(57)【要約】  本発明は、リボソームＲＮＡオリガミナノ構造、詳細にはＲＮＡステープルを含むナノ構造、そのようなオリガミナノ構造を含む組成物、ならびにそのようなオリガミ構造を製造するための方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つまたは複数の足場核酸鎖と、複数のステープル核酸鎖と、を含むＲＮＡオリガミナノ構造であって、前記１つまたは複数の足場核酸鎖が、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）核酸、その断片または類似体を含む、ＲＮＡオリガミナノ構造。
【請求項２】
前記足場核酸鎖、その断片または類似体が、単離されたｒＲＮＡ核酸鎖、その断片または類似体である、請求項１に記載のＲＮＡオリガミナノ構造。
【請求項３】
前記足場が、約１１００ヌクレオチド以上、約１１００〜約５０００、または約１３００〜約４０００ヌクレオチドを含む、請求項１または２に記載のＲＮＡオリガミナノ構造。
【請求項４】
前記ｒＲＮＡ核酸鎖が、原核生物および真核生物のｒＲＮＡ核酸から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＲＮＡオリガミナノ構造。
【請求項５】
前記原核生物のｒＲＮＡが、大腸菌、ストレプトコッカス・エピデルミディス、ラクトバチルス・アシドフィルス、およびビフィドバクテリアのｒＲＮＡから選択され；前記真核生物のｒＲＮＡが、Ｓ．セレビシエ、酵母、ヒト、植物およびウシのｒＲＮＡから選択される、請求項４に記載のＲＮＡオリガミナノ構造。
【請求項６】
前記ｒＲＮＡが、原核生物の１６Ｓ、原核生物の２３Ｓ、原核生物の５Ｓ、真核生物の２５Ｓ、真核生物の２６Ｓ、真核生物の５Ｓ、真核生物の５．８Ｓ、真核生物の２８Ｓおよび真核生物の１８Ｓ  ｒＲＮＡから選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＲＮＡオリガミナノ構造。
【請求項７】
前記足場核酸鎖および前記ステープル核酸が、Ａ型コンフォメーション二重らせんを形成している、請求項１〜６のいずれか１項に記載のＲＮＡオリガミナノ構造。
【請求項８】
前記ステープル核酸が、ＲＮＡ核酸および／またはＤＮＡ核酸である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のＲＮＡオリガミナノ構造。
【請求項９】
前記ステープル核酸が、ＲＮＡ核酸であり、前記得られた二重らせんが、ターンあたり１２塩基対を有する、請求項７または８に記載のＲＮＡオリガミナノ構造。
【請求項１０】
複数の足場核酸鎖を含み、そして／またはタンパク質、核酸、脂質、糖タンパク質、糖脂質、および小分子などの活性部分をさらに含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載のＲＮＡオリガミナノ構造。
【請求項１１】
前記活性部分が、場合によりリンカーを介して、前記ナノ構造の内面または外面に結合され、場合によりハンドルに結合されている、請求項１０に記載のＲＮＡオリガミナノ構造。
【請求項１２】
前記ナノ構造の前記表面に１つまたは複数の標的ドメインをさらに含み、場合により前記標的ドメインがアプタマーである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のＲＮＡオリガミナノ構造。
【請求項１３】
前記標的ドメインにハイブリダイズされたラッチドメインをさらに含み、前記標的ドメインおよび前記ラッチドメインが、標的分子への前記標的ドメインの結合の際に離脱し、それにより前記ナノ構造をクローズ型コンフォメーションからオープン型コンフォメーションに変移させることを可能にする、請求項１２に記載のＲＮＡオリガミナノ構造。
【請求項１４】
前記標的分子が、腫瘍関連分子、細胞膜受容体、成長因子、または病原性抗原から選択される、請求項１３に記載のＲＮＡオリガミナノ構造。
【請求項１５】
前記足場核酸が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、その断片または類似体で示される配列を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のＲＮＡオリガミナノ構造。
【請求項１６】
（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜５５、（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０８〜５６１、（ｉｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５５〜６９５、または（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）の配列の任意の組み合わせ、で示される配列を有する前記ステープル核酸鎖を含み、場合により、（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６〜６７、（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６２〜５７３、または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の配列の任意の組み合わせ、で示される配列を有するステープルオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項１５に記載のＲＮＡオリガミナノ構造。
【請求項１７】
前記足場ポリヌクレオチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８、その断片または類似体で示される配列を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のＲＮＡオリガミナノ構造。
【請求項１８】
（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９〜１７０、そして場合によりＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７１〜１８６、（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６０〜４３７、または（ｉｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３８〜５００で示される配列から選択される配列を有する前記ステープルオリゴヌクレオチドを含み、前記ナノ構造が立方八面体である、請求項１７に記載のＲＮＡオリガミナノ構造。
【請求項１９】
複数の足場核酸鎖を含み、前記足場核酸鎖の少なくとも１つが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で示される配列を有し、そして／または前記足場核酸鎖の少なくとも１つが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８で示される配列を有する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のＲＮＡオリガミナノ構造。
【請求項２０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８７〜３５９で示される配列を有する前記ステープルオリゴヌクレオチドを含む、請求項１９に記載のＲＮＡオリガミナノ構造。
【請求項２１】
活性部分をさらに含む、請求項１５〜２０のいずれか１項に記載のＲＮＡオリガミナノ構造。
【請求項２２】
前記ナノ構造の表面に１つまたは複数の標的ドメイン（複数可）をさらに含む、請求項１５〜２１のいずれか１項に記載のＲＮＡオリガミナノ構造。
【請求項２３】
前記標的ドメインにハイブリダイズされたラッチドメインをさらに含み、前記標的ドメインおよび前記ラッチドメインが、標的分子への前記標的ドメインの結合の際に離脱し、それにより前記ナノ構造をクローズ型コンフォメーションからオープン型コンフォメーションに変移させることを可能にする、請求項２２に記載のＲＮＡオリガミナノ構造。
【請求項２４】
以下のステップ：
（ａ）ｒＲＮＡ足場核酸（複数可）、その断片または類似体と、ステープル核酸と、を含む初期混合物を約５７℃〜約６５℃で約０．５〜約５分間インキュベートするステップと；
（ｂ）（ａ）の混合物を約５３℃〜約５８℃で約３〜約１０分間インキュベートするステップと；
（ｃ）（ｂ）の混合物を約４８℃〜約５３℃で約３〜約１５分間インキュベートするステップと；
（ｄ）（ｃ）の混合物を約３２℃〜約４８℃で約５〜約２０分間インキュベートするステップと；
（ｅ）（ｄ）の混合物を約２０℃〜約３２℃で約５分間〜約２０分間インキュベートするステップ；または（ｄ）の混合物を約０．０５℃／分〜約−２℃／分の速度で約２０℃〜４℃の範囲内の温度まで冷却するステップと
を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のＲＮＡオリガミナノ構造の調製のための方法。
【請求項２５】
（ａ）ｒＲＮＡ足場核酸（複数可）、その断片または類似体と、ステープルと、を含む初期混合物を約６０℃で約０．５〜約２分間インキュベートすること；
（ｂ）（ａ）の混合物を約５５℃で約３〜約１０分間インキュベートすること；
（ｃ）（ｂ）の混合物を約５０℃で約３〜約１５分間インキュベートすること；
（ｄ）（ｃ）の混合物を約３７℃で約５〜約２０分間インキュベートすること；および
（ｅ）（ｄ）の混合物を約２５℃で約５〜約２０分間インキュベートすること
を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
（ａ）ｒＲＮＡ足場核酸（複数可）、その断片または類似体と、ステープル核酸と、を含む初期混合物を約６０℃で約０．５〜約２分間インキュベートすること；
（ｂ）（ａ）の混合物を約５５℃で約３〜１０分間インキュベートすること；
（ｃ）（ｂ）の混合物を約５０℃で約３〜約１５分間インキュベートすること；
（ｄ）（ｃ）の混合物を約４５℃で約５〜２０分間インキュベートすること；および
（ｅ）（ｄ）の混合物を約−０．０５℃／分〜約０．１５℃／分の速度で約４０℃から約１５℃に冷却すること
を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＲＮＡオリガミナノ構造を約３３℃〜約４２℃で約１〜約１０日間、約２〜約８日間、約３〜約６日間、または約４〜約５日間、インキュベートすることをさらに含む、請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＲＮＡオリガミナノ構造を約３７℃で約１〜約１０日間、約２〜約８日間、約３〜約６日間、または約４〜約５日間、インキュベートすることを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
以下のステップ：
（ａ）ｒＲＮＡ足場核酸（複数可）、その断片または類似体と、ステープル核酸と、を含む初期混合物を約５７℃〜約６５℃で約０．５〜約２分間インキュベートするステップと；
（ｂ）（ａ）の混合物を約−０．５℃／分〜約−２℃／分の速度で約５８〜約５２℃の範囲内の温度まで冷却するステップと；
（ｃ１）（ｂ）の混合物を約−０．３℃／分〜約−３℃／分の速度で約１５〜約３０の範囲内の温度まで冷却するステップ；または
（ｃ２．ｉ）（ｂ）の混合物を約５３℃〜約５８℃で約３〜約１０分間インキュベートするステップと；
（ｃ２．ｉｉ）（ｃ２．ｉ）の混合物を約−０．３℃／分〜約−３℃／分の速度で約５２℃〜約４８℃の範囲内の温度まで冷却するステップと；
（ｃ２．ｉｉｉ）（ｃ２．ｉｉ）の混合物を約４８℃〜約５２℃で約５〜約１５分間インキュベートするステップと；
（ｃ２．ｉｖ）（ｃ２．ｉｉｉ）の混合物を約−０．３℃／分〜約−３℃／分の速度で約４０℃〜約３５の範囲内の温度まで冷却するステップと；
（ｃ２．ｖ）（ｃ２．ｉｖ）の混合物を約３５℃〜約４０℃で約５〜約１５分間インキュベートするステップと；
（ｃ２．ｖｉ）（ｃ２．ｖ）の混合物を約−０．３℃／分〜約−３℃／分の速度で約３０℃〜約１５℃の範囲内の温度まで冷却するステップと；
（ｃ２．ｖｉｉ）（ｃ２．ｖｉ）の混合物を約２０℃〜約３０℃で約５〜約１５分間インキュベートするステップと
を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のＲＮＡオリガミナノ構造の調製のための方法。
【請求項３０】
以下のステップ：
（ａ）ｒＲＮＡ足場核酸（複数可）、その断片または類似体と、ステープル核酸と、を含む初期混合物を約６０℃で約０．５〜約２分間インキュベートするステップと；
（ｂ）（ａ）の混合物を約−０．５℃／分〜約−２℃／分の速度で約５９℃から約５６℃に冷却するステップと；
（ｃ）（ｂ）の混合物を約−０．５℃／分〜約−２℃／分の速度で約５５℃から約２５に冷却するステップと
を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
以下のステップ：
（ａ）ｒＲＮＡ足場核酸（複数可）、その断片または類似体と、ステープル核酸と、を含む初期混合物を約６０℃で約０．５〜約２分間インキュベートするステップと；
（ｂ）（ａ）の混合物を約−０．５℃／分〜約−２℃／分の速度で約５９℃から約５６℃まで冷却するステップと；
（ｃ）（ｂ）の混合物を約５５℃で約３〜約１０分間インキュベートするステップと；
（ｄ）（ｃ）の混合物を約−０．５℃／分〜約−２℃／分の速度で約５４℃から約５１℃まで冷却するステップと；
（ｅ）（ｄ）の混合物を約５０℃で約５〜約１５分間インキュベートするステップと；
（ｆ）（ｅ）の混合物を約−０．５℃／分〜約−２℃／分の速度で約４９℃から約３８℃まで冷却するステップと；
（ｇ）（ｆ）の混合物を約３７℃で約５〜約１５分間インキュベートするステップと；
（ｈ）（ｇ）の混合物を約−０．５℃／分〜約−２℃／分の速度で約３６℃から約２６℃まで冷却するステップと；
（ｉ）（ｈ）の混合物を約２５℃で約５〜約１５分間インキュベートするステップと
を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＲＮＡオリガミナノ構造を約３３℃〜約４２℃で約１〜約１０日間、約２〜約８日間、または約３〜約６日間、インキュベートすることをさらに含む、請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＲＮＡオリガミナノ構造を約３７℃で約１〜約１０日間、約２〜約８日間、約３〜約６日間、または約４〜約５日間、インキュベートすることを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
足場核酸（複数可）、その断片または類似体と、ステープル核酸と、を含む初期混合物を、約４０℃〜約６０℃の一定温度で約０．２〜約６日間、インキュベートすることを含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のＲＮＡオリガミナノ構造の調製のための方法。
【請求項３５】
足場核酸（複数可）、その断片または類似体と、ステープル核酸と、を含む初期混合物を、約５０℃の一定温度で約１．５〜約３日間、または約５５℃で約５〜約４８時間インキュベートすることを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
（ａ）別々に、（ｉ）ステープル核酸鎖を６５℃で１０分間、そして（ｉｉ）足場核酸鎖（複数可）を６０℃で１分間、加熱するステップと；
（ｂ）ステップ（ａ）の前記加熱されたステープル核酸と、前記予備加熱された足場核酸鎖（複数可）と、を混合するステップと；
（ｃ）前記混合物を−１℃／分の速度で６０℃から１５℃に冷却するステップと
を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のＲＮＡオリガミナノ構造を調製するための方法。
【請求項３７】
前記足場核酸、その断片または類似体が、単離されたｒＲＮＡ核酸鎖、その断片または類似体である、請求項２４〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記足場核酸鎖（複数可）を含む前記初期混合物が、総細胞ＲＮＡを含む、請求項２４〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記足場核酸が、約１１００ヌクレオチド塩基以上、約１１００〜約１００００、約１２００〜約５０００、または約１３００〜約４０００ヌクレオチドを含む、請求項２４〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記足場核酸鎖が、ＲＮＡ核酸および／またはＤＮＡ核酸である、請求項２４〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記足場核酸が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８、およびその断片または類似体から選択される配列を含む、請求項２４〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
（Ｉ）前記足場核酸が、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を有し、前記ステープル核酸が、配列（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜５５、そして場合によりＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６〜６７、（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０８〜５６１、そして場合によりＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６２〜５７３、（ｉｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５５〜６９５、もしくは（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉ）の配列の任意の組み合わせ、を有するか；または
（ＩＩ）前記足場核酸が、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８を有し、前記ステープル核酸が、（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９〜１７０、そして場合によりＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７１〜１８６、（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６０〜４３７、もしくは（ｉｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３８〜５００で示される配列を有し、前記得られたナノ構造が、立方八面体である、
請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記得られたＲＮＡオリガミナノ構造が、活性部分をさらに含む、請求項２４〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
１つまたは複数の足場核酸鎖と、複数のステープル核酸鎖と、を含むＲＮＡオリガミナノ構造であって、前記１つまたは複数の足場核酸鎖（複数可）が、請求項２４〜４３のいずれか１項に記載の方法により調製されたリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）核酸鎖、その断片または類似体を含む、ＲＮＡオリガミナノ構造。
【請求項４５】
（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜５５、（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜６７、（ｉｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および５０８〜５６１、（ｉｖ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および５６２〜５７３、（ｖ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８〜１７０、（ｖｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８〜１８６、（ｖｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６０〜４３７、（ｖｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３８〜５００、または（ｖｉｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および６５５〜６９５で示される配列を含む、核酸分子。
【請求項４６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、６８および１８７〜３５９で示される配列を含む、核酸分子。
【請求項４７】
請求項４５または４６に記載の少なくとも１種の核酸分子を含む、核酸構築物。
【請求項４８】
請求項４５もしくは４６に記載の核酸分子、または請求項４７に記載の核酸構築物を含む、ベクター。
【請求項４９】
請求項４５もしくは４６に記載の核酸、請求項４７に記載の核酸構築物、または請求項４８に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項５０】
請求項１〜２３のいずれか１項、または請求項４４に記載のＲＮＡオリガミナノ構造を含む、医薬組成物。
【請求項５１】
１つまたは複数の足場核酸鎖と、複数のステープル核酸鎖と、を含むＲＮＡオリガミナノ構造であって、前記足場核酸鎖が、細胞由来のＲＮＡ核酸、その断片または類似体を含む、ＲＮＡオリガミナノ構造。
【請求項５２】
１つまたは複数の足場核酸鎖と、複数のステープル核酸鎖と、を含むＲＮＡオリガミナノ構造であって、前記１つまたは複数の足場核酸（複数可）が、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）核酸、その断片または類似体を含み、前記足場核酸（複数可）および前記ステープル核酸が、Ａ型コンフォメーション二重らせんを形成している、ＲＮＡオリガミナノ構造。
【請求項５３】
前記ステープル核酸が、ＲＮＡ核酸であり、前記得られた二重らせんが、ターンあたり１２塩基対を有する、請求項５２に記載のＲＮＡオリガミナノ構造。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、リボソームＲＮＡオリガミナノ構造、およびそれを生成するための方法に関する。該構造は、必要となる機能になるように設計された複合的２Ｄおよび３Ｄ構造を有していてもよい。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ＤＮＡは、ほぼ３０年間にわたりナノスケールの物体の合理的設計および構築のために用いられてきた。近年になり「足場ＤＮＡオリガミ」が、広範囲の適用を有するＤＮＡナノテクノロジーにおける最も有望な組み立て技術の１つとして出現した（Ｒｏｔｈｅｍｕｎｄ，  ２００６，  Ｎａｔｕｒｅ，  ４４０，  ２９７−３０１）。この方法の創案により、コンピュータ支援設計（ＣＡＤ）ソフトウエアを用いた工程を補助するソフトウエアが開発され、特定の形状を形成するために必要となる足場およびステープルの配列の予備計算および決定を可能にした。
【０００３】
大きな期待にもかかわらず、ＤＮＡオリガミは、当該業界に強く浸透することはなかった。主な障害の１つは、高価格の原材料、即ち一本鎖ＤＮＡである。標準の室内実験では、ほんの少量しか必要にならないが、商業化を見込むと、経費が過度に高くなる。
【０００４】
ＲＮＡがＤＮＡよりもかなり豊富なことは、周知の事実であるが、ＲＮＡは、オリガミ構造の生成のための潜在的「原材料」として見込まれなかった。Ｅｎｄｏら（Ｃｈｅｍ．  Ｅｕｒ．  Ｊ．  ２０１４，  ２０，  １５３３０−１５３３３）およびＷａｎｇら（Ｃｈｅｍ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  ２０１３，  ４９，  ５４６２−５４６４）は、限定的収量の、人工的に転写されたＲＮＡの相対的に短い鎖を用いた核酸オリガミの調製を記載している。  ＧｅｒａｓｉｍｏｖａおよびＫｏｌｐａｓｈｃｈｉｋｏｖ（Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌ．  ２０１３  ５２（４０）  ｄｏｉ：１０．１００２ａｎｉｅ．２０１３０３９１９）  は、デオキシリボザイムセンサー（標的被分析物に相補的な断片と、フルオロフォアおよびクエンチャー標識蛍光発生レポータ基質に相補的な断片と、を含む２つのＤＮＡ鎖（ｓｔａｎｄｓ））を活用する細菌性ＲＮＡを分析するアッセイを記載した。ＧｅｒａｓｉｍｏｖａおよびＫｏｌｐａｓｈｃｈｉｋｏｖは、ＲＮＡへのステープルのハイブリダイゼーションが二次構造をほぐして、「糸上のデオキシリボザイム（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｚｙｍｅｓ−ｏｎ−ａ−ｓｔｒｉｎｇ）」複合体を形成することを示した。しかし、安価で即座に入手可能なオリガミナノ構造の大量生産を可能にする現実のツールについての例はない。生物学的ナノ構造の工業的規模の製造に用いられ得る遺伝子材料の安価な供給源を利用する方法には、アンメットニーズがある。
【発明の概要】
【０００５】
発明の概要
急速に成長する哺乳動物細胞（例えば、培養ＨｅＬａ細胞）内の総ＲＮＡのおよそ８０％が、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）であり、そのためそれは遺伝子材料の最も入手可能で最も安価な供給源の１つとなっている。現在までｒＲＮＡは、合理的に設計された生物学的構造を開発するための潜在的材料と見なされていなかった。本発明は、ｒＲＮＡが２Ｄおよび３Ｄ  ｒＲＮＡオリガミナノ構造を製造するために用いられ得ることを初めて示す。ｒＲＮＡをプロセシングするための方法、およびそれをｒＲＮＡオリガミ構造へフォールディングするための方法もまた、提供される。
【０００６】
一態様において、本発明は、１つまたは複数の足場核酸鎖と、複数のステープル核酸鎖と、を含むＲＮＡオリガミナノ構造であって、該１つまたは複数の足場核酸鎖（複数可）が、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）核酸鎖、その断片または類似体を含む、ＲＮＡオリガミナノ構造を提供する。幾つかの実施形態によれば、該足場鎖は、約１１００ヌクレオチド以上、約１１００〜約５０００、または約１３００〜約４０００ヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態によれば、該ステープル核酸は、ＲＮＡ核酸である。幾つかの実施形態によれば、該ステープル核酸は、５〜３００、１０〜２００から３０〜１００ヌクレオチドからなる。一実施形態によれば、該足場核酸鎖および該ＲＮＡステープル核酸鎖は、Ａ型コンフォメーション二重らせんを形成している。一実施形態において、該Ａ型コンフォメーション二重らせんは、ターンあたり１２塩基対を有する。幾つかの実施形態によれば、該ステープル核酸は、ＤＮＡ核酸である。一実施形態によれば、該足場核酸鎖および該ＤＮＡステープル核酸鎖は、Ａ型コンフォメーション二重らせんを形成している。幾つかの実施形態によれば、該ｒＲＮＡナノ構造は、活性部分および／または標的ドメインを含む。
【０００７】
別の態様によれば、本発明は、本発明のＲＮＡオリガミナノ構造の調製のための方法であって、
ｒＲＮＡ足場核酸、その断片または類似体と、ステープル核酸と、を含む初期混合物を約５７℃〜約６５℃で約０．５〜約５分間インキュベートすること；
（ｂ）（ａ）の混合物を約５３℃〜約５８℃で約３〜約１０分間インキュベートすること；
（ｃ）（ｂ）の混合物を約４８℃〜約５３℃で約３〜約１５分間インキュベートすること；
（ｄ）（ｃ）の混合物を約３２℃〜約４８℃で約５〜約２０分間インキュベートすること；および
（ｅ）（ｄ）の混合物を約２０℃〜約３２℃で約５〜約２０分間インキュベートすること；または（ｄ）の混合物を約−０．０５℃／分〜約−２℃／分の速度で約２０℃〜４℃の範囲内の温度まで冷却すること
を含む、方法を提供する。
【０００８】
さらなる態様によれば、本発明は、本発明のＲＮＡオリガミナノ構造の調製のための方法であって、
（ａ）ｒＲＮＡ足場核酸、その断片または類似体と、ステープル核酸と、を含む初期混合物を約５７℃〜約６５℃で約０．５〜約２分間インキュベートすること；
（ｂ）（ａ）の混合物を約−０．５℃／分〜約−２℃／分の速度で約５８〜約５２℃の範囲内の温度まで冷却すること；
（ｃ１）（ｂ）の混合物を約−０．３℃／分〜約−３℃／分の速度で約１５〜約３０の範囲内の温度まで冷却すること；または
（ｃ２．ｉ）（ｂ）の混合物を約５３℃〜約５８℃で約３〜約１０分間インキュベートすること；
（ｃ２．ｉｉ）（ｃ２．ｉ）の混合物を約−０．３℃／分〜約−３℃／分の速度で約５２℃〜約４８℃の範囲内の温度まで冷却すること；
（ｃ２．ｉｉｉ）（ｃ２．ｉｉ）の混合物を約４８℃〜約５２℃で約５〜約１５分間インキュベートすること；
（ｃ２．ｉｖ）（ｃ２．ｉｉｉ）の混合物を約−０．３℃／分〜約−３℃／分の速度で４０℃〜約３５の範囲内の温度まで冷却すること；
（ｃ２．ｖ）（ｃ２．ｉｖ）の混合物を約３５℃〜約４０℃で約５〜約１５分間インキュベートすること；
（ｃ２．ｖｉ）（ｃ２．ｖ）の混合物を約−０．３℃／分〜約−３℃／分の速度で約３０℃〜約１５℃の範囲内の温度まで冷却すること；および
（ｃ２．ｖｉｉ）（ｃ２．ｖｉ）の混合物を約２０℃〜約３０℃で約５〜約１５分間インキュベートすること
を含む、方法を提供する。
【０００９】
さらに別の態様によれば、本発明は、本発明のＲＮＡオリガミナノ構造の調製のための方法であって、足場核酸、その断片または類似体と、ステープル核酸と、を含む初期混合物を約４０℃〜約６０℃の一定温度で約０．２〜約５日間インキュベートすることを含む、方法を提供する。
【００１０】
特定の態様によれば、本発明は、本発明のＲＮＡオリガミナノ構造の調製のための方法であって、
（ａ）（ｉ）ステープル核酸鎖を６５℃で１０分間、そして（ｉｉ）足場核酸鎖を６０℃で１分間、別々に加熱すること；
（ｂ）ステップ（ａ）の該加熱されたステープル核酸と、予備加熱された足場核酸鎖と、を混合すること；および
（ｃ）得られた混合物を−１℃／分の速度で６０℃から１５℃に冷却すること
を含む、方法を提供する。
【００１１】
幾つかの態様によれば、本発明は、（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜５５、（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜６７、（ｉｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および５０８〜５６１、（ｉｖ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および５６２〜５７３、（ｖ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８〜１７０、（ｖｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８〜１８６、（ｖｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６０〜４３７、または（ｖｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３８〜５００、または（ｖｉｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、６８および１８７〜３５９で示された配列を含む核酸分子を提供する。
【００１２】
別の態様によれば、本発明は、１つまたは複数の足場核酸鎖と、複数のステープル核酸鎖と、を含むＲＮＡオリガミナノ構造であって、該足場核酸鎖が、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）核酸鎖、その断片または類似体を含み、該ＲＮＡオリガミナノ構造が、本発明の方法の任意の１つにより調製される、ＲＮＡオリガミナノ構造を提供する。
【００１３】
一態様によれば、本発明は、本発明の少なくとも１種の核酸分子を含む核酸構築物を提供する。
【００１４】
さらなる態様によれば、本発明は、本発明の核酸構築物を含むベクターを提供する。
【００１５】
別の態様によれば、本発明は、本発明の核酸構築物または核酸分子を含む細胞を提供する。
【００１６】
幾つかの態様によれば、本発明は、本発明のＲＮＡオリガミナノ構造を含む医薬組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】異なる温度で最長１時間のＳ．セレビシエのリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）の安定性を示す（アガロースゲル）。レーン２〜６：それぞれ６５℃、６１．６℃、５７．６℃、５２．７℃および４５で５分間；レーン７〜１１：それぞれ６５℃、６１．６℃、５７．６℃、５２．７℃および４５で１０分間；レーン１２〜１６：それぞれ６５℃、６１．６℃、５７．６℃、５２．７℃および４５で２０分間。
【図１Ｂ】レーン２〜６：それぞれ６５℃、６１．６℃、５７．６℃、５２．７℃および４５で３０分間；レーン７〜１１：それぞれ６５℃、６１．６℃、５７．６℃、５２．７℃および４５で４０分間；レーン１２〜１６：それぞれ６５℃、６１．６℃、５７．６℃、５２．７℃および４５で６０分間；（アガロースゲル）。
【図２】２時間にわたりテストされた３つの異なる温度、即ち６５℃（レーン２〜７）、６１℃（レーン８〜１３）および５７．５℃（レーン１４〜１９）でのＲＮＡステープルの安定性を示す。テストされたタイムポイントは、各温度で１０、２０、４０、６０、９０および１２０分であった。対照として用いられたレーン１  −  試料は高温に供されなかった（アガロースゲル）。
【図３】「非精製」足場（レーン２  −  Ｓ．セレビシエから抽出された総ＲＮＡ）を用いたフォールディングと、精製足場（レーン３  −  アガロースゲル上で精製された１８Ｓ  ｒＲＮＡ）を用いたフォールディングとの比較のアガロースゲルを示し；レーン５および６は、それぞれフォールディングされた「非精製」および精製１８Ｓ  ｒＲＮＡであり；レーン１：１ｋｂ  ＤＮＡラダー。フォールディングは、１２ｍＭ  ＭｇＣｌ２の１×ＴＡＥ中で実施された。
【図４】実施例４のフォールディングされた精製１８Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡ構造の原子間力顕微鏡測定（ＡＦＭ）のスキャンを示す。
【図５】エッジステープルを用いない（図５Ａ）または用いた（図５Ｂ）１８Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡ構造の略図を示す（ステープルは灰色に、足場は黒色に着色されている。エッジステープルは、この形状の左側および右側に見出されるステープルである）。
【図６】エッジステープルを用いた（レーン５〜１０）または用いない（レーン１１〜１６）異なる濃度のＭｇＣｌ２の１×ＴＡＥ中でフォールディングされた１８Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡ構造のアガロースゲルを示す。レーン１：１ｋｂ  ＤＮＡラダー；レーン２：Ｓ．セレビシエから抽出された総ＲＮＡ；レーン３および４：それぞれ精製２５Ｓおよび１８Ｓ  ｒＲＮＡサブユニット。この実験は、総ＲＮＡを用いて実施された。各レーンは、レーン５および１１では１０ｍＭから開始し、レーン１０および１６では、＋２ｍＭずつ段階的に上昇させて最大２０ｍＭのＭｇＣｌ２濃度を表す。
【図７】さらに１×ＴＡＥ  １２ｍＭ  ＭｇＣｌ２（対照  −  レーン５〜８）、１×ＴＡＥ  ＋２ｍＭ  ＭｇＣｌ２（レーン９〜１２）およびＤＥＰＣ（レーン１３〜１６）中、３７℃で０、１、３時間および一晩インキュベートされた、フォールディングされた１８Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡ構造のアガロースゲルを示す。
【図８】１２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２の１×ＴＡＥ（レーン９〜１４）、またはヒト血中浸透圧を模倣した条件（１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、４．２ｍＭ  ＫＣｌおよび１．９３ｍＭ  ＣａＣｌ２）（レーン３〜８）中、３７℃で０（レーン３および９）、３０、６０、１２０、２４０および３６０分間（それぞれレーン８および１４）さらにインキュベートされた、フォールディングされた１８Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡ構造のアガロースゲルを示す。
【図９】プロトコル１を用いて総ＲＮＡからフォールディングされ、さらに３７℃で９日間にわたりインキュベートされた１８Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡ構造のアガロースゲルを示す。レーン１：１ｋｂ  ＤＮＡラダー；レーン２：総ＲＮＡ；レーン３：３７℃で保持されなかった１８Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡフォールディング構造；およびレーン４〜１０：３７℃で９日間にわたりインキュベートされた１８Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡ構造。フォールディング反応は、１２ｍＭ  ＭｇＣｌ２の１×ＴＡＥ中で実施された。
【図１０】フォールディングプロトコル１（実施例４）に従ってフォールディングされ、その後、３７℃で異なる期間、インキュベートされた１８Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡ構造のアガロースゲルを示す。レーン１：１ｋｂ  ＤＮＡラダー；レーン２：総ＲＮＡ；総ＲＮＡ（レーン３〜５）から、または精製１８Ｓ（レーン６〜８）からフォールディングされ、３７℃で０時間（レーン３および６）、２．５時間（レーン４および７）または９．５時間（レーン５および８）保持された１８Ｓ  ＲＮＡ−ＤＮＡ構造。フォールディングは、１２ｍＭ  ＭｇＣｌ２の１×ＴＡＥ中で実施された。
【図１１】総ＲＮＡまたは精製１８Ｓ  ｒＲＮＡからフォールディングされ、３７℃で２．５または９．５日間保持された１８Ｓ  ｒＲＮＡのＡＦＭ画像を示す。図１１Ａおよび１１Ｂ：非精製で２．５日間（異なる倍率）；図１１Ｃおよび１１Ｄ：精製されて２．５日間（異なる倍率）；図１１Ｅ：非精製で９．５日間；図１１Ｆ：精製されて９．５日間。
【図１２】フォールディング緩衝液（１×ＴＡＥ、１２ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中でフォールディングプロトコル１に従ってフォールディングされ、３７℃で異なる期間維持された１８Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡのアガロースゲルを示す。レーン３〜５：精製１８Ｓ  ｒＲＮＡを用いてフォールディングされた１８Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡ構造の、３７℃でそれぞれ０、２および９日間にわたる安定性；レーン６〜９および１３〜１４：総ＲＮＡを用いてフォールディングされた１８Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡ構造の、３７℃でそれぞれ０、１、２、５、６および９日間にわたる安定性。
【図１３】１００ｋＤａカットオフの遠心分離フィルター（Ａｍｉｃｏｎ  １００Ｋ）での遠心分離前および後の１８Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡ構造を示す。
【図１４】フォールディングプロトコル１に従って精製１８Ｓ  ｒＲＮＡからフォールディングされた１８Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡ構造を示し、該構造は白色の構造によって表された４つのビオチン部位を含む。
【図１５】アビジンを含む、または含まないビオチン部位を有するフォールディングされた１８Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡ構造のアガロースゲルを示す。レーン３〜４：クリーニング前のフォールディングされた１８Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡ構造；レーン５：クリーニング（Ａｍｉｃｏｎ  １００Ｋ使用）後のフォールディングされた１８Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡ構造；レーン６：アビジンに結合されたクリーニング済みの１８Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡ構造。
【図１６】ビオチン部位を担い、アビジン分子に結合された、１８Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡ構造のＡＦＭ画像を示す。
【図１７】２５Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡ複合体の略図を示す（ステープルを灰色で、足場を黒色で表す）。
【図１８】１２．５ｍＭおよび１６ｍＭ  ＭｇＣｌ２の１×ＴＡＥ中でプロトコル１を用いて総ＲＮＡまたは精製２５Ｓ  ｒＲＮＡ単位からフォールディングされた２５Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡ構造のアガロースゲルを示す。レーン３：Ｓ．セレビシエからの総ＲＮＡ；レーン４：精製２５Ｓ  ｒＲＮＡ；レーン５〜６：それぞれ１２．５ｍＭおよび１６ｍＭ  ＭｇＣｌ２での精製２５Ｓからのフォールディング；レーン７〜８：それぞれ１２．５ｍＭおよび１６ｍＭ  ＭｇＣｌ２での総ＲＮＡからのフォールディング。
【図１９】フォールディングプロトコル１に従って１６ｍＭ  ＭｇＣｌ２で精製２６Ｓ  ｒＲＮＡからフォールディングされた２５Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡ構造のＡＦＭ画像を示す。
【図２０】４つの異なるプロトコルを用いてフォールディングされた２５Ｓ  ＲＮＡ−ＤＮＡ構造のアガロースゲルを示す。レーン１：１ｋｂ  ＤＮＡラダーを含む；レーン２および３：それぞれ総ＲＮＡおよび精製２６Ｓ；レーン４〜７：それぞれプロトコル１〜４を用いたフォールディング。フォールディング緩衝液は、１×ＴＡＥ、１６ｍＭ  ＭｇＣｌ２であった。
【図２１】プロトコル２（図２１Ａ）、プロトコル３（図２１Ｂ）またはプロトコル４（図２１Ｃ）を用いてフォールディングされた２５Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡ構造のＡＦＭ画像を示す。
【図２２】４つの異なるプロトコルを用いてフォールディングされた２５Ｓ  ＲＮＡ−ＤＮＡ構造のアガロースゲルを示すが、得られた構造は、さらに３７℃で異なる期間、インキュベートされている。図２２Ａ：レーン１：１ｋｂ  ＤＮＡラダー；レーン２：精製２５Ｓ  ｒＲＮＡ；レーン３：総ＲＮＡ；レーン４〜８：プロトコル１＋それぞれ０、２．５、４、５および６日間インキュベーション；レーン９〜１３：プロトコル２＋それぞれ０、２．５、４、５および６日間インキュベーション。図２２Ｂ：レーン４〜８：プロトコル３＋それぞれ０、２．５、４、５および６日間インキュベーション；レーン９〜１３：プロトコル４＋それぞれ０、２．５、４、５および６日間インキュベーション。フォールディング緩衝液は、１×ＴＡＥ、１６ｍＭ  ＭｇＣｌ２であった。
【図２３】プロトコル１〜４を用いてフォールディングされ、さらに３７℃で異なる期間インキュベートされた２５Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡ構造のＡＦＭ画像を示す。図２３Ａおよび２３Ｂ：プロトコル１＋それぞれ０または５日間のインキュベーション；図２３Ｃおよび２３Ｄ：プロトコル２＋それぞれ０または５日間のインキュベーション；図２３Ｅおよび２３Ｆ：プロトコル３＋それぞれ０または５日間のインキュベーション；図２３Ｇ〜２３Ｋ：プロトコル３＋それぞれ０、２．５、４、５および６日間のインキュベーション。
【図２４】４５℃（図２４Ａ）または５０℃（図２４Ｂ）でプロトコル５を用いてフォールディングされ、０、４、７時間後、１、１．５および２日後（両図ともレーン４〜９）にテストされた２５Ｓ  ＲＮＡ−ＤＮＡ構造のアガロースゲルを示す。フォールディング緩衝液は、１×ＴＡＥ、１６ｍＭ  ＭｇＣｌ２であった。
【図２５】プロトコル５を用いて５０℃で７時間後（図２５Ａ）、１または２日後（それぞれ２５Ｂおよび図２５Ｃ）にフォールディングされた２５Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡ構造のＡＦＭ画像を示す。
【図２６】ＭｇＣｌ２を含むプロトコル５を用いてフォールディングされた、５０℃で２日後の２５Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡ構造のＡＦＭ画像を示す。
【図２７】総ＲＮＡからの２５Ｓおよび１８Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡ構造の同時フォールディングの略図を示す。
【図２８】１２ｍＭ  ＭｇＣｌ２（図２８Ａ）または１６ｍＭ  ＭｇＣｌ２（図２８Ｂ）の１×ＴＡＥ中での総ＲＮＡからの２５Ｓおよび１８Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡ構造の同時フォールディングのアガロースゲルを示す。対照として、２５Ｓおよび１８Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡ構造を別々にフォールディングした。該構造を、３７℃での０、１、２、３、６．５日インキュベーションの後にテストした。両方のゲルについて、レーン１：Ｓ．セレビシエから抽出された総ＲＮＡを含む；レーン２〜６：対照。１８Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡ構造の別のフォールディングのための５つのタイムポイント；レーン７〜１１：対照。２５Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡ構造の別のフォールディングのための５つのタイムポイント；レーン１２〜１６：総ｒＲＮＡからの同時フォールディングのための５つのタイムポイント。
【図２９】３７℃で６．５日後の１６ｍＭ  ＭｇＣｌ２の総ＲＮＡからの２５Ｓおよび１８Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡ構造の同時フォールディングのＡＦＭ画像を示す（図２９Ａおよび図２９Ｂは異なる解像度を表す）。
【図３０】１×ＴＡＥ中、５０℃でプロトコル５を用いた２５Ｓおよび１８Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡ構造の同時フォールディングのアガロースゲルを示す。レーン３、４：それぞれ２．５および５日後にテストされた１２ｍＭ  ＭｇＣｌ２；レーン５、６：それぞれ２．５および５日後にテストされた１６ｍＭ  ＭｇＣｌ２；レーン７、８：それぞれ２および４日後にテストされた１２ｍＭ  ＭｇＣｌ２；レーン９、１０：それぞれ２および４日後にテストされた１６ｍＭ  ＭｇＣｌ２。足場：ステープル比は、レーン３〜６では１：０、そしてレーン７〜１０では１：５であった。
【図３１】足場：ステープル比が１：５であった場合の、１２ｍＭ（図３１Ａ）または１６ｍＭ（図３１Ｂ）ＭｇＣｌ２の１×ＴＡＥ中、５０℃で２日間にわたるプロトコル５を用いた２５Ｓおよび１８Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡ構造の同時フォールディングのＡＦＭ画像を示す。図３１Ｃは、多量の反応物中で足場濃度５０ｎＭ、足場：ステープル比  １：５で総ＲＮＡから１２ｍＭにより５０℃で２日間にわたりプロトコル５を用いた２５Ｓおよび１８Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡ構造のフォールディングを示す。
【図３２】連結したステープルと共にプレインキュベートせずに（図３２Ａ）またはプレインキュベートして（図３２Ｂ）５０℃で２日後の２５Ｓ−１８Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡ構造のフォールディングのＡＦＭ画像を示す。フォールディングは、フォールディング緩衝液１×ＴＡＥ、１６ｍＭ  ＭｇＣｌ２中で実施した。
【図３３】Ｓ．セレビシエ２５Ｓ  ｒＲＮＡを足場として用いたｒＲＮＡ−ＤＮＡ立方八面体のための２Ｄ（図３３Ａ）および３Ｄ（図３３Ｂおよび図３３Ｃ）略図を示す。
【図３４】１２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２のフォールディング緩衝液１×ＴＡＥ中で４つの異なるフォールディンプロトコルを用いてフォールディングされた２Ｄ立方八面体のアガロースゲルを示す。レーン１：１ｋｂ  ＤＮＡラダー；レーン２：総ＲＮＡ；レーン３：クリーニングされた総ＲＮＡ；レーン５：任意のフォールディングプロトコルに供されなかったフォールディング混合物（陰性対照）；レーン６：フォールディングプロトコル１；レーン７〜９：プロトコル２＋それぞれ２．５、３．５および４．５日間インキュベーション：レーン１１：プロトコル６；レーン１３〜１４：それぞれ２．５および４．５日にわたる４０℃でのプロトコル５。技術的問題が、レーン９および１４に生じた。
【図３５】２Ｄ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡ立方八面体のＡＦＭ画像を示す；図３５Ａおよび３５Ｂ：プロトコル１。異なる解像度；図３５Ｃ：プロトコル１＋３７℃で２．５日間のインキュベーション；図３５Ｄ：プロトコル６。
【図３６】プロトコル１またはプロトコル６でフォールディングされた３Ｄ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡ立方八面体のアガロースゲルを示す；レーン３、４：それぞれプロトコル１および６の２Ｄフォールディング；レーン５、６：それぞれ３Ｄフォールディングプロトコル１および６；レーン１および４：それぞれ２Ｄおよび３Ｄフォールディングのための全成分の混合物を含有するが、任意のフォールディングプロトコルに供されなかった「フォールディングなし」の陰性対照。フォールディングは、フォールディング緩衝液１×ＴＡＥ、１２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２中で実施した。
【図３７】３Ｄ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡ立方八面体のＡＦＭ画像を示す；図３７Ａ〜Ｃ：プロトコル１、異なる解像度；図３７Ｄ〜Ｆ：プロトコル１、異なる解像度。
【図３８】異なる温度での安定性についてテストされた３０６塩基のｓｓＲＮＡのアガロースゲルを示す；レーン２〜６：それぞれ６５℃で５、１０、２０、４０、および６０分；レーン７〜１１：それぞれ約６０℃で５、１０、２０、４０および６０分；レーン１２〜１６：それぞれ約５５℃で５、１０、２０、４０および６０分；レーン１７〜２１：それぞれ５０℃で５、１０、２０、４０および６０分。
【図３９】３０６ｂ−ＲＮＡ−ＲＮＡフォールディング構造のアガロースゲルを示す。；レーン１：足場；レーン２：ステープル；レーン３〜５：ステープルを２５０ｎＭの一定濃度に保持しながら２５（足場：ステープル  １：１０）、５０（足場：ステープル  １：５）または１００ｎＭ（足場：ステープル  １：２．５）の足場を利用したフォールディング。フォールディングは、フォールディング緩衝液１×ＴＡＥ、１１ｍＭ  ＭｇＣｌ２中で実施した。
【図４０】１００ｎＭの足場を用いた３０６ｂ−ＲＮＡ−ＲＮＡフォールディング構造のＡＦＭ画像を示す（２種の異なる解像度）。
【図４１】フォールディングプロトコル１に従ってフォールディングされ、３７℃で異なる期間、インキュベートされた１８Ｓ  ＲＮＡ−ＲＮＡ構造のアガロースゲルを示す。フォールディングは、総ｒＲＮＡを含むフォールディング緩衝液（１×ＴＡＥ、１２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中で実施した。レーン１：１ｋｂ  ＤＮＡラダー；レーン２：Ｓ．セレビシエから抽出された総ＲＮＡ；レーン３、７および１１；フォールディングされてインキュベートされていない構造、レーン３〜１０：エッジステープルを用いて（３〜６）または用いずに（７〜１０）フォールディングされ、３７℃でそれぞれ０、１、４および７日間インキュベートされた１８Ｓ  ＲＮＡ−ＤＮＡ構造の対照；レーン１１〜１６：それぞれ３７℃で０、１、４、５、６および７日間インキュベートされた１８Ｓ  ｒＲＮＡ−ＲＮＡ（エッジを含まない）フォールディング構造。
【図４２】エッジステープルを含まないプロトコル１を用いてフォールディングされ、３７℃で５日間インキュベートされた、１８Ｓ  ｒＲＮＡ−ＲＮＡ（図４２Ａ）または１８Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡ（図４２Ｂ）のＡＦＭ画像を示す。
【図４３】プロトコル１を用いてフォールディングされ、さらに３７℃で５．５日間インキュベートされた、足場としての大腸菌１６Ｓ  ｒＲＮＡ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜５４を有するステープルを用いて得られた１６Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡ構造のＡＦＭ画像を示す。
【図４４】プロトコル１を用いてフォールディングされ、さらに３７℃で５．５日間インキュベートされた、足場としての大腸菌１６Ｓ  ｒＲＮＡ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５〜８１を有するステープルを用いて得られた１６Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡ構造のＡＦＭ画像を示す。
【図４５】１６ｓ  ｒＲＮＡを標的とする（右パネル）、またはそれを用いない（左パネル）配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５〜８１を有するＤＮＡステープル核酸の存在下での大腸菌Ｋ１２のインキュベーションの影響を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の詳細な記載
ＲＮＡの長鎖が高温で安定していないことは、周知である。実施例１に示される通り、６５℃でのＳ．セレビシエからのリボソームＲＮＡは、安定しておらず、５分後にはほぼ完全に分解した。短いＲＮＡ鎖は、より安定していることが示されており；ＲＮＡオリゴヌクレオチド（ステープル）は、６５℃で最長２時間、安定していた。これらの観察に従うと、ＤＮＡオリガミ構造の作製に用いられる方法は、長いポリヌクレオチド鎖からのＲＮＡオリガミの調製には適用可能でなく、したがって新しい技術の開発が、求められた。驚くべきことに、相対的に高い温度を短時間適用し、次に冷却してより穏やかな温度でインキュベートすることにより、ｒＲＮＡ−ＤＮＡおよびｒＲＮＡ−ＲＮＡオリガミナノ構造のフォールディングを成功させ得ることが、見出された。その上、驚くべきことに、得られたナノ構造を３７℃に近い温度でインキュベートすると、フォールディングの品質および収率が改善されることが、見出された。
【００１９】
本発明は、ＲＮＡ核酸鎖、特にｒＲＮＡ核酸を用いてハイブリッドＲＮＡ−ＤＮＡまたは純粋なＲＮＡ−ＲＮＡ構造のいずれかの核酸オリガミナノ構造を構築することで、核酸オリガミナノ構造をフォールディングするための既知の方法に比較して生産コストを１００〜１０００倍低減する新規な方法を記載している。この経費削減は、ＲＮＡ核酸鎖（即ち、ＲＮＡ核酸の特異的配列のコピー数）がＤＮＡよりも細胞あたりに数桁の規模で多く、任意の所与のネイティブ細菌細胞には、ＤＮＡ分子が１コピーしか存在せず、哺乳動物細胞には２コピー存在するが（染色体あたり１コピー）、特異的ＲＮＡ配列は数千コピー／分子（または約１１０ｎｇ／細胞）存在する、というこれまで見落とされてきた要因による当然の結果である。詳細にはリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）は、任意の細胞（細菌、酵母、哺乳動物、その他）の総ＲＮＡの８０〜９０％を構成する。総ＲＮＡの生成は、複雑でなく安価であるため、多量のｒＲＮＡ（グラム単位）を、相対的に低価格で即座に得ることができる。ｓｓＤＡＮのそのような量は、３〜４桁高価であろう。
【００２０】
したがって本発明は、１つまたは複数の足場核酸鎖と、複数のステープル核酸鎖と、を含むＲＮＡオリガミナノ構造であって、該１つまたは複数の足場核酸が、ＲＮＡ核酸鎖、その断片または類似体を含む、ＲＮＡオリガミナノ構造を提供する。幾つかの実施形態によれば、該複数のステープル核酸は、ステープルの組を定義する。用語「ステープルの組」および「ステープル核酸の組」は、本明細書では互換的に用いられ、特異的足場または足場の組み合わせに基づいて１つのＲＮＡオリガミナノ構造をフォールディングするために用いられるステープル核酸鎖の組を指す。一実施形態によれば、該足場は、ＲＮＡ核酸である。
【００２１】
幾つかの実施形態によれば、該ＲＮＡは、細胞由来ＲＮＡである。本明細書で用いられる用語「細胞由来ＲＮＡ」は、細胞から得られた、または細胞により生成されたＲＮＡを指す。そのようなＲＮＡの例は、リボソームＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡおよび他の非コードＲＮＡである。しかしこの用語は、任意のＲＮＡが任意の公知転写技術によりインビトロで合成すること、または人工的に生成することを除外する。周知の通り、細胞由来ＲＮＡの構造は、インビトロで得られたものと著しく異なる。一部として、この差異は、転写後修飾により説明され得る。特定の形状およびフォールディングの任意の設計では、ネイティブの「濁った（ｄｉｒｔｙ）」供給源からの合成および誘導の際に足場鎖のネイティブの構成から差異が生じることが考慮されなければならない。ネイティブｒＲＮＡまたは他のネイティブＲＮＡ分子は、切断以外にも内部修飾を受け、さらにトリミングおよび／またはスプライシングおよび５’キャップ形成を受けるため、インビトロ転写（ＩＶＴ）または合成で作製されたＲＮＡと異なる。ｐｒｅ−ｒＲＮＡは、合成と同時に、またはその直後に、内部修飾を受ける。ｒＲＮＡ中に見出された３種の基本的修飾が、塩基メチル化、リボースメチル化、およびシュードウリジン化である。これらのｒＲＮＡおよびｐｒｅ−ｒＲＮＡ修飾は、真核および原核細胞の両方に見出される。例えば、Ｓ．セレビシエのｒＲＮＡは、１０の塩基メチルと、５５の２’−Ｏ−リボースメチルと、４４のシュードウリジンと、の合計１１２の修飾塩基を有する（例えば、Ｂａｃｈｅｌｌｅｒｉｅ  ＆  Ｃａｖａｉｌｌｅ，  １９９８，  Ｈ．  Ｇｒｏｓｊｅａｎ  ＆  Ｒ．  Ｂｅｎｎｅ  （Ｅｄｓ．），  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｄｉｔｉｎｇ  ｏｆ  ＲＮＡ  （ｐｐ．  ２５５−２７２）；    Ｏｆｅｎｇａｎｄ  ＆  Ｆｏｕｒｎｉｅｒ，  １９９８，  Ｈ．  Ｇｒｏｓｊｅａｎ  ＆  Ｒ．  Ｂｅｎｎｅ  （Ｅｄｓ．），  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｄｉｔｉｎｇ  ｏｆ  ＲＮＡ（ｐｐ．  ２２９−２５４）内）。これらの修飾は、ｒＲＮＡ構造、機能およびｒＲＮＡフォールディングを先導する際に重要な役割を担う。
【００２２】
一実施形態によれば、該ＲＮＡ核酸鎖は、リボソームＲＮＡ核酸（ｒＲＮＡ）であり、したがって本発明は、一態様において、１つまたは複数の足場核酸鎖と、複数のステープル核酸鎖と、を含むＲＮＡオリガミナノ構造であって、該１つまたは複数の足場核酸鎖が、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）核酸鎖（複数可）、その断片または類似体を含む、ＲＮＡオリガミナノ構造を提供する。幾つかの実施形態によれば、該ＲＮＡ核酸は、ポリヌクレオチドであり、そして／または該ステープル核酸鎖は、オリゴヌクレオチドである。一実施形態によれば、本発明は、１つまたは複数の足場ポリヌクレオチド鎖と、複数のステープルオリゴヌクレオチド鎖と、を含むＲＮＡオリガミナノ構造であって、該１つまたは複数の足場ポリヌクレオチド鎖が、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）ポリヌクレオチド鎖（複数可）、その断片もしくは類似体を含む、またはリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）ポリヌクレオチド鎖（複数可）、その断片もしくは類似体である、ＲＮＡオリガミナノ構造を提供する。
【００２３】
用語「核酸オリガミナノ構造」、「オリガミナノ構造」、「ナノ構造」および「ＲＮＡオリガミナノ構造」は、本明細書では互換的に用いられ、ｒＲＮＡ足場核酸（例えば、ポリヌクレオチド）など、足場（複数可）としてのＲＮＡポリヌクレオチド鎖（複数可）と、複数のステープル核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）と、を含み、該足場が該ステープルによって所望の２Ｄまたは３Ｄ構造にフォールディングされる、２次元または３次元の形状をあつらえたナノ構造を指す。
【００２４】
一般に、該核酸オリガミナノ構造は、「ステープル」と称される複数の合理的に設計された核酸を用いて、「足場」と称される１つまたは複数の長い核酸を特別な形状にフォールディングすることにより得られる。ステープル核酸の配列は、足場核酸の少なくとも２つの非連続配列とハイブリダイズし、それゆえ特別な形状へのフォールディングを押し進めるように設計される。
【００２５】
用語「核酸」は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの配列（ポリマー）を指す。加えて、該ポリヌクレオチドは、具体的に言及されない限り、天然のポリヌクレオチドの類似体を包含する。該核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、およびそれらの類似体から選択されてもよいが、それらに限定されない。該用語は、一本鎖または二本鎖のいずれかのＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびにそれらの化学修飾を包含する。
【００２６】
本明細書で用いられる用語「ポリヌクレオチド」は、２００を超えるヌクレオチドを含む長い核酸を指す。幾つかの実施形態において、ポリヌクレオチドおよび「足場」という用語は、互換的に用いられる。
【００２７】
本明細書で用いられる用語「オリゴヌクレオチド」は、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはそのミメティクスなどの核酸の短い配列を指し、該核酸は、典型的には２００以下のヌクレオチドを有する。
【００２８】
用語「ヌクレオチド塩基」および「ヌクレオチド」および「核酸塩基」は、本明細書では互換的に用いられ、ＤＮＡまたはＲＮＡ塩基、およびそれらの任意の修飾を指す。
【００２９】
用語「足場」、「足場鎖」、「足場核酸鎖」および「足場核酸」は、本明細書では互換的に用いられ、長い一本鎖ＲＮＡ核酸を指す。ＲＮＡ足場の非限定的例が、ｒＲＮＡ核酸、例えばＣ．エレガンス  ２６Ｓまたは１８Ｓ  ｒＲＮＡ核酸鎖である。該ＲＮＡポリヌクレオチドは、幾つかの実施形態において、１０００以上のヌクレオチドを含んでいてもよい。幾つかの実施形態によれば、足場ポリヌクレオチドは、約１１００〜約２００００のＲＮＡ塩基を含む。幾つかの実施形態によれば、該足場核酸は、ポリヌクレオチドである。
【００３０】
用語「ステープル」、「ステープル鎖」、「ステープル核酸」、および「ステープル核酸鎖」は、本明細書では互換的に用いられ、足場核酸鎖とハイブリダイズするように、特に足場核酸内の少なくとも２つの非連続配列とハイブリダイズするように設計された一本鎖核酸を指す。幾つかの実施形態によれば、該ステープルは、合成核酸である。ステープル核酸と２つ以上の非連続断片とのハイブリダイゼーションは、これらの断片の並置を押し進め、それゆえ足場が特別な２Ｄまたは３Ｄ構造にフォールディングするように押し進める。幾つかの実施形態によれば、該ステープル核酸は、オリゴヌクレオチドである。したがって幾つかの実施形態において、用語「ステープル核酸」および「ステープルオリゴヌクレオチド」は、互換的に用いられてもよい。幾つかの実施形態によれば、該ステープルは、ＲＮＡ核酸である。他の実施形態によれば、該ステープルは、ＤＮＡ核酸である。幾つかの実施形態によれば、該ステープルは、ＲＮＡオリゴヌクレオチドである。他の実施形態によれば、該ステープルは、ＤＮＡオリゴヌクレオチドである。さらなる実施形態において、該ステープルオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡおよびＲＮＡオリゴヌクレオチドの両方である。幾つかの実施形態において、該用語「オリゴヌクレオチド」および「ステープル」は、互換的に用いられる。幾つかの実施形態によれば、該ステープルオリゴヌクレオチドは、該足場ポリヌクレオチド内の２つ以上の非連続配列に同時にハイブリダイズする、または特異的に結合する。したがって一実施形態において、該ステープル核酸は、それぞれが足場配列に相補的な配列を含む領域を２つ以上含む。一実施形態によれば、該ステープル核酸は、結合する足場核酸の各断片と相補的な配列を少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％  または９５％有する。他の実施形態によれば、該ステープル核酸は、結合する足場核酸の各断片と相補的な配列を少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％有する。幾つかの実施形態によれば、該ステープルオリゴヌクレオチドは、２つの結合領域の間に非結合領域を有する。本明細書で参照される用語「相補的な」は、核酸の鎖の間の塩基対合を対象とする。当該技術分野で公知の通り、核酸の各鎖は、別の鎖に対して相補的で、鎖間の塩基対が２つまたは３つの水素結合を介して非共有結合で連結され得る。例えば「１００％相補的な」は、各鎖内の全ヌクレオチドが相補鎖と塩基対を形成していることを示す。例えば「９５％相補的な」は、各鎖内のヌクレオチドの９５％が相補鎖と塩基対を形成していることを示す。充分に相補的という用語は、約３０％〜約１００％の相補性の任意のパーセンテージを包含してもよい。
【００３１】
本発明の任意の態様および実施形態によれば、特異的足場または特異的足場の組み合わせに基づいて１つのＲＮＡオリガミナノ構造をフォールディングするのに用いられる複数のステープル核酸が、ステープルの組である。幾つかの実施形態によれば、該ステープルの組は、足場の断片と相補的な核酸をさらに含む。幾つかの実施形態において、本発明は、１つまたは複数の足場核酸鎖と、ステープル核酸鎖の組と、を含むＲＮＡオリガミナノ構造であって、該１つまたは複数の足場核酸が、ＲＮＡ核酸鎖、その断片または類似体を含む、ＲＮＡオリガミナノ構造を提供する。一実施形態によれば、該ＲＮＡは、ｒＲＮＡである。本明細書で用いられる用語「断片」は、ネイティブｒＲＮＡ核酸の断片などの足場核酸の一部または断片を指す。幾つかの実施形態によれば、断片という用語は、ネイティブｒＲＮＡ核酸の約５０％〜約９９％、約６０％〜約９８％、約７０％〜約９７％、約７５％〜約９６％、約８０％〜約９５％、約８５％〜約９２％または約８７〜約９０％を含む核酸に対応する。他の実施形態によれば、該断片は、ネイティブｒＲＮＡ核酸の１０％〜６０％、２０％〜５０％、３０％〜４０％を含む。幾つかの実施形態によれば、該断片は、２００を超える、３００を超える、５００を超える、７００を超える、または７５０を超える塩基を含む。一実施形態によれば、該断片は、８００を超える、９００を超える、１０００を超える、１１００を超える、１２００を超える、１３００を超える、１５００を超える、１７００を超える、２０００を超える、２５００を超える、２８００を超える、３０００を超える、３５００を超える、または４０００を超える塩基を含む。別の実施形態によれば、足場核酸鎖の断片は、約７００〜約２００００、約７５０〜約１５０００、約８００〜約１３０００、約８５０〜約１２０００、約９００〜約１１０００、約１０００〜約１００００、約１１００〜約８０００、約１２００〜約５０００、または約１３００〜約４０００ヌクレオチドを含む。さらなる実施形態によれば、該断片は、約１５００〜約３５００、約１８００〜約３０００、約２０００〜約３８００、または約２５００〜約３５００ヌクレオチドを含む。さらに別の実施形態によれば、該断片は、約２８００〜約３２００  または約３０００の塩基を含む。より具体的な実施形態によれば、該足場核酸鎖は、約１６００〜約３５００ヌクレオチドを含む。他の実施形態によれば、該断片は、約２００〜約５０００、約３００〜約４０００、約４００〜約３０００、約５００〜約２０００または約６００〜約１８００ヌクレオチド塩基を含む。そのような実施形態によれば、該足場核酸は、ポリヌクレオチドである。
【００３２】
用語「類似体」および「変異体」は、本明細書では互換的に用いられ、１つまたは複数の修飾または置換されたヌクレオチドを有するＲＮＡ核酸を指す。そのような置換されたＲＮＡは、ヌクレアーゼへの耐性を付与するヌクレオチド（複数可）を含んでいてもよい。そのような置換された核酸の例としては、２’−フルオロ−２’デオキシシチジンまたは２’−フルオロ−２’−デオキシウリジン残基を含む２’−フルオロ−ピリミジンなどの置換されたピリミジンが挙げられる。該置換されたピリミジンはまた、２’−アミノ−２’−デオキシシチジンまたは２’−アミノ−２’−デオキシウリジン残基などの２’−アミノ−ピリミジンを含んでいてもよい。該ヌクレオチドはまた、２’−フルオロ−２’−デオキシアデニンまたは２’−フルオロ−２’−デオキシグアニジン残基をはじめとする２’−フルオロ−プリンなどの置換されたプリンを含んでいてもよい。同じく包含されるのは、２’−アミノ−２’デオキシアデニンまたは２’−アミノ−２’−デオキシグアニジン残基をはじめとする２’−アミノ−プリンを含む置換されたプリンである。他の企図される修飾は、ビオチン結合、メチル化、リン酸化、ＳＳ、ＮＨ、フルオロフォアの付着である。類似体という用語は、ネイティブｒＲＮＡおよびその断片の両方を指す。この用語はまた、ＤＮＡまたはＲＮＡステープルのいずれかのステープルの修飾を指す。１つの特別な実施形態において、該ＲＮＡステープルは、修飾されている。
【００３３】
幾つかの実施形態によれば、該足場核酸鎖は、単離されたＲＮＡ核酸である。一実施形態によれば、該単離されたＲＮＡは、単離されたｒＲＮＡ核酸鎖である。ｒＲＮＡが、細胞内でタンパク質および追加のｒＲＮＡとの複合体中にリボソームの一部として存在することは、周知である。そのため、該単離されたｒＲＮＡ鎖は、ネイティブｒＲＮＡと完全に異なる構造および機能を有する。幾つかの実施形態によれば、該足場核酸は、ｒＲＮＡの単離された断片、またはｒＲＮＡの単離された類似体、またはｒＲＮＡ核酸の断片の単離された類似体である。そのような実施形態によれば、該足場核酸は、ポリヌクレオチドである。
【００３４】
本明細書の先に定義された通り、該足場核酸鎖は、長いｒＲＮＡ核酸である。幾つかの実施形態によれば、該足場核酸は、ポリヌクレオチドである。一実施形態によれば、該足場ポリヌクレオチドは、少なくとも８００ヌクレオチドを含む。別の実施形態によれば、該足場鎖は、約１０００以上のヌクレオチド塩基を含む。さらなる実施形態によれば、該足場ポリヌクレオチドは、２００を超える、３００を超える、５００を超える、７００を超える、または７５０を超える塩基を含む。さらなる実施形態によれば、該足場ポリヌクレオチドは、８００を超える、９００を超える、１０００を超える、１１００を超える、１２００を超える、１３００を超える、１５００を超える、１７００を超える、２０００を超える、２５００を超える、２８００を超える、３０００を超える、３５００を超える、または４０００を超える塩基を含む。別の実施形態によれば、該足場ポリヌクレオチド鎖は、約７００〜約２００００、約７５０〜約１５０００、約８００〜約１３０００、約８５０〜約１２０００、約９００〜約１１０００、約１０００〜約１００００、約１１００〜約８０００、約１２００〜約５０００、または約１３００〜約４０００ヌクレオチドを含む。さらなる実施形態によれば、該足場ポリヌクレオチドは、約１５００〜約３５００、約１８００〜約３０００、約２０００〜約３８００、または約２５００〜約３５００ヌクレオチドを含む。さらに別の実施形態によれば、該足場ポリヌクレオチドは、約２８００〜約３２００または約３０００の塩基を含む。より具体的な実施形態によれば、該足場ポリヌクレオチドは、約１６００〜約３５００ヌクレオチド塩基を含む。他の実施形態によれば、該ポリヌクレオチド、その断片または類似体は、約２００〜約５０００、約３００〜約４０００、約４００〜約３０００、約５００〜約２０００または約６００〜約１８００ヌクレオチド塩基を含む。
【００３５】
上記実施形態の任意の１つによれば、該ｒＲＮＡ核酸鎖は、原核生物および真核生物のｒＲＮＡ核酸から選択される。一実施形態によれば、該ｒＲＮＡ核酸は、原核生物のｒＲＮＡ核酸である。別の実施形態によれば、ｒＲＮＡ核酸は、真核生物のｒＲＮＡ核酸である。幾つかの実施形態によれば、該ｒＲＮＡは、４５Ｓ、４７Ｓ、４０Ｓ、３７Ｓおよび３５Ｓ  ｐｒｅ−ｒＲＮＡなどの前駆体ｒＲＮＡ（ｐｒｅ−ｒＲＮＡ）である。一実施形態によれば、該原核生物のｒＲＮＡは、細菌性ｒＲＮＡである。別の実施形態によれば、該原核生物のｒＲＮＡは、古細菌性ｒＲＮＡである。そのような実施形態によれば、該足場核酸は、ポリヌクレオチドである。
【００３６】
幾つかの実施形態によれば、該原核生物のｒＲＮＡは、非病原菌のｒＲＮＡである。幾つかの実施形態によれば、該ｒＲＮＡは、ビフィドバクテリウムｓｐｐ．（例えば、ビフィドゥム、ロングム、インファンティス）、ラクトバチルスｓｐｐ．（例えば、ブルガリカス、アシドフィルス、ラクティス、ヘルベティカス、カゼイ、プランタルム、ロイテリ、デルブルエッキー、チャムノサス（ｃｈａｍｎｏｓｕｓ）、ジョンソニー、パラカゼイ）、ストレプトコッカスｓｐｐ．（例えば、サーモフィルス、ジアセチラクティス、クレモリス、デュランス、フェカリス）、サッカロマイセスｓｐｐ．（例えば、ポンベ、ボウラルディー（ｂｏｕｌａｒｄｉｉ））、ロイコノストックｓｐｐ．（例えば、シトロボラム、デキストラニカス）およびバチルスｓｐ．（例えば、パストゥリ）、ラクトコッカス、ストレプトマイセス、およびサーモトガのｒＲＮＡから選択される。原核生物のｒＲＮＡ鎖の非限定的例は、大腸菌、ストレプトコッカス・エピデルミディス、ラクトバチルス・アシドフィルス、およびビフィドバクテリアのｒＲＮＡ鎖である。より特別な実施形態において、該原核生物のｒＲＮＡは、原核生物１６Ｓ、２３Ｓ（植物もしくは真菌２５Ｓ−２６Ｓ  ｒＲＮＡ、または真核生物２８Ｓ  ｒＲＮＡの類似体）、または５Ｓ  ｒＲＮＡ核酸である。１つのより特別な実施形態において、該ｒＲＮＡ核酸鎖は、大腸菌、ストレプトコッカス・エピデルミディス、ラクトバチルス・アシドフィルス、またはビフィドバクテリアの１６Ｓまたは２３Ｓ  ｒＲＮＡ核酸鎖である。
【００３７】
幾つかの実施形態によれば、該ｒＲＮＡは、真核生物のｒＲＮＡである。一実施形態によれば、該真核生物は、酵母、真菌、植物、無脊椎動物、および脊椎動物から選択される。特定の実施形態において、該酵母は、ファフィア・ロドジーマ、サッカロマイセス・セレビシエ、シゾサッカロマイセス・ポンベ、ピキア・パストリス、ピキア・スチピティス、カンジダ・ウティリス、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・ギリエルモンディまたはクリプトコッカス・アルビドゥスである。特定の他の実施形態において、該真菌は、メタリジウム・フラビボリド（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ  ｆｌａｖｉｖｏｒｉｄｅ）、ビューベリア・バッシアナ、ペシロマイセス・フモソレウス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｍｏｓｏｒｅｕｓ）またはグラジオクラジウム・フィムブリアタムである。特定の他に実施形態において、該植物は、テキサス・ブレビフォリアである。他の実施形態において、無脊椎動物は、線虫（例えば、Ｃ．エレガンス）または昆虫（例えば、トリコプルシア・ニ）である。他の実施形態において、該脊椎動物は、爬虫類、両生類、鳥、魚、または哺乳動物である。特定のさらなる実施形態において、該哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類、ウシ、ウマ、ヒツジ、およびブタである。別の実施形態において、該古細菌は、マリノコッカスまたはスルフォロブス・シバタエ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｈｉｂａｔａｅ）である。一実施形態によれば、該真核生物のｒＲＮＡ核酸鎖は、Ｓ．セレビシエ、酵母、ヒト、植物およびウシのｒＲＮＡ核酸から選択される。特別な実施形態によれば、該真核生物のｒＲＮＡ核酸は、真核生物の２６Ｓ、５Ｓ、５．８Ｓ、２８Ｓ、１８Ｓ、２５Ｓ、４５Ｓおよび３５Ｓ  ｒＲＮＡ核酸から選択される。より特別な実施形態によれば、該ｒＲＮＡ核酸は、ヒトまたはウシの２８Ｓまたは１８Ｓ  ｒＲＮＡヌクレオチドから選択される。一実施形態によれば、該ｒＲＮＡは、サッカロマイセス・セレビシエの２５Ｓまたは１８ＳのｒＲＮＡポリヌクレオチドである。ｒＲＮＡの名称に関する分野には、若干の不一致がある。例えば２５Ｓおよび２６Ｓ  ｒＲＮＡは、同一のｒＲＮＡを指す場合があり、２８Ｓ  ｒＲＮＡと類似する場合があり、それゆえ用語「２５Ｓ  ｒＲＮＡ」、「２６Ｓ  ｒＲＮＡ」および「２８Ｓ  ｒＲＮＡ」は、幾つかの実施形態において互換的に用いられてもよい。そのような実施形態によれば、該足場核酸は、ポリヌクレオチドであってもよい。
【００３８】
他の実施形態によれば、該ｒＲＮＡ核酸鎖は、スルフォロブスのｒＲＮＡ核酸などの古細菌性ｒＲＮＡ核酸である。
【００３９】
先に議論された通り、ＲＮＡオリガミ構造の作製は、複数の合理的に設計されたステープル核酸を用いて、一本鎖足場核酸鎖（複数可）を特別な形状にフォールディングすることを含む。該足場および該ステープルは、２本鎖核酸またはポリヌクレオチドを形成する。上記実施形態の任意の１つによれば、本発明の足場およびステープルは、Ａ型ＤＮＡ二重らせんの幾何学的配置と類似し、Ａ型ＤＮＡ二重らせんと類似の構造的特性を有する、Ａ型コンフォメーション、例えばＡ型ＲＮＡ：ＲＮＡまたはＡ型ＲＮＡ：ＤＮＡコンフォメーションを有する二重らせんを形成する。
【００４０】
一実施形態によれば、本発明によるステープル核酸は、ＤＮＡ核酸である。別の実施形態によれば、該ステープル核酸は、ＲＮＡ核酸である。さらなる実施形態によれば、該ステープル核酸は、ＲＮＡ核酸とＤＮＡ核酸の組み合わせである。一実施形態によれば、該ステープルは、１０〜３００ヌクレオチド、１５〜２８０、２０〜２５０、２５〜２２０、３０〜２００、３５〜１８０、４０〜１５０、５０〜１２０、または７０〜１００ヌクレオチドからなる。幾つかの実施形態によれば、該ステープル核酸は、ステープルオリゴヌクレオチドである。幾つかの実施形態によれば、該ステープルオリゴヌクレオチドは、５〜１２０または１０〜１００ヌクレオチドからなる。一実施形態によれば、該ステープルオリゴヌクレオチドは、５〜８０ヌクレオチドからなる。別の実施形態によれば、該ステープルオリゴヌクレオチドは、６〜６０、７〜５０または８〜４５ヌクレオチドからなる。さらなる実施形態によれば、該ステープルオリゴヌクレオチドは、１０〜４５または１５〜４０ヌクレオチドからなる。特定の実施形態によれば、該ステープルオリゴヌクレオチドは、７〜７５ヌクレオチドからなる。幾つかの実施形態によれば、該ステープルは、ＲＮＡ核酸ステープルである。一実施形態によれば、該足場および該ＲＮＡ核酸ステープルは、Ａ型コンフォメーション二重らせんを形成している。本明細書で用いられる用語「Ａ型コンフォメーション」は、Ａ型ＤＮＡ二重らせんと類似の特徴を有するポリヌクレオチド二重らせんを指す。それゆえ、用語「Ａ型ＲＮＡ：ＲＮＡ」、「Ａ型ＲＮＡ」は、本明細書では互換的に用いられ、Ａ型コンフォメーションの幾何学的配置を有するＲＮＡ−ＲＮＡ二重らせん（Ａ型らせん）を指し、用語「Ａ型ＲＮＡ：ＤＮＡ」および「Ａ型ＤＮＡ」は、本明細書では互換的に用いられ、Ａ型コンフォメーションの幾何学的配置を有するＲＮＡ−ＤＮＡ二重らせんを指す。１つの特別な実施形態によれば、該足場および該ＲＮＡステープルは、ターンあたり１２塩基対の周期性を有するＡ型ＲＮＡ：ＲＮＡ二重らせんを形成している。用語「ターンあたりの塩基対」および「ターンあたりのヌクレオチド」は、互換的に用いられる。用語「ターンあたりのヌクレオチド」は、らせんの１ターン中に見出される二本鎖構造中の一本鎖足場核酸のヌクレオチド数を指す。一実施形態によれば、該ＲＮＡ核酸ステープルは、足場によりＡ型ＲＮＡ：ＲＮＡ二重らせんを形成するように設計されている。より特別な実施形態において、該ＲＮＡ核酸ステープルは、ターンあたり１２塩基対のらせん周期性を形成する足場によりＡ型ＲＮＡ：ＲＮＡ二重らせんを形成するように設計されている。したがって一実施形態において、本発明は、１つまたは複数の足場ｒＲＭＡ核酸鎖と、複数のステープルＲＮＡ核酸鎖と、を含むＲＮＡオリガミナノ構造であって、該足場および該ステープルが、ターンあたり１２塩基対を有するＲＮＡ−ＲＮＡ二重らせんを形成している、ＲＮＡオリガミナノ構造を提供する。場合により、該ＲＮＡ−ＲＮＡ二重らせんは、Ａ型コンフォメーションの幾何学的配置を有する。実施例、例えば実施例２２〜２４に示される通り、ｒＲＮＡステープルを用いてターンあたり１２塩基対を有するＡ型コンフォメーションの幾何学的配置を形成することで、高収率のｒＲＮＡ−ＲＮＡオリガミナノ構造が得られる。そのような実施形態によれば、該足場は、２８Ｓ、２５Ｓ、２６Ｓ、１８Ｓ  ｒＲＮＡまたはそれらの組み合わせから選択される。他のそのような実施形態によれば、該足場は、５Ｓおよび５．８Ｓ、２８Ｓ、２５Ｓ、２６Ｓ、１８Ｓ  ｒＲＮＡ、またはそれらの任意の組み合わせから選択される。一実施形態によれば、該足場は、ポリヌクレオチドであり、そして／または該ステープルは、オリゴヌクレオチドである。
【００４１】
一実施形態によれば、該ステープルは、ＤＮＡステープルである。一実施形態によれば、該足場および該ＤＮＡステープルは、ＲＮＡ：ＤＮＡのＡ型コンフォメーション二重らせんを形成している。幾つかの実施形態によれば、該ＲＮＡオリガミナノ構造は、ＲＮＡステープルおよびＤＮＡステープルの両方を含む。幾つかの実施形態によれば、該ＲＮＡ：ＤＮＡ  Ａ型コンフォメーション二重らせんは、ターンあたり１１塩基対を有する。
【００４２】
上記実施形態の任意の１つによれば、該ＲＮＡオリガミナノ構造は、複数の足場核酸鎖を含む。該足場核酸は、先に定義された通りである。一実施形態によれば、該ＲＮＡオリガミナノ構造は、２〜１０、３〜９、４〜８または５〜７の足場核酸を含む。別の実施形態によれば、該ＲＮＡオリガミナノ構造は、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の核酸またはポリヌクレオチド鎖を含む。幾つかの実施形態によれば、全ての足場核酸は、同じ配列、即ち１つの核酸の複数のコピーを有する。他の実施形態によれば、該足場核酸は、異なる核酸であり、即ち異なる配列を有する。一実施形態によれば、ＲＮＡオリガミナノ構造は、２、３または４足場核酸を含み、それらの全てが、異なる配列を有する。幾つかの実施形態によれば、該足場核酸は、真核生物および／または細菌性ｒＲＮＡ核酸である。１つの特別な実施形態によれば、該ＲＮＡオリガミナノ構造は、複数の真核生物１８Ｓ  ｒＲＮＡ核酸、複数の真核生物２５Ｓ  ｒＲＮＡ核酸鎖、または１８Ｓ  ｒＲＮＡ核酸鎖と２５Ｓ  ｒＲＮＡ核酸鎖の組み合わせを含む。そのような実施形態によれば、該足場核酸は、ポリヌクレオチドであってもよい。
【００４３】
上記実施形態の任意の１つによれば、足場（複数可）に基づく１つのｒＲＮＡオリガミナノ構造をフォールディングするために必要となる足場（複数可）とステープルの組のモル比（足場：ステープル組のモル比）は、約１：１〜約１：３０である。幾つかの実施形態によれば、該比は、約１：２〜１：２０、１：３〜約１：１５、約１：４〜約１：１２、または約１：６〜約１：８である。別の実施形態によれば、該比は、約１：５〜約１：１０である。幾つかの実施形態によれば、該ステープル核酸は、ステープルオリゴヌクレオチドである。
【００４４】
本発明の実施形態の任意の１つによれば、該用語「含む」はまた、それからなる、そしてそれにより置換され得るという意味を包含する。したがって実施形態において、足場核酸がリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）核酸を含むと定義すると、該実施形態は、該足場核酸がｒＲＮＡからなること、またはｒＲＮＡであることを包含する。
【００４５】
上記実施形態の任意の１つによれば、該ＲＮＡオリガミナノ構造は、活性部分をさらに含む。幾つかの実施形態によれば、該活性部分は、タンパク質、核酸、脂質、糖タンパク質、糖脂質、ｒＲＮＡオリガミ、ＤＮＡオリガミ、および小分子から選択される。幾つかの実施形態によれば、該活性部分は、該ナノ構造の内面に結合されている。別の実施形態によれば、該活性部分は、該ナノ構造の外面に結合されている。さらなる実施形態によれば、該活性部分は、該ＲＮＡオリガミナノ構造内に封入または捕捉される。該用語「活性剤」および「活性部分」は、本明細書では互換的に用いられ、幾つかの薬理学的効果を提供する表題の任意の分子、薬物、化合物、組成物、またはそれらの混合物を指す。
【００４６】
幾つかの実施形態によれば、該活性部分は、該ＲＮＡオリガミナノ構造の内面または外面に共有結合されている。一実施形態によれば、該活性部分は、表面の一方、即ち内面または外面に直接結合している。他の実施形態によれば、該活性部分は、ハンドルを介して結合されている。別の実施形態によれば、該活性部分は、リンカーを介して該表面または該ハンドルに結合されている。本明細書で用いられる用語「ハンドル」は、活性部分に結合することが可能なステープル、または該活性部分に結合された他の物体を指す。本明細書で用いられる用語「リンカー」は、該活性部分をＲＮＡオリガミナノ構造またはハンドルに連結させる任意の非ステープル分子を指す。この用語は、ステープルでないオリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、有機および無機分子を含む。
【００４７】
上記実施形態の任意の１つによれば、該ＲＮＡオリガミナノ構造は、標的ドメインを含む。一実施形態によれば、該標的ドメインは、ナノ構造の外面に配置されている。他の実施形態によれば、該標的ドメインは、内面、または外面と内面の両方に配置されている。本明細書で用いられる用語「標的ドメイン」は、標的分子に特異的に結合することが可能な任意の分子、例えばステープルなどの核酸分子を指す。
【００４８】
該標的ドメインは、当該技術分野で公知の方法を利用して、本質的に該当する任意の標的分子を標的とするように設計され得る。例えば、該当する標的に特異的なアプタマーを設計する方法は、米国特許第５，５８２，９８１号、同第５，７５６，２９１号、同第５，８４０，８６７号および同第７，７４５，６０７号、ならびにＴａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，  Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  ７９：４９００−４９０７（２００７）に見出すことができ、それらの文書はそれぞれ、全体とし参照により本明細書に組み入れられる。一実施形態によれば、該標的ドメインは、アプタマーである。他の実施形態によれば、該標的ドメインは、ポリ−ＰＮＡである。
【００４９】
一実施形態によれば、該標的分子は、腫瘍関連分子、細胞膜受容体、成長因子、または病原性抗原から選択される。
【００５０】
本発明のＲＮＡオリガミナノ構造は、例えば環境刺激に応答して、１つのコンフォメーション（例えば、クローズ型コンフォメーション）から別のコンフォメーション（例えば、オープン型コンフォメーション）への変移を受けることができる。本明細書で用いられる用語「クローズ型コンフォメーション」は、ＲＮＡオリガミナノ構造の表面の一部が環境から立体的に分離または遮蔽された立体配座を指す。本明細書で用いられる用語「オープン型コンフォメーション」は、全ての利用可能なＲＮＡオリガミナノ構造の表面が環境に暴露されたコンフォメーションを指す。本明細書で用いられる用語「内面」は、ＲＮＡオリガミナノ構造の隣接する環境に暴露されておらず、接触していない、ＲＮＡオリガミナノ構造の任意の表面積を指す。本明細書で用いられる用語「外面」は、ＲＮＡオリガミナノ構造の隣接する環境に暴露されたＲＮＡオリガミナノ構造の任意の表面積を指す。
【００５１】
幾つかの実施形態によれば、本発明のＲＮＡオリガミナノ構造は、オープン型またはクローズ型コンフォメーションで存在し得る。一実施形態によれば、ラッチドメインを含む本発明のＲＮＡオリガミナノ構造。一実施形態によれば、該ラッチドメインと該標的ドメインは、ハイブリダイズすることが可能で、したがって該ＲＮＡオリガミナノ構造をクローズ型コンフォメーションに維持することが可能である。別の実施形態によれば、該ラッチドメインおよび該標的ドメインは、標的分子への標的ドメインの結合の際に離脱し、それにより該ナノ構造をクローズ型コンフォメーションからオープン型コンフォメーションへ変移させることを可能にする。他の実施形態によれば、該ラッチドメインは、環境刺激の際に標的ドメインとハイブリダイズし、それによりオープン型コンフォメーションからクローズ型コンフォメーションに変化する。本明細書で用いられる用語「ラッチドメイン」は、標的ドメイン、例えばアプタマーにハイブリダイズすることが可能な核酸ドメインを指し、それにより該核酸オリガミナノ構造をクローズ型コンフォメーションに固定する。
【００５２】
幾つかの実施形態によれば、クローズ型コンフォメーションからオープン型コンフォメーションへの変換の際に、該活性部分は、内面から外面に移動する。別の実施形態によれば、オープン型コンフォメーションからクローズ型コンフォメーションへの変換の際に、該活性部分は、外面から内面に移動する。
【００５３】
したがって一実施形態によれば、該ＲＮＡオリガミナノ構造は、標的ドメインにハイブリダイズされたラッチドメインを含み、該標的ドメインおよび該ラッチドメインは、標的分子への標的ドメインの結合の際に離脱し、それによりナノ構造をクローズ型コンフォメーションからオープン型コンフォメーションに変移させることを可能にする。
【００５４】
上記実施形態の任意の１つによれば、該足場ポリヌクレオチドは、核酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を含む。特別な実施形態によれば、該足場ポリヌクレオチドは、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の長さの約５０％〜約９９％、約６０％〜約９０％、約７０％〜約８０％、約８０％〜約９９％、約８５％〜約９８％、約９０％〜約９７％、約９２％〜約９５％、または約９５％〜約９９％の配列を含む、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の断片である配列を含む。さらなる実施形態によれば、該足場ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の類似体またはその断片である配列を含む。幾つかの実施形態によれば、該足場ポリヌクレオチドは、核酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１からなる。
【００５５】
本発明の態様および実施形態の任意の１つによれば、用語「ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：Ｘで示された核酸配列を含む核酸」、「ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：Ｘで示された配列を含む核酸」、「ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：Ｘを含む核酸」および「ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：Ｘを有する核酸」は、本明細書では互換的に用いられる。用語「ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：Ｘで示された核酸配列からなる核酸」、「ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：Ｘで示された配列からなる核酸」、「ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：Ｘからなる核酸」および「ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：Ｘの核酸」は、本明細書では互換的に用いられる。本発明の態様および実施形態の任意の１つにおいて、含むという用語は、からなる、という用語も包含し、それゆえ本発明の態様および実施形態の任意の１つにおいて、用語「配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：Ｘを含む核酸」は、用語「配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：Ｘからなる核酸」を包含し、それにより置換えることができる。これらの言明は、ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドについてもあてはまる。
【００５６】
そのような実施形態によれば、該ＲＮＡオリガミナノ構造は、核酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を含む足場ポリヌクレオチドと、ＤＮＡ核酸であるステープル核酸、即ちＤＮＡステープルオリゴヌクレオチドと、を含む。一実施形態によれば、該ステープルオリゴヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜５５で示される配列を有する。別の実施形態によれば、そのようなＲＮＡオリガミナノ構造は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６〜６７で示される配列を有するＤＮＡステープルオリゴヌクレオチドをさらに含む。したがって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜５５で示される配列を有するステープルオリゴヌクレオチドは、ステープルの組を定義する。しかしそのようなＲＮＡオリガミナノ構造は、その組の幾つかのステープルオリゴヌクレオチドを欠いていてもよい。したがって一実施形態によれば、該ＲＮＡオリガミナノ構造は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜５５で示される配列を有するステープルオリゴヌクレオチドの組の約５０％〜約９９％、約６０〜約９５％、約７０％〜約９０％、または約８０％〜８５％を含む。
【００５７】
別のそのような実施形態によれば、該ＲＮＡオリガミナノ構造は、ＲＮＡ核酸であるステープル核酸、即ちＲＮＡステープルオリゴヌクレオチドを含む。一実施形態によれば、該ステープルオリゴヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０８〜５６１で示される配列を有する。別の実施形態によれば、該ＲＮＡオリガミナノ構造は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６２〜５７３で示される配列を有するＲＮＡステープルオリゴヌクレオチドをさらに含む。一実施形態によれば、該ＲＮＡオリガミナノ構造は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０８〜５６１またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６２〜５７３で示される配列を有するステープルオリゴヌクレオチドの組の約５０％〜約９９％、約６０〜約９５％、約７０％〜約９０％、または約８０％〜８５％を含む。同様に、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜６７を有するステープルオリゴヌクレオチドは、ステープルの組を定義する。
【００５８】
別の実施形態によれば、該ＲＮＡオリガミナノ構造は、核酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を含む足場ポリヌクレオチドと、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５５〜６９５で示される配列を有するステープルオリゴヌクレオチドと、を含む。一実施形態によれば、該ＲＮＡオリガミナノ構造は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５５〜６９５で示される配列を有するステープルオリゴヌクレオチドの組の約５０％〜約９９％、約６０〜約９５％、約７０％〜約９０％、または約８０％〜８５％を含む。
【００５９】
別の実施形態によれば、該ＲＮＡオリガミナノ構造は、ＲＮＡステープル核酸とＤＮＡステープル核酸の組み合わせであるステープル核酸を含む。一実施形態によれば、該ステープルは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜５５および５０８〜５６１で示される配列を有するステープルの組み合わせである。別の実施形態によれば、該ＲＮＡオリガミナノ構造は、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６〜６７を有するステープルと、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６２〜５７３を有するステープルと、の組み合わせをさらに含む。
【００６０】
一実施形態によれば、該ＲＮＡオリガミは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を含む、またはそれからなるポリヌクレオチド足場と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜５５を有するオリゴヌクレオチドを含むステープルの組と、を含む。別の実施形態によれば、該ＲＮＡオリガミは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を含む、またはそれからなるポリヌクレオチド足場と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０８〜５６１を有するオリゴヌクレオチドを含むステープルの組と、を含む。特定の実施形態によれば、該ＲＮＡオリガミは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を含む、またはそれからなるポリヌクレオチド足場と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜６７を有するオリゴヌクレオチドを含むステープルの組と、を含む。さらに別の実施形態によれば、該ＲＮＡオリガミは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を含む、またはそれからなるポリヌクレオチド足場と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０８〜５７３を有するオリゴヌクレオチドを含むステープルの組と、を含む。一実施形態によれば、該ステープルの組は、元のステープルの組の約５０％〜約９９％、約６０〜約９５％、約７０％〜約９０％、または約８０％〜８５％を含む。
【００６１】
さらなる実施形態によれば、そのようなＲＮＡオリガミナノ構造は、活性部分をさらに含む。
【００６２】
幾つかの実施形態によれば、該足場ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８で示される配列を含む。特別な実施形態によれば、該足場ポリヌクレオチド鎖は、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８の断片である配列を含み、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８の長さの約５０％〜約９９％、約６０％〜約９０％、約７０％〜約８０％、約８０％〜約９９％、約８５％〜約９８％、約９０％〜約９７％、約９２％〜約９５％、または約９５％〜約９９％の配列を含む。さらなる実施形態によれば、該足場ポリヌクレオチド鎖は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８の類似体またはその断片の配列を含む。幾つかの実施形態によれば、該足場ポリヌクレオチドは、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８からなる。
【００６３】
そのような実施形態によれば、該ＲＮＡオリガミナノ構造は、ＤＮＡステープル核酸を含む。一実施形態によれば、該ステープルの組は、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９〜１７０を有するステープルオリゴヌクレオチドを含む。別の実施形態によれば、該ステープルの組は、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７１〜１８６を有するステープルオリゴヌクレオチドを含む。さらに別の実施形態によれば、該ステープルオリゴヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６０〜４３７で示される配列を有する。さらなる実施形態によれば、該ステープルの組は、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３８〜５００を有するステープルオリゴヌクレオチドを含み、該ナノ構造は、３Ｄ立方八面体の形態である。
【００６４】
他のそのような実施形態によれば、該ＲＮＡオリガミナノ構造は、ＲＮＡステープル核酸を含む。一実施形態によれば、該ＲＮＡステープルは、Ｔ−ヌクレオチドがＵ−ヌクレオチドで置換された配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９〜１７０を有する。別の実施形態によれば、該ステープルの組は、Ｔ−ヌクレオチドがＵ−ヌクレオチドで置換された配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７１〜１８６を有するステープルオリゴヌクレオチドをさらに含む。特定の実施形態によれば、該ＲＮＡステープルは、Ｔ−ヌクレオチドがＵ−ヌクレオチドで置換された配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６０〜４３７を有する。別の実施形態によれば、該ＲＮＡステープルは、Ｔ−ヌクレオチドがＵ−ヌクレオチドで置換された配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３８〜５００を有し、該ナノ構造は、３Ｄ立方八面体構造の形態である。
【００６５】
一実施形態によれば、該ＲＮＡオリガミナノ構造は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８を含む、またはそれからなる足場ポリヌクレオチドと、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９〜１７０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９〜１８６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６０〜４３７およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３８〜５００を含む組から選択されるステープルの組と、を含む。別の実施形態によれば、該ＲＮＡオリガミナノ構造は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８を含む、またはそれからなる足場ポリヌクレオチドと、ＲＮＡオリゴヌクレオチドであるステープルの組とを含み、該ステープルは、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９〜１７０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９〜１８６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６０〜４３７およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３８〜５００を含む組から選択され、その中でＴ−ヌクレオチドがＵ−ヌクレオチドで置換されている。
【００６６】
幾つかの実施形態によれば、本発明のＲＮＡオリガミナノ構造は、複数の足場核酸を含む。一実施形態によれば、そのようなＲＮＡオリガミナノ構造は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で示される配列を有する少なくとも１つの足場ポリヌクレオチドを含む。別の実施形態によれば、そのようなＲＮＡオリガミナノ構造は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８で示される配列を有する少なくとも１つの足場ポリヌクレオチドを含む。
【００６７】
さらなる実施形態によれば、ＲＮＡオリガミナノ構造は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で示される配列を有する少なくとも１つの足場ポリヌクレオチドと、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８で示される配列を有する少なくとも１つの足場ポリヌクレオチドと、を含む。一実施形態によれば、ＲＮＡオリガミナノ構造は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で示される配列からなる１つの足場ポリヌクレオチドと、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８で示される配列からなる１つの足場ポリヌクレオチドと、を含む。別の実施形態によれば、該ＲＮＡオリガミナノ構造は、Ｔ−ヌクレオチドがＵ−ヌクレオチドで置換されている、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８７〜３５９で示される配列を有するＤＮＡステープルオリゴヌクレオチド、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８７〜３５９で示される配列を有するＲＮＡステープルを含む。
【００６８】
上記実施形態の任意の１つによれば、足場（複数可）に基づいて１つのｒＲＮＡオリガミナノ構造をフォールディングするために必要となる足場（複数可）とステープルの組のモル比（足場：ステープル組のモル比）は、約１：１〜約１：３０である。幾つかの実施形態によれば、該比は、約１：２〜１：２０、１：３〜約１：１５、約１：４〜約１：１２、または約１：６〜約１：８である。幾つかの実施形態によれば、該比は、約１：３〜約１：１５である。別の実施形態によれば、該比は、約１：５〜約１：１０である。
【００６９】
上記実施形態の任意の１つによれば、本発明のＲＮＡオリガミナノ構造は、活性部分をさらに含む。一実施形態によれば、活性部分を含む該ＲＮＡオリガミナノ構造は、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８を有する足場ポリヌクレオチド鎖、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８で示される配列を有する複数の足場、例えば複数の足場ポリヌクレオチド鎖を含み、あるいは少なくとも１つの足場ポリヌクレオチドが、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で示される配列を有し、少なくとも１つの足場ポリヌクレオチド鎖が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８で示される配列を有する。
【００７０】
別の実施形態によれば、そのようなＲＮＡオリガミナノ構造は、該ナノ構造の表面に１つまたは複数の標的ドメインをさらに含む。さらに別の実施形態によれば、該ＲＮＡオリガミナノ構造は、該標的ドメインにハイブリダイズされたラッチドメインをさらに含み、該標的ドメインおよび該ラッチドメインは、標的分子への標的ドメインの結合の際に離脱し、それによりナノ構造をクローズ型コンフォメーションからオープン型コンフォメーションに変移させることを可能にする。
【００７１】
先に記載された通り、核酸オリガミ技術により、長く脆弱なＲＮＡ分子をフォールディングして複雑な３Ｄ構造を形成するには、特有の方法およびプロトコルの開発が必要であったため、別の態様において、本発明は、上記実施形態の任意の１つのＲＮＡオリガミナノ構造の調製のための方法を提供する。
【００７２】
幾つかの実施形態によれば、本発明は、上記実施形態の任意の１つにより、ＲＮＡオリガミナノ構造の調製のための方法であって、
（ａ）ｒＲＮＡ足場核酸（複数可）、その断片または類似体と、ステープル核酸と、を含む初期混合物を約５７℃〜約６５℃で約０．５分間〜約５分間、または約１分間〜約２分間インキュベートするステップと；
（ｂ）（ａ）の混合物を約５３℃〜約５８℃で約３〜約１０分間インキュベートするステップと；
（ｃ）（ｂ）の混合物を約４８℃〜約５３℃で約３〜約１５分間インキュベートするステップと；
（ｄ）（ｃ）の混合物を約３２℃〜約４８℃で約５〜約２０分間インキュベートするステップと；
（ｅ）（ｄ）の混合物を約２０℃〜約３２℃で約５〜約２０分間インキュベートするステップ；または（ｄ）の混合物を約０．０５℃／分〜約−２℃／分の速度で、もしくは約０．１℃／分〜約１℃／分の速度で、もしくは約０．１５℃／分〜約０．５℃／分の速度で約２０℃〜４℃もしくは約１５〜約１０℃の範囲内の温度まで冷却するステップと；
を含む、方法を提供する。
【００７３】
本明細書で用いられる用語「インキュベートすること」は、混合物、組成物または調製物を一定の定義された温度で定義された期間、固定、保持または維持することを指す。該用語が、ある温度範囲に関して、例えば約３０℃〜約４０℃でインキュベートすることに関して用いられる場合、該用語は、該混合物、組成物または調製物を定義された範囲内の１つの一定温度で定義された期間、固定、保持または維持することを指す。
【００７４】
一実施形態によれば、該方法は、
（ａ）ｒＲＮＡ足場核酸（複数可）、その断片または類似体と、ステープル核酸と、を含む初期混合物を約６０℃で約０．５〜約２分間インキュベートすること；
（ｂ）（ａ）の混合物を約５５℃で約３〜約１０分間インキュベートすること；
（ｃ）（ｂ）の混合物を約５０℃で約３〜約１５分間インキュベートすること；
（ｄ）（ｃ）の混合物を約３７℃で約５〜約２０分間インキュベートすること；および
（ｅ）（ｄ）の混合物を約２５℃で約５〜約２０分間インキュベートすること
を含む。
【００７５】
別の実施形態によれば、該方法は、
（ａ）ｒＲＮＡ足場核酸（複数可）、その断片または類似体と、ステープル核酸と、を含む初期混合物を約５７℃〜約６５℃で約１分間インキュベートすること；
（ｂ）（ａ）の混合物を約５３℃〜約５８℃で約２分間インキュベートすること；
（ｃ）（ｂ）の混合物を約４８℃〜約５２℃で約１０分間インキュベートすること；
（ｄ）（ｃ）の混合物を約３２℃〜約４７℃で約１０分間インキュベートすること；および
（ｅ）（ｄ）の混合物を約２０℃〜約３０℃で約１０分間インキュベートすること
を含む。
【００７６】
さらなる実施形態によれば、該方法は、
（ａ）ｒＲＮＡ足場核酸（複数可）、その断片または類似体と、ステープル核酸と、を含む初期混合物を約６０℃で約０．５〜約２分間インキュベートすること；
（ｂ）（ａ）の混合物を約５５℃で約３〜１０分間インキュベートすること；
（ｃ）ｒＲＮＡ足場およびステープルを約５０℃で約３〜約１５分間インキュベートすること；
（ｄ）（ｃ）の混合物を約４５℃で約５〜２０分間インキュベートすること；および
（ｅ）（ｄ）の混合物を約−０．０５℃／分〜約０．１５℃／分の速度で約４５℃から約１５℃に冷却すること
を含む。
【００７７】
さらに別の実施形態によれば、該方法は、
（ａ）ｒＲＮＡ足場核酸（複数可）、その断片または類似体と、ステープル核酸と、を含む初期混合物を約５７℃〜約６５℃で約１分間インキュベートすること；
（ｂ）（ａ）の混合物を約５３℃〜約５８℃で約５分間インキュベートすること；
（ｃ）（ｂ）の混合物を約４８℃〜約５２℃で約５分間インキュベートすること；
（ｄ）（ｃ）の混合物を約３２℃〜約４７℃で約１０分間インキュベートすること；および
（ｅ）（ｄ）の混合物を約−０．０１℃／分の速度で約２０℃〜１０℃、約１５℃の範囲内の温度に冷却すること
を含む。
【００７８】
一実施形態によれば、ステップ（ｅ）での冷却は、約−０．０１℃／分の速度で４０℃から約１５℃にする。
【００７９】
上記および下記実施形態の任意の１つによれば、該冷却は、０．０１℃／分〜５℃／分、０．０１５℃／分〜４℃／分、０．０２℃／分〜３℃／分、０．２℃／分〜２℃／分、０．５℃／分〜１℃／分、０．６℃／分〜０．８℃／分の間の速度で実施されてもよい。
【００８０】
上記実施形態の任意の１つによれば、該方法は、該得られたＲＮＡオリガミナノ構造を約３３℃〜約４２℃で約１〜約１０日間、約２〜約８日間、または約３〜約６日間、インキュベートすることをさらに含む。別の実施形態によれば、該方法は、該得られたＲＮＡオリガミナノ構造を約３５℃〜約４０℃で約２〜約８日間、約３〜約６日間、または約４〜約５日間、インキュベートすることを含む。さらに特別な実施形態によれば、該方法は、該ＲＮＡオリガミナノ構造を約３７℃で約１〜約１０日間、約２〜約８日間、約３〜約６日間、または約４〜約５日間、インキュベートすることを含む。
【００８１】
幾つかの実施形態によれば、本発明は、上記実施形態の任意の１つによる、ＲＮＡオリガミナノ構造の調製のための方法であって、以下のステップ：
（ａ）ｒＲＮＡ核酸足場（複数可）、その断片または類似体と、ステープル核酸と、を含む初期混合物を約５７℃〜約６５℃で約０．５〜約５分間または約１〜２分間インキュベートするステップと；
（ｂ）（ａ）の混合物を約−０．５℃／分〜約−２℃／分の速度で約５８℃〜約５２℃の範囲内の温度まで冷却するステップと；
（ｃ）（ｂ）の混合物を約−０．３℃／分〜約−３℃／分の速度で約１５℃〜約３０の範囲内の温度まで冷却するステップと
を含む、方法を提供する。
【００８２】
別の実施形態によれば、該方法は、
（ａ）ｒＲＮＡ核酸足場（複数可）、その断片または類似体と、ステープル核酸と、を含む初期混合物を約６０℃で約０．５〜約２分間インキュベートすること；
（ｂ）（ａ）の混合物を約−０．５℃／分〜約−２℃／分の速度で約５９℃から約５６℃に冷却すること；および
（ｃ）（ｂ）の混合物を約−０．５℃／分〜約−２℃／分の速度で約５５℃から約２５に冷却すること
を含む。
【００８３】
別の実施形態によれば、該方法は、以下のステップ：
（ａ）ｒＲＮＡ核酸足場（複数可）、その断片または類似体と、ステープル核酸と、を含む初期混合物を約５７℃〜約６５℃で約０．５〜約２分間インキュベートするステップと；
（ｂ）（ａ）の混合物を約−０．５℃／分〜約−２℃／分の速度で５８〜約５２℃の範囲内の温度まで冷却するステップと；
（ｃ）（ｂ）の混合物を約５３℃〜約５８℃で約３〜約１０分間インキュベートするステップと；
（ｄ）（ｃ）の混合物を約−０．３℃／分〜約−３℃／分の速度で約５２℃〜約４８℃の範囲内の温度まで冷却するステップと；
（ｅ）（ｄ）の混合物を約４８℃〜約５２℃で約５〜約１５分間インキュベートするステップと；
（ｆ）（ｅ）の混合物を約−０．３℃／分〜約−３℃／分の速度で約４０℃〜約３５の範囲内の温度まで冷却するステップと；
（ｇ）（ｆ）の混合物を約３５℃〜約４０℃で約５〜約１５分間インキュベートするステップと；
（ｈ）（ｇ）の混合物を約−０．３℃／分〜約−３℃／分の速度で約３０℃〜約１５℃の範囲内の温度まで冷却するステップと；
（ｉ）（ｈ）の混合物を約２０℃〜約３０℃で約５〜約１５分間インキュベートするステップと；
を含む。
【００８４】
さらなる実施形態において、該方法は、以下のステップ：
（ａ）ｒＲＮＡ核酸足場（複数可）、その断片または類似体と、ステープル核酸と、を含む初期混合物を約６０℃で約０．５〜約２分間インキュベートするステップと；
（ｂ）（ａ）の混合物を約−０．５℃／分〜約−２℃／分の速度で約５９℃から約５６℃に冷却するステップと；
（ｃ）（ｂ）の混合物を約５５℃で約３〜約１０分間インキュベートするステップと；
（ｄ）（ｃ）の混合物を約−０．５℃／分〜約−２℃／分の速度で約５４℃から約５１℃に冷却するステップと；
（ｅ）（ｄ）の混合物を約５０℃で約５〜約１５分間インキュベートするステップと；
（ｆ）（ｅ）の混合物を約−０．５℃／分〜約−２℃／分の速度で約４９℃から約３８℃に冷却するステップと；
（ｇ）（ｆ）の混合物を約３７℃で約５〜約１５分間インキュベートするステップと；
（ｈ）（ｇ）の混合物を約−０．５℃／分〜約−２℃／分の速度で約３６℃から約２６℃に冷却するステップと；
（ｉ）（ｈ）の混合物を約２５℃で約５〜約１５分間インキュベートするステップと；
を含む。
【００８５】
上記実施形態の任意の１つによれば、該ステープルは、ＲＮＡ核酸である。他の実施形態によれば、該ステープルは、ＤＮＡ核酸である。
【００８６】
上記実施形態の任意の１つによれば、該足場：ステープル組のモル比は、約１：１〜約１：３０である。幾つかの実施形態によれば、該比は、約１：２〜１：２０、１：３〜約１：１５、約１：４〜約１：１２、または約１：６〜約１：８である。幾つかの実施形態によれば、該比は、約１：３〜約１：１５である。別の実施形態によれば、該比は、約１：５〜約１：１０である。
【００８７】
上記実施形態の任意の１つによれば、該方法は、該得られたＲＮＡオリガミナノ構造を約３３℃〜約４２℃で約１〜約１０日間、または約２〜約８日間、または約３〜約６日間、インキュベートすることをさらに含む。別の実施形態によれば、該方法は、該得られたＲＮＡオリガミナノ構造を約３５℃〜約４０℃で約２〜約８日間、または約３〜約６日間、または約４〜約５日間、インキュベートすることを含む。さらに特別な実施形態によれば、該方法は、該ＲＮＡオリガミナノ構造を約３７℃で約１〜約１０日間、約２〜約８日間、約３〜約６日間、または約４〜約５日間、インキュベートすることを含む。
【００８８】
さらなる実施形態によれば、本発明は、ｒＲＮＡ核酸足場（複数可）、その断片または類似体と、ステープルと、を約４０℃〜約６０℃の一定温度で約０．２〜約６日間インキュベートすることを含む、上記実施形態の任意の１つによるＲＮＡオリガミナノ構造の調製のための方法を提供する。別の実施形態によれば、該インキュベーションは、約４５℃〜約５５℃の一定温度で行われる。幾つかの実施形態によれば、該方法は、ｒＲＮＡ足場、その断片または類似体と、ステープルとを、約５０℃〜約５５℃の一定温度で約５〜約７２時間、または約７〜約６０時間、または約１２〜約４８時間、または約１８〜約３６時間インキュベートすることを含む。
【００８９】
さらに別の実施形態において、上記実施形態の任意の１つによるＲＮＡオリガミナノ構造を調製するための方法は、
（ａ）別々に、（ｉ）ステープル核酸鎖を６５℃で１０分間、そして（ｉｉ）足場核酸鎖（複数可）を６０℃で１分間、加熱するステップと；
（ｂ）ステップ（ａ）の該加熱されたステープル核酸と、予備加熱された足場核酸鎖（複数可）と、を混合するステップと；
（ｃ）（ｂ）の混合物を−１℃／分の速度で６０℃から１５℃に段階的に冷却するステップと
を含む。
【００９０】
上記実施形態および方法の任意の１つによれば、該足場核酸およびステープル核酸鎖は、上記態様および実施形態の任意の１つに定義された通りである。一実施形態によれば、該足場核酸鎖、その断片または類似体は、単離されたＲＮＡ核酸、その断片または類似体である。幾つかの実施形態によれば、該ＲＮＡは、リボソームＲＮＡまたは非コードＲＮＡなどの細胞由来ＲＮＡである。一実施形態によれば、該ＲＮＡは、リボソームＲＮＡである。一実施形態によれば、該足場核酸、その断片または類似体は、単離されたｒＲＮＡ核酸、その断片または類似体である。特定の実施形態によれば、該単離されたＲＮＡ、特に単離されたｒＲＮＡは、細胞から単離されたＲＮＡ、即ち細胞由来ｒＲＮＡなどの細胞由来ＲＮＡを含む。したがって上記実施形態の任意の１つによれば、上記方法は、ＲＮＡ、特に細菌またはＳ．セレビシエなどの細胞からのｒＲＮＡの単離を含む。したがって一実施形態によれば、上記実施形態の任意の１つによるＲＮＡオリガミナノ構造の調製のための方法は、単離されたｒＲＮＡ核酸およびステープルを混合して、混合物を得ることを含む。別の実施形態によれば、ＲＮＡオリガミナノ構造の調製のための方法は、総細胞ＲＮＡをステープルと混合して初期混合物を得ることを含む。
【００９１】
上記実施形態の任意の１つによれば、本発明によるＲＮＡオリガミナノ構造の調製のための方法は、足場核酸鎖、その断片または類似体と、ステープルと、を含む初期混合物をインキュベートすることを含み、足場核酸は、２００を超える、３００を超える、５００を超える、７００を超える、７５０を超える、８００を超える、９００を超える、１０００を超える、１１００を超える、１２００を超える、１３００を超える、１５００を超える、１７００を超える、２０００を超える、２５００を超える、２８００を超える、３０００を超える、３５００を超える、または４０００を超える塩基を含む。別の実施形態によれば、足場ポリヌクレオチドは、約７００〜２００００、約７５０〜約１５０００、約８００〜約１３０００、約８５０〜約１２０００、約９００〜約１１０００、約１０００〜約１００００、約１１００〜約８０００、約１２００〜約５０００、または約１３００〜約４０００ヌクレオチドを含む。さらなる実施形態によれば、該足場ポリヌクレオチドは、約１５００〜約３５００、約１８００〜約３０００、約２０００〜約３８００、または約２５００〜約３５００ヌクレオチドを含む。さらに別の実施形態によれば、該足場ポリヌクレオチドは、約２８００〜約３２００  または約３０００の塩基を含む。より具体的な実施形態によれば、該足場ポリヌクレオチドは、約１６００〜約３５００ヌクレオチド塩基を含む。他の実施形態によれば、該ポリヌクレオチド、その断片または類似体は、約２００〜約５０００、約３００〜約４０００、約４００〜約３０００、約５００〜約２０００または約６００〜約１８００ヌクレオチド塩基を含む。
【００９２】
幾つかの実施形態によれば、該ステープルは、ＲＮＡ核酸である。他の実施形態によれば、該ステープルは、ＤＮＡ核酸である。
【００９３】
幾つかの実施形態によれば、本発明によりＲＮＡオリガミナノ構造を調製するために用いられる足場核酸は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８から選択される配列を有する足場、またはその断片もしくは類似体である。
【００９４】
別の実施形態によれば、ＲＮＡオリガミナノ構造は、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を含む足場ポリヌクレオチドと、配列（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜５５、（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０８〜５６１、または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の配列の任意の組み合わせ、を有するステープルオリゴヌクレオチドを含むステープルの組と、を含む。幾つかの実施形態によれば、本発明の方法により得られたＲＮＡオリガミナノ構造は、（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６〜６７、（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６１〜５７３、または（ｃ）それらの任意の組み合わせ、で示される配列を有するステープルをさらに含む。
【００９５】
別の実施形態によれば、該ＲＮＡオリガミナノ構造は、核酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を含む足場ポリヌクレオチドと、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５５〜６９５で示される配列を有するステープルオリゴヌクレオチドと、を含む。一実施形態によれば、該ＲＮＡオリガミナノ構造は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５５〜６９５で示される配列を有するステープルオリゴヌクレオチドの組の約５０％〜約９９％、約６０〜約９５％、約７０％〜約９０％、または約８０％〜約８５％を含む。
【００９６】
別の実施形態によれば、該足場ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８で示される配列と、（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９〜１７０、そして場合により１７１〜１８６、（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６０〜４３７、または（ｉｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３８〜５００で示される配列を有するステープルオリゴヌクレオチド鎖と、を含み、得られたナノ構造は、立方八面体である。
【００９７】
幾つかの実施形態によれば、該方法は、以下に記載されるプロトコル１、プロトコル２、プロトコル３、プロトコル４、プロトコル５、プロトコル６、およびプロトコル７から選択される。
【００９８】
プロトコル１  −  ｒＲＮＡ足場核酸、その断片または類似体と、ステープル核酸と、含む初期混合物を、以下の通りインキュベートすること：
ａ．  ６０℃で１分間インキュベートすること；
ｂ．  ５５℃で５分間インキュベートすること；
ｃ．  ５０℃で１０分間インキュベートすること；
ｄ．  ３７℃で１０分間インキュベートすること；および
ｅ．  ２５℃で１０分間インキュベートすること。
【００９９】
プロトコル２  −  ｒＲＮＡ足場核酸、その断片または類似体と、ステープル核酸と、含む初期混合物を、以下の通りインキュベートすること：
（ａ）  ６０℃で１．５分間インキュベートすること；
（ｂ）  ５５℃で７．５分間インキュベートすること；
（ｃ）  ５０℃で１５分間インキュベートすること；
（ｄ）  ３７℃で１５分間インキュベートすること；および
（ｅ）  ２５℃で１５分間インキュベートすること。
【０１００】
フォールディングのプロトコル３  −  ｒＲＮＡ足場核酸、その断片または類似体と、ステープル核酸と、含む初期混合物を、以下の通りインキュベートすること：
（ａ）  ６０℃で１分間インキュベートすること；
（ｂ）  −１℃／０．５分の速度で５９℃から５６℃に冷却すること；
（ｃ）  ５５℃で５分間インキュベートすること；
（ｄ）  −１℃／０．５分の速度で５４℃から５１℃に冷却すること；
（ｅ）  ５０℃で１０分間インキュベートすること；
（ｆ）  −１℃／０．５分の速度で４９℃から３８℃に冷却すること；
（ｇ）  ３７℃で１０分間インキュベートすること；
（ｈ）  −１℃／０．５分の速度で３６℃から２６℃に冷却すること；
（ｉ）  ２５℃で１０分間インキュベートすること。
【０１０１】
フォールディングのプロトコル４  −  ｒＲＮＡ足場核酸、その断片または類似体と、ステープル核酸と、含む初期混合物を、以下の通りインキュベートすること：
（ａ）  ６０℃で１．５分間インキュベートすること；
（ｂ）  −１℃／０．５分の速度で５９℃から５６℃に冷却すること；
（ｃ）  −１℃／分の速度で５５℃から２５℃に冷却すること。
【０１０２】
フォールディングのプロトコル６  −  ｒＲＮＡ足場核酸、その断片または類似体と、ステープル核酸と、含む初期混合物を、以下の通りインキュベートすること：
（ａ）  ６０℃で１分間インキュベートすること；
（ｂ）  ５５℃で５分間インキュベートすること；
（ｃ）  ５０℃で５分間インキュベートすること；
（ｄ）  ４５℃で１０分間インキュベートすること；および
（ｅ）  −１℃／１０分の速度で４０℃から１５℃に冷却すること。
【０１０３】
フォールディングのプロトコル７：ｒＲＮＡ足場核酸、その断片または類似体と、ステープル核酸と、を含む初期混合物を、以下の通り−１℃／分の速度で６５℃から１５℃に冷却すること。
【０１０４】
幾つかの実施形態によれば、該方法は、実施例に記載されたプロトコル５である。
【０１０５】
上記実施形態の任意の１つによれば、本発明は、本発明の方法の任意の１つにより調製される本発明のＲＮＡオリガミナノ構造を提供する。したがって一実施形態において、本発明は、１つまたは複数の足場核酸鎖と、複数のステープルオリゴヌクレオチド鎖と、を含むＲＮＡオリガミナノ構造であって、該１つまたは複数の足場ポリヌクレオチド鎖が、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）ポリヌクレオチド鎖、その断片または類似体を含み、該ＲＮＡオリガミナノ構造が、本発明の方法の任意の１つにより調製される、ＲＮＡオリガミナノ構造を提供する。一実施形態によれば、該ＲＮＡオリガミナノ構造は、活性部分をさらに含む。
【０１０６】
別の態様によれば、本発明は、本発明のｒＲＮＡ足場およびステープル核酸を含む核酸分子を提供する。一実施形態において、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜５５で示される配列を含む核酸分子を提供する。一実施形態によれば、核酸分子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜６７で示された配列を含む。
【０１０７】
別の実施形態によれば、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および５０８〜５６１で示される配列を含む核酸分子を提供する。さらなる実施形態によれば、該核酸分子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６２〜５７３で示される配列をさらに含む。
【０１０８】
別の実施形態によれば、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および６５５〜６９５で示される配列を含む核酸分子を提供する。
【０１０９】
幾つかの実施形態によれば、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８〜１７０で示される配列を含む核酸分子を提供する。一実施形態によれば、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８〜１８６で示される配列を含む核酸分子を提供する。別の実施形態によれば、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８および３６０〜４３７で示される配列を含む核酸分子を提供する。さらに別の実施形態によれば、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８および４３８〜５００で示される配列を含む核酸分子を提供する。
【０１１０】
他の実施形態によれば、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、６８および１８７〜３５９で示される配列を含む核酸分子を提供する。
【０１１１】
幾つかの実施形態によれば、該核酸分子は、先に定義されたステープルの組の約５０％〜約９９％、約６０〜約９５％、約７０％〜約９０％、または約８０％〜約８５％を含む。
【０１１２】
別の実施形態によれば、本発明は、プロモーターに動作可能に連結された上記実施形態の任意の１つの少なくとも１つの核酸分子を含む核酸構築物を提供する。
【０１１３】
本明細書で用いられる用語「プロモーター」は、下流の核酸の転写を開始する調節配列である。
【０１１４】
本明細書で用いられる用語「動作可能に連結された」は、機能的に関連させることが可能な要素の配列を指す。例えばプロモーターは、それが配列によるＲＮＡへの転写またはタンパク質への翻訳を制御するならば、該配列に動作可能に連結されている。
【０１１５】
さらなる実施形態によれば、本発明は、本発明の核酸構築物を含むベクターを提供する。
【０１１６】
用語「ベクター」および「発現ベクター」は、本明細書では互換的に用いられ、プラスミド、ウイルス、レトロウイルス、バクテリオファージ、コスミド、人工染色体（細菌性または酵母）、ファージ、ファージミド、二本鎖もしくは一本鎖直鎖状もしくは環状形態のバイナリーベクター、または核酸、宿主細胞を形質転換することが可能で、場合により宿主細胞中で複製が可能である配列など、任意のウイルスまたは非ウイルスベクターを指す。該ベクターは、細胞ゲノム内に取り込まれてもよく、または染色体外に存在してもよい（例えば、複製起点を有する自律複製プラスミド）。該ベクターは、形質転換細胞の同定における使用に適した任意選択によるマーカー、例えばテトラサイクリン耐性、カナマイシン耐性、またはアンピシリン耐性を含んでいてもよい。クローニングベクターは、それが発現ベクターとして動作するために必要となる特性を有していても、または有していなくてもよい。
【０１１７】
さらに別の態様によれば、本発明は、上記実施形態の任意の１つによる核酸分子、核酸構築物またはベクターを含む宿主細胞を提供する。幾つかの実施形態によれば、該細胞は、原核または真核細胞である。そのため本発明は、１つまたは複数の足場核酸鎖と、複数のステープル核酸鎖と、を含むＲＮＡオリガミナノ構造であって、該１つまたは複数のＲＮＡ足場核酸が、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）核酸、その断片または類似体を含み、該ＲＮＡオリガミナノ構造が、細胞内に形成される、ＲＮＡオリガミナノ構造を包含する。
【０１１８】
さらに別の態様によれば、本発明は、本発明の複数のＲＮＡオリガミナノ構造を含む医薬組成物を提供する。
【０１１９】
本明細書で用いられる用語「医薬組成物」は、場合により１種または複数の医薬的に許容できる担体と共に配合される、本明細書に開示された少なくとも１種のＲＮＡオリガミナノ構造を含む組成物を指す。
【０１２０】
該医薬組成物の配合は、適用に応じて調整されてもよい。詳細には該医薬組成物は、哺乳動物への投与後に有効成分の急速な、連続した、または遅延された放出を提供するように、当該技術分野で公知の方法を利用して配合されてもよい。
【０１２１】
上記実施形態の任意の１つによれば、該医薬組成物は、錠剤、丸薬、カプセル、ペレット、顆粒、粉末、ロゼンジ、サシェ剤、カシェ剤、エリキシル、懸濁液、分散液、エマルジョン、溶液、輸液、シロップ、エアロゾル、眼科用軟膏、軟膏、ソフトおよびハードゼラチンカプセル、坐剤、滅菌注射溶液、ならびに滅菌包装粉末からなる群から選択される形態である。
【０１２２】
上記実施形態の任意の１つによれば、該医薬組成物は、経口、経直腸、筋肉内、皮下、静脈内、腹腔内、鼻内、動脈内、膀胱内、眼内、経皮および局所からなる群から選択される経路を介した投与に適している。
【０１２３】
経口投与のための組成物は、錠剤、トローチ、ロゼンジ、水性もしくは油性懸濁液、分散性粉末もしくは顆粒、エマルジョン、ハードもしくはソフトカプセル、またはシロップもしくはエリキシルの形態であってもよい。経口使用を意図された医薬組成物は、医薬組成物の製造のために当該技術分野で公知の任意の方法に従って調製されてもよく、医薬的に洗練されていて味の良い調製物を提供するために、甘味剤、香味剤、着色剤および防腐剤から選択される１種または複数の薬剤をさらに含んでいてもよい。錠剤は、非毒性の医薬的に許容できて錠剤の製造に適した賦形剤と混和された活性剤を含有する。これらの賦形剤は、例えば炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム、またはリン酸ナトリウムなどの不活性希釈剤；造粒および崩壊剤、例えばコーンスターチまたはアルギン酸；結合剤；ならびに滑沢剤であってもよい。該錠剤は、好ましくは消化管内での崩壊および吸収を遅延させ、それによりより長期間にわたる薬物の放出延長を提供するように、公知の技術を利用してコーティングされている。
【０１２４】
本明細書で用いられる用語「医薬的に許容できる担体」または「医薬的に許容できる賦形剤」は、医薬的投与に適合性があるあらゆる溶媒、分散媒、防腐剤、抗酸化剤、コーティング、等張および吸着遅延剤、界面活性剤、充填剤、崩壊剤、結合剤、希釈剤、滑沢剤、滑剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、増進剤。湿潤剤、可溶化剤、界面活性剤、抗酸化剤などを指す。医薬的活性物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当該技術分野で周知である。該組成物は、補助的、追加的、または増強的治療機能を提供する他の活性化合物を含有していてもよい。固体担体または賦形剤は、例えばラクトース、デンプンまたはタルクまたは液体担体、例えば水、脂肪油、または流動パラフィンなどである。
【０１２５】
用いられ得る他の担体または賦形剤としては、ゼラチン、デキストリンおよび大豆、小麦およびサイリウムシードタンパク質などの動物性または植物性タンパク質由来の材料；アラビアゴム、グアーガム、寒天およびキサンタンガムなどのガム；多糖類：アルギン酸塩；カルボキシメチルセルロース；カラギーナン；デキストラン；ペクチン；ポリビニルピロリドンなどの合成ポリマー；ゼラチン−アラビアゴム複合体などのポリペプチド／タンパク質または多糖複合体；マンニトール、デキストロース、ガラクトースおよびトレハロースなどの糖；シクロデキストリンなどの環状糖；リン酸ナトリウム、塩化ナトリウムおよびケイ酸アルミニウムなどの無機塩；ならびに炭素原子２〜１２個を有するアミノ酸およびその誘導体、例えば非限定的にグリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシンおよびＬ−フェニルアラニンなどが挙げられるが、これらに限定されない。各可能性は、本発明の別の実施形態を表す。
【０１２６】
非経口、皮内、または皮下適用に用いられる溶液または懸濁液は、典型的には以下の成分を含む：注射用の水などの滅菌希釈剤、生理食塩液、不揮発油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール（または他の合成溶媒）、抗菌剤（例えば、ベンジルアルコール、メチルパラベン）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、重亜硫酸ナトリウム）、キレート化剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸）、緩衝剤（例えば、酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩）、および稠度を調整する薬剤（例えば、塩化ナトリウム、デキストロース）。ｐＨは、例えば塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調整され得る。非経口調製物が、アンプル、ディスポーザブルシリンジ、または反復投与用ガラスもしくはプラスチックバイアルに封入され得る。
【０１２７】
非経口投与に適合される医薬組成物としては、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および該組成物を予定のレシピエントの血液と実質的に等張にする溶質を含有し得る水性および非水性滅菌注射溶液または懸濁液が挙げられるが、これらに限定されない。そのような組成物はまた、例えば水、アルコール、ポリオール、グリセリンおよび植物油を含有し得る。即時注射溶液および懸濁液を、滅菌粉末、顆粒および錠剤から調製することができる。そのような組成物は、好ましくは、対象への適当な投与のための形態を提供するような適切な量の担体と共に、治療有効量の本発明の化合物および／または他の治療薬（複数可）を含む。
【０１２８】
用語「医薬的に許容できる」および「薬理学的に許容できる」は、動物またはヒトに適宜、投与された時に、有害反応、アレルギー反応、または他の不都合な反応を生じない分子物体および組成物を包含する。ヒトへの投与の場合、調製物は、政府の薬物規制当局、例えば生物製剤の規準の米国食品医薬品局（ＦＤＡ）に要求される無菌性、発熱性、全般的安全性、および純度の規準に適合しなければならない。
【０１２９】
本発明の医薬組成物は、任意の公知方法により投与されてもよい。例えば化合物または薬剤が、静脈内、動脈内、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、眼球、舌下、経口（摂取による）、鼻内（吸入による）、脊髄内、脳内、および経皮（例えば皮膚の導管を通した、吸収による）で投与され得る。化合物または薬剤はまた、該化合物または薬剤の延長された、緩徐な、または制御された放出を提供する、充電性（ｒｅｃｈａｒｇｅａｂｌｅ）または生分解性ポリマーデバイスまたは他のデバイス、例えばパッチおよびポンプ、または配合物により適宜、導入され得る。投与はまた、例えば１回、複数回、および／または１回もしくは複数の長期間にわたり実施され得る。幾つかの態様において、該投与は、自己投与を含む直接投与、および薬物を処方する行為を含む間接的投与の両方を包含する。例えば本明細書で用いられる通り、薬物を自己投与するようもしくは薬物を他者に投与させるよう患者に指導する医師、および／または薬物の処方を患者に提供する医師は、薬物を患者に投与している。
【０１３０】
一実施形態によれば、医薬組成物は、１つまたは複数の足場核酸鎖と、複数のステープル核酸鎖と、を含む複数のＲＮＡオリガミナノ構造を複数含み、該足場核酸は、細胞由来のＲＮＡを含む。別の実施形態によれば、該細胞由来ＲＮＡは、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）であり、したがって幾つかの実施形態において、医薬組成物は、１つまたは複数の足場核酸鎖と、複数のステープル核酸鎖と、を含むＲＮＡオリガミナノ構造を含み、該足場核酸（複数可）は、ｒＲＮＡ核酸、その断片または類似体を含む。一実施形態によれば、該足場核酸鎖は、単離されたｒＲＮＡポリヌクレオチドである。一実施形態によれば、該足場ポリヌクレオチドは、少なくとも８００のヌクレオチドを含む。別の実施形態によれば、該足場ポリヌクレオチド鎖は、約１０００以上のヌクレオチドを含む。さらなる実施形態によれば、該足場ポリヌクレオチドは、７００を超える、７５０を超える、８００を超える、９００を超える、１０００を超える、１１００を超える、１２００を超える、１３００を超える、１５００を超える、１７００を超える、２０００を超える、２５００を超える、２８００を超える、３０００を超える、３５００を超える、または４０００を超えるヌクレオチドを含む。別の実施形態によれば、該足場ポリヌクレオチドは、約７００〜約２００００、約７５０〜約１５０００、約８００〜約１３０００、約８５０〜約１２０００、約９００〜約１１０００、約１０００〜約１００００、約１１００〜約８０００、約１２００〜約５０００、または約１３００〜約４０００ヌクレオチドを含む。さらなる実施形態によれば、該足場ポリヌクレオチドは、約１５００〜約３５００、約１８００〜約３０００、約２０００〜約３８００、または約２５００〜約３５００ヌクレオチドを含む。さらに別の実施形態によれば、該足場ポリヌクレオチドは、約２８００〜約３２００または約３０００の塩基を含む。より具体的な実施形態によれば、該足場ポリヌクレオチドは、約１６００〜約３５００ヌクレオチド塩基を含む。他の実施形態によれば、該足場ポリヌクレオチド鎖、その断片または類似体は、約２００〜約５０００、約３００〜約４０００、約４００〜約３０００、約５００〜約２０００または約６００〜約１８００ヌクレオチドを含む。
【０１３１】
上記実施形態の任意の１つによれば、該ｒＲＮＡ核酸は、原核生物および真核生物のｒＲＮＡ核酸から選択される。一実施形態によれば、該ｒＲＮＡは、細菌性ｒＲＮＡである。一実施形態によれば、該ｒＲＮＡはＳ．セレビシエからのｒＲＮＡなどの真核生物のｒＲＮＡ核酸である。幾つかの実施形態によれば、本発明によるステープルは、ＲＮＡステープル、ＤＮＡステープル、またはＲＮＡステープルとＤＮＡステープルの組み合わせである。幾つかの実施形態によれば、該ステープルは、足場（複数可）とＡ型コンフォメーションの二重らせんを形成しているＲＮＡステープルである。１つの特別な実施形態によれば、該足場および該ＲＮＡステープルは、ターンあたり１２塩基対を有するＡ型コンフォメーションのＲＮＡ：ＲＮＡ二重らせんを形成している。別の実施形態によれば、該足場およびステープルは、ＲＮＡ：ＤＮＡ  Ａ型コンフォメーションの二重らせんを形成している。上記実施形態の任意の１つによれば、該ＲＮＡオリガミナノ構造は、複数の足場核酸を含む。幾つかの実施形態によれば、該ＲＮＡオリガミナノ構造は、活性部分をさらに含む。幾つかの実施形態によれば、該活性部分は、タンパク質、核酸、脂質、糖タンパク質、糖脂質、および小分子から選択される。上記実施形態の任意の１つによれば、該ＲＮＡオリガミナノ構造は、標的ドメインを含む。一実施形態によれば、該ＲＮＡオリガミナノ構造は、標的ドメインにハイブリダイズされたラッチドメインを含み、該標的ドメインおよび該ラッチドメインは、標的分子への標的ドメインの結合の際に離脱し、それにより該ナノ構造をクローズ型コンフォメーションからオープン型コンフォメーションに変移させることを可能にする。
【０１３２】
他の実施形態によれば、本発明による医薬組成物は、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を有する足場ポリヌクレオチド、その断片または類似体を含むＲＮＡオリガミナノ構造を含む。そのような実施形態によれば、該ＲＮＡオリガミナノ構造は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜５５または５０８〜５６１で示される配列を有し、場合によりＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６〜６７または５６１〜５７３で示される配列を有するステープルをさらに含む、ステープルオリゴヌクレオチドを含む。別の実施形態によれば、該医薬組成物は、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を有する足場ポリヌクレオチド、その断片または類似体と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５５〜６９５で示される配列を有するステープルオリゴヌクレオチドと、を含むＲＮＡオリガミナノ構造を含む。
【０１３３】
他の実施形態によれば、本発明による医薬組成物は、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８、その断片または類似体を有する足場ポリヌクレオチドを含むＲＮＡオリガミナノ構造を含む。そのような実施形態によれば、該ＲＮＡオリガミナノ構造は、（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９〜１７０で示される配列を有するステープルオリゴヌクレオチド、そして場合により配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７１〜１８６、（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６０〜４３７、または（ｉｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３８〜５００で示される配列を有するオリゴヌクレオチドと、を含む。幾つかの実施形態によれば、本発明による医薬組成物は、複数の足場ポリヌクレオチド（複数可）、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８で示される配列を有する複数の足場ポリヌクレオチドを含むＲＮＡオリガミナノ構造を含む。別の実施形態によるそのようなＲＮＡオリガミナノ構造は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８７〜３５９で示される配列を有するステープルオリゴヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態によれば、該ＲＮＡオリガミナノ構造は、本明細書の先に定義されたステープルの組の約５０％〜約９９％、約６０〜約９５％、約７０％〜約９０％、または約８０％〜約８５％を含む。
【０１３４】
本発明によるｒＲＮＡオリガミナノ構造、およびそれを含む医薬組成物は、例えば活性部分を特別な標的に送達するために、当該技術分野で周知の通り用いられてもよい。
【０１３５】
抗菌性核酸の組
本発明は、一部として、核酸オリガミナノ構造を形成することが可能なステープル核酸の組を細菌性リボソームＲＮＡと共に細菌に投与することが細菌の効果を提供する、という観察に基づく。
【０１３６】
本発明は、さらなる態様において、複数の異なるステープル核酸を含む抗菌性核酸の組であって、該ステープル核酸が、細菌性リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）に特異的に結合して、核酸オリガミナノ構造を形成する、抗菌性核酸の組を提供する。
【０１３７】
幾つかの実施形態において、用語「ステープル核酸」および「ステープル」は、互換的に用いられ、細菌性ｒＲＮＡ内の少なくとも２つの非隣接配列とハイブリダイズするステープル核酸を指す。
【０１３８】
一実施形態によれば、用語「足場」は、長い一本鎖細菌性ｒＲＮＡ核酸を指す。
【０１３９】
一実施形態によれば、用語「ステープルの組」および「ステープル核酸の組」は、本明細書では互換的に用いられ、１つまたは複数の特別な細菌性ｒＲＮＡ（複数可）に基づく１つの核酸オリガミナノ構造をフォールディングするために用いられるステープル核酸の組を指す。本明細書で用いられる用語「抗菌性核酸」は、該核酸が細菌性ｒＲＮＡに結合することを意味する。
【０１４０】
一実施形態によれば、該細菌性ｒＲＮＡは、１６Ｓ、２３Ｓ、５Ｓ  ｒＲＮＡおよびｐｒｅ−ｒＲＮＡから選択される。一次転写産物としても知られる用語「ｐｒｅ−ｒＲＮＡ」は、典型的には１６Ｓ、２３Ｓ、および５Ｓ  ｒＲＮＡの各１つの最大３コピーを含む細菌性リボソームＲＮＡ前駆体を指す。
【０１４１】
一実施形態によれば、該ステープル核酸は、ＤＮＡ核酸である。別の実施形態によれば、該ステープル核酸は、ＲＮＡ核酸である。幾つかの実施形態によれば、該ステープル核酸は、オリゴヌクレオチドである。
【０１４２】
幾つかの実施形態によれば、ステープルオリゴヌクレオチドなどの該ステープル核酸は、５〜１２０、または１０〜１００ヌクレオチドからなる。一実施形態によれば、該ステープルオリゴヌクレオチドは、５〜８０ヌクレオチドからなる。別の実施形態によれば、該ステープルオリゴヌクレオチドは、６〜６０、７〜５０または８〜４５ヌクレオチドからなる。さらなる実施形態によれば、該ステープルオリゴヌクレオチドは、１０〜４５または１５〜４０ヌクレオチドからなる。特定の実施形態によれば、該ステープルオリゴヌクレオチドは、７〜７５ヌクレオチドからなる。別の実施形態によれば、該ステープルは、１０〜３００ヌクレオチド、１５〜２８０、２０〜２５０、２５〜２２０、３０〜２００、３５〜１８０、４０〜１５０、５０〜１２０、または７０〜１００ヌクレオチドからなる。幾つかの実施形態において、該ステープルは、１００〜６００、１２０〜５６０、１５０〜５２０、２００〜４８０、２５０〜４２０、３００〜３８０または３２０〜３６０ヌクレオチドからなる。他の実施形態において、該ステープルは、標的足場におけるヌクレオチド数の最大６０％からなる。
【０１４３】
幾つかの実施形態によれば、ステープル核酸の組は、２〜４０の異なるステープル核酸を含む。幾つかの実施形態によれば、該組は、５〜２５０、１０〜２００、１５〜１８０、２０〜１５０、２５〜１２０、３０〜１００、３５〜８０、４０〜６０のステープル核酸を含む。該用語「異なる」は、該ステープルが異なる配列を有することを意味する。
【０１４４】
一実施形態によれば、該組は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７５〜６２７で示される配列を有するステープル核酸を含む。別の実施形態によれば、該組は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２８〜６５４で示される配列を有するステープル核酸を含む。一実施形態によれば、該組は、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７５〜６２７またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２８〜６５４を有するステープル核酸の組の約１０％〜約９９％、約２０％〜約９５％、約３０％〜約９０％、約４０％〜約８５％、約５０％〜約８０％または約６０％〜約７０％を含む。
【０１４５】
幾つかの実施形態によれば、本発明は、先に記載された抗菌性核酸の組のステープル核酸の配列を含む核酸構築物を提供する。幾つかの実施形態によれば、該核酸構築物は、該組のステープル核酸の１０％〜９０％の配列を含む。
【０１４６】
幾つかの実施形態によれば、該核酸構築物は、先に記載された抗菌性核酸の組のステープル核酸の逆配列を含む。幾つかの実施形態によれば、該核酸構築物は、該組のステープル核酸の１０％〜９０％の逆配列を含む。
【０１４７】
さらなる実施形態によれば、該核酸構築物は、透過性増進部分にコンジュゲートされている。
【０１４８】
用語「透過性増進部分」は、細胞内への該化合物の透過性を能動的もしくは受動的に容易にする、または増進する、当該技術分野で公知の任意部分を指す。一実施形態によれば、該透過性増進部分は、多糖類である。
【０１４９】
さらなる実施形態によれば、本発明は、本発明の核酸構築物を含むベクターを提供する。
【０１５０】
一実施形態によれば、該ベクターは、先に記載された本発明による抗菌性核酸の組のステープル核酸の配列を含む核酸構築物を含む。一実施形態によれば、該ステープル核酸の配列の各１つは、複製起点に、そして終結部位に動作可能に連結されている。
【０１５１】
一実施形態によれば、各ステープルオリゴヌクレオチドが細菌性ＤＮＡ複製機構により別個に複製されるように、該ステープルオリゴヌクレオチドの各１つは、複製起点に、そして終結部位に動作可能に連結されている。
【０１５２】
別の実施形態によれば、該ベクターは、先に記載された本発明による抗菌性核酸の組のステープル核酸の配列を含む核酸構築物を含み、該核酸構築物は、複製起点に、そして終結部位に動作可能に連結されており、該核酸構築物は、核酸の配列の各対の間に切断可能な配列を含む。一実施形態によれば、該切断可能な配列は、ヘアピン形成配列である。幾つかの実施形態によれば、該ヘアピンは、酵素で切断可能なヘアピンである。そのような実施形態によれば、該ステープルオリゴヌクレオチドの配列を含む核酸は、細菌性ＤＮＡ複製機構により複製され、結果的に自己スプライシングまたは酵素的スプライシングを介してスプライシングまたはパースされて（ｐａｒｓｅｄ）、ＤＮＡステープルオリゴヌクレオチドを生成する。幾つかの実施形態によれば、該切断可能な配列は、リボザイムにより切断可能である、またはリボザイムからなる。
【０１５３】
一実施形態によれば、該ベクターは、先に記載された本発明による抗菌性核酸の組のステープル核酸の逆配列を含む核酸構築物を含む。一実施形態によれば、該ステープル核酸の逆配列の各１つは、プロモーターに動作可能に連結されている。そのような実施形態によれば、ステープル核酸の各逆配列は、細菌転写機構により別々に転写されて、ＲＮＡステープル核酸を生成する。
【０１５４】
別の実施形態によれば、該ベクターは、先に記載された本発明による抗菌性オリゴヌクレオチドの組のステープルオリゴヌクレオチドの逆配列を含む核酸構築物を含み、該核酸構築物は、プロモーターに動作可能に連結され、該核酸構築物は、核酸配列の各対の間に切断可能な配列をコードする。一実施形態によれば、該切断可能な配列は、ヘアピン形成配列である。幾つかの実施形態によれば、該ヘアピンは、酵素で切断可能なヘアピンである。そのような実施形態によれば、該ステープルオリゴヌクレオチドの配列を含む核酸は、細菌転写機構により転写され、結果的に自己スプライシングまたは酵素的スプライシングを介してスプライシングまたはパースされて、ＲＮＡステープルオリゴヌクレオチドを得る。幾つかの実施形態によれば、該切断可能な配列は、リボザイムにより切断可能である、またはリボザイムからなる。
【０１５５】
一実施形態によれば、該ベクターは、プラスミドである。別の実施形態によれば、該ベクターは、ファージである。
【０１５６】
該実施形態の任意の１つによれば、ステープルオリゴヌクレオチドは、該ベクターの複製または転写により得られる。
【０１５７】
さらなる実施形態によれば、該ベクターは、透過性増進部分にコンジュゲートされている。
【０１５８】
一実施形態によれば、本発明のベクターは、送達系のビヒクル中で配合される。一実施形態によれば、該送達系は、リポソーム、ミセル、ナノ粒子、ウイルスナノ粒子（ｖｉｒａｌ  ｎａｎｏｐｅｒｔｉｃａｌｓ）、カルボナノチューブ（ｃａｒｂｏｎａｎｏ  ｔｕｂｅｓ）、アプタマー、ポリマー薬物コンジュゲート、デンドリマー、ゼラチンカプセル、プロリポソーム、ミクロスフェア、ゲル、シクロデキストリン、ミクロスフェア、ナノ構造、ビロソーム、ポリマーミセル、およびキトサンから選択される。
【０１５９】
さらなる態様によれば、本発明は、細菌を、抗菌性核酸の組と、抗菌性核酸の組を含む核酸構築物と、またはそのような核酸構築物を含むベクターと、接触させることを含む、細菌を処置するための方法を提供する。
【０１６０】
一実施形態によれば、本明細書で用いられる用語「細菌を処置すること」は、細菌を殺傷すること、ならびに細菌増殖および複製を予防することを指す。一実施形態によれば、本発明は、細菌を処置するための方法であって、該細菌を、本発明の、抗菌性オリゴヌクレオチドの組と、核酸構築物と、またはベクターと、接触させることを含む、方法を提供する。
【０１６１】
幾つかの実施形態によれば、該細菌は、グラム陽性菌である。一実施形態によれば、該グラム陽性菌は、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス、エンテロコッカス、グラム陽性球菌、およびペプトストレプトコッカスから選択される。さらに場合により、該グラム陽性菌は、ベータ溶血性ストレプトコッカス、コアグラーゼ陰性スタフィロコッカス、エンテロコッカス・フェカリス（ＶＳＥ）、スタフィロコッカス・アウレウスおよびストレプトコッカス・ピオゲネスから選択される。さらに場合により、該グラム陽性菌は、メチシリン感受性スタフィロコッカス・アウレウス（ＭＳＳＡ）、およびメチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（ＭＲＳＡ）、スタフィロコッカス・アウレウス、スタフィロコッカス・エピデルミスおよび他のコアグラーゼ陰性ブドウ球菌、ストレプトコッカス・ピオゲネス、ストレプトコッカス・ニューモニエ、ストレプトコッカス・アガラクチエ、およびエンテロコッカスから選択される。
【０１６２】
他の実施形態によれば、該細菌は、グラム陰性菌である。一実施形態によれば、該グラム陰性菌は、アクチノバチルス、エロモナス、アナプラスマ、アルコバクター、アビバクテリウム、バクテロイデス、バルトネラ、ボルデテラ、ボレリア、ブラキスピラ、ブルセラ、カンピロバクター、カプノサイトファーガ、クラミジア、クラミドフィラ、クリセオバクテリウム、コクシエラ、サイトファーガ、ジケロバクター、エドワードシエラ、エルリチア、エシェリヒア、フラボバクテリウム、フランシセラ、フソバクテリウム、ガリバクテリウム、ヘモフィルス、ヒストフィルス、クレブシエラ、ローソニア、レプトスピラ、マンヘミア、メガスフェラ、モラキセラ、ネオリケッチア、ニコレテラ、オルニトバクテリウム、パスツレラ、フォトバクテリウム、ピシクラミジア、ピシリケッチア、ポルフィロモナス、プレボテラ、プロテウス、シュードモナス、リケッチア、リエメレラ、サルモネラ、ストレプトバチルス、テナチバキュラム、ビブリオおよびエルシニアからなる群から選択される。
【０１６３】
さらに場合により、該グラム陽性菌は、スタフィロコッカスｓｐｐ、連鎖球菌、エンテロコッカスｓｐｐ、ロイコノストックｓｐｐ、コリネバクテリウムｓｐｐ、アルカノバクテリアｓｐｐ、ツルエペレラｓｐｐ、ロドコッカスｓｐｐ、バチルスｓｐｐ、嫌気性球菌、嫌気性グラム陽性非胞子形成桿菌、アクチノマイセスｓｐｐ、クロストリジウムｓｐｐ、ノカルジアｓｐｐ、エリシペロトリックスｓｐｐ、リステリアｓｐｐ、キトコッカスｓｐｐ、マイコプラズマｓｐｐ、ウレアプラズマｓｐｐ、およびマイコバクテリウムｓｐｐから選択される。
【０１６４】
別の態様によれば、本発明は、（ｉ）本発明の抗菌性核酸の少なくとも１つの組；（ｉｉ）該抗菌性核酸の組の配列もしくは逆配列を含む少なくとも１つの核酸構築物；または（ｉｉｉ）（ｉｉ）の核酸構築物を含む少なくとも１つのベクター、のうちの少なくとも１つと、医薬的に許容できる賦形剤と、を含む医薬組成物を提供する。
【０１６５】
該医薬組成物の配合は、適用に応じて調整されてもよい。詳細には該医薬組成物は、哺乳動物への投与後に有効成分の急速な、連続した、または遅延された放出を提供するように、当該技術分野で公知の方法を利用して配合されてもよい。
【０１６６】
上記実施形態の任意の１つによれば、該医薬組成物は、錠剤、丸薬、カプセル、ペレット、顆粒、粉末、ロゼンジ、サシェ剤、カシェ剤、エリキシル、懸濁液、分散液、エマルジョン、溶液、輸液、シロップ、エアロゾル、眼科用軟膏、軟膏、ソフトおよびハードゼラチンカプセル、坐剤、滅菌注射溶液、ならびに滅菌包装粉末からなる群から選択される形態である。
【０１６７】
上記実施形態の任意の１つによれば、該医薬組成物は、経口、経直腸、筋肉内、皮下、静脈内、腹腔内、鼻内、動脈内、膀胱内、眼内、経皮および局所からなる群から選択される経路を介した投与に適する。
【０１６８】
該医薬組成物は、任意の公知方法により投与されてもよい。対象への物質、化合物または薬剤「を投与すること」または「の投与」という用語は、当業者に公知の種々の方法の１つを利用して実施され得る。例えば化合物または薬剤が、静脈内、動脈内、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、眼球、舌下、経口（摂取による）、鼻内（吸入による）、脊髄内、脳内、および経皮（例えば皮膚の導管を通した、吸収による）で投与され得る。化合物または薬剤はまた、該化合物または薬剤の延長された、緩徐な、または制御された放出を提供する、充電性または生分解性ポリマーデバイスまたは他のデバイス、例えばパッチおよびポンプ、または配合物により適宜、導入され得る。投与はまた、例えば１回、複数回、および／または１回もしくは複数の長期間にわたり実施され得る。幾つかの態様において、該投与は、自己投与を含む直接投与、および薬物を処方する行為を含む間接的投与の両方を包含する。例えば本明細書で用いられる、薬物を自己投与するようもしくは薬物を他者に投与させるよう患者に指導する医師、および／または薬物の処方を患者に提供する医師は、薬物を患者に投与している。
【０１６９】
一実施形態によれば、本発明は、抗菌性核酸の少なくとも１つの組を含む医薬組成物であって、該組が、複数の異なるステープル核酸を含み、該ステープル核酸が、細菌性リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）に特異的に結合して、核酸オリガミナノ構造を形成する、医薬組成物を提供する。一実施形態によれば、該細菌性ｒＲＮＡは、１６Ｓ、２３Ｓ、５Ｓ  ｒＲＮＡおよびｐｒｅ−ｒＲＮＡから選択される。別の実施形態によれば、該ステープル核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡ核酸から選択される。さらなる実施形態によれば、該組は、２〜４００の異なるステープル核酸を含む。特定の実施形態によれば、該組は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７５〜６２７またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２８〜６５４で示される配列を有するステープル核酸を含む。
【０１７０】
一実施形態によれば、本発明は、抗菌性核酸の組の配列を含む少なくとも１種の核酸構築物を含む医薬組成物であって、該ステープル核酸が、細菌性リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）に特異的に結合して、核酸オリガミナノ構造を形成する、医薬組成物を提供する。
【０１７１】
一実施形態によれば、本発明は、抗菌性核酸の組の逆配列を含む少なくとも１種の核酸構築物を含む医薬組成物であって、該ステープル核酸が、細菌性リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）に特異的に結合して、核酸オリガミナノ構造を形成する、医薬組成物を提供する。
【０１７２】
さらなる実施形態によれば、本発明は、抗菌性核酸の組の配列または逆配列を含む核酸構築物を含む少なくとも１種のベクターを含む医薬組成物であって、該ステープル核酸が、細菌性リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）に特異的に結合して、核酸オリガミナノ構造を形成する、医薬組成物を提供する。一実施形態によれば、該ベクターは、プラスミドである。別の実施形態によれば、該ベクターは、ファージである。
【０１７３】
上記実施形態の任意の１つによれば、該医薬組成物は、細菌細胞中へのベクター、例えばプラスミドの透過性を増進するように配合される。
【０１７４】
上記実施形態の任意の１つによれば、該医薬組成物は、細菌感染を処置する際の使用のためである。幾つかの実施形態によれば、該医薬組成物は、グラム陽性またはグラム陰性菌により誘発される細菌感染を処置する際の使用のためである。幾つかの実施形態によれば、該グラム陽性菌は、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス、エンテロコッカス、グラム陽性球菌、およびペプトストレプトコッカスから選択される。他の実施形態によれば、該グラム陰性菌は、アクチノバチルス、エロモナス、アナプラスマ、アルコバクター、アビバクテリウム、バクテロイデス、バルトネラ、ボルデテラ、ボレリア、ブラキスピラ、ブルセラ、カンピロバクター、カプノサイトファーガ、クラミジア、クラミドフィラ、クリセオバクテリウム、コクシエラ、サイトファーガ、ジケロバクター、エドワードシエラ、エルリチア、エシェリヒア、フラボバクテリウム、フランシセラ、フソバクテリウム、ガリバクテリウム、ヘモフィルス、ヒストフィルス、クレブシエラ、ローソニア、レプトスピラ、マンヘミア、メガスフェラ、モラキセラ、ネオリケッチア、ニコレテラ、オルニトバクテリウム、パスツレラ、フォトバクテリウム、ピシクラミジア、ピシリケッチア、ポルフィロモナス、プレボテラ、プロテウス、シュードモナス、リケッチア、リエメレラ、サルモネラ、ストレプトバチルス、テナチバキュラム、ビブリオおよびエルシニアから選択される。
【０１７５】
別の態様によれば、本発明は、必要とする対象における細菌感染を処置する方法であって、（ｉ）本発明の抗菌性核酸の少なくとも１つの組；（ｉｉ）該抗菌性核酸の組の配列もしくは逆配列を含む少なくとも１つの核酸構築物；または（ｉｉｉ）（ｉｉ）の核酸構築物を含む少なくとも１つのベクター、のうちの少なくとも１つと、医薬的に許容できる賦形剤と、を含む医薬組成物を、該対象に投与することを含む、方法を提供する。
【０１７６】
幾つかの実施形態によれば、該方法は、該医薬組成物を、経口、経直腸、筋肉内、皮下、静脈内、腹腔内、鼻内、動脈内、膀胱内、眼内、経皮および局所からなる群から選択される経路を介して投与することを含む。
【０１７７】
用語「含むこと」、「含む（複数可）」、「包含する（複数可）」、「有すること」、「有する」および「含有する（複数可）」は、本明細書では互換的に用いられ、「少なくとも一部が〜からなる」の意味を有する。用語「含むこと」を包含する本明細書内の各言及を解釈する際、該用語により前置きされたもの以外の特色が、存在してもよい。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ、ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」などの関連する用語は、同様の手法で解釈されなければならない。用語「有する（ｈａｖｅ、ｈａｓ）」「有すること」および「含むこと」は、「からなる」および「から本質的になる」の意味も包含してよく、これらの用語により置き換えられてもよい。用語「からなる」は、具体的に叙述または列挙されていない任意の成分、ステップまたは手順を除外する。
【０１７８】
本明細書で用いられる用語「約」は、それに続く値の±１０％以内を意味する。幾つかの実施形態において、用語「約」は、それに続く値の±５％または約±１％以内を意味する。
【０１７９】
本発明は、以下の実施例によりさらに例示されるが、それは限定と解釈されてはならない。当業者は、本明細書に記載された具体的物質および手順との数多くの均等物を、日常的実験を用いるだけで認識する、または確認することが可能である。そのような均等物は、以下の実施例に続く特許請求の範囲に包含されるものとする。
【０１８０】
実施例
実施例１．異なる温度でのｒＲＮＡポリヌクレオチド鎖の安定性
Ｓ．セレビシエリボソームＲＮＡの安定性を、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を補充された１×ＴＡＥ緩衝液中、異なる温度、即ち４５℃、５２．７℃、５７．６℃、６１．６℃および６５℃で最長１時間、テストした。図１から認められる通り、６５℃のｒＲＮＡは、安定しておらず、５分後にほぼ完全に分解する。より低い温度（６１．６℃、５７．６℃、５２．７℃、および４５℃）では、ｒＲＮＡは、より安定しており、例えばｒＲＮＡは、５２．７℃では２０分間にわたり完全に安定しているが、２０〜３０分の間に分解し始める。４０分後は、４５℃に保持された試料のみが、これらの条件下で安定している。
【０１８１】
実施例２．異なる温度での短いＲＮＡオリゴヌクレオチド鎖の安定性
ＲＮＡ二重らせんとして形成された核酸ナノ構造は、インビトロ転写により細胞外で作製されたＲＮＡステープルを利用して組み立てることができる。異なる温度でのそのような短いＲＮＡステープル（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０８〜５７３）の安定性をテストした。図２に示される通り、短いＲＮＡオリゴヌクレオチド鎖は、６５℃で最長２時間安定していた。この温度では、ｒＲＮＡは、数分間内に分解した。
【０１８２】
実施例３．ｒＲＮＡ抽出プロトコル
酵母細胞（Ｓ．セレビシエ）を、適当な培地１５００ｍｌ中、およそ１〜２×１０７細胞／ｍｌ（対数期）の密度に増殖させ、遠心分離によりペレット化した。ペレットを滅菌生理食塩水（０．９％Ｗ／Ｖ、ＮａＣｌ）３０ｍｌに再懸濁させ、高速で遠心分離した。ペレットをＳＴＥ（０．３２Ｍスクロース、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．Ｃｌ−ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ−ｐＨ８．０）３ｍＬに再懸濁させ、酸洗浄ビーズ（Ｓｉｇｍａ  ＃Ｇ８７７２）の存在下で手短にボルテックス処理した。
【０１８３】
ＮＴＥＳ（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．Ｃｌ−ｐＨ７．５、１％ＳＤＳ）１８ｍｌを添加して、混合物を再度、手短にボルテックス処理した。高温の酸性フェノール（Ｓｉｇｍａ  ＃Ｐ４６８２、６５℃）１５ｍＬを添加して、混合物を直ちにボルテックス処理し、さらに頻繁にボルテックス処理しながら６５℃で５分間インキュベートした。混合物を高速で５分間遠心分離し、水相とタンパク質の界面を高温フェノールのアリコット約１５ｍｌに取り出して、頻繁にボルテックス処理しながら６５℃で２分間インキュベートすることにより、混合物の水相を２回取り出して洗浄した。
【０１８４】
その後、水相のみを室温のフェノール／クロロホルム（１：１フェノール  Ｓｉｇｍａ  ＃Ｐ４６８２、およびクロロホルム：イソアミルアルコール２４：１  Ｓｉｇｍａ  ＃Ｃ０５４９）１２ｍｌに取り出し、ボルテックス処理して、遠沈させた。水相をクロロホルム（Ｓｉｇｍａ  ＃Ｃ０５４９）９ｍｌで再抽出し、ボルテックス処理して、遠沈させた。３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）（Ａｍｂｉｏｎ  ＃ＡＭ９７４０）１／１０容量、その後の無水エタノール２．５容量を添加し、ボルテックス処理し、−８０℃で一晩インキュベートすることにより、水層を沈殿させた。沈殿後に、混合物を高速で４０分間遠心分離した。ペレットをＤＥＰＣ中の７０％低温エタノール３０ｍｌで洗浄して、４５００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、手短に乾燥させた。ＲＮＡペレットをＤＥＰＣ  ５ｍｌに再懸濁させ、放置して５５℃で１０分間溶解させた。ＲＮＡを−２０〜−８０℃で貯蔵した。濃度および品質を分光光度法により推定した（Ｏ．Ｄおよび２６０／２８０比）。
【０１８５】
１８Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡ構造
１８Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡ構造をフォールディングするためのプロトコルを開発および改善すること、ならびにそれらの安定性を評定することを目標とした一連の実験を実施した。これらの実験において、他に断りがなければ、足場の濃度は、１０または５０ｎＭであり、足場：ステープル組の比は、１：１０または１：５であった。
【０１８６】
実施例４．フォールディング：精製足場  ｖｓ  非精製足場
この実験では、足場としての１８Ｓ  Ｓ．セレビシエ  ｒＲＮＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）および１２ｍＭ  ＭｇＣｌ２のステープル（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜５５）を用い、フォールディングプロトコル１に従ったｒＲＮＡ−ＤＮＡ構造のフォールディングをテストした。フォールディングは、Ｓ．セレビシエからの総ＲＮＡまたは精製足場１８Ｓ  ｒＲＮＡを用いて実施した。
【０１８７】
プロトコル１：
ｆ．６０℃で１分間インキュベートすること
ｇ．５５℃で５分間インキュベートすること
ｈ．５０℃で１０分間インキュベートすること
ｉ．３７℃で１０分間インキュベートすること、および
ｊ．２５℃で１０分間インキュベートすること。
【０１８８】
ゲルから認められる通り（図３）、フォールディングは、両方の例（レーン５〜６）で成功したが、総ＲＮＡを足場として用いたフォールディングは、スメアなバンド（レーン５）、および精製１８Ｓサブユニットよりも汚れた試料となった（レーン６）。図４は、精製１８Ｓ  ｒＲＮＡから得られたフォールディング済みｒＲＮＡ−ＤＮＡのＡＦＭ画像を示しており、１８Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡの定義された長方形構造を認めることができる。この試料は、スキャンの前に、過剰なステープルがクリーニングされていなかった。
【０１８９】
実施例５．異なる濃度のＭｇＣｌ２でエッジステープルを用いた、または用いないＳ．セレビシエ１８Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡのフォールディング
フォールディングプロトコル１を利用し、足場としての１８Ｓ  Ｓ．セレビシエ  ｒＲＮＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）および異なるＭｇＣｌ２濃度（＋２ｍＭで段階的に１０ｍＭ〜２０ｍＭ）のステープル（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜５５およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６〜６７：エッジステープル）を用いて１８Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡ構造のフォールディングを実施した。
【０１９０】
足場および足場ステープルを含む１８Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡ構造（図５Ａ）、およびさらにエッジステープルを含む１８Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６〜６７、図５Ｂ）の略図を表す。
【０１９１】
図６に認められる通り、エッジを含む（レーン５〜１０）または含まない（レーン１１〜１６）１８Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡ構造のフォールディングに有意差はなかった。ゲルによれば、フォールディングは、全てのＭｇＣｌ２濃度：１０ｍＭ、１２ｍＭ、１４ｍＭ、１６ｍＭ、１８ｍＭおよび２０ｍＭで起こった。
【０１９２】
実施例６．異なるカチオン条件におけるフォールディングされた１８Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡ構造の安定性
異なる緩衝液（１×ＴＡＥ、１２ｍＭ  ＭｇＣｌ２；１×ＴＡＥ＋２ｍＭ  ＭｇＣｌ２；およびＤＥＰＣ）中で、精製された１８Ｓ  ｒＲＮＡを足場として用いてフォールディングプロトコル１に従ってフォールディングされた１８Ｓ  ＲＮＡ−ＤＮＡ構造の、３７℃で０、１、３時間および一晩にわたる安定性を評定した。結果を、図７に表す。
【０１９３】
加えて、異なる浸透圧条件で、フォールディングされ（プロトコル１）、クリーニングされた１８Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡ構造の３７℃での安定性を、数回の間隔の間にテストした。テストされた条件は、１×ＴＡＥ、１２ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、４．２ｍＭ  ＫＣｌおよび１．９３ｍＭ  ＣａＣｌ２（ヒト血液に似た条件）であった。テストされたタイムポイントは、０、３０、６０、１２０、２４０および３６０分であった。結果を、図８に表す。
【０１９４】
図７に認められる通り、フォールディング条件が、１×ＴＡＥ＋２ｍＭ  ＭｇＣｌ２またはＤＥＰＣである場合、３時間後および一晩経った後にバンドにわずかなスメアが存在し、これは、ＭｇＣｌ２濃度が低下すると、形状が崩壊し始めることを意味する。加えて、１８Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡ構造のバンドは、レーン１５〜１６ではわずかに下にシフトしており、ＤＥＰＣがＤＮＡ−ＲＮＡオリガミの安定性にあまり適さないことが示される。
【０１９５】
図８に認められる通り、該ｒＲＮＡ構造は、両条件で６時間にわたり安定していた。恐らく総ＲＮＡ抽出物中に存在する他のＲＮＡ分子のわずかな分解のために、バンドはよりスメアになり、１００ｋＤａカットオフの遠心分離フィルター（１００ｋ  Ａｍｉｃｏｎ）における遠心分離により除去されなかった（例えば２５Ｓサブユニット）。３時間後および一晩経った後に形状（即ち、フォールディング構造）が二量体を生成した、という指標も存在する。ヒト血液を模倣した混合物中に存在する他の陽イオンが１２ｍＭ〜１．５ｍＭへのＭｇＣｌ２濃度の低下を補填すると結論付けた。
【０１９６】
実施例７．プロトコル１の改変：３７℃での１８Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡ構造の安定性
１８Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡ構造をフォールディングプロトコル１に従って総ＲＮＡからフォールディングし、その後、ヒト体温中の安定性をテストするために、１×ＴＡＥ緩衝液（１２ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中、３７℃で最長９日間インキュベートした。図９に表された結果から、構造／形状を３７℃で長時間インキュベートするほど、ゲル上のバンドが強くなることが示される。このことから、形状が３７℃で安定しているだけでなく、１８Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡ構造を３７℃に保持することがフォールディングの品質および収率を改善することが示された。上のバンドがレーン７〜１０（２５Ｓ長方形バンドの上のバンド）においてよりシャープに見えたことから、その形状が二量体を形成する可能性が示され得る。
【０１９７】
実施例８．プロトコル１の改変：３７℃での１８Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡ構造の安定性  −  精製  ｖｓ  非精製
実施例７にさらに加えて、本発明者らは、実施例７と類似の条件で実施された、フォールディングの有効性に及ぼす１８Ｓ  ｒＲＮＡの精製の影響をテストした。精製または非精製ＲＮＡからフォールディングされた構造を、３７℃で２．５および９．５日間インキュベートした。ゲルおよびＡＦＭスキャンを、それぞれ図１０および１１に表す。
【０１９８】
フォールディングが、両方の実験で成功したが、総ＲＮＡでのフォールディングが通常、スメアなバンドを生じ、アガロースゲルで泳動した場合に、ＡＦＭで示された通りより汚れた試料となり、スキャンの品質に影響を及ぼすことが認められる。より高い解像度の画像では、図１１Ａの画像（非精製）の背景が図１１Ｃ（精製１８Ｓ  ｒＲＮＡからのフォールディング）の背景よりもかなり汚れていることが認められる。
【０１９９】
さらに、バンドは９．５日後により強くシャープになっており、これはフォールディングされた構造を３７℃でインキュベートすること（フォールディングプロトコル１で競合した後）がフォールディングの品質および収率を改善することを意味している。
【０２００】
実施例９．プロトコル１  −  最適化
本発明者らは、３７℃での異なる期間にわたる（０、１、２、５、６および９日間）１８Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡ構造（フォールディング緩衝液（１×ＴＡＥ、１２ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中でフォールディングプロトコル１に従ってフォールディングされた）の安定性をさらにテストした。図１２に表された結果から、この構造が３７℃でより長時間保持されるほど、ベンド（ｂｅｎｄ）が強くなっており、３７℃での該構造の維持が、フォールディングおよびその収率を改善したことが示される。
【０２０１】
本発明者らは、過剰のステープルおよび１００ｋＤａサイズ未満の総ＲＮＡの他の成分を、１００ｋＤａカットオフの遠心分離フィルターで１８Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡ構造を遠心分離することにより排除してもよい（図１３参照）。１８Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡ構造は、この手順により損傷されなかった。この手順はまた、該構造の濃度のために使用してもよい。
【０２０２】
実施例１０．ビオチンを用いた１８Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡ構造の作製
４つのビオチン部位を有する１８Ｓ  ＲＮＡ−ＤＮＡ構造を、フォールディング緩衝液（１×ＴＡＥ、１２ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中で、フォールディングプロトコル１に従って精製１８Ｓ  ｒＲＮＡからフォールディングした。構造の略図を、図１４に示す。結合部位は、５’にビオチンを含む４つの本来のステープル（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ４、２８、４８および４９）である。これらのビオチン部位は、ビオチン−アビジン−ビオチン相互作用を介する、または化学的もしくは生物学的反応を実行するための、所望のペイロードへのローディング部位として働き得る。事実、ステープルのいずれも、５’および／または３’に任意の修飾、例えばビオチン、フルオロフォア、ＮＨ２などを有し得る。図１５に認められる通り、アビジンは、対応するバンドのシフトにより実証される通り該構造への結合に成功した。
【０２０３】
１８Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡ構造内でのビオチン部位へのアビジンの結合もまた、ＡＦＭスキャンにより実証された（図１６参照）。該構造の明るい部分は、アビジン分子であり、結合が成功したことを意味している。４つのステープル上のビオチン修飾がフォールディング品質に影響を及ぼさず、その形状が充分にフォールディングされたことが認められる。結合されたアビジンのパーセンテージは、ローディング部位：アビジン比、およびアビジンと構造とのインキュベーション時間に依存する。
【０２０４】
実施例１１．２５Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡ構造のフォールディング
この実験では、足場としての２５Ｓ  Ｓ．セレビシエ  ｒＲＮＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８）および１２ｍＭ  ＭｇＣｌ２のステープル（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９〜１７８）を用い、フォールディングプロトコル１に従ったｒＲＮＡ−ＤＮＡ構造のフォールディングをテストした。該構造の略図を、図１７に示す。
【０２０５】
該構造を、精製足場からの総ＲＮＡからの、１２．５ｍＭまたは１６ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む１×ＴＡＥ中でプロトコル１に従ってフォールディングした。図１８に認められる通り、総ＲＮＡまたは精製２５Ｓ  ｒＲＮＡサブユニットのどちらが用いられたかにかかわらず、フォールディングは成功した。しかし総ＲＮＡのフォールディングは、スメアなバンドおよびより汚れた試料となった。
【０２０６】
ＡＦＭスキャン（図１９）から、２５Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡが長方形という特別な構造にフォールディングするが、その収率および品質が充分に高くなく、フォールディングプロトコルおよび条件を最適化させなければならないことが示される。
【０２０７】
実施例１２．２５Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡ構造をフォールディングするためのフォールディングプロトコルの最適化  −  Ｉ
３つの異なるプロトコルを、以下の通りプロトコル１に基づいて開発した：
【０２０８】
フォールディングプロトコル２：
（ａ）６０℃で１．５分間インキュベートすること；
（ｂ）５５℃で７．５分間インキュベートすること；
（ｃ）５０℃で１５分間インキュベートすること；
（ｄ）３７℃で１５分間インキュベートすること；および
（ｅ）２５℃で１５分間インキュベートすること。
【０２０９】
フォールディングプロトコル３：
（ｊ）６０℃で１分間インキュベートすること；
（ｋ）−１℃／０．５分の速度で５９℃から５６℃に冷却すること；
（ｌ）５５℃で５分間インキュベートすること；
（ｍ）−１℃／０．５分の速度で５４℃から５１℃に冷却すること；
（ｎ）５０℃で１０分間インキュベートすること；
（０）−１℃／０．５分の速度で４９℃から３８℃に冷却すること；
（ｐ）３７℃で１０分間インキュベートすること；
（ｑ）−１℃／０．５分の速度で３６℃から２６℃に冷却すること；
（ｒ）２５℃で１０分間インキュベートすること。
【０２１０】
フォールディングプロトコル４：
（ａ）６０℃で１．５分間インキュベートすること；
（ｂ）−１℃／０．５分の速度で５９℃から５６℃に冷却すること；
（ｃ）−１℃／分の速度で５５℃から２５℃に冷却すること。
異なるプロトコルを用いたフォールディングの結果を、図２０（アガロースゲル）およびフォールディングされた構造のＡＦＭ画像を示した図２１に表す。これらの結果に従うと、フォールディングされた２５Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡ構造を示すバンドは、スメアであり、強くシャープでない。２５Ｓ構造以外のＡＦＭ画像では、４つのフォールディングプロトコル全てにおいて、部分的にフォールディングされた形状が観察された。
【０２１１】
実施例１３．２５Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡ構造をフォールディングするためのフォールディングプロトコルの最適化  −  ＩＩ
さらなる実験において、フォールディングを実施例１１と同様に実施し、さらに、得られた構造を３７℃で異なる期間、インキュベートした。フォールディングは、フォールディング緩衝液（１×ＴＡＥ、１６ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中で総ＲＮＡから実施した。フォールディングに続いて、試料を３７℃で２．５、４、５および６日間インキュベートした。結果を図２２（アガロースゲル）および図２３（ＡＦＭ画像）に表す。
【０２１２】
図２２に認められる通り、バンドは、２５Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡ構造のフォールディングの成功を示し、試料を３７℃で長期間インキュベートするほど、強くなっており、フォールディングの品質および収率が改善されたことが示される。重要なこととして、２．５日後に１８Ｓ  ｒＲＮＡを表すバンドが消失したため、これらのプロトコルでは１８Ｓ  ｒＲＮＡが分解する。
【０２１３】
ＡＦＭ画像（図２３）から、上述のことが裏付けられた。さらに、フォールディングプロトコル４を用いてフォールディングされた構造の３７℃でのインキュベートでは、５つのタイムポイント全てで採取された画像に基づくと、充分に形成された２５Ｓ構造を高収率で受け取るためには、３７℃で少なくとも４日間必要となることが認められる。より短時間では、部分的構造となる。
【０２１４】
実施例１４．一定温度での２５Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡ構造のフォールディング
２５Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡ構造をフォールディングするための新しいフォールディングプロトコル５を開発した。このフォールディングは、一定温度：４５℃（図２４Ａ、レーン１１〜１６参照）または５０℃（図２４Ｂ、レーン４〜９）で２日間にわたり実施した。フォールディング温度は、より低くても、またはより高くてもよく、プロトコルの期間は、形状の複雑性の関数として変動させてもよい。
【０２１５】
図２４に認められる通り、フォールディングは、４５℃および５０℃の両方で成功した。バンドの高さおよび強度を比較することにより、フォールディングが４５℃よりも５０℃でより急速かつ効率的に起こることが分かる。図２５から、該構造が両方の温度でうまく形成されたことが示される。７時間のインキュベートがフォールディングを高い品質および収率で得るのに充分であるが、ゲル（７時間と１．５〜２日のバンド高を比較した場合）およびＡＦＭ画像から分かる通り、フォールディングが１〜２日目に最適であることが認められる。
【０２１６】
さらなる実験において、フォールディングが低濃度のＭｇＣｌ２（例えば、１２ｍＭ）および／または５５℃などの高温で実施され得ることが示された（図２６）。５５℃では、７時間後に既に２５Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡ構造を表すバンドが出現し、翌日にかけてより強くなるが、５０℃ではバンドがその時点でよりスメアでより高く、形状のほとんどが依然としてフォールディングしていることを意味するため、フォールディングが５５℃でわずかに急速であることが観察された。１日後に、バンドは両方の温度で類似して見え、フォールディングが両方の温度およびＭｇＣｌ２濃度で実施し得ることが示される。
【０２１７】
実施例１５．１つの混合物からの２５Ｓおよび１８Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡ構造のフォールディング：プロトコル１
本発明者らは、「ミックス反応物」と称される１つの反応物から２種の異なる別のｒＲＮＡ−ＤＮＡ構造（一方の長方形は小さく、足場として１８Ｓを有して形成され、他方はより大きく、足場として２５Ｓ  ｒＲＮＡを有する）をフォールディングするためのフォールディング条件（ＭｇＣｌ２）およびフォールディングプロトコルを較正した（この実験の略図を図２７に表す）。該フォールディングは、１×ＴＡＥ中に１２ｍＭおよび１６ｍＭという２種のＭｇＣｌ２濃度で、Ｓ．セレビシエからの総ＲＮＡを用いて実施した。用いられたフォールディングプロトコルは、フォールディングプロトコル１であり、その後、該構造を３７℃で７日間にわたりインキュベートした。対照として、１８Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡおよび２５Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡ構造を別の反応で形成させて、これらの条件でフォールディングをテストした。
【０２１８】
フォールディングは、両方のＭｇＣｌ２濃度、即ち１２ｍＭおよび１６ｍＭで成功したが（図２８および図２９参照）、過去の実施例で認められた通り、フォールディングプロトコル１の終了後の少なくとも４〜５日間、３７℃でインキュベートすることが、２５Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡ構造の充分なフォールディングおよび高い収率に求められる。
【０２１９】
実施例１６．１つの混合物からの２５Ｓおよび１８Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡ構造のフォールディング：プロトコル５
さらなる実験において、足場：ステープル比を１：１０から１：５に低下させた場合の、５０℃でプロトコル５を用いた大規模なミックス反応物からの該構造の調製の有効性を評価した。ＭｇＣｌ２濃度も、変動させた。結果に従うと（図３０および３１参照）、フォールディングが両方の実験で既に２〜２．５時間後に成功しており、これはＭｇＣｌ２濃度を１２ｍＭに低下させ、そして／または足場：ステープル比を１：５に低下させたことがフォールディングの品質に影響を及ぼさなかったことを意味する。
【０２２０】
さらなる実験において、本発明者らは、足場（そして結果的にステープル）の濃度を上昇させること、したがってフォールディングの収率を上昇させることが可能であることを示した。さらに本発明者らは、反応物の容量を増加させることが可能であることを示した。収率およびフォールディングの品質は、高かった。１８Ｓ構造と２５Ｓ構造の比は、総ＲＮＡ抽出物中の２５Ｓ  ｒＲＮＡに対する１８Ｓ  ｒＲＮＡの比に依存する。本発明者らは、得られた構造の品質を維持しながら、大量生産に不可欠であるフォールディング反応の容量を増加させるように、例えばＰＣＲ（ＤＮＡオリガミをフォールディングするために用いられる標準的デバイス）以外のデバイスでフォールディングさせるように管理した（図３１Ｃ参照）。
【０２２１】
実施例１７．２５Ｓ−１８Ｓ組み合わせのｒＲＮＡ−ＤＮＡ構造のフォールディング
１６ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含むフォールディング緩衝液１×ＴＡＥ中、５０℃で３日にわたり２種の異なる足場をフォールディングすることにより（フォールディングプロトコル５）、２５Ｓ−１８Ｓ組み合わせのｒＲＮＡ−ＤＮＡ構造を形成させた。Ｓ．セレビシエｒＲＮＡからの１８Ｓ  ｒＲＮＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）および２５Ｓ  ｒＲＮＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８）の両方を足場として用いて、１つの組み合わせた形状を組み立てた（実施例１４または１５で得られた２種の構造とは異なる）。用いられたステープルは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８７〜３５９である。これらの実験において、２種の足場から１つの形状をフォールディングさせた。この実験は２つの方法で実施され、第一の実験では、足場として用いられた１８Ｓおよび２５Ｓ  ｒＲＮＡをインキュベートした後、コネクターステープルＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３３を含むフォールディングプロトコルを室温で２時間適用し；第二の実験では、足場をコネクターステープルと共にインキュベートした後に、フォールディングを行った。１〜３日目のバンドがより強いことがゲルから分かり（図示しない）、両方の反応でフォールディングが成功し、４時間のレーンは異なるが、バンドがスメアになりシャープでなかったことが示される。第一の実験と第二の実験の間でフォールディングの有意差はなく、即ち、Ｓ１８  ｒＲＮＡおよびＳ２５  ｒＲＮＡ足場とコネクティングステープルとのインキュベーションは、結果を改善しない（図３２）。これらの結果から、ＰＣＲはもはや必要とされないため、フォールディングがより高容量であっても実施され得ることが示される。
【０２２２】
実施例１８．Ｓ１８、Ｓ２５およびＳ１８−Ｓ２５  ＲＮＡ−ＤＮＡ構造の概要
異なるパラメータを、Ｓ１８、Ｓ２５および２５Ｓ−１８Ｓ  ＲＮＡ−ＤＮＡ構造で測定し、表１に表している。
【表１】
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【０２２３】
実施例１９．ｒＲＮＡ−ＤＮＡオリガミ立方八面体（Ｃｕｂ．）  −  ２Ｄ
フォールディングプロトコルを用いて、２Ｄ（図示）および３Ｄ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡオリガミナノ構造の両方を、設計の原理および開発されたフォールディングプロトコルに基づいてフォールディングした。図３３は、Ｓ．セレビシエ  ２５Ｓ  ｒＲＮＡを足場として用いたｒＲＮＡ−ＤＮＡ立方八面体（Ｃｕｂ．）の２Ｄ（図３３Ａ）および３Ｄ（図３３Ｂおよび３３Ｃ）の略図を示す。
【０２２４】
２Ｄ−Ｃｕｂ．の設計は、マニュアル法であり（ｃａＤＮＡｎｏソフトウエアに基づかず）、１１フォールドのＤＮＡ：ＲＮＡらせんの幾何学的配置およびパラメータに基づいた。ｒＲＮＡ−ＤＮＡ立方八面体のフォールディングは、４つの異なるフォールディングプロトコルに従い、足場としての２５Ｓ  Ｓ．セレビシエｒＲＮＡおよびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６０〜４３７のステープルを用いて実行した。フォールディングは、ゲル濾過クロマトグラフィーによりｔＲＮＡおよび他の小分子からクリーニングされた総ＲＮＡと共に、フォールディング緩衝液１×ＴＡＥ、１２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２中で実施した（総ＲＮＡとは正反対に（レーン２）、図３４、レーン３、クリーニング後にｔＲＮＡのバンドが消失）。
【０２２５】
フォールディングプロトコルは：
・  フォールディングプロトコル１；
・  フォールディングプロトコル１の後、３７℃で最長４．５日間インキュベートすること；
・  フォールディングプロトコル６；
（ａ）６０℃で１分間インキュベートすること；
（ｂ）５５℃で５分間インキュベートすること；
（ｃ）５０℃で５分間インキュベートすること；
（ｄ）４５℃で１０分間インキュベートすること；および
（ｅ）−１℃／１０分の速度で４０℃から１５℃に冷却すること。
・  ４０℃で２．５および４．５日間にわたりインキュベートするフォールディングプロトコル５（レーン１３、１４）。
【０２２６】
図３４および３５に表された結果に従うと、フォールディングが全てのプロトコルで成功した。２Ｄ−Ｃｕｂ．バンドを超えるバンドから、これらの形状が二量体を生成したことが示される。
【０２２７】
特定のＡＦＭスキャンでは、形状が設計とほとんど異ならないように見えており、これは、試料が雲母表面にどのようにして付着および接着されたか、そしてスキャンに必要となる試料調製手順に依存する。
【０２２８】
実施例２０．ｒＲＮＡ−ＤＮＡオリガミのフォールディングされた立方八面体（Ｃｕｂ．）  −  ３Ｄ
３Ｄ  Ｃｕｂ（図３３ＢおよびＣ参照）を、足場としての２５Ｓ  Ｓ．セレビシエｒＲＮＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８）およびＤＮＡステープルＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３８〜５００を用いた１１フォールドのＤＮＡ−ＲＮＡらせんの幾何学的配置およびパラメータに従ってマニュアル法で設計した。
【０２２９】
該立方八面体は、２つのフォールディングプロトコル、即ちプロトコル１および６を用いて調製した。フォールディングは、実施例１８と同様にｔＲＮＡおよび他の小分子からクリーニングされた総ＲＮＡと共に、フォールディング緩衝液１×ＴＡＥ、１２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２中で実施した。本発明者らはまた、２Ｄ立方八面体のフォールディング（図３６、レーン３、４。それぞれフォールディングプロトコル１および参照６）を３Ｄ立方八面体のフォールディングに比較した。
【０２３０】
フォールディングは、両方のプロトコルを用いた２Ｄおよび３Ｄ立方八面体の両方で成功した。フォールディング形状を表すバンドが、シャープで強く、高品質のフォールディングであることが示される。３Ｄ  Ｃｕｂ．バンドは、該形状が球構造にフォールディングされるため、２Ｄ  Ｃｕｂ．バンドよりもわずかに低いことが認められる（図３６）。そのような構造は、２Ｄ  Ｃｕｂ．のオープン型構造よりも急速にアガロースマトリックスを通して遊走する。ＡＦＭ画像は、ゲルの結果を裏付けており、立方八面体構造が明確に認められる（図３７）。
【０２３１】
実施例２１．３０６ｂ  ｓｓＲＮＡ足場の安定性
複数の期間インキュベートされた異なる温度値（６５℃、約６０℃、約５５および５０℃）での３０６塩基のｓｓＲＮＡ（３０６ｂ）足場（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０１）の安定性を評定した。３０６ｂを、ＤＮＡ鋳型に基づくインビトロ転写（ＩＶＴ）反応により生成した。さらなる副生物が該反応で生成され、それを「ＩＶＴ生成物」と示す。試料は全て、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を補充された１×ＴＡＥ緩衝液中に維持された。テストされたタイムポイントは、温度それぞれで５、１０、２０、４０、および６０分であった。図３８に表された結果から、６５℃では、３０６ｂが２０分後に分解し始めることが認められる。より低い温度（５５℃および５０℃）では、３０６ｂ  ｓｓＲＮＡはより安定しているが、４０分後に分解が観察された。５０℃に保持された試料のみが、４０分後に安定していた。
【０２３２】
重要なこととして、長いｓｓＲＮＡほど、高温での安定性が低く、例えばＩＶＴ副生物（３０６ｂ足場の少なくとも２倍のサイズ）は、より短いものよりも６５℃、６０℃および５５℃でより急速に分解した。それぞれ１８００ｂおよび３３９６ｂ長の１８Ｓおよび２６Ｓ  ｒＲＮＡは、６５℃では２、３分より長く存在し続けなかった。このことは、ＤＮＡがより安定していて、９５℃でも供され得ることから、重要である。ＤＮＡおよびＲＮＡの異なる安定性を考慮すると、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡオリガミ構造をフォールディングする際、異なるフォールディングプロトコルが用いられなければならない。
【０２３３】
追加の実験において、３０６ｂ足場（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０１）およびそのフォールディングのためのＲＮＡステープル（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０２〜５０７および６９６〜６９７）が、フォールディングプロトコル１の条件でインタクトであることが示された。
【０２３４】
実施例２２．３０６ｂ−ＲＮＡ−ＲＮＡ構造のフォールディング
３０６ｂ足場およびＲＮＡステープルを用いたＲＮＡ−ＲＮＡ構造のフォールディングを、フォールディングプロトコル１に従って１１ｍＭ  ＭｇＣｌ２の１×ＴＡＥ中で実施した（図３９参照）。フォールディングは、３種の足場の推定濃度：２５ｎＭ（足場：ステープル  １：１０）、５０ｎＭ（足場：ステープル  １：５）または１００ｎＭ（足場：ステープル  １：２．５）で実施したが、試料濃度は、２５０ｎＭのままであった。図３９から認められる通り、フォールディング構造に対応するバンドが、レーン４および５に出現し、３０６ｂ−ＲＮＡ−ＲＮＡ構造のフォールディングの成功を示しており、レーン３のバンドは、足場濃度が不正確でゲル電気泳動分析により検出不能な低いフォールディング構造濃度になったため、ほとんど認められない。ＡＭＦ画像（図４０）から、フォールディングに成功したゲルの結果が裏付けられる。画像の試料は、高いステープル濃度（２５０ｎＭ）のせいで極めて汚れている。これらの結果から、（ａ）ＲＮＡ−ＲＮＡオリガミ構造が実現可能であること、ならびに（ｂ）ＲＮＡ−ＲＮＡ二重らせん構造およびＲＮＡ−ＤＮＡ二重らせん構造の両者が、Ａ型コンフォメーションの二重らせん構造を形成していても、ＲＮＡ−ＲＮＡ二重らせん構造はＲＮＡ−ＤＮＡ二重らせんと異なること、が立証された。これらの結果から、ＲＮＡ−ＲＮＡ構造中のらせんターンが、ターンあたり１２塩基対であり、これまで考えられた１１でないことが実証された。
【０２３５】
実施例２３．１８Ｓ−ＲＮＡ−ＲＮＡ構造のフォールディング
足場としての１８Ｓ−ｒＲＮＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）と、ＴヌクレオチドがＵヌクレオチドで置換されたＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜６７の配列を有するＲＮＡステープル（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０８〜５７３）と、を用いた１８Ｓ−ｒＲＮＡ−ＲＮＡ構造を、フォールディングプロトコル１に従ってフォールディングし、その後、３７℃で７日間にわたり保持した。フォールディング反応は、フォールディング緩衝液（１×ＴＡＥ、１２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中で総ＲＮＡから実施し、３７℃で０、１、４、５、６、および７日後にテストした（それぞれ、図４１のレーン１１〜１６参照）。タイムポイント０では、３７℃に保持せずに、該形状をフォールディングプロトコル１のみに従ってフォールディングした。１８Ｓ−ｒＲＮＡ−ＲＮＡ構造  ｖｓ  １８Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡ構造のＡＦＭ画像は、それぞれ４２Ａおよび４２Ｂに表される。
【０２３６】
結果に従うと、１８Ｓ  ｒＲＮＡ−ＲＮＡ構造が得られたが、１８Ｓ  ＲＮＡ−ＲＮＡのフォールディングの収率は１８Ｓ  ｒＲＮＡ−ＤＮＡよりも低かった。
【０２３７】
追加のプロトコル：例えば、プロトコル７：フォールディング緩衝液２（６ｍＭ  Ｍｇ（ＯＡｃ）２、４０ｍＭ  Ｎａ−ＯＡｃ、４０ｍＭ  ＫＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＯＡｃ（ｐＨ  ７．８））中、−１℃／分の速度で６５℃から１５℃に冷却すること、をテストして、フォールディングの収率を上昇させた。この実験では、相対的に低収率のフォールディングとなった。他の過去に発表されたプロトコルをテストしたが、同じく低収率となった。
【０２３８】
実施例２４．１８Ｓ−ｒＲＮＡ−ＲＮＡ構造のフォールディング
足場としての１８Ｓ−ｒＲＮＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）および配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５５〜６９５を有するＲＮＡステープルを用いた１８Ｓ  ｒＲＮＡ−ＲＮＡ構造を、フォールディングプロトコル１に従ってフォールディングし、その後、３７℃で７日間にわたり保持する。フォールディング反応は、フォールディング緩衝液（１×ＴＡＥ、１２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中で総ＲＮＡから実施し、３７℃で０、１、４、５、６、および７日後にテストした。タイムポイント０では、該形状は、３７℃に保持せずにフォールディングプロトコル１に従った場合のみ、フォールディングされる。並行実験で、１８Ｓ−ｒＲＮＡ、および配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５５〜６９５を有するＲＮＡステープルは、フォールディングプロトコル２〜４および７に従ってフォールディングされる。
【０２３９】
ターンあたり１２塩基対のＡ−ＲＮＡ：ＲＮＡ構造を提供するステープルの設計が、過去の実験よりもかなり高い収量の獲得を可能にする。
【０２４０】
実施例２５．ＤＮＡステープルの２つの異なる組を用いた細菌性１６Ｓ  ｒＲＮＡのフォールディング
この実験では、１６Ｓ  ｒＲＮＡを含む大腸菌ＤＨ５αからの総ＲＮＡを用い、フォールディングプロトコル１に従ったｒＲＮＡ−ＤＮＡ構造のフォールディングをテストした。１６Ｓ  ｒＲＮＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７４）を足場として用い、フォールディングのために、ステープルの２つの異なる組：組１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７５〜６２７）および組２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２８〜６５４）を実行した。フォールディングは、足場：ステープル組の比１：１０（２０ｎＭ：２００ｎＭ）を利用して、１２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２で実施した。
【０２４１】
プロトコル１：
６０℃で１分間インキュベートすること
５５℃で５分間インキュベートすること
５０℃で１０分間インキュベートすること
３７℃で１０分間インキュベートすること、および
２５℃で１０分間インキュベートすること。
【０２４２】
フォールディングに続いて、得られた構造を３７℃で１〜６日間インキュベートした。３７℃で５．５日間のインキュベーション後に得られたオリガミ構造を示した図４３および４４に認められる通り、両方のステープル組は、細菌性１６Ｓ  ｒＲＮＡのフォールディングに効果的であった。
【０２４３】
実施例２６．ステープル核酸の抗菌効果
この実験では、本発明者らは、１６Ｓを標的化する「組２」ＤＮＡステープル（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２８〜６５４）１μＭを、大腸菌Ｋ１２に添加した。インキュベーションの前に、ＲｅｄｏｘＧｒｅｅｎを細菌に添加した（最終濃度１μＭ）。大腸菌を、インキュベーター内に１時間静置させた。１時間後に、細胞をフローサイトメトリーでの分析のために採取した。結果を、図４５に表す。
【０２４４】
ＲｅｄｏｘＧｒｅｅｎは、細菌代謝活性の指示薬であり、それゆえ大腸菌の生存率を示す。生存する細菌は、代謝を阻害された細菌および死菌よりもかなり高い緑色シグナルを有する。図４５（右パネル）から認められる通り、１時間のみのインキュベーションに続いて、細菌の約１４％が死滅し、約４２％が代謝阻害され、投与されたステープル核酸の殺菌および静菌効果が示された。
【０２４５】
本発明の特定の実施形態を例示および説明したが、本発明が本明細書に記載された実施形態に限定されないことは、明白であろう。以下の特許明細書に記載された本発明の主旨および範囲を逸脱することなく、数多くの修正、変更、改変、置換および均等物が、当業者に自明となろう。
【図１Ａ】
2020505042.tif 000003
【図１Ｂ】
2020505042.tif 000004
【図２】
2020505042.tif 000005
【図３】
2020505042.tif 000006
【図４】
2020505042.tif 000007
【図５Ａ】
2020505042.tif 000008
【図５Ｂ】
2020505042.tif 000009
【図６】
2020505042.tif 000010
【図７】
2020505042.tif 000011
【図８】
2020505042.tif 000012
【図９】
2020505042.tif 000013
【図１０】
2020505042.tif 000014
【図１１Ａ】
2020505042.tif 000015
【図１１Ｂ】
2020505042.tif 000016
【図１１Ｃ】
2020505042.tif 000017
【図１１Ｄ】
2020505042.tif 000018
【図１１Ｅ】
2020505042.tif 000019
【図１１Ｆ】
2020505042.tif 000020
【図１２】
2020505042.tif 000021
【図１３】
2020505042.tif 000022
【図１４】
2020505042.tif 000023
【図１５】
2020505042.tif 000024
【図１６】
2020505042.tif 000025
【図１７】
2020505042.tif 000026
【図１８】
2020505042.tif 000027
【図１９】
2020505042.tif 000028
【図２０】
2020505042.tif 000029
【図２１Ａ】
2020505042.tif 000030
【図２１Ｂ】
2020505042.tif 000031
【図２１Ｃ】
2020505042.tif 000032
【図２２】
2020505042.tif 000033
【図２３Ａ】
2020505042.tif 000034
【図２３Ｂ】
2020505042.tif 000035
【図２３Ｃ】
2020505042.tif 000036
【図２３Ｄ】
2020505042.tif 000037
【図２３Ｅ】
2020505042.tif 000038
【図２３Ｆ】
2020505042.tif 000039
【図２３Ｇ】
2020505042.tif 000040
【図２３Ｈ】
2020505042.tif 000041
【図２３Ｉ】
2020505042.tif 000042
【図２３Ｊ】
2020505042.tif 000043
【図２３Ｋ】
2020505042.tif 000044
【図２４】
2020505042.tif 000045
【図２５Ａ】
2020505042.tif 000046
【図２５Ｂ】
2020505042.tif 000047
【図２５Ｃ】
2020505042.tif 000048
【図２６】
2020505042.tif 000049
【図２７】
2020505042.tif 000050
【図２８】
2020505042.tif 000051
【図２９Ａ】
2020505042.tif 000052
【図２９Ｂ】
2020505042.tif 000053
【図３０】
2020505042.tif 000054
【図３１Ａ】
2020505042.tif 000055
【図３１Ｂ】
2020505042.tif 000056
【図３１Ｃ】
2020505042.tif 000057
【図３２Ａ】
2020505042.tif 000058
【図３２Ｂ】
2020505042.tif 000059
【図３３Ａ】
2020505042.tif 000060
【図３３Ｂ】
2020505042.tif 000061
【図３３Ｃ】
2020505042.tif 000062
【図３４】
2020505042.tif 000063
【図３５Ａ】
2020505042.tif 000064
【図３５Ｂ】
2020505042.tif 000065
【図３５Ｃ】
2020505042.tif 000066
【図３５Ｄ】
2020505042.tif 000067
【図３６】
2020505042.tif 000068
【図３７Ａ】
2020505042.tif 000069
【図３７Ｂ】
2020505042.tif 000070
【図３７Ｃ】
2020505042.tif 000071
【図３７Ｄ】
2020505042.tif 000072
【図３７Ｅ】
2020505042.tif 000073
【図３７Ｆ】
2020505042.tif 000074
【図３８】
2020505042.tif 000075
【図３９】
2020505042.tif 000076
【図４０Ａ】
2020505042.tif 000077
【図４０Ｂ】
2020505042.tif 000078
【図４１】
2020505042.tif 000079
【図４２Ａ】
2020505042.tif 000080
【図４２Ｂ】
2020505042.tif 000081
【図４３】
2020505042.tif 000082
【図４４】
2020505042.tif 000083
【図４５】
2020505042.tif 000084
【手続補正書】
【提出日】令和1年10月7日(2019.10.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2020505042000001.app
【国際調査報告】
2020505042.tif 000085
2020505042.tif 000086