(57)【要約】  本発明は、転移性黒色腫を有する患者が、上記患者由来の糞便試料中の腸微生物叢を分析することによって、抗ＣＴＬＡ−４分子、好ましくは、イピリムマブによる治療から恩恵を受ける可能性が高いかどうかをｅｘ  ｖｉｖｏで決定する方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＣＴＬ４分子による抗癌治療に対する個体の応答を予測する方法であって、
（ｉ）前記個体の糞便試料中の腸微生物ＯＴＵを決定する工程と、
（ｉｉ）配列番号１のｄｅｎｏｖｏ３０６６、配列番号２のｄｅｎｏｖｏ９９１、配列番号３のｄｅｎｏｖｏ４６６６、配列番号４のｄｅｎｏｖｏ５９０５、配列番号５のｄｅｎｏｖｏ３７９５、配列番号６のｄｅｎｏｖｏ４７８７、配列番号７のｄｅｎｏｖｏ４５３、配列番号８のｄｅｎｏｖｏ４０５４、配列番号９のｄｅｎｏｖｏ３８１６、配列番号１０のｄｅｎｏｖｏ３６５７、配列番号１１のｄｅｎｏｖｏ５８００及び配列番号１２のｄｅｎｏｖｏ５１７８からなる群において選択される核酸配列と、少なくとも９７％、好ましくは９８％、９９％又は１００％の同一性を有する配列のヌクレオチド断片を含む少なくとも１つのＯＴＵの相対存在量を決定する工程、好ましくは、配列番号１のｄｅｎｏｖｏ３０６６、配列番号２のｄｅｎｏｖｏ９９１、配列番号５のｄｅｎｏｖｏ３７９５、配列番号６のｄｅｎｏｖｏ４７８７、配列番号８のｄｅｎｏｖｏ４０５４、配列番号９のｄｅｎｏｖｏ３８１６、配列番号１０のｄｅｎｏｖｏ３６５７及び配列番号１２のｄｅｎｏｖｏ５１７８からなる群において選択される核酸配列と、少なくとも９７％、好ましくは９８％、９９％又は１００％の同一性を有する配列のヌクレオチド断片を含む少なくとも１つのＯＴＵの相対存在量を決定する工程と、
を含み、配列番号１のｄｅｎｏｖｏ３０６６、配列番号２のｄｅｎｏｖｏ９９１、配列番号３のｄｅｎｏｖｏ４６６６、配列番号４のｄｅｎｏｖｏ５９０５、配列番号５のｄｅｎｏｖｏ３７９５、配列番号６のｄｅｎｏｖｏ４７８７、配列番号７のｄｅｎｏｖｏ４５３及び配列番号１２のｄｅｎｏｖｏ５１７８からなる群において選択される少なくとも１つのＯＴＵが富化され、及び／又は配列番号８のｄｅｎｏｖｏ４０５４、配列番号９のｄｅｎｏｖｏ３８１６、配列番号１０のｄｅｎｏｖｏ３６５７及び配列番号１１のｄｅｎｏｖｏ５８００からなる群において選択される少なくとも１つのＯＴＵが減少した腸微生物叢を有する個体が、前記抗癌治療に対する良好なレスポンダーである、方法。
【請求項２】
前記工程（ｉｉ）は、配列番号１のｄｅｎｏｖｏ３０６６、配列番号２のｄｅｎｏｖｏ９９１、配列番号３のｄｅｎｏｖｏ４６６６、配列番号４のｄｅｎｏｖｏ５９０５、配列番号５のｄｅｎｏｖｏ３７９５、配列番号６のｄｅｎｏｖｏ４７８７、配列番号７のｄｅｎｏｖｏ４５３、配列番号８のｄｅｎｏｖｏ４０５４、配列番号９のｄｅｎｏｖｏ３８１６、配列番号１０のｄｅｎｏｖｏ３６５７、配列番号１１のｄｅｎｏｖｏ５８００、配列番号１２のｄｅｎｏｖｏ５１７８、配列番号１３のｄｅｎｏｖｏ３０７３、配列番号１４のｄｅｎｏｖｏ３４２８、配列番号１５のｄｅｎｏｖｏ８９２及び配列番号１６のｄｅｎｏｖｏ２５８２からなる群において選択されるＯＴＵの核酸配列と、少なくとも９７％、好ましくは９８％、９９％又は１００％の同一性を有する少なくとも２個、３個、４個、５個又は６個の配列の相対存在量を決定することで構成される、請求項１に記載の抗ＣＴＬ４分子による抗癌治療に対する個体の応答を予測する方法。
【請求項３】
個体の前記腸微生物叢におけるＯＴＵの前記組合せの下記の相対存在量は、前記個体が、前記抗癌治療に対する良好なレスポンダーであることを意味する、請求項２に記載の抗ＣＴＬ４分子による抗癌治療に対する個体の応答を予測する方法。
【表７】
2020511442.tif 000009
【請求項４】
抗ＣＴＬ４分子による抗癌治療に対する個体の応答を予測する方法であって、
（ｉ）前記個体の糞便試料中の腸微生物ＯＴＵを決定する工程と、
（ｉｉ）ＯＴＵの存在若しくは非存在を規定するように配列の総数（試料１つ当たり）の０．２％の検出閾値を適用することによって、又は特異的なＯＴＵ若しくは細菌単離株を標的とするプローブを用いた定量的ＰＣＲ検出を適用することによって、配列番号１のｄｅｎｏｖｏ３０６６、配列番号２のｄｅｎｏｖｏ９９１、配列番号３のｄｅｎｏｖｏ４６６６、配列番号４のｄｅｎｏｖｏ５９０５、配列番号５のｄｅｎｏｖｏ３７９５、配列番号６のｄｅｎｏｖｏ４７８７、配列番号７のｄｅｎｏｖｏ４５３、配列番号８のｄｅｎｏｖｏ４０５４、配列番号９のｄｅｎｏｖｏ３８１６、配列番号１０のｄｅｎｏｖｏ３６５７、配列番号１１のｄｅｎｏｖｏ５８００及び配列番号１２のｄｅｎｏｖｏ５１７８からなる群において選択される核酸配列と、少なくとも９７％、好ましくは９８％、９９％又は１００％の同一性を有する配列のヌクレオチド断片を含む少なくとも１つのＯＴＵの存在又は非存在を決定する工程と、
を含み、配列番号１のｄｅｎｏｖｏ３０６６、配列番号２のｄｅｎｏｖｏ９９１、配列番号３のｄｅｎｏｖｏ４６６６、配列番号４のｄｅｎｏｖｏ５９０５、配列番号５のｄｅｎｏｖｏ３７９５、配列番号６のｄｅｎｏｖｏ４７８７、配列番号７のｄｅｎｏｖｏ４５３及び配列番号１２のｄｅｎｏｖｏ５１７８からなる群において選択される少なくとも１つのＯＴＵの存在を示し、及び／又は配列番号８のｄｅｎｏｖｏ４０５４、配列番号９のｄｅｎｏｖｏ３８１６、配列番号１０のｄｅｎｏｖｏ３６５７及び配列番号１１のｄｅｎｏｖｏ５８００からなる群において選択される少なくとも１つのＯＴＵの非存在を示す腸微生物叢を有する個体が、前記抗癌治療に対する良好なレスポンダーである、方法。
【請求項５】
前記工程（ｉｉ）は、配列番号１のｄｅｎｏｖｏ３０６６、配列番号２のｄｅｎｏｖｏ９９１、配列番号３のｄｅｎｏｖｏ４６６６、配列番号４のｄｅｎｏｖｏ５９０５、配列番号５のｄｅｎｏｖｏ３７９５、配列番号６のｄｅｎｏｖｏ４７８７、配列番号７のｄｅｎｏｖｏ４５３、配列番号８のｄｅｎｏｖｏ４０５４、配列番号９のｄｅｎｏｖｏ３８１６、配列番号１０のｄｅｎｏｖｏ３６５７、配列番号１１のｄｅｎｏｖｏ５８００、配列番号１２のｄｅｎｏｖｏ５１７８、配列番号１３のｄｅｎｏｖｏ３０７３、配列番号１４のｄｅｎｏｖｏ３４２８、配列番号１５のｄｅｎｏｖｏ８９２及び配列番号１６のｄｅｎｏｖｏ２５８２からなる群において選択されるＯＴＵの核酸配列と、少なくとも９７％、好ましくは９８％、９９％又は１００％の同一性を有する少なくとも２個、３個、４個、５個又は６個の配列の存在又は非存在を決定することで構成される、請求項４に記載の抗ＣＴＬ４分子による抗癌治療に対する個体の応答を予測する方法。
【請求項６】
個体の前記腸微生物叢におけるＯＴＵの前記組合せに関して観察される下記の結果は、前記個体が、前記抗癌治療に対する良好なレスポンダーであることを意味する、請求項５に記載の抗ＣＴＬ４分子による抗癌治療に対する個体の応答を予測する方法。
【表８】
2020511442.tif 000010
【請求項７】
抗ＣＴＬ４分子による抗癌治療に対する個体の応答を予測する方法であって、
（ｉ）適切な培養培地上で、また適切な培養条件で、糞便試料を培養する工程と、
（ｉｉ）配列番号１〜配列番号１２のＯＴＵに属する細菌単離株／種の少なくとも１つの相対存在量及び／又は存在若しくは非存在を検出する工程と、
を含み、パラバクテロイデス・ディスタソニス、無培養細菌ＮＡ４８  ＡＹ９７５５５２（クロストリジウムＸＩＶａ／フシカテニバクター・サッカリボランス）、酪酸菌ＳＳ２  １  ＡＹ３０５３１９（アナエロスティペス・ハドラス）、無培養細菌Ｃ３  １３  ＧＱ８９６９５７（ルミノコッカス属／オシリバクター・バレリシゲネス）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィ、ゲンミゲル・フォルミシリス、無培養細菌ＲＬ２４６  ａａｉ７４ｅ１２  ＤＱ７９３６２３（未分類クロストリジウム目／フィーカリバクテリウム種イヌ口腔分類群１４７）及び酪酸菌Ｌ２  ２１  ＡＪ２７０４７７／ユーバクテリウム・レクターレからなる群において選択される細菌単離株／種の個体の腸微生物叢における富化若しくは存在、及び／又はバクテロイデス・オバツス、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィ、クロストリジウム種ＸＢ９０／エイセンベルギエラ・マッシリエンシス及び無培養細菌ＲＥＣ１Ｍ  ２１  ＡＹ３４３１６０（オシリバクター種マルセイユ−Ｐ２７７８）からなる群において選択される細菌単離株／種の前記個体の腸微生物叢における減少若しくは非存在は、前記個体が、前記抗癌治療に対する良好なレスポンダーであることを意味する、方法。
【請求項８】
抗ＣＴＬ４分子による抗癌治療に対する個体の応答を予測する方法であって、
（ｉ）前記個体の糞便試料中の腸微生物ＯＴＵを決定する工程と、
（ｉｉ）配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７及び配列番号２８からなる群において選択される１６Ｓ  ｒＲＮＡの核酸断片配列と、少なくとも９７％、好ましくは９８％、９９％又は１００％同一性の配列を有する３００ｐｂ〜１５００ｐｂの核酸断片を含む少なくとも１つのＯＴＵの相対存在量を決定する工程と、
を含む、方法。
【請求項９】
抗ＣＴＬ４分子による抗癌治療に対する個体の応答を予測する方法であって、前記個体の生物試料における、
膜及び細胞内構造分子
他のグリカン分解
リポ多糖生合成
他のイオン連結輸送体
アミノ糖及びヌクレオチド糖代謝
原核生物における炭素固定経路
プリン代謝
ガラクトース代謝
スフィンゴ脂質代謝
シャペロン及びフォールディング触媒
フルクトース及びマンノース代謝
リソソーム
酸化的リン酸化
アラニン＿アスパラギン酸及びグルタミン酸代謝
ペプチダーゼ
分泌系
ポルフィリン及びクロロフィル代謝
二成分系
鞭毛集合
細菌走化性
細菌運動性タンパク質
ＡＢＣ輸送体
輸送体
からなる群において選択される少なくとも１つの代謝産物（ＫＥＧＧ  ＩＤとして記載される）の存在又は非存在を決定する工程を含み、
分泌系
ポルフィリン及びクロロフィル代謝
二成分系
鞭毛集合
細菌走化性
細菌運動性タンパク質
ＡＢＣ輸送体
輸送体
からなる群において選択される少なくとも１つの代謝産物の存在が、前記抗癌治療に対する良好な応答と関連付けられ、及び／又は、
膜及び細胞内構造分子
他のグリカン分解
リポ多糖生合成
他のイオン連結輸送体
アミノ糖及びヌクレオチド糖代謝
原核生物における炭素固定経路
プリン代謝
ガラクトース代謝
スフィンゴ脂質代謝
シャペロン及びフォールディング触媒
フルクトース及びマンノース代謝
リソソーム
酸化的リン酸化
アラニン＿アスパラギン酸及びグルタミン酸代謝
ペプチダーゼ
からなる群において選択される少なくとも１つの代謝産物の存在が、前記抗癌治療に対する不十分な応答と関連付けられる、方法。
【請求項１０】
抗ＣＴＬ４分子による抗癌治療に対する個体の応答を予測する方法であって、前記個体の生物試料における下記の代謝産物（代謝産物の第１のセット）：
トレハロース−スクロース−イソマルトース
グアニン
Ｄ−ラフィノース
３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸
１２−ヒドロキシドデカン酸
の存在又は非存在を決定する工程を含み、下記の代謝産物：
トレハロース−スクロース−イソマルトース
グアニン
Ｄ−ラフィノース
３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸
の存在が、前記抗癌治療に対する良好な応答と関連付けられ、及び／又は、
１２−ヒドロキシドデカン酸
からなる群において選択される少なくとも１つの代謝産物の存在が、前記抗癌治療に対する不十分な応答と関連付けられる、方法。
【請求項１１】
抗ＣＴＬ４分子による抗癌治療に対する個体の応答を予測する方法であって、前記個体の生物試料における下記の代謝産物（代謝産物の第２のセット）：
１−メチルキサンチン
ピペコリン酸
２−イソプロピルリンゴ酸
の存在又は非存在を決定する工程を含み、下記の代謝産物：
２−イソプロピルリンゴ酸
の存在が、前記抗癌治療に対する良好な応答と関連付けられ、及び／又は、
１−メチルキサンチン
ピペコリン酸
からなる群において選択される少なくとも１つの代謝産物の存在が、前記抗癌治療に対する不十分な応答と関連付けられる、方法。
【請求項１２】
抗ＣＴＬ４分子による抗癌治療に対する個体の応答を予測する方法であって、前記個体の生物試料における下記の代謝産物：
トレハロース−スクロース−イソマルトース
グアニン
Ｄ−ラフィノース
３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸
１２−ヒドロキシドデカン酸
１−メチルキサンチン
ピペコリン酸
２−イソプロピルリンゴ酸
アルファＤアミノアジピン酸
キヌレン酸
メチルイミダゾール酢酸
３，４−ジヒドロキシヒドロケイ皮酸
コチニン
２−メチルニコチンアミド
の存在又は非存在を決定する工程を含み、下記の代謝産物：
トレハロース−スクロース−イソマルトース
グアニン
Ｄ−ラフィノース
３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸
２−イソプロピルリンゴ酸
キヌレン酸
の存在が、前記抗癌治療に対する良好な応答と関連付けられ、及び／又は、
１２−ヒドロキシドデカン酸
１−メチルキサンチン
ピペコリン酸
アルファＤアミノアジピン酸
メチルイミダゾール酢酸
３，４−ジヒドロキシヒドロケイ皮酸
コチニン
２−メチルニコチンアミド
からなる群において選択される少なくとも１つの代謝産物の存在が、前記抗癌治療に対する不十分な応答と関連付けられる、方法。
【請求項１３】
前記個体は、転移性黒色腫を有する患者であり、及び／又は抗ＣＴＬ４分子は、イピリムマブである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ラクノスピラ科酪酸菌、バクテロイデス・オバツス、クロストリジウム目ルミノコッカス科細菌、ブラウティア・オベウム、フシカテニバクター・サッカリボランス、ロゼブリア・イヌリニボランス、ゲンミゲル・フォルミシリス、及びフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィからなる群から選択される種の１個以上の精製細菌株を含む組成物。
【請求項１５】
２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、又は１０個以上の細菌株を含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
ラクノスピラ科酪酸菌、バクテロイデス・オバツス、クロストリジウム目ルミノコッカス科細菌、ブラウティア・オベウム、フシカテニバクター・サッカリボランス、ロゼブリア・イヌリニボランス、ゲンミゲル・フォルミシリス、及びフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィからなる群から選択される種の細菌株と、少なくとも９７％の配列同一性を有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を有する１個以上の精製細菌株を含む組成物。
【請求項１７】
前記精製細菌株は、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を有する、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、又は１０個以上の細菌株を含む、請求項１６又は１７に記載の組成物。
【請求項１９】
酪酸菌ＳＳ２−１、バクテロイデス・オバツスＣＩＰ  １０３７５６、クロストリジウム目細菌ＣＩＥＡＦ  ０２６、ブラウティア・オベウム１−３３、フシカテニバクター・サッカリボランスＴＴ−１１１、ロゼブリア・イヌリニボランスＡ２−１９４型株、ゲンミゲル・フォルミシリスＡＴＣＣ  ２７７４９  Ｘ２−５６、酪酸菌Ｌ２−２１及びフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィＬ２−６からなる群から選択される１個以上の精製細菌株を含む組成物。
【請求項２０】
２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、又は１０個以上の細菌株を含む、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
酪酸菌ＳＳ２−１、バクテロイデス・オバツスＣＩＰ  １０３７５６、クロストリジウム目細菌ＣＩＥＡＦ  ０２６、ブラウティア・オベウム１−３３、フシカテニバクター・サッカリボランスＴＴ−１１１、ロゼブリア・イヌリニボランスＡ２−１９４型株、ゲンミゲル・フォルミシリスＡＴＣＣ  ２７７４９  Ｘ２−５６、酪酸菌Ｌ２−２１及びフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィＬ２−６からなる群から選択される細菌株と、少なくとも９７％の配列同一性を有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を有する１個以上の精製細菌株を含む組成物。
【請求項２２】
前記精製細菌株は、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を有する、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、又は１０個以上の細菌株を含む、請求項２１又は２２に記載の組成物。
【請求項２４】
ラクノスピラ科酪酸菌、ゲンミゲル・フォルミシリス、及びフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィからなる群から選択される種の１個以上の精製細菌株を含む組成物。
【請求項２５】
２個以上、３個以上、４個以上、又は５個以上の細菌株を含む、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
ラクノスピラ科酪酸菌、ゲンミゲル・フォルミシリス、及びフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィからなる群から選択される種の細菌株と、少なくとも９７％の配列同一性を有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を有する１個以上の精製細菌株を含む組成物。
【請求項２７】
前記精製細菌株は、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
２個以上、３個以上、４個以上、又は５個以上の細菌株を含む、請求項２６又は２７に記載の組成物。
【請求項２９】
ゲンミゲル・フォルミシリスＡＴＣＣ  ２７７４９  Ｘ２−５６、酪酸菌Ｌ２−２１及びフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィＬ２−６からなる群から選択される１個以上の精製細菌株を含む組成物。
【請求項３０】
２個以上、３個以上、４個以上、又は５個以上の細菌株を含む、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
ゲンミゲル・フォルミシリスＡＴＣＣ  ２７７４９  Ｘ２−５６、酪酸菌Ｌ２−２１及びフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィＬ２−６からなる群から選択される細菌株と、少なくとも９７％の配列同一性を有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を有する１個以上の精製細菌株を含む組成物。
【請求項３２】
前記精製細菌株は、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
２個以上、３個以上、４個以上、又は５個以上の細菌株を含む、請求項３１又は３２に記載の組成物。
【請求項３４】
前記細菌株の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも１００％が、フィルミクテス門に属する、請求項１４〜３３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３５】
前記細菌株の１００％未満、９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、又は１０％未満が、バクテロイデス属に属する、請求項１４〜３４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３６】
バクテロイデス属の細菌株を含まない、請求項１４〜３５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３７】
バクテロイデス・フラジリス又はバクテロイデス・テタイオタオミクロン種の細菌株を含まない、請求項１４〜３６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３８】
細菌株フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィＡ２−１６５を含まない、請求項１４〜３７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３９】
前記細菌株は、凍結乾燥されている、請求項１４〜３８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４０】
免疫チェックポイント阻害剤を更に含む、請求項１４〜３９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４１】
前記免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１阻害剤、ＰＤ−Ｌ１阻害剤、又はＣＴＬＡ−４阻害剤である、請求項１４〜４０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４２】
前記免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ−４阻害剤である、請求項１４〜４１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４３】
前記ＣＴＬＡ−４阻害剤は、イピリムマブ又はトレメリムマブである、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
前記ＣＴＬＡ−４阻害剤は、イピリムマブである、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
前記免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１阻害剤である、請求項１４〜４１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４６】
前記ＰＤ−１阻害剤は、ニボルマブ又はペムブロリズマブである、請求項４５に記載の組成物。
【請求項４７】
前記免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−Ｌ１阻害剤である、請求項１４〜４１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４８】
前記ＰＤ−Ｌ１阻害剤は、アテゾリズマブ、アベルマブ又はデュルバルマブである、請求項４７に記載の組成物。
【請求項４９】
請求項１４〜４８のいずれか一項に記載の組成物と薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。
【請求項５０】
腸管への送達用に製剤化される、請求項４９に記載の医薬組成物。
【請求項５１】
カプセルの形態で存在する、請求項４９又は５０に記載の医薬組成物。
【請求項５２】
経口投与用に製剤化される、請求項４９に記載の医薬組成物。
【請求項５３】
１つ以上の腸溶性ポリマーを含むｐＨ感受性組成物を含む、請求項に記載の医薬組成物。
【請求項５４】
癌を治療する方法であって、対象において前記癌を治療するのに薬学的に有効な量の請求項４９〜５３のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項５５】
前記癌は、黒色腫である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記対象が大腸炎を発症したかどうかを決定することを更に含む、請求項５４又は５５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗癌治療の分野に、より具体的には、転移性黒色腫を有する患者が、上記患者由来の糞便試料中の腸微生物叢を分析することによって、抗ＣＴＬＡ−４分子、好ましくは、イピリムマブによる治療から恩恵を受ける可能性が高いかどうかをｅｘ  ｖｉｖｏで決定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫療法は、腫瘍学における主要な治療戦略となっている。細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）に対する抗体、即ち、イピリムマブによって、道が切り開かれ、転移性黒色腫（ＭＭ）を有する患者において有意な生存利益（survival benefit：延命効果）を示した１、２。イピリムマブで治療したＭＭ患者の２２％が、生存期間を延長させるとこれまでに報告されている３。
【０００３】
ＣＴＬＡ−４は、ＣＤ２８のホモログであり、抗原提示中にＴ細胞共刺激をダウンレギュレートし、したがって、免疫応答の非特異的な負のチェックポイントを構成する４〜６。イピリムマブは、抗原特異性にも関わらず、リンパ器官において抗原刺激される（primed）Ｔ細胞を再活性化して、その結果として、抗癌応答に関与するものよりもかなり広範囲のＴ細胞のレパートリーに影響を及ぼす７、８。このことがおそらく、ＣＴＬＡ−４遮断が、数多くの様々な免疫関連の有害事象（ｉｒＡＥ）と関連付けられる理由を説明する。これらのｉｒＡＥは主に、皮膚、腸、内分泌腺及び肝臓に影響を及ぼす９、１０。大腸炎は、イピリムマブで治療した患者の８％〜２２％を侵し１０、１１、イピリムマブの中断及び高用量のステロイドを必要とする。重篤な大腸炎を有する患者によっては、抗ＴＮＦ療法、場合によっては結腸切除術を必要とする場合がある１１、１２。まとめると、イピリムマブは、限られた割合の患者の恩恵となり、潜在的に重篤なｉｒＡＥを引き起こし兼ねない。この状況で、この薬物のリスク／ベネフィット比を最適化することが可能な有効性及び／又は毒性の信頼できるバイオマーカーが、最優先で関心が持たれている。
【０００４】
イピリムマブに起因する大腸炎は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）と幾つかの特徴を共有している１２。ＩＢＤにおいて、無秩序な炎症は、疾患の抗原性原因（antigenic drive）であるとされている腸管微生物叢の腸内菌共生バランス失調（dysbiotic）組成と関連付けられている１３〜１５。ヒト腸微生物叢を構成する膨大な細菌は、粘膜系及び全身免疫系の両方の適正な成熟に関与し、脊椎動物のマイクロバイオームの組成が、病原体に対する適切な免疫応答の促進及び免疫ホメオスタシスの維持にとって必須であることが、長い間知られている１６。さらに、マウスにおいて実施した研究により、マイクロバイオーム組成が、抗ＣＴＬＡ−４及び抗ＰＤ−１モノクローナル抗体に対する抗腫瘍免疫応答を促進するのに不可欠であることが示唆されている１７、１８。
【０００５】
本発明者らは、イピリムマブで治療した転移性黒色腫を有する患者に対する前向き研究を行った。糞便微生物叢組成を、ベースラインで、及び各イピリムマブ注入前に評価した。微生物叢は、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子シーケンシングを使用して研究し、患者を、有力な微生物叢パターンに基づいてクラスター分けした（clustered）。
【０００６】
ここで、この研究に基づいて、本発明者らは、イピリムマブに起因する抗癌応答及び免疫関連腸炎が、マイクロバイオーム組成に依存することを実証した。
【０００７】
実際に、実験の部に提示した結果は、特徴的なベースライン腸微生物叢組成が、臨床応答及び大腸炎の両方と関連付けられたことを示している。ベースライン微生物叢がバクテロイデス属（Bacteroides）によって決定される患者（クラスターＢ、ｎ＝１２）と比較して、ベースライン微生物叢が、フィーカリバクテリウム属（Faecalibacterium genus）及び他のフィルミクテス門（Firmicutes）が富化された（enriched）患者（クラスターＡ、ｎ＝１０）は、より長い無増悪生存期間（ｐ＝０．００３９）及び全生存期間（ｐ＝０．０５１）を有した。ベースライン大腸炎に関連するファイロタイプの大部分が、フィルミクテス門（例えば、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィ（Faecalibacterium prausnitzii）、及びゲンミゲル・フォルミシリス（Gemmiger formicilis）の近縁種）に関連した一方で、大腸炎なしに関連するファイロタイプは、バクテロイデス門に帰属された。低比率の末梢血制御性Ｔ細胞は、クラスターＡ、長期臨床ベネフィット及び大腸炎と関連付けられた。イピリムマブは、ＣＤ４＋Ｔ細胞に対して、より高い誘導性Ｔ細胞共刺激分子誘導、及びクラスターＡに属する患者における血清ＣＤ２５のより高い増加をもたらした。
【０００８】
フィーカリバクテリウム属及び他のフィルミクテス門が富化されたベースライン腸微生物叢は、イピリムマブに対する有益な臨床応答及びイピリムマブ関連大腸炎のより高頻度の発生と関連付けられる。
【発明の概要】
【０００９】
したがって、本発明は、抗ＣＴＬ４分子による抗癌治療に対する個体の応答を予測する方法であって、
（ｉ）前記個体の糞便試料中の腸微生物ＯＴＵ（又は、互いに少なくとも９７％の類似性を共有し、したがって、ＯＴＵ：操作的分類単位と呼ばれる分類学的本質（taxonomic entity）において一緒に分類され、選択される代表的な配列によって表されるファイロタイプ若しくは分子種；即ち、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列の任意の群）を決定する工程と、
（ｉｉ）配列番号１のｄｅｎｏｖｏ３０６６、配列番号２のｄｅｎｏｖｏ９９１、配列番号３のｄｅｎｏｖｏ４６６６、配列番号４のｄｅｎｏｖｏ５９０５、配列番号５のｄｅｎｏｖｏ３７９５、配列番号６のｄｅｎｏｖｏ４７８７、配列番号７のｄｅｎｏｖｏ４５３、配列番号８のｄｅｎｏｖｏ４０５４、配列番号９のｄｅｎｏｖｏ３８１６、配列番号１０のｄｅｎｏｖｏ３６５７、配列番号１１のｄｅｎｏｖｏ５８００及び配列番号１２のｄｅｎｏｖｏ５１７８からなる群において選択される核酸配列と、少なくとも９７％、好ましくは９８％、９９％又は１００％の同一性を有する配列のヌクレオチド断片を含む少なくとも１つのＯＴＵの相対存在量を決定する工程、好ましくは、配列番号１のｄｅｎｏｖｏ３０６６、配列番号２のｄｅｎｏｖｏ９９１、配列番号５のｄｅｎｏｖｏ３７９５、配列番号６のｄｅｎｏｖｏ４７８７、配列番号８のｄｅｎｏｖｏ４０５４、配列番号９のｄｅｎｏｖｏ３８１６、配列番号１０のｄｅｎｏｖｏ３６５７及び配列番号１２のｄｅｎｏｖｏ５１７８からなる群において選択される核酸配列と、少なくとも９７％、好ましくは９８％、９９％又は１００％の同一性を有する配列のヌクレオチド断片を含む少なくとも１つのＯＴＵの相対存在量を決定する工程と、
を含み、配列番号１のｄｅｎｏｖｏ３０６６、配列番号２のｄｅｎｏｖｏ９９１、配列番号３のｄｅｎｏｖｏ４６６６、配列番号４のｄｅｎｏｖｏ５９０５、配列番号５のｄｅｎｏｖｏ３７９５、配列番号６のｄｅｎｏｖｏ４７８７、配列番号７のｄｅｎｏｖｏ４５３及び配列番号１２のｄｅｎｏｖｏ５１７８からなる群において選択される少なくとも１つのＯＴＵが富化され、及び／又は配列番号８のｄｅｎｏｖｏ４０５４、配列番号９のｄｅｎｏｖｏ３８１６、配列番号１０のｄｅｎｏｖｏ３６５７及び配列番号１１のｄｅｎｏｖｏ５８００からなる群において選択される少なくとも１つのＯＴＵが減少した（depleted）腸微生物叢を有する個体が、前記抗癌治療に対する良好なレスポンダーである、方法に関連する。
【００１０】
ＯＴＵの「相対存在量」は、糞便試料中の配列の総数に対するこのＯＴＵに分類される配列の数の割合として定義される。ＯＴＵは、少なくとも２つの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列（シングルトン、即ち、唯一の配列を含有するＯＴＵは考慮されない）を分類すべきである。
【００１１】
腸微生物組成及び所与のＯＴＵの相対存在量の決定は、当業者に既知の古典的で適切な方法を用いて行うことができる。特定の実施の形態において、上記決定は、サンガー、４５４パイロシーケンシング、ＭｉＳｅｑ又はＨｉＳｅｑ技術等の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子シーケンシングによって、ヒト糞便又は粘膜又は組織試料から抽出された総ＤＮＡに対して実施される。決定はまた、特異的なＯＴＵ配列又はその属する細菌単離株のいずれかを標的とする特異的なプローブ及び上記ＯＴＵの核酸配列と少なくとも９７％、好ましくは９８％、９９％又は１００％の同一性を有する任意の配列を用いた定量的ＰＣＲ技術によっても実施することができる。
【００１２】
富化又は減少は、両方の群、即ちレスポンダーと非レスポンダーとの間での比較として記載され、したがって、シーケンシング技術、コホートの大きさ等の方法論的課題に強く依存する。さらに、ＯＴＵはそれぞれ、相対存在量において異なるレベルで表され、ＯＴＵ相対存在量が、配列の総数の０．０１％〜０．１％の範囲のものもあれば、配列の総数の０．５％〜３５％の範囲のものもある。好ましくは、本発明の方法において、ＯＴＵ相対存在量は、配列の総数（試料１つ当たり）の０．２％、又は好ましくは１％のいずれかの検出閾値を適用することによって評価される。
【００１３】
以下の表Ｉは、各応答群（即ち、ＣＴＬＡ４治療に対するレスポンダー対非レスポンダー、以下の実験の部を参照）の各ＯＴＵ（配列番号１〜配列番号１６）の相対存在量の平均値、中央値、範囲、第１四分位数（1st quartile）及び第３四分位数（3rd quartile）を示す。２つの判断基準を定義しており、１つは、ＯＴＵの相対存在量の閾値を考慮し（ｃｒｉｔ２）、第２の判断基準は、各ＯＴＵの検出レベルを考慮する（ｃｒｉｔ１）。
【００１４】
【表１】
2020511442.tif 000002
2020511442.tif 000003
【００１５】
別の実施の形態によれば、本発明は、抗ＣＴＬ４分子による抗癌治療に対する個体の応答を予測する方法であって、
（ｉ）上記個体の糞便試料中の腸微生物ＯＴＵを決定する工程と、
（ｉｉ）ＯＴＵの存在若しくは非存在を規定するように配列の総数（試料１つ当たり）の０．２％の検出閾値を適用することによって、又は特異的なＯＴＵ若しくは細菌単離株を標的とするプローブを用いた定量的ＰＣＲ検出を適用することによって、配列番号１のｄｅｎｏｖｏ３０６６、配列番号２のｄｅｎｏｖｏ９９１、配列番号３のｄｅｎｏｖｏ４６６６、配列番号４のｄｅｎｏｖｏ５９０５、配列番号５のｄｅｎｏｖｏ３７９５、配列番号６のｄｅｎｏｖｏ４７８７、配列番号７のｄｅｎｏｖｏ４５３、配列番号８のｄｅｎｏｖｏ４０５４、配列番号９のｄｅｎｏｖｏ３８１６、配列番号１０のｄｅｎｏｖｏ３６５７、配列番号１１のｄｅｎｏｖｏ５８００及び配列番号１２のｄｅｎｏｖｏ５１７８からなる群において選択される核酸配列と、少なくとも９７％、好ましくは９８％、９９％又は１００％の同一性を有する配列のヌクレオチド断片を含む少なくとも１つのＯＴＵの存在又は非存在を決定する工程と、
を含み、配列番号１のｄｅｎｏｖｏ３０６６、配列番号２のｄｅｎｏｖｏ９９１、配列番号３のｄｅｎｏｖｏ４６６６、配列番号４のｄｅｎｏｖｏ５９０５、配列番号５のｄｅｎｏｖｏ３７９５、配列番号６のｄｅｎｏｖｏ４７８７、配列番号７のｄｅｎｏｖｏ４５３及び配列番号１２のｄｅｎｏｖｏ５１７８からなる群において選択される少なくとも１つのＯＴＵの存在を示し、及び／又は配列番号８のｄｅｎｏｖｏ４０５４、配列番号９のｄｅｎｏｖｏ３８１６、配列番号１０のｄｅｎｏｖｏ３６５７及び配列番号１１のｄｅｎｏｖｏ５８００からなる群において選択される少なくとも１つのＯＴＵの非存在を示す腸微生物叢を有する個体が、上記抗癌治療に対する良好なレスポンダーである、方法に関する。
【００１６】
「抗癌治療に対する良好なレスポンダー」である患者は、癌に罹患しており、かつ上記抗癌治療を受けたのちに臨床的に有意な応答を示す患者であり、臨床的に有意な応答は、臨床検査（体重、全身状態、疼痛、及び存在する場合には、触知腫瘤）、バイオマーカー及び画像研究（超音波検査法、ＣＴスキャン、ＰＡＴスキャン、ＭＲＩ）によって評価され得る。
【００１７】
本明細書中で使用する場合、「癌」は、全てのタイプの癌を意味する。特に、癌は、固形癌又は非固形癌であってもよい。癌の非限定的な例は、頭頸部扁平上皮癌、ホジキンリンパ腫、膀胱の尿路上皮癌、ミスマッチ修復欠損結腸直腸癌、胃癌及びメルケル細胞癌である。
【００１８】
本明細書中の「治療」という用語は、癌の進行、重篤性及び／又は持続期間の任意の低減を指す。
【００１９】
特定の実施の形態によれば、個体は、転移性黒色腫を有する患者である。
【００２０】
別の特定の実施の形態によれば、抗ＣＴＬ４分子は、イピリムマブ等の抗ＣＴＬ４抗体である。
【００２１】
したがって、本発明の方法は、転移性黒色腫を有する患者が、上記患者由来の糞便試料中の腸微生物叢の分析によって、イピリムマブによる治療から恩恵を受ける可能性が高いかどうかを決定することが可能である。
【００２２】
腸微生物叢は、動物界に属する任意の生物の腸管中に生存する微生物の集団に関し、本発明では、上記生物は、ヒトであることが好ましい。腸微生物組成は、全生涯を通じて変化し、それは、種々の環境の影響の結果である。
【００２３】
腸内菌共生バランス失調（Dysbiosis）とは、幾つかの特定の状況において生じ得る腸微生物組成におけるバランスの有害な損失を指す。
【００２４】
糞便試料は、抗癌治療の開始を決定する前の任意の時点で、又は上記治療中の任意の時点で収集され、好ましくは、糞便試料は、抗癌治療の開始前に収集される。いかなる場合においても、糞便試料は、大腸炎を有さない患者において収集される。
【００２５】
ＯＴＵは、操作的分類単位を意味し、本発明では、ＯＴＵは、同じか、又は類似した（少なくとも９７％の）配列同一性を共有する細菌１６Ｓ配列を再編成して、「ｄｅｎｏｖｏ＃」と称される。ＯＴＵはそれぞれ、公開データベースに記載される配列と９８％以上の配列類似性を共有する場合に、単離されているか、又は単離されておらず、培養されているか、又は無培養のいずれかの細菌種に属する。
【００２６】
特定の実施の形態によれば、本発明の方法の工程（ｉｉ）は、配列番号１のｄｅｎｏｖｏ３０６６、配列番号２のｄｅｎｏｖｏ９９１、配列番号３のｄｅｎｏｖｏ４６６６、配列番号４のｄｅｎｏｖｏ５９０５、配列番号５のｄｅｎｏｖｏ３７９５、配列番号６のｄｅｎｏｖｏ４７８７、配列番号７のｄｅｎｏｖｏ４５３、配列番号８のｄｅｎｏｖｏ４０５４、配列番号９のｄｅｎｏｖｏ３８１６、配列番号１０のｄｅｎｏｖｏ３６５７、配列番号１１のｄｅｎｏｖｏ５８００、配列番号１２のｄｅｎｏｖｏ５１７８、配列番号１３のｄｅｎｏｖｏ３０７３、配列番号１４のｄｅｎｏｖｏ３４２８、配列番号１５のｄｅｎｏｖｏ８９２及び配列番号１６のｄｅｎｏｖｏ２５８２からなる群において選択されるＯＴＵの核酸配列と、少なくとも９７％、好ましくは９８％、９９％又は１００％の同一性を有する少なくとも２個、３個、４個、５個又は６個の配列の相対存在量又は存在若しくは非存在を決定することで構成される。
【００２７】
曲線下面積（ＡＵＣ）は、抗ＣＴＬＡ４治療に対する応答を予測するＯＴＵの幾つかの組合せに関して算出され、以下の表ＩＩに提示する１２個の組合せが、０．９０を超えるＡＵＣで、良好な予測値を有した。
【００２８】
【表２】
2020511442.tif 000004
【００２９】
本発明の方法の１つの特定の実施の形態によれば、工程（ｉｉ）は、上記の列挙したＯＴＵの組合せの相対存在量（富化又は減少）を決定することを目的とし、個体の腸微生物叢におけるＯＴＵの上記組合せの下記の相対存在量は、上記個体が、上記抗癌治療に対する良好なレスポンダーであることを意味する。
【００３０】
【表３】
2020511442.tif 000005
【００３１】
本発明の方法の別の特定の実施の形態によれば、工程（ｉｉ）は、上記の列挙したＯＴＵの組合せの存在又は非存在を決定することを目的とし、個体の腸微生物叢におけるＯＴＵの上記組合せについて観察される下記の結果は、上記個体が、上記抗癌治療に対する良好なレスポンダーであることを意味する。
【００３２】
【表４】
2020511442.tif 000006
【００３３】
以下の表ＩＩＩは、ＯＴＵとそれらの属する細菌単離株／種との間の対応関係を示す。
【００３４】
【表５】
2020511442.tif 000007
【００３５】
更なる実施の形態によれば、本発明の方法の工程（ｉｉ）は、適切な培養培地上で、また適切な培養条件で、糞便試料を培養することによって、配列番号１〜配列番号１２のＯＴＵに属する細菌単離株／種の少なくとも１つの相対存在量及び／又は存在若しくは非存在を検出することで構成され、ここで、パラバクテロイデス・ディスタソニス（Parabacteroides distasonis）、無培養細菌ＮＡ４８  ＡＹ９７５５５２（クロストリジウム（Clostridium）ＸＩＶａ／フシカテニバクター・サッカリボランス（Fusicatenibacter saccharivorans））、酪酸菌（butyrate producing bacterium）ＳＳ２  １  ＡＹ３０５３１９（アナエロスティペス・ハドラス（Anaerostipes hadrus））、無培養細菌Ｃ３  １３  ＧＱ８９６９５７（ルミノコッカス属（Ruminococcus）／オシリバクター・バレリシゲネス（Oscillibacter valericigenes））、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィ（Faecalibacterium prausnitzii）、ゲンミゲル・フォルミシリス（Gemmiger formicilis）、無培養細菌ＲＬ２４６  ａａｉ７４ｅ１２  ＤＱ７９３６２３（未分類クロストリジウム目（Clostridiales）／フィーカリバクテリウム種イヌ口腔分類群（Faecalibacterium sp. canine oral taxon）１４７）及び酪酸菌Ｌ２  ２１  ＡＪ２７０４７７／ユーバクテリウム・レクターレ（Eubacterium rectale）からなる群において選択される細菌単離株／種の個体の腸微生物叢における富化若しくは存在、及び／又はバクテロイデス・オバツス（Bacteroides ovatus）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィ（Faecalibacterium prausnitzii）、クロストリジウム種（Clostridium sp.）ＸＢ９０／エイセンベルギエラ・マッシリエンシス（Eisenbergiella massiliensis）及び無培養細菌ＲＥＣ１Ｍ  ２１  ＡＹ３４３１６０（オシリバクター種マルセイユ（Oscillibacter sp. Marseille）−Ｐ２７７８）からなる群において選択される細菌単離株／種の上記個体の腸微生物叢における減少若しくは非存在は、上記個体が、上記抗癌治療に対する良好なレスポンダーであることを意味する。
【００３６】
別の実施の形態によれば、本発明による方法の工程（ｉｉ）は、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７及び配列番号２８からなる群において選択される１６Ｓ  ｒＲＮＡの核酸断片配列と、少なくとも９７％、好ましくは９８％、９９％又は１００％同一性の配列を有する３００ｐｂ〜１５００ｐｂの核酸断片を含む少なくとも１つのＯＴＵの相対存在量を決定することで構成される。
【００３７】
コホート全体に記載されるＯＴＵ集団から、ＬＥＦＳｅと組み合わせたＰＩＣＲＵＳｔアルゴリズムをｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで適用して、メタボロームプロファイルを推定した。
【００３８】
抗ＣＴＬＡ４に対する応答又は抗ＣＴＬＡ４に対する毒性と具体的に関連付けられる代謝経路の特定のセット（ＫＥＧＧ  ＩＤとして記載される）を強調させた（実験の部ＩＶを参照）。
【００３９】
このｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで得られた結果を更に確証して、及び／又は抗ＣＴＬＡ４に対する応答に関して患者を識別する、既知又は未知の両方の新たな代謝産物を強調するために、ベースラインでの２６名の患者の糞便のメタボロームプロファイリングを評価して、抗ＣＴＬＡ４に対する応答と関連付けられる代謝産物のセットを同定することが可能であった。
【００４０】
このため、本発明はまた、抗ＣＴＬ４分子による抗癌治療に対する個体の応答を予測する方法であって、上記個体の生物試料における、
膜及び細胞内構造分子
他のグリカン分解
リポ多糖生合成
他のイオン連結輸送体
アミノ糖及びヌクレオチド糖代謝
原核生物における炭素固定経路
プリン代謝
ガラクトース代謝
スフィンゴ脂質代謝
シャペロン及びフォールディング触媒
フルクトース及びマンノース代謝
リソソーム
酸化的リン酸化
アラニン＿アスパラギン酸及びグルタミン酸代謝
ペプチダーゼ
分泌系
ポルフィリン及びクロロフィル代謝
二成分系
鞭毛集合
細菌走化性
細菌運動性タンパク質
ＡＢＣ輸送体
輸送体
からなる群において選択される少なくとも１つの代謝産物（ＫＥＧＧ  ＩＤとして記載される）の存在又は非存在を決定する工程を含み、
分泌系
ポルフィリン及びクロロフィル代謝
二成分系
鞭毛集合
細菌走化性
細菌運動性タンパク質
ＡＢＣ輸送体
輸送体
からなる群において選択される少なくとも１つの代謝産物の存在が、上記抗癌治療に対する良好な応答と関連付けられ、及び／又は、
膜及び細胞内構造分子
他のグリカン分解
リポ多糖生合成
他のイオン連結輸送体
アミノ糖及びヌクレオチド糖代謝
原核生物における炭素固定経路
プリン代謝
ガラクトース代謝
スフィンゴ脂質代謝
シャペロン及びフォールディング触媒
フルクトース及びマンノース代謝
リソソーム
酸化的リン酸化
アラニン＿アスパラギン酸及びグルタミン酸代謝
ペプチダーゼ
からなる群において選択される少なくとも１つの代謝産物の存在が、上記抗癌治療に対する不十分な応答と関連付けられる、方法に関する。
【００４１】
このため、本発明はまた、抗ＣＴＬ４分子による抗癌治療に対する個体の応答を予測する方法であって、上記個体の生物試料における下記の代謝産物（代謝産物の第１のセット）：
トレハロース−スクロース−イソマルトース
グアニン
Ｄ−ラフィノース
３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸
１２−ヒドロキシドデカン酸
の存在又は非存在を決定する工程を含み、下記の代謝産物：
トレハロース−スクロース−イソマルトース
グアニン
Ｄ−ラフィノース
３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸
の存在が、上記抗癌治療に対する良好な応答と関連付けられ、及び／又は、
１２−ヒドロキシドデカン酸
からなる群において選択される少なくとも１つの代謝産物の存在が、上記抗癌治療に対する不十分な応答と関連付けられる、方法に関する。
【００４２】
本発明は更に、抗ＣＴＬ４分子による抗癌治療に対する個体の応答を予測する方法であって、上記個体の生物試料における下記の代謝産物（代謝産物の第２のセット）：
１−メチルキサンチン
ピペコリン酸
２−イソプロピルリンゴ酸
の存在又は非存在を決定する工程を含み、下記の代謝産物：
２−イソプロピルリンゴ酸
の存在が、上記抗癌治療に対する良好な応答と関連付けられ、及び／又は、
１−メチルキサンチン
ピペコリン酸
からなる群において選択される少なくとも１つの代謝産物の存在が、上記抗癌治療に対する不十分な応答と関連付けられる、方法に関する。
【００４３】
任意選択で、代謝産物の第２のセットを利用する方法は、代謝産物の第１のセットを利用する方法と組み合わせてもよい。
【００４４】
本発明は更に、抗ＣＴＬ４分子による抗癌治療に対する個体の応答を予測する方法であって、上記個体の生物試料における代謝産物の第１のセット及び第２のセットと組み合わせて、下記の代謝産物（代謝産物の第３のセット）：
アルファＤアミノアジピン酸
キヌレン酸
メチルイミダゾール酢酸
３，４−ジヒドロキシヒドロケイ皮酸
コチニン
２−メチルニコチンアミド
の存在又は非存在を決定する工程を含み、下記の代謝産物：
キヌレン酸
の存在が、上記抗癌治療に対する良好な応答と関連付けられ、及び／又は、
アルファＤアミノアジピン酸
メチルイミダゾール酢酸
３，４−ジヒドロキシヒドロケイ皮酸
コチニン
２−メチルニコチンアミド
からなる群において選択される少なくとも１つの代謝産物の存在が、上記抗癌治療に対する不十分な応答と関連付けられる、方法に関する。
【００４５】
本発明はまた、下記のものに関する：
ラクノスピラ科（Lachnospiraceae）酪酸菌、バクテロイデス・オバツス、クロストリジウム目ルミノコッカス科（Ruminococcaceae）細菌、ブラウティア・オベウム（Blautia obeum）、フシカテニバクター・サッカリボランス、ロゼブリア・イヌリニボランス（Roseburia inulinivorans）、ゲンミゲル・フォルミシリス、及びフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィからなる群から選択される種の１個以上の精製細菌株を含む組成物；他の実施の形態において、上記組成物は、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、又は１０個以上の細菌株を含む；
ラクノスピラ科酪酸菌、バクテロイデス・オバツス、クロストリジウム目ルミノコッカス科細菌、ブラウティア・オベウム、フシカテニバクター・サッカリボランス、ロゼブリア・イヌリニボランス、ゲンミゲル・フォルミシリス、及びフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィからなる群から選択される種の細菌株と、少なくとも９７％の配列同一性を有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を有する１個以上の精製細菌株を含む組成物；他の実施の形態において、上記精製細菌株は、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を有し、及び／又は上記組成物は、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、若しくは１０個以上の細菌株を含む；
酪酸菌ＳＳ２−１、バクテロイデス・オバツスＣＩＰ  １０３７５６、クロストリジウム目細菌ＣＩＥＡＦ  ０２６、ブラウティア・オベウム１−３３、フシカテニバクター・サッカリボランスＴＴ−１１１、ロゼブリア・イヌリニボランスＡ２−１９４型株、ゲンミゲル・フォルミシリスＡＴＣＣ  ２７７４９  Ｘ２−５６、酪酸菌Ｌ２−２１及びフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィＬ２−６からなる群から選択される１個以上の精製細菌株を含む組成物；他の実施の形態において、上記組成物は、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、又は１０個以上の細菌株を含む；
酪酸菌ＳＳ２−１、バクテロイデス・オバツスＣＩＰ  １０３７５６、クロストリジウム目細菌ＣＩＥＡＦ  ０２６、ブラウティア・オベウム１−３３、フシカテニバクター・サッカリボランスＴＴ−１１１、ロゼブリア・イヌリニボランスＡ２−１９４型株、ゲンミゲル・フォルミシリスＡＴＣＣ  ２７７４９  Ｘ２−５６、酪酸菌Ｌ２−２１及びフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィＬ２−６からなる群から選択される細菌株と、少なくとも９７％の配列同一性を有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を有する１個以上の精製細菌株を含む組成物；他の実施の形態において、上記精製細菌株は、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を有し、及び／又は上記組成物は、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、若しくは１０個以上の細菌株を含む；
ラクノスピラ科酪酸菌、ゲンミゲル・フォルミシリス、及びフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィからなる群から選択される種の１個以上の精製細菌株を含む組成物；他の実施の形態において、上記組成物は、２個以上、３個以上、４個以上、又は５個以上の細菌株を含む；
ラクノスピラ科酪酸菌、ゲンミゲル・フォルミシリス、及びフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィからなる群から選択される種の細菌株と、少なくとも９７％の配列同一性を有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を有する１個以上の精製細菌株を含む組成物；他の実施の形態において、上記精製細菌株は、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有し、及び／又は上記組成物は、２個以上、３個以上、４個以上、若しくは５個以上の細菌株を含む；
ゲンミゲル・フォルミシリスＡＴＣＣ  ２７７４９  Ｘ２−５６、酪酸菌Ｌ２−２１及びフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィＬ２−６からなる群から選択される１個以上の精製細菌株を含む組成物；他の実施の形態において、上記組成物は、２個以上、３個以上、４個以上、又は５個以上の細菌株を含む；
ゲンミゲル・フォルミシリスＡＴＣＣ  ２７７４９  Ｘ２−５６、酪酸菌Ｌ２−２１及びフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィＬ２−６からなる群から選択される細菌株と、少なくとも９７％の配列同一性を有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を有する１個以上の精製細菌株を含む組成物；他の実施の形態において、上記精製細菌株は、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有し、及び／又は上記組成物は、２個以上、３個以上、４個以上、若しくは５個以上の細菌株を含む。
【００４６】
特定の実施の形態によれば、上述の組成物はそれぞれ、下記のようなものであり得る：
上記細菌株の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも１００％が、フィルミクテス門に属し；
上記細菌株の１００％未満、９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、又は１０％未満が、バクテロイデス属に属し；
上記組成物が、バクテロイデス属の細菌株を含まず；
上記組成物が、バクテロイデス・フラジリス（Bacteroides fragilis）又はバクテロイデス・テタイオタオミクロン種の細菌株を含まず；
上記組成物が、細菌株フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィＡ２−１６５を含まず；
上記細菌株は、凍結乾燥されており；
上記組成物は、免疫チェックポイント阻害剤を更に含み、特定の実施の形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１阻害剤、ＰＤ−Ｌ１阻害剤、又はＣＴＬＡ−４阻害剤であり、免疫チェックポイント阻害剤がＣＴＬＡ−４阻害剤である場合、上記ＣＴＬＡ−４阻害剤は、イピリムマブ又はトレメリムマブであってもよく、好ましくは、上記ＣＴＬＡ−４阻害剤は、イピリムマブであり、免疫チェックポイント阻害剤がＰＤ−１阻害剤である場合、上記ＰＤ−１阻害剤は、ニボルマブ又はペムブロリズマブであってもよく、免疫チェックポイント阻害剤がＰＤ−Ｌ１阻害剤である場合、上記ＰＤ−Ｌ１阻害剤は、アテゾリズマブ、アベルマブ又はデュルバルマブであってもよい。
【００４７】
本発明は更に、本発明の組成物のいずれかと、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物に関する。
【００４８】
或る実施の形態において、上記医薬組成物は、腸管への送達用に製剤化される。
【００４９】
或る実施の形態において、上記医薬組成物は、カプセルの形態で存在する。
【００５０】
或る実施の形態において、上記医薬組成物は、経口投与用に製剤化される。
【００５１】
或る実施の形態において、上記医薬組成物は、１つ以上の腸溶性ポリマーを含むｐＨ感受性組成物を含む。
【００５２】
本発明はまた、癌を治療する方法であって、対象において癌を治療するのに薬学的に有効な量の本発明の医薬組成物を投与することを含む、方法に関する。或る実施の形態において、上記癌は、黒色腫である。或る実施の形態において、上記方法は、対象が大腸炎を発症したかどうかを決定する工程を更に含む。
【００５３】
幾つかの実施の形態において、細菌株は精製される。本明細書中に記載する細菌株のいずれも、例えば、培養液又は微生物叢試料（例えば、糞便物質）等の供給源から単離及び／又は精製され得る。本明細書で提供される組成物において使用される細菌株は概して、健常な個体のマイクロバイオームから単離される。また、本明細書中で使用する場合、「精製される」という用語は、混入物等の１つ以上の構成成分から分離されたものを含む細菌株又は組成物を指す。幾つかの実施の形態において、細菌株は、混入物を実質的に含まない。幾つかの実施の形態において、組成物の１つ以上の細菌株は、細菌株を含有する培養液若しくは試料において産生され、及び／又は細菌株を含む培養液若しくは試料中に存在する１つ以上の他の細菌から独立して精製され得る。幾つかの実施の形態において、細菌株は、試料から単離又は精製され、次に、細菌複製に適した条件下で、例えば、嫌気性培養条件下で培養される。続いて、細菌複製に適した条件下で成長させた細菌は、成長した培地から単離／精製され得る。
【００５４】
幾つかの実施の形態において、組成物は、免疫チェックポイント阻害剤（「チェックポイント阻害剤」とも称される）を更に含む。免疫チェックポイントは、異常な免疫応答に起因する細胞損傷を最低限に抑えるように免疫ホメオスタシス（例えば、免疫応答の持続期間及び程度を調節する自己寛容）を維持することに関与する免疫系内の調節経路である。本明細書中で「免疫チェックポイント阻害剤」と称される免疫チェックポイントの阻害剤は、免疫チェックポイントを特異的に阻害して、免疫応答に対する刺激効果又は阻害効果を有し得る。いかなる特定の理論に拘束されることを望まないが、種々の癌及び腫瘍は、免疫チェックポイントを操作することで、検出を逃れ、及び／又は免疫応答を調節し得ると考えられる。
【００５５】
幾つかの実施の形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１阻害剤、ＰＤ−Ｌ１阻害剤、又はＣＴＬＡ−４阻害剤である（例えば、Vesely MD, Annu Rev Immunol 2011, 29:235-271; Nature Reviews Cancer 12, 252-264を参照）。本明細書で提供される組成物の幾つかの実施の形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１阻害剤、ＰＤ−Ｌ−１阻害剤、ＣＴＬＡ−４阻害剤、ＩＤＯ１阻害剤、ＬＡＧ３阻害剤又はＴＩＭ３阻害剤である。
【００５６】
幾つかの実施の形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ−４阻害剤である。幾つかの実施の形態において、ＣＴＬＡ−４阻害剤は、抗ＣＴＬＡ−４抗体である。抗ＣＴＬＡ−４抗体の例として、イピリムマブ、トレメリムマブ（ＣＰ−６７５２０６）、９Ｈ１０、４Ｆ１０、及び９Ｄ９が挙げられるが、これらに限定されない。幾つかの実施の形態において、ＣＴＬＡ−４阻害剤は、イピリムマブである。幾つかの実施の形態において、ＣＴＬＡ−４阻害剤は、トレメリムマブである。
【００５７】
幾つかの実施の形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１阻害剤である。幾つかの実施の形態において、ＰＤ−１阻害剤は、ニボルマブである。幾つかの実施の形態において、ＰＤ−１阻害剤は、ペムブロリズマブである。
【００５８】
幾つかの実施の形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−Ｌ１阻害剤である。幾つかの実施の形態において、ＰＤ−Ｌ１阻害剤は、アテゾリズマブである。幾つかの実施の形態において、ＰＤ−Ｌ１阻害剤は、アベルマブである。幾つかの実施の形態において、ＰＤ−Ｌ１阻害剤は、デュルバルマブである。
【００５９】
複数の免疫チェックポイント阻害剤を、本明細書中に開示する方法及び組成物に使用してもよいことが、更に理解されるべきである。例えば、非限定的な例では、本明細書中に記載する方法は、ＰＤ−１阻害剤及びＣＴＬＡ−４阻害剤の両方の投与を含む。
【００６０】
本明細書中に記載する組成物のいずれも、癌（例えば、黒色腫又は転移性黒色腫）を治療するのに薬学的に有効な量（本明細書中では「治療上有効な量」とも称される）又は治療上有効な量の用量で、対象に投与されてもよい。「治療する」又は「治療」という用語は、癌と関連付けられる症状の１つ以上を低減又は緩和することを指す。
【００６１】
組成物を含む医薬組成物を含む本明細書中に記載する組成物のいずれも、任意の形態で、例えば、溶液又は懸濁液等の水性形態で、半固形形態中に包埋されて、粉末形態又は凍結乾燥形態で、細菌株を含有し得る。幾つかの実施の形態において、組成物又は組成物の細菌株は、凍結乾燥されている。幾つかの実施の形態において、組成物中の細菌株のサブセットは、凍結乾燥されている。組成物、具体的には細菌を含む組成物を凍結乾燥する方法は、当該技術分野で既知である。例えば、米国特許第３，２６１，７６１号、米国特許第４，２０５，１３２号、ＰＣＴ国際公開第２０１４／０２９５７８号及び国際公開第２０１２／０９８３５８号（それらの全体を引用することにより本明細書の一部をなす）を参照されたい。複数の細菌を組合せとして凍結乾燥してもよく、及び／又は複数の細菌を別々に凍結乾燥して、投与前に組み合わせてもよい。細菌株は、他の細菌株と組み合わせる前に、医薬添加剤と組み合わせてもよく、又は複数の凍結乾燥細菌を、凍結乾燥形態の間に組み合わせてもよく、組み合わせた細菌の混合物を、続いて、医薬添加剤と組み合わせてもよい。幾つかの実施の形態において、細菌株は、凍結乾燥ケーキである。幾つかの実施の形態において、１つ以上の細菌株を含む組成物は、凍結乾燥ケーキである。
【００６２】
組成物の細菌株は、当該技術分野で既知の発酵技法を使用して製造することができる。幾つかの実施の形態において、活性成分は、嫌気性細菌種の迅速な成長を支持することができる嫌気性発酵槽を使用して製造される。嫌気性発酵槽は、例えば、攪拌タンクリアクター又は使い捨てのウェーブバイオリアクターであってもよい。ＢＬ培地及びＥＧ培地等の培養培地、又は動物構成成分を欠如したこれらの培地の類似バージョンを、細菌種の成長を支持するのに使用することができる。細菌産物は、遠心分離及び濾過等の伝統的な技法によって、発酵ブロスから精製及び濃縮することができ、任意選択で、当該技術において既知の技法によって、乾燥及び凍結乾燥することができる。
【００６３】
幾つかの実施の形態において、細菌株の組成物は、医薬組成物としての投与用に製剤化され得る。「医薬組成物」という用語は、本明細書中で使用する場合、任意の２つ以上の本明細書中に記載する精製細菌株等の少なくとも１つの活性成分と、１つ以上の薬学的に許容可能な添加剤（「薬学的に許容可能な担体」とも称される）を含み得る１つ以上の不活性成分とを混合すること又は組み合わせることによって生じる生成物を意味する。「許容可能な」添加剤は、活性成分と適合し、かつ投与される対象にとって無害でなくてはならない添加剤を指す。幾つかの実施の形態において、薬学的に許容可能な添加剤は、組成物の対象とする投与経路に基づいて選択され、例えば、経口又は経鼻投与用の組成物は、直腸投与用の組成物とは異なる薬学的に許容可能な添加剤を含み得る。添加剤の例として、滅菌水、生理的食塩水、溶媒、基剤、乳化剤、懸濁化剤、界面活性剤、安定剤、香料、芳香剤、賦形剤、ビヒクル、防腐剤、結合剤、希釈剤、等張化剤、無痛化剤、増量剤、崩壊剤、緩衝剤、コーティング剤、滑沢剤、着色料、甘味料、増粘剤及び可溶化剤が挙げられる。
【００６４】
本開示の医薬組成物は、当該技術分野において既知であり、また日常的に実施される方法に従って調製することができる（例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co. 20th ed. 2000を参照）。本明細書中に記載する医薬組成物は、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で、任意の担体又は安定剤を更に含み得る。許容可能な添加剤、担体、又は安定剤として、例えばバッファー、抗酸化剤、防腐剤、ポリマー、キレート剤、及び／又は界面活性剤が挙げられる。医薬組成物はＧＭＰ条件下で製造されることが好ましい。医薬組成物は、経口、経鼻又は非経口で、例えばカプセル、錠剤、丸剤、サシェ、液剤、散剤、顆粒剤、微細顆粒剤、フィルムコーティング製剤、ペレット、トローチ、舌下製剤、チュアブル錠、バッカル製剤、ペースト、シロップ剤、懸濁剤、エリキシル剤、乳剤、リニメント剤、軟膏、プラスター剤、パップ剤、経皮吸収システム、ローション、吸入剤、エアロゾル、注射剤、坐剤等の形態で使用することができる。
【００６５】
幾つかの実施の形態において、組成物は、腸管（例えば、小腸及び／又は結腸）への送達用に製剤化される。幾つかの実施の形態において、組成物は、胃の中の厳しい環境を通り抜ける細菌の生存率を高める腸溶性コーティングを用いて製剤化される。腸溶性コーティングは、胃の中の胃液の作用に抵抗するものであり、その結果、コーティングに取り込まれた細菌は、胃を通り抜けて、腸管に入る。腸溶性コーティングは、腸液と接触すると直ちに溶解し、その結果、コーティングに封入された細菌は、腸管で放出される。腸溶性コーティングは、市販のＥＵＤＲＡＧＩＴ（Evonik Industries社）等の当該技術分野で既知のポリマー及びコポリマーで構成され得る（例えば、Zhang, AAPS PharmSciTech, (2016) 17 (1), 56-67を参照）。
【００６６】
細菌はまた、腸管（例えば、結腸）への直腸送達用に製剤化され得る。したがって、幾つかの実施の形態において、細菌組成物は、坐剤、結腸内視鏡検査、内視鏡検査、Ｓ状結腸内視鏡検査又は注腸による送達用に製剤化され得る。医薬調合品又は製剤、特に経口投与用の医薬調合品は、本開示の組成物の、腸管（例えば、結腸）への効率的な送達を可能にする更なる構成成分を含んでもよい。組成物の、腸管（例えば、結腸）への送達を可能にする様々な医薬調合品を使用することができる。それらの例として、ｐＨ感受性組成物、より具体的には、緩衝サシェ製剤、又は腸溶性ポリマーが胃を通過した後にｐＨがアルカリ性になると、その内容物を放出する腸溶性ポリマーが挙げられる。ｐＨ感受性組成物が、医薬調合品を製剤化するのに使用される場合、ｐＨ感受性組成物は、組成物の分解のｐＨ閾値が約６．８〜約７．５であるポリマーであることが好ましい。かかる数値範囲は、胃の遠位部分ではｐＨがアルカリ側にシフトする範囲であり、したがって、結腸への送達における使用に適した範囲である。腸管の各部分（例えば、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸及び直腸）は、異なる生化学的環境及び化学的環境を有することが、更に理解されるべきである。例えば、腸管の部分は、異なるｐＨを有し、特異的なｐＨ感受性を有する組成物による標的化送達を可能にする。したがって、本明細書で提供される組成物は、製剤に適切なｐＨ感受性を与えることにより、腸管又は腸管の特定部分（例えば、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸及び直腸）への送達用に製剤化され得る（例えば、Villena et al., Int J P harm 2015, 487 (1-2): 314-9を参照）。
【００６７】
組成物の、腸管（例えば、結腸）への送達に有用な医薬調合品の別の実施の形態は、内容物（例えば、細菌株）の放出を、小腸通過時間に相当するおよそ３時間〜５時間遅延させることによって、結腸への送達を保証するものである。遅延放出用の医薬調合品の一実施の形態において、ヒドロゲルは、シェルとして使用される。ヒドロゲルは、胃腸液との接触時に水和されて、膨張することで、内容物が有効に放出される（主に結腸で放出される）。遅延放出投薬単位は、投与される薬物又は活性成分をコーティングするか、又は選択的にコーティングする材料を有する薬物含有組成物を含む。このような選択的なコーティング材料の例として、ｉｎ  ｖｉｖｏ分解性ポリマー、漸次加水分解性ポリマー、漸次水溶性ポリマー及び／又は酵素分解性ポリマーが挙げられる。放出を遅延させる幅広いコーティング材料が利用可能であり、例えばヒドロキシプロピルセルロース等のセルロースベースのポリマー、メタクリル酸ポリマー及びコポリマー等のアクリル酸ポリマー及びコポリマー、並びにポリビニルピロリドン等のビニルポリマー及びコポリマーが挙げられる。
【００６８】
腸管（例えば、結腸）への送達を可能にする医薬組成物の更なる例として、結腸粘膜に特異的に付着する生体接着組成物（例えば、米国特許第６，３６８，５８６号の明細書中に記載されるポリマー）及び特に胃腸管におけるバイオ医薬調合品をプロテアーゼの活性に起因した分解から防御するためにプロテアーゼ阻害剤を取り入れた組成物が挙げられる。
【００６９】
細菌株を含む組成物は、当業者に既知の従来法によって、薬学的に許容可能な剤形へと製剤化される。投薬レジメンは、最適な所望の応答（例えば、予防効果又は治療効果）を提供するように調節される。幾つかの実施の形態において、組成物の剤形は、錠剤、丸剤、カプセル、散剤、顆粒剤、液剤又は坐剤である。幾つかの実施の形態において、医薬組成物は、経口投与用に製剤化される。幾つかの実施の形態において、医薬組成物は、組成物の細菌、又はその一部が、対象の胃を通過した後に生存可能なままであるように製剤化される。幾つかの実施の形態において、医薬組成物は、直腸投与用に、例えば坐剤として製剤化される。幾つかの実施の形態において、医薬組成物は、適切なコーティング（例えば、ｐＨ特異的なコーティング、標的領域特異的な酵素によって分解することができるコーティング、又は標的領域中に存在する受容体に結合することができるコーティング）を提供することによって、腸管又は腸管の特定領域（例えば、結腸）への送達用に製剤化される。
【００７０】
医薬組成物中の活性成分の投与量は、毒性ではなく、又は対象に対して有害な影響を持たずに、特定の対象、組成物、及び投与様式に関して所望の医薬応答を達成するのに有効な量の活性成分を得るように変化させることができる。選択される投与量レベルは、用いられる本開示の特定の組成物の活性、投与経路、投与の時間、治療の持続期間、用いられる特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物及び／又は材料、治療される対象の年齢、性別、体重、状態、全体的な健康及び過去の病歴等の要因を含む様々な要因に依存する。医師、獣医又は他の専門家は、所望の治療効果を達成するのに必要とされるレベルよりも低レベルの医薬組成物の用量から始めて、所望の効果が達成されるまで、投与量を徐々に増加してもよい。概して、本明細書中に記載するような人々の集団の予防的処置のための本開示の組成物の有効用量は、投与経路、対象がヒトか動物かに関わりなく対象の生理学的状態、施される他の薬物療法、及び所望の治療効果を含む多くの異なる要因に応じて多様である。投与量は、安全性及び有効性を最適化するように用量設定される（titrated）必要がある。幾つかの実施の形態において、投薬レジメンは、本明細書中に記載する組成物のいずれかの単回用量の経口投与を含む。幾つかの実施の形態において、投薬レジメンは、本明細書中に記載する組成物のいずれかの複数回用量の経口投与を含む。幾つかの実施の形態において、組成物は、対象に、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、又は少なくとも１０回経口投与される。
【００７１】
本開示の態様は、対象における癌の治療に関する方法及び組成物を含む。幾つかの実施の形態において、対象は、癌を有するか、又は癌を発症するリスクがある。本明細書で提供される方法で治療することができる癌の例として、限定されるものではないが、癌腫、神経膠腫、中皮腫、黒色腫（例えば転移性黒色腫）、リンパ腫、白血病、腺癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、神経膠芽腫、多発性骨髄腫、前立腺癌、バーキットリンパ腫、頭頸部癌、結腸癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、食道癌、胃癌、膵癌、肝胆道癌、胆嚢癌、小腸癌、直腸癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、陰茎癌、尿道癌、精巣癌、膣癌、子宮癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、膵内分泌癌、カルチノイド癌、骨癌、皮膚癌、網膜芽細胞腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、カポジ肉腫、多中心性キャッスルマン病、エイズ関連原発性滲出性リンパ腫、神経外胚葉性腫瘍、又は横紋筋肉腫が挙げられる。本明細書で提供される方法の幾つかの実施の形態において、癌は、前立腺癌、膀胱癌、非小細胞肺癌、尿路上皮癌、黒色腫、メルケル細胞癌又は腎細胞癌である。幾つかの実施形態において、癌は、黒色腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、ホジキンリンパ腫、頭頸部癌、腎細胞癌、膀胱癌、又はメルケル細胞癌である。
【００７２】
幾つかの実施の形態において、癌は、黒色腫であり、抗癌療法は、ＣＴＬＡ−４阻害剤（例えば、イピリムマブ、トレメリムマブ）及び本明細書で提供される細菌組成物の１つ以上を投与することを包含する。幾つかの実施の形態において、癌は、黒色腫、ＮＳＣＬＣ、ホジキンリンパ腫、直腸癌、頭頸部癌であり、抗癌療法は、ＰＤ−１阻害剤（例えば、ペムブロリズマブ、ニボルマブ）及び本明細書で提供される細菌組成物の１つ以上を投与することを包含する。幾つかの実施の形態において、癌は、膀胱癌、ＮＳＣＬＣ、又はメルケル細胞癌であり、抗癌療法は、ＰＤ−Ｌ１阻害剤（例えば、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ）及び本明細書で提供される細菌組成物の１つ以上を投与することを包含する。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】イピリムマブで治療した転移性黒色腫を有する患者におけるベースラインでの及び大腸炎中の腸微生物叢を示す図である。Ａ．ベースラインの来診（Ｖ１）と大腸炎との間の細菌属組成に基づく患者分布の主成分分析の表示。７名の患者が、ベースライン及び大腸炎発症時の両方で糞便試料を収集した。モンテカルロシミュレーション（Monte-Carlo simulated）ｐ値＝０．００５９。構成成分１は、分散１３．５９％を明確にし、構成成分２は、分散１１．４５％を明確にする。Ｂ．ベースライン（Ｖ１）と比較した場合に大腸炎（Ｖｔｏｘ）中に有意に低減された有力な（総読取りの１％を超える）腸微生物属の相対存在量。ＬＡＣＨＮ：ラクノスピラ・インケルタエ・セディス（Lachnospiracea incertae sedis）、ＲＵＭ：ルミノコッカス属、ＢＬＡＵ：ブラウティア属（Blautia）、ＣＬ＿ＩＶ：クロストリジウム属（Clostridium）ＩＶ、ＥＵＢ：ユーバクテリウム属（Eubacterium）、Ｕｎｃ＿ＬＡＣＨ：未分類ラクノスピラ科（Lachnospiraceae）、ＰＳＥＵＤ：シュードフラボニフラクター属（Pseudoflavonifractor）（全ての属に関して、対応のあるｔ検定ｐ＜０．０５）。Ｃ．ベースライン（Ｖ１）と比較した場合に大腸炎（Ｖｔｏｘ）中に有意に影響を受けた細菌単離株の総読取りに対するパーセントとしての割合。有意な（対応のあるｔ検定ｐ＜０．０５）データのみを提示する。
【図２】イピリムマブに対する応答の予測因子としてのベースライン腸微生物叢を示す図である。Ａ．イピリムマブ治療のベネフィットに応じたベースライン（Ｖ１）での細菌属組成に基づく患者の分布の主成分分析の表示。ＬＴベネフィット：長期ベネフィット（緑色）対Ｐｏｏｒベネフィット（えんじ色）。構成成分１は、分散１２．８６％を明確にし、構成成分２は、分散８．６７％を明確にする。モンテカルロシミュレーションｐ値＝０．００８９９。Ｂ．両群間で差次的に表示される４つの有力な（総読取りの１％を超える）属、即ち、バクテロイデス属、フィーカリバクテリウム属、クロストリジウム属ＸＩＶａ及びゲンミゲル属（Gemmiger）のパーセントの箱ひげ図。ＬＴ＿ベネフィット：長期ベネフィット対Ｐｏｏｒベネフィット；＊：ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００１。Ｃ．イピリムマブ治療後の全生存期間に応じたベースライン（Ｖ１）での細菌属組成に基づく患者分布のクラス間主成分分析の表示。ＧＳ０＿６：０ヵ月〜６ヵ月の範囲の全生存期間（ｎ＝２）、ＧＳ６＿９：６ヵ月〜９ヵ月の範囲の全生存期間（ｎ＝５）、ＧＳ９＿１２：９ヵ月〜１２ヵ月の範囲の全生存期間（ｎ＝４）、ＧＳ１２＿１８：１２ヵ月〜１８ヵ月の範囲の全生存期間（ｎ＝７）、ＧＳｓｕｐ１８：１８ヵ月を上回る全生存期間（ｎ＝８）。モンテカルロシミュレーションｐ値＝０．０１０９８。Ｄ．１８ヵ月を超える全生存期間のベースライン（Ｖ１）でのバイオマーカーとして強調される３つの特異的なＯＴＵのパーセント。患者の微生物叢をそれぞれ、グラフで表す。ＧＳ０＿６：０ヵ月〜６ヵ月の範囲の全生存期間（ｎ＝２）、ＧＳ６＿９：６ヵ月〜９ヵ月の範囲の全生存期間（ｎ＝５）、ＧＳ９＿１２：９ヵ月〜１２ヵ月の範囲の全生存期間（ｎ＝４）、ＧＳ１２＿１８：１２ヵ月〜１８ヵ月の範囲の全生存期間（ｎ＝７）、ＧＳｓｕｐ１８：１８ヵ月を上回る全生存期間（ｎ＝８）。
【図３】ベースライン腸微生物叢組成は、イピリムマブに対する臨床応答を予測することを示す図である。Ａ．ベースライン（Ｖ１）での３つの統計学的に頑健なクラスター（Ａ、Ｂ及びＣ）への患者の層別化のクラス間の主成分分析の表示。モンテカルロシミュレーションｐ値＝０．０００９９。Ｂ．ベースラインでの３つの異なるクラスターを識別する細菌属を、ランダムフォレスト分析で評価して、ウィルコクソン検定を用いて確認した。これらの６つの属それぞれに関する読取りのパーセントを、各クラスターに関して表示する。Ｃ．ベースライン腸微生物叢組成及び全生存率（ＯＳ）。クラスター、即ちクラスターＡ対クラスターＢに従って２つの群に分類した患者のカプラン・マイヤー生存曲線。Ｄ．ベースライン腸微生物叢組成物及び無増悪生存率。クラスター、即ちクラスターＡ対クラスターＢに従って２つの群に分類した患者のカプラン・マイヤー生存曲線。ｐ値を各グラフ上に示す。
【図４】ベースラインでの腸微生物叢組成は、イピリムマブ誘導性大腸炎を予測することを示す図である。Ａ．イピリムマブ誘導性大腸炎に罹りやすい患者又はイピリムマブ誘導性大腸炎に対して耐性を示す患者間のベースラインでの２つの有力なフィルミクテス門及びバクテロイデス門の相対存在量の箱ひげ図。ウィルコクソン検定を適用して、有意性を評価しており、ｐ値をグラフ上に示す。Ｂ．クラスター、即ちクラスターＡ対クラスターＢに従って２つの群に分類した患者の大腸炎累積発生率（グレイの検定）。ｐ値をグラフ上に示す。Ｃ．イピリムマブ治療中の大腸炎発症を予測するＯＴＵ。ＬＥｆＳｅは、差次的に豊富な特徴（即ち、細菌ＯＴＵ）それぞれのエフェクトサイズを推定するのに線形判別分析（ＬＤＡ）を使用する。左のパネルでは、濃灰色のＯＴＵは、大腸炎発症のバイオマーカーである（大腸炎）。淡灰色のＯＴＵは、大腸炎発症が存在しないことのバイオマーカーである（大腸炎なし）。最良のバイオマーカーは、最小閾値３．５で、最も高い絶対ＬＤＡスコアを示す（即ち、大腸炎なしの群に関しては、ＯＴＵ  ｄｅｎｏｖｏ５９２、及び大腸炎の群に関してはＯＴＵ  ｄｅｎｏｖｏ３７９５）。右のパネルは、これらのＯＴＵそれぞれの分類学的所属を示す。Ｓｉｍ．：ＲＤＰ  Ｓａｂ＿スコアによって評価されるＯＴＵ読取りと第１の帰属単離株１６Ｓ配列との間の類似性。ＲＤＰ  Ｓａｂ＿スコアは、２つの配列間で共有される７量体のパーセントである。
【図５】全身免疫状態及び微生物叢組成を示す図である。Ａ〜Ｃ．新鮮な全血ＣＤ４＋Ｔ細胞のＴｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ３＋細胞内のＣＤ４＋ＣＤ３＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋の％）；ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞中のα４＋β７＋のベースライン（Ｖ１）のパーセント及び絶対数、ＩＬ−６、ＩＬ−８及びｓＣＤ２５の血清濃度を分析して、クラスターＡに属する患者と、クラスターＢに属する患者との間で（Ａ）、長期臨床ベネフィット（ＬＴベネフィット）と、不十分な臨床ベネフィット（Ｐｏｏｒベネフィット）との間で（Ｂ）、大腸炎を有する患者（大腸炎）と、大腸炎を有さない患者（大腸炎なし）との間で（Ｃ）比較した。ドットはそれぞれ、患者１名を表す。ｐ値を各グラフ上に示し、ｎｓは、「有意ではない」ことを意味し、マンホイットニー検定を使用した。（Ｄ）ＣＤ４＋２１Ｔ細胞上でのＩＣＯＳの発現を、イピリムマブ治療前（Ｖ１）及びイピリムマブの１回又は２回注射後（Ｖ２〜Ｖ３）に、新鮮な全血においてモニタリングした。ｓＣＤ２５の血清濃度は、イピリムマブ治療に先立って（Ｖ１）、及びイピリムマブの１回又は２回注射後（Ｖ２〜Ｖ３）にモニタリングした。従来のＣＤ４＋２４Ｔ細胞（Ｔｃｏｎｖ）のパーセントは、Ｔｒｅｇ細胞を排除したＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔの％として定義した。グラフは、クラスターＡに属する患者（白丸）及びクラスターＢに属する患者（黒丸）におけるイピリムマブ治療にわたる免疫活性化の具体的な変化を表す。ドットはそれぞれ、患者１名を表す。ｐ値を各グラフ上に示す。マンホイットニー検定（Ａ〜Ｃ）及びウィルコクソンの対応した符号順位検定（Ｄ）を使用した。
【図６】患者の糞便試料中の５つの代謝産物の個々の再分配（repartition）のグラフ表示である。
【図７】ＲＯＣ曲線の略図を、これらの１４個の代謝産物に基づいて構築し、曲線下面積は、良好な予測値を示した（ＡＵＣ＝０．８６０２９４１）。
【図８】この図は、代謝産物の第１のセット（５つの選択したバイオマーカー）の組合せが、良好な予測値（ＡＵＣ＞０．８）を示すのに対して、セット＃２及びセット＃３の追加により、ＡＵＣ＞０．８５で層別化力が高まり、したがって、バイオマーカー特異性を改善することを示す。
【図９】箱ひげ図での患者の２つの群内の１４個の代謝産物の再分配のグラフ表示である（ｙ軸＝ピーク面積）。
【図１０】抗ＣＴＬＡ４に対する毒性と具体的に関連付けられる代謝経路の特定のセット（ＫＥＧＧ  ＩＤと記載される）を強調したグラフである。
【図１１】抗ＣＴＬＡ４に対する応答と具体的に関連付けられる代謝経路の特定のセット（ＫＥＧＧ  ＩＤと記載される）を強調したグラフである。
【図１２】ＣＴＬＡ４治療に対するレスポンダーと非レスポンダーとを識別するのを助長する糞便中に存在する主要な代謝産物を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００７４】
Ｉ．患者、材料及び方法
患者
イピリムマブで治療したＭＭを有する患者を、２０１３年３月〜２０１４年１２月にGustave Roussy Cancer Campusにて前向きに登録した。患者は、研究について知らされ、同意して、参加した。この研究は、Kremlin Bicetre Hospital Ethics Committee (GOLD study: SC12-018; ID-RCB-2012-A01496-37)によって認可され、手順は全て、ヘルシンキ宣言に従って実施した。患者は、予め指定した臨床精密検査を受け、ベースライン（Ｖ１）で、各イピリムマブ注入に先立って（Ｖ２、Ｖ３、Ｖ４）、治療の最後に（即ち、最後の注入の３週後；Ｖ５）、及び存在する場合には、大腸炎発生時に（ＶＴｏｘ）、糞便及び血液を収集した。イピリムマブは、３ｍｇ／Ｋｇ又は１０ｍｇ／Ｋｇの用量で、３週毎に静脈内に投与し、疾患が制御された（応答又は安定な疾患）患者において、１２週毎に１回の注入の維持用量で、Ｖ４後に継続することができた。免疫媒介性腸炎（グレードＩＩＩ以上）が疑われた場合、患者について、Gastroenterology Department of Bicetre Hospitalに問い合わせた。イピリムマブ誘導性大腸炎の診断は、虚血及び感染等の炎症の内視鏡的な兆候を有し、大腸菌の他の原因を持たない患者において成された（細菌病原体及びクロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）毒素に関する便検査は、陰性でなくてはならなかった）。
【００７５】
イピリムマブに対する応答を、幾つかの判断基準によって評価した。長期臨床ベネフィットは、免疫関連応答の判断基準［１５、１６］によるベースラインに対する５０％以上の腫瘍量の応答低下又は６ヵ月を越える安定な疾患（最下点に対して腫瘍量の５０％未満の低下であるが、２５％未満の増加）によって定義された。不十分なベネフィットを有する患者は、長期ベネフィットを欠如し、即ち６ヵ月未満の無増悪生存期間を伴う（最下点に対して２５％以上の腫瘍量の確認される増加として定義される免疫関連進行性疾患を有する）患者として定義された［１５、１６］。応答は全て、最初に記録した日から４週以上の続く評価によって確認した。
【００７６】
ハイスループットシーケンシングによる細菌組成の評価
糞便試料を、ベースラインで（Ｖ１）、各イピリムマブ注入に先立って（Ｖ２、Ｖ３、Ｖ４）、治療の最後に（Ｖ５）、及び大腸炎時に（ＶＴｏｘ）、嫌気的に収集して、分析まで−８０℃で維持した。これまで記載されるように、物理的溶解及び化学的溶解の両方を使用して、総ＤＮＡを糞便試料分取量（およそ１５０ｍｇ）から抽出した［１７］。培養非依存性１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子シーケンシングを、８３個の糞便試料に対して実施した（ｎ＝２６の患者、表Ｓ３）。４５４パイロシーケンシング技術（Life Sciences, a Roche company社、米国コネチカット州ブランフォード）及びＭｉＳｅｑ（Illumina Inc社、米国カリフォルニア州サンディエゴ）技術の両方を、Ｖ３〜Ｖ４  １６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子領域に対して適用した。腸細菌組成を、大腸炎又は臨床ベネフィットの知識を持たずに前向きに決定し、それは、研究の最後に決定した。
【００７７】
より正確には、パイロシーケンシング（４５４）及びＭｉＳｅｑシーケンシングの両方に関して、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のＶ３〜Ｖ４領域を、下記のプライマーを用いて増幅させた：Ｖ３Ｆ＜＜ＴＡＣＧＧＲＡＧＧＣＡＧＣＡＧ＞＞（Ｇに代わってＲで修飾したＶ３Ｆ  ｂａｃ３３９Ｆ）（Wilson KH, et al. J Clin Microbiol. 1990）及びＶ４Ｒ＜＜ＧＧＡＣＴＡＣＣＡＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴ＞＞ｂａｃ８０６Ｒ。４５４に関して、適用した品質フィルターは、最小長＝２５０ｂｐ、最大長＝６００ｂｐ、最小品質閾値＝２５、ホモポリマーの最大数＝６であった。ＭｉＳｅｑに関しては、フィルターは、最小長＝２００ｂｐ及び最小品質閾値＝２０であった。これらのフィルターを適用して、平均１６３９回及び７３７７回の読取り／試料を、それぞれ、４５４及びＭｉＳｅｑ技術を用いた更なる分析用に維持した。高品質読取りをプールして、キメラに関して検査して、QIIME社のｕｃｌｕｓｔソフトウェアを用いて、９７％類似性閾値に基づいて操作的分類単位（ＯＴＵ）へ分類した。最終的に、４６２３１２個の高品質読取り（平均４６２３個の読取り／試料）を分析して、QIIME社のｕｃｌｕｓｔソフトウェアに基づいて、試料１つ当たり平均３４９個の操作的分類単位（ＯＴＵ）（９７％類似性閾値；ＯＴＵ又はファイロタイプ）へ分類した［１］。ファイロタイプの豊富さと多様性の推定を、希薄なＯＴＵ表（ｎ＝１０００の読取り）で、シャノン指数及びシンプソン指数の両方を使用して算出した。シングルトンを除去して、各ＯＴＵの系統学的所属分類は、リボソームデータベースプロジェクト分類学を使用することによって行われ［２］、門レベルから種レベルまで実施した。
【００７８】
種々の研究の一環内での比較に使用される試料の数のように、適用したシーケンシング技術を、表Ｓ３における試料（ｎ＝８３）それぞれに関して示す。統計学的解析を適用して、微生物叢に対するイピリムマブ治療、大腸炎発症、及び他の臨床因子の影響を解釈して、ＭＭ患者における大腸炎発症に有意に関与する微生物群及び免疫学的欠陥の組合せを強調した。
【００７９】
２つの群の全ての組合せ間の有意差に関する統計学的実験を、対応のあるスチューデント検定又はマンホイットニー検定の何れかを使用して実施した。データ可視化に、また細菌属に関して、存在量ベースの主成分分析（ＰＣＡ）及びモンテカルロ順位検定と関連付けられるクラス間ＰＣＡを実施するのに、統計学的な１つのＲ言語を使用した。
【００８０】
ランダムフォレスト分類子を、分布する細菌属及びＯＴＵの相対存在量データに適用して、各患者を或る特定の表現型へ分類する際の微生物構成成分の可変的な重要性を評価した［３］。
【００８１】
ランダムフォレスト機械学習分析を適用して、群間の糞便群集組成を区別する細菌属レベルを同定した。ランダムフォレスト等の分類子の目的は、入力値又は予測因子のセット（ここでは、属存在量に関する）を、別個の出力値（ここでは、臨床群に関する）にマッピングする機能を学習することである。
【００８２】
ランダムフォレストは、分類群間の非線形の関係性及び複雑な依存性を利用することができる強力な分類子である。この方法の成功度は、試料のサブセットに関してランダムフォレストを訓練して、残りの試料をカテゴリー化するのに使用することによって推定される、目に見えない試料を正確に分類するその能力である［３］。相互検証誤差を、最も共通するカテゴリーを常に予測することによって達成されるベースライン誤差と比較する。ランダムフォレスト分析は、５０００個の希薄なバージョンのデータに関して、各比較のために実施した。
【００８３】
さらに、ランダムフォレストは、予測因子のセットからその属を排除することによって引き起こされる誤差の増加を推定することによって、重要性スコアを各属に割り当てる。ランダムフォレストはまた、変数のＧｉｎｉ重要性を報告し、これは、その変数が分割に使用されたフォレストにおけるあらゆるノードのＧｉｎｉ不純物低下の合計としてコンピューター処理される。さらに、大腸炎を有するが、イピリムマブ治療にも応答する可能性のある（又は応答しない可能性のある）患者を識別するバイオマーカーの高次元の発見に、ＬＥｆＳｅ（線形判別分析エフェクトサイズ）アルゴリズム［４］を適用した。アルゴリズムは、http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/にて、無料で利用可能である。最終的に、患者を、それらの有力な腸微生物組成（属レベル）に基づいて統計学的に層別化した。患者のクラスタリングは、これまでに記載されるように［５］、ｋ平均法クラスタリングアルゴリズム及びカリンスキー・ハラバシュ指数１を用いて実施されて、クラスターの最適数を選択した。Ｒパッケージで実行されるｋ平均法クラスタリングアルゴリズムを使用した。
【００８４】
操作変数としてクラスターを用いた属組成のクラス間ＰＣＡもまた、１０００個の複製物を用いたモンテカルロ検定に基づいて評価した。
【００８５】
最終的に、ランダムフォレスト分析も実施して、３つの同定されたクラスター間の糞便群集組成を区別する細菌群を同定した。
【００８６】
新鮮な全血免疫モニタリング及び可溶性免疫マーカー
血液試料を、ベースライン（Ｖ１）で、各イピリムマブ注入に先立って（Ｖ２、Ｖ３、Ｖ４）、治療の最後に（Ｖ５）に、及び大腸炎時に（ＶＴｏｘ）収集した。新鮮な全血、又はフィコール密度勾配によって単離して、後の分析用に凍結させた新鮮な末梢血単核細胞（補足材料を参照）に対して、表現型決定を実施した。血清試料は全て、炎症の可溶性免疫マーカー（ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１、ＴＮＦα、ｓＣＤ２５）及び細菌移行の可溶性免疫マーカー（ｓＣＤ１４）の更なる分析まで−８０℃で保管した。免疫モニタリングの詳細は、補足材料において見出すことができる。これまでの研究により、メモリーＴ細胞及びＴ細胞におけるＩＣＯＳ誘導はともに、臨床応答に関連され得ることが実証されている［１８］ことから、本発明者らは、メモリーＴ細胞及びＴ細胞におけるＩＣＯＳ誘導をモニタリングした。制御性Ｔ細胞は、腸における免疫ホメオスタシスの維持において重大な役割を果たし、抗ＣＴＬＡ−４治療に対する主要な標的であると提唱されている［１９］。ヘテロ二量体α４β７は、Ｔ細胞の腸管ホーミングにおいて重大な役割を果たし、本発明者らは、α４＋β７＋Ｔ細胞をモニタリングして、イピリムマブ誘導性大腸炎のメカニズムにおいて幾つかの洞察を得た。本発明者らは、微生物叢組成を補足するものとして、炎症及び細菌移行の可溶性免疫マーカーをモニタリングした。実際に、微生物叢組成は、腸バリア機能、局所免疫性及び全身免疫性に影響を及ぼす［２０〜２５］［２６］。
【００８７】
統計学的解析
正式な試料サイズの算出は、この先駆的な研究に関しては実施しなかった。微生物叢の有力なプロファイルと免疫学的パラメーターとの間の関連は、スピアマンの相関係数及び両側ウィルコクソン検定を用いて評価した。複数の比較に関する調節は、分析の探索用構成成分のため、行わなかった。フィッシャーの正確確立検定を使用して、微生物叢クラスターと免疫パラメーター、微生物叢クラスターと大腸炎、及び微生物叢クラスターと臨床応答との間の関連を調べた。
【００８８】
腸管微生物叢（クラスターＡ対クラスターＢ）による、及び従来のＣＤ４＋Ｔ細胞の数（少数の従来のＣＤ４対多数の従来のＣＤ４）による全生存率（ＯＳ）並びに無増悪生存率（ＰＦＳ）は、カプラン・マイヤー法を使用して推定し、ログランク検定を使用して比較した。
【００８９】
毒性の発生を考慮する場合、進行及び死亡は、情報価値のある打ち切りをもたらす。というのも患者が進行又は死亡時に打ち切られると、患者の毒性のリスクは、打ち切られない患者の毒性のリスクと異なり得るからである。競合リスク分析は、情報価値のある打ち切りによって誘導される選択バイアスを回避するように、競合する事象を取り扱う方法である。
【００９０】
その結果として、毒性累積発生関数（ＣＩＦ）は、競合リスク分析により推定され、競合リスク分析では、毒性は所定の事象であり、死亡又は進行は、競合事象であり、最後の追跡日に進行又は毒性なしで生存する患者は、最後の追跡日から打ち切られた。種々の腸微生物叢クラスターにおける及び種々の従来のＣＤ４レベルに関する毒性累積発生関数は、ＳＡＳマクロ％ＣＩＦを使用して推定し、層別グレイの検定を使用して比較した［２７、２８］。これらの分析は、ＳＡＳソフトウェア、バージョン９．４（SAS Institute Inc.社、米国ノースカロライナ州ケーリー）を使用して実施した。
【００９１】
ＩＩ．結果
患者の臨床特性
５５名の患者が研究に含まれており、少なくとも６ヵ月間、追跡した。５５名の患者の中で、１３名の患者には、イピリムマブを投与しなかったのに対して、４名の患者には、イピリムマブを単回注入のみを行い、その後まもなくして、黒色腫に起因して亡くなった。したがって、この４名の患者は、更なる分析から排除した。残りの３８名の患者の中で、２６名が、微生物叢分析のためにベースラインでの（即ち、イピリムマブの１回目の投薬前の）糞便試料を提供した。これら２６名の患者のうち９名（３４．６％）が、長期臨床ベネフィットを有し、７名（２６．９％）が、免疫媒介性大腸炎を発症した。
【００９２】
微生物叢組成は、大腸炎時を除いて、イピリムマブ治療によって変更されない
腸微生物叢は、イピリムマブ治療にわたって有意に変更されなかった。主な細菌門であるフィルミクテス門及びバクテロイデス門は、経時的に安定のままであった。細菌属の比率が、種々の時点間で異なる場合でさえ、これらの細菌門はイピリムマブ治療によって有意に変更されなかった（ウィルコクソン検定ｐ＞０．０５）。同様に、多様性は、シャノン指数及びシンプソン指数の両方によって評価した場合に、イピリムマブ注射によって変更されなかった。まとめると、これらのデータは、イピリムマブが、ＭＭを有する患者において、腸内菌共生バランス失調を誘導しないことを示している。
【００９３】
７名の患者が、ベースライン時（Ｖ１）及び大腸炎中（Ｖｔｏｘ）の両方で糞便試料を提供した。免疫関連大腸炎は、主成分分析で強調されるように、腸微生物組成のシフトと関連付けられた（ＰＣＡ；図１Ａ）。これらの差は、科レベルで（ウィルコクソン検定、ｐ＝０．００４９）、及び属レベルで（ｐ＝０．００５９）で有意であった。７つの属の比率は、Ｖ１と比較してＶｔｏｘでは、少なくとも２倍、有意に低減された（図１Ｂ）。７つの属は全て、フィルミクテス門（ルミノコッカス属、ラクノスピラ・インケルタエ・セディス、ブラウティア属、クロストリジウム属ＩＶ、ユーバクテリウム属、未分類ラクノスピラ科及びシュードフラボニフラクター属）に属し、微生物叢の有力な成員であった。同様に、１８個の細菌単離株、主に、フィルミクテス門は、Ｖ１とＶｔｏｘとの間で有意に低減された（対応のあるスチューデントｔ検定ｐ＜０．０５、図１Ｃ）。最終的に、大腸炎は、大腸炎時のより低いシャノン多様度指数によって反映されるように、細菌多様度の低下と関連付けられた（Ｖ１シャノン＝５．５８、Ｖｔｏｘシャノン＝４．６５；対応のあるスチューデントｔ検定ｐ＝０．０４２）。
【００９４】
ベースラインの微生物叢組成は、続く臨床応答及び免疫関連大腸炎と関連付けられる
Ｖ１で、属組成に基づくクラス間ＰＣＡは、イピリムマブに応答して臨床ベネフィット、即ち長期臨床ベネフィット又は不十分な臨床ベネフィットのいずれかに応じて、患者の有意なクラスタリングを示した（モンテカルロ検定、ｐ＝０．００８９９、図２Ａ）。これはまた、種又はＯＴＵ組成等のより精密な分類学的レベルでも当てはまった（それぞれ、ｐ＝０．００４９９及び０．００７９９）。さらに、Ｖ１での糞便微生物叢は、患者の８４．６％を、長期ベネフィット又は不十分な臨床ベネフィットカテゴリーのいずれかへ正確に分類することを可能にし、ランダムフォレスト分析によって評価されるように、不十分なベネフィットを有する患者に関して、精度は９９％超に達した（５０００個のブートストラップ）。受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線は、曲線下面積（ＡＵＣ）０．７７をもたらし、これは、全微生物組成に基づいて、公正な分類を示す。この層別化を占める主な属は、フィーカリバクテリウム属、ゲンミゲル属、バクテロイデス属及びクロストリジウム属ＸＩＶａであり、これらの属の比率が、単に層別化を試験するのに考慮された場合、分類力は増加して、スコアは、ほぼ優れていた（ＡＵＣ＝０．８９５）。高比率のバクテロイデス属は、不十分な臨床ベネフィットを有する患者ではベースラインで存在した（ウィルコクソン検定、ｐ＝０．０３３６３）のに対して、フィーカリバクテリウム属のパーセントは、長期ベネフィットを有する患者において、有意に高かった（ｐ＝０．００９２４８、図２Ｂ）。ベースラインの糞便微生物叢組成はまた、１８ヵ月よりも長い患者の全生存期間と有意に関連付けられた（ウィルコクソン検定、ｐ＝０．０１１、図２Ｃ）。実際に、１８ヵ月よりも長い全生存期間を有する患者は全て、Ｖ１で、その腸微生物組成に基づいて分類することができ、フィルミクテス門：ルミノコッカス属及びラクノスピラ科の属（フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィＬ２−６、ゲンミゲル・フォルミシリス及び酪酸菌ＳＳ２−１の近縁種；図２Ｄ）に属するＯＴＵのより高い比率を示した。抗生物質の処方は、微生物組成を変更する可能性があるが、イピリムマブ治療に先立つ抗生物質は、ベースラインの有力な微生物叢に影響を与えず、潜在的に予測されるＯＴＵ又は細菌分類群はいずれも、抗生物質の使用と関連付けられなかったことに留意すべきである。
【００９５】
患者の微生物叢組成が、臨床特性とは独立して、また推測的な仮説を伴わずにベースラインで考慮された（ｋ平均法クラスタリングアルゴリズム及びカリンスキー・ハラバシュ指数）場合、クラスター：クラスターＡ、クラスターＢ及びクラスターＣと定義される３つの群の患者が出現した。これらの３つのクラスターのいずれかに属することに応じた、属組成に基づくクラス間ＰＣＡは、この層別化が有意であることを強調した（モンテカルロ検定、ｐ＝０．０００９９、図３Ａ）。クラスターＡに属する患者（ベースライン時にｎ＝１２）の微生物叢は、フィーカリバクテリウム属及び他のフィルミクテス門（未分類ルミノコッカス科（Ruminococcaceae）、クロストリジウム属ＸＩＶａ及びブラウティア属）によって決定された。クラスターＢ（ベースライン時にｎ＝１０）は、バクテロイデス属が富化され、クラスターＣ（ベースライン時にｎ＝４）は、プレボテラ属（Prevotella）が富化された（図３Ｂ）。クラスターＡは、クラスターＢよりも高い無増悪生存率（ｐ＝０．００３９、図３Ｄ）、また比較的程度は低いが、より高い全生存率（ｐ＝０．０５１、図３Ｃ）と関連付けられた。バクテロイデス属に決定されるクラスターＢ由来の２２名の患者の大部分（８０％）が、患者の５０％における抗ＰＤ−１剤を含む続く治療を受けたのに対して、フィーカリバクテリウムで決定されるクラスターＡ由来の患者の５８％が続く療法による治療を受けたが、その２５％のみに、抗ＰＤ−１剤を投与した。クラスターＡはまた、クラスターＢ（０／１０、ｐ＝０．００１６８８、フィッシャーの正確確立検定）と比較して、より高比率の長期臨床ベネフィットと関連付けられた（８／１２、６７％）。
【００９６】
門レベルで、大腸炎を発症する傾向にある患者の微生物叢は、ベースラインでフィルミクテス門が富化されていた（ウィルコクソン検定、ｐ＝０．００９）のに対して、大腸炎を発症しない患者では、高比率のバクテロイデス門が観察された（ｐ＝０．０１１、図４Ａ）。競合リスク分析では、クラスターＡ（フィーカリバクテリウム属及び他のフィルミクテス門によって決定される）に属することにより、クラスターＢ（バクテロイデス属によって決定される）と比較した場合に、より短い大腸炎のない累積発生と関連付けられる傾向にあった（グレイの検定、ｐ＝０．０５４５、図４Ｂ）。線形判別分析エフェクトサイズ（ＬＥｆＳｅ）分析を使用して、１５個の細菌ＯＴＵを、イピリムマブ治療中に、大腸炎のない進行又は大腸炎発症のいずれかの潜在的なバイオマーカーとして検出した（図４Ｃ）。バクテロイデス門（例えば、Ｂ．ユニフォルミス（B. uniformis）、Ｂ．ブルガータス（B. vulgatus）及びパラバクテロイデス・ディスタソニス）由来の５つの（６つのうちの）ＯＴＵは、大腸炎の非存在と関連付けられた一方で、続発する大腸炎と関連付けられるＯＴＵは、主にフィルミクテス門に関連した（８／９のＯＴＵ）。これらの潜在的な大腸炎を予測するベースラインＯＴＵ（フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィＬ２−６、酪酸菌Ｌ２−２１及びゲンミゲル・フォルミシリス２７７４９の近縁種）の幾つかはまた、より長期の全生存期間と関連付けられた。
【００９７】
微生物叢クラスタリング、臨床ベネフィット及びイピリムマブ誘導性大腸炎に関連するベースライン免疫パラメーター
２６名の患者が、Ｖ１時に免疫モニタリング及び微生物叢組成分析の両方を受けた。クラスターＣ由来の患者は、このクラスターに属する患者が少ないこと（ｎ＝４）に起因して、この分析に含めることはできなかった。クラスターＡに属する患者（ｎ＝１２）及びクラスターＢに属する患者（ｎ＝１０）は、末梢血ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の絶対数に差は見られなかった（表Ｓ５）ため、主なＴ細胞亜集団を、パーセントとして考慮した。フィーカリバクテリウム属によって決定されるクラスターＡに属する患者は、バクテロイデス属によって決定されるクラスターＢに属する患者と比較して、低比率のベースライン制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を有し、有意に低い比率のベースラインα４＋β７＋ＣＤ４＋（ｐ＝０．０４４７）Ｔ細胞及びα４＋β７＋ＣＤ８＋（ｐ＝０．０３４４）Ｔ細胞を有した（図５Ａ）。
【００９８】
長期ベネフィットを有する患者は、不十分な臨床ベネフィットを有する患者と比較して、より低頻度の制御性Ｔ細胞（ｐ＝０．０５６）並びにより低頻度のα４＋β７＋ＣＤ４＋（ｐ＝０．０１４）Ｔ細胞及びα４＋β７＋ＣＤ８＋（ｐ＝０．００８１）Ｔ細胞を有する傾向にあった（図５Ｂ）。細菌侵襲（移行）のマーカーとみなされる炎症の幾つかのバイオマーカー（ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１、ＴＮＦα、ｓＣＤ２５）及びｓＣＤ１４の血清濃度を測定したが、これらはいずれも、ベースライン時にいかなるクラスター又は臨床ベネフィットとも関連付けられなかった。
【００９９】
イピリムマブ誘導性大腸炎を発症する患者は、大腸炎を有さない患者と比較して、ベースライン時に、有意に高い絶対数のＣＤ４＋Ｔ細胞を有する傾向にあり（ｐ＝０．０５２９）、有意に低いレベルのＩＬ−６、ＩＬ−８及びｓＣＤ２５を有した（図５Ｃ）。競合リスク分析では、多数の従来のＣＤ４＋Ｔ細胞を有する患者は、少数の従来のＣＤ４＋Ｔ細胞を有する患者と比較して、より短い大腸炎のない累積発生を有した（ｐ＝０．００３８）。Ｔｒｅｇのパーセントの中央値は、大腸炎を有さない患者と比較して、イピリムマブの過程で大腸炎を発症した患者において、イピリムマブの導入前では低かった（２．５％対８．４％、０．０１８２）。しかしながら、Ｔｒｅｇの絶対数は、有意に異ならなかった。ベースライン時の他のＣＤ４＋Ｔ細胞亜集団はいずれも、大腸炎発症に関連しなかった。
【０１００】
誘導性Ｔ細胞共刺激分子（ＩＣＯＳ）は、フィーカリバクテリウム属によって決定されるクラスターＡに属する患者において、イピリムマブ治療後にＣＤ４＋Ｔ細胞で有意にアップレギュレートされる
免疫パラメーターを長期的にモニタリングしたため、イピリムマブ治療の過程で免疫活性化の特異的な変化を、クラスターＡ由来の患者対クラスターＢ由来の患者において評価した。イピリムマブ治療中に、誘導性Ｔ細胞共刺激分子（ＩＣＯＳ）は、クラスターＡに属する患者において、従来のＣＤ４＋Ｔ細胞及びＴｒｅｇ細胞で有意に増加した（図６Ａ及び図６Ｂ）が、クラスターＢに属する患者では増加しなかった（図６Ａ及び図６Ｂ）。ＩＣＯＳがＩＬ−２刺激後にＣＤ４＋Ｔ細胞で誘導されると仮定して、ＩＬ−２含浸（impregnation）のマーカーであるｓＣＤ２５［２９、３０］の濃度を、イピリムマブ治療の過程で調べた。クラスターＡに属する患者は、クラスターＢ由来の患者と比較して、より高いＶ２／３対Ｖ１の比によって実証されるように、クラスターＢ由来の患者よりもｓＣＤ２５において経時的により多くの増加を示した（図６Ｃ）。
【０１０１】
ＩＩＩ．結論
この研究により、特徴的なベースライン腸微生物叢組成が、イピリムマブで治療した転移性黒色腫を有する患者において、抗癌応答及び免疫媒介性大腸炎と関連付けられることが示される。フィルミクテス門による、より具体的にはフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィＬ２−６、酪酸菌Ｌ２−２１、及びゲンミゲル・フォルミシリスＡＴＣＣ  ２７７４９に関連したＯＴＵによるコロニー形成は、抗癌応答及び免疫関連大腸炎の両方と関連付けられる。不十分な抗癌応答を有する患者、及び大腸炎のないままの患者において、バクテロイデス門（主に、バクテロイデス属）がより高く示される。
【０１０２】
さらに、本発明者らのデータセットにおいて、バクテロイデス・フラジリス及びバクテロイデス・テタイオタオミクロンは、ベースラインでは豊富には表示されなかった。全体として、これらの細菌種は、大腸炎のないままの不十分な臨床ベネフィットを有する患者において、より豊富であった。
【０１０３】
本発明者らは、フィーカリバクテリウム属によって決定されるクラスターＡ及び臨床ベネフィットが、低いベースラインパーセントの循環性α４＋β７＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔｒｅｇと関連付けられることを見つけ出した。さらに、高比率のフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィ、低いベースラインパーセントの循環性ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ並びに低いベースラインレベルのＩＬ−６、ＩＬ−８及びｓＣＤ２５等の全身炎症性タンパク質は、続発する大腸炎と関連付けられた。
【０１０４】
また、フィーカリバクテリウム属によって決定されるクラスターＡに属する患者は、ＣＤ４＋Ｔ細胞でより高いＩＣＯＳ誘導及びｓＣＤ２５のより高い増加を有することが観察された。
【０１０５】
総合すると、これらの観察により、ベースライン時の腸微生物叢組成は、どの患者がイピリムマブに適正に応答するかを予測することができることが示される。
【０１０６】
ＩＶ．メタボロミクス研究の結果
コホート全体に記載するＯＴＵ集団から、ＬＥＦＳｅと組み合わせたＰＩＣＲＵＳｔアルゴリズムをｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで適用して、メタボロームプロファイルを推定した。
【０１０７】
抗ＣＴＬＡ４に対する応答（図１１を参照）又は抗ＣＴＬＡ４に対する毒性（図１０を参照）と特異的に関連付けられる代謝経路の特定のセット（ＫＥＧＧ  ＩＤとして記載される）を強調させた。
【０１０８】
ハイスループットメタボロミクスをベースライン時に糞便試料で実施した
代謝産物抽出後、試料を、下記の通りにＬＣ−ＨＲＭＳによって分析した：
極性及び親水性化合物の分離のための高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）技法：Ｓｅｑｕａｎｔ  ＺＩＣ−ｐＨＩＬＩＣ（Merck社、ドイツ、ダルムシュタット）、
３０分間の勾配分析、
Ｑ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ質量分析法（Thermo Fisher Scientific社）、
高解像度分析（７００００ＦＷＨＭ）交互の陽イオン化及び陰イオン化モード。
【０１０９】
同定した各代謝産物（特有のｍ／ｚ＆ＲＴ対）に関して、イオン強度（ピーク面積）を各試料に関して報告する。試料間の特定の代謝産物の相対強度を比較して、半定量的な分析を実施することができ、データは、１つの試料のプロファイル内の各代謝産物の相対存在量（比率）として正規化される。
【０１１０】
２５６個の検出された代謝産物の全体のうち、１４個の代謝産物の組合せが、ＣＴＬＡ４治療前に解釈するのを助長することができる一方で、患者は、治療に対して適切に、より答えやすいか、又はあまり答えやすくない。これらの１４個の代謝産物は、３つの異なるセットに属する。
【０１１１】
まず、代謝産物の組合せをＣＴＬＡ４に対する応答のバイオマーカーとしてスクリーニングすることができる。ＬＥｆＳｅ（線形判別分析エフェクトサイズ）アルゴリズムは、イピリムマブに応答する（又は、応答しない）患者を識別するバイオマーカーの高次元の発見に適用された。アルゴリズムは、http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/にて、無料で利用可能である。
【０１１２】
これらの代謝バイオマーカーは、それらが属する臨床群の糞便試料において、より高い存在量で検出される場合が多い。
【０１１３】
レスポンダーと非レスポンダーとを識別するのを助長する主な代謝産物は、
レスポンダーの糞便中により多く存在する、
１−  トレハロース−スクロース−イソマルトース（ｐ＝０．０２６６）
２−  グアニン（ｐ＝０．０７５２３）
３−  Ｄ−ラフィノース（ｐ＝０．０８５８１）
４−  ３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸（ｐ＝０．０７５５）、及び、
非レスポンダーの糞便中により多く存在する、
５−  １２−ヒドロキシドデカン酸（ｐ＝０．００６１７２）
である（図１２を参照）。
【０１１４】
患者の糞便試料中のこれらの５個の代謝産物の個々の分配を図６に示す。
【０１１５】
代謝産物の第２のセット（ｎ＝３）は、１つの臨床群由来の各試料に特異的ではないにも関わらず、ＣＴＬＡ４治療に応答する患者と、応答しない患者との間で有意に差次的に表示された。これらの代謝産物を以下の表ＶＩＩに示す。
【０１１６】
【表６】
2020511442.tif 000008
【０１１７】
イソプロピルリンゴ酸レベルもまた、イピリムマブ関連大腸炎を発症した患者においてベースラインでより高かった（大腸炎を有する患者において１．６倍以上）ことは注目すべきであった。
【０１１８】
最終的に、代謝産物のこれまでの２つのセットでは適正に分類されなかった患者の層別化を可能にする代謝産物の第３のセット（ｎ＝６）を選択した。第３のセットには下記が含まれた：
１−  アルファＤアミノアジピン酸（非レスポンダーにおいてより高レベル）
２−  キヌレン酸（レスポンダーにおいてより高レベル）
３−  メチルイミダゾール酢酸（非レスポンダーにおいてより高レベル）
４−  ３，４−ジヒドロキシヒドロケイ皮酸（非レスポンダーにおいてより高レベル）
５−  コチニン（非レスポンダーにおいてより高レベル）
６−  ２−メチルニコチンアミド（非レスポンダーにおいてより高レベル）
【０１１９】
まとめると、これらの１４個の代謝産物は、ベースライン時にレスポンダーと非レスポンダーとの間での層別化を可能にする（ＰＣＡ；構成成分１は、分散２３．６４％を明確にし、構成成分２は、分散１２．９３％を明確にする；クラス間ＰＣＡでのモンテカルロｒａｎｄｔｅｓｔ検定シミュレーションｐ値＝０．００７８９）。
【０１２０】
これらの１４個の代謝産物に基づいて、ＲＯＣ曲線を構築し、曲線下面積は、良好な予測値（ＡＵＣ＝０．８６０２９４１）を示した（図７を参照）。
【０１２１】
代謝産物の第１のセット（５つの選択したバイオマーカー）の組合せが、良好な予測値を示す（ＡＵＣ＞０．８）のに対して、セット＃２及びセット＃３の追加は、ＡＵＣ＞０．８５で層別化力を増加させ、したがって、バイオマーカー特異性を改善する（図８を参照）。
【０１２２】
患者の２群内の１４個の代謝産物の分布を、図９の箱ひげ図（ｙ軸＝ピーク面積）で表示する。
【０１２３】
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【図１Ａ】
2020511442.tif 000011
【図１Ｂ】
2020511442.tif 000012
【図１Ｃ】
2020511442.tif 000013
【図２Ａ】
2020511442.tif 000014
【図２Ｂ】
2020511442.tif 000015
【図２Ｃ】
2020511442.tif 000016
【図２Ｄ】
2020511442.tif 000017
【図３Ａ】
2020511442.tif 000018
【図３Ｂ】
2020511442.tif 000019
【図３Ｃ】
2020511442.tif 000020
【図３Ｄ】
2020511442.tif 000021
【図４Ａ】
2020511442.tif 000022
【図４Ｂ】
2020511442.tif 000023
【図４Ｃ１】
2020511442.tif 000024
【図４Ｃ２】
2020511442.tif 000025
【図５Ａ】
2020511442.tif 000026
【図５Ｂ】
2020511442.tif 000027
【図５Ｃ】
2020511442.tif 000028
【図５Ｄ】
2020511442.tif 000029
【図６】
2020511442.tif 000030
【図７】
2020511442.tif 000031
【図８】
2020511442.tif 000032
【図９】
2020511442.tif 000033
【図１０】
2020511442.tif 000034
【図１１】
2020511442.tif 000035
【図１２】
2020511442.tif 000036
【配列表】
2020511442000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年11月29日(2019.11.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクノスピラ科酪酸菌、バクテロイデス・オバツス、クロストリジウム目ルミノコッカス科細菌、ブラウティア・オベウム、フシカテニバクター・サッカリボランス、ロゼブリア・イヌリニボランス、ゲンミゲル・フォルミシリス、及びフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィからなる群から選択される細菌株と少なくとも９７％の配列同一性を有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を有する１個以上の精製細菌株を含む組成物。
【請求項２】
ラクノスピラ科酪酸菌、バクテロイデス・オバツス、クロストリジウム目ルミノコッカス科細菌、ブラウティア・オベウム、フシカテニバクター・サッカリボランス、ロゼブリア・イヌリニボランス、ゲンミゲル・フォルミシリス、及びフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィからなる群から選択される１個以上の精製細菌株を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記配列同一性が、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、又は１０個以上の細菌株を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記細菌株の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも１００％が、フィルミクテス門に属する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記細菌株の１００％未満、９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、又は１０％未満が、バクテロイデス属に属する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
バクテロイデス属の細菌株を含まない、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
バクテロイデス・フラジリス又はバクテロイデス・テタイオタオミクロン種の細菌株を含まない、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
細菌株フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィＡ２−１６５を含まない、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記細菌株は、凍結乾燥されている、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
免疫チェックポイント阻害剤を更に含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１阻害剤、ＰＤ−Ｌ１阻害剤、又はＣＴＬＡ−４阻害剤である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物と薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。
【請求項１４】
腸管への送達用に製剤化される、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
カプセルの形態で存在する、請求項１３又は１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
経口投与用に製剤化される、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
１つ以上の腸溶性ポリマーを含むｐＨ感受性組成物を含む、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
癌を治療するために用いられる、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記癌は、黒色腫である、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記対象が大腸炎を発症したかどうかを決定した後に投与される、請求項１８又は１９に記載の医薬組成物。
【国際調査報告】
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