(57)【要約】  本発明は、そのような病に罹患している対象に投与することができる、ボツリヌス毒素を含む新規の注射用組成物で、頸部ジストニア、それに関連する障害、又はその症状を、治療又は予防する方法を提供する。注射可能な組成物及びこれらの組成物が使用されている方法は、高い応答者の比率、効果の長い持続時間、例えば、２４週及びこれより長い間の効果の持続時間がもたらされる、新規なかつ有利な治療を提供する。
2020520917.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ボツリヌス毒素を投与して、頸部ジストニアの個体において延長された持続時間の治療効果を実現する方法であって、
治療を必要とする前記個体の前記頸部ジストニアを引き起こしている１又は２以上の筋肉に滅菌注射用組成物の第１の治療用量を注射により投与して、前記組成物での第１の治療後に前記治療効果を実現するステップ
を含み、
前記組成物が、注射に適した薬学的に許容される希釈剤と、
ボツリヌス毒素、ボツリヌス毒素複合体、及び低ボツリヌス毒素複合体からなる群から選択されるボツリヌス毒素成分と、
下付き文字ｐ及びｑがそれぞれ独立して０〜２０の整数であるアミノ酸配列（ｇｌｙ）ｐ−ＲＧＲＤＤＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（配列番号１）、（ｇｌｙ）ｐ−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（配列番号２）又は（ｇｌｙ）ｐ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（配列番号３）を有する正に帯電した１又は２以上の効率基が共有結合で結合している正に帯電したポリリジン骨格を含む正に帯電した担体成分と
を含み、
前記個体に投与されるボツリヌス毒素成分の総治療用量が１００Ｕ〜４５０Ｕであり、
前記正に帯電した担体が前記ボツリヌス毒素成分と非共有結合で会合し、
前記個体に注射により投与された前記組成物の前記第１の治療用量によって、少なくとも約２４週の効果の持続時間を有する、延長された持続時間の治療効果又は美容効果が実現され、任意で、その後に、第２の又はそれ以降の治療用量が投与される、前記方法。
【請求項２】
それを必要とする個体における頸部ジストニアを治療する方法であって、
注射用の薬学的に許容される希釈剤と、
ボツリヌス毒素、ボツリヌス毒素複合体、及び低ボツリヌス毒素複合体からなる群から選択されるボツリヌス毒素成分と、
下付き文字ｐ及びｑがそれぞれ独立して０〜２０の整数であるアミノ酸配列（ｇｌｙ）ｐ−ＲＧＲＤＤＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（配列番号１）、（ｇｌｙ）ｐ−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（配列番号２）又は（ｇｌｙ）ｐ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（配列番号３）を有する正に帯電した１又は２以上の効率基が共有結合で結合している正に帯電したポリリジン骨格を含む正に帯電した担体成分と
を含む組成物を、前記個体の前記頸部ジストニアを引き起こしている１又は２以上の筋肉に注射により前記個体に投与するステップを含み、
前記ボツリヌス毒素が１００Ｕ〜４５０Ｕの総治療用量で前記個体に投与され、
前記正に帯電した担体が前記ボツリヌス成分と非共有結合で会合し、
前記組成物の注射により、前記個体における前記頸部ジストニアの症状の低減において少なくとも約２４週の持続時間の効果を有する単回治療用量が提供され、これによって前記個体に対して治療間隔の持続時間が延長される、前記方法。
【請求項３】
頸部ジストニアの個体において延長された持続時間の治療効果を実現する、ボツリヌス毒素の投与において使用するための滅菌注射用製剤の医薬組成物であって、
前記医薬組成物が、注射に適した薬学的に許容される希釈剤と、
ボツリヌス毒素複合体、低ボツリヌス毒素複合体、及びボツリヌス毒素からなる群から選択される、１００Ｕ〜４５０Ｕの治療用量のボツリヌス毒素成分と、
下付き文字ｐ及びｑがそれぞれ独立して０〜２０の整数であるアミノ酸配列（ｇｌｙ）ｐ−ＲＧＲＤＤＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（配列番号１）、（ｇｌｙ）ｐ−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（配列番号２）又は（ｇｌｙ）ｐ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（配列番号３）を有する正に帯電した１又は２以上の効率基が共有結合で結合している正に帯電したポリリジン骨格を含む正に帯電した担体成分と
を含み、
前記正に帯電した担体が前記ボツリヌス毒素成分と非共有結合で会合し、
前記組成物の前記治療用量によって、注射により前記製剤が投与された前記個体において少なくとも約２４週の効果の持続時間を有する、延長された持続時間の治療効果が実現される、前記医薬組成物。
【請求項４】
それを必要とする個体における頸部ジストニアの症状の低減において使用するための滅菌注射用製剤の医薬組成物であって、前記医薬組成物が、
ボツリヌス毒素複合体、低ボツリヌス毒素複合体、及びボツリヌス毒素からなる群から選択される、１００Ｕ〜４５０Ｕの用量のボツリヌス毒素成分と、
下付き文字ｐ及びｑがそれぞれ独立して０〜２０の整数であるアミノ酸配列（ｇｌｙ）ｐ−ＲＧＲＤＤＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（配列番号１）、（ｇｌｙ）ｐ−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（配列番号２）又は（ｇｌｙ）ｐ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（配列番号３）を有する正に帯電した１又は２以上の効率基が共有結合で結合している正に帯電したポリリジン骨格を含む正に帯電した担体成分と、
注射用の薬学的に許容される希釈剤と
を含み、
前記正に帯電した担体が前記ボツリヌス毒素成分と非共有結合で会合し、
前記組成物の前記用量により、前記個体における前記頸部ジストニアの症状の低減において少なくとも約２４週の持続時間の効果を有する単回治療が提供され、これによって前記個体に対して治療間隔の持続時間が延長される、前記医薬組成物。
【請求項５】
組成物が、少なくとも約８ヶ月間延長された持続時間の治療効果を実現する、請求項１若しくは２に記載の方法、又は請求項３若しくは４に記載の、使用のための医薬組成物。
【請求項６】
組成物が、血清型Ａのボツリヌス毒素を含む、請求項５に記載の方法、又は請求項５に記載の、使用のための医薬組成物。
【請求項７】
組成物が、分子量１５０ｋＤａを有する血清型Ａのボツリヌス毒素を含む、請求項６に記載の方法、又は請求項６に記載の、使用のための医薬組成物。
【請求項８】
正に帯電したポリリジン骨格が、下付き文字ｐ及びｑがそれぞれ独立して０〜２０の整数であるアミノ酸配列（ｇｌｙ）ｐ−ＲＧＲＤＤＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（配列番号１）を有する正に帯電した１又は２以上の効率基が共有結合で結合している、請求項１〜７のいずれかに記載の方法、又は請求項１〜７のいずれかに記載の、使用のための医薬組成物。
【請求項９】
正に帯電したポリリジン骨格が、下付き文字ｐ及びｑがそれぞれ独立して０〜２０の整数であるアミノ酸配列（ｇｌｙ）ｐ−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（配列番号２）を有する正に帯電した１又は２以上の効率基が共有結合で結合している、請求項１〜７のいずれかに記載の方法、又は請求項１〜７のいずれかに記載の、使用のための医薬組成物。
【請求項１０】
正に帯電したポリリジン骨格が、下付き文字ｐ及びｑがそれぞれ独立して０〜２０の整数であるアミノ酸配列（ｇｌｙ）ｐ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（配列番号３）を有する正に帯電した１又は２以上の効率基が共有結合で結合している、請求項１〜７のいずれかに記載の方法、又は請求項１〜７のいずれかに記載の、使用のための医薬組成物。
【請求項１１】
（ｉ）下付き文字ｐ及びｑが、それぞれ独立して０〜８の整数であり、又は（ii）それぞれ独立して２〜５の整数である、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法、又は請求項１〜１０のいずれかに記載の、使用のための医薬組成物。
【請求項１２】
正に帯電した１又は２以上の効率基が、正に帯電した担体の正に帯電したポリリジン骨格のいずれかの末端、又は両方の末端に結合している、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法、又は請求項１〜１１のいずれかに記載の、使用のための医薬組成物。
【請求項１３】
正に帯電した担体が、アミノ酸配列ＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ−（Ｋ）１５−ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号４）を有する、請求項１２に記載の方法、又は請求項１２に記載の、使用のための医薬組成物。
【請求項１４】
組成物が、注射後に注射の部位から局所的に拡散しない、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法、又は請求項１〜１３のいずれかに記載の、使用のための医薬組成物。
【請求項１５】
ボツリヌス毒素の治療用量が、約１００Ｕ〜２００Ｕの量で個体に投与される、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法、又は請求項１〜１４のいずれかに記載の、使用のための医薬組成物。
【請求項１６】
ボツリヌス毒素の治療用量が、約２００Ｕ〜３００Ｕの量で個体に投与される、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法、又は請求項１〜１４のいずれかに記載の、使用のための医薬組成物。
【請求項１７】
ボツリヌス毒素の治療用量が、約３００Ｕ〜４５０Ｕの量で個体に投与される、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法、又は請求項１〜１４のいずれかに記載の、使用のための医薬組成物。
【請求項１８】
治療効果の持続時間が３ヶ月超を含む、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法、又は請求項１〜１７のいずれかに記載の、使用のための医薬組成物。
【請求項１９】
治療効果の持続時間が４ヶ月超を含む、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法、又は請求項１〜１７のいずれかに記載の、使用のための医薬組成物。
【請求項２０】
治療効果の持続時間が５ヶ月超を含む、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法、又は請求項１〜１７のいずれかに記載の、使用のための医薬組成物。
【請求項２１】
治療効果の持続時間が６ヶ月超を含む、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法、又は請求項１〜１７のいずれかに記載の、使用のための医薬組成物。
【請求項２２】
治療効果の持続時間が７ヶ月超を含む、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法、又は請求項１〜１７のいずれかに記載の、使用のための医薬組成物。
【請求項２３】
治療効果の持続時間が８ヶ月超を含む、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法、又は請求項１〜１７のいずれかに記載の、使用のための医薬組成物。
【請求項２４】
治療効果の持続時間が９ヶ月超を含む、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法、又は請求項１〜１７のいずれかに記載の、使用のための医薬組成物。
【請求項２５】
治療効果の持続時間が少なくとも６ヶ月〜１０ヶ月を含む、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法、又は請求項１〜１７のいずれかに記載の、使用のための医薬組成物。
【請求項２６】
１００Ｕ、２００Ｕ、３００Ｕ又は４５０Ｕから選択される投与量の、ボツリヌス毒素、ボツリヌス毒素複合体、及び低ボツリヌス毒素複合体からなる群から選択されるボツリヌス毒素成分と、
下付き文字ｐ及びｑがそれぞれ独立して０〜２０の整数であるアミノ酸配列（ｇｌｙ）ｐ−ＲＧＲＤＤＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（配列番号１）、（ｇｌｙ）ｐ−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（配列番号２）又は（ｇｌｙ）ｐ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（配列番号３）を有する正に帯電した１又は２以上の効率基が共有結合で結合している正に帯電したポリリジン骨格を含む正に帯電した担体成分と、
注射用の薬学的に許容される希釈剤と
を含む滅菌注射用組成物であって、
前記正に帯電した担体が前記ボツリヌス毒素成分と非共有結合で会合し、
前記組成物が、前記注射用組成物での個体の単回治療後に、少なくとも２４週の間続く美容効果又は治療効果を提供する、前記組成物。
【請求項２７】
正に帯電した担体が、アミノ酸配列ＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ−（Ｋ）１５−ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号４）を有する、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
血清型Ａのボツリヌス毒素を含む、請求項２６又は２７に記載の組成物。
【請求項２９】
分子量１５０ｋＤａを有する血清型Ａのボツリヌス毒素を含む、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
ボツリヌス毒素の治療用量が１００Ｕの量で個体に投与される、請求項２６〜２９のいずれかに記載の組成物。
【請求項３１】
ボツリヌス毒素の治療用量が２００Ｕの量で個体に投与される、請求項２６〜２９のいずれかに記載の組成物。
【請求項３２】
ボツリヌス毒素の治療用量が４５０Ｕの量で個体に投与される、請求項２８〜３１のいずれかに記載の組成物。
【請求項３３】
注射用ボツリヌス毒素での治療を必要とする頸部ジストニアの個体を治療する方法であって、
前記方法が、効果の持続時間及びそれぞれの治療間隔の間の持続時間の時間が長時間である複数の治療間隔を有する治療コースを含み、
前記治療コースが、
治療を必要とする前記個体の頸部ジストニアを引き起こしている１又は２以上の筋肉に滅菌注射用組成物の最初の治療用量を注射により投与して、前記組成物での最初の治療後に前記頸部ジストニアの症状を低減する治療効果を実現するステップであって、
前記組成物が、注射に適した薬学的に許容される希釈剤と、
ボツリヌス毒素、ボツリヌス毒素複合体、及び低ボツリヌス毒素複合体からなる群から選択されるボツリヌス毒素成分と、
下付き文字ｐ及びｑがそれぞれ独立して０〜２０の整数であるアミノ酸配列（ｇｌｙ）ｐ−ＲＧＲＤＤＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（配列番号１）、（ｇｌｙ）ｐ−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（配列番号２）又は（ｇｌｙ）ｐ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（配列番号３）を有する正に帯電した１又は２以上の効率基が共有結合で結合している正に帯電したポリリジン骨格を含む正に帯電した担体成分と
を含み、
前記ボツリヌス毒素成分が約１００Ｕ〜約４５０Ｕの治療用量で前記個体に投与され、
前記正に帯電した担体が前記ボツリヌス毒素成分と非共有結合で会合し、
前記個体に注射により投与された前記組成物の前記最初の治療用量によって、少なくとも約１０ヶ月を通じて続く効果の治療的持続時間が提供される、ステップ；と、
前記最初の治療用量の後及びそれぞれのそれ以降の治療用量の間に６ヶ月以上〜少なくとも約１０ヶ月の持続時間を含む治療間隔で、前記個体に注射により前記組成物のそれ以降の治療用量を投与するステップ；と
を含む、
前記方法。
【請求項３４】
組成物が血清型Ａのボツリヌス毒素を含む、請求項３３〜３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
組成物が、分子量１５０ｋＤａを有する血清型Ａのボツリヌス毒素を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
正に帯電したポリリジン骨格は、下付き文字ｐ及びｑがそれぞれ独立して０〜２０の整数であるアミノ酸配列（ｇｌｙ）ｐ−ＲＧＲＤＤＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（配列番号１）を有する正に帯電した１又は２以上の効率基が共有結合で結合している、請求項３３〜３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
正に帯電したポリリジン骨格は、下付き文字ｐ及びｑがそれぞれ独立して０〜２０の整数であるアミノ酸配列（ｇｌｙ）ｐ−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（配列番号２）を有する正に帯電した１又は２以上の効率基が共有結合で結合している、請求項３３〜３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
正に帯電したポリリジン骨格は、下付き文字ｐ及びｑがそれぞれ独立して０〜２０の整数であるアミノ酸配列（ｇｌｙ）ｐ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（配列番号３）を有する正に帯電した１又は２以上の効率基が共有結合で結合している、請求項３３〜３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
（ｉ）下付き文字ｐ及びｑが、それぞれ独立して０〜８の整数であり、又は（ii）それぞれ独立して２〜５の整数である、請求項３３〜３８のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
正に帯電した１又は２以上の効率基が、正に帯電した担体の正に帯電したポリリジン骨格のいずれかの末端、又は両方の末端に結合している、請求項３３〜３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
正に帯電した担体が、アミノ酸配列ＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ−（Ｋ）１５−ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号４）を有する、請求項３３〜３５のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
組成物が、注射後に注射の部位から局所的に拡散しない、請求項３３〜４１のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
ボツリヌス毒素が約１００Ｕ〜２００Ｕの量で個体に投与される、請求項３３〜４２のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
ボツリヌス毒素が２００Ｕ〜３００Ｕの量で個体に投与される、請求項３３〜４２のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
ボツリヌス毒素が３００Ｕ〜４５０Ｕの量で個体に投与される、請求項３３〜４２のいずれかに記載の方法。
【請求項４６】
治療間隔の持続時間が３ヶ月超を含む、請求項３３〜４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
治療間隔の持続時間が４ヶ月超を含む、請求項３３〜４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】
治療間隔の持続時間が５ヶ月超を含む、請求項３３〜４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】
治療間隔の持続時間が６ヶ月超を含む、請求項３３〜４５のいずれかに記載の方法。
【請求項５０】
治療間隔の持続時間が７ヶ月超を含む、請求項３３〜４５のいずれかに記載の方法。
【請求項５１】
治療間隔の持続時間が８ヶ月超を含む、請求項３３〜４５のいずれかに記載の方法。
【請求項５２】
治療間隔の持続時間が９ヶ月超を含む、請求項３３〜４５のいずれかに記載の方法。
【請求項５３】
治療間隔の持続時間が少なくとも６ヶ月〜１０ヶ月を含む、請求項３３〜４５のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出している配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０１６年１２月１３日に作成された前記ＡＳＣＩＩのコピーは、ＣＤ．ｔｘｔと命名され、６，８０９バイトのサイズである。
【０００２】
本発明は、そのような病に罹患している対象に投与することができる、ボツリヌス毒素を含む新規の注射用組成物で、頸部ジストニア、それに関連する障害、又はその症状を、治療又は予防する方法に関する。注射用組成物及び本組成物が使用されている方法は、高い応答者の比率、効果の長い持続時間、例えば、２４週にわたる間の効果の持続時間がもたらされる、新規なかつ有利な治療を提供する。
【背景技術】
【０００３】
頸部ジストニアとは極端な苦痛を与える慢性的な神経運動障害であり、頚部及び肩の筋肉が不随意に収縮しかつゆがみ、頭部が左右に（斜頚）、上に（頚後屈）、下に（首下がり）又は横に（側屈）ねじれたり曲がったりするなどの、頭部及び頚部の異常運動やぎこちない姿勢を引き起こす。運動は持続性（緊張型）の場合も、痙攣性（間代性）の場合も、又は組合せの場合もある。頸部ジストニア（頚部ジストニア又は痙性斜頚とも呼ばれる）は、筋活動を制御するヒトの能力に影響を及ぼす。頸部ジストニアは原発性（家族歴の有無にかかわらず、これは単に見かけ上の神経障害であることを意味する）である場合もあり、二次的な原因（身体的外傷などの）によってもたらされる場合もあるが、脳卒中、疾患又は外傷によって引き起こされる神経系の損傷が原因とされることが多い。あらゆる年齢で、幼児期でも発生し得る希少障害、すなわち、頸部ジストニアは中高年の固体に最も多く発生し、男性よりも女性に多く見られる。頸部ジストニア又は他のタイプのジストニアに関して家族歴を有する人たちは、障害を発症するリスクが高い。
【０００４】
頸部ジストニアは、本態性振戦及びパーキンソン病に続いて３番目に一般的な運動障害である。１０，０００人当たり推定３人が頸部ジストニアに罹患していることが知られている。北米のみで報告された症例数はほぼ３００，０００である。
【０００５】
症状は一般には徐々に始まり、次いで、症状が実質的に悪化しないプラトーに達する。残念なことに、頸部ジストニアの治癒法は存在せず、その状態によって個人の生活の質は大きな影響を受ける。場合によっては、障害は治療しなくても解決するが、持続的寛解は極めてまれである。
【０００６】
Ａ型の形態のボツリヌス毒素は、人類が知る最も致死性の天然生物剤であることが報告されている。Ｃ．ボツリヌス種（C. botulinum）の胞子は、土壌中に見出され、不適切に滅菌され密封された食品容器中で増殖することができる。致命的となり得るボツリヌス中毒は、細菌の摂取によって生じ得る。ボツリヌス毒素は、神経筋接合部にわたるアセチルコリンの放出を阻害することにより、シナプス伝達を妨げることによって筋肉の麻痺を生じるように作用し、その上他の様式でも作用すると考えられている。その作用により、筋肉の痙攣又は収縮を通常引き起こすシグナルが本質的に遮断され、麻痺に陥る。過去１０年の間に、ボツリヌス毒素の筋肉麻痺活性を活かすことで、様々な治療効果が実現された。ボツリヌス毒素の制御投与を使用して筋肉麻痺をもたらし、それによって、様々な医学的状態を、例えば、機能亢進性骨格筋により特徴付けられる神経筋障害を治療してきた。ボツリヌス毒素で治療されてきた状態として、片側顔面痙攣、成人発症型痙性斜頚、裂肛、眼瞼痙攣、脳性麻痺、頚部ジストニア、片頭痛、斜視、側頭下顎関節障害、並びに様々な種類の筋痙攣及び痙攣が挙げられる。さらに最近では、ボツリヌス毒素の筋肉麻痺効果は、しわ、渋面のしわ線、及び顔面筋の痙攣又は収縮の他の結果の治療などの、治療的及び美容的顔面用途に適用されている。
【０００７】
Ａ型の形態のボツリヌス毒素に加えて、グラム陽性細菌のクロストリジウム・ボツリナム種（Clostridium botulinum）によってまた産生される、他の７種の血清学的に異なる形態のボツリヌス毒素が存在する。これらの８種の血清学的に異なる型のボツリヌス毒素のうち、麻痺を引き起こすことができる７種は、ボツリヌス毒素血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧと命名された。これらのそれぞれは、型特異的抗体を用いた中和によって識別される。ボツリヌス毒素タンパク質のそれぞれの分子量は、約１５０ｋＤである。ボツリヌス毒素の分子サイズ及び分子構造のために、ボツリヌス毒素は、角質層及び下にある皮膚構造の複数の層を横断することができない。ボツリヌス毒素の様々な血清型は、様々な動物種において、その効果、並びにこれらが誘起する麻痺の重症度及び持続時間が異なる。例えば、ラットにおいて、ボツリヌス毒素Ａ型は、麻痺の割合によって測定して、ボツリヌス毒素Ｂ型より５００倍強力であると判定された。さらに、ボツリヌス毒素Ｂ型は、Ａ型に対する霊長類のＬＤ５０の約１２倍である、４８０Ｕ／ｋｇの用量で、霊長類において非毒性であると判定された。
【０００８】
クロストリジウム・ボツリナム種細菌によって放出される場合、ボツリヌス毒素は、付随する非毒素タンパク質とともに、約１５０ｋＤのボツリヌス毒素タンパク質分子を含有する毒素複合体の成分である。これらの内因性非毒素タンパク質は、血球凝集素タンパク質、並びに非血球凝集素タンパク質のファミリーを含むと考えられている。非毒素タンパク質は、毒素複合体中のボツリヌス毒素分子を安定化させ、毒素複合体が摂取されるとき、消化性酸による変性からボツリヌス毒素分子を保護すると報告されている。したがって、毒素複合体の非毒素タンパク質はボツリヌス毒素の活性を保護し、それによって、毒素複合体が消化管を介して投与される場合、全身性の浸透を増強する。さらに、非毒素タンパク質の一部は、血液中でボツリヌス毒素分子を特に安定化させると考えられている。
【０００９】
毒素複合体中の非毒素タンパク質の存在により、毒素複合体に、先に述べたように約１５０ｋＤであるボツリヌス毒素分子だけの分子量よりも大きい分子量が、典型的にはもたらされる。例えば、クロストリジウム・ボツリナム種細菌は、約９００ｋＤ、５００ｋＤ、又は３００ｋＤの分子量を有するボツリヌスＡ型毒素複合体を産生することができる。ボツリヌス毒素Ｂ及びＣ型は、約７００ｋＤ又は約５００ｋＤの分子量を有する複合体として産生される。ボツリヌス毒素Ｄ型は、約３００ｋＤ又は５００ｋＤの分子量を有する複合体として産生される。ボツリヌス毒素Ｅ及びＦ型は、約３００ｋＤの分子量を有する複合体としてのみ産生される。
【００１０】
ボツリヌス毒素にさらなる安定性を提供するために、毒素複合体は、製造中に複合体をアルブミンと組み合わせることによって従来安定化される。例えば、ＢＯＴＯＸ（登録商標）（Allergan, Inc.社製、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）は、アクセサリータンパク質、０．５ミリグラムのヒトアルブミンと０．９ミリグラムの塩化ナトリウムとともに１００ＵのＡ型ボツリヌス毒素を含有するボツリヌス毒素含有製剤である。アルブミンは、製造、輸送、貯蔵、及び投与に関連するものを含めて、異種環境中で、毒素複合体に結合し、これを安定化させるように機能する。
【００１１】
通常は、ボツリヌス毒素は、ボツリヌス毒素複合体とアルブミンを含有する組成物を慎重に制御して注射することによって患者に投与される。しかし、この手法に関連するいくつかの問題が存在する。所望の治療効果又は美容効果を実現するためには、注射が苦痛であるだけでなく、注射部位の周囲に、典型的には大きな、毒素の皮下原泉（well）が局所的に生成される。ボツリヌス毒素は、これらの皮下原泉から移動して、身体の周囲領域内に望まれない麻痺を引き起こすおそれがある。この問題は、治療されるべき領域が大きく、その領域を治療するのに、毒素の多くの注射が必要とされる場合、悪化する。さらに、注射される毒素複合体は、非毒素タンパク質とアルブミンを含有し、これらは、ボツリヌス毒素を安定化し、毒素コンプレックスの分子量を増加させるので、毒素複合体は、体内で長い半減期を有し、患者中に望ましくない抗原反応を引き起こすおそれがある。例えば、一部の患者は、現在の市販の製剤中で安定剤として使用されるアルブミンに対してアレルギーを経時的に発症する。また、毒素複合体は、患者の免疫系を誘発して中和抗体を形成する場合があり、その結果、同じ効果を実現するのに、その後の投与においてより大量の毒素が必要とされる。これが起こる場合、その後の注射は、こうした注射により、患者の血流中に大量の毒素が放出されないように慎重に行わなければならず、大量の毒素が放出されると、特に非毒素タンパク質とアルブミンは血液中でボツリヌス毒素を安定化させるので、致命的な全身性の毒作用に至るおそれがある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Inlander, Skin, New York, N.Y.: People's Medical Society, 1-7 (1998)
【非特許文献２】Benedetto, International Journal of Dermatology, 38:641-655 (1999)
【非特許文献３】Stegman et al., The Skin of the Aging Face Cosmetic Dermatological Surgery, 2nded., St.  Louis, Mo.: Mosby Year Book: 5-15 (1990)
【非特許文献４】Schantz and Scott, In Lewis G. E. (Ed) Biomedical Aspects of Botulinum, New York: Academic Press, 143-150 (1981)
【非特許文献５】Scott, Ophthalmol, 87:1044-1049 (1980)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
現在のボツリヌス毒素製剤に関連する欠点を考慮すると、効果的で安定であるが、抗原性の低下、及び注射後の局所的拡散傾向がより低い注射用ボツリヌス毒素製剤を有することが非常に望ましい。頸部ジストニアを治療するのに、治療目的のためにそのようなボツリヌス毒素製剤を使用することも望ましい。
【００１４】
頸部ジストニアの治療としては、飲み薬、ボツリヌス毒素注射、手術、及び補完療法が挙げられる。頸部ジストニアの最も一般的に処方される治療は、ボツリヌス毒素、通常にはＡ型の使用であり（Ｂ型も使用されてきたが）、これによって、その徴候と症状とを低減できる。ボツリヌス毒素は、神経と筋肉との間のコミュニケーションを遮断する助けとなり得るとともに、異常な運動や姿勢を緩和することが可能である。注射の回数は通常、ジストニアの重症度に基づいている。毒素を注射する医師は、異常な姿勢又は動きを観察し、筋痙攣を探ることによって、又は筋電計を使用して筋活動を測定することによって、注射すべき筋肉を選択できる。ジストニア侵されている筋肉それぞれは通常、個別に注射を受ける必要がある。したがって、現在利用可能な毒素製剤の拡散特性に基づくと、一度に体内に注射できる毒素の総量には限界が存在する。頸部ジストニアの治療には定期的な神経学的介入が含まれ、これは注射後４〜７日の期間又はこれより長期にわたり効力を発するが、ボツリヌス毒素による治療に対する応答は通常、１２週の期間後に、多くの場合早ければ１０週で、消え去り、頸部ジストニアに罹患しているヒトは再度注射を受ける必要がある。したがって、神経学的介入が少なくて済む、永続性のあるより長期間作用する治療が望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の態様の一つでは、本発明は、そのような治療を必要とする対象又は患者に、本発明の組成物の有効量、好ましくは治療有効量を注射することによって、頸部ジストニアの治療において生物学的効果を生じる方法に関する。
【００１６】
本発明の態様の別のものでは、本発明は、それを必要とする個体（individual）において頸部ジストニアを治療する方法であって、
ボツリヌス毒素、ボツリヌス毒素複合体、又は低ボツリヌス毒素複合体と、
下付き文字ｐ及びｑがそれぞれ独立して０〜２０の整数であるアミノ酸配列（ｇｌｙ）ｐ−ＲＧＲＤＤＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（配列番号１）、（ｇｌｙ）ｐ−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（配列番号２）又は（ｇｌｙ）ｐ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（配列番号３）を有する正に帯電した１又は２以上の効率基が共有結合で結合している正に帯電したポリリジン骨格を含む正に帯電した担体と、注射用の薬学的に許容される希釈剤と、
を含む組成物の注射を個体に投与するステップを含み；
ボツリヌス毒素が約１００Ｕ〜約４５０Ｕの量で個体に投与され；
正に帯電した担体が、ボツリヌス毒素、ボツリヌス毒素複合体、又は低ボツリヌス毒素複合体の成分と非共有結合で会合し；並びに
組成物の注射により、頸部ジストニアの症状の低減において少なくとも約６ヶ月〜約１０ヶ月の効果の持続時間を有する治療が提供され、これによって個体に対して治療間隔の持続時間が延長される、方法を提供する。
【００１７】
本発明の態様の別のものでは、本発明は、頸部ジストニアを治療するのに使用する、正に帯電した担体分子と非共有結合で会合したボツリヌス毒素を含む注射用組成物を提供する。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、従来の市販のボツリヌス毒素製剤、例えば、ＢＯＴＯＸ（登録商標）又はＭＹＯＢＬＯＣ（登録商標）に勝る１又は２以上の利点を有する。例えば、ある特定の実施形態では、組成物は、抗原性の低下、注射後に周囲組織中への拡散を起こす傾向の低下、従来のボツリヌス毒素製剤と比べた、臨床的有効性の持続時間の増大又は改善された効力、臨床的有効性のより速やかな発現、及び／又は安定性の改善を含めて、従来の注射用ボツリヌス製剤に勝る１又は２以上の利点を示すことができる。
【００１８】
本発明のさらなる態様は、ある特定の非天然分子（すなわち、クロストリジウム・ボツリナム種細菌から得られるボツリヌス毒素複合体中に見出されない分子）を、ボツリヌス毒素、ボツリヌス毒素複合体、特に、低ボツリヌス毒素複合体（reduced botulinum toxin complex）（本明細書に定義の通り）に付加して、頸部ジストニアの治療において組織を通しての毒素の拡散を改善することができるという認識である。非天然分子は、毒素と非共有結合で会合し、注射後に毒素が標的構造に到達する能力を改善する、浸透促進剤として作用する。さらに、非天然分子は、注射前後の毒素の安定性を増大させることができる。例として、浸透促進剤は、陽イオンペプチドなどの正に帯電した担体とすることができ、これは、固有のボツリヌス毒素様活性をまったく有さず、しかも、本明細書に記載のように１又は２以上のタンパク質形質導入ドメインを含有する。
【００１９】
本発明の別の態様は、頸部ジストニアを治療する方法において使用するための、ボツリヌス毒素、ボツリヌス毒素複合体（又は１５０ｋＤの神経毒自体のみ、若しくは天然複合タンパク質の、全部ではないが、一部を有する神経毒を含む、低タンパク質ボツリヌス毒素複合体）及び正に帯電した担体を含む組成物を提供することである。
【００２０】
別の態様では、本発明は、治療を必要とする対象又は患者に注射による投与に続いて、長期継続的な、持続的有効性、例えば、長い持続時間の奏効率が得られる、本発明の組成物の有効用量及び有効量を頸部ジストニアの治療において提供する。このような用量及び量は、当該用量及び量が投与されている対象において所望の治療効果を生じるか又はもたらす治療有効用量及び有効量であることが好ましい。特定の実施形態では、対象当たり約１００Ｕ〜約４５０Ｕの治療有効用量で、本明細書に記載の、ボツリヌス毒素Ａなどのボツリヌス毒素と正に帯電した担体とを含む本発明の組成物で対象又は患者を単回治療することによって、少なくとも１６週の間、少なくとも２０週の間、少なくとも２４週の間、若しくは約６ヶ月〜１０カ月の間、又はさらに長い間、頸部ジストニアの症状の低減に関して奏功率が得られた。さらに、本発明の組成物によって、注射後に注射部位からの拡散又は広がりが低減するという属性が提供され、これによって、所望の場所での毒素及びその効果が局所化され、治療のための注射部位から離れた部位又は場所での毒素の非特異的又は望ましくない効果が低下する。
【００２１】
本発明の組成物、例えば、RT002により並びに記載の治療方法及び使用により、提供される効果の持続時間によって、当技術分野と比べて、大きな利点が得られる。例として、ボツリヌス毒素を含有する組成物による治療を受けている対象は、治療後の効果の持続時間は彼らにとって重要性が高いことを考慮する。本発明の生成物、例えば、RT002の有効用量及び治療法での単回治療によっても実現される、効果のこのような長い、持続性持続時間によって、患者に対する治療コース１回当たりの注射の数を減らすことができ、このようなことは対象にとって極めて重要なことである。本明細書に記載の本発明の組成物及び方法によって提供されるような、明瞭な有効性及び安全性を有する生成物での単回治療による長時間の持続時間効果によって、治療のコースを受けている患者に対して、より小さい不快感、より低コスト、より高い利便性が提供される。さらに、生成物による対象への単回注射による治療の後、少なくとも１６若しくは２４週の期間、又は少なくとも６ヶ月の期間、又は６ヶ月超の期間維持される有意かつ持続的な効果を奏する生成物によって、開業医と患者双方にとって、当技術分野で満たされていないニーズに対する解決策が提供される。したがって、本発明の組成物及び方法によって、治療があまりにも頻繁である問題に対する解決策が提供され、患者の全体的な健康感が向上する。作用の持続時間がこのように長期であると、全体的な治療コースにわたって治療の数が減ることになる。
【００２２】
別の態様では、本発明は、ボツリヌス毒素を投与して、頸部ジストニアに罹患している個体において延長された持続時間の治療効果を実現する方法であって、治療を必要とする個体のある領域に滅菌注射用組成物の一用量を注射により投与して、組成物での第１の治療後に治療効果を実現するステップを含み；組成物が、注射に適した薬学的に許容される希釈剤と、ボツリヌス毒素、ボツリヌス毒素複合体、又は低ボツリヌス毒素複合体の成分と、下付き文字ｐ及びｑがそれぞれ独立して０〜２０の整数であるアミノ酸配列（ｇｌｙ）ｐ−ＲＧＲＤＤＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（配列番号１）、（ｇｌｙ）ｐ−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（配列番号２）又は（ｇｌｙ）ｐ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（配列番号３）を有する正に帯電した１又は２以上の効率基（efficiency group）が共有結合で結合している正に帯電したポリリジン骨格を含む正に帯電した担体成分とを含み；ボツリヌス毒素、ボツリヌス毒素複合体、又は低ボツリヌス毒素複合体の成分が、約１００Ｕ〜４５０Ｕ；又は、より詳細には、約１００Ｕ〜２００Ｕ又は約２００Ｕ〜３００Ｕ又は約３００Ｕ〜４５０Ｕの治療用量で個体に投与され、正に帯電した担体が、ボツリヌス毒素、ボツリヌス毒素複合体、又は低ボツリヌス毒素複合体の成分と非共有結合で会合し；個体に注射により投与された組成物の第１の治療用量によって、少なくとも約６ヶ月〜約１０ヶ月の効果の持続時間を有する、延長された持続時間の治療効果が実現され、任意で、その後に、第２の又はそれ以降の治療用量が投与される、方法を提供する。
【００２３】
別の態様では、本発明は、注射用の薬学的に許容される希釈剤と、１００Ｕ超から、１００〜２００Ｕ、２００〜３００Ｕ、又は３００〜４５０Ｕから選択される投与量のボツリヌス毒素、ボツリヌス毒素複合体、又は低ボツリヌス毒素複合体と、下付き文字ｐ及びｑがそれぞれ独立して０〜２０の整数であるアミノ酸配列（ｇｌｙ）ｐ−ＲＧＲＤＤＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（配列番号１）、（ｇｌｙ）ｐ−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（配列番号２）又は（ｇｌｙ）ｐ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（配列番号３）を有する正に帯電した１又は２以上の効率基が共有結合で結合している正に帯電したポリリジン骨格を含む正に帯電した担体とを含む滅菌注射用組成物であって；正に帯電した担体が、ボツリヌス毒素、ボツリヌス毒素複合体、又は低ボツリヌス毒素複合体の成分と非共有結合で会合し；組成物が、注射用組成物の有効用量での個体の治療後に、少なくとも２０〜２４週の間、又は少なくとも６ヶ月の間、又は６ヶ月超、例えば約６ヶ月〜約１０ヶ月続く治療効果を提供する、組成物を頸部ジストニアの治療のために提供する。
【００２４】
これらの上記の方法及び組成物の一部の実施形態では、組成物は、血清型Ａのボツリヌス毒素を、好ましくは分子量１５０ｋＤａを有する血清型Ａのボツリヌス毒素を含む。一実施形態では、正に帯電した担体は、アミノ酸配列ＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ−（Ｋ）１５−ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号４）を有する。一実施形態では、ボツリヌス毒素は１００Ｕ超からの、１００〜２００Ｕ、又は２００〜３００Ｕ又は３００〜４５０Ｕの投与量で組成物中に存在する。一実施形態では、ボツリヌス毒素は１００Ｕ、２００Ｕ、３００Ｕ及び４５０Ｕからなる群から選択される投与量で組成物中に存在する。一実施形態では、組成物により、組成物の注射による単回治療を受けた個体において頸部ジストニアの症状が低減する。ある特定の実施形態では、治療効果の持続時間は、６ヶ月超、７ヶ月超、８ヶ月超、９ヶ月超、又は少なくとも６ヶ月〜１０ヶ月を含む。
【００２５】
本発明の態様の別のものでは、本発明は、注射用ボツリヌス毒素での治療を必要とする、頸部ジストニアに罹患している個体を治療する方法であって、治療の方法が、効果の持続時間及びそれぞれの治療間隔の間の持続時間の時間が長時間である複数の治療間隔を有する治療コースを含み、治療コースが、治療を必要とする個体のある領域に滅菌注射用組成物の最初の治療用量を注射により投与して、組成物での最初の治療後に治療効果を実現するステップであって、組成物が、ボツリヌス毒素、ボツリヌス毒素複合体、又は低ボツリヌス毒素複合体の成分と、下付き文字ｐ及びｑがそれぞれ独立して０〜２０の整数であるアミノ酸配列（ｇｌｙ）ｐ−ＲＧＲＤＤＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（配列番号１）、（ｇｌｙ）ｐ−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（配列番号２）又は（ｇｌｙ）ｐ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（配列番号３）を有する正に帯電した１又は２以上の効率基が共有結合で結合している正に帯電したポリリジン骨格を含む正に帯電した担体成分とを含み；ボツリヌス毒素、ボツリヌス毒素複合体、又は低ボツリヌス毒素複合体の成分が１００Ｕ超からの、１００〜２００Ｕ、２００〜３００Ｕ、又は３００〜４５０Ｕの治療用量で前記個体に投与され：正に帯電した担体が、ボツリヌス毒素、ボツリヌス毒素複合体、又は低ボツリヌス毒素複合体の成分と非共有結合で会合し；個体に注射により投与された組成物の最初の治療用量によって、少なくとも約１０ヶ月を通じて続く効果の治療的持続時間が提供される、ステップ；並びに、最初の治療用量の後及びそれぞれのそれ以降の治療用量の間に３ヶ月以上〜少なくとも約１０ヶ月の持続時間を含む治療間隔で、個体に注射により組成物のそれ以降の治療用量を投与するステップを含む、方法を提供する。
【００２６】
上記治療方法の実施形態では、治療効果は、頸部ジストニアの症状の治療である。一実施形態では、組成物は、血清型Ａのボツリヌス毒素を、好ましくは分子量１５０ｋＤａを有する血清型Ａのボツリヌス毒素を含む。一実施形態では、正に帯電した担体は、アミノ酸配列ＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ−（Ｋ）１５−ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号４）を有する正に帯電したペプチドである。一実施形態では、組成物は注射後に注射の部位から局所的に拡散しない。特定の実施形態では、ボツリヌス毒素は１００Ｕ超の、１００〜２００Ｕ、２００〜３００Ｕ、又は３００〜４５０Ｕの量で個体に投与される。ある特定の実施形態では、治療間隔の持続時間は、３ヶ月超、４ヶ月超、５ヶ月超、６ヶ月超、７ヶ月超、８ヶ月超、９ヶ月超、又は少なくとも６ヶ月〜１０ヶ月を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本明細書の実施例に記載の頸部ジストニア第２相試験設計を示す図である。
【図２】本明細書の実施例に記載の試験における、コホート別のデモグラフィックスを示す図である。
【図３】本明細書の実施例に記載の試験における、基本語別のコホート別の治療関連ＡＥ’ｓを有する対象の数（％）を示す図である。
【図４】本明細書の実施例に記載の試験における、コホート別の主要エンドポイント−４週目のＴＷＳＴＲＳ−総スコアの低下を示す図である。
【図５】本明細書の実施例に記載の試験における、コホート別の副次エンドポイント−ＴＷＳＴＲＳ−経時的な総スコアのベースラインからの変化を示す図である。
【図６】本明細書の実施例に記載の試験における、コホート別の副次エンドポイント−目標−ＴＷＳＴＲＳスコアに達している対象によって定義される応答の持続時間（４週目で改善を伴う対象のうち、再治療の必要性による脱落例は事象としてみなされる）を示す図である。
【図７】本明細書の実施例に記載の試験における、用量別の対象分布−投与される試験用量は２つの個別の用量群にクラスターを成すことを示す図である。
【図８】本明細書の実施例に記載の、用量群別の副次エンドポイント−ＴＷＳＴＲＳ−経時的な総スコアのベースラインからの変化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明は、頸部ジストニアを治療する方法において使用される、ボツリヌス毒素、ボツリヌス毒素複合体、又は低ボツリヌス毒素複合体を含む新規の注射用組成物に関する。好ましい実施形態では、本組成物は、毒素を安定化させ、又は注射後に組織を通して毒素を輸送若しくは送達することを可能にし、その結果、本発明の毒素は、外因性アルブミンに結合している従来の市販のボツリヌス毒素複合体（例えば、ＢＯＴＯＸ（登録商標）又はＭＹＯＢＬＯＣ（登録商標））と比較して、抗原性の低下、より良好な安全性プロファイル、改善された効力、臨床的有効性のより速やかな発現及び／又は臨床的有効性のより長い持続時間を有する。本発明の組成物は、本明細書に記載のように、様々な治療目的のために、対象にボツリヌス毒素を供給するための注射用適用物として使用することができる。本発明の組成物はまた、ボツリヌス毒素に関して他の組成物及び送達方法に勝る、改善された安全性プロファイルを有する。加えて、こういった組成物によって、ボツリヌス毒素に対する免疫応答において有益な低下を与えることができる。複数の実施形態では、本発明の注射用組成物が、特に、１００Ｕ以上の量でボツリヌス毒素を含むものが、頸部ジストニアの治療のために注射により投与されている対象において、本発明の注射用組成物によって、長期継続的な有効性、例えば、少なくとも２０週、少なくとも２４週、少なくとも６ヶ月、又は６ヶ月超、例えば約１０ヶ月まで継続する効果が提供される。
【００２９】
用語「ボツリヌス毒素」とは、本明細書で使用する場合、細菌によって産生されるものであっても、組換え技法によって産生されるものであっても、既知の型のボツリヌス毒素（例えば、Ｃ．ボツリヌス種の様々な血清型に関連する１５０ｋＤのボツリヌス毒素タンパク質分子）のいずれか、さらに新しく発見される血清型を含めて、引き続き発見され得るそのようないかなる型、並びに改変されたバリアント又は融合タンパク質を指すことができる。上述のように、現在、７つの免疫学的に異なるボツリヌス神経毒が特徴付けられ、すなわちボツリヌス神経毒素血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧであり、このそれぞれは、型特異的抗体を用いた中和によって識別される。ボツリヌス毒素血清型は、例えば、Sigma-Aldrich社（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から、及びMetabiologics, Inc.社（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）から、並びに他の供給源から市販されている。ボツリヌス毒素の様々な血清型は、これらが影響する動物種において変化し、並びにこれらが誘起する麻痺の重症度及び持続時間において異なる。ボツリヌス毒素の少なくとも２つの型、すなわちＡ型及びＢ型が、ある特定の状態を治療するための製剤中で市販されている。Ａ型は、例えば、商標ＢＯＴＯＸ（登録商標）を有するAllergan社、及び商標ＤＹＳＰＯＲＴ（登録商標）を有するIpsen社の製剤中に含まれており、Ｂ型は、商標ＭＹＯＢＬＯＣ（登録商標）を有するElan社の製剤中に含まれている。
【００３０】
本発明の組成物中に使用される用語「ボツリヌス毒素」とは、或いは、ボツリヌス毒素誘導体、すなわち、ボツリヌス毒素活性を有するが、自然由来のボツリヌス毒素又は組換え天然ボツリヌス毒素と比べて、任意の部分上に又は任意のアミノ酸鎖上に、１若しくは２以上の化学的又は機能的改変を含有する化合物を指すことができる。例えば、ボツリヌス毒素は、天然型と比較した場合に、そのアミノ酸のうちの少なくとも１つが欠失、修飾、又は置換された神経毒素である修飾神経毒素とすることができ、或いは修飾神経毒素は、組換えで産生された神経毒素、又はその誘導体若しくは断片とすることができる。例えば、ボツリヌス毒素は、例えば、その特性を増強し又は望ましくない副作用を減少させる方法で修飾されているが、所望のボツリヌス毒素活性を依然として保持するものであってもよい。或いは、本発明で使用されるボツリヌス毒素は、組換え技法又は合成化学技法を使用して調製された毒素、例えば、様々なボツリヌス毒素血清型のサブユニット若しくはドメインから調製された、例えば、組換えペプチド、融合タンパク質、ハイブリッド神経毒（例えば、米国特許第６，４４４，２０９号明細書を参照）とすることができる。ボツリヌス毒素はまた、分子全体のうちの必要なボツリヌス毒素活性を有することが示された一部分とすることもでき、かかる場合にはそのままで、又は、組合せ分子若しくはコンジュゲート分子の一部として、例えば融合タンパク質の一部として使用することもできる。或いは、ボツリヌス毒素はボツリヌス毒素前駆体の形とすることができ、かかる前駆体はそれ自体非毒性であって、例えばタンパク質分解的切断時に毒性となる非毒性亜鉛プロテアーゼとすることができる。
【００３１】
用語「ボツリヌス毒素複合体」又は「毒素複合体」とは、本明細書で使用する場合、付随する内因性非毒素タンパク質（すなわち、クロストリジウム・ボツリナム種細菌によって産生される血球凝集素タンパク質及び非毒素非血球凝集素タンパク質）を伴った、約１５０ｋＤのボツリヌス毒素タンパク質分子（ボツリヌス毒素血清型Ａ〜Ｇのいずれかに属する）を指す。しかし、ボツリヌス毒素複合体は、単一の毒素複合体として、クロストリジウム・ボツリナム種細菌に由来する必要はないことに留意されたい。例えば、ボツリヌス毒素又は修飾ボツリヌス毒素を組換えで最初に調製し、次いで引き続いて非毒素タンパク質と組み合わせる場合もある。組換えボツリヌス毒素を購入し（例えば、List Biological Laboratories社製、Ｃａｍｐｂｅｌｌ、ＣＡ）、次いで非毒素タンパク質と組み合わせることもできる。
【００３２】
本発明はまた、１又は２以上の外因性安定剤の添加、内因性安定剤の除去、又はこれらの組合せを通じて、ボツリヌス毒素分子の安定性を調節することも企図する。例えば、本発明は、「低ボツリヌス毒素複合体」の使用を企図し、この場合、クロストリジウム・ボツリナム種細菌によって産生されるボツリヌス毒素複合体中に自然界に見出される量と比較して、ボツリヌス毒素複合体は非毒素タンパク質の量が低下している。一実施形態では、クロストリジウム・ボツリナム種細菌に由来するボツリヌス毒素複合体から、血球凝集素タンパク質又は非毒素非血球凝集素タンパク質の画分を抽出する、従来の任意のタンパク質分離方法を使用して、低ボツリヌス毒素複合体が調製される。例えば、低ボツリヌス毒素複合体は、ｐＨ７．３で赤血球に曝露することにより、ボツリヌス毒素複合体を解離することによって産生することができる（例えば、参照により本明細書に組み込まれている、欧州公開特許公報第１５１４５５６Ａ１号を参照）。ＨＰＬＣ、透析、カラム、遠心分離、及びタンパク質からタンパク質を抽出するためのその他の方法を使用することができる。或いは、低ボツリヌス毒素複合体を、合成で産生されるボツリヌス毒素を非毒素タンパク質と組み合わせることによって産生する場合、自然由来のボツリヌス毒素複合体に存在すると考えられるよりも少ない血球凝集素又は非毒素非血球凝集素タンパク質を混合物に単に添加することができる。本発明による低ボツリヌス毒素複合体中の非毒素タンパク質のいずれも（例えば、血球凝集素タンパク質若しくは非毒素非血球凝集素タンパク質、又は両方）、独立して任意の量だけ減少することができる。ある特定の例示的な実施形態では、１又は２以上の非毒素タンパク質は、ボツリヌス毒素複合体中に通常見出される量と比較して、少なくとも約０．５％、１％、３％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％減少されている。上述のように、クロストリジウム・ボツリナム種細菌は、７つの異なる血清型の毒素を産生し、市販の製剤は、様々な相対的量の非毒素タンパク質（すなわち、様々な量の毒素複合体）とともに製造される。例えば、ＭＹＯＢＬＯＣ（商標）は、０．０５％のヒト血清アルブミン、０．０１Ｍのコハク酸ナトリウム、及び０．１Ｍの塩化ナトリウムとともに、１ｍｌ当たり５０００Ｕのボツリヌス毒素Ｂ型を有する。ＤＹＳＰＯＲＴ（商標）は、１２５ｍｃｇのアルブミン及び２．４ｍｇのラクトースとともに、５００Ｕのボツリヌス毒素Ａ型−血球凝集素複合体を有する。ある特定の実施形態では、クロストリジウム・ボツリナム種細菌に由来するボツリヌス毒素複合体中に通常見出される、非毒素タンパク質のうちの実質的に全て（例えば、血球凝集素タンパク質及び非毒素非血球凝集素タンパク質の９５％超、９６％超、９７％超、９８％超、又は９９％超）が、ボツリヌス毒素複合体から除去されている。さらに、内因性非毒素タンパク質の量を、場合によっては同じ量で減少させることができるが、本発明は、内因性非毒素タンパク質のそれぞれを異なる量で減少させること、並びに内因性非毒素タンパク質のうちの少なくとも１つを減少させるが、他のものは減少させないことも企図する。
【００３３】
上述のように、外因性安定剤（例えば、アルブミン）を、ボツリヌス毒素製剤を安定化するために通常は添加する。例えば、ＢＯＴＯＸ（登録商標）の場合では、複合体を安定化するために、Ａ型ボツリヌス毒素複合体１００Ｕ当たり、０．５ｍｇのヒトアルブミンが添加されている。一般に、本発明による組成物を安定化するために添加することができる外因性安定剤の量は、特に制限されない。一部の実施形態では、添加される安定剤の量は、本発明の正に帯電した担体がそれ自体で安定剤として作用する能力により、従来添加する量より少なくすることができる。例えば、添加する外因性アルブミンの量は、外因性アルブミンの従来の１０００倍過剰に満たない任意の量とすることができ、本発明のある特定の例示的な実施形態では、ボツリヌス毒素１００Ｕ当たり、わずか約０．２５、０．２０、０．１５、０．１０、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．００００１、０．０００００５、０．０００００１、又は０．００００００１ｍｇである。一実施形態では、外因性アルブミンは、本発明の組成物に安定剤としてまったく添加されず、したがって、アルブミンフリーのボツリヌス毒素組成物が産生される。
【００３４】
本発明の好ましい組成物は、タンパク質性賦形剤無しで、特に動物タンパク質由来の賦形剤無しで安定化している液体の、ボツリヌス毒素含有組成物である。このような液体組成物は、ボツリヌス毒素、好ましくは血清型Ａのボツリヌス毒素、正に帯電した担体（例えば、ペプチド）、非還元性二糖又は非還元性三糖、非イオン性界面活性剤、及び４．５〜７．５の間のｐＨを維持するための生理的適合性緩衝剤を含む。液体組成物の非還元性糖の濃度は１０％〜４０％（ｗ／ｖ）の範囲であり、非イオン性界面活性剤の濃度は０．００５％〜０．５％（ｗ／ｖ）の範囲である。好ましい組成物により、単回注射での治療後に長い持続時間の効果が提供される。好ましい一実施形態では、ボツリヌス毒素Ａは分子量（ＭＷ、molecular weight）１５０ｋＤａを有する。好ましい組成物は、ボツリヌス毒素、好ましくボツリヌス毒素Ａ、より好ましくは１５０ｋＤａＭＷのボツリヌス毒素Ａ、本明細書に記載の正に帯電した担体（例えば、ペプチド）、非還元性二糖、例えば、スクロース、非イオン性界面活性剤、例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、又はソルビタンエステル、並びに生理的適合性緩衝剤、例えば、クエン酸、酢酸、コハク酸、酒石酸、マレイン酸、及びヒスチジンを含むとともに、ｐＨ４．５〜ｐＨ７．５の範囲のｐＨを有する。
【００３５】
本発明によれば、タンパク質形質導入ドメイン、又は効率基を有する正に帯電した担体分子は、本明細書に記載のように、ボツリヌス毒素向けの輸送システムとして適しており、これを使用すると、筋肉などの標的構造への浸透が改善された状態で毒素を注射することが可能となることが見出された。輸送は、ボツリヌス毒素の共有結合性修飾無しで進行する。ボツリヌス毒素の浸透を増強することに加えて、本発明の正に帯電した担体は、ある特定の好ましい実施形態では、分解に対してボツリヌス毒素を安定化することができる。そのような実施形態では、ボツリヌス毒素を安定化させるために通常存在する血球凝集素タンパク質及び非毒素非血球凝集素タンパク質を、減少させるか又は完全に省略することができる。同様に、製造の間に通常添加される外因性アルブミンも省略することができる。
【００３６】
用語「担体」に関連して用語「正に帯電した」又は「陽イオン性の」を使用することにより、担体が、少なくとも何らかの溶液相条件下で、より好ましくは、少なくとも何らかの生理学的に適合性の条件下で、正電荷を有することを意味する。より具体的には、「正に帯電した」及び「陽イオン性の」とは、本明細書で使用する場合、対象の基は、全てのｐＨ条件下で帯電している官能基、例えば、四級アミンを含有しているか、又は一級アミンの場合においてはｐＨ変化などのある特定の溶液相条件下で、正電荷を獲得することができる官能基を含有することを意味する。より好ましくは、「正に帯電した」又は「陽イオン性の」とは、本明細書で使用する場合、生理学的に適合性の条件にわたって陰イオンと会合する挙動を有するそういった基を指す。当業者であれば明らかなように、多数の正に帯電した部分を有するポリマーは、ホモポリマーである必要はない。正に帯電した部分のその他の例は、従来技術においてよく知られており、当業者であれば明らかなように、容易に使用することができる。
【００３７】
一般に、正に帯電した担体（「正に帯電した骨格」とも呼ばれる）は典型的には、生理的ｐＨで正電荷を担持する、鎖中の基、又は骨格から延びる側鎖に結合している、正電荷を担持する基のいずれかを有する原子の鎖である。ある特定の好ましい実施形態では、正に帯電した骨格は、陽イオンペプチドである。本明細書で使用する場合、用語「ペプチド」とは、アミノ酸配列を指すが、アミノ酸配列内のアミノ酸残基の数に関して意味を持たない。したがって、用語「ペプチド」とはまた、ポリペプチド及びタンパク質も包含し得る。ある特定の好ましい実施形態では、正に帯電した骨格自体は、特定の酵素的又は治療的生物活性を有さない。ある特定の実施形態では、骨格は直鎖状炭化水素骨格であり、これは、一部の実施形態では、窒素、酸素、硫黄、ケイ素、及びリンから選択されるヘテロ原子が介在している。骨格鎖の原子の大部分は、通常、炭素である。さらに、骨格は、反復単位（例えば、アミノ酸、ポリ（エチレンオキシ）、ポリ（プロピレンアミン）、ポリアルキレンイミンなど）のポリマーであることが多いが、ヘテロポリマーであってもよい。実施形態のうちの一群では、正に帯電した骨格は、ポリプロピレンアミンであり、いくつかのアミン窒素原子が、正電荷を担持するアンモニウム基（テトラ置換された）として存在する。別の実施形態では、正に帯電した骨格は非ペプチジルポリマーであり、これは、約１０，０００〜約２，５００，０００、好ましくは、約１００，０００〜約１，８００，０００、最も好ましくは、約５００，０００〜約１，４００，０００の分子量を有する、ポリアルキレンイミン、例えば、ポリエチレンイミン又はポリプロピレンイミンなどのヘテロポリマー又はホモポリマーとすることができる。実施形態の別の群では、骨格は、正に帯電した基（例えば、アンモニウム基、ピリジニウム基、ホスホニウム基、スルホニウム基、グアニジウム基、又はアミジニウム基）を含む複数の側鎖部分を結合している。実施形態のうちこういった群における側鎖部分は、骨格に沿って間隔を置いて配置することができ、この間隔は、離間が一貫しているか、又は可変である。さらに、側鎖の長さは、類似していても異なっていてもよい。例えば、実施形態のうちの一群では、側鎖は、１〜２０個の炭素原子を有し、上述の正に帯電した基の１つの遠位端（骨格から離れた）で終端となる直鎖状又は分岐状の炭化水素鎖とすることができる。正に帯電した担体とボツリヌス毒素の間の会合は、非共有結合性相互作用によるものであり、その非限定例としては、イオン相互作用、水素結合、ファンデルワールス力、又はこれらの組合せが挙げられる。
【００３８】
実施形態群のうちの一群では、正に帯電した骨格は、複数の正に帯電した側鎖基（例えば、リジン、アルギニン、オルニチン、ホモアルギニン等）を有するポリペプチドである。好ましくは、ポリペプチドは、約１００〜約１，５００，０００、より好ましくは約５００〜約１，２００，０００、最も好ましくは約１０００〜約１，０００，０００の分子量を有する。本発明のこの部分にアミノ酸が使用される場合には、側鎖が結合の中心でＤ型又はＬ型（Ｒ立体配置又はＳ立体配置）のいずれかを有し得ることを、当業者であれば理解するであろう。ある特定の好ましい実施形態では、ポリペプチドは、約５００〜約５０００、より好ましくは１０００〜約４０００、より好ましくは２０００〜約３０００の分子量を有する。他の好ましい実施形態では、ポリペプチドは、１０〜２０個のアミノ酸、又は１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０個のアミノ酸、好ましくはポリリジンを含む。
【００３９】
或いは、骨格は、アミノ酸アナログ及び／又は合成アミノ酸を含むことができる。骨格はまた、ペプトイドなどのポリペプチドのアナログとすることもできる。例えば、Kessler, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32:543 (1993); Zuckermann et al. Chemtracts-Macromol. Chem. 4:80 (1992)；及びSimon et al. Proc. Nat'l. Acad.  Sci.  USA 89:9367 (1992)を参照されたい。要約すると、ペプトイドは、その側鎖が、α−炭素原子ではなく骨格の窒素原子に結合しているポリグリシンである。上記のように、側鎖の一部分が、正に帯電した基で典型的に終止することによって、正に帯電した骨格成分をもたらす。ペプトイドの合成は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，８７７，２７８号明細書に記載されている。その用語が本明細書で使用される場合、アルファ−炭素位に自然由来の側鎖を有するアミノ酸から構成されていないので、ペプトイド骨格構成を有する正に帯電した骨格が「非ペプチド」とみなされる。
【００４０】
例えば、ポリペプチドの立体的又は電子的模倣体を利用して、様々な他の骨格を使用することができ、この場合、ペプチドのアミド連結は代替物で、例えば、エステル連結、チオアミド（−−ＣＳＮＨ−−）、逆チオアミド（−−ＮＨＣＳ−−）、アミノメチレン（−−ＮＨＣＨ２−−）又は逆メチレンアミノ（−−ＣＨ２ＮＨ−−）基、ケト−メチレン（−−ＣＯＣＨ２−−）基、ホスフィネート（−−ＰＯ２ＲＣＨ２−−）、ホスホンアミデート及びホスホンアミデートエステル（−−ＰＯ２ＲＮＨ−−）、逆ペプチド（−−ＮＨＣＯ−−）、ｔｒａｎｓ−アルケン（−−ＣＲ＝ＣＨ−−）、フルオロアルケン（−−ＣＦ＝ＣＨ−−）、ジメチレン（−−ＣＨ２ＣＨ２−−）、チオエーテル（−−ＣＨ２Ｓ−−）、ヒドロキシエチレン（−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−）、メチレンオキシ（−−ＣＨ２Ｏ−−）、テトラゾール（ＣＮ４）、スルホンアミド（−−ＳＯ２ＮＨ−−）、メチレンスルホンアミド（−−ＣＨＲＳＯ２ＮＨ−−）、逆スルホンアミド（−−ＮＨＳＯ２−−）で、並びにマロネート及び／又はｇｅｍ−ジアミノ−アルキルサブユニットを有する骨格で、置き換えられてあり、例えば、Fletcher et al.（(1998) Chem.  Rev.  98:763）により概説され、そこに引用されている文献により詳述されている。前述の置換の多くが、α−アミノ酸から形成される骨格と比べて、ほぼ等配電子のポリマー骨格をもたらす。
【００４１】
上に提供の骨格のそれぞれにおいて、正に帯電した基を担持する側鎖基を付加することができる。例えば、スルホンアミドと連結した骨格（−−ＳＯ２ＮＨ−−及び−−ＮＨＳＯ２−−）は、窒素原子に結合した側鎖基を有することができる。同様に、ヒドロキシエチレン（−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−）連結は、ヒドロキシ置換基に結合している側鎖基を有することができる。当業者であれば、他の連結化学を適用して、標準的な合成法を使用することにより、正に帯電した側鎖基を容易に提供することができる。
【００４２】
一実施形態では、正に帯電した骨格とは、タンパク質形質導入ドメイン（効率基とも呼ばれる）を有するポリペプチドである。本明細書で使用する場合、効率基又はタンパク質形質導入ドメインとは、組織又は細胞膜を通して、正に帯電した骨格の転移を促進する効果を有する任意の薬剤である。タンパク質形質導入ドメイン又は効率基の非限定例としては、−（ｇｌｙ）ｎ１−（ａｒｇ）ｎ２（配列番号５）、ＨＩＶ−ＴＡＴ若しくはその断片、又はアンテナペディアのタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ、protein transduction domain）若しくはその断片が挙げられ、ここで、下付き文字ｎ１は、０〜２０、より好ましくは０〜８、さらにより好ましくは２〜５の整数であり、下付き文字ｎ２は、独立して、約５〜約２５、より好ましくは約７〜約１７、最も好ましくは約７〜約１３の奇整数である。一部の実施形態では、ジスルフィド凝集に関連する問題を最小限にするために、ＨＩＶ−ＴＡＴ断片は、システインを多く含む、ＨＩＶ−ＴＡＴ分子の領域を含有しない。好ましくは、ＨＩＶ−ＴＡＴ及びアンテナペディアタンパク質形質導入ドメインの断片は、完全タンパク質のタンパク質形質導入活性を保持している。なおさらに好ましいのは、ＨＩＶ−ＴＡＴ断片はアミノ酸配列（ｇｌｙ）ｐ−ＲＧＲＤＤＲＲＱＲＲＲ―（ｇｌｙ）ｑ（配列番号１）、（ｇｌｙ）ｐ−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（配列番号２）又は（ｇｌｙ）ｐ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（配列番号３）を有している実施形態であり、ここで、下付き文字ｐ及びｑはそれぞれ独立して０〜２０の整数であり、又はｐ及びｑはそれぞれ独立して整数１である。別の実施形態では、断片又は効率基は、断片又は効率基のアミノ酸配列のＣ末端又はＮ末端のいずれかを介して骨格に結合している。ある特定の好ましい実施形態では、ｐは１でありかつｑは０であり、又はｐは０でありかつｑは１である。好ましいＨＩＶ−ＴＡＴ断片は、下付き文字ｐ及びｑがそれぞれ独立して、０〜８、より好ましくは０〜５の整数のものである。別の好ましい実施形態では、正に帯電した側鎖又は分岐基は、アンテナペディア（Ａｎｔｐ，Antennapedia）タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）、又は活性を保持するその断片である。これらは、例えば、Console et al., J. Biol. Chem.  278:35109 (2003)から、当技術分野において知られており、本発明によって企図されるアンテナペディアＰＴＤの非限定例は、アミノ酸配列ＳＧＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＣ（配列番号６）を有するＰＴＤである。他の実施形態では、正に帯電した担体とは、本発明の組成物及び方法において使用するための、アミノ酸配列ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−Ｇ−（Ｋ）１５−Ｇ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号４）を有する正に帯電したペプチドであり；又はアミノ酸配列ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−Ｇ−（Ｋ）１５−Ｇ−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号７）を有する正に帯電したペプチドであり；又はアミノ酸配列ＲＧＲＤＤＲＲＱＲＲＲ−Ｇ−（Ｋ）１５−Ｇ−ＲＧＲＤＤＲＲＱＲＲＲ（配列番号８）を有する正に帯電したペプチドである。
【００４３】
好ましくは、正に帯電した担体は、全担体重量の百分率として少なくとも約０．０１％、好ましくは約０．０１〜約５０重量パーセント、より好ましくは約０．０５〜約４５重量パーセント、最も好ましくは約０．１〜約３０重量％の量で側鎖が正に帯電したタンパク質形質導入ドメイン又は正に帯電した効率基を含む。式−（ｇｌｙ）ｎ１−（ａｒｇ）ｎ２（配列番号５）を有する正に帯電したタンパク質形質導入ドメインの場合、好ましい範囲は約０．１〜約２５％である。
【００４４】
別の実施形態では、骨格部分はポリリジンであり、正に帯電したタンパク質形質導入ドメインは、リジン側鎖のアミノ基に、又はＣ末端若しくはＮ末端に結合している。一部の好ましい実施形態では、ポリリジンは、少なくとも１００Ｄ、２００Ｄ、３００Ｄ、４００Ｄ、５００Ｄ、６００Ｄ、７００Ｄ、８００Ｄ、９００Ｄ、１０００Ｄ、１５００Ｄ、２０００Ｄ、２５００Ｄ、３０００Ｄ、３５００Ｄ、４０００Ｄ、４５００Ｄ、５０００Ｄ、５５００Ｄ、又は６０００Ｄであり、並びに約２，０００，０００Ｄ未満、１，０００，０００Ｄ未満、５００，０００Ｄ未満、２５０，０００Ｄ未満、１００，０００Ｄ未満、７５，０００Ｄ未満、５０，０００Ｄ未満、及び２５，０００Ｄ未満である分子量を有することができる。１００〜２，０００，０００Ｄの範囲内で、下限及び／又は上限の範囲は、それぞれ１００増減することができ、得られる各サブ範囲は、本発明の特に企図された実施形態であることが、企図されている。一部の例示的な実施形態では、ポリリジンは、約１，０００〜約１，５００，０００Ｄ、約２，０００〜約８００，０００Ｄ、又は約３，０００〜約２００，０００Ｄの分子量を有する。他の例示的な実施形態では、ポリリジンは、約１００〜約１０，０００Ｄ、約５００〜約５，０００Ｄ、約１，０００〜約４，０００Ｄ、約１，５００〜約３，５００Ｄ、又は約２，０００〜約３，０００Ｄの分子量を有する。好ましいのは、１０〜２０個のリジン（配列番号９）、より好ましくは、１５個のリジンを有するポリリジンポリペプチドである。一部の実施形態では、本発明によって企図されるポリリジンは、例えば、ＭＷ＞７０，０００を有するポリリジン、７０，０００〜１５０，０００のＭＷを有するポリリジン、１５０，０００〜３００，０００のＭＷを有するポリリジン、及びＭＷ＞３００，０００を有するポリリジンなどの、市販の（Sigma Chemical Company社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．、米国）ポリリジンのいずれかとすることができる。適切なポリリジンの選択は、組成物の残りの成分に依存し、組成物に全体的な正味の正電荷を提供するのに十分であり、負に荷電した成分の長さの好ましくは合計の１〜４倍である長さを提供するのに十分である。好ましい正に帯電したタンパク質形質導入ドメイン又は効率基には、例えば、−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ａｒｇ−ａｒｇ−ａｒｇ−ａｒｇ−ａｒｇ−ａｒｇ−ａｒｇ（−Ｇｌｙ３Ａｒｇ７（配列番号１０））又はＨＩＶ−ＴＡＴが含まれる。
【００４５】
別の好ましい実施形態では、正に帯電した骨格はポリアルキレンイミンであり、その非限定例としては、ポリエチレンイミン、ポリプロピレンイミン、及びポリブチレンイミンが挙げられる。ある特定の実施形態では、ポリアルキレンイミンは、少なくとも１００Ｄ、２００Ｄ、３００Ｄ、４００Ｄ、５００Ｄ、６００Ｄ、７００Ｄ、８００Ｄ、９００Ｄ、１０００Ｄ、１５００Ｄ、２０００Ｄ、２５００Ｄ、３０００Ｄ、３５００Ｄ、４０００Ｄ、４５００Ｄ、５０００Ｄ、５５００Ｄ、又は６０００Ｄ、並びに約２，０００，０００Ｄ未満、１，０００，０００Ｄ未満、５００，０００Ｄ未満、２５０，０００Ｄ未満、１００，０００Ｄ未満、７５，０００Ｄ未満、５０，０００Ｄ未満、及び約２５，０００Ｄ未満の分子量を有する。１００〜２，０００，０００Ｄの範囲内で、下限及び／又は上限の範囲は、それぞれ１００増減することができ、得られる各サブ範囲は、本発明の特に企図された実施形態であることが、企図されている。
【００４６】
本発明の他の実施形態では、担体は、比較的短いポリリジン又はポリエチレンイミン（ＰＥＩ、polyethyleneimine）骨格（これは、直鎖状であっても分岐状であってもよい）であり、これは、正に帯電した分岐基を有する。理論によって束縛されることを望むものではないが、輸送効率を劇的に減少させる、治療組成物中での骨格とボツリヌス毒素との非制御的凝集を最小限にするのに、そのような担体は有用であると考えられる。担体が比較的短い直鎖状ポリリジン又はＰＥＩ骨格である場合、骨格は、７５，０００Ｄ未満、より好ましくは、３０，０００Ｄ未満、最も好ましくは、２５，０００Ｄ未満の分子量を有することになる。しかし、担体が比較的短い分岐状ポリリジン又はＰＥＩ骨格である場合、骨格は、６０，０００Ｄ未満、より好ましくは、５５，０００Ｄ未満、最も好ましくは、５０，０００Ｄ未満の分子量を有することになる。
【００４７】
特に興味深い一実施形態では、非天然分子は、固有のボツリヌス毒素様活性をまったく有さず、しかも本明細書に記載の１又は２以上のタンパク質形質導入ドメインを含有する陽イオンペプチドである。なんら特定の科学的な理論に束縛されることを望むものではないが、このペプチドは、注射後の、複合体中で会合した分子の組織浸透を増強する一方で、皮膚内及びインビトロでボツリヌス毒素の安定化を増強すると考えられる。これらのペプチドで得られる組織浸透の増強によって、外因性アルブミン（例えば、ＢＯＴＯＸ（登録商標）又はＭＹＯＢＬＯＣ（登録商標））に結合している従来の市販のボツリヌス毒素複合体と比較して、特に、抗原性の低下、より良好な安全性プロファイル、改善された効力、臨床的有効性のより速やかな発現、又は臨床的有効性のより長い持続時間が得られると考えられる。
【００４８】
好ましい実施形態では、本発明による組成物中の正に帯電した担体の濃度は、例えば、運動神経板などの分子標的へのボツリヌス毒素の送達を増強するのに十分である。さらに、理論に束縛されることを望むわけではないが、浸透速度は、受容体媒介性速度論に従い、その結果、浸透増強分子の量が飽和点まで高まるのに伴って組織浸透が高まり、こうして、輸送速度は一定になると考えられる。したがって、好ましい一実施形態では、添加される浸透増強分子の量は、飽和直前で浸透速度を最大にする量に等しい。本発明の注射用組成物中の正に帯電した担体（又は担体ペプチド）についての有用な濃度範囲は、本明細書に記載の通り、ボツリヌス毒素１ユニット（Ｕ、Unit）当たり担体約０．１ｐｇ（０．１ｐｇ／Ｕ）〜ボツリヌス毒素１ユニット当たり約１．０ｍｇ（ｍｇ／Ｕ）である。本発明の局所用組成物中の正に帯電した担体（又は担体ペプチド）についての有用な濃度範囲は、約１．０ｐｇ／ボツリヌス毒素１Ｕ〜０．５ｍｇ／ボツリヌス毒素１Ｕ（担体の量／ボツリヌス毒素１Ｕ）である。他の実施形態では、正に帯電した担体（又は担体ペプチド）は、例えば、１０ｎｇ／ボツリヌス毒素１Ｕ〜２００ｎｇ／ボツリヌス毒素１Ｕの範囲で、又は１ｎｇ／ボツリヌス毒素１Ｕ〜１０００ｎｇ／ボツリヌス毒素１Ｕの範囲で、又は０．１ｎｇ／ボツリヌス毒素１Ｕ〜１０，０００ｎｇ／ボツリヌス毒素１Ｕの範囲で、本発明の注射用組成物に存在する。一部の実施形態では、本発明の組成物に存在するボツリヌス毒素のユニットに対する正に帯電した担体（又は担体ペプチド）の量は、非限定的例として、ボツリヌス毒素１ユニット当たり、担体５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００ｎｇ等（ｎｇ／Ｕ）である。好ましくは、ボツリヌス毒素は血清型Ａであり、特に血清型Ａボツリヌス毒素の１５０ｋＤ型である。
【００４９】
一般に、ボツリヌス毒素の活性を測定するための方法及び手順、すなわち、ボツリヌス毒素活性の単位（Ｕ）は、当業者に知られており、彼らによって実施されている。要約すると、マウスにおける半数致死アッセイ（ＬＤ５０アッセイ）は、高精度でボツリヌス毒素の単位数を推定するために従来から使用されている。全ての市販のボツリヌス毒素の用量は、生物学的活性の単位で表現されている。一例として、ボツリヌス毒素の１単位は、メスＳｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウスにおける、計算された半数腹腔内致死量（ＬＤ５０）に相当する。当技術分野での致死アッセイについても記載している、Hoffman, R.O. et al., 1986, Int. Ophthalmol. Clin., 26:241-50、並びにDePass, L.R., 1989, Toxicol. Letters, 49:159-170；及びPearce, L.B. et al., 1994, Toxicol. Appl. Pharmacol., 128:69-77を参照されたい。より具体的には、本発明の組成物のボツリヌス毒素成分についてボツリヌス毒素ユニットを決定する適切な方法は次の通りである：体重１７〜２３グラムの四十八（４８）匹のメスＣＤ−１マウスを、１用量群当たり八（８）匹の動物で、被験物質の６用量（１．５４、１．３１、１．１１、０．９５、０．８０、及び０．６８Ｕ／０．５ｍＬ）に無作為に割り当てる。被験物質とはアッセイ又は試験されるボツリヌス毒素調製物又は試料を指す。動物をケージ当たり８匹収容し、被験物質での投与の２４時間以内に秤量する。投与の日に、被験物質を等張食塩水（０．９％ＮａＣｌ）中で適切な濃度に希釈する。各動物に腹腔内注射を介して希釈した被験物質０．５ｍＬを投与する。注射の後、マウスをケージに戻し、死亡数を３日間毎日記録する。致死率を注射後７２時間スコアし、その結果をプロビット又はロジスティック解析により解析して、同一の投薬レジメンを使用して評価される標準品に対してＬＤ５０値を導出する。一例として、被験物質の相対的効力を導出する比較のために使用される、本発明の同一組成物の特に認定されかつ較正されたロットが、標準品である。次いで、決定したＬＤ５０値を実施した累積希釈に対して補正して、ニートの（非希釈）被験物質に対して相対的効力値を割り当てる。
【００５０】
本発明の組成物は、対象又は患者の皮膚又は上皮への注射を可能とする形態であることが好ましい。用語「必要とする」とは、薬学的ニーズ又は健康関連のニーズ（例えば、望ましくないジストニック収縮又は筋痙攣を伴う状態を治療すること）の両方を含むものとする。好ましい実施形態では、組成物は、ボツリヌス毒素（付随する非毒素タンパク質、又は付随する低非毒素タンパク質のいずれかを含有する）を、正に帯電した担体と、及び通常、１又は２以上の追加の薬学的に許容される担体又は賦形剤と混合することによって調製される。その最も単純な形態では、これらは、緩衝食塩水（例えば、リン酸緩衝食塩水）などの水性の薬学的に許容される希釈剤を含有することができる。しかし、組成物は、適用される組織と適合性である皮膚科学的又は薬学的に許容される担体、媒体、又は媒質を含めて、注射用の医薬組成物又は薬用化粧品組成物中に一般に見出される他の成分を含有することができる。用語「薬学的に許容される」とは、本明細書で使用する場合、そのように記載される組成物又はその成分は、全体として過度の毒性、不適合性、不安定性、アレルギー反応などを伴うことなく、そういった組織との接触で使用するのに、又は患者において使用するのに適していることを意味する。適宜、本発明の組成物は、検討中の分野において従来から使用される任意の成分を含むことができる。
【００５１】
その形態の観点から、本発明の組成物は、筋肉及び組成物を使用することができる他の組織に注射するのに使用される、溶液、エマルジョン（マイクロエマルジョンを含む）、懸濁液、ゲル、粉末、又はその他の一般的な固体組成物若しくは液体組成物を含むことができる。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、シリンジを用いて注射するのに適した低粘度の、滅菌製剤中に存在する。本明細書で使用する場合、用語、組成物及び製剤は、本発明による組成物及び製剤に言及する場合、本質的に同じ意味で用いられる。本発明の組成物は、注射する前に薬学的に許容される液体希釈剤を使用して再構成される凍結乾燥粉末の形態とすることができる。ある特定の実施形態では、凍結乾燥粉末は、液体希釈剤を用いて再構成されて、約０．１〜約２０００ｃＰ、より好ましくは、約０．２〜約５００ｃＰ、さらにより好ましくは、約０．３〜約５０ｃＰ、さらにより好ましくは、約０．４〜約２．０ｃＰの粘度を有する注射用製剤を形成する。本発明の組成物は、ボツリヌス毒素及び正に帯電した担体に加えて、抗菌剤、水和剤、組織増量剤又は組織充填剤、保存剤、乳化剤、天然油又は合成油、溶媒、界面活性剤、洗剤、ゲル化剤、抗酸化剤、充填剤、増粘剤、粉剤、粘度制御剤及び水など、並びに麻酔薬、かゆみ止め活性物、植物抽出物、品質改良剤、ミネラル、ポリフェノール、シリコーン又はその誘導体、ビタミン、及び植物薬を含めてもよいが、こういった製品において一般に使用される他の成分を含有することができる。
【００５２】
本発明による注射用組成物は、制御放出組成物又は徐放組成物の形態とすることができ、これらの組成物は、カプセル化されているか、又は他の方法で材料内に収められたボツリヌス毒素及び正に帯電した担体を含み、その結果、これらは、経時的に制御された様式で組織内で放出される。ボツリヌス毒素及び正に帯電した担体を含む組成物は、マトリックス、リポソーム、ベシクル、マイクロカプセル、微小球内など、又は固体微粒子材料内に含有させることができ、これらの全ては、経時的にボツリヌス毒素を放出するように選択及び／又は構築されている。ボツリヌス毒素及び正に帯電した担体は、一緒に（すなわち、同一カプセル内）又は別個に（すなわち、別個のカプセル内）カプセル化することができる。
【００５３】
複数の実施形態では、本発明の組成物は、本明細書に記載のボツリヌス毒素、本明細書に記載の正に帯電した担体（又はペプチド）、非還元性二糖又は非還元性三糖、非イオン性界面活性剤、及びｐＨ４．５〜ｐＨ７．５、又はｐＨ４．５〜ｐＨ６．８、又はｐＨ４．５〜ｐＨ６．５の範囲のｐＨなどの適切なｐＨを維持できる生理的適合性緩衝剤を含む液体（水性）組成物（又は製剤）を含む。適切なｐＨは、この範囲の上限のｐＨ値及び下限のｐＨ値、例えば、６．５のｐＨ又は７．５のｐＨも含むことが理解されよう。液体組成物中の非還元糖の濃度は１０％〜４０％（ｗ／ｖ）の範囲であり、非イオン性界面活性剤の濃度は０．００５％〜０．５％（ｗ／ｖ）の範囲である。液体組成物は、好ましくは凍結乾燥で乾燥して安定な固体組成物を産生することができ、このような固体組成物は、例えば、滅菌食塩水又はその他の既知の生理的に及び薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、又は媒体、特に注射用製剤での使用向けに知られているものを使用して、使用のためにその後に再構成することができる。好ましくは、乾燥、例えば、凍結乾燥した固体組成物は、非晶質及びアモルファス固体組成物であり、例えば、粉剤の形態とすることができる。また、好ましくは、本発明の組成物は、アルブミンなどの動物タンパク質由来の産物を含まない。本発明に適した組成物はまた、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第２０１０／０３３０１２３号明細書にも記載されている。特定の実施形態では、組成物は血清型Ａのボツリヌス毒素を含む。他の特定の実施形態では、組成物は分子量１５０ｋＤａを有する血清型Ａのボツリヌス毒素を含む。
【００５４】
ある特定の実施形態では、本発明の組成物は非還元糖を含有し、これは二糖が好ましく、この非限定的例には、その無水型及び水和型を含めてトレハロース、又はスクロース、並びにそれらの組合せが挙げられる。一部の実施形態では、トレハロースの水和型、トレハロース二水和物が好ましい。他の実施形態では、組成物は三糖を含有し、その非限定的例はラフィノースである。一般に、本発明の組成物中の、非還元糖、好ましくは二糖の、例えばスクロースの濃度は、１０％〜４０％（ｗ／ｖ）、好ましくは１０％〜２５％（ｗ／ｖ）、より好ましくは１５％〜２０％（ｗ／ｖ）の範囲である。一部の好ましい実施形態では、非還元糖、好ましくは二糖の、例えばスクロースの濃度は、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％又は２０％（ｗ／ｖ）である。
【００５５】
一般に、本発明の組成物は、ボツリヌス毒素を安定化する能力を有するとともに製薬学的用途に適した任意の非イオン性界面活性剤を含むことができる。一部の実施形態では、非イオン性界面活性剤はポリソルベートであり、例えば、その非限定的一例として、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、及びポリソルベート８０である。他の実施形態では、非イオン性界面活性剤はソルビタンエステルであり、その非限定的例には、ＳＰＡＮ（登録商標）２０、ＳＰＡＮ（登録商標）６０、ＳＰＡＮ（登録商標）６５、及びＳＰＡＮ（登録商標）８０が挙げられる。非イオン性界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００又はＮＰ−４０も使用することができる。加えて、様々な非イオン性界面活性剤の組合せを使用することができる。ある特定の好ましい実施形態では、非イオン性界面活性剤は、ポリソルベート、ポロキサマー及び／又はソルビタンであり、ポリソルベート及びソルビタンが特に好ましい。複数の実施形態では、非イオン性界面活性剤は、上限値及び下限値を含めて、０．００５％〜０．５％の範囲で、又は０．０１％〜０．２％の範囲で、又は０．０２％〜０．１％の範囲で、又は０．０５〜０．０８％の範囲で、本発明の組成物中に存在する。加えて、本発明の組成物は、０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１０％、０．１１％、０．１２％、０．１３％、０．１４％、又は０．１５％の量で、非イオン性界面活性剤を含有することができる。
【００５６】
一般に、本発明の組成物に対して、上記の範囲のｐＨを維持することができる任意の生理的適合性緩衝剤が使用に適している。そのような緩衝剤の非限定的例としては、クエン酸、酢酸、コハク酸、酒石酸、マレイン酸、及びヒスチジンの塩が挙げられる。適切な緩衝剤濃度の非限定的例としては、０．４００％〜０．６００％、０．４５０％〜０．５７５％、又は０．５００％〜０．５６５％の範囲の緩衝剤濃度が挙げられる。本発明の組成物はまた、緩衝剤塩の混合物を含むことができ、その非限定的例としては、クエン酸塩／酢酸塩、クエン酸塩／ヒスチジン、クエン酸塩／酒石酸塩、マレイン酸塩／ヒスチジン、又はコハク酸塩／ヒスチジンが挙げられる。したがって、単回注射による治療後に長い持続時間の効果を提供する本発明の組成物は、本明細書に記載のボツリヌス毒素Ａ又は１５０ｋＤａＭＷのボツリヌス毒素Ａなどのボツリヌス毒素、本発明に記載の正に帯電した担体（又はペプチド）、スクロースなどの非還元性二糖、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、又はソルビタンエステルなどの非イオン性界面活性剤、並びにクエン酸、酢酸、コハク酸、酒石酸、マレイン酸、及びヒスチジンなどの生理的適合性緩衝剤を含む。生理的適合性緩衝剤は、本明細書に記載のｗ／ｖの量で、ｐＨ４．５〜６．５の範囲のｐＨ又はｐＨ４．５〜７．５の範囲のｐＨなどの適切なｐＨを維持することできる。
【００５７】
本発明の特定の一組成物は、アルブミンフリー、液体（水性）組成物であり、これは、ボツリヌス毒素Ａ、好ましくは血清型Ａのボツリヌス毒素、又は分子量１５０ｋＤａを有するボツリヌス毒素Ａ；正に帯電した担体（又はペプチド）；１０％〜４０％（ｗ／ｖ）の範囲で存在する、非還元性二糖又は非還元性三糖、好ましく二糖、；０．００５％〜０．５％（ｗ／ｖ）の範囲で存在する、非イオン性界面活性剤、好ましくはポリソルベート又はソルビタンエステル；並びに、４．５〜７．５の間のｐＨを維持するために０．４００％〜０．６００％、０．４５０％〜０．５７５％、又は０．５００％〜０．５６５％の範囲で存在する、クエン酸、酢酸、コハク酸、酒石酸、マレイン酸、又はヒスチジンなどの生理的適合性緩衝剤を含む。
【００５８】
本発明によるボツリヌス毒素製剤は、注射によって（典型的にはシリンジを使用して）、皮膚の下にある筋肉に、又は皮膚内の腺構造に、麻痺を生じさせ、弛緩を生じさせ、収縮を軽減し、痙攣を予防若しくは軽減し、腺の排出量を低減するのに有効な量で、又はその他の所望の効果を生じさせるのに有効な量で送達することができる。このようにしてボツリヌス毒素を局所的に送達することにより、注射用材質又は移植可能材質と比べて、投与量の減少をもたらし、毒性を低減し、所望の効果に関してより正確な投与量の最適化を可能とすることができる。
【００５９】
ボツリヌス毒素の有効量、好ましくは治療有効量を送達するために、本発明の組成物が投与される。用語「有効量」又は「治療有効量」とは、本明細書で使用する場合、所望の筋肉麻痺効果、又はその他の生物学的効果を生じるのに十分であるが、暗黙的に安全な量、すなわち、深刻な副作用を回避するのに十分低い量である、上に定義のボツリヌス毒素の量を意味する。
【００６０】
本発明の組成物は、単回用量の治療として適用するために、適切な有効量のボツリヌス毒素を含有することができ、又は投与箇所で希釈するためでも、複数の適用及び／若しくは一定時間にわたって逐次適用において使用するためでも、より濃縮することができる。本発明の正に帯電した担体を使用することにより、ボツリヌス毒素は、頸部ジストニアなどの状態を治療するために、対象に注射で投与することができる。ボツリヌス毒素は、筋肉、又は他の皮膚に関連する組織構造、若しくは他の標的組織構造に注射によって投与される。
【００６１】
最も好ましくは、組成物は、医師又は他の健康管理専門家によって、又はこれらの指導の下で投与される。組成物は、単回治療において、又は経時的に一連の治療において投与することができる。好ましい実施形態では、本発明による組成物は、ボツリヌス毒素に関連する効果が望まれるある位置で又は複数の位置で注射される。頸部ジストニアの治療において、次の表１では、特定の筋肉群について用量範囲１、２及び３によって、RTT150（RT002製品は精製１５０ｋＤａボツリヌス神経毒で構成され、RTT150と呼ばれる）の適切な投与量に関して、指針が提供されている：
［表１は、関与する筋肉によるBOTOX（登録商標）の推奨投与範囲の観点を使用して作成した（Allergan, Inc. BOTOX（登録商標） US Prescribing Information, 2015 & BOTOX（登録商標） medical website, Flexible dosing in cervical dystonia. https://www.botoxmedical.com/CervicalDystonia/DosingAndAdministration）］
【００６２】
【表１】
2020520917.tif 000003
【００６３】
その性質のために、ボツリヌス毒素は、いずれの有害な結果又は望まれない結果も生じることなく、所望の結果を生じる量、適用割合、及び頻度で投与されることが好ましい。複数の実施形態では、本発明の組成物の有効用量による単回治療によって、ボツリヌス毒素によって治療可能な適応症の向けの治療、又は単回の複数治療セッション中の一連の注射で済むように、延長された時間にわたって、例えば、少なくとも６ヶ月若しくは６ヶ月超、すなわち、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、又は１０ヶ月を含めてより長く続く長い持続時間の効果が、付随効果とともに得られる。治療のゴール又は効果を維持するために複数の治療を使用している場合、作用の持続時間がより長いことによって、治療と治療の間のより長い間隔又は期間が提供される。一実施形態では、例えば、合間を含めて、少なくとも６ヶ月又は７、８、９、若しくは１０ヶ月などの６ヶ月超、ボツリヌス毒素を約１００Ｕ〜４５０Ｕ；又は、より詳細には、約１００Ｕ〜２００Ｕ又は約２００Ｕ〜３００Ｕ又は約３００Ｕ〜４５０Ｕ供給する本発明の組成物を使用する、個体への投与後の、又はそれらの投薬後の組成物の効果のより長い持続時間は、本発明による正に帯電した担体（又はペプチド）を含有していないボツリヌス毒素含有組成物又は製品の効果の持続時間と相対的である。場合によっては、本発明の正に帯電した担体（又はペプチド）無しのボツリヌス毒素含有組成物又は製品は、３ヶ月又は４ヶ月などの６ヶ月未満の間有効である。
【００６４】
ある特定の実施形態では、ボツリヌス毒素と、本明細書に記載の、共有結合で結合し正に帯電した１又は２以上の効率基を有する正に帯電したポリマー骨格を含む正に帯電した担体とを含む、本発明の組成物を、頸部ジストニアの治療のために、１対象当たり１回の治療用量当たり、ボツリヌス毒素を、約１００Ｕ〜４５０Ｕ；又は、より詳細には、約１００Ｕ〜２００Ｕ又は約２００Ｕ〜３００Ｕ又は約３００Ｕ〜４５０Ｕ供給する量で又は用量にて、それを必要とする対象又は患者に単回注射として投与する。本発明によれば、治療効果が、数週間又は数ヶ月間、例えば、少なくとも１０週間、少なくとも１２週間、少なくとも１６週間、少なくとも２０週間、少なくとも２４週間、又は少なくとも６ヶ月間若しくは６ヶ月超、すなわち、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、若しくは１０ヶ月、或いはより長く続く。複数の実施形態では、ボツリヌス毒素は血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、又はＧである。一実施形態では、ボツリヌス毒素は血清型Ａである。一実施形態では、血清型Ａのボツリヌス毒素は分子量１５０ｋＤａを有する。一実施形態では、上に記載のように血清型Ａのボツリヌス毒素はより高分子量の複合体の形態である。好ましい実施形態では、１５０ｋＤａボツリヌス毒素又は毒素のより高分子量の形態はアルブミンフリー製剤である。一実施形態では、正に帯電したポリマー骨格はポリリジン又はポリエチレンイミンである。一実施形態では、正に帯電した１又は２以上の効率基は−（ｇｌｙ）ｎ１−（ａｒｇ）ｎ２（配列番号５）を含み、ここで、下付き文字ｎ１は、０〜２０、より好ましくは０〜８、さらにより好ましくは２〜５の整数であり、下付き文字ｎ２は、独立して、約５〜約２５、より好ましくは約７〜約１７、最も好ましくは約７〜約１３の奇整数である。一部の実施形態では、正に帯電した１又は２以上の効率基は、下付き文字ｐ及びｑがそれぞれ独立して０〜２０の整数であるアミノ酸配列（ｇｌｙ）ｐ−ＲＧＲＤＤＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（配列番号１）、（ｇｌｙ）ｐ−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（配列番号２）又は（ｇｌｙ）ｐ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（配列番号３）を有する。ある特定の好ましい実施形態では、ｐは１でありかつｑは０であり、又はｐは０でありかつｑは１である。他の好ましい実施形態では、下付き文字ｐ及びｑはそれぞれ独立して、０〜８、より好ましくは０〜５の整数である。特定の一実施形態では、正に帯電した担体は、アミノ酸配列ＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ−（Ｋ）１５−ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号４）を有する。他の実施形態では、正に帯電した１又は２以上の効率基は、効率基、例えばアミノ酸配列のＣ末端若しくはＮ末端のいずれかを介して正に帯電した骨格に結合している。一部の実施形態では、正に帯電した１又は２以上の効率基は、正に帯電した担体の正に帯電したポリリジン骨格のいずれかの末端、又は両端に結合している。特定の実施形態では、正に帯電した骨格はポリリジンであり、ボツリヌス毒素は血清型Ａである。別の特定の実施形態では、血清型Ａのボツリヌス毒素は分子量１５０ｋＤａを有し、正に帯電した骨格はポリリジンであり、共有結合で結合し正に帯電した１又は２以上の効率基は、下付き文字ｐ及びｑがそれぞれ独立して０〜２０の整数であるか、又はそれぞれ独立して上に記載の値である、アミノ酸配列（ｇｌｙ）ｐ−ＲＧＲＤＤＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（配列番号１）、（ｇｌｙ）ｐ−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（配列番号２）又は（ｇｌｙ）ｐ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（配列番号３）を有し、或いは正に帯電した担体はアミノ酸配列ＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ−（Ｋ）１５−ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号４）を有する。複数の実施形態では、１回の注射当たり、ボツリヌス毒素を２０Ｕ若しくは少なくとも２０Ｕ；３０Ｕ若しくは少なくとも３０Ｕ；４０Ｕ若しくは少なくとも４０Ｕ；５０Ｕ若しくは少なくとも５０Ｕ；６０Ｕ若しくは少なくとも６０Ｕ；７０Ｕ若しくは少なくとも７０Ｕ；８０Ｕ若しくは少なくとも８０Ｕ；９０Ｕ若しくは少なくとも９０Ｕ；又は１００Ｕ若しくは少なくとも１００Ｕ供給する量又は用量で、組成物は注射により投与される。前述の量又は用量の間の量又は用量も、例えば、２５Ｕ若しくは少なくとも２５Ｕ；３５Ｕ若しくは少なくとも３５Ｕ；４５Ｕ若しくは少なくとも４５Ｕ等も、企図されている。特定の実施形態では、組成物は、ボツリヌス毒素を約１００Ｕ〜４５０Ｕ；又は、より詳細には、約１００Ｕ〜２００Ｕ又は約２００Ｕ〜３００Ｕ又は約３００Ｕ〜４５０Ｕ供給する量で単回治療用量として注射により投与され、応答又は効果が、長い持続時間、例えば、少なくとも１０週間、少なくとも１２週間、少なくとも１６週間、少なくとも２０週間、少なくとも２４週、例えば、６、７、８、９若しくは１０ヶ月、又はより長くなどの、少なくとも６ヶ月又は６ヶ月超、実現かつ維持される。
【００６５】
限定することを望むものではないが、治療のコースにおいて、本発明の組成物は、本明細書に記載の本発明の組成物及び方法に関する治療有効用量によって得られる効果の延長された持続時間に基づいて、最初の治療用量後に頻度の少ない間隔で投与することができる。例えば、本発明の組成物は、本発明の方法の実施によって、１年当たり約２回（約６ヶ月毎）、又は７ヶ月毎に、８ヶ月毎に、９ヶ月毎に、若しくは１０ヶ月毎に、或いはより長期毎に、必要とする対象に投与（又は投薬）することができる。特定の一実施形態では、個体は本発明の一組成物の一用量を１年当たり２回投与される。用量と用量の間の中央持続時間は、治療処置及び／又は治療を受ける個体によって決定される治療に対する要望に応じて、６ヶ月、少なくとも６ヶ月、又は６ヶ月超とすることができる。したがって、本発明の組成物での個体の投薬は、１年に２回又は１年に２回より長期で、例えば、初回用量後、６ヶ月毎に、７ヶ月毎に、８ヶ月毎に、９ヶ月毎に、又は１０ヶ月毎に、行うことができる。本発明の一組成物は、組成物中ボツリヌス毒素を約１００Ｕ〜４５０Ｕ；又は、より詳細には、約１００Ｕ〜２００Ｕ又は約２００Ｕ〜３００Ｕ又は約３００Ｕ〜４５０Ｕで、適切な間隔で投薬することができる。
【００６６】
本発明は、皮膚を通して、本明細書に記載のボツリヌス毒素含有組成物を注射するための、様々な送達デバイスの使用も企図する。そのようなデバイスには、限定されないが、針及びシリンジを挙げることができ、又は、組成物を調剤し、組成物の調剤をモニターし、任意で、１又は２以上の態様において対象の状態をモニターする（例えば、調剤される物質に対する対象の反応をモニターすること）ことができる、より高度なデバイスが含まれてもよい。
【００６７】
一部の実施形態では、組成物は、予め製剤化し、及び／又はそのようにして送達デバイス内に予め取り付けることができる。本発明は、組成物が、残りの成分から１又は２以上の成分を、別個に格納するキットで提供される、実施形態も企図する。例えば、ある特定の実施形態では、本発明は、適用時又は適用時の前に混合するために、ボツリヌス毒素及び正に帯電した担体を、別個に格納するキットを提供する。正に帯電した担体の量、又はこれらの分子とボツリヌス毒素の濃度比は、対象とする組成物において使用するのにどの担体が選択されるかに依存する。所与の場合における担体分子の適切な量又は比は、例えば、以下に記載のものなどの１又は２以上の実験を行うことによって、容易に決定することができる。
【００６８】
全体的に、本発明はまた、ボツリヌス毒素（或いは、ボツリヌス毒素複合体又は低ボツリヌス毒素複合体として）を、その必要のある対象又は患者に投与するための方法も企図し、この場合、本明細書に記載されるように、有効量のボツリヌス毒素が正に帯電した担体と併せて投与される。「と併せて」とは、２つの成分（ボツリヌス毒素及び正に帯電した担体）が、組合せの手順で投与されることを意味し、２つの成分が一緒に作用して、有効量の治療用タンパク質に関して必要とされる送達が提供されるように、この手順は、対象に投与する前にこれらを組み合わせるステップを含んでもよいし、これらを別々に投与するステップを含んでもよい。例えば、正に帯電した担体を含有する組成物を対象の皮膚に最初に投与し、その後、ボツリヌス毒素を含有する皮膚パッチ、シリンジ、又は他のデバイスを適用することができる。ボツリヌス毒素は、シリンジ又は他の調剤デバイス内に乾燥形態で格納することができ、そして、正に帯電した担体を注射し、その後毒素を適用することができ、その結果、２つが一緒に作用し、所望の組織浸透の増強がもたらされる。したがって、その意味で、２つの物質（正に帯電した担体及びボツリヌス毒素）は、組合せで作用し、又はおそらく相互作用して、インサイチュで組成物又は組合せを形成する。したがって、本発明はまた、ボツリヌス毒素を調剤するためのデバイスと、正に帯電した担体を含有するとともに、対象の皮膚又は標的組織に注射するのに適した液体、ゲル等とを有するキットも含む。健康管理専門家の指示下で、又は患者若しくは対象によっていずれかで、本発明の組成物を投与するためのキットは、その目的に適した特注のアプリケーターも含むことができる。
【００６９】
本発明の組成物は、約４．５〜約６．３の範囲のｐＨを有する生理学的環境で使用するのに適しており、したがって、そのようなｐＨを有することができる。しかし、約４．５〜約７．５の範囲のｐＨを有する組成物も本明細書に記載の本発明によって包含される。本発明による組成物は、室温で又は冷蔵条件下のいずれかで貯蔵することができる。
【００７０】
一部の実施形態では、治療される患者は、６５歳、少なくとも６５歳、又は６５歳超である。例えば、患者は、６５、６６、６８、７０、７５、８０歳、又はこれより年長であってもよい。
［実施例］
【実施例１】
【００７１】
本実施例は、成人において、中度〜重度の孤立性頸部ジストニア、すなわち頚部の運動障害を治療するための注射用DaxibotulinumtoxinA（RT002）の非盲検、逐次、用量漸増臨床試験である。中度〜重度の頸部ジストニアの３７人の対象が、合衆国の複数の現場で登録された。試験の第１のコホート１２人の対象は、注射用RT002最大２００ユニットの単回投与を受け、第２のコホート１２人の対象は２００〜３００ユニットを受け、第３のコホート１３人の対象は３００〜４５０ユニットを受けた。試験によってポジティブな有効性が、そしてRT002は概して安全かつ忍容性が良好であることが示された。
【００７２】
対象は全て、彼らがベースラインに戻るまで、又は治療後最大で計２４週間追跡された。第１のコホートで見られた効果は持続時間が長いことにより、第２の及び第３のコホートの対象には継続する選択権が与えられた。数人の患者が試験にとどまることを選んだが、最大３６週間追跡されることになる。
【００７３】
第２相試験の主要有効性エンドポイントは、トロント西部痙攣性斜頸評価尺度（ＴＷＳＴＲＳ、Toronto Western Spasmodic Torticollis Rating Scale）−４週目の総スコアのベースラインからの変化（低下）で評価した、ジストニアの症状における改善とした。ＴＷＳＴＲＳは、頸部ジストニア状態のさまざまな特徴をカバーする有効な合成尺度である。尺度の第１の部分はジストニアの身体所見及び重症度に基づいており、第２の部分は患者の知覚障害レベルを評価し、第３の部分は状態に関連する痛みを評価する。本試験プロトコルでは、いくつかの副次的有効性エンドポイントも特徴付けされている。
【００７４】
要するに、試験目的は：
−  孤立性頸部ジストニアの対象において注射用RT002の安全性及び予備的有効性を評価すること、並びに
−  孤立性頸部ジストニアの治療において注射用RT002の効果の持続時間を評価すること
とした。
【００７５】
主要エンドポイントは：
−  ＴＷＳＴＲＳ−４週目の総スコア（ＴＷＳＴＲＳ＝トロント西部痙攣性斜頸評価尺度）のベースラインからの変化で評価される、ジストニアの改善
とした。
【００７６】
副次エンドポイントは：
−  ＴＷＳＴＲＳ−総スコアのベースラインからの変化；
−  ＴＷＳＴＲＳ下位尺度スコアのベースラインからの変化：（すなわち、ＴＷＳＴＲＳ−重症度スケール、ＴＷＳＴＲＳ−障害スケール及びＴＷＳＴＲＳ−痛みスケール）；
−  対象が彼らの目標ＴＷＳＴＲＳ−総スコアに達するかこれを超える場合、又は対象が治療の必要性を示し、治験責任医師が必要であることに同意する場合にみなされる、治療から治療を是認する症状が再発するまでの週数で評価される、効果の持続時間；
−  臨床医の全般印象度の変化（ＣＧＩＣ、Clinician Global Impression of Change）で改善を示しているレスポンダーの割合；並びに
−  頸部ジストニアインパクトプロファイル−５８（ＣＤＩＰ−５８、Cervical Dystonia Impact Profile-58）総スコア（全ての治療後の時点）のベースラインからの変化によって評価される、患者が評価した生活の質
とした。
【００７７】
トップライン２４週の結果：
少なくとも２４週の効果の持続時間：効果の持続時間中央値は、試験された３つの用量コホートのそれぞれについて少なくとも２４週であった。効果の持続時間は、彼らの目標トロント西部痙攣性斜頸評価尺度（ＴＷＳＴＲＳ）スコアに達している対象に基づいて、治療から再治療を是認する兆候及び症状が戻るまでの週数として定義された。参考までに、頸部ジストニアの現在の治療では、ボツリヌス毒素の注射がほぼ３か月（１２週）毎、又は１年当たり４回必要とする。
【００７８】
ポジティブな有効性結果：試験の４週間の主要有効性評価は、ベースラインからのＴＷＳＴＲＳ−総スコアの低下により決定される頸部ジストニアの徴候及び症状の改善とした。４週目に、注射用RT002は、３つのコホート全てにわたってベースラインから３８％の臨床的に有意な平均低下を示した。この低下は、全ての対象について６週目で５０％まで高まり続け、１２週目で４２％であり、２４週目まで３０％で又はこれを超えて維持された。参考として、頸部ジストニアの治療に承認されているボツリヌス毒素Ａ型製品対するプラセボ対照試験では、ベースラインからのＴＷＳＴＲＳ−総スコアの低下が４週目で２１％〜２６％、１２週目で１３％〜１６％であった。
【００７９】
主要な副次エンドポイント、すなわち、臨床医の全般印象度の変化（ＣＧＩＣ）上で改善を示したレスポンダーの百分率に関して、全対象の９７％が、４週目で頸部ジストニア症状の改善を経験した。
【００８０】
概して安全かつ忍容性が良好である：３つのコホート全てにおいて、注射用RT002は２４週目まで概して安全かつ忍容性が良好であると思われた。重篤な有害事象及び有害事象の用量依存的な増加はなかった。治療関連の有害事象は概して一時的であり、重症度が軽度〜中度であり、１例の頚部痛が重度であると報告された。最も一般的な有害事象は、嚥下障害、又は嚥下困難（１４％）、このうち全ての症例は重症度が軽度であったが、注射部位の発赤（８％）、注射部位内出血（５％）、注射部痛（５％）、筋緊張（５％）及び筋力低下（５％）、であった。参考までに、頸部ジストニアの治療に承認されているボツリヌス毒素Ａ型製品対する試験では、１３％〜３９％の範囲の嚥下障害の有害事象を有する。
【００８１】
頸部ジストニアの患者は、かなりの痛みと衰弱に苦しみ、このことは彼らの生活の質に劇的に影響を及ぼす。本試験のほぼ全ての対象が治療に応答し、大多数は２４週目でもRT002になおも応答していた。図１〜図８に、試験設計及び結果に関するさらなるデータが提供されている。
【００８２】
試験の安全性の概要：RT002は、評価された全ての用量群にわたって２４週目まで概して安全かつ忍容性が良好であると思われ、用量漸増によって治療下で発現した有害事象（ＴＥＡＥ’ｓ、Treatment-Emergent Adverse Event’s）の増加はなかった。
【００８３】
３７人の対象のうち１３人（３５％）で合計２２件の治療関連ＴＥＡＥ’ｓが報告された
−  最も頻繁に報告された：嚥下障害（１４％）、注射部位紅斑（８％）、注射部位内出血（５％）、注射部痛（５％）、筋緊張（５％）及び筋力低下（５％）
−  １例の頚部痛が重度であると報告されたことを除いて（１０日目発症、２日持続時間）、全てのＴＥＡＥ’ｓは重症度が軽度又は中度であった
【００８４】
重篤な有害事象は報告されなかった。
【００８５】
特に興味深い全ての治療関連ＴＥＡＥ’ｓは、以前のBoNTA試験に対して、同等又はより低い発生率で解決した（ＣＤの治療が承認された他のBoNTA製品の試験では、１３〜３９％の範囲である嚥下障害率を有する；BOTOX、Dysport及びXeominを含む。製品処方情報で報告のデータ）。
−  嚥下障害：１４％（５／３７；全て軽度）；平均持続時間３５日。
−  筋力低下：５％（２／３７；軽度１、中度１）、両方とも局所
−  頚部痛：３％（１／３７；重度）
【００８６】
試験の有効性の概要：
効果の持続時間：効果の持続時間の中央値は、４週目で達成された治療利益の少なくとも２０％を維持する対象として定義（目標ＴＷＳＴＲＳスコア）、試験された３コホートのそれぞれについて２４週を超えていた
−  用量群ＡとＢとにより解析した場合、効果の持続時間の中央値は両群に対して２４週を超えていた
【００８７】
ＣＤ徴候及び症状の改善：ＴＷＳＴＲＳ総スコアのベースラインからの臨床的に有意である低下３８％が、全ての対象にわたって４週目に観察された
−  ベースラインからの改善は、６週目に５０％でピークとなり、この治療利益の大部分は２４週まで３０％を超えて維持された
【００８８】
全般印象度の変化での奏功率：臨床医の全般印象度の変化（ＣＧＩＣ）によって評価される対象の頸部ジストニア症状において４週目で全対象の９７％が改善（１を超えるスコア）を経験した
【００８９】
本発明の好ましい実施形態では、ボツリヌス毒素Ａ、及び正に帯電した１又は２以上の効率基が共有結合している正に帯電したポリリジンポリペプチドを含む正に帯電した担体を含む、RT002と呼ばれる本発明の注射用組成物。RT002製品は、式ＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ−（Ｋ）１５−ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号４）を有する正に帯電した担体ペプチドと共有結合で会合していない１５０ｋＤサブタイプＡボツリヌス毒素分子を含み、アクセサリータンパク質又は動物由来の成分を含まない注射用製剤である。本発明の好ましい方法のうちで、頸部ジストニアの治療のためのRT002の注射による単回の（１回の）治療が、任意で対象の頚部の様々筋肉位置に投与される。好ましい治療用量は、RT002の１００Ｕ超、１００〜２００Ｕ、２００〜３００Ｕ及び３００〜４５０Ｕである。RT002製品は、RTT150と呼ばれる精製済み１５０ｋＤａボツリヌス神経毒から構成され、凍結乾燥粉末として製剤化される。非臨床試験で、RT002はその他の形態のボツリヌス神経毒Ａ（ＢｏＮＴＡ）よりも小さい拡散を示すことが示されており、近隣の筋肉への毒素の遠隔分散に起因する副作用が小さいことにより標的部位での効果をよりよく制御することができる。さらに、RT002添加剤不含Ａ型ボツリヌス毒素製剤は、製剤に存在する非活性タンパク質が存在しないことにより、より小さい免疫原性をもたらすという能力を有する。さらに、RT002は、ラットでの最大５０Ｕ／ｋｇの反復用量筋肉内投与後の忍容性が良好であった。
【００９０】
投薬レジメン及び注射技術：本発明のRT002の好ましい投薬レジメンは、治療を受けている対象の頚部の注射部位への筋肉内注射０．１ｍＬとして、RT002の単回治療である（対象当たり最大１００Ｕ、１００〜２００Ｕ、２００〜３００Ｕ又は３００〜４５０Ｕで投薬）。
【００９１】
RT002の拡散の減少は、非臨床試験及び事前試験と一致し、ボツリヌス毒素Ａなどのボツリヌス毒素、及び本明細書に記載される、１又は２以上の正に帯電した効率基が共有結合で結合している、ポリリジンなどの骨格を含む正に帯電した担体を含む、RT002などの本発明の組成物で治療を行った対象において観察される毒素の分散の減少を支持するものである。
【００９２】
投与量及び効果の持続時間：限定されることを望むものではないが、中間解析結果は、高いレスポンダー率、効果の持続時間及び陽性の安全性プロファイルに基づき、本発明のボツリヌスを含む組成物による単回治療に最適な用量として１００Ｕ超の用量選択を支持する。さらに、RT002などの本発明の組成物は、例えば、対象への注射による投与後少なくとも６ヶ月間の、持続し長く続く効果の持続時間を有する。RT002などの、本発明の組成物によりもたらされる効果の持続時間、及び治療方法及びその使用により、治療を受ける対象が、彼らにとって治療後の効果の持続時間が非常に重要であると考えるという点において、利点がもたらされる。特に単回すなわち一回限りの注射用量の製品、つまりRT002により実現されるこのような長い、持続する効果の持続時間により、対象にとって治療過程当たりの注射をより少なくすることが可能となり、このことが対象の快適性、利便性及び全体的な幸福において重要である。対象への製品の注射による単回治療投薬後少なくとも６ヶ月の期間維持される、有意かつ持続する効果をもたらす製品は、専門家及び患者の両方に、当技術分野で満たされていないニーズに対する解決策を提供する。
【００９３】
本明細書に記載する以下の実施例及び実施形態は、例示のためのものに過ぎず、それらに照らした多様な改変形態又は変化形態が当業者に示唆され、それらは本出願及び添付の特許請求の範囲の精神及び趣旨の内に含まれるものとすることが理解される。
【００９４】
本明細書に引用される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、あらゆる目的のために、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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