(57)【要約】  本発明は、神経変性状態について後成的試験に関連する後成的染色体相互作用を決定する方法を提供する。【選択図】図１
2020513748.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経変性状態について後成的試験に関連する後成的染色体相互作用を決定する方法であって、前記試験がサブグループを識別し、
前記サブグループからの核酸の第一セットを、染色体相互作用のインデックス集団を表す核酸の第二セットと接触させ、
そして相補配列をハイブリダイズさせることを含み、
核酸の前記第一および第二セット中の前記核酸が、一緒になって後成的染色体相互作用をする両前記染色体領域からの配列を含むライゲート産物を表し、
前記核酸の第一および第二セット間のハイブリダイゼーションの前記パターンによって、どの後成的染色体相互作用が前記集団におけるサブグループに対して特異的であるかを判定することが可能になり、
前記サブグループが、場合によって、診断、予後、発症の確率および／または前記状態に対する傾向から選択される、前記状態に関連する少なくとも一つの特徴で異なる、方法。
【請求項２】
−前記神経変性状態がアルツハイマー病である、および／または
−前記神経変性状態が認知症または認知障害である、および／または
−前記特徴が前記状態の早期発症前検出である、および／または
−前記サブグループが前記ヒト集団のサブグループである、および／または
−前記核酸の第一セットが少なくとも８の個体由来である；および／または
−前記核酸の第一セットが、第一サブグループからの少なくとも４の個体および好ましくは前記第一サブグループを重複しない第二サブグループからの少なくとも４の個体由来である、および／または
−前記核酸の第二セットが染色体相互作用の非選択群である、および／または
−前記核酸の第二セットが、所定の位置のアレイに結合する、および／または
−前記核酸の第二セットが少なくとも１００の異なる遺伝子または座位における染色体相互作用を表す、および／または
−前記核酸の第二セットが、少なくとも１０００の異なる後成的染色体相互作用を表す少なくとも１０００の異なる核酸を含む、および／または
−前記核酸の第一セットおよび前記核酸の第二セットが１０〜１００ヌクレオチド塩基長の核酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
個体における神経変性状態の特徴を判定する方法であって：
（ａ）請求項１または２に記載の方法によって特定された少なくとも一つの染色体相互作用を分類すること、および／または
（ｂ）神経変性状態の特徴と関連付けられる少なくとも一つの染色体相互作用を分類することを含み、前記特徴が、場合によって、前記状態に対する診断、予後、発症の確率、傾向および／または前記状態の早期発症前検出から選択されてもよい、方法。
【請求項４】
−請求項１または２に記載の核酸の第一セットが、
によって生成される、および／または
−請求項３において前記染色体相互作用の前記分類が、
（ｉ）一緒になって染色体相互作用をして架橋核酸を形成する染色体領域のインビトロ架橋のステップと、
（ｉｉ）前記架橋核酸を酵素での制限消化切断に供するステップと、
（ｉｉｉ）前記架橋され切断された核酸末端をライゲートして前記ライゲート産物を形成するステップと
を含む方法によって実施される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
−前記神経変性状態がアルツハイマー病である、および／または
−少なくとも５〜５００、好ましくは１０〜３００、さらに好ましくは２０〜１００の染色体相互作用が分類される、および／または
−前記分類が、一緒になって前記相互作用をする前記染色体の前記領域を表す、好ましくはＰＣＲによるかもしくはプローブハイブリダイゼーション検出によるライゲートされた核酸の検出を含む、および／または
−前記方法を実施して、臨床試験、好ましくは神経変性についての候補薬物の有効性が試験される臨床試験のために個体を選択する、および／または
−前記方法を実施して、神経変性状態に関連する特徴に基づいて臨床試験に参加する個体を階層化する、請求項３または請求項３に従属する請求項４に記載の方法。
【請求項６】
請求項３〜５のいずれか一項に記載の方法によって特定されている個体における神経変性状態の治療および／または予防において使用するための神経変性状態用治療薬である、薬剤。
【請求項７】
第一状態から第二状態へと神経変性状態を有する個体の疾患状態を変えることができる薬剤を特定する方法であって、候補剤が、前記第一状態に対応するものから前記個体が前記神経変性状態に関連する特徴を欠く第二状態に対応する染色体の相互作用へと前記染色体の相互作用を変えることができるか否かを判定することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、染色体相互作用の検出に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経変性疾患の現行の診断は、特に初期段階では困難である。通常、診断は症状、例えば知能の低下が現れ始めたときに行われる。
【発明の概要】
【０００３】
本発明者らは、染色体の相互作用が神経変性状態に関連するゲノムの領域を特定した。本発明者らの研究により、染色体相互作用に基づいて異なる神経変性特徴を有するサブグループに個体を分類することが可能になる。
【０００４】
したがって、当該方法は、神経変性状態の後成的試験に関連する後成的染色体相互作用を判定する方法であって、サブグループを区別する方法であり、サブグループからの核酸の第一セットを、染色体相互作用のインデックス集団を表す核酸の第二セットと接触させ、そして相補配列をハイブリダイズさせることを含み、核酸の第一および第二セット中の核酸は、一緒になって後成的染色体相互作用をする染色体領域の両方からの配列を含むライゲート産物を表し、核酸の第一および第二セット間のハイブリダイゼーションのパターンによって、どの後成的染色体相互作用が集団中のサブグループに特異的であるかの判定が可能になり、サブグループは状態に関連する少なくとも一つの特徴が異なり、場合によって診断、予後、発症の確率および／または状態に対する傾向から選択されてもよい。
【０００５】
本発明はまた、個体における神経変性状態の特徴を判定する方法であって：（ａ）前記方法によって特定された少なくとも一つの染色体相互作用を分類し、および／または（ｂ）神経変性状態の特徴に関連づけられた少なくとも一つの染色体相互作用を分類することを含む方法も提供し、前記特徴は、場合によって、診断、予後、発症の確率、状態に対する傾向および／または状態の早期発症前検出から選択され、前記関連は、染色体相互作用の存在または非存在であり得る。状態は、好ましくは、認知症または認知障害、好ましくはアルツハイマー病である。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】図１は３Ｃ抽出法の概略図である。３Ｃとはクロマチンコンフォメーションキャプチャー、または染色体コンフォメーションキャプチャーを意味する。
【図２】図２は、（Ａ）単一のサンプルの電気泳動図の一例、および（Ｂ）対照サンプルと比較してアルツハイマー病患者において高頻度で見られるマーカーについての、複数のサンプルを比較するＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸシステムを用いて作成されるバーチャルゲル画像の一例である。サンプルごとに５０μｌの血液を使用して分析を実施した。パネル（Ｂ）では、各カラムの最上部の標識は、サンプルタイプ（ＡＬＺ：アルツハイマー患者；ＣＴＬ：対照患者）および使用したＰＣＲプライマーを表す。プライマー対：ＯＢＤ１４０＿０６１．０６３；マーカー：１０＿１４２７００９２＿１４２７１５２１＿１４３１０５０４＿１４３１５６９１＿ＲＲ；このマーカーのｑ値：０．００６１９１１４４。
【図３】図３は、（Ａ）単一のサンプルについての電気泳動図の一例、および（Ｂ）アルツハイマー病患者と比較して対照サンプルにおいて存在するマーカーについて、複数のサンプルを比較するＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸシステムを使用して作製したバーチャルゲル画像の一例である。サンプルごとに５０μｌの血液を使用して分析を実施した。パネル（Ｂ）において、各カラムの最上部の標識は、サンプルタイプ（ＡＬＺ：アルツハイマー患者；ＣＴＬ：対照患者）および使用したＰＣＲプライマーを表す。プライマー対：ＯＢＤ１４０＿００５．００７；マーカー：８＿３１８４８７６＿３１８６９４６＿３２１４８１７＿３２２１５６０＿ＦＲ；このマーカーのｑ値は０．００５３４３５１５である。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明は、特に：
−異なるサブグループに関連する後成的染色体相互作用を特定するための方法；
−特定の特徴を有するサブグループを選択する方法、および／または個体のサブグループを特定する方法；
−神経変性状態を治療または予防するために使用できる薬物を特定する方法
を含む、様々な異なる態様を有する。
【０００８】
神経変性疾患に関連する領域
本発明は、神経変性状態に関連する、疾患関連または後成的活性領域での染色体相互作用を分類することに関する。そのような領域では、状態の態様に影響を及ぼす染色体相互作用が起こるであろう。染色体相互作用は、（転帰に関連する）状態または予後を有することもしくは感受性であることに影響を及ぼす可能性があるか、または関連づけられる可能性がある。したがって、染色体相互作用は疾患の診断もしくは発症の確率に関連する可能性がある。神経変性状態に関連する特異的染色体相互作用、遺伝子および領域を本明細書中の表で開示する。
【０００９】
分類される染色体相互作用は、遺伝子（コーディング配列を含む）とその調節領域、例えばプロモータとの間で起こるものであってもよいし、そうでなくてもよい。分類される染色体相互作用は、遺伝するもの、遺伝子領域の例えば刷り込まれた遺伝形質であってもよいし、そうでなくてもよい。染色体相互作用は、２つの調節領域間で起こり得るもの、例えばエンハンサとプロモータとの間の相互作用またはプロモータと別のプロモータとの間の相互作用などであってもよいし、そうでなくてもよい。染色体相互作用は、遺伝子の調節解除、例えばエンハンサにおける活性の変化（例えば増加または減少）と関連付けることができる。
【００１０】
予後
予後は、本明細書中で使用する場合、病状の起こり得る経過、例えば１以上の転帰を予想することに関する。予後因子は典型的には、客観的に測定可能であり、神経変性状態の起こり得る転帰に関する情報を提供する臨床的または生物学的特徴である。
【００１１】
後成的相互作用
本明細書中で使用する場合、「後成的」相互作用という用語は、典型的には、染色体上の座の遠位領域間の相互作用を指し、前記相互作用は、染色体の領域の状態に応じて、動的であり、変更、形成または破壊するものである。
【００１２】
本発明の特定の方法において、染色体相互作用は、まず、相互作用の一部である染色体の両領域からの配列を含むライゲートされた核酸を生成させることによって検出される。そのような方法では、領域は、任意の好適な手段によって架橋することができる。好ましい実施形態において、相互作用は、ホルムアルデヒドを使用して架橋されるが、任意のアルデヒド、またはＤ−ビオチニル−ｅ−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルまたはジゴキシゲニン−３−Ｏ−メチルカルボニル−ｅ−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルによって架橋することもできる。パラホルムアルデヒドが好ましく、４オングストローム離間しているＤＮＡ鎖を架橋することができる。
【００１３】
染色体相互作用は、例えば、転写されるかまたは抑制されるかなどの染色体の領域の状態を反映する可能性がある。本明細書中で定義するようなサブグループに対して特異的である染色体相互作用は安定であり、したがって２つのサブグループ間の差異を測定するための信頼できる手段を提供することが判明している。
【００１４】
さらに、特徴に特異的な染色体相互作用は、通常、例えばメチル化またはヒストンタンパク質の結合に対する変化などの他の後成的マーカーと比較すると、生物学的プロセスにおいて早期に起こる。したがって、本発明の方法は生物学的プロセスの初期段階を検出することができる。これにより早期介入（例えば治療）が可能になり、その結果、より有効となり得る。さらに、同じサブグループ内の個体間での関連する染色体相互作用のばらつきがほとんどない。本発明において、染色体相互作用の分類によって、早期および／または発症前診断が可能になる。ある特定の実施形態において、症状発症の少なくとも１、５、１０、２０または４０年前の状態の特徴の検出が可能になる（１年は３６５日と定義される）。早期または発症前検出はアルツハイマー病に関する実施形態に特に好ましい。
【００１５】
後成的相互作用の位置および原因
後成的染色体の相互作用は、関連するかまたは記載されていない遺伝子をコードすることが示された染色体の領域と重複し含み得るが、等しく遺伝子間領域中にあり得る。さらに、本発明者らが全ての領域における後成的相互作用は染色体座の状態を判定する際に等しく重要であることを見出したことに留意すべきである。これらの相互作用は、座に位置する特定の遺伝子のコーディング領域に必ずしもあるとは限らず、遺伝子間領域にある可能性がある。これらの相互作用は、遺伝子とそれらの調節エレメントとの間の長範囲（ｌｏｎｇ  ｒａｎｇｅ）相互作用であってもよいし、そうでなくてもよい。これらの相互作用は、プロモータ−プロモータ相互作用および／またはプロモータ−エンハンサ相互作用を含んでもよいし、含まなくてもよい。本発明で検出される染色体相互作用は、基礎となるＤＮＡ配列に対する変化によって、環境因子、ＤＮＡメチル化、非コーディングアンチセンスＲＮＡ転写物、非変異誘発性発がん物質、ヒストン修飾、クロマチンリモデリングおよび特異的局所ＤＮＡ相互作用によって引き起こされ得る。染色体相互作用に至る変化は、基礎となる核酸配列に対する変化によって引き起こされる可能性があり、そのような変化は、それ自体では遺伝子産物または遺伝子発現様式に直接影響を及ぼさない。そのような変化は、例えば、遺伝子の内部および／または外部のＳＮＰ、遺伝子間ＤＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、および非コーディングＲＮＡの遺伝子融合および／または欠失であり得る。例えば、ＳＮＰのおよそ２０％は非コーディング領域にあることが知られており、したがって、記載されているような方法はまた、非コーディング状況においても有益である。一実施形態において、一緒になって相互作用を形成する染色体の領域は、同じ染色体上で５ｋｂ未満、３ｋｂ未満、１ｋｂ未満、５００塩基対未満または２００塩基対未満離れている。一緒になって相互作用を形成する染色体の領域は、同じ染色体上で５ｋｂ超、１０ｋｂ超、５０ｋｂ超、１００ｋｂ超、２００ｋｂ超、５００ｋｂ超、または８００ｋｂ超離れている可能性があり、例えば８００ｋｂ〜１，５００ｋｂ離れている可能性がある。
【００１６】
検出される染色体相互作用は、好ましくは本明細書中の表中で言及する遺伝子のいずれかの内部である。しかしながら、遺伝子の上流または下流であってもよく、例えば、遺伝子またはコーディング配列から最大５０，０００、最大３０，０００、最大２０，０００、最大１０，０００または最大５０００塩基上流または下流であってもよい。
【００１７】
臨床的状況のタイプ
本発明の目的は、集団におけるサブグループを規定する特徴に関連する染色体相互作用の検出を可能にすることである。例えば、この技術は、特異的表現型（例えば、神経変性状態に関連する）のバイオマーカーに基づく階層化を可能にし、すなわち、特定の染色体確認シグネチャーおよび／または特定のシグネチャーにおける変化を認識することによる。
【００１８】
本発明の方法は、疾患に関連する特定の特徴の関連で、例えば、診断、予後、疾患の経過のモニタリング、および／または疾患に対する傾向の特定に関連して使用することができる。したがって、方法は、特定の状態の存在の診断のために使用してもよいし、使用しなくてもよい。本発明の方法を使用して、疾患の機序が未知であるか、不明であるか、または複雑である座位を分類することができる。染色体相互作用の検出は、その一部が複雑である、異なる調節レベルの変化を追従する効率的な方法を提供する。例えば、場合によって、ほぼ３７，０００の非コーディングＲＮＡを単一の衝撃によって活性化することができる。
【００１９】
サブグループおよびパーソナル化治療
本明細書中で使用する場合、「サブグループ」は、好ましくは集団サブグループ（集団におけるサブグループ）を指し、さらに好ましくは、特定の真核生物、または哺乳類（例えば、ヒト、非ヒト、非ヒト霊長類、または齧歯類、例えばマウスもしくはラット）などの特定の動物の集団におけるサブグループを指す。最も好ましくは、「サブグループ」とは、ヒト集団におけるサブグループを指す。
【００２０】
本発明は、集団における特定のサブグループを検出し治療することを含む。そのようなサブグループ内に、本明細書中で検討する特徴（例えば認知障害、または神経変性状態の診断）が存在するかまたは存在しない。染色体に対する後成的相互作用の差異は、一般的に言うと、ゲノムレベルで存在する構造的差異である。本発明者らは、所与の集団におけるサブセット（例えば、２つまたは少なくとも２つのサブセット）間でこれらが異なることを見出した。これらの差異の特定によって、医師は方法で記載されるように集団の１つのサブセットの一部として彼らの患者を分類することができるようになる。したがって、本発明は患者の後成的染色体相互作用に基づいて患者のために医薬をパーソナル化する方法を医師に提供し、さらに有効な代替的治療レジメを提供する。
【００２１】
別の実施形態において、どのような程度まで対象が１つのサブグループであり集団の他方ではないと規定されるかを判定するための閾値レベルが適用される。典型的には、サブグループは母集団の少なくとも１％、５％、１０％、３０％、５０％または８０％であろう。
【００２２】
ライゲートされた核酸の生成
本発明のある特定の実施形態は、ライゲートされた核酸、特にライゲートされたＤＮＡを利用する。これらは、一緒になって染色体相互作用をする領域の両方からの配列を含み、したがって、相互作用に関する情報を提供する。本明細書中で記載するＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）法は、そのようなライゲートされた核酸の生成を使用して染色体相互作用を検出する。
【００２３】
したがって、本発明の方法は：
（ｉ）染色体座で存在する後成的染色体の相互作用のインビトロ架橋；
（ｉｉ）場合によって前記染色体座から架橋したＤＮＡを単離すること；
（ｉｉｉ）前記架橋したＤＮＡを、例えば、それを少なくとも１回切断する酵素（特に前記染色体座内で少なくとも１回切断する酵素）での制限消化により切断すること；
（ｉｖ）前記架橋し切断されたＤＮＡの末端をライゲートすること（特にＤＮＡループを形成する）；および
（ｖ）前記ライゲートされたＤＮＡおよび／または前記ＤＮＡループの存在を、特にＰＣＲなどの技術を使用して特定して、特異的な染色体の相互作用の存在を特定すること
により、ライゲートされた核酸（例えば、ＤＮＡ）を生成するステップを含み得る。
【００２４】
任意の好適な技術を使用して、ライゲートされた核酸を検出することができ、例えば、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を使用してライゲートされた核酸を検出または特定することができる。この場合、産生されるＰＣＲ産物のサイズは、存在する特異的染色体相互作用を示すものであり得、したがって、座の状態を特定するために使用できる。ＰＣＲを使用して、特定の表現型サブグループについて特異的なバイオマーカーを検出し選択することができる。本明細書中で開示するＰＣＲプライマーまたはプライマー対のいずれか、または同じライゲートされた核酸を増幅することができるホモログおよび／もしくはフラグメントなどの変異体を使用することができる。同様に、本明細書中で開示される任意のプローブ、または同じライゲートされた核酸と特異的に結合できるプローブのホモログおよび／もしくはフラグメントを使用することができる。
【００２５】
当業者には関心対象の染色体座内のＤＮＡを切断するために使用できる多くの制限酵素がわかっているであろう。使用される特定の酵素が、研究対象の座およびその中に位置するＤＮＡの配列に依存することは明らかであろう。本発明で記載するようなＤＮＡを切断するために使用できる制限酵素の非限定例はＴａｑＩである。
【００２６】
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）技術などの実施形態
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）技術の一部は、後成的染色体コンフォメーションシグネチャーの検出におけるマイクロアレイＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーデータの使用に関する。一実施形態において、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイプラットフォームを使用できるが、本発明はこのアレイプラットフォームに限定されない。一実施形態において、本発明は、ＰＣＲに基づく技術のみを使用して実施される。
【００２７】
本明細書中で記載する方法でライゲートされた核酸を利用するＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）などの実施形態はいくつかの利点を有する。例えば、本発明の核酸の第一セットからの核酸配列が核酸の第二セットとハイブリダイズするかまたはハイブリダイズできないかのいずれかであるので、それらは低レベルの確率的雑音を有する。これは、後成的レベルで複雑な機序を測定するための比較的簡単な方法を可能にする二元結果を提供する。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）技術はまた、処理時間が短く低コストである。一実施形態において、処理時間は３〜６時間である。
【００２８】
サンプルおよびサンプル治療
サンプルは個体からのＤＮＡを含む。それは通常細胞を含む。一実施形態において、サンプルは低侵襲性手段によって得られ、血液などであってよい。ＤＮＡを抽出することができ、標準的制限酵素で切断することができる。これは、どの染色体コンフォメーションが保持され、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）プラットフォームで検出されるかをあらかじめ決定することができる。サンプルが患者からあらかじめ得られた血液サンプルである一実施形態において、記載した方法は手順が低侵襲性であるので有利である。水平移動を含む組織と血液との間の染色体相互作用の同期のために、血液サンプルを使用して、組織、例えば疾患に関連する組織における染色体相互作用を出することができる。
【００２９】
本発明で使用する核酸の特性
本発明は核酸に関する。これらは、本明細書中で言及する第一および第二核酸と同じであり得るか、またはその特性のいずれかを有し得る。本発明の核酸は、典型的には、一緒になって染色体相互作用をする染色体の２つの領域のうちの１つからの配列を各々が含む２つの部分を含む。典型的には、各部分が少なくとも８、１０、１５、２０、３０または４０ヌクレオチド長、例えば、１０〜４０ヌクレオチド長である。好ましい核酸（第一および／または第二の核酸セットを含む）は、表のいずれかで言及する遺伝子のいずれかからの配列を含む。好ましい核酸は、特異的プローブ配列のいずれかおよび／もしくは表のいずれかで言及されるプライマー配列のいずれか；またはそのような配列のフラグメントおよび／もしくはホモログを含む。好ましいライゲートされた核酸（第一または第二の核酸セットを含む）は、本明細書中で言及されるプローブ、プライマーまたはプライマー対のいずれかによって検出することができる（例えば特異的に結合する）。好ましくは、核酸はＤＮＡである。特異的配列が言及される場合、本発明は特定の実施形態で必要とされる相補配列を使用し得ることが理解される。
【００３０】
核酸の第二セット−「インデックス」配列
核酸配列の第二セットは、インデックス配列のセットであるという機能を有し、本質的に、サブグループ特異的配列を特定するために好適である核酸配列のセットである。それらは「バックグラウンド」染色体の相互作用を表すことができ、何らかの方法で選択してもよいか、または選択されなくてもよい。それらは概してあらゆる可能な染色体の相互作用のサブセットである。
【００３１】
核酸の第二セットは、任意の好適な方法によって誘導することができる。それらはコンピュータ計算によって誘導することができるか、または個体における染色体相互作用に基づくものであってよい。それらは典型的には、核酸の第一セットより大きな集団群である。特定の一実施形態において、核酸の第二セットは特定の遺伝子セットにおける全ての可能な後成的染色体の相互作用を表す。別の特定の実施形態において、核酸の第二セットは、本明細書中で記載する集団中に存在する全ての可能な後成的染色体の相互作用の大部分を表す。一実施形態において、核酸の第二セットは、少なくとも２０、５０、１００または５００遺伝子、例えば２０〜１００または５０〜５００遺伝子における後成的染色体の相互作用の少なくとも５０％または少なくとも８０％を表す。
【００３２】
核酸の第二セットは、典型的には、少なくとも１００の可能な後成的染色体相互作用を表し、これは、集団における疾患状態／表現型を修飾、調節または何らかの方法で媒介する。核酸の第二セットは、種における疾患状態に影響を及ぼす染色体相互作用を表すことができ、例えば、サイトカイン、キナーゼ、または任意の疾患状態、疾患に対する傾向もしくは疾患表現型に関連するレギュレータをコードする核酸配列を含む。核酸の第二セットは、典型的には、サブグループを規定する特徴に関連する後成的相互作用および関連しない後成的相互作用を表す配列を含む。
【００３３】
特定の一実施形態において、核酸の第二セットは、集団において天然に存在する配列から少なくとも部分的に誘導され、典型的には、コンピュータを用いた方法によって得られる。前記核酸は、天然に存在する核酸中に存在する核酸の対応する部分と比較して単一または複数の変異をさらに含み得る。変異は、１以上のヌクレオチド塩基対の欠失、置換および／または付加を含む。特定の一実施形態において、核酸の第二セットは、天然に存在する種において存在する核酸の対応する部分と少なくとも７０％の配列同一性を有するホモログおよび／またはオルトログを表す配列を含み得る。別の特定の実施形態において、天然に存在する種において存在する核酸の対応する部分に対して少なくとも８０％の配列同一性または少なくとも９０％の配列同一性が提供される。
【００３４】
核酸の第二セットの特性
特定の一実施形態において、核酸の第二セットにおいて少なくとも１００の異なる核酸配列があり、好ましくは少なくとも１０００、２０００または５０００の異なる核酸配列があり、最高１００，０００、１，０００，０００または１０，０００，０００の異なる核酸配列がある。典型的な数は１００〜１，０００，０００、例えば１，０００〜１００，０００の異なる核酸配列である。これらのすべて、または少なくとも９０％もしくは少なくとも５０％は異なる染色体の相互作用に対応する。
【００３５】
特定の一実施形態において、核酸の第二セットは、少なくとも２０の異なる座位もしくは遺伝子、好ましくは少なくとも４０の異なる座位もしくは遺伝子、そしてさらに好ましくは少なくとも１００、少なくとも５００、少なくとも１０００または少なくとも５０００の異なる座位もしくは遺伝子、例えば１００〜１０，０００の異なる座位もしくは遺伝子における染色体相互作用を表す。核酸の第二セットの長さは、それらがワトソン・クリック塩基対合にしたがって核酸の第一セットと特異的にハイブリダイズして、サブグループに対して特異的な染色体相互作用の特定を可能とするのに好適である。典型的には、核酸の第二セットは、一緒になって染色体相互作用をする２つの染色体領域に対応する２つの部分を配列中に含む。核酸の第二セットは、典型的には、少なくとも１０、好ましくは２０、そしてさらに好ましくは３０塩基（ヌクレオチド）長である核酸配列を含む。別の実施形態において、核酸配列は、せいぜい５００塩基対長、好ましくは１００塩基対長まで、そしてさらに好ましくは５０塩基対長までであり得る。好ましい実施形態において、核酸の第二セットは、１７〜２５塩基対の核酸配列を含む。一実施形態において、少なくとも１００、８０％または５０％の核酸配列の第二セットは前記のような長さを有する。好ましくは異なる核酸はオーバーラップする配列を有さず、例えば少なくとも１００％、９０％、８０％または５０％の核酸は少なくとも５の連続するヌクレオチドにわたって同じ配列を有さない。
【００３６】
核酸の第二セットが「インデックス」として作用するなら、第二の核酸の同じセットを異なる特徴のサブグループを表す第一の核酸の異なるセットとともに使用することができる、すなわち、核酸の第二セットは、異なる特徴に関連する染色体相互作用を特定するために使用することができる核酸の「ユニバーサル」なコレクションを表し得る。
【００３７】
核酸の第一セット
核酸の第一セットは、通常、コンパニオン診断に関連する特徴、例えば本明細書中で言及される任意のそのような特徴の有無によって規定される２以上の異なるサブグループに含まれることが知られている個体からのものである。第一の核酸は、本明細書中で言及される核酸の第二セットの特徴および特性のいずれかを有し得る。核酸の第一セットは、通常、本明細書中で記載するような治療および処理、特にＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）架橋および切断ステップを受けた個体からのサンプルに由来する。典型的には、核酸の第一セットは、個体から採取されたサンプル中に存在する染色体相互作用の全部または少なくとも８０％もしくは５０％を表す。
【００３８】
典型的には、核酸の第一セットは、核酸の第二セットによって表される染色体相互作用と比較して核酸の第二セットによって表される遺伝子の座位にわたる染色体相互作用のより小さな集団を表す、すなわち、核酸の第二セットは、座位または遺伝子の所定のセットにおける相互作用のバックグラウンドまたはインデックスセットを表す。
【００３９】
核酸
本明細書中で記載する核酸は、少なくとも２００、少なくとも５００、少なくとも１，０００、少なくとも５，０００または少なくとも１０，０００の異なる核酸、例えば１００，０００までまたは５００，０００までの本明細書中で開示する異なる核酸、例えば「第一」または「第二」の核酸のセットを含む核酸のライブラリの形態であってもよい。ライブラリは、例えば相補配列とハイブリダイズすることが可能になる方法でアレイと結合した核酸の形態であってもよい。
【００４０】
ハイブリダイゼーション
本発明は、核酸の第一セットおよび核酸の第二セットからの全体的または部分的に相補的な核酸配列がハイブリダイズするのを可能にする手段を必要とする。一実施形態において、核酸の第一セットのすべてを核酸の第二セットのすべてと単一のアッセイで、すなわち単一のハイブリダイゼーションステップで接触させる。しかしながら、任意の好適なアッセイを使用できる。本明細書中で記載する実施形態において、核酸の結合は、典型的には、完全または部分的相補配列間のワトソン・クリック塩基対合（ハイブリッド形成）による特異的結合であってもよい。
【００４１】
標識された核酸およびハイブリダイゼーションのパターン
本明細書中で言及される核酸は、例えば、検出可能な標識を使用して、好ましくはハイブリダイゼーション検出の成功を支援するフルオロフォア（蛍光性分子）または放射性標識などの独立した標識を使用して標識してもよい。ある特定の標識をＵＶ光下で検出できる。例えば本明細書中で記載するアレイ上のハイブリダイゼーションのパターンは、２つのサブグループの間の後成的染色体相互作用における差異を表し、したがって、後成的染色体相互作用を比較し、どの後成的染色体相互作用が本発明の集団におけるサブグループに対して特異的であるかを判定する方法を提供する。
【００４２】
「ハイブリダイゼーションのパターン」という語は、核酸の第一および第二セット間のハイブリダイゼーションの有無、すなわち、第一セットからのどの特定の核酸が第二セットからのどの特定の核酸とハイブリダイズするかを広範に対象とし、そして任意の特定のアッセイまたは技術に限定されないか、またはその上で「パターン」が検出され得る表面またはアレイを有する必要はない。
【００４３】
特定のシステム特徴を有するサブグループの選択
本発明は、個体における特徴の存在または非存在を判定するために、染色体相互作用の存在または非存在、典型的には、１〜５、または５〜２０または５〜５００のそのような相互作用、好ましくは１０〜２０または２０〜３００または５０〜１００の相互作用を検出することを含む方法を提供する。好ましくは、染色体相互作用は、本明細書中で言及される遺伝子のいずれかにおけるものである。一実施形態において、分類される染色体相互作用は、本明細書中で開示される関連する表のいずれか１つ以上における核酸によって表されるものである。
【００４４】
好ましくは、本明細書中で言及される関連する遺伝子のいずれか、例えば、任意の表中で言及される遺伝子の少なくとも１、２、３、４、５、６、１０、１４、１５、最大全部の内部での染色体相互作用のいずれかの存在または非存在が検出される。好ましくは、本明細書中で開示される任意の特異的プライマーおよび／またはプローブ配列によって表される染色体相互作用の有無は当該方法で判定される。典型的には、本明細書中で開示される任意の特異的プライマーおよび／またはプローブ配列によって表される１以上、例えば３、５、７または１０の染色体相互作用の存在ならびに本明細書中で開示される任意の特異的プライマーおよび／またはプローブ配列によって表される１以上、例えば３、５、７または１０の染色体相互作用の非存在は当該方法で判定される。これらの数の遺伝子または染色体相互作用を本明細書中で言及される様々な実施形態のいずれかで使用することができる。
【００４５】
具体的な条件
本発明の方法は、本明細書中で言及される具体的な条件または特徴のいずれかの存在を検出するために使用することができ、好ましくは、神経変性疾患または状態、好ましくは認知症、例えばアルツハイマー病、軽度の認知障害、血管性認知症、レビー小体を伴う認知症、前頭側頭認知症、またはさらに好ましくはアルツハイマー病、最も好ましくはβアミロイド凝集体誘発性アルツハイマー病に対する発症の確率および／または傾向を検出するために使用される。
【００４６】
好ましくは、表中で言及される関連する遺伝子のいずれかの内部での染色体相互作用のいずれかの存在および／または非存在が検出される。例えば、表のいずれか１つで言及される少なくとも１、３、５、１０、１４、１５、または２０、または３０、または４２の遺伝子において。好ましくは、表中のプローブ配列によって表される染色体相互作用の存在および／または非存在が当該方法で判定される。これらの数の遺伝子または染色体相互作用を本明細書中で言及される様々な実施形態のいずれかで使用することができる。
【００４７】
試験される個体
試験される個体は、本明細書中で言及する任意の状態または特徴の任意の症状を有していてもよいし、有していなくてもよい。個体は任意のそのような状態または特徴のリスクがあり得る。個体は、好ましくは哺乳類、例えば霊長類、ヒト、非ヒト哺乳類または齧歯類である。個体は、オスであってもメスであってもよい。個体は３０歳またはそれ以上であってよい。個体は２９歳またはそれ以下であってよい。
【００４８】
好ましい遺伝子領域、座位、遺伝子および染色体相互作用
本発明のすべての態様について、好ましい遺伝子領域（例えば、特定の位置番号で規定される）、座位、遺伝子および染色体相互作用が本明細書中で言及される。典型的には、本発明の方法において、染色体相互作用は、表中に列挙される少なくとも１、３、５、１０、１５２０、３０または４２の関連遺伝子から検出される。好ましくは、本明細書中の表のいずれか１つでプローブ配列によって表される少なくとも１、３、５、１０、１５、２０、または３０または４２の関連する特異的染色体相互作用の存在または非存在が検出される。好ましくは、表のいずれかのプライマー配列によって表される少なくとも１、３、５、１０、１５、２０、または３０または４２、例えば１３、１４、２０、３０または４２の関連する特異的染色体相互作用の存在または非存在が検出される。一実施形態において、他の染色体相互作用は検出されない。
【００４９】
当該領域は、本明細書中で言及される遺伝子のいずれかの上流または下流、例えばコーディング配列から、例えば５０ｋｂ上流または２０ｋｂ下流であってよい。
【００５０】
一実施形態において、検出される染色体相互作用は、表中に示される位置のいずれかまたは領域（４ｋｂ領域を含む）のいずれかで存在する。ライゲート産物が当該方法で検出される場合、表のいずれかのプローブ配列で示される配列を検出することができる。したがって、典型的には、好ましくは接合配列を含む、プローブの両領域からの（すなわち、染色体相互作用の両部位からの）配列を検出することができた。好ましい実施形態において、表のいずれかで示すプローブと同じかまたは相補的な配列を含むかまたはこれからなるプローブが当該方法で使用される。いくつかの実施形態では、表で示すプローブ配列のいずれかに対して相同性である配列を含むプローブを使用する。ＰＣＲによる方法でライゲート産物が検出される場合、表のいずれかのプローブ配列のいずれかで示される配列は、検出することができる。プライマーは表中で記載されるプローブ位置および関連する領域を検出することができるかまたは領域内でハイブリダイズするように設計することができる。好ましい実施形態において、任意の表で示されるプライマー対と同じかまたはプライマー対に対して相補的な配列を含むかまたはこれからなるプライマー対が当該方法で使用される。いくつかの実施形態では、表で示されるプライマー配列のいずれかと相同性である、および／または表で示されるプライマー配列のいずれかのフラグメントである配列を含むプライマーを使用する。
【００５１】
本明細書中の表で開示される相互作用のすべてまたは表からの選択（本明細書中で定義される選択のいずれかなど）を表す染色体相互作用の特定の組み合わせを検出すること（すなわち、非存在の存在を判定すること）ができる。本明細書中で言及されるように、特定の数の相互作用を個々の表から選択することができる。一実施形態において、任意の表（表３を含む）で開示される相互作用の少なくとも１０％、２０％、３０％、５０％、７０％または９０％が検出される。
【００５２】
一実施形態において、表３中に示されるｑ値の最低５０％（すなわち、０に最も近い）によって表される、少なくとも１、３、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０の関連する特異的染色体相互作用の存在または非存在が検出される。
【００５３】
一実施形態において、表３中で示されるｑ値の最低５０％によって表される少なくとも１、３、５、６、７、８、９、１０の関連する特異的染色体相互作用の存在は、相互作用の存在がアルツハイマー病に関連する場合に検出される、および／または表３で示されるｑ値の最低５０％によって表される少なくとも１、３、５、６、７、８、９、１０の特異的染色体相互作用の非存在は、相互作用の非存在がアルツハイマー病に関連する場合に検出される。
【００５４】
一実施形態において、０〜０．００３のｑ値を有する表３で示されるありとあらゆる相互作用を検出することができる。別の実施形態において、０．００３〜０．００６のｑ値を有する表３で示されるありとあらゆる相互作用を検出することができる。別の実施形態において、０．００６〜０．０１のｑ値を有する表３で示されるありとあらゆる相互作用を検出することができる。
【００５５】
一実施形態では、配列番号１〜１０で表されるありとあらゆる相互作用が検出される。当該方法は、配列番号１１〜２０で表されるありとあらゆる相互作用が検出されるものであり得る。当該方法は、配列番号２１〜３０で表されるありとあらゆる相互作用が検出されるものであり得る。当該方法は、配列番号３１〜４２で表されるありとあらゆる相互作用が検出されるものであり得る。
【００５６】
検出される相互作用は、例えば本明細書中、例えば本明細書中の任意の表で規定されるような特定の特徴の存在または非存在に対応し得る。相互作用の組み合わせが検出される場合、それらはすべて特徴の存在に相当し得るか、またはすべて特徴の非存在に相当し得る。一実施形態において、検出される相互作用の組み合わせは、特徴の存在に関連する少なくとも２、５または１０の相互作用および特徴の非存在に関連する少なくとも２、５または１０の他の相互作用に相当する。
【００５７】
方法の一実施形態において、本明細書中で開示される特定の相互作用のいずれかまたは本明細書中で開示される特定の選択のいずれかは、当該方法では検出されない。したがって、当該方法は配列番号１〜１０によって表される相互作用が検出されないものであり得る。当該方法は、配列番号１１〜２０によって表される相互作用が検出されないものであり得る。当該方法は配列番号２１〜３０によって表される相互作用が検出されないものであり得る。当該方法は配列番号３１〜４２によって表される相互作用が検出されないものであり得る。
【００５８】
本明細書中で提示する表
本明細書中の表は、プローブ（ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカー）データまたは状態（第一に言及した群）において存在し、対照群において存在しないか、またはその状態において存在せず、対照群において存在する染色体相互作用を表す遺伝子データのいずれかを示す。プローブ配列は、一緒になって染色体相互作用をする遺伝子領域の両領域から生成するライゲート産物を検出するために使用できる配列を示す、すなわち、プローブはライゲート産物中の配列に対して相補性である配列を含む。スタート−エンド位置の第一の２つのセット（Ａ）はプローブ位置を示し、スタート−エンド位置の第二の２つのセット（Ｂ）は関連する４ｋｂ領域を示す（表２ｂ）。
【００５９】
遺伝子表データは、関連する染色体相互作用が起こることが見い出された遺伝子を示す。
【００６０】
表３は、指名されたプローブのそれぞれおよびプライマーのセットについて算出されたｑ値を示す。試験のｑ値は、特定の試験が有意と呼ばれる場合の発生した偽陽性の割合（偽陽性率と呼ばれる）を評価する。プローブは、状態を有するサブグループにおいて高頻度にみられるマーカー、または状態を有するサブグループにおいて存在しないが、対照サブグループにおいて存在するマーカーを表し得る。
【００６１】
表４は本発明の方法での使用に好ましいマーカーを列挙する。これらのマーカーは、例えば、増幅反応において直接マーカーと関連するプライマーを用いて、またはプローブ配列を使用することによって検出することができる。ＡＤ−Ｐマーカーはアルツハイマー患者において存在するが、対照患者においては存在しない。ＡＤ−Ｎマーカーは対照患者において高頻度にみられるが、アルツハイマー患者では高頻度で見られない。
【００６２】
プローブはＴａｑ１部位から３０ｂｐ離れているように設計される。ＰＣＲの場合、ＰＣＲプライマーはまた、ライゲート産物を検出するように設計されるが、Ｔａｑ１部位からのそれらの位置は様々である。
【００６３】
プローブ位置：
スタート１−フラグメント１上のＴａｑＩ部位の３０塩基上流
エンド１−フラグメント１上のＴａｑＩ制限部位
スタート２−フラグメント２上のＴａｑＩ制限部位
エンド２−フラグメント２上のＴａｑＩ部位の３０塩基下流
４ｋｂ配列位置：
スタート１−フラグメント１上のＴａｑＩ部位の４０００塩基上流
エンド１−フラグメント１上のＴａｑＩ制限部位
スタート２−フラグメント２上のＴａｑＩ制限部位
エンド２−フラグメント２上のＴａｑＩ部位の４０００塩基下流
【００６４】
サンプル調製および染色体相互作用検出の好ましい実施形態
サンプルを調製する方法および染色体コンフォメーションを検出する方法を本明細書中で記載する。これらの方法の最適化（非従来型）バージョンは、例えばこの節で記載されているように使用することができる。
【００６５】
典型的には、サンプルは少なくとも２×１０５個の細胞を含む。サンプルは最大５×１０５個の細胞を含み得る。一実施形態において、サンプルは２×１０５〜５．５×１０５個の細胞を含む。
染色体座で存在する後成的染色体の相互作用の架橋を本明細書中で記載する。これは、細胞溶解が起こる前に実施することができる。細胞溶解は、３〜７分、例えば４〜６または約５分間実施することができる。いくつかの実施形態において、細胞溶解を少なくとも５分間および１０分未満実施する。
【００６６】
制限酵素でのＤＮＡの消化を本明細書中で記載する。典型的には、ＤＮＡ制限を約５５℃〜約７０℃で、例えば約６５℃で、約１０〜３０分の期間、例えば約２０分実施する。
【００６７】
好ましくは、フリークエントカッター（ｆｒｅｑｕｅｎｔ  ｃｕｔｔｅｒ）制限酵素を使用し、これにより最大４０００塩基対の平均フラグメントサイズを有するライゲートされたＤＮＡのフラグメントが得られる。場合によって、制限酵素により約２００〜３００塩基対、例えば約２５６塩基対の平均フラグメントサイズを有するライゲートされたＤＮＡのフラグメントが得られる。一実施形態において、典型的にはフラグメントサイズは２００塩基対〜４，０００塩基対、例えば４００〜２，０００または５００〜１，０００塩基対である。
【００６８】
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）法の一実施形態では、ＤＮＡ調製ステップはＤＮＡ制限消化ステップとＤＮＡライゲーションステップとの間で実施されない。
【００６９】
ＤＮＡライゲーションを本明細書中で記載する。典型的には、ＤＮＡライゲーションを５〜３０分、例えば約１０分間実施する。
【００７０】
サンプル中のタンパク質は酵素により、例えばプロテイナーゼ、場合によってプロテイナーゼＫを使用して消化することができる。タンパク質を約３０分〜１時間の期間、例えば約４５分間酵素により消化することができる。一実施形態において、タンパク質の消化、例えばプロテイナーゼＫ消化後、架橋逆転（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋ  ｒｅｖｅｒｓａｌ）またはフェノールＤＮＡ抽出ステップはない。
【００７１】
一実施形態において、ＰＣＲ検出は、ライゲートされた核酸の単一のコピーを、好ましくはライゲートされた核酸の存在／非存在についての二元読み出しとともに検出することができる。
【００７２】
本発明の方法および使用
本発明の方法は、様々な方法で記載することができる。ライゲートされた核酸を作製する方法であって、（ｉ）一緒になって染色体相互作用をする染色体領域をインビトロ架橋し；（ｉｉ）前記架橋したＤＮＡを切断または制限消化切断に供し；そして（ｉｉｉ）前記架橋し切断されたＤＮＡの末端をライゲートして、ライゲートされた核酸を形成することを含み、ライゲートされた核酸の検出を使用して、座での染色体状態を決定することができ、好ましくは：
−座は本明細書中で言及される座位、領域または遺伝子のいずれかであり得、
−および／または染色体の相互作用は、本明細書中で言及されるか、もしくは表中で開示されるプローブのいずれかに対応する染色体相互作用のいずれかであり得、および／または
−ライゲート産物が（ｉ）本明細書中で開示されるプローブ配列のいずれかと同じかもしくは相同性である配列；または（ｉｉ）（ｉｉ）に対して相補性である配列を有し得るかもしくは含み得る方法として記載することができる。
【００７３】
ホモログおよびフラグメント
どの実施形態においても、特異的配列のホモログおよび／またはフラグメントを代わりに使用することができ、場合によって、それらはもとの配列と同じ結合特徴を有する。
【００７４】
ポリヌクレオチド／核酸（例えば、ＤＮＡ）配列のホモログが本明細書中で言及される。そのようなホモログは、典型的には、少なくとも７０％の相同性、好ましくは少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の相同性を、例えば少なくとも１０、１５、２０、３０、１００もしくはそれ以上の連続したヌクレオチドの領域にわたって、または染色体相互作用に関与する染色体の領域からの核酸の部分にわたって有する。相同性は、ヌクレオチド同一性（「ハード相同性（ｈａｒｄ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」と称する場合がある）に基づいて算出することができる。
【００７５】
したがって、特定の実施形態において、ポリヌクレオチド／核酸（例えば、ＤＮＡ）配列のホモログは％配列同一性を参照して言及される。典型的には、そのようなホモログは、少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を、例えば少なくとも１０、１５、２０、３０、１００またはそれ以上の連続したヌクレオチドの領域にわたって、または染色体相互作用に関与する染色体の領域からの核酸の部分にわたって有する。
【００７６】
例えば、ＵＷＧＣＧ  Ｐａｃｋａｇｅは、相同性および／または％配列同一性を算出するために使用できるＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供する（例えばそのデフォルト設定で使用）（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ  （１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２，ｐ３８７−３９５）。ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ．Ｆ．（１９９３）Ｊ  ＭｏＩ  Ｅｖｏｌ  ３６：２９０−３００；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ，Ｆ  ｅｔ  ａｌ（１９９０）Ｊ  ＭｏＩ  Ｂｉｏｌ  ２１５：４０３−１０で記載されているようにして相同性および／または％配列同一性および／またはラインナップ配列（等価配列または対応する配列を特定するなど（典型的にはそれらのデフォルト設定で）を算出することができる。
【００７７】
ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは全米バイオテクノロジー情報センターから好適に入手可能である。このアルゴリズムは、まず、データベース配列中の同じ長さのワードと整列した場合に、ある正の値の閾値スコアＴと一致するかまたは満足するかのいずれかであるクエリ配列中の長さＷの短いワードを特定することによって高スコア配列対（ＨＳＰ）を特定することを含む。Ｔは近傍ワードスコア（近傍ワードスコア）閾値と称する（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ、上記）。これらの初期近傍ワードヒットは、それらを含むＨＳＰを見つけるための検索を開始するためのシードとして作用する。ワードヒットは、累積アラインメントスコアを増大させることができる範囲まで各配列にそって両方向に拡張される。各方向でのワードヒットの拡張は、累積アラインメントスコアがその最大実績値から量Ｘだけ減少する場合；１以上の負のスコアの剰余アラインメントの蓄積のために累積スコアがゼロ以下になる場合；またはいずれかの配列のエンドに達した場合、停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ５ＴおよびＸはアラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５−１０９１９を参照）アラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両ストランドの比較を使用する。
【００７８】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは２つの配列間の類似性の統計的分析を実行する；例えば、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７を参照。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の一手段は最小合計（ｓｍａｌｌｅｓｔ  ｓｕｍ）確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは２つのポリヌクレオチド配列間でどのような一致が偶然起こるかによって確率の指標を提供する。例えば、配列は、第一配列を第二配列と比較した最小合計確率が約１未満、好ましくは約０．１未満、さらに好ましくは約０．０１未満、そして最も好ましくは約０．００１未満である場合に、別の配列と類似しているとみなされる。
【００７９】
相同性配列は、典型的には、１、２、３、４またはそれ以上の塩基、例えば１０、１５または２０未満の塩基が異なる（ヌクレオチドの置換、欠失または挿入であり得る）。これらの変化は、相同性および／または％配列同一性の算出に関連して上述した領域のいずれかにわたって測定することができる。
【００８０】
配列のフラグメントまたは一部は、典型的には、もとの配列の少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、９０％または１００％を含み、典型的には、少なくとも１０、２０または３０塩基対長である。
【００８１】
アレイ
核酸の第二セットはアレイと結合していてもよく、一実施形態において、好ましくは少なくとも３００、９００、２０００または５０００の座位を表す、アレイに結合した少なくとも１５，０００、４５，０００、１００，０００または２５０，０００の異なる第二の核酸がある。一実施形態において、第二の核酸の異なる集団の一つ、またはそれ以上、または全部がアレイの一つより多い異なる領域に結合し、事実上、アレイ上で反復して、エラー検出を可能にする。アレイは、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ  Ｇ３  Ｃｕｓｔｏｍ  ＣＧＨマイクロアレイプラットフォームに基づくものであってよい。第一の核酸のアレイへの結合の検出は、二色システムによって実施することができる。
【００８２】
治療薬
治療薬を本明細書中で言及する。本発明は、関連する状態の予防または治療するための薬剤を提供する。これは、必要とする個体に治療上有効な量の薬剤を投与することを含み得る。本発明は、疾患を予防または治療するための薬物の製造における薬剤の使用を提供する。本発明の方法は、治療のために個体を選択するために使用することができる。本発明の方法、そして特にコンパニオン後成的試験を実施するための方法は、方法によって特定された個人に、次いで関連する状態を予防または治療する薬剤を投与してもよい治療ステップを含んでもよい。
【００８３】
薬剤の処方は、薬剤の性質に依存するであろう。薬剤および医薬上許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物の形態で提供される。好適な担体および希釈剤は、等張生理食塩水、例えばリン酸塩緩衝食塩水を含む。典型的な経口投与組成物には、錠剤、カプセル、液状溶液および液状懸濁液が含まれる。薬剤は、非経口、静脈内、筋肉内、皮下、経皮または経口投与ように処方することができる。
【００８４】
薬剤の用量は、様々なパラメータにしたがって、特に使用する物質；治療される個体の年齢、体重および状態；投与経路；および必要とされるレジメンに従って、決定することができる。医師は任意の特定の薬剤について必要とされる投与経路および投与量を決定することができる。しかしながら、好適な用量は０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、例えば１〜４０ｍｇ／ｋｇ体重を、例えば、１日１〜３回摂取する。
【００８５】
本明細書中で言及する物質の形態
本明細書中で言及する物質、例えば核酸または治療薬のいずれかは、精製または単離形態であってよい。それらは、自然界で見出されるものとは異なる形態であってもよく、例えば、それらは自然界に共存しない他の物質と組み合わせて存在していてもよい。核酸（本明細書中で定義される配列の一部を含む）は、例えば、相同性に関する節で記載するような配列における少なくとも１、２、３、４またはそれ以上のヌクレオチド変化を有する、自然界で見出されるものとは異なる配列を有し得る。核酸は、５’または３’末端で異種配列を有し得る。核酸は、自然界で見出されるものとは化学的に異なり得、例えば、それらは何らかの方法で修飾されていてもよいが、好ましくは、それでもワトソン・クリック塩基対合可能である。適切な場合、核酸は二本鎖または一本鎖形態で提供される。本発明は、一本鎖または二本鎖形態で本明細書中にて言及される特定の核酸配列のすべてを提供し、したがって、開示される任意の配列に対する相補鎖を含む。
【００８６】
本発明はまた、特定のサブグループに関連する染色体の相互作用の検出を含む、本発明の任意のプロセスを実施するためのキットも提供する。そのようなキットは、関連する染色体の相互作用を検出できる特異的結合剤、例えば本発明のプロセスによって生成されるライゲートされた核酸を検出できる薬剤を含み得る。キット中に存在する好ましい薬剤は、例えば、ＰＣＲ反応においてライゲートされた核酸を増幅できる、本明細書中で記載するような、ライゲートされた核酸またはプライマー対とハイブリダイズすることができるプローブを含む。
【００８７】
本発明はまた、関連する染色体相互作用を検出できるデバイスも提供する。デバイスは、好ましくは、染色体相互作用を検出できる任意の特異的結合剤、プローブまたはプライマー対、例えば本明細書中で記載する任意のそのような薬剤、プローブまたはプライマー対を含む。
【００８８】
特定の記載した状態のために本発明で使用するために好ましい治療薬
Ａ．軽度から中等度のアルツハイマー病（ＭＭＡＤ）の治療
コリンエステラーゼ阻害剤を使用して、軽度から中等度のアルツハイマー病を治療することができる。使用できる薬物としては、ガランタミン、リバスチグミンおよびドネペジルが挙げられる。
Ｂ．中等度から重度のアルツハイマー病の治療
Ｄ−アスパラギン酸Ｎ−メチル拮抗物質は中等度から重度のアルツハイマー病を治療するために処方することができ、例えば、メマンチンはアルツハイマー病の治療のためにＦＤＡによって承認されたＮＭＤＡ拮抗物質である。
【００８９】
ＮＭＤＡ拮抗物質はコリンエステラーゼ阻害剤と組み合わせて使用することができる。例えば、アリセプトおよびナムザリック、メマンチンとドネペジルとの組み合わせは、中等度から重度のアルツハイマー病の治療のためにＦＤＡによって承認されている。
【００９０】
当業者は、当該技術分野において適切な、他の神経変性状態用の治療薬を特定することができる。
【００９１】
具体的な実施形態
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）プラットフォーム技術は座位における正常状態および異常状態間の調節変化の後成的調節シグネチャーを検出する。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）プラットフォームは、染色体コンフォメーションシグネチャーとも呼ばれるヒト染色体の調節高次構造と関連する遺伝子調節の基礎的後成的レベルを特定しモニタリングする。染色体シグネチャーは遺伝子調節解除のカスケードにおける独立した主要ステップである。それらは、例えばＤＮＡメチル化およびＲＮＡプロファイリングなどの後期後成的および遺伝子発現バイオマーカーを利用するバイオマーカープラットフォームに対して独自の利点を有する高次バイオマーカーである。
【００９２】
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイアッセイ
カスタムＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイスクリーニングプラットフォームは、１５Ｋ、４５Ｋ、１００Ｋ、および２５０Ｋの４種の密度の独自の染色体コンフォメーションで得られ、各キメラフラグメントはアレイ上で４回反復されて、それぞれ６０Ｋ、１８０Ｋ、４００Ｋおよび１００００００の有効な密度を形成する。
【００９３】
カスタムデザインのＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイ
１５ＫのＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイは、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）バイオマーカー発見技術で求められた約３００座位を含む全ゲノムをスクリーニングできる。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイはＡｇｉｌｅｎｔ  ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ  Ｇ３  Ｃｕｓｔｏｍ  ＣＧＨマイクロアレイプラットフォーム上で構築される；この技術は４種の密度、すなわち、６０Ｋ、１８０Ｋ、４００Ｋおよび１００００００プローブを提供する。アレイ当たりの密度は、各ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）プローブが４連で提供されるので１５Ｋ、４５Ｋ、１００Ｋおよび２５０Ｋに減少し、したがって、再現性の統計的評価が可能になる。遺伝子座あたりの求められる潜在的ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーの平均数は５０であり；したがって、調査できる座位の数は３００、９００、２０００、および５０００である。
【００９４】
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）Ｃｕｓｔｏｍアレイパイプライン
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイは、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ライブラリ作成後にＣｙ５中で標識されたサンプルの一セットとＣｙ３中で標識された比較／分析される他方のサンプル（対照）とを有する二色システムである。アレイは、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＳｕｒｅＳｃａｎ  Ｓｃａｎｎｅｒを使用してスキャンし、結果物の特徴は、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｆｅａｔｕｒｅ抽出ソフトウェアを使用して抽出する。データを次に、ＲにおけるＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイプロセッシングスクリプトを使用して処理する。アレイは、ＲにおけるＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ中の標準的二色パッケージ：Ｌｉｍｍａ＊を使用して処理する。アレイの正規化は、Ｌｉｍｍａ＊における正規化されたアレイ内関数を用いて行われ、これは、チップ上のＡｇｉｌｅｎｔ陽性対照およびＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）陽性対照に関して実施される。データをＡｇｉｌｅｎｔ  Ｆｌａｇコールに基づいてフィルタリングし、Ａｇｉｌｅｎｔ対照プローブを除去し、技術的複製プローブは、Ｌｉｍｍａ＊を用いて分析するために平均する。プローブは、比較される２つのシナリオ間の差異に基づいてモデル化され、次いで偽陽性率を用いて補正される。＜＝−１．１または＝＞１．１であり、ｐ＜＝０．１ＦＤＲ  ｐ値にパスする変動係数（ＣＶ）＜＝３０％を有するプローブをさらなるスクリーニングのために使用する。プローブセットを減らすために、さらなる多因子分析を、ＲにおけるＦａｃｔｏｒＭｉｎｅＲパッケージを使用して実施する。
＊注：ＬＩＭＭＡは、マイクロアレイ実験における差次的発現を評価するための線形モデルおよび経験的ベイズプロセスである。Ｌｉｍｍａは、マイクロアレイまたはＲＮＡ−Ｓｅｑから得られる遺伝子発現データの分析のためのＲパッケージである。
【００９５】
プローブのプールをまず最終ピッキングのために、調節したｐ値、ＦＣおよびＣＶ＜３０％（任意のカットオフポイント）パラメータに基づいて選択する。さらなる分析および最終リストを最初の２つのパラメータ（調節したｐ値；ＦＣ）のみに基づいて作成する。
【００９６】
統計的パイプライン
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）スクリーニングアレイは、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＰＣＲプラットフォーム上での翻訳のために高値のＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーを選択するために、ＲにおいてＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｐａｃｋａｇｅを使用して処理する。
【００９７】
ステップ１。プローブはそれらの補正されたｐ値（偽陽性率、ＦＤＲ）に基づいて選択され、これは修飾された線形回帰モデルの積である。ｐ値＜＝０．１以下のプローブが選択され、次にそれらの後成的比率（ＥＲ）によってさらに減少され、プローブＥＲはさらなる分析のために選択するために、＜＝−１．１または＝＞１．１でなければならない。最後のフィルターは変動係数（ＣＶ）であり、プローブは＜＝０．３以下でなければならない。
【００９８】
ステップ２。統計的リストからの上位４０のマーカーをＰＣＲ翻訳のためのマーカーとしての選択のためにそれらのＥＲに基づいて選択する。最高の負のＥＲロードを有する上位２０のマーカーおよび最高の正のＥＲロードを有する上位２０のマーカーでリストを形成する。
【００９９】
ステップ３。ステップ１から結果として得られるマーカー、統計的に有意なプローブは超幾何学的エンリッチメント（ＨＥ）を用いたエンリッチメント分析の基礎をなす。この分析は有意なプローブリストからのマーカーの減少を可能にし、ステップ２からのマーカーとともに、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＰＣＲプラットフォーム上に翻訳されたプローブのリストを形成する。
【０１００】
統計的プローブをＨＥによって処理して、どの遺伝子位置が統計的に有意なプローブの濃縮を有し、どの遺伝子位置が後成的差異のハブであるかを示すかを判定する。
【０１０１】
正しいｐ値に基づく最も重要な濃縮座位を、プローブリスト作成のために選択する。０．３または０．２のｐ値の下の遺伝子位置が選択される。ステップ２からのマーカーを用いてこれらの遺伝子位置に対して統計的プローブをマッピングすることで、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＰＣＲ翻訳のための高値マーカーが形成される。
【０１０２】
アレイ設計およびプロセッシング
アレイ設計
１．遺伝子座は、ＳＩＩソフトウェア（現在はｖ３．２）を使用して処理して：
ａ．これらの特定の遺伝子座におけるゲノムの配列（上流に５０ｋｂおよび下流に２０ｋｂを有する遺伝子配列）を取り出し、
ｂ．この領域内の配列がＣＣに関与する確率を規定し、
ｃ．特異的ＲＥを使用して配列を切断し、
ｄ．どの制限フラグメントがある特定の配向で相互作用しやすいかを判定し、
ｅ．一緒になって相互作用する異なるＣＣの尤度をランク付けする。
２．アレイサイズと、したがって利用可能なプローブ位置の数（ｘ）を決定する。
３．ｘ／４相互作用を取り出す。
４．各相互作用について、パート１からの制限部位に対する３０ｂｐおよびパート２からの制限部位に対する３０ｂｐの配列を規定する。それらの領域が繰り返し配列でないかを調べ、もしそうであるならば除外し、次の相互作用をリストに載せる。両３０ｂｐをあわせてプローブを規定する。
５．ｘ／４のプローブ＋規定された対照プローブのリストを作成し、４回複製して、アレイ上に作成されるリストを作成する。
６．プローブのリストをカスタムＣＧＨアレイ用にＡｇｉｌｅｎｔ  Ｓｕｒｅデザインウェブサイトにアップロードする。
７．プローブ群を使用して、ＡｇｉｌｅｎｔカスタムＣＧＨアレイを設計する。
【０１０３】
アレイプロセッシング
１．鋳型産生用のＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＳＯＰを使用してサンプルを処理する。
２．アレイプロセッシング実験室によりエタノール沈澱で浄化する。
３．血液、細胞または組織のゲノムＤＮＡ分析酵素標識のためのＡｇｉｌｅｎｔ  ＳｕｒｅＴａｇ完全ＤＮＡ標識キット−Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｒｒａｙ−ｂａｓｅｄ  ＣＧＨにしたがってサンプルを処理する。
４．Ａｇｉｌｅｎｔ特徴抽出ソフトウェアを使用するＡｇｉｌｅｎｔ  Ｃ  Ｓｃａｎｎｅｒを用いてスキャンする。
【０１０４】
刊行物
本明細書中で言及するすべての刊行物の内容は、参照により本明細書に組み込まれ、本発明に関連する特徴をさらに規定するために使用することができる。
【実施例】
【０１０５】
本発明者らは、ＡＤ（アルツハイマー病）陽性患者および年齢が一致したＡＤ陰性対照の所見に基づいて神経変性状態を有する患者の後成的プロフィールを特徴づけた。ＡＤマーカーが特定された遺伝子の詳細を表１に示し、また関連するプローブ配列および位置も示す（表２）。商標名ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）抽出プロセスは、抽出反応あたり５０μｌの血液を使用してサンプルに関して実施した。簡単に言うと、サンプルをホルムアルデヒドで固定し、１５分間インキュベートし、グリシンでクエンチした。サンプルを溶解させ、密度クッション遠心分離（ｄｅｎｓｉｔｙ  ｃｕｓｈｉｏｎ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）を使用して核を精製した。Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙライゲーションは制限酵素ＴａｑＩおよびＴ４  ＤＮＡリガーゼを使用して実施した。各抽出のために、タンパク質およびＲＮＡ量を、プロテイナーゼＫを介して除去した。
【０１０６】
ネステッドＰＣＲは、鋳型として１３μｌのサンプル希釈シリーズを使用して実施した。ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸ  Ｔｏｕｃｈ  ＨＴ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）ハイスループットゲル電気泳動システムを使用してＰＣＲ産物を分析した。Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ製のＬａｂＣｈｉｐシステムは、キャピラリー電気泳動を使用して「Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  ｃｈｉｐ」の内部でゲル電気泳動を実施する。ＰＣＲ産物の検出は、ＤＮＡ  Ｄｙｅ／ｌａｓｅｒ励起システムおよびサイジングおよび標準的ラダーに対して算出した濃度測定値によるものである。各ラダーおよび試験したサンプルは、キャピラリーゲル電気泳動を実施する前に下側および上側マーカー化合物を混入させて、ラダーに対して正しいアラインメントを可能にする。ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸシステムの出力は、Ｙ軸上にＲｅｌａｔｉｖｅ  蛍光性ユニットおよびＸ軸上に時間の電気泳動図の形態である（例えば、図２および３）。Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒソフトウェアは電気泳動図のバーチャルゲル画像を作製して、伝統的なゲル画像を表す。検出された各ＤＮＡピークのサイズおよび濃度を定量化し、電気泳動図／バーチャルゲル画像およびエクスポート可能な表で提示する。
【０１０７】
正しいサイズとして特定されたピークを含むＰＣＲ反応（可能な３Ｃ相互作用に基づいて予想されるサイズと一致するもの）を「１」と記録して、生成物の検出を意味し、一方、サンプルが検出されない生成物である場合は「０」と記録する。この読み出しは、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈネステッドＰＣＲプラットフォームの二元読み出しを提供する。別のＴａｑＩ部位のために各プライマー組み合わせについて複数のサイズのピークが予想され、したがって、すべての予想されるピークサイズを分析する。
【０１０８】
患者診断
５人のアルツハイマー患者（重度から軽度の認知症）、および５人の年齢が一致した対照由来のライゲートされたＤＮＡを有するサンプルを、表３に記載したプライマーを使用するＰＣＲアッセイに供した。
【０１０９】
表３は、対照群からの患者に対するＡＤのＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）プローブ（ＡＤ−Ｎ）を、マーカーのｑ値およびマーカーがアルツハイマー患者コホートまたは対照コホートにおいて高頻度でみられるかとともに示す。
【０１１０】
表４は、アルツハイマー病にかかっている対象において高頻度でみられるか、またはアルツハイマー病にかかっていない対象で存在しないと予想されるかをはじめとする、ＡＤについての１４の好ましいマーカーの詳細を提示する。
【０１１１】
サンプル
本データをもたらす血液サンプルはすべてロシア国モスクワ市の白色人種由来のものであった。
【０１１２】
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【０１１３】
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【０１１４】
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【０１１５】
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【０１１６】
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【０１１７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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