(57)【要約】  生物学的又は非生物学的サンプル中のクロストリジウム・ディフィシルのｔｃｄＣ遺伝子における一塩基欠失の存在又は不存在を検出するための方法を記載する。本方法は、増幅工程、ハイブリダイズ工程、及び検出工程を実施することを含みうる。更に、一塩基欠失の検出用に設計されたプライマー、プローブ、およびキットを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中のＣ．ディフィシルのリボタイプ０２７株のｔｃｄＣ遺伝子のヌクレオチド１１７位における一塩基欠失（ｔｃｄＣΔ１１７）を検出する方法であって、
該方法は、
サンプルをｔｃｄＣプライマーのセットに接触させ、ｔｃｄＣ核酸がサンプル中に存在する場合、増幅産物を生成することを含む増幅工程を実施すること；
増幅産物を検出可能なｔｃｄＣΔ１１７プローブに接触させることを含むハイブリダイズ工程を実施すること；及び、
前記検出可能なｔｃｄＣΔ１１７プローブからのシグナルの存在又は不存在を検出すること，ここで、シグナルの存在はサンプル中のｔｃｄＣΔ１１７の存在を示し、シグナルの不存在はサンプル中のｔｃｄＣΔ１１７の不存在を示す；
を含み、
ここで前記検出可能なｔｃｄＣΔ１１７プローブは、ヌクレオチド１１７位における一塩基欠失に完全に相補的なコンティグ配列を有するレポータードメインを含むＣｏｂｒａプローブであり、かつ前記レポータードメインは、１つまたは複数のヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）を含む非ヌクレオシドリンカーによりアンカードメインから分離されている、前記方法。
【請求項２】
前記ハイブリダイズ工程は、前記増幅産物をドナー蛍光部分および対応するアクセプター蛍光部分が標識された前記Ｃｏｂｒａプローブに接触させることを含み；かつ
前記検出工程は、前記Ｃｏｂｒａプローブのドナー蛍光部分とアクセプター蛍光部分間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の存在又は不存在を検出することを含み，ここで、蛍光の存在又は不存在は、サンプル中のｔｃｄＣΔ１１７の存在又は不存在を示す、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記増幅は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素を用いる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｃｏｂｒａプローブは、配列番号１及び２からなる群より選択される配列又はそれらの相補体を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ｔｃｄＣΔ１１７プローブは、二次構造の形成を許容する核酸配列を含み、ここで前記二次構造の形成は、ドナー蛍光部分とアクセプター蛍光部分の間が空間的に近接する結果をもたらす、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記第２の蛍光部分は、クエンチャーである、請求項２〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
Ｃ．ディフィシルのリボタイプ０２７株のｔｃｄＣ遺伝子のヌクレオチド１１７位における一塩基欠失（ｔｃｄＣΔ１１７）を検出するためのキットであって、
一対のオリゴヌクレオチドプライマー、ここで、各オリゴヌクレオチドプライマーは、ヌクレオチド１１７位を含むｔｃｄＣ遺伝子の部分配列の逆鎖にハイブリダイズ可能である；および
配列番号１および２からなる群より選択される配列又はそれらの相補体を含む検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドプローブ：
を含むキット。
【請求項８】
前記検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、ドナー蛍光部分および対応するアクセプター蛍光部分を含む、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
前記アクセプター蛍光部分はクエンチャーである、請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
ヌクレオシド三リン酸、核酸ポリメラーゼ、および核酸ポリメラーゼの機能に必要なバッファを更に含む、請求項７〜９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１１】
配列番号１および２からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドの配列又はそれらの相補体を含むオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
前記オリゴヌクレオチドは少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項１１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
前記オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの保存的に修飾されたバリエーションを含む、請求項１１又は１２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
１つまたは複数の検出可能な標識を更に含む、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
前記オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの標識部分及び／又は少なくとも１つのクエンチャー部分を含む、請求項１４に記載のオリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物診断の分野に関し、より具体的には、クロストリジウム・ディフィシルのエピデミックなリボタイプのマーカーの検出に関する。
【背景技術】
【０００２】
クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ，「Ｃ．ディフィシル」又は「Ｃ．ｄｉｆｆ」）は、重度の下痢その他の腸疾患を引き起しうる嫌気性、グラム陽性、胞子形成細菌である。Ｃ．ディフィシル胞子は病院内でみられることが多く、胞子が直接感染を引き起こすことはないものの、消化されると、活性のある感染性の形態に変換しうる。Ｃ．ディフィシル感染症は、単純な下痢から著しい罹患率や死亡率につながるような偽膜性大腸炎まで広範な臨床的な症状を含む。抗生物質関連の大腸炎は、腸内細菌叢の競合細菌が抗生物質によって一掃されると発症しＣ．ディフィシルによって引き起こされる腸の感染症である。それは患者が院内でかかる最も一般的な感染症である。
【０００３】
Ｃ．ディフィシルによる感染症はほとんどが、病院や介護施設などの施設にて６５歳以上の高齢者や患者間で発生する。１９９６年から２００９年にかけてＣ．ディフィシル率は、６５歳以上の入院患者では２００％、６５〜７４歳の患者では１７５％、７５〜８４歳の患者では１９８％、８５歳以上の患者では２０１％増加した。８５歳以上の患者のディフィシル率は他の年齢層に対し著しく高かった（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｄｉｓｃｈａｒｇｅ  Ｓｕｒｖｅｙ，Ａｎｎｕａｌ，Ｆｉｌｅｓ，１９９６−２００９）。
【０００４】
近年、院内感染および地域感染型のクロストリジウム・ディフィシル感染症（ＣＤＩ）の罹患率が増加しており、特に北半球では、高毒性の０２７／ＮＡＰ／ＢＩ（リボタイプ０２７）株が蔓延している。病原性Ｃ．ディフィシルでは、毒素ＡおよびＢがそれぞれｔｃｄＡおよびｔｃｄＢによってコードされ、それらの発現がｔｃｄＲ（正の調節因子）およびｔｃｄＣ（負の調節因子）によって制御される。リボタイプ０２７株の高い毒性は、ｔｃｄＣのヌクレオチド１１７位における一塩基欠失（ｔｃｄＣΔ１１７）の結果として毒素Ａ／Ｂ産生が増加すること並びにｃｄｔＡ及びｃｄｔＢによりコードされる二元毒素ＣＤＴの産生に起因すると仮定されている（ＭａｃＣａｎｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  ４４：６，  ２１４７−２１５２，  ２００６）。ｔｃｄＣは特徴的な１８ｂｐの欠失（ヌクレオチド３３０〜３４７位）があるものの、かかる欠失のみでは機能に影響を及ぼさない（Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１３６：１９１３-１９２４，２００９）。遺伝子バリエーションおよび変異が、病原体を識別するために用いることができ、特定の場合、予後および治療経過を予測するのに有用である。それ故、依然として、敏感かつ特異的であり、かつ偽陽性または偽陰性の結果に対し感受性が低い、Ｃ．ディフィシルの高病原性株におけるバリエーションおよび突然変異を検出するための分子試験を開発する大きな臨床的必要性がある。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、Ｃ．ディフィシルを含有することが疑われる生物学的又は非生物学的サンプル中のＣ．ディフィシルのｔｃｄＣ遺伝子のヌクレオチド１１７位における一塩基欠失（ｔｃｄＣΔ１１７）の存在を検出するための方法に関する。本発明の実施形態は、米国特許第８，４０９，８０２号及び米国特許第９，０６８，２２５号に開示される「Ｃｏｂｒａ」プローブの使用を伴う。簡潔にいうと、Ｃｏｂｒａプローブは検出可能なシグナルで標識され、２つのドメインがリンカー部で分離されている。第１のドメインは、遺伝子バリエーションまたは変異（例えば、ｔｃｄＣ遺伝子における一塩基欠失）を含む標的核酸の領域に対して相補的になるよう設計されている５’レポーター配列である。第２のドメインは、標的核酸に対して完全に相補的になるよう設計され、配列ミスマッチに耐性であるか、または標的核酸の相補的な領域内における可変性が低い領域と二本鎖を形成するように設計されている３’アンカー配列である。Ｃｏｂｒａプローブのレポータードメインおよびアンカードメインは、レポーター配列およびアンカー配列の両方が標的核酸にハイブリダイズする場合、わずかな数のヌクレオチドしか介在せずに互いに隣接する標的核酸内の領域に結合するように設計されている。リンカー部は、アンカードメインからレポータードメインを分離し、レポータードメインとアンカードメインとの間隔を維持するように機能する非ヌクレオシドリンカーで構成されている。
【０００６】
本発明は、増幅工程およびハイブリダイズ工程を含んでもよい少なくとも１回のサイクリング工程を実施することを含む、ｔｃｄＣΔ１１７の検出方法を含む。更に、本発明は、ｔｃｄＣΔ１１７の検出用に設計されたプライマー、プローブ、およびキットに関する。
【０００７】
１つの態様では、本発明は、個体より得られた生物学的サンプルにおけるｔｃｄＣΔ１１７の存在又は不存在を検出する方法を提供する。かかる方法は、一般に、増幅工程および蛍光標識されたＣｏｂｒａプローブを使用する色素結合工程又はハイブリダイズ工程を含む少なくとも１回のサイクリング工程を実施することを含む。典型的には、増幅工程は、ｔｃｄＣ核酸分子がサンプル中に存在する場合、サンプルをｔｃｄＣプライマー対と接触させてｔｃｄＣ増幅産物を生成することを含み、検出工程は、ハイブリダイゼーションによりｔｃｄＣΔ１１７の存在又は不存在を特異的に認識することが可能な蛍光標識されたＣｏｂｒａプローブにｔｃｄＣ増幅産物を接触させることを含む。
【０００８】
より具体的には、本発明は、サンプル中のＣ．ディフィシルのリボタイプ０２７株のｔｃｄＣ遺伝子のヌクレオチド１１７位における一塩基欠失（ｔｃｄＣΔ１１７）を検出する方法であって、サンプルをｔｃｄＣプライマーのセットに接触させ、Ｃ．ディフィシルのｔｃｄＣ核酸がサンプル中に存在する場合、増幅産物を生成することを含む増幅工程を実施すること；増幅産物を、ｔｃｄＣΔ１１７にハイブリダイズするよう設計された検出可能なＣｏｂｒａプローブ（例えば、検出可能なｔｃｄＣΔ１１７プローブ）に接触させることを含むハイブリダイズ工程を実施すること；及び、（例えば、前記検出可能なｔｃｄＣΔ１１７プローブからのシグナルの存在又は不存在を検出することにより）増副産物の存在又は不存在を検出すること、ここで、増副産物の存在（例えば、シグナルの存在）はサンプル中のｔｃｄＣΔ１１７の存在を示し、増副産物の不存在（例えば、シグナルの不存在）はサンプル中のｔｃｄＣΔ１１７の不存在を示す；を含む、前記方法を提供する。ここで前記検出可能なｔｃｄＣΔ１１７プローブは、ヌクレオチド１１７位における一塩基欠失に完全に相補的なコンティグ配列を有するレポータードメインを含むＣｏｂｒａプローブであってもよく、そして前記レポータードメインは、１つまたは複数のヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）を含む非ヌクレオシドリンカーによりアンカードメインから分離されている。いくつかの実施形態では、前記ハイブリダイズ工程は、増幅産物をドナー蛍光部分および対応するアクセプター蛍光部分が標識されたＣｏｂｒａプローブに接触させることを含み；かつ、前記検出工程は、Ｃｏｂｒａプローブのドナー蛍光部分とアクセプター蛍光部分間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の存在又は不存在を検出することを含み，ここで、蛍光の存在又は不存在は、サンプル中のｔｃｄＣΔ１１７の存在又は不存在を示す。いくつかの実施形態では、前記増幅は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素を使用する。いくつかの実施形態では、前記Ｃｏｂｒａプローブは、配列番号１および２からなる群より選択される配列又はそれらの相補体を含むかあるいはかかる配列又は相補体からなる。いくつかの実施形態では、前記ｔｃｄＣΔ１１７プローブは、二次構造の形成を許容する核酸配列を含み、ここで前記二次構造の形成は、ドナー蛍光部分とアクセプター蛍光部分の間が空間的に近接する結果をもたらす。いくつかの実施形態では、前記第２の蛍光部分は、クエンチャーである。いくつかの実施形態では、増幅工程とハイブリダイズ工程は少なくとも１回繰り返される。いくつかの実施形態では、増幅工程とハイブリダイズ工程は少なくとも約２０回繰り返されるが、少なくとも４０回，少なくとも６０回，又は少なくとも１００回繰り返されてもよい。いくつかの実施形態では、本方法は、複数回のサイクリング工程を実施することを含み、ここで、各サイクリング工程は、サンプルをｔｃｄＣプライマーのセットに接触させ、ｔｃｄＣ核酸がサンプル中に存在する場合、増幅産物を生成することを含む増幅工程、及び増幅産物を検出可能なｔｃｄＣΔ１１７プローブに接触させることを含むハイブリダイズ工程を含む。ここで、サイク���ング工程は少なくとも約２０回繰り返されるが、少なくとも４０回，少なくとも６０回，又は少なくとも１００回繰り返されてもよい。
【０００９】
更なる態様では、本発明は、ｔｃｄＣΔ１１７の核酸を検出するためのキットを提供する。本キットは、配列番号１および２からなる群より選択される配列又はそれらの相補体を含むかあるいはかかる配列又は相補体からなる検出可能に標識されたオリゴヌクレオチド（Ｃｏｂｒａプローブ）を含みうる。より具体的には、本発明は、Ｃ．ディフィシルのリボタイプ０２７株のｔｃｄＣ遺伝子のヌクレオチド１１７位における一塩基欠失（ｔｃｄＣΔ１１７）を検出するためのキットであって、一対のオリゴヌクレオチドプライマー、ここで、各オリゴヌクレオチドプライマーは、ヌクレオチド１１７位を含むｔｃｄＣ遺伝子の部分配列の逆鎖にハイブリダイズ可能である；および、配列番号１および２からなる群より選択される配列又はそれらの相補体を含むかあるいはかかる配列又は相補体からなる検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドプローブ：を含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、前記検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、ドナー蛍光部分および対応するアクセプター蛍光部分を含む。いくつかの実施形態では、前記アクセプター蛍光部分はクエンチャーである。いくつかの実施形態では、前記キットは、ヌクレオシド三リン酸、核酸ポリメラーゼ、および核酸ポリメラーゼの機能に必要なバッファを更に含む。いくつかの実施形態では、前記キットは、サンプル中のｔｃｄＣΔ１１７の存在又は不存在を検出するためのプライマー、プローブ、および蛍光体部分を使用するための添付文書や説明書を含んでもよい。
【００１０】
別の態様では、本発明は、配列番号１および２からなる群より選択されるヌクレオチドの配列又はそれらの相補体を含むかあるいはかかる配列又は相補体からなるオリゴヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは１００以下のヌクレオチドを有する。別の態様では、本発明は、配列番号１および２のいずれかに対し少なくとも７０％配列同一性（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％、等）を有する核酸又はそれらの相補体を含み、１００以下のヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドを提供する。一般に、これらの実施形態では、これらのオリゴヌクレオチドはプローブ核酸等である。これらの特定の実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、５０以下のヌクレオチド（例えば、４５以下のヌクレオチド、４０以下のヌクレオチド、等）を有する。いくつかの実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、例えば、非修飾ヌクレオチドに対する核酸ハイブリダイゼーション安定性を改変するための、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの保存的に修飾されたバリエーションを含む。いくつかの実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の検出可能な標識を含む。いくつかの実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの標識部分及び／又は少なくとも１つのクエンチャー部分を含む。
【００１１】
他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。さらに、材料、方法、および実施例は例示的なものにすぎず、限定的であることを意図しない。
【００１２】
本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細は、添付の図面および以下の説明に記載されている。本発明の他の特徴、目的、および利点は、図面、詳細な説明、及び特許請求の範囲から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、非ヌクレオシドリンカーで分離されたレポータードメインとアンカードメインを示すＣｏｂｒａプローブの模式図である。
【００１４】
【図２】図２は、実施例１で記載されるようなｔｃｄＣΔ１１７を検出するために設計されたＣｏｂｒａプローブを示す。
【００１５】
【図３】図３は、配列番号３の通常のΔ１１７プローブ（Δ１１７−センスＦＱ４）の存在下で、野生株（１２８４０）、ヌクレオチド１２０位にＳＮＰを有する株（１１３１３）、またはΔ１１７欠失を有する株（１１３１４）由来のゲノムＣ．ディフィシルＤＮＡを、様々な開始濃度から生成し、ＦＡＭシグナルとして測定したＰＣＲ増殖曲線を示す。
【００１６】
【図４】図４は、配列番号２のＣｏｂｒａΔ１１７プローブ（Δ１１７−Ｃｏｂｒａ  ＦＱ６）の存在下で、野生株（１２８４０）、ヌクレオチド１２０位にＳＮＰを有する株（１１３１３）、またはΔ１１７欠失を有する株（１１３１４）由来のゲノムＣ．ディフィシルＤＮＡを、様々な開始濃度から生成し、ＦＡＭシグナルとして測定したＰＣＲ増殖曲線を示す。
【００１７】
【図５】図５は、配列番号１のＣｏｂｒａΔ１１７プローブ（Δ１１７−Ｃｏｂｒａ  ＦＱ９）の存在下で、野生株（１２８４０）、ヌクレオチド１２０位にＳＮＰを有する株（１１３１３）、またはΔ１１７欠失を有する株（１１３１４）由来のゲノムＣ．ディフィシルＤＮＡを、様々な開始濃度から生成し、ＦＡＭシグナルとして測定したＰＣＲ増殖曲線を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
サンプル中のＣ．ディフィシルのリボタイプ０２７株のｔｃｄＣ遺伝子のヌクレオチド１１７位における一塩基欠失（ｔｃｄＣΔ１１７）を検出するためのリアルタイムアッセイを本明細書に記載する。ｔｃｄＣΔ１１７を検出するためのＣｏｂｒａプローブ、並びに、かかるプローブを含む製品またはキットが提供される。他の方法に比べ、ｔｃｄＣΔ１１７の検出用のリアルタイムＰＣＲの感度が向上し、そして、サンプルの保持および増幅産物のリアルタイム検出を含めたリアルタイムＰＣＲの機能が改良されているため、臨床検査室におけるｔｃｄＣΔ１１７の診断のための本技術の実施が可能である。
【００１９】
本方法は、一対のｔｃｄＣプライマーを使用してサンプルから得たｔｃｄＣ核酸分子の一部を増幅することを含む少なくとも１回のサイクリング工程を実施することを含んでもよい。本明細書で使用される「ｔｃｄＣプライマー」は、ｔｃｄＣをコードする核酸配列に特異的にアニールし、そして適切な条件下でそこから合成を開始する、オリゴヌクレオチドプライマーを指す。各ｔｃｄＣプライマーは、ｔｃｄＣ核酸分子内部または隣接する標的にアニールするので、各増幅産物の少なくとも一部はｔｃｄＣに対応する核酸配列を含むようになっている。ｔｃｄＣ核酸がサンプル中に存在するという条件でｔｃｄＣ増幅産物が産生されるので、ｔｃｄＣ増幅産物の存在はサンプル中のＣ．ディフィシルの存在を示す。増幅産物は、１つまたは複数の検出可能なｔｃｄＣプローブに相補的な核酸配列を含むはずである。各サイクリング工程は、増幅工程、ハイブリダイゼーション工程、および検出工程を含み、この工程においてサンプルは、サンプル中のＣ．ディフィシルの存在又は不存在を検出するための１つまたは複数の検出可能なｔｃｄＣプローブと接触される。
【００２０】
本明細書中で使用される場合、用語「増幅する」は、鋳型核酸分子（例えば、ｔｃｄＣ核酸分子）の一方または両方の鎖に相補的な核酸分子を合成するプロセスを指す。核酸分子を増幅することは、典型的には、鋳型核酸を変性すること、プライマーの融解温度より低い温度でプライマーを鋳型核酸にアニールさせること、およびプライマーから酵素的に伸長して増幅産物を生成することを含む。増幅は典型的には、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、ＤＮＡポリメラーゼ酵素（例、Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｔａｑ）および該ポリメラーゼ酵素の最適な活性のために適切なバッファ及び／又は補因子（例えば、ＭｇＣｌ２および／またはＫＣｌ）の存在を必要とする。
【００２１】
特定の核酸配列の「保存的に修飾されたバリエーション」または単に「保存的バリエーション」とは、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸、あるいは、アミノ酸をコードしない核酸の場合、本質的に同一の配列を指す。当業者は、コードされた配列における単一のアミノ酸または少ない割合のアミノ酸（典型的には５％未満、より典型的には４％、２％または１％未満）を改変、付加または削除する個々の置換、あるいは欠失または付加は「保存的に修飾されたバリエーション」であり、ここで改変はアミノ酸の欠失、アミノ酸の付加、またはアミノ酸を化学的に類似したアミノ酸へ置換する結果となることを理解するであろう。
【００２２】
本明細書では用語「プライマー」は、当業者に知られているように使用され、オリゴマー化合物、主にオリゴヌクレオチドを指すが、鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成を「プライム」することができる修飾オリゴヌクレオチドも指す。つまり、例えば、オリゴヌクレオチドの３’−末端が、遊離３’−ＯＨ基を提供し、そこにさらに３’→５’ホスホジエステル結合を確立する鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼによってデオキシヌクレオシド三リン酸が使用されホスフェートがピロ放出されるような更なる「ヌクレオチド」が結合されてもよい。したがって、おそらくは意図する機能を除き、本発明に係る「プライマー」、「オリゴヌクレオチド」、または「プローブ」の間に根本的な違いはない。
【００２３】
用語「ハイブリダイズ」は、１つはまた複数のプローブを増幅産物にアニールすることを指す。ハイブリダイゼーション条件は、典型的にはプローブの融解温度より低いがプローブの非特異的ハイブリッド形成を回避する温度が挙げられる。
【００２４】
用語「５’→３’エキソヌクレアーゼ活性」は、核酸ポリメラーゼの活性を指し、通常、活性は、核酸鎖合成に関連し、それによってヌクレオチドが核酸鎖の５’末端から除去される。
【００２５】
用語「熱安定性ポリメラーゼ」は、熱に安定なポリメラーゼ酵素、すなわち、鋳型に相補的なプライマー伸長産物の形成を触媒し、二本鎖鋳型核酸の変性をもたらすのに必要な時間の間、高温にさらされたときに不可逆的に変性することはない酵素を指す。一般に、合成は各プライマーの３’末端で開始され、鋳型鎖に沿って５’→３’方向に進行する。熱安定性ポリメラーゼは、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｉａｖｕｓ、Ｔ．ｒｕｂｅｒ、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｔ．ｌａｃｔｅｕｓ、Ｔ．ｒｕｂｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、及びＭｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｅｒｖｉｄｕｓから単離されている。しかしながら、熱安定性ではないポリメラーゼもまた、酵素が補充されるならＰＣＲアッセイに使用することができる。
【００２６】
用語「その／それらの相補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｔｈｅｒｅｏｆ）」は、所与の核酸と同じ長さであり、正確に相補的な核酸を指す。
【００２７】
用語「伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）」又は「伸長（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ）」は、核酸に関して使用される場合、追加のヌクレオチド（または他の類似の分子）が核酸に組み込まれる場合を指す。例えば、場合により、核酸は、通常核酸の３’末端にヌクレオチドを付加するポリメラーゼのような、生体触媒を組み込んだヌクレオチドによって伸長されることがある。
【００２８】
２つ以上の核酸配列の文脈における用語「同一」またはパーセント「同一性」は、例えば、当業者に利用可能な配列比較アルゴリズムの１つを使用してまたは目視検査によって測定され、比較し最大限一致するようアラインされたとき、同一であるかまたは同一である特定の割合のヌクレオチドを有する、２つ以上の配列または部分配列を指す。配列同一性パーセントおよび配列類似性パーセントを決定するのに適切な例示的なアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴプログラムであり、これは、例えば、以下に記載される：Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）“Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，Ｇｉｓｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｂｙ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ｓｅａｒｃｈ”Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．３：２６６−２７２，Ｍａｄｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）“Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ＢＬＡＳＴ  ｓｅｒｖｅｒ”Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１−１４１，Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）“Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ”Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，ａｎｄ  Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）“ＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴ：Ａ  ｎｅｗ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ＢＬＡＳＴ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ又はａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ”Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．７：６４９−６５６。
【００２９】
オリゴヌクレオチドの文脈において「修飾ヌクレオチド」は、当該オリゴヌクレオチド配列の少なくとも１つのヌクレオチドが異なるヌクレオチドに置換され、当該オリゴヌクレオチドに望ましい性質を与える改変を指す。本明細書に記載のオリゴヌクレオチドにおいて置換される可能性のある例示的な修飾ヌクレオチドとして、例えば、Ｃ５−メチル−ｄＣ、Ｃ５−エチル−ｄＣ、Ｃ５−メチル−ｄＵ、Ｃ５−エチル−ｄＵ、２，６−ジアミノプリン、Ｃ５−プロピニル−ｄＣ、Ｃ５−プロピニル−ｄＵ、Ｃ７−プロピニル−ｄＡ、Ｃ７−プロピニル−ｄＧ、Ｃ５−プロパルギルアミノ−ｄＣ、Ｃ５−プロパルギルアミノ−ｄＵ、Ｃ７−プロパルギルアミノ−ｄＡ、Ｃ７−プロパルギルアミノ−ｄＧ、７−デアザ−２−デオキシキサントシン、ピラゾロピリミジン類似体、擬−ｄＵ、ニトロピロール、ニトロインドール、２’−０−メチルＲｉｂｏ−Ｕ，２’−０−メチルＲｉｂｏ−Ｃ，Ｎ４−エチル−ｄＣ，Ｎ６−メチル−ｄＡ，等が挙げられる。本発明のオリゴヌクレオチドにおいて置換される可能性のある他の多くの修飾ヌクレオチドは、本明細書に記載されているか、または当分野で知られている。特定の実施形態では、修飾ヌクレオチド置換は、対応する非修飾オリゴヌクレオチドの融解温度に対して、オリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）を改変する。さらに説明すると、いくつかの実施形態では、ある種の修飾オリゴヌクレオチド置換は、非特異的核酸増幅を減少させる（例えば、プライマーダイマー形成を最小化するなど）、意図する標的アンプリコンの収率を増加させる、及び／又は同様のことができる。かかる種類の核酸修飾の例は、例えば、米国特許第６，００１，６１１号に記載されている。
【００３０】
Ｃ．ディフィシル核酸及びオリゴヌクレオチド
本発明は、例えば、ｔｃｄＣ遺伝子の一部を増幅することによって、Ｃ．ディフィシルのエピデミックなリボタイプ（例えば、リボタイプ０２７）を検出する方法を提供する。Ｃ．ディフィシル由来のｔｃｄＣ遺伝子の核酸配列が利用可能である（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＭ１８０３５５を参照のこと）。具体的には、ｔｃｄＣ核酸分子を増幅および検出するためのプライマーおよびプローブが本発明によって提供される。さらに、ｔｃｄＣ遺伝子のヌクレオチド１１７位における一塩基欠失、ｔｃｄＣΔ１１７、を特異的に検出するためのＣｏｂｒａプローブが本発明により提供される。
【００３１】
より具体的には、本発明のオリゴヌクレオチドは、それぞれ、配列番号１および２、それらと実質的に同一のバリアントであって、配列番号１および２の一方と少なくとも例えば、８０％，９０％，又は９５％の配列同一性を有するバリアント、並びに配列番号１および２、及びかかるバリアントの相補体からなる群より選択される配列を有する核酸を含む。
【００３２】
本発明の一実施形態では、ｔｃｄＣプライマーの特定のセットとｔｃｄＣΔ１１７に特異的なＣｏｂｒａプローブが、Ｃ．ディフィシルを含有することが疑われる生物学的サンプルにおけるｔｃｄＣΔ１１７の検出をするために使用される。プライマーのセットとプローブは、ｔｃｄＣに特異的な少なくとも１つのプライマーとプローブを含んでもよい。本発明の方法のプローブを使用することによって、配列番号１および２のＣｏｂｒａプローブの機能的に活性なバリアントを同定してもよい。配列番号１および２のＣｏｂｒａプローブの機能的に活性なバリアントは、本発明の方法またはキットにおいて配列番号１および２のそれぞれの配列と比較して同等またはさらに高い特異性および感度を提供するプローブに関する。
【００３３】
バリアントは、例えば、配列番号１および２の配列とは、１つまたは複数のヌクレオチドの付加、削除または置換、例えば、配列番号１および２のそれぞれの配列の５’末端及び／又は３’末端における１つまたは複数のヌクレオチド追加、削除または置換等、により異なっていてもよい。上記に詳述したように、プローブは化学的に修飾されていてもよい、すなわちプローブは修飾ヌクレオチドまたは非ヌクレオチド化合物を含んでいてもよい。その場合、プローブは修飾オリゴヌクレオチドである。「修飾ヌクレオチド」（または「ヌクレオチド類似体」）は、若干の修飾によって天然「ヌクレオチド」と異なるものの、塩基または塩基様化合物、ペントフラノシル糖またはペントフラノシル糖様化合物、ホスフェート部分またはホスフェート様部分、あるいはそれらの組み合わせから構成される。例えば、「標識」を「ヌクレオチド」の塩基部分に結合することにより、「修飾ヌクレオチド」を得てもよい。また、「ヌクレオチド」における天然の塩基を、７−デサザプリンで置換することにより、「修飾ヌクレオチド」を得てもよい。用語「修飾ヌクレオチド」または「ヌクレオチド類似体」は、本出願において互換的に用いられる。「修飾ヌクレオシド」（または「ヌクレオシド類似体」）は、「修飾ヌクレオチド」（または「ヌクレオチド類似体」）について上述したように、若干の修飾が天然のヌクレオシドと異なる。
【００３４】
ｔｃｄＣをコードする核酸分子を増幅する、修飾オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体を含むオリゴヌクレオチド、例えばｔｃｄＣの代替部分をコードする核酸は、例えば、ＯＬＩＧＯ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  Ｉｎｃ．，Ｃａｓｃａｄｅ，Ｃｏｌｏ．）のようなコンピュータプログラムを使用して設計することができる。増幅プライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドを設計する際の重要な特徴として、（例えば、電気泳動による）検出を容易にするための適切なサイズの増幅産物、一対のプライマーのメンバーに対する同等の融解温度、各プライマーの長さ（すなわち、プライマーは、配列特異的にアニールして合成を開始するのに十分な長さであるが、オリゴヌクレオチド合成中に忠実度が低下するほど長くない必要がある）が挙げられるが、これらに限定されない。典型的には、オリゴヌクレオチドプライマーは８〜５０ヌクレオチドの長さ（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、又は５０ヌクレオチドの長さ）である。
【００３５】
プライマーのセットに加えて、本発明の方法は、ｔｃｄＣΔ１１７の存在または不存在を検出するために１つは複数のプローブを使用してもよい。用語「プローブ」は、合成的または生物学的に生成された核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を指し、設計または選択により、所定のストリンジェンシー下で「標的核酸」、この場合、ｔｃｄＣ（標的）核酸、に特異的に（すなわち優先的に）ハイブリダイズすることを可能にする特定のヌクレオチド配列を含む。「プローブ」は、標的核酸を検出することを意味する「検出プローブ」とも称される。
【００３６】
本発明によれば、ｔｃｄＣプローブは、少なくとも１つの蛍光標識で標識することができる。１つの実施形態では、ｔｃｄＣプローブは、ドナー蛍光部分、例えば蛍光染料、および対応するアクセプター蛍光部分、例えば、クエンチャーで標識することができる。
【００３７】
本発明の一実施形態では、少なくとも１つのプローブは、蛍光部分及び配列番号１および２からなる群より選択される核酸配列（標識を除いて示す）を含むか又はかかる蛍光部分及び配列からなる。
【００３８】
ハイブリダイゼーションプローブとして使用するためのオリゴヌクレオチドの設計は、プライマーの設計と同様の方法で実行することができる。本発明の実施形態は、増幅産物の検出に単一のプローブまたは一対のプローブを使用してもよい。実施形態によっては、使用するプローブが少なくとも１つの標識及び／又は少なくとも１つのクエンチャー部分を含んでもよい。プライマーと同様に、プローブは通常、同等の融解温度を有し、そして各プローブの長さは、配列特異的ハイブリダイゼーションが起こるのに十分であり、かつ合成中に忠実度が低下するほど長くはない。オリゴヌクレオチドプローブの一般的な長さは３０〜５０ヌクレオチドである。
【００３９】
本発明の構築体は、ｔｃｄＣ核酸分子を含むベクターを含む。本発明の構築体は、例えば、対照鋳型核酸分子として使用することができる。本発明の使用に適したベクターは市販されているおよび／または当技術分野で日常的な組換え核酸技術の方法によって製造される。ＴｃｄＣ核酸分子は、例えば、化学合成、Ｃ．ディフィシルからの直接クローニング、またはＰＣＲ増幅によって得ることができる。
【００４０】
本発明の方法における使用に適した構築体は、典型的には、ｔｃｄＣ核酸分子に加えて、所望の構築体および／または形質転換体を選択するための選択マーカー（例、抗生物質耐性遺伝子）をコードする配列、並びに複製起点を含む。ベクター系の選択は通常、宿主細胞の選択、複製効率、選択性、誘導性、および回収の容易さなどが挙げられるがこれらに限定されない、いくつかの要因に依存する。
【００４１】
ｔｃｄＣ核酸分子を含有する本発明の構築体は、宿主細胞中で増殖させることができる。本明細書中で使用される場合、宿主細胞という用語は、原核生物、並びに、酵母、植物および動物細胞などの真核生物を含むことを意味する。原核生物の宿主としては、Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ，Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ，ａｎｄ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓが挙げられる。真核生物の宿主としては、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，Ｓ．ｐｏｍｂｅ，Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ等の酵母、ＣＯＳ細胞又はＣｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ（ＣＨＯ）細胞等の哺乳動物細胞，昆虫細胞、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ及びＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ等の植物細胞が挙げられる。本発明の構築体は、当業者に一般に知られている任意の技術を用いて宿主細胞に導入することができる。例として、リン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーション、ヒートショック、リポフェクション、マイクロインジェクション、およびウイルスによる核酸導入が、宿主細胞に核酸を導入するための一般的な方法である。さらに、裸のＤＮＡを細胞に直接送達することができる（例えば、米国特許第５，５８０，８５９号および第５，５８９，４６６号参照）。
【００４２】
Ｃｏｂｒａプローブ
本発明で使用するＣｏｂｒａプローブは米国特許第８，４０９，８０２号及び米国特許第９，０６８，２２５号に記載される。Ｃｏｂｒａプローブは、標的核酸配列の存在又は不存在を特異的に検出することを可能にするフレキシブルなリンカーを有する２ドメインプローブを指す。１つ目のドメインは、標的核酸に対するプローブのハイブリダイゼーションをドライブする「アンカー」としてのものである。このドメインは安定的に標的核酸にハイブリダイズし、潜在的なミスマッチに耐性であるか、あるいは標的核酸の相補的な領域（「アンカ−結合」領域）内の可変性が低い領域と二本鎖を形成するように設計されている。２つ目のドメインは、対象の配列を検出するように設計されている「レポーター」としてのものである。「レポーター」は、標的核酸の相補的な領域（「レポーター結合」領域）に高度に特異的であり、標的配列の存在又は不存在の検出、ならびにレポーター結合領域とのマッチ／ミスマッチの区別をすることができる。レポータードメインは、一般に、レポータードメインのハイブリダイゼーションの有無を区別することができるように標識が結合しているので、標的配列の存在又は不存在を検出するか、あるいは融解温度の変化を検出することによってプローブ領域におけるミスマッチを検出する。この設計の２ドメインプローブにより、対象の標的配列を検出する特異性を非常に向上することができる。
【００４３】
Ｃｏｂｒａプローブは、標的核酸の存在又は不存在を検出するために、つまり、レポータードメインが標的にハイブリダイズする場合、レポーターが標的にハイブリダイズしていない場合と比較して、標識からのシグナルの変化があるよう、検出可能に標識されるように設計されている。検出可能なシグナルの変化を検出および測定することにより、標的核酸配列の存在または不存在を定性的または定量的に決定することができる。融解温度の変化を検出することによって、標的の変異または改変の存在又は不存在を決定することができる。
【００４４】
Ｃｏｂｒａプローブのアンカードメインは、アッセイ条件下で標的核酸の「アンカー結合」配列にハイブリダイズするよう設計されている。対照的に、レポータードメインは、正確な標的配列が存在するか否かに応じて、その標的「結合領域」ハイブリダイズする場合としない場合がある。レポータードメインは、例えば、標的核酸の「レポーター結合」配列に相補的又は少なくとも実質的に相補的になるように設計することができる。使用される反応条件に応じて、レポータードメインの標的へのハイブリダイゼーションを標的バリアント配列へのハイブリダイゼーションと区別することができる。
【００４５】
Ｃｏｂｒａプローブは、適切な反応条件下で、例えば、ポリメラーゼなどのヌクレオチド付加性生体触媒を用いて、鎖の伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）または伸長（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ）を可能にするプライマーとして作用するように設計することができる。あるいは、追加のヌクレオチドを加えることができないように、プローブを伸長不可能にすることもできる。例えば、ヒドロキシ基がもはや伸長に関与することができないように、プローブの３’末端を修飾することによって、プローブを伸長不可能にすることもできる。３’天然ヌクレオチドのヒドロキシ基は、さまざまな官能基で簡単に修飾できる。例えば、３’ヒドロキシ基を欠いているか、または伸長用のポリメラーゼの基質として機能することができないヌクレオチド類似体を組み込むことによって、プローブの３’末端を伸長不可能にすることができる。場合により、３’末端に標識を組み込むことでプローブを伸長不可能にすることができる。
【００４６】
いくつかの実施形態では、Ｃｏｂｒａプローブは、２’−ターミネーターヌクレオチド、つまりヌクレオチドの糖部分の２’位に保護基（ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ）を有するヌクレオチド類似体、を組み込むことによって、伸長不可能にすることができる。「保護基」は、典型的には核酸の伸長を妨げる化学基または部分を指す（すなわち、２’−ターミネーターヌクレオチドは、典型的には１つまたは複数のヌクレオチド付加性生体触媒によって伸長不可能である）。すなわち、２’−ターミネーターヌクレオチドが一旦核酸に（例えば、核酸の３’末端に）組み込まれると、保護基は少なくとも１つのヌクレオチド付加性生体触媒によるさらなる核酸の伸長を妨げる。ヌクレオチド付加性生体触媒の例示として、例えば、Ｇ４６Ｅ  Ｅ６７８Ｇ  ＣＳ５  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｇ４６Ｅ  Ｌ３２９Ａ  Ｅ６７８Ｇ  ＣＳ５  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｇ４６Ｅ  Ｌ３２９Ａ  Ｄ６４０Ｇ  Ｓ６７１Ｆ  ＣＳ５  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｇ４６Ｅ  Ｌ３２９Ａ  Ｄ６４０Ｇ  Ｓ６７１Ｆ  Ｅ６７８Ｇ  ＣＳ５  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｇ４６Ｅ  Ｅ６７８Ｇ  ＣＳ６  ＤＮＡポリメラーゼ、ΔＺＯ５Ｒポリメラーゼ、Ｅ６１５Ｇ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓポリメラーゼ、ＴＭＡ−２５ポリメラーゼ、ＴＭＡ−３０ポリメラーゼ、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｐｅｃｉｅ  ＳＰＳ−１７ポリメラーゼ、Ｅ６１５Ｇ  Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  Ｚ０５Ｒポリメラーゼ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｏｒｎｂｅｒｇ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｋｌｅｎｏｗ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｌ  ＤＮＡポリメラーゼ、ａｌｐｈａ  ＤＮＡポリメラーゼ、リバーストランスクリプターゼ、ＡＭＶリバーストランスクリプターゼ、Ｍ−ＭｕＬＶリバーストランスクリプターゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、ターミナルトランスフェラーゼ、ポリヌクレオチドホスホリラーゼ、リボヌクレオチド付加性ＤＮＡポリメラーゼ等を含むＤＮＡポリメラーゼが挙げられるがこれらに限定されない。
【００４７】
例示的な保護基はリン酸基である。例示的な２’−ターミネーターヌクレオチドとして、２’−モノホスフェート−３’−ヒドロキシ−５’−トリホスフェートヌクレオシド及び２’−モノホスフェート−３’−ヒドロキシ−５’−ジホスフェートヌクレオシドが挙げられる。他の２’−ターミネーターヌクレオチドは、例えば、以下に記載されている：米国特許出願第１０／８７９，４９４号，タイトル「ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＯＦ  ２’−ＴＥＲＭＩＮＡＴＯＲ  ＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ，」（２００４年６月２８日Ｂｏｄｅｐｕｄｉ  ｅｔ  ａｌ．により出願）、及び米国特許出願第１０／８７９，４９３号，タイトル「２’−ＴＥＲＭＩＮＡＴＯＲ  ＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ−ＲＥＬＡＴＥＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＳＹＳＴＥＭＳ」，（２００４年６月２８日にＧｅｌｆａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．により出願）、及び米国特許出願第１１／５８３，６０６号，タイトル「２’−ＴＥＲＭＩＮＡＴＯＲ  ＲＥＬＡＴＥＤ  ＰＹＲＯＰＨＯＳＰＨＯＲＯＬＹＳＩＳ  ＡＣＴＩＶＡＴＥＤ  ＰＯＬＹＭＥＲＩＺＡＴＩＯＮ，」（２００６年１０月８日にＧｅｌｆａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．により出願）。
【００４８】
Ｃｏｂｒａプローブでは、アンカー核酸ドメインとレポーター核酸ドメインは、非ヌクレオシドリンカーによって結合されている。任意の標準的な技術を使用して、アンカー核酸ドメインまたはレポーター核酸ドメインを非ヌクレオシドリンカーに結合させることができる。アンカー核酸ドメインまたはレポーター核酸ドメインは、直接または間接的に、非ヌクレオシドリンカーに結合することができる。いくつかの実施形態では、アンカー核酸ドメインまたはレポーター核酸ドメインは、非ヌクレオシドリンカーに共有結合している。
【００４９】
アンカー核酸ドメインは、アッセイ条件下で生物学的サンプル中の標的核酸の「アンカー結合」配列に結合するように設計されている。したがって、アンカー核酸ドメインは、標的核酸の「アンカー結合」配列に相補的なまたは実質的に相補的な領域を含むように設計することができる。本発明のいくつかの実施形態では、アンカー核酸ドメインは、標的核酸内の「アンカー結合」配列に対して相補的または実質的に相補的な領域を含むかまたはそれらからなる。相補的な領域は、限定されないものの、少なくとも４、６、８、１０、１２、１４、１６、２０又はそれ以上のヌクレオチド、例えば、３〜５０、５〜２０、５〜５０、又は８〜２５ヌクレオチド長など任意の長さであり得る。
【００５０】
アンカー核酸ドメインは、追加の領域、例えば検出可能な標識を結合させるための領域を含み得る。いくつかの実施形態では、アンカー核酸ドメインは、標的核酸の１つの「アンカー結合」配列に対して相補的なまたは実質的に相補的な１つの領域のみを含む。いくつかの実施形態では、アンカー核酸ドメインは、それぞれが標的核酸内の異なる「アンカー結合」配列に結合する２つ以上の領域を含み得る。
【００５１】
アンカー核酸ドメイン（または第１のドメイン）は、プローブの標的核酸へのハイブリダイゼーションをドライブするように設計されている。いくつかの実施形態では、アンカー核酸ドメインの組成および長さは、「アンカー結合」配列内の頻度が低い多型によるアンカー核酸ドメインと「アンカー結合」配列との間の潜在的なミスマッチを克服する（すなわち、ミスマッチにもかかわらず当該方法の条件下でハイブリダイズする）ように選択される。アンカー核酸ドメインと「アンカー結合」配列との間の親和性が反応条件下でハイブリダイズするのに十分大きい限り、アンカー核酸ドメインは任意の長さであり得る。いくつかの実施形態では、アンカー核酸ドメインの長さは、プローブと標的核酸との間に、それらが反応条件下でハイブリダイズするように十分な特異性が存在するように選択される。いくつかの実施形態では、アンカー核酸ドメインと「アンカー結合」配列との間のハイブリダイゼーション（すなわち、レポータードメインが標的にハイブリダイズするか否か）だけで、プローブの標的核酸の意図された位置へのハイブリダイゼーションをドライブするのに十分である。
【００５２】
いくつかの実施形態では、アンカー核酸ドメインは、長さが約５ヌクレオチド〜約２００ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、アンカー核酸ドメインは、長さが４〜５０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、アンカー核酸ドメインは、長さが６〜５０ヌクレオチドである。本発明のいくつかの実施形態では、アンカー核酸ドメインは、長さが２０〜４０ヌクレオチドである。本発明のいくつかの実施形態では、アンカー核酸ドメインは、長さが８〜２５ヌクレオチドである。本発明のいくつかの実施形態では、アンカー核酸ドメインは、長さが約３０ヌクレオチドである。本発明の他の実施形態では、アンカー核酸ドメインは、長さが４０〜６０ヌクレオチドである。本発明の他の実施形態では、アンカー核酸ドメインは、長さが６０ヌクレオチド超である。
【００５３】
アンカー核酸ドメインは、天然ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、またはそれらの組み合わせを含みうる。例示的な核酸としては、従来のリボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、ならびにこれらの分子の化学類似体、例えば、ロックされたヌクレオチド類似体（「ＬＮＡ」）およびペプチド核酸（「ＰＮＡ」）が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載の様々な核酸類似体もまた、アンカー核酸ドメインに使用することができる。いくつかの実施形態では、非天然ヌクレオチドは、非天然ヌクレオチドではない対応天然ヌクレオチドを使用する場合と比較して、アンカードメインの融解温度を上昇させる。Ｔｍの上昇に寄与する例示的な人工塩基は当技術分野において記載されており、例えば、限定されないものの以下に記載のものが挙げられる：Ｌｅｂｅｄｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｅｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ−Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １３：１５−２１（１９９６）；Ｘｏｄｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：５６２５−５６３１（１９９１）；Ｆｒｏｅｈｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３３：５３０７−５３１０（１９９２）；Ｋｕｔｙａｖｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：１１１７０−１１１７６（１９９６）；Ｎｇｕｙｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３０５９９−６５（１９９７）。いくつかの実施形態では、非天然ヌクレオチドはプロピニル−ｄＮである。本発明のいくつかの実施形態では、チミンはプロピニルｄＵに、シトシンはプロピニルｄＣに置換されている。
【００５４】
レポーター核酸ドメインは、生物学的サンプル中の標的核酸配列の存在または不存在を検出するように設計されている。したがって、レポーター核酸ドメインは、標的核酸内の「レポーター結合」配列に相補的なまたは実質的に相補的な領域を含むように設計することができる。本明細書で論じられるように、標的のアンカー結合ドメインと標的のレポーター結合ドメインは、標的核酸の同じ鎖上にある。いくつかの実施形態では、レポーター核酸ドメインは、標的核酸内の「レポーター結合」配列に対して相補的なまたは実質的に相補的な領域を含むか、またはかかる領域からなる。他の実施形態では、レポーター核酸ドメインは、追加の領域、例えば検出可能な標識を結合させるための領域を含む。いくつかの実施形態では、レポーター核酸ドメインは、標的核酸の１つの「レポーター結合」配列と相補的なまたは実質的に相補的な領域を１つだけ含む。いくつかの実施形態では、レポーター核酸ドメインは、それぞれが、標的核酸の別個の「レポーター結合」配列、例えば、標的核酸内の複数のＳＮＰ領域、にハイブリダイズすることができる２つ以上の領域を含みうる。
【００５５】
レポータードメイン配列は特定のレポータードメイン結合配列に対して選択的であるように設計されているので、一般にレポータードメインの領域はレポーター結合配列に完全に相補的である。あるいは、レポータードメインは、反応条件と組み合わせて、レポータードメインが特定の標的または特定の標的とわずかな（例えば、単一のヌクレオチドミスマッチまたは欠失）バリアントにハイブリダイズするが、より多様な配列（例えば、より大きい欠失または置換、並べ替え、複数のミスマッチなど）には結合されないように設計することができる。
【００５６】
レポーター核酸ドメインおよび検出可能な標識は、対象の標的核酸の存在または不存在を検出するように設計することができる。標的核酸は任意の供給源由来であり得る。例えば、標的核酸はウイルス性または微生物性の核酸であり得る。あるいは、標的核酸は、例えば、動物、哺乳動物、ヒト、真菌または植物の核酸であり得る。いくつかの実施形態では、本発明のレポーター核酸ドメインは、一塩基多型（ＳＮＰ）の存在または不存在、あるいは標的核酸内の変異を検出するように設計することができる。したがって、いくつかの実施形態では、レポーター核酸ドメインは、ＳＮＰまたは変異の１つの対立遺伝子に１００％相補的な結合領域を含み、そしてプローブは、ＳＮＰの１つの対立遺伝子および他の可能性のある対立遺伝子、または野生型配列に対する結合間の識別を可能にする条件下で使用される。
【００５７】
したがって、レポーター核酸ドメインは、「レポーター結合」配列に高度に特異的であるように設計することができる。いくつかの実施形態では、一塩基ミスマッチ、一塩基挿入、またはレポーター核酸ドメインと「レポーター結合」配列との間の一塩基挿入でさえも、マッチ（またはミスマッチ）の検出を容易にするのに十分なほど顕著な化学的または物理的な性質のシグナルの変化を引き起こしうる。シグナル変化は、プローブの立体配座の変化、すなわち、ランダムコイルからレポーター核酸ドメインと標的核酸間で形成される二重鎖への変化であり得る。シグナル変化は、物理的または化学的に検出可能であり得る。例えば、マッチまたはミスマッチの際に蛍光シグナルを誘発または変化させることができるようにプローブを蛍光標識することができる。標識とプローブは、レポーター核酸ドメインと「レポーター結合」配列との間のハイブリダイゼーションと非ハイブリダイゼーションの間で蛍光の差が検出されるように設計することができる。いくつかの実施形態では、この差は、プローブのいずれのドメインでも（例えば、標的の不存在下において）ステムループが関与しない。シグナル変化は、レポーター核酸ドメインと「レポーター結合」配列との間に形成されるハイブリダイズ二本鎖の融解温度の変化でもあり得る。Ｔｍ変化は、例えば、レポーター核酸ドメインと「レポーター結合」配列との間に形成される相補的な二本鎖とミスマッチ二本鎖との間で測定することができる。
【００５８】
いくつかの実施形態では、レポーター核酸ドメインは、標的核酸内の「レポーター結合」配列に対して相補的なまたは実質的に相補的な領域を含むか、またはかかる領域からなる。相補的な領域は、本発明にとって有用な任意の長さであり得て、例えば、少なくとも４、６、８、１０、１２、１４、１６、２０以上のオリゴヌクレオチド、例えば、３〜５０、５〜２０、５〜５０、又は８〜２５オリゴヌクレオチドの長さが挙げられるがこれに限定されない。
【００５９】
レポーター核酸ドメインは任意の適切な長さであり得る。いくつかの実施形態では、その相補的な配列に対する特異性を最大にするために、本発明のレポーター核酸ドメインは、長さが比較的短くなるように設計されている。いくつかの実施形態では、レポーター核酸ドメインの標的結合部分の長さは４〜２０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、レポーター核酸ドメインの長さは６〜１２ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、レポーター核酸ドメインの長さは８〜２５ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、レポーター核酸ドメインの長さは６〜４０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、レポーター核酸ドメインは少なくとも６、７、８、９、１０、１１、又は１２ヌクレオチドの長さである。
【００６０】
Ｃｏｂｒａプローブは、「レポーター結合」配列に対するレポーター核酸ドメインの高度な特異性を利用している。したがって、レポーター核酸ドメインは、レポーター核酸ドメインの結合特異性を増加させるために非天然ヌクレオチドを含むことができ、それにより、マッチとミスマッチとの間のプローブ識別能を向上できる。本発明のいくつかの実施形態では、非天然ヌクレオチドの溶融温度は、非天然ヌクレオチドではない対応天然ヌクレオチドを使用する場合よりも高い。本発明のいくつかの実施形態では、非天然ヌクレチオチドはマッチとミスマッチのＴｍの差を大きくする。本発明のいくつかの実施形態では、非天然ヌクレオチドはプロピニル−ｄＮである。Ｔｍの増加に寄与する例示的な人工塩基は当技術分野において、例えば、限定されないものの以下に記載されている：Ｌｅｂｅｄｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｅｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ−Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １３：１５−２１（１９９６）；Ｘｏｄｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：５６２５−５６３１（１９９１）；Ｆｒｏｅｈｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３３：５３０７−５３１０（１９９２）；Ｋｕｔｙａｖｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：１１１７０−１１１７６（１９９６）；Ｎｇｕｙｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３０５９９−６５（１９９７）。例えば、２−アミノＡはＡよりもＴｍが約３℃高く、５−Ｍエチル−ＣはＣよりもＴｍが約１．３℃高く、Ｃ−５プロピニル−ＣはＣよりもＴｍが約２．８℃が核、Ｃ−５プロピニル−ＵはＴよりもＴｍが約１．７℃高い。レポーター領域は、可変である可能性がある配列（例えば、ＳＮＰまたは可能性があると予測される変異）にハイブリダイズするレポーター領域の部分で、１つは複数（例、２、３、４、５、６、７、８、９、またはそれ以上）の安定化塩基を含む場合があるが、安定化塩基を１つまたは全く（非天然）含まなくてもよい。
【００６１】
アンカー核酸ドメインおよびレポーター核酸ドメインは、標的核酸の非存在下で任意の立体配座を採用することができる。いくつかの実施形態では、アンカードメインもレポータードメインもステムループを形成していない。いくつかの実施形態では、アンカー核酸ドメインおよびレポーター核酸ドメインは、特定の二次構造（例えば、ランダムコイル）を有さないように設計されている。いくつかの実施形態では、これらのドメインの一部の領域は、相互にハイブリダイズすることができる。例えば、アンカー核酸ドメイン内の領域は、レポーター核酸ドメイン内の領域に相補的なものでも部分的に相補的なものでもよい。いくつかの実施形態では、アンカードメインとレポータードメインは５０％未満相補的である。いくつかの実施形態では、プローブは、標的核酸の非存在下で、アンカードメインとレポータードメインの相補的または部分的に相補的な領域（例として、少なくとも４つの隣接ヌクレオチド領域）の間に形成されるステムループ構造を有する。他の実施形態では、アンカードメインは、標的核酸の非存在下でステムループを形成することができる。あるいは、レポータードメインは、標的核酸の非存在下でステムループを形成することができる。
【００６２】
いくつかの実施形態では、アンカードメインもレポートドメインもステムループを含まない。よって、いくつかの実施形態では、レポータードメインは、完全に相補的な少なくとも３つのヌクレオチドの２つの配列を含まず、ここで、上記２つの配列が少なくとも２つの介在ヌクレオチドを有する；及び／又は、アンカードメインは、完全に相補的な少なくとも３つのヌクレオチドの２つの配列を含まず、ここで、上記２つの配列が少なくとも２つの介在ヌクレオチドを有する。
【００６３】
いくつかの実施形態では、アンカーはプローブの３’末端にあり、レポーターはプローブの５’末端にある。図１はレポーターがアンカードメインの５’末端に結合されている実施形態を示しているが、レポーターはアンカードメインの３’末端に結合されるように設計する（プローブの３’末端にレポーターを作成し、５’末端にアンカーを作成する）こともできることを理解されたい。
【００６４】
「非ヌクレオシドリンカー」は、アンカードメインとレポータードメインを分離する。当業者は、任意の適切な非ヌクレオシドリンカーを使用できることを認識するであろう。日常的な実験を使用して、リンカーの最適な特性を判断することができる。アンカードメインとレポータードメインは、互いに隣接する標的核酸の領域に結合するように設計されている。したがって、いくつかの実施形態では、アンカードメインとレポータードメインは、互いに比較的近くになる（例えば、レポータードメインとアンカードメインが両方とも標的にハイブリダイズする場合、１、２、３、４、または５個以下のヌクレオチドが介在する）よう設計できる。リンカーは、一般に、アンカーが標的内の隣接する配列にハイブリダイズするとき、レポーターがハイブリダイズする又はしないことを可能にするのに十分フレキシブルである。非ヌクレオシドリンカーは、アンカードメインとレポータードメインの間隔を保つよう機能する。したがって、アンカードメインとレポータードメインの間の間隔は、さまざまな長さの非ヌクレオチドリンカーを使用して調整できる。
【００６５】
非ヌクレオシドリンカーは、例えば、脂肪族、芳香族、アリール、環状、キラル、アキラル、ペプチド、炭水化物、脂質、脂肪酸、トリ−、テトラ−、ペンタ−、ヘキサ−ポリエチレングリコール（ＨＥＧ）またはポリ−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、または複素環式部分であり得る。他の従来の非ヌクレオシドリンカーはホモ二官能性およびヘテロ二官能性架橋剤（ｈｏｍｏｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  ｈｅｔｅｒｏｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔｓ）を使用する。ホモ二官能性剤は２つの同一の官能基を有するのに対し、ヘテロ二官能性剤は生物製剤を生体接着剤に結合させる（ｔｏ  ｌｉｎｋ  ｔｈｅ  ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｂｉｏａｄｈｅｓｉｖｅ）ために２つの異なる官能基を含む。ヘテロ二官能性架橋剤の大多数は、第一級アミン反応性基およびチオール反応性基を含む。共有結合架橋剤は、ジスルフィド（Ｓ−−Ｓ）、グリコール（−−ＣＨ（ＯＨ）−−ＣＨ（ＯＨ）−−）、アゾ（−−Ｎ＝Ｎ−−），スルホン（−−Ｓ（＝Ｏ２−−），エステル（−−Ｃ（＝Ｏ）−−Ｏ−−）、またはアミド（−−Ｃ（＝Ｏ）−−Ｎ−−）架橋を形成可能な試薬から選択される。
【００６６】
Ｃｏｂｒａプローブは、さまざまな組み合わせのアンカー核酸ドメイン、レポーター核酸ドメイン、および非ヌクレオシドリンカーを有するように設計されている。いくつかの実施形態では、リンカーは、アンカー核酸ドメインまたはレポーター核酸ドメインの末端、例えば、アンカー核酸ドメインまたはレポーター核酸ドメインの３’または５’の位置に結合することができる。あるいは、リンカーは、リンケージまたは結合が、プローブの機能、例えば、プローブと意図する標的核酸とのハイブリダイゼーション、を妨害しない限り、プローブの一方または両方の核酸ドメインの他の内部位置に結合することができる。例えば、リンカーはレポータードメインに、レポータードメインの３’又は５’末端の例えば、１、２、３、４、またはそれ以上の数のヌクレオチドの部分で結合できる。同様に、リンカーはアンカードメインに、アンカードメインの３’又は５’末端の例えば、１、２、３、４、またはそれ以上の数のヌクレオチドの部分で結合できる。アンカー核酸ドメインとレポーター核酸ドメインは、非ヌクレオシドリンカーの様々な位置に結合できる。いくつかの実施形態では、これらの核酸ドメインはリンカーの末端に結合している。場合により、それらはリンカーの異なる位置に結合しうる。
【００６７】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
米国特許第４，６８３，２０２号、第４，６８３，１９５号、第４，８００，１５９号、及び第４，９６５，１８８号は、従来のＰＣＲ技術を開示する。ＰＣＲは通常、選択された核酸鋳型（例、ＤＮＡまたはＲＮＡ）に結合する２つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用する。本発明において有用なプライマーは、ｔｃｄＣ核酸配列内での核酸合成の開始点として作用することができるオリゴヌクレオチドを含む。プライマーは制限酵素による消化物から常法により精製することができ、あるいは、合成的に製造することができる。プライマーは、増幅において最大の効率を得るために、一本鎖であることが好ましいが、二本鎖であってもよい。二本鎖プライマーは最初に変性される、すなわち鎖を分離するように処理される。二本鎖核酸を変性する１つの方法は加熱によるものである。
【００６８】
鋳型核酸が二本鎖である場合、ＰＣＲにおける鋳型として使用される前に二本鎖を分離することが必要である。鎖の分離は、物理的、化学的または酵素的手段を含む任意の適切な変性方法によって達成することができる。核酸鎖を分離する１つの方法は、ほとんどの核酸が変性するまで（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％を超える核酸の変性）核酸を加熱することが挙げられる。鋳型核酸の変性に必要な加熱条件は、例えば、バッファ塩濃度、並びに変性される核酸の長さおよびヌクレオチド組成に依存するが、典型的には約９０℃〜約１０５℃の範囲で、温度や核酸長などの反応の特性に応じた時間である。変性は通常約３０秒〜４分（例えば、１分〜２分３０秒、又は１．５分）行われる。
【００６９】
二本鎖鋳型核酸が熱によって変性される場合、反応混合物は各プライマーのｔｃｄＣ核酸上の標的配列へのアニーリングを促進する温度まで冷却される。アニーリング温度は通常約３５℃〜約６５℃（例えば、約４０℃〜約６０℃；約４５℃〜約５０℃）である。アニーリング時間は約１０秒〜約１分（例えば、約２０秒〜約５０秒；約３０秒〜約４０秒）である。次いで、反応混合物を、ポリメラーゼの活性が促進または最適化される温度、すなわち、鋳型核酸に相補的な生成物を生成するためにアニール後のプライマーから伸長が起こるのに十分な温度に調整する。温度は、核酸鋳型にアニーリングされた各プライマーから伸長生成物を合成するのに十分であるべきであるが、その相補的な鋳型から伸長生成物を変性させるほど高くてはならない（例えば、伸長のための温度は通常約４０℃〜約８０℃（例えば、約５０℃〜約７０℃；約６０℃）である）。伸長時間は約１０秒〜約５分（例えば、約３０秒〜約４分；約１分〜約３分；約１分３０秒〜約２分）である。
【００７０】
ＰＣＲアッセイは、ＲＮＡまたはＤＮＡ（ｃＤＮＡ）などのＣ．ディフィシル核酸を使用することができる。鋳型核酸は精製する必要はなく、ヒト細胞に含まれるＣ．ディフィシル核酸といった複合的な混合物の一部であってもよい。Ｃ．ディフィシル核酸は、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｐｅｒｓｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ），１９９３，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．）に記載されているような日常的な技術によって生物学的サンプルから抽出してもよい。核酸は、プラスミド、あるいは細菌、酵母、ウイルス、オルガネラ、または植物もしくは動物など高等生物を含む天然供給源といった任意の数の供給源から得ることができる。
【００７１】
オリゴヌクレオチドプライマーは、プライマー伸長を誘導する反応条件下でＰＣＲ試薬と混合される。例えば、鎖伸長反応は一般に５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１５ｍＭのＭｇＣｌ2、０．００１％（ｗ／ｖ）のゼラチン、０．５〜１．０μｇの変性鋳型ＤＮＡ、５０ｐｍｏｌｅの各オリゴヌクレオチドプライマー、２．５ＵのＴａｑポリメラーゼ、及び１０％のＤＭＳＯを含む。反応は、通常１５０〜３２０μＭの各ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＧＴＰ，又は１つまたは複数のそれらの類似体を含む。
【００７２】
新たに合成された鎖は、反応の次の工程で使用することができる二本鎖分子を形成する。鎖の分離、アニーリング、および伸長の工程は、標的ｔｃｄＣ核酸分子に対応する所望の量の増幅産物を産生するのに必要な回数繰り返すことができる。反応における制限要因は、反応中に存在するプライマー、熱安定性酵素、およびヌクレオシド三リン酸の量である。サイリング工程（すなわち、変性、アニーリング、および伸長）は、少なくとも１回繰り返されることが好ましい。検出に使用するためには、サイクリング工程の数は、例えばサンプルの性質によって異なる。サンプルが核酸の複合的な混合物である場合、検出のために十分な標的配列を増幅するためにより多くのサイクル化工程が必要とされるであろう。一般的に、サイクリング工程は少なくとも約２０回繰り返されるが、４０回、６０回、１００回程の多さで繰り返されてもよい。
【００７３】
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）
ＦＲＥＴ技術（例えば、米国特許第４，９９６，１４３号、第５，５６５，３２２号、第５，８４９，４８９号、及び第６，１６２，６０３号参照）は、ドナー蛍光部分および対応するアクセプター蛍光部分が互いに一定の距離内にあると、可視化または検出及び／又は定量化が可能な２つの蛍光部分の間でエネルギー移動が起こるという概念に基づく。典型的には、ドナーが適切な波長の光照射によって励起されると、ドナーはエネルギーをアクセプターに伝達する。アクセプターは、典型的には、伝達されたエネルギーを異なる波長の光照射の形態で再出射する。
【００７４】
一例では、オリゴヌクレオチドプローブは、ドナー蛍光部分および伝達されたエネルギーを光以外の形態で消散させる対応するクエンチャーを含みうる。プローブが損なわれていないとき、エネルギー移動は典型的には、ドナー蛍光部分からの蛍光発光が消光されるよう２つの蛍光部分の間で起こる。ポリメラーゼ連鎖反応の伸長工程の間に、増幅産物に結合したプローブは、ドナー蛍光部分の蛍光発光はもはや消光されないように、例えば、Ｔａｑポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によって切断される。この目的のための例示的なプローブは、例えば、米国特許第５，２１０，０１５号、第５，９９４，０５６号、及び第６，１７１，７８５号に記載されている。一般的に使用されるドナー−アクセプター対としてＦＡＭ−ＴＡＭＲＡ対が挙げられる。一般的に使用されるクエンチャーはＤＡＢＣＹＬとＴＡＭＲＡである。一般的に使用されるダーククエンチャーとして、ＢｌａｃｋＨｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒｓ（商標）（ＢＨＱ−１，ＢＨＱ−２），（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｏｖａｔｏ，Ｃａｌ．），Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ（商標），（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈ．，Ｉｎｃ．，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，Ｉｏｗａ），ＢｌａｃｋＢｅｒｒｙ（商標）Ｑｕｅｎｃｈｅｒ  ６５０（ＢＢＱ−６５０），（Ｂｅｒｒｙ  ＆  Ａｓｓｏｃ．，Ｄｅｘｔｅｒ，Ｍｉｃｈ．）が挙げられる。
【００７５】
別の例では、それぞれ蛍光部分を含有する２つのオリゴヌクレオチドプローブは、オリゴヌクレオチドプローブとｔｃｄＣ標的核酸配列との相補性によって決定される特定の位置で増幅産物にハイブリダイズすることができる。適切な位置でオリゴヌクレオチドプローブの増幅産物核酸へのハイブリダイゼーションを行うと、ＦＲＥＴシグナルが生成される。ハイブリダイゼーション温度は、約３５℃〜約６５℃で約１０秒〜約１分の範囲であり得る。
【００７６】
蛍光分析は、例えば、フォトンカウンティング落射蛍光顕微鏡システム（特定の範囲で蛍光発光をモニターするための適切なダイクロイックミラーおよびフィルターを含む）、フォトンカウンティングフォトマルチプライヤーシステム、または蛍光光度計を使用して実施することができる。エネルギー移動を開始させるための励起は、アルゴンイオンレーザー、高強度水銀（Ｈｇ）アークランプ、光ファイバー光源、または所望の範囲での励起のために適切にフィルタリングされた他の高強度光源を用いて行われ得る。
【００７７】
ドナーおよび対応するアクセプター蛍光部分に関して本明細書中で使用される場合、「対応する」とは、アクセプター蛍光部分がドナー蛍光部分の励起スペクトルと重なる発光スペクトルを有することを指す。アクセプター蛍光部分の発光スペクトルの最大波長は、ドナー蛍光部分の励起スペクトルの最大波長よりも少なくとも１００ｎｍ大きくなければならない。従って、それらの間で効率的な非放射エネルギー伝達を生じさせることができる。
【００７８】
蛍光ドナーおよび対応するアクセプター部分は一般に、（ａ）高効率なフォースターエネルギー伝達；（ｂ）大きな最終ストークスシフト（＞１００ｎｍ）；（ｃ）可能な限り可視スペクトルの赤色部分（＞６００ｎｍ）への発光のシフト；（ｄ）ドナー励起波長での励起により生成されるラマン水蛍光発光よりも高い波長への発光のシフトに関し、選択される。例えば、ドナー蛍光部分は、レーザー線（例えば、ヘリウム−カドミウム４４２ｎｍまたはアルゴン４８８ｎｍ）の近くの励起極大、高い吸光係数、高い量子収率、および対応するアクセプター蛍光部分の励起スペクトルとの蛍光発光との良好な重なりを有するものを選択することができる。対応するアクセプター蛍光部分は、高い吸光係数、高い量子収率、ドナー蛍光部分の発光と励起との良好な重なり、および可視スペクトルの赤色部分（＞６００ｎｍ）での発光を有するものを選択することができる。
【００７９】
ＦＲＥＴ技術において様々なアクセプター蛍光部分と共に使用することができる代表的なドナー蛍光部分として、フルオレセイン、ルシファーイエロー、Ｂ−フィコエリスリン、９−アクリジンイソチオシアネート、ルシファーイエローＶＳ、４−アセトアミド−４’−イソチオ−シアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸、７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリン、スクシンイミジル−１−ピレンブチレート、４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸誘導体が挙げられる。代表的なアクセプター蛍光部分として、使用されるドナー蛍光部分に応じ、ＬＣ  Ｒｅｄ  ６４０、ＬＣ  Ｒｅｄ  ７０５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、リサミンローダミンＢスルホニルクロリド、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、ローダミンｘイソチオシアネート、エリスロシンイソチオシアネート、フルオレセイン、ジエチレントリアミンペンタアセテート、またはランタニドイオンの他のキレート（例えば、ユーロピウム、またはテルビウム）が挙げられる。ドナーおよびアクセプター蛍光部分は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｊｕｎｃｔｉｏｎ  Ｃｉｔｙ、ＯＲ）またはＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から入手できる。
【００８０】
ドナーおよびアクセプター蛍光部分は、リンカアームを介して適切なプローブオリゴヌクレオチドに結合することができる。リンカアームはドナーとアクセプター蛍光部分との間の距離に影響するので、各リンカアームの長さは重要である。本発明の目的のためのリンカアームの長さは、ヌクレオチド塩基から蛍光部分までオングストローム（Å）単位の距離である。一般に、リンカアームは約１０Åから約２５Åである。リンカアームは、ＷＯ８４／０３２８５号に記載されている種類のものでよい。ＷＯ８４／０３２８５号はまた、リンカアームを特定のヌクレオチド塩基に結合する方法、および蛍光部分をリンカアームに結合する方法も開示している。
【００８１】
ＬＣ  Ｒｅｄ  ６４０−ＮＨＳ−エステルなどのアクセプター蛍光部分をＣ６−ホスホルアミダイト（ＡＢＩ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）から入手可能）またはＧｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＶＡ）と組み合わせることによって、例えばＬＣ  Ｒｅｄ６４０−ホスホルアミダイトを生成することができる。フルオレセインのようなドナー蛍光部分をオリゴヌクレオチドに結合するためによく使用されるリンカーとして、以下のものが挙げられる：チオ尿素リンカー（ＦＩＴＣ−由来，例えば、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ又はＣｈｅｍＧｅｎｅ（Ａｓｈｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．）のフルオレセイン−ＣＰＧ），アミド−リンカー（フルオレセイン−ＮＨＳ−エステル−由来、例えば、ＢｉｏＧｅｎｅｘ（Ｓａｎ  Ｒａｍｏｎ，Ｃａｌｉｆ．）のフルオレセイン−ＣＰＧ），又はオリゴヌクレオチド合成後にフルオレセイン−ＮＨＳ−エステルとカップリングすることが必要な３’−アミノ−ＣＰＧ。
【００８２】
クロストリジウム・ディフィシルの検出
本発明は、生物学的又は非生物学的サンプル中のＣ．ディフィシルのｔｃｄＣ遺伝子のヌクレオチド１１７位における一塩基欠失（ｔｃｄＣΔ１１７）の存在又は不存在を検出するための方法を提供する。特許請求の範囲に記載の方法は、サンプルの汚染、例えばランからランへのキャリーオーバー汚染、偽陰性、例えば、感度、および偽陽性、例えば、特異性の問題を回避することができる。本方法は、一対のｔｃｄＣプライマーを用いてサンプルからｔｃｄＣ核酸分子の一部を増幅することを含む少なくとも１回のサイクリング工程およびＦＲＥＴ検出工程を行うことを含む。好ましくはサーモサイクラー内で、複数回のサイクリング工程を行う。本発明の方法は、ｔｃｄＣΔ１１７の存在を検出するためにｔｃｄＣプライマーおよびＣｏｂｒａプローブを使用して実施することができ、そしてｔｃｄＣΔ１１７が検出されることは、サンプル中にＣ．ディフィシルのエピデミックなリボタイプが存在することを示す。
【００８３】
本明細書中に記載されるように、増幅産物は、ＦＲＥＴ技術を利用する標識されたハイブリダイゼーションプローブを用いて検出できる。１つのＦＲＥＴフォーマットは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）技術を利用して、増幅産物の存在または不存在を検出し、それにより、Ｃ．ディフィシルの存在又は不存在を検出する。ＴａｑＭａｎ（登録商標）技術は、２つの蛍光部分で標識された１本の一本鎖ハイブリダイゼーションプローブを利用する。第１の蛍光部分が適切な波長の光で励起されると、吸収されたエネルギーはＦＲＥＴの原理に従って第２の蛍光部分に伝達される。第２の蛍光部分は、一般にクエンチャー分子である。ＰＣＲ反応のアニーリング工程の間に、標識されたハイブリダイゼーションプローブは、標的ＤＮＡ（すなわち、増幅産物）に結合し、そしてその後の伸長フェーズの間に、Ｔａｑポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によって分解される。その結果、励起された蛍光部分とクエンチャー部分は互いに空間的に分離されるようになる。結果として、クエンチャーの非存在下で第１の蛍光部分を励起すると、第１の蛍光部分からの蛍光発光を検出することができる。例として、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）技術を使用し、そして本明細書に記載のサンプルにおけるＣ．ディフィシルの存在又は不存在を検出するための方法を実行するのに適している。
【００８４】
ＦＲＥＴと共に分子ビーコンを使用して、本発明のリアルタイムＰＣＲ法を使用して増幅産物の存在を検出することもできる。分子ビーコン技術は、第１の蛍光部分および第２の蛍光部分で標識されたハイブリダイゼーションプローブを使用する。第２の蛍光部分は一般的にはクエンチャーであり、そして蛍光標識は典型的にはプローブの両端に配置される。分子ビーコン技術は、二次構造（例えば、ヘアピン）の形成を可能にする配列を有するプローブオリゴヌクレオチドを使用する。プローブ内における二次構造の形成の結果、両方の蛍光部分は、プローブが溶液中にあるときに空間的に近接する。標的核酸（すなわち、増幅産物）へのハイブリダイゼーション後、プローブの二次構造は破壊され、蛍光部分は互いに分離され、適切な波長の光で励起された後に第１の蛍光部分の発光が検出できるようになる。
【００８５】
ＦＲＥＴ技術の他の一般的なフォーマットは、２つのハイブリダイゼーションプローブを利用する。各プローブは異なる蛍光部分で標識することができ、一般的に標的ＤＮＡ分子（例えば、増幅産物）内で互いに近接してハイブリダイズするように設計されている。ドナー蛍光部分、例えばフルオレセインは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）機器の光源によって４７０ｎｍで励起される。ＦＲＥＴの間に、フルオレセインはそのエネルギーをＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）−Ｒｅｄ  ６４０（ＬＣ  Ｒｅｄ  ６４０）又はＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）−Ｒｅｄ  ７０５（ＬＣ  Ｒｅｄ  ７０５）等のアクセプター蛍光部分に伝達する。次いでアクセプター蛍光部分はより長い波長の光を放射し、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）機器の光学検出システムにより検出される。効率的なＦＲＥＴは、蛍光部分が直接局所的に近接している場合、およびドナー蛍光部分の発光スペクトルがアクセプター蛍光部分の吸収スペクトルと重なる場合にのみ発生する。放出されたシグナルの強度は、元の標的ＤＮＡ分子の数（例、Ｃ．ディフィシルゲノムの数）と相関し得る。ｔｃｄＣ核酸の増幅が起こり、増幅産物が生成される場合、ハイブリダイズ工程により、一対のプローブのメンバー間のＦＲＥＴに基づく検出可能なシグナルが得られる。
【００８６】
一般に、ＦＲＥＴの存在はサンプル中のＣ．ディフィシルの存在を示し、そしてＦＲＥＴの不存在はサンプル中のＣ．ディフィルの不存在を示す。しかしながら、検体採取の不適切さ、輸送の遅れ、不適切な輸送条件、特定の採取スワブ（アルギン酸カルシウムまたはアルミシャフト）の使用はすべて、成功および／または試験結果の精度に影響する可能性がある条件である。本明細書に開示されている方法を使用すると、例えば、４５回のサイクリング工程でＦＲＥＴが検出されることは、Ｃ．ディフィシルの感染を示す。
【００８７】
本発明の方法の実施に使用することができる代表的な生物学的サンプルとしては、皮膚スワブ、鼻スワブ、創傷スワブ、血液培養物、皮膚、および軟組織感染症が挙げられるが、これらに限定されない。生物学的サンプルの収集および保存方法は当業者に知られている。生物学的サンプルを（例えば、当業界で知られている核酸抽出法および／またはキットによって）処理してＣ．ディフィシル核酸を放出することができ、あるいは場合により、生物学的サンプルをＰＣＲ反応成分および適切なオリゴヌクレオチドと直接接触させることができる。
【００８８】
融解曲線解析は、サイクリングプロファイルに含めることができる追加的な工程である。融解曲線解析は、ＤＮＡ二本鎖の半分が一本鎖に分離する温度として定義される融解温度（Ｔｍ）と呼ばれる特性温度でＤＮＡが融解するという事実に基づいている。ＤＮＡの融解温度は、主にそのヌクレオチド組成に依存する。したがって、ＧおよびＣヌクレオチドを多く含むＤＮＡ分子は、ＡおよびＴヌクレオチドを多く含むものよりも高いＴｍを有する。シグナルが失われる温度を検出することによって、プローブの融解温度を決定することができる。同様に、シグナルが生成される温度を検出することによって、プローブのアニーリング温度を決定することができる。ｔｃｄＣ増幅産物から得たｔｃｄＣプローブの融解温度により、サンプル中のＣ．ディフィシルの存在または不存在を確認することができる。
【００８９】
各サーモサイクラーのランにおいて、対照サンプルも同様にサイクリングする。陽性対照サンプルは、例えば、対照プライマーおよび対照プローブを使用して、Ｃ．ディフィシル核酸対照鋳型（ｔｃｄＣ以外）を増幅することができる。陽性対照サンプルは、例えばｔｃｄＣ核酸分子を含むプラスミド構築体も増幅することができる。このようなプラスミド対照は、内部的に（例えば、サンプル中で）増幅することも、あるいは患者のサンプルと並行してランさせる別個のサンプル中で増幅することもできる。各サーモサイクラーのランには、例えば、Ｃ．ディフィシル鋳型ＤＮＡを欠く陰性対照を含めることもできる。このような対照は、増幅、ハイブリダイゼーション、および／またはＦＲＥＴ反応の成功または失敗の指標である。それ故、対照反応は、例えば、配列特異性を持ってアニールし伸長を開始するプライマーの能力、配列特異性を持ってハイブリダイズするプローブの能力、並びにＦＲＥＴの発生を容易に決定することができる。
【００９０】
一実施形態では、本発明の方法は、汚染を回避するための工程を含む。例えば、ある回のサーモサイクラーのランと次の回のランとの間の汚染を低減または排除するためのウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼを利用した酵素的方法が、米国特許第５，０３５，９９６号、第５，６８３，８９６号、及び第５，９４５，３１３号に記載されている。
【００９１】
本発明の方法を実施するためにＦＲＥＴ技術と組み合わせた従来のＰＣＲ法を使用することができる。一実施形態では、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）機器が使用される。以下の特許出願は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）技術において使用されるリアルタイムＰＣＲを記載している：ＷＯ９７／４６７０７号、ＷＯ９７／４６７１４号、及びＷＯ９７／４６７１２号。
【００９２】
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）は、ＰＣワークステーションを使用して操作することができ、Ｗｉｎｄｏｗｓ  ＮＴオペレーティングシステムを利用することができる。機械がキャピラリを光学ユニット上に順次位置決めするときに、サンプルからのシグナルが得られる。ソフトウェアは各測定の直後にリアルタイムで蛍光シグナルを表示することができる。蛍光取得時間は１０〜１００ミリ秒（ｍｓｅｃ）である。各サイクリング工程の後、蛍光対サイクル数の定量的表示をすべてのサンプルについて継続的にアップデートすることができる。生成されたデータはさらなる分析のために保存することができる。
【００９３】
ＦＲＥＴに代わるものとして、蛍光ＤＮＡ結合色素（例、ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎまたはＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ））などの二本鎖ＤＮＡ結合色素を用いて増幅産物を検出することができる。二本鎖核酸と相互作用すると、かかる蛍光ＤＮＡ結合色素は、適切な波長の光で励起した後に蛍光シグナルを発する。核酸インターカレーター色素などの二本鎖ＤＮＡ結合色素を使用することもできる。二本鎖ＤＮＡ結合色素を使用する場合、通常、増幅産物の存在を確認するために融解曲線解析を行う。
【００９４】
本発明は、１つは複数の市販の機器の構成によって限定されないことが理解される。
【００９５】
製品／キット
本発明は、更に、Ｃ．ディフィシルのｔｃｄＣ遺伝子のヌクレオチド１１７位における一塩基欠失（ｔｃｄＣΔ１１７）を検出するための製品又はキットを提供する。本発明にかかる製品は、ｔｃｄＣΔ１１７を検出するために使用されるプライマーおよびプローブを適切なパッケージ材料と共に含みうる。ｔｃｄＣΔ１１７を検出するための代表的なプライマーおよびプローブは、ｔｃｄＣ核酸分子へのハイブリダイズが可能である。さらに、キットは、ＤＮＡ固定化、ハイブリダイゼーション、および検出に必要な適切にパッケージされた試薬および材料、例えば固体支持体、バッファー、酵素、およびＤＮＡ標準を含んでもよい。プライマーおよびプローブの設計方法が本明細書に開示されており、ｔｃｄＣ核酸分子の増幅およびハイブリダイズをするプライマーおよびプローブの代表例が提供されている。
【００９６】
本発明の製品は、プローブを標識するための１つ又は複数の蛍光部分を含むこともでき、あるいは、キットにて供給されるプローブを標識することもできる。例えば、製品は、一方のｔｃｄＣプローブを標識するためのドナー蛍光部分と他方のｔｃｄＣプローブを標識するためのアクセプター蛍光部分とをそれぞれ含んでもよい。適切なＦＲＥＴドナー蛍光部分および対応するアクセプター蛍光部分の例は上述の通りである。
【００９７】
本発明の製品はまた、サンプル中のｔｃｄＣΔ１１７を検出するためのｔｃｄＣプライマーおよびプローブを使用するための指示が記載されている添付文書またはパッケージラベルを含み得る。製品は、本明細書に開示される方法を実施するための試薬（例えば、バッファ、ポリメラーゼ酵素、補因子、または汚染を防止するための薬剤）をさらに含んでもよい。そのような試薬は、本明細書に記載の市販の機器の１つに特異的であってもよい。
【００９８】
本発明は、以下の実施例においてさらに説明されるが、特許請求の範囲に記載の発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００９９】
以下の実施例および図面は、本発明の理解を助けるために提供されており、本発明の真の範囲は添付の特許請求の範囲に記載されている。本発明の精神から逸脱することなく、記載の手順を改変できることが理解される。
【０１００】
実施例１：ｔｃｄＣΔ１１７を検出するためのＣｏｂｒａプローブの設計
ｔｃｄＣ中のヌクレオチド１１７位における一塩基欠失（ｔｃｄＣΔ１１７）を検出するために、伝統的なプローブおよびＣｏｂｒａプローブを、一塩基欠失を表す変異配列について設計した。ＪＮ  ９４４６１９は、ｔｃｄＣΔ１１７を検出するためのプライマーおよびプローブの設計に使用されるＣ．ディフィシルＣＤ１３９５株のＮＣＢＩ参照配列である。ゲノムおよびプラスミドＤＮＡサンプルを様々なコピーレベルで試験し、ｃｏｂａｓ  ｚ  ４８０装置（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ）によるリアルタイムＰＣＲを用いて増幅を行った。
【０１０１】
Ｃｏｂｒａプローブのヌクレオチド配列、およびｔｃｄＣ遺伝子におけるΔ１１７一塩基欠失に完全に一致する「通常の」センスプローブのヌクレオチド配列、およびフォワードおよびリバースプライマーの配列を表１に列挙する。
【表１】
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【０１０２】
実施例２：リアルタイムＰＣＲアッセイ条件
【表２】
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【０１０３】
次の表は、ＰＣＲ増幅反応に使用される典型的なサーモプロファイルを示す。
【表３】
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【０１０４】
実施例３：ｔｃｄＣΔ１１７の検出のためのＰＣＲアッセイの結果
Ｃ．ディフィシルの３つの株由来のゲノムＤＮＡを鋳型として使用した。株１２８４０由来の鋳型は野生型Ｃ．ディフィシルを表す。株１１３１３由来の鋳型は、ｔｃｄＣ遺伝子のオリゴヌクレオチド１２０位にＳＮＰを有する変異型Ｃ．ディフィシルを表し、これは二成分毒素を産生するが、Δ１１７については野生型である。株１１３１４由来の鋳型は、ｔｃｄＣΔ１１７遺伝子を有する変異型Ｃ．ディフィシル株を表す。フォワードプライマー（配列番号：４）およびリバースプライマー（配列番号：５）による通常のセンスプローブΔ１１７−センスＦＱ４（配列番号：３）を用いたＰＣＲ実験から得た増殖曲線を図３に示す。最大のシグナルが、１００（１ｅ２）および１０００（１ｅ３）コピー／反応濃度の１１３１４鋳型（ｔｃｄＣΔ１１７）で観察されたが、１０（１ｅ１）コピー／反応濃度の１１３１４鋳型ではシグナルが観察されなかった。また、識別可能なシグナルは、１０5（１ｅ５）および１０6（１ｅ６）コピー／反応濃度で株１１３１３の鋳型（ＳＮＰ１２０）から、および１０5コピー／反応濃度で１２８４０野生型の鋳型からも検出することができた。対照的に、プローブΔ１１７−Ｃｏｂｒａ  ＦＱ９（配列番号１）またはΔ１１７−Ｃｏｂｒａ  ＦＱ６（配列番号２）を同じフォワードプライマーおよびリバースプライマーと共に使用した場合、１１３１４  ｔｃｄＣΔ１１７鋳型について感度が高かった（シグナルは１０［１ｅ１］コピー／反応で検出された）のみならず、１０5（１ｅ５）または１０6（１ｅ６）のコピー／反応濃度で株１１３１３および株１２８４０の鋳型に対するシグナルは減少するか又は観察されなかった（図４および図５）。
【０１０５】
明瞭さと理解のために前述の発明を幾分詳細に説明してきたが、当業者は本開示により本発明の真の範囲から逸脱することなく形態や詳細を様々に改変ができることは明らかである。例えば、上記のすべての技術および装置は様々な組み合わせで使用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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