ｎ２ａの場合に、１０％ＦＢＳ ＤＭＳＯ中で−８０℃で凍結保存される。系統の維持のために、培養フラスコの細胞をトリプシン処理することにより、２〜３日毎に継代を行い、そして、細胞を集め、遠心分離した後、必要に応じて、それらを継代１：３〜１：６で再播種した。
【０１５６】
細胞トランスフェクション
細胞トランスフェクションは、製造業者の説明書に従って、カチオン試薬エフェクテンを用いて実施された。
【０１５７】
動物と手術方法：
成人期に注射したマウスには９０日齢で注射した。新生児状態で注射したマウスに、生後１〜２日目に注射した。実験によれば、野生型マウス（ＷＴ）またはＹＡＣマウスおよびそれらの野生型同胞を対照として使用した。全ての場合において、使用された株はＣ５７ＢＬ／６であった。マウスは、１２：１２時間の明暗周期で飼育され、食物と水に自由にアクセスできた。
本発明の開発において示された全ての動物実験について、チリのチリ大学の動物管理使用委員会によって確立されたガイドラインが使用された。
【０１５８】
ＹＡＣ １２８トランスジェニックマウスの作製
完全なヒトハンチンチン遺伝子を含む酵母人工染色体（ＹＡＣ）から、それをエクソン１中の１２８個のグルタミン反復の拡大で修飾した。得られた構築物、ＹＡＣ１２８をＦＶＢ／Ｎ株の前核に注入した。導入系統番号５３が、トランスジェニック系統として確立された。ｃ５７ＢＬ／６株を得るために、戻し交配を行い、動物のバックグラウンドを保証した。
【０１５９】
イムノブロットまたは「ウエスタンブロット」
場合によっては、総タンパク質の抽出を、Ｎ２ａ細胞の培養物、または野生動物もしくはトランスジェニック動物から解剖した組織から行った。細胞を、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含む１％ＰＢＳ−トリトン緩衝液中に回収した。
試料は、ローディングバッファー中で所望の濃度で調製された。２５〜１００μｇのタンパク質をポリアクリルアミドゲルにロードした。電気泳動は、グリシン電気泳動緩衝液中のミニ−プロテアン３システムで開発された。電気泳動分離の後、ミニトランスブロットシステムを用いて、予めメタノール中で水和し、トランスバッファー緩衝液中で５分間平衡化したＰＶＤＦ膜にタンパク質を転写した。
フィルタートラップアッセイは、１％ＳＤＳ中で調製された同じタンパク質抽出物から実施された。２５〜５０μｇのタンパク質を、孔が０．２２μｍ未満の膜を用いてフィルタートラップ支持体上に負荷した。
【０１６０】
行動テスト
全ての実験は、盲検で行われた。異なる動物コホートは、各行動試験用に使用された。
【０１６１】
ロータロッド
要約すると、マウスは４日間の訓練を受け、その間に、動物はロータロッド、作業および実験者と接触する。５日目に、動物が１２０秒で４〜４０ｒｐｍの加速度でロータロッドに留まる時間を測定する試験を実施する。全てのマウスがロッドから落ちるまで、試験を続けた。各マウスについて、落下潜時および落下時の回転数を記録した。１匹のマウスにつき３回のアッセイを行い、平均した。
【０１６２】
アデノ随伴ベクターの生産
ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２／２）粒子は、２９３―ＡＡＶ細胞（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州サンタクララ）のトランスフェクションによって産生され、イオジキサノールのグラジエント、続いてカラムアフィニティークロマトグラフィー上で精製された。懸濁液中のゲノムを含むＡＡＶ粒子の数、ならびにＨＥＫ２９３Ｔ細胞中のベクター懸濁液の感染力を、ＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲアッセイによって決定した。
【０１６３】
ＩＧＦ２―ＨＡ用のアデノウイルスプラスミド（ｐＡＡＶ）の調製
この目的の開発のために、マウスＩＧＦ２配列は、ＣＡＧプロモーター下で、導入遺伝子を発現するアデノウイルスプラスミドｐＡＡＶ―ＭＣＳにクローニングされた。オリバーブラッコ博士から親切に寄付されたｐＳＰＯＲＴ６ベクターにクローニングされたｃＤＮＡから、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは、ｐＡＡＶ−ＭＣＳベクターにサブクローニングするために、Ｉｇｆ２およびＩｇｆ２−ＨＡを得ることを可能にする。ＨＡタグ付きＣ末端をコードするＩＧＦ２−ＨＡ ｃＤＮＡは、Ｉｇｆ２−ＥｃｏＲ１、ＳＮ２、およびＩｇｆ２−ＨＡ−Ｂｇｌ ＩＩ ＡＳのＰＣＲ増幅によって作製された。
【０１６４】
−センスプライマー
5 'GGCGAATTCCCTGGCTATGGGGATCCCAGTG3'
−アンチセンスＨＡプライマー
5 'ACGTAGATCTTTAGACGTAATCTGGAACATCGTATGGGTACTGATGGTTGCTGG3'
−アンチセンスプライマー
GGCAGATCTTCACTGATGGTTGCTGG
【０１６５】
マウス組織中のＩＧＦ２を認識する抗体の低効率のため、ＨＡタグの配列をクローニング戦略に含めた。これは、（とりわけ、ＦＬＡＧ、ＧＦＰ、ＨｉｓおよびＭｙｃなどの形質導入された細胞を同定するための他のエピトープ配列を除外することなく）形質導入細胞の同定およびＩＧＦ２の発現を可能にした。従って、ＩＧＦ２は、３’末端でＨＡタグ配列を用いて増幅された。得られたクローンをＤＮＡ配列決定により確認した。このようにして、本発明者らは、タグ付きおよびタグなしで、それぞれＩＧＦ２融合タンパク質をコードするｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ＩＧＦ２−ＨＡおよびｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ＩＧＦ２構築物を作製した。空のアデノウイルスプラスミドｐＡＡＶ ＣＡＧを対照として使用した。
生成された構築物の発現を確認するために、異なる構築物でＨＥＫ細胞をトランスフェクトし、トランスフェクションの２４時間後に、抗ＩＧＦ２および抗ＨＡ抗体を用いてＷＢによって評価されるタンパク質の抽出を行った。
最後に、図１８／１８に示すように、プラスミドｐＡＡＶ−ＩＧＦ２およびｐＡＡＶ−ＩＧＦ２−ＨＡをそれぞれトランスフェクトした細胞において、ＩＧＦ２（１７ｋＤａ）およびＩＧＦ２−ＨＡ（１８ｋＤａ）について予想される分子量のバンドが検出された。
【０１６６】
定位注射
ケタミン／キシラジン麻酔（ケタミン：１００ｍｇ／ｋｇ、キシラジン：１０ｍｇ／ｋｇ、Ｖｅｔｃｏｍ、チリ）を用いてマウスに麻酔をかけ、口、鼻および耳を固定した状態で定位固定フレームに置いた（Ｄａｖｉｄ Ｋｏｐｆ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、米国）。実験によれば、ＡＡＶ―ｍＨＴＴ― ＲＦＰ、ＡＡＶ―ＩＧＦ２―ＨＡ、またはＡＡＶエンプティ（対照）の片側または両側注射を、濃度１．９６×１０１２、１×１０１３、および１．２×１０１３単位の形質導入／μｌで行った。２μｌのＡＡＶを、５μｌのハミルトンシリンジ（ハミルトン、米国）を用いて線条体領域の一点に以下の座標で注射した。ＡＰ：＋０．０７ｃｍ、ＭＬ：−０．２ｃｍ、ＤＶ：−０．３１ｃｍ（１９９７年のパキソンとフランクリンのアトラスによる）。注射液を０．５μｌ／分の速度で投与し、針を引っ込める前に５分間針を定位置に置いた。図１０／１８に示すように、ｍＨＴＴ発現をＷＢにより調べた。ＩＧＦ２の発現は、従来のＰＣＲによって確認された。
【０１６７】
生化学分析用の組織の準備
マウスをＣＯ２麻酔により屠殺し、脳を除去し、そして、両方の脳半球の皮質および線条体を氷上のプレート上で迅速に解剖した。組織を、プロテアーゼ阻害剤とホスファターゼ阻害剤（ロシュアプライドサイエンス、米国）の混合物を補ったリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）中で均質化した。ホモジネートを分割してｍＲＮＡを得、タンパク質抽出の後に、標準的な精製および定量化プロトコルを続けた。
【０１６８】
ＲＮＡ抽出、リアルタイムＰＣＲおよび従来のＰＣＲ
全ＲＮＡを皮質および線条体から単離した。ＰＢＳ中でホモジナイズした後、製造業者によって推奨されているトリゾールＲＮＡ抽出プロトコルに従った。ｃＤＮＡは、大容量ｃＤＮＡ逆転写キット（アプライドバイオシステムズ）を用いて合成された。定量的ＲＴ−ＰＣＲには、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅからのＥｖａ ＧｒｅｅｎおよびＭｘ３００５Ｐ装置を使用した。ｃＤＮＡの相対量は、対照としてβ−アクチンを用いた比較閾値サイクル法によって計算された。従来のＰＣＲには、プロメガのＧｏＴａｑ（登録商標）グリーンマスターミックスを使用した。プライマー配列は、プライマーバンクから得た（表ＶＩ）。
【０１６９】
表ＶＩ
2020501613.tif 000004
【０１７０】
ウエスタンブロット
マウス組織からのタンパク質抽出は、プロテアーゼ阻害剤の混合物およびホスファターゼ阻害剤（シグマ、米国）の混合物を含むＲＩＰＡ緩衝液（２０ｍＭトリスｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ＳＤＳ、０．５％デオキシコール酸、０．５％トリトンＸ―１００）中で行った。細胞株からのタンパク質の抽出は、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含むＰＢＳ中の１％トリトン中で行った。試料をＢＣＡアッセイキット（ピアース、米国）を用いて定量した。全細胞抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ポリ二フッ化ビニリデン膜に移した。以下の抗体をイムノブロット分析に使用した。抗Ｈｓｐ９０（１：３０００、サンタクルズ）、抗ＩＧＦ２（１：１０００ Abcam）、抗ポリＱ（１：１０００ シグマ）、抗ＧＦＰ（１：１０００サンタクルズ）、抗ＤＡＲＰＰ３２（１：１０００ Cell Siganlling）、抗チューブリン（１：３０００、ミリポア）。
【０１７１】
神経細胞培養とトランスフェクション
ニューロ２Ａ細胞をＡＴＣＣから入手し、５％ウシ血清および抗生物質（１００００ Ｕ／ｍｌペニシリン、１０ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン）を補充したＤＭＥＭ培地中、３７℃および５％ＣＯ２で培養した。
【０１７２】
統計
データは、平均およびＳＥＭとして表す。実験に基づいて、結果は、スチューデントＴ検定またはマン−ホイットニーテスト、二元配置分散分析、その後の事後テストとしてのホルム−シダックまたはボンフェローニ、またはクラスカル−ワリス、範囲内の一元配置分散分析、その後の事後テストとしてのダン法またはボンフェローニ法を用いて統計的に比較された。
【０１７３】
参考文献
1. W. E. Balch, R. I. Morimoto, A. Dillin, J. W. Kelly, Science. 319, 916-919 (2008).
2. J. Leitman et al., PLoS One. 9, e90803 (2014).
3. H. Lee et al., Hum. Mol. Genet. 21, 101-114 (2012).
4. J. R. Naranjo et al., J. Clin. Invest. 126, 627-638 (2016).
5. R. L. Vidal et al., Hum Mol Genet. 21, 2245-2262 (2012).
6. R. Vidal, B. Caballero, A. Couve, C. Hetz, Curr. Mol. Med. 11, 1-12 (2011).
7. C. Hetz, B. Mollereau, Nat Rev Neurosci. 15, 233-249 (2014).
8. H. L. Smith, G. R. Mallucci, Brain (2016), doi:10.1093/brain/aww101.
9. W. Scheper, J. J. M. Hoozemans, Acta Neuropathol. 130, 315-31 (2015).
10. P. Walter, D. Ron, Science (80‐. ). 334, 1081-1086 (2011).
11. C. Hetz et al., Genes Dev. 23, 2294-2306 (2009).
12. P. Valdes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 6804-9 (2014).
13. A. M. Fernandez, I. Torres‐Aleman, Nat. Rev. Neurosci. 13, 225-239 (2012).
14. E. Carro et al., Neurobiol. Aging. 27, 1250-1257 (2006).
15. B. K. Kaspar, J. Llado, N. Sherkat, et al, Science. 301, 839-42 (2003).
16. C. K. Franz et al., Neurobiol. Dis. 33, 473-81 (2009).
17. M. Pascual‐Lucas et al., EMBO Mol. Med. 6, 1246-1263 (2014).
18. T. J. Mellott, S. M. Pender, R. M. Burke, et al, PLoS One. 9, e94287 (2014).
19. I. Allodi et al., Sci. Rep. 6, 25960 (2016).
20. E. J. Rivera et al., J. Alzheimers. Dis. 8, 247-68 (2005).
21. W. E. Heywood et al., Mol. Neurodegener. 10, 64 (2015).
22. D. Aberg et al., J. Alzheimers. Dis. 48, 637-46 (2015).
23. P. Garcia‐Huerta, P. Troncoso‐Escudero, C. Jerez, C. Hetz, R. L. Vidal, Brain Res. (2016), doi:10.1016/j.brainres.2016.02.052.
24. Fauli Trillo C, "Tratado de Farmacia Galenica" (Ed Luzan 5, SA, Madrid, ES, 1993.) and Gennaro A, Ed., "Remington: The Science and Practice de Farmacia" 20a ed. (Lippincott Williams Wilkins, Philadelphia, PA, Estados Unidos, 2003).
25. Product Data Sheet Paav-MCS Expression vector, Catalog Number: VPK-410.
26. A. Zuleta, R. L. Vidal, D. Armentano, G. Parsons, C. Hetz, Biochem Biophys Res Commun. 420, 558-563 (2012).
27. Candace et al (2005) Journal of Pharmaceutical Sciences, volume 94 number (6), pages 1187-1195.
28. Constantini et al (2000) Gene Therapy volume 7, pages 93-10.
29. Ulusoy et al (1999) Molecular Theraphy volume 17, no 9, pages 1574-1584.
30. Carter B, asociados-A.deno para la entrega de genes, Lassic D, et al, Eds, "Gene" Therapy: Mecanismos y estrategias terapeuticas ".. (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, NY, Estados Unidos, 2000) and Gao et al., J. Virol. 2004; 78 (12): 6381-6388.
【０１７４】
表Ｉ
ｐＡＡＶ／２−ＭＣＳプラスミドの特徴と配列
ジェンバンク：ＡＦ０４３３０３．１
オリジン
1 TTGGCCACTC CCTCTCTGCG CGCTCGCTCG CTCACTGAGG CCGGGCGACC AAAGGTCGCC
61 CGACGCCCGG GCTTTGCCCG GGCGGCCTCA GTGAGCGAGC GAGCGCGCAG AGAGGGAGTG
121 GCCAACTCCA TCACTAGGGG TTCCTGGAGG GGTGGAGTCG TGACGTGAAT TACGTCATAG
181 GGTTAGGGAG GTCCTGTATT AGAGGTCACG TGAGTGTTTT GCGACATTTT GCGACACCAT
241 GTGGTCACGC TGGGTATTTA AGCCCGAGTG AGCACGCAGG GTCTCCATTT TGAAGCGGGA
301 GGTTTGAACG CGCAGCCGCC ATGCCGGGGT TTTACGAGAT TGTGATTAAG GTCCCCAGCG
361 ACCTTGACGA GCATCTGCCC GGCATTTCTG ACAGCTTTGT GAACTGGGTG GCCGAGAAGG
421 AATGGGAGTT GCCGCCAGAT TCTGACATGG ATCTGAATCT GATTGAGCAG GCACCCCTGA
481 CCGTGGCCGA GAAGCTGCAG CGCGACTTTC TGACGGAATG GCGCCGTGTG AGTAAGGCCC
541 CGGAGGCCCT TTTCTTTGTG CAATTTGAGA AGGGAGAGAG CTACTTCCAC ATGCACGTGC
601 TCGTGGAAAC CACCGGGGTG AAATCCATGG TTTTGGGACG TTTCCTGAGT CAGATTCGCG
661 AAAAACTGAT TCAGAGAATT TACCGCGGGA TCGAGCCGAC TTTGCCAAAC TGGTTCGCGG
721 TCACAAAGAC CAGAAATGGC GCCGGAGGCG GGAACAAGGT GGTGGATGAG TGCTACATCC
781 CCAATTACTT GCTCCCCAAA ACCCAGCCTG AGCTCCAGTG GGCGTGGACT AATATGGAAC
841 AGTATTTAAG CGCCTGTTTG AATCTCACGG AGCGTAAACG GTTGGTGGCG CAGCATCTGA
901 CGCACGTGTC GCAGACGCAG GAGCAGAACA AAGAGAATCA GAATCCCAAT TCTGATGCGC
961 CGGTGATCAG ATCAAAAACT TCAGCCAGGT ACATGGAGCT GGTCGGGTGG CTCGTGGACA
1021 AGGGGATTAC CTCGGAGAAG CAGTGGATCC AGGAGGACCA GGCCTCATAC ATCTCCTTCA
1081 ATGCGGCCTC CAACTCGCGG TCCCAAATCA AGGCTGCCTT GGACAATGCG GGAAAGATTA
1141 TGAGCCTGAC TAAAACCGCC CCCGACTACC TGGTGGGCCA GCAGCCCGTG GAGGACATTT
1201 CCAGCAATCG GATTTATAAA ATTTTGGAAC TAAACGGGTA CGATCCCCAA TATGCGGCTT
1261 CCGTCTTTCT GGGATGGGCC ACGAAAAAGT TCGGCAAGAG GAACACCATC TGGCTGTTTG
1321 GGCCTGCAAC TACCGGGAAG ACCAACATCG CGGAGGCCAT AGCCCACACT GTGCCCTTCT
1381 ACGGGTGCGT AAACTGGACC AATGAGAACT TTCCCTTCAA CGACTGTGTC GACAAGATGG
1441 TGATCTGGTG GGAGGAGGGG AAGATGACCG CCAAGGTCGT GGAGTCGGCC AAAGCCATTC
1501 TCGGAGGAAG CAAGGTGCGC GTGGACCAGA AATGCAAGTC CTCGGCCCAG ATAGACCCGA
1561 CTCCCGTGAT CGTCACCTCC AACACCAACA TGTGCGCCGT GATTGACGGG AACTCAACGA
1621 CCTTCGAACA CCAGCAGCCG TTGCAAGACC GGATGTTCAA ATTTGAACTC ACCCGCCGTC
1681 TGGATCATGA CTTTGGGAAG GTCACCAAGC AGGAAGTCAA AGACTTTTTC CGGTGGGCAA
1741 AGGATCACGT GGTTGAGGTG GAGCATGAAT TCTACGTCAA AAAGGGTGGA GCCAAGAAAA
1801 GACCCGCCCC CAGTGACGCA GATATAAGTG AGCCCAAACG GGTGCGCGAG TCAGTTGCGC
1861 AGCCATCGAC GTCAGACGCG GAAGCTTCGA TCAACTACGC AGACAGGTAC CAAAACAAAT
1921 GTTCTCGTCA CGTGGGCATG AATCTGATGC TGTTTCCCTG CAGACAATGC GAGAGAATGA
1981 ATCAGAATTC AAATATCTGC TTCACTCACG GACAGAAAGA CTGTTTAGAG TGCTTTCCCG
2041 TGTCAGAATC TCAACCCGTT TCTGTCGTCA AAAAGGCGTA TCAGAAACTG TGCTACATTC
2101 ATCATATCAT GGGAAAGGTG CCAGACGCTT GCACTGCCTG CGATCTGGTC AATGTGGATT
2161 TGGATGACTG CATCTTTGAA CAATAAATGA TTTAAATCAG GTATGGCTGC CGATGGTTAT
2221 CTTCCAGATT GGCTCGAGGA CACTCTCTCT GAAGGAATAA GACAGTGGTG GAAGCTCAAA
2281 CCTGGCCCAC CACCACCAAA GCCCGCAGAG CGGCATAAGG ACGACAGCAG GGGTCTTGTG
2341 CTTCCTGGGT ACAAGTACCT CGGACCCTTC AACGGACTCG ACAAGGGAGA GCCGGTCAAC
2401 GAGGCAGACG CCGCGGCCCT CGAGCACGAC AAAGCCTACG ACCGGCAGCT CGACAGCGGA
2461 GACAACCCGT ACCTCAAGTA CAACCACGCC GACGCGGAGT TTCAGGAGCG CCTTAAAGAA
2521 GATACGTCTT TTGGGGGCAA CCTCGGACGA GCAGTCTTCC AGGCGAAAAA GAGGGTTCTT
2581 GAACCTCTGG GCCTGGTTGA GGAACCTGTT AAGACGGCTC CGGGAAAAAA GAGGCCGGTA
2641 GAGCACTCTC CTGTGGAGCC AGACTCCTCC TCGGGAACCG GAAAGGCGGG CCAGCAGCCT
2701 GCAAGAAAAA GATTGAATTT TGGTCAGACT GGAGACGCAG ACTCAGTACC TGACCCCCAG
2761 CCTCTCGGAC AGCCACCAGC AGCCCCCTCT GGTCTGGGAA CTAATACGAT GGCTACAGGC
2821 AGTGGCGCAC CAATGGCAGA CAATAACGAG GGCGCCGACG GAGTGGGTAA TTCCTCGGGA
2881 AATTGGCATT GCGATTCCAC ATGGATGGGC GACAGAGTCA TCACCACCAG CACCCGAACC
2941 TGGGCCCTGC CCACCTACAA CAACCACCTC TACAAACAAA TTTCCAGCCA ATCAGGAGCC
3001 TCGAACGACA ATCACTACTT TGGCTACAGC ACCCCTTGGG GGTATTTTGA CTTCAACAGA
3061 TTCCACTGCC ACTTTTCACC ACGTGACTGG CAAAGACTCA TCAACAACAA CTGGGGATTC
3121 CGACCCAAGA GACTCAACTT CAAGCTCTTT AACATTCAAG TCAAAGAGGT CACGCAGAAT
3181 GACGGTACGA CGACGATTGC CAATAACCTT ACCAGCACGG TTCAGGTGTT TACTGACTCG
3241 GAGTACCAGC TCCCGTACGT CCTCGGCTCG GCGCATCAAG GATGCCTCCC GCCGTTCCCA
3301 GCAGACGTCT TCATGGTGCC ACAGTATGGA TACCTCACCC TGAACAACGG GAGTCAGGCA
3361 GTAGGACGCT CTTCATTTTA CTGCCTGGAG TACTTTCCTT CTCAGATGCT GCGTACCGGA
3421 AACAACTTTA CCTTCAGCTA CACTTTTGAG GACGTTCCTT TCCACAGCAG CTACGCTCAC
3481 AGCCAGAGTC TGGACCGTCT CATGAATCCT CTCATCGACC AGTACCTGTA TTACTTGAGC
3541 AGAACAAACA CTCCAAGTGG AACCACCACG CAGTCAAGGC TTCAGTTTTC TCAGGCCGGA
3601 GCGAGTGACA TTCGGGACCA GTCTAGGAAC TGGCTTCCTG GACCCTGTTA CCGCCAGCAG
3661 CGAGTATCAA AGACATCTGC GGATAACAAC AACAGTGAAT ACTCGTGGAC TGGAGCTACC
3721 AAGTACCACC TCAATGGCAG AGACTCTCTG GTGAATCCGG GCCCGGCCAT GGCAAGCCAC
3781 AAGGACGATG AAGAAAAGTT TTTTCCTCAG AGCGGGGTTC TCATCTTTGG GAAGCAAGGC
3841 TCAGAGAAAA CAAATGTGGA CATTGAAAAG GTCATGATTA CAGACGAAGA GGAAATCAGG
3901 ACAACCAATC CCGTGGCTAC GGAGCAGTAT GGTTCTGTAT CTACCAACCT CCAGAGAGGC
3961 AACAGACAAG CAGCTACCGC AGATGTCAAC ACACAAGGCG TTCTTCCAGG CATGGTCTGG
4021 CAGGACAGAG ATGTGTACCT TCAGGGGCCC ATCTGGGCAA AGATTCCACA CACGGACGGA
4081 CATTTTCACC CCTCTCCCCT CATGGGTGGA TTCGGACTTA AACACCCTCC TCCACAGATT
4141 CTCATCAAGA ACACCCCGGT ACCTGCGAAT CCTTCGACCA CCTTCAGTGC GGCAAAGTTT
4201 GCTTCCTTCA TCACACAGTA CTCCACGGGA CAGGTCAGCG TGGAGATCGA GTGGGAGCTG
4261 CAGAAGGAAA ACAGCAAACG CTGGAATCCC GAAATTCAGT ACACTTCCAA CTACAACAAG
4321 TCTGTTAATG TGGACTTTAC TGTGGACACT AATGGCGTGT ATTCAGAGCC TCGCCCCATT
4381 GGCACCAGAT ACCTGACTCG TAATCTGTAA TTGCTTGTTA ATCAATAAAC CGTTTAATTC
4441 GTTTCAGTTG AACTTTGGTC TCTGCGTATT TCTTTCTTAT CTAGTTTCCA TGGCTACGTA
4501 GATAAGTAGC ATGGCGGGTT AATCATTAAC TACAAGGAAC CCCTAGTGAT GGAGTTGGCC
4561 ACTCCCTCTC TGCGCGCTCG CTCGCTCACT GAGGCCGGGC GACCAAAGGT CGCCCGACGC
4621 CCGGGCTTTG CCCGGGCGGC CTCAGTGAGC GAGCGAGCGC GCAGAGAGGG AGTGGCCAA
【０１７５】
表ＩＩ
ｐＡＡＶ２−ＩＧＦ２ベクター配列
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGCACGCGTGGAGCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGTCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGATTCGAATCCCGGCCGGGAACGGTGCATTGGAACGCGGATTCCCCGTGCCAAGAGTGACGTAAGTACCGCCTATAGAGTCTATAGGCCCACAAAAAATGCTTTCTTCTTTTAATATACTTTTTTGTTTATCTTATTTCTAATACTTTCCCTAATCTCTTTCTTTCAGGGCAATAATGATACAATGTATCATGCCTCTTTGCACCATTCTAAAGAATAACAGTGATAATTTCTGGGTTAAGGCAATAGCAATATTTCTGCATATAAATATTTCTGCATATAAATTGTAACTGATGTAAGAGGTTTCATATTGCTAATAGCAGCTACAATCCAGCTACCATTCTGCTTTTATTTTATGGTTGGGATAAGGCTGGATTATTCTGAGTCCAAGCTAGGCCCTTTTGCTAATCATGTTCATACCTCTTATCTTCCTCCCACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTCTGTGTGCTGGCCCATCACTTTGGCAAAGAATTGGGATTCGAACATCGATTGAATTCCCTGGCTATGGGGATCCCAGTGGGGAAGTCGATGTTGGTGCTTCTCATCTCTTTGGCCTTCGCCTTGTGCTGCATCGCTGCTTACGGCCCCGGAGAGACTCTGTGCGGAGGGGAGCTTGTTGACACGCTTCAGTTTGTCTGTTCGGACCGCGGCTTCTACTTCAGCAGGCCTTCAAGCCGTGCCAACCGTCGCAGCCGTGGCATCGTGGAAGAGTGCTGCTTCCGCAGCTGCGACCTGGCCCTCCTGGAGACATACTGTGCCACCCCCGCCAAGTCCGAGAGGGACGTGTCTACCTCTCAGGCCGTACTTCCGGACGACTTCCCCAGATACCCCGTGGGCAAGTTCTTCCAATATGACACCTGGAGACAGTCCGCGGGACGCCTGCGCAGAGGCCTGCCTGCCCTCCTGCGTGCCCGCCGGGGTCGCATGCTTGCCAAAGAGCTCAAAGAGTTCAGAGAGGCCAAACGTCATCGTCCCCTGATCGTGTTACCACCCAAAGACCCCGCCCACGGGGGAGCCTCTTCGGAGATGTCCAGCAACCATCAGTGAAGATCTACGGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCCCTGGAAGTTGCCACTCCAGTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATCATTTTGTCTGACTAGGTGTCCTTCTATAATATTATGGGGTGGAGGGGGGTGGTATGGAGCAAGGGGCAAGTTGGGAAGACAACCTGTAGGGCCTGCGGGGTCTATTGGGAACCAAGCTGGAGTGCAGTGGCACAATCTTGGCTCACTGCAATCTCCGCCTCCTGGGTTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCGAGTTGTTGGGATTCCAGGCATGCATGACCAGGCTCAGCTAATTTTTGTTTTTTTGGTAGAGACGGGGTTTCACCATATTGGCCAGGCTGGTCTCCAACTCCTAATCTCAGGTGATCTACCCACCTTGGCCTCCCAAATTGCTGGGATTACAGGCGTGAACCACTGCTCCCTTCCCTGTCCTTCTGATTTTGTAGGTAACCACGTGCGGACCGAGCGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGGGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACGTCAAAGCAACCATAGTACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTTGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGGCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGT
【０１７６】
特徴：
ＩＧＦ２                                 ：［１３３９：１８７８−ＣＷ］
Ｆ１オリジン                        ：［３０６６：２６２６−ＣＷ］
Ｓｔｏｐ                                 ：［１３３９：１８７８−ＣＷ］
Ｌ−ＩＴＲ                            ：［２４３０：２５２８−ＣＷ］
Ｒ−ＩＴＲ                            ：［１２：１０６−ＣＷ］
Ｍ１３オリジン                   ：［２６２１：３０７６−ＣＷ］
ＣｏｌＥ１オリジン         ：［４４７２：５１００−ＣＷ］
ＡｍｐＲ                                 ：［３６６１：４３２０−ＣＷ］
Ａｍｐ Ｐｒｏｍ                ：［３３９３：３４２１−ＣＷ］
ｈＧＨ ポリＡシグナル  ：［１８８９：２３６９−ＣＷ］
ＣＭＶ前初期プロモーター                                 ：［１７０：７２１−ＣＷ］
内部ｂ ＧｌｏｂとＣＡＧエンハンサー       ：［８２０：１３１２−ＣＷ］
【０１７７】
表ＩＩＩ
ＡＡＶ２−ＩＧＦ２−ＨＡベクター配列
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGCACGCGTGGAGCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGTCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGATTCGAATCCCGGCCGGGAACGGTGCATTGGAACGCGGATTCCCCGTGCCAAGAGTGACGTAAGTACCGCCTATAGAGTCTATAGGCCCACAAAAAATGCTTTCTTCTTTTAATATACTTTTTTGTTTATCTTATTTCTAATACTTTCCCTAATCTCTTTCTTTCAGGGCAATAATGATACAATGTATCATGCCTCTTTGCACCATTCTAAAGAATAACAGTGATAATTTCTGGGTTAAGGCAATAGCAATATTTCTGCATATAAATATTTCTGCATATAAATTGTAACTGATGTAAGAGGTTTCATATTGCTAATAGCAGCTACAATCCAGCTACCATTCTGCTTTTATTTTATGGTTGGGATAAGGCTGGATTATTCTGAGTCCAAGCTAGGCCCTTTTGCTAATCATGTTCATACCTCTTATCTTCCTCCCACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTCTGTGTGCTGGCCCATCACTTTGGCAAAGAATTGGGATTCGAACATCGATTGAATTCCCTGGCTATGGGGATCCCAGTGGGGAAGTCGATGTTGGTGCTTCTCATCTCTTTGGCCTTCGCCTTGTGCTGCATCGCTGCTTACGGCCCCGGAGAGACTCTGTGCGGAGGGGAGCTTGTTGACACGCTTCAGTTTGTCTGTTCGGACCGCGGCTTCTACTTCAGCAGGCCTTCAAGCCGTGCCAACCGTCGCAGCCGTGGCATCGTGGAAGAGTGCTGCTTCCGCAGCTGCGACCTGGCCCTCCTGGAGACATACTGTGCCACCCCCGCCAAGTCCGAGAGGGACGTGTCTACCTCTCAGGCCGTACTTCCGGACGACTTCCCCAGATACCCCGTGGGCAAGTTCTTCCAATATGACACCTGGAGACAGTCCGCGGGACGCCTGCGCAGAGGCCTGCCTGCCCTCCTGCGTGCCCGCCGGGGTCGCATGCTTGCCAAAGAGCTCAAAGAGTTCAGAGAGGCCAAACGTCATCGTCCCCTGATCGTGTTACCACCCAAAGACCCCGCCCACGGGGGAGCCTCTTCGGAGATGTCCAGCAACCATCAGTACCCATACGATGTTCCAGATTACGTCTAAAGATCTACGGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCCCTGGAAGTTGCCACTCCAGTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATCATTTTGTCTGACTAGGTGTCCTTCTATAATATTATGGGGTGGAGGGGGGTGGTATGGAGCAAGGGGCAAGTTGGGAAGACAACCTGTAGGGCCTGCGGGGTCTATTGGGAACCAAGCTGGAGTGCAGTGGCACAATCTTGGCTCACTGCAATCTCCGCCTCCTGGGTTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCGAGTTGTTGGGATTCCAGGCATGCATGACCAGGCTCAGCTAATTTTTGTTTTTTTGGTAGAGACGGGGTTTCACCATATTGGCCAGGCTGGTCTCCAACTCCTAATCTCAGGTGATCTACCCACCTTGGCCTCCCAAATTGCTGGGATTACAGGCGTGAACCACTGCTCCCTTCCCTGTCCTTCTGATTTTGTAGGTAACCACGTGCGGACCGAGCGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGGGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACGTCAAAGCAACCATAGTACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTTGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGGCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGT
【０１７８】
特徴：
ＩＧＦ２                                 ：［１３３９：１８７８−ＣＷ］
Ｆ１オリジン                        ：［３０９３：２６５３−ＣＷ］
ＨＡ                                          ：［１８７９：１９０８−ＣＷ］
Ｌ−ＩＴＲ                            ：［８９：１９６−ＣＷ］
Ｒ−ＩＴＲ                            ：［１２：１０６−ＣＷ］
Ｔ７                                           ：［２５８７：２６０６−ＣＷ］
Ｔ７                                           ：［３５３２：３５５１−ＣＷ］
Ｍ１３オリジン                   ：［２６４８：３１０３−ＣＷ］
ＣｏｌＥ１オリジン         ：［４４９９：５１２７−ＣＷ］
ＡｍｐＲ                                 ：［３６８８：４３４７−ＣＷ］
Ａｍｐ Ｐｒｏｍ                ：［３４２０：３４４８−ＣＷ］
ｈＧＨ ポリＡシグナル  ：［１９１６：２３９６−ＣＷ］
ＣＭＶ前初期プロモーター                                 ：［１７０：７２１−ＣＷ］
内部ｂ Ｇｌｏｂ ｙ ＣＡＧエンハンサー  ：［８２０：１３１２−ＣＷ］
【０１７９】
表ＩＶ
Ｉｇｆ２（マウス）
TGGGGATCCCAGTGGGGAAGTCGATGTTGGTGCTTCTCATCTCTTTGGCCTTCGCCTTGTGCTGCATCGCTGCTTACGGCCCCGGAGAGACTCTGTGCGGAGGGGAGCTTGTTGACACGCTTCAGTTTGTCTGTTCGGACCGCGGCTTCTACTTCAGCAGGCCTTCAAGCCGTGCCAACCGTCGCAGCCGTGGCATCGTGGAAGAGTGCTGCTTCCGCAGCTGCGACCTGGCCCTCCTGGAGACATACTGTGCCACCCCCGCCAAGTCCGAGAGGGACGTGTCTACCTCTCAGGCCGTACTTCCGGACGACTTCCCCAGATACCCCGTGGGCAAGTTCTTCCAATATGACACCTGGAGACAGTCCGCGGGACGCCTGCGCAGAGGCCTGCCTGCCCTCCTGCGTGCCCGCCGGGGTCGCATGCTTGCCAAAGAGCTCAAAGAGTTCAGAGAGGCCAAACGTCATCGTCCCCTGATCGTGTTACCACCCAAAGACCCCGCCCACGGGGGAGCCTCTTCGGAGATGTCCAGCAACCATCAG
【０１８０】
表Ｖ
Ｉｇｆ２−ＨＡ（マウス）
TGGGGATCCCAGTGGGGAAGTCGATGTTGGTGCTTCTCATCTCTTTGGCCTTCGCCTTGTGCTGCATCGCTGCTTACGGCCCCGGAGAGACTCTGTGCGGAGGGGAGCTTGTTGACACGCTTCAGTTTGTCTGTTCGGACCGCGGCTTCTACTTCAGCAGGCCTTCAAGCCGTGCCAACCGTCGCAGCCGTGGCATCGTGGAAGAGTGCTGCTTCCGCAGCTGCGACCTGGCCCTCCTGGAGACATACTGTGCCACCCCCGCCAAGTCCGAGAGGGACGTGTCTACCTCTCAGGCCGTACTTCCGGACGACTTCCCCAGATACCCCGTGGGCAAGTTCTTCCAATATGACACCTGGAGACAGTCCGCGGGACGCCTGCGCAGAGGCCTGCCTGCCCTCCTGCGTGCCCGCCGGGGTCGCATGCTTGCCAAAGAGCTCAAAGAGTTCAGAGAGGCCAAACGTCATCGTCCCCTGATCGTGTTACCACCCAAAGACCCCGCCCACGGGGGAGCCTCTTCGGAGATGTCCAGCAACCATCAGTACCCATACGATGTTCCAGATTACGTCTAA
【０１８１】
表ＶＩＩ
Ｉｇｆ２（ヒト）
ATGGGAATCCCAATGGGGAAGTCGATGCTGGTGCTTCTCACCTTCTTGGCCTTCGCCTCGTGCTGCATTGCTGCTTACCGCCCCAGTGAGACCCTGTGCGGCGGGGAGCTGGTGGACACCCTCCAGTTCGTCTGTGGGGACCGCGGCTTCTACTTCAGCAGGCCCGCAAGCCGTGTGAGCCGTCGCAGCCGTGGCATCGTTGAGGAGTGCTGTTTCCGCAGCTGTGACCTGGCCCTCCTGGAGACGTACTGTGCTACCCCCGCCAAGTCCGAGAGGGACGTGTCGACCCCTCCGACCGTGCTTCCGGACAACTTCCCCAGATACCCCGTGGGCAAGTTCTTCCAATATGACACCTGGAAGCAGTCCACCCAGCGCCTGCGCAGGGGCCTGCCTGCCCTCCTGCGTGCCCGCCGGGGTCACGTGCTCGCCAAGGAGCTCGAGGCGTTCAGGGAGGCCAAACGTCACCGTCCCCTGATTGCTCTACCCACCCAAGACCCCGCCCACGGGGGCGCCCCCCCAGAGATGGCCAGCAATCGGAAGTGA
【図１】
2020501613.tif 000005
【図２】
2020501613.tif 000006
【図３】
2020501613.tif 000007
【図４】
2020501613.tif 000008
【図５】
2020501613.tif 000009
【図６】
2020501613.tif 000010
【図７】
2020501613.tif 000011
【図８】
2020501613.tif 000012
【図９】
2020501613.tif 000013
【図１０】
2020501613.tif 000014
【図１１】
2020501613.tif 000015
【図１２】
2020501613.tif 000016
【図１３】
2020501613.tif 000017
【図１４】
2020501613.tif 000018
【図１５】
2020501613.tif 000019
【図１６】
2020501613.tif 000020
【図１７】
2020501613.tif 000021
【図１８】
2020501613.tif 000022
【図１９】
2020501613.tif 000023
【配列表】
2020501613000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年11月29日(2019.11.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、中枢神経系（ＣＮＳ）の細胞において、好ましくは、運動認知制御、神経劣化の回復および改善の領域において、ＩＧＦ２増殖因子を過剰発現するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の使用によって、特に、タンパク質フォールディングの過程において、医学の分野で適用される。
【背景技術】
【０００２】
ＣＮＳ疾患、特に、変性神経疾患に関連する疾患に関する科学的研究は、近年、非常に興味深いものとなっている。ハンチントン病などのタンパク質ミスフォールディングに関連する疾患の治療は、タンパク質ミスフォールディングの結果として、神経の死によって引き起こされる症状を軽減するためのアロパシー療法（抗精神病薬および抗鬱剤）を用いたアプローチを有する。しかし、これは退化を遅らせるものでも、すでに引き起こしたダメージを元に戻すためのものではない。
【０００３】
ハンチントン病（ＨＤ）に関して、その遺伝的原因は、２０年以上前に発見された。しかしながら、神経機能障害および細胞死をもたらすメカニズムは、特定され始めたばかりである。
【０００４】
これらのメカニズムの特定の間に、プロテオスタシスネットワークの一般的な変化は、ＨＤの妊娠における重要な病理学的事象であることが示唆されている。小胞体（ＥＲ）のストレスの出現が際立っている。この細胞小器官において、折りたたまれていないタンパク質応答（ＵＰＲ）、ＥＲストレス下で細胞の運命を制御する反応シグナルの活性化を担うタンパク質が存在する。
【０００５】
ＨＤは、認知機能低下によって、第一段階で特徴付けられる神経変性疾患であり、より高度な段階での運動制御の障害とともに、性格を変化させる。これは、日常生活の課題の遂行を妨げ、患者の早死につながる。タンパク質レベルでは、この疾患は、ハンチンチンタンパク質内のグルタミンの３５回以上の繰り返しの拡大によって特徴付けられている。そして、支配的な毒性機能をそれに与えている。これは、変異ハンチンチン（ｍＨｔｔ）の進行性蓄積および線条体におけるニューロン喪失の発生をもたらす。ｍＨｔｔが神経機能に及ぼす影響のメカニズムについてはまだ議論されているが、種々の文献は、タンパク質恒常性に対する全体的な変化（１）がＥＲ、ＥＲおよびゴルジにおける小胞輸送、軸索輸送およびオートファジーにおける障害（６）に関連するタンパク質分解の変化を含む病因（２-５）に寄与していることを示唆している。これら全ての事象は、細胞のタンパク質負荷を増加させ、ＥＲにおけるそれらの正しいフォールディングおよび成熟を妨害し、慢性ＥＲストレスおよび神経機能不全を生じさせる（７）。ＥＲストレスは、折り畳まれていないタンパク質応答（ＵＰＲ）の活性化を誘発する。これは、第一に、プロテオスタシスを回復するための細胞適応を媒介することを可能にするシグナル伝達経路である。
【０００６】
しかし、慢性的なＥＲストレスは、細胞死や神経変性を誘発する。ＥＲストレスは、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、およびパーキンソン病（ＰＤ）を含むいくつかの神経変性疾患に関連していることに注意することが重要である（７−９）。このシグナル伝達の範囲内で、最も保護されている分枝は、プロテオスタシスネットワークの異なる側面に関与する一群の遺伝子の発現を制御する結合タンパク質１のＸ−ボックス転写因子（ＸＢＰ１）によって制御される（１０）。ＨＤを有するマウスモデルにおけるニューロン中のＸＢＰ１の欠失が神経保護効果を有することは、以前に実証された（５）。一般に、動物は、ニューロン生存の改善およびより良い運動能力と関連して、疾患の発症に対してより耐性があった。この表現型は、おそらくオートファジーの正の調節による、ｍＨｔｔレベルの劇的な減少によって説明された（５）。ＡＬＳ（１１）とＰＤ（１２）のモデルでも、同様の観察結果が得られた。
【０００７】
これらのタンパク質ミスフォールディング疾患の治療の探索において、ＩＧＦ２と呼ばれるインスリン様成長因子ＩＩが同定されている。その機能は、胎児成長の生物学的および分子的メカニズムに関与しているだけでなく、いくつかの癌性腫瘍に関与している。
【０００８】
ＩＧＦ２は、いくつかのモデルにおいて、興味深い神経保護活性を有する分泌型増殖因子である。要約すると、最近のいくつかの研究は、一般に、ＩＧＦが神経変性疾患の治療のための可能なターゲットであることを示唆している。特に、それは、神経剤としてのそれらの機能および神経保護効果を考慮している（１３）。事実、ＡＤおよびＡＬＳの前臨床モデルにおけるＩＧＦ１の送達は、遺伝子治療を用いることによって、病理学的特徴を弱める（１４−１６）。ＩＧＦ１およびインスリンとは対照的に、ＩＧＦ２は、ほとんど研究されていない。ごく少数の最近の報告が、ＩＧＦ２の神経保護的役割を示唆している。それは、ＡＤモデルにおけるアミロイド斑および認知障害を減少させる（１７、１８）。同様に、ＡＬＳにおいて、ＩＧＦ２は、疾患に対して抵抗力のある運動ニューロンにおいて差次的に発現される。そして、遺伝子治療によるその過剰発現は、その進行を遅らせる（１９）。さらに、ヒトにおいて、ＩＧＦ２レベルは、ＡＤ患者の海馬において減少し（１７、２０）、そしてまた、ＣＳＦサンプルにおいて変化を示す（２１、２２）。
【０００９】
しかしながら、ＩＧＦ２をＨＤと結び付けた機能的研究はない。
【００１０】
一般に、ＵＰＲのシグナル伝達と、成長因子のシグナル伝達との間のダイナミクスは、プロテオスタシスネットワークと神経生理学を調節する生存シグナルとを結び付ける新しいアプローチを想定している（２３）。これらの理由から、ＩＧＦ２は、疾患の進行をモニターするためのバイオマーカーとしてのその潜在的な使用に加えて、その治療のための新しい治療経路を提供することができるＨＤに照らして、研究のための興味深い候補を表す。
【００１１】
ＩＧＦ２を含む融合タンパク質がリソソームタンパク質に関連する疾患の治療のために提示されている国際出願ＷＯ２０１４／０８５６２１を有する文書ＣＬ３５１０―２０１４には、ＨＤを治療するための遺伝子治療についての言及がない。
【００１２】
また、第２の文書、ＥＳ ２４４２２４２ Ａ１がある。これは、異なる成長因子を含む、血液から抽出された抽出物に基づく組成物について言及する。ＨＤを治療するための遺伝子治療のいずれにも言及していない。
【００１３】
そのため、ＩＧＦ２遺伝子とＨＤの治療を結び付けた遺伝子治療を用いた文献はない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
一般に、本発明は、遺伝子治療薬、治療法、識別装置、およびハンチントン病を治療するための使用を生み出すことを目的とする。具体的な技術目標または解決すべき問題は以下に示される。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の第１の態様は、脳、好ましくは、線条体および皮質におけるＩＧＦ２および／またはＩＧＦ２−ＨＡの過剰発現を可能にするウイルスを使用することによって、好ましくはヒトにおけるハンチントン病を改善または治療する方法に関する。
【００１６】
本発明の第２の態様は、ハンチントン病を改善または治療するための治療的処置方法を提供する。この方法は、静脈内投与および／または腹腔内投与および／または頭蓋内投与および／または髄内投与および／または鼻腔内投与および／または神経内投与および／または患者もしくは対象の血液脳関門を通過することによってウイルスを脳に導入する任意の経路を含む。このウイルスは、個体あたり１６から１３０ウイルス単位の用量範囲で、ＩＧＦ２および／またはＩＧＦ２−ＨＡのニューロン過剰発現を誘発する。
【００１７】
本発明の第３の態様は、静脈内組成物および／または腹腔内組成物および／または頭蓋内組成物および／または髄内組成物および／または鼻腔内組成物および／または神経内医薬組成物および／または以前に提示されたような用量範囲で、ＩＧＦ２および／またはＩＧＦ２−ＨＡのニューロン過剰発現を脳に（好ましくは海馬に）誘発し、血液脳関門を横断するウイルスを送達する任意の形態である。また、第３の態様は、ハンチントン病を有するヒト患者の長期記憶の最適化および改善に使用するための薬学的に許容されるビヒクルである。
【００１８】
本発明の第４の態様は、ＩＧＦ２および／またはＩＧＦ２−ＨＡのニューロン過剰発現を誘発するウイルスおよびそのタンパク質誘導体化合物の使用である。それは、ハンチントン病の寛解に有用な薬物を調製するのに役立つ。
【００１９】
本発明の第５の態様は、同じウイルス配列を有するアデノ随伴型（ＡＡＶ）のウイルスおよび表ＩＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２）および表ＩＩＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３）に記載のヌクレオチド配列を有するインサートまたはその変異体のいずれかである。これらは、国際寄託機関、寄託番号ＲＧＭ２３３６およびＲＧＭ２３３５を有する微生物遺伝資源のチリコレクション（ＣＣｈＲＧＭ）に寄託されたプラスミドで形質転換された大腸菌株に含まれる。ＩＧＦ２および／またはＩＧＦ２−ＨＡ増殖因子は、それぞれ、主に線条体と皮質に過剰発現される。
【００２０】
本発明の第６の態様は、ウイルスの核酸フラグメントを有するプラスミドと、表ＩＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２）およびＩＩＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３）に記載され、国際寄託機関、微生物遺伝資源のチリコレクション（ＣＣｈＲＧＭ）に寄託されたプラスミドで形質転換された大腸菌株に含まれるようなヌクレオチド配列を有するインサートとである。これは、寄託番号ＲＧＭ２３３６およびＲＧＭ２３３５および／またはこのフラグメントのいずれかの変異体を有し、それぞれＩＧＦ２および／またはＩＧＦ２−ＨＡ増殖因子をそれぞれコードし、過剰発現する。
【００２１】
本発明の第７の態様は、ハンチントン病を診断する方法を提供することである。
【００２２】
以下の発明の第８の態様は、ＩＧＦ２および／またはＩＧＦ２−ＨＡおよびそのタンパク質誘導体化合物の過剰発現を誘導するウイルスの使用である。それは、ハンチントン病患者の生理学的レベルの安定化に有用な薬物を調製するのに役立つ。
【００２３】
本特許はまた、ウイルスの核酸フラグメントを有するプラスミドの配列、ならびに表ＩＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４）、Ｖ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５）、およびＶＩＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６）に記載のヌクレオチド配列を有するインサート、あるいはこのフラグメントの任意の変異体を表す。これらは、ＩＧＦ２および／またはＩＧＦ２−ＨＡ増殖因子をコードおよび過剰発現する。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
微生物の寄託
プラスミドｐＡＡＶ−ＩＧＦ２−ＨＡおよびｐＡＡＶ−ＩＧＦ２は、国際寄託機関、チリの微生物遺伝資源のコレクション（ＣＣｈＲＧＭ）に寄託されたプラスミドで形質転換された、大腸菌の株に含まれ、２０１６年に国際寄託機関に寄託された。これは、それぞれＲＧＭ２３３５およびＲＧＭ２３３６の寄託番号を有する。
【００２５】
当然のことながら、本発明は、本明細書に記載の特定の方法論、化合物、材料、製造技術、使用および用途に限定されるものではないことが理解されるべきである。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、本発明の観点および可能性を限定することを意図するものではないことが理解されるべきである。
【００２６】
本明細書、添付の特許請求の範囲、および本文全体で使用されているように、文脈上明らかに別段の指示がない限り、単数形は複数の指示対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「使用または方法」への言及は、１つまたは複数の使用または方法への言及を含み、当業者（当技術分野）に公知の等価物を含む。同様に、さらなる例として、「工程」、「ステージ」、または「モード」への言及は、１つまたは複数の工程、ステージ、またはモードへの言及を含む。これは、黙示的および／または代替のサブ工程、サブステージまたはサブモードを含む。
【００２７】
使用されるすべての接続詞は、それほど限定的ではなく、より包括的な可能な意味で理解されなければならない。例えば、文脈や文章が明示的にそれを要求している、またはそれを述べている場合を除き、接続詞「または」は、その正統的な論理的意味で理解されるべきであり、除外する「または」として理解されるべきではない。記載された構造、材料、および／または要素は、無限の列挙が避けられるように、機能的に同等のものも参照していることを理解されたい。
【００２８】
近似や概念を表すのに使用される表現は、文脈が異なる読み方を表現していない限り、それらの本質的な意味で理解されるべきである。
【００２９】
本明細書で使用されるすべての技術的および／または科学的な名称および用語は、異なる意味が明確に表現されている場合を除いて、当業者によって与えられる通常の意味を有する。
【００３０】
方法、技術、要素、化合物および組成物が記載されているが、既に記載されたものと類似および／または同等の方法、技術、要素、化合物および組成物は、本発明の実施および／または試験において使用されることができるか、好ましい。
【００３１】
全ての特許および他の刊行物は、例えば、本発明に関して有用であり得る前記刊行物に記載された方法論を記載するおよび／または知らせる目的で、参照として含まれる。
【００３２】
本明細書に含まれる刊行物は、本出願の出願日より前の開示についてのみ提供されている。
【００３３】
この点に関して、著者および／または発明者が権利を与えられていないこと、または、前記刊行物が他の以前の刊行物より前の日付であることは、承認または容認、拒絶または排除として、または、他の何らかの理由によって、解釈されるべきではない。
【００３４】
本発明は、局所投与した場合、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４または任意の血清型、ハイブリッド、ならびに遺伝子の脳への移入を効率的に媒介することができるアデノ随伴ウイルス、好ましくはＡＡＶ２、好ましくはＡＡＶ２／２、好ましくは線条体および皮質（皮質）に基づくベクターを記載する。（図１０、１１および１２）。
【００３５】
これらのベクターの全身投与はまた、脳ならびに線条体および皮質の両方に効率的な遺伝子伝達をもたらす。ベクターＡＡＶ２およびＡＡＶ２／２によって媒介される遺伝子の伝達はより効率的であるが、全身投与の場合の伝達は、脳または線条体および皮質のみに限定されない。本発明は、成長因子ＩＧＦ２の発現をコードする遺伝子を有するベクターＡＡＶ２およびＡＡＶ２／２が、脳内、特に、線条体および皮質内の目的の因子群において、応答の生成を可能にすることを示す。特に、Ｉｇｆ２遺伝子がＣＡＧプロモーターの制御下にある発現カセットを含むＡＡＶ２／２ベクターの局所投与は、インビボでのハンチントン病の治療における改善を得る。（図１１と１２）。
【００３６】
Ｉ．一般的な用語および表現の定義
【００３７】
本明細書中で使用されるように、用語「アデノ随伴ウイルス」、「ＡＡＶウイルス」、「ＡＡＶビリオン」、「ＡＡＶウイルス粒子」、および「ＡＡＶ粒子」は、交換可能であり、少なくとも１つのＡＡＶキャプシドタンパク質（好ましくは、特定のＡＡＶ血清型のすべてのキャプシドタンパク質による）およびキャプシド形成されたＡＡＶゲノムのポリヌクレオチドから構成されるウイルス粒子をいう。粒子がＡＡＶ逆方向末端反復配列に隣接する異種ポリヌクレオチド（すなわち、哺乳動物細胞に送達される導入遺伝子などの野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を含む場合、典型的には、どちらかが「ＡＡＶベクター粒子」または「ＡＡＶベクター」と呼ばれる。ＡＡＶは、パルボウイルス科のデペンドウイルス属に属するウイルスを指す。ＡＡＶゲノムは、約４．７キロベースの長さであり、ポジティブセンスまたはネガティブセンスのいずれかである一本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）から構成される。ゲノムは、ＤＮＡ鎖の両端に逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）と、２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）：ＲＥＰおよびＣＡＰ（レプリカーゼおよびキャプシド）とを含む。ＲＥＰフレームは、ＡＡＶライフサイクルに必要とされるＲＥＰタンパク質（ＲＥＰ７８、ＲＥＰ６８、ＲＥＰ５２およびＲＥＰ４０）をコードする４つの重複遺伝子からなる。ＣＡＰフレームは、２０個のキャプシドタンパク質配列：ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３の重複ヌクレオチドを含む。これらは、図１５に示されるように、互いに相互作用して、正二十面体対称性を有するキャプシドを形成する（３０）。
【００３８】
本明細書中で使用される場合、用語「アデノ随伴ウイルスＩＴＲ」または「ＡＡＶ ＩＴＲ」とは、アデノ随伴ウイルスゲノムのＤＮＡ鎖の両端に反復して存在する逆方向末端をいう。ＩＴＲ配列は、ＡＡＶゲノムの効率的な増殖に必要とされる。これらの配列の別の性質は、フォークを形成するそれらの能力である。この特徴は、その複製に寄与する。これは、ＤＮＡの第二鎖とは別に、一次合成を可能にする。野生型ＡＡＶ ＤＮＡの宿主細胞ゲノムへの組込みおよびその救済、ならびに、その完全なアセンブリの生成と組み合わせたＡＡＶ ＤＮＡの効率的なキャプシド形成の両方にＩＴＲが必要であることも証明されている（２５）。
【００３９】
本発明で使用される場合、用語「ＡＡＶ２」および「ＡＡＶ２／２」は、アデノ随伴ウイルスの血清型２を指す。これは、以下のウェブサイト上にある受入番号ジェンバンクＪ０１９０１．１に定義されるようなゲノム配列を有する。
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/J01901.1
【００４０】
今日までに特徴付けられている１１個の血清型から、最も特徴付けられそして最も頻繁に使用されるものは、ＡＡＶ２である。異なる血清型間の違いは、それらの細胞向性によって決定される。ＡＡＶ２は、中枢神経系の細胞を感染させるための最も高い「親和性」を有するものの一つである。
【００４１】
本発明で使用されるように、用語「ＡＡＶベクター」はさらに、ＡＡＶ末端反復（ＩＴＲ）配列に隣接する１つ以上の目的のポリヌクレオチド（または導入遺伝子）を含むベクターを指す。前記ＡＡＶベクターは、それらがＲＥＰおよびＣＡＰ遺伝子をコードし、発現するベクター（すなわち、ＡＡＶタンパク質ＲＥＰおよびＣＡＰ）でトランスフェクトされている宿主細胞中に存在する場合、複製および感染性ウイルス粒子にパッケージングされる。宿主細胞は、Ｅ４またはｆ６アデノウイルスリーディングフレームのタンパク質をコードし、発現するベクターでトランスフェクトされている。ＡＡＶベクターがより大きなポリヌクレオチド（例えば、染色体、または、クローニングもしくはトランスフェクションに使用されるプラスミドなどの他のベクター）に組み込まれる場合、そのＡＡＶベクターは、通常「プロベクター」と呼ばれる。プロベクターは、ＡＡＶのパッケージング機能およびＥ４またはｆ６によって提供される必要な補助機能の存在下で、複製およびキャプシド形成によって「救済」される。
【００４２】
本発明で使用されるように、用語「ＣＡＰ遺伝子」または「ＡＡＶ ＣＡＰ遺伝子」は、ＣＡＰタンパク質をコードする遺伝子を指す。本明細書で使用される用語「ＣＡＰタンパク質」は、野生型ＡＡＶ（ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３）のＣＡＰタンパク質の少なくとも１つの機能的活性の活性を有するポリペプチドを指す。ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３タンパク質の機能的活性の例は、キャプシドの形成を誘発する能力、一本鎖ＤＮＡの蓄積を促進すること、キャプシド中のＡＡＶ ＤＮＡのパッケージングを促進すること（すなわちキャプシド化）、細胞受容体に結合すること、およびビリオンの宿主への侵入を促進することを含む。
【００４３】
本発明で使用されるように、用語「キャプシド」は、ウイルスゲノムがパッケージングされている構造を指す。キャプシドは、ＣＡＰタンパク質の構造サブユニットを有するオリゴマー構造からなる。例えば、ＡＡＶは、３つのキャプシドタンパク質：ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の相互作用によって形成された二十面体キャプシドを有する。
【００４４】
本明細書で使用されるように、用語「細胞組成物」は、本発明の細胞と、少なくとも１つの他の成分とを含む複合型材料を指す。組成物は、単一製剤として製剤化されることもできるし、または各成分の別々の製剤として提供することもできる。これは、併用製剤として、組み合わせ使用のために組み合わせられる。組成物は、各成分が個別に処方され、包装されているパーツキットである。
【００４５】
本発明で使用されるように、用語「構成的プロモーター」は、プロモーターを指す。このプロモーターの活性は、細胞の環境条件および外部条件をほとんどまたは全く考慮せずに、生命体のいたるところで、または、ほとんどの実験段階の間、比較的一定レベルに維持される。
【００４６】
本明細書中で使用される場合、用語「発現カセット」とは、核酸の一連の特定の要素を有し、組換えまたは合成によって生成される核酸の構築物をいう。これは、標的細胞において、特定の核酸の転写を可能にする。
【００４７】
本明細書中で使用される場合、用語「ヘルパー機能を提供する遺伝子」とは、ＡＡＶが複製に依存している機能（すなわち、「ヘルパー機能」）を実行するポリペプチドをコードする遺伝子をいう。補助機能は、ＡＡＶ複製に必要な機能を含む。これは、ＡＡＶ遺伝子転写の活性化、ＡＡＶ ｍＲＮＡの特異的スプライシング工程、ＡＡＶ ＤＮＡの複製、ＣＡＰ生成物の合成、およびＡＡＶキャプシドの集合に関与するフラグメントを含む。アクセサリーウイルス機能は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、およびワクシニアウイルスなどの任意の公知のヘルパーウイルスに由来する。補助機能としては、限定されないが、ＷＨＶレンチウイルスが挙げられる。
【００４８】
本明細書中で使用される場合、用語「局所的に投与される」とは、本発明のポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチド、および／または薬学的組成物が特定の部位またはその近くで、被験体に投与されることを意味する。
【００４９】
本明細書において、用語「薬学的に許容される担体」、「薬学的に許容される希釈剤」、「薬学的に許容される賦形剤」または「薬学的に許容されるビヒクル」は、交換可能であり、無毒性、半固体または液体充填剤、希釈剤またはカプセル化材料、または任意の従来型のための補助配合物を指す。薬学的に許容される担体は、投与量および濃度で使用される受容体に対して本質的に無毒である。そしてそれは、製剤の他の成分と適合性がある。薬学的に許容されるビヒクルの数および性質は、所望の投与形態に依存する。薬学的に許容される担体は、公知であり、当該分野で周知の方法により調製される。（２４）
【００５０】
本明細書中で使用される場合、用語「プロモーター」は、核酸をいう。その核酸は、１つ以上のポリヌクレオチドの転写を制御するように働き、ポリヌクレオチド配列の上流に位置し、そして、ＤＮＡ依存性ＲＮＡ−ポリメラーゼ結合部位、転写開始部位、および他の任意のＤＮＡ配列（転写因子結合部位、リプレッサー、アクチベータータンパク質結合部位、ならびにプロモーターからの転写量を調節するために当技術分野で直接的または間接的に知られている他の任意のヌクレオチド配列を含むがこれらに限定されない）の存在によって、構造的に同定される。「組織特異的」プロモーターは、ある種の分化細胞または組織においてのみ活性化される。
【００５１】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドをそれぞれ含む、核酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかをいう。核酸は、二本鎖、一本鎖であってもよく、または二本鎖もしくは一本鎖配列のいずれかの部分を含む。用語「ポリヌクレオチド」は、特に限定されないが、ポリペプチドをコードする能力を有する核酸配列、および細胞の内因性ポリヌクレオチドに部分的または全体的に相補的な核酸配列、またはそれらと処置される対象を含む。その結果、その転写後に、それは、内在性ポリヌクレオチドの発現をハイブリダイズしそしてその発現を阻害することができるＲＮＡ分子（例えば、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ）を生成する。
【００５２】
本明細書において、用語「ストランド」は、連続したヌクレオチドの配列（修飾天然ヌクレオチドまたは非天然ヌクレオチドを含むか含まない）を指す。２本以上のストランドは、別々の分子であるか、またはその一部を形成することができ、または例えばポリエチレングリコールなどのリンカーなどのカップリングによって共有結合的に相互接続して、分子を形成することができる。少なくとも１つの鎖は、標的ＲＮＡに対して十分に相補的な領域を含み得る。
【００５３】
本明細書中で使用される場合、用語「組換えウイルスゲノム」は、野生型ＡＡＶゲノムにおける発現に対して、外来性の少なくとも１つのポリヌクレオチドカセットが挿入されているＡＡＶゲノムをいう。
【００５４】
本明細書中で使用される場合、用語「ｒｅｐ遺伝子」または「ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子」は、Ｒｅｐタンパク質をコードする遺伝子をいう。本明細書で使用される用語「Ｒｅｐタンパク質」は、ＡＡＶ天然ｒｅｐタンパク質（例えば、Ｒｅｐ４０、５２、６８、７８）の少なくとも１つの機能的活性を有するポリペプチドを指す。Ｒｅｐタンパク質（例えばＲｅｐ４０、５２、６８、７８）の「機能的活性」は、タンパク質の生理学的機能に関連する任意の活性（認識、結合、およびＡＡＶ ＤＮＡ複製起点の切断によるＤＮＡ複製の促進を含む）、ならびにＤＮＡヘリカーゼ活性である。さらなる機能としては、ＡＡＶ（または他の異種）転写プロモーターの調節、および宿主染色体へのＡＡＶ ＤＮＡの部位特異的組み込みが挙げられる。
【００５５】
本明細書中で使用される場合、用語「被験体」は、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、チンパンジーまたは他のサルおよびサルの種）、動物（例えば、鳥、魚、牛、羊、豚、山羊、馬）、哺乳動物（例：犬や猫）、実験動物（例えば、マウス、ラット、サイレント遺伝子を持つマウス（ノックアウトマウス）、遺伝子を過剰発現するマウス（トランスジェニックマウス）およびモルモットなどの齧歯動物）などの個体、植物、哺乳動物または動物をいう。この用語は、特定の年齢や性別を表すものではない。用語「被験体」は、胚および胎児を含む。
【００５６】
本明細書中で使用される場合、用語「全身投与される」および「全身投与」は、本発明のポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチド、または薬学的組成物が非局所化形態で被験体に投与されることを意味する。本発明のポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチド、または医薬組成物の全身投与は、被験体の体中のさまざまな器官または組織に到達するか、または、被験体の新たな特定の組織または器官に到達することができる。例えば、本発明の医薬組成物の静脈内投与は、被験体中の複数の組織または器官における形質導入をもたらす。本発明に関して、それはまた、全身的に作用する本発明のポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチドまたは医薬組成物が、ニューロン神経細胞とまたはそれに近接して、または、非ニューロン神経細胞とまたはそれに近接して、細胞内または細胞外で作用することを意味する。
【００５７】
本明細書中で使用される場合、用語「形質導入」は、外来ヌクレオチドの配列がウイルスによって細胞内に導入されるプロセスをいう。
【００５８】
本明細書中で使用される場合、用語「トランスフェクション」は、レシピエント真核細胞へのＤＮＡの導入をいう。
【００５９】
本明細書中で使用される場合、用語「ベクター」は、宿主細胞において、１つ以上の目的のポリヌクレオチドを送達することができ、そして場合により発現することができる構築物をいう。ベクターの例としては、特に限定されないが、ウイルスベクター、ＤＮＡまたは裸のＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミドまたはファージベクター、カチオン性縮合剤と会合したＲＮＡまたはＤＮＡ発現ベクター、リポソームに封入されたＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、およびプロデューサー細胞などの真核細胞などが挙げられる。ベクターは、安定であり、自己複製する。使用できるベクターの種類に関して、制限はない。ベクターは、増殖に適し、ポリヌクレオチド、遺伝子構築物、または様々な異種生物に組み込まれた発現ベクターを得るのに適したクローニングベクターである。適切なベクターには、原核生物発現ベクター、ファージおよびシャトルベクター、ならびにウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ならびにレトロウイルスおよびレンチウイルス）に基づく真核生物発現ベクター、ならびに非ウイルスベクターが含まれる。
【００６０】
本明細書中で使用される場合、用語「ＤＡＲＰＰ」は、ｍＨｔｔの発現によって影響を受ける主要なニューロンである中型有棘ニューロン（ＭＳＮ）のマーカーとして使用されるドーパミン調節リンタンパク質である。その発現は、生存能力マーカーとして用いられる。
【００６１】
本明細書中で使用される用語ＩＧＦ２は、それ自体がＩＧＦ２ポリペプチドを指すが、ＨＡエピトープに結合した変異体も指す。
【００６２】
本発明の方法および組成物、例えば、インサートＩＧＦ２−ＨＡまたは単にＩＧＦ２を有するＡＡＶの方法および組成物は、本発明に記載の任意の投与量および／または製剤と共に、ならびに、本発明に記載の任意の投与経路で使用される。
【００６３】
用語「ハンチントン病の改善」は、本発明で定義されるように、精神医学的、行動的、および運動的症状の改善、ならびに、異なる種および／または対象におけるハンチンチン凝集体の減少を指す。
【００６４】
用語「ｃＤＮＡ」または「相補的ＤＮＡ」は、それがＲＴ―ＰＣＲによって合成されるＲＮＡに完全に相補的なＤＮＡ配列を指す。
【００６５】
本明細書中で使用される場合、用語「相補的」は、安定で特異的な結合が化合物と標的ＲＮＡ分子との間で生じる十分な程度の相補性を示すために使用される。特異的結合は、特異的結合が望まれる条件下、すなわち、インビボアッセイまたは治療的処置の場合における生理学的条件下、あるいはアッセイが行われた条件下のインビトロアッセイの場合における生理学的条件下で、非標的配列へのオリゴマー化合物の非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性を必要とする。
【００６６】
リガンド
【００６７】
薬理学的性質を含むウイルスの性質は、例えば、リガンドの導入によって、影響を受け、調整される。さらに、ウイルス剤の薬理学的性質は、薬剤およびウイルスの製剤中にリガンドを組み込むことによって増強される。
【００６８】
リガンドは、例えばウイルス剤に結合するリガンド、または、例えばリガンド結合モノマーサブユニットのビヒクルとの結合体もしくは製剤添加物として使用することができるリガンドなど、多種多様な実在物に結合することができる。実施例は、リガンド結合モノマーサブユニットの文脈で以下に記載されるが、それは単に好ましいものであり、実在物は他の点でウイルスと結合される。
【００６９】
リガンドは、それが組み込まれているウイルス剤の分布、方向、または寿命を変える。好ましい実施形態では、リガンドは、例えば、この配位子が存在しない種と比較して、選択された標的、例えば、分子、細胞、または細胞型、コンパートメント、例えば、細胞または器官コンパートメント、組織、または身体の領域に対してより優れた親和性を提供する。
【００７０】
リガンドは、本発明の場合、ウイルスの標的分子の輸送、ハイブリダイゼーション、および特異性を改善することができる。
【００７１】
リガンドは、一般に、例えば、個体における分子の吸収を改善するために治療修飾剤、例えば、分布を監視するための診断化合物またはレポーターグループ、架橋剤、免疫反応に対する耐性を付与する部分、および、天然または異常な核酸塩基を含む。
【００７２】
一般的な例としては、親油性分子、脂質、レクチン（例えば、ヘシゲニン、ジオスゲニン）、テルペン（例えば、トリテルペン、例えば、サルササポゲニン、フレデリン、エピフリデラノール誘導体化リトコール酸）、ビタミン、炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、合成ポリマー［例えば、オリゴ乳酸１５量体］および天然ポリマー［例えば、低分子量および中分子量を有する］、イヌリン、シクロデキストリン、またはヒアルロン酸）、タンパク質、タンパク質結合剤、インテグリン標的分子、ポリカチオン、ペプチド、ポリアミン、およびペプチド模倣物などが挙げられる。他の例には、上皮細胞またはトランスフェリンなどの葉酸受容体リガンドが含まれる。
【００７３】
リガンドは、合成ポリマー、例えば、合成ポリアミノ酸などの天然の組換え合成形態で示される分子である。ポリアミノ酸の例には、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）、ポリ−Ｌ−アスパラギン酸、ポリ−Ｌ−グルタミン酸、スチレン−無水マレイン酸コポリマー、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）コポリマー、ジビニルエーテル−無水マレイン酸、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＭＰＡ）コポリマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−エチルアクリル酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマー、またはポリホスファジンなどが含まれる。ポリアミンの例には、ポリエチレンイミン、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、シュードペプチド−ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性部分、例えば、チオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの第四級塩、またはアルファヘリックスペプチドなどが含まれる。
【００７４】
リガンドはまた、標的化グループ、例えば、細胞または組織への標的化剤、例えば、チロトロピン、メラノトロピン、界面活性剤プロテインＡ、ムチン炭水化物、グリコシル化ポリアミノ酸、ビスホスホネート、ポリグルタメート、ポリアスパラギン酸、またはＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチド、またはＲＧＤペプチド模倣物を含む。
【００７５】
リガンドは、タンパク質、例えば、糖タンパク、リポタンパク質、例えば、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）またはアルブミン、例えば、血清アルブミン、またはペプチド、例えば、コリガンドに対して特異的親和性を有する分子、または抗体、例えば、特定の細胞型に結合する抗体などである。リガンドは、ホルモンおよびホルモン受容体も含む。それらはまた、補因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、多価マンノース、または多価フコースなどの非ペプチド種を含む。
【００７６】
リガンドは、基質、例えば、細胞の細胞骨格を変化させることにより、例えば、微小管、マイクロフィラメント、および／または細胞のフィラメント中間体を変化させることにより、例えば、細胞内のウイルス剤の吸収を増大させることができる薬剤である。
【００７７】
一態様では、リガンドは、脂質、または脂質ベースの分子である。この脂質またはこの脂質ベースの分子は、好ましくは、乳清タンパク質、例えば、血清アルブミンに結合される。
【００７８】
別の実施形態では、以前に命名されたものに、ウイルスが詰め込まれる。
【００７９】
ウイルスの注射用溶液は、必要な濃度のウイルスをＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）で希釈することによって調製される。その処方は、以下の通りである。
【００８０】
ＰＢＳ １倍
１．以下の物質を含む８００ｍｌの蒸留水にウイルス用量を溶解する。
８ｇのＮａＣｌ
０．２ｇのＫＣｌ
１．４４ｇのＮａ２ＨＰＯ４
０．２４ｇのＫＨ２ＰＯ４
２．ＨＣｌでｐＨを７．４に調整する。
３．追加の蒸留水Ｈ２Ｏを用いて容量を１Ｌに調整する。
４．滅菌してオートクレーブに入れる。
【００８１】
デザインと選択
【００８２】
ハンチンチンの変異型の発現を制御することは、ハンチントン病を改善または治療するための鍵となる。
【００８３】
細胞内には、誤って折り畳まれたタンパク質を分解することができるいくつかのメカニズムがある。これは、ＥＲおよびオートファジーに関連する分解を含む。しかしながら、特定のタンパク質を選択的に分解することは非常に難しい。それにもかかわらず、今日までに行われた研究は、ＩＧＦ２が何らかの方法でハンチンチンの発現を減少させることができ、従って、その毒性機能を減少させることを示している。
【００８４】
局所タンパク質合成の調節を必要とすることに加えて、ハンチントン病の寛解または治療は、様々な膜受容体およびイオンチャネルの合成および輸送、カルシウムシグナル伝達の増加、膜の合成、およびタンパク質複合体の集合を含む分泌経路における他の側面を含む。しかしながら、ＩＧＦ２の独特の機能は、線条体および皮質において、優先的に見つかったが、排他的には見つからなかった。
【００８５】
本明細書に記載の適用例は、ＩＧＦ２がｍＨｔｔの発現を減少させ、ニューロンの生存能力を増加させるという証拠を提供する。これは、ハンチントン病の発症を遅らせる。
【００８６】
治療としてのその使用の生物医学的範囲を分析するとき、効果的かつ革新的な方法がハンチントン病を改善または治療するために提供された。この技術の使用は、その用途において驚くべき結果を生み出している。
【００８７】
実験的には、ＨＤとの関連でＩＧＦ２を過剰発現させると、ポリグルタミンペプチドの凝集体、ならびに変異型ハンチンチンが劇的に減少することが報告されている。加えて、神経保護効果が観察され、中型有棘ニューロンの生存率が増加した。
【００８８】
ＨＤモデルを用いた以前の研究は、ＣＮＳニューロンにおける転写因子ＸＢＰ１の欠乏がこの疾患において神経保護効果を有し、凝集体の量を減少させ、そして、ニューロン生存能力を改善すると結論付けた。（これは、用途の例で見られる）。
【００８９】
神経系のＸＢＰ１欠損を有する動物で観察された保護効果の根底にある可能性のあるメカニズムを定義するために、グローバルプロファイル分析は、ハンチントンモデルＹＡＣ １２８を使用するＨＤの状況において、ＸＢＰ１欠損マウスの線条体および大脳皮質を含む、５３匹の動物の遺伝子発現に関して行われた。この研究から、図１に見られるように、ＩＧＦ２が遺伝子として得られた。その発現は、ＸＢＰ１欠失によって最も影響を受けた。さらに、これは、ＸＢＰ１欠損マウスのｍＲＮＡが配列決定された、並行して行われた研究と一致した唯一のものであった。
【００９０】
これらの結果は、ｑＰＣＲ（定量的ＰＣＲ）によって、ＸＢＰ１欠損マウスの脳の異なる領域におけるＩｇｆ２のレベルを測定することによって確認された。図２にそれぞれ示すように、内因性レベルのＩｇｆ２ ｍＲＮＡが皮質および線条体において有意に増加することが観察された。これらのデータは、ＩＧＦ２が何らかの方法で、ＸＢＰ１ ＫＯマウスで観察された防御に関与していることを示している。
【００９１】
ＨＤへのＩＧＦ２の寄与を研究するために、ニューロ２ａ細胞において、ＧＦＰと融合したポリＱ７９ペプチドを一時的に発現する細胞モデルにおいてその活性を調べた。ニューロ２ａ細胞におけるＩＧＦ２とポリＱ７９−ＧＦＰの同時発現は、蛍光画像、ウエスタンブロットおよびフィルタートラップを含む３つの異なる方法論の評価、大きなサイズの凝集体を評価することを可能にする技術（図３、４、５）に従って、タンパク質封入体および凝集体の数を劇的に減少させた。
【００９２】
次に、観察された効果が分泌されたＩＧＦ２またはその細胞内蓄積によるものであるかどうかを試験した。したがって、ペプチドポリＱ７９またはｍＨＴＴＱ８５−ＧＦＰは、ＩＧＦ２を豊富に含む培地の存在下で、ニューロ２ａ細胞に発現された。一貫して、ＩＧＦ２は、ポリＱと、ｍＨｔｔとの凝集体を減少させた（図６および７）。
【００９３】
一方、ＩＧＦ２が既存のｍＨｔｔ凝集体を「元に戻す」ことができたかどうかを決定した。この目的のために、ポリＱ７９−ＧＦＰまたはＧＦＰ−ｍＨＴＴＱ８５を既に発現するニューロ２ａ細胞をＩＧＦ２リッチ培地で処理した。以前の実験シナリオで観察されたように、ＩＧＦ２は、両方の実験パラメーターにおいて、タンパク質凝集体を有意に減少させた（図８、９）。
【００９４】
全体として、以前に得られた結果は、細胞培養アッセイにおいて、強力な抗凝集効果を実証している。
【００９５】
現在の開発の自然な継続は、ＡＡＶ２／２型のアデノ随伴ウイルスを用いた、インビボでの予備実験の実施である（２６）。このウイルスの配列内で、ＨＡエピトープで標識されたＩＧＦ２のバージョンは、ペプチドの発現をよりよく検出するためにクローニングされた。第一のアプローチでは、ｍＨｔｔを発現するウイルス粒子をＩＧＦ２の存在下または非存在下で注射した。２週間後、これらの動物の線条体を分析したところ、図１０に示すように、変異型ハンチンチン発現レベルの低下が観察された。
【００９６】
より生理学的なアプローチでは、変異型ヒトハンチンチンを発現するトランスジェニック動物（ＹＡＣ１２８モデル）を治療した。１〜２日齢の新生児動物にＡＡＶ−ＩＧＦ２−ＨＡを脳室内注射した。６ヶ月後、動物を屠殺して、組織を得た。ＡＡＶで処置した後、図１１に示すように、対照条件に対して、ＩＧＦ２−ＨＡを注射した動物において、ｍＨｔｔ発現の顕著な減少が観察された。同様に、成人も治療された。これらの動物に３ヶ月齢でＡＡＶ−ＩＧＦ２／ＨＡを注射し、６ヶ月齢で屠殺して組織を得た。図１２に見られるように、ＩＧＦ２−ＨＡによる処置は、対照条件と比較して、ｍＨｔｔ発現レベルを減少させた。
【００９７】
また、前記研究内で、図１３に示すように、ＩＧＦ２で修飾されたＡＡＶに曝露されたＨＤを有するマウスにおいて、運動改善を検証するためにいくつかの研究が行われた。
【００９８】
一方、ＨＤ患者および対照個体からの尾状核／被殻のタンパク質抽出物中のＩＧＦ２レベルを測定する実験を行った。結果は、ＨＤ患者では、ＩＧＦ２の含有量がほとんど発現されないことを示した。これは、病理学の発達において、その意味を示唆している。この特許で提案されていることによれば、図１９に示すように、本特許は、ＩＧＦ２の生理学的レベルの回復も達成し、疾患の症状を改善すると我々は考えている。
【００９９】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の発生に関して、それは、目的のポリヌクレオチドに作動可能に結合された海馬組織−特異的転写調節領域を含む発現カセットを含むウイルス組換えゲノムを含む。
【０１００】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、一般に、４２個の血清型に対応し、パルボウイルスに由来する。一般に、異なるＡＡＶ血清型は、アミノ酸および核酸レベルで有意な相同性を有するゲノム配列である。それらは、同一の遺伝機能を提供し、機能的および物理的用語において本質的に同一の振動を提供し、そして、それらの複製および集合は実際上同じメカニズムを使用する。
【０１０１】
特に、表Ｉ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１）に示すように、アクセス番号Ｊ０１９０１．１を有するＡＡＶ血清型２／２（ＡＡＶ２／２）を本発明において使用した。
【０１０２】
本発明によるＡＡＶゲノムは、シス５’アクチュエータおよび３’で逆方向末端反復配列、ならびに発現カセットを含む。ＩＴＲまたはＬＴＲ配列は、１４１塩基対の長さである。好ましくは、ＬＴＲの全配列は分子中で使用され、そして配列のわずかな修飾のみが許容される。本発明の好ましい態様において、ＡＡＶ組換えゲノムは、５’および３’ＡＡＶ ＬＴＲを含む。
【０１０３】
一方、ＩＴＲは、他のＡＡＶ血清型に由来する。
【０１０４】
本発明のＡＡＶは、任意の血清型のキャプシドを含む。特に、本発明においては、血清型２由来のキャプシドが好ましい。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、本発明の方法で使用するためのＡＡＶキャップは、ＡＡＶキャップの１つまたはそのコード核酸の突然変異誘発（すなわち挿入、欠失、または置換）によって生成される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶキャップは、前記ＡＡＶキャップと同様に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％以上である。
【０１０６】
いくつかの態様において、ＡＡＶキャップは、キメラである。それは、２、３、４、またはそれ以上の前記ＡＡＶキャップのドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶキャップは、単量体ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３のモザイクであり、２つまたは３つの異なるＡＡＶまたは組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）に由来する。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ組成物は、２つ以上の前述のＣＡＰＳを含む。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ組成物に使用するためのＡＡＶ ＣＡＰは、異種配列または他の修飾を含むように設計されている。例えば、選択的標的化または免疫回避を付与するペプチドまたはタンパク質配列は、遺伝子操作によってＣａｐタンパク質に修飾される。あるいは、またはさらに、キャップは、ｒＡＡＶの表面が特定の化学修飾物（例えば、ポリエチレングリコールなど）を示すように、化学修飾されることができる。これは、免疫回避を容易にすることができる。Ｃａｐタンパク質は、（例えば、その天然の結合受容体を除去するために、または免疫原性エピトープを隠すために）変異誘発されることもできる。
【０１０８】
一実施形態では、ＡＡＶベクターは、以下の表から選択されるマウス起源のＩｇｆ２またはＩｇｆ２−ＨＡ配列を付加したプロモーターを含む。表ＩＶ（Ｉｇｆ２）（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４）および表Ｖ（Ｉｇｆ２−ＨＡ）（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５）、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０１０５１４．３、ＮＭ＿００１１２２７３６．２、ＮＭ＿００１１２２７３７．２、ＮＭ＿００１３１５４８８．１、およびＮＭ＿００１３１５４８９．１。これらは、転写変異体１、２、３、４、および５に対応しており、そのタンパク質産物が同一であり、配列表または表に示される配列によってコードされる。
【０１０９】
一実施形態では、ＡＡＶベクターは、以下の表から選択されるヒト起源のＩｇｆ２またはＩｇｆ２−ＨＡ配列を付加したプロモーターを含む。表ＶＩＩ（ヒトＩｇｆ２）（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６）、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０００６１２．５、ＮＭ＿００１００７１３９．５、ＮＭ＿００１１２７５９８．２、ＮＭ＿００１２９１８６１．２、およびＮＭ＿００１２９１８６２．２。これらは、転写変異体１、２、３、４および５に対応しており、これらのタンパク質産物は同一であり、配列表および表に表される配列によってコードされる。
【０１１０】
一実施形態では、ＡＡＶベクターは、表ＩＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４）から選択される、少なくとも１つのＩｇｆ２配列を付加した真核生物発現プロモーターを含み、表ＩＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２）に示すような配列を得る。
【０１１１】
一実施形態では、ＡＡＶベクターは、表Ｖ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５）から選択される少なくとも１つのＩｇｆ２―ｈａ配列を付加した真核生物発現プロモーターを含み、表ＩＩＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３）に示されるような配列を得る。
【０１１２】
一実施形態では、ＡＡＶベクターは、少なくとも１つのヒトＩｇｆ２配列を付加した真核生物発現プロモーターを含む。これは、表ＶＩＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６）から選択される。
【０１１３】
一実施形態では、ＡＡＶベクターは、前述のリスト、表ＩＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２）および表ＩＩＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３）から選択される配列に対して、８５％の相同性を有する少なくとも１つの配列を付加したプロモーターを含有する。
【０１１４】
一実施形態では、ＡＡＶベクターは、前述の表から選択される配列に対して、７０％の相同性を有する少なくとも１つの配列を付加したプロモーターを含む。
【０１１５】
一実施形態では、ＡＡＶベクターは、前述の表から選択される配列と機能的に等価である少なくとも１つの配列を付加したプロモーターを含む。
【０１１６】
転写調節領域は、プロモーター、および必要に応じてエンハンサー領域を含む。好ましくは、プロモーターは、真核生物遺伝子発現プロモーターであり、以下のリストから選択される。とりわけ、ＣＡＧ（ＣＡＧは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時型エンハンサーエレメント、プロモーター、第１エクソン、およびニワトリベータアクチン遺伝子の第１イントロンに対応する配列を含むプロモーター、ならびに、ウサギベータグロビン遺伝子のスプライシング受容体である）、ＣＭＶ、ｂグロビン、ＣＢＡ、ｅｌＦアルファなどがある。エンハンサーは、神経組織に特異的である必要はない。
【０１１７】
一実施形態では、プロモーターは、特異的であり、サイトメガロウイルスまたはＣＭＶプロモーターである。
【０１１８】
一実施形態では、プロモーターは、特異的であり、ｂ−グロビンである。
一実施形態では、プロモーターは、特異的であり、ＣＡＧである。
一実施形態では、プロモーターは、特異的であり、ｅｌＦアルファとしても知られているヒト伸長因子−１アルファである。
【０１１９】
別の実施形態では、本発明のＡＡＶの一部を形成する発現カセットは、転写後調節領域をさらに含む。好ましい実施形態では、転写後調節領域は、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後領域（ＷＰＲＥ）または機能的変異体およびそのフラグメント、ならびにＰＰＴ―ＣＴＳまたは機能的変異体およびそのフラグメント自体である。特定の実施形態では、転写後調節領域は、ＷＰＲＥである。
【０１２０】
本発明によるＡＡＶの一部を形成する発現カセットは、「目的のポリヌクレオチド」を含む。好ましい態様において、目的のポリヌクレオチドは、全身的に作用するタンパク質をコードする。別の実施形態では、目的のポリヌクレオチドは、ニューロン内で作用するタンパク質をコードする。好ましい実施形態では、前記ニューロン内で作用するタンパク質は、ＩＧＦ２であり、細胞内位置が異なるその任意のアイソフォーム、および任意のエピトープで標識された任意のアイソフォームを含む。
【０１２１】
ＡＡＶベクターのパッケージングサイズ制限は、野生型ＡＡＶゲノムのサイズに制限される。これは、ＡＡＶ血清型に従ってサイズが異なる（すなわち、４０８７〜４７６７の間）。例えば、野生型ＡＡＶ−２は、およそ４．７ｋＢのゲノムサイズを有する。いくつかの実施形態において、組換えＲＮＡベクターのクローニング能力は制限され、所望のコード配列は、４．８キロベースのウイルスゲノムの完全な置換を含む。したがって、いくつかの場合、大型の遺伝子は、標準的な組換えＡＡＶベクターでの使用には適していない。当業者であれば、限られたコード化能力を克服するための選択肢が利用可能であることを理解する。例えば、２つのゲノムのＡＡＶ ＩＲＴは、ハイブリダイズして、ヘッドトゥテイルコンカテマーを形成する。これは、ベクターの容量をほぼ２倍にする。スプライス部位の挿入は、転写後のＩＴＲの除去を可能にする。限定されたクローニング容量を克服するための他の選択肢は、当業者には明らかである。
【０１２２】
投与経路
【０１２３】
ウイルスの投与経路は、血液脳関門を通過して、標的ニューロンに感染する。
この目的を達成するために、２つの投与経路が本発明において定義されている。
【０１２４】
これらの経路の最初のものは鼻（２７）である。通常、鼻経路で投与された薬は、血液を全身循環に進入させることができ、脳に直接浸透させることができ、または、場合によっては両方の経路をたどることができる。しかしながら、これらの経路のそれぞれを通る薬物の流れを制御する要因の多くは、完全には定義されていない。一般に、鼻腔内に投与された薬物が移動することができる３つの経路がある。これらの経路（２７）は、鼻粘膜（２８）を介した体循環への直接進入、ニューロンを介した軸索輸送による嗅球への進入、および脳への直接進入（２９）を含む。様々なモデル基質に対するこれらの経路のそれぞれの役割を裏付ける証拠を、異なる種類のウイルスについて以下に要約する。
【０１２５】
2020501613.tif 000024
【０１２６】
この表は、本質的に網羅的なものであることを意図していない。むしろ、さまざまなクラスの溶質のいくつかは、１つ以上の経路をたどることを示しているものを強調することを意図している。
【０１２７】
ＣＮＳ細胞への他の投与経路は（２８）は、次のことを含む。
眼の硝子体液のような流動性空間への直接注射、あるいは、脈絡叢、上衣／髄膜層への送達のために、そこからこれらの層内に広がるプロセスを介して隣接する脳への、異なる経路（脳室内または髄腔内（＊＊））を経由した脳脊髄液への直接注射、一時的な浸透圧または薬理学的破壊と組み合わされた動脈内注射によって血液脳関門または血液腫瘍関門を通過する経路などである。
【０１２８】
用語（＊＊）髄腔内（intra + teca、「鞘内」）は、鞘内の解剖学的空間または潜在的な空間、最も一般的には、脳のくも膜または脊髄に発生するまたは導入されるものを指す形容詞である。
【０１２９】
線量計算
Ulusoy et al（２９）によると、ベクターの滴定は、１０１０〜１０１２ ｇｃ／ｍｌの試験用量で、１ ｍｌあたり１０９〜１０１３コピーのゲノム（ＣＧ）の範囲を必要とする。他方、滴定するためのベクターの希釈率がどのようなものであっても、それらは、１０１１ ｇｃ／ｍｌの低い中程度の範囲を持たなければならない。これは、毒性の消失をもたらす。
【０１３０】
ヒトへの投与量
ヒトにおける用量範囲は、１０９〜１０３０ウイルス単位／体重ｋｇの範囲にある。これは、この範囲を異なる年齢群における適用に制限することなく、または年齢または病理学によって改変された分布量を伴う。
【０１３１】
物質の最大濃度またはレベルは、実験または観察により見出され、定義された暴露条件下で、標的生物の、形態、機能的能力、成長、発達または寿命に検出可能な有害な変化を引き起こさず、同一の種および系統の通常の（対照）生物で観察されるものと区別できる。
【０１３２】
適用方法
先端直径が約６０〜８０ミクロンのガラスキャピラリーを備えた５μｌハミルトンシリンジを用いて、ｒＡＡＶ２ベクターを線条体に両側注射した。適切な濃度のウイルス粒子を含有する２マイクロリットルの緩衝液を０．４μｌ／分の速度で注入した。注射をしてから５分後に針をゆっくり抜く。
【図面の簡単な説明】
【０１３３】
図１
この図は、優れた遺伝子のセットを表す。その遺伝子の発現は、ＨＤとの関連でＸＢＰ１欠損動物において行われた遺伝子発現の研究において変動した。ＩｇＦ２、Ｍｍｐ１４、Ｌｒｐ４、およびＵｈｒｆのレベルは、ＸＢＰ１欠損同腹子および対照動物において、ヒト変異ハンチンチン（ＹＡＣ１２８）を有するトランスジェニックマウスにおいて、皮質および線条体の両方の異なる群において変化した。
Ｉｇｆ２遺伝子の上方調節は、皮質および線条体の両方において明らかに見られる。
【０１３４】
図２
図１に示された研究において得られた結果は、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって確認された。この図は、左側に皮質の結果を、右側に線条体の結果を示し、それらの脳におけるＸＢＰ１欠損マウスモデルにおけるＩｇｆ２ ｍＲＮＡの上方調節を示している。この技術により、内因性Ｉｇｆ２ ｍＲＮＡレベルがＸＢＰ１欠損動物の皮質および線条体において有意に増加することが観察された。
全てのインビボ実験について、ｎ＝５、ｔ−スチューデント＊＊ｐ＜０．０５を用いた。
【０１３５】
図３
この図は、ハンチントン病のニューロ２ａ細胞モデルにおいて、ＩＧＦ２の発現がｍＨＴＴ凝集体のレベルをどのように低下させるかを示している。
特に、ニューロ２ａ細胞をポリＱ７９−ＥＧＦＰおよびＩＧＦ２または対照用のベクターで一過性にトランスフェクトした。続いて、ポリＱの凝集体を評価し、定量した。
この図は、トランスフェクションの２４および４８時間後の、蛍光顕微鏡による写真およびその右側に蛍光の定量化を表す。
全てのインビボ実験について、ｎ＝３、ｔ−スチューデント＊＊＊ｐ＜０．００１を使用した。
【０１３６】
図４
この図は、ハンチントン病についてのニューロ２ａ細胞モデルにおいて、ＩＧＦ２発現がどのようにポリＱペプチド凝集体のレベルを低下させるかを示す。
特に、ニューロ２ａ細胞をポリＱ７９−ＥＧＦＰおよびＩＧＦ２または対照用のベクターで一過性にトランスフェクトした。続いて、ポリＱの凝集体を評価し、定量した。
この図は、トランスフェクションの２４および４８時間後のウエスタンブロットの写真およびその右側に定量化を示す。
全てのインビボ実験について、ｎ＝３、ｔ−スチューデント＊＊＊ｐ＜０．００１を使用した。
【０１３７】
図５
この図は、ハンチントン病についてのニューロ２ａ細胞モデルにおいて、ＩＧＦ２発現がどのようにポリＱペプチド凝集体のレベルを低下させるかを示す。
特に、ニューロ２ａ細胞をポリＱ７９−ＥＧＦＰおよびＩＧＦ２または対照用のベクターで一過性にトランスフェクトした。続いて、ポリＱの凝集体を評価し、定量した。
この図は、トランスフェクションの２４および４８時間後のフィルタートラップの写真およびその右側に定量化を示す。
全てのインビボ実験について、ｎ＝３、ｔ−スチューデント＊＊＊ｐ＜０．００１を使用した。
【０１３８】
図６
この図は、ハンチントン病のニューロ２ａ細胞モデルにおいて、ＩＧＦ２の発現がｍＨＴＴ凝集体のレベルをどのように低下させるかを示す。
特に、ニューロ２ａ細胞を、ＩＧＦ２富化培地または対照の存在下で、ポリＱ７９−ＥＧＦＰ、ｍＨＴＴＱ８５−ＧＦＰ用のベクターで一過性にトランスフェクトした。タンパク質凝集を２４時間後に評価および定量した。
この図は、トランスフェクションの２４時間後の蛍光顕微鏡による写真およびその右側にその蛍光の定量化を示す。
全てのインビトロ実験について、ｎ＝３、ｔ−スチューデント＊＊＊ｐ＜０．００１を使用した。
【０１３９】
図７
この図は、ハンチントン病のニューロ２ａ細胞モデルにおいて、ＩＧＦ２の発現がｍＨＴＴ凝集体のレベルをどのように低下させるかを示す。
特に、ニューロ２ａ細胞を、ＩＧＦ２富化培地または対照の存在下で、ポリＱ７９−ＥＧＦＰ、ｍＨＴＴＱ８５−ＧＦＰ用のベクターで一過性にトランスフェクトした。タンパク質凝集を２４時間後に評価および定量した。
この図は、トランスフェクションの２４時間後のウエスタンブロットによる写真およびその右側に定量化を示す。
全てのインビトロ実験について、ｎ＝３、ｔ−スチューデント＊＊＊ｐ＜０．００１を使用した。
【０１４０】
図８
この図は、ハンチントン病のニューロ２ａ細胞モデルにおいて、ＩＧＦ２の発現がｍＨＴＴ凝集体のレベルをどのように低下させるかを示す。
特に、ＩＧＦ２がポリＱまたはｍＨＴＴＱ８５−ＧＦＰの以前に形成された含有物を減少させることができたかどうかを試験するために、検出可能な含有物を発現する細胞をＩＧＦ２富化培地または対照で処理した。タンパク質凝集体を２４時間後に評価および定量した。
この図は、トランスフェクションの２４時間後のウエスタンブロットによる写真およびその右側に定量化を示す。
全てのインビトロ実験について、ｎ＝３、ｔ−スチューデント＊＊＊ｐ＜０．００１を使用した。
【０１４１】
図９
この図は、ハンチントン病のニューロ２ａ細胞モデルにおいて、ＩＧＦ２の発現がｍＨＴＴ凝集体のレベルをどのように低下させるかを示す。
特に、ＩＧＦ２がポリＱまたはｍＨＴＴＱ８５−ＧＦＰの以前に形成された含有物を減少させることができたかどうかを試験するために、検出可能な含有物を発現する細胞をＩＧＦ２富化培地または対照で処理した。タンパク質凝集を２４時間後に評価および定量した。
この図は、トランスフェクションの２４時間後のフィルタートラップの写真およびその右側に定量化を示す。
全てのインビトロ実験について、ｎ＝３、ｔ−スチューデント＊＊＊ｐ＜０．００１を使用した。
【０１４２】
図１０
この図は、ハンチントン病のＹＡＣ１２８マウスモデルにおいて、ＩＧＦ２の発現がｍＨＴＴ凝集体のレベルをどのように低下させるかを示す。
特に、野生動物を、ＩＧＦ２−ＨＡを有するｍＨｔｔのフラグメントまたは対照を発現するＡＡＶと共に、線状体に定位固定法で同時注射した。ｍＨＴＴのタンパク質凝集体を評価し、２週間後に定量した。
この図は、形質導入の２週間後のウエスタンブロットの写真およびその右側に定量化を示す。
全てのインビボ実験について、ｎ＝５、ｔ−スチューデント＊＊ｐ＜０．０５を用いた。
【０１４３】
図１１
この図は、ＡＡＶウイルスからのＩＧＦ２発現がハンチントン病のＹＡＣ１２８マウスモデルにおいてポリＱ凝集体のレベルをどのように減少させるかを示す。
特に、ＩＧＦ２を発現するＡＡＶまたは対照を９０日齢の成体ＹＡＣ１２８マウスの線条体に注射した。注射の３ヶ月後に、ｍＨｔｔ凝集体ならびにＤＡＲＰＰ−３２のレベルを線条体ニューロンの生存能力の反映として評価した。
インビトロで観察されたものと同様の様式で、ｍＨｔｔ発現の減少およびＤＡＲＰＰレベルの増加があった。このタンパク質は、主にハンチントン病によって影響を受けたニューロンの生存率の代表である。したがって、ＤＡＲＰＰが多ければ多いほど、神経細胞死は少なくなると結論付けられる。
全てのインビボ実験について、ｎ＝５、ｔ−スチューデント＊＊ｐ＜０．０５を用いた。
【０１４４】
図１２
この図は、ＡＡＶウイルスからのＩＧＦ２発現がハンチントン病のＹＡＣ１２８マウスモデルにおいてポリＱ凝集体のレベルをどのように減少させるかを示す。
特に、ＩＧＦ２を発現するＡＡＶまたは対照を、１または２日齢のＹＡＣ１２８新生児動物に脳室内注射した。ｍＨｔｔの凝集レベルを注射の６ヶ月後に評価した。インビトロで観察されたものと同様の方法で、ｍＨｔｔ発現の減少が見られた。
【０１４５】
図１３
この図は、ハンチントン病のＹＡＣ１２８マウスモデルにおけるＩＧＦ２の発現が、この疾患によって生じる運動障害をどのようにして是正するかを示している。
特に、運動試験は、ＡＡＶ−ＩＧＦ２−ＨＡまたはＡＡＶ−対照を定位固定により両側注射したＹＡＣ１２８マウスで実施された。記録は、２週間ごとに、２ヶ月間にわたって記録された。この図は、ＡＡＶ２／ＩＧＦ２−ＨＡの影響下でのロータロッド試験に対する経時的挙動グラフを示す。
【０１４６】
図１４
上の図は、新生児マウスの注射位置を示す。
下の図は、成体マウスの線条体にＡＡＶを脳内注射した位置を示す。
【０１４７】
図１５
本図は、ＡＡＶゲノムのスキームを示す。
ＲＥＰ：ＡＡＶ複製メカニズムに関与する遺伝子。
ＶＰ：キャプシド形成と集合に関与する遺伝子。
ＩＴＲ：ＬＴＲ、逆方向末端反復配列と同等である。
【０１４８】
図１６
この図は、表ＩＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２）に従って、以下の具体的な説明と共に、ＩＧＦ２−ＨＡインサートを有するＡＡＶウイルスベクターを示す。
【０１４９】
図１７
この図は、表ＩＩＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３）に従って、以下の具体的な説明と共に、ＩＧＦ２インサートを有するＡＡＶウイルスベクターを示す。
【０１５０】
図１８
この図は、生成されたウイルス構築物の発現の確認を示す。この目的のために、ＨＥＫ細胞を異なる構築物でトランスフェクトし、トランスフェクションの２４時間後、ＷＢによって評価されたタンパク質を抗ＩＧＦ２抗体および抗ＨＡ抗体を用いて抽出した。
最後に、プラスミドｐＡＡＶ−ＩＧＦ２およびｐＡＡＶ−ＩＧＦ２−ＨＡをそれぞれトランスフェクトした細胞において、ＩＧＦ２（１７ｋＤａ）およびＩＧＦ２−ＨＡ（１８ｋＤａ）について予想される分子量のバンドが検出された。
【０１５１】
図１９
この図は、ＨＤを有する患者および対照個体を有する患者におけるＩＧＦ２のタンパク質レベルを示す。ＨＤを有する患者では、ＩＧＦ２はほとんど発現されず、病理学の発達への関与を示唆していることが見出された。
左側の図は、ＩＧＦ２についてのウエスタンブロットを有し、右側の図は、ＨＤの患者におけるそのブランドの定量化およびその低い位置のマークを示す。
【実施例】
【０１５２】
実験テスト１
若年成体ＷＴマウスのモデルにおいて、インビボ実験を行った。ＲＦＰおよびＡＡＶ／ＩＧＦ２−ＨＡまたは対照に結合したヒトｍＨｔｔの大きなフラグメント（５８８ｂｉｓ）を発現するＡＡＶ形質転換ウイルスを、脳定位法によって線条体に同時注入した（図１４）。
２週間後、動物を屠殺して、線条体を解剖した。以前のインビトロの結果から予想されるように、ＩＧＦ２投与後に、ｍＨｔｔ凝集体の明らかな減少が観察された（図１０）。
【０１５３】
実験テスト２
ＩＧＦ２治療の有効性を評価するために、それ自身のプロモーターの下で、ヒトｍＨｔｔを発現するより生理学的なモデルを使用した。
この実験的戦略において、ＡＡＶ−ＩＧＦ２による処理は、変異体ハンチンチンのレベルを有意に減少させることが実証された。さらに、ＤＡＲＰＰ３２レベルの増加によって示されるように、より大きなニューロン生存率が観察された（図１１）。
特に、対照と比較して、定位手術により線条体に注射されたＩＧＦ２−ＨＡを発現するＡＡＶが凝集体を減少させる効果を達成し、それにより、ニューロン生存率を改善するかどうかを試験した。
３ヶ月後、ｍＨｔｔ発現およびＤＡＲＰＰ−３２タンパク質発現レベルを評価し、定量した。
ｍＨｔｔ発現の減少およびＤＡＲＰＰレベルの増加がはっきりと観察された。このタンパク質は、ハンチントン病によって主に影響を受けたニューロンの生存率の代表である。したがって、ＤＡＲＰＰが多いほど、神経細胞死は少ないと結論付けられた。
全てのインビボ実験について、少なくとも１つのｎ＝４、ｔ−スチューデント＊＊ｐ＜０．０５を用いた。
【０１５４】
実験テスト３
この実験では、ＡＡＶ−ＩＧＦ２−ＨＡによる治療が、疾患によって引き起こされる運動障害を是正することができるかどうかを研究することを目的とした（図１３）。この目的のために、動物は、ＡＡＶ−ＩＧＦ２−ＨＡまたはＡＡＶ対照と共に、線条体に定位固定法で両側注射された。
３ヶ月間および２週間ごとに、それらは疾患の進行を定量化するために、この運動試験を受けた。ＡＡＶ−ＩＧＦ２−ＨＡで処置した動物は、ＡＡＶ対照で処置したそれらの同胞種よりも優れた運動活性を示すことが観察された。
全てのインビボ実験について、ｎ＝５、ｔ−スチューデント＊＊ｐ＜０．０５を用いた。
【０１５５】
材料および方法
細胞培養
ニューロ２ａ細胞は、マウス神経芽細胞腫に由来し、細胞モデルとして広く使用されている。細胞は、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌグルタミンペニシリン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ中、５％ＣＯ２雰囲気、３７℃で維持された。細胞は、Ｎ２ａの場合に、１０％ＦＢＳ ＤＭＳＯ中で−８０℃で凍結保存される。系統の維持のために、培養フラスコの細胞をトリプシン処理することにより、２〜３日毎に継代を行い、そして、細胞を集め、遠心分離した後、必要に応じて、それらを継代１：３〜１：６で再播種した。
【０１５６】
細胞トランスフェクション
細胞トランスフェクションは、製造業者の説明書に従って、カチオン試薬エフェクテンを用いて実施された。
【０１５７】
動物と手術方法：
成人期に注射したマウスには９０日齢で注射した。新生児状態で注射したマウスに、生後１〜２日目に注射した。実験によれば、野生型マウス（ＷＴ）またはＹＡＣマウスおよびそれらの野生型同胞を対照として使用した。全ての場合において、使用された株はＣ５７ＢＬ／６であった。マウスは、１２：１２時間の明暗周期で飼育され、食物と水に自由にアクセスできた。
本発明の開発において示された全ての動物実験について、チリのチリ大学の動物管理使用委員会によって確立されたガイドラインが使用された。
【０１５８】
ＹＡＣ １２８トランスジェニックマウスの作製
完全なヒトハンチンチン遺伝子を含む酵母人工染色体（ＹＡＣ）から、それをエクソン１中の１２８個のグルタミン反復の拡大で修飾した。得られた構築物、ＹＡＣ１２８をＦＶＢ／Ｎ株の前核に注入した。導入系統番号５３が、トランスジェニック系統として確立された。ｃ５７ＢＬ／６株を得るために、戻し交配を行い、動物のバックグラウンドを保証した。
【０１５９】
イムノブロットまたは「ウエスタンブロット」
場合によっては、総タンパク質の抽出を、Ｎ２ａ細胞の培養物、または野生動物もしくはトランスジェニック動物から解剖した組織から行った。細胞を、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含む１％ＰＢＳ−トリトン緩衝液中に回収した。
試料は、ローディングバッファー中で所望の濃度で調製された。２５〜１００μｇのタンパク質をポリアクリルアミドゲルにロードした。電気泳動は、グリシン電気泳動緩衝液中のミニ−プロテアン３システムで開発された。電気泳動分離の後、ミニトランスブロットシステムを用いて、予めメタノール中で水和し、トランスバッファー緩衝液中で５分間平衡化したＰＶＤＦ膜にタンパク質を転写した。
フィルタートラップアッセイは、１％ＳＤＳ中で調製された同じタンパク質抽出物から実施された。２５〜５０μｇのタンパク質を、孔が０．２２μｍ未満の膜を用いてフィルタートラップ支持体上に負荷した。
【０１６０】
行動テスト
全ての実験は、盲検で行われた。異なる動物コホートは、各行動試験用に使用された。
【０１６１】
ロータロッド
要約すると、マウスは４日間の訓練を受け、その間に、動物はロータロッド、作業および実験者と接触する。５日目に、動物が１２０秒で４〜４０ｒｐｍの加速度でロータロッドに留まる時間を測定する試験を実施する。全てのマウスがロッドから落ちるまで、試験を続けた。各マウスについて、落下潜時および落下時の回転数を記録した。１匹のマウスにつき３回のアッセイを行い、平均した。
【０１６２】
アデノ随伴ベクターの生産
ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２／２）粒子は、２９３―ＡＡＶ細胞（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州サンタクララ）のトランスフェクションによって産生され、イオジキサノールのグラジエント、続いてカラムアフィニティークロマトグラフィー上で精製された。懸濁液中のゲノムを含むＡＡＶ粒子の数、ならびにＨＥＫ２９３Ｔ細胞中のベクター懸濁液の感染力を、ＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲアッセイによって決定した。
【０１６３】
ＩＧＦ２―ＨＡ用のアデノウイルスプラスミド（ｐＡＡＶ）の調製
この目的の開発のために、マウスＩＧＦ２配列は、ＣＡＧプロモーター下で、導入遺伝子を発現するアデノウイルスプラスミドｐＡＡＶ―ＭＣＳにクローニングされた。オリバーブラッコ博士から親切に寄付されたｐＳＰＯＲＴ６ベクターにクローニングされたｃＤＮＡから、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは、ｐＡＡＶ−ＭＣＳベクターにサブクローニングするために、Ｉｇｆ２およびＩｇｆ２−ＨＡを得ることを可能にする。ＨＡタグ付きＣ末端をコードするＩＧＦ２−ＨＡ ｃＤＮＡは、Ｉｇｆ２−ＥｃｏＲ１、ＳＮ２、およびＩｇｆ２−ＨＡ−Ｂｇｌ ＩＩ ＡＳのＰＣＲ増幅によって作製された。
【０１６４】
−センスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７）
5 'GGCGAATTCCCTGGCTATGGGGATCCCAGTG3'
−アンチセンスＨＡプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８）
5 'ACGTAGATCTTTAGACGTAATCTGGAACATCGTATGGGTACTGATGGTTGCTGG3'
−アンチセンスプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９）
GGCAGATCTTCACTGATGGTTGCTGG
【０１６５】
マウス組織中のＩＧＦ２を認識する抗体の低効率のため、ＨＡタグの配列をクローニング戦略に含めた。これは、（とりわけ、ＦＬＡＧ、ＧＦＰ、ＨｉｓおよびＭｙｃなどの形質導入された細胞を同定するための他のエピトープ配列を除外することなく）形質導入細胞の同定およびＩＧＦ２の発現を可能にした。従って、ＩＧＦ２は、３’末端でＨＡタグ配列を用いて増幅された。得られたクローンをＤＮＡ配列決定により確認した。このようにして、本発明者らは、タグ付きおよびタグなしで、それぞれＩＧＦ２融合タンパク質をコードするｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ＩＧＦ２−ＨＡおよびｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ＩＧＦ２構築物を作製した。空のアデノウイルスプラスミドｐＡＡＶ ＣＡＧを対照として使用した。
生成された構築物の発現を確認するために、異なる構築物でＨＥＫ細胞をトランスフェクトし、トランスフェクションの２４時間後に、抗ＩＧＦ２および抗ＨＡ抗体を用いてＷＢによって評価されるタンパク質の抽出を行った。
最後に、図１８に示すように、プラスミドｐＡＡＶ−ＩＧＦ２およびｐＡＡＶ−ＩＧＦ２−ＨＡをそれぞれトランスフェクトした細胞において、ＩＧＦ２（１７ｋＤａ）およびＩＧＦ２−ＨＡ（１８ｋＤａ）について予想される分子量のバンドが検出された。
【０１６６】
定位注射
ケタミン／キシラジン麻酔（ケタミン：１００ｍｇ／ｋｇ、キシラジン：１０ｍｇ／ｋｇ、Ｖｅｔｃｏｍ、チリ）を用いてマウスに麻酔をかけ、口、鼻および耳を固定した状態で定位固定フレームに置いた（Ｄａｖｉｄ Ｋｏｐｆ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、米国）。実験によれば、ＡＡＶ―ｍＨＴＴ― ＲＦＰ、ＡＡＶ―ＩＧＦ２―ＨＡ、またはＡＡＶエンプティ（対照）の片側または両側注射を、濃度１．９６×１０１２、１×１０１３、および１．２×１０１３単位の形質導入／μｌで行った。２μｌのＡＡＶを、５μｌのハミルトンシリンジ（ハミルトン、米国）を用いて線条体領域の一点に以下の座標で注射した。ＡＰ：＋０．０７ｃｍ、ＭＬ：−０．２ｃｍ、ＤＶ：−０．３１ｃｍ（１９９７年のパキソンとフランクリンのアトラスによる）。注射液を０．５μｌ／分の速度で投与し、針を引っ込める前に５分間針を定位置に置いた。図１０に示すように、ｍＨＴＴ発現をＷＢにより調べた。ＩＧＦ２の発現は、従来のＰＣＲによって確認された。
【０１６７】
生化学分析用の組織の準備
マウスをＣＯ２麻酔により屠殺し、脳を除去し、そして、両方の脳半球の皮質および線条体を氷上のプレート上で迅速に解剖した。組織を、プロテアーゼ阻害剤とホスファターゼ阻害剤（ロシュアプライドサイエンス、米国）の混合物を補ったリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）中で均質化した。ホモジネートを分割してｍＲＮＡを得、タンパク質抽出の後に、標準的な精製および定量化プロトコルを続けた。
【０１６８】
ＲＮＡ抽出、リアルタイムＰＣＲおよび従来のＰＣＲ
全ＲＮＡを皮質および線条体から単離した。ＰＢＳ中でホモジナイズした後、製造業者によって推奨されているトリゾールＲＮＡ抽出プロトコルに従った。ｃＤＮＡは、大容量ｃＤＮＡ逆転写キット（アプライドバイオシステムズ）を用いて合成された。定量的ＲＴ−ＰＣＲには、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅからのＥｖａ ＧｒｅｅｎおよびＭｘ３００５Ｐ装置を使用した。ｃＤＮＡの相対量は、対照としてβ−アクチンを用いた比較閾値サイクル法によって計算された。従来のＰＣＲには、プロメガのＧｏＴａｑ（登録商標）グリーンマスターミックスを使用した。プライマー配列は、プライマーバンクから得た（表ＶＩ、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０〜ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１５）。
【０１６９】
表ＶＩ
2020501613.tif 000025
【０１７０】
ウエスタンブロット
マウス組織からのタンパク質抽出は、プロテアーゼ阻害剤の混合物およびホスファターゼ阻害剤（シグマ、米国）の混合物を含むＲＩＰＡ緩衝液（２０ｍＭトリスｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ＳＤＳ、０．５％デオキシコール酸、０．５％トリトンＸ―１００）中で行った。細胞株からのタンパク質の抽出は、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含むＰＢＳ中の１％トリトン中で行った。試料をＢＣＡアッセイキット（ピアース、米国）を用いて定量した。全細胞抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ポリ二フッ化ビニリデン膜に移した。以下の抗体をイムノブロット分析に使用した。抗Ｈｓｐ９０（１：３０００、サンタクルズ）、抗ＩＧＦ２（１：１０００ Abcam）、抗ポリＱ（１：１０００ シグマ）、抗ＧＦＰ（１：１０００サンタクルズ）、抗ＤＡＲＰＰ３２（１：１０００ Cell Siganlling）、抗チューブリン（１：３０００、ミリポア）。
【０１７１】
神経細胞培養とトランスフェクション
ニューロ２Ａ細胞をＡＴＣＣから入手し、５％ウシ血清および抗生物質（１００００ Ｕ／ｍｌペニシリン、１０ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン）を補充したＤＭＥＭ培地中、３７℃および５％ＣＯ２で培養した。
【０１７２】
統計
データは、平均およびＳＥＭとして表す。実験に基づいて、結果は、スチューデントＴ検定またはマン−ホイットニーテスト、二元配置分散分析、その後の事後テストとしてのホルム−シダックまたはボンフェローニ、またはクラスカル−ワリス、範囲内の一元配置分散分析、その後の事後テストとしてのダン法またはボンフェローニ法を用いて統計的に比較された。
【０１７３】
参考文献
1. W. E. Balch, R. I. Morimoto, A. Dillin, J. W. Kelly, Science. 319, 916-919 (2008).
2. J. Leitman et al., PLoS One. 9, e90803 (2014).
3. H. Lee et al., Hum. Mol. Genet. 21, 101-114 (2012).
4. J. R. Naranjo et al., J. Clin. Invest. 126, 627-638 (2016).
5. R. L. Vidal et al., Hum Mol Genet. 21, 2245-2262 (2012).
6. R. Vidal, B. Caballero, A. Couve, C. Hetz, Curr. Mol. Med. 11, 1-12 (2011).
7. C. Hetz, B. Mollereau, Nat Rev Neurosci. 15, 233-249 (2014).
8. H. L. Smith, G. R. Mallucci, Brain (2016), doi:10.1093/brain/aww101.
9. W. Scheper, J. J. M. Hoozemans, Acta Neuropathol. 130, 315-31 (2015).
10. P. Walter, D. Ron, Science (80‐. ). 334, 1081-1086 (2011).
11. C. Hetz et al., Genes Dev. 23, 2294-2306 (2009).
12. P. Valdes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 6804-9 (2014).
13. A. M. Fernandez, I. Torres‐Aleman, Nat. Rev. Neurosci. 13, 225-239 (2012).
14. E. Carro et al., Neurobiol. Aging. 27, 1250-1257 (2006).
15. B. K. Kaspar, J. Llado, N. Sherkat, et al, Science. 301, 839-42 (2003).
16. C. K. Franz et al., Neurobiol. Dis. 33, 473-81 (2009).
17. M. Pascual‐Lucas et al., EMBO Mol. Med. 6, 1246-1263 (2014).
18. T. J. Mellott, S. M. Pender, R. M. Burke, et al, PLoS One. 9, e94287 (2014).
19. I. Allodi et al., Sci. Rep. 6, 25960 (2016).
20. E. J. Rivera et al., J. Alzheimers. Dis. 8, 247-68 (2005).
21. W. E. Heywood et al., Mol. Neurodegener. 10, 64 (2015).
22. D. Aberg et al., J. Alzheimers. Dis. 48, 637-46 (2015).
23. P. Garcia‐Huerta, P. Troncoso‐Escudero, C. Jerez, C. Hetz, R. L. Vidal, Brain Res. (2016), doi:10.1016/j.brainres.2016.02.052.
24. Fauli Trillo C, "Tratado de Farmacia Galenica" (Ed Luzan 5, SA, Madrid, ES, 1993.) and Gennaro A, Ed., "Remington: The Science and Practice de Farmacia" 20a ed. (Lippincott Williams Wilkins, Philadelphia, PA, Estados Unidos, 2003).
25. Product Data Sheet Paav-MCS Expression vector, Catalog Number: VPK-410.
26. A. Zuleta, R. L. Vidal, D. Armentano, G. Parsons, C. Hetz, Biochem Biophys Res Commun. 420, 558-563 (2012).
27. Candace et al (2005) Journal of Pharmaceutical Sciences, volume 94 number (6), pages 1187-1195.
28. Constantini et al (2000) Gene Therapy volume 7, pages 93-10.
29. Ulusoy et al (1999) Molecular Theraphy volume 17, no 9, pages 1574-1584.
30. Carter B, asociados-A.deno para la entrega de genes, Lassic D, et al, Eds, "Gene" Therapy: Mecanismos y estrategias terapeuticas ".. (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, NY, Estados Unidos, 2000) and Gao et al., J. Virol. 2004; 78 (12): 6381-6388.
【０１７４】
表Ｉ
ｐＡＡＶ／２−ＭＣＳプラスミドの特徴と配列
ジェンバンク：ＡＦ０４３３０３．１
オリジン
1 TTGGCCACTC CCTCTCTGCG CGCTCGCTCG CTCACTGAGG CCGGGCGACC AAAGGTCGCC
61 CGACGCCCGG GCTTTGCCCG GGCGGCCTCA GTGAGCGAGC GAGCGCGCAG AGAGGGAGTG
121 GCCAACTCCA TCACTAGGGG TTCCTGGAGG GGTGGAGTCG TGACGTGAAT TACGTCATAG
181 GGTTAGGGAG GTCCTGTATT AGAGGTCACG TGAGTGTTTT GCGACATTTT GCGACACCAT
241 GTGGTCACGC TGGGTATTTA AGCCCGAGTG AGCACGCAGG GTCTCCATTT TGAAGCGGGA
301 GGTTTGAACG CGCAGCCGCC ATGCCGGGGT TTTACGAGAT TGTGATTAAG GTCCCCAGCG
361 ACCTTGACGA GCATCTGCCC GGCATTTCTG ACAGCTTTGT GAACTGGGTG GCCGAGAAGG
421 AATGGGAGTT GCCGCCAGAT TCTGACATGG ATCTGAATCT GATTGAGCAG GCACCCCTGA
481 CCGTGGCCGA GAAGCTGCAG CGCGACTTTC TGACGGAATG GCGCCGTGTG AGTAAGGCCC
541 CGGAGGCCCT TTTCTTTGTG CAATTTGAGA AGGGAGAGAG CTACTTCCAC ATGCACGTGC
601 TCGTGGAAAC CACCGGGGTG AAATCCATGG TTTTGGGACG TTTCCTGAGT CAGATTCGCG
661 AAAAACTGAT TCAGAGAATT TACCGCGGGA TCGAGCCGAC TTTGCCAAAC TGGTTCGCGG
721 TCACAAAGAC CAGAAATGGC GCCGGAGGCG GGAACAAGGT GGTGGATGAG TGCTACATCC
781 CCAATTACTT GCTCCCCAAA ACCCAGCCTG AGCTCCAGTG GGCGTGGACT AATATGGAAC
841 AGTATTTAAG CGCCTGTTTG AATCTCACGG AGCGTAAACG GTTGGTGGCG CAGCATCTGA
901 CGCACGTGTC GCAGACGCAG GAGCAGAACA AAGAGAATCA GAATCCCAAT TCTGATGCGC
961 CGGTGATCAG ATCAAAAACT TCAGCCAGGT ACATGGAGCT GGTCGGGTGG CTCGTGGACA
1021 AGGGGATTAC CTCGGAGAAG CAGTGGATCC AGGAGGACCA GGCCTCATAC ATCTCCTTCA
1081 ATGCGGCCTC CAACTCGCGG TCCCAAATCA AGGCTGCCTT GGACAATGCG GGAAAGATTA
1141 TGAGCCTGAC TAAAACCGCC CCCGACTACC TGGTGGGCCA GCAGCCCGTG GAGGACATTT
1201 CCAGCAATCG GATTTATAAA ATTTTGGAAC TAAACGGGTA CGATCCCCAA TATGCGGCTT
1261 CCGTCTTTCT GGGATGGGCC ACGAAAAAGT TCGGCAAGAG GAACACCATC TGGCTGTTTG
1321 GGCCTGCAAC TACCGGGAAG ACCAACATCG CGGAGGCCAT AGCCCACACT GTGCCCTTCT
1381 ACGGGTGCGT AAACTGGACC AATGAGAACT TTCCCTTCAA CGACTGTGTC GACAAGATGG
1441 TGATCTGGTG GGAGGAGGGG AAGATGACCG CCAAGGTCGT GGAGTCGGCC AAAGCCATTC
1501 TCGGAGGAAG CAAGGTGCGC GTGGACCAGA AATGCAAGTC CTCGGCCCAG ATAGACCCGA
1561 CTCCCGTGAT CGTCACCTCC AACACCAACA TGTGCGCCGT GATTGACGGG AACTCAACGA
1621 CCTTCGAACA CCAGCAGCCG TTGCAAGACC GGATGTTCAA ATTTGAACTC ACCCGCCGTC
1681 TGGATCATGA CTTTGGGAAG GTCACCAAGC AGGAAGTCAA AGACTTTTTC CGGTGGGCAA
1741 AGGATCACGT GGTTGAGGTG GAGCATGAAT TCTACGTCAA AAAGGGTGGA GCCAAGAAAA
1801 GACCCGCCCC CAGTGACGCA GATATAAGTG AGCCCAAACG GGTGCGCGAG TCAGTTGCGC
1861 AGCCATCGAC GTCAGACGCG GAAGCTTCGA TCAACTACGC AGACAGGTAC CAAAACAAAT
1921 GTTCTCGTCA CGTGGGCATG AATCTGATGC TGTTTCCCTG CAGACAATGC GAGAGAATGA
1981 ATCAGAATTC AAATATCTGC TTCACTCACG GACAGAAAGA CTGTTTAGAG TGCTTTCCCG
2041 TGTCAGAATC TCAACCCGTT TCTGTCGTCA AAAAGGCGTA TCAGAAACTG TGCTACATTC
2101 ATCATATCAT GGGAAAGGTG CCAGACGCTT GCACTGCCTG CGATCTGGTC AATGTGGATT
2161 TGGATGACTG CATCTTTGAA CAATAAATGA TTTAAATCAG GTATGGCTGC CGATGGTTAT
2221 CTTCCAGATT GGCTCGAGGA CACTCTCTCT GAAGGAATAA GACAGTGGTG GAAGCTCAAA
2281 CCTGGCCCAC CACCACCAAA GCCCGCAGAG CGGCATAAGG ACGACAGCAG GGGTCTTGTG
2341 CTTCCTGGGT ACAAGTACCT CGGACCCTTC AACGGACTCG ACAAGGGAGA GCCGGTCAAC
2401 GAGGCAGACG CCGCGGCCCT CGAGCACGAC AAAGCCTACG ACCGGCAGCT CGACAGCGGA
2461 GACAACCCGT ACCTCAAGTA CAACCACGCC GACGCGGAGT TTCAGGAGCG CCTTAAAGAA
2521 GATACGTCTT TTGGGGGCAA CCTCGGACGA GCAGTCTTCC AGGCGAAAAA GAGGGTTCTT
2581 GAACCTCTGG GCCTGGTTGA GGAACCTGTT AAGACGGCTC CGGGAAAAAA GAGGCCGGTA
2641 GAGCACTCTC CTGTGGAGCC AGACTCCTCC TCGGGAACCG GAAAGGCGGG CCAGCAGCCT
2701 GCAAGAAAAA GATTGAATTT TGGTCAGACT GGAGACGCAG ACTCAGTACC TGACCCCCAG
2761 CCTCTCGGAC AGCCACCAGC AGCCCCCTCT GGTCTGGGAA CTAATACGAT GGCTACAGGC
2821 AGTGGCGCAC CAATGGCAGA CAATAACGAG GGCGCCGACG GAGTGGGTAA TTCCTCGGGA
2881 AATTGGCATT GCGATTCCAC ATGGATGGGC GACAGAGTCA TCACCACCAG CACCCGAACC
2941 TGGGCCCTGC CCACCTACAA CAACCACCTC TACAAACAAA TTTCCAGCCA ATCAGGAGCC
3001 TCGAACGACA ATCACTACTT TGGCTACAGC ACCCCTTGGG GGTATTTTGA CTTCAACAGA
3061 TTCCACTGCC ACTTTTCACC ACGTGACTGG CAAAGACTCA TCAACAACAA CTGGGGATTC
3121 CGACCCAAGA GACTCAACTT CAAGCTCTTT AACATTCAAG TCAAAGAGGT CACGCAGAAT
3181 GACGGTACGA CGACGATTGC CAATAACCTT ACCAGCACGG TTCAGGTGTT TACTGACTCG
3241 GAGTACCAGC TCCCGTACGT CCTCGGCTCG GCGCATCAAG GATGCCTCCC GCCGTTCCCA
3301 GCAGACGTCT TCATGGTGCC ACAGTATGGA TACCTCACCC TGAACAACGG GAGTCAGGCA
3361 GTAGGACGCT CTTCATTTTA CTGCCTGGAG TACTTTCCTT CTCAGATGCT GCGTACCGGA
3421 AACAACTTTA CCTTCAGCTA CACTTTTGAG GACGTTCCTT TCCACAGCAG CTACGCTCAC
3481 AGCCAGAGTC TGGACCGTCT CATGAATCCT CTCATCGACC AGTACCTGTA TTACTTGAGC
3541 AGAACAAACA CTCCAAGTGG AACCACCACG CAGTCAAGGC TTCAGTTTTC TCAGGCCGGA
3601 GCGAGTGACA TTCGGGACCA GTCTAGGAAC TGGCTTCCTG GACCCTGTTA CCGCCAGCAG
3661 CGAGTATCAA AGACATCTGC GGATAACAAC AACAGTGAAT ACTCGTGGAC TGGAGCTACC
3721 AAGTACCACC TCAATGGCAG AGACTCTCTG GTGAATCCGG GCCCGGCCAT GGCAAGCCAC
3781 AAGGACGATG AAGAAAAGTT TTTTCCTCAG AGCGGGGTTC TCATCTTTGG GAAGCAAGGC
3841 TCAGAGAAAA CAAATGTGGA CATTGAAAAG GTCATGATTA CAGACGAAGA GGAAATCAGG
3901 ACAACCAATC CCGTGGCTAC GGAGCAGTAT GGTTCTGTAT CTACCAACCT CCAGAGAGGC
3961 AACAGACAAG CAGCTACCGC AGATGTCAAC ACACAAGGCG TTCTTCCAGG CATGGTCTGG
4021 CAGGACAGAG ATGTGTACCT TCAGGGGCCC ATCTGGGCAA AGATTCCACA CACGGACGGA
4081 CATTTTCACC CCTCTCCCCT CATGGGTGGA TTCGGACTTA AACACCCTCC TCCACAGATT
4141 CTCATCAAGA ACACCCCGGT ACCTGCGAAT CCTTCGACCA CCTTCAGTGC GGCAAAGTTT
4201 GCTTCCTTCA TCACACAGTA CTCCACGGGA CAGGTCAGCG TGGAGATCGA GTGGGAGCTG
4261 CAGAAGGAAA ACAGCAAACG CTGGAATCCC GAAATTCAGT ACACTTCCAA CTACAACAAG
4321 TCTGTTAATG TGGACTTTAC TGTGGACACT AATGGCGTGT ATTCAGAGCC TCGCCCCATT
4381 GGCACCAGAT ACCTGACTCG TAATCTGTAA TTGCTTGTTA ATCAATAAAC CGTTTAATTC
4441 GTTTCAGTTG AACTTTGGTC TCTGCGTATT TCTTTCTTAT CTAGTTTCCA TGGCTACGTA
4501 GATAAGTAGC ATGGCGGGTT AATCATTAAC TACAAGGAAC CCCTAGTGAT GGAGTTGGCC
4561 ACTCCCTCTC TGCGCGCTCG CTCGCTCACT GAGGCCGGGC GACCAAAGGT CGCCCGACGC
4621 CCGGGCTTTG CCCGGGCGGC CTCAGTGAGC GAGCGAGCGC GCAGAGAGGG AGTGGCCAA
【０１７５】
表ＩＩ
ｐＡＡＶ２−ＩＧＦ２ベクター配列
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGCACGCGTGGAGCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGTCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGATTCGAATCCCGGCCGGGAACGGTGCATTGGAACGCGGATTCCCCGTGCCAAGAGTGACGTAAGTACCGCCTATAGAGTCTATAGGCCCACAAAAAATGCTTTCTTCTTTTAATATACTTTTTTGTTTATCTTATTTCTAATACTTTCCCTAATCTCTTTCTTTCAGGGCAATAATGATACAATGTATCATGCCTCTTTGCACCATTCTAAAGAATAACAGTGATAATTTCTGGGTTAAGGCAATAGCAATATTTCTGCATATAAATATTTCTGCATATAAATTGTAACTGATGTAAGAGGTTTCATATTGCTAATAGCAGCTACAATCCAGCTACCATTCTGCTTTTATTTTATGGTTGGGATAAGGCTGGATTATTCTGAGTCCAAGCTAGGCCCTTTTGCTAATCATGTTCATACCTCTTATCTTCCTCCCACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTCTGTGTGCTGGCCCATCACTTTGGCAAAGAATTGGGATTCGAACATCGATTGAATTCCCTGGCTATGGGGATCCCAGTGGGGAAGTCGATGTTGGTGCTTCTCATCTCTTTGGCCTTCGCCTTGTGCTGCATCGCTGCTTACGGCCCCGGAGAGACTCTGTGCGGAGGGGAGCTTGTTGACACGCTTCAGTTTGTCTGTTCGGACCGCGGCTTCTACTTCAGCAGGCCTTCAAGCCGTGCCAACCGTCGCAGCCGTGGCATCGTGGAAGAGTGCTGCTTCCGCAGCTGCGACCTGGCCCTCCTGGAGACATACTGTGCCACCCCCGCCAAGTCCGAGAGGGACGTGTCTACCTCTCAGGCCGTACTTCCGGACGACTTCCCCAGATACCCCGTGGGCAAGTTCTTCCAATATGACACCTGGAGACAGTCCGCGGGACGCCTGCGCAGAGGCCTGCCTGCCCTCCTGCGTGCCCGCCGGGGTCGCATGCTTGCCAAAGAGCTCAAAGAGTTCAGAGAGGCCAAACGTCATCGTCCCCTGATCGTGTTACCACCCAAAGACCCCGCCCACGGGGGAGCCTCTTCGGAGATGTCCAGCAACCATCAGTGAAGATCTACGGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCCCTGGAAGTTGCCACTCCAGTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATCATTTTGTCTGACTAGGTGTCCTTCTATAATATTATGGGGTGGAGGGGGGTGGTATGGAGCAAGGGGCAAGTTGGGAAGACAACCTGTAGGGCCTGCGGGGTCTATTGGGAACCAAGCTGGAGTGCAGTGGCACAATCTTGGCTCACTGCAATCTCCGCCTCCTGGGTTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCGAGTTGTTGGGATTCCAGGCATGCATGACCAGGCTCAGCTAATTTTTGTTTTTTTGGTAGAGACGGGGTTTCACCATATTGGCCAGGCTGGTCTCCAACTCCTAATCTCAGGTGATCTACCCACCTTGGCCTCCCAAATTGCTGGGATTACAGGCGTGAACCACTGCTCCCTTCCCTGTCCTTCTGATTTTGTAGGTAACCACGTGCGGACCGAGCGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGGGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACGTCAAAGCAACCATAGTACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTTGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGGCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGT
【０１７６】
特徴：
ＩＧＦ２                                 ：［１３３９：１８７８−ＣＷ］
Ｆ１オリジン                        ：［３０６６：２６２６−ＣＷ］
Ｓｔｏｐ                                 ：［１３３９：１８７８−ＣＷ］
Ｌ−ＩＴＲ                            ：［２４３０：２５２８−ＣＷ］
Ｒ−ＩＴＲ                            ：［１２：１０６−ＣＷ］
Ｍ１３オリジン                   ：［２６２１：３０７６−ＣＷ］
ＣｏｌＥ１オリジン         ：［４４７２：５１００−ＣＷ］
ＡｍｐＲ                                 ：［３６６１：４３２０−ＣＷ］
Ａｍｐ Ｐｒｏｍ                ：［３３９３：３４２１−ＣＷ］
ｈＧＨ ポリＡシグナル  ：［１８８９：２３６９−ＣＷ］
ＣＭＶ前初期プロモーター                                 ：［１７０：７２１−ＣＷ］
内部ｂ ＧｌｏｂとＣＡＧエンハンサー       ：［８２０：１３１２−ＣＷ］
【０１７７】
表ＩＩＩ
ＡＡＶ２−ＩＧＦ２−ＨＡベクター配列
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGCACGCGTGGAGCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGTCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGATTCGAATCCCGGCCGGGAACGGTGCATTGGAACGCGGATTCCCCGTGCCAAGAGTGACGTAAGTACCGCCTATAGAGTCTATAGGCCCACAAAAAATGCTTTCTTCTTTTAATATACTTTTTTGTTTATCTTATTTCTAATACTTTCCCTAATCTCTTTCTTTCAGGGCAATAATGATACAATGTATCATGCCTCTTTGCACCATTCTAAAGAATAACAGTGATAATTTCTGGGTTAAGGCAATAGCAATATTTCTGCATATAAATATTTCTGCATATAAATTGTAACTGATGTAAGAGGTTTCATATTGCTAATAGCAGCTACAATCCAGCTACCATTCTGCTTTTATTTTATGGTTGGGATAAGGCTGGATTATTCTGAGTCCAAGCTAGGCCCTTTTGCTAATCATGTTCATACCTCTTATCTTCCTCCCACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTCTGTGTGCTGGCCCATCACTTTGGCAAAGAATTGGGATTCGAACATCGATTGAATTCCCTGGCTATGGGGATCCCAGTGGGGAAGTCGATGTTGGTGCTTCTCATCTCTTTGGCCTTCGCCTTGTGCTGCATCGCTGCTTACGGCCCCGGAGAGACTCTGTGCGGAGGGGAGCTTGTTGACACGCTTCAGTTTGTCTGTTCGGACCGCGGCTTCTACTTCAGCAGGCCTTCAAGCCGTGCCAACCGTCGCAGCCGTGGCATCGTGGAAGAGTGCTGCTTCCGCAGCTGCGACCTGGCCCTCCTGGAGACATACTGTGCCACCCCCGCCAAGTCCGAGAGGGACGTGTCTACCTCTCAGGCCGTACTTCCGGACGACTTCCCCAGATACCCCGTGGGCAAGTTCTTCCAATATGACACCTGGAGACAGTCCGCGGGACGCCTGCGCAGAGGCCTGCCTGCCCTCCTGCGTGCCCGCCGGGGTCGCATGCTTGCCAAAGAGCTCAAAGAGTTCAGAGAGGCCAAACGTCATCGTCCCCTGATCGTGTTACCACCCAAAGACCCCGCCCACGGGGGAGCCTCTTCGGAGATGTCCAGCAACCATCAGTACCCATACGATGTTCCAGATTACGTCTAAAGATCTACGGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCCCTGGAAGTTGCCACTCCAGTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATCATTTTGTCTGACTAGGTGTCCTTCTATAATATTATGGGGTGGAGGGGGGTGGTATGGAGCAAGGGGCAAGTTGGGAAGACAACCTGTAGGGCCTGCGGGGTCTATTGGGAACCAAGCTGGAGTGCAGTGGCACAATCTTGGCTCACTGCAATCTCCGCCTCCTGGGTTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCGAGTTGTTGGGATTCCAGGCATGCATGACCAGGCTCAGCTAATTTTTGTTTTTTTGGTAGAGACGGGGTTTCACCATATTGGCCAGGCTGGTCTCCAACTCCTAATCTCAGGTGATCTACCCACCTTGGCCTCCCAAATTGCTGGGATTACAGGCGTGAACCACTGCTCCCTTCCCTGTCCTTCTGATTTTGTAGGTAACCACGTGCGGACCGAGCGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGGGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACGTCAAAGCAACCATAGTACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTTGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGGCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGT
【０１７８】
特徴：
ＩＧＦ２                                 ：［１３３９：１８７８−ＣＷ］
Ｆ１オリジン                        ：［３０９３：２６５３−ＣＷ］
ＨＡ                                          ：［１８７９：１９０８−ＣＷ］
Ｌ−ＩＴＲ                            ：［８９：１９６−ＣＷ］
Ｒ−ＩＴＲ                            ：［１２：１０６−ＣＷ］
Ｔ７                                           ：［２５８７：２６０６−ＣＷ］
Ｔ７                                           ：［３５３２：３５５１−ＣＷ］
Ｍ１３オリジン                   ：［２６４８：３１０３−ＣＷ］
ＣｏｌＥ１オリジン         ：［４４９９：５１２７−ＣＷ］
ＡｍｐＲ                                 ：［３６８８：４３４７−ＣＷ］
Ａｍｐ Ｐｒｏｍ                ：［３４２０：３４４８−ＣＷ］
ｈＧＨ ポリＡシグナル  ：［１９１６：２３９６−ＣＷ］
ＣＭＶ前初期プロモーター                                 ：［１７０：７２１−ＣＷ］
内部ｂ Ｇｌｏｂ ｙ ＣＡＧエンハンサー  ：［８２０：１３１２−ＣＷ］
【０１７９】
表ＩＶ
Ｉｇｆ２（マウス）
TGGGGATCCCAGTGGGGAAGTCGATGTTGGTGCTTCTCATCTCTTTGGCCTTCGCCTTGTGCTGCATCGCTGCTTACGGCCCCGGAGAGACTCTGTGCGGAGGGGAGCTTGTTGACACGCTTCAGTTTGTCTGTTCGGACCGCGGCTTCTACTTCAGCAGGCCTTCAAGCCGTGCCAACCGTCGCAGCCGTGGCATCGTGGAAGAGTGCTGCTTCCGCAGCTGCGACCTGGCCCTCCTGGAGACATACTGTGCCACCCCCGCCAAGTCCGAGAGGGACGTGTCTACCTCTCAGGCCGTACTTCCGGACGACTTCCCCAGATACCCCGTGGGCAAGTTCTTCCAATATGACACCTGGAGACAGTCCGCGGGACGCCTGCGCAGAGGCCTGCCTGCCCTCCTGCGTGCCCGCCGGGGTCGCATGCTTGCCAAAGAGCTCAAAGAGTTCAGAGAGGCCAAACGTCATCGTCCCCTGATCGTGTTACCACCCAAAGACCCCGCCCACGGGGGAGCCTCTTCGGAGATGTCCAGCAACCATCAG
【０１８０】
表Ｖ
Ｉｇｆ２−ＨＡ（マウス）
TGGGGATCCCAGTGGGGAAGTCGATGTTGGTGCTTCTCATCTCTTTGGCCTTCGCCTTGTGCTGCATCGCTGCTTACGGCCCCGGAGAGACTCTGTGCGGAGGGGAGCTTGTTGACACGCTTCAGTTTGTCTGTTCGGACCGCGGCTTCTACTTCAGCAGGCCTTCAAGCCGTGCCAACCGTCGCAGCCGTGGCATCGTGGAAGAGTGCTGCTTCCGCAGCTGCGACCTGGCCCTCCTGGAGACATACTGTGCCACCCCCGCCAAGTCCGAGAGGGACGTGTCTACCTCTCAGGCCGTACTTCCGGACGACTTCCCCAGATACCCCGTGGGCAAGTTCTTCCAATATGACACCTGGAGACAGTCCGCGGGACGCCTGCGCAGAGGCCTGCCTGCCCTCCTGCGTGCCCGCCGGGGTCGCATGCTTGCCAAAGAGCTCAAAGAGTTCAGAGAGGCCAAACGTCATCGTCCCCTGATCGTGTTACCACCCAAAGACCCCGCCCACGGGGGAGCCTCTTCGGAGATGTCCAGCAACCATCAGTACCCATACGATGTTCCAGATTACGTCTAA
【０１８１】
表ＶＩＩ
Ｉｇｆ２（ヒト）
ATGGGAATCCCAATGGGGAAGTCGATGCTGGTGCTTCTCACCTTCTTGGCCTTCGCCTCGTGCTGCATTGCTGCTTACCGCCCCAGTGAGACCCTGTGCGGCGGGGAGCTGGTGGACACCCTCCAGTTCGTCTGTGGGGACCGCGGCTTCTACTTCAGCAGGCCCGCAAGCCGTGTGAGCCGTCGCAGCCGTGGCATCGTTGAGGAGTGCTGTTTCCGCAGCTGTGACCTGGCCCTCCTGGAGACGTACTGTGCTACCCCCGCCAAGTCCGAGAGGGACGTGTCGACCCCTCCGACCGTGCTTCCGGACAACTTCCCCAGATACCCCGTGGGCAAGTTCTTCCAATATGACACCTGGAAGCAGTCCACCCAGCGCCTGCGCAGGGGCCTGCCTGCCCTCCTGCGTGCCCGCCGGGGTCACGTGCTCGCCAAGGAGCTCGAGGCGTTCAGGGAGGCCAAACGTCACCGTCCCCTGATTGCTCTACCCACCCAAGACCCCGCCCACGGGGGCGCCCCCCCAGAGATGGCCAGCAATCGGAAGTGA
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えウイルスゲノムを含み、
前記組換えウイルスゲノムは、発現カセットを含み、
前記発現カセットは、ＩＧＦ２またはＩＧＦ２−ＨＡをコードする目的のポリヌクレオチドに動作可能に結合された神経組織に特異的な転写調節領域を含むことを特徴とするアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）。
【請求項２】
前記ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、および偽型ＡＡＶを含む群から選択される請求項１に記載のアデノ随伴ウイルス。
【請求項３】
前記調節領域は、ＣＡＧ、ＣＭＶ、ｂ―グロビン、ＣＢＡ、ｅｌＦアルファ、およびＰＧＫを含む群から選択されるプロモーター領域を含む請求項１および２に記載のアデノ随伴ウイルス。
【請求項４】
前記発現カセットは、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）である転写後調節領域を含む請求項１に記載のアデノ随伴ウイルス。
【請求項５】
前記目的のポリヌクレオチドは、神経細胞に作用する請求項１に記載のアデノ随伴ウイルス。
【請求項６】
請求項１に記載のアデノ随伴ウイルスと、薬学的に許容される賦形剤と、を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項７】
組成物１ｍｌ当たり１０９〜１０１３ゲノムコピー（ＧＣ）の範囲の用量の前記ウイルスを含む請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
哺乳動物におけるハンチントン病の予防または治療のための、請求項１に記載のアデノ随伴ウイルスまたは請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項９】
アデノ随伴ウイルスのＩＴＲが隣接する発現カセットを含み、
前記発現カセットは、プロモーター、免疫応答のためのコード領域、およびＩＧＦ２またはＩＧＦ２−ＨＡをコードする目的のポリヌクレオチドを含むことを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項１０】
前記プロモーター領域は、ＣＡＧ、ＣＭＶ、ｂ−グロビン、ＣＢＡ、ｅｌＦアルファ、およびＰＧＫを含む群から選択される請求項９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
前記発現カセットは、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）である転写後調節領域をさらに含む請求項９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
前記目的のポリヌクレオチドは、前記皮質および前記線条体の細胞に特異的である請求項９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
アデノ随伴ベクターの配列と、前記アデノ随伴ウイルスのＩＴＲに隣接する発現カセットとを含み、
前記発現カセットは、プロモーター、免疫応答のためのコード領域、および目的のポリヌクレオチドを含み、
これらは、国際寄託生物寄託機関に寄託され、国際寄託生物寄託機関であるチリの微生物遺伝資源コレクション（ＣＣｈＲＧＭ）に、寄託番号ＲＧＭ２３３５およびＲＧＭ２３３６を有して寄託されたプラスミドで形質転換された大腸菌株に含まれることを特徴とするプラスミド。
【請求項１４】
請求項９に記載の前記ポリヌクレオチド含むウイルスゲノムを含むことを特徴とするアデノ随伴ウイルス。
【請求項１５】
ａ．ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質、およびＡＡＶがその複製に依存するウイルスタンパク質を、請求項９に記載のポリヌクレオチドを含む細胞に提供する工程と、
ｂ．前記ＡＡＶの集合に適した条件下で前記細胞を維持する工程と、
ｃ．前記細胞によって産生された前記アデノ随伴ウイルスベクターを精製する工程と、
を含むことを特徴とするアデノ随伴ウイルスを取得する方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2020501613.tif 000026
【図２】
2020501613.tif 000027
【図３】
2020501613.tif 000028
【図４】
2020501613.tif 000029
【図５】
2020501613.tif 000030
【図６】
2020501613.tif 000031
【図７】
2020501613.tif 000032
【図８】
2020501613.tif 000033
【図９】
2020501613.tif 000034
【図１０】
2020501613.tif 000035
【図１１】
2020501613.tif 000036
【図１２】
2020501613.tif 000037
【図１３】
2020501613.tif 000038
【図１４】
2020501613.tif 000039
【図１５】
2020501613.tif 000040
【図１６】
2020501613.tif 000041
【図１７】
2020501613.tif 000042
【図１８】
2020501613.tif 000043
【図１９】
2020501613.tif 000044
【国際調査報告】
2020501613.tif 000045
2020501613.tif 000046
2020501613.tif 000047
2020501613.tif 000048
2020501613.tif 000049
2020501613.tif 000050
2020501613.tif 000051
2020501613.tif 000052
2020501613.tif 000053
2020501613.tif 000054