(57)【要約】  本開示は、断片を伸長し、伸長された断片をメチルトランスフェラーゼ及びメチル基供給源で処理することで、ヘミメチル化二本鎖ＤＮＡをフルメチル化二本鎖ＤＮＡに変換することによる、増幅されたメチロームの作製方法を提供する。
2020513801.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）メチル化パターンを有する二本鎖ＤＮＡ配列を断片化することで、メチル化パターンを有し、且つ、５’末端及び３’末端のそれぞれにプライマー結合部位を含む、鋳型二本鎖ＤＮＡ断片配列群を作製すること、
（ｂ）前記鋳型二本鎖ＤＮＡ断片配列群をそれぞれ上下の鋳型鎖に分離すること、
（ｃ）プライマー、ポリメラーゼ及びヌクレオチドを用いて前記上下の鋳型鎖を伸長させ、非メチル化相補鎖を作製することで、メチル化パターンを有する前記鋳型二本鎖ＤＮＡ断片配列群に対応するヘミメチル化二本鎖ＤＮＡ配列群を得ること、
（ｄ）前記ヘミメチル化二本鎖ＤＮＡ配列群をメチルトランスフェラーゼとメチル基供給源とで処理することにより、対応する前記鋳型二本鎖ＤＮＡ断片配列群におけるメチル化シトシンに対応する位置にメチル基を付加して、フルメチル化鋳型二本鎖ＤＮＡ断片配列群を作製すること；及び、
（ｅ）工程（ｂ）〜（ｄ）を繰り返して、前記鋳型二本鎖ＤＮＡ断片配列群のフルメチル化アンプリコン群を作製すること、
を含む、増幅されたメチロームの作製方法。
【請求項２】
前記鋳型二本鎖ＤＮＡ断片配列群のフルメチル化アンプリコン群を、シトシン残基をウラシルに変換するための試薬で処理すること、及び
メチル化シトシンパターンを解析すること、
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ａ）における断片化が、
前記二本鎖ＤＮＡ配列をトランスポソームライブラリーと接触させること、及び、
トランスポゾンＤＮＡと鋳型二本鎖ＤＮＡ断片配列との間のギャップをギャップ充填して、各端にプライマー結合部位を有する鋳型二本鎖ＤＮＡ断片配列のライブラリーを形成すること、
によるものであり、
前記ライブラリーの各トランスポソームはそれぞれ独自の付随バーコード配列を有しており、
前記ライブラリーの各トランスポソームはトランスポザーゼ−トランスポゾンＤＮＡのホモ二量体を含んでおり、前記ホモ二量体の各トランスポゾンＤＮＡはトランスポザーゼ結合部位と、独自のバーコード配列と、プライマー結合部位と、を含んでおり、
前記トランスポソームライブラリーが前記二本鎖ＤＮＡ配列上に存在する標的部位群に結合して、前記トランスポザーゼが前記二本鎖ＤＮＡ配列を前記鋳型二本鎖ＤＮＡ断片配列群へと切断し、
各鋳型二本鎖ＤＮＡ断片配列はその各端に独自のバーコード配列対のうちの一方を含んでいる、
請求項１に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｃ）がマグネシウムイオンを含み、
工程（ｄ）の処理が、マグネシウムイオンをキレート化するためにキレート化剤を添加することを含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｃ）がマグネシウムイオンを含み、
工程（ｄ）の処理が、マグネシウムイオンをキレート化するためにＥＤＴＡを添加することを含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項６】
工程（ｃ）がマグネシウムイオンを含み、
工程（ｄ）の処理が、メチルトランスフェラーゼにとって理想的な緩衝液条件をつくるために、マグネシウムイオンを等モル量でキレート化するようにＥＤＴＡを添加することを含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項７】
工程（ｅ）が、反復される工程（ｃ）において、プライマー伸長に理想的なプライマー伸長用緩衝液条件をつくるために、マグネシウムイオンを添加することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記メチルトランスフェラーゼがＤＮＭＴ１である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記トランスポザーゼが、Ｔｎ５トランスポザーゼ、Ｍｕトランスポザーゼ、Ｔｎ７トランスポザーゼ又はＩＳ５トランスポザーゼである、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
前記シトシン残基をウラシルに変換するための試薬が亜硫酸水素ナトリウムである、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記二本鎖ＤＮＡ配列がゲノムＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記二本鎖ＤＮＡ配列が、単一細胞から得られた全ゲノムＤＮＡ、又はセルフリーＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記二本鎖ＤＮＡ配列が出生前細胞、がん細胞、又は循環腫瘍細胞に由来するゲノムＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記二本鎖ＤＮＡ配列が、個人から採取された血液試料から得られたセルフリー腫瘍細胞ゲノムＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
工程（ｂ）〜（ｄ）が１〜２０回繰り返される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
工程（ｂ）〜（ｄ）が１〜１０回繰り返される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
工程（ｂ）〜（ｄ）が１〜５回繰り返される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記鋳型二本鎖ＤＮＡ断片配列群のフルメチル化アンプリコン群が、シトシン残基をウラシルに変換するための試薬で処理される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記シトシン残基をウラシルに変換するための試薬がＡＰＯＢＥＣファミリーの酵素である、請求項２に記載の方法。
【請求項２０】
前記シトシン残基をウラシルに変換するための試薬がＡＰＯＢＥＣ３Ａである、請求項２に記載の方法。
【請求項２１】
前記プライマーが遺伝子座特異的プライマーである、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記プライマーが疾患特異的プライマーである、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記プライマーががん特異的プライマーである、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
（ａ）個人由来の液体生検試料から得られた、メチル化パターンを有する二本鎖ＤＮＡ配列を断片化することで、メチル化パターンを有し、且つ、５’末端及び３’末端のそれぞれにプライマー結合部位を含む、鋳型二本鎖ＤＮＡ断片配列群を作製すること、
（ｂ）前記鋳型二本鎖ＤＮＡ断片配列群をそれぞれ上下の鋳型鎖に分離すること、
（ｃ）がん特異的プライマー、ポリメラーゼ及びヌクレオチドを用いて前記上下の鋳型鎖を伸長させ、非メチル化相補鎖を作製することで、メチル化パターンを有する前記鋳型二本鎖ＤＮＡ断片配列群に対応するヘミメチル化二本鎖ＤＮＡ配列群を得ること、
（ｄ）前記ヘミメチル化二本鎖ＤＮＡ配列群をメチルトランスフェラーゼとメチル基供給源とで処理することにより、対応する前記鋳型二本鎖ＤＮＡ断片配列群におけるメチル化シトシンに対応する位置にメチル基を付加して、フルメチル化鋳型二本鎖ＤＮＡ断片配列群を作製すること；
（ｅ）工程（ｂ）〜（ｄ）を繰り返して、前記鋳型二本鎖ＤＮＡ断片配列群のフルメチル化アンプリコンを作製すること、
前記鋳型二本鎖ＤＮＡ断片配列群のフルメチル化アンプリコン群を、シトシン残基をウラシルに変換するための試薬で処理すること；
メチル化シトシンパターンを決定すること；
前記メチル化シトシンパターンを、がんＤＮＡの標準的なメチル化シトシンパターンと比較すること；
前記メチル化シトシンパターンと前記がんＤＮＡの標準的なメチル化シトシンパターンとの間の差異を決定すること；並びに
決定された前記メチル化シトシンパターンが前記がんＤＮＡの標準的なメチル化シトシンパターンと一致している場合に前記個人をがんと診断すること、
を含む、個人のがんを診断する方法。
【請求項２５】
前記液体生検試料が血液試料、髄液試料又は尿試料である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
工程（ｃ）がマグネシウムイオンを含み、
工程（ｄ）の処理が、マグネシウムイオンをキレート化するためにキレート化剤を添加することを含む、
請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
工程（ｃ）がマグネシウムイオンを含み、
工程（ｄ）の処理が、マグネシウムイオンをキレート化するためにＥＤＴＡを添加することを含む、
請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
工程（ｃ）がマグネシウムイオンを含み、
工程（ｄ）の処理が、メチルトランスフェラーゼにとって理想的な緩衝液条件をつくるために、マグネシウムイオンを等モル量でキレート化するようにＥＤＴＡを添加することを含む、
請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
工程（ｅ）が、反復される工程（ｃ）において、プライマー伸長に理想的なプライマー伸長用緩衝液条件をつくるために、マグネシウムイオンを添加することを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
前記メチルトランスフェラーゼがＤＮＭＴ１である、請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
前記シトシン残基をウラシルに変換するための試薬が亜硫酸水素ナトリウムである、請求項２４に記載の方法。
【請求項３２】
前記シトシン残基をウラシルに変換するための試薬がＡＰＯＢＥＣファミリーの酵素である、請求項２４に記載の方法。
【請求項３３】
前記シトシン残基をウラシルに変換するための試薬がＡＰＯＢＥＣ３Ａである、請求項２４に記載の方法。
【請求項３４】
前記二本鎖ＤＮＡ配列が単一細胞から得られた全ゲノムＤＮＡである、請求項２４に記載の方法。
【請求項３５】
前記二本鎖ＤＮＡ配列ががん細胞又は循環腫瘍細胞に由来するゲノムＤＮＡである、請求項２４に記載の方法。
【請求項３６】
前記二本鎖ＤＮＡ配列が、個人から採取された血液試料から得られたセルフリー腫瘍細胞ゲノムＤＮＡである、請求項２４に記載の方法。
【請求項３７】
工程（ｂ）〜（ｄ）が１〜２０回繰り返される、請求項２４に記載の方法。
【請求項３８】
工程（ｂ）〜（ｄ）が１〜１０回繰り返される、請求項２４に記載の方法。
【請求項３９】
工程（ｂ）〜（ｄ）が１〜５回繰り返される、請求項２４に記載の方法。
【請求項４０】
前記プライマーががん特異的プライマーである、請求項２４に記載の方法。
【請求項４１】
メチル化シトシンパターンの決定が次世代シーケンシング、メチル化特異的ｑＰＣＲ、又はメチル化検出用マイクロアレイを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項４２】
前記がんが胸部の浸潤癌、結腸の腺癌、肝臓の肝細胞癌、前立腺の腺癌、胃の腺癌、及び子宮体部の子宮内膜癌からなる群から選択されるがんである、請求項２４に記載の方法。
【請求項４３】
（ａ）個人由来の液体生検試料から、正常な体細胞と比較して異なるメチル化パターンを有するセルフリー腫瘍ＤＮＡを含有する可能性のある、セルフリーＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを抽出すること、
（ｂ）前記二本鎖ＤＮＡ配列群をそれぞれ上下の鋳型鎖に分離すること、
（ｃ）ポリメラーゼと、ヌクレオチドと、がん細胞と正常細胞とが異なるメチル化パターンを有するゲノム領域群を標的とする選択されたプライマーセットと、を用いて前記上下の鋳型鎖を伸長させることで、選択された差示的メチル化遺伝子座群のヘミメチル化二本鎖ＤＮＡ配列群を得ること、
（ｄ）前記ヘミメチル化二本鎖ＤＮＡ配列群をメチルトランスフェラーゼで処理することで、対応する二本鎖ＤＮＡ配列内のメチル化シトシンに対応する位置にメチル基を付加して、選択された差示的メチル化遺伝子座群のフルメチル化二本鎖ＤＮＡ配列群を得ること、
（ｅ）工程（ｂ）〜（ｄ）を繰り返して、前記選択された差示的メチル化遺伝子座のフルメチル化アンプリコン群を作製すること、
（ｆ）前記フルメチル化アンプリコン群を、メチル化シトシン残基は変化させずにシトシン残基をウラシルに変換するための試薬で処理すること、
（ｇ）メチル化シトシンパターンを決定すること；
（ｈ）セルフリーＤＮＡのメチル化シトシンパターンと、異なるがん組織のメチル化シトシンパターンと、を比較し、前記セルフリーＤＮＡのメチル化シトシンパターンと前記異なるがん組織のメチル化シトシンパターンとの間の差異を決定し、セルフリー腫瘍ＤＮＡが前記試料中に存在するかどうかを判定することにより、前記試料中のセルフリー腫瘍ＤＮＡの有無を判定すること；及び、
（ｉ）決定された前記メチル化シトシンパターンががん特異的なメチル化パターンを含む場合に、前記個人が特定の種類のがんを有すると診断すること、
を含む、個人のがんを早期に診断する方法。
【請求項４４】
前記液体生検試料が血液試料、髄液試料又は尿試料である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
工程（ｃ）がマグネシウムイオンを含み、
工程（ｄ）の処理がマグネシウムイオンをキレート化するためにキレート化剤を添加することを含む、
請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
工程（ｃ）がマグネシウムイオンを含み、
工程（ｄ）の処理がマグネシウムイオンをキレート化するためにＥＤＴＡを添加することを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
工程（ｃ）がマグネシウムイオンを含み、
工程（ｄ）の処理が、メチルトランスフェラーゼにとって理想的な緩衝液条件をつくるために、マグネシウムイオンを等モル量でキレート化するようにＥＤＴＡを添加することを含む、
請求項４３に記載の方法。
【請求項４８】
工程（ｅ）が、反復される工程（ｃ）において、プライマー伸長に理想的なプライマー伸長用緩衝液条件をつくるために、マグネシウムイオンを添加することを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４９】
前記メチルトランスフェラーゼがＤＮＭＴ１である、請求項４３に記載の方法。
【請求項５０】
前記シトシン残基をウラシルに変換するための試薬が亜硫酸水素ナトリウムである、請求項４３に記載の方法。
【請求項５１】
前記シトシン残基をウラシルに変換するための試薬がＡＰＯＢＥＣファミリーの酵素である、請求項４３に記載の方法。
【請求項５２】
前記シトシン残基をウラシルに変換するための試薬がＡＰＯＢＥＣ３Ａである、請求項４３に記載の方法。
【請求項５３】
前記二本鎖ＤＮＡ配列が単一細胞から得られた全ゲノムＤＮＡである、請求項４３に記載の方法。
【請求項５４】
前記二本鎖ＤＮＡ配列ががん細胞又は循環腫瘍細胞に由来するゲノムＤＮＡである、請求項４３に記載の方法。
【請求項５５】
前記二本鎖ＤＮＡ配列が、個人から採取された血液試料から得られたセルフリー腫瘍細胞ゲノムＤＮＡである、請求項４３に記載の方法。
【請求項５６】
工程（ｂ）〜（ｄ）が１〜２０回繰り返される、請求項４３に記載の方法。
【請求項５７】
工程（ｂ）〜（ｄ）が１〜１０回繰り返される、請求項４３に記載の方法。
【請求項５８】
工程（ｂ）〜（ｄ）が１〜５回繰り返される、請求項４３に記載の方法。
【請求項５９】
前記プライマーががん特異的プライマーである、請求項４３に記載の方法。
【請求項６０】
メチル化シトシンパターンの決定が次世代シーケンシング、メチル化特異的ｑＰＣＲ、又はメチル化検出用マイクロアレイを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項６１】
前記がんが胸部の浸潤癌、結腸の腺癌、肝臓の肝細胞癌、前立腺の腺癌、胃の腺癌、及び子宮体部の子宮内膜癌からなる群から選択されるがんである、請求項４３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１７年３月８日に出願された米国仮特許出願第６２／４６８，５９５号に基づく優先権を主張し、当該米国仮特許出願の内容全体をあらゆる目的のために参照により援用するものである。
【０００２】
政府利益に関する陳述
本発明は、アメリカ国立衛生研究所により与えられた５ＤＰ１ＣＡ１８６６９３を基に、政府援助を得てなされたものである。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
本発明の実施形態は、全体としては、メチル化情報又はメチル化状態が維持されるような、単一細胞由来ＤＮＡ又はセルフリーＤＮＡなどのＤＮＡの増幅方法、及びそれに用いる組成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
亜硫酸水素ナトリウムによるゲノムＤＮＡの変換は今やＤＮＡメチル化解析のためのゴールドスタンダードとなっている。ＤＮＡをバイサルファイト（亜硫酸水素塩）で処理すると、シトシン残基はウラシルへと変換されるが、５−メチルシトシン残基は影響を受けない。この方法により、非メチル化シトシンとメチル化シトシンの区別が可能となり、１ヌクレオチドレベルの解像度を有する、ＤＮＡメチル化状態を表すマップが得られる。
【０００５】
バイサルファイト変換の主な問題点は、当該変換と同時にＤＮＡの分解と断片化が起こってしまうことにある。完全な変換のために必要な条件としては、長いインキュベーション時間、高温、及び高濃度バイサルファイトなどが挙げられるが、そのような条件は、インキュベートされたＤＮＡの９０％にまで及ぶ分解と断片化をもたらす可能性がある。この分解はＤＮＡの脱プリンとして起こり、これはランダムな鎖切断を引き起こす。分解量が多いことは問題であり、最初のＤＮＡ量が限られている場合や、１細胞レベルのＤＮＡを扱う場合などではさらに問題となる。バイサルファイト法を用いた低カバレッジの単一細胞の配列決定は、単一細胞に対してバイサルファイト変換を直接行い、その後ＤＮＡ増幅を行うことにより既に達成されている。Guo, H., et al. (2013). "Single-cell methylome landscapes of mouse embryonic stem cells and early embryos analyzed using reduced representation bisulfite sequencing." Genome Res 23(12): 2126-2135; Smallwood, S. A., et al. (2014). "Single-cell genome-wide bisulfite sequencing for assessing epigenetic heterogeneity." Nat Methods 11(8): 817-820。
【０００６】
１細胞レベルのＤＮＡに対してゲノムのメチル化研究を高カバレッジで行えることは、腫瘍増殖、幹細胞リプログラミング、記憶形成、胚発生など、細胞間のばらつきや集団の不均一性が重要な役割を果たす研究において重要となる。また、解析に供される細胞試料が貴重、又は稀、又は微量な場合（例えば、試料が、単一細胞である場合、又は単一細胞の全ゲノム若しくは部分ゲノムである場合、又はセルフリーＤＮＡである場合など）においても、重要である。
【０００７】
全ゲノム増幅法などの既知の種々の増幅法では、ＤＮＡは増幅されるが、オリジナルの鋳型のメチル化情報又はメチル化状態が失われる。そのような全ゲノム増幅法として、ＭＤＡ（multiple displacement amplification）が挙げられる。これは、当該技術分野において、単一細胞から得られたゲノムＤＮＡに対し、シーケンシングや他の解析の前に一般的に用いられる方法である。この方法では、ランダムプライマーのアニーリングの後に、強力な鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを利用した伸長が行われる。単一細胞から得られたオリジナルのゲノムＤＮＡはカスケード方式で指数関数的に増幅され、超分岐型のＤＮＡ構造を形成する。単一細胞から得られたゲノムＤＮＡを増幅する別の方法として、Zong, C., Lu, S., Chapman, A.R., and Xie, X.S. (2012), Genome-wide detection of single-nucleotide and copy-number variations of a single human cell, Science 338, 1622-1626には、多重アニーリング及びループ化による増幅サイクル法（Multiple Annealing and Looping-Based Amplification Cycles）（ＭＡＬＢＡＣ）が記載されている。当該技術分野において公知の別の方法として、縮重オリゴヌクレオチドプライマーＰＣＲ（degenerate oligonucleotide primed PCR）、すなわちＤＯＰ−ＰＣＲ法がある。単一細胞ゲノムＤＮＡに使用されるいくつかの他の方法としては、次のようなものがある：
Cheung, V.G. and S.F. Nelson, Whole genome amplification using a degenerate oligonucleotide primer allows hundreds of genotypes to be performed on less than one nanogram of genomic DNA, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1996. 93(25): p. 14676-9; 
Telenius, H., et al., Degenerate oligonucleotide-primed PCR: general amplification of target DNA by a single degenerate primer, Genomics, 1992. 13(3): p. 718-25; 
Zhang, L., et al., Whole genome amplification from a single cell: implications for genetic analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1992, 89(13): p. 5847-51; 
Lao, K., N.L. Xu, and N.A. Straus, Whole genome amplification using single-primer PCR, Biotechnology Journal, 2008, 3(3): p. 378-82; 
Dean, F.B., et al., Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2002. 99(8): p. 5261-6; 
Lage, J.M., et al., Whole genome analysis of genetic alterations in small DNA samples using hyperbranched strand displacement amplification and array-CGH, Genome Research, 2003, 13(2): p. 294-307; 
Spits, C., et al., Optimization and evaluation of single-cell whole-genome multiple displacement amplification, Human Mutation, 2006, 27(5): p. 496-503; 
Gole, J., et al., Massively parallel polymerase cloning and genome sequencing of single cells using nanoliter microwells, Nature Biotechnology, 2013. 31(12): p. 1126-32; 
Jiang, Z., et al., Genome amplification of single sperm using multiple displacement amplification, Nucleic Acids Research, 2005, 33(10): p. e91; 
Wang, J., et al., Genome-wide Single-Cell Analysis of Recombination Activity and De Novo Mutation Rates in Human Sperm, Cell, 2012. 150(2): p. 402-12; 
Ni, X., Reproducible copy number variation patterns among single circulating tumor cells of lung cancer patients, PNAS, 2013, 110, 21082-21088; 
Navin, N., Tumor evolution inferred by single cell sequencing, Nature, 2011, 472 (7341):90-94; 
Evrony, G.D., et al., Single-neuron sequencing analysis of l1 retrotransposition and somatic mutation in the human brain, Cell, 2012. 151(3): p. 483-96;及び、
McLean, J.S., et al., Genome of the pathogen Porphyromonas gingivalis recovered from a biofilm in a hospital sink using a high-throughput single-cell genomics platform, Genome Research, 2013. 23(5): p. 867-77。
国際公開第２０１２／１６６４２５号、米国特許第７，７１８，４０３号、米国特許出願公開第２００３／０１０８８７０号及び米国特許第７，４０２，３８６号には、全ゲノム増幅の態様を対象とした方法が報告されている。
【０００８】
しかしながら、オリジナルの鋳型のメチル化情報がアンプリコンにおいて維持される、単一細胞、小細胞群、又はセルフリーＤＮＡなどに由来する少量のゲノムＤＮＡ又はＤＮＡ断片を増幅するさらなる方法が求められている。
【発明の概要】
【０００９】
本開示は、ＤＮＡ断片を作製又は使用する方法を提供する。このＤＮＡ断片は、例えばＰＣＲ条件を用いて、その後にさらに変性されてシングルプライマー伸長などのプライマー伸長にかけられることで、２コピーのヘミメチル化型の二本鎖状の鋳型又は断片を生成しうる。この２コピーのヘミメチル化型の二本鎖状の鋳型又は断片を、メチルトランスフェラーゼで処理することで、新たに合成された鎖の、オリジナルの鋳型二本鎖断片でメチル化されていた場所、すなわち、伸長反応の結果としてメチル基が除去されている場合がある場所において、シトシンがメチル化される。プライマー伸長によるヘミメチル化二本鎖ＤＮＡの形成及びメチルトランスフェラーゼによる処理のプロセスを繰り返すことで、オリジナルの二本鎖鋳型ＤＮＡ断片のメチル化パターンを有する増幅された二本鎖ＤＮＡ断片を作製してもよい。オリジナルの鋳型断片のメチル化の特徴を有する増幅されたＤＮＡ断片の集団を解析することにより、メチル化の特徴を決定してもよい。
【００１０】
断片化の方法としては、当該技術分野において公知の方法が挙げられ、例えば、トランスポザーゼ断片化が挙げられる。このトランスポザーゼ断片化においては、トランスポザーゼ又はトランスポソームを用いて、ゲノムＤＮＡ、その断片、セルフリーＤＮＡなどのオリジナルの核酸配列又は開始用の核酸配列を断片化し、所望により、全メチローム又はメチローム全体のｄｅ  ｎｏｖｏアセンブリの一環として、それぞれの切断部位又は断片化部位の末端にバーコード配列を結合して、その後のコンピュータを用いた断片配列の再結合に役立てる。
【００１１】
本開示のいくつかの実施形態のさらなる特徴及び利点が、以下の実施形態の説明及びその図面の説明において、並びに特許請求の範囲から、より詳細に明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
本特許又は出願ファイルは、少なくとも１つのカラー図面を含んでいる。カラー図面を含む本特許又は特許出願公開の写しは、請求に応じて、必要な手数料が支払われた場合に、米国特許商標庁により提供される。本発明の上記及び他の特徴及び利点は、添付の図面と併せて、下記の例示的な実施形態の詳細な説明から、より十分に理解される。
【図１】図１は、ゲノム核酸試料を断片化した後、変性、プライマー伸長、及びメチル化剤処理にかける方法を模式的に示している。このサイクルを２〜４回繰り返すことで、増幅されたメチロームが得られ、その後、バイサルファイト、ＡＢＯＰＥＣファミリーメンバーなどの酵素、又は他の試薬による処理にかけることで、シトシンがウラシルに変化する。
【図２】図２は、２×１５０ｂｐ  ＭｉＳｅｑ  ｖ２キット（リード数１，０００，０００）を用いた、バイサルファイトシーケンス法の結果の、独自のアライメントリードにおけるメチル化シトシンの割合を示すグラフである。
【図３】図３は、メチルトランスフェラーゼＤＮＭＴ１の性能を示すグラフである。
【図４】図４は、本明細書に記載の増幅及びメチル化法を用いたがんの診断方法を示す模式図である。
【図５】図５は、本明細書に記載の増幅反応及びメチル化反応に最適な反応緩衝液を開発するための、インビトロにおけるメチル化感受性制限酵素Ｃｌａｉの合成オリゴヌクレオチドに対する性能の解析データを示している。
【図６】図６は、ある緩衝液条件における、ＤＮＭＴ１のメチル基転移効率の評価データを示している。
【図７】図７は、ある緩衝液条件における、変性、プライマー伸長及びメチル化剤処理の、１サイクル目及び２サイクル目における、ＤＮＭＴ１のメチル基転移効率の評価データを示している。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
いくつかの実施形態の実施又はいくつかの実施形態の特徴には、特に記載がない限り、当該技術分野において通常の技能の範囲内にある、分子生物学、微生物学及び組換えＤＮＡなどの従来技術を用いてよい。そのような技術は下記の文献において十分に説明されている。例えば、Sambrook, Fritsch, and Maniatis, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second Edition (1989), OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (M. J. Gait Ed., 1984), ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, Ed., 1987), METHODS IN ENZYMOLOGYシリーズ (Academic Press, Inc.); GENE TRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS (J. M. Miller and M. P. Calos eds. 1987), HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY, (D. M. Weir and C. C. Blackwell, Eds.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J. G. Siedman, J. A. Smith, and K. Struhl, eds., 1987), CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY (J. E. coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach and W. Strober, eds., 1991); ANNUAL REVIEW OF IMMUNOLOGY;及びADVANCES IN IMMUNOLOGYなどの学術誌中の研究論文を参照されたい。上記及び下記の、本明細書に記載された全ての特許、特許出願、及び刊行物は、参照により本明細書に援用される。
【００１４】
本明細書で使用される核酸化学、生化学、遺伝学、及び分子生物学の用語及び記号は、当該分野において標準的な論文及び教科書、例えば、Kornberg and Baker, DNA Replication, Second Edition (W.H. Freeman, New York, 1992); Lehninger, Biochemistry, Second Edition (Worth Publishers, New York, 1975); Strachan and Read, Human Molecular Genetics, Second Edition (Wiley-Liss, New York, 1999); Eckstein, editor, Oligonucleotides and Analogs: A Practical Approach (Oxford University Press, New York, 1991); Gait, editor, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1984)などの用語及び記号に従っている。
【００１５】
ＣｐＧ部位又はＣＧ部位とは、５’→３’方向の直鎖塩基配列において、シトシンヌクレオチドの次にグアニンヌクレオチドが現れているＤＮＡ領域のことである。哺乳類では、ＣｐＧジヌクレオチドのシトシンは、メチル化により５−メチルシトシンを形成していることがある。ある遺伝子内のシトシンのメチル化は、その遺伝子の発現を変化させる可能性があり、通常は転写のサイレンシングや抑制が起こる。哺乳類では、ＣｐＧシトシンの７０％〜８０％がメチル化しており、ヒトには合計２８，０００，０００箇所のＣｐＧ部位が存在する。哺乳類ＤＮＡにおけるＣｐＧジヌクレオチド内のシトシンのメチル化は、胚形成、ゲノム刷り込み、Ｘ染色体の不活性化、加齢、及び発癌をはじめとするいくつかの重要なプロセスと関連していることが分かっている。哺乳類の胚形成では、ＤＮＡメチル化のパターンは世代間で大部分消去された後に再建される。親のメチル化情報は、始めに配偶子形成中にほぼ全て消去され、そして再度、初期胚形成においてほぼ全てが消去され、その度に脱メチル化と再メチル化が起こる。がんなどの多くの疾病過程の中で、遺伝子プロモーター内のＣｐＧアイランドは異常な高度メチル化を受ける。この異常なメチル化は、細胞分裂後に娘細胞に継承され得る転写サイレンシングをもたらす。
【００１６】
本開示は、ゲノムメチル化解析の正確性は、微量ＤＮＡ、単一細胞由来ＤＮＡ又はセルフリーＤＮＡなどの、ＤＮＡの処理中のメチル化情報の維持に依存する、という認識に基づいている。本開示は、単一細胞由来ＤＮＡ又は少量のＤＮＡを増幅して、オリジナルの鋳型ＤＮＡのメチル化情報又はメチル化状態を有するアンプリコンを作製する方法を提供する。１つの態様によれば、ＤＮＡメチル化の研究を可能にする本明細書に記載の方法は、血液から得られたセルフリーＤＮＡ試料などの、ある個体由来のＤＮＡ試料のメチル化状態を、がんの指標となるＤＮＡのメチル化状態、すなわち標準（スタンダード）と比較することによる、さらなるがん診断法を提供する。ＤＮＡ試料のメチル化状態ががんの指標となる標準のメチル化状態と相関していた場合、その個体はがんと診断される。本明細書に記載の方法で標準となり得るがんＤＮＡのメチル化パターンは、例えば、内容全体が参照により本明細書に援用される以下の文献に記載されている通り、当業者には公知である。Vadakedath S, Kandi V (2016) DNA Methylation and Its Effect on Various Cancers: An Overview. J Mol Biomark Diagn S2:017. doi: 10.4172/2155-9929.S2-017及びA DataBase of Methylation Analysis on different type of cancers: MethHC: a database of DNA methylation and gene expression in human cancer. W.Y. Huang, S.D. Hsu, H.Y. Huang, Y.M. Sun, C.H. Chou, S.L. Weng, H.D. Huang* Nucleic Acids Res. 2015 Jan;43(Database issue): D856-61。
【００１７】
１つの態様によれば、セルフリーＤＮＡなどの二本鎖ＤＮＡ断片、又はゲノムＤＮＡなどの大きなＤＮＡから生成されたＤＮＡ断片を、第一の鋳型一本鎖ＤＮＡ及び第二の鋳型一本鎖ＤＮＡへと変性させた後、前記第一の鋳型一本鎖ＤＮＡ及び前記第二の鋳型一本鎖ＤＮＡのそれぞれをシングルプライマー伸長などのプライマー伸長にかけることで、第一のヘミメチル化二本鎖ＤＮＡ及び第二のヘミメチル化二本鎖ＤＮＡが形成される。この二本鎖ＤＮＡは、プライマー伸長により生成した相補鎖が、置換されたオリジナル鎖のメチル化状態を欠いている限り、ヘミメチル化型である。次に、このヘミメチル化二本鎖ＤＮＡをメチル化剤、例えばメチルトランスフェラーゼ、例えばＤＮＭＴ１、で処理することで、メチル化された二本鎖ＤＮＡ断片が得られ、これにより、オリジナルの鋳型のメチル化状態又はメチル化情報を複製することができる。このメチル化によりオリジナルの鋳型のオリジナルのメチル化状態が達成された場合、ヘミメチル化二本鎖ＤＮＡのメチル化はフルメチル化された言える。この、変性し、プライマー伸長によりヘミメチル化二本鎖ＤＮＡを形成し、メチル化剤処理によりメチル化を再建するプロセスを、複数回、例えば１〜３回、１〜４回又は１〜５回繰り返すことで、すなわち、このプロセスを２〜４回、２〜５回、又は２〜６回実行することで、オリジナルの鋳型断片のメチル化状態又はメチル化情報を有する断片を増幅することができる。次にこの、オリジナルの鋳型断片のメチル化状態又はメチル化情報を有する増幅断片を、当該技術分野で知られているような、シトシンをウラシルに変換する試薬で処理してもよく、その後、処理後の増幅断片を、当該技術分野で知られているような、例えばハイスループットシーケンス法を用いる、配列決定にかけることで、メチル化の性質及び程度、メチル化のパターン、メチル化の有無などを決定してもよい。１つの態様によれば、この増幅プロセスにより、メチル化解析に十分なＤＮＡを維持しながら、シトシンをウラシルに変換する試薬で処理することによる分解、例えばバイサルファイト処理による分解、又はＰＣＲ反応実行時のアレルドロップアウト、を原因とするＤＮＡ喪失を補うような、オリジナルの鋳型のオリジナルのメチル化状態を有する、十分な量のアンプリコンが得られる。
【００１８】
メチル化剤は当業者に公知のものであり、本開示により明らかとなる。メチル化剤はメチルトランスフェラーゼとしてよい。１つの例示的なメチル化剤はＤＮＭＴ１である。ＤＮＭＴ１は、哺乳類細胞で最も豊富なＤＮＡメチルトランスフェラーゼであり、哺乳類ゲノム内のヘミメチル化ＣｐＧジヌクレオチドを大部分メチル化することができるため、重要な維持型メチルトランスフェラーゼと見なされている。この酵素は、非メチル化基質と比較して、ヘミメチル化ＤＮＡに対して７〜１００倍高いインビトロ活性を有する。ゲノムＤＮＡに対して１サイクルのＰＣＲ反応とＤＮＭＴ１インキュベーションとを組み合わせることにより、ゲノムＤＮＡのメチル化状態の複製を達成できる。さらに、このメチル化複製ループを複数回実行することで、バイサルファイト変換用に、又はＡＰＯＢＥＣ若しくはシトシンをウラシルに変換する他の試薬などの酵素変換用に、最初のＤＮＡを３２倍にまで増加できる。さらなる有用なメチル化剤として、哺乳類メチルトランスフェラーゼであるＤＮＭＴ３ａ及びＤＮＭＴ３ｂも挙げられる。さらなる有用なメチル化剤として、植物メチルトランスフェラーゼであるＤＲＭ２、ＭＥＴ１、及びＣＭＴ３も挙げられる。さらなる有用なメチル化剤として、細菌メチルトランスフェラーゼであるＤａｍも挙げられる。一態様において、ＤＮＭＴ１又は他の好適なメチルトランスフェラーゼはメチル源と共に使用されること、及び当業者に公知の補助因子は共に使用してもしなくてもよいことは理解すべきである。ＤＮＭＴ１はインビトロで補助因子無しでも９５％の効率で働くが、Bashtrykov P1, Jankevicius G, Jurkowska RZ, Ragozin S, Jeltsch Aに記載されるようなＮＰ９５（Ｕｈｒｆ１）などの補助因子と共に用いられてもよい。このＵＨＲＦ１タンパク質は、アロステリック機構によって維持型ＤＮＡメチルトランスフェラーゼＤＮＭＴ１の活性及び特異性を刺激する（内容全体が参照により本明細書に援用される、J Biol Chem. 2014）。
【００１９】
１つの態様によれば、ＤＮＭＴ１などのメチルトランスフェラーゼは、プライマー伸長に用いられるＰＣＲ反応の構成成分又は条件になり得る、例えばマグネシウムイオン又はマンガンイオンなどの、イオン（陽イオンなど）を含まない、緩衝液条件などの条件を必要とする場合がある。プライマー伸長又はＰＣＲ反応に用いられる、陽イオンなどのイオンの性質及び程度は、当業者には容易に理解される。１つの態様によれば、メチル化工程の実行のために、プライマー伸長工程の後にＥＤＴＡなどのキレート化剤が用いられて、マグネシウムイオンなどのイオンがキレート化される。このキレート化工程が、プライマー伸長工程で用いられるがメチル化工程を阻害する可能性のあるイオンのキレート化を目的としていることは当業者に理解されるだろう。条件によっては、メチル化工程時の反応媒体中にマグネシウムイオンが存在してもよいことは理解すべきである。しかし、プライマー伸長工程とメチル化工程とが同一媒体を含む同一容器内で実行される場合など、ある特定の実施形態では、ＥＤＴＡなどのキレート化剤を用いることで、等モル量でマグネシウムがキレート化されて、メチル基転移反応用のマグネシウム非含有緩衝液が得られるため、精製工程は不要である。メチル基転移反応の完了後、ＰＣＲ条件下での次のプライマー伸長工程のために、反応系にマグネシウムが補充される。例示的なキレート化剤として、イミノジコハク酸（ＩＤＳ）、ポリアスパラギン酸、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ′−ジコハク酸（ＥＤＤＳ）、メチルグリシン二酢酸、アミノポリカルボキシレート系キレート、テトラナトリウム塩又はＮ−二酢酸が挙げられる。
【００２０】
シトシンをウラシルに変換するための試薬は当業者に公知であり、例えば、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸水素カリウム、亜硫酸水素アンモニウム、亜硫酸水素マグネシウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸カリウム、メタ重亜硫酸アンモニウム、メタ重亜硫酸マグネシウムなどのバイサルファイト試薬が挙げられる。シトシンをウラシルに変換する酵素試薬、すなわちシトシンデアミナーゼとして、ＡＢＯＰＥＣファミリーの酵素、例えばＡＰＯＢＥＣ−ＳｅｑやＡＰＯＢＥＣ３Ａが挙げられる。このＡＰＯＢＥＣファミリーのメンバーは、５−メチルシトシンを維持しながら、すなわち５−メチルシトシンを変化させずに、シトシンをウラシルに変換する、シチジンデアミナーゼである。このような酵素は米国特許出願公開第２０１３／０２４４２３７号に記載されており、ニュー・イングランド・バイオラボ社から入手できる。他の酵素試薬も、本開示に基づいて当業者には明らかとなるだろう。
【００２１】
亜硫酸水素ナトリウムなどのバイサルファイト試薬で処理されたＤＮＡ試料は、５−メチルシトシン（ｍＣ）は変化させずに、シトシンをウラシルに変換可能である。従って、バイサルファイト処理後、前記ＤＮＡ内の５−ｍＣはシトシンのまま残り、未修飾シトシンはウラシルへと変化する。このバイサルファイト処理は、Ｉｍｐｒｉｎｔ  ＤＮＡ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（シグマ社）、ＥＺ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−Ｄｉｒｅｃｔ（商標）Ｋｉｔ（ザイモリサーチ社）などの市販キットにより実行できる。ＤＮＡバイサルファイト変換の完了後、一本鎖ＤＮＡは捕捉、脱スルホン化、純化される。バイサルファイト処理されたＤＮＡは、精製用のカラム又は磁気ビーズで捕捉できる。バイサルファイト処理されたＤＮＡはさらに、アルカリ性溶液で脱スルホン化される。アルカリ性溶液は好ましくは水酸化ナトリウムである。次に、このＤＮＡが溶出され、ＰＣＲ用チューブに集められる。バイサルファイト処理された一本鎖ＤＮＡは、適切なプライマーを用いた酵素触媒型ＤＮＡ鎖合成を通じて、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に変換できる。好適な酵素としては、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ欠失クレノウＤＮＡポリメラーゼラージフラグメント、ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、ＨＩＶ−１逆転写酵素、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素などが挙げられる。これらの酵素は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）鋳型内のウラシルをチミンとして認識し、相補鎖にアデニンを付加する。相補鎖上のさらなるポリメラーゼ伸長により、バイサルファイト処理後のオリジナルのｓｓＤＮＡ鋳型が複製される（ただしウラシルはチミンに変換されている）。すなわち、参照ゲノムとの比較を通じて、シトシンからチミンへの変換及びグアニンからアデニンへの変換（相補鎖）を全て特定することにより、全ての未修飾シトシンを特定することができ、残りのシトシンはメチル化シトシンと見なされる。
【００２２】
単細胞全メチローム解析では、ランダムプライマーが用いられ、好ましくは６ｍｅｒ〜８ｍｅｒが用いられ、最も好ましくは６ｍｅｒが用いられる。がん診断用には、様々ながん差示的（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）メチル化遺伝子（ある特定の種類のがんにおいてのみメチル化されている又はメチル化されていない遺伝子）を標的とする、選択されたバイサルファイトＰＣＲプライマー群（バイサルファイト処理ＤＮＡを増幅するように設計されている）のセット（２０＋）が用いられる。例示的ながん関連遺伝子としては、ＳＥＰＴ９遺伝子、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＮＣＳ１、ＵＸＳ１、ＨＯＲＭＡＤ２、ＲＥＣ８、ＤＯＣＫ８、ＣＤＫＬ５などが挙げられる。さらなるがん関連遺伝子が、本開示に基づいて当業者には明らかとなろう。プライマーの選択は、標準がんメチル化データに基づく。標的遺伝子のメチル化状態の様々な組み合わせにより、個人に現れている特定のがん型が特定される。
【００２３】
従って、本明細書に記載の方法は、単一細胞若しくは同一細胞型の複数の細胞から得られた、又は、個体又は培養基材から採取された胚試料、組織試料、体液試料若しくは血液試料から得られた、１又は複数のゲノム配列などの、核酸試料、例えば、少量のゲノムＤＮＡ又はセルフリーＤＮＡなどの限られた量のＤＮＡに対して実施できる。本開示のある態様によれば、前記核酸試料は、単一細胞から得られた未精製又は未処理のライセートに含まれるものとすることができる。本開示のある態様によれば、前記核酸試料は、血液などの液体生物試料中に存在するものなどの、セルフリーＤＮＡとすることができる。本明細書で開示する方法に供される核酸は、本明細書に記載されるような各種試薬との接触前及び各種条件下に供する前に、カラム精製などによって精製を行う必要はない。
【００２４】
ある態様によれば、本明細書に記載の方法は、メチル化増幅法又はメチルトランスフェラーゼを用いたメチローム複製ループ（methylome replication loops with methyl-transferase）（ＭＥＲＬＯＴ）と称される場合がある。本明細書に記載の方法により、オリジナルの鋳型のｄｓＤＮＡ配列のメチル化情報又はメチル化状態を維持しながら、単一細胞レベルのゲノムＤＮＡ又は少量のＤＮＡを前増幅することが可能となる。１つの例示的な態様によれば、前記方法では、ＤＮＡに対して、１サイクルのＰＣＲ反応と、ヒトメチルトランスフェラーゼであるＤＮＭＴ１とのインキュベーションとが組み合わされることで、ＤＮＡメチル化状態の複製が達成される。１つの態様によれば、メチローム複製ループを複数回実行することで、バイサルファイト変換に供するための、最初のＤＮＡ量の、２倍〜３２倍の増加、２倍〜１９倍の増加、２倍〜１８倍の増加、２倍〜１７倍の増加、２倍〜１６倍の増加、２倍〜８倍の増加、２倍〜４倍の増加が達成される。このような増幅されたＤＮＡは、バイサルファイト変換又は全ゲノム増幅の際のＤＮＡ減少を相殺することができ、単一細胞レベルのＤＮＡ又は少量のＤＮＡなどのＤＮＡのメチル化状態がより効率的に特徴付けされる。
【００２５】
本発明の実施形態では、ＤＮＡ断片を作製する方法、例えば、単一細胞の全ゲノム、少量のＤＮＡ、又は胚由来ＤＮＡからＤＮＡ断片を作製する方法が利用され、これらのＤＮＡ断片はその後、メチル化情報を維持するように本明細書に記載の増幅方法に供された後、当業者に公知であり且つ本明細書に記載されるようなシーケンス法にかけられ得る。
【００２６】
オリジナルのＤＮＡ試料からＤＮＡ断片を作製する方法は当業者に公知である。１つのアプローチとして、超音波処理の後、末端修復及びアダプター配列ライゲーションを行うことが挙げられる。がん診断用では、選択された標的化ＰＣＲプライマー群（２０＋）のセット（正常ＤＮＡ用）を用いて、両端にプライミング部位を有するＤＮＡアンプリコンが作製される。遺伝子標的としては、ＳＥＰＴ９遺伝子、ＴＭＥＭ１０６Ａ、ＮＣＳ１、ＵＸＳ１、ＨＯＲＭＡＤ２、ＲＥＣ８、ＤＯＣＫ８、ＣＤＫＬ５などが挙げられる。
【００２７】
１つの例示的な態様において、Ｔｎ５などの酵素を用いて核酸断片を作製する方法が記載される。このような方法は当該技術分野において公知であり、イルミナ社製Ｎｅｘｔｅｒａキットを用いて実行される方法が挙げられる。１つの例示的な態様によれば、本明細書に記載の方法では、トランスポソームライブラリーと、「タグメンテーション」と呼ばれる方法とが利用される。この方法では、巨大ｄｓＤＮＡ配列から、シングルプライマー伸長及び増幅で使用されるプライマーでタグ付けされた断片が作製される。通常、トランスポソームの一部であるトランスポザーゼを用いて、一連の二本鎖ゲノムＤＮＡ断片が作製される。ある態様によれば、トランスポザーゼは、反応器内又は反応体積内に置かれた場合などで、トランスポゾンＤＮＡと接触した際に、トランスポゾンＤＮＡに結合して二量体化し、トランスポソームと称されるトランスポザーゼ／トランスポゾンＤＮＡ複合二量体を形成する能力を有する。トランスポソームの各トランスポゾンＤＮＡは、二本鎖トランスポザーゼ結合部位と、増幅促進配列（特異的なプライミング部位（「プライマー結合部位」）又は転写プロモーター部位（transcription promoter site）など）を含む第一の核酸配列と、を含む。前記第一の核酸配列は一本鎖伸長物の形態であってもよい。
【００２８】
トランスポソームは、二本鎖ゲノムＤＮＡなどの二本鎖核酸上の標的部位にランダムに結合し、トランスポソーム及び二本鎖ゲノムＤＮＡを含む複合体を形成する能力を有する。トランスポソーム内のトランスポザーゼは、一方のトランスポザーゼが上側鎖を切断し、もう一方のトランスポザーゼが下側鎖を切断することにより、二本鎖ゲノムＤＮＡを切断する。トランスポソーム内のトランスポゾンＤＮＡの各々は、各々の切断部位末端で、二本鎖ゲノムＤＮＡに結合する。すなわち、トランスポソームの一方のトランスポゾンＤＮＡは左側の切断部位に結合し、トランスポソームの他方のトランスポゾンＤＮＡは右側の切断部位に結合する。このようにして、左側の切断部位及び右側の切断部位に、プライマー結合部位が与えられる。
【００２９】
ある態様によれば、複数のトランスポザーゼ／トランスポゾンＤＮＡ複合二量体、すなわちトランスポソームが、例えば二本鎖ゲノムＤＮＡ上の対応する複数の標的部位に結合し、その後、該二本鎖ゲノムＤＮＡが、二本鎖断片の各末端にプライマー結合部位が結合したトランスポゾンＤＮＡをそれぞれ有する複数の二本鎖断片に切断される。このようにすることで、プライマー結合部位を、シングルプライマー伸長反応に用いてもよい。
【００３０】
１つの態様によれば、トランスポゾンＤＮＡが二本鎖ゲノムＤＮＡに結合すると、ゲノムＤＮＡの片鎖とトランスポゾンＤＮＡの片鎖との間に一本鎖状のギャップが存在することとなる。１つの態様によれば、ギャップ伸長を行うことにより、このギャップが埋められ、二本鎖ゲノムＤＮＡと二本鎖トランスポゾンＤＮＡとの間に二本鎖の連結がつくり出される。１つの態様によれば、トランスポゾンＤＮＡのトランスポザーゼ結合部位と増幅促進配列とを含む核酸配列が、二本鎖断片の各末端に結合される。ある態様によれば、トランスポザーゼは、二本鎖断片の各末端に結合しているトランスポゾンＤＮＡに結合している。一態様によれば、トランスポザーゼは、二本鎖ゲノムＤＮＡ断片の各末端に結合しているトランスポゾンＤＮＡから除去されている。
【００３１】
本開示の１つの態様によれば、トランスポザーゼによって生成した、その各末端にトランスポゾンＤＮＡが結合した二本鎖ゲノムＤＮＡ断片は、その後、該トランスポゾンＤＮＡを鋳型として用いて、プライマー結合部位を通じて、ギャップが充填され伸長される。これにより、二本鎖ゲノムＤＮＡと、該二本鎖ゲノムＤＮＡの各末端における、増幅促進配列（すなわちプライマー伸長配列）を含む二本鎖トランスポゾンＤＮＡと、を含む、二本鎖核酸伸長産物が生成する。
【００３２】
この段階において、ゲノムＤＮＡ断片と増幅促進配列とを含む二本鎖核酸伸長産物を、当業者に公知の方法を用いるプライマー伸長にかけることで、一対のヘミメチル化二本鎖ＤＮＡを作製できる。この一対のヘミメチル化二本鎖ＤＮＡを次に、メチル化剤、例えばメチルトランスフェラーゼ、例えばＤＮＭＴ１、及びメチル基の供給源と共にインキュベートすることで、プライマー伸長で生成した鎖上に、オリジナルの鋳型鎖のメチル化部位と一致するようにメチル基が配置される。このようにして、前記方法によって、メチル基が付加された、又は、メチル基が復元された、すなわち、相補鎖を生成させるためのシングルプライマー伸長反応により失われたオリジナルの鋳型鎖のメチル化情報又はメチル化状態が復元された、と言える。
【００３３】
プライマー伸長には、シングルプライマー伸長又はマルチプルプライマー伸長の使用が含まれる。シングルプライマー伸長には、促進配列の使用が含まれ、この促進配列は二本鎖ゲノムＤＮＡの各末端における特定のプライマー結合部位であってもよい。「特定の」プライマー結合部位とは、２つのプライマー結合部位が同一の配列を有するため、共通の配列のプライマーを全ての断片の伸長に使用できることを示している。伸長にはＰＣＲ用のプライマー配列及び試薬を使用することができる。この伸長法は、所望により、またオリジナルの鋳型断片のメチル化情報を有するアンプリコンの生成を最大化するように、何度実施してもよい。
【００３４】
次いで、アンプリコンは収集及び／又は精製され、その後さらなる解析にかけられ得る。アンプリコンは、当業者に公知の方法を用いて増幅及び／又はシーケンスされ得る。シーケンス後、その断片のメチル化情報は、例えば個人のある特定の疾患を診断する方法として、当業者に公知の方法を用いて解析された後、ある特定の疾患に対応するメチル化の標準と比較され得る。
【００３５】
本開示の実施形態は、相補鎖を生成させるための増幅及び／又はプライマー伸長反応により失われ得る、オリジナルの鋳型ＤＮＡのメチル化状態又はメチル化情報を有するＤＮＡアンプリコンを作製する方法に関する。前記ＤＮＡは、単一細胞若しくは同一細胞型の複数の細胞から得られた、又は個体又は培養基材から採取された組織試料、体液試料若しくは血液試料から得られた（すなわち循環ＤＮＡ）、１又は複数のゲノム配列などの、少量のゲノムＤＮＡ又は量が限られたＤＮＡであってもよい。本開示のある態様によれば、本明細書に記載の方法では、伸長プライマーを含むトランスポザーゼを用いて、伸長プライマー部位を含むｄｓＤＮＡを作製する、ＤＮＡを断片化するタグメンテーション法が利用されるか、又は、標的遺伝子のアンプリコンを作製するための標的化ＰＣＲが用いられる。これらの断片が、変性されて個々の鎖となり、伸長され、メチル化情報が再建され得る。このプロセスが何度も繰り返されることにより、メチロームの増幅が行われ、その後、バイサルファイト変換又はＡＢＯＰＥＣ処理が行われてもよい。次に、バイサルファイト変換後の増幅メチロームが、増幅及び／又はシーケンシング、例えば当業者に公知のハイスループットシーケンスプラットフォームを用いたシーケンシング、にかけられてもよい。前記シーケンス情報の解析などによる、当該技術分野において公知の方法に従って、メチル化状態が解析されてもよい。
【００３６】
本明細書に記載の方法は、とりわけ、腫瘍及び神経集団（neural mass）などの非常に異種の細胞集団を特徴とする生体系又は組織試料に適用される。本明細書に記載の方法は、遺伝子的に異種の組織（例えば、がん）、希少且つ貴重な試料（例えば、胚性幹細胞）、及び非分裂細胞（例えば、神経細胞）などを含む種々のＤＮＡ材料源、並びに、当業者に公知のシーケンスプラットフォーム及び遺伝子型同定法を利用することができる。
【００３７】
１つの態様によれば、溶解した単一細胞から得られるゲノム核酸などの、ＤＮＡが得られる。複数のトランスポソーム又はトランスポソームライブラリーが用いられることで、ＤＮＡが二本鎖断片へと切断される。前記複数のトランスポソーム又はトランスポソームライブラリーのうちの各トランスポソームは、トランスポゾンＤＮＡに結合したトランスポザーゼの二量体であり、すなわち、各トランスポソームは２本の別々のトランスポゾンＤＮＡを含む。トランスポソームのトランスポゾンＤＮＡはそれぞれ、トランスポザーゼ結合部位と、例えばシングルプライマー伸長法のための、特定のプライマー結合部位などの、増幅促進配列又は伸長促進配列とを含んでいる。
【００３８】
このトランスポゾンＤＮＡが、それぞれの切断部位又は断片化部位において、各二本鎖断片の上側鎖及び下側鎖に結合する。次に、これらの二本鎖断片がギャップ充填処理にかけられる。次に、これらの断片がシングルプライマー伸長にかけられることで、ヘミメチル化ｄｓＤＮＡが生成し、その後、ヘミメチル化ｄｓＤＮＡがメチルトランスフェラーゼに曝されることで、様々な位置にメチル基が付加され、結果、オリジナルのｄｓＤＮＡ鋳型のメチル化状態が複製される。このプロセスが繰り返されることで、オリジナルの鋳型断片のメチル化特徴を有する増幅鋳型断片の集団が得られる。メチル化特徴の決定が行われてもよい。１つの態様によれば、断片が増幅及び／又はシーケンスされ、メチル化特徴が決定され得る。
【００３９】
ある態様では、プライマー伸長増幅はＰＣＲ条件を用いて達成される。ＰＣＲは、プライマー対、すなわち上流プライマーと下流プライマーとからなるプライマーセット、及びＤＮＡポリメラーゼ（典型的には、耐熱性ポリメラーゼ酵素）などの重合触媒を用いる、標的ポリヌクレオチドから複製コピーを作製する反応である。ＰＣＲのための方法は当該技術分野において周知であり、例えば、MacPherson et al. (1991) PCR 1: A Practical Approach (IRL Press at Oxford University Press)にて教示されている。Ｍｕｌｌｉｓ（米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、及び同第４，９６５，１８８号）による「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）という用語は、クローニングも精製も含まず、標的配列のあるセグメントの濃度を増加させるための方法を指す。この標的配列を増幅するためのプロセスは、所望の標的配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー及び増幅用試薬を供給し、その後、ポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）存在下で厳密な一連の熱サイクルを行うことを含む。これらのプライマーは二本鎖標的配列の各々の鎖（「プライマー結合配列」）に対して相補的である。増幅を実行するには、二本鎖標的配列が変性された後、プライマーが標的分子内のそれらの相補的配列にアニーリングされる。アニーリングの後、プライマーがポリメラーゼにより伸長されて、新たな相補鎖対が形成される。所望により、これらの変性工程、プライマーアニーリング工程、及びポリメラーゼ伸長工程を、何度も繰り返すことで（すなわち、変性、アニーリング及び伸長が１つの「サイクル」を構成し、多数の「サイクル」が行われ得る）、所望の標的配列の高濃度に増幅されたセグメントを得ることもできる。本開示によれば、１回のサイクルの後、得られたアンプリコンが、メチル付加試薬又はメチル付加酵素、例えばメチルトランスフェラーゼ、例えばＤＮＭＴ１、で処理されることにより、二本鎖核酸断片にメチル基が付加される。所望の標的配列の増幅セグメントの長さはプライマー対の互いに対する相対位置によって決定されるため、この長さは調節可能なパラメーターである。前記プロセスの反復的な側面から、この方法は「ポリメラーゼ連鎖反応」（以下、「ＰＣＲ」）と称され、標的配列は「ＰＣＲ増幅物」と称される。ＤＮＡポリメラーゼ活性が阻害されるある特定の量まで二本鎖ＤＮＡ増幅産物が蓄積すると、ＰＣＲ増幅は飽和に達する。飽和すると、ＰＣＲ増幅はプラトーに達して、それ以上ＰＣＲサイクルを行っても増幅産物が増加しなくなる。
【００４０】
ＰＣＲを用いて、ゲノムＤＮＡ内の特定の標的配列の単一コピーを、検出可能なレベルにまで、いくつかの種々の方法論（例えば、標識プローブを用いたハイブリダイゼーション；ビオチン化プライマー組み込み後のアビジン−酵素複合体による検出；ｄＣＴＰ又はｄＡＴＰなどの３２Ｐ標識デオキシヌクレオチド三リン酸の増幅セグメント内への組み込み）により増幅することが可能である。適切なプライマー分子セットを用いることで、ゲノムＤＮＡだけでなく、あらゆるオリゴヌクレオチド配列又はポリヌクレオチド配列が増幅可能である。特に、ＰＣＲプロセスそれ自体によって作製された増幅セグメントは、それら自体が、後のＰＣＲ増幅のための有効な鋳型となる。ＰＣＲを実行するための方法及びキットは当該技術分野において周知である。本明細書では、ＰＣＲ又は遺伝子クローニングなどの、ポリヌクレオチドの複製コピーを作製するプロセスは全て、まとめて複製と称される。プライマーは、サザンブロット解析又はノーザンブロット解析など、ハイブリダイゼーション反応におけるプローブとして使用することもできる。
【００４１】
「増幅」又は「増幅させる」という表現は、特定のポリヌクレオチドのコピーが余分に又は多重に形成されるプロセスを指す。増幅には、ＰＣＲ、ライゲーション法による増幅（すなわちリガーゼ連鎖反応、ＬＣＲ）などの増幅方法が含まれる。これらの方法は当該技術分野において公知であり、広く実施されている。例えば、ＰＣＲに関しては、米国特許第４，６８３，１９５号及び同第４，６８３，２０２号、並びにInnis et al., “PCR protocols: a guide to method and applications” Academic Press, Incorporated (1990)を、ＬＣＲに関しては、Wu et al. (1989) Genomics 4:560-569を、参照されたい。一般に、ＰＣＲ手順は、（ｉ）ＤＮＡ試料（又はライブラリー）内の特定の遺伝子に対するプライマーの配列特異的ハイブリダイゼーション、（ｉｉ）引き続く、ＤＮＡポリメラーゼを用いた、複数サイクルのアニーリング、伸長、及び変性を含む増幅、並びに、（ｉｉｉ）ＰＣＲ産物における正確なサイズのバンドのスクリーニング、から構成される遺伝子増幅方法として説明される。使用されるプライマーは、重合を開始させるのに十分な長さ及び適切な配列を有するオリゴヌクレオチドであり、すなわち、各プライマーは、増幅されるゲノム遺伝子座の各々の鎖に相補的となるように特別に設計されている。
【００４２】
増幅反応を行うための試薬及びハードウェアは市販で入手可能である。特定の遺伝子領域からの配列を増幅するのに有用なプライマーは、標的領域内の配列又はその隣接領域内の配列に相補的であり、且つそれに特異的にハイブリダイズすることが好ましく、当業者に公知の方法を用いて作製できる。増幅によって作製された核酸配列はそのまま配列決定することができる。
【００４３】
ハイブリダイゼーションが２本の一本鎖ポリヌクレオチドの間で逆平行配置で生じる場合、その反応は「アニーリング」と称され、それらのポリヌクレオチドは「相補的」とされる。二本鎖ポリヌクレオチドは別のポリヌクレオチドに対して、第一のポリヌクレオチドの一方の鎖と第二のポリヌクレオチドの一方の鎖との間でハイブリダイゼーションが発生可能である場合に、相補的又は相同であるとすることができる。相補性又は相同性（あるポリヌクレオチドが別のポリヌクレオチドと相補的である程度）は、一般に認められている塩基対形成法則に従って、互いに水素結合を形成すると予想される対向する鎖内の塩基の割合によって、数量化できる。
【００４４】
「ＰＣＲ産物」、「ＰＣＲ断片」、及び「増幅産物」という用語は、変性工程、アニーリング工程及び伸長工程からなるＰＣＲサイクルが１回又は複数回完了した後に得られる化合物の混合物を指す。これらの用語は、１又は複数の標的配列の１又は複数のセグメントの増幅が起こった場合も包含する。
【００４５】
用語「増幅試薬」は、プライマー、核酸鋳型、及び増幅酵素以外の、増幅に必要な試薬（デオキシリボヌクレオチド三リン酸、緩衝液など）を指し得る。典型的には、増幅試薬は他の反応成分と共に、反応器（試験管、マイクロウェルなど）内に添加及び含有される。増幅方法には、当業者に公知のＰＣＲ法が含まれ、また、ローリングサークル増幅（Blanco et al., J. Biol. Chem., 264, 8935-8940, 1989）、超分岐ローリングサークル増幅（Lizard et al., Nat. Genetics, 19, 225-232, 1998）、及びループ介在等温増幅（Notomi et al., Nuc. Acids Res., 28, e63, 2000）も含まれる（各文献は参照によってその全体が本明細書に援用される）。
【００４６】
１つの態様によれば、単一細胞由来二本鎖ゲノムＤＮＡを、トランスポゾンＤＮＡ（トランスポゾンＤＮＡは二本鎖の１９ｂｐのトランスポザーゼ（Ｔｎｐ）結合部位と、プライマー結合部位を含む第一の核酸配列と、を含む）に各々結合しているＴｎ５トランスポザーゼに接触させることで、トランスポソームと称されるトランスポザーゼ／トランスポゾンＤＮＡ複合二量体を形成させることを含む、バイサルファイト処理又はＡＰＯＢＥＣ処理のための増幅メチロームの作製法が提供される。第一の核酸配列は一本鎖伸長物の形態であってもよい。１つの態様によれば、第一の核酸配列は、プライミング部位を含む、５’オーバーハングなどのオーバーハングであってもよい。オーバーハングの長さは、所望のプライミング部位を含むのに好適な長さであれば特に限定されない。トランスポソームは二本鎖ゲノムＤＮＡ上の標的部位に結合し、該二本鎖ゲノムＤＮＡを複数の二本鎖断片に切断する。それぞれの二本鎖断片は、Ｔｎｐ結合部位により上側鎖に結合した第一の複合体、及びＴｎｐ結合部位により下側鎖に結合した第二の複合体を有するものとなる。トランスポゾン結合部位、すなわちトランスポゾンＤＮＡは、前記二本鎖断片の各５’末端に結合する。１つの態様によれば、Ｔｎ５トランスポザーゼは前記複合体から取り除かれる。前記二本鎖断片がトランスポゾンＤＮＡに沿って伸長されて、各末端に特定のプライマー結合部位を有する二本鎖伸長産物が生成する。１つの態様によれば、Ｔｎ５トランスポザーゼ結合部位の二本鎖ゲノムＤＮＡ断片への結合によって生じ得るギャップは充填され得る。ギャップが充填された二本鎖伸長産物を変性して一本鎖にし、それぞれをシングルプライマー伸長にかけることでヘミメチル化ｄｓＤＮＡを作製し、その後、ＤＮＭＴ１などのメチルトランスフェラーゼで処理することにより、メチル基が該ヘミメチル化ｄｓＤＮＡに付加される。これらの変性工程、プライマー伸長工程及びメチル化工程を複数回繰り返すことで、オリジナルのメチル化状態を有するオリジナルの鋳型ｄｓＤＮＡのアンプリコンが生成する。次に、これらのアンプリコンが、バイサルファイト、若しくはＡＰＯＢＥＣ、又はシトシンをウラシルに変換するが５−メチルシトシンは変化させない他の試薬で処理され得る。処理後のアンプリコンＤＮＡは次に、クレノウフラグメント（ｅｘｏ−）又はＢｓｔラージフラグメントなどを用いる複数サイクルのランダムプライミング増幅にかけられ、その後、イルミナ社製のアダプターなどを用いたアダプターＰＣＲ反応が１３〜１８サイクル程度行われ得る。好適な増幅プロトコルが、内容全体が参照により本明細書に援用される、Stephen J Clark, Sebastien A Smallwood, Heather J Lee, Felix Krueger, Wolf Reik & Gavin Kelsey. Genome-wide base-resolution mapping of DNA methylation in single cells using single-cell bisulfite sequencing (scBS-seq). Nature Protocols (2017)に記載されている。ザイモリサーチ社製のＰｉｃｏ  Ｍｅｔｈｙｌ−Ｓｅｑ（商標）Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔも使用できる。
【００４７】
ある態様によれば、例示的なトランスポゾン系として、Ｔｎ５トランスポザーゼ、Ｍｕトランスポザーゼ、Ｔｎ７トランスポザーゼ、又はＩＳ５トランスポザーゼなどが挙げられる。他の有用なトランスポゾン系は当業者に公知であり、例えば以下が挙げられる：Ｔｎ３トランスポゾン系（Maekawa, T., Yanagihara, K., and Ohtsubo, E. (1996), A cell-free system of Tn3 transposition and transposition immunity, Genes Cells 1, 1007-1016参照）、Ｔｎ７トランスポゾン系（Craig, N.L. (1991), Tn7: a target site-specific transposon, Mol. Microbiol. 5, 2569-2573参照）、Ｔｎ１０トランスポゾン系（Chalmers, R., Sewitz, S., Lipkow, K., and Crellin, P. (2000), Complete nucleotide sequence of Tn10, J. Bacteriol 182, 2970-2972参照）、ピギーバック（Piggybac）トランスポゾン系（Li, X., Burnight, E.R., Cooney, A.L., Malani, N., Brady, T., Sander, J.D., Staber, J., Wheelan, S.J., Joung, J.K., McCray, P.B., Jr., et al. (2013), PiggyBac transposase tools for genome engineering, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110, E2279-2287参照）、スリーピングビューティー（Sleeping beauty）トランスポゾン系（Ivics, Z., Hackett, P.B., Plasterk, R.H., and Izsvak, Z. (1997), Molecular reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like transposon from fish, and its transposition in human cells, Cell 91, 501-510参照）、Ｔｏｌ２トランスポゾン系（Kawakami, K. (2007), Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates, Genome Biol. 8 Suppl. 1, S7参照）。
【００４８】
ＤＮＡは生物試料から得てもよい。本明細書で使用される場合、用語「生物試料」は、限定はされないが、対象から分離された、組織、細胞、生体液、及びそれらの分離物、並びに対象内に存在する組織、細胞及び体液を包含することが意図される。
【００４９】
ＤＮＡは、単一細胞から得てもよいし、少量の細胞から得てもよい。ＤＮＡはいかなる種又は生物に由来するＤＮＡであってもよく、例えば、ヒトＤＮＡ、動物ＤＮＡ、植物ＤＮＡ、酵母ＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、真核生物ＤＮＡ及び原核生物ＤＮＡが挙げられるが、これらに限定はされない。特定の態様において、実施形態は、特定部位の提示が失われることなくメチロームの増幅をもたらす、実質的に全体のゲノムを増幅するための方法に関する（本明細書において「全ゲノム増幅」と定義される）。特定の実施形態において、全ゲノム増幅は、ゲノムライブラリーの実質的に全ての断片、又は全ての断片の増幅を含む。さらなる特定の実施形態において、「実質的に全体の」又は「実質的に全ての」とは、ゲノム内の全配列のうちの約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、又は約９９％を指す。
１つの態様によれば、ＤＮＡ試料は、ゲノムＤＮＡ、顕微解剖された染色体ＤＮＡ、酵母人工染色体（ＹＡＣ）ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、コスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、Ｐ１由来人工染色体（ＰＡＣ）ＤＮＡ、又はバクテリア人工染色体（ＢＡＣ）ＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、葉緑体ＤＮＡ、法医学試料ＤＮＡ、又は試験対象である天然供給源若しくは人工的供給源に由来する他のＤＮＡである。別の好ましい実施形態では、ＤＮＡ試料は哺乳類ＤＮＡ、植物ＤＮＡ、酵母ＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、又は原核生物ＤＮＡである。さらに別の好ましい実施形態では、ＤＮＡ試料はヒト、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、げっ歯類、トリ、魚、エビ、植物、酵母、ウイルス、又は細菌から得られる。ＤＮＡ試料はゲノムＤＮＡであることが好ましい。
【００５０】
ある特定の例示的な態様によれば、例えば単一の反応器の中で、転移系を用いて、複数回のプライマー伸長反応及びメチル化反応のための核酸断片が作製され、バイサルファイト処理のための増幅メチロームが作製される。図１に示される例示的な実施形態によれば、まず、単一細胞がＰＣＲ用チューブ内の溶解緩衝液中に捕獲され、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）の放出が行われる。次に、このゲノムＤＮＡがＴｎ５タグメンテーションにかけられ、両端に相補的なＰＣＲプライミング部位を有する約１ｋｂのｄｓＤＮＡに断片化される。得られたｄｓＤＮＡ断片が熱変性されてｓｓＤＮＡとなり、次にプライマー伸長が行われて、ヘミメチル化ｄｓＤＮＡが形成される。このヘミメチル化ｄｓＤＮＡがＤＮＭＴ１及びＳＡＭと一緒に３時間インキュベートされることでフルメチル化ｄｓＤＮＡとなり、オリジナルの鋳型のメチル化状態の複製が達成される。フルメチル化ｄｓＤＮＡが再び熱変性され、この複製ループが繰り返される。複製ループは１〜２０回、１〜１０回、又は１〜５回、繰り返され得る。増幅産物が亜硫酸水素ナトリウムで処理され、その後の解析の準備が完了する。
【００５１】
特定のＴｎ５転移系が報告されており、当業者に利用可能である。内容全体があらゆる目的のために参照により本明細書に援用される、Goryshin, I.Y. and W.S. Reznikoff, Tn5 in vitro transposition. The Journal of biological chemistry, 1998. 273(13): p. 7367-74; Davies, D.R., et al., Three-dimensional structure of the Tn5 synaptic complex transposition intermediate. Science, 2000. 289(5476): p. 77-85; Goryshin, I.Y., et al., Insertional transposon mutagenesis by electroporation of released Tn5 transposition complexes. Nature biotechnology, 2000. 18(1): p. 97-100、及び、Steiniger-White, M., I. Rayment, and W.S. Reznikoff, Structure/function insights into Tn5 transposition. Current opinion in structural biology, 2004. 14(1): p. 50-7を参照されたい。ＤＮＡライブラリー調製及び他の用途のための、Ｔｎ５転移系を利用したキットが知られている。内容全体があらゆる目的のために参照により本明細書に援用される、Adey, A., et al., Rapid, low-input, low-bias construction of shotgun fragment libraries by high-density in vitro transposition. Genome biology, 2010. 11(12): p. R119; Marine, R., et al., Evaluation of a transposase protocol for rapid generation of shotgun high-throughput sequencing libraries from nanogram quantities of DNA. Applied and environmental microbiology, 2011. 77(22): p. 8071-9; Parkinson, N.J., et al., Preparation of high-quality next-generation sequencing libraries from picogram quantities of target DNA. Genome research, 2012. 22(1): p. 125-33; Adey, A. and J. Shendure, Ultra-low-input, tagmentation-based whole-genome bisulfite sequencing. Genome research, 2012. 22(6): p. 1139-43; Picelli, S., et al., Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature protocols, 2014. 9(1): p. 171-81、及びBuenrostro, J.D., et al., Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature methods, 2013を参照されたい。また、内容全体が参照によって本明細書に援用される、国際公開第９８／１００７７号、欧州特許第２５２７４３８号及び同第２３７６５１７号も参照されたい。市販の転移キットがＮＥＸＴＥＲＡの名で販売されており、イルミナ社から入手できる。
【００５２】
用語「ゲノム」は、本明細書で使用される場合、個体、細胞、又は細胞小器官が保有する、一連の遺伝子群と定義される。用語「ゲノムＤＮＡ」は、本明細書で使用される場合、個体、細胞、又は細胞小器官が保有する、一連の遺伝子群の一部又は全てを含むＤＮＡ物質と定義される。本開示の態様として、セルフリーＤＮＡの用途が含まれる。
【００５３】
本明細書で使用される場合、用語「ヌクレオシド」は、リボース糖又はデオキシリボース糖にプリン塩基又はピリミジン塩基が共有結合的に連結された分子を指す。例示的なヌクレオシドとして、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン及びチミジンが挙げられる。さらなる例示的なヌクレオシドとして、イノシン、１−メチルイノシン、プソイドウリジン、５，６−ジヒドロウリジン、リボチミジン、２Ｎ−メチルグアノシン、及び２，２Ｎ，Ｎ−ジメチルグアノシン（「希」ヌクレオシドとも称される）が挙げられる。用語「ヌクレオチド」は、１又は複数のリン酸基が糖部分にエステル結合で連結されたヌクレオシドを指す。例示的なヌクレオチドとして、ヌクレオシド一リン酸、ヌクレオシド二リン酸、及びヌクレオシド三リン酸が挙げられる。「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」及び「核酸分子」という用語は、本明細書では同義的に使用されており、５’炭素原子と３’炭素原子との間のホスホジエステル結合によって結合した、あらゆる長さの、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドいずれかのヌクレオチドの重合体を指す。ポリヌクレオチドは、あらゆる三次元構造をとることができ、既知又は未知を問わず、あらゆる機能を実行することができる。以下はポリヌクレオチドの例であるが、これらに限定はされない：遺伝子又は遺伝子断片（例えば、プローブ、プライマー、ＥＳＴ又はＳＡＧＥタグ）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、あらゆる配列の単離ＤＮＡ、あらゆる配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体などの修飾ヌクレオチドを含むことができる。また、前記用語は二本鎖分子及び一本鎖分子の両方を指す。特に記載や必要がない限り、ポリヌクレオチドを含む本発明の実施形態はいずれも、二本鎖形態、及び二本鎖形態をつくることが知られている又は予想される２本の相補的な一本鎖形態の各々、の両方を包含する。ポリヌクレオチドは、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）という４種のヌクレオチド塩基からなる特定の配列から構成され、ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合、チミンはウラシル（Ｕ）である。すなわち、ポリヌクレオチド配列という用語は、ポリヌクレオチド分子のアルファベット表記である。このアルファベット表記は、中央演算処理装置を備えたコンピュータにおいてデータベースに入力することができ、機能ゲノミクス及び相同性検索などのバイオインフォマティクス応用に利用できる。
【００５４】
「ＤＮＡ」、「ＤＮＡ分子」及び「デオキシリボ核酸分子」という用語は、デオキシリボヌクレオチドの重合体を指す。ＤＮＡは天然に合成された（例えば、ＤＮＡ複製による）ＤＮＡであり得る。ＲＮＡは転写後修飾されたＲＮＡであり得る。ＤＮＡは化学合成されたＤＮＡであってもよい。ＤＮＡは一本鎖（すなわち、ｓｓＤＮＡ）であってもよいし、多重鎖（例えば、二本鎖、すなわち、ｄｓＤＮＡ）であってもよい。
【００５５】
「ヌクレオチド類似体」、「改変ヌクレオチド」及び「修飾ヌクレオチド」という用語は、非天然のリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドを含む、非標準的なヌクレオチドを指す。ある特定の例示的な実施形態において、ヌクレオチド類似体は、当該ヌクレオチド類似体が目的の機能を実行する能力を保持しつつも、ヌクレオチドのある特定の化学的性質を変化させるような、いかなる位置においても修飾されてよい。誘導体化を受け得るヌクレオチドの位置の例としては、５位（例えば、５−（２−アミノ）プロピルウリジン、５−ブロモウリジン、５−プロピンウリジン、５−プロペニルウリジンなど）；６位（例えば、６−（２−アミノ）プロピルウリジン）；アデノシン及び／又はグアノシンに関しては８位（８−ブロモグアノシン、８−クロログアノシン、８−フルオログアノシンなど）が挙げられる。ヌクレオチド類似体としては、デアザヌクレオチド、（例えば、７−デアザ−アデノシン）；Ｏ−修飾ヌクレオチド及びＮ−修飾ヌクレオチド（例えば、Ｏ−アルキル化ヌクレオチド及びＮ−アルキル化ヌクレオチド、例えば、Ｎ６−メチルアデノシン、又はその他当該技術分野において公知の修飾ヌクレオチド）；並びに、Herdewijn, Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 2000 Aug. 10(4):297-310などに記載されている他の複素環修飾ヌクレオチド類似体も挙げられる。
【００５６】
ヌクレオチド類似体はヌクレオチドの糖部分への修飾を含んでいてもよい。例えば、２位のＯＨ基がＨ、ＯＲ、Ｒ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、ＣＯＯＲ、又はＯＲから選択される基で置換されていてもよく、ここで、Ｒは置換又は非置換のＣ１〜Ｃ６のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリールなどである。他の可能な修飾としては、米国特許第５，８５８，９８８号及び同第６，２９１，４３８号に記載される修飾が挙げられる。
【００５７】
また、ヌクレオチドのリン酸基が修飾されていてもよく、例えば、リン酸基の１又は複数の酸素を硫黄と置換することにより修飾されていてもよいし（例えば、ホスホロチオエート）、あるいは、ヌクレオチドがその目的の機能を果たすことを可能にする他の置換を行うことにより修飾されていてもよい。そのような置換は、例えば、Eckstein, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2000 Apr. 10(2):117-21, Rusckowski et al. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2000 Oct. 10(5):333-45, Stein, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2001 Oct. 11(5): 317-25, Vorobjev et al. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2001 Apr. 11(2):77-85、及び米国特許第５，６８４，１４３号に記載されている。上記修飾のいくつか（例えば、リン酸基修飾）は、前記類似体を含むポリヌクレオチドなどの、インビボ又はインビトロにおける加水分解率を減少させる。
【００５８】
用語「インビトロ」は、当該技術分野で認識されている意味を有し、例えば、精製された試薬や、細胞抽出物などの抽出物が関与する。用語「インビボ」も、当該技術分野で認識されている意味を有し、例えば、不死化細胞、初代細胞、細胞株、及び／又は生物内の細胞などの生細胞が関わる。
【００５９】
本明細書で使用される場合、「相補的」及び「相補性」という用語は、ヌクレオチド配列が塩基対合則に従う関連性にあることを指して使用される。例えば、５’−ＡＧＴ−３’という配列は、５’−ＡＣＴ−３’という配列に対して相補的である。相補性は部分相補であったり、完全相補であったりする。部分的な相補性は、１又は複数の核酸塩基が塩基対合則に従うマッチをしていない場合に生じる。核酸間の全体的又は完全な相補性は、塩基対合則に基づいて、全ての各核酸塩基がもう一方の塩基とマッチしている場合に生じる。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率及び強度に対し重大な影響を及ぼす。
【００６０】
用語「ハイブリダイゼーション」は、相補的な核酸同士が対合することを指す。ハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの強度（すなわち、核酸間の結合の強度）は、例えば、核酸間の相補性の程度、関連条件のストリンジェンシー、形成されたハイブリッドのＴｍ、及び核酸内のＧ：Ｃ比などの要素に影響を受ける。単一分子で、その構造内に相補的な核酸同士の対合が存在するものは、「セルフハイブリダイズ」しているといわれる。
【００６１】
用語「Ｔｍ」は、核酸の融解温度を指す。融解温度は、二本鎖核酸分子の集団の半分が一本鎖に解離する温度である。核酸のＴｍを算出するための式は当該技術分野において周知である。標準的な参考文献に示されるように、核酸が１Ｍ  ＮａＣｌ水溶液中に存在する場合、単純なＴｍ推定値は、式：Ｔｍ＝８１．５＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）によって算出され得る（例えば、Anderson and Young, Quantitative Filter Hybridization, in Nucleic Acid Hybridization (1985)を参照）。他の参考文献には、Ｔｍの算出のために配列的特徴だけでなく構造的な特徴も考慮に入れたより高度な算出が含まれる。
【００６２】
用語「ストリンジェンシー」は、核酸ハイブリダイゼーションが行われる、温度、イオン強度、及び有機溶剤などの他の化合物の存在の条件を指す。
【００６３】
核酸ハイブリダイゼーションに関連して使用される場合の「低ストリンジェンシー条件」は、約５００ヌクレオチド長のプローブが使用される場合、５×ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、６．９ｇ／Ｌ  ＮａＨ２ＰＯ４（Ｈ２Ｏ）及び１．８５ｇ／Ｌ  ＥＤＴＡ、ｐＨはＮａＯＨで７．４に調整）、０．１％ＳＤＳ、５×デンハート試薬（５０×デンハート試薬は５００ｍＬ当たり、５ｇのフィコール（Ｔｙｐｅ  ４００、ファルマシア社）、５ｇのＢＳＡ（Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ；シグマ社）を含有する）及び１００ｍｇ／ｍＬ変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中、４２℃で結合又はハイブリダイゼーションを行い、その後、５×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳを含む溶液中、４２℃で洗浄を行う場合と等価な条件を含む。
【００６４】
核酸ハイブリダイゼーションに関連して使用される場合の「中ストリンジェンシー条件」は、約５００ヌクレオチド長のプローブが使用される場合、５×ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、６．９ｇ／Ｌ  ＮａＨ２ＰＯ４（Ｈ２Ｏ）及び１．８５ｇ／Ｌ  ＥＤＴＡ、ｐＨはＮａＯＨで７．４に調整）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート試薬、及び１００ｍｇ／ｍＬ変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中、４２℃で結合又はハイブリダイゼーションを行い、その後、１．０×ＳＳＰＥ、１．０％ＳＤＳを含む溶液中、４２℃で洗浄を行う場合と等価な条件を含む。
【００６５】
核酸ハイブリダイゼーションに関連して使用される場合の「高ストリンジェンシー条件」は、約５００ヌクレオチド長のプローブが使用される場合、５×ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、６．９ｇ／Ｌ  ＮａＨ２ＰＯ４（Ｈ２Ｏ）及び１．８５ｇ／Ｌ  ＥＤＴＡ、ｐＨはＮａＯＨで７．４に調整）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート試薬、及び１００ｍｇ／ｍＬ変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中、４２℃で結合又はハイブリダイゼーションを行い、その後、０．１×ＳＳＰＥ、１．０％ＳＤＳを含む溶液中、４２℃で洗浄を行う場合と等価な条件を含む。
【００６６】
ある特定の例示的な実施形態では、細胞が同定された後に、単一の細胞又は複数の細胞が単離される。本開示の範囲に含まれる細胞として、ＤＮＡの内容を理解することが当業者に有用と見なされる、あらゆる種類の細胞が包含される。本開示における細胞は、あらゆる種類のがん細胞、肝細胞、卵母細胞、胚、幹細胞、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、神経細胞、赤血球、メラニン細胞、アストロサイト、生殖細胞、オリゴデンドロサイト、腎細胞などを包含する。１つの態様によれば、本発明の方法は単一細胞から得られた細胞ＤＮＡを用いて実行される。複数の細胞としては、約２〜約１，０００，０００個の細胞、約２〜約１０個の細胞、約２〜約１００個の細胞、約２〜約１，０００個の細胞、約２〜約１０，０００個の細胞、約２〜約１００，０００個の細胞、約２〜約１０個の細胞、又は約２〜約５個の細胞が挙げられる。
【００６７】
本明細書に記載の方法により処理される核酸はＤＮＡであり得る。前記核酸は、例えばヒト試料などの、あらゆる有用な供給源から得られた核酸であり得る。特定の実施形態では、二本鎖ＤＮＡ分子は、より詳細には、ゲノムを含むものと定義され、例えば、ヒト由来試料から得られたものなどが挙げられる。前記試料は、血液、血清、血漿、脳脊髄液、頬擦過標本、乳頭吸引液、生検材料、精液（射出精液と称される場合がある）、尿、糞便、毛包、唾液、汗、免疫沈降した又は物理的に単離したクロマチンなどの、ヒト由来のあらゆる試料であり得る。特定の実施形態では、前記試料は単一細胞を含む。特定の実施形態では、前記試料は単一細胞のみを含む。
【００６８】
また、本発明で使用される核酸は、天然塩基を含むことも、非天然塩基を含むこともできる。これに関して、天然デオキシリボ核酸は、アデニン、チミン、シトシン又はグアニンからなる群から選択される１又は複数の塩基を有し、リボ核酸は、ウラシル、アデニン、シトシン又はグアニンからなる群から選択される１又は複数の塩基を有し得る。天然骨格か類似体構造のいずれかを有する、核酸内に含まれ得る例示的な非天然塩基としては、イノシン、キサンチン（xathanine）、ヒポキサンチン（hypoxathanine）、イソシトシン、イソグアニン、５−メチルシトシン、５−ヒロドキシメチルシトシン、２−アミノアデニン、６−メチルアデニン、６−メチルグアニン、２−プロピルグアニン、２−プロピルアデニン、２−チオウラシル（2-thioLiracil）、２−チオチミン、２−チオシトシン、１５−ハロウラシル、１５−ハロシトシン、５−プロピニルウラシル、５−プロピニルシトシン、６−アゾウラシル、６−アゾシトシン、６−アゾチミン、５−ウラシル、４−チオウラシル、８−ハロアデニン、８−ハログアニン、８−アミノアデニン、８−アミノグアニン、８−チオールアデニン、８−チオールグアニン、８−チオアルキルアデニン、８−チオアルキルグアニン、８−ヒドロキシルアデニン、８−ヒドロキシルグアニン、５−ハロ置換ウラシル、５−ハロ置換シトシン、７−メチルグアニン、７−メチルアデニン、８−アザグアニン、８−アザアデニン、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、３−デアザグアニン、又は３−デアザアデニンなどが挙げられるが、これらに限定はされない。特定の実施形態では、米国特許第５，６８１，７０２号に一般的に記載されているように、非特異的なハイブリダイゼーションを低減する目的で、核酸内にイソシトシン及びイソグアニンが利用され得る。
【００６９】
特定の実施形態では、バイサルファイト、ＡＰＯＢＥＣ、又は他のシトシンをウラシルに変換する試薬で処理され、メチル化解析された増幅メチロームにより、診断又は予後に関する情報が得られる。例えば、特定の実施形態では、バイサルファイト、ＡＰＯＢＥＣ、又は他のシトシンをウラシルに変換する試薬で処理され、メチル化解析された増幅メチロームにより、ゲノムのコピー数及び／又は配列に関する情報、ゲノム刷り込みに関する情報、対立遺伝子変異に関する情報、がん診断、出生前診断、父子鑑定に関する情報、疾患診断、検出、モニタリング、及び／又は処置に関する情報、配列情報、などが得られ得る。
【００７０】
本明細書で使用される場合、「単一細胞」は１個の細胞を指す。本明細書に記載の方法において有用な単一細胞は、目的の組織から、又は生検材料、血液試料、若しくは細胞培養物から得ることができる。さらに、本明細書に記載の方法においては、特定の臓器、組織、腫瘍、新生物などに由来する細胞が、入手され使用され得る。さらに、通常、前記方法においては、細菌又は酵母をはじめとする、原核生物性又は真核生物性の単細胞生物集団など、いかなる集団に由来する細胞も使用され得る。単一細胞懸濁液は、当該技術分野において公知の標準的な方法を用いて得ることができ、例えば、酵素法によりトリプシン若しくはパパインを用いて組織試料における細胞同士を接続しているタンパク質を消化する方法、又は培養液中へ接着細胞を剥離する方法、又は試料中の細胞を機械的に分離する方法、が挙げられる。単一細胞は、単一細胞を個々に処理することが可能な、あらゆる好適な反応器内に入れることができる。例えば、各単一細胞がシングルウェル内に入れられるような、９６ウェルプレートが挙げられる。
【００７１】
単一細胞を操作するための方法は、当該技術分野において公知であり、例えば、ＦＡＣＳ（fluorescence-activated cell sorting）、フローサイトメトリー（Herzenberg., PNAS USA 76:1453-55 1979）、顕微操作、及び半自動化細胞ピッキング装置（例えば、ストールティング社製のＱｕｉｘｅｌｌ（商標）細胞移送システム）の使用が挙げられる。個々の細胞は、例えば、位置、形態、又はレポーター遺伝子発現などの、顕微鏡観察によって検出可能な特徴に基づいて、個々に選別することができる。さらに、単離又は選別の効率を上げるために勾配遠心分離及びフローサイトメトリーを併用してもよい。
【００７２】
目的の細胞が同定された後、当業者に公知の方法を用いて、細胞は溶解され、ＤＮＡを含む細胞内容物を放出する。細胞内容物は容器内、すなわち収集用容積の中に含まれる。本発明のいくつかの態様では、ゲノムＤＮＡなどの細胞内容物が、細胞を溶解することにより、該細胞から放出され得る。溶解は、例えば、細胞の加熱、又は界面活性剤若しくは他の化学的手法の使用、又はこれらの組み合せにより、達成可能である。しかし、当該技術分野において公知のあらゆる好適な溶解法が使用できる。例えば、Ｔｗｅｅｎ−２０存在下で、７２℃で２分間、細胞を加熱することにより、細胞は十分に溶解される。あるいは、細胞を、水中で６５℃で１０分間加熱してもよいし（Esumi et al., Neurosci Res 60(4):439-51 (2008)）、０．５％ＮＰ−４０を添加したＰＣＲバッファー  ＩＩ（アプライドバイオシステムズ社）中で７０℃で９０秒間加熱してもよいし（Kurimoto et al., Nucleic Acids Res 34(5):e42 (2006)）、あるいは、プロテアーゼＫなどのプロテアーゼを用いて溶解してもよいし、グアニジンイソチオシアネートなどのカオトロピック塩を用いて溶解してもよい（米国特許出願公開第２００７／０２８１３１３号）。反応混合物を細胞溶解液に添加できるように、本明細書に記載の方法によるゲノムＤＮＡの増幅は細胞溶解液に対してそのまま実行されてもよい。あるいは、細胞溶解液は、当業者に公知の方法を用いて、２以上の容器、チューブ又は領域などの中に、２以上の体積に分割してもよく、この場合、細胞溶解液の一部が各々の容積容器、チューブ又は領域内に含有される。各々の容器、チューブ又は領域内に含まれるゲノムＤＮＡは、その後、本明細書に記載の方法又は当業者に公知の方法によって増幅され得る。
【００７３】
本明細書で使用される場合、通常、用語「プライマー」には、シーケンスプライマーなど、ポリヌクレオチド鋳型と二本鎖を形成した後に核酸合成の開始点として働き、鋳型に沿ってその３’末端から伸長されることで、伸長された二本鎖が形成され得る、天然又は合成の、オリゴヌクレオチドが包含される。伸長プロセスの際に付加されるヌクレオチドの順序は、鋳型ポリヌクレオチドの配列によって決定される。通常、プライマーはＤＮＡポリメラーゼによって伸長される。プライマーは、通常３〜３６ヌクレオチドの範囲内の長さを有し、また、５〜２４ヌクレオチドの範囲内の長さを有することもあり、１４〜３６ヌクレオチドの範囲内の長さを有することもある。本発明の範囲に含まれるプライマーには、オルトゴナルなプライマー（orthogonal primer）、増幅プライマー、及び構築プライマー(constructions primer)などが含まれる。プライマー対は、１つの目的配列に隣接させることも、一連の目的配列に隣接させることもできる。プライマー及びプローブは、縮重配列とすることも、準縮重配列とすることもできる。本発明の範囲に含まれるプライマーは標的配列に隣接して結合する。「プライマー」は、通常、遊離３’−ＯＨ基を有し、目的試料中に存在し得る標的又は鋳型に、該標的とのハイブリダイズにより結合し、その後、該標的に相補的なポリヌクレオチドの重合を促進する、短いポリヌクレオチドと見なされ得る。本発明のプライマーは、１７〜３０ヌクレオチドの範囲のヌクレオチドから構成される。一態様において、プライマーは、少なくとも１７ヌクレオチドであり、あるいは、少なくとも１８ヌクレオチド、少なくとも１９ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも２１ヌクレオチド、少なくとも２２ヌクレオチド、少なくとも２３ヌクレオチド、少なくとも２４ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド、少なくとも２６ヌクレオチド、少なくとも２７ヌクレオチド、少なくとも２８ヌクレオチド、少なくとも２９ヌクレオチド、少なくとも３０ヌクレオチド、少なくとも５０ヌクレオチド、少なくとも７５ヌクレオチド、又は、少なくとも１００ヌクレオチドである。
【００７４】
プライマーとしては、がんなどの疾患と関連したＤＮＡの、選択された標的遺伝子座に特異的なプライマーが包含され、そのようなプライマーは、標的遺伝子座特異的プライマー、疾患特異的プライマー、又はがん特異的プライマーと称される場合がある。そのような標的遺伝子座特異的プライマー、疾患特異的プライマー、又はがん特異的プライマーを用いることで、疾患特異的なＤＮＡ又はがん特異的なＤＮＡなどの標的遺伝子座の増幅が可能となり、これにより、個人の疾患又はがんの診断を行うための疾患特異的ＤＮＡ又はがん特異的ＤＮＡの同定が可能となる。
【００７５】
「増幅」又は「増幅する」という表現は、特定のポリヌクレオチドのコピーが余分に又は多重に形成されるプロセスを指す。
【００７６】
バイサルファイト、ＡＰＯＢＥＣ、又は他のシトシンをウラシルに変換する試薬で処理された増幅メチロームは、当業者に公知の方法を用いて増幅され、シーケンスされ、解析され得る。目的の核酸配列の配列決定は、当該技術分野において公知の種々の配列決定法を用いて行うことができ、例えば以下が挙げられるが、これらに限定はされない：ハイブリダイゼーションによる配列決定法（sequencing by hybridization）（ＳＢＨ）、ライゲーションによる配列決定法（sequencing by ligation）（ＳＢＬ）（Shendure et al. (2005) Science 309:1728）、定量的漸増蛍光ヌクレオチド付加配列決定法（quantitative incremental fluorescent nucleotide addition sequencing）（ＱＩＦＮＡＳ）、段階的なライゲーション及び切断、蛍光共鳴エネルギー転移（fluorescence resonance energy transfer）（ＦＲＥＴ）、分子ビーコン、ＴａｑＭａｎレポータープローブ消化（TaqMan reporter probe digestion）、ピロシーケンス、蛍光インサイツ配列決定法（fluorescent in situ sequencing）（ＦＩＳＳＥＱ）、ＦＩＳＳＥＱ用ビーズ（米国特許第７，４２５，４３１号）、ゆらぎ配列決定法（wobble sequencing）（ＰＣＴ／ＵＳ０５／２７６９５）、マルチプレックスシーケンス（米国特許出願公開第１２／０２７，０３９号、２００８年２月６日出願；Porreca et al (2007) Nat. Methods 4:931）、重合コロニー（polymerized colony）（ＰＯＬＯＮＹ）配列決定法（米国特許第６，４３２，３６０号、同第６，４８５，９４４号及び同第６，５１１，８０３号、並びにＰＣＴ／ＵＳ０５／０６４２５）；ナノグリッド（nanogrid）ローリングサークル配列決定法（rolling circle sequencing）（ＲＯＬＯＮＹ）（米国特許出願公開第１２／１２０，５４１号、２００８年５月１４日出願）、対立遺伝子特異的オリゴライゲーションアッセイ（allele-specific oligo ligation assay）（例えば、オリゴライゲーションアッセイ（oligo ligation assay）（ＯＬＡ）、連結された直鎖状プローブ及びローリングサークル増幅（rolling circle amplification）（ＲＣＡ）による読み取りを利用した単一鋳型分子ＯＬＡ、連結されたパッドロックプローブ、並びに／又は、連結された環状パッドロックプローブ及びローリングサークル増幅（ＲＣＡ）による読み取りを利用した単一鋳型分子ＯＬＡ）。例えば、Ｒｏｃｈｅ  ４５４、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｓｏｌｅｘａ、ＡＢ−ＳＯＬｉＤ、Ｈｅｌｉｃｏｓ、Ｐｏｌｏｎａｔｏｒなどのプラットフォームを用いたハイスループット配列決定法も利用できる。種々の光に基づく配列決定技術が、当該技術分野において公知である（Landegren et al. (1998) Genome Res. 8:769-76; Kwok (2000) Pharmacogenomics 1:95-100；及びShi (2001) Clin. Chem. 47:164-172）。
【００７７】
さらなる配列決定法として、ハイスループットスクリーニング法が挙げられ、例えば、アプライドバイオシステムズ社製のＳＯＬｉＤシーケンス技術、又はイルミナ社製のＧｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒなどがある。本発明の一つの態様において、ＤＮＡはショットガン法で配列決定され得る。リード数は、少なくとも１０，０００、少なくとも１，０００，０００、少なくとも１０，０００，０００、少なくとも１００，０００，０００、又は少なくとも１，０００，０００，０００であり得る。別の態様では、リード数は、１０，０００〜１００，０００、あるいは１００，０００〜１，０００，０００、又は１，０００，０００〜１０，０００，０００、又は１０，０００，０００〜１００，０００，０００、又は１００，０００，０００〜１，０００，０００，０００であり得る。「リード」とは、シーケンス反応によって得られる、連続した核酸配列の長さである。
【００７８】
「ショットガン配列決定法」は、非常に大量のＤＮＡ（ゲノム全体など）の配列決定に使用される方法を指す。この方法では、まず、配列決定しようとするＤＮＡが、個々に配列決定可能なより小さな断片に細断される。その後、これらの断片の配列が、重複している配列に基づいて元の順番に再構築され、これにより完全配列が得られる。ＤＮＡの「細断」は、制限酵素消化又は機械的剪断を含む種々様々な手法を用いて行われ得る。重複配列は、通常、適切にプログラミングされたコンピュータによってアライメントされる。ｃＤＮＡライブラリーをショットガン法で配列決定するための方法及びプログラムは当該技術分野において周知である。
【００７９】
本明細書に記載の方法は、診断検査、予後検査、薬理ゲノミクス、及び臨床試験モニタリングを予後判定（予測）目的に使用することで、個人を予防的に治療する、予測医療の分野において有用である。従って、本発明の一つの態様は、個人が障害及び／又は疾患を発症する危険性の有無を判定することを目的とした、ゲノムＤＮＡを判定するための診断検査に関する。このような検査を、予後判定又は予測を目的に使用することで、障害及び／又は疾患の発症前に個人を予防的に治療することができる。従って、ある特定の例示的な実施形態において、本明細書に記載の発現プロファイリング法のうちの１又は複数を用いた、１又は複数の疾患及び／又は障害を診断及び／又は予後予測する方法が提供される。
【００８０】
ある特定の例示的な実施形態では、本明細書に記載の１又は複数のゲノムＤＮＡ配列を含む電子装置可読媒体が提供される。本明細書で使用される場合、「電子装置可読媒体」とは、そのまま電子装置による読み取り及びアクセスが可能な、データ又は情報を記憶、保持又は格納するための、あらゆる好適な媒体を指す。そのような媒体としては、フロッピーディスク、ハードディスク記憶媒体、及び磁気テープなどの磁気記憶媒体；コンパクトディスクなどの光学式記憶媒体；ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、及びＥＥＰＲＯＭなどの電子記憶媒体；一般的なハードディスク、並びに磁気／光学式記憶媒体などのこれらのカテゴリーの複合型を挙げることができるが、これらに限定はされない。媒体は、本明細書に記載の１又は複数の発現プロファイルが記録されるように適合又は構成される。
【００８１】
本明細書で使用される場合、用語「電子装置」は、あらゆる好適な演算装置若しくは処理装置、又はデータ若しくは情報を記憶するように構成若しくは適合された他のデバイスを包含することが意図される。本発明において好適に使用される電子装置の例としては、独立型演算装置；構内ネットワーク（ＬＡＮ）、広域ネットワーク（ＷＡＮ）インターネット、イントラネット、及びエクストラネットを含むネットワーク；携帯情報端末（ＰＤＡ）、携帯電話、及びポケットベルなどの電子装置；並びに局所内処理システム及び分散処理システムが挙げられる。
【００８２】
本明細書で使用される場合、「記録」とは、情報を電子装置可読媒体上に記憶又はコード化するための処理を指す。当業者であれば、情報を公知の媒体上に記録して、本明細書に記載の１又は複数の発現プロファイルを含む製品を生み出すための、現在知られているいずれの方法も、容易に採用することができる。
【００８３】
種々のソフトウェアプログラム及びフォーマットを用いて、本発明のゲノムＤＮＡ情報を電子装置可読媒体上に記憶することができる。例えば、核酸配列は、ＷｏｒｄＰｅｒｆｅｃｔ及びＭｉｃｒｏＳｏｆｔ  Ｗｏｒｄなどの市販のソフトウェアでフォーマットされたワードプロセッシングテキストファイル中に、又は、ＤＢ２、Ｓｙｂａｓｅ若しくはＯｒａｃｌｅなどのデータベースアプリケーションに記憶されたＡＳＣＩＩファイルの形式で、並びに他の形式で、表すことができる。本明細書に記載の１又は複数の発現プロファイルが記録された媒体を得る、又は作製するために、データ処理装置構築フォーマット（例えば、テキストファイル又はデータベース）を、いくつでも用いてよい。
【００８４】
本発明の実施形態を説明してきたが、これらが本発明の諸原理のいくつかの適用の単なる例示であることは理解されたい。当業者は、本明細書に提供された教示に基づいて、本発明の趣旨の範囲内で、多くの変更を行うことができる。本願に引用された全ての参考文献、特許及び特許出願公開の内容は、全ての目的のためにそれらの全体が参照によって本明細書に援用される。
【実施例】
【００８５】
下記の実施例は本発明の代表的なものとして記載される。これらの実施例及び他の等価な実施形態は本開示、図面及び添付の特許請求の範囲を考慮すれば明らかであるため、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【００８６】
≪実施例Ｉ≫
（プロトコル）
以下の一般プロトコルが単一細胞全メチローム増幅に有用である。単一細胞の単離は、マウスピペッティング、レーザーダイセクション、マイクロ流体デバイス、フローサイトメトリーなどによって実行できる。
【００８７】
通常、単一細胞は溶解緩衝液中で溶解する。プライマー結合部位配列を有するトランスポソーム、及び転移緩衝液を細胞溶解に加える。転移後、プロテアーゼを添加して、単一細胞ゲノムＤＮＡへ結合している状態から、トランスポザーゼを取り除く。この反応混合物にＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  （ｅｘｏ−）  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ｄＮＴＰ、ＰＣＲ反応緩衝液及びプライマーを添加することで、トランスポゾン挿入により生成したギャップを充填する。ギャップ修復後、そのＤＮＡ断片を変性させる。得られたｓｓＤＮＡは、相補的な末端を有するため、ステムループ構造を形成する。このステムループ構造体を増幅するため、アニーリング温度を逓減させるシングルプライマーＰＣＲ反応を行う。次に、得られた伸長産物をＤＮＭＴ１などのメチル化試薬と共にインキュベートする。インキュベーション後、メチル化複製が必要となるサイクル数に応じて、ＤｅｅｐＶｅｎｔ  ＰＣＲ反応及びＤＮＭＴ１インキュベーションを複数回実行できる。生成物は、ザイモリサーチ社製ＥＺ−Ｄｉｒｅｃｔ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｋｉｔを用いて、バイサルファイト変換試薬による処理を、直接行うことができる。
【００８８】
以下に、単一細胞全メチローム増幅のより具体的なプロトコルを記載する。
【００８９】
（単一細胞溶解）
単一細胞を、ＦＡＣＳソーティング又はマウスピペッティングにより、２．５μＬの溶解緩衝液中に入れる。この溶解緩衝液は以下を含有する：１．８２５μＬのＨ２Ｏ、０．０５μＬの１Ｍ  ＴＥバッファー（ｐＨ８．０）、０．０５μＬの１Ｍ  ＫＣＬ、０．３７５μＬの０．１Ｍ  ＤＴＴ、０．０７５μＬの１０％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１２５  ２０ｍｇ／ｍｌ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｑ  （キアゲン社）。溶解反応は以下の熱サイクルで行う：５０℃２０分間、７５℃２０分間、８０℃５分間。溶解後、ｄｓＤＮＡが単一細胞から放出される。
【００９０】
（Ｔｎ５タグメンテーション）
タグメンテーション用にＴｎ５トランスポゾン複合体を以下の通りに調製する。１μＬの精製された５μＭ  Ｔｎ５  Ｐｒｏｔｅｉｎを、１μＬの５μＭ  Ｔｎ５  ｄｓＤＮＡと混合する。２５℃で４５分間インキュベートする。９８μＬのＴｎ５  Ｄｉｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒを２μＬの前記トランスポゾン混合物に添加して、０．０５μＭ  Ｔｎ５複合体を得る。前記Ｔｎ５  Ｄｉｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒは、１０μＬの１Ｍ  ＴＥバッファー（ｐＨ８．０）、４μＬの０．５Ｍ  ＮａＣｌ、及び８４μＬのＨ２Ｏを含む。Ｔｎ５  ｄｓＤＮＡは、上側鎖の５’−ＣＡＴ  ＴＡＣ  ＧＡＧ  ＣＧＡ  ＧＡＴ  ＧＴＧ  ＴＡＴ  ＡＡＧ  ＡＧＡ  ＣＡＧ−３’と、下側鎖の５’−Ｐｈｏｓ−ＣＴＧ  ＴＣＴ  ＣＴＴ  ＡＴＡ  ＣＡＣ  ＡＴＣ  ｉｎｖｄＴ−３’とを含む。２．５μＬの細胞溶解物に、１．５μＬの０．０５μＭ  Ｔｎ５トランスポゾン複合体、１μＬの５×Ｔｎ５  Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒを添加する。Ｔｎ５  Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒの１×バッファー条件には、１０ｍＭトリス塩酸、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５℃でｐＨ７．８が含まれる。５μＬの反応系を５０℃で１０分間インキュベートする。１μＬの１ｍｇ／μＬ  ＰｒｏｔｅａｓｅＱ（キアゲン社）を前記反応系に添加し、以下の熱サイクルでインキュベートする：５０℃、２０分間及び７０℃、３０分間。得られるｄｓＤＮＡは、３０ｂｐのＤＮＡプライミング部位が両端に付加され、３’末端に９ｂｐのギャップを残して、５００ｂｐ〜１０００ｂｐの長さになるはずである。
【００９１】
（ギャップ修復及び１サイクル目のＰＣＲ反応）
９ｂｐのギャップを充填するため、鎖置換活性を有するＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  （ｅｘｏ−）  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いてこのギャップを修復する。ギャップ修復後、ＤＮＡ断片を熱変性させる。得られたｓｓＤＮＡは、相補的な末端を有するため、ステムループ構造を形成する。このステムループ構造体を増幅するため、アニーリング温度を逓減させるシングルプライマーＰＣＲ反応を行う。６μＬの前記反応系に、１μＬの１０×ＰＣＲバッファー、０．２μＬのｄＮＴＰ、０．１μＬの２Ｕ／μＬ  ＤｅｅｐＶｅｎｔ  ｅｘｏ−、配列５’−ＣＡＴ  ＴＡＣ  ＧＡＧ  ＣＧＡ  ＧＡＴ  ＧＴＧ  ＴＡＴ  ＡＡＧ  ＡＧＡ  ＣＡＧ−３’を有する、０．２μＬの１μＭ  ３０ｂｐ  ｓｓＤＮＡプライマー、０．２μＬの１００ｍＭ  ＭｇＳＯ４、及び２．３μＬのＨ２Ｏを添加する。１×ＰＣＲバッファー条件は、２０ｍＭトリス塩酸、１０ｍＭ  ＫＣＬ、０．１％Ｔｒｉｔｉｏｎ  Ｘ−１００、２５℃でｐＨ７．８を含む。１０μＬの前記反応に対して、以下の熱サイクルを実行する：７２℃１０分間、９５℃３分間、６８℃６０秒間、６７℃６０秒間、６６℃６０秒間、６５℃６０秒間、６４℃６０秒間、６３℃６０秒間、６２℃６０秒間、６１℃６０秒間、６０℃６０秒間、５９℃６０秒間、５８℃６０秒間、及び７２℃３分間。これによりヘミメチル化ｄｓＤＮＡ断片が得られる。
【００９２】
（１サイクル目のＤＮＭＴ１メチル基転移反応）
次に、得られた伸長産物をＤＮＭＴと共にインキュベートする。ＥＤＴＡを添加してＭｇ２＋をキレート化する。１０μＬの反応系に、１．５μＬの１０×  Ｍｅｔｈｙｌ−Ｔｒａｎｓｆｅｒ（ＭＴ）  Ｂｕｆｆｅｒ、０．１５μＬの１６０μＭ  ＳＡＭ、０．１５μＬの１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、０．３μＬの２００ｍＭ  ＥＤＴＡ、２μＬの２Ｕ／μＬ  ＤＮＭＴ１、０．９μＬのＨ２Ｏを添加する。ＭＥＲＬＯＴ  ＭＴ  Ｂｕｆｆｅｒの１×バッファー条件は、２０ｍＭトリス塩酸、１ｍＭ  ＤＴＴ、５％グリセロール、２５℃でｐＨ７．８を含む。１５μＬの前記反応系を３７℃で３時間インキュベートする。これにより、メチル化ｄｓＤＮＡ断片が得られ、１サイクルの増幅、すなわちシングルプライマー伸長、及びメチル化が完了する。
【００９３】
（所望による複数サイクルの増幅及びメチル化）
さらに、１〜２０サイクル、１〜１０サイクル又は１〜５サイクルの増幅及びメチル化を所望により実行できる。熱サイクルは１サイクル目の増幅及びメチル化と同じである。２サイクル目、３サイクル目、４サイクル目、５サイクル目などの増幅及びメチル化ではそれぞれ以下の試薬を添加する。
【００９４】
（２サイクル目の増幅、ＰＣＲ）
１５μＬの前記反応系に、１μＬの１０×ＰＣＲバッファー、０．２μＬのｄＮＴＰ、０．１μＬの２Ｕ／μＬ  ＤｅｅｐＶｅｎｔ  ｅｘｏ−、０．２μＬの１μＭ  ３０ｂｐ  ｓｓＤＮＡプライマー、０．５５μＬの１００ｍＭ  ＭｇＳＯ４、及び２．９５μＬのＨ２Ｏを添加する。
【００９５】
（２サイクル目のＤＮＭＴ１メチル基転移反応）
２０μＬの前記反応系に、１μＬの１０×  Ｍｅｔｈｙｌ−Ｔｒａｎｓｆｅｒ（ＭＴ）  Ｂｕｆｆｅｒ、０．２５μＬの１６０μＭ  ＳＡＭ、０．１μＬの１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、０．３２５μＬの１００ｍＭ  ＥＤＴＡ、２μＬの２Ｕ／μＬ  ＤＮＭＴ１、０．１５μＬの１００ｍＭ  ＤＴＴ、及び１．１７５μＬのＨ２Ｏを添加する。
【００９６】
（３サイクル目の増幅、ＰＣＲ）
２５μＬの前記反応系に、１μＬの１０×ＰＣＲバッファー、０．２μＬのｄＮＴＰ、０．１μＬの２Ｕ／μＬ  ＤｅｅｐＶｅｎｔ  ｅｘｏ−、０．２μＬの１μＭ  ３０ｂｐ  ｓｓＤＮＡプライマー、０．８５μＬの１００ｍＭ  ＭｇＳＯ４、及び２．６５μＬのＨ２Ｏを添加する。
【００９７】
（３サイクル目のＤＮＭＴ１メチル基転移反応）
３０μＬの前記反応系に、１μＬの１０×ＭＥＲＬＯＴ  Ｍｅｔｈｙｌ−Ｔｒａｎｓｆｅｒ（ＭＴ）  Ｂｕｆｆｅｒ、０．３５μＬの１６０μＭ  ＳＡＭ、０．１μＬの１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、０．４７５μＬの２００ｍＭ  ＥＤＴＡ、２μＬの２Ｕ／μＬ  ＤＮＭＴ１、０．２５μＬの１００ｍＭ  ＤＴＴ、及び０．８２５μＬのＨ２Ｏを添加する。
【００９８】
（４サイクル目のＰＣＲ）
３５μＬの前記反応系に、１μＬの１０×ＰＣＲバッファー、０．２μＬのｄＮＴＰ、０．１μＬの２Ｕ／μＬ  ＤｅｅｐＶｅｎｔ  ｅｘｏ−、０．２μＬの１μＭ  ３０ｂｐ  ｓｓＤＮＡプライマー、１．１５μＬの１００ｍＭ  ＭｇＳＯ４、及び２．３５μＬのＨ２Ｏを添加する。
【００９９】
（４サイクル目のＤＮＭＴ１メチル基転移反応）
４０μＬの前記反応系に、１μＬの１０×Ｍｅｔｈｙｌ−Ｔｒａｎｓｆｅｒ（ＭＴ）  Ｂｕｆｆｅｒ、０．４５μＬの１６０μＭ  ＳＡＭ、０．１μＬの１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、０．６２５μＬの２００ｍＭ  ＥＤＴＡ、２μＬの２Ｕ／μＬ  ＤＮＭＴ１、０．３５μＬの１００ｍＭ  ＤＴＴ、及び０．４７５μＬのＨ２Ｏを添加する。
【０１００】
（５サイクル目のＰＣＲ）
４５μＬの前記反応系に、１μＬの１０×ＰＣＲバッファー、０．２μＬのｄＮＴＰ、０．１μＬの２Ｕ／μＬ  ＤｅｅｐＶｅｎｔ  ｅｘｏ−、０．２μＬの１μＭ  ３０ｂｐ  ｓｓＤＮＡプライマー、１．４５μＬの１００ｍＭ  ＭｇＳＯ４、及び２．０５μＬのＨ２Ｏを添加する。
【０１０１】
（５サイクル目のＤＮＭＴ１メチル基転移反応）
５０μＬの前記反応系に、１μＬの１０×Ｍｅｔｈｙｌ−Ｔｒａｎｓｆｅｒ（ＭＴ）  Ｂｕｆｆｅｒ、０．５５μＬの１６０μＭ  ＳＡＭ、０．１μＬの１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、０．７７５μＬの１００ｍＭ  ＥＤＴＡ、２μＬの２Ｕ／μＬ  ＤＮＭＴ１、０．４５μＬの１００ｍＭ  ＤＴＴ、及び０．１２５μＬのＨ２Ｏを添加する。
【０１０２】
フルメチル化後のｄｓＤＮＡ増幅産物は、そのまま、ザイモリサーチ社製ＥＺ−Ｄｉｒｅｃｔ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｋｉｔなどの市販キットを用いて、亜硫酸水素ナトリウム処理できる。バイサルファイト変換されたＤＮＡは、全ゲノムバイサルファイトシーケンス法などのその後の解析に供することができる状態となる。
【０１０３】
≪実施例ＩＩ≫
（キット）
本開示の方法に必要な材料及び試薬はキット内に一緒にまとめてもよい。本開示の単一細胞全ゲノムメチロームシーケンスのためのキットは、通常、必要に応じてプライマーセットと一緒に、特許請求された方法を実行するのに必要な、トランスポソーム（トランスポザーゼ酵素とトランスポゾンＤＮＡとからなる）、ヌクレオチド、及びＤＮＡポリメラーゼを少なくとも含む。前記キットはまた、ＤＮＭＴ１と、必要となるあらゆる緩衝液と、を含み、例えば、本明細書に記載されるような陽イオンを含有する緩衝液が挙げられる。前記キットは、メチル化工程の際にそのような陽イオンをキレート化するためのキレート化剤を含んでいてもよく、プライマー伸長を実行する際に反応媒質を補充するための陽イオンを含んでもよい。前記キットは、ＤＮＡ試料からメチローム増幅物を作製するための指示書も含む。本開示の早期のがん診断のためのキットは、通常、特許請求された方法を実施するために必要な、選択されたプライマーセットと、ヌクレオチドと、ＤＮＡポリメラーゼとを少なくとも含む。前記キットはまた、ＤＮＭＴ１と、必要となるあらゆる緩衝液とを含む。前記キットは、セルフリーＤＮＡ試料から標的ＤＮＡ領域を増幅するための指示書も含む。いずれの場合でも、キットはそれぞれの試薬、酵素又は反応物用の別々の容器を含むことが好ましい。通常、各試薬は各々の容器に分注されていることが好適である。キットの収容手段としては、通常、少なくとも１つのバイアル又は試験管が含まれる。フラスコ、ビン、及び試薬を入れ分注するための他の収容手段も含まれ得る。キットの個々の容器は、商業販売用にきつく密閉した状態で維持されることが好ましい。好適なより大型の容器としては、中に所望のバイアルが保持された、射出成形又はブロー成形されたプラスチック容器が挙げられる。キットには説明書が備えられていることが好ましい。
【０１０４】
≪実施例ＩＩＩ≫
（メチル基転移効率）
本明細書に記載の方法のメチル基転移効率を決定するために、バイサルファイトシーケンス法（ＭｉＳｅｑ  ｖ２ケミストリーキット、２×１５０ｂｐのペアエンドリード、総リード数１，０００，０００）を、１０ｐｇのＨｅＬａ由来フルメチル化ｇＤＮＡ、及び１０ｐｇのＨｅＬａ由来フルメチル化ｇＤＮＡを本明細書に記載されるような１サイクルのシングルプライマー伸長及びＤＮＭＴ１インキュベーションにかけて得られた増幅ＤＮＡ、に対して実施した。ヒトゲノムに対して独自にアライメントされた全てのリードの中で、ＨｅＬａ由来フルメチル化ｇＤＮＡについては、９８．７％のＣｐＧ配列内シトシンがメチル化されており、一方、１０ｐｇのＨｅＬａ由来フルメチル化ｇＤＮＡを、本明細書に記載されるような、１サイクルのシングルプライマー伸長及びＤＮＭＴ１インキュベーションにかけて得られた増幅ＤＮＡについては、９３．６０％のＣｐＧ配列内シトシンがメチル化されている。図２を参照されたい。このことは、ＤＮＭＴ１インキュベーションの際のメチル基転移効率が９５．１％であることを示している。図３を参照されたい。
【０１０５】
ＤＮＭＴ１は、新規（ｄｅ  ｎｏｖｏ）メチル化活性を有することも知られている。本明細書に記載の方法の新規メチル化率を推測するために、バイサルファイトシーケンス法（ＭｉＳｅｑ  ｖ２ケミストリーキット、２×１５０ｂｐのペアエンドリード、総リード数１，０００，０００）を、１０ｐｇのＳＭ４８０単一細胞由来ｇＤＮＡ  ＰＣＲ産物、及び１０ｐｇのＳＭ４８０単一細胞由来ｇＤＮＡ  ＰＣＲ産物を本明細書に記載されるような１サイクルのシングルプライマー伸長及びＤＮＭＴ１インキュベーションにかけて得られた増幅ＤＮＡ、に対して実施した。図２を参照されたい。結果は、新規メチル化率が１．７％という許容できる値であることを示している。図３を参照されたい。
【０１０６】
単一細胞全メチロームシーケンスにおいては、バイサルファイト変換前に本明細書に記載のようなメチロームの前増幅を実施せず、単一細胞がそのまま亜硫酸水素ナトリウムで処理された後、バイサルファイト後の増幅及びシーケンシングが実施されることがある。この場合、バイサルファイト変換時のＤＮＡ減少により、メチロームのカバレッジは低い。代表的な達成カバレッジとしては、マウスのメチロームで平均２０％程度である。内容全体が参照により本明細書に援用される、Smallwood, S. A., et al. (2014). “Single-cell genome-wide bisulfite sequencing for assessing epigenetic heterogeneity.” Nat Methods 11(8): 817-820を参照されたい。また、レデュースド・リプレゼンテーション・バイサルファイトシーケンス法（reduced representation version）は平均４％のメチロームカバレッジで達成される。内容全体が参照により本明細書に援用される、Guo, H., et al. (2013). “Single-cell methylome landscapes of mouse embryonic stem cells and early embryos analyzed using reduced representation bisulfite sequencing.” Genome Res 23(12): 2126-2135を参照されたい。この低いカバレッジでは、十分な統計的信頼度を達成するために大量の細胞を解析する必要があり（２０％のカバレッジでは、特定のＣｐＧ部位のメチル化状態を３回以上再現するために、約１５個の細胞をシーケンスにかける必要があるため）、これにより、細胞集団間のメチル化不均一性やヒト胚などの希少な試料に対する解析に効果的に対処できるようになる。シングルプライマー伸長及びメチル基付加剤とのインキュベーションを含む本明細書に記載の方法は、メチロームカバレッジを３〜４倍向上させ、これにより、希少試料や細胞間不均一性の解析能力が大幅に向上する。
【０１０７】
がん診断に関する１つの実施形態によれば、腫瘍から放出されたセルフリーＤＮＡの量は、血漿中ＤＮＡと比較して極端に少ない。大量のバックグラウンド（血漿中ＤＮＡ）からセルフリー腫瘍ＤＮＡのメチル化情報を回収するために、現行の手法は高感度なメチル化検出法を必要としており、例えばメチル化特異的ｑＰＣＲが挙げられるが、この方法は、早期がんと比較して腫瘍由来のセルフリーＤＮＡの量が顕著により多い、中期又は後期のがんに依存している。また、そのような方法は早期がん診断のためには感度が乏しい（すなわち５０％程度）。メチル化検出法を最適化するかわりに、本明細書に記載の方法は、メチル化剤、及び差示的メチル化遺伝子を標的とする選択されたプライマーセットを用いて、メチル化状態を維持したままセルフリーＤＮＡを増幅する。メチル化情報又はメチル化状態を維持しながらの増幅により、各種検出方法においてより多くの初期物質が提供され、感度を向上させることができる。
【０１０８】
１つの態様によれば、メチル基転移効率及び新規メチル化率を利用することにより、増幅メチロームの作製効率が最大化される。メチル基転移効率とは、ヘミメチル化ＣｐＧが、ＤＮＭＴ１などのメチル化剤とのインキュベーション後にフルメチル化される割合を指す。新規メチル化率とは、非メチル化ＣｐＧが、インキュベーション後にフルメチル化される割合を指す。
【０１０９】
１００％のメチル基転移効率は、鋳型の元のヘミメチル化ＣｐＧ部位のメチル化状態の完全な複製を意味する。９５％のメチル基転移効率とは、１サイクルのＤＮＭＴ１とのインキュベーションにおいて、メチル化状態のうちの５％がランダムに失われ、５％の偽陰性率がメチル化状態解析に生じることを意味する。３サイクルの増幅、すなわち、３サイクルのシングルプライマー伸長及びメチル化剤とのインキュベーション、においては、次式のように偽陰性率は指数関数的に増加する：１−０．９５３＝１４．３％。特定の遺伝子のメチル化を算出する場合、偽陰性率を減少させるために、複数のＣｐＧ部位のメチル化状態が考慮されるが、メチル基転移効率は９５％以上であることが好ましい。
【０１１０】
０％の新規メチル化率とは、オリジナルの鋳型の非メチル化ＣｐＧ部位にはメチル基が付加されないことを意味する。２％の新規メチル化率とは、１サイクルのＤＮＭＴ１とのインキュベーションにおいて、メチル化されていなかったＣｐＧ部位のうちの２％が、ランダムにメチル化され、２％の偽陽性率がメチル化状態解析に生じることを意味する。３サイクルの増幅、すなわち、３サイクルのシングルプライマー伸長及びメチル化剤とのインキュベーション、においては、次式のように偽陽性率は直線的に増加する：３×０．０２＝６％。特定の遺伝子のメチル化を算出する場合、偽陽性率を減少させるために、複数のＣｐＧ部位のメチル化状態が考慮されるが、新規メチル化は２％以下であることが好ましい。
【０１１１】
≪実施例ＩＶ≫
（メチル化解析に基づいた診断法）
本開示の態様は、がんなどの状態の診断又は予後予測に基づいている。１つの態様によれば、セルフリーＤＮＡを含む血液試料が個人から採取される。このセルフリーＤＮＡが、本明細書に記載の方法に従い処理及び解析され、がん細胞ＤＮＡと一致するメチル化パターンの同定に基づいてがん細胞ＤＮＡの有無が判定される。差示的メチル化標的遺伝子座のメチル化状態を増幅することにより、少量のセルフリー腫瘍ＤＮＡに対する捕捉感度が増加する。前記方法は以下を含む：（ａ）個人から採取された血液試料から得られたメチル化パターンを有する二本鎖ＤＮＡ配列を断片化することで、メチル化パターンを有し、且つ、各５’末端にプライマー結合部位を含む、鋳型二本鎖ＤＮＡ断片配列群を作製すること、（ｂ）前記鋳型二本鎖ＤＮＡ断片配列群をそれぞれ上下の鋳型鎖に分離すること、（ｃ）プライマー、ポリメラーゼ及びヌクレオチドを用いて前記上下の鋳型鎖を伸長させ、非メチル化相補鎖を作製することで、メチル化パターンを有する前記鋳型二本鎖ＤＮＡ断片配列群に対応するヘミメチル化二本鎖ＤＮＡ配列を得ること、（ｄ）前記ヘミメチル化二本鎖ＤＮＡ配列を処理することにより、対応する前記鋳型二本鎖ＤＮＡ断片配列群におけるメチル化シトシンに対応する位置にメチル基を付加して、フルメチル化鋳型二本鎖ＤＮＡ断片配列群を作製すること；工程（ｂ）〜（ｄ）を１〜５回繰り返して、前記鋳型二本鎖ＤＮＡ断片配列群のフルメチル化アンプリコンを作製すること；前記鋳型二本鎖ＤＮＡ断片配列群のフルメチル化アンプリコンを、シトシン残基をウラシルに変換するための試薬で処理すること；メチル化シトシンパターンを決定すること；前記メチル化シトシンパターンを、がんＤＮＡの標準的なメチル化シトシンパターンと比較すること；並びに、前記決定されたメチル化シトシンパターンが前記がんＤＮＡの標準的なメチル化シトシンパターンと一致している場合に前記個人をがんと診断すること。
【０１１２】
１つの態様によれば、以下を含む方法が記載される：（ａ）個々の患者由来の液体生検試料から、正常体細胞と比較して異なるメチル化パターンを有するセルフリー腫瘍ＤＮＡを含有する可能性のある、セルフリーＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを抽出すること；（ｂ）前記二本鎖ＤＮＡ配列群をそれぞれ上下の鋳型鎖に分離すること；（ｃ）ポリメラーゼと、ヌクレオチドと、差示的メチル化遺伝子座群を標的とする選択されたプライマーセットと、を用いて前記上下の鋳型鎖を伸長させ、非メチル化相補鎖を生成することで、選択された差示的メチル化遺伝子座群の、ヘミメチル化二本鎖ＤＮＡ配列群を得ること；（ｄ）マグネシウムイオンを等モル量でキレート化するようにＥＤＴＡを添加することにより、非マグネシウム緩衝液条件をつくること；（ｅ）前記ヘミメチル化二本鎖ＤＮＡ配列群をメチルトランスフェラーゼで処理して、前記対応する二本鎖ＤＮＡ配列群におけるメチル化シトシンに対応する位置にメチル基を付加することで、選択された差示的メチル化遺伝子座群のフルメチル化二本鎖ＤＮＡ配列群を得ること；（ｆ）そのような処理の後、必要に応じて、後のプライマー伸長反応に理想的な濃度までマグネシウムイオンを添加すること（ＰＣＲ条件を用いるなど）；並びに、（ｇ）これらの工程を繰り返して、前記選択された差示的メチル化遺伝子座群のフルメチル化アンプリコンを作製すること。その後、前記フルメチル化アンプリコンが、メチル化シトシン残基は変化させずに、シトシン残基をウラシルに変換するための試薬で処理されてもよい。前記メチル化シトシンパターンが決定されてもよい。セルフリーＤＮＡのメチル化シトシンパターンを、異なるがん組織のメチル化シトシンパターンと比較することにより、セルフリー腫瘍ＤＮＡが試料中に存在していたかどうかが判定される。決定されたメチル化シトシンパターンがある特定の種類のがんの標準メチル化シトシンパターンを有する場合に、前記個人が特定の種類のがんを有すると診断されてもよい。
【０１１３】
１つの態様によれば、血液試料から血漿ＤＮＡが抽出される。がんにおける差示的メチル化遺伝子の標的遺伝子座を標的とする選択されたビオチン結合型ＰＣＲプライマーセットを用い、１サイクルのＰＣＲプライマー伸長及びメチル化剤とのインキュベーションを行うことで、前記標的遺伝子座のヘミメチル化アンプリコンが作製される。ＤＮＭＴ１をメチル基転移反応に用いて、標的遺伝子座のメチル化アンプリコンが作製され得る。前記プライマー伸長工程及びインキュベーション工程を適宜繰り返すことで、選択された標的遺伝子座の増幅メチロームが作製され得る。前記プライマー伸長工程及びインキュベーション工程を、１〜２０回又はそれ以上の回数、適宜繰り返すことで、選択された標的遺伝子座の増幅メチロームが作製され得る。ビオチン標識アンプリコンが、例えば基質に結合したアビジン結合パートナーを用いて単離、すなわち「プルダウン」される。単離されたアンプリコンが亜硫酸水素ナトリウムで処理される。同じＰＣＲプライマーセットのバイサルファイト変換版を用いて、バイサルファイト変換アンプリコンが増幅される。全ての未修飾シトシンがウラシルに変換されており、そのＣとＵの変換との整合をとるためにプライマーを少し変化させる必要があるため、同一のＰＣＲプライマーではバイサルファイト処理されたアンプリコンは増幅できない。この工程の次に、ライブラリーの準備とシーケンシングが行われる。あるいは、この工程の次に、メチル化特異的ｑＰＣＲが行われて、前記バイサルファイト処理アンプリコンのメチル化状態の探索が（一実施形態では単一遺伝子ずつ）行われる。例示的な遺伝子としては、ＳＥＰＴ９などのがん遺伝子である。好適なメチル化特異的ｑＰＣＲが、その内容全体が参照により本明細書に援用されるJorja D Warren et al., "Septin 9 methylated DNA is a sensitive and specific blood test for colorectal cancer.", BMC Medicine 2011, 9:133に記載されている。１つの態様によれば、本明細書に記載のようにメチル化状態を維持するように増幅を行い、増幅メチロームを作製することは、セルフリーＤＮＡのがん遺伝子のメチル化状態を直接的に探索するための、ＥｐｉＰｒｏＣｏｌｏｎで行われるｑＰＣＲなどの既知のｑＰＣＲ技術を超えて、感度を向上させる。
【０１１４】
より具体的には、セルフリー腫瘍ＤＮＡのメチル化解析のための、増幅及びメチル化の方法は、図４の模式図に示されるように実行され得る。血漿からのセルフリーＤＮＡの抽出は以下の通りに行われる。１０ｍｌの血液をＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酢酸）バキュテナーチューブ中に採取する。各チューブを室温で１２分間、１３５０×ｇ±１５０×ｇで遠心分離する。バフィーコートを乱さないように、血漿をきれいな１５ｍｌコニカルチューブに移した。この試料に、１２分間、１３５０×ｇ±１５０×ｇの２回目の遠心分離を行った。ペレットを乱さないように、血漿を４ｍｌチューブに移した。ＱＩＡａｍｐ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて４ｍｌの血漿からセルフリーＤＮＡを抽出し、５０μＬの溶出緩衝液中に溶出させた。このセルフリーＤＮＡの抽出は、Ｑｕｉｃｋ−ｃｆＤＮＡ（商標）Ｓｅｒｕｍ  ＆  Ｐｌａｓｍａ  Ｋｉｔ（ザイモリサーチ社）、Ｃｈａｍａｇｉｃ  ｃｆＤＮＡ  ５ｋ  Ｋｉｔ（ケマジェン社（Chemagen））、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｐｌａｓｍａ  ＸＳ（タカラバイオ社）などによっても行うことができる。この５０μＬの溶出ＤＮＡがＤＮＡ濃縮純化キット（ザイモリサーチ社）でさらに濃縮され、６μＬの溶出緩衝液中、ＰＣＲ用チューブに溶出される。
【０１１５】
差示的メチル化遺伝子座を標的とするＰＣＲプライマーセットを用いて、抽出されたセルフリーＤＮＡに対して、プライマー伸長及びメチル化が行われ、増幅メチロームが得られる。標準的ながんメチル化データに基づいて、正常体細胞との比較でがん細胞において異なるメチル化状態を有する遺伝子である差示的メチル化遺伝子が選択される。差示的メチル化遺伝子としては、以下が挙げられ、これらに限定はされない：ＳＥＰＴ９；ＴＭＥＭ１０６Ａ；ＮＣＳ１；ＵＸＳ１；ＨＯＲＭＡＤ２；ＲＥＣ８；ＤＯＣＫ８；ＣＤＫＬ５；ＳＮＲＰＮ；ＳＮＵＲＦ；ＡＢＣＣ６；ＣＡ１０；ＤＢＣ２；ＨＥＰＡＣＡＭ；ＫＲＴ１３；ＭＹＯ３Ａ；ＮＫＸ６−２；ＰＭＦ１；ＰＯＵ４Ｆ２；ＳＹＮＰＯ２／ミオポジン（myopodin）；ＺＮＦ１５４；３ＯＳＴ３Ｂ；ＡＣＡＤＬ；ＡＴＯＨ１／ｈＡＴＨ；ＢＥＣＮ１；Ｃ１４；ＣＢＦＡ２Ｔ３；ＣＯＬ７Ａ１；ＣＲＥＢＢＰ；ＣＸＣＬ１；ＥＤＮ３；ＥＴＳ１；ＦＡＭ１１０Ａ／ｃ２０；ＦＡＭ１９Ａ４／ＦＬＪ２５１６１；ＦＡＴ４；ＦＧＦＲ４；ＦＯＸＣ１；ＦＯＸＦ１；ＧＨＳＲ；ＧＪＢ２／ＣＸ２６；ＧＰＲ１８０／ＩＴＲ；ＨＤＡＣ１；ＨＳＤ１７Ｂ１；ＨＳＤ１７Ｂ２；ＨＳＤ１７Ｂ４；ＩＰＦ１；ＩＳＬ１；ＩＴＩＨ５；ＬＥＢＲＥＬ１／Ｐ３Ｈ２；ＬＥＢＲＥＬ２／Ｐ３Ｈ３；ＬＲＲＣ４９；ＭＧＡ；ｍｉＲ−１２４；ｍｉＲ−１９６ａ−２；ｍｉＲ−３３５；ＡＤＡＭＴＳ５；ＭＹＢＬ２；ＮＦＩＸ；ＮＲＮ１；ＯＧＧ１；ＰＣＤＨＧＢ６；ＰＰＰ２Ｒ２Ｂ；ＰＲＤＭ１２；ＰＴＲＦ；ＲＮＦ２０；ＳＴ１８；ＳＴＫ３６；ＳＴＭＮ１；ＳＵＬＴ１Ａ１；ＳＹＮＭ；ＴＨＡＰ１０；ＴＯＸ；ＴＳＣ１；ＵＡＰ１Ｌ１；ＵＧＴ３Ａ１；ＺＢＴＢ８Ａ；ＺＮＦ４３２；ＡＤＡＭＴＳ１２；ＡＤＨＦＥ１；ＢＡＲＸ１；ＢＥＮＤ４；ＣＡＳＲ；ＣＤ１０９；ＣＤＸ１；ＣＮＲ１／ＣＢ（１）受容体；ＣＮＲＩＰ１；ＣＮＴＦＲ；ＤＥＸＩ；ＤＵＳＰ２６；ＥＤＩＬ３；ＥＬＭＯ１；ＥＸＴＬ３；ＥＹＡ２；ＦＬＴ１；ＧＪＣ１；ＧＬＰ１Ｒ；ＧＰＲ１０１；ＧＲＩＮ２／ＮＭＤＡＲ２Ａ；ＧＳＰＴ２；ＨＯＭＥＲ２；ＩＮＡ；ＫＣＮＫ１２；ＬＡＭＡ１；ＬＲＰ２／メガリン；ＫＩＳＳ１；ＭＢＤ４／ＭＥＤ１；ＭＣＣ；ｍｉＲ−３４２；ｍｉＲ−３４５；ＮＤＲＧ４；ＮＧＦＲ；ＮＲ３Ｃ１／ＧＲ；ＰＩＫ３ＣＧ；ＰＰＡＲＧ；ＰＴＧＩＳ；ＰＴＰＲＲ；ＱＫＩ；ＲＧＭＡ；ＳＥＰＴ９；ＳＰＧ２０；ＳＴＡＲＤ８；ＳＴＯＸ２；ＴＢＸ５；ＴＨＢＳ４／ＴＳＰ４；ＴＭＥＭ８Ｂ／ＮＧＸ６；ＶＳＸ２／ＨＯＸ１０；ＡＮＧＴＬ２；ＡＸＩＮ１；ＣＣＢＥ１；ＣＴＧＦ／ＩＧＦＢＰ８；ＤＮＡＪＣ１５；ＦＢＸＯ３２；ＦＩＬＩＰ１Ｌ；ＦＺＤ４；ＧＰＲ１５０；ＧＵＣＹ２Ｃ；ＨＯＸＢ５；ＩＴＧＡ８；ＬＲＰ５；ｍｉＲ−１３０ｂ；ＮＦＡＴＸ；ＰＴＰＲＮ；ＲＵＮＸ１Ｔ１；ＴＥＲＣ／ｈＴＲ；ＴＥＳ；ＴＭＣＯ５；ＩＦＦＯ１；ＡＬＫ；ＣＨＧＡ；ＣＳＭＤ２；ＤＥＳ；ＤＵＳＰ６；ＥＬＯＶＬ４；ＦＡＮＣＧ；ＦＧＦ２；ＦＧＦ３；ＦＧＦ５；ＦＧＦ８；ＦＧＦＲ１；ＦＬＴ３；ＦＬＴ４；ＧＡＳ１；ＧＥＭＩＮ２／ＳＩＰ１；ＨＩＣ２；ＨＳＤ１７Ｂ１２；ＩＧＦＢＰ５；ＩＴＰＲ２；ＬＭＯ１／ＲＢＴＮ１；Ｉ−ｍｆａ；ｍｉＲ−１３２；ＮＥＦＬ；ＮＫＸ２−８；���ＴＲＫ３／ＴＲＫＣ；ＮＴＳＲ１；ＰＲＧ２；ＰＴＣＨ２；ＳＬＣ３２Ａ１；ＴＲＨ；ＴＵＢＢ３；ＺＮＦ４１５；ＣＬＳＴＮ１；ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ；ＨＩＳＴ２Ｈ２ＢＦ；ＩＮＨＡ／インヒビンα；ＫＣＮＭＡ１；ＮＫＸ３．１；ＮＰＢＷＲ１／ＧＰＲ７；ＮＳＭＣＥ１／ＮＳＥ１；ＰＸＭＰ４／ＰＭＰ２４；ＲＧＳ２；Ｓ１００Ａ６；ＳＬＣ１８Ａ２；ＳＰＲＹ４；ＳＶＩＬ；ＴＦＡＰ２Ｅ；ＴＧＦＢ２；ＺＮＦ１３２；ＮＦＡＴＣ；ＣＳＴ６；ＭＤＦＩ；ＡＤＡＭ２３；ＡＬＤＨ１Ａ３；ＡＰＣ；ＢＮＣ１；ＢＲＣＡ１；ＣＡＤＭ１／ＴＳＬＣ１／ＩＧＳＦ４；ＣＡＳＢ；ＣＡＶ１；ＣＣＮＡ１；ＣＣＮＤ２；ＣＤ２／ＳＲＢＣ；ＣＤ４４；ＣＤＨ１／Ｅ−カドヘリン；ＣＤＨ１３／Ｈ−カドヘリン；ＣＤＫＮ１Ｃ／ＫＩＰ２／ｐ５７；ＣＤＫＮ２Ａ／ＡＲＦ／ｐ１４；ＣＤＫＮ２Ｂ／ＩＮＫ４Ｂ／ｐ１５；ＣＨＦＲ；ＣＩＤＥＡ；ＣＬＳＴＮ１；ＣＯＬ１Ａ２；ＣＹＰ１Ａ１；ＤＡＢ２ＩＰ；ＤＡＰＫ１；ＤＢＣ１；ＤＩＲＡＳ（３）／ＡＲＨＩ；ＤＫＫ３；ＤＬＣ１；ＤＬＥＣ１；ＤＰＹＳ；ＥＯＭＥＳ；ＥＰＨＡ５；ＥＳＲ１／ＥＲ−α；ＥＳＲ２／ＥＲ−β；ＦＨＩＴ；ＦＨＬ１；ＧＡＳ７；ＧＡＴＡ５；ＧＳＴＰ１；ＨＩＣ１；ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ；ＨＩＳＴ２Ｈ２Ｂｆ；ＨＯＸＡ１１；ＨＯＸＡ９；ＨＳ３ＳＴ２／３０ＳＴ２；ＩＤ４；ＩＧＦ２；ＩＧＦＢＰ３；ＫＣＮＭＡ１；ＬＡＭＡ３；ＬＡＭＣ２；ＭＡＬ；ＭＡＲＶＥＬＤ１；ＭＤＦＩ；ＭＧＭＴ；ＭＩＮＴ１／ＡＰＢＡ１；ＭＩＮＴ２／ＡＰＢＡ２；ＭＩＮＴ３１；ｍｉＲ−３４ａ；ｍｉＲ−３４ｂ；ｍｉＲ−３４ｃ；ｍｉＲ−９−１；ＭＬＨ１；ＭＭＰ２；ＭＳＨ２；ＭＳＸ１；ＭＹＯＤ１／ＭＹＦ−３；ＮＩＤ２；ＮＫＸ３−１；ＮＰＢＷＲ１；ＮＳＭＣＥ１／ＮＳＥ１；ＯＰＣＭＬ；ｐ１４；ＰＣＤＨ１７；ＰＤＬＩＭ４／ＲＩＬ；ＰＥＮＫ；ＰＧＲ；ＰＩＴＸ２；ＰＬＡＵ／ｕＰＡ；ＰＲＤＭ２／ＲＩＺ１；ＰＴＥＮ／ＭＭＡＣ１；ＰＴＧＳ２／ＣＯＸ２；ＰＸＭＰ４／ＰＭＰ２４；ＰＹＣＡＲＤ／ＡＳＣ／ＴＭＳ１；ＲＡＲＢ；ＲＡＲＢ２；ＲＡＲＲＥＳ１／ＴＩＧ１；ＲＡＳＳＦ１；ＲＡＳＳＦ１Ａ；ＲＡＳＳＦ２；ＲＢ１；ＲＢＰ１／ＣＲＢＰ１；ＲＧＳ２；ＲＰＩＡ；ＲＰＲＭ／レプリモ（Reprimo）；ＲＵＮＸ３；Ｓ１００Ａ６；ＳＣＧＢ３Ａ１／ＨＩＮ１；ＳＥＲＰＩＮＢ５／マスピン；ＳＦＮ／１４−３−３σ；ＳＦＲＰ１／ＳＡＲＰ２；ＳＦＲＰ２；ＳＦＲＰ４；ＳＦＲＰ５；ＳＬＣ１８Ａ２；ＳＬＣ５Ａ８；ＳＬＩＴ２；ＳＯＣＳ１；ＳＯＸ１１；ＳＯＸ１７；ＳＰＡＲＣ；ＳＰＯＣＫ２；ＳＰＲＹ４；ＳＴＫ１１／ＬＫＢ１；ＳＶＩＬ；ＳＹＫ；ＴＣＦ２１；ＴＥＲＴ；ＴＦＡＰ２Ｅ；ＴＦＰＩ２；ＴＧＦＢ２；ＴＨＢＳ１；ＴＩＭＰ３；ＴＭＥＦＦ２／ＨＰＰ１／ＴＰＥＦ；ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ／ＤｃＲ１；ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ／ＤｃＲ２；ＴＮＦＲＳＦ２５／ＤＲ３；ＴＷＩＳＴ１；ＵＣＨＬ１／ＰＧＰ９．５；ＶＩＭ；ＷＩＦ１；ＷＷＯＸ；ＸＡＦ１；ＺＮＦ１３２。
【０１１６】
１つの例示的な実施形態によれば、プライマーミックスは以下の単一の差示的メチル化遺伝子をそれぞれ標的とする２１対のビオチン修飾プライマーの等量混合物である：ＳＥＰＴ９；ＴＭＥＭ１０６Ａ；ＮＣＳ１；ＵＸＳ１；ＨＯＲＭＡＤ２；ＲＥＣ８；ＤＯＣＫ８；ＣＤＫＬ５；ＳＮＲＰＮ；ＳＮＵＲＦ；ＡＢＣＣ６；ＣＡ１０；ＤＢＣ２；ＨＥＰＡＣＡＭ；ＫＲＴ１３；ＭＹＯ３Ａ；ＮＫＸ６−２；ＰＭＦ１；ＰＯＵ４Ｆ２；ＳＹＮＰＯ２／ミオポジン；及びＣＤＨ１／Ｅ−カドヘリン。この組み合わせが選択されるのは、この２１種の標的遺伝子のメチル化状態の様々な組み合わせによって、ｂｒｃａ：胸部の浸潤癌；ｃｏａｄ：結腸の腺癌；ｌｉｈｃ：肝臓の肝細胞癌；ｐｒａｄ：前立腺の腺癌；ｓｔａｄ：胃の腺癌；及びｕｃｅｃ：子宮体部の子宮内膜癌を含む、６種類の一般的ながんの診断がカバーされるためである。他のがん遺伝子の組み合わせ及びそれらのメチル化状態又はメチル化特徴を用いれば、他のがんを診断することができることは、当業者には理解される。さらなる方法として、より多くのがんの種類を網羅したり、がん診断の感度や特異性を向上させたりするために、より多くのプライマーを含ませたり、プライマーミックスの組成を変えたものを用いてもよい。方法は以下の通りに実行することができる。
【０１１７】
（プライマーミックスを用いた１サイクル目のＰＣＲ反応）
前記６μＬの溶出物に、１μＬの１０×ＰＣＲバッファー、０．２μＬのｄＮＴＰ、０．１μＬの２Ｕ／μＬ  ＤｅｅｐＶｅｎｔ  ｅｘｏ−、０．２μＬの１μＭ  ＭＥＲＬＯＴビオチン−プライマーミックス、０．２μＬの１００ｍＭ  ＭｇＳＯ４、及び２．３μＬのＨ２Ｏを添加する。１×ＭＥＲＬＯＴ  ＰＣＲバッファー条件は、２０ｍＭトリス塩酸、１０ｍＭ  ＫＣＬ、０．１％Ｔｒｉｔｉｏｎ  Ｘ−１００、２５℃でｐＨ７．８、を含む。２１種のプライマーの全てのアニーリング温度にまたがるように（５８℃〜６４℃）、１０μＬの前記反応系に対して以下の熱サイクルを実行する：９４℃２分間、６４℃６０秒間、６３℃６０秒間、６２℃６０秒間、６１℃６０秒間、６０℃６０秒間、５９℃６０秒間、５８℃６０秒間、及び７２℃３分間。これにより、一方の鎖がビオチンと結合しているヘミメチル化ｄｓＤＮＡ断片が得られる。
【０１１８】
（１サイクル目のＤＮＭＴ１メチル基転移反応）
１０μＬの前記反応系に、１．５μＬの１０×ＭＥＲＬＯＴ  Ｍｅｔｈｙｌ−Ｔｒａｎｓｆｅｒ（ＭＴ）Ｂｕｆｆｅｒ、０．１５μＬの１６０μＭ  ＳＡＭ、０．１５μＬの１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、０．３μＬの２００ｍＭ  ＥＤＴＡ、２μＬの２Ｕ／μＬ  ＤＮＭＴ１、及び０．９μＬのＨ２Ｏを添加する。ＭＴ  Ｂｕｆｆｅｒの１×バッファー条件は、２０ｍＭトリス塩酸、１ｍＭ  ＤＴＴ、５％グリセロール、２５℃でｐＨ７．８を含む。１５μＬの前記反応系を３７℃で３時間インキュベートする。これにより、メチル化ｄｓＤＮＡ断片が得られ、１サイクルの増幅及びメチル化が完了となる。
【０１１９】
（所望による複数サイクルのＭＥＲＬＯＴ）
さらに、１〜４サイクルの増幅及びメチル化を所望により実行できる。熱サイクルは１サイクル目の増幅及びメチル化と同じである。２サイクル目、３サイクル目、４サイクル目、５サイクル目の増幅及びメチル化ではそれぞれ以下の試薬を添加する。
【０１２０】
（２サイクル目のＰＣＲ）
１５μＬの前記反応系に、１μＬの１０×ＰＣＲバッファー、０．２μＬのｄＮＴＰ、０．１μＬの２Ｕ／μＬ  ＤｅｅｐＶｅｎｔ  ｅｘｏ−、０．２μＬの１μＭ  ＭＥＲＬＯＴビオチン−プライマーミックス、０．５５μＬの１００ｍＭ  ＭｇＳＯ４、及び２．９５μＬのＨ２Ｏを添加する。
【０１２１】
（２サイクル目のＤＮＭＴ１メチル基転移反応）
２０μＬの前記反応系に、１μＬの１０×Ｍｅｔｈｙｌ−Ｔｒａｎｓｆｅｒ（ＭＴ）Ｂｕｆｆｅｒ、０．２５μＬの１６０μＭ  ＳＡＭ、０．１μＬの１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、０．３２５μＬの１００ｍＭ  ＥＤＴＡ、２μＬの２Ｕ／μＬ  ＤＮＭＴ１、０．１５μＬの１００ｍＭ  ＤＴＴ、及び１．１７５μＬのＨ２Ｏを添加する。
【０１２２】
（３サイクル目のＰＣＲ）
２５μＬの前記反応系に、１μＬの１０×ＭＥＲＬＯＴ  ＰＣＲバッファー、０．２μＬのｄＮＴＰ、０．１μＬの２Ｕ／μＬ  ＤｅｅｐＶｅｎｔ  ｅｘｏ−、０．２μＬの１μＭ  ＭＥＲＬＯＴビオチン−プライマーミックス、０．８５μＬの１００ｍＭ  ＭｇＳＯ４、２．６５μＬのＨ２Ｏを添加する。
【０１２３】
（３サイクル目のＤＮＭＴ１メチル基転移反応）
３０μＬの前記反応系に、１μＬの１０×Ｍｅｔｈｙｌ−Ｔｒａｎｓｆｅｒ（ＭＴ）Ｂｕｆｆｅｒ、０．３５μＬの１６０μＭ  ＳＡＭ、０．１μＬの１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、０．４７５μＬの２００ｍＭ  ＥＤＴＡ、２μＬの２Ｕ／μＬ  ＤＮＭＴ１、０．２５μＬの１００ｍＭ  ＤＴＴ、及び０．８２５μＬのＨ２Ｏを添加する。
【０１２４】
（４サイクル目のＰＣＲ）
３５μＬの前記反応系に、１μＬの１０×ＰＣＲバッファー、０．２μＬのｄＮＴＰ、０．１μＬの２Ｕ／μＬ  ＤｅｅｐＶｅｎｔ  ｅｘｏ−、０．２μＬの１μＭ  ＭＥＲＬＯＴビオチン−プライマーミックス、１．１５μＬの１００ｍＭ  ＭｇＳＯ４、及び２．３５μＬのＨ２Ｏを添加する。
【０１２５】
（４サイクル目のＤＮＭＴ１メチル基転移反応）
４０μＬの前記反応系に、１μＬの１０×Ｍｅｔｈｙｌ−Ｔｒａｎｓｆｅｒ（ＭＴ）Ｂｕｆｆｅｒ、０．４５μＬの１６０μＭ  ＳＡＭ、０．１μＬの１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、０．６２５μＬの２００ｍＭ  ＥＤＴＡ、２μＬの２Ｕ／μＬ  ＤＮＭＴ１、０．３５μＬの１００ｍＭ  ＤＴＴ、及び０．４７５μＬのＨ２Ｏを添加する。
【０１２６】
（５サイクル目のＰＣＲ）
４５μＬの前記反応系に、１μＬの１０×ＰＣＲバッファー、０．２μＬのｄＮＴＰ、０．１μＬの２Ｕ／μＬ  ＤｅｅｐＶｅｎｔ  ｅｘｏ−、０．２μＬの１μＭ  ＭＥＲＬＯＴビオチン−プライマーミックス、１．４５μＬの１００ｍＭ  ＭｇＳＯ４、及び２．０５μＬのＨ２Ｏを添加する。
【０１２７】
（５サイクル目のＤＮＭＴ１メチル基転移反応）
５０μＬの前記反応系に、１μＬの１０×Ｍｅｔｈｙｌ−Ｔｒａｎｓｆｅｒ（ＭＴ）Ｂｕｆｆｅｒ、０．５５μＬの１６０μＭ  ＳＡＭ、０．１μＬの１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、０．７７５μＬの１００ｍＭ  ＥＤＴＡ、２μＬの２Ｕ／μＬ  ＤＮＭＴ１、０．４５μＬの１００ｍＭ  ＤＴＴ、０．１２５μＬのＨ２Ｏを添加する。
【０１２８】
（Ｄｙｎａｂｅａｄｓを用いた濃縮及びバイサルファイト変換）
増幅及びメチル化されたｄｓＤＮＡは、ＤＮＡアンプリコンの両端に結合したビオチン分子を含有する。標準的なＤｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２８０  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ洗浄によりこのアンプリコンが濃縮され、２０μＬの溶出緩衝液に溶出される。この増幅された差示的メチル化遺伝子アンプリコンが、ザイモリサーチ社製ＥＺ−Ｄｉｒｅｃｔ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｋｉｔの指示書に従って亜硫酸水素ナトリウムで処理される。バイサルファイト変換されたＤＮＡは、メチル化特異的ｑＰＣＲ、ＮＧＳシーケンス、ピロシーケンス、サンガー法シーケンスなどのその後の解析に供することができる状態となる。前記遺伝子アンプリコンのメチル化状態をがん遺伝子の既知のメチル化状態、すなわち標準（スタンダード）と比較することで、一致の状態（すなわち、がん細胞ＤＮＡの既知のメチル化状態に類似したメチル化状態）によって、試験された初期試料中にがん細胞由来の核酸が存在しているかどうかが判定される。
【０１２９】
≪実施例Ｖ≫
（合成鋳型での増幅及びメチル化）
インビトロにおけるＤＮＭＴ１の性能を試験するため、また、本明細書に記載の増幅反応及びメチル化感応に最適な反応緩衝液を開発するために、図５に示されるようなメチル化感受性制限酵素切断部位を含む、合成ｄｓＤＮＡを用いる。この８７ｂｐのｄｓＤＮＡは６ｂｐのＣｌａＩモチーフである５’−ＡＴＣＧＡＴ−３’を含有する。この８７ｂｐのｄｓＤＮＡは、そのＣｐＧ部位がメチル化されていない場合、Ｃｌａｉとのインキュベーションにより２つの断片に切断される。ＣｐＧ部位がメチル化されている場合、このｄｓＤＮＡは切断されない。ｄｓＤＮＡの一方の鎖だけがメチル化シトシンを含む場合、Ｃｌａｉの切断速度は大幅に減少するが、反応時間が十分に長ければ飽和するまで断片化する。Ｃｌａｉと３時間インキュベートした後（飽和）、バイオアナライザで電気泳動にかけることにより、未変化のｄｓＤＮＡ鋳型の正確な割合が算出され、これにより、試料中のメチル化された鋳型の割合が示される。
【０１３０】
前記８７ｂｐのｄｓＤＮＡ鋳型は以下である：
上側鎖：５’−ＡＣＣ  ＴＧＴ  ＧＡＣ  ＴＧＡ  ＧＡＣ  ＡＴＣ  ＴＧＡ  ＡＧＧ  ＴＧＣ  ＡＡＴ  ＣＡＧ  ＧＴＧ  ＴＣＡ  ＧＴＣ  ＴＴＡ  ＡＡＧ  ＧＡＴ  ＣＧＡ  ＴＡＡ  ＧＧＡ  ＡＧＣ  ＧＧＡ  ＡＧＴ  ＡＧＴ  ＧＧＴ  ＣＴＣ  ＧＴＣ  ＧＴＡ  ＧＴＧ−３’
下側鎖：５’−ＣＡＣ  ＴＡＣ  ＧＡＣ  ＧＡＧ  ＡＣＣ  ＡＣＴ  ＡＣＴ  ＴＣＣ  ＧＣＴ  ＴＣＣ  ＴＴＡ  ＴＣＧ  ＡＴＣ  ＣＴＴ  ＴＡＡ  ＧＡＣ  ＴＧＡ  ＣＡＣ  ＣＴＧ  ＡＴＴ  ＧＣＡ  ＣＣＴ  ＴＣＡ  ＧＡＴ  ＧＴＣ  ＴＣＡ  ＧＴＣ  ＡＣＡ  ＧＧＴ−３’。
【０１３１】
図６に示されるように、ある特定の緩衝液条件におけるＤＮＭＴ１のメチル基転移効率を評価するため、ヘミメチル化ｄｓＤＮＡ鋳型が自家製緩衝液中でＤＮＭＴ１とインキュベートされた後、Ｃｌａｉ切断及び電気泳動が行われる。ＤＮＭＴ１は、２μＬの２Ｕ／μＬ  ＤＮＭＴ１（ＮＥＢ社）を含有する１５μＬの反応系中で、１００％近くのメチル基転移効率を達成できた。反応緩衝液条件は次の通りである：０．１５μＬの１６０μＭ  ＳＡＭ、０．１５μＬの１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡを添加した１×ＭＴ  Ｂｕｆｆｅｒ。
【０１３２】
図７に示されるように、ある特定の緩衝液条件におけるＤＮＭＴ１の新規メチル化率を評価するため、非メチル化ｄｓＤＮＡ鋳型が自家製緩衝液中でＤＮＭＴ１とインキュベートされた後、Ｃｌａｉ切断及び電気泳動が行われる。２μＬの２Ｕ／μＬ  ＤＮＭＴ１（ＮＥＢ社）と共に３時間インキュベートされた１５μＬの反応系において、ＤＮＭＴ１は約０．１％の新規メチル化率を示す。反応緩衝液条件は次の通りである：０．１５μＬの１６０μＭ  ＳＡＭ、０．１５μＬの１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、０．３μＬの２００ｍＭ  ＥＤＴＡを添加した１×ＭＴ  Ｂｕｆｆｅｒ。ＭＴ  Ｂｕｆｆｅｒの１×バッファー条件は、２０ｍＭトリス塩酸、１ｍＭ  ＤＴＴ、５％グリセロールを、２５℃でｐＨ７．８、を含む。ＭＴ  Ｂｕｆｆｅｒ中で反応すると、ＤＮＭＴ１はロバストな性能を発揮し得るが、メチル化状態を増幅するためには、ポリメラーゼ伸長反応のロバスト性も求められる。ポリメラーゼ伸長に理想的な緩衝液条件は、ＭＴ  Ｂｕｆｆｅｒと競合しないはずであり、ＰＣＲバッファーとＭＴ  Ｂｕｆｆｅｒとの交換は複雑でないはずである。現在、本明細書に記載の増幅反応及びメチル化反応では、１０μＬの反応体積中、０．１μＬの２Ｕ／μＬ  ＤｅｅｐＶｅｎｔ  ｅｘｏ−を用いてポリメラーゼ伸長を行う。緩衝液条件は、０．２μＬのｄＮＴＰ及び０．２μＬの１００ｍＭ  ＭｇＳＯ４を添加した１×  ＰＣＲバッファーである。緩衝液交換はＭｇ２＋をＥＤＴＡでキレート化することにより達成される。１×ＰＣＲバッファー条件は、２０ｍＭトリス塩酸、１ｍＭ  ＤＴＴ、５％グリセロール、２５℃でｐＨ７．８、を含む。８７ｂｐ  ｄｓＤＮＡ鋳型のポリメラーゼ伸長用の熱サイクルは、９４℃２分間、５８℃６０秒間、及び７２℃３分間である。フォワードプライマーは５’−ＡＣＣ  ＴＧＴ  ＧＡＣ  ＴＧＡ  ＧＡＣ  ＡＴＣ  ＴＧ−３’である。リバースプライマーは５’−ＣＡＣ  ＴＡＣ  ＧＡＣ  ＧＡＧ  ＡＣＣ  ＡＣＴ  ＡＣ−３’である。
【０１３３】
ポリメラーゼ伸長とＤＮＭＴ１メチル基転移反応とを組み合わせることにより（ＭＥＲＬＯＴ法）、オリジナルの鋳型のメチル化状態の複製を達成できる。８７ｂｐメチル化鋳型に対する１サイクルのＭＥＲＬＯＴ法と、その後のＣｌａｉ切断及び電気泳動により、９６．６％の完全長鋳型が得られ、このことは、ＤＮＭＴ１のメチル基転移効率が９６．６％であることを示している。８７ｂｐメチル化鋳型に対する２サイクルのＭＥＲＬＯＴと、その後のＣｌａｉ切断及び電気泳動により、９５．４％の完全長鋳型が得られ、このことは、キレート化反応を用いた緩衝液交換の成功を示している。
【０１３４】
≪実施例ＶＩ≫
（実施形態）
本開示は、（ａ）メチル化パターンを有する二本鎖ＤＮＡ配列を断片化することで、メチル化パターンを有し、且つ、５’末端及び３’末端のそれぞれにプライマー結合部位を含む、鋳型二本鎖ＤＮＡ断片配列群を作製すること、（ｂ）前記鋳型二本鎖ＤＮＡ断片配列群をそれぞれ上下の鋳型鎖に分離すること、（ｃ）プライマー、ポリメラーゼ及びヌクレオチドを用いて前記上下の鋳型鎖を伸長させ、非メチル化相補鎖を作製することで、メチル化パターンを有する前記鋳型二本鎖ＤＮＡ断片配列群に対応するヘミメチル化二本鎖ＤＮＡ配列群を得ること、（ｄ）前記ヘミメチル化二本鎖ＤＮＡ配列群をメチルトランスフェラーゼとメチル基供給源とで処理することにより、対応する前記鋳型二本鎖ＤＮＡ断片配列群におけるメチル化シトシンに対応する位置にメチル基を付加して、フルメチル化鋳型二本鎖ＤＮＡ断片配列群を作製すること；及び、（ｅ）工程（ｂ）〜（ｄ）を繰り返して、前記鋳型二本鎖ＤＮＡ断片配列群のフルメチル化アンプリコン群を作製すること、を含む、増幅されたメチロームの作製方法を提供する。
１つの態様によれば、前記方法は、前記鋳型二本鎖ＤＮＡ断片配列群のフルメチル化アンプリコン群を、シトシン残基をウラシルに変換するための試薬で処理すること、及びメチル化シトシンパターンを解析すること、をさらに含む。
１つの態様によれば、工程（ａ）における断片化は、前記二本鎖ＤＮＡ配列をトランスポソームライブラリーと接触させること、及び、トランスポゾンＤＮＡと鋳型二本鎖ＤＮＡ断片配列との間のギャップをギャップ充填して、各端にプライマー結合部位を有する鋳型二本鎖ＤＮＡ断片配列のライブラリーを形成すること、によるものであり、前記ライブラリーの各トランスポソームはそれぞれ独自の付随バーコード配列を有しており、前記ライブラリーの各トランスポソームはトランスポザーゼ−トランスポゾンＤＮＡのホモ二量体を含んでおり、前記ホモ二量体の各トランスポゾンＤＮＡはトランスポザーゼ結合部位と、独自のバーコード配列と、プライマー結合部位と、を含んでおり、前記トランスポソームライブラリーが前記二本鎖ＤＮＡ配列上に存在する標的部位群に結合して、前記トランスポザーゼが前記二本鎖ＤＮＡ配列を前記鋳型二本鎖ＤＮＡ断片配列群へと切断し、各鋳型二本鎖ＤＮＡ断片配列はその各端に独自のバーコード配列対のうちの一方を含んでいる。
１つの態様によれば、工程（ｃ）はマグネシウムイオンを含み、工程（ｄ）の処理はマグネシウムイオンをキレート化するためにキレート化剤を添加することを含む。
１つの態様によれば、工程（ｃ）はマグネシウムイオンを含み、工程（ｄ）の処理はマグネシウムイオンをキレート化するためにＥＤＴＡを添加することを含む。
１つの態様によれば、工程（ｃ）はマグネシウムイオンを含み、工程（ｄ）の処理は、メチルトランスフェラーゼにとって理想的な緩衝液条件をつくるために、マグネシウムイオンを等モル量でキレート化するようにＥＤＴＡを添加することを含む。
工程（ｅ）は、反復される工程（ｃ）において、プライマー伸長に理想的なプライマー伸長用緩衝液条件をつくるために、マグネシウムイオンを添加することを含む。
１つの態様によれば、前記メチルトランスフェラーゼはＤＮＭＴ１である。
１つの態様によれば、前記トランスポザーゼはＴｎ５トランスポザーゼ、Ｍｕトランスポザーゼ、Ｔｎ７トランスポザーゼ又はＩＳ５トランスポザーゼである。
１つの態様によれば、前記シトシン残基をウラシルに変換するための試薬は亜硫酸水素ナトリウムである。
１つの態様によれば、前記二本鎖ＤＮＡ配列はゲノムＤＮＡである。
１つの態様によれば、前記二本鎖ＤＮＡ配列は単一細胞から得られた全ゲノムＤＮＡ、又はセルフリーＤＮＡである。
１つの態様によれば、前記二本鎖ＤＮＡ配列は出生前細胞、がん細胞、又は循環腫瘍細胞に由来するゲノムＤＮＡである。
１つの態様によれば、前記二本鎖ＤＮＡ配列は、個人から採取された血液試料から得られたセルフリー腫瘍細胞ゲノムＤＮＡである。
１つの態様によれば、工程（ｂ）〜（ｄ）は１〜２０回繰り返される。
１つの態様によれば、工程（ｂ）〜（ｄ）は１〜１０回繰り返される。
１つの態様によれば、工程（ｂ）〜（ｄ）は１〜５回繰り返される。
１つの態様によれば、前記鋳型二本鎖ＤＮＡ断片配列群のフルメチル化アンプリコンは、シトシン残基をウラシルに変換するための試薬で処理される。
１つの態様によれば、前記シトシン残基をウラシルに変換するための試薬はＡＰＯＢＥＣファミリーの酵素である。
１つの態様によれば、前記シトシン残基をウラシルに変換するための試薬はＡＰＯＢＥＣ３Ａである。
１つの態様によれば、前記プライマーは遺伝子座特異的プライマーである。
１つの態様によれば、前記プライマーは疾患特異的プライマーである。
１つの態様によれば、前記プライマーはがん特異的プライマーである。
【０１３５】
本開示は、（ａ）個人由来の液体生検試料から得られた、メチル化パターンを有する二本鎖ＤＮＡ配列を断片化することで、メチル化パターンを有し、且つ、５’末端及び３’末端のそれぞれにプライマー結合部位を含む、鋳型二本鎖ＤＮＡ断片配列群を作製すること、
（ｂ）前記鋳型二本鎖ＤＮＡ断片配列群をそれぞれ上下の鋳型鎖に分離すること、
（ｃ）がん特異的プライマー、ポリメラーゼ及びヌクレオチドを用いて前記上下の鋳型鎖を伸長させ、非メチル化相補鎖を作製することで、メチル化パターンを有する前記鋳型二本鎖ＤＮＡ断片配列群に対応するヘミメチル化二本鎖ＤＮＡ配列群を得ること、
（ｄ）前記ヘミメチル化二本鎖ＤＮＡ配列群をメチルトランスフェラーゼとメチル基供給源とで処理することにより、対応する前記鋳型二本鎖ＤＮＡ断片配列群におけるメチル化シトシンに対応する位置にメチル基を付加して、フルメチル化鋳型二本鎖ＤＮＡ断片配列群を作製すること；
（ｅ）工程（ｂ）〜（ｄ）を繰り返して、前記鋳型二本鎖ＤＮＡ断片配列群のフルメチル化アンプリコンを作製すること、
前記鋳型二本鎖ＤＮＡ断片配列群のフルメチル化アンプリコン群を、シトシン残基をウラシルに変換するための試薬で処理すること；
メチル化シトシンパターンを決定すること；
前記メチル化シトシンパターンを、がんＤＮＡの標準的なメチル化シトシンパターンと比較すること；
前記メチル化シトシンパターンと前記がんＤＮＡの標準的なメチル化シトシンパターンとの間の差異を決定すること；並びに
決定された前記メチル化シトシンパターンが前記がんＤＮＡの標準的なメチル化シトシンパターンと一致している場合に前記個人をがんと診断すること、
を含む、個人のがんを診断する方法を提供する。
１つの態様によれば、前記液体生検試料は血液試料、髄液試料又は尿試料である。
１つの態様によれば、工程（ｃ）はマグネシウムイオンを含み、工程（ｄ）の処理はマグネシウムイオンをキレート化するためにキレート化剤を添加することを含む。
１つの態様によれば、工程（ｃ）はマグネシウムイオンを含み、工程（ｄ）の処理はマグネシウムイオンをキレート化するためにＥＤＴＡを添加することを含む。
１つの態様によれば、工程（ｃ）はマグネシウムイオンを含み、工程（ｄ）の処理は、メチルトランスフェラーゼにとって理想的な緩衝液条件をつくるために、マグネシウムイオンを等モル量でキレート化するようにＥＤＴＡを添加することを含む。
１つの態様によれば、工程（ｅ）は、反復される工程（ｃ）において、プライマー伸長に理想的なプライマー伸長用緩衝液条件をつくるために、マグネシウムイオンを添加することを含む。
１つの態様によれば、前記メチルトランスフェラーゼはＤＮＭＴ１である。
１つの態様によれば、前記シトシン残基をウラシルに変換するための試薬は亜硫酸水素ナトリウムである。
１つの態様によれば、前記シトシン残基をウラシルに変換するための試薬はＡＰＯＢＥＣファミリーの酵素である。
１つの態様によれば、前記シトシン残基をウラシルに変換するための試薬はＡＰＯＢＥＣ３Ａである。
１つの態様によれば、前記二本鎖ＤＮＡ配列は単一細胞から得られた全ゲノムＤＮＡである。
１つの態様によれば、前記二本鎖ＤＮＡ配列はがん細胞、又は循環腫瘍細胞に由来するゲノムＤＮＡである。
１つの態様によれば、前記二本鎖ＤＮＡ配列は、個人から採取された血液試料から得られたセルフリー腫瘍細胞ゲノムＤＮＡである。
１つの態様によれば、工程（ｂ）〜（ｄ）は１〜２０回繰り返される。
１つの態様によれば、工程（ｂ）〜（ｄ）は１〜１０回繰り返される。
１つの態様によれば、工程（ｂ）〜（ｄ）は１〜５回繰り返される。
１つの態様によれば、前記プライマーはがん特異的プライマーである。
１つの態様によれば、メチル化シトシンパターンの決定は、次世代シーケンシング、メチル化特異的ｑＰＣＲ、又はメチル化検出用マイクロアレイを含む。
１つの態様によれば、前記がんは、胸部の浸潤癌、結腸の腺癌、肝臓の肝細胞癌、前立腺の腺癌、胃の腺癌、及び子宮体部の子宮内膜癌からなる群から選択されるがんである。
【０１３６】
本開示は、（ａ）個人由来の液体生検試料から、正常な体細胞と比較して異なるメチル化パターンを有するセルフリー腫瘍ＤＮＡを含有する可能性のある、セルフリーＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを抽出すること、
（ｂ）前記二本鎖ＤＮＡ配列群をそれぞれ上下の鋳型鎖に分離すること、
（ｃ）ポリメラーゼと、ヌクレオチドと、がん細胞と正常細胞とが異なるメチル化パターンを有するゲノム領域群を標的とする選択されたプライマーセットと、を用いて前記上下の鋳型鎖を伸長させることで、選択された差示的メチル化遺伝子座群のヘミメチル化二本鎖ＤＮＡ配列群を得ること、
（ｄ）前記ヘミメチル化二本鎖ＤＮＡ配列群をメチルトランスフェラーゼで処理することで、対応する二本鎖ＤＮＡ配列内のメチル化シトシンに対応する位置にメチル基を付加して、選択された差示的メチル化遺伝子座群のフルメチル化二本鎖ＤＮＡ配列群を得ること、
（ｅ）工程（ｂ）〜（ｄ）を繰り返して、前記選択された差示的メチル化遺伝子座のフルメチル化アンプリコン群を作製すること、
（ｆ）前記フルメチル化アンプリコン群を、メチル化シトシン残基は変化させずにシトシン残基をウラシルに変換するための試薬で処理すること、
（ｇ）メチル化シトシンパターンを決定すること；
（ｈ）セルフリーＤＮＡのメチル化シトシンパターンと、異なるがん組織のメチル化シトシンパターンと、を比較し、前記セルフリーＤＮＡのメチル化シトシンパターンと前記異なるがん組織のメチル化シトシンパターンとの間の差異を決定し、セルフリー腫瘍ＤＮＡが前記試料中に存在するかどうかを判定することにより、前記試料中のセルフリー腫瘍ＤＮＡの有無を判定すること；及び、
（ｉ）決定された前記メチル化シトシンパターンががん特異的なメチル化パターンを含む場合に、前記個人が特定の種類のがんを有すると診断すること、
を含む、個人のがんを早期に診断する方法を提供する。
１つの態様によれば、前記液体生検試料は血液試料、髄液試料又は尿試料である。
１つの態様によれば、工程（ｃ）はマグネシウムイオンを含み、工程（ｄ）の処理はマグネシウムイオンをキレート化するためにキレート化剤を添加することを含む。
１つの態様によれば、工程（ｃ）はマグネシウムイオンを含み、工程（ｄ）の処理はマグネシウムイオンをキレート化するためにＥＤＴＡを添加することを含む。
１つの態様によれば、工程（ｃ）はマグネシウムイオンを含み、工程（ｄ）の処理は、メチルトランスフェラーゼにとって理想的な緩衝液条件をつくるために、マグネシウムイオンを等モル量でキレート化するようにＥＤＴＡを添加することを含む。
１つの態様によれば、工程（ｅ）は、反復される工程（ｃ）において、プライマー伸長に理想的なプライマー伸長用緩衝液条件をつくるために、マグネシウムイオンを添加することを含む。
１つの態様によれば、前記メチルトランスフェラーゼはＤＮＭＴ１である。
１つの態様によれば、前記シトシン残基をウラシルに変換するための試薬は亜硫酸水素ナトリウムである。
１つの態様によれば、前記シトシン残基をウラシルに変換するための試薬はＡＰＯＢＥＣファミリーの酵素である。
１つの態様によれば、前記シトシン残基をウラシルに変換するための試薬はＡＰＯＢＥＣ３Ａである。
１つの態様によれば、前記二本鎖ＤＮＡ配列は単一細胞から得られた全ゲノムＤＮＡである。
１つの態様によれば、前記二本鎖ＤＮＡ配列はがん細胞、又は循環腫瘍細胞に由来するゲノムＤＮＡである。
１つの態様によれば、前記二本鎖ＤＮＡ配列は、個人から採取された血液試料から得られたセルフリー腫瘍細胞ゲノムＤＮＡである。
１つの態様によれば、工程（ｂ）〜（ｄ）は１〜２０回繰り返される。
１つの態様によれば、工程（ｂ）〜（ｄ）は１〜１０回繰り返される。
１つの態様によれば、工程（ｂ）〜（ｄ）は１〜５回繰り返される。
１つの態様によれば、前記プライマーはがん特異的プライマーである。
１つの態様によれば、メチル化シトシンパターンの決定は、次世代シーケンシング、メチル化特異的ｑＰＣＲ、又はメチル化検出用マイクロアレイを含む。
１つの態様によれば、前記がんは、胸部の浸潤癌、結腸の腺癌、肝臓の肝細胞癌、前立腺の腺癌、胃の腺癌、及び子宮体部の子宮内膜癌からなる群から選択されるがんである。
【図１−１】
2020513801.tif 000003
【図１−２】
2020513801.tif 000004
【図１−３】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
2020513801000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年11月14日(2019.11.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９０】
（Ｔｎ５タグメンテーション）
タグメンテーション用にＴｎ５トランスポゾン複合体を以下の通りに調製する。１μＬの精製された５μＭ  Ｔｎ５  Ｐｒｏｔｅｉｎを、１μＬの５μＭ  Ｔｎ５  ｄｓＤＮＡと混合する。２５℃で４５分間インキュベートする。９８μＬのＴｎ５  Ｄｉｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒを２μＬの前記トランスポゾン混合物に添加して、０．０５μＭ  Ｔｎ５複合体を得る。前記Ｔｎ５  Ｄｉｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒは、１０μＬの１Ｍ  ＴＥバッファー（ｐＨ８．０）、４μＬの０．５Ｍ  ＮａＣｌ、及び８４μＬのＨ２Ｏを含む。Ｔｎ５  ｄｓＤＮＡは、上側鎖の５’−ＣＡＴ  ＴＡＣ  ＧＡＧ  ＣＧＡ  ＧＡＴ  ＧＴＧ  ＴＡＴ  ＡＡＧ  ＡＧＡ  ＣＡＧ−３’（配列番号１）と、下側鎖の５’−Ｐｈｏｓ−ＣＴＧ  ＴＣＴ  ＣＴＴ  ＡＴＡ  ＣＡＣ  ＡＴＣ  ｉｎｖｄＴ−３’（配列番号２）とを含む。２．５μＬの細胞溶解物に、１．５μＬの０．０５μＭ  Ｔｎ５トランスポゾン複合体、１μＬの５×Ｔｎ５  Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒを添加する。Ｔｎ５  Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒの１×バッファー条件には、１０ｍＭトリス塩酸、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５℃でｐＨ７．８が含まれる。５μＬの反応系を５０℃で１０分間インキュベートする。１μＬの１ｍｇ／μＬ  ＰｒｏｔｅａｓｅＱ（キアゲン社）を前記反応系に添加し、以下の熱サイクルでインキュベートする：５０℃、２０分間及び７０℃、３０分間。得られるｄｓＤＮＡは、３０ｂｐのＤＮＡプライミング部位が両端に付加され、３’末端に９ｂｐのギャップを残して、５００ｂｐ〜１０００ｂｐの長さになるはずである。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９１】
（ギャップ修復及び１サイクル目のＰＣＲ反応）
９ｂｐのギャップを充填するため、鎖置換活性を有するＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  （ｅｘｏ−）  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いてこのギャップを修復する。ギャップ修復後、ＤＮＡ断片を熱変性させる。得られたｓｓＤＮＡは、相補的な末端を有するため、ステムループ構造を形成する。このステムループ構造体を増幅するため、アニーリング温度を逓減させるシングルプライマーＰＣＲ反応を行う。６μＬの前記反応系に、１μＬの１０×ＰＣＲバッファー、０．２μＬのｄＮＴＰ、０．１μＬの２Ｕ／μＬ  ＤｅｅｐＶｅｎｔ  ｅｘｏ−、配列５’−ＣＡＴ  ＴＡＣ  ＧＡＧ  ＣＧＡ  ＧＡＴ  ＧＴＧ  ＴＡＴ  ＡＡＧ  ＡＧＡ  ＣＡＧ−３’（配列番号１）を有する、０．２μＬの１μＭ  ３０ｂｐ  ｓｓＤＮＡプライマー、０．２μＬの１００ｍＭ  ＭｇＳＯ４、及び２．３μＬのＨ２Ｏを添加する。１×ＰＣＲバッファー条件は、２０ｍＭトリス塩酸、１０ｍＭ  ＫＣＬ、０．１％Ｔｒｉｔｉｏｎ  Ｘ−１００、２５℃でｐＨ７．８を含む。１０μＬの前記反応に対して、以下の熱サイクルを実行する：７２℃１０分間、９５℃３分間、６８℃６０秒間、６７℃６０秒間、６６℃６０秒間、６５℃６０秒間、６４℃６０秒間、６３℃６０秒間、６２℃６０秒間、６１℃６０秒間、６０℃６０秒間、５９℃６０秒間、５８℃６０秒間、及び７２℃３分間。これによりヘミメチル化ｄｓＤＮＡ断片が得られる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３０】
前記８７ｂｐのｄｓＤＮＡ鋳型は以下である：
上側鎖：５’−ＡＣＣ  ＴＧＴ  ＧＡＣ  ＴＧＡ  ＧＡＣ  ＡＴＣ  ＴＧＡ  ＡＧＧ  ＴＧＣ  ＡＡＴ  ＣＡＧ  ＧＴＧ  ＴＣＡ  ＧＴＣ  ＴＴＡ  ＡＡＧ  ＧＡＴ  ＣＧＡ  ＴＡＡ  ＧＧＡ  ＡＧＣ  ＧＧＡ  ＡＧＴ  ＡＧＴ  ＧＧＴ  ＣＴＣ  ＧＴＣ  ＧＴＡ  ＧＴＧ−３’（配列番号３）
下側鎖：５’−ＣＡＣ  ＴＡＣ  ＧＡＣ  ＧＡＧ  ＡＣＣ  ＡＣＴ  ＡＣＴ  ＴＣＣ  ＧＣＴ  ＴＣＣ  ＴＴＡ  ＴＣＧ  ＡＴＣ  ＣＴＴ  ＴＡＡ  ＧＡＣ  ＴＧＡ  ＣＡＣ  ＣＴＧ  ＡＴＴ  ＧＣＡ  ＣＣＴ  ＴＣＡ  ＧＡＴ  ＧＴＣ  ＴＣＡ  ＧＴＣ  ＡＣＡ  ＧＧＴ−３’（配列番号４）。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３２】
図７に示されるように、ある特定の緩衝液条件におけるＤＮＭＴ１の新規メチル化率を評価するため、非メチル化ｄｓＤＮＡ鋳型が自家製緩衝液中でＤＮＭＴ１とインキュベートされた後、Ｃｌａｉ切断及び電気泳動が行われる。２μＬの２Ｕ／μＬ  ＤＮＭＴ１（ＮＥＢ社）と共に３時間インキュベートされた１５μＬの反応系において、ＤＮＭＴ１は約０．１％の新規メチル化率を示す。反応緩衝液条件は次の通りである：０．１５μＬの１６０μＭ  ＳＡＭ、０．１５μＬの１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、０．３μＬの２００ｍＭ  ＥＤＴＡを添加した１×ＭＴ  Ｂｕｆｆｅｒ。ＭＴ  Ｂｕｆｆｅｒの１×バッファー条件は、２０ｍＭトリス塩酸、１ｍＭ  ＤＴＴ、５％グリセロールを、２５℃でｐＨ７．８、を含む。ＭＴ  Ｂｕｆｆｅｒ中で反応すると、ＤＮＭＴ１はロバストな性能を発揮し得るが、メチル化状態を増幅するためには、ポリメラーゼ伸長反応のロバスト性も求められる。ポリメラーゼ伸長に理想的な緩衝液条件は、ＭＴ  Ｂｕｆｆｅｒと競合しないはずであり、ＰＣＲバッファーとＭＴ  Ｂｕｆｆｅｒとの交換は複雑でないはずである。現在、本明細書に記載の増幅反応及びメチル化反応では、１０μＬの反応体積中、０．１μＬの２Ｕ／μＬ  ＤｅｅｐＶｅｎｔ  ｅｘｏ−を用いてポリメラーゼ伸長を行う。緩衝液条件は、０．２μＬのｄＮＴＰ及び０．２μＬの１００ｍＭ  ＭｇＳＯ４を添加した１×  ＰＣＲバッファーである。緩衝液交換はＭｇ２＋をＥＤＴＡでキレート化することにより達成される。１×ＰＣＲバッファー条件は、２０ｍＭトリス塩酸、１ｍＭ  ＤＴＴ、５％グリセロール、２５℃でｐＨ７．８、を含む。８７ｂｐ  ｄｓＤＮＡ鋳型のポリメラーゼ伸長用の熱サイクルは、９４℃２分間、５８℃６０秒間、及び７２℃３分間である。フォワードプライマーは５’−ＡＣＣ  ＴＧＴ  ＧＡＣ  ＴＧＡ  ＧＡＣ  ＡＴＣ  ＴＧ−３’（配列番号５）である。リバースプライマーは５’−ＣＡＣ  ＴＡＣ  ＧＡＣ  ＧＡＧ  ＡＣＣ  ＡＣＴ  ＡＣ−３’（配列番号６）である。
【国際調査報告】
2020513801.tif 000013