(57)【要約】  本発明は、グリコール酸および／またはグリオキシル酸の産生に有用な方法および組み換え微生物に関する。本発明の方法は、本発明の改変微生物の一段階の発酵のみ、または、本発明の改変微生物の一段階の発酵およびグリコール酸またはグリオキシル酸の生物変換または化学変換の一段階のいずれかの発酵を含む方法、またはホスホケトラーゼ遺伝子を過剰発現する本発明の微生物である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つの発酵工程および改変微生物を用いて、唯一の炭素源としての炭水化物からグリコール酸および／またはグリオキシル酸を製造する方法であって、前記改変微生物において：
−ａｃｅＢ、ｇｌｃＢ、ｇｃｌおよびｅｄａから選択される少なくとも一つの遺伝子の発現を低減させ、かつ、
−キシルロース５−リン酸ホスホケトラーゼおよび／またはフルクトース６−リン酸ホスホケトラーゼをコードする少なくとも一つの遺伝子の発現が増強されている、
前記製造方法。
【請求項２】
前記ホスホケトラーゼをコードする遺伝子が、ラクトバチルス・ペントサス（Lactobacillus pentosus）のｘｐｋＡ遺伝子、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Bifidobacterium animalis）のｘｆｐ遺伝子、またはビフィドバクテリウム・ラクティス（Bifidobacterium lactis）のｘｆｐ遺伝子、またはそれらの相同遺伝子から選択される、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記改変微生物が、大腸菌（Escherichia coli）由来のｙｃｄＷ遺伝子またはその相同遺伝子をさらに過剰発現する、請求項１または２に記載のグリコール酸の製造方法。
【請求項４】
グリコール酸からグリオキシル酸を製造するための請求項３に記載の方法であって、
−任意に発酵ブロスからグリコール酸を分離する工程、
−大腸菌由来のｇｌｄＤＥＦＧ遺伝子によりコードされるグリコール酸オキシダーゼおよび大腸菌由来のｋａｔＥまたはｋａｔＧ遺伝子によりコードされるカタラーゼを用いたグリコール酸からの生物変換によって、またはニトロキシルラジカル触媒を用いた化学変換によって、グリコール酸をグリオキシル酸に変換する工程、
−グリオキシル酸を回収する工程
をさらに含む、前記製造方法。
【請求項５】
グリコール酸オキシダーゼおよびカタラーゼが同じ微生物において発現される、請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
前記改変微生物において、少なくとも大腸菌由来のｙｃｄＷ遺伝子が低減されている、請求項１または２に記載のグリオキシル酸の製造方法。
【請求項７】
グリオキシル酸からグリコール酸を製造するための請求項６に記載の方法であって、
−任意に発酵ブロスからグリオキシル酸を分離する工程、
−大腸菌由来の遺伝子ｙｃｄＷ遺伝子またはリゾビウム・エトリ（Rhizobium etli）由来のｇｒｘＡ遺伝子によりコードされるグリオキシル酸レダクターゼを用いたグリオキシル酸からの生物変換によって、または水素化ホウ素ナトリウムを用いた化学変換によって、グリオキシル酸をグリコール酸に変換する工程、
−グリコール酸を回収する工程
をさらに含む、前記製造方法。
【請求項８】
グリシンと、枯草菌（Bacillus subtilis）由来のグリシンオキシダーゼをコードする遺伝子および任意に大腸菌由来のカタラーゼをコードするｋａｔＥまたはｋａｔＧ遺伝子を過剰発現する微生物とを接触させることにより、グリシンからグリオキシル酸を製造する方法。
【請求項９】
グリコール酸が、結晶化、蒸留、液−液抽出または抽出発酵の工程により精製される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１０】
グリオキシル酸が、イオン交換、結晶化、沈殿または抽出発酵の工程により精製される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１１】
グリコール酸またはグリオキシル酸の製造のために改変された微生物であって、
−ａｃｅＢ、ｇｌｃＢ、ｇｃｌおよびｅｄａから選択される少なくとも一つの遺伝子の発現が低減され、
−ホスホケトラーゼをコードする少なくとも一つの遺伝子の発現が増強されている、
前記微生物。
【請求項１２】
前記ホスホケトラーゼをコードする遺伝子が、ラクトバチルス・ペントサスのｘｐｋＡ遺伝子、ビフィドバクテリウム・アニマリスのｘｆｐ遺伝子、またはビフィドバクテリウム・ラクティスのｘｆｐ遺伝子、またはそれらの相同遺伝子から選択される、請求項１１記載の微生物。
【請求項１３】
−大腸菌由来のｙｃｄＷ遺伝子またはグリコール酸産生のためのその相同遺伝子の過剰発現、または、
−グリオキシル酸産生のための大腸菌由来の少なくともｙｃｄＷ遺伝子の発現の低減をさらに含む、
請求項１１または１２に記載の微生物。
【請求項１４】
前記微生物が、腸内細菌科、クロストリジウム科、コリネバクテリウム科、バチルス科、ビフィドバクテリウム科、ラクトバチルス科または酵母から選択される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項１５】
前記微生物が大腸菌種由来である、請求項１４に記載の微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グリコール酸および／またはグリオキシル酸の製造に有用な方法および組み換え微生物に関する。本発明の微生物は、ホスホケトラーゼ活性を過剰発現することにより、炭素源からのグリコール酸および／またはグリオキシル酸の収率が増大するように改変されている。本発明の方法は、本発明の改変微生物の一段階の発酵のみ、または、本発明の改変微生物の一段階の発酵およびグリコール酸またはグリオキシル酸の生物変換または化学変換の一段階のいずれかを含む。
【背景技術】
【０００２】
カルボン酸は、少なくとも一つのカルボキシル基を含む有機化合物である。カルボン酸は広く存在し、例えばアミノ酸（タンパク質を構成する）と酢酸（酢の一部であり、代謝で発生する）とを含む。カルボン酸は、ポリマー、医薬品、溶媒および食品添加物の製造に使用される。産業的に重要なカルボン酸としては、酢酸（酢の成分、溶媒およびコーティング（coating）の前駆体）、アクリル酸およびメタクリル酸（ポリマーの前駆体、接着剤）、アジピン酸（ポリマー）、クエン酸（飲料）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）（キレート化剤）、脂肪酸（コーティング）、マレイン酸（ポリマー）、プロピオン酸（食品保存料）、テレフタル酸（ポリマー）、酪酸（食品添加物）、コハク酸（食品添加物、ポリマー）が挙げられる。
【０００３】
グリコール酸（ＨＯＣＨ２ＣＯＯＨ、ＣＡＳ番号：７９−１４−１）、またはその共役塩基のグリコレートは、カルボン酸のα−ヒドロキシ酸ファミリーの最も単純なメンバーである。グリコール酸は、非常に小さな分子中にアルコールおよび適度に強い酸官能基の両方を含む二重機能性を有する。その特性により、井戸の復旧、皮革産業、石油およびガス産業、洗濯および繊維産業、クリーニング製品、およびパーソナルケア製品のコンポーネントとしての使用を含む、幅広い消費者および産業用途に適している。また、優れたガスバリア性を有するポリグリコール酸を含む熱可塑性樹脂を含むさまざまな高分子材料の製造にも使用できるため、同じ特性を持つ包装材料（例えば、飲料容器等）の製造に使用することができる。ポリエステルポリマーは、水性環境において制御可能な速度で徐々に加水分解される。このような特性を有することにより、ポリエステルポリマーは、溶解性縫合糸等の生物医学的用途や、ｐＨを下げるために酸の放出を制御する必要がある用途において有用である。現在、世界中で年間５０，０００トンを超えるグリコール酸が消費されている。
【０００４】
グリコール酸は、サトウキビ、ビート、ブドウおよび果物において微量成分として天然に存在するが、主に合成により製造される。グリコール酸を製造する他の技術は、文献または特許出願に記載されている。例えば、特許出願ＥＰ２０２５７５９およびＥＰ２０２５７６０は、微生物を使用することにより、末端にヒドロキシル基を有する脂肪族多価アルコールから前記ヒドロキシカルボン酸を製造する方法を記載している。この方法は、エチレングリコール酸化微生物を用いたグリコール酸の製造に関する論文（Kataoka et al., 2001）においてMichihiko Kataokaが述べているように、生物変換である。グリコール酸は、改善されたニトリラーゼ活性を有する変異ニトリラーゼを使用するグリコロニトリルからの生物変換によっても製造され、その技術は、特許出願ＷＯ２００６／０６９１１０、ＷＯ２００９／０５９１０４およびＷＯ２００９／０５９０９６に開示されており、または、特許出願ＪＰ２００７／２２８９２７またはＷＯ２００５／１０６００５に開示されているように、エチレングリコール、グリコールアルデヒドまたはグリオキサールからの生物変換によって製造される。炭水化物が一つの直接的な発酵工程によってグリコール酸に変換される再生可能資源からの発酵によりグリコール酸を製造するための方法および微生物は、大腸菌株を用いた方法については特許出願ＷＯ２００７／１４１３１６、ＷＯ２０１０／１０８９０９、ＷＯ２０１１／０３６２１３、ＷＯ２０１１／１５７７２８、ＷＯ２０１２／０２５７８０、ＣＮ１０５６４７８４４Ａ、ＣＮ１０６０１１１８５ＡおよびＷＯ２０１６／０７９４４０に開示されており、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）株またはクルイベロミセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）株を用いた方法についてはＷＯ２０１３／０５０６５９、ＷＯ２０１４／１６２０６３およびＷＯ２０１６／１９３５４０に開示されている。
【０００５】
グリオキシル酸またはオキソ酢酸（ＨＣＯＣＯＯＨ、ＣＡＳ番号：２９８−１２−４）、またはその共役塩基のグリオキシレートは、Ｃ２カルボン酸である。グリオキシル酸は、グリオキシル酸サイクルの中間体であり、細菌、真菌、植物等の生物が脂肪酸を炭水化物に変換できるようにする。グリオキシレートは、いくつかのアミド化ペプチドの生合成におけるアミド化プロセスの副産物である。それは天然に存在する無色の固体であり、産業的に有用である。さまざまな産業用途の洗浄剤として、特殊な化学的および生分解性共重合体の原料として、また化粧品の成分として使用される。農薬および医薬品の化学物質として有用な化合物である。実際、グリオキシル酸は、フェノールとの縮合により４−ヒドロキシマンデル酸を生成し、それはアンモニアと反応して薬物アモキシシリンの前駆体であるヒドロキシフェニルグリシンを生成し、還元されて薬剤アテノロールの前駆体である４−ヒドロキシフェニル酢酸を生成するため、医薬品産業において有用であり得る。さらに、グリオキシル酸と尿素との酸触媒反応により、化粧品、軟膏において、また、一部の癌の治療において使用されるアラントインが生成される（Cativiela et al., 2003）。最後に、フェノールの代わりにグアイアコールと縮合すると、食品、飲料および医薬品における香味剤として使用されるバニリンへの経路がもたらされる。
【０００６】
グリオキシル酸は、未熟な果物や若い緑の葉において微量成分として天然に存在するが、主に合成により製造される。グリオキシル酸を製造する他の技術は、文献または特許出願に記載されている。例えば、グリオキシル酸は、ジブロモ酢酸をいくらかの水で加熱することにより、またはシュウ酸の電解還元により、またはグリオキサールの窒素酸化（nitric oxidation）により化学的に製造され得る。特許出願ＷＯ１９９３／１４２１４、ＵＳ５，４３９，８１３およびＷＯ１９９４／２８１５５等のいくつかの特許出願には、Isobe & Nishise (1999)と同様に、微生物によって産生されるグリコール酸オキシダーゼを用いたグリコール酸からの生物変換が開示されており、生物変換によるグリオキシル酸の製造プロセスが記載されている。特許出願ＵＳ２００７／００２６５１０には、アルデヒドオキシダーゼを用いたグリオキサールからの生物変換が開示されている。
【０００７】
グリコール酸およびグリオキシル酸に対する産業上の関心は、化学製品製造中に形成される化学副産物による環境的な懸念と相まって、そのようなカルボン酸の微生物的製造は魅力的可能性を有している。
【０００８】
本発明者らは、少なくとも一つの発酵工程およびホスホケトラーゼ活性が増強された改変微生物が関与する、唯一の炭素源としての炭水化物からグリコール酸および／またはグリオキシル酸を製造するための新しい方法を明らかにした。
【０００９】
ホスホケトラーゼ活性およびそのような活性を持つ酵素をコードする遺伝子は、当技術分野で公知である（Papini et al., 2012）。２つの異なるホスホケトラーゼ活性が細菌で報告されている。キシルロース５−リン酸ホスホケトラーゼは、リン酸塩を消費して、水の放出を伴うキシルロース５−リン酸からグリセルアルデヒド３−リン酸およびアセチルリン酸への変換を触媒する。キシルロース５−リン酸ホスホケトラーゼは、例えば、ラクトバチルス・ペントサス（Lactobacillus pentosus）のｘｐｋＡ遺伝子によってコードされている（Posthuma et al., 2002）。フルクトース６−リン酸ホスホケトラーゼは、リン酸塩を消費して、水の放出を伴うフルクトース６−リン酸からエリスロース４−リン酸およびアセチルリン酸への変換を触媒する。例えば、ビフィドバクテリウム・ラクティス（Bifidobacterium lactis）（Meile et al., 2001）またはビフィドバクテリウム・アニマリス（Bifidobacterium animalis）（ＷＯ２００６／０１６７０５およびＷＯ２０１６／０４４７１３）のｘｆｐ遺伝子によってコードされるタンパク質の場合のように、キシルロース５−リン酸ホスホケトラーゼおよびフルクトース６−リン酸ホスホケトラーゼ活性の両方を有するホスホケトラーゼをコードする遺伝子はほとんどない。
【００１０】
目的の代謝産物の製造のためのホスホケトラーゼの使用は既に知られており、特許出願ＷＯ２００６／０１６７０５およびＷＯ２０１６／０４４７１３において開示されている。目的の代謝産物は、グルタミン酸、グルタミン、プロリン、アルギニン、ロイシン、システイン、コハク酸、ポリヒドロブチレートおよび１，４−ブタンジオールである。グリコール酸またはグリオキシル酸の製造のためのホスホケトラーゼの使用は未だに開示されていない。
【００１１】
本発明の方法および微生物は、グリコール酸および／またはグリオキシル酸の製造のためのホスホケトラーゼの使用がこれまでに開示されたことがないので、従来技術よりも新しいものである。驚くべきことに、本発明者らは、本発明の微生物におけるホスホケトラーゼの過剰産生により、グリコール酸および／またはグリオキシル酸の産生が向上することを見出した。
【００１２】
本発明者らによって明らかにされた方法は、本発明の改変微生物の一段階の発酵のみ、または、本発明の改変微生物の一段階の発酵およびグリコール酸またはグリオキシル酸の生物変換または化学変換の一段階のいずれかを含む。
【発明の概要】
【００１３】
本発明は、少なくとも一つの発酵工程および改変微生物を用いて、唯一の炭素源としての炭水化物からグリコール酸および／またはグリオキシル酸を製造するための組み換え微生物および方法、ならびに、ａｃｅＢ、ｇｌｃＢ、ｇｃｌおよびｅｄａから選択される少なくとも一つの遺伝子の発現が低減され、キシルロース５−リン酸ホスホケトラーゼおよび／またはフルクトース６−リン酸ホスホケトラーゼをコードする遺伝子の発現が増強された微生物に関する。好ましくは、ホスホケトラーゼをコードする遺伝子は、ラクトバチルス・ペントサスのｘｐｋＡ遺伝子、ビフィドバクテリウム・アニマリスのｘｆｐ遺伝子、またはビフィドバクテリウム・ラクティスのｘｆｐ遺伝子、またはそれらの相同遺伝子の中から選択される。
【００１４】
本発明者らによって明らかにされた方法は、グリコール酸またはグリオキシル酸の製造のための本発明の改変微生物の一段階の発酵のみ、または対応する中間体グリコール酸またはグリオキシル酸の製造のための本発明の改変微生物の一段階の発酵および中間体グリコール酸またはグリオキシル酸をそれぞれグリオキシル酸またはグリコール酸に生物変換または化学変換する一段階のいずれかを含む。
【００１５】
本発明の別の方法は、グリシンオキシダーゼおよび任意にカタラーゼを用いたグリシンからのグリオキシル酸の製造に関する。
【００１６】
本発明の微生物は、腸内細菌科、クロストリジウム科、コリネバクテリウム科、バチルス科、ビフィドバクテリウム科、ラクトバチルス科または酵母等の細菌から選択される。より好ましくは、本発明の微生物は大腸菌種に由来する。
【発明の詳細な説明】
【００１７】
本発明を詳細に説明する前に、本発明は特に例示された方法に限定されず、もちろん変化し得ることを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、本発明の特定の実施形態を説明することのみを目的としており、制限することを意味するものではなく、添付の特許請求の範囲によってのみ制限されることが意図されることも理解されたい。
【００１８】
本明細書で引用されたすべての刊行物、特許および特許出願は、上記または下記にかかわらず、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００１９】
さらに、本発明の実施には、特に明記しない限り、当業者の範囲内の従来の微生物学的および分子生物学的技術が使用される。そのような技術は、熟練した作業者にはよく知られており、文献において十分に説明されている。
【００２０】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「a」、「an」および「the」は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数の言及を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば、「微生物」への言及は、複数のそのような微生物を含み、「内在性遺伝子」への言及は、一つまたは複数の内在性遺伝子等への言及となる。特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるのと類似または同等の任意の材料および方法を使用して本発明を実施または試験することができるが、好ましい材料および方法をここで説明する。
【００２１】
特許請求の範囲および本発明の連続した説明において、表現言語または必要な含意のために文脈がそうでないことを必要とする場合を除き、「含む（comprise）」、「含む（contain）」、「含む（involve）」または「含む（include）」という語または「含む（comprises）」、「含む（comprising）」、「含む（containing）」、「含む（involved）」、「含む（includes）」、「含む（including）」は包括的意味で使用され、すなわち、述べられた特徴の存在を特定するが、本発明の様々な実施形態におけるさらなる特徴の存在または追加を排除するものではない。
【００２２】
本発明は、グリコール酸および／またはグリオキシル酸の産生を向上させるための組み換え微生物および方法に関する。本発明者らによって明らかにされた方法は、グリコール酸またはグリオキシル酸の製造のための本発明の改変微生物の一段階の発酵のみ、または対応する中間体グリコール酸またはグリオキシル酸の製造のための本発明の改変微生物の一段階の発酵および前記中間体をそれぞれグリオキシル酸またはグリコール酸に生物変換する一段階のいずれかを含む。
【００２３】
「グリコール酸」という用語は、化学式ＨＯＣＨ２ＣＯＯＨおよびＣＡＳ番号７９−１４−１のカルボン酸を指す。
【００２４】
「グリオキシル酸」という用語は、化学式ＨＣＯＣＯＯＨ、およびＣＡＳ番号２９８−１２−４のカルボン酸を指す。
【００２５】
本明細書で使用される「微生物」という用語は、人工的に改変されていない細菌、酵母または真菌を指す。優先的には、微生物は腸内細菌科、クロストリジウム科、コリネバクテリウム科、バチルス科、ビフィドバクテリウム菌科、ラクトバチルス科または酵母から選択される。より優先的には、微生物は、エシェリヒア種、クレブシエラ種、ラクトバチルス種、ビフィドバクテリウム種、コリネバクテリウム種、クルイベロミセス種またはサッカロミセス種である。さらにより優先的には、本発明の微生物は大腸菌種に由来する。
【００２６】
本明細書で使用される「組み換え微生物」または「遺伝子改変微生物」という用語は、天然には見られず、天然に見られる同等のものとは遺伝的に異なる細菌、酵母または真菌を指す。それは、導入または削除によって、または遺伝的因子の改変のいずれかによって改変されることを意味する。また、特定の選択圧下での直接的な突然変異誘発と進化とを組み合わせることにより、新しい代謝経路の開発と進化とを強制的に引き起こすことにより形質転換することもできる（例えば、ＷＯ２００４／０７６６５９またはＷＯ２００７／０１１９３９を参照）。
【００２７】
外因性遺伝子が微生物に導入され、すべての因子が宿主微生物におけるそれらの発現を可能にする場合、微生物を改変してそれらの外因性遺伝子を発現させることができる。外因性ＤＮＡによる微生物の改変または「形質転換」は、当業者にとって日常的な作業である。
【００２８】
微生物は、内在性遺伝子の発現レベルを調節するために改変され得る。
【００２９】
「内在性遺伝子」という用語は、遺伝子が、遺伝子改変される前に微生物に存在していたことを意味する。内在性遺伝子は、内在性調節因子に加えて、または内在性調節因子と置換して異種配列を導入するか、遺伝子の一つまたは複数の追加コピーを染色体またはプラスミドに導入することによって過剰発現され得る。内在性遺伝子は、エンコードされた対応するタンパク質の発現および活性を調節するためにも改変され得る。例えば、遺伝子産物を改変するためにコード配列に突然変異を導入するか、または、内在性調節因子に加えて、または内在性調節因子と置換して異種配列を導入することができる。内在性遺伝子の調節は、遺伝子産物の活性の上方制御および／または増強、または内在性遺伝子産物の活性の下方制御および／または低下をもたらし得る。
【００３０】
それらの発現を調節する別の方法は、遺伝子の内在性プロモーター（例えば、野生型プロモーター）をより強いまたはより弱いプロモーターと交換して、内在性遺伝子の発現を上方または下方制御することである。これらのプロモーターは同種でも異種でもよい。適切なプロモーターを選択することは、十分に当業者の能力の範囲内である。
【００３１】
反対に、「外因性遺伝子」は、当業者に公知の手段によって遺伝子が微生物に導入されることを意味するが、この遺伝子は微生物中に天然には存在しない。外因性遺伝子は、宿主染色体に組み込まれるか、または、プラスミドまたはベクターによって染色体外で発現される。複製起点および細胞内でのコピー数に関して異なる様々なプラスミドが当技術分野で公知である。これらの遺伝子は相同であってもよい。
【００３２】
本発明の文脈において、用語「相同遺伝子」は、理論的に共通の遺伝的祖先を有する遺伝子を指すだけではなく、遺伝的に無関係であるが、同様に機能するおよび／または同様の構造を有するタンパク質をコードするように進化した遺伝子を含む。したがって、本発明の目的のための「機能的相同体」という用語は、特定の酵素活性が、定義されたアミノ酸配列の特定のタンパク質によってもたらされるだけでなく、他の（関連のない）関連のある微生物に由来する類似の配列のタンパク質によってももたらされるという事実に関する。
【００３３】
既知の遺伝子についてＧｅｎｂａｎｋに記載されている参考文献を用いることにより、当業者は他の生物、細菌株、酵母、真菌、哺乳動物、植物等における同等の遺伝子を決定することができる。この定型的な作業は、他の微生物に由来する遺伝子と配列アラインメントを実行し、縮退プローブを設計して別の生物の対応する遺伝子をクローン化することにより決定することができるコンセンサス配列を用いることにより有利に行うことができる。これらの分子生物学の定型的な作業は、当業者に周知である。
【００３４】
本明細書で使用される「向上したグリコール酸および／またはグリオキシル酸産生」、「グリコール酸および／またはグリオキシル酸産生の向上」という用語、およびそれらの文法的同等物は、向上したグリコール酸および／またはグリオキシル酸／炭素源収率を指す（消費される炭素源のグラム／モルあたりの生成されるグリコール酸のグラム／モルおよび／またはグリオキシル酸のグラム／モルの比であって、パーセントで表すことができる）。消費される炭素源の量および生成されるグリコール酸および／またはグリオキシル酸の量を決定する方法は、当業者に公知である。組み換え微生物では、対応する非改変微生物と比較して収量が高くなる。
【００３５】
「グリコール酸および／またはグリオキシル酸の発酵生産に最適化された微生物」という用語は、対応する野生型微生物の内在性生産と比較して向上したグリコール酸および／またはグリオキシル酸生産を示すように進化および／または遺伝子改変された微生物を指す。グリコール酸および／またはグリオキシル酸生産のために「最適化された」そのような微生物は当技術分野において公知であり、特に特許出願ＷＯ２００７／１４１３１６、ＷＯ２０１０／１０８９０９、ＷＯ２０１１／０３６２１３、ＷＯ２０１１／１５７７２８およびＷＯ２０１２／０２５７８０に開示されている。
【００３６】
本発明によれば、用語「発酵生産」、「培養」、「発酵工程」または「発酵」は、細菌の成長を示すために使用される。この成長は、一般に、使用される微生物に適合し、少なくとも一つの単純な炭素源を含む適切な培地と、必要に応じて補助基質を含む発酵槽で行われる。
【００３７】
「適切な培地」とは、炭素源または炭素基質、窒素源、例えば、ペプトン、酵母抽出物、肉抽出物、麦芽抽出物、尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウムおよびリン酸アンモニウム;リン源、例えば、リン酸一カリウムまたはリン酸二カリウム；微量元素（例えば、金属塩）、例えば、マグネシウム塩、コバルト塩および／またはマンガン塩；同様にアミノ酸およびビタミン等の成長因子等の細胞の維持および／または成長に不可欠または有益な栄養素を含む培地（例えば、無菌の液体培地）を指す。
【００３８】
本発明における「炭素源」または「炭素基質」または「炭素の源」という用語は、微生物の正常な成長を助けるために当業者が使用できる炭素源を示す。炭素源は、単糖類（グルコース、ガラクトース、キシロース、フルクトースまたはラクトース等）、オリゴ糖、二糖類（スクロース、セロビオースまたはマルトース等）、糖蜜、デンプンまたはその誘導体、ヘミセルロース、およびそれらの組み合わせを指す炭水化物から選択されます。特に好ましい単純な炭素源はグルコースである。別の好ましい単純な炭素源はスクロースである。炭素源は、再生可能な原料から得ることができる。再生可能な原料は、特定の工業的プロセスに必要な原料として定義され、わずかな遅れの間に目的の製品への変換を可能にするのに十分な量で再生することができる。処理または非処理の植物バイオマスは、興味深い再生可能な炭素源である。
【００３９】
本発明によれば、「生物変換工程」または「生物変換」または「生体内変換」または「生物触媒」または「生物学的変換」という用語は、酵素産生微生物（本発明の改変微生物とは異なる）によって産生される特定の酵素による有機物質の望ましい生成物への変換を指す。生物変換の反応は、酵素、そのメカニズムおよびプロセスの制限に応じて異なる方法で行うことができ、それらは当業者に公知である。
【００４０】
１．有機材料に精製酵素を添加することにより、有機材料と酵素とを接触させてもよく、または、
２．細菌から精製された酵素を含む酵素産生微生物の発酵ブロスを有機材料に添加することにより、有機材料と酵素とを接触させてもよく、または、
３．酵素産生微生物の溶解細胞の抽出物を有機材料に添加することにより、有機材料と酵素とを接触させてもよく、または、
４．酵素反応と、反応再生に必要な酵素産生微生物の生存率（特定の補因子の利用可能性）との両方が可能となるように前処理した酵素産生微生物の生細胞を有機材料に添加することにより、有機材料と酵素とを接触させてもよい。このシステムは、全細胞生体触媒システムと呼ばれる。
【００４１】
本発明の好ましい実施形態において、有機材料は、本発明の方法の発酵の第一工程、すなわち、本発明の改変微生物により産生されるグリコール酸またはグリオキシル酸に由来する。発酵の第一工程から生じる有機材料は、培養液から多少なりとも精製することができる。本発明の別の実施形態において、有機材料は化学的または生物学的に提供されるグリシンである。
【００４２】
本発明の第１の態様において、本発明は、少なくとも一つの発酵工程および本発明の改変微生物が含まれる改変微生物を用いて、唯一の炭素源としての炭水化物からグリコール酸および／またはグリオキシル酸を製造する方法であって、ａｃｅＢ、ｇｌｃＢ、ｇｃｌおよびｅｄａから選択される少なくとも一つの遺伝子の発現を低減させ、かつ、キシルロース５−リン酸ホスホケトラーゼおよび／またはフルクトース６−リン酸ホスホケトラーゼをコードする少なくとも一つの遺伝子を過剰発現させることを含む方法に関する。
【００４３】
特許出願ＷＯ２００７／１４１３１６に開示されているように、リンゴ酸シンターゼをコードするａｃｅＢ、リンゴ酸シンターゼをコードするｇｌｃＢ、グリオキシル酸カルボリガーゼをコードするｇｃｌおよび２−ケト−３−デオキシグルコン酸６−リン酸アルドラーゼをコードするｅｄａから選択される少なくとも一つの遺伝子の欠失は、グリオキシレートの変換の減少をもたらし、それにより培地から回収され得るか、またはグリコール酸にさらに変換され得るグリオキシレートが蓄積される。好ましくは、本発明の微生物では、遺伝子ａｃｅＢおよびｇｌｃＢおよびｇｃｌの発現が低減されている。
【００４４】
より好ましくは、本発明の改変微生物は、特許出願ＷＯ２０１０／１０８９０９、ＷＯ２０１１／０３６２１３、ＷＯ２０１１／１５７７２８、ＷＯ２０１２／０２５７８０に開示されているように、さらに改変され得る：
−グリコール酸オキシダーゼをコードする遺伝子ｇｌｃＤＥＦＧおよび／またはグリコアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするａｌｄＡを低減することにより、グリコレートの実質的な代謝をできなくする
−特にイソクエン酸デヒドロゲナーゼをコードするｉｃｄ、ＩｃｄキナーゼホスファターゼをコードするａｃｅＫ、ホスホトランスアセチラーゼをコードするｐｔａ、酢酸キナーゼをコードするａｃｋＡ、ピルビン酸オキシダーゼをコードするｐｏｘＢ、グリオキシル酸経路リプレッサーをコードするｉｃｌＲまたはｆａｄＲの低減、および／またはイソクエン酸リアーゼをコードする遺伝子ａｃｅＡの過剰発現により得られるグリオキシレート経路の流れ（flux）を増大させる。
【００４５】
イソクエン酸デヒドロゲナーゼのレベルを低減するには、イソクエン酸デヒドロゲナーゼをコードするｉｃｄ遺伝子の発現を駆動する人工的なプロモーターを導入するか、または、タンパク質の酵素活性を低下させる突然変異をｉｃｄ遺伝子に導入する。
【００４６】
タンパク質Ｉｃｄの活性はリン酸化によって低下するため、野生型ＡｃｅＫ酵素と比較してキナーゼ活性が増加またはホスファターゼ活性が低下した変異ａｃｅＫ遺伝子を導入することによっても制御することができる。
−特に遺伝子ｐｇｉ、ｕｄｈＡ、ｅｄｄの低減により得られるＮＡＤＰＨの利用可能性を向上させる。
【００４７】
「低減」または「発現低減」という用語は、この文脈において、遺伝子の発現および／または酵素の産生が、非改変微生物と比較して減少または抑制され、非改変微生物と比較してリボ核酸、タンパク質または酵素の細胞内濃度の低下をもたらすことを意味する。当業者にとって、細胞におけるリボ核酸濃度またはタンパク質濃度を測定するための異なる手段および方法、例えば、リボ核酸濃度を決定するための逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）の使用、特定のタンパク質の濃度を決定するための特定の抗体の使用は公知である。
【００４８】
酵素の産生の減少または抑制は、前記酵素をコードする遺伝子の発現の低減により達成される。
【００４９】
遺伝子の低減は、当業者に公知の手段および方法により達成され得る。一般的に、遺伝子発現の低減は以下によって達成される：
−コード領域またはプロモーター領域の変異、または、
−遺伝子発現に必要なプロモーター領域の全部または一部の削除、または、
−相同組み換えによる遺伝子のコーディング領域の全部または一部の削除、または、
−コーディング領域またはプロモーター領域への外部因子の挿入、または、
−弱いプロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下での遺伝子の発現。
【００５０】
当業者にとって、異なる強度を示す様々なプロモーターと、弱いまたは誘導可能な遺伝子発現のためにどのプロモーターを使用するかは公知である。
【００５１】
酵素の「活性」という用語は、「機能」という用語と交換可能に使用され、本発明の文脈において、酵素によって触媒される反応を指す。当業者にとって、前記酵素の酵素活性を測定する方法は公知である。
【００５２】
酵素の「低減活性」または「活性の低下」という用語は、アミノ酸配列の変異により得られるタンパク質の比触媒活性の低下、および／またはヌクレオチド配列の変異または遺伝子のコード領域の欠失により得られる細胞内のタンパク質濃度の低下のいずれかを意味する。
【００５３】
酵素の「増強された活性」または「増大した活性」という用語は、例えば酵素をコードする遺伝子を過剰発現することにより得られる、細胞における酵素の比触媒活性の増大、および／または細胞における酵素の量／利用可能性の増大を示す。
【００５４】
用語「増大された発現」、「増強された発現」または「過剰発現」、およびそれらの文法上の同等物は、本明細書において交換可能に使用され、同様の意味を有する。これらの用語は、遺伝子の発現または酵素の産生が非改変微生物と比較して増大し、非改変微生物と比較してリボ核酸、タンパク質または酵素の細胞内濃度が増大することを意味する。当業者にとって、細胞におけるリボ核酸濃度またはタンパク質濃度を測定するための異なる手段および方法、例えば、リボ核酸濃度を決定するための逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）の使用、および特定のタンパク質の濃度を決定するための特定の抗体の使用は公知である。
【００５５】
酵素の産生の増大は、前記酵素をコードする遺伝子の発現を増大させることにより達成される。
【００５６】
当業者にとって、遺伝子の発現を増加させるための以下のような異なる技術は公知である：
−微生物の遺伝子のコピー数の増大。遺伝子は、染色体または染色体外にコードされている。遺伝子が染色体上に位置する場合、遺伝子のいくつかのコピーを、当業者に公知の組み換え法（遺伝子置換を含む）により染色体上に導入することができる。遺伝子が染色体外に位置する場合、複製起点、したがって細胞内のコピー数に関して異なる種類のプラスミドによって運ばれる可能性がある。これらのプラスミドは、プラスミドの性質に応じて、１〜５コピー、または約２０コピー、または最大５００コピーで微生物に存在する：タイトな複製を伴う低コピー数プラスミド（ｐＳＣ１０１、ＲＫ２）、低コピー数プラスミド（ｐＡＣＹＣ、ｐＲＳＦ１０１０）または高コピー数プラスミド（ｐＳＫ  ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ）。
−高レベルの遺伝子発現をもたらすプロモーターの使用。当業者にとって、どのプロモーターが最も都合がよいかは公知である。例えば、プロモーターＰｔｒｃ、Ｐｔａｃ、ＰｌａｃまたはλプロモーターＰＲおよびＰＬが広く使用されている。これらのプロモーターは、特定の化合物によって、または温度や光等の特定の外部条件によって「誘導可能」であり得る。これらのプロモーターは同種でも異種でもよい。
【００５７】
−遺伝子の特異的または非特異的な転写抑制因子の活性または発現の低減。
−対応するメッセンジャーＲＮＡを安定化する因子（Carrier and Keasling, 1999）またはタンパク質を安定化する因子（例えばＧＳＴタグ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の使用。
【００５８】
「コードする（encoding）」または「コードする（coding）」という用語は、転写および翻訳のメカニズムを介してポリヌクレオチドがアミノ酸配列を生成するプロセスを指す。酵素をコードする遺伝子は外因性であても内在性であってもよい。
【００５９】
用語「ホスホケトラーゼ」は、典型的には、キシルロース５−リン酸ホスホケトラーゼ活性（ＥＣ４．１．２．９）および／またはフルクトース６−リン酸ホスホケトラーゼ活性（ＥＣ４．１．２．２２）を有する酵素を指す。キシルロース５−リン酸ホスホケトラーゼ活性とは、リン酸塩を消費して、水の放出を伴いキシルロース５−リン酸をグリセルアルデヒド３−リン酸およびアセチルリン酸に変換する活性を意味する。フルクトース６−リン酸ホスホケトラーゼ活性とは、リン酸塩を消費して、水の放出を伴いフルクトース６−リン酸をエリスロース４−リン酸およびアセチルリン酸に変換する活性を意味する。これら２つの活性は、Meile et al(2001)に記載された方法により測定することができる。Ｄ−キシルロース５−リン酸ホスホケトラーゼ酵素またはそのコード遺伝子は、乳酸菌、メタノール同化細菌、メタン同化細菌、連鎖球菌、より具体的にはアセトバクター属、ビフィドバクテリウム属、ラクトバチルス属、チオバチルス属、ストレプトコッカス属、メチロコッカス属、ブチリビブリオ属、フィブロバクター属に属するＤ−キシルロース５−リン酸ホスホケトラーゼ活性を有する細菌、および／またはカンジダ属、ロドトルラ属、ロドスポリジウム属、ピキア属、ヤロウィア属、ハンセヌラ属、クルイベロミセス属、サッカロミセス属、トリコスポロン属、ウィンゲア属等に属する酵母に由来する。フルクトース６−リン酸ホスホケトラーゼ酵素またはそのコード遺伝子は、アセトバクター属、ビフィドバクテリウム属、クロロビウム属、ブルセラ属、メチロコッカス属、ガルドネレラ属に属するフルクトース６−リン酸ホスホケトラーゼの活性を有する細菌、および／またはロドトルラ属、カンジダ属、サッカロミセス属等に属する酵母に由来する。さらに、ビフィドバクテリウム・アニマリス由来のＸｆｐ（ＷＯ２００６／０１６７０５およびＷＯ２０１６／０４４７１３）またはビフィドバクテリウム・ラクティス（Meile et al., 2001）等のいくつかの酵素は、キシルロース５−リン酸ホスホケトラーゼ活性およびフルクトース６−リン酸ホスホケトラーゼ活性の両方の活性を触媒することが報告されている。
【００６０】
本発明の文脈において、改変微生物は、グリコール酸および／またはグリオキシル酸の産生を増強するために、ホスホケトラーゼをコードする遺伝子を過剰発現する。本発明の微生物がホスホケトラーゼを自然に発現する場合、ホスホケトラーゼをコードする遺伝子は、上記で詳述した過剰発現方法を用いて過剰発現される。一方、本発明の微生物がホスホケトラーゼを自然に発現しない場合、ホスホケトラーゼをコードする外因性の遺伝子が微生物に導入される。この場合、遺伝子の導入により、ホスホケトラーゼをコードする遺伝子の過剰発現がもたらされる。
【００６１】
ホスホケトラーゼをコードする遺伝子は、ビフィドバクテリウム・アニマリスのｘｆｐ遺伝子（ＷＯ２００６／０１６７０５およびＷＯ２０１６／０４４７１３）、ビフィドバクテリウム・ラクティスのｘｆｐ遺伝子（Meile et al., 2001）、ラクトバチルス・ペントサスのｘｐｋＡ（Posthuma et al., 2002）またはそれらの相同遺伝子：ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）のｘｐｋ１遺伝子、ラクトバチルス・プランタラムのｘｐｋ２遺伝子、ストレプトコッカス・アガラクティア（Streptococcus agalactiae）ＮＥＭ３１６のｘｐｋ遺伝子、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）のｐｔｋ遺伝子、ラクトバチルス・ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）のｘｐｋ遺伝子、ラクトバチルス・アシドフィラス（Lactobacillus acidophilus）のｘｐｋ遺伝子、ビフィドバクテリウムロンガム（Bifidobacterium longum）のｘｆｐ遺伝子、クロロビウム・テピダム（Chlorobium tepidum）のｘｆｐ遺伝子、ブルセラ・スイス（Brucella suis）のｘｆｐ遺伝子、ブルセラ・アボルタス（Brucella abortus）のｘｆｐ遺伝子から選択される。優先的には、微生物は、ビフィドバクテリウム・ラクティスのｘｆｐ遺伝子（Meile et al., 2001）、ビフィドバクテリウム・アニマリスのｘｆｐ遺伝子（ＷＯ２００６／０１６７０５およびＷＯ２０１６／０４４７１３）またはラクトバチルス・ペントサスのｘｐｋＡ（Posthuma et al., 2002）を過剰発現する。さらにより好ましくは、微生物は、ビフィドバクテリウム・アニマリスのｘｆｐ遺伝子（ＷＯ２００６／０１６７０５およびＷＯ２０１６／０４４７１３）またはラクトバチルス・ペントサスのｘｐｋＡ遺伝子（Posthuma et al., 2002）を過剰発現する。
【００６２】
本発明の好ましい実施形態において、特許出願ＷＯ２００７／１４１３１６に開示されているように、グリオキシル酸のグリコール酸への変換を増大させるために、改変微生物はｙｃｄＷまたはその相同遺伝子をさらに過剰発現する。本発明の目的は、ａｃｅＢ、ｇｌｃＢ、ｇｃｌおよびｅｄａから選択される少なくとも一つの遺伝子の発現が低減され、ビフィドバクテリウム・ラクティスのｘｆｐ遺伝子、ビフィドバクテリウム・アニマリスのｘｆｐ遺伝子またはラクトバチルス・ペントサスのｘｐｋＡ遺伝子の発現、およびｙｃｄＷ遺伝子および／またはｙｉａＥ遺伝子の発現が過剰発現している改変微生物を用いたグリコール酸の製造方法を提供することである。好ましくは、改変微生物を用いたグリコール酸の製造方法において、ａｃｅＢ、ｇｌｃＢ、ｇｃｌおよびｅｄａから選択される少なくとも一つの遺伝子の発現が低減され、ビフィドバクテリウム・アニマリスのｘｆｐ遺伝子またはラクトバチルス・ペントサスのｘｐｋＡ遺伝子の発現が過剰発現し、かつ、ｙｃｄＷ遺伝子および／またはｙｉａＥ遺伝子の発現が過剰発現している。
【００６３】
グリコール酸の製造のためのこの方法により、グリコール酸からの生物変換または化学変換のいずれかによるグリオキシル酸の製造が可能となる。この本発明の第二の方法は、発酵ブロスからのグリコール酸の任意の単離、大腸菌の遺伝子ｇｌｄＤＥＦＧによりコードされるグリコール酸オキシダーゼおよび大腸菌の遺伝子ｋａｔＥまたはｋａｔＧによりコードされるカタラーゼを用いた生物変換（Loewen & Switala, 1986）、または、例えばＡＺＡＤＯ等のニトロキシルラジカル触媒を用いた化学変換（Furukawa et al., 2016）によるグリコール酸のグリオキシル酸への変換工程と、変換媒体からのグリオキシル酸の回収を含む。
【００６４】
グリコール酸の任意の単離は、少なくとも発酵ブロスからの微生物細胞の回収であり得る。グリコール酸は、特許出願ＷＯ２０１２／１５３０４１、ＷＯ２０１２／１５３０４２およびＷＯ２０１２／１５３０４３に開示されているように、連続蒸留により発酵ブロスの他の有機種からさらに精製され得る。あるいは、グリコール酸は、米国特許第７４３９３９１号に開示されているような反復結晶化工程により、または適切な溶媒を用いた液−液抽出により精製され得る。使用可能な溶媒は、最も便利な溶媒を選択できる当業者に公知である。発酵ブロスからグリコール酸を精製する別の方法は、反応性抽出プロセスまたは抽出発酵プロセスとしても知られる発酵抽出プロセスの使用である。抽出発酵は、反応プロセス、すなわち発酵を精製操作、すなわち特許出願ＷＯ２００９／０４２９５０またはＷＯ１９９９／５４８５６に開示されているような液体抽出と組み合わせた統合プロセスとみなすことができる。このプロセスは、グリコール酸が生成されるとすぐに除去できるようにし、グリコール酸の毒性作用による細胞増殖の阻害を低減し、したがってグリコール酸が一つの連続工程で生成および回収され、その結果、ダウンストリーム処理と回収コストを低減されるという有利な効果を示す。溶媒は、炭素結合酸素含有溶媒、リン結合酸素含有溶媒、または高分子量脂肪族アミンから選択される。好ましい溶媒は、トリ−ｎ−オクチルホスフィンオキシド、トリ−ｎ−ブチルホスフェート、ラウリル−トリアルキルメチルアミン、トリ−ｎ−オクチルアミン、トリ−イソ−オクチルアミン、トリ−ｎ−（オクチル−デシル）−アミン、第四級アルキルアンモニウム塩、ポリエチレングリコール、ポリエチレンイミンおよびポリプロピレンイミンである。より優先的には、使用される溶媒はトリ−ｎ−オクチルホスフィンオキシドである。有利なことに、抽出発酵は、結晶化または蒸留に続く工程によって完了してもよい。
【００６５】
グリコール酸からグリオキシル酸への生物変換の工程は、反応を触媒する（Ｓ）−２−ヒドロキシ酸オキシダーゼとしても知られるグリコール酸オキシダーゼ（ＥＣ番号：１．１．３．１５）によって媒介される：
【数１】
2020505922.tif 000002
【００６６】
この酵素は、酸化還元酵素のファミリー、特にアクセプターとして酸素を有するドナーのＣＨ−ＯＨ基に作用するものに属する。
【００６７】
本発明で用いられるグリコール酸オキシダーゼは、より良い安定性または触媒効率を示す酵素の天然形態またはこれらの天然酵素の変異体に対応し得る。用いられる天然のグリコール酸オキシダーゼは、ホウレンソウまたはビートの葉から抽出および精製されるか、あるいはこれらの酵素をコードする遺伝子は、特許出願ＷＯ１９９４／２０６３１およびＷＯ１９９５／０１４４４に開示されるように生産微生物に挿入され得る。あるいは、グリコール酸オキシダーゼをコードする大腸菌由来のｇｌｄＤＥＦＧ遺伝子は、生産生物において過剰発現する。生産生物は、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hnasenula polymorpha）、アスペルギルス・ニジュランス（Aspergillus nidulans）または大腸菌から選択される。最も好ましくは、大腸菌が使用される。グリコール酸オキシダーゼはＨ２Ｏ２を生成するため、ピキア・パストリス、ハンセヌラ・ポリモルファ、アスペルギルス・ニデュランスまたは大腸菌によって内因的に発現されるカタラーゼ（ＥＣ番号：１．１１．１．６）とグリコール酸オキシダーゼとを組み合わせて使用することが有利である。大腸菌において、カタラーゼはｋａｔＥまたはｋａｔＧ遺伝子によってコードされる。好ましくは、グリコール酸オキシダーゼおよびカタラーゼは同じ微生物において過剰発現される。グリコール酸オキシダーゼおよびカタラーゼの使用は、特許出願ＷＯ１９９６／００７９３、ＷＯ１９９４／２０６３１またはＷＯ１９９５／０１４４４に開示されている。
【００６８】
生物変換のために、グリコール酸オキシダーゼおよび／またはカタラーゼを、グリコール酸の溶液に精製酵素を直接添加するか（部分精製または非精製）、またはグリコール酸オキシダーゼおよび／またはカタラーゼ生産微生物の発酵ブロス、またはグリコール酸オキシダーゼおよび／またはカタラーゼ生産微生物の溶解細胞の抽出物を添加することにより、グリコール酸と接触させる。生物変換の効率を改善するため、米国特許第５，４３９，８１３号に開示されているように、精製後に固定化酵素を使用してもよい。
【００６９】
次いで、形成されたグリオキシル酸は、例えば、水酸化カルシウムによる結晶化または沈殿または液−液抽出等の当業者に公知の手段を用いて精製される。
【００７０】
本発明の別の好ましい実施形態において、グリオキシル酸のグリコール酸への変換を回避するために、少なくともｙｃｄＷ遺伝子の発現が低減するように、改変微生物をさらに操作する。また、本発明の目的は、ａｃｅＢ、ｇｌｃＢ、ｇｃｌおよびｅｄａから選択される少なくとも一つの遺伝子の発現が低減され、ビフィドバクテリウム・ラクティスのｘｆｐ遺伝子の発現、ビフィドバクテリウム・アニマリスのｘｆｐ遺伝子の発現、またはラクトバチルス・ペントサスのｘｐｋＡ遺伝子が過剰発現し、ｙｃｄＷ遺伝子およびｙｉａＥ遺伝子の発現が低減または完全に消失している改変微生物を用いたグリオキシル酸の製造方法を提供することである。好ましくは、改変微生物を用いたグリオキシル酸の製造方法において、ａｃｅＢ、ｇｌｃＢ、ｇｃｌおよびｅｄａから選択される少なくとも一つの遺伝子の発現が低減され、ビフィドバクテリウム・アニマリスのｘｆｐ遺伝子またはラクトバチルス・ペントサスのｘｐｋＡ遺伝子の発現が過剰発現し、ｙｃｄＷ遺伝子およびｙｉａＥ遺伝子の発現が低減または完全に消失している。
【００７１】
グリオキシル酸の製造のためのこの方法により、グリオキシル酸からの生物変換または化学変換によるグリコール酸の製造が可能になる。この本発明の第四の方法は、発酵ブロスからのグリオキシル酸の任意の単離、グリオキシル酸レダクターゼを用いた生物変換によるか、または、例えば、水素化ホウ素ナトリウムを用いた化学変換のいずれかによりグリオキシル酸のグリコール酸への変換、および変換媒体からのグリコール酸の回収工程を含む。前記グリオキシル酸レダクターゼは、大腸菌の遺伝子ｙｃｄＷによって、またはリゾビウム・エトリ（Rhizobium etli）の遺伝子ｇｒｘＡによってコードされ得る。
【００７２】
グリオキシル酸の任意の単離は、少なくとも発酵ブロスからの微生物細胞の回収であり得る。グリオキシル酸は、発酵ブロスの他の有機種から、イオン交換または沈殿／結晶化法または液−液抽出によってさらに精製することができる。発酵ブロスからグリオキシル酸を精製する別の方法は、抽出発酵プロセスの使用である。抽出発酵は、反応プロセス、すなわち発酵を精製操作、すなわち特許出願ＷＯ２００９／０４２９５０またはＷＯ１９９９／５４８５６に開示されているような液体抽出と組み合わせた統合プロセスとみなすことができる。このプロセスは、グリオキシル酸が生成されるとすぐに除去できるようにし、グリオキシル酸の毒性作用による細胞増殖の阻害を軽減し、したがってグリオキシル酸が一つの連続工程で生成および回収され、その結果、ダウンストリーム処理と回収コストが低減されるという有利な効果を示す。溶媒は、炭素結合酸素含有溶媒、リン結合酸素含有溶媒、または高分子量脂肪族アミンから選択される。好ましい溶媒は、トリ−ｎ−オクチルホスフィンオキシド、トリ−ｎ−ブチルホスフェート、ラウリル−トリアルキルメチルアミン、トリ−ｎ−オクチルアミン、トリ−イソ−オクチルアミン、トリ−ｎ−（オクチル−デシル）−アミン、第四級アルキルアンモニウム塩、ポリエチレングリコール、ポリエチレンイミンおよびポリプロピレンイミンである。より優先的には、使用される溶媒はトリ−ｎ−オクチルホスフィンオキシドである。有利なことに、抽出発酵は、結晶化または蒸留に続く工程によって完了してもよい。あるいは、抽出発酵の場合、発酵中に生成されるグリオキシル酸の毒性を低減するために、セミカルバジドまたはカルボヒドラジドまたは２，４−ジニトロフェニルヒドラジン等のアルデヒドと複合体を形成することが知られている分子を発酵ブロスに添加し、グリオキシル酸と複合体を形成し、細胞に対するアルデヒドの毒性を低減することができる。これにより、グリオキシル酸の生産性が向上する可能性がある（Sardari et al., 2014）。
【００７３】
グリオキシル酸のグリコール酸への生物変換の工程は、グリオキシル酸レダクターゼによって媒介される。グリオキシル酸レダクターゼは、ホウレンソウの葉から最初に単離され、補因子ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを使用して、グリオキシル酸からグリコール酸への還元を触媒する酵素でである。グリコール酸レダクターゼは、ＮＡＤＨ依存性（ＥＣ番号：１．１．１．２６）またはＮＡＤＰＨ依存性（ＥＣ番号：１．１．１．７９）であってもよい。使用可能なＮＡＤＨ依存性グリオキシル酸レダクターゼの例は：リゾビウム・エトリのｇｘｒＡ遺伝子によりコードされるＧｘｒＡ、サッカロミセス・セレビシエのＧＯＲ１遺伝子によりコードされるＧＯＲ１、メチロバクテリウム・エクストルキエンス（Methylobacterium extorquens）のｈｐｒＡ遺伝子によりコードされるＨｐｒＡ、またはピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）のｇｙａＲ遺伝子によりコードされるＧｙａＲである。ＮＡＤＰＨ依存性グリオキシル酸レダクターゼの例は：大腸菌のｙｃｄＷ遺伝子によりコードされるＹｃｄＷ、大腸菌のｙｉａＥ遺伝子によりコードされるＹｉａＥ、大腸菌のｙｊｇＢ遺伝子によりコードされるＹｊｂＧ、大腸菌のｙａｆＢ遺伝子によりコードされるＹａｆＢ、大腸菌のｙｑｈＤ遺伝子によりコードされるＹｑｈＤ、またはアラビドプシス・タリアナ（Arabidopsis thaliana）のＧＬＹＲ１およびＧＬＹＲ２遺伝子によりコードされるＧＬＹＲ１およびＧＬＹＲ２である。有利には、グリオキシル酸レダクターゼ生産微生物は大腸菌である。
【００７４】
グリオキシル酸のグリコール酸への生物変換のために、グリオキシル酸レダクターゼ酵素はＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ補因子のいずれかを必要とする。そのような場合、生物変換は、特定の酵素、および反応中に補因子を生成および再生できる生細胞の存在下で行う必要がある。これは、いわゆる全細胞生体触媒システムである。したがって、部分的に精製されたまたは精製されていないグリオキシル酸の溶液を、グリオキシル酸レダクターゼ酵素を過剰生産し、補因子を生産および再生するためにまだ生存可能なグリオキシル酸レダクターゼ生産微生物の発酵ブロスと接触させる。生物変換の効率を改善するために、反応を助けるために前処理された生きた微生物の存在下で固定化酵素を使用してもよい。
【００７５】
次いで、形成されたグリコール酸は、蒸留、結晶化、水酸化カルシウムによる沈殿または液−液抽出等の当業者に公知の手段を用いて精製される。
【００７６】
本発明の別の実施形態において、グリオキシル酸は、グリシンオキシダーゼを用いることによるグリシン（ＣＡＳ番号：５６−４０−６）の生物変換によって生成され得る。グリシンオキシダーゼ（ＥＣ番号：１．４．３．１９）は、以下の反応を触媒する：
【数２】
2020505922.tif 000003
【００７７】
本発明で使用されるグリシンオキシダーゼは、特許出願ＵＳ２０１６／０００２６１０に開示されているようにより良好な安定性または触媒効率を示す酵素の天然形態またはそれらの天然酵素の変異体に対応し得る。グリシンオキシダーゼは枯草菌において同定された（Nishiya & Imanaka, 1998; Job et al., 2002）。この酵素は、枯草菌から抽出および精製されてもよく、あるいは、この酵素をコードする遺伝子が生産微生物に挿入されてもよい。生産生物は、好ましくは大腸菌である。グリシンオキシダーゼはＨ２Ｏ２を生成するため、グリシンオキシダーゼと組み合わせて、ｋａｔＥおよびｋａｔＧ遺伝子により大腸菌により内在的に発現されるカタラーゼ（ＥＣ番号：１．１１．１．６）を使用することが有利である。好ましくは、グリシンオキシダーゼおよびカタラーゼは同じ微生物で過剰発現される。
【００７８】
生物変換のために、グリシンの溶液に精製酵素を直接添加するか、またはグリシンオキシダーゼおよび／またはカタラーゼ生産微生物の発酵ブロス、またはグリシンオキシダーゼおよび／またはカタラーゼ生産微生物の溶解細胞の抽出物を添加することにより、グリシンオキシダーゼおよび／またはカタラーゼとグリシンとを接触させる。生物変換の効率を改善するため、米国特許第５，４３９，８１３号に開示されているように、精製後に固定化酵素を使用してもよい。
【００７９】
最後に、本発明は、ａｃｅＢ、ｇｌｃＢ、ｇｃｌおよびｅｄａから選択される少なくとも一つの遺伝子の発現が低減され、ホスホケトラーゼをコードする少なくとも一つの遺伝子の発現が増強された、グリコール酸および／またはグリオキシル酸の製造のための改変微生物に関する。ホスホケトラーゼは、ビフィドバクテリウム・アニマリスのｘｆｐ遺伝子、ビフィドバクテリウム・ラクティスのｘｆｐ遺伝子、またはラクトバチルス・ペントサスのｘｐｋＡ遺伝子によってコードされている。
【００８０】
グリコール酸の製造のために、本発明の微生物は、大腸菌のｙｃｄＷ遺伝子またはその相同遺伝子の少なくとも一つを過剰発現するようにさらに改変される。
【００８１】
グリオキシル酸の製造のために、本発明の微生物は、少なくとも遺伝子ｙｃｄＷの発現を低減するかまたは完全に消失させるようにさらに改変される。
【００８２】
本発明の微生物は、腸内細菌科、クロストリジウム科、コリネバクテリウム科、バチルス科、ビフィドバクテリウム科、ラクトバチルス科または酵母から選択される。より優先的には、本発明の微生物は大腸菌種に由来する。
【実施例】
【００８３】
以下の実験は、改変されたグリコール酸産生大腸菌組み換え株をバックグラウンドとして用い、グリコール酸またはグリオキシル酸を製造する方法を示す。
【００８４】
以下に示す実施例においては、Datsenko & Wanner, （2000）においてよく知られているように、当技術分野で周知の方法を用いて、複製ベクターおよび／または相同組み換えを用いたさまざまな染色体挿入、欠失および置換を含む大腸菌株を構築した。
【００８５】
プロトコル
以下の実施例で説明するグリオキシル酸産生株を構築するために、いくつかのプロトコルを使用した。
【００８６】
本発明で使用されるプロトコル１（相同組み換えによる染色体改変、組み換え体の選択およびＦＲＴ配列に隣接する抗生物質カセットの切除）およびプロトコル２（ファージＰ１の形質導入）は、特許出願ＷＯ２０１３／００１０５５に完全に記載されている。
【００８７】
プロトコル３：ＬｏｘＰ配列に隣接する抗生物質カセットの切除
ＬｏｘＰ配列に隣接する耐性遺伝子は、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードする遺伝子を担持するプラスミドｐＪＷ１６８（Palmeros et al., 2000）を用いて除去された。端的には、ｐＪＷ１６８プラスミドを含むクローンをＬＢで３７℃または４２℃で培養し、次いで３０℃で抗生物質耐性の喪失を試験した。次に、適切なプライマーを用いたＰＣＲにより、抗生物質感受性クローンを検証した。
【００８８】
実施例１：大腸菌グリコール酸過剰産生組み換え株におけるｙｃｄＷ遺伝子の過剰発現の抑制−株１の説明および株２〜３の構築
株１の説明
特許出願ＷＯ２０１１／１５７７２８の実施例２、パート２に記載され、ＡＧ１４１３の親株、すなわちｐＭＥ１０１−ｙｃｄＷ−ＴＴ０７−ＰａｃｅＡ−ａｃｅＡ−ＴＴ０１プラスミドを含まないＡＧ１４１３株に対応する株を、本特許出願（current patent application）において株１と命名した。
【００８９】
株２の構築
株１を使用する前に、抗生物質耐性カセットを、それぞれＦｌｐリコンビナーゼ（プロトコル１に準拠）およびＣｒｅリコンビナーゼ（プロトコル３に準拠）を用いて遺伝子座ｉｃｄ（配列番号０２の配列を有するタンパク質をコードする配列番号０１）およびａｃｅＫ（配列番号４の配列を有するタンパク質をコードする配列番号０３）から除去した。次いで、カナマイシンおよびクロラムフェニコール感受性の形質転換体を選択し、適切なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ分析により抗生物質マーカーの不在を確認した。保持された株を、株２と命名した。
【００９０】
株３の構築
グリオキシル酸／ヒドロキシピルビン酸レダクターゼをコードし、特許出願ＷＯ２０１０／１０８９０９に記載のｐＭＥ１０１−ｙｃｄＷ−ＴＴ０７−ＰａｃｅＡ−ａｃｅＡ−ＴＴ０１プラスミドに担持されるｙｃｄＷ遺伝子（配列番号０６の配列を有するタンパク質をコードする配列番号０５）を、制限酵素およびリガーゼにより、プラスミドからそのプロモーターおよびｌａｃＩ遺伝子（配列番号０８の配列を有するタンパク質をコードする配列番号０７）から除去し、ｐＡＧ００９４プラスミドを得た。
【００９１】
プラスミドｐＡＧ００９４を株２に導入して、株３を得た。
【００９２】
実施例２：大腸菌グリコール酸過剰産生組み換え株におけるｙｃｄＷ遺伝子の完全な除去によるグリオキシル酸産生の向上−株４〜６の構築
大腸菌組み換えグリコール酸産生株２において、ｙｃｄＷ遺伝子の内在性コピーを除去した。
【００９３】
ｙｃｄＷ遺伝子の欠失を達成するために、Datsenko & Wanner, 2000（プロトコル１に準拠）に記載されている相同組み換え方法を用いた。
【００９４】
ｙｃｄＷ欠失のために、ｙｃｄＷ遺伝子の上流および下流領域に相同なＤＮＡ配列が隣接する耐性マーカーを有するフラグメントを、オーバーラップＰＣＲ技術（オーバーラップオリゴヌクレオチド）によりＰＣＲ増幅した。ｙｃｄＷ遺伝子の上流および下流領域への組み換えのための配列は、配列番号０９および１０と呼ばれる。次に、得られたＰＣＲ産物「ΔｙｃｄＷ：：Ｋｍ」を、エレクトロポレーションにより株ＭＧ１６５５（ｐＫＤ４６）に導入した。抗生物質耐性形質転換体を選択し、適切なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ分析により、関連する耐性カセットを有するｙｃｄＷ遺伝子の欠失を検証した。保持された株を、ＭＧ１６５５ΔｙｃｄＷ：：Ｋｍと命名した。最後に、ΔｙｃｄＷ：：Ｋｍ欠失を、Ｐ１ファージ形質導入（プロトコル２に準拠）によってＭＧ１６５５ΔｙｃｄＷ：：Ｋｍから株２に転換した。カナマイシン耐性形質転換体を選択し、適切なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ分析によりΔｙｃｄＷ：：Ｋｍ欠失の存在を検証した。保持された株を、株４と命名した。
【００９５】
次いで、ａｃｅＡ遺伝子の内在性コピー（配列番号１２の配列を有するタンパク質をコードする配列番号１１）を株４において欠失させた。
【００９６】
ａｃｅＡ遺伝子の欠失を達成するために、Datsenko & Wanner, 2000（プロトコル１に準拠）に記載されている相同組み換え方法を用いた。ａｃｅＢ（配列番号１４の配列を有するタンパク質をコードする配列番号１３）およびａｃｅＫ（配列番号０４の配列を有するタンパク質をコードする配列番号０３）遺伝子を、株４において予め欠失させ、相同組み換え方法はａｃｅＢＡＫオペロンを欠失させるために用いたものと同じものを用いた。
【００９７】
ａｃｅＢＡＫ欠失のために、ａｃｅＢＡＫオペロンの上流および下流領域に相同なＤＮＡ配列が隣接する抗生物質耐性マーカーを有するフラグメントを、オーバーラップＰＣＲ技術（オーバーラップオリゴヌクレオチド）によりＰＣＲ増幅した。ａｃｅＢＡＫオペロンの上流および下流領域への組み換えのための配列は、配列番号１５および１６と呼ばれる。次に、得られたＰＣＲ産物「ΔａｃｅＢＡＫ：：Ｃｍ」をエレクトロポレーションによってＭＧ１６５５株（ｐＫＤ４６）に導入した。抗生物質耐性の形質導入体を選択し、適切なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ分析により、関連する耐性カセットを有するａｃｅＢＡＫオペロンの欠失を検証した。保持された株を、ＭＧ１６５５ΔａｃｅＢＡＫ：：Ｃｍと命名した。最後に、ΔａｃｅＢＡＫ：：Ｃｍ欠失を、Ｐ１ファージ形質導入（プロトコル２に準拠）によってＭＧ１６５５ΔａｃｅＢＡＫ：：Ｃｍから株４に転換した。クロラムフェニコール耐性形質導入体を選択し、適切なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ分析によりΔａｃｅＢＡＫ：：  Ｃｍ欠失の存在を検証した。保持された株を、株５と命名した。
【００９８】
グリオキシル酸／ヒドロキシピルビン酸レダクターゼをコードし、ｐＭＥ１０１−ｙｃｄＷ−ＴＴ０７−ＰａｃｅＡ−ａｃｅＡ−ＴＴ０１プラスミドに担持されるｙｃｄＷ遺伝子（配列番号０５および配列番号０６）を、制限酵素およびリガーゼにより、プラスミドからそのプロモーターおよびｌａｃＩ遺伝子を削除することなく除去し（実施例１に記載のｐＡＧ００９４とは異なる）、ｐＡＧ０３０３プラスミドを得た。したがって、このプラスミドでは、ａｃｅＡ遺伝子発現の一部がその天然のプロモーターを介して駆動されるが、ｙｃｄＷおよびｌａｃＩ遺伝子の残りのプロモーターを介してＩＰＴＧを追加することにより、ａｃｅＡ発現のレベルを上げることもできる。
【００９９】
プラスミドｐＡＧ０３０３を株５に導入して、株６を得た。
【０１００】
実施例３：株３および６を用いた発酵によるグリコール酸およびグリオキシル酸の生産
生産株は、Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒバッフル付きフラスコで評価された。
【０１０１】
５ｍＬの前培養物を、混合培地（２．５ｇ／Ｌのグルコースと９０％の最小培地Ｍ１とを含む１０％ＬＢ培地（Ｓｉｇｍａ２５％））で１６時間３７℃で成長させた。これを使用して、培地Ｍ１におけるＯＤ６００が０．２となるように５０ｍＬ培養物を接種した。培地Ｍ１の組成を表１に示す。
【０１０２】
必要に応じて、抗生物質を培地（５０ｍｇ／Ｌの最終濃度のスペクチノマイシン）と最終濃度１００μＭのＩＰＴＧとに添加した。培養物の温度は３０℃であった。
【０１０３】
培養物のＯＤ６００が５まで達した時点で、屈折率検出（有機酸およびグルコース）を伴うＨＰＬＣにより、細胞外代謝物を分析した。
【０１０４】
各株について、数回繰り返して分析を行った。
【表１】
2020505922.tif 000004
【０１０５】
【表２】
2020505922.tif 000005
【０１０６】
上記表２に示されるように、ｙｃｄＷコピーの欠失およびａｃｅＡ遺伝子の制御された誘導により、株６は株３よりもはるかに多くのグリオキシル酸を産生した。予想された通り、このグリオキシル酸の生産は、株６におけるグリコール酸合成の低下に関連していた。
【０１０７】
ＧＡおよびＧｘＡの収量は以下のように表された：
【数３】
2020505922.tif 000006
【０１０８】
実施例４：グリコール酸過剰産生組み換え大腸菌株におけるホスホケトラーゼ酵素をコードする異種遺伝子の過剰発現によるグリコール酸産生の向上−株７〜１２の構築
株７〜９の構築：グリコール酸過剰産生組み換え大腸菌株におけるリン酸アセチルトランスフェラーゼをコードする大腸菌ｐｔａ遺伝子の再構築
株ＡＧ１４１３およびその親株である株１において、オペロン中に構造化されているａｃｋＡ（配列番号１８の配列を有するタンパク質をコードする配列番号１７）およびｐｔａ（配列番号１８の配列を有するタンパク質をコードする配列番号１９）の両方を、予め欠失させた。アセチルリン酸（以下の株のホスホケトラーゼによって生成される）を再びアセチルＣｏＡに変換するために、ａｃｋＡ遺伝子の欠失を保存させつつ、ｐｔａ遺伝子を株１のバックグラウンドに再構築した。
【０１０９】
ｐｔａ遺伝子の再構築を達成するために、ａｃｋＡ遺伝子のみが欠失され、野生型ｐｔａ遺伝子を保持しているＫｅｉｏコレクションのΔａｃｋＡ：：Ｋｍ変異体を用いた。ｐｔａ野生型遺伝子に関連するΔａｃｋＡ：：Ｋｍ欠失は、Ｐ１ファージ形質導入（プロトコル２に準拠）によりΔａｃｋＡ：：Ｋｍ  Ｋｅｉｏ変異体から株２に転換された。カナマイシン耐性形質導入体を選択し、適切なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ分析によりΔａｃｋＡ：：Ｋｍの欠失およびｐｔａ野生型遺伝子の存在を検証した。保持された株を、株７と命名した。
【０１１０】
次に、株７のＦｌｐリコンビナーゼ（プロトコル１に準拠）を用いてΔａｃｋＡの欠失から抗生物質カセットを除去した。カナマイシン感受性形質転換体を選択し、適切なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ分析により抗生物質マーカーの非存在を確認した。保持された株を、株８と命名した。
【０１１１】
リン酸アセチルトランスフェラーゼ活性アッセイのために、エルマンチオール試薬、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）を用いて、３０℃における４１２ｎｍ（ε４１２＝１３．６ｍＭ−１ｃｍ−１）でのチオフェノール酸アニオンの形成を測定することによって、アセチルＣｏＡからのＣｏＡのリン酸依存性放出をモニターした。アッセイ混合物（１ｍｌ）は、１００ｍＭのＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ８）、０．５ｍＭのＤＴＮＢ、および１ｍＭのアセチル−ＣｏＡを含んでいた。アッセイでアセチルＣｏＡなしで測定された活性値を差し引いた。比活性は、タンパク質１ミリグラムあたりのミリ単位（ｍＵＩ）で表される。
【０１１２】
株７のリン酸アセチルトランスフェラーゼ活性は、株８の１０倍であった（株７では１１００ｍＵＩ／ｍｇであり、株８では１１０ｍＵＩ／ｍｇであった）。
【０１１３】
次に、特許出願ＷＯ２０１０／１０８９０９に記載されているプラスミドｐＭＥ１０１−ｙｃｄＷ−ＴＴ０７−ＰａｃｅＡ−ａｃｅＡ−ＴＴ０１を株８に導入して、株９を得た。
【０１１４】
株１０〜１２の構築：グリコール酸過剰産生組み換え大腸菌株におけるホスホケトラーゼ酵素をコードする異種遺伝子の過剰発現
アセチル−ＣｏＡプールを増加させ、それによりグリコール酸産生を増加させるために、グリコール酸過剰産生大腸菌株で異なるホスホケトラーゼが過剰産生された。
【０１１５】
ホスホケトラーゼ酵素をコードする３つの異なる遺伝子は、株９で個別に過剰発現した：
−ビフィドバクテリウム・アニマリスからのｘｆｐ（配列番号２２の配列を有するタンパク質をコードする配列番号２１）、
−ビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Bifidobacterium adolescentis）からのｆｘｐｋ（配列番号２４の配列を有するタンパク質をコードする配列番号２３）、
−ラクトバチルス・ペントサスからのｘｐｋ（配列番号２６の配列を有するタンパク質をコードする配列番号２５）。
【０１１６】
「Ｏ１ｅｃ」という接尾辞で識別される各遺伝子について、大腸菌における産生に最適化されたコドン調和バージョンが、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＧｅｎｅＡｒｔ  Ｇｅｎｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｅｒｖｉｃｅによって合成された。各遺伝子は、人工Ｐｔｒｃプロモーター（人工プロモーターは、特許出願ＷＯ２００９／０４３８０３；Brosius et al, 1985）においてｃｙｓＰＵＷＡＭオペロンの過剰発現について記載されているもの）と共に、適切なオリゴヌクレオチドを用いて、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ５ベクター（Kovach et al, 1995）とにサブクローニングされ、それぞれ以下の表３に詳述されているプラスミドを得た。
【０１１７】
【表３】
2020505922.tif 000007
【０１１８】
各プラスミドを個別に株９に導入し、以下の表４に記載する株を得た。
【０１１９】
【表４】
2020505922.tif 000008
【０１２０】
ｐＢＢＲ１プラスミドは、中程度のコピー数で安定して複製します。
【０１２１】
ホスホケトラーゼ遺伝子のいくつかのレベルの過剰発現を得るために、遺伝子はまた、細胞への既知の異なるコピー数で以下のプラスミドにクローン化された：
−低コピー数ｐＣＬ１９２０ベクター（Lerner & Inouye, 1990）ｐＭＥ１０１−ｙｃｄＷ−ＴＴ０７−ＰａｃｅＡ−ａｃｅＡ−ＴＴ０１プラスミド、および
−１コピー数の細菌人工染色体ｐＢＡＣプラスミド（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ（登録商標））。
【０１２２】
ホスホケトラーゼ過剰発現プラスミドは、ｐＭＥ１０１−ｙｃｄＷ−ＴＴ０７−ＰａｃｅＡ−ａｃｅＡ−ＴＴ０１プラスミドと共に、株７および８にも導入された。
【０１２３】
振とうフラスコおよび反応器の性能
まず、実施例３に記載されているように、振盪フラスコで菌株を評価した。
【０１２４】
【表５】
2020505922.tif 000009
【０１２５】
表５に示すように、試験されたすべてのホスホケトラーゼ遺伝子が過剰発現すると、グリコール酸の生産量が増大した。収量は、ビフィドバクテリウム・アニマリスおよびラクトバチルス・ペントサスからのホスホケトラーゼ遺伝子の過剰発現の場合により高かった。
【０１２６】
これらの株は、フェドバッチ（fedbatch）法を用いて２Ｌ発酵槽（Ｐｉｅｒｒｅ  Ｇｕｅｒｉｎ）で評価された。
【０１２７】
チューブ内での最初の前培養は、混合培地（２．５ｇ／Ｌのグルコースと９０％の最小培地Ｍ１を含む１０％ＬＢ培地（Ｓｉｇｍａ２５％））で３７℃で１０時間行った。これを使用して、培地Ｍ１におけるＯＤ６００が０．２となるように５０ｍＬの２番目の種（seed）を接種した。前培養のこの工程は、４０ｇ／ＬのＭＯＰＳと１０ｇ／Ｌのグルコースを補充した５０ｍＬの合成培地（Ｍ１）を満たした５００ｍＬＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコで３７℃で行った。この２番目の前培養物は、ＯＤ６００ｎｍが９に近づいた後に発酵槽の接種に使用された。
【０１２８】
２０ｇ／Ｌのグルコースを補充した７００ｍＬの合成培地（Ｍ２）で満たされた反応器に、約０．５の初期光学密度で接種した。Ｍ２培地の組成を表６に記載する。培養は撹拌しながら３０℃で行い、撹拌と通気を増やすことで溶存酸素濃度を２０〜４０％、優先的には３０％の飽和値に維持した。ＮＨ４ＯＨ／ＮａＯＨ溶液（１５／５ｗ／ｗ）を自動的に添加することにより、ｐＨを６．８に調整した。
【０１２９】
培養は、グルコースが枯渇するまでバッチモードで行われた。その時点で、硫酸マグネシウム、オリゴ元素およびチアミンを補充した７００ｇ／Ｌのグルコース溶液を添加して、反応器内の２０ｇ／Ｌのグルコース濃度を回復した。グルコースが再び使い果たされるたびに、さらなる添加を行った。５回目のパルス（pulse）の後、３時間の増大（ramp）により、ｐＨは７．４の値に増大した。
【０１３０】
培養は４０〜４５時間後に停止した。細胞外代謝物は、屈折率検出（有機酸およびグルコース）を伴うＨＰＬＣを用いて分析された。
【０１３１】
各株について、数回繰り返して分析を行った。最終的な性能を表７に示す。
【表６】
2020505922.tif 000010
【０１３２】
【表７】
2020505922.tif 000011
記号〜は、パラメータの変動が参照株と比較して−５％〜５％であることを示す。記号＋は、５〜１０％の増加を示し、記号＋＋は１０〜２０％の増加を示す。
【０１３３】
ホスホケトラーゼ遺伝子の過剰発現により、株１０および１２の産生収率は、試験した異種遺伝子の性質に応じて５〜２０％の増加を示した。力価や生産性への影響は見られなかった。これらの結果により、ＧＡ産生に対するホスホケトラーゼ活性の利点が確認された。
【０１３４】
ホスホケトラーゼ遺伝子の発現レベルは、結果の傾向を変えなかった。グリコール酸産生は、３つの遺伝子：ｐＣＬ１９２０またはｐＢＡＣに担持されたｘｆｐＯ１ｅｃ、ｆｘｐｋＯ１ｅｃ、ｘｐｋＯ１ｅ（データは示していない）の異なる過剰発現レベルにより改善された。
【０１３５】
収率は以下のように計算される：
発酵槽の容量は、ｐＨを調整し、培養液を供給するために添加した溶液の量を初期容量に追加し、サンプリングに使用した容量と蒸発により失われた容量を差し引いて算出した。
【０１３６】
フィードストック（feeding stock）の重量を量ることにより、フェドバッチ量を連続的に追跡した。次いで、注入されたグルコースの量を、注入された重量、溶液の密度、およびＢｒｉｘの方法によって制御されたグルコース濃度（[グルコース]）に基づいて算出した。ＧＡの収率は以下のように表される：
【数４】
2020505922.tif 000012
【０１３７】
ＧＡ０およびＧＡｆはそれぞれ初期および最終ＧＡ濃度に対応し、Ｖ０およびＶｆはそれぞれ初期および最終容量に対応する。消費されたグルコースをｇで表す。
【０１３８】
粗抽出物のＤ−キシルロース５−リン酸およびフルクトース６−リン酸ホスホケトラーゼアッセイ（Ｘ５ＰＰＫおよびＦ６ＰＰＫ）
ホスホケトラーゼ活性は、Racker et al., 1962およびMeile et al., 2001に従って酵素的に生成されたアセチルリン酸から生成されたアセチルヒドロキサム酸第二鉄として分光測光法で測定された。０．０７５ｍｌの標準反応混合物は、３３．３ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ６．５）、塩酸Ｌ−システイン（１．９ｍＭ）、フッ化ナトリウム（２３ｍＭ）、ヨード酢酸ナトリウム（８ｍＭ）、Ｄ−フルクトース６−リン酸（Ｆ６Ｐ）（１００ｍＭ）またはＤ−キシルロース５−リン酸（Ｘ５Ｐ）（２７ｍＭ）のいずれかを基質として含み、粗抽出物の反応が開始される。３７℃で１０または３０分間インキュベートした後、０．０７５ｍｌのヒドロキシルアミン塩酸塩（２Ｍ、ｐＨ６．５）を添加して酵素反応を停止した。室温で１０分後、０．０５ｍｌの１５％（ｗｔ／ｖｏｌ）トリクロロ酢酸、０．０５ｍｌの４Ｍ  ＨＣｌ、および０．０５ｍｌのＦｅＣｌ３×６Ｈ２Ｏ（０．１ＭのＨＣｌ中の５％［ｗｔ／ｖｏｌ］）を、ヒドロキサミン酸第二鉄の最終的な発色のために添加した。２５℃で５分間撹拌した後、混合物を２２５０×ｇで５分間遠心分離し、２００μｌの上清を新しいマイクロプレートに移して吸光度を測定した。次いで、１．５ｍＭと１５０ｍＭの間の一連のアセチルリン酸標準と比較することにより、ヒドロキサミン酸第二鉄の形成を５０５ｎｍで分光光度的に定量化した。ホスホケトラーゼ活性の１単位は、Ｆ６ＰまたはＸ５Ｐのいずれかから毎分１ミリモルのアセチルリン酸を形成する抽出物の量として定義される。アッセイにおいて基質なしで測定された活性値を差し引いた。比活性は、タンパク質１ミリグラムあたりのミリ単位で表される。
【０１３９】
株１０〜１２のＤ−キシルロース５−リン酸およびフルクトース６−リン酸ホスホケトラーゼ活性を表８に示す。
【０１４０】
【表８】
2020505922.tif 000013
【０１４１】
大腸菌で発現したビフィドバクテリウム・アニマリスのｘｆｐおよびビフィドバクテリウム・アドレセンティスのｆｘｐｋによりコードされるホスホケトラーゼ酵素は、キシルロース５−リン酸およびフルクトース６−リン酸基質の両方の活性を触媒する。それにもかかわらず、これらの酵素は、表８に示されるように、フルクトース６−リン酸よりも基質キシルロース５−リン酸に対してより活性を有する。対照的に、大腸菌で発現したラクトバチルス・ペントサスのｘｐｋによりコードされるホスホケトラーゼ酵素は、基質であるキシルロース５−リン酸に対してのみ活性を有する。
【０１４２】
この実施例の結果は、ＰＫを含まない参照株９と比較して、異なるホスホケトラーゼ（ＰＫ）酵素を保持する株１０、１１、１２のグリコール酸産生を示しており、ホスホケトラーゼ活性により、酵素（Ｘ５ＰＰＫまたはＦ６ＰＰＫ）の基質特異性に関わらず、消費されるグルコースあたりのグリコール酸の収率が向上することを示している。
【０１４３】
実施例５：グリコール酸過剰産生組み換え大腸菌株におけるｙｃｄＷ発現の抑制とホスホケトラーゼ酵素をコードする異種遺伝子の過剰発現の両方によるグリオキシル酸産生の改善−株１３〜１７の構築
株１３および１４の構築：ΔａｃｋＡ＋ｐｔａ  ＡＧ１４１３株におけるグリオキシル酸／ヒドロキシピルビン酸レダクターゼをコードする大腸菌ｙｃｄＷ遺伝子の発現の抑制
株ＡＧ１４１３は、ｙｃｄＷ遺伝子のコピーを２つ有しており、一つは染色体上に、もう一つはｐＭＥ１０１−ｙｃｄＷ−ＴＴ０７−ＰａｃｅＡ−ａｃｅＡ−ＴＴ０１プラスミド上に存在する。
【０１４４】
ＡＧ１４１３株のバックグラウンドでｙｃｄＷの染色体コピーを欠失させるために、実施例２に記載のΔｙｃｄＷ：：Ｋｍ欠失を、Ｐ１ファージ形質導入（プロトコル２に準拠）によりＭＧ１６５５ΔｙｃｄＷ：：Ｋｍから株２に転換した。カナマイシン耐性形質導入体を選択し、適切なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ分析により、ΔｙｃｄＷ：：Ｋｍ欠失の存在を確認した。保持された株を、株１３と命名した。
【０１４５】
次に、ｙｃｄＷ遺伝子なしでａｃｅＡ遺伝子を過剰発現させた実施例２に記載されたプラスミドｐＡＧ０３０３を株１３に導入して、株１４を得た。
【０１４６】
株１５〜１６の構築：ｐｔａ野生型株９におけるグリオキシル酸／ヒドロキシピルビン酸レダクターゼをコードする大腸菌ｙｃｄＷ遺伝子の発現の抑制
株９は、ｙｃｄＷ遺伝子の２つのコピーを有し、一つは染色体上に、もう一つはｐＭＥ１０１−ｙｃｄＷ−ＴＴ０７−ＰａｃｅＡ−ａｃｅＡ−ＴＴ０１プラスミド上に存在する。
【０１４７】
株９のバックグラウンドでｙｃｄＷの染色体コピーを欠失させるために、実施例２に記載のΔｙｃｄＷ：：Ｋｍ欠失を、Ｐ１ファージ形質導入（プロトコル２に準拠）によりＭＧ１６５５ΔｙｃｄＷ：：Ｋｍから株８に転換した。カナマイシン耐性形質導入体を選択し、適切なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ分析により、ΔｙｃｄＷ：：Ｋｍ欠失の存在を確認した。保持された菌株を、菌株１５と命名した。
【０１４８】
次に、ｙｃｄＷ遺伝子を含まないａｃｅＡ遺伝子を過剰発現させた実施例２に記載のプラスミドｐＡＧ０３０３を１５株に導入して、１６株を得た。
【０１４９】
株１７の構築：グリオキシル酸過剰産生組み換え大腸菌株におけるホスホケトラーゼ酵素をコードするビフィドバクテリウム・アニマリス遺伝子の過剰発現
ホスホケトラーゼ酵素をコードするビフィドバクテリウム・アニマリスのｘｆｐＯ１ｅｃ遺伝子のコドン調和バージョンを、株１６において過剰発現させた。
【０１５０】
この遺伝子を株１６において過剰発現させるために、実施例４に記載のプラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ５−Ｐｔｒｃ０１−ｘｆｐＯ１ｅｃを株１６に導入して、株１７を得た。
【０１５１】
ホスホケトラーゼ遺伝子の異なるレベルの過剰発現を試験するために、ｘｆｐＯ１ｅｃ遺伝子は、ｐＢＢＲ１より低いコピー数でプラスミドにクローン化された：低コピー数ｐＣＬ１９２０ベクター（Lerner & Inouye, 1990）、実施例２に記載のｐＡＧ３０３。
【０１５２】
上記のすべての改変は、株７のバックグラウンドでも行われた。
【０１５３】
同じ作業を、他のホスホケトラーゼ遺伝子、ｆｘｐｋＯ１ｅｃおよびｘｐｋＯ１ｅｃの両方に対しても行った。
【０１５４】
振とうフラスコにおける性能
実施例３に記載されているように、振とうフラスコで株を評価した。
【表９】
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【０１５５】
上記表９に示されるように、ビフィドバクテリウム・アニマリスからのホスホケトラーゼ遺伝子の過剰発現は、グリオキシル酸の産生をわずかに増加させた（１７株対１４株）。
【０１５６】
同じ結果、すなわちグリオキシル酸産生の増加が、試験した他のホスホケトラーゼ酵素でも得られた（データは示していない）。
【０１５７】
粗抽出物のＤ−キシルロース５−リン酸およびフルクトース６−リン酸ホスホケトラーゼアッセイ（Ｘ５ＰＰＫおよびＦ６ＰＰＫ）
ホスホケトラーゼ活性は、実施例４で上述したプロトコルに従って測定した。株１６および１７のＤ−キシルロース５−リン酸およびフルクトース６−リン酸ホスホケトラーゼ活性を表１０に示す。
【０１５８】
【表１０】
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【０１５９】
ビフィドバクテリウム・アニマリスからのｘｆｐによりコードされ、大腸菌において発現されるホスホケトラーゼ酵素は、キシルロース５−リン酸およびフルクトース６−リン酸基質の両方の活性を触媒する。酵素は基質キシルロース５−リン酸に対してより活性が高かった。
【０１６０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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