(57)【要約】  一酸化窒素を貯蔵および放出するように共有結合的に修飾された高分子量アルギン酸塩、ならびにその製造方法および使用方法が本明細書に開示されている。共有結合的に修飾されたアルギン酸塩は、制御された様式で一酸化窒素を放出するように調整されることができ、浮遊性細菌およびバイオフィルム系細菌の両方の根絶のために有用である。【選択図】図１
2020504778.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉの１つ以上の共有結合的に修飾されたモノマー、
【化１】
2020504778.tif 000061
および、場合により、式ＩＩの少なくとも１つのモノマー
【化２】
2020504778.tif 000062
を含む官能化アルギン酸塩であって、式中、
Ｒ１およびＲ２がそれぞれ独立して、水素、Ｃ１〜５アルキル（Ｃ＝Ｏ）−およびＣ１〜５アルキルからなる群から選択され、
Ｒ３が水素またはＣ１〜５アルキルであり、
Ｒ４が、それぞれの場合において、水素またはＣ１〜５アルキルであり、
Ｑが、−（ＣＲａＲｂ）ｖ−であり、
式中、ＲａおよびＲｂが独立して、水素またはＣ１〜５アルキルであり、ｖが２〜６の整数であり、
Ａが
【化３】
2020504778.tif 000063
であり、式中、ＬがＳ、Ｏ、またはＮであり、
Ｇが、それぞれの場合において、水素であるか、Ｌと一緒になって一酸化窒素供与体を形成するか、または存在せず、
ｐが、１〜１０の整数であり、
Ｂが、水素、−Ｙ−Ｚ、およびＣ１〜５アルキルからなる群から選択され、前記Ｃ１〜５アルキルが、アミノ、ヒドロキシル、ニトリル、ＣＯ２Ｈ、モノ（Ｃ１〜６）アルキルアミノ−、ジ（Ｃ１〜６）アルキルアミノ−、−（ＣＯ）ＮＲｃＲｄまたは−ＮＲｃ（ＣＯ）Ｒｄで場合により置換されており、
式中、ＲｃおよびＲｄがそれぞれ独立して、水素およびＣ１〜６アルキルからなる群から選択され、
式中、Ｙが次の構造
【化４】
2020504778.tif 000064
を有し、式中、Ｒｐ、Ｒｑ、ＲｓおよびＲｔが、それぞれの場合において独立して、水素またはヒドロキシルであり、
ｋが、１〜２０の整数であり、
Ｚが、次の構造
【化５】
2020504778.tif 000065
を有し、式中、ｊが、それぞれの場合において、１〜１００の整数であり、
式Ｉの少なくとも１つのモノマーが、一酸化窒素供与体を含有する、官能化アルギン酸塩。
【請求項２】
前記一酸化窒素供与体が、ジアゼニウムジオラート、ニトロソチオール、ニトロソアミン、ヒドロキシルニトロソアミン、ヒドロキシルアミン、ヒドロキシ尿素、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の官能化アルギン酸塩。
【請求項３】
前記一酸化窒素供与体がジアゼニウムジオラートである、請求項２に記載の官能化アルギン酸塩。
【請求項４】
Ｒ１およびＲ２が水素またはＣ１〜５アルキルであり、
Ｒ３が水素であり、
Ｒ４が、それぞれの場合において、水素またはＣ１〜５アルキルである、請求項１に記載の官能化アルギン酸塩。
【請求項５】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４が水素である、請求項４に記載の官能化アルギン酸塩。
【請求項６】
ｖが２または３であり、
ＬがＮであり、
ｐが１〜３の整数である、請求項１に記載の官能化アルギン酸塩。
【請求項７】
Ｂが−Ｙ−Ｚである、請求項６に記載の官能化アルギン酸塩。
【請求項８】
Ｙが、次の構造を有する、請求項７に記載の官能化アルギン酸塩。
【化６】
2020504778.tif 000066
【請求項９】
Ｚが、次の構造を有する、請求項７に記載の官能化アルギン酸塩。
【化７】
2020504778.tif 000067
【請求項１０】
Ｂが、水素およびＣ１〜５アルキルからなる群から選択され、前記Ｃ１〜５アルキルが、場合によりアミノ、ヒドロキシル、ニトリル、ＣＯ２Ｈ、モノ（Ｃ１〜６）アルキルアミノ−、ジ（Ｃ１〜６）アルキルアミノ−、−（ＣＯ）ＮＲｃＲｄまたは−ＮＲｃ（ＣＯ）Ｒｄで置換されており、式中、ＲｃおよびＲｄがそれぞれ独立して水素およびＣ１〜６アルキルからなる群から選択される、請求項６に記載の官能化アルギン酸塩。
【請求項１１】
Ｂが、水素または非置換Ｃ１〜５アルキルである、請求項１０に記載の官能化アルギン酸塩。
【請求項１２】
Ｂが、水素またはＣ３アルキルである、請求項１１に記載の官能化アルギン酸塩。
【請求項１３】
−（Ｑ−Ａ−）ｐ−Ｂが、次の構造
【化８】
2020504778.tif 000068
を有する、請求項１２に記載の官能化アルギン酸塩。
【請求項１４】
Ｇが、構造ｖｉ、ｖｉｉ、ｖｉｉｉ、またはｉｘ中の窒素と一緒になって一酸化窒素供与体を形成する、請求項１３に記載の官能化アルギン酸塩。
【請求項１５】
前記一酸化窒素供与体が、ジアゼニウムジオラートである、請求項１４に記載の官能化アルギン酸塩。
【請求項１６】
−（Ｑ−Ａ−）ｐ−Ｂが、次の構造を有する、請求項１２に記載の官能化アルギン酸塩。
【化９】
2020504778.tif 000069
【請求項１７】
Ｇが、構造ｖｉｉ中の窒素と一緒になって一酸化窒素供与体を形成する、請求項１６に記載の官能化アルギン酸塩。
【請求項１８】
前記一酸化窒素供与体がジアゼニウムジオラートである、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の官能化アルギン酸塩。
【請求項１９】
前記官能化アルギン酸塩が水溶性である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の官能化アルギン酸塩。
【請求項２０】
前記官能化アルギン酸塩が、前記官能化アルギン酸塩１ミリグラム当たり０．１〜１．０μｍｏｌの範囲の一酸化窒素において放出可能な総一酸化窒素貯蔵量を有する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の官能化アルギン酸塩。
【請求項２１】
前記一酸化窒素放出が、０．１〜２４時間の範囲の半減期を有する、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の官能化アルギン酸塩。
【請求項２２】
前記一酸化窒素放出の総持続時間が、１〜６０時間の範囲である、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の官能化アルギン酸塩。
【請求項２３】
４時間後の前記総一酸化窒素放出が、前記官能化アルギン酸塩１ミリグラム当たり０．１〜１．０μｍｏｌの範囲のＮＯである、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の官能化アルギン酸塩。
【請求項２４】
前記官能化アルギン酸塩中のモノマーの１５％超が式Ｉのモノマーである、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の官能化アルギン酸塩。
【請求項２５】
前記官能化アルギン酸塩が、１〜６００ｋＤａの範囲の分子量を有する、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の官能化アルギン酸塩。
【請求項２６】
式Ｉの２つ以上の異なる共有結合的に修飾されたモノマーを含む、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の官能化アルギン酸塩。
【請求項２７】
請求項１〜２６のいずれか１項に記載の官能化アルギン酸塩を調製するための方法であって、
ｉ．ペプチドカップリング試薬の存在下で、式ＩＩＩのアミン
【化１０】
2020504778.tif 000070
をアルギン酸塩と接触させることであって、式中、
Ｒ４、Ｑ、Ａ、Ｂおよびｐが先に説明したとおりであり、式Ｉの共有結合的に修飾されたモノマーが調製され、
【化１１】
2020504778.tif 000071
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｑ、Ａ、Ｂおよびｐが先に説明したとおりである、接触させることと、
ｉｉ．式Ｉの共有結合的に修飾されたモノマー
【化１２】
2020504778.tif 000072
を含有する前記アルギン酸塩を一酸化窒素源と接触させることであって、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｑ、Ａ、Ｂおよびｐが先に説明したとおりであり、請求項１に記載の官能化アルギン酸塩が調製される、接触させることと、を含む、方法。
【請求項２８】
Ｒ１およびＲ２が、水素またはＣ１〜５アルキルであり、
Ｒ３が、水素またはＣ１〜５アルキルであり、
Ｒ４が、それぞれの場合において、水素またはＣ１〜５アルキルであり、
ｖが２または３であり、
ＬがＮであり、
ｐが１〜３の整数である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
−（Ｑ−Ａ−）ｐ−Ｂが次の構造
【化１３】
2020504778.tif 000073
を有する、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
Ｇが窒素と一緒になって一酸化窒素供与体を形成する、請求項２７〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記一酸化窒素供与体が、ジアゼニウムジオラートである、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
一酸化窒素を対象に送達する方法であって、
有効量の請求項１〜２６のいずれか１項に記載の官能化アルギン酸塩を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項３３】
疾患状態を処置する方法であって、
有効量の請求項１〜２６のいずれか１項に記載の官能化アルギン酸塩を、これを必要とする対象に投与することを含み、前記疾患状態が、癌、心血管疾患、微生物感染症、医療機器への血液の曝露によって引き起こされる血小板凝集および血小板粘着、異常な細胞増殖から結果として生じる病理学的容態、移植拒絶反応、自己免疫疾患、炎症、血管疾患、瘢痕組織、創傷収縮、再狭窄、疼痛、発熱、消化管障害、呼吸器障害、性機能障害、ならびに性感染症からなる群から選択される、方法。
【請求項３４】
前記疾患状態が、微生物感染症である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ｉ．請求項１〜２６のいずれか１項に記載の官能化アルギン酸塩と、
ｉｉ．薬学的に許容される賦形剤と、を含む、医薬製剤。
【請求項３６】
前記官能化アルギン酸塩が水溶性である、請求項３５に記載の医薬製剤。
【請求項３７】
式Ｉの１つ以上の共有結合的に修飾されたモノマー、
【化１４】
2020504778.tif 000074
および、場合により、式ＩＩ’の少なくとも１つのモノマー
【化１５】
2020504778.tif 000075
を含む官能化アルギン酸塩であって、式中、
Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ２、Ｒ２’、Ｒ３、およびＲ４がそれぞれ独立して、水素、−（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ−Ｈ、−（（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ−（ＣＨ２）ｏＨ、およびＣ１〜５アルキルからなる群から選択され、ここで、ｍ、ｎ、およびｏは独立して０〜６の整数であり、
Ｑが、−（ＣＲａＲｂ）ｖ−であり、
式中、ＲａおよびＲｂが独立して水素であり、ｖが２〜６の整数であり、
Ａが、
【化１６】
2020504778.tif 000076
であり、式中、ＬがＳ、Ｏ、またはＮであり、
Ｇが、それぞれの場合において、水素であるか、Ｌと一緒になって一酸化窒素供与体を形成するか、または存在せず、
前記一酸化窒素供与体が、存在する場合、以下からなる群から選択され、
【化１７】
2020504778.tif 000077
ｐが、１〜１０の整数であり、
Ｂが、存在しないか、または水素、−Ｙ−Ｚ、およびＣ１〜５アルキルからなる群から選択され、ここで前記Ｃ１〜５アルキルが場合により、アミノ、ヒドロキシル、ニトリル、ＣＯ２Ｈ、モノ（Ｃ１〜６）アルキルアミノ−、ジ（Ｃ１〜６）アルキルアミノ−、−（ＣＯ）ＮＲｃＲｄまたは−ＮＲｃ（ＣＯ）Ｒｄで置換されており、
式中、ＲｃおよびＲｄがそれぞれ独立して、水素およびＣ１〜６アルキルからなる群から選択され、
式中、Ｙが次の構造
【化１８】
2020504778.tif 000078
を有し、式中、Ｒｐ、Ｒｑ、ＲｓおよびＲｔが、それぞれの場合において、独立して、水素またはヒドロキシルであり、
ｋが１〜２０の整数であり、
Ｚが次の構造
【化１９】
2020504778.tif 000079
を有し、式中、ｊが、それぞれの場合において、１〜１００の整数であり、
式Ｉの少なくとも１つのモノマーが一酸化窒素供与体を含有している、官能化アルギン酸塩。
【請求項３８】
【化２０】
2020504778.tif 000080
が、次のうちの１つ以上から選択される構造を有する、請求項３７に記載の官能化アルギン酸塩。
【化２１】
2020504778.tif 000081
【請求項３９】
【化２２】
2020504778.tif 000082
が、次のうちの１つ以上から選択される構造を有する、請求項３７または３８に記載の官能化アルギン酸塩。
【化２３】
2020504778.tif 000083
【請求項４０】
Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ２、Ｒ２’、Ｒ３、およびＲ４が水素である、請求項３７〜３９のいずれか１項に記載の官能化アルギン酸塩。
【請求項４１】
一酸化窒素放出性水溶性官能化アルギン酸塩であって、前記官能化アルギン酸塩が、前記アルギン酸塩の少なくとも繰り返し単位へ共有結合したアミン含有基を含む、一酸化窒素放出性水溶性官能化アルギン酸塩を含む、微生物低減のための化合物であって、
前記アミン含有基が一酸化窒素供与体を含み、
前記一酸化窒素供与体が一酸化窒素を生成し、微生物ＤＮＡおよび膜構造への酸化的損傷および／またはニトロソ化による損傷を誘発し、それにより微生物量を低減させる、化合物。
【請求項４２】
前記官能化が、前記アルギン酸塩をカップリング試薬およびアミン含有基と接触させて、前記アミン含有基を前記アルギン酸塩に共有結合させることを含む、請求項４１に記載の化合物。
【請求項４３】
前記アミン含有基が、式ＩＩＩによる構造を有する、請求項４２に記載の化合物。
【請求項４４】
前記一酸化窒素供与体がジアゼニウムジオラートを含む、請求項４１〜４３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項４５】
前記官能化アルギン酸塩が１〜６００ｋＤａの範囲の分子量を有し、前記化合物が約１〜１５時間の範囲の一酸化窒素放出半減期を有し、前記化合物がニトロソアミンの形成を結果的に生じない、請求項４１〜４４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項４６】
前記化合物が、前記化合物１ミリグラム当たり０．１〜１．０μｍｏｌの範囲の一酸化窒素において放出可能な総一酸化窒素貯蔵量を有する、請求項４１〜４５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項４７】
前記化合物が、１〜６０時間の範囲の一酸化窒素放出の総持続時間を有する、請求項４１〜４６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項４８】
４時間後の前記総一酸化窒素放出が、前記化合物１ミリグラム当たり０．１〜１．０μｍｏｌの一酸化窒素の範囲内である、請求項４１〜４７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項４９】
前記化合物中の繰り返し単位の少なくとも１５％が式Ｉのモノマーである、請求項４１〜４８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項５０】
前記化合物が場合により、式ＩＩ’の少なくとも１つの繰り返し単位をさらに含む、請求項４１〜４９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項５１】
前記微生物量が、ヒト免疫不全ウイルス、単純ヘルペスウイルス、パピローマウイルス、パラインフルエンザウイルス、インフルエンザ、肝炎、コクサッキーウイルス、帯状疱疹、麻疹、おたふく風邪、風疹、狂犬病、肺炎、出血性ウイルス熱、Ｈ１Ｎ１、プリオン、寄生虫、真菌、カビ、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、および黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、Ａ群連鎖球菌（Ｇｒｏｕｐ  Ａ  ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、カルバペネム耐性腸内細菌科群（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、およびバークホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）のうちの１つ以上の存在を含む、請求項４１〜５０のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項５２】
前記微生物量が、黄色ブドウ球菌の存在を含む、請求項５１に記載の化合物。
【請求項５３】
前記微生物量が、緑膿菌の存在を含む、請求項５１に記載の化合物。
【請求項５４】
前記微生物量が、バークホルデリア・セパシアの存在を含む、請求項５１に記載の化合物。
【請求項５５】
水溶性官能化アルギン酸塩の少なくとも１つの繰り返し単位へ結合したアミン含有基を含む前記アルギン酸塩を含む、微生物量の低下および粘液の粘弾性の低減のための二重作用化合物であって、
前記アミン含有基が、一酸化窒素を生成する一酸化窒素供与体を含み、
前記一酸化窒素が微生物ＤＮＡおよび膜構造への損傷を誘発し、それにより微生物量を低減させ、
前記一酸化窒素が、粘液層中のムチン間相互作用を破壊し、それにより粘液の粘弾性を低下させる、二重作用化合物。
【請求項５６】
前記一酸化窒素供与体が、ジアゼニウムジオラート、ニトロソチオール、ニトロソアミン、ヒドロキシルニトロソアミン、ヒドロキシルアミン、ヒドロキシ尿素、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項５５に記載の二重作用化合物。
【請求項５７】
前記官能化アルギン酸塩が、２００〜６００ｋＤａの範囲の分子量を有する、請求項５５または５６に記載の二重作用化合物。
【請求項５８】
前記二重作用化合物が、約１〜１５時間の範囲の一酸化窒素放出半減期を有する、請求項５５〜５７のいずれか１項に記載の二重作用化合物。
【請求項５９】
前記化合物がニトロソアミンの形成を結果的に生じない、請求項５５〜５８のいずれか１項に記載の二重作用化合物。
【請求項６０】
前記二重作用化合物が、前記化合物１ミリグラム当たり０．１〜１．０μｍｏｌの範囲の一酸化窒素における放出可能な総一酸化窒素貯蔵量を有する、請求項５５〜５９のいずれか１項に記載の二重作用化合物。
【請求項６１】
前記化合物が、１〜６０時間の範囲の一酸化窒素放出の総持続属時間を有する、請求項５５〜６０のいずれか１項に記載の二重作用化合物。
【請求項６２】
４時間後の前記総一酸化窒素放出量が、前記化合物１ミリグラム当たり０．１〜１．０μｍｏｌの一酸化窒素の範囲内である、請求項５５〜６１のいずれか１項に記載の二重作用化合物。
【請求項６３】
前記少なくとも１つの繰り返し基が式Ｉのモノマーを含む、請求項５５〜６２のいずれか１項に記載の二重作用化合物。
【請求項６４】
前記化合物中の前記総繰り返し単位の少なくとも１５％が式Ｉのモノマーである、請求項６３に記載の二重作用化合物。
【請求項６５】
前記二重作用化合物が場合により、式ＩＩ’の少なくとも１つの繰り返し単位をさらに含む、請求項５５〜６４のいずれか１項に記載の二重作用化合物。
【請求項６６】
前記微生物量が、ヒト免疫不全ウイルス、単純ヘルペスウイルス、パピローマウイルス、パラインフルエンザウイルス、インフルエンザ、肝炎、コクサッキーウイルス、帯状疱疹、麻疹、おたふく風邪、風疹、狂犬病、肺炎、出血性ウイルス熱、Ｈ１Ｎ１、プリオン、寄生虫、真菌、カビ、カンジダ・アルビカンス、アスペルギルス・ニガー、大腸菌、緑膿菌、および黄色ブドウ球菌、Ａ群連鎖球菌、肺炎球菌、結核菌、カンピロバクター・ジェジュニ、サルモネラ、赤痢菌、カルバペネム耐性腸内細菌科群、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、およびバークホルデリア・セパシアのうちの１つ以上の存在を含む、請求項５５〜６５のいずれか１項に記載の二重作用化合物。
【請求項６７】
前記微生物量が、黄色ブドウ球菌の存在を含む、請求項６６に記載の化合物。
【請求項６８】
前記微生物量が、緑膿菌の存在を含む、請求項６６に記載の化合物。
【請求項６９】
前記微生物量が、バークホルデリア・セパシアの存在を含む、請求項６６に記載の化合物。
【請求項７０】
水溶性官能化アルギン酸塩の少なくとも１つの繰り返し単位へ結合したアミン含有基を含む前記アルギン酸塩を含む化合物の、嚢胞性線維症の処置のための薬剤の調製における使用であって、
前記アミン含有基が、一酸化窒素を生成する一酸化窒素供与体を含み、
前記一酸化窒素が、微生物ＤＮＡおよび膜構造への損傷を誘発し、それにより微生物量を低減させ、
前記一酸化窒素が、粘液層中のムチン間相互作用を破壊し、それにより粘液の粘弾性を低下させ、
前記粘液の粘弾性の低下が、微生物の肺クリアランスの改善を可能にする、使用。
【請求項７１】
前記化合物が、嚢胞性線維症に罹患している対象の肺への送達のために製剤される、請求項７０に記載の化合物の使用。
【請求項７２】
前記化合物が、嚢胞性線維症に罹患している対象への少なくとも１日２回の送達のために製剤される、請求項７０または７１に記載の化合物の使用。
【請求項７３】
前記一酸化窒素供与体が、ジアゼニウムジオラート、ニトロソチオール、ニトロソアミン、ヒドロキシルニトロソアミン、ヒドロキシルアミン、ヒドロキシ尿素、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項７０〜７２のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項７４】
前記官能化アルギン酸塩が、１〜６００ｋＤａの範囲の分子量を有する、請求項７０〜７３のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項７５】
前記二重作用化合物が、約１〜１５時間の範囲の一酸化窒素放出半減期を有する、請求項７０〜７４のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項７６】
前記化合物が、ニトロソアミンの形成を結果的に生じない、請求項７０〜７５のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項７７】
前記二重作用化合物が、前記化合物１ミリグラム当たり０．１〜１．０μｍｏｌの範囲の一酸化窒素における放出可能な総一酸化窒素貯蔵量を有する、請求項７０〜７６のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項７８】
前記化合物が、１〜６０時間の範囲の一酸化窒素放出の総持続時間を有する、請求項７０〜７７のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項７９】
４時間後の前記総ＮＯ放出が、前記化合物１ミリグラム当たり０．１〜１．０μｍｏｌの一酸化窒素の範囲内である、請求項７０〜７８のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項８０】
前記嚢胞性線維症が、黄色ブドウ球菌の存在による、請求項７０〜７９のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項８１】
前記嚢胞性線維症が、緑膿菌の存在による、請求項７０〜７９のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項８２】
前記嚢胞性線維症が、バークホルデリア・セパシアの存在による、請求項７０〜７９のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項８３】
前記化合物が、追加の薬剤の投与に適しており、前記追加の薬剤が、アモキシシリン、アムホテリシンＢ、アンピシリン、アジスロマイシン、セフジニル、セファロスポリンＣ、クロラムフェニコール、シプロフロキサシン、クラリスロマイシン、クリンダマイシン、ドキシサイクリン、エリスロマイシン、ムピロシン、リファンピン、テトラサイクリン、およびバンコマイシン、ブレオマイシン、ペントスタチン、ミトキサントロン、マイトマイシン、ダクチノマイシン、プリカマイシンおよびアミカシンのうちの１種以上を含む、請求項７０〜８２のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項８４】
複数の微生物で汚染された表面へ化合物を適用することを含む、表面上の微生物量を低減させる方法であって、
前記化合物が、一酸化窒素放出性水溶性官能化アルギン酸塩を含み、前記官能化アルギン酸塩が前記アルギン酸塩の少なくとも繰り返し単位へ共有結合したアミン含有基を含み、前記アミン含有基が一酸化窒素供与体を含み、
前記一酸化窒素供与体が一酸化窒素を生成し、微生物ＤＮＡおよび膜構造への酸化的損傷および／またはニトロソ化による損傷を誘発し、それにより微生物量を低減させ、前記複数の微生物が、次のもの、すなわち、グラム陽性菌、グラム陰性菌、真菌、酵母、ウイルスのうちの２つ以上を含む、方法。
【請求項８５】
前記表面が有機表面である、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記表面がヒトの皮膚である、請求項８４または８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記適用が皮膚刺激を誘発しない、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記表面が動物の皮膚である、請求項８４または８５に記載の方法。
【請求項８９】
前記適用が皮膚刺激を誘発しない、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記表面がヒトの気道組織である、請求項８４または８５に記載の方法。
【請求項９１】
前記適用が気道上皮細胞の刺激を誘発しない、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記表面が無機表面である、請求項８４に記載の方法。
【請求項９３】
前記無機表面が医療装置の外面または内面である、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記化合物の適用が、前記医療装置の前記外面または内面の上に抗菌コーティングを生成する、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記医療装置が、内視鏡を含む、請求項９３または９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記微生物量が薬剤耐性細菌を含む、請求項８４〜９５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９７】
前記薬剤耐性細菌がカルバペネム耐性腸内細菌科群を含む、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
前記薬剤耐性細菌がメチシリン耐性黄色ブドウ球菌を含む、請求項９６に記載の方法。
【請求項９９】
前記微生物量が、ヒト免疫不全ウイルス、単純ヘルペスウイルス、パピローマウイルス、パラインフルエンザウイルス、インフルエンザ、肝炎、コクサッキーウイルス、帯状疱疹、麻疹、おたふく風邪、風疹、狂犬病、肺炎、出血性ウイルス熱、Ｈ１Ｎ１、プリオン、寄生虫、真菌、カビ、カンジダ・アルビカンス、アスペルギルス・ニガー、大腸菌、緑膿菌、および黄色ブドウ球菌、Ａ群連鎖球菌、肺炎球菌、結核菌、カンピロバクター・ジェジュニ、サルモネラ、赤痢菌、カルバペネム耐性腸内細菌科群、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、およびバークホルデリア・セパシアのうちの１つ以上の存在を含む、請求項８４〜９５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１００】
前記微生物量が黄色ブドウ球菌の存在を含む、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記微生物量が緑膿菌の存在を含む、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０２】
前記微生物量がバークホルデリア・セパシアの存在を含む、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０３】
アモキシシリン、アムホテリシンＢ、アンピシリン、アジスロマイシン、セフジニル、セファロスポリンＣ、クロラムフェニコール、シプロフロキサシン、クラリスロマイシン、クリンダマイシン、ドキシサイクリン、エリスロマイシン、ムピロシン、リファンピン、テトラサイクリン、バンコマイシン、ブレオマイシン、ペントスタチン、ミトキサントロン、マイトマイシン、ダクチノマイシン、プリカマイシンおよびアミカシンのうちの１種以上を投与することをさらに含む、請求項８４〜１０２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０４】
アモキシシリンが投与される、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
セフジニルが投与される、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０６】
テトラサイクリンが投与される、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０７】
複数の微生物で汚染された表面を、一酸化窒素放出性水溶性官能化アルギン酸塩を含む化合物と接触させることを含む、微生物感染症を処置する方法であって、
前記一酸化窒素放出性水溶性官能化アルギン酸塩が、前記アルギン酸塩の少なくとも繰り返し単位に共有結合したアミン含有基を含み、前記アミン含有基が一酸化窒素供与体を含み、
前記一酸化窒素供与体が一酸化窒素を生成し、微生物の膜および／またはＤＮＡへの損傷を誘発し、それにより生存可能な微生物の数を低減させ、感染を処置し、
前記複数の微生物が、ウイルス、グラム陽性菌、グラム陰性菌、薬剤耐性菌、カビ、酵母、真菌、およびこれらの組み合わせのうちの１つ以上を含む、方法。
【請求項１０８】
前記化合物が、局所経路を介した投与、注射を介した投与、経口摂取を介した投与、または吸入を介した投与のために製剤されている、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
前記表面がヒトの皮膚である、請求項１０７または１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
前記適用が皮膚刺激を誘発しない、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
前記表面がヒトの気道組織である、請求項１０７または１０８に記載の方法。
【請求項１１２】
前記適用が気道上皮細胞の刺激を誘発しない、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
前記方法が嚢胞性線維症を処置するためである、請求項１０７〜１１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１４】
前記一酸化窒素供与体が、ジアゼニウムジオラート、ニトロソチオール、ニトロソアミン、ヒドロキシルニトロソアミン、ヒドロキシルアミン、ヒドロキシ尿素、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１０７〜１１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１５】
前記官能化アルギン酸塩が、１〜６００ｋＤａの範囲の分子量を有する、請求項１０７〜１１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１６】
前記化合物が、約１〜１５時間の範囲の一酸化窒素放出半減期を有する、請求項１０７〜１１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１７】
前記化合物が、前記化合物１ミリグラム当たり０．１〜１．０μｍｏｌの範囲の一酸化窒素における放出可能な総一酸化窒素貯蔵量を有する、請求項１０７〜１１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１８】
前記化合物が、１〜６０時間の範囲の一酸化窒素放出の総持続時間を有する、請求項１０７〜１１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１９】
４時間後の前記総一酸化窒素放出量が、前記化合物１ミリグラム当たり０．１〜１．０μｍｏｌの一酸化窒素の範囲内である、請求項１０７〜１１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２０】
前記少なくとも１つの繰り返し基が式Ｉのモノマーを含む、請求項１０７〜１１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２１】
前記化合物が場合により、式ＩＩ’の少なくとも１つの繰り返し単位をさらに含む、請求項１０７〜１２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２２】
前記化合物がニトロソアミンの形成を結果的に生じない、請求項１０７〜１２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２３】
前記複数の微生物が、ヒト免疫不全ウイルス、単純ヘルペスウイルス、パピローマウイルス、パラインフルエンザウイルス、インフルエンザ、肝炎、コクサッキーウイルス、帯状疱疹、麻疹、おたふく風邪、風疹、狂犬病、肺炎、出血性ウイルス熱、Ｈ１Ｎ１、プリオン、寄生虫、真菌、カビ、カンジダ・アルビカンス、アスペルギルス・ニガー、大腸菌、緑膿菌、および黄色ブドウ球菌、Ａ群連鎖球菌、肺炎球菌、結核菌、カンピロバクター・ジェジュニ、サルモネラ、赤痢菌、カルバペネム耐性腸内細菌科群、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、およびバークホルデリア・セパシアのうちの１つ以上を含む、請求項１０７〜１２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２４】
前記複数の微生物が黄色ブドウ球菌を含む、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２５】
前記複数の微生物が緑膿菌を含む、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２６】
前記複数の微生物がバークホルデリア・セパシアを含む、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２７】
アモキシシリン、アムホテリシンＢ、アンピシリン、アジスロマイシン、セフジニル、セファロスポリンＣ、クロラムフェニコール、シプロフロキサシン、クラリスロマイシン、クリンダマイシン、ドキシサイクリン、エリスロマイシン、ムピロシン、リファンピン、テトラサイクリン、バンコマイシン、ブレオマイシン、ペントスタチン、ミトキサントロン、マイトマイシン、ダクチノマイシン、プリカマイシンおよびアミカシンのうちの１種以上を投与することをさらに含む、請求項１０７〜１２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２８】
アモキシシリンが投与される、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１２９】
セフジニルが投与される、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１３０】
テトラサイクリンが投与される、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１３１】
粘液層を含む表面を、一酸化窒素放出性水溶性官能化アルギン酸塩を含む化合物と接触させることを含む、粘液層の粘弾性を低減させる方法であって、
前記官能化アルギン酸塩が前記アルギン酸塩の少なくとも繰り返し単位へ共有結合したアミン含有基を含み、前記アミン含有基が一酸化窒素供与体を含み、
前記一酸化窒素供与体が一酸化窒素を生成し、前記一酸化窒素が前記粘液層中のムチン間相互作用を破壊し、それにより粘液の粘弾性を減少させる、方法。
【請求項１３２】
前記化合物が、局所経路を介した投与、注射を介した投与、経口摂取を介した投与、または吸入を介した投与のために製剤されている、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３３】
前記表面がヒトの気道組織である、請求項１３１または１３２に記載の方法。
【請求項１３４】
前記適用が気道上皮細胞の刺激を誘発しない、請求項１３３に記載の方法。
【請求項１３５】
前記方法が嚢胞性線維症を処置するためである、請求項１３１〜１３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３６】
前記一酸化窒素供与体が、ジアゼニウムジオラート、ニトロソチオール、ニトロソアミン、ヒドロキシルニトロソアミン、ヒドロキシルアミン、ヒドロキシ尿素、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１３１〜１３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３７】
前記官能化アルギン酸塩が、１〜６００ｋＤａの範囲の分子量を有する、請求項１３１〜１３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３８】
前記化合物が、約１〜１５時間の範囲の一酸化窒素放出半減期を有する、請求項１３１〜１３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３９】
前記化合物が、前記化合物１ミリグラム当たり０．１〜１．０μｍｏｌの一酸化窒素の範囲の放出可能な総一酸化窒素貯蔵量を有する、請求項１３１〜１３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４０】
前記化合物が、１〜６０時間の範囲の一酸化窒素放出の総持続時間を有する、請求項１３１〜１３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４１】
４時間後の前記総一酸化窒素放出量が、前記化合物１ミリグラム当たり０．１〜１．０μｍｏｌの一酸化窒素の範囲内である、請求項１３１〜１４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４２】
前記少なくとも１つの繰り返し基が式Ｉのモノマーを含む、請求項１３１〜１４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４３】
前記化合物が場合により、式ＩＩ’の少なくとも１つの繰り返し単位をさらに含む、請求項１３１〜１４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４４】
前記化合物がニトロソアミンの形成を結果的に生じない、請求項１３１〜１４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４５】
前記粘液層が、ヒト免疫不全ウイルス、単純ヘルペスウイルス、パピローマウイルス、パラインフルエンザウイルス、インフルエンザ、肝炎、コクサッキーウイルス、帯状疱疹、麻疹、おたふく風邪、風疹、狂犬病、肺炎、出血性ウイルス熱、Ｈ１Ｎ１、プリオン、寄生虫、真菌、カビ、カンジダ・アルビカンス、アスペルギルス・ニガー、大腸菌、緑膿菌、および黄色ブドウ球菌、Ａ群連鎖球菌、肺炎球菌、結核菌、カンピロバクター・ジェジュニ、サルモネラ、赤痢菌、カルバペネム耐性腸内細菌科群、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、およびバークホルデリア・セパシアのうちの１つ以上を含む複数の微生物を含む、請求項１３１〜１４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４６】
前記複数の微生物が黄色ブドウ球菌を含む、請求項１４５に記載の方法。
【請求項１４７】
前記複数の微生物が緑膿菌を含む、請求項１４５に記載の方法。
【請求項１４８】
前記複数の微生物がバークホルデリア・セパシアを含む、請求項１４５に記載の方法。
【請求項１４９】
前記表面をアモキシシリン、アムホテリシンＢ、アンピシリン、アジスロマイシン、セフジニル、セファロスポリンＣ、クロラムフェニコール、シプロフロキサシン、クラリスロマイシン、クリンダマイシン、ドキシサイクリン、エリスロマイシン、ムピロシン、リファンピン、テトラサイクリン、バンコマイシン、ブレオマイシン、ペントスタチン、ミトキサントロン、マイトマイシン、ダクチノマイシン、プリカマイシンおよびアミカシンと接触させることをさらに含む、請求項１３１〜１４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５０】
アモキシシリンが投与される、請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５１】
セフジニルが投与される、請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５２】
テトラサイクリンが投与される、請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５３】
少なくとも１〜１５時間の時間にわたって抗菌濃度で標的部位に一酸化窒素を送達するための方法であって、
微生物量で汚染された標的部位を、一酸化窒素放出性水溶性官能化アルギン酸塩を含む化合物と接触させることであって、
前記官能化アルギン酸塩が、前記アルギン酸塩の少なくとも繰り返し単位へ共有結合したアミン含有基を含む、接触させることを含み、前記アミン含有基が一酸化窒素供与体を含み、
前記一酸化窒素供与体が、前記標的部位における生存可能な微生物の数を低減させるのに十分な濃度で一酸化窒素を生成する、方法。
【請求項１５４】
前記接触させることが、局所接触を介する、注射を介する、経口摂取を介する、または吸入を介する、請求項１５３に記載の方法。
【請求項１５５】
前記表面がヒトの気道組織である、請求項１５３または１５４に記載の方法。
【請求項１５６】
前記適用が気道上皮細胞の刺激を誘発しない、請求項１５５に記載の方法。
【請求項１５７】
前記方法が嚢胞性線維症を処置するためである、請求項１５３〜１５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５８】
前記一酸化窒素供与体が、ジアゼニウムジオラート、ニトロソチオール、ニトロソアミン、ヒドロキシルニトロソアミン、ヒドロキシルアミン、ヒドロキシ尿素、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１５３〜１５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５９】
前記官能化アルギン酸塩が、１〜６００ｋＤａの範囲の分子量を有する、請求項１５３〜１５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６０】
前記化合物が、約１〜１５時間の範囲の一酸化窒素放出半減期を有する、請求項１５３〜１５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６１】
前記化合物が、前記化合物１ミリグラム当たり０．１〜１．０μｍｏｌの一酸化窒素の範囲の放出可能な総一酸化窒素貯蔵量を有する、請求項１５３〜１６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６２】
４時間後の前記総一酸化窒素放出量が、前記化合物１ミリグラム当たり０．１〜１．０μｍｏｌの一酸化窒素の範囲内である、請求項１５３〜１６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６３】
前記標的部位における前記一酸化窒素濃度が、約１〜２００μＭである、請求項１５３〜１６２のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
すべての優先出願の参照による援用
本特許出願は、２０１７年１月３日および２０１７年４月１０日にそれぞれ出願された米国仮特許出願第６２／４４１，７４２号および同第６２／４８３，５０５号に対する優先権の利益を主張し、それらの全体がすべての目的のために参照により本明細書により援用される。
【０００２】
政府の関心
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与されたＡＩ１１２０２９の下での政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明においてある特定の権利を有する。
【０００３】
本開示の対象は概して、一酸化窒素を制御された様式で貯蔵および放出するように共有結合的に修飾されている、一酸化窒素放出アルギン酸塩ポリマーに関する。アルギン酸塩ポリマーの合成方法および抗菌薬としての使用が、さらに開示されている。
【背景技術】
【０００４】
細菌感染症は、地域社会および病院でヒトの健康に大きな課題をもたらしている。植え込み型装置、慢性創傷、および嚢胞性線維症と関係するものなど、いくつかの慢性感染症は、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）および黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）などのバイオフィルム形成病原体によって引き起こされることが多い。バイオフィルムは、宿主の免疫応答および抗生物質から細菌を保護するエキソ多糖（ＥＰＳ）マトリックスによって被包された細菌の協同的なコミュニティである。バイオフィルムの根絶は、浮遊性細菌に必要とされる濃度の１０００倍高い抗生物質濃度を必要とし得ることが報告されている。細菌の代謝が低いこと、ＥＰＳマトリックス内での抗菌薬の拡散の制限、微小環境の変化（例えば、栄養素枯渇部）を含む、いくつかの因子が観察されたバイオフィルムの抗菌耐性に起因している。
【発明の概要】
【０００５】
従来の抗菌薬に対するバイオフィルムの耐性のために、バイオフィルム系細菌コロニーに有効に浸透して根絶することができる新たな抗菌薬が大いに必要とされている。そのような薬剤、およびそれを製造するための方法、ならびに微生物量を減少および／または除去する上でのそれらの使用が、本明細書に提供される。
【０００６】
一酸化窒素（ＮＯ）は、シグナル伝達分子として種々の生理学的役割を担っており、本明細書に開示されているように、病態生理学において、例えば治療薬としても重要な役割を担うことができる。治療薬としてのＮＯの使用はこれまで、治療用組成物の限られたＮＯ負荷量、望まれるよりも迅速なＮＯ放出速度、および標的化されたＮＯ送達の欠如に少なくとも部分的に基づいて、十分に利用されていない。ＮＯ放出足場、そのような足場の製造方法、および増強されたＮＯ放出特徴に影響を及ぼして、ＮＯを放出する薬理学的能力の豊富な可能性を利用するそのような足場を使用して、種々の病態生理学的性質を処置する方法が、本明細書に提供される。特に、抗菌薬として非常に有効である化合物が本明細書に提供される。
【０００７】
いくつかの実施形態において、式Ｉの１つ以上の共有結合的に修飾されたモノマーを含む官能化アルギン酸塩が提供され、
【化１】
2020504778.tif 000003
【０００８】
ここで、式Ｉの少なくとも１つのモノマーは一酸化窒素供与体を含有している。いくつかの実施形態において、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、水素、Ｃ１〜５アルキル（Ｃ＝Ｏ）−、およびＣ１〜５アルキル、またはそれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ３は水素またはＣ１〜５アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ４は、Ｒ４が存在するそれぞれの場合において、水素またはＣ１〜５アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｑは、−（ＣＲａＲｂ）ｖ−であり、ＲａおよびＲｂは独立して水素またはＣ１〜５アルキルであり、ｖは２〜６の範囲の整数である。いくつかの実施形態において、Ａは次の構造（またはその変異体）を有する。
【化２】
2020504778.tif 000004
【０００９】
式中、Ｌは、Ｓ、Ｏ、またはＮである。いくつかの実施形態において、Ｇは、それぞれの場合、水素であるか、Ｌと一緒になって一酸化窒素供与体を形成するか、または実施形態によっては存在しない。いくつかの実施形態において、ｐは、１〜１０の範囲の整数である。いくつかの実施形態において、Ｂは水素、−Ｙ−Ｚ、およびＣ１〜５アルキルからなる群から選択される。この実施形態に応じて、Ｃ１〜５アルキルは、場合により、アミノ、ヒドロキシル、ニトリル、ＣＯ２Ｈ、モノ（Ｃ１〜６）アルキルアミノ−、ジ（Ｃ１〜６）アルキルアミノ−、−（ＣＯ）ＮＲｃＲｄまたは−ＮＲｃ（ＣＯ）Ｒｄで置換される。この実施形態に応じて、Ｃ１〜５アルキルにおけるこれらの置換の組み合わせを、この化合物において使用することができる。いくつかの実施形態において、ＲｃおよびＲｄはそれぞれ独立して水素およびＣ１〜６アルキルからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、Ｙは次の構造のうちの１つを有する。
【化３】
2020504778.tif 000005
【００１０】
いくつかの実施形態において、Ｒｐ、Ｒｑ、ＲｓおよびＲｔは、それぞれの場合において、独立して、水素またはヒドロキシルである。この実施形態に応じて、Ｙの構造の組み合わせをこの化合物において使用することができる。いくつかの実施形態において、ｋは１〜２０の範囲の整数である。いくつかの実施形態において、Ｚは、次の構造のうちの１つを有する。
【化４】
2020504778.tif 000006
【００１１】
いくつかの実施形態において、ｊは、それぞれの場合において、１〜１００の範囲の整数である。
【００１２】
いくつかの実施形態において、官能化アルギン酸塩は、式ＩＩの少なくとも１つのモノマーをさらに含む。
【化５】
2020504778.tif 000007
【００１３】
いくつかの実施形態において、一酸化窒素供与体は、ジアゼニウムジオラート、ニトロソチオール、ニトロソアミン、ヒドロキシルニトロソアミン、ヒドロキシルアミン、またはヒドロキシ尿素である。いくつかの実施形態において、一酸化窒素供与体の組み合わせが使用される。いくつかの実施形態において、官能化アルギン酸塩によって生成された一酸化窒素は、１つ以上の追加の一酸化窒素供給源（内在性一酸化窒素形成を増強する追加の化合物などの外因性または内在性のいずれか）で場合により補充することができる。いくつかの実施形態において、官能化アルギン酸塩は、一酸化窒素供与体としてジアゼニウムジオラートを使用する。いくつかの実施形態において、官能化アルギン酸塩は、Ｒ１およびＲ２が水素またはＣ１〜５アルキルであり、Ｒ３が水素であり、Ｒ４がそれぞれの場合において水素またはＣ１〜５アルキルであるように製剤される。いくつかの実施形態において、官能化アルギン酸塩は、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４が水素であるように製剤される。いくつかの実施形態において、官能化アルギン酸塩は、ｖが２または３であり、ＬがＮであり、ｐが１、２、または３となるように製剤される。いくつかの実施形態において、官能化アルギン酸塩は、Ｂが−Ｙ−Ｚであるように製剤される。いくつかの実施形態において、官能化アルギン酸塩は、Ｙが次の構造を有するように製剤される。
【化６】
2020504778.tif 000008
【００１４】
いくつかの実施形態において、官能化アルギン酸塩は、Ｚが次の構造を有するように製剤される。
【化７】
2020504778.tif 000009
【００１５】
いくつかの実施形態において、官能化アルギン酸塩は、Ｂが水素およびＣ１〜５アルキルからなる群から選択されるように製剤され、式中、Ｃ１〜５アルキルは場合によりアミノ、ヒドロキシル、ニトリル、ＣＯ２Ｈ、モノ（Ｃ１〜６）アルキルアミノ−、ジ（Ｃ１〜６）アルキルアミノ−、−（ＣＯ）ＮＲｃＲｄまたは−ＮＲｃ（ＣＯ）Ｒｄで置換され、ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、水素およびＣ１〜６アルキルからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、Ｂは水素または非置換Ｃ１〜５アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｂは水素またはＣ３アルキルである。いくつかの実施形態において、官能化アルギン酸塩は、−（Ｑ−Ａ−）ｐ−Ｂが次の構造を有するように製剤される。
【化８】
2020504778.tif 000010
【００１６】
いくつかの実施形態において、Ｇは構造ｖｉ、ｖｉｉ、ｖｉｉｉまたはｉｘ中の窒素と一緒になって一酸化窒素供与体を形成する。先に考察したように、この実施形態に応じて、一酸化窒素供与体は変更することができる。いくつかの実施形態において、一酸化窒素供与体はジアゼニウムジオラートである。
【００１７】
いくつかの実施形態において、官能化アルギン酸塩は、−（Ｑ−Ａ−）ｐ−Ｂが次の構造を有するように製剤される。
【化９】
2020504778.tif 000011
【００１８】
いくつかの実施形態において、Ｇは構造ｖｉｉ中の窒素と一緒になって一酸化窒素供与体を形成する。
【００１９】
式Ｉの１つ以上の共有結合的に修飾されたモノマー、
【化１０】
2020504778.tif 000012
【００２０】
および場合により、式ＩＩ’の少なくとも１つのモノマーを含む官能化アルギン酸塩も提供され、
【化１１】
2020504778.tif 000013
【００２１】
ここで、式Ｉの少なくとも１つのモノマーは一酸化窒素供与体を含有する。いくつかの実施形態において、Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ２、Ｒ２’、Ｒ３、およびＲ４はそれぞれ独立して、水素、−（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ−Ｈ、−（（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ−（ＣＨ２）ｏＨ、およびＣ１〜５アルキルからなる群から選択され、式中、ｍ、ｎ、およびｏは独立して０〜６の整数である。いくつかの実施形態において、Ｑは、−（ＣＲａＲｂ）ｖ−である。いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂは独立して水素である。いくつかの実施形態において、ｖは２〜６の整数である。いくつかの実施形態において、Ａは次式であり、
【化１２】
2020504778.tif 000014
式中、Ｌは、Ｓ、Ｏ、またはＮである。いくつかの実施形態において、Ｇは、それぞれの場合、水素であるか、Ｌと一緒になって一酸化窒素供与体を形成するか、または存在しない。いくつかの実施形態において、一酸化窒素供与体は、存在する場合、次式から選択される。
【化１３】
2020504778.tif 000015
【００２２】
いくつかの実施形態において、ｐは１〜１０の整数である。いくつかの実施形態において、Ｂは存在しないか、または水素、−Ｙ−Ｚ、およびＣ１〜５アルキルからなる群から選択され、ここでＣ１〜５アルキルは場合により、アミノ、ヒドロキシル、ニトリル、ＣＯ２Ｈ、モノ（Ｃ１〜６）アルキルアミノ−、ジ（Ｃ１〜６）アルキルアミノ−、−（ＣＯ）ＮＲｃＲｄまたは−ＮＲｃ（ＣＯ）Ｒｄで置換される。いくつかの実施形態において、ＲｃおよびＲｄはそれぞれ独立して水素およびＣ１〜６アルキルからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、Ｙは、次の構造を有する。
【化１４】
2020504778.tif 000016
【００２３】
いくつかの実施形態において、Ｒｐ、Ｒｑ、ＲｓおよびＲｔは、それぞれの場合において、独立して、水素またはヒドロキシルである。いくつかの実施形態において、ｋは１〜２０の整数である。いくつかの実施形態において、Ｚは、次式の構造を有し、
【化１５】
2020504778.tif 000017
式中、ｊは、それぞれの場合において、１〜１００の整数である。
【００２４】
いくつかの実施形態において、
【化１６】
2020504778.tif 000018
は、次のうちの１つ以上から選択される構造を有する。
【化１７】
2020504778.tif 000019
【００２５】
いくつかの実施形態において、
【化１８】
2020504778.tif 000020
は、次のうちの１つ以上から選択される構造を有する。
【化１９】
2020504778.tif 000021
【００２６】
いくつかの実施形態において、Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ２、Ｒ２’、Ｒ３、およびＲ４は水素である。
【００２７】
いくつかの実施形態において、官能化アルギン酸塩は水溶性である。いくつかの実施形態において、官能化アルギン酸塩は、官能化アルギン酸塩１ミリグラム当たり、約０．１〜０．３μｍｏｌ／ｍｇ、０．３〜０．５μｍｏｌ／ｍｇ、０．５〜０．７μｍｏｌ／ｍｇ、０．７〜０．９μｍｏｌ／ｍｇ、０．９〜１．０μｍｏｌ／ｍｇ、および終点を含むそれらの間のいずれかの貯蔵量を含む、０．１〜１．０μｍｏｌのＮＯの範囲の放出可能な総一酸化窒素貯蔵量を有する。いくつかの実施形態において、ＮＯ放出は、終点を含む、以下の間のいずれかの時間を含む、約０．１〜約０．５時間、約０．５〜約１時間、約１〜約２時間、約２〜約４時間、約４〜約６時間、約６〜約１０時間、約１０〜約１５時間約１５〜約２０時間、および約２０〜約２４時間を含む、０．１〜２４時間の範囲の半減期を有する。いくつかの実施形態において、ＮＯ放出の総持続時間は、約１〜約５時間、約５〜約１０時間、約１０〜約１５時間、約１５〜約２０時間、約２０〜約３０時間、約３０〜約５０時間、または約５０〜約６０時間、および終点を含むそれらの間のいずれかの時間を含む、１〜６０時間の範囲である。いくつかの実施形態において、これらのＮＯ放出特徴は、（有益な効果のうちでとりわけ）微生物量の低減を可能にする時間、所望の標的部位への有効量のＮＯの送達を可能にするので特に有利である。本明細書に開示された技術がない場合にＮＯの既知の短い半減期がＮＯの有用性を制限することを考慮すると、このことは特に有利である。いくつかの実施形態において、４時間後の総ＮＯ放出は、官能化アルギン酸塩１ミリグラム当たり０．１〜１．０μｍｏｌ範囲のＮＯである。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される化合物は、ＮＯを送達する他の方法と比較して、標的部位へのより高濃度のＮＯの送達を可能にするので、特に有利である。例えば、いくつかの実施形態において、本化合物（およびそれらの使用方法）は結果的に、約１０〜２０μＭ、２０〜約５０μＭ、５０〜約１００μＭ、１００〜約１５０μＭ、１５０〜約２００μＭ、２００〜約２５０μＭ、２５０〜約３００μＭ、３００〜約３５０μＭ、３５０〜約４００μＭ、４００〜約４５０μＭ、４５０〜約５００μＭ、および終点を含む列挙されたもののうちのいずれかの濃度を含む、約１０〜５００μＭのＮＯ濃度を標的部位で生じる。いくつかの実施形態において、これらの濃度は、他のＮＯ送達方法によって達成されるものを超過する時間にわたって維持される。例えば、いくつかの実施形態において、ＮＯの殺菌濃度は、約１時間、約２時間、約４時間、約８時間、約１２時間、約１８時間、または約２４時間（または終点を含むそれらの間のいずれかの時間）にわたって維持される。
【００２８】
いくつかの実施形態において、官能化アルギン酸塩中のモノマーの１５％以上が式Ｉのモノマーである。いくつかの実施形態において、官能化アルギン酸塩は１〜６００ｋＤａの範囲の分子量を有する。いくつかの実施形態において、官能化アルギン酸塩は、式Ｉの２つ以上の異なる共有結合的に修飾されたモノマーを有する。
【００２９】
本明細書では、いくつかの実施形態において、一酸化窒素（ＮＯ）放出水溶性官能化アルギン酸塩を含む微生物低減用化合物も提供され、この官能化アルギン酸塩は、アルギン酸塩の少なくとも繰り返し単位へ共有結合したアミン含有基を含み、アミン含有基は、ＮＯ供与体を含み、ＮＯ供与体はＮＯを生成し、微生物ＤＮＡおよび膜構造への酸化的損傷および／またはニトロソ化による損傷を誘発し、それにより微生物量を低減させる。いくつかの実施形態において、この化合物中の繰り返し単位の少なくとも１５％は式Ｉのモノマーである。いくつかの実施形態において、この化合物は場合により、式ＩＩ’の少なくとも１つの繰り返し単位をさらに含む。いくつかの実施形態において、この化合物はニトロソアミンの形成を結果的に生じない。
【００３０】
水溶性官能化アルギン酸塩の少なくとも１つの繰り返し単位へ結合したアミン含有基を含む当該アルギン酸塩を含む、微生物量の低下および粘液粘弾性の低減のための二重作用化合物も本明細書に提供されており、ここで、アミン含有基は、ＮＯを生成するＮＯ供与体を含み、ＮＯは、微生物ＤＮＡおよび膜構造への損傷を誘発し、それによって微生物量を低減させ、このＮＯは、粘液層におけるムチン間相互作用を破壊し、それによって粘液粘弾性を低下させる。いくつかの実施形態において、ＮＯのジスルフィド還元反応性は、少なくとも部分的には、粘液粘度の低減を招来する。いくつかの実施形態において、粘液粘度の低減は、その後のＮＯ処置の有効性を増強することができ、および／または微生物量をさらに制御する対象の生得的免疫系の能力を向上させることができる。いくつかの実施形態において、二重作用化合物はニトロソアミンの形成を結果的に生じない。
【００３１】
本明細書では、いくつかの実施形態において、足場に結合したアミン含有基を含む水溶性一酸化窒素（ＮＯ）放出足場を含む微生物低減用化合物も提供され、ここでアミン含有基はＮＯ供与体を含み、ここで、ＮＯ供与体は、ＮＯを生成し、微生物ＤＮＡおよび膜構造への酸化的損傷および／またはニトロソ化による損傷を誘発し、それにより微生物量を低減させる。いくつかの実施形態において、足場は生体高分子を含む。いくつかの実施形態において、生体高分子は、とりわけ本明細書に開示されているキトサン、アルギン酸塩、またはヒアルロン酸である。いくつかの実施形態において、水溶性一酸化窒素（ＮＯ）放出足場は、キトサンもしくはヒアルロン酸を含まないか、および／または欠いている。いくつかの実施形態において、水溶性一酸化窒素（ＮＯ）放出足場はデンドリマーを含まないか、および／または欠いている。いくつかの実施形態において、水溶性一酸化窒素（ＮＯ）放出足場は、ポリアミドアミンもしくはポリウレタンを含まないか、および／または欠いている。いくつかの実施形態において、一酸化窒素放出足場はニトロソアミンの形成を結果的に生じない。
【００３２】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される官能化ＮＯ放出アルギン酸塩のうちのいずれかと、薬学的に許容される賦形剤と、を含む医薬製剤も本明細書に提供される。
【００３３】
本明細書に開示されるような官能化アルギン酸塩を調製するための方法も提供される。例えば、いくつかの実施形態において、方法は、式ＩＩＩのアミン
【化２０】
2020504778.tif 000022
をペプチド結合試薬の存在下でアルギン酸塩と接触させて、式Ｉの修飾されたモノマーを形成することと
【化２１】
2020504778.tif 000023
式Ｉの共有結合的に修飾されたモノマーを含有するアルギン酸塩を一酸化窒素源と接触させて、先に説明したような官能化アルギン酸塩を形成することと、を含む。いくつかの実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｑ、Ａ、Ｂおよび／またはｐは、先に説明したとおりである。いくつかの実施形態において、Ｒ１およびＲ２は水素またはＣ１〜５アルキルであり、Ｒ３は水素またはＣ１〜５アルキルであり、Ｒ４はそれぞれの場合において水素またはＣ１〜５アルキルであり、ｖは２または３であり、ＬはＮであり、ｐは１〜３の整数である。いくつかの実施形態において、−（Ｑ−Ａ−）ｐ−Ｂは、次の構造を有する。
【化２２】
2020504778.tif 000024
【００３４】
いくつかの実施形態において、Ｇは窒素と一緒になって一酸化窒素供与体を形成する。いくつかの実施形態において、方法は、一酸化窒素供与体としてジアゼニウムジオラートを使用することを含む。いくつかの実施形態において、結果的に生じる官能化アルギン酸塩は水溶性である。
【００３５】
有効量の本明細書に開示される官能化アルギン酸塩のいずれかを対象へ投与することを含む、対象へ一酸化窒素を送達するための方法も本明細書に提供される。疾患状態を処置する方法もまた本明細書に提供され、いくつかの実施形態において、本方法は、処置を必要とする対象へ有効量の本明細書に開示される官能化アルギン酸塩のいずれかを投与することを含み、疾患状態は、癌、心血管疾患、微生物感染症、医療機器への血液の曝露によって引き起こされる血小板凝集および血小板粘着、異常な細胞増殖から結果として生じる病理学的容態、移植拒絶反応、自己免疫疾患、炎症、血管疾患、瘢痕組織、創傷収縮、再狭窄、疼痛、発熱、消化管障害、呼吸器障害、性機能障害、ならびに性感染症からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、疾患状態は微生物感染症である。いくつかの実施形態において、疾患状態は嚢胞性線維症である。
【００３６】
本明細書では、嚢胞性線維症の処置のための薬剤の調製における化合物の使用も本明細書に提供され、当該化合物が水溶性官能化アルギン酸塩の少なくとも１つの繰り返し単位へ結合したアミン含有基を含む当該アルギン酸塩を含み、当該アミン含有基は、ＮＯを生成するＮＯ供与体を含み、当該ＮＯは微生物ＤＮＡおよび膜構造への損傷を誘発し、それにより微生物量を低減させ、当該ＮＯは粘液層におけるムチン間相互作用を破壊し、それにより粘液粘弾性を減少させ、当該粘液粘弾性の低下は微生物の肺クリアランスの改善を可能にする。いくつかの実施形態において、当該化合物は嚢胞性線維症に罹患している対象の肺への送達用に製剤される。いくつかの実施形態において、当該化合物は、嚢胞性線維症に罹患している対象への少なくとも１日２回の送達のために製剤される。
【００３７】
いくつかの実施形態において、化合物を複数の微生物で汚染された表面に適用することを含む、表面上の微生物量を低減させる方法が本明細書に提供され、当該化合物は、一酸化窒素（ＮＯ）放出水溶性官能化アルギン酸塩を含み、当該官能化アルギン酸塩は、当該アルギン酸塩の少なくとも繰り返し単位へ共有結合したアミン含有基を含み、当該アミン含有基はＮＯ供与体を含み、ＮＯ供与体はＮＯを生成し、微生物ＤＮＡおよび膜構造への酸化的損傷および／またはニトロソ化による損傷を誘発し、それにより、微生物量を低減させ、複数の微生物は、次のもの、すなわちグラム陽性菌、グラム陰性菌、真菌、酵母、およびウイルス、のうちの２つ以上を含む。いくつかの実施形態において、表面は有機表面である。いくつかの実施形態において、表面はヒトの皮膚である。いくつかの実施形態において、化合物の適用は皮膚刺激を誘発しない。いくつかの実施形態において、表面は動物の皮膚である。いくつかの実施形態において、化合物の適用は皮膚刺激を誘発しない。いくつかの実施形態において、表面はヒト気道組織である。いくつかの実施形態において、化合物の適用（例えば、吸入）は気道上皮細胞の刺激を誘発しない。いくつかの実施形態において、表面は無機表面である。いくつかの実施形態において、無機表面は医療機器の外面または内面である。いくつかの実施形態において、化合物の適用は、医療機器の外面または内面に抗菌コーティングを生成する。いくつかの実施形態において、医療機器は内視鏡を含む。
【００３８】
いくつかの実施形態において、低減および／または除去されることになっている微生物量は薬物耐性菌を含む。いくつかの実施形態において、薬物耐性細菌はカルバペネム耐性腸内細菌科群（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）を含む。いくつかの実施形態において、薬剤耐性細菌は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）を含む。いくつかの実施形態において、微生物は、ヒト免疫不全ウイルス、単純ヘルペスウイルス、パピローマウイルス、パラインフルエンザウイルス、インフルエンザ、肝炎、コクサッキーウイルス、帯状疱疹、麻疹、おたふく風邪、風疹、狂犬病、肺炎、出血性ウイルス熱、Ｈ１Ｎ１など）、プリオン、寄生虫、真菌、カビ、酵母、ならびに、とりわけ、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ））、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ））および黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ））を含む細菌（グラム陽性およびグラム陰性の両方）、Ａ群連鎖球菌（Ｇｒｏｕｐ  Ａ  ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ならびに種々の薬剤耐性細菌を含む。微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）および微生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）という用語は相互交換可能に使用されるものとする。微生物は、野生型、遺伝子操作された、または改変された生物を含むことができる。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されている製剤および方法は、局所使用または表面の処置のためのものである。
【００３９】
いくつかの実施形態において、複数の微生物で汚染された表面を、一酸化窒素（ＮＯ）放出水溶性官能化アルギン酸塩を含む化合物と接触させることを含む、微生物感染症を処置する方法が提供され、当該官能化アルギン酸塩は、当該アルギン酸塩の少なくとも繰り返し単位へ共有結合したアミン含有基を含み、当該アミン含有基はＮＯ供与体を含み、当該ＮＯ供与体はＮＯを生成し、微生物の膜および／またはＤＮＡへの損傷を誘発し、それにより生存可能な微生物の数を減少させ、感染を処置し、複数の微生物は、ウイルス、グラム陽性菌、グラム陰性菌、薬剤耐性菌、カビ、酵母、真菌、およびこれらの組み合わせのうちの１つ以上を含む。
【００４０】
いくつかの実施形態において、粘液層を含む表面を、一酸化窒素放出水溶性官能化アルギン酸塩を含む化合物と接触させることを含む、粘液層の粘弾性を低減させる方法が提供され、当該官能化アルギン酸塩は、アルギン酸塩の少なくとも繰り返し単位へ共有結合したアミン含有基を含み、当該アミン含有基は一酸化窒素供与体を含み、一酸化窒素供与体は一酸化窒素を生成し、一酸化窒素は粘液層中のムチン間相互作用を破壊し、それにより粘液粘弾性を減少させる。いくつかの実施形態において、粘液層は複数の微生物の存在から結果的に生じる。いくつかの実施形態において、微生物は黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）を含む。いくつかの実施形態において、微生物は緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）を含む。いくつかの実施形態において、微生物はバークホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）を含む。いくつかの実施形態において、微生物は嚢胞性線維症の発症に起因する。いくつかの実施形態において、本方法は、粘液層を抗菌薬と接触させることをさらに含む。いくつかの実施形態において、抗菌薬はアモキシシリンである。いくつかの実施形態において、抗菌薬はセフジニルである。いくつかの実施形態において、抗菌薬はテトラサイクリンである。
【００４１】
実施形態に応じて、本方法および使用は、局所経路を介した投与、注射を介した投与、経口摂取を介した投与、または吸入を介した投与のために製剤された、本明細書に開示されている化合物を使用する。いくつかの実施形態において、本経路は吸入であり（例えば、吸入器を経る）、無放出化合物の方法および使用は嚢胞性線維症の処置のためのものである。
【００４２】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される発明対象は、Ｎ−ジアゼニウムジオラートＮＯ供与体で修飾して多様で調整可能な放出動態を可能にするＮＯ放出生体高分子を生成することができる小分子ポリアミンを有する官能化高分子量アルギン酸塩に関する。アルギン酸塩骨格中の少なくとも１つの構造単位は、式Ｉの構造単位を含有する。
【化２３】
2020504778.tif 000025
【００４３】
場合により、アルギン酸塩の少なくとも１つの構造単位は、式ＩＩの構造単位および／または式ＩＩ’の構造単位をさらに含む。
【化２４】
2020504778.tif 000026
【００４４】
有利には、いくつかの実施形態において、本明細書に説明するアルギン酸塩は水溶性であり、ＮＯ貯蔵およびＮＯ放出動態に関して調整可能であり、ならびに／またはＮＯを標的へ送達することができる。
【００４５】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される発明対象は、式Ｉの少なくとも１つの構造単位および／または、場合により、式ＩＩの少なくとも１つの構造単位を含むアルギン酸塩を調製する方法に関する。
【００４６】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されている発明対象は、ＮＯを対象へ送達および／または放出する方法に関する。いくつかの実施形態において、本方法は、式Ｉの少なくとも１つの構造単位および／または、場合により、式ＩＩの少なくとも１つの構造単位を含むアルギン酸塩を対象へ投与することを含む。
【００４７】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されている発明対象は、対象の疾患状態を処置する方法に関する。いくつかの実施形態において、本方法は、式Ｉの少なくとも１つの構造単位および／または、場合により、式ＩＩの少なくとも１つの構造単位を含むアルギン酸塩を対象へ投与することを含む。
【００４８】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される発明対象は、式Ｉの少なくとも１つの構造単位および／または、場合により、式ＩＩの少なくとも１つの構造単位を含むアルギン酸塩と、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤と、を含む医薬組成物に関する。
【００４９】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される発明対象は、式Ｉの少なくとも１つの構造単位および／または、場合により、式ＩＩの少なくとも１つの構造単位を含むアルギン酸塩を用いることによって、バイオフィルムを破壊、根絶、および／または防止する方法に関する。
【００５０】
本明細書に説明するいくつかの実施形態において、ＮＯは、一酸化窒素放出足場のいずれかから放出および／または生成される。他の実施形態において、ＮＯ、ＮＯ＋およびＮＯ−のうちの１つ以上は、一酸化窒素放出足場のいずれかから放出および／または生成される。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】ＮＯ放出アルギン酸塩の実施形態からの最初の１時間のリアルタイムＮＯ放出特性（図１Ａ）および総ＮＯ放出対時間のプロット（図１Ｂ）を示す。
【図２】ＮＯ放出アルギン酸塩の実施形態についての時間ベースの殺菌有効性を示す。図２Ａは、８ｍｇ／ｍＬ濃度でのＮＯ放出アルギン酸塩材料の実施形態についての殺菌有効性を示す。図２Ｂは、２４時間時の個々の最小バイオフィルム根絶濃度（ＭＢＥＣ２４時間）における迅速なＮＯ放出アルギン酸塩の実施形態の殺菌有効性を示す。
【図３】対照およびＮＯ放出アルギン酸塩の実施形態へ曝露されたＡ５４９細胞の生存度を示す。具体的には、（図３Ａ）緑膿菌および（図３Ｂ）黄色ブドウ球菌に対するＭＢＥＣ２４時間時においてである。試験は、標準偏差を表すエラーバーを伴う少なくとも３つの実験からなった。
【図４−１】Ｄ２Ｏにおける、Ａｌｇ−ＤＥＴＡの実施形態（図４Ａ）、（図４Ｂ）Ａｌｇ−ＤＰＴＡの実施形態、（図４Ｃ）Ａｌｇ−ＰＡＰＡの実施形態、および（図４Ｄ）Ａｌｇ−ＳＰＥＲの実施形態の代表的な１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す。
【図４−２】同上
【図５−１】Ｄ２Ｏにおける（図５Ａ）Ａｌｇ−ＤＥＴＡの実施形態、（図５Ｂ）Ａｌｇ−ＤＰＴＡの実施形態、（図５Ｃ）Ａｌｇ−ＰＡＰＡの一実施形態、および（図５Ｄ）Ａｌｇ−ＳＰＥＲの実施形態の代表的な１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルを示す。
【図５−２】同上
【図６−１】（図６Ａ）Ａｌｇ−ＤＥＴＡ／ＮＯの第二級アミンおよびＮ−ジアゼニウムジオラートアルギナートの実施形態、（図６Ｂ）Ａｌｇ−ＤＰＴＡ／ＮＯの実施形態、（図６Ｃ）Ａｌｇ−ＰＡＰＡ／ＮＯの実施形態、および（図６Ｄ）Ａｌｇ−ＳＰＥＲ／ＮＯの実施形態についての代表的な紫外可視スペクトルを示す。
【図６−２】同上
【図７】浮遊性（図７Ａ）緑膿菌および（図７Ｂ）黄色ブドウ球菌に対するＮＯ放出アルギン酸塩（黒色マーカー）および対照アルギン酸塩（白色マーカー）の実施形態の抗菌有効性を示す。すべての測定について、ｎ≧３のプールされた実験とした。
【図８】は、（図８Ａ）緑膿菌および（図８Ｂ）黄色ブドウ球菌のバイオフィルムに対する、ＮＯ放出アルギン酸塩（黒色マーカー）および対照アルギン酸塩（白色マーカー）の実施形態の抗バイオフィルム有効性を示す。すべての測定について、ｎ≧３のプールされた実験とした。
【図９−１】（図９Ａ）ＰＢＳ（ｐＨ７．４）および３２ｍｇ／ｍＬの（図９Ｂ）アルギン酸塩、（図９Ｃ）Ａｌｇ−ＳＰＥＲの実施形態、ならびに（図９Ｄ）Ａｌｇ−ＳＰＥＲ／ＮＯの実施形態で２４時間処理したＡ５４９細胞の代表的な顕微鏡画像を示す。
【図９−２】同上
【図１０】Ａｌｇ−ＤＥＴＡ／ＮＯ放出アルギン酸塩の実施形態の紫外可視スペクトルを示す。３３０ｎｍ付近の領域は、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中での２４時間のＮＯ放出の後でさえもニトロソアミン形成に相当する鋭いピークが存在しないことを強調するために四角で囲まれている。
【図１１】Ａｌｇ−ＤＰＴＡ／ＮＯ放出アルギン酸塩の実施形態の紫外可視スペクトルを示す。３３０ｎｍ付近の領域は、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中での２４時間のＮＯ放出の後でさえもニトロソアミン形成に相当する鋭いピークが存在しないことを強調するために四角で囲まれている。
【図１２】Ａｌｇ−ＰＡＰＡ／ＮＯ放出アルギン酸塩の実施形態の紫外可視スペクトルを示す。３３０ｎｍ付近の領域は、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中での２４時間のＮＯ放出の後でさえもニトロソアミン形成に相当する鋭いピークが存在しないことを強調するために四角で囲まれている。
【図１３】Ａｌｇ−ＳＰＥＲ／ＮＯ放出アルギン酸塩の実施形態の紫外可視スペクトルを示す。３３０ｎｍ付近の領域は、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中での２４時間のＮＯ放出の後でさえもニトロソアミン形成に相当する鋭いピークが存在しないことを強調するために四角で囲まれている。
【図１４】ＨＢＥムチンへ曝露されてキトサンオリゴ糖（ＣＳＯ）へと酸化的に分解される間の経時的な散逸変化を示す。３、５、７、９、１１、１３番目の倍音を示す。黒色の矢印はＰＢＳによるすすぎを示し、破線の矢印はＣＳＯ−１の導入を示す。
【図１５】アルギン酸塩の経時的な散逸変化を示す。３、５、７、９、１１、１３番目の倍音を示す。黒色の矢印はＰＢＳによるすすぎを示し、破線の矢印はＡｌｇの導入を示す。
【図１６】図１６Ａは弾性係数（実線）および粘性係数（縞状）を示し、図１６Ｂは３７℃でアルギン酸塩生体高分子を用いた１８時間処理の後の１０ｒａｄ／秒のＨＢＥ粘液での複合体粘度を示す。（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。
【図１７】図１７Ａは弾性係数（実線）および粘性係数（縞状）を示し、図１７Ｂは３７℃でＡＯＤおよびＨＡ生体高分子を用いた１８時間処理の後の１０ｒａｄ／ｓのＨＢＥ粘液での複合体粘度を示す。（＊ｐ＜０．０１、＊＊ｐ＜０．００１）。
【図１８】は弾性係数（実線）と粘性係数（縞状）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
新たな抗菌薬が必要とされており、一酸化窒素（ＮＯ）は、微生物のＤＮＡおよび膜構造に対する酸化的損傷およびニトロソ化による損傷を生じるＮＯ副産物（例えば、）主に酸化的原因となる反応性ＮＯ副生成物（例えば、ペルオキシ亜硝酸および三酸化二窒素）の形成を主として通じて、浮遊性細菌およびバイオフィルムの両方を根絶することができる内在的に産生される広範囲の抗菌薬である。ＮＯがその抗菌効果を発揮する広範な機序により、細菌が耐性を促進することはありそうもない。しかしながら、気体状ＮＯを送達することと関係する困難さのため、特定の環境条件下でＮＯを貯蔵および放出することができる分子状ＮＯ供与体の使用が必要となる。特に、Ｎ−ジアゼニウムジオラートＮＯ供与体は、生理学的条件におけるそれらの自発的なプロトン開始性ＮＯ放出のために、制御されたＮＯ送達における用途について関心を集めてきた。ＮＯ放出動態は、本明細書に説明されるように、いくつかのパラメータ、例えば、ｐＨ、温度、および前駆体アミンの化学構造に基づいて調整することができる。低分子量のＮ−ジアゼニウムジオラートＮＯ供与体が処置薬として広く利用されてきたが、特定の作用部位への間接的なＮＯ送達および標的外毒性は依然として問題のままである。したがって、関心対象の部位でＮＯ放出を制御および局在化するように調整することができる代替的な送達薬としての巨大分子ＮＯ放出足場（例えば、デンドリマー、シリカナノ粒子）の開発についての必要性がある。
【００５３】
いくつかの実施形態は、一酸化窒素（ＮＯ）を貯蔵および放出するように化学的に修飾された高分子量アルギン酸塩に関する。いくつかの実施形態において、アルギン酸塩のカルボン酸部分はまず、カップリングの化学的性質（例えば、カルボジイミドの化学的性質）を使用して一連の小分子アミン基で修飾される。いくつかの実施形態において、カップリング反応は、第二級アミンを含むアルギン酸塩を結果的に生じる。いくつかの実施形態において、第二級アミンを加圧ＮＯガスと反応させて、Ｎ−ジアゼニウムジオラートＮＯ供与体を形成する。いくつかの実施形態において、本明細書に説明する結果的に生じるＮＯ放出性巨大分子アルギン酸塩は、ある範囲のＮＯ放出（μｍｏｌ  ＮＯ・ｍｇ−１）特性を有する。いくつかの実施形態において、結果的に生じるＮＯ放出性巨大分子アルギン酸塩は、多様なＮＯ放出動態（例えば、ｔ１／２）を有する。いくつかの実施形態において、アルギン酸塩の放出動態は前駆体アミン構造に依存する。
【００５４】
キトサン、セルロースなどのような生体巨大分子は、それらの低い毒性および生分解性のために潜在的なＮＯ供与体足場を表す。しかしながら、ＰＬＧＡおよびキトサンなどのポリマーに基づく高分子量生体巨大分子は、低い水溶性および低い一酸化窒素量を有する。いくつかの実施形態において、本開示の一酸化窒素（ＮＯ）放出アルギン酸塩は、有利には生分解性、水溶性、および／またはＮＯ充填、貯蔵、および放出に関して調整可能である。いくつかの実施形態において、これらの特性のうちの１つ以上は、処置における、および／または水溶性処置が例えば細菌の処置において有利である疾患状態を処置することにおける本開示のアルギン酸塩の有用性に寄与する。いくつかの実施形態によると、本開示の官能化ＮＯ放出アルギン酸塩が有する既知のＮＯ放出粒子を超えるいくつかの利点としては、次のうちの１つ以上が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５５】
１）いくつかの実施形態において、アミン含有鎖を非官能化アルギン酸塩と接触させることによって生成される、効率的かつ独特な合成経路および結果として生じる化学組成物。
【００５６】
２）生成された一酸化窒素放出足場のＮＯ貯蔵およびＮＯ放出動態は、特定の用途に合わせて調整することができる。この調整は、いくつかの実施形態において、例えば、式Ｉの官能化モノマーの種類および／または数を変更することによって達成される。いくつかの実施形態において、例えば、異なる疎水性／親水性の化合物による、生成された酸化窒素放出足場中のアミンのさらなる官能化はさらに、ＮＯ放出動態の制御を可能にする。実際に、優れたＮＯ貯蔵は、現在開示されている官能化アルギン酸塩によって観察された。
【００５７】
３）粒子とは対照的に、本明細書に説明する官能化アルギン酸塩は水溶性であり、水溶性が望まれる生物医学的用途を含む、より広範な範囲の用途を容易にする。ＮＯ放出性キトサンは水溶性ではないと考えられている。したがって、いくつかの実施形態において、本開示の水溶性官能化アルギン酸塩は、バイオフィルムに容易に浸透し根絶することができ、ならびに
【００５８】
４）有害作用を有する可能性のある副産物または化合物の発生の低減。例えば、ニトロソアミンの存在は、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中での２４時間のＮＯ放出の後でさえも、本明細書で開示および／または検査されたいかなるＮＯ放出アルギン酸塩についても紫外可視スペクトルにおいて観察されなかった。したがって、いくつかの実施形態において、ニトロソアミンの形成は、実質的なＮＯ放出の前または後に紫外可視スペクトルによって検出することができない。ニトロソアミンは動物における癌の形成に連関してきた。
【００５９】
いくつかの実施形態において、第二級アミン基は、Ｎ−ジアゼニウムジオラートの安定性に直接影響を及ぼし、ＮＯ貯蔵および放出の両方の動態に対する制御を可能にする。ＮＯ放出性材料の抗菌有効性は、ＮＯ負荷量および関連する放出動態の両方に依存している。ＮＯ放出動態、総ＮＯ貯蔵、およびアミン構造に関するアルギン酸塩の殺菌有効性が本明細書に開示されている。
【００６０】
本明細書に説明する発明対象は、異なる形態で具現化することができ、本明細書に明らかにする実施形態に限定されると解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施形態は説明のために提供されており、それにより、本開示は徹底的かつ完全であり、本発明の対象の範囲を当業者に伝えるであろう。例えば、一実施形態に関して説明される特徴は他の実施形態へと組み込むことができ、特定の実施形態に関して説明された特徴を削除して別の実施形態を提供することができる。さらに、本明細書で示唆された実施形態に対する多数の変形および追加は、本開示の点において本明細書で企図され、それらは本発明の対象から逸脱しない。
【００６１】
別途定義されない限り、本明細書において使用される技術用語および科学用語はすべて、当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書の発明の対象の説明に使用される用語は、特定の実施形態を説明する目的のためだけであって、発明の対象を限定することを意図するものではない。
【００６２】
本明細書で使用する場合、「ａ」、「ａｎ」、または「ｔｈｅ」は、１つまたは１つ超を意味し得る。例えば、「ａ」ＮＯ放出部分は、単一または多数を意味し得る。
【００６３】
また、本明細書で使用する場合、「および／または」は、関連する列挙された項目のうちの１つ以上のいかなるおよびすべての可能な組み合わせ、ならびに代替物（「または」）で解釈されるときの組み合わせの欠如を指し、これを包含する。
【００６４】
さらに、本発明の対象の化合物または薬剤の量、用量、時間、温度などの測定可能な値を指すときに本明細書で使用される「約」という用語は、指定された量の±２０％、±１０％、±５％、±１％、±０．５％、またはさらには±０．１％の変化を包含するよう意図される。
【００６５】
「有効量」という用語は、本明細書で使用する場合、当該技術分野で周知であろうように、例えば、対象の容態の（例えば、１つ以上の症状の）改善、容態の進行の遅延もしくは低減、障害の発症の予防もしくは遅延、および／または臨床パラメータ、疾患もしくは病気における変化などを含む、障害、疾患または病気に罹患している対象への有益な効果であり得る調節効果を与える官能化アルギン酸塩の量を指す。例えば、有効量は、対象の容態を少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％改善する組成物、化合物、または薬剤の量を指すことができる。いくつかの実施形態において、容態の改善は感染の低減であり得る。いくつかの実施形態において、改善は、表面上のまたは対象内の細菌量（例えば、汚染微生物数）の低減であり得る）。いくつかの実施形態において、粘液層の厚さ、産生または他の特徴の低減とは改善である。本開示の発明の対象の有効組成物中の有効成分の実際の薬用量レベルは、特定の対象および／または用途に対して所望の応答を達成するのに有効である量の有効化合物（複数可）を投与するように変えることができる。選択された薬用量レベルは、組成物の活性、製剤、投与経路、他の薬物または処置との組み合わせ、処置されている容態の重症度、および処置されている対象の健康状態および以前の病歴を含む種々の因子に依存するであろう。好ましくは、最低減の用量が投与され、用量は、用量制限毒性の非存在下で最小有効量まで漸増される。有効量の決定および調整、ならびにこのような調整をいつおよびどのように行うかの評価が、本明細書で企図される。
【００６６】
「処置する」または「処置すること」または「処置」は、当該技術分野で周知であろうような、障害、疾患または病気に罹患している対象の容態の（１つ以上の症状の）改善、容態の進行の遅延もしくは低減、および／または臨床パラメータ、疾患もしくは病気の変化などを含む、当該対象に、例えば、有益な効果であり得る調節効果を与えるいずれかの種類の作用を指す。
【００６７】
「破壊すること」および「根絶すること」という用語は、本明細書に開示されている官能化アルギン酸塩がバイオフィルムと戦う能力を指す。バイオフィルムは部分的に根絶されるかまたは破壊されることがあり、これは細胞がもはや互いにまたは表面に付着しないことを意味する。バイオフィルムは完全に根絶されることがあり、これはバイオフィルムがもはや実質的な程度まで、相互接続された、凝集したまたは連続的な細胞ネットワークではないことを意味する。この実施形態に応じて、バイオフィルム（または細菌）は少なくとも約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％またはそれより多く低減する。いくつかの実施形態において、バイオフィルムは、例えば感染症の症状の出現を引き起こす環境（例えば、局所的環境）を創出することがもはやできないように、実質的に根絶される。
【００６８】
本明細書で使用する場合、「水溶性」という用語は、アルギン酸塩が水に溶解することができることを意味する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示する水溶性官能化アルギン酸塩は、１ｍＬの水当たり２０ｍｇ超の官能化アルギン酸塩が溶解するように可溶性である。いくつかの実施形態において、本明細書に開示する水溶性官能化アルギン酸塩は、１ｍＬの水当たり５０ｍｇ超の官能化アルギン酸塩が溶解するように可溶性である。いくつかの実施形態において、本明細書に開示する水溶性官能化アルギン酸塩は、１ｍＬの水当たり７５ｍｇ超の官能化アルギン酸塩が溶解するように可溶性である。いくつかの実施形態において、本明細書に開示する水溶性官能化アルギン酸塩は、１ｍＬの水当たり１００ｍｇ超の官能化アルギン酸塩が溶解するように可溶性である。いくつかの実施形態において、本明細書に開示する水溶性官能化アルギン酸塩は、約１０ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、７５ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ以上の濃度、または上述の値を含むおよび／もしくはそれらを網羅する範囲まで水中で可溶性であるものである。
【００６９】
本明細書で使用する場合、「高分子量」という用語は、ポリマーが１０ｋＤａ超の分子量を有することを意味する。特に有用なアルギン酸塩は、１０ｋＤａ〜１０００ｋＤａ、５０ｋＤａ〜８００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜６００ｋＤａ、または３００ｋＤａ〜４００ｋＤａの範囲の大きさであり得るポリマーである。いくつかの実施形態において、「高分子量」ポリマーは、約１０ｋＤａ、５０ｋＤａ、２００ｋＤａ、３００ｋＤａ、４００ｋＤａ、６００ｋＤａ、８００ｋＤａ、１０００ｋＤａ、または上述の値を含むもしくはそれらを網羅する範囲の分子量を有するものである。
【００７０】
「一酸化窒素供与体」または「ＮＯ供与体」という用語は、一酸化窒素種の生物活性が、意図された作用部位で発現するように、一酸化窒素種を供与、放出および／または直接的にもしくは間接的に移動させ、および／またはインビボで一酸化窒素の内在性産生を刺激するおよび／またはインビボで一酸化窒素の内在性レベルを上昇させる種を指す。
【００７１】
「一酸化窒素放出」という用語は、一酸化窒素の３つの酸化還元形態（ＮＯ＋、ＮＯ−、ＮＯ）のうちのいずれか１つ（または２つ以上）を供与、放出および／または直接的にもしくは間接的に移動させる種、ならびに／あるいは一酸化窒素の３つの酸化還元形態（ＮＯ＋、ＮＯ−、ＮＯ）のうちのいずれか１つ（または２つ以上）を供与、放出および／または直接的にもしくは間接的に移動させる方法を指す。いくつかの実施形態において、一酸化窒素種の生物活性が、意図する作用部位で発現するように、一酸化窒素放出が達成される。
【００７２】
本明細書で使用する場合の「微生物感染症」という用語は、細菌、真菌、ウイルス、酵母感染症、および他の微生物、ならびにそれらの組み合わせを指す。
【００７３】
本明細書に開示する多くの実施形態において処置される「患者」または「対象」は、いくつかの実施形態において、ヒト患者であるが、本開示の発明の対象の原理は本開示の発明の対象が「対象」および「患者」という用語に含まれるよう意図されている、哺乳類を含むすべての脊椎動物種に関して有効であることを示すことを理解されることになっている。適切な対象は概して哺乳類対象である。本明細書に説明する発明の対象は、研究ならびに獣医学的および医学的用途における使用を見出している。本明細書で使用する「哺乳類」という用語は、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギ、げっ歯類（例えば、ラットまたはマウス）、サルなどを含むが、これらに限定されない。ヒト対象は、新生児、乳児、年少者、成人および老人の対象を含む。
【００７４】
いくつかの実施形態において、対象とは、本明細書に開示する方法を必要とする対象が、疾患状態を経験しているおよび／または疾患状態を経験すると予想される対象であり得、本明細書に説明する発明の対象の方法および組成物は、治療的および／または予防的処置に用いられる。
【００７５】
本明細書で使用する場合、「官能化アルギン酸塩」という用語は、１つ以上の共有結合的に修飾されたモノマーを含有するアルギン酸塩ポリマーを指す。このような「官能化アルギン酸塩」は、一酸化窒素供与体部分が結合していてもいなくてもよい。「共有結合的に修飾されたモノマー」は、本明細書で使用する場合、マンヌロン酸および／またはグルロン酸モノマーの類似体または誘導体であるモノマーを指す。「モノマー」という用語は、例えば、アルギン酸塩を形成するために他の糖と結合していてもいなくてもよい単一の単位を指す。モノマーという用語は、したがって、ポリマー鎖中のモノマー単位（例えば、繰り返し単位）を含む。モノマーの非限定的な例は、グルロン酸およびマンヌロン酸である。
【００７６】
アルギン酸塩は、藻類源から収穫された天然に存在するアニオン性ポリマーであり、１，４結合α−ｌ−グルロン酸（Ｇ）およびβ−ｄ−マンヌロン酸（Ｍ）単位から構成される。
【化２５】
2020504778.tif 000027
【００７７】
アルギン酸塩は、高分子量（２００ｋＤａ超を超えるものを含む）でさえその水溶性を維持する生体高分子である。有利なことに、本明細書に開示する官能化アルギン酸塩は水溶性である。いくつかの実施形態において、本明細書に開示する官能化アルギン酸塩は、本明細書の他所に開示するように、１００ｍｇ／ｍＬ以上の溶解度を有する。アルギン酸塩は、創傷包帯、薬物送達ビヒクル、および嚢胞性線維症のためのムチン修飾剤などのようなものを含む、多数の生物医学的用途において使用されてきた。アルギン酸塩は、ヒドロキシルおよびカルボン酸官能基を使用して化学的に修飾され得る。有用なアルギン酸塩の有利な特徴は、ＮＯ放出アルギン酸塩を形成するために本明細書に説明する方法により誘導体化される、炭水化物骨格上の利用可能なカルボン酸である。
【００７８】
本明細書の他所に開示するように、いくつかの実施形態は官能化アルギン酸塩に関する。いくつかの実施形態において、官能化アルギン酸塩は、式Ｉの１種以上の共有結合的に修飾されたモノマーと、
【化２６】
2020504778.tif 000028
【００７９】
場合により、式ＩＩの少なくとも１つのモノマーおよび／または場合により、式ＩＩ’の少なくとも１つのモノマーとを含み、
【化２７】
2020504778.tif 000029
【００８０】
式中、Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ２およびＲ２’は、それぞれの場合において、それぞれ独立して、水素、Ｃ１〜５アルキル（Ｃ＝Ｏ）−、およびＣ１〜５アルキルからなる群から選択され、
【００８１】
Ｒ３は、それぞれの場合において、水素またはＣ１〜５アルキルであり、
【００８２】
Ｒ４は、それぞれの場合において、水素またはＣ１〜５アルキルであり、
【００８３】
Ｑは、−（ＣＲａＲｂ）ｖ−であり、
【００８４】
式中、ＲａおよびＲｂは独立して水素またはＣ１〜５アルキルであり、ｖは２〜６の整数であり、
【００８５】
Ａは
【化２８】
2020504778.tif 000030
【００８６】
であり、式中、ＬはＳ、Ｏ、またはＮであり、
【００８７】
Ｇは、それぞれの場合において水素であるか、Ｌと一緒になって一酸化窒素供与体を形成するか、または存在せず、
【００８８】
ｐは１〜１０の整数であり、
【００８９】
Ｂは、水素、−Ｙ−Ｚ、およびＣ１〜５アルキルからなる群から選択され、ここで、Ｃ１〜５アルキルは、アミノ、ヒドロキシル、ニトリル、ＣＯ２Ｈ、モノ（Ｃ１〜６）アルキルアミノ−、ジ（Ｃ１〜６）アルキルアミノ−、−（ＣＯ）ＮＲｃＲｄもしくは−ＮＲｃ（ＣＯ）Ｒｄであるか、またはＢは存在せず、
【００９０】
式中、ＲｃおよびＲｄはそれぞれ独立して水素およびＣ１〜６アルキルからなる群から選択され、
【００９１】
式中、Ｙは次の構造を有し、
【化２９】
2020504778.tif 000031
【００９２】
式中、Ｒｐ、Ｒｑ、ＲｓおよびＲｔは、それぞれの場合において、独立して、水素またはヒドロキシルであり、
【００９３】
ｋは１〜２０の整数であり、
【００９４】
Ｚは、次の構造を有し、
【化３０】
2020504778.tif 000032
【００９５】
式中、ｊは、それぞれの場合において、１〜１００の整数であり、
【００９６】
式Ｉの少なくとも１つのモノマーは一酸化窒素供与体を含有する。
【００９７】
いくつかの実施形態において、官能化アルギン酸塩であり、一酸化窒素供与体が、ジアゼニウムジオラート、ニトロソチオール、ニトロソアミン、ヒドロキシルニトロソアミン、ヒドロキシルアミン、ヒドロキシ尿素、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、一酸化窒素供与体（例えば、Ｌと一緒になったＧ）は、次のように構造上図示することができる。
【化３１】
2020504778.tif 000033
【００９８】
いくつかの実施形態において、一酸化窒素供与体はジアゼニウムジオラートである。
【００９９】
いくつかの実施形態において、Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ２およびＲ２’は水素またはＣ１〜５アルキルであり、
【０１００】
Ｒ３は水素であり、および／または
【０１０１】
Ｒ４は、それぞれの場合において、水素またはＣ１〜５アルキルである。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ２、Ｒ２’、Ｒ３、およびＲ４は水素である。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ２、Ｒ２’、Ｒ３、およびＲ４はそれぞれ独立して、水素、−（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ−Ｈ、−（（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ−（ＣＨ２）ｏＨおよびＣ１〜５アルキルからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ｍ、ｎ、およびｏは、独立して、０〜１０の整数である。いくつかの実施形態において、ｍ、ｎ、およびｏは、独立して、０〜６の整数である。いくつかの実施形態において、ｎは２である。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、ｖは２または３である。
【０１０５】
ＬはＮであり、および／または
【０１０６】
ｐは１〜３の整数である。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、Ｂは−Ｙ−Ｚである。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、Ｙは次の構造を有する。
【化３２】
2020504778.tif 000034
【０１０９】
いくつかの実施形態において、Ｚは次の構造を有する。
【化３３】
2020504778.tif 000035
【０１１０】
いくつかの実施形態において、Ｂは水素およびＣ１〜５アルキルからなる群から選択され、ここでＣ１〜５アルキルはアミノ、ヒドロキシル、ニトリル、ＣＯ２Ｈ、モノ（Ｃ１〜６）アルキルアミノ−、ジ（Ｃ１〜６）アルキルアミノ−、−（ＣＯ）ＮＲｃＲｄまたは−ＮＲｃ（ＣＯ）Ｒｄで場合により置換され、
【０１１１】
式中、ＲｃおよびＲｄはそれぞれ独立して水素およびＣ１〜６アルキルからなる群から選択される。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、Ｂは水素または非置換Ｃ１〜５アルキルである。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、Ｂは水素またはＣ３アルキルである。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、それぞれの場合において、−（Ｑ−Ａ−）ｐ−Ｂは、次の構造のうちの１つ以上を含むことができるものを有する。
【化３４】
2020504778.tif 000036
【０１１５】
いくつかの実施形態において、Ｇは、構造ｖｉ、ｖｉｉ、ｖｉｉｉまたはｉｘ中の窒素と一緒になって一酸化窒素供与体を形成する（例えば、ｖｉ、ｖｉｉ、ｖｉｉｉまたはｉｘのうちの１つ以上におけるアミンＨをＧで置き換えてＬ−Ｇを提供することによる）。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、一酸化窒素供与体はジアゼニウムジオラートである。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、−（Ｑ−Ａ−）ｐ−Ｂは、次の構造を有する。
【化３５】
2020504778.tif 000037
【０１１８】
いくつかの実施形態において、Ｇは、構造ｖｉｉ中の窒素と一緒になって一酸化窒素供与体を形成する。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、一酸化窒素供与体はジアゼニウムジオラートである。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、官能化アルギン酸塩は、式Ｉａの１つ以上の共有結合的に修飾されたモノマーと、
【化３６】
2020504778.tif 000038
場合により、式ＩＩ’ａの少なくとも１つのモノマー
【化３７】
2020504778.tif 000039
とを含み、式中、Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ２、Ｒ２’、Ｒ３、Ｒ４、および−（Ｑ−Ａ−）ｐ−Ｂは、本明細書の他所で定義されたとおりである。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、官能化アルギン酸塩は、式Ｉ、Ｉａ、ＩＩ、ＩＩ’、および／またはＩＩａの１つ以上の共有結合的に修飾されたモノマーを含み、Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ２、Ｒ２’、Ｒ３、Ｒ４、および−（Ｑ−Ａ−）ｐ−Ｂは、本明細書の他所で定義されたとおりである。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、−（Ｑ−Ａ−）ｐ−Ｂは、次のうちの１つ以上から選択された構造を有する。
【化３８】
2020504778.tif 000040
【０１２３】
いくつかの実施形態において、
【化３９】
2020504778.tif 000041
は、本明細書の他所で示されるように、次のうちの１つ以上から選択された構造を有する。
【化４０】
2020504778.tif 000042
【０１２４】
いくつかの実施形態において、 
【化４１】
2020504778.tif 000043
は、本明細書の他所で示されるように、次のうちの１つ以上から選択された構造を有する。
【化４２】
2020504778.tif 000044
【０１２５】
いくつかの実施形態において、官能化アルギン酸塩は水溶性である。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、官能化アルギン酸塩は、官能化アルギン酸塩１ミリグラム当たり０．１〜１．０μｍｏｌのＮＯの範囲の放出可能な総一酸化窒素貯蔵量を有する。いくつかの実施形態において、放出可能な総一酸化窒素貯蔵量は、官能化アルギン酸塩１ミリグラム当たり約０．１５〜０．９、０．２〜０．８、０．３〜０．７、または０．４〜０．６μｍｏｌのＮＯの範囲内である。いくつかの実施形態において、官能化アルギン酸塩１ミリグラム当たりのＮＯのμｍｏｌに基づいて、官能化アルギン酸塩は、約０．１、０．１５、０．２、０．５、０．７、０．８、０．９、１．０以上、または上述の値を含むおよび／もしくは網羅する範囲の放出可能な総一酸化窒素貯蔵量を有する。
【０１２７】
いくつかの実施形態において、官能化アルギン酸塩であり、ＮＯ放出が０．１〜２４時間の範囲の半減期を有する。いくつかの実施形態において、この半減期は、約０．２５〜１８時間、０．５〜１３時間、１〜８時間、２〜６時間、または３〜４時間の範囲内である。いくつかの実施形態において、官能化アルギン酸塩のＮＯ放出半減期は、約０．１時間、０．２５時間、０．５時間、１時間、２時間、３時間、４時間、６時間、８時間、１３時間、１８時間、２４時間以上、または上述の値を含むおよび／もしくは網羅する範囲である。
【０１２８】
いくつかの実施形態において、ＮＯ放出の総持続時間は１〜６０時間の範囲である。いくつかの実施形態において、総持続時間は、約２〜５０時間、３〜４０時間、４〜３０時間、５〜２０時間、または６〜１０時間の範囲内である。いくつかの実施形態において、総持続時間は、約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、１０時間、２０時間、３０時間、４０時間、５０時間、６０時間以上、または、上述の値を含むおよび／または網羅する範囲である。
【０１２９】
いくつかの実施形態において、４時間後の総ＮＯ放出は、官能化アルギン酸塩１ミリグラム当たり０．１〜１．０μｍｏｌのＮＯの範囲内である。いくつかの実施形態において、４時間後の放出可能な総一酸化窒素貯蔵量は、官能化アルギン酸塩１ミリグラム当たり約０．１５〜０．９、０．２〜０．８、０．３〜０．７、または０．４〜０．６μｍｏｌのＮＯの範囲内である。いくつかの実施形態において、４時間後の放出可能な一酸化窒素の総貯蔵量（官能化アルギン酸塩１ミリグラム当たりのＮＯのμｍｏｌにおける）は、約０．１、０．１５、０．２、０．３、０．３、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０以上、または上述の値を含むおよび／もしくは網羅する範囲である。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、官能化アルギン酸塩中のモノマー（例えば、繰り返し単位）の１５％超は、式Ｉのモノマーである。いくつかの実施形態において、官能化アルギン酸塩中のモノマーの百分率は、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％超の式Ｉのモノマーである。いくつかの実施形態において、式Ｉを有する官能化アルギン酸塩中のモノマーの百分率は、約２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％以上、または上述の値を含むおよび／もしくは網羅する範囲である。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、官能化アルギン酸塩は、２００〜６００ｋＤａの範囲の分子量を有する。いくつかの実施形態において、官能化アルギン酸塩は、約１ｋＤａ〜１０００ｋＤａ、５ｋＤａ〜９００ｋＤａ、５０ｋＤａ〜８００ｋＤａ、２００ｋＤａ〜６００ｋＤａ、または３００ｋＤａ〜４００ｋＤａの範囲の分子量を有する。いくつかの実施形態において、官能化アルギン酸塩は、約１ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、５０ｋＤａ、２００ｋＤａ、３００ｋＤａ、４００ｋＤａ、６００ｋＤａ、８００ｋＤａ、１０００ｋＤａ、または上述の値を含むおよび／もしくは網羅する範囲の分子量を有する。いくつかの実施形態において、官能化アルギン酸塩は、約５ｋＤａ、１０ｋＤａ、５０ｋＤａ、２００ｋＤａ、３００ｋＤａ、４００ｋＤａ、６００ｋＤａ、８００ｋＤａ、１０００ｋＤａ、または上述の値を含むおよび／もしくは網羅する範囲の分子量を有する。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、式Ｉの２つ以上の異なる共有結合的に修飾されたモノマーを含む官能化アルギン酸塩である。
【０１３３】
有用なＮＯ放出部は、当該技術分野で公知のいずれかのＮＯ放出基を含む。いくつかの実施形態において、ＮＯ放出部分は、官能化アルギン酸塩上のＮへ共有結合しているＮＯ放出基の残基、すなわち、ＮＯ供与体である。いくつかの実施形態において、ＮＯ供与体は、それが結合しているアルギン酸塩上の原子と一緒になって、ジアゼニウムジオラート、例えばニトロソチオール基の一部としての−ＮＯ、ニトロソアミン、ヒドロキシルニトロソアミン、ヒドロキシルアミン、ヒドロキシ尿素、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される部分を形成する。好ましくは、ＮＯ放出部分はジアゼニウムジオラートである。いくつかの実施形態において、これらの基は塩の形態で存在してもよい。
【０１３４】
いくつかの実施形態において、ＮＯ供与体は、Ｎ−ジアゼニウムジオラート（すなわち、１−アミノ置換デアゼン−１−ルム−１，２−ジオラート）である。Ｎ−ジアゼニウムジオラートは、生物学的条件下でＮＯを自発的に生成する能力のためにＮＯ供与体として特に魅力的である。第一級および第二級アミン、ポリアミン、ならびに第二級アミノ酸を包含する一連の求核残基を用いて、いくつかのＮ−ジアゼニウムジオラート化合物が合成されてきた。Ｎ−ジアゼニウムジオラートの形成において、１当量のアミンが高圧下で２当量の一酸化窒素と反応する。塩基（例えば、メトキシドのようなアルコキシド）は、アミン窒素からプロトンを除去してアニオン性の安定化した［Ｎ（Ｏ）ＮＯ］基を創出する。雰囲気条件下では安定であるが、Ｎ−ジアゼニウムジオラートは水性媒体中で自発的に分解して、ｐＨ、温度、および／またはアミン部分の構造に依存する速度でＮＯを生成する。例えば、Ｎ−ジアゼニウムジオラート修飾プロリン（ＰＲＯＬＩ／ＮＯ）、２−（ジメチルアミノ）−エチルプトレアムルン（ｅｔｈｙｌｐｕｔｒｅａｍｌｎｅ）（ＤＭＡＥＰ／ＮＯ）、Ｎ、Ｎ−ジメチルヘキサンジアミン（ＤＭＨＤ／ＮＯ）、およびジエチレントリアミン（ＤＥＴＡ／ＮＯ）が、ｐＨ７．４および３７℃で２秒間〜２０時間の範囲の多様なＮＯ放出半減期を有する小分子ＮＯ供与体として開発されている。
【０１３５】
いくつかの実施形態において、ニトロソアミンは、Ｎ−ジアゼニウムジオラート形成中には存在しない。
【０１３６】
いくつかの実施形態において、ニトロソアミンは、ＮＯ放出中には存在しない。いくつかの実施形態において、ＮＯ放出は、約０．０１時間、０．１時間、０．２５時間、０．５時間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、１０時間、１５時間、２０時間、２４時間、３６時間、４８時間、または６０時間の時間にわたって生じ得る。いくつかの実施形態において、ＮＯ放出は、約０．０１時間、０．１時間、０．２５時間、０．５時間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、１０時間、１５時間、２０時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間以内に、または上述の値を含むおよび／もしくは網羅する範囲で生じる。本明細書中で使用する場合、「ニトロソアミンは存在しない」という句は、紫外可視スペクトルによって（または当該技術分野における他の承認されている方法によって）測定されるように検出可能ではないニトロソアミンのレベルをいう。
【０１３７】
「アミノ」および「アミン」という用語は、ＮＲ３、ＮＨ３、ＮＨＲ２、およびＮＨ２Ｒなどの含窒素基を指し、式中、Ｒは、本明細書の他所で説明されるとおりであり得る。したがって、本明細書で使用する「アミノ」は、第一級アミン、第二級アミン、または第三級アミンを指すことができる。いくつかの実施形態において、アミノ基の１つのＲはジアゼニウムジオラート（すなわち、ＮＯＮＯ）であり得る。
【０１３８】
「第四級アミン」という用語は、追加の（すなわち、第四の）基、例えば、窒素に結合した水素またはアルキル基を有するアミノ基を指す。したがって、第四級アミンは正の電荷を帯電している。
【０１３９】
「アルキル」という用語は、１〜２４個の炭素原子、例えば、１〜１２個の炭素原子を含有する直鎖または分枝鎖の炭化水素鎖を示す。アルキル基の例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチルなどが挙げられる。本明細書に現れるときはいつでも、「１〜２４」または１〜２４などの数値範囲は、所与の範囲内のそれぞれの整数を指し、例えば、「１〜１０個の炭素原子」または「Ｃ１〜Ｃ５アルキル」は、アルキル基が１個の炭素原子、２個の炭素原子、３個の炭素原子などからなり得、最大１０個の炭素原子を含み得ることを意味する（しかし、本定義は、数値範囲が指定されていない場合の「アルキル」という用語の出現もカバーし、例えば１〜２４である）。例としてにすぎないが、「Ｃ１〜Ｃ５アルキル」は、アルキル鎖中に１〜５個の炭素原子があることを示し、すなわち、アルキル鎖はメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル（分枝鎖および直鎖）、などから選択される。典型的なアルキル基としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、第三ブチル、ペンチルおよびヘキシルが挙げられるが、これらに限定するものではない。
【０１４０】
整数の範囲が与えられるとき、この範囲にはその範囲内に収まる何らかの数およびその範囲の両端を定義する数が含まれる。例えば、「１〜１０の整数」という用語が使用されるとき、この範囲に含まれる整数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、および１０である。
【０１４１】
「共有結合した（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ  ｂｏｕｎｄ）」または「共有結合した（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」は、１対以上の電子を共有することによって形成された化学結合を指す。
【０１４２】
本明細書で使用する場合、「接触させること」という用語は、反応が起こり得るように密接な近接関係にある試薬を指す。
【０１４３】
いくつかの実施形態において、置換基および／または変形物の組み合わせは、このような組み合わせがそれぞれの原子についての既知の原子価と一致する化合物を結果的に生じる場合にのみ許容可能である。
【０１４４】
いくつかの実施形態は、官能化アルギン酸塩を調製するための方法に関する。いくつかの実施形態において、この方法は、次のステップのうちの１つ以上を含む。
【０１４５】
ｉ．式ＩＩＩのアミン
【化４３】
2020504778.tif 000045
【０１４６】
をペプチドカップリング試薬の存在下でアルギン酸塩と接触させることであって、式中、Ｒ４、Ｑ、Ａ、Ｂおよびｐは先に説明したとおりであり、式Ｉの共有結合的に修飾されたモノマーが調製され
【化４４】
2020504778.tif 000046
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｑ、Ａ、Ｂおよびｐは先に説明したとおりである、接触させることと、
【０１４７】
ｉｉ．式Ｉの共有結合的に修飾されたモノマーを含有するアルギン酸塩
【化４５】
2020504778.tif 000047
【０１４８】
を一酸化窒素源と接触させることであって、式中、
【０１４９】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｑ、Ａ、Ｂおよびｐは先に説明したとおりであり、ここで官能化アルギン酸塩が調製される。
【０１５０】
いくつかの実施形態において、Ｒ１およびＲ２は水素またはＣ１〜５アルキルであり、
【０１５１】
Ｒ３は、水素またはＣ１〜５アルキルであり、
【０１５２】
Ｒ４は、それぞれの場合において、水素またはＣ１〜５アルキルであり、
【０１５３】
ｖは、２または３であり、
【０１５４】
Ｌは、Ｎであり、
【０１５５】
ｐは、１〜３の整数である。
【０１５６】
いくつかの実施形態において、−（Ｑ−Ａ−）ｐ−Ｂは、次の構造のうちの１つ以上を有する。
【化４６】
2020504778.tif 000048
【０１５７】
いくつかの実施形態において、Ｇは、窒素と一緒になって一酸化窒素供与体を形成する。
【０１５８】
いくつかの実施形態において、一酸化窒素供与体は、ジアゼニウムジオラートである。
【０１５９】
官能化アルギン酸塩は、何らかの利用可能なアルギン酸塩ポリマーの共有結合性修飾を通じて調製することができる。共有結合的に修飾されたモノマーは、当該技術分野において公知の種々の合成手順を用いてアルギン酸塩ポリマーへと導入することができる。
【０１６０】
アルギン酸塩の代表的な化学構造は、次のとおりである。
【化４７】
2020504778.tif 000049
【０１６１】
個々の単位は、マンヌロン酸（Ｍ）およびグルロン酸（Ｇ）単位として標識されている。この表現は、代表的なアルギン酸塩内でＧブロック、Ｍブロック、ＧＭブロック、およびＭＧブロックとして指定される非限定的な潜在的なポリマー結合を表す。いくつかの実施形態において、ＭまたはＧの少なくとも１つは式Ｉのモノマーと置き換えられる。いくつかの実施形態において、官能化アルギン酸塩中の式Ｉのモノマーの百分率は、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％である。いくつかの実施形態において、官能化アルギン酸塩は、ある百分率の式ＩＩのモノマーをさらに含む。いくつかの実施形態において、官能化アルギン酸塩中の式ＩＩのモノマーの百分率は、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％である。いくつかの実施形態において、官能化アルギン酸塩中の式ＩＩのモノマーの百分率は、約１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、少なくとも９５％、９９％以上、または上述の値を含むおよび／または網羅する範囲である。いくつかの実施形態において、官能化アルギン酸塩中の式Ｉおよび式ＩＩのモノマーの合計した百分率は、少なくとも少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％である。いくつかの実施形態において、官能化アルギン酸塩中の式Ｉおよび式ＩＩのモノマーの合計した百分率は、約１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、少なくとも９５％、９９％以上、または上述の値を含むおよび／または網羅する範囲である。いくつかの実施形態において、式ＩＩのモノマーは、未修飾のＭまたはＧモノマーである。いくつかの実施形態において、式Ｉのモノマー対式ＩＩのモノマーの比は、約３０：１、２０：１、１０：１、５：１、１：１、１：５、１：１０、１：２０、１：３０、上述の比の間の比、またはそれ以外のものであり得る。
【０１６２】
アルギン酸塩中のこれらのＧおよびＭブロックの割合、分布、および長さは、アルギン酸塩ポリマーの化学的および物理的特性に影響し得る。いくつかの実施形態において、「高Ｇアルギン酸塩」の実施形態が使用される。高Ｇアルギン酸塩において、他の種類のモノマーよりも多くのグルロン酸塩モノマーが存在するか、またはマンヌロン酸塩モノマーよりも多くのグルロン酸塩モノマーが存在する。例えば、高Ｇアルギン酸塩は、グルロン酸塩としてモル百分率または重量百分率で約５０％超または少なくとも約６５％超のアルギン酸塩モノマーを含むことができる。いくつかの実施形態において、「高Ｍアルギン酸塩」の実施形態が使用される。高Ｍアルギン酸塩において、他の種類のモノマーよりも多くのマンヌロン酸塩モノマーが存在するか、またはグルロン酸塩モノマーよりも多くのマンヌロン酸塩モノマーが存在する。例えば、高Ｍアルギン酸塩は、モル百分率または重量百分率で約５０％超または少なくとも約６５％超のアルギン酸塩モノマーをマンヌロン酸塩として含み得る。いくつかの実施形態において、Ｇモノマーとほぼ同数のＭモノマーがある。いくつかの実施形態において、官能化アルギン酸塩中の「Ｇ」モノマーの百分率は、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％である。いくつかの実施形態において、官能化アルギン酸塩中の「Ｍ」モノマーの百分率は、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％である。
【０１６３】
いくつかの実施形態において、マンヌロン酸塩およびグルロン酸塩モノマーは、それらのカルボン酸部分のエステル化および／またはアミド化を介して共有結合的に修飾されている。共有結合性修飾中の反応物の化学量論的変化は、官能化アルギン酸塩中の共有結合的に修飾されたモノマーの量を変えるために使用することができる。例えば、実施形態において、官能化アルギン酸塩の形成中のＥＤＣ：モノマーまたはアミン：モノマーの化学量論比は、１０：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、または０．５：１であり得る。好ましくは、この比は２：１、ＥＤＣ：モノマーおよび／または２：１アミン：モノマーである。後に考察する反応に加えて、マンヌロン酸塩およびグルロン酸塩モノマーの共有結合性修飾のための代替的な合成方法論が当該分野で公知である。（例えば、Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．ａｎｄ  Ｍａｒｃｈ，Ｊ．，Ｍａｒｃｈ’ｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，５ｔｈ  ｅｄ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｗｉｌｅｙ，２００１を参照されたい）。さらに、溶媒、ｐＨ、および温度などの他の反応条件における変化は、当該技術分野において公知である。
【０１６４】
本明細書で使用する場合、「緩衝剤」とは、酸または塩基がそれに添加されたときにｐＨの変化に抵抗する溶液である。緩衝剤は典型的にはその塩の１つと一緒に弱酸または弱塩基を包含する。緩衝剤の非限定的な例は、トリス、ＨＥＰＥＳ、ＰＢＳ（リン酸緩衝塩類溶液）、酢酸トリエチルアンモニウム緩衝剤、および重炭酸トリエチルアンモニウム緩衝剤である。緩衝剤は特定の濃度および／またはｐＨを有することができる。実施形態において、緩衝剤は、約２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、または１２．５のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、ｐＨは約７．３〜約１１である。他の実施形態において、ｐＨは約７．８〜約９．３である。いくつかの実施形態において、ｐＨは約６．５である。いくつかの実施形態において、ｐＨは約７．５である。いくつかの実施形態において、ｐＨは約８．５である。いくつかの実施形態において、ペプチドカップリング反応は緩衝溶液中で実施することができる。
【０１６５】
本明細書で使用する場合、「ペプチドカップリング試薬」という用語は、アミンとカルボン酸との間の反応を促進してアミド結合を形成するために使用される化学物質を指す。いくつかの実施形態において、適切なペプチドカップリング試薬には、カルボジイミド試薬、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）または１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）、ホスホニウム試薬、例えば、（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＢＯＰ）、およびウロニウム試薬、例えば、Ｏ−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボラート（ＴＢＴＵ）が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、１つ以上のペプチドカップリング試薬を使用して、アルギン酸塩のカルボン酸を介して、第一級または第二級アミン含有基をアルギン酸塩に共有結合させることができる。いくつかの実施形態において、本明細書の他所で説明するように、ビス（３−アミノプロピル）アミン（ＤＰＴＡ）、ジエチレントリアミン（ＤＥＴＡ）、Ｎ−プロピル−１，３−プロパンジアミン（ＰＡＰＡ）、スペルミン（ＳＰＥＲ）のうちの１つ以上をアルギン酸塩へと官能化して、官能化アルギン酸塩を提供することができる。いくつかの実施形態において、ペプチドカップリング試薬は、ｖｉ、ｖｉｉ、ｖｉｉｉ、およびｉｘから選択される１つ以上の構造を有する−（Ｑ−Ａ−）ｐ−Ｂを備えた官能化アルギン酸塩を提供するために、１つ以上の化合物とともに使用される。
【０１６６】
本明細書で使用する場合、「一酸化窒素源」という用語は、例えば、ジアゼニウムジオラートＮＯ供与体を形成するのに有用な一酸化窒素の源を指す。一酸化窒素源の非限定的な例は、ＮＯガスである。
【０１６７】
いくつかの実施形態において、有効量の官能化アルギン酸塩を対象に投与することを含む、対象に一酸化窒素を送達する方法が提供される。
【０１６８】
いくつかの実施形態において、疾患状態を処置することを必要とする対象に有効量の官能化アルギン酸塩を投与することを含む、疾患状態を処置する方法が提供される。いくつかの実施形態において、疾患状態は、癌、心血管疾患、微生物感染症、医療機器への血液の曝露によって引き起こされる血小板凝集および血小板粘着、異常な細胞増殖から結果として生じる病理学的容態、移植拒絶反応、自己免疫疾患、炎症、血管疾患、瘢痕組織、創傷収縮、再狭窄、疼痛、発熱、消化管障害、呼吸器障害、性機能障害、性感染症、ならびに／または嚢胞性線維症からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、疾患状態は、細菌感染症などの微生物感染症である。いくつかの実施形態において、微生物感染症は、嚢胞性線維症などの別の疾患状態と関係している。
【０１６９】
いくつかの実施形態において、バイオフィルムを破壊する、根絶する、または防止する方法が提供される。いくつかの実施形態において、本方法は、バイオフィルムを含有するか、または表面もしくは領域の一部もしくは全部を形成するかもしくは占有するバイオフィルムを受けやすい表面もしくは領域を、本明細書に説明する官能化アルギン酸塩と接触させることを含む。「バイオフィルム」という用語は、細胞が互いに、通常は表面上に付着する１つ以上の微生物の集合体を意味することを意図している。ほとんどの何らかの自由浮遊微生物はバイオフィルムを形成することができ、および／または表面に付着することができる。微生物は、ファンデルワールス力を介した弱い可逆的付着を通じて表面へまたは互いに付着することができる。微生物は、細胞接着または線毛などの構造を使用して、より永久的に固定することができる。
【０１７０】
いくつかの実施形態において、官能化アルギン酸塩を含む医薬製剤が提供される。いくつかの実施形態において、この医薬製剤は薬学的に許容される賦形剤を含む。いくつかの実施形態において、官能化アルギン酸塩は、本明細書の他所で説明するように水溶性である。
【０１７１】
「薬学的に許容される」は、本明細書で使用する場合、生物学的にまたは他の点で望ましくない材料を意味し、すなわちこの材料は、実質的に有害な生物学的作用を引き起こしたり、有害な様式で、含有される組成物の他の成分のいずれとも相互作用したりすることなく、本明細書に説明する発明の対象の組成物とともに個体に投与することができる。この材料は、対象における有効成分のいかなる分解も最小限にし、いかなる有害な副作用も最小限にするように自然に選択されるであろう（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ；２０  ｅｄ．２００５を参照されたい）。本明細書に説明する発明の対象の組成物のための例となる薬学的に許容される賦形剤には、滅菌発熱物質非含有水および滅菌発熱物質非含有生理塩類溶液水が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７２】
本開示の治療用組成物は、いくつかの実施形態において、本開示の一酸化窒素放出性アルギン酸塩と薬学的に許容される賦形剤とを含む組成物を含む。適切な組成物としては、抗酸化薬、緩衝剤、静菌薬、殺菌性抗生物質および製剤を意図する受け手の体液と等張にする溶質を含有することができる水性および非水性の無菌注射溶液と、懸濁剤および増粘剤を含むことができる水性および非水性滅菌懸濁液とが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７３】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法において使用される組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルションなどの形態をとることができ、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤などのフォーミュラトリー（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ）剤を含有することができる。あるいは、有効成分は、使用前に適切なビヒクル、例えば滅菌発熱物質非含有水を用いた構成のために粉末形態であり得る。
【０１７４】
いくつかの実施形態において、本明細書の他所に開示されている治療用組成物は、単位用量または複数回用量の容器、例えば密封アンプルおよびバイアルで提供でき、使用直前に滅菌液体担体の添加のみを必要とする凍結条件または凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｉｅｄ）（凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ））条件で保存することができる。
【０１７５】
いくつかの実施形態において、経口投与のために、本明細書の他所に開示される組成物は、例えば、結合剤（例えば、α化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）などの薬学的に許容される賦形剤；充填剤（例えば、ラクトース、微結晶セルロースまたはリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモでん粉またはグリコール酸でん粉ナトリウム）；または湿潤剤（例、ラウリル硫酸ナトリウム）など、薬学的に許容される賦形剤を用いて従来技術によって調製される錠剤またはカプセル剤の形態をとることができる。錠剤は当該技術分野で公知の方法でコーティングすることができる。例えば、治療薬は、ヒドロクロロチアジドと組み合わせて、標的器官に到達するまで治療薬を保護する腸溶コーティングまたは遅延放出コーティングを有するｐＨ安定化コアとして製剤することができる。
【０１７６】
「薬学的に許容される賦形剤」は、対象に対して無毒である、有効成分以外の医薬製剤中の成分を指す。薬学的に許容される賦形剤としては、緩衝剤、担体、安定化剤、または保存剤が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されている発明の対象は、官能化アルギン酸塩と薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬製剤に関する。
【０１７７】
いくつかの実施形態において、本開示の化合物の液体調製物を調製することができる。いくつかの実施形態において、経口投与のための液体製剤は、例えば液剤、シロップ剤もしくは懸濁剤の形態をとることができ、または使用前に水もしくは他の適切なビヒクルを用いた構成のための乾燥製品として呈されることができる。いくつかの実施形態において、このような液体調製物は、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素添加食用脂肪）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコールまたは分別植物油）；および保存剤（例えば、メチル−ｐ−ヒドロキシベンゾアートもしくはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾアートまたはソルビン酸）など、薬学的に許容される助剤を用いた従来技術によって調製することができる。いくつかの実施形態において、調製物は、緩衝塩、香味剤、着色剤および甘味剤を適宜含有することができる。いくつかの実施形態において、経口投与用製剤は、有効化合物を徐放を与えるように適切に製剤することができる。いくつかの実施形態において、頬側投与について、本組成物は従来の様式で製剤された錠剤またはロゼンジ剤の形態をとることができる。
【０１７８】
いくつかの実施形態において、本明細書の他所に開示されている化合物は、移植または注射用の調製物として製剤することもできる。したがって、例えば、いくつかの実施形態において、本化合物は、適切なポリマー材料または疎水性材料（例えば、許容される油中のエマルションとして）および／またはイオン交換樹脂、および／または難溶性誘導体（例えば、難溶性塩として）とともに製剤することができる。いくつかの実施形態において、本化合物は、直腸用組成物（例えば、カカオバターまたは他のグリセリドなど、従来の坐剤基剤を含有する坐剤または停留浣腸）、クリームもしくはローション、および／または経皮パッチ中に製剤することもできる。
【０１７９】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されている化合物の医薬製剤が提供される。いくつかの実施形態において、医薬製剤は、吸入によるエアゾールとしての投与に適している。いくつかの実施形態において、本明細書に説明する官能化アルギン酸塩は、溶液および／またはエアゾールの形態で製剤される。いくつかの実施形態において、これらの製剤は、本明細書に説明するＮＯ放出アルギン酸塩の溶液または懸濁液を含む。いくつかの実施形態において、所望の製剤を小さなチャンバに入れて噴霧することができる。いくつかの実施形態において、噴霧化は、ＮＯ放出アルギン酸塩を含む複数の液滴または固体粒子を形成するために圧縮空気によってまたは超音波エネルギーによって達成することができる。例えば、いくつかの実施形態において、開示されたＮＯ放出アルギン酸塩は、嚢胞性線維症と関連する細菌感染症を処置するために吸入を介して投与することができる。いくつかの実施形態において、開示されたＮＯ放出アルギン酸塩は、二重作用の抗菌作用および粘液溶解作用を提供することができる。いくつかの実施形態において、この二重作用は嚢胞性線維症の処置において有益である。
【０１８０】
嚢胞性線維症は、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）遺伝子の機能不全によって引き起こされる遺伝的障害である。ＣＦＴＲタンパク質は、気道上皮細胞周囲のｐＨおよび粘液粘弾性、水、タンパク質、塩、脂質、およびムチンからなる、杯状細胞から分泌される異種性ゲルに影響する塩化物イオンおよび重炭酸イオンのイオンチャネルとして機能する。これらのチャネルの機能不全は、上皮表面の脱水およびムチン濃度の上昇を引き起こす。ＣＦはすべての粘液産生器官に影響するが、肺疾患の進行は最も生命を脅かす作用である。ＣＦにおける粘液の粘弾性の上昇は、肺からの病原体の除去が非常に困難となるので、疾患の病理発生に寄与する。肥厚した粘液層は気道上皮の表面に付着し、粘膜繊毛のクリアランスが損なわれ、気道閉塞、細菌感染、慢性炎症、および気道への永久的な構造上の損傷をもたらす。
【０１８１】
粘性粘液の蓄積は、細菌の増殖に理想的な環境を提供し、物理的な支援および栄養源のいずれとしても機能し、気道のさらなる炎症を引き起こす。ＣＦの成人の約８０％に感染する緑膿菌のような病原体によって引き起こされる肺感染症は慢性となり得、従来の抗生物質が高用量でさえ根絶することができないバイオフィルムを形成することができる。さらに、ＣＦ気道に認められる異常な粘液は、コロニーへの抗菌薬の浸透を軽減し、慢性感染症、肺閉塞症、および患者の死亡をもたらす。感染部位へ動員された好中球は死滅して、粘液中にＤＮＡを放出するにつれて、バイオフィルムの増殖は粘液のレオロジーを悪化させ、粘性をさらに上昇させる。ＣＦ患者における非常に弾性のある粘液は、細菌の定着および疾患の重症度を悪化させることと相関する。
【０１８２】
市販のＣＦ処置の大部分は、粘液の過剰分泌を制御し、細菌感染症を根絶することを目的としている。今日使用されている粘液レオロジーに直接影響するように設計された２つの療法は、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）およびドルナーゼアルファであり、それぞれジスルフィド結合破壊およびＤＮＡの酵素分解を通じて作用する。ＮＡＣの有効性は低力価および気道刺激によって制限されているのに対し、ドルナーゼアルファ処置は上気道刺激、発疹、胸痛、および結膜炎と関係しており、一部の患者は薬剤に対する耐性を発生させている。さらに、緑膿菌のようなＣＦ病原体は粘性粘液中のバイオフィルム形成によって従来の抗生物質処置（すなわち、トブラマイシンおよびアジスロマイシン）から大部分が保護されている。処置を生き残った細菌はバイオフィルムを再発達させ、抗生物質耐性株を促進することができる。クリアランスを改善するために細菌の根絶と粘液粘弾性の低下とを組み合わせた改善されたＣＦ処置薬が本明細書で開示される。
【０１８３】
嚢胞性線維症関連細菌感染症としては、ステノトロホモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）、マイコバクテリウム・アビウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｉｒｅ）およびマイコバクテリウム・アブセサス（Ｍ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓ）、バークホルデリア・セパシア、ならびに緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ））感染症が挙げられるが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態において、本開示のＮＯ放出アルギン酸塩は、ステノトロホモナス、マイコバクテリウム・アビウム・イントラセルラーレおよびマイコバクテリウム・アブセサス、バークホルデリア・セパシア、ならびに／または緑膿菌（緑膿菌）のうちの１つ以上による感染を処置するために使用することができる。いくつかの実施形態において、本開示のＮＯ放出アルギン酸塩は粘液溶解性である。いくつかの実施形態において、本明細書の他所に開示されているように、本開示のＮＯ放出アルギン酸塩は、粘液溶解性および抗菌性の両方であり、ＣＦについての処置有効性の亢進を提供する。
【０１８４】
いくつかの実施形態において、本開示のＮＯ放出アルギン酸塩は、少なくとも約２０％、５０％、７０％、９０％、９５％、または上述の値を含むおよび／または網羅する範囲で、ＣＦと関係する粘液の粘度を低下させることができる。いくつかの実施形態において、本開示のＮＯ放出アルギン酸塩は、少なくとも約１０％、２０％、５０％、６０％、８０％、または上述の値を含むおよび／または網羅する範囲で、ＣＦと関係する粘液の弾力性を低下させることができる。いくつかの実施形態において、本開示のＮＯ放出アルギン酸塩は、ＣＦと関係するムチン層の崩壊を引き起こさず、かつ／またはムチン層の厚さを保持しない。いくつかの実施形態において、本開示のＮＯ放出アルギン酸塩は、ＣＦと関係するムチン層の粘弾性を上昇および／または低減させない。いくつかの実施形態において、本開示のＮＯ放出アルギン酸塩は、粘液のＧ’、Ｇ”および／またはη＊を低下させて、粘液を通る薬剤拡散を促進する。いくつかの実施形態において、本開示のＮＯ放出アルギン酸塩は、粘液のＧ’、Ｇ”および／またはη＊を少なくとも約２０％、５０％、７０％、９０％、９５％、または上述の値を含むおよび／または網羅する範囲で低下させる。
【０１８５】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組成物の投与のために、マウス動物モデルへ投与された用量に基づいてヒト薬用量を推定する従来の方法を行うことができる。いくつかの実施形態において、マウス薬用量をヒト薬用量へ変換するための次の変換係数を使用して外挿を行うことができる：１ｋｇ当たりのヒト用量＝１ｋｇ当たりのマウス用量×１２。いくつかの実施形態において、薬剤用量は、体表面積１平方メートル当たりのミリグラムで与えることもでき、その理由は、この方法が、体重よりもむしろ、ある特定の代謝機能および排泄機能との良好な相関関係を達成するからである。その上、体表面積は、成人および年少者ならびに異なる動物種における薬剤の薬用量についての一般的な分母として使用することができる。簡潔にいえば、何らかの所与の種におけるｍｇ／ｋｇ用量を等価のｍｇ／平方ｍ用量として表すために、用量に適切なｋｍ係数を乗じる。成人においては、１００ｍｇ／ｋｇは、１００ｍｇ／ｋｇ×３７ｋｇ／平方ｍ＝３７００ｍｇ／ｍ２と等価である。
【０１８６】
いくつかの実施形態において、本開示の発明の対象の組成物を対象へ投与するための適切な方法としては、全身投与、非経口投与（血管内投与、筋肉内投与、動脈内投与を含む）、経口送達、頬側送達、皮下投与、吸入、気管内設置、外科的植え込み、経皮送達、局所注射、および高速注射／衝撃が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、該当する場合、連続注入は標的部位での薬剤蓄積を亢進することができる。
【０１８７】
本開示の発明の対象の方法に従って使用される薬剤投与の特定の様式は、使用される薬剤および／または担体、処置されることになっている容態の重症度、ならびに代謝についてのまたは投与後の活性剤の除去についての機序を含むがこれらに限定されない種々の因子に依存する。
【０１８８】
いくつかの実施形態において、１つ以上の追加の治療薬は、官能化アルギン酸塩との組み合わせで使用することができる。いくつかの実施形態において、このような追加の薬剤は、官能化アルギン酸塩を含む製剤の一部であり得るか、または官能化アルギン酸塩を含む製剤の前に、後に、または同時に（ａｔ  ｔｈｅ  ｓａｍｅ  ｔｉｍｅ）（同時に（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔｌｙ））別個の製剤として投与され得る。いくつかの実施形態において、このような追加の治療薬は、特に、抗癌治療薬、抗菌薬、鎮痛薬、抗炎症薬、血管拡張薬、および免疫抑制薬、ならびに処置されている疾患または容態の軽減を亢進し得る何らかの他の公知の治療薬を含む。いくつかの実施形態において、「同時に」は、複合効果を生み出すために同時にまたは十分に時間的に近いことを意味する（すなわち、同時に（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔｌｙ）は、同時に（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ）であり得、または互いの前後の短時間内に発生する２つ以上の事象であり得る）。）いくつかの実施形態において、２つ以上の化合物を「同時に」投与することは、一方の存在がもう一方の生物学的効果を変化させる時間において十分近くで２つの化合物が投与されることを意味する。いくつかの実施形態において、２つの化合物は、同じかまたは異なる製剤中でまたは連続的に投与することができる。いくつかの実施形態において、同時投与は、投与前に化合物を混合することによって、または例えば同じ時点であるが異なる解剖学的部位でもしくは異なる投与経路を使用して２つの異なる製剤における化合物を投与することによって実施することができる。
【０１８９】
いくつかの実施形態において、ＮＯ放出アルギン酸塩との組み合わせにおいて使用されることになっている追加の治療薬の選択は、対象の疾患の種類、年齢、および全般的な健康状態、疾患進行の攻撃性、ならびにこの組み合わせを含む薬剤に耐容する対象の能力を含むがこれらに限定されない種々の因子によるであろう。
【０１９０】
いくつかの実施形態において、追加の治療薬（複数可）は抗菌薬である。本明細書で使用する場合、「抗菌薬」という用語は、細菌、真菌、酵母、またはウイルスを殺滅するか、これらの増殖を抑制するか、またはこれらの増殖を防止する何らかの薬剤を指す。微生物感染症の処置または予防を支援するために本開示のＮＯ放出官能化アルギン酸塩へと組み込むことができる適切な抗菌薬としては、バンコマイシン、ブレオマイシン、ペントスタチン、ミトキサントロン、マイトマイシン、ダクチノマイシン、プリカマイシンおよびアミカシンなどの抗生物質が含まれるがこれらに限定されない。他の抗菌薬には、２−ｐ−スルファニリアニリノエタノール、４，４’−スルフィニルジアニリン、４−スルファニルアミドサリチル酸、アセジアスルホン、アセトスルホン、アミカシン、アモキシシリン、アンホテリシンＢ、アンピシリン、アパルシリン、アピシクリン、アプラマイシン、アルベカシン、アスポキシシリン、アジダンフェニコール、アジスロマイシン、アズトレオナム、バシトラシン、バンベリマイシン（複数可）、ビアペネム、ブロジモプリム、ブチロシン、カプレオマイシン、カルベニシリン、カルボマイシン、カルモナム、セファドロキシル、セファマンドール、セファトリジン、セフブペラゾン、セフクリジン、セフジニル、セフジトレン、セフピム、セフェタメット、セフィキシム、セフメノキシム、セフィニノクス（ｃｅｆｉｎｉｎｏｘ）、セホジジム、セホニシド、セホペラゾン、セホラニド、セホタキシム、セホテタン、セホチアム、セフゾプラム、セフピミゾール、セフピラミド、セフピロム、セフプロジル、セフロキサジン、セフタジジム、セフテラム、セフチブテン、セフトリアキソン、セフゾナム、セファレキシン、セファログリシン、セファロスポリンＣ、セフラジン、クロラムフェニコール、クロルテトラサイクリン、シプロフロキサシン、クラリスロマイシン、クリナフロキサシン、クリンダマイシン、クリンダマイシンホスファート、クロモサイクリン、コリスチン、シクラシリン、ダプソン、デメシサイクリン（ｄｅｍｅｃｉｃｙｃｌｉｎｅ）、ジアチモスルホン、ジベカシン、ジヒドロストレプトマイシン、ジリスロマイシン、ドキシサイクリン、エノキサシン、エンビオマイシン、エピシリン、エリスロマイシン、フロモキセフ、ホルチミシン（複数可）、ゲンタミシン（複数可）、グルコスルホンソラスルホン、グラミシジンＳ、グラミシジン（複数可）、グレパフロキサシン、グアメシクリン、エタシリン、イミペネム、イセパミシン、ジョサマイシン、カナマイシン（複数可）、ロイコマイシン（複数可）、リンコマイシン、ロメフロキサシン、ルセンソマイシン、リムシクリン、メクロシクリン、メロペネム、メタサイクリン、ミクロノミシン、ミデカマイシン（複数可）、ミノサイクリン、モキサラクタム、ムピロシン、ナジフロキサシン、ナタマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、ノルフロキサシン、オレアンドマイシン、オキシテトラサイクリン、ｐ−スルファニリルベンジルアミン、パニペネム、パロモマイシン、パズフロキサシン、ペニシリンＮ、ピパシクリン、ピペミド酸、ポリミキシン、プリマイシン、キナシリン、リボスタマイシン、リファミド、リファンピン、リファマイシンＳＶ、リファペンチン、リファキシミン、リストセチン、リチペネム、ロキタマイシン、ロリテトラサイクリン、ロサラマイシン（ｒｏｓａｒａｍｙｃｉｎ）、ロキシトロマイシン、サラゾスルファジミジン、サンサイクリン、シソマイシン、スパルフロキサシン、スペクチノマイシン、スピラマイシン、ストレプトマイシン、スクシスルホン、スルファクリソイジン（ｓｕｌｆａｃｈｒｙｓｏｉｄｉｎｅ）、スルファロクス酸、スルファミドクリソイジン、スルファニル酸、スルホキソン、テイコプラニン、テマフロキサシン、テモシリン、テトラサイクリン、テトロキソプリム、チアンフェニコール、チアゾスルホン、チオストレプトン、チカルシリン、チゲモナム、トブラマイシン、トスフロキサシン、トリメトプリム、トロスペクトマイシン、トロバフロキサシン、ツベルアクチノマイシンおよびバンコマイシンなどの抗菌薬が含まれる。抗菌薬には、アムホテリシンＢ、アザセリン、カンジシジン（複数可）、クロルフェネシン、デルマスタチン、フィリピン、フジクロミン、メパルチリン、ナイスタチン、オリゴマイシン、ペリマイシンＡ、ツベルシジン、イミダゾール、トリアゾール、デルモスタチン（複数可）、フィリピン、フンギクロミン、メパルトリシン、ニスタチン、オリゴマイシン（複数可）、ペリマイシンＡ、ツベルシジン、イミダゾール、トリアゾール、およびグリエソフルビン（ｇｒｉｅｓｏｆｕｌｖｉｎ）などの抗真菌薬も含むことができる。いくつかの実施形態において、抗菌薬は、アモキシシリン、アムホテリシンＢ、アンピシリン、アジスロマイシン、セフジニル、セファロスポリンＣ、クロラムフェニコール、シプロフロキサシン、クラリスロマイシン、クリンダマイシン、ドキシサイクリン、エリスロマイシン、ムピロシン、リファンピン、テトラサイクリン、およびバンコマイシンから選択される。
【０１９１】
いくつかの実施形態において、ＮＯ放出アルギン酸塩はポリマーフィルムに組み込むことができる。いくつかの実施形態において、このような組み込みは、アルギン酸塩をポリマー表面へ物理的に埋め込むことを通じて、ポリマー表面へのアルギン酸塩の静電的会合を介して、またはポリマー表面上の反応基への官能化アルギン酸塩の共有結合によってであり得る。いくつかの実施形態において、官能化アルギン酸塩は、液体ポリマー前駆体の溶液に混合することができ、ポリマーが硬化したときにポリマーマトリックス中に捕捉されることができる。いくつかの実施形態において、重合性基を使用して官能化アルギン酸塩をさらに官能化することもでき、その際、アルギン酸塩は重合過程中にポリマーへと共重合することができる。いくつかの実施形態において、ＮＯ放出アルギン酸塩を組み込むことができる適切なポリマーには、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリテトラフルオロエチレン、およびポリビニリデンなどのポリオレフィン、ならびにポリエステル、ポリエーテル、ポリウレタンなどが含まれる。いくつかの実施形態において、ポリウレタンは医学的にセグメント化されたポリウレタンを含むことができる。医学的にセグメント化されたポリウレタンは、ポリマーにさらなる長さまたは重量を加える、アルキレン鎖などの１つ以上のエキスパンダ部分も含むことができる。このようなポリウレタンも概して無毒性である。医学的にセグメント化されたポリウレタンの一例はＴＥＣＯＦＬＥＸ（登録商標）である。
【０１９２】
いくつかの実施形態において、ＮＯ放出アルギン酸塩を生分解性および／または生体適合性ポリマーに組み込むことができる。いくつかの実施形態において、ＮＯ放出ポリマーは、アルギン酸塩ベースではない生分解性および／または生体適合性ポリマーである。いくつかの実施形態において、生分解性および／または生体適合性ポリマーは、ポリ乳酸、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）、ポリ（カプロラクトン）、ポリグリコリド、ポリラクチド、ポリヒドロキソブチラート、キトサン、ヒアルロン酸、ヒドロゲル、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリラート）、ポリ（エチレングリコール）、キトサン、ポリ（Ｌ−ラクチド）、およびこれらの組み合わせのうちの１つ以上を含むことができる。いくつかの実施形態において、ＮＯ放出アルギン酸塩は、フィルム中の生分解性および／または生体適合性ポリマーに組み込むことができる。
【０１９３】
いくつかの実施形態において、ＮＯ放出アルギン酸塩を含有するポリマーフィルムを使用して、種々の物品、特に外科用器具、および医用インプラントを被覆して、血小板粘着を防止し、細菌感染を防止し、血管拡張剤として作用することができる。いくつかの実施形態において、これらの物品は、脈管医療装置、泌尿器科医療装置、胆管医療装置、消化管医療装置、手術部位に配置するのに適した医療装置、および皮膚の創傷または開口部に配置するのに適した医療装置における使用に関するものであり得る。いくつかの実施形態において、ポリマーは、動脈ステント、誘導ワイヤ、カテーテル、トロカール針、骨アンカー、骨ネジ、保護用メッキ、股関節および関節置換物、リード線、バイオセンサ、プローブ、縫合糸、外科用ドレープ、創傷包帯、ならびに包帯を被覆するために使用できる。
【０１９４】
いくつかの実施形態において、被覆される装置は、例えば、ステンレス鋼、ニッケル、チタン、アルミニウム、銅、金、銀、白金、およびこれらの組み合わせなどの金属表面を有することができる。いくつかの実施形態において、ＮＯ放出アルギン酸塩を含有するフィルムまたはポリマーは、ガラスまたは繊維（例えば、布または紙）などの非金属表面を被覆するために使用することができる。
【０１９５】
いくつかの実施形態において、ＮＯ放出アルギン酸塩を含有するポリマーを使用してそれ自体、装置を形成することができる。例えば、ポリマーは、血液もしくは組織のための保存用バッグへと、または創傷被覆材として形成することができる。
【０１９６】
いくつかの実施形態において、バイオフィルムを防止または破壊するために官能化アルギン酸塩と接触させることができる表面には、医療装置、配管器具、コンデンサコイル、光学表面、ボート船体および航空機からなる群から選択されるものが含まれる。他の非限定的な例としては、カウンタートップ、窓、電気器具、硬質の床、敷物、浴槽、シャワー、鏡、トイレ、ビデ、浴室備品、流し台、冷蔵庫、電子レンジ、小型キッチン家電、テーブル、椅子、キャビネット、引き出し、ソファ、ラブシート、ベンチ、ベッド、スツール、戸棚、チェスト、ドレッサー、飾り戸棚、時計、ビュッフェ、シェード、シャッター、娯楽センター、アームレール、ランプ、手すり、書庫、キャビネット、机、ドア、棚、カウチ、カート、ピアノ、彫像および他の芸術品、ラック、ファン、照明器具、ビリヤード台、卓球台、サッカー台、カード台、器具（例えば、手動式および／または携帯型器具、電気器具、空力器具など）、電話、ラジオ、テレビ、ステレオ機器、ＣＤおよびＤＶＤプレーヤ、アナログおよびデジタルサウンドデバイス、パームコンピュータ、ラップトップコンピュータ、デスクトップおよびタワーコンピュータ、コンピュータモニタ、ｍｐ３プレーヤ、メモリストレージデバイス、カメラ、カムコーダ、車両表面（例：フロントガラス；タイヤ；金属、グラスファイバー、複合材料および／またはプラスチックの外装面；布地および／またはビニール外面；布地、ビニール、および／または革の内装面；金属、プラスチック、木材および／または複合材料の内装面、ガラスの内装面など）、自転車、スノーモービル、オートバイ、オフロード車、庭手入れ用機器、農機、洗浄設備（例：パワーワッシャーなど）、塗装機器（例えば、電気および空圧式の塗装機器など）、医用および／または歯科用機器、海洋機器（例えば、手漕ぎボート、動力付きボート、いかだ、セイルボード、カヌー、ロウボートなど）、玩具、筆記用具、腕時計、額入りの写真または絵画、本などが挙げられる。１種類以上の液体を表面から流れ出させ、表面に吸収させないように、および／または表面に染み込ませないようにすることが望ましいいかなる表面も、基材であり得る。例えば、環境条件に曝露されている表面である。表面が体組織または体液と接触する医療機器など、微生物付着のための場所となり得る場合も特に好ましい。
【０１９７】
いくつかの実施形態において、本明細書の他所に開示されているように、医療機器は、バイオフィルムを防止または破壊するために官能化アルギン酸塩で被覆または別の方法で処理することができる。血管または他の体腔を通る動きに適合しているカテーテルのような医療装置は典型的には低摩擦の外装面を備えている。医療機器の表面が低摩擦表面ではない場合、機器を体腔内に挿入したり体腔から取り外したりすることがより困難となり、身体組織の損傷または炎症が起こる可能性がある。低摩擦表面は、例えば、患者の活動の結果として、ある特定の長期間の装置（例えば、長期間のカテーテル）と周囲の組織との間の移動の結果として生じ得る不快感および損傷を低減させるためにも有益である。医療機器は、種々の植え込み型および挿入型医療機器（本明細書では「内部医療機器」とも呼ぶ）を含む。このような医療機器の例としては、流体（例えば、薬物含有流体、膨張流体などの加圧流体、体液、造影剤、熱い媒体または冷たい媒体など）の送達または除去を包含する装置、ならびに心臓、動脈（例えば、冠状動脈、大腿動脈、大動脈、腸骨動脈、頸動脈および椎骨脳底動脈）および静脈などの心血管系の管腔、尿道（前立腺部尿道を含む）、膀胱、尿管、膣、子宮、精管およびファロピー管などの尿路性器系の管腔、鼻涙管、耳管、気管、気管支、鼻道および副鼻腔などの気道の管腔、食道、腸、十二指腸、小腸、大腸、直腸、胆管系および膵管系などの消化管の管腔、リンパ系の管腔、主要体腔（腹腔、胸腔、心膜腔）などを含む広範な範囲の体腔の中へのおよび／または体腔を通じての挿入のための装置が挙げられる。内部医療機器の非限定的な具体例としては、バルーンおよびそのための膨張チューブを含む脈管カテーテル（例えば、バルーンカテーテル）、加水分解カテーテル、誘導ワイヤ、プルバックシース、フィルタ（例えば、大静脈フィルタ）、左心室補助装置、全人工心臓、注射針、薬物送達管、排液管、胃腸管および結腸鏡管、内視鏡装置、気道管などの気管内装置、尿道カテーテルおよび尿管ステントなどの尿路用装置、ならびにカテーテルおよびワイヤ、トロカール針、骨アンカー、骨ネジ、保護用メッキ、関節置換物、リード線、バイオセンサ、プローブ、縫合糸、外科用ドレープ、創傷包帯、ならびに包帯などの神経領域のための装置が挙げられる。本明細書に説明する発明の対象に従った多くの装置は、中実および中空の両方の円筒状を含む、円筒状の１つ以上の部分を有する。
【０１９８】
いくつかの実施形態において、バイオフィルムを防止または破壊するために、固体基材材料は、官能化アルギン酸塩で被覆グするかまたは他の方法で処理することができる。固体基材材料は、ポリマー材料などの有機材料（例えば、５０重量％以上の有機種を含有する材料）、ならびに金属材料（例えば、金属および金属合金）および非金属材料（例えば、炭素、半導体、ガラスおよびセラミックを含み、とりわけ、種々の金属酸化物および非金属酸化物、種々の金属窒化物および非金属窒化物、種々の金属炭化物および非金属炭化物、種々の金属ホウ化物および非金属ホウ化物、種々の金属リン酸塩および非金属リン酸塩、ならびに種々の金属硫化物および非金属硫化物を含有し得る）などの無機材料（例えば、５０重量％以上の無機種を含有する材料）を含むことができる。非金属無機材料の具体例は、次のうちの１つ以上を含有する材料であり得る：酸化アルミニウムおよび遷移金属酸化物（例えば、チタン、ジルコニウム、ハフニウム、タンタル、モリブデン、タングステン、レニウム、およびイリジウムの酸化物）；ケイ素；窒化ケイ素、炭化ケイ素および酸化ケイ素を含有するものなどのケイ素系セラミック（時にガラスセラミックとも呼ぶ）；リン酸カルシウムセラミックス（例えば、ヒドロキシアパタイト）；炭素；窒化炭素などの炭素系のセラミック様材料。
【０１９９】
さらに、ＮＯ放出アルギン酸塩は、これに限定されるわけではないが、抗菌石鹸などの洗剤へと組み込むことができる。いくつかの実施形態において、バーソープに埋め込まれた官能化アルギン酸塩からのＮＯ放出は、水との接触および／または使用時のｐＨの低下によって誘起することができる。いくつかの実施形態において、バーソープの外面が侵食または溶解されるにつれ、バーソープ表面内の追加の官能化アルギン酸塩は、その後のバーソープの使用のために露出されるようになる。ＮＯ放出アルギン酸塩は、液体石鹸に懸濁することもできる。このような石鹸または洗剤は、個人衛生のためにまたは繊維のための抗菌処理を提供するために使用することができる。このような石鹸または洗剤は、細菌、真菌またはウイルスなどの微生物に曝露される可能性がある家庭用品の表面または病院もしくは他の医療環境におけるいずれかの表面を処理するために使用することもできる。
【０２００】
「生体適合性」という用語は、本明細書において、ある特定の量で患者へ投与されたときに、毒性または望ましくない副作用を誘発しない有機溶媒を指す。
【０２０１】
いくつかの実施形態において、官能化アルギン酸塩は薬学的に許容される塩として提供することができる。製剤はそのすべての薬学的に許容される塩形態を含む。このような塩の例としては、薬学的に許容される無機および有機の酸および塩基から誘導されるものが挙げられる。適切な酸塩の例としては、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、グリコール酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、シュウ酸塩、パルモアート（ｐａｌｍｏａｔｅ）、ペクチン酸塩、過硫酸塩、ヒドロキシナフトエ酸塩、ピバリン酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアナート、トシラートおよびウンデカノアートが挙げられる。シュウ酸などの他の酸は、それ自体は薬学的に許容され得ないが、本明細書に説明する発明の対象の化合物およびそれらの薬学的に許容される酸付加塩を得る際の中間体として有用な塩の調製に使用することができる。
【０２０２】
いくつかの実施形態において、適切な塩基に由来する塩が使用される。このような塩としては、限定するものではないが、アルカリ金属（例えば、ナトリウム、カリウム）、アルカリ土類金属（例えば、マグネシウムおよびカルシウム）、アンモニウムおよびＮ−（アルキル）４＋塩が挙げられる。
【０２０３】
いくつかの実施形態において、官能化アルギン酸塩には、その中にいずれかの塩基性窒素含有基の四級化を有するもの、したがって第四級アミンを提供するものも含む。
【０２０４】
いくつかの実施形態において、本開示の官能化ＮＯ放出アルギン酸塩は、抗菌活性を有し、８ｍｇ／ｍＬ以下のポリマー濃度で緑膿菌および／または黄色ブドウ球菌に、４時間にわたる静止条件下で実施される細菌生存度アッセイにおける９９％以上の細菌低減を提供する。いくつかの実施形態において、本開示の官能化ＮＯ放出アルギン酸塩は、８ｍｇ／ｍＬ以下のポリマー濃度で、緑膿菌および／または黄色ブドウ球菌に、４時間にわたる細菌生存度（ＭＢＣ４時間）における少なくとも約３対数低減（すなわち、９９．９％の殺滅）を惹起する。いくつかの実施形態において、本開示の官能化ＮＯ放出アルギン酸塩は、抗菌活性を有し、８ｍｇ／ｍＬ以下のポリマー濃度で４時間にわたって静止条件下で実施される細菌生存度アッセイにおける９９％以上の細菌低減を提供する。いくつかの実施形態において、本開示の官能化ＮＯ放出アルギン酸塩は、８ｍｇ／ｍＬ以下のポリマー濃度で４時間にわたる細菌生存度（ＭＢＣ４時間）における少なくとも約３対数低減（すなわち、９９．９％の殺滅）を惹起する。いくつかの実施形態において、本開示の官能化ＮＯ放出アルギン酸塩は、８ｍｇ／ｍＬ以下のポリマー濃度で８時間にわたる細菌生存度における少なくとも約５対数低減を惹起する。
【０２０５】
本明細書における考察は、単純化のために、立体異性を参照せずに提供される。本明細書に説明するアルギン酸塩は、１つ以上の不斉中心を含有することができ、したがってラセミ化合物およびラセミ混合物、単一の光学異性体、個々のジアステレオマー、ならびにジアステレオマー混合物として生じることができる。これらの化合物のすべてのこのような異性体は、本発明の対象に明白に含まれる。
【０２０６】
本発明の対象のいくつかの実施形態は、次の非限定的な実施例においてより詳細に説明される。
【実施例】
【０２０７】
実施例１：合成方法
材料。褐藻（低粘度）由来のアルギン酸ナトリウム塩、ビス（３−アミノプロピル）アミン（ＤＰＴＡ）、ジエチレントリアミン（ＤＥＴＡ）、Ｎ−プロピル−１，３−プロパンジアミン（ＰＡＰＡ）、スペルミン（ＳＰＥＲ）、およびトリパンブルー溶液（０．４％）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。一般的な実験室用の塩および溶媒は、Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｆａｉｒ  Ｌａｗｎ，ＮＪ）から購入した。特に指定のない限り、すべての化学物質はさらに精製することなく受領したまま使用した。トリプシン処理ダイズブロス（ＴＳＢ）およびトリプシン処理ダイズ寒天（ＴＳＡ）は、Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）から入手した。実験室の緑膿菌（ＡＴＣＣ＃１９１４３）、黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣ＃２９２１３）、およびＡ５４９ヒト肺腺癌細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１８５）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から得た。細胞増殖に使用する気管支上皮細胞増殖培地（ＢＧＥＭ）は、ＵＮＣ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｐｒｏｃｕｒｅｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｒｅ（Ｃｈａｐｅｌ  Ｈｉｌｌ，ＮＣ）から入手した。アルゴン、二酸化炭素（ＣＯ２）、窒素（Ｎ２）、一酸化窒素（ＮＯ）の較正（２５．８７ｐｐｍ、Ｎ２平衡）のガスボンベは、Ａｉｒｇａｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｗｅｌｄｅｒｓ（Ｒａｌｅｉｇｈ，ＮＣ）から購入した。純ＮＯガス（９９．５％）は、Ｐｒａｘａｉｒ（Ｓａｎｆｏｒｄ，ＮＣ）から入手した。蒸留水は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｉｌｌｉ−Ｑ  ＵＶ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ａ１０  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を使用して、１８．２ＭΩの抵抗率まで精製し、総有機物含有量を１０ｐｐｂ以下にした。
【０２０８】
計装１Ｈおよび１３Ｃ核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ（６００ＭＨｚ）分光計で記録した。元素分析（炭素、水素、および窒素（ＣＨＮ））は、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｅｌｅｍｅｎｔａｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  Ｓｅｒｉｅｓ  ２４００  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して実施した。ゼータ電位測定は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＵＫ）を用いてリン酸緩衝液（ＰＢ）（ｐＨ７．４）中で行った。すべてのＵＶ測定値は、ＵＶ−ｖｉｓ  Ｌａｍｂｄａ  ４０  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して、５０ｍＭ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）中で得た。
【０２０９】
ポリアミン官能化アルギン酸塩の合成アルギン酸塩材料（「Ａｌｇ−ポリアミン」と呼ぶ）を、アルギン酸塩のカルボン酸部分とポリアミンの第一級アミンとの間の共有結合性アミド結合形成を通じて、ジエチレントリアミン（ＤＥＴＡ）、ビス（３−アミノプロピル）アミン（ＤＰＴＡ）、Ｎ−プロピル−１，３−プロパンジアミン（ＰＡＰＡ）、またはスペルミン（ＳＰＥＲ）のいずれかで修飾した。簡潔にいえば、アルギン酸塩（１００ｍｇ）を、アルギン酸塩足場のカルボン酸部分に関して、２：１のモル比の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）および２：１のモル比のＮ−ヒドロキシスクシンイミドで、１０ｍＬのリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）（１０ｍＭ、ｐＨ６．５）に溶解した。次いで、アルギン酸塩足場のカルボン酸基に対して２：１のモル比のポリアミンをこの混合物に添加し、反応を室温で２４時間進行させておいた。アミン官能化アルギン酸塩をメタノール中で沈殿させ、遠心分離を介して収集し、メタノールで２回洗浄し、真空乾固させて、各修飾について白色の固体を得た。
【０２１０】
アルギン酸塩およびポリアミン官能化アルギン酸塩の代表的な１Ｈ  ＮＭＲは、以下に説明する次のピークを含んでいた。
【０２１１】
アルギン酸塩：１Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ、δ）３．６０〜４．０５（ＯＣＨＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ））、４．３０（ＯＣＨＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ），４．５０〜４．６０（ＮＨＣＯＣＨ），４．９０（ＯＣＨ（ＣＨＯＨ）Ｏ）。
【０２１２】
Ａｌｇ−ＤＥＴＡ：１Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，δ）２．３０〜３．３０（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２），３．６０〜４．０５（ＯＣＨＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）），４．３０（ＯＣＨＣＨ  （ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ），４．５０〜４．６０（ＮＨＣＯＣＨ），４．９０（ＯＣＨ（ＣＨＯＨ）Ｏ）。
【０２１３】
Ａｌｇ−ＤＰＴＡ：１Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，δ）１．６０〜１．８０（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、２．６０〜２．３０（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、２．８０〜３．１０（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、３．６０〜４．０５（ＯＣＨＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）），４．３０（ＯＣＨＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ））、４．５０〜４．６０（ＮＨＣＯＣＨ），４．９０（ＯＣＨ（ＣＨＯＨ）Ｏ）。
【０２１４】
Ａｌｇ−ＰＡＰＡ：１Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，δ）０．７０〜０．８０（ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３），１．５２（ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３），１．８５（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３），２．８０〜３．１０（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３），３．６０〜４．０５（ＯＣＨＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）），４．３０（ＯＣＨＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ），４．５０〜４．６０（ＮＨＣＯＣＨ），４．９０（ＯＣＨ（ＣＨＯＨ）Ｏ）。
【０２１５】
Ａｌｇ−ＳＰＥＲ：１Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，δ）１．１３（ＮＨＣＨ２（ＣＨ２）２ＣＨ２ＮＨ），１．５６（ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ），１．８０（Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ），２．２０〜２．４０（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ，ＮＨＣＨ２（ＣＨ２）２ＣＨ２ＮＨ，ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２），２．６８（ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２），２．８０〜３．１０（Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ，ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２），３．６０〜４．０５（ＯＣＨＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）），４．３０（ＯＣＨＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ），４．５０〜４．６０（ＮＨＣＯＣＨ），４．９０（ＯＣＨ（ＣＨＯＨ）Ｏ）。
【０２１６】
アルギン酸塩およびポリアミン官能化アルギン酸塩の代表的な１３Ｃ  ＮＭＲは、以下に説明する次のピークを含んでいた。
【０２１７】
アルギン酸塩：１２Ｃ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，δ）６５．０〜８０．０（ＯＣＨＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（Ｏ）），１００．０（ＯＣＨＣＨ（ＯＨ）），１７５．０（ＣＨＣ（Ｏ））。
【０２１８】
Ａｌｇ−ＤＥＴＡ：１２Ｃ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，δ）３９．０〜４７．０（Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２），６５．０〜８０．０（ＯＣＨＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（Ｏ）），１００．０（ＯＣＨＣＨ（ＯＨ）），１６０．０（ＣＨＣ（Ｏ）ＮＨ），１７５．０（ＣＨＣ（Ｏ））。
【０２１９】
Ａｌｇ−ＤＰＴＡ：１３Ｃ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，δ）２６．９〜２９．５（Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ，ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２），３７．６〜４６．０ＣＨ２（Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ，ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２），６５．０〜８０．０（ＯＣＨＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（Ｏ）），１００．０（ＯＣＨＣＨ（ＯＨ）），１６０．０（ＣＨＣ（Ｏ）ＮＨ），１７５．０（ＣＨＣ（Ｏ））。
【０２２０】
１３Ｃ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，δ）１０．９（ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３），２０．０（ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３），３１．３〜４９．０（Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ，ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３），６５．０〜８０．０（ＯＣＨＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（Ｏ）），１００．０（ＯＣＨＣＨ（ＯＨ）），１６０．０（ＣＨＣ（Ｏ）ＮＨ），１７５．０（ＣＨＣ（Ｏ））。
【０２２１】
１３Ｃ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，δ）２３．２（ＮＨＣＨ２（ＣＨ２）２ＣＨ２ＮＨ），３４．８〜４５．０（Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ），６５．０〜８０．０（ＯＣＨＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（Ｏ）），１００．０（ＯＣＨＣＨ（ＯＨ）），１６０．０（ＣＨＣ（Ｏ）ＮＨ），１７５．０（ＣＨＣ（Ｏ））。
【０２２２】
第二級アミン官能化アルギン酸塩の合成。アルギン酸塩は、典型的には、多分散高分子量ポリマー（２００〜５００ｋＤａ）として天然に見出され、大きな多糖類としても水溶性である。第二級アミン含有官能基および他の基の付加は、例えば、Ｎ−ジアゼニウムジオラートＮＯ供与体のその後の形成を通じてアルギン酸塩の一酸化窒素貯蔵能力および放出能力を可能にする。本明細書に説明するように、小分子アミンを、ＥＤＣ／ＮＨＳ反応を介してアルギン酸塩のカルボン酸部分に結合させた（スキーム１）。
【化４８】
2020504778.tif 000050
【０２２３】
１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲの両方を使用して、得られたアルギン酸塩修飾を特徴付け（図４および図５）、アルギン酸塩骨格の修飾を確認した。元素分析もアミン付着を確認した（表１）。アルギン酸塩骨格上の小さなアミン部分のグラフト化は、Ａｌｇ−ＰＡＰＡ、Ａｌｇ−ＤＥＴＡ、Ａｌｇ−ＤＰＴＡ、およびＡｌｇ−ＳＰＥＲについて、約６〜８重量％の増加する窒素含有量の存在を結果的に生じた（すなわち、約４０〜５０％の反応転化）。分子の表面電荷の正のシフトも、足場に存在するアミンの増加とともに見られる（表１）。
【表１】
2020504778.tif 000051
【０２２４】
ＮＯ放出アルギン酸塩の合成。アルギン酸塩足場上にＮ−ジアゼニウムジオラートＮＯ供与体を形成するために、ポリアミン官能化アルギン酸塩（４５ｍｇ）を、１ドラムガラスバイアル中の５０ｍＭのＮａＯＨ溶液（３ｍＬ）を用いて溶解した。開いたバイアルを、連続的に磁気撹拌するステンレス鋼反応器に入れた。アルゴン（１０秒、７バール）で３回パージし、続いてアルゴン（１０分、７バール）でさらなる長いパージを３回することによって容器から酸素を除去した。次いで、容器をＮＯガス（水酸化カリウム上で精製）で３日間１０バールに加圧した。その後、同じアルゴンパージプロトコルを繰り返して未反応ＮＯを除去した。次いで、ＮＯ放出アルギン酸塩をメタノール中で沈殿させ、遠心分離によって収集し、一晩真空乾固させて、−２０℃で白色の粉末として保存した。
【０２２５】
ＮＯ貯蔵および放出の特徴一酸化窒素放出を、Ｓｉｅｖｅｒｓ  ２８０ｉ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ＮＯ分析装置（ＮＯＡ）（Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）を用いてリアルタイムで評価した。分析前に、ＮＯゼロフィルタ（０ｐｐｍＮＯ）および２５．８７ｐｐｍのＮＯ標準ガス（Ｎ２平衡）を通過した空気を用いて  ＮＯＡを較正した。典型的な測定において、ＮＯ放出アルギン酸塩（１ｍｇ）を３０ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４、３７℃）に溶解した。窒素を７０ｍＬ／分の流量で溶液に流して、遊離したＮＯをアルギン酸塩足場から分析装置へと運搬した。機器の収集速度（２００ｍＬ／分）に合わせるために、追加の窒素流をフラスコに供給した。一酸化窒素分析は、ＮＯレベルが１０ｐｐｂのＮＯ／ｍｇアルギン酸塩（機器の検出限界）を下回ったときに終了した。
【０２２６】
Ｎ−ジアゼニウムジオラート官能化アルギン酸塩の合成第二級アミン官能化アルギン酸塩を塩基性条件下で高圧のＮＯに曝露して、Ｎ−ジアゼニウムジオラートＮＯ供与体を形成した。反応溶媒として５０ｍＭのＮａＯＨ水溶液を使用することにより、各試料について一酸化窒素貯蔵を最適化した。Ｎ−ジアゼニウムジオラート形成は、ジアゼニウムジオラート形成前の第二級アミン官能化アルギン酸塩の吸光度スペクトルにおいて存在しないピークである２５３ｎｍにおいて特徴的な吸光度の最大値が存在する紫外可視分光法を用いて確認した（図６）。
【０２２７】
図１は、３７℃のＰＢＳ（ｐＨ７．４）中のＮ−ジアゼニウムジオラート官能化アルギン酸塩についての代表的なＮＯ放出特性を示す。Ａｌｇ−ＳＰＥＲ／ＮＯおよびＡｌｇ−ＰＡＰＡ／ＮＯの両方が、約０．６μｍｏｌ／ｍｇの同様の総ＮＯ貯蔵を有することが認められたが、Ａｌｇ−ＤＥＴＡ／ＮＯおよびＡｌｇ−ＤＰＴＡ／ＮＯの両方は、より少量のＮＯ（約０．４μｍｏｌ／ｍｇ）を放出した（表２）。先の値は、線状生分解性足場であるＮＯ放出キトサンオリゴ糖で達成された報告されたＮＯ合計を含む、他の巨大分子ＮＯ放出生体高分子足場に匹敵する。しかしながら、Ａｌｇ−ＰＡＰＡ／ＮＯが最短のＮＯ放出半減期（約０．５時間）を有し、Ａｌｇ−ＤＥＴＡ／ＮＯが最長（約１３時間）を有する、広範囲のＮＯ放出動態がアルギン酸塩足場について観察された。理論に縛られることなく、ＮＯ放出動態におけるこれらの傾向はアミン前駆体構造に依存していたと考えられる。小分子前駆体についての半減期値を報告した。本明細書に説明するこれらの実施例は、アルギン酸塩骨格にグラフトされたアミン前駆体の化学構造を変えることによって、全ＮＯ貯蔵および放出動態の両方を非常に望ましい特異性に調整および制御する能力を実証している。
【表２】
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【０２２８】
実施例２：生物学的アッセイ
浮遊性殺菌アッセイ緑膿菌および黄色ブドウ球菌細菌培養物を、凍結した（−８０℃）ストックからＴＳＢ中、３７℃で一晩増殖させた。培養物の５００μＬの一定分量を５０ｍＬの新鮮なＴＳＢ中で１ｍＬ当たり１０８コロニー形成単位の濃度（ＣＦＵ／ｍＬ）まで増殖させた。ＴＳＡ上に細菌懸濁液を播種し、３７℃で一晩インキュベートすることにより、作業細菌ストックを作製した。ＴＳＡ細菌ストックを毎週調製し、４℃で保存した。殺菌アッセイのために、緑膿菌および黄色ブドウ球菌のコロニーをＴＳＡプレートから採取し、３ｍＬのＴＳＢに３７℃で一晩接種し、新鮮なＴＳＢ（５０ｍＬ）中で１０８ＣＦＵ／ｍＬの濃度まで再培養した。これらの培養物を遠心分離し、ＰＢＳ中に再懸濁し、１０６ＣＦＵ／ｍＬに希釈した。非ＮＯ放出およびＮＯ放出アルギン酸塩の秤量試料を１ドラムバイアルに添加した。次いで、１０６ＣＦＵ／ｍＬという対応する容量の細菌を添加してある範囲のアルギン酸塩濃度（０．５〜１６ｍｇ／ｍＬ）を得て、３７℃で４時間インキュベートした。未処理の対照（ブランク）を各実験に含め、実験期間にわたる細菌生存度を確保した。処理後、細菌溶液を段階希釈し（１０倍および１００倍希釈）、Ｅｄｄｙ  Ｊｅｔらせん状塗布装置（ＩＵＬ、Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）を用いてＴＳＡ上にらせん状播種し、３７℃で一晩インキュベートした。Ｆｌａｓｈ  ＆  Ｇｏコロニー計数装置（ＩＵＬ；Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）を用いて細菌生存度を評価した。４時間曝露（ＭＢＣ４時間）後の最小殺菌濃度は、未処理の細胞と比較して、細菌生存度の３対数低減を達成するために必要とされる最小濃度として定義した（すなわち、１０６〜１０３ＣＦＵ／ｍＬ）。用いたプレート計数法は、２．５×１０３ＣＦＵ／ｍＬの検出限界を有する。対応するＮＯ用量は、アルギン酸塩試料のＭＢＣ４時間（ｍｇ／ｍＬ）にＰＢＳ中の利用可能なＮＯ（ｐＨ７．４）（μｍｏｌ  ＮＯ／ｍｇアルギン酸塩）を乗じることによって計算した。
【０２２９】
バイオフィルム根絶アッセイ。浮遊性実験と同様に、緑膿菌および黄色ブドウ球菌の細菌培養物をＴＳＢ中で３７℃で一晩増殖させ、新鮮なＴＳＢ中で１０８ＣＦＵ／ｍＬの濃度まで再培養した。次いで、細菌溶液を滅菌培地（緑膿菌、ＴＳＢ；黄色ブドウ球菌、ＴＳＢ＋０．１％グルコース）で１０６ＣＦＵ／ｍＬに希釈し、穏やかに振盪しながら３７℃で４８時間増殖させた。形成された粘性のあるマイクロコロニーバイオフィルムはピペッティングを介して増殖培地から容易に分離された。バイオフィルム（２５０μＬ）を７５０μＬのＰＢＳと混合し、予め測定された非ＮＯ放出およびＮＯ放出アルギン酸塩の試料を含有する１ドラムバイアルに添加し、最終アルギン酸塩濃度は４〜６４ｍｇ／ｍＬの範囲であった。試料を穏やかに振盪しながら３７℃で２４時間インキュベートした。未処理の対照（ブランク）を各実験に含め、実験期間中の細菌生存度を確保にした。分散したバイオフィルムをボルテックスし、段階希釈し（１０倍、１００倍、１０００倍、および１０，０００倍希釈）、Ｅｄｄｙ  Ｊｅｔ螺旋状播種装置（ＩＵＬ；Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）を用いてＴＳＡプレート上に播種し、３７℃で一晩インキュベートした。Ｆｌａｓｈ  ＆Ｇｏコロニー計数装置（ＩＵＬ；Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）を用いて細菌生存度を評価した。２４時間での最小バイオフィルム根絶濃度（ＭＢＥＣ２４時間）は、２４時間処理後にバイオフィルムの生存度をプレート計数法の検出限界（２．５×１０３ＣＦＵ／ｍＬ）を下回るまで低減させた濃度として定義した。対応するＮＯ用量は、アルギン酸塩試料のＭＢＥＣ２４時間（ｍｇ／ｍＬ）にＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の利用可能なＮＯ（μｍｏｌ  ＮＯ／ｍｇアルギン酸塩）を乗じることによって計算した。
【０２３０】
時間に基づくバイオフィルム根絶アッセイバイオフィルム根絶アッセイのための同じプロトコルに従って、緑膿菌バイオフィルムを増殖させ、ＮＯ放出アルギン酸塩（８ｍｇ／ｍＬ）で処理した。未処理の対照（ブランク）を含めて、実験期間中の細菌生存度を確保した。試料を、異なる長さの曝露で（１〜８時間）３７℃で穏やかに振盪しながらインキュベートした後、Ｅｄｄｙ  Ｊｅｔ螺旋状播種装置（ＩＵＬ；Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）を使用してＴＳＡプレート上に播種し、３７℃で一晩インキュベートした。Ｆｌａｓｈ  ＆  Ｇｏコロニー計数装置（ＩＵＬ；Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）を用いて細菌生存度を評価した。８ｍｇ／ｍＬでの時間に基づく殺滅との比較のために、同様の実験をＡｌｇ−ＰＡＰＡ／ＮＯおよびＡｌｇ−ＳＰＥＲ／ＮＯについてＭＢＥＣ２４時間で行った。
【０２３１】
インビトロ細胞毒性アッセイ。Ａ５４９ヒト腺癌細胞をＢＧＥＭ培地中で増殖させ、３７℃の加湿／好気条件下で５％ＣＯ２中でインキュベートした。８０％集密度に達した後、細胞をポリスチレン製９６ウェルプレートに１ウェルあたり１×１０４個／ｍＬの密度で播種し、３７℃で２４時間インキュベートした。次いで、上清を吸引し、緑膿菌または黄色ブドウ球菌バイオフィルムに対してＭＢＥＣ２４時間と等価の最終アルギン酸塩濃度を有するＰＢＳ中の２００μＬの新鮮増殖培地および２０μＬのアルギン酸塩と置き換えた。３７℃で２４時間インキュベートした後、５０μＬのトリパンブルー溶液を添加し、混合物を室温で約３分間インキュベートした。上清を吸引し、ウェルをＰＢＳで洗浄した。Ｎｉｋｏｎ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｓｉｇｈｔ  ＤＳ−Ｕ２コントローラを装備した４０倍の倍率でＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ２０００−Ｅ倒立顕微鏡を使用して、各ウェルの細胞を撮像した。画像は、ＮＩＳ−Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して処理し、カスタムＭＡＴＬＡＢスクリプトを使用して、各画像内の生存細胞数と死細胞数を区別して計数した。各試料についての細胞生存度は次のように計算した。
【数１】
2020504778.tif 000053
【０２３２】
実施例３：抗菌試験
緑膿菌および黄色ブドウ球菌病原体に対するＮＯ放出アルギン酸塩の殺菌活性はＮＯ放出動態に依存しており、約４時間の放出半減期は、より迅速に放出するシステムと比較して浮遊性細菌およびバイオフィルムに基づく細菌の両方を根絶するためにより低いアルギン酸塩濃度を必要とした。ＮＯ放出アルギン酸塩および対照アルギン酸塩のいずれも、バイオフィルムに基づく細菌についての生存度の５対数低減を達成するのに必要とされる濃度で、ヒト呼吸器上皮（Ａ５４９）細胞に対する低い毒性を惹起した。
【０２３３】
浮遊性細菌に対する抗菌作用対照およびＮＯ放出アルギン酸塩の抗菌活性を、慢性感染症と関係する最も一般的な病原体のうちの２つである緑膿菌および黄色ブドウ球菌に対して評価した。細菌生存度アッセイを静止条件下で行い、４時間にわたる細菌生存度（ＭＢＣ４時間）の３対数低減（すなわち、９９．９％殺滅）を惹起するのに必要な最小濃度のＮＯ放出アルギン酸塩を求めた。それぞれのアルギン酸塩修飾に必要とされるＭＢＣ４時間および殺菌性ＮＯ用量の両方を表３に提供する。同等の濃度で、対照アルギン酸塩材料は、緑膿菌および黄色ブドウ球菌の両方について細菌生存度の有意な低減を呈さず、殺菌剤としてのＮＯを暗示した（図７）。
【表３】
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【０２３４】
ＮＯ放出アルギン酸塩足場のそれぞれは、比較的低濃度（＜８ｍｇ／ｍＬ）で９９．９％以上の殺菌を達成し、より低い負に帯電したアルギン酸塩修飾は殺菌活性を達成するためにより低い濃度を必要とした（表１）。先行研究では、正に帯電した足場が細菌とより容易に会合し、結果的に殺菌作用が増強することが報告されてきた。本明細書に開示されたデータは、Ａｌｇ−ＳＰＥＲ／ＮＯが殺菌作用を惹起するために最低濃度を必要とし、Ａｌｇ−ＰＡＰＡ／ＮＯが最高濃度を必要とすることを示す。理論に縛られることなく、放出動態はアルギン酸塩材料に対して殺菌作用を惹起するのに必要とされる濃度で役割を担っていると考えられ、Ａｌｇ−ＰＡＰＡ／ＮＯは、緑膿菌および黄色ブドウ球菌に対してそれぞれ、Ａｌｇ−ＤＰＴＡ／ＮＯおよびＡｌｇ−ＤＥＴＡ／ＮＯと同じＭＢＣ濃度を有する。より大きな総ＮＯ放出（約０．６μｍｏｌ／ｍｇ）にもかかわらず、Ａｌｇ−ＰＡＰＡ／ＮＯと関係する迅速な放出動態は、時期尚早のＮＯ放出に起因し得る（すなわち、細菌と会合する前）。その一方で、Ａｌｇ−ＤＥＴＡ／ＮＯに必要とされるより高い濃度は、他の３つのアルギン酸塩修飾と比較して、４時間後にこのシステムによって放出されるより少量のＮＯ（約０．１０μｍｏｌ／ｍｇ）に起因し得る。
【０２３５】
緑膿菌と比較して黄色ブドウ球菌に対する殺菌活性を達成するためには、より高濃度のＮＯ放出アルギン酸塩が必要であった。この感受性の低下は、グラム陽性菌とグラム陰性菌との間のペプチドグリカン層の組成の違いに起因すると考えられている。黄色ブドウ球菌などのグラム陰性菌は、黄色ブドウ球菌などのグラム陽性菌の外壁上のより厚いより耐性のあるペプチドグリカン層とは対照的に、脂質の豊富な外膜および薄いペプチドグリカンシートを有する。このより頑強な膜は、細菌中へのＮＯの拡散を低下させると考えられ、したがって殺滅を達成するためにより高いＮＯ用量を必要とする。
【０２３６】
抗バイオフィルムの有効性浮遊性細菌に対する殺菌作用を呈することに加えて、ＮＯ放出アルギン酸塩足場は、緑膿菌および黄色ブドウ球菌のバイオフィルムに対して有効であることも立証した。異なるＮＯ放出アルギン酸塩足場の抗バイオフィルム有効性を評価するために、緑膿菌および黄色ブドウ球菌のバイオフィルムをＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で４〜６４ｍｇ／ｍＬのＮＯ放出アルギン酸塩へ２４時間曝露した。浮遊性試験と同様に、黄色ブドウ球菌バイオフィルムと比較して、緑膿菌に対する殺菌活性の上昇が見られた（表４）。Ｗｏｒｌｅｙらは、バイオフィルム構造に関する差異により、緑膿菌と比較して、黄色ブドウ球菌バイオフィルムへのＮＯ放出ポリ（アミドアミン）デンドリマーの浸透の低減を実証した。特定の機序に縛られることなく、この知見は、妨げられたＮＯ供与体足場の拡散により、緑膿菌を上回る黄色ブドウ球菌バイオフィルムについてのＮＯ耐性の上昇を示唆している。さらに、緑膿菌および黄色ブドウ球菌バイオフィルムは、抗菌薬に対するそれらの感受性に影響を及ぼすと考えられる異なる浮遊性分散機序を呈することが報告されてきた。
【表４】
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【０２３７】
より長い半減期（約４〜１３時間）を有するアルギン酸塩足場は、より短い半減期（約０．５〜１時間）を有するアルギン酸塩足場よりも、バイオフィルムに基づく細菌を根絶するために、一貫して低いアルギン酸塩濃度、したがって低いＮＯ用量を必要とした。この特徴は、グラムの陽陰に関係なく観察され、より緩徐な持続的ＮＯ放出は、より有効なＮＯ送達を確実にすることを示唆する。この理論的根拠と一致して、Ａｌｇ−ＳＰＥＲ／ＮＯおよびＡｌｇ−ＰＡＰＡ／ＮＯの両方からの時期尚早のＮＯ放出は、バイオフィルムに送達されるＮＯの量を低下させた。材料の根絶有効性を経時的に検査するために、緑膿菌バイオフィルムを等濃度（８ｍｇ／ｍＬ）の異なるＮＯ放出アルギン酸塩で処理し（図２Ａ）、生存度を種々の曝露時間で評価した。１時間時に、Ａｌｇ−ＰＡＰＡ／ＮＯまたはＡｌｇ−ＳＰＥＲ／ＮＯのいずれかで処理すると、２つのＮＯ放出アルギン酸塩のＮＯ放出半減期（約０．５〜１．４時間）に基づいて予想されるように、バイオフィルム細菌生存度が１〜２対数低減した。しかしながら、生存可能な緑膿菌の濃度が約１０８ＣＦＵ／ｍＬまで回復するにつれて、より長い期間でアルギン酸塩から放出される低ＮＯ濃度は細菌死を引き起こすのに不十分であった。ＭＢＥＣ２４時間で、Ａｌｇ−ＳＰＥＲ／ＮＯおよびＡｌｇ−ＰＡＰＡ／ＮＯ（図２Ｂ）は、１時間および４時間の曝露後に１２時間まで観察可能な細菌増殖がないまま、細菌生存度の５対数低減を惹起した。理論に束縛されるものではないが、アルギン酸塩（すなわち、ＮＯ）濃度の上昇は、より大きな初期ＮＯバーストによって引き起こされる急速な細菌死を通じて、より迅速なＮＯ放出アルギン酸塩の有効性を改善すると考えられる。
【０２３８】
迅速なＮＯ放出システムとは対照的に、より緩徐な放出動態（Ａｌｇ−ＤＰＴＡ／ＮＯおよびＡｌｇ−ＤＥＴＡ／ＮＯについてそれぞれ約４時間および１３時間）を有するアルギン酸塩足場は、同じ濃度（すなわち、８ｍｇ／ｍＬ）で生存度のより緩やかな低下を惹起し、最終的には、８時間の曝露後に５対数低減を達成した。実際、結果は、より低いアルギン酸塩濃度を使用するときは、より緩徐な持続的なＮＯ放出特性がバイオフィルム根絶にとって好ましいことを示している。
【０２３９】
Ａ５４９細胞に対するインビトロ細胞毒性。生物医学的用途における使用のためのアルギン酸塩の特性のうちの１つは、哺乳類細胞に対するその低い毒性である。しかしながら、Ｎ−ジアゼニウムジオラート含有ポリアミンでアルギン酸塩骨格を修飾することの効果は知られていない。したがって、対照およびＮＯ放出アルギン酸塩の細胞毒性を、ヒト呼吸器上皮（Ａ５４９）細胞を曝露することによって比較した。Ａ５４９細胞は、インビトロ細胞毒性試験のための肺上皮細胞モデルとして一般的に使用されている。アルギン酸塩足場の毒性を、緑膿菌および黄色ブドウ球菌の両方に対するそれらのＭＢＥＣで２４時間にわたって評価した。細胞生存度は、トリパンブルー色素排除アッセイを用いて求め、損なわれた細胞膜を有する死細胞はトリパン色素の包含を可能にするのに対し、無傷の細胞膜を有する生細胞は色素を排除する。図３に示すように、対照およびＮＯ放出アルギン酸塩足場は、それらのＭＢＥＣにおいてＡ５４９細胞に対して有意な毒性を呈さず、他のより毒性の高い巨大分子ＮＯ放出系（例えば、シリカナノ粒子およびデンドリマー）と比較して抗バイオフィルム薬としてのこれらの材料の利点を強調する。ＮＯ放出足場はまた、アルギン酸塩対照と比較して細胞生存度のわずかな上昇を促進し、ある一定レベルのＮＯが細胞増殖を促進し得るという従来の報告を裏付けた。まとめると、殺菌濃度でのＮＯ放出アルギン酸塩の低い毒性は、創傷治癒および嚢胞性線維症の治療薬としてのそれらの使用のための見込みを示している。
【０２４０】
多様なＮＯ放出動態（０．５〜１３時間半減期）を可能とするＮ−ジアゼニウムジオラート官能化アルギン酸塩足場は、生分解性抗菌薬として開発された。ＮＯ放出アルギン酸塩材料の殺菌有効性は、緑膿菌および黄色ブドウ球菌の浮遊形態およびバイオフィルムに基づく形態の両方に対して実証された。緩徐で持続的なＮＯ放出（すなわち、Ａｌｇ−ＤＰＴＡ／ＮＯおよびＡｌｇ−ＤＥＴＡ／ＮＯ）をもたらしたアルギン酸塩修飾は、本試験で使用したグラム陰性バイオフィルムおよびグラム陽性バイオフィルムの両方に対してより有効であり、結果として低いアルギン酸塩／ＮＯ濃度で根絶をもたらすと立証された。このような材料は、Ａ５４９細胞に対してほとんどまたは全く毒性を発揮せず、ＮＯ放出アルギン酸塩の使用と関係した独特の利点を強調した。本研究に基づいて、ＮＯ放出アルギン酸塩材料は、慢性感染症における抗菌薬として（例えば、嚢胞性線維症の処置として）使用され得る。
【０２４１】
実施例４：ＣＦ試験。殺菌作用を有し、関連する生物学的過程を調節する内在的に生成されたフリーラジカルである一酸化窒素（ＮＯ）は、ＣＦの処置のための治療薬としての可能性を有する。グラム陽性菌およびグラム陰性菌の両方に対するＮＯの広範な抗菌活性は、ニトロソ化ストレスおよび酸化ストレスによるものであり、脂質過酸化およびＤＮＡ脱アミノ化を通じて細胞機能を破壊する。一酸化窒素は、粘液溶解薬として機能し、毛様体クリアランスを刺激し、ＣＦ治療薬としての候補にする。ガス状ＮＯを用いた初期の研究では気道炎症の低減および肺機能の改善を示しているが、治療上の利益は毒性の懸念および患者のコンプライアンスによって制限されている。いくつかの実施形態において、生理学的条件下でＮＯを放出する巨大分子足場は、持続放出の能力とともに、改善された殺菌有効性および調整可能な放出動態のために生物医学的により適している。特に、キトサン、アルギン酸塩、およびヒアルロン酸などの生体高分子は、それらの生体適合性および生分解性の特徴のために、ＮＯ送達足場としての成功した候補になり得る。
【０２４２】
カチオン性キトサンオリゴ糖は、浮遊性およびバイオフィルムの両方の緑膿菌に対して、ＮＯ放出足場としていくらかの活性を示す。しかしながら、比較試験は、アニオン性生体高分子であるヒアルロン酸がキトサンよりも粘膜付着性であることを示した。ポリマー上の強いアニオン電荷が生体接着に必要であることが示された。
【０２４３】
次の実験は、粘液溶解除去能およびＮＯ放出に関して、３つの異なる多糖、２つの天然生体高分子、アルギン酸塩（Ａｌｇ）およびヒアルロン酸（ＨＡ）、ならびに１つの合成カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）の検査を示す。いくつかの実施形態において、これらのポリマーおよび他の生体適合性ポリマーは、ＣＦの処置に使用され得る。生体高分子のレオロジー上の利点とＮＯの抗菌作用および粘液溶解作用とを組み合わせることによって、気道内の厚い粘液を浸透することができ、慢性細菌感染、バイオフィルム、および薬剤耐性株を根絶することができる新たなＣＦ治療薬が提供される。足場が粘液レオロジーならびにＮＯの殺菌作用および粘液溶解作用に及ぼす影響を検査した。
【０２４４】
特定の機序に縛られることなく、より大きな分子量のアニオン性生体高分子は、粘液レオロジーに有意に影響すると考えられており、その理由は、アニオン性の電荷がムチン鎖の静電気的相互作用を妨害し、より高分子量が、生物付着、ムチンネットワークの関わり合いおよび接触時間を改善するからである。
【表５】
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【０２４５】
生体高分子の分解と特徴づけ粘液の粘弾性を低下させる生体高分子特性の解明は、ＣＦ療法のためのＮＯ放出足場の有用性への洞察を提供する。このようにして、多数の生体高分子組成物および分子量を評価した。高分子量キトサンは、低い水溶性を有するカチオン性足場である。溶解性を付与するために、キトサンを酸化的に分解してキトサンオリゴ糖（ＣＳＯ）を生成した。アニオン性足場は、アルギン酸塩（Ａｌｇ）、ヒアルロン酸（ＨＡ）、およびカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を含んだが、実施形態に応じて、他の生体適合性アニオン性ポリマーも使用されると考えられる。高分子量アルギン酸塩は、酸加水分解により分解されて、異なるグルロン酸（Ｇ）残基含有量（ＡｌｇＧ−７０％、およびＡｌｇＭ−３０％）を有する同様の大きさの多糖類を生成した。アルギン酸塩とＣＳＯを比較するために、Ａｌｇを酸化的に分解してアルギン酸オリゴ糖（ＡＯＤ）を生成した。例えば、３００ｋＤａのアルギン酸塩（Ａｌｇ３００）の酸化的分解は、アルギン酸塩５ｋＤａのオリゴ糖（Ａｌｇ５）を生じた。足場の分子量は、ＧＰＣ／ＳＥＣ−ＭＡＬＳによって求めた。これらの生体高分子の評価により、粘液レオロジーに対する電荷、大きさ、および組成の影響を比較することができた。
【０２４６】
散逸を伴うクオーツ結晶微量天秤（ＱＣＭ−Ｄ）を用いた粘弾性の解析生体高分子とムチンの相互作用をＱＣＭ−Ｄで試験して、生体高分子曝露によるムチンのレオロジー変化を評価した。特定の理論に縛られることなく、ムチンネットワーク相互作用を破壊することを通じてムチン層の厚さを増大させ粘弾性を低下させる能力は、粘液中での薬物拡散の改善をもたらすはずである。相互作用試験は、Ｑ−Ｓｅｎｓｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｂｉｏｌｉｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）ＱＣＭ−Ｄ、ペリスタポンプ、およびいずれかの側に金電極を有する圧電ＡＴカットクオーツ結晶を使用して行った。共鳴周波数（Δｆ）信号および散逸（ΔＤ）信号がベースラインを確立するまでＨＢＥムチンの溶液を結晶を横切って流し、続いてリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）で洗浄した。次に生体高分子溶液をチャンバに流し、シグナルが新たなベースラインに達した後にＰＢＳで洗浄した。
【０２４７】
頻度はＰＢＳですすぐことによって影響されなかったので、ムチンの結合は不可逆的であることが立証された（図１４）。ＣＳＯはムチンと相互作用し、散逸がわずかに増大し、ＰＢＳですすいだ後にベースライン近くに戻った。ＣＳＯは当初、ムチン層の剛性にはほとんど影響しないように見えたが、曝露の影響はＶｏｉｇｈｔのモデル化後に明らかになった（表６）。表６に示すように、ＣＳＯはムチン層の厚さを有意に低下させた。
【表６】
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【０２４８】
正に帯電したキトサン足場と負に帯電したムチンとの間の静電引力は、ムチン層の崩壊および架橋の増大を引き起こし、それが続いて吸着層の厚さを低下させた。図１４は、ＣＳＯ−１をＨＢＥムチンに曝露したときの散逸の経時的変化を示す。３、５、７、９、１１、１３番目の倍音を示す。黒色の矢印はＰＢＳによるすすぎを示し、破線の矢印はＣＳＯ−１の導入を示す。図１４で観察された変化と同様に、Ａｌｇ、ＣＭＣ、およびＨＡへの曝露後に質量および散逸のわずかな変化も観察され、比較のためにＡｌｇのみが示されている（図１５）。図１５にＡｌｇについての経時的な散逸変化を示す。３、５、７、９、１１、１３番目の倍音を示す。黒色の矢印はＰＢＳ洗浄を示し、破線の矢印はＡｌｇ導入を示す。ＡｌｇとＣＭＣはいずれも、チャンバを通るポリマー溶液の流れの際に散逸の大幅な増大を引き起こし、これは柔らかい粘弾層が結晶へ結合したことを示している。一旦ＰＢＳですすがれると、散逸曲線はベースラインに戻り、ポリマーはムチン層に強く結合しなかったが、露光中のフィルムの粘弾性および水和の両方に有意に影響を及ぼしたことが示唆された。ヒアルロン酸は散逸をわずかに増大させたが、ムチンについての元の散逸値を下回るベースラインを確立し、これは、ＨＡへの曝露が層剛性を増大させたことを示した。他のアルギン酸塩を用いた場合、ベースラインからの変化は特筆されなかった。
【０２４９】
ＨＡおよびＣＭＣはいずれも、ＣＳＯよりも大幅に層の厚さを有意に低下させた（表６）。高分子量のＨＡおよびＣＭＣのようなセルロースエーテルは溶液の粘度を上昇させる。それぞれ１．５ＭＤａおよび２５０ｋＤａのこれらのポリマーの大きな分子量は、生体接着および絡み合いの改善に寄与することができ、それによって粘度を上昇させ、これはムチン層の崩壊が起こるにつれて層の厚さが低下することと一致する。アルギン酸塩足場はムチンに有意に影響しなかったが、ＡＯＤは層の厚さを低下させる傾向を示した。オリゴグルロン酸塩は、ムチン間相互作用を妨害することによってムチンネットワークを修飾し、これは観察される厚さの低下を引き起こし得る。このデータに基づいて、アルギン酸塩誘導体は、ムチン層の粘弾性を上昇させない足場であるようであり、それ自体、バルクの粘液レオロジーに有益な効果をもたらし得る。
【０２５０】
平行平板レオロジーを特徴とする粘液に対する生体高分子曝露の効果。ムチンに対するＱＣＭ−Ｄ実験から得られた情報は、ポリマー足場からのＮＯ送達のより明確な理解を得るために、粘液に関する平行平板レオロジー実験と一緒に使用され得る。平行平板レオロジーは、ＣＦ粘液のバルクレオロジーの特徴づけ（すなわち、粘性係数（Ｇ”）、弾性係数（Ｇ’）、および複合体粘度（η＊））を可能にするマクロレオロジー技術を表す。バルクレオロジーを使用して、粘液繊毛クリアランスを含む粘液の特性および／またはマクロスケール機能を求めることができる。ＱＣＭ−Ｄ実験からの結果は、アルギン酸塩誘導体がムチン層に対するそれらの低い影響のために治療薬として有望であることを示している。ＣＳＯ、ＨＡ、およびＣＭＣは、アルギン酸塩と比較して増大したムチン粘弾性を実証している。アルギン酸塩足場を選択して、バルク粘液レオロジーに対する分子量およびＧ残基含有量の効果を評価した。ＨＡはムチン粘弾性を有意に上昇させたため、追加検査用に選択された。
【０２５１】
生体高分子足場を、１０ｍｇ／ｍＬの終濃度になるようにＨＢＥ粘液（３％固形分ｗｔ／ｗｔ）に接種し、１８時間回転させながら３７℃でインキュベートした。それぞれの試料のレオロジー特性は、５０μｍの間隙厚に設定された２０ｍｍ平行平板を備えたＤｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＨＲ−３レオメーター（ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｎｅｗ  Ｃａｓｔｌｅ，ＤＥ）での振幅掃引実験および周波数掃引実験によって測定した。試料の脱水を防ぐために、実験は２３℃で３つ組で行った。
【０２５２】
有用な送達足場は、粘液を通じての薬物拡散を促進するためにＧ’、Ｇ”および／またはη＊を低下させることができ、ならびに／あるいはモデル試験（例えば、カエル試験など）における粘性および弾性の両方の低減は、毛様体クリアランスの改善と関係している。ＡＯＤに曝露した後、粘液のＧ’、Ｇ”およびη＊は有意に低減した（図１６Ａ〜図１６Ｂ）。図１６Ａは、弾性係数（実線）および粘性係数（縞状）を示し、図１６Ｂは、３７℃でアルギン酸塩生体高分子で１８時間処理した後の１０ｒａｄ／秒のＨＢＥ粘液での複合体粘度を示す。（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。特定の機序に縛られるわけではないが、これは、オリゴグルロン酸塩がムチン上のアミノ基と相互作用して水素結合を妨害することによってムチン間相互作用を妨害することによっておそらく引き起こされた結果であった。ＡＯＤによって引き起こされる粘弾性の低減が、病原体を除去するために重要であり、粘液粘弾性に大きく依存する咳および毛様体クリアランスの両方を改善するはずであると考えられ、ＡＯＤを非常に有望なＮＯ送達足場とする。
【０２５３】
さらに、ＡｌｇおよびＡｌｇＧはムチン層の弾性をわずかに低下させた。特定の理論に縛られるわけではないが、これはグルクロン酸残基とムチンとの水素結合およびムチン間相互作用の混乱により架橋が低下したためと考えられる。対照的に、より少ないＧ残基含有量を有するＡｌｇＭは、粘液レオロジーを有意に変えなかった。注目すべきことに、ＨＡはＧ’、Ｇ”、およびη＊の劇的な増大を引き起こした（図１７Ａ〜図１７Ｂ）。図１７Ａは、弾性係数（実線）および粘性係数（縞状）を示し、図１７Ｂは、３７℃でＡＯＤおよびＨＡの生体高分子で１８時間処理した後の１０ｒａｄ／秒のＨＢＥ粘液での複合体粘度を示す。（＊ｐ＜０．０１、＊＊ｐ＜０．００１）。
【０２５４】
このデータは、ＨＡが粘弾性を上昇させたＱＣＭ−Ｄ実験で見られた傾向を裏付けている。特定の理論に縛られることなく、これはおそらく有意な生体付着および絡み合いによるものであった。このデータに基づくと、咳のクリアランスおよび繊毛の活動の両方がＨＡへの曝露によって負に影響を受けることになるであろう。
【０２５５】
ＱＣＭ−Ｄと平行平板レオロジーの両方の結果を考慮すると、ＡＯＤは、粘液除去を促進するための有望な足場であると思われた。より低い分子量、高Ｇ残基含有量、および負の帯電は、粘液の粘弾性を低下させる特性であると思われる。オリゴグルロン酸塩は、ムチン層の厚さを低下させ、粘液のバルクの粘弾性の有意な減少を引き起こした。これらの傾向はバイオフィルム含有粘液と、粘液輸送に及ぼす効果とにおいて続くと考えられている。
【０２５６】
粘弾性に対する一酸化窒素放出の影響。先の正の粘液溶解性の結果は、ＮＯ放出の添加によりさらに増強される。図１８に示すように、ＮＯの放出能力は、迅速であろうと（例えば、ＰＡＰＡ）またはより持続的であろうと（例えば、ＤＰＴＡは、弾性率および粘性率の両方をさらに低下させる。図１８は、弾性係数（実線）と粘性係数（縞状）を示す。
【０２５７】
したがって、ＮＯ放出アルギン酸塩（例えば、低分子量、Ａｌｇ５、または高分子量、Ａｌｇ３００）は、二重の抗菌特性および粘液溶解特性の両方を有する。好ましい生体適合性および生分解性とともに、バイオフィルムの粘性を低減させる能力は、同様に、ＮＯ放出足場（例えば、アルギン酸塩足場）を非常に魅力的なＣＦ治療薬にする。
【表７】
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【表８】
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【表９】
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【０２５８】
明快さと理解のために例証と実施例によって上述のものをある程度詳細に説明したが、本開示の趣旨から逸脱することなく変更を加えることができることは企図されている。それゆえ、本明細書に開示の形態は例示的なものにすぎず、本開示の範囲を制限することを意図するものではなく、むしろ本発明の実施形態の真の範囲および趣旨に伴うすべての修正および代替も網羅するよう意図される。
【０２５９】
先に開示した実施形態の具体的な特長および態様の様々な組み合わせまたは部分組み合わせがなされてもよく、それでもなお本発明の１つ以上の範囲内に収まり得ることが企図される。さらに、実施形態に関連した何らかの特定の特長、態様、方法、特性、特徴、品質、属性、要素などの本明細書における開示は、本明細書で明らかにされる他のすべての実施形態において使用することができる。したがって、開示された実施形態の種々の特長および態様は、開示された本発明の様々な様式を形成するために互いに組み合わされるかまたは互いに置き換えることができることは理解されるべきである。したがって、本明細書に開示された本発明の範囲は、先に説明した特定の開示された実施形態によって制限されるべきではないことが意図されている。その上、本発明は種々の修正形態および代替形態を受け入れることができるが、その具体例が図面に示されており、本明細書で詳細に説明されている。しかしながら、本発明は開示された特定の形態または方法に制限されるべきではなく、反対に、本発明は、説明される種々の実施形態および添付の特許請求の範囲の趣旨および範囲内に収まるすべての修正物、等価物、および代替物を網羅するものである。本明細書に開示されたいかなる方法も、列挙された順序で実行される必要はない。本明細書に開示された方法は、実施者によってとられたある特定の行動を含むが、それらには、明示的または黙示的のいずれかで、それらの行動に関する何らかの第三者からの指示を含めることもできる。例えば、「一酸化窒素放出化合物を投与すること」などの行為は、「一酸化窒素放出化合物の投与を指示すること」を含む。さらに、本開示の特長または態様がマーカッシュ群の点で説明されている場合、当業者は、本開示がそれによってマーカッシュ群のいずれかの個々のメンバーまたはメンバーの部分群の点においても説明されることを認識するであろう。
【０２６０】
本明細書に開示されている範囲は、ありとあらゆる重複、部分範囲、およびこれらの組み合わせも包含する。「までの」、「少なくとも」、「より大きい」、「より小さい」、「の間」などの言語は、列挙された数を含む。「約」または「およそ」などの用語が先行する数字は、列挙された数字を含む。例えば、「約１０ナノメートル」は「１０ナノメートル」を含む。
【０２６１】
本出願において使用される用語および句、ならびに特に添付の特許請求の範囲における変形は、他に明示的に述べられていない限り、制限していることとは対照的にオープンエンドとして解釈されるべきである。上述の例として、「含むこと」という用語は、「制限することなく含む」、「含むがこれに限定されない」などを意味するよう読まれるべきである。
【０２６２】
不定冠詞「ａ」または「ａｎ」は複数を除外しない。例えば、分子量の値および範囲を定義するために本明細書で使用される「約」という用語は、示された値および／または範囲限界が±２０％以内、例えば±１０％以内で変動し得ることを意味する。数字の前の「約」の使用は、その数字自体も含む。例えば、「約５」は「５」を明示的に支持する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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