(57)【要約】がん関連タンパク質に由来する１つまたは複数の抗原性ペプチド（例えばＰＥＳＴ含有ペプチドに融合したもの）を含む組換え融合ポリペプチドが本明細書において提供される。抗原性ペプチドは、反復性がん突然変異を含む抗原性ペプチド、ヘテロクリティック突然変異を含む抗原性ペプチド、またはユビキチンタンパク質に融合した抗原性ペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべてを含み得る。例えば、２つまたはそれよりも多くの抗原性ペプチド（例えばＰＥＳＴ含有ペプチドに融合したもの）を含む組換え融合ポリペプチドであって、各抗原性ペプチドが、反復性がん突然変異を含み、抗原性ペプチドのうちの少なくとも２つが、同じがん関連タンパク質の断片である、組換え融合ポリペプチドが、本明細書において提供される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つまたはそれよりも多くの抗原性ペプチドに融合したＰＥＳＴ含有ペプチドを含む融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株であって、少なくとも１つの抗原性ペプチドが、がん関連タンパク質に由来し、かつ反復性がん突然変異を含み、少なくとも１つの抗原性ペプチドが、がん関連タンパク質に由来し、かつヘテロクリティック突然変異を含む、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項２】
前記ＰＥＳＴ含有ペプチドが、細菌分泌シグナル配列を含み、前記融合ポリペプチドが、カルボキシ末端側の抗原性ペプチドに融合したユビキチンタンパク質をさらに含み、前記ＰＥＳＴ含有ペプチド、前記２つまたはそれよりも多くの抗原性ペプチド、前記ユビキチン、および前記カルボキシ末端側の抗原性ペプチドが、前記融合ポリペプチドのアミノ末端からカルボキシ末端までタンデムに配置されている、請求項１に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項３】
前記抗原性ペプチドが、次の遺伝子：ＫＲＡＳ、ＥＧＦＲ、Ｕ２ＡＦ１、ＢＲＡＦ、ＰＩＫ３ＣＡ、およびＴＰ５３のすべてによってコードされるタンパク質に由来する反復性がん突然変異を含む、請求項１または２に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項４】
前記抗原性ペプチドが、次の反復性がん突然変異：ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｃ、ＥＧＦＲ＿Ｌ８５８Ｒ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ、Ｕ２ＡＦ１＿Ｓ３４Ｆ、ＢＲＡＦ＿Ｖ６００Ｅ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｖ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｅ５４５Ｋ、ＴＰ５３＿Ｒ１５８Ｌ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ａ、ＥＧＦＲ＿Ｌ８６１ＱおよびＴＰ５３＿Ｒ２７３Ｌのすべてを含む、請求項３に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項５】
前記抗原性ペプチドが、表３５に示されるペプチドのすべてを含む、請求項４に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項６】
前記抗原性ペプチドが、次の遺伝子：ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＡＧＥＡ６、ＭＡＧＥＡ４、ＧＡＧＥ１、ＮＹＥＳＯ１、ＳＴＥＡＰ１、およびＲＮＦ４３のすべてによってコードされるタンパク質におけるヘテロクリティック突然変異を含む、請求項１または２に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項７】
前記抗原性ペプチドが、表３６に示されるペプチドのすべてを含む、請求項６に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項８】
前記抗原性ペプチドが、表３５および３６に示されるペプチドのすべてを含む、請求項５または７に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項９】
反復性がん突然変異を含む前記抗原性ペプチドのうちの１つまたは複数に、配列番号３１６に示されるリンカーが先行し、ヘテロクリティック突然変異を含む前記抗原性ペプチドのうちの１つまたは複数に、配列番号８２１〜８２９のうちのいずれか１つに示されるリンカーが先行する、請求項８に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項１０】
前記融合ポリペプチドが、配列番号８９５に示される配列を含む、請求項９に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項１１】
前記抗原性ペプチドが、次の遺伝子：ＳＰＯＰ、ＣＨＥＫ２、ＲＧＰＤ８、ＡＮＫＲＤ３６Ｃ、およびＡＲのすべてによってコードされるタンパク質に由来する反復性がん突然変異を含む、請求項１または２に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項１２】
前記抗原性ペプチドが、次の反復性がん突然変異：ＳＰＯＰ＿Ｆ１３３Ｖ、ＣＨＥＫ２＿Ｋ３７３Ｅ、ＲＧＰＤ８＿Ｐ１７６０Ａ、ＡＮＫＲＤ３６Ｃ＿Ｉ６３４Ｔ、ＡＮＫＲＤ３６Ｃ＿Ｄ６２９Ｙ、ＳＰＯＰ＿Ｗ１３１Ｇ、ＡＮＫＲＤ３６Ｃ＿Ｄ６２６Ｎ、ＳＰＯＰ＿Ｆ１３３Ｌ、ＡＲ＿Ｔ８７８Ａ、ＡＲ＿Ｌ７０２Ｈ、ＡＲ＿Ｗ７４２Ｃ、ＡＲ＿Ｈ８７５ＹおよびＡＲ＿Ｆ８７７Ｌのすべてを含む、請求項１１に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項１３】
前記抗原性ペプチドが、表５２に示されるペプチドのすべてを含む、請求項１２に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項１４】
前記抗原性ペプチドが、次の遺伝子：ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＡＧＥＡ４、ＳＴＥＡＰ１、ＲＮＦ４３、ＳＳＸ２、ＳＡＲＴ３、ＰＡＧＥ４、ＰＳＭＡ、およびＰＳＡのすべてによってコードされるタンパク質におけるヘテロクリティック突然変異を含む、請求項１または２に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項１５】
前記抗原性ペプチドが、表５３に示されるペプチドのすべてを含む、請求項１４に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項１６】
前記抗原性ペプチドが、表５２および５３に示されるペプチドのすべてを含む、請求項１３または１５に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項１７】
反復性がん突然変異を含む前記抗原性ペプチドのうちの１つまたは複数に、配列番号３１６に示されるリンカーが先行し、ヘテロクリティック突然変異を含む前記抗原性ペプチドのうちの１つまたは複数に、配列番号８２１〜８２９のうちのいずれか１つに示されるリンカーが先行する、請求項１６に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項１８】
前記融合ポリペプチドが、配列番号８９３に示される配列を含む、請求項１７に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項１９】
前記カルボキシ末端側の抗原性ペプチドが、がん関連タンパク質に由来し、かつヘテロクリティック突然変異を含む、請求項２に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項２０】
前記カルボキシ末端側の抗原性ペプチドが、約７〜１１、８〜１０、または９アミノ酸長である、請求項２または１９に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項２１】
前記カルボキシ末端側の抗原性ペプチドが、次のＨＬＡ型：ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２、およびＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２のうちの１つまたは複数に結合する、請求項２および１９から２０のいずれか一項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項２２】
前記カルボキシ末端側の抗原性ペプチドが、次の遺伝子：ＳＴＥＡＰ１、ＣＥＡＣＡＭ５、ＮＹＥＳＯ１、およびＮＵＦ２のうちの１つによってコードされるタンパク質に由来する、請求項２および１９から２１のいずれか一項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項２３】
前記カルボキシ末端側の抗原性ペプチドが、配列番号７９６、７９７、７９８、７９９、８００、および８０７に示されるペプチドから選択される、請求項２２に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項２４】
各抗原性ペプチドが、がん関連タンパク質の断片であり、約７〜２００アミノ酸長である、請求項１から２および１９から２３のいずれか一項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項２５】
前記融合ポリペプチドが、少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、もしくは２５個の抗原性ペプチドを含むか、または約５〜５０、１０〜４０、もしくは２０〜３０個の抗原性ペプチドを含む、請求項１から２および１９から２４のいずれか一項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項２６】
前記融合ポリペプチドが、反復性がん突然変異を含む少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個の抗原性ペプチド、または反復性がん突然変異を含む約５〜３０もしくは１０〜２０個の抗原性ペプチドを含み、かつ／あるいは、
前記融合ポリペプチドが、ヘテロクリティック突然変異を含む少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個の抗原性ペプチド、またはヘテロクリティック突然変異を含む約５〜３０もしくは１０〜２０個の抗原性ペプチドを含む、
請求項１から２および１９から２５のいずれか一項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項２７】
反復性がん突然変異を含む前記抗原性ペプチドがタンデムになっており、ヘテロクリティック突然変異を含む前記抗原性ペプチドがタンデムになっている、請求項２６に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項２８】
反復性がん突然変異を含む前記抗原性ペプチドおよびヘテロクリティック突然変異を含む前記抗原性ペプチドが、前記融合ポリペプチド内で混ざり合っている、請求項２６に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項２９】
前記２つまたはそれよりも多くの抗原性ペプチドが、ペプチドリンカーを介して互いに連結している、請求項１から２および１９から２８のいずれか一項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項３０】
前記ペプチドリンカーが、可動性リンカーおよび／もしくは剛性リンカーおよび／もしくは免疫プロテアソームプロセシングリンカーを含むか、または配列番号３１３〜３１６、３１９、および８２１〜８２９に示されるリンカーのうちの１つもしくは複数が、前記２つもしくはそれよりも多くの抗原性ペプチドを連結させるために使用されている、請求項２９に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項３１】
ヘテロクリティック突然変異を含む前記抗原性ペプチドのうちの１つまたは複数の上流の前記ペプチドリンカーが、免疫プロテアソームプロセシングリンカーであるか、または配列番号８２１〜８２９に示されるリンカーから選択される、請求項３０に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項３２】
前記融合ポリペプチドのいかなる領域も、スライディング２１アミノ酸ウィンドウを用いてＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅのハイドロパシー指数によりハイドロパシーをスコアリングしたとき、約１．６のカットオフを超えるスコアを有しない、請求項１から２および１９から３１のいずれか一項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項３３】
前記抗原性ペプチドのうちの少なくとも２つが、異なる反復性がん突然変異を含み、かつ同じがん関連タンパク質の断片である、請求項１から２および１９から３２のいずれか一項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項３４】
前記抗原性ペプチドのうちの少なくとも２つにおける前記反復性がん突然変異が、同じがん関連タンパク質に由来し、かつ、天然に共存しない、請求項１から２および１９から３３のいずれか一項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項３５】
前記抗原性ペプチドのうちの少なくとも２つが、同じがん関連タンパク質の重複断片である、請求項１から２および１９から３４のいずれか一項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項３６】
前記抗原性ペプチドのうちの少なくとも２つにおける前記反復性がん突然変異が、同じがん関連タンパク質に由来し、かつ前記がん関連タンパク質の同じアミノ酸残基において生じる、請求項３５に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項３７】
前記抗原性ペプチドのうちの２つが、同じ反復性がん突然変異を含む、請求項３６に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項３８】
反復性がん突然変異を含む各抗原性ペプチドが、異なる反復性がん突然変異を含む、請求項１から２および１９から３６のいずれか一項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項３９】
前記融合ポリペプチドにおける各反復性がん突然変異が、体細胞フレームシフト突然変異または体細胞ミスセンス突然変異である、請求項１から２および１９から３８のいずれか一項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項４０】
前記融合ポリペプチドにおける各反復性がん突然変異が、体細胞ミスセンス突然変異である、請求項３９に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項４１】
反復性がん突然変異を含む前記抗原性ペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべてが、前記反復性がん突然変異の各側に隣接する同数のアミノ酸を有する、請求項１から２および１９から４０のいずれか一項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項４２】
前記反復性がん突然変異の各側の隣接アミノ酸の数が、少なくとも１０アミノ酸である、請求項４１に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項４３】
前記抗原性ペプチドが、特定のタイプのがんに由来する、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個の最もよく見られる反復性がん突然変異または反復性体細胞ミスセンスがん突然変異を含む、請求項１から２および１９から４２のいずれか一項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項４４】
特定のタイプのがんを有する患者の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、３５％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％が、前記融合ポリペプチドにおける抗原性ペプチドの組合せに含まれる反復性がん突然変異を有する、請求項１から２および１９から４３のいずれか一項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項４５】
前記抗原性ペプチドが、特定のタイプのがんに由来する、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、もしくは３０個の異なる反復性がん突然変異または反復性体細胞ミスセンスがん突然変異を含むか、あるいは前記抗原性ペプチドが、特定のタイプのがんに由来する、約２〜８０、１０〜６０、１０〜５０、１０〜４０、もしくは１０〜３０個の異なる反復性がん突然変異または反復性体細胞ミスセンスがん突然変異を含む、請求項１から２および１９から４４のいずれか一項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項４６】
前記特定のタイプのがんが、非小細胞肺がん、前立腺がん、膵臓がん、膀胱がん、乳がん、子宮がん、卵巣がん、低悪性度神経膠腫、結腸直腸がん、または頭頸部がんである、請求項４３から４５のいずれか一項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項４７】
前記抗原性ペプチドが、２つまたはそれよりも多くのがん関連タンパク質に由来する、請求項１から２および１９から４６のいずれか一項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項４８】
前記２つまたはそれよりも多くのがん関連タンパク質が、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個のがん関連タンパク質であるか、または前記２つまたはそれよりも多くのがん関連タンパク質が、約２〜３０、２〜２５、２〜２０、２〜１５、もしくは２〜１０個のがん関連タンパク質である、請求項４７に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項４９】
前記抗原性ペプチドが、次の遺伝子：ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＤＡＭ２８、ＡＫＴ１、ＡＮＫＲＤ３６Ｃ、ＡＲ、ＡＲＩＤ１Ａ、ＢＭＰＲ２、ＢＲＡＦ、ＣＨＥＫ２、Ｃ１２ｏｒｆ４、ＣＴＮＮＢ１、ＤＯＣＫ３、ＥＧＦＲ、ＥＳＲ１、ＦＢＸＷ７、ＦＧＦＲ３、ＦＨＯＤ３、ＧＮＡＳ、ＨＲＡＳ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＫＩＡＡ２０２６、ＫＲＡＳ、ＫＲＴＡＰ１−５、ＫＲＴＡＰ４−１１、ＬＡＲＰ４Ｂ、ＭＢＯＡＴ２、ＮＦＥ２Ｌ２、ＰＧＭ５、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＬＥＫＨＡ６、ＰＯＬＥ、ＰＴＥＮ、ＲＧＰＤ８、ＲＮＦ４３、ＲＸＲＡ、ＳＭＡＤ４、ＳＰＯＰ、ＳＶＩＬ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＰ５３、ＴＲＩＭ４８、ＵＢＲ５、Ｕ２ＡＦ１、ＷＮＴ１６、ＸＹＬＴ２、ＺＢＴＢ２０およびＺＮＦ８１４のうちの１つまたは複数によってコードされるタンパク質に由来する反復性がん突然変異を含む、請求項１から２および１９から４８のいずれか一項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項５０】
（ａ）前記抗原性ペプチドが、次の遺伝子：ＫＲＡＳ、ＥＧＦＲ、Ｕ２ＡＦ１、ＢＲＡＦ、ＰＩＫ３ＣＡ、およびＴＰ５３のうちの１つもしくは複数またはすべてによってコードされるタンパク質に由来する反復性がん突然変異を含むか、
（ｂ）前記抗原性ペプチドが、次の遺伝子：ＳＰＯＰ、ＣＨＥＫ２、ＲＧＰＤ８、ＡＮＫＲＤ３６Ｃ、およびＡＲのうちの１つもしくは複数またはすべてによってコードされるタンパク質に由来する反復性がん突然変異を含むか、
（ｃ）前記抗原性ペプチドが、次の遺伝子：ＫＲＡＳ、Ｕ２ＡＦ１、ＴＰ５３、ＳＭＡＤ４、およびＧＮＡＳのうちの１つもしくは複数またはすべてによってコードされるタンパク質に由来する反復性がん突然変異を含むか、
（ｄ）前記抗原性ペプチドが、次の遺伝子：ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＴＰ５３、ＲＸＲＡ、ＦＢＸＷ７、およびＮＦＥ２Ｌ２のうちの１つもしくは複数またはすべてによってコードされるタンパク質に由来する反復性がん突然変異を含むか、
（ｅ）前記抗原性ペプチドが、次の遺伝子：ＰＩＫ３ＣＡ、ＡＫＴ１、およびＥＳＲ１のうちの１つもしくは複数またはすべてによってコードされるタンパク質に由来する反復性がん突然変異を含むか、
（ｆ）前記抗原性ペプチドが、次の遺伝子：ＰＴＥＮ、ＫＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＣＴＮＮＢ１、ＦＢＸＷ７、およびＴＰ５３のうちの１つもしくは複数またはすべてによってコードされるタンパク質に由来する反復性がん突然変異を含むか、
（ｇ）前記抗原性ペプチドが、次の遺伝子：ＴＰ５３のうちの１つもしくは複数またはすべてによってコードされるタンパク質に由来する反復性がん突然変異を含むか、
（ｈ）前記抗原性ペプチドが、次の遺伝子：ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、およびＥＧＦＲのうちの１つもしくは複数またはすべてによってコードされるタンパク質に由来する反復性がん突然変異を含むか、
（ｉ）前記抗原性ペプチドが、次の遺伝子：ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＰＩＫ３ＣＡ、およびＴＰ５３のうちの１つもしくは複数またはすべてによってコードされるタンパク質に由来する反復性がん突然変異を含むか、あるいは
（ｊ）前記抗原性ペプチドが、次の遺伝子：ＰＩＫ３ＣＡ、ＣＨＥＫ２、ＲＧＰＤ８、ＡＮＫＲＤ３６Ｃ、ＴＰ５３、ＺＮＦ８１４、ＫＲＴＡＰ１−５、ＫＲＴＡＰ４−１１、およびＨＲＡＳのうちの１つもしくは複数またはすべてによってコードされるタンパク質に由来する反復性がん突然変異を含む、
請求項４９に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項５１】
（ａ）前記抗原性ペプチドが、次の反復性がん突然変異：ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｃ、ＥＧＦＲ＿Ｌ８５８Ｒ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ、Ｕ２ＡＦ１＿Ｓ３４Ｆ、ＢＲＡＦ＿Ｖ６００Ｅ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｖ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｅ５４５Ｋ、ＴＰ５３＿Ｒ１５８Ｌ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ａ、ＥＧＦＲ＿Ｌ８６１ＱおよびＴＰ５３＿Ｒ２７３Ｌのうちの１つもしくは複数またはすべてを含むか、
（ｂ）前記抗原性ペプチドが、次の反復性がん突然変異：ＳＰＯＰ＿Ｆ１３３Ｖ、ＣＨＥＫ２＿Ｋ３７３Ｅ、ＲＧＰＤ８＿Ｐ１７６０Ａ、ＡＮＫＲＤ３６Ｃ＿Ｉ６３４Ｔ、ＡＮＫＲＤ３６Ｃ＿Ｄ６２９Ｙ、ＳＰＯＰ＿Ｗ１３１Ｇ、ＡＮＫＲＤ３６Ｃ＿Ｄ６２６Ｎ、ＳＰＯＰ＿Ｆ１３３Ｌ、ＡＲ＿Ｔ８７８Ａ、ＡＲ＿Ｌ７０２Ｈ、ＡＲ＿Ｗ７４２Ｃ、ＡＲ＿Ｈ８７５ＹおよびＡＲ＿Ｆ８７７Ｌのうちの１つもしくは複数またはすべてを含むか、
（ｃ）前記抗原性ペプチドが、次の反復性がん突然変異：ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｃ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ、Ｕ２ＡＦ１＿Ｓ３４Ｆ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｖ、ＴＰ５３＿Ｒ２４８Ｑ、ＴＰ５３＿Ｒ２４８Ｗ、ＴＰ５３＿Ｒ１７５Ｈ、ＴＰ５３＿Ｒ２７３Ｃ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｒ、ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｈ、ＴＰ５３＿Ｒ２８２Ｗ、ＴＰ５３＿Ｒ２７３Ｈ、ＴＰ５３＿Ｇ２４５Ｓ、ＳＭＡＤ４＿Ｒ３６１Ｃ、ＧＮＡＳ＿Ｒ２０１ＣおよびＧＮＡＳ＿Ｒ２０１Ｈのうちの１つもしくは複数またはすべてを含むか、
（ｄ）前記抗原性ペプチドが、次の反復性がん突然変異：ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｅ５４５Ｋ、ＦＧＦＲ３＿Ｓ２４９Ｃ、ＴＰ５３＿Ｒ２４８Ｑ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｅ５４２Ｋ、ＲＸＲＡ＿Ｓ４２７Ｆ、ＦＢＸＷ７＿Ｒ５０５Ｇ、ＴＰ５３＿Ｒ２８０Ｔ、ＮＦＥ２Ｌ２＿Ｅ７９Ｋ、ＦＧＦＲ３＿Ｒ２４８Ｃ、ＴＰ５３＿Ｋ１３２Ｎ、ＴＰ５３＿Ｒ２４８Ｗ、ＴＰ５３＿Ｒ１７５ＨおよびＴＰ５３＿Ｒ２７３Ｃのうちの１つもしくは複数またはすべてを含むか、
（ｅ）前記抗原性ペプチドが、次の反復性がん突然変異：ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｅ５４５Ｋ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｅ５４２Ｋ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｈ１０４７Ｒ、ＡＫＴ１＿Ｅ１７Ｋ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｈ１０４７Ｌ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｑ５４６Ｋ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｅ５４５Ａ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｅ５４５Ｇ、ＥＳＲ１＿Ｋ３０３Ｒ、ＥＳＲ１＿Ｄ５３８Ｇ、ＥＳＲ１＿Ｙ５３７Ｓ、ＥＳＲ１＿Ｙ５３７Ｎ、ＥＳＲ１＿Ｙ５３７ＣおよびＥＳＲ１＿Ｅ３８０Ｑのうちの１つもしくは複数またはすべてを含むか、
（ｆ）前記抗原性ペプチドが、次の反復性がん突然変異：ＰＴＥＮ＿Ｒ１３０Ｇ、ＰＴＥＮ＿Ｒ１３０Ｑ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｖ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｈ１０４７Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｒ８８Ｑ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｅ５４５Ｋ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｅ５４２Ｋ、ＣＴＮＮＢ１＿Ｓ３７Ｆ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１３Ｄ、ＣＴＮＮＢ１＿Ｓ３７Ｃ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｈ１０４７Ｌ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｇ１１８Ｄ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ａ、ＦＢＸＷ７＿Ｒ５０５ＣおよびＴＰ５３＿Ｒ２４８Ｗのうちの１つもしくは複数またはすべてを含むか、
（ｇ）前記抗原性ペプチドが、次の反復性がん突然変異：ＴＰ５３＿Ｒ２４８Ｑ、ＴＰ５３＿Ｒ２４８Ｗ、ＴＰ５３＿Ｒ１７５Ｈ、ＴＰ５３＿Ｒ２７３Ｃ、ＴＰ５３＿Ｒ２８２Ｗ、ＴＰ５３＿Ｒ２７３Ｈ、ＴＰ５３＿Ｙ２２０Ｃ、ＴＰ５３＿Ｉ１９５Ｔ、ＴＰ５３＿Ｃ１７６Ｙ、ＴＰ５３＿Ｈ１７９Ｒ、ＴＰ５３＿Ｓ２４１ＦおよびＴＰ５３＿Ｈ１９３Ｒのうちの１つもしくは複数またはすべてを含むか、
（ｈ）前記抗原性ペプチドが、次の反復性がん突然変異：ＴＰ５３＿Ｒ２７３Ｌ、ＴＰ５３＿Ｒ２７３Ｃ、ＴＰ５３＿Ｒ２７３Ｈ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｇ１１８Ｄ、ＩＤＨ１＿Ｒ１３２Ｃ、ＩＤＨ１＿Ｒ１３２Ｇ、ＩＤＨ１＿Ｒ１３２Ｈ、ＩＤＨ１＿Ｒ１３２Ｓ、ＩＤＨ２＿Ｒ１７２Ｋ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｅ４５３ＫおよびＥＧＦＲ＿Ｇ５９８Ｖのうちの１つもしくは複数またはすべてを含むか、
（ｉ）前記抗原性ペプチドが、次の反復性がん突然変異：ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｃ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ、ＢＲＡＦ＿Ｖ６００Ｅ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｖ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｅ５４５Ｋ、ＴＰ５３＿Ｒ２４８Ｗ、ＴＰ５３＿Ｒ１７５Ｈ、ＴＰ５３＿Ｒ２７３Ｃ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｈ１０４７Ｒ、ＴＰ５３＿Ｒ２８２Ｗ、ＴＰ５３＿Ｒ２７３ＨおよびＫＲＡＳ＿Ｇ１３Ｄのうちの１つもしくは複数またはすべてを含むか、あるいは
（ｊ）前記抗原性ペプチドが、次の反復性がん突然変異：ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｅ５４５Ｋ、ＣＨＥＫ２＿Ｋ３７３Ｅ、ＲＧＰＤ８＿Ｐ１７６０Ａ、ＡＮＫＲＤ３６Ｃ＿Ｉ６３４Ｔ、ＴＰ５３＿Ｒ２４８Ｑ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｅ５４２Ｋ、ＴＰ５３＿Ｒ２４８Ｗ、ＴＰ５３＿Ｒ１７５Ｈ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｈ１０４７Ｒ、ＴＰ５３＿Ｒ２８２Ｗ、ＴＰ５３＿Ｒ２７３Ｈ、ＴＰ５３＿Ｇ２４５Ｓ、ＴＰ５３＿Ｙ２２０Ｃ、ＺＮＦ８１４＿Ｄ４０４Ｅ、ＫＲＴＡＰ１−５＿Ｉ８８Ｔ、ＫＲＴＡＰ４−１１＿Ｌ１６１ＶおよびＨＲＡＳ＿Ｇ１３Ｖのうちの１つもしくは複数またはすべてを含む、請求項５０に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項５２】
（ａ）前記抗原性ペプチドが、表３５に示されるペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべてを含むか、
（ｂ）前記抗原性ペプチドが、表５２に示されるペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべてを含むか、
（ｃ）前記抗原性ペプチドが、表６８に示されるペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべてを含むか、
（ｄ）前記抗原性ペプチドが、表７６に示されるペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべてを含むか、
（ｅ）前記抗原性ペプチドが、表８７に示されるペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべてを含むか、
（ｆ）前記抗原性ペプチドが、表９５に示されるペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべてを含むか、
（ｇ）前記抗原性ペプチドが、表１００に示されるペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべてを含むか、
（ｈ）前記抗原性ペプチドが、表１０４に示されるペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべてを含むか、
（ｉ）前記抗原性ペプチドが、表１０８に示されるペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべてを含むか、あるいは
（ｊ）前記抗原性ペプチドが、表１１２に示されるペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべてを含む、
請求項５１に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項５３】
ヘテロクリティック突然変異を含む各抗原性ペプチドが、約７〜１１、８〜１０、または９アミノ酸長である、請求項１から２および１９から５２のいずれか一項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項５４】
ヘテロクリティック突然変異を含む前記抗原性ペプチドが、次のＨＬＡ型：ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２、およびＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２のうちの１つまたは複数またはすべてに結合する、請求項１から２および１９から５３のいずれか一項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項５５】
前記抗原性ペプチドが、次の遺伝子：ＣＥＡＣＡＭ５、ＧＡＧＥ１、ｈＴＥＲＴ、ＫＬＨＬ７、ＭＡＧＥＡ３、ＭＡＧＥＡ４、ＭＡＧＥＡ６、ＮＵＦ２、ＮＹＥＳＯ１、ＰＡＧＥ４、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＲＮＦ４３、ＳＡＲＴ３、ＳＳＸ２、ＳＴＥＡＰ１およびＳＵＲＶＩＶＩＮのうちの１つまたは複数によってコードされるタンパク質におけるヘテロクリティック突然変異を含む、請求項１から２および１９から５４のいずれか一項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項５６】
（ａ）前記抗原性ペプチドが、次の遺伝子：ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＡＧＥＡ６、ＭＡＧＥＡ４、ＧＡＧＥ１、ＮＹＥＳＯ１、ＳＴＥＡＰ１、およびＲＮＦ４３のうちの１つもしくは複数またはすべてによってコードされるタンパク質におけるヘテロクリティック突然変異を含むか、
（ｂ）前記抗原性ペプチドが、次の遺伝子：ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＡＧＥＡ４、ＳＴＥＡＰ１、ＲＮＦ４３、ＳＳＸ２、ＳＡＲＴ３、ＰＡＧＥ４、ＰＳＭＡ、およびＰＳＡのうちの１つもしくは複数またはすべてによってコードされるタンパク質におけるヘテロクリティック突然変異を含むか、
（ｃ）前記抗原性ペプチドが、次の遺伝子：ＣＥＡＣＡＭ５、ＳＴＥＡＰ１、ＭＡＧＥＡ３、ＰＲＡＭＥ、ｈＴＥＲＴ、およびＳＵＲＶＩＶＩＮのうちの１つもしくは複数またはすべてによってコードされるタンパク質におけるヘテロクリティック突然変異を含むか、
（ｄ）前記抗原性ペプチドが、次の遺伝子：ＣＥＡＣＡＭ５、ＧＡＧＥ１、ＮＹＥＳＯ１、ＲＮＦ４３、ＮＵＦ２、ＫＬＨＬ７、ＭＡＧＥＡ３、およびＰＲＡＭＥのうちの１つもしくは複数またはすべてによってコードされるタンパク質におけるヘテロクリティック突然変異を含むか、
（ｅ）前記抗原性ペプチドが、次の遺伝子：ＣＥＡＣＡＭ５、ＳＴＥＡＰ１、ＲＮＦ４３、ＭＡＧＥＡ３、ＰＲＡＭＥ、およびｈＴＥＲＴのうちの１つもしくは複数またはすべてによってコードされるタンパク質におけるヘテロクリティック突然変異を含むか、
（ｆ）前記抗原性ペプチドが、次の遺伝子：ＣＥＡＣＡＭ５、ＰＲＡＭＥ、ｈＴＥＲＴ、ＳＴＥＡＰ１、ＲＮＦ４３、ＮＵＦ２、ＫＬＨＬ７、およびＳＡＲＴ３のうちの１つもしくは複数またはすべてによってコードされるタンパク質におけるヘテロクリティック突然変異を含むか、
（ｇ）前記抗原性ペプチドが、次の遺伝子：ＣＥＡＣＡＭ５、ＳＴＥＡＰ１、ＲＮＦ４３、ＳＡＲＴ３、ＮＵＦ２、ＫＬＨＬ７、ＰＲＡＭＥ、およびｈＴＥＲＴのうちの１つもしくは複数またはすべてによってコードされるタンパク質におけるヘテロクリティック突然変異を含むか、
（ｈ）前記抗原性ペプチドが、次の遺伝子：ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＡＧＥＡ６、ＳＴＥＡＰ１、ＲＮＦ４３、ＳＡＲＴ３、ＮＵＦ２、ＫＬＨＬ７、およびｈＴＥＲＴのうちの１つもしくは複数またはすべてによってコードされるタンパク質におけるヘテロクリティック突然変異を含むか、
（ｉ）前記抗原性ペプチドが、次の遺伝子：ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＡＧＥＡ６、ＭＡＧＥＡ４、ＧＡＧＥ１、ＮＹＥＳＯ１、ＳＴＥＡＰ１、ＲＮＦ４３、およびＭＡＧＥＡ３のうちの１つもしくは複数またはすべてによってコードされるタンパク質におけるヘテロクリティック突然変異を含むか、あるいは
（ｊ）前記抗原性ペプチドが、次の遺伝子：ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＡＧＥＡ４、ＳＴＥＡＰ１、ＮＹＥＳＯ１、ＰＲＡＭＥ、およびｈＴＥＲＴのうちの１つもしくは複数またはすべてによってコードされるタンパク質におけるヘテロクリティック突然変異を含む、
請求項５５に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項５７】
（ａ）前記抗原性ペプチドが、表３６に示されるペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべてを含むか、
（ｂ）前記抗原性ペプチドが、表５３に示されるペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべてを含むか、
（ｃ）前記抗原性ペプチドが、表６９に示されるペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべてを含むか、
（ｄ）前記抗原性ペプチドが、表７７に示されるペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべてを含むか、
（ｅ）前記抗原性ペプチドが、表８８に示されるペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべてを含むか、
（ｆ）前記抗原性ペプチドが、表９６に示されるペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべてを含むか、
（ｇ）前記抗原性ペプチドが、表１０１に示されるペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべてを含むか、
（ｈ）前記抗原性ペプチドが、表１０５に示されるペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべてを含むか、
（ｉ）前記抗原性ペプチドが、表１０９に示されるペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべてを含むか、あるいは
（ｊ）前記抗原性ペプチドが、表１１３に示されるペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべてを含む、
請求項５６に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項５８】
（ａ）前記抗原性ペプチドが、表３５および３６に示されるペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべてを含むか、
（ｂ）前記抗原性ペプチドが、表５２および５３に示されるペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべてを含むか、
（ｃ）前記抗原性ペプチドが、表６８および６９に示されるペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべてを含むか、
（ｄ）前記抗原性ペプチドが、表７６および７７に示されるペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべてを含むか、
（ｅ）前記抗原性ペプチドが、表８７および８８に示されるペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべてを含むか、
（ｆ）前記抗原性ペプチドが、表９５および９６に示されるペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべてを含むか、
（ｇ）前記抗原性ペプチドが、表１００および１０１に示されるペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべてを含むか、
（ｈ）前記抗原性ペプチドが、表１０４および１０５に示されるペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべてを含むか、
（ｉ）前記抗原性ペプチドが、表１０８および１０９に示されるペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべてを含むか、あるいは
（ｊ）前記抗原性ペプチドが、表１１２および１１３に示されるペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべてを含む、
請求項１から２および１９から５７のいずれか一項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項５９】
（ａ）前記融合ポリペプチドが、配列番号８５９、８６０、８６１、８６２、８６３、８６４、８６５、８９４、８９５、および９０５のいずれか１つに示される配列を含むか、
（ｂ）前記融合ポリペプチドが、配列番号８７１、８７２、８７３、８７４、８７５、８７６、８７７、８９２、８９３、および９０６のいずれか１つに示される配列を含むか、
（ｃ）前記融合ポリペプチドが、配列番号８６６、８６７、８６８、８６９、８７０、および９０８のいずれか１つに示される配列を含むか、
（ｄ）前記融合ポリペプチドが、配列番号８７８、８７９、８８０、８８１、８８２、８８８、８８９、８９０、および８９１のいずれか１つに示される配列を含むか、
（ｅ）前記融合ポリペプチドが、配列番号８８３、８８４、８８５、８８６、８８７、および９０７のいずれか１つに示される配列を含むか、
（ｆ）前記融合ポリペプチドが、配列番号８９６、８９７、および９０４のいずれか１つに示される配列を含むか、
（ｇ）前記融合ポリペプチドが、配列番号８９８および８９９のいずれか１つに示される配列を含むか、
（ｈ）前記融合ポリペプチドが、配列番号９００および９０１のいずれか１つに示される配列を含むか、
（ｉ）前記融合ポリペプチドが、配列番号９０２および９０３のいずれか１つに示される配列を含むか、または
（ｊ）前記融合ポリペプチドが、配列番号９１８および９１９のいずれか１つに示される配列を含む、
請求項５８に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項６０】
前記融合ポリペプチドが、約１５０ｋＤａ以下または約１２５ｋＤａ以下の分子量を有する、請求項１から２および１９から５９のいずれか一項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項６１】
融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株であって、前記融合ポリペプチドが、２つまたはそれよりも多くの抗原性ペプチドに融合したＰＥＳＴ含有ペプチドを含み、各抗原性ペプチドが、反復性がん突然変異を含み、前記抗原性ペプチドのうちの少なくとも２つが、異なる反復性がん突然変異を含み、かつ同じがん関連タンパク質の断片である、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項６２】
前記抗原性ペプチドのうちの少なくとも２つにおける前記反復性がん突然変異が、同じがん関連タンパク質に由来し、かつ、天然に共存しない、請求項６１に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項６３】
前記抗原性ペプチドのうちの少なくとも２つが、同じがん関連タンパク質の重複断片である、請求項６１または６２に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項６４】
前記抗原性ペプチドのうちの少なくとも２つにおける前記反復性がん突然変異が、同じがん関連タンパク質に由来し、かつ前記がん関連タンパク質の同じアミノ酸残基において生じる、請求項６３に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項６５】
前記融合ポリペプチドにおける前記反復性がん突然変異のうちの１つまたは複数が、体細胞ミスセンス突然変異である、請求項６１から６４のいずれか一項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項６６】
前記融合ポリペプチドにおける前記反復性がん突然変異のうちの１つまたは複数が、体細胞フレームシフト突然変異である、請求項６１から６５のいずれか一項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項６７】
前記抗原性ペプチドが、次の遺伝子：ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＴＲＩＭ４８、ＰＴＥＮ、ＰＯＬＥ、ＰＧＭ５、ＭＢＯＡＴ２、ＫＩＡＡ２０２６、ＦＢＸＷ７、Ｃ１２ｏｒｆ４、ＺＢＴＢ２０、ＸＹＬＴ２、ＷＮＴ１６、ＵＢＲ５、ＴＧＦＢＲ２、ＳＶＩＬ、ＲＮＦ４３、ＰＬＥＫＨＡ６、ＬＡＲＰ４Ｂ、ＦＨＯＤ３、ＤＯＣＫ３、ＢＭＰＲ２、ＡＲＩＤ１Ａ、ＡＤＡＭ２８およびＡＣＶＲ２Ａのうちの１つもしくは複数またはすべてによってコードされるタンパク質に由来する反復性がん突然変異を含む、請求項６１から６６のいずれか一項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項６８】
前記抗原性ペプチドが、次の反復性がん突然変異：ＴＲＩＭ４８＿Ｙ１９２Ｈ、ＰＴＥＮ＿Ｒ１３０Ｎ、ＰＯＬＥ＿Ｖ４１１Ｌ、ＰＯＬＥ＿Ｐ２８６Ｒ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｈ１０４７Ｒ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｒ８８Ｎ、ＰＧＭ５＿Ｉ９８Ｖ、ＭＢＯＡＴ２＿Ｒ４３Ｎ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ、ＫＩＡＡ２０２６＿Ｒ５７４Ｃ、ＦＢＸＷ７＿Ｒ４６５Ｃ、Ｃ１２ｏｒｆ４＿Ｒ３３５Ｎ、ＢＲＡＦ＿Ｖ６００Ｅ、ＺＢＴＢ２０＿ｐ．Ｐｒｏ６９２ＬｅｕｆｓＴｅｒ４３、ＸＹＬＴ２＿ｐ．Ｇｌｙ５２９ＡｌａｆｓＴｅｒ７８、ＷＮＴ１６＿ｐ．Ｇｌｙ１６７ＡｌａｆｓＴｅｒ１７、ＵＢＲ５＿ｐ．Ｇｌｕ２１２１ＬｙｓｆｓＴｅｒ２８、ＴＧＦＢＲ２＿ｐ．Ｇｌｕ１５０ＧｌｙｆｓＴｅｒ３５、ＳＶＩＬ＿ｐ．Ｍｅｔ１８６３ＴｒｐｆｓＴｅｒ４４、ＲＮＦ４３＿ｐ．Ｇｌｙ６５９ＶａｌｆｓＴｅｒ４１、ＰＬＥＫＨＡ６＿ｐ．Ｖａｌ３２８ＴｙｒｆｓＴｅｒ１７２、ＬＡＲＰ４Ｂ＿ｐ．Ｔｈｒ１６３ＨｉｓｆｓＴｅｒ４７、ＦＨＯＤ３＿ｐ．Ｓｅｒ３３６ＶａｌｆｓＴｅｒ１３８、ＤＯＣＫ３＿ｐ．Ｐｒｏ１８５２ＧｌｎｆｓＴｅｒ４５、ＢＭＰＲ２＿ｐ．Ａｓｎ５８３ＴｈｒｆｓＴｅｒ４４、ＡＲＩＤ１Ａ＿ｐ．Ａｓｐ１８５０ＴｈｒｆｓＴｅｒ３３、ＡＤＡＭ２８＿ｐ．Ａｓｎ７５ＬｙｓｆｓＴｅｒ１５およびＡＣＶＲ２Ａ＿ｐ．Ｌｙｓ４３５ＧｌｕｆｓＴｅｒ１９のうちの１つもしくは複数またはすべてを含む、請求項６７に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項６９】
前記抗原性ペプチドが、表１１６に示されるペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべてを含む、請求項６８に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項７０】
前記融合ポリペプチドが、配列番号９１７のいずれか１つに示される配列を含む、請求項６９に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項７１】
前記融合ポリペプチドが、前記２つまたはそれよりも多くの抗原性ペプチドの組合せのＮ末端側および／またはＣ末端側に１つまたは複数のペプチドタグをさらに含み、前記１つまたは複数のペプチドタグが、ＦＬＡＧタグおよびＳＩＩＮＦＥＫＬタグのうちの一方または両方を含む、先行する請求項のいずれかに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項７２】
前記ＰＥＳＴ含有ペプチドが、前記融合ポリペプチドのＮ末端にある、先行する請求項のいずれかに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項７３】
前記ＰＥＳＴ含有ペプチドが、ＬＬＯのＮ末端断片である、請求項７２に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項７４】
前記ＬＬＯのＮ末端断片が、配列番号３３６に示される配列を有する、請求項７３に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項７５】
前記核酸が、エピソームプラスミドに存在する、先行する請求項のいずれかに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項７６】
前記核酸が、前記組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株に抗生物質耐性を与えない、先行する請求項のいずれかに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項７７】
弱毒化栄養要求性Ｌｉｓｔｅｒｉａ株である、先行する請求項のいずれかに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項７８】
前記弱毒化栄養要求性Ｌｉｓｔｅｒｉａ株が、１つまたは複数の内在性遺伝子に、前記１つまたは複数の内在性遺伝子を不活性化させる突然変異を含む、請求項７７に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項７９】
前記１つまたは複数の内在性遺伝子が、ａｃｔＡ、ｄａｌ、およびｄａｔを含む、請求項７８に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項８０】
前記核酸が、代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームを含む、先行する請求項のいずれかに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項８１】
前記代謝酵素が、アラニンラセマーゼ酵素またはＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ酵素である、請求項８０に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項８２】
前記融合ポリペプチドがｈｌｙプロモーターから発現される、先行する請求項のいずれかに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項８３】
組換えＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株である、先行する請求項のいずれかに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項８４】
前記組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株が、ａｃｔＡ、ｄａｌ、およびｄａｔの欠失、またはこれらにおける不活性化突然変異を含む、弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株であり、前記核酸が、エピソームプラスミドに存在し、かつアラニンラセマーゼ酵素またはＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームを含み、前記ＰＥＳＴ含有ペプチドが、ＬＬＯのＮ末端断片である、先行する請求項のいずれかに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項８５】
先行する請求項のいずれかに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む免疫原性組成物。
【請求項８６】
前記免疫原性組成物が、２つまたはそれよりも多くの組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株の組合せを含み、各組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株が、異なる抗原性ペプチドセット、または異なる順序における同じ抗原性ペプチドセットを含む、請求項８５に記載の免疫原性組成物。
【請求項８７】
各組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株が、異なる抗原性ペプチドセットを含む、請求項８６に記載の免疫原性組成物。
【請求項８８】
前記組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株の組合せが、約５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、４５〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００、１００〜１２０、１２０〜１４０、１４０〜１６０、１６０〜１８０、１８０〜２００、２００〜２２０、２２０〜２４０、２４０〜２６０、２６０〜２８０、または２８０〜３００個の異なる抗原性ペプチドを含む、請求項８７に記載の免疫原性組成物。
【請求項８９】
アジュバントをさらに含む、請求項８５から８８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項９０】
前記アジュバントが、顆粒細胞／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）タンパク質、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド分子、サポニンＱＳ２１、モノホスホリルリピドＡ、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、または解毒リステリオリシンＯタンパク質を含む、請求項８９に記載の免疫原性組成物。
【請求項９１】
対象において腫瘍またはがんに対する免疫応答を誘導する方法であって、前記対象に、請求項１から８４のいずれか一項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株または請求項８５から９０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を投与するステップを含む方法。
【請求項９２】
対象において腫瘍またはがんを防止または処置する方法であって、前記対象に、請求項１から８４のいずれか一項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株または請求項８５から９０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を投与するステップを含む方法。
【請求項９３】
複数の異なる組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株または複数の異なる免疫原性組成物が前記対象に投与される、請求項９１または９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記複数の異なる組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株または複数の異なる免疫原性組成物が前記対象に同時に投与される、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記複数の異なる組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株または複数の異なる免疫原性組成物が前記対象に連続的に投与される、請求項９３に記載の方法。
【請求項９６】
前記複数の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株または複数の異なる免疫原性組成物が、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０個の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株または免疫原性組成物を含む、請求項９３から９５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９７】
前記対象が、１つまたは複数のがん関連タンパク質における１つまたは複数の反復性がん突然変異に関連するがんを有し、前記対象に投与される前記組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株または前記免疫原性組成物が、前記がんに関連する１つまたは複数の反復性がん突然変異を含む抗原性ペプチドを含む、請求項９３から９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９８】
前記方法が、前記投与するステップの前に、前記対象を前記１つまたは複数の反復性がん突然変異のうちの少なくとも１つについてスクリーニングして、それを同定するステップを含み、前記対象に投与される前記組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株または前記免疫原性組成物が、前記対象において同定された前記１つまたは複数の反復性がん突然変異のうちの前記少なくとも１つを含む抗原性ペプチドを含む、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
前記投与するステップの前に、前記対象を反復性がん突然変異についてスクリーニングして、それを同定するステップを含まない、請求項９７に記載の方法。
【請求項１００】
請求項１から８４のいずれか一項に記載の１つまたは複数の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む細胞バンク。
【請求項１０１】
冷凍細胞バンクまたは凍結乾燥細胞バンクである、請求項１００に記載の細胞バンク。
【請求項１０２】
免疫療法構築物を生成する方法であって、
（ａ）前記免疫療法構築物に含めるための、がん関連タンパク質における反復性がん突然変異セットおよびヘテロクリティック突然変異セットを選択するステップと、
（ｂ）前記反復性がん突然変異のそれぞれおよび前記ヘテロクリティック突然変異のそれぞれを含む抗原性ペプチドを設計するステップと、
（ｃ）抗原性ペプチドセットを選択するステップであって、前記各抗原性ペプチドのハイドロパシーを検査すること、および抗原性ペプチドが、選択されたハイドロパシー指数閾値を超えるスコアを有する場合はこれを修飾または選択解除することを含むステップと、
（ｄ）前記選択された抗原性ペプチドのそれぞれを含む融合ポリペプチドを設計するステップと、
（ｅ）前記融合ポリペプチドをコードする核酸構築物を生成するステップと
を含む方法。
【請求項１０３】
前記反復性がん突然変異が、ステップ（ａ）において、次の基準：
（ｉ）複数のタイプのがんまたは特定のタイプのがんにおける発生頻度、
（ｉｉ）がん関連タンパク質の機能的ドメイン内の位置、
（ｉｉｉ）公知のがんドライバー突然変異または化学療法耐性突然変異としてのステータス、および
（ｉｖ）体細胞ミスセンス突然変異または体細胞フレームシフト突然変異としての同定
のうちの１つまたは複数に基づいて選択される、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
前記ヘテロクリティック突然変異が、ステップ（ａ）において、次の基準：
（ｉ）次のＨＬＡ型：ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２、およびＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２のうちの１つまたは複数に結合する能力、
（ｉｉ）ＣＤ８＋Ｔリンパ球応答を生成する能力、および
（ｉｉｉ）対応する野生型配列と同等かまたはこれよりも強い特定のＨＬＡ型に対する結合親和性
のうちの１つまたは複数に基づいて選択される、請求項１０２または１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
ステップ（ａ）において選択される前記反復性がん突然変異セットが、次の基準：
（ｉ）前記セットが、約３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、もしくは５０個以下の反復性がん突然変異、および／または約３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、もしくは５０個以下のヘテロクリティック突然変異を含むこと、
（ｉｉ）前記セットが、特定のタイプのがんを有するがん患者の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％において見出される反復性がん突然変異を含むこと、および
（ｉｉｉ）前記セットが、特定のタイプのがんに由来する、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０個の異なる反復性がん突然変異または反復性体細胞ミスセンス突然変異を含むこと
のうちの１つまたは複数に基づいて選択される、請求項１０２から１０４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０６】
反復性がん突然変異を含むようにステップ（ｂ）において設計される各抗原性ペプチドが、前記反復性がん突然変異および各側の隣接配列を含む前記がん関連タンパク質の断片を含むように設計される、請求項１０２から１０５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０７】
反復性がん突然変異を含む前記抗原性ペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべてが、前記反復性がん突然変異の各側に少なくとも約１０個の隣接アミノ酸を含む、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
ヘテロクリティック突然変異を含む前記抗原性ペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべてが、アンカー位置に好ましいアミノ酸を有するように設計される、請求項１０２から１０７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０９】
抗原性ペプチドが、ステップ（ｃ）において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける分泌可能性を予測する、ハイドロパシー閾値未満の場合に選択される、請求項１０２から１０８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１０】
前記抗原性ペプチドが、ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅのハイドロパシー指数２１アミノ酸ウィンドウによってスコアリングされ、約１．６のカットオフを超えるスコアを有するペプチドはすべて除外されるか、または前記カットオフ未満のスコアを有するように修飾される、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
ステップ（ｃ）が、対象ＨＬＡに結合する前記抗原性ペプチドの能力に基づいて抗原性ペプチドをスコアリングし選択することをさらに含む、請求項１０２から１１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１２】
ステップ（ｄ）における前記融合ポリペプチド内の抗原性ペプチドの順序が、ランダム化を使用して選択される、請求項１０２から１１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１３】
前記融合ポリペプチドが、約１５０ｋＤａ以下または約１２５ｋＤａ以下の分子量を有するように設計される、請求項１０２から１１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１４】
ステップ（ｄ）が、前記融合ポリペプチドのハイドロパシーを検査すること、および前記融合ポリペプチドのいずれかの領域が選択されたハイドロパシー指数閾値を超えるスコアを有する場合、前記抗原性ペプチドを並べ替えること、または問題がある抗原性ペプチドを除去することのいずれかをさらに含む、請求項１０２から１１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１５】
前記融合ポリペプチドが、スライディング２１アミノ酸ウィンドウを用いてＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅのハイドロパシー指数によりスコアリングされ、前記閾値が約１．６である、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
ステップ（ｅ）が、前記核酸配列を最適化することをさらに含む、請求項１０２から１１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１７】
前記最適化がコドン最適化を含む、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
前記核酸をＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株に導入するステップと、コードされた前記融合ポリペプチドの発現および分泌を確認するステップとをさらに含む、請求項１０２から１１７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１６年１１月３０日に出願された米国出願第６２／４２８，５１５号、２０１７年１月６日に出願された米国出願第６２／４４３，４８３号、および２０１７年１１月８日に出願された米国出願第６２／５３８，２９２号の利益を主張しており、これら出願の各々は、すべての目的のためにその全体が参考として本明細書中に援用される。
【０００２】
ＥＦＳ  ＷＥＢを介してテキストファイルとして提出された配列表の参照
５０７１８０ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔというファイルに書かれた配列表は１．８９メガバイトであり、２０１７年１１月３０日に作成され、これにより参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
背景
多くのがん患者は、最も高頻度で突然変異するか、または少なくとも部分的に悪性表現型の発生の原因となる、重要な腫瘍ドライバー遺伝子の機能的ドメインによく見られる突然変異を共有する。複数の腫瘍型のがん患者が、これらの「ホットスポット」突然変異を共通してもっている。体細胞性のドライバー突然変異の獲得は、発癌に必要とされる増殖、浸潤、およびアポトーシスの調節不全に関与する主要な機構のうちの１つである。これらの突然変異の多くは、生物学的に活性なタンパク質の機能的領域（例えば、キナーゼドメインまたは結合ドメイン）において高頻度で生じるか、または活性部位（例えば、リン酸化部位）を妨害し、結果として機能喪失型または機能獲得型の突然変異をもたらす。あるいは、これらの突然変異の多くは、正常な機能を妨げるほど十分にタンパク質の三次元構造および／または電荷バランスが乱れるようなかたちで生じる場合がある。
【０００４】
前臨床エビデンスおよび早期臨床試験データは、がんが定着した患者を処置するために免疫系の抗腫瘍能が利用され得ることを示唆している。このワクチン戦略は、種々のタイプのがんに関連する腫瘍抗原を活用する。腫瘍関連抗原を発現するウイルまたは細菌ベクターなどの生ワクチンを用いた免疫化は、腫瘍に対する強力なＣＴＬ応答を誘発するための１つの戦略である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
概要
がん免疫療法のための方法および組成物が提供される。一態様では、融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株であって、融合ポリペプチドが、２つまたはそれよりも多くの抗原性ペプチドに融合したＰＥＳＴ含有ペプチドを含み、各抗原性ペプチドが、反復性がん突然変異を含み、抗原性ペプチドのうちの少なくとも２つが、異なる反復性がん突然変異を含み、かつ同じがん関連タンパク質の断片である組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株が、本明細書において提供される。代替的に、抗原性ペプチドのそれぞれは、異なるがん関連タンパク質に由来する異なる反復性がん突然変異を含む。必要に応じて、抗原性ペプチドのそれぞれは、単一のタイプのがんに由来する異なる反復性がん突然変異を含む。また、かかる融合ポリペプチドおよびかかる融合ポリペプチドをコードする核酸も提供される。
【０００６】
別の態様では、２つまたはそれよりも多くの抗原性ペプチドに融合したＰＥＳＴ含有ペプチドを含む融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株であって、少なくとも１つの抗原性ペプチドが、がん関連タンパク質に由来し、かつ反復性がん突然変異を含み、少なくとも１つの抗原性ペプチドが、がん関連タンパク質に由来し、かつヘテロクリティック突然変異を含む、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株が本明細書において提供される。必要に応じて、ＰＥＳＴ含有ペプチドが、細菌分泌シグナル配列を含み、融合ポリペプチドが、カルボキシ末端側の抗原性ペプチドに融合したユビキチンタンパク質をさらに含み、ＰＥＳＴ含有ペプチド、２つまたはそれよりも多くの抗原性ペプチド、ユビキチン、およびカルボキシ末端側の抗原性ペプチドが、融合ポリペプチドのアミノ末端からカルボキシ末端までタンデムに配置されている。また、かかる融合ポリペプチドおよびかかる融合ポリペプチドをコードする核酸も提供される。
【０００７】
別の態様では、融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む免疫原性組成物、医薬組成物またはワクチンであって、融合ポリペプチドが、２つまたはそれよりも多くの抗原性ペプチドに融合したＰＥＳＴ含有ペプチドを含み、各抗原性ペプチドが、反復性がん突然変異を含み、抗原性ペプチドのうちの少なくとも２つが、異なる反復性がん突然変異を含み、かつ同じがん関連タンパク質の断片である、免疫原性阻止物、医薬組成物またはワクチンが本明細書において提供される。代替的に、抗原性ペプチドのそれぞれは、異なるがん関連タンパク質に由来する異なる反復性がん突然変異を含む。必要に応じて、抗原性ペプチドのそれぞれは、単一のタイプのがんに由来する異なる反復性がん突然変異を含む。また、融合ポリペプチドまたは融合ポリペプチドをコードする核酸を含む免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチンも提供される。
【０００８】
別の態様では、対象において腫瘍またはがんに対する免疫応答を誘導する方法であって、対象に、融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株であって、融合ポリペプチドが、２つまたはそれよりも多くの抗原性ペプチドに融合したＰＥＳＴ含有ペプチドを含み、各抗原性ペプチドが、反復性がん突然変異を含み、抗原性ペプチドのうちの少なくとも２つが、異なる反復性がん突然変異を含み、かつ同じがん関連タンパク質の断片である、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を投与するステップを含む方法が、本明細書において提供される。代替的に、抗原性ペプチドのそれぞれは、異なるがん関連タンパク質に由来する異なる反復性がん突然変異を含む。必要に応じて、抗原性ペプチドのそれぞれは、単一のタイプのがんに由来する異なる反復性がん突然変異を含む。また、対象において腫瘍またはがんに対する免疫応答を誘導する方法であって、対象に、かかる組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチンを投与するステップを含む方法が提供される。また、対象において腫瘍またはがんに対する免疫応答を誘導する方法であって、対象に、融合ポリペプチドもしくは融合ポリペプチドをコードする核酸、融合ポリペプチドもしくは融合ポリペプチドをコードする核酸を含む免疫原性組成物、融合ポリペプチドもしくは融合ポリペプチドをコードする核酸を含む医薬組成物、または融合ポリペプチドもしくは融合ポリペプチドをコードする核酸を含むワクチンを投与するステップを含む方法が提供される。
【０００９】
別の態様では、対象において腫瘍またはがんを予防または処置する方法であって、対象に、融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株であって、融合ポリペプチドが、２つまたはそれよりも多くの抗原性ペプチドに融合したＰＥＳＴ含有ペプチドを含み、各抗原性ペプチドが、反復性がん突然変異を含み、抗原性ペプチドのうちの少なくとも２つが、異なる反復性がん突然変異を含み、かつ同じがん関連タンパク質の断片である、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を投与するステップを含む方法が、本明細書において提供される。代替的に、抗原性ペプチドのそれぞれは、異なるがん関連タンパク質に由来する異なる反復性がん突然変異を含む。必要に応じて、抗原性ペプチドのそれぞれは、単一のタイプのがんに由来する異なる反復性がん突然変異を含む。また、対象において腫瘍またはがんを予防または処置する方法であって、対象に、かかる組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチンを投与するステップを含む方法が提供される。また、対象において腫瘍またはがんを予防または処置する方法であって、対象に、融合ポリペプチド、融合ポリペプチドをコードする核酸、融合ポリペプチドもしくは融合ポリペプチドをコードする核酸を含む免疫原性組成物、融合ポリペプチドもしくは融合ポリペプチドをコードする核酸を含む医薬組成物、または融合ポリペプチドもしくは融合ポリペプチドをコードする核酸を含むワクチンを投与するステップを含む方法が提供される。
【００１０】
別の態様では、融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む１つまたは複数の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む細胞バンクであって、融合ポリペプチドが、２つまたはそれよりも多くの抗原性ペプチドに融合したＰＥＳＴ含有ペプチドを含み、各抗原性ペプチドが、反復性がん突然変異を含み、抗原性ペプチドのうちの少なくとも２つが、異なる反復性がん突然変異を含み、かつ同じがん関連タンパク質の断片である、細胞バンクが、本明細書において提供される。代替的に、抗原性ペプチドのそれぞれは、異なるがん関連タンパク質に由来する異なる反復性がん突然変異を含む。必要に応じて、抗原性ペプチドのそれぞれは、単一のタイプのがんに由来する異なる反復性がん突然変異を含む。
【００１１】
別の態様では、免疫療法構築物を生成する方法であって、（ａ）免疫療法構築物に含めるための、反復性がん突然変異セットを選択するステップと、（ｂ）反復性がん突然変異のそれぞれを含む抗原性ペプチドを設計するステップと、（ｃ）抗原性ペプチドセットを選択するステップであって、各抗原性ペプチドのハイドロパシーを検査すること、および抗原性ペプチドが、選択されたハイドロパシー指数閾値を超えるスコアを有する場合はこれを修飾または選択解除することを含むステップと、（ｄ）選択された抗原性ペプチドのそれぞれを含む融合ポリペプチドを設計するステップと、（ｅ）融合ポリペプチドをコードする核酸構築物を生成するステップとを含む方法が、本明細書において提供される。必要に応じて、反復性がん突然変異のそれぞれは、同じがん関連タンパク質に由来する。必要に応じて、反復性がん突然変異のそれぞれは、単一のタイプのがんに由来する異なる反復性がん突然変異を含む。
【００１２】
別の態様では、免疫療法構築物を生成する方法であって、（ａ）免疫療法構築物に含めるための、がん関連タンパク質における反復性がん突然変異セットおよびヘテロクリティック突然変異セットを選択するステップと、（ｂ）反復性がん突然変異のそれぞれおよびヘテロクリティック突然変異のそれぞれを含む抗原性ペプチドを設計するステップと、（ｃ）抗原性ペプチドセットを選択するステップであって、各抗原性ペプチドのハイドロパシーを検査すること、および抗原性ペプチドが、選択されたハイドロパシー指数閾値を超えるスコアを有する場合はこれを修飾または選択解除することを含むステップと、（ｄ）選択された抗原性ペプチドのそれぞれを含む融合ポリペプチドを設計するステップと、（ｅ）融合ポリペプチドをコードする核酸構築物を生成するステップとを含む方法が、本明細書において提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、ＰＢＳ対照、ＬｍｄｄＡ−２７４対照、Ｌｍ  ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ＿Ｋｄ＿ミニ遺伝子、Ｌｍ  ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ＿Ｄｄ＿ミニ遺伝子およびＬｍ  ＫＲＡＳ−Ｇ１２Ｄ＿２１ｍｅｒで処置したマウスにおけるＣＴ２６腫瘍体積を示す。
【００１４】
【図２】図２Ａおよび図２Ｂは、ＷＴ１ミニ遺伝子構築物の概略図を示す。図２Ａは、単一ＷＴ１キメラポリペプチド抗原を発現するように設計されたＷＴ１ミニ遺伝子構築物を示す。図２Ｂは、３種の別々のＷＴ１キメラポリペプチド抗原を発現するように設計されたＷＴ１ミニ遺伝子構築物を示す。
【００１５】
【図３】図３Ａおよび図３Ｂは、Ｌｍｄｄａ−ＷＴ１−ｔＬＬＯ−ＦＬＡＧ−Ｕｂ−ヘテロクリティックフェニルアラニンミニ遺伝子構築物（図３Ａ）およびＬｍｄｄａ−ＷＴ１−ｔＬＬＯ−Ｐ１−Ｐ２−Ｐ３−ＦＬＡＧ−Ｕｂ−ヘテロクリティックチロシンミニ遺伝子構築物（図３Ｂ）のウエスタンブロットを示す。図３Ａにおいて、レーン１は、ラダーであり、レーン２は、Ｌｍｄｄａ−ＷＴ１−ｔＬＬＯ−Ｐ１−Ｐ２−Ｐ３−ＦＬＡＧ−Ｕｂ−ヘテロクリティックチロシンミニ遺伝子構築物（６８ｋＤａ）であり、レーン３は、陰性対照である。図３Ｂにおいて、レーン１は、ラダーであり、レーン２は、陰性対照であり、レーン３は、ＷＴ１−ｔＬＬＯ−ＦＬＡＧ−Ｕｂ−ヘテロクリティックフェニルアラニンミニ遺伝子構築物（構築物＃１）である。
【００１６】
【図４】図４は、ヘテロクリティック突然変異体ＷＴ１ペプチドを発現するいくつかのＬｍ−ミニ遺伝子構築物のコロニーＰＣＲ結果を示す。突然変異した残基を太字および下線で示す。
【００１７】
【図５】図５は、ＷＴ１ペプチドＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号７４９）およびＦＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号７３２）によりｅｘ  ｖｉｖｏで刺激された脾細胞におけるＥＬＩＳＰＯＴアッセイを示す。脾細胞は、ＷＴ１−Ｆミニ遺伝子構築物で免疫化されたＨＬＡ２トランスジェニックマウスに由来する。ＰＢＳおよびＬｍｄｄＡ２７４を陰性対照として使用した。
【００１８】
【図６】図６は、ＷＴ１ペプチドＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号７４９）およびＹＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号７４１）によりｅｘ  ｖｉｖｏで刺激された脾細胞におけるＥＬＩＳＰＯＴアッセイを示す。脾細胞は、ＷＴ１−ＡＨ１−Ｔｙｒミニ遺伝子構築物で免疫化されたＨＬＡ２トランスジェニックマウスに由来する。ＰＢＳおよびＬｍｄｄＡ２７４を陰性対照として使用した。
【００１９】
【図７】図７Ａおよび図７Ｂは、ＷＴ１ペプチドＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号７４９；図７Ａ）およびＦＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号７３２；図７Ｂ）によりｅｘ  ｖｉｖｏで刺激された脾細胞百万個当たりのＩＦＮ−γスポット形成細胞（ＳＦＣ）を示す。脾細胞は、ＷＴ１−Ｆミニ遺伝子構築物で免疫化されたＨＬＡ２トランスジェニックマウスに由来する。ＰＢＳおよびＬｍｄｄＡ２７４を陰性対照として使用した。
【００２０】
【図８】図８Ａおよび図８Ｂは、ＷＴ１ペプチドＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号７４９；図８Ａ）およびＹＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号７４１；図８Ｂ）によりｅｘ  ｖｉｖｏで刺激された脾細胞百万個当たりのＩＦＮ−γスポット形成細胞（ＳＦＣ）を示す。脾細胞は、ＷＴ１−ＡＨ１−Ｔｙｒミニ遺伝子構築物で免疫化されたＨＬＡ２トランスジェニックマウスに由来する。ＰＢＳおよびＬｍｄｄＡ２７４を陰性対照として使用した。
【００２１】
【図９】図９は、ＬｍｄｄＡ−２７４対照、Ｌｍ  Ｄｐａｇｔ１＋Ａｄｐｇｋ非ミニ遺伝子、Ｌｍ  Ａｄｐｇｋミニ遺伝子およびＬｍ  Ｄｐａｇｔ１ミニ遺伝子で処置したマウスにおけるＭＣ３８腫瘍体積を示す。
【００２２】
【図１０】図１０Ａおよび図１０Ｂは、腹腔内（ＩＰ）投薬（図１０Ａ）または静脈内（ＩＶ）投薬（図１０Ｂ）後の、ＰＢＳ対照、ＬｍｄｄＡ−２７４対照、Ｌｍ  ＡＨ１＿２１ｍｅｒおよびＬｍ  ＡＨ１＿ミニ遺伝子で処置したマウスにおけるＣＴ２６腫瘍体積を示す。
【００２３】
【図１１】図１１は、ＰＢＳ対照またはＬｍ  ＡＨ１＿ＨＣで処置したマウスにおけるＣＴ２６腫瘍体積を示す。
【００２４】
【図１２】図１２は、異なるＮＳＣＬＣ構築物のウエスタンブロットデータを示す。左上パネルは、抗Ｆｌａｇ抗体を使用した、ＬｍｄｄＡによって上清へと発現および分泌されたＮＳＣＬＣ構築物の検出を示す（ウエスタンブロット）。左下パネルは、抗ｐ６０抗体を使用した、ＬｍｄｄＡによって上清へと発現および分泌されたローディング対照ｐ６０タンパク質の検出を示す（ウエスタンブロット）。右側の表は、ウエスタンブロットのためのレーン順序を示す。
【００２５】
【図１３】図１３は、異なる前立腺がん構築物のウエスタンブロットデータを示す。左上パネルは、抗Ｆｌａｇ抗体を使用した、ＬｍｄｄＡによって上清へと発現および分泌された前立腺がん構築物の検出を示す（ウエスタンブロット）。左下パネルは、抗ｐ６０抗体を使用した、ＬｍｄｄＡによって上清へと発現および分泌されたローディング対照ｐ６０タンパク質の検出を示す（ウエスタンブロット）。右側の表は、ウエスタンブロットのためのレーン順序を示す。
【００２６】
【図１４】図１４は、異なる膀胱がん構築物のウエスタンブロットデータを示す。左上パネルは、抗Ｆｌａｇ抗体を使用した、ＬｍｄｄＡによって上清へと発現および分泌された膀胱がん構築物の検出を示す（ウエスタンブロット）。左下パネルは、抗ｐ６０抗体を使用した、ＬｍｄｄＡによって上清へと発現および分泌されたローディング対照ｐ６０タンパク質の検出を示す（ウエスタンブロット）。右側の表は、ウエスタンブロットのためのレーン順序を示す。
【００２７】
【図１５】図１５は、異なる膀胱がん構築物のウエスタンブロットデータを示す。左上パネルは、抗Ｆｌａｇ抗体を使用した、ＬｍｄｄＡによって上清へと発現および分泌された膀胱がん構築物の検出を示す（ウエスタンブロット）。左下パネルは、抗ｐ６０抗体を使用した、ＬｍｄｄＡによって上清へと発現および分泌されたローディング対照ｐ６０タンパク質の検出を示す（ウエスタンブロット）。右側の表は、ウエスタンブロットのためのレーン順序を示す。
【００２８】
【図１６】図１６は、異なる乳がん構築物のウエスタンブロットデータを示す。左上パネルは、抗Ｆｌａｇ抗体を使用した、ＬｍｄｄＡによって上清へと発現および分泌された乳がん構築物の検出を示す（ウエスタンブロット）。左下パネルは、抗ｐ６０抗体を使用した、ＬｍｄｄＡによって上清へと発現および分泌されたローディング対照ｐ６０タンパク質の検出を示す（ウエスタンブロット）。右側の表は、ウエスタンブロットのためのレーン順序を示す。
【００２９】
【図１７】図１７は、異なる膵臓がん構築物のウエスタンブロットデータを示す。左上パネルは、抗Ｆｌａｇ抗体を使用した、ＬｍｄｄＡによって上清へと発現および分泌された膵臓がん構築物の検出を示す（ウエスタンブロット）。左下パネルは、抗ｐ６０抗体を使用した、ＬｍｄｄＡによって上清へと発現および分泌されたローディング対照ｐ６０タンパク質の検出を示す（ウエスタンブロット）。右側の表は、ウエスタンブロットのためのレーン順序を示す。
【００３０】
【図１８】図１８は、異なるＮＳＣＬＣ構築物のウエスタンブロットデータを示す。左上パネルは、抗Ｆｌａｇ抗体を使用した、ＬｍｄｄＡによって上清へと発現および分泌されたＮＳＣＬＣ構築物の検出を示す（ウエスタンブロット）。左下パネルは、抗ｐ６０抗体を使用した、ＬｍｄｄＡによって上清へと発現および分泌されたローディング対照ｐ６０タンパク質の検出を示す（ウエスタンブロット）。右側の表は、ウエスタンブロットのためのレーン順序を示す。
【００３１】
【図１９】図１９は、異なる前立腺がん構築物のウエスタンブロットデータを示す。左上パネルは、抗Ｆｌａｇ抗体を使用した、ＬｍｄｄＡによって上清へと発現および分泌された前立腺がん構築物の検出を示す（ウエスタンブロット）。左下パネルは、抗ｐ６０抗体を使用した、ＬｍｄｄＡによって上清へと発現および分泌されたローディング対照ｐ６０タンパク質の検出を示す（ウエスタンブロット）。右側の表は、ウエスタンブロットのためのレーン順序を示す。
【００３２】
【図２０】図２０は、最小ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド（配列番号１００７）によりｅｘ  ｖｉｖｏで刺激された脾細胞２×１０５個当たりのＩＦＮ−γスポット形成細胞（ＳＦＣ）を示す。脾細胞は、様々な低発現Ｌｍ構築物で免疫化されたマウスに由来した。
【００３３】
【図２１】図２１は、構築物設計概略図を示す。上部パネルは、Ｃ末端３×ＦＬＡＧおよびＳＩＩＮＦＥＫＬタグ部分を有するがリンカー配列を持たない、ｔＬＬＯ融合タンパク質設計を示す。中央パネルは、Ｃ末端タグおよび隣接リンカー配列を有する、ｔＬＬＯ融合タンパク質を示す。下パネルは、２１ｍｅｒ隣接リンカー（＾）、長いスペーサー（＊）および免疫プロテアソームスペーサー（＃）を有する、ｔＬＬＯ融合タンパク質の各構成成分を定義する。
【００３４】
【図２２】図２２は、様々なリンカー組合せを含有するまたは含有しない、マウスＭＣ３８結腸直腸がん細胞系に由来する１５種の非同義突然変異を標的とするＬｍ構築物の発現および分泌を示す。左パネルは、同じ１５種の突然変異を標的とする１０種の特有の構築物に由来する培養上清の代表的抗ＦＬＡＧ抗体ウエスタンブロットを示す。右パネルは、各構築物の構築物設計戦略および予想されるサイズ（ｋＤａ）を示す。全構築物において同じ基礎ＭＴ１５アミノ酸配列を使用した；構築物は、可動性、剛性または優先的プロテアソーム切断増強特性のいずれかを有する隣接リンカーおよび長いスペーサーの様々な並べ替えの非存在または包含が異なった。
【００３５】
【図２３】図２３は、異なる乳がん構築物のウエスタンブロットデータを示す。左上パネルは、抗Ｆｌａｇ抗体を使用した、ＬｍｄｄＡによって上清へと発現および分泌された乳がん構築物の検出を示す（ウエスタンブロット）。左下パネルは、抗ｐ６０抗体を使用した、ＬｍｄｄＡによって上清へと発現および分泌されたローディング対照ｐ６０タンパク質の検出を示す（ウエスタンブロット）。右側の表は、ウエスタンブロットのためのレーン順序を示す。
【００３６】
【図２４】図２４Ａおよび図２４Ｂは、Ｌｍ−ＨＯＴ（ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ）構築物が、腫瘍がないマウスの末梢においてＫＲＡＳ誘導性特異的ＩＦＮｇ免疫応答を誘導したことを示す。図２４Ａは、ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝４／群）が、０および７日目に、Ｌｍ−ＨＯＴ  ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ構築物で免疫化され、脾臓が、最終免疫化１週間後（１４日目）に収集されて、細胞性免疫応答を査定することを示す。図２４Ｂにおいて、ＴＨ１応答の誘導は、ＩＦＮｇ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって決定される、脾細胞百万個当たりのＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ特異的ＩＦＮｇスポット形成コロニー（ＳＦＣ）の数によって示される。ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｄ  ２１ｍｅｒ抗原標的全体に及ぶＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄプールペプチド（９アミノ酸により重複する１５ｍｅｒ；２．５μｇ／ｍＬ最終濃度）を使用して、脾細胞を１８時間刺激した。＊＊＊Ｐ＜０．００１。エラーバーは、ＳＥＭを示す；ｎ＝４／群。
【００３７】
【図２５】図２５Ａ〜図２５Ｄは、Ｌｍ−ＨＯＴ構築物治療法が、ＣＴ２６結腸直腸腫瘍モデルにおける腫瘍免疫微小環境の細胞組成を変更し、ＫＲＡＳ腫瘍特異的Ｔ細胞を誘導したことを示す。無処置ＢＡＬＢ／ｃマウスの側腹部に、３００，０００個のＣＴ２６結腸直腸腫瘍細胞を植え込んだ。腫瘍植え込み４日後に、マウスをＨＯＴ−Ｌｍ  ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ構築物で免疫化し、続いて初期免疫化１週間後にブーストした。腫瘍植え込み１４日後に、処置したＣＴ２６マウスの腫瘍に由来するＴＩＬを収集した。図２５Ａおよび図２５Ｂにおいて、総ＣＤ４５＋細胞のパーセンテージとしてのＣＤ４５＋白血球浸潤およびＣＤ８＋ＴＩＬが、処置、対、対照群において示される。図２５Ｃにおいて、ＴＨ１応答の誘導は、ＩＦＮｇ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって決定される、ＴＩＬ百万個当たりのＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ特異的ＩＦＮｇスポット形成コロニー（ＳＦＣ）の数によって示される。図２５Ｄにおいて、概略プロットデータは、総ＣＤ４５＋細胞のパーセンテージとしてのＣＤ４５＋ＴＩＬおよびＣＤ４＋ＦＯＸＰ３−ＴＩＬのそれぞれＦＯＸＰ３＋ＣＤ４＋およびＦＯＸＰ３＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔｒｅｇのパーセンテージを示す。ＴＩＬ集団は、フローサイトメトリーによって同定した。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；ｎｓ、有意でない。エラーバーは、ｎ＝４／群のＳＥＭを示す。
【００３８】
【図２６】図２６は、異なる膀胱がん構築物のウエスタンブロットデータを示す。左上パネルは、抗Ｆｌａｇ抗体を使用した、ＬｍｄｄＡによって上清へと発現および分泌された膀胱がん構築物の検出を示す（ウエスタンブロット）。左下パネルは、抗ｐ６０抗体を使用した、ＬｍｄｄＡによって上清へと発現および分泌されたローディング対照ｐ６０タンパク質の検出を示す（ウエスタンブロット）。右側の表は、ウエスタンブロットのためのレーン順序を示す。
【００３９】
【図２７】図２７は、異なる非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）構築物のウエスタンブロットデータを示す。左上パネルは、抗Ｆｌａｇ抗体を使用した、ＬｍｄｄＡによって上清へと発現および分泌されたＮＳＣＬＣ構築物の検出を示す（ウエスタンブロット）。左下パネルは、抗ｐ６０抗体を使用した、ＬｍｄｄＡによって上清へと発現および分泌されたローディング対照ｐ６０タンパク質の検出を示す（ウエスタンブロット）。右側の表は、ウエスタンブロットのためのレーン順序を示す。
【００４０】
【図２８】図２８は、異なる前立腺がん構築物のウエスタンブロットデータを示す。左上パネルは、抗Ｆｌａｇ抗体を使用した、ＬｍｄｄＡによって上清へと発現および分泌された前立腺がん構築物の検出を示す（ウエスタンブロット）。左下パネルは、抗ｐ６０抗体を使用した、ＬｍｄｄＡによって上清へと発現および分泌されたローディング対照ｐ６０タンパク質の検出を示す（ウエスタンブロット）。右側の表は、ウエスタンブロットのためのレーン順序を示す。
【００４１】
【図２９】図２９は、異なる結腸直腸がん構築物のウエスタンブロットデータを示す。左上パネルは、抗Ｆｌａｇ抗体を使用した、ＬｍｄｄＡによって上清へと発現および分泌された結腸直腸がん構築物の検出を示す（ウエスタンブロット）。左下パネルは、抗ｐ６０抗体を使用した、ＬｍｄｄＡによって上清へと発現および分泌されたローディング対照ｐ６０タンパク質の検出を示す（ウエスタンブロット）。右側の表は、ウエスタンブロットのためのレーン順序を示す。
【００４２】
【図３０】図３０は、異なる膵臓がん構築物のウエスタンブロットデータを示す。左上パネルは、抗Ｆｌａｇ抗体を使用した、ＬｍｄｄＡによって上清へと発現および分泌された膵臓がん構築物の検出を示す（ウエスタンブロット）。左下パネルは、抗ｐ６０抗体を使用した、ＬｍｄｄＡによって上清へと発現および分泌されたローディング対照ｐ６０タンパク質の検出を示す（ウエスタンブロット）。右側の表は、ウエスタンブロットのためのレーン順序を示す。
【００４３】
【図３１】図３１は、異なる膀胱がん構築物のウエスタンブロットデータを示す。左上パネルは、抗Ｆｌａｇ抗体を使用した、ＬｍｄｄＡによって上清へと発現および分泌された膀胱がん構築物の検出を示す（ウエスタンブロット）。左下パネルは、抗ｐ６０抗体を使用した、ＬｍｄｄＡによって上清へと発現および分泌されたローディング対照ｐ６０タンパク質の検出を示す（ウエスタンブロット）。右側の表は、ウエスタンブロットのためのレーン順序を示す。
【００４４】
【図３２】図３２は、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）構築物のウエスタンブロットデータを示す。左上パネルは、抗Ｆｌａｇ抗体を使用した、ＬｍｄｄＡによって上清へと発現および分泌されたＮＳＣＬＣ構築物の検出を示す（ウエスタンブロット）。左下パネルは、抗ｐ６０抗体を使用した、ＬｍｄｄＡによって上清へと発現および分泌されたローディング対照ｐ６０タンパク質の検出を示す（ウエスタンブロット）。右側の表は、ウエスタンブロットのためのレーン順序を示す。
【００４５】
【図３３】図３３は、異なる前立腺がん構築物のウエスタンブロットデータを示す。左上パネルは、抗Ｆｌａｇ抗体を使用した、ＬｍｄｄＡによって上清へと発現および分泌された前立腺がん構築物の検出を示す（ウエスタンブロット）。左下パネルは、抗ｐ６０抗体を使用した、ＬｍｄｄＡによって上清へと発現および分泌されたローディング対照ｐ６０タンパク質の検出を示す（ウエスタンブロット）。右側の表は、ウエスタンブロットのためのレーン順序を示す。
【００４６】
【図３４】図３４は、ナイーブマウス、ならびにＬｍｄｄＡ−２７４対照、Ｌｍ  ＫＲＡＳ−Ｇ１２Ｄ＿２１ｍｅｒおよびＬｍ  ＮＳＣＬＣ  ＨＯＴ  ＥＶＯ２  ＥＡＡＡＫ．ｉ２０（Ｂ）（ＨＯＴ−肺）で処置したマウスにおけるＣＴ２６腫瘍体積を示す。＊＊＊＊は、Ｐ＜０．００１を示す；エラーバーは、ｎ＝１０／群のＳＥＭを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
定義
本明細書において交換可能に使用される「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」という用語は、コードされるアミノ酸およびコードされないアミノ酸、ならびに化学的または生化学的に修飾または誘導体化されたアミノ酸を含む、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指す。これらの用語には、修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドなど、修飾されているポリマーが含まれる。
【００４８】
タンパク質は、「Ｎ末端」および「Ｃ末端」を有すると言われる。「Ｎ末端」という用語は、遊離アミン基（−ＮＨ２）を有するアミノ酸で終結するタンパク質またはポリペプチドの始点に関する。「Ｃ末端」という用語は、遊離カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）で終結するアミノ酸鎖（タンパク質またはポリペプチド）の終点に関する。
【００４９】
「融合タンパク質」という用語は、ペプチド結合または他の化学結合によってひとつに連結した２つまたはそれよりも多くのペプチドを含むタンパク質を指す。ペプチドは、ペプチドまたは他の化学結合によって直接的にひとつに連結している場合がある。例えば、化学分子は、単鎖融合タンパク質として組換え発現する場合がある。代替的に、ペプチドは、「リンカー」、例えば１つもしくは複数のアミノ酸、または２つもしくはそれよりも多くのペプチドの間の別の好適なリンカーによってひとつに連結していてもよい。
【００５０】
本明細書において交換可能に使用される「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはそれらのアナログもしくは修飾バージョンを含む、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。これらには、一本鎖、二本鎖、および多重鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、ならびにプリン塩基、ピリミジン塩基、または他の天然の、化学的に修飾された、生化学的に修飾された、非天然の、もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーが含まれる。
【００５１】
核酸が「５’末端」および「３’末端」を有すると言われるのは、モノヌクレオチドが反応して、１つのモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸が、その隣の３’酸素に、リン酸ジエステル結合を介して一方向に付着するような様式でオリゴヌクレオチドを作るためである。オリゴヌクレオチドの一端は、その５’リン酸がモノヌクレオチドペントース環の３’酸素に連結していない場合には「５’末端」と呼ばれる。オリゴヌクレオチドの一端は、その３’酸素が別のモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸に連結していない場合には「３’末端」と呼ばれる。核酸配列は、より大きなオリゴヌクレオチドの内部にある場合でも、５’および３’末端を有すると言われる場合がある。線状または環状ＤＮＡ分子のいずれにおいても、個別のエレメントは、「下流」または３’側エレメントの「上流」または５’側にあると言われる。
【００５２】
「コドン最適化」とは、天然のアミノ酸配列を維持しながら、天然配列の少なくとも１つのコドンを、宿主細胞の遺伝子においてより高頻度または最も高頻度で使用されるコドンで置き換えることにより、特定の宿主細胞における発現を増強させるために核酸配列を修飾するプロセスを指す。例えば、融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、天然に存在する核酸配列と比較して所与のＬｉｓｔｅｒｉａ細胞または任意の他の宿主細胞において高い使用頻度を有するコドンを置換するように修飾することができる。コドン使用頻度表は、例えば「Ｃｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ」において容易に利用可能である。各アミノ酸についてＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓによって利用される最適なコドンは、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれているＵＳ２００７／０２０７１７０に示されている。これらの表は、いくつかの方法で適合させることができる。あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれている、Nakamuraら（２０００年）、Nucleic  Acids  Research、２８巻：２９２頁を参照されたい。特定の宿主における発現に関して特定の配列のコドン最適化のためのコンピュータアルゴリズムも利用可能である（例えば、Ｇｅｎｅ  Ｆｏｒｇｅを参照されたい）。
【００５３】
「プラスミド」または「ベクター」という用語には、細菌送達ベクター、ウイルスベクター送達ベクター、ペプチド免疫療法送達ベクター、ＤＮＡ免疫療法送達ベクター、エピソームプラスミド、組み込みプラスミド、またはファージベクターを含む、任意の公知の送達ベクターが含まれる。「ベクター」という用語は、宿主細胞において、１つまたは複数の融合ポリペプチドを送達することができ、必要に応じて発現することができる構築物を指す。
【００５４】
「エピソームプラスミド」または「染色体外プラスミド」という用語は、染色体ＤＮＡから物理的に分離しており（すなわち、エピソーム性または染色体外性であり、宿主細胞のゲノムに組み込まれておらず）、染色体ＤＮＡとは無関係に複製する核酸ベクターを指す。プラスミドは、線状であっても環状であってもよく、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。エピソームプラスミドは、必要に応じて、宿主細胞の細胞質（例えばＬｉｓｔｅｒｉａ）において複数のコピーで持続し、エピソームプラスミド内の任意の目的の遺伝子の増幅をもたらす場合がある。
【００５５】
「ゲノムに組み込まれた」という用語は、ヌクレオチド配列が細胞のゲノムに組み込まれ、その後代に受け継がれることができるように、細胞に導入された核酸を指す。細胞のゲノムに核酸を安定に組み込むためには、任意のプロトコールを使用してよい。
【００５６】
「安定に維持される」という用語は、核酸分子またはプラスミドが、選択（例えば抗生物質選択）の非存在下で、少なくとも１０世代にわたり、検出可能な喪失を伴わずに維持されることを指す。例えばその期間は、少なくとも１５世代、２０世代、少なくとも２５世代、少なくとも３０世代、少なくとも４０世代、少なくとも５０世代、少なくとも６０世代、少なくとも８０世代、少なくとも１００世代、少なくとも１５０世代、少なくとも２００世代、少なくとも３００世代、または少なくとも５００世代であり得る。安定に維持されることは、核酸分子またはプラスミドが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（例えば培養下）の細胞において安定に維持されること、ｉｎ  ｖｉｖｏで安定に維持されること、または両方を指す場合がある。
【００５７】
「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」とは、ＤＮＡのうち、タンパク質をコードする可能性があり得る塩基の配列を含む部分である。例として、ＯＲＦは、遺伝子の開始コード配列（開始コドン）と停止コドン配列（終結コドン）との間に位置する場合がある。
【００５８】
「プロモーター」とは、特定のポリヌクレオチド配列の適切な転写開始部位におけるＲＮＡ合成を開始するようにＲＮＡポリメラーゼＩＩを方向付けることができるＴＡＴＡボックスを一般的に含むＤＮＡの調節領域である。プロモーターは、転写開始速度に影響する他の領域をさらに含む場合がある。本明細書において開示されるプロモーター配列は、作動可能に連結したポリヌクレオチドの転写をモジュレートする。プロモーターは、本明細書において開示される細胞型（例えば、真核細胞、非ヒト哺乳動物細胞、ヒト細胞、齧歯動物細胞、多能性細胞、一細胞期胚、分化細胞、またはそれらの組合せ）のうちの１つまたは複数において活性であり得る。プロモーターは、例えば、構成的活性型プロモーター、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、時間的に制限されたプロモーター（例えば、発生的に調節されたプロモーター）、または空間的に制限されたプロモーター（例えば、細胞特異的または組織特異的なプロモーター）であってもよい。プロモーターの例は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれているＷＯ２０１３／１７６７７２に見出すことができる。
【００５９】
「作動可能な連結」または「作動可能に連結した」とは、２つまたはそれよりも多くの構成成分（例えば、プロモーターおよび別の配列エレメント）の並置であって、両方の構成成分が正常に機能し、かつ構成成分のうちの少なくとも１つが、他の構成成分のうちの少なくとも１つに対して発揮される機能を媒介し得るという可能性を許容するような並置を指す。例えば、プロモーターは、プロモーターが１つまたは複数の転写調節因子の存在または非存在に応じてコード配列の転写レベルを制御する場合、コード配列に作動可能に連結している場合がある。作動可能な連結には、互いと連続した配列またはトランスで作用する配列が含まれ得る（例えば、調節配列は、コード配列の転写を制御するために離れて作用することができる）。
【００６０】
２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の文脈における「配列同一性」または「同一性」は、規定の比較ウィンドウにわたる最大一致度についてアラインしたとき同じである、２つの配列における残基を参照する。タンパク質に関連して配列同一性のパーセンテージが使用されるとき、同一でない残基の位置は、多くの場合、保存的アミノ酸置換によって異なると認識されている。保存的アミノ酸置換では、アミノ酸残基が、同様の化学的特性（例えば電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基で置換され、したがって分子の機能的特性は変化しない。配列が保存的置換において異なる場合、配列同一性パーセントは、置換の保存的性質を補正するために上方に調整され得る。かかる保存的置換によって異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有すると言われる。この調整を行うための手段は、当業者には周知である。典型的には、これは保存的置換を完全なミスマッチではなく部分的ミスマッチとしてスコアリングすることにより、配列同一性パーセンテージを増加させることを含む。よって、例えば、同一のアミノ酸に１のスコアが与えられ、非保存的置換にゼロのスコアが与えられる場合、保存的置換にはゼロと１の間のスコアが与えられる。保存的置換のスコアリングは、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）に実装されているように計算される。
【００６１】
「配列同一性のパーセンテージ」とは、２つの最適にアラインされた配列（完全にマッチした残基の最大数）を比較ウィンドウに対して比較することによって決定される値を指し、ここで、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適なアライメントについて参照配列（付加または欠失を含まない）と比較した場合、付加または欠失（すなわちギャップ）を含み得る。このパーセンテージは、両方の配列において同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が存在する位置の数を決定し、マッチした位置の数を求め、マッチした位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で除し、その結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを求めることにより計算される。別段の規定がある（例えば、より短い配列が、連結した異種配列を含む）場合を除き、比較ウィンドウは、比較されている２つの配列のうち短い方の全長である。
【００６２】
別段の記載がない限り、配列同一性／類似性の値は、ヌクレオチド配列の同一性％および類似性％については、ギャップ重み５０および長さ重み３のパラメーター、ならびにｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコアリング行列を使用し、アミノ酸配列の同一性％および類似性％については、ギャップ重み８および長さ重み２のパラメーター、ならびにＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング行列を使用し、ＧＡＰ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０を使用して、またはそれと同等の任意のプログラムを使用して得られた値を指す。「同等のプログラム」としては、問題の任意の２つの配列について、ＧＡＰ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０によって生成された対応するアライメントと比較したとき、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基マッチおよび同一の配列同一性パーセントを有するアライメントを生成する、任意の配列比較プログラムが挙げられる。
【００６３】
「保存的アミノ酸置換」という用語は、配列内に通常存在するアミノ酸の、同様のサイズ、電荷、または極性の異なるアミノ酸による置換を指す。保存的置換の例としては、イソロイシン、バリン、またはロイシンなどの非極性（疎水性）残基から別の非極性残基への置換が挙げられる。同様に、保存的置換の例としては、１つの極性（親水性）残基から別のものへの置換、例えばアルギニンとリシンとの置換、グルタミンとアスパラギンとの置換、またはグリシンとセリンとの置換が挙げられる。さらに、リシン、アルギニン、もしくはヒスチジンなどの塩基性残基から別のものへの置換、またはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸などの１つの酸性残基から別の酸性残基への置換は、保存的置換のさらなる例である。非保存的置換の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、もしくはメチオニンなどの非極性（疎水性）アミノ酸残基から、システイン、グルタミン、グルタミン酸、もしくはリシンなどの極性（親水性）残基への置換、および／または極性残基から非極性残基への置換が挙げられる。典型的なアミノ酸のカテゴリー分類を以下にまとめる。
【表１２４】
2020513737.tif 000003
【００６４】
「相同な」配列（例えば核酸配列）とは、例えば、既知の参照配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるような、既知の参照配列と同一であるか、または実質的に類似している配列を指す。
【００６５】
「野生型」という用語は、正常な（突然変異の、罹患した、変更されたなどとは対照的な）状態または文脈において見出される構造および／または活性を有する実態を指す。野生型遺伝子およびポリペプチドは、複数の異なる形態（例えば対立遺伝子）において存在することが多い。
【００６６】
タンパク質および核酸に関する「単離された」という用語は、ｉｎ  ｓｉｔｕで通常存在し得る他の細菌、ウイルス、または細胞の構成成分に対して比較的精製されているタンパク質および核酸を指し、タンパク質およびポリヌクレオチドの実質的に純粋な調製物まで含まれる。「単離された」という用語には、タンパク質および核酸であって、天然に存在する対応物を有しないもの、化学合成され、したがって他のタンパク質もしくは核酸が実質的に混入していないもの、または、天然において付随するほとんどの他の細胞構成成分（例えば、他の細胞タンパク質、ポリヌクレオチド、または細胞構成成分）から分離もしくは精製されているものも含まれる。
【００６７】
「外来性」または「異種」の分子または配列は、細胞において通常発現しないか、またはその形態で細胞に通常存在しない分子または配列である。通常の存在には、細胞の特定の発生段階および環境条件に関する存在が含まれる。外来性または異種の分子または配列は、例えば、細胞内の対応する内在性配列の突然変異バージョンを含む場合もあれば、細胞内の内在性配列に対応する配列だが異なる形態にある（すなわち、染色体内にない）ものを含む場合もある。特定の細胞における外来性または異種の分子または配列は、その細胞の基準となる種とは異なる種または同じ種内の異なる生物に由来する分子または配列であってもよい。例えば、異種ポリペプチドを発現するＬｉｓｔｅｒｉａ株の場合、異種ポリペプチドは、同じ種内の異なる生物に由来する、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株以外を起源とする、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株によって通常は発現されない、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株に天然または内在性ではないポリペプチドであり得る。
【００６８】
対照的に、「内在性」分子もしくは配列または「天然」分子もしくは配列は、特定の環境条件下で特定の発生段階の特定の細胞において、その形態で通常存在する分子または配列である。
【００６９】
「バリアント」という用語は、集団の大部分とは異なるが、依然としてそれらのうちの１つであるとみなされるのに十分なほど共通の態様と類似しているアミノ酸または核酸配列（または生物もしくは組織）（例えばスプライスバリアント）を指す。
【００７０】
「アイソフォーム」という用語は、別のアイソフォームまたは（例えば同じタンパク質の）バージョンと比較してわずかな差だけある分子（例えばタンパク質）のバージョンを指す。例えば、タンパク質アイソフォームは、異なるが関連した遺伝子から産生される場合もあれば、選択的スプライシングによって同じ遺伝子から生じる場合もあり、または単一のヌクレオチド多型から生じる場合もある。
【００７１】
「断片」という用語は、タンパク質について言及している場合、全長タンパク質よりも短いか、または少ないアミノ酸を有するタンパク質を意味する。「断片」という用語は、核酸について言及している場合、全長核酸よりも短いか、または少ないヌクレオチドを有する核酸を意味する。断片は、例えば、Ｎ末端断片（すなわち、タンパク質のＣ末端の一部分の除去）、Ｃ末端断片（すなわち、タンパク質のＮ末端の一部分の除去）、または内部断片であり得る。断片はまた、例えば、機能的断片または免疫原性断片であってもよい。
【００７２】
「アナログ」という用語は、タンパク質について言及している場合、保存的なアミノ酸の相違によって、アミノ酸配列に影響を与えない修飾によって、または両方によって、天然に存在するタンパク質と異なるタンパク質を意味する。
【００７３】
「機能的」という用語は、生物活性または機能を呈するタンパク質または核酸（またはそれらの断片、アイソフォーム、もしくはバリアント）の固有の能力を指す。そのような生物活性または機能としては、例えば、対象に投与されたときに免疫応答を誘発する能力を挙げることができる。そのような生物活性または機能としては、例えば、相互作用パートナーへの結合を挙げることもできる。機能的断片、アイソフォーム、またはバリアントの場合、これらの生物学的機能は、実際には（例えば、それらの特異性または選択性に関して）変化してもよいが、基本的な生物学的機能は保持される。
【００７４】
「免疫原性（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）」または「免疫原性（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ）」という用語は、対象に投与されたときに対象において免疫応答を誘発する分子（例えばタンパク質、核酸、抗原、または生物）の固有の能力を指す。免疫原性は、例えば、分子に対する抗体の数の増加、分子に対する抗体の多様性の増加、分子に特異的なＴ細胞の数の増加、分子に対する細胞傷害性またはヘルパーＴ細胞応答の増加などによって測定することができる。
【００７５】
「抗原」という用語は、本明細書では、対象または生物との接触下におかれたとき（例えば、対象もしくは生物に存在するとき、または対象もしくは生物によって検出されるとき）、対象または生物から検出可能な免疫応答をもたらす物質を指すように使用される。抗原は、例えば、脂質、タンパク質、炭水化物、核酸、またはそれらの組合せおよび変形形態であり得る。例えば、「抗原性ペプチド」は、対象もしくは生物に存在するとき、または対象もしくは生物によって検出されるとき、対象または生物において免疫応答のマウンティングをもたらすペプチドを指す。例えば、そのような「抗原性ペプチド」には、宿主細胞の表面上のＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ分子にローディングされ提示され、宿主の免疫細胞によって認識または検出されることにより、タンパク質に対する免疫応答のマウンティングをもたらすことができるタンパク質が包含され得る。そのような免疫応答は、宿主における他の細胞、例えば同じタンパク質を発現する罹患細胞（例えば腫瘍またはがん細胞）にも及ぶことがある。
【００７６】
「エピトープ」という用語は、免疫系によって認識される（例えば抗体が結合する）抗原上の部位を指す。エピトープは、連続するアミノ酸、または１つもしくは複数のタンパク質の三次フォールディングによって並置された不連続のアミノ酸から形成され得る。連続するアミノ酸から形成されたエピトープ（別称、線状エピトープ）は、典型的には、変性溶媒に曝露しても保持されるが、三次フォールディングによって形成されたエピトープ（別称、コンフォメーショナルエピトープ）は、典型的には、変性溶媒で処置すると失われる。エピトープは、典型的には、特有の空間的コンフォメーションに少なくとも３個、より一般的には少なくとも５個または８〜１０個のアミノ酸を含む。エピトープの空間的コンフォメーションを決定する方法としては、例えば、Ｘ線結晶解析および２次元核磁気共鳴が挙げられる。例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれている、Epitope  Mapping  Protocols、Methods  in  Molecular  Biology、６６巻、Glenn  E.  Morris編（１９９６年）を参照されたい。
【００７７】
「突然変異」という用語は、遺伝子またはタンパク質の構造のあらゆる変化を指す。例えば、突然変異は、染色体またはタンパク質の欠失、挿入、置換、または再構成から生じ得る。「挿入」は、１つまたは複数のさらなるヌクレオチドまたはアミノ酸を付加することにより、遺伝子内のヌクレオチドの数またはタンパク質内のアミノ酸の数を変化させる。「欠失」は、１つまたは複数のさらなるヌクレオチドまたはアミノ酸を低減させることにより、遺伝子内のヌクレオチドの数またはタンパク質内のアミノ酸の数を変化させる。
【００７８】
ＤＮＡにおける「フレームシフト」突然変異は、ヌクレオチドの付加または損失が遺伝子のリーディングフレームを変化させるときに起こる。リーディングフレームは、それぞれが１つのアミノ酸をコードする３つの塩基の群からなる。フレームシフト突然変異は、これらの塩基群をずらし、アミノ酸コードを変化させる。結果として生じるタンパク質は、一般的に非機能性である。挿入および欠失はそれぞれフレームシフト突然変異であり得る。
【００７９】
「ミスセンス」突然変異または置換とは、コードされるアミノ酸の変化をもたらす、タンパク質のうちの１つのアミノ酸の変化、または単一のヌクレオチドにおける点突然変異を指す。１つのアミノ酸の変化をもたらす、単一のヌクレオチドにおける点突然変異は、ＤＮＡ配列における「非同義」置換である。非同義置換は、「ナンセンス」突然変異をもたらす場合もある。ナンセンス突然変異では、コドンが中途停止コドンに変化し、結果として生じるタンパク質がトランケートされる。対照的に、ＤＮＡにおける「同義」突然変異は、タンパク質のアミノ酸配列を変更しない（コドン縮退に起因する）ものである。
【００８０】
「体細胞突然変異」という用語は、胚細胞以外の細胞（例えば精子または卵子）によって獲得される遺伝的変更を含む。そのような突然変異は、細胞分裂の過程において突然変異細胞の後代に伝えられる場合があるが、遺伝性ではない。対照的に、胚突然変異は生殖系列において生じ、次世代の子孫に伝えられ得る。
【００８１】
「反復性がん突然変異」とは、複数のタイプのがんおよび／または特定のタイプのがんを有する複数の対象において生じる、タンパク質のアミノ酸配列の変化である。がんに関連するこのような突然変異は、対応する健康な組織に通常存在しない腫瘍関連抗原をもたらし得る。
【００８２】
「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」という用語は、人工環境、および人工環境（例えば試験管）内で起こるプロセスまたは反応を指す。
【００８３】
「ｉｎ  ｖｉｖｏ」という用語は、自然環境（例えば、細胞または生物または身体）、および自然環境内で起こるプロセスまたは反応を指す。
【００８４】
１つまたは複数の列挙されている要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」組成物または方法は、明確に列挙されていない他の要素を含む場合がある。例えば、タンパク質を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」組成物は、タンパク質を単独で、または他の成分と組み合わせて含有してもよい。
【００８５】
値の範囲の指定は、その範囲内にある、またはその範囲を定義するすべての整数、およびその範囲内の整数によって定義されるすべての部分範囲を含む。
【００８６】
文脈上他の意味に解すべきことが明らかでない限り、「約」という用語は、表示値の測定標準誤差（例えばＳＥＭ）内の値、または規定値から±０．５％、１％、５％、もしくは１０％の差異を包含する。
【００８７】
「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」という単数形の冠詞は、文脈が他の意味を明らかに示す場合を除き、複数の参照対象を含む。例えば、「抗原（ａｎ  ａｎｔｉｇｅｎ）」または「少なくとも１つの抗原」という用語には、複数の抗原（それらの混合物を含む）が含まれ得る。
【００８８】
統計的に有意とは、ｐ≦０．０５を意味する。
【００８９】
詳細な説明
Ｉ．概説
がん関連タンパク質に由来する１つまたは複数の抗原性ペプチド（例えばＰＥＳＴ含有ペプチドに融合したもの）を含む組換え融合ポリペプチドが、本明細書において提供される。抗原性ペプチドは、反復性がん突然変異を含む抗原性ペプチド、ヘテロクリティック突然変異を含む抗原性ペプチド、またはユビキチンタンパク質に融合した抗原性ペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべてを含み得る。例えば、２つまたはそれよりも多くの抗原性ペプチド（例えばＰＥＳＴ含有ペプチドに融合したもの）を含む組換え融合ポリペプチドであって、各抗原性ペプチドが、反復性がん突然変異を含み、抗原性ペプチドのうちの少なくとも２つが、同じがん関連タンパク質の断片である、組換え融合ポリペプチドが、本明細書において提供される。また、かかる融合ポリペプチドをコードする核酸；かかる融合ポリペプチドもしくはかかる核酸を含む組換え細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株；かかる組換え細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む細胞バンク；かかる融合ポリペプチド、かかる核酸、またはかかる組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む免疫原性組成物、医薬組成物、およびワクチン；ならびにかかる融合ポリペプチド、かかる核酸、およびかかる組換え細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株を生成する方法が、本明細書において提供される。また、かかる組換え融合ポリペプチド、核酸、組換え細菌もしくはリステリア株、免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチンを使用して、対象において抗腫瘍関連抗原免疫応答を誘導する方法、対象において抗腫瘍または抗がん免疫応答を誘導する方法、対象において腫瘍またはがんを処置する方法、対象において腫瘍またはがんを防止する方法、および腫瘍またはがんから対象を保護する方法も提供される。
【００９０】
ヒトがんにおける一部の治療標的は、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＴＥＮ、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、およびＥＧＦＲなどの腫瘍特異的突然変異「ホットスポット」を有する腫瘍ドライバー遺伝子によってコードされるタンパク質である。ホットスポットは、突然変異する可能性が最も高いＤＮＡ分子内の領域である。体細胞性のドライバー突然変異の獲得は、発癌に必要とされる増殖、浸潤、およびアポトーシスの調節不全に関与する主要な機構のうちの１つである。これらの突然変異の多くは、生物学的に活性なタンパク質の機能的領域（例えば、キナーゼドメインまたは結合ドメイン）において高頻度で生じるか、または活性部位（例えば、リン酸化部位）を妨害し、結果として機能喪失または機能獲得型の突然変異をもたらす。多くの患者は、最も高頻度で突然変異するか、または少なくとも部分的に悪性表現型の発生の原因となる、重要な腫瘍ドライバー遺伝子の機能的ドメインによく見られる突然変異を共有する。例えば、１つの研究は、４１の異なる腫瘍型において１１，０００を超える腫瘍を評価し、２７５の遺伝子に影響を与える４７０の体細胞突然変異ホットスポットを報告した。すべての固形腫瘍のうちおよそ５５％が、１つまたは複数のホットスポットを有することも報告された（あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれているChangら（２０１６年）、Nat  Biotechnol、３４巻（２号）：１５５〜１６３頁）。これらのホットスポットから生じる特定のミスセンスアミノ酸置換を評価すると、複数の腫瘍型のがん患者が多くの突然変異を共通してもっていることが明らかになる。例えば、ほとんどのヒト腫瘍においてｐ５３機能が損なわれ、すべての腫瘍のうち少なくとも半数がｐ５３の突然変異を呈すると仮定されている（あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれているPolagerおよびGinsberg（２００９年）、Nat  Rev.  Cancer、９巻（１０号）：７３８〜７４８頁）。患者および腫瘍型を越えたこの突然変異の「共有」は、これらのよく見られるホットスポットを標的とする処置用構築物の「オフザシェルフ」開発の機会を作る。後天的な腫瘍特異的またはがん特異的な突然変異の標的化は、中枢性寛容によって妨げられず、正常な細胞におけるオフターゲット効果を最小限に抑える。本明細書では、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（Ｌｍ）技術（ＡＤＸＳ−ＨＯＴ）を使用した、かかる「オフザシェルフ」の構築物、および治療方法におけるその使用が開示される。
【００９１】
Ｌｍ技術は、強力な自然免疫刺激、樹状細胞および抗原提示細胞のサイトゾルへの標的ペプチドの直接送達、標的化されたＴ細胞応答の生成、ならびに腫瘍微小環境における調節性Ｔ細胞および骨髄系由来サプレッサー細胞による免疫抑制の低減を組み込む作用機構を有する。中和抗体を用いず、複数の処置を与え、かつ／または組み合わせることができる。Ｌｍ技術は例えば、生きている弱毒化されたバイオエンジニアリングされているＬｍ細胞を使用して免疫系を刺激し、腫瘍細胞を細菌に感染した可能性がある細胞とみなし、排除する標的とすることができる。この技術のプロセスは、Ｌｉｓｔｅｒｉａの生弱毒化株から始めることができ、例えば、例えば、目的の抗原に結合したＬＬＯ（リステリオリシンＯ）分子の断片を含む、融合タンパク質配列をコードするプラスミドの複数のコピーを付加することができる。この融合タンパク質は、抗原提示細胞の中でＬｉｓｔｅｒｉａによって分泌される。この結果として、免疫系の自然免疫と適応免疫の両方が刺激され、これにより腫瘍防御機構が低減し、免疫系ががん細胞を攻撃し破壊することが容易になる。
【００９２】
免疫学的に言って、Ｌｍベースのベクターは、ペプチドワクチンと比較して、ＣＤ８＋優勢Ｔ細胞応答の生成のための遥かに優れたプラットフォームである。第１に、フィルグラスチム注射のアジュバントを付加する必要がない。これは、生弱毒化細菌ベクターが、いくつかのＴＬＲ、ＰＡＭＰ、およびＤＡＭＰ受容体を含む数多くの自然免疫活性化トリガーを本質的に作動させ、かつ抗原提示細胞のサイトゾル内のＳＴＩＮＧ受容体をアゴナイズする強力な能力を有するためである。これは、患者の免疫系を適応免疫応答に向けてプライミングする、免疫微小環境のはるかに広範な変更である。第２に、Ｌｍベクターは静脈内に注入される。そのため、Ｌｍベクターは、皮下組織の限られた領域内に存在し得るものよりもかなり多くの抗原提示細胞に達することができる。また、それは、皮下注射の必要性、フィルグラスチムの使用、および遅延型過敏症のリスクを排除する。また、それは、最適なＣＤ８＋Ｔ細胞数が典型的には３回の処置（１０回以下）の後にピークに達するため、高いＴ細胞力価をより急速に生成する可能性も高い。第３に、Ｌｍは、ＣＤ４＋交差反応性の優勢なＣＤ８＋Ｔ細胞応答を促進し、Ｔ細胞を助ける。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、がん細胞を死滅させるのに最も効果的であり、ＬｍベクターはＡＰＣの細胞質内でそれらの抗原を提示するため、これらのペプチドは急速にプロテアソームにシャントされてプロセシングされ、ＭＨＣクラス１と複合体を形成し、ＡＰＣ表面に輸送され、主にＣＤ８＋Ｔ細胞に提示される。このことは、皮下のＭｏｎｔａｎｉｄｅによる抗原ペプチド提示よりも多くのＣＤ８＋Ｔ細胞が生成されるという利点をもたらすはずである。第４に、Ｌｍベクターは、腫瘍および周囲のリンパ節におけるケモカインおよびケモカイン受容体の発現を増加させる。これにより、活性化されたＴ細胞を固形腫瘍の近傍に誘引することが容易になる。第５に、Ｌｍベクターは、Ｔ細胞の攻撃から腫瘍を保護し得る免疫抑制細胞の相対数および抑制機能を減少させ、がん細胞のＴ細胞死滅をより良好に可能にする。調節性Ｔ細胞および骨髄系由来サプレッサー細胞の免疫抑制能力のこの低減により、これらのペプチドに対して生成されたＴ細胞が固形腫瘍においてより良好な活性を有することがより良好に可能になる。第６に、Ｌｍベクターは中和抗体を生成しない。このためこれらのベクターは、中和抗体からの有効性の喪失、および遅延型過敏症またはアナフィラキシーを含み得る急性過敏症の発症を伴わずに、長期間にわたって繰り返し投与することができる。
【００９３】
Ｌｍベクターは、複数の免疫療法機構、すなわちｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）およびインターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）受容体を含む病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）を介した強力な自然免疫刺激、強いＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞応答、エピトープ拡散、ならびに腫瘍微小環境におけるＴｒｅｇおよび骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を無能にすることによる免疫抑制を介して作用する。加えて、Ｌｉｓｔｅｒｉａの特有の細胞内生活環が中和抗体を回避するため、反復投薬が可能である。Ｌｍは、チェックポイント阻害剤、共刺激アゴニスト、および他の薬剤との相乗作用を有することからも有利である。それは、大きい容量も有し、多くの異なる腫瘍型を標的とするように適合させることができる。例として、Ｌｍの生弱毒化株は、アジュバント特性を有するリステリオリシンＯのトランケート断片（ｔＬＬＯ）、および１つもしくは複数の腫瘍関連抗原を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる、抗原−アジュバント融合タンパク質を分泌するように、バイオエンジニアリングすることができる。患者に注入すると、バイオエンジニアリングされているＬｍは、抗原提示細胞によって貪食され得、ここで融合タンパク質がＬｍによって分泌され、プロセシングされ、主要組織適合抗原（ＭＨＣ）クラスＩおよびＩＩ分子に提示される。抗原提示細胞の表面に提示された標的ペプチドは、腫瘍関連抗原特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激する。活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞は次に、腫瘍関連抗原発現がん細胞を捜し出して死滅させ、免疫抑制を克服するために腫瘍微小環境をモジュレートし得る。
【００９４】
Ｌｍベクターは、いくつかの臨床的利点を有する。処置に関連する任意の副作用は、患者が未だクリニックにいる注入直後の数時間で現れ、ほぼ例外なく軽度から中程度であり、処置に容易に応答し、遅発、累積毒、または持続する後遺症のエビデンスなしに投薬日に解消する。実用的利点としては、複数の薬剤を投与して、その後の投与のために代替的な投薬部位に切り替える必要がないという事実が挙げられる。
【００９５】
製造の観点からは、いくつかの利点がある。第１に、個々のペプチドを高濃度および高純度で製造する必要がない。Ｌｍ菌は、細菌の中でＤＮＡプラスミドの複数のコピーにおいて同時にＤＮＡを転写し、これらのペプチドをＡＰＣの細胞質内に直接分泌し、ここでこれらはほぼ即時的にプロテアソームに輸送されてプロセシングされる。本質的にペプチドは、抗原プロセシングのために使用されるまさにその場で細菌によって製造される。第２に、Ｌｍベクターは高度にスケーラブルである。遺伝子工学操作が完了次第、細菌はブロス培養物中で自らを複製する。この培養物をスケールアップして、製品のコストを大幅に削減することができる。第３に、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅのような複合担体に配合したり、エマルジョンを作ったりする必要がない。第４に、この細菌は、ペプチド製剤の効力喪失につながり得るペプチド分解または崩壊生成物混入の心配がなく、一部は５年超にわたって非常に安定である。
【００９６】
本明細書において開示されるＡＤＸＳ−ＨＯＴ構築物は、がん関連遺伝子（例えば、主要な腫瘍ドライバー遺伝子）において生じる複数の反復性がん突然変異（例えば、共通の腫瘍ドライバーホットスポット突然変異）によって表される特定のエピトープ（例えば、Ｔ細胞エピトープ）を標的とするために、Ｌｍベクター技術を利用する。例として、特定の腫瘍ドライバー遺伝子における突然変異を共有する患者の大部分において見出される特定のホットスポットミスセンス突然変異をカバーし得る、１つのＬｍベクターを調製することができる。このアプローチにより、単一の生成物が、例えば、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、またはＮＲＡＳもしくはＫＲＡＳなどの特定の遺伝子に後天的突然変異を有する患者の９０％またはそれよりも多く（例えば９８％またはそれよりも多く）において見出されることになる潜在的な突然変異エピトープを表すことが可能になる。例えば、１７位における突然変異エピトープは、ＴＰ５３における反復性ミスセンスがん突然変異の＞９０％をカバーし得る。かなりの割合のがん患者がこれらの突然変異の多くを共有しているため、腫瘍ドライバー遺伝子における潜在的な突然変異の大部分を組み合わせて１つの生成物にすることが可能である。結果として、固形腫瘍の潜在的な腫瘍ドライバー遺伝子ミスセンス突然変異のスペクトル全体を１つのＬｍ構築物の容量内にカバーすることができる。このためＬｍベクター技術は、よく見られる突然変異を標的とする「オフザシェルフ」ホットスポット構築物を工学操作するための高効率かつ適合可能な技術である。
【００９７】
別の例として、特定のタイプのがんを有する患者の大部分（または、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、もしくは５０％など、ある特定のパーセンテージの患者）において見出される特定のホットスポットミスセンス突然変異をカバーし得る、１つのＬｍベクターを調製することができる。このアプローチにより、単一の生成物が、例えば、特定のタイプのがんを有する患者の５０％またはそれよりも多くにおいて見出されることになる潜在的な突然変異エピトープを表すことが可能になる。かなりの割合のがん患者がこれらの突然変異の多くを共有しているため、特定のタイプのがんにおける潜在的な突然変異の大部分またはかなりのパーセンテージを組み合わせて１つの生成物にすることが可能である。結果として、固形腫瘍の潜在的な腫瘍ドライバー遺伝子ミスセンス突然変異のスペクトル全体を１つのＬｍ構築物の容量内にカバーすることができる。このためＬｍベクター技術は、よく見られる突然変異を標的とする「オフザシェルフ」ホットスポット構築物を工学操作するための高効率かつ適合可能な技術である。
【００９８】
ＡＤＸＳ−ＨＯＴ構築物は、最もよく見られる腫瘍ドライバーホットスポット突然変異を標的とするようにバイオエンジニアリングすることができる。これらの生成物は、特定の腫瘍ドライバー遺伝子のＡＤＸＳ−ＨＯＴ生成物の突然変異カバー範囲に含まれる突然変異を有することがバイオマーカー検査によって見出された患者のために製造され、即時利用可能であり得る。同様に、これらの生成物は、２つまたはそれよりも多くの特定の腫瘍ドライバー遺伝子のＡＤＸＳ−ＨＯＴ生成物の突然変異カバー範囲に含まれる突然変異を有することがバイオマーカー検査によって見出された患者のために製造され、即時利用可能であり得る。この突然変異の存在は、生検またはアーカイブ腫瘍組織、または既に存在し得るＤＮＡもしくはＲＮＡ配列決定情報に対する、高速ＰＣＲ検査、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ、ＤＮＡ配列決定、ＲＮＡ配列決定、または別の診断用バイオマーカー手順により、各患者について判定または確認することができる。バイオマーカー検査結果を使用して適格性を迅速に確認できることで、患者に直接ＡＤＸＳ−ＨＯＴ生成物を迅速に送達することが容易になり、カスタマイズされた処置を開発するのに必要な一切の待機期間がなくなる。バイオマーカー検査によってホットスポット突然変異の存在を迅速に判定することができ、「オフザシェルフ」処置を直ちに開始することができる。ＤＮＡ配列決定は必要とされず、患者特異的な生成物の製造は不要である。この適格患者に対するホットスポット標的免疫療法の「オフザシェルフ」送達は、がん処置における重要な治療選択肢を意味する。
【００９９】
腫瘍関連抗原遺伝子に由来する（例えば、がん精巣抗原または癌胎児性抗原に由来する）ヘテロクリティック配列（すなわち、配列最適化されたペプチド）の設計および使用は、ＭＨＣクラスＩ対立遺伝子による提示を増加させ得る。ヘテロクリティック配列は、中枢性寛容を克服するためにＴ細胞応答をプライミングし、野生型ペプチドに対して首尾よい交差反応性免疫応答を誘発するのに十分であることが示されている。ホットスポット標的免疫療法にヘテロクリティックエピトープを付加することにより、がんタイプにおける全患者カバー範囲が１００％に近づき得るという点で、元のホットスポット突然変異ペプチドが補完され得る。したがって、患者は、最も多く見られるＨＬＡ（ＨＬＡ−Ａ０２０１、ＨＬＡ−Ａ０３０１、ＨＬＡ−Ａ２４０２、およびＨＬＡ−Ｂ０７０２）をカバーするようにヘテロクリティックペプチドが設計された腫瘍関連抗原を発現すると考えられるため、処置の前に患者の配列決定を行う必要がない。
【０１００】
本明細書において開示されるミニ遺伝子構築物アプローチを特異的ＭＨＣクラスＩ結合抗原性決定基の発現のために使用することにより、プロフェッショナル抗原提示細胞（ｐＡＰＣ）の抗原提示経路に短いペプチド配列を高効率で送達することが可能になる。ミニ遺伝子技術の特定の利点は、ＭＨＣクラスＩ分子に結合し、これに提示され得る短いペプチド配列を遊離させるための、より大きなタンパク質のプロテアソーム媒介性分解の必要性が回避されることである。これにより、ｐＡＰＣの表面における大幅に高効率のペプチド−ＭＨＣクラスＩ抗原提示と、ひいては、抗原特異的Ｔ細胞応答のプライミングのための大幅に高レベルの抗原発現とがもたらされる。
【０１０１】
本明細書において開示される一部のアプローチでは、最大４つまたはそれよりも多くの別個の特質を組み合わせて、標的カバー範囲を最大にし、オフターゲット毒性を最小限に抑える、単一の疾患特異的なオフザシェルフ生成物にすることができる。これらの特質は、弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（Ｌｍ）ベクター、ｔＬＬＯ融合タンパク質、ホットスポット突然変異、およびがん精巣抗原（ＣＴＡ）または癌胎児性抗原（ＯＦＡ）に由来する最適化されたペプチドを含み得る。体内のＬｍは抗原提示細胞によって能動的に取り込まれ、細胞質内に移動する。したがってこれは、ＭＨＣ  ＩおよびＩＩ経路の両方を介して提示されるように抗原を送達するために理想的なベクターである。Ｌｍはまた、宿主のサイトゾルにおける生存を可能にし、免疫系を強力に刺激する、ビルレンス因子を産生する。これらのビルレンス因子は、腫瘍関連抗原の免疫原性を増強させ得る。Ｌｍ内の複数のプラスミドは、抗原提示細胞内での腫瘍関連抗原融合タンパク質（例えばｔＬＬＯ融合タンパク質）の発現をコードし得る。このことは、ＭＨＣ  Ｉ経路に沿って強力なＣＤ８＋Ｔ細胞応答を始動させる。ＬｍおよびｔＬＬＯ融合タンパク質はまた、腫瘍を保護する調節性Ｔ細胞およびＭＤＳＣを中和し、ＣＤ８＋Ｔ細胞の有効性を増加させ得る。Ｌｍ内にプラスミドの複数のコピーを有することにより、抗原提示および腫瘍微小環境の影響が増加する。融合タンパク質は、ホットスポットペプチドおよび／または例えばＣＴＡもしくはＯＦＡに由来する配列最適化されたペプチド（すなわち、ヘテロクリティック突然変異を有するペプチド）を含み得る。ホットスポット突然変異は、腫瘍ドライバーに対する価値の高い標的であり、これらを標的とすることにより、強い免疫応答を生成し、腫瘍増殖を阻害することができる。複数のホットスポット突然変異ペプチドを組み込むことにより、標的の疾患における患者のカバー範囲が広がる。ホットスポットは、複数の患者において、多くの場合、発癌に寄与する腫瘍ドライバー遺伝子において高頻度で観察される体細胞突然変異である。これらのホットスポット突然変異は、「共通」または「パブリック」抗原の源となる。本明細書に記載されている構築物におけるホットスポット標的は、同定されている１２，５００以上のＨＬＡクラスＩ対立遺伝子の実質的にすべてに対するエピトープを生成するように設計することができ、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏアルゴリズムに依存せず優先順位付けすることができる。ＯＦＡおよびＣＴＡは、あるがん徴候に該当する患者の最大１００％において発現するが、成人の健康な組織では発現しない（例えば、通常は胚組織でのみ発現する）。多くのＯＦＡ／ＣＴＡが発癌における主要な役割を有する。ＯＦＡ／ＣＴＡは、がんにおける組織発現が高度に制限されているため、免疫療法のための魅力的な標的である。複数の配列最適化された独自の免疫原性ＯＦＡ／ＣＴＡペプチドまたは腫瘍関連抗原ペプチド（すなわち、免疫原性を改善するために配列最適化されたもの）を付加することにより、強いＴ細胞応答を生成することができる、さらなる標的がもたらされる。組み合わせると、これらの構成成分は、より従来型の過剰発現され���天然配列の腫瘍関連抗原よりも、腫瘍細胞を死滅させるために強力で腫瘍特異的な強度（アビディティー）が高いＴ細胞を生成する能力が高い、体細胞突然変異、がん精巣抗原、および癌胎児性抗原を活用する。ほとんどのホットスポット突然変異およびＯＦＡ／ＣＴＡタンパク質は、発癌において重要な役割を果たす。両方を同時に標的とすることで、がんの増殖が著しく損なわれる可能性がある。ホットスポット突然変異を複数のＯＦＡ／ＣＴＡペプチドと組み合わせると、標的疾患を有する全患者において発現される複数の高アビディティー標的が、１回の処置で提示される。
【０１０２】
がん関連遺伝子（例えば腫瘍ドライバー遺伝子）に複数の突然変異を有する患者が、バイオマーカー検査において同定された各自の特定の突然変異遺伝子を標的とする組合せ（例えば、２種またはそれよりも多くの免疫療法からなる単一の投薬レジメン）を用いて処置される場合もあれば、代替的に、その疾患を有する患者において一般に見出される突然変異遺伝子をカバーする、各自のがんタイプに合った組合せキットまたはパネル（例えば、２種またはそれよりも多くの免疫療法からなる単一の投薬レジメン）（例えば、肺腺癌パネル、結腸直腸がんパネルなど）が使用される場合もある。特定のタイプのがんを有する患者は次に、その特定のタイプのがんにおいて一般に観察される突然変異遺伝子を標的とするＡＤＸＳ−ＨＯＴ構築物の固定の組合せまたはパネルを用いて処置され得る。代替的に、かかる患者は、バイオマーカー検査において同定された各自の特定の突然変異遺伝子を標的とする単一の免疫療法、または、その疾患を有する患者において見出される複数の異なるがん関連タンパク質において見出される突然変異遺伝子をカバーする、各自のがんタイプに特異的な単一の免疫療法を用いて処置されてもよい。所与の腫瘍型を有するすべての患者が、同じ方法で処置され得る。例えば、ある特定の疾患では、高いパーセンテージの患者において突然変異を有する比較的少ない遺伝子が存在する。これらの事例では、例えば、同じ疾患型を有するすべての患者に同じ組合せのＡＤＸＳ−ＨＯＴ構築物を与えることは、より手際がよい場合がある。例えば、卵巣がん患者の９３％はＴＰ５３の突然変異を有するため、診断検査の必要がない場合がある。結腸直腸がん（ＣＲＣ）では、４つの腫瘍ドライバー遺伝子が最も高頻度で突然変異し、ほとんどの患者は、これら４つの遺伝子に１つより多くの突然変異を保有する。ＣＲＣにおける腫瘍ドライバー突然変異は、７６％の患者でＡＰＣ、５２％の患者でＴＰ−５３、５２％の患者でＲＡＳ（ＫＲＡＳ／ＮＲＡＳ）、そして１９％の患者でＰＩＫ３ＣＡを含むため、ＣＲＣの「標準」の組合せは、ＡＰＣ、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、およびＲＡＳに対するＡＤＸＳ−ＨＯＴ構築物を含み得る。代替的に、ＣＲＣの「標準」は、ＡＰＣ、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、およびＲＡＳの最もよく見られるＣＲＣ突然変異セットを含む単一のＡＤＸＳ−ＨＯＴ構築物を含み得る。ほとんどの患者はこれらのうち２つから４つをどこかに発現する可能性が高いため、複数の反復性がん突然変異が標的になる。
【０１０３】
本明細書において開示されるＡＤＸＳ−ＨＯＴ免疫療法は、健康な細胞に対する影響をほとんどまたは全く伴わずに、ホットスポットに対する有効性が高く標的化された攻撃を行うことにより、がんの処置に大変革をもたらす可能性を有する。腫瘍免疫療法は、宿主自身の免疫細胞という、自然が生み出した最も効果的な抗がん剤を活用する。
【０１０４】
腫瘍特異的突然変異の結果として生じる腫瘍特異的抗原は、効果的ながん免疫療法のために重要な標的である。がんの免疫療法に対する最も効果的かつ最も長く持続する応答は、腫瘍内の突然変異に関連する腫瘍特異的抗原または腫瘍特異的エピトープに対するＴ細胞応答の増幅に起因し得る。さらに、腫瘍ドライバー遺伝子の突然変異は、ほとんどの場合、がん細胞の持続または成長を推進する機能喪失型または機能獲得型の表現型に関連する。これらのドライバー突然変異を特異的に標的にすることにより、免疫療法が正常な細胞を損なうことなく疾患進行を阻害し、がん細胞を排除する絶好の機会がもたらされ得る。反復性がん突然変異は個別化された処置に含まれる場合も含まれない場合もあるが、ＡＤＸＳ−ＨＯＴアプローチは、がんの処置のための個別化されたネオエピトープを標的とする患者特異的生成物に勝る固有の利点を有する。第１に、このアプローチは、がんの成長に関連する最も重要な突然変異であり得るものを標的とする。第２に、共通の反復性がん突然変異を標的とすることにより、同じ生成物を複数の患者に使用することが可能になる。Ｌｍ−ＬＬＯベクターの容量は、単一の遺伝子を標的とする生成物において生じ得る突然変異のほぼすべてをカバーすることができ、その結果この生成物は、特定のがん関連遺伝子（例えば腫瘍ドライバー遺伝子）に何らかの後天的突然変異を有するほぼすべての患者を処置することができる。ＡＤＸＳ−ＨＯＴ構築物はバルクで製造することができ、Ｌｍ−ＬＬＯ生成物は、５年間またはそれを超えて良好な安定性を示している。加えて、複数の構築物を組み合わせることができるため、カバー範囲が増大する。最後に、ＡＤＸＳ−ＨＯＴは準備が済んだ状態で保管されており、患者が処置を直ちに開始し、それにもかかわらず腫瘍特異的エピトープを標的とするために利用可能である。患者毎に１つ限りの生成物とは対照的に、より大きなバッチを作ることにより、製品のコストを低く抑えることができる。これまでのＬＭ−ＬＬＯ構築物に対する生成物の安定性は、例えば、５年を超える場合がある。進行がんを有する患者は、個人的なネオエピトープ生成物を用いた処置を始めるまで数カ月間待機することができない場合があるが、ＡＤＸＳ−ＨＯＴパネルを利用することにより、腫瘍特異的エピトープに対する処置をほぼ即時的に開始することができる。
【０１０５】
本明細書において開示される複数のＬｍ−ＬＬＯ構築物は、複数の腫瘍型、および腫瘍ドライバー遺伝子によく見られる突然変異を共有する複数の患者に対して、広い有用性を有する。生成物は、複数の患者が共有する後天的な反復性がん突然変異を標的とし、寛容によって保護されている正常な細胞における天然配列ペプチドよりも高い免疫原性を有するはずである。Ｐ−５３およびＰＩ３キナーゼにおける突然変異だけでも、すべてのがん患者の５０％超において生じ、腫瘍ドライバー遺伝子におけるホットスポット突然変異がよく見られる、本明細書において開示される主要ながんのためのパネルが形成され得る。
【０１０６】
バイオマーカー検査の判定によって推進される「スパイスラック」アプローチを行うために、複数のＡＤＸＳ−ＨＯＴ構築物を作ることができる。容易に利用可能である迅速なバイオマーカー検査および／またはＲＮＡもしくはＤＮＡの配列決定により、個々の患者のために個別化された薬の「キット」を作るため、標的の存在を判定することができる。疾患特異的なパネルは、よく見られる突然変異を共有する特定の疾患を有する患者の大部分を標的とすることができる。代替的に、ある特定の疾患型に対して決まった組合せを与えてもよく、これには、診断検査を必要とすることなく、ある特定の疾患を有する患者の大部分において見出される突然変異が含まれる。
【０１０７】
構築物は、単独療法として使用してよいが、いくつかの個々のホットスポット生成物を他の治療的がん処置と併せた、または組み合わせたものとして、ＡＤＸＳ−ＨＯＴ構築物を併用処置レジメンの一部として使用する可能性も存在する。例として、同じ患者において１つより多くの遺伝子が突然変異している場合、各遺伝子に対する代表的構築物を注入の直前に混合してよい。例えば、患者がＴＰ５３、ＲＡＳ、およびＢＲＡＦのホットスポットにおけるミスセンス突然変異を有することが見出された場合、これら３つのＡＤＸＳ−ＨＯＴ生成物は、組み合わせて（ＡＤＸＳ−ｈｔＴＰ５３、ＡＤＸＳ−ｈｔＲＡＳ、およびＡＤＸＳ−ｈｔＢＲＡＦ）処置レジメンとして与えてもよい。加えて、他のＬｍ構築物と同様に、ホットスポット処置は、チェックポイント阻害剤、共刺激アゴニスト、もしくは放射線療法のような他のがん処置と組み合わせて、または連続的に与えてもよい。この理由は、動物モデルおよび臨床試験からの早期データにより、Ｌｍ−ＬＬＯ免疫療法が、活性免疫療法剤、特にＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１遮断抗体との著しい相乗効果の可能性を有することが示されたことである。
【０１０８】
例えば、Ｌｍ−ＬＬＯベースのワクチンの抗ＰＤ−１抗体との組合せは、免疫サプレッサー細胞（ＴｒｅｇおよびＭＤＳＣ）の減少と併せて、抗原特異的免疫応答および腫瘍浸潤性ＣＤ８＋Ｔ細胞の増加をもたらす。組合せレジメンは、処置された動物において、腫瘍成長の著しい阻害および生存期間の延長／腫瘍の完全な退縮を伴う相乗活性をもたらした。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１の遮断とＬｍ−ＬＬＯベースのワクチンの組合せは、いずれかの薬剤単独と比べて、抗腫瘍免疫療法の有効性の全体的な増強をもたらし得る。また、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＬｍ感染がヒト単球由来樹状細胞における表面ＰＤ−Ｌ１発現の著しい上方調節をもたらすことも示された。このことは、この所見の翻訳能を示唆する。
【０１０９】
前臨床データは、Ｏｘ−４０およびＧＩＴＲのような免疫共刺激アゴニストとの相乗効果も示唆している（あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれているMkrtichyanら（２０１３年）、J  Immunother  Cancer、１巻：１５号、doi:10.1186/2051-1426-1-15）。放射線療法とＬｍ−ＬＬＯベクターの相乗効果は、前臨床モデルにおいて実証されており（あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれているHannanら（２０１２年）、Cancer  Immunol  Immunother、６１巻（１２号）：２２２７〜２２３８頁）、また、未切除のイヌ骨肉腫における進行中の獣医学的試験において観察されている。Ｌｍ処置は化学療法と連続的に与えてもよいが、十分な造血回復があることを条件とする。加えて、Ｌｍベクターによる中和抗体が発生しないことが現在までの研究によって示されており、そのため、単一のＬｍベクターを用いた反復処置、または複数のベクターを用いた同時もしくは連続的な処置が可能である。
【０１１０】
ＩＩ．反復性がん突然変異を含む組換え融合ポリペプチド
２つまたはそれよりも多くの抗原性ペプチドに融合したＰＥＳＴ含有ペプチド（すなわち、タンデムになっているもの、例えばＰＥＳＴ−ペプチド１−ペプチド２）を含む組換え融合ポリペプチドであって、各抗原性ペプチドが、単一の反復性がん突然変異（すなわち、タンパク質のアミノ酸配列における単一の反復性変化、または遺伝子における単一の異なる非同義の反復性がん突然変異によってコードされる配列）を含む、組換え融合ポリペプチドが、本明細書において開示される。また、２つまたはそれよりも多くの抗原性ペプチドに融合したＰＥＳＴ含有ペプチド（すなわち、タンデムになっているもの、例えばＰＥＳＴ−ペプチド１−ペプチド２）を含む組換え融合ポリペプチドであって、各抗原性ペプチドが、単一の反復性がん突然変異（すなわち、タンパク質のアミノ酸配列における単一の反復性変化、または遺伝子における単一の異なる非同義の反復性がん突然変異によってコードされる配列）を含み、抗原性ペプチドのうちの少なくとも２つが、異なる反復性がん突然変異を含み、かつ同じがん関連タンパク質の断片である、組換え融合ポリペプチドも本明細書において開示される。代替的に、抗原性ペプチドのそれぞれは、異なるがん関連タンパク質に由来する異なる反復性がん突然変異を含む。代替的に、各抗原性ペプチドが各自のＰＥＳＴ含有ペプチドに融合している、別々の融合ポリペプチドの組合せ（例えば、ＰＥＳＴ１−ペプチド１、ＰＥＳＴ２−ペプチド２）を使用してもよい。必要に応じて、断片の一部またはすべては、同じがん関連タンパク質の不連続断片である。不連続断片とは、タンパク質配列において連続的に生じない断片である（例えば、第１の断片は残基１０〜３０からなり、第２の断片は残基１００〜１２０からなるか、または、第１の断片は残基１０〜３０からなり、第２の断片は残基２０〜４０からなる）。必要に応じて、抗原性ペプチドのそれぞれは、単一のタイプのがんに由来する異なる反復性がん突然変異を含む。例えば、単一のタイプのがんは、非小細胞肺がん、前立腺がん、膵臓がん、膀胱がん、乳がん（例えばＥＲ＋乳がん）、子宮がん、卵巣がん、低悪性度神経膠腫、結腸直腸がん（例えばＭＳＳ結腸直腸がん）、または頭頸部がんであり得る。
【０１１１】
また、２つまたはそれよりも多くの抗原性ペプチドを含む組換え融合ポリペプチドであって、各抗原性ペプチドが、単一の反復性がん突然変異（すなわち、タンパク質のアミノ酸配列における単一の反復性変化、または遺伝子における単一の異なる非同義の反復性がん突然変異によってコードされる配列）を含み、融合ポリペプチドがＰＥＳＴ含有ペプチドを含まない、組換え融合ポリペプチドも本明細書において開示される。また、２つまたはそれよりも多くの抗原性ペプチドを含む組換え融合ポリペプチドであって、各抗原性ペプチドが、単一の反復性がん突然変異（すなわち、タンパク質のアミノ酸配列における単一の反復性変化、または遺伝子における単一の異なる非同義の反復性がん突然変異によってコードされる配列）を含み、抗原性ペプチドのうちの少なくとも２つが、異なる反復性がん突然変異を含み、かつ同じがん関連タンパク質の断片であり、融合ポリペプチドがＰＥＳＴ含有ペプチドを含まない、組換え融合ポリペプチドも本明細書において開示される。代替的に、抗原性ペプチドのそれぞれは、異なるがん関連タンパク質に由来する異なる反復性がん突然変異を含む。必要に応じて、断片の一部またはすべては、同じがん関連タンパク質の不連続断片である。必要に応じて、抗原性ペプチドのそれぞれは、単一のタイプのがんに由来する異なる反復性がん突然変異を含む。例えば、単一のタイプのがんは、非小細胞肺がん、前立腺がん、膵臓がん、膀胱がん、乳がん（例えばＥＲ＋乳がん）、子宮がん、卵巣がん、低悪性度神経膠腫、結腸直腸がん（例えばＭＳＳ結腸直腸がん）、または頭頸部がんであり得る。
【０１１２】
また、Ｎ末端からＣ末端に向かって、細菌分泌配列、ユビキチン（Ｕｂ）タンパク質、および２つまたはそれよりも多くの抗原性ペプチド（すなわち、タンデムになっているもの、例えばＵｂ−ペプチド１−ペプチド２）を含む組換え融合ポリペプチドであって、各抗原性ペプチドが、単一の反復性がん突然変異（すなわち、タンパク質のアミノ酸配列における単一の反復性変化、または遺伝子における単一の異なる非同義の反復性がん突然変異によってコードされる配列）を含み、抗原性ペプチドのうちの少なくとも２つが、同じがん関連タンパク質の断片である、組換え融合ポリペプチドも本明細書において提供される。代替的に、抗原性ペプチドのそれぞれは、異なるがん関連タンパク質に由来する異なる反復性がん突然変異を含む。代替的に、各抗原性ペプチドが各自の分泌配列およびＵｂタンパク質に融合している、別々の融合ポリペプチドの組合せ（例えば、Ｕｂ１−ペプチド１、Ｕｂ２−ペプチド２）を使用してもよい。必要に応じて、断片の一部またはすべては、同じがん関連タンパク質の不連続断片である。必要に応じて、抗原性ペプチドのそれぞれは、単一のタイプのがんに由来する異なる反復性がん突然変異を含む。例えば、単一のタイプのがんは、非小細胞肺がん、前立腺がん、膵臓がん、膀胱がん、乳がん（例えばＥＲ＋乳がん）、子宮がん、卵巣がん、低悪性度神経膠腫、結腸直腸がん（例えばＭＳＳ結腸直腸がん）、または頭頸部がんであり得る。
【０１１３】
かかる組換え融合ポリペプチドをコードする核酸（ミニ遺伝子構築物と呼ぶ）も開示される。かかるミニ遺伝子核酸構築物は、各オープンリーディングフレーム間のシャイン・ダルガーノリボソーム結合部位核酸配列によって連結された２つまたはそれよりも多くのオープンリーディングフレームをさらに含み得る。例えば、ミニ遺伝子核酸構築物は、各オープンリーディングフレーム間のシャイン・ダルガーノリボソーム結合部位核酸配列によって連結された２〜４つのオープンリーディングフレームをさらに含み得る。各オープンリーディングフレームが異なるポリペプチドをコードしてよい。一部の核酸構築物では、融合ポリペプチドのカルボキシ末端をコードするコドンの後に、タンパク質合成の終結を確実にする２つの停止コドンが続く。
【０１１４】
細菌シグナル配列は、ＨｌｙもしくはＡｃｔＡシグナル配列などのリステリアのシグナル配列、または任意の他の公知のシグナル配列であってよい。他の場合では、シグナル配列はＬＬＯシグナル配列であってよい。シグナル配列は、細菌性のものであっても、宿主細菌に対して天然のもの（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに対して天然のもの、例えばｓｅｃＡ１シグナルペプチド）であっても、宿主細菌に対して異質のものであってもよい。シグナルペプチドの具体例としては、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓに由来するＵｓｐ４５シグナルペプチド、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓに由来する保護抗原シグナルペプチド、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに由来するｐ６０シグナルペプチドなどのｓｅｃＡ２シグナルペプチド、およびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  Ｔａｔシグナルペプチド（例えばＰｈｏＤ）などのＴａｔシグナルペプチドが挙げられる。具体例において、分泌シグナル配列は、Ｌｉｓｔｅｒｉａタンパク質由来、例えばＡｃｔＡ３００分泌シグナルまたはＡｃｔＡ１００分泌シグナルなどである。
【０１１５】
ユビキチンは、例えば、全長タンパク質であり得る。本明細書において提供される核酸構築物から発現されるユビキチンは、宿主細胞サイトゾルに侵入するとヒドロラーゼの作用によって核酸構築物から発現される組換え融合ポリペプチドの残部からカルボキシ末端において切断され得る。これにより融合ポリペプチドのアミノ末端が遊離し、宿主細胞サイトゾルにおいてペプチドが産生される。
【０１１６】
融合ポリペプチド内の抗原性ペプチドの選択、変形形態、および配置は、本明細書の他所で詳細に論じられ、がん関連タンパク質は、本明細書の他所でより詳細に論じられる。
【０１１７】
組換え融合ポリペプチドは、１つまたは複数のタグを含み得る。例えば、組換え融合ポリペプチドは、２つまたはそれよりも多くの抗原性ペプチドの組合せのＮ末端側および／またはＣ末端側に、１つまたは複数のペプチドタグを含み得る。タグは、抗原性ペプチドに直接融合していても、リンカーを介して抗原性ペプチドに連結していてもよい（この例は本明細書の他所で開示されている）。タグの例としては、ＦＬＡＧタグ、２×ＦＬＡＧタグ、３×ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓタグ、６×Ｈｉｓタグ、およびＳＩＩＮＦＥＫＬタグが挙げられる。例示的なＳＩＩＮＦＥＫＬタグは、配列番号２９３に示されている（配列番号２７８〜２９２に示される核酸のうちのいずれか１つによってコードされる）。別の例示的なＳＩＩＮＦＥＫＬタグは、配列番号９２２に示されている。例示的な３×ＦＬＡＧタグは、配列番号３０９に示されている（配列番号２９４〜３０８に示される核酸のうちのいずれか１つによってコードされる）。別の例示的なＦＬＡＧタグは、配列番号７６２に示されている。２×ＦＬＡＧタグおよびＳＩＩＮＦＥＫＬタグ、３×ＦＬＡＧタグおよびＳＩＩＮＦＥＫＬタグ、または６×ＨｉｓタグおよびＳＩＩＮＦＥＫＬタグなど、２つまたはそれよりも多くのタグを一緒に使用してもよい。２つまたはそれよりも多くのタグが使用される場合、これらは、組換え融合ポリペプチド内のどの場所に、どの順序で位置していてもよい。例えば、２つのタグが組換え融合ポリペプチドのＣ末端にあってもよく、２つのタグが組換え融合ポリペプチドのＮ末端にあってもよく、２つのタグが組換え融合ポリペプチドの内部に位置していてもよく、１つのタグが組換え融合ポリペプチドのＣ末端にあり、１つのタグがＮ末端にあってもよく、１つのタグが組換え融合ポリペプチドのＣ末端にあり、１つが内部にあってもよく、または、１つのタグが組換え融合ポリペプチドのＮ末端にあり、１つが内部にあってもよい。他のタグとしては、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン（ＴＲＸ）、およびポリ（ＮＡＮＰ）が挙げられる。特定の組換え融合ポリペプチドは、Ｃ末端側のＳＩＩＮＦＥＫＬタグを含む。このようなタグにより、組換え融合タンパク質の容易な検出、組換え融合タンパク質の分泌の確認、またはこれらの「タグ」配列ペプチドに対する免疫応答を追跡することによる分泌された融合ポリペプチドの免疫原性の追跡が可能になり得る。かかる免疫応答は、例えば、これらのタグに特異的なモノクローナル抗体およびＤＮＡまたはＲＮＡプローブを含む、いくつかの試薬を使用してモニタリングすることができる。
【０１１８】
本明細書において開示される組換え融合ポリペプチドは、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株によって発現させることもできるし、タンパク質の発現および単離に使用される他のベクターおよび細胞系から発現させ単離することもできる。かかる抗原性ペプチドを発現する組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株は、例えば、かかる組換えＬｉｓｔｅｒｉａを含む免疫原性組成物において、ならびに組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株およびアジュバントを含むワクチンにおいて使用され得る。Ｌｉｓｔｅｒｉａ株における宿主細胞系およびＬｉｓｔｅｒｉａ以外の宿主細胞系における、ＬＬＯ、ＡｃｔＡ、またはＰＥＳＴ様配列の非溶血性トランケート型との融合ポリペプチドとしての１つまたは複数の抗原性ペプチドの発現は、抗原性ペプチドの免疫原性の増強をもたらし得る。
【０１１９】
組換え融合ポリペプチドは、任意の分子量であってよい。例えば、組換え融合ポリペプチドは、約２００、１９５、１９０、１８５、１８０、１７５、１７０、１６５、１６０、１５５、１５０、１４５、１４０、１３５、１３０、もしくは１２５キロダルトン（ｋＤａ）未満またはそれ以下であり得る。具体例において、組換え融合ポリペプチドは、約１５０ｋＤａ未満もしくはそれ以下、または約１３０ｋＤａ未満もしくはそれ以下である。別の例として、組換え融合ポリペプチドは、約５０〜２００、５０〜１９５、５０〜１９０、５０〜１８５、５０〜１８０、５０〜１７５、５０〜１７０、５０〜１６５、５０〜１６０、５０〜１５５、５０〜１５０、５０〜１４５、５０〜１４０、５０〜１３５、５０〜１３０、５０〜１２５、１００〜２００、１００〜１９５、１００〜１９０、１００〜１８５、１００〜１８０、１００〜１７５、１００〜１７０、１００〜１６５、１００〜１６０、１００〜１５５、１００〜１５０、１００〜１４５、１００〜１４０、１００〜１３５、１００〜１３０、または１００〜１２５ｋＤａであり得る。具体例において、組換え融合ポリペプチドは、約５０〜１５０、１００〜１５０、５０〜１２５、または１００〜１２５ｋＤａである。別の例として、組換え融合ポリペプチドは、少なくとも約５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、または１２５ｋＤａであり得る。具体例として、組換え融合ポリペプチドは、少なくとも約１００ｋＤａであり得る。
【０１２０】
かかる組換え融合ポリペプチドをコードする核酸も開示される。核酸は、任意の形態であってよい。核酸は、ＤＮＡもしくはＲＮＡを含んでも、またはそれらからなってもよく、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。核酸は、エピソームプラスミド、マルチコピーエピソームプラスミド、または組込みプラスミドなどのプラスミドの形態であり得る。代替的に、核酸は、ウイルスベクター、ファージベクター、または細菌人工染色体中の形態であってもよい。かかる核酸は、１つのオープンリーディングフレームを有してもよいし、２つまたはそれよりも多くのオープンリーディングフレーム（例えば、組換え融合ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、および代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレーム）を有してもよい。一例において、かかる核酸は、各オープンリーディングフレーム間のシャイン・ダルガーノリボソーム結合部位核酸配列によって連結された２つまたはそれよりも多くのオープンリーディングフレームを含み得る。例えば、核酸は、各オープンリーディングフレーム間のシャイン・ダルガーノリボソーム結合部位核酸配列によって連結された２〜４つのオープンリーディングフレームを含み得る。各オープンリーディングフレームが異なるポリペプチドをコードしてよい。一部の核酸では、融合ポリペプチドのカルボキシ末端をコードするコドンの後に、タンパク質合成の終結を確実にする２つの停止コドンが続く。
【０１２１】
Ａ．抗原性ペプチド
各抗原性ペプチドは、がん関連タンパク質の断片（すなわち、がん関連タンパク質のアミノ酸の連続した配列）であり得る。各抗原性ペプチドは、免疫応答を誘導するのに十分な任意の長さであってよく、各抗原性ペプチドが同じ長さであってもよいし、または抗原性ペプチドが異なる長さを有してもよい。例えば、本明細書において開示される抗原性ペプチドは、５〜２００、５〜１００、７〜２００、７〜１００、１５〜５０、もしくは２１〜２７アミノ酸長、または１５〜１００、１５〜９５、１５〜９０、１５〜８５、１５〜８０、１５〜７５、１５〜７０、１５〜６５、１５〜６０、１５〜５５、１５〜５０、１５〜４５、１５〜４０、１５〜３５、１５〜３０、２０〜１００、２０〜９５、２０〜９０、２０〜８５、２０〜８０、２０〜７５、２０〜７０、２０〜６５、２０〜６０、２０〜５５、２０〜５０、２０〜４５、２０〜４０、２０〜３５、２０〜３０、１１〜２１、１５〜２１、２１〜３１、３１〜４１、４１〜５１、５１〜６１、６１〜７１、７１〜８１、８１〜９１、９１〜１０１、１０１〜１２１、１２１〜１４１、１４１〜１６１、１６１〜１８１、１８１〜２０１、８〜２７、１０〜３０、１０〜４０、１５〜３０、１５〜４０、１５〜２５、１〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、１〜１００、５〜７５、５〜５０、５〜４０、５〜３０、５〜２０、５〜１５、５〜１０、１〜７５、１〜５０、１〜４０、１〜３０、１〜２０、１〜１５、１〜１０、８〜１１、もしくは１１〜１６アミノ酸長であり得る。例えば、抗原性ペプチドは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または６０アミノ酸長であり得る。抗原性ペプチドの一部の具体例は、２１または２７アミノ酸長である。
【０１２２】
各抗原性ペプチドは親水性であってもよく、すなわち、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓまたは別の目的の細菌における分泌可能性を予測し得る、ある特定のハイドロパシー閾値以下またはそれ未満のスコアを有し得る。例えば、抗原性ペプチドは、ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅのハイドロパシー指数２１アミノ酸ウィンドウによってスコアリングすることができ、カットオフ（約１．６）を超えるスコアを有するものはすべて、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓによって分泌可能である可能性が低いために除外することができる。
【０１２３】
各抗原性ペプチドは、単一の反復性がん突然変異を含んでもよいし、２つまたはそれよりも多くの反復性がん突然変異（例えば、２つの反復性がん突然変異）を含んでもよい。例えば、抗原性ペプチドは、がん関連タンパク質において突然変異した残基が互いに近接しているために、１つより多くの反復性がん突然変異（例えば、２つまたは３つの反復性がん突然変異）を含んでもよい。反復性がん突然変異は、任意のタイプの突然変異（例えば、体細胞ミスセンス突然変異またはフレームシフト突然変異）であり得る。各抗原性ペプチドにおける反復性がん突然変異は、各側に同数のアミノ酸が隣接していてもよいし、各側に異なる数のアミノ酸が隣接していてもよい（例えば、Ｎ末端側に９個のアミノ酸が隣接し、Ｃ末端側に１０個のアミノ酸が隣接している、またはＮ末端側に１０個のアミノ酸が隣接し、Ｃ末端側に１３個のアミノ酸が隣接している）。反復性がん突然変異の各側の隣接配列は、がん関連タンパク質における突然変異に天然において隣接する配列であり得る。例えば、抗原性ペプチドにおける反復性がん突然変異は、各側に同数のアミノ酸が隣接していてもよく、この隣接配列が、がん関連タンパク質における反復性がん突然変異に天然において隣接する配列と同一である。反復性がん突然変異の各側の隣接アミノ酸の数は、各側に隣接する５〜３０個のアミノ酸など、任意の長さであり得る。一例として、反復性がん突然変異は、各側に少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、または５０個のアミノ酸（例えば、少なくとも１０個のアミノ酸、または少なくとも１３個のアミノ酸）が隣接していてよい。好ましくは、異なるＨＬＡ  Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）リーディングフレームの少なくとも一部をもたらすために、クラス１  ＭＨＣ−１提示に適応するように、検出された反復性がん突然変異の各側に少なくとも約１０個の隣接アミノ酸が組み込まれるか、または、ＣＤ４＋Ｔ細胞抗原提示のための異なるＨＬＡ  Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）リーディングフレームの少なくとも一部をもたらすために、クラス２  ＭＨＣ−２提示に適応するように、検出された反復性がん突然変異の各側に少なくとも約１３個の隣接アミノ酸が組み込まれる。しかしながら、こうする必要は必ずしもなく、場合によっては不可能なこともある（例えば、反復性がん突然変異が、タンパク質のうち最初の１０個のアミノ酸、またはタンパク質のうち最後の１０個のアミノ酸において生じる場合）。場合によっては、がん関連タンパク質における反復性がん突然変異の位置は、１つの特定の側にどれだけ多くのアミノ酸が隣接しているかを左右し得る（例えば、突然変異が、タンパク質のうち最初の１０個のアミノ酸、またはタンパク質のうち最後の１０個のアミノ酸にある場合）。フレームシフト突然変異の場合、フレームシフト突然変異の下流の任意の数の予想されるアミノ酸が含まれ得る。例えば、フレームシフト突然変異の下流の予想されるアミノ酸のすべてが含まれていてよい。
【０１２４】
抗原性ペプチドは、任意の様式でひとつに連結していてよい。例えば、抗原性ペプチドは、介在配列なしで直接互いに融合していてよい。代替的に、抗原性ペプチドは、ペプチドリンカーなどの１つまたは複数のリンカーを介して間接的に互いに連結していてもよい。場合によっては、隣接する抗原性ペプチドの一部の対は互いに直接融合していてもよく、抗原性ペプチドの他の対は、１つまたは複数のリンカーを介して間接的に互いに連結していてもよい。隣接する抗原性ペプチドの各対の間に同じリンカーを使用してもよいし、隣接する抗原性ペプチドの異なる対の間に任意の数の異なるリンカーを使用してもよい。加えて、一対の隣接する抗原性ペプチド間に１つのリンカーを使用してもよいし、一対の隣接する抗原性ペプチド間に複数のリンカーを使用してもよい。
【０１２５】
任意の好適な配列をペプチドリンカーに使用することができる。例として、リンカー配列は、例えば、１〜約５０アミノ酸長であってよい。一部のリンカーは親水性であり得る。リンカーは様々な目的に役立つことができる。例えば、リンカーは、細菌分泌を増大させること、抗原プロセシングを促進すること、融合ポリペプチドの可動性を増大させること、融合ポリペプチドの剛性を増大させること、または任意の他の目的に役立つことができる。具体例として、可動性リンカー、剛性リンカー、および免疫プロテアソームプロセシングリンカーのうちの１つもしくは複数またはすべてを使用することができる。そのようなリンカーの例を以下に提供する。場合によっては、リピートを最小限に抑えるために、異なるアミノ酸リンカー配列が抗原性ペプチド間に分布しているか、または同じアミノ酸リンカー配列をコードする異なる核酸が抗原性ペプチド間（例えば配列番号５７２〜５８２）に分布している。これは、二次構造を低減させることにより、Ｌｍ組換えベクター株集団内の融合ポリペプチドをコードする核酸（例えばプラスミド）の効率的な転写、翻訳、分泌、維持、または安定化を可能にすることに役立つことができる。他の好適なペプチドリンカー配列は、例えば、次の要素：（１）可動性がある伸長したコンフォメーションをとる能力、（２）抗原性ペプチドの機能的エピトープと相互作用し得る二次構造をとる能力の欠如、および（３）機能的エピトープと反応し得る疎水性または荷電残基の欠如のうちの１つまたは複数に基づいて選択され得る。例えば、ペプチドリンカー配列は、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、およびＳｅｒ残基を含み得る。他のほぼ中性のアミノ酸、例えばＴｈｒおよびＡｌａをリンカー配列に使用してもよい。リンカーとして有用に用いられ得るアミノ酸配列としては、Marateaら（１９８５年）、Gene、４０巻：３９〜４６頁、Murphyら（１９８６年）、Proc  Natl  Acad  Sci  USA、８３巻：８２５８〜８２６２頁、米国特許第４，９３５，２３３号、およびＵＳ４，７５１，１８０に開示されているものが挙げられ、これらはそれぞれ、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれている。リンカーの具体例としては、以下の表中のものが挙げられる（これらはそれぞれ、リンカーとしてそれ自体で使用されても、配列のリピートを含むリンカーにおいて使用されても、または表中の他の配列のうちの１つもしくは複数をさらに含むリンカーにおいて使用されてもよい）が、その他のものも想定され得る（例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれている、Reddy  Chichiliら（２０１３年）、Protein  Science、２２巻：１５３〜１６７頁を参照されたい）。特記なき限り、「ｎ」は、列記されるリンカーにおけるリピートの不確定数を表す。
【表１２５】
2020513737.tif 000004
【０１２６】
ＶＧＫＧＧＳＧＧリンカー（配列番号３１４）は、例えば、融合ペプチドのｔＬＬＯと抗原部分との間、およびタグ配列の前にさらなる空間をもたらすように、ｔＬＬＯの後、およびまたタグ配列の前の、より長いリンカーとして使用され得る。これは、融合タンパク質に可動性および電荷の平衡をもたらすこともできる。ＥＡＡＡＫリンカー（配列番号３１６）は、例えば、融合タンパク質がさもなければそれ自体に折り畳まれる場合、発現および分泌を促進するために使用され得る、剛性／硬性リンカーである。ＧＧＧＧＳリンカー（配列番号３１３）は、例えば、増大した可動性を融合タンパク質に付加して発現および分泌の促進を助けるために使用され得る、可動性リンカーである。「ｉ２０」リンカー（例えば配列番号８２１〜８２９）は、例えば、免疫プロテアソームによる融合タンパク質の切断の促進を助け、所望される最小の結合性断片そのものが得られる頻度を増大させるように設計された、免疫プロテアソームリンカーである。ＧＧＧＧＳおよびＥＡＡＡＫリンカー（それぞれ、配列番号３１３および３１６）の組合せは、例えば、発現および分泌の改善のために可動性と剛性とが交互になるようにして構築物のバランスを取ることを助けるため、また、選択できる特有のコドンをより多く提供することによりＤＮＡ合成の促進を助けるために使用され得る。
【０１２７】
融合ポリペプチドは、任意の数の抗原性ペプチドを含み得る。場合によっては、融合ポリペプチドは、融合ポリペプチドが組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株から産生および分泌され得るような、任意の数の抗原性ペプチドを含む。例えば、融合ポリペプチドは、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、もしくは３０個の抗原性ペプチド、または２〜５０、２〜４５、２〜４０、２〜３５、２〜３０、２〜２５、２〜２０、２〜１５、２〜１０、２〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、もしくは４５〜５０個の抗原性ポリペプチドを含み得る。別の例では、融合ポリペプチドは、単一の抗原性ペプチドを含み得る。別の例では、融合ポリペプチドは、約１〜１００、１〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００、５〜１５、５〜２０、５〜２５、１５〜２０、１５〜２５、１５〜３０、１５〜３５、２０〜２５、２０〜３５、２０〜４５、３０〜４５、３０〜５５、４０〜５５、４０〜６５、５０〜６５、５０〜７５、６０〜７５、６０〜８５、７０〜８５、７０〜９５、８０〜９５、８０〜１０５、９５〜１０５、５０〜１００、１〜１００、５〜１００、５〜７５、５〜５０、５〜４０、５〜３０、５〜２０、５〜１５、５〜１０、１〜１００、１〜７５、１〜５０、１〜４０、１〜３０、１〜２０、１〜１５、または１〜１０個の抗原性ペプチドの範囲の数の抗原性ペプチドを含み得る。別の例では、融合ポリペプチドは、最大約１００、１０、２０、３０、４０、または５０個の抗原性ペプチドを含み得る。別の例では、融合ポリペプチドは、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００個の抗原性ペプチドを含み得る。別の例では、融合ポリペプチドは、少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、もしくは２５個の抗原性ペプチド、または約５〜５０、１０〜４０、もしくは２０〜３０個の抗原性ペプチドを含み得る。
【０１２８】
加えて、融合ポリペプチドは、同じがん関連タンパク質に由来する任意の数の抗原性ペプチド（すなわち、同じがん関連タンパク質に由来する任意の数の不連続断片）を含み得る。代替的に、融合ポリペプチドは、２つまたはそれよりも多くの異なるがん関連タンパク質に由来する、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のがん関連タンパク質に由来する、任意の数の抗原性ペプチドを含んでもよい。例えば、２つまたはそれよりも多くのがん関連タンパク質は、約２〜３０、約２〜２５、約２〜２０、約２〜１５、または約２〜１０個のがん関連タンパク質であり得る。例えば、融合ポリペプチドは、同じがん関連タンパク質に由来する少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、もしくは３０個の抗原性ペプチド、または同じがん関連タンパク質に由来する２〜５０、２〜４５、２〜４０、２〜３５、２〜３０、２〜２５、２〜２０、２〜１５、２〜１０、２〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、もしくは４５〜５０個の抗原性ポリペプチドを含み得る。同様に、融合ポリペプチドは、同じがん関連タンパク質に由来する少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、もしくは３０個の抗原性ペプチド、または２つもしくはそれよりも多くの異なるがん関連タンパク質に由来する２〜５０、２〜４５、２〜４０、２〜３５、２〜３０、２〜２５、２〜２０、２〜１５、２〜１０、２〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、もしくは４５〜５０個の抗原性ポリペプチドを含み得る。加えて、融合ポリペプチドは、同じがん関連タンパク質に由来する任意の数の不連続抗原性ペプチド（すなわち、同じがん関連タンパク質に由来する任意の数の不連続断片）を含み得る。例えば、融合ポリペプチドは、同じがん関連タンパク質に由来する少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、もしくは３０個の不連続抗原性ペプチド、または同じがん関連タンパク質に由来する２〜５０、２〜４５、２〜４０、２〜３５、２〜３０、２〜２５、２〜２０、２〜１５、２〜１０、２〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、もしくは４５〜５０個の不連続抗原性ポリペプチドを含み得る。場合によっては、抗原性ペプチドのうち少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはすべてが、同じがん関連タンパク質に由来する不連続抗原性ペプチドであるか、または、単一のがん関連タンパク質に由来する抗原性ペプチドのうち少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはすべてが、そのがん関連タンパク質に由来する不連続抗原性ペプチドである。
【０１２９】
各抗原性ペプチドが、異なる（すなわち、特有の）反復性がん突然変異を含んでもよい。代替的に、融合ポリペプチドにおける抗原性ペプチドのうちの２つまたはそれよりも多くが、同じ反復性がん突然変異を含んでもよい。例えば、同じ抗原性ポリペプチドの２つまたはそれよりも多くのコピーが、融合ポリペプチドに含まれていてもよい（すなわち、融合ポリペプチドが、同じ抗原性ペプチドの２つまたはそれよりも多くのコピーを含む）。一部の融合ポリペプチドでは、抗原性ペプチドのうち少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が、他の抗原性ペプチドのうちのいずれにも存在しない異なる（すなわち、特有の）反復性がん突然変異を含む。
【０１３０】
場合によっては、抗原性ペプチドのうち少なくとも２つが、同じがん関連タンパク質の重複断片を含み得る。同様に、抗原性ペプチドのうちの少なくとも２つにおける反復性がん突然変異は、同じ対象において天然に共存しない反復性がん突然変異であり得る。例えば、抗原性ペプチドのうちの２つまたはそれよりも多くは、がん関連タンパク質の同じアミノ酸残基（例えば、ＴＰ５３によりコードされるタンパク質におけるＲ２４８Ｌ、Ｒ２４８Ｑ、およびＲ２４８Ｗ）に、異なる反復性がん突然変異を含み得る。
【０１３１】
一部の抗原性ペプチドは、少なくとも２つの異なる反復性がん突然変異、少なくとも３つの異なる反復性がん突然変異、または少なくとも４つの異なる反復性がん突然変異を含み得る。
【０１３２】
反復性がん突然変異の任意の組合せが、融合ポリペプチドに含まれていてよい。反復性がん突然変異のそれぞれが体細胞ミスセンス突然変異であってもよいし、反復性がん突然変異が他の突然変異も含んでいてもよい。例えば、一部の融合ポリペプチドでは、反復性がん突然変異のうち少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が体細胞ミスセンス突然変異である。一例として、抗原性ペプチドは、がん関連タンパク質における、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０個の最もよく見られる反復性がん突然変異のうち、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％を含み得る。例えば、抗原性ペプチドは、がん関連タンパク質における、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０個の最もよく見られる反復性体細胞ミスセンスがん突然変異のうち、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％を含み得る。別の例として、がん関連タンパク質に突然変異を有するがん患者の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％は、融合ポリペプチドにおける抗原性ペプチドの組合せに含まれる、がん関連タンパク質の反復性がん突然変異を有する。例えば、がん関連タンパク質に体細胞ミスセンス突然変異を有するがん患者の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％は、融合ポリペプチドにおける抗原性ペプチドの組合せに含まれる、がん関連タンパク質の反復性がん突然変異を有する。別の例として、抗原性ペプチドは、特定のタイプのがんにおける、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、もしくは４０個の最もよく見られる反復性がん突然変異または最もよく見られる反復性体細胞ミスセンスがん突然変異のうち、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％を含み得る。別の例として、特定のタイプのがんを有するがん患者の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％は、融合ポリペプチドにおける（または２つもしくはそれよりも多くの融合ポリペプチドの組合せにおける）抗原性ペプチドの組合せに含まれる反復性がん突然変異を有する。例えば、特定のタイプのがんを有するがん患者の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％は、融合ポリペプチドにおける（または２つもしくはそれよりも多くの融合ポリペプチドの組合せにおける）抗原性ペプチドの組合せに含まれる反復性がん突然変異を有する。特定の例では、抗原性ペプチドは、同じタイプのがんに由来する、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、もしくは６０個の異なる反復性がん突然変異もしくは異なる反復性体細胞ミスセンス突然変異を含むか、または抗原性ペプチドは、単一のタイプのがんに由来する、２〜８０、１０〜６０、１０〜５０、１０〜４０、もしくは１０〜３０個の異なる反復性がん突然変異もしくは異なる反復性体細胞ミスセンス突然変異を含む。例えば、単一のタイプのがんは、非小細胞肺がん、前立腺がん、膵臓がん、膀胱がん、乳がん（例えばＥＲ＋乳がん）、子宮がん、卵巣がん、低悪性度神経膠腫、結腸直腸がん（例えばＭＳＳ結腸直腸がん）、または頭頸部がんであり得る。
【０１３３】
融合ポリペプチドにおける抗原性ペプチドのそれぞれが、同じがん関連タンパク質に由来する反復性がん突然変異を含んでもよいし、融合ポリペプチドにおける抗原性ペプチドの組合せが、２つまたはそれよりも多くのがん関連タンパク質に由来する反復性がん突然変異を含んでもよい。例えば、融合ポリペプチドは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０個のがん関連タンパク質、または２〜５、５〜１０、１０〜１５、もしくは１５〜２０個のがん関連タンパク質に由来する反復性がん突然変異を含み得る。例えば、２つまたはそれよりも多くのがん関連タンパク質は、約２〜３０、約２〜２５、約２〜２０、約２〜１５、または約２〜１０個のがん関連タンパク質であり得る。一例において、抗原性ペプチドのうち少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％は、同じがん関連タンパク質に由来する反復性がん突然変異を含む。別の例では、抗原性ペプチドのいずれも、同じがん関連タンパク質に由来する反復性がん突然変異を含まない。
【０１３４】
抗原性ペプチドの例示的な配列は、本明細書の他所に開示されている。例として、抗原性ペプチドは、本明細書において開示される抗原性ペプチド配列のうちのいずれかと少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一な配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなることができる。
【０１３５】
Ｂ．がん関連タンパク質および反復性がん突然変異
本明細書において開示される融合ポリペプチドは、がん関連タンパク質に由来する反復性がん突然変異を含む抗原性ペプチドを含む。本明細書において開示される反復性がん突然変異の任意の組合せが、融合ポリペプチドに含まれていてよい。「がん関連タンパク質」という用語には、複数のタイプのがんにおいて生じる突然変異、特定のタイプのがんを有する複数の対象において生じる突然変異、または１つもしくは複数のタイプのがんの発生もしくは進行に相関する突然変異を有するタンパク質が含まれる。例えば、がん関連タンパク質は、発癌性タンパク質（すなわち、がんの進行に寄与し得る活性をもつタンパク質、例えば細胞成長を調節するタンパク質）であってもよいし、腫瘍抑制タンパク質（すなわち、典型的には、例えば細胞周期の負の調節またはアポトーシスの促進により、がん形成の可能性を軽減するように作用するタンパク質）であってもよい。好ましくは、がん関連タンパク質は、「突然変異ホットスポット」を有する。突然変異ホットスポットとは、選択の非存在下で予想されるよりも高頻度で突然変異する（好ましくは、転座、増幅、および欠失などの他の体細胞異常ではなく体細胞置換による）、タンパク質コード遺伝子におけるアミノ酸位置である。このようなホットスポット突然変異は、複数のタイプのがんで生じる場合があり、かつ／または複数のがん患者に共通する場合がある。突然変異ホットスポットは、腫瘍試料の集団全体にかかる選択圧を示す。腫瘍ゲノムは、変更されると腫瘍細胞に選択的成長の利点を与える遺伝子（すなわち、腫瘍ドライバー遺伝子）に影響を与えることによって腫瘍発生を「推進する」反復性がん突然変異を含む。そのような腫瘍ドライバー遺伝子は、例えば、バックグラウンド突然変異率（すなわち、再発率）から予想されるよりも高頻度で突然変異する遺伝子を同定すること；腫瘍試料間で正の選択の他のシグナル（例えば、サイレント突然変異と比較して高い率の非サイレント突然変異、または機能的突然変異の蓄積に対するバイアス）を呈する遺伝子を同定すること；不活性化突然変異はタンパク質の配列に沿って分布しているが、機能獲得型突然変異は特定の残基もしくはドメインにおいて特異的に生じる傾向があるという知識に基づいて、タンパク質配列のある特定の領域において突然変異を持続させる傾向を利用すること；またはリン酸化部位などの特定の機能的残基における突然変異の過剰提示を利用することにより、同定することができる。これらの突然変異の多くは、生物学的に活性なタンパク質の機能的領域（例えば、キナーゼドメインまたは結合ドメイン）において高頻度で生じるか、もしくは活性部位（例えば、リン酸化部位）を妨害し、結果として機能喪失型もしくは機能獲得型の突然変異をもたらす、または、これらの突然変異の多くは、正常な機能を妨げるほど十分にタンパク質の三次元構造および／もしくは電荷バランスが乱れるようなかたちで生じる場合がある。多数の腫瘍のゲノム解析によって、突然変異は、多くの場合、限られた数のアミノ酸位置において生じることが明らかになっている。したがって、よく見られる突然変異の大部分は、比較的少数の潜在的な腫瘍関連抗原またはＴ細胞エピトープによって表され得る。
【０１３６】
例えば、がん関連タンパク質は、次のうちのいずれか１つであり得る。
【表１２６−１】
2020513737.tif 000005
【表１２６−２】
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【表１２６−３】
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【表１２６−４】
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【表１２６−５】
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【０１３７】
複数のがんまたは複数のがん患者において生じるよく見られる突然変異を有する他の腫瘍ドライバー遺伝子およびがん関連タンパク質も公知であり、複数の腫瘍試料および複数の腫瘍型間の配列決定データが存在する。例えば、それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれているChangら（２０１６年）、Nat  Biotechnol、３４巻（２号）：１５５〜１６３頁、Tamboreroら（２０１３年）、Sci  Rep、３巻：２６５０頁を参照されたい。
【０１３８】
一連の具体例として、がん関連タンパク質は、次の遺伝子：ＢＲＡＦ、ＥＧＦＲ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＴＥＮ、ＲＡＳ（例えば、ＫＲＡＳ）、ＴＰ５３、ＡＰＣ、ＦＢＸＷ７、ＫＥＡＰ１、ＳＴＫ１１、ＮＦ１、ＫＭＴ２Ｄ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＮＦＥ２Ｌ２、ＳＰＯＰ、ＧＡＴＡ３、ＡＫＴ１、ＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４のうちの１つによってコードされ得る。一連の具体例として、がん関連タンパク質は、次の遺伝子：ＢＲＡＦ、ＥＧＦＲ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＴＥＮ、ＲＡＳ（例えば、ＫＲＡＳ）、ＴＰ５３、ＡＰＣ、ＦＢＸＷ７、ＫＥＡＰ１、ＳＴＫ１１、ＮＦ１、ＫＭＴ２Ｄ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＮＦＥ２Ｌ２、ＳＰＯＰ、ＧＡＴＡ３、ＡＫＴ１、ＭＡＰ３Ｋ１、ＭＡＰ２Ｋ４、ＡＨＮＡＫ２、ＡＮＫＲＤ３６Ｃ、ＣＨＥＫ２、ＫＲＴＡＰ４−１１、ＲＧＰＤ８、ＦＡＭ４７ＣおよびＺＡＮのうちの１つによってコードされ得る。別の一連の具体例として、がん関連タンパク質は、次の遺伝子：ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＤＡＭ２８、ＡＫＴ１、ＡＮＫＲＤ３６Ｃ、ＡＲ、ＡＲＩＤ１Ａ、ＢＭＰＲ２、ＢＲＡＦ、ＣＨＥＫ２、Ｃ１２ｏｒｆ４、ＣＴＮＮＢ１、ＤＯＣＫ３、ＥＧＦＲ、ＥＳＲ１、ＦＢＸＷ７、ＦＧＦＲ３、ＦＨＯＤ３、ＧＮＡＳ、ＨＲＡＳ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＫＩＡＡ２０２６、ＫＲＡＳ、ＫＲＴＡＰ１−５、ＫＲＴＡＰ４−１１、ＬＡＲＰ４Ｂ、ＭＢＯＡＴ２、ＮＦＥ２Ｌ２、ＰＧＭ５、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＬＥＫＨＡ６、ＰＯＬＥ、ＰＴＥＮ、ＲＧＰＤ８、ＲＮＦ４３、ＲＸＲＡ、ＳＭＡＤ４、ＳＰＯＰ、ＳＶＩＬ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＰ５３、ＴＲＩＭ４８、ＵＢＲ５、Ｕ２ＡＦ１、ＷＮＴ１６、ＸＹＬＴ２、ＺＢＴＢ２０およびＺＮＦ８１４のうちの１つによってコードされ得る。
【０１３９】
本明細書において開示される融合ポリペプチドは、がん関連タンパク質の任意の組合せ（すなわち、１つまたは複数のがん関連タンパク質）に由来し、かつ任意の順序における、反復性がん突然変異の任意の組合せを含む抗原性ペプチドを含み得る。抗原性ペプチドまたは融合ポリペプチドの組合せは親水性であってもよく、すなわち、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓまたは別の目的の細菌における分泌可能性を予測し得る、ある特定のハイドロパシー閾値以下またはそれ未満のスコアを有し得る。
【０１４０】
一例として、がん関連タンパク質は、ＢＲＡＦによってコードされてもよく、抗原性ペプチドは、次の反復性がん突然変異：Ｇ４６６Ｅ、Ｇ４６６Ｖ、Ｇ４６９Ａ、Ｇ４６９Ｒ、Ｇ４６９Ｓ、Ｇ４６９Ｖ、Ｖ６００Ｅ、およびＶ６００Ｋのうちの２個もしくはそれよりも多く、３個もしくはそれよりも多く、４個もしくはそれよりも多く、５個もしくはそれよりも多く、６個もしくはそれよりも多く、７個もしくはそれよりも多く、またはすべてを含む。野生型ＢＲＡＦ参照配列は、配列番号３６１に示されている。突然変異は、任意の順序であってよい。例えば、融合ポリペプチドは、Ｎ末端側からＣ末端側に、次のＢＲＡＦ突然変異：Ｇ４６９Ｖ、Ｇ４６９Ｒ、Ｖ６００Ｅ、Ｇ４６９Ｓ、Ｇ４６６Ｖ、Ｖ６００Ｋ、Ｇ４６９Ａ、およびＧ４６６Ｅを含む抗原性ペプチドを含み得る。例えば、配列番号１〜６を参照されたい。代替的に、融合ポリペプチドは、Ｎ末端側からＣ末端側に、次のＢＲＡＦ突然変異：Ｖ６００Ｋ、Ｇ４６９Ｒ、Ｇ４６９Ｖ、Ｇ４６６Ｖ、Ｇ４６６Ｅ、Ｖ６００Ｅ、Ｇ４６９Ａ、およびＧ４６９Ｓを含む抗原性ペプチドを含んでもよい。例えば、配列番号７〜１２を参照されたい。代替的に、融合ポリペプチドは、Ｎ末端側からＣ末端側に、次のＢＲＡＦ突然変異：Ｇ４６９Ｖ、Ｖ６００Ｋ、Ｇ４６９Ｓ、Ｇ４６６Ｖ、Ｇ４６９Ａ、Ｖ６００Ｅ、Ｇ４６６Ｅ、およびＧ４６９Ｒを含む抗原性ペプチドを含んでもよい。例えば、配列番号１３〜１８を参照されたい。代替的に、融合ポリペプチドは、Ｎ末端側からＣ末端側に、次のＢＲＡＦ突然変異：Ｖ６００Ｅ、Ｖ６００Ｋ、Ｇ４６９Ａ、Ｇ４６９Ｓ、Ｇ４６９Ｒ、Ｇ４６９Ｖ、Ｇ４６６Ｖ、およびＧ４６６Ｅを含む抗原性ペプチドを含んでもよい。例えば、配列番号１９〜２４を参照されたい。具体例において、ＢＲＡＦ抗原性ペプチドは、反復性がん突然変異の各側に隣接する天然に存在する１０個のアミノ酸をそれぞれが含む２１ｍｅｒ（例えば、直接ひとつに融合した２１ｍｅｒ）であり得る。
【０１４１】
別の例として、がん関連タンパク質は、ＥＧＦＲによってコードされてもよく、抗原性ペプチドは、次の反復性がん突然変異：Ｒ１０８Ｋ、Ａ２８９Ｖ、Ｇ５９８Ｖ、Ｅ７０９Ａ、Ｅ７０９Ｋ、Ｇ７１９Ａ、Ｇ７１９Ｃ、Ｇ７１９Ｓ、Ｌ７４７Ｐ、Ｌ７４７Ｓ、Ｓ７６８Ｉ、Ｔ７９０Ｍ、Ｌ８３３Ｖ／Ｈ８３５Ｌ、Ｔ８３３Ｖ、Ｌ８５８Ｒ、およびＬ８６１Ｑのうちの２個もしくはそれよりも多く、３個もしくはそれよりも多く、４個もしくはそれよりも多く、５個もしくはそれよりも多く、６個もしくはそれよりも多く、７個もしくはそれよりも多く、８個もしくはそれよりも多く、９個もしくはそれよりも多く、１０個もしくはそれよりも多く、１１個もしくはそれよりも多く、１２個もしくはそれよりも多く、１３個もしくはそれよりも多く、１４個もしくはそれよりも多く、１５個もしくはそれよりも多く、またはすべてを含む。野生型ＥＧＦＲ参照配列は、配列番号３６２に示されている。例えば、抗原性ペプチドは、次の反復性がん突然変異：Ｒ１０８Ｋ、Ａ２８９Ｖ、Ｇ５９８Ｖ、Ｅ７０９Ａ、Ｅ７０９Ｋ、Ｇ７１９Ａ、Ｇ７１９Ｃ、Ｇ７１９Ｓ、Ｌ７４７Ｐ、Ｌ７４７Ｓ、Ｓ７６８Ｉ、Ｔ７９０Ｍ、Ｌ８３３Ｖ／Ｈ８３５Ｌ、Ｔ８３３Ｖ、Ｌ８５８Ｒ、およびＬ８６１Ｑのうちの２個もしくはそれよりも多く、３個もしくはそれよりも多く、４個もしくはそれよりも多く、５個もしくはそれよりも多く、６個もしくはそれよりも多く、７個もしくはそれよりも多く、８個もしくはそれよりも多く、９個もしくはそれよりも多く、１０個もしくはそれよりも多く、１１個もしくはそれよりも多く、１２個もしくはそれよりも多く、１３個もしくはそれよりも多く、１４個もしくはそれよりも多く、１５個もしくはそれよりも多く、またはすべてを含む。代替的に、抗原性ペプチドは、次の反復性がん突然変異：Ａ２８９Ｖ、Ｇ５９８Ｖ、Ｅ７０９Ｋ、Ｇ７１９Ａ、Ｇ７１９Ｃ、Ｇ７１９Ｓ、Ｓ７６８Ｉ、Ｔ７９０Ｍ、Ｌ８３３Ｖ／Ｈ８３５Ｌ、Ｌ８５８Ｒ、およびＬ８６１Ｑのうちの２個もしくはそれよりも多く、３個もしくはそれよりも多く、４個もしくはそれよりも多く、５個もしくはそれよりも多く、６個もしくはそれよりも多く、７個もしくはそれよりも多く、８個もしくはそれよりも多く、９個もしくはそれよりも多く、１０個もしくはそれよりも多く、またはすべてを含む。突然変異は、任意の順序であってよい。例えば、融合ポリペプチドは、Ｎ末端側からＣ末端側に、次のＥＧＦＲ突然変異：Ｇ７１９Ｓ、Ｌ７４７Ｐ、Ｇ７１９Ｃ、Ｒ１０８Ｋ、Ｓ７６８Ｉ、Ｌ８３３Ｖ／Ｈ８３５Ｌ、Ｔ８３３Ｖ、Ｅ７０９Ａ、Ｇ５９８Ｖ、Ｔ７９０Ｍ、Ｅ７０９Ｋ、Ａ２８９Ｖ、Ｌ８６１Ｑ、Ｇ７１９Ａ、Ｌ７４７Ｓ、およびＬ８５８Ｒを含む抗原性ペプチドを含み得る。例えば、配列番号２５〜３０を参照されたい。代替的に、融合ポリペプチドは、Ｎ末端側からＣ末端側に、次のＥＧＦＲ突然変異：Ｔ７９０Ｍ、Ｓ７６８Ｉ、Ｇ７１９Ｃ、Ｒ１０８Ｋ、Ｌ７４７Ｐ、Ｇ７１９Ａ、Ｌ７４７Ｓ、Ｅ７０９Ｋ、Ｔ８３３Ｖ、Ｌ８６１Ｑ、Ｅ７０９Ａ、Ｌ８５８Ｒ、Ｇ５９８Ｖ、Ａ２８９Ｖ、Ｌ８３３Ｖ／Ｈ８３５Ｌ、およびＧ７１９Ｓを含む抗原性ペプチドを含んでもよい。例えば、配列番号３１〜３６を参照されたい。代替的に、融合ポリペプチドは、Ｎ末端側からＣ末端側に、次のＥＧＦＲ突然変異：Ｒ１０８Ｋ、Ｔ８３３Ｖ、Ｌ７４７Ｓ、Ｔ７９０Ｍ、Ｇ７１９Ｃ、Ａ２８９Ｖ、Ｌ８５８Ｒ、Ｅ７０９Ａ、Ｇ７１９Ｓ、Ｅ７０９Ｋ、Ｇ７１９Ａ、Ｌ７４７Ｐ、Ｇ５９８Ｖ、Ｌ８６１Ｑ、Ｓ７６８Ｉ、およびＬ８３３Ｖ／Ｈ８３５Ｌを含む抗原性ペプチドを含んでもよい。例えば、配列番号３７〜４２を参照されたい。代替的に、融合ポリペプチドは、Ｎ末端側からＣ末端側に、次のＥＧＦＲ突然変異：Ｇ７１９Ａ、Ｌ８５８Ｒ、Ｇ７１９Ｃ、Ａ２８９Ｖ、Ｔ７９０Ｍ、Ｓ７６８Ｉ、Ｔ８３３Ｖ、Ｇ５９８Ｖ、Ｇ７１９Ｓ、Ｌ７４７Ｓ、Ｌ７４７Ｐ、Ｌ８３３Ｖ／Ｈ８３５Ｌ、Ｅ７０９Ａ、Ｒ１０８Ｋ、Ｌ８６１Ｑ、およびＥ７０９Ｋを含む抗原性ペプチドを含んでもよい。例えば、配列番号４３〜４８を参照されたい。代替的に、融合ポリペプチドは、Ｎ末端側からＣ末端側に、次のＥＧＦＲ突然変異：Ａ２８９Ｖ、Ｇ５９８Ｖ、Ｅ７０９Ｋ、Ｇ７１９Ａ、Ｓ７６８Ｉ、Ｇ７１９Ｓ、Ｌ８６１Ｑ、Ｔ７９０Ｍ、Ｇ７１９Ｃ、Ｌ８３３Ｖ／Ｈ８３５Ｌ、およびＬ８５８Ｒを含む抗原性ペプチドを含んでもよい。例えば、配列番号２２９〜２３５を参照されたい。具体例において、ＥＧＦＲ抗原性ペプチドは、反復性がん突然変異の各側に隣接する天然に存在する１０個のアミノ酸をそれぞれが含む２１ｍｅｒ（例えば、直接ひとつに融合した２１ｍｅｒ）であり得る。
【０１４２】
別の例として、がん関連タンパク質は、ＰＩＫ３ＣＡによってコードされてもよく、抗原性ペプチドは、次の反復性がん突然変異：Ｒ３８Ｃ；Ｒ３８Ｈ；Ｅ８１Ｋ；Ｒ８８Ｑ；Ｒ９３Ｑ；Ｒ９３Ｗ；Ｒ１０８Ｈ；Ｇ１１８Ｄ；Ｌ３３４Ｇ；Ｎ３４５Ｋ；Ｃ４２０Ｒ；Ｅ４５３Ｋ；Ｅ５４２Ｋ；Ｅ５４５Ａ；Ｅ５４５Ｇ；Ｅ５４５Ｋ；Ｅ５４５Ｑ；Ｑ５４６Ｋ；Ｑ５４６Ｒ；Ｅ７２６Ｋ；Ｍ１０４３Ｉ；Ｍ１０４３Ｖ；Ｈ１０４７Ｌ；Ｈ１０４７ＲおよびＧ１０４９Ｒのうちの２個もしくはそれよりも多く、３個もしくはそれよりも多く、４個もしくはそれよりも多く、５個もしくはそれよりも多く、６個もしくはそれよりも多く、７個もしくはそれよりも多く、８個もしくはそれよりも多く、９個もしくはそれよりも多く、１０個もしくはそれよりも多く、１１個もしくはそれよりも多く、１２個もしくはそれよりも多く、１３個もしくはそれよりも多く、１４個もしくはそれよりも多く、１５個もしくはそれよりも多く、１６個もしくはそれよりも多く、１７個もしくはそれよりも多く、１８個もしくはそれよりも多く、１９個もしくはそれよりも多く、２０個もしくはそれよりも多く、２１個もしくはそれよりも多く、２２個もしくはそれよりも多く、２３個もしくはそれよりも多く、２４個もしくはそれよりも多く、またはすべてを含む。野生型ＰＩＫ３ＣＡ参照配列は、配列番号３６３に示されている。例えば、抗原性ペプチドは、次の反復性がん突然変異：Ｒ３８Ｈ；Ｅ８１Ｋ；Ｒ８８Ｑ；Ｒ１０８Ｈ；Ｇ１１８Ｄ；Ｎ３４５Ｋ；Ｃ４２０Ｒ；Ｅ５４２Ｋ；Ｅ５４５Ａ；Ｅ５４５Ｇ；Ｅ５４５Ｋ；Ｑ５４６Ｋ；Ｑ５４６Ｒ；Ｍ１０４３Ｉ；Ｈ１０４７Ｌ；Ｈ１０４７ＲおよびＧ１０４９Ｒのうちの２個もしくはそれよりも多く、３個もしくはそれよりも多く、４個もしくはそれよりも多く、５個もしくはそれよりも多く、６個もしくはそれよりも多く、７個もしくはそれよりも多く、８個もしくはそれよりも多く、９個もしくはそれよりも多く、１０個もしくはそれよりも多く、１１個もしくはそれよりも多く、１２個もしくはそれよりも多く、１３個もしくはそれよりも多く、１４個もしくはそれよりも多く、１５個もしくはそれよりも多く、１６個もしくはそれよりも多く、またはすべてを含む。代替的に、抗原性ペプチドは、次の反復性がん突然変異：Ｒ８８Ｑ、Ｅ５４２Ｋ、Ｅ５４５Ａ、Ｅ５４５Ｇ、Ｅ５４５Ｋ、Ｑ５４６Ｋ、Ｈ１０４７Ｌ、およびＨ１０４７のうちの２個もしくはそれよりも多く、３個もしくはそれよりも多く、４個もしくはそれよりも多く、５個もしくはそれよりも多く、６個もしくはそれよりも多く、７個もしくはそれよりも多く、またはすべてを含む。代替的に、抗原性ペプチドは、次の反復性がん突然変異：Ｒ３８Ｈ、Ｅ８１Ｋ、Ｒ１０８Ｈ、Ｇ１１８Ｄ、Ｎ３４５Ｋ、Ｃ４２０Ｒ、Ｑ５４６Ｒ、Ｍ１０４３Ｉ、およびＧ１０４９Ｒのうちの２個もしくはそれよりも多く、３個もしくはそれよりも多く、４個もしくはそれよりも多く、５個もしくはそれよりも多く、６個もしくはそれよりも多く、７個もしくはそれよりも多く、８個もしくはそれよりも多く、またはすべてを含む。突然変異は、任意の順序であってよい。例えば、融合ポリペプチドは、Ｎ末端側からＣ末端側に、次のＰＩＫ３ＣＡ突然変異：Ｍ１０４３Ｖ；Ｅ５４５Ｇ；Ｅ７２６Ｋ；Ｑ５４６Ｒ；Ｌ３３４Ｇ；Ｇ１０４９Ｒ；Ｍ１０４３Ｉ；Ｑ５４６Ｋ；Ｅ５４２Ｋ；Ｒ９３Ｑ；Ｈ１０４７Ｒ；Ｒ１０８Ｈ；Ｒ９３Ｗ；Ｅ８１Ｋ；Ｒ３８Ｈ；Ｎ３４５Ｋ；Ｒ８８Ｑ；Ｇ１１８Ｄ；Ｅ５４５Ｑ；Ｈ１０４７Ｌ；Ｅ５４５Ａ；Ｅ４５３Ｋ；Ｅ５４５Ｋ；Ｒ３８ＣおよびＣ４２０Ｒを含む抗原性ペプチドを含み得る。例えば、配列番号４９〜５４を参照されたい。代替的に、融合ポリペプチドは、Ｎ末端側からＣ末端側に、次のＰＩＫ３ＣＡ突然変異：Ｅ７２６Ｋ；Ｅ８１Ｋ；Ｍ１０４３Ｖ；Ｅ５４５Ａ；Ｅ５４５Ｋ；Ｒ３８Ｃ；Ｇ１１８Ｄ；Ｒ９３Ｗ；Ｅ５４５Ｇ；Ｅ５４２Ｋ；Ｇ１０４９Ｒ；Ｎ３４５Ｋ；Ｑ５４６Ｋ；Ｅ４５３Ｋ；Ｃ４２０Ｒ；Ｈ１０４７Ｌ；Ｌ３３４Ｇ；Ｅ５４５Ｑ；Ｒ８８Ｑ；Ｈ１０４７Ｒ；Ｍ１０４３Ｉ；Ｒ９３Ｑ；Ｒ１０８Ｈ；Ｑ５４６ＲおよびＲ３８Ｈを含む抗原性ペプチドを含んでもよい。例えば、配列番号５５〜６０を参照されたい。代替的に、融合ポリペプチドは、Ｎ末端側からＣ末端側に、次のＰＩＫ３ＣＡ突然変異：Ｒ１０８Ｈ；Ｍ１０４３Ｖ；Ｒ８８Ｑ；Ｒ９３Ｗ；Ｒ３８Ｈ；Ｈ１０４７Ｒ；Ｅ５４５Ｋ；Ｍ１０４３Ｉ；Ｑ５４６Ｒ；Ｅ５４２Ｋ；Ｎ３４５Ｋ；Ｒ３８Ｃ；Ｅ５４５Ｇ；Ｅ８１Ｋ；Ｑ５４６Ｋ；Ｒ９３Ｑ；Ｅ４５３Ｋ；Ｇ１０４９Ｒ；Ｅ５４５Ａ；Ｃ４２０Ｒ；Ｈ１０４７Ｌ；Ｌ３３４Ｇ；Ｇ１１８Ｄ；Ｅ７２６ＫおよびＥ５４５Ｑを含む抗原性ペプチドを含んでもよい。例えば、配列番号６１〜６６を参照されたい。代替的に、融合ポリペプチドは、Ｎ末端側からＣ末端側に、次のＰＩＫ３ＣＡ突然変異：Ｎ３４５Ｋ；Ｒ３８Ｈ；Ｅ５４５Ｋ；Ｇ１０４９Ｒ；Ｈ１０４７Ｌ；Ｅ７２６Ｋ；Ｒ８８Ｑ；Ｅ８１Ｋ；Ｒ９３Ｑ；Ｅ５４５Ｑ；Ｌ３３４Ｇ；Ｒ３８Ｃ；Ｈ１０４７Ｒ；Ｃ４２０Ｒ；Ｒ９３Ｗ；Ｑ５４６Ｋ；Ｍ１０４３Ｖ；Ｍ１０４３Ｉ；Ｅ５４５Ｇ；Ｅ５４５Ａ；Ｇ１１８Ｄ；Ｅ４５３Ｋ；Ｑ５４６Ｒ；Ｒ１０８ＨおよびＥ５４２Ｋを含む抗原性ペプチドを含んでもよい。例えば、配列番号６７〜７２を参照されたい。代替的に、融合ポリペプチドは、Ｎ末端側からＣ末端側に、次のＰＩＫ３ＣＡ突然変異：Ｅ５４２Ｋ；Ｅ５４５Ｋ；Ｒ８８Ｑ；Ｅ５４５Ａ；Ｈ１０４７Ｒ；Ｅ５４５Ｇ；Ｈ１０４７Ｌ；Ｑ５４６Ｋ；Ｒ３８Ｈ；Ｅ８１Ｋ；Ｒ１０８Ｈ；Ｎ３４５Ｋ；Ｃ４２０Ｒ；Ｑ５４６Ｒ；Ｍ１０４３Ｉ；Ｇ１１８ＤおよびＧ１０４９Ｒを含む抗原性ペプチドを含んでもよい。例えば、配列番号２３６〜２４２を参照されたい。代替的に、融合ポリペプチドは、Ｎ末端側からＣ末端側に、次のＰＩＫ３ＣＡ突然変異：Ｅ５４２Ｋ；Ｅ５４５Ｋ；Ｒ８８Ｑ；Ｅ５４５Ａ；Ｈ１０４７Ｒ；Ｅ５４５Ｇ；Ｈ１０４７ＬおよびＱ５４６Ｋを含む抗原性ペプチドを含んでもよい。例えば、配列番号２４３〜２４９を参照されたい。代替的に、融合ポリペプチドは、Ｎ末端側からＣ末端側に、次のＰＩＫ３ＣＡ突然変異：Ｒ３８Ｈ；Ｅ８１Ｋ；Ｒ１０８Ｈ；Ｎ３４５Ｋ；Ｃ４２０Ｒ；Ｑ５４６Ｒ；Ｍ１０４３Ｉ；Ｇ１１８ＤおよびＧ１０４９Ｒを含む抗原性ペプチドを含んでもよい。例えば、配列番号２５０〜２５６を参照されたい。具体例において、ＰＩＫ３ＣＡ抗原性ペプチドは、反復性がん突然変異の各側に隣接する天然に存在する１０個のアミノ酸をそれぞれが含む２１ｍｅｒ（例えば、直接ひとつに融合した２１ｍｅｒ）であり得る。
【０１４３】
別の例として、がん関連タンパク質は、ＰＩＫ３Ｒ１によってコードされてもよく、抗原性ペプチドは、次の反復性がん突然変異：Ｇ３７６Ｒ、Ｎ５６４Ｄ、およびＫ５６７Ｅのうちの２つもしくはそれよりも多くまたはすべてを含む。野生型ＰＩＫ３Ｒ１参照配列は、配列番号３６４に示されている。突然変異は、任意の順序であってよい。例えば、融合ポリペプチドは、Ｎ末端側からＣ末端側に、次のＰＩＫ３Ｒ１突然変異：Ｇ３７６Ｒ、Ｎ５６４Ｄ、およびＫ５６７Ｅを含む抗原性ペプチドを含み得る。例えば、配列番号７３〜７８を参照されたい。代替的に、融合ポリペプチドは、Ｎ末端側からＣ末端側に、次のＰＩＫ３Ｒ１突然変異：Ｎ５６４Ｄ、Ｋ５６７Ｅ、およびＧ３７６Ｒを含む抗原性ペプチドを含んでもよい。例えば、配列番号７９〜８４を参照されたい。具体例において、ＰＩＫ３Ｒ１抗原性ペプチドは、反復性がん突然変異の各側に隣接する天然に存在する１０個のアミノ酸をそれぞれが含む２１ｍｅｒ（例えば、直接ひとつに融合した２１ｍｅｒ）であり得る。
【０１４４】
別の例として、がん関連タンパク質は、ＰＩＫ３ＣＡおよびＰＩＫ３Ｒ１によってコードされてもよく、抗原性ペプチドは、次の反復性がん突然変異：ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ３８Ｃ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ３８Ｈ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ８１Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ８８Ｑ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ９３Ｑ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ９３Ｗ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ１０８Ｈ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｇ１１８Ｄ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｌ３３４Ｇ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｎ３４５Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｃ４２０Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ４５３Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４２Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ａ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ｇ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ｑ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｑ５４６Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｑ５４６Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ７２６Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｍ１０４３Ｉ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｍ１０４３Ｖ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｈ１０４７Ｌ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｈ１０４７Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｇ１０４９Ｒ；ＰＩＫ３Ｒ１｜Ｇ３７６Ｒ；ＰＩＫ３Ｒ１｜Ｎ５６４ＤおよびＰＩＫ３Ｒ１｜Ｋ５６７Ｅのうちの２個もしくはそれよりも多く、３個もしくはそれよりも多く、４個もしくはそれよりも多く、５個もしくはそれよりも多く、６個もしくはそれよりも多く、７個もしくはそれよりも多く、８個もしくはそれよりも多く、９個もしくはそれよりも多く、１０個もしくはそれよりも多く、１１個もしくはそれよりも多く、１２個もしくはそれよりも多く、１３個もしくはそれよりも多く、１４個もしくはそれよりも多く、１５個もしくはそれよりも多く、１６個もしくはそれよりも多く、１７個もしくはそれよりも多く、１８個もしくはそれよりも多く、１９個もしくはそれよりも多く、２０個もしくはそれよりも多く、２１個もしくはそれよりも多く、２２個もしくはそれよりも多く、２３個もしくはそれよりも多く、２４個もしくはそれよりも多く、２５個もしくはそれよりも多く、２６個もしくはそれよりも多く、２７個もしくはそれよりも多く、またはすべてを含む。突然変異は、任意の順序であってよい。例えば、融合ポリペプチドは、Ｎ末端側からＣ末端側に、次のＰＩＫ３ＣＡ突然変異およびＰＩＫ３Ｒ１突然変異：ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ３８Ｃ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｎ３４５Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ７２６Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ４５３Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ９３Ｑ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｈ１０４７Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ａ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｍ１０４３Ｖ；ＰＩＫ３Ｒ１｜Ｎ５６４Ｄ；ＰＩＫ３Ｒ１｜Ｋ５６７Ｅ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ８１Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ１０８Ｈ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｑ５４６Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｑ５４６Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ｑ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｇ１０４９Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｃ４２０Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｈ１０４７Ｌ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ９３Ｗ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ８８Ｑ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｍ１０４３Ｉ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ｇ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｇ１１８Ｄ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ３８Ｈ；ＰＩＫ３Ｒ１｜Ｇ３７６Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４２Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５ＫおよびＰＩＫ３ＣＡ｜Ｌ３３４Ｇを含む抗原性ペプチドを含み得る。例えば、配列番号８５〜９０を参照されたい。代替的に、融合ポリペプチドは、Ｎ末端側からＣ末端側に、次のＰＩＫ３ＣＡ突然変異およびＰＩＫ３Ｒ１突然変異：ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ３８Ｃ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ１０８Ｈ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｃ４２０Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ９３Ｑ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ４５３Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｍ１０４３Ｖ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｈ１０４７Ｌ；ＰＩＫ３Ｒ１｜Ｎ５６４Ｄ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ７２６Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｇ１１８Ｄ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｑ５４６Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｑ５４６Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４２Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｇ１０４９Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｍ１０４３Ｉ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｌ３３４Ｇ；ＰＩＫ３Ｒ１｜Ｋ５６７Ｅ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ３８Ｈ；ＰＩＫ３Ｒ１｜Ｇ３７６Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ９３Ｗ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｈ１０４７Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ｇ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ８１Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ８８Ｑ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｎ３４５Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５ＡおよびＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ｑを含む抗原性ペプチドを含んでもよい。例えば、配列番号９１〜９６を参照されたい。代替的に、融合ポリペプチドは、Ｎ末端側からＣ末端側に、次のＰＩＫ３ＣＡ突然変異およびＰＩＫ３Ｒ１突然変異：ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ１０８Ｈ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｍ１０４３Ｖ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ８８Ｑ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ９３Ｗ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ３８Ｈ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｈ１０４７Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｍ１０４３Ｉ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｑ５４６Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４２Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｎ３４５Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ３８Ｃ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ｇ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ８１Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｑ５４６Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ９３Ｑ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ４５３Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｇ１０４９Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ａ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｃ４２０Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｈ１０４７Ｌ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｌ３３４Ｇ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｇ１１８Ｄ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ７２６ＫおよびＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ｑを含む抗原性ペプチドを含んでもよい。例えば、配列番号９７〜１０２を参照されたい。代替的に、融合ポリペプチドは、Ｎ末端側からＣ末端側に、次のＰＩＫ３ＣＡ突然変異およびＰＩＫ３Ｒ１突然変異：ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ｑ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ９３Ｗ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｈ１０４７Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｇ１０４９Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｎ３４５Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｑ５４６Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ４５３Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｌ３３４Ｇ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｈ１０４７Ｌ；ＰＩＫ３Ｒ１｜Ｇ３７６Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｍ１０４３Ｖ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ８８Ｑ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ３８Ｈ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｇ１１８Ｄ；ＰＩＫ３Ｒ１｜Ｋ５６７Ｅ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ３８Ｃ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４２Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｑ５４６Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ７２６Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｃ４２０Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ａ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ９３Ｑ；ＰＩＫ３Ｒ１｜Ｎ５６４Ｄ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ１０８Ｈ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｍ１０４３Ｉ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５ＧおよびＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ８１Ｋを含む抗原性ペプチドを含んでもよい。例えば、配列番号１０３〜１０８を参照されたい。具体例において、ＰＩＫ３ＣＡおよびＰＩＫ３Ｒ１抗原性ペプチドは、反復性がん突然変異の各側に隣接する天然に存在する１０個のアミノ酸をそれぞれが含む２１ｍｅｒ（例えば、直接ひとつに融合した２１ｍｅｒ）であり得る。
【０１４５】
別の例として、がん関連タンパク質は、ＰＴＥＮによってコードされてもよく、抗原性ペプチドは、次の反復性がん突然変異：Ｙ６８Ｈ；Ｙ８８Ｃ；Ｄ９２Ｅ；ｄｅｌ１２１−１３１；Ｒ１３０Ｇ；Ｒ１３０Ｌ；Ｒ１３０Ｐ；Ｒ１３０Ｑ；Ｃ１３６Ｙ；Ｒ１４２Ｗ；Ｙ１５５Ｃ；Ｒ１７３ＨおよびＰ２４６Ｌのうちの２個もしくはそれよりも多く、３個もしくはそれよりも多く、４個もしくはそれよりも多く、５個もしくはそれよりも多く、６個もしくはそれよりも多く、７個もしくはそれよりも多く、８個もしくはそれよりも多く、９個もしくはそれよりも多く、１０個もしくはそれよりも多く、１１個もしくはそれよりも多く、１２個もしくはそれよりも多く、またはすべてを含む。野生型ＰＴＥＮ参照配列は、配列番号３６５に示されている。突然変異は、任意の順序であってよい。例えば、融合ポリペプチドは、Ｎ末端側からＣ末端側に、次のＰＴＥＮ突然変異：ｄｅｌ１２１−１３１；Ｙ８８Ｃ；Ｒ１３０Ｇ；Ｙ１５５Ｃ；Ｄ９２Ｅ；Ｃ１３６Ｙ；Ｒ１３０Ｑ；Ｙ６８Ｈ；Ｒ１４２Ｗ；Ｒ１７３Ｈ；Ｒ１３０Ｌ；Ｒ１３０ＰおよびＰ２４６Ｌを含む抗原性ペプチドを含み得る。例えば、配列番号１０９〜１１４を参照されたい。代替的に、融合ポリペプチドは、Ｎ末端側からＣ末端側に、次のＰＴＥＮ突然変異：Ｒ１３０Ｐ；Ｒ１３０Ｇ；Ｙ１５５Ｃ；Ｒ１３０Ｌ；Ｃ１３６Ｙ；ｄｅｌ１２１−１３１；Ｐ２４６Ｌ；Ｄ９２Ｅ；Ｒ１７３Ｈ；Ｙ６８Ｈ；Ｒ１３０Ｑ；Ｙ８８ＣおよびＲ１４２Ｗを含む抗原性ペプチドを含んでもよい。例えば、配列番号１１５〜１２０を参照されたい。代替的に、融合ポリペプチドは、Ｎ末端側からＣ末端側に、次のＰＴＥＮ突然変異：Ｒ１３０Ｑ；Ｒ１３０Ｇ；ｄｅｌ１２１−１３１；Ｃ１３６Ｙ；Ｒ１３０Ｌ；Ｐ２４６Ｌ；Ｙ１５５Ｃ；Ｄ９２Ｅ；Ｒ１４２Ｗ；Ｒ１３０Ｐ；Ｙ８８Ｃ；Ｙ６８ＨおよびＲ１７３Ｈを含む抗原性ペプチドを含んでもよい。例えば、配列番号１２１〜１２６を参照されたい。代替的に、融合ポリペプチドは、Ｎ末端側からＣ末端側に、次のＰＴＥＮ突然変異：ｄｅｌ１２１−１３１；Ｃ１３６Ｙ；Ｙ６８Ｈ；Ｒ１４２Ｗ；Ｒ１７３Ｈ；｜Ｒ１３０Ｌ；Ｐ２４６Ｌ；Ｒ１３０Ｇ；Ｒ１３０Ｐ；Ｙ８８Ｃ；Ｄ９２Ｅ；Ｒ１３０ＱおよびＹ１５５Ｃを含む抗原性ペプチドを含んでもよい。例えば、配列番号１２７〜１３２を参照されたい。具体例において、ＰＴＥＮ抗原性ペプチドは、反復性がん突然変異の各側に隣接する天然に存在する１０個のアミノ酸をそれぞれが含む２１ｍｅｒ（例えば、直接ひとつに融合した２１ｍｅｒ）であり得る。
【０１４６】
別の例として、がん関連タンパク質は、ＫＲＡＳによってコードされてもよく、抗原性ペプチドは、次の反復性がん突然変異：Ｇ１２Ａ；Ｇ１２Ｃ；Ｇ１２Ｄ；Ｇ１２Ｒ；Ｇ１２Ｓ；Ｇ１２Ｖ；Ｇ１３Ｃ；Ｇ１３Ｄ；Ｇ１３Ｒ；Ｇ１３Ｓ；Ｇ１３Ｖ；Ｌ１９Ｆ；Ｑ６１Ｋ；Ｑ６１Ｈ；Ｑ６１Ｌ；Ｑ６１Ｒ；Ｋ１１７Ｎ；Ａ１４６Ｔ；Ａ１４６ＶおよびＡ１６４Ｇのうちの２個もしくはそれよりも多く、３個もしくはそれよりも多く、４個もしくはそれよりも多く、５個もしくはそれよりも多く、６個もしくはそれよりも多く、７個もしくはそれよりも多く、８個もしくはそれよりも多く、９個もしくはそれよりも多く、１０個もしくはそれよりも多く、１１個もしくはそれよりも多く、１２個もしくはそれよりも多く、１３個もしくはそれよりも多く、１４個もしくはそれよりも多く、１５個もしくはそれよりも多く、１６個もしくはそれよりも多く、１７個もしくはそれよりも多く、１８個もしくはそれよりも多く、１９個もしくはそれよりも多く、またはすべてを含む。野生型ＫＲＡＳ参照配列は、配列番号３６６に示されている。突然変異は、任意の順序であってよい。例えば、融合ポリペプチドは、Ｎ末端側からＣ末端側に、次のＫＲＡＳ突然変異：Ｑ６１Ｒ；Ｑ６１Ｋ；Ｑ６１Ｌ；Ｑ６１Ｈ；Ｌ１９Ｆ；Ｋ１１７Ｎ；Ｇ１２Ａ；Ａ１６４Ｇ；Ｇ１２Ｄ；Ｇ１３Ｄ；Ｇ１３Ｓ；Ｇ１２Ｓ；Ａ１４６Ｖ；Ｇ１３Ｒ；Ｇ１３Ｃ；Ｇ１２Ｃ；Ｇ１２Ｒ；Ｇ１３Ｖ；Ｇ１２ＶおよびＡ１４６Ｔを含む抗原性ペプチドを含み得る。例えば、配列番号１３３〜１３８を参照されたい。代替的に、融合ポリペプチドは、Ｎ末端側からＣ末端側に、次のＫＲＡＳ突然変異：Ｑ６１Ｈ；Ｋ１１７Ｎ；Ｇ１３Ｃ；Ｇ１３Ｒ；Ｇ１２Ｄ；Ｇ１２Ｓ；Ｇ１２Ｖ；Ｇ１２Ａ；Ｑ６１Ｋ；Ｇ１３Ｖ；Ｇ１２Ｃ；Ｌ１９Ｆ；Ｑ６１Ｒ；Ｑ６１Ｌ；Ａ１４６Ｖ；Ａ１６４Ｇ；Ｇ１２Ｒ；Ｇ１３Ｓ；Ａ１４６ＴおよびＧ１３Ｄを含む抗原性ペプチドを含んでもよい。例えば、配列番号１３９〜１４４を参照されたい。代替的に、融合ポリペプチドは、Ｎ末端側からＣ末端側に、次のＫＲＡＳ突然変異：Ｇ１２Ｄ；Ｌ１９Ｆ；Ａ１４６Ｖ；Ｑ６１Ｈ；Ｇ１２Ｖ；Ａ１６４Ｇ；Ｇ１２Ｃ；Ｑ６１Ｌ；Ａ１４６Ｔ；Ｇ１３Ｓ；Ｇ１２Ａ；Ｇ１３Ｖ；Ｇ１３Ｃ；Ｇ１３Ｄ；Ｇ１２Ｒ；Ｇ１２Ｓ；Ｑ６１Ｒ；Ｑ６１Ｋ；Ｇ１３ＲおよびＫ１１７Ｎを含む抗原性ペプチドを含んでもよい。例えば、配列番号１４５〜１５０を参照されたい。代替的に、融合ポリペプチドは、Ｎ末端側からＣ末端側に、次のＫＲＡＳ突然変異：Ｇ１３Ｖ；Ｇ１３Ｓ；Ｇ１２Ｖ；Ｇ１２Ｒ；Ａ１４６Ｖ；Ｇ１３Ｄ；Ｇ１２Ｄ；Ｋ１１７Ｎ；Ｑ６１Ｈ；Ｇ１２Ｃ；Ｇ１３Ｃ；Ａ１４６Ｔ；Ｇ１２Ａ；Ｑ６１Ｌ；Ｑ６１Ｋ；Ａ１６４Ｇ；Ｇ１２Ｓ；Ｌ１９Ｆ；Ｇ１３ＲおよびＱ６１Ｒを含む抗原性ペプチドを含んでもよい。例えば、配列番号１５１〜１５６を参照されたい。具体例において、ＫＲＡＳ抗原性ペプチドは、反復性がん突然変異の各側に隣接する天然に存在する１０個のアミノ酸をそれぞれが含む２１ｍｅｒ（例えば、直接ひとつに融合した２１ｍｅｒ）であり得る。
【０１４７】
別の例として、がん関連タンパク質は、ＴＰ５３によってコードされてもよく、抗原性ペプチドは、次の反復性がん突然変異：Ｙ１０７Ｄ；Ｋ１３２Ｎ；Ｃ１４１Ｙ；Ｖ１４３Ａ；Ｖ１５７Ｆ；Ｙ１６３Ｃ；Ｒ１７５Ｈ；Ｃ１７６Ｆ；Ｃ１７６Ｙ；Ｈ１７９Ｒ；Ｈ１７９Ｗ；Ｈ１９３Ｒ；Ｉ１９５Ｔ；Ｖ２１６Ｍ；Ｙ２２０Ｃ；Ｙ２３４Ｃ；Ｙ２３４Ｈ；Ｓ２４１Ｆ；Ｓ２４２Ｆ；Ｇ２４５Ｄ；Ｇ２４５Ｓ；Ｒ２４８Ｌ；Ｒ２４８Ｑ；Ｒ２４８Ｗ；Ｒ２４９Ｓ；Ｒ２７３Ｃ；Ｒ２７３Ｈ；Ｒ２７３Ｌ；Ｐ２７８Ｌ；Ｐ２７８Ｓ；Ｒ２８２Ｇ；Ｒ２８２ＷおよびＲ３３７Ｈのうちの２個もしくはそれよりも多く、３個もしくはそれよりも多く、４個もしくはそれよりも多く、５個もしくはそれよりも多く、６個もしくはそれよりも多く、７個もしくはそれよりも多く、８個もしくはそれよりも多く、９個もしくはそれよりも多く、１０個もしくはそれよりも多く、１１個もしくはそれよりも多く、１２個もしくはそれよりも多く、１３個もしくはそれよりも多く、１４個もしくはそれよりも多く、１５個もしくはそれよりも多く、１６個もしくはそれよりも多く、１７個もしくはそれよりも多く、１８個もしくはそれよりも多く、１９個もしくはそれよりも多く、２０個もしくはそれよりも多く、２１個もしくはそれよりも多く、２２個もしくはそれよりも多く、２３個もしくはそれよりも多く、２４個もしくはそれよりも多く、２５個もしくはそれよりも多く、２６個もしくはそれよりも多く、２７個もしくはそれよりも多く、２８個もしくはそれよりも多く、２９個もしくはそれよりも多く、３０個もしくはそれよりも多く、３１個もしくはそれよりも多く、３２個もしくはそれよりも多く、またはすべてを含む。野生型ＴＰ５３参照配列は、配列番号３６７に示されている。例えば、抗原性ペプチドは、次の反復性がん突然変異：Ｙ１０７Ｄ；Ｃ１４１Ｙ；Ｖ１４３Ａ；Ｖ１５７Ｆ；Ｙ１６３Ｃ；Ｒ１７５Ｈ；Ｃ１７６Ｆ；Ｈ１９３Ｒ；Ｉ１９５Ｔ；Ｖ２１６Ｍ；Ｙ２２０Ｃ；Ｙ２３４Ｃ；Ｙ２３４Ｈ；Ｇ２４５Ｄ；Ｇ２４５Ｓ；Ｒ２４８Ｑ；Ｒ２４８Ｗ；Ｒ２４９Ｓ；Ｒ２７３Ｃ；Ｒ２７３Ｈ；Ｒ２７３Ｌ；Ｒ２８２ＧおよびＲ２８２Ｗのうちの２個もしくはそれよりも多く、３個もしくはそれよりも多く、４個もしくはそれよりも多く、５個もしくはそれよりも多く、６個もしくはそれよりも多く、７個もしくはそれよりも多く、８個もしくはそれよりも多く、９個もしくはそれよりも多く、１０個もしくはそれよりも多く、１１個もしくはそれよりも多く、１２個もしくはそれよりも多く、１３個もしくはそれよりも多く、１４個もしくはそれよりも多く、１５個もしくはそれよりも多く、１６個もしくはそれよりも多く、１７個もしくはそれよりも多く、１８個もしくはそれよりも多く、１９個もしくはそれよりも多く、２０個もしくはそれよりも多く、２１個もしくはそれよりも多く、２２個もしくはそれよりも多く、またはすべてを含む。代替的に、抗原性ペプチドは、次の反復性がん突然変異：Ｖ１４３Ａ；Ｒ１７５Ｈ；Ｈ１９３Ｒ；Ｙ２２０Ｃ；Ｇ２４５Ｄ；Ｒ２４８Ｑ；Ｒ２４８Ｗ；Ｒ２４９Ｓ；Ｒ２７３Ｃ；Ｒ２７３ＨおよびＲ２８２Ｗのうちの２個もしくはそれよりも多く、３個もしくはそれよりも多く、４個もしくはそれよりも多く、５個もしくはそれよりも多く、６個もしくはそれよりも多く、７個もしくはそれよりも多く、８個もしくはそれよりも多く、９個もしくはそれよりも多く、１０個もしくはそれよりも多く、またはすべてを含む。代替的に、抗原性ペプチドは、次の反復性がん突然変異：Ｙ１０７Ｄ；Ｃ１４１Ｙ；Ｖ１５７Ｆ；Ｙ１６３Ｃ；Ｃ１７６Ｆ；Ｉ１９５Ｔ；Ｖ２１６Ｍ；Ｙ２３４Ｃ；Ｙ２３４Ｈ；Ｇ２４５Ｓ；Ｒ２７３ＬおよびＲ２８２Ｇのうちの２個もしくはそれよりも多く、３個もしくはそれよりも多く、４個もしくはそれよりも多く、５個もしくはそれよりも多く、６個もしくはそれよりも多く、７個もしくはそれよりも多く、８個もしくはそれよりも多く、９個もしくはそれよりも多く、１０個もしくはそれよりも多く、１１個もしくはそれよりも多く、またはすべてを含む。代替的に、抗原性ペプチドは、次の反復性がん突然変異：Ｙ１０７Ｄ；Ｃ１４１Ｙ；Ｖ１４３Ａ；Ｙ１６３Ｃ；Ｃ１７６Ｙ；Ｈ１７９Ｒ；Ｈ１７９Ｗ；Ｈ１９３Ｒ；Ｖ２１６Ｍ；Ｙ２３４Ｈ；Ｓ２４１Ｆ；Ｇ２４５Ｄ；Ｒ２４８Ｑ；Ｒ２４８Ｗ；Ｒ２７３Ｃ；Ｒ２７３ＬおよびＰ２７８Ｓのうちの２個もしくはそれよりも多く、３個もしくはそれよりも多く、４個もしくはそれよりも多く、５個もしくはそれよりも多く、６個もしくはそれよりも多く、７個もしくはそれよりも多く、８個もしくはそれよりも多く、９個もしくはそれよりも多く、１０個もしくはそれよりも多く、１１個もしくはそれよりも多く、１２個もしくはそれよりも多く、１３個もしくはそれよりも多く、１４個もしくはそれよりも多く、１５個もしくはそれよりも多く、１６個もしくはそれよりも多く、またはすべてを含む。代替的に、抗原性ペプチドは、次の反復性がん突然変異：Ｃ１４１Ｙ；Ｒ１７５Ｈ；Ｈ１７９Ｒ；Ｈ１９３Ｒ；Ｖ２１６Ｍ；Ｙ２３４Ｈ；Ｇ２４５Ｄ；Ｇ２４５Ｓ；Ｒ２４８Ｌ；Ｒ２４８Ｗ；Ｒ２７３Ｃ；Ｒ２７３Ｈ；Ｐ２７８Ｌ；Ｐ２７８Ｓ；Ｒ２８２Ｇ；Ｒ２８２ＷおよびＲ３３７Ｈのうちの２個もしくはそれよりも多く、３個もしくはそれよりも多く、４個もしくはそれよりも多く、５個もしくはそれよりも多く、６個もしくはそれよりも多く、７個もしくはそれよりも多く、８個もしくはそれよりも多く、９個もしくはそれよりも多く、１０個もしくはそれよりも多く、１１個もしくはそれよりも多く、１２個もしくはそれよりも多く、１３個もしくはそれよりも多く、１４個もしくはそれよりも多く、１５個もしくはそれよりも多く、１６個もしくはそれよりも多く、またはすべてを含む。代替的に、抗原性ペプチドは、次の反復性がん突然変異：Ｙ１０７Ｄ；Ｃ１４１Ｙ；Ｖ１４３Ａ；Ｃ１７６Ｆ；Ｈ１７９Ｒ；Ｖ２１６Ｍ；Ｙ２２０Ｃ；Ｓ２４１Ｆ；Ｓ２４２Ｆ；Ｇ２４５Ｓ；Ｒ２４８Ｌ；Ｒ２４８Ｗ；Ｒ２７３Ｌ；Ｐ２７８Ｌ；Ｐ２７８Ｓ；Ｒ２８２ＧおよびＲ２８２Ｗのうちの２個もしくはそれよりも多く、３個もしくはそれよりも多く、４個もしくはそれよりも多く、５個もしくはそれよりも多く、６個もしくはそれよりも多く、７個もしくはそれよりも多く、８個もしくはそれよりも多く、９個もしくはそれよりも多く、１０個もしくはそれよりも多く、１１個もしくはそれよりも多く、１２個もしくはそれよりも多く、１３個もしくはそれよりも多く、１４個もしくはそれよりも多く、１５個もしくはそれよりも多く、１６個もしくはそれよりも多く、またはすべてを含む。代替的に、抗原性ペプチドは、次の反復性がん突然変異：Ｙ１０７Ｄ；Ｋ１３２Ｎ；Ｖ１４３Ａ；Ｖ１５７Ｆ；Ｙ１６３Ｃ；Ｒ１７５Ｈ；Ｃ１７６Ｙ；Ｙ２３４Ｃ；Ｙ２３４Ｈ；Ｓ２４１Ｆ；Ｓ２４２Ｆ；Ｇ２４５Ｄ；Ｇ２４５Ｓ；Ｒ２７３Ｃ；Ｐ２７８Ｓ；Ｒ２８２ＷおよびＲ３３７Ｈのうちの２個もしくはそれよりも多く、３個もしくはそれよりも多く、４個もしくはそれよりも多く、５個もしくはそれよりも多く、６個もしくはそれよりも多く、７個もしくはそれよりも多く、８個もしくはそれよりも多く、９個もしくはそれよりも多く、１０個もしくはそれよりも多く、１１個もしくはそれよりも多く、１２個もしくはそれよりも多く、１３個もしくはそれよりも多く、１４個もしくはそれよりも多く、１５個もしくはそれよりも多く、１６個もしくはそれよりも多く、またはすべてを含む。代替的に、抗原性ペプチドは、次の反復性がん突然変異：  Ｋ１３２Ｎ；Ｖ１５７Ｆ；Ｒ１７５Ｈ；Ｃ１７６Ｆ；Ｉ１９５Ｔ；Ｙ２２０Ｃ；Ｙ２３４Ｃ；Ｓ２４２Ｆ；Ｇ２４５Ｓ；Ｒ２４８Ｌ；Ｒ２４９Ｓ；Ｒ２７３Ｈ；Ｐ２７８Ｌ；Ｒ２８２Ｇ；Ｒ２８２ＷおよびＲ３３７Ｈのうちの２個もしくはそれよりも多く、３個もしくはそれよりも多く、４個もしくはそれよりも多く、５個もしくはそれよりも多く、６個もしくはそれよりも多く、７個もしくはそれよりも多く、８個もしくはそれよりも多く、９個もしくはそれよりも多く、１０個もしくはそれよりも多く、１１個もしくはそれよりも多く、１２個もしくはそれよりも多く、１３個もしくはそれよりも多く、１４個もしくはそれよりも多く、１５個もしくはそれよりも多く、またはすべてを含む。  代替的に、抗原性ペプチドは、次の反復性がん突然変異：Ｙ１０７Ｄ；Ｋ１３２Ｎ；Ｖ１４３Ａ；Ｖ１５７Ｆ；Ｙ１６３Ｃ；Ｃ１７６Ｆ；Ｃ１７６Ｙ；Ｈ１７９Ｗ；Ｉ１９５Ｔ；Ｙ２２０Ｃ；Ｙ２３４Ｃ；Ｓ２４１Ｆ；Ｓ２４２Ｆ；Ｒ２４８Ｑ；Ｒ２４９ＳおよびＲ２７３Ｌのうちの２個もしくはそれよりも多く、３個もしくはそれよりも多く、４個もしくはそれよりも多く、５個もしくはそれよりも多く、６個もしくはそれよりも多く、７個もしくはそれよりも多く、８個もしくはそれよりも多く、９個もしくはそれよりも多く、１０個もしくはそれよりも多く、１１個もしくはそれよりも多く、１２個もしくはそれよりも多く、１３個もしくはそれよりも多く、１４個もしくはそれよりも多く、１５個もしくはそれよりも多く、またはすべてを含む。代替的に、抗原性ペプチドは、次の反復性がん突然変異：Ｋ１３２Ｎ；Ｖ１５７Ｆ；Ｙ１６３Ｃ；Ｒ１７５Ｈ；Ｃ１７６Ｙ；Ｈ１７９Ｗ；Ｈ１９３Ｒ；Ｉ１９５Ｔ；Ｙ２３４Ｃ；Ｙ２３４Ｈ；Ｇ２４５Ｄ；Ｒ２４８Ｑ；Ｒ２４９Ｓ；Ｒ２７３Ｃ；Ｒ２７３ＨおよびＲ３３７Ｈのうちの２個もしくはそれよりも多く、３個もしくはそれよりも多く、４個もしくはそれよりも多く、５個もしくはそれよりも多く、６個もしくはそれよりも多く、７個もしくはそれよりも多く、８個もしくはそれよりも多く、９個もしくはそれよりも多く、１０個もしくは��れよりも多く、１１個もしくはそれよりも多く、１２個もしくはそれよりも多く、１３個もしくはそれよりも多く、１４個もしくはそれよりも多く、１５個もしくはそれよりも多く、またはすべてを含む。代替的に、抗原性ペプチドは、次の反復性がん突然変異：Ｃ１４１Ｙ；Ｃ１７６Ｆ；Ｈ１７９Ｒ；Ｈ１７９Ｗ；Ｈ１９３Ｒ；Ｉ１９５Ｔ；Ｖ２１６Ｍ；Ｙ２２０Ｃ；Ｒ２４８Ｌ；Ｒ２４８Ｑ；Ｒ２４８Ｗ；Ｒ２４９Ｓ；Ｒ２７３Ｈ；Ｒ２７３Ｌ；Ｐ２７８ＬおよびＲ２８２Ｇのうちの２個もしくはそれよりも多く、３個もしくはそれよりも多く、４個もしくはそれよりも多く、５個もしくはそれよりも多く、６個もしくはそれよりも多く、７個もしくはそれよりも多く、８個もしくはそれよりも多く、９個もしくはそれよりも多く、１０個もしくはそれよりも多く、１１個もしくはそれよりも多く、１２個もしくはそれよりも多く、１３個もしくはそれよりも多く、１４個もしくはそれよりも多く、１５個もしくはそれよりも多く、またはすべてを含む。突然変異は、任意の順序であってよい。例えば、融合ポリペプチドは、Ｎ末端側からＣ末端側に、次のＴＰ５３突然変異を含む抗原性ペプチドを含み得る：Ｈ１７９Ｗ；Ｒ２７３Ｌ；Ｒ２４９Ｓ；Ｒ２４８Ｑ；Ｙ２３４Ｈ；Ｇ２４５Ｄ；Ｙ２２０Ｃ；Ｒ２４８Ｌ；Ｈ１９３Ｒ；Ｋ１３２Ｎ；Ｓ２４２Ｆ；Ｙ２３４Ｃ；Ｇ２４５Ｓ；Ｃ１７６Ｆ；Ｒ２８２Ｗ；Ｒ２７３Ｈ；Ｒ２８２Ｇ；Ｃ１４１Ｙ；Ｒ２７３Ｃ；Ｖ２１６Ｍ；Ｒ３３７Ｈ；Ｒ２４８Ｗ；Ｖ１４３Ａ；Ｉ１９５Ｔ；Ｐ２７８Ｓ；Ｓ２４１Ｆ；Ｃ１７６Ｙ；Ｙ１０７Ｄ；Ｒ１７５Ｈ；Ｈ１７９Ｒ；Ｖ１５７Ｆ；Ｐ２７８ＬおよびＹ１６３Ｃ。例えば、配列番号１５７〜１６２を参照されたい。代替的に、融合ポリペプチドは、Ｎ末端側からＣ末端側に、次のＴＰ５３突然変異：Ｒ２４８Ｗ；Ｒ２４８Ｌ；Ｙ２２０Ｃ；Ｙ１６３Ｃ；Ｇ２４５Ｄ；Ｙ１０７Ｄ；Ｈ１７９Ｒ；Ｖ２１６Ｍ；Ｐ２７８Ｓ；Ｓ２４１Ｆ；Ｒ２７３Ｌ；Ｐ２７８Ｌ；Ｃ１７６Ｆ；Ｃ１４１Ｙ；Ｓ２４２Ｆ；Ｒ２４９Ｓ；Ｖ１４３Ａ；Ｉ１９５Ｔ；Ｒ２７３Ｈ；Ｒ２７３Ｃ；Ｒ２８２Ｇ；Ｈ１７９Ｗ；Ｒ１７５Ｈ；Ｒ２４８Ｑ；Ｇ２４５Ｓ；Ｈ１９３Ｒ；Ｒ３３７Ｈ；Ｒ２８２Ｗ；Ｙ２３４Ｃ；Ｖ１５７Ｆ；Ｙ２３４Ｈ；Ｃ１７６ＹおよびＫ１３２Ｎを含む抗原性ペプチドを含み得る。例えば、配列番号１６３〜１６６を参照されたい。代替的に、融合ポリペプチドは、Ｎ末端側からＣ末端
側に、次のＴＰ５３突然変異：Ｒ２４８Ｗ；Ｈ１７９Ｒ；Ｒ２７３Ｈ；Ｙ１０７Ｄ；Ｒ３３７Ｈ；Ｒ２８２Ｇ；Ｖ１５７Ｆ；Ｖ１４３Ａ；Ｙ２３４Ｈ；Ｙ２２０Ｃ；Ｒ２８２Ｗ；Ｒ２４８Ｌ；Ｓ２４１Ｆ；Ｈ１７９Ｗ；Ｒ２７３Ｃ；Ｃ１４１Ｙ；Ｒ２４９Ｓ；Ｐ２７８Ｌ；Ｇ２４５Ｓ；Ｉ１９５Ｔ；Ｒ１７５Ｈ；Ｇ２４５Ｄ；Ｒ２７３Ｌ；Ｋ１３２Ｎ；Ｖ２１６Ｍ；Ｙ１６３Ｃ；Ｃ１７６Ｆ；Ｓ２４２Ｆ；Ｙ２３４Ｃ；Ｈ１９３Ｒ；Ｒ２４８Ｑ；Ｐ２７８ＳおよびＣ１７６Ｙを含む抗原性ペプチドを含み得る。例えば、配列番号１６７〜１７４を参照されたい。代替的に、融合ポリペプチドは、Ｎ末端側からＣ末端側に、次のＴＰ５３突然変異：Ｖ１４３Ａ；Ｒ２８２Ｗ；Ｖ１５７Ｆ；Ｈ１７９Ｗ；Ｋ１３２Ｎ；Ｙ１６３Ｃ；Ｃ１７６Ｙ；Ｇ２４５Ｄ；Ｙ２２０Ｃ；Ｓ２４２Ｆ；Ｙ２３４Ｃ；Ｒ２４９Ｓ；Ｈ１７９Ｒ；Ｒ２７３Ｈ；Ｃ１４１Ｙ；Ｒ２７３Ｌ；Ｐ２７８Ｓ；Ｃ１７６Ｆ；Ｒ３３７Ｈ；Ｈ１９３Ｒ；Ｒ２７３Ｃ；Ｒ２８２Ｇ；Ｒ１７５Ｈ；Ｒ２４８Ｗ；Ｐ２７８Ｌ；Ｉ１９５Ｔ；Ｓ２４１Ｆ；Ｒ２４８Ｌ；Ｙ２３４Ｈ；Ｖ２１６Ｍ；Ｇ２４５Ｓ；Ｙ１０７ＤおよびＲ２４８Ｑを含む抗原性ペプチドを含み得る。例えば、配列番号１７５〜１８０を参照されたい。代替的に、融合ポリペプチドは、Ｎ末端側からＣ末端側に、次のＴＰ５３突然変異：Ｓ２４１Ｆ；Ｇ２４５Ｄ；Ｖ１４３Ａ；Ｐ２７８Ｓ；Ｒ２７３Ｃ；Ｃ１７６Ｙ；Ｙ２３４Ｈ；Ｒ２４８Ｗ；Ｖ２１６Ｍ；Ｒ２４８Ｑ；Ｃ１４１Ｙ；Ｙ１６３Ｃ；Ｈ１９３Ｒ；Ｈ１７９Ｒ；Ｈ１７９Ｗ；Ｙ１０７ＤおよびＲ２７３Ｌを含む抗原性ペプチドを含み得る。例えば、配列番号１８１〜１８６を参照されたい。代替的に、融合ポリペプチドは、Ｎ末端側からＣ末端側に、次のＴＰ５３突然変異：Ｋ１３２Ｎ；Ｒ２８２Ｗ；Ｇ２４５Ｓ；Ｙ２３４Ｃ；Ｓ２４２Ｆ；Ｒ１７５Ｈ；Ｙ２２０Ｃ；Ｖ１５７Ｆ；Ｒ２８２Ｇ；Ｃ１７６Ｆ；Ｒ３３７Ｈ；Ｉ１９５Ｔ；Ｒ２４９Ｓ；Ｐ２７８Ｌ；Ｒ２７３ＨおよびＲ２４８Ｌを含む抗原性ペプチドを含み得る。例えば、配列番号１８７〜１９２を参照されたい。代替的に、融合ポリペプチドは、Ｎ末端側からＣ末端側に、次のＴＰ５３突然変異：Ｈ１９３Ｒ；Ｐ２７８Ｌ；Ｒ２７３Ｃ；Ｒ２４８Ｗ；Ｈ１７９Ｒ；Ｐ２７８Ｓ；Ｒ２４８Ｌ；Ｖ２１６Ｍ；Ｒ２８２Ｇ；Ｒ３３７Ｈ；Ｒ１７５Ｈ；Ｙ２３４Ｈ；Ｇ２４５Ｄ；Ｒ２７３Ｈ；Ｇ２４５Ｓ；Ｒ２８２ＷおよびＣ１４１Ｙを含む抗原性ペプチドを含み得る。例えば、配列番号１９３〜１９８を参照されたい。代替的に、融合ポリペプチドは、Ｎ末端側からＣ末端側に、次のＴＰ５３突然変異：Ｙ１０７Ｄ；Ｋ１３２Ｎ；Ｃ１７６Ｆ；Ｃ１７６Ｙ；Ｒ２７３Ｌ；Ｙ２２０Ｃ；Ｒ２４８Ｑ；Ｖ１４３Ａ；Ｉ１９５Ｔ；Ｒ２４９Ｓ；Ｓ２４２Ｆ；Ｙ２３４Ｃ；Ｈ１７９Ｗ；Ｖ１５７Ｆ；Ｙ１６３ＣおよびＳ２４１Ｆを含む抗原性ペプチドを含み得る。例えば、配列番号１９９〜２０４を参照されたい。代替的に、融合ポリペプチドは、Ｎ末端側からＣ末端側に、次のＴＰ５３突然変異：Ｐ２７８Ｓ；Ｃ１７６Ｆ；Ｈ１７９Ｒ；Ｒ２８２Ｇ；Ｓ２４１Ｆ；Ｒ２７３Ｌ；Ｐ２７８Ｌ；Ｃ１４１Ｙ；Ｙ１０７Ｄ；Ｒ２４８Ｗ；Ｖ２１６Ｍ；Ｒ２８２Ｗ；Ｓ２４２Ｆ；Ｙ２２０Ｃ；Ｖ１４３Ａ；Ｇ２４５ＳおよびＲ２４８Ｌを含む抗原性ペプチドを含み得る。例えば、配列番号２０５〜２１０を参照されたい。代替的に、融合ポリペプチドは、Ｎ末端側からＣ末端側に、次のＴＰ５３突然変異：Ｒ１７５Ｈ；Ｈ１７９Ｗ；Ｒ２４９Ｓ；Ｙ２３４Ｈ；Ｉ１９５Ｔ；Ｒ２４８Ｑ；Ｒ２７３Ｈ；Ｃ１７６Ｙ；Ｖ１５７Ｆ；Ｈ１９３Ｒ；Ｙ２３４Ｃ；Ｋ１３２Ｎ；Ｒ２７３Ｃ；Ｙ１６３Ｃ；Ｇ２４５ＤおよびＲ３３７Ｈを含む抗原性ペプチドを含み得る。例えば、配列番号２１１〜２１６を参照されたい。代替的に、融合ポリペプチドは、Ｎ末端側からＣ末端側に、次のＴＰ５３突然変異：Ｃ１７６Ｙ；Ｒ１７５Ｈ；Ｇ２４５Ｄ；Ｒ３３７Ｈ；Ｓ２４１Ｆ；Ｋ１３２Ｎ；Ｖ１４３Ａ；Ｐ２７８Ｓ；Ｒ２８２Ｗ；Ｙ１６３Ｃ；Ｙ１０７Ｄ；Ｒ２７３Ｃ；Ｓ２４２Ｆ；Ｇ２４５Ｓ；Ｖ１５７Ｆ；Ｙ２３４ＣおよびＹ２３４Ｈを含む抗原性ペプチドを含み得る。例えば、配列番号２１７〜２２２を参照されたい。代替的に、融合ポリペプチドは、Ｎ末端側からＣ末端側に、次のＴＰ５３突然変異：Ｃ１７６Ｆ；Ｒ２７３Ｌ；Ｈ１７９Ｒ；Ｒ２８２Ｇ；Ｙ２２０Ｃ；Ｉ１９５Ｔ；Ｃ１４１Ｙ；Ｒ２４８Ｌ；Ｒ２７３Ｈ；Ｈ１７９Ｗ；Ｈ１９３Ｒ；Ｒ２４９Ｓ；Ｖ２１６Ｍ；Ｐ２７８Ｌ；Ｒ２４８ＷおよびＲ２４８Ｑを含む抗原性ペプチドを含み得る。例えば、配列番号２２３〜２２８を参照されたい。代替的に、融合ポリペプチドは、Ｎ末端側からＣ末端側に、次のＴＰ５３突然変異：Ｒ２４８Ｗ；Ｒ２７３Ｈ；Ｖ１４３Ａ；Ｒ２４９Ｓ；Ｒ１７５Ｈ；Ｈ１９３Ｒ；Ｙ２２０Ｃ；Ｇ２４５Ｄ；Ｒ２４８Ｑ；Ｒ２７３Ｃ；Ｒ２８２Ｗ；Ｙ１０７Ｄ；Ｃ１４１Ｙ；Ｖ１５７Ｆ；Ｙ１６３Ｃ；Ｃ１７６Ｆ；Ｉ１９５Ｔ；Ｖ２１６Ｍ；Ｙ２３４Ｈ；Ｇ２４５Ｓ；Ｒ２７３Ｌ；Ｙ２３４ＣおよびＲ２８２Ｇを含む抗原性ペプチドを含み得る。例えば、配列番号２５７〜２６３を参照されたい。代替的に、融合ポリペプチドは、Ｎ末端側からＣ末端側に、次のＴＰ５３突然変異：Ｒ２４８Ｗ；Ｒ２７３Ｈ；Ｖ１４３Ａ；Ｒ２４９Ｓ；Ｒ１７５Ｈ；Ｈ１９３Ｒ；Ｙ２２０Ｃ；Ｇ２４５Ｄ；Ｒ２４８Ｑ；Ｒ２７３ＣおよびＲ２８２Ｗを含む抗原性ペプチドを含み得る。例えば、配列番号２６４〜２７０を参照されたい。代替的に、融合ポリペプチドは、Ｎ末端側からＣ末端側に、次のＴＰ５３突然変異：Ｙ１０７Ｄ；Ｃ１４１Ｙ；Ｖ１５７Ｆ；Ｙ１６３Ｃ；Ｃ１７６Ｆ；Ｉ１９５Ｔ；Ｖ２１６Ｍ；Ｙ２３４Ｈ；Ｇ２４５Ｓ；Ｒ２７３Ｌ；Ｙ２３４ＣおよびＲ２８２Ｇを含む抗原性ペプチドを含み得る。例えば、配列番号２７１〜２７７を参照されたい。具体例において、ＴＰ５３抗原性ペプチドは、反復性がん突然変異の各側に隣接する天然に存在する１０個のアミノ酸をそれぞれが含む２１ｍｅｒ（例えば、直接ひとつに融合した２１ｍｅｒ）であり得る。
【０１４８】
場合によっては、反復性がん突然変異は、複数のがん関連タンパク質に由来してもよい。例えば、特定の融合ポリペプチドにおける（または、例えば単一の投薬レジメンにおいて使用される融合ポリペプチドセットにおける）反復性がん突然変異のそれぞれが、同じタイプのがんにおいて生じる反復性がん突然変異であってもよい。例として、２つまたはそれよりも多くのがん関連タンパク質は、次の遺伝子：ＰＩ３ＫＣＡ、ＡＫＴ１、ＡＨＮＡＫ２、ＥＲＢＢ２、およびＴＰ５３のうちの２つもしくはそれよりも多くまたはすべてによってコードされるタンパク質を含む。抗原性ペプチドは、例えば、次の反復性がん突然変異：ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｈ１０４７Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４２Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｈ１０４７Ｌ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｑ５４６Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ａ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ｇ；ＡＫＴ１｜Ｅ１７Ｋ；ＡＨＮＡＫ２｜Ｖ２０１６Ｌ、ＥＲＢＢ２｜Ｌ７５５ＳおよびＴＰ５３｜Ｒ１７５Ｈのうちの２個またはそれよりも多く、３個もしくはそれよりも多く、４個もしくはそれよりも多く、５個もしくはそれよりも多く、６個もしくはそれよりも多く、７個もしくはそれよりも多く、８個もしくはそれよりも多く、９個もしくはそれよりも多く、または１０個もしくはそれよりも多くを含み得る。突然変異は、任意の順序であってよい。具体例において、抗原性ペプチドは、反復性がん突然変異の各側に隣接する天然に存在する１０個のアミノ酸をそれぞれが含む２１ｍｅｒ（例えば、直接ひとつに融合した２１ｍｅｒ）であり得る。そのような２１ｍｅｒの例は、実施例３および配列番号５８４〜５９４に示されている。
【０１４９】
別の例として、２つまたはそれよりも多くのがん関連タンパク質は、次の遺伝子：ＢＲＡＦ、ＫＲＡＳ／ＮＲＡＳ、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡおよびＳＭＡＤ４のうちの２つもしくはそれよりも多くまたはすべてによってコードされるタンパク質を含む。抗原性ペプチドは、例えば、次の反復性がん突然変異：ＢＲＡＦ｜Ｖ６００Ｅ；ＫＲＡＳ｜Ｇ１２Ｄ；ＫＲＡＳ｜Ｇ１３Ｄ；ＫＲＡＳ｜Ｇ１２Ｖ；ＫＲＡＳ｜Ｇ１２Ｃ；ＫＲＡＳ｜Ｑ６１Ｋ；ＫＲＡＳ｜Ｇ１２Ａ；ＫＲＡＳ｜Ｇ１２Ｓ；ＴＰ５３｜Ｒ１７５Ｈ；ＴＰ５３｜Ｒ２４８Ｗ；ＴＰ５３｜Ｒ２７３Ｃ；ＴＰ５３｜Ｒ２８２Ｗ；ＴＰ５３｜Ｒ２７３Ｈ；ＴＰ５３｜Ｒ２４８Ｑ；ＴＰ５３｜Ｇ２４５Ｓ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｈ１０４７Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ８８ＱおよびＳＭＡＤ４｜Ｒ３６１Ｈのうちの２個もしくはそれよりも多く、３個もしくはそれよりも多く、４個もしくはそれよりも多く、５個もしくはそれよりも多く、６個もしくはそれよりも多く、７個もしくはそれよりも多く、８個もしくはそれよりも多く、９個もしくはそれよりも多く、１０個もしくはそれよりも多く、１１個もしくはそれよりも多く、１２個もしくはそれよりも多く、１３個もしくはそれよりも多く、１４個もしくはそれよりも多く、１５個もしくはそれよりも多く、１６個もしくはそれよりも多く、１７個もしくはそれよりも多く、または１８個もしくはそれよりも多くを含み得る。突然変異は、任意の順序であってよい。具体例において、抗原性ペプチドは、反復性がん突然変異の各側に隣接する天然に存在する１０個のアミノ酸をそれぞれが含む２１ｍｅｒ（例えば、直接ひとつに融合した２１ｍｅｒ）であり得る。そのような２１ｍｅｒの例は、実施例３および配列番号５９５〜６１３に示されている。
【０１５０】
別の例として、２つまたはそれよりも多くのがん関連タンパク質は、次の遺伝子：ＫＲＡＳ、ＴＰ５３、ＥＧＦＲ、Ｕ２ＡＦ１、ＢＲＡＦおよびＰＩＫ３ＣＡのうちの２つもしくはそれよりも多くまたはすべてによってコードされるタンパク質を含む。抗原性ペプチドは、例えば、次の反復性がん突然変異：ＫＲＡＳ｜Ｇ１２Ｃ；ＫＲＡＳ｜Ｇ１２Ｖ；ＫＲＡＳ｜Ｇ１２Ｄ；ＫＲＡＳ｜Ｇ１２Ｆ；ＫＲＡＳ｜Ｇ１２Ｒ；ＫＲＡＳ｜Ｑ６１Ｌ；ＫＲＡＳ｜Ｇ１２Ｙ；ＴＰ５３｜Ｒ１５８Ｌ；ＴＰ５３｜Ｒ２７３Ｌ；ＴＰ５３｜Ｇ２４５Ｖ；ＴＰ５３｜Ｒ１７５Ｈ；ＴＰ５３｜Ａ１５９Ｐ；ＴＰ５３｜Ｒ２４９Ｍ；ＴＰ５３｜Ｒ２７３Ｈ；ＴＰ５３｜Ｒ２８０Ｉ；ＴＰ５３｜Ｑ１４４Ｌ；ＴＰ５３｜Ｒ２７３Ｃ；ＴＰ５３｜Ｒ２８０Ｇ；ＴＰ５３｜Ｒ２８０Ｔ；ＥＧＦＲ｜Ｌ８５８Ｒ；ＥＧＦＲ｜Ｌ８６１Ｑ；ＥＧＦＲ｜Ｇ７１９Ａ；Ｕ２ＡＦ１｜Ｓ３４Ｆ；ＢＲＡＦ１｜Ｖ６００Ｅ；ＢＲＡＦ１｜Ｇ４６６Ｖ；ＢＲＡＦ１｜Ｎ５８１Ｓ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ７２６ＫおよびＰＩＫ３ＣＡ｜Ｈ１０４７Ｒのうちの２個もしくはそれよりも多く、３個もしくはそれよりも多く、４個もしくはそれよりも多く、５個もしくはそれよりも多く、６個もしくはそれよりも多く、７個もしくはそれよりも多く、８個もしくはそれよりも多く、９個もしくはそれよりも多く、１０個もしくはそれよりも多く、１１個もしくはそれよりも多く、１２個もしくはそれよりも多く、１３個もしくはそれよりも多く、１４個もしくはそれよりも多く、１５個もしくはそれよりも多く、１６個もしくはそれよりも多く、１７個もしくはそれよりも多く、１８個もしくはそれよりも多く、１９個もしくはそれよりも多く、２０個もしくはそれよりも多く、２１個もしくはそれよりも多く、２２個もしくはそれよりも多く、２３個もしくはそれよりも多く、２４個もしくはそれよりも多く、２５個もしくはそれよりも多く、２６個もしくはそれよりも多く、２７個もしくはそれよりも多く、または２８個もしくはそれよりも多くを含み得る。突然変異は、任意の順序であってよい。具体例において、抗原性ペプチドは、反復性がん突然変異の各側に隣接する天然に存在する１０個のアミノ酸をそれぞれが含む２１ｍｅｒ（例えば、直接ひとつに融合した２１ｍｅｒ）であり得る。そのような２１ｍｅｒの例は、実施例３および配列番号６１４〜６４３に示されている。
【０１５１】
別の例において、２つまたはそれよりも多くのがん関連タンパク質は、次の遺伝子：ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＮＦＥ２Ｌ２、ＣＤＫＮ２ＡおよびＰＴＥＮのうちの２つもしくはそれよりも多くまたはすべてによってコードされるタンパク質を含む。抗原性ペプチドは、例えば、次の反復性がん突然変異：ＴＰ５３｜Ｙ１６３Ｃ；ＴＰ５３｜Ｒ１７５Ｇ；ＴＰ５３｜Ｃ２４２Ｆ；ＴＰ５３｜Ｒ２７３Ｌ；ＴＰ５３｜Ｈ１７９Ｌ；ＴＰ５３｜Ｈ１９３Ｌ；ＴＰ５３｜Ｈ２１４Ｒ；ＴＰ５３｜Ｙ２２０Ｃ；ＴＰ５３｜Ｙ２３４Ｃ；ＴＰ５３｜Ｇ２４５Ｖ；ＴＰ５３｜Ｌ１１１Ｑ；ＴＰ５３｜Ｔ１２５Ｐ；ＴＰ５３｜Ｋ１３２Ｒ；ＴＰ５３｜Ｃ１３５Ｗ；ＴＰ５３｜Ｃ１４１Ｗ；ＴＰ５３｜Ｃ１７６Ｆ；ＴＰ５３｜Ｃ１７６Ｙ；ＴＰ５３｜Ｈ１７９Ｒ；ＴＰ５３｜Ｈ１７９Ｙ；ＴＰ５３｜Ｈ１９３Ｒ；ＴＰ５３｜Ｉ１９５Ｓ；ＴＰ５３｜Ｙ２０５Ｃ；ＴＰ５３｜Ｒ２１３Ｇ；ＴＰ５３｜Ｖ２１６Ｅ；ＴＰ５３｜Ｙ２３４Ｓ；ＴＰ５３｜Ｙ２３６Ｃ；ＴＰ５３｜Ｍ２３７Ｉ；ＴＰ５３｜Ｇ２４４Ｃ；ＴＰ５３｜Ｇ２４５Ｓ；ＴＰ５３｜Ｒ２４８Ｌ；ＴＰ５３｜Ｒ２４８Ｐ；ＴＰ５３｜Ｒ２４８Ｑ；ＴＰ５３｜Ｒ２４８Ｗ；ＴＰ５３｜Ｒ２４９Ｇ；ＴＰ５３｜Ｒ２４９Ｓ；ＴＰ５３｜Ｒ２４９Ｗ；ＴＰ５３｜Ｇ２６６Ｖ；ＴＰ５３｜Ｆ２７０Ｉ；ＴＰ５３｜Ｒ２７３Ｃ；ＴＰ５３｜Ｒ２７３Ｈ；ＴＰ５３｜Ｒ２７３Ｐ；ＴＰ５３｜Ｒ２８０Ｉ；ＴＰ５３｜Ｄ２８１Ｙ；ＴＰ５３｜Ｒ２８２Ｑ；ＴＰ５３｜Ｒ２８２Ｗ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４２Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｈ１０４７Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ７２６Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｃ４２０Ｒ；ＮＦＥ２Ｌ２｜Ｅ７９Ｑ；ＮＦＥ２Ｌ２｜Ｒ３４Ｑ；ＮＦＥ２Ｌ２｜Ｌ３０Ｆ；ＮＦＥ２Ｌ２｜Ｇ８１Ｓ；ＮＦＥ２Ｌ２｜Ｇ３１Ａ；ＮＦＥ２Ｌ２｜Ｄ２９Ｇ；ＮＦＥ２Ｌ２｜Ｇ８１Ｖ；ＣＤＫＮ２Ａ｜Ｄ１０８Ｙ；ＣＤＫＮ２Ａ｜Ｄ１８ＮおよびＰＴＥＮ｜Ｒ１３０Ｑのうちの２個もしくはそれよりも多く、３個もしくはそれよりも多く、４個もしくはそれよりも多く、５個もしくはそれよりも多く、６個もしくはそれよりも多く、７個もしくはそれよりも多く、８個もしくはそれよりも多く、９個もしくはそれよりも多く、１０個もしくはそれよりも多く、１１個もしくはそれよりも多く、１２個もしくはそれよりも多く、１３個もしくはそれよりも多く、１４個もしくはそれよりも多く、１５個もしくはそれよりも多く、１６個もしくはそれよりも多く、１７個もしくはそれよりも多く、１８個もしくはそれよりも多く、１９個もしくはそれよりも多く、２０個もしくはそれよりも多く、２１個もしくはそれよりも多く、２２個もしくはそれよりも多く、２３個もしくはそれよりも多く、２４個もしくはそれよりも多く、２５個もしくはそれよりも多く、２６個もしくはそれよりも多く、２７個もしくはそれよりも多く、２８個もしくはそれよりも多く、２９個もしくはそれよりも多く、３０個もしくはそれよりも多く、３１個もしくはそれよりも多く、３２個もしくはそれよりも多く、３３個もしくはそれよりも多く、３４個もしくはそれよりも多く、３５個もしくはそれよりも多く、３６個もしくはそれよりも多く、３７個もしくはそれよりも多く、３８個もしくはそれよりも多く、３９個もしくはそれよりも多く、４０個もしくはそれよりも多く、４１個もしくはそれよりも多く、４２個もしくはそれよりも多く、４３個もしくはそれよりも多く、４４個もしくはそれよりも多く、４５個もしくはそれよりも多く、４６個もしくはそれよりも多く、４７個もしくはそれよりも多く、４８個もしくはそれよりも多く、４９個もしくはそれよりも多く、５０個もしくはそれよりも多く、５１個もしくはそれよりも多く、５２個もしくはそれよりも多く、５３個もしくはそれよりも多く、５４個もしくはそれよりも多く、５５個もしくはそれよりも多く、５６個もしくはそれよりも多く、５７個もしくはそれよりも多く、５８個もしくはそれよりも多く、または５９個もしくはそれよりも多くを含み得る。突然変異は、任意の順序であってよい。具体例において、抗原性ペプチドは、反復性がん突然変異の各側に隣接する天然に存在する１０個のアミノ酸をそれぞれが含む２１ｍｅｒ（例えば、直接ひとつに融合した２１ｍｅｒ）であり得る。そのような２１ｍｅｒの例は、実施例３および配列番号６４４〜７０３に示されている。
【０１５２】
別の例として、２つまたはそれよりも多くのがん関連タンパク質は、次の遺伝子：ＡＮＫＲＤ３６Ｃ、ＳＰＯＰ、ＣＨＥＫ２、ＫＲＴＡＰ４−１１、ＲＧＰＤ８、ＴＰ５３、ＦＡＭ４７Ｃ、ＺＡＮおよびＰＩＫ３ＣＡのうちの２つもしくはそれよりも多くまたはすべてによってコードされるタンパク質を含む。抗原性ペプチドは、例えば、次の反復性がん突然変異：ＡＮＫＲＤ３６Ｃ｜Ｉ６４５Ｔ；ＡＮＫＲＤ３６Ｃ｜Ｄ６２９Ｙ；ＡＮＫＲＤ３６Ｃ｜Ｄ６２９Ｎ；ＳＰＯＰ｜Ｗ１３１Ｇ；ＳＰＯＰ｜Ｆ１３３Ｌ；ＳＰＯＰ｜Ｆ１３３Ｖ；ＳＰＯＰ｜Ｆ１３３Ｃ；ＳＰＯＰ｜Ｗ１３１Ｒ；ＳＰＯＰ｜Ｗ１３１Ｌ；ＣＨＥＫ２｜Ｋ３７３Ｅ；ＫＲＴＡＰ４−１１｜Ｍ９３Ｖ；ＫＲＴＡＰ４−１１｜Ｒ５１Ｋ；ＫＲＴＡＰ４−１１｜Ｌ１６１Ｖ；ＲＧＰＤ８｜Ｐ１７６０Ａ；ＴＰ５３｜Ｒ２４８Ｑ；ＴＰ５３｜Ｇ２４５Ｓ；ＴＰ５３｜Ｇ２４５Ｄ；ＦＡＭ４７Ｃ｜Ｎ６４８Ｄ；ＺＡＮ｜Ｌ８７８Ｐ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４２ＫおよびＰＩＫ３ＣＡ｜Ｈ１０４７Ｒのうちの２個もしくはそれよりも多く、３個もしくはそれよりも多く、４個もしくはそれよりも多く、５個もしくはそれよりも多く、６個もしくはそれよりも多く、７個もしくはそれよりも多く、８個もしくはそれよりも多く、９個もしくはそれよりも多く、１０個もしくはそれよりも多く、１１個もしくはそれよりも多く、１２個もしくはそれよりも多く、１３個もしくはそれよりも多く、１４個もしくはそれよりも多く、１５個もしくはそれよりも多く、１６個もしくはそれよりも多く、１７個もしくはそれよりも多く、１８個もしくはそれよりも多く、１９個もしくはそれよりも多く、または２０個もしくはそれよりも多くを含み得る。突然変異は、任意の順序であってよい。具体例において、抗原性ペプチドは、反復性がん突然変異の各側に隣接する天然に存在する１０個のアミノ酸をそれぞれが含む２１ｍｅｒ（例えば、直接ひとつに融合した２１ｍｅｒ）であり得る。そのような２１ｍｅｒの例は、実施例３および配列番号７０４〜７２４に示されている。
【０１５３】
別の例として、がん関連タンパク質は、次の遺伝子：ＫＲＡＳ、ＥＧＦＲ、Ｕ２ＡＦ１、ＢＲＡＦ、ＰＩＫ３ＣＡおよびＴＰ５３のうちの１個もしくはそれよりも多く、２個もしくはそれよりも多く、３個もしくはそれよりも多く、４個もしくはそれよりも多く、５個もしくはそれよりも多く、またはすべてによってコードされるタンパク質を含み得る。抗原性ペプチドは、例えば、次の反復性がん突然変異：ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｃ、ＥＧＦＲ＿Ｌ８５８Ｒ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ、Ｕ２ＡＦ１＿Ｓ３４Ｆ、ＢＲＡＦ＿Ｖ６００Ｅ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｖ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｅ５４５Ｋ、ＴＰ５３＿Ｒ１５８Ｌ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ａ、ＥＧＦＲ＿Ｌ８６１ＱおよびＴＰ５３＿Ｒ２７３Ｌのうちの１個もしくはそれよりも多く、２個もしくはそれよりも多く、３個もしくはそれよりも多く、４個もしくはそれよりも多く、５個もしくはそれよりも多く、６個もしくはそれよりも多く、７個もしくはそれよりも多く、８個もしくはそれよりも多く、９個もしくはそれよりも多く、１０個もしくはそれよりも多く、またはすべてを含み得る。そのような突然変異は、例えば、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）に関連している。突然変異は、任意の順序であってよい。抗原性ペプチドは、直接ひとつに融合していても、リンカーによってひとつに連結されていてもよく、リンカーの例は本明細書の他所に開示されている。具体例において、抗原性ペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべては、反復性がん突然変異の各側に隣接する天然に存在する１０個のアミノ酸をそれぞれが含む２１ｍｅｒ（例えば、リンカーによってひとつに連結している２１ｍｅｒ）であり得る。そのような抗原性ペプチドの例は、実施例１１において提供される。抗原性ペプチドは、例えば、表３５における抗原性ペプチドのうちの１個もしくはそれよりも多く、２個もしくはそれよりも多く、３個もしくはそれよりも多く、４個もしくはそれよりも多く、５個もしくはそれよりも多く、６個もしくはそれよりも多く、７個もしくはそれよりも多く、８個もしくはそれよりも多く、９個もしくはそれよりも多く、１０個もしくはそれよりも多く、またはすべてを含み得る。
【０１５４】
別の例として、がん関連タンパク質は、次の遺伝子：ＳＰＯＰ、ＣＨＥＫ２、ＲＧＰＤ８、ＡＮＫＲＤ３６ＣおよびＡＲのうちの１個もしくはそれよりも多く、２個もしくはそれよりも多く、３個もしくはそれよりも多く、４個もしくはそれよりも多く、またはすべてによってコードされるタンパク質を含み得る。抗原性ペプチドは、例えば、次の反復性がん突然変異：ＳＰＯＰ＿Ｆ１３３Ｖ、ＣＨＥＫ２＿Ｋ３７３Ｅ、ＲＧＰＤ８＿Ｐ１７６０Ａ、ＡＮＫＲＤ３６Ｃ＿Ｉ６３４Ｔ、ＡＮＫＲＤ３６Ｃ＿Ｄ６２９Ｙ、ＳＰＯＰ＿Ｗ１３１Ｇ、ＡＮＫＲＤ３６Ｃ＿Ｄ６２６Ｎ、ＳＰＯＰ＿Ｆ１３３Ｌ、ＡＲ＿Ｔ８７８Ａ、ＡＲ＿Ｌ７０２Ｈ、ＡＲ＿Ｗ７４２Ｃ、ＡＲ＿Ｈ８７５ＹおよびＡＲ＿Ｆ８７７Ｌのうちの１個もしくはそれよりも多く、２個もしくはそれよりも多く、３個もしくはそれよりも多く、４個もしくはそれよりも多く、５個もしくはそれよりも多く、６個もしくはそれよりも多く、７個もしくはそれよりも多く、８個もしくはそれよりも多く、９個もしくはそれよりも多く、１０個もしくはそれよりも多く、１１個もしくはそれよりも多く、１２個もしくはそれよりも多く、１３個もしくはそれよりも多く、またはすべてを含み得る。そのような突然変異は、例えば、前立腺がんに関連している。突然変異は、任意の順序であってよい。抗原性ペプチドは、直接ひとつに融合していても、リンカーによってひとつに連結されていてもよく、リンカーの例は本明細書の他所に開示されている。具体例において、抗原性ペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべては、反復性がん突然変異の各側に隣接する天然に存在する１０個のアミノ酸をそれぞれが含む２１ｍｅｒ（例えば、リンカーによってひとつに連結している２１ｍｅｒ）であり得る。そのような抗原性ペプチドの例は、実施例１１において提供される。抗原性ペプチドは、例えば、表５２における抗原性ペプチドのうちの１個もしくはそれよりも多く、２個もしくはそれよりも多く、３個もしくはそれよりも多く、４個もしくはそれよりも多く、５個もしくはそれよりも多く、６個もしくはそれよりも多く、７個もしくはそれよりも多く、８個もしくはそれよりも多く、９個もしくはそれよりも多く、１０個もしくはそれよりも多く、１１個もしくはそれよりも多く、１２個もしくはそれよりも多く、１３個もしくはそれよりも多く、またはすべてを含み得る。
【０１５５】
別の例として、がん関連タンパク質は、次の遺伝子：ＫＲＡＳ、Ｕ２ＡＦ１、ＴＰ５３、ＳＭＡＤ４およびＧＮＡＳのうちの１個もしくはそれよりも多く、２個もしくはそれよりも多く、３個もしくはそれよりも多く、４個もしくはそれよりも多く、またはすべてによってコードされるタンパク質を含み得る。抗原性ペプチドは、例えば、次の反復性がん突然変異：ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｃ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ、Ｕ２ＡＦ１＿Ｓ３４Ｆ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｖ、ＴＰ５３＿Ｒ２４８Ｑ、ＴＰ５３＿Ｒ２４８Ｗ、ＴＰ５３＿Ｒ１７５Ｈ、ＴＰ５３＿Ｒ２７３Ｃ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｒ、ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｈ、ＴＰ５３＿Ｒ２８２Ｗ、ＴＰ５３＿Ｒ２７３Ｈ、ＴＰ５３＿Ｇ２４５Ｓ、ＳＭＡＤ４＿Ｒ３６１Ｃ、ＧＮＡＳ＿Ｒ２０１ＣおよびＧＮＡＳ＿Ｒ２０１Ｈのうちの１個もしくはそれよりも多く、２個もしくはそれよりも多く、３個もしくはそれよりも多く、４個もしくはそれよりも多く、５個もしくはそれよりも多く、６個もしくはそれよりも多く、７個もしくはそれよりも多く、８個もしくはそれよりも多く、９個もしくはそれよりも多く、１０個もしくはそれよりも多く、１１個もしくはそれよりも多く、１２個もしくはそれよりも多く、１３個もしくはそれよりも多く、１４個もしくはそれよりも多く、１５個もしくはそれよりも多く、またはすべてを含み得る。そのような突然変異は、例えば、膵臓がんに関連している。突然変異は、任意の順序であってよい。抗原性ペプチドは、直接ひとつに融合していても、リンカーによってひとつに連結されていてもよく、リンカーの例は本明細書の他所に開示されている。具体例において、抗原性ペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべては、反復性がん突然変異の各側に隣接する天然に存在する１０個のアミノ酸をそれぞれが含む２１ｍｅｒ（例えば、リンカーによってひとつに連結している２１ｍｅｒ）であり得る。そのような抗原性ペプチドの例は、実施例１１において提供される。抗原性ペプチドは、例えば、表６８における抗原性ペプチドのうちの１個もしくはそれよりも多く、２個もしくはそれよりも多く、３個もしくはそれよりも多く、４個もしくはそれよりも多く、５個もしくはそれよりも多く、６個もしくはそれよりも多く、７個もしくはそれよりも多く、８個もしくはそれよりも多く、９個もしくはそれよりも多く、１０個もしくはそれよりも多く、１１個もしくはそれよりも多く、１２個もしくはそれよりも多く、１３個もしくはそれよりも多く、１４個もしくはそれよりも多く、１５個もしくはそれよりも多く、またはすべてを含み得る。
【０１５６】
別の例として、がん関連タンパク質は、次の遺伝子：ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＴＰ５３、ＲＸＲＡ、ＦＢＸＷ７およびＮＦＥ２Ｌ２のうちの１個もしくはそれよりも多く、２個もしくはそれよりも多く、３個もしくはそれよりも多く、４個もしくはそれよりも多く、５個もしくはそれよりも多く、またはすべてによってコードされるタンパク質を含み得る。抗原性ペプチドは、例えば、次の反復性がん突然変異：ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｅ５４５Ｋ、ＦＧＦＲ３＿Ｓ２４９Ｃ、ＴＰ５３＿Ｒ２４８Ｑ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｅ５４２Ｋ、ＲＸＲＡ＿Ｓ４２７Ｆ、ＦＢＸＷ７＿Ｒ５０５Ｇ、ＴＰ５３＿Ｒ２８０Ｔ、ＮＦＥ２Ｌ２＿Ｅ７９Ｋ、ＦＧＦＲ３＿Ｒ２４８Ｃ、ＴＰ５３＿Ｋ１３２Ｎ、ＴＰ５３＿Ｒ２４８Ｗ、ＴＰ５３＿Ｒ１７５ＨおよびＴＰ５３＿Ｒ２７３Ｃのうちの１個もしくはそれよりも多く、２個もしくはそれよりも多く、３個もしくはそれよりも多く、４個もしくはそれよりも多く、５個もしくはそれよりも多く、６個もしくはそれよりも多く、７個もしくはそれよりも多く、８個もしくはそれよりも多く、９個もしくはそれよりも多く、１０個もしくはそれよりも多く、１１個もしくはそれよりも多く、１２個もしくはそれよりも多く、またはすべてを含み得る。そのような突然変異は、例えば、膀胱がんに関連している。突然変異は、任意の順序であってよい。抗原性ペプチドは、直接ひとつに融合していても、リンカーによってひとつに連結されていてもよく、リンカーの例は本明細書の他所に開示されている。具体例において、抗原性ペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべては、反復性がん突然変異の各側に隣接する天然に存在する１０個のアミノ酸をそれぞれが含む２１ｍｅｒ（例えば、リンカーによってひとつに連結している２１ｍｅｒ）であり得る。そのような抗原性ペプチドの例は、実施例１１において提供される。抗原性ペプチドは、例えば、表７６における抗原性ペプチドのうちの１個もしくはそれよりも多く、２個もしくはそれよりも多く、３個もしくはそれよりも多く、４個もしくはそれよりも多く、５個もしくはそれよりも多く、６個もしくはそれよりも多く、７個もしくはそれよりも多く、８個もしくはそれよりも多く、９個もしくはそれよりも多く、１０個もしくはそれよりも多く、１１個もしくはそれよりも多く、１２個もしくはそれよりも多く、またはすべてを含み得る。
【０１５７】
別の例として、がん関連タンパク質は、次の遺伝子：ＰＩＫ３ＣＡ、ＡＫＴ１およびＥＳＲ１のうちの１個もしくはそれよりも多く、２個もしくはそれよりも多く、またはすべてによってコードされるタンパク質を含み得る。抗原性ペプチドは、例えば、次の反復性がん突然変異：ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｅ５４５Ｋ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｅ５４２Ｋ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｈ１０４７Ｒ、ＡＫＴ１＿Ｅ１７Ｋ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｈ１０４７Ｌ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｑ５４６Ｋ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｅ５４５Ａ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｅ５４５Ｇ、ＥＳＲ１＿Ｋ３０３Ｒ、ＥＳＲ１＿Ｄ５３８Ｇ、ＥＳＲ１＿Ｙ５３７Ｓ、ＥＳＲ１＿Ｙ５３７Ｎ、ＥＳＲ１＿Ｙ５３７ＣおよびＥＳＲ１＿Ｅ３８０Ｑのうちの１個もしくはそれよりも多く、２個もしくはそれよりも多く、３個もしくはそれよりも多く、４個もしくはそれよりも多く、５個もしくはそれよりも多く、６個もしくはそれよりも多く、７個もしくはそれよりも多く、８個もしくはそれよりも多く、９個もしくはそれよりも多く、１０個もしくはそれよりも多く、１１個もしくはそれよりも多く、１２個もしくはそれよりも多く、１３個もしくはそれよりも多く、またはすべてを含み得る。そのような突然変異は、例えば、乳がん（例えば、ＥＲ＋乳がん）に関連している。突然変異は、任意の順序であってよい。抗原性ペプチドは、直接ひとつに融合していても、リンカーによってひとつに連結されていてもよく、リンカーの例は本明細書の他所に開示されている。具体例において、抗原性ペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべては、反復性がん突然変異の各側に隣接する天然に存在する１０個のアミノ酸をそれぞれが含む２１ｍｅｒ（例えば、リンカーによってひとつに連結している２１ｍｅｒ）であり得る。そのような抗原性ペプチドの例は、実施例１１において提供される。抗原性ペプチドは、例えば、表８７における抗原性ペプチドのうちの１個もしくはそれよりも多く、２個もしくはそれよりも多く、３個もしくはそれよりも多く、４個もしくはそれよりも多く、５個もしくはそれよりも多く、６個もしくはそれよりも多く、７個もしくはそれよりも多く、８個もしくはそれよりも多く、９個もしくはそれよりも多く、１０個もしくはそれよりも多く、１１個もしくはそれよりも多く、１２個もしくはそれよりも多く、１３個もしくはそれよりも多く、またはすべてを含み得る。
【０１５８】
別の例として、がん関連タンパク質は、次の遺伝子：ＰＴＥＮ、ＫＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＣＴＮＮＢ１、ＦＢＸＷ７およびＴＰ５３のうちの１個もしくはそれよりも多く、２個もしくはそれよりも多く、３個もしくはそれよりも多く、４個もしくはそれよりも多く、５個もしくはそれよりも多く、またはすべてによってコードされるタンパク質を含み得る。抗原性ペプチドは、例えば、次の反復性がん突然変異：ＰＴＥＮ＿Ｒ１３０Ｇ、ＰＴＥＮ＿Ｒ１３０Ｑ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｖ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｈ１０４７Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｒ８８Ｑ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｅ５４５Ｋ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｅ５４２Ｋ、ＣＴＮＮＢ１＿Ｓ３７Ｆ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１３Ｄ、ＣＴＮＮＢ１＿Ｓ３７Ｃ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｈ１０４７Ｌ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｇ１１８Ｄ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ａ、ＦＢＸＷ７＿Ｒ５０５ＣおよびＴＰ５３＿Ｒ２４８Ｗのうちの１個もしくはそれよりも多く、２個もしくはそれよりも多く、３個もしくはそれよりも多く、４個もしくはそれよりも多く、５個もしくはそれよりも多く、６個もしくはそれよりも多く、７個もしくはそれよりも多く、８個もしくはそれよりも多く、９個もしくはそれよりも多く、１０個もしくはそれよりも多く、１１個もしくはそれよりも多く、１２個もしくはそれよりも多く、１３個もしくはそれよりも多く、１４個もしくはそれよりも多く、１５個もしくはそれよりも多く、またはすべてを含み得る。そのような突然変異は、例えば、子宮がんに関連している。突然変異は、任意の順序であってよい。抗原性ペプチドは、直接ひとつに融合していても、リンカーによってひとつに連結されていてもよく、リンカーの例は本明細書の他所に開示されている。具体例において、抗原性ペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべては、反復性がん突然変異の各側に隣接する天然に存在する１０個のアミノ酸をそれぞれが含む２１ｍｅｒ（例えば、リンカーによってひとつに連結している２１ｍｅｒ）であり得る。そのような抗原性ペプチドの例は、実施例１１において提供される。抗原性ペプチドは、例えば、表９５における抗原性ペプチドのうちの１個もしくはそれよりも多く、２個もしくはそれよりも多く、３個もしくはそれよりも多く、４個もしくはそれよりも多く、５個もしくはそれよりも多く、６個もしくはそれよりも多く、７個もしくはそれよりも多く、８個もしくはそれよりも多く、９個もしくはそれよりも多く、１０個もしくはそれよりも多く、１１個もしくはそれよりも多く、１２個もしくはそれよりも多く、１３個もしくはそれよりも多く、１４個もしくはそれよりも多く、１５個もしくはそれよりも多く、またはすべてを含み得る。
【０１５９】
別の例として、がん関連タンパク質は、ＴＰ５３によってコードされるタンパク質を含み得る。抗原性ペプチドは、例えば、次の反復性がん突然変異：ＴＰ５３＿Ｒ２４８Ｑ、ＴＰ５３＿Ｒ２４８Ｗ、ＴＰ５３＿Ｒ１７５Ｈ、ＴＰ５３＿Ｒ２７３Ｃ、ＴＰ５３＿Ｒ２８２Ｗ、ＴＰ５３＿Ｒ２７３Ｈ、ＴＰ５３＿Ｙ２２０Ｃ、ＴＰ５３＿Ｉ１９５Ｔ、ＴＰ５３＿Ｃ１７６Ｙ、ＴＰ５３＿Ｈ１７９Ｒ、ＴＰ５３＿Ｓ２４１ＦおよびＴＰ５３＿Ｈ１９３Ｒのうちの１個もしくはそれよりも多く、２個もしくはそれよりも多く、３個もしくはそれよりも多く、４個もしくはそれよりも多く、５個もしくはそれよりも多く、６個もしくはそれよりも多く、７個もしくはそれよりも多く、８個もしくはそれよりも多く、９個もしくはそれよりも多く、１０個もしくはそれよりも多く、１１個もしくはそれよりも多く、またはすべてを含み得る。そのような突然変異は、例えば、卵巣がんに関連している。突然変異は、任意の順序であってよい。抗原性ペプチドは、直接ひとつに融合していても、リンカーによってひとつに連結されていてもよく、リンカーの例は本明細書の他所に開示されている。具体例において、抗原性ペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべては、反復性がん突然変異の各側に隣接する天然に存在する１０個のアミノ酸をそれぞれが含む２１ｍｅｒ（例えば、リンカーによってひとつに連結している２１ｍｅｒ）であり得る。そのような抗原性ペプチドの例は、実施例１１において提供される。抗原性ペプチドは、例えば、表１００における抗原性ペプチドのうちの１個もしくはそれよりも多く、２個もしくはそれよりも多く、３個もしくはそれよりも多く、４個もしくはそれよりも多く、５個もしくはそれよりも多く、６個もしくはそれよりも多く、７個もしくはそれよりも多く、８個もしくはそれよりも多く、９個もしくはそれよりも多く、１０個もしくはそれよりも多く、１１個もしくはそれよりも多く、またはすべてを含み得る。
【０１６０】
別の例として、がん関連タンパク質は、次の遺伝子：ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２およびＥＧＦＲのうちの１個もしくはそれよりも多く、２個もしくはそれよりも多く、３個もしくはそれよりも多く、４個もしくはそれよりも多く、またはすべてによってコードされるタンパク質を含み得る。抗原性ペプチドは、例えば、次の反復性がん突然変異：ＴＰ５３＿Ｒ２７３Ｌ、ＴＰ５３＿Ｒ２７３Ｃ、ＴＰ５３＿Ｒ２７３Ｈ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｇ１１８Ｄ、ＩＤＨ１＿Ｒ１３２Ｃ、ＩＤＨ１＿Ｒ１３２Ｇ、ＩＤＨ１＿Ｒ１３２Ｈ、ＩＤＨ１＿Ｒ１３２Ｓ、ＩＤＨ２＿Ｒ１７２Ｋ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｅ４５３ＫおよびＥＧＦＲ＿Ｇ５９８Ｖのうちの１個もしくはそれよりも多く、２個もしくはそれよりも多く、３個もしくはそれよりも多く、４個もしくはそれよりも多く、５個もしくはそれよりも多く、６個もしくはそれよりも多く、７個もしくはそれよりも多く、８個もしくはそれよりも多く、９個もしくはそれよりも多く、１０個もしくはそれよりも多く、またはすべてを含み得る。そのような突然変異は、例えば、低悪性度神経膠腫（low-grade  glioma）に関連している。突然変異は、任意の順序であってよい。抗原性ペプチドは、直接ひとつに融合していても、リンカーによってひとつに連結されていてもよく、リンカーの例は本明細書の他所に開示されている。具体例において、抗原性ペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべては、反復性がん突然変異の各側に隣接する天然に存在する１０個のアミノ酸をそれぞれが含む２１ｍｅｒ（例えば、リンカーによってひとつに連結している２１ｍｅｒ）であり得る。そのような抗原性ペプチドの例は、実施例１１において提供される。抗原性ペプチドは、例えば、表１０４における抗原性ペプチドのうちの１個もしくはそれよりも多く、２個もしくはそれよりも多く、３個もしくはそれよりも多く、４個もしくはそれよりも多く、５個もしくはそれよりも多く、６個もしくはそれよりも多く、７個もしくはそれよりも多く、８個もしくはそれよりも多く、９個もしくはそれよりも多く、１０個もしくはそれよりも多く、またはすべてを含み得る。
【０１６１】
別の例として、がん関連タンパク質は、次の遺伝子：ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＰＩＫ３ＣＡおよびＴＰ５３のうちの１個もしくはそれよりも多く、２個もしくはそれよりも多く、３個もしくはそれよりも多く、またはすべてによってコードされるタンパク質を含み得る。抗原性ペプチドは、例えば、次の反復性がん突然変異：ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｃ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ、ＢＲＡＦ＿Ｖ６００Ｅ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｖ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｅ５４５Ｋ、ＴＰ５３＿Ｒ２４８Ｗ、ＴＰ５３＿Ｒ１７５Ｈ、ＴＰ５３＿Ｒ２７３Ｃ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｈ１０４７Ｒ、ＴＰ５３＿Ｒ２８２Ｗ、ＴＰ５３＿Ｒ２７３ＨおよびＫＲＡＳ＿Ｇ１３Ｄのうちの１個もしくはそれよりも多く、２個もしくはそれよりも多く、３個もしくはそれよりも多く、４個もしくはそれよりも多く、５個もしくはそれよりも多く、６個もしくはそれよりも多く、７個もしくはそれよりも多く、８個もしくはそれよりも多く、９個もしくはそれよりも多く、１０個もしくはそれよりも多く、１１個もしくはそれよりも多く、またはすべてを含み得る。そのような突然変異は、例えば、結腸直腸がん（例えば、ＭＳＳ結腸直腸がん）に関連している。突然変異は、任意の順序であってよい。抗原性ペプチドは、直接ひとつに融合していても、リンカーによってひとつに連結されていてもよく、リンカーの例は本明細書の他所に開示されている。具体例において、抗原性ペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべては、反復性がん突然変異の各側に隣接する天然に存在する１０個のアミノ酸をそれぞれが含む２１ｍｅｒ（例えば、リンカーによってひとつに連結している２１ｍｅｒ）であり得る。そのような抗原性ペプチドの例は、実施例１１において提供される。抗原性ペプチドは、例えば、表１０８における抗原性ペプチドのうちの１個もしくはそれよりも多く、２個もしくはそれよりも多く、３個もしくはそれよりも多く、４個もしくはそれよりも多く、５個もしくはそれよりも多く、６個もしくはそれよりも多く、７個もしくはそれよりも多く、８個もしくはそれよりも多く、９個もしくはそれよりも多く、１０個もしくはそれよりも多く、１１個もしくはそれよりも多く、またはすべてを含み得る。
【０１６２】
別の例として、がん関連タンパク質は、次の遺伝子：ＰＩＫ３ＣＡ、ＣＨＥＫ２、ＲＧＰＤ８、ＡＮＫＲＤ３６Ｃ、ＴＰ５３、ＺＮＦ８１４、ＫＲＴＡＰ１−５、ＫＲＴＡＰ４−１１およびＨＲＡＳのうちの１個もしくはそれよりも多く、２個もしくはそれよりも多く、３個もしくはそれよりも多く、４個もしくはそれよりも多く、５個もしくはそれよりも多く、６個もしくはそれよりも多く、７個もしくはそれよりも多く、８個もしくはそれよりも多く、またはすべてによってコードされるタンパク質を含み得る。抗原性ペプチドは、例えば、次の反復性がん突然変異：ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｅ５４５Ｋ、ＣＨＥＫ２＿Ｋ３７３Ｅ、ＲＧＰＤ８＿Ｐ１７６０Ａ、ＡＮＫＲＤ３６Ｃ＿Ｉ６３４Ｔ、ＴＰ５３＿Ｒ２４８Ｑ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｅ５４２Ｋ、ＴＰ５３＿Ｒ２４８Ｗ、ＴＰ５３＿Ｒ１７５Ｈ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｈ１０４７Ｒ、ＴＰ５３＿Ｒ２８２Ｗ、ＴＰ５３＿Ｒ２７３Ｈ、ＴＰ５３＿Ｇ２４５Ｓ、ＴＰ５３＿Ｙ２２０Ｃ、ＺＮＦ８１４＿Ｄ４０４Ｅ、ＫＲＴＡＰ１−５＿Ｉ８８Ｔ、ＫＲＴＡＰ４−１１＿Ｌ１６１ＶおよびＨＲＡＳ＿Ｇ１３Ｖのうちの１個もしくはそれよりも多く、２個もしくはそれよりも多く、３個もしくはそれよりも多く、４個もしくはそれよりも多く、５個もしくはそれよりも多く、６個もしくはそれよりも多く、７個もしくはそれよりも多く、８個もしくはそれよりも多く、９個もしくはそれよりも多く、１０個もしくはそれよりも多く、１１個もしくはそれよりも多く、１２個もしくはそれよりも多く、１３個もしくはそれよりも多く、１４個もしくはそれよりも多く、１５個もしくはそれよりも多く、１６個もしくはそれよりも多く、またはすべてを含み得る。そのような突然変異は、例えば、頭頸部がんに関連している。突然変異は、任意の順序であってよい。抗原性ペプチドは、直接ひとつに融合していても、リンカーによってひとつに連結されていてもよく、リンカーの例は本明細書の他所に開示されている。具体例において、抗原性ペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべては、反復性がん突然変異の各側に隣接する天然に存在する１０個のアミノ酸をそれぞれが含む２１ｍｅｒ（例えば、リンカーによってひとつに連結している２１ｍｅｒ）であり得る。そのような抗原性ペプチドの例は、実施例１１において提供される。抗原性ペプチドは、例えば、表１１２における抗原性ペプチドのうちの１個もしくはそれよりも多く、２個もしくはそれよりも多く、３個もしくはそれよりも多く、４個もしくはそれよりも多く、５個もしくはそれよりも多く、６個もしくはそれよりも多く、７個もしくはそれよりも多く、８個もしくはそれよりも多く、９個もしくはそれよりも多く、１０個もしくはそれよりも多く、１１個もしくはそれよりも多く、１２個もしくはそれよりも多く、１３個もしくはそれよりも多く、１４個もしくはそれよりも多く、１５個もしくはそれよりも多く、１６個もしくはそれよりも多く、またはすべてを含み得る。
【０１６３】
別の例として、がん関連タンパク質は、次の遺伝子：ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＴＲＩＭ４８、ＰＴＥＮ、ＰＯＬＥ、ＰＧＭ５、ＭＢＯＡＴ２、ＫＩＡＡ２０２６、ＦＢＸＷ７、Ｃ１２ｏｒｆ４、ＺＢＴＢ２０、ＸＹＬＴ２、ＷＮＴ１６、ＵＢＲ５、ＴＧＦＢＲ２、ＳＶＩＬ、ＲＮＦ４３、ＰＬＥＫＨＡ６、ＬＡＲＰ４Ｂ、ＦＨＯＤ３、ＤＯＣＫ３、ＢＭＰＲ２、ＡＲＩＤ１Ａ、ＡＤＡＭ２８およびＡＣＶＲ２Ａのうちの１個もしくはそれよりも多く、２個もしくはそれよりも多く、３個もしくはそれよりも多く、４個もしくはそれよりも多く、５個もしくはそれよりも多く、６個もしくはそれよりも多く、７個もしくはそれよりも多く、８個もしくはそれよりも多く、９個もしくはそれよりも多く、１０個もしくはそれよりも多く、１１個もしくはそれよりも多く、１２個もしくはそれよりも多く、１３個もしくはそれよりも多く、１４個もしくはそれよりも多く、１５個もしくはそれよりも多く、１６個もしくはそれよりも多く、１７個もしくはそれよりも多く、１８個もしくはそれよりも多く、１９個もしくはそれよりも多く、２０個もしくはそれよりも多く、２１個もしくはそれよりも多く、２２個もしくはそれよりも多く、２３個もしくはそれよりも多く、２４個もしくはそれよりも多く、２５個もしくはそれよりも多く、またはすべてによってコードされるタンパク質を含み得る。抗原性ペプチドは、例えば、次の反復性がん突然変異：ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ、ＢＲＡＦ＿Ｖ６００Ｅ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｈ１０４７Ｒ、ＴＲＩＭ４８＿Ｙ１９２Ｈ、ＰＴＥＮ＿Ｒ１３０Ｎ、ＰＯＬＥ＿Ｖ４１１Ｌ、ＰＯＬＥ＿Ｐ２８６Ｒ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｒ８８Ｎ、ＰＧＭ５＿Ｉ９８Ｖ、ＭＢＯＡＴ２＿Ｒ４３Ｎ、ＫＩＡＡ２０２６＿Ｒ５７４Ｃ、ＦＢＸＷ７＿Ｒ４６５Ｃ、Ｃ１２ｏｒｆ４＿Ｒ３３５Ｎ、ＺＢＴＢ２０＿ｐ．Ｐｒｏ６９２ＬｅｕｆｓＴｅｒ４３、ＸＹＬＴ２＿ｐ．Ｇｌｙ５２９ＡｌａｆｓＴｅｒ７８、ＷＮＴ１６＿ｐ．Ｇｌｙ１６７ＡｌａｆｓＴｅｒ１７、ＵＢＲ５＿ｐ．Ｇｌｕ２１２１ＬｙｓｆｓＴｅｒ２８、ＴＧＦＢＲ２＿ｐ．Ｇｌｕ１５０ＧｌｙｆｓＴｅｒ３５、ＳＶＩＬ＿ｐ．Ｍｅｔ１８６３ＴｒｐｆｓＴｅｒ４４、ＲＮＦ４３＿ｐ．Ｇｌｙ６５９ＶａｌｆｓＴｅｒ４１、ＰＬＥＫＨＡ６＿ｐ．Ｖａｌ３２８ＴｙｒｆｓＴｅｒ１７２、ＬＡＲＰ４Ｂ＿ｐ．Ｔｈｒ１６３ＨｉｓｆｓＴｅｒ４７、ＦＨＯＤ３＿ｐ．Ｓｅｒ３３６ＶａｌｆｓＴｅｒ１３８、ＤＯＣＫ３＿ｐ．Ｐｒｏ１８５２ＧｌｎｆｓＴｅｒ４５、ＢＭＰＲ２＿ｐ．Ａｓｎ５８３ＴｈｒｆｓＴｅｒ４４、ＡＲＩＤ１Ａ＿ｐ．Ａｓｐ１８５０ＴｈｒｆｓＴｅｒ３３、ＡＤＡＭ２８＿ｐ．Ａｓｎ７５ＬｙｓｆｓＴｅｒ１５およびＡＣＶＲ２Ａ＿ｐ．Ｌｙｓ４３５ＧｌｕｆｓＴｅｒ１９のうちの１個もしくはそれよりも多く、２個もしくはそれよりも多く、３個もしくはそれよりも多く、４個もしくはそれよりも多く、５個もしくはそれよりも多く、６個もしくはそれよりも多く、７個もしくはそれよりも多く、８個もしくはそれよりも多く、９個もしくはそれよりも多く、１０個もしくはそれよりも多く、１１個もしくはそれよりも多く、１２個もしくはそれよりも多く、１３個もしくはそれよりも多く、１４個もしくはそれよりも多く、１５個もしくはそれよりも多く、１６個もしくはそれよりも多く、１７個もしくはそれよりも多く、１８個もしくはそれよりも多く、１９個もしくはそれよりも多く、２０個もしくはそれよりも多く、２１個もしくはそれよりも多く、２２個もしくはそれよりも多く、２３個もしくはそれよりも多く、２４個もしくはそれよりも多く、２５個もしくはそれよりも多く、２６個もしくはそれよりも多く、２７個もしくはそれよりも多く、またはすべてを含み得る。そのような突然変異は、例えば、ＤＮＡミスマッチ修復欠損がんまたは腫瘍に関連している。突然変異は、任意の順序であってよい。抗原性ペプチドは、直接ひとつに融合していても、リンカーによってひとつに連結されていてもよく、リンカーの例は本明細書の他所に開示されている。具体例において、抗原性ペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべては、反復性がん突然変異の各側に隣接する天然に存在する１０個のアミノ酸をそれぞれが含む２１ｍｅｒ（例えば、リンカーによってひとつに連結している２１ｍｅｒ）であり得る。そのような抗原性ペプチドの例は、実施例１１において提供される。抗原性ペプチドは、例えば、表１１６における抗原性ペプチドのうちの１個もしくは複数、２個もしくはそれよりも多く、３個もしくはそれよりも多く、４個もしくはそれよりも多く、５個もしくはそれよりも多く、６個もしくはそれよりも多く、７個もしくはそれよりも多く、８個もしくはそれよりも多く、９個もしくはそれよりも多く、１０個もしくはそれよりも多く、１１個もしくはそれよりも多く、１２個もしくはそれよりも多く、１３個もしくはそれよりも多く、１４個もしくはそれよりも多く、１５個もしくはそれよりも多く、１６個もしくはそれよりも多く、１７個もしくはそれよりも多く、１８個もしくはそれよりも多く、１９個もしくはそれよりも多く、２０個もしくはそれよりも多く、２１個もしくはそれよりも多く、２２個もしくはそれよりも多く、２３個もしくはそれよりも多く、２４個もしくはそれよりも多く、２５個もしくはそれよりも多く、２６個もしくはそれよりも多く、２７個もしくはそれよりも多く、またはすべてを含み得る。例示的な融合ポリペプチドインサート配列（すなわち、ｔＬＬＯの下流のペプチド配列）は、配列番号９１７に示される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一な配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。各構築物における個々の構成成分のアミノ酸位置の内訳を表１１７に提供する。
【０１６４】
Ｃ．ＰＥＳＴ含有ペプチド
本明細書において開示される組換え融合タンパク質は、ＰＥＳＴ含有ペプチドを含む。ＰＥＳＴ含有ペプチドは、融合ポリペプチドのアミノ末端（Ｎ末端）（すなわち、抗原性ペプチドに対してＮ末端側）にあってもよいし、融合ポリペプチドのカルボキシ末端（Ｃ末端）（すなわち、抗原性ペプチドに対してＣ末端側）にあってもよいし、抗原性ペプチド内に埋め込まれていてもよい。一部の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株および方法において、ＰＥＳＴ含有ペプチドは、融合ポリペプチドの一部ではなく、融合ポリペプチドから分離している。ＬＬＯペプチドなどのＰＥＳＴ様配列に抗原性ペプチドを融合させると、抗原性ペプチドの免疫原性を増強することができ、細胞媒介性および抗腫瘍免疫応答を増大させる（すなわち、細胞媒介性および抗腫瘍免疫を増大させる）ことができる。例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれているSinghら（２００５年）、J  Immunol、１７５巻（６号）：３６６３〜３６７３頁を参照されたい。
【０１６５】
ＰＥＳＴ含有ペプチドは、ＰＥＳＴ配列またはＰＥＳＴ様配列を含むものである。真核生物タンパク質におけるＰＥＳＴ配列は、かねてから同定されている。例えば、プロリン（Ｐ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）、およびスレオニン（Ｔ）に富んだアミノ酸配列（ＰＥＳＴ）を含むタンパク質には、必ずしもそうとは限らないが、概して、いくつかの正に荷電したアミノ酸を含むクラスターが隣接しており、急速な細胞内半減期を有する（あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれているRogersら（１９８６年）、Science、２３４巻：３６４〜３６９頁）。さらに、これらの配列により、このタンパク質がユビキチン−プロテオソーム経路による分解の標的となることが報告されている（あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれているRechsteinerおよびRogers（１９９６年）、Trends  Biochem.  Sci.、２１巻：２６７〜２７１頁）。この経路は、真核細胞によってＭＨＣクラスＩに結合する免疫原性ペプチドを生成するためにも使用され、ＰＥＳＴ配列は、免疫原性ペプチドを生じさせる真核生物タンパク質において豊富であると仮定されている（あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれているRealiniら（１９９４年）、FEBS  Lett.、３４８巻：１０９〜１１３頁）。原核生物タンパク質はこの酵素経路を有しないため、通常はＰＥＳＴ配列を含まない。しかしながら、アミノ酸プロリン（Ｐ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）、およびスレオニン（Ｔ）に富んだＰＥＳＴ様配列は、ＬＬＯのアミノ末端において報告されており、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの病原性に必須であることが報告されている（あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれているDecaturおよびPortnoy（２０００年）、Science、２９０巻：９９２〜９９５頁）。このＰＥＳＴ様配列がＬＬＯに存在することで、ＬＬＯがその機能を果たし、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓがファゴソームまたはファゴリソソームの空胞から脱出することを促進したら、それが細胞を損傷し得る前に破壊されるように、タンパク質が宿主細胞のタンパク質分解機序による破壊の標的となる。
【０１６６】
ＰＥＳＴおよびＰＥＳＴ様配列の同定は当技術分野で周知であり、例えば、Rogersら（１９８６年）、Science、２３４巻（４７７４号）：３６４〜３７８頁、ならびにRechsteinerおよびRogers（１９９６年）、Trends  Biochem.  Sci.、２１巻：２６７〜２７１頁に記載されており、これらはそれぞれ、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれている。ＰＥＳＴまたはＰＥＳＴ様配列は、ＰＥＳＴ−ｆｉｎｄプログラムを使用して同定することができる。例えば、ＰＥＳＴ様配列は、プロリン（Ｐ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）、およびスレオニン（Ｔ）残基に富んだ領域であり得る。必要に応じて、ＰＥＳＴ様配列には、いくつかの正に荷電したアミノ酸を含む１つまたは複数のクラスターが隣接していてもよい。例えば、ＰＥＳＴ様配列は、プロリン（Ｐ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）、および／またはスレオニン（Ｔ）残基の局所濃度が高い、少なくとも１２アミノ酸長の親水性区画として定義され得る。場合によっては、ＰＥＳＴ様配列は、正に荷電したアミノ酸、すなわちアルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、およびリシン（Ｋ）を含まない。一部のＰＥＳＴ様配列は、１つまたは複数の内部リン酸化部位を含む場合があり、これらの部位におけるリン酸化は、タンパク質分解に先行する。
【０１６７】
一例において、ＰＥＳＴ様配列は、Rogersらにおいて開示されているアルゴリズムに当てはまる。別の例では、ＰＥＳＴ様配列は、RechsteinerおよびRogersにおいて開示されているアルゴリズムに当てはまる。ＰＥＳＴ様配列は、規定のタンパク質配列内における正に荷電したアミノ酸Ｒ、Ｈ、およびＫの初期スキャンによって同定することもできる。正に荷電したフランクの間のすべてのアミノ酸が計数され、ウィンドウサイズパラメーターと等しいかまたはそれを超える数のアミノ酸を含むモチーフのみが、さらに検討される。必要に応じて、ＰＥＳＴ様配列は、少なくとも１つのＰ、少なくとも１つのＤまたはＥ、および少なくとも１つのＳまたはＴを含まなければならない。
【０１６８】
ＰＥＳＴモチーフの質は、重要なアミノ酸の局所集中ならびにモチーフの疎水性に基づくスコアリングパラメーターによって洗練することができる。Ｄ、Ｅ、Ｐ、Ｓ、およびＴの集中は、質量パーセント（ｗ／ｗ）で表され、１当量のＤまたはＥ、１当量のＰ、および１当量のＳまたはＴに対して補正される。疎水性の計算は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれている、KyteおよびDoolittle（１９８２年）、J.  Mol.  Biol.、１５７巻：１０５頁の方法に原則的に従うこともできる。計算を簡略化するために、元々はアルギニン−４．５からイソロイシン＋４．５までの範囲であったＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅハイドロパシー指数は、以下の線形変換を使用して正の整数に変換され、これにより、アルギニン０からイソロイシン９０までの値が得られた：ハイドロパシー指数＝１０＊Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅハイドロパシー指数＋４５。
【０１６９】
潜在的なＰＥＳＴモチーフの疎水性は、各アミノ酸種のモルパーセントと疎水性指数との積の合計として計算することもできる。望ましいＰＥＳＴスコアは、以下の等式によって表される局所集中タームおよび疎水性タームの組合せとして得られる：ＰＥＳＴスコア＝０．５５＊ＤＥＰＳＴ−０．５＊疎水性指数。
【０１７０】
よって、ＰＥＳＴ含有ペプチドは、上記のアルゴリズムを使用して少なくとも＋５のスコアを有するペプチドを指す場合がある。代替的に、ＰＥＳＴ含有ペプチドは、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも３２、少なくとも３５、少なくとも３８、少なくとも４０、または少なくとも４５のスコアを有するペプチドを指す場合がある。
【０１７１】
当技術分野で公知である任意の他の利用可能な方法またはアルゴリズムを使用して、ＰＥＳＴ様配列を同定することもできる。例えば、ＣａＳＰｒｅｄｉｃｔｏｒを参照されたい（あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれているGaray-Malpartidaら（２００５年）、Bioinformatics、２１巻、付録１：ｉ１６９〜７６頁）。使用され得る別の方法は次のものである：アミノ酸Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、またはＧｌｎに１の値を割り当てることにより、適切な長さの各区画（例えば、３０〜３５個のアミノ酸の区画）についてのＰＥＳＴ指数を計算する。ＰＥＳＴ残基のそれぞれの係数値（ＣＶ）は１であり、他のＡＡ（非ＰＥＳＴ）のそれぞれのＣＶはゼロである。
【０１７２】
ＰＥＳＴ様アミノ酸配列の例は、配列番号３２０〜３２８に示されているものである。ＰＥＳＴ様配列の一例は、ＫＥＮＳＩＳＳＭＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫ（配列番号３２０）である。ＰＥＳＴ様配列の別の例は、ＫＥＮＳＩＳＳＭＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫ（配列番号３２１）である。しかしながら、いかなるＰＥＳＴまたはＰＥＳＴ様アミノ酸配列を使用してもよい。ＰＥＳＴ配列ペプチドは公知であり、例えば、ＵＳ７，６３５，４７９、ＵＳ７，６６５，２３８、およびＵＳ２０１４／０１８６３８７に記載されており、これらはそれぞれ、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０１７３】
ＰＥＳＴ様配列は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ種由来、例えばＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ由来であり得る。例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＡｃｔＡタンパク質は、少なくとも４つのかかる配列（配列番号３２２〜３２５）を含み、そのいずれもが本明細書において開示される組成物および方法において使用するのに好適である。他の同様のＰＥＳＴ様配列としては、配列番号３２９〜３３１が挙げられる。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．に由来するストレプトリジンＯタンパク質もＰＥＳＴ配列を含む。例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓストレプトリジンＯは、ＰＥＳＴ配列ＫＱＮＴＡＳＴＥＴＴＴＴＮＥＱＰＫ（配列番号３２６）をアミノ酸３５〜５１に含み、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓストレプトリジンＯは、ＰＥＳＴ様配列ＫＱＮＴＡＮＴＥＴＴＴＴＮＥＱＰＫ（配列番号３２７）をアミノ酸３８〜５４に含む。ＰＥＳＴ様配列の別の例は、ｌｓｏ遺伝子によってコードされるＬｉｓｔｅｒｉａ  ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ細胞溶解素に由来するＲＳＥＶＴＩＳＰＡＥＴＰＥＳＰＰＡＴＰ（例えば配列番号３２８）である。
【０１７４】
代替的に、ＰＥＳＴ様配列は、他の原核生物に由来してもよい。ＰＥＳＴ様アミノ酸配列が予想される他の原核生物としては、例えば、他のＬｉｓｔｅｒｉａ種が挙げられる。
【０１７５】
（１）リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）
本明細書において開示される組成物および方法において利用され得るＰＥＳＴ含有ペプチドの一例は、リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）ペプチドである。ＬＬＯタンパク質の一例は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ１３１２８が割り当てられたタンパク質である（配列番号３３２；核酸配列はＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ１５１２７に示されている）。配列番号３３２は、シグナル配列を含むプロタンパク質である。このプロタンパク質のうち最初の２５個のアミノ酸はシグナル配列であり、これが細菌によって分泌されるときにＬＬＯから切断されることにより、シグナル配列のない５０４アミノ酸の全長活性ＬＬＯタンパク質がもたらされる。本明細書において開示されるＬＬＯペプチドは、シグナル配列を含んでもよいし、シグナル配列を含まないペプチドを含んでもよい。使用され得る例示的なＬＬＯタンパク質は、配列番号３３２に示される配列、もしくは配列番号３３２のホモログ、バリアント、アイソフォーム、アナログ、断片、ホモログの断片、バリアントの断片、アナログの断片、およびアイソフォームの断片を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる。ＬＬＯタンパク質の断片、またはＬＬＯタンパク質のホモログ、バリアント、アイソフォーム、アナログ、ホモログの断片、バリアントの断片、もしくはアナログの断片をコードする任意の配列を使用することができる。相同ＬＬＯタンパク質は、参照ＬＬＯタンパク質と、例えば７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％超の配列同一性を有し得る。
【０１７６】
ＬＬＯタンパク質の別の例は、配列番号３３３に示されている。使用され得るＬＬＯタンパク質は、配列番号３３３に示される配列、もしくは配列番号３３３のホモログ、バリアント、アイソフォーム、アナログ、断片、ホモログの断片、バリアントの断片、アナログの断片、およびアイソフォームの断片を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなってもよい。
【０１７７】
ＬＬＯタンパク質の別の例は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＺＰ＿０１９４２３３０もしくはＥＢＡ２１８３３に示される、またはＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＺ＿ＡＡＲＺ０１００００１５もしくはＡＡＲＺ０１００００１５．１に示される核酸配列によってコードされる、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  １０４０３Ｓ株に由来するＬＬＯタンパク質である。ＬＬＯタンパク質の別の例は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ４ｂ  Ｆ２３６５株（例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＹＰ＿０１２８２３を参照されたい）、ＥＧＤ−ｅ株（例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＰ＿４６３７３３を参照されたい）、または任意の他のＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株に由来するＬＬＯタンパク質である。ＬＬＯタンパク質のさらに別の例は、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＨＴＣＣ２１７０に由来するＬＬＯタンパク質である（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＺＰ＿０１１０６７４７もしくはＥＡＲ０１４３３、またはＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＺ＿ＡＡＯＣ０１０００００３によってコードされるものを参照されたい）。使用され得るＬＬＯタンパク質は、上記のＬＬＯタンパク質、または上記のＬＬＯタンパク質のホモログ、バリアント、アイソフォーム、アナログ、断片、ホモログの断片、バリアントの断片、アナログの断片、およびアイソフォームの断片のうちのいずれかを含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなってもよい。
【０１７８】
ＬＬＯ、またはそのホモログ、バリアント、アイソフォーム、アナログ、断片、ホモログの断片、バリアントの断片、アナログの断片、およびアイソフォームの断片と相同であるタンパク質を使用することもできる。１つのそのような例は、例えば、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｖｅｉに見出すことができるアルベオリジン（alveolysin）である（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：Ｐ２３５６４もしくはＡＡＡ２２２２４、またはＧｅｎＢａｎｋ受託番号：Ｍ６２７０９によってコードされるものを参照されたい）。他のそのような相同タンパク質は公知である。
【０１７９】
ＬＬＯペプチドは、全長ＬＬＯタンパク質、またはトランケート型ＬＬＯタンパク質もしくはＬＬＯ断片であってもよい。同様に、ＬＬＯペプチドは、天然ＬＬＯタンパク質の１つまたは複数の機能性を保持するものであっても、天然ＬＬＯタンパク質の１つまたは複数の機能性を欠いているものであってもよい。例えば、保持されるＬＬＯの機能性は、ファゴソームもしくはファゴリソソームから細菌（例えばＬｉｓｔｅｒｉａ）が脱出することを可能にすること、またはそれが融合するペプチドの免疫原性を増強することであり得る。保持される機能性は、溶血機能または抗原機能であってもよい。代替的に、ＬＬＯペプチドは、非溶血性ＬＬＯであってもよい。ＬＬＯの他の機能が公知であり、ＬＬＯ機能性を評価するための方法およびアッセイも同じく公知である。
【０１８０】
ＬＬＯ断片は、ＰＥＳＴ様配列であってもよいし、またはＰＥＳＴ様配列を含んでもよい。ＬＬＯ断片は、内部欠失、Ｃ末端からのトランケーション、およびＮ末端からのトランケーションのうちの１つまたは複数を含み得る。場合によっては、ＬＬＯ断片は、１つより多くの内部欠失を含んでもよい。他のＬＬＯペプチドは、１つまたは複数の突然変異を有する全長ＬＬＯタンパク質であり得る。
【０１８１】
一部のＬＬＯタンパク質または断片は、野生型ＬＬＯと比べて低減した溶血活性を有するか、または非溶血性断片である。例えば、ＬＬＯタンパク質は、カルボキシ末端における活性化ドメインの欠失もしくは突然変異、システイン４８４の欠失もしくは突然変異、または別の位置における欠失もしくは突然変異によって、非溶血性にされてもよい。
【０１８２】
他のＬＬＯタンパク質は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれているＵＳ８，７７１，７０２に詳述されているように、コレステロール結合ドメイン（ＣＢＤ）の欠失または突然変異によって非溶血性にされる。突然変異は、例えば、置換または欠失を含み得る。ＣＢＤ全体が突然変異してもよいし、ＣＢＤの一部分が突然変異してもよいし、またはＣＢＤ内の特定の残基が突然変異してもよい。例えば、ＬＬＯタンパク質は、配列番号３３２の残基Ｃ４８４、Ｗ４９１、およびＷ４９２のうちの１つまたは複数（例えばＣ４８４、Ｗ４９１、Ｗ４９２、Ｃ４８４およびＷ４９１、Ｃ４８４およびＷ４９２、Ｗ４９１およびＷ４９２、または３つすべての残基）、または配列番号３３２と最適にアラインされたときに対応する残基（例えば、対応するシステインまたはトリプトファン残基）の突然変異を含み得る。例として、ＬＬＯの残基Ｃ４８４、Ｗ４９１、およびＷ４９２がアラニン残基で置換されている突然変異体ＬＬＯタンパク質を作ることができる。この置換は、溶血活性を野生型ＬＬＯと比べて実質的に低減させる。Ｃ４８４Ａ、Ｗ４９１Ａ、およびＷ４９２Ａの突然変異を有する突然変異体ＬＬＯタンパク質を「ｍｕｔＬＬＯ」と呼ぶ。
【０１８３】
別の例として、コレステロール結合ドメインを含む内部欠失を有する突然変異体ＬＬＯタンパク質を作ることができる。配列番号３３２のコレステロール結合ドメインの配列は、配列番号３５１に示されている。例えば、内部欠失は、１〜１１アミノ酸の欠失であっても、１１〜５０アミノ酸の欠失であっても、またはそれより長くてもよい。同様に、突然変異領域は、１〜１１アミノ酸、１１〜５０アミノ酸、またはそれより長いアミノ酸（例えば、１〜５０、１〜１１、２〜１１、３〜１１、４〜１１、５〜１１、６〜１１、７〜１１、８〜１１、９〜１１、１０〜１１、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、２〜３、２〜４、２〜５、２〜６、２〜７、２〜８、２〜９、２〜１０、３〜４、３〜５、３〜６、３〜７、３〜８、３〜９、３〜１０、１２〜５０、１１〜１５、１１〜２０、１１〜２５、１１〜３０、１１〜３５、１１〜４０、１１〜５０、１１〜６０、１１〜７０、１１〜８０、１１〜９０、１１〜１００、１１〜１５０、１５〜２０、１５〜２５、１５〜３０、１５〜３５、１５〜４０、１５〜５０、１５〜６０、１５〜７０、１５〜８０、１５〜９０、１５〜１００、１５〜１５０、２０〜２５、２０〜３０、２０〜３５、２０〜４０、２０〜５０、２０〜６０、２０〜７０、２０〜８０、２０〜９０、２０〜１００、２０〜１５０、３０〜３５、３０〜４０、３０〜６０、３０〜７０、３０〜８０、３０〜９０、３０〜１００または３０〜１５０アミノ酸）であってもよい。例えば、配列番号３３２の残基４７０〜５００、４７０〜５１０、または４８０〜５００からなる突然変異領域は、ＣＢＤ（配列番号３３２の残基４８３〜４９３）を含む欠失配列をもたらす。しかしながら、突然変異領域はＣＢＤの断片であってもよいし、またはＣＢＤの一部分と重複してもよい。例えば、突然変異領域は、配列番号３３２の残基４７０〜４９０、４８０〜４８８、４８５〜４９０、４８６〜４８８、４９０〜５００、または４８６〜５１０からなり得る。例えば、ＣＢＤの断片（残基４８４〜４９２）は、異種配列に置き換えられ得る。この置き換えは、溶血活性を野生型ＬＬＯと比べて実質的に低減させる。例えば、ＣＢＤ（ＥＣＴＧＬＡＷＥＷＷＲ；配列番号３５１）は、ＮＹ−ＥＳＯ−１のＨＬＡ−Ａ２制限エピトープ１５７〜１６５を含む、抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１のＣＴＬエピトープ（ＥＳＬＬＭＷＩＴＱＣＲ；配列番号３５２）に置き換えられ得る。結果として生じるＬＬＯを「ｃｔＬＬＯ」と呼ぶ。
【０１８４】
一部の突然変異ＬＬＯタンパク質では、突然変異領域は、異種配列によって置き換えられ得る。例えば、突然変異領域は、同数の異種アミノ酸、より小さい数の異種アミノ酸、またはより大きい数のアミノ酸（例えば、１〜５０、１〜１１、２〜１１、３〜１１、４〜１１、５〜１１、６〜１１、７〜１１、８〜１１、９〜１１、１０〜１１、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、２〜３、２〜４、２〜５、２〜６、２〜７、２〜８、２〜９、２〜１０、３〜４、３〜５、３〜６、３〜７、３〜８、３〜９、３〜１０、１２〜５０、１１〜１５、１１〜２０、１１〜２５、１１〜３０、１１〜３５、１１〜４０、１１〜５０、１１〜６０、１１〜７０、１１〜８０、１１〜９０、１１〜１００、１１〜１５０、１５〜２０、１５〜２５、１５〜３０、１５〜３５、１５〜４０、１５〜５０、１５〜６０、１５〜７０、１５〜８０、１５〜９０、１５〜１００、１５〜１５０、２０〜２５、２０〜３０、２０〜３５、２０〜４０、２０〜５０、２０〜６０、２０〜７０、２０〜８０、２０〜９０、２０〜１００、２０〜１５０、３０〜３５、３０〜４０、３０〜６０、３０〜７０、３０〜８０、３０〜９０、３０〜１００または３０〜１５０アミノ酸）によって置き換えられ得る。他の突然変異ＬＬＯタンパク質は、１つまたは複数の点突然変異（例えば、１残基、２残基、３残基、またはそれよりも多くの点突然変異）を有する。突然変異残基は、連続していても連続していなくてもよい。
【０１８５】
１つの実施形態例では、ＬＬＯペプチドは、シグナル配列内の欠失およびＣＢＤ内の突然変異または置換を有し得る。
【０１８６】
一部のＬＬＯペプチドは、Ｎ末端ＬＬＯ断片（すなわち、Ｃ末端欠失を有するＬＬＯタンパク質）である。一部のＬＬＯペプチドは、少なくとも４９４、４８９、４９２、４９３、５００、５０５、５１０、５１５、５２０、もしくは５２５アミノ酸長、または４９２〜５２８アミノ酸長である。例えば、ＬＬＯ断片は、ＬＬＯタンパク質のうち最初の約４４０または４４１個のアミノ酸（例えば、配列番号３３２もしくは３３３のうち最初の４４１個のアミノ酸、または配列番号３３２もしくは３３３と最適にアラインされた場合の別のＬＬＯタンパク質の対応する断片）からなる場合がある。他のＮ末端ＬＬＯ断片は、ＬＬＯタンパク質の最初の４２０個のアミノ酸（例えば、配列番号３３２もしくは３３３のうち最初の４２０個のアミノ酸、または配列番号３３２もしくは３３３と最適にアラインされた場合の別のＬＬＯタンパク質の対応する断片）からなる場合がある。他のＮ末端断片は、ＬＬＯタンパク質のアミノ酸２０〜４４２付近（例えば、配列番号３３２もしくは３３３のアミノ酸２０〜４４２、または配列番号３３２もしくは３３３と最適にアラインされた場合の別のＬＬＯタンパク質の対応する断片）からなる場合がある。他のＮ末端ＬＬＯ断片は、システイン４８４を含む活性化ドメインを含まない、特にシステイン４８４を含まない、任意のΔＬＬＯを含む。例えば、Ｎ末端ＬＬＯ断片は、ＬＬＯタンパク質のうち最初の４２５、４００、３７５、３５０、３２５、３００、２７５、２５０、２２５、２００、１７５、１５０、１２５、１００、７５、５０、または２５個のアミノ酸（例えば、配列番号３３２もしくは３３３のうち最初の４２５、４００、３７５、３５０、３２５、３００、２７５、２５０、２２５、２００、１７５、１５０、１２５、１００、７５、５０、もしくは２５個のアミノ酸、または配列番号３３２もしくは３３３と最適にアラインされた場合の別のＬＬＯタンパク質の対応する断片）に対応し得る。好ましくは、断片は、１つまたは複数のＰＥＳＴ様配列を含む。ＬＬＯ断片およびトランケート型ＬＬＯタンパク質は、上記の特定のアミノ酸範囲のうちのいずれか１つに対応する相同ＬＬＯタンパク質の残基を含み得る。残基数は、上記に列挙した残基数と厳密に一致する必要はない（例えば、相同ＬＬＯタンパク質が、本明細書において開示される特定のＬＬＯタンパク質に対する挿入または欠失を有する場合）。Ｎ末端ＬＬＯ断片の例としては、配列番号３３４、３３５、および３３６が挙げられる。使用され得るＬＬＯタンパク質は、配列番号３３４、３３５、もしくは３３６に示される配列、または配列番号３３４、３３５、もしくは３３６のホモログ、バリアント、アイソフォーム、アナログ、断片、ホモログの断片、バリアントの断片、アナログの断片、およびアイソフォームの断片を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる。一部の組成物および方法では、配列番号３３６に示されるＮ末端ＬＬＯ断片が使用される。配列番号３３６に示されるＮ末端ＬＬＯ断片をコードする核酸の一例は、配列番号３３７である。
【０１８７】
（２）ＡｃｔＡ
本明細書において開示される組成物および方法において利用され得るＰＥＳＴ含有ペプチドの別の例は、ＡｃｔＡペプチドである。ＡｃｔＡは表面結合タンパク質であり、細胞質を通してＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを推進するために、宿主のアクチンポリマーの重合、組立、および活性化を促進するための、感染宿主細胞内の足場として作用する。哺乳動物細胞サイトゾルに進入した直後、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓは、宿主のアクチン線維の重合を誘導し、アクチン重合により発生した力を使用して、まず細胞内に、そして細胞から細胞へと移動する。ＡｃｔＡは、アクチン核形成およびアクチンに基づく運動の媒介に関与する。ＡｃｔＡタンパク質は、宿主の細胞骨格構成成分のための複数の結合部位をもたらすことにより、細胞のアクチン重合機序を組み立てるための足場として作用する。ＡｃｔＡのＮ末端は、単量体アクチンに結合し、内因性のアクチン核形成活性を刺激することにより構成的活性型の核形成促進因子として作用する。ａｃｔＡおよびｈｌｙ遺伝子はいずれも、転写活性化因子ＰｒｆＡによって調節される１０ｋｂ遺伝子クラスターのメンバーであり、ａｃｔＡは、哺乳動物のサイトゾルにおいておよそ２２６倍上方調節される。ＡｃｔＡタンパク質、またはＡｃｔＡタンパク質のホモログ、バリアント、アイソフォーム、アナログ、ホモログの断片、バリアントの断片、もしくはアナログの断片をコードする任意の配列を使用することができる。相同ＡｃｔＡタンパク質は、参照ＡｃｔＡタンパク質と、例えば７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％超の配列同一性を有し得る。
【０１８８】
ＡｃｔＡタンパク質の一例は、配列番号３３８に示される配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。ＡｃｔＡタンパク質の別の例は、配列番号３３９に示される配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。これらの配列のいずれかに対応するプロタンパク質のうち最初の２９個のアミノ酸はシグナル配列であり、これが細菌によって分泌されるときにＡｃｔＡタンパク質から切断される。ＡｃｔＡペプチドは、シグナル配列（例えば、配列番号３３８または３３９のアミノ酸１〜２９）を含んでもよいし、シグナル配列を含まないペプチドを含んでもよい。ＡｃｔＡタンパク質の他の例は、配列番号３３８もしくは３３９のホモログ、バリアント、アイソフォーム、アナログ、断片、ホモログの断片、アイソフォームの断片、またはアナログの断片を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる。
【０１８９】
ＡｃｔＡタンパク質の別の例は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  １０４０３Ｓ株（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＤＱ０５４５８５）、ＮＩＣＰＢＰ  ５４００２株（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＥＵ３９４９５９）、Ｓ３株（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＥＵ３９４９６０）、ＮＣＴＣ  ５３４８株（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＥＵ３９４９６１）、ＮＩＣＰＢＰ  ５４００６株（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＥＵ３９４９６２）、Ｍ７株（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＥＵ３９４９６３）、Ｓ１９株（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＥＵ３９４９６４）、または任意の他のＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株に由来するＡｃｔＡタンパク質である。使用され得るＬＬＯタンパク質は、上記のＬＬＯタンパク質、または上記のＬＬＯタンパク質のホモログ、バリアント、アイソフォーム、アナログ、断片、ホモログの断片、バリアントの断片、アナログの断片、およびアイソフォームの断片のうちのいずれかを含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなってもよい。
【０１９０】
ＡｃｔＡペプチドは、全長ＡｃｔＡタンパク質、またはトランケート型ＡｃｔＡタンパク質もしくはＡｃｔＡ断片（例えば、Ｃ末端側部分が除去されているＮ末端ＡｃｔＡ断片）であってもよい。好ましくは、トランケート型ＡｃｔＡタンパク質は、少なくとも１つのＰＥＳＴ配列（例えば、１つより多くのＰＥＳＴ配列）を含む。加えて、トランケート型ＡｃｔＡタンパク質は、必要に応じて、ＡｃｔＡシグナルペプチドを含んでもよい。トランケート型ＡｃｔＡタンパク質に含まれるＰＥＳＴ様配列の例としては、配列番号３２２〜３２５が挙げられる。一部のそのようなトランケート型ＡｃｔＡタンパク質は、配列番号３２２〜３２５に示されるＰＥＳＴ様配列のうちの少なくとも２つもしくはそれらのホモログ、配列番号３２２〜３２５に示されるＰＥＳＴ様配列のうちの少なくとも３つもしくはそれらのホモログ、または配列番号３２２〜３２５に示されるＰＥＳＴ様配列の４つすべてもしくはそれらのホモログを含む。トランケート型ＡｃｔＡタンパク質の例としては、全長ＡｃｔＡタンパク質配列（例えば配列番号３３９）の残基３０〜１２２付近、残基３０〜２２９付近、残基３０〜３３２付近、残基３０〜２００付近、もしくは残基３０〜３９９付近を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなるものが挙げられる。トランケート型ＡｃｔＡタンパク質の他の例としては、全長ＡｃｔＡタンパク質配列（例えば配列番号３３９）のうち最初の約５０、１００、１５０、２００、２３３、２５０、３００、３９０、４００、もしくは４１８個の残基を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなるものが挙げられる。トランケート型ＡｃｔＡタンパク質の他の例としては、全長ＡｃｔＡタンパク質配列（例えば配列番号３３９）の残基２００〜３００もしくは残基３００〜４００付近を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなるものが挙げられる。例えば、トランケート型ＡｃｔＡは、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれているＵＳ７，６５５，２３８に記載されている、野生型ＡｃｔＡタンパク質のうち最初の３９０個のアミノ酸からなる。別の例として、トランケート型ＡｃｔＡは、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれているＵＳ２０１４／０１８６３８７に記載されている、ＰＥＳＴモチーフが欠失しており、非保存的ＱＤＮＫＲ（配列番号３５０）置換を含む、ＡｃｔＡ−Ｎ１００またはその修飾バージョン（ＡｃｔＡ−Ｎ１００＊と呼ぶ）であり得る。代替的に、トランケート型ＡｃｔＡタンパク質は、上記のアミノ酸範囲、または本明細書において開示されるＡｃｔＡペプチドのうちのいずれかのアミノ酸範囲のうちの１つに対応する、相同ＡｃｔＡタンパク質の残基を含んでもよい。残基数は、本明細書において列挙される残基数と厳密に一致する必要はない（例えば、相同ＡｃｔＡタンパク質が、本明細書において利用されるＡｃｔＡタンパク質に対する挿入または欠失を有する場合、それに従って残基数を調整してよい）。
【０１９１】
トランケート型ＡｃｔＡタンパク質の例としては、例えば、配列番号３４０、３４１、３４２、もしくは３４３に示される配列、または配列番号３４０、３４１、３４２、もしくは３４３のホモログ、バリアント、アイソフォーム、アナログ、バリアントの断片、アイソフォームの断片、もしくはアナログの断片を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなるタンパク質が挙げられる。配列番号３４０は、ＡｃｔＡ／ＰＥＳＴ１と呼ばれ、配列番号３３９に示される全長ＡｃｔＡ配列のアミノ酸３０〜１２２からなる。配列番号３４１は、ＡｃｔＡ／ＰＥＳＴ２またはＬＡ２２９と呼ばれ、配列番号３３９に示される全長ＡｃｔＡ配列に示される全長ＡｃｔＡ配列のアミノ酸３０〜２２９からなる。配列番号３４２は、ＡｃｔＡ／ＰＥＳＴ３と呼ばれ、配列番号３３９に示される全長ＡｃｔＡ配列のアミノ酸３０〜３３２からなる。配列番号３４３は、ＡｃｔＡ／ＰＥＳＴ４と呼ばれ、配列番号３３９に示される全長ＡｃｔＡ配列のアミノ酸３０〜３９９からなる。具体例として、配列番号３４１に示される配列からなるトランケート型ＡｃｔＡタンパク質を使用することができる。
【０１９２】
トランケート型ＡｃｔＡタンパク質の例としては、例えば、配列番号３４４、３４６、３４７、もしくは３４９に示される配列、または配列番号３４４、３４６、３４７、もしくは３４９のホモログ、バリアント、アイソフォーム、アナログ、バリアントの断片、アイソフォームの断片、もしくはアナログの断片を含むか、それらから本質的になるか、あるいはそれらからなるタンパク質が挙げられる。具体例として、配列番号３４４に示される配列（配列番号３４５に示される核酸によってコードされる）からなるトランケート型ＡｃｔＡタンパク質を使用することができる。別の具体例として、配列番号３４７に示される配列（配列番号３４８に示される核酸によってコードされる）からなるトランケート型ＡｃｔＡタンパク質を使用してもよい。配列番号３４８は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  １０４０３Ｓ株におけるＡｃｔＡをコードする最初の１１７０個のヌクレオチドである。場合によっては、ＡｃｔＡ断片は、異種シグナルペプチドに融合していてもよい。例えば、配列番号３４９は、Ｈｌｙシグナルペプチドに融合したＡｃｔＡ断片を示す。
【０１９３】
Ｄ．組換え融合ポリペプチドをコードする免疫療法構築物の生成
また、本明細書において開示される組換え融合ポリペプチドをコードする免疫療法構築物、またはこの組換え融合ポリペプチドを含む組成物を生成するための方法も本明細書において提供される。例えば、かかる方法は、免疫療法構築物に含めるための、反復性がん突然変異セットを選択するステップと、反復性がん突然変異のそれぞれを含む抗原性ペプチドを設計するステップ（そして例えば、各抗原性ペプチドのハイドロパシーを検査するステップと、抗原性ペプチドが、選択されたハイドロパシー指数閾値を超えるスコアを有する場合はこれを修飾または選択解除するステップ）と、１つまたは複数の抗原性ペプチドセットを選択するステップと、選択された抗原性ペプチドのそれぞれを含む１つまたは複数の融合ポリペプチドを設計するステップと、融合ポリペプチドをコードする核酸構築物を生成するステップとを含み得る。
【０１９４】
個々の反復性がん突然変異は、任意の基準に基づいて選択してよい。例えば、個々の選択される反復性がん突然変異は、複数のタイプのがんにおける発生頻度（例えば、すべてのがん患者の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％における発生率）、特定のタイプのがんにおける発生頻度（例えば、特定のタイプのがんを有するすべての患者の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％における発生率）、がん関連タンパク質の機能的ドメイン内の位置、公知のがんドライバー突然変異としてのステータス、公知の化学療法耐性突然変異としてのステータス、または体細胞ミスセンス突然変異としての同定に基づいて選択され得る。特定のがん関連タンパク質は、例えば、特定のがん関連タンパク質における突然変異が、がんの全症例または特定のタイプのがんの少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％において生じ得る場合に選択され得る。１つまたは複数のがん関連タンパク質の選択後、最も高頻度で共通する体細胞突然変異を同定することができる。これは例えば、ＣＯＳＭＩＣ（Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ；cancer.Sanger.ac.uk）もしくはＣａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓなどのデータベース、または他の同様のがん関連遺伝子データベースを使用して行うことができる。他のそのようなデータベースの例としては、ＴＣＧＡ、ＩＧＧＣ、およびｃＢｉｏｐｏｒｔａｌが挙げられる。突然変異は、例えば、特定のタイプのがんまたはすべてのがんにおける発生頻度；本明細書の他所に開示されている突然変異ホットスポット内の位置；およびタンパク質の機能に対する突然変異の影響（例えば、腫瘍抑制タンパク質の機能喪失；公知のがん「ドライバー」突然変異；公知の化学療法耐性突然変異）のうちの１つまたは複数に従ってランク付けされ得る。必要に応じて、ナンセンス突然変異、欠失突然変異、挿入突然変異、フレームシフト突然変異、または転座突然変異のうちの１つまたは複数を除外してもよい。場合によっては、体細胞ミスセンス突然変異のみが検討される。場合によっては、フレームシフト（例えば体細胞フレームシフト突然変異）のみが検討される。場合によっては、体細胞ミスセンスおよびフレームシフト突然変異の両方が検討される。
【０１９５】
反復性がん突然変異セットは、１つまたは複数のさらなる基準に基づいて選択されてもよい。例えば、反復性がん突然変異セットは、単一のがん関連タンパク質に突然変異を有するがん患者の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、または単一のがん関連タンパク質に体細胞ミスセンス突然変異を有するがん患者の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％において見出されることになる潜在的な突然変異エピトープを含むセットに基づいて選択することができる。同様に、反復性がん突然変異セットは、特定のタイプのがんを有するがん患者の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％において見出されることになる潜在的な突然変異エピトープを含むセットに基づいて選択することができる。このセットは、単一のがん関連タンパク質に由来する少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、もしくは４０個の異なる反復性がん突然変異、または、単一のがん関連タンパク質に由来する、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、もしくは４０個の異なる反復性体細胞ミスセンスがん突然変異を含むセットに基づいて選択することもできる。同様に、このセットは、単一のタイプのがんに由来する少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、もしくは４０個の異なる反復性がん突然変異、または、単一のタイプのがんに由来する少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、もしくは４０個の異なる反復性体細胞ミスセンスがん突然変異を含むセットに基づいて選択することもできる。例えば、単一のタイプのがんは、非小細胞肺がん、前立腺がん、膵臓がん、膀胱がん、乳がん（例えばＥＲ＋乳がん）、子宮がん、卵巣がん、低悪性度神経膠腫、結腸直腸がん（例えばＭＳＳ結腸直腸がん）、または頭頸部がんであり得る。このセットは、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９もしくは５０個以下の反復性がん突然変異を含むセット、または特定の送達系（例えば細菌送達系）の容量に基づく任意の他の閾値に基づいて選択することもできる。加えて、このセットは、ステップ（ａ）で選択された反復性がん突然変異の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはすべてが単一のがん関連タンパク質に由来するように、または、ステップ（ａ）における反復性がん突然変異のうち、同じがん関連タンパク質に由来するものが５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以下である、もしくは全くないように選択されてもよい。
【０１９６】
具体例において、突然変異データは、疾患の徴候タイプによって細層別化される場合がある。特定のタイプの突然変異が検討のために選択され得る。例えば、反復性体細胞突然変異は、インフレーム突然変異およびフレームシフト突然変異をもたらすミスセンス置換および挿入／欠失（ＩＮＤＥＬ）を含み得る。体細胞突然変異は、全試料で観察された突然変異事象の総数の頻度に基づいて、特定の徴候をもつコホートにおいて順位付けることができる。ある特定の頻度（例えば１％、２％、３％、４％、５％、または１０％）未満の頻度で生じる突然変異は除外され得る。例えば、１％、２％、３％、４％、５％、または１０％に等しいおよびこれを超える疾患徴候頻度を有する反復性突然変異は、パネルに選択され得る。
【０１９７】
融合ポリペプチドに含める可能性がある反復性がん突然変異セットの同定後、各反復性がん突然変異を含む抗原性ペプチドの配列を選択することができる。各抗原性ペプチドは、例えば、反復性がん突然変異および各側の隣接配列を含むがん関連タンパク質の断片を含むように設計され得る。本明細書の他所に開示されているように、異なるサイズの抗原性ペプチドを使用してよい。しかしながら、好ましくは、異なるＨＬＡ  Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）リーディングフレームの少なくとも一部をもたらすために、クラス１  ＭＨＣ−１提示に適応するように、反復性がん突然変異の各側に少なくとも約１０個の隣接アミノ酸が組み込まれる。例えば、抗原性ペプチドは、反復性がん突然変異と、がん関連タンパク質の各側の１０個の隣接アミノ酸とを含むように選択され得る（すなわち、２１ｍｅｒ）。代替的に、例えば、抗原性ペプチドは、反復性がん突然変異と、がん関連タンパク質の各側の１３個の隣接アミノ酸とを含むように選択されてもよい（すなわち、２７ｍｅｒ）。
【０１９８】
次に、抗原性ペプチドを疎水性または親水性についてスクリーニングすることができる。抗原性ペプチドは、例えば、それらが親水性である場合に、すなわち、特定の目的の細菌（例えばＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）における分泌可能性を予測し得る、ある特定のハイドロパシー閾値以下またはそれ未満のスコアを有する場合に、選択され得る。例えば、抗原性ペプチドは、２１アミノ酸ウィンドウを用いてＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅのハイドロパシー指数によりスコアリングすることができ、カットオフ（約１．６）を超えるスコアを有するものはすべて、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓによって分泌可能である可能性が低いために除外される。例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれているKyte-Doolittle（１９８２年）、J  Mol  Biol、１５７巻（１号）：１０５〜１３２頁を参照されたい。代替的に、選択されたカットオフ付近のスコアを有する抗原性ペプチドは、変更すること（例えば、抗原性ペプチドの長さを変化させること、または抗原性ペプチドに含まれるがん関連タンパク質の領域をずらすこと）ができる（ただし、抗原性ペプチドが依然として反復性がん突然変異と各側の十分な隣接配列とを含む場合に限る）。使用され得る他のスライディングウィンドウサイズとしては、例えば、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、またはそれよりも多くのアミノ酸が挙げられる。例えば、スライディングウィンドウサイズは、９〜１１アミノ酸、１１〜１３アミノ酸、１３〜１５アミノ酸、１５〜１７アミノ酸、１７〜１９アミノ酸、１９〜２１アミノ酸、２１〜２３アミノ酸、２３〜２５アミノ酸、または２５〜２７アミノ酸であり得る。使用され得る他のカットオフとしては、例えば、次の範囲１．２〜１．４、１．４〜１．６、１．６〜１．８、１．８〜２．０、２．０〜２．２、２．２〜２．５、２．５〜３．０、３．０〜３．５、３．５〜４．０、もしくは４．０〜４．５が挙げられ、またはカットオフは、１．４、１．５、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．３、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、もしくは４．５であってもよい。カットオフは、例えば、融合ポリペプチドを送達するために使用されている細菌の属または種に応じて異なり得る。
【０１９９】
他の好適なハイドロパシープロット、または他の適切なスケールとしては、例えば、Roseら（１９９３年）、Annu  Rev  Biomol  Struct、２２巻：３８１〜４１５頁；Biswasら（２００３年）、Journal  of  Chromatography  A、１０００巻：６３７〜６５５頁；Eisenberg（１９８４年）、Ann  Rev  Biochem、５３巻：５９５〜６２３頁；AbrahamおよびLeo（１９８７年）、Proteins:  Structure,  Function  and  Genetics、２巻：１３０〜１５２頁；SweetおよびEisenberg（１９８３年）、Mol  Biol、１７１巻：４７９〜４８８頁；BullおよびBreese（１９７４年）、Arch  Biochem  Biophys、１６１巻：６６５〜６７０頁；Guy（１９８５年）、Biophys  J、４７巻：６１〜７０頁；Miyazawaら（１９８５年）、Macromolecules、１８巻：５３４〜５５２頁；Roseman（１９８８年）、J  Mol  Biol、２００巻：５１３〜５２２頁；Wolfendenら（１９８１年）、Biochemistry、２０巻：８４９〜８５５頁；Wilson（１９８１年）、Biochem  J、１９９巻：３１〜４１頁；CowanおよびWhittaker（１９９０年）、Peptide  Research、３巻：７５〜８０頁；Aboderin（１９７１年）、Int  J  Biochem、２巻：５３７〜５４４頁；Eisenbergら（１９８４年）、J  Mol  Biol、１７９巻：１２５〜１４２頁；HoppおよびWoods（１９８１年）、Proc  Natl  Acad  Sci  USA、７８巻：３８２４〜３８２８頁；ManavalanおよびPonnuswamy（１９７８年）、Nature、２７５巻：６７３〜６７４頁；BlackおよびMould（１９９１年）、Anal  Biochem、１９３巻：７２〜８２頁；FauchereおよびPliska（１９８３年）、Eur  J  Med  Chem、１８巻：３６９〜３７５頁；Janin（１９７９年）、Nature、２７７巻：４９１〜４９２頁；RaoおよびArgos（１９８６年）、Biochim  Biophys  Acta、８６９巻：１９７〜２１４頁；Tanford（１９６２年）、Am  Chem  Soc、８４巻：４２４０〜４２７４頁；Wellingら（１９８５年）、FEBS  Lett、１８８巻：２１５〜２１８頁；Parkerら（１９８６年）、Biochemistry、２５巻：５４２５〜５４３１頁；ならびにCowanおよびWhittaker（１９９０年）、Peptide  Research、３巻：７５〜８０頁において報告されているものが挙げられ、これらはそれぞれ、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０２００】
次に、必要に応じて、残りの抗原性ペプチドを、対象のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）タイプに結合する能力についてスコアリングし（例えば、ｎｅｔＭＨＣｐａｎ、ＡＮＮ、ＳＭＭＰＭＢＥＣ．ＳＭＭ、ＣｏｍｂＬｉｂ＿Ｓｉｄｎｅｙ２００８、ＰｉｃｋＰｏｃｋｅｔ、およびｎｅｔＭＨＣｃｏｎｓを含む、www.iedb.orgにおいて利用可能なＩｍｍｕｎｅ  Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ＩＥＤ）を使用することにより）、各抗原性ペプチドの最良のＭＨＣ結合スコアによってランク付けしてよい。他のソースとしては、ＴＥｐｒｅｄｉｃｔ（tepredict.sourceforge.net/help.html）または他の利用可能なＭＨＣ結合測定スケールが挙げられる。カットオフは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａなどの異なる発現ベクターでは異なってよい。
【０２０１】
必要に応じて、抗原性ペプチドを選択解除するため、または免疫抑制の影響を回避するために、免疫抑制エピトープ（例えばＴ−ｒｅｇエピトープ、ＩＬ−１０誘導性Ｔヘルパーエピトープなど）について、抗原性ペプチドをさらにスクリーニングしてもよい。
【０２０２】
必要に応じて、エピトープの免疫原性を予測するアルゴリズムを使用して、抗原性ペプチドをスクリーニングしてもよい。しかしながら、これらのアルゴリズムは、どのペプチドがＴ細胞応答を生成するかを予測するにあたり、せいぜい２０％の精度である。代替的には、スクリーニング／予測的アルゴリズムは使用されない。代替的に、抗原性ペプチドを免疫原性についてスクリーニングしてもよい。例えばこれは、１つまたは複数のＴ細胞を抗原性ペプチドに接触させることと、免疫原性Ｔ細胞応答について分析することとを含む場合があり、ここで免疫原性Ｔ細胞応答は、このペプチドを免疫原性ペプチドとして同定する。これは、１つまたは複数のＴ細胞をペプチドと接触させたら、免疫原性アッセイを使用して、ＣＤ２５、ＣＤ４４、もしくはＣＤ６９のうちの少なくとも１つの分泌を測定すること、またはＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、およびＩＬ−２を含む群から選択されるサイトカインの分泌を測定することを含む場合もあり、ここで分泌の増加は、このペプチドを１つまたは複数のＴ細胞エピトープを含むものとして同定する。
【０２０３】
反復性突然変異に関して標的ペプチドが生成される具体例において、ミスセンス置換の場合、突然変異体アミノ酸には、例えば、ミスセンス突然変異位置の直前および後に最大１０個の野生型アミノ酸が隣接していてよい。フレームシフト置換では、フレーム外のＩＮＤＥＬ置換から生じる予測されるペプチド配列がアノテーション転写物から生成されてよく、例えば最大１０個の野生型アミノ酸がフレームシフト突然変異位置の上流に付加されてよい。フレーム内のＩＮＤＥＬ置換では、ＩＮＤＥＬ位置の前および後にある、例えば最大１０個の野生型アミノ酸配列がひとつに結合されてよい。各ホットスポット標的ペプチドについて、アンダースコアによって分けられた遺伝子記号（ＨＧＮＣフォーマット）および突然変異置換情報（ＨＧＶＳフォーマット）からなる特異的な識別子が生成され得る。例えば、ＫＲＡＳの１２位におけるグリシンからアスパラギン酸への置換は、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄの特異的な識別子を与える。標的ペプチドは次に、ヒトの非冗長性タンパク質配列（ｎｒ）データベースに対するＢＬＡＳＴ解析に付され得る。このステップは、フレームシフト突然変異から生成された標的ペプチド配列が公知の野生型配列を表さないことを確実にし得る。ミスセンス置換の場合、このステップは、隣接する野生型アミノ酸が公知のヒト参照プロテオームにマッチすることを確実にし得る。
【０２０４】
選択された抗原性ペプチドは次に、潜在的な融合ポリペプチドの１つまたは複数の候補順に配置され得る。単一のプラスミドに収まり得るよりも多くの使用可能な抗原性ペプチドが存在する場合、異なる抗原性ペプチドに、必要／所望に応じて優先度ランクを割り当て、かつ／または（例えば、異なる組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株に含めるために）異なる融合ポリペプチドに分けることができる。優先度ランクは、相対的サイズ、転写の優先度、および／または翻訳されたポリペプチドの全体的な疎水性などの要因によって決定され得る。抗原性ペプチドは、本明細書の他所でより詳細に開示されるように、リンカーまたは任意の数の抗原性ペプチド対の間のリンカーの任意の組合せを用いずに、直接ひとつに結合するように配置されてもよい。含まれる線状抗原性ペプチドの数は、必要な構築物の数と突然変異負荷との対比、単一のプラスミドからの複数のエピトープの翻訳および分泌の効率、プラスミドを含む各細菌もしくはＬｍに必要なＭＯＩ、特定のがん関連タンパク質における反復性がん突然変異もしくはホットスポット突然変異の数、またはそのがん関連タンパク質における突然変異もしくは体細胞突然変異を有するがん患者の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％をカバーするためにどれだけ多くの反復性がん突然変異を含める必要があるかということの検討に基づいて決定され得る。同様に、含まれる線状抗原性ペプチドの数は、特定のタイプのがんにおける反復性がん突然変異もしくはホットスポット突然変異の数、または特定のタイプのがんを有するがん患者の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％をカバーするためにどれだけ多くの反復性がん突然変異を含める必要があるかということの検討に部分的に基づいて決定され得る。例えば、線状抗原性ペプチドの範囲は、例えば、プラスミドあたり約５０、４０、３０、２０、または１０個の抗原性ペプチドから始まり得る。
【０２０５】
抗原性ペプチドの順序をランダム化する１つまたは複数の反復法によって、融合ポリペプチドにおける同じ抗原性ペプチドの様々な可能性がある配置を生成することができる。そのようなランダム化は、例えば、抗原性ペプチドセット全体の順序をランダム化することを含む場合もあれば、抗原性ペプチドのサブセットの順序をランダム化することを含む場合もある。例えば、２０個の抗原性ペプチド（１〜２０と順序付けられたもの）がある場合、ランダム化は、２０個すべてのペプチドの順序をランダム化することを含む場合もあれば、ペプチドのサブセット（例えばペプチド１〜５または６〜１０）のみの順序をランダム化することを含む場合もある。このような順序のランダム化は、融合ポリペプチドおよび各個々の抗原性ペプチドの分泌および提示を促進し得る。代替的に、抗原性ペプチドの順序は、抗原性ペプチドの予め定義されたランキングなどの選択されたパラメーターを使用して生成されてもよい。
【０２０６】
抗原性ペプチドの組合せまたは融合ポリペプチド全体（すなわち、抗原性ペプチドおよびＰＥＳＴ含有ペプチドならびに任意のタグを含むもの）を疎水性についてスコアリングすることもできる。例えば、融合した抗原性ペプチドの全体または融合ポリペプチド全体は、スライディング２１アミノ酸ウィンドウを用いてＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅのハイドロパシー指数によりハイドロパシーをスコアリングすることができる。カットオフ（例えば約１．６）を超えるスコアを有する領域がある場合、選択されたパラメーターを使用して、またはランダム化を使用して、抗原性ペプチドの許容可能な順序（すなわち、いずれの領域のスコアもカットオフを超えないもの）が見出されるまで、融合ポリペプチド内の抗原性ペプチドを並べ替える、またはシャッフルすることができる。代替的に、問題がある抗原性ペプチドがあれば、これを除去するか、または再設計して異なるサイズのものにするか、もしくは抗原性ペプチドに含まれるがん関連タンパク質の配列をずらしてよい（ただし、抗原性ペプチドが依然として反復性がん突然変異と十分なサイズの隣接配列とを含む場合に限る）。代替的に、または付加的には、疎水性を変化させるために、本明細書の他所に開示される抗原性ペプチド間の１つまたは複数のリンカーを付加または修飾してもよい。個々の抗原性ペプチドのハイドロパシー検査と同じく、他のウィンドウサイズを使用してもよいし、他のカットオフを使用してもよい（例えば、融合ポリペプチドを送達するために使用されている細菌の属または種に応じて）。加えて、他の好適なハイドロパシープロットまたは他の適切なスケールを使用してもよい。
【０２０７】
必要に応じて、抗原性ペプチドを選択解除するため、または免疫抑制の影響を回避するために、免疫抑制エピトープ（例えばＴ−ｒｅｇエピトープ、ＩＬ−１０誘導性Ｔヘルパーエピトープなど）について、抗原性ペプチドの組合せまたは融合ポリペプチド全体をさらにスクリーニングしてもよい。
【０２０８】
次に、抗原性ペプチドまたは融合ポリペプチドの候補組合せをコードする核酸を設計し最適化することができる。例えば、配列は、翻訳のレベル、発現の持続期間、分泌のレベル、転写のレベル、およびそれらの任意の組合せを増大させるために最適化され得る。例えば、この増大は、対照の最適化されていない配列と比べて２倍〜１０００倍、２倍〜５００倍、２倍〜１００倍、２倍〜５０倍、２倍〜２０倍、２倍〜１０倍、または３倍〜５倍であり得る。
【０２０９】
例えば、融合ポリペプチドまたは融合ポリペプチドをコードする核酸は、オリゴヌクレオチド配列に形成される可能性がある二次構造のレベルを低下させるために最適化されてよく、または代替的に、配列を修飾し得る何らかの酵素の付着を防止するために最適化されてもよい。細菌細胞における発現は、例えば、転写サイレンシング、低いｍＲＮＡ半減期、二次構造形成、リプレッサーおよび阻害剤などのオリゴヌクレオチド結合分子の付着部位、ならびに稀なｔＲＮＡプールの可用性によって妨げられ得る。細菌発現における多くの問題の源は、元の配列内に見出される。ＲＮＡの最適化には、シス作用性エレメントの修飾、そのＧＣ含有量の適合、細胞細菌の非限定的なｔＲＮＡプールに対するコドンバイアスの修正、および内部相同領域の回避が含まれ得る。よって、配列の最適化は、例えば、非常に高い（＞８０％）または非常に低い（＜３０％）ＧＣ含有量の領域を調整することを伴う場合がある。配列の最適化は、例えば、次のシス作用性配列モチーフ：内部ＴＡＴＡボックス、カイ部位、およびリボソーム進入部位；ＡＴリッチもしくはＧＣリッチの配列区画；リピート配列およびＲＮＡ二次構造；（暗号）スプライスドナーおよびアクセプター部位；分岐点；またはそれらの組合せのうちの１つまたは複数を回避することを伴う場合もある。発現の最適化は、遺伝子の隣接領域および／またはプラスミド内の他所に配列エレメントを付加することを伴う場合もある。
【０２１０】
配列の最適化は、例えば、コドン使用頻度を宿主遺伝子（例えばＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ遺伝子）のコドンバイアスに適合させることを伴う場合もある。例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓには以下のコドンが使用され得る。
【表１２７】
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【０２１１】
融合ポリペプチドをコードする核酸を生成し、細菌株またはＬｉｓｔｅｒｉａ株などの送達ビヒクルに導入することができる。ワクシニアウイルスまたはウイルス様粒子などの他の送達ビヒクルが、ＤＮＡ免疫療法またはペプチド免疫療法に好適である場合がある。融合ポリペプチドをコードするプラスミドが生成され、細菌株またはＬｉｓｔｅｒｉａ株に導入されたら、この細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株を培養し、特徴付けることで、抗原性ペプチドを含む融合ポリペプチドの発現および分泌を確認することができる。
【０２１２】
ＩＩＩ．ヘテロクリティック抗原性ペプチドを含む組換え融合ポリペプチド
２つまたはそれより多くの抗原性ペプチドと融合しているＰＥＳＴ含有ペプチド（すなわち、タンデムに、例えば、ＰＥＳＴ−ペプチド１−ペプチド２）を含む組換え融合ポリペプチドであって、各抗原性ペプチド（例えば、がん関連タンパク質に由来する）が、ヘテロクリティック突然変異を含む、組換え融合ポリペプチドが、本明細書で開示される。２つまたはそれより多くの抗原性ペプチドと融合しているＰＥＳＴ含有ペプチド（すなわち、タンデムに、例えば、ＰＥＳＴ−ペプチド１−ペプチド２）を含む組換え融合ポリペプチドであって、各抗原性ペプチド（例えば、がん関連タンパク質に由来する）が、ヘテロクリティック突然変異を含み、抗原性ペプチドの少なくとも２つが、異なるヘテロクリティック突然変異を含み、同じがん関連タンパク質の断片である、組換え融合ポリペプチドも、本明細書で開示される。あるいは、抗原性ペプチドのそれぞれは、異なるがん関連タンパク質に由来する異なるヘテロクリティック突然変異を含む。あるいは、各抗原性ペプチドがその独自のＰＥＳＴ含有ペプチドと融合している（例えば、ＰＥＳＴ１−ペプチド、ＰＥＳＴ２−ペプチド）、別個の融合ポリペプチドの組合せを使用することができる。必要に応じて、断片の一部またはすべては、同じがん関連タンパク質の不連続断片である。不連続断片は、タンパク質配列中に逐次的に存在しない断片である（例えば、第１の断片は、残基１０〜３０からなり、第２の断片は、残基１００〜１２０からなるか、または第１の断片は、残基１０〜３０からなり、第２の断片は、残基２０〜４０からなる）。
【０２１３】
２つまたはそれより多くの抗原性ペプチドを含む組換え融合ポリペプチドであって、各抗原性ペプチド（例えば、がん関連タンパク質に由来する）が、ヘテロクリティック突然変異を含み、抗原性ペプチドの少なくとも２つが、異なるヘテロクリティック突然変異を含み、同じがん関連タンパク質の断片であり、融合ポリペプチドが、ＰＥＳＴ含有ペプチドを含まない、組換え融合ポリペプチドも、本明細書で開示される。２つまたはそれより多くの抗原性ペプチドを含む組換え融合ポリペプチドであって、各抗原性ペプチド（例えば、がん関連タンパク質に由来する）が、ヘテロクリティック突然変異を含み、抗原性ペプチドの少なくとも２つが、異なるヘテロクリティック突然変異を含み、同じがん関連タンパク質の断片であり、融合ポリペプチドが、ＰＥＳＴ含有ペプチドを含まない、組換え融合ポリペプチドも、本明細書で開示される。あるいは、抗原性ペプチドのそれぞれは、異なるがん関連タンパク質に由来する異なるヘテロクリティック突然変異を含む。必要に応じて、断片の一部またはすべては、同じがん関連タンパク質の不連続断片である。
【０２１４】
Ｎ末端からＣ末端に向かって細菌分泌配列、ユビキチン（Ｕｂ）タンパク質そして２つまたはそれより多くの抗原性ペプチド（すなわち、タンデムに、例えば、Ｕｂ−ペプチド１−ペプチド２）を含む、組換え融合ポリペプチドであって、各抗原性ペプチド（例えば、がん関連タンパク質に由来する）が、ヘテロクリティック突然変異を含む、組換え融合ポリペプチドも、本明細書で開示される。あるいは、各抗原性ペプチドが、その独自の分泌配列およびＵｂタンパク質と融合している（例えば、Ｕｂ１−ペプチド１、Ｕｂ２−ペプチド２）、別個の融合ポリペプチドの組合せを使用することができる。必要に応じて、断片の一部またはすべては、同じがん関連タンパク質の不連続断片である。
【０２１５】
かかる組換え融合ポリペプチドをコードする核酸（ミニ遺伝子構築物と呼ぶ）も開示される。かかるミニ遺伝子核酸構築物は、各オープンリーディングフレーム間のシャイン・ダルガーノリボソーム結合部位核酸配列によって連結された２つまたはそれよりも多くのオープンリーディングフレームをさらに含み得る。例えば、ミニ遺伝子核酸構築物は、各オープンリーディングフレーム間のシャイン・ダルガーノリボソーム結合部位核酸配列によって連結された２〜４つのオープンリーディングフレームをさらに含み得る。各オープンリーディングフレームが異なるポリペプチドをコードしてよい。一部の核酸構築物では、融合ポリペプチドのカルボキシ末端をコードするコドンの後に、タンパク質合成の終結を確実にする２つの停止コドンが続く。
【０２１６】
細菌シグナル配列は、ＨｌｙもしくはＡｃｔＡシグナル配列などのリステリアのシグナル配列、または任意の他の公知のシグナル配列であってよい。他の場合では、シグナル配列はＬＬＯシグナル配列であってよい。シグナル配列は、細菌性のものであっても、宿主細菌に対して天然のもの（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに対して天然のもの、例えばｓｅｃＡ１シグナルペプチド）であっても、宿主細菌に対して異質のものであってもよい。シグナルペプチドの具体例としては、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓに由来するＵｓｐ４５シグナルペプチド、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓに由来する保護抗原シグナルペプチド、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに由来するｐ６０シグナルペプチドなどのｓｅｃＡ２シグナルペプチド、およびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  Ｔａｔシグナルペプチド（例えばＰｈｏＤ）などのＴａｔシグナルペプチドが挙げられる。具体例において、分泌シグナル配列は、Ｌｉｓｔｅｒｉａタンパク質由来、例えばＡｃｔＡ３００分泌シグナルまたはＡｃｔＡ１００分泌シグナルなどである。
【０２１７】
ユビキチンは、例えば、全長タンパク質であり得る。本明細書において提供される核酸構築物から発現されるユビキチンは、宿主細胞サイトゾルに侵入するとヒドロラーゼの作用によって核酸構築物から発現される組換え融合ポリペプチドの残部からカルボキシ末端において切断され得る。これにより融合ポリペプチドのアミノ末端が遊離し、宿主細胞サイトゾルにおいてペプチドが産生される。
【０２１８】
融合ポリペプチド内の抗原性ペプチドの選択、変形形態、および配置は、本明細書の他所で詳細に論じられ、がん関連タンパク質は、本明細書の他所でより詳細に論じられる。組換え融合ポリペプチドは、本明細書中の他の箇所でより詳細に開示されるような１つまたは複数のタグを含むことができる。
【０２１９】
本明細書において開示される組換え融合ポリペプチドは、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株によって発現させることもできるし、タンパク質の発現および単離に使用される他のベクターおよび細胞系から発現させ単離することもできる。かかる抗原性ペプチドを発現する組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株は、例えば、かかる組換えＬｉｓｔｅｒｉａを含む免疫原性組成物において、ならびに組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株およびアジュバントを含むワクチンにおいて使用され得る。Ｌｉｓｔｅｒｉａ株における宿主細胞系およびＬｉｓｔｅｒｉａ以外の宿主細胞系における、ＬＬＯ、ＡｃｔＡ、またはＰＥＳＴ様配列の非溶血性トランケート型との融合ポリペプチドとしての１つまたは複数の抗原性ペプチドの発現は、抗原性ペプチドの免疫原性の増強をもたらし得る。
【０２２０】
組換え融合ポリペプチドは、任意の分子量であってよい。例えば、組換え融合ポリペプチドは、約２００、１９５、１９０、１８５、１８０、１７５、１７０、１６５、１６０、１５５、１５０、１４５、１４０、１３５、１３０、もしくは１２５キロダルトン（ｋＤａ）未満またはそれ以下であり得る。具体例において、組換え融合ポリペプチドは、約１５０ｋＤａ未満もしくはそれ以下、または約１３０ｋＤａ未満もしくはそれ以下である。別の例として、組換え融合ポリペプチドは、約５０〜２００、５０〜１９５、５０〜１９０、５０〜１８５、５０〜１８０、５０〜１７５、５０〜１７０、５０〜１６５、５０〜１６０、５０〜１５５、５０〜１５０、５０〜１４５、５０〜１４０、５０〜１３５、５０〜１３０、５０〜１２５、１００〜２００、１００〜１９５、１００〜１９０、１００〜１８５、１００〜１８０、１００〜１７５、１００〜１７０、１００〜１６５、１００〜１６０、１００〜１５５、１００〜１５０、１００〜１４５、１００〜１４０、１００〜１３５、１００〜１３０、または１００〜１２５ｋＤａであり得る。具体例において、組換え融合ポリペプチドは、約５０〜１５０、１００〜１５０、５０〜１２５、または１００〜１２５ｋＤａである。別の例として、組換え融合ポリペプチドは、少なくとも約５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、または１２５ｋＤａであり得る。具体例として、組換え融合ポリペプチドは、少なくとも約１００ｋＤａであり得る。
【０２２１】
かかる組換え融合ポリペプチドをコードする核酸も開示される。核酸は、任意の形態であってよい。核酸は、ＤＮＡもしくはＲＮＡを含んでも、またはそれらからなってもよく、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。核酸は、エピソームプラスミド、マルチコピーエピソームプラスミド、または組込みプラスミドなどのプラスミドの形態であり得る。代替的に、核酸は、ウイルスベクター、ファージベクター、または細菌人工染色体中の形態であってもよい。かかる核酸は、１つのオープンリーディングフレームを有してもよいし、２つまたはそれよりも多くのオープンリーディングフレーム（例えば、組換え融合ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、および代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレーム）を有してもよい。一例において、かかる核酸は、各オープンリーディングフレーム間のシャイン・ダルガーノリボソーム結合部位核酸配列によって連結された２つまたはそれよりも多くのオープンリーディングフレームを含み得る。例えば、核酸は、各オープンリーディングフレーム間のシャイン・ダルガーノリボソーム結合部位核酸配列によって連結された２〜４つのオープンリーディングフレームを含み得る。各オープンリーディングフレームが異なるポリペプチドをコードしてよい。一部の核酸では、融合ポリペプチドのカルボキシ末端をコードするコドンの後に、タンパク質合成の終結を確実にする２つの停止コドンが続く。
【０２２２】
Ａ．ヘテロクリティック抗原性ペプチド
各ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、ヘテロクリティック突然変異を含むがん関連タンパク質の断片（すなわち、がん関連タンパク質に由来するアミノ酸の連続した配列）であり得る。各ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、免疫応答を誘導するのに十分な任意の長さであってよく、各ヘテロクリティック抗原性ペプチドが同じ長さであってもよいし、またはヘテロクリティック抗原性ペプチドが異なる長さを有してもよい。例えば、本明細書で開示されるヘテロクリティック抗原性ペプチドは、５〜１００、１５〜５０、もしくは２１〜２７アミノ酸長、または１５〜１００、１５〜９５、１５〜９０、１５〜８５、１５〜８０、１５〜７５、１５〜７０、１５〜６５、１５〜６０、１５〜５５、１５〜５０、１５〜４５、１５〜４０、１５〜３５、１５〜３０、２０〜１００、２０〜９５、２０〜９０、２０〜８５、２０〜８０、２０〜７５、２０〜７０、２０〜６５、２０〜６０、２０〜５５、２０〜５０、２０〜４５、２０〜４０、２０〜３５、２０〜３０、１１〜２１、１５〜２１、２１〜３１、３１〜４１、４１〜５１、５１〜６１、６１〜７１、７１〜８１、８１〜９１、９１〜１０１、１０１〜１２１、１２１〜１４１、１４１〜１６１、１６１〜１８１、１８１〜２０１、８〜２７、１０〜３０、１０〜４０、１５〜３０、１５〜４０、１５〜２５、１〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、１〜１００、５〜７５、５〜５０、５〜４０、５〜３０、５〜２０、５〜１５、５〜１０、１〜７５、１〜５０、１〜４０、１〜３０、１〜２０、１〜１５、１〜１０、８〜１１または１１〜１６アミノ酸長であり得る。例えば、ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９または６０アミノ酸長であり得る。例えば、ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、８〜１００、８〜５０、８〜３０、８〜２５、８〜２２、８〜２０、８〜１５、８〜１４、８〜１３、８〜１２、８〜１１、７〜１１、または８〜１０アミノ酸長であり得る。一例では、ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、９アミノ酸長であり得る。
【０２２３】
各ヘテロクリティック抗原性ペプチドはまた、親水性であることができ、またはある特定のハイドロパシー閾値以下もしくはそれ未満のスコアを有することができ、このスコアは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓまたは目的の別の細菌における分泌可能性を予測することができる。例えば、ヘテロクリティック抗原性ペプチドをＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅのハイドロパシー指数２１アミノ酸ウィンドウによりスコアリングすることができ、カットオフ（およそ１．６）を超えるスコアを有するすべてを除外することができる。それらは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓによって分泌可能である可能性が低いからである。
【０２２４】
各ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、単一のヘテロクリティック突然変異を含むこともあり、または２つもしくはそれより多くのヘテロクリティック突然変異（例えば、２つのヘテロクリティック突然変異）を含むこともある。例示的なヘテロクリティック突然変異型ペプチドが、対応する野生型（天然）ペプチドとともに、下記の表に提供される。対応するヘテロクリティックペプチドでは修飾されている、野生型ペプチド中の残基は、太字であり、かつ下線付きである。
【０２２５】
【表１２２】
2020513737.tif 000011
【０２２６】
ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、任意の様式で互いに連結していてもよい。例えば、ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、介在配列なしで、互いに直接融合していることがある。あるいは、ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、ペプチドリンカーなどの１つまたは複数のリンカーを介して、互いに間接的に連結していることもある。一部の場合、隣接するヘテロクリティック抗原性ペプチドの一部の対は、互いに直接融合していることもあり、ヘテロクリティック抗原性ペプチドの他の対は、１つまたは複数のリンカーを介して互いに間接的に連結していることもある。同じリンカーを、隣接するヘテロクリティック抗原性ペプチドの各対間に使用することができ、または任意の数の異なるリンカーを、隣接するヘテロクリティック抗原性ペプチドの異なる対間に使用することができる。加えて、１つのリンカーを、隣接するヘテロクリティック抗原性ペプチドの対間に使用することができ、または複数のリンカーを、隣接するヘテロクリティック抗原性ペプチドの対間に使用することができる。
【０２２７】
任意の好適な配列をペプチドリンカーに使用することができる。一例として、リンカー配列は、例えば、１〜約５０アミノ酸長であってもよい。一部のリンカーは、親水性であり得る。リンカーは、様々な目的に役立つことができる。例えば、リンカーは、細菌分泌を増大させること、抗原プロセシングを促進すること、融合ポリペプチドの可動性を増大させること、融合ポリペプチドの剛性を増大させること、または任意の他の目的に役立つことができる。一部の場合、リピートを最小限に抑えるために、異なるアミノ酸リンカー配列が、ヘテロクリティック抗原性ペプチド間に分布しているか、または同じアミノ酸リンカー配列をコードする異なる核酸が、ヘテロクリティック抗原性ペプチド（例えば、配列番号５７２〜５８２）間に分布している。これはまた、二次構造を低減させることにより、Ｌｍ組換えベクター株集団内の融合ポリペプチドをコードする核酸（例えば、プラスミド）の効率的な転写、翻訳、分泌、維持または安定化を可能にすることに役立つことができる。他の好適なペプチドリンカー配列は、例えば、以下の要素：（１）それらが、可動性がある伸長したコンフォメーションをとる能力、（２）それらが、ヘテロクリティック抗原性ペプチド上の機能的エピトープと相互作用することができる二次構造をとる能力の欠除、および（３）機能的エピトープと反応し得る疎水性または荷電残基の欠除のうちの１つまたは複数に基づいて選択することができる。例えば、ペプチドリンカー配列は、Ｇｌｙ、ＡｓｎおよびＳｅｒ残基を含有することがある。他の中性付近のアミノ酸、例えば、ＴｈｒおよびＡｌａが、リンカー配列に使用されることもある。リンカーとして有用に利用することができるアミノ酸配列は、Marateaら（１９８５年）Gene  ４０巻：３９〜４６頁；Murphyら（１９８６年）Proc  Natl  Acad  Sci  USA  ８３巻：８２５８〜８２６２頁；米国特許第４，９３５，２３３号およびＵＳ４，７５１，１８０において開示されているものを含み、これらのそれぞれは、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。リンカーの具体例は、本明細書中の他の箇所で開示される。
【０２２８】
融合ポリペプチドは、任意の数のヘテロクリティック抗原性ペプチドを含むことができる。一部の場合、融合ポリペプチドは、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株から融合ポリペプチドが産生および分泌され得るような、任意の数のヘテロクリティック抗原性ペプチドを含む。例えば、融合ポリペプチドは、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９もしくは３０のヘテロクリティック抗原性ペプチド、または２〜５０、２〜４５、２〜４０、２〜３５、２〜３０、２〜２５、２〜２０、２〜１５、２〜１０、２〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５もしくは４５〜５０のヘテロクリティック抗原性ポリペプチドを含むことができる。別の例では、融合ポリペプチドは、単一のヘテロクリティック抗原性ペプチドを含むことができる。別の例では、融合ポリペプチドは、ヘテロクリティック抗原性ペプチド約１〜１００、１〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０，４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００、５〜１５、５〜２０、５〜２５、１５〜２０、１５〜２５、１５〜３０、１５〜３５、２０〜２５、２０〜３５、２０〜４５、３０〜４５、３０〜５５、４０〜５５、４０〜６５、５０〜６５、５０〜７５、６０〜７５、６０〜８５、７０〜８５、７０〜９５、８０〜９５、８０〜１０５、９５〜１０５、５０〜１００、１〜１００、５〜１００、５〜７５、５〜５０、５〜４０、５〜３０、５〜２０、５〜１５、５〜１０、１〜１００、１〜７５、１〜５０、１〜４０、１〜３０、１〜２０、１〜１５または１〜１０の範囲の、多数のヘテロクリティック抗原性ペプチドを含むことができる。別の例では、融合ポリペプチドは、最大約１００、１０、２０、３０、４０または５０のヘテロクリティック抗原性ペプチドを含むことができる。別の例では、融合ポリペプチドは、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００のヘテロクリティック抗原性ペプチドを含むことができる。
【０２２９】
加えて、融合ポリペプチドは、同じがん関連タンパク質に由来する任意の数のヘテロクリティック抗原性ペプチド（すなわち、同じがん関連タンパク質に由来する任意の数の不連続断片）を含むことができる。あるいは、融合ポリペプチドは、２つまたはそれより多くの異なるがん関連タンパク質に由来する、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のがん関連タンパク質に由来する、任意の数のヘテロクリティック抗原性ペプチドを含むことができる。例えば、融合ポリペプチドは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０のがん関連タンパク質、または２〜５、５〜１０、１０〜１５、もしくは１５〜２０のがん関連タンパク質に由来するヘテロクリティック突然変異を含むことができる。例えば、２つまたはそれより多くのがん関連タンパク質は、約２〜３０、約２〜２５、約２〜２０、約２〜１５、または約２〜１０のがん関連タンパク質であることがある。例えば、融合ポリペプチドは、同じがん関連タンパク質に由来する少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、もしくは３０のヘテロクリティック抗原性ペプチド、または同じがん関連タンパク質に由来する２〜５０、２〜４５、２〜４０、２〜３５、２〜３０、２〜２５、２〜２０、２〜１５、２〜１０、２〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、もしくは４５〜５０のヘテロクリティック抗原性ポリペプチドを含むことができる。同様に、融合ポリペプチドは、同じがん関連タンパク質に由来する少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、もしくは３０のヘテロクリティック抗原性ペプチド、または２つもしくはそれより多くの異なるがん関連タンパク質に由来する２〜５０、２〜４５、２〜４０、２〜３５、２〜３０、２〜２５、２〜２０、２〜１５、２〜１０、２〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、もしくは４５〜５０のヘテロクリティック抗原性ポリペプチドを含むことができる。加えて、融合ポリペプチドは、同じがん関連タンパク質に由来する任意の数の不連続なヘテロクリティック抗原性ペプチド（すなわち、同じがん関連タンパク質に由来する任意の数の不連続断片）を含むことができる。例えば、融合ポリペプチドは、同じがん関連タンパク質に由来する少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、もしくは３０の不連続なヘテロクリティック抗原性ペプチド、または同じがん関連タンパク質に由来する２〜５０、２〜４５、２〜４０、２〜３５、２〜３０、２〜２５、２〜２０、２〜１５、２〜１０、２〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、もしくは４５〜５０の不連続なヘテロクリティック抗原性ポリペプチドを含むことができる。一部の場合、ヘテロクリティック抗原性ペプチドの少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはすべてが、同じがん関連タンパク質に由来する不連続なヘテロクリティック抗原性ペプチドであり、または単一のがん関連タンパク質に由来するヘテロクリティック抗原性ペプチドの少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはすべてが、そのがん関連タンパク質に由来する不連続なヘテロクリティック抗原性ペプチドである。
【０２３０】
各ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、異なる（すなわち、特有の）ヘテロクリティック突然変異を含むことができる。あるいは、融合ポリペプチド中のヘテロクリティック抗原性ペプチドの２つまたはそれより多くが、同じヘテロクリティック突然変異を含むことができる。例えば、同じヘテロクリティック抗原性ポリペプチドの２つまたはそれより多くのコピーが、融合ポリペプチドに含まれることもある（すなわち、融合ポリペプチドは、同じヘテロクリティック抗原性ペプチドの２つまたはそれより多くのコピーを含む）。一部の融合ポリペプチドでは、ヘテロクリティック抗原性ペプチドの少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％は、いずれの他のヘテロクリティック抗原性ペプチドにも存在しない、異なる（すなわち、特有の）ヘテロクリティック突然変異を含む。
【０２３１】
一部の場合、ヘテロクリティック抗原性ペプチドの少なくとも２つは、同じがん関連タンパク質の重複する断片を含むことができる。例えば、ヘテロクリティック抗原性ペプチドの２つまたはそれより多くが、がん関連タンパク質の同じアミノ酸残基に異なるヘテロクリティック突然変異を含むことができる。
【０２３２】
一部のヘテロクリティック抗原性ペプチドは、少なくとも２つの異なるヘテロクリティック突然変異、少なくとも３つの異なるヘテロクリティック突然変異、または少なくとも４つの異なるヘテロクリティック突然変異を含むことができる。
【０２３３】
ヘテロクリティック突然変異のいずれの組合せが融合ポリペプチドに含まれていてもよい。例えば、１つまたは複数の異なるＨＬＡ型と結合するヘテロクリティック抗原性ペプチドが、含まれていてもよい。例えば、次のＨＬＡ型：ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２、およびＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２のうちの１つもしくは複数またはすべてと結合するヘテロクリティック抗原性ペプチドを同定することができる。
【０２３４】
融合ポリペプチド中のヘテロクリティック抗原性ペプチドのそれぞれが、同じがん関連タンパク質に由来するヘテロクリティック突然変異を含むこともあり、または融合ポリペプチド中のヘテロクリティック抗原性ペプチドの組合せが、２つもしくはそれより多くのがん関連タンパク質に由来するヘテロクリティック突然変異を含むこともある。例えば、融合ポリペプチドは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０のがん関連タンパク質、または２〜５、５〜１０、１０〜１５、もしくは１５〜２０のがん関連タンパク質に由来するヘテロクリティック突然変異を含むことができる。例えば、２つまたはそれより多くのがん関連タンパク質は、約２〜３０、約２〜２５、約２〜２０、約２〜１５、または約２〜１０のがん関連タンパク質であり得る。一例では、ヘテロクリティック抗原性ペプチドの少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％は、同じがん関連タンパク質に由来するヘテロクリティック突然変異を含む。別の例では、同じがん関連タンパク質に由来するヘテロクリティック突然変異を含むヘテロクリティック抗原性ペプチドはない。
【０２３５】
例示的なヘテロクリティック抗原性ペプチド配列は、本明細書中の他の箇所で開示される。一例として、ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、本明細書で開示される抗原性ペプチド配列のいずれかと少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一の配列を含むことができ、そのような配列から本質的になることができ、またはそのような配列からなることができる。
【０２３６】
Ｂ．がん関連タンパク質およびヘテロクリティック突然変異
本明細書で開示される融合ポリペプチドは、がん関連タンパク質に由来するヘテロクリティック突然変異を含む抗原性ペプチドを含む。本明細書で開示されるヘテロクリティック突然変異のいずれの組合せが、融合ポリペプチドに含まれていてもよい。ヘテロクリティックペプチドに関しての用語「がん関連タンパク質」は、その発現が１タイプまたは複数のタイプのがんの発生または進行と相関するタンパク質を指す。必要に応じて、そのようなタンパク質は、複数のタイプのがんに存在する突然変異を有するタンパク質、特定のタイプのがんを有する複数の対象に存在する突然変異を有するタンパク質、または１タイプもしくは複数のタイプのがんの発生もしくは進行と相関する突然変異を有するタンパク質を含む。例えば、がん関連タンパク質は、発癌タンパク質（すなわち、細胞成長を調節するタンパク質などの、がん進行に寄与することができる活性を有するタンパク質）であることもあり、または腫瘍抑制タンパク質（すなわち、がん形成の可能性を、例えば、細胞周期の負の調節によって、またはアポトーシスを促進することにより、軽減するように概して作用するタンパク質）であることもある。好ましくは、ヘテロクリティックペプチドの元になるがん関連タンパク質は、特定のタイプのがんに発現されるが通常は健常成人組織には発現されないタンパク質（すなわち、がん特異的発現、がん限定発現、腫瘍特異的発現、または腫瘍限定発現を有するタンパク質）である。しかし、がん関連タンパク質は、がん特異的、がん限定、腫瘍特異的または腫瘍限定発現を有する必要はない。がん特異的またはがん限定と見なされるタンパク質の例は、がん精巣抗原または癌胎児性抗原である。がん精巣抗原（ＣＴＡ）は、種々の組織起源のヒト腫瘍に発現されるが、雄生殖細胞を除く正常組織には発現されない、腫瘍関連抗原の大きなファミリーである。がんでは、これらの発育抗原は、再発現されることがあり、免疫活性化遺伝子座として役立つことができる。癌胎児性抗原（ＯＦＡ）は、概して胎児発育中にしか存在しないがある特定の種類のがんを有する成人には見出されるタンパク質である。ＣＴＡおよびＯＦＡの腫瘍限定発現パターンが、それらを腫瘍特異的免疫療法に理想的な標的にする。大部分のＯＦＡ／ＣＴＡタンパク質は、発癌に重要な役割を果たす。
【０２３７】
用語「ヘテロクリティック」は、ヘテロクリティックペプチドの元になった天然ペプチド（例えば、アンカー残基突然変異を含有しないペプチド）を認識する免疫応答を生じさせるペプチドを指す。例えば、ＹＬＭＰＶＮＳＥＶ（配列番号７２６）は、ＹＭＭＰＶＮＳＥＶ（配列番号７２５）から、残基２のメチオニンへの突然変異により生成された。ヘテロクリティックペプチドは、そのヘテロクリティックペプチドの元になった天然ペプチドを認識する免疫応答を生じさせることができる。例えば、ヘテロクリティックペプチドのワクチンの接種により生じる天然ペプチドに対する免疫応答は、天然ペプチドのワクチンの接種により生じる免疫応答と同等のまたはそれより大きい規模であり得る。免疫応答は、例えば、２倍、３倍、５倍、７倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、５０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、３００倍、５００倍、１０００倍、またはそれより大きく増大され得る。
【０２３８】
本明細書で開示されるヘテロクリティックペプチドは、１つまたは複数のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）分子と結合することができる。ＨＬＡ分子は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子としても公知であり、ペプチドに結合し、免疫細胞に対してそれらのペプチドを提示する。ペプチドの免疫原性は、ＨＬＡ分子に対するその親和性によって一部は決定され得る。ＨＬＡクラスＩ分子は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）上に一般に存在するＣＤ８分子と相互作用する。ＨＬＡクラスＩＩ分子は、ヘルパーＴリンパ球上に一般に存在するＣＤ４分子と相互作用する。例えば、本明細書で開示されるヘテロクリティックペプチドは、前駆Ｔ細胞を活性化するのに十分な親和性で、またはＴ細胞による認識を媒介するのに十分な親和性で、ＨＬＡ分子と結合することができる。
【０２３９】
本明細書で開示されるヘテロクリティックペプチドは、１つまたは複数のＨＬＡクラスＩＩ分子と結合することができる。例えば、ヘテロクリティックペプチドは、ＨＬＡ−ＤＲＢ分子、ＨＬＡ−ＤＲＡ分子、ＨＬＡ−ＤＱＡ１分子、ＨＬＡ−ＤＱＢ１分子、ＨＬＡ−ＤＰＡ１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ  １分子、ＨＬＡ−ＤＭＡ分子、ＨＬＡ−ＤＭＢ分子、ＨＬＡ−ＤＯＡ分子、またはＨＬＡ−ＤＯＢ分子と結合することができる。
【０２４０】
本明細書で開示される天然またはヘテロクリティックペプチドは、１つまたは複数のＨＬＡクラスＩ分子と結合することができる。例えば、ヘテロクリティックペプチドは、ＨＬＡ−Ａ分子、ＨＬＡ−Ｂ分子、ＨＬＡ−Ｃ分子、ＨＬＡ−Ａ０２０１分子、ＨＬＡ  Ａ１、ＨＬＡ  Ａ２、ＨＬＡ  Ａ２．１、ＨＬＡ  Ａ３、ＨＬＡ  Ａ３．２、ＨＬＡ  Ａ１１、ＨＬＡ  Ａ２４、ＨＬＡ  Ｂ７、ＨＬＡ  Ｂ２７、またはＨＬＡ  Ｂ８と結合することができる。同様に、ヘテロクリティックペプチドは、ＨＬＡクラスＩ分子のスーパーファミリー、例えば、Ａ２スーパーファミリー、Ａ３スーパーファミリー、Ａ２４スーパーファミリー、Ｂ７スーパーファミリー、Ｂ２７スーパーファミリー、Ｂ４４スーパーファミリー、Ｃ１スーパーファミリー、またはＣ４スーパーファミリーと結合することができる。
【０２４１】
ヘテロクリティックペプチドは、ＨＬＡクラスＩＩ分子とペプチドの結合を、対応する天然ペプチドと比較して増強する突然変異を含むことができる。あるいは、または加えて、ヘテロクリティックペプチドは、ＨＬＡクラスＩ分子とペプチドの結合を、対応する天然ペプチドと比較して増強する突然変異を含むことができる。例えば、突然変異残基は、ＨＬＡクラスＩＩモチーフアンカー残基であり得る。「アンカーモチーフ」または「アンカー残基」は、別の実施形態では、ＨＬＡ結合配列（例えば、ＨＬＡクラスＩＩ結合配列またはＨＬＡクラスＩ結合配列）中の特定の位置における１つまたは１セットの好ましい残基を指す。
【０２４２】
野生型エピトープに対する交差反応性免疫原性応答を惹起する可能性がある予測ヘテロクリティックエピトープを生成するための様々な方法が周知である。例えば、野生型エピトープに対する交差反応性免疫原性応答を惹起する可能性があるヘテロクリティックエピトープを設計するために、ＮｅｔＭＨＣｐａｎ  ３．０サーバー（ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＭＨＣｐａｎ／）を使用して、野生型エピトープのベースライン予測ペプチド−ＭＨＣ結合親和性を決定することができる。１．０未満または１．０であるペプチド−ＭＨＣ結合親和性パーセントランクは、免疫応答を惹起する可能性が高い強力なバインダーと見なされる。可能性のあるヘテロクリティックエピトープは、強力なバインダーであると予測される野生型エピトープの、これらに限定されないが、１位、２位、３位またはＣ末端位置における、１つまたは複数のアミノ酸のランダムな置換により生成される。次いで、ＮｅｔＭＨＣｐａｎ  ３．０サーバーを使用して、可能性のあるヘテロクリティックエピトープのペプチド−ＭＨＣ結合親和性が、推定される。結合親和性をランク付けるパーセンテージが野生型エピトープと同様であり、パーセンテージランクが１．０未満または１．０である、ヘテロクリティックエピトープは、将来検証される可能性のある抗原と見なすことができる。
【０２４３】
ＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩ残基を同定するための他の方法、ならびに残基を突然変異させることによりＨＬＡ結合を改善するための他の方法は、周知である。例えば、ＵＳ８，７６５，６８７、ＵＳ７，４８８，７１８、ＵＳ９，２３３，１４９およびＵＳ７，５９８，２２１を参照されたく、これらのそれぞれは、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。例えば、ＭＨＣクラスＩＩエピトープを予測するための方法は、周知である。一例として、ＭＨＣクラスＩＩエピトープは、ＴＥＰＩＴＯＰＥ（その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれるMeisterら（１９９５年）Vaccine  １３巻：５８１〜５９１頁）を使用して予測することができる。別の例として、ＭＨＣクラスＩＩエピトープは、ＥｐｉＭａｔｒｉｘ（その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれるDe  Grootら（１９９７年）AIDS  Res.  Hum.  Retroviruses  １３巻：５２９〜５３１頁）を使用して予測することができる。さらに別の例として、ＭＨＣクラスＩＩエピトープは、Ｐｒｅｄｉｃｔ  Ｍｅｔｈｏｄ（その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれるYu  Kら（２００２年）Mol.  Med.８巻：１３７〜１４８頁）を使用して予測することができる。さらに別の例として、ＭＨＣクラスＩＩエピトープは、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩエピトープ予測アルゴリズムを使用して予測することができる。ＳＹＦＰＥＩＴＨＩは、クラスＩおよびクラスＩＩ  ＭＨＣ分子と結合することが公知の４５００より多くのエピトープ配列を含む、データベースである。ＳＹＦＰＥＩＴＨＩは、ＭＨＣ結合溝に沿って、ある特定の位置の、ある特定のアミノ酸の存在に基づくスコアを提供する。理想的なアミノ酸アンカーが、１０点で評価され、普通でないアンカーは、６〜８点に値し、補助アンカーは、４〜６点に値し、好ましい残基は、１〜４点に値する；結合スコアに対する負のアミノ酸効果は−１〜−３の間である。ＨＬＡ−Ａ＊０２０１についての最大スコアは、３６である。さらに別の例として、ＭＨＣクラスＩＩエピトープは、Ｒａｎｋｐｅｐを使用して予測することができる。Ｒａｎｋｐｅｐは、位置特異的スコアリング行列（ＰＳＳＭ）を使用するか、またはＭＨＣ−ペプチド結合の予測因子として、所与のＭＨＣ分子と結合することが公知のアラインされたペプチドセットからのプロファイルを使用する。Ｒａｎｋｐｅｐは、選択されたプロファイルを有する、ペプチドのスコアに関する情報、および予測ペプチドの、最大スコアを生じさせるコンセンサス配列のものに対する％最適またはパーセンタイルスコアに関する情報を含む。Ｒａｎｋｐｅｐは、ＭＨＣ  ＩおよびＭＨＣ  ＩＩ分子とのペプチド結合の予測のためにそれぞれ１０２および８０のＰＳＳＭの選択を含む。異なるサイズのペプチドバインダーを予測するいくつかのＰＳＳＭを通常はＭＨＣ  Ｉ分子ごとに利用可能である。別の例として、ＭＨＣクラスＩＩエピトープは、ＳＶＭＨＣ（その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれるDonnesおよびElofsson（２００２年）BMC  Bioinformatics  １１巻；３号：２５頁）を使用して同定することができる。
【０２４４】
ＭＨＣクラスＩエピトープを同定するための方法も周知である。一例として、ＭＨＣクラスＩエピトープは、ＢＩＭＡＳソフトウェアを使用して予測することができる。ＢＩＭＡＳスコアは、ペプチド結合親和性の評価基準であるＭＨＣ−Ｉ／β２−ミクログロブリン／ペプチド複合体の理論半減期の計算に基づく。このプログラムは、８〜１０アミノ酸長のＨＬＡ−Ｉペプチドについての情報を使用する。ペプチドのＭＨＣに対する結合親和性が高いほど、このペプチドがエピトープに相当する尤度が高い。ＢＩＭＡＳアルゴリズムは、ペプチド中の各アミノ酸がクラスＩ分子との結合に独立して寄与すると仮定する。結合に不可欠である主要アンカー残基は、表中で１より有意に高い係数を有する。不利なアミノ酸は、１未満である正の係数を有する。アミノ酸が、結合に対して有利または不利いずれに寄与するかが分からない場合には、値１を割り当てられる。アミノ酸に割り当てられるすべての値が乗算され、得られた実行スコアに定数が乗算されて、解離半減期の推定値が得られる。別の例として、ＭＨＣクラスＩエピトープは、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩを使用して同定することができる。さらに別の例では、ＭＨＣクラスＩエピトープは、ＳＶＭＨＣを使用して同定することができる。さらに別の例として、ＭＨＣクラスＩエピトープは、ＮｅｔＭＨＣ−２．０（その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれるBuusら（２００３年）Tissue  Antigens  ６２巻：３７８〜３８４頁）を使用して同定することができる。
【０２４５】
ＨＬＡ結合モチーフ中の異なる残基を、ＭＨＣ結合を増強するように突然変異させることができる。一例では、ＭＨＣ結合を増強する突然変異は、ＨＬＡクラスＩ結合モチーフの１位の残基における突然変異（例えば、チロシン、グリシン、トレオニンまたはフェニルアラニンへの突然変異）である。別の例として、突然変異は、ＨＬＡクラスＩ結合モチーフの２位における突然変異（例えば、ロイシン、バリン、イソロイシンまたはメチオニンへの突然変異）であり得る。別の例として、突然変異は、ＨＬＡクラスＩ結合モチーフの６位における突然変異（例えば、バリン、システイン、グルタミンまたはヒスチジンへの突然変異）であり得る。別の例として、突然変異は、ＨＬＡクラスＩ結合モチーフの９位におけるまたはＣ末端位置における突然変異（例えば、バリン、トレオニン、イソロイシン、ロイシン、アラニンまたはシステインへの突然変異）であり得る。突然変異は、一次アンカー残基における突然変異であることもあり、または二次アンカー残基における突然変異であることもある。例えば、ＨＬＡクラスＩ一次アンカー残基は、２位および９位であることがあり、二次アンカー残基は、１および８位、または１、３、６、７および８位であることがある。別の例では、４、５および８位から選択される位置に点突然変異が存在することもある。
【０２４６】
同様に、ＨＬＡクラスＩＩ結合部位における異なる残基を突然変異させることができる。例えば、ＨＬＡクラスＩＩモチーフアンカー残基を突然変異させることができる。例えば、Ｐ１位、Ｐ２位、Ｐ６位またはＰ９位を突然変異させることができる。あるいはＰ４位、Ｐ５位、Ｐ１０位、Ｐ１１位、Ｐ１２位またはＰ１３位を突然変異させることができる。
【０２４７】
用語「がん関連タンパク質」は、複数のタイプのがんに存在する突然変異を有するタンパク質、特定のタイプのがんを有する複数の対象に存在する突然変異を有するタンパク質、または１タイプもしくは複数のタイプのがんの発生もしくは進行と相関する突然変異を有するタンパク質を含む。例えば、がん関連タンパク質は、発癌タンパク質（すなわち、細胞成長を調節するタンパク質などの、がん進行に寄与することができる活性を有するタンパク質）であることもあり、または腫瘍抑制タンパク質（すなわち、がん形成の可能性を、例えば、細胞周期の負の調節によって、またはアポトーシスを促進することにより、軽減するように概して作用するタンパク質）であることもある。
【０２４８】
例えば、がん関連タンパク質は、本明細書中の他の箇所で列挙されるがん関連タンパク質のいずれか１つであり得る。例えば、がん関連タンパク質は、次の遺伝子：CEACAM5、GAGE1、hTERT、KLHL7、MAGEA3、MAGEA4、MAGEA6、NUF2、NYESO1、PAGE4、PRAME、PSA、PSMA、RNF43、SART3、SSX2、STEAP1およびSURVIVINのうちの１つによりコードされ得る。
【０２４９】
本明細書で開示される融合ポリペプチドは、がん関連タンパク質の任意の組合せ（すなわち、１つまたは複数のがん関連タンパク質）に由来する任意の順序でのヘテロクリティック突然変異の任意の組合せを含む、ヘテロクリティック抗原性ペプチドを含むことができる。ヘテロクリティック抗原性ペプチドの組合せまたは融合ポリペプチドは、親水性であることができ、またはある特定のハイドロパシー閾値以下もしくはそれ未満のスコアを有することができ、このスコアは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓまたは目的の別の細菌における分泌可能性を予測することができる。一部の場合、ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、複数のがん関連タンパク質（例えば、２つまたはそれより多くのがん関連タンパク質）に由来し得る。
【０２５０】
一例として、がん関連タンパク質は、次の遺伝子：ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＡＧＥＡ６、ＭＡＧＥＡ４、ＧＡＧＥ１、ＮＹＥＳＯ１、ＳＴＥＡＰ１およびＲＮＦ４３のうちの１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、またはすべてによりコードされるタンパク質を含むことができる。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、ＨＬＡ型Ａ０２０１、Ａ０３０１、Ａ２４０２およびＢ０７０２の１つもしくは複数またはすべてに、結合することができる。そのようながん関連タンパク質は、例えば、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）と関連する。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、いずれの順序で存在してもよい。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、互いに直接融合していることもあり、またはリンカーにより互いに連結していることもあり、それらの例は、本明細書中の他の箇所で開示される。具体例では、ヘテロクリティック抗原性ペプチドの１つもしくは複数またはすべてが、９ｍｅｒ（例えば、リンカーにより互いに連結している９ｍｅｒ）であり得る。そのような抗原性ペプチドの例は、実施例１１で提供される。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、表３６中のヘテロクリティック抗原性ペプチドの１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、１０もしくはそれより多く、または１１すべてを含むことができる。
【０２５１】
別の例として、がん関連タンパク質は、次の遺伝子：ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＡＧＥＡ４、ＳＴＥＡＰ１、ＲＮＦ４３、ＳＳＸ２、ＳＡＲＴ３、ＰＡＧＥ４、ＰＳＭＡおよびＰＳＡのうちの１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、またはすべてによりコードされるタンパク質を含むことができる。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、ＨＬＡ型Ａ０２０１、Ａ０３０１、Ａ２４０２およびＢ０７０２の１つもしくは複数またはすべてに、結合することができる。そのようながん関連タンパク質は、例えば、前立腺がんと関連する。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、いずれの順序で存在してもよい。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、互いに直接融合していることもあり、またはリンカーにより互いに連結していることもあり、それらの例は、本明細書中の他の箇所で開示される。具体例では、抗原性ペプチドの１つもしくは複数またはすべてが、９ｍｅｒ（例えば、リンカーにより互いに連結している９ｍｅｒ）であり得る。そのようなヘテロクリティック抗原性ペプチドの例は、実施例１１で提供される。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、表５３中のヘテロクリティック抗原性ペプチドの１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、または１０すべてを含むことができる。
【０２５２】
別の例として、がん関連タンパク質は、次の遺伝子：ＣＥＡＣＡＭ５、ＳＴＥＡＰ１、ＭＡＧＥＡ３、ＰＲＡＭＥ、ｈＴＥＲＴおよびＳＵＲＶＩＶＩＮのうちの１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、またはすべてによりコードされるタンパク質を含むことができる。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、ＨＬＡ型Ａ０２０１、Ａ０３０１、Ａ２４０２およびＢ０７０２の１つもしくは複数またはすべてに、結合することができる。そのようながん関連タンパク質は、例えば、すい臓がんと関連する。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、いずれの順序で存在してもよい。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、互いに直接融合していることもあり、またはリンカーにより互いに連結していることもあり、それらの例は、本明細書中の他の箇所で開示される。具体例では、抗原性ペプチドの１つもしくは複数またはすべてが、９ｍｅｒ（例えば、リンカーにより互いに連結している９ｍｅｒ）であり得る。そのようなヘテロクリティック抗原性ペプチドの例は、実施例１１で提供される。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、表６９中のヘテロクリティック抗原性ペプチドの１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、１０もしくはそれより多く、１１もしくはそれより多く、または１２すべてを含むことができる。
【０２５３】
別の例として、がん関連タンパク質は、次の遺伝子：ＣＥＡＣＡＭ５、ＧＡＧＥ１、ＮＹＥＳＯ１、ＲＮＦ４３、ＮＵＦ２、ＫＬＨＬ７、ＭＡＧＥＡ３およびＰＲＡＭＥのうちの１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、またはすべてによりコードされるタンパク質を含むことができる。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、ＨＬＡ型Ａ０２０１、Ａ０３０１、Ａ２４０２およびＢ０７０２の１つもしくは複数またはすべてに、結合することができる。そのようながん関連タンパク質は、例えば、膀胱がんと関連する。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、いずれの順序で存在してもよい。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、互いに直接融合していることもあり、またはリンカーにより互いに連結していることもあり、それらの例は、本明細書中の他の箇所で開示される。具体例では、抗原性ペプチドの１つもしくは複数またはすべてが、９ｍｅｒ（例えば、リンカーにより互いに連結している９ｍｅｒ）であり得る。そのようなヘテロクリティック抗原性ペプチドの例は、実施例１１で提供される。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、表７７中のヘテロクリティック抗原性ペプチドの１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、１０もしくはそれより多く、１１もしくはそれより多く、１２もしくはそれより多く、１３もしくはそれより多く、または１４すべてを含むことができる。
【０２５４】
別の例として、がん関連タンパク質は、次の遺伝子：ＣＥＡＣＡＭ５、ＳＴＥＡＰ１、ＲＮＦ４３、ＭＡＧＥＡ３、ＰＲＡＭＥおよびｈＴＥＲＴのうちの１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、またはすべてによりコードされるタンパク質を含むことができる。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、ＨＬＡ型Ａ０２０１、Ａ０３０１、Ａ２４０２およびＢ０７０２の１つもしくは複数またはすべてに、結合することができる。そのようながん関連タンパク質は、例えば、乳がん（例えば、ＥＲ＋乳がん）と関連する。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、いずれの順序で存在してもよい。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、互いに直接融合していることもあり、またはリンカーにより互いに連結していることもあり、それらの例は、本明細書中の他の箇所で開示される。具体例では、抗原性ペプチドの１つもしくは複数またはすべてが、９ｍｅｒ（例えば、リンカーにより互いに連結している９ｍｅｒ）であり得る。そのようなヘテロクリティック抗原性ペプチドの例は、実施例１１で提供される。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、表８８中のヘテロクリティック抗原性ペプチドの１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、１０もしくはそれより多く、または１１すべてを含むことができる。
【０２５５】
別の例として、がん関連タンパク質は、次の遺伝子：ＣＥＡＣＡＭ５、ＰＲＡＭＥ、ｈＴＥＲＴ、ＳＴＥＡＰ１、ＲＮＦ４３、ＮＵＦ２、ＫＬＨＬ７およびＳＡＲＴ３のうちの１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、またはすべてによりコードされるタンパク質を含むことができる。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、ＨＬＡ型Ａ０２０１、Ａ０３０１、Ａ２４０２およびＢ０７０２の１つもしくは複数またはすべてに、結合することができる。そのようながん関連タンパク質は、例えば、子宮がんと関連する。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、いずれの順序で存在してもよい。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、互いに直接融合していることもあり、またはリンカーにより互いに連結していることもあり、それらの例は、本明細書中の他の箇所で開示される。具体例では、抗原性ペプチドの１つもしくは複数またはすべてが、９ｍｅｒ（例えば、リンカーにより互いに連結している９ｍｅｒ）であり得る。そのようなヘテロクリティック抗原性ペプチドの例は、実施例１１で提供される。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、表９６中のヘテロクリティック抗原性ペプチドの１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、１０もしくはそれより多く、１１もしくはそれより多く、１２もしくはそれより多く、１３もしくはそれより多く、または１４すべてを含むことができる。
【０２５６】
別の例として、がん関連タンパク質は、次の遺伝子：ＣＥＡＣＡＭ５，ＳＴＥＡＰ１，ＲＮＦ４３，ＳＡＲＴ３，ＮＵＦ２，ＫＬＨＬ７，ＰＲＡＭＥおよびｈＴＥＲＴのうちの１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、またはすべてによりコードされるタンパク質を含むことができる。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、ＨＬＡ型Ａ０２０１、Ａ０３０１、Ａ２４０２およびＢ０７０２の１つもしくは複数またはすべてに、結合することができる。そのようながん関連タンパク質は、例えば、卵巣がんと関連する。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、いずれの順序で存在してもよい。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、互いに直接融合していることもあり、またはリンカーにより互いに連結していることもあり、それらの例は、本明細書中の他の箇所で開示される。具体例では、抗原性ペプチドの１つもしくは複数またはすべてが、９ｍｅｒ（例えば、リンカーにより互いに連結している９ｍｅｒ）であり得る。そのようなヘテロクリティック抗原性ペプチドの例は、実施例１１で提供される。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、表１０１中のヘテロクリティック抗原性ペプチドの１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、１０もしくはそれより多く、１１もしくはそれより多く、１２もしくはそれより多く、１３もしくはそれより多く、または１４すべてを含むことができる。
【０２５７】
別の例として、がん関連タンパク質は、次の遺伝子：ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＡＧＥＡ６、ＳＴＥＡＰ１、ＲＮＦ４３、ＳＡＲＴ３、ＮＵＦ２、ＫＬＨＬ７およびｈＴＥＲＴのうちの１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、またはすべてによりコードされるタンパク質を含むことができる。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、ＨＬＡ型Ａ０２０１、Ａ０３０１、Ａ２４０２およびＢ０７０２の１つもしくは複数またはすべてに、結合することができる。そのようながん関連タンパク質は、例えば、低悪性度神経膠腫と関連する。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、いずれの順序で存在してもよい。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、互いに直接融合していることもあり、またはリンカーにより互いに連結していることもあり、それらの例は、本明細書中の他の箇所で開示される。具体例では、抗原性ペプチドの１つもしくは複数またはすべてが、９ｍｅｒ（例えば、リンカーにより互いに連結している９ｍｅｒ）であり得る。そのようなヘテロクリティック抗原性ペプチドの例は、実施例１１で提供される。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、表１０５中のヘテロクリティック抗原性ペプチドの１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、または１０すべてを含むことができる。
【０２５８】
別の例として、がん関連タンパク質は、次の遺伝子：ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＡＧＥＡ６、ＭＡＧＥＡ４、ＧＡＧＥ１、ＮＹＥＳＯ１、ＳＴＥＡＰ１、ＲＮＦ４３およびＭＡＧＥＡ３のうちの１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、またはすべてによりコードされるタンパク質を含むことができる。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、ＨＬＡ型Ａ０２０１、Ａ０３０１、Ａ２４０２およびＢ０７０２の１つもしくは複数またはすべてに、結合することができる。そのようながん関連タンパク質は、例えば、結腸直腸がん（例えば、ＭＳＳ結腸直腸がん）と関連する。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、いずれの順序で存在してもよい。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、互いに直接融合していることもあり、またはリンカーにより互いに連結していることもあり、それらの例は、本明細書中の他の箇所で開示される。具体例では、抗原性ペプチドの１つもしくは複数またはすべてが、９ｍｅｒ（例えば、リンカーにより互いに連結している９ｍｅｒ）であり得る。そのようなヘテロクリティック抗原性ペプチドの例は、実施例１１で提供される。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、表１０９中のヘテロクリティック抗原性ペプチドの１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、または１０すべてを含むことができる。
【０２５９】
別の例として、がん関連タンパク質は、次の遺伝子：ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＡＧＥＡ４、ＳＴＥＡＰ１、ＮＹＥＳＯ１、ＰＲＡＭＥおよびｈＴＥＲＴのうちの１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、またはすべてによりコードされるタンパク質を含むことができる。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、ＨＬＡ型Ａ０２０１、Ａ０３０１、Ａ２４０２およびＢ０７０２の１つもしくは複数またはすべてに、結合することができる。そのようながん関連タンパク質は、例えば、頭頸部がんと関連する。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、いずれの順序で存在してもよい。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、互いに直接融合していることもあり、またはリンカーにより互いに連結していることもあり、それらの例は、本明細書中の他の箇所で開示される。具体例では、抗原性ペプチドの１つもしくは複数またはすべてが、９ｍｅｒ（例えば、リンカーにより互いに連結している９ｍｅｒ）であり得る。そのようなヘテロクリティック抗原性ペプチドの例は、実施例１１で提供される。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、表１１３中のヘテロクリティック抗原性ペプチドの１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、または１０すべてを含むことができる。
【０２６０】
Ｃ．ＰＥＳＴ含有ペプチド
本明細書で開示される組換え融合タンパク質は、ＰＥＳＴ含有ペプチドを含む。ＰＥＳＴ含有ペプチドは、融合ポリペプチドのアミノ末端（Ｎ末端）（すなわち、抗原性ペプチドのＮ末端側）にあってもよく、融合ポリペプチドのカルボキシ末端（Ｃ末端）（すなわち、抗原性ペプチドのＣ末端側）にあってもよく、または抗原性ペプチド中に組み込まれていてもよい。一部の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株および方法では、ＰＥＳＴ含有ペプチドは、融合ポリペプチドの一部ではなく、融合ポリペプチドとは別である。ＬＬＯペプチドなどの抗原性ペプチドのＰＥＳＴ様配列との融合は、抗原性ペプチドの免疫原性を増強することができ、細胞により媒介される抗腫瘍免疫応答を増大させる（すなわち、細胞により媒介される抗腫瘍免疫を増大させる）ことができる。例えば、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれるSinghら（２００５年）J  Immunol  １７５巻（６号）：３６６３〜３６７３頁を参照されたい。ＰＥＳＴ含有ペプチドは、本明細書中の他の箇所でより詳細に開示される。
【０２６１】
Ｄ．組換え融合ポリペプチドをコードする免疫療法構築物の生成
本明細書で開示される組換え融合ポリペプチドをコードする免疫療法構築物または本明細書で開示される組換え融合ポリペプチドを含む組成物を生成するための方法も、本明細書で提供される。例えば、そのような方法は、免疫療法構築物に含めるためのヘテロクリティック突然変異セットを選択するステップ、ヘテロクリティック突然変異のそれぞれを含むヘテロクリティック抗原性ペプチドを設計するステップ（および例えば、各ヘテロクリティック抗原性ペプチドのハイドロパシーを検査し、ヘテロクリティック抗原性ペプチドが、選択されたハイドロパシー指数閾値を超えるスコアを有する場合はこれを修飾または選択解除するステップ）、ヘテロクリティック抗原性ペプチドの１つまたは複数のセットを選択するステップ、選択されたヘテロクリティック抗原性ペプチドのそれぞれを含む１つまたは複数の融合ポリペプチドを設計するステップ、および融合ポリペプチドをコードする核酸構築物を生成するステップを含むことができる。
【０２６２】
本明細書中の他の箇所でさらに詳細に論じられるように、任意の基準に基づいて、個々のヘテロクリティック突然変異を選択することができる。例えば、個々のヘテロクリティック突然変異またはヘテロクリティックペプチドを、それらがＣＤ８＋Ｔリンパ球応答を生じさせることが分かった場合、選択することができる。
【０２６３】
融合ポリペプチドに含めることが可能なヘテロクリティック突然変異セットの同定後、各ヘテロクリティック突然変異を含むヘテロクリティック抗原性ペプチドについての配列を選択することができる。本明細書中の他の箇所で開示されるように、種々のサイズの抗原性ペプチドを使用することができる。例えば、ヘテロクリティック突然変異またはヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、９アミノ酸からなるＭＨＣクラスＩエピトープに重点を置いたものであり得る。
【０２６４】
その場合、ヘテロクリティック抗原性ペプチドの配列を、ＭＨＣクラスＩ分子との結合を増強するように最適化することができる。各ＨＬＡとの結合を最適化するために、Ｐｅｐｔｉｄｅ  ＭＨＣ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ＭｏｔｉｆおよびＡｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ＣｈａｒｔをＩｍｍｕｎｅ  Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（例えば、ｉｅｄｂ．ｏｒｇ／ＭＨＣａｌｌｅｌｅｉｄ／１４３）から評定することができる。アンカー位における好ましいアミノ酸を、ヘテロクリティック抗原性ペプチド配列に挿入することができる（例えば、ＮＵＦ２−野生型：ＹＭＭＰＶＮＳＥＶ（配列番号７２５）およびＮＵＦ２−ヘテロクリティック：ＹＬＭＰＶＮＳＥＶ（配列番号７２６））。
【０２６５】
次いで、配列最適化されたヘテロクリティック抗原性ペプチドの結合親和性を、例えば次のアルゴリズムの１つを使用して、評定することができる：ＮｅｔＭＨＣ４．０サーバー、ＮｅｔＭＨＣｐａｎ４．０サーバー、およびｍｈｃｆｌｕｒｒｙ  ｖ０．２．０。例えば、特定のＨＬＡに対する予測結合親和性が、対応する天然配列と等価であるか、それより強い場合、ヘテロクリティック抗原性ペプチドと見なすことができる。次いで、選択された、配列最適化されたヘテロクリティック抗原性ペプチドを、ＰｒｏＩｍｍｕｎｅのＲＥＶＥＡＬアッセイを使用して特定のＨＬＡとのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの結合についてスクリーニングすることができる。例えば、結合親和性がＲＥＶＥＡＬアッセイの陽性対照ペプチドの≧４５％であるヘテロクリティック抗原性ペプチドを、バインダーと見なした。
【０２６６】
ヘテロクリティック抗原性ペプチドのＲＮＡ発現レベルをＴＣＧＡ  ＲＮＡｓｅｑＶ２データセット中の特定の徴候に関して測定することもできる。正規化ＲＮＡ発現リードが０より大きいＴＣＧＡ試料のパーセンテージを計算することができる。試料の大多数の中でＴＣＧＡ発現を有するヘテロクリティック抗原性ペプチドを優先することができる。
【０２６７】
そのような方法は、例えば、各ヘテロクリティック抗原性ペプチドのハイドロパシーを検査し、ヘテロクリティック抗原性ペプチドを、それが選択されたハイドロパシー指数閾値を超えるスコアを有する場合、修飾または選択解除するステップ、選択されたヘテロクリティック抗原性ペプチドのそれぞれを含む１つまたは複数の融合ポリペプチドを設計するステップ、および融合ポリペプチドをコードする核酸構築物を生成するステップを含むこともできる。そのような方法は、本明細書中の他の箇所でより詳細に開示される。
【０２６８】
具体例では、文献検討を行って、徴候特異的腫瘍関連抗原のゲノムランドスケープを調査して、可能性のあるＴＡＡのショートリストを生成することができる。もう１度文献検討を行って、ショートリストＴＡＡが、ＣＤ８＋Ｔリンパ球応答を生じさせる公知の免疫原性ペプチドを含有するかどうかを判定することができる。このアプローチは、例えば、ＴＡＡに由来する９アミノ酸（９ｍｅｒ）からなるＭＨＣクラスＩエピトープに主眼を置くことができる。このステップは、例えば、４つのＨＬＡ型（ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２、およびＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２）の１つと結合する、９ｍｅｒ形式の、可能性のある標的ペプチドを同定することができる。
【０２６９】
その場合、標的ペプチドは、ＭＨＣクラスＩ分子（別名ヘテロクリティックペプチド）との結合を増強するように最適化された配列であり得る。各ＨＬＡとの結合を最適化するために、Ｐｅｐｔｉｄｅ  ＭＨＣ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ＭｏｔｉｆおよびＡｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｃｈａｒｔを、Ｉｍｍｕｎｅ  Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（例えば、ｉｅｄｂ．ｏｒｇ／ＭＨＣａｌｌｅｌｅｉｄ／１４３）から評定することができる。アンカー位における好ましいアミノ酸を、標的ペプチド配列に挿入することができる（例えば、ＮＵＦ２−野生型：ＹＭＭＰＶＮＳＥＶ（配列番号７２５）およびＮＵＦ２−ヘテロクリティック：ＹＬＭＰＶＮＳＥＶ（配列番号７２６））。次いで、配列最適化された標的ペプチドおよび野生型標的ペプチドの結合親和性を、例えば次のアルゴリズムの１つを使用して、評定することができる：ＮｅｔＭＨＣ４．０サーバー、ＮｅｔＭＨＣｐａｎ４．０サーバー、およびｍｈｃｆｌｕｒｒｙ  ｖ０．２．０。例えば、特定のＨＬＡに対する予測結合親和性が、野生型標的ペプチド配列と等価であるか、それより強い場合、配列最適化された標的ペプチドと見なすことができる。次いで、選択された配列最適化された標的ペプチドを、ＰｒｏＩｍｍｕｎｅのＲＥＶＥＡＬアッセイを使用して特定のＨＬＡとのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの結合についてスクリーニングすることができる。例えば、結合親和性がＲＥＶＥＡＬアッセイの陽性対照ペプチドの≧４５％である標的ペプチドは、バインダーと見なすことができる。最後に、標的ペプチドのＲＮＡ発現レベルをＴＣＧＡ  ＲＮＡｓｅｑＶ２データセット中の特定の徴候に関して測定することができる。例えば、正規化ＲＮＡ発現リードが０より大きいＴＣＧＡ試料のパーセンテージを計算することができる。例えば、試料の大多数の中でＴＣＧＡ発現を有する標的ペプチドを優先することができる。
【０２７０】
ＩＶ．ミニ遺伝子構築物によりコードされる組換え融合ポリペプチド
Ｎ末端からＣ末端に向かって、細菌分泌シグナル配列、ユビキチン（Ｕｂ）タンパク質、そしてがん関連タンパク質に由来する抗原性ペプチド（または１つもしくは複数の抗原性ペプチド）を含む、組換え融合ポリペプチドが、本明細書で開示される。２つまたはそれより多くの抗原性ペプチドが含まれる場合、それらの抗原性ペプチドは、タンデムに存在し得る（例えば、Ｕｂ−ペプチド１−ペプチド２）。あるいは、各抗原性ペプチドが、その独自の分泌配列およびＵｂタンパク質と融合している（例えば、Ｕｂ１−ペプチド１、Ｕｂ２−ペプチド２）、別個の融合ポリペプチドの組合せを、使用することができる。好適な抗原性ペプチドの例は、本明細書中の他の箇所で開示される。抗原性ペプチドは、本明細書中の他の箇所で開示されるような反復性がん突然変異を含むことができる。あるいは、抗原性ペプチドは、本明細書中の他の箇所で開示されるようなヘテロクリティック突然変異を含むことができる。
【０２７１】
そのような組換え融合ポリペプチドをコードする核酸（ミニ遺伝子構築物と称される）も開示される。そのようなミニ遺伝子核酸構築物は、各オープンリーディングフレーム間がシャイン・ダルガーノリボソーム結合部位核酸配列によって連結された２つまたはそれより多くのオープンリーディングフレームをさらに含むことができる。例えば、ミニ遺伝子核酸構築物は、各オープンリーディングフレーム間がシャイン・ダルガーノリボソーム結合部位核酸配列によって連結された２〜４つのオープンリーディングフレームをさらに含むことができる。各オープンリーディングフレームは、Ｎ末端からＣ末端に向かって細菌分泌配列、ユビキチン（Ｕｂ）タンパク質、そして１つまたは複数の抗原性ペプチドを含む、異なる融合ポリペプチドをコードすることができる。融合ポリペプチドのカルボキシ末端をコードするコドンの後に、タンパク質合成の終結を確実にするための２つの停止コドンが続き得る。
【０２７２】
ミニ遺伝子構築物によりコードされる一部の融合ポリペプチドには、がん関連タンパク質に由来する（例えば、反復性がん突然変異および／またはヘテロクリティック突然変異を含む）１つまたは複数のさらなる抗原性ペプチドが、細菌分泌配列とユビキチンタンパク質の間にある。例えば、１〜４０、１〜３５、１〜３０、１〜２５、１〜２０、１〜１５、１〜１０、１〜５、１〜４、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０のさらなる抗原性ペプチドが、細菌分泌配列とユビキチンタンパク質の間にあることがある。２つまたはそれより多くのさらなる抗原性ペプチドがある場合、それらは、互いに直接融合していることもあり、またはペプチドリンカーによって連結していることもある。例示的なリンカーは、本明細書中の他の箇所で開示される。さらなる抗原性ペプチドは、反復性がん突然変異を含む１つもしくは複数の抗原性ペプチド、および／または１つもしくは複数のヘテロクリティック抗原性ペプチドを含むことができる。そのようなペプチドの例は、本明細書中の他の箇所で開示される。
【０２７３】
細菌分泌シグナル配列の例は、本明細書中の他の箇所でより詳細に開示される。ユビキチンは、例えば、完全長タンパク質であることができる。ミニ遺伝子構築物によりコードされる例示的なユビキチンペプチドは、配列番号７４７に記載の配列を含む、そのような配列から本質的になる、またはそのような配列からなる。本明細書で提供される核酸構築物から発現されるユビキチンは、宿主細胞サイトゾルに侵入すると加水分解酵素の作用によって、核酸構築物から発現される組換え融合ポリペプチドの残部からユビキチンのカルボキシ末端で切断され得る。これにより、宿主細胞サイトゾル中で融合タンパク質の残部が遊離されてペプチドが産生される。
【０２７４】
融合ポリペプチド中の抗原性ペプチドの選択、変形形態および配置は、本明細書中の他の箇所で詳細に論じられ、ヘテロクリティック突然変異型抗原性ペプチドの生成方法は、本明細書中の他の箇所でより詳細に論じられる。組換え融合ポリペプチドは、本明細書中の他の箇所で開示されるような１つまたは複数のタグを含むことができる。例えば、組換え融合ポリペプチドは、１つもしくは複数の抗原性ペプチドのＮ末端および／もしくはＣ末端側に、またはユビキチンのＮ末端および／もしくはＣ末端側に（例えば、ユビキチンのＮ末端側に）、１つまたは複数のペプチドタグを含むことができる。タグは、抗原性ペプチドもしくはユビキチンと直接融合していることもあり、またはリンカー（その例は、本明細書中の他の箇所で開示される）を介して抗原性ペプチドもしくはユビキチンに連結していることもある。
【０２７５】
本明細書において開示される組換え融合ポリペプチドは、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株によって発現させることもできるし、タンパク質の発現および単離に使用される他のベクターおよび細胞系から発現させ単離することもできる。かかる抗原性ペプチドを発現する組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株は、例えば、かかる組換えＬｉｓｔｅｒｉａを含む免疫原性組成物において、ならびに組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株およびアジュバントを含むワクチンにおいて使用され得る。
【０２７６】
そのような組換え融合ポリペプチドをコードする核酸（ミニ遺伝子構築物）も開示される。核酸は、任意の形態であってよい。核酸は、ＤＮＡもしくはＲＮＡを含んでも、またはそれらからなってもよく、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。核酸は、エピソームプラスミド、マルチコピーエピソームプラスミド、または組込みプラスミドなどのプラスミドの形態であり得る。代替的に、核酸は、ウイルスベクター、ファージベクター、または細菌人工染色体中の形態であってもよい。かかる核酸は、１つのオープンリーディングフレームを有してもよいし、２つまたはそれよりも多くのオープンリーディングフレーム（例えば、組換え融合ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、および代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレーム）を有してもよい。一例において、かかる核酸は、各オープンリーディングフレーム間のシャイン・ダルガーノリボソーム結合部位核酸配列によって連結された２つまたはそれよりも多くのオープンリーディングフレームを含み得る。例えば、核酸は、各オープンリーディングフレーム間のシャイン・ダルガーノリボソーム結合部位核酸配列によって連結された２〜４つのオープンリーディングフレームを含み得る。各オープンリーディングフレームが異なるポリペプチドをコードしてよい。融合ポリペプチドのカルボキシ末端をコードするコドンの後に、タンパク質合成の終結を確実にするための２つの停止コドンが続き得る。
【０２７７】
ミニ遺伝子構築物に含めるための一部の例示的抗原性ペプチドは、下記の表中のものを含む。
【表１２８】
2020513737.tif 000012
【０２７８】
Ａ．ミニ遺伝子構築物によりコードされる抗原性ペプチド
本明細書で開示されるミニ遺伝子構築物によりコードされる抗原性ペプチドは、反復性がん突然変異抗原性ペプチドおよび／またはヘテロクリティック抗原性ペプチド（例えば、ＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩヘテロクリティックペプチド）であり得る。そのようなペプチドの例は、本明細書中の他の箇所で開示される。例えば、ミニ遺伝子構築物によりコードされる抗原性ペプチドは、次のＨＬＡ型：ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２およびＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２のうちの１つまたは複数と結合するヘテロクリティック抗原性ペプチドであり得る。具体例として、ミニ遺伝子構築物によりコードされる抗原性ペプチドは、次の遺伝子：ＳＴＥＡＰ１、ＣＥＡＣＡＭ５、ＮＹＥＳＯ１およびＮＵＦ２のうちの１つによりコードされるタンパク質に由来し得る。
【０２７９】
ミニ遺伝子構築物によりコードされる融合ポリペプチドは、単一の抗原性ペプチドを含むこともあり、または２つもしくはそれより多くの抗原性ペプチドを含むこともある。各抗原性ペプチドは、免疫応答を誘導するのに十分な任意の長さであることができ、各抗原ペ性プチドが同じ長さであることもあり、または抗原性ペプチドが異なる長さを有することもある。例えば、ミニ遺伝子構築物によりコードされる抗原性ペプチドは、８〜１００、８〜５０、８〜３０、８〜２５、８〜２２、８〜２０、８〜１５、８〜１４、８〜１３、８〜１２、８〜１１、７〜１１、または８〜１０アミノ酸長であり得る。一例では、抗原性ペプチドは、９アミノ酸長であり得る。
【０２８０】
各抗原性ペプチドはまた、親水性であることができ、またはある特定のハイドロパシー閾値以下もしくはそれ未満のスコアを有することができ、このスコアは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓまたは目的の別の細菌における分泌可能性を予測することができる。例えば、抗原性ペプチドをＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅのハイドロパシー指数２１アミノ酸ウィンドウによりスコアリングすることができ、カットオフ（およそ１．６）を超えるスコアを有するすべてを除外することができる。それらは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓによって分泌可能である可能性が低いからである。同様に、抗原性ペプチドの組合せまたは融合ポリペプチドは、親水性であることができ、またはある特定のハイドロパシー閾値以下もしくはそれ未満のスコアを有することができ、このスコアは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓまたは目的の別の細菌における分泌可能性を予測することができる。
【０２８１】
融合ポリペプチドが１つより多くの抗原性ペプチドを含む場合、抗原性ペプチドは、いかなる様式で互いに連結していてもよい。例えば、抗原性ペプチドは、介在配列なしで直接互いに融合していてよい。代替的に、抗原性ペプチドは、ペプチドリンカーなどの１つまたは複数のリンカーを介して間接的に互いに連結していてもよい。場合によっては、隣接する抗原性ペプチドの一部の対は互いに直接融合していてもよく、抗原性ペプチドの他の対は、１つまたは複数のリンカーを介して間接的に互いに連結していてもよい。隣接する抗原性ペプチドの各対の間に同じリンカーを使用してもよいし、隣接する抗原性ペプチドの異なる対の間に任意の数の異なるリンカーを使用してもよい。加えて、一対の隣接する抗原性ペプチド間に１つのリンカーを使用してもよいし、一対の隣接する抗原性ペプチド間に複数のリンカーを使用してもよい。任意の好適な配列をペプチドリンカーに使用することができる。好適なリンカーの例は、本明細書中の他の箇所で開示される。
【０２８２】
ミニ遺伝子構築物に使用するための抗原性ペプチドの例示的な配列は、本明細書中の他の箇所で開示される。一例として、抗原性ペプチドは、本明細書で開示される抗原性ペプチド配列のいずれかと少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一の配列を含むことができ、そのような配列から本質的になることができ、またはそのような配列からなることができる。
【０２８３】
Ｂ．細菌分泌シグナル配列
細菌分泌シグナル配列は、Ｌｉｓｔｅｒｉａシグナル配列、例えば、ＨｌｙもしくはＡｃｔＡシグナル配列、または任意の他の公知のシグナル配列であり得る。他の場合、シグナル配列は、ＬＬＯシグナル配列であり得る。例示的なＬＬＯシグナル配列は、配列番号９２０に記載されている。例えば、本明細書におけるミニ遺伝子構築物によりコードされる細菌分泌シグナル配列は、配列番号３３６に記載のものなどのＬＬＯのＮ末端断片であり得る。シグナル配列は、細菌のものであることもあり、宿主細菌に特有のもの（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、例えばｓｅｃＡ１シグナルペプチド）であるであることもあり、または宿主細菌にとって異質のものであることもある。シグナルペプチドの具体例としては、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓに由来するＵｓｐ４５シグナルペプチド、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓに由来する保護抗原シグナルペプチド、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに由来するｐ６０シグナルペプチドなどのｓｅｃＡ２シグナルペプチド、およびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  Ｔａｔシグナルペプチド（例えば、ＰｈｏＤ）などのＴａｔシグナルペプチドが挙げられる。具体例では、分泌シグナル配列は、Ｌｉｓｔｅｒｉａタンパク質に由来するもの、例えば、ＡｃｔＡ３００分泌シグナル、またはＡｃｔＡ１００分泌シグナル（ＡｃｔＡ分泌シグナル配列の最初の１００アミノ酸を含む）である。例示的なＡｃｔＡシグナル配列は、配列番号９２１に記載されている。
【０２８４】
Ｃ．ミニ遺伝子構築物によりコードされる組換え融合ポリペプチドをコードする免疫療法構築物の生成
本明細書で開示される組換え融合ポリペプチドをコードする免疫療法構築物または本明細書で開示される組換え融合ポリペプチドを含む組成物を生成するための方法も、本明細書で提供される。例えば、そのような方法は、免疫療法構築物に含めるための抗原または免疫原性ペプチドを選択および設計するステップ（および例えば、各抗原性ペプチドのハイドロパシーを検査し、抗原性ペプチドを、それが選択されたハイドロパシー指数閾値を超えるスコアを有する場合、修飾または選択解除するステップ）、選択された抗原性ペプチドのそれぞれを含む１つまたは複数の融合ポリペプチドを設計するステップ、ならびに融合ポリペプチドをコードする核酸構築物を生成するステップを含むことができる。そのような方法は、本明細書中の他の箇所でより詳細に開示される。加えて、野生型エピトープに対する交差反応性免疫原性応答を惹起する可能性がある予測ヘテロクリティックエピトープを生成するための方法が、本明細書中の他の箇所でより詳細に記載される。
【０２８５】
Ｖ．反復性がん突然変異抗原性ペプチドとヘテロクリティック抗原性ペプチドとミニ遺伝子構築物によりコードされるペプチドとの組合せを含む組換え融合ポリペプチド
本明細書で開示される組換え融合ポリペプチドは、本明細書で開示される反復性がん突然変異のいずれかを含む抗原性ペプチドと、本明細書で開示されるヘテロクリティック突然変異のいずれかを含む抗原性ペプチド（例えば、がん関連タンパク質に由来する）と、本明細書で開示されるミニ遺伝子構築物のいずれかから発現される抗原性ペプチド（例えば、がん関連タンパク質に由来する）（すなわち、ユビキチンと融合している抗原性ペプチド）との任意の組合せを含むことができる。本明細書で開示されるいずれの抗原性ペプチドが、組換え融合ポリペプチドに含まれていてもよい。例えば、組換え融合ポリペプチドは、反復性がん突然変異抗原性ペプチドのみを含むこともあり、ヘテロクリティック抗原性ペプチドのみを含むこともあり、またはミニ遺伝子構築物抗原性ペプチドのみを含むこともある。同様に、組換え融合ポリペプチドは、反復性がん突然変異抗原性ペプチドとヘテロクリティック抗原性ペプチドの両方を含むが、ミニ遺伝子構築物抗原性ペプチドを含まないことがある。同様に、組換え融合ポリペプチドは、反復性がん突然変異抗原性ペプチドとミニ遺伝子構築物抗原性ペプチドの両方を含むが、ヘテロクリティック抗原性ペプチドを含まないことがある。同様に、組換え融合ポリペプチドは、ヘテロクリティック抗原性ペプチドとミニ遺伝子構築物抗原性ペプチドの両方を含むが、反復性がん突然変異抗原性ペプチドを含まないことがある。
【０２８６】
例えば、２つまたはそれより多くの抗原性ペプチドと融合しているＰＥＳＴ含有ペプチド（すなわち、タンデムに、例えば、ＰＥＳＴ−ペプチド１−ペプチド２）を含む組換え融合ポリペプチドであって、少なくとも１つの抗原性ペプチドが、反復性がん突然変異を含み、少なくとも１つの抗原性ペプチド（例えば、がん関連タンパク質に由来する）が、ヘテロクリティック突然変異を含む、組換え融合ポリペプチドが、本明細書で開示される。２つまたはそれより多くの抗原性ペプチドと融合しているＰＥＳＴ含有ペプチド（すなわち、タンデムに融合しているもの、例えば、ＰＥＳＴ−ペプチド１−ペプチド２）を含む組換え融合ポリペプチドであって、少なくとも１つの抗原性ペプチドが、反復性がん突然変異を含み、少なくとも１つの抗原性ペプチドが、ヘテロクリティック突然変異を含み、融合ポリペプチドが、ＰＥＳＴ含有ペプチドを含まない、組換え融合ポリペプチドも、本明細書に存在する。反復性がん突然変異およびヘテロクリティック突然変異の例は、本明細書中の他の箇所で開示される。
【０２８７】
Ｎ末端からＣ末端に向かって、細菌分泌シグナル配列を含むＰＥＳＴ含有ペプチド、反復性がん突然変異を含む１つまたは複数の抗原性ペプチド、ユビキチン（Ｕｂ）タンパク質、そしてがん関連タンパク質に由来する抗原性ペプチド（または１つもしくは複数の抗原性ペプチド）を含む、組換え融合ポリペプチドも、本明細書で開示される。２つまたはそれより多くの抗原性ペプチドがＣ末端に含まれる場合、それらの抗原性ペプチドは、タンデムに存在し得る（例えば、Ｕｂ−ペプチド１−ペプチド２）。あるいは、各抗原性ペプチドが、その独自の分泌配列およびＵｂタンパク質と融合している（例えば、Ｕｂ１−ペプチド１、Ｕｂ２−ペプチド２）、別個の融合ポリペプチドの組合せを、使用することができる。好適な抗原性ペプチドの例は、本明細書中の他の箇所で開示される。反復性がん突然変異を含む抗原性ペプチドの例は、本明細書中の他の箇所で開示される。
【０２８８】
Ｎ末端からＣ末端に向かって、細菌分泌シグナル配列を含むＰＥＳＴ含有ペプチド、ヘテロクリティック突然変異を含む１つまたは複数の抗原性ペプチド（例えば、がん関連タンパク質に由来する）、ユビキチン（Ｕｂ）タンパク質、そしてがん関連タンパク質に由来する抗原性ペプチド（または１つもしくは複数の抗原性ペプチド）を含む、組換え融合ポリペプチドも、本明細書で開示される。２つまたはそれより多くの抗原性ペプチドがＣ末端に含まれる場合、それらの抗原性ペプチドは、タンデムに存在し得る（例えば、Ｕｂ−ペプチド１−ペプチド２）。あるいは、各抗原性ペプチドが、その独自の分泌配列およびＵｂタンパク質と融合している（例えば、Ｕｂ１−ペプチド１、Ｕｂ２−ペプチド２）、別個の融合ポリペプチドの組合せを、使用することができる。好適な抗原性ペプチドの例は、本明細書中の他の箇所で開示される。ヘテロクリティック突然変異を含む抗原性ペプチドの例は、本明細書中の他の箇所で開示される。
【０２８９】
Ｎ末端からＣ末端に向かって、細菌分泌シグナル配列を含むＰＥＳＴ含有ペプチド、２つまたはそれより多くの抗原性ペプチド（この場合、少なくとも１つの抗原性ペプチドは、反復性がん突然変異を含み、少なくとも１つの抗原性ペプチド（例えば、がん関連タンパク質に由来する）は、ヘテロクリティック突然変異を含む）、ユビキチン（Ｕｂ）タンパク質、そしてがん関連タンパク質に由来する抗原性ペプチド（または１つもしくは複数の抗原性ペプチド）を含む、組換え融合ポリペプチドも、本明細書で開示される。２つまたはそれより多くの抗原性ペプチドがＣ末端に含まれる場合、それらの抗原性ペプチドは、タンデムに存在し得る（例えば、Ｕｂ−ペプチド１−ペプチド２）。あるいは、各抗原性ペプチドが、その独自の分泌配列およびＵｂタンパク質と融合している（例えば、Ｕｂ１−ペプチド１、Ｕｂ２−ペプチド２）、別個の融合ポリペプチドの組合せを、使用することができる。好適な抗原性ペプチドの例は、本明細書中の他の箇所で開示される。反復性がん突然変異を含む抗原性ペプチドの例は、本明細書中の他の箇所で開示される。ヘテロクリティック突然変異を含む抗原性ペプチドの例は、本明細書中の他の箇所で開示される。
【０２９０】
組換え融合ポリペプチドは、本明細書中の他の箇所でより詳細に開示されるような１つまたは複数のタグを含むことができる。反復性がん突然変異抗原性ペプチド、ヘテロクリティック抗原性ペプチド、およびミニ遺伝子構築物抗原性ペプチドの選択および例は、本明細書中の他の箇所で開示される。融合ポリペプチド中の抗原性ペプチドの選択、変形形態および配置は、本明細書中の他の箇所で詳細に論じられ、がん関連タンパク質は、本明細書中の他の箇所でより詳細に論じられる。ＰＥＳＴ含有ペプチドおよび細菌分泌シグナル配列の例は、本明細書中の他の箇所で開示される。そのような組換え融合ポリペプチドをコードする免疫療法構築物の生成は、本明細書中の他の箇所で開示される。
【０２９１】
本明細書で開示される組換え融合ポリペプチドは、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株により発現されることもあり、またはタンパク質発現および単離に使用される他のベクターおよび細胞系から発現され、単離されることもある。そのような抗原性ペプチドの発現する組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株は、例えば、そのような組換えＬｉｓｔｅｒｉａを含む免疫原性組成物に、および組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株とアジュバントとを含むワクチンに使用することができる。Ｌｉｓｔｅｒｉａ株の宿主細胞系における、およびＬｉｓｔｅｒｉａ以外の宿主細胞系における、非溶血性トランケート型のＬＬＯ、ＡｃｔＡまたはＰＥＳＴ様配列との融合ポリペプチドとしての１つまたは複数の抗原性ペプチドの発現は、抗原性ペプチドの免疫原性の増強をもたらすことができる。
【０２９２】
融合ポリペプチドは、任意の数の抗原性ペプチドを含み得る。場合によっては、融合ポリペプチドは、融合ポリペプチドが組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株から産生および分泌され得るような、任意の数の抗原性ペプチドを含む。例えば、融合ポリペプチドは、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、もしくは３０個の抗原性ペプチド、または２〜５０、２〜４５、２〜４０、２〜３５、２〜３０、２〜２５、２〜２０、２〜１５、２〜１０、２〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、もしくは４５〜５０個の抗原性ポリペプチドを含み得る。別の例では、融合ポリペプチドは、単一の抗原性ペプチドを含み得る。別の例では、融合ポリペプチドは、約１〜１００、１〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００、５〜１５、５〜２０、５〜２５、１５〜２０、１５〜２５、１５〜３０、１５〜３５、２０〜２５、２０〜３５、２０〜４５、３０〜４５、３０〜５５、４０〜５５、４０〜６５、５０〜６５、５０〜７５、６０〜７５、６０〜８５、７０〜８５、７０〜９５、８０〜９５、８０〜１０５、９５〜１０５、５０〜１００、１〜１００、５〜１００、５〜７５、５〜５０、５〜４０、５〜３０、５〜２０、５〜１５、５〜１０、１〜１００、１〜７５、１〜５０、１〜４０、１〜３０、１〜２０、１〜１５、または１〜１０個の抗原性ペプチドの範囲の数の抗原性ペプチドを含み得る。別の例では、融合ポリペプチドは、最大約１００、１０、２０、３０、４０、または５０個の抗原性ペプチドを含み得る。別の例では、融合ポリペプチドは、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００個の抗原性ペプチドを含み得る。
【０２９３】
別の例では、融合ポリペプチドは、少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４もしくは２５の抗原性ペプチド、または約５〜５０の間、１０〜４０の間、もしくは２０〜３０の間の抗原性ペプチドを含むことができる。例えば、融合ポリペプチドは、反復性がん突然変異を含む少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０の抗原性ペプチド、または反復性がん突然変異を含む約５〜約３０の間、もしくは約１０〜約２０の間の抗原性ペプチドを含むことができ、および／あるいはヘテロクリティック突然変異を含む少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０の抗原性ペプチド、またはヘテロクリティック突然変異を含む約５〜約３０の間、もしくは約１０〜約２０の間の抗原性ペプチドを含むことができる。
【０２９４】
抗原性ペプチドは、任意の数のがん関連タンパク質に由来し得る。例えば、融合ポリペプチドは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０のがん関連タンパク質、または２〜５、５〜１０、１０〜１５、もしくは１５〜２０のがん関連タンパク質に由来する抗原性ペプチドを含むことができる。例えば、がん関連タンパク質は、約２〜３０、約２〜２５、約２〜２０、約２〜１５、または約２〜１０のがん関連タンパク質であり得る。
【０２９５】
反復性がん突然変異を含む２つもしくはそれより多くの抗原性ペプチド、および／またはヘテロクリティック突然変異を含む２つもしくはそれより多くの抗原性ペプチドを含む、融合ポリペプチドには、反復性がん突然変異を含む抗原性ペプチドがタンデムに存在することもあり、ヘテロクリティック突然変異を含む抗原性ペプチドがタンデムに存在することもある。あるいは、反復性がん突然変異を含む抗原性ペプチド、およびヘテロクリティック突然変異を含む抗原性ペプチドが、融合ポリペプチド中に混在することもある。
【０２９６】
融合ポリペプチド中の構成成分は、本明細書中の他の箇所でより詳細に開示されるように、互いに直接融合していることもあり、またはリンカー（例えば、ペプチドリンカー）を介して連結していることもある。例えば、使用されるペプチドリンカーは、可動性リンカーおよび／もしくは剛性リンカーおよび／もしくはイムノプロテアソームリンカーを含むことができ、または配列番号３１０〜３１９および８２１〜８２９に記載のリンカーの１つもしくは複数を（例えば、２つまたはそれより多くの抗原性ペプチドを連結させるために）含むことができる。一例では、ヘテロクリティック突然変異を含む各抗原性ペプチドの上流のペプチドリンカーは、イムノプロテアソームリンカーであるか、または配列番号８２１〜８２９に記載のリンカーから選択される。
【０２９７】
ＶＧＫＧＧＳＧＧリンカー（配列番号３１４）は、例えば、融合ペプチドのｔＬＬＯと抗原部分との間、およびタグ配列の前にさらなる空間をもたらすように、ｔＬＬＯの後、およびまたタグ配列の前のより長いリンカーとして使用され得る。これは、融合タンパク質に可動性および電荷の平衡をもたらすこともできる。ＥＡＡＡＫリンカー（配列番号３１６）は、例えば、融合タンパク質がさもなければそれ自体に折り畳まれる場合、発現および分泌を促進するために使用され得る、剛性／硬性リンカーである。ＧＧＧＧＳリンカー（配列番号３１３）は、例えば、増大した可動性を融合タンパク質に付加して発現および分泌の促進を助けるために使用され得る、可動性リンカーである。「ｉ２０」リンカー（例えば配列番号８２１〜８２９）は、例えば、免疫プロテアソームによる融合タンパク質の切断の促進を助け、所望される最小の結合性断片そのものが得られる頻度を増大させるように設計された、免疫プロテアソームリンカーである。ＧＧＧＧＳおよびＥＡＡＡＫリンカー（それぞれ、配列番号３１３および３１６）の組合せは、例えば、発現および分泌の改善のために可動性と剛性とが交互になるようにして構築物のバランスを取ることを助けるため、また、選択できる特有のコドンをより多く提供することによりＤＮＡ合成の促進を助けるために使用され得る。
【０２９８】
組換え融合ポリペプチドは、任意の分子量であってよい。例えば、組換え融合ポリペプチドは、約２００、１９５、１９０、１８５、１８０、１７５、１７０、１６５、１６０、１５５、１５０、１４５、１４０、１３５、１３０、もしくは１２５キロダルトン（ｋＤａ）未満またはそれ以下であり得る。具体例において、組換え融合ポリペプチドは、約１５０ｋＤａ未満もしくはそれ以下、または約１３０ｋＤａ未満もしくはそれ以下である。別の例として、組換え融合ポリペプチドは、約５０〜２００、５０〜１９５、５０〜１９０、５０〜１８５、５０〜１８０、５０〜１７５、５０〜１７０、５０〜１６５、５０〜１６０、５０〜１５５、５０〜１５０、５０〜１４５、５０〜１４０、５０〜１３５、５０〜１３０、５０〜１２５、１００〜２００、１００〜１９５、１００〜１９０、１００〜１８５、１００〜１８０、１００〜１７５、１００〜１７０、１００〜１６５、１００〜１６０、１００〜１５５、１００〜１５０、１００〜１４５、１００〜１４０、１００〜１３５、１００〜１３０、または１００〜１２５ｋＤａであり得る。具体例において、組換え融合ポリペプチドは、約５０〜１５０、１００〜１５０、５０〜１２５、または１００〜１２５ｋＤａである。別の例として、組換え融合ポリペプチドは、少なくとも約５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、または１２５ｋＤａであり得る。具体例として、組換え融合ポリペプチドは、少なくとも約１００ｋＤａであり得る。
【０２９９】
かかる組換え融合ポリペプチドをコードする核酸も開示される。核酸は、任意の形態であってよい。核酸は、ＤＮＡもしくはＲＮＡを含んでも、またはそれらからなってもよく、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。核酸は、エピソームプラスミド、マルチコピーエピソームプラスミド、または組込みプラスミドなどのプラスミドの形態であり得る。代替的に、核酸は、ウイルスベクター、ファージベクター、または細菌人工染色体中の形態であってもよい。かかる核酸は、１つのオープンリーディングフレームを有してもよいし、２つまたはそれよりも多くのオープンリーディングフレーム（例えば、組換え融合ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、および代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレーム）を有してもよい。一例において、かかる核酸は、各オープンリーディングフレーム間のシャイン・ダルガーノリボソーム結合部位核酸配列によって連結された２つまたはそれよりも多くのオープンリーディングフレームを含み得る。例えば、核酸は、各オープンリーディングフレーム間のシャイン・ダルガーノリボソーム結合部位核酸配列によって連結された２〜４つのオープンリーディングフレームを含み得る。各オープンリーディングフレームが異なるポリペプチドをコードしてよい。一部の核酸では、融合ポリペプチドのカルボキシ末端をコードするコドンの後に、タンパク質合成の終結を確実にする２つの停止コドンが続く。
【０３００】
本明細書で開示される融合ポリペプチドは、がん関連タンパク質（すなわち１つまたは複数のがん関連タンパク質）の任意の組合せに由来する任意の順序での抗原性ペプチドを含むことができる。抗原性ペプチドの組合せまたは融合ポリペプチドは、親水性であることができ、またはある特定のハイドロパシー閾値以下もしくはそれ未満のスコアを有することができ、このスコアは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓまたは目的の別の細菌における分泌可能性を予測することができる。一部の場合、抗原性ペプチドは、複数のがん関連タンパク質（例えば、２つまたはそれより多くのがん関連タンパク質）に由来し得る。
【０３０１】
一例として、反復性がん突然変異ペプチドが生成されるがん関連タンパク質は、次の遺伝子：ＫＲＡＳ、ＥＧＦＲ、Ｕ２ＡＦ１、ＢＲＡＦ、ＰＩＫ３ＣＡおよびＴＰ５３のうちの１つもしくはそれより多く、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、またはすべてによりコードされるタンパク質を含むことができる。抗原性ペプチドは、例えば、次の反復性がん突然変異の１つもしくはそれより多く、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、１０もしくはそれより多く、またはすべてを含むことができる：ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｃ、ＥＧＦＲ＿Ｌ８５８Ｒ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ、Ｕ２ＡＦ１＿Ｓ３４Ｆ、ＢＲＡＦ＿Ｖ６００Ｅ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｖ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｅ５４５Ｋ、ＴＰ５３＿Ｒ１５８Ｌ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ａ、ＥＧＦＲ＿Ｌ８６１ＱおよびＴＰ５３＿Ｒ２７３Ｌ。そのような突然変異は、例えば、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）と関連する。突然変異は、いずれの順序で存在してもよい。抗原性ペプチドは、互いに直接融合していることもあり、またはリンカーにより互いに連結していることもあり、それらの例は、本明細書中の他の箇所で開示される。具体例では、抗原性ペプチドの１つもしくは複数またはすべては、反復性がん突然変異の両側に隣接している１０個の天然に存在するアミノ酸をそれぞれが含む、２１ｍｅｒ（例えば、リンカーにより互いに連結している２１ｍｅｒ）であり得る。そのような抗原性ペプチドの例は、実施例１１で提供される。抗原性ペプチドは、例えば、表３５中の抗原性ペプチドの１つもしくはそれより多く、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、１０もしくはそれより多く、またはすべてを含むことができる。ヘテロクリティック抗原性ペプチドが生成されるがん関連タンパク質は、以下の遺伝子の１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、またはすべてによりコードされるタンパク質を含むことができる：ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＡＧＥＡ６、ＭＡＧＥＡ４、ＧＡＧＥ１、ＮＹＥＳＯ１、ＳＴＥＡＰ１およびＲＮＦ４３。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、ＨＬＡ型Ａ０２０１、Ａ０３０１、Ａ２４０２およびＢ０７０２の１つもしくは複数またはすべてに結合することができる。そのようながん関連タンパク質は、例えば、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）と関連する。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、いずれの順序で存在してもよい。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、互いに直接融合していることもあり、またはリンカーにより互いに連結していることもあり、それらの例は、本明細書中の他の箇所で開示される。具体例では、ヘテロクリティック抗原性ペプチドの１つもしくは複数またはすべてが、９ｍｅｒ（例えば、リンカーにより互いに連結している９ｍｅｒ）であり得る。そのような抗原性ペプチドの例は、実施例１１で提供される。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、表３６中のヘテロクリティック抗原性ペプチドの１つもしくはそれより多く、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、１０もしくはそれより多く、または１１すべてを含むことができる。具体例では、ミニ遺伝子抗原性ペプチドが生成されるがん関連タンパク質は、ＣＥＡＣＡＭ５によりコードされるタンパク質を含むことができる。例えば、ミニ遺伝子抗原性ペプチドは、配列番号７９８または配列番号７９６を含むことができる。一例では、融合ポリペプチド中の抗原性ペプチドは、表３５および表３６に記載のペプチドの１つもしくは複数またはすべてを含むことができる。例示的な融合ポリペプチドインサート配列（すなわち、ｔＬＬＯの下流のペプチド配列）は、配列番号８５９、配列番号８６０、配列番号８６１、配列番号８６２、配列番号８６３、配列番号８６４、配列番号８６５、配列番号８９４、配列番号８９５、配列番号９０５、配列番号９０９、配列番号９１０、配列番号９１１もしくは配列番号９１２に記載の配列の１つと少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を含むか、そのような配列から本質的になるか、またはそのような配列からなる。各構築物中の個々の構成成分のアミノ酸位置の明細は、表３８〜５１で提供される。
【０３０２】
別の例として、反復性がん突然変異ペプチドが生成されるがん関連タンパク質は、次の遺伝子：ＳＰＯＰ、ＣＨＥＫ２、ＲＧＰＤ８、ＡＮＫＲＤ３６ＣおよびＡＲのうちの１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、またはすべてによりコードされるタンパク質を含むことができる。抗原性ペプチドは、例えば、次の反復性がん突然変異の１つもしくはそれより多く、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、１０もしくはそれより多く、１１もしくはそれより多く、１２もしくはそれより多く、１３もしくはそれより多く、またはすべてを含むことができる：ＳＰＯＰ＿Ｆ１３３Ｖ、ＣＨＥＫ２＿Ｋ３７３Ｅ、ＲＧＰＤ８＿Ｐ１７６０Ａ、ＡＮＫＲＤ３６Ｃ＿Ｉ６３４Ｔ、ＡＮＫＲＤ３６Ｃ＿Ｄ６２９Ｙ、ＳＰＯＰ＿Ｗ１３１Ｇ、ＡＮＫＲＤ３６Ｃ＿Ｄ６２６Ｎ、ＳＰＯＰ＿Ｆ１３３Ｌ、ＡＲ＿Ｔ８７８Ａ、ＡＲ＿Ｌ７０２Ｈ、ＡＲ＿Ｗ７４２Ｃ、ＡＲ＿Ｈ８７５ＹおよびＡＲ＿Ｆ８７７Ｌ。そのような突然変異は、例えば、前立腺がんと関連する。突然変異は、いずれの順序で存在してもよい。抗原性ペプチドは、互いに直接融合していることもあり、またはリンカーにより互いに連結していることもあり、それらの例は、本明細書中の他の箇所で開示される。具体例では、抗原性ペプチドの１つもしくは複数またはすべては、反復性がん突然変異の両側に隣接している１０個の天然に存在するアミノ酸をそれぞれが含む、２１ｍｅｒ（例えば、リンカーにより互いに連結している２１ｍｅｒ）であり得る。そのような抗原性ペプチドの例は、実施例１１で提供される。抗原性ペプチドは、例えば、表５２中の抗原性ペプチドの１つもしくはそれより多く、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、１０もしくはそれより多く、１１もしくはそれより多く、１２もしくはそれより多く、１３もしくはそれより多く、またはすべてを含むことができる。ヘテロクリティック抗原性ペプチドが生成されるがん関連タンパク質は、以下の遺伝子の１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、またはすべてによりコードされるタンパク質を含むことができる：ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＡＧＥＡ４、ＳＴＥＡＰ１、ＲＮＦ４３、ＳＳＸ２、ＳＡＲＴ３、ＰＡＧＥ４、ＰＳＭＡおよびＰＳＡ。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、ＨＬＡ型Ａ０２０１、Ａ０３０１、Ａ２４０２およびＢ０７０２の１つもしくは複数またはすべてに結合することができる。そのようながん関連タンパク質は、例えば、前立腺がんと関連する。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、いずれの順序で存在してもよい。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、互いに直接融合していることもあり、またはリンカーにより互いに連結していることもあり、それらの例は、本明細書中の他の箇所で開示される。具体例では、抗原性ペプチドの１つもしくは複数またはすべてが、９ｍｅｒ（例えば、リンカーにより互いに連結している９ｍｅｒ）であり得る。そのようなヘテロクリティック抗原性ペプチドの例は、実施例１１で提供される。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、表５３中のヘテロクリティック抗原性ペプチドの１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、または１０すべてを含むことができる。具体例では、ミニ遺伝子抗原性ペプチドが生成されるがん関連タンパク質は、ＳＴＥＡＰ１によりコードされるタンパク質を含むことができる。例えば、ミニ遺伝子抗原性ペプチドは、配列番号７９９または配列番号８００を含むことができる。一例では、融合ポリペプチド中の抗原性ペプチドは、表５２および表５４に記載のペプチドの１つもしくは複数またはすべてを含むことができる。例示的な融合ポリペプチドインサート配列（すなわち、ｔＬＬＯの下流のペプチド配列）は、配列番号８７１；配列番号８７２；配列番号８７３；配列番号８７４；配列番号８７５；配列番号８７６；配列番号８７７；配列番号８９２；配列番号８９３；配列番号９０６、配列番号９１３、配列番号９１４、配列番号９１５もしくは配列番号９１６に記載の配列の１つと少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を含むか、そのような配列から本質的になるか、またはそのような配列からなる。各構築物中の個々の構成成分のアミノ酸位置の明細は、表５４〜６７で提供される。
【０３０３】
別の例として、反復性がん突然変異ペプチドが生成されるがん関連タンパク質は、次の遺伝子：ＫＲＡＳ、Ｕ２ＡＦ１、ＴＰ５３、ＳＭＡＤ４およびＧＮＡＳのうちの１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、またはすべてによりコードされるタンパク質を含むことができる。抗原性ペプチドは、例えば、次の反復性がん突然変異の１つもしくはそれより多く、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、１０もしくはそれより多く、１１もしくはそれより多く、１２もしくはそれより多く、１３もしくはそれより多く、１４もしくはそれより多く、１５もしくはそれより多く、またはすべてを含むことができる：ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｃ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ、Ｕ２ＡＦ１＿Ｓ３４Ｆ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｖ、ＴＰ５３＿Ｒ２４８Ｑ、ＴＰ５３＿Ｒ２４８Ｗ、ＴＰ５３＿Ｒ１７５Ｈ、ＴＰ５３＿Ｒ２７３Ｃ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｒ、ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｈ、ＴＰ５３＿Ｒ２８２Ｗ、ＴＰ５３＿Ｒ２７３Ｈ、ＴＰ５３＿Ｇ２４５Ｓ、ＳＭＡＤ４＿Ｒ３６１Ｃ、ＧＮＡＳ＿Ｒ２０１ＣおよびＧＮＡＳ＿Ｒ２０１Ｈ。そのような突然変異は、例えば、すい臓がんと関連する。突然変異は、いずれの順序で存在してもよい。抗原性ペプチドは、互いに直接融合していることもあり、またはリンカーにより互いに連結していることもあり、それらの例は、本明細書中の他の箇所で開示される。具体例では、抗原性ペプチドの１つもしくは複数またはすべては、反復性がん突然変異の両側に隣接している１０個の天然に存在するアミノ酸をそれぞれが含む、２１ｍｅｒ（例えば、リンカーにより互いに連結している２１ｍｅｒ）であり得る。そのような抗原性ペプチドの例は、実施例１１で提供される。抗原性ペプチドは、例えば、表６８中の抗原性ペプチドの１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、１０もしくはそれより多く、１１もしくはそれより多く、１２もしくはそれより多く、１３もしくはそれより多く、１４もしくはそれより多く、１５もしくはそれより多く、またはすべてを含むことができる。ヘテロクリティック抗原性ペプチドが生成されるがん関連タンパク質は、以下の遺伝子の１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、またはすべてによりコードされるタンパク質を含むことができる：ＣＥＡＣＡＭ５、ＳＴＥＡＰ１、ＭＡＧＥＡ３、ＰＲＡＭＥ、ｈＴＥＲＴおよびＳＵＲＶＩＶＩＮ。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、ＨＬＡ型Ａ０２０１、Ａ０３０１、Ａ２４０２およびＢ０７０２の１つもしくは複数またはすべてに結合することができる。そのようながん関連タンパク質は、例えば、すい臓がんと関連する。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、いずれの順序で存在してもよい。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、互いに直接融合していることもあり、またはリンカーにより互いに連結していることもあり、それらの例は、本明細書中の他の箇所で開示される。具体例では、抗原性ペプチドの１つもしくは複数またはすべてが、９ｍｅｒ（例えば、リンカーにより互いに連結している９ｍｅｒ）であり得る。そのようなヘテロクリティック抗原性ペプチドの例は、実施例１１で提供される。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、表６９中のヘテロクリティック抗原性ペプチドの１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、１０もしくはそれより多く、１１もしくはそれより多く、または１２すべてを含むことができる。具体例では、ミニ遺伝子抗原性ペプチドが生成されるがん関連タンパク質は、ＣＥＡＣＡＭ５によりコードされるタンパク質を含むことができる。例えば、ミニ遺伝子抗原性ペプチドは、配列番号７９８または配列番号７９６を含むことができる。一例では、融合ポリペプチド中の抗原性ペプチドは、表６８および表６９に記載のペプチドの１つもしくは複数またはすべてを含むことができる。例示的な融合ポリペプチドインサート配列（すなわち、ｔＬＬＯの下流のペプチド配列）は、配列番号８６６；配列番号８６７；配列番号８６８；配列番号８６９；配列番号８７０；もしくは配列番号９０８に記載の配列の１つと少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を含むか、そのような配列から本質的になるか、またはそのような配列からなる。各構築物中の個々の構成成分のアミノ酸位置の明細は、表７０〜７５で提供される。
【０３０４】
別の例として、反復性がん突然変異ペプチドが生成されるがん関連タンパク質は、次の遺伝子：ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＴＰ５３、ＲＸＲＡ、ＦＢＸＷ７およびＮＦＥ２Ｌ２のうちの１つもしくはそれより多く、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、またはすべてによりコードされるタンパク質を含むことができる。抗原性ペプチドは、例えば、次の反復性がん突然変異の１つもしくはそれより多く、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、１０もしくはそれより多く、１１もしくはそれより多く、１２もしくはそれより多く、またはすべてを含むことができる：ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｅ５４５Ｋ、ＦＧＦＲ３＿Ｓ２４９Ｃ、ＴＰ５３＿Ｒ２４８Ｑ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｅ５４２Ｋ、ＲＸＲＡ＿Ｓ４２７Ｆ、ＦＢＸＷ７＿Ｒ５０５Ｇ、ＴＰ５３＿Ｒ２８０Ｔ、ＮＦＥ２Ｌ２＿Ｅ７９Ｋ、ＦＧＦＲ３＿Ｒ２４８Ｃ、ＴＰ５３＿Ｋ１３２Ｎ、ＴＰ５３＿Ｒ２４８Ｗ、ＴＰ５３＿Ｒ１７５ＨおよびＴＰ５３＿Ｒ２７３Ｃ。そのような突然変異は、例えば、膀胱がんと関連する。突然変異は、いずれの順序で存在してもよい。抗原性ペプチドは、互いに直接融合していることもあり、またはリンカーにより互いに連結していることもあり、それらの例は、本明細書中の他の箇所で開示される。具体例では、抗原性ペプチドの１つもしくは複数またはすべては、反復性がん突然変異の両側に隣接している１０個の天然に存在するアミノ酸をそれぞれが含む、２１ｍｅｒ（例えば、リンカーにより互いに連結している２１ｍｅｒ）であり得る。そのような抗原性ペプチドの例は、実施例１１で提供される。抗原性ペプチドは、例えば、表７６中の抗原性ペプチドの１つもしくはそれより多く、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、１０もしくはそれより多く、１１もしくはそれより多く、１２もしくはそれより多く、またはすべてを含むことができる。ヘテロクリティック抗原性ペプチドが生成されるがん関連タンパク質は、以下の遺伝子の１つもしくはそれより多く、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、またはすべてによりコードされるタンパク質を含むことができる：ＣＥＡＣＡＭ５、ＧＡＧＥ１、ＮＹＥＳＯ１、ＲＮＦ４３、ＮＵＦ２、ＫＬＨＬ７、ＭＡＧＥＡ３およびＰＲＡＭＥ。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、ＨＬＡ型Ａ０２０１、Ａ０３０１、Ａ２４０２およびＢ０７０２の１つもしくは複数またはすべてに結合することができる。そのようながん関連タンパク質は、例えば、膀胱がんと関連する。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、いずれの順序で存在してもよい。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、互いに直接融合していることもあり、またはリンカーにより互いに連結していることもあり、それらの例は、本明細書中の他の箇所で開示される。具体例では、抗原性ペプチドの１つもしくは複数またはすべてが、９ｍｅｒ（例えば、リンカーにより互いに連結している９ｍｅｒ）であり得る。そのようなヘテロクリティック抗原性ペプチドの例は、実施例１１で提供される。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、表７７中のヘテロクリティック抗原性ペプチドの１つもしくはそれより多く、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、１０もしくはそれより多く、１１もしくはそれより多く、１２もしくはそれより多く、１３もしくはそれより多く、または１４すべてを含むことができる。具体例では、ミニ遺伝子抗原性ペプチドが生成されるがん関連タンパク質は、ＮＹＥＳＯ１またはＮＵＦ２によりコードされるタンパク質を含むことができる。例えば、ミニ遺伝子抗原性ペプチドは、配列番号７９７または配列番号８００を含むことができる。一例では、融合ポリペプチド中の抗原性ペプチドは、表７６および表７７に記載のペプチドの１つもしくは複数またはすべてを含むことができる。例示的な融合ポリペプチドインサート配列（すなわち、ｔＬＬＯの下流のペプチド配列）は、配列番号８７８；配列番号８７９；配列番号８８０；配列番号８８１；配列番号８８２；配列番号８８８；配列番号８８９；配列番号８９０もしくは配列番号８９１に記載の配列の１つと少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を含むか、そのような配列から本質的になるか、またはそのような配列からなる。各構築物中の個々の構成成分のアミノ酸位置の明細は、表７８〜８６で提供される。
【０３０５】
別の例として、反復性がん突然変異ペプチドが生成されるがん関連タンパク質は、次の遺伝子：ＰＩＫ３ＣＡ、ＡＫＴ１およびＥＳＲ１のうちの１つもしくはそれより多く、２つもしくはそれより多く、またはすべてによりコードされるタンパク質を含むことができる。抗原性ペプチドは、例えば、次の反復性がん突然変異の１つもしくはそれより多く、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、１０もしくはそれより多く、１１もしくはそれより多く、１２もしくはそれより多く、１３もしくはそれより多く、またはすべてを含むことができる：ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｅ５４５Ｋ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｅ５４２Ｋ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｈ１０４７Ｒ、ＡＫＴ１＿Ｅ１７Ｋ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｈ１０４７Ｌ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｑ５４６Ｋ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｅ５４５Ａ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｅ５４５Ｇ、ＥＳＲ１＿Ｋ３０３Ｒ、ＥＳＲ１＿Ｄ５３８Ｇ、ＥＳＲ１＿Ｙ５３７Ｓ、ＥＳＲ１＿Ｙ５３７Ｎ、ＥＳＲ１＿Ｙ５３７ＣおよびＥＳＲ１＿Ｅ３８０Ｑ。そのような突然変異は、例えば、乳がん（例えば、ＥＲ＋乳がん）と関連する。突然変異は、いずれの順序で存在してもよい。抗原性ペプチドは、互いに直接融合していることもあり、またはリンカーにより互いに連結していることもあり、それらの例は、本明細書中の他の箇所で開示される。具体例では、抗原性ペプチドの１つもしくは複数またはすべては、反復性がん突然変異の両側に隣接している１０個の天然に存在するアミノ酸をそれぞれが含む、２１ｍｅｒ（例えば、リンカーにより互いに連結している２１ｍｅｒ）であり得る。そのような抗原性ペプチドの例は、実施例１１で提供される。抗原性ペプチドは、例えば、表８７中の抗原性ペプチドの１つもしくはそれより多く、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、１０もしくはそれより多く、１１もしくはそれより多く、１２もしくはそれより多く、１３もしくはそれより多く、またはすべてを含むことができる。ヘテロクリティック抗原性ペプチドが生成されるがん関連タンパク質は、以下の遺伝子の１つもしくはそれより多く、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、またはすべてによりコードされるタンパク質を含むことができる：ＣＥＡＣＡＭ５、ＳＴＥＡＰ１、ＲＮＦ４３、ＭＡＧＥＡ３、ＰＲＡＭＥおよびｈＴＥＲＴ。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、ＨＬＡ型Ａ０２０１、Ａ０３０１、Ａ２４０２およびＢ０７０２の１つもしくは複数またはすべてに結合することができる。そのようながん関連タンパク質は、例えば、乳がん（例えば、ＥＲ＋乳がん）と関連する。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、いずれの順序で存在してもよい。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、互いに直接融合していることもあり、またはリンカーにより互いに連結していることもあり、それらの例は、本明細書中の他の箇所で開示される。具体例では、抗原性ペプチドの１つもしくは複数またはすべてが、９ｍｅｒ（例えば、リンカーにより互いに連結している９ｍｅｒ）であり得る。そのようなヘテロクリティック抗原性ペプチドの例は、実施例１１で提供される。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、表８８中のヘテロクリティック抗原性ペプチドの１つもしくはそれより多く、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、１０もしくはそれより多く、または１１すべてを含むことができる。具体例では、ミニ遺伝子抗原性ペプチドが生成されるがん関連タンパク質は、ＳＴＥＡＰ１によりコードされるタンパク質を含むことができる。例えば、ミニ遺伝子抗原性ペプチドは、配列番号７９９または配列番号８００を含むことができる。一例では、融合ポリペプチド中の抗原性ペプチドは、表８７および表８８に記載のペプチドの１つもしくは複数またはすべてを含むことができる。例示的な融合ポリペプチドインサート配列（すなわち、ｔＬＬＯの下流のペプチド配列）は、配列番号８８３；配列番号８８４；配列番号８８５；配列番号８８６；配列番号８８７もしくは配列番号９０７に記載の配列の１つと少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を含むか、そのような配列から本質的になるか、またはそのような配列からなる。各構築物中の個々の構成成分のアミノ酸位置の明細は、表８９〜９４で提供される。
【０３０６】
別の例として、反復性がん突然変異ペプチドが生成されるがん関連タンパク質は、次の遺伝子：ＰＴＥＮ、ＫＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＣＴＮＮＢ１、ＦＢＸＷ７およびＴＰ５３のうちの１つもしくはそれより多く、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、またはすべてによりコードされるタンパク質を含むことができる。抗原性ペプチドは、例えば、次の反復性がん突然変異の１つもしくはそれより多く、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、１０もしくはそれより多く、１１もしくはそれより多く、１２もしくはそれより多く、１３もしくはそれより多く、１４もしくはそれより多く、１５もしくはそれより多く、またはすべてを含むことができる：ＰＴＥＮ＿Ｒ１３０Ｇ、ＰＴＥＮ＿Ｒ１３０Ｑ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｖ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｈ１０４７Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｒ８８Ｑ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｅ５４５Ｋ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｅ５４２Ｋ、ＣＴＮＮＢ１＿Ｓ３７Ｆ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１３Ｄ、ＣＴＮＮＢ１＿Ｓ３７Ｃ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｈ１０４７Ｌ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｇ１１８Ｄ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ａ、ＦＢＸＷ７＿Ｒ５０５ＣおよびＴＰ５３＿Ｒ２４８Ｗ。そのような突然変異は、例えば、子宮がんと関連する。突然変異は、いずれの順序で存在してもよい。抗原性ペプチドは、互いに直接融合していることもあり、またはリンカーにより互いに連結していることもあり、それらの例は、本明細書中の他の箇所で開示される。具体例では、抗原性ペプチドの１つもしくは複数またはすべては、反復性がん突然変異の両側に隣接している１０個の天然に存在するアミノ酸をそれぞれが含む、２１ｍｅｒ（例えば、リンカーにより互いに連結している２１ｍｅｒ）であり得る。そのような抗原性ペプチドの例は、実施例１１で提供される。抗原性ペプチドは、例えば、表９５中の抗原性ペプチドの１つもしくはそれより多く、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、１０もしくはそれより多く、１１もしくはそれより多く、１２もしくはそれより多く、１３もしくはそれより多く、１４もしくはそれより多く、１５もしくはそれより多く、またはすべてを含むことができる。ヘテロクリティック抗原性ペプチドが生成されるがん関連タンパク質は、以下の遺伝子の１つもしくはそれより多く、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、またはすべてによりコードされるタンパク質を含むことができる：ＣＥＡＣＡＭ５、ＰＲＡＭＥ、ｈＴＥＲＴ、ＳＴＥＡＰ１、ＲＮＦ４３、ＮＵＦ２、ＫＬＨＬ７およびＳＡＲＴ３。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、ＨＬＡ型Ａ０２０１、Ａ０３０１、Ａ２４０２およびＢ０７０２の１つもしくは複数またはすべてに結合することができる。そのようながん関連タンパク質は、例えば、子宮がんと関連する。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、いずれの順序で存在してもよい。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、互いに直接融合していることもあり、またはリンカーにより互いに連結していることもあり、それらの例は、本明細書中の他の箇所で開示される。具体例では、抗原性ペプチドの１つもしくは複数またはすべてが、９ｍｅｒ（例えば、リンカーにより互いに連結している９ｍｅｒ）であり得る。そのようなヘテロクリティック抗原性ペプチドの例は、実施例１１で提供される。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、表９６中のヘテロクリティック抗原性ペプチドの１つもしくはそれより多く、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、１０もしくはそれより多く、１１もしくはそれより多く、１２もしくはそれより多く、１３もしくはそれより多く、または１４すべてを含むことができる。具体例では、ミニ遺伝子抗原性ペプチドが生成されるがん関連タンパク質は、ＳＴＥＡＰ１によりコードされるタンパク質を含むことができる。例えば、ミニ遺伝子抗原性ペプチドは、配列番号７９９または配列番号８００を含むことができる。一例では、融合ポリペプチド中の抗原性ペプチドは、表９５および表９６に記載のペプチドの１つもしくは複数またはすべてを含むことができる。例示的な融合ポリペプチドインサート配列（すなわち、ｔＬＬＯの下流のペプチド配列）は、配列番号８９６；配列番号８９７もしくは配列番号９０４に記載の配列の１つと少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を含むか、そのような配列から本質的になるか、またはそのような配列からなる。各構築物中の個々の構成成分のアミノ酸位置の明細は、表９７〜９９で提供される。
【０３０７】
別の例として、反復性がん突然変異ペプチドが生成されるがん関連タンパク質は、ＴＰ５３を含むことができる。抗原性ペプチドは、例えば、次の反復性がん突然変異の１つもしくはそれより多く、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、１０もしくはそれより多く、１１もしくはそれより多く、またはすべてを含むことができる：ＴＰ５３＿Ｒ２４８Ｑ、ＴＰ５３＿Ｒ２４８Ｗ、ＴＰ５３＿Ｒ１７５Ｈ、ＴＰ５３＿Ｒ２７３Ｃ、ＴＰ５３＿Ｒ２８２Ｗ、ＴＰ５３＿Ｒ２７３Ｈ、ＴＰ５３＿Ｙ２２０Ｃ、ＴＰ５３＿Ｉ１９５Ｔ、ＴＰ５３＿Ｃ１７６Ｙ、ＴＰ５３＿Ｈ１７９Ｒ、ＴＰ５３＿Ｓ２４１ＦおよびＴＰ５３＿Ｈ１９３Ｒ。そのような突然変異は、例えば、卵巣がんと関連する。突然変異は、いずれの順序で存在してもよい。抗原性ペプチドは、互いに直接融合していることもあり、またはリンカーにより互いに連結していることもあり、それらの例は、本明細書中の他の箇所で開示される。具体例では、抗原性ペプチドの１つもしくは複数またはすべては、反復性がん突然変異の両側に隣接している１０個の天然に存在するアミノ酸をそれぞれが含む、２１ｍｅｒ（例えば、リンカーにより互いに連結している２１ｍｅｒ）であり得る。そのような抗原性ペプチドの例は、実施例１１で提供される。抗原性ペプチドは、例えば、表１００中の抗原性ペプチドの１つもしくはそれより多く、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、１０もしくはそれより多く、１１もしくはそれより多く、またはすべてを含むことができる。ヘテロクリティック抗原性ペプチドが生成されるがん関連タンパク質は、以下の遺伝子の１つもしくはそれより多く、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、またはすべてによりコードされるタンパク質を含むことができる：ＣＥＡＣＡＭ５、ＳＴＥＡＰ１、ＲＮＦ４３、ＳＡＲＴ３、ＮＵＦ２、ＫＬＨＬ７、ＰＲＡＭＥおよびｈＴＥＲＴ。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、ＨＬＡ型Ａ０２０１、Ａ０３０１、Ａ２４０２およびＢ０７０２の１つもしくは複数またはすべてに結合することができる。そのようながん関連タンパク質は、例えば、卵巣がんと関連する。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、いずれの順序で存在してもよい。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、互いに直接融合していることもあり、またはリンカーにより互いに連結していることもあり、それらの例は、本明細書中の他の箇所で開示される。具体例では、抗原性ペプチドの１つもしくは複数またはすべてが、９ｍｅｒ（例えば、リンカーにより互いに連結している９ｍｅｒ）であり得る。そのようなヘテロクリティック抗原性ペプチドの例は、実施例１１で提供される。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、表１０１中のヘテロクリティック抗原性ペプチドの１つもしくはそれより多く、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、１０もしくはそれより多く、１１もしくはそれより多く、１２もしくはそれより多く、１３もしくはそれより多く、または１４すべてを含むことができる。具体例では、ミニ遺伝子抗原性ペプチドが生成されるがん関連タンパク質は、ＳＴＥＡＰ１によりコードされるタンパク質を含むことができる。例えば、ミニ遺伝子抗原性ペプチドは、配列番号７９９を含むことができる。一例では、融合ポリペプチド中の抗原性ペプチドは、表１００および表１０１に記載のペプチドの１つもしくは複数またはすべてを含むことができる。例示的な融合ポリペプチドインサート配列（すなわち、ｔＬＬＯの下流のペプチド配列）は、配列番号８９８もしくは配列番号８９９に記載の配列の１つと少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を含むか、そのような配列から本質的になるか、またはそのような配列からなる。各構築物中の個々の構成成分のアミノ酸位置の明細は、表１０２〜１０３で提供される。
【０３０８】
別の例として、反復性がん突然変異ペプチドが生成されるがん関連タンパク質は、次の遺伝子：ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２およびＥＧＦＲのうちの１つもしくはそれより多く、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、またはすべてによりコードされるタンパク質を含むことができる。抗原性ペプチドは、例えば、次の反復性がん突然変異の１つもしくはそれより多く、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、１０もしくはそれより多く、またはすべてを含むことができる：ＴＰ５３＿Ｒ２７３Ｌ、ＴＰ５３＿Ｒ２７３Ｃ、ＴＰ５３＿Ｒ２７３Ｈ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｇ１１８Ｄ、ＩＤＨ１＿Ｒ１３２Ｃ、ＩＤＨ１＿Ｒ１３２Ｇ、ＩＤＨ１＿Ｒ１３２Ｈ、ＩＤＨ１＿Ｒ１３２Ｓ、ＩＤＨ２＿Ｒ１７２Ｋ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｅ４５３ＫおよびＥＧＦＲ＿Ｇ５９８Ｖ。そのような突然変異は、例えば、低悪性度神経膠腫と関連する。突然変異は、いずれの順序で存在してもよい。抗原性ペプチドは、互いに直接融合していることもあり、またはリンカーにより互いに連結していることもあり、それらの例は、本明細書中の他の箇所で開示される。具体例では、抗原性ペプチドの１つもしくは複数またはすべては、反復性がん突然変異の両側に隣接している１０個の天然に存在するアミノ酸をそれぞれが含む、２１ｍｅｒ（例えば、リンカーにより互いに連結している２１ｍｅｒ）であり得る。そのような抗原性ペプチドの例は、実施例１１で提供される。抗原性ペプチドは、例えば、表１０４中の抗原性ペプチドの１つもしくはそれより多く、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、１０もしくはそれより多く、またはすべてを含むことができる。ヘテロクリティック抗原性ペプチドが生成されるがん関連タンパク質は、以下の遺伝子の１つもしくはそれより多く、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、またはすべてによりコードされるタンパク質を含むことができる：ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＡＧＥＡ６、ＳＴＥＡＰ１、ＲＮＦ４３、ＳＡＲＴ３、ＮＵＦ２、ＫＬＨＬ７およびｈＴＥＲＴ。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、ＨＬＡ型Ａ０２０１、Ａ０３０１、Ａ２４０２およびＢ０７０２の１つもしくは複数またはすべてに結合することができる。そのようながん関連タンパク質は、例えば、低悪性度神経膠腫と関連する。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、いずれの順序で存在してもよい。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、互いに直接融合していることもあり、またはリンカーにより互いに連結していることもあり、それらの例は、本明細書中の他の箇所で開示される。具体例では、抗原性ペプチドの１つもしくは複数またはすべてが、９ｍｅｒ（例えば、リンカーにより互いに連結している９ｍｅｒ）であり得る。そのようなヘテロクリティック抗原性ペプチドの例は、実施例１１で提供される。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、表１０５中のヘテロクリティック抗原性ペプチドの１つもしくはそれより多く、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、または１０すべてを含むことができる。具体例では、ミニ遺伝子抗原性ペプチドが生成されるがん関連タンパク質は、ＮＵＦ２によりコードされるタンパク質を含むことができる。例えば、ミニ遺伝子抗原性ペプチドは、配列番号８０７を含むことができる。一例では、融合ポリペプチド中の抗原性ペプチドは、表１０４および表１０５に記載のペプチドの１つもしくは複数またはすべてを含むことができる。例示的な融合ポリペプチドインサート配列（すなわち、ｔＬＬＯの下流のペプチド配列）は、配列番号９００もしくは配列番号９０１に記載の配列の１つと少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を含むか、そのような配列から本質的になるか、またはそのような配列からなる。各構築物中の個々の構成成分のアミノ酸位置の明細は、表１０６〜１０７で提供される。
【０３０９】
別の例として、反復性がん突然変異ペプチドが生成されるがん関連タンパク質は、次の遺伝子：ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＰＩＫ３ＣＡおよびＴＰ５３のうちの１つもしくはそれより多く、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、またはすべてによりコードされるタンパク質を含むことができる。抗原性ペプチドは、例えば、次の反復性がん突然変異の１つもしくはそれより多く、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、１０もしくはそれより多く、１１もしくはそれより多く、またはすべてを含むことができる：ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｃ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ、ＢＲＡＦ＿Ｖ６００Ｅ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｖ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｅ５４５Ｋ、ＴＰ５３＿Ｒ２４８Ｗ、ＴＰ５３＿Ｒ１７５Ｈ、ＴＰ５３＿Ｒ２７３Ｃ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｈ１０４７Ｒ、ＴＰ５３＿Ｒ２８２Ｗ、ＴＰ５３＿Ｒ２７３ＨおよびＫＲＡＳ＿Ｇ１３Ｄ。そのような突然変異は、例えば、結腸直腸がん（例えば、ＭＳＳ結腸直腸がん）と関連する。突然変異は、いずれの順序で存在してもよい。抗原性ペプチドは、互いに直接融合していることもあり、またはリンカーにより互いに連結していることもあり、それらの例は、本明細書中の他の箇所で開示される。具体例では、抗原性ペプチドの１つもしくは複数またはすべては、反復性がん突然変異の両側に隣接している１０個の天然に存在するアミノ酸をそれぞれが含む、２１ｍｅｒ（例えば、リンカーにより互いに連結している２１ｍｅｒ）であり得る。そのような抗原性ペプチドの例は、実施例１１で提供される。抗原性ペプチドは、例えば、表１０８中の抗原性ペプチドの１つもしくはそれより多く、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、１０もしくはそれより多く、１１もしくはそれより多く、またはすべてを含むことができる。ヘテロクリティック抗原性ペプチドが生成されるがん関連タンパク質は、以下の遺伝子の１つもしくはそれより多く、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、またはすべてによりコードされるタンパク質を含むことができる：ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＡＧＥＡ６、ＭＡＧＥＡ４、ＧＡＧＥ１、ＮＹＥＳＯ１、ＳＴＥＡＰ１、ＲＮＦ４３およびＭＡＧＥＡ３。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、ＨＬＡ型Ａ０２０１、Ａ０３０１、Ａ２４０２およびＢ０７０２の１つもしくは複数またはすべてに結合することができる。そのようながん関連タンパク質は、例えば、結腸直腸がん（例えば、ＭＳＳ結腸直腸がん）と関連する。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、いずれの順序で存在してもよい。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、互いに直接融合していることもあり、またはリンカーにより互いに連結していることもあり、それらの例は、本明細書中の他の箇所で開示される。具体例では、抗原性ペプチドの１つもしくは複数またはすべてが、９ｍｅｒ（例えば、リンカーにより互いに連結している９ｍｅｒ）であり得る。そのようなヘテロクリティック抗原性ペプチドの例は、実施例１１で提供される。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、表１０９中のヘテロクリティック抗原性ペプチドの１つもしくはそれより多く、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、または１０すべてを含むことができる。具体例では、ミニ遺伝子抗原性ペプチドが生成されるがん関連タンパク質は、ＳＴＥＡＰ１によりコードされるタンパク質を含むことができる。例えば、ミニ遺伝子抗原性ペプチドは、配列番号７９９を含むことができる。一例では、融合ポリペプチド中の抗原性ペプチドは、表１０８および表１０９に記載のペプチドの１つもしくは複数またはすべてを含むことができる。例示的な融合ポリペプチドインサート配列（すなわち、ｔＬＬＯの下流のペプチド配列）は、配列番号９０２もしくは配列番号９０３に記載の配列の１つと少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を含むか、そのような配列から本質的になるか、またはそのような配列からなる。各構築物中の個々の構成成分のアミノ酸位置の明細は、表１１０〜１１１で提供される。
【０３１０】
別の例として、反復性がん突然変異ペプチドが生成されるがん関連タンパク質は、次の遺伝子：ＰＩＫ３ＣＡ、ＣＨＥＫ２、ＲＧＰＤ８、ＡＮＫＲＤ３６Ｃ、ＴＰ５３、ＺＮＦ８１４、ＫＲＴＡＰ１−５、ＫＲＴＡＰ４−１１およびＨＲＡＳのうちの１つもしくはそれより多く、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、またはすべてによりコードされるタンパク質を含むことができる。抗原性ペプチドは、例えば、次の反復性がん突然変異の１つもしくはそれより多く、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、１０もしくはそれより多く、１１もしくはそれより多く、１２もしくはそれより多く、１３もしくはそれより多く、１４もしくはそれより多く、１５もしくはそれより多く、１６もしくはそれより多く、またはすべてを含むことができる：ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｅ５４５Ｋ、ＣＨＥＫ２＿Ｋ３７３Ｅ、ＲＧＰＤ８＿Ｐ１７６０Ａ、ＡＮＫＲＤ３６Ｃ＿Ｉ６３４Ｔ、ＴＰ５３＿Ｒ２４８Ｑ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｅ５４２Ｋ、ＴＰ５３＿Ｒ２４８Ｗ、ＴＰ５３＿Ｒ１７５Ｈ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｈ１０４７Ｒ、ＴＰ５３＿Ｒ２８２Ｗ、ＴＰ５３＿Ｒ２７３Ｈ、ＴＰ５３＿Ｇ２４５Ｓ、ＴＰ５３＿Ｙ２２０Ｃ、ＺＮＦ８１４＿Ｄ４０４Ｅ、ＫＲＴＡＰ１−５＿Ｉ８８Ｔ、ＫＲＴＡＰ４−１１＿Ｌ１６１ＶおよびＨＲＡＳ＿Ｇ１３Ｖ。そのような突然変異は、例えば、頭頸部がんと関連する。突然変異は、いずれの順序で存在してもよい。抗原性ペプチドは、互いに直接融合していることもあり、またはリンカーにより互いに連結していることもあり、それらの例は、本明細書中の他の箇所で開示される。具体例では、抗原性ペプチドの１つもしくは複数またはすべては、反復性がん突然変異の両側に隣接している１０個の天然に存在するアミノ酸をそれぞれが含む、２１ｍｅｒ（例えば、リンカーにより互いに連結している２１ｍｅｒ）であり得る。そのような抗原性ペプチドの例は、実施例１１で提供される。抗原性ペプチドは、例えば、表１１２中の抗原性ペプチドの１つもしくはそれより多く、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、１０もしくはそれより多く、１１もしくはそれより多く、１２もしくはそれより多く、１３もしくはそれより多く、１４もしくはそれより多く、１５もしくはそれより多く、１６もしくはそれより多く、またはすべてを含むことができる。ヘテロクリティック抗原性ペプチドが生成されるがん関連タンパク質は、以下の遺伝子の１つもしくはそれより多く、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、またはすべてによりコードされるタンパク質を含むことができる：ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＡＧＥＡ４、ＳＴＥＡＰ１、ＮＹＥＳＯ１、ＰＲＡＭＥおよびｈＴＥＲＴ。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、ＨＬＡ型Ａ０２０１、Ａ０３０１、Ａ２４０２およびＢ０７０２の１つもしくは複数またはすべてに結合することができる。そのようながん関連タンパク質は、例えば、頭頸部がんと関連する。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、いずれの順序で存在してもよい。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、互いに直接融合していることもあり、またはリンカーにより互いに連結していることもあり、それらの例は、本明細書中の他の箇所で開示される。具体例では、抗原性ペプチドの１つもしくは複数またはすべてが、９ｍｅｒ（例えば、リンカーにより互いに連結している９ｍｅｒ）であり得る。そのようなヘテロクリティック抗原性ペプチドの例は、実施例１１で提供される。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、表１１３中のヘテロクリティック抗原性ペプチドの１つもしくはそれより多く、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、または１０すべてを含むことができる。具体例では、ミニ遺伝子抗原性ペプチドが生成されるがん関連タンパク質は、ＳＴＥＡＰ１によりコードされるタンパク質を含むことができる。例えば、ミニ遺伝子抗原性ペプチドは、配列番号７９９を含むことができる。一例では、融合ポリペプチド中の抗原性ペプチドは、表１１２および表１１３に記載のペプチドの１つもしくは複数またはすべてを含むことができる。例示的な融合ポリペプチドインサート配列（すなわち、ｔＬＬＯの下流のペプチド配列）は、配列番号９１８もしくは配列番号９１９に記載の配列の１つと少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を含むか、そのような配列から本質的になるか、またはそのような配列からなる。各構築物中の個々の構成成分のアミノ酸位置の明細は、表１１４〜１１５で提供される。
【０３１１】
本明細書で開示される組換え融合ポリペプチドをコードする免疫療法構築物または本明細書で開示される組換え融合ポリペプチドを含む組成物を生成するための方法も、本明細書で提供される。例えば、そのような方法は、免疫療法構築物に含めるための抗原または免疫原性ペプチドを選択および設計するステップ（および例えば、各抗原性ペプチドのハイドロパシーを検査し、抗原性ペプチドを、それが選択されたハイドロパシー指数閾値を超えるスコアを有する場合、修飾または選択解除するステップ）、選択された抗原性ペプチドのそれぞれを含む１つまたは複数の融合ポリペプチドを設計するステップ、ならびに融合ポリペプチドをコードする核酸構築物を生成するステップを含むことができる。そのような方法は、本明細書中の他の箇所でより詳細に開示される。具体例として、そのような方法は、（ａ）免疫療法構築物に含めるためのがん関連タンパク質における反復性がん突然変異セットおよびヘテロクリティック突然変異セットを選択するステップ、（ｂ）反復性がん突然変異のそれぞれおよびヘテロクリティック突然変異のそれぞれを含む抗原性ペプチドを設計するステップ、（ｃ）抗原性ペプチドセットを選択するステップであって、各抗原性ペプチドのハイドロパシーを検査すること、および抗原性ペプチドが、選択されたハイドロパシー指数閾値を超えるスコアを有する場合はこれを修飾または選択解除することを含むステップ、（ｄ）選択された抗原性ペプチドのそれぞれを含む融合ポリペプチドを設計するステップ、ならびに（ｅ）融合ポリペプチドをコードする核酸構築物を生成するステップを含むことができる。
【０３１２】
個々に選択された反復性がん突然変異は、ステップ（ａ）で、例えば次の基準：（ｉ）複数のタイプのがんまたは特定のタイプのがんにわたっての発生頻度、（ｉｉ）がん関連タンパク質の機能的ドメイン内の位置、（ｉｉｉ）公知のがんドライバー突然変異または化学療法耐性突然変異としてのステータス、および（ｉｖ）体細胞ミスセンス突然変異または体細胞フレームシフト突然変異としての同定のうちの１つまたは複数に基づいて選択することができる。同様に、ステップ（ａ）で選択された反復性がん突然変異セットを、次の基準：（ｉ）セットが、約３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９もしくは５０以下の反復性がん突然変異、および／または約３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９もしくは５０以下のヘテロクリティック突然変異を含むこと、（ｉｉ）セットが、単一のタイプのがんを有するがん患者の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％  ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％に見出されるであろう反復性がん突然変異を含むこと、ならびに（ｉｉｉ）セットが、単一のタイプのがんに由来する少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０の異なる反復性がん突然変異または反復性体細胞ミスセンス突然変異を含むことのうちの１つまたは複数に基づいて選択することができる。
【０３１３】
個々に選択されたヘテロクリティック突然変異を、ステップ（ａ）で、例えば次の基準：（ｉ）次のＨＬＡ型：ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２およびＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２びうちの１つまたは複数と結合する能力、（ｉｉ）ＣＤ８＋Ｔリンパ球応答を生じさせる能力、ならびに（ｉｉｉ）対応する野生型配列と等価であるかまたはそれより強い、特定のＨＬＡに対する結合親和性のうちの１つまたは複数に基づいて選択することができる。同様に、ステップ（ａ）で選択されるヘテロクリティック突然変異セットを、次のＨＬＡ型：ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２、およびＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２のうちの１つもしくは複数またはすべてと結合する集団的能力に基づいて選択することができる。
【０３１４】
反復性がん突然変異を含むようにステップ（ｂ）で設計される抗原性ペプチドの１つもしくは複数またはすべてを、例えば、反復性がん突然変異を含み両側に隣接配列を含むがん関連タンパク質の断片を含むように、設計することができる。例えば、反復性がん突然変異を含む抗性原ペプチドの１つもしくは複数またはすべては、反復性がん突然変異の両側に少なくとも約１０の隣接アミノ酸を含むことができる。
【０３１５】
ヘテロクリティック突然変異を含むようにステップ（ｂ）で設計される抗原性ペプチドの１つもしくは複数またはすべてを、例えば、アンカー位に好ましいアミノ酸を有するように設計することができる。
【０３１６】
抗原性ペプチドは、例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける分泌可能性を予測するハイドロパシー閾値未満である場合、それらをステップ（ｃ）で選択することができる。例えば、抗原性ペプチドをＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅのハイドロパシー指数２１アミノ酸ウィンドウによりスコアリングすることができ、約１．６のカットオフを超えるスコアを有する一切のペプチドを除外することができ、またはそのようなペプチドは、カットオフ未満のスコアを有するように修飾される。同様に、融合ポリペプチドのハイドロパシーを検査し、続いて、融合ポリペプチドのいずれかの領域が、選択されたハイドロパシー指数閾値（例えば、閾値が約１．６である、スライディング２１アミノ酸ウィンドウを有するＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅのハイドロパシー指数）を超えるスコアを有する場合、抗原性ペプチドを並べ替えること、または問題がある抗原性ペプチドを除去することのいずれかを行うことができる。加えて、例えば、約１５０ｋＤａ以下または約１２０ｋＤａ以下の分子量を有するように、融合ポリペプチドを設計することができる。例えば、組換え融合ポリペプチドは、約２００、１９５、１９０、１８５、１８０、１７５、１７０、１６５、１６０、１５５、１５０、１４５、１４０、１３５、１３０、もしくは１２５キロダルトン（ｋＤａ）未満またはそれ以下であり得る。具体例において、組換え融合ポリペプチドは、約１５０ｋＤａ未満もしくはそれ以下、または約１３０ｋＤａ未満もしくはそれ以下である。別の例として、組換え融合ポリペプチドは、約５０〜２００、５０〜１９５、５０〜１９０、５０〜１８５、５０〜１８０、５０〜１７５、５０〜１７０、５０〜１６５、５０〜１６０、５０〜１５５、５０〜１５０、５０〜１４５、５０〜１４０、５０〜１３５、５０〜１３０、５０〜１２５、１００〜２００、１００〜１９５、１００〜１９０、１００〜１８５、１００〜１８０、１００〜１７５、１００〜１７０、１００〜１６５、１００〜１６０、１００〜１５５、１００〜１５０、１００〜１４５、１００〜１４０、１００〜１３５、１００〜１３０、または１００〜１２５ｋＤａであり得る。具体例において、組換え融合ポリペプチドは、約５０〜１５０、１００〜１５０、５０〜１２５、または１００〜１２５ｋＤａである。別の例として、組換え融合ポリペプチドは、少なくとも約５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、または１２５ｋＤａであり得る。具体例として、組換え融合ポリペプチドは、少なくとも約１００ｋＤａであり得る。抗原性ペプチドおよび融合ポリペプチドの設計および選択のための他のパラメーターは、本明細書中の他の箇所でより詳細に開示され、それらも使用することができる。
【０３１７】
ＶＩ．組換え菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株
本明細書で開示される組換え融合ポリペプチドを含む、または本明細書中の他の箇所で開示されるような組換え融合ポリペプチドをコードする核酸を含む、組換え菌株、例えばＬｉｓｔｅｒｉａ株も、本明細書で提供される。好ましくは、菌株は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株、例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（Ｌｍ）株である。Ｌｍは、ワクチンベクターとしての多数の固有の利点を有する。この細菌は、特別な要件なしにｉｎ  ｖｉｔｒｏで非常に効率的に増殖し、この細菌は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａなどのグラム陰性菌における主要毒性因子であるＬＰＳを欠いている。遺伝的に弱毒化されたＬｍベクターは、重篤な有害効果が起こった場合には抗生物質でそれらを容易に除去することができ、一部のウイルスベクターとは異なり宿主ゲノムへの遺伝物質の組込みが起こらないので、さらなる安全性ももたらす。
【０３１８】
組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株は、いずれのＬｉｓｔｅｒｉａ株であってもよい。好適なＬｉｓｔｅｒｉａ株の例としては、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｖａｎｏｖｉｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｕｒｒａｙｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｗｅｌｓｈｉｍｅｒｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（Ｌｍ）、または当技術分野において公知の任意の他のＬｉｓｔｅｒｉａ種が挙げられる。好ましくは、組換えｌｉｓｔｅｒｉａ株は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ種の株である。Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株の例としては、次のものが挙げられる：Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  １０４０３Ｓ野生型（例えば、BishopおよびHinrichs（１９８７年）J  Immunol  １３９巻：２００５〜２００９頁；Lauerら（２００２年）J  Bact  １８４巻：４１７７〜４１８６頁を参照されたい）、ファージキュアリングされているＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＤＰ−Ｌ４０５６（例えば、Lauerら（２００２年）J  Bact  １８４巻：４１７７〜４１８６頁を参照されたい）；ファージキュアリングされており、ｈｌｙ遺伝子欠失を有する、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＤＰ−Ｌ４０２７（例えば、Lauerら（２００２年）J  Bact  １８４巻：４１７７〜４１８６頁；JonesおよびPortnoy（１９９４年）Infect  Immunity  ６５巻：５６０８〜５６１３頁を参照されたい）；ファージキュアリングされており、ａｃｔＡ遺伝子欠失を有する、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＤＰ−Ｌ４０２９（例えば、Lauerら（２００２年）J  Bact  １８４巻：４１７７〜４１８６頁；Skobleら（２０００年）J  Cell  Biol  １５０巻：５２７〜５３８頁を参照されたい）；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＤＰ−Ｌ４０４２（デルタＰＥＳＴ）（例えば、Brockstedtら（２００４年）Proc  Natl  Acad  Sci.  USA  １０１巻：１３８３２〜１３８３７頁および支援情報を参照されたい）；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＤＰ−Ｌ４０９７（ＬＬＯ−Ｓ４４Ａ）（例えば、Brockstedtら（２００４年）Proc  Natl  Acad  Sci  USA  １０１巻：１３８３２〜１３８３７頁および支援情報を参照されたい）；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＤＰ−Ｌ４３６４（デルタｌｐｌＡ；リポ酸タンパク質リガーゼ）（例えば、Brockstedtら（２００４年）Proc  Natl  Acad  Sci  USA  １０１巻：１３８３２〜１３８３７頁および支援情報を参照されたい）；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＤＰ−Ｌ４４０５（デルタｉｎｌＡ）（例えば、Brockstedtら（２００４年）Proc  Natl  Acad  Sci  USA  １０１巻：１３８３２〜１３８３７頁および支援情報を参照されたい）；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＤＰ−Ｌ４４０６（デルタｉｎｌＢ）（例えば、Brockstedtら（２００４年）Proc  Natl  Acad  Sci  USA  １０１巻：１３８３２〜１３８３７頁および支援情報を参照されたい）；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＣＳ−ＬＯＯＯ１（デルタａｃｔＡ；デルタｉｎｌＢ）（例えば、Brockstedtら（２００４年）Proc  Natl  Acad  Sci  USA  １０１巻：１３８３２〜１３８３７頁および支援情報を参照されたい）；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＣＳ−Ｌ０００２（デルタａｃｔＡ；デルタｌｐｌＡ）（例えば、Brockstedtら（２００４年）Proc  Natl  Acad  Sci  USA  １０１巻：１３８３２〜１３８３７頁および支援情報を参照されたい）；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＣＳ−Ｌ０００３（ＬＬＯ  Ｌ４６１Ｔ；デルタｌｐｌＡ）（例えば、Brockstedtら（２００４年）Proc  Natl  Acad  Sci  USA  １０１巻：１３８３２〜１３８３７頁および支援情報を参照されたい）；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＤＰ−Ｌ４０３８（デルタａｃｔＡ；ＬＬＯ  Ｌ４６１Ｔ）（例えば、Brockstedtら（２００４年）Proc  Natl  Acad  Sci  USA  １０１巻：１３８３２〜１３８３７頁および支援情報を参照されたい）；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＤＰ−Ｌ４３８４（ＬＬＯ  Ｓ４４Ａ；ＬＬＯ  Ｌ４６１Ｔ）（例えば、Brockstedtら（２００４年）Proc  Natl  Acad  Sci  USA  １０１巻：１３８３２〜１３８３７頁および支援情報を参照されたい）；ｌｐｌＡ１欠失を有するＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株（リポ酸タンパク質リガーゼＬｐｌＡ１をコードする）（例えば、O'Riordanら（２００３年）Science  ３０２巻：４６２〜４６４頁を参照されたい）；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＤＰ−Ｌ４０１７（ＬＬＯ  Ｌ４６１Ｔを有する１０４０３Ｓ）（例えば、ＵＳ７，６９１，３９３を参照されたい）；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＥＧＤ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＬ５９１８２４を参照されたい）。別の実施形態では、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＥＧＤ−ｅ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００３２１０；ＡＴＣＣ受託番号ＢＡＡ−６７９を参照されたい）；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＤＰ−Ｌ４０２９（ａｃｔＡ欠失、必要に応じてｕｖｒＡＢ欠失を兼備して（ＤＰ−Ｌ４０２９ｕｖｒＡＢ））（例えば、ＵＳ７，６９１，３９３を参照されたい）；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ａｃｔＡ−／ｉｎｌＢ−二重突然変異体（例えば、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５５６２を参照されたい）；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ｌｐｌＡ突然変異体またはｈｌｙ突然変異体（例えば、ＵＳ２００４／００１３６９０を参照されたい）；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ｄａｌ／ｄａｔ二重突然変異体（例えば、ＵＳ２００５／００４８０８１を参照されたい）である。他のＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株としては、次の遺伝子：ｈｌｙ（ＬＬＯ；リステリオリシン）、ｉａｐ（ｐ６０）、ｉｎｌＡ、ｉｎｌＢ、ｉｎｌＣ、ｄａｌ（アラニンラセマーゼ）、ｄａｔ（Ｄ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ）、ｐｌｃＡ、ｐｌｃＢ、ａｃｔＡのうちの１つもしくはこれらの任意の組合せをコードする核酸を含有するように、または単層小胞の成長、拡散、分解、二層小胞の分解、宿主細胞との結合、もしくは宿主細胞による取込みを媒介する任意の核酸を含有するように（例えば、プラスミドにより、および／またはゲノム組込みにより）、修飾されているものが挙げられる。上記参照文献のそれぞれは、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。
【０３１９】
組換え菌またはＬｉｓｔｅｒｉａは、野生型ビルレンスを有することもあり、弱毒化されたビルレンスを有することもあり、またはビルレンスがないこともあり得る。例えば、組換えＬｉｓｔｅｒｉａには、ファゴソームまたはファゴリソソームから逃れてサイトゾルに侵入するのに十分なビルレンスがあることもある。そのようなＬｉｓｔｅｒｉａ株は、本明細書中の他の箇所で開示されるような少なくとも１つの弱毒化突然変異、欠失または不活性化を含む生弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株であることもある。好ましくは、組換えＬｉｓｔｅｒｉａは、弱毒化栄養要求性株である。栄養要求性株は、その増殖に必要な特定の有機化合物を合成することができないものである。そのような株の例は、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれるＵＳ８，１１４，４１４に記載されている。
【０３２０】
好ましくは、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株は、抗生物質耐性遺伝子を欠いている。例えば、そのような組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株は、抗生物質耐性遺伝子をコードしないプラスミドを含むことができる。しかし、本明細書で提供される一部の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株は、抗生物質耐性遺伝子をコードする核酸を含むプラスミドを含む。抗生物質耐性遺伝子は、分子生物学およびワクチン調製に一般に利用される従来の選択およびクローニングプロセスに使用され得る。例示的な抗生物質耐性遺伝子としては、アンピシリン、ペニシリン、メチシリン、ストレプトマイシン、エリスロマイシン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール（ＣＡＴ）、ネオマイシン、ハイグロマイシンおよびゲンタマイシンに対する耐性を付与する遺伝子産物が挙げられる。
【０３２１】
Ａ．組換え融合ポリペプチドを含む、または組換え融合ポリペプチドをコードする核酸を含む、菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株
本明細書で開示される組換え菌株（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株）は、本明細書で開示される組換え融合ポリペプチドを含むか、または本明細書中の他の箇所で開示されるような組換え融合ポリペプチドをコードする核酸を含む。
【０３２２】
組換え融合タンパク質をコードする核酸を含む菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株では、核酸は、コドン最適化され得る。各アミノ酸についてのＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにより利用される最適なコドンは、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２００７／０２０７１７０に示されている。核酸は、その核酸中の少なくとも１つのコドンが、その原配列でのコドンよりそのアミノ酸についてのＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓによる使用頻度が高いコドンで置き換えられている場合、コドン最適化されている。
【０３２３】
核酸は、菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株中のエピソームプラスミドに存在することもあり、および／または核酸は、菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株のゲノムに組み込まれていることもある。一部の組換え菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株は、本明細書で開示されるような２つの組換え融合ポリペプチドをコードする２つの別個の核酸を含み、１つの核酸はエピソームプラスミド中にあり、１つは、菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株のゲノムに組み込まれている。
【０３２４】
エピソームプラスミドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで（細胞培養で）、ｉｎ  ｖｉｖｏで（宿主内で）、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏとｉｎ  ｖｉｖｏの両方で、安定して維持されるものであり得る。エピソームプラスミド中の場合、組換え融合ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームは、プラスミド中のプロモーター／調節配列に作動可能に連結していることがある。菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株のゲノムに組み込まれている場合、組換え融合ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームは、外来性プロモーター／調節配列に作動可能に連結していることもあり、または内在性プロモーター／調節配列に作動可能に連結していることもある。遺伝子の構成的発現の駆動に有用なプロモーター／調節配列の例は周知であり、例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａのｈｌｙ、ｈｌｙＡ、ａｃｔＡ、ｐｒｆＡおよびｐ６０プロモーター、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂａｃプロモーター、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ  ｓｇｉＡプロモーター、ならびにＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ｐｈａＺプロモーターを含む。一部の場合、目的の挿入遺伝子は、中断されも、ゲノムＤＮＡへの組込みから生じることが多い調節的制約を受けもせず、一部の場合、挿入異種遺伝子は、細胞自体の重要な領域の再編成または中断をもたらさない。
【０３２５】
そのような組換え菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株は、組換え融合ポリペプチドをコードする核酸を含むプラスミドまたはベクターで、菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株または本明細書中の他の箇所に記載されている弱毒化菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株を形質転換することにより、作製することができる。プラスミドは、宿主染色体に組み込まれないエピソームプラスミドであることがある。あるいは、プラスミドは、菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株の染色体に組み込まれる組込プラスミドであることもある。本明細書で使用されるプラスミドは、多コピープラスミドであることもある。細菌を形質転換するための方法は周知であり、塩化カルシウムコンピテント細胞に基づく方法、電気穿孔方法、バクテリオファージ媒介形質導入、化学的形質転換技術、および物理的形質転換技術を含む。例えば、de  Boerら（１９８９年）Cell  ５６巻：６４１〜６４９頁；Millerら（１９９５年）FASEB  J.９巻：１９０〜１９９頁；Sambrookら（１９８９年）Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual、Cold  Spring  Harbor  Laboratory、New  York；Ausubelら（１９９７年）Current  Protocols  in  Molecular  Biology、John  Wiley  &  Sons、New  York；Gerhardtら編、１９９４年、Methods  for  General  and  Molecular  Bacteriology、American  Society  for  Microbiology、Washington,  D.C.；およびMiller、１９９２年、A  Short  Course  in  Bacterial  Genetics、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、Cold  Spring  Harbor、N.Y.を参照されたく、これらのそれぞれは、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。
【０３２６】
異種核酸がゲノムに組み込まれた菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株は、例えば、組み込まれた遺伝子を含む細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａが相同組換えを使用して作出される、部位特異的組込み型ベクターを使用することによって、作製することができる。組込み型ベクターは、菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株を感染させることができる、いずれの部位特異的組込み型ベクターであってもよい。そのような組込み型ベクターは、例えば、ＰＳＡ  ａｔｔＰＰ’部位、ＰＳＡインテグラーゼをコードする遺伝子、Ｕ１５３  ａｔｔＰＰ’部位、Ｕ１５３インテグラーゼをコードする遺伝子、Ａ１１８  ａｔｔＰＰ’部位、Ａ１１８インテグラーゼをコードする遺伝子、または任意の他の公知のａｔｔＰＰ’部位もしくは任意の他のファージインテグラーゼを含むことができる。
【０３２７】
組み込まれた遺伝子を含むそのような菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株は、異種核酸を細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａの染色体に組み込むための任意の他の公知の方法を使用して作出することもできる。相同組換え技術は周知であり、例えば、Balogluら（２００５年）Vet  Microbiol  １０９巻（１−２号）：１１〜１７頁；Jiangら（２００５年）Acta  Biochim  Biophys  Sin  (Shanghai)３７巻（１号）：１９〜２４頁、およびＵＳ６，８５５，３２０に記載されており、これらのそれぞれは、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。
【０３２８】
細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａの染色体への組込みを、トランスポゾン挿入を使用して果たすこともできる。トランスポゾン挿入技術は周知であり、例えば、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれるSunら（１９９０年）Infection  and  Immunity  ５８巻：３７７０〜３７７８頁によりＤＰ−Ｌ９６７の構築について記載されている。トランスポゾン突然変異誘発は、安定したゲノム挿入を果たすことができるが、異種核酸が挿入されたゲノム内の位置は分からない。
【０３２９】
細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａの染色体への組込みを、ファージ組込み部位を使用して果たすこともできる（例えば、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれるLauerら（２００２年）J  Bacteriol  １８４巻（１５号）：４１７７〜４１８６頁を参照されたい）。例えば、インテグラーゼ遺伝子、およびバクテリオファージの接着部位（例えば、Ｕ１５３またはＰＳＡリステリオファージ）を使用して、対応する接着部位に異種遺伝子を挿入することができ、対応する接着部位は、ゲノム内のいずれの適切な部位（例えば、ｃｏｍＫ、またはａｒｇ  ｔＲＮＡ遺伝子の３’末端）であってもよい。利用する接着部位から、内在性プロファージを、異種核酸の組込み前にキュアリングすることができる。そのような方法は、例えば、単一コピー組込み体を生じさせる結果となり得る。「ファージキュアリングステップ」を回避するために、ＰＳＡファージに基づくファージ組込みシステムを使用することができる（例えば、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれるLauerら（２００２年）J  Bacteriol  １８４巻：４１７７〜４１８６頁を参照されたい）。組み込まれた遺伝子の維持は、例えば、抗生物質による連続選択を必要とし得る。あるいは、抗生物質での選択を必要としない、ファージに基づく染色体組込みシステムを確立することができる。その代わりに、栄養要求性宿主株を補完してもよい。例えば、例えばＤ−アラニンラセマーゼをはじめとする必須酵素に対して栄養要求性である宿主株（例えば、Ｌｍ  ｄａｌ（−）ｄａｔ（−））を使用する、臨床応用用のファージに基づく染色体組込みシステムを使用することができる。
【０３３０】
コンジュゲーションを使用して、遺伝物質および／またはプラスミドを細菌に導入することもできる。コンジュゲーション方法は周知であり、例えば、Nikodinovicら（２００６年）Plasmid  ５６巻（３号）：２２３〜２２７頁、およびAuchtungら（２００５年）Proc  Natl  Acad  Sci  USA  １０２巻（３５号）：１２５５４〜１２５５９頁に記載されており、これらのそれぞれは、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。
【０３３１】
具体例では、組換え菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株は、内在性ａｃｔＡ配列（ＡｃｔＡタンパク質をコードする）または内在性ｈｌｙ配列（ＬＬＯタンパク質をコードする）を有するオープンリーディングフレームとして細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａゲノムに組み込まれた組換え融合ポリペプチドをコードする核酸を含むことができる。例えば、融合ポリペプチドの発現および分泌は、内在性ａｃｔＡプロモーターおよびＡｃｔＡシグナル配列の制御下にあることもあり、または内在性ｈｌｙプロモーターおよびＬＬＯシグナル配列の制御下にあることもある。別の例として、組換え融合ポリペプチドをコードする核酸は、ＡｃｔＡタンパク質をコードするａｃｔＡ配列、またはＬＬＯタンパク質をコードするｈｌｙ配列に置き換わることもある。
【０３３２】
組換え菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株の選択は、任意の手段により果たすことができる。例えば、抗生物質選択を使用することができる。抗生物質耐性遺伝子は、分子生物学およびワクチン調製に一般に利用される従来の選択およびクローニングプロセスに使用され得る。例示的な抗生物質耐性遺伝子としては、アンピシリン、ペニシリン、メチシリン、ストレプトマイシン、エリスロマイシン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール（ＣＡＴ）、ネオマイシン、ハイグロマイシンおよびゲンタマイシンに対する耐性を付与する遺伝子産物が挙げられる。あるいは、栄養要求性株を使用することができ、外来性代謝関連遺伝子を、抗生物質耐性遺伝子の代わりに、または抗生物質耐性遺伝子に加えて、選択に使用することができる。一例として、本明細書で提供される代謝酵素または補完遺伝子をコードするプラスミドを含む栄養要求性細菌を選択するために、代謝酵素をコードする遺伝子（例えば、アミノ酸代謝遺伝子）または補完遺伝子の発現を選択することになる培地で形質転換栄養要求性細菌を増殖させることができる。あるいは、組換え体を選択するために温度感受性プラスミドを使用することができ、または組換え体を選択するための任意の他の公知の手段を使用することができる。
【０３３３】
Ｂ．菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株の弱毒化
本明細書で開示される組換え菌株（例えば、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株）は、弱毒化することができる。用語「弱毒化」は、宿主動物において疾患を引き起こす細菌の能力の減少を包含する。例えば、弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株の病原特性を野生型Ｌｉｓｔｅｒｉａと比較して低下させることができるが、その弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａを培養で増殖させ、維持することができる。一例として、ＢＡＬＢ／ｃマウスへの弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａの静脈内接種を使用すると、接種された動物の５０％が生き延びる致死量（ＬＤ５０）は、好ましくは、野生型ＬｉｓｔｅｒｉａのＬＤ５０より上に少なくとも約１０倍、より好ましくは少なくとも約１００倍、より好ましくは少なくとも約１，０００倍、よりいっそう好ましくは少なくとも約１０，０００倍、最も好ましくは少なくとも約１００，０００倍増加される。したがって、Ｌｉｓｔｅｒｉａの弱毒化株は、それが投与される動物の死をもたらさないものであるか、または投与される細菌数が、同動物の死をもたらすために必要となる野生型非弱毒化細菌の数より非常に多い場合にのみ、動物の死をもたらすものである。弱毒化細菌は、一般的な環境では、その増殖に必要な栄養素がそこに存在しないため、複製することができないものを意味すると解釈すべきでもある。したがって、細菌は、必要な栄養素が提供される制御環境での複製に限定される。弱毒化株は、無制御複製ができないことから環境上安全である。
【０３３４】
（１）菌およびＬｉｓｔｅｒｉａ株を弱毒化する方法
弱毒化は、任意の公知の手段により遂行することができる。例えば、そのような弱毒化株は、１つもしくは複数の内在性ビルレンス遺伝子または１つもしくは複数の内在性代謝関連遺伝子が欠損していることもある。そのような遺伝子の例は、本明細書で開示され、弱毒化は、本明細書で開示される遺伝子のいずれか１つまたは任意の組合せの不活性化により果たすことができる。不活性化は、例えば、欠失によって、または突然変異（例えば、不活性化突然変異）によって、果たすことができる。用語「突然変異」は、配列（核酸またはアミノ酸配列）に対する任意のタイプの突然変異または修飾を含み、欠失、トランケーション、挿入、置換、破壊または転座を包含し得る。例えば、突然変異は、フレームシフト突然変異、タンパク質の未完熟終了を引き起こす突然変異、または遺伝子発現に影響を与える調節配列の突然変異を含むことができる。突然変異誘発は、組換えＤＮＡ技術を使用して遂行することができ、または変異原性化学物質もしくは放射線を使用する旧来の突然変異誘発およびその後の突然変異体の選択を使用して遂行することができる。付随する低い復帰突然変異の確率のため、欠失突然変異体が好ましいこともある。用語「代謝関連遺伝子」は、宿主細菌が利用または必要とする栄養素の合成に関与するまたはそのような合成に必要とされる酵素をコードする遺伝子を指す。例えば、酵素は、宿主細菌の持続的増殖に必要とされる栄養素の合成に関与し得るか、またはそのような合成に必要とされ得る。用語「ビルレンス」遺伝子は、生物のゲノムにおけるその存在または活性がその生物の病原性に寄与する（例えば、生物による宿主におけるニッチへの定着（細胞への接着を含む）、免疫回避（宿主の免疫応答の回避）、免疫抑制（宿主の免疫応答の阻害）、細胞への侵入および細胞からの退出、または宿主からの栄養の獲得を可能にする）遺伝子を含む。
【０３３５】
そのような弱毒化株の具体例は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（Ｌｍ）ｄａｌ（−）ｄａｔ（−）（Ｌｍｄｄ）である。そのような弱毒化株の別の例は、Ｌｍ  ｄａｌ（−）ｄａｔ（−）ΔａｃｔＡ（ＬｍｄｄＡ）である。例えば、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１１／０１４２７９１を参照されたい。ＬｍｄｄＡは、内在性ビルレンス遺伝子ａｃｔＡの欠失に起因して弱毒化されているＬｉｓｔｅｒｉａ株に基づく。そのような株は、ｄａｌ遺伝子の相補性によるｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抗原発現のためのプラスミドを保持することができる。あるいは、ＬｍｄｄＡは、内在性ｄａｌ、ｄａｔおよびａｃｔＡ遺伝子の突然変異を有するｄａｌ／ｄａｔ／ａｃｔＡ  Ｌｉｓｔｅｒｉａであることもある。そのような突然変異は、例えば、欠失または他の不活性化突然変異であり得る。
【０３３６】
減弱化株の別の具体例は、Ｌｍ  ｐｒｆＡ（−）、またはｐｒｆＡ遺伝子の部分的欠失もしくは不活性化突然変異を有する株である。ＰｒｆＡタンパク質は、Ｌｍがその脊椎動物宿主に定着するために必要とする必須ビルレンス遺伝子を含むレギュロンの発現を制御し、したがって、ｐｒｆＡ突然変異は、ＰｒｆＡに、ＰｒｆＡ依存性ビルレンス遺伝子の発現を活性化する能力を、強力に付与する。
【０３３７】
弱毒化株のさらに別の具体例は、細菌の天然ビルレンスに重要な２つの遺伝子−インターナリンＢおよびａｃｔＡ−が欠失している、Ｌｍ  ｉｎｌＢ（−）ａｃｔＡ（−）である。
【０３３８】
弱毒化菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株の他の例としては、１つまたは複数の内在性ビルレンス遺伝子が欠損している、菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株が挙げられる。そのような遺伝子の例としては、ＬｉｓｔｅｒｉａにおけるａｃｔＡ、ｐｒｆＡ、ｐｌｃＢ、ｐｌｃＡ、ｉｎｌＡ、ｉｎｌＢ、ｉｎｌＣ、ｉｎｌＪおよびｂｓｈが挙げられる。弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、上述の株のいずれかについての二重突然変異体または三重突然変異体であることもある。弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、本明細書で提供される（例えば、ａｃｔＡ、ｐｒｆＡ、およびｄａｌ／ｄａｔ遺伝子を含む）遺伝子のそれぞれ１つについての突然変異もしくは欠失を含むことがあり、または本明細書で提供される遺伝子のいずれかの、例えば最大１０についての、突然変異もしくは欠失を含むこともある。例えば、弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、内在性インターナリンＣ（ｉｎｌＣ）遺伝子の突然変異もしくは欠失、および／または内在性ａｃｔＡ遺伝子の突然変異もしくは欠失を含むことがある。あるいは、弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、内在性インターナリンＢ（ｉｎｌＢ）遺伝子の突然変異もしくは欠失、および／または内在性ａｃｔＡ遺伝子の突然変異もしくは欠失を含むことがある。あるいは、弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、内在性ｉｎｌＢ、ｉｎｌＣおよびａｃｔＡ遺伝子の突然変異または欠失を含むことがある。隣接細胞へのＬｉｓｔｅｒｉａの移行は、そのプロセスに関与する内在性ａｃｔＡ遺伝子および／または内在性ｉｎｌＣ遺伝子もしくは内在性ｉｎｌＢ遺伝子の欠失により阻害され、その結果、免疫原性増加に対する高レベルの弱毒化、および株骨格としての有用性が生じる。弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、ｐｌｃＡとｐｌｃＢ両方の突然変異または欠失を含む、二重突然変異体であることもある。一部の場合、株は、ＥＧＤ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ骨格から構築され得る。
【０３３９】
菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株は、代謝関連遺伝子の突然変異を有する栄養要求性株であることもある。一例として、株は、１つまたは複数の内在性アミノ酸代謝遺伝子が欠損していることがある。例えば、Ｄ−アラニンが欠損しているＬｉｓｔｅｒｉａの栄養要求性株の生成は、例えば、欠失突然変異、挿入突然変異、フレームシフト突然変異、タンパク質の未完熟終了を引き起こす突然変異、または遺伝子発現に影響を与える調節配列の突然変異を含む、周知である多数の方法で遂行することができる。栄養要求性表現型の付随する低い復帰突然変異確率のため、欠失突然変異体が好ましいこともある。一例として、本明細書で提示されるプロトコールに従って生成されるＤ−アラニンの突然変異体を、単純な実験室培養アッセイで、Ｄ−アラニンの非存在下で増殖する能力について検査してもよい。この化合物の非存在下で増殖することができない突然変異体を選択することができる。
【０３４０】
内在性アミノ酸代謝遺伝子の例としては、ビタミン合成遺伝子、パントテン酸シンターゼをコードする遺伝子、Ｄ−グルタミン酸シンターゼ遺伝子、Ｄ−アラニンアミノトランスフェラーゼ（ｄａｔ）遺伝子、Ｄ−アラニンラセマーゼ（ｄａｌ）遺伝子、ｄｇａ、ジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）の合成に関与する遺伝子、システインシンターゼＡの合成に関与する遺伝子（ｃｙｓＫ）、ビタミンＢ１２依存性メチオニンシンターゼ、ｔｒｐＡ、ｔｒｐＢ、ｔｒｐＥ、ａｓｎＢ、ｇｌｔＤ、ｇｌｔＢ、ｌｅｕＡ、ａｒｇＧおよびｔｈｒＣが挙げられる。Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、２つまたはそれより多くのそのような遺伝子（例えば、ｄａｔおよびｄａｌ）が欠損していることもある。Ｄ−グルタミン酸合成は、Ｄ−ｇｌｕ＋ｐｙｒのアルファ−ケトグルタル酸塩＋Ｄ−ａｌａへの変換および逆反応に関与するｄａｌ遺伝子によって、一部は制御される。
【０３４１】
別の例として、弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、アミノ酸合成遺伝子などの内在性シンターゼ遺伝子が欠損していることもある。そのような遺伝子の例としては、ｆｏｌＰ、ジヒドロウリジンシンターゼファミリータンパク質をコードする遺伝子、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＦ、ホスホエノールピルビン酸シンターゼをコードする遺伝子、ｈｉｓＦ、ｈｉｓＨ、ｆｌｉＩ、リボソーム大サブユニットプソイドウリジンシンターゼをコードする遺伝子、ｉｓｐＤ、二官能性ＧＭＰシンターゼ／グルタミンアミドトランスフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子、ｃｏｂＳ、ｃｏｂＢ、ｃｂｉＤ、ウロポルフィリン−ＩＩＩ  Ｃ−メチルトランスフェラーゼ／ウロポルフィリノーゲン−ＩＩＩシンターゼをコードする遺伝子、ｃｏｂＱ、ｕｐｐＳ、ｔｒｕＢ、ｄｘｓ、ｍｖａＳ、ｄａｐＡ、ｉｓｐＧ、ｆｏｌＣ、クエン酸シンターゼをコードする遺伝子、ａｒｇＪ、３−デオキシ−７−ホスホヘプツロン酸シンターゼをコードする遺伝子、インドール−３−グリセロール−リン酸シンターゼをコードする遺伝子、アントラニル酸シンターゼ／グルタミンアミドトランスフェラーゼ構成成分をコードする遺伝子、ｍｅｎＢ、メナキノン特異的イソコリスミ酸シンターゼをコードする遺伝子、ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンターゼＩまたはＩＩをコードする遺伝子、ホスホリボシルアミノイミダゾール−スクシノカルボキサミドシンターゼをコードする遺伝子、ｃａｒＢ、ｃａｒＡ、ｔｈｙＡ、ｍｇｓＡ、ａｒｏＢ、ｈｅｐＢ、ｒｌｕＢ、ｉｌｖＢ、ｉｌｖＮ、ａｌｓＳ、ｆａｂＦ、ｆａｂＨ、プソイドウリジンシンターゼをコードする遺伝子、ｐｙｒＧ、ｔｒｕＡ、ｐａｂＢ、およびａｔｐシンターゼ遺伝子（例えば、ａｔｐＣ、ａｔｐＤ−２、ａｐｔＧ、ａｔｐＡ−２およびその他）が挙げられる。
【０３４２】
弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、内在性ｐｈｏＰ、ａｒｏＡ、ａｒｏＣ、ａｒｏＤまたはｐｌｃＢが欠損していることもある。さらに別の例として、弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、内在性ペプチド輸送体が欠損していることもある。例としては、ＡＢＣ輸送体／ＡＴＰ結合／パーミアーゼタンパク質、オリゴペプチドＡＢＣ輸送体／オリゴペプチド結合タンパク質、オリゴペプチドＡＢＣ輸送体／パーミアーゼタンパク質、亜鉛ＡＢＣ輸送体／亜鉛結合タンパク質、糖ＡＢＣ輸送体、リン酸輸送体、ＺＩＰ亜鉛輸送体、ＥｍｒＢ／ＱａｃＡファミリーの薬物耐性輸送体、硫酸輸送体、プロトン依存性オリゴペプチド輸送体、マグネシウム輸送体、葉酸／亜硝酸輸送体、スペルミジン／プトレシンＡＢＣ輸送体、Ｎａ／Ｐｉ共輸送体、糖リン酸輸送体、グルタミンＡＢＣ輸送体、主要促進因子ファミリー輸送体、グリシンベタイン／Ｌ−プロリンＡＢＣ輸送体、モリブデンＡＢＣ輸送体、タイコ酸（techoic  acid）ＡＢＣ輸送体、コバルトＡＢＣ輸送体、アンモニウム輸送体、アミノ酸ＡＢＣ輸送体、細胞分裂ＡＢＣ輸送体、マンガンＡＢＣ輸送体、鉄化合物ＡＢＣ輸送体、マルトース／マルトデキストリンＡＢＣ輸送体、Ｂｃｒ／ＣｆｌＡファミリーの薬物耐性輸送体、および上記タンパク質のうちの１つのサブユニットをコードする遺伝子が挙げられる。
【０３４３】
他の弱毒化菌およびＬｉｓｔｅｒｉａ株は、細菌増殖プロセス、複製プロセス、細胞壁合成、タンパク質合成、脂肪酸の代謝に、または任意の他の増殖もしくは複製プロセスに使用されるアミノ酸を代謝する内在性代謝酵素が欠損していることもある。同様に、弱毒化株は、細胞壁合成に使用されるアミノ酸の形成を触媒することができる、細胞壁合成に使用されるアミノ酸の合成を触媒することができる、または細胞壁合成に使用されるアミノ酸の合成に関与することができる、内在性代謝酵素が欠損していることもある。あるいは、アミノ酸は、細胞壁生合成に使用されることがある。あるいは、代謝酵素は、細胞壁構成成分であるＤ−グルタミン酸の合成酵素である。
【０３４４】
他の弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、Ｄ−グルタミン酸合成遺伝子、ｄｇａ、ａｌｒ（アラニンラセマーゼ）遺伝子によりコードされる代謝酵素、またはアラニン合成に関与する任意の他の酵素が欠損していることもある。Ｌｉｓｔｅｒｉａ株に欠損していることがある代謝酵素のさらに他の例としては、ｓｅｒＣによりコードされる酵素（ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ）、ａｓｄによりコードされる酵素（アスパラギン酸ベータセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ；細胞壁構成要素ジアミノピメリン酸の合成に関与する）、ｇｓａＢ−グルタミン酸−１−セミアルデヒドアミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子によりコードされる酵素（（Ｓ）−４−アミノ−５−オキソペンタノエートからの５−アミノレブリネートの形成を触媒する）、ｈｅｍＬによりコードされる酵素（（Ｓ）−４−アミノ−５−オキソペンタノエートからの５−アミノレブリネートの形成を触媒する）、ａｓｐＢによりコードされる酵素（Ｌ−アスパルテートおよび２−オキソグルタレートからのオキサロアセテート（oxalozcetate）およびＬ−グルタメートの形成を触媒するアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）、ａｒｇＦ−１によりコードされる酵素（アルギニン生合成に関与する）、ａｒｏＥによりコードされる酵素（アミノ酸生合成に関与する）、ａｒｏＢによりコードされる酵素（３−デヒドロキネート生合成に関与する）、ａｒｏＤによりコードされる酵素（アミノ酸生合成に関与する）、ａｒｏＣによりコードされる酵素（アミノ酸生合成に関与する）、ｈｉｓＢによりコードされる酵素（ヒスチジン生合成に関与する）、ｈｉｓＤによりコードされる酵素（ヒスチジン生合成に関与する）、ｈｉｓＧによりコードされる酵素（ヒスチジン生合成に関与する）、ｍｅｔＸによりコードされる酵素（メチオニン生合成に関与する）、ｐｒｏＢによりコードされる酵素（プロリン生合成に関与する）、ａｒｇＲによりコードされる酵素（アルギニン生合成に関与する）、ａｒｇＪによりコードされる酵素（アルギニン生合成に関与する）、ｔｈｉｌ（チアミン生合成に関与する）、ＬＭＯｆ２３６５＿１６５２によりコードされる酵素（トリプトファン生合成に関与する）、ａｒｏＡによりコードされる酵素（トリプトファン生合成に関与する）、ｉｌｖＤによりコードされる酵素（バリンおよびイソロイシン生合成に関与する）、ｉｌｖＣによりコードされる酵素（バリンおよびイソロイシン生合成に関与する）、ｌｅｕＡによりコードされる酵素（ロイシン生合成に関与する）、ｄａｐＦによりコードされる酵素（リシン生合成に関与する）、およびｔｈｒＢによりコードされる酵素（トレオニン生合成に関与する）（すべてＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００２９７３）が挙げられる。
【０３４５】
弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、ｔＲＮＡシンテターゼなどの他の代謝酵素の突然変異により生成されることもある。例えば、代謝酵素は、トリプトファニルｔＲＮＡシンテターゼをコードするｔｒｐＳ遺伝子によりコードされることもある。例えば、宿主株細菌は、Δ（ｔｒｐＳ  ａｒｏＡ）であることがあり、両方のマーカーが組込み型ベクターに含有されることがある。
【０３４６】
弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株を生成するように突然変異され得る代謝酵素の他の例としては、ｍｕｒＥによりコードされる酵素（ジアミノピメリン酸の合成に関与する；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００３４８５）、ＬＭＯｆ２３６５＿２４９４によりコードされる酵素（タイコ酸生合成に関与する）、ＷｅｃＥによりコードされる酵素（リポ多糖生合成タンパク質ｒｆｆＡ；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＥ０１４０７５．１）、またはａｍｉＡによりコードされる酵素（Ｎ−アセチルムラモイルーＬ−アラニンアミダーゼ）が挙げられる。代謝酵素のさらに他の例としては、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、ヒスチジノール−リン酸アミノトランスフェラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿４６６３４７）、または細胞壁タイコ酸グリコシル化タンパク質ＧｔｃＡが挙げられる。
【０３４７】
弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株を生成するように突然変異され得る代謝酵素の他の例としては、ペプチドグリカン構成成分または前駆体の合成酵素が挙げられる。構成成分は、例えば、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルムラミルペンタペプチド、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン、ＭｕｒＮＡｃ−（ペンタペプチド）−ピロホスホリル−ウンデカプレノール、ＧｌｃＮＡｃ−ｐ−（１，４）−ＭｕｒＮＡｃ−（ペンタペプチド）−ピロホスホリルウンデカプレノール、または任意の他のペプチドグリカン構成成分もしくは前駆体であり得る。
【０３４８】
弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株を生成するように突然変異され得る代謝酵素のさらに他の例としては、ｍｕｒＧ、ｍｕｒＤ、ｍｕｒＡ−１またはｍｕｒＡ−２によりコードされる代謝酵素（すべてＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００２９７３に記載されている）が挙げられる。あるいは、代謝酵素は、ペプチドグリカン構成成分または前駆体の任意の他の合成酵素であってもよい。代謝酵素はまた、トランス−グリコシラーゼ、トランス−ペプチダーゼ、カルボキシ−ペプチダーゼ、任意の他のクラスの代謝酵素、または任意の他の代謝酵素であってもよい。例えば、代謝酵素は、任意の他のＬｉｓｔｅｒｉａ代謝酵素であってもよく、または任意の他のＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ代謝酵素であってもよい。
【０３４９】
他の菌株を、他の菌株中の対応するオルソロガス遺伝子を突然変異させることにより、Ｌｉｓｔｅｒｉａについて上で記載したように弱毒化することができる。
【０３５０】
（２）弱毒化菌およびＬｉｓｔｅｒｉａ株を補完する方法
本明細書で開示される弱毒化菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株は、補完遺伝子を含む核酸、または弱毒化突然変異を補完する（例えば、栄養要求性Ｌｉｓｔｅｒｉａ株の栄養要求性を補完する）代謝酵素をコードする核酸をさらに含むことができる。例えば、本明細書で開示されるような融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを有する核酸は、補完遺伝子を含む、または補完代謝酵素をコードする、第２のオープンリーディングフレームをさらに含むことができる。あるいは、第１の核酸は、融合ポリペプチドをコードすることができ、別の第２の核酸は、補完遺伝子を含むことができ、または補完代謝酵素をコードすることができる。
【０３５１】
補完遺伝子は、染色体外性であってもよく、または細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａゲノムに組み込まれていてもよい。例えば、栄養要求性Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、代謝酵素をコードする核酸を含むエピソームプラスミドを含むことができる。そのようなプラスミドは、エピソームまたは染色体外様式でＬｉｓｔｅｒｉａ内に含有されることになる。あるいは、栄養要求性Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、代謝酵素をコードする核酸を含む組込みプラスミド（すなわち、組込み型ベクター）を含むことができる。そのような組込みプラスミドをＬｉｓｔｅｒｉａ染色体への組込みに使用することができる。好ましくは、エピソームプラスミドまたは組込みプラスミドは、抗生物質耐性マーカーを欠いている。
【０３５２】
抗生物質耐性遺伝子の代わりに、または抗生物質耐性遺伝子に加えて、代謝関連遺伝子を選択に使用することができる。一例として、本明細書で提供される代謝酵素または補完遺伝子をコードするプラスミドを含む栄養要求性細菌を選択するために、代謝酵素をコードする遺伝子（例えば、アミノ酸代謝遺伝子）または補完遺伝子の発現を選択することになる培地で形質転換栄養要求性細菌を増殖させることができる。例えば、Ｄ−グルタミン酸合成のための栄養を要求する細菌を、Ｄ−グルタミン酸合成のための遺伝子を含むプラスミドで形質転換することができ、その栄養要求性細菌は、Ｄ−グルタミン酸の非存在下で増殖するであろうが、プラスミドで形質転換されていない、またはＤ−グルタミン酸合成のためのタンパク質をコードするプラスミドを発現しない、栄養要求性細菌は、増殖しないであろう。同様に、Ｄ−アラニン合成のための栄養を要求する細菌は、形質転換され、Ｄ−アラニン合成のためのアミノ酸代謝酵素をコードする核酸含むプラスミドを発現する場合、Ｄ−アラニンの非存在下で増殖するであろう。必要な増殖因子、栄養補助剤、アミノ酸、ビタミン、抗生物質およびこれらに類するものを含むまたは欠いている適切な培地を作製するためのそのような方法は周知であり、市販されている。
【０３５３】
本明細書で提供される代謝酵素または補完遺伝子をコードするプラスミドを含む栄養要求性細菌を適切な培地で選択したら、それらの細菌を選択圧の存在下で繁殖させることができる。そのような繁殖は、栄養要求性因子を含まない培地中で細菌を増殖させることを含み得る。栄養要求性細菌における代謝酵素または補完遺伝子を発現するプラスミドの存在により、確実にプラスミドが細菌とともに複製することになり、したがって、プラスミドを保有する細菌が連続的に選択されることになる。菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株の産生は、プラスミドを含む栄養要求性細菌が増殖することになる培地の体積を調整することにより、容易に規模拡大することができる。
【０３５４】
１つの具体例では、弱毒化株は、ｄａｌおよびｄａｔの欠失または不活性化突然変異を有する株（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（Ｌｍ）ｄａｌ（−）ｄａｔ（−）（Ｌｍｄｄ）またはＬｍ  ｄａｌ（−）ｄａｔ（−）ΔａｃｔＡ（ＬｍｄｄＡ））であり、補完遺伝子は、アラニンラセマーゼ酵素（例えば、ｄａｌ遺伝子によりコードされる）、またはＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ酵素（例えば、ｄａｔ遺伝子によりコードされる）をコードする。例示的なアラニンラセマーゼタンパク質は、配列番号３５３に記載の配列（配列番号３５５によりコードされる；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０３８４３８）を有することがあり、または配列番号３５３のホモログ、バリアント、アイソフォーム、アナログ、断片、ホモログの断片、バリアントの断片、アナログの断片、もしくはアイソフォームの断片であることもある。アラニンラセマーゼタンパク質はまた、任意の他のＬｉｓｔｅｒｉａアラニンラセマーゼタンパク質であってもよい。あるいは、アラニンラセマーゼタンパク質は、任意の他のグラム陽性アラニンラセマーゼタンパク質であってもよく、または任意の他のアラニンラセマーゼタンパク質であってもよい。例示的なＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼタンパク質は、配列番号３５４に記載の配列（配列番号３５６によりコードされる；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０３８４３９）を有することがあり、または配列番号３５４のホモログ、バリアント、アイソフォーム、アナログ、断片、ホモログの断片、バリアントの断片、アナログの断片、もしくはアイソフォームの断片であることもある。Ｄ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼタンパク質はまた、任意の他のＬｉｓｔｅｒｉａ  Ｄ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼタンパク質であってもよい。あるいは、Ｄ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼタンパク質は、任意の他のグラム陽性Ｄ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼタンパク質であってもよく、または任意の他のＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼタンパク質であってもよい。
【０３５５】
別の具体例では、弱毒化株は、ｐｒｆＡの欠失または不活性化突然変異を有する株（例えば、Ｌｍ  ｐｒｆＡ（−））であり、補完遺伝子は、ＰｒｆＡタンパク質をコードする。例えば、補完遺伝子は、一部のＰｒｆＡ機能を回復させる突然変異型ＰｒｆＡ（Ｄ１３３Ｖ）タンパク質をコードすることができる。野生型ＰｒｆＡタンパク質の例は、配列番号３５７に記載されており（配列番号３５８に記載の核酸によりコードされる）、Ｄ１３３Ｖ突然変異型ＰｒｆＡタンパク質の一例は、配列番号３５９に記載されている（配列番号３６０に記載の核酸によりコードされる）。補完ＰｒｆＡタンパク質は、配列番号３５７または３５９のホモログ、バリアント、アイソフォーム、アナログ、断片、ホモログの断片、バリアントの断片、アナログの断片またはアイソフォームの断片であってもよい。ＰｒｆＡタンパク質はまた、任意の他のＬｉｓｔｅｒｉａ  ＰｒｆＡタンパク質であってもよい。あるいは、ＰｒｆＡタンパク質は、任意の他のグラム陽性ＰｒｆＡタンパク質であってもよく、または任意の他のＰｒｆＡタンパク質であってもよい。
【０３５６】
別の例では、菌株またはＬｉｓｔｅｒｉａ株は、ａｃｔＡ遺伝子の欠失または不活性化突然変異を含むことがあり、突然変異を補完し、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株に対する機能を回復するために、補完遺伝子は、ａｃｔＡ遺伝子を含むことがある。
【０３５７】
他の栄養要求性株および補完系を、本明細書で提供される方法および組成物での使用に採用することもできる。
【０３５８】
Ｃ．菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株の調製および保管
組換え菌株（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株）は、必要に応じて、動物宿主によって継代されたものである。そのような継代は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株のワクチンベクターとしての有効性を最大化することができ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株の免疫原性を安定させることができ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株のビルレンスを安定させることができ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株の免疫原性を増大させることができ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株のビルレンスを増大させることができ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株の不安定な亜株を除去することができ、またはＬｉｓｔｅｒｉａ株の不安定な亜株の保有率を低下させることができる。動物宿主によって組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を継代させるための方法は、当技術分野において周知であり、例えば、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２００６／０２３３８３５に記載されている。
【０３５９】
組換え菌株（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株）を凍結細胞バンクに保管することができ、または凍結乾燥細胞バンクに保管することができる。そのような細胞バンクは、例えば、マスター細胞バンク、ワーキング細胞バンク、または医薬品等の製造管理および品質管理に関する基準（ＧＭＰ）に準拠する細胞バンクであり得る。「医薬品等の製造管理および品質管理に関する基準」の例は、米国連邦規則集ＣＦＲ第２１巻２１０〜２１１章により規定されているものを含む。しかし、「医薬品等の製造管理および品質管理に関する基準」は、臨床グレード材料の生産についてのまたはヒトによる摂取についての他の基準、例えば、米国以外の国の基準によって規定されることもある。そのような細胞バンクは、臨床グレード材料の生産を対象としたものであることもあり、またはヒトによる使用についての規則慣行に準拠することもある。
【０３６０】
そのような細胞バンクは、例えば、本明細書で開示される組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を１〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、もしくは４５〜５０、またはそれより多く含むことができる。そのような組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株は、例えば、１〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、または４５〜５０のがん関連タンパク質の反復性がん突然変異を含むことがある。例えば、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株は、各がん関連タンパク質に最も多く見られる２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０の反復性がん突然変異を含むことがある。同様に、各がん関連タンパク質について、そのがん関連タンパク質の突然変異を有するがん患者の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％は、細胞バンクにおける組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株における抗原性ペプチドの組合せに含まれる、がん関連タンパク質の反復性がん突然変異を有する。
【０３６１】
組換え菌株（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株）は、ワクチン用量のバッチから、凍結ストックから、または凍結乾燥ストックからのものであることもある。
【０３６２】
そのような細胞バンク、凍結ストック、またはワクチン用量のバッチは、例えば、９０％より多く解凍すると生存能を示すことができる。解凍は、例えば、２４時間の凍結保存または凍結保管の後に行われることがある。あるいは、保管は、例えば、２日、３日、４日、１週間、２週間、３週間、１カ月、２カ月、３カ月、５カ月、６カ月、９カ月または１年間続くこともある。
【０３６３】
細胞バンク、凍結ストック、またはワクチン用量のバッチは、例えば、栄養培地において菌株（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株）の培養物を増殖させるステップ、グリセロールを含む溶液中で培養物を凍結するステップ、およびＬｉｓｔｅｒｉａ株を−２０℃未満で保管するステップを含む方法により、凍結保存することができる。温度は、例えば、約−７０℃、または約−７０〜約−８０℃の間であり得る。あるいは、細胞バンク、凍結ストック、またはワクチン用量のバッチは、限定培地においてＬｉｓｔｅｒｉａ株の培養物を増殖させるステップ、グリセロールを含む溶液中で培養物を凍結するステップ、およびＬｉｓｔｅｒｉａ株を−２０℃未満で保管するステップを含む方法により、凍結保存することができる。温度は、例えば、約−７０℃、または約−７０〜約−８０℃の間であり得る。いずれの限定微生物培地をこの方法に使用してもよい。
【０３６４】
培養物（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａワクチン用量のバッチを産生するために使用されるＬｉｓｔｅｒｉａワクチン株の培養物）、例えば、細胞バンクからの、凍結ストックからの、スターター培養からの、またはコロニーからの培養物を接種することができる。培養物を、例えば、対数増殖期中期に、ほぼ対数増殖期中期に、または別の増殖期に接種することができる。
【０３６５】
凍結に使用される溶液は、グリセロールの代わりに、またはグリセロールに加えて、別の束一性添加剤、または凍結防止特性を有する添加剤を必要に応じて含有する。そのような添加剤の例としては、例えば、マンニトール、ＤＭＳＯ、スクロース、または任意の他の束一性添加剤、もしくは凍結防止特性を有する添加剤が挙げられる。
【０３６６】
菌株（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株）の培養物を増殖させるために利用される栄養培地は、いずれの好適な栄養培地であってもよい。好適な培地の例としては、例えば、ＬＢ培地、ＴＢ培地、動物質を含まない変性テリフィックブロス培地、または限定培地が挙げられる。
【０３６７】
増殖させるステップは、任意の公知の細菌増殖手段により行うことができる。例えば、増殖させるステップは、振盪フラスコ（例えば、バッフル付き振盪フラスコ）、回分式培養槽、撹拌タンクもしくはフラスコ、エアリフト型培養槽、フェッドバッチ、連続セル反応器、セル固定化反応器、または任意の他の細菌増殖手段を用いて行うことができる。
【０３６８】
必要に応じて、培養物の（例えば、回分式培養槽内での）増殖中に一定ｐＨが維持される。例えば、ｐＨを約６．０で、約６．５で、約７．０で、約７．５で、または約８．０で維持することができる。同様に、ｐＨは、例えば、約６．５〜約７．５、約６．０〜約８．０、約６．０〜約７．０、約６．０〜約７．０、または約６．５〜約７．５であってもよい。
【０３６９】
必要に応じて、培養物の増殖中に一定温度を維持することができる。例えば、温度を約３７℃でまたは３７℃で維持することができる。あるいは、温度を、２５℃、２７℃、２８℃、３０℃、３２℃、３４℃、３５℃、３６℃、３８℃、または３９℃で維持することができる。
【０３７０】
必要に応じて、培養物の増殖中に一定溶存酸素濃度を維持することができる。例えば、溶存酸素濃度を、飽和度２０％、飽和度１５％、飽和度１６％、飽和度１８％、飽和度２２％、飽和度２５％、飽和度３０％、飽和度３５％、飽和度４０％、飽和度４５％、飽和度５０％、飽和度５５％、飽和度６０％、飽和度６５％、飽和度７０％、飽和度７５％、飽和度８０％、飽和度８５％、飽和度９０％、飽和度９５％、飽和度１００％、または飽和度ほぼ１００％で維持することができる。
【０３７１】
組換え菌株（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株）の凍結乾燥および凍結保存方法は、公知である。例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ培養物を液体窒素で急速凍結させ、その後、最終凍結温度で保管することができる。あるいは、培養物をより穏やかな手法で（例えば、最終保管温度の培養バイアルに入れることにより）凍結させることができる。培養物を、細菌培養物を凍結させるための任意の他の公知の方法により凍結させることもできる。
【０３７２】
培養物の保管温度は、例えば、−２０〜−８０℃の間であり得る。例えば、温度は、−２０℃より有意に低いことがあり、または−７０℃以下の温度であることもある。あるいは、温度は、約−７０℃、−２０℃、−３０℃、−４０℃、−５０℃、−６０℃、−８０℃、−３０〜−７０℃、−４０〜−７０℃、−５０〜−７０℃、−６０〜−７０℃、−３０〜−８０℃、−４０〜−８０℃、−５０〜−８０℃、−６０〜−８０℃、または−７０〜−８０℃であり得る。あるいは、温度は、７０℃より低温、または−８０℃より低温であることもある。
【０３７３】
ＶＩＩ．免疫原性組成物、医薬組成物およびワクチン
本明細書で開示されるような組換え融合ポリペプチド、本明細書で開示されるような組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、または本明細書で開示されるような組換え菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む、免疫原性組成物、医薬組成物またはワクチンも提供される。Ｌｉｓｔｅｒｉａ株を含む免疫原性組成物は、それがＬｉｓｔｅｒｉａ株を含むという理由で本質的に免疫原性であることができ、および／または組成物は、アジュバントをさらに含むこともできる。他の免疫原性組成物は、ＤＮＡ免疫療法またはペプチド免疫療法用組成物を含む。
【０３７４】
用語「免疫原性組成物」は、抗原を含有する組成物であって、組成物への曝露時に対象において抗原に対する免疫応答を惹起する、任意の組成物を指す。免疫原性組成物により惹起される免疫応答は、特定の抗原に対するものであることもあり、または抗原上の特定のエピトープに対するものであることもある。
【０３７５】
免疫原性組成物は、単一の本明細書で開示されるような組換え融合ポリペプチド、本明細書で開示されるような組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、または本明細書で開示されるような組換え菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株を含むこともあり、あるいは複数の異なる、本明細書で開示されるような組換え融合ポリペプチド、本明細書で開示されるような組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、または本明細書で開示されるような組換え菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株を含むこともある。第１の組換え融合ポリペプチドは、例えば、第２の組換え融合ポリペプチドが含まない１つの抗原性ペプチドを含む場合、第２の組換え融合ポリペプチドとは異なる。２つの組換え融合ポリペプチドが、多数の同じ抗原性ペプチドを含み、それにもかかわらず異なると見なされることもある。一例として、免疫原性組成物は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０の組換え融合ポリペプチド、組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、または組換え菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株を含むことができる。あるいは、免疫原性組成物は、１〜２、１〜５、１〜１０、１〜２０または１〜４０の組換え融合ポリペプチド、組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、または組換え菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株の混合物、あるいは１〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、または４０〜５０の組換え融合ポリペプチド、組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、または組換え菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株の混合物を、含むことができる。そのような異なる組換え融合ポリペプチド、組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、または組換え菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株を、対象に同時に投与することができ、または対象に逐次的に投与することができる。逐次投与は、本明細書で開示される組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株（または組換え融合ポリペプチドまたは核酸）を含む原薬が、異なる剤形である（例えば、１つの薬剤が錠剤またはカプセルであり、別の薬剤が滅菌液である）、および／または異なる投薬スケジュールで投与される（例えば、混合物からの１つの組成物が少なくとも毎日投与され、別のものが、より低い頻度で、例えば、週１回、２週間に１回、または３週間に１回投与される）場合、特に有用であり得る。複数の組換え融合ポリペプチド、組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、または組換え菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株は、それぞれが異なる抗原性ペプチドセットを含むことができる。あるいは、組換え融合ポリペプチド、組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、または組換え菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株の２つまたはそれより多くが同じ、抗原性ペプチドセット（例えば、異なる順序における同じ抗原性ペプチドセット）を含むことができる。組換え融合ポリペプチド、組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、または組換え菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株は、単一のがん関連タンパク質に由来する抗原性ペプチドを含むこともあり、または多数のがん関連タンパク質（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０のがん関連タンパク質）に由来する抗原性ペプチドを含むこともある。加えて、組換え融合ポリペプチド、組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、または組換え菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株の組合せは、任意の数の、異なる抗原性ペプチド、例えば、約１〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、４５〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００、１００〜１２０、１２０〜１４０、１４０〜１６０、１６０〜１８０、１８０〜２００、２００〜２２０、２２０〜２４０、２４０〜２６０、２６０〜２８０、２８０〜３００、３００〜３２０、３２０〜３４０、３４０〜３６０、３６０〜３８０、または３８０〜４００の異なる抗原性ペプチドを含むことができる。異なる抗原性ペプチドの数は、最大約１００の抗原性ペプチドであってもよく、約１００より多くの抗原性ペプチドであってもよく、最大約１０の抗原性ペプチドであってもよく、最大約２０の抗原性ペプチドであってもよく、最大約５０の抗原性ペプチドであってもよい。あるいは、それは、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９もしくは５０の抗原性ペプチドであってもよく、または約５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００の抗原性ペプチドであってもよく、または約５〜１５、５〜２０、５〜２５、１５〜２０、１５〜２５、１５〜３０、１５〜３５、２０〜２５、２０〜３５、２０〜４５、３０〜４５、３０〜５５、４０〜５５、４０〜６５、５０〜６５、５０〜７５、６０〜７５、６０〜８５、７０〜８５、７０〜９５、８０〜９５、８０〜１０５もしくは９５〜１０５の抗原性ペプチドであってもよく、または約１〜５、１〜１０、１〜２０、１〜３０、１〜５０、１〜６０、１〜７０、１〜８０、１〜９０、１〜１００、１〜１１０、１〜１５０、１〜２００、１〜２５０、１〜３００、もしくは１〜５００の抗原性ペプチドであってもよい。
【０３７６】
反復性がん突然変異のいずれの組合せが免疫原性組成物に含まれていてもよい。反復性がん突然変異のそれぞれは、体細胞ミスセンス突然変異であることがあり、または反復性がん突然変異は、他の突然変異も含むことがある。例えば、一部の免疫原性組成物では、反復性がん突然変異の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％は、体細胞ミスセンス突然変異である。一例として、抗原性ペプチドは、がん関連タンパク質において最も多く見られる２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０の反復性がん突然変異の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％を含むことがある。例えば、抗原性ペプチドは、がん関連タンパク質において最も多く見られる２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０の反復性体細胞ミスセンスがん突然変異の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％を含むことがある。別の例として、がん関連タンパク質の突然変異を有するがん患者の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％は、免疫原性組成物中の抗原性ペプチドの組合せに含まれるがん関連タンパク質の反復性がん突然変異を有する。例えば、がん関連タンパク質の体細胞ミスセンス突然変異を有するがん患者の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％は、免疫原性組成物中の抗原性ペプチドの組合せに含まれるがん関連タンパク質の反復性がん突然変異を有する。別の例として、抗原性ペプチドは、特定のタイプのがんにおいて最も多く見られる２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０の反復性がん突然変異または反復性体細胞ミスセンスがん突然変異の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％を含むことがある。別の例として、特定のタイプのがんを有するがん患者の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％は、免疫原性組成物中の抗原性ペプチドの組合せに含まれる反復性がん突然変異を有する。例えば、特定のタイプのがんを有するがん患者の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％は、免疫原性組成物中の抗原性ペプチドの組合せに含まれる反復性がん突然変異を有する。特定の例では、抗原性ペプチドは、同じタイプのがんに由来する少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９もしくは６０の異なる反復性がん突然変異もしくは異なる反復性体細胞ミスセンス突然変異を含み、または抗原性ペプチドは、単一のタイプのがんに由来する２〜８０、１０〜６０、１０〜５０、１０〜４０、もしくは１０〜３０の異なる反復性がん突然変異もしくは異なる反復性体細胞ミスセンス突然変異を含む。例えば、単一のタイプのがんは、非小細胞肺がん、前立腺がん、膵臓がん、膀胱がん、乳がん（例えば、ＥＲ＋乳がん）、子宮がん、卵巣がん、低悪性度神経膠腫、結腸直腸がん（例えば、ＭＳＳ結腸直腸がん）、または頭頸部がんであり得る。
【０３７７】
免疫原性組成物は、アジュバント（例えば、２種もしくはそれより多くのアジュバント）、サイトカイン、ケモカイン、またはそれらの組合せをさらに含むことできる。必要に応じて、免疫原性組成物は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）をさらに含むことができ、ＡＰＣは、対象にとって自己のものであってもよく、または同種異系のものであってもよい。
【０３７８】
用語アジュバントは、抗原に対する免疫応答を増強する化合物または混合物を含む。例えば、アジュバントは、本明細書で開示される免疫原性組成物と組み合わせられたとき、よりいっそう増強されたおよび／または長期の免疫応答をもたらす、免疫応答の非特異的刺激因子、または対象においてデポーの生成を可能にする物質であり得る。アジュバントは、例えば、Ｔｈ１により主として媒介される免疫応答、Ｔｈ１型免疫応答、またはＴｈ１媒介免疫応答に有利に働くことができる。同様に、アジュバントは、抗体媒介応答より細胞媒介免疫応答に有利に働くことができる。あるいは、アジュバントは、抗体媒介応答に有利に働くことができる。一部のアジュバントは、抗原を緩徐に放出することにより免疫応答を増強することができ、その一方で他のアジュバントは、それらの効果を次のメカニズムのいずれかにより媒介することができる：注射部位への細胞浸潤、炎症および輸送を、特に抗原提示細胞（ＡＰＣ）について、増加させるメカニズム、共刺激性シグナルもしくは主要組織適合複合体（ＭＨＣ）発現を上方調節することによりＡＰＣの活性化状態を促進するメカニズム、抗原提示を増強するメカニズム、または間接的効果のためにサイトカイン放出を誘導するメカニズム。
【０３７９】
アジュバントの例としては、サポニンＱＳ２１、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、ＭＰＬ、ＴＬＲアゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ９アゴニスト、Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ（登録商標）、イミキモド、サイトカインまたはそれをコードする核酸、ケモカインまたはそれをコードする核酸、ＩＬ−１２またはそれをコードする核酸、ＩＬ−６またはそれをコードする核酸、およびリポ多糖が挙げられる。好適なアジュバントの別の例は、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ５１である。Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ５１は、天然の代謝可能な油と精製された乳化剤とを含有する。好適なアジュバントの他の例としては、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）またはそれをコードする核酸、およびキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）タンパク質またはそれをコードする核酸が挙げられる。ＧＭ−ＣＳＦは、例えば、酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ベクター内で成長したヒトタンパク質であり得る。ＧＭ−ＣＳＦは、造血前駆細胞、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、樹状細胞およびＴ細胞のクローン拡大および分化を促進する。好適なアジュバントのさらに別の例は、解毒リステリオリシンＯ（ｄｔＬＬＯ）タンパク質である。アジュバントとしての使用に好適なｄｔＬＬＯの一例は、配列番号５８３によりコードされる。配列番号５８３と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一の配列によりコードされるｄｔＬＬＯも、アジュバントとしての使用に好適である。アジュバントの他の例としては、増殖因子もしくはそれをコードする核酸、細胞集団、フロイント不完全アジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）、ミョウバン、インターロイキンもしくはそれをコードする核酸、クイルグリコシド、モノホスホリルリピドＡ、リポソーム、細菌マイトジェン、細菌毒素、または任意の他のタイプの公知のアジュバント（例えば、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれるFundamental  Immunology、第５版（２００３年８月）：William  E.  Paul（編者）、Lippincott  Williams  &  Wilkins  Publishers、第４３章：Vaccines、GJV  Nossalを参照されたい）が挙げられる。
【０３８０】
免疫原性組成物は、１つまたは複数の免疫調節分子をさらに含むことができる。例としては、インターフェロンガンマ、サイトカイン、ケモカイン、およびＴ細胞刺激物質が挙げられる。
【０３８１】
免疫原性組成物は、ワクチンまたは医薬組成物の形態であってもよい。用語「ワクチン」および「医薬組成物」は、置き換え可能であり、対象へのｉｎ  ｖｉｖｏ投与のための薬学的に許容される担体中の免疫原性組成物を指す。ワクチンは、例えば、ペプチドワクチン（例えば、本明細書で開示されるような組換え融合ポリペプチドを含む）であってもよく、ＤＮＡワクチン（例えば、本明細書で開示されるような組換え融合ポリペプチドをコードする核酸を含む）であってもよく、または細胞内に含有され、細胞により送達されるワクチン（例えば、本明細書で開示されるような組換えＬｉｓｔｅｒｉａ）であってもよい。ワクチンは、対象が疾患もしくは状態に罹患しないように、または疾患もしくは状態を発症しないように予防することもあり、および／あるいはワクチンは、疾患または状態を有する対象に対して治療的であることもある。ペプチドワクチンを調製するための方法は周知であり、例えば、ＥＰ１４０８０４８、ＵＳ２００７／０１５４９５３、およびOgasawaraら（１９９２年）Proc.  Natl  Acad  Sci  USA  ８９巻：８９９５〜８９９９頁に記載されており、これらのそれぞれは、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。必要に応じて、ペプチド進化技術を使用して、より高い免疫原性を有する抗原を作出することができる。ペプチド進化技術は周知であり、例えば、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれるＵＳ６，７７３，９００に記載されている。
【０３８２】
「薬学的に許容される担体」は、免疫原性組成物を収容するビヒクルであって、有意な有害効果なく対象に導入することができ、かつ免疫原性組成物に対して有害な効果をもたらさない、ビヒクルを指す。すなわち、「薬学的に許容される」は、安全である処方であって、本明細書で開示される方法での使用のための少なくとも１つの免疫原性組成物の有効量の所望の投与経路に適した送達をもたらす、任意の処方を指す。薬学的に許容される担体またはビヒクルまたは賦形剤は、周知である。好適な薬学的に許容される担体、およびそれらの選択に関与する因子についての記載は、例えば、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれるRemington's  Pharmaceutical  Sciences、第１８版、１９９０年などの、様々な容易に入手できる情報源で見つけられる。そのような担体は、任意の投与経路（例えば、非経口、経腸（例えば、経口）または局所的適用）に好適であり得る。そのような医薬組成物を緩衝することができ、例えば、その場合、ｐＨは、免疫原性組成物の安定性および投与経路に応じてｐＨ４．０〜ｐＨ９．０の範囲の特定の所望の値で維持される。
【０３８３】
好適な薬学的に許容される担体としては、例えば、滅菌水、食塩水、例えば生理食塩水、グルコース、緩衝溶液、例えばリン酸緩衝溶液または重炭酸緩衝溶液、アルコール、アラビアゴム、植物油、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、炭水化物（例えば、ラクトース、アミロースまたはデンプン）、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、白色パラフィン、グリセロール、アルギン酸塩、ヒアルロン酸、コラーゲン、香油、脂肪酸モノグリセリドおよびジグリセリド、ペンタエリトリトール脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ならびにこれらに類するものが挙げられる。医薬組成物またはワクチンは、例えば、免疫原性組成物と有害に反応しない、希釈剤、安定剤（例えば、糖およびアミノ酸）、保存薬、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤、増粘用添加剤、滑沢剤、浸透圧に影響を与えるための塩、緩衝液、ビタミン、着色、着香、芳香物質、およびこれらに類するものを含む、助剤も含むことがある。
【０３８４】
例えば液体製剤のための、薬学的に許容される担体は、水性または非水性の溶液、懸濁液、エマルジョン、または油であり得る。非水性溶媒としては、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、および注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルが挙げられる。水性担体としては、例えば、水、アルコール性／水性の溶液、エマルジョンまたは懸濁液（生理食塩水および緩衝媒体を含む）が挙げられる。油の例としては、石油、動物、植物または合成起源のもの、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱物油、オリーブ油、ヒマワリ油および魚肝油が挙げられる。固体担体／希釈剤としては、例えば、ゴム、デンプン（例えば、トウモロコシデンプン、アルファー化デンプン）、糖（例えば、ラクトース、マンニトール、スクロースもしくはデキストロース）、セルロース系材料（例えば、微結晶性セルロース）、アクリレート（例えば、ポリメチルアクリレート）、炭酸カルシウム、酸化マグネシウム、タルク、またはこれらの混合物が挙げられる。
【０３８５】
必要に応じて、持続放出性または指向放出性医薬組成物またはワクチンを製剤化することができる。これは、例えば、活性化合物が（例えば、マイクロカプセル化、複数のコーティング、およびその他による）段階的分解性コーティングで保護されるリポソームまたは組成物の使用によって、遂行することができる。そのような組成物を即時放出用に製剤化してもよく、または徐放用に製剤化してもよい。組成物をフリーズドライし、得られた凍結乾燥物を（例えば、注射用製品の調製に）使用することも可能である。
【０３８６】
本明細書で開示される免疫原性組成物、医薬組成物またはワクチンは、がんの予防または処置に有効な１つまたは複数のさらなる化合物も含むことができる。例えば、さらなる化合物は、化学療法に有用な化合物、例えば、アムサクリン、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロファラビン、クリサンタスパーゼ、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ゲムシタビン、グリアデルインプラント、ヒドロキシカルバミド、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロイコボリン、リポソームドキソルビシン、リポソームダウノルビシン、ロムスチン、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ）、ペメトレキセド、ペントスタチン、プロカルバジン、ラルチトレキセド、サトラプラチン、ストレプトゾシン、テガフール−ウラシル、テモゾロミド、テニポシド、チオテパ、チオグアニン、トポテカン、トレオスルファン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、またはこれらの組合せを含むことができる。さらなる化合物は、他の生物製剤も含むことができ、そのような生物製剤としては、ＨＥＲ２抗原に対するＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（トラスツズマブ）、ＶＥＧＦに対するＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）（ベバシズマブ）、またはＥＧＦ受容体に対する抗体、例えば、Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）（セツキシマブ）およびＶｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標）（パニツムマブ）が挙げられる。さらなる化合物は、例えば、さらなる免疫療法薬も含むことができる。
【０３８７】
さらなる化合物は、免疫チェックポイント阻害剤アンタゴニスト、例えば、ＰＤ−１シグナル伝達経路阻害剤、ＣＤ−８０／８６およびＣＴＬＡ−４シグナル伝達経路阻害剤、Ｔ細胞膜タンパク質３（ＴＩＭ３）シグナル伝達経路阻害剤、アデノシンＡ２ａ受容体（Ａ２ａＲ）シグナル伝達経路阻害剤、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）シグナル伝達経路阻害剤、キラー免疫グロブリン受容体（ＫＩＲ）シグナル伝達経路阻害剤、ＣＤ４０シグナル伝達経路阻害剤、または任意の他の抗原提示細胞／Ｔ細胞シグナル伝達経路阻害剤も、含むことができる。免疫チェックポイント阻害剤アンタゴニストの例としては、抗ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体もしくはその断片、抗ＰＤ−１抗体もしくはその断片、抗ＣＴＬＡ−４抗体もしくはその断片、または抗Ｂ７−Ｈ４抗体もしくはその断片が挙げられる。さらなる化合物は、Ｔ細胞受容体共刺激分子、抗原提示細胞受容体に結合する共刺激分子、またはＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーと結合する抗体もしくはその機能的断片などの、Ｔ細胞刺激因子も含むことができる。Ｔ細胞受容体共刺激分子は、例えば、ＣＤ２８またはＩＣＯＳを含むことができる。抗原提示細胞受容体に結合する共刺激分子は、例えば、ＣＤ８０受容体、ＣＤ８６受容体、またはＣＤ４６受容体を含むことができる。ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーは、例えば、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体（ＧＩＴＲ）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４受容体）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７受容体）、またはＴＮＦＲ２５を含むことができる。例えば、ＷＯ２０１６１００９２９、ＷＯ２０１６０１１３６２、およびＷＯ２０１６０１１３５７を参照されたく、これらのそれぞれは、その全体があらゆる目的で参照により組み込まれる。
【０３８８】
ＶＩＩＩ．治療方法
本明細書で開示される組換え融合ポリペプチド、組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、組換え菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物、およびワクチンは、様々な方法に使用することができる。それらは、例えば、対象において抗腫瘍関連抗原免疫応答を誘導する方法に、対象において抗腫瘍もしくは抗がん免疫応答を誘導する方法に、対象における腫瘍もしくはがんを処置する方法に、対象における腫瘍もしくはがんを予防する方法に、または対象を腫瘍もしくはがんから保護する方法に使用することができる。それらは、エフェクターＴ細胞が腫瘍関連抗原に標的化される、対象の脾臓および腫瘍におけるエフェクターＴ細胞の調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対する比を上昇させる方法に使用することもできる。それらは、対象における腫瘍関連抗原Ｔ細胞を増加させるための方法、腫瘍もしくはがんを有する対象の生存期間を延長するための方法、対象におけるがんの開始を遅延させるための方法、または対象における腫瘍もしくは転移サイズを低減させるための方法に使用することもできる。
【０３８９】
対象において抗腫瘍関連抗原免疫応答を誘導する方法は、例えば、対象に、本明細書で開示される組換え融合ポリペプチド、組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、組換え菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチン（例えば、腫瘍関連抗原を含む組換え融合ポリペプチドを含むもの、または組換え融合ポリペプチドをコードする核酸を含むもの）を投与するステップを含むことができる。それによって抗腫瘍関連抗原免疫応答を対象において誘導することができる。例えば、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株の場合、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、融合ポリペプチドを発現することによって対象において免疫応答を惹起することができる。免疫応答は、例えば、Ｔ細胞応答、例えば、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞応答、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答、またはＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答を含むことができる。そのような方法は、対象の脾臓および腫瘍微小環境におけるエフェクターＴ細胞の調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対する比を上昇させて、対象においてより顕著な抗腫瘍応答を可能ならしめることもできる。
【０３９０】
対象において抗腫瘍または抗がん免疫応答を誘導する方法は、例えば、本明細書で開示される組換え融合ポリペプチド、組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、組換え菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチンを対象に投与するステップを含むことができる。それによって抗腫瘍または抗がん免疫応答を対象において誘導することができる。例えば、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株の場合、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、融合ポリペプチドを発現することによって対象において抗腫瘍または抗がん応答を惹起することができる。
【０３９１】
対象における腫瘍またはがんを処置する方法（例えば、腫瘍またはがんが、１つもしくは複数の腫瘍関連抗原を発現するか、または１つもしくは複数の反復性がん突然変異を有する）は、例えば、対象に、本明細書で開示される組換え融合ポリペプチド、組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、組換え菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチンを投与するステップを含むことができる。対象は、その後、１つもしくは複数の腫瘍関連抗原または１つもしくは複数の反復性がん突然変異を発現する腫瘍またはがんに対する免疫応答を開始し、それによって対象における腫瘍またはがんを処置することができる。
【０３９２】
対象における腫瘍もしくはがんを予防するまたは対象が腫瘍もしくはがんを発症しないように保護する方法（例えば、腫瘍またはがんが、１つもしくは複数の腫瘍関連抗原または１つもしくは複数の反復性がん突然変異の発現と関連する）は、例えば、対象に、本明細書で開示される組換え融合ポリペプチド、組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、組換え菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチンを投与するステップを含むことができる。対象は、その後、１つもしくは複数の腫瘍関連抗原または１つもしくは複数の反復性がん突然変異に対する免疫応答を開始し、それによって腫瘍もしくはがんを予防することまたは対象が腫瘍もしくはがんを発症しないように保護することができる。
【０３９３】
上記方法の一部では、２つまたはそれより多く（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれより多く）の組換え融合ポリペプチド、組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、組換え菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチンが、投与される。例えば、第１のがん関連タンパク質に由来する反復性がん突然変異を含む抗原性ペプチドを含む第１のＬｉｓｔｅｒｉａ株を投与することができ、第２のがん関連タンパク質に由来する反復性がん突然変異を含む抗原性ペプチドを含む第２のＬｉｓｔｅｒｉａ株を投与することができる。複数の組換え融合ポリペプチド、組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、組換え菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチンを、任意の順序もしくは組合せで逐次的に投与することができ、または任意の組合せで同時に投与することができる。一例として、４つの異なるＬｉｓｔｅｒｉａ株を投与することになる場合、それらを逐次的に投与することができ、それらを同時に投与することができ、またはそれらを任意の組合せで投与すること（例えば、第１の株と第２の株を同時に投与し、その後、第３の株と第４の株を同時に投与すること）ができる。必要に応じて、逐次投与の場合、組成物を同じ免疫応答中に、好ましくは、互いに０〜１０または３〜７日以内に投与することができる。複数の組換え融合ポリペプチド、組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、組換え菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチンは、それぞれが異なる抗原性ペプチドセットを含むことができる。あるいは、２つまたはそれより多くが、同じ抗原性ペプチドセット（例えば、異なる順序における同じ抗原性ペプチドセット）を含むことができる。複数の組換え融合ポリペプチド、組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、組換え菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチンは、２つまたはそれより多くのがん関連タンパク質（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０のがん関連タンパク質）に由来する抗原性ペプチドを含むことができる。加えて、複数の組換え融合ポリペプチド、組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、組換え菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチンの組合せは、約５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、４５〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００、１００〜１２０、１２０〜１４０、１４０〜１６０、１６０〜１８０、１８０〜２００、２００〜２２０、２２０〜２４０、２４０〜２６０、２６０〜２８０、２８０〜３００、３００〜３２０、３２０〜３４０、３４０〜３６０、３６０〜３８０、または３８０〜４００の異なる抗原性ペプチドを含むことができる。
【０３９４】
上記方法のいずれにおいても、反復性がん突然変異のいずれの組合せが、投与される組換え融合ポリペプチド、組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、組換え菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチンに含まれていてもよい。反復性がん突然変異のそれぞれは、体細胞ミスセンス突然変異であることがあり、または反復性がん突然変異は、他の突然変異も含むことがある。例えば、一部の方法では、反復性がん突然変異の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％は、体細胞ミスセンス突然変異である。一例として、抗原性ペプチドは、がん関連タンパク質において最も多く見られる２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０の反復性がん突然変異の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％を含むことがある。例えば、抗原性ペプチドは、がん関連タンパク質において最も多く見られる２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０の反復性体細胞ミスセンスがん突然変異の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％を含むことがある。別の例として、がん関連タンパク質の突然変異を有するがん患者の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％は、投与される抗原性ペプチドの組合せに含まれるがん関連タンパク質の反復性がん突然変異を有する。例えば、がん関連タンパク質の体細胞ミスセンス突然変異を有するがん患者の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％は、投与される抗原性ペプチドの組合せに含まれるがん関連タンパク質の反復性がん突然変異を有する。別の例として、抗原性ペプチドは、特定のタイプのがんにおいて最も多く見られる２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０の反復性がん突然変異または反復性体細胞ミスセンスがん突然変異の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％を含むことがある。別の例として、特定のタイプのがんを有するがん患者の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％は、投与される抗原性ペプチドの組合せに含まれる反復性がん突然変異を有する。例えば、特定のタイプのがんを有するがん患者の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％は、投与される抗原性ペプチドの組合せに含まれる反復性がん突然変異を有する。特定の例では、抗原性ペプチドは、同じタイプのがんに由来する少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９もしくは６０の異なる反復性がん突然変異もしくは異なる反復性体細胞ミスセンス突然変異を含み、または抗原性ペプチドは、単一のタイプのがんに由来する２〜８０、１０〜６０、１０〜５０、１０〜４０、もしくは１０〜３０の異なる反復性がん突然変異もしくは異なる反復性体細胞ミスセンス突然変異を含む。例えば、単一のタイプのがんは、非小細胞肺がん、前立腺がん、膵臓がん、膀胱がん、乳がん（例えば、ＥＲ＋乳がん）、子宮がん、卵巣がん、低悪性度神経膠腫、結腸直腸がん（例えば、ＭＳＳ結腸直腸がん）、または頭頸部がんであり得る。
【０３９５】
上記方法のいずれも、投与するステップの前に１つまたは複数の反復性がん突然変異について対象をスクリーニングし、１つまたは複数の反復性がん突然変異を同定するステップ、そしてその後、対象において同定された１つまたは複数の反復性がん突然変異を含む、抗原性ペプチドを含む組換え融合ポリペプチド、組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、組換え菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチンを、対象に投与するステップをさらに含むことができる。あるいは、対象が、１つまたは複数のがん関連タンパク質の反復性がん突然変異に関連するがんを有する場合、方法は、がんに関連する反復性がん突然変異を含む組換え融合ポリペプチド、組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、組換え菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチンを対象に投与するステップを含むことができる。例えば、特定のがん関連タンパク質の突然変異が、特定のタイプのがんのすべての事例の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％に存在することもあり、またはがん関連タンパク質中の特定の残基（すなわち、ホットスポット（単数））もしくは残基のセット（すなわち、ホットスポット（複数））の突然変異が、特定のタイプのがんのすべての事例の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％に存在することもある。同様に、特定の反復性がん突然変異が、特定のタイプのがんのすべての事例（例えば、特定のタイプのがんを有するすべての対象）の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％に存在することもある。同様に、反復性がん突然変異の特定のセットが、特定のタイプのがんのすべての事例（例えば、特定のタイプのがんを有するすべての対象）の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％に存在することもある。
【０３９６】
がんは、典型的に非調節細胞成長および増殖によって特徴付けられる、哺乳動物における生理状態である。がんは、造血器悪性腫瘍または固形腫瘍（すなわち、前がん病変（pre-cancerous  legions）を含む、過度の細胞成長または増殖の結果として生じる細胞塊）であることもある。転移性がんは、体内の最初に開始した位置から別の位置に拡散したがんを指す。転移性がん細胞により形成される腫瘍は、転移性腫瘍または転移と呼ばれ、転移は、がん細胞が他の体部に拡散するプロセスを指すためにも使用される用語である。一般に、転移性がんは、元の、または原発性の、がんと同じ名称および同じタイプのがん細胞を有する。固形腫瘍の例としては、黒色腫、癌腫、芽腫および肉腫が挙げられる。血液学的悪性腫瘍は、例えば、白血病またはリンパ系悪性腫瘍、例えばリンパ腫を含む。がんの例示的なカテゴリーには、脳がん、乳がん、消化器がん、泌尿生殖器がん、婦人科がん、頭頸部がん、ヘムがん、皮膚がんおよび胸部がんカテゴリーが含まれる。脳悪性腫瘍は、例えば、神経膠芽腫、高悪性度橋神経膠腫、低悪性度神経膠腫、髄芽腫、神経芽腫、および毛様細胞性星細胞腫を含む。消化器がんは、例えば、結腸直腸がん、胆嚢がん、肝細胞がん、膵臓がん、ＰＮＥＴ、胃のがんおよび食道がんを含む。尿生殖器がんは、例えば、副腎皮質がん、膀胱がん、嫌色素性腎臓がん、腎（明細胞）がん、腎（乳頭）がん、ラブドイドがん、および前立腺がんを含む。婦人科がんは、例えば、子宮癌肉腫、子宮内膜がん、漿液性卵巣がん、および子宮頸がんを含む。頭頸部がんは、例えば、甲状腺がん、上咽頭がん、頭頸部がん、および腺様嚢胞がんを含む。ヘムがんは、例えば、多発性骨髄腫、脊髄形成異常、マントル細胞リンパ腫、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、非リンパ腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を含む。皮膚がんは、例えば、皮膚黒色腫および扁平上皮癌を含む。胸部がんは、例えば、扁平上皮肺がん、小細胞肺がん、および肺腺癌を含む。
【０３９７】
そのようながんのより詳細な例としては、扁平上皮がんまたは癌（例えば、口腔扁平上皮癌）、骨髄腫、口腔がん、若年性鼻咽喉血管線維腫、神経内分泌腫瘍、肺がん、腹膜がん、肝細胞がん、胃のがんまたは胃がん（消化器がんを含む）、膵臓がん、神経膠腫、神経膠芽腫、グリア系腫瘍、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、ヘパトーマ、肝細胞癌、乳がん、トリプルネガティブ乳がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がんまたは子宮がんもしくは癌、唾液腺癌、腎臓または腎がん（例えば、腎細胞癌）、前立腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、肝癌、肛門癌、陰茎癌、線維肉腫、胆嚢がん、骨肉腫、中皮腫、および頭頸部がんが挙げられる。がんはまた、脳がんまたは別のタイプのＣＮＳもしくは頭蓋内腫瘍であってもよい。例えば、対象は、星細胞系腫瘍（例えば、星細胞腫、未分化星細胞腫、神経膠芽腫、毛様細胞性星細胞腫、上衣下巨細胞性星細胞腫、多形黄色星細胞腫）、乏突起膠細胞系腫瘍（例えば、乏突起神経膠腫、退形成性乏突起神経膠腫）、上衣細胞腫瘍（例えば、上衣腫、退形成性上衣腫、粘液乳頭状上衣腫、上衣下腫）、混合型神経膠腫（例えば、混合型乏突起星細胞腫、退形成性乏突起星細胞腫）、原因不明の神経上皮腫瘍（例えば、極性海綿芽腫、星状芽細胞腫、大脳神経膠腫症）、脈絡叢の腫瘍（例えば、脈絡叢乳頭腫、脈絡叢癌）、神経細胞性もしくは混合神経細胞膠細胞性腫瘍（例えば、神経節細胞腫、小脳異形成性神経節細胞腫、神経節膠腫、退形成性神経節膠腫、線維形成性乳児神経節腫、中枢性神経細胞腫、胚芽異形成性神経上皮腫瘍、嗅神経芽腫）、松果体実質腫瘍（例えば、松果体細胞腫、松果体芽腫、松果体細胞腫／松果体芽腫混合型）、または混合神経細胞性もしくは神経芽細胞性要素を有する腫瘍（例えば、髄上皮腫、膠芽腫、神経芽腫、網膜芽腫、上衣芽腫）を有し得る。がんの他の例としては、低悪性度神経膠腫、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、エストロゲン受容体陽性（ＥＲ＋）乳がん、およびＤＮＡミスマッチ修復欠損がんまたは腫瘍が挙げられる。がんは、エストロゲンの受容体を有する場合、エストロゲン受容体陽性と呼ばれる。がんの別の例は、マイクロサテライト安定性（ＭＳＳ）結腸直腸がんである。
【０３９８】
用語「処置する」または「処置すること」は、その目的が標的腫瘍またはがんを予防または緩和することである、治療的処置と予防的もしくは予防対策（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ  ｏｒ  ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ  ｍｅａｓｕｒｅｓ）の両方を指す。処置することは、腫瘍もしくはがんに直接影響を及ぼすこと、もしくはそれを直接治癒させること、抑制すること、阻害すること、予防すること、その重症度を低下させること、その開始を遅延させること、その進行を緩徐化すること、その進行を安定させること、その寛解を誘導すること、その転移を予防するもしくは遅延させること、それに関連する症状を軽減／改善することの１つもしくは複数、またはこれらの組合せを含むことができる。例えば、処置することは、予想生存期間を延長することを含むこともあり、または腫瘍もしくは転移サイズを減少させることを含むこともある。効果（例えば、抑制する、阻害する、予防する、その重症度を低下させる、その開始を遅延させる、その進行を緩徐化する、その進行を安定させる、その寛解を誘導する、その転移を予防するまたは遅延させる、その症状を軽減／改善する、およびその他の効果）は、処置を受けていないまたはプラセボ処置を受けている対照対象と比較してのものであり得る。用語「処置する」または「処置すること」は、腫瘍またはがんを有する対象について（例えば、処置を受けていないまたはプラセボ処置を受けている対照対象と比較して）生存の可能性パーセントを増すことまたは予想生存期間を延長することを指すこともできる。一例では、「処置すること」は、（例えば、処置を受けていないまたはプラセボ処置を受けている対照対象と比較して）進行を遅延させること、寛解を促進すること、寛解を誘導すること、寛解を増加させること、回復を加速させること、代替療法の有効性を増大させること、代替療法に対する抵抗性を低下させること、またはこれらの組合せを指す。用語「予防すること」または「遅らせること」は、例えば、症状の開始を遅延させること、腫瘍もしくはがんの再発を予防すること、再発エピソードの数もしくは頻度を減少させること、症候性エピソード間の潜伏期間を延長すること、腫瘍もしくはがんの転移を予防すること、またはこれらの組合せを指すことができる。用語「抑制すること」または「阻害すること」は、例えば、症状の重症度を低下させること、急性エピソードの重症度を低下させること、症状の数を低減させること、疾患関連症状の発生率を低下させること、症状の潜伏期間を短縮すること、症状を改善すること、二次症状を軽減すること、二次感染を低減させること、患者生存期間を延長すること、またはこれらの組合せを指すことができる。
【０３９９】
用語「対象」は、腫瘍もしくはがんの治療を必要としている、または腫瘍もしくはがんを発症しやすい、哺乳動物（例えば、ヒト）を指す。用語対象は、予防的処置または治療的処理のいずれかを受ける哺乳動物（例えば、ヒト）も指す。対象は、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラット、マウス、非ヒト哺乳動物、およびヒトを含むことができる。用語「対象」は、あらゆる点で健常であり、がんもしくは腫瘍を有さないか、またはがんもしくは腫瘍の徴候を示さない個体を、必ずしも除外するとは限らない。
【０４００】
個体は、リスク因子（例えば、遺伝的、生化学的、家族歴、および状況的曝露）であって、そのリスク因子を有する個体が腫瘍またはがんを発症するリスクを、そのリスク因子を有さない個体より統計学的に有意に高くすることが公知のリスク因子を少なくとも１つ対象が有する場合、腫瘍またはがんを発症するリスクが高い。
【０４０１】
「症状」または「徴候」は、医師によって観察されるような疾患の客観的証拠、または対象によって知覚されるような疾患の主観的証拠、例えば歩行の変化を指す。症状または徴候は、疾患の何らかの所見であり得る。症状は、初発症状であることもあり、二次症状であることもある。用語「初発」は、特定の疾患または障害（例えば、腫瘍またはがん）の直接的結果である症状を指し、その一方で用語「二次」は、初発の原因に由来するまたはその結果として生じる症状を指す。本明細書で開示される組換え融合ポリペプチド、組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、免疫原性組成物、医薬組成物、およびワクチンは、初発もしくは二次症状または二次性合併症を処置することができる。
【０４０２】
組換え融合ポリペプチド、組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、組換え菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチンは、腫瘍もしくはがんの発生を遅延させる、その重症度を低下させる、そのさらなる悪化を阻害する、および／またはその少なくとも１つの徴候もしくは症状を改善する、投薬量、投与経路および投与頻度を意味する、有効な投与計画で投与される。あるいは、組換え融合ポリペプチド、組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、組換え菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチンは、組換え融合ポリペプチド（または核酸によりコードされる組換え融合ポリペプチド）、組換え菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチン中の異種抗原に対する免疫応答を誘導する、あるいは組換え菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株の場合、その菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株自体に対する免疫応答を誘導する、投薬量、投与経路および投与頻度を意味する、有効な投与計画で投与される。対象が既に腫瘍またはがんに罹患している場合、その投与計画を治療的に有効な投与計画と呼ぶことができる。対象が、一般集団と比較して腫瘍またはがんを発症するリスクが高いがまだ症状を経験していない場合、その投与計画を予防的に有効な投与計画と呼ぶことができる。一部の事例では、個々の患者において、歴史的対照と比較して、または同じ患者における過去の経験と比較して、治療的または予防的有効性を観察することができる。他の事例では、前臨床または臨床試験で、処置を受けた患者の集団において、未処置の患者の対照集団と比較して治療的または予防的有効性を実証することができる。例えば、処置を受けた個々の患者が、本明細書に記載されている方法による処置を受けていない比較対象患者の対照集団における平均成績より好ましい成績を達成した場合、あるいはより好ましい成績が、処置を受けた患者において、対照臨床試験（例えば、第ＩＩ相、第ＩＩ／ＩＩＩ相または第ＩＩＩ相試験）で、ｐ＜０．０５もしくは０．０１またはさらには０．００１レベルで実証された場合、投与計画を治療的にまたは予防的に有効と見なすことができる。
【０４０３】
組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株についての例示的投薬量は、例えば、１×１０６〜１×１０７ＣＦＵ、１×１０７〜１×１０８ＣＦＵ、１×１０８〜３．３１×１０１０ＣＦＵ、１×１０９〜３．３１×１０１０ＣＦＵ、５〜５００×１０８ＣＦＵ、７〜５００×１０８ＣＦＵ、１０〜５００×１０８ＣＦＵ、２０〜５００×１０８ＣＦＵ、３０〜５００×１０８ＣＦＵ、５０〜５００×１０８ＣＦＵ、７０〜５００×１０８ＣＦＵ、１００〜５００×１０８ＣＦＵ、１５０〜５００×１０８ＣＦＵ、５〜３００×１０８ＣＦＵ、５〜２００×１０８ＣＦＵ、５〜１５×１０８ＣＦＵ、５〜１００×１０８ＣＦＵ、５〜７０×１０８ＣＦＵ、５〜５０×１０８ＣＦＵ、５〜３０×１０８ＣＦＵ、５〜２０×１０８ＣＦＵ、１〜３０×１０９ＣＦＵ、１〜２０×１０９ＣＦＵ、２〜３０×１０９ＣＦＵ、１〜１０×１０９ＣＦＵ、２〜１０×１０９ＣＦＵ、３〜１０×１０９ＣＦＵ、２〜７×１０９ＣＦＵ、２〜５×１０９ＣＦＵ、および３〜５×１０９ＣＦＵである。組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株についての他の例示的投薬量は、例えば、１×１０７生物、１．５×１０７生物、２×１０８生物、３×１０７生物、４×１０７生物、５×１０７生物、６×１０７生物、７×１０７生物、８×１０７生物、１０×１０７生物、１．５×１０８生物、２×１０８生物、２．５×１０８生物、３×１０８生物、３．３×１０８生物、４×１０８生物、５×１０８生物、１×１０９生物、１．５×１０９生物、２×１０９生物、３×１０９生物、４×１０９生物、５×１０９生物、６×１０９生物、７×１０９生物、８×１０９生物、１０×１０９生物、１．５×１０１０生物、２×１０１０生物、２．５×１０１０生物、３×１０１０生物、３．３×１０１０生物、４×１０１０生物、および５×１０１０生物である。投薬量は、患者の状態、および以前の処置がもしあれば、その処置が予防的であろうと治療的であろうと、その以前の処置に対する応答、ならびに他の要因に依存し得る。
【０４０４】
投与は、いずれの好適な手段による投与であってもよい。例えば、投与は、非経口、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、髄腔内、脳室内、腹腔内、局所、鼻腔内、筋肉内、眼内、直腸内、結膜、経皮、皮内、経膣、直腸、腫瘍内、側癌、経粘膜、血管内、心室内、吸入（エアロゾル）、鼻吸引（スプレー）、舌下、エアロゾル、坐剤、またはこれらの組合せであり得る。吸入による鼻腔内投与または適用には、適切な担体の存在下で混合され、エアロゾル化または霧化される、組換え融合ポリペプチド、組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、組換え菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチンの溶液または懸濁液が、好適である。そのようなエアロゾルは、本明細書に記載されているいずれの組換え融合ポリペプチド、組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、組換え菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチンを含んでもよい。投与はまた、坐剤（例えば、肛門坐剤または尿道坐剤）の形態であってもよく、皮下埋込み用の（例えば、ある期間にわたって制御放出をもたらす）ペレットの形態であってもよく、またはカプセルの形態であってもよい。投与はまた、腫瘍部位へのまたは腫瘍への注射による投与であってもよい。投与レジメンは、処置されることになる腫瘍またはがんの正確な性質およびタイプ、腫瘍またはがんの重症度、対象の年齢および全身の健康状態、対象の体重、個々の対象の応答ならびにこれらに類するものなどの要因に基づいて、容易に決定することができる。
【０４０５】
投与頻度は、数ある要因の中でも特に、対象における組換え融合ポリペプチド、組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、組換え菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物、もしくはワクチンの半減期、対象の状態、および投与経路に依存し得る。頻度は、例えば、対象の状態の変化または処置されることになる腫瘍もしくはがんの進行に応じて、毎日、週１回、月１回、年４回、または不定期間隔であり得る。処置コースは、対象の状態および他の要因に依存し得る。例えば、処置コースは、数週間、数カ月、または数年（例えば、２年以下）であり得る。例えば、腫瘍退縮、または腫瘍成長の抑制を果たすために、初回処置コースの直後にまたは数日、数週間もしくは数カ月の時間を置いた後に反復投与（用量）を始めてもよい。診断方法、例えばイメージング技術、血清腫瘍マーカー、生検または腫瘍関連症状の存在、非存在もしくは改善の分析を含む、任意の公知の技術によって、評定を決定することができる。具体例として、組換え融合ポリペプチド、組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、組換え菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチンを、２年以下にわたって３週間ごとに投与することができる。一例では、本明細書で開示される組換え融合ポリペプチド、組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、組換え菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチンは、エフェクターＴ細胞対調節性Ｔ細胞比を上昇させ、より強力な抗腫瘍免疫応答を生じさせるために、漸増用量で投与される。抗腫瘍免疫応答は、例えば、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、および細胞免疫応答を増強することが公知の他のサイトカインを含む、サイトカインを対象に提供することにより、さらに強化することができる。例えば、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれるＵＳ６，９９１，７８５を参照されたい。
【０４０６】
一部の方法は、さらなる組換え融合ポリペプチド、組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、組換え菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチンで、対象を「ブーストする」ステップ、あるいは組換え融合ポリペプチド、組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、組換え菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチンを複数回投与するステップをさらに含むことができる。「ブーストすること」は、対象にさらなる用量を投与することを指す。例えば、一部の方法では、２回のブースト（または合計３回の接種）が投与され、３回のブーストが投与され、４回のブーストが投与され、５回のブーストが投与され、または６回もしくはそれより多くのブーストが投与される。投与される投薬数は、例えば、処置に対する腫瘍またはがんの応答に依存し得る。
【０４０７】
必要に応じて、ブースター接種に使用される組換え融合ポリペプチド、組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、組換え菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチンは、最初の「プライミング」接種に使用される組換え融合ポリペプチド、組換え菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチンと同じである。あるいは、ブースター組換え融合ポリペプチド、組換え菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチンは、プライミング用組換え融合ポリペプチド、組換え菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチンとは異なる。必要に応じて、同じ投薬量が、プライミングおよびブースト接種に使用される。あるいは、より多い投薬量がブースターに使用され、またはより少ない投薬量がブースターに使用される。プライミング接種とブースト接種間の期間は、実験に基づいて決定することができる。例えば、プライミング接種とブースト接種間の期間は、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６〜８週間、または８〜１０週間であり得る。
【０４０８】
異種プライム・ブースト戦略は、非常に多くの病原体に対する免疫応答および保護の増強に効果をあげている。例えば、Schneiderら（１９９９年）Immunol.  Rev.１７０巻：２９〜３８頁；Robinson（２００２年）Nat.  Rev.  Immunol.２巻：２３９〜２５０頁；Gonzaloら（２００２年）Vaccine  ２０巻：１２２６〜１２３１頁；およびTanghe（２００１年）Infect.  Immun.６９巻：３０４１〜３０４７頁を参照されたく、これらのそれぞれは、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。プライム注射とブースト注射で異なる形態の抗原を提供することで、抗原に対する免疫応答を最大化することができる。ＤＮＡワクチンでのプライミング、続いてのアジュバント中のタンパク質でのブーストまたはＤＮＡをコードする抗原のウイルスベクター送達によるブーストは、抗原特異的抗体およびＣＤ４＋Ｔ細胞応答またはＣＤ８＋Ｔ細胞応答を向上させる１つの有効な方法である。例えば、Shiverら（２００２年）Nature  ４１５巻：３３１〜３３５頁；Gilbertら（２００２年）Vaccine  ２０巻：１０３９〜１０４５頁；Billaut-Mulotら（２０００年）Vaccine  １９巻：９５〜１０２頁；およびSinら（１９９９年）DNA  Cell  Biol.１８巻：７７１〜７７９頁を参照されたく、これらのそれぞれは、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。一例として、対象に、ＤＮＡプライムのワクチン接種を施し、その後、抗原を発現するアデノウイルスベクターでのブーストのワクチン接種を施す場合、抗原をコードするＤＮＡにＣＲＬ１００５ポロクサマー（１２ｋＤａ、５％ＰＯＥ）を加えることで、Ｔ細胞応答を増強することができる。例えば、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれるShiverら（２００２年）Nature  ４１５巻：３３１〜３３５頁を参照されたい。別の例として、抗原の免疫原性部分および抗原の免疫原性部分を含むタンパク質をコードする、ベクター構築物を投与することができる。例えば、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２００２／０１６５１７２を参照されたい。同様に、核酸ワクチン接種に対する免疫応答を、目的のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの（例えば、同じ免疫応答中の、好ましくは、互いに０〜１０または３〜７日以内の）同時投与によって増強することができる。例えば、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれるＵＳ６，５００，４３２を参照されたい。
【０４０９】
本明細書で開示される治療方法は、がんの予防または処置に有効な１つまたは複数のさらなる化合物を投与するステップも含むことができる。例えば、さらなる化合物は、化学療法に有用な化合物、例えば、アムサクリン、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロファラビン、クリサンタスパーゼ、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ゲムシタビン、グリアデルインプラント、ヒドロキシカルバミド、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロイコボリン、リポソームドキソルビシン、リポソームダウノルビシン、ロムスチン、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ）、ペメトレキセド、ペントスタチン、プロカルバジン、ラルチトレキセド、サトラプラチン、ストレプトゾシン、テガフール−ウラシル、テモゾロミド、テニポシド、チオテパ、チオグアニン、トポテカン、トレオスルファン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、またはこれらの組合せを含むことができる。あるいは、さらなる化合物は、他の生物製剤も含むことができ、そのような生物製剤としては、ＨＥＲ２抗原に対するＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（トラスツズマブ）、ＶＥＧＦに対するＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）（ベバシズマブ）、またはＥＧＦ受容体に対する抗体、例えば、Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）（セツキシマブ）およびＶｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標）（パニツムマブ）が挙げられる。あるいは、さらなる化合物は、他の免疫療法薬を含むことができる。あるいは、さらなる化合物は、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）経路阻害剤、例えば、１−メチルトリプトファン（１ＭＴ）、１−メチルトリプトファン（１ＭＴ）、ネクロスタチン−１、ピリドキサールイソニコチノイルヒドラゾン、エブセレン、５−メチルインドール−３−カルボキシアルデヒド、ＣＡＹ１０５８１、抗ＩＤＯ抗体、または小分子ＩＤＯ阻害剤であってもよい。ＩＤＯ阻害は、化学療法剤の有効性を増強することができる。本明細書で開示される治療方法は、放射線、幹細胞処置、外科手術または任意の他の処置と組み合わせることもできる。
【０４１０】
そのようなさらなる化合物または処置は、本明細書で開示される組換え融合ポリペプチド、組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、組換え菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチンの投与に先行してもよく、本明細書で開示される組換え融合ポリペプチド、組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、組換え菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチンの投与の後に続いてもよく、あるいは本明細書で開示される組換え融合ポリペプチド、組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、組換え菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチンの投与と同時であってもよい。
【０４１１】
標的免疫調節療法は、例えば、４−１ＢＢ、ＯＸ４０およびＧＩＴＲ（グルココルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体関連）を含む腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーを標的とするアゴニスト抗体の使用による、共刺激受容体の活性化に主眼をおいている。ＧＩＴＲのモジュレーションは、抗腫瘍設定でもワクチン設定でも可能性を実証してきた。アゴニスト抗体の別の標的は、Ｔ細胞活性化のための共刺激シグナル分子である。共刺激シグナル分子の標的化は、Ｔ細胞の活性化増強およびより強力な免疫応答の促進につながり得る。共刺激は、チェックポイント阻害からの阻害的影響の防止、および抗原特異的Ｔ細胞増殖の増加にも役立ち得る。
【０４１２】
Ｌｉｓｔｅｒｉａに基づく免疫療法は、腫瘍に浸潤して腫瘍を破壊する腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の新規生成を誘導することにより、ならびに腫瘍微小環境における免疫抑制性調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）および骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）の数および活性を低下させることにより作用する。Ｔ細胞共阻害または共刺激受容体（例えば、チェックポイント阻害剤ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ３ならびに共刺激因子ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＧＩＴＲおよびＣＤ４０）に対する抗体（またはその機能的断片）には、Ｌｉｓｔｅｒｉａに基づく免疫療法との相乗作用があり得る。
【０４１３】
したがって、一部の方法は、ＰＤ−１シグナル伝達経路阻害剤、ＣＤ−８０／８６およびＣＴＬＡ−４シグナル伝達経路阻害剤、Ｔ細胞膜タンパク質３（ＴＩＭ３）シグナル伝達経路阻害剤、アデノシンＡ２ａ受容体（Ａ２ａＲ）シグナル伝達経路阻害剤、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）シグナル伝達経路阻害剤、キラー免疫グロブリン受容体（ＫＩＲ）シグナル伝達経路阻害剤、ＣＤ４０シグナル伝達経路阻害剤または任意の他の抗原提示細胞／Ｔ細胞シグナル伝達経路阻害剤などの、免疫チェックポイント阻害剤アンタゴニストを含む組成物を投与するステップをさらに含むことができる。免疫チェックポイント阻害剤アンタゴニストの例としては、抗ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体もしくはその断片、抗ＰＤ−１抗体もしくはその断片、抗ＣＴＬＡ−４抗体もしくはその断片、または抗Ｂ７−Ｈ４抗体もしくはその断片が挙げられる。例えば、抗ＰＤ−１抗体を、対象に、２週間ごとに５〜１０ｍｇ／ｋｇ、３週間ごとに５〜１０ｍｇ／ｋｇ、３週間ごとに１〜２ｍｇ／ｋｇ、毎週１〜１０ｍｇ／ｋｇ、２週間ごとに１〜１０ｍｇ／ｋｇ、３週間ごとに１〜１０ｍｇ／ｋｇ、または４週間ごとに１〜１０ｍｇ／ｋｇで投与することができる。
【０４１４】
同様に、一部の方法は、Ｔ細胞受容体共刺激分子、抗原提示細胞受容体に結合する共刺激分子、またはＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーと結合する抗体もしくはその機能的断片などの、Ｔ細胞刺激因子を投与するステップをさらに含むことができる。Ｔ細胞受容体共刺激分子は、例えば、ＣＤ２８またはＩＣＯＳを含むことができる。抗原提示細胞受容体に結合する共刺激分子は、例えば、ＣＤ８０受容体、ＣＤ８６受容体、またはＣＤ４６受容体を含むことができる。ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーは、例えば、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体（ＧＩＴＲ）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４受容体）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７受容体）、またはＴＮＦＲ２５を含むことができる。
【０４１５】
例えば、一部の方法は、Ｔ細胞受容体共刺激分子と結合する抗体もしくはその機能的断片、または共刺激分子に結合する抗原提示細胞受容体と結合する抗体もしくはその機能的断片を含む組成物の有効量を投与するステップをさらに含むことができる。抗体は、例えば、抗ＴＮＦ受容体抗体もしくはその抗原結合性断片（例えば、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーグルココルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体（ＧＩＴＲ）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４受容体）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７受容体）、またはＴＮＦＲ２５）、抗ＯＸ４０抗体もしくはその抗原結合性断片、または抗ＧＩＴＲ抗体もしくはその抗原結合性断片であり得る。あるいは、他のアゴニスト分子（例えば、ＧＩＴＲＬ、ＧＩＴＲＬの活性断片、ＧＩＴＲＬを含有する融合タンパク質、ＧＩＴＲＬの活性断片を含有する融合タンパク質、抗原提示細胞（ＡＰＣ）／Ｔ細胞アゴニスト、ＣＤ１３４またはそのリガンドもしくは断片、ＣＤ１３７またはそのリガンドもしくは断片、あるいは誘導性Ｔ細胞共刺激（ＩＣＯＳ）またはそのリガンドもしくは断片、あるいはアゴニスト小分子）を投与することができる。
【０４１６】
具体例では、一部の方法は、抗ＣＴＬＡ−４抗体もしくはその機能的断片および／または抗ＣＤ１３７抗体もしくはその機能的断片を投与するステップをさらに含むことができる。例えば、抗ＣＴＬＡ−４抗体もしくはその機能的断片または抗ＣＤ１３７抗体もしくはその機能的断片を、組換え融合ポリペプチド、組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、組換え菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチンの初回用量の約７２時間後に、あるいは組換え融合ポリペプチド、組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、組換え菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチンの初回用量の約４８時間後に投与することができる。抗ＣＴＬＡ−４抗体もしくはその機能的断片または抗ＣＤ１３７抗体もしくはその機能的断片を、例えば、約０．０５ｍｇ／ｋｇおよび約５ｍｇ／ｋｇの用量で、投与することができる。組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株、または組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む免疫原性組成物を、例えば、約１×１０９ＣＦＵの用量で投与することができる。一部のそのような方法は、抗ＰＤ−１抗体またはその機能的断片の有効量を投与するステップをさらに含むことができる。
【０４１７】
がん免疫療法の有効性を評定するための方法は周知であり、例えば、Dzojicら（２００６年）Prostate  ６６巻（８号）：８３１〜８３８頁；Naruishiら（２００６年）Cancer  Gene  Ther.１３巻（７号）：６５８〜６６３頁、Sehgalら（２００６年）Cancer  Cell  Int.６巻：２１頁、およびHeinrichら（２００７年）Cancer  Immunol  Immunother  ５６巻（５号）：７２５〜７３０頁に記載されており、これらのそれぞれは、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。一例として、前立腺がんについては、本明細書で開示される方法および組成物を検査するための、前立腺がんモデル、例えば、ＴＲＡＭＰ−Ｃ２マウスモデル、１７８−２  ＢＭＡ細胞モデル、ＰＡＩＩＩ腺癌細胞モデル、ＰＣ−３Ｍモデル、または任意の他の前立腺がんモデルが存在し得る。
【０４１８】
あるいは、または加えて、免疫療法をヒト対象で検査することができ、公知の方法を使用して有効性をモニターすることができる。そのような方法は、例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答を直接測定するステップ、または疾患進行を（例えば、腫瘍転移の数もしくはサイズを判定すること、または疾患症状、例えば咳、胸痛、体重減少およびその他をモニターすることにより）測定するステップを含むことができる。ヒト対象におけるがん免疫療法の有効性を評定するための方法は周知であり、例えば、Uenakaら（２００７年）Cancer  Immun.７巻：９頁、およびThomas-Kaskelら（２００６年）Int  J  Cancer  １１９巻（１０号）：２４２８〜２４３４頁に記載されており、これらのそれぞれは、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。
【０４１９】
ＩＸ．キット
本明細書で開示される方法を行う際に利用される試薬を含むキット、または本明細書で開示される組成物、ツールもしくは器具を含むキットも、提供される。
【０４２０】
例えば、そのようなキットは、本明細書で開示される組換え融合ポリペプチド、本明細書で開示される組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、本明細書で開示される組換え菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、本明細書で開示される免疫原性組成物、本明細書で開示される医薬組成物、または医薬組成物ワクチンを含むことができる。そのようなキットは、本明細書で開示される方法を行うための組換え融合ポリペプチド、組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチンの使用を記載する説明資料をさらに含むことができる。そのようなキットは、アプリケーターを必要に応じてさらに含むことができる。モデルキットが下で記載されるが、他の有用なキットの内容は、本開示に照らせば明白であろう。
【０４２１】
上記または下記で引用されるすべての特許出願、ウェブサイト、他の公表文献、受託番号およびこれらに類するものは、それら全体があらゆる目的で参照により組み込まれ、この組み込みは、それぞれの個々の事柄が参照によりそのように組み込まれると具体的にかつ個々に示されている場合と同程度のものである。異なるバージョンの配列が、異なる時点で、ある受託番号に結び付けられたとしても、本出願の有効出願日の時点でその受託番号に結び付けられるバージョンのつもりで述べている。有効出願日とは、利用可能な場合には受託番号を参照して、実際の出願日または優先権出願の出願日のどちらか早いほうの日を意味する。同様に、異なるバージョンの公表文献、ウェブサイトまたはこれらに類するものが、異なる時点で公表されていたとしても、別段の指示がない限り、本出願の有効出願日の最も近日に公表されたバージョンのつもりで述べている。別段の具体的な指示がない限り、本発明のいずれの特徴、ステップ、要素、実施形態または態様を、いずれの他のものと組み合わせて使用してもよい。明確化および理解を目的として図示および例によりある程度詳細に本発明を記載してきたが、ある特定の変更および修飾を添付の特許請求の範囲に記載の範囲内で行うことができることは明らかであろう。
【０４２２】
実施形態の一覧
本明細書において開示される主題は以下の実施形態を含むが、これらに限定されない。
【０４２３】
実施形態１。融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株であって、融合ポリペプチドが、２つまたはそれよりも多くの抗原性ペプチドに融合したＰＥＳＴ含有ペプチドを含み、各抗原性ペプチドが、反復性がん突然変異を含み、抗原性ペプチドのうちの少なくとも２つが、異なる反復性がん突然変異を含み、かつ同じがん関連タンパク質の断片である、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４２４】
実施形態２。各抗原性ペプチドが、がん関連タンパク質の断片であり、約５〜１００、１５〜５０、または２１〜２７アミノ酸長である、実施形態１に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４２５】
実施形態３。各抗原性ペプチドが、各側に同数のアミノ酸が隣接している反復性がん突然変異を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４２６】
実施形態４。各抗原性ペプチドが、各側に少なくとも１０個または少なくとも１３個のアミノ酸が隣接している反復性がん突然変異を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４２７】
実施形態５。２つまたはそれよりも多くの抗原性ペプチドが、介在配列なしで直接互いに融合している、先行する実施形態のいずれかに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４２８】
実施形態６。２つまたはそれよりも多くの抗原性ペプチドが、ペプチドリンカーを介して互いに連結している、実施形態１から４のいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４２９】
実施形態７。配列番号３１０〜３１９に示されるリンカーのうちの１つまたは複数が、２つまたはそれよりも多くの抗原性ペプチドを連結するために使用されている、実施形態６に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４３０】
実施形態８。融合ポリペプチドのいかなる領域も、スライディング２１アミノ酸ウィンドウを用いてＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅのハイドロパシー指数によりハイドロパシーをスコアリングしたとき、約１．６のカットオフを超えるスコアを有しない、先行する実施形態のいずれかに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４３１】
実施形態９。融合ポリペプチドが、同じがん関連タンパク質に由来する少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、もしくは３０個の抗原性ペプチド、または同じがん関連タンパク質に由来する３〜４０個の抗原性ペプチドを含むか、あるいは、融合ポリペプチドが、同じがん関連タンパク質に由来する少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、もしくは３０個の不連続抗原性ペプチド、または同じがん関連タンパク質に由来する２〜４０個の不連続抗原性ペプチドを含む、先行する実施形態のいずれかに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４３２】
実施形態１０。抗原性ペプチドが、がん関連タンパク質における、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の最もよく見られる反復性がん突然変異を含む、実施形態９に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４３３】
実施形態１１。抗原性ペプチドが、がん関連タンパク質における、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の最もよく見られる反復性体細胞ミスセンスがん突然変異を含む、実施形態１０に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４３４】
実施形態１２。がん関連タンパク質に突然変異を有するがん患者の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株における抗原性ペプチドの組合せに含まれる、がん関連タンパク質の反復性がん突然変異を有する、先行する実施形態のいずれかに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４３５】
実施形態１３。がん関連タンパク質に体細胞ミスセンス突然変異を有するがん患者の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株における抗原性ペプチドの組合せに含まれる、がん関連タンパク質の反復性がん突然変異を有する、先行する実施形態のいずれかに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４３６】
実施形態１４。抗原性ペプチドのうちの少なくとも２つにおける反復性がん突然変異が、同じがん関連タンパク質に由来し、かつ、天然に共存しない、先行する実施形態のいずれかに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４３７】
実施形態１５。抗原性ペプチドのうちの少なくとも２つが、同じがん関連タンパク質の重複断片である、先行する実施形態のいずれかに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４３８】
実施形態１６。抗原性ペプチドのうちの少なくとも２つにおける反復性がん突然変異が、同じがん関連タンパク質に由来し、かつがん関連タンパク質の同じアミノ酸残基において生じる、実施形態１５に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４３９】
実施形態１７。融合ポリペプチドが、単一の抗原性ペプチドの２つもしくはそれよりも多くのコピーを含むか、または抗原性ペプチドのうちの２つが、同じ反復性がん突然変異を含む、実施形態１６に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４４０】
実施形態１８。各抗原性ペプチドが、異なる反復性がん突然変異を含む、実施形態１から１６のいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ。
【０４４１】
実施形態１９。融合ポリペプチドにおける各反復性がん突然変異が、体細胞ミスセンス突然変異である、先行する実施形態のいずれかに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４４２】
実施形態２０。抗原性ペプチドが、がん関連タンパク質および１つまたは複数のさらなるタンパク質に由来する、先行する実施形態のいずれかに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４４３】
実施形態２１。がん関連タンパク質が、発癌性タンパク質または腫瘍抑制タンパク質である、先行する実施形態のいずれかに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４４４】
実施形態２２。がん関連タンパク質が、次のヒト遺伝子：ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＡＰＣ、ＣＴＮＮＢ１、ＣＤＫＮ２Ａ、ＮＦＥ２Ｌ２、ＢＲＡＦ、ＫＲＡＳ、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＳＦ３Ｂ１、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＳＭＡＤ４、ＳＰＯＰ、ＰＴＰＮ１１、ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＨＲＡＳ、Ｕ２ＡＦ１、ＥＲＢＢ３、ＦＧＦＲ３、ＡＲＩＤ１Ａ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＦＧＦＲ２、ＲＨＯＡ、ＭＴＯＲ、ＢＣＬ２Ｌ１２、ＲＡＣ１、ＩＤＨ２、Ｈ３Ｆ３Ａ、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＰＯＬＥ、ＡＴＭ、ＥＰ３００、ＡＬＫ、ＲＱＣＤ１、ＧＰＲＩＮ２、ＴＨＳＤ７Ｂ、ＣＤＫ４、ＮＵＰ９３、ＣＣＮＤ１、ＦＧＦＲ１、ＭＡＸ、ＶＨＬ、ＡＣＶＲ１、ＭＥＦ２Ａ、ＭＹＣ、ＦＲＭＤ６、ＳＲＣ、ＫＩＴ、ＫＥＡＰ１、ＳＴＫ１１、ＮＦ１、ＫＭＴ２Ｄ、ＧＡＴＡ３、ＡＫＴ１、ＭＡＰ３Ｋ１、ＭＡＰ２Ｋ４、ＫＭＴ２Ｃ、ＦＡＴ１、ＰＢＲＭ１、ＳＥＴＤ２、ＣＲＥＢＢＰ、ＲＢ１、ＳＭＡＲＣＡ４、ＣＨＤ４、ＦＬＴ３、ＡＲＩＤ２、ＣＤＨ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＡＲＨＧＡＰ３５、ＢＣＯＲ、ＣＴＣＦ、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ６Ａ、ＣＡＳＰ８、ＡＳＸＬ１、ＲＡＳＡ１、ＲＵＮＸ１、ＮＰＭ１、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ２Ｍ、ＲＰＬ５、ＭＹＤ８８、ＣＢＦＢおよびＧＰＳ２のうちの１つによってコードされるか、または、がん関連タンパク質が、次のヒト遺伝子：ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＡＰＣ、ＣＴＮＮＢ１、ＣＤＫＮ２Ａ、ＮＦＥ２Ｌ２、ＢＲＡＦ、ＫＲＡＳ、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＳＦ３Ｂ１、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＳＭＡＤ４、ＳＰＯＰ、ＰＴＰＮ１１、ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＨＲＡＳ、Ｕ２ＡＦ１、ＥＲＢＢ３、ＦＧＦＲ３、ＡＲＩＤ１Ａ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＦＧＦＲ２、ＲＨＯＡ、ＭＴＯＲ、ＢＣＬ２Ｌ１２、ＲＡＣ１、ＩＤＨ２、Ｈ３Ｆ３Ａ、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＰＯＬＥ、ＡＴＭ、ＥＰ３００、ＡＬＫ、ＲＱＣＤ１、ＧＰＲＩＮ２、ＴＨＳＤ７Ｂ、ＣＤＫ４、ＮＵＰ９３、ＣＣＮＤ１、ＦＧＦＲ１、ＭＡＸ、ＶＨＬ、ＡＣＶＲ１、ＭＥＦ２Ａ、ＭＹＣ、ＦＲＭＤ６、ＳＲＣ、ＫＩＴ、ＫＥＡＰ１、ＳＴＫ１１、ＮＦ１、ＫＭＴ２Ｄ、ＧＡＴＡ３、ＡＫＴ１、ＭＡＰ３Ｋ１、ＭＡＰ２Ｋ４、ＫＭＴ２Ｃ、ＦＡＴ１、ＰＢＲＭ１、ＳＥＴＤ２、ＣＲＥＢＢＰ、ＲＢ１、ＳＭＡＲＣＡ４、ＣＨＤ４、ＦＬＴ３、ＡＲＩＤ２、ＣＤＨ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＡＲＨＧＡＰ３５、ＢＣＯＲ、ＣＴＣＦ、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ６Ａ、ＣＡＳＰ８、ＡＳＸＬ１、ＲＡＳＡ１、ＲＵＮＸ１、ＮＰＭ１、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ２Ｍ、ＲＰＬ５、ＭＹＤ８８、ＣＢＦＢ、ＧＰＳ２、ＡＨＮＡＫ２、ＡＮＫＲＤ３６Ｃ、ＣＨＥＫ２、ＫＲＴＡＰ４−１１、ＲＧＰＤ８、ＦＡＭ４７ＣおよびＺＡＮのうちの１つによってコードされる、実施形態１から１９のいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４４５】
実施形態２３。がん関連タンパク質が、次の遺伝子：ＢＲＡＦ、ＥＧＦＲ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＴＥＮ、ＫＲＡＳ、ＴＰ５３、ＡＰＣ、ＦＢＸＷ７、ＫＥＡＰ１、ＳＴＫ１１、ＮＦ１、ＫＭＴ２Ｄ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＮＦＥ２Ｌ２、ＳＰＯＰ、ＧＡＴＡ３、ＡＫＴ１、ＭＡＰ３Ｋ１およびＭＡＰ２Ｋ４のうちの１つによってコードされるか、または、がん関連タンパク質が、次の遺伝子：ＢＲＡＦ、ＥＧＦＲ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＴＥＮ、ＫＲＡＳ、ＴＰ５３、ＡＰＣ、ＦＢＸＷ７、ＫＥＡＰ１、ＳＴＫ１１、ＮＦ１、ＫＭＴ２Ｄ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＮＦＥ２Ｌ２、ＳＰＯＰ、ＧＡＴＡ３、ＡＫＴ１、ＭＡＰ３Ｋ１、ＭＡＰ２Ｋ４、ＡＨＮＡＫ２、ＡＮＫＲＤ３６Ｃ、ＣＨＥＫ２、ＫＲＴＡＰ４−１１、ＲＧＰＤ８、ＦＡＭ４７ＣおよびＺＡＮのうちの１つによってコードされる、実施形態２２に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４４６】
実施形態２４。がん関連タンパク質が、ＢＲＡＦによってコードされ、抗原性ペプチドが、次の反復性がん突然変異：Ｇ４６６Ｅ、Ｇ４６６Ｖ、Ｇ４６９Ａ、Ｇ４６９Ｒ、Ｇ４６９Ｓ、Ｇ４６９Ｖ、Ｖ６００Ｅ、およびＶ６００Ｋのうちの２つもしくはそれよりも多くまたはすべてを含む、実施形態２３に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４４７】
実施形態２５。融合ポリペプチドが、次のＮ末端側からＣ末端側への順序のうちの１つにおいて、次の反復性がん突然変異：（ａ）Ｇ４６９Ｖ、Ｇ４６９Ｒ、Ｖ６００Ｅ、Ｇ４６９Ｓ、Ｇ４６６Ｖ、Ｖ６００Ｋ、Ｇ４６９Ａ、およびＧ４６６Ｅ、（ｂ）Ｖ６００Ｋ、Ｇ４６９Ｒ、Ｇ４６９Ｖ、Ｇ４６６Ｖ、Ｇ４６６Ｅ、Ｖ６００Ｅ、Ｇ４６９Ａ、およびＧ４６９Ｓ、（ｃ）Ｇ４６９Ｖ、Ｖ６００Ｋ、Ｇ４６９Ｓ、Ｇ４６６Ｖ、Ｇ４６９Ａ、Ｖ６００Ｅ、Ｇ４６６Ｅ、およびＧ４６９Ｒ、ならびに（ｄ）Ｖ６００Ｅ、Ｖ６００Ｋ、Ｇ４６９Ａ、Ｇ４６９Ｓ、Ｇ４６９Ｒ、Ｇ４６９Ｖ、Ｇ４６６Ｖ、およびＧ４６６Ｅを含む抗原性ペプチドを含む、実施形態２４に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４４８】
実施形態２６。融合ポリペプチドにおける抗原性ペプチドの組合せが、配列番号２、８、１４、および２０のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一な配列を含む、実施形態２５に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４４９】
実施形態２７。抗原性ペプチドの組合せをコードするオープンリーディングフレームの部分が、配列番号１、７、１３、および１９のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一な配列を含む、実施形態２６に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４５０】
実施形態２８。がん関連タンパク質が、ＥＧＦＲによってコードされ、抗原性ペプチドが、次の反復性がん突然変異：Ｒ１０８Ｋ、Ａ２８９Ｖ、Ｇ５９８Ｖ、Ｅ７０９Ａ、Ｅ７０９Ｋ、Ｇ７１９Ａ、Ｇ７１９Ｃ、Ｇ７１９Ｓ、Ｌ７４７Ｐ、Ｌ７４７Ｓ、Ｓ７６８Ｉ、Ｔ７９０Ｍ、Ｌ８３３Ｖ／Ｈ８３５Ｌ、Ｔ８３３Ｖ、Ｌ８５８Ｒ、およびＬ８６１Ｑのうちの２つまたはそれよりも多くを含む、実施形態２３に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４５１】
実施形態２９。融合ポリペプチドが、次のＮ末端側からＣ末端側への順序のうちの１つにおいて、次の反復性がん突然変異：（ａ）Ｇ７１９Ｓ；Ｌ７４７Ｐ；Ｇ７１９Ｃ；Ｒ１０８Ｋ；Ｓ７６８Ｉ；Ｌ８３３Ｖ／Ｈ８３５Ｌ；Ｔ８３３Ｖ；Ｅ７０９Ａ；Ｇ５９８Ｖ；Ｔ７９０Ｍ；Ｅ７０９Ｋ；Ａ２８９Ｖ；Ｌ８６１Ｑ；Ｇ７１９Ａ；Ｌ７４７ＳおよびＬ８５８Ｒ；（ｂ）Ｔ７９０Ｍ；Ｓ７６８Ｉ；Ｇ７１９Ｃ；Ｒ１０８Ｋ；Ｌ７４７Ｐ；Ｇ７１９Ａ；Ｌ７４７Ｓ；Ｅ７０９Ｋ；Ｔ８３３Ｖ；Ｌ８６１Ｑ；Ｅ７０９Ａ；Ｌ８５８Ｒ；Ｇ５９８Ｖ；Ａ２８９Ｖ；Ｌ８３３Ｖ／Ｈ８３５ＬおよびＧ７１９Ｓ；（ｃ）Ｒ１０８Ｋ；Ｔ８３３Ｖ；Ｌ７４７Ｓ；Ｔ７９０Ｍ；Ｇ７１９Ｃ；Ａ２８９Ｖ；Ｌ８５８Ｒ；Ｅ７０９Ａ；Ｇ７１９Ｓ；Ｅ７０９Ｋ；Ｇ７１９Ａ；Ｌ７４７Ｐ；Ｇ５９８Ｖ；Ｌ８６１Ｑ；Ｓ７６８ＩおよびＬ８３３Ｖ／Ｈ８３５Ｌ；（ｄ）Ｇ７１９Ａ；Ｌ８５８Ｒ；Ｇ７１９Ｃ；Ａ２８９Ｖ；Ｔ７９０Ｍ；Ｓ７６８Ｉ；Ｔ８３３Ｖ；Ｇ５９８Ｖ；Ｇ７１９Ｓ；Ｌ７４７Ｓ；Ｌ７４７Ｐ；Ｌ８３３Ｖ／Ｈ８３５Ｌ；Ｅ７０９Ａ；Ｒ１０８Ｋ；Ｌ８６１ＱおよびＥ７０９Ｋおよび（ｅ）Ａ２８９Ｖ；Ｇ５９８Ｖ；Ｅ７０９Ｋ；Ｇ７１９Ａ；Ｓ７６８Ｉ；Ｇ７１９Ｓ；Ｌ８６１Ｑ；Ｔ７９０Ｍ；Ｇ７１９Ｃ；Ｌ８３３Ｖ／Ｈ８３５ＬおよびＬ８５８Ｒを含む抗原性ペプチドを含む、実施形態２８に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４５２】
実施形態３０。融合ポリペプチドにおける抗原性ペプチドの組合せが、配列番号２６、３２、３８、４４、および２３１のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一な配列を含む、実施形態２９に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４５３】
実施形態３１。抗原性ペプチドの組合せをコードするオープンリーディングフレームの部分が、配列番号２５、３１、３７、４３、２２９、および２３０のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一な配列を含む、実施形態３０に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４５４】
実施形態３２。がん関連タンパク質が、ＰＩＫ３ＣＡによってコードされ、抗原性ペプチドが、次の反復性がん突然変異：Ｒ３８Ｃ、Ｒ３８Ｈ、Ｅ８１Ｋ、Ｒ８８Ｑ、Ｒ９３Ｑ、Ｒ９３Ｗ、Ｒ１０８Ｈ、Ｇ１１８Ｄ、Ｌ３３４Ｇ、Ｎ３４５Ｋ、Ｃ４２０Ｒ、Ｅ４５３Ｋ、Ｅ５４２Ｋ、Ｅ５４５Ａ、Ｅ５４５Ｇ、Ｅ５４５Ｋ、Ｅ５４５Ｑ、Ｑ５４６Ｋ、Ｑ５４６Ｒ、Ｅ７２６Ｋ、Ｍ１０４３Ｉ、Ｍ１０４３Ｖ、Ｈ１０４７Ｌ、Ｈ１０４７Ｒ、およびＧ１０４９Ｒのうちの２つもしくはそれよりも多くまたはすべてを含む、実施形態２３に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４５５】
実施形態３３。抗原性ペプチドが、次の反復性がん突然変異：Ｒ８８Ｑ、Ｅ５４２Ｋ、Ｅ５４５Ａ、Ｅ５４５Ｇ、Ｅ５４５Ｋ、Ｑ５４６Ｋ、Ｈ１０４７Ｌ、およびＨ１０４７Ｒのうちの２つもしくはそれよりも多くまたはすべてを含む、実施形態３２に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４５６】
実施形態３４。抗原性ペプチドが、次の反復性がん突然変異：Ｒ３８Ｈ；Ｅ８１Ｋ；Ｒ１０８Ｈ；Ｇ１１８Ｄ；Ｎ３４５Ｋ；Ｃ４２０Ｒ；Ｑ５４６Ｒ；Ｍ１０４３ＩおよびＧ１０４９Ｒのうちの２つもしくはそれよりも多くまたはすべてを含む、実施形態３２に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４５７】
実施形態３５。融合ポリペプチドが、次のＮ末端側からＣ末端側への順序のうちの１つにおいて、次の反復性がん突然変異：（ａ）Ｍ１０４３Ｖ；Ｅ５４５Ｇ；Ｅ７２６Ｋ；Ｑ５４６Ｒ；Ｌ３３４Ｇ；Ｇ１０４９Ｒ；Ｍ１０４３Ｉ；Ｑ５４６Ｋ；Ｅ５４２Ｋ；Ｒ９３Ｑ；Ｈ１０４７Ｒ；Ｒ１０８Ｈ；Ｒ９３Ｗ；Ｅ８１Ｋ；Ｒ３８Ｈ；Ｎ３４５Ｋ；Ｒ８８Ｑ；Ｇ１１８Ｄ；Ｅ５４５Ｑ；Ｈ１０４７Ｌ；Ｅ５４５Ａ；Ｅ４５３Ｋ；Ｅ５４５Ｋ；Ｒ３８ＣおよびＣ４２０Ｒ；（ｂ）Ｅ７２６Ｋ；Ｅ８１Ｋ；Ｍ１０４３Ｖ；Ｅ５４５Ａ；Ｅ５４５Ｋ；Ｒ３８Ｃ；Ｇ１１８Ｄ；Ｒ９３Ｗ；Ｅ５４５Ｇ；Ｅ５４２Ｋ；Ｇ１０４９Ｒ；Ｎ３４５Ｋ；Ｑ５４６Ｋ；Ｅ４５３Ｋ；Ｃ４２０Ｒ；Ｈ１０４７Ｌ；Ｌ３３４Ｇ；Ｅ５４５Ｑ；Ｒ８８Ｑ；Ｈ１０４７Ｒ；Ｍ１０４３Ｉ；Ｒ９３Ｑ；Ｒ１０８Ｈ；Ｑ５４６ＲおよびＲ３８Ｈ；（ｃ）Ｒ１０８Ｈ；Ｍ１０４３Ｖ；Ｒ８８Ｑ；Ｒ９３Ｗ；Ｒ３８Ｈ；Ｈ１０４７Ｒ；Ｅ５４５Ｋ；Ｍ１０４３Ｉ；Ｑ５４６Ｒ；Ｅ５４２Ｋ；Ｎ３４５Ｋ；Ｒ３８Ｃ；Ｅ５４５Ｇ；Ｅ８１Ｋ；Ｑ５４６Ｋ；Ｒ９３Ｑ；Ｅ４５３Ｋ；Ｇ１０４９Ｒ；Ｅ５４５Ａ；Ｃ４２０Ｒ；Ｈ１０４７Ｌ；Ｌ３３４Ｇ；Ｇ１１８Ｄ；Ｅ７２６ＫおよびＥ５４５Ｑ；（ｄ）Ｎ３４５Ｋ；Ｒ３８Ｈ；Ｅ５４５Ｋ；Ｇ１０４９Ｒ；Ｈ１０４７Ｌ；Ｅ７２６Ｋ；Ｒ８８Ｑ；Ｅ８１Ｋ；Ｒ９３Ｑ；Ｅ５４５Ｑ；Ｌ３３４Ｇ；Ｒ３８Ｃ；Ｈ１０４７Ｒ；Ｃ４２０Ｒ；Ｒ９３Ｗ；Ｑ５４６Ｋ；Ｍ１０４３Ｖ；Ｍ１０４３Ｉ；Ｅ５４５Ｇ；Ｅ５４５Ａ；Ｇ１１８Ｄ；Ｅ４５３Ｋ；Ｑ５４６Ｒ；Ｒ１０８ＨおよびＥ５４２Ｋ；（ｅ）Ｅ５４２Ｋ；Ｅ５４５Ｋ；Ｒ８８Ｑ；Ｅ５４５Ａ；Ｈ１０４７Ｒ；Ｅ５４５Ｇ；Ｈ１０４７Ｌ；Ｑ５４６Ｋ；Ｒ３８Ｈ；Ｅ８１Ｋ；Ｒ１０８Ｈ；Ｎ３４５Ｋ；Ｃ４２０Ｒ；Ｑ５４６Ｒ；Ｍ１０４３Ｉ；Ｇ１１８ＤおよびＧ１０４９Ｒ；（ｆ）Ｅ５４２Ｋ；Ｅ５４５Ｋ；Ｒ８８Ｑ；Ｅ５４５Ａ；Ｈ１０４７Ｒ；Ｅ５４５Ｇ；Ｈ１０４７ＬおよびＱ５４６Ｋおよび（ｇ）  Ｒ３８Ｈ；Ｅ８１Ｋ；Ｒ１０８Ｈ；Ｎ３４５Ｋ；Ｃ４２０Ｒ；Ｑ５４６Ｒ；Ｍ１０４３Ｉ；Ｇ１１８ＤおよびＧ１０４９Ｒを含む抗原性ペプチドを含む、実施形態３２に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４５８】
実施形態３６。融合ポリペプチドにおける抗原性ペプチドの組合せが、配列番号５０、５６、６２、６８、２３８、２４５、および２５２のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一な配列を含む、実施形態３５に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４５９】
実施形態３７。抗原性ペプチドの組合せをコードするオープンリーディングフレームの部分が、配列番号４９、５５、６１、６７、２３６、２３７、２４３、２４４、２５０、および２５１のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一な配列を含む、実施形態３６に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４６０】
実施形態３８。がん関連タンパク質が、ＰＩＫ３Ｒ１によってコードされ、抗原性ペプチドが、次の反復性がん突然変異：Ｇ３７６Ｒ、Ｎ５６４Ｄ、およびＫ５６７Ｅのうちの２つもしくはそれよりも多くまたはすべてを含む、実施形態２３に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４６１】
実施形態３９。融合ポリペプチドが、次のＮ末端側からＣ末端側への順序のうちの１つにおいて、次の反復性がん突然変異：（ａ）Ｇ３７６Ｒ、Ｎ５６４Ｄ、およびＫ５６７Ｅ、ならびに（ｂ）Ｎ５６４Ｄ、Ｋ５６７Ｅ、およびＧ３７６Ｒを含む抗原性ペプチドを含む、実施形態３８に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４６２】
実施形態４０。融合ポリペプチドにおける抗原性ペプチドの組合せが、配列番号７４および８０のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一な配列を含む、実施形態３９に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４６３】
実施形態４１。抗原性ペプチドの組合せをコードするオープンリーディングフレームの部分が、配列番号７３および７９のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一な配列を含む、実施形態４０に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４６４】
実施形態４２。がん関連タンパク質が、ＰＩＫ３ＣＡによってコードされ、ＰＩＫ３ＣＡに由来する抗原性ペプチドが、次の反復性ＰＩＫ３ＣＡ突然変異：Ｒ３８Ｃ、Ｒ３８Ｈ、Ｅ８１Ｋ、Ｒ８８Ｑ、Ｒ９３Ｑ、Ｒ９３Ｗ、Ｒ１０８Ｈ、Ｇ１１８Ｄ、Ｌ３３４Ｇ、Ｎ３４５Ｋ、Ｃ４２０Ｒ、Ｅ４５３Ｋ、Ｅ５４２Ｋ、Ｅ５４５Ａ、Ｅ５４５Ｇ、Ｅ５４５Ｋ、Ｅ５４５Ｑ、Ｑ５４６Ｋ、Ｑ５４６Ｒ、Ｅ７２６Ｋ、Ｍ１０４３Ｉ、Ｍ１０４３Ｖ、Ｈ１０４７Ｌ、Ｈ１０４７Ｒ、およびＧ１０４９Ｒのうちの２つもしくはそれよりも多くまたはすべてを含み、抗原性ペプチドが、ＰＩＫ３Ｒ１によってコードされるタンパク質に由来する抗原性ペプチドをさらに含み、ＰＩＫ３Ｒ１に由来する抗原性ペプチドが、次の反復性ＰＩＫ３Ｒ１突然変異：Ｇ３７６Ｒ、Ｎ５６４Ｄ、およびＫ５６７Ｅのうちの２つもしくはそれよりも多くまたはすべてを含む、実施形態２３に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４６５】
実施形態４３。融合ポリペプチドが、次のＮ末端側からＣ末端側への順序のうちの１つにおいて、次の反復性がん突然変異：（ａ）ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ３８Ｃ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｎ３４５Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ７２６Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ４５３Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ９３Ｑ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｈ１０４７Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ａ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｍ１０４３Ｖ；ＰＩＫ３Ｒ１｜Ｎ５６４Ｄ；ＰＩＫ３Ｒ１｜Ｋ５６７Ｅ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ８１Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ１０８Ｈ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｑ５４６Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｑ５４６Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ｑ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｇ１０４９Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｃ４２０Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｈ１０４７Ｌ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ９３Ｗ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ８８Ｑ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｍ１０４３Ｉ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ｇ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｇ１１８Ｄ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ３８Ｈ；ＰＩＫ３Ｒ１｜Ｇ３７６Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４２Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５ＫおよびＰＩＫ３ＣＡ｜Ｌ３３４Ｇ；（ｂ）ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ３８Ｃ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ１０８Ｈ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｃ４２０Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ９３Ｑ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ４５３Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｍ１０４３Ｖ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｈ１０４７Ｌ；ＰＩＫ３Ｒ１｜Ｎ５６４Ｄ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ７２６Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｇ１１８Ｄ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｑ５４６Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｑ５４６Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４２Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｇ１０４９Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｍ１０４３Ｉ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｌ３３４Ｇ；ＰＩＫ３Ｒ１｜Ｋ５６７Ｅ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ３８Ｈ；ＰＩＫ３Ｒ１｜Ｇ３７６Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ９３Ｗ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｈ１０４７Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ｇ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ８１Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ８８Ｑ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｎ３４５Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５ＡおよびＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ｑ；（ｃ）ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ１０８Ｈ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｍ１０４３Ｖ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ８８Ｑ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ９３Ｗ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ３８Ｈ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｈ１０４７Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｍ１０４３Ｉ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｑ５４６Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４２Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｎ３４５Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ３８Ｃ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ｇ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ８１Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｑ５４６Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ９３Ｑ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ４５３Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｇ１０４９Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ａ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｃ４２０Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｈ１０４７Ｌ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｌ３３４Ｇ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｇ１１８Ｄ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ７２６ＫおよびＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ｑおよび（ｄ）ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ｑ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ９３Ｗ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｈ１０４７Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｇ１０４９Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｎ３４５Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｑ５４６Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ４５３Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｌ３３４Ｇ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｈ１０４７Ｌ；ＰＩＫ３Ｒ１｜Ｇ３７６Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｍ１０４３Ｖ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ８８Ｑ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ３８Ｈ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｇ１１８Ｄ；ＰＩＫ３Ｒ１｜Ｋ５６７Ｅ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ３８Ｃ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４２Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｑ５４６Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ７２６Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｃ４２０Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ａ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ９３Ｑ；ＰＩＫ３Ｒ１｜Ｎ５６４Ｄ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ１０８Ｈ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｍ１０４３Ｉ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５ＧおよびＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ８１Ｋを含む抗原性ペプチドを含む、実施形態４２に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４６６】
実施形態４４。融合ポリペプチドにおける抗原性ペプチドの組合せが、配列番号８６、９２、９８、および１０４のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一な配列を含む、実施形態４３に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４６７】
実施形態４５。抗原性ペプチドの組合せをコードするオープンリーディングフレームの部分が、配列番号８５、９１、９７、および１０３のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一な配列を含む、実施形態４４に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４６８】
実施形態４６。がん関連タンパク質が、ＰＴＥＮによってコードされ、抗原性ペプチドが、次の反復性がん突然変異：Ｙ６８Ｈ、Ｙ８８Ｃ、Ｄ９２Ｅ、ｄｅｌ１２１−１３１、Ｒ１３０Ｇ、Ｒ１３０Ｌ、Ｒ１３０Ｐ、Ｒ１３０Ｑ、Ｃ１３６Ｙ、Ｒ１４２Ｗ、Ｙ１５５Ｃ、Ｒ１７３Ｈ、およびＰ２４６Ｌのうちの２つもしくはそれよりも多くまたはすべてを含む、実施形態２３に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４６９】
実施形態４７。融合ポリペプチドが、次のＮ末端側からＣ末端側への順序のうちの１つにおいて、次の反復性がん突然変異：（ａ）ｄｅｌ１２１−１３１；Ｙ８８Ｃ；Ｒ１３０Ｇ；Ｙ１５５Ｃ；Ｄ９２Ｅ；Ｃ１３６Ｙ；Ｒ１３０Ｑ；Ｙ６８Ｈ；Ｒ１４２Ｗ；Ｒ１７３Ｈ；Ｒ１３０Ｌ；Ｒ１３０ＰおよびＰ２４６Ｌ；（ｂ）Ｒ１３０Ｐ；Ｒ１３０Ｇ；Ｙ１５５Ｃ；Ｒ１３０Ｌ；Ｃ１３６Ｙ；ｄｅｌ１２１−１３１；Ｐ２４６Ｌ；Ｄ９２Ｅ；Ｒ１７３Ｈ；Ｙ６８Ｈ；Ｒ１３０Ｑ；Ｙ８８ＣおよびＲ１４２Ｗ；（ｃ）Ｒ１３０Ｑ；Ｒ１３０Ｇ；ｄｅｌ１２１−１３１；Ｃ１３６Ｙ；Ｒ１３０Ｌ；Ｐ２４６Ｌ；Ｙ１５５Ｃ；Ｄ９２Ｅ；Ｒ１４２Ｗ；Ｒ１３０Ｐ；Ｙ８８Ｃ；Ｙ６８ＨおよびＲ１７３Ｈおよび（ｄ）ｄｅｌ１２１−１３１；Ｃ１３６Ｙ；Ｙ６８Ｈ；Ｒ１４２Ｗ；Ｒ１７３Ｈ；｜Ｒ１３０Ｌ；Ｐ２４６Ｌ；Ｒ１３０Ｇ；Ｒ１３０Ｐ；Ｙ８８Ｃ；Ｄ９２Ｅ；Ｒ１３０ＱおよびＹ１５５Ｃを含む抗原性ペプチドを含む、実施形態４６に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４７０】
実施形態４８。融合ポリペプチドにおける抗原性ペプチドの組合せが、配列番号１１０、１１６、１２２、および１２８のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一な配列を含む、実施形態４７に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４７１】
実施形態４９。抗原性ペプチドの組合せをコードするオープンリーディングフレームの部分が、配列番号１０９、１１５、１２１、および１２７のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一な配列を含む、実施形態４８に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４７２】
実施形態５０。がん関連タンパク質が、ＫＲＡＳによってコードされ、抗原性ペプチドが、次の反復性がん突然変異：Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｖ、Ｌ１９Ｆ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、Ｋ１１７Ｎ、Ａ１４６Ｔ、Ａ１４６Ｖ、およびＡ１６４Ｇのうちの２つもしくはそれよりも多くまたはすべてを含む、実施形態２３に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４７３】
実施形態５１。融合ポリペプチドが、次のＮ末端側からＣ末端側への順序のうちの１つにおいて、次の反復性がん突然変異：（ａ）Ｑ６１Ｒ；Ｑ６１Ｋ；Ｑ６１Ｌ；Ｑ６１Ｈ；Ｌ１９Ｆ；Ｋ１１７Ｎ；Ｇ１２Ａ；Ａ１６４Ｇ；Ｇ１２Ｄ；Ｇ１３Ｄ；Ｇ１３Ｓ；Ｇ１２Ｓ；Ａ１４６Ｖ；Ｇ１３Ｒ；Ｇ１３Ｃ；Ｇ１２Ｃ；Ｇ１２Ｒ；Ｇ１３Ｖ；Ｇ１２ＶおよびＡ１４６Ｔ；（ｂ）Ｑ６１Ｈ；Ｋ１１７Ｎ；Ｇ１３Ｃ；Ｇ１３Ｒ；Ｇ１２Ｄ；Ｇ１２Ｓ；Ｇ１２Ｖ；Ｇ１２Ａ；Ｑ６１Ｋ；Ｇ１３Ｖ；Ｇ１２Ｃ；Ｌ１９Ｆ；Ｑ６１Ｒ；Ｑ６１Ｌ；Ａ１４６Ｖ；Ａ１６４Ｇ；Ｇ１２Ｒ；Ｇ１３Ｓ；Ａ１４６ＴおよびＧ１３Ｄ；（ｃ）Ｇ１２Ｄ；Ｌ１９Ｆ；Ａ１４６Ｖ；Ｑ６１Ｈ；Ｇ１２Ｖ；Ａ１６４Ｇ；Ｇ１２Ｃ；Ｑ６１Ｌ；Ａ１４６Ｔ；Ｇ１３Ｓ；Ｇ１２Ａ；Ｇ１３Ｖ；Ｇ１３Ｃ；Ｇ１３Ｄ；Ｇ１２Ｒ；Ｇ１２Ｓ；Ｑ６１Ｒ；Ｑ６１Ｋ；Ｇ１３ＲおよびＫ１１７Ｎおよび（ｄ）Ｇ１３Ｖ；Ｇ１３Ｓ；Ｇ１２Ｖ；Ｇ１２Ｒ；Ａ１４６Ｖ；Ｇ１３Ｄ；Ｇ１２Ｄ；Ｋ１１７Ｎ；Ｑ６１Ｈ；Ｇ１２Ｃ；Ｇ１３Ｃ；Ａ１４６Ｔ；Ｇ１２Ａ；Ｑ６１Ｌ；Ｑ６１Ｋ；Ａ１６４Ｇ；Ｇ１２Ｓ；Ｌ１９Ｆ；Ｇ１３ＲおよびＱ６１Ｒを含む抗原性ペプチドを含む、実施形態５０に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４７４】
実施形態５２。融合ポリペプチドにおける抗原性ペプチドの組合せが、配列番号１３４、１４０、１４６、および１５２のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一な配列を含む、実施形態５１に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４７５】
実施形態５３。抗原性ペプチドの組合せをコードするオープンリーディングフレームの部分が、配列番号１３３、１３９、１４５、および１５１のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一な配列を含む、実施形態５２に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４７６】
実施形態５４。がん関連タンパク質が、ＴＰ５３によってコードされ、抗原性ペプチドが、次の反復性がん突然変異：Ｙ１０７Ｄ；Ｋ１３２Ｎ；Ｃ１４１Ｙ；Ｖ１４３Ａ；Ｖ１５７Ｆ；Ｙ１６３Ｃ；Ｒ１７５Ｈ；Ｃ１７６Ｆ；Ｃ１７６Ｙ；Ｈ１７９Ｒ；Ｈ１７９Ｗ；Ｈ１９３Ｒ；Ｉ１９５Ｔ；Ｖ２１６Ｍ；Ｙ２２０Ｃ；Ｙ２３４Ｃ；Ｙ２３４Ｈ；Ｓ２４１Ｆ；Ｓ２４２Ｆ；Ｇ２４５Ｄ；Ｇ２４５Ｓ；Ｒ２４８Ｌ；Ｒ２４８Ｑ；Ｒ２４８Ｗ；Ｒ２４９Ｓ；Ｒ２７３Ｃ；Ｒ２７３Ｈ；Ｒ２７３Ｌ；Ｐ２７８Ｌ；Ｐ２７８Ｓ；Ｒ２８２Ｇ；Ｒ２８２ＷおよびＲ３３７Ｈのうちの２つもしくはそれよりも多くまたはすべてを含む、実施形態２３に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４７７】
実施形態５５。抗原性ペプチドが、次の反復性がん突然変異：Ｙ１０７Ｄ；Ｃ１４１Ｙ；Ｖ１４３Ａ；Ｖ１５７Ｆ；Ｙ１６３Ｃ；Ｒ１７５Ｈ；Ｃ１７６Ｆ；Ｈ１９３Ｒ；Ｉ１９５Ｔ；Ｖ２１６Ｍ；Ｙ２２０Ｃ；Ｙ２３４Ｃ；Ｙ２３４Ｈ；Ｇ２４５Ｄ；Ｇ２４５Ｓ；Ｒ２４８Ｑ；Ｒ２４８Ｗ；Ｒ２４９Ｓ；Ｒ２７３Ｃ；Ｒ２７３Ｈ；Ｒ２７３Ｌ；Ｒ２８２ＧおよびＲ２８２Ｗのうちの２つもしくはそれよりも多くまたはすべてを含む、実施形態５４に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４７８】
実施形態５６。抗原性ペプチドが、次の反復性がん突然変異：Ｖ１４３Ａ；Ｒ１７５Ｈ；Ｈ１９３Ｒ；Ｙ２２０Ｃ；Ｇ２４５Ｄ；Ｒ２４８Ｑ；Ｒ２４８Ｗ；Ｒ２４９Ｓ；Ｒ２７３Ｃ；Ｒ２７３ＨおよびＲ２８２Ｗのうちの２つもしくはそれよりも多くまたはすべてを含む、実施形態５４に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４７９】
実施形態５７。抗原性ペプチドが、次の反復性がん突然変異：Ｙ１０７Ｄ；Ｃ１４１Ｙ；Ｖ１５７Ｆ；Ｙ１６３Ｃ；Ｃ１７６Ｆ；Ｉ１９５Ｔ；Ｖ２１６Ｍ；Ｙ２３４Ｃ；Ｙ２３４Ｈ；Ｇ２４５Ｓ；Ｒ２７３ＬおよびＲ２８２Ｇのうちの２つもしくはそれよりも多くまたはすべてを含む、実施形態５４に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４８０】
実施形態５８。抗原性ペプチドが、（ａ）次の反復性がん突然変異：Ｙ１０７Ｄ、Ｃ１４１Ｙ、Ｖ１４３Ａ、Ｙ１６３Ｃ、Ｃ１７６Ｙ、Ｈ１７９Ｒ、Ｈ１７９Ｗ、Ｈ１９３Ｒ、Ｖ２１６Ｍ、Ｙ２３４Ｈ、Ｓ２４１Ｆ、Ｇ２４５Ｄ、Ｒ２４８Ｑ、Ｒ２４８Ｗ、Ｒ２７３Ｃ、Ｒ２７３Ｌ、およびＰ２７８Ｓのうちの２つもしくはそれよりも多くまたはすべて、（ｂ）次の反復性がん突然変異：Ｃ１４１Ｙ、Ｒ１７５Ｈ、Ｈ１７９Ｒ、Ｈ１９３Ｒ、Ｖ２１６Ｍ、Ｙ２３４Ｈ、Ｇ２４５Ｄ、Ｇ２４５Ｓ、Ｒ２４８Ｌ、Ｒ２４８Ｗ、Ｒ２７３Ｃ、Ｒ２７３Ｈ、Ｐ２７８Ｌ、Ｐ２７８Ｓ、Ｒ２８２Ｇ、Ｒ２８２Ｗ、およびＲ３３７Ｈのうちの２つもしくはそれよりも多くまたはすべて、（ｃ）次の反復性がん突然変異：Ｙ１０７Ｄ、Ｃ１４１Ｙ、Ｖ１４３Ａ、Ｃ１７６Ｆ、Ｈ１７９Ｒ、Ｖ２１６Ｍ、Ｙ２２０Ｃ、Ｓ２４１Ｆ、Ｓ２４２Ｆ、Ｇ２４５Ｓ、Ｒ２４８Ｌ、Ｒ２４８Ｗ、Ｒ２７３Ｌ、Ｐ２７８Ｌ、Ｐ２７８Ｓ、Ｒ２８２Ｇ、およびＲ２８２Ｗのうちの２つもしくはそれよりも多くまたはすべて、あるいは（ｄ）次の反復性がん突然変異：Ｙ１０７Ｄ、Ｋ１３２Ｎ、Ｖ１４３Ａ、Ｖ１５７Ｆ、Ｙ１６３Ｃ、Ｒ１７５Ｈ、Ｃ１７６Ｙ、Ｙ２３４Ｃ、Ｙ２３４Ｈ、Ｓ２４１Ｆ、Ｓ２４２Ｆ、Ｇ２４５Ｄ、Ｇ２４５Ｓ、Ｒ２７３Ｃ、Ｐ２７８Ｓ、Ｒ２８２Ｗ、およびＲ３３７Ｈのうちの２つもしくはそれよりも多くまたはすべてを含む、実施形態５４に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４８１】
実施形態５９。抗原性ペプチドが、（ａ）次の反復性がん突然変異：Ｋ１３２Ｎ、Ｖ１５７Ｆ、Ｒ１７５Ｈ、Ｃ１７６Ｆ、Ｉ１９５Ｔ、Ｙ２２０Ｃ、Ｙ２３４Ｃ、Ｓ２４２Ｆ、Ｇ２４５Ｓ、Ｒ２４８Ｌ、Ｒ２４９Ｓ、Ｒ２７３Ｈ、Ｐ２７８Ｌ、Ｒ２８２Ｇ、Ｒ２８２Ｗ、およびＲ３３７Ｈのうちの２つもしくはそれよりも多くまたはすべて、（ｂ）次の反復性がん突然変異：Ｙ１０７Ｄ、Ｋ１３２Ｎ、Ｖ１４３Ａ、Ｖ１５７Ｆ、Ｙ１６３Ｃ、Ｃ１７６Ｆ、Ｃ１７６Ｙ、Ｈ１７９Ｗ、Ｉ１９５Ｔ、Ｙ２２０Ｃ、Ｙ２３４Ｃ、Ｓ２４１Ｆ、Ｓ２４２Ｆ、Ｒ２４８Ｑ、Ｒ２４９Ｓ、およびＲ２７３Ｌのうちの２つもしくはそれよりも多くまたはすべて、（ｃ）次の反復性がん突然変異：Ｋ１３２Ｎ、Ｖ１５７Ｆ、Ｙ１６３Ｃ、Ｒ１７５Ｈ、Ｃ１７６Ｙ、Ｈ１７９Ｗ、Ｈ１９３Ｒ、Ｉ１９５Ｔ、Ｙ２３４Ｃ、Ｙ２３４Ｈ、Ｇ２４５Ｄ、Ｒ２４８Ｑ、Ｒ２４９Ｓ、Ｒ２７３Ｃ、Ｒ２７３Ｈ、およびＲ３３７Ｈのうちの２つもしくはそれよりも多くまたはすべて、あるいは（ｄ）次の反復性がん突然変異：Ｃ１４１Ｙ、Ｃ１７６Ｆ、Ｈ１７９Ｒ、Ｈ１７９Ｗ、Ｈ１９３Ｒ、Ｉ１９５Ｔ、Ｖ２１６Ｍ、Ｙ２２０Ｃ、Ｒ２４８Ｌ、Ｒ２４８Ｑ、Ｒ２４８Ｗ、Ｒ２４９Ｓ、Ｒ２７３Ｈ、Ｒ２７３Ｌ、Ｐ２７８Ｌ、およびＲ２８２Ｇのうちの２つもしくはそれよりも多くまたはすべてを含む、実施形態５４に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４８２】
実施形態６０。融合ポリペプチドが、次のＮ末端側からＣ末端側への順序のうちの１つにおいて、次の反復性がん突然変異：（ａ）Ｈ１７９Ｗ；Ｒ２７３Ｌ；Ｒ２４９Ｓ；Ｒ２４８Ｑ；Ｙ２３４Ｈ；Ｇ２４５Ｄ；Ｙ２２０Ｃ；Ｒ２４８Ｌ；Ｈ１９３Ｒ；Ｋ１３２Ｎ；Ｓ２４２Ｆ；Ｙ２３４Ｃ；Ｇ２４５Ｓ；Ｃ１７６Ｆ；Ｒ２８２Ｗ；Ｒ２７３Ｈ；Ｒ２８２Ｇ；Ｃ１４１Ｙ；Ｒ２７３Ｃ；Ｖ２１６Ｍ；Ｒ３３７Ｈ；Ｒ２４８Ｗ；Ｖ１４３Ａ；Ｉ１９５Ｔ；Ｐ２７８Ｓ；Ｓ２４１Ｆ；Ｃ１７６Ｙ；Ｙ１０７Ｄ；Ｒ１７５Ｈ；Ｈ１７９Ｒ；Ｖ１５７Ｆ；Ｐ２７８ＬおよびＹ１６３Ｃ；（ｂ）Ｒ２４８Ｗ；Ｒ２４８Ｌ；Ｙ２２０Ｃ；Ｙ１６３Ｃ；Ｇ２４５Ｄ；Ｙ１０７Ｄ；Ｈ１７９Ｒ；Ｖ２１６Ｍ；Ｐ２７８Ｓ；Ｓ２４１Ｆ；Ｒ２７３Ｌ；Ｐ２７８Ｌ；Ｃ１７６Ｆ；Ｃ１４１Ｙ；Ｓ２４２Ｆ；Ｒ２４９Ｓ；Ｖ１４３Ａ；Ｉ１９５Ｔ；Ｒ２７３Ｈ；Ｒ２７３Ｃ；Ｒ２８２Ｇ；Ｈ１７９Ｗ；Ｒ１７５Ｈ；Ｒ２４８Ｑ；Ｇ２４５Ｓ；Ｈ１９３Ｒ；Ｒ３３７Ｈ；Ｒ２８２Ｗ；Ｙ２３４Ｃ；Ｖ１５７Ｆ；Ｙ２３４Ｈ；Ｃ１７６ＹおよびＫ１３２Ｎ；（ｃ）Ｒ２４８Ｗ；Ｈ１７９Ｒ；Ｒ２７３Ｈ；Ｙ１０７Ｄ；Ｒ３３７Ｈ；Ｒ２８２Ｇ；Ｖ１５７Ｆ；Ｖ１４３Ａ；Ｙ２３４Ｈ；Ｙ２２０Ｃ；Ｒ２８２Ｗ；Ｒ２４８Ｌ；Ｓ２４１Ｆ；Ｈ１７９Ｗ；Ｒ２７３Ｃ；Ｃ１４１Ｙ；Ｒ２４９Ｓ；Ｐ２７８Ｌ；Ｇ２４５Ｓ；Ｉ１９５Ｔ；Ｒ１７５Ｈ；Ｇ２４５Ｄ；Ｒ２７３Ｌ；Ｋ１３２Ｎ；Ｖ２１６Ｍ；Ｙ１６３Ｃ；Ｃ１７６Ｆ；Ｓ２４２Ｆ；Ｙ２３４Ｃ；Ｈ１９３Ｒ；Ｒ２４８Ｑ；Ｐ２７８ＳおよびＣ１７６Ｙ；（ｄ）Ｖ１４３Ａ；Ｒ２８２Ｗ；Ｖ１５７Ｆ；Ｈ１７９Ｗ；Ｋ１３２Ｎ；Ｙ１６３Ｃ；Ｃ１７６Ｙ；Ｇ２４５Ｄ；Ｙ２２０Ｃ；Ｓ２４２Ｆ；Ｙ２３４Ｃ；Ｒ２４９Ｓ；Ｈ１７９Ｒ；Ｒ２７３Ｈ；Ｃ１４１Ｙ；Ｒ２７３Ｌ；Ｐ２７８Ｓ；Ｃ１７６Ｆ；Ｒ３３７Ｈ；Ｈ１９３Ｒ；Ｒ２７３Ｃ；Ｒ２８２Ｇ；Ｒ１７５Ｈ；Ｒ２４８Ｗ；Ｐ２７８Ｌ；Ｉ１９５Ｔ；Ｓ２４１Ｆ；Ｒ２４８Ｌ；Ｙ２３４Ｈ；Ｖ２１６Ｍ；Ｇ２４５Ｓ；Ｙ１０７ＤおよびＲ２４８Ｑ；（ｅ）Ｓ２４１Ｆ；Ｇ２４５Ｄ；Ｖ１４３Ａ；Ｐ２７８Ｓ；Ｒ２７３Ｃ；Ｃ１７６Ｙ；Ｙ２３４Ｈ；Ｒ２４８Ｗ；Ｖ２１６Ｍ；Ｒ２４８Ｑ；Ｃ１４１Ｙ；Ｙ１６３Ｃ；Ｈ１９３Ｒ；Ｈ１７９Ｒ；Ｈ１７９Ｗ；Ｙ１０７ＤおよびＲ２７３Ｌ；（ｆ）Ｋ１３２Ｎ；Ｒ２８２Ｗ；Ｇ２４５Ｓ；Ｙ２３４Ｃ；Ｓ２４２Ｆ；Ｒ１７５Ｈ；Ｙ２２０Ｃ；Ｖ１５７Ｆ；Ｒ２８２Ｇ；Ｃ１７６Ｆ；Ｒ３３７Ｈ；Ｉ１９５Ｔ；Ｒ２４９Ｓ；Ｐ２７８Ｌ；Ｒ２７３ＨおよびＲ２４８Ｌ；（ｇ）Ｈ１９３Ｒ；Ｐ２７８Ｌ；Ｒ２７３Ｃ；Ｒ２４８Ｗ；Ｈ１７９Ｒ；Ｐ２７８Ｓ；Ｒ２４８Ｌ；Ｖ２１６Ｍ；Ｒ２８２Ｇ；Ｒ３３７Ｈ；Ｒ１７５Ｈ；Ｙ２３４Ｈ；Ｇ２４５Ｄ；Ｒ２７３Ｈ；Ｇ２４５Ｓ；Ｒ２８２ＷおよびＣ１４１Ｙ；（ｈ）Ｙ１０７Ｄ；Ｋ１３２Ｎ；Ｃ１７６Ｆ；Ｃ１７６Ｙ；Ｒ２７３Ｌ；Ｙ２２０Ｃ；Ｒ２４８Ｑ；Ｖ１４３Ａ；Ｉ１９５Ｔ；Ｒ２４９Ｓ；Ｓ２４２Ｆ；Ｙ２３４Ｃ；Ｈ１７９Ｗ；Ｖ１５７Ｆ；Ｙ１６３ＣおよびＳ２４１Ｆ；（ｉ）Ｐ２７８Ｓ；Ｃ１７６Ｆ；Ｈ１７９Ｒ；Ｒ２８２Ｇ；Ｓ２４１Ｆ；Ｒ２７３Ｌ；Ｐ２７８Ｌ；Ｃ１４１Ｙ；Ｙ１０７Ｄ；Ｒ２４８Ｗ；Ｖ２１６Ｍ；Ｒ２８２Ｗ；Ｓ２４２Ｆ；Ｙ２２０Ｃ；Ｖ１４３Ａ；Ｇ２４５ＳおよびＲ２４８Ｌ；（ｊ）Ｒ１７５Ｈ；Ｈ１７９Ｗ；Ｒ２４９Ｓ；Ｙ２３４Ｈ；Ｉ１９５Ｔ；Ｒ２４８Ｑ；Ｒ２７３Ｈ；Ｃ１７６Ｙ；Ｖ１５７Ｆ；Ｈ１９３Ｒ；Ｙ２３４Ｃ；Ｋ１３２Ｎ；Ｒ２７３Ｃ；Ｙ１６３Ｃ；Ｇ２４５ＤおよびＲ３３７Ｈ；（ｋ）Ｃ１７６Ｙ；Ｒ１７５Ｈ；Ｇ２４５Ｄ；Ｒ３３７Ｈ；Ｓ２４１Ｆ；Ｋ１３２Ｎ；Ｖ１４３Ａ；Ｐ２７８Ｓ；Ｒ２８２Ｗ；Ｙ１６３Ｃ；Ｙ１０７Ｄ；Ｒ２７３Ｃ；Ｓ２４２Ｆ；Ｇ２４５Ｓ；Ｖ１５７Ｆ；Ｙ２３４ＣおよびＹ２３４Ｈ；（ｌ）Ｃ１７６Ｆ；Ｒ２７３Ｌ；Ｈ１７９Ｒ；Ｒ２８２Ｇ；Ｙ２２０Ｃ；Ｉ１９５Ｔ；Ｃ１４１Ｙ；Ｒ２４８Ｌ；Ｒ２７３Ｈ；Ｈ１７９Ｗ；Ｈ１９３Ｒ；Ｒ２４９Ｓ；Ｖ２１６Ｍ；Ｐ２７８Ｌ；Ｒ２４８ＷおよびＲ２４８Ｑ；（ｍ）Ｒ２４８Ｗ；Ｒ２７３Ｈ；Ｖ１４３Ａ；Ｒ２４９Ｓ；Ｒ１７５Ｈ；Ｈ１９３Ｒ；Ｙ２２０Ｃ；Ｇ２４５Ｄ；Ｒ２４８Ｑ；Ｒ２７３Ｃ；Ｒ２８２Ｗ；Ｙ１０７Ｄ；Ｃ１４１Ｙ；Ｖ１５７Ｆ；Ｙ１６３Ｃ；Ｃ１７６Ｆ；Ｉ１９５Ｔ；Ｖ２１６Ｍ；Ｙ２３４Ｈ；Ｇ２４５Ｓ；Ｒ２７３Ｌ；Ｙ２３４ＣおよびＲ２８２Ｇ；（ｎ）Ｒ２４８Ｗ；Ｒ２７３Ｈ；Ｖ１４３Ａ；Ｒ２４９Ｓ；Ｒ１７５Ｈ；Ｈ１９３Ｒ；Ｙ２２０Ｃ；Ｇ２４５Ｄ；Ｒ２４８Ｑ；Ｒ２７３ＣおよびＲ２８２Ｗおよび（ｏ）Ｙ１０７Ｄ；Ｃ１４１Ｙ；Ｖ１５７Ｆ；Ｙ１６３Ｃ；Ｃ１７６Ｆ；Ｉ１９５Ｔ；Ｖ２１６Ｍ；Ｙ２３４Ｈ；Ｇ２４５Ｓ；Ｒ２７３Ｌ；Ｙ２３４ＣおよびＲ２８２Ｇを含む抗原性ペプチドを含む、実施形態５４に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４８３】
実施形態６１。融合ポリペプチドにおける抗原性ペプチドの組合せが、配列番号１５８、１６４、１７０、１７６、１８２、１８８、１９４、２００、２０６、２１２、２１８、２２４、２５９、２６６、および２７３のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一な配列を含む、実施形態６０に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４８４】
実施形態６２。抗原性ペプチドの組合せをコードするオープンリーディングフレームの部分が、配列番号１５７、１６３、１６９、１７５、１８１、１８７、１９３、１９９、２０５、２１１、２１７、２２３、２５７、２５８、２６４、２６５、２７１、および２７２のうちの１つと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一な配列を含む、実施形態６１に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４８５】
実施形態６２ｂ。抗原性ペプチドが、２つまたはそれよりも多くのがん関連タンパク質に由来する、実施形態２０から２３のいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４８６】
実施形態６２ｃ。２つまたはそれよりも多くのがん関連タンパク質が、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のがん関連タンパク質である、実施形態６２ｂに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４８７】
実施形態６２ｄ。抗原性ペプチドが、同じタイプのがんに由来する、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、もしくは６０個の異なる反復性がん突然変異を含むか、または抗原性ペプチドが、単一のタイプのがんに由来する、２〜８０、１０〜６０、１０〜５０、１０〜４０、もしくは１０〜３０個の異なる反復性がん突然変異を含むか、または抗原性ペプチドが、単一のタイプのがんに由来する、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、もしくは６０個の異なる反復性体細胞ミスセンスがん突然変異を含むか、または抗原性ペプチドが、単一のタイプのがんに由来する、２〜８０、１０〜６０、１０〜５０、１０〜４０、もしくは１０〜３０個の異なる反復性体細胞ミスセンスがん突然変異を含む、実施形態６２ｂまたは６２ｃに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４８８】
実施形態６２ｅ。（ａ）２つまたはそれよりも多くのがん関連タンパク質が、次の遺伝子：ＰＩ３ＫＣＡ、ＡＫＴ１、ＡＨＮＡＫ２、ＥＲＢＢ２、およびＴＰ５３のうちの２つもしくはそれよりも多くまたはすべてによってコードされるタンパク質を含むか、（ｂ）２つまたはそれよりも多くのがん関連タンパク質が、次の遺伝子：ＢＲＡＦ、ＫＲＡＳ／ＮＲＡＳ、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、およびＳＭＡＤ４のうちの２つもしくはそれよりも多くまたはすべてによってコードされるタンパク質を含むか、（ｃ）２つまたはそれよりも多くのがん関連タンパク質が、次の遺伝子：ＫＲＡＳ、ＴＰ５３、ＥＧＦＲ、Ｕ２ＡＦ１、ＢＲＡＦ、およびＰＩＫ３ＣＡのうちの２つもしくはそれよりも多くまたはすべてによってコードされるタンパク質を含むか、（ｄ）２つもしくはそれよりも多くのがん関連タンパク質が、次の遺伝子：ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＮＦＥ２Ｌ２、ＣＤＫＮ２Ａ、およびＰＴＥＮのうちの２つもしくはそれよりも多くまたはすべてによってコードされるタンパク質を含むか、あるいは（ｅ）２つまたはそれよりも多くのがん関連タンパク質が、次の遺伝子：ＡＮＫＲＤ３６Ｃ、ＳＰＯＰ、ＣＨＥＫ２、ＫＲＴＡＰ４−１１、ＲＧＰＤ８、ＴＰ５３、ＦＡＭ４７Ｃ、ＺＡＮ、およびＰＩＫ３ＣＡのうちの２つもしくはそれよりも多くまたはすべてによってコードされるタンパク質を含む、実施形態６２ｂから６２ｄのいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４８９】
実施形態６２ｆ。抗原性ペプチドが、次の反復性がん突然変異：ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｈ１０４７Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４２Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｈ１０４７Ｌ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｑ５４６Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ａ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ｇ；ＡＫＴ１｜Ｅ１７Ｋ；ＡＨＮＡＫ２｜Ｖ２０１６Ｌ、ＥＲＢＢ２｜Ｌ７５５ＳおよびＴＰ５３｜Ｒ１７５Ｈのうちの２つもしくはそれよりも多くまたはすべてを含む、実施形態６２ｅに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４９０】
実施形態６２ｇ。抗原性ペプチドが、次の反復性がん突然変異：ＢＲＡＦ｜Ｖ６００Ｅ；ＫＲＡＳ｜Ｇ１２Ｄ；ＫＲＡＳ｜Ｇ１３Ｄ；ＫＲＡＳ｜Ｇ１２Ｖ；ＫＲＡＳ｜Ｇ１２Ｃ；ＫＲＡＳ｜Ｑ６１Ｋ；ＫＲＡＳ｜Ｇ１２Ａ；ＫＲＡＳ｜Ｇ１２Ｓ；ＴＰ５３｜Ｒ１７５Ｈ；ＴＰ５３｜Ｒ２４８Ｗ；ＴＰ５３｜Ｒ２７３Ｃ；ＴＰ５３｜Ｒ２８２Ｗ；ＴＰ５３｜Ｒ２７３Ｈ；ＴＰ５３｜Ｒ２４８Ｑ；ＴＰ５３｜Ｇ２４５Ｓ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｈ１０４７Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ８８ＱおよびＳＭＡＤ４｜Ｒ３６１Ｈのうちの２つもしくはそれよりも多くまたはすべてを含む、実施形態６２ｅに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４９１】
実施形態６２ｈ。抗原性ペプチドが、次の反復性がん突然変異：ＫＲＡＳ｜Ｇ１２Ｃ；ＫＲＡＳ｜Ｇ１２Ｖ；ＫＲＡＳ｜Ｇ１２Ｄ；ＫＲＡＳ｜Ｇ１２Ｆ；ＫＲＡＳ｜Ｇ１２Ｒ；ＫＲＡＳ｜Ｑ６１Ｌ；ＫＲＡＳ｜Ｇ１２Ｙ；ＴＰ５３｜Ｒ１５８Ｌ；ＴＰ５３｜Ｒ２７３Ｌ；ＴＰ５３｜Ｇ２４５Ｖ；ＴＰ５３｜Ｒ１７５Ｈ；ＴＰ５３｜Ａ１５９Ｐ；ＴＰ５３｜Ｒ２４９Ｍ；ＴＰ５３｜Ｒ２７３Ｈ；ＴＰ５３｜Ｒ２８０Ｉ；ＴＰ５３｜Ｑ１４４Ｌ；ＴＰ５３｜Ｒ２７３Ｃ；ＴＰ５３｜Ｒ２８０Ｇ；ＴＰ５３｜Ｒ２８０Ｔ；ＥＧＦＲ｜Ｌ８５８Ｒ；ＥＧＦＲ｜Ｌ８６１Ｑ；ＥＧＦＲ｜Ｇ７１９Ａ；Ｕ２ＡＦ１｜Ｓ３４Ｆ；ＢＲＡＦ１｜Ｖ６００Ｅ；ＢＲＡＦ１｜Ｇ４６６Ｖ；ＢＲＡＦ１｜Ｎ５８１Ｓ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ７２６ＫおよびＰＩＫ３ＣＡ｜Ｈ１０４７Ｒのうちの２つもしくはそれよりも多くまたはすべてを含む、実施形態６２ｅに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４９２】
実施形態６２ｉ。抗原性ペプチドが、次の反復性がん突然変異：ＴＰ５３｜Ｙ１６３Ｃ；ＴＰ５３｜Ｒ１７５Ｇ；ＴＰ５３｜Ｃ２４２Ｆ；ＴＰ５３｜Ｒ２７３Ｌ；ＴＰ５３｜Ｈ１７９Ｌ；ＴＰ５３｜Ｈ１９３Ｌ；ＴＰ５３｜Ｈ２１４Ｒ；ＴＰ５３｜Ｙ２２０Ｃ；ＴＰ５３｜Ｙ２３４Ｃ；ＴＰ５３｜Ｇ２４５Ｖ；ＴＰ５３｜Ｌ１１１Ｑ；ＴＰ５３｜Ｔ１２５Ｐ；ＴＰ５３｜Ｋ１３２Ｒ；ＴＰ５３｜Ｃ１３５Ｗ；ＴＰ５３｜Ｃ１４１Ｗ；ＴＰ５３｜Ｃ１７６Ｆ；ＴＰ５３｜Ｃ１７６Ｙ；ＴＰ５３｜Ｈ１７９Ｒ；ＴＰ５３｜Ｈ１７９Ｙ；ＴＰ５３｜Ｈ１９３Ｒ；ＴＰ５３｜Ｉ１９５Ｓ；ＴＰ５３｜Ｙ２０５Ｃ；ＴＰ５３｜Ｒ２１３Ｇ；ＴＰ５３｜Ｖ２１６Ｅ；ＴＰ５３｜Ｙ２３４Ｓ；ＴＰ５３｜Ｙ２３６Ｃ；ＴＰ５３｜Ｍ２３７Ｉ；ＴＰ５３｜Ｇ２４４Ｃ；ＴＰ５３｜Ｇ２４５Ｓ；ＴＰ５３｜Ｒ２４８Ｌ；ＴＰ５３｜Ｒ２４８Ｐ；ＴＰ５３｜Ｒ２４８Ｑ；ＴＰ５３｜Ｒ２４８Ｗ；ＴＰ５３｜Ｒ２４９Ｇ；ＴＰ５３｜Ｒ２４９Ｓ；ＴＰ５３｜Ｒ２４９Ｗ；ＴＰ５３｜Ｇ２６６Ｖ；ＴＰ５３｜Ｆ２７０Ｉ；ＴＰ５３｜Ｒ２７３Ｃ；ＴＰ５３｜Ｒ２７３Ｈ；ＴＰ５３｜Ｒ２７３Ｐ；ＴＰ５３｜Ｒ２８０Ｉ；ＴＰ５３｜Ｄ２８１Ｙ；ＴＰ５３｜Ｒ２８２Ｑ；ＴＰ５３｜Ｒ２８２Ｗ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４２Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｈ１０４７Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ７２６Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｃ４２０Ｒ；ＮＦＥ２Ｌ２｜Ｅ７９Ｑ；ＮＦＥ２Ｌ２｜Ｒ３４Ｑ；ＮＦＥ２Ｌ２｜Ｌ３０Ｆ；ＮＦＥ２Ｌ２｜Ｇ８１Ｓ；ＮＦＥ２Ｌ２｜Ｇ３１Ａ；ＮＦＥ２Ｌ２｜Ｄ２９Ｇ；ＮＦＥ２Ｌ２｜Ｇ８１Ｖ；ＣＤＫＮ２Ａ｜Ｄ１０８Ｙ；ＣＤＫＮ２Ａ｜Ｄ１８ＮおよびＰＴＥＮ｜Ｒ１３０Ｑのうちの２つもしくはそれよりも多くまたはすべてを含む、実施形態６２ｅに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４９３】
実施形態６２ｊ。抗原性ペプチドが、次の反復性がん突然変異：ＡＮＫＲＤ３６Ｃ｜Ｉ６４５Ｔ；ＡＮＫＲＤ３６Ｃ｜Ｄ６２９Ｙ；ＡＮＫＲＤ３６Ｃ｜Ｄ６２９Ｎ；ＳＰＯＰ｜Ｗ１３１Ｇ；ＳＰＯＰ｜Ｆ１３３Ｌ；ＳＰＯＰ｜Ｆ１３３Ｖ；ＳＰＯＰ｜Ｆ１３３Ｃ；ＳＰＯＰ｜Ｗ１３１Ｒ；ＳＰＯＰ｜Ｗ１３１Ｌ；ＣＨＥＫ２｜Ｋ３７３Ｅ；ＫＲＴＡＰ４−１１｜Ｍ９３Ｖ；ＫＲＴＡＰ４−１１｜Ｒ５１Ｋ；ＫＲＴＡＰ４−１１｜Ｌ１６１Ｖ；ＲＧＰＤ８｜Ｐ１７６０Ａ；ＴＰ５３｜Ｒ２４８Ｑ；ＴＰ５３｜Ｇ２４５Ｓ；ＴＰ５３｜Ｇ２４５Ｄ；ＦＡＭ４７Ｃ｜Ｎ６４８Ｄ；ＺＡＮ｜Ｌ８７８Ｐ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４２ＫおよびＰＩＫ３ＣＡ｜Ｈ１０４７Ｒのうちの２つもしくはそれよりも多くまたはすべてを含む、実施形態６２ｅに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４９４】
実施形態６３。融合ポリペプチドが、２つまたはそれよりも多くの抗原性ペプチドの組合せのＮ末端側および／またはＣ末端側に、１つまたは複数のペプチドタグをさらに含む、先行する実施形態のいずれかに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４９５】
実施形態６４。１つまたは複数のペプチドタグが、３×ＦＬＡＧタグ、６×Ｈｉｓタグ、およびＳＩＩＮＦＥＫＬタグのうちの１つまたは複数を含む、実施形態６３に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４９６】
実施形態６５。ＰＥＳＴ含有ペプチドが、融合ポリペプチドのＮ末端にある、先行する実施形態のいずれかに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４９７】
実施形態６６。ＰＥＳＴ含有ペプチドが、リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質もしくはその断片、またはＡｃｔＡタンパク質もしくはその断片である、先行する実施形態のいずれかに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４９８】
実施形態６７。ＰＥＳＴ含有ペプチドが、ＬＬＯのＮ末端断片である、実施形態６６に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０４９９】
実施形態６８。ＬＬＯのＮ末端断片が、配列番号３３６に示される配列を有する、実施形態６７に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０５００】
実施形態６９。ＰＥＳＴ含有ペプチドが、ＬＬＯタンパク質またはその断片であり、コレステロール結合ドメインに突然変異を含む、実施形態６６に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０５０１】
実施形態７０。ＬＬＯ突然変異が、（１）配列番号３３２の残基Ｃ４８４、Ｗ４９１、もしくはＷ４９２の置換、またはＬＬＯタンパク質が配列番号３３２と最適にアラインされたときに対応する置換、あるいは（２）配列番号３３２の残基４８３〜４９３における１〜１１個のアミノ酸の欠失、またはＬＬＯタンパク質が配列番号３３２と最適にアラインされたときに対応する欠失のうちの１つを含む、実施形態６９に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０５０２】
実施形態７１。核酸がＬｉｓｔｅｒｉａゲノムに作動可能に組み込まれている、先行する実施形態のいずれかに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０５０３】
実施形態７２。核酸が、エピソームプラスミドに存在する、実施形態１から７０のいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０５０４】
実施形態７３。核酸が、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株に抗生物質耐性を与えない、先行する実施形態のいずれかに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０５０５】
実施形態７４。組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株が弱毒化されている、先行する実施形態のいずれかに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０５０６】
実施形態７５。組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株が、栄養要求性Ｌｉｓｔｅｒｉａ株である、先行する実施形態のいずれかに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０５０７】
実施形態７６。弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株が、１つまたは複数の内在性遺伝子に、１つまたは複数の内在性遺伝子を不活性化させる突然変異を含む、実施形態７４または７５に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０５０８】
実施形態７７。１つまたは複数の内在性遺伝子が、ｐｒｆＡを含む、実施形態７６に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０５０９】
実施形態７８。１つまたは複数の内在性遺伝子が、ａｃｔＡを含む、実施形態７６に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０５１０】
実施形態７９。１つまたは複数の内在性遺伝子が、ａｃｔＡおよびｉｎｌＢを含む、実施形態７６に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０５１１】
実施形態８０。１つまたは複数の内在性遺伝子が、ａｃｔＡ、ｄａｌ、およびｄａｔを含む、実施形態７６に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０５１２】
実施形態８１。核酸が、代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームを含む、先行する実施形態のいずれかに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０５１３】
実施形態８２。代謝酵素が、アラニンラセマーゼ酵素またはＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ酵素である、実施形態８１に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０５１４】
実施形態８３。融合ポリペプチドがｈｌｙプロモーター、ｐｒｆＡプロモーター、ａｃｔＡプロモーターまたはｐ６０プロモーターから発現される、先行する実施形態のいずれかに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０５１５】
実施形態８４。融合ポリペプチドがｈｌｙプロモーターから発現される、実施形態８３に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０５１６】
実施形態８５。組換えＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株である、先行する実施形態のいずれかに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０５１７】
実施形態８６。組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株が、ｐｒｆＡの欠失、またはこれにおける不活性化突然変異を含む、弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株であり、核酸が、エピソームプラスミドに存在し、かつＤ１３３Ｖ  ＰｒｆＡ突然変異体タンパク質をコードする第２のオープンリーディングフレームを含む、実施形態１から６５のいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０５１８】
実施形態８７。組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株が、ａｃｔＡ、ｄａｌ、およびｄａｔの欠失、またはこれらにおける不活性化突然変異を含む、弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株であり、核酸が、エピソームプラスミドに存在し、かつアラニンラセマーゼ酵素またはＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームを含み、ＰＥＳＴ含有ペプチドが、ＬＬＯのＮ末端断片である、実施形態１から６５のいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０５１９】
実施形態８８。組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株が、ａｃｔＡおよびｉｎｌＢの欠失、またはこれらにおける不活性化突然変異を含む、弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株であり、核酸が、ゲノムに組み込まれており、ＰＥＳＴ含有ペプチドが、ＡｃｔＡタンパク質またはその断片である、実施形態１から６５のいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０５２０】
実施形態８９。組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株が、動物宿主を通して継代されたものである、先行する実施形態のいずれかに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０５２１】
実施形態９０。組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株が、ファゴリソソームから脱出することができる、先行する実施形態のいずれかに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０５２２】
実施形態９１。先行する実施形態のいずれかに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む免疫原性組成物。
【０５２３】
実施形態９２。免疫原性組成物が、２つまたはそれよりも多くの組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株の組合せを含み、各組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株が、異なる抗原性ペプチドセット、または異なる順序における同じ抗原性ペプチドセットを含む、実施形態９１に記載の免疫原性組成物。
【０５２４】
実施形態９３。各組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株が、異なる抗原性ペプチドセットを含む、実施形態９２に記載の免疫原性組成物。
【０５２５】
実施形態９４。２つまたはそれよりも多くの組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株が、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む、実施形態９２または９３に記載の免疫原性組成物。
【０５２６】
実施形態９５。２つまたはそれよりも多くの組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株が、２つまたはそれよりも多くのがん関連タンパク質に由来する抗原性ペプチドを含む、実施形態９２から９４のいずれか１つに記載の免疫原性組成物。
【０５２７】
実施形態９６。２つまたはそれよりも多くのがん関連タンパク質が、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のがん関連タンパク質である、実施形態９５に記載の免疫原性組成物。
【０５２８】
実施形態９７。２つもしくはそれよりも多くのがん関連タンパク質が、次のヒト遺伝子：ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＡＰＣ、ＣＴＮＮＢ１、ＣＤＫＮ２Ａ、ＮＦＥ２Ｌ２、ＢＲＡＦ、ＫＲＡＳ、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＳＦ３Ｂ１、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＳＭＡＤ４、ＳＰＯＰ、ＰＴＰＮ１１、ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＨＲＡＳ、Ｕ２ＡＦ１、ＥＲＢＢ３、ＦＧＦＲ３、ＡＲＩＤ１Ａ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＦＧＦＲ２、ＲＨＯＡ、ＭＴＯＲ、ＢＣＬ２Ｌ１２、ＲＡＣ１、ＩＤＨ２、Ｈ３Ｆ３Ａ、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＰＯＬＥ、ＡＴＭ、ＥＰ３００、ＡＬＫ、ＲＱＣＤ１、ＧＰＲＩＮ２、ＴＨＳＤ７Ｂ、ＣＤＫ４、ＮＵＰ９３、ＣＣＮＤ１、ＦＧＦＲ１、ＭＡＸ、ＶＨＬ、ＡＣＶＲ１、ＭＥＦ２Ａ、ＭＹＣ、ＦＲＭＤ６、ＳＲＣ、ＫＩＴ、ＫＥＡＰ１、ＳＴＫ１１、ＮＦ１、ＫＭＴ２Ｄ、ＧＡＴＡ３、ＡＫＴ１、ＭＡＰ３Ｋ１、ＭＡＰ２Ｋ４、ＫＭＴ２Ｃ、ＦＡＴ１、ＰＢＲＭ１、ＳＥＴＤ２、ＣＲＥＢＢＰ、ＲＢ１、ＳＭＡＲＣＡ４、ＣＨＤ４、ＦＬＴ３、ＡＲＩＤ２、ＣＤＨ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＡＲＨＧＡＰ３５、ＢＣＯＲ、ＣＴＣＦ、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ６Ａ、ＣＡＳＰ８、ＡＳＸＬ１、ＲＡＳＡ１、ＲＵＮＸ１、ＮＰＭ１、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ２Ｍ、ＲＰＬ５、ＭＹＤ８８、ＣＢＦＢおよびＧＰＳ２のうちの２つもしくはそれよりも多くによってコードされるか、または、２つもしくはそれよりも多くのがん関連タンパク質が、次のヒト遺伝子：ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＡＰＣ、ＣＴＮＮＢ１、ＣＤＫＮ２Ａ、ＮＦＥ２Ｌ２、ＢＲＡＦ、ＫＲＡＳ、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＳＦ３Ｂ１、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３Ｒ１、ＳＭＡＤ４、ＳＰＯＰ、ＰＴＰＮ１１、ＮＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＨＲＡＳ、Ｕ２ＡＦ１、ＥＲＢＢ３、ＦＧＦＲ３、ＡＲＩＤ１Ａ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＦＧＦＲ２、ＲＨＯＡ、ＭＴＯＲ、ＢＣＬ２Ｌ１２、ＲＡＣ１、ＩＤＨ２、Ｈ３Ｆ３Ａ、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＰＯＬＥ、ＡＴＭ、ＥＰ３００、ＡＬＫ、ＲＱＣＤ１、ＧＰＲＩＮ２、ＴＨＳＤ７Ｂ、ＣＤＫ４、ＮＵＰ９３、ＣＣＮＤ１、ＦＧＦＲ１、ＭＡＸ、ＶＨＬ、ＡＣＶＲ１、ＭＥＦ２Ａ、ＭＹＣ、ＦＲＭＤ６、ＳＲＣ、ＫＩＴ、ＫＥＡＰ１、ＳＴＫ１１、ＮＦ１、ＫＭＴ２Ｄ、ＧＡＴＡ３、ＡＫＴ１、ＭＡＰ３Ｋ１、ＭＡＰ２Ｋ４、ＫＭＴ２Ｃ、ＦＡＴ１、ＰＢＲＭ１、ＳＥＴＤ２、ＣＲＥＢＢＰ、ＲＢ１、ＳＭＡＲＣＡ４、ＣＨＤ４、ＦＬＴ３、ＡＲＩＤ２、ＣＤＨ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＡＲＨＧＡＰ３５、ＢＣＯＲ、ＣＴＣＦ、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ６Ａ、ＣＡＳＰ８、ＡＳＸＬ１、ＲＡＳＡ１、ＲＵＮＸ１、ＮＰＭ１、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ２Ｍ、ＲＰＬ５、ＭＹＤ８８、ＣＢＦＢ、ＧＰＳ２、ＡＨＮＡＫ２、ＡＮＫＲＤ３６Ｃ、ＣＨＥＫ２、ＫＲＴＡＰ４−１１、ＲＧＰＤ８、ＦＡＭ４７ＣおよびＺＡＮのうちの２つもしくはそれよりも多くによってコードされる、実施形態９５または９６に記載の免疫原性組成物。
【０５２９】
実施形態９８。２つもしくはそれよりも多くのがん関連タンパク質が、次のヒト遺伝子：ＢＲＡＦ、ＥＧＦＲ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＴＥＮ、ＫＲＡＳ、ＴＰ５３、ＡＰＣ、ＦＢＸＷ７、ＫＥＡＰ１、ＳＴＫ１１、ＮＦ１、ＫＭＴ２Ｄ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＮＦＥ２Ｌ２、ＳＰＯＰ、ＧＡＴＡ３、ＡＫＴ１、ＭＡＰ３Ｋ１、およびＭＡＰ２Ｋ４のうちの２つもしくはそれよりも多くによってコードされるか、または、２つもしくはそれよりも多くのがん関連タンパク質が、次のヒト遺伝子：ＢＲＡＦ、ＥＧＦＲ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＴＥＮ、ＫＲＡＳ、ＴＰ５３、ＡＰＣ、ＦＢＸＷ７、ＫＥＡＰ１、ＳＴＫ１１、ＮＦ１、ＫＭＴ２Ｄ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＮＦＥ２Ｌ２、ＳＰＯＰ、ＧＡＴＡ３、ＡＫＴ１、ＭＡＰ３Ｋ１、ＭＡＰ２Ｋ４、ＡＨＮＡＫ２、ＡＮＫＲＤ３６Ｃ、ＣＨＥＫ２、ＫＲＴＡＰ４−１１、ＲＧＰＤ８、ＦＡＭ４７Ｃ、およびＺＡＮのうちの２つもしくはそれよりも多くによってコードされる、実施形態９７に記載の免疫原性組成物。
【０５３０】
実施形態９９。組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株の組合せが、約５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、４５〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００、１００〜１２０、１２０〜１４０、１４０〜１６０、１６０〜１８０、１８０〜２００、２００〜２２０、２２０〜２４０、２４０〜２６０、２６０〜２８０、または２８０〜３００個の異なる抗原性ペプチドを含む、実施形態９２から９８のいずれか１つに記載の免疫原性組成物。
【０５３１】
実施形態１００。アジュバントをさらに含む、実施形態９１から９９のいずれか１つに記載の免疫原性組成物。
【０５３２】
実施形態１０１。アジュバントが、顆粒細胞／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）タンパク質、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド分子、サポニンＱＳ２１、モノホスホリルリピドＡまたは非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含む、実施形態１００に記載の免疫原性組成物。
【０５３３】
実施形態１０２。対象において腫瘍またはがんに対する免疫応答を誘導する方法であって、対象に、実施形態１から９０のいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株または実施形態９１から１０１のいずれか１つに記載の免疫原性組成物を投与するステップを含む方法。
【０５３４】
実施形態１０３。対象において腫瘍またはがんを防止または処置する方法であって、対象に、実施形態１から９０のいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株または実施形態９１から１０１のいずれか１つに記載の免疫原性組成物を投与するステップを含む方法。
【０５３５】
実施形態１０４。複数の異なる組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株または複数の異なる免疫原性組成物が対象に投与される、実施形態１０２または１０３に記載の方法。
【０５３６】
実施形態１０５。複数の異なる組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株または複数の異なる免疫原性組成物が対象に同時に投与される、実施形態１０４に記載の方法。
【０５３７】
実施形態１０６。複数の異なる組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株または複数の免疫原性組成物が対象に連続的に投与される、実施形態１０４に記載の方法。
【０５３８】
実施形態１０７。複数の異なる組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株または複数の免疫原性組成物が、それぞれ、異なる抗原性ペプチドセット、または異なる順序における同じ抗原性ペプチドセットを含む、実施形態１０４から１０６のいずれか１つに記載の方法。
【０５３９】
実施形態１０８。各組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株または免疫原性組成物が、異なる抗原性ペプチドセットを含む、実施形態１０７に記載の方法。
【０５４０】
実施形態１０９。複数の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株または複数の免疫原性組成物が、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０個の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株または免疫原性組成物を含む、実施形態１０４から１０８のいずれか１つに記載の方法。
【０５４１】
実施形態１１０。複数の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株または複数の免疫原性組成物が、２つまたはそれよりも多くのがん関連タンパク質に由来する抗原性ペプチドを含む、実施形態１０４から１０９のいずれか１つに記載の方法。
【０５４２】
実施形態１１１。２つまたはそれよりも多くのがん関連タンパク質が、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のがん関連タンパク質である、実施形態１１０に記載の方法。
【０５４３】
実施形態１１２。組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株または免疫原性組成物の組合せが、約５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、４５〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００、１００〜１２０、１２０〜１４０、１４０〜１６０、１６０〜１８０、１８０〜２００、２００〜２２０、２２０〜２４０、２４０〜２６０、２６０〜２８０、または２８０〜３００個の異なる抗原性ペプチドを含む、実施形態１０４から１１１のいずれか１つに記載の方法。
【０５４４】
実施形態１１３。免疫チェックポイント阻害剤アンタゴニストを投与するステップをさらに含む、実施形態１０２から１１２のいずれか１つに記載の方法。
【０５４５】
実施形態１１４。免疫チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ−１抗体もしくはその抗原結合性断片、および／または抗ＣＴＬＡ−４抗体もしくはその抗原結合性断片を含む、実施形態１１３に記載の方法。
【０５４６】
実施形態１１５。Ｔ細胞刺激因子を投与するステップをさらに含む、実施形態１０２から１１４のいずれか１つに記載の方法。
【０５４７】
実施形態１１６。Ｔ細胞刺激因子が、抗ＯＸ４０抗体もしくはその抗原結合性断片、または抗ＧＩＴＲ抗体もしくはその抗原結合性断片を含む、実施形態１１５に記載の方法。
【０５４８】
実施形態１１７。対象が、１つまたは複数のがん関連タンパク質における反復性がん突然変異に関連するがんを有し、投与される組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株または投与される免疫原性組成物が、がんに関連する反復性がん突然変異を含む抗原性ペプチドを含む、実施形態１０２から１１６のいずれか１つに記載の方法。
【０５４９】
実施形態１１８。方法が、投与するステップの前に、対象を１つまたは複数の反復性がん突然変異についてスクリーニングして、それを同定するステップを含み、対象に投与される組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株または免疫原性組成物が、対象において同定された１つまたは複数の反復性がん突然変異を含む抗原性ペプチドを含む、実施形態１０２から１１７のいずれか１つに記載の方法。
【０５５０】
実施形態１１９。実施形態１から９０のいずれか１つに記載の１つまたは複数の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む細胞バンク。
【０５５１】
実施形態１２０。冷凍細胞バンクまたは凍結乾燥細胞バンクである、実施形態１１９に記載の細胞バンク。
【０５５２】
実施形態１２１。細胞バンクが、２〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、もしくは４５〜５０個、またはそれよりも多くの組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む、実施形態１１９または１２０に記載の細胞バンク。
【０５５３】
実施形態１２２。１つまたは複数の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株が、２〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、または４５〜５０個のがん関連タンパク質に由来する反復性がん突然変異を含む抗原性ペプチドを含む、実施形態１１９から１２１のいずれか１つに記載の細胞バンク。
【０５５４】
実施形態１２３。１つまたは複数の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株が、各がん関連タンパク質において、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の最もよく見られる反復性がん突然変異を含む抗原性ペプチドを含む、実施形態１２２に記載の細胞バンク。
【０５５５】
実施形態１２４。各がん関連タンパク質について、がん関連タンパク質に突然変異を有するがん患者の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が、細胞バンク内の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株における抗原性ペプチドの組合せに含まれる、がん関連タンパク質の反復性がん突然変異を有する、実施形態１２２または１２３に記載の細胞バンク。
【０５５６】
実施形態１２５。免疫療法構築物を生成する方法であって、
（ａ）免疫療法構築物に含めるための、がん関連タンパク質における反復性がん突然変異セットを選択するステップと、
（ｂ）反復性がん突然変異のそれぞれを含む抗原性ペプチドを設計するステップと、
（ｃ）抗原性ペプチドセットを選択するステップであって、各抗原性ペプチドのハイドロパシーを検査すること、および抗原性ペプチドが、選択されたハイドロパシー指数閾値を超えるスコアを有する場合はこれを修飾または選択解除することを含むステップと、
（ｄ）選択された抗原性ペプチドのそれぞれを含む融合ポリペプチドを設計するステップと、
（ｅ）融合ポリペプチドをコードする核酸構築物を生成するステップと
を含む方法。
【０５５７】
実施形態１２６。個々の選択される反復性がん突然変異が、ステップ（ａ）において、次の基準：
（ａ）複数のタイプのがんまたは特定のタイプのがんにおける発生頻度、
（ｂ）がん関連タンパク質の機能的ドメイン内の位置、
（ｃ）公知のがんドライバー突然変異または化学療法耐性突然変異としてのステータス、および
（ｃ）体細胞ミスセンス突然変異としての同定
のうちの１つまたは複数に基づいて選択される、実施形態１２５に記載の方法。
【０５５８】
実施形態１２７。ステップ（ａ）において選択される反復性がん突然変異セットが、次の基準：（ａ）セットが、単一のがん関連タンパク質に突然変異を有するがん患者の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％において見出されることになる潜在的な突然変異エピトープを含むこと；（ｂ）セットが、単一のがん関連タンパク質に体細胞ミスセンス突然変異を有するがん患者の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％において見出されることになる潜在的な突然変異エピトープを含むこと；（ｃ）セットが、単一のがん関連タンパク質に由来する、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０個の異なる反復性がん突然変異を含むこと；（ｄ）セットが、単一のがん関連タンパク質に由来する、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０個の異なる反復性体細胞ミスセンスがん突然変異を含むこと；および（ｅ）セットが、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０個以下の反復性がん突然変異を含むこと；（ｆ）ステップ（ａ）において選択された反復性がん突然変異の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはすべてが、単一のがん関連タンパク質に由来すること；（ｇ）セットが、特定のタイプのがんを有するがん患者の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％において見出されることになる潜在的な突然変異エピトープを含むこと；（ｈ）セットが、単一のタイプのがんに由来する、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０個の異なる反復性がん突然変異を含むこと；および（ｉ）セットが、単一のタイプのがんに由来する、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０個の異なる反復性体細胞ミスセンスがん突然変異を含むことのうちの１つまたは複数に基づいて選択される、実施形態１２５または１２６に記載の方法。
【０５５９】
実施形態１２８。各抗原性ペプチドが、ステップ（ｂ）において、反復性がん突然変異および各側の隣接配列を含むがん関連タンパク質の断片を含むように設計される、実施形態１２５から１２７のいずれか１つに記載の方法。
【０５６０】
実施形態１２９。各抗原性ペプチドが、各側に少なくとも約１０個の隣接アミノ酸を含む、実施形態１２８に記載の方法。
【０５６１】
実施形態１３０。抗原性ペプチドが、ステップ（ｃ）において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける分泌可能性を予測する、ハイドロパシー閾値未満の場合に選択される、実施形態１２５から１２９のいずれか１つに記載の方法。
【０５６２】
実施形態１３１。抗原性ペプチドが、ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅのハイドロパシー指数２１アミノ酸ウィンドウによってスコアリングされ、約１．６のカットオフを超えるスコアを有するペプチドはすべて除外されるか、またはカットオフ未満のスコアを有するように修飾される、実施形態１３０に記載の方法。
【０５６３】
実施形態１３２。ステップ（ｃ）が、対象ＨＬＡに結合する抗原性ペプチドの能力に基づいて抗原性ペプチドをスコアリングし選択することをさらに含む、実施形態１２５から１３１のいずれか１つに記載の方法。
【０５６４】
実施形態１３３。ステップ（ｃ）が、抗原性ペプチドを免疫抑制エピトープについてスクリーニングすることをさらに含み、免疫抑制エピトープを有する抗原性ペプチドが、選択解除されるか、または免疫抑制エピトープを有しないように修飾される、実施形態１２５から１３２のいずれか１つに記載の方法。
【０５６５】
実施形態１３４。ステップ（ｃ）が、抗原性ペプチドを免疫原性についてスクリーニングすることをさらに含む、実施形態１２５から１３３のいずれか１つに記載の方法。
【０５６６】
実施形態１３５。ステップ（ｄ）における融合ポリペプチド内の抗原性ペプチドの順序が、ランダム化を使用して選択される、実施形態１２５から１３４のいずれか１つに記載の方法。
【０５６７】
実施形態１３６。ステップ（ｄ）が、融合ポリペプチドのハイドロパシーを検査すること、および融合ポリペプチドのいずれかの領域が選択されたハイドロパシー指数閾値を超えるスコアを有する場合、抗原性ペプチドを並べ替えること、または問題がある抗原性ペプチドを除去することのいずれかをさらに含む、実施形態１２５から１３５のいずれか１つに記載の方法。
【０５６８】
実施形態１３７。融合ポリペプチドが、スライディング２１アミノ酸ウィンドウを用いてＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅのハイドロパシー指数によりスコアリングされ、閾値が約１．６である、実施形態１３６に記載の方法。
【０５６９】
実施形態１３８。ステップ（ｅ）が、核酸配列を最適化することをさらに含む、実施形態１２５から１３７のいずれか１つに記載の方法。
【０５７０】
実施形態１３９。最適化がコドン最適化を含む、実施形態１３８に記載の方法。
【０５７１】
実施形態１４０。最適化が、非常に高い（＞８０％）もしくは非常に低い（＜３０％）ＧＣ含有量の領域を調整すること、または、次のシス作用性配列モチーフ：内部ＴＡＴＡボックス、カイ部位、およびリボソーム進入部位；ＡＴリッチもしくはＧＣリッチの配列区画；リピート配列および予測されるＲＮＡ二次構造；（暗号）スプライスドナーおよびアクセプター部位；ならびに分岐点のうちの１つもしくは複数を回避することを含む、実施形態１３８または１３９に記載の方法。
【０５７２】
実施形態１４１。核酸をＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株に導入するステップと、コードされた融合ポリペプチドの発現および分泌を確認するステップとをさらに含む、実施形態１２５から１４０のいずれか１つに記載の方法。
【０５７３】
本明細書において開示される主題は以下の実施形態も含むが、これらに限定されない。
【０５７４】
実施形態１。２つまたはそれよりも多くの抗原性ペプチドに融合したＰＥＳＴ含有ペプチドを含む融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株であって、少なくとも１つの抗原性ペプチドが、がん関連タンパク質に由来し、かつ反復性がん突然変異を含み、少なくとも１つの抗原性ペプチドが、がん関連タンパク質に由来し、かつヘテロクリティック突然変異を含む、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０５７５】
実施形態２。ＰＥＳＴ含有ペプチドが、細菌分泌シグナル配列を含み、融合ポリペプチドが、カルボキシ末端側の抗原性ペプチドに融合したユビキチンタンパク質をさらに含み、ＰＥＳＴ含有ペプチド、２つまたはそれよりも多くの抗原性ペプチド、ユビキチン、およびカルボキシ末端側の抗原性ペプチドが、融合ポリペプチドのアミノ末端からカルボキシ末端までタンデムに配置されている、実施形態１に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０５７６】
実施形態３。カルボキシ末端側の抗原性ペプチドが、がん関連タンパク質に由来し、かつヘテロクリティック突然変異を含む、実施形態２に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０５７７】
実施形態４。カルボキシ末端側の抗原性ペプチドが、約７〜１１、８〜１０、または９アミノ酸長である、実施形態２または３に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０５７８】
実施形態５。カルボキシ末端側の抗原性ペプチドが、次のＨＬＡ型：ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２、およびＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２のうちの１つまたは複数に結合する、実施形態２から４のいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０５７９】
実施形態６。カルボキシ末端側の抗原性ペプチドが、次の遺伝子：ＳＴＥＡＰ１、ＣＥＡＣＡＭ５、ＮＹＥＳＯ１、およびＮＵＦ２のうちの１つによってコードされるタンパク質に由来する、実施形態２から５のいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０５８０】
実施形態７。カルボキシ末端側の抗原性ペプチドが、配列番号７９６、７９７、７９８、７９９、８００、および８０７に示されるペプチドから選択される、実施形態６に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０５８１】
実施形態８。各抗原性ペプチドが、がん関連タンパク質の断片であり、約７〜２００アミノ酸長である、先行する実施形態のいずれかに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０５８２】
実施形態９。融合ポリペプチドが、少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、もしくは２５個の抗原性ペプチドを含むか、または約５〜５０、１０〜４０、もしくは２０〜３０個の抗原性ペプチドを含む、先行する実施形態のいずれかに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０５８３】
実施形態１０。融合ポリペプチドが、反復性がん突然変異を含む少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個の抗原性ペプチド、または反復性がん突然変異を含む約５〜３０もしくは１０〜２０個の抗原性ペプチドを含み、かつ／あるいは、
融合ポリペプチドが、ヘテロクリティック突然変異を含む少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個の抗原性ペプチド、またはヘテロクリティック突然変異を含む約５〜３０もしくは１０〜２０個の抗原性ペプチドを含む、
先行する実施形態のいずれかに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０５８４】
実施形態１１。反復性がん突然変異を含む抗原性ペプチドがタンデムになっており、ヘテロクリティック突然変異を含む抗原性ペプチドがタンデムになっている、実施形態１０に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０５８５】
実施形態１２。反復性がん突然変異を含む抗原性ペプチドおよびヘテロクリティック突然変異を含む抗原性ペプチドが、融合ポリペプチド内で混ざり合っている、実施形態１０に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０５８６】
実施形態１３。２つまたはそれよりも多くの抗原性ペプチドが、ペプチドリンカーを介して互いに連結している、先行する実施形態のいずれかに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０５８７】
実施形態１４。ペプチドリンカーが、可動性リンカーおよび／もしくは剛性リンカーおよび／もしくは免疫プロテアソームプロセシングリンカーを含むか、または配列番号３１３〜３１６、３１９、および８２１〜８２９に示されるリンカーのうちの１つもしくは複数が、２つもしくはそれよりも多くの抗原性ペプチドを連結させるために使用されている、実施形態１３に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０５８８】
実施形態１５。ヘテロクリティック突然変異を含む抗原性ペプチドのうちの１つまたは複数の上流のペプチドリンカーが、免疫プロテアソームプロセシングリンカーであるか、または配列番号８２１〜８２９に示されるリンカーから選択される、実施形態１４に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０５８９】
実施形態１６。融合ポリペプチドのいかなる領域も、スライディング２１アミノ酸ウィンドウを用いてＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅのハイドロパシー指数によりハイドロパシーをスコアリングしたとき、約１．６のカットオフを超えるスコアを有しない、先行する実施形態のいずれかに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０５９０】
実施形態１７。抗原性ペプチドのうちの少なくとも２つが、異なる反復性がん突然変異を含み、かつ同じがん関連タンパク質の断片である、先行する実施形態のいずれかに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０５９１】
実施形態１８。抗原性ペプチドのうちの少なくとも２つにおける反復性がん突然変異が、同じがん関連タンパク質に由来し、かつ、天然に共存しない、先行する実施形態のいずれかに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０５９２】
実施形態１９。抗原性ペプチドのうちの少なくとも２つが、同じがん関連タンパク質の重複断片である、先行する実施形態のいずれかに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０５９３】
実施形態２０。抗原性ペプチドのうちの少なくとも２つにおける反復性がん突然変異が、同じがん関連タンパク質に由来し、かつがん関連タンパク質の同じアミノ酸残基において生じる、実施形態１９に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０５９４】
実施形態２１。抗原性ペプチドのうちの２つが、同じ反復性がん突然変異を含む、実施形態２０に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０５９５】
実施形態２２。反復性がん突然変異を含む各抗原性ペプチドが、異なる反復性がん突然変異を含む、実施形態１から２０のいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０５９６】
実施形態２３。融合ポリペプチドにおける各反復性がん突然変異が、体細胞フレームシフト突然変異または体細胞ミスセンス突然変異である、先行する実施形態のいずれかに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０５９７】
実施形態２４。融合ポリペプチドにおける各反復性がん突然変異が、体細胞ミスセンス突然変異である、実施形態２３に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０５９８】
実施形態２５。反復性がん突然変異を含む抗原性ペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべてが、反復性がん突然変異の各側に隣接する同数のアミノ酸を有する、先行する実施形態のいずれかに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０５９９】
実施形態２６。反復性がん突然変異の各側の隣接アミノ酸の数が、少なくとも１０アミノ酸である、実施形態２５に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０６００】
実施形態２７。抗原性ペプチドが、特定のタイプのがんに由来する、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個の最もよく見られる反復性がん突然変異または反復性体細胞ミスセンスがん突然変異を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０６０１】
実施形態２８。特定のタイプのがんを有する患者の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、３５％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％が、融合ポリペプチドにおける抗原性ペプチドの組合せに含まれる反復性がん突然変異を有する、先行する実施形態のいずれかに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０６０２】
実施形態２９。抗原性ペプチドが、特定のタイプのがんに由来する、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、もしくは３０個の異なる反復性がん突然変異または反復性体細胞ミスセンスがん突然変異を含むか、あるいは抗原性ペプチドが、特定のタイプのがんに由来する、約２〜８０、１０〜６０、１０〜５０、１０〜４０、もしくは１０〜３０個の異なる反復性がん突然変異または反復性体細胞ミスセンスがん突然変異を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０６０３】
実施形態３０。特定のタイプのがんが、非小細胞肺がん、前立腺がん、膵臓がん、膀胱がん、乳がん、子宮がん、卵巣がん、低悪性度神経膠腫、結腸直腸がん、または頭頸部がんである、実施形態２７から２９のいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０６０４】
実施形態３１。抗原性ペプチドが、２つまたはそれよりも多くのがん関連タンパク質に由来する、先行する実施形態のいずれかに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０６０５】
実施形態３２。２つまたはそれよりも多くのがん関連タンパク質が、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個のがん関連タンパク質であるか、または２つまたはそれよりも多くのがん関連タンパク質が、約２〜３０、２〜２５、２〜２０、２〜１５、もしくは２〜１０個のがん関連タンパク質である、実施形態３１に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０６０６】
実施形態３３。抗原性ペプチドが、次の遺伝子：ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＤＡＭ２８、ＡＫＴ１、ＡＮＫＲＤ３６Ｃ、ＡＲ、ＡＲＩＤ１Ａ、ＢＭＰＲ２、ＢＲＡＦ、ＣＨＥＫ２、Ｃ１２ｏｒｆ４、ＣＴＮＮＢ１、ＤＯＣＫ３、ＥＧＦＲ、ＥＳＲ１、ＦＢＸＷ７、ＦＧＦＲ３、ＦＨＯＤ３、ＧＮＡＳ、ＨＲＡＳ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＫＩＡＡ２０２６、ＫＲＡＳ、ＫＲＴＡＰ１−５、ＫＲＴＡＰ４−１１、ＬＡＲＰ４Ｂ、ＭＢＯＡＴ２、ＮＦＥ２Ｌ２、ＰＧＭ５、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＬＥＫＨＡ６、ＰＯＬＥ、ＰＴＥＮ、ＲＧＰＤ８、ＲＮＦ４３、ＲＸＲＡ、ＳＭＡＤ４、ＳＰＯＰ、ＳＶＩＬ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＰ５３、ＴＲＩＭ４８、ＵＢＲ５、Ｕ２ＡＦ１、ＷＮＴ１６、ＸＹＬＴ２、ＺＢＴＢ２０およびＺＮＦ８１４のうちの１つまたは複数によってコードされるタンパク質に由来する反復性がん突然変異を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０６０７】
実施形態３４。（ａ）抗原性ペプチドが、次の遺伝子：ＫＲＡＳ、ＥＧＦＲ、Ｕ２ＡＦ１、ＢＲＡＦ、ＰＩＫ３ＣＡ、およびＴＰ５３のうちの１つもしくは複数またはすべてによってコードされるタンパク質に由来する反復性がん突然変異を含むか、
（ｂ）抗原性ペプチドが、次の遺伝子：ＳＰＯＰ、ＣＨＥＫ２、ＲＧＰＤ８、ＡＮＫＲＤ３６Ｃ、およびＡＲのうちの１つもしくは複数またはすべてによってコードされるタンパク質に由来する反復性がん突然変異を含むか、
（ｃ）抗原性ペプチドが、次の遺伝子：ＫＲＡＳ、Ｕ２ＡＦ１、ＴＰ５３、ＳＭＡＤ４、およびＧＮＡＳのうちの１つもしくは複数またはすべてによってコードされるタンパク質に由来する反復性がん突然変異を含むか、
（ｄ）抗原性ペプチドが、次の遺伝子：ＰＩＫ３ＣＡ、ＦＧＦＲ３、ＴＰ５３、ＲＸＲＡ、ＦＢＸＷ７、およびＮＦＥ２Ｌ２のうちの１つもしくは複数またはすべてによってコードされるタンパク質に由来する反復性がん突然変異を含むか、
（ｅ）抗原性ペプチドが、次の遺伝子：ＰＩＫ３ＣＡ、ＡＫＴ１、およびＥＳＲ１のうちの１つもしくは複数またはすべてによってコードされるタンパク質に由来する反復性がん突然変異を含むか、
（ｆ）抗原性ペプチドが、次の遺伝子：ＰＴＥＮ、ＫＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＣＴＮＮＢ１、ＦＢＸＷ７、およびＴＰ５３のうちの１つもしくは複数またはすべてによってコードされるタンパク質に由来する反復性がん突然変異を含むか、
（ｇ）抗原性ペプチドが、次の遺伝子：ＴＰ５３のうちの１つもしくは複数またはすべてによってコードされるタンパク質に由来する反復性がん突然変異を含むか、
（ｈ）抗原性ペプチドが、次の遺伝子：ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、およびＥＧＦＲのうちの１つもしくは複数またはすべてによってコードされるタンパク質に由来する反復性がん突然変異を含むか、
（ｉ）抗原性ペプチドが、次の遺伝子：ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＰＩＫ３ＣＡ、およびＴＰ５３のうちの１つもしくは複数またはすべてによってコードされるタンパク質に由来する反復性がん突然変異を含むか、あるいは
（ｊ）抗原性ペプチドが、次の遺伝子：ＰＩＫ３ＣＡ、ＣＨＥＫ２、ＲＧＰＤ８、ＡＮＫＲＤ３６Ｃ、ＴＰ５３、ＺＮＦ８１４、ＫＲＴＡＰ１−５、ＫＲＴＡＰ４−１１、およびＨＲＡＳのうちの１つもしくは複数またはすべてによってコードされるタンパク質に由来する反復性がん突然変異を含む、
実施形態３３に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０６０８】
実施形態３５。（ａ）抗原性ペプチドが、次の反復性がん突然変異：ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｃ、ＥＧＦＲ＿Ｌ８５８Ｒ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ、Ｕ２ＡＦ１＿Ｓ３４Ｆ、ＢＲＡＦ＿Ｖ６００Ｅ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｖ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｅ５４５Ｋ、ＴＰ５３＿Ｒ１５８Ｌ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ａ、ＥＧＦＲ＿Ｌ８６１ＱおよびＴＰ５３＿Ｒ２７３Ｌのうちの１つもしくは複数またはすべてを含むか、
（ｂ）抗原性ペプチドが、次の反復性がん突然変異：ＳＰＯＰ＿Ｆ１３３Ｖ、ＣＨＥＫ２＿Ｋ３７３Ｅ、ＲＧＰＤ８＿Ｐ１７６０Ａ、ＡＮＫＲＤ３６Ｃ＿Ｉ６３４Ｔ、ＡＮＫＲＤ３６Ｃ＿Ｄ６２９Ｙ、ＳＰＯＰ＿Ｗ１３１Ｇ、ＡＮＫＲＤ３６Ｃ＿Ｄ６２６Ｎ、ＳＰＯＰ＿Ｆ１３３Ｌ、ＡＲ＿Ｔ８７８Ａ、ＡＲ＿Ｌ７０２Ｈ、ＡＲ＿Ｗ７４２Ｃ、ＡＲ＿Ｈ８７５ＹおよびＡＲ＿Ｆ８７７Ｌのうちの１つもしくは複数またはすべてを含むか、
（ｃ）抗原性ペプチドが、次の反復性がん突然変異：ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｃ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ、Ｕ２ＡＦ１＿Ｓ３４Ｆ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｖ、ＴＰ５３＿Ｒ２４８Ｑ、ＴＰ５３＿Ｒ２４８Ｗ、ＴＰ５３＿Ｒ１７５Ｈ、ＴＰ５３＿Ｒ２７３Ｃ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｒ、ＫＲＡＳ＿Ｑ６１Ｈ、ＴＰ５３＿Ｒ２８２Ｗ、ＴＰ５３＿Ｒ２７３Ｈ、ＴＰ５３＿Ｇ２４５Ｓ、ＳＭＡＤ４＿Ｒ３６１Ｃ、ＧＮＡＳ＿Ｒ２０１ＣおよびＧＮＡＳ＿Ｒ２０１Ｈのうちの１つもしくは複数またはすべてを含むか、
（ｄ）抗原性ペプチドが、次の反復性がん突然変異：ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｅ５４５Ｋ、ＦＧＦＲ３＿Ｓ２４９Ｃ、ＴＰ５３＿Ｒ２４８Ｑ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｅ５４２Ｋ、ＲＸＲＡ＿Ｓ４２７Ｆ、ＦＢＸＷ７＿Ｒ５０５Ｇ、ＴＰ５３＿Ｒ２８０Ｔ、ＮＦＥ２Ｌ２＿Ｅ７９Ｋ、ＦＧＦＲ３＿Ｒ２４８Ｃ、ＴＰ５３＿Ｋ１３２Ｎ、ＴＰ５３＿Ｒ２４８Ｗ、ＴＰ５３＿Ｒ１７５ＨおよびＴＰ５３＿Ｒ２７３Ｃのうちの１つもしくは複数またはすべてを含むか、
（ｅ）抗原性ペプチドが、次の反復性がん突然変異：ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｅ５４５Ｋ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｅ５４２Ｋ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｈ１０４７Ｒ、ＡＫＴ１＿Ｅ１７Ｋ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｈ１０４７Ｌ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｑ５４６Ｋ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｅ５４５Ａ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｅ５４５Ｇ、ＥＳＲ１＿Ｋ３０３Ｒ、ＥＳＲ１＿Ｄ５３８Ｇ、ＥＳＲ１＿Ｙ５３７Ｓ、ＥＳＲ１＿Ｙ５３７Ｎ、ＥＳＲ１＿Ｙ５３７ＣおよびＥＳＲ１＿Ｅ３８０Ｑのうちの１つもしくは複数またはすべてを含むか、
（ｆ）抗原性ペプチドが、次の反復性がん突然変異：ＰＴＥＮ＿Ｒ１３０Ｇ、ＰＴＥＮ＿Ｒ１３０Ｑ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｖ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｈ１０４７Ｒ；  ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｒ８８Ｑ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｅ５４５Ｋ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｅ５４２Ｋ、ＣＴＮＮＢ１＿Ｓ３７Ｆ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１３Ｄ、ＣＴＮＮＢ１＿Ｓ３７Ｃ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｈ１０４７Ｌ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｇ１１８Ｄ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ａ、ＦＢＸＷ７＿Ｒ５０５ＣおよびＴＰ５３＿Ｒ２４８Ｗのうちの１つもしくは複数またはすべてを含むか、
（ｇ）抗原性ペプチドが、次の反復性がん突然変異：ＴＰ５３＿Ｒ２４８Ｑ、ＴＰ５３＿Ｒ２４８Ｗ、ＴＰ５３＿Ｒ１７５Ｈ、ＴＰ５３＿Ｒ２７３Ｃ、ＴＰ５３＿Ｒ２８２Ｗ、ＴＰ５３＿Ｒ２７３Ｈ、ＴＰ５３＿Ｙ２２０Ｃ、ＴＰ５３＿Ｉ１９５Ｔ、ＴＰ５３＿Ｃ１７６Ｙ、ＴＰ５３＿Ｈ１７９Ｒ、ＴＰ５３＿Ｓ２４１ＦおよびＴＰ５３＿Ｈ１９３Ｒのうちの１つもしくは複数またはすべてを含むか、
（ｈ）抗原性ペプチドが、次の反復性がん突然変異：ＴＰ５３＿Ｒ２７３Ｌ、ＴＰ５３＿Ｒ２７３Ｃ、ＴＰ５３＿Ｒ２７３Ｈ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｇ１１８Ｄ、ＩＤＨ１＿Ｒ１３２Ｃ、ＩＤＨ１＿Ｒ１３２Ｇ、ＩＤＨ１＿Ｒ１３２Ｈ、ＩＤＨ１＿Ｒ１３２Ｓ、ＩＤＨ２＿Ｒ１７２Ｋ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｅ４５３ＫおよびＥＧＦＲ＿Ｇ５９８Ｖのうちの１つもしくは複数またはすべてを含むか、
（ｉ）抗原性ペプチドが、次の反復性がん突然変異：ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｃ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ、ＢＲＡＦ＿Ｖ６００Ｅ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｖ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｅ５４５Ｋ、ＴＰ５３＿Ｒ２４８Ｗ、ＴＰ５３＿Ｒ１７５Ｈ、ＴＰ５３＿Ｒ２７３Ｃ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｈ１０４７Ｒ、ＴＰ５３＿Ｒ２８２Ｗ、ＴＰ５３＿Ｒ２７３ＨおよびＫＲＡＳ＿Ｇ１３Ｄのうちの１つもしくは複数またはすべてを含むか、あるいは
（ｊ）抗原性ペプチドが、次の反復性がん突然変異：ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｅ５４５Ｋ、ＣＨＥＫ２＿Ｋ３７３Ｅ、ＲＧＰＤ８＿Ｐ１７６０Ａ、ＡＮＫＲＤ３６Ｃ＿Ｉ６３４Ｔ、ＴＰ５３＿Ｒ２４８Ｑ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｅ５４２Ｋ、ＴＰ５３＿Ｒ２４８Ｗ、ＴＰ５３＿Ｒ１７５Ｈ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｈ１０４７Ｒ、ＴＰ５３＿Ｒ２８２Ｗ、ＴＰ５３＿Ｒ２７３Ｈ、ＴＰ５３＿Ｇ２４５Ｓ、ＴＰ５３＿Ｙ２２０Ｃ、ＺＮＦ８１４＿Ｄ４０４Ｅ、ＫＲＴＡＰ１−５＿Ｉ８８Ｔ、ＫＲＴＡＰ４−１１＿Ｌ１６１ＶおよびＨＲＡＳ＿Ｇ１３Ｖのうちの１つもしくは複数またはすべてを含む、実施形態３４に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０６０９】
実施形態３６。（ａ）抗原性ペプチドが、表３５に示されるペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべてを含むか、
（ｂ）抗原性ペプチドが、表５２に示されるペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべてを含むか、
（ｃ）抗原性ペプチドが、表６８に示されるペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべてを含むか、
（ｄ）抗原性ペプチドが、表７６に示されるペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべてを含むか、
（ｅ）抗原性ペプチドが、表８７に示されるペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべてを含むか、
（ｆ）抗原性ペプチドが、表９５に示されるペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべてを含むか、
（ｇ）抗原性ペプチドが、表１００に示されるペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべてを含むか、
（ｈ）抗原性ペプチドが、表１０４に示されるペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべてを含むか、
（ｉ）抗原性ペプチドが、表１０８に示されるペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべてを含むか、あるいは
（ｊ）抗原性ペプチドが、表１１２に示されるペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべてを含む、
実施形態３５に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０６１０】
実施形態３７。ヘテロクリティック突然変異を含む各抗原性ペプチドが、約７〜１１、８〜１０、または９アミノ酸長である、先行する実施形態のいずれかに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０６１１】
実施形態３８。ヘテロクリティック突然変異を含む抗原性ペプチドが、次のＨＬＡ型：ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２、およびＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２のうちの１つまたは複数またはすべてに結合する、先行する実施形態のいずれかに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０６１２】
実施形態３９。抗原性ペプチドが、次の遺伝子：ＣＥＡＣＡＭ５、ＧＡＧＥ１、ｈＴＥＲＴ、ＫＬＨＬ７、ＭＡＧＥＡ３、ＭＡＧＥＡ４、ＭＡＧＥＡ６、ＮＵＦ２、ＮＹＥＳＯ１、ＰＡＧＥ４、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＲＮＦ４３、ＳＡＲＴ３、ＳＳＸ２、ＳＴＥＡＰ１およびＳＵＲＶＩＶＩＮのうちの１つまたは複数によってコードされるタンパク質におけるヘテロクリティック突然変異を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０６１３】
実施形態４０。（ａ）抗原性ペプチドが、次の遺伝子：ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＡＧＥＡ６、ＭＡＧＥＡ４、ＧＡＧＥ１、ＮＹＥＳＯ１、ＳＴＥＡＰ１、およびＲＮＦ４３のうちの１つもしくは複数またはすべてによってコードされるタンパク質におけるヘテロクリティック突然変異を含むか、
（ｂ）抗原性ペプチドが、次の遺伝子：ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＡＧＥＡ４、ＳＴＥＡＰ１、ＲＮＦ４３、ＳＳＸ２、ＳＡＲＴ３、ＰＡＧＥ４、ＰＳＭＡ、およびＰＳＡのうちの１つもしくは複数またはすべてによってコードされるタンパク質におけるヘテロクリティック突然変異を含むか、
（ｃ）抗原性ペプチドが、次の遺伝子：ＣＥＡＣＡＭ５、ＳＴＥＡＰ１、ＭＡＧＥＡ３、ＰＲＡＭＥ、ｈＴＥＲＴ、およびＳＵＲＶＩＶＩＮのうちの１つもしくは複数またはすべてによってコードされるタンパク質におけるヘテロクリティック突然変異を含むか、
（ｄ）抗原性ペプチドが、次の遺伝子：ＣＥＡＣＡＭ５、ＧＡＧＥ１、ＮＹＥＳＯ１、ＲＮＦ４３、ＮＵＦ２、ＫＬＨＬ７、ＭＡＧＥＡ３、およびＰＲＡＭＥのうちの１つもしくは複数またはすべてによってコードされるタンパク質におけるヘテロクリティック突然変異を含むか、
（ｅ）抗原性ペプチドが、次の遺伝子：ＣＥＡＣＡＭ５、ＳＴＥＡＰ１、ＲＮＦ４３、ＭＡＧＥＡ３、ＰＲＡＭＥ、およびｈＴＥＲＴのうちの１つもしくは複数またはすべてによってコードされるタンパク質におけるヘテロクリティック突然変異を含むか、
（ｆ）抗原性ペプチドが、次の遺伝子：ＣＥＡＣＡＭ５、ＰＲＡＭＥ、ｈＴＥＲＴ、ＳＴＥＡＰ１、ＲＮＦ４３、ＮＵＦ２、ＫＬＨＬ７、およびＳＡＲＴ３のうちの１つもしくは複数またはすべてによってコードされるタンパク質におけるヘテロクリティック突然変異を含むか、
（ｇ）抗原性ペプチドが、次の遺伝子：ＣＥＡＣＡＭ５、ＳＴＥＡＰ１、ＲＮＦ４３、ＳＡＲＴ３、ＮＵＦ２、ＫＬＨＬ７、ＰＲＡＭＥ、およびｈＴＥＲＴのうちの１つもしくは複数またはすべてによってコードされるタンパク質におけるヘテロクリティック突然変異を含むか、
（ｈ）抗原性ペプチドが、次の遺伝子：ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＡＧＥＡ６、ＳＴＥＡＰ１、ＲＮＦ４３、ＳＡＲＴ３、ＮＵＦ２、ＫＬＨＬ７、およびｈＴＥＲＴのうちの１つもしくは複数またはすべてによってコードされるタンパク質におけるヘテロクリティック突然変異を含むか、
（ｉ）抗原性ペプチドが、次の遺伝子：ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＡＧＥＡ６、ＭＡＧＥＡ４、ＧＡＧＥ１、ＮＹＥＳＯ１、ＳＴＥＡＰ１、ＲＮＦ４３、およびＭＡＧＥＡ３のうちの１つもしくは複数またはすべてによってコードされるタンパク質におけるヘテロクリティック突然変異を含むか、あるいは
（ｊ）抗原性ペプチドが、次の遺伝子：ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＡＧＥＡ４、ＳＴＥＡＰ１、ＮＹＥＳＯ１、ＰＲＡＭＥ、およびｈＴＥＲＴのうちの１つもしくは複数またはすべてによってコードされるタンパク質におけるヘテロクリティック突然変異を含む、
実施形態３９に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０６１４】
実施形態４１。（ａ）抗原性ペプチドが、表３６に示されるペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべてを含むか、
（ｂ）抗原性ペプチドが、表５３に示されるペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべてを含むか、
（ｃ）抗原性ペプチドが、表６９に示されるペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべてを含むか、
（ｄ）抗原性ペプチドが、表７７に示されるペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべてを含むか、
（ｅ）抗原性ペプチドが、表８８に示されるペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべてを含むか、
（ｆ）抗原性ペプチドが、表９６に示されるペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべてを含むか、
（ｇ）抗原性ペプチドが、表１０１に示されるペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべてを含むか、
（ｈ）抗原性ペプチドが、表１０５に示されるペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべてを含むか、
（ｉ）抗原性ペプチドが、表１０９に示されるペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべてを含むか、あるいは
（ｊ）抗原性ペプチドが、表１１３に示されるペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべてを含む、
実施形態４０に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０６１５】
実施形態４２。（ａ）抗原性ペプチドが、表３５および３６に示されるペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべてを含むか、
（ｂ）抗原性ペプチドが、表５２および５３に示されるペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべてを含むか、
（ｃ）抗原性ペプチドが、表６８および６９に示されるペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべてを含むか、
（ｄ）抗原性ペプチドが、表７６および７７に示されるペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべてを含むか、
（ｅ）抗原性ペプチドが、表８７および８８に示されるペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべてを含むか、
（ｆ）抗原性ペプチドが、表９５および９６に示されるペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべてを含むか、
（ｇ）抗原性ペプチドが、表１００および１０１に示されるペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべてを含むか、
（ｈ）抗原性ペプチドが、表１０４および１０５に示されるペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべてを含むか、
（ｉ）抗原性ペプチドが、表１０８および１０９に示されるペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべてを含むか、あるいは
（ｊ）抗原性ペプチドが、表１１２および１１３に示されるペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべてを含む、
先行する実施形態のいずれかに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０６１６】
実施形態４３。（ａ）融合ポリペプチドが、配列番号８５９、８６０、８６１、８６２、８６３、８６４、８６５、８９４、８９５、および９０５のいずれか１つに示される配列を含むか、
（ｂ）融合ポリペプチドが、配列番号８７１、８７２、８７３、８７４、８７５、８７６、８７７、８９２、８９３、および９０６のいずれか１つに示される配列を含むか、
（ｃ）融合ポリペプチドが、配列番号８６６、８６７、８６８、８６９、８７０、および９０８のいずれか１つに示される配列を含むか、
（ｄ）融合ポリペプチドが、配列番号８７８、８７９、８８０、８８１、８８２、８８８、８８９、８９０、および８９１のいずれか１つに示される配列を含むか、
（ｅ）融合ポリペプチドが、配列番号８８３、８８４、８８５、８８６、８８７、および９０７のいずれか１つに示される配列を含むか、
（ｆ）融合ポリペプチドが、配列番号８９６、８９７、および９０４のいずれか１つに示される配列を含むか、
（ｇ）融合ポリペプチドが、配列番号８９８および８９９のいずれか１つに示される配列を含むか、
（ｈ）融合ポリペプチドが、配列番号９００および９０１のいずれか１つに示される配列を含むか、
（ｉ）融合ポリペプチドが、配列番号９０２および９０３のいずれか１つに示される配列を含むか、または
（ｊ）融合ポリペプチドが、配列番号９１８および９１９のいずれか１つに示される配列を含む、
実施形態４２に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０６１７】
実施形態４４。融合ポリペプチドが、約１５０ｋＤａ以下または約１２５ｋＤａ以下の分子量を有する、先行する実施形態のいずれかに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０６１８】
実施形態４５。抗原性ペプチドが、次の遺伝子：ＫＲＡＳ、ＥＧＦＲ、Ｕ２ＡＦ１、ＢＲＡＦ、ＰＩＫ３ＣＡ、およびＴＰ５３のすべてによってコードされるタンパク質に由来する反復性がん突然変異を含む、実施形態１もしくは２に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株、または、抗原性ペプチドが、次の遺伝子：ＫＲＡＳ、ＥＧＦＲ、Ｕ２ＡＦ１、ＢＲＡＦ、ＰＩＫ３ＣＡ、およびＴＰ５３のすべてによってコードされるタンパク質に由来する反復性がん突然変異を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０６１９】
実施形態４６。抗原性ペプチドが、次の反復性がん突然変異：ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｃ、ＥＧＦＲ＿Ｌ８５８Ｒ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ、Ｕ２ＡＦ１＿Ｓ３４Ｆ、ＢＲＡＦ＿Ｖ６００Ｅ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｖ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｅ５４５Ｋ、ＴＰ５３＿Ｒ１５８Ｌ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ａ、ＥＧＦＲ＿Ｌ８６１ＱおよびＴＰ５３＿Ｒ２７３Ｌのすべてを含む、実施形態４５に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０６２０】
実施形態４７。抗原性ペプチドが、表３５に示されるペプチドのすべてを含む、実施形態４６に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０６２１】
実施形態４８。抗原性ペプチドが、次の遺伝子：ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＡＧＥＡ６、ＭＡＧＥＡ４、ＧＡＧＥ１、ＮＹＥＳＯ１、ＳＴＥＡＰ１、およびＲＮＦ４３のすべてによってコードされるタンパク質におけるヘテロクリティック突然変異を含む、実施形態１もしくは２に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株、または、抗原性ペプチドが、次の遺伝子：ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＡＧＥＡ６、ＭＡＧＥＡ４、ＧＡＧＥ１、ＮＹＥＳＯ１、ＳＴＥＡＰ１、およびＲＮＦ４３のすべてによってコードされるタンパク質におけるヘテロクリティック突然変異を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０６２２】
実施形態４９。抗原性ペプチドが、表３６に示されるペプチドのすべてを含む、実施形態４８に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０６２３】
実施形態５０。抗原性ペプチドが、表３５および３６に示されるペプチドのすべてを含む、実施形態４７または４９に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０６２４】
実施形態５１。反復性がん突然変異を含む抗原性ペプチドのうちの１つまたは複数に、配列番号３１６に示されるリンカーが先行し、ヘテロクリティック突然変異を含む抗原性ペプチドのうちの１つまたは複数に、配列番号８２１〜８２９のうちのいずれか１つに示されるリンカーが先行する、実施形態５０に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０６２５】
実施形態５２。融合ポリペプチドが、配列番号８９５に示される配列を含む、実施形態５１に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０６２６】
実施形態５３．抗原性ペプチドが、次の遺伝子：ＳＰＯＰ、ＣＨＥＫ２、ＲＧＰＤ８、ＡＮＫＲＤ３６Ｃ、およびＡＲのすべてによってコードされるタンパク質に由来する反復性がん突然変異を含む、実施形態１もしくは２に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株、または、抗原性ペプチドが、次の遺伝子：ＳＰＯＰ、ＣＨＥＫ２、ＲＧＰＤ８、ＡＮＫＲＤ３６Ｃ、およびＡＲのすべてによってコードされるタンパク質に由来する反復性がん突然変異を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０６２７】
実施形態５４。抗原性ペプチドが、次の反復性がん突然変異：ＳＰＯＰ＿Ｆ１３３Ｖ、ＣＨＥＫ２＿Ｋ３７３Ｅ、ＲＧＰＤ８＿Ｐ１７６０Ａ、ＡＮＫＲＤ３６Ｃ＿Ｉ６３４Ｔ、ＡＮＫＲＤ３６Ｃ＿Ｄ６２９Ｙ、ＳＰＯＰ＿Ｗ１３１Ｇ、ＡＮＫＲＤ３６Ｃ＿Ｄ６２６Ｎ、ＳＰＯＰ＿Ｆ１３３Ｌ、ＡＲ＿Ｔ８７８Ａ、ＡＲ＿Ｌ７０２Ｈ、ＡＲ＿Ｗ７４２Ｃ、ＡＲ＿Ｈ８７５ＹおよびＡＲ＿Ｆ８７７Ｌのすべてを含む、実施形態５３に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０６２８】
実施形態５５。抗原性ペプチドが、表５２に示されるペプチドのすべてを含む、実施形態５４に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０６２９】
実施形態５６。抗原性ペプチドが、次の遺伝子：ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＡＧＥＡ４、ＳＴＥＡＰ１、ＲＮＦ４３、ＳＳＸ２、ＳＡＲＴ３、ＰＡＧＥ４、ＰＳＭＡ、およびＰＳＡのすべてによってコードされるタンパク質におけるヘテロクリティック突然変異を含む、実施形態１もしくは２に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株、または、抗原性ペプチドが、次の遺伝子：ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＡＧＥＡ４、ＳＴＥＡＰ１、ＲＮＦ４３、ＳＳＸ２、ＳＡＲＴ３、ＰＡＧＥ４、ＰＳＭＡ、およびＰＳＡのすべてによってコードされるタンパク質におけるヘテロクリティック突然変異を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０６３０】
実施形態５７。抗原性ペプチドが、表５３に示されるペプチドのすべてを含む、実施形態５６に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０６３１】
実施形態５８。抗原性ペプチドが、表５２および５３に示されるペプチドのすべてを含む、実施形態５５または５７に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０６３２】
実施形態５９。反復性がん突然変異を含む抗原性ペプチドのうちの１つまたは複数に、配列番号３１６に示されるリンカーが先行し、ヘテロクリティック突然変異を含む抗原性ペプチドのうちの１つまたは複数に、配列番号８２１〜８２９のうちのいずれか１つに示されるリンカーが先行する、実施形態５８に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０６３３】
実施形態６０。融合ポリペプチドが、配列番号８９３に示される配列を含む、実施形態５９に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０６３４】
実施形態６１．融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株であって、融合ポリペプチドが、２つもしくはそれよりも多くの抗原性ペプチドに融合したＰＥＳＴ含有ペプチドを含み、各抗原性ペプチドが、反復性がん突然変異を含み、抗原性ペプチドのうちの少なくとも２つが、異なる反復性がん突然変異を含み、かつ同じがん関連タンパク質の断片である、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株、または、融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株であって、融合ポリペプチドが、２つもしくはそれよりも多くの抗原性ペプチドに融合したＰＥＳＴ含有ペプチドを含み、抗原性ペプチドのうちの少なくとも２つが、異なる反復性がん突然変異を含み、かつ同じがん関連タンパク質の断片である、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０６３５】
実施形態６２。抗原性ペプチドのうちの少なくとも２つにおける反復性がん突然変異が、同じがん関連タンパク質に由来し、かつ、天然に共存しない、実施形態６１に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０６３６】
実施形態６３。抗原性ペプチドのうちの少なくとも２つが、同じがん関連タンパク質の重複断片である、実施形態６１または６２に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０６３７】
実施形態６４。抗原性ペプチドのうちの少なくとも２つにおける反復性がん突然変異が、同じがん関連タンパク質に由来し、かつがん関連タンパク質の同じアミノ酸残基において生じる、実施形態６３に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０６３８】
実施形態６５。融合ポリペプチドにおける反復性がん突然変異のうちの１つまたは複数が、体細胞ミスセンス突然変異である、実施形態６１から６４のいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０６３９】
実施形態６６。融合ポリペプチドにおける反復性がん突然変異のうちの１つまたは複数が、体細胞フレームシフト突然変異である、実施形態６１から６５のいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０６４０】
実施形態６７。抗原性ペプチドが、次の遺伝子：ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＴＲＩＭ４８、ＰＴＥＮ、ＰＯＬＥ、ＰＧＭ５、ＭＢＯＡＴ２、ＫＩＡＡ２０２６、ＦＢＸＷ７、Ｃ１２ｏｒｆ４、ＺＢＴＢ２０、ＸＹＬＴ２、ＷＮＴ１６、ＵＢＲ５、ＴＧＦＢＲ２、ＳＶＩＬ、ＲＮＦ４３、ＰＬＥＫＨＡ６、ＬＡＲＰ４Ｂ、ＦＨＯＤ３、ＤＯＣＫ３、ＢＭＰＲ２、ＡＲＩＤ１Ａ、ＡＤＡＭ２８およびＡＣＶＲ２Ａのうちの１つもしくは複数またはすべてによってコードされるタンパク質に由来する反復性がん突然変異を含む、実施形態６１から６６のいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０６４１】
実施形態６８。抗原性ペプチドが、次の反復性がん突然変異：ＴＲＩＭ４８＿Ｙ１９２Ｈ、ＰＴＥＮ＿Ｒ１３０Ｎ、ＰＯＬＥ＿Ｖ４１１Ｌ、ＰＯＬＥ＿Ｐ２８６Ｒ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｈ１０４７Ｒ、ＰＩＫ３ＣＡ＿Ｒ８８Ｎ、ＰＧＭ５＿Ｉ９８Ｖ、ＭＢＯＡＴ２＿Ｒ４３Ｎ、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ、ＫＩＡＡ２０２６＿Ｒ５７４Ｃ、ＦＢＸＷ７＿Ｒ４６５Ｃ、Ｃ１２ｏｒｆ４＿Ｒ３３５Ｎ、ＢＲＡＦ＿Ｖ６００Ｅ、ＺＢＴＢ２０＿ｐ．Ｐｒｏ６９２ＬｅｕｆｓＴｅｒ４３、ＸＹＬＴ２＿ｐ．Ｇｌｙ５２９ＡｌａｆｓＴｅｒ７８、ＷＮＴ１６＿ｐ．Ｇｌｙ１６７ＡｌａｆｓＴｅｒ１７、ＵＢＲ５＿ｐ．Ｇｌｕ２１２１ＬｙｓｆｓＴｅｒ２８、ＴＧＦＢＲ２＿ｐ．Ｇｌｕ１５０ＧｌｙｆｓＴｅｒ３５、ＳＶＩＬ＿ｐ．Ｍｅｔ１８６３ＴｒｐｆｓＴｅｒ４４、ＲＮＦ４３＿ｐ．Ｇｌｙ６５９ＶａｌｆｓＴｅｒ４１、ＰＬＥＫＨＡ６＿ｐ．Ｖａｌ３２８ＴｙｒｆｓＴｅｒ１７２、ＬＡＲＰ４Ｂ＿ｐ．Ｔｈｒ１６３ＨｉｓｆｓＴｅｒ４７、ＦＨＯＤ３＿ｐ．Ｓｅｒ３３６ＶａｌｆｓＴｅｒ１３８、ＤＯＣＫ３＿ｐ．Ｐｒｏ１８５２ＧｌｎｆｓＴｅｒ４５、ＢＭＰＲ２＿ｐ．Ａｓｎ５８３ＴｈｒｆｓＴｅｒ４４、ＡＲＩＤ１Ａ＿ｐ．Ａｓｐ１８５０ＴｈｒｆｓＴｅｒ３３、ＡＤＡＭ２８＿ｐ．Ａｓｎ７５ＬｙｓｆｓＴｅｒ１５およびＡＣＶＲ２Ａ＿ｐ．Ｌｙｓ４３５ＧｌｕｆｓＴｅｒ１９のうちの１つもしくは複数またはすべてを含む、実施形態６７に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０６４２】
実施形態６９。抗原性ペプチドが、表１１６に示されるペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべてを含む、実施形態６８に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０６４３】
実施形態７０。融合ポリペプチドが、配列番号９１７のいずれか１つに示される配列を含む、実施形態６９に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０６４４】
実施形態７１。融合ポリペプチドが、２つまたはそれよりも多くの抗原性ペプチドの組合せのＮ末端側および／またはＣ末端側に１つまたは複数のペプチドタグをさらに含み、１つまたは複数のペプチドタグが、ＦＬＡＧタグおよびＳＩＩＮＦＥＫＬタグのうちの一方または両方を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０６４５】
実施形態７２。ＰＥＳＴ含有ペプチドが、融合ポリペプチドのＮ末端にある、先行する実施形態のいずれかに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０６４６】
実施形態７３。ＰＥＳＴ含有ペプチドが、ＬＬＯのＮ末端断片である、実施形態７２に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０６４７】
実施形態７４。ＬＬＯのＮ末端断片が、配列番号３３６に示される配列を有する、実施形態７３に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０６４８】
実施形態７５。核酸が、エピソームプラスミドに存在する、先行する実施形態のいずれかに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０６４９】
実施形態７６。核酸が、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株に抗生物質耐性を与えない、先行する実施形態のいずれかに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０６５０】
実施形態７７。弱毒化栄養要求性Ｌｉｓｔｅｒｉａ株である、先行する実施形態のいずれかに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０６５１】
実施形態７８。弱毒化栄養要求性Ｌｉｓｔｅｒｉａ株が、１つまたは複数の内在性遺伝子に、１つまたは複数の内在性遺伝子を不活性化させる突然変異を含む、実施形態７７に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０６５２】
実施形態７９。１つまたは複数の内在性遺伝子が、ａｃｔＡ、ｄａｌ、およびｄａｔを含む、実施形態７８に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０６５３】
実施形態８０。核酸が、代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームを含む、先行する実施形態のいずれかに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０６５４】
実施形態８１。代謝酵素が、アラニンラセマーゼ酵素またはＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ酵素である、実施形態８０に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０６５５】
実施形態８２。融合ポリペプチドがｈｌｙプロモーターから発現される、先行する実施形態のいずれかに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０６５６】
実施形態８３。組換えＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株である、先行する実施形態のいずれかに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０６５７】
実施形態８４。組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株が、ａｃｔＡ、ｄａｌ、およびｄａｔの欠失、またはこれらにおける不活性化突然変異を含む、弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株であり、核酸が、エピソームプラスミドに存在し、かつアラニンラセマーゼ酵素またはＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームを含み、ＰＥＳＴ含有ペプチドが、ＬＬＯのＮ末端断片である、先行する実施形態のいずれかに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０６５８】
実施形態８５。先行する実施形態のいずれかに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む免疫原性組成物。
【０６５９】
実施形態８６。免疫原性組成物が、２つまたはそれよりも多くの組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株の組合せを含み、各組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株が、異なる抗原性ペプチドセット、または異なる順序における同じ抗原性ペプチドセットを含む、実施形態８５に記載の免疫原性組成物。
【０６６０】
実施形態８７。各組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株が、異なる抗原性ペプチドセットを含む、実施形態８６に記載の免疫原性組成物。
【０６６１】
実施形態８８。組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株の組合せが、約５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、４５〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００、１００〜１２０、１２０〜１４０、１４０〜１６０、１６０〜１８０、１８０〜２００、２００〜２２０、２２０〜２４０、２４０〜２６０、２６０〜２８０、または２８０〜３００個の異なる抗原性ペプチドを含む、実施形態８７に記載の免疫原性組成物。
【０６６２】
実施形態８９。アジュバントをさらに含む、実施形態８５から８８のいずれか１つに記載の免疫原性組成物。
【０６６３】
実施形態９０。アジュバントが、顆粒細胞／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）タンパク質、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド分子、サポニンＱＳ２１、モノホスホリルリピドＡ、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、または解毒リステリオリシンＯタンパク質を含む、実施形態８９に記載の免疫原性組成物。
【０６６４】
実施形態９１。対象において腫瘍またはがんに対する免疫応答を誘導する方法であって、対象に、実施形態１から８４のいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株または実施形態８５から９０のいずれか１つに記載の免疫原性組成物を投与するステップを含む方法。
【０６６５】
実施形態９２。対象において腫瘍またはがんを防止または処置する方法であって、対象に、実施形態１から８４のいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株または実施形態８５から９０のいずれか１つに記載の免疫原性組成物を投与するステップを含む方法。
【０６６６】
実施形態９３。複数の異なる組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株または複数の異なる免疫原性組成物が対象に投与される、実施形態９１または９２に記載の方法。
【０６６７】
実施形態９４。複数の異なる組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株または複数の異なる免疫原性組成物が対象に同時に投与される、実施形態９３に記載の方法。
【０６６８】
実施形態９５。複数の異なる組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株または複数の異なる免疫原性組成物が対象に連続的に投与される、実施形態９３に記載の方法。
【０６６９】
実施形態９６。複数の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株または複数の異なる免疫原性組成物が、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０個の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株または免疫原性組成物を含む、実施形態９３から９５のいずれか１つに記載の方法。
【０６７０】
実施形態９７。対象が、１つまたは複数のがん関連タンパク質における１つまたは複数の反復性がん突然変異に関連するがんを有し、対象に投与される組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株または免疫原性組成物が、がんに関連する１つまたは複数の反復性がん突然変異を含む抗原性ペプチドを含む、実施形態９３から９６のいずれか１つに記載の方法。
【０６７１】
実施形態９８。方法が、投与するステップの前に、対象を１つまたは複数の反復性がん突然変異のうちの少なくとも１つについてスクリーニングして、それを同定するステップを含み、対象に投与される組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株または免疫原性組成物が、対象において同定された１つまたは複数の反復性がん突然変異のうちの少なくとも１つを含む抗原性ペプチドを含む、実施形態９７に記載の方法。
【０６７２】
実施形態９９。投与するステップの前に、対象を反復性がん突然変異についてスクリーニングして、それを同定するステップを含まない、実施形態９７に記載の方法。
【０６７３】
実施形態１００。実施形態１から８４のいずれか１つに記載の１つまたは複数の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む細胞バンク。
【０６７４】
実施形態１０１。冷凍細胞バンクまたは凍結乾燥細胞バンクである、実施形態１００に記載の細胞バンク。
【０６７５】
実施形態１０２。免疫療法構築物を生成する方法であって、
（ａ）免疫療法構築物に含めるための、がん関連タンパク質における反復性がん突然変異セットおよびヘテロクリティック突然変異セットを選択するステップと、
（ｂ）反復性がん突然変異のそれぞれおよびヘテロクリティック突然変異のそれぞれを含む抗原性ペプチドを設計するステップと、
（ｃ）抗原性ペプチドセットを選択するステップであって、各抗原性ペプチドのハイドロパシーを検査すること、および抗原性ペプチドが、選択されたハイドロパシー指数閾値を超えるスコアを有する場合はこれを修飾または選択解除することを含むステップと、
（ｄ）選択された抗原性ペプチドのそれぞれを含む融合ポリペプチドを設計するステップと、
（ｅ）融合ポリペプチドをコードする核酸構築物を生成するステップと
を含む方法。
【０６７６】
実施形態１０３。反復性がん突然変異が、ステップ（ａ）において、次の基準：
（ｉ）複数のタイプのがんまたは特定のタイプのがんにおける発生頻度、
（ｉｉ）がん関連タンパク質の機能的ドメイン内の位置、
（ｉｉｉ）公知のがんドライバー突然変異または化学療法耐性突然変異としてのステータス、および
（ｉｖ）体細胞ミスセンス突然変異または体細胞フレームシフト突然変異としての同定
のうちの１つまたは複数に基づいて選択される、実施形態１０２に記載の方法。
【０６７７】
実施形態１０４。ヘテロクリティック突然変異が、ステップ（ａ）において、次の基準：
（ｉ）次のＨＬＡ型：ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２、およびＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２のうちの１つまたは複数に結合する能力、
（ｉｉ）ＣＤ８＋Ｔリンパ球応答を生成する能力、および
（ｉｉｉ）対応する野生型配列と同等かまたはこれよりも強い特定のＨＬＡ型に対する結合親和性
のうちの１つまたは複数に基づいて選択される、実施形態１０２または１０３に記載の方法。
【０６７８】
実施形態１０５。ステップ（ａ）において選択される反復性がん突然変異セットが、次の基準：
（ｉ）セットが、約３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、もしくは５０個以下の反復性がん突然変異、および／または約３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、もしくは５０個以下のヘテロクリティック突然変異を含むこと、
（ｉｉ）セットが、特定のタイプのがんを有するがん患者の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％において見出される反復性がん突然変異を含むこと、および
（ｉｉｉ）セットが、特定のタイプのがんに由来する、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０個の異なる反復性がん突然変異または反復性体細胞ミスセンス突然変異を含むこと
のうちの１つまたは複数に基づいて選択される、実施形態１０２から１０４のいずれか１つに記載の方法。
【０６７９】
実施形態１０６。反復性がん突然変異を含むようにステップ（ｂ）において設計される各抗原性ペプチドが、反復性がん突然変異および各側の隣接配列を含むがん関連タンパク質の断片を含むように設計される、実施形態１０２から１０５のいずれか１つに記載の方法。
【０６８０】
実施形態１０７。反復性がん突然変異を含む抗原性ペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべてが、反復性がん突然変異の各側に少なくとも約１０個の隣接アミノ酸を含む、実施形態１０６に記載の方法。
【０６８１】
実施形態１０８。ヘテロクリティック突然変異を含む抗原性ペプチドのうちの１つもしくは複数またはすべてが、アンカー位置に好ましいアミノ酸を有するように設計される、実施形態１０２から１０７のいずれか１つに記載の方法。
【０６８２】
実施形態１０９。抗原性ペプチドが、ステップ（ｃ）において、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける分泌可能性を予測する、ハイドロパシー閾値未満の場合に選択される、実施形態１０２から１０８のいずれか１つに記載の方法。
【０６８３】
実施形態１１０。抗原性ペプチドが、ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅのハイドロパシー指数２１アミノ酸ウィンドウによってスコアリングされ、約１．６のカットオフを超えるスコアを有するペプチドはすべて除外されるか、または前記カットオフ未満のスコアを有するように修飾される、実施形態１０９に記載の方法。
【０６８４】
実施形態１１１。ステップ（ｃ）が、対象ＨＬＡに結合する前記抗原性ペプチドの能力に基づいて抗原性ペプチドをスコアリングし選択することをさらに含む、実施形態１０２から１１０のいずれか１つに記載の方法。
【０６８５】
実施形態１１２。ステップ（ｄ）における前記融合ポリペプチド内の抗原性ペプチドの順序が、ランダム化を使用して選択される、実施形態１０２から１１１のいずれか１つに記載の方法。
【０６８６】
実施形態１１３。前記融合ポリペプチドが、約１５０ｋＤａ以下または約１２５ｋＤａ以下の分子量を有するように設計される、実施形態１０２から１１２のいずれか１つに記載の方法。
【０６８７】
実施形態１１４。ステップ（ｄ）が、前記融合ポリペプチドのハイドロパシーを検査すること、および前記融合ポリペプチドのいずれかの領域が選択されたハイドロパシー指数閾値を超えるスコアを有する場合、前記抗原性ペプチドを並べ替えること、または問題がある抗原性ペプチドを除去することのいずれかをさらに含む、実施形態１０２から１１３のいずれか１つに記載の方法。
【０６８８】
実施形態１１５。前記融合ポリペプチドが、スライディング２１アミノ酸ウィンドウを用いてＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅのハイドロパシー指数によりスコアリングされ、前記閾値が約１．６である、実施形態１１４に記載の方法。
【０６８９】
実施形態１１６。ステップ（ｅ）が、前記核酸配列を最適化することをさらに含む、実施形態１０２から１１５のいずれか１つに記載の方法。
【０６９０】
実施形態１１７。前記最適化がコドン最適化を含む、実施形態１１６に記載の方法。
【０６９１】
実施形態１１８。前記核酸をＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株に導入するステップと、コードされた融合ポリペプチドの発現および分泌を確認するステップとをさらに含む、実施形態１０２から１１７のいずれか１つに記載の方法。
【０６９２】
配列の簡単な説明
添付の配列表に列記されるヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、標準的なヌクレオチド塩基の略号およびアミノ酸の三文字コードを使用して示されている。ヌクレオチド配列は、配列の５’末端から始まり３’末端に向かって（すなわち、各行で左から右に）進行する標準的な慣例に従う。各ヌクレオチド配列の１つの鎖しか示されていないが、表示されている鎖のあらゆる参照により相補鎖が含まれるものと理解される。アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が提供されている場合、同じアミノ酸配列をコードするそのコドン縮重バリアントも提供されるものと理解される。アミノ酸配列は、配列のアミノ末端から始まりカルボキシ末端に向かって（すなわち、各行で左から右に）進行する標準的な慣例に従う。
【表１２９−１】
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【表１２９−２】
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【表１２９−３】
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【表１２９−４】
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【表１２９−５】
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【表１２９−６】
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【表１２９−７】
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【表１２９−８】
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【表１２９−９】
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【表１２９−１０】
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【表１２９−１１】
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【表１２９−１２】
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【表１２９−１３】
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【表１２９−１４】
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【表１２９−１５】
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【表１２９−１６】
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【実施例】
【０６９３】
（実施例１）
腫瘍関連タンパク質のためのＡＤＸＳ−ＨＯＴ構築物の設計
本出願人らは、ＡＤＸＳ−ＨＯＴ構築物に前臨床開発努力の焦点を合わせる反復性がん突然変異を有する７種の初期腫瘍関連タンパク質を選択した（表１を参照）。これら７種の腫瘍関連タンパク質は、複数のがん型にわたる多数の患者において一般的に呈される反復性がん突然変異を有するため選択された。産生における他のＡＤＸＳ−ＨＯＴ構築物は、複数のがんにわたり一般的に観察される腫瘍ドライバー、ならびに非小細胞肺がん、結腸直腸がん、乳がん、卵巣がん、頭頸部がんおよびその他のような主要がん型において一般的に観察される追加の突然変異した遺伝子標的を標的とする。
【０６９４】
【表１】
2020513737.tif 000029
【０６９５】
構築物に含まれる反復性がん突然変異毎に、２１アミノ酸長のペプチドを設計した。しかし、一部の場合、２０アミノ酸または２４アミノ酸（例えば、Ｎ末端に隣接する９アミノ酸およびＣ末端に隣接する１０アミノ酸による、またはＮ末端に隣接する１０アミノ酸およびＣ末端に隣接する１３アミノ酸による）等、異なる長さのペプチドが使用された。また、一部の場合、タンパク質において突然変異した残基が互いに極めて接近しているため、２または３種の反復性がん突然変異を含むペプチドが設計された。２３、３７、３９または５３アミノ酸長のかかるペプチドの例は、下に開示されている。
【０６９６】
反復性がん突然変異およびその両側の１０アミノ酸の隣接配列を含む、反復性がん突然変異が発生するがん関連タンパク質の断片となるように、２１ｍｅｒペプチドを設計した。２１アミノ酸ウィンドウによりＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅのハイドロパシー指数によって抗原性ペプチドをスコアリングし、およそ１．６のカットオフを超えるスコアを有するペプチドは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓによって分泌可能である可能性が低いため除外した。ランダム化によって生成される複数の異なる順序でのペプチドにより、構築物を設計した。ペプチドの順序付け毎に、Ｎ末端における３×ＦＬＡＧタグおよびＣ末端におけるＳＩＩＮＦＥＫＬタグにより、またはＣ末端における３×ＦＬＡＧタグおよびＳＩＩＮＦＥＫＬタグにより、構築物を設計した。スライディング２１アミノ酸ウィンドウを用いてＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅのハイドロパシー指数によりペプチドの各順序付けをスコアリングし、ペプチドの特定の順序付けのためのいずれかの領域が、およそ１．６のカットオフを超えるスコアを有する場合、ペプチドの順序付けが、カットオフを超えるスコアを有する領域を持たないポリペプチドをもたらすまで、ペプチドの順序を再度シャッフルした。
【０６９７】
ＢＲＡＦ構築物に関して、８種の反復性がん突然変異が、構築物に含まれた：Ｇ４６６Ｅ；Ｇ４６６Ｖ；Ｇ４６９Ａ；Ｇ４６９Ｒ；Ｇ４６９Ｓ；Ｇ４６９Ｖ；Ｖ６００Ｅ；およびＶ６００Ｋ。参照野生型ＢＲＡＦ配列は、配列番号３６１に表記されている。Ｎ末端からＣ末端への４通りの異なる順序で８種の反復性がん突然変異を含むペプチドにより、構築物を設計した。構築物の配列は、配列番号１〜２４に見出される。配列番号１〜６におけるホットスポット突然変異２１ｍｅｒの順序を次に示す：ＢＲＡＦ｜Ｇ４６９Ｖ；ＢＲＡＦ｜Ｇ４６９Ｒ；ＢＲＡＦ｜Ｖ６００Ｅ；ＢＲＡＦ｜Ｇ４６９Ｓ；ＢＲＡＦ｜Ｇ４６６Ｖ；ＢＲＡＦ｜Ｖ６００Ｋ；ＢＲＡＦ｜Ｇ４６９Ａ；およびＢＲＡＦ｜Ｇ４６６Ｅ。配列番号７〜１２におけるホットスポット突然変異２１ｍｅｒの順序を次に示す：ＢＲＡＦ｜Ｖ６００Ｋ；ＢＲＡＦ｜Ｇ４６９Ｒ；ＢＲＡＦ｜Ｇ４６９Ｖ；ＢＲＡＦ｜Ｇ４６６Ｖ；ＢＲＡＦ｜Ｇ４６６Ｅ；ＢＲＡＦ｜Ｖ６００Ｅ；ＢＲＡＦ｜Ｇ４６９Ａ；およびＢＲＡＦ｜Ｇ４６９Ｓ。配列番号１３〜１８におけるホットスポット突然変異２１ｍｅｒの順序を次に示す：ＢＲＡＦ｜Ｇ４６９Ｖ；ＢＲＡＦ｜Ｖ６００Ｋ；ＢＲＡＦ｜Ｇ４６９Ｓ；ＢＲＡＦ｜Ｇ４６６Ｖ；ＢＲＡＦ｜Ｇ４６９Ａ；ＢＲＡＦ｜Ｖ６００Ｅ；ＢＲＡＦ｜Ｇ４６６Ｅ；およびＢＲＡＦ｜Ｇ４６９Ｒ。配列番号１９〜２４におけるホットスポット突然変異２１ｍｅｒの順序を次に示す：ＢＲＡＦ｜Ｖ６００Ｅ；ＢＲＡＦ｜Ｖ６００Ｋ；ＢＲＡＦ｜Ｇ４６９Ａ；ＢＲＡＦ｜Ｇ４６９Ｓ；ＢＲＡＦ｜Ｇ４６９Ｒ；ＢＲＡＦ｜Ｇ４６９Ｖ；ＢＲＡＦ｜Ｇ４６６Ｖ；およびＢＲＡＦ｜Ｇ４６６Ｅ。構築物に含まれる（includes）抗原性ペプチドの例は、表２に提示する。
【０６９８】
【表２】
2020513737.tif 000030
【０６９９】
ＥＧＦＲ構築物に関して、１６種の反復性がん突然変異が、構築物に含まれた：Ｒ１０８Ｋ；Ａ２８９Ｖ；Ｇ５９８Ｖ；Ｅ７０９Ａ；Ｅ７０９Ｋ；Ｇ７１９Ａ；Ｇ７１９Ｃ；Ｇ７１９Ｓ；Ｌ７４７Ｐ；Ｌ７４７Ｓ；Ｓ７６８Ｉ；Ｔ７９０Ｍ；Ｌ８３３Ｖ／Ｈ８３５Ｌ；Ｔ８３３Ｖ；Ｌ８５８Ｒ；およびＬ８６１Ｑ。参照野生型ＥＧＦＲ配列は、配列番号３６２に表記されている。Ｌ８３３Ｖ／Ｈ８３５ＬおよびＴ８３３Ｖ突然変異によって示される通り、８３３位は、異なる非突然変異バージョンのＥＧＦＲにおいて「Ｈ」または「Ｔ」となることができる。一部の構築物において、次の１６種の反復性がん突然変異が含まれた：Ｒ１０８Ｋ；Ａ２８９Ｖ；Ｇ５９８Ｖ；Ｅ７０９Ａ；Ｅ７０９Ｋ；Ｇ７１９Ａ；Ｇ７１９Ｃ；Ｇ７１９Ｓ；Ｌ７４７Ｐ；Ｌ７４７Ｓ；Ｓ７６８Ｉ；Ｔ７９０Ｍ；Ｌ８３３Ｖ／Ｈ８３５Ｌ；Ｔ８３３Ｖ；Ｌ８５８Ｒ；およびＬ８６１Ｑ。Ｎ末端からＣ末端への４通りの異なる順序で８種の反復性がん突然変異を含むペプチドにより構築物を設計した。これらの構築物の配列は、配列番号２５〜４８に表記されている。配列番号２５〜３０におけるホットスポット突然変異２１ｍｅｒの順序を次に示す：ＥＧＦＲ｜Ｇ７１９Ｓ；ＥＧＦＲ｜Ｌ７４７Ｐ；ＥＧＦＲ｜Ｇ７１９Ｃ；ＥＧＦＲ｜Ｒ１０８Ｋ；ＥＧＦＲ｜Ｓ７６８Ｉ；｛ＥＧＦＲ｜Ｌ８３３Ｖ／Ｈ８３５Ｌ−２３−ｍｅｒ｝；ＥＧＦＲ｜Ｔ８３３Ｖ；ＥＧＦＲ｜Ｅ７０９Ａ；ＥＧＦＲ｜Ｇ５９８Ｖ；ＥＧＦＲ｜Ｔ７９０Ｍ；ＥＧＦＲ｜Ｅ７０９Ｋ；ＥＧＦＲ｜Ａ２８９Ｖ；ＥＧＦＲ｜Ｌ８６１Ｑ；ＥＧＦＲ｜Ｇ７１９Ａ；ＥＧＦＲ｜Ｌ７４７ＳおよびＥＧＦＲ｜Ｌ８５８Ｒ。配列番号３１〜３６におけるホットスポット突然変異２１ｍｅｒの順序を次に示す：ＥＧＦＲ｜Ｔ７９０Ｍ；ＥＧＦＲ｜Ｓ７６８Ｉ；ＥＧＦＲ｜Ｇ７１９Ｃ；ＥＧＦＲ｜Ｒ１０８Ｋ；ＥＧＦＲ｜Ｌ７４７Ｐ；ＥＧＦＲ｜Ｇ７１９Ａ；ＥＧＦＲ｜Ｌ７４７Ｓ；ＥＧＦＲ｜Ｅ７０９Ｋ；ＥＧＦＲ｜Ｔ８３３Ｖ；ＥＧＦＲ｜Ｌ８６１Ｑ；ＥＧＦＲ｜Ｅ７０９Ａ；ＥＧＦＲ｜Ｌ８５８Ｒ；ＥＧＦＲ｜Ｇ５９８Ｖ；ＥＧＦＲ｜Ａ２８９Ｖ；｛ＥＧＦＲ｜Ｌ８３３Ｖ／Ｈ８３５Ｌ−２３−ｍｅｒ｝およびＥＧＦＲ｜Ｇ７１９Ｓ。配列番号３７〜４２におけるホットスポット突然変異２１ｍｅｒの順序を次に示す：ＥＧＦＲ｜Ｒ１０８Ｋ；ＥＧＦＲ｜Ｔ８３３Ｖ；ＥＧＦＲ｜Ｌ７４７Ｓ；ＥＧＦＲ｜Ｔ７９０Ｍ；ＥＧＦＲ｜Ｇ７１９Ｃ；ＥＧＦＲ｜Ａ２８９Ｖ；ＥＧＦＲ｜Ｌ８５８Ｒ；ＥＧＦＲ｜Ｅ７０９Ａ；ＥＧＦＲ｜Ｇ７１９Ｓ；ＥＧＦＲ｜Ｅ７０９Ｋ；ＥＧＦＲ｜Ｇ７１９Ａ；ＥＧＦＲ｜Ｌ７４７Ｐ；ＥＧＦＲ｜Ｇ５９８Ｖ；ＥＧＦＲ｜Ｌ８６１Ｑ；ＥＧＦＲ｜Ｓ７６８Ｉおよび｛ＥＧＦＲ｜Ｌ８３３Ｖ／Ｈ８３５Ｌ−２３−ｍｅｒ｝。配列番号４３〜４８におけるホットスポット突然変異２１ｍｅｒの順序を次に示す：ＥＧＦＲ｜Ｇ７１９Ａ；ＥＧＦＲ｜Ｌ８５８Ｒ；ＥＧＦＲ｜Ｇ７１９Ｃ；ＥＧＦＲ｜Ａ２８９Ｖ；ＥＧＦＲ｜Ｔ７９０Ｍ；ＥＧＦＲ｜Ｓ７６８Ｉ；ＥＧＦＲ｜Ｔ８３３Ｖ；ＥＧＦＲ｜Ｇ５９８Ｖ；ＥＧＦＲ｜Ｇ７１９Ｓ；ＥＧＦＲ｜Ｌ７４７Ｓ；ＥＧＦＲ｜Ｌ７４７Ｐ；｛ＥＧＦＲ｜Ｌ８３３Ｖ／Ｈ８３５Ｌ−２３−ｍｅｒ｝；ＥＧＦＲ｜Ｅ７０９Ａ；ＥＧＦＲ｜Ｒ１０８Ｋ；ＥＧＦＲ｜Ｌ８６１ＱおよびＥＧＦＲ｜Ｅ７０９Ｋ。他のＥＧＦＲ構築物において、次の１１種の反復性がん突然変異が含まれた：Ａ２８９Ｖ；Ｇ５９８Ｖ；Ｅ７０９Ｋ；Ｇ７１９Ａ；Ｇ７１９Ｃ；Ｇ７１９Ｓ；Ｓ７６８Ｉ；Ｔ７９０Ｍ；Ｌ８３３Ｖ／Ｈ８３５Ｌ；Ｌ８５８Ｒ；およびＬ８６１Ｑ。これらの構築物の配列は、配列番号２２９〜２３５に表記されている。配列番号２２９〜２３５におけるホットスポット突然変異２１ｍｅｒの順序を次に示す：ＥＧＦＲ｜Ａ２８９Ｖ；ＥＧＦＲ｜Ｇ５９８Ｖ；ＥＧＦＲ｜Ｅ７０９Ｋ；ＥＧＦＲ｜Ｇ７１９Ａ；ＥＧＦＲ｜Ｓ７６８Ｉ；ＥＧＦＲ｜Ｇ７１９Ｓ；ＥＧＦＲ｜Ｌ８６１Ｑ；ＥＧＦＲ｜Ｔ７９０Ｍ；ＥＧＦＲ｜Ｇ７１９Ｃ；｛ＥＧＦＲ｜Ｌ８３３Ｖ／Ｈ８３５Ｌ  −  ２３ｍｅｒ｝；およびＥＧＦＲ｜Ｌ８５８Ｒ。構築物に含まれる抗原性ペプチドの例は、表３に提示する。
【０７００】
【表３−１】
2020513737.tif 000031
【表３−２】
2020513737.tif 000032
【０７０１】
ＰＩＫ３ＣＡ構築物の一部に関して、２５種の反復性がん突然変異が、構築物に含まれた：Ｒ３８Ｃ；Ｒ３８Ｈ；Ｅ８１Ｋ；Ｒ８８Ｑ；Ｒ９３Ｑ；Ｒ９３Ｗ；Ｒ１０８Ｈ；Ｇ１１８Ｄ；Ｌ３３４Ｇ；Ｎ３４５Ｋ；Ｃ４２０Ｒ；Ｅ４５３Ｋ；Ｅ５４２Ｋ；Ｅ５４５Ａ；Ｅ５４５Ｇ；Ｅ５４５Ｋ；Ｅ５４５Ｑ；Ｑ５４６Ｋ；Ｑ５４６Ｒ；Ｅ７２６Ｋ；Ｍ１０４３Ｉ；Ｍ１０４３Ｖ；Ｈ１０４７Ｌ；Ｈ１０４７ＲおよびＧ１０４９Ｒ。野生型ＰＩＫ３ＣＡ参照配列は、配列番号３６３に表記されている。Ｎ末端からＣ末端への４通りの異なる順序で２５種の反復性がん突然変異を含むペプチドにより、構築物を設計した。構築物の配列は、配列番号４９〜７２に見出される。配列番号４９〜５４におけるホットスポット突然変異２１ｍｅｒの順序を次に示す：ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｍ１０４３Ｖ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ｇ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ７２６Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｑ５４６Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｌ３３４Ｇ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｇ１０４９Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｍ１０４３Ｉ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｑ５４６Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４２Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ９３Ｑ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｈ１０４７Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ１０８Ｈ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ９３Ｗ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ８１Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ３８Ｈ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｎ３４５Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ８８Ｑ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｇ１１８Ｄ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ｑ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｈ１０４７Ｌ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ａ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ４５３Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ３８ＣおよびＰＩＫ３ＣＡ｜Ｃ４２０Ｒ。配列番号５５〜６０におけるホットスポット突然変異２１ｍｅｒの順序を次に示す：ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ７２６Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ８１Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｍ１０４３Ｖ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ａ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ３８Ｃ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｇ１１８Ｄ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ９３Ｗ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ｇ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４２Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｇ１０４９Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｎ３４５Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｑ５４６Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ４５３Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｃ４２０Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｈ１０４７Ｌ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｌ３３４Ｇ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ｑ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ８８Ｑ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｈ１０４７Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｍ１０４３Ｉ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ９３Ｑ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ１０８Ｈ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｑ５４６ＲおよびＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ３８Ｈ。配列番号６１〜６６におけるホットスポット突然変異２１ｍｅｒの順序を次に示す：ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ１０８Ｈ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｍ１０４３Ｖ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ８８Ｑ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ９３Ｗ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ３８Ｈ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｈ１０４７Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｍ１０４３Ｉ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｑ５４６Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４２Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｎ３４５Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ３８Ｃ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ｇ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ８１Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｑ５４６Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ９３Ｑ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ４５３Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｇ１０４９Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ａ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｃ４２０Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｈ１０４７Ｌ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｌ３３４Ｇ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｇ１１８Ｄ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ７２６ＫおよびＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ｑ。配列番号６７〜７２におけるホットスポット突然変異２１ｍｅｒの順序を次に示す：ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｎ３４５Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ３８Ｈ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｇ１０４９Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｈ１０４７Ｌ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ７２６Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ８８Ｑ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ８１Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ９３Ｑ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ｑ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｌ３３４Ｇ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ３８Ｃ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｈ１０４７Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｃ４２０Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ９３Ｗ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｑ５４６Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｍ１０４３Ｖ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｍ１０４３Ｉ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ｇ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ａ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｇ１１８Ｄ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ４５３Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｑ５４６Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ１０８ＨおよびＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４２Ｋ。他のＰＩＫ３ＣＡ構築物において、１７種の反復性がん突然変異が、構築物に含まれた：Ｒ３８Ｈ；Ｅ８１Ｋ；Ｒ８８Ｑ；Ｒ１０８Ｈ；Ｇ１１８Ｄ；Ｎ３４５Ｋ；Ｃ４２０Ｒ；Ｅ５４２Ｋ；Ｅ５４５Ａ；Ｅ５４５Ｇ；Ｅ５４５Ｋ；Ｑ５４６Ｋ；Ｑ５４６Ｒ；Ｍ１０４３Ｉ；Ｈ１０４７Ｌ；Ｈ１０４７ＲおよびＧ１０４９Ｒ。構築物の配列は、配列番号２３６〜２４２に見出される。配列番号２３６〜２４２におけるホットスポット突然変異２１ｍｅｒの順序を次に示す：ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４２Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ８８Ｑ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ａ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｈ１０４７Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ｇ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｈ１０４７Ｌ；｛ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｑ５４６Ｋ  −  ２０−ｍｅｒ｝；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ３８Ｈ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ８１Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ１０８Ｈ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｎ３４５Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｃ４２０Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｑ５４６Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｍ１０４３Ｉ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｇ１１８ＤおよびＰＩＫ３ＣＡ｜Ｇ１０４９Ｒ。他のＰＩＫ３ＣＡ構築物において、８種の反復性がん突然変異が、構築物に含まれた：Ｒ８８Ｑ；Ｅ５４２Ｋ；Ｅ５４５Ａ；Ｅ５４５Ｇ；Ｅ５４５Ｋ；Ｑ５４６Ｋ；Ｈ１０４７Ｌ；およびＨ１０４７。構築物の配列は、配列番号２４３〜２４９に見出される。配列番号２４３〜２４９におけるホットスポット突然変異２１ｍｅｒの順序を次に示す：ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４２Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ８８Ｑ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ａ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｈ１０４７Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ｇ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｈ１０４７Ｌおよび｛ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｑ５４６Ｋ  −  ２０−ｍｅｒ｝。他のＰＩＫ３ＣＡ構築物において、９種の反復性がん突然変異が、構築物に含まれた：Ｒ３８Ｈ；Ｅ８１Ｋ；Ｒ１０８Ｈ；Ｇ１１８Ｄ；Ｎ３４５Ｋ；Ｃ４２０Ｒ；Ｑ５４６Ｒ；Ｍ１０４３Ｉ；およびＧ１０４９Ｒ。構築物の配列は、配列番号２５０〜２５６に見出される。配列番号２５０〜２５６におけるホットスポット突然変異２１ｍｅｒの順序を次に示す：ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ３８Ｈ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ８１Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ１０８Ｈ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｎ３４５Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｃ４２０Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｑ５４６Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｍ１０４３Ｉ；ＰＩＫ���ＣＡ｜Ｇ１１８ＤおよびＰＩＫ３ＣＡ｜Ｇ１０４９Ｒ。構築物に含まれる抗原性ペプチドの例は、表４に提示する。
【０７０２】
【表４】
2020513737.tif 000033
【０７０３】
ＰＩＫ３Ｒ１構築物に関して、３種の反復性がん突然変異が、構築物に含まれた：Ｇ３７６Ｒ；Ｎ５６４Ｄ；およびＫ５６７Ｅ。野生型ＰＩＫ３Ｒ１参照配列は、配列番号３６４に表記されている。Ｎ末端からＣ末端への２通りの異なる順序で３種の反復性がん突然変異を含むペプチドにより、構築物を設計した。これらの構築物の配列は、配列番号７３〜８４に表記されている。配列番号７３〜７８におけるホットスポット突然変異２１ｍｅｒの順序を次に示す：ＰＩＫ３Ｒ１｜Ｇ３７６Ｒ；ＰＩＫ３Ｒ１｜Ｎ５６４Ｄ；およびＰＩＫ３Ｒ１｜Ｋ５６７Ｅ。配列番号７９〜８４におけるホットスポット突然変異２１ｍｅｒの順序を次に示す：ＰＩＫ３Ｒ１｜Ｎ５６４Ｄ；ＰＩＫ３Ｒ１｜Ｋ５６７Ｅ；およびＰＩＫ３Ｒ１｜Ｇ３７６Ｒ。構築物に含まれる抗原性ペプチドの例は、表５に提示する。
【０７０４】
【表５】
2020513737.tif 000034
【０７０５】
ＰＩＫ３ＣＡ／ＰＩＫ３Ｒ１組合せ構築物に関して、２８種の反復性がん突然変異が、構築物に含まれた：ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ３８Ｃ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ３８Ｈ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ８１Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ８８Ｑ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ９３Ｑ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ９３Ｗ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ１０８Ｈ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｇ１１８Ｄ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｌ３３４Ｇ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｎ３４５Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｃ４２０Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ４５３Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４２Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ａ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ｇ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ｑ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｑ５４６Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｑ５４６Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ７２６Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｍ１０４３Ｉ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｍ１０４３Ｖ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｈ１０４７Ｌ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｈ１０４７Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｇ１０４９Ｒ；ＰＩＫ３Ｒ１｜Ｇ３７６Ｒ；ＰＩＫ３Ｒ１｜Ｎ５６４ＤおよびＰＩＫ３Ｒ１｜Ｋ５６７Ｅ。Ｎ末端からＣ末端への４通りの異なる順序で２８種の反復性がん突然変異を含むペプチドにより、構築物を設計した。これらの構築物の配列は、配列番号８５〜１０８に表記されている。配列番号８５〜９０におけるホットスポット突然変異２１ｍｅｒの順序を次に示す：ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ３８Ｃ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｎ３４５Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ７２６Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ４５３Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ９３Ｑ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｈ１０４７Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ａ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｍ１０４３Ｖ；ＰＩＫ３Ｒ１｜Ｎ５６４Ｄ；ＰＩＫ３Ｒ１｜Ｋ５６７Ｅ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ８１Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ１０８Ｈ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｑ５４６Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｑ５４６Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ｑ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｇ１０４９Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｃ４２０Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｈ１０４７Ｌ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ９３Ｗ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ８８Ｑ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｍ１０４３Ｉ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ｇ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｇ１１８Ｄ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ３８Ｈ；ＰＩＫ３Ｒ１｜Ｇ３７６Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４２Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５ＫおよびＰＩＫ３ＣＡ｜Ｌ３３４Ｇ。配列番号９１〜９６におけるホットスポット突然変異２１ｍｅｒの順序を次に示す：ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ３８Ｃ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ１０８Ｈ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｃ４２０Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ９３Ｑ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ４５３Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｍ１０４３Ｖ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｈ１０４７Ｌ；ＰＩＫ３Ｒ１｜Ｎ５６４Ｄ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ７２６Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｇ１１８Ｄ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｑ５４６Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｑ５４６Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４２Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｇ１０４９Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｍ１０４３Ｉ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｌ３３４Ｇ；ＰＩＫ３Ｒ１｜Ｋ５６７Ｅ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ３８Ｈ；ＰＩＫ３Ｒ１｜Ｇ３７６Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ９３Ｗ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｈ１０４７Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ｇ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ８１Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ８８Ｑ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｎ３４５Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５ＡおよびＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ｑ。配列番号９７〜１０２におけるホットスポット突然変異２１ｍｅｒの順序を次に示す：ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ１０８Ｈ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｍ１０４３Ｖ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ８８Ｑ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ９３Ｗ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ３８Ｈ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｈ１０４７Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｍ１０４３Ｉ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｑ５４６Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４２Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｎ３４５Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ３８Ｃ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ｇ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ８１Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｑ５４６Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ９３Ｑ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ４５３Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｇ１０４９Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ａ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｃ４２０Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｈ１０４７Ｌ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｌ３３４Ｇ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｇ１１８Ｄ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ７２６ＫおよびＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ｑ。配列番号１０３〜１０８におけるホットスポット突然変異２１ｍｅｒの順序を次に示す：ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ｑ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ９３Ｗ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｈ１０４７Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｇ１０４９Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｎ３４５Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｑ５４６Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ４５３Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｌ３３４Ｇ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｈ１０４７Ｌ；ＰＩＫ３Ｒ１｜Ｇ３７６Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｍ１０４３Ｖ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ８８Ｑ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ３８Ｈ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｇ１１８Ｄ；ＰＩＫ３Ｒ１｜Ｋ５６７Ｅ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ３８Ｃ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４２Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｑ５４６Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ７２６Ｋ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｃ４２０Ｒ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５Ａ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ９３Ｑ；ＰＩＫ３Ｒ１｜Ｎ５６４Ｄ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｒ１０８Ｈ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｍ１０４３Ｉ；ＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ５４５ＧおよびＰＩＫ３ＣＡ｜Ｅ８１Ｋ。
【０７０６】
ＰＴＥＮ構築物に関して、１３種の反復性がん突然変異が、構築物に含まれた：Ｙ６８Ｈ；Ｙ８８Ｃ；Ｄ９２Ｅ；ｄｅｌ１２１−１３１；Ｒ１３０Ｇ；Ｒ１３０Ｌ；Ｒ１３０Ｐ；Ｒ１３０Ｑ；Ｃ１３６Ｙ；Ｒ１４２Ｗ；Ｙ１５５Ｃ；Ｒ１７３Ｈ；およびＰ２４６Ｌ。野生型ＰＴＥＮ参照配列は、配列番号３６５に表記されている。Ｎ末端からＣ末端への４通りの異なる順序で１３種の反復性がん突然変異を含むペプチドにより構築物を設計した。これらの構築物の配列は、配列番号１０９〜１３２に表記されている。配列番号１０９〜１１４におけるホットスポット突然変異２１ｍｅｒの順序を次に示す：ＰＴＥＮ｜ｄｅｌｔａ１２１−１３１；ＰＴＥＮ｜Ｙ８８Ｃ；ＰＴＥＮ｜Ｒ１３０Ｇ；ＰＴＥＮ｜Ｙ１５５Ｃ；ＰＴＥＮ｜Ｄ９２Ｅ；ＰＴＥＮ｜Ｃ１３６Ｙ；ＰＴＥＮ｜Ｒ１３０Ｑ；ＰＴＥＮ｜Ｙ６８Ｈ；ＰＴＥＮ｜Ｒ１４２Ｗ；ＰＴＥＮ｜Ｒ１７３Ｈ；ＰＴＥＮ｜Ｒ１３０Ｌ；ＰＴＥＮ｜Ｒ１３０Ｐ；およびＰＴＥＮ｜Ｐ２４６Ｌ。配列番号１１５〜１２０におけるホットスポット突然変異２１ｍｅｒの順序を次に示す：ＰＴＥＮ｜Ｒ１３０Ｐ；ＰＴＥＮ｜Ｒ１３０Ｇ；ＰＴＥＮ｜Ｙ１５５Ｃ；ＰＴＥＮ｜Ｒ１３０Ｌ；ＰＴＥＮ｜Ｃ１３６Ｙ；ＰＴＥＮ｜ｄｅｌｔａ１２１−１３１；ＰＴＥＮ｜Ｐ２４６Ｌ；ＰＴＥＮ｜Ｄ９２Ｅ；ＰＴＥＮ｜Ｒ１７３Ｈ；ＰＴＥＮ｜Ｙ６８Ｈ；ＰＴＥＮ｜Ｒ１３０Ｑ；ＰＴＥＮ｜Ｙ８８Ｃ；およびＰＴＥＮ｜Ｒ１４２Ｗ。配列番号１２１〜１２６におけるホットスポット突然変異２１ｍｅｒの順序を次に示す：ＰＴＥＮ｜Ｒ１３０Ｑ；ＰＴＥＮ｜Ｒ１３０Ｇ；ＰＴＥＮ｜ｄｅｌｔａ１２１−１３１；ＰＴＥＮ｜Ｃ１３６Ｙ；ＰＴＥＮ｜Ｒ１３０Ｌ；ＰＴＥＮ｜Ｐ２４６Ｌ；ＰＴＥＮ｜Ｙ１５５Ｃ；ＰＴＥＮ｜Ｄ９２Ｅ；ＰＴＥＮ｜Ｒ１４２Ｗ；ＰＴＥＮ｜Ｒ１３０Ｐ；ＰＴＥＮ｜Ｙ８８Ｃ；ＰＴＥＮ｜Ｙ６８Ｈ；およびＰＴＥＮ｜Ｒ１７３Ｈ。配列番号１２７〜１３２におけるホットスポット突然変異２１ｍｅｒの順序を次に示す：ＰＴＥＮ｜ｄｅｌｔａ１２１−１３１；ＰＴＥＮ｜Ｃ１３６Ｙ；ＰＴＥＮ｜Ｙ６８Ｈ；ＰＴＥＮ｜Ｒ１４２Ｗ；ＰＴＥＮ｜Ｒ１７３Ｈ；ＰＴＥＮ｜Ｒ１３０Ｌ；ＰＴＥＮ｜Ｐ２４６Ｌ；ＰＴＥＮ｜Ｒ１３０Ｇ；ＰＴＥＮ｜Ｒ１３０Ｐ；ＰＴＥＮ｜Ｙ８８Ｃ；ＰＴＥＮ｜Ｄ９２Ｅ；ＰＴＥＮ｜Ｒ１３０Ｑ；およびＰＴＥＮ｜Ｙ１５５Ｃ。構築物に含まれる抗原性ペプチドの例は、表６に提示する。
【０７０７】
【表６】
2020513737.tif 000035
【０７０８】
ＫＲＡＳ構築物に関して、２０種の反復性がん突然変異が、構築物に含まれた：Ｇ１２Ａ；Ｇ１２Ｃ；Ｇ１２Ｄ；Ｇ１２Ｒ；Ｇ１２Ｓ；Ｇ１２Ｖ；Ｇ１３Ｃ；Ｇ１３Ｄ；Ｇ１３Ｒ；Ｇ１３Ｓ；Ｇ１３Ｖ；Ｌ１９Ｆ；Ｑ６１Ｋ；Ｑ６１Ｈ；Ｑ６１Ｌ；Ｑ６１Ｒ；Ｋ１１７Ｎ；Ａ１４６Ｔ；Ａ１４６Ｖ，  ａｎｄ  Ａ１６４Ｇ。野生型ＫＲＡＳ参照配列は、配列番号３６６に表記されている。Ｎ末端からＣ末端への４通りの異なる順序で２０種の反復性がん突然変異を含むペプチドにより、構築物を設計した。これらの構築物の配列は、配列番号１３３〜１５６に表記されている。配列番号１３３〜１３８におけるホットスポット突然変異２１ｍｅｒの順序を次に示す：ＫＲＡＳ｜Ｑ６１Ｒ；ＫＲＡＳ｜Ｑ６１Ｋ；ＫＲＡＳ｜Ｑ６１Ｌ；ＫＲＡＳ｜Ｑ６１Ｈ；ＫＲＡＳ｜Ｌ１９Ｆ；ＫＲＡＳ｜Ｋ１１７Ｎ；ＫＲＡＳ｜Ｇ１２Ａ；ＫＲＡＳ｜Ａ１６４Ｇ；ＲＡＳ｜Ｇ１２Ｄ；ＫＲＡＳ｜Ｇ１３Ｄ；ＫＲＡＳ｜Ｇ１３Ｓ；ＫＲＡＳ｜Ｇ１２Ｓ；ＫＲＡＳ｜Ａ１４６Ｖ；ＫＲＡＳ｜Ｇ１３Ｒ；ＫＲＡＳ｜Ｇ１３Ｃ；ＫＲＡＳ｜Ｇ１２Ｃ；ＫＲＡＳ｜Ｇ１２Ｒ；ＫＲＡＳ｜Ｇ１３Ｖ；ＫＲＡＳ｜Ｇ１２ＶおよびＫＲＡＳ｜Ａ１４６Ｔ。配列番号１３９〜１４４におけるホットスポット突然変異２１ｍｅｒの順序を次に示す：ＫＲＡＳ｜Ｑ６１Ｈ；ＫＲＡＳ｜Ｋ１１７Ｎ；ＫＲＡＳ｜Ｇ１３Ｃ；ＫＲＡＳ｜Ｇ１３Ｒ；ＫＲＡＳ｜Ｇ１２Ｄ；ＫＲＡＳ｜Ｇ１２Ｓ；ＫＲＡＳ｜Ｇ１２Ｖ；ＫＲＡＳ｜Ｇ１２Ａ；ＫＲＡＳ｜Ｑ６１Ｋ；ＫＲＡＳ｜Ｇ１３Ｖ；ＫＲＡＳ｜Ｇ１２Ｃ；ＫＲＡＳ｜Ｌ１９Ｆ；ＫＲＡＳ｜Ｑ６１Ｒ；ＫＲＡＳ｜Ｑ６１Ｌ；ＫＲＡＳ｜Ａ１４６Ｖ；ＫＲＡＳ｜Ａ１６４Ｇ；ＫＲＡＳ｜Ｇ１２Ｒ；ＫＲＡＳ｜Ｇ１３Ｓ；ＫＲＡＳ｜Ａ１４６ＴおよびＫＲＡＳ｜Ｇ１３Ｄ。配列番号１４５〜１５０におけるホットスポット突然変異２１ｍｅｒの順序を次に示す：ＫＲＡＳ｜Ｇ１２Ｄ；ＫＲＡＳ｜Ｌ１９Ｆ；ＫＲＡＳ｜Ａ１４６Ｖ；ＫＲＡＳ｜Ｑ６１Ｈ；ＫＲＡＳ｜Ｇ１２Ｖ；ＫＲＡＳ｜Ａ１６４Ｇ；ＫＲＡＳ｜Ｇ１２Ｃ；ＫＲＡＳ｜Ｑ６１Ｌ；ＫＲＡＳ｜Ａ１４６Ｔ；ＫＲＡＳ｜Ｇ１３Ｓ；ＫＲＡＳ｜Ｇ１２Ａ；ＫＲＡＳ｜Ｇ１３Ｖ；ＫＲＡＳ｜Ｇ１３Ｃ；ＫＲＡＳ｜Ｇ１３Ｄ；ＫＲＡＳ｜Ｇ１２Ｒ；ＫＲＡＳ｜Ｇ１２Ｓ；ＫＲＡＳ｜Ｑ６１Ｒ；ＫＲＡＳ｜Ｑ６１Ｋ；ＫＲＡＳ｜Ｇ１３ＲおよびＫＲＡＳ｜Ｋ１１７Ｎ。配列番号１５１〜１５６におけるホットスポット突然変異２１ｍｅｒの順序を次に示す：ＫＲＡＳ｜Ｇ１３Ｖ；ＫＲＡＳ｜Ｇ１３Ｓ；ＫＲＡＳ｜Ｇ１２Ｖ；ＫＲＡＳ｜Ｇ１２Ｒ；ＫＲＡＳ｜Ａ１４６Ｖ；ＫＲＡＳ｜Ｇ１３Ｄ；ＫＲＡＳ｜Ｇ１２Ｄ；ＫＲＡＳ｜Ｋ１１７Ｎ；ＫＲＡＳ｜Ｑ６１Ｈ；ＫＲＡＳ｜Ｇ１２Ｃ；ＫＲＡＳ｜Ｇ１３Ｃ；ＫＲＡＳ｜Ａ１４６Ｔ；ＫＲＡＳ｜Ｇ１２Ａ；ＫＲＡＳ｜Ｑ６１Ｌ；ＫＲＡＳ｜Ｑ６１Ｋ；ＫＲＡＳ｜Ａ１６４Ｇ；ＫＲＡＳ｜Ｇ１２Ｓ；ＫＲＡＳ｜Ｌ１９Ｆ；ＫＲＡＳ｜Ｇ１３ＲおよびＫＲＡＳ｜Ｑ６１Ｒ。構築物に含まれる抗原性ペプチドの例は、表７に提示する。
【０７０９】
【表７】
2020513737.tif 000036
【０７１０】
ＴＰ５３構築物の一部に関して、３３種の反復性がん突然変異が、構築物に含まれた：Ｙ１０７Ｄ；Ｋ１３２Ｎ；Ｃ１４１Ｙ；Ｖ１４３Ａ；Ｖ１５７Ｆ；Ｙ１６３Ｃ；Ｒ１７５Ｈ；Ｃ１７６Ｆ；Ｃ１７６Ｙ；Ｈ１７９Ｒ；Ｈ１７９Ｗ；Ｈ１９３Ｒ；Ｉ１９５Ｔ；Ｖ２１６Ｍ；Ｙ２２０Ｃ；Ｙ２３４Ｃ；Ｙ２３４Ｈ；Ｓ２４１Ｆ；Ｓ２４２Ｆ；Ｇ２４５Ｄ；Ｇ２４５Ｓ；Ｒ２４８Ｌ；Ｒ２４８Ｑ；Ｒ２４８Ｗ；Ｒ２４９Ｓ；Ｒ２７３Ｃ；Ｒ２７３Ｈ；Ｒ２７３Ｌ；Ｐ２７８Ｌ；Ｐ２７８Ｓ；Ｒ２８２Ｇ；Ｒ２８２ＷおよびＲ３３７Ｈ。野生型ＴＰ５３参照配列は、配列番号３６７に表記されている。Ｎ末端からＣ末端への４通りの異なる順序で３３種の反復性がん突然変異を含むペプチドにより、構築物を設計した。これらの構築物の配列は、配列番号１５７〜１８０に表記されている。配列番号１５７〜１６２におけるホットスポット突然変異２１ｍｅｒの順序を次に示す：ＴＰ５３｜Ｈ１７９Ｗ；ＴＰ５３｜Ｒ２７３Ｌ；ＴＰ５３｜Ｒ２４９Ｓ；ＴＰ５３｜Ｒ２４８Ｑ；ＴＰ５３｜Ｙ２３４Ｈ；ＴＰ５３｜Ｇ２４５Ｄ；ＴＰ５３｜Ｙ２２０Ｃ；ＴＰ５３｜Ｒ２４８Ｌ；ＴＰ５３｜Ｈ１９３Ｒ；ＴＰ５３｜Ｋ１３２Ｎ；ＴＰ５３｜Ｓ２４２Ｆ；ＴＰ５３｜Ｙ２３４Ｃ；ＴＰ５３｜Ｇ２４５Ｓ；ＴＰ５３｜Ｃ１７６Ｆ；ＴＰ５３｜Ｒ２８２Ｗ；ＴＰ５３｜Ｒ２７３Ｈ；ＴＰ５３｜Ｒ２８２Ｇ；ＴＰ５３｜Ｃ１４１Ｙ；ＴＰ５３｜Ｒ２７３Ｃ；ＴＰ５３｜Ｖ２１６Ｍ；ＴＰ５３｜Ｒ３３７Ｈ；ＴＰ５３｜Ｒ２４８Ｗ；ＴＰ５３｜Ｖ１４３Ａ；ＴＰ５３｜Ｉ１９５Ｔ；ＴＰ５３｜Ｐ２７８Ｓ；ＴＰ５３｜Ｓ２４１Ｆ；ＴＰ５３｜Ｃ１７６Ｙ；ＴＰ５３｜Ｙ１０７Ｄ；ＴＰ５３｜Ｒ１７５Ｈ；ＴＰ５３｜Ｈ１７９Ｒ；ＴＰ５３｜Ｖ１５７Ｆ；ＴＰ５３｜Ｐ２７８ＬおよびＴＰ５３｜Ｙ１６３Ｃ。配列番号１６３〜１６８におけるホットスポット突然変異２１ｍｅｒの順序を次に示す：ＴＰ５３｜Ｒ２４８Ｗ；ＴＰ５３｜Ｒ２４８Ｌ；ＴＰ５３｜Ｙ２２０Ｃ；ＴＰ５３｜Ｙ１６３Ｃ；ＴＰ５３｜Ｇ２４５Ｄ；ＴＰ５３｜Ｙ１０７Ｄ；ＴＰ５３｜Ｈ１７９Ｒ；ＴＰ５３｜Ｖ２１６Ｍ；ＴＰ５３｜Ｐ２７８Ｓ；ＴＰ５３｜Ｓ２４１Ｆ；ＴＰ５３｜Ｒ２７３Ｌ；ＴＰ５３｜Ｐ２７８Ｌ；ＴＰ５３｜Ｃ１７６Ｆ；ＴＰ５３｜Ｃ１４１Ｙ；ＴＰ５３｜Ｓ２４２Ｆ；ＴＰ５３｜Ｒ２４９Ｓ；ＴＰ５３｜Ｖ１４３Ａ；ＴＰ５３｜Ｉ１９５Ｔ；ＴＰ５３｜Ｒ２７３Ｈ；ＴＰ５３｜Ｒ２７３Ｃ；ＴＰ５３｜Ｒ２８２Ｇ；ＴＰ５３｜Ｈ１７９Ｗ；ＴＰ５３｜Ｒ１７５Ｈ；ＴＰ５３｜Ｒ２４８Ｑ；ＴＰ５３｜Ｇ２４５Ｓ；ＴＰ５３｜Ｈ１９３Ｒ；ＴＰ５３｜Ｒ３３７Ｈ；ＴＰ５３｜Ｒ２８２Ｗ；ＴＰ５３｜Ｙ２３４Ｃ；ＴＰ５３｜Ｖ１５７Ｆ；ＴＰ５３｜Ｙ２３４Ｈ；ＴＰ５３｜Ｃ１７６ＹおよびＴＰ５３｜Ｋ１３２Ｎ。配列番号１６９〜１７４におけるホットスポット突然変異２１ｍｅｒの順序を次に示す：ＴＰ５３｜Ｒ２４８Ｗ；ＴＰ５３｜Ｈ１７９Ｒ；ＴＰ５３｜Ｒ２７３Ｈ；ＴＰ５３｜Ｙ１０７Ｄ；ＴＰ５３｜Ｒ３３７Ｈ；ＴＰ５３｜Ｒ２８２Ｇ；ＴＰ５３｜Ｖ１５７Ｆ；ＴＰ５３｜Ｖ１４３Ａ；ＴＰ５３｜Ｙ２３４Ｈ；ＴＰ５３｜Ｙ２２０Ｃ；ＴＰ５３｜Ｒ２８２Ｗ；ＴＰ５３｜Ｒ２４８Ｌ；ＴＰ５３｜Ｓ２４１Ｆ；ＴＰ５３｜Ｈ１７９Ｗ；ＴＰ５３｜Ｒ２７３Ｃ；ＴＰ５３｜Ｃ１４１Ｙ；ＴＰ５３｜Ｒ２４９Ｓ；ＴＰ５３｜Ｐ２７８Ｌ；ＴＰ５３｜Ｇ２４５Ｓ；ＴＰ５３｜Ｉ１９５Ｔ；ＴＰ５３｜Ｒ１７５Ｈ；ＴＰ５３｜Ｇ２４５Ｄ；ＴＰ５３｜Ｒ２７３Ｌ；ＴＰ５３｜Ｋ１３２Ｎ；ＴＰ５３｜Ｖ２１６Ｍ；ＴＰ５３｜Ｙ１６３Ｃ；ＴＰ５３｜Ｃ１７６Ｆ；ＴＰ５３｜Ｓ２４２Ｆ；ＴＰ５３｜Ｙ２３４Ｃ；ＴＰ５３｜Ｈ１９３Ｒ；ＴＰ５３｜Ｒ２４８Ｑ；ＴＰ５３｜Ｐ２７８ＳおよびＴＰ５３｜Ｃ１７６Ｙ。配列番号１７５〜１８０におけるホットスポット突然変異２１ｍｅｒの順序を次に示す：ＴＰ５３｜Ｖ１４３Ａ；ＴＰ５３｜Ｒ２８２Ｗ；ＴＰ５３｜Ｖ１５７Ｆ；ＴＰ５３｜Ｈ１７９Ｗ；ＴＰ５３｜Ｋ１３２Ｎ；ＴＰ５３｜Ｙ１６３Ｃ；ＴＰ５３｜Ｃ１７６Ｙ；ＴＰ５３｜Ｇ２４５Ｄ；ＴＰ５３｜Ｙ２２０Ｃ；ＴＰ５３｜Ｓ２４２Ｆ；ＴＰ５３｜Ｙ２３４Ｃ；ＴＰ５３｜Ｒ２４９Ｓ；ＴＰ５３｜Ｈ１７９Ｒ；ＴＰ５３｜Ｒ２７３Ｈ；ＴＰ５３｜Ｃ１４１Ｙ；ＴＰ５３｜Ｒ２７３Ｌ；ＴＰ５３｜Ｐ２７８Ｓ；ＴＰ５３｜Ｃ１７６Ｆ；ＴＰ５３｜Ｒ３３７Ｈ；ＴＰ５３｜Ｈ１９３Ｒ；ＴＰ５３｜Ｒ２７３Ｃ；ＴＰ５３｜Ｒ２８２Ｇ；ＴＰ５３｜Ｒ１７５Ｈ；ＴＰ５３｜Ｒ２４８Ｗ；ＴＰ５３｜Ｐ２７８Ｌ；ＴＰ５３｜Ｉ１９５Ｔ；ＴＰ５３｜Ｓ２４１Ｆ；ＴＰ５３｜Ｒ２４８Ｌ；ＴＰ５３｜Ｙ２３４Ｈ；ＴＰ５３｜Ｖ２１６Ｍ；ＴＰ５３｜Ｇ２４５Ｓ；ＴＰ５３｜Ｙ１０７ＤおよびＴＰ５３｜Ｒ２４８Ｑ。他のＴＰ５３構築物に関して、２３種の反復性がん突然変異が、構築物に含まれた：Ｙ１０７Ｄ；Ｃ１４１Ｙ；Ｖ１４３Ａ；Ｖ１５７Ｆ；Ｙ１６３Ｃ；Ｒ１７５Ｈ；Ｃ１７６Ｆ；Ｈ１９３Ｒ；Ｉ１９５Ｔ；Ｖ２１６Ｍ；Ｙ２２０Ｃ；Ｙ２３４Ｃ；Ｙ２３４Ｈ；Ｇ２４５Ｄ；Ｇ２４５Ｓ；Ｒ２４８Ｑ；Ｒ２４８Ｗ；Ｒ２４９Ｓ；Ｒ２７３Ｃ；Ｒ２７３Ｈ；Ｒ２７３Ｌ；Ｒ２８２ＧおよびＲ２８２Ｗ。これらの構築物の配列は、配列番号２５７〜２６３に表記されている。配列番号２５７〜２６３におけるホットスポット突然変異２１ｍｅｒの順序を次に示す：ＴＰ５３｜Ｒ２４８Ｗ；｛ＴＰ５３｜Ｒ２７３Ｈ  −  ２４ｍｅｒ｝；ＴＰ５３｜Ｖ１４３Ａ；ＴＰ５３｜Ｒ２４９Ｓ；｛ＴＰ５３｜Ｒ１７５Ｈ−ＴＰ５３｜Ｈ１９３Ｒ  −  ３９ｍｅｒ組合せ｝；ＴＰ５３｜Ｙ２２０Ｃ；｛ＴＰ５３｜Ｇ２４５Ｄ  −  ２０ｍｅｒ｝；ＴＰ５３｜Ｒ２４８Ｑ；ＴＰ５３｜Ｒ２７３Ｃ；ＴＰ５３｜Ｒ２８２Ｗ；｛ＴＰ５３｜Ｙ１０７Ｄ  −  ２０ｍｅｒ｝；｛ＴＰ５３｜Ｃ１４１Ｙ−ＴＰ５３｜Ｖ１５７Ｆ  −  ３７ｍｅｒ組合せ｝；｛ＴＰ５３｜Ｙ１６３Ｃ−ＴＰ５３｜Ｃ１７６Ｆ−ＴＰ５３｜Ｉ１９５Ｔ  −  ５３ｍｅｒ組合せ｝；｛ＴＰ５３｜Ｖ２１６Ｍ−ＴＰ５３｜Ｙ２３４Ｈ  −  ３９ｍｅｒ組合せ｝；ＴＰ５３｜Ｇ２４５Ｓ；ＴＰ５３｜Ｒ２７３Ｌ；ＴＰ５３｜Ｙ２３４Ｃ；およびＴＰ５３｜Ｒ２８２Ｇ。他のＴＰ５３構築物に関して、１１種の反復性がん突然変異が、構築物に含まれた：Ｖ１４３Ａ；Ｒ１７５Ｈ；Ｈ１９３Ｒ；Ｙ２２０Ｃ；Ｇ２４５Ｄ；Ｒ２４８Ｑ；Ｒ２４８Ｗ；Ｒ２４９Ｓ；Ｒ２７３Ｃ；Ｒ２７３Ｈ；およびＲ２８２Ｗ。これらの構築物の配列は、配列番号２６４〜２７０に表記されている。配列番号２６４〜２７０におけるホットスポット突然変異２１ｍｅｒの順序��次に示す：ＴＰ５３｜Ｒ２４８Ｗ；ＴＰ５３｜Ｒ２７３Ｈ；ＴＰ５３｜Ｖ１４３Ａ；ＴＰ５３｜Ｒ２４９Ｓ；｛ＴＰ５３｜Ｒ１７５Ｈ−ＴＰ５３｜Ｈ１９３Ｒ  −  ３９ｍｅｒ組合せ｝；ＴＰ５３｜Ｙ２２０Ｃ；｛ＴＰ５３｜Ｇ２４５Ｄ  −  ２０ｍｅｒ｝；ＴＰ５３｜Ｒ２４８Ｑ；ＴＰ５３｜Ｒ２７３Ｃ；およびＴＰ５３｜Ｒ２８２Ｗ。他のＴＰ５３構築物に関して、１２種の反復性がん突然変異が、構築物に含まれた：Ｙ１０７Ｄ；Ｃ１４１Ｙ；Ｖ１５７Ｆ；Ｙ１６３Ｃ；Ｃ１７６Ｆ；Ｉ１９５Ｔ；Ｖ２１６Ｍ；Ｙ２３４Ｃ；Ｙ２３４Ｈ；Ｇ２４５Ｓ；Ｒ２７３Ｌ；およびＲ２８２Ｇ。これらの構築物の配列は、配列番号２７１〜２７７に表記されている。配列番号２７１〜２７７におけるホットスポット突然変異２１ｍｅｒの順序を次に示す：ＴＰ５３｜Ｙ１０７Ｄ；｛ＴＰ５３｜Ｃ１４１Ｙ−ＴＰ５３｜Ｖ１５７Ｆ  −  ３７ｍｅｒ組合せ｝；｛ＴＰ５３｜Ｙ１６３Ｃ−ＴＰ５３｜Ｃ１７６Ｆ−ＴＰ５３｜Ｉ１９５Ｔ  −  ５３ｍｅｒ組合せ｝；｛ＴＰ５３｜Ｖ２１６Ｍ−ＴＰ５３｜Ｙ２３４Ｈ  −  ３９ｍｅｒ組合せ｝；ＴＰ５３｜Ｇ２４５Ｓ；ＴＰ５３｜Ｒ２７３Ｌ；ＴＰ５３｜Ｙ２３４Ｃ；およびＴＰ５３｜Ｒ２８２Ｇ。１７種の反復性がん突然変異の異なる組合せを含むように、他のＴＰ５３構築物を設計した。他のＴＰ５３構築物に関して、１７種の反復性がん突然変異が、構築物に含まれた：Ｙ１０７Ｄ；Ｃ１４１Ｙ；Ｖ１４３Ａ；Ｙ１６３Ｃ；Ｃ１７６Ｙ；Ｈ１７９Ｒ；Ｈ１７９Ｗ；Ｈ１９３Ｒ；Ｖ２１６Ｍ；Ｙ２３４Ｈ；Ｓ２４１Ｆ；Ｇ２４５Ｄ；Ｒ２４８Ｑ；Ｒ２４８Ｗ；Ｒ２７３Ｃ；Ｒ２７３ＬおよびＰ２７８Ｓ。これらの構築物の配列は、配列番号１８１〜１８６に表記されている。配列番号１８１〜１８６におけるホットスポット突然変異２１ｍｅｒの順序を次に示す：ＴＰ５３｜Ｓ２４１Ｆ；ＴＰ５３｜Ｇ２４５Ｄ；ＴＰ５３｜Ｖ１４３Ａ；ＴＰ５３｜Ｐ２７８Ｓ；ＴＰ５３｜Ｒ２７３Ｃ；ＴＰ５３｜Ｃ１７６Ｙ；ＴＰ５３｜Ｙ２３４Ｈ；ＴＰ５３｜Ｒ２４８Ｗ；ＴＰ５３｜Ｖ２１６Ｍ；ＴＰ５３｜Ｒ２４８Ｑ；ＴＰ５３｜Ｃ１４１Ｙ；ＴＰ５３｜Ｙ１６３Ｃ；ＴＰ５３｜Ｈ１９３Ｒ；ＴＰ５３｜Ｈ１７９Ｒ；ＴＰ５３｜Ｈ１７９Ｗ；ＴＰ５３｜Ｙ１０７ＤおよびＴＰ５３｜Ｒ２７３Ｌ。他のＴＰ５３構築物に関して、１７種の反復性がん突然変異が、構築物に含まれた：Ｃ１４１Ｙ；Ｒ１７５Ｈ；Ｈ１７９Ｒ；Ｈ１９３Ｒ；Ｖ２１６Ｍ；Ｙ２３４Ｈ；Ｇ２４５Ｄ；Ｇ２４５Ｓ；Ｒ２４８Ｌ；Ｒ２４８Ｗ；Ｒ２７３Ｃ；Ｒ２７３Ｈ；Ｐ２７８Ｌ；Ｐ２７８Ｓ；Ｒ２８２Ｇ；Ｒ２８２Ｗ；およびＲ３３７Ｈ。これらの構築物の配列は、配列番号１９３〜１９８に表記されている。配列番号１９３〜１９８におけるホットスポット突然変異２１ｍｅｒの順序を次に示す：ＴＰ５３｜Ｈ１９３Ｒ；ＴＰ５３｜Ｐ２７８Ｌ；ＴＰ５３｜Ｒ２７３Ｃ；ＴＰ５３｜Ｒ２４８Ｗ；ＴＰ５３｜Ｈ１７９Ｒ；ＴＰ５３｜Ｐ２７８Ｓ；ＴＰ５３｜Ｒ２４８Ｌ；ＴＰ５３｜Ｖ２１６Ｍ；ＴＰ５３｜Ｒ２８２Ｇ；ＴＰ５３｜Ｒ３３７Ｈ；ＴＰ５３｜Ｒ１７５Ｈ；ＴＰ５３｜Ｙ２３４Ｈ；ＴＰ５３｜Ｇ２４５Ｄ；ＴＰ５３｜Ｒ２７３Ｈ；ＴＰ５３｜Ｇ２４５Ｓ；ＴＰ５３｜Ｒ２８２ＷおよびＴＰ５３｜Ｃ１４１Ｙ。他のＴＰ５３構築物に関して、１７種の反復性がん突然変異が、構築物に含まれた：Ｙ１０７Ｄ；Ｃ１４１Ｙ；Ｖ１４３Ａ；Ｃ１７６Ｆ；Ｈ１７９Ｒ；Ｖ２１６Ｍ；Ｙ２２０Ｃ；Ｓ２４１Ｆ；Ｓ２４２Ｆ；Ｇ２４５Ｓ；Ｒ２４８Ｌ；Ｒ２４８Ｗ；Ｒ２７３Ｌ；Ｐ２７８Ｌ；Ｐ２７８Ｓ；Ｒ２８２ＧおよびＲ２８２Ｗ。これらの構築物の配列は、配列番号２０５〜２１０に表記されている。配列番号２０５〜２１０におけるホットスポット突然変異２１ｍｅｒの順序を次に示す：ＴＰ５３｜Ｐ２７８Ｓ；ＴＰ５３｜Ｃ１７６Ｆ；ＴＰ５３｜Ｈ１７９Ｒ；ＴＰ５３｜Ｒ２８２Ｇ；ＴＰ５３｜Ｓ２４１Ｆ；ＴＰ５３｜Ｒ２７３Ｌ；ＴＰ５３｜Ｐ２７８Ｌ；ＴＰ５３｜Ｃ１４１Ｙ；ＴＰ５３｜Ｙ１０７Ｄ；ＴＰ５３｜Ｒ２４８Ｗ；ＴＰ５３｜Ｖ２１６Ｍ；ＴＰ５３｜Ｒ２８２Ｗ；ＴＰ５３｜Ｓ２４２Ｆ；ＴＰ５３｜Ｙ２２０Ｃ；ＴＰ５３｜Ｖ１４３Ａ；ＴＰ５３｜Ｇ２４５ＳおよびＴＰ５３｜Ｒ２４８Ｌ。他のＴＰ５３構築物に関して、１７種の反復性がん突然変異が、構築物に含まれた：Ｙ１０７Ｄ；Ｋ１３２Ｎ；Ｖ１４３Ａ；Ｖ１５７Ｆ；Ｙ１６３Ｃ；Ｒ１７５Ｈ；Ｃ１７６Ｙ；Ｙ２３４Ｃ；Ｙ２３４Ｈ；Ｓ２４１Ｆ；Ｓ２４２Ｆ；Ｇ２４５Ｄ；Ｇ２４５Ｓ；Ｒ２７３Ｃ；Ｐ２７８Ｓ；Ｒ２８２ＷおよびＲ３３７Ｈ。これらの構築物の配列は、配列番号２１７〜２２２に表記されている。配列番号２１７〜２２２におけるホットスポット突然変異２１ｍｅｒの順序を次に示す：ＴＰ５３｜Ｃ１７６Ｙ；ＴＰ５３｜Ｒ１７５Ｈ；ＴＰ５３｜Ｇ２４５Ｄ；ＴＰ５３｜Ｒ３３７Ｈ；ＴＰ５３｜Ｓ２４１Ｆ；ＴＰ５３｜Ｋ１３２Ｎ；ＴＰ５３｜Ｖ１４３Ａ；ＴＰ５３｜Ｐ２７８Ｓ；ＴＰ５３｜Ｒ２８２Ｗ；ＴＰ５３｜Ｙ１６３Ｃ；ＴＰ５３｜Ｙ１０７Ｄ；ＴＰ５３｜Ｒ２７３Ｃ；ＴＰ５３｜Ｓ２４２Ｆ；ＴＰ５３｜Ｇ２４５Ｓ；ＴＰ５３｜Ｖ１５７Ｆ；ＴＰ５３｜Ｙ２３４ＣおよびＴＰ５３｜Ｙ２３４Ｈ。１６種の反復性がん突然変異の異なる組合せを含むように、他のＴＰ５３構築物を設計した。他のＴＰ５３構築物に関して、１６種の反復性がん突然変異が、構築物に含まれた：Ｋ１３２Ｎ；Ｖ１５７Ｆ；Ｒ１７５Ｈ；Ｃ１７６Ｆ；Ｉ１９５Ｔ；Ｙ２２０Ｃ；Ｙ２３４Ｃ；Ｓ２４２Ｆ；Ｇ２４５Ｓ；Ｒ２４８Ｌ；Ｒ２４９Ｓ；Ｒ２７３Ｈ；Ｐ２７８Ｌ；Ｒ２８２Ｇ；Ｒ２８２ＷおよびＲ３３７Ｈ。これらの構築物の配列は、配列番号１８７〜１９２に表記されている。配列番号１８７〜１
９２におけるホットスポット突然変異２１ｍｅｒの順序を次に示す：ＴＰ５３｜Ｋ１３２Ｎ；ＴＰ５３｜Ｒ２８２Ｗ；ＴＰ５３｜Ｇ２４５Ｓ；ＴＰ５３｜Ｙ２３４Ｃ；ＴＰ５３｜Ｓ２４２Ｆ；ＴＰ５３｜Ｒ１７５Ｈ；ＴＰ５３｜Ｙ２２０Ｃ；ＴＰ５３｜Ｖ１５７Ｆ；ＴＰ５３｜Ｒ２８２Ｇ；ＴＰ５３｜Ｃ１７６Ｆ；ＴＰ５３｜Ｒ３３７Ｈ；ＴＰ５３｜Ｉ１９５Ｔ；ＴＰ５３｜Ｒ２４９Ｓ；ＴＰ５３｜Ｐ２７８Ｌ；ＴＰ５３｜Ｒ２７３ＨおよびＴＰ５３｜Ｒ２４８Ｌ。他のＴＰ５３構築物に関して、１６種の反復性がん突然変異が、構築物に含まれた：Ｙ１０７Ｄ；Ｋ１３２Ｎ；Ｖ１４３Ａ；Ｖ１５７Ｆ；Ｙ１６３Ｃ；Ｃ１７６Ｆ；Ｃ１７６Ｙ；Ｈ１７９Ｗ；Ｉ１９５Ｔ；Ｙ２２０Ｃ；Ｙ２３４Ｃ；Ｓ２４１Ｆ；Ｓ２４２Ｆ；Ｒ２４８Ｑ；Ｒ２４９ＳおよびＲ２７３Ｌ。これらの構築物の配列は、配列番号１９９〜２０４に表記されている。配列番号１９９〜２０４におけるホットスポット突然変異２１ｍｅｒの順序を次に示す：ＴＰ５３｜Ｙ１０７Ｄ；ＴＰ５３｜Ｋ１３２Ｎ；ＴＰ５３｜Ｃ１７６Ｆ；ＴＰ５３｜Ｃ１７６Ｙ；ＴＰ５３｜Ｒ２７３Ｌ；ＴＰ５３｜Ｙ２２０Ｃ；ＴＰ５３｜Ｒ２４８Ｑ；ＴＰ５３｜Ｖ１４３Ａ；ＴＰ５３｜Ｉ１９５Ｔ；ＴＰ５３｜Ｒ２４９Ｓ；ＴＰ５３｜Ｓ２４２Ｆ；ＴＰ５３｜Ｙ２３４Ｃ；ＴＰ５３｜Ｈ１７９Ｗ；ＴＰ５３｜Ｖ１５７Ｆ；ＴＰ５３｜Ｙ１６３ＣおよびＴＰ５３｜Ｓ２４１Ｆ。他のＴＰ５３構築物に関して、１６種の反復性がん突然変異が、構築物に含まれた：Ｋ１３２Ｎ；Ｖ１５７Ｆ；Ｙ１６３Ｃ；Ｒ１７５Ｈ；Ｃ１７６Ｙ；Ｈ１７９Ｗ；Ｈ１９３Ｒ；Ｉ１９５Ｔ；Ｙ２３４Ｃ；Ｙ２３４Ｈ；Ｇ２４５Ｄ；Ｒ２４８Ｑ；Ｒ２４９Ｓ；Ｒ２７３Ｃ；Ｒ２７３ＨおよびＲ３３７Ｈ。これらの構築物の配列は、配列番号２１１〜２１６に表記されている。配列番号２１１〜２１６におけるホットスポット突然変異２１ｍｅｒの順序を次に示す：ＴＰ５３｜Ｒ１７５Ｈ；ＴＰ５３｜Ｈ１７９Ｗ；ＴＰ５３｜Ｒ２４９Ｓ；ＴＰ５３｜Ｙ２３４Ｈ；ＴＰ５３｜Ｉ１９５Ｔ；ＴＰ５３｜Ｒ２４８Ｑ；ＴＰ５３｜Ｒ２７３Ｈ；ＴＰ５３｜Ｃ１７６Ｙ；ＴＰ５３｜Ｖ１５７Ｆ；ＴＰ５３｜Ｈ１９３Ｒ；ＴＰ５３｜Ｙ２３４Ｃ；ＴＰ５３｜Ｋ１３２Ｎ；ＴＰ５３｜Ｒ２７３Ｃ；ＴＰ５３｜Ｙ１６３Ｃ；ＴＰ５３｜Ｇ２４５ＤおよびＴＰ５３｜Ｒ３３７Ｈ。他のＴＰ５３構築物に関して、１６種の反復性がん突然変異が、構築物に含まれた：Ｃ１４１Ｙ；Ｃ１７６Ｆ；Ｈ１７９Ｒ；Ｈ１７９Ｗ；Ｈ１９３Ｒ；Ｉ１９５Ｔ；Ｖ２１６Ｍ；Ｙ２２０Ｃ；Ｒ２４８Ｌ；Ｒ２４８Ｑ；Ｒ２４８Ｗ；Ｒ２４９Ｓ；Ｒ２７３Ｈ；Ｒ２７３Ｌ；Ｐ２７８ＬおよびＲ２８２Ｇ。これらの構築物の配列は、配列番号２２３〜２２８に表記されている。配列番号２２３〜２２８におけるホットスポット突然変異２１ｍｅｒの順序を次に示す：ＴＰ５３｜Ｃ１７６Ｆ；ＴＰ５３｜Ｒ２７３Ｌ；ＴＰ５３｜Ｈ１７９Ｒ；ＴＰ５３｜Ｒ２８２Ｇ；ＴＰ５３｜Ｙ２２０Ｃ；ＴＰ５３｜Ｉ１９５Ｔ；ＴＰ５３｜Ｃ１４１Ｙ；ＴＰ５３｜Ｒ２４８Ｌ；ＴＰ５３｜Ｒ２７３Ｈ；ＴＰ５３｜Ｈ１７９Ｗ；ＴＰ５３｜Ｈ１９３Ｒ；ＴＰ５３｜Ｒ２４９Ｓ；ＴＰ５３｜Ｖ２１６Ｍ；ＴＰ５３｜Ｐ２７８Ｌ；ＴＰ５３｜Ｒ２４８ＷおよびＴＰ５３｜Ｒ２４８Ｑ。構築物に含まれる抗原性ペプチドの例は、表８に提示する。
【０７１１】
【表８−１】
2020513737.tif 000037
【表８−２】
2020513737.tif 000038
【０７１２】
全がんにわたる共通のものに追加して、ある特定の強い影響のがんにおいて高頻度で突然変異されているがん関連タンパク質のための構築物の追加のセットも開発中である。このような疾患は、肺の扁平上皮および腺癌、結腸直腸がん、乳がん、卵巣がんその他を含む。
【０７１３】
【表９】
2020513737.tif 000039
【０７１４】
これらの構築物のうち、大部分の主要型のがんに特徴的な共有される突然変異したエピトープをカバーするいくつかのパネルを考案することができる。ＡＤＸＳ−ＨＯＴ構築物から開発されている疾患特異的パネルは、表１０のものを含むことができる。
【０７１５】
【表１０】
2020513737.tif 000040
【０７１６】
さらに、反復性ホットスポット突然変異が、４０種を超えるがん型に及ぶ１１，０００種を超えるヒト腫瘍において同定され、２７５種の遺伝子における４７０種の体細胞置換ホットスポットが同定される。例えば、あらゆる目的のためその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Changら（２０１６年）Nat  Biotechnol  ３４巻（２号）：１５５〜１６３頁を参照されたい（腫瘍型の分布、公知および分類されたホットスポットの内訳、ならびにコホート内で２種またはそれよりも多いホットスポットが検出される４９種の遺伝子のそれぞれにおけるホットスポットの数を提供する）。このランドスケープは、より幅広いがん患者集団に対する「オフザシェルフ」処置の数を拡大するための追加のＡＤＸＳ−ＨＯＴ構築物の開発のための大きな機会を提供する。
【０７１７】
（実施例２）
結腸直腸がん免疫療法戦略：ホットスポット構築物
結腸直腸がん（ＣＲＣ）の発癌は、体細胞突然変異の獲得および蓄積によって駆動される。ＡＰＣ突然変異は、初期に腺腫形成に、続いて後期事象としてのＴＰ５３不活性化により中等度腺腫から癌への移行を促進するＫＲＡＳの発癌性突然変異に関与する。追加の突然変異は、腫瘍ドライバーとして寄与するＰＩＫ３ＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＮＲＡＳおよびＢＲＡＦにおいて獲得され得、ＥＧＦＲ阻害のような処置に対する抵抗性を付与することができる（またはこれにより選択され得る）。
【０７１８】
近年、大規模ＰＣＲに基づく配列決定の出現は、ＣＲＣのゲノムランドスケープの描写に使用され、多数の高頻度突然変異した遺伝子が、これらの遺伝子において共有される突然変異の共通性のために「遺伝子の山（gene  mountain）」として同定された。これらは、ＡＰＣ、ＫＲＡＳ、ＴＰ５３、ＦＢＸＷ７、ＰＩＫ３ＣＡ、ＮＲＡＳおよびＢＲＡＦを含む重大な意味を持つ腫瘍ドライバー遺伝子において発生する体細胞突然変異によって含まれる。さらなるより低頻度の共有される突然変異遺伝子クラスターも同定された。しかし、圧倒的多数のＣＲＣ腫瘍は、これらの一般的に観察される共有される腫瘍ドライバー（drive）「遺伝子の山」における代表的突然変異のうち１種または複数の取り込みによって特徴付けることができる。これらの鍵となる腫瘍ドライバー遺伝子における体細胞突然変異は、突然変異「ホットスポット」として記載され得るものにおいて、分子の機能に干渉するペプチドの重大な意味を持つアミノ酸位置において高頻度で発生する。このような種類の共有される突然変異は、個々の患者に特異的なネオ抗原とは対照的に、これらの腫瘍ドライバー遺伝子における一般的に観察される共有される突然変異エピトープの大部分に焦点を合わせる免疫療法を生成する機会を提供する。例として、ＢＲＡＦ遺伝子は、ＶからＥへの６００位における体細胞置換に関連する非常に十分に特徴付けされた腫瘍特異的抗原を示すことができる。
【０７１９】
ＢＲＡＦ突然変異は、後期ＣＲＣを有する患者における生存短縮に関連することも公知である。単純な例として、ＢＲＡＦにおいて発生する圧倒的多数の突然変異は、Ｖ６００Ｅとして表されるアミノ酸位置６００に存在し、有意な頻度で発生する他の唯一の共有される突然変異は、ＢＲＡＦ  Ｇ４６９Ｖ（またはＧ４６９Ａ）である。よって、免疫化によるこれら３種の特異的な共有されるエピトープをカバーすることで、症例の９９％超でＢＲＡＦにおいて発生する可能性があるいずれかの体細胞突然変異に対するＴ細胞応答を生成することができる。この高リスク突然変異により同定された患者は、この予後に関連する細胞を排除する試みにおいて、このバイオマーカーを標的とする免疫療法で処置することができた。
【０７２０】
共通腫瘍ドライバー遺伝子における腫瘍特異的突然変異の結果として生じる圧倒的多数の腫瘍特異的エピトープを標的とするであろう、Ｌｍ−ＬＬＯシリーズの構築物が開発中である。これらの製品は、本出願人らのＬｍ−ＬＬＯプラットフォームに基づき、これらのそれぞれは、特定の遺伝子において観察される潜在的突然変異の≧９９％をカバーすることが企図される。腫瘍ドライバー遺伝子における鍵となる反復性がん突然変異の存在は、特異的なＰＣＲに基づくキットにより診断することができる、またはＤＮＡもしくはＲＮＡ配列決定により他の仕方で開示される。患者が、２種以上の反復性がん突然変異を有する場合、投与に先立ち個々のホットスポット構築物を単純に混合することにより、これらの構築物は、組み合わせて与えることができる。共通に突然変異された遺伝子が明らかに同定されており、大部分の患者は、これらの腫瘍ドライバー遺伝子のいくつかにおける突然変異を共有するため、結腸直腸がんへのこれらの薬剤の適用は、特に有用となることができる。そのようなものとして、例えば、ＡＰＣ、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＫＲＡＳおよびＢＲＡＦにおける突然変異が挙げられる。
【０７２１】
ＤＮＡミスマッチ修復における欠損に起因するマイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）は、孤発性（非リンチ症候群）ＣＲＣの１０〜２５％における高い突然変異負担を引き起こすが、より良好な予後にも関連し、チェックポイント阻害に対する応答であった。近年のデータは、このような患者が、チェックポイント阻害剤単剤療法でより有効に処置されることを示唆する。したがって、ＣＲＣにおける最大の医学的必要は、マイクロサテライト安定（ＭＳＳ）ＣＲＣを有する患者の８５〜９０％に対するものである。
【０７２２】
近年のデータは、腫瘍が、免疫学的に「ホット（hot）」になる、またはＴＨ−１支持的微小環境の発現に関連するリンパ球より浸潤される場合、ＭＳＳ  ＣＲＣが、チェックポイント阻害処置に対して感受性になる場合があることを示唆する（ＡＳＣＯ  ２０１６年、口頭発表、要約、met  inhibition  of  MSS  CRC  followed  by  PD-1）。本出願人らのＬｍ−ＬＬＯベクターは、ＴｒｅｇおよびＭＤＳＣの抑制能力の低下と共に固形腫瘍微小環境へのＴ細胞の浸潤増加において最高に達するＴＨ−１型Ｔ細胞免疫を支持する有意な自然免疫刺激に寄与することが判明した（Wallechaら（２０１３年）J  Immunother  ３６巻：４６８〜４７６頁；Chenら（２０１４年）Cancer  Immunol  Res  ２巻（９号）：９１１〜９２２頁；およびMkrtichyanら（２０１３年）J  Immunother  Cancer  １巻：１５頁．ｄｏｉ：１０．１１８６／２０５１−１４２６−１−１５、これらのそれぞれは、あらゆる目的のためその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０７２３】
これらの効果は、ＭＳＳ  ＣＲＣ微小環境の変更においてまとめて寄与することができ、腫瘍特異的標的が提示される場合、これを「ホット」にした。加えて、これらの構築物は、エピトープ拡散を誘導することが示された。これらの処置は、腫瘍ドライバー遺伝子における腫瘍特異的突然変異の結果として生じる腫瘍特異的抗原を標的化する場合に、単剤療法として有効となることができ、チェックポイント阻害処置に対するその感受性を大いに増強することもできた。Ｌｍ−ＬＬＯ構築物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの相乗作用を実証し、進行中の組合せ治験は、チェックポイント阻害剤と安全に組み合わせることができることを実証した。
【０７２４】
ＣＲＣの腫瘍ドライバー遺伝子における反復性がん突然変異の公知発現に基づき、ＭＳＳ  ＣＲＣのＣＲＣ特異的ＡＤＸＳ−ＨＯＴ処置の開発は、次の標的に対して方向付けられるであろう。意図は、診断スクリーニングに基づく組合せ処置のために選択され得る、または全ＭＳＳ  ＣＲＣ患者に与えることが企図されるセット組合せ戦略において組み合わされ得る、のいずれかである遺伝子特異的構築物のパネルを開発することにある。ＣＲＣパネルは、最小でも次の腫瘍ドライバーホットスポット標的化構築物を含むであろう（突然変異に対する「ｍ」）：ｍＡＰＣ（ＣＲＣ患者の７６％に見出される）、ｍＴＰ５３（患者の５２％）、ｍＲＡＳ｛ＫＲＡＳ／ＮＲＡＳ｝（患者の５２％｛それぞれ患者の４３％／９％｝）、ｍＰＩＫ３ＣＡ（患者の１９％）、ｍＢＲＡＦ（患者の９％）。
【０７２５】
ＣＲＣのためのこれらの構築物から発生した２種の処置選択肢がある場合がある。その１種は、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇからのバイオマーカーの発現、またはＰＣＲに基づく診断またはＤＮＡもしくはＲＮＡ配列決定に基づく患者に対する個別化となるであろう。
【０７２６】
【表１１】
2020513737.tif 000041
【０７２７】
他の選択肢は、共通疾患型を有する全患者に、同じ組合せ混合物を与えることである。個別化医療アプローチのために、パネルに由来する構築物の組合せは、そのバイオマーカー検査結果に基づく患者のためのキットへとアセンブルされ、処置の直前に現場で一緒に混合されるであろう。追加の標的を進行中のパネルに加えることができる。いくつかの他の腫瘍ドライバー突然変異標的構築物も、肺の扁平上皮および腺癌、乳がんならびに卵巣がんを含む他の疾患において高頻度で突然変異されている遺伝子を標的とするように調製されるであろう。これらの他の構築物の一部は、利用できるようになるため、ＣＲＣパネルにおいて有用となることもできる。
【０７２８】
一般化された共通疾患特異的混合物のため、認定疾患型を有する全患者に、構築物の同じ組合せが与えられるであろう。ＭＳＳ  ＣＲＣのため、この組合せは、ＡＰＣ、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡおよびＲＡＳ、および（潜在的に）ＢＲＡＦを含むであろう。患者の７６％におけるｍＡＰＣ、患者の５２％におけるｍＴＰ５３、患者の５２％におけるｍＲＡＳ｛ＫＲＡＳ／ＮＲＡＳ｝、および患者の１９％におけるｍＰＩＫ３ＣＡを含め、体細胞腫瘍ドライバー突然変異がＣＲＣに見出されるため、大部分の患者が、これらの代表的な突然変異した腫瘍ドライバー遺伝子の２〜４または２〜５種のいずれかを発現し、よって、複数のドライバー遺伝子突然変異が標的化される見込みが大いにある。
【０７２９】
一体的なまたは他の治療的がん処置と組み合わせたいくつかの個々のホットスポット産物のいずれかとして、組合せ処置レジメンの一部としてＡＤＸＳ−ＨＯＴ構築物を使用する潜在力も存在する。本出願人らのＬｍ構築物のその他と同様に、ホットスポット処置は、チェックポイント阻害剤、共刺激アゴニストまたは放射線療法のような他のがん処置と組み合わせてまたはこれと逐次に与えることができる。その理由は、動物モデルおよび臨床試験の初期データが、Ｌｍ−ＬＬＯ免疫療法が、ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１遮断抗体等、活性免疫療法剤との有意な相乗作用のための潜在力を有することを示したことが挙げられる。
【０７３０】
Ｌｍ−ＬＬＯベースのワクチンの抗ＰＤ−１抗体との組合せは、免疫サプレッサー細胞（ＴｒｅｇおよびＭＤＳＣ）の減少と併せて、抗原特異的免疫応答および腫瘍浸潤性ＣＤ８＋Ｔ細胞の増加をもたらす。組合せレジメンは、処置された動物において、腫瘍成長の著しい阻害および生存期間の延長／腫瘍の完全な退縮を伴う相乗活性をもたらした。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１の遮断とＬｍ−ＬＬＯベースのワクチンの組合せは、いずれかの薬剤単独と比べて、抗腫瘍免疫療法の有効性の全体的な増強をもたらし得る。また、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＬｍ感染がヒト単球由来樹状細胞における表面ＰＤ−Ｌ１発現の著しい上方調節をもたらすことも示された。このことは、この所見の翻訳能を示唆する。
【０７３１】
Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ、２０１６年（Ｓｉｋｏｒａ要約、Ａｄｖａｘｉｓレセプションデータ発表）で発表されたデータは、ヒト頭頸部腫瘍におけるＬｍ−ＬＬＯ薬剤によるＰＤ−１の上方調節およびＴ細胞の活性化を支持する証拠を提供した。試験のデータは、ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１発現の上方調節、ＴｒｅｇおよびＭＤＳＣの低下、ならびにＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞の浸潤を含む、腫瘍微小環境内の免疫活性化増加を示した。これらの観察は、抗ＰＤ−１抗体との潜在的に強い相乗作用を示唆する（あらゆる目的のためその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Wolfら（２０１３年）J  Immunol  １９０巻（６号）：２５０１〜２５０９頁）。
【０７３２】
前臨床データは、Ｏｘ−４０およびＧＩＴＲのような免疫共刺激アゴニストとの相乗効果も示唆している（あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれているMkrtichyanら（２０１３年）、J  Immunother  Cancer、１巻：１５号、doi:  10.1186/2051-1426-1-15）。放射線療法とＬｍ−ＬＬＯベクターの相乗効果は、前臨床モデルにおいて実証されており（あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれているHannanら（２０１２年）、Cancer  Immunol  Immunother、６１巻（１２号）：２２２７〜２２３８頁）、また、未切除のイヌ骨肉腫における進行中の獣医学的試験において観察されている。Ｌｍ−ＬＬＯ処置は化学療法と連続的に与えてもよいが、十分な造血回復があることを条件とする。加えて、Ｌｍベクターによる中和抗体が発生しないことが現在までの研究によって示されており、そのため、単一のＬｍベクターを用いた反復処置、または複数のベクターを用いた同時もしくは連続的な処置が可能である。
【０７３３】
本明細書において開示されるＡＤＸＳ−ＨＯＴ免疫療法は、健康な細胞に対する影響をほとんどまたは全く伴わずに、ホットスポットに対する有効性が高く標的化された攻撃を行うことにより、がんの処置に大変革をもたらす可能性を有する。腫瘍免疫療法は、宿主自身の免疫細胞という、自然が生み出した最も効果的な抗がん剤を活用する。ＭＳＳ  ＣＲＣのための有効レジメンにおけるこれらのＡＤＸＳ−ＨＯＴ  ＣＲＣプログラムの適用成功は、現在存在しない、この壊滅的な疾患のための有効な免疫療法選択肢へと開発される潜在力を有する。
【０７３４】
（実施例３）
がん型特異的ホットスポット構築物の設計
本出願人らは、ＡＤＸＳ−ＨＯＴ構築物のために前臨床開発努力の焦点を合わせる反復性がん突然変異を有する５種の初期がん型を選択した。これらは、ルミナルＡ乳がん、結腸直腸腺癌、ＮＳＣＬＣ腺癌、扁平上皮がんおよび前立腺がんを含む。
【０７３５】
ルミナルＡ乳がん
５種の遺伝子にわたる総計１１種のホットスポット突然変異を、ルミナルＡ乳がんＡＤＸＳ−ＨＯＴ構築物のために選択した。ホットスポット突然変異のこのパネルは、全ルミナルＡ乳がん患者の５０．６％をカバーする。
【０７３６】
【表１２】
2020513737.tif 000042
【０７３７】
構築物に含まれる反復性がん突然変異毎に、２１アミノ酸長のペプチドを設計した。
【０７３８】
【表１３】
2020513737.tif 000043
【０７３９】
２１ｍｅｒペプチドは、反復性がん突然変異およびその両側の１０アミノ酸の隣接配列を含む、反復性がん突然変異が発生するがん関連タンパク質の断片となるように設計した。抗原性ペプチドは、２１アミノ酸ウィンドウで、ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅのハイドロパシー指数によってスコアリングし、およそ１．６のカットオフを超えるスコアを有するペプチドは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓによって分泌可能である可能性が低いため除外した。構築物は、ランダム化によって生成された複数の異なる順序のペプチドにより設計されるであろう。ペプチドの各順序付けは、スライディング２１アミノ酸ウィンドウを用いてＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅのハイドロパシー指数によりスコアリングされ、ペプチドの特定の順序付けのためのいずれかの領域が、およそ１．６のカットオフを超えるスコアを有する場合、ペプチドの順序付けが、カットオフを超えるスコアを有する領域を持たないポリペプチドをもたらすまで、ペプチドの順序は再度シャッフルされるであろう。
【０７４０】
結腸直腸腺癌
６種の遺伝子にわたる総計１７種のホットスポット突然変異を、結腸直腸腺癌ＡＤＸＳ−ＨＯＴ構築物のために選択した。ホットスポット突然変異のこのパネルは、全結腸直腸がん患者の４２．８％およびマイクロサテライト安定患者の５８％をカバーする。
【０７４１】
【表１４】
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【０７４２】
構築物に含まれる反復性がん突然変異毎に、２１アミノ酸長のペプチドを設計した。
【０７４３】
【表１５】
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【０７４４】
２１ｍｅｒペプチドは、反復性がん突然変異およびその両側の１０アミノ酸の隣接配列を含む、反復性がん突然変異が発生するがん関連タンパク質の断片となるように設計した。抗原性ペプチドは、２１アミノ酸ウィンドウで、ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅのハイドロパシー指数によってスコアリングし、およそ１．６のカットオフを超えるスコアを有するペプチドは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓによって分泌可能である可能性が低いため除外した。構築物は、ランダム化によって生成された複数の異なる順序のペプチドにより設計されるであろう。ペプチドの各順序付けは、スライディング２１アミノ酸ウィンドウを用いてＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅのハイドロパシー指数によりスコアリングされ、ペプチドの特定の順序付けのためのいずれかの領域が、およそ１．６のカットオフを超えるスコアを有する場合、ペプチドの順序付けが、カットオフを超えるスコアを有する領域を持たないポリペプチドをもたらすまで、ペプチドの順序は再度シャッフルされるであろう。
【０７４５】
肺腺癌
６種の遺伝子にわたる総計３０種のホットスポット突然変異を、肺腺癌（ＮＳＣＬＣ）ＡＤＸＳ−ＨＯＴ構築物のために選択した。ホットスポット突然変異のこのパネルは、全肺腺癌患者の５３．５％をカバーする。
【０７４６】
【表１６】
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【０７４７】
構築物に含まれる反復性がん突然変異毎に、２１アミノ酸長のペプチドを設計した。
【０７４８】
【表１７】
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【０７４９】
２１ｍｅｒペプチドは、反復性がん突然変異およびその両側の１０アミノ酸の隣接配列を含む、反復性がん突然変異が発生するがん関連タンパク質の断片となるように設計した。抗原性ペプチドは、２１アミノ酸ウィンドウで、ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅのハイドロパシー指数によってスコアリングし、およそ１．６のカットオフを超えるスコアを有するペプチドは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓによって分泌可能である可能性が低いため除外した。構築物は、ランダム化によって生成された複数の異なる順序のペプチドにより設計されるであろう。ペプチドの各順序付けは、スライディング２１アミノ酸ウィンドウを用いてＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅのハイドロパシー指数によりスコアリングされ、ペプチドの特定の順序付けのためのいずれかの領域が、およそ１．６のカットオフを超えるスコアを有する場合、ペプチドの順序付けが、カットオフを超えるスコアを有する領域を持たないポリペプチドをもたらすまで、ペプチドの順序は再度シャッフルされるであろう。
【０７５０】
ＮＳＣＬＣ扁平上皮がん
５種の遺伝子にわたる総計６０種のホットスポット突然変異を、ＮＳＣＬＣ扁平上皮がんＡＤＸＳ−ＨＯＴ構築物のために選択した。ホットスポット突然変異のこのパネルは、全ＮＳＣＬＣ扁平上皮がん患者の５２．３％をカバーする。
【０７５１】
【表１８】
2020513737.tif 000048
【０７５２】
構築物に含まれる反復性がん突然変異毎に、２１アミノ酸長のペプチドを設計した。
【０７５３】
【表１９−１】
2020513737.tif 000049
【表１９−２】
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【表１９−３】
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【０７５４】
２１ｍｅｒペプチドは、反復性がん突然変異およびその両側の１０アミノ酸の隣接配列を含む、反復性がん突然変異が発生するがん関連タンパク質の断片となるように設計した。抗原性ペプチドは、２１アミノ酸ウィンドウで、ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅのハイドロパシー指数によってスコアリングし、およそ１．６のカットオフを超えるスコアを有するペプチドは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓによって分泌可能である可能性が低いため除外した。構築物は、ランダム化によって生成された複数の異なる順序のペプチドにより設計されるであろう。ペプチドの各順序付けは、スライディング２１アミノ酸ウィンドウを用いてＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅのハイドロパシー指数によりスコアリングされ、ペプチドの特定の順序付けのためのいずれかの領域が、およそ１．６のカットオフを超えるスコアを有する場合、ペプチドの順序付けが、カットオフを超えるスコアを有する領域を持たないポリペプチドをもたらすまで、ペプチドの順序は再度シャッフルされるであろう。
前立腺がん
【０７５５】
９種の遺伝子にわたる総計２１種のホットスポット突然変異を、前立腺がんパネルのために選択した。ホットスポット突然変異のこのパネルは、全前立腺がん患者の２７．６％をカバーする。
【０７５６】
【表２０】
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【０７５７】
構築物に含まれる反復性がん突然変異毎に、２１アミノ酸長のペプチドを設計した。
【０７５８】
【表２１】
2020513737.tif 000053
【０７５９】
２１ｍｅｒペプチドは、反復性がん突然変異およびその両側の１０アミノ酸の隣接配列を含む、反復性がん突然変異が発生するがん関連タンパク質の断片となるように設計した。抗原性ペプチドは、２１アミノ酸ウィンドウで、ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅのハイドロパシー指数によってスコアリングし、およそ１．６のカットオフを超えるスコアを有するペプチドは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓによって分泌可能である可能性が低いため除外した。構築物は、ランダム化によって生成された複数の異なる順序のペプチドにより設計されるであろう。ペプチドの各順序付けは、スライディング２１アミノ酸ウィンドウを用いてＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅのハイドロパシー指数によりスコアリングされ、ペプチドの特定の順序付けのためのいずれかの領域が、およそ１．６のカットオフを超えるスコアを有する場合、ペプチドの順序付けが、カットオフを超えるスコアを有する領域を持たないポリペプチドをもたらすまで、ペプチドの順序は再度シャッフルされるであろう。
【０７６０】
（実施例４）
ＡＤＸＳ＿ＨＯＴ構築物設計のためのｉｎ  Ｓｉｌｉｃｏ方法論
ホットスポット突然変異を有するペプチド、腫瘍関連抗原遺伝子に由来するヘテロクリティックペプチド、およびヘテロクリティックペプチドを発現するミニ遺伝子構築物により、構築物を設計した。これら３種のエレメントを単独でまたはいずれかの組合せで含むように、追加の構築物を設計した。
【０７６１】
ホットスポット突然変異は、多数のがん患者にわたって反復的に変更される体細胞的変更である。多くの患者は、最も高頻度で突然変異される、または少なくとも部分的に悪性表現型の発生の原因となる、重大な意味を持つ腫瘍ドライバー遺伝子の機能的ドメインに共通突然変異を共有する。本明細書の他の箇所に記載されている通り、患者および腫瘍型にわたるこの突然変異の「共有」は、このような共通ホットスポットを標的とする処置構築物の「オフザシェルフ」開発の機会を生じる。本出願人らが含めたホットスポット標的は、全体的頻度が徴候において１６％〜８０％に及ぶ。１２，５００以上のＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ型が存在するため、あらゆる可能なクラスＩバインダーをカバーするように標的ペプチドを含めると、正しいＨＬＡ／突然変異組合せを有するいずれかの潜在的患者を処置することが可能になる。例えば、ホットスポット突然変異およびその両側のがん関連タンパク質に由来する１０隣接アミノ酸を有する２１ｍｅｒホットスポット標的ペプチドを提供することにより、２１ｍｅｒ標的ペプチドは、ホットスポットミスセンス突然変異を含有するあらゆる８ｍｅｒ、９ｍｅｒ、１０ｍｅｒまたは１１ｍｅｒペプチドをカバーするであろう。あらゆる潜在的クラスＩエピトープ（８ｍｅｒ〜１１ｍｅｒ）を含むことにより、ホットスポットパネルは、原則として（in  principal）、公知の１２，５００以上のＭＨＣクラスＩ分子のいずれかとのいかなる潜在的重複をカバーすることもできる。ＡＤＸＳ＿ＨＯＴ構築物におけるホットスポット標的は、同定されている１２，５００以上のＨＬＡクラスＩ対立遺伝子のうち事実上いずれに対してもエピトープを生成するように設計され、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏアルゴリズムに依存せず優先順位付けされる。
【０７６２】
ホットスポットペプチドに加えて、ヘテロクリティック配列（すなわち、配列最適化されたペプチド）を、ＭＨＣクラスＩ対立遺伝子による提示を増加させるような設計した。腫瘍組織において発現されるが、正常で健康な組織における発現が最小である遺伝子を表すため、腫瘍関連抗原遺伝子によって発現されるペプチドを変更することにより、ヘテロクリティックペプチドを派生させた。特に、ヘテロクリティックペプチドは、がん精巣抗原または癌胎児性抗原等のがん関連タンパク質から設計した（すなわち、腫瘍関連抗原から設計した）。がん精巣抗原（ＣＴＡ）は、異なる組織学的起源のヒト腫瘍において発現されるが、雄性胚細胞を除いて正常組織では発現されない腫瘍関連抗原の大ファミリーである。がんにおいて、このような発生上の抗原は、再度発現されて、免疫活性化の遺伝子座として機能することができる。癌胎児性抗原（ＯＦＡ）は、胎児発生中のみに典型的に存在するが、ある特定の種類のがんを有する成人に見出されるタンパク質である。ＣＴＡおよびＯＦＡは、その腫瘍に制限される発現パターンにより、腫瘍特異的免疫療法に理想的な標的となる。複数のホットスポットペプチドおよびＯＦＡ／ＣＴＡの組合せは、患者カバー範囲を最大化する。大部分のホットスポット突然変異およびＯＦＡ／ＣＴＡタンパク質は、発癌において重大な意味を持つ役割を果たす。一度に両方を標的とすることは、がん増殖を有意に損なうことができる。複数のＯＦＡ／ＣＴＡペプチドとホットスポット突然変異とを組み合わせることは、標的疾患を有する潜在的に全ての患者において発現される、１回の処置において複数の高アビディティー標的を提示する。例えば、構築物は、各患者が、少なくとも１種の標的突然変異を発現するように設計することができる。患者が発現しないホットスポットペプチドは、いかなる免疫応答も誘発しない。専用の配列最適化されたペプチド（すなわち、ヘテロクリティックペプチド）の付加は、徴候に関して患者集団の最大１００％にカバー範囲を増加させることができる。
【０７６３】
ヘテロクリティックを、がん型において最大１００％発現を有する遺伝子から、北米における４種の最も多く見られるＨＬＡに対して設計した。選択されたＨＬＡ型は、Ａ０２０１、Ａ０３０１、Ａ２４０２およびＢ０７０２を含み、これらは、北米のコーカサス人種においてそれぞれ４７．８％、２０．６％、２０．６％および２８．７％の頻度を有し、北米のアフリカ系アメリカ人において１６．８％、２３．８％、８．９％および１６．０％の頻度を有する。これは、患者当たり少なくとも１種のペプチド−ＭＨＣ組合せのオッズを増加させる。ヘテロクリティック配列は、Ｔ細胞応答のプライミングに、中枢性寛容の克服に、また、野生型ペプチドに対して首尾よい交差反応性免疫応答を誘発するのに十分であることが示された。がん型内の総患者カバー範囲が１００％に近づくという点において、ヘテロクリティックエピトープの付加は、ホットスポット突然変異ペプチドを補完する。したがって、本出願人らは、最も多く見られるＨＬＡ（ＨＬＡ−Ａ０２０１、ＨＬＡ−Ａ０３０１、ＨＬＡ−Ａ２４０２およびＨＬＡ−Ｂ０７０２）をカバーするようにヘテロクリティックペプチドを設計した腫瘍関連抗原を患者が発現すると仮定するため、処置に先立ち患者を配列決定する必要がない。
【０７６４】
文献に由来する免疫原性情報があったＨＬＡ−Ａ０２０１に対するヘテロクリティックペプチドを、いくつかの構築物においてミニ遺伝子エピトープであると選択した。ＨＬＡ−Ａ２４０２に対するヘテロクリティックペプチドもいくつかの構築物において使用した。本明細書に開示されるホットスポットペプチドアプローチおよび／またはヘテロクリティックペプチドアプローチに加えて、ミニ遺伝子構築物アプローチを特異的ＭＨＣクラスＩ結合抗原性決定基の発現のために使用することにより、プロフェッショナル抗原提示細胞（ｐＡＰＣ）の抗原提示経路に短いペプチド配列を高効率で送達することが可能になる。ミニ遺伝子技術の特定の利点は、ＭＨＣクラスＩ分子に結合し、これに提示され得る短いペプチド配列を遊離させるための、より大きなタンパク質のプロテアソーム媒介性分解の必要性が回避されることである。これにより、ｐＡＰＣの表面における大幅に高効率のペプチド−ＭＨＣクラスＩ抗原提示と、ひいては、抗原特異的Ｔ細胞応答のプライミングのための大幅に高レベルの抗原発現とがもたらされる。
【０７６５】
ホットスポット
反復性体細胞突然変異「ホットスポット」を同定するために、公開されている突然変異データベースを利用した。データベースは、ＴＣＧＡ、ＩＣＧＣ、ＣＯＳＭＩＣ、ｃＢｉｏｐｏｒｔａｌその他を含んだ。
【０７６６】
突然変異データを疾患徴候型によって細層別化した。換言すると、全徴候特異的試料を突然変異頻度計算のために選択した。
【０７６７】
反復性体細胞突然変異は、インフレームおよびフレームシフト突然変異をもたらすミスセンス置換およびＩＮＤＥＬを含んだ。
【０７６８】
全試料にわたって観察される突然変異事象の総数の頻度に基づき、特定の徴候をもつコホート内で体細胞突然変異を順位序列付けした。
【０７６９】
１％未満の頻度で発生する突然変異を除外した。
【０７７０】
１％に等しいおよびこれを超える疾患徴候頻度を有する反復性突然変異をパネルのために選択した。
【０７７１】
標的ペプチドを反復性突然変異のために生成した。ミスセンス置換のため、突然変異体アミノ酸を、ミスセンス突然変異位置の直前および直後に、最大１０個の野生型アミノ酸で挟んだ。フレームシフト置換のため、フレーム外（out-of-frame）ＩＮＤＥＬ置換から生じる予測されるペプチド配列をアノテーション転写物から生成し、最大１０個の野生型アミノ酸をフレームシフト突然変異位置の上流に付加した。インフレームＩＮＤＥＬ置換のため、ＩＮＤＥＬ位置の前後に最大１０個の野生型アミノ酸配列を一体に連接した。
【０７７２】
アンダースコアで分けた遺伝子記号（ＨＧＮＣ形式）および突然変異置換情報（ＨＧＶＳ形式）からなる、ホットスポット標的ペプチド毎の特異的識別子を生成した。例えば、ＫＲＡＳの１２位におけるグリシンからアスパラギン酸への置換は、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄの特異的識別子を与えるであろう。
【０７７３】
次に、標的ペプチドを、ヒトの非冗長性タンパク質配列（ｎｒ）データベースに対するＢＬＡＳＴ解析に付した。このステップは、フレームシフト突然変異から生成された標的ペプチド配列が、公知の野生型配列を表さないことを確実にした。ミスセンス置換（substation）のため、このステップは、隣接野生型アミノ酸が、公知のヒト参照プロテオームにマッチすることを確実にした。
【０７７４】
腫瘍関連抗原ペプチド（ＴＡＡＰ）  −  ヘテロクリティック突然変異
文献検討を行って、徴候特異的腫瘍関連抗原のゲノムランドスケープを調査して、潜在的ＴＡＡの短いリストを生成した。
【０７７５】
第２の文献検討を行って、短いリストのＴＡＡが、ＣＤ８＋Ｔリンパ球応答を生成する公知の免疫原性ペプチドを含有するか決定した。このアプローチは、主に、ＴＡＡに由来する９アミノ酸（９ｍｅｒ）からなるＭＨＣクラスＩエピトープに焦点を合わせた。このステップは、４種のＨＬＡ型（ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２およびＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２）のうち１種に結合する９ｍｅｒ形式の潜在的ＴＡＡＰを同定した。
【０７７６】
ＴＡＡＰを配列最適化して、ＭＨＣクラスＩ分子（ａｋａヘテロクリティックペプチド）への結合を増強した。各ＨＬＡへの結合を最適化するために、ペプチドＭＨＣ結合モチーフおよびアミノ酸結合チャートを、Ｉｍｍｕｎｅ  Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（例えば：iedb.org/MHCalleleid/143）から査定した。アンカー位置における好まれるアミノ酸をＴＡＡＰ配列に挿入した（例えば、ＮＵＦ２−野生型：ＹＭＭＰＶＮＳＥＶ（配列番号７２５）；およびＮＵＦ２−ヘテロクリティック：ＹＬＭＰＶＮＳＥＶ（配列番号７２６））。
【０７７７】
次に、配列最適化されたＴＡＡＰおよび野生型ＴＡＡＰ配列の結合親和性を、次のアルゴリズムのうち１種を使用して査定した：ＮｅｔＭＨＣ４．０サーバー；ＮｅｔＭＨＣｐａｎ４．０サーバー；およびｍｈｃｆｌｕｒｒｙ  ｖ０．２．０。
【０７７８】
特異的ＨＬＡに対する予測結合親和性が、野生型ＴＡＡＰ配列と均等であるまたはそれよりも強かった場合、配列最適化されたＴＡＡＰを考慮した。
【０７７９】
次に、ＰｒｏＩｍｍｕｎｅのＲＥＶＥＡＬアッセイを使用して、選択された配列最適化されたＴＡＡＰを、特異的ＨＬＡへのｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合に関してスクリーニングした。ＲＥＶＥＡＬアッセイの陽性対照ペプチドの結合親和性＞＝４５％を有するＴＡＡＰをバインダーと考慮した。
【０７８０】
最後に、ＴＣＧＡ  ＲＮＡｓｅｑＶ２データセットにおいて、特定の徴候におけるＴＡＡＰのＲＮＡ発現レベルを測定した。０を超える正規化ＲＮＡ発現リードを有するＴＣＧＡ試料のパーセンテージを計算した。大部分の試料におけるＴＣＧＡ発現を有するＴＡＡＰを優先した。
【０７８１】
（実施例５）
ベクターへのインサートのライゲーション、Ｌｍへのトランスフェクション、配列決定、ＰＣＲ確認、およびＬｍ発現のウエスタンブロット確認のための例示的なプロトコール
合成されたＤＮＡを適切なベンダー（ＧＥＮＥＷＩＺ、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔまたはその他）から受け取った。所望のインサートは、隣接末端に制限部位ＸｈｏＩおよびＸｍａＩを含有して、分子操作を可能にした。ベンダーは、インサートをその選択シャトルベクター（典型的にはｐＵＣベクター）内にライゲーションした。インサートは、ｐＵＣベクターから切り出されて、ｐＡｄｖ１３４ベクター内にライゲーションされなければならない。これが完了したら、ＬｍｄｄＡ系統において発現試験を行った。
【０７８２】
ｐＡｄｖ１３４ベクターおよびインサートの制限酵素消化
目標：ｐＡｄｖ１３４ベクターおよびインサート（ｐＵＣまたは同様のシャトルベクター内の）の両方の適正なバンドを切り出して、両者が後に一緒にライゲーションされ得るように、正しい粘着末端を有することを確実にすること。
【０７８３】
（１）次の反応による１．２μｇのＤＮＡの制限酵素消化をセットアップした：ＤＮＡ（ほぼ１．２μｇ）；ＸｈｏＩ；ＸｍａＩ；１０×ＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液（最終濃度１×）；および水（必要に応じて）。セルフライゲーションを防止できるように、ベクターＤＮＡのみに、１μＬのＣＩＰを添加した。
【０７８４】
（２）消化物を迅速に混合し、スピンし、３７℃で２〜３時間放置した。
【０７８５】
（３）最終１×濃度となるように６×ローディング色素を各消化物に添加した。
【０７８６】
（４）１％アガロースゲルに全消化物をローディングした。
【０７８７】
（５）アガロースゲルにおけるサイズをモニタリングすることができるように、１０μＬの適切なＤＮＡラダーをローディングした。
【０７８８】
（６）アガロースゲルを１２０Ｖでほぼ４５分間泳動した。
【０７８９】
（７）ＤＮＡ試料毎に適切なサイズのバンドを可視化し、アガロースゲルから抽出した。
【０７９０】
（８）ゲル抽出キット（Ｚｙｍｏ  Ｃｌｅａｎ  Ｇｅｌ  ＤＮＡ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  Ｋｉｔ  Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｄ４００２／Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、抽出されたバンドを精製した。
【０７９１】
（９）Ｎａｎｏｄｒｏｐ（または同様の少体積分光光度計）を使用して、精製されたＤＮＡの濃度を測定した。
【０７９２】
（１０）適切なＤＮＡラダーに並べて、１μＬの最終精製ＤＮＡ（＋１×ローディング色素）を１％アガロースゲルにローディングした。
【０７９３】
（１１）アガロースゲルを１２０Ｖでほぼ４５分間泳動して、単一の適切なサイズのバンドを確実にした。
【０７９４】
ライゲーション
目標：ｐＡｄｖ１３４ベクターと挿入ＤＮＡとを一体に繋ぎ合わせて、インサートおよびｐＡｄｖ１３４の両方を含む完全に環状な部分のＤＮＡを得ること。
【０７９５】
（１）ライゲーション反応をセットアップした：直鎖化（ＸｈｏＩ／ＸｍａＩカット）および精製されたｐＡｄｖ１３４ベクター（５０ｎｇ）；カット（ＸｈｏＩ／ＸｍａＩ）および精製されたインサート（１００ｎｇ）；２μＬの１０×Ｔ４リガーゼ緩衝液（最終濃度１×）；１μＬのＴ４リガーゼ；および総体積２０μＬとなるような水。
【０７９６】
（２）ライゲーション反応物を迅速に混合し、スピンした。
【０７９７】
（３）次のパラメーターによりサーモサイクラー（thermocycler）内でライゲーション反応物をインキュベートした：（ステップ１）２２℃で２時間；（ステップ２）１６℃で４時間；および（ステップ３）４℃で一晩。
【０７９８】
（４）ＰＣＲ精製キット（ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ−５：Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｄ４００３／Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、カラムを通してライゲーション反応物を精製して、過剰な塩および酵素を取り除いた。最終体積１０μＬの水で溶出した以外は、キット内に提供されたプロトコールに従った。
【０７９９】
形質転換
目標：ライゲーションされたプラスミド産物をＥ．ｃｏｌｉ  ＭＢ２１５９系統に進入させること。その上、プラスミドを含有するＥ．ｃｏｌｉ細胞を≧倍加させること。
【０８００】
（１）１バイアル（７５μＬアリコート）のＥ．ｃｏｌｉ  ＭＢ２１５９エレクトロコンピテント（electrocompetent）細胞を氷上で穏やかに解凍した。
【０８０１】
（２）５μＬの精製ライゲーション反応物を解凍したＥ．ｃｏｌｉ  ＭＢ２１５９エレクトロコンピテント細胞に添加した。
【０８０２】
（３）細胞懸濁液を１ｍｍ電気穿孔キュベットに移し、底を穏やかにタップした。
【０８０３】
（４）電気穿孔器において次の設定でキュベット１×をパルスした：Ｖ＝１８００Ｖ；Ｒ＝２００Ω；およびＣ＝２５μＦ。
【０８０４】
（５）９００μＬ  ＳＯＣ培地をキュベットに直接的に直ちに添加した（数回穏やかにピペッティングして細胞を再懸濁した）。
【０８０５】
（６）電気穿孔した細胞を含むＳＯＣ培地を、１４ｍＬ  Ｆａｌｃｏｎ管に移し、２００ｒｐｍで１時間、３７℃にて振盪しつつ育成した。
【０８０６】
（７）ＬＢプレート上に２００μＬの細胞懸濁液を蒔いた。
【０８０７】
（８）プレートを３７℃で一晩インキュベートした。
【０８０８】
（９）翌朝、コロニーを採取した。
【０８０９】
クローン確認
目標：ｐＤＮＡを含有するコロニーを同定すること。
【０８１０】
（１）ＰＣＲマスターミックスを調製して、ｐＤＮＡに関して検査されているコロニーの数を査定した：１０μＬ  Ｔｅｒｒａ（商標）ＰＣＲ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｒｅｄ  Ｄｙｅ  Ｐｒｅｍｉｘ；０．５μＬフォワードプライマー（５’ｃａｔｃｇａｔｃａｃｔｃｔｇｇａ（配列番号７２７））；０．５μＬリバースプライマー（５’ｃｔａａｃｔｃｃａａｔｇｔｔａｃｔｔｇ（配列番号７２８））；９μＬ水；コロニー（ステップ２で添加）、総体積２０μＬ。
【０８１１】
（２）査定に必要とされるコロニー毎に、次のステップを行った：（ａ）ピペットチップでコロニーを採取し、これを新鮮ＬＢプレート上に再度画線して、周りにコロニーを引くように試みて、翌日に単離コロニーを得た；（ｂ）チップ上にはある程度のコロニーが残っており、これを適切なＰＣＲ反応管内でタップ／回旋させた。
【０８１２】
（３）コロニー再度画線が完了したら、新たなプレート（複数可）を３７℃に一晩置いた。
【０８１３】
（４）次のプログラム設定によるサーモサイクラー内でＰＣＲ反応を実行した：９８℃で３分間；９８℃で３０秒間；５８℃で３０秒間（３４サイクル反復（総計３５サイクル））；６８℃で２分間；７２℃で５分間；および実行準備が出来るまで４℃。
【０８１４】
（５）１％アガロースゲルに１０μＬのＰＣＲをローディングし、別々のレーンに１０μＬの１ｋＢ＋ＤＮＡラダーを確実に含めた。
【０８１５】
（６）アガロースゲルを１２０Ｖでほぼ４５分間泳動した。
【０８１６】
（７）ゲルを可視化し、適切なサイズのアンプリコンを探した。正しいアンプリコンは、最終ｐＤＮＡ構築物に実行可能な選択肢と考慮することができた。
【０８１７】
（８）翌日、午前中にインキュベーターから再度画線したプレート（複数可）を取り出し、その午後遅くまで４℃で貯蔵した。
【０８１８】
（９）夕方に、所望の正しい構築物毎に、１個のコロニーを採取し、これを２００μＬのＬＢに接種した。
【０８１９】
（１０）翌朝、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−ＮａｇｅｌによるＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ（登録商標）Ｘｔｒａ  Ｍｉｄｉ  ＥＦキットのミディプレップ（midi  prep）指示に従った。
【０８２０】
（１１）ｐＤＮＡが濃縮されたら、Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計（又は少体積用の均等物）を使用して濃度を測定した。濃度がほぼ３００ｎｇ／μＬであり、Ａ２６０／２８０比がほぼ１．８であることを確実にした。
【０８２１】
（１２）サンガー配列決定のためにｐＤＮＡを送って、参照に対する１００％配列マッチを確認した。
【０８２２】
Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓへの形質転換
目標：ＬｍｄｄＡ系統にプラスミドＤＮＡを形質転換すること
【０８２３】
（１）１バイアル（５０μＬアリコート）のＬｍｄｄＡエレクトロコンピテント細胞を氷上で穏やかに解凍した。
【０８２４】
（２）５００μｇのプラスミドＤＮＡを解凍したＬｍｄｄＡエレクトロコンピテント細胞に添加した。
【０８２５】
（３）氷上で５分間インキュベートした。
【０８２６】
（４）細胞懸濁液を１ｍｍ電気穿孔キュベットに移し、底に穏やかにタップした。
【０８２７】
（５）電気穿孔器において次の設定でキュベット１×をパルスした：Ｖ＝１０００Ｖ；Ｒ＝４００Ω；およびＣ＝２５μＦ。
【０８２８】
（６）９００μＬ  ＢＨＩ＋０．５Ｍスクロースをキュベットに直接的に直ちに添加した（数回穏やかにピペッティングして、細胞を再懸濁した）。
【０８２９】
（７）細胞懸濁液を１４ｍＬ  Ｆａｌｃｏｎ管に移し、２００ｒｐｍで１時間、３０℃にて振盪しつつ育成した。
【０８３０】
（８）１００μＬの細胞懸濁液をＢＨＩ＋１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンプレート上に蒔いた。
【０８３１】
（９）プレートを３７℃でほぼ２４時間インキュベートした。
【０８３２】
（１０）２個のコロニーを採取して、新たなＢＨＩ＋１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンプレート上に再度画線して、単一コロニー単離株を得た。
【０８３３】
（１１）プレートを３７℃でほぼ２４時間インキュベートした。
【０８３４】
（１２）次の夕方、再度画線（restruck）したプレート（ステップ１１プレート）から１個の単離コロニーを採取し、これを３ｍＬ  ＢＨＩ＋１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンにおいて３０℃で定常期まで一晩育成した。
【０８３５】
（１３）翌朝、５００μＬの培養物を採集し、これをクライオバイアルに添加し、次いで５００μＬの５０％グリセロールを添加することにより、一晩培養物からグリセロールストックを作製した。十分に混合する。
【０８３６】
（１４）グリセロールストックを−８０℃で貯蔵した。
【０８３７】
グリセロールストックにおける品質管理
目標：ＬｍｄｄＡ系統に形質転換されたｐＤＮＡを、正しい配列ＩＤとアラインさせることを確実にする。
【０８３８】
（１）ＰＣＲマスターミックスを調製して、検査されているグリセロールストックの数をｐＤＮＡ挿入サイズに関して査定した：１０μＬ  Ｔｅｒｒａ（商標）ＰＣＲ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｒｅｄ  Ｄｙｅ  Ｐｒｅｍｉｘ；０．５μＬフォワードプライマー（５’ｃａｔｃｇａｔｃａｃｔｃｔｇｇａ（配列番号７２７））；５μＬリバースプライマー（５’ｃｔａａｃｔｃｃａａｔｇｔｔａｃｔｔｇ（配列番号７２８））；９μＬ水；および総体積２０μＬとなるようなグリセロールストック材料。
【０８３９】
（２）査定が必要とされるグリセロールストック毎に、次のステップを行った：（ａ）ドライアイス上のグリセロールストックを用いて、ピペットチップを取ってストックから少量の材料をすくい上げ；（ｂ）適切なＰＣＲ反応管内でこれをタップ／回旋させた。
【０８４０】
（３）次のプログラム設定によりサーモサイクラー内でＰＣＲ反応を実行した：９８℃で３分間；９８℃で３０秒間；５８℃で３０秒間（３４サイクル反復（総計３５サイクル））；６８℃で２分間；７２℃で５分間；および実行準備が出来るまで４℃。
【０８４１】
（４）１％アガロースゲルに１０μＬのＰＣＲをローディングし、別々のレーンに１０μＬの１ｋＢ＋ＤＮＡラダーを確実に含めた。
【０８４２】
（５）アガロースゲルを１２０Ｖでほぼ４５分間泳動した。
【０８４３】
（６）ゲルを可視化し、適切なサイズのアンプリコンを探した。これは、検証に向けた最初のステップであった。
【０８４４】
（７）ゲル抽出キット（Ｚｙｍｏ  Ｃｌｅａｎ  Ｇｅｌ  ＤＮＡ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  Ｋｉｔ  Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｄ４００２／Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、抽出されたバンドを精製し、最終ステップのために水中に確実に溶出させた（その他の点ではキットのプロトコールに従った）。
【０８４５】
（８）サンガー配列決定のために抽出されたＤＮＡを送って、配列同一性（identify）を確認した。これは、検証に向けた最終ステップであった。
【０８４６】
Ｌｍ発現試験
目標：本出願人らの標的抗原（複数可）によるタンパク質発現の量を可視化すること。これは、構築物の３’末端におけるＦＬＡＧタグの使用により査定された。抗ｐ６０抗体を使用することにより、ローディングを制御した。
【０８４７】
（１）ＢＨＩ＋１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンプレート上に目的のグリセロールストックを画線した。翌日に単一コロニーが単離され得るように画線した。
【０８４８】
（２）プレートを３７℃でほぼ２４時間インキュベートした。
【０８４９】
（３）次の夕方、１個のコロニーを３ｍＬのＴＳＢ＋１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンに接種した。
【０８５０】
（４）培養物（複数可）を３７℃で、２００ｒｐｍで振盪しつつ一晩インキュベートした。
【０８５１】
（５）翌朝、１ｍＬの培養物を１．５ｍＬ管に添加した。
【０８５２】
（６）５分間、６０００ｇで４℃にて遠心分離した。
【０８５３】
（７）スピンしている間に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディング緩衝液を調製した：４×レムリ緩衝液における１０％２−メルカプトエタノール（例、４５０μＬ  ４×レムリ中の５０μＬ  ＢＭＥ）。また、移すための管を４℃に予冷した。
【０８５４】
（８）１ｍＬ上清を新たな予冷した１．５ｍＬ管に移した。ペレットを避けた。
【０８５５】
（９）室温でＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料管を調製した：（ａ）９０μＬの上清を新たな１．５ｍＬ管に添加し；（ｂ）３０μＬの調製したレムリローディング緩衝液を添加し；（ｃ）ＬｉｄＬｏｃｋを付けて管に蓋をし（加熱中にポンと開くのを防止）；（ｄ）試料を１０分間「煮沸」し（９８℃がうまくいった）；（ｅ）煮沸中に、上清試料の残りを長期貯蔵のために−２０℃に置き；（ｆ）ＬｉｄＬｏｃｋを外す前に、加熱した試料を数分間放置した（圧力を下げる）。
【０８５６】
（１０）ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを調製した（１枚のゲルは抗Ｆｌａｇ用、もう１枚は抗ｐ６０用）：（ａ）コームおよび底に通したテープを除去し；（ｂ）Ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ  Ｔｅｔｒａ  Ｃｅｌｌ（最大４枚のゲルを保持することができる）内にゲルをアセンブルし；（ｃ）ランニング緩衝液を調製し（水における１０％１０×Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙ／ＳＤＳ緩衝液を作製することにより、１×ランニング緩衝液を作った（４枚のゲルの同時泳動には約１．２Ｌが必要））；（ｄ）内側および外側チャンバーにランニング緩衝液を指定レベルまで満たした。
【０８５７】
（１１）７μｌの標準（ラダー）を適切なウェル（複数可）にローディングした。
【０８５８】
（１２）ウェル当たり１４μｌの試料をローディングした。
【０８５９】
（１３）システムをほぼ９０分間泳動した：（ａ）色素のフロント部がゲルに入るまで（ほぼ１０分間）９０Ｖで泳動し；（ｂ）適切な分離を達成するまで（ほぼ１．５時間）１２０Ｖに増加させた。
【０８６０】
（１４）完了したら、カセット上の矢印とアラインさせることにより、カセット開放レバーでカセットをこじ開ける。
【０８６１】
（１５）トランスファーを進める。
【０８６２】
（１６）適切な数のＴｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ  Ｔｕｒｂｏ  Ｍｉｄｉ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｐａｃｋ（ＰＶＤＦ）を開けた  −  １個のパックは、上で使用されたゲル（「ミニゲル」）の２枚をトランスファーするであろう。
【０８６３】
（１７）膜および下部スタックを、Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ  Ｔｕｒｂｏトランスファーシステムのトランスファーベースに置いた  −  ローラーを使用して気泡を除去した。
【０８６４】
（１８）いかなる過剰アクリルアミド（ゲルの最下端および上部レーン）も鋭利な器具で穏やかに除去した。
【０８６５】
（１９）トリミングしたゲル（複数可）をカセットから除去し、トランスファーベースに据えたＰＶＤＦ膜の上に直接的に置いた  −  ローラーを使用して気泡を除去した。
【０８６６】
（２０）Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ  Ｔｕｒｂｏ  Ｍｉｄｉ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｐａｃｋから予め湿らせたペーパーの上部スタックをゲル（複数可）の上に置いた  −  ローラーを使用して気泡を除去した。
【０８６７】
（２１）Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ  Ｔｕｒｂｏトランスファーユニットの上部をスタックの上に穏やかだがしっかりと置いた；次に、押しながら、カセット蓋を所定の位置にロックした。
【０８６８】
（２２）カセットをＴｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ  Ｔｕｒｂｏトランスファーユニット内に置いた。
【０８６９】
（２３）トランスファーを始めた。
【０８７０】
（２４）トランスファーの実行中に、次のセクションのための７５ｍＬの作業用ｉＢｉｎｄ溶液を調製し（７２ｍＬ体積は、４枚のミニゲルを覆う  −  各ｉＢｉｎｄ  Ｆｌｅｘ機械は、２枚のミニゲルを処理することができるため、４枚のゲルの処理は、２個の機械を必要とする）：５９．２５ｍＬの水を添加し；７５０μＬの１００×添加剤を添加し；１５ｍＬの５×緩衝液を添加し；使用まで４℃で維持した。
【０８７１】
（２５）トランスファーの実行中に、抗体溶液（ブロット当たりの体積を示す）を調製した：（ａ）一次：２ｍＬの調製されたｉＢｉｎｄ  Ｆｌｅｘ溶液を１５ｍＬコニカル＋１：１０００一次（２μＬ）＊に添加した；および（ｂ）二次：２ｍＬの調製されたｉＢｉｎｄ  Ｆｌｅｘ溶液を１５ｍＬコニカル＋１：１０００二次（２μＬ）＊に添加した（＊希釈は、使用した抗体に基づき変化させることができる  −  ここにはα−Ｆｌａｇおよびα−ｐ６０ブロット用を示す（全て１：１０００で））。
【０８７２】
（２６）完了したら、トランスファーカセット（複数可）を開け、膜（複数可）を取り出した  −  水中に置き、ブロッティングの準備が出来るまで穏やかに揺らした。
【０８７３】
（２７）ｉＢｉｎｄ  Ｆｌｅｘ機械（複数可）内に正しい試薬トレーをセットアップした。
【０８７４】
（２８）機械（複数可）にｉＢｉｎｄ  Ｆｌｅｘカードを加えた。
【０８７５】
（２９）カードを１０ｍＬの調製されたｉＢｉｎｄ  Ｆｌｅｘ溶液で予め湿らせた。
【０８７６】
（３０）膜をカード上に置く直前に、追加の１ｍＬの調製されたｉＢｉｎｄ  Ｆｌｅｘ溶液を、各ミニブロットが置かれることになる区域に添加した。
【０８７７】
（３１）ガイドグリッドを使用して、適切な区域にタンパク質側を下にしてブロット（複数可）を置き、低分子量がスタックに最も近かった。
【０８７８】
（３２）ブロットにローラーをかけて、いかなる空気の泡も除去した。
【０８７９】
（３３）閉めて、蓋の上にラッチを押した。
【０８８０】
（３４）試薬を試薬トレーに添加した（ここで体積はミニゲル用を示す）：（ａ）レーン１：ブロット当たり２ｍＬの一次抗体（ｉＢｉｎｄ  Ｆｌｅｘ溶液において先に調製した）；（ｂ）レーン２：ブロット当たり２ｍＬの調製されたｉＢｉｎｄ  Ｆｌｅｘ溶液；（ｃ）レーン３：ブロット当たり２ｍＬの二次抗体（ｉＢｉｎｄ  Ｆｌｅｘ溶液において先に調製した）；および（ｄ）レーン４：ブロット当たり６ｍＬの調製されたｉＢｉｎｄ  Ｆｌｅｘ溶液。
【０８８１】
（３５）試薬カバーを閉め、インキュベーションの開始時間を記録した。
【０８８２】
（３６）インキュベーションを少なくとも３時間、ただし最大Ｏ／Ｎで進めた。
【０８８３】
（３７）時間が経過したら、試薬リザーバまで蓋を開けて、液体が全てなくなったことを確実にした。
【０８８４】
（３８）膜を取り出し、水中にリンス／貯蔵した。
【０８８５】
（３９）ｉＢｉｎｄ  Ｆｌｅｘカードを廃棄した。
【０８８６】
（４０）等量のＳｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｄｕｒａ  Ｓｔａｂｌｅ  Ｐｅｒｏｘｉｄｅ溶液およびＬｕｍｉｎｏｌ／Ｅｎｈａｎｃｅｒ溶液を管内で混合した。
【０８８７】
（４１）ＧＥ  ＡＩ６００をオンにした。ウォーミングアップ中に、現像試薬を最初のブロットに添加し：（ａ）膜から水を全てデカントし；（ｂ）膜をプラスチックシートプロテクターの内部区画に加え；（ｃ）１ｍＬの調製された現像溶液を膜に直接的に添加し、シートプロテクターの上部を溶液／ブロットの上に置き；いかなる気泡も排除し；（ｄ）膜をほぼ１〜５分間インキュベートした。
【０８８８】
（４２）ブロットを撮像した。
【０８８９】
（４３）ブロットをリンスし、水中に４℃で保存した、またはさらなる必要がなければ廃棄した。
【０８９０】
（実施例６）
概念実証：ＣＴ２６負荷試験におけるＬｍ−ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄホットスポット構築物の治療有効性
本試験は、ＣＴ２６腫瘍成長の抑制におけるＬｍ−ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｄホットスポット構築物の治療有効性を決定した。ＣＴ２６マウスモデルにおける本明細書で標的化されるＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ突然変異は、多くのヒト腫瘍徴候において同定されるヒトＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄホットスポットと同一である。その上、本試験は、非ミニ遺伝子として送達されるまたはミニ遺伝子構築物として送達されるＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ構築物の有効性を査定した。特異的ＭＨＣ対立遺伝子（ＭＨＣ−Ｉ  ＫｄおよびＭＨＣ−Ｉ  Ｄｄ）に結合する免疫原性９ｍｅｒの予測に使用されるホットスポットヘテロクリティック設計戦略を使用して、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ  ＫｄおよびＤｄ構築物を設計した。しかし、標的はホットスポット突然変異を天然において有するため、これらの構築物には、ヘテロクリティック突然変異を与えなかった。
【０８９１】
処置スケジュール
Ｌｍ−ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄホットスポットワクチン接種は、表１および２に記載されている通りに始まり、続いて１週間間隔で２回のブーストが行われた。植え込みおよび投薬スケジュールの詳細を表２２に示す。
【０８９２】
【表２２】
2020513737.tif 000054
【０８９３】
実験の詳細
腫瘍細胞系増大。１０％ＦＢＳを有するＲＰＭＩにおいてＣＴ２６細胞系（マウス結腸癌細胞系）を培養した。
【０８９４】
腫瘍接種。０日目に（１４ＪＵＮ１７）、ＣＴ２６細胞は、０．２５％トリプシン（１×）でトリプシン処理され、ＰＢＳにおいて適切な濃度（５×１０５細胞／マウス）となるよう培地で２回洗浄されるであろう。ＣＴ２６細胞を、各マウスの右側腹部の皮下に植え込んだ。
【０８９５】
処置。ワクチン調製を次に示す：（ａ）３７℃ウォーターバスにおいて−８０℃から（form）１バイアルを解凍し；（ｂ）１４，０００ｒｐｍで２分間スピンし、上清を廃棄し；（ｃ）１ｍＬ  ＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳを廃棄し；（ｄ）最終濃度５×１０８ＣＦＵ／ｍＬとなるように再懸濁した。腫瘍植え込み４日後に投薬を開始した。
【０８９６】
【表２３】
2020513737.tif 000055
【０８９７】
結果および結論
ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄホットスポット突然変異は、マウスＣＴ２６結腸直腸がんモデルにおける腫瘍成長を有意に制御することができた。図１を参照されたい。これらのデータは、共有されるホットスポット突然変異を標的化するための強い概念実証を提供した。その上、本明細書で使用されるＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄホットスポットは、様々なヒトがん徴候において同定されるＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄホットスポット突然変異と同一であった。
【０８９８】
さらに、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄホットスポット構築物は、２１ｍｅｒまたはミニ遺伝子として送達されたかにかかわらず、腫瘍成長を有効に制御することができた。図１を参照されたい。ミニ遺伝子構築物の有効性は、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ予測ＭＨＣ結合アルゴリズムに基づきミニ遺伝子構築物を予測および選択するための設計戦略を強く支持した。
【０８９９】
Ｌｍ  ＮＳＣＬＣ  ＨＯＴ  ＥＶＯ２  ＥＡＡＡＫ．ｉ２０（Ｂ）によるＣＴ２６負荷試験
同様の実験を行って、ＣＴ２６腫瘍成長の抑制におけるＬｍ  ＮＳＣＬＣ  ＨＯＴ  ＥＶＯ２  ＥＡＡＡＫ．ｉ２０（Ｂ）ホットスポット構築物（配列番号８９５に表記されている融合ポリペプチドインサート配列）の治療有効性を決定した。ＫＲＡＳ突然変異が、自発的ヒトがんの線形かつ均一な進化の高頻度ドライバーであることが公知である。同じＫＲＡＳ遺伝子は、ＣＴ２６結腸直腸マウスモデルにおいて突然変異されている（ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ）。したがって、Ｌｍ  ＮＳＣＬＣ  ＨＯＴ  ＥＶＯ２  ＥＡＡＡＫ．ｉ２０（Ｂ）ホットスポット構築物が、本出願人らのＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ＿２１ｍｅｒとして同じＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ突然変異標的を含有することを考慮して、本出願人らは、Ｌｍ  ＮＳＣＬＣ  ＨＯＴ  ＥＶＯ２  ＥＡＡＡＫ．ｉ２０（Ｂ）ホットスポット構築物が、同様の様式で腫瘍成長を抑制することを仮定した。無処置ＢＡＬＢ／ｃマウスの側腹部に、３００，０００個のＣＴ２６結腸直腸腫瘍細胞を植え込んだ。腫瘍植え込み４日後に、マウスを全Ｌｍ−構築物（ＬｍｄｄＡ−２７４（対照）、Ｌｍ  ＮＳＣＬＣ  ＨＯＴ  ＥＶＯ２  ＥＡＡＡＫ．ｉ２０（Ｂ）ホットスポット構築物（図３４にＨＯＴ−肺として示す）およびＨＯＴ−Ｌｍ  ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ構築物）で免疫化し、続いて初期免疫化１週間後にブーストした。図３４に示すデータは、群腫瘍測定値を示す。図３４に示すデータは、Ｌｍ  ＮＳＣＬＣ  ＨＯＴ  ＥＶＯ２  ＥＡＡＡＫ．ｉ２０（Ｂ）ホットスポット構築物が、対照群（無処置およびＬｍｄｄＡ−２７４）と比較して腫瘍進行を有意に抑制することができることを明らかに実証する。Ｌｍ  ＮＳＣＬＣ  ＨＯＴ  ＥＶＯ２  ＥＡＡＡＫ．ｉ２０（Ｂ）ホットスポット構築物およびＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ＿２１ｍｅｒ構築物の間に有意差はなかった。結果は、Ｌｍ  ＮＳＣＬＣ  ＨＯＴ  ＥＶＯ２  ＥＡＡＡＫ．ｉ２０（Ｂ）ホットスポット構築物が、ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ＿２１ｍｅｒ構築物と均等に腫瘍成長を有意に制御することができることを実証し、その抗腫瘍特性を強調する。
【０９００】
Ｔ細胞データ
ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝４／群）を、０および７日目に、Ｌｍ−ＨＯＴ  ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ−２１ｍｅｒ構築物で免疫化し、最終免疫化１週間後（１４日目）に脾臓を収集して、細胞免疫応答を査定した。図２４Ａおよび図２４Ｂは、Ｌｍ−ＨＯＴ  ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ治療法が、腫瘍がないマウスにおける抗原特異的Ｔ細胞応答を誘導することができることを実証する。Ｌｍ−ＨＯＴ治療法は、脾臓ＫＲＡＳ特異的ＩＦＮｇ  ＥＬＩＳｐｏｔ応答のレベル増加によって証明される通り、対照よりもエフェクターＴ細胞機能を増強した。ＴＨ１応答の誘導は、ＩＦＮｇ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって決定される、脾細胞百万個当たりのＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ特異的ＩＦＮｇスポット形成コロニー（ＳＦＣ）の数によって示される。ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｄ  ２１ｍｅｒ抗原標的全体に及ぶＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄプールペプチド（９アミノ酸によって重複する１５ｍｅｒ；２．５μｇ／ｍＬ最終濃度）を使用して、脾細胞を１８時間刺激した。
【０９０１】
図２５Ａ〜図２５Ｄは、Ｌｍ−ＨＯＴ  ＫＲＡＳ−Ｇ１２Ｄ治療法が、腫瘍免疫微小環境を変更することができることを示す。無処置ＢＡＬＢ／ｃマウスの側腹部に、３００，０００個のＣＴ２６結腸直腸腫瘍細胞を植え込んだ。腫瘍植え込み４日後に、マウスをＨＯＴ−Ｌｍ  ＫＲＡＳ＿Ｇ１２Ｄ構築物で免疫化し、続いて初期免疫化１週間後にブーストした。腫瘍植え込み１４日後に処置ＣＴ２６マウスの腫瘍に由来するＴＩＬを収集した。ワクチン治療法は、ＣＴ２６結腸直腸腫瘍モデルにおける腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）組成を変更した。ワクチン治療法は、総ＣＤ４５集団の浸潤、腫瘍浸潤ＣＤ８  Ｔ細胞のパーセンテージを有意に増加させ、腫瘍浸潤ＣＤ４  Ｔｒｅｇのパーセンテージを有意に低下させた。さらに、図２５Ｃは、Ｌｍ−ＨＯＴ構築物が、ＫＲＡＳ特異的腫瘍浸潤Ｔ細胞応答を駆動することができることを示す。結果的に、Ｌｍ−ＨＯＴ治療法は、ＣＴ２６結腸直腸腫瘍モデルにおける腫瘍成長を有意に抑制した。
【０９０２】
（実施例７）
概念実証：ＬｍヘテロクリティックＷＴ１ミニ遺伝子融合タンパク質構築物の有効性
ペプチドミニ遺伝子発現系を使用して、ウィルムス腫瘍タンパク質を標的とする特有のヘテロクリティックミニ遺伝子を査定した。この発現系は、カルボキシ末端に別個のペプチド部分を含有する組換えタンパク質のパネルのクローニングを容易にするように設計した。これは、鋳型としてシグナル配列（ＳＳ）−ユビキチン（Ｕｂ）−抗原性ペプチド構築物の１種をコードする配列を利用する単純なＰＣＲ反応によって達成される。Ｕｂ配列のカルボキシ末端領域へと伸長するプライマーを使用し、プライマーの３’末端に所望のペプチド配列のコドンを導入することにより、単一ＰＣＲ反応で新たなＳＳ−Ｕｂ−ペプチド配列を生成することができる。細菌プロモーターおよびシグナル配列（例えば、ＬＬＯまたはＡｃｔＡ１〜１００分泌シグナル）の最初の数個のヌクレオチドをコードする５’プライマーは、全構築物に対して同じものとなることができる。この戦略を使用して生成された構築物を図２Ａおよび図２Ｂに概略的に表す。
【０９０３】
ミニ遺伝子系の利点の１つは、単一のＬｉｓｔｅｒｉａベクター構築物を使用して複数のペプチドを細胞にローディングすることが可能となることである。複数のペプチドは、上述の単一ペプチド発現系の修飾を使用して、組換え弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ（例えば、Ｌｍｄｄａ）に導入することができる。逐次ＳＳ−Ｕｂ−ペプチド配列に由来する複数の別個のペプチドをコードするキメラタンパク質は、１個のインサートにおいてコードされ得る。例えば、図２Ｂを参照されたい。シャイン・ダルガーノリボソーム結合部位を、各ＳＳ−Ｕｂ−ペプチドコード配列の前に導入して、ペプチド構築物のそれぞれの別々の翻訳を可能にすることができる。図２Ｂは、１株の組換えＬｉｓｔｅｒｉａから３種の別々のペプチド抗原を発現するように設計された構築物の概略表示を実証する。
【０９０４】
ＡＤＸＳ  Ｌｍｄｄａ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ構築物によるｔＬＬＯ−ＷＴ１−ヘテロクリティック融合タンパク質の発現を査定するために、ウィルムス腫瘍１タンパク質を標的とする特有のヘテロクリティックミニ遺伝子をｐＡｄｖ１３４プラスミドにおいて生成し、Ｌｍｄｄａに形質転換した。ｐＡｄｖ１３４  ｔＬＬＯプラスミドは、配列番号３３６に表記されるＮ末端ＬＬＯ断片をコードする。ｔＬＬＯ−ＷＴ１ヘテロクリティック融合タンパク質は、次のものをＮ末端からＣ末端に含む：配列番号３３６に表記されるＮ末端ＬＬＯ断片、続いて配列番号７６２に表記されているＦＬＡＧタグ、続いて配列番号７４７に表記されているユビキチン配列、続いて下表２４に収載されているヘテロクリティックＷＴ１  ９ｍｅｒ。
【０９０５】
【表２４】
2020513737.tif 000056
【０９０６】
組み合わせたＷＴ１−ｔＬＬＯ−ＦＬＡＧ−Ｕｂ−ヘテロクリティックフェニルアラニン構築物（構築物＃１）は、配列番号７４２に表記されている（ｔＬＬＯ＝１〜４４１；ＦＬＡＧ＝４４２〜４６２；ユビキチン＝４６３〜５３７；ヘテロクリティックフェニルアラニンペプチド＝５３８〜５４６）。３種のＷＴ１ペプチド（Ｐ１−Ｐ２−Ｐ３；それぞれ配列番号７４３（ＲＳＤＥＬＶＲＨＨＮＭＨＱＲＮＭＴＫＬ）、７４４（ＰＧＣＮＫＲＹＦＫＬＳＨＬＱＭＨＳＲＫＨＴＧ）および７４５（ＳＧＱＡＹＭＦＰＮＡＰＹＬＰＳＣＬＥＳ））を標的とする１種の追加の構築物（Ｌｍｄｄａ−ＷＴ１−ｔＬＬＯ−Ｐ１−Ｐ２−Ｐ３−ＦＬＡＧ−ＵＢ−ヘテロクリティックチロシンミニ遺伝子構築物）を生成した。各「Ｐ」ペプチドは、１９〜２２アミノ酸で構成されており、これは、追加のＣＤ４  Ｔヘルパーエピトープの提供に十分な長さである。３種のペプチドは、リンカーによって分離されている。Ｐ３ペプチドは、ＳＧＱＡＲＭＦＰＮＡＰＹＬＰＳＣＬＥＳ（配列番号７４６）をＳＧＱＡＹＭＦＰＮＡＰＹＬＰＳＣＬＥＳ（配列番号７４５）に変換するヘテロクリティック突然変異を含有する。ヘテロクリティックＰ３ペプチドに加えて、Ｌｍｄｄａ−ＷＴ１−ｔＬＬＯ−Ｐ１−Ｐ２−Ｐ３−ＦＬＡＧ−ＵＢ−ヘテロクリティックチロシンミニ遺伝子構築物は、Ｃ末端にユビキチン−ＹＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号７４１）部分を含有する。組み合わせたＷＴ１−ｔＬＬＯ−Ｐ１−Ｐ２−Ｐ３−ＦＬＡＧ−ＵＢ−ヘテロクリティックチロシンミニ遺伝子構築物は、配列番号７４８に表記されている（ｔＬＬＯ＝１〜４４１；野生型ＷＴ１ペプチドｖ１４−ＷＴ１−４２７長＝４４２〜４６０；野生型ＷＴ１ペプチドｖ１５−ＷＴ１−３３１長＝４６６〜４８７；ヘテロクリティックＷＴ１ペプチドｖ１Ｂ−ＷＴ１−１２２Ａ１-ロング＝４９３〜５１１；ＦＬＡＧ＝５１２〜５３２；ユビキチン＝５３３〜６０７；ヘテロクリティックチロシンペプチド＝６０８〜６１６）。ウエスタンブロットによって、特有のヘテロクリティックＷＴ１ミニ遺伝子産物のｔＬＬＯ−融合タンパク質発現に関して、個々のＬｍｄｄａ構築物のそれぞれをアッセイした。
【０９０７】
ウエスタンブロットによって、特有のヘテロクリティックＷＴ１ミニ遺伝子産物のｔＬＬＯ−融合タンパク質発現に関して、構築物＃１（Ｌｍｄｄａ−ＷＴ１−ｔＬＬＯ−ＦＬＡＧ−Ｕｂ−ヘテロクリティックフェニルアラニンミニ遺伝子構築物）およびＬｍｄｄａ−ＷＴ１−ｔＬＬＯ−Ｐ１−Ｐ２−Ｐ３−ＦＬＡＧ−ＵＢ−ヘテロクリティックチロシンミニ遺伝子構築物をアッセイした。Ｌｍ  ＷＴ１ミニ遺伝子構築物を含有するプレートに由来する単一コロニーを使用して、３７℃のドライ振盪インキュベーター内で６ｍＬのブレインハートインフュージョン（Brain  Heart  Infusion）（ＢＨＩ）ブロスにおける一晩培養物を接種した。翌日、本来の一晩培養物の１：１０希釈を、９ｍＬの新鮮ＢＨＩに再懸濁し、ＯＤ６００＝０．６に達するまで、３７℃のドライ振盪インキュベーター内で育成した。１３０００ＲＰＭの２分間遠心分離によって細胞をペレットにした。試料上清を収集し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動した。２５μＬの４×ＬＤＳ試料緩衝液（Ｃａｔ＃１６１−０７４７）で７５μＬの試料を希釈することにより試料を調製し、９８℃で１０分間煮沸し、氷上に置き、次いで最大スピードで１０分間、４℃にて遠心分離した。１３μＬの試料を４〜１５％プレキャストタンパク質ゲル（ＢｉｏＲａｄ  Ｃａｔ＃４５６１０８６）で泳動した。Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ  Ｔｕｒｂｏトランスファー装置（Ｃａｔ＃１７０−４１５５）およびＰＶＤＦ  Ｍｉｄｉトランスファーパック（Ｂｉｏ−Ｒａｄ＃１７０−４１５７）を使用して、タンパク質ゲルをトランスファーした。一次として抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ  Ｆ１８０４）または抗ＬＬＯ（Ａｂｃａｍ  ａｂ２００５３８）を、二次抗体としてヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰコンジュゲート（ｓｃ２００５）を用いてブロットをインキュベートした。次に、ブロットをｉＢｉｎｄ  Ｆｌｅｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃａｔ＃１７７２８６６）においてインキュベートし、洗浄し、次いでＳｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｄｕｒａ  Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｄｕｒａｔｉｏｎ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ＃３４０７６）によって現像した；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｉｍａｇｅｒ  ６００（ＧＥ）において画像を現像した。
【０９０８】
特有のｔＬＬＯ−ＷＴ１−ヘテロクリティックミニ遺伝子融合タンパク質の発現および分泌を確認した。構築物＃１およびＬｍｄｄａ−ＷＴ１−Ｐ１−Ｐ２−Ｐ３−ＹＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号７４１）ヘテロクリティックチロシン＋ミニ遺伝子構築物に由来する培養上清の抗Ｆｌａｇタグ抗体ウエスタンブロットをそれぞれ図３Ａおよび図３Ｂに示す。本出願人らは、個々のｔＬＬＯ−ＷＴ１−ヘテロクリティックミニ遺伝子融合タンパク質毎に正しいサイズおよび同一性に対応するタンパク質バンドを検出することができた。これらのデータは、ｐＡｄｖ１３４プラスミドおよびＬｍｄｄａ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ系統を使用して、ＷＴ１タンパク質内の複数のペプチド断片を標的とするヘテロクリティックペプチドの生成される能力を実証する。
【０９０９】
表２４における構築物＃２〜９に対して、ヘテロクリティックＷＴ１ミニ遺伝子を含有する特有のｔＬＬＯ−融合タンパク質のそれぞれからプラスミドＤＮＡを検出するために、コロニーＰＣＲによって個々のＬｍｄｄａ構築物のそれぞれをアッセイした。
【０９１０】
【表２５】
2020513737.tif 000057
【０９１１】
手順
使用した一般的コロニーＰＣＲ手順を次に示す。大きいコロニーを有するプレートを得た（一般に、３７℃で２４時間育成したプレートがこの手順では良好である）。次の通りにＰＣＲのためのマスターミックスを作製した。
【表１３０】
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【０９１２】
２０μＬのマスターミックスを各ＰＣＲ管に等分した。ピペットチップ（１０〜２０μＬ体積が最も良好）を使用して、１個のコロニーから多大な体積をすくい上げた。ＰＣＲ管内でピペットチップを数回タップし、回旋させて、細菌を除去した。次のＰＣＲプログラムを使用して、サーモサイクラー内でＰＣＲ反応（複数可）を実行した。
【表１３１】
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【０９１３】
サーモサイクラーからＰＣＲ管を取り出し、４μＬの６×ローディング色素を添加した。１％アガロースゲルにおいて、１０μＬの１ｋｂ＋ＤＮＡラダーに並べて１０μＬの各ＰＣＲ反応物を泳動した。プライマーは、産物に追加の１６３塩基対を付加した。フォワードプライマーは、ｔＬＬＯの３’末端の７０塩基対上流に結合した（ＸｈｏＩ部位を含む）。リバースプライマーは、停止部位の９３塩基対下流に結合した（ＸｍａＩ部位を含む）。
【０９１４】
表２４に由来するｐＡｄｖ１３４  ＷＴ１−ヘテロクリティックプラスミド＃２〜９を含有するＬｍｄｄａ系統を示す代表的コロニーＰＣＲ結果を図４に示す。本出願人らは、個々のｔＬＬＯ−ＷＴ１−ヘテロクリティックミニ遺伝子プラスミド毎の正しいサイズおよび同一性に対応するＤＮＡバンドを検出することができた。これらのデータは、ｐＡｄｖ１３４プラスミドおよびＬｍｄｄａ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ系統を使用して、ＷＴ１タンパク質内の複数のペプチド断片を標的とするヘテロクリティックペプチドの生成される能力を実証し、このことは、かかる構築物を治療組成物として使用して、ＷＴ１を標的化して、ＷＴ１ならびにＷＴ１発現がんおよび腫瘍に対する免疫応答を作製または増強することができることを示す。
【０９１５】
２種の異なるＷＴ１構築物を使用して、ＡＡＤマウスにおけるＷＴ１特異的Ｔ細胞応答の生成を査定するために、ＥＬＩＳｐｏｔを行って、所望のワクチン誘導性Ａｇ特異的応答を決定した。ＡＡＤマウス（Ｂ６．Ｃｇ−Ｔｇ（ＨＬＡ−Ａ／Ｈ２−Ｄ）２Ｅｎｇｅ／Ｊ；Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  −  ストック番号：００４１９１）は、ヒトＨＬＡ−Ａ２．１プロモーターの方向付けにより、ヒトＨＬＡ−Ａ２．１遺伝子のアルファ−１およびアルファ−２ドメイン、ならびにマウスＨ−２Ｄｄ遺伝子のアルファ−３膜貫通および細胞質ドメインを含有する、種間ハイブリッドクラスＩ  ＭＨＣ遺伝子、ＡＡＤを発現するトランスジェニックマウスである。このトランスジェニック系統は、ＨＬＡ−Ａ２提示抗原に対するヒトＴ細胞免疫応答のモデリングを可能にし、感染性疾患またはがん治療法のためのワクチンの検査において有用となり得る。免疫化スケジュールを表２６に提示する。使用したマウスは、８〜１０週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスであった。
【０９１６】
【表２６】
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【０９１７】
ワクチン調製。簡潔に説明すると、要求される栄養プレート上に各グリセロールストックを画線し、一晩育成した。単一コロニーを、抗生物質選択下でのブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）ブロスの一晩培養物における育成に使用した。一晩培養物を１：１０（ｖｏｌ／ｖｏｌ）希釈で使用して、新鮮ＢＨＩブロスに接種した。ＯＤほぼ０．６〜０．７の対数期中期まで、１〜３時間３７℃にて軌道旋回振盪機内で細菌をインキュベートした。マウスに、ＰＢＳにおけるｉ．ｐ．接種によって１×１０９ＣＦＵ  Ｌｍを感染させた。
【０９１８】
ＥＬＩＳＰＯＴ。１８日目に、ＩＡＣＵＣプロトコールに従ってＣＯ２窒息によってマウスを屠殺し、脾臓を収集し、脾細胞の単一細胞懸濁液を９６ウェルプレートに蒔き、野生型またはヘテロクリティックペプチドのいずれかで刺激した（表２７）。他の野生型およびヘテロクリティックペプチド対を用いて同様の実験を行った（表２８）。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用して、野生型またはヘテロクリティックペプチドのいずれかに対して応答する抗原特異的ＣＤ８  Ｔ細胞を列挙した。完全ＥＬＩＳＰＯＴプロトコールは、ＣＴＬ  ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ（www.immunospot.com/resources/protocols/ELISPOT-protocol.htm）の通りであった。
【０９１９】
【表２７】
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【０９２０】
【表２８】
2020513737.tif 000062
【０９２１】
一般的ＥＬＩＳＰＯＴプロトコールを下に示す。
【０９２２】
０日目（無菌条件）。特異的プロトコールに従って捕捉抗体を希釈することにより捕捉溶液を調製した。多くのサイトカインは、各ウェルに８０μＬの捕捉溶液を添加する前に、７０％エタノールで３０秒間ＰＶＤＦ膜を予め湿らせ、１５０μＬのＰＢＳで３回洗浄することから利益を得る。加湿チャンバー内でプレートを一晩４℃でインキュベートした。
【０９２３】
１日目（無菌条件）。１％新鮮Ｌ−グルタミンを添加することによりＣＴＬ−Ｔｅｓｔ（商標）培地を調製した。ＣＴＬ−Ｔｅｓｔ（商標）培地において２×最終濃度で抗原／マイトジェン溶液を調製した。０日目からコーティング抗体でプレートをデカントし、１５０μＬ  ＰＢＳで１回洗浄した。１００μＬ／ウェルで抗原／マイトジェン溶液を蒔いた。ＰＢＭＣを解凍した後に、または密度勾配により白血球細胞を単離した後に、ＣＴＬ−Ｔｅｓｔ（商標）培地において所望の濃度、例えば、３００，０００細胞／ウェルに対応する３百万個／ｍＬになるようにＰＢＭＣを調整した（しかし、１００，０００〜８００，０００細胞／ウェルは線形結果を達成する筈であるから、細胞数は、予想スポット数に従って調整することができる）。ＰＢＭＣの処理の間、また、これを蒔くまで、加湿インキュベーター、５〜９％ＣＯ２内で３７℃にて細胞を維持した。大オリフィスチップを使用して、１００μＬ／ウェルでＰＢＭＣを蒔いた。完了したら、プレートの側面を穏やかにタップし、３７℃加湿インキュベーター、５〜９％ＣＯ２内に直ちに置いた。使用するサイトカインに応じて２４〜７２時間インキュベートした。プレートはスタックしなかった。インキュベーターのドアを慎重に開け閉めすることにより、プレートの振盪を回避した。インキュベーション中にプレートに触れなかった。
【０９２４】
２日目。当日の洗浄溶液を調製した：ＰＢＳ、蒸留水およびＴｗｅｅｎ−ＰＢＳ。特異的プロトコールに従って検出抗体を希釈することにより、検出溶液を調製した。プレートをＰＢＳで２回、次いで０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで２回、各回２００μＬ／ウェルにて洗浄した。８０μＬ／ウェルの検出溶液を添加した。ＲＴで２時間インキュベートした。特異的プロトコールに従って三次抗体を希釈することにより、三次溶液を調製した。プレートを２００μＬ／ウェルの０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで３回洗浄した。８０μＬ／ウェルのＳｔｒｅｐ−ＡＰ溶液を添加した。ＲＴで３０分間インキュベートした。その特異的プロトコールに従って現像溶液を調製した。プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで２回、次いで蒸留水で２回、各回２００μＬ／ウェルにて洗浄した。８０μＬ／ウェルの現像溶液を添加した。ＲＴで１０〜２０分間インキュベートした。膜を水道水で穏やかにリンスすることにより反応を停止させ、デカントし、これを３回反復した。プレートの保護暗渠（underdrain）を除去し、プレートの裏を水道水でリンスした。プレートを伏せて稼働中のフード内で２時間またはペーパータオル上に２４時間卓上で風乾させた。プレートをスキャンし、計数した。
【０９２５】
記載されている通りにＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックＢ６マウスにワクチン接種し、脾細胞を特異的ＷＴ１ペプチド（ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号７４９）、ＦＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号７３２））によりｅｘ  ｖｉｖｏで刺激し、ＩＦＮｇ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって解析した。ヘテロクリティックワクチン接種（ＷＴ１−Ｆミニ遺伝子：ＦＭＦＰＮＡＰＹＬ；配列番号７３２）は、免疫化ＨＬＡ２トランスジェニックマウスにおけるＡｇ特異的Ｔ細胞応答を誘導した。図５および図７Ｂを参照されたい。加えて、ヘテロクリティックワクチン接種は、天然ＷＴ１腫瘍抗原（ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ；配列番号７４９）と交差反応するＴ細胞応答を誘発した。図５および図７Ａを参照されたい。データは、ＷＴ１−Ｆヘテロクリティックミニ遺伝子ワクチンによるワクチン接種が、ＷＴ１−天然腫瘍抗原（ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ；配列番号７４９）と交差反応性のＴ細胞を誘発することができることを実証した。全体的に見て、データは、ヘテロクリティックミニ遺伝子ワクチンが、天然腫瘍抗原と交差反応するＴ細胞を誘発することができることを実証した。
【０９２６】
記載されている通りにＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックＢ６マウスにワクチン接種し、脾細胞を収集した。ワクチン特異的ＹＭＦＰＮＡＰＹＬペプチド（配列番号７４１）または天然ＷＴ１ペプチド（ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ；配列番号７４９）に応答してＩＦＮｇを産生するＴ細胞の能力をＩＦＮｇ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって決定した。ヘテロクリティックワクチン接種（ＷＴ１−ＡＨ１−Ｔｙｒミニ遺伝子：ＹＭＦＰＮＡＰＹＬ；配列番号７４１）は、免疫化ＨＬＡ２トランスジェニックマウスにおけるＡｇ特異的Ｔ細胞応答を誘導した。図６および図８Ｂを参照されたい。加えて、ヘテロクリティックワクチン接種は、天然ＷＴ１腫瘍抗原（ＲＭＦＰＡＰＹＬ；配列番号７４９）と交差反応するＴ細胞応答を誘発した。図６および図８Ａを参照されたい。
【０９２７】
（実施例８）
概念実証：Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスを使用したＭＣ３８に基づく移植可能な結腸直腸腫瘍モデルにおけるＬｍ  ＭＣ３８構築物の治療有効性
本試験は、確立されたＭＣ３８腫瘍の制御における様々なＭＣ３８構築物（非ミニ遺伝子およびミニ遺伝子）の治療有効性を調べた。ＭＣ３８腫瘍は、マウス結腸腺癌に由来するＭＣ３８細胞系を使用した腫瘍モデルである。腫瘍体積および生存を観察した。２１ｍｅｒ非ミニ遺伝子形態およびミニ遺伝子形態における全ＭＣ３８腫瘍モデルに存在する２種の突然変異を検査した。１種の突然変異は、マウスＡｄｐｇｋ遺伝子（ＡＤＰ依存性グルコキナーゼ；ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ８ＶＤＬ４）に存在し、１種の突然変異は、マウスＤｐａｇｔ１遺伝子（ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−−ドリチル（dolichyl）−ホスフェートＮ−アセチルグルコサミンホスホトランスフェラーゼ；ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ４２８６７）に存在した。これらの突然変異は、あらゆる目的のためその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Yadavら（２０１４年）Nature  ５１５巻（７５２８号）：５７２〜５７６頁から同定された。
【０９２８】
処置スケジュール
腫瘍が触知できるようになったら（８日目  −  １５ＪＵＮ１７）、マウスに様々な（Ｌｍ）ＭＣ３８構築物を腹腔内に（ＩＰ）１週間に１回を３週連続で（無期限に）投薬した。
【０９２９】
【表２９】
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【０９３０】
実験の詳細
腫瘍細胞系増大。ＭＣ３８細胞を１：５希釈で分割し、培地（ＩＭＤＭ完全培地（ｃ−ＲＰＭＩ）；１０％のＦＢＳ（５０ｍＬ）；５ｍＬのＧｌｕｔａｍａｘ）において育成した。０日目（０７ＪＵＮ１７）に、ＭＣ３８細胞をＩＭＤＭにおいて培養し、育成の対数期中期から後期に達した（ほぼ５０％集密度）。細胞を０．２５％トリプシン（１×）で２分間、ＲＴにてトリプシン処理した。トリプシンを３倍体積の完全培地で阻害し、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。ペレットを培地（抗生物質なし）に再懸濁し、ＢＣによるＭｏｘｉＦｌｏｗで計数した。
【０９３１】
腫瘍接種。細胞を計数し、２×１０５細胞／２００ｕＬ／マウスの濃度で再懸濁した。腫瘍細胞を各マウスの右側腹部に皮下注射した。
【０９３２】
処置。ワクチン調製を次に示す：（ａ）−８０℃から３７℃ウォーターバス内で１バイアルを解凍し；（ｂ）１４，０００ｒｐｍで２分間スピンし、上清を廃棄し；（ｃ）１ｍＬ  ＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳを廃棄し；（ｄ）最終濃度５×１０８ＣＦＵ／ｍＬとなるように再懸濁した。
【０９３３】
【表３０】
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【０９３４】
結果および結論
ミニ遺伝子としてＡｄｐｇｋまたはＤｐａｇｔ１のいずれかでマウスを免疫化した場合、ＭＣ３８腫瘍体積は、ＬｍｄｄＡ−２７４空ベクター対照と比較して、また、非ミニ遺伝子形態で標的化された組み合わせたＡｄｐｇｋおよびＤｐａｇｔ１突然変異と比較して有意に低下した。図９を参照されたい。
【０９３５】
（実施例９）
概念実証：ＣＴ２６負荷試験における非ミニ遺伝子およびミニ遺伝子Ｌｍ−ＡＨ１構築物の治療有効性
本試験は、ＣＴ２６腫瘍成長の抑制における、ミニ遺伝子および非ミニ遺伝子構築物を含むＬｍ−ＡＨ１構築物の治療有効性を検査した。構築物は、ｇｐ７０に由来する野生型ペプチドを含む融合ポリペプチドを発現する。ＡＨ１は、内在性マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）のエンベロープ糖タンパク質７０（ｇｐ７０）に由来する生理活性ナノマー（nanomeric）ペプチドを指し、ＢＡＬＢ／ｃ由来ＣＴ２６結腸直腸癌によって発現される。例えば、あらゆる目的のためその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Scrimieriら（２０１３年）Oncoimmunology  ２巻（１１号）：ｅ２６８８９頁を参照されたい。
【０９３６】
処置スケジュール
Ｌｍ−ＡＨ１ワクチン接種は、腫瘍植え込み７〜９日後に始まり、続いて１週間間隔で２回のブーストが行われた。植え込みおよび投薬スケジュールの詳細を表３１に示す。
【０９３７】
【表３１】
2020513737.tif 000065
【０９３８】
実験の詳細
腫瘍細胞系増大。１０％ＦＢＳを有するＲＰＭＩにおいてＣＴ２６細胞系を培養した。
【０９３９】
腫瘍接種。０日目に（１４ＪＵＮ１７）、ＣＴ２６細胞は、０．２５％トリプシン（１×）でトリプシン処理され、ＰＢＳにおいて適切な濃度（５×１０５細胞／マウス）となるよう培地で２回洗浄されるであろう。ＣＴ２６細胞を、各マウスの右側腹部の皮下に植え込んだ。
【０９４０】
処置。ワクチン調製を次に示す：（ａ）３７℃ウォーターバスにおいて−８０℃から１バイアルを解凍し；（ｂ）１４，０００ｒｐｍで２分間スピンし、上清を廃棄し；（ｃ）１ｍＬ  ＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳを廃棄し；（ｄ）最終濃度５×１０８ＣＦＵ／ｍＬとなるように再懸濁した。
【０９４１】
【表３２】
2020513737.tif 000066
【０９４２】
結果および結論
そこで、本出願人らは、ＣＴ２６モデルにおけるＡＨ１ワクチンの最も有効な投与経路が、ＩＶ投薬によるものであることを実証した。その上、ミニ遺伝子構築物は、非ミニ遺伝子対応物よりも僅かに良好に機能するが、この結果は、統計的に異なるものではない。図１０Ａおよび図１０Ｂを参照されたい。これらのデータは、ミニ遺伝子および非ミニ遺伝子形態の両方におけるＬｍ構築物の有効性を支持する。
【０９４３】
（実施例１０）
概念実証：ＣＴ２６負荷試験におけるヘテロクリティックＬｍ−ＡＨ１構築物の治療有効性
本試験は、Ｌｍ  ＡＨ１−ＨＣヘテロクリティックミニ遺伝子ワクチンが、ＣＴ２６腫瘍成長を制御または抑制することができるか検査した。
【０９４４】
処置スケジュール
ヘテロクリティックＡＨ１−ＨＣワクチン接種は、表３３に記載されている通りに始まり、続いて推奨されるワクチンにより１週間間隔で２回のブーストが行われた。
【０９４５】
【表３３】
2020513737.tif 000067
【０９４６】
実験の詳細
ワクチン投薬詳細。ＡＨ１−ＨＣは、ヘテロクリティックＡＨ１−ＨＣワクチンをプライミングおよびブーストされたマウスを指す。
【０９４７】
腫瘍細胞系増大。１０％ＦＢＳを有するＲＰＭＩにおいてＣＴ２６細胞系を培養した。
【０９４８】
腫瘍接種。０日目に（１４ＪＵＮ１７）、ＣＴ２６細胞は、０．２５％トリプシン（１×）でトリプシン処理され、ＰＢＳにおいて適切な濃度（３×１０５細胞／マウス）となるよう培地で２回洗浄されるであろう。ＣＴ２６細胞を、各マウスの右側腹部の皮下に植え込んだ。
【０９４９】
処置。ワクチン調製を次に示す：（ａ）３７℃ウォーターバスにおいて−８０℃から１バイアルを解凍し；（ｂ）１４，０００ｒｐｍで２分間スピンし、上清を廃棄し；（ｃ）１ｍＬ  ＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳを廃棄し；（ｄ）最終濃度５×１０８ＣＦＵ／ｍＬとなるように再懸濁した。ワクチン投薬は、腫瘍植え込み３〜４日後に始まった。
【０９５０】
【表３４】
2020513737.tif 000068
【０９５１】
結果および結論
Ｌｍ−ＡＨ１  ＨＣ構築物は、マウスＣＴ２６結腸直腸がんモデルにおける腫瘍成長を有意に制御することができた。図１１を参照されたい。
【０９５２】
（実施例１１）
ヘテロクリティックペプチドおよびミニ遺伝子によるがん型特異的ホットスポット構築物の設計および発現
本出願人らは、ＡＤＸＳ−ＨＯＴ構築物のために前臨床開発努力の焦点を合わせる反復性がん突然変異を有するがん型を選択した。がん型は、非小細胞肺がん、前立腺がん、膵臓がん、膀胱がん、乳がん（例えば、ＥＲ＋乳がん）、子宮がん、卵巣がん、低悪性度神経膠腫、結腸直腸がん（例えば、ＭＳＳ結腸直腸がん）、頭頸部がんおよびＤＮＡミスマッチ修復欠損がんを含んだ。構築物の例示的なアミノ酸配列は、実施例を通して提示されている。かかる構築物をコードする例示的な核酸配列は、例えば、配列番号９２３〜１００２および２８３２〜２８４８に提示されている。表１２３は、構築物の概略を提示する。最後の欄は、当該徴候に関してＴｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）患者の少なくとも９０％において発現された、前の欄における腫瘍関連抗原（例えば、ＣＴＡ／ＯＦＡ）遺伝子の数を示す。例えば、３種のＴＡＡ遺伝子が、ＮＳＣＬＣ患者の９０％超において発現された。ＴＡＡ遺伝子の残りは、ＴＣＧＡ  ＮＳＣＬＣ患者の集団の＜９０％において発現された。
【０９５３】
【表１２３】
2020513737.tif 000069
【０９５４】
非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）ホットスポット／ヘテロクリティック／ミニ遺伝子構築物
６種の遺伝子にわたる総計１１種のホットスポット突然変異を、実施例４および本明細書の他の箇所に記載されている通り、ＮＳＣＬＣ  ＡＤＸＳ−ＨＯＴ構築物のために選択した。ホットスポット突然変異のこのパネルは、全非小細胞肺がん患者の４３％をカバーする（すなわち、非小細胞肺がん患者の４３％は、パネルのホットスポット突然変異のうち少なくとも１種を有するであろう）。構築物に含まれる反復性がん突然変異毎に、実施例４および本明細書の他の箇所に記載されている通り、２１アミノ酸長のペプチドを設計した。ペプチドを表３５に示す。それぞれの中のホットスポット突然変異は、太字および下線で示す。
【０９５５】
【表３５】
2020513737.tif 000070
【０９５６】
７種の遺伝子にわたるヘテロクリティック突然変異を有する総計１１種のペプチドを、ＮＳＣＬＣ  ＡＤＸＳ−ＨＯＴ構築物のために選択した。ヘテロクリティック突然変異毎に、実施例４および本明細書の他の箇所に記載されている通り、９アミノ酸長のペプチドを設計した。ペプチドを表３６に示す。それぞれの中のヘテロクリティック突然変異は、表１２２に記載されている通りである。
【０９５７】
【表３６】
2020513737.tif 000071
【０９５８】
ヘテロクリティック９ｍｅｒペプチドのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで予測される結合親和性およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合親和性は、表３６Ｂに提示する。ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで予測される結合親和性は、５０％阻害濃度（ＩＣ５０）値（ｎＭ）の単位でＭＨＣクラスＩ分子に結合するペプチドを予測するＮｅｔＭＨＣ４．０アルゴリズムに基づく；より少ない数値は、より強い予測される結合親和性を反映する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合親和性は、結合を高親和性Ｔ細胞エピトープの結合と比較することにより、示されているＭＨＣクラスＩ対立遺伝子に結合し、ＭＨＣ−ペプチド複合体を安定化する各候補ペプチドの能力を決定する結合アッセイにより決定した。簡潔に説明すると、各ペプチドを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいてその特異的ＨＬＡ分子と共にインキュベートする。結合強度を、１００％に設定された陽性対照結合スコアを有する陽性対照として、同じＨＬＡ分子に対する公知免疫原性ペプチドに対して比較する。配列最適化された結合スコアを、対照ペプチドに対して正規化する。すなわち、各ペプチドは、非常に強い結合特性を有する公知Ｔ細胞エピトープである陽性対照ペプチドと比べたスコアを得た。ヘテロクリティック検査ペプチドのスコアは、陽性対照ペプチドによって生成されたシグナルのパーセンテージとして定量的に報告される。陽性対照の４５％を超えるまたはこれに等しいスコアを有するペプチドは、バインダーであるとみなされる。表３６Ｂには、ＮＳＣＬＣを有する患者における各遺伝子のパーセント発現（Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）データベース）、検査されているＨＬＡ対立遺伝子、および各ヘテロクリティックペプチドに対応する野生型ペプチドが免疫原性であることが公知であるか否かも提示されている。表３６Ｂにおけるヘテロクリティックペプチドのそれぞれを含む構築物に関して、ＨＬＡ型Ａ＊０２：０１を有するＮＳＣＬＣ患者の１００％は、ＴＡＡ遺伝子のうち少なくとも１種を発現し、ＨＬＡ型Ａ＊０３：０１を有するＮＳＣＬＣ患者の１００％は、ＴＡＡ遺伝子のうち少なくとも１種を発現し、ＨＬＡ型Ａ＊２４：０２を有するＮＳＣＬＣ患者の１００％は、ＴＡＡ遺伝子のうち少なくとも１種を発現し、ＨＬＡ型Ｂ＊０７：０２を有するＮＳＣＬＣ患者の１００％は、ＴＡＡ遺伝子のうち少なくとも１種を発現する。
【０９５９】
【表３６Ｂ】
2020513737.tif 000072
【０９６０】
ホットスポットペプチド、およびヘテロクリティックペプチドの１種または複数または全てに融合されたｔＬＬＯを含む融合ポリペプチドをコードするように構築物を設計し、Ｃ末端ヘテロクリティックペプチドがユビキチンペプチドに続いた。一部の構築物において、ユビキチンは、ＣＥＡＣＡＭ５＿Ａ０２０１ヘテロクリティックペプチドに融合された。構築物のうちいくつかにおいて、ユビキチンは、ＣＥＡＣＡＭ５＿Ａ２４０２ヘテロクリティックペプチドに融合された。一部の構築物において、ヘテロクリティックペプチドは、ホットスポットペプチドに対してＣ末端である。一部の構築物において、ヘテロクリティックペプチドは、ホットスポットペプチドの間に散在される。ＦＬＡＧタグおよびＳＩＩＮＦＥＫＬタグも、ユビキチンの上流に含まれた。融合ポリペプチドのｔＬＬＯ、ホットスポットペプチド、ヘテロクリティックペプチドおよびユビキチン／ヘテロクリティックペプチド構成成分は、表３７のリンカーから選択される様々なリンカーによって連接された。ＶＧＫＧＧＳＧＧリンカー（配列番号３１４）は、例えば、融合ペプチドのｔＬＬＯと抗原部分との間、およびタグ配列の前にさらなる空間をもたらすように、ｔＬＬＯの後、およびまたタグ配列の前の、より長いリンカーとして使用され得る。これは、融合タンパク質に可動性および電荷の平衡をもたらすこともできる。ＥＡＡＡＫリンカー（配列番号３１６）は、例えば、融合タンパク質がさもなければそれ自体に折り畳まれる場合、発現および分泌を促進するために使用され得る、剛性／硬性リンカーである。ＧＧＧＧＳリンカー（配列番号３１３）は、例えば、増大した可動性を融合タンパク質に付加して発現および分泌の促進を助けるために使用され得る、可動性リンカーである。「ｉ２０」リンカー（例えば配列番号８２１〜８２９）は、例えば、免疫プロテアソームによる融合タンパク質の切断の促進を助け、所望される最小の結合性断片そのものが得られる頻度を増大させるように設計された、免疫プロテアソームリンカーである。生成が所望される正確な最小８ｍｅｒ〜１１ｍｅｒは公知であるため、これらは、例えば、ヘテロクリティックペプチド配列の周囲で使用することができる。ＧＧＧＧＳおよびＥＡＡＡＫリンカー（それぞれ、配列番号３１３および３１６）の組合せは、例えば、発現および分泌の改善のために可動性と剛性とが交互になるようにして構築物のバランスを取ることを助けるため、また、選択できる特有のコドンをより多く提供することによりＤＮＡ合成の促進を助けるために使用され得る。例えば、２１ｍｅｒホットスポットペプチドの周囲に剛性ＥＡＡＡＫリンカーを配置し、生成が所望される正確な９ｍｅｒが分かっているヘテロクリティック配列の周囲に「ｉ２０」リンカーを配置することにより、ＥＡＡＡＫリンカー（配列番号３１６）および「ｉ２０」リンカーの組合せを使用することができる。例えば、２１ｍｅｒホットスポットペプチドの周囲に可動性ＧＧＧＧＳリンカーを配置し、生成が所望される正確な９ｍｅｒが分かっているヘテロクリティック配列の周囲に「ｉ２０」リンカーを配置することにより、ＧＧＧＧＳリンカー（配列番号３１３）および「ｉ２０」リンカーの組合せを使用することができる。
【０９６１】
【表３７】
2020513737.tif 000073
【０９６２】
例示的な融合ポリペプチドインサート配列（すなわち、ｔＬＬＯの下流のペプチド配列）は、次のものを含む：（１）ＮＳＣＬＣ  ＨＯＴ  ＥＶＯ２  ＥＡＡＡＫ．Ｇ４Ｓ（Ａ）（配列番号８５９）；（２）ＮＳＣＬＣ  ＨＯＴ  Ｇ４Ｓ（Ａ）（配列番号８６０）；（３）ＮＳＣＬＣ  ＨＯＴ  ＥＶＯ２  ＥＡＡＡＫ−Ｇ４Ｓ混合（Ａ）（配列番号８６１）；（４）ＮＳＣＬＣ  ＨＯＴ  ＥＶＯ２  ＥＡＡＡＫ．ｉ２０（Ａ）（配列番号８６２）；（５）ＮＳＣＬＣ  ＨＯＴ  ＥＶＯ２  Ｇ４Ｓ．ｉ２０（Ａ）（配列番号８６３）；（６）ＮＳＣＬＣ  ＨＯＴ  ＥＶＯ  ２  Ｇ４Ｓ  ＬＳ＃１（Ａ）（配列番号８６４）；（７）ＮＳＣＬＣ  ＨＯＴ  ＥＶＯ  ２  Ｇ４Ｓ  ＬＳ＃２（Ａ）（配列番号８６５）；（８）ＮＳＣＬＣ  ＨＯＴ  ＥＶＯ２  ＥＡＡＡＫ．Ｇ４Ｓ（Ｂ）（配列番号８９４）；（９）ＮＳＣＬＣ  ＨＯＴ  ＥＶＯ２  ＥＡＡＡＫ．ｉ２０（Ｂ）（配列番号８９５）；および（１０）ＮＳＣＬＣ  Ａ２４  ＨＯＴ（配列番号９０５）。各構築物における個々の構成成分のアミノ酸位置の内訳は、表３８〜４７に提示されている。（Ｂ）構築物に関して、追加のヘテロクリティックエピトープが付加されて、がん型内の総患者カバー範囲が１００％に近づくことができるように、本来のホットスポット突然変異ペプチドを補完した。したがって、いかなる患者も、最も多く見られるＨＬＡ（ＨＬＡ−Ａ０２０１、ＨＬＡ−Ａ０３０１、ＨＬＡ−Ａ２４０２およびＨＬＡ−Ｂ０７０２）をカバーするためにヘテロクリティックペプチドを設計した腫瘍関連抗原を発現する可能性があるであろう。Ａ２４構築物に関して、ミニ遺伝子中の９ｍｅｒは、Ａ２４  ９ｍｅｒによって置き換えた。Ａ２４（ＨＬＡ−Ａ２４０２）は、アジアで一般的に見出されるＨＬＡ型である。ＬＳ構築物に関して、融合ポリペプチドにおける抗原性ペプチドは、疎水性および電荷に基づき再度順序付けた。Ｇ４Ｓ、ＥＡＡＡＫおよびｉ２０は、それぞれ可動性リンカー、剛性リンカーおよび免疫プロテアソームプロセシングリンカーの包含を指す。
【０９６３】
【表３８】
2020513737.tif 000074
【０９６４】
【表３９】
2020513737.tif 000075
【０９６５】
【表４０】
2020513737.tif 000076
【０９６６】
【表４１】
2020513737.tif 000077
【０９６７】
【表４２】
2020513737.tif 000078
【０９６８】
【表４３】
2020513737.tif 000079
【０９６９】
【表４４】
2020513737.tif 000080
【０９７０】
【表４５】
2020513737.tif 000081
【０９７１】
【表４６】
2020513737.tif 000082
【０９７２】
【表４７】
2020513737.tif 000083
【０９７３】
構築物はまた、ホットスポットペプチド、およびヘテロクリティックペプチドの１種または複数または全てに融合されたｔＬＬＯを含む融合ポリペプチドをコードするように設計され、ユビキチンペプチドは含まなかった（すなわち、「ミニ遺伝子」なしの、ホットスポットペプチド、プラス、ヘテロクリティックペプチド）。融合ポリペプチドのｔＬＬＯ、ホットスポットペプチドおよびヘテロクリティックペプチド構成成分は、表３７のリンカーから選択される様々なリンカーによって連接された。例示的な融合ポリペプチドインサート配列（すなわち、ｔＬＬＯの下流のペプチド配列）は、ＮＳＣＬＣ  ＨＳ＋ＨＣ（配列番号９０９）である。
【０９７４】
構築物はまた、ホットスポットペプチドに融合されたｔＬＬＯを含む融合ポリペプチドをコードするように設計され、Ｃ末端においてヘテロクリティックペプチドに融合されたユビキチンペプチド以外のヘテロクリティックペプチドはなかった（すなわち、追加のヘテロクリティックペプチドなしの、ホットスポットペプチド、プラス、「ミニ遺伝子」）。融合ポリペプチドのｔＬＬＯ、ホットスポットペプチドおよびユビキチン／ヘテロクリティックペプチド構成成分は、表３７のリンカーから選択される様々なリンカーによって連接された。例示的な融合ポリペプチドインサート配列（すなわち、ｔＬＬＯの下流のペプチド配列）は、ＮＳＣＬＣ  ＨＳ＋ＭＧ（配列番号９１０）である。
【０９７５】
構築物はまた、１種または複数のヘテロクリティックペプチドに融合されたｔＬＬＯを含む融合ポリペプチドをコードするように設計され、Ｃ末端ヘテロクリティックペプチドがユビキチンペプチドに続いた（すなわち、ホットスポットペプチドなしの、ヘテロクリティックペプチドおよび「ミニ遺伝子」）。融合ポリペプチドのｔＬＬＯ、ヘテロクリティックペプチドおよびユビキチン／ヘテロクリティックペプチド構成成分は、表３７のリンカーから選択される様々なリンカーによって連接された。例示的な融合ポリペプチドインサート配列（すなわち、ｔＬＬＯの下流のペプチド配列）は、ＮＳＣＬＣ  ＨＣ＋ＭＧ（配列番号９１１）である。
【０９７６】
構築物はまた、１種または複数のヘテロクリティックペプチドに融合されたｔＬＬＯを含む融合ポリペプチドをコードするように設計され、いかなるユビキチンペプチドも含まず、いかなるホットスポットペプチドも含まなかった（すなわち、「ミニ遺伝子」なしおよびホットスポットペプチドなしの、ヘテロクリティックペプチド）。融合ポリペプチドのｔＬＬＯおよびヘテロクリティックペプチド構成成分は、表３７のリンカーから選択される様々なリンカーによって連接された。例示的な融合ポリペプチドインサート配列（すなわち、ｔＬＬＯの下流のペプチド配列）は、ＮＳＣＬＣ  ＨＣのみ（配列番号９１２）である。
【０９７７】
各構築物における個々の構成成分のアミノ酸位置の内訳は、表４８〜５１に提示されている。
【０９７８】
【表４８】
2020513737.tif 000084
【０９７９】
【表４９】
2020513737.tif 000085
【０９８０】
【表５０】
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【０９８１】
【表５１】
2020513737.tif 000087
【０９８２】
Ｌｍｄｄａ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ構築物によるｔＬＬＯ−抗原性ペプチド融合タンパク質の発現を査定するために、本明細書の他の箇所に記載されている通りにＤＮＡ構築物を生成し、Ｌｍｄｄａへと形質転換した。個々のＬｍｄｄａ構築物のそれぞれを、抗ＦＬＡＧ抗体を使用して、ｔＬＬＯ融合ポリペプチド発現に関してウエスタンブロットによってアッセイした。図１２および図１８は、様々なＮＳＣＬＳ構築物に関するＬｍｄｄａによる上清へのｔＬＬＯ融合ポリペプチドの発現および分泌を示す。これらのウエスタンブロットにおいて可視化された構築物は全て、１０３〜１２５ｋＤａの間に収まり、本出願内に見出される構築物の大部分と同様のサイズである。このようなサイズは、相当に大型のタンパク質を示すが、示されている発現データは、抗原プロセシングに十分過ぎなものとなるべきレベルでＨＯＴ構築物を発現および分泌するＬｍｄｄＡ系統の能力を実証する。図２７は、ＮＳＣＬＣ  ＨＯＴ  ＥＶＯ２  ＥＡＡＡＫ．Ｇ４Ｓ（Ｂ）およびＮＳＣＬＣ  ＨＯＴ  ＥＶＯ２  ＥＡＡＡＫ．ｉ２０（Ｂ）構築物に関するＬｍｄｄａによる上清へのｔＬＬＯ融合ポリペプチドの発現および分泌を示す。これらのウエスタンブロットにおいて可視化された構築物は、１０３〜１２５ｋＤａの間に収まり、本出願内に見出される構築物の大部分と同様のサイズである。このようなサイズは、相当に大型のタンパク質を示すが、示されている発現データは、抗原プロセシングに十分過ぎなものとなるべきレベルでＨＯＴ構築物を発現および分泌するＬｍｄｄＡ系統の能力を実証する。図３２は、ＮＳＣＬＣ  ＨＳ＋ＭＧ構築物に関するＬｍｄｄａによる上清へのｔＬＬＯ融合ポリペプチドの発現および分泌を示す。示されている発現データは、抗原プロセシングに十分過ぎなものとなるべきレベルでＨＯＴ構築物を発現および分泌するＬｍｄｄＡ系統の能力を実証する。
【０９８３】
前立腺がんホットスポット／ヘテロクリティック／ミニ遺伝子構築物
５種の遺伝子にわたる総計１４種のホットスポット突然変異を、実施例４および本明細書の他の箇所に記載されている通り、前立腺がんＡＤＸＳ−ＨＯＴ構築物のために選択した。ホットスポット突然変異のこのパネルは、全前立腺がん患者の１６％をカバーする（すなわち、前立腺がん患者の１６％は、パネルに由来するホットスポット突然変異のうち少なくとも１種を有するであろう）。構築物に含まれる反復性がん突然変異毎に、実施例４および本明細書の他の箇所に記載されている通り、２１アミノ酸長のペプチドを設計した。しかし、突然変異は、ＲＧＰＤのＣ末端付近にあるため、ＲＧＰＤ＿Ｐ１７６０Ａホットスポットペプチドは、１６アミノ酸のみであった。加えて、２個の隣接ホットスポット突然変異を含む、ＡＲ＿Ｈ８７５Ｙ＿Ｔ８７８Ａ二重ホットスポットペプチドは、２４アミノ酸長である。ペプチドを表５２に示す。それぞれの中のホットスポット突然変異（複数可）は、太字および下線で示す。
【０９８４】
【表５２】
2020513737.tif 000088
【０９８５】
９種の遺伝子にわたるヘテロクリティック突然変異を有する総計１０種のペプチドを、前立腺がんＡＤＸＳ−ＨＯＴ構築物のために選択した。ヘテロクリティック突然変異毎に、実施例４および本明細書の他の箇所に記載されている通り、９アミノ酸長のペプチドを設計した。ペプチドを表５３に示す。それぞれの中のヘテロクリティック突然変異は、表１２２に記載されている通りである。
【０９８６】
【表５３】
2020513737.tif 000089
【０９８７】
ヘテロクリティック９ｍｅｒペプチドのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで予測される結合親和性およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合親和性は、表５３Ｂに提示する。ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで予測される結合親和性は、５０％阻害濃度（ＩＣ５０）値（ｎＭ）の単位でＭＨＣクラスＩ分子に結合するペプチドを予測するＮｅｔＭＨＣ４．０アルゴリズムに基づく；より少ない数値は、より強い予測される結合親和性を反映する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合親和性は、結合を高親和性Ｔ細胞エピトープの結合と比較することにより、示されているＭＨＣクラスＩ対立遺伝子に結合し、ＭＨＣ−ペプチド複合体を安定化する各候補ペプチドの能力を決定する結合アッセイにより決定した。簡潔に説明すると、各ペプチドを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいてその特異的ＨＬＡ分子と共にインキュベートする。結合強度を、１００％に設定された陽性対照結合スコアを有する陽性対照として、同じＨＬＡ分子に対する公知免疫原性ペプチドに対して比較する。配列最適化された結合スコアを、対照ペプチドに対して正規化する。すなわち、各ペプチドは、非常に強い結合特性を有する公知Ｔ細胞エピトープである陽性対照ペプチドと比べたスコアを得た。ヘテロクリティック検査ペプチドのスコアは、陽性対照ペプチドによって生成されたシグナルのパーセンテージとして定量的に報告される。陽性対照の４５％を超えるまたはこれに等しいスコアを有するペプチドは、バインダーであるとみなされる。表５３Ｂには、前立腺がんを有する患者における各遺伝子のパーセント発現（Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓデータベース）、検査されているＨＬＡ対立遺伝子、および各ヘテロクリティックペプチドに対応する野生型ペプチドが免疫原性であることが公知であるか否かも提示されている。表５３Ｂにおけるヘテロクリティックペプチドのそれぞれを含む構築物に関して、ＨＬＡ型Ａ＊０２：０１を有する前立腺がん患者の１００％は、ＴＡＡ遺伝子のうち少なくとも１種を発現し、ＨＬＡ型Ａ＊０３：０１を有する前立腺がん患者の１００％は、ＴＡＡ遺伝子のうち少なくとも１種を発現し、ＨＬＡ型Ａ＊２４：０２を有する前立腺がん患者の１００％は、ＴＡＡ遺伝子のうち少なくとも１種を発現し、ＨＬＡ型Ｂ＊０７：０２を有する前立腺がん患者の１００％は、ＴＡＡ遺伝子のうち少なくとも１種を発現する。
【０９８８】
【表５３Ｂ】
2020513737.tif 000090
【０９８９】
ホットスポットペプチド、およびヘテロクリティックペプチドの１種または複数または全てに融合されたｔＬＬＯを含む融合ポリペプチドをコードするように構築物を設計し、Ｃ末端ヘテロクリティックペプチドがユビキチンペプチドに続いた。一部の構築物において、ユビキチンは、ＳＴＥＡＰ１＿Ａ０２０１ヘテロクリティックペプチドに融合された。構築物のうちいくつかにおいて、ユビキチンは、ＳＴＥＡＰ１＿Ａ２４０２ヘテロクリティックペプチドに融合された。一部の構築物において、ヘテロクリティックペプチドは、ホットスポットペプチドに対してＣ末端である。一部の構築物において、ヘテロクリティックペプチドは、ホットスポットペプチドの間に散在される。ＦＬＡＧタグおよびＳＩＩＮＦＥＫＬタグも、ユビキチンの上流に含まれた。融合ポリペプチドのｔＬＬＯ、ホットスポットペプチド、ヘテロクリティックペプチドおよびユビキチン／ヘテロクリティックペプチド構成成分は、表３７のリンカーから選択される様々なリンカーによって連接された。
【０９９０】
例示的な融合ポリペプチドインサート配列（すなわち、ｔＬＬＯの下流のペプチド配列）は、次のものを含む：（１）ＰｒｏＳｔａｒ  ＥＶＯ２  ＥＡＡＡＫ．Ｇ４Ｓ（Ａ）（配列番号８７１）；（２）ＰｒｏＳｔａｒ  ＥＶＯ２  Ｇ４Ｓ（Ａ）（配列番号８７２）；（３）ＰｒｏＳｔａｒ  ＥＶＯ２  ＥＡＡＡＫ−Ｇ４Ｓ混合（Ａ）（配列番号８７３）；（４）ＰｒｏＳｔａｒ  ＥＶＯ２  ＥＡＡＡＫ．ｉ２０（Ａ）（配列番号８７４）；（５）ＰｒｏＳｔａｒ  ＥＶＯ２  Ｇ４Ｓ．ｉ２０（Ａ）（配列番号８７５）；（６）ＰｒｏＳｔａｒ  ＥＶＯ  ２  Ｇ４Ｓ  ＬＳ＃１（Ａ）（配列番号８７６）；（７）ＰｒｏＳｔａｒ  ＥＶＯ  ２  Ｇ４Ｓ  ＬＳ＃２（Ａ）（配列番号８７７）；（８）ＰｒｏＳｔａｒ  ＥＶＯ２  ＥＡＡＡＫ．Ｇ４Ｓ（Ｂ）（配列番号８９２）；（９）ＰｒｏＳｔａｒ  ＥＶＯ２  ＥＡＡＡＫ．ｉ２０（Ｂ）（配列番号８９３）；および（１０）Ｐｒｏｓｔａｒ  Ａ２４  ＨＯＴ（配列番号９０６）。各構築物における個々の構成成分のアミノ酸位置の内訳は、表５４〜６３に提示されている。（Ｂ）構築物に関して、追加のヘテロクリティックエピトープが付加されて、がん型内の総患者カバー範囲が１００％に近づくことができるように、本来のホットスポット突然変異ペプチドを補完した。したがって、いかなる患者も、最も多く見られるＨＬＡ（ＨＬＡ−Ａ０２０１、ＨＬＡ−Ａ０３０１、ＨＬＡ−Ａ２４０２およびＨＬＡ−Ｂ０７０２）をカバーするためにヘテロクリティックペプチドを設計した腫瘍関連抗原を発現する可能性があるであろう。Ａ２４構築物に関して、ミニ遺伝子中の９ｍｅｒは、Ａ２４  ９ｍｅｒによって置き換えた。Ａ２４（ＨＬＡ−Ａ２４０２）は、アジアで一般的に見出されるＨＬＡ型である。ＬＳ構築物に関して、融合ポリペプチドにおける抗原性ペプチドは、疎水性および電荷に基づき再度順序付けた。Ｇ４Ｓ、ＥＡＡＡＫおよびｉ２０は、それぞれ可動性リンカー、剛性リンカーおよび免疫プロテアソームプロセシングリンカーの包含を指す。
【０９９１】
【表５４】
2020513737.tif 000091
【０９９２】
【表５５】
2020513737.tif 000092
【０９９３】
【表５６】
2020513737.tif 000093
【０９９４】
【表５７】
2020513737.tif 000094
【０９９５】
【表５８】
2020513737.tif 000095
【０９９６】
【表５９】
2020513737.tif 000096
【０９９７】
【表６０】
2020513737.tif 000097
【０９９８】
【表６１】
2020513737.tif 000098
【０９９９】
【表６２】
2020513737.tif 000099
【１０００】
【表６３】
2020513737.tif 000100
【１００１】
構築物はまた、ホットスポットペプチド、およびヘテロクリティックペプチドの１種または複数または全てに融合されたｔＬＬＯを含む融合ポリペプチドをコードするように設計され、ユビキチンペプチドは含まなかった（すなわち、「ミニ遺伝子」なしの、ホットスポットペプチド、プラス、ヘテロクリティックペプチド）。融合ポリペプチドのｔＬＬＯ、ホットスポットペプチドおよびヘテロクリティックペプチド構成成分は、表３７のリンカーから選択される様々なリンカーによって連接された。例示的な融合ポリペプチドインサート配列（すなわち、ｔＬＬＯの下流のペプチド配列）は、Ｐｒｏｓｔａｒ  ＨＳ＋ＨＣ（配列番号９１３）である。
【１００２】
構築物はまた、ＡＲ−Ｈ８７５Ｙ−Ｔ８７８Ａ以外のホットスポットペプチドに融合されたｔＬＬＯを含む融合ポリペプチドをコードするように設計され、Ｃ末端においてヘテロクリティックペプチドに融合されたユビキチンペプチド以外のヘテロクリティックペプチドはなかった（すなわち、追加のヘテロクリティックペプチドなしの、ホットスポットペプチド、プラス、「ミニ遺伝子」）。融合ポリペプチドのｔＬＬＯ、ホットスポットペプチドおよびユビキチン／ヘテロクリティックペプチド構成成分は、表３７のリンカーから選択される様々なリンカーによって連接された。例示的な融合ポリペプチドインサート配列（すなわち、ｔＬＬＯの下流のペプチド配列）は、Ｐｒｏｓｔａｒ  ＨＳ＋ＭＧ（配列番号９１４）である。
【１００３】
構築物はまた、１種または複数のヘテロクリティックペプチドおよびＡＲ−Ｈ８７５Ｙ−Ｔ８７８Ａペプチドに融合されたｔＬＬＯを含む融合ポリペプチドをコードするように設計され、Ｃ末端ヘテロクリティックペプチドがユビキチンペプチドに続いた（すなわち、二重ホットスポットペプチドのみを有する、ヘテロクリティックペプチドおよび「ミニ遺伝子」）。融合ポリペプチドのｔＬＬＯ、ヘテロクリティックペプチドおよびユビキチン／ヘテロクリティックペプチド構成成分は、表３７のリンカーから選択される様々なリンカーによって連接された。例示的な融合ポリペプチドインサート配列（すなわち、ｔＬＬＯの下流のペプチド配列）は、Ｐｒｏｓｔａｒ  ＨＣ＋ＭＧ（配列番号９１５）である。
【１００４】
構築物はまた、１種または複数のヘテロクリティックペプチドおよびＡＲ−Ｈ８７５Ｙ−Ｔ８７８Ａペプチドに融合されたｔＬＬＯを含む融合ポリペプチドをコードするように設計され、いかなるユビキチンペプチドも含まず、二重ホットスポットＡＲ−Ｈ８７５Ｙ−Ｔ８７８Ａペプチド以外のいかなるホットスポットペプチドも含まない（すなわち、「ミニ遺伝子」がなく、二重ホットスポットペプチドのみを有する、ヘテロクリティックペプチド）。融合ポリペプチドのｔＬＬＯおよびヘテロクリティックペプチド構成成分は、表３７のリンカーから選択される様々なリンカーによって連接された。例示的な融合ポリペプチドインサート配列（すなわち、ｔＬＬＯの下流のペプチド配列）は、Ｐｒｏｓｔａｒ  ＨＣのみ（配列番号９１６）である。
【１００５】
各構築物における個々の構成成分のアミノ酸位置の内訳は、表６４〜６７に提示されている。
【１００６】
【表６４】
2020513737.tif 000101
【１００７】
【表６５】
2020513737.tif 000102
【１００８】
【表６６】
2020513737.tif 000103
【１００９】
【表６７】
2020513737.tif 000104
【１０１０】
Ｌｍｄｄａ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ構築物によるｔＬＬＯ−抗原性ペプチド融合タンパク質の発現を査定するために、本明細書の他の箇所に記載されている通りにＤＮＡ構築物を生成し、Ｌｍｄｄａへと形質転換した。個々のＬｍｄｄａ構築物のそれぞれを、抗ＦＬＡＧ抗体を使用して、ｔＬＬＯ融合ポリペプチド発現に関してウエスタンブロットによってアッセイした。図１３および図１９は、様々な前立腺がん構築物に関するＬｍｄｄａによる上清へのｔＬＬＯ融合ポリペプチドの発現および分泌を示す。これらのウエスタンブロットにおいて可視化された構築物は全て、１０３〜１２５ｋＤａの間に収まり、本出願内に見出される構築物の大部分と同様のサイズである。このようなサイズは、相当に大型のタンパク質を示すが、示されている発現データは、抗原プロセシングに十分過ぎなものとなるべきレベルでＨＯＴ構築物を発現および分泌するＬｍｄｄＡ系統の能力を実証する。図２８は、ＰｒｏＳｔａｒ  ＥＶＯ２  ＥＡＡＡＫ．Ｇ４Ｓ（Ｂ）およびＰｒｏＳｔａｒ  ＥＶＯ２  ＥＡＡＡＫ．ｉ２０（Ｂ）構築物に関するＬｍｄｄａによる上清へのｔＬＬＯ融合ポリペプチドの発現および分泌を示す。これらのウエスタンブロットにおいて可視化された構築物は、１０３〜１２５ｋＤａの間に収まり、本出願内に見出される構築物の大部分と同様のサイズである。このようなサイズは、相当に大型のタンパク質を示すが、示されている発現データは、抗原プロセシングに十分過ぎなものとなるべきレベルでＨＯＴ構築物を発現および分泌するＬｍｄｄＡ系統の能力を実証する。図３３は、ＰｒｏＳｔａｒ  ＨＳ＋ＨＣ、ＰｒｏＳｔａｒ  ＨＳ＋ＭＧ、ＰｒｏＳｔａｒ  ＨＣ＋ＭＧおよびＰｒｏＳｔａｒ  ＨＣのみ構築物に関するＬｍｄｄａによる上清へのｔＬＬＯ融合ポリペプチドの発現および分泌を示す。示されている発現データは、抗原プロセシングに十分過ぎなものとなるべきレベルでＨＯＴ構築物を発現および分泌するＬｍｄｄＡ系統の能力を実証する。
【１０１１】
膵臓がんホットスポット／ヘテロクリティック／ミニ遺伝子構築物
５種の遺伝子にわたる総計１６種のホットスポット突然変異を、実施例４および本明細書の他の箇所に記載されている通り、膵臓がんＡＤＸＳ−ＨＯＴ構築物のために選択した。ホットスポット突然変異のこのパネルは、全膵臓がん患者の８７％をカバーする（すなわち、膵臓がん患者の８７％は、パネルに由来するホットスポット突然変異のうち少なくとも１種を有するであろう）。構築物に含まれる反復性がん突然変異毎に、実施例４および本明細書の他の箇所に記載されている通り、２１アミノ酸長のペプチドを設計した。ペプチドを表６８に示す。それぞれの中のホットスポット突然変異は、太字および下線で示す。
【１０１２】
【表６８】
2020513737.tif 000105
【１０１３】
６種の遺伝子にわたるヘテロクリティック突然変異を有する総計１２種のペプチドを、膵臓がんＡＤＸＳ−ＨＯＴ構築物のために選択した。ヘテロクリティック突然変異毎に、実施例４および本明細書の他の箇所に記載されている通り、９アミノ酸長のペプチドを設計した。ペプチドを表６９に示す。それぞれの中のヘテロクリティック突然変異は、表１２２に記載されている通りである。
【１０１４】
【表６９】
2020513737.tif 000106
【１０１５】
ヘテロクリティック９ｍｅｒペプチドのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで予測される結合親和性およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合親和性は、表６９Ｂに提示する。ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで予測される結合親和性は、５０％阻害濃度（ＩＣ５０）値（ｎＭ）の単位でＭＨＣクラスＩ分子に結合するペプチドを予測するＮｅｔＭＨＣ４．０アルゴリズムに基づく；より少ない数値は、より強い予測される結合親和性を反映する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合親和性は、結合を高親和性Ｔ細胞エピトープの結合と比較することにより、示されているＭＨＣクラスＩ対立遺伝子に結合し、ＭＨＣ−ペプチド複合体を安定化する各候補ペプチドの能力を決定する結合アッセイにより決定した。簡潔に説明すると、各ペプチドを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいてその特異的ＨＬＡ分子と共にインキュベートする。結合強度を、１００％に設定された陽性対照結合スコアを有する陽性対照として、同じＨＬＡ分子に対する公知免疫原性ペプチドに対して比較する。配列最適化された結合スコアを、対照ペプチドに対して正規化する。すなわち、各ペプチドは、非常に強い結合特性を有する公知Ｔ細胞エピトープである陽性対照ペプチドと比べたスコアを得た。ヘテロクリティック検査ペプチドのスコアは、陽性対照ペプチドによって生成されたシグナルのパーセンテージとして定量的に報告される。陽性対照の４５％を超えるまたはこれに等しいスコアを有するペプチドは、バインダーであるとみなされる。表６９Ｂには、膵臓がんを有する患者における各遺伝子のパーセント発現（Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓデータベース）、検査されているＨＬＡ対立遺伝子、および各ヘテロクリティックペプチドに対応する野生型ペプチドが免疫原性であることが公知であるか否かも提示されている。表６９Ｂにおけるヘテロクリティックペプチドのそれぞれを含む構築物に関して、ＨＬＡ型Ａ＊０２：０１を有する膵臓がん患者の１００％は、ＴＡＡ遺伝子のうち少なくとも１種を発現し、ＨＬＡ型Ａ＊０３：０１を有する膵臓がん患者の９８％は、ＴＡＡ遺伝子のうち少なくとも１種を発現し、ＨＬＡ型Ａ＊２４：０２を有する膵臓がん患者の１００％は、ＴＡＡ遺伝子のうち少なくとも１種を発現し、ＨＬＡ型Ｂ＊０７：０２を有する膵臓がん患者の９８％は、ＴＡＡ遺伝子のうち少なくとも１種を発現する。
【１０１６】
【表６９Ｂ】
2020513737.tif 000107
【１０１７】
ホットスポットペプチド、およびヘテロクリティックペプチドの１種または複数または全てに融合されたｔＬＬＯを含む融合ポリペプチドをコードするように構築物を設計し、Ｃ末端ヘテロクリティックペプチドがユビキチンペプチドに続いた。
【１０１８】
一部の構築物において、ユビキチンは、ＣＥＡＣＡＭ５＿Ａ０２０１ヘテロクリティックペプチドに融合された。構築物のうちいくつかにおいて、ユビキチンは、ＣＥＡＣＡＭ５＿Ａ２４０２ヘテロクリティックペプチドに融合された。ヘテロクリティックペプチドは、ホットスポットペプチドに対してＣ末端であった。ＦＬＡＧタグおよびＳＩＩＮＦＥＫＬタグも、ユビキチンの上流に含まれた。融合ポリペプチドのｔＬＬＯ、ホットスポットペプチド、ヘテロクリティックペプチドおよびユビキチン／ヘテロクリティックペプチド構成成分は、表３７のリンカーから選択される様々なリンカーによって連接された。
【１０１９】
例示的な融合ポリペプチドインサート配列（すなわち、ｔＬＬＯの下流のペプチド配列）は、次のものを含む：（１）ＰＡＮＣ  ＨＯＴ  ＥＶＯ２  ＥＡＡＡＫ．Ｇ４Ｓ（Ａ）（配列番号８６６）；（２）ＰＡＮＣ  ＨＯＴ  Ｇ４Ｓ（Ａ）（配列番号８６７）；（３）ＰＡＮＣ  ＨＯＴ  ＥＶＯ２  ＥＡＡＡＫ−Ｇ４Ｓ混合（Ａ）（配列番号８６８）；（４）ＰＡＮＣ  ＨＯＴ  ＥＶＯ２  ＥＡＡＡＫ．ｉ２０（Ａ）（配列番号８６９）；（５）ＰＡＮＣ  ＨＯＴ  ＥＶＯ２  Ｇ４Ｓ．ｉ２０（Ａ）（配列番号８７０）；および（６）膵臓Ａ２４  ＨＯＴ（配列番号９０８）。各構築物における個々の構成成分のアミノ酸位置の内訳は、表７０〜７５に提示されている。Ａ２４構築物に関して、ミニ遺伝子中の９ｍｅｒは、Ａ２４  ９ｍｅｒによって置き換えた。Ａ２４（ＨＬＡ−Ａ２４０２）は、アジアで一般的に見出されるＨＬＡ型である。Ｇ４Ｓ、ＥＡＡＡＫおよびｉ２０は、それぞれ可動性リンカー、剛性リンカーおよび免疫プロテアソームプロセシングリンカーの包含を指す。
【１０２０】
【表７０】
2020513737.tif 000108
【１０２１】
【表７１】
2020513737.tif 000109
【１０２２】
【表７２】
2020513737.tif 000110
【１０２３】
【表７３】
2020513737.tif 000111
【１０２４】
【表７４】
2020513737.tif 000112
【１０２５】
【表７５】
2020513737.tif 000113
【１０２６】
Ｌｍｄｄａ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ構築物によるｔＬＬＯ−抗原性ペプチド融合タンパク質の発現を査定するために、本明細書の他の箇所に記載されている通りにＤＮＡ構築物を生成し、Ｌｍｄｄａへと形質転換した。個々のＬｍｄｄａ構築物のそれぞれを、抗ＦＬＡＧ抗体を使用して、ｔＬＬＯ融合ポリペプチド発現に関してウエスタンブロットによってアッセイした。図１７は、ＰＡＮＣ  ＨＯＴ  ＥＶＯ２  ＥＡＡＫ  Ｇ４Ｓ構築物に関するＬｍｄｄａによる上清へのｔＬＬＯ融合ポリペプチドの発現および分泌を示す。これらのウエスタンブロットにおいて可視化された構築物は、１０３〜１２５ｋＤａの間に収まり、本出願内に見出される構築物の大部分と同様のサイズである。このようなサイズは、相当に大型のタンパク質を示すが、示されている発現データは、抗原プロセシングに十分過ぎなものとなるべきレベルでＨＯＴ構築物を発現および分泌するＬｍｄｄＡ系統の能力を実証する。図３０は、ＰＡＮＣ  ＨＯＴ  ＥＶＯ２  ＥＡＡＡＫ．Ｇ４Ｓ、ＰＡＮＣ  ＨＯＴ  ＥＶＯ２  ＥＡＡＡＫ−Ｇ４Ｓ混合、ＰＡＮＣ  ＨＯＴ  ＥＶＯ２  ＥＡＡＡＫ．ｉ２０およびＰＡＮＣ  ＨＯＴ  ＥＶＯ２  Ｇ４Ｓ．ｉ２０構築物に関するＬｍｄｄａによる上清へのｔＬＬＯ融合ポリペプチドの発現および分泌を示す。これらのウエスタンブロットにおいて可視化された構築物は、１０３〜１３５ｋＤａの間に収まり、本出願内に見出される構築物の大部分と同様のサイズである。このようなサイズは、相当に大型のタンパク質を示すが、示されている発現データは、抗原プロセシングに十分過ぎなものとなるべきレベルでＨＯＴ構築物を発現および分泌するＬｍｄｄＡ系統の能力を実証する。
【１０２７】
膀胱がんホットスポット／ヘテロクリティック／ミニ遺伝子構築物
６種の遺伝子にわたる総計１３種のホットスポット突然変異を、実施例４および本明細書の他の箇所に記載されている通り、膀胱がんＡＤＸＳ−ＨＯＴ構築物のために選択した。ホットスポット突然変異のこのパネルは、全膀胱がん患者の４３％をカバーする（すなわち、膀胱がん患者の４３％は、パネルに由来するホットスポット突然変異のうち少なくとも１種を有するであろう）。構築物に含まれる反復性がん突然変異毎に、実施例４および本明細書の他の箇所に記載されている通り、２１アミノ酸長のペプチドを設計した。ペプチドを表７６に示す。それぞれの中のホットスポット突然変異は、太字および下線で示す。
【１０２８】
【表７６】
2020513737.tif 000114
【１０２９】
８種の遺伝子にわたるヘテロクリティック突然変異を有する総計１４種のペプチドを、膀胱がんＡＤＸＳ−ＨＯＴ構築物のために選択した。ヘテロクリティック突然変異毎に、実施例４および本明細書の他の箇所に記載されている通り、９アミノ酸長のペプチドを設計した。ペプチドを表７７に示す。それぞれの中のヘテロクリティック突然変異は、表１２２に記載されている通りである。
【１０３０】
【表７７】
2020513737.tif 000115
【１０３１】
ヘテロクリティック９ｍｅｒペプチドのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで予測される結合親和性およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合親和性は、表７７Ｂに提示する。ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで予測される結合親和性は、５０％阻害濃度（ＩＣ５０）値（ｎＭ）の単位でＭＨＣクラスＩ分子に結合するペプチドを予測するＮｅｔＭＨＣ４．０アルゴリズムに基づく；より少ない数値は、より強い予測される結合親和性を反映する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合親和性は、結合を高親和性Ｔ細胞エピトープの結合と比較することにより、示されているＭＨＣクラスＩ対立遺伝子に結合し、ＭＨＣ−ペプチド複合体を安定化する各候補ペプチドの能力を決定する結合アッセイにより決定した。簡潔に説明すると、各ペプチドを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいてその特異的ＨＬＡ分子と共にインキュベートする。結合強度を、１００％に設定された陽性対照結合スコアを有する陽性対照として、同じＨＬＡ分子に対する公知免疫原性ペプチドに対して比較する。配列最適化された結合スコアを、対照ペプチドに対して正規化する。すなわち、各ペプチドは、非常に強い結合特性を有する公知Ｔ細胞エピトープである陽性対照ペプチドと比べたスコアを得た。ヘテロクリティック検査ペプチドのスコアは、陽性対照ペプチドによって生成されたシグナルのパーセンテージとして定量的に報告される。陽性対照の４５％を超えるまたはこれに等しいスコアを有するペプチドは、バインダーであるとみなされる。表７７Ｂには、膀胱がんを有する患者における各遺伝子のパーセント発現（Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓデータベース）、検査されているＨＬＡ対立遺伝子、および各ヘテロクリティックペプチドに対応する野生型ペプチドが免疫原性であることが公知であるか否かも提示されている。表７７Ｂにおけるヘテロクリティックペプチドのそれぞれを含む構築物に関して、ＨＬＡ型Ａ＊０２：０１を有する膀胱がん患者の１００％は、ＴＡＡ遺伝子のうち少なくとも１種を発現し、ＨＬＡ型Ａ＊０３：０１を有する膀胱がん患者の１００％は、ＴＡＡ遺伝子のうち少なくとも１種を発現し、ＨＬＡ型Ａ＊２４：０２を有する膀胱がん患者の１００％は、ＴＡＡ遺伝子のうち少なくとも１種を発現し、ＨＬＡ型Ｂ＊０７：０２を有する膀胱がん患者の１００％は、ＴＡＡ遺伝子のうち少なくとも１種を発現する。
【１０３２】
【表７７Ｂ】
2020513737.tif 000116
【１０３３】
ホットスポットペプチド、およびヘテロクリティックペプチドの１種または複数または全てに融合されたｔＬＬＯを含む融合ポリペプチドをコードするように構築物を設計し、Ｃ末端ヘテロクリティックペプチドがユビキチンペプチドに続いた。一部の構築物において、ユビキチンは、ＮＹＥＳＯ１＿Ａ０２０１ヘテロクリティックペプチドに融合された。構築物のうちいくつかにおいて、ユビキチンは、ＮＵＦ２＿Ａ０２０１ヘテロクリティックペプチドに融合された。ヘテロクリティックペプチドは、ホットスポットペプチドに対してＣ末端であった。ＦＬＡＧタグおよびＳＩＩＮＦＥＫＬタグも、ユビキチンの上流に含まれた。融合ポリペプチドのｔＬＬＯ、ホットスポットペプチド、ヘテロクリティックペプチドおよびユビキチン／ヘテロクリティックペプチド構成成分は、表３７のリンカーから選択される様々なリンカーによって連接された。
【１０３４】
例示的な融合ポリペプチドインサート配列（すなわち、ｔＬＬＯの下流のペプチド配列）は、次のものを含む：（１）膀胱ＨＯＴ  ＥＶＯ２  ＥＡＡＡＫ．Ｇ４Ｓ（Ａ）（配列番号８７８）；（２）膀胱ＨＯＴ  Ｇ４Ｓ（Ａ）（配列番号８７９）；（３）膀胱ＨＯＴ  ＥＶＯ２  ＥＡＡＡＫ−Ｇ４Ｓ混合（Ａ）（配列番号８８０）；（４）膀胱ＨＯＴ  ＥＶＯ２  ＥＡＡＡＫ．ｉ２０（Ａ）（配列番号８８１）；（５）膀胱ＨＯＴ  ＥＶＯ２  Ｇ４Ｓ．ｉ２０（Ａ）（配列番号８８２）；（６）膀胱ＨＯＴ  ＥＶＯ２  ＥＡＡＡＫ．Ｇ４Ｓ（Ｂ）（配列番号８８８）；（７）膀胱ＨＯＴ  ＥＶＯ２  ＥＡＡＡＫ．ｉ２０（Ｂ）（配列番号８８９）；（８）膀胱ＨＯＴ  ＥＶＯ２  ＥＡＡＡＫ．Ｇ４Ｓ  ＮＵＦミニ遺伝子（Ｂ）（配列番号８９０）；および（９）膀胱ＨＯＴ  ＥＶＯ２  ＥＡＡＡＫ．ｉ２０  ＮＵＦミニ遺伝子（Ｂ）（配列番号８９１）。各構築物における個々の構成成分のアミノ酸位置の内訳は、表７８〜８６に提示されている。（Ｂ）構築物に関して、がん型内の総患者カバー範囲が１００％に近づくことができるように、追加のヘテロクリティックエピトープを付加して、本来のホットスポット突然変異ペプチドを補完した。したがって、いかなる患者も、最も多く見られるＨＬＡ（ＨＬＡ−Ａ０２０１、ＨＬＡ−Ａ０３０１、ＨＬＡ−Ａ２４０２およびＨＬＡ−Ｂ０７０２）をカバーするためにヘテロクリティックペプチドを設計した腫瘍関連抗原を発現する可能性があるであろう。Ｇ４Ｓ、ＥＡＡＡＫおよびｉ２０は、それぞれ可動性リンカー、剛性リンカーおよび免疫プロテアソームプロセシングリンカーの包含を指す。
【１０３５】
【表７８】
2020513737.tif 000117
【１０３６】
【表７９】
2020513737.tif 000118
【１０３７】
【表８０】
2020513737.tif 000119
【１０３８】
【表８１】
2020513737.tif 000120
【１０３９】
【表８２】
2020513737.tif 000121
【１０４０】
【表８３】
2020513737.tif 000122
【１０４１】
【表８４】
2020513737.tif 000123
【１０４２】
【表８５】
2020513737.tif 000124
【１０４３】
【表８６】
2020513737.tif 000125
【１０４４】
Ｌｍｄｄａ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ構築物によるｔＬＬＯ−抗原性ペプチド融合タンパク質の発現を査定するために、本明細書の他の箇所に記載されている通りにＤＮＡ構築物を生成し、Ｌｍｄｄａへと形質転換した。個々のＬｍｄｄａ構築物のそれぞれを、抗ＦＬＡＧ抗体を使用して、ｔＬＬＯ融合ポリペプチド発現に関してウエスタンブロットによってアッセイした。図１４および図１５は、様々な膀胱がん構築物に関するＬｍｄｄａによる上清へのｔＬＬＯ融合ポリペプチドの発現および分泌を示す。これらのウエスタンブロットにおいて可視化された構築物は全て、１０３〜１２５ｋＤａの間に収まり、本出願内に見出される構築物の大部分と同様のサイズである。このようなサイズは、相当に大型のタンパク質を示すが、示されている発現データは、抗原プロセシングに十分過ぎなものとなるべきレベルでＨＯＴ構築物を発現および分泌するＬｍｄｄＡ系統の能力を実証する。図２６は、膀胱ＨＯＴ  ＥＶＯ２  ＥＡＡＡＫ．Ｇ４Ｓ、膀胱ＨＯＴ  Ｇ４Ｓ、膀胱ＨＯＴ  ＥＡＡＡＫ−Ｇ４Ｓ混合、膀胱ＨＯＴ  ＥＶＯ２  ＥＡＡＡＫ．ｉ２０および膀胱ＨＯＴ  ＥＶＯ２  Ｇ４Ｓ．ｉ２０構築物に関するＬｍｄｄａによる上清へのｔＬＬＯ融合ポリペプチドの発現および分泌を示す。これらのウエスタンブロットにおいて可視化された構築物は、１０３〜１２５ｋＤａの間に収まり、本出願内に見出される構築物の大部分と同様のサイズである。このようなサイズは、相当に大型のタンパク質を示すが、示されている発現データは、抗原プロセシングに十分過ぎなものとなるべきレベルでＨＯＴ構築物を発現および分泌するＬｍｄｄＡ系統の能力を実証する。図３１は、膀胱ＨＯＴ  ＥＶＯ２  ＥＡＡＡＫ．Ｇ４Ｓ（Ｂ）、膀胱ＨＯＴ  ＥＶＯ２  ＥＡＡＡＫ．Ｇ４Ｓ  ＮＵＦミニ遺伝子（Ｂ）および膀胱ＨＯＴ  ＥＶＯ２  ＥＡＡＡＫ．ｉ２０  ＮＵＦミニ遺伝子（Ｂ）構築物に関するＬｍｄｄａによる上清へのｔＬＬＯ融合ポリペプチドの発現および分泌を示す。これらのウエスタンブロットにおいて可視化された構築物は、１０３〜１３５ｋＤａの間に収まり、本出願内に見出される構築物の大部分と同様のサイズである。このようなサイズは、相当に大型のタンパク質を示すが、示されている発現データは、抗原プロセシングに十分過ぎなものとなるべきレベルでＨＯＴ構築物を発現および分泌するＬｍｄｄＡ系統の能力を実証する。
【１０４５】
乳がんホットスポット／ヘテロクリティック／ミニ遺伝子構築物
３種の遺伝子にわたる総計１４種のホットスポット突然変異を、実施例４および本明細書の他の箇所に記載されている通り、乳がんＡＤＸＳ−ＨＯＴ構築物のために選択した。ホットスポット突然変異のこのパネルは、全エストロゲン受容体陽性（ＥＲ＋）乳がん患者の４７％をカバーする（すなわち、ＥＲ＋乳がん患者の４７％は、パネルに由来するホットスポット突然変異のうち少なくとも１種を有するであろう）。構築物に含まれる反復性がん突然変異毎に、実施例４および本明細書の他の箇所に記載されている通り、２１アミノ酸長のペプチドを設計した。ペプチドを表８７に示す。それぞれの中のホットスポット突然変異は、太字および下線で示す。
【１０４６】
【表８７】
2020513737.tif 000126
【１０４７】
６種の遺伝子にわたるヘテロクリティック突然変異を有する総計１１種のペプチドを、乳がんＡＤＸＳ−ＨＯＴ構築物のために選択した。ヘテロクリティック突然変異毎に、実施例４および本明細書の他の箇所に記載されている通り、９アミノ酸長のペプチドを設計した。ペプチドを表８８に示す。それぞれの中のヘテロクリティック突然変異は、表１２２に記載されている通りである。
【１０４８】
【表８８】
2020513737.tif 000127
【１０４９】
ヘテロクリティック９ｍｅｒペプチドのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで予測される結合親和性およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合親和性は、表８８Ｂに提示する。ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで予測される結合親和性は、５０％阻害濃度（ＩＣ５０）値（ｎＭ）の単位でＭＨＣクラスＩ分子に結合するペプチドを予測するＮｅｔＭＨＣ４．０アルゴリズムに基づく；より少ない数値は、より強い予測される結合親和性を反映する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合親和性は、結合を高親和性Ｔ細胞エピトープの結合と比較することにより、示されているＭＨＣクラスＩ対立遺伝子に結合し、ＭＨＣ−ペプチド複合体を安定化する各候補ペプチドの能力を決定する結合アッセイにより決定した。簡潔に説明すると、各ペプチドを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいてその特異的ＨＬＡ分子と共にインキュベートする。結合強度を、１００％に設定された陽性対照結合スコアを有する陽性対照として、同じＨＬＡ分子に対する公知免疫原性ペプチドに対して比較する。配列最適化された結合スコアを、対照ペプチドに対して正規化する。すなわち、各ペプチドは、非常に強い結合特性を有する公知Ｔ細胞エピトープである陽性対照ペプチドと比べたスコアを得た。ヘテロクリティック検査ペプチドのスコアは、陽性対照ペプチドによって生成されたシグナルのパーセンテージとして定量的に報告される。陽性対照の４５％を超えるまたはこれに等しいスコアを有するペプチドは、バインダーであるとみなされる。表８８Ｂには、乳がんを有する患者における各遺伝子のパーセント発現（Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓデータベース）、検査されているＨＬＡ対立遺伝子、および各ヘテロクリティックペプチドに対応する野生型ペプチドが免疫原性であることが公知であるか否かも提示されている。表８８Ｂにおけるヘテロクリティックペプチドのそれぞれを含む構築物に関して、ＨＬＡ型Ａ＊０２：０１を有する乳がん患者の１００％は、ＴＡＡ遺伝子のうち少なくとも１種を発現し、ＨＬＡ型Ａ＊０３：０１を有する乳がん患者の９５％は、ＴＡＡ遺伝子のうち少なくとも１種を発現し、ＨＬＡ型Ａ＊２４：０２を有する乳がん患者の１００％は、ＴＡＡ遺伝子のうち少なくとも１種を発現し、ＨＬＡ型Ｂ＊０７：０２を有する乳がん患者の１００％は、ＴＡＡ遺伝子のうち少なくとも１種を発現する。
【１０５０】
【表８８Ｂ】
2020513737.tif 000128
【１０５１】
ホットスポットペプチド、およびヘテロクリティックペプチドの１種または複数または全てに融合されたｔＬＬＯを含む融合ポリペプチドをコードするように構築物を設計し、Ｃ末端ヘテロクリティックペプチドがユビキチンペプチドに続いた。一部の構築物において、ユビキチンは、ＳＴＥＡＰ１＿Ａ０２０１ヘテロクリティックペプチドに融合された。構築物のうちいくつかにおいて、ユビキチンは、ＳＴＥＡＰ１＿Ａ２４０２ヘテロクリティックペプチドに融合された。ヘテロクリティックペプチドは、ホットスポットペプチドに対してＣ末端であった。ＦＬＡＧタグおよびＳＩＩＮＦＥＫＬタグも、ユビキチンの上流に含まれた。融合ポリペプチドのｔＬＬＯ、ホットスポットペプチド、ヘテロクリティックペプチドおよびユビキチン／ヘテロクリティックペプチド構成成分は、表３７のリンカーから選択される様々なリンカーによって連接された。
【１０５２】
例示的な融合ポリペプチドインサート配列（すなわち、ｔＬＬＯの下流のペプチド配列）は、次のものを含む：（１）乳ＨＯＴ  ＥＶＯ２  ＥＡＡＡＫ．Ｇ４Ｓ（Ａ）（配列番号８８３）；（２）乳ＨＯＴ  Ｇ４Ｓ（Ａ）（配列番号８８４）；（３）乳ＨＯＴ  ＥＶＯ２  ＥＡＡＡＫ−Ｇ４Ｓ混合（Ａ）（配列番号８８５）；（４）乳ＨＯＴ  ＥＶＯ２  ＥＡＡＡＫ．ｉ２０（Ａ）（配列番号８８６）；（５）乳ＨＯＴ  ＥＶＯ２  Ｇ４Ｓ．ｉ２０（Ａ）（配列番号８８７）；および（６）乳Ａ２４  ＨＯＴ（配列番号９０７）。各構築物における個々の構成成分のアミノ酸位置の内訳は、表８９〜９４に提示されている。Ａ２４構築物に関して、ミニ遺伝子中の９ｍｅｒは、Ａ２４  ９ｍｅｒによって置き換えた。Ａ２４（ＨＬＡ−Ａ２４０２）は、アジアで一般的に見出されるＨＬＡ型である。Ｇ４Ｓ、ＥＡＡＡＫおよびｉ２０は、それぞれ可動性リンカー、剛性リンカーおよび免疫プロテアソームプロセシングリンカーの包含を指す。
【１０５３】
【表８９】
2020513737.tif 000129
【１０５４】
【表９０】
2020513737.tif 000130
【１０５５】
【表９１】
2020513737.tif 000131
【１０５６】
【表９２】
2020513737.tif 000132
【１０５７】
【表９３】
2020513737.tif 000133
【１０５８】
【表９４】
2020513737.tif 000134
【１０５９】
Ｌｍｄｄａ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ構築物によるｔＬＬＯ−抗原性ペプチド融合タンパク質の発現を査定するために、本明細書の他の箇所に記載されている通りにＤＮＡ構築物を生成し、Ｌｍｄｄａへと形質転換した。個々のＬｍｄｄａ構築物のそれぞれを、抗ＦＬＡＧ抗体を使用して、ｔＬＬＯ融合ポリペプチド発現に関してウエスタンブロットによってアッセイした。図１６は、乳ＨＯＴ  Ｇ４Ｓ構築物に関するＬｍｄｄａによる上清へのｔＬＬＯ融合ポリペプチドの発現および分泌を示す。図２３は、乳ＨＯＴ  ＥＶＯ２  ＥＡＡＡＫ．Ｇ４Ｓ、乳ＨＯＴ  Ｇ４Ｓ、乳ＨＯＴ  ＥＶＯ２  ＥＡＡＡＫ−Ｇ４Ｓ混合、乳ＨＯＴ  ＥＶＯ２  ＥＡＡＡＫ．ｉ２０および乳ＨＯＴ  ＥＶＯ２  Ｇ４ｓ．ｉ２０構築物に関するＬｍｄｄａによる上清へのｔＬＬＯ融合ポリペプチドの発現および分泌を示す。これらのウエスタンブロットにおいて可視化された構築物は、１０３〜１３０ｋＤａの間に収まり、本出願内に見出される構築物の大部分と同様のサイズである。このようなサイズは、相当に大型のタンパク質を示すが、示されている発現データは、抗原プロセシングに十分過ぎなものとなるべきレベルでＨＯＴ構築物を発現および分泌するＬｍｄｄＡ系統の能力を実証する。
【１０６０】
子宮がんホットスポット／ヘテロクリティック／ミニ遺伝子構築物
６種の遺伝子にわたる総計１６種のホットスポット突然変異を、実施例４および本明細書の他の箇所に記載されている通り、子宮がんＡＤＸＳ−ＨＯＴ構築物のために選択した。ホットスポット突然変異のこのパネルは、全子宮がん患者の６４％をカバーする（すなわち、子宮がん患者の６４％は、パネルに由来するホットスポット突然変異のうち少なくとも１種を有するであろう）。構築物に含まれる反復性がん突然変異毎に、実施例４および本明細書の他の箇所に記載されている通り、２１アミノ酸長のペプチドを設計した。ペプチドを表９５に示す。それぞれの中のホットスポット突然変異は、太字および下線で示す。
【１０６１】
【表９５】
2020513737.tif 000135
【１０６２】
８種の遺伝子にわたるヘテロクリティック突然変異を有する総計１４種のペプチドを、子宮がんＡＤＸＳ−ＨＯＴ構築物のために選択した。ヘテロクリティック突然変異毎に、実施例４および本明細書の他の箇所に記載されている通り、９アミノ酸長のペプチドを設計した。ペプチドを表９６に示す。それぞれの中のヘテロクリティック突然変異は、表１２２に記載されている通りである。
【１０６３】
【表９６】
2020513737.tif 000136
【１０６４】
ヘテロクリティック９ｍｅｒペプチドのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで予測される結合親和性およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合親和性は、表９６Ｂに提示する。ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで予測される結合親和性は、５０％阻害濃度（ＩＣ５０）値（ｎＭ）の単位でＭＨＣクラスＩ分子に結合するペプチドを予測するＮｅｔＭＨＣ４．０アルゴリズムに基づく；より少ない数値は、より強い予測される結合親和性を反映する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合親和性は、結合を高親和性Ｔ細胞エピトープの結合と比較することにより、示されているＭＨＣクラスＩ対立遺伝子に結合し、ＭＨＣ−ペプチド複合体を安定化する各候補ペプチドの能力を決定する結合アッセイにより決定した。簡潔に説明すると、各ペプチドを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいてその特異的ＨＬＡ分子と共にインキュベートする。結合強度を、１００％に設定された陽性対照結合スコアを有する陽性対照として、同じＨＬＡ分子に対する公知免疫原性ペプチドに対して比較する。配列最適化された結合スコアを、対照ペプチドに対して正規化する。すなわち、各ペプチドは、非常に強い結合特性を有する公知Ｔ細胞エピトープである陽性対照ペプチドと比べたスコアを得た。ヘテロクリティック検査ペプチドのスコアは、陽性対照ペプチドによって生成されたシグナルのパーセンテージとして定量的に報告される。陽性対照の４５％を超えるまたはこれに等しいスコアを有するペプチドは、バインダーであるとみなされる。表９６Ｂには、子宮がんを有する患者における各遺伝子のパーセント発現（Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）データベース）、検査されているＨＬＡ対立遺伝子、および各ヘテロクリティックペプチドに対応する野生型ペプチドが免疫原性であることが公知であるか否かも提示されている。表９６Ｂにおけるヘテロクリティックペプチドのそれぞれを含む構築物に関して、ＨＬＡ型Ａ＊０２：０１を有する子宮がん患者の１００％は、ＴＡＡ遺伝子のうち少なくとも１種を発現し、ＨＬＡ型Ａ＊０３：０１を有する子宮がん患者の８３％は、ＴＡＡ遺伝子のうち少なくとも１種を発現し、ＨＬＡ型Ａ＊２４：０２を有する子宮がん患者の１００％は、ＴＡＡ遺伝子のうち少なくとも１種を発現し、ＨＬＡ型Ｂ＊０７：０２を有する子宮がん患者の１００％は、ＴＡＡ遺伝子のうち少なくとも１種を発現する。
【１０６５】
【表９６Ｂ】
2020513737.tif 000137
【１０６６】
ホットスポットペプチド、およびヘテロクリティックペプチドの１種または複数または全てに融合されたｔＬＬＯを含む融合ポリペプチドをコードするように構築物を設計し、Ｃ末端ヘテロクリティックペプチドがユビキチンペプチドに続いた。一部の構築物において、ユビキチンは、ＳＴＥＡＰ１＿Ａ０２０１ヘテロクリティックペプチドに融合された。構築物のうちいくつかにおいて、ユビキチンは、ＳＴＥＡＰ＿Ａ２４０２ヘテロクリティックペプチドに融合された。ＦＬＡＧタグおよびＳＩＩＮＦＥＫＬタグも、ユビキチンの上流に含まれた。融合ポリペプチドのｔＬＬＯ、ホットスポットペプチド、ヘテロクリティックペプチドおよびユビキチン／ヘテロクリティックペプチド構成成分は、表３７のリンカーから選択される様々なリンカーによって連接された。
【１０６７】
例示的な融合ポリペプチドインサート配列（すなわち、ｔＬＬＯの下流のペプチド配列）は、次のものを含む：（１）子宮ＨＯＴ  ＥＶＯ２  ＥＡＡＡＫ．Ｇ４Ｓ（配列番号８９６）；（２）子宮ＨＯＴ  ＥＶＯ２  ＥＡＡＡＫ．ｉ２０（配列番号８９７）；および（３）子宮Ａ２４  ＨＯＴ（配列番号９０４）。各構築物における個々の構成成分のアミノ酸位置の内訳は、表９７〜９９に提示されている。Ａ２４構築物に関して、ミニ遺伝子中の９ｍｅｒは、Ａ２４  ９ｍｅｒによって置き換えた。Ａ２４（ＨＬＡ−Ａ２４０２）は、アジアで一般的に見出されるＨＬＡ型である。Ｇ４Ｓ、ＥＡＡＡＫおよびｉ２０は、それぞれ可動性リンカー、剛性リンカーおよび免疫プロテアソームプロセシングリンカーの包含を指す。
【１０６８】
【表９７】
2020513737.tif 000138
【１０６９】
【表９８】
2020513737.tif 000139
【１０７０】
【表９９】
2020513737.tif 000140
【１０７１】
卵巣がんホットスポット／ヘテロクリティック／ミニ遺伝子構築物
１種の遺伝子にわたる総計１２種のホットスポット突然変異を、実施例４および本明細書の他の箇所に記載されている通り、卵巣がんＡＤＸＳ−ＨＯＴ構築物のために選択した。ホットスポット突然変異のこのパネルは、全卵巣がん患者の２５％をカバーする（すなわち、卵巣がん患者の２５％は、パネルに由来するホットスポット突然変異のうち少なくとも１種を有するであろう）。構築物に含まれる反復性がん突然変異毎に、実施例４および本明細書の他の箇所に記載されている通り、２１アミノ酸長のペプチドを設計した。ペプチドを表１００に示す。それぞれの中のホットスポット突然変異は、太字および下線で示す。
【１０７２】
【表１００】
2020513737.tif 000141
【１０７３】
８種の遺伝子にわたるヘテロクリティック突然変異を有する総計１４種のペプチドを、卵巣がんＡＤＸＳ−ＨＯＴ構築物のために選択した。ヘテロクリティック突然変異毎に、実施例４および本明細書の他の箇所に記載されている通り、９アミノ酸長のペプチドを設計した。ペプチドを表１０１に示す。それぞれの中のヘテロクリティック突然変異は、表１２２に記載されている通りである。
【１０７４】
【表１０１】
2020513737.tif 000142
【１０７５】
ヘテロクリティック９ｍｅｒペプチドのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで予測される結合親和性およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合親和性は、表１０１Ｂに提示する。ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで予測される結合親和性は、５０％阻害濃度（ＩＣ５０）値（ｎＭ）の単位でＭＨＣクラスＩ分子に結合するペプチドを予測するＮｅｔＭＨＣ４．０アルゴリズムに基づく；より少ない数値は、より強い予測される結合親和性を反映する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合親和性は、結合を高親和性Ｔ細胞エピトープの結合と比較することにより、示されているＭＨＣクラスＩ対立遺伝子に結合し、ＭＨＣ−ペプチド複合体を安定化する各候補ペプチドの能力を決定する結合アッセイにより決定した。簡潔に説明すると、各ペプチドを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいてその特異的ＨＬＡ分子と共にインキュベートする。結合強度を、１００％に設定された陽性対照結合スコアを有する陽性対照として、同じＨＬＡ分子に対する公知免疫原性ペプチドに対して比較する。配列最適化された結合スコアを、対照ペプチドに対して正規化する。すなわち、各ペプチドは、非常に強い結合特性を有する公知Ｔ細胞エピトープである陽性対照ペプチドと比べたスコアを得た。ヘテロクリティック検査ペプチドのスコアは、陽性対照ペプチドによって生成されたシグナルのパーセンテージとして定量的に報告される。陽性対照の４５％を超えるまたはこれに等しいスコアを有するペプチドは、バインダーであるとみなされる。表１０１Ｂには、卵巣がんを有する患者における各遺伝子のパーセント発現（Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）データベース）、検査されているＨＬＡ対立遺伝子、および各ヘテロクリティックペプチドに対応する野生型ペプチドが免疫原性であることが公知であるか否かも提示されている。表１０１Ｂにおけるヘテロクリティックペプチドのそれぞれを含む構築物に関して、ＨＬＡ型Ａ＊０２：０１を有する卵巣がん患者の１００％は、ＴＡＡ遺伝子のうち少なくとも１種を発現し、ＨＬＡ型Ａ＊０３：０１を有する卵巣がん患者の８３％は、ＴＡＡ遺伝子のうち少なくとも１種を発現し、ＨＬＡ型Ａ＊２４：０２を有する卵巣がん患者の１００％は、ＴＡＡ遺伝子のうち少なくとも１種を発現し、ＨＬＡ型Ｂ＊０７：０２を有する卵巣がん患者の１００％は、ＴＡＡ遺伝子のうち少なくとも１種を発現する。
【１０７６】
【表１０１Ｂ】
2020513737.tif 000143
【１０７７】
ホットスポットペプチド、およびヘテロクリティックペプチドの１種または複数または全てに融合されたｔＬＬＯを含む融合ポリペプチドをコードするように構築物を設計し、Ｃ末端ヘテロクリティックペプチドがユビキチンペプチドに続いた。ユビキチンは、ＳＴＥＡＰ１＿Ａ０２０１ヘテロクリティックペプチドに融合された。ＦＬＡＧタグおよびＳＩＩＮＦＥＫＬタグも、ユビキチンの上流に含まれた。融合ポリペプチドのｔＬＬＯ、ホットスポットペプチド、ヘテロクリティックペプチドおよびユビキチン／ヘテロクリティックペプチド構成成分は、表３７のリンカーから選択される様々なリンカーによって連接された。
【１０７８】
例示的な融合ポリペプチドインサート配列（すなわち、ｔＬＬＯの下流のペプチド配列）は、次のものを含む：（１）卵巣ＨＯＴ  ＥＶＯ２  ＥＡＡＡＫ．Ｇ４Ｓ（Ｃ）（配列番号８９８）；および（２）卵巣ＨＯＴ  ＥＶＯ２  ＥＡＡＡＫ．ｉ２０（Ｃ）（配列番号８９９）。各構築物における個々の構成成分のアミノ酸位置の内訳は、表１０２〜１０３に提示されている。Ｇ４Ｓ、ＥＡＡＡＫおよびｉ２０は、それぞれ可動性リンカー、剛性リンカーおよび免疫プロテアソームプロセシングリンカーの包含を指す。
【１０７９】
【表１０２】
2020513737.tif 000144
【１０８０】
【表１０３】
2020513737.tif 000145
【１０８１】
低悪性度神経膠腫（ＬＧＧ）ホットスポット／ヘテロクリティック／ミニ遺伝子構築物
５種の遺伝子にわたる総計１１種のホットスポット突然変異を、実施例４および本明細書の他の箇所に記載されている通り、低悪性度神経膠腫（ＬＧＧ）ＡＤＸＳ−ＨＯＴ構築物のために選択した。ホットスポット突然変異のこのパネルは、全低悪性度神経膠腫患者の８０％をカバーする（すなわち、低悪性度神経膠腫患者の８０％は、パネルに由来するホットスポット突然変異のうち少なくとも１種を有するであろう）。構築物に含まれる反復性がん突然変異毎に、実施例４および本明細書の他の箇所に記載されている通り、２１アミノ酸長のペプチドを設計した。ペプチドを表１０４に示す。それぞれの中のホットスポット突然変異は、太字および下線で示す。
【１０８２】
【表１０４】
2020513737.tif 000146
【１０８３】
８種の遺伝子にわたるヘテロクリティック突然変異を有する総計１０種のペプチドを、ＬＧＧ  ＡＤＸＳ−ＨＯＴ構築物のために選択した。ヘテロクリティック突然変異毎に、実施例４および本明細書の他の箇所に記載されている通り、９アミノ酸長のペプチドを設計した。ペプチドを表１０５に示す。それぞれの中のヘテロクリティック突然変異は、表１２２に記載されている通りである。
【１０８４】
【表１０５】
2020513737.tif 000147
【１０８５】
ヘテロクリティック９ｍｅｒペプチドのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで予測される結合親和性およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合親和性は、表１０５Ｂに提示する。ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで予測される結合親和性は、５０％阻害濃度（ＩＣ５０）値（ｎＭ）の単位でＭＨＣクラスＩ分子に結合するペプチドを予測するＮｅｔＭＨＣ４．０アルゴリズムに基づく；より少ない数値は、より強い予測される結合親和性を反映する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合親和性は、結合を高親和性Ｔ細胞エピトープの結合と比較することにより、示されているＭＨＣクラスＩ対立遺伝子に結合し、ＭＨＣ−ペプチド複合体を安定化する各候補ペプチドの能力を決定する結合アッセイにより決定した。簡潔に説明すると、各ペプチドを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいてその特異的ＨＬＡ分子と共にインキュベートする。結合強度を、１００％に設定された陽性対照結合スコアを有する陽性対照として、同じＨＬＡ分子に対する公知免疫原性ペプチドに対して比較する。配列最適化された結合スコアを、対照ペプチドに対して正規化する。すなわち、各ペプチドは、非常に強い結合特性を有する公知Ｔ細胞エピトープである陽性対照ペプチドと比べたスコアを得た。ヘテロクリティック検査ペプチドのスコアは、陽性対照ペプチドによって生成されたシグナルのパーセンテージとして定量的に報告される。陽性対照の４５％を超えるまたはこれに等しいスコアを有するペプチドは、バインダーであるとみなされる。表１０５Ｂには、低悪性度神経膠腫（ＬＧＧ）を有する患者における各遺伝子のパーセント発現（Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）データベース）、検査されているＨＬＡ対立遺伝子、および各ヘテロクリティックペプチドに対応する野生型ペプチドが免疫原性であることが公知であるか否かも提示されている。表１０５Ｂにおけるヘテロクリティックペプチドのそれぞれを含む構築物に関して、ＨＬＡ型Ａ＊０２：０１を有するＬＧＧ患者の１００％は、ＴＡＡ遺伝子のうち少なくとも１種を発現し、ＨＬＡ型Ａ＊０３：０１を有するＬＧＧ患者の４３％は、ＴＡＡ遺伝子のうち少なくとも１種を発現し、ＨＬＡ型Ａ＊２４：０２を有するＬＧＧ患者の１００％は、ＴＡＡ遺伝子のうち少なくとも１種を発現し、ＨＬＡ型Ｂ＊０７：０２を有するＬＧＧ患者の１００％は、ＴＡＡ遺伝子のうち少なくとも１種を発現する。
【１０８６】
【表１０５Ｂ】
2020513737.tif 000148
【１０８７】
ホットスポットペプチド、およびヘテロクリティックペプチドの１種または複数または全てに融合されたｔＬＬＯを含む融合ポリペプチドをコードするように構築物を設計し、Ｃ末端ヘテロクリティックペプチドがユビキチンペプチドに続いた。ユビキチンは、ＮＵＦ２＿Ａ０２０１ヘテロクリティックペプチドに融合された。ＦＬＡＧタグおよびＳＩＩＮＦＥＫＬタグも、ユビキチンの上流に含まれた。融合ポリペプチドのｔＬＬＯ、ホットスポットペプチド、ヘテロクリティックペプチドおよびユビキチン／ヘテロクリティックペプチド構成成分は、表３７のリンカーから選択される様々なリンカーによって連接された。
【１０８８】
例示的な融合ポリペプチドインサート配列（すなわち、ｔＬＬＯの下流のペプチド配列）は、次のものを含む：（１）ＬＧＧ  ＨＯＴ  ＥＶＯ２  ＥＡＡＡＫ．Ｇ４Ｓ  ＮＵＦミニ遺伝子（Ｃ）（配列番号９００）；および（２）ＬＧＧ  ＨＯＴ  ＥＶＯ２  ＥＡＡＡＫ．ｉ２０＿ＮＵＦミニ遺伝子（Ｃ）（配列番号９０１）。各構築物における個々の構成成分のアミノ酸位置の内訳は、表１０６〜１０７に提示されている。Ｇ４Ｓ、ＥＡＡＡＫおよびｉ２０は、それぞれ可動性リンカー、剛性リンカーおよび免疫プロテアソームプロセシングリンカーの包含を指す。
【１０８９】
【表１０６】
2020513737.tif 000149
【１０９０】
【表１０７】
2020513737.tif 000150
【１０９１】
結腸直腸がん（ＣＲＣ）ホットスポット／ヘテロクリティック／ミニ遺伝子構築物
４種の遺伝子にわたる総計１２種のホットスポット突然変異を、実施例４および本明細書の他の箇所に記載されている通り、結腸直腸がん（ＣＲＣ）ＡＤＸＳ−ＨＯＴ構築物のために選択した。ホットスポット突然変異のこのパネルは、全マイクロサテライト安定（ＭＳＳ）結腸直腸がん患者の５８％をカバーする（すなわち、ＭＳＳ結腸直腸がん患者の５８％は、パネルに由来するホットスポット突然変異のうち少なくとも１種を有するであろう）。構築物に含まれる反復性がん突然変異毎に、実施例４および本明細書の他の箇所に記載されている通り、２１アミノ酸長のペプチドを設計した。ペプチドを表１０８に示す。それぞれの中のホットスポット突然変異は、太字および下線で示す。
【１０９２】
【表１０８】
2020513737.tif 000151
【１０９３】
８種の遺伝子にわたるヘテロクリティック突然変異を有する総計１０種のペプチドを、ＣＲＣ  ＡＤＸＳ−ＨＯＴ構築物のために選択した。ヘテロクリティック突然変異毎に、実施例４および本明細書の他の箇所に記載されている通り、９アミノ酸長のペプチドを設計した。ペプチドを表１０９に示す。それぞれの中のヘテロクリティック突然変異は、表１２２に記載されている通りである。
【１０９４】
【表１０９】
2020513737.tif 000152
【１０９５】
ヘテロクリティック９ｍｅｒペプチドのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで予測される結合親和性およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合親和性は、表１０９Ｂに提示する。ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで予測される結合親和性は、５０％阻害濃度（ＩＣ５０）値（ｎＭ）の単位でＭＨＣクラスＩ分子に結合するペプチドを予測するＮｅｔＭＨＣ４．０アルゴリズムに基づく；より少ない数値は、より強い予測される結合親和性を反映する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合親和性は、結合を高親和性Ｔ細胞エピトープの結合と比較することにより、示されているＭＨＣクラスＩ対立遺伝子に結合し、ＭＨＣ−ペプチド複合体を安定化する各候補ペプチドの能力を決定する結合アッセイにより決定した。簡潔に説明すると、各ペプチドを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいてその特異的ＨＬＡ分子と共にインキュベートする。結合強度を、１００％に設定された陽性対照結合スコアを有する陽性対照として、同じＨＬＡ分子に対する公知免疫原性ペプチドに対して比較する。配列最適化された結合スコアを、対照ペプチドに対して正規化する。すなわち、各ペプチドは、非常に強い結合特性を有する公知Ｔ細胞エピトープである陽性対照ペプチドと比べたスコアを得た。ヘテロクリティック検査ペプチドのスコアは、陽性対照ペプチドによって生成されたシグナルのパーセンテージとして定量的に報告される。陽性対照の４５％を超えるまたはこれに等しいスコアを有するペプチドは、バインダーであるとみなされる。表１０９Ｂには、結腸直腸がんを有する患者における各遺伝子のパーセント発現（Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓデータベース）、検査されているＨＬＡ対立遺伝子、および各ヘテロクリティックペプチドに対応する野生型ペプチドが免疫原性であることが公知であるか否かも提示されている。表１０９Ｂにおけるヘテロクリティックペプチドのそれぞれを含む構築物に関して、ＨＬＡ型Ａ＊０２：０１を有する結腸直腸がん患者の１００％は、ＴＡＡ遺伝子のうち少なくとも１種を発現し、ＨＬＡ型Ａ＊０３：０１を有する結腸直腸がん患者の９８％は、ＴＡＡ遺伝子のうち少なくとも１種を発現し、ＨＬＡ型Ａ＊２４：０２を有する結腸直腸がん患者の１００％は、ＴＡＡ遺伝子のうち少なくとも１種を発現し、ＨＬＡ型Ｂ＊０７：０２を有する結腸直腸がん患者の９８％は、ＴＡＡ遺伝子のうち少なくとも１種を発現する。
【１０９６】
【表１０９Ｂ】
2020513737.tif 000153
【１０９７】
ホットスポットペプチド、およびヘテロクリティックペプチドの１種または複数または全てに融合されたｔＬＬＯを含む融合ポリペプチドをコードするように構築物を設計し、Ｃ末端ヘテロクリティックペプチドがユビキチンペプチドに続いた。ＣＥＡＣＡＭ５＿Ｂ０７０２は、２回含まれた。ユビキチンは、ＳＴＥＡＰ１＿Ａ０２０１ヘテロクリティックペプチドに融合された。ＦＬＡＧタグおよびＳＩＩＮＦＥＫＬタグも、ユビキチンの上流に含まれた。融合ポリペプチドのｔＬＬＯ、ホットスポットペプチド、ヘテロクリティックペプチドおよびユビキチン／ヘテロクリティックペプチド構成成分は、表３７のリンカーから選択される様々なリンカーによって連接された。
【１０９８】
例示的な融合ポリペプチドインサート配列（すなわち、ｔＬＬＯの下流のペプチド配列）は、次のものを含む：（１）ＣＲＣ  ＭＳＳ  ＥＶＯ２  ＥＡＡＡＫ．Ｇ４Ｓ（Ｃ）（配列番号９０２）；および（２）ＣＲＣ  ＭＳＳ  ＥＶＯ２  ＥＡＡＡＫ．ｉ２０（Ｃ）（配列番号９０３）。各構築物における個々の構成成分のアミノ酸位置の内訳は、表１１０〜１１１に提示されている。Ｇ４Ｓ、ＥＡＡＡＫおよびｉ２０は、それぞれ可動性リンカー、剛性リンカーおよび免疫プロテアソームプロセシングリンカーの包含を指す。
【１０９９】
【表１１０】
2020513737.tif 000154
【１１００】
【表１１１】
2020513737.tif 000155
【１１０１】
Ｌｍｄｄａ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ構築物によるｔＬＬＯ−抗原性ペプチド融合タンパク質の発現を査定するために、本明細書の他の箇所に記載されている通りにＤＮＡ構築物を生成し、Ｌｍｄｄａへと形質転換した。個々のＬｍｄｄａ構築物のそれぞれを、抗ＦＬＡＧ抗体を使用して、ｔＬＬＯ融合ポリペプチド発現に関してウエスタンブロットによってアッセイした。図２９は、ＣＲＣ  ＭＳＳ  ＥＶＯ２  ＥＡＡＡＫ．Ｇ４ＳおよびＣＲＣ  ＭＳＳ  ＥＶＯ２  ＥＡＡＡＫ．ｉ２０構築物に関するＬｍｄｄａによる上清へのｔＬＬＯ融合ポリペプチドの発現および分泌を示す。これらのウエスタンブロットにおいて可視化された構築物は、１０３〜１２５ｋＤａの間に収まり、本出願内に見出される構築物の大部分と同様のサイズである。このようなサイズは、相当に大型のタンパク質を示すが、示されている発現データは、抗原プロセシングに十分過ぎなものとなるべきレベルでＨＯＴ構築物を発現および分泌するＬｍｄｄＡ系統の能力を実証する。
【１１０２】
頭頸部がんホットスポット／ヘテロクリティック／ミニ遺伝子構築物
９種の遺伝子にわたる総計１７種のホットスポット突然変異を、実施例４および本明細書の他の箇所に記載されている通り、頭頸部がんＡＤＸＳ−ＨＯＴ構築物のために選択した。ホットスポット突然変異のこのパネルは、全頭頸部がん患者の３４％をカバーする（すなわち、頭頸部がん患者の３４％は、パネルに由来するホットスポット突然変異のうち少なくとも１種を有するであろう）。構築物に含まれる反復性がん突然変異毎に、実施例４および本明細書の他の箇所に記載されている通り、２１アミノ酸長のペプチドを設計した。しかし、ホットスポット突然変異は、タンパク質のＣ末端付近にあったため、ＲＧＰＤ８＿Ｐ１７６０Ａペプチドは、１６アミノ酸長であった。ペプチドを表１１２に示す。それぞれの中のホットスポット突然変異は、太字および下線で示す。
【１１０３】
【表１１２】
2020513737.tif 000156
【１１０４】
６種の遺伝子にわたるヘテロクリティック突然変異を有する総計１０種のペプチドを、頭頸部がんＡＤＸＳ−ＨＯＴ構築物のために選択した。ヘテロクリティック突然変異毎に、実施例４および本明細書の他の箇所に記載されている通り、９アミノ酸長のペプチドを設計した。ペプチドを表１１３に示す。それぞれの中のヘテロクリティック突然変異は、表１２２に記載されている通りである。
【１１０５】
【表１１３】
2020513737.tif 000157
【１１０６】
ヘテロクリティック９ｍｅｒペプチドのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで予測される結合親和性およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合親和性は、表１１３Ｂに提示する。ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで予測される結合親和性は、５０％阻害濃度（ＩＣ５０）値（ｎＭ）の単位でＭＨＣクラスＩ分子に結合するペプチドを予測するＮｅｔＭＨＣ４．０アルゴリズムに基づく；より少ない数値は、より強い予測される結合親和性を反映する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合親和性は、結合を高親和性Ｔ細胞エピトープの結合と比較することにより、示されているＭＨＣクラスＩ対立遺伝子に結合し、ＭＨＣ−ペプチド複合体を安定化する各候補ペプチドの能力を決定する結合アッセイにより決定した。簡潔に説明すると、各ペプチドを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいてその特異的ＨＬＡ分子と共にインキュベートする。結合強度を、１００％に設定された陽性対照結合スコアを有する陽性対照として、同じＨＬＡ分子に対する公知免疫原性ペプチドに対して比較する。配列最適化された結合スコアを、対照ペプチドに対して正規化する。すなわち、各ペプチドは、非常に強い結合特性を有する公知Ｔ細胞エピトープである陽性対照ペプチドと比べたスコアを得た。ヘテロクリティック検査ペプチドのスコアは、陽性対照ペプチドによって生成されたシグナルのパーセンテージとして定量的に報告される。陽性対照の４５％を超えるまたはこれに等しいスコアを有するペプチドは、バインダーであるとみなされる。表１１３Ｂには、頭頸部がんを有する患者における各遺伝子のパーセント発現（Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓデータベース）、検査されているＨＬＡ対立遺伝子、および各ヘテロクリティックペプチドに対応する野生型ペプチドが免疫原性であることが公知であるか否かも提示されている。表１１３Ｂにおけるヘテロクリティックペプチドのそれぞれを含む構築物に関して、ＨＬＡ型Ａ＊０２：０１を有する頭頸部がん患者の１００％は、ＴＡＡ遺伝子のうち少なくとも１種を発現し、ＨＬＡ型Ａ＊０３：０１を有する頭頸部がん患者の１００％は、ＴＡＡ遺伝子のうち少なくとも１種を発現し、ＨＬＡ型Ａ＊２４：０２を有する頭頸部がん患者の１００％は、ＴＡＡ遺伝子のうち少なくとも１種を発現し、ＨＬＡ型Ｂ＊０７：０２を有する頭頸部がん患者の１００％は、ＴＡＡ遺伝子のうち少なくとも１種を発現する。
【１１０７】
【表１１３Ｂ】
2020513737.tif 000158
【１１０８】
ホットスポットペプチド、およびヘテロクリティックペプチドの１種または複数または全てに融合されたｔＬＬＯを含む融合ポリペプチドをコードするように構築物を設計し、Ｃ末端ヘテロクリティックペプチドがユビキチンペプチドに続いた。ユビキチンは、ＳＴＥＡＰ１＿Ａ０２０１ヘテロクリティックペプチドに融合された。ＦＬＡＧタグおよびＳＩＩＮＦＥＫＬタグも、ユビキチンの上流に含まれた。融合ポリペプチドのｔＬＬＯ、ホットスポットペプチド、ヘテロクリティックペプチドおよびユビキチン／ヘテロクリティックペプチド構成成分は、表３７のリンカーから選択される様々なリンカーによって連接された。
【１１０９】
例示的な融合ポリペプチドインサート配列（すなわち、ｔＬＬＯの下流のペプチド配列）は、次のものを含む：（１）頭頸部ＨＯＴ  ＥＶＯ２  ＥＡＡＡＫ．Ｇ４Ｓ（配列番号９１８）；および（２）頭頸部ＨＯＴ  ＥＶＯ２  ＥＡＡＡＫ．ｉ２０（配列番号９１９）。各構築物における個々の構成成分のアミノ酸位置の内訳は、表１１４〜１１５に提示されている。Ｇ４Ｓ、ＥＡＡＡＫおよびｉ２０は、それぞれ可動性リンカー、剛性リンカーおよび免疫プロテアソームプロセシングリンカーの包含を指す。
【１１１０】
【表１１４】
2020513737.tif 000159
【１１１１】
【表１１５】
2020513737.tif 000160
【１１１２】
ｄＭＭＲホットスポット構築物
ＤＮＡミスマッチ修復は、ＤＮＡ複製中に遺伝的ミスマッチを同定および修復する生物学的機構である。欠損ＤＮＡミスマッチ修復（ｄＭＭＲ）は、複製中に生じるＤＮＡミスマッチを修復できない状態をもたらす。ｄＭＭＲを有する患者は一般に、高い突然変異率を生じるＤＮＡ複製中の高頻度エラーにより、マイクロサテライト不安定性、高（ＭＳＩ−Ｈ）を発生する。各突然変異は、ＭＨＣ系によって提示されて、Ｔ細胞によって異物として認識され得るため、このような高突然変異腫瘍は、免疫療法のための優れた標的である。ｄＭＭＲは、４種のタンパク質：ＰＭＳ２、ＭＬＨ１、ＭＳＨ６およびＭＳＨ２の損失に関連する。
【１１１３】
ｄＭＭＲパネルを設計するために、本出願人らは、多数の腫瘍型にわたりＴＣＧＡにおける全患者を選択した。本出願人らは、ＰＭＳ２、ＭＬＨ１、ＭＳＨ６およびＭＳＨ２に突然変異を有する患者にフィルターをかけたが、その理由として、これらの遺伝子に突然変異を有する患者は、ＭＳＩである可能性が高いことが挙げられる。次に、このコホート内の全体細胞突然変異の頻度を計算し、４．５％を超える頻度を有する上位突然変異を選択した。
【１１１４】
２６種の遺伝子にわたる総計２８種のホットスポット突然変異を、実施例４および本明細書の他の箇所に記載されている通り、ＤＮＡミスマッチ修復欠損（ｄＭＭＲ）ＡＤＸＳ−ＨＯＴ構築物のために選択した。ホットスポット突然変異のこのパネルは、全ＤＮＡミスマッチ修復欠損がん患者の５４％をカバーする（すなわち、ＤＮＡミスマッチ修復欠損がん患者の５４％は、パネルに由来するホットスポット突然変異のうち少なくとも１種を有するであろう）。構築物に含まれる反復性ミスセンスがん突然変異毎に、実施例４および本明細書の他の箇所に記載されている通り、２１アミノ酸長のペプチドを設計した。構築物に含まれるフレームシフト突然変異毎に、フレーム外ＩＮＤＥＬ置換から生じる予測されるペプチド配列を含むように、より長いペプチドを設計した。ペプチドを表１１６に示す。それぞれの中のホットスポット突然変異は、太字および下線で示す。
【１１１５】
【表１１６−１】
2020513737.tif 000161
【表１１６−２】
2020513737.tif 000162
【１１１６】
ホットスポットペプチドに融合されたｔＬＬＯを含む融合ポリペプチドをコードするように構築物を設計した。ＳＩＩＮＦＥＫＬタグも含まれた。融合ポリペプチドのｔＬＬＯおよびホットスポットペプチド構成成分は、表３７のリンカーから選択される様々なリンカーによって連接された。融合ポリペプチドインサート（すなわち、ｔＬＬＯの下流のペプチド）の配列は、配列番号９１７（ＤＮＡミスマッチ修復ＨＯＴ  ＥＶＯ２  ＥＡＡＡＫ．Ｇ４Ｓ）に表記されている。各構築物における個々の構成成分のアミノ酸位置の内訳は、表１１７に提示されている。Ｇ４ＳおよびＥＡＡＡＫは、それぞれ可動性リンカーおよび剛性リンカーの包含を指す。
【１１１７】
【表１１７】
2020513737.tif 000163
【１１１８】
（実施例１２）
概念実証：低発現Ｌｍ構築物による免疫の生成
本試験は、Ｌｍ構築物による免疫化後のＣ５７ＢＬ／６マウスにおける、極度に低いまたは検出限界を下回るウエスタンブロット結果を有する構築物に対する免疫応答を評価した。このアッセイは、１０種の異なるＬｍ  ＳＩＩＮＦＥＫＬタグ付き構築物で免疫化したマウスにおけるＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的免疫の生成を検査した。各Ｌｍ構築物は、融合タンパク質のＣ末端にＳＩＩＮＦＥＫＬタグを有した（ｔＬＬＯ＋抗原）。ＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的免疫応答は、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドによる脾細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ刺激およびＥＬＩＳＰＯＴアッセイによるＩＦＮγ陽性細胞の検出によって検出された。免疫化スケジュールおよび系統の詳細は、表１１８および１１９に示されている。
【１１１９】
処置スケジュール
【表１１８】
2020513737.tif 000164
【１１２０】
【表１１９】
2020513737.tif 000165
【１１２１】
ワクチン調製
ワクチン調製は次の通りであった（全てＢＨＩ培地により調製）：（ａ）−８０℃から３７℃ウォーターバス内で１バイアルを解凍し；（ｂ）１４，０００ｒｐｍで２分間スピンし、上清を廃棄し；（ｃ）１ｍＬ  ＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳを廃棄し；（ｄ）適切な最終濃度５×１０８ＣＦＵ／ｍＬとなるように再懸濁した。
【１１２２】
【表１２０】
2020513737.tif 000166
【１１２３】
単離された脾細胞の調製
（１）無菌ピンセットおよびハサミを使用して、実験および対照から脾臓を収集した。完全ＲＰＭＩを含有する１５ｍＬ管を研究室に運んだ。
【１１２４】
（２）無菌ペトリ皿に脾臓を注いだ。
【１１２５】
（３）３ｍＬシリンジのプランジャーの裏を使用してｃＲＰＭＩ中で脾臓を破壊した。
【１１２６】
（４）１もしくは２個の脾臓に対しては培地中の細胞を１５ｍＬ管に、または２個を超える脾臓の場合は５０ｍＬ管に移した。
【１１２７】
（５）１，０００ＲＰＭで５分間ＲＴにて、細胞をペレットにした。
【１１２８】
（６）上清を廃棄し、残っている洗浄緩衝液に細胞を穏やかに再懸濁し、脾臓１個につき２ｍＬのＲＢＣ溶解緩衝液を細胞ペレットに添加した。管をタップすることにより、溶解緩衝液で細胞を穏やかに混合し、１分間待った。
【１１２９】
（７）１０ｍＬのｃ−ＲＰＭＩ培地を細胞懸濁液に直ちに添加して、溶解緩衝液を非活性化した。
【１１３０】
（８）１，０００で５分間、ＲＴにて細胞をスピンした。
【１１３１】
（９）細胞濾過器に細胞を通過させ、これを１０ｍＬ  ｃ−ＲＰＭＩでさらに１回洗浄した。
【１１３２】
（１０）２５ｍＬのｃ−ＲＰＭＩに細胞ペレットを再懸濁した。
【１１３３】
（１１）血球計数器を使用して細胞を計数し、ＰＩ染色によって生存率をチェックした。各脾臓は、１〜２×１０８個の細胞を生じた。
【１１３４】
（１２）ペンタマー染色およびＥＬＩＳｐｏｔのために細胞を分割した。
【１１３５】
ＥＬＩＳＰＯＴプロトコール
使用したＥＬＩＳｐｏｔペプチドは、ペプチド＃１（ＳＩＩＮＦＥＫＬ  −  配列番号１００７）およびペプチド＃２（ＰＳＡ−９  −  無関係ペプチド対照およびバックグラウンド減算）を含んだ。
【１１３６】
１日目に、プレートコーティングのためのＣＴＬイムノスポットプロトコールに従った。
【１１３７】
次に、抗原溶液を次の通りにセットアップした：（ａ）１ｍＭ  ＯＶＡ−８（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）を作製し：ＩＭＤＭへの１０ｍＭ  ＯＶＡ−２１ストックの１：１０希釈、すなわち、５μＬ：４５μＬ；（ｂ）２μＭ抗原溶液を作製し：２μＬ／ｍＬの１ｍＭ溶液を抗原溶液に添加し、ほぼ８μＬの１ｍＭ  ＯＶＡ−８を４ｍＬ抗原溶液に添加し；（ｃ）１ｍＭ  ＰＳＡ−９（無関係ペプチド）を作製し：ＩＭＤＭへの１０ｍＭ  ＰＳＡ−９ストックの１：１０希釈、すなわち、５μＬ：４５μＬ；（ｄ）２μＭ抗原溶液を作製し：２μＬ／ｍＬの１ｍＭ溶液を抗原溶液に添加し、ほぼ８μＬの１ｍＭ  ＰＳＡ−９を４ｍＬ抗原溶液に添加し；（ｅ）１×ＰＭＡ／Ｉｏｎｏを作製し：抗原溶液への１００×ＰＭＡストックの１：１００希釈：ほぼ４μＬを３９６μＬ抗原溶液に希釈し；（ｆ）１００μＬの各抗原溶液を適切なウェルに添加した。
【１１３８】
次の通りに脾細胞を調製した：（ａ）ほぼ２×１０６個の各脾細胞を洗浄した。２×１０６／ｍＬ（ほぼ１ｍＬ  ＣＴＬ培地）の濃度となるようにＣＴＬ検査培地に再懸濁し；（ｂ）１００μＬの各脾細胞を適切なウェルに添加した。
【１１３９】
次に、キット使用説明書の通りにＥＬＩＳＰＯＴプロトコールに従った（すなわち、３７℃で一晩インキュベートした）。
【１１４０】
２日目に、下に示すＥＬＩＳＰＯＴプロトコールに従った。
【１１４１】
０日目（無菌条件）。特異的プロトコールに従って捕捉抗体を希釈することにより捕捉溶液を調製した。多くのサイトカインは、各ウェルに８０μＬの捕捉溶液を添加する前に、７０％エタノールで３０秒間ＰＶＤＦ膜を予め湿らせ、１５０μＬのＰＢＳで３回洗浄することから利益を得る。加湿チャンバー内でプレートを一晩４℃でインキュベートした。
【１１４２】
１日目（無菌条件）。１％新鮮Ｌ−グルタミンを添加することによりＣＴＬ−Ｔｅｓｔ（商標）培地を調製した。ＣＴＬ−Ｔｅｓｔ（商標）培地において２×最終濃度で抗原／マイトジェン溶液を調製した。０日目からコーティング抗体でプレートをデカントし、１５０μＬ  ＰＢＳで１回洗浄した。１００μＬ／ウェルで抗原／マイトジェン溶液を蒔いた。ＰＢＭＣを解凍した後に、または密度勾配により白血球細胞を単離した後に、ＣＴＬ−Ｔｅｓｔ（商標）培地において所望の濃度、例えば、３００，０００細胞／ウェルに対応する３百万個／ｍＬになるようにＰＢＭＣを調整した（しかし、１００，０００〜８００，０００細胞／ウェルは線形結果を達成する筈であるから、細胞数は、予想スポット数に従って調整することができる）。ＰＢＭＣの処理の間、また、これを蒔くまで、加湿インキュベーター、５〜９％ＣＯ２内で３７℃にて細胞を維持した。大オリフィスチップを使用して、１００μＬ／ウェルでＰＢＭＣを蒔いた。完了したら、プレートの側面を穏やかにタップし、３７℃加湿インキュベーター、５〜９％ＣＯ２内に直ちに置いた。使用するサイトカインに応じて２４〜７２時間インキュベートした。プレートはスタックしなかった。インキュベーターのドアを慎重に開け閉めすることにより、プレートの振盪を回避した。インキュベーション中にプレートに触れなかった。
【１１４３】
２日目。当日の洗浄溶液を調製した：ＰＢＳ、蒸留水およびＴｗｅｅｎ−ＰＢＳ。特異的プロトコールに従って検出抗体を希釈することにより、検出溶液を調製した。プレートをＰＢＳで２回、次いで０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで２回、各回２００μＬ／ウェルにて洗浄した。８０μＬ／ウェルの検出溶液を添加した。ＲＴで２時間インキュベートした。特異的プロトコールに従って三次抗体を希釈することにより、三次溶液を調製した。プレートを２００μＬ／ウェルの０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで３回洗浄した。８０μＬ／ウェルのＳｔｒｅｐ−ＡＰ溶液を添加した。ＲＴで３０分間インキュベートした。その特異的プロトコールに従って現像溶液を調製した。プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで２回、次いで蒸留水で２回、各回２００μＬ／ウェルにて洗浄した。８０μＬ／ウェルの現像溶液を添加した。ＲＴで１０〜２０分間インキュベートした。膜を水道水で穏やかにリンスすることにより反応を停止させ、デカントし、これを３回反復した。プレートの保護暗渠を除去し、プレートの裏を水道水でリンスした。プレートを伏せて稼働中のフード内で２時間またはペーパータオル上に２４時間卓上で風乾させた。プレートをスキャンし、計数した。
【１１４４】
結果および結論
現在のところ（２０１７年４月）最低の融合タンパク質発現レベルを有する１０種の構築物を、マウスへの免疫化のために選択した。構築物は、かろうじて検出可能であるか、または一部の場合、ウエスタンブロットによって融合タンパク質発現が「陰性」であるとみなされたであろうが、本出願人らは、融合タンパク質内のＳＩＩＮＦＥＫＬタグを標的とするマウスＴ細胞応答を検出することができた。図２０を参照されたい。図２０において、ＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を検出するために、ＭＨＣ−Ｉ（Ｈ−２  ＫｂＯＶＡ２５７〜２６４）に特異的に結合する最小ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドでｅｘ  ｖｉｖｏ脾細胞を刺激した。その後の検査は、図２０における第１の対照が、真の陰性対照ではないことを明らかにした。むしろ、ＳＩＩＮＦＥＫＬを発現した構築物による混入のため、それは第２の陽性対照であった。しかし、全試料は、陽性Ｔ細胞応答を示した。
【１１４５】
これらのデータは、極度に低レベルの融合タンパク質発現（またはウエスタンブロットではおそらく検出不能）を有するＬｍ構築物が依然として、Ｌｍ構築物による免疫化後にＴ細胞応答を誘発することができることを実証する。加えて、これらのデータは、融合タンパク質発現（低レベルでも）を有するＬｍ構築物が、Ｌｍ構築物による免疫化後にＴ細胞応答を誘発することを実証する。
【１１４６】
（実施例１３）
ｔＬＬＯ融合タンパク質におけるリンカーおよびスペーサーの包含
【１１４７】
本試験は、定義されるリンカー配列を有する隣接抗原性ペプチドが、ｔＬＬＯ−抗原性ペプチド融合タンパク質の発現を改善するか検査した。ｔＬＬＯ−抗原性ペプチド融合タンパク質の分泌を、抗ＦＬＡＧ抗体を使用したウエスタンブロットによって検出した。これらの試験において生成された前臨床データは、定義されるリンカー配列の包含が、ｔＬＬＯ−抗原性ペプチド融合タンパク質の発現および分泌を有意に改善し、はるかにより高い成功率で構築物を生成する能力を徹底的に改善することを実証する。
【１１４８】
複数の２１ｍｅｒ（例えば、ホットスポット突然変異の両側を挟む１０アミノ酸を有するがん関連タンパク質に由来する２１ｍｅｒ）との融合ポリペプチドの設計において、２個の近位２１ｍｅｒの接合部が、Ｌｍ発現および分泌に干渉し得る見込みを最小化するために、特有の２１ｍｅｒの逐次順序をランダムに生成することができる。しかし、ランダムアセンブリ方法は必ずしも、抗ＦＬＡＧウエスタンブロットによって決定される通り、１００％成功率で、ｔＬＬＯ融合タンパク質を発現および分泌する構築物の生成に十分に信頼できるとは限らない可能性がある。「数珠玉構造（beads  on  a  string）」方法を使用して構築物に付加されたさらなる２１ｍｅｒは、２個またはそれよりも多い２１ｍｅｒ配列が、ｔＬＬＯ融合タンパク質の発現および分泌を有意に低下またはさらには排除する仕方で互いに相互作用するオッズを有意に増加させる。
【１１４９】
そこで、本出願人らは、Ｌｍ構築物の発現および分泌の有意な改善に使用される新たなプラスミド設計戦略について記載する。本出願人らは、ランダムアセンブリ設計戦略に伴う限界が、リンカーとして公知の定義されるアミノ酸配列によって特有の２１ｍｅｒを連接することにより有意に軽減され得ることを見出した。スペーサーとしても公知のリンカーは、タンパク質内のドメインを分離するように天然で生成される２〜２５個超の残基に及ぶ短いアミノ酸配列である。特異的な特徴を有するリンカーの多くの異なるクラスが存在する；本出願人らの試験は、剛性、可動性を加える、またはプロテアソーム切断を増強するように設計されたリンカーに焦点を合わせた。下表は、Ｌｍ構築物において評価された適したリンカーについて記載する：
【１１５０】
【表１２１】
2020513737.tif 000167
【１１５１】
この報告に記載されているデータは、剛性、可動性およびプロテアソームリンカーの組合せを有するＬｍ構築物の構築について詳述し、リンカーが存在すると発現および分泌が増強されることを実証する。
【１１５２】
材料と方法
構築物設計。試料構築物を生成するために、２１アミノ酸のウィンドウサイズによるＫｙｔｅ／Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ方法論を使用して、ハイドロパシーのために標的配列をスコアリングし（web.expasy.org/protscale/?_ga=1.215352275.536452039.1486395060）、１．６を超えてまたはこれに等しくスコアリングする全標的配列は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓによって分泌可能である可能性が低いため、使用から除外した。次に、残っている標的配列は全て、ＯＰＴＩＭＩＺＥＲ（genomes.urv.es/OPTIMIZER/）を使用して、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓコドン最適化配列へと逆翻訳した。試料構築物インサートは、２０種の標的配列をコンカテマー化（concatamerize）し、ＦＬＡＧ（ＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＫ（配列番号７６２））ＳＩＩＮＦＥＫＬタグコード配列を３’末端に付加することにより設計して、構築物インサートを生成した。次に、インサート配列全体にわたり２１アミノ酸スライディングウィンドウを使用して、上述の通りハイドロパシーによって１．６のまたはそれを超えるピークを含有しないように、個々のインサート適合性を再確認した。
【１１５３】
ｔＬＬＯ融合ポリペプチド分泌に関するウエスタンブロットスクリーニング。Ｌｍ構築物を含有するプレートに由来する単一コロニーを使用して、３７℃のドライ振盪インキュベーター内で６ｍＬのＢＨＩにおける一晩培養物を接種した。翌日、本来の一晩培養物の１：１０希釈を、９ｍＬの新鮮ＢＨＩに再懸濁し、ＯＤ６００＝０．６に達するまで、３７℃のドライ振盪インキュベーター内で育成した。１３０００ＲＰＭの２分間遠心分離によって細胞をペレットにした。試料上清を収集し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動した。２５μＬの４×ＬＤＳ試料緩衝液（Ｃａｔ＃１６１−０７４７）で７５μＬの試料を希釈することにより試料を調製し、９８℃で１０分間煮沸し、氷上に置き、次いで最大スピードで１０分間、４℃にて遠心分離した。１３μＬの試料を４〜１５％プレキャストタンパク質ゲル（ＢｉｏＲａｄ  Ｃａｔ＃４５６１０８６）で泳動した。Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ  Ｔｕｒｂｏトランスファー装置（Ｃａｔ＃１７０−４１５５）およびＰＶＤＦ  Ｍｉｄｉトランスファーパック（Ｂｉｏ−Ｒａｄ＃１７０−４１５７）を使用して、タンパク質ゲルをトランスファーした。一次として抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ  Ｆ１８０４）または抗ＬＬＯ（Ａｂｃａｍ  ａｂ２００５３８）を、二次抗体としてヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰコンジュゲート（ｓｃ２００５）を用いてブロットをインキュベートした。次に、ブロットをｉＢｉｎｄ  Ｆｌｅｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃａｔ＃１７７２８６６）においてインキュベートし、洗浄し、次いでＳｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｄｕｒａ  Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｄｕｒａｔｉｏｎ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ＃３４０７６）によって現像した；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｉｍａｇｅｒ  ６００（ＧＥ）において画像を現像した。
【１１５４】
結果
マウスｍｃ３８腫瘍細胞系に由来する突然変異を含むペプチドを設計し、ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅの通りにハイドロパシーに関して個々の２１ｍｅｒをスコアリングした。ハイドロパシーフィルターカットオフを通った２１ｍｅｒを、Ｃ末端に付加されたＳＩＩＮＦＥＫＬミニ遺伝子およびＦＬＡＧタグ部分を有する１５個の「数珠玉構造」として逐次（図２１）、または各個々の２１ｍｅｒに隣接するリンカーの様々な並べ替えおよび組合せ（図２１）のいずれかで配置した。これらのＣ末端部分タグの付加は、ｔＬＬＯ融合タンパク質の発現、分泌、プロセシングおよび提示、ならびに免疫原性のモニタリングを可能にする。より長く僅かに荷電したスペーサー（図２１、＊）をｔＬＬＯの直後に使用して、融合タンパク質のＴＡＡカセットならびにＮ末端およびＣ末端の間にさらなる分離をもたらすと共に、ｔＬＬＯ分泌シグナルの正味の正電荷を維持した。隣接リンカー（図２１、＾）を使用して、個々の２１ｍｅｒを分離した。剛性、可動性およびプロテアソーム増強リンカーを生成し、数百種のＬｍ構築物において検査した。最後に、免疫プロテアソームリンカーを３×ＦＬＡＧおよびＳＩＩＮＦＥＫＬの間に配置し、これにより、Ｃ末端ＳＩＩＮＦＥＫＬタグのより効率的なプロテアソームプロセシングが可能になった。免疫プロテアソームリンカーは、免疫プロテアソームの２０Ｓサブユニットによって優先的に切断される、６個のＣ末端に続く６個のＮ末端である１２アミノ酸切断モチーフで構成された。例えば、あらゆる目的のためその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Toesら（２００１年）J.  Exp.  Med.１９４巻（１号）：１〜１２頁を参照されたい。プロテアソーム増強リンカーの包含は、確率的プロテアソームＣ末端切断およびＮ末端分解単独によって予想されるものよりも高い頻度での所望のアミノ酸配列（例えば、ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１００７））の方向付けられた遊離を可能にする（図２１、＃）。
【１１５５】
ｔＬＬＯ融合タンパク質の発現および分泌においてリンカーおよびスペーサーが有する効果を評価するために、本出願人らは、可動性、剛性およびプロテアソーム増強リンカーおよびスペーサーの特有の組合せをそれぞれ有する数百種のＬｍ構築物を生成した。図２２は、発現、分泌およびＬｍ産物生成に関する全体的成功率におけるリンカーの相対的効果を決定するためにウエスタンブロットによってアッセイされた１０種のかかる構築物を描写する。ランダムアセンブリ戦略のみを使用して設計されたＭＴ１５構築物に由来する培養上清（図２２  −  レーン２）は、検出可能（detectible）レベルのｔＬＬＯ融合タンパク質を生じず、最終的にスクリーニングプロセスは失敗した。しかし、本出願人らは、同じランダムにアセンブルされたＭＴ１５構築物（レーン２）により設計された構築物から正しいサイズのｔＬＬＯ融合タンパク質を明らかに検出することができたが、可動性の長いスペーサーおよび可動性のリンカーの包含により（レーン３）；この構築物は、全体的スクリーニングプロセスを通った。全事例において、長いスペーサーの包含は、基礎ＭＴ１５構築物と比較して、検出可能ｔＬＬＯ融合タンパク質のレベルを有意に改善した。さらに、対応する長いスペーサー構築物のそれぞれへの隣接リンカーの付加は、ｔＬＬＯ融合タンパク質発現（データ図示せず）および分泌（例えば、レーン４対レーン５）を有意に増強した。その上、隣接リンカーの付加は、総当たりのランダムアセンブリ設計戦略の必要をなくした。２１ｍｅｒの交互順序付けのみに起因する、分泌されたｔＬＬＯ融合タンパク質のレベルに有意差を有する構築物は、２１ｍｅｒの順序に関係なく、各特有の２１ｍｅｒを分離する隣接リンカーにより設計された場合にｔＬＬＯ融合タンパク質発現または分泌に有意差を示さなかった（データ図示せず）。
【１１５６】
結論として、Ｌｍ構築物にスペーサーおよびリンカーを取り込むことにより、本出願人らは、ｔＬＬＯ融合タンパク質の発現および分泌を有意に改善することができる。その上、Ｌｍ構築物設計へのリンカーおよびスペーサーの取り込みは、完全Ｌｍ構築物（例えば、あらゆる所望のホットスポット突然変異を標的とする）を産生するオッズを増加させるために、複数のランダムにアセンブルされた構築物の生成の必要を有意に低下させる。
【１１５７】
リンカーおよびスペーサーを付加することにより、本出願人らは、ｔＬＬＯ融合タンパク質の発現および分泌、ならびに検出可能レベルのｔＬＬＯ融合タンパク質を分泌する構築物の生成の全体的成功率を有意に増強することができる。リンカーおよびスペーサーにより作製された数百種のＬｍ構築物から、本出願人らは、全事例においてウエスタンブロットによってｔＬＬＯ融合タンパク質を検出することができた。これは、リンカーおよびスペーサーなしで設計された構築物の成功率を超える有意な改善である。本出願人らは、有意に改善されたｔＬＬＯ発現および分泌を生じる有効なリンカーおよびスペーサー組合せを同定したが、本試験において同定されたリンカーは徹底的ではない。まとめると、これらのデータは、Ｌｍプラットフォームへのリンカーおよびスペーサーの付加の実現可能性を実証する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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