(57)【要約】  本発明は、マイコトキシンの解毒におけるマンガンペルオキシダーゼの応用を提供する。具体的には、本発明は、５種類のマンガンペルオキシダーゼ（ＭｎＰ−１、ＭｎＰ−２、ＭｎＰ−４、ＭｎＰ−５及びＭｎＰ−６）及びその遺伝子、その応用を提供する。本発明は、リグノセルロース分解細菌に由来する５種類のマンガンペルオキシダーゼ（ＭｎＰ−１、ＭｎＰ−２、ＭｎＰ−４、ＭｎＰ−５及びおよびＭｎＰ−６）を提供し、それらのアミノ酸配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１０及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１３に示される。【選択図】図１
2020529829.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイコトキシンの解毒におけるマンガンペルオキシダーゼの応用。
【請求項２】
前記マンガンペルオキシダーゼは、
ａ）アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３のうちのいずれか１つに示されるもの、又は
ｂ）前記ａ）に示されているアミノ酸配列に、１つ又は複数のアミノ酸残基の置換、及び／又は欠失、及び／又は付加が行われており、かつマイコトキシンの解毒機能を有する誘導タンパク質、又は
ｃ）前記ａ）に示されているアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列一致性を有し、かつマイコトキシンの解毒機能を有するタンパク質、
から選択されることを特徴とする請求項１に記載の応用。
【請求項３】
前記マンガンペルオキシダーゼの成熟タンパク質は、
ａ）アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５のうちのいずれか１つに示されるもの、又は
ｂ）前記ａ）に示されているアミノ酸配列に、１つ又は複数のアミノ酸残基の置換、及び／又は欠失、及び／又は付加が行われており、かつマイコトキシンの解毒機能を有する誘導タンパク質、又は
ｃ）前記ａ）に示されているアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列一致性を有し、かつマイコトキシンの解毒機能を有するタンパク質、
から選択されることを特徴とする請求項１又は２に記載の応用。
【請求項４】
マイコトキシンを解毒するマンガンペルオキシダーゼであって、
ａ）アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３のうちのいずれか１つに示されるもの、又は
ｂ）前記ａ）に示されているアミノ酸配列に、１つ又は複数のアミノ酸残基の置換、及び／又は欠失、及び／又は付加が行われており、かつマイコトキシンの解毒機能を有する誘導タンパク質、又は
ｃ）前記ａ）に示されているアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列一致性を有し、かつマイコトキシンの解毒機能を有するタンパク質、
から選択されることを特徴とするマンガンペルオキシダーゼ。
【請求項５】
前記マンガンペルオキシダーゼの成熟タンパク質は、
ａ）アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５のうちのいずれか１つに示されるもの、又は
ｂ）前記ａ）に示されているアミノ酸配列に、１つ又は複数のアミノ酸残基の置換、及び／又は欠失、及び／又は付加が行われており、かつマイコトキシンの解毒機能を有する誘導タンパク質、又は
ｃ）前記ａ）に示されているアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列一致性を有し、かつマイコトキシンの解毒機能を有するタンパク質、
から選択されることを特徴とする請求項４に記載のマンガンペルオキシダーゼ。
【請求項６】
請求項４又は５に記載のマンガンペルオキシダーゼをコードした遺伝子。
【請求項７】
ａ）ヌクレオチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のうちのいずれか１つに示されるもの、又は
ｂ）ヌクレオチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０のうちのいずれか１つに示されるもの、又は
前記ａ）又はｂ）に示されているヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％の一致性を有し、かつコーディングが同じ又は同様の機能を持つヌクレオチド配列、
から選択されることを特徴とする請求項６に記載の遺伝子。
【請求項８】
請求項６又は７に記載の遺伝子を含む組換えベクター。
【請求項９】
請求項６又は７に記載の遺伝子、又は
請求項８に記載の組換えベクター、
を含むことを特徴とする組換え菌株。
【請求項１０】
１）請求項８に記載の組換えベクターを用いて宿主細胞を形質転換させ、組換え菌株を取得するステップと、
２）組み換え株を培養して、マンガンペルオキシダーゼの発現を誘発するステップと、
３）前記マンガンペルオキシダーゼを純化するステップと、
を含むことを特徴とする請求項４又は５に記載のマンガンペルオキシダーゼの調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子工学の技術分野に関する。具体的には、５種類のマンガンペルオキシダーゼ（ＭｎＰ−１、ＭｎＰ−２、ＭｎＰ−４、ＭｎＰ−５及びＭｎＰ−６）及びその遺伝子、当該遺伝子を含む組換えベクター、その応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイコトキシンは、さまざまな構造と特性を持つ真菌の二次代謝産物であり、家畜、家禽及び人間の健康には非常に有害である。マイコトキシンは、カビで汚染された食品及び飼料において広く拡散されており、食品及び飼料の安全性について世界中で広く懸念されている。一般的なマイコトキシンは、アフラトキシン、ゼアラレノン、ボミトキシン（デオキシニバレノール）、シトリニン、オクラトキシン、フモニシン、パツリン及びトリコテセン系マイコトキシンを含み、それらが環状構造又は非環状構造を持つ２種類の毒素に大別できる。ほとんどのマイコトキシン（例えば、アフラトキシンやゼアラレノン等）は、環状構造を持つサブグループに属し、通常、真菌ポリケチドによって合成される。例えば、アフラトキシン（ａｆｌａｔｏｘｉｎ）Ｂ１は、アスペルギルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）によって生成される強力な肝臓の発癌物質であり、コアとしての１つのクマリン環と、両側にある５員の炭素環と、並置された２つのジヒドロフラン環とを有する。また、ゼアラレノンは、メタジヒドロキシ安息香酸フェノールラクトン（ｍ−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ  Ｐｈｅｎｏｌ  Ｌａｃｔｏｎｅ）である。一方、フモニシンは、炭素原子数２２のパラアミノフェノール線形スケルトンを有し、側鎖に２つのトリカルバリル酸を持つ。
【０００３】
物理的吸着（又は不活性化）と生体内変化は、食品および飼料におけるマイコトキシンを解毒する２つの主な方法である。中でも、マイコトキシンを解毒するために、微生物、特に微生物によって生成された酵素の使用は、ますます普及している手段である。ラッカーゼ、パントラクトン加水分解酵素、ペルオキシダーゼ及びいくつかの分類不能の酵素は、酸化または加水分解のメカニズムによりアフラトキシンとゼアラレノンを分解することができるということが知られている。より多くの証拠により、他の性質未知の酵素も、環状構造を持つマイコトキシンであるアフラトキシン及びゼアラレノンの両方の分解に貢献する可能性があるということが知られている。リグノセルロース分解細菌に由来するマンガンペルオキシダーゼ（ＭｎＰ）は、リグニンの酸化分解に貢献する酵素群である。Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｓｏｒｄｉｄａ及びＰｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｏｓｔｒｅａｔｕｓに由来する少数のマンガンペルオキシダーゼがアフラトキシンを分解できることが判明したが、他のマンガンペルオキシダーゼがマイコトキシンを分解できるか否かはまだ不明である。
【０００４】
ウスバタケは、白色腐朽菌の１種であり、リグノセルロースを効果的に分解できる。生化学、ゲノミクス及びトランスクリプトーム解析により、マンガンペルオキシダーゼがリグニンの分解に重要な役割を果たすことが判明した。マンガンペルオキシダーゼは、リグニン分解の分野だけでなく、合成染料や多環芳香族炭化水素化合物に汚染された環境の修復にも適用する。本発明者らは、ウスバタケに由来する５つのマンガンペルオキシダーゼの遺伝子をクローン化して発現し、アフラトキシン、ゼアラレノン、ボミトキシンに対してこれらの分解性能を分析した。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の目的は、マイコトキシンを効率的に解毒する５種類のマンガンペルオキシダーゼを提供することである。
【０００６】
また、本発明の別の目的は、前記マンガンペルオキシダーゼをコードする遺伝子を提供することである。
【０００７】
また、本発明の更に別の目的は、前記遺伝子を含む組換えベクターを提供することである。
【０００８】
また、本発明の更に別の目的は、前記遺伝子を含む組換え菌株を提供することである。
【０００９】
また、本発明の更に別の目的は、前記マンガンペルオキシダーゼを調製する遺伝子工学方法を提供することである。
【００１０】
また、本発明の更に別の目的は、前記マンガンペルオキシダーゼのマイコトキシン解毒への応用を提供することである。
【００１１】
本発明は、ウスバタケ（Ｉｒｐｅｘ  ｌａｃｔｅｕｓ）から、５種類の新しいマンガンペルオキシダーゼＭｎＰ−１、ＭｎＰ−２、ＭｎＰ−４、ＭｎＰ−５及びＭｎＰ−６を単離した。それらのアミノ酸配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１０及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１３に示される。
【００１２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１（ＭｎＰ−１）：
【００１３】
MAFKTILAFVALATAALAAPSSRVTCSPGRVVSNGACCKWFDVLDDIQENLFDGGVCGEEVHESLRLTFHDAIGFSLSAEREGKFGGGGADGSIMAFAEIETNFHANNGVDEIVEAQRPFAIKHKVSFGDFIQFAGAVGVSNCLGGPRLEFMAGRSNISRAAPDLTVPEPSDSVDKILARMGDAGFSSSEVVDLLISHTVAAQDHVDPTIPGTPFDSTPSEFDPQFFVETLLKGTLFPGNGSNVGELQSPLRGEFRLQSDALLARDPRTACEWQSFVNNQRLMVTKFEAVMSKLAVLGHNPRDLVDCSEVIPVPPRAKTNVAVLPAGKTRADVQAACAATPFPTLQTAPGPATSIVPV
【００１４】
ここで、当該酵素遺伝子は、３５８個のアミノ酸をコードしており、Ｎ末端の１８個のアミノ酸がシグナルペプチド配列「ＭＡＦＫＴＩＬＡＦＶＡＬＡＴＡＡＬＡ」（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２）である。
【００１５】
従って、成熟化されたマンガンペルオキシダーゼＭＮＰ−１は、理論分子量が３６．１ｋＤａであり、アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３に示される。
【００１６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３：
【００１７】
APSSRVTCSPGRVVSNGACCKWFDVLDDIQENLFDGGVCGEEVHESLRLTFHDAIGFSLSAEREGKFGGGGADGSIMAFAEIETNFHANNGVDEIVEAQRPFAIKHKVSFGDFIQFAGAVGVSNCLGGPRLEFMAGRSNISRAAPDLTVPEPSDSVDKILARMGDAGFSSSEVVDLLISHTVAAQDHVDPTIPGTPFDSTPSEFDPQFFVETLLKGTLFPGNGSNVGELQSPLRGEFRLQSDALLARDPRTACEWQSFVNNQRLMVTKFEAVMSKLAVLGHNPRDLVDCSEVIPVPPRAKTNVAVLPAGKTRADVQAACAATPFPTLQTAPGPATSIVPV
【００１８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４（ＭｎＰ−２）：
【００１９】
MAFKHLVVALSIVLSLGVAQAAITKRVACPDGKNTATNAACCSLFAIRDDIQANLFDGGECGEEVHESFRLTFHDAIGTGSFGGGGADGSIIVFDDIETNFHANNGVDEIIDEQKPFIARHNITPGDFIQFAGAVGVSNCPGAPRLDFFLGRPNPVAAAPDKTVPEPFDTVDSILARFKDAGGFTPAEIVALLGSHTIAAADHVDPTIPGTPFDSTPEVFDTQVFVEVQLRGTLFPGTGGNQGEVQSPLRGEIRLQSDHDLARDSRTACEWQSFVNNQAKLQSAFKAAFKKLSVLGHNINNLIDCSEVIPEPPNVKVKPATFPAGITHADVEQACATTPFPTLATDPGPATSVAPVPPS
【００２０】
ここで、当該酵素遺伝子は、３５９個のアミノ酸をコードしており、Ｎ末端の２１個のアミノ酸がシグナルペプチド配列「ＭＡＦＫＨＬＶＶＡＬＳＩＶＬＳＬＧＶＡＱＡ」（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５）である。
【００２１】
従って、成熟化されたマンガンペルオキシダーゼＭＮＰ−２は、理論分子量が３５．６ｋＤａであり、アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６に示される。
【００２２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６：
【００２３】
AITKRVACPDGKNTATNAACCSLFAIRDDIQANLFDGGECGEEVHESFRLTFHDAIGTGSFGGGGADGSIIVFDDIETNFHANNGVDEIIDEQKPFIARHNITPGDFIQFAGAVGVSNCPGAPRLDFFLGRPNPVAAAPDKTVPEPFDTVDSILARFKDAGGFTPAEIVALLGSHTIAAADHVDPTIPGTPFDSTPEVFDTQVFVEVQLRGTLFPGTGGNQGEVQSPLRGEIRLQSDHDLARDSRTACEWQSFVNNQAKLQSAFKAAFKKLSVLGHNINNLIDCSEVIPEPPNVKVKPATFPAGITHADVEQACATTPFPTLATDPGPATSVAPVPPS
【００２４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７（ＭｎＰ−４）：
【００２５】
MTFKALLALLTVTSAVLAAPQDVTAANKVSCGGGRVAGHAQCCKWYDVLDDIQKNLFDGGECGEEVHESLRLTFHDAIGFSLSAQREGKFGGGGADGSIMAFAEIETKFHANNGVDEIIEAQRPFALNHSVSFGDFIQFAGAVGVSNCGGGPRLQFLAGRSNSSKAAPDGTVPEPFDSTDKILAHMGDAGFSPSEVVDLLASHSVAAQDHVDASIPGTPFDSTPSTFDAQFFVETLLKGTLFPGNGSNQGEVQSPLHGEFRLQSDFELARDSRTACEWQSFITDHNSMVRKFEAAMAKLAVLGHDPRTLIDCSDVIPQPKGAKSNVAVLPAGKHRADIQASCHQTPFPTLKTAPGPETSIPPVPPS
【００２６】
ここで、当該酵素遺伝子は、３６５個のアミノ酸をコードしており、Ｎ末端の１８個のアミノ酸がシグナルペプチド配列「ＭＴＦＫＡＬＬＡＬＬＴＶＴＳＡＶＬＡ」（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．８）である。
【００２７】
従って、成熟化されたマンガンペルオキシダーゼＭＮＰ−４は、理論分子量が３６．８ｋＤａであり、アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．９に示される。
【００２８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．９：
【００２９】
APQDVTAANKVSCGGGRVAGHAQCCKWYDVLDDIQKNLFDGGECGEEVHESLRLTFHDAIGFSLSAQREGKFGGGGADGSIMAFAEIETKFHANNGVDEIIEAQRPFALNHSVSFGDFIQFAGAVGVSNCGGGPRLQFLAGRSNSSKAAPDGTVPEPFDSTDKILAHMGDAGFSPSEVVDLLASHSVAAQDHVDASIPGTPFDSTPSTFDAQFFVETLLKGTLFPGNGSNQGEVQSPLHGEFRLQSDFELARDSRTACEWQSFITDHNSMVRKFEAAMAKLAVLGHDPRTLIDCSDVIPQPKGAKSNVAVLPAGKHRADIQASCHQTPFPTLKTAPGPETSIPPVPPS
【００３０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１０（ＭｎＰ−５）：
【００３１】
MAFKQLVATLSLALLAHGAVVRRVTCPDGVNTATNAACCSLFAVRDDIQQNLFDNGQCGEDVHESFRLSFHDAIGISPKIAATGQFGGGGADGSIILFEEIETNFHANIGVDEIVDEQKPFIARHNITPGDFIQFAAAVGVSNCPGAPRLDFFLGRPAATQPAPDKTVPEPFDTVDTILERFADAGNFTPAEVVALLVSHTIAAADEVDPTIPGTPFDSTPEVFDSQFFVETQLRGTGFPGTAGNQGEVESPLAGELRLQSDSELARDSRTACEWQSFVGNQQKIQTAFKAAFQKMAVLGVDTSKMVDCSELIPVPPELKITAAHFPAGKTNADVEQACASTPFPTLSTDPGPATSVAPVPPS
【００３２】
ここで、当該酵素遺伝子は、３６３個のアミノ酸をコードしており、Ｎ末端の１８個のアミノ酸がシグナルペプチド配列「ＭＡＦＫＱＬＶＡＴＬＳＬＡＬＬＡＨＧ」（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１１）である。
【００３３】
従って、成熟化されたマンガンペルオキシダーゼＭＮＰ−５は、理論分子量が３６．５ｋＤａであり、アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１２に示される。
【００３４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１２：
【００３５】
AVVRRVTCPDGVNTATNAACCSLFAVRDDIQQNLFDNGQCGEDVHESFRLSFHDAIGISPKIAATGQFGGGGADGSIILFEEIETNFHANIGVDEIVDEQKPFIARHNITPGDFIQFAAAVGVSNCPGAPRLDFFLGRPAATQPAPDKTVPEPFDTVDTILERFADAGNFTPAEVVALLVSHTIAAADEVDPTIPGTPFDSTPEVFDSQFFVETQLRGTGFPGTAGNQGEVESPLAGELRLQSDSELARDSRTACEWQSFVGNQQKIQTAFKAAFQKMAVLGVDTSKMVDCSELIPVPPELKITAAHFPAGKTNADVEQACASTPFPTLSTDPGPATSVAPVPPS
【００３６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１３（ＭｎＰ−６）：
【００３７】
MAFKQLVAALTVALSLGVAQGAITRRVACPDGVNTATNAACCSLFAIRDDIQQNLFDGGECGEEVHESFRLTFHDAIGIGSNGGGGADGSIAVFEDIETAFHANNGVDEIIDEQKPFLARHNITPGDFIQFAGAVGVSNCPGAPRLDFFLGRPNPVAPAPDKTVPEPFDTVDSILARFADAGGFSPAEVVALLGSHTIAAADHVDPTIPGTPFDSTPEVFDTQVFLEVQLRGTLFPGTGGNQGEVESPLRGEIRLQSDHDLARDSRTACEWQSFVNNQVKLQTAFKAAFKKLAVLGHDVNNMVDCSEVIPEPPNVKIKAATFPAGQTNADVEQACASTPFPTLATDPGPATSVAPVPPS
【００３８】
ここで、当該酵素遺伝子は、３５９個のアミノ酸をコードしており、Ｎ末端の２１個のアミノ酸がシグナルペプチド配列「ＭＡＦＫＱＬＶＡＡＬＴＶＡＬＳＬＧＶＡＱＧ」（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１４）である。
【００３９】
従って、成熟化されたマンガンペルオキシダーゼＭＮＰ−６は、理論分子量が３５．６ｋＤａであり、アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１５に示される。
【００４０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１５：
【００４１】
AITRRVACPDGVNTATNAACCSLFAIRDDIQQNLFDGGECGEEVHESFRLTFHDAIGIGSNGGGGADGSIAVFEDIETAFHANNGVDEIIDEQKPFLARHNITPGDFIQFAGAVGVSNCPGAPRLDFFLGRPNPVAPAPDKTVPEPFDTVDSILARFADAGGFSPAEVVALLGSHTIAAADHVDPTIPGTPFDSTPEVFDTQVFLEVQLRGTLFPGTGGNQGEVESPLRGEIRLQSDHDLARDSRTACEWQSFVNNQVKLQTAFKAAFKKLAVLGHDVNNMVDCSEVIPEPPNVKIKAATFPAGQTNADVEQACASTPFPTLATDPGPATSVAPVPPS
【００４２】
本発明は、前記マンガンペルオキシダーゼをコードしたＭｎＰ−１（イタリック）、ＭｎＰ−２（イタリック）、ＭｎＰ−４（イタリック）、ＭｎＰ−５（イタリック）及びＭｎＰ−６（イタリック）を提供する。具体的には、ＭｎＰ−１（イタリック）遺伝子のゲノム配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１６に示される。
【００４３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１６（ＭｎＰ−１（イタリック））：
【００４４】
atggctttcaagactatccttgccttcgttgctctcgccacagctgctcttgcggcaccctcttctagagtgacatgcagtccgggacgtgttgttagcaacggagctgtaagcaattctcgacaccgtcctaccaattataacgtctaatggccgtcgtactagtgctgcaagtggttcgacgttctcgacgacatccaggagaacctgtatgtccttcccgttgctcagtgaaccttgtcgccgctgattccatcacaggtttgacggcggtgtatgtggcgaagaagttcacgaggtaagtaacgattacagcaggtagttgatgcatactaacagttgctctttgcagtcgcttcgtgtaagtgactctcagaatgaacgtggtgaacgcatattgacatgtgccttccattgccaagctcactttccacgacgcgtaagtgtctgttgtcactattcttgcttcttgtgctgatcctgtctgtatagtattggctttagtctctctgctgagcgcgagggcaagtttgggttcgtacttcaacttcacaatgtccctttttgatgattcacatccgcctatagtggtggaggagctgatggctctatcatggcattcgccgagattgagaccaacttccgtgcgtaaacctgggcctttgttgagtgcttatattaaactctgaagcagatgcaaacaatggtgtcgacgaaattgtcgaggcggtatgtctcttcatgtgtccatttttcgagtcacctcactgatccatcatgtatagcaacgcccattcgctatcaagcacaaagtctccttcggcgacttcatccaatttgcaggggcagtcggtgtgtcgaattgccttggtggcccccgtctcgagttcatggctggtcgttccaacatctctcgcgctgctcccgacctcactgttcctgagccctctgactcagttgacaagatcttggcccgcatgggcgatgctggcttttcctcttcggaagttgtggaccttctcatttcccacaccgttgcagctcaagaccacgttgatcccaccatccccgtgagccactctggtaatcaggcatattattgagcaatactcatcacgacatctacagggaacaccttttgactccaccccctccgaattcgatcctcagttcttcgtagaggtaagctttgaccacgtcatcgtcaagcgaagcgacttaagggtctttttacagactctcttgaagggcactctgttccctggtaacggttccaatgtcggcgaacttcagtccccccttagaggagagttccgtcttcaatccgacgctctccttgctcgtgaccccaggaccgcctgtgaatggcaatctttcgttagtgagtatcctcttcactttcatgtcgagactctataattgatgcacccgcctgtcagacaaccaacgtctcatggtcaccaagttcgaggccgtcatgtccaagcttgctgtcctcggccacaacccgcgtgatctcgtcgactgctcggaagtcatccccgtgcctccacgtgccaagaccaatgtcgcagttctccccgctggcaagactcgcgctgatgtccaggctgcttgcgctgctacacccttcccaaccctccagaccgcccctggccccgccacctccatcgttcctgtgtaa
【００４５】
本発明において、マンガンペルオキシダーゼ遺伝子ＭｎＰ−１（イタリック）は、ＰＣＲ法により単離、クローニングされる。全ＤＮＡ配列の分析結果から、マンガンペルオキシダーゼＭｎＰ−１のゲノムＭｎＰ−１（イタリック）の全長が１６８４ｂｐで、コーディング遺伝子配列の全長が１０７７ｂｐである。ここで、シグナルペプチドの塩基配列は、以下の通りである。
【００４６】
ATGGCTTTCAAGACTATCCTTGCCTTCGTTGCTCTCGCCACAGCTGCTCTTGCG (SEQ ID NO.17)。
【００４７】
成熟化されたマンガンペルオキシダーゼＭｎＰ−１は、ｃＤＮＡ（シグナルペプチド除去）配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１８に示される。
【００４８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１８：
【００４９】
gcaccctcttctagagtgacatgcagtccgggacgtgttgttagcaacggagcttgctgcaagtggttcgacgttctcgacgacatccaggagaacctgtttgacggcggtgtatgtggcgaagaagttcacgagtcgcttcgtctcactttccacgacgctattggctttagtctctctgctgagcgcgagggcaagtttggtggtggaggagctgatggctctatcatggcattcgccgagattgagaccaacttccatgcaaacaatggtgtcgacgaaattgtcgaggcgcaacgcccattcgctatcaagcacaaagtctccttcggcgacttcatccaatttgcaggggcagtcggtgtgtcgaattgccttggtggcccccgtctcgagttcatggctggtcgttccaacatctctcgcgctgctcccgacctcactgttcctgagccctctgactcagttgacaagatcttggcccgcatgggcgatgctggcttttcctcttcggaagttgtggaccttctcatttcccacaccgttgcagctcaagaccacgttgatcccaccatccccggaacaccttttgactccaccccctccgaattcgatcctcagttcttcgtagagactctcttgaagggcactctgttccctggtaacggttccaatgtcggcgaacttcagtccccccttagaggagagttccgtcttcaatccgacgctctccttgctcgtgaccccaggaccgcctgtgaatggcaatctttcgttaacaaccaacgtctcatggtcaccaagttcgaggccgtcatgtccaagcttgctgtcctcggccacaacccgcgtgatctcgtcgactgctcggaagtcatccccgtgcctccacgtgccaagaccaatgtcgcagttctccccgctggcaagactcgcgctgatgtccaggctgcttgcgctgctacacccttcccaaccctccagaccgcccctggccccgccacctccatcgttcctgtgtaa
【００５０】
成熟タンパク質の理論分子量が３６．１ｋＤａであり、ＭｎＰ−１は１種の新しいマンガンペルオキシダーゼである。
【００５１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１９（ＭｎＰ−２（イタリック））：
【００５２】
atggccttcaaacacctcgtcgttgcactctctatcgttctctcgcttggtgtcgcacaaggtcagtagctcatggaataatgcgcctgctaacttcgctgatgggactatgttgcagctgcaatcaccaagcgtgttgcttgtcctgacggcaagaatacagcgacaaacgcggcttgctgttctttgttcgccattcgtgatgatatccaggcaaacctcttcgacggtggtgaatgcggtgaagaagtccacgagtccttccgtctgtcagtacttggactcttctaacgtatcacttgtgaaattcatgcatgttttcagcacattccacgacgctatcggtactggctctttcgggtgagagatcaaagcttttatattgtgtactctacgcctgacatttgattatagtggcggaggtgccgatggctccatcattgtcttcgatgatatcgagactaacttccacgctaacaacggcgtcgacgaaattatcgacgagcagaagccgttcatcgccaggcacaatattacccccggcgacttgtgagctgatcttgctattctatcgcattctgaccactaatatatacactgatttcagcattcaatttgctggcgccgtcggcgtctccaactgtcctggggctcctcgtcttgacttcttcctcggtaagactcatttcaataccgacaatgggcccatactgatgatacgatatccaggccgaccaaaccctgtggctgctgcaccggacaagactgtacctgagccattcggtcagtacaccaatcttcatcgtatctactccaaagctgatgtaagggcccctagacaccgtggatagcatccttgctcgtttcaaggatgctggcggattcactccagctgaggtagttgctctcctcggctctcacacgatcgctgcagccgatcatgtcgaccctaccatccctggtactcctttcgattctactcctgaggtcttcgatacccaggttttcgtcgaggttcaactccgtggcacgctcttcccagggtgagtttcctgttttataacacatacctgagtctgactgcgacttgcccattagaactggtggcaaccagggcgaagttcagtctcctctccgcggtgagatccgtctccaatctgaccatgatgtacgtgtacgatggatatttcgttctgggtcttactgacaagccttaagctcgctcgtgactctcgaaccgcctgcgagtggcagtcgtttgtgaacaaccaggctaagctccaatctgctttcaaagcagccttcaagaagctctcagtccttggccacaacattaacaacttgattgactgctctgaggtcatccctgagccaccaaatgtcaaggttaagcccgctaccttcccagctggcattacccacgccgatgtcgagcaagctgtacgtgctctttctcctttgcttcctctatactcctaataatctgtttcactttgtagtgcgccactactccattcccgactctcgctaccgaccccggccccgcaacttctgtcgcccctgtgtaagttacatctttgacttcatgttacattatatgctcatatcgctttcagccctccctcgtaa
【００５３】
本発明において、マンガンペルオキシダーゼ遺伝子ＭｎＰ−２（イタリック）は、ＰＣＲ法により単離、クローニングされる。全ＤＮＡ配列の分析結果から、マンガンペルオキシダーゼＭｎＰ−２の遺伝子ＭｎＰ−２（イタリック）の全長が１６２９ｂｐで、コーディング遺伝子配列の全長が１０８０ｂｐである。ここで、シグナルペプチドの塩基配列は、以下の通りである。
【００５４】
ATGGCCTTCAAACACCTCGTCGTTGCACTCTCTATCGTTCTCTCGCTTGGTGTCGCACAAGCT(SEQ ID NO.20)。
【００５５】
成熟化されたマンガンペルオキシダーゼＭｎＰ−２は、ｃＤＮＡ（シグナルペプチド除去）配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２１に示される。
【００５６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２１：
【００５７】
Gcaatcaccaagcgtgttgcttgtcctgacggcaagaatacagcgacaaacgcggcttgctgttctttgttcgccattcgtgatgatatccaggcaaacctcttcgacggtggtgaatgcggtgaagaagtccacgagtccttccgtctcacattccacgacgctatcggtactggctctttcggtggcggaggtgccgatggctccatcattgtcttcgatgatatcgagactaacttccacgctaacaacggcgtcgacgaaattatcgacgagcagaagccgttcatcgccaggcacaatattacccccggcgacttcattcaatttgctggcgccgtcggcgtctccaactgtcctggggctcctcgtcttgacttcttcctcggccgaccaaaccctgtggctgctgcaccggacaagactgtacctgagccattcgacaccgtggatagcatccttgctcgtttcaaggatgctggcggattcactccagctgagatagttgctctcctcggctctcacacgatcgctgcagccgatcatgtcgaccctaccatccctggtactcctttcgattctactcctgaggtcttcgatacccaggttttcgtcgaggttcaactccgtggcacgctcttcccaggaactggtggcaaccagggcgaagttcagtctcctctccgcggtgagatccgtctccaatctgaccatgatctcgctcgtgactctcgaaccgcctgcgagtggcagtcgtttgtgaacaaccaggctaagctccaatctgctttcaaagcagccttcaagaagctctcagtccttggccacaacattaacaacttgattgactgctctgaggtcatccctgagccaccaaatgtcaaggttaagcccgctaccttcccagctggcattacccacgccgatgtcgagcaagcttgcgccactactccattcccgactctcgctaccgaccccggccccgcaacttctgtcgcccctgtccctccctcgtaa
【００５８】
成熟タンパク質の理論分子量が３５．６ｋＤａであり、ＭｎＰ−２は１種の新しいマンガンペルオキシダーゼである。
【００５９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２２（ＭｎＰ−４（イタリック））：
【００６０】
ATGACTTTCAAGGCTCTTCTTGCTCTTTTGACGGTTACTTCTGCGGTGCTCGCCGCTCCCCAAGACGTTACTGCCGCTAACAAGGTATCATGCGGTGGAGGCCGTGTCGCAGGTCATGCTCAATGCTGCAAGTGGTATGACGTTCTCGACGACATACAGAAGAATTTGTTTGACGGTGGAGAATGCGGTGAAGAAGTTCACGAGTCTTTGCGACTGACTTTCCACGACGCGATCGGCTTCAGTCTTTCGGCCCAGCGTGAAGGGAAATTCGGCGGTGGAGGAGCTGACGGCTCTATCATGGCCTTCGCAGAGATCGAGACTAAATTTCACGCTAACAACGGTGTCGACGAGATCATTGAAGCTCAACGCCCCTTCGCCCTCAACCACAGCGTGTCCTTCGGAGATTTCATCCAGTTCGCTGGTGCAGTCGGTGTTTCCAACTGTGGCGGCGGCCCTCGACTGCAGTTCTTGGCCGGTCGATCTAACAGCTCCAAGGCCGCACCTGATGGCACTGTCCCTGAGCCATTTGACTCTACTGATAAGATCCTCGCTCACATGGGCGACGCTGGTTTCTCTCCGAGTGAAGTGGTCGATCTCTTGGCATCTCATTCCGTGGCTGCACAGGACCATGTCGACGCTTCTATCCCGGGAACCCCATTCGATTCTACTCCCAGCACATTCGATGCCCAATTCTTTGTGGAGACTTTGCTGAAGGGCACGCTTTTCCCTGGAAATGGCTCTAACCAAGGCGAAGTCCAGTCCCCTCTTCACGGAGAATTCCGCCTTCAGTCCGACTTTGAGCTCGCTCGTGACTCCCGCACTGCTTGCGAGTGGCAGTCCTTCATCACCGATCACAACTCGATGGTTCGCAAGTTCGAAGCCGCTATGGCCAAGCTAGCTGTTCTCGGTCACGACCCCCGCACTTTGATTGACTGTTCCGATGTCATTCCTCAACCCAAGGGTGCCAAATCTAACGTGGCTGTACTTCCGGCTGGAAAGCACCGTGCGGATATTCAAGCATCTTGCCATCAAACGCCGTTTCCCACCCTCAAGACCGCTCCCGGACCCGAGACCTCGATTCCTCCAGTACCTCCGTCGTAA
【００６１】
本発明において、マンガンペルオキシダーゼ遺伝子ＭｎＰ−４（イタリック）は、ＰＣＲ法により単離、クローニングされる。全ＤＮＡ配列の分析結果から、マンガンペルオキシダーゼＭｎＰ−４の遺伝子ＭｎＰ−４（イタリック）の全長が１７６０ｂｐで、コーディング遺伝子配列の全長が１１０１ｂｐである。ここで、シグナルペプチドの塩基配列は、以下の通りである。
【００６２】
ATGACTTTCAAGGCTCTTCTTGCTCTTTTGACGGTTACTTCTGCGGTGCTCGCC (SEQ ID NO.23)。
【００６３】
成熟化されたマンガンペルオキシダーゼＭｎＰ−４は、ｃＤＮＡ（シグナルペプチド除去）配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２４に示される。
【００６４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２４：
【００６５】
GCTCCCCAAGACGTTACTGCCGCTAACAAGGTATCATGCGGTGGAGGCCGTGTCGCAGGTCATGCTCAATGCTGCAAGTGGTATGACGTTCTCGACGACATACAGAAGAATTTGTTTGACGGTGGAGAATGCGGTGAAGAAGTTCACGAGTCTTTGCGACTGACTTTCCACGACGCGATCGGCTTCAGTCTTTCGGCCCAGCGTGAAGGGAAATTCGGCGGTGGAGGAGCTGACGGCTCTATCATGGCCTTCGCAGAGATCGAGACTAAATTTCACGCTAACAACGGTGTCGACGAGATCATTGAAGCTCAACGCCCCTTCGCCCTCAACCACAGCGTGTCCTTCGGAGATTTCATCCAGTTCGCTGGTGCAGTCGGTGTTTCCAACTGTGGCGGCGGCCCTCGACTGCAGTTCTTGGCCGGTCGATCTAACAGCTCCAAGGCCGCACCTGATGGCACTGTCCCTGAGCCATTTGACTCTACTGATAAGATCCTCGCTCACATGGGCGACGCTGGTTTCTCTCCGAGTGAAGTGGTCGATCTCTTGGCATCTCATTCCGTGGCTGCACAGGACCATGTCGACGCTTCTATCCCGGGAACCCCATTCGATTCTACTCCCAGCACATTCGATGCCCAATTCTTTGTGGAGACTTTGCTGAAGGGCACGCTTTTCCCTGGAAATGGCTCTAACCAAGGCGAAGTCCAGTCCCCTCTTCACGGAGAATTCCGCCTTCAGTCCGACTTTGAGCTCGCTCGTGACTCCCGCACTGCTTGCGAGTGGCAGTCCTTCATCACCGATCACAACTCGATGGTTCGCAAGTTCGAAGCCGCTATGGCCAAGCTAGCTGTTCTCGGTCACGACCCCCGCACTTTGATTGACTGTTCCGATGTCATTCCTCAACCCAAGGGTGCCAAATCTAACGTGGCTGTACTTCCGGCTGGAAAGCACCGTGCGGATATTCAAGCATCTTGCCATCAAACGCCGTTTCCCACCCTCAAGACCGCTCCCGGACCCGAGACCTCGATTCCTCCAGTACCTCCGTCGTAA
【００６６】
成熟タンパク質の理論分子量が３６．８ｋＤａであり、ＭｎＰ−４は１種の新しいマンガンペルオキシダーゼである。
【００６７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２５（ＭｎＰ−５（イタリック））：
【００６８】
ATGGCCTTCAAACAACTCGTTGCTACGCTCTCTCTCGCTCTCCTCGCCCATGGTGCCGTCGTCAGGCGTGTCACTTGTCCCGACGGAGTGAACACAGCCACCAACGCAGCTTGCTGCTCTTTGTTCGCCGTTCGTGACGATATCCAGCAGAACCTCTTCGACAACGGCCAATGCGGTGAAGACGTCCACGAATCTTTCCGTCTCTCCTTCCACGATGCCATCGGAATCTCTCCCAAGATTGCGGCAACCGGCCAGTTTGGAGGTGGAGGCGCTGACGGCTCTATCATCCTCTTTGAGGAGATTGAGACCAACTTCCACGCTAACATTGGTGTTGACGAGATTGTCGACGAGCAGAAGCCGTTCATCGCCAGGCACAACATCACCCCCGGAGACTTCATCCAATTTGCCGCCGCTGTTGGTGTCTCGAACTGCCCTGGTGCTCCTCGTCTCGACTTCTTCCTTGGCCGTCCCGCTGCTACTCAACCCGCTCCAGACAAGACTGTCCCCGAGCCCTTCGACACCGTCGACACCATCCTGGAACGTTTTGCAGATGCGGGAAATTTCACCCCAGCCGAGGTCGTCGCTCTCCTCGTCTCCCATACCATCGCTGCTGCCGATGAGGTGGATCCCACCATCCCGGGAACTCCCTTCGACTCTACCCCGGAGGTCTTCGACTCGCAGTTCTTCGTCGAGACTCAGCTTCGCGGAACAGGATTCCCAGGAACCGCGGGTAACCAAGGTGAAGTCGAATCTCCTCTTGCTGGAGAACTGCGTCTCCAGTCCGACTCAGAGCTCGCTCGTGACTCCAGAACCGCCTGCGAGTGGCAATCCTTCGTCGGCAACCAGCAGAAGATCCAAACCGCGTTCAAGGCCGCTTTCCAGAAGATGGCCGTTCTCGGGGTAGACACCAGCAAGATGGTCGACTGCTCCGAGCTCATTCCTGTTCCTCCTGAGCTGAAGATCACCGCCGCGCATTTCCCTGCTGGCAAGACCAACGCTGACGTCGAGCAAGCTTGTGCTTCGACCCCCTTCCCCACTCTGTCCACTGACCCCGGCCCGGCTACTTCTGTCGCTCCTGTCCCTCCGTCCTAA
【００６９】
本発明において、マンガンペルオキシダーゼ遺伝子ＭｎＰ−５（イタリック）は、ＰＣＲ法により単離、クローニングされる。全ＤＮＡ配列の分析結果から、マンガンペルオキシダーゼＭｎＰ−５の遺伝子ＭｎＰ−５（イタリック）の全長が１８６２ｂｐで、コーディング遺伝子配列の全長が１０９２ｂｐである。ここで、シグナルペプチドの塩基配列は、以下の通りである。
【００７０】
ATGGCCTTCAAACAACTCGTTGCTACGCTCTCTCTCGCTCTCCTCGCCCATGGT (SEQ ID NO.26)。
【００７１】
成熟化されたマンガンペルオキシダーゼＭｎＰ−５は、ｃＤＮＡ（シグナルペプチド除去）配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２７に示される。
【００７２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２７：
【００７３】
GCCGTCGTCAGGCGTGTCACTTGTCCCGACGGAGTGAACACAGCCACCAACGCAGCTTGCTGCTCTTTGTTCGCCGTTCGTGACGATATCCAGCAGAACCTCTTCGACAACGGCCAATGCGGTGAAGACGTCCACGAATCTTTCCGTCTCTCCTTCCACGATGCCATCGGAATCTCTCCCAAGATTGCGGCAACCGGCCAGTTTGGAGGTGGAGGCGCTGACGGCTCTATCATCCTCTTTGAGGAGATTGAGACCAACTTCCACGCTAACATTGGTGTTGACGAGATTGTCGACGAGCAGAAGCCGTTCATCGCCAGGCACAACATCACCCCCGGAGACTTCATCCAATTTGCCGCCGCTGTTGGTGTCTCGAACTGCCCTGGTGCTCCTCGTCTCGACTTCTTCCTTGGCCGTCCCGCTGCTACTCAACCCGCTCCAGACAAGACTGTCCCCGAGCCCTTCGACACCGTCGACACCATCCTGGAACGTTTTGCAGATGCGGGAAATTTCACCCCAGCCGAGGTCGTCGCTCTCCTCGTCTCCCATACCATCGCTGCTGCCGATGAGGTGGATCCCACCATCCCGGGAACTCCCTTCGACTCTACCCCGGAGGTCTTCGACTCGCAGTTCTTCGTCGAGACTCAGCTTCGCGGAACAGGATTCCCAGGAACCGCGGGTAACCAAGGTGAAGTCGAATCTCCTCTTGCTGGAGAACTGCGTCTCCAGTCCGACTCAGAGCTCGCTCGTGACTCCAGAACCGCCTGCGAGTGGCAATCCTTCGTCGGCAACCAGCAGAAGATCCAAACCGCGTTCAAGGCCGCTTTCCAGAAGATGGCCGTTCTCGGGGTAGACACCAGCAAGATGGTCGACTGCTCCGAGCTCATTCCTGTTCCTCCTGAGCTGAAGATCACCGCCGCGCATTTCCCTGCTGGCAAGACCAACGCTGACGTCGAGCAAGCTTGTGCTTCGACCCCCTTCCCCACTCTGTCCACTGACCCCGGCCCGGCTACTTCTGTCGCTCCTGTCCCTCCGTCCTAA
【００７４】
成熟タンパク質の理論分子量が３６．５ｋＤａであり、ＭｎＰ−５は１種の新しいマンガンペルオキシダーゼである。
【００７５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２８（ＭｎＰ−６（イタリック））：
【００７６】
ATGGCCTTCAAACAACTCGTCGCTGCACTTACAGTCGCGCTGTCACTCGGTGTTGCACAAGGTGCTATCACCAGACGTGTTGCGTGCCCCGACGGCGTGAACACGGCCACCAACGCGGCCTGTTGTTCTTTGTTCGCCATTCGTGATGATATCCAACAAAACCTCTTCGACGGTGGTGAATGTGGGGAGGAGGTTCACGAGTCTTTCCGTCTGACCTTCCATGATGCCATCGGCATTGGCTCAAACGGTGGCGGAGGTGCTGACGGCTCCATTGCTGTTTTCGAGGACATTGAGACCGCTTTCCACGCCAACAACGGTGTCGACGAAATCATCGACGAGCAGAAGCCGTTCCTCGCCAGACACAACATCACCCCCGGTGATTTCATTCAATTCGCTGGTGCTGTCGGTGTCTCCAACTGTCCCGGTGCTCCTCGTCTCGATTTCTTCCTCGGCCGACCAAACCCGGTCGCTCCTGCTCCTGACAAGACCGTTCCTGAGCCTTTCGATACTGTTGACAGCATTCTGGCTCGCTTCGCGGATGCTGGTGGATTCAGCCCGGCTGAGGTTGTCGCTCTTCTTGGATCCCACACGATCGCTGCAGCCGATCATGTTGACCCGACCATCCCTGGTACACCTTTCGACTCTACTCCTGAGGTGTTCGACACCCAGGTGTTCCTTGAAGTCCAGCTTCGTGGAACGCTCTTCCCCGGAACTGGTGGAAACCAGGGTGAAGTTGAGTCTCCTCTTCGTGGTGAAATCCGTCTTCAGTCTGACCATGACCTCGCCCGTGACTCGAGGACGGCTTGCGAATGGCAGTCGTTCGTGAACAATCAAGTCAAGCTTCAGACTGCCTTCAAGGCCGCTTTCAAGAAGCTCGCTGTACTCGGCCACGATGTCAACAACATGGTTGACTGCTCCGAAGTCATCCCCGAGCCCCCGAACGTCAAGATCAAGGCCGCGACCTTCCCCGCTGGCCAGACCAACGCCGATGTTGAGCAGGCTTGCGCCTCCACTCCCTTCCCCACTCTTGCTACTGACCCCGGCCCGGCTACCTCCGTTGCCCCTGTTCCCCCGTCTTAA
【００７７】
本発明において、マンガンペルオキシダーゼ遺伝子ＭｎＰ−６（イタリック）は、ＰＣＲ法により単離、クローニングされる。全ＤＮＡ配列の分析結果から、マンガンペルオキシダーゼＭｎＰ−６の遺伝子ＭｎＰ−６（イタリック）の全長が１５８０ｂｐで、コーディング遺伝子配列の全長が１０８０ｂｐである。ここで、シグナルペプチドの塩基配列は、以下の通りである。
【００７８】
ATGGCCTTCAAACAACTCGTCGCTGCACTTACAGTCGCGCTGTCACTCGGTGTTGCACAAGGT (SEQ ID NO.29)。
【００７９】
成熟化されたマンガンペルオキシダーゼＭｎＰ−６は、ｃＤＮＡ（シグナルペプチド除去）配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３０に示される。
【００８０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３０：
【００８１】
Gctatcaccagacgtgttgcgtgccccgacggcgtgaacacggccaccaacgcggcctgttgttctttgttcgccattcgtgatgatatccaacaaaacctcttcgacggtggtgaatgtggggaggaggttcacgagtctttccgtctgaccttccatgatgccatcggcattggctcaaacggtggcggaggtgctgacggctccattgctgttttcgaggacattgagaccgctttccacgccaacaacggtgtcgacgaaatcatcgacgagcagaagccgttcctcgccagacacaacatcacccccggtgatttcattcaattcgctggtgctgtcggtgtctccaactgtcccggtgctcctcgtctcgatttcttcctcggccgaccaaacccggtcgctcctgctcctgacaagaccgttcctgagcctttcgatactgttgacagcattctggctcgcttcgcggatgctggtggattcagcccggctgaggttgtcgctcttcttggatcccacacgatcgctgcagccgatcatgttgacccgaccatccctggtacacctttcgactctactcctgaggtgttcgacacccaggtgttccttgaagtccagcttcgtggaacgctcttccccggaactggtggaaaccagggtgaagttgagtctcctcttcgtggtgaaatccgtcttcagtctgaccatgacctcgcccgtgactcgaggacggcttgcgaatggcagtcgttcgtgaacaatcaagtcaagcttcagactgccttcaaggccgctttcaagaagctcgctgtactcggccacgatgtcaacaacatggttgactgctccgaagtcatccccgagcccccgaacgtcaagatcaaggccgcgaccttccccgctggccagaccaacgccgatgttgagcaggcttgcgcctccactcccttccccactcttgctactgaccccggcccggctacctccgttgcccctgttcccccgtcttaa
【００８２】
成熟タンパク質の理論分子量が３５．６ｋＤａであり、ＭｎＰ−６は１種の新しいマンガンペルオキシダーゼである。
【００８３】
また、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列に、１つ又は複数のアミノ酸残基の置換、及び／又は欠失、及び／又は付加が行われており、かつマイコトキシンの解毒機能を有する誘導タンパク質を提供する。
【００８４】
さらに、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の一致性を有し、かつマイコトキシンの解毒機能を有するタンパク質を提供する。
【００８５】
また、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５のいずれか１つに示されるアミノ酸配列に、１つ又は複数のアミノ酸残基の置換、及び／又は欠失、及び／又は付加が行われており、かつマイコトキシンの解毒機能を有する誘導タンパク質を提供する。
【００８６】
さらに、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５のいずれか１つに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の一致性を有し、かつマイコトキシンの解毒機能を有するタンパク質を提供する。
【００８７】
また、本発明は、マンガンペルオキシダーゼＭｎＰ−１、ＭｎＰ−２、ＭｎＰ−４、ＭｎＰ−５又はＭｎＰ−６がコードされたヌクレオチド配列：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０のいずれか１つに対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の一致性を有するヌクレオチド配列を提供する。その配列のコーディングが、上記のヌクレオチドコーディングのタンパク質と同じまたは同様の機能を持つタンパク質を有する。一致性を有するヌクレオチド配列は、コドン最適化配列、酵素切断部位が挿入された配列、又は当技術分野で既知の他の修飾がされた配列であってもよい。
【００８８】
また、本発明は、前記マンガンペルオキシダーゼ遺伝子ＭｎＰ−１（イタリック）、ＭｎＰ−２（イタリック）、ＭｎＰ−４（イタリック）、ＭｎＰ−５（イタリック）及びＭｎＰ−６（イタリック）を含む組換えベクターを提供する。好ましくは、ｐＥＴ２８ａ−ＭｎＰ−１、ｐＥＴ２８ａ−ＭｎＰ−２、ｐＥＴ２８ａ−ＭｎＰ−４、ｐＥＴ２８ａ−ＭｎＰ−５及びｐＥＴ２８ａ−ＭｎＰ−６である。本発明のマンガンペルオキシダーゼ遺伝子は、発現ベクターの適切な制限酵素切断部位の間に挿入されるため、そのヌクレオチド配列が発現制御配列に作動可能に連結される。本発明の最も好ましい実施形態として、本発明のマンガンペルオキシダーゼ遺伝子ＭｎＰ−１（イタリック）、ＭｎＰ−２（イタリック）、ＭｎＰ−４（イタリック）、ＭｎＰ−５（イタリック）及びＭｎＰ−６（イタリック）が、それぞれプラスミドｐＥＴ２８ａ上のＢａｍＨ（イタリック）Ｉ−Ｎｏｔ（イタリック）  Ｉ、ＢａｍＨ（イタリック）Ｉ−Ｘｈｏ（イタリック）Ｉ、ＢａｍＨ（イタリック）Ｉ−Ｘｈｏ（イタリック）Ｉ、ＥｃｏＲ（イタリック）Ｉ−Ｘｈｏ（イタリック）Ｉ及びＥｃｏＲ（イタリック）Ｉ−Ｎｏｔ（イタリック）Ｉの制限酵素切断部位の間に挿入され、ヌクレオチド配列がＴ７プロモーターの下流に位置しＴ７プロモーターによって制御されることにより、組換え大腸菌発現プラスミドｐＥＴ２８ａ−ＭｎＰ−１、ｐＥＴ２８ａ−ＭｎＰ−２、ｐＥＴ２８ａ−ＭｎＰ−４、ｐＥＴ２８ａ−ＭｎＰ−５及びｐＥＴ２８ａ−ＭｎＰ−６を得る。
【００８９】
また、本発明は、前記マンガンペルオキシダーゼ遺伝子ＭｎＰ−１（イタリック）、ＭｎＰ−２（イタリック）、ＭｎＰ−４（イタリック）、ＭｎＰ−５（イタリック）及びＭｎＰ−６（イタリック）を含む組換え菌株を提供する。好ましくは、組換え大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＭｎＰ−１、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＭｎＰ−２、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＭｎＰ−４、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＭｎＰ−５及びＢＬ２１（ＤＥ３）／ＭｎＰ−６である。
【００９０】
また、本発明は、マンガンペルオキシダーゼＭｎＰ−１、ＭｎＰ−２、ＭｎＰ−４、ＭｎＰ−５及びＭｎＰ−６の調製方法を提供する。この調製方法は、
１）前記組換えベクターを用いて宿主細胞を形質転換させ、組換え菌株を取得するステップと、
２）組み換え株を培養して、組換えマンガンペルオキシダーゼの発現を誘発するステップと、
３）発現されたマンガンペルオキシダーゼＭｎＰ−１、ＭｎＰ−２、ＭｎＰ−４、ＭｎＰ−５及びＭｎＰ−６を再生し、純化するステップと、を含む。
【００９１】
中でも、好ましくは、組換え大腸菌発現プラスミドを大腸菌細胞ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換させ、組換え菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＭｎＰ−１、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＭｎＰ−２、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＭｎＰ−４、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＭｎＰ−５及びＢＬ２１（ＤＥ３）／ＭｎＰ−６を取得する。
【００９２】
また、本発明は、前記マンガンペルオキシダーゼＭｎＰ−１、ＭｎＰ−２、ＭｎＰ−４、ＭｎＰ−５及びＭｎＰ−６のマイコトキシン解毒への応用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】組換えマンガンペルオキシダーゼＭｎＰ−１、ＭｎＰ−２、ＭｎＰ−４、ＭｎＰ−５及びＭｎＰ−６によるアフラトキシンの分解率を示す図である。
【図２】組換えマンガンペルオキシダーゼＭｎＰ−１、ＭｎＰ−２、ＭｎＰ−４、ＭｎＰ−５及びＭｎＰ−６によるゼアラレノンの分解率を示す図である。
【図３】組換えマンガンペルオキシダーゼＭｎＰ−１、ＭｎＰ−２、ＭｎＰ−４、ＭｎＰ−５及びＭｎＰ−６によるボミトキシンの分解率を示す図である。
【図４】組換えマンガンペルオキシダーゼＭｎＰ−１、ＭｎＰ−２、ＭｎＰ−４、ＭｎＰ−５及びＭｎＰ−６によるアフラトキシンの分解のＨＰＬＣ分析結果を示す図である。
【図５】組換えマンガンペルオキシダーゼＭｎＰ−１、ＭｎＰ−２、ＭｎＰ−４、ＭｎＰ−５及びＭｎＰ−６によるゼアラレノンの分解のＨＰＬＣ分析結果を示す図である。
【図６】組換えマンガンペルオキシダーゼＭｎＰ−１、ＭｎＰ−２、ＭｎＰ−４、ＭｎＰ−５及びＭｎＰ−６によるボミトキシンの分解のＨＰＬＣ分析結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００９４】
以下、図面を参照して本発明をさらに説明する。
【００９５】
試験材料及び試薬
【００９６】
１、菌株及びベクターについて、本発明は、（Ｉｒｐｅｘ  ｌａｃｔｅｕｓ）から、５種類の新しいマンガンペルオキシダーゼＭｎＰ−１、ＭｎＰ−２、ＭｎＰ−４、ＭｎＰ−５及びＭｎＰ−６を単離した。大腸菌発現ベクターｐＥＴ−２８ａ（＋）及び菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）が、それぞれＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社及び北京全式金生体技術有限公司から購入された。
【００９７】
２、酵素及びその他の生化学試薬について、エンドヌクレアーゼがＦｅｒｍｅｎｔａｓ社から購入され、リガーゼがＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入された。アフラトキシンが上海阿拉丁公司から購入され、ゼアラレノン及びボミトキシンがいずれもＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入され、その他がいずれも中国国産試薬（いずれも一般的な生化学試薬会社から購入可能）である。
【００９８】
３、培地：
【００９９】
（１）Ｉｒｐｅｘ  ｌａｃｔｅｕｓ酵素生産培地：１％リグノセルロース、０．２ｇ／Ｌ  酒石酸アンモニウム、２ｇ／Ｌ  ＫＨ2ＰＯ4、０．７１ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．１ｇ／Ｌ  ＣａＣｌ2、７０ｍＬ微量元素溶液。
【０１００】
（２）微量元素溶液：１ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、０．１８４ｇ／Ｌ  ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、０．１ｇ／Ｌ  ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．１ｇ／Ｌ  ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．１ｇ／Ｌ  ＣｕＳＯ4、０．０１ｇ／Ｌ  Ｈ3ＢＯ3、０．０１ｇ／Ｌ  Ｎａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ、０．０１ｇ／Ｌ  ＫＡｌ（ＳＯ4）2・１２Ｈ2Ｏ、１．５ｇ／Ｌ ニトリロ三酢酸。
【０１０１】
（３）大腸菌培地ＬＢ（１％ペプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）。
【０１０２】
注：以下の実施例で具体的に説明されていない分子生物学実験方法は、いずれも「分子クローニング実験ガイド」（第３版、著者Ｊ．サムブルック）に記載されている具体的な方法、又はキットと製品の説明書に従って実行された。
【０１０３】
実施例１：ウスバタケＩｒｐｅｘ  ｌａｃｔｅｕｓのマンガンペルオキシダーゼのコーディング遺伝子ＭｎＰ−１（イタリック）、ＭｎＰ−２（イタリック）、ＭｎＰ−４（イタリック）、ＭｎＰ−５（イタリック）及びＭｎＰ−６（イタリック）のクローニング
【０１０４】
ウスバタケＩｒｐｅｘ  ｌａｃｔｅｕｓのトータルＲＮＡ抽出：
【０１０５】
３日間にわたって液体培養した菌糸体を収集し、ろ紙に押して乾かし、液体窒素中において徹底的に粉砕して粉末にした。８００μｌ  Ｔｒｉｚｏｌ試薬を１００ｍｇの菌糸に加え、ピペッティングにより均一に混合し、室温で５分間放置した。２００μｌのクロロホルムを加え、１５秒間激しく振とうし、室温で３分間放置し、４℃及び１２０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上清液を吸引し、等体積のイソプロパノールを加え、均一に混合し、室温で１０分間放置し、４℃及び１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清液を捨て、沈殿用７０％エタノールで１回洗浄し、沈殿物を空気中で５分間乾燥した。適量のＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ脱イオン水を加えてＲＮＡを溶解し、ＮａｎｏＤｒｏｐ微量核酸タンパク質測定器を用いてＲＮＡ濃度を測定した。１％アガロースゲル又は１．５％ホルムアルデヒド変性アガロースで、電気泳動法によりその完全性を評価した。
【０１０６】
マンガンペルオキシダーゼ遺伝子のコード配列に基づいて、特定のプライマーを設計、合成した。
【０１０７】
ＭｎＰ−１（イタリック）：
【０１０８】
P1: 5'-CGCGGATCCGCACCCTCTTCTAGAGTGACATGCAGT-3'；
P2: 5'-TAAAGCGGCCGCTTACACAGGAACGATGGAGGTGGCG-3'。
【０１０９】
ＭｎＰ−２（イタリック）：
【０１１０】
P3: 5'-CGCGGATCCGCAATCACCAAGCGTGTTGCTTGTCCT-3'；
P4: 5'-CCGCTCGAGTTACGAGGGAGGGACAGGGGCGACAGA-3'。
【０１１１】
ＭｎＰ−４（イタリック）：
【０１１２】
P5: 5'-CGCGGATCCGCTCCCCAAGACGTTACTGCCGC-3'；
P6: 5'- CCGCTCGAGTTACGACGGAGGTACTGGAGGAATCG-3'。
【０１１３】
ＭｎＰ−５（イタリック）：
【０１１４】
P7: 5'- CGGAATTCGCCGTCGTCAGGCGTGTCACTTG-3'；
P8: 5'- CCGCTCGAGTTAGGACGGAGGGACAGGAGCGAC-3'。
【０１１５】
ＭｎＰ−６（イタリック）：
【０１１６】
P9: 5'- CGGAATTCGCTATCACCAGACGTGTTGCGTGC -3'；
P10: 5'- ATTTGCGGCCGCTTAAGACGGGGGAACAGGGGCAAC-3'。
【０１１７】
Ｉｒｐｅｘ  ｌａｃｔｅｕｓのトータルＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡをテンプレートとして、ＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ反応パラメーターは、９５℃で５分間の変性、次に９４℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で１分間の延伸、３５サイクル後に７２℃で１０分間の温度維持という反応パラメーターである。１％アガロースゲルで電気泳動させ、ゲルを切断して標的断片を取得し、その断片を回収し、ｐＥＡＳＹ−Ｔ３ベクターにリンクして睿博生物技術有限公司に送って配列を測定した。
【０１１８】
実施例２：組換えマンガンペルオキシダーゼの調製
【０１１９】
マンガンペルオキシダーゼからコードされた遺伝子ＭｎＰ−１（イタリック）、ＭｎＰ−２（イタリック）、ＭｎＰ−４（イタリック）、ＭｎＰ−５（イタリック）及びＭｎＰ−６（イタリック）の断片をダブルダイジェストすることにより、成熟マンガンペルオキシダーゼからコードされた遺伝子断片を切断し、さらにそれに応じて発現ベクターｐＥＴ−２８ａ（＋）をダブルダイジェストした。両方をリンクして、Ｉｒｐｅｘ  ｌａｃｔｅｕｓマンガンペルオキシダーゼ遺伝子ＭｎＰ−１（イタリック）、ＭｎＰ−２（イタリック）、ＭｎＰ−４（イタリック）、ＭｎＰ−５（イタリック）及びＭｎＰ−６（イタリック）が含まれる組換えプラスミドｐＥＴ２８ａ−ＭｎＰ−１（イタリック）、ｐＥＴ２８ａ−ＭｎＰ−２（イタリック）、ｐＥＴ２８ａ−ＭｎＰ−４（イタリック）、ｐＥＴ２８ａ−ＭｎＰ−５（イタリック）及びｐＥＴ２８ａ−ＭｎＰ−６（イタリック）を取得した。次に、大腸菌細胞ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換させ、組換え大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＭｎＰ−１（イタリック）、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＭｎＰ−２（イタリック）、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＭｎＰ−４（イタリック）、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＭｎＰ−５（イタリック）及びＢＬ２１（ＤＥ３）／ＭｎＰ−６（イタリック）を得た。
【０１２０】
組換えプラスミドを含むＤＥ３（イタリック）菌株を取り、４０ｍＬ  ＬＢ培地に接種し、３７℃、２５０ｒｐｍ及び１２時間で振とう培養した後、２％の比率で３００ｍＬ  ＬＢ培地に移し、３７℃、２５０ｒｐｍ及び４時間で振とう培養し（ＯＤ600は０．８になり）、最終濃度１ｍＭの誘導剤ＩＰＴＧを加えて４時間誘導した後、遠心分離により菌体を収集した。リゾチーム法で菌体を分裂・溶解し、８Ｍ尿素で封入体タンパク質を溶解し、再生系であるｐＨ９．５  ５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ、０．５Ｍ  ｕｒｅａ、０．５ｍＭ  ＧＳＳＧ、０．１ｍＭ  ＤＴＴ、１０μＭ  ｈｅｍｉｎ、５ｍＭ  ＣａＣｌ2、０．１ｍｇ／ｍｌタンパク質溶液を調整した。１５℃及び１０時間で、静置・再生させた。再生されたマンガンペルオキシダーゼを分離、純化した後、そのタンパク質の含有量は総タンパク質の９５％以上になった。
【０１２１】
実施例３：組換えマンガンペルオキシダーゼよるアフラトキシンの分解
【０１２２】
アフラトキシンをジメチルスルホキシドに溶解して５０ｍｇ／Ｌの母液を調製し、７０μｌマロン酸緩衝液（０．２Ｍ，ｐＨ５．０）、２０μｌアフラトキシン溶液、５μｌ硫酸マンガン（４０ｍＭ）、１００μｌマンガンペルオキシダーゼ（１０００Ｕ／Ｌ）、５μｌ過酸化水素（４ｍＭ）の反応系を構築した。マンガンペルオキシダーゼが含まれていない反応系を対照として、マンガンペルオキシダーゼ毎に３回の繰り返しを設定した。反応は、３０℃で行われ、１０時間後に体積３倍のＤＭＳＯを加えて反応を停止し、高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）でアフラトキシンの分解率を分析した。液体クロマトグラフの分析は、島津Ｎｅｘｅｒａ  ＵＨＰＬＣ高速液体クロマトグラフィーにより行われ、クロマトグラフィーカラムがＺｏｒｂａｘ  ＳＢ−Ｃ１８（４．６×２５０、５μｍ）、移動相Ａ（０．０６％ＴＦＡの水）、移動相Ｂ（０．０５％ＴＦＡのアセトニトリル）であり、勾配溶出条件が３０％Ｂ溶出４分間、３０％〜１００％Ｂ溶出１５分間、１００％Ｂ溶出５分間であり、検出波長が３６５ｎｍである。
【０１２３】
実施例４：組換えマンガンペルオキシダーゼよるゼアラレノンの分解
【０１２４】
ゼアラレノンをジメチルスルホキシドに溶解して５０ｍｇ／Ｌの母液を調製し、７０μｌマロン酸緩衝液（０．２Ｍ，ｐＨ５．０）、２０μｌゼアラレノン溶液、５μｌ硫酸マンガン（４０ｍＭ）、１００μｌマンガンペルオキシダーゼ（１０００Ｕ／Ｌ）、５μｌ過酸化水素（４ｍＭ）の反応系を構築した。マンガンペルオキシダーゼが含まれていない反応系を対照として、マンガンペルオキシダーゼ毎に３回の繰り返しを設定した。反応は、３０℃で行われ、１０時間後に体積３倍のＤＭＳＯを加えて反応を停止し、高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）でゼアラレノンの分解率を分析した。液体クロマトグラフの分析は、島津Ｎｅｘｅｒａ  ＵＨＰＬＣ高速液体クロマトグラフィーにより行われ、クロマトグラフィーカラムがＺｏｒｂａｘ  ＳＢ−Ｃ１８（４．６×２５０、５μｍ）、移動相Ａ（０．０６％ＴＦＡの水）、移動相Ｂ（０．０５％ＴＦＡのアセトニトリル）であり、勾配溶出条件が３０％Ｂ溶出４分間、３０％〜１００％Ｂ溶出１５分間、１００％Ｂ溶出５分間であり、検出波長が３１６ｎｍである。
【０１２５】
実施例５：組換えマンガンペルオキシダーゼよるボミトキシンの分解
【０１２６】
ボミトキシンをメタノールに溶解して１００ｍｇ／Ｌの母液を調製し、７０μｌマロン酸緩衝液（０．２Ｍ，ｐＨ５．０）、２０μｌボミトキシン溶液、５μｌ硫酸マンガン（４０ｍＭ）、１００μｌマンガンペルオキシダーゼ（１０００Ｕ／Ｌ）、５μｌ過酸化水素（４ｍＭ）の反応系を構築した。マンガンペルオキシダーゼが含まれていない反応系を対照として、マンガンペルオキシダーゼ毎に３回の繰り返しを設定した。反応は、３０℃で行われ、１０時間後に体積３倍のメタノールを加えて反応を停止し、高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）でボミトキシンの分解率を分析した。液体クロマトグラフの分析は、島津Ｎｅｘｅｒａ  ＵＨＰＬＣ高速液体クロマトグラフィーにより行われ、クロマトグラフィーカラムがＺｏｒｂａｘ  ＳＢ−Ｃ１８（４．６×２５０、５μｍ）、移動相Ａ（水）、移動相Ｂ（メタノール）であり、等勾配溶出条件が２０％Ｂ等勾配溶出２０分間であり、検出波長が２２０ｎｍである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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