(57)【要約】  本発明は、ＬＤＨＡ遺伝子を標的とする二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）組成物、並びにこのようなｄｓＲＮＡ組成物を用いて、ＬＤＨＡの発現を阻害する方法、ＬＤＨＡ及びＨＡＯ１を阻害する方法、及びＬＤＨＡの発現の低下から利益を得られ得る対象、例えば、オキサレート経路に関連する疾病、障害又は病態に罹患している対象を処置する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内での乳酸脱水素酵素Ａ（ＬＤＨＡ）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤であって、前記ｄｓＲＮＡ剤が、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が、表２〜５のいずれか１つに列挙されるアンチセンス配列のいずれか１つと３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む相補性の領域を含む、ｄｓＲＮＡ剤。
【請求項２】
前記ｄｓＲＮＡ剤が、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項３】
前記センス鎖の前記ヌクレオチドの実質的に全てが、修飾を含み；前記アンチセンス鎖の前記ヌクレオチドの実質的に全てが、修飾を含み；又は前記センス鎖の前記ヌクレオチドの実質的に全て及び前記アンチセンス鎖の前記ヌクレオチドの実質的に全てが、修飾を含む、請求項１又は２に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項４】
前記センス鎖の前記ヌクレオチドの全てが、修飾を含み；前記アンチセンス鎖の前記ヌクレオチドの全てが、修飾を含み；又は前記センス鎖の前記ヌクレオチドの全て及び前記アンチセンス鎖の前記ヌクレオチドの全てが、修飾を含む、請求項３に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項５】
前記修飾ヌクレオチドの少なくとも１つが、デオキシ−ヌクレオチド、３’末端デオキシ−チミン（ｄＴ）ヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ−修飾ヌクレオチド、固定ヌクレオチド、非固定ヌクレオチド、立体配座的に制限されたヌクレオチド、拘束エチルヌクレオチド、非塩基性ヌクレオチド、２’−アミノ−修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−アリル−修飾ヌクレオチド、２’−Ｃ−アルキル−修飾ヌクレオチド、２’−ヒドロキシル−修飾ヌクレオチド、２’−メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキル−修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミデート、非天然塩基を含むヌクレオチド、テトラヒドロピラン修飾ヌクレオチド、１，５−アンヒドロヘキシトール修飾ヌクレオチド、シクロヘキセニル修飾ヌクレオチド、ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、メチルホスホネート基を含むヌクレオチド、５’−ホスフェートを含むヌクレオチド、５’−ホスフェート模倣体を含むヌクレオチド、グリコール修飾ヌクレオチド、及び２−Ｏ−（Ｎ−メチルアセトアミド）修飾ヌクレオチド、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２〜４のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項６】
前記相補性の領域が、少なくとも１７ヌクレオチド長である、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項７】
前記相補性の領域が、１９〜３０ヌクレオチド長である、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項８】
前記相補性の領域が、１９〜２５ヌクレオチド長である、請求項７に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項９】
前記相補性の領域が、２１〜２３ヌクレオチド長である、請求項７に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項１０】
各鎖が、３０ヌクレオチド長以下である、請求項１〜９のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項１１】
各鎖が、独立して、１９〜３０ヌクレオチド長である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項１２】
各鎖が、独立して、１９〜２５ヌクレオチド長である、請求項１１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項１３】
各鎖が、独立して、２１〜２３ヌクレオチド長である、請求項１１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項１４】
少なくとも１つの鎖が、少なくとも１つのヌクレオチド３’オーバーハングを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項１５】
少なくとも１つの鎖が、少なくとも２つのヌクレオチド３’オーバーハングを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項１６】
前記剤が、少なくとも１つのホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合を更に含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項１７】
前記ホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合が、１つの鎖の３’末端にある、請求項１６に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項１８】
前記鎖が、前記アンチセンス鎖である、請求項１７に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項１９】
前記鎖が、前記センス鎖である、請求項１７に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項２０】
前記ホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合が、１つの鎖の５’末端にある、請求項１６に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項２１】
前記鎖が、前記アンチセンス鎖である、請求項２０に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項２２】
前記鎖が、前記センス鎖である、請求項２０に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項２３】
前記ホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合が、１つの鎖の５’末端及び３’末端の両方にある、請求項１６に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項２４】
リガンドを更に含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項２５】
前記リガンドが、前記ｄｓＲＮＡ剤の前記センス鎖の３’末端にコンジュゲートされる、請求項２４に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項２６】
前記リガンドが、一価、二価、又は三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された１つ又は複数のＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）誘導体である、請求項２４又は２５に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項２７】
前記リガンドが、
【化１】
2020532289.tif 000121
である、請求項２６に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項２８】
前記ｄｓＲＮＡ剤が、以下の概略図
【化２】
2020532289.tif 000122
に示される前記リガンドにコンジュゲートされ、式中、Ｘが、Ｏ又はＳである、請求項２７に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項２９】
前記ＸがＯである、請求項２８に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項３０】
前記相補性の領域が、表２〜５のいずれか１つに列挙されるアンチセンス配列のうちの１つからなる、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項３１】
前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖が、表２〜５のいずれか１つに列挙される剤のいずれか１つのヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項３２】
センス鎖及びアンチセンス鎖を含む乳酸脱水素酵素Ａ（ＬＤＨＡ）の発現を阻害する第１の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤と；
センス鎖及びアンチセンス鎖を含むヒドロキシ酸オキシダーゼ１（グリコール酸オキシダーゼ）（ＨＡＯ１）の発現を阻害する第２の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤とを含む二重標的化ＲＮＡｉ剤であって、
前記第１のｄｓＲＮＡ剤及び前記第２のｄｓＲＮＡ剤が共有結合されている、二重標的化ＲＮＡｉ剤。
【請求項３３】
前記第１のｄｓＲＮＡ剤の前記センス鎖が、配列番号１のヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、前記第１のｄｓＲＮＡ剤の前記アンチセンス鎖が、配列番号２のヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む、請求項３２に記載の二重標的化ＲＮＡｉ剤。
【請求項３４】
前記第１のｄｓＲＮＡ剤の前記アンチセンス鎖が、表２〜５のいずれか１つに列挙されるアンチセンス配列のいずれか１つと３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む相補性の領域を含む、請求項３２に記載の二重標的化ＲＮＡｉ剤。
【請求項３５】
前記第２のｄｓＲＮＡ剤の前記センス鎖が、配列番号２１のヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、前記第２のｄｓＲＮＡ剤の前記アンチセンス鎖が、配列番号２２のヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む、請求項３２に記載の二重標的化ＲＮＡｉ剤。
【請求項３６】
前記第２のｄｓＲＮＡ剤の前記アンチセンス鎖が、表７〜１４のいずれか１つに列挙されるアンチセンス配列のいずれか１つと３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む相補性の領域を含む、請求項３２に記載の二重標的化ＲＮＡｉ剤。
【請求項３７】
前記第１のｄｓＲＮＡ剤及び前記第２のｄｓＲＮＡ剤がそれぞれ、独立して、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項３２〜３６のいずれか一項に記載の二重標的化ＲＮＡｉ剤。
【請求項３８】
前記センス鎖の前記ヌクレオチドの実質的に全て及び前記第１のｄｓＲＮＡ剤の前記アンチセンス鎖の前記ヌクレオチドの実質的に全て及び前記センス鎖の前記ヌクレオチドの実質的に全て及び前記第２のｄｓＲＮＡ剤の前記アンチセンス鎖の前記ヌクレオチドの実質的に全てが、修飾ヌクレオチドである、請求項３２〜３６のいずれか一項に記載の二重標的化ＲＮＡｉ剤。
【請求項３９】
前記第１のｄｓＲＮＡ剤の前記修飾ヌクレオチドの少なくとも１つ及び前記第２のｄｓＲＮＡ剤の前記修飾ヌクレオチドの少なくとも１つがそれぞれ、独立して、デオキシ−ヌクレオチド、３’末端デオキシ−チミン（ｄＴ）ヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ−修飾ヌクレオチド、固定ヌクレオチド、非固定ヌクレオチド、立体配座的に制限されたヌクレオチド、拘束エチルヌクレオチド、非塩基性ヌクレオチド、２’−アミノ−修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−アリル−修飾ヌクレオチド、２’−Ｃ−アルキル−修飾ヌクレオチド、２’−ヒドロキシル−修飾ヌクレオチド、２’−メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキル−修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミデート、非天然塩基を含むヌクレオチド、テトラヒドロピラン修飾ヌクレオチド、１，５−アンヒドロヘキシトール修飾ヌクレオチド、シクロヘキセニル修飾ヌクレオチド、ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、メチルホスホネート基を含むヌクレオチド、５’−ホスフェートを含むヌクレオチド、及び５’−ホスフェート模倣体を含むヌクレオチドからなる群から選択される、請求項３８に記載の二重標的化ＲＮＡｉ剤。
【請求項４０】
前記第１のｄｓＲＮＡ剤の前記修飾ヌクレオチドの少なくとも１つ及び前記第２のｄｓＲＮＡ剤の前記修飾ヌクレオチドの少なくとも１つがそれぞれ、独立して、２’−Ｏ−メチル及び２’フルオロ修飾からなる群から選択される、請求項３８に記載の二重標的化ＲＮＡｉ剤。
【請求項４１】
前記第１のｄｓＲＮＡ剤の前記相補性の領域及び／又は前記第２のｄｓＲＮＡ剤の前記相補性の領域がそれぞれ、独立して、１９〜３０ヌクレオチド長である、請求項３４又は３６に記載の二重標的化ＲＮＡｉ剤。
【請求項４２】
前記第１のｄｓＲＮＡ剤の各鎖及び前記第２のｄｓＲＮＡ剤の各鎖がそれぞれ、独立して、１９〜３０ヌクレオチド長である、請求項３２〜３６のいずれか一項に記載の二重標的化ＲＮＡｉ剤。
【請求項４３】
前記第１のｄｓＲＮＡ剤の少なくとも１つの鎖及び／又は前記第２のｄｓＲＮＡ剤の少なくとも１つの鎖がそれぞれ、独立して、少なくとも１つのヌクレオチドの３’オーバーハングを含む、請求項３２〜３６のいずれか一項に記載の二重標的化ＲＮＡｉ剤。
【請求項４４】
前記第１のｄｓＲＮＡ剤及び／又は前記第２のｄｓＲＮＡ剤がそれぞれ、独立して、少なくとも１つのホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合を更に含む、請求項３２〜３６のいずれか一項に記載の二重標的化ＲＮＡｉ剤。
【請求項４５】
前記第１のｄｓＲＮＡ剤及び／又は前記第２のｄｓＲＮＡ剤がそれぞれ、独立して、少なくとも１つのリガンドを更に含む、請求項３２〜３６のいずれか一項に記載の二重標的化ＲＮＡｉ剤。
【請求項４６】
前記少なくとも１つのリガンドが、前記第１のｄｓＲＮＡ剤及び／又は前記第２のｄｓＲＮＡ剤の前記センス鎖にコンジュゲートされる、請求項４５に記載の二重標的化ＲＮＡｉ剤。
【請求項４７】
前記少なくとも１つのリガンドが、前記センス鎖の１つの３’末端、５’末端、又は内部の位置にコンジュゲートされる、請求項４５に記載の二重標的化ＲＮＡｉ剤。
【請求項４８】
前記少なくとも１つのリガンドが、前記第１のｄｓＲＮＡ剤及び／又は前記第２のｄｓＲＮＡ剤の前記アンチセンス鎖にコンジュゲートされる、請求項４５に記載の二重標的化ＲＮＡｉ剤。
【請求項４９】
前記少なくとも１つのリガンドが、前記アンチセンス鎖の１つの３’末端、５’末端、又は内部の位置にコンジュゲートされる、請求項４５に記載の二重標的化ＲＮＡｉ剤。
【請求項５０】
前記リガンドが、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）誘導体である、請求項４５に記載の二重標的化ＲＮＡｉ剤。
【請求項５１】
前記リガンドが、一価、二価、又は三価の分枝鎖状リンカーを介して結合される１つ又は複数のＧａｌＮＡｃ誘導体である、請求項５０に記載の二重標的化ＲＮＡｉ剤。
【請求項５２】
前記リガンドが、
【化３】
2020532289.tif 000123
である、請求項５１に記載の二重標的化ＲＮＡｉ剤。
【請求項５３】
前記第１のｄｓＲＮＡ剤及び前記第２のｄｓＲＮＡ剤がそれぞれ、独立して、以下の概略図
【化４】
2020532289.tif 000124
に示される前記リガンドにコンジュゲートされ、式中、Ｘが、Ｏ又はＳである、請求項５２に記載の二重標的化ＲＮＡｉ剤。
【請求項５４】
前記ＸがＯである、請求項５３に記載の二重標的化ＲＮＡｉ剤。
【請求項５５】
前記第１のｄｓＲＮＡ剤及び前記第２のｄｓＲＮＡ剤が、共有結合リンカーを介して共有結合されている、請求項３２〜３６のいずれか一項に記載の二重標的化ＲＮＡｉ剤。
【請求項５６】
前記共有結合リンカーが、一本鎖核酸リンカー、二本鎖核酸リンカー、部分的に一本鎖の核酸リンカー、部分的に二本鎖の核酸リンカー、炭水化物部分リンカー、及びペプチドリンカーからなる群から選択される、請求項５５に記載の二重標的化ＲＮＡｉ剤。
【請求項５７】
前記共有結合リンカーが、切断可能なリンカー又は切断不可能なリンカーである、請求項５５に記載の二重標的化ＲＮＡｉ剤。
【請求項５８】
前記共有結合リンカーが、前記第１のｄｓＲＮＡ剤の前記センス鎖を、前記第２のｄｓＲＮＡ剤の前記センス鎖に結合する、請求項５５に記載の二重標的化ＲＮＡｉ剤。
【請求項５９】
前記共有結合リンカーが、前記第１のｄｓＲＮＡ剤の前記アンチセンス鎖を、前記第２のｄｓＲＮＡ剤の前記アンチセンス鎖に結合する、請求項５５に記載の二重標的化ＲＮＡｉ剤。
【請求項６０】
前記共有結合リンカーが、少なくとも１つのリガンドを更に含む、請求項５５に記載の二重標的化ＲＮＡｉ剤。
【請求項６１】
細胞を、前記二重標的化ＲＮＡｉ剤と接触させることが、前記ＬＤＨＡ遺伝子及び前記ＨＡＯ１遺伝子の発現を、細胞を両方のｄｓＲＮＡ剤と個別に接触させることによって得られる発現の阻害のレベルと実質的に同じレベルに阻害する、請求項３２〜３６のいずれか一項に記載の二重標的化ＲＮＡｉ剤。
【請求項６２】
細胞を、前記二重標的化ＲＮＡｉ剤と接触させることが、前記ＬＤＨＡ遺伝子及び前記ＨＡＯ１遺伝子の発現を、細胞を両方のｄｓＲＮＡ剤と個別に接触させることによって得られる発現の阻害のレベルより高いレベルに阻害する、請求項３２〜３６のいずれか一項に記載の二重標的化ＲＮＡｉ剤。
【請求項６３】
ＬＤＨＡ発現の阻害の前記レベルが、細胞を両方のｄｓＲＮＡ剤と個別に接触させることによって得られる発現の阻害のレベルより少なくとも約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％又は約１００％高い、請求項６１に記載の二重標的化ＲＮＡｉ剤。
【請求項６４】
ＨＡＯ１発現の阻害の前記レベルが、細胞を両方のｄｓＲＮＡ剤と個別に接触させることによって得られる発現の阻害のレベルより少なくとも約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％又は約１００％高い、請求項６１に記載の二重標的化ＲＮＡｉ剤。
【請求項６５】
細胞を、前記二重標的化ＲＮＡｉ剤と接触させることが、オキサレート及び／又はグリオキシレートタンパク質産生を、細胞を両方のｄｓＲＮＡ剤と個別に接触させることによって得られるタンパク質産生のレベルより低いレベルに阻害する、請求項３２〜３６のいずれか一項に記載の二重標的化ＲＮＡｉ剤。
【請求項６６】
細胞を、前記二重標的化ＲＮＡｉ剤と接触させることが、オキサレート及び／又はグリオキシレートタンパク質産生を、細胞を両方のｄｓＲＮＡ剤と個別に接触させることによって得られるタンパク質産生のレベルより低いレベルに阻害する、請求項３２〜３６のいずれか一項に記載の二重標的化ＲＮＡｉ剤。
【請求項６７】
請求項１〜３１のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤を含む細胞。
【請求項６８】
請求項３２〜６６のいずれか一項に記載の二重標的化ＲＮＡｉ剤を含む細胞。
【請求項６９】
請求項１〜３１のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤の少なくとも１つの鎖をコードするベクター。
【請求項７０】
請求項３２〜６６のいずれか一項に記載の二重標的化ＲＮＡｉ剤の少なくとも１つの鎖をコードするベクター。
【請求項７１】
請求項１〜３１のいずれか一項に記載の剤を含む、乳酸脱水素酵素Ａ（ＬＤＨＡ）遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物。
【請求項７２】
請求項３２〜６６のいずれか一項に記載の二重標的化ＲＮＡｉ剤を含む、乳酸脱水素酵素Ａ（ＬＤＨＡ）遺伝子及びヒドロキシ酸オキシダーゼ１（グリコール酸オキシダーゼ）（ＨＡＯ１）遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物。
【請求項７３】
センス鎖及びアンチセンス鎖を含む乳酸脱水素酵素Ａ（ＬＤＨＡ）の発現を阻害する第１の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤であって、前記センス鎖が、配列番号１のヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号２のヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む第１の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤と；
センス鎖及びアンチセンス鎖を含むヒドロキシ酸オキシダーゼ１（グリコール酸オキシダーゼ）（ＨＡＯ１）の発現を阻害する第２の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤であって、前記センス鎖が、配列番号２１のヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号２２のヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む第２の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤と
を含む医薬組成物。
【請求項７４】
センス鎖及びアンチセンス鎖を含む乳酸脱水素酵素Ａ（ＬＤＨＡ）の発現を阻害する第１の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤であって、前記アンチセンス鎖が、表２〜５のいずれか１つに列挙されるアンチセンス配列のいずれか１つと３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む相補性の領域を含む第１の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤と；
センス鎖及びアンチセンス鎖を含むヒドロキシ酸オキシダーゼ１（グリコール酸オキシダーゼ）（ＨＡＯ１）の発現を阻害する第２の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤であって、前記アンチセンス鎖が、表７〜１４のいずれか１つに列挙されるアンチセンス配列のいずれか１つと３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む相補性の領域を含む第２の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤と
を含む医薬組成物。
【請求項７５】
前記剤が、非緩衝液中で製剤化される、請求項７１〜７４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７６】
前記非緩衝液が、生理食塩水又は水である、請求項７５に記載の医薬組成物。
【請求項７７】
前記剤が、緩衝液中で製剤化される、請求項７１〜７４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７８】
前記緩衝液が、酢酸塩、クエン酸塩、プロラミン、炭酸塩、若しくはリン酸塩又はそれらの任意の組み合わせを含む、請求項７７に記載の医薬組成物。
【請求項７９】
前記緩衝液が、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である、請求項７７に記載の医薬組成物。
【請求項８０】
細胞内での乳酸脱水素酵素Ａ（ＬＤＨＡ）発現を阻害する方法であって、前記細胞を、請求項１〜６６のいずれか一項に記載の剤、又は請求項７１〜７４のいずれか一項に記載の医薬組成物と接触させ、それによって、前記細胞内でのＬＤＨＡの発現を阻害する工程を含む、方法。
【請求項８１】
細胞内での乳酸脱水素酵素Ａ（ＬＤＨＡ）発現及びヒドロキシ酸オキシダーゼ１（グリコール酸オキシダーゼ）（ＨＡＯ１）発現を阻害する方法であって、前記細胞を、請求項３２〜６６のいずれか一項に記載の剤、又は請求項７２〜７４のいずれか一項に記載の医薬組成物と接触させ、それによって、前記細胞内でのＬＤＨＡ及びＨＡＯ１の発現を阻害する工程を含む、方法。
【請求項８２】
前記細胞が、対象中にある、請求項８０又は８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記対象がヒトである、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記ＬＤＨＡ発現が、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％だけ、又はＬＤＨＡ発現の検出のレベル未満まで阻害される、請求項８０〜８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
前記ＨＡＯ１発現が、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％だけ、又はＨＡＯ１発現の検出のレベル未満まで阻害される、請求項８１〜８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
前記ヒト対象が、オキサレート経路に関連する疾病、障害又は病態に罹患している、請求項８３に記載の方法。
【請求項８７】
前記オキサレート経路に関連する疾病、障害、若しくは病態が、オキサレートに関連する疾病、障害、若しくは病態、又は乳酸脱水素酵素に関連する疾病、障害、若しくは病態である、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記オキサレートに関連する疾病、障害、若しくは病態が、腎臓結石形成疾病、障害、若しくは病態、又はシュウ酸カルシウム組織沈着疾病、障害、若しくは病態である、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記腎臓結石形成疾病、障害、若しくは病態が、シュウ酸カルシウム結石形成疾病、障害、若しくは病態又は非シュウ酸カルシウム結石形成疾病、障害、若しくは病態である、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記シュウ酸カルシウム結石形成疾病、障害、若しくは病態が、高シュウ酸尿症疾病、障害、若しくは病態又は非高シュウ酸尿症疾病、障害、若しくは病態である、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記高シュウ酸尿症疾病、障害、若しくは病態が、原発性高シュウ酸尿症、腸管高シュウ酸尿症、食餌性高シュウ酸尿症、及び特発性高シュウ酸尿症からなる群から選択される、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記非高シュウ酸尿症結石形成疾病、障害、若しくは病態が、高カルシウム尿症及び／又は低クエン酸尿症である、請求項９０に記載の方法。
【請求項９３】
前記非高シュウ酸尿症結石形成疾病、障害、若しくは病態が、シュウ酸カルシウム又は非シュウ酸カルシウム腎臓結石形成疾病である、請求項９０に記載の方法。
【請求項９４】
前記シュウ酸カルシウム組織沈着疾病、障害、若しくは病態が、全身性シュウ酸カルシウム組織沈着疾病、障害、若しくは病態又は組織特異的シュウ酸カルシウム組織沈着疾病、障害、若しくは病態からなる群から選択される、請求項８８に記載の方法。
【請求項９５】
前記乳酸脱水素酵素に関連する疾病、障害、若しくは病態が、癌、脂肪肝（脂肪症）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、肝臓中の脂肪の蓄積、肝臓の炎症、肝細胞壊死、肝線維症、及び非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）からなる群から選択される、請求項８８に記載の方法。
【請求項９６】
前記細胞が肝細胞である、請求項８０〜９５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９７】
対象におけるＬＤＨＡの発現を阻害する方法であって、
治療有効量の、請求項１〜６６のいずれか一項に記載の剤、又は請求項７１〜７４のいずれか一項に記載の医薬組成物を前記対象に投与し、それによって、前記対象におけるＬＤＨＡの発現を阻害する工程を含む、方法。
【請求項９８】
対象における乳酸脱水素酵素Ａ（ＬＤＨＡ）発現及びヒドロキシ酸オキシダーゼ１（グリコール酸オキシダーゼ）（ＨＡＯ１）発現を阻害する方法であって、
治療有効量の、請求項３２〜６６のいずれか一項、又は請求項７２〜７４のいずれか一項に記載の医薬組成物を前記対象に投与し、それによって、前記対象におけるＬＤＨＡ及びＨＡＯ１の発現を阻害する工程を含む、方法。
【請求項９９】
ＬＤＨＡ発現の低下から利益を得られ得る障害に罹患している対象を処置する方法であって、
治療有効量の、請求項１〜６６のいずれか一項に記載の剤、又は請求項７１〜７４のいずれか一項に記載の医薬組成物を前記対象に投与し、それによって、前記対象を処置する工程を含む、方法。
【請求項１００】
ＬＤＨＡ遺伝子の発現の低下から利益を得られ得る疾病又は障害に罹患している対象の少なくとも１つの症状を予防する方法であって、
予防的に有効な量の、請求項１〜６６のいずれか一項に記載の剤、又は請求項７１〜７４のいずれか一項に記載の医薬組成物を前記対象に投与し、それによって、前記対象の少なくとも１つの症状を予防する工程を含む、方法。
【請求項１０１】
前記障害が、オキサレート経路に関連する疾病、障害又は病態である、請求項９９又は１００に記載の方法。
【請求項１０２】
オキサレート経路に関連する疾病、障害又は病態に罹患している対象を処置する方法であって、
治療有効量の、請求項１〜６６のいずれか一項に記載の剤、又は請求項７１〜７４のいずれか一項に記載の医薬組成物を前記対象に投与し、それによって、前記対象を処置する工程を含む、方法。
【請求項１０３】
オキサレート経路に関連する疾病、障害又は病態に罹患している対象の少なくとも１つの症状を予防する方法であって、
予防的に有効な量の、請求項１〜６６のいずれか一項に記載の剤、又は請求項７１〜７４のいずれか一項に記載の医薬組成物を前記対象に投与し、それによって、前記対象の少なくとも１つの症状を予防する工程を含む、方法。
【請求項１０４】
前記対象への前記ｄｓＲＮＡ剤又は前記医薬組成物の投与が、尿中オキサレート、組織オキサレート、血漿オキサレートの減少、ＬＤＨＡ酵素活性の低下、ＬＤＨＡタンパク質蓄積の減少、及び／又はＨＡＯ１タンパク質蓄積の減少を引き起こす、請求項９８〜１０３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０５】
前記オキサレート経路に関連する疾病、障害、若しくは病態が、オキサレートに関連する疾病、障害、若しくは病態、又は乳酸脱水素酵素に関連する疾病、障害、若しくは病態である、請求項１０１〜１０４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０６】
前記オキサレートに関連する疾病、障害、若しくは病態が、腎臓結石形成疾病、障害、若しくは病態、又はシュウ酸カルシウム組織沈着疾病、障害、若しくは病態である、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
前記腎臓結石形成疾病、障害、若しくは病態が、シュウ酸カルシウム結石形成疾病、障害、若しくは病態又は非シュウ酸カルシウム結石形成疾病、障害、若しくは病態である、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
前記シュウ酸カルシウム結石形成疾病、障害、若しくは病態が、高シュウ酸尿症疾病、障害、若しくは病態又は非高シュウ酸尿症疾病、障害、若しくは病態である、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
前記高シュウ酸尿症疾病、障害、若しくは病態が、原発性高シュウ酸尿症、腸管高シュウ酸尿症、食餌性高シュウ酸尿症、及び特発性高シュウ酸尿症からなる群から選択される、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
前記非高シュウ酸尿症結石形成疾病、障害、若しくは病態が、高カルシウム尿症及び／又は低クエン酸尿症である、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
前記非高シュウ酸尿症結石形成疾病、障害、若しくは病態が、シュウ酸カルシウム又は非シュウ酸カルシウム腎臓結石形成疾病である、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
前記シュウ酸カルシウム組織沈着疾病、障害、若しくは病態が、全身性シュウ酸カルシウム組織沈着疾病、障害、若しくは病態又は組織特異的シュウ酸カルシウム組織沈着疾病、障害、若しくは病態からなる群から選択される、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１１３】
前記乳酸脱水素酵素に関連する疾病、障害、若しくは病態が、癌、脂肪肝（脂肪症）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、肝臓中の脂肪の蓄積、肝臓の炎症、肝細胞壊死、肝線維症、及び非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）からなる群から選択される、請求項１０１〜１０４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１４】
前記疾病、障害若しくは病態が、原発性高シュウ酸尿症２（ＰＨ２）である、請求項９７〜９９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１５】
前記対象の食事を変化させることを更に含む、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
前記対象が、腎臓移植を受ける、請求項１１４又は１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
前記対象がヒトである、請求項９８〜１１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１８】
更なる治療剤を前記対象に投与する工程を更に含む、請求項９８〜１１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１９】
前記剤が、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ又は約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの用量で前記対象に投与される、請求項９８〜１１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２０】
前記剤が、前記対象に皮下投与される、請求項９８〜１１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２１】
前記剤が、乳酸脱水素酵素Ｂ（ＬＤＨＢ）の発現及び／又は活性を実質的に阻害しない、請求項９８〜１２０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１７年１０月２５日に出願された米国仮特許出願第６２／５７６，７８３号明細書及び２０１７年７月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／５３２，０２０号明細書の優先権の利益を主張するものである。上記の仮出願のそれぞれの全内容が参照により本明細書に援用される。
【０００２】
配列表
本出願は、全体が参照により本明細書に援用される、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出されている配列表を含む。２０１８年７月７月１２日に作成された前記ＡＳＣＩＩのコピーの名称は、１２１３０１−０７５２０＿ＳＬ．ＴＸＴであり、サイズは１，１５４，８０８バイトである。
【背景技術】
【０００３】
オキサレート（Ｃ２Ｏ４２−）は、植物及び動物の両方において広く分布するシュウ酸（Ｃ２Ｈ２Ｏ４）の塩形成イオンである。オキサレートは、人間の食事の不可避な成分並びに植物及び植物由来の食物のありふれた成分である。オキサレートはまた、肝臓に存在する代謝経路を介して内因的に合成され得る。尿中オキサレート排泄への食事の寄与及び内因性の寄与は同等である。グリオキシレートは、オキサレートの直接前駆体であり、ヒドロキシ酸オキシダーゼ（ＨＡＯ１）としても知られるとともに本明細書においてそのように呼ばれる酵素グリコール酸オキシダーゼ（ＧＯ）によるグリコレートの酸化、又はコラーゲンの成分であるヒドロキシプロリンの異化から誘導される。酵素アラニン／グリオキシレートアミノトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）による、アラニンとグリオキシレートのアミノ基転移は、ピルベート及びグリシンの形成をもたらす。過剰なグリオキシレートは、乳酸脱水素酵素Ａ（本明細書においてＬＤＨＡと呼ばれる）によってオキサレートに転化される。オキサレート代謝のための内因性経路は、図１Ａに示される。
【０００４】
乳酸脱水素酵素は、全ての組織に見られるタンパク質である。乳酸脱水素酵素は、４つのサブユニットから構成され、２つの最も一般的なサブユニットは、ＬＤＨ−Ｍ及びＬＤＨ−Ｈタンパク質である。これらのタンパク質は、それぞれＬＤＨＡ及びＬＤＨＢ遺伝子によってコードされる。ＬＤＨ−Ｍ及びＬＤＨ−Ｈタンパク質の様々な組み合わせが、ＬＤＨの５つの異なるアイソフォームをもたらす。ＬＤＨＡは、肝臓乳酸脱水素酵素アイソフォームに関与する最も重要な遺伝子である。特に、肝臓内で、ＬＤＨＡは、前駆体であるグリオキシレートをオキサレートに転化することによる、オキサレートの内因性産生の最終的な工程として重要である。ＬＤＨＡはまた、コリ回路において、及びＬＤＨＡがラクテートをピルベートに転化し、逆の転化も行う解糖の嫌気性段階において重要な役割を果たす。
【０００５】
シュウ酸は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、及びカルシウムなどの様々なカチオンとともにシュウ酸塩を形成し得る。シュウ酸ナトリウム、シュウ酸カリウム、及びシュウ酸マグネシウムは、水溶性であるが、シュウ酸カルシウム（ＣａＯｘ）は、ほぼ不溶性である。オキサレートの排泄は、主に、糸球体ろ過及び尿細管分泌を介して、腎臓によって行われる。
【０００６】
オキサレートは、腎臓中でカルシウムと結合するため、尿中ＣａＯｘ過飽和が起こり得、腎組織又は集合系におけるＣａＯｘ結晶の形成及び沈着をもたらす。これらのＣａＯｘ結晶は、広範な腎臓石灰化（腎石灰沈着症）及び結石（腎結石症）の形成の一因となる。広範な腎臓石灰化又は非閉塞性結石を有する対象は、典型的に、症状を有さない。しかしながら、閉塞性結石は、激痛を引き起こし得る。更に、時間とともに、これらのＣａＯｘ結晶は、腎臓への損傷及び進行性炎症を引き起こし、閉塞などの二次性合併症が存在する場合、これらのＣａＯｘ結晶は、腎機能の低下につながり、重症例では、更に末期腎不全及び透析の必要性につながり得る。更に、ＣａＯｘの全身性沈着（全身性シュウ酸症）は、軟組織（甲状腺及び乳房など）、心臓、神経、関節、皮膚、及び網膜を含む腎外組織において発生し得、これは、治療せずに放置すると、早期死亡につながり得る。
【０００７】
最もよく知られているオキサレート経路に関連する疾病、例えば、腎臓結石形成疾病の中でも、可変の臨床表現型を有する、内因性オキサレート合成の増加によって特徴付けられる遺伝疾患である原発性高シュウ酸尿症がある。オキサレート合成を調節する治療法は、現在利用できず、遺伝性高シュウ酸尿症に罹患している対象のために存在する治療選択肢はごくわずかである。最終的に、遺伝性高シュウ酸尿症に罹患している一部の対象は、腎臓／肝臓移植を必要とする。他のオキサレート経路に関連する疾病、障害、及び病態としては、シュウ酸カルシウム組織沈着疾病、障害、及び病態が挙げられる。
【０００８】
現在、これらのオキサレート経路に関連する疾病、障害、及び病態（例えば、腎臓結石疾患を伴う）の多くの一次治療は、水分摂取量の増加及び食事の変化（例えば、タンパク質摂取量の減少、ナトリウム摂取量の減少、アスコルビン酸摂取量の減少、適度なカルシウム摂取量、リン酸塩又はマグネシウム補給、及びピリドキシン処理）である。しかしながら、対象は、このようなライフスタイルの変化を遵守することができず、大きな利益も得られないことが多い。慢性腎疾患などの、他のオキサレート経路に関連する疾病、障害、及び病態のいくつかのための治療は、疾病の進行を遅らせ得るＡＣＥ阻害剤（アンジオテンシン転化酵素阻害剤）及びＡＲＢ（アンジオテンシンＩＩ拮抗薬）の使用を含む。それにもかかわらず、慢性腎疾患に罹患している対象は、腎機能が徐々に低下し、進行して、透析又は腎臓移植が必要になる。これらのオキサレート経路に関連する疾病の大部分は、治療法がなく、現在、利用可能なオキサレート減少治療はない。
【０００９】
更に、オキサレート経路に関連する疾病、障害、及び病態としては、乳酸脱水素酵素に関連する疾病、障害、及び病態が挙げられる。例えば、癌（肝細胞癌）における乳酸脱水素酵素の役割は、周知であり、阻害が、癌増殖を減少させることが示されている。他の乳酸脱水素酵素に関連する疾病、障害及び病態としては、脂肪肝（脂肪症）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、肝臓中の脂肪の蓄積、肝臓の炎症、肝細胞壊死、肝線維症、及び非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）が挙げられる。しかしながら、解糖におけるＬＤＨの重要な役割を考慮すると、治療選択肢は限られている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、オキサレート経路に関連する疾病、障害、及び病態に罹患している対象のための代替的な治療法が当該技術分野において必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、ｉＲＮＡ剤、このような剤を含む組成物、及び本明細書に開示される方法を用いて、ＬＤＨＡを標的化することによって、肝臓特異的且つ優れたＬＤＨＡ及び尿中オキサレート低下効果が達成されるという発見に少なくとも部分的に基づいている。
【００１２】
したがって、本発明は、ＬＤＨＡ遺伝子のＲＮＡ転写物のＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）媒介性切断をもたらすｉＲＮＡ組成物を提供する。ＬＤＨＡ遺伝子は、細胞、例えば、ヒトなどの対象中の細胞内にあり得る。本発明は、ＬＤＨＡ遺伝子の発現を阻害するか又は低下させることから利益を得られ得る対象、例えば、尿中オキサレート産生の低下又は阻害から利益を得られ得る対象、例えば、オキサレート経路に関連する疾病、障害、又は病態に罹患しているか又は罹患しやすい対象、例えば、オキサレートに関連する疾病、障害、若しくは病態、例えば、腎臓結石形成疾病、障害、若しくは病態又はシュウ酸カルシウム組織沈着疾病、障害、若しくは病態；又はＬＤＨＡに関連する疾病、障害、若しくは病態に罹患しているか又は罹患しやすい対象を処置するために、ＬＤＨＡ遺伝子の発現を阻害するために、本発明のｉＲＮＡ組成物を使用する方法も提供する。
【００１３】
本発明は、ＬＤＨＡ遺伝子及びＨＡＯ１遺伝子のＲＮＡ転写物のＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）媒介性切断をもたらすｉＲＮＡ組成物も提供する。ＬＤＨＡ遺伝子及びＨＡＯ１遺伝子は、細胞、例えば、ヒトなどの対象中の細胞内にあり得る。本発明は、ＬＤＨＡ遺伝子及びＨＡＯ１遺伝子の発現を阻害するか又は低下させることから利益を得られ得る対象、例えば、尿中オキサレート産生の低下又は阻害から利益を得られ得る対象、例えば、オキサレートに関連する疾病、障害、若しくは病態、例えば、腎臓結石形成疾病、障害、若しくは病態又はシュウ酸カルシウム組織沈着疾病、障害、若しくは病態；又はＬＤＨに関連する疾病、障害、若しくは病態に罹患しているか又は罹患しやすい対象を処置するために、ＬＤＨＡ遺伝子及びＨＡＯ１遺伝子の発現を阻害するために、本発明のｉＲＮＡ組成物を使用する方法も提供する。
【００１４】
したがって、一態様において、本発明は、細胞内での乳酸脱水素酵素Ａ（ＬＤＨＡ）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤であって、前記ｄｓＲＮＡ剤が、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖が、表２〜５のいずれか１つに列挙されるアンチセンス配列のいずれか１つと３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む相補性の領域を含む、ｄｓＲＮＡ剤を提供する。
【００１５】
一実施形態において、ｄｓＲＮＡ剤は、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。
【００１６】
他の実施形態において、センス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが、修飾を含み；アンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが、修飾を含み；又はセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全て及びアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが、修飾を含む。
【００１７】
更に他の実施形態において、センス鎖のヌクレオチドの全てが、修飾を含み；アンチセンス鎖のヌクレオチドの全てが、修飾を含み；又はセンス鎖のヌクレオチドの全て及びアンチセンス鎖のヌクレオチドの全てが、修飾を含む。
【００１８】
一実施形態において、前記修飾ヌクレオチドの少なくとも１つが、デオキシ−ヌクレオチド、３’末端デオキシ−チミン（ｄＴ）ヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ−修飾ヌクレオチド、固定ヌクレオチド、非固定ヌクレオチド、立体配座的に制限されたヌクレオチド、拘束エチルヌクレオチド、非塩基性ヌクレオチド、２’−アミノ−修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−アリル−修飾ヌクレオチド、２’−Ｃ−アルキル−修飾ヌクレオチド、２’−ヒドロキシル−修飾ヌクレオチド、２’−メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキル−修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミデート、非天然塩基を含むヌクレオチド、テトラヒドロピラン修飾ヌクレオチド、１，５−アンヒドロヘキシトール修飾ヌクレオチド、シクロヘキセニル修飾ヌクレオチド、ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、メチルホスホネート基を含むヌクレオチド、５’−ホスフェートを含むヌクレオチド、５’−ホスフェート模倣体を含むヌクレオチド、グリコール修飾ヌクレオチド、及び２−Ｏ−（Ｎ−メチルアセトアミド）修飾ヌクレオチド、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００１９】
相補性の領域は、少なくとも１７ヌクレオチド長；１９〜３０ヌクレオチド長；１９〜２５ヌクレオチド長；又は２１〜２３ヌクレオチド長であり得る。
【００２０】
ｄｓＲＮＡ剤の各鎖は、３０ヌクレオチド長以下であり得る。ｄｓＲＮＡ剤の各鎖は、独立して、１９〜３０ヌクレオチド長；独立して、１９〜２５ヌクレオチド長；又は独立して、２１〜２３ヌクレオチド長であり得る。
【００２１】
ｄｓＲＮＡ剤の少なくとも１つの鎖が、少なくとも１つのヌクレオチドの３’オーバーハングを含み得；又は少なくとも１つの鎖が、少なくとも２つのヌクレオチドの３’オーバーハングを含み得る。
【００２２】
一実施形態において、ｄｓＲＮＡ剤は、少なくとも１つのホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合を更に含む。
【００２３】
ホスホロチオエート又メチルホスホネートヌクレオチド間結合は、１つの鎖（例えば、アンチセンス鎖；又はセンス鎖）の３’末端にあり得；又はホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合は、１つの鎖（例えば、アンチセンス鎖；又はセンス鎖）の５’末端にあり得；又はホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合は、１つの鎖の５’末端及び３’末端の両方にあり得る。
【００２４】
ｄｓＲＮＡ剤は、リガンドを更に含み得る。
【００２５】
一実施形態において、リガンドは、ｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖の３’末端にコンジュゲートされる。
【００２６】
一実施形態において、リガンドは、一価、二価、又は三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された１つ又は複数のＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）誘導体である。
【００２７】
別の実施形態において、リガンドは、
【化１】
2020532289.tif 000002
である。
【００２８】
一実施形態において、ｄｓＲＮＡ剤は、以下の概略図
【化２】
2020532289.tif 000003
に示されるリガンドにコンジュゲートされ、式中、Ｘが、Ｏ又はＳである。
【００２９】
一実施形態において、ＸがＯである。
【００３０】
一実施形態において、相補性の領域は、表２〜５のいずれか１つに列挙されるアンチセンス配列のうちの１つからなる。
【００３１】
一実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖は、表２〜５のいずれか１つに列挙される剤のいずれか１つのヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００３２】
別の態様において、本発明は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含む乳酸脱水素酵素Ａ（ＬＤＨＡ）の発現を阻害する第１の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤と；センス鎖及びアンチセンス鎖を含むヒドロキシ酸オキシダーゼ１（グリコール酸オキシダーゼ）（ＨＡＯ１）の発現を阻害する第２の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤とを含む二重標的化ＲＮＡｉ剤であって、第１のｄｓＲＮＡ剤及び第２のｄｓＲＮＡ剤が共有結合されている、二重標的化ＲＮＡｉ剤を提供する。
【００３３】
一実施形態において、第１のｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖は、配列番号１のヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、第１のｄｓＲＮＡ剤の前記アンチセンス鎖は、配列番号２のヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む。
【００３４】
別の実施形態において、第１のｄｓＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は、表２〜５のいずれか１つに列挙されるアンチセンス配列のいずれか１つと３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む相補性の領域を含む。
【００３５】
一実施形態において、第２のｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖は、配列番号２１のヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、第２のｄｓＲＮＡ剤の前記アンチセンス鎖は、配列番号２２のヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む。
【００３６】
別の実施形態において、第２のｄｓＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は、表７〜１４のいずれか１つに列挙されるアンチセンス配列のいずれか１つと３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む相補性の領域を含む。
【００３７】
一実施形態において、第１のｄｓＲＮＡ剤及び第２のｄｓＲＮＡ剤はそれぞれ、独立して、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。
【００３８】
別の実施形態において、センス鎖のヌクレオチドの実質的に全て及び第１のｄｓＲＮＡ剤のアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全て及及びセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全て及び第２のｄｓＲＮＡ剤のアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが、修飾ヌクレオチドである。
【００３９】
一実施形態において、第１のｄｓＲＮＡ剤の修飾ヌクレオチドの少なくとも１つ及び第２のｄｓＲＮＡ剤の修飾ヌクレオチドの少なくとも１つはそれぞれ、独立して、デオキシ−ヌクレオチド、３’末端デオキシ−チミン（ｄＴ）ヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ−修飾ヌクレオチド、固定ヌクレオチド、非固定ヌクレオチド、立体配座的に制限されたヌクレオチド、拘束エチルヌクレオチド、非塩基性ヌクレオチド、２’−アミノ−修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−アリル−修飾ヌクレオチド、２’−Ｃ−アルキル−修飾ヌクレオチド、２’−ヒドロキシル−修飾ヌクレオチド、２’−メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキル−修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミデート、非天然塩基を含むヌクレオチド、テトラヒドロピラン修飾ヌクレオチド、１，５−アンヒドロヘキシトール修飾ヌクレオチド、シクロヘキセニル修飾ヌクレオチド、ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、メチルホスホネート基を含むヌクレオチド、５’−ホスフェートを含むヌクレオチド、及び５’−ホスフェート模倣体を含むヌクレオチドからなる群から選択される。
【００４０】
別の実施形態において、第１のｄｓＲＮＡ剤の修飾ヌクレオチドの少なくとも１つ及び第２のｄｓＲＮＡ剤の修飾ヌクレオチドの少なくとも１つはそれぞれ、独立して、２’−Ｏ−メチル及び２’フルオロ修飾からなる群から選択される。
【００４１】
第１のｄｓＲＮＡ剤の相補性の領域及び／又は第２のｄｓＲＮＡ剤の相補性の領域はそれぞれ、独立して、１９〜３０ヌクレオチド長であり得る。
【００４２】
第１のｄｓＲＮＡ剤の各鎖及び第２のｄｓＲＮＡ剤の各鎖はそれぞれ、独立して、１９〜３０ヌクレオチド長であり得る。
【００４３】
一実施形態において、第１のｄｓＲＮＡ剤の少なくとも１つの鎖及び／又は第２のｄｓＲＮＡ剤の少なくとも１つの鎖はそれぞれ、独立して、少なくとも１つのヌクレオチドの３’オーバーハングを含む。
【００４４】
一実施形態において、第１のｄｓＲＮＡ剤及び／又は第２のｄｓＲＮＡ剤はそれぞれ、独立して、少なくとも１つのホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合を更に含む。
【００４５】
一実施形態において、第１のｄｓＲＮＡ剤及び／又は第２のｄｓＲＮＡ剤はそれぞれ、独立して、少なくとも１つのリガンドを更に含む。
【００４６】
別の実施形態において、少なくとも１つのリガンドは、第１のｄｓＲＮＡ剤及び／又は第２のｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖にコンジュゲートされる。
【００４７】
一実施形態において、少なくとも１つのリガンドは、センス鎖の１つの３’末端、５’末端、又は内部の位置にコンジュゲートされる。
【００４８】
別の実施形態において、少なくとも１つのリガンドは、第１のｄｓＲＮＡ剤及び／又は第２のｄｓＲＮＡ剤のアンチセンス鎖にコンジュゲートされる。
【００４９】
一実施形態において、少なくとも１つのリガンドは、アンチセンス鎖の１つの３’末端、５’末端、又は内部の位置にコンジュゲートされる。
【００５０】
一実施形態において、リガンドは、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）誘導体である。
【００５１】
一実施形態において、リガンドは、一価、二価、又は三価の分枝鎖状リンカーを介して結合される１つ又は複数のＧａｌＮＡｃ誘導体である。
【００５２】
一実施形態において、リガンドは、
【化３】
2020532289.tif 000004
である。
【００５３】
一実施形態において、第１のｄｓＲＮＡ剤及び第２のｄｓＲＮＡ剤はそれぞれ、独立して、以下の概略図
【化４】
2020532289.tif 000005
に示されるリガンドにコンジュゲートされ、式中、Ｘが、Ｏ又はＳである。
【００５４】
一実施形態において、ＸがＯである。
【００５５】
一実施形態において、第１のｄｓＲＮＡ剤及び第２のｄｓＲＮＡ剤は、共有結合リンカーを介して共有結合される。
【００５６】
一実施形態において、共有結合リンカーは、一本鎖核酸リンカー、二本鎖核酸リンカー、部分的に一本鎖の核酸リンカー、部分的に二本鎖の核酸リンカー、炭水化物部分リンカー、及びペプチドリンカーからなる群から選択される。別の実施形態において、共有結合リンカーは、切断可能なリンカー又は切断不可能なリンカーである。一実施形態において、共有結合リンカーは、第１のｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖を、第２のｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖に結合する。別の実施形態において、共有結合リンカーは、第１のｄｓＲＮＡ剤のアンチセンス鎖を、第２のｄｓＲＮＡ剤のアンチセンス鎖に結合する。
【００５７】
一実施形態において、共有結合リンカーは、少なくとも１つのリガンドを更に含む。
【００５８】
一実施形態において、細胞を、本発明の二重標的化ＲＮＡｉ剤と接触させることは、ＬＤＨＡ遺伝子及びＨＡＯ１遺伝子の発現を、細胞を両方のｄｓＲＮＡ剤と個別に接触させることによって得られる発現の阻害のレベルと実質的に同じレベルに阻害する。別の実施形態において、細胞を、二重標的化ＲＮＡｉ剤と接触させることは、ＬＤＨＡ遺伝子及びＨＡＯ１遺伝子の発現を、細胞を両方のｄｓＲＮＡ剤と個別に接触させることによって得られる発現の阻害のレベルより高いレベルに阻害する。
【００５９】
一実施形態において、ＬＤＨＡ発現の阻害のレベルが、細胞を両方のｄｓＲＮＡ剤と個別に接触させることによって得られる発現の阻害のレベルより少なくとも約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％又は約１００％高い。
【００６０】
一実施形態において、ＨＡＯ１発現の阻害のレベルが、細胞を両方のｄｓＲＮＡ剤と個別に接触させることによって得られる発現の阻害のレベルより少なくとも約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％又は約１００％高い。
【００６１】
一実施形態において、細胞を、二重標的化ＲＮＡｉ剤と接触させることは、オキサレート及び／又はグリオキシレートタンパク質産生を、細胞を両方のｄｓＲＮＡ剤と個別に接触させることによって得られるタンパク質産生のレベルより低いレベルに阻害する。別の実施形態において、細胞を、二重標的化ＲＮＡｉ剤と接触させることは、オキサレート及び／又はグリオキシレートタンパク質産生を、細胞を両方のｄｓＲＮＡ剤と個別に接触させることによって得られるタンパク質産生のレベルより低いレベルに阻害する。
【００６２】
本発明は、本発明のｄｓＲＮＡ剤又は二重標的化ＲＮＡｉ剤を含む細胞；及び本発明のｄｓＲＮＡ剤又は二重標的化ＲＮＡｉ剤の少なくとも１つの鎖をコードするベクターも提供する。
【００６３】
更に、本発明は、本発明のｄｓＲＮＡ剤を含む、乳酸脱水素酵素Ａ（ＬＤＨＡ）遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物；又は本発明の二重標的化ＲＮＡｉ剤を含む、乳酸脱水素酵素Ａ（ＬＤＨＡ）遺伝子及びヒドロキシ酸オキシダーゼ１（グリコール酸オキシダーゼ）（ＨＡＯ１）遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物を提供する。
【００６４】
一態様において、本発明は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含む乳酸脱水素酵素Ａ（ＬＤＨＡ）の発現を阻害する第１の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤であって、前記センス鎖が、配列番号１のヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号２のヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む第１の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤と；センス鎖及びアンチセンス鎖を含むヒドロキシ酸オキシダーゼ１（グリコール酸オキシダーゼ）（ＨＡＯ１）の発現を阻害する第２の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤であって、前記センス鎖が、配列番号２１のヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号２２のヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む第２の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤とを含む医薬組成物を提供する。
【００６５】
別の態様において、本発明は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含む乳酸脱水素酵素Ａ（ＬＤＨＡ）の発現を阻害する第１の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤であって、アンチセンス鎖が、表２〜５のいずれか１つに列挙されるアンチセンス配列のいずれか１つと３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む相補性の領域を含む第１の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤と；センス鎖及びアンチセンス鎖を含むヒドロキシ酸オキシダーゼ１（グリコール酸オキシダーゼ）（ＨＡＯ１）の発現を阻害する第２の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤であって、アンチセンス鎖が、表７〜１４のいずれか１つに列挙されるアンチセンス配列のいずれか１つと３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む相補性の領域を含む第２の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤とを含む医薬組成物を提供する。
【００６６】
この剤は、生理食塩水又は水などの非緩衝液中で製剤化されてもよく；又はこの剤は、酢酸塩、クエン酸塩、プロラミン、炭酸塩、若しくはリン酸塩又はそれらの任意の組み合わせを含む溶液；又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などの緩衝液とともに製剤化されてもよい。
【００６７】
本発明は、細胞内での乳酸脱水素酵素Ａ（ＬＤＨＡ）発現を阻害する方法を提供する。本方法は、細胞を、本発明の剤又は医薬組成物と接触させ、それによって、細胞内でのＬＤＨＡの発現を阻害する工程を含む。
【００６８】
本発明は、細胞内での乳酸脱水素酵素Ａ（ＬＤＨＡ）発現及びヒドロキシ酸オキシダーゼ１（グリコール酸オキシダーゼ）（ＨＡＯ１）発現を阻害する方法も提供する。本方法は、細胞を、本発明の二重標的化ＲＮＡｉ剤又は本発明の二重標的化剤を含む医薬組成物と接触させ、それによって、細胞内でのＬＤＨＡ及びＨＡＯ１の発現を阻害する工程を含む。
【００６９】
一実施形態において、細胞は、ヒトなどの対象中にある。
【００７０】
一実施形態において、ＬＤＨＡ発現は、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％だけ、又はＬＤＨＡ発現の検出のレベル未満まで阻害される。
【００７１】
一実施形態において、ＨＡＯ１発現は、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％だけ、又はＨＡＯ１発現の検出のレベル未満まで阻害される。
【００７２】
一実施形態において、ヒト対象は、オキサレート経路に関連する疾病、障害又は病態に罹患している。
【００７３】
一実施形態において、オキサレート経路に関連する疾病、障害、若しくは病態は、オキサレートに関連する疾病、障害、若しくは病態、又は乳酸脱水素酵素に関連する疾病、障害、若しくは病態である。
【００７４】
一実施形態において、オキサレートに関連する疾病、障害、若しくは病態は、腎臓結石形成疾病、障害、若しくは病態、又はシュウ酸カルシウム組織沈着疾病、障害、若しくは病態である。
【００７５】
一実施形態において、腎臓結石形成疾病、障害、若しくは病態は、シュウ酸カルシウム結石形成疾病、障害、若しくは病態又は非シュウ酸カルシウム結石形成疾病、障害、若しくは病態である。
【００７６】
一実施形態において、シュウ酸カルシウム結石形成疾病、障害、若しくは病態は、高シュウ酸尿症疾病、障害、若しくは病態又は非高シュウ酸尿症疾病、障害、若しくは病態である。
【００７７】
一実施形態において、高シュウ酸尿症疾病、障害、若しくは病態は、原発性高シュウ酸尿症、腸管高シュウ酸尿症、食餌性高シュウ酸尿症、及び特発性高シュウ酸尿症からなる群から選択される。
【００７８】
一実施形態において、非高シュウ酸尿症結石形成疾病、障害、若しくは病態は、高カルシウム尿症及び／又は低クエン酸尿症である。
【００７９】
一実施形態において、非高シュウ酸尿症結石形成疾病、障害、若しくは病態は、シュウ酸カルシウム又は非シュウ酸カルシウム腎臓結石形成疾病である。
【００８０】
一実施形態において、シュウ酸カルシウム組織沈着疾病、障害、若しくは病態は、全身性シュウ酸カルシウム組織沈着疾病、障害、若しくは病態又は組織特異的シュウ酸カルシウム組織沈着疾病、障害、若しくは病態からなる群から選択される。
【００８１】
一実施形態において、乳酸脱水素酵素に関連する疾病、障害、若しくは病態は、癌、脂肪肝（脂肪症）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、肝臓中の脂肪の蓄積、肝臓の炎症、肝細胞壊死、肝線維症、及び非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）からなる群から選択される。
【００８２】
一実施形態において、細胞は、肝細胞である。
【００８３】
一態様において、本発明は、対象におけるＬＤＨＡの発現を阻害する方法を提供する。本方法は、治療有効量の、本発明の剤又は医薬組成物を対象に投与し、それによって、対象におけるＬＤＨＡの発現を阻害する工程を含む。
【００８４】
別の態様において、本発明は、対象における乳酸脱水素酵素Ａ（ＬＤＨＡ）発現及びヒドロキシ酸オキシダーゼ１（グリコール酸オキシダーゼ）（ＨＡＯ１）発現を阻害する方法を提供する。本方法は、治療有効量の、本発明の二重標的化ＲＮＡｉ剤、又は本発明の二重標的化ＲＮＡｉ剤を含む医薬組成物を対象に投与し、それによって、対象におけるＬＤＨＡ及びＨＡＯ１の発現を阻害する工程を含む。
【００８５】
一態様において、本発明は、ＬＤＨＡ発現の低下から利益を得られ得る障害に罹患している対象を処置する方法を提供する。本方法は、治療有効量の、本発明の剤又は医薬組成物を対象に投与し、それによって、前記対象を処置する工程を含む。
【００８６】
別の態様において、本発明は、ＬＤＨＡ遺伝子の発現の低下から利益を得られ得る疾病又は障害に罹患している対象の少なくとも１つの症状を予防する方法を提供する。本方法は、予防的に有効な量の、本発明の剤又は医薬組成物を対象に投与し、それによって、対象の少なくとも１つの症状を予防する工程を含む。
【００８７】
一実施形態において、障害は、オキサレート経路に関連する疾病、障害又は病態である。
【００８８】
一態様において、本発明は、オキサレート経路に関連する疾病、障害又は病態に罹患している対象を処置する方法を提供する。本方法は、治療有効量の、本発明の剤又は医薬組成物を対象に投与し、それによって、対象を処置する工程を含む。
【００８９】
別の態様において、本発明は、オキサレート経路に関連する疾病、障害又は病態に罹患している対象の少なくとも１つの症状を予防する方法を提供する。本方法は、予防的に有効な量の、本発明の剤又は医薬組成物を対象に投与し、それによって、対象の少なくとも１つの症状を予防する工程を含む。
【００９０】
一実施形態において、対象へのｄｓＲＮＡ剤又は医薬組成物の投与は、１つ又は尿中オキサレート、組織オキサレート、血漿オキサレートの減少、ＬＤＨＡ酵素活性の低下、ＬＤＨＡタンパク質蓄積の減少、及び／又はＨＡＯ１タンパク質蓄積の減少を引き起こす。
【００９１】
一実施形態において、オキサレート経路に関連する疾病、障害、若しくは病態は、オキサレートに関連する疾病、障害、若しくは病態、又は乳酸脱水素酵素に関連する疾病、障害、若しくは病態である。
【００９２】
一実施形態において、オキサレートに関連する疾病、障害、若しくは病態は、腎臓結石形成疾病、障害、若しくは病態、又はシュウ酸カルシウム組織沈着疾病、障害、若しくは病態である。
【００９３】
一実施形態において、腎臓結石形成疾病、障害、若しくは病態は、シュウ酸カルシウム結石形成疾病、障害、若しくは病態又は非シュウ酸カルシウム結石形成疾病、障害、若しくは病態である。
【００９４】
一実施形態において、シュウ酸カルシウム結石形成疾病、障害、若しくは病態は、高シュウ酸尿症疾病、障害、若しくは病態又は非高シュウ酸尿症疾病、障害、若しくは病態である。
【００９５】
一実施形態において、高シュウ酸尿症疾病、障害、若しくは病態は、原発性高シュウ酸尿症、腸管高シュウ酸尿症、食餌性高シュウ酸尿症、及び特発性高シュウ酸尿症からなる群から選択される。
【００９６】
一実施形態において、非高シュウ酸尿症結石形成疾病、障害、若しくは病態は、高カルシウム尿症及び／又は低クエン酸尿症である。
【００９７】
一実施形態において、非高シュウ酸尿症結石形成疾病、障害、若しくは病態は、シュウ酸カルシウム又は非シュウ酸カルシウム腎臓結石形成疾病である。
【００９８】
一実施形態において、シュウ酸カルシウム組織沈着疾病、障害、若しくは病態は、全身性シュウ酸カルシウム組織沈着疾病、障害、若しくは病態又は組織特異的シュウ酸カルシウム組織沈着疾病、障害、若しくは病態からなる群から選択される。
【００９９】
一実施形態において、乳酸脱水素酵素に関連する疾病、障害、若しくは病態は、癌、脂肪肝（脂肪症）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、肝臓中の脂肪の蓄積、肝臓の炎症、肝細胞壊死、肝線維症、及び非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）からなる群から選択される。
【０１００】
一実施形態において、疾病、障害若しくは病態は、原発性高シュウ酸尿症２（ＰＨ２）である。
【０１０１】
一実施形態において、本方法は、対象の食事を変化させること（例えば、タンパク質摂取量を減少させること、ナトリウム摂取量を減少させること、アスコルビン酸摂取量を減少させること、カルシウム摂取量を抑えること、リン酸塩を補給すること、マグネシウムを補給すること、及びピリドキシン処理；及び上記のいずれかの組み合わせ）を更に含む。
【０１０２】
一実施形態において、対象は、更に腎臓移植を受ける。
【０１０３】
一実施形態において、対象はヒトである。
【０１０４】
一実施形態において、本方法は、更なる治療剤を対象に投与する工程を更に含む。
【０１０５】
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ又は約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの用量で対象に投与される。
【０１０６】
一実施形態において、この剤は、対象に皮下投与される。
【０１０７】
一実施形態において、この剤は、乳酸脱水素酵素Ｂ（ＬＤＨＢ）の発現及び／又は活性を実質的に阻害しない。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１Ａ】オキサレート合成のための内因性経路の概略図である。
【図１Ｂ】ＬＤＨＡに関連する代謝経路の概略図である。
【図２】単回の０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、又は１０ｍｇ／ｋｇの用量のＡＤ−８４７８８の投与の１０日後に野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス中に残っているＬｄｈａ  ｍＲＮＡのレベルを示すグラフである。
【図３】単回の０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、又は１０ｍｇ／ｋｇの用量のＡＤ−８４７８８の皮下投与の４週間後の成体雄Ａｇｘｔノックアウトマウスにおける肝臓ＬＤＨＡ活性を示すグラフである。０ｍｇ／ｋｇのＡＤ−８４７８８を投与されたＡｇｘｔノックアウトマウスを、非処理の対照として用いた。
【図４】実施例３に記載され、図６〜１７Ｂにおいて示される試験プロトコルの概略図である。
【図５】単回の０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、又は１０ｍｇ／ｋｇの用量のＡＤ−８４７８８の皮下投与の０、１、２、３、４、６、８、９、及び１０週間後に２４時間の期間にわたってＡｇｘｔノックアウトマウスによって排泄された尿中オキサレートの量（クレアチニンのｇ当たりのｍｇ）を示すグラフである。０ｍｇ／ｋｇのＡＤ−８４７８８を投与されたＡｇｘｔノックアウトマウスを、非処理の対照として用いた。
【図６】単回の１０ｍｇ／ｋｇの用量のＡＤ−８４７８８の４週間後にＡｇｘｔノックアウトマウス、野生型マウス、及びＧｒｈｐｒ（グリオキシレートレダクターゼ／ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ）ノックアウトマウスの尿中に排泄されたオキサレートの量（クレアチニンのｇ当たりのｍｇ）を示すグラフである。
【図７】投与前（ベースライン、即ち、−６、−５、−４、及び−３日目）；単回の１０ｍｇ／ｋｇの用量のＡＤ−８４７８８の７〜１０日後；及び０、１１、１８、及び２５日目における４回の１０／ｍｇ／ｋｇの用量のＡＤ−８４７８８の最後の投与の２８〜３１日後（図４を参照）の、０日目にｄｓＲＮＡ剤ＡＤ−８４７８８を投与されたＡｇｘｔ欠損マウスの尿中に排泄されたオキサレートの量（クレアチニンのｇ当たりのｍｇ）を示すグラフである。
【図８Ａ】非処理の対照マウス及び乳酸を基質として用いて４回の１０ｍｇ／ｋｇの用量のＡＤ−８４７８８（図４を参照）を投与されたマウスの野生型肝臓ホモジネート中のＬｄｈＡの酵素活性を示すグラフである。ＮＡＤがＬＤＨ酵素活性によってＮＡＤＨへと還元されるにつれて、吸光度が増加する。初期線形範囲を選択し、１及び６分の時点での吸光度を、比活性度計算において、５分のΔｔｉｍｅにわたるΔａｂｓとして用いた。
【図８Ｂ】非処理の対照マウス及び乳酸を基質として用いて４回の１０ｍｇ／ｋｇの用量のＡＤ−８４７８８（図４を参照）を投与されたマウスの野生型肝臓ホモジネート中のＬｄｈＡの平均比活性度を示すグラフである。比活性度が、形成されたＮＡＤＨのμｍｏｌ／分／ｇタンパク質として表される。計算を、全ての動物について個別に行い、両方の処理群からの全ての比活性度データを比較するｔ検定を行った。両方の処理群の平均比活性度が示される。（ｐ＜０．００１）。
【図９Ａ】非処理の対照マウス及びグリオキシレートを基質として用いて４回の１０ｍｇ／ｋｇの用量のＡＤ−８４７８８（図４を参照）を投与されたマウスの野生型肝臓ホモジネート中のＬｄｈＡの酵素活性を示すグラフである。ＮＡＤがＬＤＨ酵素活性によってＮＡＤＨへと還元されるにつれて、吸光度が増加する。初期線形範囲を選択し、０及び４分の時点での吸光度を、比活性度計算において、４分のΔｔｉｍｅにわたるΔａｂｓとして用いた。
【図９Ｂ】非処理の対照マウス及びグリオキシレートを基質として用いて４回の１０ｍｇ／ｋｇの用量のＡＤ−８４７８８（図４を参照）を投与されたマウスの野生型肝臓ホモジネート中のＬｄｈＡの平均比活性度を示すグラフである。比活性度が、形成されたＮＡＤＨのμｍｏｌ／分／ｇタンパク質として表される。計算を、全ての動物について個別に行い、両方の処理群からの全ての比活性度データを比較するｔ検定を行った。両方の処理群の平均比活性度が示される。（ｐ＜０．００１）。
【図１０Ａ】非処理の対照マウス及び乳酸を基質として用いて４回の１０ｍｇ／ｋｇの用量のＡＤ−８４７８８（図４を参照）を投与されたマウスのＡｇｘｔ欠損肝臓ホモジネート中のＬｄｈＡの酵素活性を示すグラフである。ＮＡＤがＬＤＨ酵素活性によってＮＡＤＨへと還元されるにつれて、吸光度が増加する。初期線形範囲を選択し、０及び４分の時点での吸光度を、比活性度計算において、４分のΔｔｉｍｅにわたるΔａｂｓとして用いた。平均処理群において、ＳＤは、小さ過ぎて視覚化されない。
【図１０Ｂ】非処理の対照マウス及び乳酸を基質として用いて４回の１０ｍｇ／ｋｇの用量のＡＤ−８４７８８（図４を参照）を投与されたマウスのＡｇｘｔ欠損肝臓ホモジネート中のＬｄｈＡの平均比活性度を示すグラフである。比活性度が、形成されたＮＡＤＨのμｍｏｌ／分／ｇタンパク質として表される。計算を、全ての動物について個別に行い、両方の処理群からの全ての比活性度データを比較するｔ検定を行った。両方の処理群の平均比活性度が示される。（ｐ＜０．００１）。
【図１１Ａ】非処理の対照マウス及びグリオキシレートを基質として用いて４回の１０ｍｇ／ｋｇの用量のＡＤ−８４７８８（図４を参照）を投与されたマウスのＡｇｘｔ欠損肝臓ホモジネート中のＬｄｈＡの酵素活性を示すグラフである。ＮＡＤがＬＤＨ酵素活性によってＮＡＤＨへと還元されるにつれて、吸光度が増加する。初期線形範囲を選択し、０及び４分の時点での吸光度を、比活性度計算において、４分のΔｔｉｍｅにわたるΔａｂｓとして用いた。
【図１１Ｂ】非処理の対照マウス及びグリオキシレートを基質として用いて４回の１０ｍｇ／ｋｇの用量のＡＤ−８４７８８（図４を参照）を投与されたマウスのＡｇｘｔ欠損肝臓ホモジネート中のＬｄｈＡの平均比活性度を示すグラフである。比活性度が、形成されたＮＡＤＨのμｍｏｌ／分／ｇタンパク質として表される。計算を、全ての動物について個別に行い、両方の処理群からの全ての比活性度データを比較するｔ検定を行った。両方の処理群の平均比活性度が示される。（ｐ＜０．００１）。
【図１２Ａ】非処理の対照マウス及び乳酸を基質として用いて４回の１０ｍｇ／ｋｇの用量のＡＤ−８４７８８（図４を参照）を投与されたマウスの野生型心臓ホモジネート中のＬｄｈＡの酵素活性を示すグラフである。ＮＡＤがＬＤＨ酵素活性によってＮＡＤＨへと還元されるにつれて、対照群及び処理群の両方についての吸光度が増加する。初期線形範囲を選択し、０及び４分の時点での吸光度を、比活性度計算において、４分のΔｔｉｍｅにわたるΔａｂｓとして用いた。
【図１２Ｂ】非処理の対照マウス及び乳酸を基質として用いて４回の１０ｍｇ／ｋｇの用量のＡＤ−８４７８８（図４を参照）を投与されたマウスの野生型心臓ホモジネート中のＬｄｈＡの平均比活性度を示すグラフである。比活性度が、形成されたＮＡＤＨのμｍｏｌ／分／ｇタンパク質として表される。計算を、全ての動物について個別に行い、両方の処理群からの全ての比活性度データを比較するｔ検定を行った。両方の処理群の平均比活性度が示される。有意差はない。
【図１２Ｃ】非処理の対照マウス及び乳酸を基質として用いて４回の１０ｍｇ／ｋｇの用量のＡＤ−８４７８８（図４を参照）を投与されたマウスの野生型大腿筋ホモジネート中のＬｄｈＡの酵素活性を示すグラフである。ＮＡＤがＬＤＨ酵素活性によってＮＡＤＨへと還元されるにつれて、対照群及び処理群の両方についての吸光度が増加する。初期線形範囲を選択し、０及び４分の時点での吸光度を、比活性度計算において、４分のΔｔｉｍｅにわたるΔａｂｓとして用いた。
【図１２Ｄ】非処理の対照マウス及び乳酸を基質として用いて４回の１０ｍｇ／ｋｇの用量のＡＤ−８４７８８（図４を参照）を投与されたマウスの野生型大腿筋ホモジネート中のＬｄｈＡの平均比活性度を示すグラフである。比活性度が、形成されたＮＡＤＨのμｍｏｌ／分／ｇタンパク質として表される。計算を、全ての動物について個別に行い、両方の処理群からの全ての比活性度データを比較するｔ検定を行った。両方の処理群の平均比活性度が示される。有意差はない。
【図１３Ａ】４回の１０ｍｇ／ｋｇの用量のＡＤ−８４７８８の投与前（ベースライン）の野生型マウスの野生型肝臓ホモジネート中のラクテートの平均量、及び４回の１０ｍｇ／ｋｇの用量のＡＤ−８４７８８（図４を参照）の投与の４週間後の野生型マウスの野生型肝臓ホモジネート中のラクテートの平均量を示すグラフである。
【図１３Ｂ】４回の１０ｍｇ／ｋｇの用量のＡＤ−８４７８８の投与前（ベースライン）の野生型マウスの野生型肝臓ホモジネート中のピルベートの平均量、及び４回の１０ｍｇ／ｋｇの用量のＡＤ−８４７８８（図４を参照）の投与の４週間後の野生型マウスの野生型肝臓ホモジネート中のピルベートの平均量を示すグラフである。
【図１４Ａ】４回の１０ｍｇ／ｋｇの用量のＡＤ−８４７８８の投与前（ベースライン）のＡｇｘｔ欠損マウスのＡｇｘｔ欠損肝臓ホモジネート中のラクテートの平均量、及び４回の１０ｍｇ／ｋｇの用量のＡＤ−８４７８８（図４を参照）の投与の４週間後のＡｇｘｔ欠損マウスのＡｇｘｔ欠損肝臓ホモジネート中のラクテートの平均量を示すグラフである。
【図１４Ｂ】４回の１０ｍｇ／ｋｇの用量のＡＤ−８４７８８の投与前（ベースライン）のＡｇｘｔ欠損マウスのＡｇｘｔ欠損肝臓ホモジネート中のピルベートの平均量、及び４回の１０ｍｇ／ｋｇの用量のＡＤ−８４７８８（図４を参照）の投与の４週間後のＡｇｘｔ欠損マウスのＡｇｘｔ欠損肝臓ホモジネート中のピルベートの平均量を示すグラフである。
【図１５Ａ】４回の１０ｍｇ／ｋｇの用量のＡＤ−８４７８８の投与前（ベースライン）の野生型マウスの野生型肝臓ホモジネート中のグリオキシレートの平均量、及び４回の１０ｍｇ／ｋｇの用量のＡＤ−８４７８８（図４を参照）の投与の４週間後の野生型マウスの野生型肝臓ホモジネート中のグリオキシレートの平均量を示すグラフである。
【図１５Ｂ】４回の１０ｍｇ／ｋｇの用量のＡＤ−８４７８８の投与前（ベースライン）のＡｇｘｔ欠損マウスのＡｇｘｔ欠損肝臓ホモジネート中のグリオキシレートの平均量、及び４回の１０ｍｇ／ｋｇの用量のＡＤ−８４７８８（図４を参照）の投与の４週間後のＡｇｘｔ欠損マウスのＡｇｘｔ欠損肝臓ホモジネート中のグリオキシレートの平均量を示すグラフである。
【図１６Ａ】４回の１０ｍｇ／ｋｇの用量のＡＤ−８４７８８の投与前（ベースライン）の野生型マウスの平均体重、及び４回の１０ｍｇ／ｋｇの用量のＡＤ−８４７８８（図４を参照）の投与の４週間後の野生型マウスの平均体重を示すグラフである。
【図１６Ｂ】４回の１０ｍｇ／ｋｇの用量のＡＤ−８４７８８の投与前（ベースライン）のＡｇｘｔ欠損マウスの平均体重、及び４回の１０ｍｇ／ｋｇの用量のＡＤ−８４７８８（図４を参照）の投与の４週間後のＡｇｘｔ欠損マウスの平均体重を示すグラフである。
【図１７Ａ】４回の１０ｍｇ／ｋｇの用量のＡＤ−８４７８８の投与前（ベースライン）の野生型マウスの平均血漿ラクテートレベル、及び４回の１０ｍｇ／ｋｇの用量のＡＤ−８４７８８（図４を参照）の投与の４週間後の野生型マウスの平均血漿ラクテートレベルを示すグラフである。
【図１７Ｂ】４回の１０ｍｇ／ｋｇの用量のＡＤ−８４７８８の投与前（ベースライン）のＡｇｘｔ欠損マウスの平均血漿ラクテートレベル、及び４回の１０ｍｇ／ｋｇの用量のＡＤ−８４７８８（図４を参照）の投与の４週間後のＡｇｘｔ欠損マウスの平均血漿ラクテートレベルを示すグラフである。
【図１８Ａ−１８Ｏ】本発明の例示的な二重標的化剤を示す。
【図１８Ａ】ＬＤＨＡを標的とする第１のｄｓＲＮＡ剤及びＨＡＯ１を標的とする第２のｄｓＲＮＡ剤を含む、本発明の例示的な二重標的化剤を示し、ここで、第１のｄｓＲＮＡ剤は、第１のセンス鎖（Ｓ）及び第１のアンチセンス鎖（ＡＳ）を含み、第２のｄｓＲＮＡ剤は、第２のセンス鎖（Ｓ）及び第２のアンチセンス鎖を含み、ここで、第１のセンス鎖の３’末端は、２’ＯＭｅ修飾ヌクレオチド（ｕｕｕ）を含むヌクレオチドリンカーにより、第２のセンス鎖の５’末端に共有結合され、第２のセンス鎖の３’末端は、ＧａｌＮＡｃリガンドを含み、第１のセンス鎖の２つの最も５’側のヌクレオチドはそれぞれ、独立して、ホスホロチオエート結合を含む。
【図１８Ｂ】ＬＤＨＡを標的とする第１のｄｓＲＮＡ剤及びＨＡＯ１を標的とする第２のｄｓＲＮＡ剤を含む、本発明の例示的な二重標的化剤を示し、ここで、第１のｄｓＲＮＡ剤は、第１のセンス鎖（Ｓ）及び第１のアンチセンス鎖（ＡＳ）を含み、第２のｄｓＲＮＡ剤は、第２のセンス鎖（Ｓ）及び第２のアンチセンス鎖（ＡＳ）を含み、ここで、第１のセンス鎖の３’末端は、２’フルオロ修飾ヌクレオチド（ＧｆＡｆＡｆ）を含むヌクレオチドリンカーにより、第２のセンス鎖の５’末端に共有結合され、第２のセンス鎖の３’末端は、ＧａｌＮＡｃリガンドを含み、第１のセンス鎖の２つの最も５’側のヌクレオチド、第１のセンス鎖の最も３’側のヌクレオチド、及び第２のセンス鎖の最も５’側のヌクレオチドはそれぞれ、独立して、ホスホロチオエート結合を含む。
【図１８Ｃ】ＬＤＨＡを標的とする第１のｄｓＲＮＡ剤及びＨＡＯ１を標的とする第２のｄｓＲＮＡ剤を含む、本発明の例示的な二重標的化剤を示し、ここで、第１のｄｓＲＮＡ剤は、第１のセンス鎖（Ｓ）及び第１のアンチセンス鎖（ＡＳ）を含み、第２のｄｓＲＮＡ剤は、第２のセンス鎖（Ｓ）及び第２のアンチセンス鎖（ＡＳ）を含み、第１のセンス鎖の３’末端は、２’フルオロ修飾ヌクレオチド（ＧｆＡｆＵｆ）を含むヌクレオチドリンカーにより、第２のセンス鎖の５’末端に共有結合され、第２のセンス鎖の３’末端は、ＧａｌＮＡｃリガンドを含み、第１のセンス鎖の２つの最も５’側のヌクレオチド、第１のセンス鎖の最も３’側のヌクレオチド、及び第２のセンス鎖の最も５’側のヌクレオチドはそれぞれ、独立して、ホスホロチオエート結合を含む。
【図１８Ｄ】ＬＤＨＡを標的とする第１のｄｓＲＮＡ剤及びＨＡＯ１を標的とする第２のｄｓＲＮＡ剤を含む、本発明の例示的な二重標的化剤を示し、ここで、第１のｄｓＲＮＡ剤は、第１のセンス鎖（Ｓ）及び第１のアンチセンス鎖（ＡＳ）を含み、第２のｄｓＲＮＡ剤は、第２のセンス鎖（Ｓ）及び第２のアンチセンス鎖（ＡＳ）を含み、第１のセンス鎖の３’末端は、デオキシリボヌクレオチド（ｄｇｄａｄａ）を含むヌクレオチドリンカーにより、第２のセンス鎖の５’末端に共有結合され、第２のセンス鎖の３’末端は、ＧａｌＮＡｃリガンドを含み、第１のセンス鎖の２つの最も５’側のヌクレオチド、第１のセンス鎖の最も３’側のヌクレオチド、及び第２のセンス鎖の最も５’側のヌクレオチドはそれぞれ、独立して、ホスホロチオエート結合を含む。
【図１８Ｅ】ＬＤＨＡを標的とする第１のｄｓＲＮＡ剤及びＨＡＯ１を標的とする第２のｄｓＲＮＡ剤を含む、本発明の例示的な二重標的化剤を示し、ここで、第１のｄｓＲＮＡ剤は、第１のセンス鎖（Ｓ）及び第１のアンチセンス鎖（ＡＳ）を含み、第２のｄｓＲＮＡ剤は、第２のセンス鎖（Ｓ）及び第２のアンチセンス鎖（ＡＳ）を含み、ここで、第１のセンス鎖の３’末端は、デオキシリボヌクレオチド（ｄｇｄａ）を含むヌクレオチドリンカーにより、第２のセンス鎖の５’末端に共有結合され、第２のセンス鎖の３’末端は、ＧａｌＮＡｃリガンドを含み、第１のセンス鎖の２つの最も５’側のヌクレオチド、第１のセンス鎖の最も３’側のヌクレオチド、及び第２のセンス鎖の最も５’側のヌクレオチドはそれぞれ、独立して、ホスホロチオエート結合を含む。
【図１８Ｆ】ＬＤＨＡを標的とする第１のｄｓＲＮＡ剤及びＨＡＯ１を標的とする第２のｄｓＲＮＡ剤を含む、本発明の例示的な二重標的化剤を示し、ここで、第１のｄｓＲＮＡ剤は、第１のセンス鎖（Ｓ）及び第１のアンチセンス鎖（ＡＳ）を含み、第２のｄｓＲＮＡ剤は、第２のセンス鎖（Ｓ）及び第２のアンチセンス鎖（ＡＳ）を含み、第１のセンス鎖の３’末端は、第２のセンス鎖の５’末端に直接（リンカーなしで）結合され、第１のセンス鎖の２つの最も５’側のヌクレオチド及び第２のセンス鎖の２つの最も３’側のヌクレオチドはそれぞれ、独立して、ホスホロチオエート結合を含み、第１のセンス鎖の３’末端は、ＧａｌＮＡｃリガンドを含む。
【図１８Ｇ】ＬＤＨＡを標的とする第１のｄｓＲＮＡ剤及びＨＡＯ１を標的とする第２のｄｓＲＮＡ剤を含む、本発明の例示的な二重標的化剤を示し、ここで、第１のｄｓＲＮＡ剤は、第１のセンス鎖（Ｓ）及び第１のアンチセンス鎖（ＡＳ）を含み、第２のｄｓＲＮＡ剤は、第２のセンス鎖（Ｓ）及び第２のアンチセンス鎖（ＡＳ）を含み、第１のアンチセンス鎖の５’末端は、２’ＯＭｅ修飾ヌクレオチド（ａｃｕ）を含むヌクレオチドリンカーにより、第２のアンチセンス鎖の３’末端に共有結合され、第２のセンス鎖の３’末端は、ＧａｌＮＡｃリガンドを含み、第１のアンチセンス鎖の２つの最も３’側のヌクレオチド及び第２のアンチセンス鎖の２つの最も５’側のヌクレオチドはそれぞれ、独立して、ホスホロチオエート結合を含む。
【図１８Ｈ】ＬＤＨＡを標的とする第１のｄｓＲＮＡ剤及びＨＡＯ１を標的とする第２のｄｓＲＮＡ剤を含む、本発明の例示的な二重標的化剤を示し、ここで、第１のｄｓＲＮＡ剤は、第１のセンス鎖（Ｓ）及び第１のアンチセンス鎖（ＡＳ）を含み、第２のｄｓＲＮＡ剤は、第２のセンス鎖（Ｓ）及び第２のアンチセンス鎖（ＡＳ）を含み、第１のアンチセンス鎖の５’末端は、２’フルオロ修飾ヌクレオチド（ＡｆＡｆＧｆ）を含むヌクレオチドリンカーにより、第２のアンチセンス鎖の３’末端に共有結合され、第２のセンス鎖の３’末端は、ＧａｌＮＡｃリガンドを含み、第１のアンチセンス鎖の２つの最も３’側のヌクレオチド、第１のアンチセンス鎖の５’ヌクレオチド、第２のアンチセンス鎖の３’ヌクレオチド、及び第２のアンチセンス鎖の２つの最も５’側のヌクレオチドはそれぞれ、独立して、ホスホロチオエート結合を含む。
【図１８Ｉ】ＬＤＨＡを標的とする第１のｄｓＲＮＡ剤及びＨＡＯ１を標的とする第２のｄｓＲＮＡ剤を含む、本発明の例示的な二重標的化剤を示し、ここで、第１のｄｓＲＮＡ剤は、第１のセンス鎖（Ｓ）及び第１のアンチセンス鎖（ＡＳ）を含み、第２のｄｓＲＮＡ剤は、第２のセンス鎖（Ｓ）及び第２のアンチセンス鎖（ＡＳ）を含み、ここで、第１のアンチセンス鎖の５’末端は、第２のアンチセンス鎖の３’末端に直接（リンカーなしで）結合され、第２のセンス鎖の３’末端は、ＧａｌＮＡｃリガンドを含み、第１のアンチセンス鎖の２つの最も３’側のヌクレオチド及び第２のアンチセンス鎖の２つの最も５’側のヌクレオチドはそれぞれ、独立して、ホスホロチオエート結合を含む。
【図１８Ｊ】ＬＤＨＡを標的とする第１のｄｓＲＮＡ剤及びＨＡＯ１を標的とする第２のｄｓＲＮＡ剤を含む、本発明の例示的な二重標的化剤を示し、ここで、第１のｄｓＲＮＡ剤は、第１のセンス鎖（Ｓ）及び第１のアンチセンス鎖（ＡＳ）を含み、第２のｄｓＲＮＡ剤は、第２のセンス鎖（Ｓ）及び第２のアンチセンス鎖（ＡＳ）を含み、ここで、第１のセンス鎖の３’末端は、２’ＯＭｅ修飾ヌクレオチド（ｕｕｕ）を含むヌクレオチドリンカーにより第２のセンス鎖の５’末端に共有結合され、第１のセンス鎖の５’末端及び第２のセンス鎖の３’末端はそれぞれ、独立して、ＧａｌＮＡｃリガンドを含み、第１のセンス鎖の５’ヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合を含む。
【図１８Ｋ】ＬＤＨＡを標的とする第１のｄｓＲＮＡ剤及びＨＡＯ１を標的とする第２のｄｓＲＮＡ剤を含む、本発明の例示的な二重標的化剤を示し、ここで、第１のｄｓＲＮＡ剤は、第１のセンス鎖（Ｓ）及び第１のアンチセンス鎖（ＡＳ）を含み、第２のｄｓＲＮＡ剤は、第２のセンス鎖（Ｓ）及び第２のアンチセンス鎖（ＡＳ）を含み、ここで、第１のセンス鎖の３’末端は、２’フルオロ修飾ヌクレオチド（ＧｆＡｆＡｆ）を含むヌクレオチドリンカーにより、第２のセンス鎖の５’末端に共有結合され、第１のセンス鎖の５’末端及び第２のセンス鎖の３’末端はそれぞれ、独立して、ＧａｌＮＡｃリガンドを含み、第１のセンス鎖の５’ヌクレオチド、第１のセンス鎖の３’ヌクレオチド、及び第２のセンス鎖の５’ヌクレオチドはそれぞれ、独立して、ホスホロチオエート結合を含む。
【図１８Ｌ】ＬＤＨＡを標的とする第１のｄｓＲＮＡ剤及びＨＡＯ１を標的とする第２のｄｓＲＮＡ剤を含む、本発明の例示的な二重標的化剤を示し、ここで、第１のｄｓＲＮＡ剤は、第１のセンス鎖（Ｓ）及び第１のアンチセンス鎖（ＡＳ）を含み、第２のｄｓＲＮＡ剤は、第２のセンス鎖（Ｓ）及び第２のアンチセンス鎖（ＡＳ）を含み、第１のセンス鎖の３’末端は、第２のセンス鎖の５’末端に直接（リンカーなしで）結合され、第１のセンス鎖の３’末端及び第２のセンス鎖の３’末端はそれぞれ、独立して、ＧａｌＮＡｃリガンドを含み、第１のセンス鎖の２つの最も５’側のヌクレオチドはそれぞれ、独立して、ホスホロチオエート結合を含む。
【図１８Ｍ】ＬＤＨＡを標的とする第１のｄｓＲＮＡ剤及びＨＡＯ１を標的とする第２のｄｓＲＮＡ剤を含む、本発明の例示的な二重標的化剤を示し、ここで、第１のｄｓＲＮＡ剤は、第１のセンス鎖（Ｓ）及び第１のアンチセンス鎖（ＡＳ）を含み、第２のｄｓＲＮＡ剤は、第２のセンス鎖（Ｓ）及び第２のアンチセンス鎖（ＡＳ）を含み、ここで、第１のアンチセンス鎖の５’末端は、２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチド（ａｃｕ）を含むヌクレオチドリンカーにより、第２のアンチセンス鎖の３’末端に共有結合され、第１のアンチセンス鎖の３’末端及び第２のセンス鎖の３’末端はそれぞれ、独立して、ＧａｌＮＡｃリガンドを含み、第２のアンチセンス鎖の２つの最も５’側のヌクレオチドはそれぞれ、独立して、ホスホロチオエート結合を含む。
【図１８Ｎ】ＬＤＨＡを標的とする第１のｄｓＲＮＡ剤及びＨＡＯ１を標的とする第２のｄｓＲＮＡ剤を含む、本発明の例示的な二重標的化剤を示し、ここで、第１のｄｓＲＮＡ剤は、第１のセンス鎖（Ｓ）及び第１のアンチセンス鎖（ＡＳ）を含み、第２のｄｓＲＮＡ剤は、第２のセンス鎖（Ｓ）及び第２のアンチセンス鎖（ＡＳ）を含み、ここで、第１のアンチセンス鎖の５’末端は、２’フルオロ修飾ヌクレオチド（ＡｆＡｆＧｆ）を含むヌクレオチドリンカーにより、第２のアンチセンス鎖の３’末端に共有結合され、第１のアンチセンス鎖の３’末端及び第２のセンス鎖の３’末端はそれぞれ、独立して、ＧａｌＮＡｃリガンドを含み、第１のアンチセンス鎖の５’ヌクレオチド、第２のアンチセンス鎖の３’ヌクレオチド、及び第２のアンチセンス鎖の２つの最も５’側のヌクレオチドはそれぞれ、独立して、ホスホロチオエート結合を含む。
【図１８Ｏ】ＬＤＨＡを標的とする第１のｄｓＲＮＡ剤及びＨＡＯ１を標的とする第２のｄｓＲＮＡ剤を含む、本発明の例示的な二重標的化剤を示し、ここで、第１のｄｓＲＮＡ剤は、第１のセンス鎖（Ｓ）及び第１のアンチセンス鎖（ＡＳ）を含み、第２のｄｓＲＮＡ剤は、第２のセンス鎖（Ｓ）及び第２のアンチセンス鎖（ＡＳ）を含み、ここで、第１のアンチセンス鎖の５’末端は、第２のアンチセンス鎖の３’末端に直接（リンカーなしで）結合され、第１のアンチセンス鎖の３’末端及び第２のセンス鎖の３’末端はそれぞれ、独立して、ＧａｌＮＡｃリガンドを含み、第２のアンチセンス鎖の２つの最も５’側のヌクレオチドはそれぞれ、独立して、ホスホロチオエート結合を含む。
【発明を実施するための形態】
【０１０９】
本発明は、ＬＤＨＡ遺伝子のＲＮＡ転写物のＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）媒介性切断をもたらすｉＲＮＡ組成物を提供する。ＬＤＨＡ遺伝子は、細胞、例えば、ヒトなどの対象中の細胞内にあり得る。本発明は、ＬＤＨＡ遺伝子の発現を阻害するため、及びＬＤＨＡ遺伝子の発現を阻害するか又は低下させることから利益を得られ得る対象、例えば、尿中オキサレート産生の低下又は阻害から利益を得られ得る対象、例えば、オキサレート経路に関連する疾病、障害、又は病態に罹患しているか又は罹患しやすい対象、例えば、オキサレートに関連する疾病、障害、若しくは病態、例えば、腎臓結石形成疾病、障害、若しくは病態又はシュウ酸カルシウム組織沈着疾病、障害、若しくは病態；又はＬＤＨに関連する疾病、障害、若しくは病態に罹患しているか又は罹患しやすい対象を処置するために、本発明のｉＲＮＡ組成物を使用する方法も提供する。
【０１１０】
本発明は、ＬＤＨＡ遺伝子及びＨＡＯ１遺伝子の発現を阻害するか又は低下させることから利益を得られ得る対象、例えば、尿中オキサレート産生の低下又は阻害から利益を得られ得る対象、例えば、オキサレート経路に関連する疾病、障害、又は病態に罹患しているか又は罹患しやすい対象、例えば、オキサレートに関連する疾病、障害、若しくは病態、例えば、腎臓結石形成疾病、障害、若しくは病態又はシュウ酸カルシウム組織沈着疾病、障害、若しくは病態；又はＬＤＨに関連する疾病、障害、若しくは病態に罹患しているか又は罹患しやすい対象を処置するために、ＬＤＨＡ遺伝子及びＨＡＯ１遺伝子の発現を阻害するために、本発明のｉＲＮＡ組成物を使用する方法も提供する。
【０１１１】
ＬＤＨＡを標的とする本発明のｉＲＮＡは、約３０ヌクレオチド長以下、例えば、１５〜３０、１５〜２９、１５〜２８、１５〜２７、１５〜２６、１５〜２５、１５〜２４、１５〜２３、１５〜２２、１５〜２１、１５〜２０、１５〜１９、１５〜１８、１５〜１７、１８〜３０、１８〜２９、１８〜２８、１８〜２７、１８〜２６、１８〜２５、１８〜２４、１８〜２３、１８〜２２、１８〜２１、１８〜２０、１９〜３０、１９〜２９、１９〜２８、１９〜２７、１９〜２６、１９〜２５、１９〜２４、１９〜２３、１９〜２２、１９〜２１、１９〜２０、２０〜３０、２０〜２９、２０〜２８、２０〜２７、２０〜２６、２０〜２５、２０〜２４、２０〜２３、２０〜２２、２０〜２１、２１〜３０、２１〜２９、２１〜２８、２１〜２７、２１〜２６、２１〜２５、２１〜２４、２１〜２３、又は２１〜２２ヌクレオチド長である領域を有するＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を含んでいてもよく、この領域は、ＬＤＨＡ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部に実質的に相補的である。
【０１１２】
ＨＡＯ１を標的とする本発明のｉＲＮＡは、約３０ヌクレオチド長以下、例えば、１５〜３０、１５〜２９、１５〜２８、１５〜２７、１５〜２６、１５〜２５、１５〜２４、１５〜２３、１５〜２２、１５〜２１、１５〜２０、１５〜１９、１５〜１８、１５〜１７、１８〜３０、１８〜２９、１８〜２８、１８〜２７、１８〜２６、１８〜２５、１８〜２４、１８〜２３、１８〜２２、１８〜２１、１８〜２０、１９〜３０、１９〜２９、１９〜２８、１９〜２７、１９〜２６、１９〜２５、１９〜２４、１９〜２３、１９〜２２、１９〜２１、１９〜２０、２０〜３０、２０〜２９、２０〜２８、２０〜２７、２０〜２６、２０〜２５、２０〜２４、２０〜２３、２０〜２２、２０〜２１、２１〜３０、２１〜２９、２１〜２８、２１〜２７、２１〜２６、２１〜２５、２１〜２４、２１〜２３、又は２１〜２２ヌクレオチド長である領域を有するＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を含んでいてもよく、この領域は、ＨＡＯ１遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部に実質的に相補的である。
【０１１３】
ＲＮＡｉ剤が、本明細書に記載されるように二重標的化ＲＮＡｉ剤である場合、ＬＤＨＡを標的とする剤は、ＨＡＯ１を標的とする剤のアンチセンス鎖の相補性の領域と同じ長さ又は異なる長さである、ＬＤＨＡに対して相補性の領域を含むアンチセンス鎖を含み得る。
【０１１４】
ある実施形態において、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤の鎖の一方又は両方は、ＬＤＨＡ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部に実質的に相補的な少なくとも１９連続ヌクレオチドの領域を有し、最大で６６ヌクレオチド長、例えば、３６〜６６、２６〜３６、２５〜３６、３１〜６０、２２〜４３、２７〜５３ヌクレオチド長である。ある実施形態において、より長い長さのアンチセンス鎖を有するこのようなｉＲＮＡ剤は、２０〜６０ヌクレオチド長の第２のＲＮＡ鎖（センス鎖）を含んでいてもよく、ここで、センス及びアンチセンス鎖は、１８〜３０連続ヌクレオチドの二本鎖を形成する。
【０１１５】
他の実施形態において、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤の鎖の一方又は両方は、ＨＡＯ１遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部に実質的に相補的な少なくとも１９連続ヌクレオチドの領域を有し、最大で６６ヌクレオチド長、例えば、３６〜６６、２６〜３６、２５〜３６、３１〜６０、２２〜４３、２７〜５３ヌクレオチド長である。ある実施形態において、より長い長さのアンチセンス鎖を有するこのようなｉＲＮＡ剤は、２０〜６０ヌクレオチド長の第２のＲＮＡ鎖（センス鎖）を含んでいてもよく、ここで、センス及びアンチセンス鎖は、１８〜３０連続ヌクレオチドの二本鎖を形成する。
【０１１６】
ＬＤＨＡを標的とする第１のｄｓＲＮＡ剤及びＨＡＯ１を標的とする第２のｄｓＲＮＡ剤が共有結合される実施形態において、第１の剤及び第２の剤の二本鎖長さは、同じか又は異なり得る。
【０１１７】
本明細書に記載されるこれらのｉＲＮＡ剤の使用は、哺乳動物におけるＬＤＨＡ遺伝子のｍＲＮＡの標的化された分解又は哺乳動物におけるＬＤＨＡ遺伝子及びＨＡＯ１遺伝子の標的化された分解を可能にする。
【０１１８】
ｉＲＮＡの非常に低い投与量は、特に、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を特異的且つ効率的に媒介して、ＬＤＨＡ遺伝子又はＬＤＨＡ遺伝子及びＨＡＯ１遺伝子の発現のかなりの阻害をもたらし得る。細胞ベース及びインビボでのアッセイを用いて、本発明者らは、ＬＤＨＡを標的とするｉＲＮＡが、ＲＮＡｉを媒介して、ＬＤＨＡ遺伝子の発現のかなりの阻害及びオキサレート産生のかなりの阻害をもたらし得ることを実証した。したがって、これらのｉＲＮＡを含む方法及び組成物は、ＬＤＨＡ発現又はＬＤＨＡ発現及びＨＡＯ１発現の低下又は阻害によって利益を得られ得る対象、例えば、オキサレート経路に関連する疾病、障害又は病態に罹患しているか又は罹患しやすい対象を処置するのに有用である。
【０１１９】
以下の詳細な説明は、ＬＤＨＡ遺伝子、ＨＡＯ１遺伝子、並びにＬＤＨＡ遺伝子及びＨＡＯ１遺伝子の両方の発現を阻害するために、ｉＲＮＡを含有する組成物を作製及び使用する方法、並びにこれらの遺伝子の発現の阻害及び／又は低下から利益を得られ得る疾病及び障害に罹患している対象を処置するための組成物及び方法を開示する。
【０１２０】
Ｉ．定義
本発明がより容易に理解され得るように、いくつかの用語がまず定義される。更に、変数の値又は値の範囲が記載されるときは常に、記載される値の中間の値及び範囲も、本発明の一部であることが意図されることに留意されたい。
【０１２１】
冠詞「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」は、その冠詞の文法的目的語の１つ又は２つ以上（即ち、少なくとも１つ）を指すために本明細書において使用される。例として、「要素（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素又は２つ以上の要素、例えば、複数の要素を意味する。
【０１２２】
「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、「〜を含むがこれらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」という語句を意味するために本明細書において使用され、この語句と同義的に使用される。「又は」という用語は、文脈上明らかに他の意味を示さない限り、「及び／又は」という用語を意味するために本明細書において使用され、この用語と同義的に使用される。
【０１２３】
細胞増殖誘導遺伝子１９タンパク質、腎臓癌抗原ＮＹ−ＲＥＮ−５９、ＬＤＨ筋肉サブユニット、ＥＣ  １．１．１．２７  ４  ６１、ＬＤＨ−Ａ、ＬＤＨ−Ｍ、精巣上体分泌精子結合タンパク質Ｌｉ  １３３Ｐ、Ｌ−乳酸脱水素酵素Ａ鎖、増殖誘導遺伝子１９、乳酸脱水素酵素Ｍ、ＨＥＬ−Ｓ−１３３Ｐ、ＥＣ  １．１．１、ＧＳＤ１１、ＰＩＧ１９、及びＬＤＨＭとしても知られている「ＬＤＨＡ」という用語（明細書において「Ｌｄｈａ」という用語と同義的に使用される）は、特に規定されない限り、限定はされないが、ヒト、ウシ、ニワトリ、げっ歯類、マウス、ラット、ブタ、ヒツジ、霊長類、サル、及びモルモットを含む任意の脊椎動物又は哺乳動物源に由来する乳酸脱水素酵素Ａをコードする周知の遺伝子を指す。
【０１２４】
この用語は、天然ＬＤＨＡの少なくとも１つのインビボ又はインビトロ活性を維持する天然ＬＤＨＡの断片及び変異体も指す。この用語は、ＬＤＨＡの完全長非プロセシング前駆体形態並びにシグナルペプチドの翻訳後切断から得られる成熟形態及びタンパク質分解処理から得られる形態を包含する。
【０１２５】
ヒトＬＤＨＡ  ｍＲＮＡ転写物の配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：２０７０２８４９３（ＮＭ＿００１１３５２３９．１；配列番号１）、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：２６００９９７２２（ＮＭ＿００１１６５４１４．１；配列番号３）、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：２６００９９７２４（ＮＭ＿００１１６５４１５．１；配列番号５）、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：２６００９９７２６（ＮＭ＿００１１６５４１６．１；配列番号７）、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：２０７０２８４６５（ＮＭ＿００５５６６．３；配列番号９）に見られ；マウスＬＤＨＡ  ｍＲＮＡ転写物の配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：２５７７４３０３８（ＮＭ＿００１１３６０６９．２；配列番号１１）、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：２５７７４３０３６（ＮＭ＿０１０６９９．２；配列番号１３）に見られ；ラットＬＤＨＡ  ｍＲＮＡ転写物の配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：８３９３７０５（ＮＭ＿０１７０２５．１；配列番号１５）に見られ；サルＬＤＨＡ  ｍＲＮＡ転写物の配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：４０２７６６３０６（ＮＭ＿００１２５７７３５．２；配列番号１７）、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：５４５６８７１０２（ＮＭ＿００１２８３５５１．１；配列番号１９）に見られる。
【０１２６】
ＬＤＨＡ  ｍＲＮＡ配列の更なる例は、公開されているデータベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔ、及びＯＭＩＭを用いて容易に利用可能である。
【０１２７】
本明細書において使用される際の「ＬＤＨＡ」という用語は、ＬＤＨＡ遺伝子における一塩基ヌクレオチド多型などの、ＬＤＨＡ遺伝子の天然ＤＮＡ配列変異によって細胞内で発現される特定のポリペプチドも指す。ＬＤＨＡ遺伝子内の多くのＳＮＰは、同定されており、例えば、ＮＣＢＩ  ｄｂＳＮＰ（例えば、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｎｐを参照）に見られる。
【０１２８】
本明細書において使用される際、「ＨＡＯ１」という用語は、特に規定されない限り、限定はされないが、ヒト、ウシ、ニワトリ、げっ歯類、マウス、ラット、ブタ、ヒツジ、霊長類、サル、及びモルモットを含む任意の脊椎動物又は哺乳動物源に由来する酵素ヒドロキシ酸オキシダーゼ１をコードする周知の遺伝子を指す。他の遺伝子名としては、ＧＯ、ＧＯＸ、ＧＯＸ１、ＨＡＯ、及びＨＡＯＸ１が挙げられる。このタンパク質は、グリコール酸オキシダーゼ及び（Ｓ）−２−ヒドロキシ酸オキシダーゼとしても知られている。
【０１２９】
この用語は、天然ＨＡＯ１の少なくとも１つのインビボ又はインビトロ活性を維持する天然ＨＡＯ１の断片及び変異体も指す。この用語は、ＨＡＯ１の完全長非プロセシング前駆体形態並びにシグナルペプチドの翻訳後切断から得られる成熟形態及びタンパク質分解処理から得られる形態を包含する。ヒトＨＡＯ１  ｍＲＮＡ転写物の配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１１１８４２３２（ＮＭ＿０１７５４５．２；配列番号２１）に見られ；サルＨＡＯ１  ｍＲＮＡ転写物の配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：５４４４６４３４５（ＸＭ＿００５５６８３８１．１；配列番号２３）に見られ；マウスＨＡＯ１  ｍＲＮＡ転写物の配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１３３８９３１６６（ＮＭ＿０１０４０３．２；配列番号２５）に見られ；ラットＨＡＯ１  ｍＲＮＡ転写物の配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１６６１５７７８５（ＮＭ＿００１１０７７８０．２；配列番号２７）に見られる。
【０１３０】
本明細書において使用される際の「ＨＡＯ１」という用語は、ＨＡＯ１遺伝子における一塩基ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）などの、ＨＡＯ１遺伝子の天然ＤＮＡ配列変異も指す。例示的なＳＮＰは、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ＳＮＰにおいて利用可能なＮＣＢＩ  ｄｂＳＮＰ  Ｓｈｏｒｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｖａｒｉａｔｉｏｎｓデータベースに見られる。
【０１３１】
本明細書において使用される際、「標的配列」は、一次転写産物のＲＮＡプロセシングの産物であるｍＲＮＡを含む、ＬＤＨＡ遺伝子又はＨＡＯ１遺伝子の転写の際に形成されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の連続する部分を指す。一実施形態において、配列の標的部分は少なくとも、ＬＤＨＡ遺伝子の転写の際に形成されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の該当部分で又はその近くでｉＲＮＡ指向性切断のための基質としての役割を果たすのに十分な長さであろう。別の実施形態において、配列の標的部分は少なくとも、ＨＡＯ１遺伝子の転写の際に形成されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の該当部分で又はその近くでｉＲＮＡ指向性切断のための基質としての役割を果たすのに十分な長さであろう。
【０１３２】
ＬＤＨＡ遺伝子の標的配列は、約９〜３６ヌクレオチド長、例えば、約１５〜３０ヌクレオチド長であり得る。例えば、標的配列は、約１５〜３０ヌクレオチド、１５−２９、１５〜２８、１５〜２７、１５〜２６、１５〜２５、１５〜２４、１５〜２３、１５〜２２、１５〜２１、１５〜２０、１５〜１９、１５〜１８、１５〜１７、１８〜３０、１８〜２９、１８〜２８、１８〜２７、１８〜２６、１８〜２５、１８〜２４、１８〜２３、１８〜２２、１８〜２１、１８〜２０、１９〜３０、１９〜２９、１９〜２８、１９〜２７、１９〜２６、１９〜２５、１９〜２４、１９〜２３、１９〜２２、１９〜２１、１９〜２０、２０〜３０、２０〜２９、２０〜２８、２０〜２７、２０〜２６、２０〜２５、２０〜２４，２０〜２３、２０〜２２、２０〜２１、２１〜３０、２１〜２９、２１〜２８、２１〜２７、２１〜２６、２１〜２５、２１〜２４、２１〜２３、又は２１〜２２ヌクレオチド長であり得る。上に記載される範囲及び長さの中間の範囲及び長さも、本発明の一部であると考えられる。
【０１３３】
ＨＡＯ１遺伝子の標的配列は、約９〜３６ヌクレオチド長、例えば、約１５〜３０ヌクレオチド長であり得る。例えば、標的配列は、約１５〜３０ヌクレオチド、１５〜２９、１５〜２８、１５〜２７、１５〜２６、１５〜２５、１５〜２４、１５〜２３、１５〜２２、１５〜２１、１５〜２０、１５〜１９、１５〜１８、１５〜１７、１８〜３０、１８〜２９、１８〜２８、１８〜２７、１８〜２６、１８〜２５、１８〜２４、１８〜２３、１８〜２２、１８〜２１、１８〜２０、１９〜３０、１９〜２９、１９〜２８、１９〜２７、１９〜２６、１９〜２５、１９〜２４、１９〜２３、１９〜２２、１９〜２１、１９〜２０、２０〜３０、２０〜２９、２０〜２８、２０〜２７、２０〜２６、２０〜２５、２０〜２４、２０〜２３、２０〜２２、２０〜２１、２１〜３０、２１〜２９、２１〜２８、２１〜２７、２１〜２６、２１〜２５、２１〜２４、２１〜２３、又は２１〜２２ヌクレオチド長であり得る。上記の範囲及び長さの中間の範囲及び長さも、本発明の一部であるものと考えられる。
【０１３４】
ＬＤＨＡを標的とする第１のｄｓＲＮＡ剤及びＨＡＯ１を標的とする第２のｄｓＲＮＡ剤が共有結合される態様において（即ち、二重標的化ＲＮＡｉ剤）、ＬＤＨＡ標的配列の長さは、ＨＡＯ１標的配列と同じか又は異なり得る。
【０１３５】
本明細書において使用される際、「配列を含む鎖」という用語は、標準的なヌクレオチドの命名法を用いて示される配列によって表されるヌクレオチドの鎖を含むオリゴヌクレオチドを指す。
【０１３６】
「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」及び「Ｕ」はそれぞれ、一般に、それぞれ、塩基としてグアニン、シトシン、アデニン、及びウラシルを含むヌクレオチドを表す。しかしながら、「リボヌクレオチド」又は「ヌクレオチド」という用語は、以下に更に詳述されるように、修飾ヌクレオチド、又は代理置換部分（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｍｏｉｅｔｙ）も指し得ることが理解されよう（例えば表１を参照）。当業者は、グアニン、シトシン、アデニン、及びウラシルが、このような置換部分を有するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対合特性をそれほど変化させずに他の部分によって置換されてもよいことを十分に認識している。例えば、限定はされないが、その塩基としてイノシンを含むヌクレオチドが、アデニン、シトシン、又はウラシルを含むヌクレオチドと塩基対合し得る。したがって、ウラシル、グアニン、又はアデニンを含むヌクレオチドは、本発明において特徴付けられるｄｓＲＮＡのヌクレオチド配列において、例えば、イノシンを含むヌクレオチドによって置換されてもよい。別の例では、オリゴヌクレオチド中のいずれかの箇所のアデニン及びシトシンが、それぞれグアニン及びウラシルで置換されて、標的ｍＲＮＡとのＧ−Ｕゆらぎ塩基対合が形成され得る。このような置換部分を含有する配列は、本発明に取り上げられる組成物及び方法に好適である。
【０１３７】
本明細書において同義的に使用される「ｉＲＮＡ」、「ＲＮＡｉ剤」、「ｉＲＮＡ剤」、「ＲＮＡ干渉剤」という用語は、その用語が本明細書において定義されるように、ＲＮＡを含有し、且つＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）経路を介してＲＮＡ転写物の標的化された切断を仲介する剤を指す。ｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として公知のプロセスによってｍＲＮＡの配列に特異的な分解を導く。ｉＲＮＡは、細胞、例えば、哺乳動物対象などの対象中の細胞内でのＬＤＨＡ及び／又はＨＡＯ１遺伝子の発現を調節する（例えば阻害する）。
【０１３８】
一実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、標的ＲＮＡ配列、例えば、ＬＤＨＡ標的ｍＲＮＡ配列及び／又はＨＡＯ１標的ｍＲＮＡ配列と相互作用して、標的ＲＮＡの切断を導く一本鎖ＲＮＡを含む。理論に制約されるのを望むものではないが、細胞中に導入される長い二本鎖ＲＮＡが、Ｄｉｃｅｒとして公知のＩＩＩ型エンドヌクレアーゼによってｓｉＲＮＡに分解されると考えられる（Ｓｈａｒｐ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１５：４８５）。リボヌクレアーゼＩＩＩ様酵素であるＤｉｃｅｒは、ｄｓＲＮＡをプロセシングして、特徴的な２つの塩基３’オーバーハングを有する１９〜２３塩基対の短干渉ＲＮＡにする（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：３６３）。次に、ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれ、ここで、１つ又は複数のヘリカーゼが、ｓｉＲＮＡ二本鎖をほどいて、相補的なアンチセンス鎖が、標的認識を導くことを可能にする（Ｎｙｋａｎｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｃｅｌｌ  １０７：３０９）。適切な標的ｍＲＮＡに結合すると、ＲＩＳＣ中の１つ又は複数のエンドヌクレアーゼが標的を切断して、サイレンシングを誘導する（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１５：１８８）。ここで、一態様において、本発明は、細胞中で生成され、且つ標的遺伝子、即ち、ＬＤＨＡ遺伝子及び／又はＨＡＯ１遺伝子のサイレンシングをもたらすＲＩＳＣ複合体の形成を促進する一本鎖ＲＮＡ（ｓｓｓｉＲＮＡ）に関する。したがって、「ｓｉＲＮＡ」という用語はまた、上記のＲＮＡｉを指すために本明細書において使用される。
【０１３９】
別の実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、標的ｍＲＮＡを阻害するために細胞又は生物に導入される一本鎖ＲＮＡｉ剤であり得る。一本鎖ＲＮＡｉ剤（ｓｓＲＮＡｉ）は、ＲＩＳＣエンドヌクレアーゼＡｒｇｏｎａｕｔｅ  ２に結合し、これが、次に、標的ｍＲＮＡを切断する。一本鎖ｓｉＲＮＡは、一般に、１５〜３０のヌクレオチドであり、化学的に修飾される。一本鎖ＲＮＡｉ剤の設計及び試験が、米国特許第８，１０１，３４８号明細書及びＬｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）Ｃｅｌｌ  １５０：８８３−８９４に記載され、それぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。本明細書に記載されるアンチセンスヌクレオチド配列のいずれかが、本明細書に記載されるような又はＬｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）Ｃｅｌｌ  １５０；：８８３−８９４に記載される方法によって化学的に修飾される一本鎖ｓｉＲＮＡとして使用され得る。
【０１４０】
別の実施形態において、本発明の組成物及び方法に使用するための「ｉＲＮＡ」は、二本鎖ＲＮＡであり、本明細書において「二本鎖ＲＮＡｉ剤」、「二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子」、「ｄｓＲＮＡ剤」、又は「ｄｓＲＮＡ」と呼ばれる。「ｄｓＲＮＡ」という用語は、標的ＲＮＡ、即ち、ＬＤＨＡ遺伝子及び／又はＨＡＯ１遺伝子に対する「センス」及び「アンチセンス」配向を有することが示される、２本の逆平行で且つ実質的に相補的な核酸鎖を含む二本鎖構造を有するリボ核酸分子の複合体を指す。本発明のある実施形態において、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、本明細書においてＲＮＡ干渉又はＲＮＡｉと呼ばれる、転写後遺伝子サイレンシング機構による、標的ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡの分解を引き起こす。
【０１４１】
更に別の実施形態において、本発明の組成物及び方法に使用するための「ｉＲＮＡ」は、「二重標的化ＲＮＡｉ剤」である。「二重標的化ＲＮＡｉ剤」という用語は、第２の標的ＲＮＡ、即ち、ＨＡＯ１遺伝子に対する「センス」及び「アンチセンス」配向を有することが示される、２本の逆平行で且つ実質的に相補的な核酸鎖を含む二本鎖構造を有するリボ核酸分子の複合体を含む第２のｄｓＲＮＡ剤を含む分子に共有結合された、第１の標的ＲＮＡ、即ち、ＬＤＨＡ遺伝子に対する「センス」及び「アンチセンス」配向を有することが示される、２本の逆平行で且つ実質的に相補的な核酸鎖を含む二本鎖構造を有するリボ核酸分子の複合体を含む第１のｄｓＲＮＡ剤を含む分子を指す。本発明のある実施形態において、二重標的化ＲＮＡｉ剤は、本明細書においてＲＮＡ干渉又はＲＮＡｉと呼ばれる転写後遺伝子サイレンシング機構による、第１及び第２の標的ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡの分解を引き起こす。
【０１４２】
一般に、ｄｓＲＮＡ分子のそれぞれの鎖のヌクレオチドの大部分は、リボヌクレオチドであるが、本明細書において詳細に記載されるように、それぞれの又は両方の鎖は、１つ又は複数の非リボヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチド及び／又は修飾ヌクレオチドも含み得る。更に、本明細書において使用される際、「ＲＮＡｉ剤」は、化学的修飾を有するリボヌクレオチドを含んでいてもよく；ＲＮＡｉ剤は、複数のヌクレオチドにおける実質的な修飾を含み得る。本明細書において使用される際、「修飾ヌクレオチド」という用語は、独立して、修飾された糖部分、修飾されたヌクレオチド間結合、及び／又は修飾された核酸塩基を有するヌクレオチドを指す。したがって、修飾ヌクレオチドという用語は、ヌクレオシド間結合、糖部分、又は核酸塩基に対する、例えば、官能基又は原子の置換、付加又は除去を包含する。本発明の剤に使用するのに好適な修飾は、本明細書に開示されるか又は当該技術分野において公知のあらゆるタイプの修飾を含む。ｓｉＲＮＡタイプの分子に使用される際のいずれのこのような修飾も、本明細書及び特許請求の範囲の目的のために「ＲＮＡｉ剤」によって包含される。
【０１４３】
二本鎖領域は、ＲＩＳＣ経路を介した所望の標的ＲＮＡの特異的な分解を可能にする任意の長さのものであってもよく、約９〜３６塩基対の長さ、例えば、約１５〜３０塩基対の長さの範囲、例えば、約１５〜３０、１５〜２９、１５〜２８、１５〜２７、１５〜２６、１５〜２５、１５〜２４、１５〜２３、１５〜２２、１５〜２１、１５〜２０、１５〜１９、１５〜１８、１５〜１７、１８〜３０、１８〜２９、１８〜２８、１８〜２７、１８〜２６、１８〜２５、１８〜２４、１８〜２３、１８〜２２、１８〜２１、１８〜２０、１９〜３０、１９〜２９、１９〜２８、１９〜２７、１９〜２６、１９〜２５、１９〜２４、１９〜２３、１９〜２２、１９〜２１、１９〜２０、２０〜３０、２０〜２９、２０〜２８、２０〜２７、２０〜２６、２０〜２５、２０〜２４，２０〜２３、２０〜２２、２０〜２１、２１〜３０、２１〜２９、２１〜２８、２１〜２７、２１〜２６、２１〜２５、２１〜２４、２１〜２３、又は２１〜２２塩基対の長さなど、約９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、又は３６塩基対の長さであり得る。上に記載される範囲及び長さの中間の範囲及び長さも、本発明の一部であると考えられる。
【０１４４】
ＬＤＨＡを標的とする第１のｄｓＲＮＡ剤及びＨＡＯ１を標的とする第２のｄｓＲＮＡ剤が共有結合される実施形態において（即ち、二重標的化ＲＮＡｉ剤）、第１の剤及び第２の剤の二本鎖領域の長さは、同じか又は異なり得る。
【０１４５】
二本鎖構造を形成する２本の鎖は、１つのより大きいＲＮＡ分子の異なる部分であってもよく、又はそれらは別個のＲＮＡ分子であってもよい。２本の鎖が、１つのより大きい分子の一部であり、したがって、二本鎖構造を形成する１本の鎖の３’末端とその他方の鎖の５’末端との間のヌクレオチドの連続した鎖によって結合された場合、結合するＲＮＡ鎖は、「ヘアピンループ」と呼ばれる。ヘアピンループは、少なくとも１つの不対ヌクレオチドを含み得る。ある実施形態において、ヘアピンループは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも２３個又はそれ以上の不対ヌクレオチドを含み得る。
【０１４６】
ＬＤＨＡを標的とする第１のｄｓＲＮＡ剤及びＨＡＯ１を標的とする第２のｄｓＲＮＡ剤が共有結合される実施形態において（即ち、二重標的化ＲＮＡｉ剤）、第１のｄｓＲＮＡ剤は、ヘアピンループを含んでいてもよく、第２のｄｓＲＮＡ剤は、ヘアピンループを含んでいてもよく、又は第１及び第２のｄｓＲＮＡ剤は両方とも、独立して、ヘアピンループを含み得る。更に、ＬＤＨＡを標的とする第１のｄｓＲＮＡ剤及びＨＡＯ１を標的とする第２のｄｓＲＮＡ剤が共有結合される実施形態において（即ち、二重標的化ＲＮＡｉ剤）、第１のｄｓＲＮＡ剤は、不対ヌクレオチドを含んでいてもよく、第２のｄｓＲＮＡ剤は、不対ヌクレオチドを含んでいてもよく、又は第１及び第２のｄｓＲＮＡ剤が両方とも、独立して、不対ヌクレオチドを含み得る。第１及び第２のｄｓＲＮＡ剤が両方とも、独立して、不対ヌクレオチドを含む場合、第１のｄｓＲＮＡ剤及び第２のｄｓＲＮＡ剤は、同じか又は異なる数の不対ヌクレオチドを含み得る。
【０１４７】
ｄｓＲＮＡの２つの実質的に相補的な鎖が、別個のＲＮＡ分子によって構成される場合、それらの分子は、共有結合され得るが、共有結合されていなくてもよい。２本の鎖が、二本鎖構造を形成する１本の鎖の３’末端とその他方の鎖の５’末端との間のヌクレオチドの連続した鎖以外の手段によって共有結合された場合、結合構造は、「リンカー」と呼ばれる。ＲＮＡ鎖は、同じか又は異なる数のヌクレオチドを有し得る。塩基対の最大数は、ｄｓＲＮＡの最も短い鎖のヌクレオチドの数から、二本鎖に存在するオーバーハングを引いた数である。二本鎖構造に加えて、ＲＮＡｉ剤は、１つ又は複数のヌクレオチドオーバーハングを含み得る。
【０１４８】
一実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、ｄｓＲＮＡであり、その各鎖が、標的ＲＮＡ配列、例えば、ＬＤＨＡ標的ｍＲＮＡ配列と相互作用して、標的ＲＮＡの切断を導く１９〜２３のヌクレオチドを含む。別の実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、ｄｓＲＮＡであり、その各鎖が、標的ＲＮＡ配列、例えば、ＨＡＯ１標的ｍＲＮＡ配列と相互作用して、標的ＲＮＡの切断を導く１９〜２３ヌクレオチドを含む。更に他の実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、第１のｄｓＲＮＡ剤（その各鎖が、標的ＲＮＡ配列、例えば、ＬＤＨＡ標的ｍＲＮＡ配列と相互作用して、標的ＲＮＡの切断を導く１９〜２３のヌクレオチドを含む）、及び第２のｄｓＲＮＡ剤（その各鎖が、独立して、標的ＲＮＡ配列、例えば、ＨＡＯ１標的ｍＲＮＡ配列と相互作用して、標的ＲＮＡの切断を導く１９〜２３のヌクレオチドを含む）を含み、第１及び第２のｄｓＲＮＡ剤は、共有結合されている。
【０１４９】
ＬＤＨＡを標的とする第１のｄｓＲＮＡ剤及びＨＡＯ１を標的とする第２のｄｓＲＮＡ剤が共有結合される実施形態において（即ち、二重標的化ＲＮＡｉ剤）、第１のｄｓＲＮＡ剤の２本の鎖が、二本鎖構造を形成する１本の鎖の３’末端とその他方の鎖の５’末端との間のヌクレオチドの連続した鎖以外の手段によって共有結合され得、第２のｄｓＲＮＡ剤の２本の鎖が、二本鎖構造を形成する１本の鎖の３’末端とその他方の鎖の５’末端との間のヌクレオチドの連続した鎖以外の手段によって共有結合され得、又は第１のｄｓＲＮＡ剤の２本の鎖及び第２のｄｓＲＮＡ剤の２本の鎖が、独立して、二本鎖構造を形成する１本の鎖の３’末端とその他方の鎖の５’末端との間のヌクレオチドの連続した鎖以外の手段によって共有結合され得る。
【０１５０】
本明細書において使用される際、「ヌクレオチドオーバーハング」という用語は、ｉＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡの二本鎖構造から突出する少なくとも１つの不対ヌクレオチドを指す。例えば、ｄｓＲＮＡの１本の鎖の３’末端が、他方の鎖の５’末端を越えて延びるか又はその逆である場合、ヌクレオチドオーバーハングが存在する。ｄｓＲＮＡは、少なくとも１つのヌクレオチドのオーバーハングを含み得るか；或いはオーバーハングは、少なくとも２つのヌクレオチド、少なくとも３つのヌクレオチド、少なくとも４つのヌクレオチド、少なくとも５つのヌクレオチド又はそれ以上を含み得る。ヌクレオチドオーバーハングは、デオキシヌクレオチド／ヌクレオシドを含むヌクレオチド／ヌクレオシド類似体を含むか又はそれからなり得る。オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖又はそれらの任意の組み合わせであり得る。更に、オーバーハングのヌクレオチドは、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖又はセンス鎖のいずれかの５’末端、３’末端又は両方の末端に存在し得る。
【０１５１】
ＬＤＨＡを標的とする第１のｄｓＲＮＡ剤及びＨＡＯ１を標的とする第２のｄｓＲＮＡ剤が共有結合される実施形態において（即ち、二重標的化ＲＮＡｉ剤）、第１の剤は、ヌクレオチドオーバーハングを含んでいてもよく、第２の剤は、ヌクレオチドオーバーハングを含んでいてもよく、又は第１及び第２の剤は両方とも、独立して、ヌクレオチドオーバーハングを含んでいてもよく、例えば、第１の剤のセンス鎖の５’末端は、オーバーハングを含んでいてもよく、第１の剤のセンス鎖の３’末端は、オーバーハングを含んでいてもよく、第１の剤のアンチセンス鎖の５’末端は、オーバーハングを含んでいてもよく、第１の剤のアンチセンス鎖の３’末端は、オーバーハングを含んでいてもよく、第１の剤のセンス鎖の５’末端及び３’末端は、オーバーハングを含んでいてもよく、第１の剤のアンチセンス鎖の５’末端及び３’末端は、オーバーハングを含んでいてもよく、第２の剤のセンス鎖の５’末端は、オーバーハングを含んでいてもよく、第２の剤のセンス鎖の３’末端は、オーバーハングを含んでいてもよく、第２の剤のアンチセンス鎖の５’末端は、オーバーハングを含んでいてもよく、第２の剤のアンチセンス鎖の３’末端は、オーバーハングを含んでいてもよく、第２の剤のセンス鎖の５’末端及び３’末端は、オーバーハングを含んでいてもよく、第２の剤のアンチセンス鎖の５’末端及び３’末端は、オーバーハングを含んでいてもよく、又はそれらの任意の組み合わせである。
【０１５２】
ＬＤＨＡを標的とする第１のｄｓＲＮＡ剤及びＨＡＯ１を標的とする第２のｄｓＲＮＡ剤が共有結合される実施形態において（即ち、二重標的化ＲＮＡｉ剤）、第１の剤及び第２の剤のオーバーハングの長さは、同じか又は異なり得る。
【０１５３】
一実施形態において、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、３’末端及び／又は５’末端に、１〜１０個のヌクレオチド、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のヌクレオチドのオーバーハングを有する。一実施形態において、ｄｓＲＮＡのセンス鎖は、３’末端及び／又は５’末端に、１〜１０のヌクレオチド、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のヌクレオチドのオーバーハングを有する。別の実施形態において、オーバーハング中のヌクレオチドの１つ又は複数が、ヌクレオシドチオリン酸で置換される。
【０１５４】
特定の実施形態において、センス鎖若しくはアンチセンス鎖、又はその両方におけるオーバーハングは、１０ヌクレオチド、例えば、１０〜３０ヌクレオチド、１０〜２５ヌクレオチド、１０〜２０ヌクレオチド又は１０〜１５ヌクレオチド長より長い、延長された長さを含み得る。特定の実施形態において、延長されたオーバーハングは、二本鎖のセンス鎖上に存在する。特定の実施形態において、延長されたオーバーハングは、二本鎖のセンス鎖の３’末端上に存在する。特定の実施形態において、延長されたオーバーハングは、二本鎖のセンス鎖の５’末端上に存在する。特定の実施形態において、延長されたオーバーハングは、二本鎖のアンチセンス鎖上にある。特定の実施形態において、延長されたオーバーハングは、二本鎖のアンチセンス鎖の３’末端上に存在する。特定の実施形態において、延長されたオーバーハングは、二本鎖のアンチセンス鎖の５’末端上に存在する。特定の実施形態において、延長されたオーバーハングにおけるヌクレオチドの１つ又は複数が、ヌクレオシドチオホスフェートで置換される。
【０１５５】
ＬＤＨＡを標的とする第１のｄｓＲＮＡ剤及びＨＡＯ１を標的とする第２のｄｓＲＮＡ剤が共有結合される実施形態において（即ち、二重標的化ＲＮＡｉ剤）、第１及び第２のｄｓＲＮＡ剤の両方の１つ及び／又は両方の鎖は、独立して、オーバーハング、例えば、延長されたオーバーハングを含み、オーバーハングの長さは、同じか又は異なっていてもよく、及び／又は、ある実施形態において、第１のｄｓＲＮＡ剤中のオーバーハングにおけるヌクレオチドの１つ又は複数及び第２のｄｓＲＮＡ剤中のオーバーハングにおける１つ又は複数のヌクレオチドは、独立して、ヌクレオシドチオホスフェートで置換され得る。
【０１５６】
ｄｓＲＮＡに関連して本明細書において使用される際の「平滑な」又は「平滑末端」という用語は、ｄｓＲＮＡの所与の末端に不対ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体が存在しない、即ち、ヌクレオチドオーバーハングが存在しないことを意味する。ｄｓＲＮＡの１つ又は両方の末端は、平滑であり得る。ｄｓＲＮＡの両方の末端が平滑である場合、ｄｓＲＮＡは、平滑末端であると記載される。明確にするために、「平滑末端」ｄｓＲＮＡは、両方の末端が平滑である、即ち、分子のいずれの末端にもヌクレオチドオーバーハングがないｄｓＲＮＡである。このような分子のほとんどは、多くの場合、その全長にわたって二本鎖である。
【０１５７】
ＬＤＨＡを標的とする第１のｄｓＲＮＡ剤及びＨＡＯ１を標的とする第２のｄｓＲＮＡ剤が共有結合される実施形態において（即ち、二重標的化ＲＮＡｉ剤）、ｄｓＲＮＡ剤の一方又は両方は、独立して、平滑末端を含み得る。
【０１５８】
「アンチセンス鎖」又は「ガイド鎖」という用語は、標的配列、例えば、ＬＤＨＡ  ｍＲＮＡ又はＨＡＯ１  ｍＲＮＡに実質的に相補的な領域を含むｉＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡの鎖を指す。
【０１５９】
本明細書において使用される際、「相補性の領域」という用語は、本明細書において定義されるように、配列、例えば標的配列、例えば、ＬＤＨＡヌクレオチド配列又はＨＡＯ１ヌクレオチド配列に実質的に相補的なアンチセンス鎖の領域を指す。相補性の領域が、標的配列に完全には相補的でない場合、その分子の内部領域又は末端領域にミスマッチが存在し得る。一般に、ほとんどの許容されるミスマッチは、末端領域、例えば、ｉＲＮＡの５’末端及び／又は３’末端の５、４、３、又は２つのヌクレオチド中に存在する。
【０１６０】
ＬＤＨＡを標的とする第１のｄｓＲＮＡ剤及びＨＡＯ１を標的とする第２のｄｓＲＮＡ剤が共有結合される実施形態において（即ち、二重標的化ＲＮＡｉ剤）、ｄｓＲＮＡ剤の一方又は両方は、独立して、ミスマッチを含み得る。
【０１６１】
本明細書において使用される際の「センス鎖」、又は「パッセンジャー鎖」という用語は、その用語が本明細書において定義されるように、アンチセンス鎖の領域と実質的に相補的な領域を含むｉＲＮＡの鎖を指す。
【０１６２】
本明細書において使用される際、「切断領域」という用語は、切断部位に直接隣接して位置する領域を指す。切断部位は、標的における、切断が生じる部位である。ある実施形態において、切断領域は、切断部位のいずれかの末端で、切断部位に直接隣接した３つの塩基を含む。ある実施形態において、切断領域は、切断部位のいずれかの末端で、切断部位に直接隣接した２つの塩基を含む。ある実施形態において、切断部位は、アンチセンス鎖のヌクレオチド１０及び１１によって結合される部位で特異的に生じ、切断領域は、ヌクレオチド１１、１２及び１３を含む。
【０１６３】
本明細書において使用される際、特に示されない限り、「相補的な」という用語は、当業者により理解されるように、第１のヌクレオチド配列を第２のヌクレオチド配列と関連して記載するのに使用される場合、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドが、所定の条件下で、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドとハイブリダイズし、二本鎖構造を形成する能力を指す。このような条件は、例えば、ストリンジェントな条件であり得、ここで、ストリンジェントな条件は、４００ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．４）、１ｍＭのＥＤＴＡ、５０℃又は７０℃で１２〜１６時間と、それに続く洗浄を含み得る（例えば“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを参照）。生物の内部で起こり得る生理学的に関連した条件などの他の条件を適用することができる。当業者は、ハイブリダイズされたヌクレオチドの最終的な用途に従って、２つの配列の相補性の試験に最も適切な条件の組を決定することができるであろう。
【０１６４】
本明細書に記載されるｉＲＮＡ中、例えば、ｄｓＲＮＡ中の相補的な配列は、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドへの第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの、一方又は両方のヌクレオチド配列の全長にわたる塩基対合を含む。このような配列は、本明細書において互いに対して「完全に相補的な」と称され得る。しかしながら、第１の配列が、本明細書において第２の配列に対して「実質的に相補的な」と称される場合、２つの配列は、完全に相補的であり得、又はそれらの最終的な適用、例えば、ＲＩＳＣ経路を介した遺伝子発現の阻害に最適な条件下でハイブリダイズする能力を保持しながら、最大で３０塩基対の二本鎖に対するハイブリダイゼーションを行うと、それらは、１つ又は複数であるが、一般に、５つ以下、４つ以下、３つ以下又は２つ以下のミスマッチ塩基対を形成し得る。しかしながら、２つのオリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーション後に１つ又は複数の一本鎖オーバーハングを形成するように設計されている場合、このようなオーバーハングは、相補性の決定に関してはミスマッチとみなされないものとする。例えば、本明細書に記載する目的のために、２１ヌクレオチド長の一方のオリゴヌクレオチドと、２３ヌクレオチド長の他方のオリゴヌクレオチドとを含むｄｓＲＮＡは、長い方のオリゴヌクレオチドが、短い方のオリゴヌクレオチドに対して完全に相補的な２１ヌクレオチドの配列を含む場合、「完全に相補的」と称されてもよい。
【０１６５】
本明細書において使用される際の「相補的な」配列は、それらのハイブリダイズする能力に関連した上記の要求が満たされる限り、非ワトソン−クリック塩基対及び／又は非天然及び修飾ヌクレオチドから形成される塩基対も含むことができ、又はこのような塩基対から完全に形成され得る。このような非ワトソン−クリック塩基対としては、限定はされないが、Ｇ：Ｕゆらぎ又はフーグスティーン型塩基対が挙げられる。
【０１６６】
本明細書における「相補的な」、「完全に相補的な」及び「実質的に相補的な」という用語は、それらの使用の状況から理解されるように、ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖との間で、又はｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖と標的配列との間で、一致する塩基に関連して使用され得る。
【０１６７】
本明細書において使用される際、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）「の少なくとも一部に実質的に相補的な」ポリヌクレオチドは、５’ＵＴＲ、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、又は３’ＵＴＲを含む目的のｍＲＮＡ（例えば、ＬＤＨＡをコードするｍＲＮＡ又はＨＡＯ１をコードするｍＲＮＡ）の連続する部分に実質的に相補的なポリヌクレオチドを指す。例えば、ポリヌクレオチドは、その配列がＬＤＨＡをコードするｍＲＮＡの連続する部分と実質的に相補的である場合、ＬＤＨＡ  ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的である。
【０１６８】
したがって、ある実施形態において、本明細書に開示されるアンチセンス鎖ポリヌクレオチドは、標的ＬＤＨＡ配列に完全に相補的である。他の実施形態において、本明細書に開示されるアンチセンス鎖ポリヌクレオチドは、標的ＬＤＨＡ配列に実質的に相補的であり、その全長にわたって、配列番号１、又は配列番号１の断片のヌクレオチド配列の相当する領域に少なくとも約８０％相補的、例えば、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約％９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％相補的な連続ヌクレオチド配列を含む。
【０１６９】
一実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、アンチセンスポリヌクレオチドに実質的に相補的な、ひいては、標的ＬＤＨＡ配列に相補的なセンス鎖を含み、センス鎖ポリヌクレオチドは、その全長にわたって、配列番号２、又は配列番号２のいずれか１つの断片のヌクレオチド配列の相当する領域に少なくとも約８０％相補的、例えば、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約％９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％相補的な連続ヌクレオチド配列を含む。
【０１７０】
ある実施形態において、本発明のｉＲＮＡは、標的ＬＤＨＡ配列に実質的に相補的なアンチセンス鎖を含み、その全長にわたって、表２〜５のいずれか１つにおけるセンス鎖のいずれか１つ、又は表２〜５のいずれか１つにおけるセンス鎖のいずれか１つの断片のヌクレオチド配列の相当する領域に少なくとも約８０％相補的、例えば、約約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％相補的、又は１００％相補的な連続ヌクレオチド配列を含む。
【０１７１】
したがって、ある実施形態において、本明細書に開示されるアンチセンス鎖ポリヌクレオチドは、標的ＨＡＯ１配列に完全に相補的である。他の実施形態において、本明細書に開示されるアンチセンス鎖ポリヌクレオチドは、標的ＨＡＯ１配列に実質的に相補的であり、その全長にわたって、配列番号２１、又は配列番号２１の断片のヌクレオチド配列の相当する領域に少なくとも約８０％相補的、例えば、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約％９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％相補的な連続ヌクレオチド配列を含む。
【０１７２】
一実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、アンチセンスポリヌクレオチドに実質的に相補的な、ひいては、標的ＨＡＯ１配列に相補的なセンス鎖を含み、センス鎖ポリヌクレオチドは、その全長にわたって、配列番号２２、又は配列番号２２のいずれか１つの断片のヌクレオチド配列の相当する領域に少なくとも約８０％相補的、例えば、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約％９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％相補的な連続ヌクレオチド配列を含む。
【０１７３】
ある実施形態において、本発明のｉＲＮＡは、標的ＨＡＯ１配列に実質的に相補的なアンチセンス鎖を含み、その全長にわたって、表７〜１４のいずれか１つにおけるセンス鎖のいずれか１つ、又は表７〜１４のいずれか１つにおけるセンス鎖のいずれか１つの断片のヌクレオチド配列の相当する領域に少なくとも約８０％相補的、例えば、約約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％相補的、又は１００％相補的な連続ヌクレオチド配列を含む。
【０１７４】
本明細書において使用される際の「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ）」という用語は、「低下させる」、「サイレンシングする」、「下方制御する」、「抑制する」及び他の類似語と同義的に使用され、任意のレベルの阻害を含む。
【０１７５】
本明細書において使用される際の「ＬＤＨＡ遺伝子の発現を阻害する」という語句は、任意のＬＤＨＡ遺伝子（例えば、マウスＬＤＨＡ遺伝子、ラットＬＤＨＡ遺伝子、サルＬＤＨＡ遺伝子、又はヒトＬＤＨＡ遺伝子など）並びにＬＤＨＡタンパク質をコードするＬＤＨＡ遺伝子の変異体又は突然変異体の発現の阻害を含む。
【０１７６】
「ＬＤＨＡ遺伝子の発現を阻害する」は、ＬＤＨＡ遺伝子の任意のレベルの阻害、例えば、少なくとも約２０％の阻害など、ＬＤＨＡ遺伝子の発現の少なくとも部分的な抑制を含む。特定の実施形態において、阻害は、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％だけである。
【０１７７】
本明細書において使用される際の「ＨＡＯ１遺伝子の発現を阻害する」という語句は、任意のＨＡＯ１遺伝子（例えば、マウスＨＡＯ１遺伝子、ラットＨＡＯ１遺伝子、サルＨＡＯ１遺伝子、又はヒトＨＡＯ１遺伝子など）並びにＨＡＯ１タンパク質をコードするＨＡＯ１遺伝子の変異体又は突然変異体の発現の阻害を含む。
【０１７８】
「ＨＡＯ１遺伝子の発現を阻害する」は、ＨＡＯ１遺伝子の任意のレベルの阻害、例えば、少なくとも約２０％の阻害など、ＨＡＯ１遺伝子の発現の少なくとも部分的な抑制を含む。特定の実施形態において、阻害は、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％，少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％だけである。
【０１７９】
ＬＤＨＡを標的とする第１のｄｓＲＮＡ剤及びＨＡＯ１を標的とする第２のｄｓＲＮＡ剤が共有結合される実施形態において、ＬＤＨＡの発現の阻害は、ＨＡＯ１発現の阻害と同じか又は異なり得る。
【０１８０】
ＬＤＨＡ遺伝子及び／又はＨＡＯ１遺伝子の発現は、ＬＤＨＡ遺伝子発現及び／又はＨＡＯ１遺伝子発現に関連する任意の変数のレベル、例えば、ＬＤＨＡ及び／又はＨＡＯ１  ｍＲＮＡレベル又はＬＤＨＡ及び／又はＨＡＯ１タンパク質レベルに基づいて評価され得る。ＬＤＨＡ遺伝子及び／又はＨＡＯ１遺伝子の発現はまた、尿、血漿、若しくは組織試料中のオキサレート若しくはグリコレートのレベル、又は組織試料、例えば、肝臓試料、骨格筋試料、及び／又は心臓試料中のＬＤＨＡの酵素活性に基づいて、間接的に評価され得る。阻害は、対照のレベルと比較したこれらの変数の１つ又は複数の絶対的又は相対的レベルの低下によって評価され得る。対照のレベルは、当該技術分野において用いられる任意のタイプの対照のレベル、例えば、投与前ベースライン（ｐｒｅ−ｄｏｓｅ  ｂａｓｅｌｉｎｅ）レベル、又は非処理又は対照（例えば、緩衝液のみの対照又は不活性な剤の対照など）で処理された同様の対象、細胞、又は試料から測定されるレベルであり得る。
【０１８１】
一実施形態において、ＬＤＨＡ遺伝子の発現の少なくとも部分的な抑制は、ＬＤＨＡ遺伝子が転写され、ＬＤＨＡ遺伝子の発現が阻害されるように処理されている第１の細胞又は細胞群から単離され得るか又はそのような第１の細胞又は細胞群において検出され得るＬＤＨＡ  ｍＲＮＡの量の、そのように処理されていない以外は第１の細胞又は細胞群と実質的に同一の第２の細胞又は細胞群（対照細胞）と比較した際の低下によって評価される。
【０１８２】
一実施形態において、ＨＡＯ１遺伝子の発現の少なくとも部分的な抑制は、ＨＡＯ１遺伝子が転写され、ＨＡＯ１遺伝子の発現が阻害されるように処理されている第１の細胞又は細胞群から単離され得るか又はそのような第１の細胞又は細胞群において検出され得るＨＡＯ１  ｍＲＮＡの量の、そのように処理されていない以外は第１の細胞又は細胞群と実質的に同一の第２の細胞又は細胞群（対照細胞）と比較した際の低下によって評価される。
【０１８３】
一実施形態において、ＬＤＨＡ遺伝子及びＨＡＯ１遺伝子の発現の少なくとも部分的な抑制は、ＬＤＨＡ遺伝子及びＨＡＯ１遺伝子が転写され、ＬＤＨＡ遺伝子及びＨＡＯ１遺伝子の発現が阻害されるように処理されている第１の細胞又は細胞群から単離され得るか又はそのような第１の細胞又は細胞群において検出され得るＬＤＨＡ  ｍＲＮＡ及びＨＡＯ１  ｍＲＮＡの量の、そのように処理されていない以外は第１の細胞又は細胞群と実質的に同一の第２の細胞又は細胞群（対照細胞）と比較した際の低下によって評価される。
【０１８４】
阻害度は、下式において表され得る。
【数１】
2020532289.tif 000006
【０１８５】
本明細書において使用される際の「細胞を（ｄｓＲＮＡなどの）ＲＮＡｉ剤と接触させる」という語句は、任意の可能な手段によって細胞を接触させる工程を含む。細胞をＲＮＡｉ剤と接触させる工程は、細胞をｉＲＮＡとインビトロで接触させる工程又は細胞をｉＲＮＡとインビボで接触させる工程を含む。接触は、直接又は間接的に行われ得る。したがって、例えば、ＲＮＡｉ剤は、方法を個々に行うことによって細胞と物理的に接触されてもよく、或いはＲＮＡｉ剤は、それを後に細胞と接触させるのを可能にするか又はそれを後に細胞と接触させる状況に置かれてもよい。
【０１８６】
ＬＤＨＡを標的とする第１のｄｓＲＮＡ剤及びＨＡＯ１を標的とする第２のｄｓＲＮＡ剤が共有結合される本発明の方法において（即ち、二重標的化ＲＮＡｉ剤）、細胞を接触させる工程は、細胞を第２の剤と接触させる工程と同時に又は異なる時点で細胞を第１の剤と接触させる工程を含み得る。
【０１８７】
細胞をインビトロで接触させる工程は、例えば、ＲＮＡｉ剤とともに細胞をインキュベートすることによって行われ得る。細胞をインビボで接触させる工程は、ＲＮＡｉ剤が接触される細胞が位置する組織に後に到達するように、例えば、ＲＮＡｉ剤を、細胞が位置する組織中又は組織の近傍に注入することによって、又はＲＮＡｉ剤を、別の領域、例えば、血流又は皮下腔中に注入することによって行われ得る。例えば、ＲＮＡｉ剤は、目的の部位、例えば、肝臓にＲＮＡｉ剤を指向するリガンド、例えば、ＧａｌＮＡｃ３を含んでいてもよく、及び／又はそれに結合され得る。インビトロ及びインビボでの接触方法の組み合わせも可能である。例えば、細胞はまた、ＲＮＡｉ剤とインビトロで接触され、その後、対象に移植されてもよい。
【０１８８】
一実施形態において、細胞をｉＲＮＡと接触させる工程は、細胞中への取り込み又は吸収を促進するか又は行うことによって、「導入する」又は「ｉＲＮＡを細胞中に送達する」工程を含む。ｉＲＮＡの吸収又は取り込みは、補助されない拡散（ｕｎａｉｄｅｄ  ｄｉｆｆｕｓｉｖｅ）又は活性な細胞プロセスによって、又は補助的な薬剤又はデバイスによって行われ得る。細胞中へのｉＲＮＡの導入は、インビトロ及び／又はインビボであってもよい。例えば、インビボでの導入の場合、ｉＲＮＡは、組織部位に注入されるか又は全身投与され得る。インビボでの送達は、全内容が参照により本明細書に援用される、米国特許第５，０３２，４０１号明細書及び同第５，６０７，６７７号明細書、及び米国特許出願公開第２００５／０２８１７８１号明細書に記載されるものなどのβ−グルカン送達系によって行うこともできる。細胞中へのインビトロでの導入は、エレクトロポレーション及びリポフェクションなどの当該技術分野において公知の方法を含む。更なる手法が、本明細書において後述され、及び／又は当該技術分野において公知である。
【０１８９】
「脂質ナノ粒子」又は「ＬＮＰ」という用語は、核酸分子、例えば、ｉＲＮＡ又はｉＲＮＡが転写されるプラスミドなどの薬学的に有効な分子を封入する脂質層を含むベシクルである。ＬＮＰは、例えば、全内容が参照により本明細書に援用される、米国特許第６，８５８，２２５号明細書、同第６，８１５，４３２号明細書、同第８，１５８，６０１号明細書、及び同第８，０５８，０６９号明細書に記載されている。
【０１９０】
本明細書において使用される際、「対象」は、霊長類（ヒト、非ヒト霊長類、例えば、サル、及びチンパンジーなど）、非霊長類（ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、マウス、ウマ、及びクジラなど）を含む哺乳動物、又は鳥類（例えば、アヒル又はガチョウ）などの動物である。
【０１９１】
一実施形態において、対象は、本明細書に記載されるように、ＬＤＨＡ発現の低下から利益を得られ得る疾病、障害若しくは病態について処置又は評価されているヒト；ＬＤＨＡ発現の低下から利益を得られ得る疾病、障害若しくは病態のリスクがあるヒト；ＬＤＨＡ発現の低下から利益を得られ得る疾病、障害若しくは病態に罹患しているヒト；及び／又はＬＤＨＡ発現の低下から利益を得られ得る疾病、障害若しくは病態について処置されているヒトなどのヒトである。
【０１９２】
ＬＤＨＡ発現の低下から利益を得られ得る疾病、障害若しくは病態について処置又は評価されているヒトが、ＬＤＨＡ及びＨＡＯ１発現の低下から利益を得られ得る疾病、障害若しくは病態について処置又は評価されているヒトを含むこと；ＬＤＨＡ発現の低下から利益を得られ得る疾病、障害若しくは病態のリスクがあるヒトが、ＬＤＨＡ及びＨＡＯ１発現の低下から利益を得られ得る疾病、障害若しくは病態のリスクがあるヒトを含むこと；ＬＤＨＡ発現の低下から利益を得られ得る疾病、障害若しくは病態に罹患しているヒトが、ＬＤＨＡ及びＨＡＯ１発現の低下から利益を得られ得る疾病、障害若しくは病態のリスクがあるヒトを含むこと；及びＬＤＨＡ発現の低下から利益を得られ得る疾病、障害若しくは病態について処置されているヒトが、本明細書に記載されるようにＬＤＨＡ及びＨＡＯ１発現の低下から利益を得られ得る疾病、障害若しくは病態について処置されているヒトを含むことが理解されるべきである。
【０１９３】
本明細書において使用される際、「処置する」又は「処置」という用語は、対象におけるオキサレートの尿中排泄レベルを低下させることなどの、有益な又は所望の結果を指す。「処置する」又は「処置」という用語は、限定はされないが、例えば、疾病の進行を遅らせること；晩期発症型（ｌａｔｅｒ−ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ）の疾病の重症度を低下させること；四肢、顔、喉頭、上気道、腹部、胴体、及び／又は生殖器の浮腫、前駆症状、喉頭浮腫、掻痒のない発疹、吐き気、嘔吐、及び／又は腹痛の低減；肝疾患の、肝硬変又は肝細胞癌への進行を低減すること；現在の結石負荷を安定させること；結石の形成の再発を減少させること；及び／又は更なるオキサレート組織沈着を予防することなどの、オキサレート経路に関連する疾病、障害、又は病態の１つ又は複数の症状の緩和又は改善も含む。「処置」は、処置をしない場合の予測される生存期間と比較した生存期間の延長も意味し得る。
【０１９４】
疾病マーカー又は症状に関連して「低下させる」という用語は、このようなレベルの統計的に有意な低下を指す。低下は、例えば、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそれ以上であり得、このような障害を有さない個体の正常範囲内であると認められるレベルまで低下されるのが好ましい。
【０１９５】
本明細書において使用される際、「予防」又は「予防する」は、ＬＤＨＡ遺伝子の発現の低下から利益を得られ得る疾病、障害若しくはその病態に関連して使用される場合、対象が、このような疾病、障害、若しくは病態に関連する症状、例えば、結石形成を発症する可能性の低下を指す。例えば、結石形成の可能性は、例えば、結石形成の１つ又は複数の危険因子を有する個体が結石を発症しない場合、又は同じ危険因子を有し、本明細書に記載される処置を受けない集団と比べてより軽度の結石を発症する場合のいずれかに低下される。疾病、障害又は病態を発症しないこと、又はこのような疾病、障害又は病態に関連する症状の発生の低下（例えば、その疾病又は障害の臨床的に認められた尺度で少なくとも約１０％）、又は症状の遅延の現れ（例えば、数日、数週間、数カ月又は数年だけ）が、有効な予防とみなされる。
【０１９６】
オキサレート経路に関連する疾病、障害、又は病態などの、ＬＤＨＡ遺伝子の発現の低下から利益を得られ得る多くの障害がある。
【０１９７】
本明細書において使用される際、「オキサレート経路に関連する疾病、障害、若しくは病態」という用語は、乳酸脱水素酵素ノックダウンが治療効果がある又は他の形で有利であることが知られているか又は予測される、例えば、乳酸脱水素酵素産生及び／又は尿中オキサレート産生のかく乱に関連するか又はそれによって引き起こされる、疾病、障害若しくはその病態を指す。
【０１９８】
一実施形態において、「オキサレート経路に関連する疾病、障害、若しくは病態」は、「乳酸脱水素酵素に関連する疾病、障害、若しくは病態」である。本明細書において使用される際、「乳酸脱水素酵素に関連する疾病、障害、若しくは病態」は、乳酸脱水素酵素遺伝子発現、複製、又はタンパク質活性の低下から利益を得られ得る任意の疾病、障害若しくは病態を含む。例示的な乳酸脱水素酵素に関連する疾病、障害、及び病態は、例えば、脂肪肝（脂肪症）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、肝臓中の脂肪の蓄積、肝臓の炎症、肝細胞壊死、肝線維症、肥満、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、及び癌、例えば、肝細胞癌を含む。
【０１９９】
別の実施形態において、「オキサレート経路に関連する疾病、障害、若しくは病態」は、「オキサレートに関連する疾病、障害、若しくは病態」である。本明細書において使用される際、「オキサレートに関連する疾病、障害、若しくは病態」は、乳酸脱水素酵素遺伝子発現、複製、又はタンパク質活性の低下から利益を得られ得る任意の疾病、障害若しくは病態を含む。「オキサレートに関連する疾病、障害、若しくは病態」という用語は、遺伝性疾患、又は誘発性若しくは後天性疾患を指す。例示的な「オキサレートに関連する疾病、障害、若しくは病態」は、「腎臓結石形成疾病、障害、及び病態」及び「シュウ酸カルシウム組織沈着疾病、障害、及び病態」を含む。
【０２００】
例示的な腎臓結石形成疾病、障害、及び病態は、「シュウ酸カルシウム結石形成疾病、障害、及び病態」及び「非シュウ酸カルシウム結石形成疾病、障害、及び病態」を含む。
【０２０１】
「シュウ酸カルシウム結石形成疾病、障害、及び病態」の非限定的な例は、高シュウ酸尿症（例えば、原発性高シュウ酸尿症１（ＰＨ１）、原発性高シュウ酸尿症２（ＰＨ２）、原発性高シュウ酸尿症３（ＰＨ３）及び非ＰＨ１／ＰＨ２／ＰＨ３などの原発性高シュウ酸尿症；腸管高シュウ酸尿症；食餌性高シュウ酸尿症；及び特発性高シュウ酸尿症）及び非高シュウ酸尿症障害（例えば、原発性副甲状腺機能亢進症、デント病、吸収性高カルシウム尿症、及び腎性高カルシウム尿症などの高カルシウム尿症；及び低クエン酸尿症）を含む。
【０２０２】
「非シュウ酸カルシウム結石形成疾病、障害、及び病態」の非限定的な例は、約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、又は約１０％未満のオキサレート、及び約５０％超の非オキサレート、例えば、リン酸カルシウム、尿酸、ストルバイト、シスチン尿、又は他の成分から構成される腎臓結石を有する対象を含む。
【０２０３】
例示的な「シュウ酸カルシウム組織沈着疾病、障害、及び病態」は、全身性シュウ酸カルシウム組織沈着疾病、障害、及び病態、例えば、末期腎疾患、サルコイドーシス、又は関節炎に起因するシュウ酸カルシウム組織沈着；並びに腎臓移植などの臓器移植に起因する、例えば、腎臓における（例えば、腎石灰沈着症、又は海綿腎に起因する）、甲状腺における、乳房における、骨における、心臓における、血管系における、又は任意の軟組織における、組織特異的シュウ酸カルシウム沈着疾病、障害、及び病態を含む。
【０２０４】
本明細書において使用される際の「治療有効量」は、オキサレート経路に関連する疾病、障害、又は病態に罹患している対象に投与される場合、（例えば、既存の疾病又は疾病の１つ又は複数の症状を軽減、改善、又は維持することによって）この疾病の処置を行うのに十分なＲＮＡｉ剤の量を含むことが意図される。「治療有効量」は、ＲＮＡｉ剤、薬剤が投与される方法、疾病及びその重症度、並びに処置される対象の病歴、年齢、体重、家族歴、遺伝子構造、もしあれば、以前の処置又は併用処置のタイプ、及び他の個体特性に応じて変化し得る。
【０２０５】
本明細書において使用される際の「予防的に有効な量」は、オキサレート経路に関連する疾病、障害又は病態に罹患している対象に投与される場合、疾病又は疾病の１つ又は複数の症状を予防又は改善するのに十分なｉＲＮＡの量を含むことが意図される。疾病の改善は、この疾病の経過を遅らせること又は後から発症する疾病の重症度を軽減することを含む。「予防的に有効な量」は、ｉＲＮＡ、薬剤が投与される方法、疾病に罹患する危険度、並びに処置される患者の病歴、年齢、体重、家族歴、遺伝子構造、もしあれば、以前の処置又は併用処置のタイプ、及び他の個体特性に応じて変化し得る。
【０２０６】
「治療有効量」又は「予防的に有効な量」は、任意の処置に適用される妥当なベネフィット・リスク比である所望の局所又は全身的作用を生じる、ＲＮＡｉ剤の量も含む。本発明の方法に用いられるｉＲＮＡは、このような処置に適用される妥当なベネフィット・リスク比を得るのに十分な量で投与され得る。
【０２０７】
ＬＤＨＡを標的とする第１のｄｓＲＮＡ剤及びＨＡＯ１を標的とする第２のｄｓＲＮＡ剤を含む医薬組成物を対象に投与する工程を含む本発明の方法において、第１のｄｓＲＮＡ剤の治療有効量は、第２のｄｓＲＮＡ剤の治療有効量と同じか又は異なり得る。同様に、ＬＤＨＡを標的とする第１のｄｓＲＮＡ剤及びＨＡＯ１を標的とする第２のｄｓＲＮＡ剤を含む医薬組成物を対象に投与する工程を含む本発明の方法において、第１のｄｓＲＮＡ剤の予防的に有効な量は、第２のｄｓＲＮＡ剤の予防的に有効な量と同じか又は異なり得る。
【０２０８】
「薬学的に許容され得る」という語句は、妥当な医学的判断の範囲内で、妥当なベネフィット・リスク比に見合って、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、或いは他の問題又は合併症を伴わずに、ヒト対象及び動物対象の組織と接触して使用するのに好適な化合物、材料、組成物、及び／又は剤形を指すために本明細書において用いられる。
【０２０９】
本明細書において使用される際の「薬学的に許容され得る担体」という語句は、身体の１つの器官、又は部分から、身体の別の器官、又は部分へと対象に化合物を運ぶ又は輸送するのに関与する、液体又は固体充填剤、希釈剤、賦形剤、製造助剤（例えば、潤滑剤、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム又はステアリン酸亜鉛、又はステアリン酸）、又は溶媒封入材料などの薬学的に許容され得る材料、組成物又はビヒクルを意味する。各担体は、製剤の他の成分と適合し、処置される対象に有害でないという意味で「許容でき」なければならない。薬学的に許容され得る担体としての役割を果たし得る材料のいくつかの例としては：（１）ラクトース、グルコース及びスクロースなどの糖類；（２）トウモロコシデンプン及びジャガイモデンプンなどのデンプン；（３）ナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロース及び酢酸セルロースなどのセルロース、及びその誘導体；（４）トラガカント末；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）マグネシウムステート（ｓｔａｔｅ）、ラウリル硫酸ナトリウム及びタルクなどの滑沢剤；（８）カカオ脂及び坐薬ワックスなどの賦形剤；（９）ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油及び大豆油などの油；（１０）プロピレングリコールなどのグリコール；（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコールなどのポリオール；（１２）オレイン酸エチル及びラウリン酸エチルなどのエステル；（１３）寒天；（１４）水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；（１５）アルギン酸；（１６）発熱性物質除去蒸留水；（１７）等張食塩水；（１８）リンゲル液；（１９）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝液；（２１）ポリエステル、ポリカーボネート及び／又はポリ無水物；（２２）ポリペプチド及びアミノ酸などの増量剤（２３）血清アルブミン、ＨＤＬ及びＬＤＬなどの血清成分；並びに（２２）医薬製剤に用いられる他の非毒性の適合する物質が挙げられる。
【０２１０】
本明細書において使用される際の「試料」という用語は、対象から単離された類似の体液、細胞、又は組織、並びに対象中に存在する体液、細胞、又は組織の集合体を含む。生体液の例としては、血液、血清及び漿膜液、血漿、脳脊髄液、眼液、リンパ液、尿、唾液などが挙げられる。組織試料は、組織、器官又は局所領域に由来する試料を含み得る。例えば、試料は、特定の器官、器官の部分、或いはそれらの器官中の体液又は細胞に由来し得る。特定の実施形態において、試料は、肝臓（例えば、全肝臓又は肝臓の特定の部分、又は例えば肝細胞などの肝臓中の特定のタイプの細胞）に由来し得る。ある実施形態において、「対象に由来する試料」は、対象から得られる血液又は血漿を指す。
【０２１１】
ＩＩ．本発明のｉＲＮＡ
標的遺伝子の発現を阻害するｉＲＮＡが、本明細書に記載される。一実施形態において、ｉＲＮＡは、ＬＤＨＡ遺伝子の発現を阻害する。一実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、細胞、例えば肝細胞、例えば、オキサレート経路に関連する疾病、障害又は病態、例えば、結石形成疾病、障害、若しくは病態に罹患している対象、例えば、哺乳動物、例えばヒト中の肝細胞内でのＬＤＨＡ遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子を含む。別の実施形態において、ｉＲＮＡは、ＨＡＯ１遺伝子の発現を阻害する。一実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、細胞、例えば肝細胞、例えば、オキサレート経路に関連する疾病、障害又は病態、例えば、オキサレートに関連する疾病、障害、若しくは病態、例えば、腎臓結石形成疾病、障害、若しくは病態又はシュウ酸カルシウム組織沈着疾病、障害、若しくは病態；又はＬＤＨに関連する疾病、障害、若しくは病態に罹患している対象、例えば、哺乳動物、例えばヒト中の肝細胞内でのＨＡＯ１遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子を含む。
【０２１２】
二重標的化ＲＮＡｉ剤と呼ばれる、２つの標的遺伝子の発現を阻害するｉＲＮＡも、本明細書に提供される。一実施形態において、二重標的化ＲＮＡｉ剤は、細胞（肝細胞、例えば、対象中の肝細胞など）における、例えば、オキサレート経路に関連する疾病、障害又は病態、例えば、オキサレートに関連する疾病、障害、若しくは病態、例えば、腎臓結石形成疾病、障害、若しくは病態又はシュウ酸カルシウム組織沈着疾病、障害、若しくは病態；又はＬＤＨに関連する疾病、障害、若しくは病態に罹患している対象、例えば、哺乳動物、例えばヒト中の細胞内でのＨＡＯ１遺伝子の発現を阻害するために第２の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤に共有結合された、細胞（肝細胞、例えば、対象中の肝細胞など）におけるＬＤＨＡ遺伝子の発現を阻害するための第１の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤を含む。
【０２１３】
ｄｓＲＮＡは、ＬＤＨＡ遺伝子又はＨＡＯ１遺伝子の発現中に形成されるｍＲＮＡの少なくとも一部に対して相補性である相補性の領域を有するアンチセンス鎖を含む。相補性の領域は、約３０ヌクレオチド長以下（例えば、約３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、又は１８ヌクレオチド長以下）である。標的遺伝子を発現する細胞と接触すると、ｉＲＮＡは、例えば、ＰＣＲ又は分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）に基づいた方法、或いは例えば、ウエスタンブロット法又はフローサイトメトリー技術を用いた免疫蛍光分析などによるタンパク質に基づいた方法によってアッセイした際に少なくとも約１０％、標的遺伝子（例えば、ヒト、霊長類、非霊長類、又は鳥類の標的遺伝子）の発現を阻害する。
【０２１４】
ｄｓＲＮＡは、２本のＲＮＡ鎖を含み、この２本のＲＮＡ鎖は、相補的であり、ｄｓＲＮＡが使用される条件下で二本鎖構造を形成するようにハイブリダイズする。ｄｓＲＮＡの１本の鎖（アンチセンス鎖）は、標的配列に実質的に相補的な、一般に完全に相補的な相補性の領域を含む。標的配列は、ＬＤＨＡ遺伝子又はＨＡＯ１遺伝子の発現中に形成されるｍＲＮＡの配列に由来し得る。他方の鎖（センス鎖）は、アンチセンス鎖に相補的な領域を含み、２本の鎖がハイブリダイズして、好適な条件下で組み合わされた際に二本鎖構造を形成するようになっている。本明細書のいずれかの箇所に記載されるように、及び当該技術分野において公知であるように、ｄｓＲＮＡの相補的配列はまた、別個のオリゴヌクレオチド上にあるのではなく、１つの核酸分子の自己相補的な領域として含まれることもある。
【０２１５】
一般に、二本鎖構造は、１５〜３０塩基対の長さ、例えば、１５〜２９、１５〜２８、１５〜２７、１５〜２６、１５〜２５、１５〜２４、１５〜２３、１５〜２２、１５〜２１、１５〜２０、１５〜１９、１５〜１８、１５〜１７、１８〜３０、１８〜２９、１８〜２８、１８〜２７、１８〜２６、１８〜２５、１８〜２４、１８〜２３、１８〜２２、１８〜２１、１８〜２０、１９〜３０、１９〜２９、１９〜２８、１９〜２７、１９〜２６、１９〜２５、１９〜２４、１９〜２３、１９〜２２、１９〜２１、１９〜２０、２０〜３０、２０〜２９、２０〜２８、２０〜２７、２０〜２６、２０〜２５、２０〜２４，２０〜２３、２０〜２２、２０〜２１、２１〜３０、２１〜２９、２１〜２８、２１〜２７、２１〜２６、２１〜２５、２１〜２４、２１〜２３、又は２１〜２２塩基対の長さである。上記の範囲及び長さの中間の範囲及び長さも、本発明の一部であるものと考えられる。
【０２１６】
同様に、標的配列の相補性の領域は、１５〜３０ヌクレオチド長、例えば、１５〜２９、１５〜２８、１５〜２７、１５〜２６、１５〜２５、１５〜２４、１５〜２３、１５〜２２、１５〜２１、１５〜２０、１５〜１９、１５〜１８、１５〜１７、１８〜３０、１８〜２９、１８〜２８、１８〜２７、１８〜２６、１８〜２５、１８〜２４、１８〜２３、１８〜２２、１８〜２１、１８〜２０、１９〜３０、１９〜２９、１９〜２８、１９〜２７、１９〜２６、１９〜２５、１９〜２４、１９〜２３、１９〜２２、１９〜２１、１９〜２０、２０〜３０、２０〜２９、２０〜２８、２０〜２７、２０〜２６、２０〜２５、２０〜２４、２０〜２３、２０〜２２、２０〜２１、２１〜３０、２１〜２９、２１〜２８、２１〜２７、２１〜２６、２１〜２５、２１〜２４、２１〜２３、又は２１〜２２ヌクレオチド長である。上記の範囲及び長さの中間の範囲及び長さも、本発明の一部であるものと考えられる。
【０２１７】
ある実施形態において、ｄｓＲＮＡは、約１５〜約２３ヌクレオチド長、又は約２５〜約３０ヌクレオチド長である。一般に、ｄｓＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒ酵素のための基質としての役割を果たすのに十分に長い。例えば、約２１〜２３ヌクレオチドより長いｄｓＲＮＡがＤｉｃｅｒのための基質としての役割を果たし得ることが当該技術分野において周知である。当業者がやはり認識するように、切断のために標的化されたＲＮＡの領域は、ほとんどの場合、より大きいＲＮＡ分子（ｍＲＮＡ分子であることが多い）の一部である。関連する場合、ｍＲＮＡ標的の「一部」は、ＲＮＡｉ指向性の切断（即ち、ＲＩＳＣ経路を介した切断）のための基質であるのが可能であるほど十分な長さのｍＲＮＡ標的の連続する配列である。
【０２１８】
二本鎖領域が、ｄｓＲＮＡの一次機能部分、例えば、約９〜３６塩基対、例えば、約１０〜３６、１１〜３６、１２〜３６、１３〜３６、１４〜３６、１５〜３６、９〜３５、１０〜３５、１１〜３５、１２〜３５、１３〜３５、１４〜３５、１５〜３５、９〜３４、１０〜３４、１１〜３４、１２〜３４、１３〜３４、１４〜３４、１５〜３４、９〜３３、１０〜３３、１１〜３３、１２〜３３、１３〜３３、１４〜３３、１５〜３３、９〜３２、１０〜３２、１１〜３２、１２〜３２、１３〜３２、１４〜３２、１５〜３２、９〜３１、１０〜３１、１１〜３１、１２〜３１、１３〜３２、１４〜３１、１５〜３１、１５〜３０、１５〜２９、１５〜２８、１５〜２７、１５〜２６、１５〜２５、１５〜２４、１５〜２３、１５〜２２、１５〜２１、１５〜２０、１５〜１９、１５〜１８、１５〜１７、１８〜３０、１８〜２９、１８〜２８、１８〜２７、１８〜２６、１８〜２５、１８〜２４、１８〜２３、１８〜２２、１８〜２１、１８〜２０、１９〜３０、１９〜２９、１９〜２８、１９〜２７、１９〜２６、１９〜２５、１９〜２４、１９〜２３、１９〜２２、１９〜２１、１９〜２０、２０〜３０、２０〜２９、２０〜２８、２０〜２７、２０〜２６、２０〜２５、２０〜２４，２０〜２３、２０〜２２、２０〜２１、２１〜３０、２１〜２９、２１〜２８、２１〜２７、２１〜２６、２１〜２５、２１〜２４、２１〜２３、又は２１〜２２塩基対の二本鎖領域であることも当業者は認識するであろう。ここで、一実施形態において、所望のＲＮＡを切断のために標的とする例えば、１５〜３０塩基対の機能性二本鎖にプロセシングされる程度まで、ＲＮＡ分子又は３０塩基対を超える二本鎖領域を有するＲＮＡ分子の複合体はｄｓＲＮＡである。したがって、当業者は、一実施形態において、ｍｉＲＮＡがｄｓＲＮＡであることを認識するであろう。別の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、天然ｍｉＲＮＡではない。別の実施形態において、ＬＤＨＡの発現又はＬＤＨＡ及びＨＡＯ１の発現を標的とするのに有用なｉＲＮＡ剤は、より大きいｄｓＲＮＡの切断によって標的細胞中に生成されない。
【０２１９】
本明細書に記載されるｄｓＲＮＡは、１つ又は複数の一本鎖ヌクレオチドオーバーハング、例えば、１、２、３、又は４つのヌクレオチドを更に含み得る。少なくとも１つのヌクレオチドオーバーハングを有するｄｓＲＮＡは、その平滑末端の同等物と比べて予想外に優れた阻害特性を有し得る。ヌクレオチドオーバーハングは、デオキシヌクレオチド／ヌクレオシドを含むヌクレオチド／ヌクレオシド類似体を含むか又はそれからなり得る。オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖又はそれらの任意の組み合わせ上にあり得る。更に、オーバーハングのヌクレオチドは、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖又はセンス鎖のいずれかの５’末端、３’末端又は両方の末端上に存在し得る。
【０２２０】
ｄｓＲＮＡは、例えば、自動ＤＮＡ合成装置（例えば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．から市販されているものなど）の使用によって、更に後述されるように、当該技術分野において公知の標準的な方法によって合成され得る。
【０２２１】
本発明のｉＲＮＡ化合物は、２工程の手順を用いて調製され得る。まず、二本鎖ＲＮＡ分子の個々の鎖が別個に調製される。次に、構成要素の鎖はアニールされる。ｓｉＲＮＡ化合物の個々の鎖は、溶液相又は固相有機合成又は両方を用いて調製され得る。有機合成は、非天然又は修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド鎖が容易に調製され得るという利点を提供する。本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドは、溶液相又は固相有機合成又は両方を用いて調製され得る。
【０２２２】
一態様において、本発明のｄｓＲＮＡは、少なくとも２つのヌクレオチド配列、センス配列及びアンチセンス配列を含む。センス鎖配列は、表２〜５のいずれか１つに示される配列の群から選択され、センス鎖のアンチセンス鎖対応するヌクレオチド配列は、表２〜５のいずれか１つに示される配列の群から選択される。この態様において、２つの配列の一方が２つの配列の他方に相補的であり、配列の一方が、ＬＤＨＡ遺伝子の発現中に生成されるｍＲＮＡの配列に実質的に相補的である。したがって、この態様において、ｄｓＲＮＡは、２つのオリゴヌクレオチドを含むことになり、ここで、１つのオリゴヌクレオチドが、表２〜５のいずれか１つ中のセンス鎖（パッセンジャー鎖）として表され、第２のオリゴヌクレオチドが、表２〜５のいずれか１つ中のセンス鎖の対応するアンチセンス鎖（ガイド鎖）として表される。一実施形態において、ｄｓＲＮＡの実質的に相補的な配列は、別個のオリゴヌクレオチドに含まれる。別の実施形態において、ｄｓＲＮＡの実質的に相補的な配列は、１つのオリゴヌクレオチドに含まれる。
【０２２３】
別の態様において、本発明のｄｓＲＮＡは、ＨＡＯ１遺伝子を標的とし、少なくとも２つのヌクレオチド配列、センス配列及びアンチセンス配列を含む。センス鎖配列は、表７〜１４のいずれか１つにおいて提供される配列の群から選択され、センス鎖のアンチセンス鎖の対応するヌクレオチド配列は、表７〜１４のいずれか１つの配列の群から選択される。この態様において、２つの配列の一方は、２つの配列の他方に相補的であり、配列の一方は、ＨＡＯ１遺伝子の発現において生成されるｍＲＮＡの配列に実質的に相補的である。したがって、この態様において、ｄｓＲＮＡは、２つのオリゴヌクレオチドを含み、ここで、一方のオリゴヌクレオチドは、表７〜１４のいずれか１つにおいてセンス鎖（パッセンジャー鎖）として表され、第２のオリゴヌクレオチドは、表７〜１４のいずれか１つにおいてセンス鎖の対応するアンチセンス鎖（ガイド鎖）として表される。一実施形態において、ｄｓＲＮＡの実質的に相補的な配列は、別のオリゴヌクレオチドに含まれる。別の実施形態において、ｄｓＲＮＡの実質的に相補的配列は、単一のオリゴヌクレオチドに含まれる。
【０２２４】
表２〜５及び７〜１４中の配列は、修飾された、修飾されていない、コンジュゲートされていない、及び／又はコンジュゲートされた配列として表されるが、本発明のｉＲＮＡ、例えば、本発明のｄｓＲＮＡのＲＮＡは、本明細書に記載されるのと異なって、修飾されていない、コンジュゲートされていない、及び／又は修飾された及び／又はコンジュゲートされた、表２〜５及び７〜１４のいずれか１つに記載される配列のいずれか１つを含み得ることが理解されるであろう。
【０２２５】
当業者は、約２０〜２３個の塩基対、例えば、２１個の塩基対の二本鎖構造を有するｄｓＲＮＡが、ＲＮＡ干渉を誘導するのに特に有効であることが認められたことを十分に認識している（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）ＥＭＢＯ  Ｊ．，：６８７７−６８８８）。しかしながら、他の当業者が、より短い又はより長いＲＮＡ二本鎖構造も有効であり得ることを見出した（Ｃｈｕ  ａｎｄ  Ｒａｎａ（２００７）ＲＮＡ  １４：１７１４−１７１９；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２３：２２２−２２６）。上記の実施形態において、本明細書に示されるオリゴヌクレオチド配列の性質によって、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡは、最小限の２１ヌクレオチド長の少なくとも１本の鎖を含み得る。一端又は両端におけるごくわずかな数のヌクレオチドを差し引いた、より短い二本鎖が、上記のｄｓＲＮＡと比較して、同様に有効であり得ることが当然予測され得る。したがって、本明細書に示される配列のうちの１つからの、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、又はそれ以上の連続するヌクレオチド配列を有するｄｓＲＮＡであって、ＬＤＨＡ遺伝子又はＨＡＯ１遺伝子の発現を阻害する能力が、完全な配列を含むｄｓＲＮＡとは約５、１０、１５、２０、２５、又は３０％以下の阻害だけ異なるｄｓＲＮＡが、本発明の範囲内にあるものと考えられる。
【０２２６】
更に、表２〜５のいずれか１つに記載されるＲＮＡは、ＲＩＳＣ媒介性切断を起こしやすいＬＤＨＡ転写物における部位を同定し、表７〜１４のいずれか１つに記載されるＲＮＡは、ＲＩＳＣ媒介性切断を起こしやすいＨＡＯ１転写物における部位を同定する。したがって、本発明は更に、この部位内を標的とするｉＲＮＡを特徴とする。本明細書において使用される際、ｉＲＮＡが、その特定の部位内のいずれかの箇所で転写物の切断を促す場合、ｉＲＮＡは、ＲＮＡ転写物の特定の部位内を標的とするとされている。このようなｉＲＮＡは、一般に、遺伝子中の選択された配列に隣接する領域から取られた更なるヌクレオチド配列に結合された、本明細書に示される配列のうちの１つからの少なくとも約１５連続ヌクレオチドを含むであろう。
【０２２７】
標的配列は、一般に、約１５〜３０ヌクレオチド長であるが、任意の所与の標的ＲＮＡの切断を導くために、この範囲内の特定の配列の適合性は様々である。本明細書に記載される様々なソフトウェアパッケージ及び指針は、任意の所与の遺伝子標的のために最適な標的配列の特定のための指針を与えるが、所与のサイズ（非限定的な例として、２１ヌクレオチド）の「ウインドウ」又は「マスク」が、標的配列としての役割を果たし得るサイズ範囲内の配列を特定するために、標的ＲＮＡ配列上に文字通りに又は比喩的に（例えば、インシリコを含む）置かれる、経験的手法を取ることもできる。完全な一連の可能な配列が、選択された任意の所与の標的サイズについて特定されるまで、初期の標的配列位置の１ヌクレオチド上流又は下流に徐々に配列「ウインドウ」を移動させることによって、次の潜在的な標的配列を特定することができる。このプロセスは、最適に機能する配列を特定するために（本明細書に記載されるか又は当該技術分野において公知のアッセイを用いて）特定された配列の系統的合成及び試験とともに、ｉＲＮＡ剤を用いて標的化されるとき、標的遺伝子の発現の最良の阻害を仲介するＲＮＡ配列を特定することができる。したがって、例えば、本明細書で特定される配列が、有効な標的配列を表すが、同等の又はより良好な阻害特性を有する配列を特定するために、所与の配列の１ヌクレオチド上流又は下流に徐々に「ウインドウを移動させる」ことによって、阻害効率の更なる最適化が達成され得ると考えられる。
【０２２８】
更に、例えば、本明細書で特定される任意の配列について、より長い又はより短い配列を生成するためにヌクレオチドを系統的に加えるか又は除去し、より長い又は短いサイズのウインドウをその点から標的ＲＮＡの上方又は下方に移動させることによって生成される配列を試験することによって、更なる最適化が達成され得ると考えられる。また、当該技術分野において公知の及び／又は本明細書に記載される阻害アッセイにおいて、新規な候補標的を生成するためのこの手法を、それらの標的配列に基づいたｉＲＮＡの有効性の試験と結び付けることで、阻害の効率が更に向上され得る。更にまた、このような最適化された配列は、例えば、本明細書に記載されるか又は当該技術分野において公知の修飾ヌクレオチドの導入、オーバーハングの追加又は変更、或いは発現阻害因子として分子を更に最適化するための当該技術分野において公知の及び／又は本明細書に説明される他の修飾（例えば、血清安定性の又は循環半減期の増加、熱安定性の増加、膜透過送達の向上、特定の位置又は細胞型への標的化、サイレンシング経路酵素との相互作用の増加、エンドソームからの放出の増加）によって調整され得る。
【０２２９】
本明細書に記載されるｉＲＮＡ剤は、標的配列との１つ又は複数のミスマッチを含み得る。一実施形態において、本明細書に記載されるｉＲＮＡは、３つ以下のミスマッチを含む。ｉＲＮＡのアンチセンス鎖が、標的配列とのミスマッチを含む場合、ミスマッチの領域が相補性の領域の中心に位置しないのが好ましい。ｉＲＮＡのアンチセンス鎖が標的配列とのミスマッチを含む場合、ミスマッチが、相補性の領域の５’末端又は３’末端のいずれかからの最後の５ヌクレオチド内に制限されるのが好ましい。例えば、２３個のヌクレオチドのｉＲＮＡ剤について、ＬＤＨＡ遺伝子又はＨＡＯ１遺伝子の領域に相補的な鎖は、一般に、中央の１３個のヌクレオチド内にミスマッチを全く含まない。本明細書に記載される方法又は当該技術分野において公知の方法を用いて、標的配列とのミスマッチを含むｉＲＮＡがＬＤＨＡ遺伝子及び／又はＨＡＯ１遺伝子の発現を阻害するのに有効であるかどうかを決定することができる。ＬＤＨＡ遺伝子及び／又はＨＡＯ１遺伝子の発現を阻害する際のミスマッチを有するｉＲＮＡの有効性を考慮することは、特に、ＬＤＨＡ遺伝子及び／又はＨＡＯ１遺伝子における特定の相補性の領域が集団内に多型配列変異を有することが分かっている場合に重要である。
【０２３０】
２つのｄｓＲＮＡ剤を含む、本発明の二重標的化ＲＮＡｉ剤は、例えば、共有結合リンカーを介して共有結合される。共有結合リンカーは、当該技術分野において周知であり、例えば、核酸リンカー、ペプチドリンカー、炭水化物リンカーなどを含む。共有結合リンカーは、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ及び／又はペプチドを含み得る。リンカーは、一本鎖、二本鎖、部分的に一本鎖、又は部分的に二本鎖であり得る。修飾ヌクレオチド又はヌクレオチドの混合物も、核酸リンカー中に存在し得る。
【０２３１】
本発明の二重標的化剤に使用するための好適なリンカーとしては、全内容が参照により本明細書に援用される米国特許第９，１８７，７４６号明細書に記載されているものが挙げられる。
【０２３２】
ある実施形態において、リンカーは、ジスルフィド結合を含む。リンカーは、切断可能又は切断不可能であり得る。
【０２３３】
リンカーは、例えば、ｄＴｓｄＴｕｕ＝（５’−２’デオキシチミジル−３’−チオホスフェート−５’−２’デオキシチミジル−３’−ホスフェート−５’−ウリジル−３’−ホスフェート−５’−ウリジル−３’−ホスフェート）；ｒＵｓｒＵ（チオホスフェートリンカー：５’−ウリジル−３’−チオホスフェート−５’−ウリジル−３’−ホスフェート）；ｒＵｒＵリンカー；ｄＴｓｄＴａａ（ａａｄＴｓｄＴ、５’−２’デオキシチミジル−３’−チオホスフェート−５’−２’デオキシチミジル−３’−ホスフェート−５’−アデニル−３’−ホスフェート−５’−アデニル−３’−ホスフェート）；ｄＴｓｄＴ（５’−２’デオキシチミジル−３’−チオホスフェート−５’−２’デオキシチミジル−３’−ホスフェート）；ｄＴｓｄＴｕｕ＝ｕｕｄＴｓｄＴ＝５’−２’デオキシチミジル−３’−チオホスフェート−５’−２’デオキシチミジル−３’−ホスフェート−５’−ウリジル−３’−ホスフェート−５’−ウリジル−３’−ホスフェートであり得る。
【０２３４】
リンカーは、ポリ（５’−アデニル−３’−ホスフェート−ＡＡＡＡＡＡＡＡ）又はポリ（５’−シチジル−３’−ホスフェート−５’−ウリジル−３’−ホスフェート−ＣＵＣＵＣＵＣＵ））、例えば、Ｘｎ一本鎖ポリＲＮＡリンカーなどのポリＲＮＡであり得、ここで、ｎが、２以上５０以下、好ましくは、４以上１５以下、最も好ましくは、７以上８以下の整数である。修飾ヌクレオチド又はヌクレオチドの混合物はまた、前記ポリＲＮＡリンカー中に存在し得る。共有結合リンカーは、ポリ（５’−２’デオキシチミジル−３’−ホスフェート−ＴＴＴＴＴＴＴＴ）などのポリＤＮＡであり得、例えば、ここで、ｎが、２以上５０以下、好ましくは、４以上１５以下、最も好ましくは、７以上８以下の整数である。修飾ヌクレオチド又はヌクレオチドの混合物はまた、前記ポリＤＮＡリンカー、一本鎖ポリＤＮＡリンカー中に存在し得、ここで、ｎが、２以上５０以下、好ましくは、４を含む、最も好ましくは、７以上８以下の整数である。修飾ヌクレオチド又はヌクレオチドの混合物はまた、前記ポリＤＮＡリンカー中に存在し得る。
【０２３５】
リンカーは、ジスルフィド結合、任意選択で、ビス−ヘキシル−ジスルフィドリンカーを含み得る。一実施形態において、ジスルフィドリンカーは、
【化５】
2020532289.tif 000007
である。
【０２３６】
リンカーは、ペプチド結合を含み得、例えば、アミノ酸を含む。一実施形態において、共有結合リンカーは、好ましくは、４〜５つのアミノ酸、任意選択で、Ｘ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｙを含む、１〜１０アミノ酸長のリンカーであり、ここで、Ｘ及びＹが、任意のアミノ酸を表す。
【０２３７】
リンカーは、ＨＥＧ、ヘキサエチレングリコールリンカーを含み得る。
【０２３８】
共有結合リンカーは、第１のｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖を、第２のｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖に結合し；第１のｄｓＲＮＡ剤のアンチセンス鎖を、第２のｄｓＲＮＡ剤のアンチセンス鎖に結合し；第１のｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖を、第２のｄｓＲＮＡ剤のアンチセンス鎖に結合し；又は第１のｄｓＲＮＡ剤のアンチセンス鎖を、第２のｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖に結合し得る。
【０２３９】
ある実施形態において、共有結合リンカーは、後述される少なくとも１つのリガンドを更に含む。
【０２４０】
ＩＩＩ．本発明の修飾ｉＲＮＡ
一実施形態において、本発明のｉＲＮＡのＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡは、修飾されておらず、例えば、当該技術分野において公知の及び本明細書に記載される化学的修飾及び／又はコンジュゲートを含まない。別の実施形態において、本発明のｉＲＮＡのＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡは、安定性又は他の有益な特性を向上させるために化学的に修飾される。本発明の特定の実施形態において、本発明のｉＲＮＡのヌクレオチドの実質的に全てが修飾される。本発明の他の実施形態において、本発明のｉＲＮＡのヌクレオチドの全てが修飾される。「ヌクレオチドの実質的に全てが修飾される」本発明のｉＲＮＡは、大部分は修飾されるが、完全に修飾されるわけではなく、５つ以下、４つ以下、３つ以下、２つ以下、又は１つ以下の非修飾ヌクレオチドを含み得る。
【０２４１】
ＬＤＨＡを標的とする第１のｄｓＲＮＡ剤及びＨＡＯ１を標的とする第２のｄｓＲＮＡ剤が共有結合される実施形態において（即ち、二重標的化ＲＮＡｉ剤）、第１の剤のヌクレオチドの実質的に全て及び第２の剤のヌクレオチドの実質的に全ては、独立して、修飾されてもよく；第１の剤のヌクレオチドの全ては、修飾されてもよく、第２の剤のヌクレオチドの全ては、独立して、修飾されてもよく；第１の剤のヌクレオチドの実質的に全て及び第２の剤のヌクレオチドの全ては、独立して、修飾されてもよく；又は第１の剤のヌクレオチドの全ては、修飾されてもよく、第２の剤のヌクレオチドの実質的に全ては、独立して、修飾されてもよい。
【０２４２】
本発明のある態様において、本発明のｉＲＮＡのヌクレオチドの実質的に全ては、修飾され、ｉＲＮＡ剤は、２’−フルオロ修飾（例えば、９つ以下の２’−フルオロ修飾、８つ以下の２’−フルオロ修飾、７つ以下の２’−フルオロ修飾、６つ以下の２’−フルオロ修飾、５つ以下の２’−フルオロ修飾、４つ以下の２’−フルオロ修飾、５つ以下の２’−フルオロ修飾、４つ以下の２’−フルオロ修飾、３つ以下の２’−フルオロ修飾、又は２つ以下の２’−フルオロ修飾）を含む１０個以下のヌクレオチドを含む。例えば、ある実施形態において、センス鎖は、２’−フルオロ修飾（例えば、３つ以下の２’−フルオロ修飾、又は２つ以下の２’−フルオロ修飾）を含む４つ以下のヌクレオチドを含む。他の実施形態において、アンチセンス鎖は、２’−フルオロ修飾（例えば、５つ以下の２’−フルオロ修飾、４つ以下の２’−フルオロ修飾、４つ以下の２’−フルオロ修飾、又は２つ以下の２’−フルオロ修飾）を含む６つ以下のヌクレオチドを含む。
【０２４３】
ＬＤＨＡを標的とする第１のｄｓＲＮＡ剤及びＨＡＯ１を標的とする第２のｄｓＲＮＡ剤が共有結合される実施形態において（即ち、二重標的化ＲＮＡｉ剤）、第１の剤のヌクレオチドの実質的に全て及び／又は第２の剤のヌクレオチドの実質的に全ては、独立して、修飾されてもよく、第１及び第２の剤は、独立して、２’−フルオロ修飾を含む１０個以下のヌクレオチドを含み得る。
【０２４４】
本発明の他の態様において、本発明のｉＲＮＡのヌクレオチドの全ては、修飾され、ｉＲＮＡ剤は、２’−フルオロ修飾（例えば、９つ以下の２’−フルオロ修飾、８つ以下の２’−フルオロ修飾、７つ以下の２’−フルオロ修飾、６つ以下の２’−フルオロ修飾、５つ以下の２’−フルオロ修飾、４つ以下の２’−フルオロ修飾、５つ以下の２’−フルオロ修飾、４つ以下の２’−フルオロ修飾、３つ以下の２’−フルオロ修飾、又は２つ以下の２’−フルオロ修飾）を含む１０個以下のヌクレオチドを含む。
【０２４５】
ＬＤＨＡを標的とする第１のｄｓＲＮＡ剤及びＨＡＯ１を標的とする第２のｄｓＲＮＡ剤が共有結合される実施形態において（即ち、二重標的化ＲＮＡｉ剤）、第１の剤のヌクレオチドの全て及び／又は第２の剤のヌクレオチドの全ては、独立して、修飾されてもよく、第１及び第２の剤は、独立して、２’−フルオロ修飾を含む１０個以下のヌクレオチドを含み得る。
【０２４６】
一実施形態において、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖の５’ヌクレオチドにおいて５’−ホスフェート又は５’−ホスフェート模倣体を更に含む。別の実施形態において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖の５’ヌクレオチドにおいて５’−ホスフェート模倣体を更に含む。特定の実施形態において、５’−ホスフェート模倣体は、５’−ビニルホスフェート（５’−ＶＰ）である。
【０２４７】
ＬＤＨＡを標的とする第１のｄｓＲＮＡ剤及びＨＡＯ１を標的とする第２のｄｓＲＮＡ剤が共有結合される実施形態において（即ち、二重標的化ＲＮＡｉ剤）、第１の剤は、アンチセンス鎖の５’ヌクレオチドにおいて５’−ホスフェート又は５’−ホスフェート模倣体を更に含んでいてもよく；第２の剤は、アンチセンス鎖の５’ヌクレオチドにおいて５’−ホスフェート又は５’−ホスフェート模倣体を更に含んでいてもよく；又は第１の剤及び第２の剤は、独立して、アンチセンス鎖の５’ヌクレオチドにおいて５’−ホスフェート又は５’−ホスフェート模倣体を更に含んでいてもよい。
【０２４８】
本発明に取り上げられる核酸は、参照により本明細書に援用される“Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，”Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｒｓ．），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡに記載されるものなどの当該技術分野において十分に確立された方法によって合成及び／又は修飾され得る。修飾としては、例えば、末端修飾、例えば、５’末端修飾（リン酸化、コンジュゲート、逆結合（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｌｉｎｋａｇｅ））又は３’末端修飾（コンジュゲート、ＤＮＡヌクレオチド、逆結合など）；塩基修飾、例えば、安定塩基、不安定塩基、又は広範なパートナーと塩基対合する塩基による置換、塩基の除去（非塩基性ヌクレオチド）、又はコンジュゲート塩基；糖修飾（例えば、２’位又は４’位で）又は糖の置換；及び／又はホスホジエステル結合の修飾又は置換を含む骨格修飾が挙げられる。本明細書に記載される実施形態に有用なｉＲＮＡ化合物の具体例としては、限定はされないが、修飾された骨格を含むか又は天然のヌクレオシド間結合を含まないＲＮＡが挙げられる。修飾された骨格を有するＲＮＡとしては、特に、骨格中にリン原子を有さないものが挙げられる。本明細書の目的のために、及び当該技術分野において時折言及されるように、ヌクレオシド間骨格中にリン原子を有さない、修飾ＲＮＡは、オリゴヌクレオシドであるとみなすこともできる。ある実施形態において、修飾ｉＲＮＡは、そのヌクレオシド間骨格中にリン原子を有する。
【０２４９】
修飾ＲＮＡ骨格としては、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルホスホネート並びに３’−アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートを含む他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホロアミデート及びアミノアルキルホスホロアミデートを含むホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、及び通常の３’−５’結合を有するボラノホスフェート、これらの２’−５’結合類似体、及びヌクレオシド単位の隣接する対が、３’−５’〜５’−３’又は２’−５’〜５’−２’に結合する、反転極性を有するものが挙げられる。様々な塩、混合塩及び遊離酸形態も含まれる。
【０２５０】
上記のリン含有結合の調製を教示する代表的な米国特許としては、限定はされないが、米国特許第３，６８７，８０８号明細書；同第４，４６９，８６３号明細書；同第４，４７６，３０１号明細書；同第５，０２３，２４３号明細書；同第５，１７７，１９５号明細書；同第５，１８８，８９７号明細書；同第５，２６４，４２３号明細書；同第５，２７６，０１９号明細書；同第５，２７８，３０２号明細書；同第５，２８６，７１７号明細書；同第５，３２１，１３１号明細書；同第５，３９９，６７６号明細書；同第５，４０５，９３９号明細書；同第５，４５３，４９６号明細書；同第５，４５５，２３３号明細書；同第５，４６６，６７７号明細書；同第５，４７６，９２５号明細書；同第５，５１９，１２６号明細書；同第５，５３６，８２１号明細書；同第５，５４１，３１６号明細書；同第５，５５０，１１１号明細書；同第５，５６３，２５３号明細書；同第５，５７１，７９９号明細書；同第５，５８７，３６１号明細書；同第５，６２５，０５０号明細書；同第６，０２８，１８８号明細書；同第６，１２４，４４５号明細書；同第６，１６０，１０９号明細書；同第６，１６９，１７０号明細書；同第６，１７２，２０９号明細書；同第６、２３９，２６５号明細書；同第６，２７７，６０３号明細書；同第６，３２６，１９９号明細書；同第６，３４６，６１４号明細書；同第６，４４４，４２３号明細書；同第６，５３１，５９０号明細書；同第６，５３４，６３９号明細書；同第６，６０８，０３５号明細書；同第６，６８３，１６７号明細書；同第６，８５８，７１５号明細書；同第６，８６７，２９４号明細書；同第６，８７８，８０５号明細書；同第７，０１５，３１５号明細書；同第７，０４１，８１６号明細書；同第７，２７３，９３３号明細書；同第７，３２１，０２９号明細書；及び米国再発行特許第ＲＥ３９４６４号明細書が挙げられ、これらのそれぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。
【０２５１】
内部にリン原子を含まない修飾ＲＮＡ骨格は、短鎖アルキル若しくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子及びアルキル若しくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、又は１つ又は複数の短鎖ヘテロ原子若しくは複素環式ヌクレオシド間結合によって形成される骨格を有する。これらとしては、モルホリノ結合（一部がヌクレオシドの糖部分から形成された）を有するもの；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシド及びスルホン骨格；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格；スルホネート及びスルホンアミド骨格；アミド骨格；並びに混合Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２構成要素部分を有する他のものが挙げられる。
【０２５２】
上記のオリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許としては、限定はされないが、米国特許第５，０３４，５０６号明細書；同第５，１６６，３１５号明細書；同第５，１８５，４４４号明細書；同第５，２１４，１３４号明細書；同第５，２１６，１４１号明細書；５，同第２３５，０３３号明細書；同第５，６４，５６２号明細書；同第５，２６４，５６４号明細書；同第５，４０５，９３８号明細書；同第５，４３４，２５７号明細書；同第５，４６６，６７７号明細書；同第５，４７０，９６７号明細書；同第５，４８９，６７７号明細書；同第５，５４１，３０７号明細書；同第５，５６１，２２５号明細書；同第５，５９６，０８６号明細書；同第５，６０２，２４０号明細書；同第５，６０８，０４６号明細書；同第５，６１０，２８９号明細書；同第５，６１８，７０４号明細書；同第５，６２３，０７０号明細書；同第５，６６３，３１２号明細書；同第５，６３３，３６０号明細書；５，６７７，４３７号明細書；及び同第５，６７７，４３９号明細書が挙げられ、これらのそれぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。
【０２５３】
他の実施形態において、好適なＲＮＡ模倣体が、ｉＲＮＡにおける使用のために考えられ、ここで、糖及びヌクレオシド間結合の両方、即ち、ヌクレオチド単位の骨格が、新規な基で置換される。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されている、このようなオリゴマー化合物の１つであるＲＮＡ模倣体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる。ＰＮＡ化合物において、ＲＮＡの糖骨格が、アミド含有骨格、特に、アミノエチルグリシン骨格で置換される。核酸塩基は、保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接又は間接的に結合される。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許としては、限定はされないが、米国特許第５，５３９，０８２；同第５，７１４，３３１号明細書；及び同第５，７１９，２６２号明細書が挙げられ、これらのそれぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。本発明のｉＲＮＡに使用するのに好適な更なるＰＮＡ化合物が、例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７−１５００に記載されている。
【０２５４】
本発明に取り上げられるある実施形態は、ホスホロチオエート骨格を有するＲＮＡ及びヘテロ原子骨格を有するオリゴヌクレオシドを含み、特に、上述した米国特許第５，４８９，６７７号明細書の−−ＣＨ２−−ＮＨ−−ＣＨ２−、−−ＣＨ２−−Ｎ（ＣＨ３）−−Ｏ−−ＣＨ２−−［メチレン（メチルイミノ）又はＭＭＩ骨格として知られている］、−−ＣＨ２−−Ｏ−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−、−−ＣＨ２−−Ｎ（ＣＨ３）−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−及び−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−ＣＨ２−−［式中、天然のホスホジエステル骨格は、−−Ｏ−−Ｐ−−Ｏ−−ＣＨ２−−として表される］、及び上述した米国特許第５，６０２，２４０号明細書のアミド骨格を含む。ある実施形態において、本明細書に取り上げられるＲＮＡは、上述した米国特許第５，０３４，５０６号明細書のモルホリノ骨格構造を有する。
【０２５５】
修飾ＲＮＡは、１つ又は複数の置換された糖部分も含有し得る。本明細書に取り上げられるｉＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡは、２’位において、ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、又はＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、又はＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−又はＮ−アルキニル；又はＯ−アルキル−Ｏ−アルキルのうちの１つを含むことができ、ここで、アルキル、アルケニル及びアルキニルは、置換又は非置換のＣ１〜Ｃ１０アルキル又はＣ２〜Ｃ１０アルケニル及びアルキニルであり得る。例示的な好適な修飾は、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）．ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、及びＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２を含み、式中、ｎ及びｍが、１〜約１０である。他の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、２’位において、Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリル又はＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、挿入基（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒ）、ｉＲＮＡの薬力学的特性を向上させる基、又はｉＲＮＡの薬物動態特性を向上させる基、及び同様の特性を有する他の置換基のうちの１つを含む。ある実施形態において、修飾は、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）又は２’−ＭＯＥとしても知られている２’−Ｏ−−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３）（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８：４８６−５０４）、即ち、アルコキシ−アルコキシ基を含む。別の例示的な修飾は、本明細書において以下の実施例に記載される、２’−ＤＭＡＯＥとしても知られている２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、即ち、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、及び２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当該技術分野において、２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチル又は２’−ＤＭＡＥＯＥとしても知られている）、即ち、２’−Ｏ−−ＣＨ２−−Ｏ−−ＣＨ２−−Ｎ（ＣＨ２）２である。更なる例示的な修飾は、５’−Ｍｅ−２’−Ｆヌクレオチド、５’−Ｍｅ−２’−ＯＭｅヌクレオチド、５’−Ｍｅ−２’−デオキシリボヌクレオチド、（これらの３つのファミリーにおけるＲ及びＳ異性体の両方）；２’−アルコキシアルキル；及び２’−ＮＭＡ（Ｎ−メチルアセトアミド）を含む。
【０２５６】
他の修飾は、２’−メトキシ（２’−ＯＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）及び２’−フルオロ（２’−Ｆ）を含む。同様の修飾を、ｉＲＮＡのＲＮＡにおける他の位置、特に、３’末端ヌクレオチド上又は２’−５’結合ｄｓＲＮＡ中の糖の３’位及び５’末端ヌクレオチドの５’位で行うこともできる。ｉＲＮＡはまた、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣体を有し得る。このような修飾された糖構造の調製を教示する代表的な米国特許としては、限定はされないが、米国特許第４，９８１，９５７号明細書；同第５，１１８，８００号明細書；同第５，３１９，０８０号明細書；同第５，３５９，０４４号明細書；同第５，３９３，８７８号明細書；同第５，４４６，１３７号明細書；同第５，４６６，７８６号明細書；同第５，５１４，７８５号明細書；同第５，５１９，１３４号明細書；同第５，５６７，８１１号明細書；同第５，５７６，４２７号明細書；同第５，５９１，７２２号明細書；同第５，５９７，９０９号明細書；同第５，６１０，３００号明細書；同第５，６２７，０５３号明細書；同第５，６３９，８７３号明細書；同第５，６４６，２６５号明細書；同第５，６５８，８７３号明細書；同第５，６７０，６３３号明細書；及び同第５，７００，９２０号明細書が挙げられ、これらのうちのいくつかは、本出願と所有者が同一である。上記のそれぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。
【０２５７】
本発明のｉＲＮＡは、核酸塩基（当該技術分野において多くの場合、単に「塩基」と称される）修飾又は置換も含み得る。本明細書において使用される際、「非修飾」又は「天然」核酸塩基は、プリン塩基アデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、並びにピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）を含む。修飾核酸塩基は、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６−メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２−プロピル及び他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及びシトシン、５−プロピニルウラシル及びシトシン、６−アゾウラシル、シトシン及びチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル及び他の８−置換アデニン及びグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル及び他の５−置換ウラシル及びシトシン、７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザグアニン及び７−ダアザアデニン（ｄａａｚａａｄｅｎｉｎｅ）並びに３−デアザグアニン及び３−デアザアデニンなどの他の合成及び天然核酸塩基を含む。更なる核酸塩基としては、米国特許第３，６８７，８０８号明細書に開示されるもの、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｐ．ｅｄ．Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，２００８に開示されるもの；Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  Ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐｐ．８５８−８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｌ，ｅｄ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されるもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，３０：６１３によって開示されるもの、及びＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ  Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  １５，ｄｓＲＮＡ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．２８９−３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，Ｅｄ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３によって開示されるものが挙げられる。これらの核酸塩基のいくつかは、本発明に取り上げられるオリゴマー化合物の結合親和性を高めるのに特に有用である。これらとしては、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル及び５−プロピニルシトシンを含む、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン及びＮ−２、Ｎ−６及び０−６置換プリンが挙げられる。５−メチルシトシン置換基が、核酸二本鎖安定性を０．６〜１．２℃だけ増加させることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，Ｅｄｓ．，ｄｓＲＮＡ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６−２７８）、例示的な塩基置換であり、特��２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わされる場合は尚更である。
【０２５８】
上記の修飾された核酸塩基並びに他の修飾された核酸塩基のいくつかの調製を教示する代表的な米国特許としては、限定はされないが、上記の米国特許第３，６８７，８０８号明細書、同４，８４５，２０５号明細書；同５，１３０，３０号明細書；同５，１３４，０６６号明細書；同５，１７５，２７３号明細書；同５，３６７，０６６号明細書；同５，４３２，２７２号明細書；同５，４５７，１８７号明細書；同５，４５９，２５５号明細書；同５，４８４，９０８号明細書；同５，５０２，１７７号明細書；同５，５２５，７１１号明細書；同５，５５２，５４０号明細書；同５，５８７，４６９号明細書；同５，５９４，１２１号明細書、同５，５９６，０９１号明細書；同５，６１４，６１７号明細書；同５，６８１，９４１号明細書；同５，７５０，６９２号明細書；同６，０１５，８８６号明細書；同６，１４７，２００号明細書；同６，１６６，１９７号明細書；同６，２２２，０２５号明細書；同６，２３５，８８７号明細書；同６，３８０，３６８号明細書；同６，５２８，６４０号明細書；同６，６３９，０６２号明細書；同６，６１７，４３８号明細書；同７，０４５，６１０号明細書；同７，４２７，６７２号明細書；及び同第７，４９５，０８８号明細書が挙げられ、これらのそれぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。
【０２５９】
本発明のｉＲＮＡはまた、１つ又は複数のロックト核酸（ＬＮＡ）を含むように修飾され得る。ロックト核酸は、修飾されたリボース部分を有するヌクレオチドであり、リボース部分は、２’及び４’炭素を結合する追加の架橋を含む。この構造は、３’−ｅｎｄｏ構造的立体配置におけるリボースを有効に「ロックする」。ｓｉＲＮＡにロックト核酸を加えると、血清中のｓｉＲＮＡ安定性が増加し、オフターゲット効果が低下されることが示されている（Ｅｌｍｅｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３３（１）：４３９−４４７；Ｍｏｏｋ，ＯＲ．ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｍｏｌ  Ｃａｎｃ  Ｔｈｅｒ  ６（３）：８３３−８４３；Ｇｒｕｎｗｅｌｌｅｒ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１（１２）：３１８５−３１９３）。
【０２６０】
本発明のｉＲＮＡはまた、１つ又は複数の二環式糖部分を含むように修飾され得る。「二環式糖」は、２個の原子の架橋によって修飾されたフラノシル環である。「二環式ヌクレオシド」（「ＢＮＡ」）は、糖環の２個の炭素原子を結合し、それによって、二環式環系を形成する架橋を含む糖部分を有するヌクレオシドである。特定の実施形態において、架橋は、糖環の４’−炭素及び２’−炭素を結合する。したがって、ある実施形態において、本発明の剤は、１つ又は複数のロックト核酸（ＬＮＡ）を含み得る。ロックト核酸は、修飾されたリボース部分を有するヌクレオチドであり、リボース部分は、２’及び４’炭素を結合する追加の架橋を含む。言い換えると、ＬＮＡは、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’架橋を含む二環式糖部分を含むヌクレオチドである。この構造は、３’−ｅｎｄｏ構造的立体配置におけるリボースを有効に「ロックする」。ｓｉＲＮＡにロックト核酸を加えると、血清中のｓｉＲＮＡ安定性が増加し、オフターゲット効果が低下されることが示されている（Ｅｌｍｅｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３３（１）：４３９−４４７；Ｍｏｏｋ，ＯＲ．ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｍｏｌ  Ｃａｎｃ  Ｔｈｅｒ  ６（３）：８３３−８４３；Ｇｒｕｎｗｅｌｌｅｒ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１（１２）：３１８５−３１９３）。本発明のポリヌクレオチドに使用するための二環式ヌクレオシドの例としては、限定はされないが、４’及び２’リボシル環原子の間の架橋を含むヌクレオシドが挙げられる。特定の実施形態において、本発明のアンチセンスポリヌクレオチド剤としては、４’−２’架橋を含む１つ又は複数の二環式ヌクレオシドが挙げられる。このような４’−２’架橋二環式ヌクレオシドの例としては、限定はされないが、４’−（ＣＨ２）−Ｏ−２’（ＬＮＡ）；４’−（ＣＨ２）−Ｓ−２’；４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’（ＥＮＡ）；４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’（「拘束エチル」又は「ｃＥｔ」とも呼ばれる）及び４’−ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ３）−Ｏ−２’（及びその類似体；例えば、米国特許第７，３９９，８４５号明細書を参照）；４’−Ｃ（ＣＨ３）（ＣＨ３）−Ｏ−２’（及びその類似体；例えば、米国特許第８，２７８，２８３号明細書を参照）；４’−ＣＨ２−Ｎ（ＯＣＨ３）−２’（及びその類似体；例えば、米国特許第８，２７８，４２５号明細書を参照）；４’−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−２’（例えば、米国特許出願公開第２００４／０１７１５７０号明細書を参照）；４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−２’（ここで、Ｒが、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキルである）、又は保護基（例えば、米国特許第７，４２７，６７２号明細書を参照）；４’−ＣＨ２−Ｃ（Ｈ）（ＣＨ３）−２’（例えば、Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２００９，７４，１１８−１３４を参照）；及び４’−ＣＨ２−Ｃ（＝ＣＨ２）−２’（及びその類似体；例えば、米国特許第８，２７８，４２６号明細書を参照）が挙げられる。これらのそれぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。
【０２６１】
ロックト核酸ヌクレオチドの調製を教示する更なる代表的な米国特許及び米国特許公報としては、限定はされないが、米国特許第６，２６８，４９０号明細書；同６，５２５，１９１号明細書；同６，６７０，４６１号明細書；同６，７７０，７４８号明細書；同６，７９４，４９９号明細書；同６，９９８，４８４号明細書；同７，０５３，２０７号明細書；同７，０３４，１３３号明細書；同７，０８４，１２５号明細書；同７，３９９，８４５号明細書；同７，４２７，６７２号明細書；同７，５６９，６８６号明細書；同７，７４１，４５７号明細書；同８，０２２，１９３号明細書；同８，０３０，４６７号明細書；同８，２７８，４２５号明細書；同８，２７８，４２６号明細書；同８，２７８，２８３号明細書；米国特許出願公開第２００８／００３９６１８号明細書；及び米国特許出願公開第２００９／００１２２８１号明細書が挙げられ、これらのそれぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。
【０２６２】
例えば、α−Ｌ−リボフラノース及びβ−Ｄ−リボフラノースを含む１つ又は複数の立体化学的糖配置を有する上記の二環式ヌクレオシドのいずれかが調製され得る（国際公開第９９／１４２２６号パンフレットを参照）。
【０２６３】
本発明のｉＲＮＡはまた、１つ又は複数の拘束エチルヌクレオチドを含むように修飾され得る。本明細書において使用される際、「拘束エチルヌクレオチド」又は「ｃＥｔ」は、４’−ＣＨ（ＣＨ３）−０−２’架橋を含む二環式糖部分を含むロックト核酸である。一実施形態において、拘束エチルヌクレオチドは、本明細書において「Ｓ−ｃＥｔ」と呼ばれるＳ立体配置にある。
【０２６４】
本発明のｉＲＮＡは、１つ又は複数の「立体配座的に制限されたヌクレオチド」（「ＣＲＮ」）も含み得る。ＣＲＮは、リボースのＣ２’及びＣ４’炭素又はリボースのＣ３及び−Ｃ５’炭素を結合するリンカーを有するヌクレオチド類似体である。ＣＲＮは、リボース環を安定した立体配置へと固定し、ｍＲＮＡに対するハイブリダイゼーション親和性（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｆｆｉｎｉｔｙ）を高める。リンカーは、酸素を安定性及び親和性のために最適な位置に配置するのに十分な長さを有し、リボース環の歪み（ｐｕｃｋｅｒｉｎｇ）を少なくする。
【０２６５】
上記のＣＲＮのいくつかの調製を教示する代表的な公報としては、限定はされないが、米国特許出願公開第２０１３／０１９０３８３号明細書；及びＰＣＴ公報の国際公開第２０１３／０３６８６８号パンフレットが挙げられ、これらのそれぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。
【０２６６】
ある実施形態において、本発明のｉＲＮＡは、ＵＮＡ（アンロックト（ｕｎｌｏｃｋｅｄ）核酸）ヌクレオチドである１つ又は複数のモノマーを含む。ＵＮＡは、アンロックト非環式核酸であり、ここで、糖の結合のいずれかが除去されており、アンロックト「糖」残基を形成する。一例において、ＵＮＡは、Ｃ１’−Ｃ４’の間の結合（即ち、Ｃ１’及びＣ４’炭素の間の共有炭素−酸素−炭素結合）が除去されたモノマーも包含する。別の例において、糖のＣ２’−Ｃ３’結合（即ち、Ｃ２’及びＣ３’炭素の間の共有炭素−炭素結合）が除去されている（参照により本明細書に援用される、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒｉｅｓ，５２，１３３−１３４（２００８）及びＦｌｕｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｓｙｓｔ．，２００９，１０，１０３９を参照）。
【０２６７】
ＵＮＡの調製を教示する代表的な米国特許公報としては、限定はされないが、米国特許第８，３１４，２２７号明細書；並びに米国特許出願公開第２０１３／００９６２８９号明細書；同第２０１３／００１１９２２号明細書；及び同第２０１１／０３１３０２０号明細書が挙げられ、これらのそれぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。
【０２６８】
ＲＮＡ分子の末端に対する潜在的に安定した修飾は、Ｎ−（アセチルアミノカプロイル）−４−ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ−Ｃ６−ＮＨＡｃ）、Ｎ−（カプロイル４−ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ−Ｃ６）、Ｎ−（アセチル−４−ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ−ＮＨＡｃ）、チミジン−２’−０−デオキシチミジン（エーテル）、Ｎ−（アミノカプロイル）−４−ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ−Ｃ６−アミノ）、２−ドコサノイル−ウリジン−３”−ホスフェート、逆方向塩基（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｂａｓｅ）ｄＴ（ｉｄＴ）などを含み得る。この修飾の開示は、ＰＣＴ公開番号国際公開第２０１１／００５８６１号パンフレットに見られる。
【０２６９】
本発明のｉＲＮＡの他の修飾は、ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖において５’ホスフェート又は５’ホスフェート模倣体、例えば、５’末端ホスフェート又はホスフェート模倣体を含む。好適なホスフェート模倣体は、例えば、全内容が参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１２／０１５７５１１号明細書に開示されている。
【０２７０】
いくつかの特定の実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、表２〜５のいずれか１つに列挙される剤の群から選択される、ＬＤＨＡ遺伝子の発現を阻害する剤である。他の実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、ＬＤＨＡ遺伝子及びＨＡＯ１の発現を阻害する二重標的化ｉＲＮＡ剤であり、ここで、第１のｄｓＲＮＡは、ＬＤＨＡ遺伝子の発現を阻害し、表２〜５のいずれか１つに列挙される剤の群から選択され、第１のｄｓＲＮＡは、ＨＡＯ１遺伝子の発現を阻害し、表７〜１４のいずれか１つに列挙される剤の群から選択される。これらの剤のいずれも、リガンドを更に含み得る。
【０２７１】
Ａ．本発明のモチーフを含む修飾ｉＲＮＡ
本発明の特定の態様において、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤としては、例えば、全内容が参照により本明細書に援用される、２０１２年１１月１６日に出願された国際公開第２０１３／０７５０３５号パンフレットに開示される化学修飾を有する剤が挙げられる。
【０２７２】
ＬＤＨＡを標的とする第１のｄｓＲＮＡ剤及びＨＡＯ１を標的とする第２のｄｓＲＮＡ剤が共有結合される実施形態において（即ち、二重標的化ＲＮＡｉ剤）、第１の剤は、後述されるモチーフのいずれか１つ又は複数を含んでいてもよく、第２の剤は、後述されるモチーフのいずれか１つ又は複数を含んでいてもよく、又は第１の剤及び第２の剤は両方とも、独立して、後述されるモチーフのいずれか１つ又は複数を含み得ることが理解されるべきである。
【０２７３】
したがって、本発明は、インビボでの標的遺伝子（即ち、ＬＤＨＡ遺伝子又はＬＤＨＡ遺伝子及びＨＡＯ１遺伝子）の発現を阻害することが可能な二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供する。ＲＮＡｉ剤は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含む。ＲＮＡｉ剤の各鎖は、１２〜３０ヌクレオチド長の範囲であり得る。例えば、各鎖は、１４〜３０ヌクレオチド長、１７〜３０ヌクレオチド長、２５〜３０ヌクレオチド長、２７〜３０ヌクレオチド長、１７〜２３ヌクレオチド長、１７〜２１ヌクレオチド長、１７〜１９ヌクレオチド長、１９〜２５ヌクレオチド長、１９〜２３ヌクレオチド長、１９〜２１ヌクレオチド長、２１〜２５ヌクレオチド長、又は２１〜２３ヌクレオチド長であり得る。
【０２７４】
センス鎖及びアンチセンス鎖は、典型的に、本明細書において「ＲＮＡｉ剤」とも呼ばれる二本鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）を形成する。ＲＮＡｉ剤の二本鎖領域は、１２〜３０ヌクレオチド対長であり得る。例えば、二本鎖領域は、１４〜３０ヌクレオチド対長、１７〜３０ヌクレオチド対長、２７〜３０ヌクレオチド対長、１７〜２３ヌクレオチド対長、１７〜２１ヌクレオチド対長、１７〜１９ヌクレオチド対長、１９〜２５ヌクレオチド対長、１９〜２３ヌクレオチド対長、１９〜２１ヌクレオチド対長、２１〜２５ヌクレオチド対長、又は２１〜２３ヌクレオチド対長であり得る。別の例では、二本鎖領域は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、及び２７ヌクレオチド長から選択される。
【０２７５】
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、１つ又は両方の鎖の３’末端、５’末端、又は両方の末端において１つ又は複数のオーバーハング領域及び／又はキャッピング基を含み得る。オーバーハングは、１〜６ヌクレオチド長、例えば、２〜６ヌクレオチド長、１〜５ヌクレオチド長、２〜５ヌクレオチド長、１〜４ヌクレオチド長、２〜４ヌクレオチド長、１〜３ヌクレオチド長、２〜３ヌクレオチド長、又は１〜２ヌクレオチド長であり得る。オーバーハングは、１つの鎖が他の鎖より長い結果であるか、又は同じ長さの２つの鎖が互い違いになっている結果であり得る。オーバーハングは、標的ｍＲＮＡとのミスマッチを形成し得るか、又はオーバーハングは、標的とされる遺伝子配列に相補的であり得るか、又は別の配列であり得る。第１及び第２の鎖がまた、例えば、ヘアピンを形成するように更なる塩基によって、又は他の非塩基リンカーによって結合され得る。
【０２７６】
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤のオーバーハング領域中のヌクレオチドはそれぞれ、独立して、限定はされないが、２−Ｆ、２’−Ｏメチル、チミジン（Ｔ）、２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン（Ｔｅｏ）、２’−Ｏ−メトキシエチルアデノシン（Ａｅｏ）、２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルシチジン（ｍ５Ｃｅｏ）、及びそれらの任意の組み合わせなどの２’−糖修飾を含む、修飾又は非修飾ヌクレオチドであり得る。例えば、ＴＴは、いずれかの鎖上のいずれかの末端のためのオーバーハング配列であり得る。オーバーハングは、標的ｍＲＮＡとのミスマッチを形成し得るか、又はオーバーハングは、標的とされる遺伝子配列に相補的であり得るか、又は別の配列であり得る。
【０２７７】
ＲＮＡｉ剤のセンス鎖、アンチセンス鎖又は両方の鎖における５’−又は３’−オーバーハングは、リン酸化され得る。ある実施形態において、オーバーハング領域は、２つのヌクレオチド間にホスホロチオエートを有する２つのヌクレオチドを含み、ここで、２つのヌクレオチドは、同じか又は異なり得る。一実施形態において、オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の鎖の３’末端に存在する。一実施形態において、この３’−オーバーハングは、アンチセンス鎖中に存在する。一実施形態において、この３’−オーバーハングは、センス鎖中に存在する。
【０２７８】
ＲＮＡｉ剤は、その全体的安定性に影響を与えずに、ＲＮＡｉの干渉活性を強化し得る１つのみのオーバーハングを含み得る。例えば、一本鎖オーバーハングは、センス鎖の３’末端、或いはアンチセンス鎖の３’末端に位置し得る。ＲＮＡｉは、アンチセンス鎖の５’末端（又はセンス鎖の３’末端）又はその逆に位置する平滑末端も有し得る。一般に、ＲＮＡｉのアンチセンス鎖は、３’末端にヌクレオチドオーバーハングを有し、５’末端は平滑である。理論に制約されるのを望むものではないが、アンチセンス鎖の５’末端及びアンチセンス鎖の３’末端オーバーハングにおける非対称の平滑末端は、ＲＩＳＣプロセスへのガイド鎖導入に有利に作用する。
【０２７９】
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、１９ヌクレオチド長の平滑末端二本鎖（ｄｏｕｂｌｅ  ｅｎｄｅｄ  ｂｌｕｎｔｍｅｒ）であり、センス鎖は、５’末端から７位、８位、９位の３連続ヌクレオチドにおける３つの２’−Ｆ修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。アンチセンス鎖は、５’末端から１１位、１２位、１３位の３連続ヌクレオチドにおける３つの２’−Ｏ−メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。
【０２８０】
別の実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、２０ヌクレオチド長の平滑末端二本鎖であり、センス鎖は、５’末端から８位、９位、１０位の３連続ヌクレオチドにおける３つの２’−Ｆ修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。アンチセンス鎖は、５’末端から１１位、１２位、１３位の３連続ヌクレオチドにおける３つの２’−Ｏ−メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。
【０２８１】
更に別の実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、２１ヌクレオチド長の平滑末端二本鎖であり、センス鎖は、５’末端から９位、１０位、１１位の３連続ヌクレオチドにおける３つの２’−Ｆ修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。アンチセンス鎖は、５’末端から１１位、１２位、１３位の３連続ヌクレオチドにおける３つの２’−Ｏ−メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。
【０２８２】
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、２１ヌクレオチドセンス鎖及び２３ヌクレオチドアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、５’末端から９位、１０位、１１位の３連続ヌクレオチドにおける３つの２’−Ｆ修飾の少なくとも１つのモチーフを含み；アンチセンス鎖は、５’末端から１１位、１２位、１３位の３連続ヌクレオチドにおける３つの２’−Ｏ−メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含み、ＲＮＡｉ剤の一方の末端が平滑である一方、他方の末端は、２つのヌクレオチドオーバーハングを含む。好ましくは、２つのヌクレオチドオーバーハングは、アンチセンス鎖の３’末端にある。
【０２８３】
２つのヌクレオチドオーバーハングが、アンチセンス鎖の３’末端にある場合、末端の３つのヌクレオチドの間に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合があり得、３つのうちの２つのヌクレオチドが、オーバーハングヌクレオチドであり、第３のヌクレオチドは、オーバーハングヌクレオチドに隣接する対合ヌクレオチドである。一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、センス鎖の５’末端及びアンチセンス鎖の５’末端の両方における末端の３つのヌクレオチドの間に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を更に有する。一実施形態において、モチーフの一部であるヌクレオチドを含む、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖中の全てのヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドである。一実施形態において、各残基が、独立して、例えば、交互のモチーフ中で、２’−Ｏ−メチル又は３’−フルオロで修飾される。任意選択で、ＲＮＡｉ剤は、リガンド（好ましくは、ＧａｌＮＡｃ３）を更に含む。
【０２８４】
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、２５〜３０ヌクレオチド残基長であり、５’末端ヌクレオチド（１位）を起点として、第１の鎖の１〜２３位が、少なくとも８つのリボヌクレオチドを含み；アンチセンス鎖は、３６〜６６ヌクレオチド残基長であり、３’末端ヌクレオチドを起点として、センス鎖の１〜２３位と対合される位置において少なくとも８つのリボヌクレオチドを含んで、二本鎖を形成し；アンチセンス鎖の少なくとも３’末端ヌクレオチドが、センス鎖と対合されず、最大で６連続の３’末端ヌクレオチドが、センス鎖と対合されず、それによって、１〜６つのヌクレオチドの３’一本鎖オーバーハングを形成し；アンチセンス鎖の５’末端は、センス鎖と対合されない１０〜３０連続ヌクレオチドを含み、それによって、１０〜３０個のヌクレオチド一本鎖５’オーバーハングを形成し；少なくともセンス鎖５’末端及び３’末端ヌクレオチドは、センス鎖及びアンチセンス鎖が最大の相補性のために整列される場合、アンチセンス鎖のヌクレオチドと対合される塩基であり、それによって、センス鎖とアンチセンス鎖との間に実質的に二本鎖の領域を形成し；アンチセンス鎖は、二本鎖核酸が哺乳動物細胞中に導入されたときに標的遺伝子の発現を低下させるように、アンチセンス鎖長の少なくとも１９個のリボヌクレオチドに沿って標的ＲＮＡに十分に相補的であり；センス鎖は、３連続ヌクレオチドにおける３つの２’−Ｆ修飾の少なくとも１つのモチーフを含み、ここで、モチーフのうちの少なくとも１つが、切断部位又はその近傍に存在する。アンチセンス鎖は、切断部位又はその近傍に３連続ヌクレオチドにおける３つの２’−Ｏ−メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。
【０２８５】
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、ＲＮＡｉ剤は、少なくとも２５且つ２９以下のヌクレオチド長を有する第１の鎖と、５’末端から１１位、１２位、１３位の３連続ヌクレオチドにおける３つの２’−Ｏ−メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含む、３０ヌクレオチド長以下を有する第２の鎖とを含み；第１の鎖の３’末端及び第２の鎖の５’末端が、平滑末端を形成し、第２の鎖は、その３’末端で第１の鎖より１〜４ヌクレオチド長く、二本鎖領域は、少なくとも２５ヌクレオチド長であり、第２の鎖は、ＲＮＡｉ剤が哺乳動物細胞中に導入されたときに標的遺伝子の発現を低下させるように、第２の鎖長の少なくとも１９のヌクレオチドに沿って標的ｍＲＮＡに十分に相補的であり、ＲＮＡｉ剤のダイサー切断（ｄｉｃｅｒ  ｃｌｅａｖａｇｅ）が、第２の鎖の３’末端を含むｓｉＲＮＡを優先的にもたらし、それにより、哺乳動物における標的遺伝子の発現を低下させる。任意選択で、ＲＮＡｉ剤は、リガンドを更に含む。
【０２８６】
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、３連続ヌクレオチドにおける３つの同一の修飾の少なくとも１つのモチーフを含み、モチーフの１つは、センス鎖の切断部位に存在する。
【０２８７】
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖も、３連続ヌクレオチドにおける３つの同一の修飾の少なくとも１つのモチーフを含むことができ、モチーフの１つは、アンチセンス鎖の切断部位又はその近傍に存在する。
【０２８８】
１７〜２３ヌクレオチド長の二本鎖領域を有するＲＮＡｉ剤では、アンチセンス鎖の切断部位は、典型的に、５’末端から１０位、１１位及び１２位の付近である。したがって、３つの同一の修飾のモチーフは、アンチセンス鎖の５’末端から１つ目のヌクレオチドから数え始めて、又はアンチセンス鎖の５’末端から、二本鎖領域内の１つ目の対合ヌクレオチドから数え始めて、アンチセンス鎖の９位、１０位、１１位；１０位、１１位、１２位；１１位、１２位、１３位；１２位、１３位、１４位；又は１３位、１４位、１５位に存在し得る。アンチセンス鎖中の切断部位はまた、５’末端からのＲＮＡｉの二本鎖領域の長さに応じて変化し得る。
【０２８９】
ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、鎖の切断部位に３連続ヌクレオチドにおける３つの同一の修飾の少なくとも１つのモチーフを含んでいてもよく；アンチセンス鎖は、鎖の切断部位又はその近傍に３連続ヌクレオチドにおける３つの同一の修飾の少なくとも１つのモチーフを有し得る。センス鎖及びアンチセンス鎖がｄｓＲＮＡ二本鎖を形成する場合、センス鎖及びアンチセンス鎖は、センス鎖における３つのヌクレオチドの１つのモチーフ及びアンチセンス鎖における３つのヌクレオチドの１つのモチーフが、少なくとも１つのヌクレオチドの重複を有し、即ち、センス鎖中のモチーフの３つのヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、アンチセンス鎖中のモチーフの３つのヌクレオチドのうちの少なくとも１つと塩基対を形成するように整列され得る。或いは、少なくとも２つのヌクレオチドが重複してもよく、又は全ての３つのヌクレオチドが重複してもよい。
【０２９０】
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、３連続ヌクレオチドにおける３つの同一の修飾の２つ以上のモチーフを含み得る。第１のモチーフは、鎖の切断部位又はその近傍に存在してもよく、他のモチーフは、ウイング修飾（ｗｉｎｇ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）であり得る。本明細書における「ウイング修飾」という用語は、同じ鎖の切断部位又はその近傍のモチーフから離れた鎖の別の部分に存在するモチーフを指す。ウイング修飾は、第１のモチーフに隣接するか、又は少なくとも１つ又は複数のヌクレオチドによって隔てられている。モチーフが、互いに直接隣接している場合、モチーフの化学構造は、互いに異なり、モチーフが、１つ又は複数のヌクレオチドによって隔てられている場合、化学構造は、同じか又は異なり得る。２つ以上のウイング修飾が存在し得る。例えば、２つのウイング修飾が存在する場合、各ウイング修飾は、切断部位又はその近傍の第１のモチーフに対して１つの端部に又はリードモチーフ（ｌｅａｄ  ｍｏｔｉｆ）のいずれかの側に存在し得る。
【０２９１】
センス鎖と同様に、ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、３連続ヌクレオチドにおける３つの同一の修飾の２つ以上のモチーフを含んでいてもよく、モチーフの少なくとも１つが、鎖の切断部位又はその近傍に存在する。このアンチセンス鎖はまた、センス鎖に存在し得るウイング修飾と同様の配列で１つ又は複数のウイング修飾を含み得る。
【０２９２】
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖又はアンチセンス鎖におけるウイング修飾は、典型的に、鎖の３’末端、５’末端又は両方の末端に第１の１つ又は２つの末端ヌクレオチドを含まない。
【０２９３】
別の実施形態において、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖又はアンチセンス鎖におけるウイング修飾は、典型的に、鎖の３’末端、５’末端又は両方の末端の二本鎖領域内に第１の１つ又は２つの対合ヌクレオチドを含まない。
【０２９４】
ＲＮＡｉ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖がそれぞれ、少なくとも１つのウイング修飾を含む場合、ウイング修飾は、二本鎖領域の同じ末端に位置してもよく、１つ、２つ又は３つのヌクレオチドの重複を有し得る。
【０２９５】
ＲＮＡｉ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖がそれぞれ、少なくとも２つのウイング修飾を含む場合、センス鎖及びアンチセンス鎖は、１つの鎖からの２つの修飾がそれぞれ、二本鎖領域の１つの末端に位置して、１つ、２つ又は３つのヌクレオチドの重複を有し；１つの鎖からの２つの修飾がそれぞれ、二本鎖領域の他方の末端に位置して、１つ、２つ又は３つのヌクレオチドの重複を有し；１つの鎖からの２つの修飾がリードモチーフの各側に位置して、二本鎖領域中に１つ、２つ又は３つのヌクレオチドの重複を有するように整列され得る。
【０２９６】
一実施形態において、モチーフの一部であるヌクレオチドを含む、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖中の全てのヌクレオチドが修飾され得る。各ヌクレオチドは、同じ又は異なる修飾で修飾されてもよく、この修飾は、非結合リン酸酸素及び／又は結合リン酸酸素の１つ又は複数の一方又は両方の１つ又は複数の変更；リボース糖の成分、例えば、リボース糖の２’ヒドロキシルの変更；「脱リン（ｄｅｐｈｏｓｐｈｏ）」リンカーによるリン酸部分の大規模な置換；天然の塩基の修飾又は置換；及びリボース−リン酸骨格の置換又は修飾を含み得る。
【０２９７】
核酸が、サブユニットのポリマーであるため、例えば、塩基、又はリン酸部分、又はリン酸部分の非結合Ｏの修飾といった修飾の多くは、核酸内の繰り返される位置に存在する。場合によっては、修飾は、核酸中の目的の位置の全てに存在し得るが、多くの場合、そうではない。例として、修飾は、３’又は５’末端位置のみに存在してもよく、末端領域、例えば、末端ヌクレオチド上の位置又は鎖の最後の２、３、４、５、又は１０のヌクレオチドのみに存在してもよい。修飾は、二本鎖領域、一本鎖領域、又はその両方に存在してもよい。修飾は、ＲＮＡの二本鎖領域のみに存在してもよく、又はＲＮＡの一本鎖領域のみに存在してもよい。例えば、非結合Ｏ位置におけるホスホロチオエート修飾は、一方又は両方の末端のみに存在してもよく、末端領域、例えば、末端ヌクレオチド上の位置又は鎖の最後の２、３、４、５、又は１０のヌクレオチドのみに存在してもよく、又は二本鎖及び一本鎖領域、特に、末端に存在してもよい。５’末端又は両方の末端が、リン酸化され得る。
【０２９８】
例えば、安定性を高めること、オーバーハング中に特定の塩基を含むこと、又は一本鎖オーバーハング、例えば、５’又は３’オーバーハング、又はその両方に修飾ヌクレオチド又はヌクレオチド代用物（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ）を含むことが可能であり得る。例えば、オーバーハング中にプリンヌクレオチドを含むことが望ましいことがある。ある実施形態において、３’又は５’オーバーハング中の塩基の全て又は一部が、例えば、本明細書に記載される修飾で修飾されてもよい。修飾は、例えば、当該技術分野において公知の修飾によるリボース糖の２’位における修飾の使用、例えば、核酸塩基のリボ糖の代わりにデオキシリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロ（２’−Ｆ）又は２’−Ｏ−メチル修飾の使用、及びリン酸基の修飾、例えば、ホスホロチオエート修飾を含み得る。オーバーハングは、標的配列と相同である必要はない。
【０２９９】
一実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖の各残基は、独立して、ＬＮＡ、ＣＲＮ、ｃＥＴ、ＵＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’−メトキシエチル、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｃ−アリル、２’−デオキシ、２’−ヒドロキシル、又は２’−フルオロで修飾される。鎖は、２つ以上の修飾を含み得る。一実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖の各残基は、独立して、２’−Ｏ−メチル又は２’−フルオロで修飾される。
【０３００】
少なくとも２つの異なる修飾が、典型的に、センス鎖及びアンチセンス鎖に存在する。それらの２つの修飾は、２’−Ｏ−メチル又は２’−フルオロ修飾、又は他のものであり得る。
【０３０１】
一実施形態において、Ｎａ及び／又はＮｂは、交互のパターンの修飾を含む。本明細書において使用される際の「交互のモチーフ」という用語は、１つ又は複数の修飾を有するモチーフを指し、各修飾が、１つの鎖の交互のヌクレオチドに存在する。交互のヌクレオチドは、１つおきのヌクレオチドに１つ又は３つおきのヌクレオチドに１つ、又は同様のパターンを指し得る。例えば、Ａ、Ｂ及びＣがそれぞれ、ヌクレオチドに対する１つのタイプの修飾を表す場合、交互のモチーフは、「ＡＢＡＢＡＢＡＢＡＢＡＢ・・・」、「ＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢ・・・」、「ＡＡＢＡＡＢＡＡＢＡＡＢ・・・」、「ＡＡＡＢＡＡＡＢＡＡＡＢ・・・」、「ＡＡＡＢＢＢＡＡＡＢＢＢ・・・」、又は「ＡＢＣＡＢＣＡＢＣＡＢＣ・・・」などであり得る。
【０３０２】
交互のモチーフに含まれる修飾のタイプは、同じか又は異なり得る。例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄがそれぞれ、ヌクレオチド上の１つのタイプの修飾を表す場合、交互のパターン、即ち、１つおきのヌクレオチドにおける修飾は、同じであってもよいが、センス鎖又はアンチセンス鎖のそれぞれが、「ＡＢＡＢＡＢ・・・」、「ＡＣＡＣＡＣ・・・」「ＢＤＢＤＢＤ・・・」又は「ＣＤＣＤＣＤ・・・」などの交互のモチーフ内の修飾のいくつかの可能性から選択され得る。
【０３０３】
一実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖における交互のモチーフの修飾パターンに対してシフトされた、センス鎖における交互のモチーフの修飾パターンを含む。このシフトは、センス鎖のヌクレオチドの修飾基が、アンチセンス鎖のヌクレオチドの異なる修飾の基に対応するか、その逆であるようなシフトであり得る。例えば、センス鎖は、ｄｓＲＮＡ二本鎖におけるアンチセンス鎖と対合される場合、センス鎖における交互のモチーフは、鎖の５’から３’へと「ＡＢＡＢＡＢ」から開始してもよく、アンチセンス鎖における交互のモチーフは、二本鎖領域内の鎖の５’から３’へと「ＢＡＢＡＢＡ」から開始され得る。別の例として、センス鎖における交互のモチーフは、鎖の５’から３’へと「ＡＡＢＢＡＡＢＢ」から開始してもよく、アンチセンス鎖における交互のモチーフは、二本鎖領域内の鎖の５’から３’へと「ＢＢＡＡＢＢＡＡ」から開始してもよく、それにより、センス鎖とアンチセンス鎖との間の修飾パターンの完全な又は部分的なシフトが存在する。
【０３０４】
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、センス鎖における２’−Ｏ−メチル修飾及び２’−Ｆ修飾の交互のモチーフのパターンを含み、このパターンは、最初に、アンチセンス鎖における２’−Ｏ−メチル修飾及び２’−Ｆ修飾の交互のモチーフのパターンに対するシフトを有し、即ち、センス鎖における２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドが、アンチセンス鎖における２’−Ｆ修飾ヌクレオチドと塩基対を形成し、その逆も同様である。センス鎖の１位は、２’−Ｆ修飾から開始してもよく、アンチセンス鎖の１位は、２’−Ｏ−メチル修飾から開始してもよい。
【０３０５】
センス鎖及び／又はアンチセンス鎖への、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つ又は複数のモチーフの導入は、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖中に存在する最初の修飾パターンを中断する。センス鎖及び／又はアンチセンス鎖に３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つ又は複数のモチーフを導入することによる、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の修飾パターンのこの中断は、標的遺伝子の対する遺伝子サイレンシング活性を意外にも高める。
【０３０６】
一実施形態において、３連続ヌクレオチド上の３つの同一の修飾のモチーフが、鎖のいずれかに導入される場合、モチーフに隣接するヌクレオチドの修飾は、モチーフの修飾と異なる修飾である。例えば、モチーフを含む配列の一部は、「・・・ＮａＹＹＹＮｂ・・・」であり、ここで、「Ｙ」は、３連続ヌクレオチドにおける３つの同一の修飾のモチーフの修飾を表し、「Ｎａ」及び「Ｎｂ」は、Ｙの修飾と異なる、モチーフ「ＹＹＹ」に隣接するヌクレオチドの修飾を表し、Ｎａ及びＮｂは、同じか又は異なる修飾であり得る。或いは、Ｎａ及び／又はＮｂは、ウイング修飾が存在する場合、存在していても又は存在していなくてもよい。
【０３０７】
ＲＮＡｉ剤は、少なくとも１つのホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合を更に含み得る。ホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合の修飾は、鎖のいずれかの位置の、センス鎖又はアンチセンス鎖又は両方の鎖の任意のヌクレオチドに存在し得る。例えば、ヌクレオチド間結合の修飾は、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖における全てのヌクレオチドに存在してもよく；各ヌクレオチド間結合の修飾は、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖において交互のパターンで存在してもよく；又はセンス鎖又はアンチセンス鎖は、交互のパターンで両方のヌクレオチド間結合の修飾を含み得る。センス鎖におけるヌクレオチド間結合の修飾の交互のパターンは、アンチセンス鎖と同じか又は異なっていてもよく、センス鎖におけるヌクレオチド間結合の修飾の交互のパターンは、アンチセンス鎖におけるヌクレオチド間結合の修飾の交互のパターンに対するシフトを有し得る。一実施形態において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、６〜８つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。一実施形態において、アンチセンス鎖は、５’末端に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合及び３’末端に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、センス鎖は、５’末端又は３’末端のいずれかに少なくとも２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。
【０３０８】
一実施形態において、ＲＮＡｉは、オーバーハング領域にホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合の修飾を含む。例えば、オーバーハング領域は、２つのヌクレオチド間にホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合を有する２つのヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチド間結合の修飾はまた、オーバーハングヌクレオチドを、二本鎖領域内の末端の対合ヌクレオチドと結合するために形成され得る。例えば、少なくとも２、３、４、又は全てのオーバーハングヌクレオチドが、ホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合によって結合されてもよく、任意選択で、オーバーハングヌクレオチドを、オーバーハングヌクレオチドに隣接する対合ヌクレオチドと結合する更なるホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合が存在し得る。例えば、末端の３つのヌクレオチド間に少なくとも２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合が存在してもよく、３つのヌクレオチドのうちの２つが、オーバーハングヌクレオチドであり、第３のヌクレオチドが、オーバーハングヌクレオチドに隣接する対合ヌクレオチドである。これらの末端の３つのヌクレオチドは、アンチセンス鎖の３’末端、センス鎖の３’末端、アンチセンス鎖の５’末端、及び／又はアンチセンス鎖の５’末端に存在し得る。
【０３０９】
一実施形態において、２つのヌクレオチドオーバーハングは、アンチセンス鎖の３’末端にあり、末端の３つのヌクレオチド間に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合が存在し、３つのヌクレオチドのうちの２つが、オーバーハングヌクレオチドであり、第３のヌクレオチドが、オーバーハングヌクレオチドに隣接する対合ヌクレオチドである。任意選択で、ＲＮＡｉ剤は、センス鎖の５’末端及びアンチセンス鎖の５’末端の両方において、末端の３つのヌクレオチド間に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を更に有し得る。
【０３１０】
ＲＮＡｉ剤は、標的とのミスマッチ、二本鎖内のミスマッチ、又はそれらの組み合わせを含む。ミスマッチは、オーバーハング領域又は二本鎖領域で生じ得る。塩基対は、解離又は融解（例えば、特定の対合の結合又は解離の自由エネルギーに対してであり、最も簡単な手法は、個々の対ごとに対を調べることであるが、類似の又は同様の分析も使用され得る）を促進する傾向に基づいて評価され得る。解離の促進に関して：Ａ：Ｕが、Ｇ：Ｃより好ましく；Ｇ：Ｕが、Ｇ：Ｃより好ましく；Ｉ：Ｃが、Ｇ：Ｃより好ましい（Ｉ＝イノシン）。ミスマッチ、例えば、非正準又は正準以外の対合（本明細書の他の箇所に記載される）が、正準な（Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｃ）対合より好ましく；ユニバーサル塩基を含む対合が、正準な対合より好ましい。
【０３１１】
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｕ、Ｉ：Ｃの群から独立して選択されるアンチセンス鎖の５’末端からの二本鎖領域内の最初の１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つの塩基対のうちの少なくとも１つ、及び二本鎖の５’末端におけるアンチセンス鎖の解離を促進するためのミスマッチ対、例えば、非正準又は正準以外の対合又はユニバーサル塩基を含む対合を含む。
【０３１２】
一実施形態において、アンチセンス鎖の５’末端からの二本鎖領域内の１位におけるヌクレオチドは、Ａ、ｄＡ、ｄＵ、Ｕ、及びｄＴからなる群から選択される。或いは、アンチセンス鎖の５’末端からの二本鎖領域内の最初の１、２又は３塩基対のうちの少なくとも１つは、ＡＵ塩基対である。例えば、アンチセンス鎖の５’末端からの二本鎖領域内の第１の塩基対は、ＡＵ塩基対である。
【０３１３】
別の実施形態において、センス鎖の３’末端におけるヌクレオチドは、デオキシ−チミン（ｄＴ）である。別の実施形態において、アンチセンス鎖の３’末端におけるヌクレオチドは、デオキシ−チミン（ｄＴ）である。一実施形態において、デオキシ−チミンヌクレオチド、例えば、センス及び／又はアンチセンス鎖に３’末端における２つのｄＴヌクレオチドの短い配列がある。
【０３１４】
一実施形態において、センス鎖配列は、式（Ｉ）：
５’ｎｐ−Ｎａ−（ＸＸＸ）ｉ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎｂ−（ＺＺＺ）ｊ−Ｎａ−ｎｑ３’（Ｉ）
（式中：
ｉ及びｊがそれぞれ、独立して、０又は１であり；
ｐ及びｑがそれぞれ、独立して、０〜６であり；
各Ｎａが、独立して、０〜２５の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；
各Ｎｂが、独立して、０〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
各ｎｐ及びｎｑが、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し；
ここで、Ｎｂ及びＹが、同じ修飾を有さず；
ＸＸＸ、ＹＹＹ及びＺＺＺがそれぞれ、独立して、３連続ヌクレオチドにおける３つの同一の修飾の１つのモチーフを表す）
によって表され得る。好ましくは、ＹＹＹが、全て２’−Ｆ修飾ヌクレオチドである。
【０３１５】
一実施形態において、Ｎａ及び／又はＮｂは、交互のパターンの修飾を含む。
【０３１６】
一実施形態において、ＹＹＹモチーフは、センス鎖の切断部位又はその近傍に存在する。例えば、ＲＮＡｉ剤が、１７〜２３ヌクレオチド長の二本鎖領域を有する場合、ＹＹＹモチーフは、５’末端から１つ目のヌクレオチドから数え始めて；又は任意選択で、５’末端から、二本鎖領域内の１つ目の対合ヌクレオチドから数え始めて、センス鎖の切断部位又はその近傍に存在し得る（例えば：６位、７位、８位、７位、８位、９位、８位、９位、１０位、９位、１０位、１１位、１０位、１１位、１２位又は１１位、１２位、１３位に存在し得る）。
【０３１７】
一実施形態において、ｉが１であり、ｊが０であり、又はｉが０であり、ｊが１であり、又はｉ及びｊの両方が１である。したがって、センス鎖は、以下の式によって表され得る：
５’ｎｐ−Ｎａ−ＹＹＹ−Ｎｂ−ＺＺＺ−Ｎａ−ｎｑ３’（Ｉｂ）；
５’ｎｐ−Ｎａ−ＸＸＸ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎａ−ｎｑ３’（Ｉｃ）；又は
５’ｎｐ−Ｎａ−ＸＸＸ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎｂ−ＺＺＺ−Ｎａ−ｎｑ３’（Ｉｄ）。
【０３１８】
センス鎖が、式（Ｉｂ）によって表される場合、Ｎｂは、０〜１０、０〜７、０〜５、０〜４、０〜２又は０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａは、独立して、２〜２０、２〜１５、又は２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。
【０３１９】
センス鎖が、式（Ｉｃ）として表される場合、Ｎｂは、０〜１０、０〜７、０〜１０、０〜７、０〜５、０〜４、０〜２又は０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａは、独立して、２〜２０、２〜１５、又は２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。
【０３２０】
センス鎖が、式（Ｉｄ）として表される場合、各Ｎｂは、独立して、０〜１０、０〜７、０〜５、０〜４、０〜２又は０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。好ましくは、Ｎｂは、０、１、２、３、４、５又は６である。各Ｎａは、独立して、２〜２０、２〜１５、又は２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。
【０３２１】
Ｘ、Ｙ及びＺのそれぞれが、互いに同じか又は異なり得る。
【０３２２】
他の実施形態において、ｉが０であり、ｊが０であり、センス鎖は、以下の式によって表され得る：
５’ｎｐ−Ｎａ−ＹＹＹ−Ｎａ−ｎｑ３’（Ｉａ）。
【０３２３】
センス鎖が、式（Ｉａ）によって表される場合、各Ｎａは、独立して、２〜２０、２〜１５、又は２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。
【０３２４】
一実施形態において、ＲＮＡｉのアンチセンス鎖配列は、式（ＩＩ）：
５’ｎｑ’−Ｎａ’−（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｋ−Ｎｂ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｌ−Ｎ’ａ−ｎｐ’３’（ＩＩ）
（式中：
ｋ及びｌがそれぞれ、独立して、０又は１であり；
ｐ’及びｑ’がそれぞれ、独立して、０〜６であり；
各Ｎａ’が、独立して、０〜２５の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；
各Ｎｂ’が、独立して、０〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
各ｎｐ’及びｎｑ’が、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し；
ここで、Ｎｂ’及びＹ’が、同じ修飾を有さず；
Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’及びＺ’Ｚ’Ｚ’がそれぞれ、独立して、３連続ヌクレオチドにおける３つの同一の修飾の１つのモチーフを表す）
によって表され得る。
【０３２５】
一実施形態において、Ｎａ’及び／又はＮｂ’は、交互のパターンの修飾を含む。
【０３２６】
Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、アンチセンス鎖の切断部位又はその近傍に存在する。例えば、ＲＮＡｉ剤が、１７〜２３ヌクレオチド長の二本鎖領域を有する場合、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、５’末端から１つ目のヌクレオチドから数え始めて；又は任意選択で、５’末端から、二本鎖領域内の１つ目の対合ヌクレオチドから数え始めて、アンチセンス鎖の９位、１０位、１１位；１０位、１１位、１２位；１１位、１２位、１３位；１２位、１３位、１４位；又は１３位、１４位、１５位に存在し得る。好ましくは、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、１１位、１２位、１３位に存在する。
【０３２７】
一実施形態において、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、全て２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチドである。
【０３２８】
一実施形態において、ｋが１であり、ｌが０であり、又はｋが０であり、ｌが１であり、又はｋ及びｌの両方が１である。
【０３２９】
したがって、アンチセンス鎖は、以下の式によって表され得る：
５’ｎｑ’−Ｎａ’−Ｚ’Ｚ’Ｚ’−Ｎｂ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎａ’−ｎｐ’３’（ＩＩｂ）；
５’ｎｑ’−Ｎａ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−Ｘ’Ｘ’Ｘ’−ｎｐ’３’（ＩＩｃ）；又は
５’ｎｑ’−Ｎａ’−Ｚ’Ｚ’Ｚ’−Ｎｂ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−Ｘ’Ｘ’Ｘ’−Ｎａ’−ｎｐ’３’（ＩＩｄ）。
【０３３０】
アンチセンス鎖が、式（ＩＩｂ）によって表される場合、Ｎｂ’は、０〜１０、０〜７、０〜１０、０〜７、０〜５、０〜４、０〜２又は０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ’は、独立して、２〜２０、２〜１５、又は２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
【０３３１】
アンチセンス鎖が、式（ＩＩｃ）として表される場合、Ｎｂ’は、０〜１０、０〜７、０〜１０、０〜７、０〜５、０〜４、０〜２又は０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ’は、独立して、２〜２０、２〜１５、又は２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
【０３３２】
アンチセンス鎖が、式（ＩＩｄ）として表される場合、各Ｎｂ’は、独立して、０〜１０、０〜７、０〜１０、０〜７、０〜５、０〜４、０〜２又は０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ’は、独立して、２〜２０、２〜１５、又は２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。好ましくは、Ｎｂは、０、１、２、３、４、５又は６である。
【０３３３】
他の実施形態において、ｋが０であり、ｌが０であり、アンチセンス鎖は、以下の式によって表され得る：
５’ｎｐ’−Ｎａ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎａ’−ｎｑ’３’（Ｉａ）。
【０３３４】
アンチセンス鎖が、式（ＩＩａ）として表される場合、各Ｎａ’は、独立して、２〜２０、２〜１５、又は２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
【０３３５】
Ｘ’、Ｙ’及びＺ’のそれぞれが、互いに同じか又は異なり得る。
【０３３６】
センス鎖及びアンチセンス鎖の各ヌクレオチドは、独立して、ＬＮＡ、ＣＲＮ、ＵＮＡ、ｃＥＴ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’−メトキシエチル、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｃ−アリル、２’−ヒドロキシル、又は２’−フルオロで修飾され得る。例えば、センス鎖及びアンチセンス鎖の各ヌクレオチドは、独立して、２’−Ｏ−メチル又は２’−フルオロで修飾される。各Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｘ’、Ｙ’及びＺ’は、特に、２’−Ｏ−メチル修飾又は２’−フルオロ修飾を表し得る。
【０３３７】
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、二本鎖領域が２１のヌクレオチドである場合、５’末端から１つ目のヌクレオチドから数え始めて；又は任意選択で、５’末端から、二本鎖領域内の１つ目の対合ヌクレオチドから数え始めて、鎖の９位、１０位及び１１位に存在するＹＹＹモチーフを含んでいてもよく；Ｙは、２’−Ｆ修飾を表す。センス鎖は、二本鎖領域の反対側の末端にウイング修飾としてＸＸＸモチーフ又はＺＺＺモチーフを更に含んでいてもよく；ＸＸＸ及びＺＺＺはそれぞれ、独立して、２’−ＯＭｅ修飾又は２’−Ｆ修飾を表す。
【０３３８】
一実施形態において、アンチセンス鎖は、５’末端から１つ目のヌクレオチドから数え始めて；又は任意選択で、５’末端から、二本鎖領域内の１つ目の対合ヌクレオチドから数え始めて、鎖の１１位、１２位、１３位に存在するＹ’Ｙ’Ｙ’モチーフを含んでいてもよく；Ｙ’は、２’−Ｏ−メチル修飾を表す。アンチセンス鎖は、二本鎖領域の反対側の末端にウイング修飾としてＸ’Ｘ’Ｘ’モチーフ又はＺ’Ｚ’Ｚ’モチーフを更に含んでいてもよく；Ｘ’Ｘ’Ｘ’及びＺ’Ｚ’Ｚ’はそれぞれ、独立して、２’−ＯＭｅ修飾又は２’−Ｆ修飾を表す。
【０３３９】
上の式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、及び（Ｉｄ）のいずれか１つによって表されるセンス鎖はそれぞれ、式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、及び（ＩＩｄ）のいずれか１つによって表されるアンチセンス鎖と二本鎖を形成する。
【０３４０】
したがって、本発明の方法に使用するためのＲＮＡｉ剤は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含んでいてもよく、各鎖は、１４〜３０のヌクレオチドを有し、ＲＮＡｉ二本鎖は、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ｎｐ−Ｎａ−（ＸＸＸ）ｉ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎｂ−（ＺＺＺ）ｊ−Ｎａ−ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ’−Ｎａ’−（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ−Ｎｂ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ−Ｎａ’−ｎｑ’５’
（ＩＩＩ）
（式中：
ｉ、ｊ、ｋ、及びｌがそれぞれ、独立して、０又は１であり；
ｐ、ｐ’、ｑ、及びｑ’がそれぞれ、独立して、０〜６であり；
各Ｎａ及びＮａ’が、独立して、０〜２５の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；
各Ｎｂ及びＮｂ’が、独立して、０〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
ここで、
それぞれ存在していても又は存在していなくてもよい各ｎｐ’、ｎｐ、ｎｑ’、及びｎｑが、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し；
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、及びＺ’Ｚ’Ｚ’がそれぞれ、独立して、３連続ヌクレオチド上に３つの同一の修飾の１つのモチーフを表す）
によって表される。
【０３４１】
一実施形態において、ｉが０であり、ｊが０であり；又はｉが１であり、ｊが０であり；又はｉが０であり、ｊが１であり；又はｉ及びｊの両方が０であり；又はｉ及びｊの両方が１である。別の実施形態において、ｋが０であり、ｌが０であり；又はｋが１であり、ｌが０であり；ｋが０であり、ｌが１であり；又はｋ及びｌの両方が０であり；又はｋ及びｌの両方が１である。
【０３４２】
ＲＮＡｉ二本鎖を形成するセンス鎖及びアンチセンス鎖の例示的な組み合わせは、以下の式を含む：
５’ｎｐ−Ｎａ−ＹＹＹ−Ｎａ−ｎｑ３’
３’ｎｐ’−Ｎａ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎａ’ｎｑ’５’
（ＩＩＩａ）
５’ｎｐ−Ｎａ−ＹＹＹ−Ｎｂ−ＺＺＺ−Ｎａ−ｎｑ３’
３’ｎｐ’−Ｎａ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−Ｚ’Ｚ’Ｚ’−Ｎａ’ｎｑ’５’
（ＩＩＩｂ）
５’ｎｐ−Ｎａ−ＸＸＸ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎａ−ｎｑ３’
３’ｎｐ’−Ｎａ’−Ｘ’Ｘ’Ｘ’−Ｎｂ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎａ’−ｎｑ’５’
（ＩＩＩｃ）
５’ｎｐ−Ｎａ−ＸＸＸ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎｂ−ＺＺＺ−Ｎａ−ｎｑ３’
３’ｎｐ’−Ｎａ’−Ｘ’Ｘ’Ｘ’−Ｎｂ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−Ｚ’Ｚ’Ｚ’−Ｎａ−ｎｑ’５’
（ＩＩＩｄ）
【０３４３】
ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩａ）によって表される場合、各Ｎａは、独立して、２〜２０、２〜１５、又は２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
【０３４４】
ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｂ）によって表される場合、各Ｎｂは、独立して、１〜１０、１〜７、１〜５又は１〜４の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａは、独立して、２〜２０、２〜１５、又は２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
【０３４５】
ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｃ）として表される場合、各Ｎｂ、Ｎｂ’が、独立して、０〜１０、０〜７、０〜１０、０〜７、０〜５、０〜４、０〜２又は０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａが、独立して、２〜２０、２〜１５、又は２〜１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
【０３４６】
ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｄ）として表される場合、各Ｎｂ、Ｎｂ’が、独立して、０〜１０、０〜７、０〜１０、０〜７、０〜５、０〜４、０〜２又は０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ、Ｎａ’が、独立して、２〜２０、２〜１５、又は２〜１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。Ｎａ、Ｎａ’、Ｎｂ及びＮｂ’のそれぞれは、独立して、交互のパターンの修飾を含む。
【０３４７】
式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、及び（ＩＩＩｄ）中のＸ、Ｙ及びＺのそれぞれは、互いに同じか又は異なり得る。
【０３４８】
ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、及び（ＩＩＩｄ）によって表される場合、Ｙヌクレオチドの少なくとも１つが、Ｙ’ヌクレオチドの１つと塩基対を形成し得る。或いは、Ｙヌクレオチドの少なくとも２つが、対応するＹ’ヌクレオチドと塩基対を形成し；又はＹヌクレオチドの全ての３つが全て、対応するＹ’ヌクレオチドと塩基対を形成する。
【０３４９】
ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｂ）又は（ＩＩＩｄ）によって表される場合、Ｚヌクレオチドの少なくとも１つが、Ｚ’ヌクレオチドの１つと塩基対を形成し得る。或いは、Ｚヌクレオチドの少なくとも２つが、対応するＺ’ヌクレオチドと塩基対を形成し；又はＺヌクレオチドの全ての３つが全て、対応するＺ’ヌクレオチドと塩基対を形成する。
【０３５０】
ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｃ）又は（ＩＩＩｄ）として表される場合、Ｘヌクレオチドの少なくとも１つが、Ｘ’ヌクレオチドの１つと塩基対を形成し得る。或いは、Ｘヌクレオチドの少なくとも２つが、対応するＸ’ヌクレオチドと塩基対を形成し；又はＸヌクレオチドの全ての３つが全て、対応するＸ’ヌクレオチドと塩基対を形成する。
【０３５１】
一実施形態において、Ｙヌクレオチド上の修飾は、Ｙ’ヌクレオチド上の修飾と異なり、Ｚヌクレオチド上の修飾は、Ｚ’ヌクレオチド上の修飾と異なり、及び／又はＸヌクレオチド上の修飾は、Ｘ’ヌクレオチド上の修飾と異なる。
【０３５２】
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｄ）によって表される場合、Ｎａ修飾は、２’−Ｏ−メチル又は２’−フルオロ修飾である。別の実施形態において、ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｄ）によって表される場合、Ｎａ修飾は、２’−Ｏ−メチル又は２’−フルオロ修飾であり、ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合される。更に別の実施形態において、ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｄ）によって表される場合、Ｎａ修飾は、２’−Ｏ−メチル又は２’−フルオロ修飾であり、ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合され、センス鎖は、二価又は三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された１つ又は複数のＧａｌＮＡｃ誘導体にコンジュゲートされる（後述される）。別の実施形態において、ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｄ）によって表される場合、Ｎａ修飾は、２’−Ｏ−メチル又は２’−フルオロ修飾であり、ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合され、センス鎖は、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含み、センス鎖は、二価又は三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された１つ又は複数のＧａｌＮＡｃ誘導体にコンジュゲートされる。
【０３５３】
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩａ）によって表される場合、Ｎａ修飾は、２’−Ｏ−メチル又は２’−フルオロ修飾であり、ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合され、センス鎖は、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含み、センス鎖は、二価又は三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された１つ又は複数のＧａｌＮＡｃ誘導体にコンジュゲートされる。
【０３５４】
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、及び（ＩＩＩｄ）によって表される少なくとも２つの二本鎖を含む多量体であり、この二本鎖は、リンカーによって結合される。リンカーは、切断可能又は切断不可能であり得る。任意選択で、多量体は、リガンドを更に含む。二本鎖のそれぞれは、同じ遺伝子又は２つの異なる遺伝子を標的とすることができ；又は二本鎖のそれぞれは、２つの異なる標的部位において同じ遺伝子を標的とすることができる。
【０３５５】
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、及び（ＩＩＩｄ）によって表される３つ、４つ、５つ、６つ又はそれ以上の二本鎖を含む多量体であり、この二本鎖は、リンカーによって結合される。リンカーは、切断可能又は切断不可能であり得る。任意選択で、多量体は、リガンドを更に含む。二本鎖のそれぞれは、同じ遺伝子又は２つの異なる遺伝子を標的とすることができ；又は二本鎖のそれぞれは、２つの異なる標的部位において同じ遺伝子を標的とすることができる。
【０３５６】
一実施形態において、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、及び（ＩＩＩｄ）によって表される２つのＲＮＡｉ剤は、５’末端、及び３’末端の一方又は両方で互いに結合され、任意選択で、リガンドにコンジュゲートされる。ＲＮＡｉ剤のそれぞれは、同じ遺伝子又は２つの異なる遺伝子を標的とすることができ；又はＲＮＡｉ剤のそれぞれは、２つの異なる標的部位において同じ遺伝子を標的とすることができる。
【０３５７】
特定の実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、２’−フルオロ修飾を含有する少ない数のヌクレオチド、例えば、２’−フルオロ修飾を有する１０個以下のヌクレオチドを含有する。例えば、ＲＮＡｉ剤は、２’−フルオロ修飾を有する１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１又は０個のヌクレオチドを含有し得る。特定の実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、２’−フルオロ修飾を有する１０個のヌクレオチド、例えば、センス鎖に２’−フルオロ修飾を有する４つのヌクレオチド及びアンチセンス鎖に２’−フルオロ修飾を有する６つのヌクレオチドを含有する。別の特定の実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、２’−フルオロ修飾を有する６つのヌクレオチド、例えば、センス鎖に２’−フルオロ修飾を有する４つのヌクレオチド及びアンチセンス鎖に２’−フルオロ修飾を有する２つのヌクレオチドを含有する。
【０３５８】
他の実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、２’−フルオロ修飾を含有するごく少ない数のヌクレオチド、例えば、２’−フルオロ修飾を含有する２つ以下のヌクレオチドを含有し得る。例えば、ＲＮＡｉ剤は、２’−フルオロ修飾を有する２、１又は０個のヌクレオチドを含有し得る。特定の実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、２’−フルオロ修飾を有する２つのヌクレオチド、例えば、センス鎖に２−フルオロ修飾を有する０個のヌクレオチド及びアンチセンス鎖に２’−フルオロ修飾を有する２つのヌクレオチドを含有し得る。
【０３５９】
様々な刊行物に、本発明の方法に使用され得る多量体ＲＮＡｉ剤が記載されている。このような刊行物としては、国際公開第２００７／０９１２６９号パンフレット、米国特許第７８５８７６９号明細書、国際公開第２０１０／１４１５１１号パンフレット、国際公開第２００７／１１７６８６号パンフレット、国際公開第２００９／０１４８８７号パンフレット及び国際公開第２０１１／０３１５２０号パンフレットが挙げられ、それぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。
【０３６０】
以下により詳細に説明されるとおり、ＲＮＡｉ剤に対する１つ又は複数の炭水化物部分のコンジュゲーションを含むＲＮＡｉ剤は、ＲＮＡｉ剤の１つ又は複数の特性を最適化することができる。多くの場合、炭水化物部分は、ＲＮＡｉ剤の修飾サブユニットに結合される。例えば、ｄｓＲＮＡ剤の１つ又は複数のリボヌクレオチドサブユニットのリボース糖は、別の部分、例えば、炭水化物リガンドが結合される非炭水化物（好ましくは環状の）担体で置換され得る。サブユニットのリボース糖がこのように置換されたリボヌクレオチドサブユニットは、本明細書において、リボース置換修飾サブユニット（ＲＲＭＳ）と呼ばれる。環状担体は、炭素環系であってもよく、即ち、全ての環原子が、炭素原子であり、又は複素環系、即ち、１つ又は複数の環原子が、ヘテロ原子、例えば、窒素、酸素、硫黄であり得る。環状担体は、単環系であってもよく、又は２つ以上の環、例えば縮合環を含み得る。環状担体は、完全に飽和した環系であってもよく、又は１つ又は複数の二重結合を含み得る。
【０３６１】
リガンドは、担体を介してポリヌクレオチドに結合され得る。担体は、（ｉ）少なくとも１つの「骨格結合点」、好ましくは、２つの「骨格結合点」及び（ｉｉ）少なくとも１つの「テザー結合点（ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｐｏｉｎｔ）」を含む。本明細書において使用される際の「骨格結合点」は、官能基、例えば、ヒドロキシル基、又は一般に、骨格、例えば、リン酸塩、又は修飾リン酸塩、例えば、硫黄を含有する、リボ核酸の骨格中への担体の組み込みに利用可能であり且つそれに適した結合を指す。「テザー結合点」（ＴＡＰ）は、ある実施形態において、選択された部分を接続する環状担体の構成環原子、例えば、炭素原子又はヘテロ原子（骨格結合点を提供する原子と異なる）を指す。この部分は、例えば、炭水化物、例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖及び多糖であり得る。任意選択で、選択された部分は、介在するテザー（ｉｎｔｅｒｖｅｎｉｎｇ  ｔｅｔｈｅｒ）によって環状担体に接続される。したがって、環状担体は、多くの場合、官能基、例えば、アミノ基を含み、又は一般に、構成環への別の化学成分、例えば、リガンドの組み込み又は連結（ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ）に適した結合を提供する。
【０３６２】
ＲＮＡｉ剤は、担体を介してリガンドにコンジュゲートされてもよく、この担体は、環式基又は環式基であり得；好ましくは、環式基は、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、［１，３］ジオキソラン、オキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル（ｐｙｒｉｄａｚｉｎｏｎｙｌ）、テトラヒドロフリル及びデカリンから選択され；好ましくは、環式基は、セリノール骨格又はジエタノールアミン骨格から選択される。
【０３６３】
本発明の別の実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０個のヌクレオチドを有する。ＲＮＡｉ剤は、式（Ｌ）：
【化６】
2020532289.tif 000008
によって表され得る。
【０３６４】
式（Ｌ）において、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ１’、Ｂ２’、Ｂ３’、及びＢ４’がそれぞれ、独立して、２’−Ｏ−アルキル、２’−置換アルコキシ、２’−置換アルキル、２’−ハロ、ＥＮＡ、及びＢＮＡ／ＬＮＡからなる群から選択される修飾を含有するヌクレオチドである。一実施形態において、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ１’、Ｂ２’、Ｂ３’、及びＢ４’がそれぞれ、２’−ＯＭｅ修飾を含有する。一実施形態において、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ１’、Ｂ２’、Ｂ３’、及びＢ４’がそれぞれ、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆ修飾を含有する。一実施形態において、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ１’、Ｂ２’、Ｂ３’、及びＢ４’の少なくとも１つが、２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）修飾を含有する。
【０３６５】
Ｃ１は、アンチセンス鎖のシード領域（即ち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜８位）と反対側の部位に配置された熱的不安定化ヌクレオチドである。例えば、Ｃ１は、アンチセンス鎖の５’末端の２〜８位においてヌクレオチドと対合するセンス鎖の位置にある。一例において、Ｃ１は、センス鎖の５’末端から１５位にある。Ｃ１ヌクレオチドは、非塩基性修飾；二本鎖中の対向するヌクレオチドとのミスマッチ；及び２’−デオキシ修飾又は非環式ヌクレオチド、例えば、アンロックト核酸（ＵＮＡ）又はグリセロール核酸（ＧＮＡ）などの糖修飾を含み得る熱的不安定化修飾を有する。一実施形態において、Ｃ１は、ｉ）アンチセンス鎖中の対向するヌクレオチドとのミスマッチ；ｉｉ）以下からなる群から選択される非塩基性修飾：
【化７】
2020532289.tif 000009
；及びｉｉｉ）以下からなる群から選択される糖修飾：
【化８】
2020532289.tif 000010
からなる群から選択される熱的不安定化修飾を有し、式中、Ｂが、修飾又は非修飾核酸塩基であり、Ｒ１及びＲ２が、独立して、Ｈ、ハロゲン、ＯＲ３、又はアルキルであり；Ｒ３が、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール又は糖である。一実施形態において、Ｃ１中の熱的不安定化修飾は、Ｇ：Ｇ、Ｇ：Ａ、Ｇ：Ｕ、Ｇ：Ｔ、Ａ：Ａ、Ａ：Ｃ、Ｃ：Ｃ、Ｃ：Ｕ、Ｃ：Ｔ、Ｕ：Ｕ、Ｔ：Ｔ、及びＵ：Ｔからなる群から選択されるミスマッチであり；任意選択で、ミスマッチ対における少なくとも１つの核酸塩基は、２’−デオキシ核酸塩基である。一例において、Ｃ１中の熱的不安定化修飾は、ＧＮＡ又は
【化９】
2020532289.tif 000011
である。
【０３６６】
Ｔ１、Ｔ１’、Ｔ２’、及びＴ３’がそれぞれ、独立して、２’−ＯＭｅ修飾の立体嵩高さ（ｓｔｅｒｉｃ  ｂｕｌｋ）以下の立体嵩高さをヌクレオチドに与える修飾を含むヌクレオチドを表す。立体嵩高さは、修飾の立体効果の総計を指す。ヌクレオチドの修飾の立体効果を決定するための方法は、当業者に公知である。修飾は、ヌクレオチドのリボース糖の２’位にあり得るか、又は非リボースヌクレオチド、非環式ヌクレオチド、若しくはリボース糖の２’位と同様又は同等のヌクレオチドの骨格に対する修飾であり得、２’−ＯＭｅ修飾の立体嵩高さ以下の立体嵩高さをヌクレオチドに与える。例えば、Ｔ１、Ｔ１’、Ｔ２’、及びＴ３’がそれぞれ、独立して、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、２’−Ｆ、及び２’−Ｆ−５’−メチルから選択される。一実施形態において、Ｔ１がＤＮＡである。一実施形態において、Ｔ１’が、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はＬＮＡである。一実施形態において、Ｔ２’が、ＤＮＡ又はＲＮＡである。一実施形態において、Ｔ３’が、ＤＮＡ又はＲＮＡである。
【０３６７】
ｎ１、ｎ３、及びｑ１が、独立して、４〜１５ヌクレオチド長である。
【０３６８】
ｎ５、ｑ３、及びｑ７が、独立して、１〜６ヌクレオチド長である。
【０３６９】
ｎ４、ｑ２、及びｑ６が、独立して、１〜３ヌクレオチド長であり；或いは、ｎ４が０である。
【０３７０】
ｑ５が、独立して、０〜１０ヌクレオチド長である。
【０３７１】
ｎ２及びｑ４が、独立して、０〜３ヌクレオチド長である。
【０３７２】
或いは、ｎ４が、０〜３ヌクレオチド長である。
【０３７３】
一実施形態において、ｎ４が０であり得る。一例において、ｎ４が０であり、ｑ２及びｑ６が１である。別の例において、ｎ４が０であり、ｑ２及びｑ６が１であり、（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及びアンチセンス鎖の１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。
【０３７４】
一実施形態において、ｎ４、ｑ２、及びｑ６がそれぞれ、１である。
【０３７５】
一実施形態において、ｎ２、ｎ４、ｑ２、ｑ４、及びｑ６がそれぞれ、１である。
【０３７６】
一実施形態において、センス鎖が１９〜２２ヌクレオチド長である場合、Ｃ１は、センス鎖の５’末端の１４〜１７位にあり、ｎ４が１である。一実施形態において、Ｃ１は、センス鎖の５’末端の１５位にある。
【０３７７】
一実施形態において、Ｔ３’が、アンチセンス鎖の５’末端から２位から開始する。一例において、Ｔ３’が、アンチセンス鎖の５’末端から２位にあり、ｑ６が１に等しい。
【０３７８】
一実施形態において、Ｔ１’が、アンチセンス鎖の５’末端から１４位から開始する。一例において、Ｔ１’が、アンチセンス鎖の５’末端から１４位にあり、ｑ２が１に等しい。
【０３７９】
例示的な実施形態において、Ｔ３’が、アンチセンス鎖の５’末端から２位から開始し、Ｔ１’が、アンチセンス鎖の５’末端から１４位から開始する。一例において、Ｔ３’が、アンチセンス鎖の５’末端から２位から開始し、ｑ６が１に等しく、Ｔ１’が、アンチセンス鎖の５’末端から１４位から開始し、ｑ２が１に等しい。
【０３８０】
一実施形態において、Ｔ１’及びＴ３’が、１１ヌクレオチド長離間している（即ち、Ｔ１’及びＴ３’ヌクレオチドを数えない）。
【０３８１】
一実施形態において、Ｔ１’が、アンチセンス鎖の５’末端から１４位にある。一例において、Ｔ１’が、アンチセンス鎖の５’末端から１４位にあり、ｑ２が１に等しく、修飾が、２’位にあるか、又は２’−ＯＭｅリボースより小さい立体嵩高さを与える非リボース、非環式若しくは骨格における位置にある。
【０３８２】
一実施形態において、Ｔ３’が、アンチセンス鎖の５’末端から２位にある。一例において、Ｔ３’が、アンチセンス鎖の５’末端から２位にあり、ｑ６が１に等しく、修飾が、２’位にあるか、又は２’−ＯＭｅリボース以下の立体嵩高さを与える非リボース、非環式若しくは骨格における位置にある。
【０３８３】
一実施形態において、Ｔ１が、センス鎖の切断部位にある。一例において、センス鎖が１９〜２２ヌクレオチド長である場合、Ｔ１は、センス鎖の５’末端から１１位にあり、ｎ２が１である。例示的な実施形態において、センス鎖が１９〜２２ヌクレオチド長である場合、Ｔ１は、センス鎖の５’末端から１１位におけるセンス鎖の切断部位にあり、ｎ２が１である。
【０３８４】
一実施形態において、Ｔ２’が、アンチセンス鎖の５’末端から６位から開始する。一例において、Ｔ２’が、アンチセンス鎖の５’末端から６〜１０位にあり、ｑ４が１である。
【０３８５】
例示的な実施形態において、センス鎖が１９〜２２ヌクレオチド長である場合、Ｔ１は、例えば、センス鎖の５’末端から１１位における、センス鎖の切断部位にあり、ｎ２が１であり；Ｔ１’が、アンチセンス鎖の５’末端から１４位にあり、ｑ２が１に等しく、Ｔ１’に対する修飾が、リボース糖の２’位にあるか、又は２’−ＯＭｅリボースより小さい立体嵩高さを与える非リボース、非環式若しくは骨格における位置にあり；Ｔ２’が、アンチセンス鎖の５’末端から６〜１０位にあり、ｑ４が１であり；Ｔ３’が、アンチセンス鎖の５’末端から２位にあり、ｑ６が１に等しく、Ｔ３’に対する修飾が、２’位にあるか、又は２’−ＯＭｅリボース以下の立体嵩高さを与える非リボース、非環式若しくは骨格における位置にある。
【０３８６】
一実施形態において、Ｔ２’が、アンチセンス鎖の５’末端から８位から開始する。一例において、Ｔ２’が、アンチセンス鎖の５’末端から８位から開始し、ｑ４が２である。
【０３８７】
一実施形態において、Ｔ２’が、アンチセンス鎖の５’末端から９位から開始する。一例において、Ｔ２’が、アンチセンス鎖の５’末端から９位にあり、ｑ４が１である。
【０３８８】
一実施形態において、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’−Ｆであり、ｑ４が１であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が６であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−ＯＭｅであり、ｑ７が１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及びアンチセンス鎖の１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。
【０３８９】
一実施形態において、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’−ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’−Ｆであり、ｑ４が１であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が６であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−ＯＭｅであり、ｑ７が１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及びアンチセンス鎖の１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。
【０３９０】
一実施形態において、Ｂ１が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’−ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’−Ｆであり、ｑ４が２であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−ＯＭｅであり、ｑ７が１である。
【０３９１】
一実施形態において、Ｂ１が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’−ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’−ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’−Ｆであり、ｑ４が２であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−ＯＭｅであり、ｑ７が１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及びアンチセンス鎖の１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。
【０３９２】
一実施形態において、Ｂ１が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１が６であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’−ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が７であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’−Ｆであり、ｑ４が２であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−ＯＭｅであり、ｑ７が１である。
【０３９３】
一実施形態において、Ｂ１が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１が６であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’−ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’−ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が７であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’−Ｆであり、ｑ４が２であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−ＯＭｅであり、ｑ７が１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及びアンチセンス鎖の１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。
【０３９４】
一実施形態において、Ｂ１が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’−ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’−Ｆであり、ｑ４が１であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が６であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−ＯＭｅであり、ｑ７が１である。
【０３９５】
一実施形態において、Ｂ１が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’−ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’−ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’−Ｆであり、ｑ４が１であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が６であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−ＯＭｅであり、ｑ７が１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及びアンチセンス鎖の１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。
【０３９６】
一実施形態において、Ｂ１が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’−ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が５であり、Ｔ２’が２’−Ｆであり、ｑ４が１であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−ＯＭｅであり、ｑ７が１であり；任意選択で、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２つの更なるＴＴを有する。
【０３９７】
一実施形態において、Ｂ１が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’−ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’−ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が５であり、Ｔ２’が２’−Ｆであり、ｑ４が１であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−ＯＭｅであり、ｑ７が１であり；任意選択で、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２つの更なるＴＴを有し；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及びアンチセンス鎖の１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。
【０３９８】
一実施形態において、Ｂ１が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’−ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’−ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が４であり、ｑ４が０であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が７であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−ＯＭｅであり、ｑ７が１である。
【０３９９】
一実施形態において、Ｂ１が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’−ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’−ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が４であり、ｑ４が０であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が７であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−ＯＭｅであり、ｑ７が１であり；（５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（５’末端から数えて）１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及びアンチセンス鎖の１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。
【０４００】
一実施形態において、Ｂ１が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’−ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’−Ｆであり、ｑ４が２であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−Ｆであり、ｑ７が１である。
【０４０１】
一実施形態において、Ｂ１が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’−ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’−ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’−Ｆであり、ｑ４が２であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−Ｆであり、ｑ７が１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及びアンチセンス鎖の１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。
【０４０２】
一実施形態において、Ｂ１が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’−ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’−ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が４であり、ｑ４が０であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が７であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−Ｆであり、ｑ７が１である。
【０４０３】
一実施形態において、Ｂ１が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’−ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’−ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が４であり、ｑ４が０であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が７であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−Ｆであり、ｑ７が１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及びアンチセンス鎖の１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。
【０４０４】
ＲＮＡｉ剤は、センス鎖又はアンチセンス鎖の５’末端にリン含有基を含み得る。５’末端リン含有基は、５’末端ホスフェート（５’−Ｐ）、５’末端ホスホロチオエート（５’−ＰＳ）、５’末端ホスホロジチオエート（５’−ＰＳ２）、５’末端ビニルホスホネート（５’−ＶＰ）、５’末端メチルホスホネート（ＭｅＰｈｏｓ）、又は５’−デオキシ−５’−Ｃ−マロニル
【化１０】
2020532289.tif 000012
であり得る。５’末端リン含有基が、５’末端ビニルホスホネート（５’−ＶＰ）である場合、５’−ＶＰは、５’−Ｅ−ＶＰ異性体（即ち、トランス−ビニルホスフェート、
【化１１】
2020532289.tif 000013
）、５’−Ｚ−ＶＰ異性体（即ち、シス−ビニルホスフェート、
【化１２】
2020532289.tif 000014
）、又はそれらの混合物のいずれかであり得る。
【０４０５】
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、センス鎖の５’末端にリン含有基を含む。一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖の５’末端にリン含有基を含む。
【０４０６】
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、５’−Ｐを含む。一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖に５’−Ｐを含む。
【０４０７】
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、５’−ＰＳを含む。一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖に５’−ＰＳを含む。
【０４０８】
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、５’−ＶＰを含む。一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖に５’−ＶＰを含む。一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖に５’−Ｅ−ＶＰを含む。一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖に５’−Ｚ−ＶＰを含む。
【０４０９】
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、５’−ＰＳ２を含む。一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖に５’−ＰＳ２を含む。
【０４１０】
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、５’−ＰＳ２を含む。一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖に５’−デオキシ−５’−Ｃ−マロニルを含む。
【０４１１】
一実施形態において、Ｂ１が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’−ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’−Ｆであり、ｑ４が２であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−ＯＭｅであり、ｑ７が１である。ＲＮＡｉ剤は、５’−ＰＳも含む。
【０４１２】
一実施形態において、Ｂ１が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’−ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’−Ｆであり、ｑ４が２であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−ＯＭｅであり、ｑ７が１である。ＲＮＡｉ剤は、５’−Ｐも含む。
【０４１３】
一実施形態において、Ｂ１が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’−ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’−Ｆであり、ｑ４が２であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−ＯＭｅであり、ｑ７が１である。ＲＮＡｉ剤は、５’−ＶＰも含む。５’−ＶＰは、５’−Ｅ−ＶＰ、５’−Ｚ−ＶＰ、又はそれらの組み合わせであり得る。
【０４１４】
一実施形態において、Ｂ１が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’−ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’−Ｆであり、ｑ４が２であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−ＯＭｅであり、ｑ７が１である。ＲＮＡｉ剤は、５’−ＰＳ２も含む。
【０４１５】
一実施形態において、Ｂ１が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’−ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’−Ｆであり、ｑ４が２であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−ＯＭｅであり、ｑ７が１である。ＲＮＡｉ剤は、５’−デオキシ−５’−Ｃ−マロニルも含む。
【０４１６】
一実施形態において、Ｂ１が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’−ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’−ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’−Ｆであり、ｑ４が２であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−ＯＭｅであり、ｑ７が１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及びアンチセンス鎖の１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−Ｐも含む。
【０４１７】
一実施形態において、Ｂ１が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’−ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’−ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’−Ｆであり、ｑ４が２であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−ＯＭｅであり、ｑ７が１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及びアンチセンス鎖の１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−ＰＳも含む。
【０４１８】
一実施形態において、Ｂ１が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’−ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’−ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’−Ｆであり、ｑ４が２であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−ＯＭｅであり、ｑ７が１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及びアンチセンス鎖の１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−ＶＰも含む。５’−ＶＰは、５’−Ｅ−ＶＰ、５’−Ｚ−ＶＰ、又はそれらの組み合わせであり得る。
【０４１９】
一実施形態において、Ｂ１が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’−ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’−ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’−Ｆであり、ｑ４が２であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−ＯＭｅであり、ｑ７が１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及びアンチセンス鎖の１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−ＰＳ２も含む。
【０４２０】
一実施形態において、Ｂ１が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’−ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’−ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’−Ｆであり、ｑ４が２であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−ＯＭｅであり、ｑ７が１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及びアンチセンス鎖の１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−デオキシ−５’−Ｃ−マロニルも含む。
【０４２１】
一実施形態において、Ｂ１が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’−ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’−ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が４であり、ｑ４が０であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が７であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−ＯＭｅであり、ｑ７が１である。ＲＮＡｉ剤は、５’−Ｐも含む。
【０４２２】
一実施形態において、Ｂ１が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’−ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’−ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が４であり、ｑ４が０であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が７であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−ＯＭｅであり、ｑ７が１である。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＰＳも含む。
【０４２３】
一実施形態において、Ｂ１が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’−ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’−ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が４であり、ｑ４が０であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が７であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−ＯＭｅであり、ｑ７が１である。ＲＮＡｉ剤は、５’−ＶＰも含む。５’−ＶＰは、５’−Ｅ−ＶＰ、５’−Ｚ−ＶＰ、又はそれらの組み合わせであり得る。
【０４２４】
一実施形態において、Ｂ１が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’−ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’−ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が４であり、ｑ４が０であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が７であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−ＯＭｅであり、ｑ７が１である。ＲＮＡｉ剤は、５’−ＰＳ２も含む。
【０４２５】
一実施形態において、Ｂ１が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’−ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’−ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が４であり、ｑ４が０であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が７であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−ＯＭｅであり、ｑ７が１である。ＲＮＡｉ剤は、５’−デオキシ−５’−Ｃ−マロニルも含む。
【０４２６】
一実施形態において、Ｂ１が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’−ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’−ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が４であり、ｑ４が０であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が７であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−ＯＭｅであり、ｑ７が１であり；（５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（５’末端から数えて）１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及びアンチセンス鎖の１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−Ｐも含む。
【０４２７】
一実施形態において、Ｂ１が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’−ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’−ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が４であり、ｑ４が０であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が７であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−ＯＭｅであり、ｑ７が１であり；（５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（５’末端から数えて）１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及びアンチセンス鎖の１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−ＰＳも含む。
【０４２８】
一実施形態において、Ｂ１が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’−ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’−ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が４であり、ｑ４が０であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が７であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−ＯＭｅであり、ｑ７が１であり；（５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（５’末端から数えて）１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及びアンチセンス鎖の１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−ＶＰも含む。５’−ＶＰは、５’−Ｅ−ＶＰ、５’−Ｚ−ＶＰ、又はそれらの組み合わせであり得る。
【０４２９】
一実施形態において、Ｂ１が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’−ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’−ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が４であり、ｑ４が０であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が７であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−ＯＭｅであり、ｑ７が１であり；（５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（５’末端から数えて）１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及びアンチセンス鎖の１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−ＰＳ２も含む。
【０４３０】
一実施形態において、Ｂ１が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’−ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’−ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が４であり、ｑ４が０であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が７であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−ＯＭｅであり、ｑ７が１であり；（５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（５’末端から数えて）１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及びアンチセンス鎖の１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−デオキシ−５’−Ｃ−マロニルも含む。
【０４３１】
一実施形態において、Ｂ１が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’−ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’−Ｆであり、ｑ４が２であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−Ｆであり、ｑ７が１である。ＲＮＡｉ剤は、５’−Ｐも含む。
【０４３２】
一実施形態において、Ｂ１が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’−ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’−Ｆであり、ｑ４が２であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−Ｆであり、ｑ７が１である。ＲＮＡｉ剤は、５’−ＰＳも含む。
【０４３３】
一実施形態において、Ｂ１が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’−ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’−Ｆであり、ｑ４が２であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−Ｆであり、ｑ７が１である。ＲＮＡｉ剤は、５’−ＶＰも含む。５’−ＶＰは、５’−Ｅ−ＶＰ、５’−Ｚ−ＶＰ、又はそれらの組み合わせであり得る。
【０４３４】
一実施形態において、Ｂ１が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’−ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’−Ｆであり、ｑ４が２であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−Ｆであり、ｑ７が１である。ｄｓＲＮＡｉ  ＲＮＡ剤は、５’−ＰＳ２も含む。
【０４３５】
一実施形態において、Ｂ１が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’−ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’−Ｆであり、ｑ４が２であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−Ｆであり、ｑ７が１である。ＲＮＡｉ剤は、５’−デオキシ−５’−Ｃ−マロニルも含む。
【０４３６】
一実施形態において、Ｂ１が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’−ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’−ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’−Ｆであり、ｑ４が２であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−Ｆであり、ｑ７が１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及びアンチセンス鎖の１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−Ｐも含む。
【０４３７】
一実施形態において、Ｂ１が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’−ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’−ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’−Ｆであり、ｑ４が２であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−Ｆであり、ｑ７が１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及びアンチセンス鎖の１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−ＰＳも含む。
【０４３８】
一実施形態において、Ｂ１が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’−ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’−ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’−Ｆであり、ｑ４が２であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−Ｆであり、ｑ７が１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及びアンチセンス鎖の１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−ＶＰも含む。５’−ＶＰは、５’−Ｅ−ＶＰ、５’−Ｚ−ＶＰ、又はそれらの組み合わせであり得る。
【０４３９】
一実施形態において、Ｂ１が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’−ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’−ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’−Ｆであり、ｑ４が２であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−Ｆであり、ｑ７が１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及びアンチセンス鎖の１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−ＰＳ２も含む。
【０４４０】
一実施形態において、Ｂ１が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’−ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’−ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’−Ｆであり、ｑ４が２であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−Ｆであり、ｑ７が１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及びアンチセンス鎖の１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−デオキシ−５’−Ｃ−マロニルも含む。
【０４４１】
一実施形態において、Ｂ１が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’−ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’−ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が４であり、ｑ４が０であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が７であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−Ｆであり、ｑ７が１である。ＲＮＡｉ剤は、５’−Ｐも含む。
【０４４２】
一実施形態において、Ｂ１が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’−ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’−ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が４であり、ｑ４が０であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が７であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−Ｆであり、ｑ７が１である。ＲＮＡｉ剤は、５’−ＰＳも含む。
【０４４３】
一実施形態において、Ｂ１が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’−ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’−ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が４であり、ｑ４が０であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が７であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−Ｆであり、ｑ７が１である。ＲＮＡｉ剤は、５’−ＶＰも含む。５’−ＶＰは、５’−Ｅ−ＶＰ、５’−Ｚ−ＶＰ、又はそれらの組み合わせであり得る。
【０４４４】
一実施形態において、Ｂ１が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’−ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’−ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が４であり、ｑ４が０であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が７であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−Ｆであり、ｑ７が１である。ＲＮＡｉ剤は、５’−ＰＳ２も含む。
【０４４５】
一実施形態において、Ｂ１が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’−ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’−ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が４であり、ｑ４が０であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が７であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−Ｆであり、ｑ７が１である。ＲＮＡｉ剤は、５’−デオキシ−５’−Ｃ−マロニルも含む。
【０４４６】
一実施形態において、Ｂ１が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’−ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’−ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が４であり、ｑ４が０であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が７であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−Ｆであり、ｑ７が１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及びアンチセンス鎖の１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−Ｐも含む。
【０４４７】
一実施形態において、Ｂ１が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’−ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’−ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が４であり、ｑ４が０であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が７であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−Ｆであり、ｑ７が１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及びアンチセンス鎖の１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−ＰＳも含む。
【０４４８】
一実施形態において、Ｂ１が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’−ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’−ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が４であり、ｑ４が０であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が７であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−Ｆであり、ｑ７が１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及びアンチセンス鎖の１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−ＶＰも含む。５’−ＶＰは、５’−Ｅ−ＶＰ、５’−Ｚ−ＶＰ、又はそれらの組み合わせであり得る。
【０４４９】
一実施形態において、Ｂ１が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’−ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’−ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が４であり、ｑ４が０であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が７であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−Ｆであり、ｑ７が１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及びアンチセンス鎖の１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−ＰＳ２も含む。
【０４５０】
一実施形態において、Ｂ１が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’−ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’−ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が４であり、ｑ４が０であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が７であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−Ｆであり、ｑ７が１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及びアンチセンス鎖の１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−デオキシ−５’−Ｃ−マロニルも含む。
【０４５１】
一実施形態において、Ｂ１が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’−ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’−ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’−Ｆであり、ｑ４が２であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−ＯＭｅであり、ｑ７が１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及びアンチセンス鎖の１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−Ｐ及び標的化リガンドも含む。一実施形態において、５’−Ｐは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
【０４５２】
一実施形態において、Ｂ１が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’−ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’−ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’−Ｆであり、ｑ４が２であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−ＯＭｅであり、ｑ７が１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及びアンチセンス鎖の１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−ＰＳ及び標的化リガンドも含む。一実施形態において、５’−ＰＳは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
【０４５３】
一実施形態において、Ｂ１が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’−ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’−ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’−Ｆであり、ｑ４が２であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−ＯＭｅであり、ｑ７が１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及びアンチセンス鎖の１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−ＶＰ（例えば、５’−Ｅ−ＶＰ、５’−Ｚ−ＶＰ、又はそれらの組み合わせ）、及び標的化リガンドも含む。一実施形態において、５’−ＶＰは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
【０４５４】
一実施形態において、Ｂ１が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’−ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’−ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’−Ｆであり、ｑ４が２であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−ＯＭｅであり、ｑ７が１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及びアンチセンス鎖の１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−ＰＳ２及び標的化リガンドも含む。一実施形態において、５’−ＰＳ２は、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
【０４５５】
一実施形態において、Ｂ１が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’−ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’−ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’−Ｆであり、ｑ４が２であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−ＯＭｅであり、ｑ７が１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及びアンチセンス鎖の１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−デオキシ−５’−Ｃ−マロニル及び標的化リガンドも含む。一実施形態において、５’−デオキシ−５’−Ｃ−マロニルは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
【０４５６】
一実施形態において、Ｂ１が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’−ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’−ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が４であり、ｑ４が０であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が７であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−ＯＭｅであり、ｑ７が１であり；（５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（５’末端から数えて）１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及びアンチセンス鎖の１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−Ｐ及び標的化リガンドも含む。一実施形態において、５’−Ｐは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
【０４５７】
一実施形態において、Ｂ１が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’−ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’−ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が４であり、ｑ４が０であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が７であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−ＯＭｅであり、ｑ７が１であり；（５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（５’末端から数えて）１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及びアンチセンス鎖の１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−ＰＳ及び標的化リガンドも含む。一実施形態において、５’−ＰＳは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
【０４５８】
一実施形態において、Ｂ１が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’−ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’−ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が４であり、ｑ４が０であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が７であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−ＯＭｅであり、ｑ７が１であり；（５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（５’末端から数えて）１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及びアンチセンス鎖の１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−ＶＰ（例えば、５’−Ｅ−ＶＰ、５’−Ｚ−ＶＰ、又はそれらの組み合わせ）及び標的化リガンドも含む。一実施形態において、５’−ＶＰは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
【０４５９】
一実施形態において、Ｂ１が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’−ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’−ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が４であり、ｑ４が０であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が７であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−ＯＭｅであり、ｑ７が１であり；（５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（５’末端から数えて）１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及びアンチセンス鎖の１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−ＰＳ２及び標的化リガンドも含む。一実施形態において、５’−ＰＳ２は、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
【０４６０】
一実施形態において、Ｂ１が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’−ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’−ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が４であり、ｑ４が０であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が７であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−ＯＭｅであり、ｑ７が１であり；（５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（５’末端から数えて）１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及びアンチセンス鎖の１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−デオキシ−５’−Ｃ−マロニル及び標的化リガンドも含む。一実施形態において、５’−デオキシ−５’−Ｃ−マロニルは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
【０４６１】
一実施形態において、Ｂ１が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’−ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’−ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’−Ｆであり、ｑ４が２であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−Ｆであり、ｑ７が１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及びアンチセンス鎖の１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−Ｐ及び標的化リガンドも含む。一実施形態において、５’−Ｐは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
【０４６２】
一実施形態において、Ｂ１が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’−ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’−ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’−Ｆであり、ｑ４が２であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−Ｆであり、ｑ７が１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及びアンチセンス鎖の１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−ＰＳ及び標的化リガンドも含む。一実施形態において、５’−ＰＳは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
【０４６３】
一実施形態において、Ｂ１が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’−ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’−ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’−Ｆであり、ｑ４が２であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−Ｆであり、ｑ７が１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及びアンチセンス鎖の１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−ＶＰ（例えば、５’−Ｅ−ＶＰ、５’−Ｚ−ＶＰ、又はそれらの組み合わせ）及び標的化リガンドも含む。一実施形態において、５’−ＶＰは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
【０４６４】
一実施形態において、Ｂ１が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’−ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’−ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’−Ｆであり、ｑ４が２であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−Ｆであり、ｑ７が１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及びアンチセンス鎖の１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−ＰＳ２及び標的化リガンドも含む。一実施形態において、５’−ＰＳ２は、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
【０４６５】
一実施形態において、Ｂ１が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’−ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’−ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’−Ｆであり、ｑ４が２であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−Ｆであり、ｑ７が１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及びアンチセンス鎖の１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−デオキシ−５’−Ｃ−マロニル及び標的化リガンドも含む。一実施形態において、５’−デオキシ−５’−Ｃ−マロニルは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
【０４６６】
一実施形態において、Ｂ１が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’−ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’−ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が４であり、ｑ４が０であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が７であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−Ｆであり、ｑ７が１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及びアンチセンス鎖の１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−Ｐ及び標的化リガンドも含む。一実施形態において、５’−Ｐは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
【０４６７】
一実施形態において、Ｂ１が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’−ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’−ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が４であり、ｑ４が０であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が７であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−Ｆであり、ｑ７が１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及びアンチセンス鎖の１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−ＰＳ及び標的化リガンドも含む。一実施形態において、５’−ＰＳは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
【０４６８】
一実施形態において、Ｂ１が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’−ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’−ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が４であり、ｑ４が０であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が７であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−Ｆであり、ｑ７が１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及びアンチセンス鎖の１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−ＶＰ（例えば、５’−Ｅ−ＶＰ、５’−Ｚ−ＶＰ、又はそれらの組み合わせ）及び標的化リガンドも含む。一実施形態において、５’−ＶＰは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
【０４６９】
一実施形態において、Ｂ１が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’−ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’−ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が４であり、ｑ４が０であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が７であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−Ｆであり、ｑ７が１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及びアンチセンス鎖の１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−ＰＳ２及び標的化リガンドも含む。一実施形態において、５’−ＰＳ２は、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
【０４７０】
一実施形態において、Ｂ１が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’−ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’−ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’−Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ３が４であり、ｑ４が０であり、Ｂ３’が、２’−ＯＭｅ又は２’−Ｆであり、ｑ５が７であり、Ｔ３’が２’−Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’−Ｆであり、ｑ７が１であり；（センス鎖の５’末端から数えて）センス鎖の１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、並びに（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）１及び２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾及びアンチセンス鎖の１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ＲＮＡｉ剤は、５’−デオキシ−５’−Ｃ−マロニル及び標的化リガンドも含む。一実施形態において、５’−デオキシ−５’−Ｃ−マロニルは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的化リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
【０４７１】
特定の実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、
（ａ）以下を有するセンス鎖：
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）３’末端に結合されたＡＳＧＰＲリガンド（ここで、前記ＡＳＧＰＲリガンドは、三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む）；及び
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）１、３、５、７、９〜１１、１３、１７、１９、及び２１位に２’−Ｆ修飾、及び２、４、６、８、１２、１４〜１６、１８、及び２０位に２’−ＯＭｅ修飾；
並びに
（ｂ）以下を有するアンチセンス鎖：
（ｉ）２３ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）１、３、５、９、１１〜１３、１５、１７、１９、２１、及び２３位に２’−ＯＭｅ修飾、及び２、４、６〜８、１０、１４、１６、１８、２０、及び２２位に２’Ｆ修飾；及び
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）ヌクレオチド位置２１及び２２の間、及びヌクレオチド位置２２及び２３の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合
を含み；
ここで、ｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’末端に２つのヌクレオチドオーバーハング、及びアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
【０４７２】
別の特定の実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、
（ａ）以下を有するセンス鎖：
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）３’末端に結合されたＡＳＧＰＲリガンド（ここで、前記ＡＳＧＰＲリガンドは、三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む）；
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）１、３、５、７、９〜１１、１３、１５、１７、１９、及び２１位に２’−Ｆ修飾、及び２、４、６、８、１２、１４、１６、１８、及び２０位に２’−ＯＭｅ修飾；及び
（ｉｖ）（５’末端から数えて）ヌクレオチド１及び２位の間、及びヌクレオチド位置２及び３の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合；
並びに
（ｂ）以下を有するアンチセンス鎖：
（ｉ）２３ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）１、３、５、７、９、１１〜１３、１５、１７、１９、及び２１〜２３位に２’−ＯＭｅ修飾、及び２、４、６、８、１０、１４、１６、１８、及び２０位に２’Ｆ修飾；及び
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）ヌクレオチド１及び２位の間、ヌクレオチド位置２及び３の間、ヌクレオチド位置２１及び２２の間、及びヌクレオチド位置２２及び２３の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合
を含み；
ここで、ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖の３’末端に２つのヌクレオチドオーバーハング、及びアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
【０４７３】
別の特定の実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、
（ａ）以下を有するセンス鎖：
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）３’末端に結合されたＡＳＧＰＲリガンド（ここで、前記ＡＳＧＰＲリガンドは、三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む）；
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）１〜６、８、１０、及び１２〜２１位に２’−ＯＭｅ修飾、７、及び９位に２’−Ｆ修飾、及び１１位にデスオキシ−ヌクレオチド（例えばｄＴ）；及び
（ｉｖ）（５’末端から数えて）ヌクレオチド１及び２位の間、及びヌクレオチド位置２及び３の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合；
並びに
（ｂ）以下を有するアンチセンス鎖：
（ｉ）２３ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）１、３、７、９、１１、１３、１５、１７、及び１９〜２３位に２’−ＯＭｅ修飾、及び２、４〜６、８、１０、１２、１４、１６、及び１８位に２’−Ｆ修飾；及び
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）ヌクレオチド１及び２位の間、ヌクレオチド位置２及び３の間、ヌクレオチド位置２１及び２２の間、及びヌクレオチド位置２２及び２３の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合
を含み；
ここで、ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖の３’末端に２つのヌクレオチドオーバーハング、及びアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
【０４７４】
別の特定の実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、
（ａ）以下を有するセンス鎖：
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）３’末端に結合されたＡＳＧＰＲリガンド（ここで、前記ＡＳＧＰＲリガンドは、三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む）；
（ｉｉｉ）１〜６、８、１０、１２、１４、及び１６〜２１位に２’−ＯＭｅ修飾、及び７、９、１１、１３、及び１５位に２’−Ｆ修飾；及び
（ｉｖ）（５’末端から数えて）ヌクレオチド１及び２位の間、及びヌクレオチド位置２及び３の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合；
並びに
（ｂ）以下を有するアンチセンス鎖：
（ｉ）２３ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）１、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、及び２１〜２３位に２’−ＯＭｅ修飾、及び２〜４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、及び２０位に２’−Ｆ修飾；及び
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）ヌクレオチド１及び２位の間、ヌクレオチド位置２及び３の間、ヌクレオチド位置２１及び２２の間、及びヌクレオチド位置２２及び２３の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合
を含み；
ここで、ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖の３’末端に２つのヌクレオチドオーバーハング、及びアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
【０４７５】
別の特定の実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、
（ａ）以下を有するセンス鎖：
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）３’末端に結合されたＡＳＧＰＲリガンド（ここで、前記ＡＳＧＰＲリガンドは、三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む）；
（ｉｉｉ）１〜９、及び１２〜２１位に２’−ＯＭｅ修飾、及び１０、及び１１位に２’−Ｆ修飾；及び
（ｉｖ）（５’末端から数えて）ヌクレオチド１及び２位の間、及びヌクレオチド位置２及び３の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合；
並びに
（ｂ）以下を有するアンチセンス鎖：
（ｉ）２３ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）１、３、５、７、９、１１〜１３、１５、１７、１９、及び２１〜２３位に２’−ＯＭｅ修飾、及び２、４、６、８、１０、１４、１６、１８、及び２０位に２’−Ｆ修飾；及び
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）ヌクレオチド１及び２位の間、ヌクレオチド位置２及び３の間、ヌクレオチド位置２１及び２２の間、及びヌクレオチド位置２２及び２３の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合
を含み；
ここで、ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖の３’末端に２つのヌクレオチドオーバーハング、及びアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
【０４７６】
別の特定の実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、
（ａ）以下を有するセンス鎖：
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）３’末端に結合されたＡＳＧＰＲリガンド（ここで、前記ＡＳＧＰＲリガンドは、三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む）；
（ｉｉｉ）１、３、５、７、９〜１１、及び１３位に２’−Ｆ修飾、及び２、４、６、８、１２、及び１４〜２１位に２’−ＯＭｅ修飾；及び
（ｉｖ）（５’末端から数えて）ヌクレオチド１及び２位の間、及びヌクレオチド位置２及び３の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合；
並びに
（ｂ）以下を有するアンチセンス鎖：
（ｉ）２３ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）１、３、５〜７、９、１１〜１３、１５、１７〜１９、及び２１〜２３位に２’−ＯＭｅ修飾、及び２、４、８、１０、１４、１６、及び２０位に２’−Ｆ修飾；及び
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）ヌクレオチド１及び２位の間、ヌクレオチド位置２及び３の間、ヌクレオチド位置２１及び２２の間、及びヌクレオチド位置２２及び２３の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合
を含み；
ここで、ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖の３’末端に２つのヌクレオチドオーバーハング、及びアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
【０４７７】
別の特定の実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、
（ａ）以下を有するセンス鎖：
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）３’末端に結合されたＡＳＧＰＲリガンド（ここで、前記ＡＳＧＰＲリガンドは、三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む）；
（ｉｉｉ）１、２、４、６、８、１２、１４、１５、１７、及び１９〜２１位に２’−ＯＭｅ修飾、及び３、５、７、９〜１１、１３、１６、及び１８位に２’−Ｆ修飾；及び
（ｉｖ）（５’末端から数えて）ヌクレオチド１及び２位の間、及びヌクレオチド位置２及び３の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合；
並びに
（ｂ）以下を有するアンチセンス鎖：
（ｉ）２５ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）１、４、６、７、９、１１〜１３、１５、１７、及び１９〜２３位に２’−ＯＭｅ修飾、２、３、５、８、１０、１４、１６、及び１８位に２’−Ｆ修飾、及び２４及び２５位にデスオキシ−ヌクレオチド（例えばｄＴ）；及び
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）ヌクレオチド１及び２位の間、ヌクレオチド位置２及び３の間、ヌクレオチド位置２１及び２２の間、及びヌクレオチド位置２２及び２３の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合
を含み；
ここで、ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖の３’末端に４つのヌクレオチドオーバーハング、及びアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
【０４７８】
別の特定の実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、
（ａ）以下を有するセンス鎖：
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）３’末端に結合されたＡＳＧＰＲリガンド（ここで、前記ＡＳＧＰＲリガンドは、三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む）；
（ｉｉｉ）１〜６、８、及び１２〜２１位に２’−ＯＭｅ修飾、及び７、及び９〜１１位に２’−Ｆ修飾；及び
（ｉｖ）（５’末端から数えて）ヌクレオチド１及び２位の間、及びヌクレオチド位置２及び３の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合；
並びに
（ｂ）以下を有するアンチセンス鎖：
（ｉ）２３ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）１、３〜５、７、８、１０〜１３、１５、及び１７〜２３位に２’−ＯＭｅ修飾、及び２、６、９、１４、及び１６位に２’−Ｆ修飾；及び
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）ヌクレオチド１及び２位の間、ヌクレオチド位置２及び３の間、ヌクレオチド位置２１及び２２の間、及びヌクレオチド位置２２及び２３の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合
を含み；
ここで、ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖の３’末端に２つのヌクレオチドオーバーハング、及びアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
【０４７９】
別の特定の実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、
（ａ）以下を有するセンス鎖：
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）３’末端に結合されたＡＳＧＰＲリガンド（ここで、前記ＡＳＧＰＲリガンドは、三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む）；
（ｉｉｉ）１〜６、８、及び１２〜２１位に２’−ＯＭｅ修飾、及び７、及び９〜１１位に２’−Ｆ修飾；及び
（ｉｖ）（５’末端から数えて）ヌクレオチド１及び２位の間、及びヌクレオチド位置２及び３の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合；
並びに
（ｂ）以下を有するアンチセンス鎖：
（ｉ）２３ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）１、３〜５、７、１０〜１３、１５、及び１７〜２３位に２’−ＯＭｅ修飾、及び２、６、８、９、１４、及び１６位に２’−Ｆ修飾；及び
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）ヌクレオチド１及び２位の間、ヌクレオチド位置２及び３の間、ヌクレオチド位置２１及び２２の間、及びヌクレオチド位置２２及び２３の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合
を含み；
ここで、ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖の３’末端に２つのヌクレオチドオーバーハング、及びアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
【０４８０】
別の特定の実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、
（ａ）以下を有するセンス鎖：
（ｉ）１９ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）３’末端に結合されたＡＳＧＰＲリガンド（ここで、前記ＡＳＧＰＲリガンドは、三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む）；
（ｉｉｉ）１〜４、６、及び１０〜１９位に２’−ＯＭｅ修飾、及び５、及び７〜９位に２’−Ｆ修飾；及び
（ｉｖ）（５’末端から数えて）ヌクレオチド１及び２位の間、及びヌクレオチド位置２及び３の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合；
並びに
（ｂ）以下を有するアンチセンス鎖：
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）１、３〜５、７、１０〜１３、１５、及び１７〜２１位に２’−ＯＭｅ修飾、及び２、６、８、９、１４、及び１６位に２’−Ｆ修飾；及び
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）ヌクレオチド１及び２位の間、ヌクレオチド位置２及び３の間、ヌクレオチド位置１９及び２０の間、及びヌクレオチド位置２０及び２１の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合
を含み；
ここで、ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖の３’末端に２つのヌクレオチドオーバーハング、及びアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
【０４８１】
ＩＶ．リガンドにコンジュゲートされたｉＲＮＡ
本発明のｉＲＮＡのＲＮＡの別の修飾は、ｉＲＮＡの活性、細胞分布又は細胞取り込みを向上させる１つ又は複数のリガンド、部分又はコンジュゲートをＲＮＡに化学的に結合することを含む。このような部分としては、限定はされないが、コレステロール部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｉｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：６５５３−６５５６）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，４：１０５３−１０６０）、チオエーテル、例えば、ベリル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，６６０：３０６−３０９；Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，３：２７６５−２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２０：５３３−５３８）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール又はウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）ＥＭＢＯ  Ｊ，１０：１１１１−１１１８；Ｋａｂａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２５９：３２７−３３０；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，７５：４９−５４）、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロール又はトリエチル−アンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，３６：３６５１−３６５４；Ｓｈｅａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８：３７７７−３７８３）、ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１４：９６９−９７３）、又はアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，３６：３６５１−３６５４）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１２６４：２２９−２３７）、又はオクタデシルアミン又はヘキシルアミノ−カルボニルオキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２７７：９２３−９３７）などの脂質部分が挙げられる。
【０４８２】
ＬＤＨＡを標的とする第１のｄｓＲＮＡ剤及びＨＡＯ１を標的とする第２のｄｓＲＮＡ剤が共有結合される実施形態において（即ち、本明細書に記載される二重標的化ＲＮＡｉ剤）、ｄｓＲＮＡ剤の一方又は両方は、独立して、１つ又は複数のリガンドを含み得る。
【０４８３】
一実施形態において、リガンドは、それが組み込まれるｉＲＮＡ剤の分布、標的化又は寿命を変化させる。好ましい実施形態において、リガンドは、例えば、このようなリガンドのない種と比較して、選択された標的（例えば、分子、細胞又は細胞型）、区画（例えば、細胞又は器官の区画）、身体の組織、器官又は領域に対する向上した親和性を提供する。好ましいリガンドは、二本鎖核酸における二本鎖の対合に関与しない。
【０４８４】
リガンドは、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低比重リポタンパク（ＬＤＬ）、又はグロブリン）；炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン又はヒアルロン酸）；又は脂質などの天然の物質を含み得る。リガンドはまた、合成ポリマー、例えば、合成ポリアミノ酸などの組み換え又は合成分子であり得る。ポリアミノ酸の例としては、ポリアミノ酸は、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリＬ−アスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−マレイン酸無水物コポリマー、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）コポリマー、ジビニルエーテル−無水マレイン酸コポリマー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−エチルアクリル酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマー、又はポリホスファジンである。ポリアミンの例としては、ポリエチレンイミン、ポリリジン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、擬似ペプチド−ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの第四級塩、又はα−へリックスペプチドが挙げられる。
【０４８５】
リガンドはまた、標的基、例えば、細胞又は組織標的剤、例えば、レクチン、糖タンパク質、脂質又はタンパク質、例えば、腎細胞などの特定の細胞型に結合する抗体を含み得る。標的基は、サイロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、界面活性剤タンパク質Ａ、ムチン炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタメート、ポリアスパルテート、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、フォレート、ビタミンＢ１２、ビタミンＡ、ビオチン、又はＲＧＤペプチド、又はＲＧＤペプチド模倣体又はアプタマーであり得る。
【０４８６】
リガンドの他の例としては、色素、挿入剤（例えばアクリジン）、架橋剤（例えばソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ又はキレート剤（例えばＥＤＴＡ）、親油性分子、例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸（ｃｈｏｌｅｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ジメトキシトリチル、又はフェノキサジン）及びペプチド複合体（例えば、アンテナペディア（ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）ペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、ホスフェート、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカー、酵素、ハプテン（例えばビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター（ｃｌｕｓｔｅｒ）、アクリジン−イミダゾール複合体、Ｅｕ３＋テトラアザ大員環複合体）、ジニトロフェニル、ＨＲＰ、又はＡＰが挙げられる。
【０４８７】
リガンドは、タンパク質、例えば、糖タンパク質、又はペプチド、例えば、コリガンド（ｃｏ−ｌｉｇａｎｄ）、又は抗体、例えば、肝細胞などの特定の細胞型に結合する抗体に対する特異親和性を有する分子であり得る。リガンドはまた、ホルモン及びホルモン受容体を含んでもよい。リガンドはまた、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、又は多価マンノース、多価フコース又はアプタマーなどの非ペプチド種を含み得る。リガンドは、例えば、リポ多糖、ｐ３８ＭＡＰキナーゼの活性化因子、又はＮＦ−κＢの活性化因子であり得る。
【０４８８】
リガンドは、例えば、細胞の微小管、マイクロフィラメント、及び／又は中間径フィラメントを破壊することによって、例えば、細胞骨格を破壊することによって、細胞中へのｉＲＮＡ剤の取り込みを向上させ得る物質、例えば、薬剤であり得る。薬剤は、例えば、タクソン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャスプラキノリド、ラトランクリンＡ、ファロイジン、スウィンホリドＡ、インダノシン、又はミオセルビンであり得る。
【０４８９】
ある実施形態において、本明細書に記載されるｉＲＮＡに結合されたリガンドは、薬物動態学的調節剤（ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）（ＰＫ調節剤）としての役割を果たす。ＰＫ調節剤としては、親油性物質（ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ）、胆汁酸、ステロイド、リン脂質類似体、ペプチド、タンパク質結合剤、ＰＥＧ、ビタミンなどが挙げられる。例示的なＰＫ調節剤としては、限定はされないが、コレステロール、脂肪酸、コール酸、リトコール酸、ジアルキルグリセリド、ジアシルグリセリド、リン脂質、スフィンゴ脂質、ナプロキセン、イブプロフェン、ビタミンＥ、ビオチンなどが挙げられる。いくつかのホスホロチオエート結合を含むオリゴヌクレオチドはまた、血清タンパク質に結合することが知られており、したがって、短いオリゴヌクレオチド、例えば、骨格中に複数のホスホロチオエート結合を含む、約５塩基、１０塩基、１５塩基又は２０塩基のオリゴヌクレオチドも、リガンド（例えばＰＫ調節リガンド）として本発明に適している。更に、血清成分（例えば血清タンパク質）に結合するアプタマーも、本明細書に記載される実施形態においてＰＫ調節リガンドとして使用するのに好適である。
【０４９０】
本発明のリガンドコンジュゲートオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドへの結合分子の結合から誘導されるものなどの反応性のペンダント官能基を有するオリゴヌクレオチドの使用によって合成され得る（後述される）。この反応性オリゴヌクレオチドは、市販のリガンド、様々な保護基のいずれかを有する、合成されたリガンド、又は結合部分が結合されたリガンドと直接反応されてもよい。
【０４９１】
本発明のコンジュゲートに使用されるオリゴヌクレオチドは、固相合成の周知の技術によって好都合に及び日常的に作製され得る。このような合成のための装置は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）を含むいくつかの業者によって販売されている。当該技術分野において公知のこのような合成のための任意の他の手段が、それに加えて又はその代わりに用いられてもよい。ホスホロチオエート及びアルキル化誘導体などの他のオリゴヌクレオチドを調製するための同様の技術を使用することも公知である。
【０４９２】
本発明の配列特異的結合ヌクレオシドを有するリガンドコンジュゲートオリゴヌクレオチド及びリガンド分子において、オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオシドは、標準的なヌクレオチド又はヌクレオシド前駆体、或いは結合部分を既に有するヌクレオチド又はヌクレオシドコンジュゲート前駆体、リガンド分子を既に有するリガンド−ヌクレオチド又はヌクレオシドコンジュゲート前駆体、或いは非ヌクレオシドリガンド含有ビルディングブロックを用いて、好適なＤＮＡ合成装置において組み立てられ得る。
【０４９３】
結合部分を既に有するヌクレオチドコンジュゲート前駆体を用いる場合、配列特異的結合ヌクレオシドの合成が、典型的に、完了されてから、リガンド分子が、結合部分と反応されて、リガンドコンジュゲートオリゴヌクレオチドが形成される。ある実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチド又は結合ヌクレオシドは、オリゴヌクレオチド合成に通例使用される市販の、標準的なホスホロアミダイト及び非標準的なホスホロアミダイトに加えて、リガンド−ヌクレオシドコンジュゲートから誘導されるホスホロアミダイトを用いて、自動合成装置によって合成される。
【０４９４】
Ａ．脂質コンジュゲート
一態様において、リガンド又はコンジュゲートは、脂質又は脂質ベースの分子である。このような脂質又は脂質ベースの分子は、好ましくは、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合する。ＨＳＡ結合リガンドは、身体の標的組織、例えば、非腎臓標的組織へのコンジュゲートの分配を可能にする。例えば、標的組織は、肝臓の実質細胞を含む肝臓であり得る。ＨＳＡに結合し得る他の分子も、リガンドとして使用され得る。例えば、ネプロキシン又はアスピリンが使用され得る。脂質又は脂質ベースのリガンドは、（ａ）コンジュゲートの分解に対する耐性を増大し、（ｂ）標的細胞又は細胞膜への標的化又は輸送を増大し、及び／又は（ｃ）血清タンパク質、例えば、ＨＳＡへの結合を調整するのに使用され得る。
【０４９５】
脂質ベースのリガンドを用いて、標的組織へのコンジュゲートの結合を阻害すること、例えば、制御することができる。例えば、より強くＨＳＡに結合する脂質又は脂質ベースのリガンドは、腎臓に対して標的化される可能性が低く、したがって、身体から除去される可能性が低い。より弱くＨＳＡに結合する脂質又は脂質ベースのリガンドを用いて、コンジュゲートを腎臓に対して標的化することができる。
【０４９６】
好ましい実施形態において、脂質ベースのリガンドは、ＨＳＡに結合する。好ましくは、脂質ベースのリガンドは、コンジュゲートが好ましくは非腎臓組織に分配されるような十分な親和性でＨＳＡに結合する。しかしながら、親和性は、ＨＳＡ−リガンド結合が反転され得ないほど強力でないのが好ましい。
【０４９７】
別の好ましい実施形態において、コンジュゲートが好ましくは腎臓に分配されるように、脂質ベースのリガンドは、ＨＳＡに弱く結合するか又は全く結合しない。腎細胞を標的とする他の部分も、脂質ベースのリガンドの代わりに又はそれに加えて使用され得る。
【０４９８】
別の態様において、リガンドは、標的細胞、例えば、増殖細胞によって取り込まれる部分、例えば、ビタミンである。これらは、例えば、悪性又は非悪性の望ましくない細胞増殖、例えば、癌細胞を特徴とする障害を処置するのに特に有用である。例示的なビタミンは、ビタミンＡ、Ｅ、及びＫを含む。他の例示的なビタミンは、ビタミンＢ、例えば、葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサール又は他のビタミン或いは肝細胞などの標的細胞によって取り込まれる栄養素を含む。ＨＡＳ及び低比重リポタンパク（ＬＤＬ）も含まれる。
【０４９９】
Ｂ．細胞透過剤
別の態様において、リガンドは、細胞透過剤（ｃｅｌｌ−ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ  ａｇｅｎｔ）、好ましくは、らせん状細胞透過剤である。好ましくは、この剤は両親媒性である。例示的な剤は、ｔａｔ又はアンテノペディア（ａｎｔｅｎｎｏｐｅｄｉａ）などのペプチドである。この剤がペプチドである場合、それは、ペプチジル模倣体、逆転異性体、非ペプチド又は擬ペプチド結合、及びＤ−アミノ酸の使用を含めて修飾され得る。らせん状剤は、好ましくはα−へリックス剤であり、これは、好ましくは、親油性及び疎油性相を有する。
【０５００】
リガンドは、ペプチド又はペプチド模倣体であり得る。ペプチド模倣体（本明細書においてオリゴペプチド模倣体とも呼ばれる）は、天然ペプチドと類似した明確な三次元構造に折り畳まれることが可能な分子である。ペプチド及びペプチド模倣体のｉＲＮＡ剤への結合は、例えば細胞認識及び吸収を強化することにより、ｉＲＮＡの薬物動態分布に影響を及ぼし得る。ペプチド又はペプチド模倣体部分は、約５〜５０個のアミノ酸の長さ、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０個のアミノ酸の長さであり得る。
【０５０１】
ペプチド又はペプチド模倣体は、例えば、細胞透過性ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、又は疎水性ペプチド（例えば、主にＴｙｒ、Ｔｒｐ又はＰｈｅからなる）であり得る。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、構造規制（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ）ペプチド又は架橋ペプチドであり得る。別の代替例において、ペプチド部分は、疎水性膜輸送配列（ＭＴＳ）を含み得る。例示的な疎水性ＭＴＳ含有ペプチドは、アミノ酸配列ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ（配列番号２９８６）を有するＲＦＧＦである。疎水性ＭＴＳを含有するＲＦＧＦ類似体（例えば、アミノ酸配列ＡＡＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号２９８７）も、標的部分であり得る。ペプチド部分は、細胞膜を介してペプチド、オリゴヌクレオチド、及びタンパク質を含む大型極性分子を運搬することができる「送達」ペプチドであり得る。例えば、ＨＩＶ  Ｔａｔタンパク質に由来する配列（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号２９８８）及びショウジョウバエアンテナペディア（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）タンパク質（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号２９８９）は、送達ペプチドとして機能することが可能であることが分かっている。ペプチド又はペプチド模倣体は、ファージディスプレイライブラリー、又は１ビーズ１化合物（ｏｎｅ−ｂｅａｄ−ｏｎｅ−ｃｏｍｐｏｕｎｄ）（ＯＢＯＣ）コンビナトリアルライブラリーから特定されたペプチドなどのＤＮＡのランダム配列によってコードされ得る（Ｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５４：８２−８４、１９９１）。細胞標的の目的のために組み込まれたモノマー単位を介してｄｓＲＮＡ剤に結合されたペプチド又はペプチド模倣体の例は、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）−ペプチド、又はＲＧＤ模倣体などのペプチドである。ペプチド部分は、約５つのアミノ酸から約４０個のアミノ酸の長さの範囲であり得る。ペプチド部分は、安定性又は直接配座特性を高めるためなどの構造修飾を有し得る。後述される構造修飾のいずれも用いられ得る。
【０５０２】
本発明の組成物及び方法において使用するためのＲＧＤペプチド部分は、直鎖状又は環状であり得、特定の組織に対する標的化を促進するために、修飾、例えば、グリコシル化又はメチル化されてもよい。ＲＧＤ含有ペプチド及びペプチド模倣体は、Ｄ−アミノ酸、並びに合成ＲＧＤ模倣体を使用し得る。ＲＧＤに加えて、インテグリンリガンドを標的とする他の部分を使用することができる。このリガンドの好ましいコンジュゲートは、ＰＥＣＡＭ−１又はＶＥＧＦを標的とする。
【０５０３】
「細胞透過性ペプチド」は、細胞、例えば、細菌又は真菌細胞などの微生物細胞、或いはヒト細胞などの哺乳動物細胞を透過することが可能である。微生物細胞を透過するペプチドは、例えば、α−へリックス直鎖状ペプチド（例えば、ＬＬ−３７又はＣｅｒｏｐｉｎ  Ｐ１）、ジスルフィド結合含有ペプチド（例えば、α−デフェンシン、β−デフェンシン又はバクテネシン（ｂａｃｔｅｎｅｃｉｎ））、又は１つ若しくは２つの支配的アミノ酸のみを含有するペプチド（例えば、ＰＲ−３９又はインドリシジン）であり得る。細胞透過性ペプチドはまた、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含み得る。例えば、細胞透過性ペプチドは、ＨＩＶ−１  ｇｐ４１の融合ペプチドドメイン及びＳＶ４０大型Ｔ抗原のＮＬＳに由来する、ＭＰＧなどの二分両親媒性ペプチドであり得る（Ｓｉｍｅｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：２７１７−２７２４，２００３）。
【０５０４】
Ｃ．炭水化物コンジュゲート
本発明の組成物及び方法のある実施形態において、ｉＲＮＡオリゴヌクレオチドは、炭水化物を更に含む。炭水化物コンジュゲートｉＲＮＡは、本明細書に記載されるように、インビボでの核酸の送達に有利であり、また組成物は、インビボでの治療的使用に好適である。本明細書において使用される際、「炭水化物」は、少なくとも６個の炭素原子（直鎖状、分枝鎖状又は環状であってもよい）を有し、各炭素原子に酸素、窒素又は硫黄原子が結合している１つ又は複数の単糖単位から構成されている炭水化物それ自体である化合物；又はその一部として、１つ又は複数の単糖単位から構成されている炭水化物部分を有し、単糖単位の各々が、少なくとも６個の炭素原子（直鎖状、分枝鎖状又は環状であってもよい）を有し、各炭素原子に酸素、窒素又は硫黄原子が結合している化合物のいずれかを指す。代表的な炭水化物としては、糖（単糖、二糖、三糖及び約４、５、６、７、８、又は９つの単糖単位を含むオリゴ糖）、並びにデンプン、グリコーゲン、セルロース及び多糖ゴムなどの多糖が挙げられる。特定の単糖としては、Ｃ５以上（例えば、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、又はＣ８）の糖が挙げられ；二糖及び三糖としては、２つ又は３つの単糖単位（例えば、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、又はＣ８）を有する糖が挙げられる。
【０５０５】
ＬＤＨＡを標的とする第１のｄｓＲＮＡ剤及びＨＡＯ１を標的とする第２のｄｓＲＮＡ剤が共有結合される実施形態において（即ち、二重標的化ＲＮＡｉ剤）、ｄｓＲＮＡ剤の一方又は両方は、独立して、１つ又は複数の炭水化物リガンドを含み得る。
【０５０６】
一実施形態において、本発明の組成物及び方法に使用するための炭水化物コンジュゲートは、
【化１３】
2020532289.tif 000015
【化１４】
2020532289.tif 000016
【化１５】
2020532289.tif 000017
【化１６】
2020532289.tif 000018
【化１７】
2020532289.tif 000019
（式中、Ｙが、Ｏ又はＳであり、ｎが、３〜６である）（式ＸＸＩＶ）；
【化１８】
2020532289.tif 000020
（式中、Ｙが、Ｏ又はＳであり、ｎが、３〜６である）（式ＸＸＶ）；
【化１９】
2020532289.tif 000021
（式中、Ｘが、Ｏ又はＳである）（式ＸＸＶＩＩ）；
【化２０】
2020532289.tif 000022
【化２１】
2020532289.tif 000023
【化２２】
2020532289.tif 000024
からなる群から選択される。
【０５０７】
別の実施形態において、本発明の組成物及び方法に使用するための炭水化物コンジュゲートは、単糖である。一実施形態において、単糖は、
【化２３】
2020532289.tif 000025
などのＮ−アセチルガラクトサミンである。
【０５０８】
本明細書に記載される実施形態に使用するための別の代表的な炭水化物コンジュゲートとしては、限定はされないが、
【化２４】
2020532289.tif 000026
が挙げられ、Ｘ又はＹの一方が、オリゴヌクレオチドである場合、他方は水素である。
【０５０９】
ＬＤＨＡを標的とする第１のｄｓＲＮＡ剤及びＨＡＯ１を標的とする第２のｄｓＲＮＡ剤が共有結合される実施形態において（即ち、二重標的化ＲＮＡｉ剤）、ｄｓＲＮＡ剤の一方又は両方は、独立して、ＧａｌＮＡｃ又はＧａｌＮＡｃ誘導体リガンドを含み得る。
【０５１０】
本発明の特定の実施形態において、ＧａｌＮＡｃ又はＧａｌＮＡｃ誘導体は、一価リンカーを介して本発明のｉＲＮＡ剤に結合される。ある実施形態において、ＧａｌＮＡｃ又はＧａｌＮＡｃ誘導体は、二価リンカーを介して本発明のｉＲＮＡ剤に結合される。本発明の更に他の実施形態において、ＧａｌＮＡｃ又はＧａｌＮＡｃ誘導体は、三価リンカーを介して本発明のｉＲＮＡ剤に結合される。
【０５１１】
一実施形態において、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、ｉＲＮＡ剤、例えば、ｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖の５’末端、又は本明細書に記載される二重標的化ＲＮＡｉ剤の一方又は両方のセンス鎖の５’末端に結合された１つのＧａｌＮＡｃ又はＧａｌＮＡｃ誘導体を含む。別の実施形態において、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤、又は本明細書に記載される二重標的化ＲＮＡｉ剤の一方又は両方のｄｓＲＮＡ剤は、複数（例えば、２、３、４、５、又は６つ）のＧａｌＮＡｃ又はＧａｌＮＡｃ誘導体を含み、これはそれぞれ独立して、複数の一価リンカーを介して二本鎖ＲＮＡｉ剤の複数のヌクレオチドに結合される。
【０５１２】
ある実施形態において、例えば、本発明のｉＲＮＡ剤の２本の鎖が、複数の不対ヌクレオチドを含むヘアピンループを形成する１本の鎖の３’末端とその他方の鎖の５’末端との間のヌクレオチドの連続した鎖によって結合される１つのより大きい分子の一部である場合、ヘアピンループ中の各不対ヌクレオチドは、独立して、一価リンカーを介して結合されたＧａｌＮＡｃ又はＧａｌＮＡｃ誘導体を含み得る。
【０５１３】
ある実施形態において、炭水化物コンジュゲート（及びリンカー）は、限定はされないが、ＰＫ調節剤及び／又は細胞透過性ペプチドなどの上述したような１つ又は複数の更なるリガンドを更に含む。
【０５１４】
本発明での使用に好適な更なる炭水化物コンジュゲートは、それぞれの全内容が参照により本明細書に援用される、ＰＣＴ公報の国際公開第２０１４／１７９６２０号パンフレット及び国際公開第２０１４／１７９６２７号パンフレットに記載されるものを含む。
【０５１５】
Ｄ．リンカー
ある実施形態において、本明細書に記載されるコンジュゲート又はリガンドは、切断可能又は切断不可能であり得る様々なリンカーを用いて、ｉＲＮＡオリゴヌクレオチドに結合され得る。
【０５１６】
「リンカー」又は「結合基」という用語は、化合物の２つの部分を接続し、例えば、化合物の２つの部分を共有結合する有機部分を意味する。リンカーは、典型的に、直接結合又は酸素若しくは硫黄などの原子、ＮＲ８、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＳＯ、ＳＯ２、ＳＯ２ＮＨなどの単位、又は限定はされないが、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル、置換若しくは非置換のアルキニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘテロシクリルアルキニル、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、アルケニルヘテロシクリルアルキニル、アルキニルヘテロシクリルアルキル、アルキニルヘテロシクリルアルケニル、アルキニルヘテロシクリルアルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、アルキニルヘテロアリール（１つ又は複数のメチレンがＯ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（Ｒ８）、Ｃ（Ｏ）、置換若しくは非置換のアリール、置換若しくは非置換のヘテロアリール、置換若しくは非置換の複素環式により中断又は終端され得る）などの原子の鎖を含み；ここでＲ８は、水素、アシル、脂肪族又は置換された脂肪族である。一実施形態において、リンカーは、約１〜２４個の原子、２〜２４、３〜２４、４〜２４、５〜２４、６〜２４、６〜１８、７〜１８、８〜１８個の原子、７−１７、８〜１７、６〜１６、７〜１７、又は８〜１６個の原子である。
【０５１７】
切断可能な結合基は、細胞の外部では十分安定であるが、標的細胞内に入った後、切断されて、リンカーが一緒に保持する２つの部分を解放するものである。好ましい実施形態において、切断可能な結合基は、標的細胞内又は第一の参照条件（例えば、細胞内条件を模倣し又は表すよう選択され得る）下で、対象の血液中、又は第二の参照条件（例えば、血液又は血清に見出される条件を模倣し又は表すよう選択され得る）下の少なくとも約１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍又はそれ以上、又は少なくとも約１００倍速く切断される。
【０５１８】
切断可能な結合基は、切断剤、例えば、ｐＨ、酸化還元電位又は分解性分子の存在に敏感である。一般に、切断剤は、血清又は血液中と比較して細胞内部に広く存在し、又はより高いレベル若しくは活性で見出される。このような分解剤の例としては、例えば、細胞内に存在する酸化若しくは還元酵素又は還元により酸化還元切断可能な結合基を分解できるメルカプタンなどの還元剤を含む、特定の基質用に選択され又は基質特異性を有さない酸化還元剤、；エステラーゼ；エンドソーム又は酸性環境を形成可能な薬剤、例えば、５以下のｐＨをもたらす薬剤；一般的な酸として作用することにより、酸切断可能な結合基を加水分解又は分解できる酵素、ペプチダーゼ（基質特異的であり得る）、及びホスファターゼが挙げられる。
【０５１９】
ジスルフィド結合などの切断可能な結合基は、ｐＨに敏感であり得る。ヒト血清のｐＨは７．４である一方、平均細胞内ｐＨは、僅かに低く、約７．１〜７．３の範囲である。エンドソームは、５．５〜６．０の範囲内のより酸性のｐＨを有し、リソソームは、ほぼ５．０の、更により酸性のｐＨを有する。いくつかのリンカーは、好ましいｐＨで切断される切断可能な結合基を有することによって、細胞内部でリガンドからカチオン性脂質を放出し、又は細胞の所望の区画内へ放出するであろう。
【０５２０】
リンカーは、特定の酵素により切断可能な、切断可能な結合基を含み得る。リンカーに組み込まれる切断可能な結合基のタイプは、標的とされる細胞に依存し得る。例えば、肝臓を標的とするリガンドは、エステル基を含むリンカーを介して、カチオン性脂質に結合され得る。肝細胞はエステラーゼに富んでいるため、このリンカーは、エステラーゼに富んでいない細胞型内と比較して、肝細胞内でより効率的に切断されるであろう。エステラーゼに富んだ他の細胞型としては、肺、腎皮質、及び精巣の細胞が挙げられる。
【０５２１】
ペプチド結合を含むリンカーは、肝細胞及び滑膜細胞などのペプチダーゼに富んだ細胞型を標的とする際に使用することができる。
【０５２２】
一般に、切断可能な候補結合基の適切性は、分解剤（又は分解条件）の候補結合基を切断する能力を試験することにより評価することができる。血液中、又は他の非標的組織との接触の際に、切断可能な候補結合基が切断に抵抗する能力を試験することも望ましいであろう。したがって、第一の条件と第二の条件との間の、切断に対する相対的な感受性を決定することができ、第一の条件は標的細胞内での切断を示すよう選択され、第二の条件は他の組織内又は生体液、例えば血液又は血清中での切断を示すよう選択される。この評価は、無細胞系内、細胞内、細胞培養物中、器官内若しくは組織培養物中、又は全動物内で行うことができる。無細胞又は培養物条件内で最初の評価を行い、全動物内での更なる評価によって確認することが有用であり得る。好ましい実施形態において、有用な候補化合物は、血液又は血清（又は細胞外条件を模倣するよう選択された、インビトロでの条件下）と比較して、細胞内（又は細胞内条件を模倣するよう選択された、インビトロでの条件下）で少なくとも約２、４、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は約１００倍速く切断される。
【０５２３】
ｉ．酸化還元切断可能な結合基
一実施形態において、切断可能な結合基は、還元又は酸化後に切断される酸化還元切断可能な結合基である。還元的に切断可能な結合基の例は、ジスルフィド結合基（−Ｓ−Ｓ−）である。切断可能な候補結合基が好適な「還元的に切断可能な結合基」であるか、又は例えば特定のｉＲＮＡ部分及び特定の標的化剤との使用に好適であるかを決定するために、本明細書に記載される方法に注目し得る。例えば、候補は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、又は当該技術分野において公知の試薬を用いた他の還元剤とのインキュベーションによって評価することができ、これは、細胞、例えば標的細胞内で観察され得る切断の速度を模倣する。候補は血液又は血清条件を模倣するよう選択された条件下でも評価され得る。その１つにおいて、候補化合物は、血液中で約１０％以下切断される。他の実施形態において、有用な候補化合物は、血液中（又は、細胞外条件を模倣するように選択されたインビトロでの条件下）と比較して、細胞内（又は、細胞内条件を模倣するように選択されたインビトロでの条件下）で少なくとも約２、４、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は約１００倍速く分解される。候補化合物の切断速度は、細胞内媒体を模倣するように選択された条件下での標準的な酵素動力学アッセイを用いて決定され、細胞外媒体を模倣するように選択された条件と比較され得る。
【０５２４】
ｉｉ．リン酸塩ベースの切断可能な結合基
別の実施形態において、切断可能なリンカーは、リン酸塩ベースの切断可能な結合基を含む。リン酸塩ベースの切断可能な結合基は、リン酸基を分解又は加水分解する薬剤によって切断される。細胞内でリン酸基を切断する薬剤の一例は、細胞内のホスファターゼなどの酵素である。リン酸塩ベースの結合基の例は、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＳＲｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）−Ｓ−である。好ましい実施形態は、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＳＨ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｈ）−Ｏ、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｈ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｈ）−Ｓ−である。好ましい実施形態は、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−である。これらの候補は、上述した方法と類似した方法を用いて評価することができる。
【０５２５】
ｉｉｉ．酸切断可能な結合基
別の実施形態において、切断可能なリンカーは、酸切断可能な結合基を含む。酸切断可能な結合基は、酸性条件下で切断される結合基である。好ましい実施形態において、酸切断可能な結合基は、約６．５以下（例えば、約６．０、５．７５、５．５、５．２５、５．０、又はそれ以下）のｐＨを有する酸性環境内で、又は一般的な酸として作用し得る酵素などの薬剤により、切断される。細胞内では、エンドソーム及びリソソームなどの特定の低ｐＨ小器官は、酸切断可能な結合基のための切断環境を提供し得る。酸切断可能な結合基の例には、限定はされないが、ヒドラゾン、エステル、及びアミノ酸のエステルが挙げられる。酸切断可能な基は、一般式−Ｃ＝ＮＮ−、Ｃ（Ｏ）Ｏ、又は−ＯＣ（Ｏ）で表され得る。好ましい実施形態は、エステルの酸素に結合した炭素（アルコキシ基）が、アリール基、置換アルキル基、又はジメチルペンチル若しくはｔ−ブチルなどの第三級アルキル基である場合である。これらの候補は、上述した方法と類似した方法を用いて評価することができる。
【０５２６】
ｉｖ．エステルベースの結合基
別の実施形態において、切断可能なリンカーは、エステルベースの切断可能な結合基を含む。エステルベースの切断可能な結合基は、細胞内のエステラーゼ及びアミラーゼなどの酵素により切断される。エステルベースの切断可能な結合基の例としては、限定はされないが、アルキレン、アルケニレン及びアルキニレン基のエステルが挙げられる。エステル切断可能な結合基は、一般式−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、又は−ＯＣ（Ｏ）−で表される。これらの候補は、上述した方法と類似した方法を用いて評価することができる。
【０５２７】
ｖ．ペプチドベースの切断基
更に別の実施形態において、切断可能なリンカーは、ペプチドベースの切断可能な結合基を含む。ペプチドベースの切断可能な結合基は、細胞内のペプチダーゼ及びプロテアーゼなどの酵素により切断される。ペプチドベースの切断可能な基は、アミノ酸間で形成されてオリゴペプチド（例えば、ジペプチド、トリペプチドなど）及びポリペプチドを与えるペプチド結合である。ペプチドベースの切断可能な基は、アミド基（−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−）を含まない。アミド基は、任意のアルキレン、アルケニレン又はアルキニレンの間で形成され得る。ペプチド結合は、アミノ酸間で形成されてペプチド及びタンパク質を与えるアミド結合の特別なタイプである。ペプチドベースの切断基は、一般に、アミノ酸間で形成されてペプチド及びタンパク質を与えるペプチド結合（即ち、アミド結合）に限定され、アミド官能基全部は含まない。ペプチドベースの切断可能な結合基は、一般式−ＮＨＣＨＲＡＣ（Ｏ）ＮＨＣＨＲＢＣ（Ｏ）−で表され、式中、ＲＡ及びＲＢは、隣接する２つのアミノ酸のＲ基である。これらの候補は、上述した方法と類似した方法を用いて評価することができる。
【０５２８】
一実施形態において、本発明のｉＲＮＡは、リンカーを介して炭水化物とコンジュゲートされる。本発明の組成物及び方法のリンカーとのｉＲＮＡ炭水化物コンジュゲートの非限定的な例としては、限定はされないが、
【化２５】
2020532289.tif 000027
【化２６】
2020532289.tif 000028
が挙げられ、Ｘ又はＹの一方がオリゴヌクレオチドである場合、他方は水素である。
【０５２９】
本発明の組成物及び方法の特定の実施形態において、リガンドは、二価又は三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された１つ又は複数の「ＧａｌＮＡｃ」（Ｎ−アセチルガラクトサミン）誘導体である。
【０５３０】
ＬＤＨＡを標的とする第１のｄｓＲＮＡ剤及びＨＡＯ１を標的とする第２のｄｓＲＮＡ剤が共有結合される実施形態において（即ち、二重標的化ＲＮＡｉ剤）、ｄｓＲＮＡ剤の一方又は両方は、独立して、二価又は三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された１つ又は複数のＧａｌＮＡｃ（Ｎ−アセチルガラクトサミン）誘導体を含むリガンドを含み得る。
【０５３１】
一実施形態において、本発明のｄｓＲＮＡは、式（ＸＬＶ）〜（ＸＬＶＩ）：
【化２７】
2020532289.tif 000029
のいずれかに示される構造の群から選択される二価又は三価の分枝鎖状リンカーにコンジュゲートされ、
式中：
ｑ２Ａ、ｑ２Ｂ、ｑ３Ａ、ｑ３Ｂ、ｑ４Ａ、ｑ４Ｂ、ｑ５Ａ、ｑ５Ｂ及びｑ５Ｃが、出現するごとに独立して、０〜２０を表し、繰返し単位は、同一又は異なっていてもよく；
Ｐ２Ａ、Ｐ２Ｂ、Ｐ３Ａ、Ｐ３Ｂ、Ｐ４Ａ、Ｐ４Ｂ、Ｐ５Ａ、Ｐ５Ｂ、Ｐ５Ｃ、Ｔ２Ａ、Ｔ２Ｂ、Ｔ３Ａ、Ｔ３Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ４Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ５Ｂ、Ｔ５Ｃがそれぞれ、出現するごとに独立して、存在しないか、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨ又はＣＨ２Ｏであり；
Ｑ２Ａ、Ｑ２Ｂ、Ｑ３Ａ、Ｑ３Ｂ、Ｑ４Ａ、Ｑ４Ｂ、Ｑ５Ａ、Ｑ５Ｂ、Ｑ５Ｃが、出現するごとに独立して、存在しないか、アルキレン、置換アルキレンであり、ここで１つ又は複数のメチレンが、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｒ’）＝Ｃ（Ｒ”）、Ｃ≡Ｃ又はＣ（Ｏ）のうちの１つ又は複数により中断又は終端されてもよく；
Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ａ、Ｒ３Ｂ、Ｒ４Ａ、Ｒ４Ｂ、Ｒ５Ａ、Ｒ５Ｂ、Ｒ５Ｃがそれぞれ、出現するごとに独立して、存在しないか、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣＨ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ（Ｒａ）−ＮＨ−、ＣＯ、ＣＨ＝Ｎ−Ｏ、
【化２８】
2020532289.tif 000030
又はヘテロシクリルであり；
Ｌ２Ａ、Ｌ２Ｂ、Ｌ３Ａ、Ｌ３Ｂ、Ｌ４Ａ、Ｌ４Ｂ、Ｌ５Ａ、Ｌ５Ｂ及びＬ５Ｃが、リガンドを表し；即ち、それぞれ、出現するごとに独立して、単糖（ＧａｌＮＡｃなど）、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、又は多糖であり；Ｒａが、Ｈ又はアミノ酸側鎖である。三価コンジュゲートＧａｌＮＡｃ誘導体は、ＲＮＡｉ剤とともに使用されて、式（ＸＬＩＸ）：
【化２９】
2020532289.tif 000031
のものなどの標的遺伝子の発現を阻害するのに特に有用であり、
式中、Ｌ５Ａ、Ｌ５Ｂ及びＬ５Ｃが、ＧａｌＮＡｃ誘導体などの単糖を表す。
【０５３２】
ＧａｌＮＡｃ誘導体にコンジュゲートする好適な二価及び三価の分枝鎖状結合基の例としては、限定はされないが、式ＩＩ、ＶＩＩ、ＸＩ、Ｘ、及びＸＩＩＩとして上に列挙される構造が挙げられる。
【０５３３】
ＲＮＡコンジュゲートの調製を教示する代表的な特許としては、限定はされないが、米国特許第４，８２８，９７９号明細書；同４，９４８，８８２号明細書；同５，２１８，１０５号明細書；同５，５２５，４６５号明細書；同５，５４１，３１３号明細書；同５，５４５，７３０号明細書；同５，５５２，５３８号明細書；同５，５７８，７１７号明細書、同５，５８０，７３１号明細書；同５，５９１，５８４号明細書；同５，１０９，１２４号明細書；同５，１１８，８０２号明細書；同５，１３８，０４５号明細書；同５，４１４，０７７号明細書；同５，４８６，６０３号明細書；同５，５１２，４３９号明細書；同５，５７８，７１８号明細書；同５，６０８，０４６号明細書；同４，５８７，０４４号明細書；同４，６０５，７３５号明細書；同４，６６７，０２５号明細書；同４，７６２，７７９号明細書；同４，７８９，７３７号明細書；同４，８２４，９４１号明細書；同４，８３５，２６３号明細書；同４，８７６，３３５号明細書；同４，９０４，５８２号明細書；同４，９５８，０１３号明細書；同５，０８２，８３０号明細書；同５，１１２，９６３号明細書；同５，２１４，１３６号明細書；同５，０８２，８３０号明細書；同５，１１２，９６３号明細書；同５，２１４，１３６号明細書；同５，２４５，０２２号明細書；同５，２５４，４６９号明細書；同５，２５８，５０６号明細書；同５，２６２，５３６号明細書；同５，２７２，２５０号明細書；同５，２９２，８７３号明細書；同５，３１７，０９８号明細書；同５，３７１，２４１号明細書、同５，３９１，７２３号明細書；同５，４１６，２０３号明細書、同５，４５１，４６３号明細書；同５，５１０，４７５号明細書；同５，５１２，６６７号明細書；同５，５１４，７８５号明細書；同５，５６５，５５２号明細書；同５，５６７，８１０号明細書；同５，５７４，１４２号明細書；同５，５８５，４８１号明細書；同５，５８７，３７１号明細書；同５，５９５，７２６号明細書；同５，５９７，６９６号明細書；同５，５９９，９２３号明細書；同５，５９９，９２８号明細書及び同５，６８８，９４１号明細書；同６，２９４，６６４号明細書；同６，３２０，０１７号明細書；同６，５７６，７５２号明細書；同６，７８３，９３１号明細書；同６，９００，２９７号明細書；同７，０３７，６４６号明細書；同８，１０６，０２２号明細書が挙げられ、これらのそれぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。
【０５３４】
所与の化合物の全ての位置が均一に修飾されている必要はなく、実際には、上記の修飾のうちの２つ以上を、単一の化合物中に又は更にはｉＲＮＡ内の単一のヌクレオシドに組み込むことができる。本発明は、キメラ化合物であるｉＲＮＡ化合物も含む。
【０５３５】
本発明に関連して、「キメラ」ｉＲＮＡ化合物又は「キメラ」は、少なくとも１つのモノマー単位、即ち、ｄｓＲＮＡ化合物の場合はヌクレオチドからそれぞれ構成される２つ以上の化学的に異なる領域を含むｉＲＮＡ化合物、好ましくは、ｄｓＲＮＡである。これらのｉＲＮＡは、典型的に、少なくとも１つの領域を含み、ここで、ＲＮＡは、ヌクレアーゼ分解に対する耐性の増加、細胞取り込みの増加、及び／又は標的核酸に対する結合親和性の増加をｉＲＮＡに与えるように修飾される。ｉＲＮＡの更なる領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡ又はＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断することが可能な酵素のための基質としての役割を果たし得る。例として、ＲＮアーゼＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼである。したがって、ＲＮアーゼＨの活性化は、ＲＮＡ標的の切断をもたらし、それによって、遺伝子発現のｉＲＮＡ阻害の効率を大幅に高める。その結果として、キメラｄｓＲＮＡが使用される場合、同じ標的領域にハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシｄｓＲＮＡと比較して、より短いｉＲＮＡによって同等の結果が得られることが多い。ＲＮＡ標的の切断は、ゲル電気泳動によって、及び必要に応じて、当該技術分野において公知の関連する核酸ハイブリダイゼーション技術によって、通例検出され得る。
【０５３６】
場合によっては、ｉＲＮＡのＲＮＡは、非リガンド基によって修飾され得る。いくつかの非リガンド分子が、ｉＲＮＡの活性、細胞分布又は細胞取り込みを向上させるためにｉＲＮＡにコンジュゲートされており、このようなコンジュゲートを行うための手順は、科学文献で入手可能である。このような非リガンド部分は、コレステロール（Ｋｕｂｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２００７，３６５（１）：５４−６１；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６：６５５３）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９４，４：１０５３）、チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０：３０６；Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３：２７６５）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９２，２０：５３３）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール又はウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１９９１，１０：１１１；Ｋａｂａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９：３２７；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５：４９）、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロール又はトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１；Ｓｈｅａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９０，１８：３７７７）、ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４：９６９）、又はアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４：２２９）、又はオクタデシルアミン又はヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７：９２３）などの脂質部分を含んでいた。このようなＲＮＡコンジュゲートの調製を教示する代表的な米国特許が上に列挙されている。典型的なコンジュゲートプロトコルは、配列の１つ又は複数の位置にアミノリンカーを有するＲＮＡの合成を含む。次に、適切なカップリング剤又は活性化試薬を用いて、アミノ基をコンジュゲートされた分子と反応させる。コンジュゲート反応は、固体担体に依然として結合されたＲＮＡを用いて、又は溶液相中のＲＮＡの切断の後に行うことができる。ＨＰＬＣによるＲＮＡコンジュゲートの精製により、典型的に、純粋なコンジュゲートが得られる。
【０５３７】
ＩＶ．本発明のｉＲＮＡの送達
細胞、例えば、ヒト対象（例えば、脂質代謝障害を有する対象などのｉＲＮＡ剤を必要とする対象）などの対象中の細胞への本発明のｉＲＮＡの送達は、いくつかの様々な方法で行うことができる。例えば、送達は、細胞を、本発明のｉＲＮＡとインビトロ又はインビボのいずれかで接触させることによって行われ得る。インビボ送達はまた、ｉＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡを含む組成物を対象に投与することによって直接行われ得る。或いは、インビボ送達は、ｉＲＮＡの発現をコードし、それを導く１つ又は複数のベクターを投与することによって、間接的に行われ得る。これらの代替例は、以下に更に説明される。
【０５３８】
ＬＤＨＡを標的とする第１のｄｓＲＮＡ剤及びＨＡＯ１を標的とする第２のｄｓＲＮＡ剤が共有結合される本発明の方法において（即ち、二重標的化ＲＮＡｉ剤）、第１の剤の送達は、第２の剤の送達と同じか又は異なり得る。
【０５３９】
一般に、核酸分子を（インビトロ又はインビボで）送達する任意の方法は、本発明のｉＲＮＡとともに使用するために適合され得る（例えば、全体が参照により本明細書に援用される、Ａｋｈｔａｒ  Ｓ．ａｎｄ  Ｊｕｌｉａｎ  ＲＬ．，（１９９２）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２（５）：１３９−１４４及び国際公開第９４／０２５９５号パンフレットを参照）。インビボ送達の場合、ｉＲＮＡ分子を送達するために考慮される因子としては、例えば、送達される分子の生物学的安定性、非特異的効果の防止、及び標的組織における送達される分子の蓄積が挙げられる。ｉＲＮＡの非特異的効果は、局所投与によって、例えば、組織への直接注入又は移植によって、或いは製剤を局所的に投与することによって、最小限に抑えられ得る。処置部位への局所投与は、剤の局所濃度を最大にし、剤によって悪影響を受け得るか又は剤を分解し得る、全身組織への剤の曝露を制限し、投与されるｉＲＮＡ分子の総投与量を少なくすることができる。いくつかの研究が、ｉＲＮＡが局所投与される場合の遺伝子産物のノックダウンの成功を示している。例えば、カニクイザルの硝子体内注射によるＶＥＧＦ  ｄｓＲＮＡの眼内送達（Ｔｏｌｅｎｔｉｎｏ，ＭＪ．ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｒｅｔｉｎａ  ２４：１３２−１３８）及びマウスの網膜下注射（Ｒｅｉｃｈ，ＳＪ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｍｏｌ．Ｖｉｓ．９：２１０−２１６）は両方とも、加齢性黄斑変性症の実験モデルにおける新血管形成を防ぐことを示した。更に、マウスにおけるｄｓＲＮＡの直接腫瘍内投与が腫瘍容積を減少させ（Ｐｉｌｌｅ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１１：２６７−２７４）、担癌マウスの生存を延長することができる（Ｋｉｍ，ＷＪ．ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１４：３４３−３５０；Ｌｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１５：５１５−５２３）。ＲＮＡ干渉は、直接注入による中枢神経系への局所送達（Ｄｏｒｎ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ３２：ｅ４９；Ｔａｎ，ＰＨ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１２：５９−６６；Ｍａｋｉｍｕｒａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）ＢＭＣ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３：１８；Ｓｈｉｓｈｋｉｎａ，ＧＴ．，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １２９：５２１−５２８；Ｔｈａｋｋｅｒ，ＥＲ．，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１：１７２７０−１７２７５；Ａｋａｎｅｙａ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．９３：５９４−６０２）及び鼻腔内投与による肺への局所送達（Ｈｏｗａｒｄ，ＫＡ．ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１４：４７６−４８４；Ｚｈａｎｇ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：１０６７７−１０６８４；Ｂｉｔｋｏ，Ｖ．ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１：５０−５５）による成功も示している。疾病の処置のためにｉＲＮＡを全身投与するために、ＲＮＡは、修飾され得るか、或いは薬剤送達システムを用いて送達され得；両方の方法は、インビボでのエンドヌクレアーゼ及びエ���ソヌクレアーゼによるｄｓＲＮＡの急速な分解を防ぐ役割を果たす。ＲＮＡ又は医薬担体の修飾は、標的組織へのｉＲＮＡ組成物の標的化を可能にし、望ましくないオフターゲット効果を回避することもできる。ｉＲＮＡ分子は、細胞取り込みを向上させ、分解を防ぐコレステロールなどの親油基への化学的結合によって修飾され得る。例えば、親油性コレステロール部分にコンジュゲートされるＡｐｏＢに対するｉＲＮＡを、マウスに全身投与し、肝臓及び空腸の両方においてａｐｏＢ  ｍＲＮＡのノックダウンを得た（Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｎａｔｕｒｅ  ４３２：１７３−１７８）。アプタマーへのｉＲＮＡのコンジュゲートは、前立腺癌のマウスモデルにおける腫瘍増殖を阻害し、腫瘍退縮を仲介することが示されている（ＭｃＮａｍａｒａ，ＪＯ．ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４：１００５−１０１５）。代替的な実施形態において、ｉＲＮＡは、ナノ粒子、デンドリマー、ポリマー、リポソーム、又はカチオン性送達システムなどの薬剤送達システムを用いて送達され得る。正に帯電したカチオン性送達システムは、ｉＲＮＡ分子（負に帯電した）の結合を促進し、また、負に帯電した細胞膜における相互作用を向上させて、細胞によるｉＲＮＡの効率的な取り込みを可能にする。カチオン性脂質、デンドリマー、又はポリマーは、ｉＲＮＡに結合され得るか、又はｉＲＮＡを包む小胞又はミセル（例えば、Ｋｉｍ  ＳＨ．ｅｔ  ａｌ．，（２００８）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １２９（２）：１０７−１１６を参照）を形成するように誘導され得る。小胞又はミセルの形成は、全身投与される場合のｉＲＮＡの分解を更に防ぐ。カチオン性ｉＲＮＡ複合体を作製し、投与するための方法は、十分当業者の能力の範囲内である（例えば、全体が参照により本明細書に援用される、Ｓｏｒｅｎｓｅｎ、ＤＲ．，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ  ３２７：７６１−７６６；Ｖｅｒｍａ，ＵＮ．ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．９：１２９１−１３００；Ａｒｎｏｌｄ，ＡＳ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．２５：１９７−２０５を参照）。ｉＲＮＡの全身送達に有用な薬剤送達システムのいくつかの非限定的な例としては、ＤＯＴＡＰ（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，ＤＲ．，ｅｔ  ａｌ（２００３）、上記参照；Ｖｅｒｍａ，ＵＮ．ｅｔ  ａｌ．，（２００３）、上記を参照）、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、「固体核酸脂質粒子」（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，ＴＳ．ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｎａｔｕｒｅ  ４４１：１１１−１１４）、カルジオリピン（Ｃｈｉｅｎ，ＰＹ．ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１２：３２１−３２８；Ｐａｌ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ｉｎｔ  Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．２６：１０８７−１０９１）、ポリエチレンイミン（Ｂｏｎｎｅｔ  ＭＥ．ｅｔ  ａｌ．，（２００８）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．Ａｕｇ  １６  Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ；Ａｉｇｎｅｒ，Ａ．（２００６）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７１６５９）、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチド（Ｌｉｕ，Ｓ．（２００６）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．３：４７２−４８７）、及びポリアミドアミン（Ｔｏｍａｌｉａ，ＤＡ．ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３５：６１−６７；Ｙｏｏ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１６：１７９９−１８０４）が挙げられる。ある実施形態において、ｉＲＮＡは、全身投与のためにシクロデキストリンとともに複合体を形成する。投与のための方法及びｉＲＮＡｓ及びシクロデキストリンの医薬組成物が、全体が参照により本明細書に援用される米国特許第７，４２７，６０５号明細書に見出され得る。
【０５４０】
Ａ．ベクターでコードされた本発明のｉＲＮＡ
ＬＤＨＡ遺伝子を標的とするｉＲＮＡ並びにＬＤＨＡ及びＨＡＯ１を標的とするｉＲＮＡは、ＤＮＡ又はＲＮＡベクターに挿入された転写単位から発現され得る（例えば、Ｃｏｕｔｕｒｅ，Ａ，ｅｔ  ａｌ．，ＴＩＧ．（１９９６），１２：５−１０；Ｓｋｉｌｌｅｒｎ，Ａ．らの国際ＰＣＴ公開番号国際公開第００／２２１１３号パンフレット、Ｃｏｎｒａｄの国際ＰＣＴ公開番号国際公開第００／２２１１４号パンフレット、及びＣｏｎｒａｄの米国特許第６，０５４，２９９号明細書を参照）。発現は、使用される特定の構築物及び標的組織又は細胞型に応じて、一時的（およそ数時間から数週間）であるか又は持続され得る（数週間から数カ月又はそれ以上）。これらの導入遺伝子は、線状構築物、環状プラスミド、又はウイルスベクターとして導入することができ、これらは、組み込み又は非組み込みベクターであり得る。導入遺伝子は、染色体外プラスミドとして継承されるのを可能にするように構築することもできる（Ｇａｓｓｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：１２９２）。
【０５４１】
ｉＲＮＡの個々の１つ又は複数の鎖は、発現ベクターにおけるプロモーターから転写され得る。２本の別個の鎖が発現されて、例えば、ｄｓＲＮＡを生成する場合、２つの別個の発現ベクターが、（例えば、トランスフェクション又は感染によって）標的細胞中に共導入され得る。或いは、ｄｓＲＮＡの各個々の鎖が、同じ発現プラスミド上に位置するプロモーターによって転写され得る。一実施形態において、ｄｓＲＮＡは、ステム・ループ構造を有するように、リンカーポリヌクレオチド配列によって接合される逆方向反復ポリヌクレオチドとして発現される。
【０５４２】
ｉＲＮＡ発現ベクターは、一般に、ＤＮＡプラスミド又はウイルスベクターである。真核細胞と適合する発現ベクター、好ましくは、脊椎動物細胞と適合する発現ベクターを用いて、本明細書に記載されるｉＲＮＡの発現のための組み換え構築物を産生することができる。真核細胞の発現ベクターは、当該技術分野において周知であり、多くの商業的供給源から入手可能である。通常、所望の核酸セグメントを挿入するのに好都合な制限部位を含むこのようなベクターが提供される。ｉＲＮＡ発現ベクターの送達は、例えば、静脈内又は筋肉内投与によるか、患者から移植された標的細胞に投与した後に患者に再導入することによるか、又は所望の標的細胞への導入を可能にする任意の他の手段などによる全身送達であり得る。
【０５４３】
本明細書に記載される方法及び組成物とともに用いられ得るウイルスベクター系としては、限定はされないが、（ａ）アデノウイルスベクター；（ｂ）レンチウイルスベクター、モロニーマウス白血病ウイルスなどを含むがこれらに限定されないレトロウイルスベクター；（ｃ）アデノ随伴ウイルスベクター；（ｄ）単純ヘルペスウイルスベクター；（ｅ）ＳＶ４０ベクター；（ｆ）ポリオーマウイルスベクター；（ｇ）パピローマウイルスベクター；（ｈ）ピコルナウイルスベクター；（ｉ）オルソポックス（ｏｒｔｈｏｐｏｘ）、例えば、ワクシニアウイルスベクター又は鳥ポックス、例えばカナリア痘又は鶏痘などのポックスウイルスベクター；及び（ｊ）ヘルパー依存性又は弱毒アデノウイルスが挙げられる。複製欠損ウイルスも有利であり得る。異なるベクターが、細胞のゲノムに組み込まれるか又は組み込まれないであろう。構築物は、必要に応じて、トランスフェクションのためのウイルス配列を含み得る。或いは、構築物は、エピソーム複製が可能なベクター、例えばＥＰＶ及びＥＢＶベクターに組み込まれ得る。ｉＲＮＡの組み換え発現のための構築物は、一般に、標的細胞内でのｉＲＮＡの発現を確実にするために、調節要素、例えば、プロモーター、エンハンサーなどを必要とする。ベクター及び構築物について考慮される他の態様が、当該技術分野において公知である。
【０５４４】
Ｖ．本発明の医薬組成物
本発明は、本発明のｉＲＮＡを含む医薬組成物及び製剤も含む。したがって、一実施形態において、肝細胞などの細胞内での乳酸脱水素酵素Ａ（ＬＤＨＡ）の発現を阻害する二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤であって、ｄｓＲＮＡ剤が、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、センス鎖が、配列番号１のヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号２のヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む、ｄｓＲＮＡ剤と；薬学的に許容され得る担体とを含む医薬組成物が本明細書に提供される。
【０５４５】
別の実施形態において、肝細胞などの細胞内での乳酸脱水素酵素Ａ（ＬＤＨＡ）の発現を阻害するｄｓＲＮＡ剤であって、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖が、表２〜５のいずれか１つに列挙されるアンチセンス配列のいずれか１つと３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む相補性の領域を含む、ｄｓＲＮＡ剤と；薬学的に許容され得る担体とを含む医薬組成物が本明細書に提供される。
【０５４６】
一実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖を含む、肝細胞などの細胞内での乳酸脱水素酵素Ａ（ＬＤＨＡ）の発現を阻害する第１の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤であって、センス鎖が、配列番号１のヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖が、配列番号２のヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む、第１の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤と；センス鎖及びアンチセンス鎖を含む、肝細胞などの細胞内でのヒドロキシ酸オキシダーゼ１（グリコール酸オキシダーゼ）（ＨＡＯ１）の発現を阻害する第２の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤であって、センス鎖が、配列番号２１のヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖が、配列番号２２のヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む、第２の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤と；薬学的に許容され得る担体とを含む医薬組成物が本明細書に提供される。
【０５４７】
別の実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖を含む、肝細胞などの細胞内での乳酸脱水素酵素Ａ（ＬＤＨＡ）の発現を阻害する第１の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤であって、アンチセンス鎖が、表２〜５のいずれか１つに列挙されるアンチセンス配列のいずれか１つと３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む相補性の領域を含む、第１の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤と；センス鎖及びアンチセンス鎖を含む、肝細胞などの細胞内でのヒドロキシ酸オキシダーゼ１（グリコール酸オキシダーゼ）（ＨＡＯ１）の発現を阻害する第２の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤であって、アンチセンス鎖が、表７〜１４のいずれか１つに列挙されるアンチセンス配列のいずれか１つと３つ以下のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む相補性の領域を含む、第２の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤とを含む医薬組成物が本明細書に提供される。
【０５４８】
更に別の実施形態において、本発明は、本発明の二重標的化ＲＮＡｉ剤と、薬学的に許容され得る担体とを含む、医薬組成物及び製剤を提供する。
【０５４９】
本発明のｉＲＮＡを含有する医薬組成物は、ＬＤＨＡ遺伝子又はＬＤＨＡ遺伝子及びＨＡＯ１遺伝子の発現又は活性に関連する疾病又は障害、例えば、オキサレート経路に関連する疾病、障害又は病態を処置するのに有用である。
【０５５０】
このような医薬組成物は、送達様式に基づいて製剤化される。一例は、非経口投与を介した、例えば、静脈内（ＩＶ）による又は皮下送達のための、全身投与用に製剤化される組成物である。別の例は、例えば、持続性ポンプ注入などによる肝臓への注入による、肝臓への直接送達用に製剤化される組成物である。
【０５５１】
本発明の医薬組成物は、ＬＤＨＡ遺伝子又はＬＤＨＡ遺伝子及びＨＡＯ１遺伝子の発現を阻害するのに十分な投与量で投与され得る。一般に、本発明のｉＲＮＡの好適な用量は、１日当たりレシピエントの体重キログラム当たり約０．００１〜約２００．０ミリグラムの範囲、一般に、１日当たり体重キログラム当たり約１〜５０ｍｇの範囲である。典型的に、本発明のｉＲＮＡの好適な用量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５．０ｍｇ／ｋｇの範囲、好ましくは、約０．３ｍｇ／ｋｇ及び約３．０ｍｇ／ｋｇである。
【０５５２】
ＬＤＨＡを標的とする第１のｄｓＲＮＡ剤及びＨＡＯ１を標的とする第２のｄｓＲＮＡ剤を含む本発明の方法において、第１の剤及び第２の剤は、同じ医薬製剤又は別の医薬製剤中に存在し得る。
【０５５３】
反復投与計画は、定期的な、例えば、１日置きないし年に１回の、治療量のｉＲＮＡの投与を含み得る。特定の実施形態において、ｉＲＮＡは、月に約１回ないし四半期に約１回（即ち、３か月に約１回）投与される。
【０５５４】
最初の処置計画の後、治療剤は、より少ない頻度で投与され得る。
【０５５５】
当業者は、非限定的に疾病又は疾患の重篤さ、以前の処置、対象の全体的な健康及び／又は年齢、並びに存在する他の疾病を含む所定の因子が対象を効果的に処置するのに必要な投与量及び時間に影響し得ることを認識するであろう。更に、治療的有効量の組成物による対象の処置は、単一の処置又は一連の処置を含み得る。本発明により包含される個々のｉＲＮＡに関する有効な投与量、及びインビボでの半減期は、従来の方法論を用いて、又は本明細書の他の箇所に記載されるような適切な動物モデルを使用したインビボでの試験に基づいて概算することができる。
【０５５６】
マウス遺伝学の進歩が、ＬＤＨＡ及び／又はＬＤＨＡ及びＨＡＯ１の発現の低下から利益を得られ得る、オキサレート経路に関連する疾病、障害又は病態などの様々なヒトの疾病の研究のための多くのマウスモデルを生み出してきた。このようなモデルは、ｉＲＮＡのインビボ試験のため、並びに治療的に有効な用量を決定するために使用され得る。好適なマウスモデルは、当該技術分野において公知であり、例えば、ＡＧＸＴ又はＧＲＨＰＲ遺伝子における突然変異又は欠失を含み得るマウスモデル（例えば、Ｓａｌｉｄｏ  ＥＣ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）ＰＮＡＳ  １０３（４８）：１８２４９−１８２５４及びＫｎｉｇｈｔ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３０２：Ｆ６８８−Ｆ６９３を参照）；ＰＨ３マウスモデル（例えば、Ｌｉ，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １８５２（１２）：２７００を参照）；及びエチレングリコール尿路結石症マウスモデルを含む。
【０５５７】
本発明の医薬組成物は、局所的又は全身的処置が必要かどうか及び処置される部位に応じて、いくつかの方法で投与され得る。投与は、局所投与（例えば、経皮パッチによる）、例えば、噴霧器などによる、粉末又はエアロゾルの吸入又は吹送による経肺投与；気管内、鼻腔内、表皮及び経皮、経口又は非経口投与であり得る。非経口投与としては、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内又は筋肉内注射又は注入；例えば、埋め込みデバイスによる皮下投与；又は例えば、実質内、髄腔内若しくは脳室内投与による頭蓋内投与が挙げられる。
【０５５８】
ｉＲＮＡは、肝臓（例えば、肝臓の肝細胞）などの特定の細胞又は組織を標的とするように送達され得る。
【０５５９】
局所投与用の医薬組成物及び製剤には、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、液滴、坐薬、噴霧剤、液剤及び散剤が挙げられる。従来の医薬担体、水性、粉末又は油性基剤、増粘剤などが必要であり、又は所望され得る。被覆コンドーム、手袋なども有用であり得る。好適な局所製剤は、本発明を特徴付けるｉＲＮＡが、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート化剤及び界面活性剤などの局所送達薬剤との混合物であるものを含む。好適な脂質及びリポソームは、中性（例えば、ジオレイルホスファチジルＤＯＰＥエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンＤＭＰＣ、ジステアロイルホスファチジルコリン）、陰イオン性（例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロールＤＭＰＧ）及び陽イオン性（例えば、ジオレイルテトラメチルアミノプロピルＤＯＴＡＰ及びジオレイルホスファチジルエタノールアミンＤＯＴＭＡ）を含む。本発明を特徴付けるｉＲＮＡは、リポソーム中に封入されることができ、又はリポソームに対して、特に陽イオン性リポソームに対して錯体を形成することができる。代替的に、ｉＲＮＡは、脂質に対して、特に陽イオン性脂質に対して錯体化されてもよい。好適な脂肪酸及びエステルには、非限定的にアラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、又はＣ１〜２０アルキルエステル（例えば、ミリスチン酸イソプロピルＩＰＭ）、モノグリセリド、ジグリセリド又はこれらの薬学的に許容され得る塩が挙げられる）。局所製剤は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，７４７，０１４号明細書に詳細に記載されている。
【０５６０】
経口投与用の組成物及び製剤には、散剤又は顆粒、微粒子、ナノ粒子、縣濁剤、又は水若しくは非水性媒体中の液剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、薬袋、錠剤又は小型錠剤が挙げられる。増粘剤、風味剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤又は結合剤は、所望され得る。いくつかの実施形態では、経口製剤は、本発明を特徴付けるｄｓＲＮＡが、１種又は複数種の透過促進剤界面活性剤及びキレート剤とともに投与されるものである。好適な界面活性剤には、脂肪酸及び／若しくはエステル又はその塩、胆汁酸及び／又はその塩が挙げられる。好適な胆汁酸／塩には、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）及びウルソデオキシケノデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸、グリコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロ−２４，２５−ジヒドロ−フシジン酸ナトリウム及びグリコジヒドロフシジン酸ナトリウムが挙げられる。好適な脂肪酸には、アラキドン酸、ウンデカン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、若しくはモノグリセリド、ジグリセリド、又はこれらの薬学的に許容され得る塩（例えば、ナトリウム）が挙げられる。いくつかの実施形態において、浸透促進剤の組み合わせ、例えば胆汁酸／塩と組み合わせた脂肪酸／塩が使用される。例示的な１つの組み合わせは、ラウリン酸、カプリン酸及びＵＤＣＡのナトリウム塩である。更なる浸透促進剤には、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−２０−セチルエーテルが挙げられる。本発明を特徴付けるＤｓＲＮＡは、噴霧乾燥粒子、又はマイクロ若しくはナノ粒子を形成するために錯体化されたものを含む顆粒形態で経口的に送達され得る。ｄｓＲＮＡ錯体化剤には、ポリ−アミノ酸；ポリイミン；ポリアクリレート；ポリアルキルアクリレート、ポリオキセタン、ポリアルキルシアノアクリレート；陽イオン化ゼラチン、アルブミン、澱粉、アクリレート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及び澱粉；ポリアルキルシアノアクリレート；ＤＥＡＥ−誘導体化ポリイミン、プルラン、セルロース及び澱粉が挙げられる。好適な錯体化剤には、キトサン、Ｎ−トリメチルキトサン、ポリ−Ｌ−リシン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノメチルエチレンＰ（ＴＤＡＥ）、ポリアミノスチレン（例えば、ｐ−アミノ）、ポリ（メチルシアノアクリレート）、ポリ（エチルシアノアクリレート）、ポリ（ブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソヘキシルシアノ（ｃｙｎａｏ）アクリレート）、ＤＥＡＥ−メタクリレート、ＤＥＡＥ−ヘキシルアクリレート、ＤＥＡＥ−アクリルアミド、ＤＥＡＥ−アルブミン及びＤＥＡＥ−デキストラン、ポリメチルアクリレート、ポリヘキシルアクリレート、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）、ポリ（ＤＬ−乳酸−コ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）、アルギン酸塩、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。ｄｓＲＮＡ用の経口製剤、及びそれらの製剤は、その各々が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，８８７，９０６号明細書、米国特許出願公開第２００３００２７７８０号明細書及び米国特許第６，７４７，０１４号明細書に記載されている。
【０５６１】
非経口、実質内（脳内へ）、くも膜下腔内、脳室内又は肝内投与用の組成物及び製剤には、無菌水性溶液を挙げることができ、その無菌水性溶液は、緩衝液、希釈剤、並びに非限定的に浸透促進剤、担体化合物、及び他の薬学的に許容され得る担体又は賦形剤などの他の好適な添加剤も含み得る。
【０５６２】
本発明の医薬組成物は、非限定的に、液剤、乳剤、及びリポソーム含有製剤を含む。これらの組成物は、非限定的に予め形成された液剤、自己乳化型固体及び自己乳化型半固体を含む多様な構成成分から生成され得る。肝癌腫などの肝疾患を処置する際、肝臓を標的とする製剤が特に好ましい。
【０５６３】
単位剤形にて都合よく存在し得る本発明の医薬製剤は、医薬産業にて周知の従来の技術に従って調製することができる。そのような技術は、活性成分を医薬担体又は賦形剤と関連させるステップを含む。一般に、製剤は、活性成分を液体担体又は微粉化固体担体又は両方と均一且つ親密に関連させた後、必要であれば、製品を成形することにより調製される。
【０５６４】
本発明の組成物は、非限定的に錠剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、液体シロップ剤、ソフトゲル剤、坐薬、及び浣腸などの多数の可能な剤形のいずれかに処方され得る。本発明の組成物はまた、水性、非水性又は混合媒体中の懸濁液として処方され得る。水性縣濁液は、更に、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール及び／又はデキストランを含む、縣濁液の粘度を増大させる物質を含んでもよい。縣濁液はまた、安定剤を含み得る。
【０５６５】
Ａ．更なる製剤
ｉ．エマルション
本発明の組成物は、エマルションとして、調製され、製剤化され得る。エマルションは、典型的に、１つの液体が、通常、直径が０．１μｍを超える液滴の形態の別の液体中に分散された不均一系である（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ  ＮＧ．，ａｎｄ  Ａｎｓｅｌ  ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ  ｅｄ．），Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．１９９；Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．２４５；Ｂｌｏｃｋ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  ２，ｐ．３３５；Ｈｉｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．３０１を参照）。エマルションは、多くの場合、互いに親密に混合され及び分散された２つの非混和性液体相を含む二層系である。一般に、エマルションは、油中水（ｗ／ｏ）又は水中油（ｏ／ｗ）の種類のいずれかであり得る。水性相が微小液滴として塊の油相中に微細に分割され及び分散された場合、得られた組成物は、油中水（ｗ／ｏ）エマルションと呼ばれる。代替的に、油相が微小液滴として塊の水性相中に微細に分割され及び分散された場合、得られた組成物は、水中油（ｏ／ｗ）エマルションと呼ばれる。エマルションは、分散相及び活性薬物に加えて追加の構成成分を含むことができ、その構成成分は、水性相、油相中の溶液として、又はそれ自体が別個の相として存在し得る。必要に応じてエマルション中に乳化剤、安定剤、染料、及び抗酸化剤などの医薬賦形剤も存在し得る。医薬エマルションは、例えば、油中水中油（ｏ／ｗ／ｏ）及び水中油中水（ｗ／ｏ／ｗ）エマルションの場合など、３つ以上の相からなる多エマルションであり得る。そのような複合製剤は、多くの場合、単純な二成分エマルションが提供しない所定の利点を提供する。ｏ／ｗエマルションの個々の油小滴が小さい水小滴を囲い込む多エマルションは、ｗ／ｏ／ｗエマルションを構成する。同様に、油の連続相中で安定化された水の小球中に囲い込まれた油小滴の系は、ｏ／ｗ／ｏエマルションを提供する。
【０５６６】
エマルションは、熱力学的安定性を殆ど又は全く有さないことにより特徴付けられる。多くの場合、エマルションの分散又は不連続相は、外部又は連続相中に良好に分散され、乳化剤の手段、又は製剤の粘度を介してこの形態に維持される。エマルションの相のいずれかは、エマルション型軟膏ベース及びクリームの場合のように半固体又は固体であり得る。エマルションを安定化させる他の手段には、エマルションのいずれかの相に組み込まれ得る乳化剤の使用が含まれる。乳化剤は、合成界面活性剤、天然乳化剤、吸収基剤、及び微細に分散した固体の４つのカテゴリーに大きく分類され得る（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ  ＮＧ．，ａｎｄ  Ａｎｓｅｌ  ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ  ｅｄ．），Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．１９９を参照）。
【０５６７】
表面活性剤としても知られている合成界面活性剤は、エマルションの製剤化に広範な適用性が見出されており、文献に概説されている（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ  ＮＧ．，ａｎｄ  Ａｎｓｅｌ  ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ  ｅｄ．），Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．２８５；Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．１９９を参照）。界面活性剤は、通常、両親媒性であり、親水性部分及び疎水性部分を含む。界面活性剤の疎水性に対する親水性の比率は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）と称されており、製剤の調製の際の界面活性剤の分類及び選択の際の貴重な手段である。界面活性剤は、親水性基の性質に基づいて、異なる種類、即ち、非イオン性、アニオン性、カチオン性及び両性に分類され得る（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ  ＮＧ．，ａｎｄ  Ａｎｓｅｌ  ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ  ｅｄ．），Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．２８５を参照）。
【０５６８】
エマルション製剤中に使用される、天然に存在する乳化剤には、ラノリン、蜜蝋、ホスファチド、レシチン及びアカシアが挙げられる。吸収ベースは、無水ラノリン及び親水性ワセリンのように、水を取り入れてｗ／ｏエマルションを形成するが、尚それらの半固体稠度を維持する親水性特性を所有する。微粉化固体は、特に界面活性剤の組み合わせ中、及び粘稠な製剤中で、良好な乳化剤として使用されている。これらには、重金属水酸化物などの極性無機固体、ベントナイト、アタパルジャイト、ヘクトライト、カオリン、モンモリロナイト、コロイド状ケイ酸アルミニウム及びコロイド状ケイ酸アルミニウムマグネシウムなどの非膨潤粘土、顔料、及び炭素などの非極性固体又はトリステアリン酸グリセリルが挙げられる。
【０５６９】
非常に多様な非乳化材料もエマルション製剤中に含まれ、エマルションの特性に寄与する。それらには、脂肪、油、蝋、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪エステル、湿潤剤、親水性コロイド、保存剤及び抗酸化剤が挙げられる（Ｂｌｏｃｋ，ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．３３５；Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．１９９）。
【０５７０】
親水性コロイド又は親水コロイドには、多糖（例えば、アカシア、寒天、アルギン酸、カラゲナン、グァーガム、カラヤガム、及びトラガカント）などの天然に存在するゴム及び合成ポリマー、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロース及びカルボキシプロピルセルロース）、及び合成ポリマー（例えば、カルボマー、セルロースエーテル、及びカルボキシビニルポリマー）が挙げられる。これらは水中に分散し又は水中で膨潤して、分散相の小滴の周囲に強力な界面フィルムを形成することにより、また、外部相の粘度を増大させることにより、エマルションを安定化するコロイド溶液を形成する。
【０５７１】
エマルションは、多くの場合、微生物の増殖を容易に支持し得る炭水化物、タンパク質、ステロール及びホスファチドなどの多数の成分を含むため、これらの製剤は、多くの場合、保存剤を組み込んでいる。製剤に含まれる、通常使用される保存剤には、メチルパラベン、プロピルパラベン、第四級アンモニウム塩、塩化ベンズアルコニウム、ｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステル、及びホウ酸が挙げられる。抗酸化剤も、通常、エマルション製剤に加えられて、製剤の変質を防止する。使用される抗酸化剤は、トコフェロール、没食子酸アルキル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエンなどの遊離基スカベンジャー、又はアスコルビン酸及びメタ重亜硫酸ナトリウムなどの還元剤、並びにクエン酸、酒石酸及びレシチンなどの抗酸化剤共力剤であり得る。
【０５７２】
皮膚、経口及び非経口経路を介したエマルション製剤の適用並びにそれらの製造方法は、文献に概説されている（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ  ＮＧ．，ａｎｄ  Ａｎｓｅｌ  ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ  ｅｄ．），Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．１９９を参照）。経口送達用のエマルション製剤は、製剤化の容易さ、並びに吸収及び生物学的利用能の観点からの有効性のため、非常に広範に使用されている（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ  ＮＧ．，ａｎｄ  Ａｎｓｅｌ  ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ  ｅｄ．），Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．２４５；Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．１９９を参照）。鉱油基剤の緩下剤、油溶性ビタミン及び高脂肪栄養製剤が、ｏ／ｗ型エマルションとして一般的に経口投与されている材料に含まれる。
【０５７３】
ｉｉ．マイクロエマルション
本発明の一実施形態において、ｉＲＮＡ及び核酸の組成物は、マイクロエマルションとして製剤化される。マイクロエマルションは、単一の光学的に等方性で且つ熱力学的に安定した液体溶液である、水、油及び両親媒性物質の系として定義され得る（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ  ＮＧ．，ａｎｄ  Ａｎｓｅｌ  ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ  ｅｄ．），Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．２４５を参照）。典型的には、マイクロエマルションは、最初に油を水性界面活性剤溶液中に分散した後、十分な量の第四の構成成分、一般に中間の鎖長のアルコールを加えて透明系を形成することにより調製される。従って、マイクロエマルションは、表面活性分子の界面フィルムにより安定化されている２つの非混和性液体からなる熱力学的に安定な、等方的に透明な分散物として記載されている（Ｌｅｕｎｇ  ａｎｄ  Ｓｈａｈ，ｉｎ：Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ：Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ａｇｇｒｅｇａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒｏｓｏｆｆ，Ｍ．，Ｅｄ．，１９８９，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１８５−２１５）。マイクロエマルションは通常、油、水、界面活性剤、補助界面活性剤及び電解質を含む３〜５つの構成成分の組み合わせを用いて調製される。マイクロエマルションが油中水（ｗ／ｏ）タイプ又は水中油（ｏ／ｗ）タイプのいずれのものであるかは、使用される油及び界面活性剤の特性と、界面活性剤分子の極性頭部及び炭化水素尾部の構造及び幾何学的充填（ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ  ｐａｃｋｉｎｇ）とに依存する（Ｓｃｈｏｔｔ，ｉｎ  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．２７１）。
【０５７４】
状態図を用いる現象論的手法が広範に研究されており、マイクロエマルションを製剤化する方法についての広範な知識を当業者に与えている（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ  ＮＧ．，ａｎｄ  Ａｎｓｅｌ  ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ  ｅｄ．），Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．２４５；Ｂｌｏｃｋ，ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．３３５を参照）。従来のエマルションと比較して、マイクロエマルションは、自発的に形成する熱力学的に安定な小滴の製剤中で水不溶性薬物を可溶化する利点を提供する。
【０５７５】
マイクロエマルションの調製に使用される界面活性剤には、単独で又は補助界面活性剤との組み合わせで、非限定的に、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、Ｂｒｉｊ  ９６、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、モノラウリン酸テトラグリセロール（ＭＬ３１０）、モノオレイン酸テトラグリセロール（ＭＯ３１０）、モノオレイン酸ヘキサグリセロール（ＰＯ３１０）、ペンタオレイン酸ヘキサグリセロール（ＰＯ５００）、モノカプリン酸デカグリセロール（ＭＣＡ７５０）、モノオレイン酸デカグリセロール（ＭＯ７５０）、セスキオレイン酸（ｓｅｑｕｉｏｌｅａｔｅ）デカグリセロール（ＳＯ７５０）、デカオレイン酸デカグリセロール（ＤＡＯ７５０）が挙げられる。通常、エタノール、１−プロパノール、及び１−ブタノールなどの短鎖アルコールである補助界面活性剤は、界面活性剤フィルム中に浸透し、その結果、界面活性剤分子間に生成された空隙空間によって不規則フィルムを形成することにより、界面流動性を増大させる役割を果たす。しかしながら、マイクロエマルションは、補助界面活性剤を使用することなく調製されることができ、アルコールフリー自己乳化型マイクロエマルション系は、当該技術分野にて既知である。水性相は、典型的には、非限定的に水、薬物の水性溶液、グリセロール、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ポリグリセロール、プロピレングリコール、及びエチレングリコールの誘導体とすることができる。油相は、非限定的にＣａｐｔｅｘ  ３００、Ｃａｐｔｅｘ  ３５５、Ｃａｐｍｕｌ  ＭＣＭ、脂肪酸エステル、中鎖（Ｃ８〜Ｃ１２）モノ、ジ、及びトリ−グリセリド、ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル、脂肪アルコール、ポリグリコール化グリセリド、飽和ポリグリコール化Ｃ８〜Ｃ１０グリセリド、植物油及びシリコーン油などの材料を含むことができる。
【０５７６】
マイクロエマルションは、薬物可溶化及び薬物吸収向上の観点から特に興味深い。脂質ベースのマイクロエマルション（ｏ／ｗ及びｗ／ｏの両方）は、ペプチドを含む薬物の経口バイオアベイラビリティの向上に提案されている（例えば米国特許第６，１９１，１０５号明細書、米国特許第７，０６３，８６０号明細書、米国特許第７，０７０，８０２号明細書、米国特許第７，１５７，０９９号明細書、Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，１１，１３８５−１３９０；Ｒｉｔｓｃｈｅｌ，Ｍｅｔｈ．Ｆｉｎｄ．Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９３，１３，２０５を参照されたい）。マイクロエマルションは、薬物可溶化の改善、酵素加水分解からの薬物の保護、界面活性剤誘導による膜流動性及び透過性の変更に起因する薬物吸収の可能な向上、調製の容易さ、固体剤形を超える経口投与の容易さ、臨床的効能の改善、及び毒性の低下の利点を提供する（例えば例えば米国特許第６，１９１，１０５号明細書、米国特許第７，０６３，８６０号明細書、米国特許第７，０７０，８０２号明細書、米国特許第７，１５７，０９９号明細書、Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，１１，１３８５；Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９６，８５，１３８−１４３を参照されたい）。多くの場合、マイクロエマルションは、マイクロエマルションの構成成分が周囲温度で一緒にされた際に自発的に形成され得る。このことは、易熱性薬物、ペプチド又はｉＲＮＡを処方する際に特に有利であり得る。マイクロエマルションはまた美容及び医薬用途の両方において活性構成成分の経費送達に有効である。本発明のマイクロエマルション組成物及び製剤が胃腸管からのｉＲＮＡ及び核酸の全身吸収の増大、並びにｉＲＮＡ及び核酸の局部細胞取り込みの改善を促進することが期待される。
【０５７７】
本発明のマイクロエマルションはまた、モノステアリン酸ソルビタン（Ｇｒｉｌｌ  ３）、ラブラソール（Ｌａｂｒａｓｏｌ）、及び透過促進剤などの追加の構成成分及び添加剤を含んで、製剤の特性を改善し、且つ本発明のｉＲＮＡ及び核酸の吸収を向上させ得る。本発明のマイクロエマルション中で使用される浸透促進剤は、５つの広いカテゴリーの１つに属するものとして分類され得る−−界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート化剤、及び非キレート化非界面活性剤（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２）。これらのクラスの各々は、上記に論じられている。
【０５７８】
ｉｉｉ．微粒子
本発明のｉＲＮＡ剤は、粒子、例えば、微粒子に組み込まれてもよい。微粒子は、噴霧乾燥によって生成され得るが、凍結乾燥、蒸発、流体床乾燥、真空乾燥、又はこれらの技術の組み合わせを含む他の方法によって生成されてもよい。
【０５７９】
ｉｖ．浸透促進剤
一実施形態において、本発明は、動物の皮膚への、核酸、特にＲＮＡｉの効率的な送達を行うために様々な浸透促進剤を用いる。ほとんどの薬剤が、イオン化及び非イオン化の両方の形態で溶液中に存在する。しかしながら、通常、脂溶性又は親油性の薬剤のみが、細胞膜を容易に横断する。横断される膜が浸透促進剤で処理されている場合、非親油性薬剤でも細胞膜を横断することができることが発見されている。細胞膜をわたる非親油性薬剤の拡散の補助に加えて、浸透促進剤は、親油性薬剤の浸透性も向上させる。
【０５８０】
浸透促進剤は、即ち、界面活性剤、脂肪酸、胆汁塩、キレート剤、及び非キレート非界面活性剤の５つの大きいカテゴリーのうちの１つに属するものとして分類され得る（例えば、Ｍａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ  ａｎｄ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｉｎ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２を参照）。浸透促進剤の上記の種類のそれぞれが、以下により詳細に記載される。
【０５８１】
界面活性剤（又は「表面活性剤」）は、水溶液に溶解されると、溶液の表面張力又は水溶液と別の液体との間の界面張力を低下させ、粘膜を通るｉＲＮＡの吸収が向上されるという結果を生じる化学物質である。胆汁塩及び脂肪酸に加えて、これらの浸透促進剤としては、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル及びポリオキシエチレン−２０−セチルエーテル）（例えば、Ｍａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ  ａｎｄ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｉｎ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２を参照）；及びＦＣ−４３などのペルフルオロ化合物エマルション（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８８，４０，２５２）が挙げられる。
【０５８２】
浸透促進剤として作用する様々な脂肪酸及びそれらの誘導体としては、例えば、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸（ｎ−デカン酸）、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン（１−モノオレイル−ｒａｃ−グリセロール）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセロール１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、それらのＣ１〜２０アルキルエステル（例えば、メチル、イソプロピル及びｔ−ブチル）、並びにそれらのモノグリセリド及びジグリセリド（即ち、オレエート、ラウレート、カプレート、ミリステート、パルミテート、ステアレート、リノレエートなど）が挙げられる（例えば、Ｔｏｕｉｔｏｕ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，２００６；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３；Ｅｌ  Ｈａｒｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９２，４４，６５１−６５４を参照）。
【０５８３】
胆汁の生理学的役割には、脂質及び脂溶性ビタミンの分散及び吸収の促進が含まれる（例えば、Ｍａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ  ａｎｄ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｉｎ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｂｒｕｎｔｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ３８  ｉｎ：Ｇｏｏｄｍａｎ＆Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，９ｔｈ  Ｅｄ．，Ｈａｒｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｄｓ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９６，ｐｐ．９３４−９３５を参照）。様々な天然の胆汁塩、及びそれらの合成誘導体が、浸透促進剤として作用する。したがって、「胆汁塩」という用語は、胆汁の天然成分のいずれか並びにそれらの合成誘導体のいずれかを含む。好適な胆汁塩としては、例えば、コール酸（又はその薬学的に許容され得るナトリウム塩、コール酸ナトリウム）、デヒドロコール酸（デヒドロコール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、グルコール酸（ｇｌｕｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）（グルコール酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｇｌｕｃｈｏｌａｔｅ））、グリコール酸（グリココール酸ナトリウム）、グリコデオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）、タウロコール酸（タウロコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシコール酸ナトリウム）、ケノデオキシコール酸（ケノデオキシコール酸ナトリウム）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、ナトリウムタウロ−２４，２５−ジヒドロ−フシデート（ＳＴＤＨＦ）、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウム及びポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ＰＯＥ）が挙げられる（例えば、Ｍａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ  ａｎｄ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｉｎ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ  ９２；Ｓｗｉｎｙａｒｄ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ３９  Ｉｎ：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ．，Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９０，ｐｐ．７８２−７８３；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３；Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９２，２６３，２５；Ｙａｍａｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９０，７９，５７９−５８３を参照）。
【０５８４】
本発明に関連して使用されるキレート剤は、金属イオンとの錯体を形成することによって溶液から金属イオンを除去し、粘膜を通るｉＲＮＡの吸収が向上されるという結果を生じる化合物として定義され得る。本発明における浸透促進剤としてのキレート剤の使用に関して、ほとんどの特徴付けられたＤＮＡヌクレアーゼが触媒作用のために二価金属イオンを必要とし、したがって、キレート剤によって阻害されるため、キレート剤は、ＤＮアーゼ阻害剤としても作用するという更なる利点を有する（Ｊａｒｒｅｔｔ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，１９９３，６１８，３１５−３３９）。好適なキレート剤としては、限定はされないが、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、クエン酸、サリチレート（例えば、サリチル酸ナトリウム、５−メトキシサリチレート及びホモバニレート（ｈｏｍｏｖａｎｉｌａｔｅ））、コラーゲンのＮ−アシル誘導体、ラウレス−９及びβ−ジケトンのＮ−アミノアシル誘導体（エナミン）が挙げられる（例えば、Ｋａｔｄａｒｅ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，２００６；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３；Ｂｕｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌ．，１９９０，１４，４３−５１を参照）。
【０５８５】
本明細書において使用される際、非キレート非界面活性剤の浸透促進化合物は、キレート剤又は界面活性剤としてのわずかな活性を示すが、それにもかかわらず、消化器粘膜を通るｉＲＮＡの吸収を促進する化合物として定義され得る（例えば、Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３を参照）。この種類の浸透促進剤としては、例えば、不飽和環状尿素、１−アルキル−及び１−アルケニルアザシクロ−アルカノン誘導体（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２）；並びにジクロフェナクナトリウム、インドメタシン及びフェニルブタゾンなどの非ステロイド性抗炎症剤（Ｙａｍａｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８７，３９，６２１−６２６）が挙げられる。
【０５８６】
細胞レベルにおけるｉＲＮＡの取り込みを促進する剤も、本発明の医薬組成物及び他の組成物に加えられ得る。例えば、リポフェクチン（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）などのカチオン性脂質（Ｊｕｎｉｃｈｉらの米国特許第５，７０５，１８８号明細書）、カチオン性グリセロール誘導体、及びポリリジンなどのポリカチオン性分子（ＬｏｌｌｏらのＰＣＴ出願の国際公開第９７／３０７３１号パンフレット）も、ｄｓＲＮＡの細胞取り込みを促進することが知られている。市販のトランスフェクション試薬の例としては、特に、例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＤＭＲＩＥ−Ｃ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００  ＣＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｏｐｔｉｆｅｃｔ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ  Ｑ２  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ；Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＤＯＴＡＰ  Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＤＯＳＰＥＲ  Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、又はＦｕｇｅｎｅ（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＴｒａｎｓＦａｓｔ（商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｔｆｘ（商標）−２０  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｔｆｘ（商標）−５０  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＤｒｅａｍＦｅｃｔ（商標）（ＯＺ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＥｃｏＴｒａｎｓｆｅｃｔ（ＯＺ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＴｒａｎｓＰａｓｓａ  Ｄ１  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＬｙｏＶｅｃ（商標）／ＬｉｐｏＧｅｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＰｅｒＦｅｃｔｉｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＮｅｕｒｏＰＯＲＴＥＲ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ  ２  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、Ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＢａｃｕｌｏＰＯＲＴＥＲ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＴｒｏｇａｎＰＯＲＴＥＲ（商標）ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＲｉｂｏＦｅｃｔ（Ｂｉｏｌｉｎｅ；Ｔａｕｎｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＰｌａｓＦｅｃｔ（Ｂｉｏｌｉｎｅ；Ｔａｕｎｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＵｎｉＦＥＣＴＯＲ（Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＳｕｒｅＦＥＣＴＯＲ（Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）、又はＨｉＦｅｃｔ（商標）（Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）が挙げられる。
【０５８７】
エチレングリコール及びプロピレングリコールなどのグリコール、２−ピロールなどのピロール、アゾン、並びにリモネン及びメントンなどのテルペンを含む、他の剤を用いて、投与される核酸の浸透を促進することができる。
【０５８８】
ｖ．担体
本発明の所定の組成物は、製剤中に担体化合物も組み込んでいる。本明細書で使用される「担体化合物」又は「担体」は、不活性（即ち、生物学的活性ｐｅｒｓｅを所有しない）であり得るが、例えば、生物学的に活性な核酸を分解し、又は循環からの核酸の除去を促進することによる、生物学的活性を有する核酸のバイオアベイラビリティを低下させるインビボでのプロセスによって、核酸であると認識される核酸又はその類似体を指すことができる。核酸及び担体化合物の共投与、典型的には過剰な後者の物質による共投与により、おそらくは共通の受容体に対する担体化合物と核酸との競合に起因して、肝臓、腎臓又は他の循環外リザーバ（ｅｘｔｒａｃｉｒｃｕｌａｔｏｒｙ  ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）中で回収される核酸の量が実質的に低下し得る。例えば、肝組織内での部分的ホスホロチオエートの回収は、それがポリイノシン酸、デキストラン硫酸塩、ポリシチジル酸（ｐｏｌｙｃｙｔｉｄｉｃ  ａｃｉｄ）又は４−アセトアミド−４’イソチオシアノ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸と共投与された際、低下され得る（Ｍｉｙａｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＤｓＲＮＡ  Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，１９９５，５，１１５−１２１；Ｔａｋａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，ＤｓＲＮＡ＆Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．，１９９６，６，１７７−１８３。
【０５８９】
ｖｉ．賦形剤
担体化合物とは対照的に、「医薬担体」又は「賦形剤」は、動物に１つ又は複数の核酸を送達するための薬学的に許容され得る溶媒、懸濁剤、又は任意の他の薬理学的に不活性なビヒクルである。賦形剤は、液体又は固体とすることができ、計画された投与方法を考慮に入れて、核酸及び医薬組成物の他の所定の構成成分と組み合わされた際に、所望の嵩、稠度などを提供するように選択される。典型的な医薬担体には、非限定的に、結合剤（例えば、α化トウモロコシ澱粉、ポリビニルピロリドン又はヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）；充填剤（例えば、乳糖及び他の糖、微結晶セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレート又はリン酸水素カルシウムなど）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、金属ステアリン酸塩、水素化植物油、トウモロコシ澱粉、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）；錠剤崩壊剤（例えば、澱粉、澱粉グリコール酸ナトリウムなど）；及び湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなど）が挙げられる。
【０５９０】
核酸と有害に反応しない、非−非経口投与に薬学的に許容され得る好適な有機又は無機賦形剤も本発明の組成物の処方に使用され得る。薬学的に許容され得る好適な担体には、非限定的に、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、乳糖、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
【０５９１】
核酸の局所投与用の製剤には、アルコールなどの通常の溶媒中の無菌及び非無菌水性溶液、非水性溶液、又は液体若しくは固体油ベース中の核酸溶液を挙げることができる。溶液は、緩衝剤、希釈剤及び他の好適な添加剤も含み得る。核酸と有害に反応しない、非−非経口投与に薬学的に許容され得る好適な有機又は無機賦形剤を使用し得る。
【０５９２】
薬学的に許容され得る好適な賦形剤には、非限定的に、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、乳糖、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
【０５９３】
ｖｉｉ．他の構成成分
本発明の組成物は更に、医薬組成物中に従来見出される他の補助構成成分も、当該技術分野にて確立されたそれらの使用レベルで含有し得る。それ故、例えば、組成物は、例えば、鎮痒薬、収斂薬、局所麻酔薬若しくは抗炎症薬剤など、更なる適合可能な医薬的に活性な材料を含有することができ、又は染料、風味剤、保存剤、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤及び安定剤などの本発明の組成物の様々な剤形を物理的に処方するのに有用な更なる材料を含有することができる。しかしながら、それらの材料は、加えられた際、本発明の組成物の構成成分の生物学的活性を過度に妨害しない必要がある。製剤は滅菌されてもよく、また所望の場合、製剤の核酸と有害に相互作用しない補助剤、例えば滑沢剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩、緩衝液、着色料、調味料及び／又は芳香性物質などと混合される。
【０５９４】
水性縣濁液は、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール及び／又はデキストランを含む、縣濁液の粘度を増大させる物質を含み得る。縣濁液は、安定剤も含み得る。
【０５９５】
ある実施形態において、本発明において特徴付けられる医薬組成物は、（ａ）１つ又は複数のｉＲＮＡ化合物及び（ｂ）非ＲＮＡｉ機構によって機能し、オキサレート経路に関連する疾病、障害又は病態を処理するのに有用な１つ又は複数の剤を含む。このような剤の例としては、限定はされないが、ピリドキシン、ＡＣＥ阻害剤（アンジオテンシン転化酵素阻害剤）、例えば、ベナゼプリル（Ｌｏｔｅｎｓｉｎ）；アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬（ＡＲＢ）（例えば、Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．’ｓ  Ｃｏｚａａｒ（登録商標）などのロサルタンカリウム）、例えば、カンデサルタン（Ａｔａｃａｎｄ）；ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤（例えば、スタチン）；食餌性オキサレート分解化合物、例えば、オキサレートデカルボキシラーゼ（Ｏｘａｚｙｍｅ）；カルシウム結合剤、例えば、セルロースリン酸ナトリウム（Ｃａｌｃｉｂｉｎｄ）；利尿薬、例えば、ヒドロクロロチアジド（Ｍｉｃｒｏｚｉｄｅ）などのチアジド利尿薬；ホスフェートバインダー、例えば、セベラマー（Ｒｅｎａｇｅｌ）；マグネシウム及びビタミンＢ６栄養補助食品；クエン酸カリウム；オルトホスフェート、ビスホスホネート；経口ホスフェート及びシトレート溶液；高い水分摂取量、尿路内視鏡検査；体外衝撃波結石破砕術；腎臓透析；腎臓結石除去（例えば、外科手術）；及び腎臓／肝臓移植；又は上記のいずれかの組み合わせが挙げられる。
【０５９６】
このような化合物の毒性及び処置効果は、例えば、ＬＤ５０（個体群の５０％の致死量）及びＥＤ５０（個体群の５０％に治療に有効な用量）を決定するための、細胞培養物又は実験動物における標準的な薬学的手順によって決定され得る。毒性作用と処置効果との間の用量比は、処置指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表され得る。高い処置指数を示す化合物が好ましい。
【０５９７】
細胞培養アッセイ及び動物試験から得られるデータは、ヒトに使用するためのある範囲の投与量を製剤化するのに使用され得る。本発明における本明細書に取り上げられる組成物の投与量は、一般に、ほとんど又は全く毒性を伴わずにＥＤ５０を含む血中濃度の範囲内である。投与量は、用いられる剤形及び用いられる投与経路に応じて、この範囲内で変化し得る。本発明に取り上げられる方法に使用される任意の化合物では、治療に有効な用量は、細胞培養アッセイから最初に推測され得る。用量は、細胞培養物中で測定して、ＩＣ５０（即ち、症状の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度）を含む、化合物の、又は適切な場合、標的配列のポリペプチド産物の循環血漿濃度範囲を動物モデル内で達成する（例えば、ポリペプチドの濃度の低下を達成する）ように処方され得る。そのような情報を使用して、ヒトでの有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。
【０５９８】
上記に述べたそれらの投与に加えて、本発明を特徴付けるｉＲＮＡは、ＬＤＨＡ又はＬＤＨＡ及びＨＡＯ１発現により仲介される病理過程の処置に有効な他の既知の薬剤と組み合わせて投与されてもよい。いずれの場合でも、投与する医師は、観察された結果に基づいて、当該技術分野にて既知の又は本明細書に記載される標準的な有効性の尺度を使用して、ｉＲＮＡの量及び投与時間を調整することができる。
【０５９９】
ＶＩ．本発明の方法
本発明は、細胞、例えば対象中の細胞内でのＬＤＨＡ又はＬＤＨＡ及びＨＡＯ１発現を低下及び／又は阻害するために、本発明のｉＲＮＡ及び／又は本発明の組成物を使用する方法も提供する。本方法は、細胞を、本発明のＲＮＡｉ剤（又はｉＲＮＡ剤を含む医薬組成物）又は医薬組成物と接触させる工程を含む。ある実施形態において、細胞は、ＬＤＨＡ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間にわたって維持される。他の実施形態において、細胞は、細胞内のＬＤＨＡ遺伝子及びＨＡＯ１遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間にわたって維持される。
【０６００】
本発明の組成物は、以下の実施例において実証されるように、多くの細胞過程（例えば、図１Ａ及び１Ｂを参照）に関与する酵素であるＬＤＨＡを標的とするが、細胞を、本発明の組成物と接触させる工程、又は本発明の組成物を対象に投与する工程が、野生型又は罹患した対象のいずれにおいても副作用をもたらさず、それによって、本発明の組成物の安全性を実証することが留意されるべきである。
【０６０１】
遺伝子発現の低下は、当該技術分野において公知の任意の方法によって評価され得る。例えば、ＬＤＨＡ、及び／又はＨＡＯ１、及び／又はグリコレートの発現の低下は、当業者に周知の方法、例えば、ノーザンブロット法、ｑＲＴ−ＰＣＲを用いて、ＬＤＨＡ、及び／又はＨＡＯ１、及び／又はグリコレートのｍＲＮＡ発現レベルを決定することによって；当業者に周知の方法、例えば、ウエスタンブロット法、免疫学的方法を用いて、ＬＤＨＡ、及び／又はＨＡＯ１、及び／又はグリコレートのタンパク質レベルを決定することによって決定され得る。ＬＤＨＡ、及び／又はＨＡＯ１、及び／又はグリコレートの発現の低下はまた、ＬＤＨＡ、及び／又はＨＡＯ１、及び／又はグリコレートの生物学的活性の低下、例えば、ＬＤＨＡの酵素活性の低下及び／又は組織若しくは血漿オキサレート、若しくは尿中オキサレート及び／又はグリコレート排泄の減少を測定することによって、間接的に評価され得る。
【０６０２】
本発明の方法において、細胞は、インビトロ又はインビボで接触されてもよく、即ち、細胞は、対象中にあり得る。
【０６０３】
本発明の方法を用いた処置に好適な細胞は、ＬＤＨＡ遺伝子を発現する任意の細胞、ＨＡＯ１遺伝子を発現する細胞、グリコレート遺伝子を発現する細胞、ＬＤＨＡ遺伝子及びグリコレート遺伝子を発現する細胞、ＨＡＯ１遺伝子及びグリコレート遺伝子を発現する細胞、ＬＤＨＡ遺伝子及びＨＡＯ１遺伝子を発現する細胞、又はＬＤＨＡ遺伝子、ＨＡＯ１遺伝子、及びグリコレート遺伝子を発現する細胞であり得る。本発明の方法に使用するのに好適な細胞は、哺乳動物細胞、例えば、霊長類細胞（ヒト細胞又は非ヒト霊長類細胞、例えば、サル細胞又はチンパンジー細胞など）、非霊長類細胞（ウシ細胞、ブタ細胞、ラクダ細胞、ラマ細胞、ウマ細胞、ヤギ細胞、ウサギ細胞、ヒツジ細胞、ハムスター、モルモット細胞、ネコ細胞、イヌ細胞、ラット細胞、マウス細胞、ライオン細胞、トラ細胞、クマ細胞、又は水牛細胞など）、鳥類細胞（例えば、アヒル細胞又はガチョウ細胞）、又はクジラ細胞であり得る。一実施形態において、細胞は、ヒト細胞、例えば、ヒト肝細胞である。
【０６０４】
ＬＤＨＡ発現は、細胞内で、少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は約１００％阻害される。好ましい実施形態において、ＬＤＨＡ発現は、少なくとも２０％阻害される。
【０６０５】
ＨＡＯ１発現は、細胞内で、少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は約１００％阻害され得る。好ましい実施形態において、ＨＡＯ１発現は、少なくとも２０％阻害される。
【０６０６】
細胞が、本発明の二重標的化ＲＮＡｉ剤と接触される実施形態において、ＬＤＨＡの阻害のレベルは、ＨＡＯ１のレベルと同じか又は異なり得る。
【０６０７】
一実施形態において、本発明のインビボ方法は、ｉＲＮＡを含有する組成物を対象に投与することを含んでいてもよく、ｉＲＮＡは、処置される哺乳動物のＬＤＨＡ遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部に相補的なヌクレオチド配列を含む。別の実施形態において、本発明のインビボ方法は、ｉＲＮＡを含有する組成物を対象に投与することを含んでいてもよく、ｉＲＮＡは、処置される哺乳動物のＬＤＨＡ遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部に相補的なヌクレオチド配列、及びＨＡＯ１遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部に相補的なヌクレオチド配列を含む。
【０６０８】
処置される生物が、ヒトなどの哺乳動物である場合、組成物は、限定はされないが、経口、腹腔内、又は頭蓋内（例えば、脳室内、実質内及びくも膜下腔内）、静脈内、筋肉内、皮下、経皮、気道（エアゾール）、経鼻、直腸、及び局所（口腔及び舌下を含む）投与を含む非経口経路を含む、当該技術分野において公知の任意の手段によって投与され得る。特定の実施形態において、組成物は、静脈内注入又は注射によって投与される。特定の実施形態において、組成物は、皮下注射によって投与される。
【０６０９】
ある実施形態において、投与は、デポー注射による。デポー注射は、長時間にわたってｉＲＮＡを一貫して放出することができる。したがって、デポー注射は、所望の効果、例えば、ＬＤＨＡの所望の阻害、又はＬＤＨＡ及びＨＡＯ１の両方の所望の阻害、又は治療又は予防効果を得るのに必要な投与の頻度を低減し得る。デポー注射はまた、より一貫した血清濃度を提供することができる。デポー注射は、皮下注射又は筋肉内注射を含み得る。好ましい実施形態において、デポー注射は、皮下注射である。
【０６１０】
ある実施形態において、投与は、ポンプによる。ポンプは、外部ポンプ又は手術により埋め込まれたポンプであってもよい。特定の実施形態において、ポンプは、皮下に埋め込まれた浸透圧ポンプである。他の実施形態において、ポンプは、注入ポンプである。注入ポンプは、静脈内、皮下、動脈内、又は硬膜外注入に使用され得る。好ましい実施形態において、注入ポンプは、皮下注入ポンプである。他の実施形態において、ポンプは、ｉＲＮＡを肝臓に送達する、手術により埋め込まれたポンプである。
【０６１１】
本発明のｉＲＮＡは、医薬組成物中、例えば好適な緩衝液中に存在し得る。緩衝液は、酢酸塩、クエン酸塩、プロラミン、炭酸塩、若しくはリン酸塩、又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。一実施形態において、緩衝液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。ｉＲＮＡを含有する緩衝液のｐＨ及び浸透圧は、対象に投与するのに好適なように調整され得る。
【０６１２】
或いは、本発明のｉＲＮＡは、ｄｓＲＮＡリポソーム製剤などの医薬組成物として投与され得る。
【０６１３】
投与方法は、局所処置が所望されるか又は全身処置が所望されるかに基づいて、及び処置される領域に基づいて選択され得る。投与の経路及び部位は、標的化を促進するように選択され得る。
【０６１４】
一態様において、本発明は、哺乳動物におけるＬＤＨＡ遺伝子の発現を阻害するための方法も提供する。本方法は、哺乳動物の細胞内のＬＤＨＡ遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡを含む組成物を哺乳動物に投与し、それによって、細胞内のＬＤＨＡ遺伝子の発現を阻害する工程を含む。
【０６１５】
別の態様において、本発明は、哺乳動物におけるＬＤＨＡ遺伝子及びＨＡＯ１遺伝子の発現を阻害するための方法も提供する。本方法は、哺乳動物の細胞内のＬＤＨＡ遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡ剤及びＨＡＯ１遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡ剤を含む医薬組成物を哺乳動物に投与し、それによって、哺乳動物におけるＬＤＨＡ遺伝子及びＨＡＯ１遺伝子の発現を阻害する工程を含む。一態様において、本発明は、哺乳動物におけるＬＤＨＡ遺伝子及びＨＡＯ１遺伝子の発現を阻害するための方法を提供する。本方法は、哺乳動物の細胞内のＬＤＨＡ遺伝子及びＨＡＯ１遺伝子を標的とする二重標的化ＲＮＡｉ剤（又は二重標的化剤を含む医薬組成物）を哺乳動物に投与し、それによって、対象におけるＬＤＨＡ遺伝子及びＨＡＯ１遺伝子の発現を阻害する工程を含む。
【０６１６】
遺伝子発現の低下は、当該技術分野において公知の任意の方法によって、及び本明細書に記載される方法、例えばｑＲＴ−ＰＣＲによって評価され得る。タンパク質産生の低下は、当該技術分野において公知の任意の方法によって、及び本明細書に記載される方法、例えばＥＬＩＳＡ、酵素活性によって評価され得る。
【０６１７】
本発明は、オキサレートに関連する疾病、障害、若しくは病態に罹患しているか、又はそれらを発症しやすい対象に、ｉＲＮＡ剤、ｉＲＮＡ剤を含む医薬組成物、又は本発明のｉＲＮＡを含むベクターを投与する工程を含む、治療及び予防方法も提供する。
【０６１８】
一態様において、本発明は、ＬＤＨＡ発現の低下から利益を得られ得る障害、例えば、オキサレート経路に関連する疾病、障害又は病態に罹患している対象を処置する方法を提供する。
【０６１９】
本発明の処置方法（及び使用）は、治療有効量の、ｄｓＲＮＡ剤、二重標的化ｉＲＮＡ剤又はｄｓＲＮＡを含む医薬組成物、二重標的化ＲＮＡｉ剤を含む医薬組成物又はＬＤＨＡの発現を阻害する第１のｄｓＲＮＡ剤及びＨＡＯ１の発現を阻害する第２のｄｓＲＮＡ剤を含む本発明の医薬組成物を対象、例えば、ヒトに投与し、それによって、対象を処置する工程を含む。
【０６２０】
一態様において、本発明は、ＬＤＨＡ発現の低下から利益を得られ得る障害、例えば、オキサレート経路に関連する疾病、障害又は病態に罹患している対象の少なくとも１つの症状を予防する方法を提供する。本方法は、予防的に有効な量の、ｄｓＲＮＡ剤、二重標的化ｉＲＮＡ剤又はｄｓＲＮＡを含む医薬組成物、二重標的化ＲＮＡｉ剤を含む医薬組成物又はＬＤＨＡの発現を阻害する第１のｄｓＲＮＡ剤及びＨＡＯ１の発現を阻害する第２のｄｓＲＮＡ剤を含む本発明の医薬組成物を対象に投与し、それによって、対象の少なくとも１つの症状を予防する工程を含む。
【０６２１】
ＬＤＨＡ遺伝子発現の低下及び／又は阻害から利益を得られ得る対象は、ＬＤＨＡ及びＨＡＯ１遺伝子発現の両方の低下から利益を得られ得る対象を含む。
【０６２２】
したがって、一実施形態において、ＬＤＨＡの発現レベルの低下又はＬＤＨＡ及びＨＡＯ１の発現の低下から利益を得られ得る対象は、正常な尿中オキサレート排泄レベル、例えば、２４時間で約４０ｍｇ（４４０μｍｏｌ）未満を有する（例えば、男性は、約４３ｍｇ／日未満の正常な尿中オキサレート排泄レベルを有し、女性は、約３２ｍｇ／日未満の正常な尿中オキサレート排泄レベルを有する）。別の実施形態において、ＬＤＨＡの発現レベルの低下又はＬＤＨＡ及びＨＡＯ１の発現の低下から利益を得られ得る対象は、軽度の高シュウ酸尿症（約４０〜約６０ｍｇ／日の尿中オキサレート排泄レベル）に罹患している。別の実施形態において、ＬＤＨＡの発現レベルの低下又はＬＤＨＡ及びＨＡＯ１の発現の低下から利益を得られ得る対象は、重度の高シュウ酸尿症（約６０ｍｇ／日を超える尿中オキサレート排泄レベル）に罹患している。
【０６２３】
一実施形態において、ＬＤＨＡ発現又はＬＤＨＡ及びＨＡＯ１発現の低下から利益を得られ得る対象は、オキサレート経路に関連する疾病、障害又は病態を発症するリスクがあるヒトである。一実施形態において、ＬＤＨＡ発現又はＬＤＨＡ及びＨＡＯ１発現の低下から利益を得られ得る対象は、オキサレート経路に関連する疾病、障害又は病態に罹患しているヒトである。更に別の実施形態において、ＬＤＨＡ発現又はＬＤＨＡ及びＨＡＯ１発現の低下から利益を得られ得る対象は、オキサレート経路に関連する疾病、障害又は病態について処置されているヒトである。
【０６２４】
一実施形態において、オキサレート経路に関連する疾病、障害又は病態に罹患している対象は、オキサレートに関連する疾病、障害、若しくは病態に罹患している。オキサレートに関連する疾病、障害、若しくは病態の非限定的な例は、腎臓結石形成疾病、障害、若しくは病態、又はシュウ酸カルシウム組織沈着疾病、障害、若しくは病態を含む。腎臓結石形成疾病、障害、若しくは病態は、シュウ酸カルシウム結石形成疾病、障害、若しくは病態又は非シュウ酸カルシウム結石形成疾病、障害、若しくは病態であり得る。シュウ酸カルシウム結石形成疾病、障害、若しくは病態は、高シュウ酸尿症疾病、障害、若しくは病態（例えば、軽度の高シュウ酸尿症（約４０〜約６０ｍｇ／日の尿中オキサレート排泄レベル）又は重度の高シュウ酸尿症（約６０ｍｇ／日を超える尿中オキサレート排泄レベル））；又は非高シュウ酸尿症疾病、障害、若しくは病態（即ち、高シュウ酸尿症を伴わないシュウ酸カルシウム結石形成疾病、例えば、正常な尿中オキサレート排泄レベル、例えば、２４時間で約４０ｍｇ（４４０μｍｏｌ）未満（例えば、男性は、約４３ｍｇ／日未満の正常な尿中オキサレート排泄レベルを有し、女性は、約３２ｍｇ／日未満の正常な尿中オキサレート排泄レベルを有する）であり得る。
【０６２５】
一実施形態において、高シュウ酸尿症疾病、障害、若しくは病態は、原発性高シュウ酸尿症、腸管高シュウ酸尿症、食餌性高シュウ酸尿症、及び特発性高シュウ酸尿症からなる群から選択される。
【０６２６】
一実施形態において、非高シュウ酸尿症結石形成疾病、障害、若しくは病態は、高カルシウム尿症及び／又は低クエン酸尿症である。別の実施形態において、非高シュウ酸尿症結石形成疾病、障害、若しくは病態は、シュウ酸カルシウム又は非シュウ酸カルシウム腎臓結石形成疾病である。
【０６２７】
一実施形態において、シュウ酸カルシウム結石形成疾病、障害、若しくは病態は、原発性高シュウ酸尿症（ＰＨ）、例えば、原発性高シュウ酸尿症１型（ＰＨ１）；原発性高シュウ酸尿症２型（ＰＨ２）；原発性高シュウ酸尿症３型（ＰＨ３）；又は原発性高シュウ酸尿症非１型、非２型、非３型（ＰＨ−非１型、非２型、非３型）などの遺伝性疾患である。ＰＨ１は、アラニングリオキシレートアミノトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）における突然変異によって引き起こされる遺伝性疾患であり、ＰＨ２は、グリオキシレートレダクターゼ／ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ（ＧＲＨＰＲ）における突然変異に起因し、ＰＨ３は、ＨＯＧＡ１（旧ＤＨＤＰＳＬ）における突然変異によって引き起こされる。ＰＨ−非１型、非２型、非３型に罹患している対象は、正常なＡＧＴ、ＧＲＨＰＲ、及びＨＯＧＡ１肝臓酵素活性を有する以外は、１、２、及び３型と区別できない臨床的特徴を有し、このような対象における顕著な高シュウ酸尿症の病因はまだ解明されていない。
【０６２８】
ＡＧＴ又はＧＲＨＰＲ活性のいずれかの欠損は、過剰なグリオキシレート及びオキサレートをもたらす（例えば、Ｋｎｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ３０２（６）：Ｆ６８８−Ｆ６９３を参照）。したがって、ＬＤＨＡ発現及び／又は活性の阻害は、過剰なオキサレートのレベルを低下させる。更に、グリコール酸オキシダーゼ（ＨＡＯ１）の阻害は、グリオキシレートのレベルを更に低下させる。ＰＨに罹患している対象におけるオキサレートの増加は、オキサレートの排泄の増加を引き起こし、これが、ひいては、腎臓及び膀胱結石をもたらす。結石は、尿路閉塞（重篤及び急性疼痛を伴うことが多い）、尿の二次感染、最終的には腎損傷を引き起こす。オキサレート結石は、重篤になりやすく、比較的早期の腎損傷（例えば、１０代から早期成人期に発症）をもたらし、これは、オキサレートの排泄を損ない、体内におけるオキサレートの蓄積の更なる加速につながる。腎不全の発症後、患者は、骨、関節及び骨髄にオキサレートを堆積させ得る。重症例では、貧血及び血小板減少症などの血液学的問題を発症することがある。体内におけるオキサレートの堆積は、尿中のオキサレートを指す「シュウ酸塩尿」と区別するために「シュウ酸症」と呼ばれることがある。腎不全は、それ自体で処置を必要とする重篤な合併症である。透析は、腎不全を制御することができるが、過剰なオキサレートに対処するには不十分である傾向がある。腎臓移植は、より効果的であり、これは、重度の高シュウ酸尿症の一次治療である。肝臓移植（多くの場合、腎臓移植に加えて）は、代謝障害を直すことによって疾病を制御することが可能であり得る。原発性高シュウ酸尿症１型に罹患している患者の一部では、ピリドキシン処理（ビタミンＢ６）も、オキサレート排泄を減少させ、腎臓結石形成を予防し得る。
【０６２９】
実施例３に例示されるように、ＰＨ１の当該技術分野において承認されている動物モデル、例えば、Ａｇｘｔ欠損マウスの尿中に排泄された内因性オキサレートのレベルは、ＬＤＨＡ特異的ｓｉＲＮＡの投与後に低下された（例えば、図６を参照）。したがって、一態様において、本発明は、ＰＨ１に罹患している対象を処置するための方法を提供する。本方法は、治療有効量の、ＬＤＨＡ遺伝子及び／又はＨＡＯ１遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡ、ＬＤＨＡ遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡ剤及び／又はＨＡＯ１遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡ剤を含む医薬組成物を対象に投与する工程を含む。
【０６３０】
同様に実施例３に例示されるように、ＰＨ２の当該技術分野において承認されている動物モデル、例えば、Ｇｒｈｐｒ欠損マウスの尿中に排泄された内因性オキサレートのレベルは、ＬＤＨＡ特異的ｓｉＲＮＡの投与後に低下された（例えば、図６を参照）。したがって、一態様において、本発明は、ＰＨ２に罹患している対象を処置するための方法を提供する。本方法は、治療有効量の、ＬＤＨＡ遺伝子及び／又はＨＡＯ１遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡ、対象の細胞内のＬＤＨＡ遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡ剤及び／又はＨＡＯ１遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡ剤を含む医薬組成物を対象に投与する工程を含む。
【０６３１】
ある実施形態において、ＰＨ２に罹患している対象を処置するための方法は、対象の食事を変化させること（例えば、タンパク質摂取量を減少させること、ナトリウム摂取量を減少させること、アスコルビン酸摂取量を減少させること、カルシウム摂取量を抑えること、リン酸塩を補給すること、マグネシウムを補給すること、又はピリドキシン処理；又は上記のいずれかの組み合わせ）及び／又は対象に腎臓を移植することを更に含む。
【０６３２】
別の実施形態において、シュウ酸カルシウム結石形成疾病、障害、若しくは病態は、腸管高シュウ酸尿症である。腸管高シュウ酸尿症は、腸内細菌異常増殖症候群、脂肪吸収不良、慢性胆道疾患又は膵疾患、様々な腸外科手術、胃バイパス手術、炎症性腸疾患、又は慢性下痢を引き起こす任意の病状、例えば、クローン病又は潰瘍性大腸炎）の結果として発生する、結腸からのオキサレートの過剰な吸収に起因する、尿路におけるシュウ酸カルシウム結石の形成である。
【０６３３】
別の実施形態において、シュウ酸カルシウム結石形成疾病、障害、若しくは病態は、食餌性高シュウ酸尿症、例えば、食事中の過剰なオキサレート、例えば、過剰なホウレンソウ、ルバーブ、アーモンド、ブルグア、キビ、粗挽きトウモロコシ、大豆粉、コーンミール、白インゲンマメなどの結果としての高シュウ酸尿症である。
【０６３４】
別の実施形態において、シュウ酸カルシウム結石形成疾病、障害、若しくは病態は、特発性高シュウ酸尿症である。特発性高シュウ酸尿症に罹患している対象は、原因不明の、尿中オキサレートの正常値より高いレベルを有するが、依然として結石を発症する。特発性高シュウ酸尿症を発症するリスクがある対象は、糖尿病及び肥満の対象を含む。例えば、疫学的データは、体格指数（ＢＭＩ）が増加するにつれて、尿中オキサレート排泄が増加し、糖尿病に罹患している対象が、増加した尿中オキサレートレベルを有することを実証している。
【０６３５】
一実施形態において、非シュウ酸カルシウム結石形成疾病、障害、若しくは病態は、高カルシウム尿症（カルシウム過剰尿症）である。高カルシウム尿症は、尿中のカルシウムが増加した状態である。慢性カルシウム過剰尿症は、腎機能の障害、腎石灰沈着症、及び腎不全につながり得る。高カルシウム尿症を発症するリスクがある対象は、デント病、吸収性高カルシウム尿症、及び原発性副甲状腺機能亢進症に罹患している対象を含む。
【０６３６】
別の実施形態において、非シュウ酸カルシウム結石形成疾病、障害、若しくは病態は、低クエン酸尿症である。一実施形態において、低クエン酸尿症は、重度の低クエン酸尿症、例えば、１日当たり１００ｍｇ未満のシトレート排泄である。別の実施形態において、低クエン酸尿症は、軽度ないし中等度の低クエン酸尿症、例えば、１日当たり１００〜３２０ｍｇのシトレート排泄である。
【０６３７】
一実施形態において、非シュウ酸カルシウム結石形成疾病、障害、若しくは病態は、カルシウム結石；ストルバイト（リン酸マグネシウムアンモニウム）結石；尿酸結石；又はシスチン結石の、疾病、障害、若しくは病態、例えば、尿管結石症又は腎石灰沈着症である。このような疾病、障害、及び病態における結石の主要成分は、オキサレート以外であるが、オキサレートが、依然として存在することがあり、結石の更なる成長のための病巣を形成する。したがって、カルシウム結石、ストルバイト（リン酸マグネシウムアンモニウム）結石、尿酸結石、又はシスチン結石の疾病、障害、若しくは病態に罹患している対象は、本発明の方法から利益を得られ得る。
【０６３８】
一実施形態において、オキサレートに関連する疾病、障害、若しくは病態は、シュウ酸カルシウム組織沈着疾病、障害、若しくは病態である。例えば、糸球体ろ過率（ＧＦＲ）が、１．７３ｍ２当たり約３０〜４０ｍＬ／分を下回る場合、シュウ酸カルシウムを排泄する腎機能が、著しく低下される。この段階で、シュウ酸カルシウムが、腎外組織に堆積し始める。シュウ酸カルシウムの堆積は、甲状腺、乳房、腎臓、骨、及び骨髄、心筋、心伝導系において発生し得る。これは、心筋症、心臓ブロック及び他の心伝導系障害、血管疾患、網膜症、滑膜炎、オキサレート骨病及び治療に対して耐性があることが示されている貧血をもたらし得る。シュウ酸カルシウムの堆積は、全身性又は組織特異的であり得る。例えば、関節炎、サルコイドーシス、末期腎疾患に罹患している対象は、全身性シュウ酸カルシウム組織沈着疾病、障害、若しくは病態を発症するリスクがある。例えば、腎臓における組織特異的堆積を発症するリスクがある対象は、海綿腎、腎石灰沈着症、尿細管性アシドーシス（ＲＴＡ）に罹患している対象、及び移植レシピエント、例えば、腎臓移植レシピエントを含む。
【０６３９】
一実施形態において、オキサレート経路に関連する疾病、障害又は病態は、乳酸脱水素酵素に関連する疾病、障害、若しくは病態である。乳酸脱水素酵素に関連する疾病、障害、若しくは病態の非限定的な例は、癌、例えば、癌、例えば、肝細胞癌、脂肪肝（脂肪症）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、肝臓中の脂肪の蓄積、肝臓の炎症、肝細胞壊死、肝線維症、及び非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を含む。
【０６４０】
非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の診断は、（ａ）イメージング又は組織学のいずれかによって、肝脂肪症のエビデンスが存在すること、及び（ｂ）かなりのアルコール摂取、脂肪合成薬物療法（ｓｔｅａｔｏｇｅｎｉｃ  ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎ）の使用又は遺伝性疾患などの、二次的な肝脂肪蓄積の原因がないことを必要とする。患者の大部分において、ＮＡＦＬＤは、肥満、糖尿病、及び脂質異常症などの代謝危険因子に関連している。ＮＡＦＬＤは、組織学的に、非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）及び非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）に更に分類される。ＮＡＦＬは、肝細胞の膨張の形態の肝細胞障害のエビデンスのない肝脂肪症の存在として定義される。ＮＡＳＨは、線維症を伴うか又は伴わない肝細胞障害（膨張）を伴う肝脂肪症及び炎症の存在として定義される（Ｃｈａｌａｓａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌ．５５：２００５−２０２３，２０１２）。単純脂肪症に罹患している患者が、あったとしても非常に遅い組織学的進行を有する一方、ＮＡＳＨに罹患している患者は、肝硬変段階の疾病への組織学的進行を示し得ることが、一般的に認められている。ＮＡＦＬＤ及びＮＡＳＨに罹患している患者の長期転帰は、いくつかの研究において報告されている。
【０６４１】
ＬＨＤＡは、腫瘍の発生、維持及び進行に必要とされ（Ｓｈｉ  ａｎｄ  Ｐｉｎｔｏ，ＰＬＯＳ  ＯＮＥ  ２０１４，９（１），ｅ８６３６５；Ｌｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０７：２０３７−２０４２）、ＬＤＨＡの上方制御は、例えば、乳癌、リンパ腫、腎臓癌（腎細胞癌腫瘍を含む）、遺伝性平滑筋腫症、膵臓癌、肝臓癌（肝細胞癌を含む）、及び他の形態の癌を含む、多くの癌型に特徴的である（Ｇｏｌｄｍａｎ  ＲＤ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２４：３８９−３９９．；Ｋｏｕｋｏｕｒａｋｉｓ  ＭＩ，ｅｔ  ａｌ，Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ８９：８７７−８８５．；Ｋｏｕｋｏｕｒａｋｉｓ  ＭＩ，ｅｔ  ａｌ，ＬＪ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２４：４３０１−４３０８．；Ｋｏｌｅｖ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ，Ａｎｎ  Ｓｕｒｇ  Ｏｎｃｏｌ  １５：２３３６−２３４４．；Ｚｈｕａｎｇ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｄ  Ｐａｔｈｏｌ  ２３：４５−５３）。
【０６４２】
別の態様において、本発明は、対象、例えば、ＬＤＨＡ発現又はＬＤＨＡ及びＨＡＯ１発現の低下及び／又は阻害から利益を得られ得る対象、例えば、オキサレート経路に関連する疾病、障害又は病態を処置するための、治療有効量の、ｄｓＲＮＡ剤、二重標的化ｉＲＮＡ剤又はｄｓＲＮＡを含む医薬組成物、二重標的化ＲＮＡｉ剤を含む医薬組成物又はＬＤＨＡの発現を阻害する第１のｄｓＲＮＡ剤及びＨＡＯ１の発現を阻害する第２のｄｓＲＮＡ剤を含む本発明の医薬組成物の使用を提供する。
【０６４３】
更なる態様において、本発明は、対象、例えば、ＬＤＨＡ発現又はＬＤＨＡ及びＨＡＯ１発現の低下及び／又は阻害から利益を得られ得る対象、例えば、オキサレート経路に関連する疾病、障害又は病態を処置するための薬剤の製造における、二重標的化ｉＲＮＡ剤又はｄｓＲＮＡ剤を含む医薬組成物、二重標的化ｉＲＮＡ剤又はｄｓＲＮＡを含む医薬組成物、二重標的化ＲＮＡｉ剤を含む医薬組成物又はＬＤＨＡの発現を阻害する第１のｄｓＲＮＡ剤及びＨＡＯ１の発現を阻害する第２のｄｓＲＮＡ剤を含む本発明の医薬組成物の使用を提供する。
【０６４４】
ＬＤＨＡを標的とする第１のｄｓＲＮＡ剤及びＨＡＯ１を標的とする第２のｄｓＲＮＡ剤を対象に投与する工程を含む本発明の方法（及び使用）において、第１及び第２のｄｓＲＮＡ剤は、同じ組成物又は異なる組成物中で製剤化されてもよく、同じ組成物又は別の組成物中で対象に投与され得る。
【０６４５】
ｄｓＲＮＡ剤は、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの用量で対象に投与され得る。典型的に、好適な用量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５．０ｍｇ／ｋｇの範囲、好ましくは、約０．３ｍｇ／ｋｇ及び約３．０ｍｇ／ｋｇである。更に、
【０６４６】
二重標的化ＲＮＡｉ剤は、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの用量で対象に投与され得る。典型的に、好適な用量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５．０ｍｇ／ｋｇの範囲、好ましくは、約０．３ｍｇ／ｋｇ及び約３．０ｍｇ／ｋｇである。更に、第１のｄｓＲＮＡ剤及び第２のｄｓＲＮＡ剤はそれぞれ、独立して、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５．０ｍｇ／ｋｇの範囲、好ましくは、約０．３ｍｇ／ｋｇ及び約３．０ｍｇ／ｋｇの用量で対象に投与され得る。
【０６４７】
ＬＤＨＡを標的とする第１のｄｓＲＮＡ剤及びＨＡＯ１を標的とする第２のｄｓＲＮＡ剤を対象に投与する工程を含む本発明の方法（及び使用）において、第１及び第２のｄｓＲＮＡ剤は、同じ用量又は異なる用量で対象に投与され得る。
【０６４８】
ｉＲＮＡは、定期的に、所定の期間にわたって静脈内注入によって投与され得る。特定の実施形態において、最初の処置計画の後、治療剤は、より少ない頻度で投与され得る。
【０６４９】
ｉＲＮＡの投与は、例えば、患者の細胞、組織、血液、尿又は他の区画におけるＬＤＨＡレベルを、少なくとも約５％、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、３９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、若しくは少なくとも約９９％又はそれ以上だけ低下させ得る。好ましい実施形態において、ｉＲＮＡの投与は、例えば、患者の細胞、組織、血液、尿又は他の区画におけるＬＤＨＡレベルを、少なくとも２０％低下させ得る。
【０６５０】
ｉＲＮＡの投与は、例えば、患者の細胞、組織、血液、尿又は他の区画におけるＨＡＯ１レベルを、少なくとも約５％、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、３９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、若しくは少なくとも約９９％又はそれ以上だけ低下させ得る。好ましい実施形態において、ｉＲＮＡの投与は、例えば、患者の細胞、組織、血液、尿又は他の区画におけるＨＡＯ１レベルを、少なくとも２０％低下させ得る。
【０６５１】
ＬＤＨＡを標的とする第１のｄｓＲＮＡ剤及びＨＡＯ１を標的とする第２のｄｓＲＮＡ剤を対象に投与する工程を含む本発明の方法（及び使用）において、ＬＤＨＡの阻害のレベルは、ＨＡＯ１の阻害のレベルと同じか又は異なり得る。
【０６５２】
二重標的化ＲＮＡｉ剤を対象に投与する工程を含む本発明の方法（及び使用）において、二重標的化ＲＮＡｉ剤は、ＬＤＨＡ遺伝子及びＨＡＯ１遺伝子の発現を、細胞を両方のｄｓＲＮＡ剤と個別に接触させることによって得られる発現の阻害のレベルと実質的に同じレベルに阻害し得、又は二重標的化ＲＮＡｉ剤は、ＬＤＨＡ遺伝子及びＨＡＯ１遺伝子の発現を、細胞を両方のｄｓＲＮＡ剤と個別に接触させることによって得られる発現の阻害のレベルより高いレベルに阻害し得る。
【０６５３】
ｉＲＮＡの総量の投与の前に、患者は、５％の輸注反応などの、より少ない用量を投与され、アレルギー反応などの副作用について監視され得る。別の例において、患者は、サイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α又はＩＮＦ−α）レベルの増加などの好ましくない免疫賦活作用について監視され得る。
【０６５４】
或いは、ｉＲＮＡは、皮下に、即ち、皮下注射によって投与され得る。１回又は複数回の注射を用いて、所望の１日用量のｉＲＮＡを対象に送達し得る。注射は、所定の期間にわたって繰り返され得る。投与は、定期的に繰り返され得る。特定の実施形態において、最初の処置計画の後、治療剤は、より少ない頻度で投与され得る。反復投与計画は、定期的な、例えば、１日置きないし年に１回の、治療量のｉＲＮＡの投与を含み得る。特定の実施形態において、ｉＲＮＡは、月に約１回ないし四半期に約１回（即ち、３か月に約１回）投与される。
【０６５５】
一実施形態において、本方法は、標的ＬＤＨＡ遺伝子及び／又は標的ＨＡＯ１遺伝子の発現が、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、１２、１６、１８、２４時間、２８、３２、又は約３６時間にわたって低下されるように、本明細書において特徴付けられる組成物を投与する工程を含む。一実施形態において、標的ＬＤＨＡ遺伝子及びＨＡＯ１遺伝子の発現は、長期間にわたって、例えば、少なくとも約２、３、４日又はそれ以上、例えば、約１週間、２週間、３週間、又は４週間又はそれ以上にわたって低下される。
【０６５６】
好ましくは、本明細書において特徴付けられる方法及び組成物に有用なｉＲＮＡは、標的ＬＤＨＡ及びＨＡＯ１遺伝子のＲＮＡ（一次又はプロセシングされた）を特異的に標的とする。ｉＲＮＡを用いてこれらの遺伝子の発現を阻害するための組成物及び方法が、本明細書に記載されるように調製及び実施され得る。
【０６５７】
本発明の方法に係るｄｓＲＮＡの投与は、脂質代謝障害を有する患者における、このような疾病又は障害の重症度、兆候、症状、及び／又はマーカーを低下させ得る。これに関連して、「低下」とは、このようなレベルの統計的に有意な低下を意味する。低下は、例えば、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は約１００％であり得る。
【０６５８】
疾病の処置又は予防の有効性は、例えば、疾病の進行、疾病の寛解、症状の重症度、痛みの減少、クオリティオブライフ、処置効果を持続させるのに必要な薬剤の用量、疾病マーカーのレベル、又は処置されている若しくは予防の対象となる所定の疾病に適切な測定可能な任意の他のパラメータを測定することによって評価され得る。このようなパラメータのいずれか１つ、又はパラメータの任意の組み合わせを測定することによって処置又は予防の有効性を監視することは、十分当業者の能力の範囲内である。例えば、脂質代謝障害の処置の有効性は、例えば、１つ又は複数の血清脂質レベル、例えば、トリグリセリドレベルの定期的な監視によって評価され得る。初期の読み取り値と後の読み取り値との比較は、処置が有効かどうかの指標を医師に与える。このようなパラメータのいずれか１つ、又はパラメータの任意の組み合わせを測定することによって処置又は予防の有効性を監視することは、十分当業者の能力の範囲内である。ｉＲＮＡ又はその医薬組成物の投与と関連して、脂質代謝障害「に対して有効」は、臨床的に適切な方法での投与が、症状の改善、治癒、疾病の軽減、寿命の延長、クオリティオブライフの改善、又は脂質代謝障害及び関連する原因の処置に精通した医師によって好ましいと一般に認識される他の効果など、少なくとも統計的に有意な割合の患者に対する有益な効果をもたらすことを示す。
【０６５９】
処置又は予防の効果は、疾病状態の１つ又は複数のパラメータの統計的に有意な改善がある場合、又は悪化若しくは本来予想されていた症状が発生しないことにより明らかである。一例として、疾病の測定可能なパラメータの少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％又はそれ以上の好ましい変化は、有効な処置を示し得る。所定のｉＲＮＡ薬剤又はその薬剤の製剤の有効性も、当該技術分野において公知であるように、所定の疾病に関して実験動物モデルを用いて判断することができる。
【０６６０】
本発明は、例えば、ＬＤＨＡ発現又はＬＤＨＡ及びＨＡＯ１発現の低下及び／又は阻害から利益を得られ得る対象、例えば、オキサレート経路に関連する疾病、障害又は病態に罹患している対象を処置するための、他の医薬品及び／又は他の治療方法、例えば、公知の医薬品及び／又は公知の治療方法、例えば、これらの障害を処置するために現在用いられているものなどと組み合わせた、本発明のｉＲＮＡ剤又は医薬組成物の使用のための方法を更に提供する。例えば、特定の実施形態において、本発明のｉＲＮＡ剤又は医薬組成物は、例えば、ピリドキシン、ＡＣＥ阻害剤（アンジオテンシン転化酵素阻害剤）、例えば、ベナゼプリル（Ｌｏｔｅｎｓｉｎ）；アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬（ＡＲＢ）（例えば、Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．’ｓ  Ｃｏｚａａｒ（登録商標）などのロサルタンカリウム）、例えば、カンデサルタン（Ａｔａｃａｎｄ）；ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤（例えば、スタチン）；食餌性オキサレート分解化合物、例えば、オキサレートデカルボキシラーゼ（Ｏｘａｚｙｍｅ）；カルシウム結合剤、例えば、セルロースリン酸ナトリウム（Ｃａｌｃｉｂｉｎｄ）；利尿薬、例えば、ヒドロクロロチアジド（Ｍｉｃｒｏｚｉｄｅ）などのチアジド利尿薬；ホスフェートバインダー、例えば、セベラマー（Ｒｅｎａｇｅｌ）；マグネシウム及びビタミンＢ６栄養補助食品；クエン酸カリウム；オルトホスフェート、ビスホスホネート；経口ホスフェート及びシトレート溶液；高い水分摂取量、尿路内視鏡検査；体外衝撃波結石破砕術；腎臓透析；腎臓結石除去（例えば、外科手術）；及び腎臓／肝臓移植；又は上記のいずれかの組み合わせと組み合わせて投与される。
【０６６１】
特定の実施形態において、本明細書に記載されるｉＲＮＡ剤は、ヒドロキシプロリンデヒドロゲナーゼ（ＨＹＰＤＨ；ＨＰＯＸ又はＰＲＯＤＨ２としても知られている）（例えば、Ｌｉ，ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ（２０１６）１８６２：２３３−２３９を参照）又はＨＹＰＤＨの阻害性類似体（例えば、Ｓｕｍｍｉｔｔ，ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ（２０１５）４６６：２７３−２８１を参照）を標的とするｉＲＮＡ剤と組み合わせて投与される。
【０６６２】
ｉＲＮＡ剤及び更なる治療剤及び／又は処置剤は、同時に及び／又は同じ組み合わせで、例えば、皮下的に投与されてもよく、又は更なる治療剤が、別個の組成物の一部として、又は別の時点で、及び／又は当該技術分野において公知の又は本明細書に記載される別の方法によって、投与され得る。
【０６６３】
ＶＩＩ．キット
本発明は、本発明の方法のいずれかを実施するためのキットも提供する。このようなキットは、１つ又は複数のＲＮＡｉ剤及び使用説明書、例えば、ＬＤＨＡ又はＬＤＨＡ及びＨＡＯ１の発現を阻害するのに有効な量の本発明のＲＮＡｉ剤又は医薬組成物と細胞を接触させることによって、細胞内でのＬＤＨＡ又はＬＤＨＡ及びＨＡＯ１の発現を阻害するための説明書を含む。キットは、任意選択で、細胞をＲＮＡｉ剤と接触させるための手段（例えば、注射デバイス）、又はＬＤＨＡ及び／又はＨＡＯ１の阻害を測定するための手段（例えば、ＬＤＨＡ及び／又はＨＡＯ１  ｍＲＮＡ及び／又はＬＤＨＡ及び／又はＨＡＯ１タンパク質の阻害を測定するための手段）を更に含み得る。ＬＤＨＡ及び／又はＨＡＯ１の阻害を測定するためのこのような手段は、例えば、血漿試料などの、対象からの試料を採取するための手段を含み得る。本発明のキットは、任意選択で、ＲＮＡｉ剤を対象に投与するための手段又は治療有効量又は予防的に有効な量を決定するための手段を更に含み得る。
【０６６４】
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者により通常に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書に記載したものと同様の又は等価な方法及び材料を、本発明を特徴付けるｉＲＮＡ及び方法の実践又は試験に使用できるが、好適な方法及び材料は下記に記載されている。本明細書に言及した全ての刊行物、特許出願、特許及び他の参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が支配する。加えて、材料、方法及び実施例は、単なる例示であり、限定を意図するものではない。
【実施例】
【０６６５】
実施例１．ｉＲＮＡ設計、合成、選択、及びインビトロ評価
試薬の供給源
本明細書に試薬の供給源が特に示されていない場合、このような試薬は、分子生物学用の試薬の任意の供給業者から、分子生物学における用途のための品質／純度基準で得ることができる。
【０６６６】
転写物
マウス及びラットＬｄｈａと交差反応するＬＤＨＡ（ヒトＮＣＢＩ  ｒｅｆｓｅｑＩＤ：ＮＭ＿０１０６９９．２）を標的とするｉＲＮＡの組を、カスタムＲ及びＰｙｔｈｏｎスクリプトを用いて設計した。マウスＬｄｈａ、変異体１  ＲＥＦＳＥＱ  ｍＲＮＡは、１，６６１塩基の長さを有する。
【０６６７】
ＬＤＨＡ（ヒト：ＮＣＢＩ  ｒｅｆｓｅｑＩＤ  ＮＭ＿００５５６６．３；ＮＣＢＩ  ＧｅｎｅＩＤ：３９３９）、並びに毒性種ＬＤＨＡオーソログ（カニクイザル：ＮＭ＿００１２８３５５１．１）を標的とする更なる組のｉＲＮＡを、カスタムＲ及びＰｙｔｈｏｎスクリプトを用いて設計した。ヒトＮＭ＿００５５６６  ＲＥＦＳＥＱ  ｍＲＮＡ、ｖｅｒｓｉｏｎ  ３は、２２２６塩基の長さを有する。
【０６６８】
非修飾マウス／ラット交差反応性ＬＤＨＡセンス及びアンチセンス鎖配列の詳細なリストが、表２に示される。修飾マウス／ラット交差反応性ＬＤＨＡセンス及びアンチセンス鎖配列の詳細なリストが、表３に示される。
【０６６９】
非修飾ヒト／カニクイザル交差反応性ＬＤＨＡセンス及びアンチセンス鎖配列の詳細なリストが、表４に示される。修飾ヒト／カニクイザル交差反応性ＬＤＨＡセンス及びアンチセンス鎖配列の詳細なリストが、表５に示される。
【０６７０】
ＰＣＴ公報、国際公開第２０１６／０５７８９３号パンフレット（その全内容が参照により本明細書に援用される）に記載されるように、ＨＡＯ１を標的とするｉＲＮＡの組も設計した。設計には、ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎからの以下の転写物を使用した：ヒト（ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ））ＨＡＯ１  ｍＲＮＡは、ＮＭ＿０１７５４５．２であり；カニクイザル（マカカ・ファシキュラリス（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ））ＨＡＯ１  ｍＲＮＡは、ＸＭ＿００５５６８３８１．１であり；マウス（ムス・ムスクルス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ））ＨＡＯ１  ｍＲＮＡは、ＮＭ＿０１０４０３．２であり；ラット（ラツス・ノルベギクス（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ））ＨＡＯ１  ｍＲＮＡは、ＸＭ＿００６２３５０９６．１である。
【０６７１】
表７及び８は、ＨＡＯ１を標的とする二本鎖の修飾センス及びアンチセンス鎖配列を示す。表９、１０、１１、１４、及び１５は、ＨＡＯ１を標的とする二本鎖の非修飾センス及びアンチセンス鎖配列を示す。表１２、１３、及び１６は、ＨＡＯ１を標的とする二本鎖の非修飾及び修飾センス及びアンチセンス鎖配列を示す。
【０６７２】
知られている場合、二本鎖によって阻害されるＨＡＯ１の種が示される：Ｈｓは、剤がヒトＨＡＯ１の発現を阻害することを示し；Ｍｍは、剤がマウスＨＡＯ１の発現を阻害することを示し；Ｈｓ／Ｍｍは、剤がヒト及びマウスＨＡＯの両方の発現を阻害することを示す。
【０６７３】
インビトロスクリーニング：
細胞培養及びトランスフェクション
初代マウス肝細胞（ＰＭＨ）（ＭＳＣＰ１０、ロット番号ＭＣ６１３）を、ウェル当たり４．９μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ及び０．１μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ．カタログ番号１３７７８−１５０）を、３８４ウェルプレート中の各ウェルの５μｌのｓｉＲＮＡ二本鎖に加えることによってトランスフェクトし、室温で１５分間インキュベートした。次に、約５×１０３個の細胞を含むウィリアムＥ培地（Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓ  Ｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）（ＰＭＨ）の４０μｌのＤＭＥＭ（Ｈｅｐ３ｂ）を、ｓｉＲＮＡ混合物に加えた。ＲＮＡ精製の前に、細胞を２４時間インキュベートした。１０ｎＭ及び０．１ｎＭの最終二本鎖濃度で単回用量実験を行った。
【０６７４】
Ｈｅｐ３ｂ細胞（ＡＴＣＣ）を、ウェル当たり４．９μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ及び０．１μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ．カタログ番号１３７７８−１５０）を、３８４ウェルプレート中の各ウェルの５μｌのｓｉＲＮＡ二本鎖に加えることによってトランスフェクトし、室温で１５分間インキュベートした。次に、約５×１０３個の細胞を含む４０ｕｌのイーグル最小必須培地（Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ）を、ｓｉＲＮＡ混合物に加えた。ＲＮＡ精製の前に、細胞を２４時間インキュベートした。単回用量実験を１０ｎＭで行った。
【０６７５】
ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ  ｍＲＮＡ単離キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、パーツ番号：６１０−１２）を用いた総ＲＮＡ単離
細胞を、ウェル当たり３μＬのビーズを含む７５μｌの溶解／結合緩衝液に溶解させ、静電シェーカー（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  ｓｈａｋｅｒ）で１０分間混合した。洗浄工程を、磁気プレートの補助を用いて、Ｂｉｏｔｅｋ  ＥＬ４０６で自動化した。緩衝液Ａで１回、緩衝液Ｂで１回、及び緩衝液Ｅで２回、ビーズを洗浄し（９０μＬ）、それらの間に吸引工程を行った。最後の吸引の後、完成した１０μＬのＲＴ混合物を、後述されるように、各ウェルに加えた。
【０６７６】
ＡＢＩ高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ、カタログ番号４３６８８１３）を用いたｃＤＮＡ合成
反応当たり１μｌの１０倍緩衝液、０．４μｌの２５倍ｄＮＴＰ、１μｌのランダムプライマー、０．５μｌの逆転写酵素、０．５μｌのＲＮアーゼ阻害剤及び６．６μｌのＨ２Ｏのマスターミックスを、ウェルごとに加えた。プレートを密閉し、静電シェーカーで１０分間撹拌し、次に、３７℃で２時間インキュベートした。この後、プレートを８０℃で８分間撹拌した。
【０６７７】
リアルタイムＰＣＲ
２μｌのｃＤＮＡを、３８４ウェルプレート（Ｒｏｃｈｅカタログ番号０４８８７３０１００１）中のウェル当たり０．５μｌのヒトＧＡＰＤＨ  ＴａｑＭａｎ  Ｐｒｏｂｅ（４３２６３１７Ｅ）、０．５μｌのヒトＬＤＨＡ、２μｌのヌクレアーゼフリー水及び５μｌのＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ  ４８０プローブマスターミックス（Ｒｏｃｈｅカタログ番号０４８８７３０１００１）を含むマスターミックスに加えた。リアルタイムＰＣＲを、ΔΔＣｔ（ＲＱ）アッセイを用いて、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ）において行った。要約表に特に示されない限り、各二本鎖を、少なくとも２回の独立したトランスフェクションにおいて試験した。
【０６７８】
相対的な倍加変化を計算するために、ΔΔＣｔ方法を用いてリアルタイムデータを分析し、１０ｎＭの非特異的ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞、又は疑似トランスフェクト細胞を用いて行ったアッセイに対して正規化した。
【０６７９】
表６Ａは、示されるＧａｌＮＡＣコンジュゲート修飾ｉＲＮＡでトランスフェクトした初代マウス肝細胞における単回用量スクリーンの結果を示す。データが、非処理の細胞に対して残っているメッセージのパーセントとして表される。
【０６８０】
表６Ｂは、示されるＧａｌＮＡＣコンジュゲート修飾ｉＲＮＡでトランスフェクトした初代マウス肝細胞における単回用量スクリーンの結果を示す。データが、非処理の細胞に対して残っているメッセージのパーセントとして表される。
【０６８１】
表１：核酸配列の説明に使用されるヌクレオチドモノマーの略語。
これらのモノマーが、オリゴヌクレオチド中に存在する場合、５’−３’−ホスホジエステル結合によって互いに結合されることが理解されるであろう。
【０６８２】
【表１】
2020532289.tif 000032
【０６８３】
【表２】
2020532289.tif 000033
【０６８４】
【表３】
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【０６８５】
【表４】
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【０６８６】
【表５】
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【０６８７】
【表６】
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【０６８８】
【表７】
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【０６８９】
【表８】
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【０６９０】
【表９】
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【０６９１】
【表１０】
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【０６９２】
【表１１】
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【０６９３】
【表１２】
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【０６９４】
【表１３】
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【０６９５】
【表１４】
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【０６９６】
【表１５】
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【０６９７】
【表１６】
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【０６９８】
【表１７】
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【０６９９】
【表１８】
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【０７００】
【表１９】
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【０７０１】
【表２０】
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【０７０２】
【表２１】
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【０７０３】
【表２２】
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【０７０４】
【表２３】
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【０７０５】
【表２４】
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【０７０６】
【表２５】
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【０７０７】
【表２６】
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【０７０８】
【表２７】
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【０７０９】
【表２８】
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【０７１０】
【表２９】
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【０７１１】
【表３０】
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【０７１２】
【表３１】
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【０７１３】
【表３２】
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【０７１４】
【表３３】
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【０７１５】
【表３４】
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【０７１６】
【表３５】
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【０７１７】
【表３６】
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【０７１８】
【表３７】
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【０７１９】
【表３８】
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【０７２０】
【表３９】
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【０７２１】
【表４０】
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【０７２２】
【表４１】
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【０７２３】
【表４２】
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【０７２４】
【表４３】
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【０７２５】
【表４４】
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【０７２６】
【表４５】
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【０７２７】
【表４６】
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【０７２８】
【表４７】
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【０７２９】
【表４８】
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【０７３０】
【表４９】
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【０７３１】
【表５０】
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【０７３２】
【表５１】
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【０７３３】
【表５２】
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【０７３４】
【表５３】
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【０７３５】
【表５４】
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【０７３６】
【表５５】
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【０７３７】
【表５６】
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【０７３８】
【表５７】
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【０７３９】
【表５８】
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【０７４０】
【表５９】
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【０７４１】
【表６０】
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【０７４２】
【表６１】
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【０７４３】
【表６２】
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【０７４４】
【表６３】
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【表６４】
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【０７４６】
【表６５】
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【０７４７】
【表６６】
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【０７４８】
【表６７】
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【０７４９】
【表６８】
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【０７５０】
【表６９】
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【０７５１】
【表７０】
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【０７５２】
【表７１】
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【０７５３】
【表７２】
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【０７５４】
【表７３】
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【０７５５】
【表７４】
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【０７５６】
【表７５】
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【０７５７】
【表７６】
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【０７５８】
【表７７】
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【０７５９】
【表７８】
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【０７６０】
【表７９】
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【０７６１】
【表８０】
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【０７６２】
【表８１】
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【０７６３】
【表８２】
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【０７６４】
【表８３】
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【０７６５】
【表８４】
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【０７６６】
【表８５】
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【０７６７】
【表８６】
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【０７６８】
【表８７】
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【０７６９】
【表８８】
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【０７７０】
【表８９】
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【０７７１】
実施例２．ＡＤ−８４７８８の単回投与は、インビボでのＬｄｈａ発現及び活性を強力に阻害する
インビボでのＬｄｈａの発現のレベルに対するＡＤ−８４７８８の効果を、単回の０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、又は１０ｍｇ／ｋｇの用量のＡＤ−８４７８８の皮下投与によって、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウスにおいて評価した。投与の４８時間後、マウス安楽死させ、肝臓を切開し、液体窒素中で急速冷凍した。肝臓を粉砕し、試料当たり約１０ｍｇの肝臓粉末をＲＮＡ単離に使用した。ＲＮＡ濃度を測定し、１００ｎｇ／μｌに調整し、ｃＤＮＡを調製し、ＲＴ−ＰＣＲ分析を上述されるように行った。
【０７７２】
これらのアッセイの結果が、図２に示され、この図は、単回の１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの用量のＡＤ−８４７８８が、Ｌｄｈａ発現を強力に阻害することを示す。
【０７７３】
肝臓Ｌｄｈａ酵素活性に対するＡＤ−８４７８８の単回の０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、又は１０ｍｇ／ｋｇの皮下投与の効果を、Ａｇｘｔ欠損マウスにおいて評価した。
【０７７４】
Ａｇｘｔ欠損マウスは、アラニン−グリオキシレートアミノトランスフェラーゼ遺伝子（Ａｇｘｔ）の標的化された破壊を有する（Ｓａｌｉｄｏ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０３：１８２４９）。突然変異体マウスは、正常に発達するが、高シュウ酸尿症及びシュウ酸カルシウム結晶形成を示す。これらのＡｇｘｔノックアウトマウスは、ＡＧＸＴ遺伝子における突然変異によって引き起こされる、腎不全につながる過剰な肝臓オキサレート産生を特徴とする希少疾患である原発性高シュウ酸尿症Ｉ型の承認された動物モデルである。
【０７７５】
肝臓ＬＤＨ酵素活性を、肝臓組織溶解物におけるＮＡＤＨへのＮＡＤの還元によって測定した。投与の４週間後、マウス安楽死させ、肝臓試料を採取し、処理した。簡潔に述べると、肝臓試料を秤量し、溶解緩衝液（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１％のＴｒｉｔｏｎ、１％のプロテアーゼ阻害剤）中で均質化し、ホモジネートを遠心分離して、細胞残屑をペレット化した。上清を回収し、ＮＡＤ及び乳酸又はグリオキシレートのいずれかの溶液を加えた。試料をマルチウェルプレートに入れ、プレートリーダーに入れた。３４０ｎｍにおける吸光度読み取り値を、１分間隔で２０分間にわたって収集した。データを用いて、ＬＤＨＡ比活性度（ＬＤＨＡ活性のｎモル／分／ｍｇタンパク質）を計算した。
【０７７６】
これらのアッセイの結果が、図３に示され、この図は、単回の０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの用量のＡＤ−８４７８８が、Ｌｄｈａ酵素活性を強力に阻害することを示す。
【０７７７】
実施例３．ＡＤ−８４７８８は、インビボでの内因性ＬＤＨＡ発現、ＬＤＨＡ活性、及びオキサレートレベルを強力に低下させる
インビボでの内因性オキサレート産生に対するＡＤ−８４７８８の効果を、野生型マウス、Ａｇｘｔ欠損マウス、及びＧｒｈｐｒノックアウトマウスにおいて評価した。
【０７７８】
Ｇｒｈｐｒ欠損マウスは、グリオキシレートレダクターゼ／ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ（Ｇｒｈｐｒ）遺伝子の標的化された破壊を有する（例えば、Ｋｎｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ３０２（６）：Ｆ６８８−Ｆ６９３を参照）。突然変異体マウスは、成長及び発達の差を示さないが、皮質及び髄質管におけるシュウ酸カルシウムの堆積を含む腎石灰沈着症を示す。Ｇｒｈｐｒノックアウトマウスは、Ｇｒｈｐｒ遺伝子における突然変異によって引き起こされるオキサレートの過剰な産生を特徴とする遺伝性疾患である原発性高シュウ酸尿症ＩＩ型の当該技術分野において承認されている動物モデルである。
【０７７９】
方法及び材料
動物
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンド上の成体（１２〜１４週齢）雄Ａｇｔ欠損（Ａｇｘｔ  Ｋｏ）マウス、Ｇｒｈｐｒ欠損（Ｇｒｈｐｒ  Ｋｏ）マウス、及び野生型同腹子を、これらの試験に使用した。マウスを、１２：１２時間の明暗周期及び２３±１℃の周囲温度で、バリア施設内で飼育し、食物及び水を自由に与えた。全てのマウスを、極低オキサレート食で飼育して、例えば、尿中オキサレート排泄レベルが実質的に内因性オキサレート産生のみを示すように、食餌によるオキサレートの寄与を取り除いた。全ての動物試験は、施設内動物管理使用委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｕｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認された。
【０７８０】
代謝ケージでの採尿
代謝ケージでの採尿のために、既に記載されるように、動物を、２４時間の尿の採取のために、Ｎａｌｇｅｎｅ代謝ケージ内で、単独で飼育した（Ｌｉ，ｅｔ．ａｌ．（２０１６）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １８６２：２３３）。ｉＲＮＡ剤の投与の前及び後に、各マウスについて３〜４回の２４時間の採尿を行った。これらの採取の平均を用いて、各動物の尿中オキサレート排泄を特性評価した。
【０７８１】
ＬＤＨＡ  ｉＲＮＡ投与
尿中オキサレート排泄に対するＡＤ−８４７８８の効果及び持続性を、０日目に、滅菌した０．９％の塩化ナトリウムで希釈した単回の０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、又は１０ｍｇ／ｋｇの用量のＡＤ−８４７８８をＡｇｘｔ欠損マウス（ｎ＝６）に投与することによって決定した。２４時間の尿を、投与の１、２、３、４、６、８、９、及び１０週間後に採取した。また、ベースラインの２４時間の採尿を、ＡＤ−８４７８８の投与の前に行った。
【０７８２】
尿中オキサレート排泄に対するＡＤ−８４７８８の効果を、０日目に、滅菌した０．９％の塩化ナトリウムで希釈した単回の１０ｍｇ／ｋｇの用量のＡＤ−８４７８８を野生型マウス（ｎ＝６）、Ａｇｘｔマウス（ｎ＝６）又はＧｒｈｐｒマウス（ｎ＝６）に投与することによって更に決定した。２４時間の尿試料を、投与の７〜１０日後に採取した。また、ベースラインの２４時間の採尿を、ＡＤ−８４７８８の投与の前に行った。
【０７８３】
また、尿中オキサレート排泄に対するＡＤ−８４７８８の複数回用量の投与の効果を、Ａｇｘｔマウス（ｎ＝６）において決定した。Ａｇｘｔ欠損マウスに、０、１１、１８、及び２５日目に、１０ｍｇ／ｋｇの用量のＡＤ−８４７８８を投与した。２４時間の尿を、投与前の−６、−５、−４、及び−３日目に採取した。２４時間の尿を、投与の７、８、９、及び１０日後；並びに投与の２８、２９、３０、及び３１日後にも採取した。
【０７８４】
２４時間の採尿の完了の後（投与の３２日後）、酵素アッセイによってＬＤＨＡタンパク質及び活性の阻害を決定するために組織を採取した。動物を６時間絶食させ、組織採取の前に気化イソフルラン（Ｆｌｕｒｉｓｏ，ＭＷＩ，Ｂｏｉｓｅ  ＩＤ）で麻酔をかけた。この複数回投与試験プロトコルの概略図が、図４に示される。
【０７８５】
分析方法
尿中オキサレートレベルを、既に記載されるように、質量分析と組み合わせたイオンクロマトグラフィー（ＩＣＭＳ）によって決定した（Ｌｉ，ｅｔ．ａｌ．（２０１６）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １８６２：２３３）。肝臓ラクテートをＩＣＭＳによって決定し（Ｋｎｉｇｈｔ，ｅｔ．ａｌ．（２０１２）．Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．４２１：１２１−１２４）、ピルベート及びグリオキシレートレベルをＨＰＬＣによって決定した（Ｋｎｉｇｈｔ  ａｎｄ  Ｈｏｌｍｅ  ｓ（２００５）Ａｍ  Ｊ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  ２５：１７１）。ラクテート、ピルベート及びグリオキシレートの測定の前に、組織を、トリクロロ酢酸（最終的に１０％  ｖ／ｖ）中で抽出した。
【０７８６】
肝臓ＬＤＨ酵素アッセイ−乳酸又はグリオキシレート基質
肝臓ＬＤＨ酵素活性を、肝臓組織溶解物におけるＮＡＤＨへのＮＡＤの還元によって測定した。簡潔に述べると、肝臓試料を秤量し、溶解緩衝液（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１％のＴｒｉｔｏｎ、１％のプロテアーゼ阻害剤）中で均質化し、ホモジネートを遠心分離して、細胞残屑をペレット化した。上清を回収し、ＮＡＤ及び乳酸又はグリオキシレートのいずれかの溶液を加えた。試料をマルチウェルプレートに入れ、プレートリーダーに入れた。３４０ｎｍにおける吸光度読み取り値を、１分間隔で２０分間にわたって収集した。データを用いて、ＬＤＨＡ比活性度（ＬＤＨＡ活性のｎモル／分／ｍｇタンパク質）を計算した。
【０７８７】
心臓及び大腿骨格筋ＬＤＨ酵素アッセイ
また、心臓及び大腿骨格筋ＬＤＨ酵素活性を、乳酸を基質として用いて測定した。簡潔に述べると、肝臓試料を秤量し、溶解緩衝液（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１％のＴｒｉｔｏｎ、１％のプロテアーゼ阻害剤）中で均質化し、ホモジネートを遠心分離して、細胞残屑をペレット化した。上清を回収し、ＮＡＤ及び乳酸の溶液を加えた。試料をマルチウェルプレートに入れ、プレートリーダーに入れた。３４０ｎｍにおける吸光度読み取り値を、１分間隔で２０分間にわたって収集した。データを用いて、ＬＤＨＡ比活性度（ＬＤＨＡ活性のｎモル／分／ｍｇタンパク質）を計算した。
【０７８８】
結果
また、内因性オキサレート排泄に対するＬＤＨＡ阻害の効果及び持続性を評価し、図５に示されるように、非処理の対照動物と比較して、単回の０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの用量のＡＤ−８４７８８の投与は、ＡＤ−８４７８８の投与後少なくとも４週間にわたって尿中オキサレート排泄を減少させた。
【０７８９】
更に、図６に示されるように、単回の１０ｍｇ／ｋｇの用量のｓｉＲＮＡの投与の４週間後、Ａｇｘｔ欠損マウスの尿中に排泄された内因性オキサレートのレベルは、ベースラインと比較して、約７５％±３％だけ有意に低下され、Ｇｒｈｐｒ欠損マウスの尿中の内因性オキサレート排泄のレベルは、約３２％±５％だけ低下された。
【０７９０】
図７に示されるように、単回の１０ｍｇ／ｋｇの用量のＡＤ−８４７８８の１週間後の時点で、Ａｇｘｔ欠損マウスの尿中に排泄された内因性オキサレートのレベルは、低下された。４回の１０ｍｇ／ｋｇの用量のＡＤ−８４７８８の投与後、Ａｇｘｔ欠損マウスの尿中に排泄された内因性オキサレートレベルは、予想外にも、１２０ｍｇ／ｄｌのベースラインレベルから約７５±３％だけ低下され、これは、Ｌｄｈａのレベルの低下が、排泄されるオキサレートのレベルを低下させ、ひいては、腎臓結石形成疾病、障害、若しくは病態に罹患している対象（例えば、非高シュウ酸尿症腎臓結石形成疾病、障害、若しくは病態に罹患している対象）を処置するのに有用であることを実証している。
【０７９１】
また、Ｌｄｈａタンパク質のレベルに対する４回の１０ｍｇ／ｋｇの用量のＡＤ−８４７８８の投与の効果を、乳酸又はグリオキシレートのいずれかを基質として用いて野生型及びＡｇｘｔマウスの両方からの肝臓試料中に存在するＬｄｈａの酵素活性を測定することによって評価した。図８Ａ、８Ｂ、９Ａ、及び９Ｂは、非処理の対照動物と比較して、野生型マウスへの４回の１０ｍｇ／ｋｇの用量のＡＤ−８４７８８の投与後、乳酸（図８Ａ及び８Ｂ）又はグリオキシレート（図９Ａ及び９Ｂ）のいずれかを用いてＮＡＤＨへのＮＡＤの還元によって測定した際に肝臓ＬＤＨ酵素活性が有意に低下されたことを示す。
【０７９２】
同様に、Ａｇｘｔマウスにおいて、非処理の対照動物と比較して、４回の１０ｍｇ／ｋｇの用量のＡＤ−８４７８８の投与後、乳酸（図１０Ａ及び１０Ｂ）又はグリオキシレート（図１１Ａ及び１１Ｂ）のいずれかを用いてＮＡＤＨへのＮＡＤの還元によって測定した際に肝臓ＬＤＨ酵素活性が有意に低下された。
【０７９３】
乳酸脱水素酵素は、体中に存在し、ＬＤＨＡを標的とするｉＲＮＡ剤の使用は、全身性作用を与え得る。しかしながら、図１２Ａ〜１２Ｄに示されるように、ＡＤ−８４７８８（即ち、肝細胞を標的とするＧａｌＮＡｃリガンドにコンジュゲートされたｉＲＮＡ剤）の投与によるＬＤＨ酵素活性の低下は、肝臓中に存在するＬＤＨに特異的である。特に、非処理の対照動物と比較して、野生型マウスへの４回の１０ｍｇ／ｋｇの用量のＡＤ−８４７８８の投与は、乳酸（図８Ａ及び８Ｂ）を基質として用いて、心臓（図１２Ａ及び１２Ｂ）又は骨格筋（図１２Ｃ及び１２Ｄ）のいずれのＬＤＨ酵素活性も有意に低下させない。
【０７９４】
更に、Ａｇｘｔ欠損マウスのいずれかの野生型への４回の１０ｍｇ／ｋｇの用量のＡＤ−８４７８８の投与によるＬｄｈａレベルの低下は、肝臓又は筋肉のラクテートレベルを増加させなかった。実際に、野生型（図１３Ａ）及びＡｇｘｔ欠損マウス（図１４Ａ）の両方において、ラクテートレベルは、複数回用量のＡＤ−８４７８８を投与された動物において有意に低下された。更に、図１３Ｂ及び１４Ｂに示されるように、肝臓ピルベートレベルはより高く、図１５Ａ及び１５Ｂに示されるように、肝臓グリオキシレートレベルは、複数回用量のＡＤ−８４７８８を投与された野生型マウス及びＡｇｘｔ欠損マウスにおいて変化していなかった。更に、４回の１０ｍｇ／ｋｇの用量のＡＤ−８４７８８の投与後の野生型及びＡｇｘｔ欠損マウスの両方における肝臓ラクテートレベルの低下にもかかわらず、野生型及びＡｇｘｔ欠損マウスの両方におけるラクテートの血漿中レベルは、影響されなかった（図１７Ａ及び１７Ｂ）。特に、試験全体を通して、処理された及び非処理の対照マウスの挙動及び体重（図１６Ａ及び１６Ｂを参照）は、一定のままであり、これは、動物における有意な代謝性変化がなかったことを示し、ひいては、ＡＤ−８４７８８などのｉＲＮＡ剤を用いた肝臓Ｌｄｈａの特異的阻害の安全性を実証している。
【０７９５】
要約すると、本発明のｄｓＲＮＡ剤を用いたＬＤＨＡの肝臓特異的ノックダウンは、健常な動物及び罹患した動物の両方において顕著なオキサレート低下をもたらした。更に、炭水化物代謝におけるＬＤＨの役割と一致して、処理された動物の肝臓中のラクテート、ピルベート及びＴＣＡ回路有機酸のレベルの大きな変化が見られた（例えば、図１Ｂを参照）。しかしながら、処理されたマウスのいずれも、挙動及び／又は体重の変化の兆候を示さず、これは、動物における有意な代謝性変化がなかったことを示す。したがって、本明細書に示されるデータは、腎臓結石形成疾病、障害、若しくは病態に罹患している対象（例えば、非高シュウ酸尿症腎臓結石形成疾病、障害、若しくは病態に罹患している対象）などの対象におけるオキサレート合成を減少させ、副作用又は安全性への懸念をもたらさずにこのような対象に有益である、オキサレートのレベルの好適な低下の測定を可能にするための、本明細書に提供される組成物及び方法の有用性を実証している。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１８−３】
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【図１８−４】
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【図１８−５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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