(57)【要約】  本発明は、シスチンのシステインへの酵素的還元のための方法であって、（ｉ）活性なグルタチオンレダクターゼ（ＥＣ１．８．１．７）；（ｉｉ）補助因子；および（ｉｉｉ）グルタチオンを含む還元溶液とシスチンを接触させるステップ；ならびにシステインを含む組成物を回収するステップを含み、還元溶液は、シスチンとの接触の間に少なくとも６のｐＨを有する、方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
シスチンのシステインへの酵素的還元のための方法であって、
（ｉ）活性なグルタチオンレダクターゼ（ＥＣ１．８．１．７）；
（ｉｉ）補助因子；および
（ｉｉｉ）グルタチオン；
を含む還元溶液とシスチンを接触させるステップ
ならびにシステインを含む組成物を回収するステップ
を含み、
前記還元溶液は、シスチンとの接触の間に少なくとも６のｐＨを有する、方法。
【請求項２】
前記システインを含む組成物を回収する前記ステップは、前記還元溶液とシスチンを接触させる前記ステップの後の１５時間以内に実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記補助因子は、好ましくは酸化型（ＮＡＤＰ＋）のニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）または好ましくは酸化型（ＮＡＤ＋）のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記グルタチオンレダクターゼは、透過処理された微生物中に含まれる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記グルタチオンレダクターゼは、無細胞抽出物中に含まれる、好ましくは、前記無細胞抽出物は、酵母または真菌細胞の酵素的、機械的、または化学的な破壊、その後、細胞壁から可溶性の画分を分離し、前記無細胞抽出物を提供することによって酵母または真菌から得られる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記還元溶液は、
（ｉｖ）グルコースデヒドロゲナーゼおよびグルコースまたはギ酸デヒドロゲナーゼおよびホルマートを含む補助因子再生成系
をさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記還元溶液中のグルタチオン：シスチンのモル比は、０．１未満である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記還元溶液は、７．０〜８．５の範囲内のｐＨを有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記シスチンは、５０％を超える前記シスチンをシステインに還元するのに十分である期間、前記還元溶液と接触させる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記還元溶液と前記シスチンを接触させるステップは、嫌気的条件下で実行される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記システインを含む組成物は、システインならびにグルコン酸、ギ酸、グルコース、ホルマート、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、グルタチオン、およびグルタチオンレダクターゼから選択される１つ以上のものを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
システインならびにグルコン酸、ギ酸、グルコース、ホルマート、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、グルタチオン、アセトン、アセトアルデヒド、およびグルタチオンレダクターゼから選択される１つ以上のものを含む組成物。
【請求項１３】
天然の食品香料としての請求項１２に記載の組成物の使用。
【請求項１４】
（ｉ）活性なグルタチオンレダクターゼ（ＥＣ１．８．１．７）；
（ｉｉ）補助因子；および
（ｉｉｉ）グルタチオン
を含む還元溶液。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［技術分野］
本発明は、シスチンのシステインへの酵素的還元のための方法に関する。別の態様によれば、本発明は、システインを含む組成物および天然の食品香料としてのその使用に関する。さらに別の態様によれば、本発明は、還元溶液およびその使用に関する。
【０００２】
［発明の背景技術］
主としてＬ−鏡像異性体であるシステインは、食料品、医薬、およびパーソナルケアの産業において前駆物質となる。より大規模な食料品への応用のうちの１つは、香料の産生である。たとえば、メイラード反応におけるシステインの糖との反応により、肉の香料がもたらされる。システインはまた、パン焼き用の加工助剤としても使用され、酸化防止剤として天然果実ジュース製品に追加される。食品添加物として使用される場合、システインは、Ｅ番号Ｅ９２０を有する。医薬としては、システインは、肝機能および色素沈着を改善するために適用される。臨床栄養学では、システインは、酸化防止剤としてアミノ酸注入液に追加される。パーソナルケアの分野では、システインは、パーマへの応用に使用され（主にアジアにおいて）、システインは、毛のケラチン中のジスルフィド結合を切断するために使用される。
【０００３】
システインおよびＬ−システインは、同じ分子を指しており、両方の用語は、区別なく使用することができる。同様に、シスチンおよびＬ−シスチンは、区別なく使用することができる。ＣｙｓまたはＣと略されるシステインは、セミ必須アミノ酸であり、ヒトがメチオニンからシステインを合成することができることを意味するが、乳児、高齢者、および疾患などのようないくつかの場合では、ブロッコリー、ニンニク、タマネギ、および肉などのような食事からシステインを得る必要がある。システインのチオール基は、構造の安定化だけでなく、より重要なことには、分子の反応性の部分として重要な役割を果たす。チオール側鎖は、酵素反応に参加することが多く、プロテアーゼおよびアシルトランスフェラーゼでのように求核剤として作用する。チオールは、酸化に対して感受性であり、ジスルフィド架橋をもたらし、これは、多くのタンパク質において重要な構造的な役割を果たす。他の考え得る翻訳後修飾は、スルフェネーション（ｓｕｌｐｈｅｎａｔｉｏｎ）（ＳＯＨ）、スルフィネーション（ｓｕｌｐｈｉｎａｔｉｏｎ）（ＳＯ２Ｈ）、ニトロシル化（ＳＮＯ）、グルタチオン付加であり、これは、細胞のレドックス状態に応答性の調節スイッチとして作用する。
【０００４】
システインは、従来より、化学的加水分解を介して動物の毛から得られてきた。しかしながら、保護のための動物の毛の使用の回避、低い生産性、および環境汚染についての懸念などのような重大な問題が存在する。そのため、システインの産生のための環境にやさしい方法に対して強い要求があった。より最近では、システインを産生する方法は、組換え微生物を使用する発酵を含む。１つの知られている方法は、１リットル当たり＞２０グラムのシステインを産生する組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の使用である。しかしながら、問題は、溶液において、システインの酸化により、すぐにジスルフィドシスチンがもたらされ、これは、還元する必要があることである。
【０００５】
システインの産生のための従来の方法は、シスチンの電気化学的還元を使用する電気化学的方法である。電気分解を使用する欠点は、電気分解がシステインの化学的性質を意図的に修飾する物理的なプロセスであるので、提供されるシステインを、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｎ  Ｆｌａｖｏｕｒｉｎｇｓにおいて意図されるものほど天然のものとして分類することができないことである。
【０００６】
国際公開第２０１１／０３９１５６号パンフレットは、システインを用いる酵母を産生するプロセスを開示する。下記の実施例４および５において示されるように酵母のグルタチオンレダクターゼ酵素は５１℃および５．９のｐＨで不活性であるので、この実施例は、シスチンの非酵素的還元を示す。そのうえ、クリーム状の酵母の使用によって、反応に追加されるグルタチオンの量は、シスチンのシステインへの還元を駆動するのに十分である。国際公開第２０１１／０３９１５６号パンフレットにおいて開示される方法の欠点は、プロセスが長時間を必要とし、システイン収量が少ないことである。
【０００７】
上記のことを考慮すれば、得られたシステインを天然のものとして分類することができる、シスチンのシステインへの還元のための方法の必要性が当技術分野においてある。
【０００８】
［発明を実施するための形態］
そのため、本発明の目的は、還元が、改善された条件で行われる方法を提供することである。本発明の別の目的は、エネルギー量の低下を必要とする還元を伴う方法を提供することである。本発明のさらなる目的は、酵素および／または媒介物質などのような出発物質の用量を低下させてもよく、同時に、還元システインの出力が同じレベルに維持されるまたはさらに増加する方法を提供することである。本発明のさらなる目的は、シスチンからシステインへの還元が完全である還元を伴う方法を提供することである。さらに別の目的は、形成されたシステインが天然のフレーバリング成分として適している、シスチンの還元のための方法を提供することである。
【０００９】
他の目的の中でも上記の目的は、本発明によって解決される。詳細には、他の目的の中でも上記の目的は、シスチンのシステインへの酵素的還元のための方法であって、
（ｉ）活性なグルタチオンレダクターゼ（ＥＣ１．８．１．７）；
（ｉｉ）補助因子；および
（ｉｉｉ）グルタチオン；
を含む還元溶液とシスチンを接触させるステップ
ならびにシステインを含む組成物を回収するステップ
を含み、
還元溶液は、シスチンとの接触の間に少なくとも６のｐＨを有する、方法を提供することによって解決される。
【００１０】
驚いたことに、本発明者らは、本発明の方法を使用することによってシスチンのシステインへの完全な還元を得ることができることを見出した。シスチンの非酵素的還元は一般に酸化シスチンおよび還元システインの間の平衡状態をもたらし、還元剤を過剰に追加した場合、完全な還元をもたらすが、本発明の酵素的還元は、媒介物質および／または補助因子を過剰に追加することなく、反応を１００％のシステインに向けることができることがわかった。したがって、好ましい実施形態では、本発明は、シスチンの１００％が還元される、シスチンのシステインへの酵素的還元のための方法である。有利には、細菌および酵母などのような微生物または単離された酵素による酵素的プロセスが天然の着香成分の産生について許容されるので、本発明の方法において回収されるシステインは、天然のシステインとして適している。
【００１１】
酵素的還元は、本発明との関係で使用されるように、シスチンが、活性なグルタチオンレダクターゼ（ＥＣ１．８．１．７）の存在下においてグルタチオンとシスチンを接触させることによってシステインに還元され、活性なグルタチオンレダクターゼ（ＥＣ１．８．１．７）は、グルタチオンの酸化の後にグルタチオンを還元することを意味することが意図される。
【００１２】
活性なグルタチオンレダクターゼ（ＥＣ１．８．１．７）は、本発明との関係で使用されるように、酵素がグルタチオンを還元するその機能において活性であることを意味する。好ましくは、グルタチオンレダクターゼは、還元溶液とシスチンを接触させるステップの間、活性なままである。より好ましくは、グルタチオンレダクターゼは、還元溶液とシスチンを接触させる全ステップの間、活性なままである。
【００１３】
補助因子は、本発明との関係で使用されるように、チオール還元酵素を支援するヘルパー分子を意味することが意図される。好ましくは、補助因子は、補酵素である。補助因子の適した例は、還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨとも略される）もしくは還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート（ＮＡＤＰＨとも略される）またはフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤＨ２とも略される）である。
【００１４】
システインの回収は、本発明との関係で使用されるように、還元溶液からシステインを回収することを意味する。システインは、当技術分野において知られている技術によって還元溶液から回収されてもよい。システインの回収に使用することができる技術の適した例は、膜、結晶化、クロマトグラフィー、およびその組み合わせの使用を含んでいてもよい。
【００１５】
好ましい実施形態では、システインを含む組成物を回収する本発明のステップは、還元溶液とシスチンを接触させるステップの後の１５時間以内に実行される。より好ましくは、システインを含む組成物を回収する本発明のステップは、還元溶液とシスチンを接触させるステップの後の１２時間以内に、より好ましくは９時間以内に、最も好ましくは６時間またはさらに３時間以内に実行される。より好ましくは、システインを含む組成物を回収する本発明のステップは、還元溶液とシスチンを接触させるステップの後の０．５時間後に実行される。
【００１６】
本発明のシスチンは、シスチンの産生のための当技術分野において知られている方法によって提供されてもよい。たとえば、本発明のシスチンは、発酵および生体触媒によって提供されてもよい。発酵は、組換え微生物を使用して実行されてもよい。生体触媒は、組換え微生物由来の酵素を使用することによって実行されてもよい。本発明のシスチンはまた、純粋なまたは希釈された形態をしたシスチンおよびシステインの混合物として提供されてもよい。
【００１７】
好ましい実施形態では、本発明のグルタチオンは、好ましくは５％、１０％、２０％、またはさらに５０％を超えるなどのように、組成物の乾燥重量で１％を超える（ｗｔ）、好ましくは２％（ｗｔ）を超えるグルタチオンを含む組成物で本発明の還元溶液に追加される。より好ましくは、本発明のグルタチオンは、精製されたまたは単離された形態をしている、すなわち、９０％（ｗｔ）を超えるグルタチオンまたは９５％（ｗｔ）を超えるグルタチオンを含む組成物中にある。これがシステインを回収するための下流の処理を簡単にするので、精製された形態をしているグルタチオンを使用することは有利である。精製された形態またはその代わりに単離された形態をしている媒介物質は、グルタチオンが、たとえば、微生物または無細胞抽出物中の化合物として存在することなく、存在するおよび／または個々の薬剤として本発明の還元溶液に追加されることを意味する。
【００１８】
本発明のグルタチオンは、酸化型（ＧＳＳＧとも略される）であっても、還元形（ＧＳＨとも略される）であってもよい。グルタチオンは、グルタチオンレダクターゼに適した媒介物質である。本発明者らは、グルタチオンレダクターゼを含む還元溶液へのグルタチオンの別々の追加が、シスチンのシステインへの還元の増加またはさらに完全な還元をもたらすことを見出した。さらに、本発明者らは、ＧＳＳＧの酵素的還元が、ＧＳＨを提供するための効率的な方法であり、シスチンの完全な還元に寄与することを見出した。さらに、ＧＳＨが高価であるので、ＧＳＳＧの酵素的還元は、生産コストを低下させることによって改善された方法を提供する。
【００１９】
還元溶液中のグルタチオン：シスチンのモル比は、好ましくは１未満である。好ましくは、グルタチオン：シスチンのモル比は、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１、０．０５未満、または０．０１未満である。より好ましくは、グルタチオン：シスチンのモル比は、０．０２および０．６の間などのように０．０１および０．７の間にある。好ましくは、シスチンに対するグルタチオンの本発明のモル比は、還元溶液中に存在するシスチンに対するグルタチオンのモル比である。シスチンに対するグルタチオンの比は、還元溶液中に存在するグルタチオンのモル量を還元溶液中に存在するシスチンのモル量によって割ることによって計算することができる。本発明者らは、還元溶液へのグルタチオンの追加が、シスチンのシステインへの還元の増加をもたらすことを見出した。シスチンよりも少ない量のグルタチオンなどのように少ない量のグルタチオンが、シスチンのシステインへの高い還元をもたらすことは驚くべきことである。これがシステインを提供するための下流の処理を簡単にするので、より少ない量のグルタチオンを使用することは有利である。
【００２０】
好ましい実施形態では、本発明のグルタチオンレダクターゼは、精製されたまたは単離された形態で追加される。これがシステインを回収するための下流の処理を簡単にするので、精製された形態をしているグルタチオンレダクターゼを使用することは有利である。その代わりに、グルタチオンレダクターゼ酵素は、支持体に固定される。
【００２１】
別の好ましい実施形態では、本発明のグルタチオンレダクターゼは、微生物中に含まれる。より好ましい実施形態では、本発明のグルタチオンレダクターゼは、透過処理された微生物中に含まれる。より好ましくは、本発明のグルタチオンレダクターゼは、微生物に由来する無細胞抽出物中に含まれる。無細胞抽出物は、細胞を破壊して開けた後に得られる細胞の可溶性の分子を含む。好ましくは、本発明の無細胞抽出物は、細胞壁を含まない。好ましくは、本発明の無細胞抽出物は、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、または酵母などのような真菌に由来する。より好ましくは、無細胞抽出物は、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）またはサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クリベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、もしくはカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する酵母の株に由来する。最も好ましくは、無細胞抽出物は、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に由来する。適した細菌微生物の属の例は、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）属、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、ならびにメタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属およびメタノサルシーナ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ）属などのような古細菌（Ａｒｃｈａｅａ）である。無細胞抽出物の使用は、たとえば酵素産生のためのパン酵母または真菌もしくは細菌による発酵の既存の大規模生産能力を無細胞抽出物の提供に効率的に使用することができるので、有利である。さらに、グルタチオンレダクターゼを提供するための無細胞抽出物の使用は、費用のかかる精製されたグルタチオンレダクターゼを使用する必要性をなくす。無細胞抽出物を使用するという別の利点は、無細胞抽出物が、本発明の還元溶液において（天然の）媒介物質として機能する量のグルタチオンおよび／またはチオレドキシン（または他の類似する分子）を含有してもよいことである。無細胞抽出物の内因性の媒介物質の使用は、シスチンの還元のための、コストおよび材料の効率がよい方法を提供する。
【００２２】
より好ましくは、無細胞抽出物は、酵母細胞の酵素的、機械的、化学的、または物理的な破壊、その後、細胞壁から可溶性の画分を分離し、無細胞抽出物を提供することによって酵母から得られる。無細胞抽出物は、好ましくは、均質化技術によって得られる。均質化技術は、砂および／またはガラスビーズなどのような粒子と共に混合することまたは粉砕することを含んでいてもよい。還元が、酵母細胞レドックス系全体から恩恵を受け得るので、酵母に由来する無細胞抽出物を使用することが有利であることがわかった。好ましい実施形態では、透過処理された細胞は、限定されないが、凍結および解凍サイクル、自己消化、ＤＭＳＯ処理、エタノールまたはトルエン処理などのような当技術分野において知られている方法によって細胞から得られる。好ましくは、無細胞抽出物は、加熱するステップを伴うことなく得られる。より好ましくは、無細胞抽出物は、グルタチオンレダクターゼを不活性化する温度で加熱するステップを伴うことなく得られる。グルタチオンレダクターゼを不活性化する温度の例は、４０℃を上回る、４５℃を上回る、５０℃を上回る、またはさらに５５℃を上回る温度である。
【００２３】
好ましい実施形態では、本発明の還元溶液は、（ｉｖ）補助因子再生成系をさらに含む。還元の過程の間に補助因子を追加するための特別なステップが必要とされないので、補助因子再生成系の使用は、シスチンの酵素的還元のプロセスの改善を提供する。さらに、シスチンのシステインへの還元をもたらすために必要とされる補助因子の量がより少なくなるので、補助因子を再生成することはコスト効率がよい。好ましくは、補助因子再生成系は、酵素および対応する基質を含む。好ましくは、補助因子再生成系は、グルコースデヒドロゲナーゼおよびグルコースならびに／またはギ酸デヒドロゲナーゼおよびギ酸を含む。ギ酸デヒドロゲナーゼは、ＮＡＤＨの再生成に特に適していることがわかっており、グルコースデヒドロゲナーゼは、ＮＡＤＰＨおよびＮＡＤＨの両方の再生成に適している。本発明の補助因子再生成系における代わりとなる酵素は、アルコールデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤＰ依存性ギ酸デヒドロゲナーゼ、グルコース６‐リン酸デヒドロゲナーゼ、Ｈ２駆動型のＮＡＤ（Ｐ）＋還元ヒドロゲナーゼ、またはホスフィットデヒドロゲナーゼ（ｐｈｏｓｐｈｉｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）である。アルコールデヒドロゲナーゼおよびアルコール、より好ましくは、イソプロパノールとアルコールデヒドロゲナーゼまたはエタノールとアルコールデヒドロゲナーゼを含む補助因子再生成系が、特に好ましい。基質としてのアルコールと共にアルコールデヒドロゲナーゼを使用する利点は、イソプロパノールを使用した後のアセトンおよびエタノールを使用した後のアセトアルデヒドなどのような、アルコールデヒドロゲナーゼによって形成される生成物が、揮発性であり、そのため、それらを、本発明の還元溶液および／またはシステインを含む溶液から容易に取り出すことができることである。
【００２４】
好ましい実施形態では、本発明の還元溶液の温度は、好ましくは還元溶液とシスチンを接触させる間、２℃〜９０℃の範囲内にある。好ましくは、温度は、１０℃〜６０℃の範囲内にある。より好ましくは、還元溶液の温度は、１５℃〜５０℃の範囲内にある。最も好ましくは、還元溶液の温度は、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃  ３６℃、３７℃、３８℃、または３９℃などのように１５℃〜４０℃℃の範囲内にある。
【００２５】
好ましい実施形態では、本発明の還元溶液のｐＨは、好ましくは還元溶液とシスチンを接触させる間、ｐＨ６〜１０の範囲内のｐＨを有する。好ましくは、ｐＨは、６．５〜９の範囲内にある。より好ましくは、還元溶液のｐＨは、６．５〜８．５またはｐＨ７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、および８．４などのように７．０〜８．５の範囲内にある。本発明者らは、６〜８．５の範囲内のｐＨを使用すると、シスチンの還元の増加が得られることを見出した。７〜８．５の範囲内のｐＨで、さらに高いまたはさらに完全なシスチンの還元が得られることは驚くべきことである。
【００２６】
本発明のさらに好ましい実施形態では、本発明の還元溶液に追加される本発明の補助因子は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ＋）または酸化ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）などのように酸化型をしている。本発明者らは、本発明の方法において、酸化型をした補助因子を使用することによってシスチンの還元を得ることができることを見出した。酸化型をした補助因子はすぐに利用可能で、したがってコスト効率がよいので、酸化型をした補助因子の使用は、改善された方法を提供する。補助因子再生成系が本発明の還元溶液中に存在する場合、酸化型をした補助因子が補助因子再生成系によって還元されるので、酸化型をした補助因子の使用は、補助因子を還元するためのさらなるステップをあらかじめ回避する。フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤＨ２）依存性酵素系が使用される場合、酸化フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ＋）を本発明の還元溶液に追加することができる。
【００２７】
本発明の方法の好ましい実施形態では、本発明のシスチンは、５０％を超える、好ましくは６０％を超える、より好ましくは７０％を超える、さらにより好ましくは８０％を超える、最も好ましくは９０％を超える、または９９％もしくはさらに１００％のシスチンをシステインに還元するのに十分である期間、還元溶液と接触させる。好ましくは、期間は、４８時間未満、より好ましくは２４時間未満、さらにより好ましくは１２時間未満、最も好ましくは６時間未満または３時間未満である。１〜３または１．５〜２．５時間の期間がより好ましい。本発明者らは、本発明の方法が、方法が工業規模で実行された場合でさえ、シスチンの還元のための時間効率がよい方法であることを見出した。したがって、本発明は、シスチンの還元のための改善された条件を提供する。
【００２８】
好ましい実施形態では、還元溶液とシスチンを接触させることは、システインのシスチンへの再酸化を低下させるまたは妨げるために低好気的（ｌｏｗ  ａｅｒｏｂｉｃ）またはさらにより好ましくは嫌気的条件下で実行される。そのため、嫌気的条件を使用するという利点は、本発明の還元溶液中のシステインの量が増加することである。
【００２９】
好ましい実施形態では、本発明の方法は、工業規模で実行される。本発明の説明の全体にわたって、工業規模の方法または工業プロセスは、≧１０Ｌ、好ましくは≧１００Ｌ、より好ましくは≧１ｍ３、≧５ｍ３、さらにより好ましくは≧１０ｍ３、最も好ましくは≧２５ｍ３、好ましくは２５０ｍ３未満の体積規模を有する還元溶液を使用する方法を包含することが理解されてもよい。
【００３０】
別の好ましい実施形態では、本発明の還元は、含有される、システインのシスチンへの再酸化を触媒することができる化合物が少ない、すなわち５％未満（ｗｔ）もしくは１％未満（ｗｔ）であるまたは含有されない。電子を「奪う」傾向を有する、そのような化合物の例は、第二鉄、硝酸、第二銅イオンである。利点は、本発明の還元溶液におけるシステインの量の増加である。
【００３１】
さらに別の好ましい実施形態では、本発明の還元溶液は、水溶液である。好ましくは、還元溶液または水溶液は、バッファーを含む。好ましくは、バッファーは、リン酸ナトリウムバッファーである。その代わりに、バッファーは、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンバッファー（もしくはトリスＨＣｌバッファー）または２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸バッファー（ＭＥＳバッファーと略される）である。
【００３２】
好ましい実施形態では、本発明の方法において回収される本発明のシステインを含む組成物は、システインおよび還元溶液とシスチンを接触させる間に還元溶液中に存在した１つ以上の化合物を含む。好ましくは、本発明の方法において回収される本発明のシステインを含む組成物は、システインならびにグルコン酸、グルコナート、ギ酸、グルコース、ホルマート、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、グルタチオン、アセトン、アセトアルデヒド、およびグルタチオンレダクターゼから選択される１つ以上のものを含む。本発明の還元溶液は、グルタチオン、補助因子、およびチオール還元酵素などのようないくつかの成分を含む。システインを含む組成物の本発明の回収は、還元溶液中に存在する１つ以上の成分を含んでいてもよい。
【００３３】
本発明の方法が、天然のものとして有益に適し得るシステインを提供することを考慮すれば、本発明は、別の態様によれば、システインまたはＬ−システインならびにグルコン酸、グルコナート、ギ酸、グルコース、ホルマート、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、グルタチオン（ＧＳＨまたはＧＳＳＧ）、およびグルタチオンレダクターゼから選択される１つ以上のものを含む組成物に関する。好ましくは、本発明の組成物は、シスチンのシステインへの酵素的還元のための本発明の方法によって入手可能である。より好ましくは、本発明の組成物は、本発明の方法によって得られる。
【００３４】
好ましくは、本発明の方法において回収される本発明の組成物または本発明のシステインを含む組成物は、システインならびに／または少なくとも１ｐｐｍ、少なくとも１０ｐｐｍ、もしくは少なくとも１００ｐｐｍのグルコン酸、グルコナート、ギ酸、グルコース、ホルマート、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、グルタチオン  アセトン、アセトアルデヒド、グルタチオン（ＧＳＨもしくはＧＳＳＧ）、およびグルタチオンレダクターゼから選択される１つ以上のものを含む。
【００３５】
好ましくは、本発明の方法において回収される本発明の組成物または本発明のシステインを含む組成物は、システインならびに／または少なくとも１ｐｐｂ、少なくとも１０ｐｐｂ、もしくは少なくとも１００ｐｐｂのグルコン酸、グルコナート、ギ酸、グルコース、ホルマート、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、グルタチオン、アセトン、アセトアルデヒド、グルタチオン（ＧＳＨもしくはＧＳＳＧ）、およびグルタチオンレダクターゼから選択される１つ以上のものを含む。
【００３６】
より好ましくは、本発明の方法において回収される本発明の組成物または本発明のシステインを含む組成物は、システインならびに多くとも１ｐｐｍ、多くとも１０ｐｐｍ、または多くとも１００ｐｐｍのグルコン酸、グルコナート、ギ酸、グルコース、ホルマート、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、グルタチオン、アセトン、アセトアルデヒド、グルタチオン（ＧＳＨまたはＧＳＳＧ）、およびグルタチオンレダクターゼから選択される１つ以上のものを含む。
【００３７】
より好ましくは、本発明の方法において回収される本発明の組成物または本発明のシステインを含む組成物は、システインならびに多くとも１ｐｐｂ、多くとも１０ｐｐｂ、または多くとも１００ｐｐｂのグルコン酸、グルコナート、ギ酸、グルコース、ホルマート、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、グルタチオン、アセトン、アセトアルデヒド、グルタチオン（ＧＳＨまたはＧＳＳＧ）、およびグルタチオンレダクターゼから選択される１つ以上のものを含む。
【００３８】
最も好ましくは、本発明の方法において回収される本発明の組成物または本発明のシステインを含む組成物は、システインおよびグルコン酸、システインおよびギ酸、またはシステインおよびグルタチオン（ＧＳＨもしくはＧＳＳＧ）を含む。
【００３９】
本発明の組成物の利点は、本発明の組成物が、システインの本発明の酵素的還元によって得られ、したがって天然のシステインと見なされるシステインを実質的に含むことである。そのため、本発明の組成物は、有利には、食料品の産生のためのまたは食品香料の産生のための天然の食品香料としてまたは天然の成分として使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１は、様々なグルタチオン濃度および補助因子としてＮＡＤＨを用いるいくつかの反応設定における還元Ｌ−シスチンのパーセンテージを示す図である。
【図２】図２は、様々なグルタチオン濃度および補助因子としてＮＡＤＰＨを用いるいくつかの反応設定における還元Ｌ−シスチンのパーセンテージを示す図である。
【図３】図３は、酵母グルタチオンレダクターゼについてのｐＨ活性曲線を示す図である。活性は、様々な酸性度でのＮＡＤＰＨのバックグラウンド変換に対して補正し、ｐＨ５および１０の間で観察される最も高い活性を基準として示す。
【図４】図４は、様々なプロセス条件下で酵母ＧＲを使用する時間毎のシステインの形成を示す図である。
【図５】図５は、５５℃でのインキュベーション前および後のグルタチオンレダクターゼ活性を示す図である。
【００４１】
［材料および方法］
［１．材料］
以下の材料を実施例において使用した。
Ｌ−シスチン、Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃ７６０２−２５Ｇ
パン酵母（Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））由来のグルタチオンレダクターゼ、Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ、Ｇ３６６４−２．５ＫＵ
還元Ｌ−グルタチオン、Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ、Ｇ４２５１−１００Ｇ
酸化Ｌ−グルタチオン、Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ、Ｇ４３７６−１０Ｇ
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）由来のチオレドキシンレダクターゼ、Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ、Ｔ７９１５−２５０ＵＧ
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）由来のチオレドキシン、Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ、Ｔ−０９１０−１ＭＧ
Ｂ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、還元テトラ（シクロヘキシルアンモニウム）塩、Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ、Ｎ５１３０−２５ＭＧ
Ｂ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元ジナトリウム塩水和物、Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ、Ｎ８１２９−５０ＭＧ
Ｂ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸水和物、Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ、Ｎ５７５５−１１０ＭＧ
Ｂ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド水和物、Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ、Ｎ１６３６−１００ＭＧ
シュードモナス種由来のグルコースデヒドロゲナーゼ、Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ、１９３５９−１０ＭＧ−Ｆ
カンジダ・ボイディニ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ）由来のギ酸デヒドロゲナーゼ、Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ、Ｆ８６４９−５０ＵＮ
Ｄ（＋）−グルコース、無水、Ｍｅｒｃｋ、ＣＡＳ  ５０−９９−７、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ
ギ酸ナトリウム、Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ、７１５３９−５００Ｇ
リン酸水素二ナトリウム二水和物、Ｍｅｒｃｋ、ＣＡＳ番号１００２８−２４−７
リン酸二水素ナトリウム一水和物、Ｍｅｒｃｋ、ＣＡＳ番号１００４９−２１−５
【００４２】
［２．反応］
本発明の実施例の反応は、リン酸ナトリウムバッファーである還元溶液中で実行する。最初に、飽和Ｌ−シスチン溶液を、リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０またはｐＨ８．０）中＞５００ｍｇ／ＬのＬ−シスチンを室温で１時間撹拌することによって作製した。さらに、チオール還元酵素、媒介物質、補助因子、および補助因子再生成系などのようなさらなる任意選択の成分を追加した。反応を２時間室温（２０〜２５℃）で実行した。反応は、５０％  ＮａＯＨと共に、６．４のｐＨを有する、４０ｇ／ｌリンゴ酸、１００ｍｇ／ｌ  １．１−ジフルオロ−１−トリメチルシラニルメチルホスホン酸（ＦＳＰ）を含む酸化ジュウテリウム溶液を追加し、１時間、インキュベーションすることによって停止させた。
【００４３】
［３．ＮＭＲ分析］
Ｌ−システインを含む、得られた還元溶液を、Ｌ−シスチンおよび遊離チオール基についてＮＭＲによって分析した。サンプルは、ヘリウム冷却クリオプローブを備えた７００ＭＨｚスペクトロメーターの３ｍｍ  ＮＭＲチューブ中で測定した。ＮＯＥＳＹＧＰＰＲ１ｄ．ＣＯＭＰウォーターサプレッションを適用した。３２回のスキャンを１．２秒間の遅延時間により取得した。構成成分は、０ｐｐｍでのＦＳＰのピーク面積を基準としたピークの積分によって定量化した。
Ｄ  ５．０４ｐｐｍ：グルコース
Ｄｄ  ３．１８ｐｐｍ：シスチン
Ｄｄ  ３．０９ｐｐｍ：ＧＳＳＧ
Ｍ  ２．２４ｐｐｍ：全ＳＨ
【００４４】
［４．シスチン還元％］
シスチンの還元パーセンテージ（％）は、反応の開始時のシスチンの量から反応の終了時のシスチンの量を引き、１００を掛けた、反応の開始時のシスチンの量でこの数を割ることによって計算した。
【００４５】
［実施例］
［実施例１］
［媒介物質：Ｌ−シスチンの比］
１７５μｌ  Ｌ−シスチン溶液（ｐＨ８．０）を９６ウェルプレートにピペッティングした。５μｌの以下のものを追加し、２００μｌの最終反応体積にした：グルタチオンレダクターゼ（１７Ｕ／ｍｌ）；ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ（１．０および０．２８ｍＭ）；グルコースデヒドロゲナーゼ（３．４Ｕ／ｍｌ）およびＤ−グルコース（２ｍＭ）；適用可能な場合、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（商標）水。最後に、５μｌの様々なグルタチオン濃度のものを追加し（図１および２を参照）、２００μｌの最終反応体積にした。反応液中の最終Ｌ−シスチン濃度は、０．８５ｍＭ最終反応液であった。反応は、材料および方法において記載されるように実行し、Ｌ−シスチンおよび遊離チオール基は、ＮＭＲによって分析した。
【００４６】
図１は、様々なグルタチオン濃度と還元Ｌ−システインのパーセンテージを示す。詳細には、図１は、ＧＳＨおよびＮＡＤＨのみを有する第１のシリーズにおける非酵素的還元が、Ｌ−シスチンよりもはるかに多くのＧＳＨが存在する場合のみ、９０％を上回る還元をもたらすことを示す。驚いたことに、グルタチオンレダクターゼの追加の後、還元の増加は、ＧＳＨ：Ｌ−シスチンのより低い比で得られる。
【００４７】
さらに、図１は、グルコースデヒドロゲナーゼおよびＤ−グルコースのような補助因子再生成系が存在すると、９０％を上回る還元をもたらすのに、さらに少ない量の媒介物質しか必要とされず、驚いたことにＧＳＨ：Ｌ−シスチンの比をかなり低下させることができることを示す。さらに、補助因子再生成系の追加は、補助因子再生成系なしのものと比較して、はるかに低い補助因子ＮＡＤＨ濃度で９０％を上回る還元でシスチンを還元することができる（０．２８ｍＭ  ＮＡＤＨが、過剰量の１．０ｍＭ  ＮＡＤＨと同様のＬ−システインへの還元をもたらすので）。
【００４８】
図１と類似して、図２は、９０％よりも高いＬ−シスチンのＬ−システインへの還元が、たとえグルタチオン：Ｌ−シスチンの比が１未満であっても、補助因子としてのＮＡＤＰＨにより得ることができることを開示する。ここで、補助因子再生成系の追加は、補助因子再生成系なしのものと比較して、はるかに低い補助因子ＮＡＤＰＨ濃度でだけでなく、９０％を上回る還元でシスチンを還元することができ（０．２８ｍＭ  ＮＡＤＰＨが、過剰量の１．０ｍＭ  ＮＡＤＰＨと同様のＬ−システインへの還元をもたらすので）、それはまた、驚いたことに、ＧＳＨ：Ｌ−シスチンの比のさらなる低下をも可能にする。
【００４９】
結論づけると、図１および図２は、Ｌ−シスチンの還元についての方法の改善を提供する本発明の実現可能性を開示する。
【００５０】
［実施例２］
［無細胞抽出物（ＣＦＥと略される）を使用する還元］
［ＣＦＥの調製］
酵母（サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））および真菌（ペニシリウム・クリゾゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ））細胞培養物をＭｉｌｌｉ−Ｑ（商標）水により洗浄し、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬバッファー（ｐＨ７．５）中で懸濁し、氷上で保存した。細胞は、０．５ｇの０．４５〜０．５ｍｍガラスビーズを含有する２．０ｍｌのバイアルに移し、合間に氷上で冷却しながらＰｒｅｃｅｌｌｙｓホモジナイザーで４０秒間、５０００ｒｐｍで、３回、十分に振盪させた。抽出物を２回遠心分離し、それぞれの遠心分離ステップの後に新鮮なチューブに上清を移した。無細胞抽出物（ＣＦＥ）の総タンパク質含有量は、Ｂｉｕｒｅｔ  Ｍｅｔｈｏｄによって決定した。サンプルは、さらなる使用まで−２０℃で保存した。
【００５１】
［アッセイ：］
１８５μｌ  Ｌ−シスチン溶液（ｐＨ６．０または８．０）を９６ウェルプレートにピペッティングした。５μｌの以下のものを追加し、２００μｌの最終反応体積にした：酵母（１ｍｇ／ｍｌ）または真菌（０．５ｍｇ／ｍｌ）ＣＦＥ；媒介物質Ｌ−グルタチオン（１００μｇ／ｍｌ）；ＮＡＤＨ（７００μｇ／ｍｌ）またはＮＡＤＰＨ（８００μｇ／ｍｌ）；適用可能な場合、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（商標）水。Ｌ−シスチン濃度は、最終反応液中、ｐＨ６．０で０．６３ｍＭおよびｐＨ８．０で０．７８ｍＭであった。反応（表２を参照）は、材料および方法において記載されるように実行し、Ｌ−シスチンおよび遊離チオール基は、ＮＭＲによって分析した。
【００５２】
【表１】
2020513734.tif 000002
【００５３】
表２は、ｐＨ８で、Ｌ−シスチンの還元が増加することを明らかに示す。さらに、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびペニシリウム  ｃｈｒ．（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒ．）のＣＦＥが、Ｌ−シスチンの還元をもたらすことができることは表２から明らかである。
【００５４】
［実施例３］
［補助因子再生成］
１７５μｌ  Ｌ−シスチン（ｐＨ８．０）を９６ウェルプレートにピペッティングした。５μｌの以下のものを追加し、２００μｌの最終反応体積にした：グルタチオンレダクターゼ（１７Ｕ／ｍｌ）または酵母ＣＦＥ（１ｍｇ／ｍｌ）；媒介物質Ｌ−グルタチオン（１００μｇ／ｍｌ）；ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ（２００および３５０μｇ／ｍｌ）；グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）またはギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）（ともに３．４Ｕ／ｍｌ）；Ｄ−グルコースまたはギ酸ナトリウム（ともに１ｍＭ）；適用可能な場合、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（商標）水。Ｌ−シスチン濃度は、それぞれ、精製酵素およびＣＦＥ反応液中０．８０ｍＭおよび０．５２ｍＭであった。反応（表３を参照）は、材料および方法において記載されるように実行し、Ｌ−シスチンおよび遊離チオール基は、ＮＭＲによって分析した。
【００５５】
【表２】
2020513734.tif 000003
【００５６】
表３は、補助因子再生成系を使用することによって、シスチンの還元が得られ、限られた量の補助因子ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨしか使用されない（２００および３５０μｇ／ｍｌであるのに対して、実施例１および３では、７００および８００μｇ／ｍｌがそれぞれ使用される）ことを明らかに示す。さらに、表３は、補助因子再生成と組み合わせて無細胞抽出物を使用することによって、シスチンの１００％の還元が得られることを示す。
【００５７】
［実施例４］
［酸化補助因子］
１７５μｌ  Ｌ−シスチン溶液（ｐＨ８．０）を９６ウェルプレートにピペッティングした。５μｌの以下のものを追加し、２００μｌの最終反応体積にした：グルタチオンレダクターゼ（１７Ｕ／ｍｌ）；媒介物質Ｌ−グルタチオン（１ｍＭ）；ＮＡＤＨ、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰＨ、またはＮＡＤＰ＋（すべて１ｍＭ）；グルコースデヒドロゲナーゼ（３．４Ｕ／ｍｌ）およびＤ−グルコース（２ｍＭ）；適用可能な場合、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（商標）水。Ｌ−シスチン濃度は、最終反応液中０．９６ｍＭであった。反応（表４を参照）は、材料および方法において記載されるように実行し、Ｌ−シスチンおよび遊離チオール基は、ＮＭＲによって分析した。
【００５８】
【表３】
2020513734.tif 000004
【００５９】
表４は、酸化型をした補助因子を使用することがシスチンの１００％の還元をもたらすことを示す。
【００６０】
［実施例５］
［酵母グルタチオンレダクターゼのｐＨ依存性の活性］
酵母グルタチオンレダクターゼ（ＧＲ）酵素についてのｐＨ曲線を、０．１Ｍリン酸バッファーにおいてｐＨ５および１０の間のすべてのｐＨ単位で活性をアッセイすることによって得た。ＧＲ酵素なしのブランクをすべてのｐＨに含めた。ｐＨ５〜９についてのバッファーは、０．１Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４溶液および０．１Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４溶液のミックスバッファーとした。バッファーがｐＨ１０に達するためには水酸化ナトリウムの追加を必要とした。５０ｍＭのＮＡＤＰＨストックを、ｍｉｌｌｉＱ水中で調製し、水酸化ナトリウムを追加して、ＮＡＤＰＨが可溶性で安定するｐＨ８にした。ＧＳＳＧ溶液は、それぞれのｐＨについて別々に調製した（２０ｍＭ＝１５ｍＬ  Ｇｒｅｉｎｅｒチューブ中６１．３ｍｇ／５ｍＬバッファー）。酵素は、最初に、水中で２０×に希釈し、次いで、様々なｐＨ設定値のバッファー中で１００×に希釈した。ＮＡＤＰＨストック溶液は、酵素の追加の前のＮＡＤＰＨのバックグラウンド変換を最小限にするために、アッセイを開始する前に所望のバッファー中で２５×に少し希釈した。アッセイは以下のとおりに実行し：１００マイクロリットル  ＧＳＳＧ溶液ｐＨ  Ｘ＋５０マイクロリットルＮＡＤＰＨ溶液ｐＨ  Ｘ＋５０マイクロリットル希釈酵素ｐＨ  Ｘ。続いて、所望のｐＨでの毎分３４０ｎｍでの吸収の減少を伴う反応速度の読み取りを実行した。反応の傾き（Δ３４０ｎｍ／分）を、同じｐＨのブランクの反応の傾きに対して補正し、活性を、酵素について測定された最も高い活性を基準として示した。相対的活性を図３に示す。
【００６１】
［実施例６］
［様々なプロセス条件での酵素の存在下におけるシスチン還元］
シスチンのシステインへの還元を、媒介物質としての酸化グルタチオンおよび補助因子としてのＮＡＤＰ＋の存在下において酵母グルタチオンレダクターゼ（ｓｉｇｍａ）および反応中にＮＡＰＰＨを再生成するためのグルコースデヒドロゲナーゼを使用して実行した。反応の概要は、以下のとおりである。
反応１：ＣＹＳ−ＣＹＳ＋２ＧＳＨ→２ＣＹＳ＋ＧＳＳＧ
反応２：ＧＳＳＧ＋ＮＡＤＰＨ→２ＧＳＨ＋ＮＡＤＰ＋Ｈ
反応３：グルコース＋ＮＡＤＰ→グルコン酸＋ＮＡＤＰＨ
【００６２】
酵素的変換は、温度およびｐＨのコントロールと共に２００ｍｌのジャケット容器において実行した。総使用体積は１００ｍｌとした。反応は２つの容器において実行した。両方の容器は、酵母ＧＲ（Ｓｉｇｍａ）およびグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ  １０５、Ｃｏｄｅｘｉｓ）を含有した。反応は、下記の表５に示す２つの異なるプロセス条件で実行した。
【００６３】
【表４】
2020513734.tif 000005
【００６４】
サンプルは、ｔ＝０（酵素の追加前）、０．５、１、２、３、４、５、および６時間に得た。２００μｌのサンプルを、１３．０００ＲＰＭで１分遠心分離し、１００μｌの上清を、９００μｌの０．１１１Ｎ  ＨＣＬ（０．１Ｎ  ＨＣＬの最終濃度）に移し、混合し、−２０℃で保存した。サンプルはすべて、Ｌ−シスチン、Ｌ−システイン、ＧＳＨ、ＧＳＳＧ、およびこれらの構成成分の組み合わせを測定するためにＬＣＭＳ−ＭＳ法によって分析した。時間毎のシステイン形成を図４に示す。
【００６５】
容器２のシステインのレベルは、時間毎に増加せず、酵母グルタチオンレダクターゼが、５１℃およびｐＨ５．１の適用条件下で活性でなかったことを示した。この反応におけるシステインの初めの増加は、ＧＳＨとの非酵素的還元の結果であり、グルタチオンレダクターゼが活性でなく、したがって酸化グルタチオンを還元することができないので、さらに増加することはない。
【００６６】
［実施例７］
［５５℃の温度でのグルタチオンレダクターゼの安定性］
グルタチオンレダクターゼの熱安定性について研究するために、１．５ｍｌの酵素ストック溶液を５５℃でインキュベートした。１５、３０、６０、１２０、および２４０分間のインキュベーションの後に、２５０μｌを新たなチューブに移し、氷水中で保存した。インキュベートしていないストック溶液（約３．５ｍｌ）は、さらなるインキュベーションを伴うことなく、氷水に直接置いた。
【００６７】
以下の反応を実行した。
ＮＡＤＰＨ＋ＧＲ＋ＧＳＳＧ→ＮＡＤＰ＋＋ＧＲ＋２ＧＳＨ
【００６８】
反応混合物において、５０μｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬバッファー（ｐＨ８．０）、５０μｌ  ＮＡＤＰＨ、５０μｌグルタチオンレダクターゼ（ＧＲ）、および５０μｌ酸化グルタチオンを追加した。グルタチオンレダクターゼとして、インキュベートしていないまたは熱処理したサンプルを使用した。反応は、平らで透明な底のＭＴＰ９６プレートにおいて２００μｌの総体積で実行した。反応は、室温で実行した。構成成分はすべて、グルタチオンを除いて混合した。反応を同時に開始するために、これらの基質は、μｑｕａｎｔ分光光度計の中にＭＴＰ９６プレートを置く直前に追加した。吸光度は、毎分３４０ｎｍで２時間測定した。
【００６９】
図５は、より高い温度でのインキュベーションの後の時間毎の吸光度の結果を示す。活性は１５分後既に下がっており、５５℃での３０および６０分間のインキュベーションの後に測定される活性は全くない。
【００７０】
［実施例８］
［プロテアーゼの存在および非存在下における酵母グルタチオンレダクターゼの耐熱性］
２０単位の酵母グルタチオンレダクターゼ（Ｓｉｇｍａ）を１０ｍｌのバッファー（０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ  ＨＣＬバッファー）中に追加し、ウォーターバス中でプロテアーゼありおよびなしで１８時間５１℃およびｐＨ５．１でインキュベートした。この実験で適用したプロテアーゼは、溶液の無水物のグラムで０．００６８ｍｇの用量のＡｌｃａｌａｓｅ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ）とした。酵素活性は、分光光度計によって、開発したアッセイを使用して、両方の溶液におけるインキュベーションの後に測定した。
【００７１】
【表５】
2020513734.tif 000006
【００７２】
結果は、酵母ＧＲ酵素が、耐熱性ではなく、活性は、摂氏５１度およびｐＨ５．１でのインキュベーションの後、１８時間後に失われることを示した。
【００７３】
［グルタチオンレダクターゼ活性測定のためのアッセイ］
ＧＲ活性を測定するためのアッセイは、以下の反応に基づくものとした：
ＧＲ＋ＧＳＳＧ＋ＮＡＤＰＨ→ＧＲ＋２ＧＳＨ＋ＮＡＤＰ＋
ここで、ＧＳＳＧ＝酸化Ｌ−グルタチオン、ＧＳＨ＝還元Ｌ−グルタチオンである。
【００７４】
適用した材料は、
グルタチオンレダクターゼアッセイ溶液：
ｍｉｌｉ−Ｑ（ｍＱ）中２０ｍＭ  ＮＡＤＰＨ（ＣＡＳ番号：２６４６−７１−１）
ｍＱ中２０ｍＭ  ＧＳＳＧ（ＣＡＳ番号：２７０２５−４１−８）
２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５、ＤＳＭ  ＭＢＫにおいて得られる）
である。
【００７５】
４５ｍｌのストック溶液を調製するために（５０サンプル）、１７ｍｌのｍＱ、２２．５ｍｌの２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５００μｌの２０ｍＭ  ＮＡＤＰＨ、５ｍｌの２０ｍＭ  ＧＳＳＧをアッセイの直前に混合した。
【００７６】
［方法：］
分光光度計を、空気で０．０００に調整した（タイプ：ＧｅｎｅｔｉｃｓのＵｌｔｒｏｓｐｅｃ（登録商標）  ２０００およびＡＢＣ  ｌａｂ  １１２８のＪａｓｃｏ  Ｖ−６３０）。アッセイストック溶液の吸光度は、サンプルなしで測定した。この分析の結果は、ネガティブコントロールとして得、酵素溶液は、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中で希釈した。１００μｌの希釈サンプルを、キュベット中の９００μｌアッセイストック溶液に追加し、ピペットで十分に混合した。キュベットを分光光度計中に置き、溶液の吸光度を、ゼロ時間（ｔ＝０）におよび１分（ｔ＝１）後に記録した。
【００７７】
［計算：］
酵素活性は、下記の式によって決定した。
【数１】
2020513734.tif 000007
ここで、
Ｄｆ＝希釈係数
ΔΑ  ｍｉｎ−１＝１分間当たりの吸光度の増加／減少
Ａｖ＝ｍｌでのアッセイ体積（１ｍｌ）
ｄ＝ｃｍでの光路長（キュベットについて、これは１ｃｍとする）
ｅ＝ＮＡＤＰＨのモル吸光係数、６．２２Ｍ−１ｃｍ−１
Ｓｖ＝ｍｌでのサンプル体積（０．１ｍｌ）
【図１】
2020513734.tif 000008
【図２】
2020513734.tif 000009
【図３】
2020513734.tif 000010
【図４】
2020513734.tif 000011
【図５】
2020513734.tif 000012
【国際調査報告】
2020513734.tif 000013
2020513734.tif 000014
2020513734.tif 000015