(57)【要約】  本開示は、タンパク質の小胞体トラフィッキングを改変する組成物および方法を提供する。本明細書では、対象動物でＧＲＰ９４の細胞外分泌レベルを増加させることによって、癌を治療する方法、および／または癌もしくはウイルス免疫療法を強化する方法もまた開示される。そのような方法は、有効量の４−ＰＢＡおよび／または４−ＰＢＡアナログ（メトキシ−ＰＢＡ、３−ＰＰＡ、５−ＰＶＡ、ヒドロキシ−ＰＰＡ、ヒドロキシ−ＰＢＡおよびトリル−ＢＡから選択される）を対象動物に投与する工程を含む。
2020520935.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
その必要がある対象動物で癌を治療する方法であって、
当該対象動物に有効量の４−ＰＢＡ（式Ｉの化合物）および／または４−ＰＢＡアナログを投与する工程を含み、前記４−ＰＢＡアナログが、メトキシ−ＰＢＡ、３−ＰＰＡ、５−ＰＶＡ、ヒドロキシ−ＰＰＡ、ヒドロキシ−ＰＢＡおよびトリル−ＢＡから選択される、前記方法。
【請求項２】
当該対象動物の１つ以上の細胞が小胞体（ＥＲ）ストレス下にあり、当該１つ以上の細胞が癌細胞であってもよい、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
４−ＰＢＡ（式Ｉの化合物）および／または４−ＰＢＡアナログが、経口的に、外用的に、鼻内に、全身的に、静脈内に、皮下に、腹腔内に、真皮内に、眼内に、イオン泳動的に、経粘膜的に、または筋肉内に投与される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
当該対象動物が人間である、請求項１−３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
１つ以上のチェックポイント阻害剤および／または１つ以上の免疫系刺激物質を別々に、連続的にまたは同時に投与する工程を含む、請求項１−４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
当該チェックポイント阻害剤がＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１またはＣＴＬＡ−４を標的とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
当該チェックポイント阻害剤が、イピリムマブ、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、ピジリズマブ、ＡＭＰ−２２４、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＭＤＸ−１１０５、ＭＥＤＩ−４７３６、アレルマブ、トレメリムマブ、ＩＭＰ３２１、ＭＧＡ２７１、ＢＭＳ−９８６０１６、リリルマブ、ウレルマブ、ＰＦ−０５０８２５６６、ＩＰＨ２１０１、ＭＥＤＩ−６４６９、ＣＰ−８７０，８９３、モガムリズマブ、バルリルマブ、ガリキシマブ、ＡＭＰ−５１４、ＡＵＮＰ  １２、インドキシモド、ＮＬＧ−９１９、ＩＮＣＢ０２４３６０（Ｉｎｃｙｔｅ）、および前記の任意の組合せはから成る群から選択される、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
当該免疫系刺激物質が、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）刺激因子、抗原提示細胞（ＡＰＣ）刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、およびトール様受容体刺激因子から成るグループから選択される１つ以上の薬剤である、請求項５−７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
当該ＮＫ刺激因子が、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ複合体、ＩＬ−１８およびＩＬ−１２から成る群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
当該ＮＫ刺激因子が、ＮＫＧ２、ＫＩＲ２ＤＬ１／Ｓ１、ＫＲＩ２ＤＬ５Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ４４およびＮＫｐ３０から成る群から選択される１つ以上の受容体を刺激する抗体である、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
当該ＡＰＣ刺激因子が、ＣＤ２８、誘発性共同刺激性（ＩＣＯＳ）、ＣＤ４０、ＣＤ３０、ＣＤ２７、ＯＸ−４０および４−１ＢＢから成る群から選択される、請求項８−１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
当該癌が、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、食道癌、子宮内膜癌、胃癌、神経膠芽腫、頭頸部癌、肝細胞癌腫、白血病、肺癌、リンパ腫、メラノーマ、メルケル細胞癌腫、多発性骨髄腫、神経芽腫、神経内分泌癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌腫、ラブドイド癌、肉腫または尿路癌である、請求項１−１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
４−ＰＢＡ（式Ｉの化合物）および／または４−ＰＢＡアナログの投与が、投与前の対象動物で観察されるものと比較して、当該対象動物でＧＲＰ９４細胞外レベル増加を生じる、請求項１−１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
４−ＰＢＡ（式Ｉの化合物）および／または４−ＰＢＡアナログがＣＯＰＩＩタンパク質と結合する、請求項１−１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
４−ＰＢＡ（式Ｉの化合物）および／または４−ＰＢＡアナログが６週間以上の間、毎日投与される、請求項１−１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
４−ＰＢＡ（式Ｉの化合物）および／または４−ＰＢＡアナログが１２週間以上の間、毎日投与される、請求項１−１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
その必要がある対象動物で癌免疫療法を強化する方法であって、
当該対象動物に有効量の４−ＰＢＡ（式Ｉの化合物）および／または４−ＰＢＡアナログを投与する工程を含み、前記４−ＰＢＡアナログが、メトキシ−ＰＢＡ、３−ＰＰＡ、５−ＰＶＡ、ヒドロキシ−ＰＰＡ、ヒドロキシ−ＰＢＡおよびトリル−ＢＡから選択される、前記方法。
【請求項１８】
４−ＰＢＡ（式Ｉの化合物）および／または４−ＰＢＡアナログの投与が、投与前の対象動物で観察されるものと比較して、当該対象動物でＧＲＰ９４／ネオアンチゲン複合体の分泌上昇を生じる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
当該ＧＲＰ９４／ネオアンチゲン複合体が、長さが約５から約５０アミノ酸であるネオアンチゲンペプチドを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
当該対象動物が、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、食道癌、子宮内膜癌、胃癌、神経膠芽腫、頭頸部癌、肝細胞癌腫、白血病、肺癌、リンパ腫、メラノーマ、メルケル細胞癌腫、多発性骨髄腫、神経芽腫、神経内分泌癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌腫、ラブドイド癌、肉腫および尿路癌から成る群から選択される癌を有すると診断される、請求項１７−１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
その必要がある対象動物で、ウイルス免疫療法を強化する方法であって、
当該対象動物に有効量の４−ＰＢＡ（式Ｉの化合物）および／または４−ＰＢＡアナログを投与する工程を含み、前記４−ＰＢＡアナログが、メトキシ−ＰＢＡ、３−ＰＰＡ、５−ＰＶＡ、ヒドロキシ−ＰＰＡ、ヒドロキシ−ＰＢＡおよびトリル−ＢＡから選択される、前記方法。
【請求項２２】
４−ＰＢＡ（式Ｉの化合物）および／または４−ＰＢＡアナログの投与が、投与前の対象動物で観察されるものと比較して、当該対象動物でＧＲＰ９４／ウイルス抗原複合体の分泌上昇を生じる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
当該対象動物が、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、インフルエンザウイルス、ＥＢＶ、エボラウイルス、水痘ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ＨＰＶ、麻疹ウイルス、ルブラウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、ラウス肉腫ウイルス、狂犬病ウイルスおよびロタウイルスから成る群から選択されるウイルスに感染している、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
４−ＰＢＡ（式Ｉの化合物）および／または４−ＰＢＡアナログが、経口的に、外用的に、鼻内に、全身的に、静脈内に、皮下に、腹腔内に、真皮内に、眼内に、イオン泳動的に、経粘膜的に、または筋肉内に投与される、請求項１７−２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
有効量のアジュバントを当該対象動物に投与する工程を含む、請求項１７―２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
１つ以上のチェックポイント阻害剤および／または１つ以上の免疫系刺激物質を別々に、連続的に、または同時に投与する工程を含む、請求項１７−２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
その必要がある対象動物で、１つ以上の細胞によるＧＲＰ９４の細胞外分泌を増加させる方法であって、
当該対象動物に有効量の４−ＰＢＡ（式Ｉの化合物）および／または４−ＰＢＡアナログを投与する工程を含み、前記４−ＰＢＡアナログが、メトキシ−ＰＢＡ、３−ＰＰＡ、５−ＰＶＡ、ヒドロキシ−ＰＰＡ、ヒドロキシ−ＰＢＡおよびトリル−ＢＡから選択される、前記方法。
【請求項２８】
当該対象動物が癌を有するかまたは癌に罹患していると診断される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
当該分泌されるＧＲＰ９４は腫瘍ネオアンチゲンと複合体を形成する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
当該癌が、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、食道癌、子宮内膜癌、胃癌、神経膠芽腫、頭頸部癌、肝細胞癌腫、白血病、肺癌、リンパ腫、メラノーマ、メルケル細胞癌腫、多発性骨髄腫、神経芽腫、神経内分泌癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌腫、ラブドイド癌、肉腫および尿路癌である、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
当該対象動物がウイルスに感染している、請求項２７−３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
当該分泌されるＧＲＰ９４がウイルス抗原と複合体を形成する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
当該ウイルスが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、インフルエンザウイルス、ＥＢＶ、エボラウイルス、水痘ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ＨＰＶ、麻疹ウイルス、ルブラウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、ラウス肉腫ウイルス、狂犬病ウイルスおよびロタウイルスから成る群から選択される、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項３４】
当該１つ以上の細胞がＥＲストレス下の細胞である、請求項２７−３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
４−ＰＢＡ（式Ｉの化合物）および／または４−ＰＢＡアナログが、経口的に、外用的に、鼻内に、全身的に、静脈内に、皮下に、腹腔内に、真皮内に、眼内に、イオン泳動的に、経粘膜的に、または筋肉内に投与される、請求項２７−３４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互引用）本出願は、米国仮特許出願６２／５０８，６１５（２０１７年５月１９日出願）（前記の開示は参照によってその全体が本明細書に含まれる）の優先権を主張する。
（技術分野）
本技術は、一般的にタンパク質の小胞体トラフィッキングを改変する組成物および方法に関する。さらに、その必要がある対象動物で癌を治療する方法および／または癌もしくはウイルス免疫療法を強化する方法もまた開示され、前記方法は、当該対象動物でＧＲＰ９４の細胞外分泌レベルを増加させる工程を含む。
【背景技術】
【０００２】
以下の記載は読み手の理解を助けるために提供される。提供される情報または引用される参考文献のいずれも、本明細書に開示の組成物および方法に対する先行技術であることを容認するものではない。
本来のカーゴタンパク質はＣＯＰＩＩ被覆小胞で小胞体（ＥＲ）を退出することができるが、一方、ＥＲ在留物質および誤って折畳まれたタンパク質は実質的にＥＲ内に維持され、小胞でのパッケージングから除外される。
ＥＲにおけるタンパク質保持の候補機構はｐ２４ファミリータンパク質を含む。これらの高度に保存されたトランスメンブレンタンパク質は、ＣＯＰＩおよびＣＯＰＩＩ小胞の豊富な成分として、ＥＲとゴルジ膜との間を絶え間なく巡回する。ｐ２４遺伝子の変異は、カエノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）では誤って折畳まれたタンパク質のＥＲ後トラフィッキングをもたらす。酵母のｐ２４遺伝子の欠失は、誤って折畳まれたタンパク質およびシャペロンのＥＲ脱出を引起し、シャペロンは細胞外媒体に分泌される。これらの作用は、ノックアウト株における常習的な非折畳みタンパク質応答（ＵＰＲ）に部分的に起因し得る。
【発明の概要】
【０００３】
ある特徴では、本開示は、その必要がある対象動物で癌を治療する方法を提供し、前記方法は、当該対象動物に有効量の４−ＰＢＡ（式Ｉの化合物）、および／または４−ＰＢＡアナログ（メトキシ−ＰＢＡ、３−ＰＰＡ、５−ＰＶＡ、ヒドロキシ−ＰＰＡ、ヒドロキシ−ＰＢＡおよびトリル−ＢＡから選択される）を投与する工程を含む。４−ＰＢＡ（式Ｉの化合物）および／または４−ＰＢＡアナログは、経口的に、外用的に（ｔｏｐｉｃａｌｌｙ）、鼻内に、全身的に、静脈内に、皮下に、腹腔内に、真皮内に（ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌｌｙ）、眼内に、イオン泳動的に、経粘膜的にまたは筋肉内に投与される。いくつかの実施態様では、対象動物の１つ以上の細胞が小胞体（ＥＲ）ストレス下にある。ある種の実施態様では、ＥＲストレス下の１つ以上の細胞は癌細胞である。加えて或いはまた別に、いくつかの実施態様では、対象動物は人間である。いくつかの実施態様では、４−ＰＢＡ（式Ｉの化合物）および／または４−ＰＢＡアナログはＣＯＰＩＩタンパク質と結合する。
加えて或いはまた別に、いくつかの実施態様では、当該方法は、１つ以上のチェックポイント阻害剤および／または１つ以上の免疫系刺激物質を別々に、連続的にまたは同時に投与する工程を含む。１つ以上のチェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１またはＣＴＬＡ−４を標的とすることができる。いくつかの実施態様では、チェックポイント阻害剤は、イピリムマブ、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、ピジリズマブ、ＡＭＰ−２２４、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＭＤＸ−１１０５、ＭＥＤＩ−４７３６、アレルマブ、トレメリムマブ、ＩＭＰ３２１、ＭＧＡ２７１、ＢＭＳ−９８６０１６、リリルマブ、ウレルマブ、ＰＦ−０５０８２５６６、ＩＰＨ２１０１、ＭＥＤＩ−６４６９、ＣＰ−８７０，８９３、モガムリズマブ、バルリルマブ、ガリキシマブ、ＡＭＰ−５１４、ＡＵＮＰ  １２、インドキシモド、ＮＬＧ−９１９、ＩＮＣＢ０２４３６０（Ｉｎｃｙｔｅ）、および前記の任意の組合せから成る群から選択される。
【０００４】
加えて或いはまた別に、いくつかの実施態様では、１つ以上の免疫系刺激物質は、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）刺激因子、抗原提示細胞（ＡＰＣ）刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、およびトール様受容体刺激因子から成るグループから選択される。ＮＫ刺激因子の例には以下が含まれる：ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ複合体、ＩＬ−１８およびＩＬ−１２の他に、ＮＫＧ２、ＫＩＲ２ＤＬ１／Ｓ１、ＫＲＩ２ＤＬ５Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ４４およびＮＫｐ３０から成る群から選択される１つ以上の受容体を刺激する抗体（ただし前記に限定されない）。ＡＰＣ刺激因子の例には、ＣＤ２８、誘発性共同刺激性（ＩＣＯＳ）、ＣＤ４０、ＣＤ３０、ＣＤ２７、ＯＸ−４０および４−１ＢＢが含まれる（ただし前記に限定されない）。
本明細書で開示される方法の上記いずれの実施態様でも、癌は、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、食道癌、子宮内膜癌、胃癌、神経膠芽腫、頭頸部癌、肝細胞癌腫、白血病、肺癌、リンパ腫、メラノーマ、メルケル細胞癌腫、多発性骨髄腫、神経芽腫、神経内分泌癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌腫、ラブドイド癌、肉腫または尿路癌である。
加えて或いはまた別に、いくつかの実施態様では、４−ＰＢＡ（式Ｉの化合物）および／または４−ＰＢＡアナログの投与は、投与前の対象動物で観察されるものと比較して、ＧＲＰ９４細胞外レベル増加を対象動物で生じる（例えば少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６倍、少なくとも６．５倍、少なくとも７倍、少なくとも７．５倍、少なくとも８倍、少なくとも８．５倍、少なくとも９倍、少なくとも９．５倍、少なくとも１０倍）。
加えて或いはまた別に、いくつかの実施態様では、４−ＰＢＡ（式Ｉの化合物）および／または４−ＰＢＡアナログは６週間以上の間毎日投与される。いくつかの実施態様では、４−ＰＢＡ（式Ｉの化合物）および／または４−ＰＢＡアナログは１２週間以上の間毎日投与される。
【０００５】
ある特徴では、本開示は、その必要がある対象動物で癌免疫療法を強化する方法を提供し、前記方法は、当該対象動物に有効量の４−ＰＢＡ（式Ｉの化合物）、および／または４−ＰＢＡアナログ（メトキシ−ＰＢＡ、３−ＰＰＡ、５−ＰＶＡ、ヒドロキシ−ＰＰＡ、ヒドロキシ−ＰＢＡおよびトリル−ＢＡから選択される）を投与する工程を含む。いくつかの実施態様では、４−ＰＢＡ（式Ｉの化合物）および／または４−ＰＢＡアナログの投与は、投与前の対象動物で観察されるものと比較して、ＧＲＰ９４／ネオアンチゲン複合体の分泌上昇を生じる。ＧＲＰ９４／ネオアンチゲン複合体は、長さが約５から約５０アミノ酸であるネオアンチゲンペプチドを含むことができる。加えて或いはまた別に、いくつかの実施態様では、対象動物は、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、食道癌、子宮内膜癌、胃癌、神経膠芽腫、頭頸部癌、肝細胞癌腫、白血病、肺癌、リンパ腫、メラノーマ、メルケル細胞癌腫、多発性骨髄腫、神経芽腫、神経内分泌癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌腫、ラブドイド癌、肉腫または尿路癌から成る群から選択される癌を有すると診断される。
別の特徴では、本開示は、その必要がある対象動物で、ウイルス免疫療法を強化する方法を提供し、前記方法は、当該対象動物に有効量の４−ＰＢＡ（式Ｉの化合物）、および／または４−ＰＢＡアナログ（メトキシ−ＰＢＡ、３−ＰＰＡ、５−ＰＶＡ、ヒドロキシ−ＰＰＡ、ヒドロキシ−ＰＢＡおよびトリル−ＢＡから選択される）を投与する工程を含む。いくつかの実施態様では、４−ＰＢＡ（式Ｉの化合物）および／または４−ＰＢＡアナログの投与は、投与前の対象動物で観察されるものと比較して、ＧＲＰ９４／ウイルス抗原複合体の分泌上昇を生じる。加えて或いはまた別に、いくつかの実施態様では、対象動物は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、インフルエンザウイルス、ＥＢＶ、エボラウイルス、水痘ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ＨＰＶ、麻疹ウイルス、ルブラウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、ラウス肉腫ウイルス、狂犬病ウイルスおよびロタウイルスから成る群から選択されるウイルスに感染している。
加えて或いはまた別に、本明細書に開示の方法のいくつかの実施態様では、４−ＰＢＡ（式Ｉの化合物）および／または４−ＰＢＡアナログは、経口的に、外用的に、鼻内に、全身的に、静脈内に、皮下に、腹腔内に、真皮内に、眼内に、イオン泳動的に、経粘膜的にまたは筋肉内に投与される。
【０００６】
前述の実施態様のいずれでも、本技術の方法はさらにまた、有効量のアジュバントを対象動物に投与する工程を含む。加えて或いはまた別に、いくつかの実施態様では、当該方法はさらにまた、本明細書に開示の１つ以上のチェックポイント阻害剤および／または本明細書に開示の１つ以上の免疫系刺激物質を別々に、連続的にまたは同時に投与する工程を含む。
ある特徴では、本開示は、その必要がある対象動物で１つ以上の細胞によるＧＲＰ９４の細胞外分泌を増加させる方法を提供し、前記方法は、当該対象動物に有効量の４−ＰＢＡ（式Ｉの化合物）、および／または４−ＰＢＡアナログ（メトキシ−ＰＢＡ、３−ＰＰＡ、５−ＰＶＡ、ヒドロキシ−ＰＰＡ、ヒドロキシ−ＰＢＡおよびトリル−ＢＡから選択される）を投与する工程を含む。４−ＰＢＡ（式Ｉの化合物）および／または４−ＰＢＡアナログは、経口的に、外用的に、鼻内に、全身的に、静脈内に、皮下に、腹腔内に、真皮内に、眼内に、イオン泳動的に、経粘膜的にまたは筋肉内に投与される。加えて或いはまた別に、いくつかの実施態様では、１つ以上の細胞はＥＲストレス下にある。
ある種の実施態様では、対象動物は癌を有するかまたは癌に罹患していると診断される。癌の例には以下が含まれる：膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、食道癌、子宮内膜癌、胃癌、神経膠芽腫、頭頸部癌、肝細胞癌腫、白血病、肺癌、リンパ腫、メラノーマ、メルケル細胞癌腫、多発性骨髄腫、神経芽腫、神経内分泌癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌腫、ラブドイド癌、肉腫または尿路癌。加えて或いはまた別に、いくつかの実施態様では、分泌されるＧＲＰ９４は腫瘍ネオアンチゲンと複合体を形成する。
加えて或いはまた別に、いくつかの実施態様では、対象動物はウイルスに感染している。ウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、インフルエンザウイルス、ＥＢＶ、エボラウイルス、水痘ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ＨＰＶ、麻疹ウイルス、ルブラウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、ラウス肉腫ウイルス、狂犬病ウイルスおよびロタウイルスから成る群から選択され得る。加えて或いはまた別に、いくつかの実施態様では、分泌されるＧＲＰ９４はウイルス抗原と複合体を形成する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１Ａ】ΦＣペプチド（枠で囲まれている）と結合したヒトＳｅｃ２３ａ／Ｓｅｃ２４ａ・Ｓｅｃ２２ｂを含むＣＯＰＩＩ・ＳＮＡＲＥ複合体の結晶構造を示す。
【図１Ｂ】Ｓ．セレビシアエ（Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ｐ２４タンパク質Ｅｒｖ２５ｐの末端Ｉｌｅ−Ｉｌｅモチーフを含む結合ΦＣ配列を有するＳｅｃ２４ａのＢ部位の構造を示す。コンター（ｃｏｎｔｏｕｒ）線（矢印）は、２．６σでコンターされた、２．６Å解像度での残留電子密度（位相バイアス無しでＦo−Ｆc合成）を示す。電子密度はまた当該ペプチドのＮ−末端残基でも観察できる（楔形）。Ｓｅｃ２４の重要な側鎖は標識されている（例えばＹ４９６、Ｒ４３０、Ｙ４３７、Ｒ７５２およびＲ７５０）。ペプチド結合結晶構造の詳細については表１を参照されたい。
【図１Ｃ】ヒトｐ２４β１の末端Ｖａｌ−Ｖａｌモチーフを含む結合ΦＣペプチドの残留（Ｆo−Ｆc）電子密度（２．６Å解像度、２．６σコンター）を示す構造を提示する。
【図１Ｄ】強力なΦＣモチーフＬｅｕ−Ｖａｌ（中央）に対する結合配置を示す模式図である。模式図は、配列ＥＶＴＳＬＶ（配列番号：１）と結合したＳｅｃ２３ａ／Ｓｅｃ２４ａ・Ｓｅｃ２２ｂの構造に基づく（表１参照）。標識ＮはＬｅｕ−Ｖａｌモチーフの上流のセリン残基を示す。
【図１Ｅ】Ｓｅｃ２４ａと結合したＥＲＧＩＣ−５３の末端Ｐｈｅ−Ｐｈｅモチーフを含むΦＣペプチドの立体配置を示す構造を提示する。（表面を表示するように描かれている）。
【図１Ｆ】０ｍＭ  ４−ＰＢＡで浸漬した結晶についてＢ部位の残留（Ｆo−Ｆc）電子密度（２．８Å解像度、２．３σコンター、位相バイアス無し）を示す構造を提示する。電子密度は、０ｍＭ  ４−ＰＢＡでこのコンターレベルでは秩序水または可溶性分子については観察できない。電子密度計算は、いずれも２．８Åでトランケート（ｔｒｕｎｃａｔｅ）される（Ｘ線データセットの詳細については表２を参照されたい）。
【図１Ｇ】１ｍＭ  ４−ＰＢＡで４−ＰＢＡに浸漬した結晶についてＢ部位の残留（Ｆo−Ｆc）電子密度（２．８Å解像度、２．３σコンター、位相バイアス無し）を示す構造を提示する。電子密度計算は、いずれも２．８Åでトランケートされる（Ｘ線データセットの詳細については表２を参照されたい）。
【図１Ｈ】１５ｍＭ  ４−ＰＢＡで４−ＰＢＡに浸漬した結晶についてＢ部位の残留（Ｆo−Ｆc）電子密度（２．８Å解像度、２．３σコンター、位相バイアス無し）を示す構造を提示する。電子密度計算は、いずれも２．８Åでトランケートされる（Ｘ線データセットの詳細については表２を参照されたい）。
【図１Ｉ】５０ｍＭ  ４−ＰＢＡで４−ＰＢＡに浸漬した結晶についてＢ部位の残留（Ｆo−Ｆc）電子密度（２．８Å解像度、２．３σコンター、位相バイアス無し）を示す構造を提示する。電子密度計算は、いずれも２．８Åでトランケートされる（Ｘ線データセットの詳細については表２を参照されたい）。
【図２Ａ】透過性付与ＣＨＯ（Ｔ−Ｒｅｘ−ＣＨＯ−Ｋ１）細胞を用い、野生型または変異体（Ｓｅｃ２４ｄ−Ｌ７５０Ｗ）ＣＯＰＩＩタンパク質で実施した再構成ＣＯＰＩＩ出芽反応を示す。単離小胞の内容物を免疫ブロッテイングで分析した。投入量と標識されたレーンは、出芽反応で用いられた開始時透過性付与細胞膜の１．１％を表す。他の全てのレーンは、開始時膜１００％の小胞生成物を表す。シンタキシン５抗体は、ＳＮＡＲＥタンパク質の短形および長形の両方を認識する。これらは、３回繰返し実施した実験の代表的なブロットである。
【図２Ｂ】Ｓｅｃ２４ｄ（図１（Ｅ）−１（Ｉ）と同じ方向性）のＢ部位を示す構造を提示する。前記は、出芽反応で用いられたＳｅｃ２４ｄ−Ｌ７５０Ｗ変異体タンパク質の４−ＰＢＡ（黒矢印）およびトリプトファン側鎖のモデル位置（灰色矢印）を示す。
【図２Ｃ】カーゴタンパク質のパッケージ率を示すグラフである。前記は、図２（Ａ）のような免疫ブロッティングおよび化学発光シグナルのデンシトメトリーによって決定された。各カーゴ分子について、データは、野生型ＣＯＰＩＩタンパク質を用いて測定したパッケージング率のパーセンテージとなるように標準化された。棒グラフは平均±ｓ．ｅ．ｍ．を示す（ｎ＝３）。
【図２Ｄ】図２（Ｃ）のデータが出芽収量で処理依存（４−ＰＢＡまたは変異体ＣＯＰＩＩ）変化について修正されたことを示す（シンタキシン５、メンブリン、Ｅｒｖ４６およびＲｅｒ１についてのパッケージング率の平均値を使用）。明瞭さのために、データは図２（Ｃ）のように標準化した。統計分析は、統計分布を保存するために標準化前のデータで実施した（ｎ＝３；ＡＮＯＶＡ検定、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ−Ｈｏｌｍ事後検定、**Ｐ＜０．０１、***Ｐ＜０．００１および****Ｐ＜０．０００１）。棒グラフは平均±ｓ．ｅ．ｍ．を示す。
【図３Ａ】Ｇ５４４Ｖ変異ＬＤＬ受容体はゴルジ複合体に到達できなかったことを示す。野生型（レーン１）または変異ＬＤＬ受容体を安定的にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を、３７°Ｃ（レーン２）または３０°Ｃ（レーン３）で２時間さらにインキュベートする前に、または１０ｍＭの４−ＰＢＡとともに３７°Ｃで２時間さらにインキュベート（レーン４）する前に、３７°Ｃで２時間テトラサイクリンで誘発した。細胞溶解物を免疫ブロッティングで分析した。標識は、ＬＤＬ受容体の１６０ｋＤａ成熟グリコシル化形および１２０ｋＤａ前駆体形を示す。
【図３Ｂ】４−ＰＢＡによる変異ＬＤＬ受容体のトラフィッキングの用量依存復元を示す。変異ＬＤＬ受容体を発現するＣＨＯ細胞を表示の濃度の４−ＰＢＡとともに３７°Ｃで２時間インキュベートした。細胞溶解物を図３（Ａ）のように分析した。
【図３Ｃ】スケールアップＣＯＰＩＩ出芽反応でアッセイした一連のｐ２４タンパク質、ＥＲ在留タンパク質および変異ＬＤＬ受容体のパッケージングを示す。投入量と標識されたレーンは開始時膜の１．１％を表し、他の全てのレーンは開始時膜１００％の小胞生成物を表す。実験は３回繰返し実施された。
【図３Ｄ】図２（Ｄ）で提示した実験と同様に（シンタキシン５、メンブリン、Ｅｒｖ４６およびＲｅｒ１パッケージング率によって管理）、ｐ２４ファミリータンパク質ｐ２４δ１およびｐ２４α２のパッケージング率を示すグラフである。ｐ２４α３およびｐ２４β１のデータは図２（Ｄ）に存在する（ｎ＝３；ＡＮＯＶＡ検定、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ−Ｈｏｌｍ事後検定、*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１および***Ｐ＜０．００１）。棒グラフは平均±ｓ．ｅ．ｍ．を示す。
【図３Ｅ】４つのＥＲ在留タンパク質および変異ＬＤＬ受容体のパッケージング率を示すグラフである。ｙ軸のスケールの変化（ｎ＝３；ＡＮＯＶＡ検定、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ−Ｈｏｌｍ事後検定、*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１および***Ｐ＜０．００１）。棒グラフは平均±ｓ．ｅ．ｍ．を示す。
【図４Ａ】透過性付与ＣＨＯ細胞（野生型ＬＤＬ受容体も変異ＬＤＬ受容体も発現しない）で実施した再構成ＣＯＰＩＩ出芽反応を示す。投入量と標識されたレーンは出芽反応で用いられた開始時膜の１．１％を表し、他の全てのレーンは開始時膜１００％の小胞生成物を表す。実験は３回繰返し実施された。
【図４Ｂ】図４（Ａ）のデータを示すグラフを提示する。前記は、シンタキシン５、Ｅｒｖ４６およびＲｅｒ１についてのパッケージング率の平均値を用い、図２（Ｄ）のように修正された（ｎ＝３；ＡＮＯＶＡ検定、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ−Ｈｏｌｍ事後検定、**Ｐ＜０．０１）。棒グラフは平均±ｓ．ｅ．ｍ．を示す。
【図４Ｃ】カルネキシン、ＥＲｐ５７およびＧＲＰ９４についてのパッケージング率を示すグラフである（ｎ＝３；ＡＮＯＶＡ検定、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ−Ｈｏｌｍ事後検定、*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１および***Ｐ＜０．００１）。棒グラフは平均±ｓ．ｅ．ｍ．を示す。
【図５Ａ】４−ＰＢＡの濃度を増加させながら３７°Ｃで２時間インキュベートされたＧ５４４Ｖ変異ＬＤＬ受容体発現ＣＨＯ細胞を示す。培地中の細胞外ＧＲＰ９４を直接分析した。変異ＬＤＬ受容体のトラッピングは、細胞内ＧＲＰ９４のレベル上昇に至るＵＰＲを引き起こし（０ｍＭ  ４−ＰＢＡレーン）、当該非折畳みタンパク質応答（ＵＰＲ）は１０−２０ｍＭ  ４−ＰＢＡで弱められた。
【図５Ｂ】ＥＲ非ストレス野生型ＣＨＯ細胞におけるＧＲＰ９４タンパク質レベルを示す。図５（Ａ）−５（Ｂ）のブロットは、ＧＲＰ９４の細胞内レベルは等価量の細胞に由来したことを示す（全タンパク質測定に基づく）。細胞外ＧＲＰ９４を検出するために、図５（Ａ）の場合よりも１０倍多いサンプルがローディングされた。
【図６Ａ】表示の濃度の４−ＰＢＡアナログとともに３７°Ｃで２時間インキュベートされたＧ５４４Ｖ変異ＬＤＬ受容体発現ＣＨＯ細胞を示す。１６０ｋＤａ成熟グリコシル化ＬＤＬ受容体の出現について、細胞溶解物を免疫ブロッティングによって分析した（標識はＬＤＬ受容体の１６０ｋＤａ成熟グリコシル化形および１２０ｋＤａ前駆体形の位置を示す）。明瞭さを改善するためにガンマ修正を適用した。
【図６Ｂ】化合物濃度の関数として変異ＬＤＬ受容体グリコシル化の獲得を示す図表を提示する。ＥＣ５０値が報告された。データは、化学発光シグナルのデンシトメトリーによって図６（Ａ）から得られた。４−（４−メトキシフェニル）ブチレート（メトキシ−ＰＢＡ）（ｎ＝４独立実験）；３−フェニルプロピオネート（３−ＰＰＡ）（ｎ＝４）；および５−フェニルバリレート（５−ＰＶＡ）（ｎ＝５）。ＥＣ５０値の標準誤差は、本明細書に記載する「全般的方法」で報告される。
【図６Ｃ】化合物濃度の関数として変異ＬＤＬ受容体グリコシル化の獲得を示す図表を提示する。ＥＣ５０値が報告された。データは、化学発光シグナルのデンシトメトリーによって図６（Ａ）から得られた。３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオネート（ヒドロキシ−ＰＰＡ）（ｎ＝４）；４−ＰＢＡ（ｎ＝５）。ＥＣ５０値の標準誤差は、本明細書に記載する「全般的方法」で報告される。
【図６Ｄ】化合物濃度の関数として変異ＬＤＬ受容体グリコシル化の獲得を示す図表を提示する。ＥＣ５０値が報告された。データは、化学発光シグナルのデンシトメトリーによって図６（Ａ）から得られた。４−（４−ヒドロキシフェニル）ブチレート（ヒドロキシ−ＰＢＡ）（ｎ＝４）；４−（４−トリル）ブチレート（トリル−ＢＡ）（ｎ＝４）。ＥＣ５０値の標準誤差は本明細書に記載する「全般的方法」で報告される。
【図６Ｅ】（ＶＳＶ  Ｇタンパク質のＥＲエクスポートシグナルに基づく）メトキシ−ＰＢＡおよび３−ＰＰＡによるヒトＳｅｃ２４ａから蛍光プローブ５−Ｆａｍ−ＱＩＹＴＤＩＥＡＮＲの移動を示すグラフである（２２°Ｃでの蛍光偏光によって測定）。ＩＣ５０値は非線形回帰フィッティングによって決定された（標準誤差は本明細書に記載する「全般的方法」で報告される）。
【図６Ｆ】（ＶＳＶ  Ｇタンパク質のＥＲエクスポートシグナルに基づく）ヒドロキシ−ＰＰＡおよび４−ＰＢＡによるヒトＳｅｃ２４ａから蛍光プローブ５−Ｆａｍ−ＱＩＹＴＤＩＥＡＮＲの移動を示すグラフである（２２°Ｃでの蛍光偏光によって測定）。ＩＣ５０値は非線形回帰フィッティングによって決定された（標準誤差は本明細書に記載する「全般的方法」で報告される）。
【図６Ｇ】（ＶＳＶ  Ｇタンパク質のＥＲエクスポートシグナルに基づく）ヒドロキシ−ＰＢＡおよびトリル−ＢＡによるヒトＳｅｃ２４ａから蛍光プローブ５−Ｆａｍ−ＱＩＹＴＤＩＥＡＮＲの移動を示すグラフである（２２°Ｃでの蛍光偏光によって測定）。ＩＣ５０値は非線形回帰フィッティングによって決定した（標準誤差は本明細書に記載する「全般的方法」で報告される）。
【図６Ｈ】細胞ベース実験および蛍光偏光実験から得られたデータを比較する散布図を示す。後者については、ＩＣ５０値は、Ｎｉｋｏｌｏｖｓｋａ−Ｃｏｌｅｓｋａら（２００４）のアプローチを用いて真の親和性（Ｋｉ）に変換された。
【図７Ａ】末端Ｐｈｅ−Ａｌａモチーフ（黒矢印）を含む結合ΦＣ配列の詳細な図を示す。このシグナルは、Ｐｈｅ−Ｐｈｅに匹敵する有効性でレポータータンパク質のＥＲエクスポートを加速する。ペプチド結合結晶構造の詳細については表１を参照されたい。
【図７Ｂ】ΦＣペプチド（枠で囲まれている）と結合したヒトＳｅｃ２３ａ／Ｓｅｃ２４ａ・Ｓｅｃ２２ｂを含むＣＯＰＩＩ複合体の結晶構造を示す。
【図７Ｃ】ＳＮＡＲＥタンパク質Ｂｅｔ１のＬｘｘＬＥモチーフと結合したＳ．セレビシアエＳｅｃ２４の結合部位（枠で囲まれている）を示す（出典：Ｍｏｓｓｅｓｓｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  １１４，  ４８３−４９５，  ２００３）。
【図７Ｄ】末端Ｌｅｕ−Ｌｅｕモチーフを含む結合ΦＣ配列を示す。Ｌｅｕ−Ｌｅｕは有効なＥＲエクスポートモチーフであるが、Ｖａｌ−Ｖａｌのように強力ではない。
【図７Ｅ】Ｓｅｃ２４ａと複合体を形成した水疱性口内炎ウイルスＧタンパク質のＤｘＥモチーフの結合態様を示す。
【図７Ｆ】末端Ｓｅｒ−Ｖａｌモチーフを含む結合ΦＣ配列を示す。
【図８】４−ＰＢＡアナログの構造式をＣＯＰＩＩタンパク質に対するそれらの親和性の順に示す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
チェックポイント阻害剤免疫療法の最近の進歩は、免疫系による癌細胞の認識における腫瘍ネオアンチゲンの中心的重要性を浮き彫りにした（Ｒ．  Ｄ．  Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ  ＆  Ｔ．  Ｎ．  Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４８，  ６９−７４，  ２０１５）。腫瘍組織から精製されたＧＲＰ９４（ａ．ｋ．ａ．  ｇｐ９６）は腫瘍ネオアンチゲンと結びつき、適応免疫および先天免疫経路の両方を介して高度に免疫原性である（Ｂｉｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７９：  ７２５４−７２６１，  ２００７；Ｓｔｒｂｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２９，  ２６１９−２６２５，  ２０１１）。ｇｐ９６／ＧＲＰ９４タンパク質は細胞の小胞体（ＥＲ）に局在し、そこで前記は、ＭＨＣクラスＩ分子にローディングされている抗原性ペプチド（例えばウイルス抗原、腫瘍ネオアンチゲン）のＥＲ貯蔵所と相互作用する。しかしながら、ｇｐ９６ネオアンチゲン複合体は、ＥＲ保持機構によって細胞内に厳重に保持される。具体的には、ＧＲＰ９４は、ＫＤＥＬ媒介検索（すなわちＧＲＰ９４のＣ−末端ＫＤＥＬ配列はＫＤＥＬ受容体のためのＥＲ検索シグナルとして機能する（Ｍｕｎｒｏ  ＆  Ｐｅｌｈａｍ  Ｃｅｌｌ  ４８：８９９−９０７，  １９８７））およびＣＯＰＩＩ媒介保持の組合せを介して、ＥＲ内のＧＲＰ９４在留場所を維持する（本明細書に記載する実施例６を参照されたい）。
本開示は、大量のｇｐ９６／ＧＲＰ９４：抗原複合体の細胞外分泌を刺激する組成物および方法を提供し、前記細胞外分泌は、適応免疫および先天免疫経路を介する免疫応答の喚起に有用である。さらにまた、本技術の方法をチェックポイント封鎖阻害剤と一緒に用いて癌を治療することができる。
【０００９】
本技術の一定の特徴、様式、実施態様、変型および特色が、下記に様々な程度に詳しく記載されて本技術の実質的な理解を提供することは理解されよう。本明細書で用いられる一定の用語の定義は下記に提供される。特段の規定がなければ、本明細書で用いられる全ての技術用語および学術用語は概ね、本発明の技術が属する業界の業者が一般的に理解する意味と同じ意味を有する。
本明細書および添付の特許請求の範囲で用いられるように、単数形“ａ”、“ａｎ”および“ｔｈｅ”は、文脈が明瞭にそうでないことを示していないかぎり複数の対応語を含む。例えば、“ａ  ｃｅｌｌ（細胞）”と言えば、２つ以上の細胞の組合せを含むというようなものである。
本明細書で用いられるように、対象動物への組成物の“投与”は、化合物の目的とする機能を果たすために対象動物に化合物を導入またはデリバリーする任意のルートを含む。投与は任意の適切なルートによって実施できる。前記ルートには、経口、鼻内、非経口（静脈内、筋肉内、腹腔内または皮下）、または外用が含まれる。投与は自己投与および別の者による投与を含む。
本明細書で用いられるように、“アジュバント”は、対象動物の免疫系を刺激または強化する１つ以上の物質を指す。アジュバントには、例えば水中油エマルジョン、油中水エマルジョン、ミョウバン（アルミニウム塩）、リポソームおよび微粒子、例えばポリスチレン、デンプン、ポリホスファゼン、ポリラクチド／ポリグリコシドが含まれ得る。アジュバントの例には、スクワレン混合物（ＳＡＦ−Ｉ）、ムラミルペプチド、サポニン誘導体、マイコバクテリウム（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）細胞壁調製物、モノホスホリル脂質Ａ、ミコール酸誘導体、非イオン性ブロックコポリマー界面活性剤、Ｑｕｉｌ  Ａ、コレラ毒素Ｂサブユニット、ポリホスファゼンおよび誘導体、並びに免疫刺激性複合体（ＩＳＣＯＭ）（例えばＴａｋａｈａｓｈｉら（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３４４：  ８７３−８７５，  １９９０）が記載したもの）が含まれるが、ただし前記に限定されない。種々の適切なアジュバントが当業界では公知である（例えば以下を参照されたい：Ｗａｒｒｅｎ  ａｎｄ  Ｃｈｅｄｉｄ，  ＣＲＣ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ８：  ８３，  １９８８；Ａｌｌｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｂｙａｒｓ，  ｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ：  Ｎｅｗ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｒｏｂｌｅｍｓ，  Ｅｌｌｉｓ，  ｅｄ．，  Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ，  Ｂｏｓｔｏｎ，  １９９２）。追加されるアジュバントには、例えば以下が含まれる：フロイントアジュバント（完全および不完全の両アジュバント）、カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）、ＤＥＴＯＸ（マイコバクテリウム・フェレイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｈｌｅｉ）の細胞壁骨格（ＣＷＳ）およびサルモネラ・ミネソタ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）のモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）を含む）などが含まれる（例えば以下を参照されたい：Ｈｏｏｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．，  １１：  ３９０，  １９９３；Ｗｏｏｄｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ２２：  ２５１−２５９，  １９９９）。
【００１０】
本明細書で用いられるように、“抗原”は、抗体（またはその抗原結合フラグメント）が選択的に結合できる分子を指す。標的の抗原は、タンパク質、炭水化物、核酸、脂質、ハプテン、または他の天然に存在するもしくは合成の化合物であり得る。抗原への暴露は対象動物の免疫応答を喚起することができる。
本明細書で用いられるように、“コントロール”は、比較の目的のために実験で用いられるまた別のサンプルである。コントロールは“陽性”または“陰性”であり得る。例えば、実験の目的が特定のタイプの疾患または症状の治療に対する治療薬の有効性の相関性を決定することである場合、陽性コントロール（所望の治療効果を示すことが判明している化合物または組成物）および陰性コントロール（治療を与えられないまたはプラセボを与えられる対象動物もしくはサンプル）が典型的には用いられる。
本明細書で用いられるように、“有効量”という用語は、所望の効果を達成するために十分な量、例えば、ＧＲＰ９４の余分な細胞レベルの増加または細胞のＧＲＰ９４分泌の増加を生じる量を指す。組成物はまた、１つ以上の追加の化合物または薬剤と組合わせて投与され得る。
本明細書で用いられるように、“免疫応答”は、リンパ球、抗原提示細胞、食細胞、顆粒球、および前述の細胞または肝臓もしくは脾臓によって産生される可溶性巨大分子（抗体、サイトカインおよび補体を含む）の１つ以上の作用を指し、前記作用は、癌性細胞、転移性腫瘍細胞、伝染性病原体などに対する選択的損傷、破壊、または人間の体からの除去をもたらす。免疫応答は、細胞性応答（例えばＴ細胞応答）または液性（抗体）応答を含むことができる。
本明細書で用いられるように、“個体”、“患者”または“対象動物”は、個々の生物、脊椎動物、哺乳動物または人間であり得る。いくつかの実施態様では、個体、患者または対象動物は人間である。
【００１１】
本明細書で用いられるように、“ネオアンチゲン”という用語は、１つ以上の腫瘍特異的変異から生じる腫瘍抗原の１クラスを指す。腫瘍ネオアンチゲン（悪性細胞内で遺伝子変化（例えば逆位、転座、欠失、ミスセンス変異、スプライス部位変異など）の結果として生じる）は、抗原の大半の腫瘍特異的クラスを占める。
本明細書で用いられるように、“ポリペプチド”、“ペプチド”および“タンパク質”は本明細書では互換的に用いられ、互いにペプチド結合または改変ペプチド結合（すなわちペプチド同配体）によって結合される２つ以上のアミノ酸を含むポリマーを指す。ポリペプチドは、短い鎖（通常はペプチド、糖ペプチドまたはオリゴマーと称される）およびより長い鎖（一般的にはタンパク質と称される）の両方を指す。ポリペプチドは、２０の遺伝子コードアミノ酸以外のアミノ酸を含むことができる。ポリペプチドは、天然の過程（例えば翻訳後プロセッシング）または当業界で周知の化学的改変技術のどちらかによって改変されるアミノ酸配列を含む。そのような改変は、基礎的な成書におよびより詳細にはモノグラフに、或いは膨大な研究論文に良く記載されている。
【００１２】
本明細書で用いられるように、“同時に投与”という用語は、同じルートによっておよび同じ時にまたは実質的に同じ時に、少なくとも２つの活性成分が投与されることを指す。
本明細書で用いられるように、“別々に投与”という用語は、同じ時にまたは実質的に同じ時に異なるルートによって、少なくとも２つの活性成分が投与されることを指す。
本明細書で用いられるように、“連続的に投与”という用語は、異なるときに少なくとも２つの活性成分が投与されることを指し、投与ルートは同一または相違する。より具体的には、連続的という語の使用は、他の１つまたは複数の物の投与が開始する前に、複数の活性成分の１つが完全に投与されることを指す。したがって、他の１つのまたは複数の活性成分の投与前に、活性な複数の成分の１つを数分、数時間または数日にわたって投与することが可能である。この事例では同時治療は存在しない。
本明細書で用いられるように、“相乗効果”は累積効果よりも大きい効果を指し、前記効果は、少なくとも２つの治療薬剤（例えば４−ＰＢＡおよび１つ以上のチェックポイント阻害剤または免疫系刺激物質）の組合せによって生じ、任意の個々の治療薬剤単独の投与から生じるものを上回る。例えば、１つ以上の治療薬剤のより低い用量を癌の治療に用いて、治療有効性の増加および副作用の低下をもたらすことができる。
本明細書で用いられる“治療の”、“治療する”または“治療”は、対象動物（例えば人間）で本明細書に記載する疾患または異常の治療をカバーし、以下を含む：（ｉ）疾患または異常の抑制、すなわちその発達の停止；（ｉｉ）疾患または異常の緩和、すなわち異常の後退；（ｉｉｉ）異常の進行速度の低下；および／または（ｉｖ）疾患または異常の１つ以上の徴候の抑制、緩和、または進行速度の低下。
記載の医学的疾患および症状の治療または予防の様々な様式が“実質的”を意味するものであることもまた理解されるべきである。そのようなものには全面的治療または予防だけでなく部分的治療または予防が含まれ、その場合には、生物学的または医学的に相応の結果が達成される。治療は、慢性疾患のための持続的長期治療、または急性症状のための治療の１回だけまたは数回の実施が可能である。
【００１３】
ＥＲトラフィッキング
真核細胞の分泌経路は、広範囲のタンパク質、複合炭水化物および脂質の生合成および適切な細胞内分布のためにもっとも重要である。分泌経路のトラフィッキングは高度に動的であり、特定の細胞の機能的要求に応答する。新規に合成されたタンパク質および脂質の前進性輸送（順行性輸送としても知られている）は小胞体（ＥＲ）で開始され、例えばＥＲ発ゴルジ輸送は細胞内膜系への重要な入り口である。
ＥＲとゴルジとの間の膜輸送は二方向性であり、同様なメカニズムを介して生じる。両事例で、運搬体はドナーの細胞小器官で形成され、続いて標的の細胞小器官に繋がれ、当該標的細胞小器官に融合する。順行性輸送と逆行性輸送のための運搬体の形成は別個の機構によって促進され（それら機構はトラフィッキングの正確性および方向性を担保する）、コートタンパク質複合体ＩＩ（ＣＯＰＩＩ）がＥＲを発する順行性経路で作動し、コートタンパク質複合体Ｉ（ＣＯＰＩ）がゴルジを発する逆行性ルートで機能する。
ＣＯＰＩＩ機構は、分泌関連ＲＡＳ関連１  ＧＴＰａｓｅ（ＳＡＲ１）および２つの準複合体ＳＥＣ２３−ＳＥＣ２４およびＳＥＣ１３−ＳＥＣ３１を含む。ＳＡＲ１の活性化は、ＥＲ膜固着グアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）ＳＥＣ１２によって協調される（ＳＥＣ１２はＳＡＲ１のＧＴＰ結合形を生成する）。活性なＳＡＲ１はアミノ末端αヘリックスを介してＥＲ膜と結合する。ＳＡＲ１は、ＳＥＣ２３サブユニットとの相互作用を介してＳＥＣ２３−ＳＥＣ２４ヘテロダイマーを補充する（前記はＳＡＲ１のためのＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質（ＧＡＰ）として機能する）。ＣＯＰＩＩ運搬体へのカーゴの拡散または‘バルクフロー’が生じるが、選択的な取込みのために、ＣＯＰＩＩサブユニットは膜タンパク質上の特異的なＥＲエクスポートシグナルを認識することができる。
本技術は、ＥＲを発するペプチドおよび／またはタンパク質のトラフィッキングを改変する方法および組成物に関する。
【００１４】
４−フェニルブチレートおよびアナログ
ある特徴では、本明細書で開示する方法で有用な組成物は、４−フェニルブチレート（４−ＰＢＡ）（式Ｉの化合物）および／または４−ＰＢＡアナログであり、ここで４−ＰＢＡアナログは以下から選択される：４−（４−メトキシフェニル）ブチレート（メトキシ−ＰＢＡ）、３−フェニルピロピオネート（３−ＰＰＡ）、５−フェニルバリレート（５−ＰＶＡ）、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオネート（ヒドロキシ−ＰＰＡ）、４−（４−ヒドロキシフェニル）ブチレート（ヒドロキシ−ＰＢＡ）および４−（４−トリル）ブチレート（トリル−ＢＡ）。図８を参照されたい。
いくつかの実施態様では、４−ＰＢＡおよび４−ＰＢＡアナログは、式Ｉの化合物、
【００１５】
【化１】
2020520935.tif 000003
（式Ｉ）
（Ｉ）
【００１６】
またはその医薬的に許容できる塩であり、式中、Ｒ1は、Ｈ、Ｃ1−Ｃ3アルキル、Ｃ1−Ｃ3アルコキシ、ヒドロキシル、チオール、Ｃ1−Ｃ3アルキルチオ、−Ｓ（Ｏ）Ｒ2、−Ｓ（Ｏ）2Ｒ3、または−Ｓ（Ｏ）2ＯＲ4であり；Ｒ2、Ｒ3、およびＲ4はそれぞれ別個にＣ1−Ｃ3アルキルであり；さらにｎは２、３、または４である。
一般的に、ある種の元素（例えば水素またはＨ）と言えば、当該元素の全ての同位体を含むことを意味する。例えば、Ｒ基が水素またはＨを含むと規定される場合、前記はまた重水素および三重水素を含む。放射性同位体（例えば三重水素、14Ｃ、32Ｐ、および35Ｓ）を含む化合物は、したがって本技術の範囲内である。そのような標識を本技術の化合物に挿入する手順は、本明細書の開示に基づいて当業者には直ちに容易となろう。
アルキル基は直鎖および分枝鎖アルキル基を含み、前記は、１から１２の炭素原子、典型的には１から１０の炭素、またはいくつかの実施態様では、１から８、１から６、もしくは１つから４つの炭素原子を有する。直鎖アルキル基の例には例えば以下の基が含まれる：メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、およびｎ−オクチル基。分枝アルキル基の例には、イソプロピル、ｉｓｏ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ネオペンチル、イソペンチル、および２，２−ジメチルプロピル基が含まれるが、ただし前記に限定されない。
アルコキシ基はヒドロキシル基（−ＯＨ）であるが、前記基では、水素原子との結合は、置換または非置換アルキル基（上記に規定）の炭素原子との結合によって入れ替えられている。直鎖アルコキシ基の例には、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、ペントキシ、ヘキソキシなどが含まれるが、ただし前記に限定されない。分枝アルコキシ基の例には、イソプロポキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、イソペントキシ、イソヘキソキシなどが含まれるが、ただし前記に限定されない。
“チオール”という用語は−ＳＨ基を指す。アルキルチオ基は、スルフィド（例えばＣ1−Ｃ3アルキル−Ｓ−）である。
本明細書で用いられるように、Ｃm−Ｃn（例えばＣ1−Ｃ12、Ｃ1−Ｃ8、またはＣ1−Ｃ6）は、１つの基の前で用いられるときは、ｍからｎの炭素原子を含む基を指す。例えばＣ1−Ｃ3は、１、２または３つの炭素原子を含む基を指す。
【００１７】
本明細書に記載する化合物の医薬的に許容できる塩は本技術の範囲内であり、酸または塩基付加塩が含まれ、前記塩は所望される薬理学的活性を保持し、かつ生物学的に望ましくないものではない（例えば前記塩は過度に毒性でも、アレルギー性でも、または炎症性でもなく、かつ生物学的に利用可能である）。本技術の化合物が塩基性の基（例えばアミノ基）を有するとき、医薬的に許容できる塩は以下により形成することができる：無機酸（例えば塩酸、臭化水素酸（ｈｙｄｒｏｂｏｒｉｃ  ａｃｉｄ）、硝酸、硫酸、およびリン酸）、有機酸（例えばアルギン酸、ギ酸、酢酸、安息香酸、グルコン酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、乳酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、およびｐ−トルエンスルホン酸）、または酸性アミノ酸（例えばアスパラギン酸およびグルタミン酸）。本技術の化合物が酸性基（例えばカルボン酸基）を有するとき、塩は例えば以下を用いて形成することができる：金属、例えばアルカリまたはアルカリ土類金属（例えばＮａ+、Ｌｉ+、Ｋ+、Ｃａ2+、Ｍｇ2+、Ｚｎ2+）、アンモニアもしくは有機アミン（例えばジシクロヘキシルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン）、または塩基性アミノ酸（例えばアルギニン、リジンおよびオルニチン）。そのような塩は、化合物の単離および精製の間にｉｎ  ｓｉｔｕで調製するか、或いは、別々に精製化合物をその遊離塩基形または遊離酸形で適切な酸もしくは塩基とそれぞれ反応させ、そのようにして形成した塩を単離することによって調製することができる。
【００１８】
本技術の化合物が、互変異性、配座異性、幾何異性および／または立体異性現象を示し得ることは当業者には理解されよう。本明細書および請求の範囲中の化学式図は、ただ１つの可能な互変異性体、配座異性体、幾何異性体および／または立体異性体形を表すことができるが、本技術は、本明細書に記載する１つ以上の有用性を有する化合物の一切の互変異性体、配座異性体、幾何異性体および／または立体異性体形とともにこれらの種々の多様な形態を包含することは理解されるべきである。
“互変異性体”は互いに平衡状態にある化合物の異性体形を指す。当該異性体形の存在および濃度は、当該化合物が見出される環境に左右され、例えば当該化合物が固体であるか、または有機もしくは水溶液に存在するかによって相違し得る。例えば、水溶液中で、キナゾリノンは以下の異性体形を示すことができ、それらは互いに互変異性体と称される：
【００１９】
【化２】
2020520935.tif 000004
【００２０】
別の例として、グアニジンはプロトン性有機溶液中で以下の異性体形を示すことができ、互いに互変異性体と称される：
【００２１】
【化３】
2020520935.tif 000005
【００２２】
構造式による化合物の表示には制限があるので、本明細書に記載する化合物の全ての化学式は本技術の化合物の全ての互変異性体を表し、それらは本技術の範囲内である。
特定の立体化学が明瞭に表示されていないかぎり、化合物の立体異性体（光学異性体としても知られている）には、１つの構造の全キラル形、ジアステレオマー形、およびラセミ形が含まれる。したがって、本叙述から明らかなように、本技術で用いられる化合物は、いずれかのもしくは全ての非対称性原子で濃縮または分解された光学異性体を含む。ラセミ混合物およびジアステレオマー混合物の両方が、個々の光学異性体と同様に単離または合成され、したがって実質的にそれらのエナンチオマーまたはジアステレオマーパートナーを含まず、これらの立体異性体はいずれも本技術の範囲内である。
本技術の化合物は溶媒和物（特に水和物）として存在することができる。水和物は、当該化合物または当該化合物を含む組成物の製造中に形成され得るか、または水和物は当該化合物の吸湿性特性のために時間の経過中に形成され得る。本技術の化合物は、有機溶媒和物（とりわけＤＭＦ、エーテルおよびアルコール溶媒和物を含む）としても同様に存在し得る。任意の個々の溶媒和物の区別および調製は、合成有機化学または医薬化学に関する業者の技術範囲内である。
【００２３】
小胞体を発するペプチドおよびタンパク質のトラフィッキング改変方法
本開示は、ＥＲを発するペプチドおよび／またはタンパク質のトラフィッキングを改変する方法を提供し、前記方法は、１つ以上の細胞を有効量の４−フェニルブチレート（４−ＰＢＡ）（式Ｉの化合物）および／または４−ＰＢＡアナログと接触させる工程を含み、４−ＰＢＡアナログは、４−（４−メトキシフェニル）ブチレート（メトキシ−ＰＢＡ）、３−フェニルピロピオネート（３−ＰＰＡ）、５−フェニルバリレート（５−ＰＶＡ）、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオネート（ヒドロキシ−ＰＰＡ）、４−（４−ヒドロキシフェニル）ブチレート（ヒドロキシ−ＰＢＡ）および４−（４−トリル）ブチレート（トリル−ＢＡ）から選択される。別の実施態様では、ＥＲを発するペプチドおよび／またはタンパク質のトラフィッキングを改変する方法は、有効量の４−ＰＢＡ（式Ｉの化合物）および／または４−ＰＢＡアナログ（メトキシ−ＰＢＡ、３−ＰＰＡ、５−ＰＶＡ、ヒドロキシ−ＰＰＡ、ヒドロキシ−ＰＢＡおよびトリル−ＢＡから選択される）をその必要がある対象動物に投与する工程を含む。
いくつかの実施態様では、細胞を有効量の４−ＰＢＡ（式Ｉの化合物）および／または４−ＰＢＡアナログ（メトキシ−ＰＢＡ、３−ＰＰＡ、５−ＰＶＡ、ヒドロキシ−ＰＰＡ、ヒドロキシ−ＰＢＡおよびトリル−ＢＡから選択される）と接触させる工程は、ＥＲ在留物質および／またはＥＲで拘束されている誤って折畳まれたもしくは折畳まれていないタンパク質のＣＯＰＩＩパッケージングを促進する。ある種の実施態様では、細胞を有効量の４−ＰＢＡ（式Ｉの化合物）および／または４−ＰＢＡアナログ（メトキシ−ＰＢＡ、３−ＰＰＡ、５−ＰＶＡ、ヒドロキシ−ＰＰＡ、ヒドロキシ−ＰＢＡおよびトリル−ＢＡから選択される）と接触させる工程は、ＥＲ在留物質および／またはＥＲで拘束されている誤って折畳まれたもしくは折畳まれていないタンパク質のＥＲ外へのトラフィッキングおよび／または分泌を増加させる。
加えて或いはまた別に、いくつかの実施態様では、４−ＰＢＡ（式Ｉの化合物）、メトキシ−ＰＢＡ、３−ＰＰＡ、５−ＰＶＡ、ヒドロキシ−ＰＰＡ、ヒドロキシ−ＰＢＡまたはトリル−ＢＡはＣＯＰＩＩと結合する。ある種の実施態様では、４−ＰＢＡ（式Ｉの化合物）、メトキシ−ＰＢＡ、３−ＰＰＡ、５−ＰＶＡ、ヒドロキシ−ＰＰＡ、ヒドロキシ−ＰＢＡまたはトリル−ＢＡはＣＯＰＩＩのＳｅｃ２４ａと結合する。いくつかの実施態様では、４−ＰＢＡ（式Ｉの化合物）、メトキシ−ＰＢＡ、３−ＰＰＡ、５−ＰＶＡ、ヒドロキシ−ＰＰＡ、ヒドロキシ−ＰＢＡまたはトリル−ＢＡはＳｅｃ２４ａのＢ部位と結合する。
加えて或いはまた別に、いくつかの実施態様では、１つ以上の細胞を有効量の４−ＰＢＡ（式Ｉの化合物）、メトキシ−ＰＢＡ、３−ＰＰＡ、５−ＰＶＡ、ヒドロキシ−ＰＰＡ、ヒドロキシ−ＰＢＡおよび／またはトリル−ＢＡと接触させる工程は、ｐ２４タンパク質および／またはＥＲＧＩＣ−５３タンパク質のＥＲパッケージングを減少させる。例示すれば（制限ではない）、いくつかの実施態様では、ｐ２４タンパク質はｐ２４δ１、ｐ２４α２、ｐ２４α３およびｐ２４β１である。
【００２４】
ＧＲＰ９４、ＧＲＰ１７０およびカルレチクリンのトラフィッキング改変
本技術は、ＧＲＰ９４、ＧＲＰ１７０およびカルレチクリンの余分な細胞レベルを増加させる方法および組成物を提供し、前記方法は、１つ以上の細胞を有効量の４−フェニルブチレート（４−ＰＢＡ）（式Ｉの化合物）および／または４−ＰＢＡアナログと接触させる工程を含み、４−ＰＢＡアナログは、式Ｉの化合物、４−（４−メトキシフェニル）ブチレート（メトキシ−ＰＢＡ）、３−フェニルピロピオネート（３−ＰＰＡ）、５−フェニルバリレート（５−ＰＶＡ）、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオネート（ヒドロキシ−ＰＰＡ）、４−（４−ヒドロキシフェニル）ブチレート（ヒドロキシ−ＰＢＡ）および４−（４−トリル）ブチレート（トリル−ＢＡ）から選択される。
いくつかの実施態様では、１つ以上の細胞はＥＲストレス下にある。ＥＲストレスは、ＥＲでのタンパク質折畳みを破壊するＥＲ機能の妨害である。例示すれば（制限ではない）、ＥＲストレスの原因には、酸素欠乏、栄養素（例えばグルコース）枯渇、レドックスバランスの変化、カルシウム恒常性の変化、翻訳後修飾の失敗、および全般的タンパク質合成の増加が含まれる。ＥＲストレスは、非折畳みおよび誤って折畳まれたタンパク質のＥＲ内蓄積をもたらす。真核細胞は、進化の間に保存された適応メカニズムである非折畳みタンパク質応答を発達させ、前記は、非折畳みタンパク質を取り除きＥＲ恒常性を復活させるために機能する。
ＥＲストレスは、当業界で一般的に公知の方法を用いて測定することができる。例えば、ＥＲストレスは、ＥＲ膨張、ＥＲストレス時のリアルタイムレドックス測定、およびＵＰＲの活性化測定（例えばＩＲＥ１α、ＰＥＲＫまたはＡＴＥ６α活性化の測定）によって測定できる。
いくつかの実施態様では、１つ以上の細胞は癌細胞である。例示すれば（限定ではない）、いくつかの実施態様では、癌細胞は、肝臓癌細胞、骨髄腫細胞、結腸直腸癌細胞、肺癌細胞、膵臓癌細胞、乳癌細胞、前立腺癌細胞などから選択される。１つ以上の細胞は前癌細胞または形成異常細胞であり得る。
【００２５】
ある特徴では、本開示は、その必要がある対象動物で１つ以上の細胞によるＧＲＰ９４の細胞外分泌を増加させる方法を提供し、前記方法は、有効量の４−ＰＢＡ（式Ｉの化合物）および／または４−ＰＢＡアナログ（メトキシ−ＰＢＡ、３−ＰＰＡ、５−ＰＶＡ、ヒドロキシ−ＰＰＡ、ヒドロキシ−ＰＢＡおよびトリル−ＢＡから選択される）を当該対象動物に投与する工程を含む。４−ＰＢＡ（式Ｉの化合物）および／または４−ＰＢＡアナログは、経口的に、外用的に、鼻内に、全身的に、静脈内に、皮下に、腹腔内に、真皮内に、眼内に、イオン泳動的に、経粘膜的に、または筋肉内に投与できる。加えて或いはまた別に、いくつかの実施態様では、１つ以上の細胞はＥＲストレス下にある細胞である。
ある種の実施態様では、対象動物は、癌を有するかまたは癌に罹患していると診断される。癌の例には、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、食道癌、子宮内膜癌、胃癌、神経膠芽腫、頭頸部癌、肝細胞癌腫、白血病、肺癌、リンパ腫、メラノーマ、メルケル細胞癌腫、多発性骨髄腫、神経芽腫、神経内分泌癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌腫、ラブドイド癌、肉腫または尿路癌が含まれる。加えて或いはまた別に、いくつかの実施態様では、分泌されるＧＲＰ９４は腫瘍ネオアンチゲンと複合体を形成する。
加えて或いはまた別に、いくつかの実施態様では、対象動物はウイルスに感染している。ウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、インフルエンザウイルス、ＥＢＶ、エボラウイルス、水痘ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ＨＰＶ、麻疹ウイルス、ルブラウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、ラウス肉腫ウイルス、狂犬病ウイルスおよびロタウイルスから成る群から選択できる。加えて或いはまた別に、いくつかの実施態様では、分泌されるＧＲＰ９４はウイルス抗原と複合体を形成する。
本明細書に開示する方法のいくつかの実施態様では、ＧＲＰ９４、ＧＲＰ１７０、および／またはカルレチクリンの余分な細胞外レベルの増加または分泌増加は、免疫応答を喚起または誘発する。いくつかの実施態様では、免疫応答は抗腫瘍免疫応答である。
【００２６】
ＥＲ回収系の飽和
本技術は、１つ以上の細胞の１つ以上のＥＲ回収系を飽和させる方法および組成物を提供し、前記方法は、１つ以上の細胞を有効量の４−フェニルブチレート（４−ＰＢＡ）（式Ｉの化合物）および／または４−ＰＢＡアナログと接触させる工程を含み、、４−ＰＢＡアナログは、４−（４−メトキシフェニル）ブチレート（メトキシ−ＰＢＡ）、３−フェニルピロピオネート（３−ＰＰＡ）、５−フェニルバリレート（５−ＰＶＡ）、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオネート（ヒドロキシ−ＰＰＡ）、４−（４−ヒドロキシフェニル）ブチレート（ヒドロキシ−ＰＢＡ）および４−（４−トリル）ブチレート（トリル−ＢＡ）から選択される。いくつかの実施態様では、１つ以上の細胞は、ＥＲストレス下にある細胞および／または癌細胞である。
加えて或いはまた別に、いくつかの実施態様では、１つ以上のＥＲ回収系は、ＫＤＥＬ媒介回収系、Ｒｅｒ１回収系、ジリシン（KK.ｘｘ）回収系、およびＥｒｖ４１−Ｅｒｖ４６回収系から成る群から選択される。
【００２７】
本技術の治療方法
ある特徴では、本開示は、その必要がある対象動物で癌を治療する方法を提供し、前記方法は、有効量の４−ＰＢＡ（式Ｉの化合物）および／または４−ＰＢＡアナログ（メトキシ−ＰＢＡ、３−ＰＰＡ、５−ＰＶＡ、ヒドロキシ−ＰＰＡ、ヒドロキシ−ＰＢＡおよびトリル−ＢＡから選択される）を当該対象動物に投与する工程を含む。４−ＰＢＡ（式Ｉの化合物）および／または４−ＰＢＡアナログは、経口的に、外用的に、鼻内に、全身的に、静脈内に、皮下に、腹腔内に、真皮内に、眼内に、イオン泳動的に、経粘膜的に、または筋肉内に投与される。いくつかの実施態様では、対象動物の１つ以上の細胞は小胞体（ＥＲ）ストレス下にある。ある種の実施態様では、ＥＲストレス下の１つ以上の細胞は癌細胞である。加えて或いはまた別に、いくつかの実施態様では、対象動物は人間である。いくつかの実施態様では、４−ＰＢＡ（式Ｉの化合物）および／または４−ＰＢＡアナログはＣＯＰＩＩタンパク質と結合する。
本明細書に開示する方法の上記実施態様のいずれでも、癌は、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、食道癌、子宮内膜癌、胃癌、神経膠芽腫、頭頸部癌、肝細胞癌腫、白血病、肺癌、リンパ腫、メラノーマ、メルケル細胞癌腫、多発性骨髄腫、神経芽腫、神経内分泌癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌腫、ラブドイド癌、肉腫または尿路癌である。
加えて或いはまた別に、いくつかの実施態様では、４−ＰＢＡ（式Ｉの化合物）および／または４−ＰＢＡアナログは、投与前の対象動物で観察されるレベルと比較して増加したＧＲＰ９４細胞外レベルを対象動物で生じる（例えば少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６倍、少なくとも６．５倍、少なくとも７倍、少なくとも７．５倍、少なくとも８倍、少なくとも８．５倍、少なくとも９倍、少なくとも９．５倍、少なくとも１０倍）。
加えて或いはまた別に、いくつかの実施態様では、４−ＰＢＡ（式Ｉの化合物）および／または４−ＰＢＡアナログは６週間以上の間毎日投与される。いくつかの実施態様では、４−ＰＢＡ（式Ｉの化合物）および／または４−ＰＢＡアナログは１２週間以上の間毎日投与される。
【００２８】
ある特徴では、本開示は、その必要がある対象動物で癌免疫療法を強化する方法を提供し、前記方法は、有効量の４−ＰＢＡ（式Ｉの化合物）および／または４−ＰＢＡアナログ（メトキシ−ＰＢＡ、３−ＰＰＡ、５−ＰＶＡ、ヒドロキシ−ＰＰＡ、ヒドロキシ−ＰＢＡおよびトリル−ＢＡから選択される）を当該対象動物に投与する工程を含む。いくつかの実施態様では、４−ＰＢＡ（式Ｉの化合物）および／または４−ＰＢＡアナログの投与は、投与前の対象動物で観察されるものと比較して、ＧＲＰ９４／ネオアンチゲン複合体の分泌上昇を対象動物で生じる。いくつかの実施態様では、ＧＲＰ９４／ネオアンチゲン複合体は、長さが約５から５０アミノ酸のネオアンチゲンペプチドを含むことができる。
ある種の実施態様では、ＧＲＰ９４／ネオアンチゲン複合体は、長さが約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、また約１２０アミノ酸のネオアンチゲンペプチドを含むことができる。加えて或いはまた別に、いくつかの実施態様では、ネオアンチゲンペプチドは、腫瘍特異的変異（例えば特定の癌タイプのためのドライバー変異）を含む。
加えて或いはまた別に、いくつかの実施態様では、対象動物は以下から選択される癌を有すると診断される：膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、食道癌、子宮内膜癌、胃癌、神経膠芽腫、頭頸部癌、肝細胞癌腫、白血病、肺癌、リンパ腫、メラノーマ、メルケル細胞癌腫、多発性骨髄腫、神経芽腫、神経内分泌癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌腫、ラブドイド癌、肉腫または尿路癌。
【００２９】
いくつかの実施態様では、癌免疫療法の強化は、癌免疫療法単独実施中の対象動物と比較して、癌免疫療法実施中でかつ本技術の化合物（４−ＰＢＡ（式Ｉの化合物）および／または４−ＰＢＡアナログ）を投与された対象動物におけるより大きな腫瘍サイズの縮小を特徴とする。
別の特徴では、本開示は、その必要がある対象動物でウイルス免疫療法を強化する方法を提供し、前記方法は、有効量の４−ＰＢＡ（式Ｉの化合物）および／または４−ＰＢＡアナログ（メトキシ−ＰＢＡ、３−ＰＰＡ、５−ＰＶＡ、ヒドロキシ−ＰＰＡ、ヒドロキシ−ＰＢＡおよびトリル−ＢＡから選択される）を当該対象動物に投与する工程を含む。いくつかの実施態様では、４−ＰＢＡ（式Ｉの化合物）および／または４−ＰＢＡアナログの投与は、投与前の対象動物で観察されるものと比較して、ＧＲＰ９４／ウイルス抗原複合体の分泌上昇を対象動物で生じる。加えて或いはまた別に、いくつかの実施態様では、対象動物は以下から選択されるウイルスに感染している：ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、インフルエンザウイルス、ＥＢＶ、エボラウイルス、水痘ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ＨＰＶ、麻疹ウイルス、ルブラウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、ラウス肉腫ウイルス、狂犬病ウイルスおよびロタウイルス。
本明細書に開示する方法のいくつかの実施態様では、ウイルス免疫療法の強化は、ウイルス免疫療法単独実施中の対象動物と比較して、ウイルス免疫療法実施中でかつ本技術の化合物（４−ＰＢＡ（式Ｉの化合物）および／または４−ＰＢＡアナログ）を投与された対象動物における抗体産生の増加を特徴とする。
加えて或いはまた別に、本明細書に開示する方法のいくつかの実施態様では、４−ＰＢＡ（式Ｉの化合物）および／または４−ＰＢＡアナログは、経口的に、外用的に、鼻内に、全身的に、静脈内に、皮下に、腹腔内に、真皮内に、眼内に、イオン泳動的に、経粘膜的に、または筋肉内に投与される。
前述の実施態様のいずれにおいても、本技術の方法はさらにまた有効量のアジュバントを対象動物に投与する工程を含む。加えて或いはまた別に、いくつかの実施態様では、本技術の方法はさらにまた、本明細書に開示する１つ以上のチェックポイント阻害剤および／または本明細書に開示する１つ以上の免疫系刺激物質を別々に、連続的にまたは同時に投与する工程を含む。
別の特徴では、本技術は前癌細胞または形成異常細胞を治療する方法に関し、前記方法は、有効量の４−フェニルブチレート（４−ＰＢＡ）（式Ｉの化合物）および／または４−ＰＢＡアナログをその必要がある対象動物に投与する工程を含み、４−ＰＢＡアナログは、４−（４−メトキシフェニル）ブチレート（メトキシ−ＰＢＡ）、３−フェニルピロピオネート（３−ＰＰＡ）、５−フェニルバリレート（５−ＰＶＡ）、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオネート（ヒドロキシ−ＰＰＡ）、４−（４−ヒドロキシフェニル）ブチレート（ヒドロキシ−ＰＢＡ）および４−（４−トリル）ブチレート（トリル−ＢＡ）から選択される。いくつかの実施態様では、前癌細胞または形成異常細胞の治療は、前癌細胞または形成異常細胞の減少を特徴とする。
【００３０】
投与の態様および有効量
細胞、器官または組織を４−ＰＢＡ（式Ｉの化合物）および／または４−ＰＢＡアナログ（メトキシ−ＰＢＡ、３−ＰＰＡ、５−ＰＶＡ、ヒドロキシ−ＰＰＡ、ヒドロキシ−ＰＢＡおよびトリル−ＢＡから選択される）と接触させるための当業者公知の任意の方法を用いることができる。適切な方法はｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法を含む。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法は、典型的には、４−ＰＢＡ（式Ｉの化合物）および／または４−ＰＢＡアナログ（メトキシ−ＰＢＡ、３−ＰＰＡ、５−ＰＶＡ、ヒドロキシ−ＰＰＡ、ヒドロキシ−ＰＢＡおよびトリル−ＢＡから選択される）の１つ以上の細胞への投与または接触を含む。いくつかの実施態様では、細胞は癌細胞である。例示すれば（制限ではない）、いくつかの実施態様では、癌細胞は、肝臓癌細胞、骨髄腫細胞、結腸直腸癌細胞、肺癌細胞、膵臓癌細胞、乳癌細胞、前立腺癌細胞から選択される。
細胞を接触させるｉｎ  ｖｉｖｏの方法は、典型的には、４−ＰＢＡ（式Ｉの化合物）および／または４−ＰＢＡアナログ（メトキシ−ＰＢＡ、３−ＰＰＡ、５−ＰＶＡ、ヒドロキシ−ＰＰＡ、ヒドロキシ−ＰＢＡおよびトリル−ＢＡから選択される）の対象動物への投与を含む。いくつかの実施態様では、対象動物は哺乳動物（例えば人間）である。ｉｎ  ｖｉｖｏで用いられるときは、４−ＰＢＡ（式Ｉの化合物）、メトキシ−ＰＢＡ、３−ＰＰＡ、５−ＰＶＡ、ヒドロキシ−ＰＰＡ、ヒドロキシ−ＰＢＡおよびトリル−ＢＡ塩は、対象動物に有効量（すなわち、所望の効果（例えば１つ以上の細胞のＧＲＰ９４の分泌増加）を有する量）で投与される。有効量は、用いられる４−ＰＢＡ、メトキシ−ＰＢＡ、３−ＰＰＡ、５−ＰＶＡ、ヒドロキシ−ＰＰＡ、ヒドロキシ−ＰＢＡおよびトリル−ＢＡの特徴に左右されるであろう。
上記の方法で用いられる、４−ＰＢＡ（式Ｉの化合物）および／または４−ＰＢＡアナログ（メトキシ−ＰＢＡ、３−ＰＰＡ、５−ＰＶＡ、ヒドロキシ−ＰＰＡ、ヒドロキシ−ＰＢＡおよびトリル−ＢＡから選択される）の有効量は、医薬化合物の投与のための多数の周知の方法のいずれかによって、その必要がある対象動物に投与できる。４−ＰＢＡ（式Ｉの化合物）および／または４−ＰＢＡアナログ（メトキシ−ＰＢＡ、３−ＰＰＡ、５−ＰＶＡ、ヒドロキシ−ＰＰＡ、ヒドロキシ−ＰＢＡおよびトリル−ＢＡから選択される）は、全身的にまたは局所的に投与される。
本明細書に記載の化合物（例えば４−ＰＢＡ）は、対象動物への投与のために医薬組成物に単独でまたは組合せて取り込まれ得る。そのような組成物は典型的には活性薬剤および医薬的に許容できる担体を含む。本明細書に用いられるように、“医薬的に許容できる担体”には、医薬投与に適合し得る食塩水、溶媒、分散媒体、被覆剤、抗菌および抗カビ剤、等張および吸収遅延剤などが含まれる。補助的活性化合物もまた当該組成物に取り込まれ得る。
【００３１】
いくつかの実施態様では、本技術の医薬組成物は、その意図する投与ルートに適合するように処方される。投与ルートの例には、非経口（例えば静脈内、真皮内、腹腔内または皮下）、経口、吸入、経皮（外用）、眼内、イオン泳動、および経粘膜投与が含まれる。非経口、真皮内または皮下適用に用いられる溶液または懸濁物は以下の成分を含むことができる：無菌的希釈剤、例えば注射用水、食塩水、不揮発油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗菌剤、例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウム；キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸；緩衝剤、例えば酢酸、クエン酸またはリン酸；および張度調整剤、例えば塩化ナトリウムまたはデキストロース。ｐＨは酸または塩基（例えば塩酸または水酸化ナトリウム）で調製することができる。
本明細書に記載する化合物（例えば４−ＰＢＡ）の全身的投与はまた経粘膜的または経皮的手段によることができる。経粘膜または経皮投与のためには、浸透されるべき障壁に対して適切な浸透剤が処方物中で用いられる。そのような浸透剤は当業界で一般的に公知であり、例えば、経粘膜投与のためには胆汁塩およびフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜投与は鼻のスプレーを使用することによって達成できる。経皮投与のためには、活性化合物は、当業界で一般的に公知の軟膏、膏薬、ゲル、またはクリーム中に処方される。ある実施態様では、経皮投与はイオン泳動法によって実施され得る。
【００３２】
４−ＰＢＡ（式Ｉの化合物）および／または４−ＰＢＡアナログ（メトキシ−ＰＢＡ、３−ＰＰＡ、５−ＰＶＡ、ヒドロキシ−ＰＰＡ、ヒドロキシ−ＰＢＡおよびトリル−ＢＡから選択される）の投薬量、毒性および有効性は、細胞培養または実験動物での標準的な医薬的方法、例えばＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％で治療的に有効な用量）によって決定できる。毒性作用と治療効果との間の用量比は治療指標であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表される。高い治療指標を示す化合物が有益である。有毒な副作用を示す化合物を用いることは可能であるが、そのような化合物の照準を罹患組織部位に合わせて非罹患細胞への潜在的な損傷を最小限にし、それによって副作用を軽減するように配慮されるべきである。
細胞培養アッセイおよび動物試験から得られるデータを人間で使用される投薬量の処方範囲に用いることができる。そのような化合物の投薬量は、ほとんどまたは全く毒性を持たないＥＤ５０を含む循環濃度範囲内であり得る。投薬量は、用いられる剤形および利用される投与ルートにしたがい前記範囲内で変動可能である。本方法で用いられるいずれの化合物についても、有効量はまず初めに細胞培養アッセイから概算することができる。細胞培養で決定されたＩＣ５０（すなわち症状の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成する用量を、動物モデルで処方することができる。そのような情報を用いて、人間で有用な用量を正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。
【００３３】
いくつかの実施態様では、所望の効果を達成するために十分である、有効量の４−ＰＢＡ（式Ｉの化合物）または４−ＰＢＡアナログ（メトキシ−ＰＢＡ、３−ＰＰＡ、５−ＰＶＡ、ヒドロキシ−ＰＰＡ、ヒドロキシ−ＰＢＡおよびトリル−ＢＡから選択される）は、１日当たり体重１キログラムにつき約０．００００１mgから１日当たり体重１キログラムにつき約１０，０００mgの範囲である。適切には、投薬量は、１日当たり体重１キログラムにつき約０．０００１mgから１日当たり体重１キログラムにつき約１００mgである。例えば投薬量は、１mg／ｋｇ体重または１０mg／ｋｇ体重で毎日、２日毎もしくは３日毎であるか、または１−１０mg／ｋｇの範囲内で毎週、２週間毎もしくは３週間毎であり得る。ある実施態様では、４−ＰＢＡ（式Ｉの化合物）または４−ＰＢＡアナログの単一投薬量は、体重１kg当たり０．００１−１０，０００マイクログラムの範囲である。ある実施態様では、例示的な治療レジメンは１日１回または１週間に１回の投与を必要とする。
いくつかの実施態様では、有効量の４−ＰＢＡ（式Ｉの化合物）または４−ＰＢＡアナログ（メトキシ−ＰＢＡ、３−ＰＰＡ、５−ＰＶＡ、ヒドロキシ−ＰＰＡ、ヒドロキシ−ＰＢＡおよびトリル−ＢＡから選択される）は、１０-12から１０-6モル濃度、例えば約１０-7モル濃度の標的組織における化合物濃度として規定される。前記濃度は全身性用量０．００１から１００mg／ｋｇまたは体表面積による等価の用量によってデリバリーできる。用量スケジュールを最適化して、標的組織における化合物濃度を例えば毎日もしくは毎週１回の投与によって維持することができるが、持続投与（例えば輸液または経皮適用）もまた含むことができる。
【００３４】
いくつかの実施態様では、有効量の４−ＰＢＡ（式Ｉの化合物）または４−ＰＢＡアナログ（メトキシ−ＰＢＡ、３−ＰＰＡ、５−ＰＶＡ、ヒドロキシ−ＰＰＡ、ヒドロキシ−ＰＢＡおよびトリル−ＢＡから選択される）は、約１から１００μＭ、５から９０μＭ、１０から８０μＭ、２０から７０μＭ、３０から６０μＭ、または４０から５０μＭと規定される。
いくつかの実施態様では、有効量の４−ＰＢＡ（式Ｉの化合物）または４−ＰＢＡアナログ（メトキシ−ＰＢＡ、３−ＰＰＡ、５−ＰＶＡ、ヒドロキシ−ＰＰＡ、ヒドロキシ−ＰＢＡおよびトリル−ＢＡから選択される）は、約１００から１０００μＭ、２００から９００μＭ、３００から８００μＭ、４００から７００μＭ、または５００から６００μＭと規定される。いくつかの実施態様では、有効量の４−ＰＢＡ（式Ｉの化合物）または４−ＰＢＡアナログ（メトキシ−ＰＢＡ、３−ＰＰＡ、５−ＰＶＡ、ヒドロキシ−ＰＰＡ、ヒドロキシ−ＰＢＡおよびトリル−ＢＡから選択される）は、約７００μＭ、８００μＭ、９００μＭ、または１０００μＭ、および前述の濃度のいずれか２つの間の任意の濃度と規定される。
いくつかの実施態様では、有効量の４−ＰＢＡ（式Ｉの化合物）または４−ＰＢＡアナログ（メトキシ−ＰＢＡ、３−ＰＰＡ、５−ＰＶＡ、ヒドロキシ−ＰＰＡ、ヒドロキシ−ＰＢＡおよびトリル−ＢＡから選択される）は、約１０００から１８００μＭ、１１００から１７００μＭ、１２００から１６００μＭ、または１３００から１５００μＭと規定される。
【００３５】
いくつかの実施態様では、有効量の４−ＰＢＡ（式Ｉの化合物）または４−ＰＢＡアナログ（メトキシ−ＰＢＡ、３−ＰＰＡ、５−ＰＶＡ、ヒドロキシ−ＰＰＡ、ヒドロキシ−ＰＢＡおよびトリル−ＢＡから選択される）は、約１から４０ｍＭ、５から３５ｍＭ、１０から３０ｍＭ、または１５から２５ｍＭと規定される。いくつかの実施態様では、有効量の４−ＰＢＡ（式Ｉの化合物）または４−ＰＢＡアナログ（メトキシ−ＰＢＡ、３−ＰＰＡ、５−ＰＶＡ、ヒドロキシ−ＰＰＡ、ヒドロキシ−ＰＢＡおよびトリル−ＢＡから選択される）は、約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、または４０ｍＭ、および前述の濃度のいずれか２つの間の任意の濃度と規定される。
いくつかの実施態様では、上記濃度は、標的組織における４−ＰＢＡ（式Ｉの化合物）または４−ＰＢＡアナログ（メトキシ−ＰＢＡ、３−ＰＰＡ、５−ＰＶＡ、ヒドロキシ−ＰＰＡ、ヒドロキシ−ＰＢＡおよびトリル−ＢＡから選択される）の濃度である。
ある種の要因が、所望される応答（例えばＧＲＰ９４の分泌増加）を引き出すために要求される投薬量または濃度およびタイミングに影響を与え得ることは当業者には理解されるであろう。さらにまた、本明細書に記載の化合物の有効量の対象動物への投与または細胞との接触は、単回治療または一連の治療を含むことができる。
本方法にしたがって本明細書に記載の組成物（例えば４−ＰＢＡ）を投与される哺乳動物は任意の哺乳動物であることができ、前記には、例えば農場飼育動物（例えばヒツジ、ブタ、乳牛およびウマ）、愛玩動物（例えばイヌおよびネコ）、実験動物（例えばラット、マウスおよびウサギ）が含まれる。いくつかの実施態様では、哺乳動物は人間である。
【００３６】
治療的適用のために、４−ＰＢＡ（式Ｉの化合物）または４−ＰＢＡアナログ（メトキシ−ＰＢＡ、３−ＰＰＡ、５−ＰＶＡ、ヒドロキシ−ＰＰＡ、ヒドロキシ−ＰＢＡおよびトリル−ＢＡから選択される）を含む本技術の組成物は対象動物に投与される。いくつかの実施態様では、本技術の組成物は、１日に１、２、３、４、または５回投与される。いくつかの実施態様では、本技術の組成物は１日に５回以上投与される。加えて或いはまた別に、いくつかの実施態様では、本技術の組成物は、１日おき、２日おき、３日おき、４日おき、または５日おきに毎日投与される。いくつかの実施態様では、本技術の組成物は、毎週、２週間毎に、３週間毎に、または毎月投与される。本技術の組成物は、１週間、２週間、３週間、４週間または５週間の期間投与される。いくつかの実施態様では、本技術の組成物は６週間以上投与される。いくつかの実施態様では、本技術の組成物は１２週間以上投与される。いくつかの実施態様では、本技術の組成物は１年未満の間投与される。いくつかの実施態様では、本技術の組成物は１年以上の期間投与される。加えて或いはまた別に、いくつかの実施態様では、本技術の組成物は、１、２、３、４または５週間毎日投与される。いくつかの実施態様では、本技術の組成物は６週間未満の間毎日投与される。いくつかの実施態様では、本技術の組成物は６週間以上の間毎日投与される。他の実施態様では、本技術の組成物は１２週間以上の間毎日投与される。
【００３７】
他の活性薬剤との併用療法
いくつかの実施態様では、４−ＰＢＡ（式Ｉの化合物）または４−ＰＢＡアナログ（メトキシ−ＰＢＡ、３−ＰＰＡ、５−ＰＶＡ、ヒドロキシ−ＰＰＡ、ヒドロキシ−ＰＢＡおよびトリル−ＢＡから選択される）は、１つ以上のチェックポイント阻害剤および／または１つ以上の免疫系刺激物質と一緒にされるか、または、別々に、連続的に若しくは同時に投与される。１つ以上のチェックポイント阻害剤はＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１またはＣＴＬＡ−４を標的とすることができる。
いくつかの実施態様では、１つ以上のチェックポイント阻害剤は以下から成る群から選択される：イピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ（商標）（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ，  Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，  ＮＪ））、ペムブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（商標）（Ｍｅｒｃｋ，  Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ，  ＮＪ））、ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（商標）（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ，  Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，  ＮＪ））、アテゾリズマブ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（商標）（Ｇｅｎｅｔｅｃｈ，  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，  ＣＡ））、アベルマブ（Ｂａｖｅｎｃｉｏ（商標）（Ｍｅｒｃｋ，  Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ，  ＮＪおよびＰｆｉｚｅｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ））、およびデュルバルマブ（Ｉｍｆｉｎｚｉ（商標）（ＡｓｔｒａｒａＺｅｎｅｃａ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＵＫ））、ピジリズマブ（Ｃｕｒｅｔｅｃｈ  Ｌｔｄ．，  Ｙａｖｎｅ，  Ｉｓｒａｅｌ））、ＡＭＰ−２２４（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（Ｒｏｃｈｅ，  Ｂａｓｅｌ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＭＤＸ−１１０５（Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｙｅｒ  Ｓｑｕｉｂｂ，  Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，  ＮＪ）、ＭＥＤＩ−４７３６（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  ＭＤ）、アレルマブ（Ｍｅｒｃｋ  Ｓｅｒｏｎｏ，  Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）、トレメリムマブ（Ｐｆｉｚｅｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ）、ＩＭＰ３２１（Ｉｍｍｕｔｅｐ  Ｓ．Ａ．，  Ｎｅｗ  Ｓｏｕｔｈ  Ｗａｌｅｓ，  Ａｕｓｔｒａｌｉａ）、ＭＧＡ２７１（Ｍａｃｒｏｇｅｎｉｃｓ，  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  ＭＤ）、ＢＭＳ−９８６０１６（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｅｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ，  Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，  ＮＪ）、リリルマブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ，  Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，  ＮＪ）、ウレルマブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｅｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ，  Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，  ＮＪ）、ＰＦ−０５０８２５６６（Ｐｆｉｚｅｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ）、ＩＰＨ２１０１（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ，  Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  ，  ＮＪ）、ＭＥＤＩ−６４６９（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  ＭＤ）、ＣＰ−８７０，８９３（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，  Ｏｃｅａｎｓｉｄｅ，  ＣＡ）、モガムリズマブ（Ｋｙｏｗａ  Ｈａｋｋｏ  Ｋｉｒｉｎ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ  ，  ＣＡ）、バルリルマブ（ＣｅｌＩＤｅｘ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  Ｈａｍｐｔｏｎ，  ＮＪ）、ガリクシマブ（Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＭＡ）、ＡＭＰ−５１４（Ａｍｐｌｉｍｍｕｎｅ，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  ＭＤ）、ＡＵＮＰ  １２（Ａｕｒｉｇｅｎｅ，  Ｂａｎｇａｌｏｒｅ，  Ｉｎｄｉａ）、インドキシモド（ＮｅｗＬｉｎｋ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  Ａｍｅｓ，  ＩＡ）、ＮＬＧ−９１９（ＮｅｗＬｉｎｋ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  Ａｍｅｓ，  ＩＡ）、ＩＮＣＢ０２４３６０（Ｉｎｃｙｔｅ，  Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，  ＤＥ）および前記の任意の組合せ。
【００３８】
例示すれば（制限ではない）、いくつかの実施態様では、１つ以上の免疫系刺激物質は、ナチュラルキラー細胞刺激因子、抗原提示細胞（ＡＰＣ）刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、およびトール様受容体刺激因子から選択される。
いくつかの実施態様では、ＮＫ刺激因子には、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲＡ複合体、ＩＬ−１８およびＩＬ−１２が含まれるが、ただし前記に限定されない。ＮＫ刺激因子には、以下の受容体（ＮＫＧ２、ＫＩＲ２ＤＬ１／Ｓ１、ＫＲＩ２ＤＬ５Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ４４またはＮＫｐ３０）の少なくとも１つを刺激する抗体が含まれる。
いくつかの実施態様では、ＡＰＣ刺激因子には、ＣＤ２８、誘発性共同刺激性（ＩＣＯＳ）、ＣＤ４０、ＣＤ３０、ＣＤ２７、ＯＸ−４０および４−１ＢＢが含まれるが、ただし前記に限定されない。
いくつかの実施態様では、４−ＰＢＡ（式Ｉの化合物）および／または４−ＰＢＡアナログ（メトキシ−ＰＢＡ、３−ＰＰＡ、５−ＰＶＡ、ヒドロキシ−ＰＰＡ、ヒドロキシ−ＰＢＡおよびトリル−ＢＡから選択される）および１つ以上のチェックポイント阻害剤および／または１つ以上の免疫系刺激物質は、任意の順序でまたは同時でさえも投与される。同時の場合には、複数の治療薬剤は、単一形でまたは複数形で（単に例示すれば、単一のピルとしてまたは２つの別々のピルとして）提供され得る。上記の化合物の一方をマルチ用量で投与してもよく、または両方をマルチ用量で投与してもよい。同時でない場合は、マルチ用量の投与タイミングは１週間から４週間未満で変動し得る。加えて、併用方法、併用組成物および併用処方は、２つの薬剤のみの使用に限定されるべきではない。いくつかの実施態様では、式Ｉの４−ＰＢＡ化合物および／または４−ＰＢＡアナログ（メトキシ−ＰＢＡ、３−ＰＰＡ、５−ＰＶＡ、ヒドロキシ−ＰＰＡ、ヒドロキシ−ＰＢＡおよびトリル−ＢＡから選択される）および１つ以上のチェックポイント阻害剤および／または１つ以上の免疫系刺激物質の併用は相乗効果を生じる。
【実施例】
【００３９】
本技術はさらにまた以下の実施例によって例証されるが、それら実施例はいかなる態様でも制限と解されてはならない。
全般的方法
発現ベクター
本実施例では、ホモ・サピエンス（Ｈ．  ｓａｐｉｅｎｓ）のＳｅｃ４ａ（Δ１−３４０）、完全長Ｓｅｃ２４ｄおよび完全長Ｓｅｃ３１ａのための構築物を、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）切断可能Ｎ−末端Ｈｉｓ６タグをコードするベクターｐＦａｓｔ−ＨＴＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でクローニングした。ホモ・サピエンスの完全長Ｓｅｃ２３ａおよびＳｅｃ１３ａをコードするベクターは、ｐＦａｓｔＢａｃ１型（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）であった。完全長Ｓｅｃ２４ｄ  Ｌ７５０Ｗ変異体を、Ｐｈｕｓｉｏｎ位置指定変異誘導キット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて作製した。一対の５’−リン酸化プライマー（フォワード：ＴＧＧＴＡ  ＣＡＣＧＡ  ＣＡＡＴＣ  ＡＧＴＧＧ  ＴＣＡＡ、リバース：ＣＡＣＡＧ  ＣＡＣＡＣ  ＴＧＧＡＴ  ＴＡＡＧＧ  ＣＴＣＣ）を用いて、野生型Ｓｅｃ２４ｄ鋳型からＳｅｃ２４ｄ  Ｌ７５０Ｗ  ＤＮＡを作製した。多様なｐＦａｓｔＢａｃベクターで形質転換させたＤＨ１０Ｂａｃ細胞を用いて組換えバクミドを作製した（Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃバキュロウイルス発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた）。
完全長ホモ・サピエンスＳａｒ１ａのためのＤＮＡをベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−１（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）でクローニングし、Ｎ−末端プレシジョンプロテアーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）切断可能グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグを有するタンパク質を得た（プロテアーゼ切断はＮ−末端配列ＧＰＬＧＳＭＳＦＩを生じる）。
ホモ・サピエンスＳｅｃ２２ｂ（残基１−１９５）をコードするＤＮＡをＰＥＴ−２８ｂベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でクローニングした。ＭａｎｉｃｉａｓとＧｏｌｄｂｅｒｇ（２００７）が記載したように付加的Ｎ−末端Ｈｉｓ6−Ｓｍｔ３融合を用いた。
完全長ホモ・サピエンスＬＤＬ受容体（野生型およびＧ５４４Ｖ型）をコードするＤＮＡを、テトラサイクリン誘発性発現ベクターｐｃＤＮＡ４／ＴＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で文献（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６；およびＴｖｅｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）に記載されたようにクローニングした。Ｇ５４４Ｖ変異体を、Ｐｈｕｓｉｏｎ位置指定変異誘導キットを用いて作製した。以下の２つの５’−リン酸化プライマーを用いた：フォワード：ＧＴＣＡＴＣ  ＡＣＣＣＴ  ＡＧＡＴＣ  ＴＣＣＴＣ  ＡＧＴ、リバース：ＡＴＴＧＧ  ＧＣＣＡＣ  ＴＧＡＡＴ  ＧＴＴＴＴ  ＣＡＧＴ。全ての組換えプラスミドの正確な構築物は、ＤＮＡシーケンシング（Ｇｅｎｅｗｉｚ，  Ｉｎｃ．）によって確認した。
【００４０】
タンパク質およびペプチドの生成
ハイファイブ昆虫細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）での発現およびＣＯＰＩＩタンパク質複合体の精製は、本質的に文献（Ｍａｎｃｉａｓ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，  ２００８）の記載のように実施された。前記は以下の複合体を含む：Ｘ−線結晶学に用いられるＳｅｃ２３ａ／Ｓｅｃ２４ａ（Δ１−３４０）、ＣＯＰＩＩ出芽アッセイのためのＳｅｃ２３ａ／Ｓｅｃ２４ｄ（完全長タンパク質）、および蛍光偏光実験のためのＳｅｃ２４ａ（Δ１−３４０）。
タンパク質生成の準備では、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（Ｓｆ９）細胞をバクミドＤＮＡでトランスフェクトすることによって（Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ  ＩＩ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｎ）使用）、組換えバキュロウイルスを作製した。バキュロウイルスを３世代増幅させてからハイファイブ昆虫細胞の感染に用いた。感染後４８時間で細胞を採集し、溶解緩衝液に再懸濁した。溶解緩衝液：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０）、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  β−メルカプトエタノール、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルフォニル（ＰＭＳＦ）およびプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）。
Ｓｅｃ２３ａ／Ｓｅｃ２４ａ（Δ１−３４０）およびＳｅｃ２４ａ（Δ１−３４０）タンパク質を細胞溶解物からＨｉｓ  Ｔｒａｐ高速クロマトグラフィー（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって精製し、Ｈｉｓ6タグは、ＴＥＶプロテアーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い以下を含む溶液に対する４°Ｃ一晩の透析で除去した（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ  ＮａＣｌおよび５ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ））。ＣＯＰＩＩタンパク質を低塩緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび５ｍＭ  ＤＴＴ）で３倍に希釈し、５ｍＬのＨｉＴｒａｐ  Ｑカラム（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）にローディングし、続いてグラディエント溶出を実施した（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび５ｍＭ  ＤＴＴ）。最後に、タンパク質をＨｉＬｏａｄ  ２６／６０スーパーデックス２００カラム（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）でサイズ排除クロマトグラフィー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２００ｍＭ  ＮａＣｌおよび４ｍＭ  ＤＴＴ）によって精製した。
完全長Ｓｅｃ２３ａ／Ｓｅｃ２４ｄタンパク質、野生型およびＬ７５０Ｗ変異体、並びに出芽実験で用いられるＳｅｃ１３ａ／３１ａタンパク質を同じ態様で精製したが、ただしＮ−末端Ｈｉｓ6タグは除去されなかった。親和性精製工程に続いて、タンパク質を直接（透析ではなく）低塩緩衝液で希釈し、続いてＨｉＴｒａｐ  Ｑでクロマトグラフィーで精製し、ＨｉＬｏａｄ  ２６／６０スーパーデックス２００カラム（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５００ｍＭ  ＮａＣｌおよび１ｍＭ  ＤＴＴ）による工程が続いた。
完全長ホモ・サピエンスＳａｒ１ａタンパク質を、ルリア・ベルターニ（ＬＢ）ブロス中の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で発現させた。ＯＤ600＝０．８の培養密度のときに、０．２ｍＭのイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（１６°Ｃで一晩）の添加によって発現を誘発した。ＧＳＴタグ付加Ｓａｒ１ａをまず初めにＧＳＴ−Ｔｒａｐ  ４Ｂカラム（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）によりＰＢＳ緩衝液（１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．４）、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ）中で精製した。ＧＳＴタグをプレシジョンプロテアーゼにより除去し、さらにＫｉｍら（２００５）の記載のように、Ｓａｒ１ａを以下を含む緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５００ｍＭ  ＮａＣｌおよび１ｍＭ  ＤＴＴ）中のサイズ排除スーパーデックス７５クロマトグラフィーによって精製した。
ホモ・サピエンスＳｅｃ２２ｂの細胞質ゾル領域（残基１−１９５）を記載（Ｍａｎｃｉａｓ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，  ２００７）にしたがって精製した。略記すれば、タンパク質をＮ−末端Ｈｉｓ6−Ｓｍｔ３タグを有する大腸菌で発現させた。Ｕｌｐ１プロテアーゼによるタグの除去に続いて、タンパク質をＨｉ−Ｔｒａｐ  Ｑカラムで、続いてサイズ排除スーパーデックス７５クロマトグラフィー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２００ｍＭ  ＮａＣｌおよび４ｍＭ  ＤＴＴ）で精製した。全精製タンパク質を濃縮し、アリコットに分け、急速冷凍して−８０°Ｃで保存した。
ΦＣシグナルモチーフを含む合成ペプチド（純度＞９５％）をタフツ大学コア施設（Ｔｕｆｔｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ）から購入した（完全な配列については表１を参照されたい）。
【００４１】
【表１】
2020520935.tif 000006
【００４２】
タンパク質結晶化および構造決定
文献（Ｍａｎｃｉａｓ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，  ２００７）に記載されたように、Ｓｅｃ２３ａ／Ｓｅｃ２４ａ・Ｓｅｃ２２ｂ複合体を、以下を含む溶液（１０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ４０００、５００ｍＭ酢酸ナトリウムおよび５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９））から結晶化させた。結晶を浸漬緩衝液（１０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ４０００、６００ｍＭ  ＮａＣｌおよび５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．９））に移した。４−ＰＢＡ（０−５０ｍＭ）または５ｍＭΦＣシグナルペプチドのどちらかを結晶含有溶液に添加し、リガンド浸漬を２２°Ｃで５時間進行させた。続いて結晶を等価のリガンド含有緩衝液（２４％エチレングリコール凍結保護剤を添加）に移し、液体窒素中で急速冷凍した。この態様で処理された結晶は、シンクロトロンＸ−線を２．５−２．８Åの解像度で回折した。
Ｘ−線回折データを、ビームラインＩＤ２４ＣまたはＩＤ−２４Ｅ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ，  Ａｒｇｏｎｎｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）により０．９７９Åの波長で収集した。プログラムＨＫＬ２０００（Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ  ａｎｄ  Ｍｉｎｏｒ，  １９９７）を用いてデータを処理した（表１および２を参照されたい）。Ｐｈｅｎｉｘ（Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０）を用い、公表されたＳｅｃ２３ａ／Ｓｅｃ２４ａ・Ｓｅｃ２２ｂの座標（ＰＤＢ  ２ＮＵＴ；Ｍａｎｃｉａｓ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，  ２００７）を基に、まず初めに剛体改善、続いて位置精密化によって構造精密化を実施した。潜在的な位相バイアスを排除するために、ΦＣシグナルペプチドまたは４−ＰＢＡのモデルは、図１の作製前の精密化には含まれなかった。これらのリガンドは精密化の最後の段階でモデル化され、その統計は表１および２に要約される。
【００４３】
【表２】
2020520935.tif 000007
【００４４】
細胞株および細胞ベース実験
野生型および変異ＬＤＬ受容体を発現するＴ−Ｒｅｘ−ＣＨＯ−Ｋ１クローン化細胞株を、文献（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６；およびＴｖｅｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）の記載および製造業者（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のプロトコルにしたがって培養した。Ｇ５４４Ｖ変異体または野生型ＬＤＬ受容体タンパク質のＣＨＯ細胞における発現は、４−ＰＢＡまたは４−ＰＢＡアナログを用いる実験の前に２４時間１μｇ／ｍＬのテトラサイクリンで誘発された（Ｔｖｅｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）。４−ＰＢＡアナログの薬理学的潜在能力を比較するために、１２ウェルの２２mmプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ  ＃３５１３）で細胞を３７°Ｃで２時間化合物とともにインキュベートした。ＧＲＰ９４の細胞外分泌に関する実験の場合（図５）、４−ＰＢＡとのインキュベーションは２４時間延長された。細胞を溶解緩衝液（１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５））で破壊し、遠心分離（１５，０００ｇ、１５分）によって清澄化した。細胞タンパク質濃度を、“タンパク質アッセイキット”（“Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ  ＩＩ”（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））で測定した。標準物質として、ウシ血清アルブミンを用いた。溶解物を１３０ｍＭジチオスレイトール含有レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）サンプル緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）に添加し、５５°Ｃで１５分間加熱した。細胞培地（分泌タンパク質を含む）を５β−メルカプトエタノール含有レムリサンプル緩衝液に添加し、５分間煮沸した。サンプルを４−１５％Ｔｒｉｓ／ＨＣｌクリテリオン（Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ）ゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で泳動し、続いて免疫ブロッティングに付した。
【００４５】
ＣＨＯ細胞の透過性付与
ｉｎ  ｖｉｔｒｏＣＯＰＩＩ出芽反応は、Ｔ−Ｒｅｘ−ＣＨＯ−Ｋ１親株および変異ＬＤＬ受容体発現クローンから調製した透過性付与細胞を用いた。透過性付与は、文献（Ｍａｎｃｉａｓ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，  ２００８）に記載された方法に改変を加えて実施した。２枚の培養皿（１５０ｍｍ）の細胞を調製した。細胞は６０％コンフルエンシーを超えない。細胞を２０ｍＬのＰＢＳ（３７°Ｃ）で洗浄し、続いて２ｍＬのトリプシン−ＥＤＴＡ（０．０５％、Ｇｉｂｃｏ）で１分間、３７°Ｃでトリプシン処理した。１００μＬのダイズトリプシン阻害剤（２ｍｇ／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ））を各培養プレートに添加した。次に、５．５ｍＬの氷冷ＫＨＭ緩衝液（１１０ｍＭ  ＫＯＡｃ、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．２）、２ｍＭ酢酸マグネシウム）を各プレートに添加し、細胞を１．５ｍＬのファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）チューブに移し、穏やかにペレットにした（４°Ｃ、２５０ｇで３分）。上清を吸引し、細胞を６ｍＬの氷冷ＫＨＭ緩衝液に再懸濁した。細胞に透過性を付与するために、６μＬのジギトニンストック溶液（ジメチルスルホキシドで４０ｍｇ／ｍＬ）を添加し、逆さまにして混合し、氷上で５分間インキュベートした。透過性付与を終了するために、ＫＨＭ緩衝液を用いて細胞を１４ｍＬに希釈し、直ちにペレットにした（４°Ｃ、２５０ｇで３分）。細胞を１４ｍＬの氷冷ＨＥＰＥＳ緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、９０ｍＭ酢酸カリウム）に再懸濁し、氷上で１０分間インキュベートし採集した（４°Ｃ、２５０ｇで３分）。最後に、細胞を１ｍＬのＫＣＬＭ緩衝液（１１０ｍＭ塩化カリウム、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、２ｍＭ塩化マグネシウム）に再懸濁し採集して（１０，０００ｇで１５秒）、さらに６０μＬのＫＣＬＭ緩衝液に再懸濁した。標準物としてＢＳＡを用い、タンパク質アッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）でタンパク質濃度を測定した。日常的に、当該測定は４−５ｍｇ／ｍＬの範囲内にあった。透過性付与細胞を調製後直ちに出芽実験に用いた。
【００４６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＣＯＰＩＩ出芽アッセイ
ＣＯＰＩＩ小胞出芽アッセイは、わずかな改変を加えながら文献（Ｍａｎｃｉａｓ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，  ２００８）の記載にしたがって実施した。各出芽反応混合物（１００μＬ）は以下を含んでいた：１１０ｍＭ塩化カリウム（塩化物は、Ｂ部位で干渉する酢酸イオンの代わりに用いられた）、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、２ｍＭ塩化マグネシウム、プロテアーゼ阻害カクテル（１ｘ  Ｒｏｃｈｅ  ｃＯｍｐｌｅｔｅ）、０．２ｍＭ  ＧＴＰ、ＡＴＰ再生系（４０ｍＭリン酸クレアチン、０．２ｍｇ／ｍＬクレアチンホスホキナーゼ、１ｍＭ  ＡＴＰ）、および表示がある場合には１０ｍＭ  ４−ＰＢＡ。前記混合物を３７°Ｃにし、透過性付与細胞（２５μｇ）を添加し、混合物を３７°Ｃで１分間インキュベートした。出芽反応は、コートタンパク質（２μｇのＳａｒ１ａ、２μｇのＳｅｃ２３ａ／２４ｄまたはＳｅｃ２３ａ／２４ｄ−Ｌ７５０Ｗ、４μｇのＳｅｃ１３ａ／３１ａ）の添加によって開始させ、出芽を３７°Ｃで１０分間進行させた。短い出芽反応時間を用い、ＥＲ膜後の小胞生成物の潜在的な夾雑を回避した。組換えＳｅｃ２４ｄを全ての出芽実験に用いた。なぜならば、Ｓｅｃ２３ａ／２４ｄおよびＳｅｃ２３ａ／２４ｄ−Ｌ７５０Ｗタンパク質の豊富さは、他のパラログとは異なりスケールアップ出芽反応に備えることができると思われるからである。反応を４°Ｃで終了させ、中等度の速度（１２，０００ｇ）で２０分間（４°Ｃ）遠心分離した。９０μＬの上清をポリプロピレン遠心分離管（Ｂｅｃｋｍａｎ，  ＃３４３６２１）に移し、小胞をＢｅｃｋｍａｎ  ＴＬＡ１０００ローターでペレットにした（５５，０００ｒｐｍ、３５分、４°Ｃ）。前記ペレットに、７μＬの溶解緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、３００ｍＭ  ＤＴＴ）および３．５μＬの３ｘレムリサンプル緩衝液を添加した。サンプルを４２°Ｃで１０分間加熱し、１０μＬのサンプルを４−２０％Ｔｒｉｓ／ＨＣｌクリテリオンゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）にローディングした。免疫ブロッティングによってその後の分析を実施した。
【００４７】
蛍光偏光アッセイ
蛍光アッセイは、酵母のＣＯＰＩＩタンパク質を用いる以前に記載されたアプローチ（Ｍｏｓｓｅｓｓｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）に基づく。合成ペプチド（配列ＱＩＹＴＤＩＥＡＮＲ、ＶＳＶ  Ｇタンパク質のＤｘＥエキスポートシグナルに基づく）をタフツ大学コア施設から購入した（純度＞９５％）。前記ペプチドは、Ｎ−末端で５−カルボキシフルオレセイン（５−Ｆａｍ）と複合化されたＢ部位に特異的に結合することが以前に示された（Ｍａｎｃｉａｓ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，  ２００８）。フルオロ緩衝液（１６０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．５））中の２５０μＭストック溶液は−８０°Ｃで保存した。４−ＰＢＡアナログ（入手可能な最高純度）のストック溶液は７１４ｍＭで、ＮａＯＨでｐＨ７．５に調整した。オートポラライザー搭載ＦｌｕｏｒｏＭａｘ−４分光蛍光計（Ｈｏｒｉｂａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で蛍光偏光滴定を実施した。励起および発光波長をそれぞれ４９０および５２０ｎｍに設定しスリットを２ｎｍに調整して、４５μＬキュベット（Ｈｅｌｌｍａ  ａｎａｌｙｔｉｃｓ  ｃｕｖｅｔｔｅ１０５．２５１）に保持したサンプルにより０．１秒シグナル捕捉中に約１．５ｘ１０6カウントを得た。５−Ｆａｍ−ＱＩＹＴＤＩＥＡＮＲとＳｅｃ２４ａとの親和性を、Ｋｄ＝１４．２μＭとして滴定することによって測定した。前記を基準にし、競合結合滴定を５−Ｆａｍ−ＱＩＹＴＤＩＥＡＮＲおよびＳｅｃ２４ａの定常濃度（それぞれ５μＭおよび２２μＭ）を維持することによって実施し、一方、競合物質４−ＰＢＡアナログの濃度は置き換えのために０．２−１００ｍＭの範囲で増加させた。蛍光レポーター濃度、Ｓｅｃ２４ａ濃度、および１４．２μＭの解離定数におけるこの比率は、レポーターの大半が滴定開始時にＳｅｃ２４ａと結合することを担保する。比較的低濃度のＳｅｃ２４ａ（レポーターに対してＫｄの〜１．５倍）は当該アッセイの動的範囲を減少させる効果を有する。しかしながら、高濃度のＳｅｃ２４ａも全ての４−ＰＢＡアナログに対するＩＣ５０を極めて高い値に増加させよう。選択条件下で、動的範囲は〜１００ｍＰである（図６）。
全ての滴定を脱気フルオロ緩衝液で２２°Ｃで実施した。反応混合物を室温で１０分間インキュベートし、蛍光測定前に１５，０００ｇで１０分間遠心分離した。Ｓｅｃ２４ａを持たない遊離蛍光レポーター（１００％阻害と等価）を含む陽性コントロールが各滴定で加えられた。
【００４８】
定量および統計分析
免疫ブロット定量：ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルからイムノブロット低蛍光ＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）にタンパク質を電気的に移し、ＴＢＳＴ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）中の５％バイオラドブロッカー（ＢｉｏＲａｄ  Ｂｌｏｃｋｅｒ）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０）を用いて封鎖した。膜をＴＢＳＴ中の一次抗体とともに４°Ｃで一晩インキュベートし、続いてセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体とともにインキュベートした。ＥＣＬプライムウェスタンブロッティング検出試薬（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＃ＲＰＮ２２３５）とのインキュベーションによって、化学発光シグナルを発生させた。ＥＲ非ストレス細胞（図４）を含むＣＯＰＩＩ出芽実験のブロットのために高強度ＥＣＬセレクト試薬（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＃ＲＰＮ２２３５）を用い、分析は最高品質の抗体に限定した。化学発光シグナルをＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰ画像化系を用いて検出し、Ｉｍａｇｅ  Ｌａｂ  ５．０ソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて捕捉した。タンパク質バンド強度の定量をＩｍａｇｅ  Ｇａｕｇｅソフトウェアバージョン４．１（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）を用いて実施した（生の画像データの修正を含む）。
ＣＯＰＩＩ出芽の分析のために、（ｐ２４、在留タンパク質およびＧ５４４Ｖ変異ＬＤＬ受容体について）バックグラウンドを差し引いたパッケージング測定を、処理（すなわち１０ｍＭの４−ＰＢＡまたは変異ＣＯＰＩＩタンパク質）に起因する出芽量の変化について修正した。修正には、シンタキシン５、メンブリン、Ｅｒｖ４６およびＲｅｒ１の平均値を用いた。（ペア毎のレーン差比率の平均を最小限にすることによって）、３回繰返したデータセットを共通のスケールに置いた。グラフで提示するために、続いてデータを標準化し、野生型ＣＯＰＩＩコートによる出芽率のパーセンテージとして示した。統計分布を保存するために、全ての統計分析を標準化前のデータについて実施した。
【００４９】
４−ＰＢＡリガンドの結合分析：Ｇ５４４Ｖ変異ＬＤＬ受容体のグリコシル化形（１６０ｋＤａ）のウェスタンブロットによる化学発光シグナルを、総ＬＤＬ受容体のタンパク質（グリコシル化＋非グリコシル化バンド）として定量した。高濃度４−ＰＢＡアナログのデータ（ＬＤＬ受容体トラフィッキングの阻害を示す）は省略した。（最大応答＝１００％を得るために）個々の実験のデータを標準化し、繰返し実験（ｎ＝４−５）のデータを平均化できた。Ｕｌｔｒａｆｉｔプログラム（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｂｉｏｓｏｆｔ）を用いて、用量−応答データの記号論理学調整を実施した。図６（Ｂ）−６（Ｄ）で示されたＥＣ５０値および標準適合度についての関連標準誤差は以下のとおりである：メトキシ−ＰＢＡ、８．６３±０．９８ｍＭ；３−ＰＰＡ、７．４８±０．６８ｍＭ；５−ＰＶＡ、３．３６±０．４２ｍＭ；ヒドロキシ−ＰＰＡ、２１．６６±１．０３ｍＭ；４−ＰＢＡ、６．３７±０．５０ｍＭ；ヒドロキシ−ＰＢＡ、１０．６４±０．４０ｍＭ；トリル−ＢＡ、４．８９±０．２４ｍＭ。Ｕｌｔｒａｆｉｔを用いて蛍光偏光滴定のデータ（図６（Ｅ）−６（Ｇ））を分析し、非線形曲線調整を用いた図表からＩＣ５０値を決定した。図６（Ｅ）−６（Ｇ）のＥＣ５０値および標準適合度についての関連する標準誤差は以下のとおりである：メトキシ−ＰＢＡ、４．１４±０．７０ｍＭ；３−ＰＰＡ、４．１１±０．３４ｍＭ；５−ＰＶＡ、０．９９±０．０８ｍＭ；ヒドロキシ−ＰＰＡ、９．２２±０．９４ｍＭ；４−ＰＢＡ、３．６６±０．２２ｍＭ；ヒドロキシ−ＰＢＡ、５．０４±０．６９ｍＭ；トリル−ＢＡ、１．７±０．１６ｍＭ。文献のアプローチ（Ｎｉｋｏｌｏｖｓｋａ−Ｃｏｌｅｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４）を用いてＩＣ５０値を真の親和性（Ｋｉ）に変換し、前記を散布図で用いた（６（Ｈ））。
【００５０】
統計：繰返し測定の全例が生物学的繰返しである。すなわち、それらは生物学的に別個のサンプルの測定である。ＣＯＰＩＩ出芽実験の分析のために、化学発光デンシトメトリーデータをエクセルで集め、群平均を一元配置分散分析によって比較した。事後検定のＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ−Ｈｏｌｍ検定を用いて、ペアワイズ比較のサブセット、特に４−ＰＢＡ処理または変異ＣＯＰＩＩ処理に対するＣＯＰＩＩに起因するカーゴパッケージング率について実験毎の誤差率を管理した。単に１０ｍＭ  ４−ＰＢＡの効果を取敢えず模倣するために、出芽実験で５０／５０（野生型／変異体）ＣＯＰＩＩ混合物を用いた。前記混合物はカーゴパッケージに部分的効果を有し、変異ＣＯＰＩＩが１００％と比較して検出力を低下させる。したがって、これらのデータは統計分析から排除した。
図６（Ｈ）で報告するように、一連の４−ＰＢＡアナログについてのＣＯＰＩＩ結合親和性と薬理学的効力との比較は線形相関係数（５）＝０．９８を生じ、前記は両側検定においてＰ＜０．０００５で有意である。
【実施例１】
【００５１】
ΦＣモチーフを含むＥＲエキスポートシグナルのためのＣＯＰＩＩタンパク質の結合部位
本実施例は、ＣＯＰＩＩメカニズムによるＥＲエキスポートはΦＣモチーフを有するシグナルを要求することを示す。
方法
酵母Ｅｍｐ２４ｐのコア配列に基づいて一連のΦＣシグナルペプチドを合成し、さらに個々のペプチドを高濃度でヒトＣＯＰＩＩタンパク質の２つの結晶形に浸漬した（１つはＳｅｃ２３ａ／Ｓｅｃ２４ａ・Ｓｅｃ２２ｂを含み、他方はＳｅｃ２４ｃを含む）。Ｘ−線回折データを凍結保存血漿から収集した（「全般的方法」を参照されたい）。全てのΦＣ配列について、ペプチドは、Ｓｅｃ２３ａ／Ｓｅｃ２４ａ・Ｓｅｃ２２ｂ結晶のＳｅｃ２４ａ上の部位に結合していることが観察された。前記は、ペプチド配列に一致する残留電子密度の存在に基づく（前記結合部位はＳｅｃ２４ｃ結晶によって塞がれる）。図１（Ａ）−（Ｅ）は、４つのＣＯＰＩＩ・ΦＣ結晶構造を示す（追加の構造は図７（Ａ）−７（Ｆ）に提示され、Ｘ−線結晶学統計およびΦＣペプチド配列は表１に報告される）。
結果
ＣＯＰＩＩ・ΦＣ結晶構造（図１（Ａ）−１（Ｅ）および７（Ａ）−７（Ｆ））は、共通の分子的特色は、Ｂ部位のクラスーター形成アルギニン残基によるカルボキシレート基認識であることを強調する。ΦＣモチーフの末端カルボキシレート基は、ＬｘｘＬＥおよびＤｘＥモチーフのグルタメート側鎖のカルボキシレートと同様な位置および結合配置を採用する（図７（Ａ）−７（Ｅ））。ΦＣモチーフの特異的認識は、Ｔｙｒ４９６に寄り添う当該モチーフの最後から二番目の疎水性残基および疎水性側鎖ポケットに適合する末端疎水性残基を用いる、Ｓｅｃ２４ａのＡｒｇ７５０およびＡｒｇ７５２と末端カルボキシレート基の結合を必要とする（図１（Ｂ）−１（Ｅ）および７（Ａ）−７（Ｅ））。これらの分子的特色は、ＥＲエキスポートシグナルとしてのΦＣモチーフに関係する機能的データと調和する（Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８；Ｎｕｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２）。Ｂ部位の疎水性ポケットはある範囲の疎水性側鎖を受け入れるが、末端バリンがもっとも好ましい残基である。なぜならば、ポケットへのその適合性は末端カルボキシレート基との結合について最適な幾何学を可能にするからである（図１（Ｄ）に模式的に示されている）。結合幾何学における微細な変化がＥＲＧＩＣ−５３のＰｈｅ−Ｐｈｅモチーフについて観察され、前記では、二座態様でＡｒｇ７５０と結合するカルボキシレート基のシフトによってフェニルアラニンのより大きな末端側鎖が受け入れられる（図１（Ｅ））。
これらの結果は、ＣＯＰＩＩメカニズムはΦＣモチーフを有するシグナルを要求することを示す。
【実施例２】
【００５２】
４−ＰＢＡはＣＯＰＩＩとの結合でΦＣシグナルモチーフを模倣する
本実施例は４−ＰＢＡはΦＣシグナルを模倣してＣＯＰＩＩと結合することを示す。
方法
１、１５および５０ｍＭの濃度で４−ＰＢＡを含む溶液で、Ｓｅｃ２３ａ／Ｓｅｃ２４ａ・Ｓｅｃ２２ｂの結晶を平衡化させた（「全般的方法」および表２を参照されたい）。
結果
Ｘ−線回折データから計算した差のフーリエマップは４−ＰＢＡとＳｅｃ２４ａのＢ部位との結合について明瞭な証拠を示す（図１（Ｆ）−１（Ｉ））。４−ＰＢＡは、ＥＲＧＩＣ−５３のＰｈｅ−Ｐｈｅモチーフの末端フェニルアラニン側鎖およびカルボキシル基を綿密に模倣する（図１（Ｅ）および１（Ｉ）を比較されたい）。４−ＰＢＡと接触する残基は４つのヒトＳｅｃ２４パラログ間でほぼ不変であり、Ｓｅｃ２４ａ残基Ｉ８１８（図１（Ｉ）に図示）のみが変化し、当該変化はＳｅｃ２４ｃ／ｄのロイシンに対して保存的なものである。
これらの結果は、４−ＰＢＡはΦＣシグナルモチーフを模倣し、ＣＯＰＩＩと結合することを示している。
【実施例３】
【００５３】
ｐ２４タンパク質の小胞パッケージングは４−ＰＢＡおよびΦＣ結合部位変異によって阻害される
本実施例は、ｐ２４タンパク質はＣＯＰＩＩのＢ部位によって小胞に捕捉されること、およびＣＯＰＩＩのＢ部位は４−ＰＢＡの標的であることを示す。
方法
ＣＯＰＩＩ被覆小胞へのカーゴタンパク質の選択的パッケージングを測定する哺乳動物の透過性付与細胞アッセイを用いて、一連のカーゴタンパク質の透過性付与ＣＨＯ（Ｔ−Ｒｅｘ−ＣＨＯ−Ｋ１）細胞から出芽する小胞へのパッケージングを測定した（図２（Ａ）および２（Ｃ）−２（Ｄ））（「全般的方法」を参照されたい）。小胞出芽は、精製組換えＣＯＰＩＩコートタンパク質（Ｓｅｃ２３／２４，  Ｓｅｃ１３／３１およびＳａｒ１）または前記の変異体によって細胞質ゾルの非存在下で推進された。
ｐ２４およびＥＲＧＩＣ−５３タンパク質のパッケージングにおけるＢ部位の役割を試験するために、Ｌ７５０Ｗ変異をＳｅｃ２４ｄに導入した。Ｓｅｃ２４ｄ−Ｌ７５０Ｗ変異（図２（Ｂ）参照）は、ただ１つの回転異性体に制限されるトリプトファン側鎖であり、この立体配座は、全てのリガンドのＢ部位との結合を封鎖する。この変異は酵母ＣＯＰＩＩの研究のために以前に設計され（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）、前記では、対応するＳｅｃ２３／Ｓｅｃ２４−Ｌ６１６Ｗ変異体タンパク質はＬｘｘＬＥ−およびＤｘＥ−シグナルカーゴをパッケージする全能力を喪失すること、Ｅｒｐ１ｐ（ｐ２４タンパク質）およびＥｍｐ４７ｐ（酵母ＥＲＧＩＣ−５３ホモログ）のパッケージング有効性の低下を示すことが報告され、当該変異タンパク質により出芽したＣＯＰＩＩ被覆小胞は、野生型小胞と比較してサイズおよび形態に無視し得る相違を示した（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）。
結果
カーゴパッケージングは効率的で（表３）ＣＯＰＩＩ依存性であった。トランスロコン付属タンパク質リボフォリンＩは、全ての小胞分画に存在せず、ＥＲ膜完全性が保存されていることが示された。
【００５４】
【表３】
2020520935.tif 000008
【００５５】
図２（Ａ）および２（Ｃ）に示すように、Ｓｅｃ２３ａ／２４ｄ−Ｌ７５０Ｗ変異ＣＯＰＩＩによるｐ２４タンパク質（ｐ２４α３およびｐ２４β１）およびＥＲＧＩＣ−５３の小胞への取り込みは、野生型ＣＯＰＩＩで得られるものの約５−８％に実質的に減少した。
ＣＯＰＩＩ小胞の総収量は変異コートで有意に低く、これはおそらくコートタンパク質とトランスメンブレンカーゴとの間で生じる接触数の減少によるものであった（哺乳動物および酵母のＣＯＰＩ−被覆小胞について以前に報告された現象（Ｂｒｅｍｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９；Ｓａｎｄｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３））。
出芽収量の変化を管理するために、Ｂ部位と結合しない以下の４つのタンパク質のパッケージング率を測定した（図２（Ａ））：リサイクリング受容体Ｅｒｖ４６およびＲｅｒ１、並びにＳＮＡＲＥタンパク質シンタキシン５およびメンブリン（ＧＳ２７）（前記は、Ｓｅｃ２４ｄとの結合に別個のＩｘＭモチーフを利用する）。小胞への取り込みは、これら４つのカーゴについて高度に相関し（図２（Ｃ）参照）、ｐ２４タンパク質についてのパッケージング率はこれを基準にして修正された（「全般的方法」の定量および統計分析を参照されたい）。
Ｓｅｃ２４ｄ−Ｌ７５０ＷにおけるＢ部位の封鎖は、ｐ２４α３およびｐ２４β１のパッケージング率を野生型レベルの２０−２５％に低下させた（図２（Ｄ））。この残留ｐ２４パッケージングは、酵母のＢ部位変異ＣＯＰＩＩで報告されたものと同様なレベルであり（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）、これは、前記がこれらタンパク質の取り込みのバルクフロー（受動的）レベルを構成することを示している。
ＣＯＰＩＩ小胞が１０ｍＭの４−ＰＢＡの存在下で出芽したとき、ｐ２４タンパク質およびＥＲＧＩＣ−５３のパッケージング率に５０％の減少が観察された（図２（Ａ）および２（Ｄ））。４−ＰＢＡのこの濃度は、細胞ベース輸送アッセイで測定されたＥＣ５０の６．４ｍＭよりわずかに高かった（図３（Ｂ）参照）。
カーゴパッケージングに対する１０ｍＭ  ４−ＰＢＡの効果が、Ｂ部位の部分的占有と一致するか否かを査定した（野生型および変異ＣＯＰＩＩタンパク質の５０／５０混合物で取敢えず模倣する）。図２（Ａ）および２（Ｃ）は、７つのカーゴタンパク質に対する２つの処理の効果は定性的におよび定量的に高度に類似したことを示す。
結晶学的観察と併せて（実施例１および実施例２を参照）、これらの結果は、ｐ２４タンパク質のＣＯＰＩＩ小胞へのパッケージングはΦＣモチーフのＢ部位との相互作用を必要とすること、および４−ＰＢＡはこの部位の結合のためにｐ２４タンパク質と直接的に競合することを示す。これらの結果は、ΦＣモチーフおよび４−ＰＢＡ分子は、Ｓｅｃ２４ａと（結晶学的分析による）およびＳｅｃ２４ｄと（出芽実験による）結合することを示す。したがって、これらの結果は、Ｓｅｃ２４の全パラログがΦＣモチーフに結合するので、さらに全てが４−ＰＢＡの標的であるので、ＣＯＰＩＩ小胞は高レベルでｐ２４タンパク質をパッケージすることを示す。
【実施例４】
【００５６】
４−ＰＢＡは在留タンパク質およびＥＲ拘束変異ＬＤＬ受容体のＣＯＰＩＩパッケージングを促進する
本実施例は、４−ＰＢＡによる処理はＥＲ保持における瑕疵を生じ、在留タンパク質および間違って折畳まれたタンパク質のパッケージングを引き起こすことを示す。
方法
テトラサイクリン誘発性プロモーター下でＧ５４４Ｖ変異ヒトＬＤＬ受容体を発現するＣＨＯ（Ｔ−Ｒｅｘ−ＣＨＯ−Ｋ１）細胞クローンを含む系を用い（「全般的方法」を参照されたい）、在留タンパク質および誤って折畳まれた変異ＬＤＬ受容体のＣＯＰＩＩ小胞（透過性付与細胞から出芽する）へのパッケージングを測定した。Ｇ５４４Ｖ変異ヒトＬＤＬ受容体は天然に出現する輸送欠陥（クラス２）変異ＬＤＬ受容体であり、前記は、シャペロン関連のＥＲ拘束を引起す内腔βプロペラドメインの点変異を有する。４−ＰＢＡは、Ｇ５４４Ｖ変異ヒトＬＤＬ受容体の形質膜への輸送を回復させることが示された（Ｔｖｅｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）。
結果
変異ＬＤＬ受容体は、細胞を３０°Ｃへ２時間温度シフトさせたときゴルジ複合体への輸送が認められなかったので熱可逆性ではないことが立証された（図３（Ａ）；ゴルジへの輸送はゴルジ特異的グリコシル化の獲得（１６０ｋＤａ形を生じる）によってモニターされる）。細胞への１０ｍＭ  ４−ＰＢＡの適用が当該受容体の２５％のトラフィッキングを回復させることもまた観察され（図３（Ｂ））、これは文献（Ｔｖｅｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）で報告された結果と一致する。
図３（Ｃ）はＣＯＰＩＩ出芽実験の結果を示し、この実験では、一連のｐ２４タンパク質、ＥＲ在留物およびＧ５４４Ｖ変異ＬＤＬ受容体のパッケージングが精査された。１０ｍＭ  ４−ＰＢＡによっておよびＢ部位変異によって引起されるｐ２４タンパク質の小胞からの枯渇は、在留物および変異ＬＤＬ受容体の有意な濃縮を伴う（図３（Ｃ）を参照されたい；図３（Ｄ）−３（Ｅ）は出芽収量の変化について修正されたパッケージング率を示す）。Ｂ部位変異ＣＯＰＩＩで出芽させた小胞は、野生型小胞より５倍のカルネキシンをパッケージする。ＢｉＰ、ＧＲＰ９４および変異ＬＤＬ受容体の濃縮因数はいずれもほぼ４倍で、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼＥＲｐ５７（ＰＤＩＡ３）は９倍濃縮された（図３（Ｅ））。
４つのｐ２４タンパク質について同じ小胞プールから得た測定は、平均で３．５倍の枯渇を示した（図２（Ｄ）および３（Ｄ））。ＣＯＰＩＩコートによるタンパク質仕分けは、ＥＲ在留物からｐ２４タンパク質を１５倍から２５倍精製した（ここでは精製は、Ｂ部位変異小胞と比較して野生型小胞における在留物−タンパク質枯渇およびｐ２４濃縮の成果を指す）。精製の程度は図３（Ｃ）の生のデータに固有であったことに留意されたい（すなわち、前記は、図２（Ｄ）および３（Ｄ）−３（Ｅ）のデータ提示のために実施される出芽収量変化の修正によって影響されない）。
これらの結果は、在留物−タンパク質複合体は、変異および４−ＰＢＡ処理ＣＯＰＩＩ小胞にパッケージされるために十分に小さいことを示す。これらの結果はまた、ｐ２４タンパク質および在留物のパッケージング間で観察される相互関係は、拡散性の在留物−タンパク質複合体のｐ２４依存排除を必要とする能動的な仕分けメカニズムのモデルと一致したことを示す。
【実施例５】
【００５７】
ＥＲ非ストレス細胞を用いて再構成されたＣＯＰＩＩ小胞によるタンパク質仕分け
本実施例は、ＥＲ非ストレス細胞の環境で、ＣＯＰＩＩコートは在留タンパク質をカーゴから仕分けできることを示す。
方法
野生型ＬＤＬ受容体も変異ＬＤＬ受容体も発現しない透過性付与ＣＨＯ細胞で、再構成ＣＯＰＩＩ出芽反応を実施した（「全般的方法」を参照されたい）。
結果
図４（Ａ）に示すように、親ＣＨＯ細胞から出芽した小胞へのタンパク質のパッケージングは、ＥＲストレス細胞と同じｐ２４依存パターンを示す。Ｂ部位変異ＣＯＰＩＩを用いて出芽させた小胞は、〜８倍の因数でｐ２４タンパク質が枯渇し（図４（Ｂ））、しかも同じ小胞プールは平均して５．５倍高いレベルで在留タンパク質をパッケージする（図４（Ｃ））。前記は、ＣＯＰＩＩコートによって〜４０倍の精製が達成されることを示す。これらの観察は、ＢｉＰが酵母ＣＯＰＩＩ小胞から厳密に排除されるという最初の発見を確認し、ＥＲ保持は透過性付与細胞アッセイで適切に果たされたことを示す（実施例４を参照されたい）。
表３のこれらデータの定量は、野生型ＣＯＰＩＩ小胞は、ＥＲ非ストレス細胞よりもＥＲストレス細胞から５倍高い割合で在留タンパク質をパッケージし、一方、真正カーゴタンパク質のパッケージング率は本質的に同じであることを示す。パッケージング率増加に加えて、非折畳みタンパク質応答（ＵＰＲ）活性化が在留シャペロン濃度を増加させるのもまたこの事例である。
ＥＲストレス細胞で観察される在留タンパク質のレベル増加およびパッケージング率の増加の組合せは小胞への実質的な漏出をもたらし、前記は、上記に記載の在留物および誤って折畳まれたタンパク質のＥＲ後トラフィッキングの所見と一致する。
これらの出芽実験の結果は、ＥＲにおける在留タンパク質保持に関する２つの一般的影響を示す：１）ＵＰＲ活性化細胞における構成的漏出、および２）ＥＲストレス細胞および非ストレス細胞で出芽するＣＯＰＩＩ小胞の一般的特性としてＥＲ保持を強いる、カーゴから在留タンパク質のｐ２４依存仕分け。
【実施例６】
【００５８】
ＫＤＥＬを標的とする在留シャペロンＧＲＰ９４の細胞外分泌
本実施例は、４−ＰＢＡ処理はＥＲ内腔在留タンパク質の分泌を生じたことを示す。
方法
Ｇ５４４Ｖ変異ＬＤＬ受容体を発現するＣＨＯ細胞を、濃度が増加する４−ＰＢＡ（０、５、１０、２０、および４０ｍＭ）とともに３７°Ｃで２４時間インキュベートした。ＫＤＥＬを標的とするシャペロンＧＲＰ９４の細胞内外における存在を測定した。
結果
ＣＨＯ細胞のＧＲＰ９４の分泌は４−ＰＢＡに用量依存性であり、ＥＲストレスおよびＥＲ非ストレス細胞の両方で２０ｍＭの４−ＰＢＡで最大であった（それぞれ図５（Ａ）−５（Ｂ））。細胞質ゾルマーカーＧＡＰＤＨは細胞外サンプルには存在しなかったので、ＧＲＰ９４は細胞溶解ではなく分泌によって放出された。最高濃度（４５ｍＭ  ４−ＰＢＡ）では、細胞溶解が検出され、細胞はＧＲＰ９４を分泌する全能力を喪失した。
ＥＲストレスＣＨＯ細胞のＧＲＰ９４分泌プロフィルは、変異ＬＤＬ受容体のトラフィッキングの回復のプロフィルと良く一致する（図３（Ｂ）と５（Ａ）を比較されたい）。加えて、ＧＲＰ９４の４−ＰＢＡ依存分泌もまたＥＲ非ストレス細胞で観察されたが、ただしＧＲＰ９４の有意により低いレベルがアッセイ開始時に細胞内に存在した（図５（Ａ）および５（Ｂ）の上列を比較されたい）。
ＥＲストレス細胞の細胞内ＧＲＰ９４レベルは、４−ＰＢＡとのインキュベーションがＵＰＲを減弱させるにつれ時間の経過とともに低下した。したがって、４−ＰＢＡの濃度増加（ＵＰＲシグナリングレベルを上昇させるのではなく低下させる処理）はＧＲＰ９４の分泌を引起す。
以前の結果に照らせば、前記のデータは、４−ＰＢＡはＣＯＰＩＩを標的としＥＲ保持の忠実性を低下させることを示し、ＥＲストレスおよびＥＲ非ストレス細胞のＧＲＰ９４分泌の用量応答プロフィルは相違し（図５（Ａ）−５（Ｂ））、ＥＲストレス細胞は４−ＰＢＡの非存在下で（低レベルとはいえ）ＧＲＰ９４を分泌し、４−ＰＢＡ濃度とＥＲストレス細胞に対するＧＲＰ９４分泌との間には直線関係が存在する（図５（Ａ））。
ＫＤＥＬ回収系は適切であるので、これらの結果はまた、ＥＲストレス細胞におけるＣＯＰＩＩ小胞への在留タンパク質の漏出は（たとえ４−ＰＢＡの非存在下であっても）、回収系の性能に近いレベルまたはまさにそれを超えるレベルでＫＤＥＬリガンドをＥＲ後膜にデリバリーすることを示す。
ＥＲ非ストレス細胞のＧＲＰ９４分泌のプロフィルは一工程応答であり、高濃度の４−ＰＢＡでのみ、在留物漏出は閾値レベルを超えてＫＤＥＬ回収系の飽和を引起すように思われる（図５（Ｂ））。これらの結果は、ＣＯＰＩＩによるタンパク質仕分けは、在留タンパク質漏出率を実質的に閾値レベルより低く維持し、正常条件下ではＫＤＥＬ回収系に有用な動的範囲を与えることを示す。
これらの結果はまた、ＫＤＥＬ受容体のフォワード輸送は、ＣＯＰＩＩ小胞における受容体濃度およびリガンド枯渇の組合せを介して（図４）、ＫＤＥＬリガンドのそれを実質的に超えることを示す。前記は、ＥＲ在留性は、ＥＲ非ストレス細胞ではＣＯＰＩＩ依存保持およびＫＤＥＬ依存回収メカニズムの相乗作用によって厳密に果たされることを示す。
加えて、これらの結果は、４−ＰＢＡは、誤って折畳まれた変異ＬＤＬ受容体のトラフィッキングの回復に加えてＧＲＰ９４の細胞外分泌を引起し、それによってｐ２４変異酵母および虫類の表現型模写を引起すことを示す。これらの結果は、ＥＲ在留性は、保持および回収プロセスの重ね合わせを必要とすることを示す。これらの実験はＫＤＥＬ媒介回収に焦点を当てているが、追加の回収系（例えばＲｅｒ１およびＥｒｖ４１−Ｅｒｖ４６を必要とするもの）もまたＣＯＰＩＩ依存保持によって支援されるであろう。
ＫＤＥＬ系の飽和（図５（Ａ）参照）は、前記が、４−ＰＢＡが誤って折畳まれたＬＤＬ受容体のトラフィッキングを回復させるメカニズムと関係があることを示す。脱出した受容体分子がシャペロン（例えばＢｉＰ）と結合し、ＫＤＥＬ受容体を介してＥＲに回収され得るならば、４−ＰＢＡによる変異ＬＤＬ受容体トラフィッキングの回復は、ＥＲ退出の強化（図３）およびＫＤＥＬ系の飽和時の回収の減少の組合せを必要とし得る。
これらの結果は、本技術の組成物は、ＥＲストレス細胞（例えば癌細胞）でＧＲＰ９４（したがってＧＲＰ９４：抗原複合体）の細胞外分泌の増加で有用であることを示す。したがって、本明細書に開示の組成物は、癌またはウイルスの免疫療法を強化する方法で有用である。
【実施例７】
【００５９】
４−ＰＢＡの標的としてのＳｅｃ２４タンパク質
本実施例は４−ＰＢＡがＣＰＯＩＩを標的とすることを示す。
方法
４−ＰＢＡの細胞標的としてのＣＯＰＩＩタンパク質の更なる試験として、一連の４−ＰＢＡアナログ（図８）を、細胞ベースアッセイにおけるその変異ＬＤＬ受容体トラフィッキング回復能力について（図６（Ａ）−６（Ｄ））、およびＳｅｃ２４タンパク質に対するその結合親和性について（図６（Ｅ）−６（Ｇ））試験した。
トラフィッキングアッセイ：Ｇ５４４Ｖ変異ＬＤＬ受容体を発現するＣＨＯ細胞を、表示の濃度の４−ＰＢＡアナログとともに３７°Ｃで２時間インキュベートした。１６０ｋＤａの成熟グリコシル化ＬＤＬ受容体の出現について、細胞溶解物を免疫ブロッティングによって分析した（標識はＬＤＬ受容体の１６０ｋＤａ成熟グリコシル化型および１２０ｋＤａ前駆体型を示す）。ガンマ修正を免疫ブロット画像に適用した。
結合アッセイ：競合結合アッセイは蛍光偏光をベースにした。蛍光偏光は、蛍光トレーサーペプチドをＳｅｃ２４ａから移しかえる４−ＰＢＡアナログの能力に基づく当該アナログの親和性を測定する。トレーサーはＶＳＶ  Ｇタンパク質の改変ＤｘＥエキスポート配列であった。前記はＢ部位に結合し、したがってこのアッセイシグナルはＢ部位との特異的結合に関して報告する。
２つのアッセイの結果は図６（Ｈ）に示される。
結果
４−ＰＢＡアナログが変異ＬＤＬ受容体のトラフィッキングを回復させる能力は、ＣＯＰＩＩタンパク質に対する親和性のランク順に増加する。これらの結果は、結晶学的観察（実施例１および２参照）および小胞出芽実験（実施例１および２参照）と併せて、４−ＰＢＡがＣＯＰＩＩコートを標的とすることの複数の独立した証拠系統を提供する。
したがって、本技術の組成物は、ＥＲを出るペプチドおよび／またはタンパク質のトラフィッキングを改変する方法で有用である。
【実施例８】
【００６０】
４−ＰＢＡ処理癌細胞におけるＫＤＥＬ標的在留シャペロンＧＲＰ９４の細胞外分泌
本実施例は、４−ＰＢＡ処理は癌細胞株で細胞外ＧＲＰ９４分泌の増加をもたらすであろうということを示す。
方法
任意の適切な癌細胞株を本実施例で利用できる。乳癌細胞（例えばＭＣＦ７）、前立腺癌細胞（例えばＰＣ−３）、腎癌細胞（例えばＴＫ−１０）、卵巣癌細胞（例えばＳＫ−ＯＶ３）、メラノーマ細胞（例えばＳＫ−ＭＥＬ−２）、ＣＮＳ癌細胞（例えばＳＦ−２６８）、結腸癌細胞（例えばＣＯＬＯ２０５）、白血病細胞（例えばＫ−５６２）およびＮＳＬＣ細胞（例えばＮＣＩ−Ｈ４６０）（前記はＧ５４４Ｖ変異ＬＤＬ受容体構築物または空ベクターのどちらかを発現する）が、濃度が増加する（０、５、１０、２０および４０ｍＭ）４−ＰＢＡとともに３７°Ｃで２４時間インキュベートされるであろう。ＫＤＥＬ標的内腔シャペロンＧＲＰ９４の細胞内外における存在がウェスタンブロットによって測定されるであろう。ＧＲＰ９４がシャペロンとして機能するＭＨＣクラスＩ前駆体ペプチドを検出するために、文献記載の方法（Ｉｓｈｉｉ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １６２：１３０３−１３０９，  １９９９）を用いて、ペプチドが細胞外分画から単離されたＧＲＰ９４タンパク質からはぎ取られ、質量分析により分析されるであろう。溶出ペプチドを標的細胞にパルスして、機能的活性がＣＴＬアッセイで査定されるであろう。以下の文献を参照されたい：Ｂｉｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７９：  ７２５４−７２６１，  ２００７。
結果
４−ＰＢＡ処理癌細胞株の１つ以上が、非処理癌細胞株で観察されるものと比較して、細胞外ＧＲＰ９４レベルの増加を示すであろうということが予想される。ＥＲストレス下にある４−ＰＢＡ処理癌細胞の１つ以上が、ＥＲストレス下にない４−ＰＢＡ処理癌細胞と比較して高レベルのＧＲＰ９４分泌を示すであろうということが期待される。さらにまた、１つ以上の４−ＰＢＡ処理癌細胞の分泌ＧＲＰ９４が、腫瘍ネオアンチゲンと結合し、それは質量分析およびＣＴＬアッセイによって検出され得るであろうということも予想される。
これらの結果は、本技術の組成物は、細胞におけるＧＲＰ９４（したがってＧＲＰ９４：抗原複合体）の細胞外分泌増加で有用であることを示す。したがって、本明細書で開示する組成物は、癌またはウイルスの免疫療法を強化する方法で有用である。
【実施例９】
【００６１】
Ｂ１６−Ｆ１０腫瘍マウスにおける４−ＰＢＡの治療効果
本実施例は、４−ＰＢＡによる処理はネズミ癌モデルで腫瘍増殖を低下させるであろうということを示す。
方法
生存実験：全ての実験で、動物は種々のグループに無作為に割当てられる（プラセボ、４−ＰＢＡ単独、抗ＣＴＬＡ−４単独、または４−ＰＢＡ＋抗ＣＴＬＡ−４）。生存試験のために、グループにつき１０−１５匹のマウスのサンプルサイズが用いられる。生存分析はログランク検定を用いて実施される。Ｂ１６−Ｆ１０モデルのために、腫瘍は、０日目に右の側腹部の真皮内に（ｉ．ｄ．）１ｘ１０5細胞の注射、４日目に左の側腹部に５ｘ１０5細胞の注射によって移植される。７、１０、１３および１６日目に、マウスは、種々の濃度の４−ＰＢＡ（例えば１μＭ−４００ｍＭ）および／または抗ＣＴＬＡ−４抗体（ｉ．ｐ．）の１００μｇで処置される。コントロールグループは、対応する用量のアイソタイプ抗体（ｉ．ｐ．）およびＰＢＳを与えられる。免疫細胞枯渇のために、腫瘍チャレンジの１日前および２日後に、ＣＤ８＋、ＣＤ４＋、ＮＫ１．１またはＩＦＮγに対するモノクローナル抗体の５００μｇが、続いて実験を通して５日毎に２５０μｇがマウスに注射（ｉ．ｐ．）される。
腫瘍浸潤リンパ球アッセイ：Ｂ１６−Ｆ１０腫瘍は、０日目に右側腹部に２ｘ１０5のＢ１６−Ｆ１０細胞の注射（ｉ．ｄ．）、４日目に左側腹部に２ｘ１０5細胞の注射によって移植される。７、１０および１３日目に、マウスは、種々の濃度の４−ＰＢＡ（例えば１μＭ−４００ｍＭ）および／または抗ＣＴＬＡ−４抗体（ｉ．ｐ．）の１００μｇで処置される。１５日目に、マウスをサクリファイスし、ピンセットおよび外科用ハサミを用いて腫瘍および腫瘍流入リンパ節を取り出し、重さを測定する。各グループの腫瘍をハサミで細切し、その後１．６７  Ｗｕｎｓｃｈ  Ｕ／ｍＬのリベラーゼ（Ｌｉｂｅｒａｓｅ）および０．２ｍｇ／ｍＬのＤＮａｓｅとともに３７°Ｃで３０分インキュベートする。ピペット操作を繰返して腫瘍を均質化し、７０μｍのナイロンフィルターでろ過する。細胞懸濁物を完全ＲＰＭＩで１回洗浄し、フィコールグラディエントで精製して死細胞を除去する。
結果
４−ＰＢＡまたは抗ＣＴＬＡ−４抗体で処置されたＢ１６−Ｆ１０担癌マウスは、未処置プラセボグループと比較して、生存増加、腫瘍浸潤増加および／または腫瘍サイズ減少を示すであろうということが予想される。４−ＰＢＡおよび抗ＣＴＬＡ−４の両方を与えられた動物は、４−ＰＢＡまたは抗ＣＴＬＡ−４抗体単独の場合に観察されたものと比較して、生存および／または腫瘍浸潤で相乗的増加、および／または腫瘍増殖で相乗的低下を示すであろうということもまた予想される。したがって、本明細書に開示する組成物は、その必要がある対象動物の癌を治療する方法で有用である。
【００６２】
等価物
本技術は、本明細書で記載した特定の実施態様の言葉に限定されるべきではなく、それら実施態様は、本技術の個々の特徴の単一の例示として意図される。当業者には明白であるように、本技術の趣旨および範囲を外れることなく、本技術の多くの改変および変型を行うことができる。本明細書に列挙したものの他に、本技術の範囲内の機能的に等価の方法および装置は前述の記載から当業者には明白であろう。そのような改変および変型は、添付の特許請求の範囲内にに含まれることが意図される。本技術は、添付の特許請求の範囲の言葉とともにそのような特許請求の範囲が権利を付与する等価物の完全な範囲によってのみ制限されるべきである。本技術は、特定の方法、試薬、化合物、組成物、または生物学的な系に制限されるべきではなく、当然それらは変動し得ることは理解されるべきである。本明細書で用いられる用語は特定の実施態様を説明する目的のためであり、制限することを意図しないこともまた理解されるべきである。
加えて、本開示の特色または特徴がマルクーシュグループに関して記載されている場合、当該開示はまた、それによってマルクーシュグループのメンバーの個々のメンバーまたはサブグループに関して記載されていることは当業者には理解されよう。
当業者には理解されるように、任意の目的および全ての目的のために、特に書面による説明を提供する場合には、本明細書に開示される全範囲はまた、任意のおよび全ての可能な部分範囲およびその部分範囲の組合せを包含する。列挙されたいずれの範囲も、十分に記載され、同じ範囲を少なくとも同じ半分、１／３、１／４、１／５、１／１０などに分解することが可能であることは容易に理解されよう。非限定的な例として、本明細書で考察される各範囲は、下方の３／１、真ん中の１／３、上方の１／３などに容易に分解することができる。当業者にはまた理解されるように、例えば、“まで”、“少なくとも”、“を超える”、“未満”などの言葉はいずれも列挙された数を含み、さらに上記で考察したように続いて部分範囲に分解することができる範囲を指す。最後に、当業者には理解されるように、範囲は個々のメンバーの各々を含む。
したがって、例えば１−３つの細胞を含むグループは、１、２または３つの細胞を含むグループを指す。同様に、１−５つの細胞を含むグループは、１、２、３、４または５つの細胞を含むグループを指し、以下同様である。
本明細書で参照または引用した全ての特許、特許出願、仮特許出願、および公開公報は、参照によってその全体（全ての図および表を含む）が本明細書に、本出願の明快な教示とは一致しない程度まで含まれる。
他の実施態様は以下の特許請求の範囲で示される。
【図１（Ａ）】
2020520935.tif 000009
【図１（Ｂ）】
2020520935.tif 000010
【図１（Ｃ）】
2020520935.tif 000011
【図１（Ｄ）】
2020520935.tif 000012
【図１（Ｅ）】
2020520935.tif 000013
【図１（Ｆ）】
2020520935.tif 000014
【図１（Ｇ）】
2020520935.tif 000015
【図１（Ｈ）】
2020520935.tif 000016
【図１（Ｉ）】
2020520935.tif 000017
【図２Ａ】
2020520935.tif 000018
【図２Ｂ】
2020520935.tif 000019
【図２Ｃ】
2020520935.tif 000020
【図２Ｄ】
2020520935.tif 000021
【図３Ａ】
2020520935.tif 000022
【図３Ｂ】
2020520935.tif 000023
【図３Ｃ】
2020520935.tif 000024
【図３Ｄ】
2020520935.tif 000025
【図３Ｅ】
2020520935.tif 000026
【図４Ａ】
2020520935.tif 000027
【図４Ｂ】
2020520935.tif 000028
【図４Ｃ】
2020520935.tif 000029
【図５Ａ】
2020520935.tif 000030
【図５Ｂ】
2020520935.tif 000031
【図６Ａ】
2020520935.tif 000032
【図６Ｂ】
2020520935.tif 000033
【図６Ｃ】
2020520935.tif 000034
【図６Ｄ】
2020520935.tif 000035
【図６Ｅ】
2020520935.tif 000036
【図６Ｆ】
2020520935.tif 000037
【図６Ｇ】
2020520935.tif 000038
【図６Ｈ】
2020520935.tif 000039
【図７（Ａ）】
2020520935.tif 000040
【図７（Ｂ）】
2020520935.tif 000041
【図７（Ｃ）】
2020520935.tif 000042
【図７（Ｄ）】
2020520935.tif 000043
【図７（Ｅ）】
2020520935.tif 000044
【図７（Ｆ）】
2020520935.tif 000045
【図８】
2020520935.tif 000046
【配列表】
2020520935000001.app
【国際調査報告】
2020520935.tif 000047
2020520935.tif 000048